(57)【要約】【課題】初代分離培養により、容易かつ正確にインフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）を検出可能な方法およびそれに用いる培地を提供することを課題とする。【解決手段】少なくとも以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）を含有する、インフルエンザ菌が発育可能な培地に検体を接種して培養後、細菌のコロニー色および溶血の有無を確認することを特徴とするインフルエンザ菌のスクリーニング方法。  （ａ）ウマ血液、  （ｂ）β−ＮＡＤまたはそのリン酸塩、  （ｃ）抗菌剤、  （ｄ）発色成分であって、インフルエンザ菌のコロニーの呈色とパラインフルエンザ菌（Haemophilus parainfluenzae）のコロニーの呈色を異なる色にする特性を有する発色成分。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ１）および（ｅ）を含有する、インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）が発育可能な培地に検体を接種して培養後、細菌のコロニー色および溶血の有無を確認することを特徴とするインフルエンザ菌のスクリーニング方法。
（ａ）溶血していないウマ血液、
（ｂ）β−ＮＡＤまたはそのリン酸塩、
（ｃ）抗菌剤、
（ｄ１）白糖およびpH指示薬であって、前記pH指示薬は、アニリンブルー、ブロモクレゾールパープル、ブロモチモールブルー、フェノールレッド、ニュートラルレッドおよびメチルレッドから成る群より選択される、前記白糖およびpH指示薬、
（ｅ）不溶性白色化合物。
【請求項２】
前記培地がさらに（ｄ２）を含有することを特徴とする請求項１に記載のインフルエンザ菌のスクリーニング方法。
（ｄ２）５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、５−ブロモ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、６−フルオロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、５−ヨード−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、Ｎ−メチルインドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドおよび４−メチル−ウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドから成る群より選択される酵素発色基質。
【請求項３】
前記抗菌剤がグラム陽性菌の増殖を抑制する抗菌剤であることを特徴とする請求項２に記載のインフルエンザ菌のスクリーニング方法。
【請求項４】
少なくとも以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ１）および（ｅ）を含有する、インフルエンザ菌が発育可能な培地に検体を接種して培養後、細菌のコロニー色および溶血の有無を確認することを特徴とするインフルエンザ菌、ヘモフィルス・ヘモリティカス（Haemophilus haemolyticus）、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・パラヘモリティカス（Haemophilus parahaemolyticus）の識別方法。
（ａ）溶血していないウマ血液、
（ｂ）β−ＮＡＤまたはそのリン酸塩、
（ｃ）抗菌剤、
（ｄ１）白糖およびpH指示薬であって、前記pH指示薬は、アニリンブルー、ブロモクレゾールパープル、ブロモチモールブルー、フェノールレッド、ニュートラルレッドおよびメチルレッドから成る群より選択される、前記白糖およびpH指示薬、
（ｅ）不溶性白色化合物。
【請求項５】
前記培地がさらに（ｄ２）を含有することを特徴とする請求項４に記載のインフルエンザ菌、ヘモフィルス・ヘモリティカス、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・パラヘモリティカスの識別方法。
（ｄ２）５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、５−ブロモ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、６−フルオロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、５−ヨード−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、Ｎ−メチルインドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドおよび４−メチル−ウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドから成る群より選択される酵素発色基質。
【請求項６】
前記抗菌剤がグラム陽性菌の増殖を抑制する抗菌剤であることを特徴とする請求項５に記載のインフルエンザ菌、ヘモフィルス・ヘモリティカス、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・パラヘモリティカスの識別方法。
【請求項７】
インフルエンザ菌が発育可能な培地に、以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ１）および（ｅ）を含むことを特徴とするインフルエンザ菌スクリーニング用培地。
（ａ）溶血していないウマ血液、
（ｂ）β−ＮＡＤまたはそのリン酸塩、
（ｃ）抗菌剤、
（ｄ１）白糖およびpH指示薬であって、前記pH指示薬は、アニリンブルー、ブロモクレゾールパープル、ブロモチモールブルー、フェノールレッド、ニュートラルレッドおよびメチルレッドから成る群より選択される、前記白糖およびpH指示薬、
（ｅ）不溶性白色化合物。
【請求項８】
さらに（ｄ２）を含有することを特徴とする請求項７に記載のインフルエンザ菌スクリーニング用培地。
（ｄ２）５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、５−ブロモ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、６−フルオロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、５−ヨード−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、Ｎ−メチルインドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドおよび４−メチル−ウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドから成る群より選択される酵素発色基質。
【請求項９】
前記抗菌剤がグラム陽性菌の増殖を抑制する抗菌剤であることを特徴とする請求項８に記載のインフルエンザ菌スクリーニング用培地。
【請求項１０】
インフルエンザ菌が発育可能な培地に、以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ１）および（ｅ）を含むことを特徴とするインフルエンザ菌、ヘモフィルス・ヘモリティカス、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・パラヘモリティカスの識別用培地。
（ａ）溶血していないウマ血液、
（ｂ）β−ＮＡＤまたはそのリン酸塩、
（ｃ）抗菌剤、
（ｄ１）白糖およびpH指示薬であって、前記pH指示薬は、アニリンブルー、ブロモクレゾールパープル、ブロモチモールブルー、フェノールレッド、ニュートラルレッドおよびメチルレッドから成る群より選択される、前記白糖およびpH指示薬、
（ｅ）不溶性白色化合物。
【請求項１１】
さらに（ｄ２）を含有することを特徴とする請求項１０に記載のインフルエンザ菌、ヘモフィルス・ヘモリティカス、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・パラヘモリティカスの識別用培地。
（ｄ２）５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、５−ブロモ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、６−フルオロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、５−ヨード−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、Ｎ−メチルインドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドおよび４−メチル−ウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドから成る群より選択される酵素発色基質。
【請求項１２】
前記抗菌剤がグラム陽性菌の増殖を抑制する抗菌剤であることを特徴とする請求項１１に記載のインフルエンザ菌、ヘモフィルス・ヘモリティカス、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・パラヘモリティカスの識別用培地。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヘモフィルス・インフルエンザ（Haemophilus influenzae、以下、インフルエンザ菌という。）の検出方法およびそれに用いる培地、並びに／または、インフルエンザ菌、ヘモフィルス・ヘモリティカス（Haemophilus haemolyticus）、ヘモフィルス・パラインフルエンザ（Haemophilus parainfluenzae、以下、パラインフルエンザ菌という。）およびヘモフィルス・パラヘモリティカス（Haemophilus parahaemolyticus）の識別方法およびそれに用いる培地に関するものである。より詳細には、インフルエンザ菌が存在する可能性のある被検体から、インフルエンザ菌の存否を、容易に検出（スクリーニング）できる方法およびスクリーニング用培地、並びに／または、インフルエンザ菌、ヘモフィルス・ヘモリティカス、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・パラヘモリティカスが存在する可能性のある検体中の、インフルエンザ菌、ヘモフィルス・ヘモリティカス、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・パラヘモリティカスを識別できる方法および識別用培地に関する。
【背景技術】
【０００２】
インフルエンザ菌は、ヒトの鼻咽腔に常在するグラム陰性桿菌であり、菌を被う莢膜多糖体の抗原性の違いによりa〜fの血清型と無莢膜株（non-typable）に型別される。無莢膜株は、ヒトに常在するインフルエンザ菌の多くを占め、中耳炎、副鼻腔炎、慢性気管支炎、結膜炎の患者からしばしば分離される。一方、小児の髄膜炎や敗血症、成人の肺炎の起因菌はb型莢膜株であることが多い（非特許文献１）。
【０００３】
通常、検査材料からのインフルエンザ菌の初代分離培養には、チョコレート寒天培地あるいはバシトラシンを添加して選択性を向上させたチョコレート寒天培地が用いられる。インフルエンザ菌は、発育に十分量のＸ因子（Heminまたは他のポルフィリン）とＶ因子（nicotinamide adenine dinucleotide：ＮＡＤ、またはそのリン酸塩）を必要とするため、Ｖ因子を破壊する酵素が赤血球中に多量に存在するヒツジ血液を含有するヒツジ血液寒天培地には発育しない。一方、ウマ血液はＶ因子を破壊する酵素含有量が少ないため、ウマ血液寒天培地にはインフルエンザ菌が発育する。しかし、発育したインフルエンザ菌のコロニーが微小であるため、ウマ血液寒天培地はインフルエンザ菌の初代分離培養用としては使用されない。そのため、Ｘ因子およびＶ因子を豊富に含有するチョコレート寒天培地がインフルエンザ菌の初代分離培養に用いられている。
初代分離培養後は、発育したコロニーの中からインフルエンザ菌を疑うコロニーを釣菌して確認試験を行うことにより、細菌が同定される。確認試験としては、被験菌を普通寒天培地に塗布し、Ｘ・Ｖ因子要求試験用ディスクを置いて培養する方法、被験菌を4分画培地（それぞれＸ因子、Ｖ因子、ＸＶ因子、ウマ血液を含有している培地）に塗布して培養する方法、被験菌のポルフィリン合成能を調べる方法等がある（非特許文献２および３、特許文献１、２および３）。
【０００４】
初代分離培養時、実際には、チョコレート寒天培地またはバシトラシン添加チョコレート寒天培地を用いた培養と並行して、ヒツジ血液寒天培地を用いた培養が行われ、ヒツジ血液寒天培地に発育せず、チョコレート寒天培地やバシトラシン添加チョコレート寒天培地に発育したコロニーの中からインフルエンザ菌を疑うコロニーを釣菌して確認試験が行われる。しかし、インフルエンザ菌以外のヘモフィルス属菌（ヘモフィルス・ヘモリティカス、パラインフルエンザ菌、ヘモフィルス・パラヘモリティカス等）もヒツジ血液寒天培地に発育せず、チョコレート寒天培地やバシトラシン添加チョコレート寒天培地に発育するため、発育したヘモフィルス属菌の中から形態のみによってインフルエンザ菌を識別しなければならず、その識別には熟練した技術が必要とされる。また、初代分離培養により発育した多数のコロニーの中からインフルエンザ菌を疑うコロニー全てを釣菌して確認試験を行うため、熟練した技術に加え、煩雑な作業および多量の確認試験薬（Ｘ・Ｖ因子要求試験用ディスク、4分画培地、ポルフィリン合成能試験薬等）が必要とされる。さらに、コロニーを釣菌する際にはインフルエンザ菌を釣菌し逃す可能性もある。
【０００５】
一方、酵素発色基質を含有するチョコレート寒天培地を用いることにより、細菌の色変化に基づいて微生物を識別する方法が開示され、Ｍａｇ−ｐｈｏｓ（５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリルホスフェート）を含有するチョコレート寒天培地を用いることにより、紫色のインフルエンザ菌コロニーが無色の正常痰細菌叢から識別されることが記載されている（特許文献４）。しかし、酵素発色基質を含有するチョコレート寒天培地を用いた場合においても、インフルエンザ菌と同じ酵素分解能を示す細菌とインフルエンザ菌とを形態によって識別するためには熟練した技術を要し、作業効率が悪く、試薬コストが嵩むという問題が依然として残っている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開昭６２−１５５０９８号公報
【特許文献２】実開昭５９−１５９３００号公報
【特許文献３】特開２００１−１６１３９４号公報
【特許文献４】特開２００１−１６１３９６号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】荒川  宣親，病原体微生物検出情報（IASR），３１，９４−９５，２０１０
【非特許文献２】長南  正佳ら，臨床検査，５８（１１），１３６２−１３６５，２０１４
【非特許文献３】山口  育男，微生物検査ナビ，１６４−１６５，２０１３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、上記の現状に鑑みてなされたものであり、検体中にインフルエンザ菌が存在するか否かを、容易かつ正確に検出（スクリーニング）できる方法およびスクリーニング用培地、並びに／または、検体中のインフルエンザ菌、ヘモフィルス・ヘモリティカス、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・パラヘモリティカスを、容易かつ正確に識別できる方法および識別用培地を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討した結果、従来、初代分離培養には用いられていなかったウマ血液寒天培地にβ−ＮＡＤ、抗菌剤を添加し、さらに発色成分として白糖、pH指示薬を添加して作製した培地に検体を接種して培養後、発育したヘモフィルス属菌の白糖分解能および溶血の有無により菌種が判別可能なこと、すなわち、初代分離培養用の培地としてウマ血液寒天培地にβ−ＮＡＤ、抗菌剤を添加し、さらに発色成分として白糖、pH指示薬を添加して作製した培地を用いることにより、発育した細菌のコロニー色および溶血の有無を確認するのみで、容易にインフルエンザ菌（白糖分解無し・溶血無し）、ヘモフィルス・ヘモリティカス（白糖分解無し・溶血有り）、パラインフルエンザ菌（白糖分解有り・溶血無し）、ヘモフィルス・パラヘモリティカス（白糖分解有り・溶血有り）の識別が可能になることを見出した。本発明者らは、また、ウマ血液寒天培地にβ−ＮＡＤ、抗菌剤を添加し、さらに発色成分としてガラクトピラノシド誘導体（以下、Ｇａｌ誘導体という。）を添加して作製した培地に検体を接種して培養後、発育したヘモフィルス属菌のＧａｌ誘導体の分解能および溶血の有無により菌種が判別可能なこと、すなわち、初代分離培養用の培地としてウマ血液寒天培地にβ−ＮＡＤ、抗菌剤を添加し、さらに発色成分としてＧａｌ誘導体を添加して作製した培地を用いることにより、発育した細菌のコロニー色および溶血の有無を確認するのみで、容易にインフルエンザ菌（Ｇａｌ誘導体分解無し・溶血無し）、ヘモフィルス・ヘモリティカス（Ｇａｌ誘導体分解無し・溶血有り）、パラインフルエンザ菌（Ｇａｌ誘導体分解有り・溶血無し）、ヘモフィルス・パラヘモリティカス（Ｇａｌ誘導体分解有り・溶血有り）の識別が可能になることを見出した。さらに、培地に酸化チタンを添加して培地色を明るく保つことにより溶血とコロニー発色の視認性が向上すること、および培地に発色成分として白糖、pH指示薬およびＧａｌ誘導体を添加することで、より正確な識別が可能になることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は以下のような構成からなるものである。
（１）少なくとも以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）を含有する、インフルエンザ菌が発育可能な培地に検体を接種して培養後、細菌のコロニー色および溶血の有無を確認することを特徴とするインフルエンザ菌のスクリーニング方法。
（ａ）ウマ血液、
（ｂ）β−ＮＡＤまたはそのリン酸塩、
（ｃ）抗菌剤、
（ｄ）発色成分であって、インフルエンザ菌のコロニーの呈色とパラインフルエンザ菌のコロニーの呈色を異なる色にする特性を有する発色成分。
（２）前記発色成分が、以下の（ｄ１）および／または（ｄ２）であることを特徴とする、（１）に記載のインフルエンザ菌のスクリーニング方法。
（ｄ１）インフルエンザ菌によっては分解されないが、パラインフルエンザ菌によって分解されて酸を生成する糖およびpH指示薬、
（ｄ２）インフルエンザ菌によっては分解されないが、パラインフルエンザ菌によって分解されて発色する酵素発色基質。
（３）前記抗菌剤がグラム陽性菌の増殖を抑制する抗菌剤であり、
前記インフルエンザ菌によっては分解されないが、パラインフルエンザ菌によって分解されて酸を生成する糖が、白糖であり、
前記pH指示薬が、アニリンブルー、ブロモクレゾールパープル、ブロモチモールブルー、フェノールレッド、ニュートラルレッドおよびメチルレッドから選択され、
前記インフルエンザ菌によっては分解されないが、パラインフルエンザ菌によって分解されて発色する酵素発色基質が、ガラクトピラノシド誘導体であること
を特徴とする、（２）に記載のインフルエンザ菌のスクリーニング方法。
（４）少なくとも以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）を含有する、インフルエンザ菌が発育可能な培地に検体を接種して培養後、細菌のコロニー色および溶血の有無を確認することを特徴とするインフルエンザ菌、ヘモフィルス・ヘモリティカス、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・パラヘモリティカスの識別方法。
（ａ）ウマ血液、
（ｂ）β−ＮＡＤまたはそのリン酸塩、
（ｃ）抗菌剤、
（ｄ）発色成分であって、インフルエンザ菌のコロニーの呈色とパラインフルエンザ菌のコロニーの呈色を異なる色にし、インフルエンザ菌およびヘモフィルス・ヘモリティカスのコロニーの呈色を同じ色にし、かつ、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・パラヘモリティカスのコロニーの呈色を同じ色にする特性を有する発色成分。
（５）前記発色成分が、以下の（ｄ１）および／または（ｄ２）であることを特徴とする、（４）に記載のインフルエンザ菌、ヘモフィルス・ヘモリティカス、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・パラヘモリティカスの識別方法。
（ｄ１）インフルエンザ菌およびヘモフィルス・ヘモリティカスによっては分解されないが、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・パラヘモリティカスによって分解されて酸を生成する糖およびpH指示薬、
（ｄ２）インフルエンザ菌およびヘモフィルス・ヘモリティカスによっては分解されないが、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・パラヘモリティカスによって分解されて発色する酵素発色基質。
（６）前記抗菌剤がグラム陽性菌の増殖を抑制する抗菌剤であり、
前記インフルエンザ菌およびヘモフィルス・ヘモリティカスによっては分解されないが、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・パラヘモリティカスによって分解されて酸を生成する糖が、白糖であり、
前記pH指示薬が、アニリンブルー、ブロモクレゾールパープル、ブロモチモールブルー、フェノールレッド、ニュートラルレッドおよびメチルレッドから選択され、
前記インフルエンザ菌およびヘモフィルス・ヘモリティカスによっては分解されないが、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・パラヘモリティカスによって分解されて発色する酵素発色基質が、ガラクトピラノシド誘導体であること
を特徴とする、（５）に記載のインフルエンザ菌、ヘモフィルス・ヘモリティカス、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・パラヘモリティカスの識別方法。
（７）インフルエンザ菌が発育可能な培地に、以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）を含むことを特徴とするインフルエンザ菌スクリーニング用培地。
（ａ）ウマ血液、
（ｂ）β−ＮＡＤまたはそのリン酸塩、
（ｃ）抗菌剤、
（ｄ）発色成分であって、インフルエンザ菌のコロニーの呈色とパラインフルエンザ菌のコロニーの呈色を異なる色にする特性を有する発色成分。
（８）前記発色成分が、以下の（ｄ１）および／または（ｄ２）であることを特徴とする、（７）に記載のインフルエンザ菌スクリーニング用培地。
（ｄ１）インフルエンザ菌によっては分解されないが、パラインフルエンザ菌によって分解されて酸を生成する糖およびpH指示薬、
（ｄ２）インフルエンザ菌によっては分解されないが、パラインフルエンザ菌によって分解されて発色する酵素発色基質。
（９）前記抗菌剤がグラム陽性菌の増殖を抑制する抗菌剤であり、
前記インフルエンザ菌によっては分解されないが、パラインフルエンザ菌によって分解されて酸を生成する糖が、白糖であり、
前記pH指示薬が、アニリンブルー、ブロモクレゾールパープル、ブロモチモールブルー、フェノールレッド、ニュートラルレッドおよびメチルレッドから選択され、
前記インフルエンザ菌によっては分解されないが、パラインフルエンザ菌によって分解されて発色する酵素発色基質が、ガラクトピラノシド誘導体であること
を特徴とする、（８）に記載のインフルエンザ菌スクリーニング用培地。
（１０）培地１Ｌあたり以下の成分を少なくとも含有することを特徴とするインフルエンザ菌スクリーニング用培地。
（ａ）ウマ血液 １０〜１００ｍＬ、
（ｂ）β−ＮＡＤ １〜１００ｍｇ、
（ｃ）バシトラシン １〜８００ｍｇ および／または バンコマイシン ０．５〜４０ｍｇ、
（ｄ）白糖 １〜４０ｇ および アニリンブルー ４０〜４００ｍｇ、並びに／または ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド ４０〜３００ｍｇ。
（１１）インフルエンザ菌が発育可能な培地に、以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）を含むことを特徴とするインフルエンザ菌、ヘモフィルス・ヘモリティカス、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・パラヘモリティカスの識別用培地。
（ａ）ウマ血液、
（ｂ）β−ＮＡＤまたはそのリン酸塩、
（ｃ）抗菌剤、
（ｄ）発色成分であって、インフルエンザ菌のコロニーの呈色とパラインフルエンザ菌のコロニーの呈色を異なる色にし、インフルエンザ菌およびヘモフィルス・ヘモリティカスのコロニーの呈色を同じ色にし、かつ、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・パラヘモリティカスのコロニーの呈色を同じ色にする特性を有する発色成分。
（１２）前記発色成分が、以下の（ｄ１）および／または（ｄ２）であることを特徴とする、（１１）に記載のインフルエンザ菌、ヘモフィルス・ヘモリティカス、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・パラヘモリティカスの識別用培地。
（ｄ１）インフルエンザ菌およびヘモフィルス・ヘモリティカスによっては分解されないが、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・パラヘモリティカスによって分解されて酸を生成する糖およびpH指示薬、
（ｄ２）インフルエンザ菌およびヘモフィルス・ヘモリティカスによっては分解されないが、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・パラヘモリティカスによって分解されて発色する酵素発色基質。
（１３）前記抗菌剤がグラム陽性菌の増殖を抑制する抗菌剤であり、
前記インフルエンザ菌およびヘモフィルス・ヘモリティカスによっては分解されないが、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・パラヘモリティカスによって分解されて酸を生成する糖が、白糖であり、
前記pH指示薬が、アニリンブルー、ブロモクレゾールパープル、ブロモチモールブルー、フェノールレッド、ニュートラルレッドおよびメチルレッドから選択され、
前記インフルエンザ菌およびヘモフィルス・ヘモリティカスによっては分解されないが、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・パラヘモリティカスによって分解されて発色する酵素発色基質が、ガラクトピラノシド誘導体であること
を特徴とする、（１２）に記載のインフルエンザ菌、ヘモフィルス・ヘモリティカス、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・パラヘモリティカスの識別用培地。
（１４）培地１Ｌあたり以下の成分を少なくとも含有することを特徴とするインフルエンザ菌、ヘモフィルス・ヘモリティカス、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・パラヘモリティカスの識別用培地。
（ａ）ウマ血液 １０〜１００ｍＬ、
（ｂ）β−ＮＡＤ １〜１００ｍｇ、
（ｃ）バシトラシン １〜２．５ｍｇ および／または バンコマイシン ０．５〜１０ｍｇ、
（ｄ）白糖 １〜４０ｇ および アニリンブルー ４０〜４００ｍｇ、並びに／または ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド ４０〜３００ｍｇ。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、培地に発育した細菌のコロニー色および溶血の有無を確認するのみで、従来は不可能であった初代分離培養によるインフルエンザ菌、ヘモフィルス・ヘモリティカス、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・パラヘモリティカスの容易な識別が可能になる。それにより、チョコレート寒天培地を用いる従来の初代分離培養法に比べて、はるかに容易かつ正確にインフルエンザ菌を検出（スクリーニング）可能になる。また、分離培養後の確認試験のために釣菌するコロニー数を減らすことができ、さらに、確認試験において溶血の有無を確認する必要がないため、4分画培地と比較して安価なＸ・Ｖ因子要求試験用ディスクによる確認試験のみでインフルエンザ菌を同定することが可能になる。その結果、初代分離培養および確認試験を含めた所要時間、操作上の手間および確認試験（Ｘ・Ｖ因子要求試験用ディスク、4分画培地、ポルフィリン合成能試験薬等）にかかるコストを従来に比べて大幅に削減できる上、釣菌し逃しによる偽陰性を無くすことができるという効果ももたらす。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明では、少なくとも（ａ）ウマ血液、（ｂ）β−ＮＡＤまたはそのリン酸塩、（ｃ）抗菌剤、並びに（ｄ）発色成分であって、インフルエンザ菌のコロニーの呈色とパラインフルエンザ菌のコロニーの呈色を異なる色にする特性を有する発色成分を含有し、インフルエンザ菌が発育可能である本発明の培地に検体を接種して培養後、細菌のコロニー色および溶血の有無を確認することによりヘモフィルス属菌の菌種を識別すること、そして、それによりインフルエンザ菌を検出することを特徴とする。実際の培養時には、基礎培地に（ａ）ウマ血液、（ｂ）β−ＮＡＤまたはそのリン酸塩、（ｃ）抗菌剤、並びに（ｄ）発色成分であって、インフルエンザ菌のコロニーの呈色とパラインフルエンザ菌のコロニーの呈色を異なる色にする特性を有する発色成分、を添加したものを本発明の培地として用いることができる。
【００１３】
本発明の培地は、インフルエンザ菌が発育可能であり、かつ、ヘモフィルス属菌による溶血の有無を判別可能な成分を栄養成分として含有する。インフルエンザ菌の発育のためにはＸ因子およびＶ因子が必要であるが、本発明ではＸ因子の供給源として、ウマ血液を添加し、Ｖ因子としてβ−ＮＡＤまたはそのリン酸塩であるβ−ＮＡＤＰ（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate）、β−ＮＡＤＰＨ（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate reduced form）を添加する。Ｖ因子はウマ血液中にも存在するが、本発明では、インフルエンザ菌の発育を促進する目的で、ウマ血液の他にβ−ＮＡＤまたはそのリン酸塩を添加する。
【００１４】
本発明の培地が含有するウマ血液は、ヘモフィルス属菌による溶血の有無を判別するためにも使用される。溶血素を産生する細菌が本発明の培地に発育した場合は、培地中に存在する赤血球を溶血させて透明化し、コロニーの周囲に透明な溶血帯が形成される。そのため、溶血素を産生するヘモフィルス属菌であるヘモフィルス・ヘモリティカス、ヘモフィルス・パラヘモリティカス等が本発明の培地に発育した場合は、溶血有りと判定される。一方、溶血素を産生しないインフルエンザ菌、パラインフルエンザ菌等が本発明の培地に発育した場合は、コロニーの周囲に溶血帯が形成されないため、溶血無しと判定される。
【００１５】
ウマ血液の添加量は、インフルエンザ菌が発育可能であり、かつ、ヘモフィルス属菌による溶血の有無を判別可能な範囲で適宜選択することができるが、例えば、１０〜１００ｍＬ／Ｌとすることが好ましい。一方、Ｖ因子の添加濃度は、インフルエンザ菌が発育可能な範囲で適宜選択することができるが、例えば、β−ＮＡＤの添加濃度を１〜１００ｍｇ／Ｌとすることが好ましい。β−ＮＡＤの代用として、同等量のβ−ＮＡＤＰ、β−ＮＡＤＰＨを添加することも可能である。
【００１６】
本発明の培地は、インフルエンザ菌のコロニーの呈色とパラインフルエンザ菌のコロニーの呈色を異なる色にする特性を有する発色成分を含有する。そのような発色成分として具体的には、（１）インフルエンザ菌によっては分解されないが、パラインフルエンザ菌によって分解されて酸を生成する糖およびpH指示薬、並びに／または（２）インフルエンザ菌によっては分解されないが、パラインフルエンザ菌によって分解されて発色する酵素発色基質、を使用することができる。
さらに、本発明の培地が含有する発色成分は、インフルエンザ菌のコロニーの呈色とパラインフルエンザ菌のコロニーの呈色を異なる色にし、インフルエンザ菌およびヘモフィルス・ヘモリティカスのコロニーの呈色を同じ色にし、かつ、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・パラヘモリティカスのコロニーの呈色を同じ色にする特性を有するものでもある。そのような発色成分として具体的には、（１）インフルエンザ菌およびヘモフィルス・ヘモリティカスによっては分解されないが、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・パラヘモリティカスによって分解されて酸を生成する糖およびpH指示薬、並びに／または（２）インフルエンザ菌およびヘモフィルス・ヘモリティカスによっては分解されないが、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・パラヘモリティカスによって分解されて発色する酵素発色基質、を使用することができる。
【００１７】
本発明の培地で用いられる糖の種類は、インフルエンザ菌が分解能を有さず、パラインフルエンザ菌が分解能を有する糖であれば特に限定されない。そのような糖の例として白糖、マンノース等が挙げられる。例えば、白糖を用いることにより、インフルエンザ菌（白糖分解無し）とパラインフルエンザ菌（白糖分解有り）を精度良く識別することができる。さらに、白糖は、ヘモフィルス・ヘモリティカスが分解能を有さず、ヘモフィルス・パラヘモリティカスが分解能を有する糖でもあるため、白糖を用いることによってヘモフィルス・ヘモリティカス（白糖分解無し）とヘモフィルス・パラヘモリティカス（白糖分解有り）も精度良く識別可能である。これらは、細菌による白糖分解性の違いを利用したものである。白糖の添加濃度はインフルエンザ菌によって分解されず、パラインフルエンザ菌によって分解されて酸を生成する範囲、またはインフルエンザ菌およびヘモフィルス・ヘモリティカスによって分解されず、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・パラヘモリティカスによって分解されて酸を生成する範囲で適宜選択することができる。そのような白糖の濃度を、例えば、１〜４０ｇ／Ｌとすることができるが、１〜２０ｇ／Ｌとすることがより好ましく、１〜１５ｇ／Ｌとすることがさらに好ましい。なお、必要に応じて、白糖に加えてマンノースを添加することも可能である。マンノースも、インフルエンザ菌が分解能を有さず、パラインフルエンザ菌が分解能を有する糖であるため、白糖に加えてマンノースを添加しても同等の効果が得られる。
【００１８】
本発明の培地で用いられるpH指示薬の種類は、白糖の分解によって生じる酸に由来するpH変化に伴って変色するものであれば特に限定されない。例えば、中性色と酸性色が異なるpH指示薬、アニリンブルー、ブロモクレゾールパープル、ブロモチモールブルー、フェノールレッド、ニュートラルレッド、メチルレッド等を使用できる。表１に、白糖およびpH指示薬を発色成分として添加する場合のpH指示薬の種類とコロニーの呈色の具体例を示したが、本発明の培地では、インフルエンザ菌、ヘモフィルス・ヘモリティカス等の、白糖を分解しない細菌のコロニーが無着色である一方で、パラインフルエンザ菌、ヘモフィルス・パラヘモリティカス等の、白糖を分解して酸を生成する細菌のコロニーは、pH指示薬の変色に基づき着色する。したがって、本発明の培地に発育した細菌のコロニーの呈色を観察することにより、その細菌による白糖の分解の有無を判断でき、これを上述の溶血の有無の判別と組み合わせることにより、インフルエンザ菌（白糖分解無し・溶血無し）、ヘモフィルス・ヘモリティカス（白糖分解無し・溶血有り）、パラインフルエンザ菌（白糖分解有り・溶血無し）、ヘモフィルス・パラヘモリティカス（白糖分解有り・溶血有り）の識別が可能である。
【００１９】
【表１】
2022002547.tif 000002
【００２０】
pH指示薬の添加濃度は、白糖の分解によって生じる酸に由来するpH変化に伴って細菌のコロニー色を変色させうる濃度であれば特に限定されないが、例えば、アニリンブルー４０〜４００ｍｇ／Ｌ、ブロモクレゾールパープル４０〜１２０ｍｇ／Ｌ、ブロモチモールブルー４０〜８０ｍｇ／Ｌ、フェノールレッド４０〜１２０ｍｇ／Ｌ、ニュートラルレッド２〜４ｍｇ／Ｌ、メチルレッド４０〜８０ｍｇ／Ｌ等とすることができる。
【００２１】
本発明の培地で用いられる酵素発色基質は、インフルエンザ菌によっては分解されず、パラインフルエンザ菌によって分解されて発色するものであれば特に限定されない。酵素として、例えば、インフルエンザ菌では発現せず、パラインフルエンザ菌で発現する酵素であるガラクトシダーゼを選択し、酵素発色基質をＧａｌ誘導体とすることで、インフルエンザ菌（Ｇａｌ誘導体分解無し）とパラインフルエンザ菌（Ｇａｌ誘導体分解有り）を精度良く識別することができる。Ｇａｌ誘導体は、ヘモフィルス・ヘモリティカスによっては分解されず、ヘモフィルス・パラヘモリティカスによって分解されて発色する特性も有しており、Ｇａｌ誘導体を使用することによってヘモフィルス・ヘモリティカス（Ｇａｌ誘導体分解無し）とヘモフィルス・パラヘモリティカス（Ｇａｌ誘導体分解有り）も精度良く識別可能である。
【００２２】
本発明の培地で用いられるＧａｌ誘導体は、ガラクトシダーゼによって加水分解されうるように発色団化合物または蛍光発色団化合物が結合している化合物であれば、特に限定されない。結合している発色団化合物の具体例としては、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル、５−ブロモ−６−クロロ−３−インドキシル、５−ブロモ−３−インドキシル、４−クロロ−３−インドキシル、６−クロロ−３−インドキシル、６−フルオロ−３−インドキシル、３−インドキシル、５−ヨード−３−インドキシル、Ｎ−メチルインドキシル等のインドキシル誘導体、２−クロロ−４−ニトロフェニル、２−ニトロフェニル、４−ニトロフェニル、４−アミノフェニル等のフェニル誘導体、６−ブロモ−２−ナフチル等のナフチル誘導体等が挙げられる。また、蛍光発色団化合物の具体例としては、８−ヒドロキシキノリン等のキノリン誘導体、４−メチルウンベリフェリル、７−ヒドロキシクマリン−６−イル等のクマリン誘導体、７−ブロモ−Ｎ−（２−メトキシフェニル）−３−ヒドロキシ−２−ナフタレンカルボキシアミド（ナフトールAS−BI）、１−ナフチル、２−ナフチル等のナフチル誘導体、レゾルフィン等が挙げられる。
【００２３】
表２に、酵素発色基質であるＧａｌ誘導体のみを発色成分として添加する場合の酵素発色基質の種類とコロニーの呈色の具体例を示したが、本発明の培地では、インフルエンザ菌、ヘモフィルス・ヘモリティカス等の、Ｇａｌ誘導体を分解しない細菌のコロニーは無着色であり、パラインフルエンザ菌、ヘモフィルス・パラヘモリティカス等の、Ｇａｌ誘導体を分解する細菌のコロニーは、分解により遊離した発色団化合物の発色に基づき着色する。また、酵素発色基質として蛍光発色団化合物が結合しているＧａｌ誘導体を使用する場合は、紫外線ランプ等を使用して、蛍光発色団化合物に適した波長の紫外線を培養後の培地にあてることにより、インフルエンザ菌、ヘモフィルス・ヘモリティカス等の、Ｇａｌ誘導体を分解しない細菌のコロニーは蛍光を発せず、パラインフルエンザ菌、ヘモフィルス・パラヘモリティカス等の、Ｇａｌ誘導体を分解する細菌のコロニーは蛍光色を呈する。したがって、本発明の培地に発育した細菌のコロニーの呈色を観察することにより、その細菌によるＧａｌ誘導体の分解の有無を判断でき、これを溶血の有無の判別と組み合わせることにより、インフルエンザ菌（Ｇａｌ誘導体分解無し・溶血無し）、ヘモフィルス・ヘモリティカス（Ｇａｌ誘導体分解無し・溶血有り）、パラインフルエンザ菌（Ｇａｌ誘導体分解有り・溶血無し）、ヘモフィルス・パラヘモリティカス（Ｇａｌ誘導体分解有り・溶血有り）の識別が可能である。
【００２４】
【表２】
2022002547.tif 000003
【００２５】
本発明では、細菌のコロニーの呈色を目視で判別できるが、培地がウマ血液を含有するため、培地の色が暗赤褐色であり、赤色を呈するpH指示薬や発色団化合物を使用した場合よりも青、緑、紫、黄色等を呈するpH指示薬や発色団化合物を使用した場合の方がコロニー色の判別が容易である。一方、本発明の培地に、さらに、酸化チタン等の不溶性白色化合物を添加することにより、培地色が明るい色になり、赤色のコロニーを含めて、視認性が向上するため、判別をより容易に行えるようになる。酸化チタンの添加濃度は特に限定されないが、例えば、１〜８ｇ／Ｌとすることができる。
【００２６】
本発明では、酵素発色基質を単独で用いることも可能であるが、検出目的に応じて２種以上の酵素発色基質を適宜組み合わせて用いることも可能である。また、例えば、酵素発色基質に加えて、イソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（Isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside、以下、ＩＰＴＧという。）等の、ガラクトシダーゼによって加水分解されても発色しない酵素基質を加水分解反応促進剤として使用することもできる。酵素発色基質の添加濃度は、培地に発育した細菌に由来するガラクトシダーゼによる加水分解によって遊離した発色団化合物または蛍光発色団化合物による細菌のコロニーの呈色を目視で識別できる濃度であれば特に限定されない。そのような濃度は、当業者であれば、適宜設定可能であるが、例えば、酵素発色基質を５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド４０〜３００ｍｇ／Ｌとすることができ、さらに、加水分解反応促進剤としてＩＰＴＧ１０〜２００ｍｇ／Ｌを添加することができる。
【００２７】
上述のとおり、本発明では、白糖およびpH指示薬を発色成分として添加すること、または酵素発色基質のみを発色成分として添加することにより、インフルエンザ菌、ヘモフィルス・ヘモリティカス、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・パラヘモリティカスの識別や、インフルエンザ菌の検出が可能であり、これらを発色成分として用いることによってインフルエンザ菌を見逃すこと無く検出することができる（後に示す実施例１および２）。また、後に示す実施例３の様に、発色成分として白糖、pH指示薬に加えて酵素発色基質であるＧａｌ誘導体を添加することによって、より高い精度でインフルエンザ菌とパラインフルエンザ菌を識別可能になる。なお、実施例では、白糖を分解する細菌のコロニーの呈色とＧａｌ誘導体を分解する細菌のコロニーの呈色がともに青色である組み合わせのみを示したが、本発明では、白糖を分解せず、かつ酵素発色基質を分解しない細菌のコロニーが無着色である一方で、白糖を分解する細菌のコロニーと酵素発色基質を分解する細菌のコロニーはいずれも着色するため、本発明の培地に添加するpH指示薬とＧａｌ誘導体をどのように組み合わせても、インフルエンザ菌と他のヘモフィルス属菌との識別が可能である。例えば、白糖、ニュートラルレッドおよび５−ブロモ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドを発色成分として含有する本発明の培地では、白糖を分解せず、かつ、５−ブロモ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドを分解しない細菌のコロニーは無着色であり、白糖を分解し、かつ、５−ブロモ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドを分解する細菌のコロニー色は紫色、白糖を分解するが、５−ブロモ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドを分解しない細菌のコロニー色は赤色、白糖を分解しないが、５−ブロモ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドを分解する細菌のコロニーは青色を呈するため、インフルエンザ菌（白〜灰白色・溶血無し）、ヘモフィルス・ヘモリティカス（白〜灰白色・溶血有り）、パラインフルエンザ菌（紫色、赤色または青色・溶血無し）、ヘモフィルス・パラヘモリティカス（紫色、赤色または青色・溶血有り）の識別が可能になる。また、白糖、アニリンブルーおよび４−メチル−ウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドを発色成分として含有する本発明の培地では、白糖を分解せず、かつ、４−メチル−ウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドを分解しない細菌のコロニーは無着色（蛍光なし）であり、白糖を分解し、かつ、４−メチル−ウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドを分解する細菌のコロニー色は青色＋蛍光発色、白糖を分解するが、４−メチル−ウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドを分解しない細菌のコロニー色は青色（蛍光なし）、白糖を分解しないが、４−メチル−ウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドを分解する細菌のコロニー色は無着色＋蛍光発色であるため、インフルエンザ菌（白〜灰白色・溶血無し）、ヘモフィルス・ヘモリティカス（白〜灰白色・溶血有り）、パラインフルエンザ菌（青色＋蛍光発色、青色（蛍光なし）、または無着色＋蛍光発色・溶血無し）、ヘモフィルス・パラヘモリティカス（青色＋���光発色、青色（蛍光なし）、または無着色＋蛍光発色・溶血有り）の識別が可能になる。
【００２８】
本発明の培地が含有する抗菌剤は、インフルエンザ菌の検出（スクリーニング）や、インフルエンザ菌、ヘモフィルス・ヘモリティカス、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・パラヘモリティカスの識別を妨げず、ヘモフィルス属以外の夾雑菌の発育を抑制する抗菌剤である。そのような抗菌剤は特に限定されないが、例えば、グラム陽性菌の発育を阻止する抗菌スペクトルを持つ抗菌剤を少なくとも１種類、添加することが好ましい。グラム陽性菌の発育を阻止する抗菌スペクトルを持つ抗菌剤は特に限定されないが、具体例としては、バシトラシン（BC）等のポリペプチド系抗菌剤、バンコマイシン（VCM）、テイコプラニン（TEIC）等のグリコペプチド系抗菌剤等が挙げられる。添加する抗菌剤は１種類のみとすることも可能であるが、２種類以上とすることも可能である。また、グラム陽性菌の発育を阻止する抗菌スペクトルを持つ抗菌剤以外の抗菌剤を添加することや、真菌の増殖を阻止する抗真菌剤をさらに添加することも可能である。
【００２９】
インフルエンザ菌のスクリーニングのためには、抗菌剤の添加濃度をインフルエンザ菌が発育可能かつインフルエンザ菌の検出を妨げない濃度範囲とすることが好ましい。一方、インフルエンザ菌、ヘモフィルス・ヘモリティカス、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・パラヘモリティカスの識別のためには、インフルエンザ菌、ヘモフィルス・ヘモリティカス、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・パラヘモリティカスが発育可能かつインフルエンザ菌、ヘモフィルス・ヘモリティカス、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・パラヘモリティカスの識別を妨げない濃度範囲で抗菌剤を添加することが好ましい。そのような濃度範囲は、当業者であれば本発明の実施例を参考にして適宜設定することができるが、例えば、インフルエンザ菌のスクリーニングのためにバシトラシンを単独で添加する場合は、１〜８００ｍｇ／Ｌ、バンコマイシンを単独で添加する場合は、０．５〜４０ｍｇ／Ｌ、バシトラシンとバンコマイシンを共に添加する場合は、バシトラシン１〜８００ｍｇ／Ｌおよびバンコマイシン０．５〜４０ｍｇ／Ｌとすることができる。また、インフルエンザ菌のスクリーニングのためにバシトラシンを添加する場合に、５〜８００ｍｇ／Ｌとすることもできるが、１０〜８００ｍｇ／Ｌとすることがより好ましく、１０〜３００ｍｇ／Ｌとすることが最も好ましい。インフルエンザ菌のスクリーニングのためにバンコマイシンを添加する場合に、１〜４０ｍｇ／Ｌとすることもできるが、３〜２０ｍｇ／Ｌとすることがより好ましく、３〜１０ｍｇ／Ｌとすることが最も好ましい。一方、インフルエンザ菌、ヘモフィルス・ヘモリティカス、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・パラヘモリティカスの識別のためにバシトラシンを単独で添加する場合は、１〜２．５ｍｇ／Ｌ、バンコマイシンを単独で添加する場合は、０．５〜１０ｍｇ／Ｌ、バシトラシンとバンコマイシンを共に添加する場合は、バシトラシン１〜２．５ｍｇ／Ｌおよびバンコマイシン０．５〜１０ｍｇ／Ｌとすることが好ましいが、バンコマイシンを単独で添加する場合は、０．５〜５ｍｇ／Ｌ、バシトラシンとバンコマイシンを共に添加する場合は、バシトラシン１〜２．５ｍｇ／Ｌおよびバンコマイシン０．５〜５ｍｇ／Ｌとすることがより好ましい。
【００３０】
上述のとおり、本発明の培地は、ヘモフィルス属以外の夾雑菌の発育を抑制するための抗菌剤を含有する。それにも関わらず夾雑菌が発育した場合でも、発育した夾雑菌のコロニーが［白糖分解有りおよび／または溶血有り］であれば、インフルエンザ菌でないことが容易に判断可能である。また、仮に、夾雑菌のコロニーが［白糖分解無し・溶血無し］である場合でも、本発明の培地を用いた培養と並行して、ヒツジ血液寒天培地を用いた培養を行えば、ヘモフィルス属以外の夾雑菌はヒツジ血液寒天培地にも発育するため、インフルエンザ菌でないことが判断できる。したがって、ヒツジ血液寒天培地に発育せず、本発明の培地に発育した細菌におけるコロニー色および溶血の有無を確認することによりインフルエンザ菌の検出（スクリーニング）や、インフルエンザ菌、ヘモフィルス・ヘモリティカス、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・パラヘモリティカスの識別が可能である。
【００３１】
本発明の培地は、少なくとも（ａ）ウマ血液、（ｂ）β−ＮＡＤまたはそのリン酸塩、（ｃ）抗菌剤、並びに（ｄ）発色成分であって、インフルエンザ菌のコロニーの呈色とパラインフルエンザ菌のコロニーの呈色を異なる色にする特性を有する発色成分を含有する、インフルエンザ菌が発育可能な培地である。本発明の培地が有する作用は、培地に発育した細菌のコロニー色および溶血の有無によりヘモフィルス属菌の識別が可能であり、それにより、インフルエンザ菌の検出が可能であるというものである。以上の成分を含有し、作用を有する本発明の培地の使用用途は、インフルエンザ菌、ヘモフィルス・ヘモリティカス、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・パラヘモリティカスの識別、インフルエンザ菌のスクリーニング等とすることが可能である。換言すれば、本発明の培地は、ヘモフィルス属菌の識別が可能であるという作用を利用して、インフルエンザ菌、ヘモフィルス・ヘモリティカス、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・パラヘモリティカスの識別用培地として使用することができ、また、インフルエンザ菌の検出が可能であるという作用を利用して、インフルエンザ菌のスクリーニング用培地として使用することができる。すなわち、本発明の培地は、用いる抗菌剤の種類、濃度等を調節することによって、インフルエンザ菌以外の夾雑菌（ヘモフィルス・ヘモリティカス、パラインフルエンザ菌、ヘモフィルス・パラヘモリティカス等のヘモフィルス属菌を含む）が発育する場合とインフルエンザ菌以外の夾雑菌の発育がほぼ抑制される場合を想定することができる。そのため、本発明のインフルエンザ菌スクリーニング用培地には、インフルエンザ菌の検出用培地およびインフルエンザ菌の選択培地が包含される。一方、本発明の培地をインフルエンザ菌、ヘモフィルス・ヘモリティカス、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・パラヘモリティカスの識別用培地とすることも可能である。
【００３２】
本発明で用いられる基礎培地は、普通寒天培地、ミュラーヒントン寒天培地、トリプトソイ寒天培地等のヘモフィルス属菌が発育可能な培地であれば特に限定されない。
【００３３】
本発明の培地は、必要に応じて、ヘモフィルス属菌の発育に適した栄養成分、ミネラル分、その他の成分をさらに添加することも可能である。
【００３４】
本発明の培地のpHの範囲は、ヘモフィルス属菌が発育可能であり、白糖の分解によって生じる酸に由来するpH変化に伴って、pH指示薬が変色する範囲であれば特に限定されない。使用するpH指示薬にもよるが、例えば、pH指示薬としてアニリンブルーを使用する場合は、pHを７〜８程度とすることができ、７．０〜８．０とすることが好ましい。具体的には、後に示す実施例の様に、７．３±０．３、７．６±０．３等とすることができる。
【００３５】
本発明では、インフルエンザ菌をスクリーニングするために、具体的に、培地１Ｌあたり以下の表３に示す成分を含有する培地を用いることができるが、以下の表４に示す成分を含有する培地を用いることがより好ましい。
【００３６】
【表３】
2022002547.tif 000004
【００３７】
【表４】
2022002547.tif 000005
【００３８】
以上の表３に示した本発明の培地においては、酵母エキス、可溶性デンプンに代えて栄養成分、ミネラル成分としてグルタミン酸ナトリウム（０〜５ｇ／Ｌ）を用いることができ、表４に示した本発明の培地においては、酵母エキス、可溶性デンプンに代えてグルタミン酸ナトリウム（０〜５ｇ／Ｌ）を用いることができる。また、表３に示した本発明の培地において、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウムに代えてＮ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−エタンスルホン酸（以下、ＨＥＰＥＳという。）（０〜１０ｇ／Ｌ）、３−モルホリノプロパンスルホン酸（以下、ＭＯＰＳという。）（０〜１０ｇ／Ｌ）、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（以下、ＡＣＥＳという。）（０〜１０ｇ／Ｌ）等のグッド緩衝剤を用いることができ、表４に示した本発明の培地においては、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウムに代えてＨＥＰＥＳ（０〜１０ｇ／Ｌ）、ＭＯＰＳ（０〜１０ｇ／Ｌ）、ＡＣＥＳ（０〜１０ｇ／Ｌ）等のグッド緩衝剤を用いることができる。
【００３９】
一方、本発明では、インフルエンザ菌、ヘモフィルス・ヘモリティカス、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・パラヘモリティカスを識別するために、具体的に、培地１Ｌあたり以下の表５に示す成分を含有する培地を用いることができるが、以下の表６に示す成分を含有する培地を用いることがより好ましい。
【００４０】
【表５】
2022002547.tif 000006
【００４１】
【表６】
2022002547.tif 000007
【００４２】
以上の表５に示した本発明の培地においては、酵母エキス、可溶性デンプンに代えて栄養成分、ミネラル成分としてグルタミン酸ナトリウム（０〜５ｇ／Ｌ）を用いることができ、表６に示した本発明の培地においては、酵母エキス、可溶性デンプンに代えてグルタミン酸ナトリウム（０〜５ｇ／Ｌ）を用いることができる。また、表５に示した本発明の培地において、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウムに代えてＨＥＰＥＳ（０〜１０ｇ／Ｌ）、ＭＯＰＳ（０〜１０ｇ／Ｌ）、ＡＣＥＳ（０〜１０ｇ／Ｌ）等のグッド緩衝剤を用いることができ、表６に示した本発明の培地においては、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウムに代えてＨＥＰＥＳ（０〜１０ｇ／Ｌ）、ＭＯＰＳ（０〜１０ｇ／Ｌ）、ＡＣＥＳ（０〜１０ｇ／Ｌ）等のグッド緩衝剤を用いることができる。
【００４３】
本発明で使用される検体は、インフルエンザ菌をはじめとするヘモフィルス属菌の存在が疑われるものであれば特に限定されない。ヒトの咽頭拭い液、鼻咽頭拭い液、髄液、耳漏、眼脂等が具体例として挙げられる。
【００４４】
本発明の培地の形態は、固形、シート状培地等、溶血の有無が確認できる形態であれば特に限定されないが、検出や識別のしやすさ等の観点から、固形培地が好ましく、平板固形培地の形態がより好ましい。
固形培地の固化剤としては、寒天、アガロース等通常使用されているものが挙げられる。
【実施例】
【００４５】
以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこれら実施例により限定されるものではない。
【実施例１】
【００４６】
（発色成分として白糖およびpH指示薬を含有する培地を用いたインフルエンザ菌の検出）
発色成分として白糖およびアニリンブルーを含有する培地にインフルエンザ菌、パラインフルエンザ菌および大腸菌を接種し、培地のインフルエンザ菌検出性能を調べた。なお、使用した菌株名は表１１に記載した。
【００４７】
（１）培地の準備
以下の表７に示した培地成分１を秤量し、以下の（２）でβ−ＮＡＤ、ウマ血液および抗菌剤を添加した後の培地量が１Ｌとなるように精製水に懸濁後、１２１℃で１５分間高圧滅菌した。
【００４８】
【表７】
2022002547.tif 000008
【００４９】
（２）β−ＮＡＤ、ウマ血液および抗菌剤の添加
高圧滅菌後、培地を５０℃に冷却した後、予め濾過滅菌したβ−ＮＡＤ、ウマ脱繊維素血液、バシトラシンおよびバンコマイシンを以下の表８に示す濃度となるように添加した。その後、培地を２０ｍＬずつシャーレに分注して固化した。
【００５０】
【表８】
2022002547.tif 000009
【００５１】
（３）細菌の接種と培養
前培養した各菌株を滅菌生理食塩水に懸濁し、McFarland No. 1の菌液を作製した。その後、前記菌液を（１）、（２）で調製した培地に画線し、３５℃で２０時間、５％炭酸ガス環境下で培養を行い、細菌のコロニー色および溶血の有無を調べた。
【００５２】
（４）結果
結果を表１１に示す。溶血有りを＋、溶血無しを−と表し、コロニー色とともに表示している。
【実施例２】
【００５３】
（発色成分としてガラクトピラノシド誘導体を含有する培地を用いたインフルエンザ菌の検出）
発色成分として５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドを含有する培地にインフルエンザ菌、パラインフルエンザ菌および大腸菌を接種し、培地のインフルエンザ菌検出性能を調べた。なお、使用した菌株名は表１１に記載した。
【００５４】
（１）培地の準備
以下の表９に示した培地成分２を秤量し、以下の（２）でβ−ＮＡＤ、ウマ血液および抗菌剤を添加した後の培地量が１Ｌとなるように精製水に懸濁後、１２１℃で１５分間高圧滅菌した。
【００５５】
【表９】
2022002547.tif 000010
【００５６】
（２）β−ＮＡＤ、ウマ血液および抗菌剤の添加
実施例１と同様とした。
【００５７】
（３）細菌の接種と培養
実施例１と同様とした。
【００５８】
（４）結果
結果を表１１に示す。溶血有りを＋、溶血無しを−と表し、コロニー色とともに表示している。
【実施例３】
【００５９】
（発色成分として白糖、pH指示薬およびガラクトピラノシド誘導体を含有する培地を用いたインフルエンザ菌の検出）
発色成分として白糖、アニリンブルーおよび５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドを含有する培地にインフルエンザ菌、パラインフルエンザ菌および大腸菌を接種し、培地のインフルエンザ菌検出性能を調べた。なお、使用した菌株名は表１１に記載した。
【００６０】
（１）培地の準備
以下の表１０に示した培地成分３を秤量し、以下の（２）でβ−ＮＡＤ、ウマ血液および抗菌剤を添加した後の培地量が１Ｌとなるように精製水に懸濁後、１２１℃で１５分間高圧滅菌した。
【００６１】
【表１０】
2022002547.tif 000011
【００６２】
（２）β−ＮＡＤ、ウマ血液および抗菌剤の添加
実施例１と同様とした。
【００６３】
（３）細菌の接種と培養
実施例１と同様とした。
【００６４】
（４）結果
結果を以下の表１１に示す。溶血有りを＋、溶血無しを−と表し、コロニー色とともに表示している。
【００６５】
【表１１】
2022002547.tif 000012
【００６６】
表１１に示した様に、実施例１の培地では、試験したすべてのインフルエンザ菌のコロニー色が白糖分解無しを表す灰白色であり、溶血は無しであった。また、実施例２の培地では、試験したすべてのインフルエンザ菌のコロニー色が、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドの分解無しを表す灰白色であり、溶血無しであり、実施例３の培地では、試験したすべてのインフルエンザ菌のコロニー色が、白糖分解無し、かつ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド分解無しを表す灰白色であり、溶血無しであった。このことから、発色成分として白糖、アニリンブルーのみを含有する培地（実施例１）、発色成分として５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドのみを含有する培地（実施例２）、発色成分として白糖、アニリンブルーおよび５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドを含有する培地（実施例３）のいずれを用いても、インフルエンザ菌を見逃すこと無く検出できることが示唆された。さらに実施例３の培地では、試験したすべてのパラインフルエンザ菌のコロニーの色が、白糖分解有りおよび／または５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド分解有りを表す青色であり、溶血は無し、大腸菌もコロニー色が青色、溶血無しであったことから、発色成分として白糖、アニリンブルーおよび５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドを含有する培地は偽陽性が無く、より高い精度でインフルエンザ菌とその他の細菌を識別可能であることが示された。
【実施例４】
【００６７】
（インフルエンザ菌、ヘモフィルス・ヘモリティカス、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・パラヘモリティカスの識別）
発色成分として白糖、アニリンブルーおよび５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドを含有する培地にインフルエンザ菌、ヘモフィルス・ヘモリティカス、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・パラヘモリティカスを接種し、培地の性能を調べた。なお、使用した菌株名は表１４に記載した。
【００６８】
（１）培地の準備
以下の表１２に示した培地成分４を秤量し、以下の（２）でβ−ＮＡＤ、ウマ血液および抗菌剤を添加した後の培地量が１Ｌとなるように精製水に懸濁後、１２１℃で１５分間高圧滅菌した。
【００６９】
【表１２】
2022002547.tif 000013
【００７０】
（２）β−ＮＡＤ、ウマ血液および抗菌剤の添加
高圧滅菌後、培地を５０℃に冷却した後、予め濾過滅菌したβ−ＮＡＤ、ウマ脱繊維素血液、バシトラシン（BC）およびバンコマイシン（VCM）を以下の表１３に示す濃度となるように添加した。その後、培地を２０ｍＬずつシャーレに分注して固化した。
【００７１】
【表１３】
2022002547.tif 000014
【００７２】
（３）細菌の接種と培養
前培養した各菌株を滅菌生理食塩水に懸濁し、McFarland No. 1の菌液を作製した。その後、前記菌液を（１）、（２）で調製した培地に画線し、３５℃で２０時間、５％炭酸ガス環境下で培養を行い、細菌のコロニー色および溶血の有無を調べた。
【００７３】
（４）結果
結果を以下の表１４に示す。溶血有りを＋、溶血無しを−と表し、コロニー色とともに表示している。
【００７４】
【表１４】
2022002547.tif 000015
【００７５】
バシトラシン２．５ｍｇ／Ｌおよび／またはバンコマイシン５ｍｇ／Ｌを添加した培地では、インフルエンザ菌（灰白色・溶血無し）、ヘモフィルス・ヘモリティカス（灰白色・溶血有り）、パラインフルエンザ菌（青色・溶血無し）、ヘモフィルス・パラヘモリティカス（青色・溶血有り）がいずれも良好に発育し、コロニー色および溶血の有無によってこれらの菌種を識別可能であることが示された。一方、バンコマイシン１０ｍｇ／Ｌを単独で添加した培地では、インフルエンザ菌、ヘモフィルス・ヘモリティカス、パラインフルエンザ菌、ヘモフィルス・パラヘモリティカスをコロニー色および溶血の有無によって識別可能であるものの、ヘモフィルス・パラヘモリティカスが弱い発育であった。なお、表１４に示したとおり、検討した何れの抗菌剤濃度の培地も、コロニー色および溶血の有無によってインフルエンザ菌を検出可能であった。
【実施例５】
【００７６】
（pH指示薬の検討）
発色成分として白糖およびpH指示薬のみを含有する培地において、pH指示薬をアニリンブルーまたはフェノールレッドとし、インフルエンザ菌、ヘモフィルス・ヘモリティカス、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・パラヘモリティカスを接種し、培地の性能を調べた。なお、使用した菌株名は表１６に記載した。
【００７７】
（１）培地の準備
pH指示薬をアニリンブルー100mg/Lまたはフェノールレッド120mg/Lとする以外は実施例１と同様とした。
【００７８】
（２）β−ＮＡＤ、ウマ血液および抗菌剤の添加
高圧滅菌後、培地を５０℃に冷却した後、予め濾過滅菌したβ−ＮＡＤ、ウマ脱繊維素血液、バシトラシンおよびバンコマイシンを以下の表１５に示す濃度となるように添加した。その後、培地を２０ｍＬずつシャーレに分注して固化した。
【００７９】
【表１５】
2022002547.tif 000016
【００８０】
（３）細菌の接種と培養
前培養した各菌株を滅菌生理食塩水に懸濁し、McFarland No. 1の菌液を作製した。その後、前記菌液を（１）、（２）で調製した培地に画線し、３５℃で２０時間、５％炭酸ガス環境下で培養を行い、細菌のコロニー色および溶血の有無を調べた。
【００８１】
（４）結果
結果を以下の表１６に示す。溶血有りを＋、溶血無しを−と表し、コロニー色とともに表示している。
【００８２】
【表１６】
2022002547.tif 000017
【００８３】
pH指示薬としてアニリンブルーを用いた培地もフェノールレッドを用いた培地も、ともに、コロニー色および溶血の有無によってインフルエンザ菌、ヘモフィルス・ヘモリティカス、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・パラヘモリティカスを良好に識別可能であった。
【実施例６】
【００８４】
（抗菌剤の検討および従来法との比較）
発色成分として白糖、アニリンブルーおよび５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドを含有する培地において、抗菌剤の種類を変えて、インフルエンザ菌、ヘモフィルス・ヘモリティカス、パラインフルエンザ菌、ヘモフィルス・パラヘモリティカスおよびその他の社内保存菌を接種し、培地の性能を調べた。さらに、ポアメディア（登録商標）羊血液寒天培地（栄研化学製培地）、従来のヘモフィルス属分離培養用の培地である従来法Ａ培地（栄研化学製培地）および従来法Ｂ培地（ベクトン・ディキンソン社製バシトラシン添加培地）を用意し、同様の細菌を接種して比較した。なお、使用した菌株名は表１８に記載した。
【００８５】
（１）本発明の培地の準備
実施例４と同様とした。
【００８６】
（２）本発明の培地へのβ−ＮＡＤ、ウマ血液および抗菌剤の添加
高圧滅菌後、培地を５０℃に冷却した後、予め濾過滅菌したβ−ＮＡＤ、ウマ脱繊維素血液、バシトラシン（BC）およびバンコマイシン（VCM）を以下の表１７に示す濃度となるように添加した。その後、培地を２０ｍＬずつシャーレに分注して固化した。
【００８７】
【表１７】
2022002547.tif 000018
【００８８】
（３）細菌の接種と培養
前培養した各菌株を滅菌生理食塩水に懸濁し、McFarland No. 1の菌液を作製した。その後、前記菌液を（１）、（２）で調製した培地および比較用の各培地（羊血液寒天培地、従来法Ａ培地、従来法Ｂ培地）に画線し、３５℃で２０時間、５％炭酸ガス環境下で培養を行い、細菌のコロニー色および溶血の有無を調べた。
【００８９】
（４）結果
結果を以下の表１８に示す。本発明の培地による結果は、溶血有りを＋、溶血無しを−と表し、コロニー色とともに表示し、従来法Ａ培地、Ｂ培地およびポアメディア羊血液寒天培地の結果は、コロニー色により表示している。
【００９０】
【表１８】
2022002547.tif 000019
【００９１】
本発明の培地では、抗菌剤として、バシトラシン単独を用いた場合、バンコマイシン単独を用いた場合、バシトラシンおよびバンコマイシンを共に添加した場合のいずれにおいても、コロニー色および溶血の有無によるインフルエンザ菌、ヘモフィルス・ヘモリティカス、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・パラヘモリティカスの識別と、インフルエンザ菌の検出が可能であった。それに対して、従来法Ａ培地およびＢ培地に発育したコロニーはいずれも灰白色であり、形態以外にインフルエンザ菌、ヘモフィルス・ヘモリティカス、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・パラヘモリティカスを識別する手段がなかった。このことから、本発明の培地は、従来法に比べて顕著に容易かつ正確にインフルエンザ菌を検出可能であることが示された。
また、本発明の培地では、抗菌剤として、バシトラシン単独を用いた場合、バンコマイシン単独を用いた場合、バシトラシンおよびバンコマイシンを共に添加した場合のいずれにおいても、ヘモフィルス属以外の夾雑菌に対する一定の抑制効果が認められ、試験した培地の中では、特に、バシトラシン300mg/Lおよびバンコマイシン10mg/Lを添加した本発明の培地が最も良好に夾雑菌の発育を抑制し、極めて簡易に精度良くインフルエンザ菌を検出可能であることが示された。なお、本発明の培地においても一部の夾雑菌の発育が認められたが、夾雑菌は、羊血液寒天培地にも発育したため、ヘモフィルス属菌でないことが容易に判断可能であった。
【実施例７】
【００９２】
（咽頭拭い液検体による検討）
健常者５名の咽頭を綿棒で擦過し、発色成分として白糖、アニリンブルーおよび５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドを含有する本発明の培地に接種して培養後、発育したコロニーを釣菌して栄研化学製ＸＶマルチディスク‘栄研’（登録商標）、シスメックス・ビオメリュー社製アピ（登録商標）ＮＨにより細菌の同定を行った。なお、同定試験の方法はそれぞれの添付文書に従った。
【００９３】
（１）本発明の培地の準備
実施例４と同様とした。
【００９４】
（２）β−ＮＡＤ、ウマ血液および抗菌剤の添加
実施例１と同様とした。
【００９５】
（３）検体の接種と培養
健常者５名の咽頭を綿棒で擦過した後、（１）、（２）で調製した培地に接種し、３５℃で２０時間、５％炭酸ガス環境下で培養を行い、細菌のコロニー色および溶血の有無を調べた。
【００９６】
（４）結果
栄研化学製ＸＶマルチディスクによる同定結果を以下の表１９、シスメックス・ビオメリュー社製アピＮＨによる同定結果を表２０に示す。
【００９７】
【表１９】
2022002547.tif 000020
【００９８】
【表２０】
2022002547.tif 000021
【００９９】
本発明の培地で灰白色に呈色したコロニーはすべて同一のコロニー形態・溶血無しであり、青色に呈色したコロニーはすべて溶血無しであった（データは示していない）。灰白色・溶血無しのうちの１コロニーと、青色・溶血無しのコロニーのうち、優勢に発育した１コロニーを代表として釣菌してＸＶマルチディスクによる同定を行った結果、灰白色・溶血無しのコロニーはＸＶ要求性であることからインフルエンザ菌であると確認された。一方、青色・溶血無しのコロニーはＶ要求性であることからパラインフルエンザ菌であると確認された（表１９）。また、同様に、灰白色・溶血無しの１コロニーと青色・溶血無しのコロニーのうち、優勢に発育した１コロニーを代表としてシスメックス・ビオメリュー社製アピＮＨにより同定した結果、灰白色に呈色したコロニーは99.9％の信頼度でインフルエンザ菌であると同定され、青色に呈色したコロニーは99.1％の信頼度でパラインフルエンザ菌であると同定された（表２０）。このことから、本発明の培地は、初代分離培養により高精度にインフルエンザ菌とパラインフルエンザ菌を識別し、インフルエンザ菌を検出可能であることが示唆された。
【実施例８】
【０１００】
（白糖添加濃度の検討）
発色成分として白糖およびアニリンブルーを含有する培地にインフルエンザ菌、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・ヘモリティカスを接種し、これらの菌種を識別可能な白糖濃度を調べた。なお、使用した菌株名は表２３に記載した。
【０１０１】
（１）培地の準備
以下の表２１に示した培地成分５を秤量し、以下の（２）でβ−ＮＡＤ、ウマ血液および抗菌剤を添加した後の培地量が１Ｌとなるように精製水に懸濁後、１２１℃で１５分間高圧滅菌した。
【０１０２】
【表２１】
2022002547.tif 000022
【０１０３】
（２）β−ＮＡＤ、ウマ血液および抗菌剤の添加
高圧滅菌後、培地を５０℃に冷却した後、予め濾過滅菌したβ−ＮＡＤ、ウマ脱繊維素血液、バシトラシンおよびバンコマイシンを以下の表２２に示す濃度となるように添加した。その後、培地を２０ｍＬずつシャーレに分注して固化した。
【０１０４】
【表２２】
2022002547.tif 000023
【０１０５】
（３）細菌の接種と培養
前培養した各菌株を滅菌生理食塩水に懸濁し、McFarland No. 1の菌液を作製した。その後、前記菌液を（１）、（２）で調製した培地に画線し、３５℃で２０時間、５％炭酸ガス環境下で培養を行い、細菌のコロニー色および溶血の有無を調べた。
【０１０６】
（４）結果
結果を表２３に示す。溶血有りを＋、溶血無しを−と表し、コロニー色とともに表示している。
【０１０７】
【表２３】
2022002547.tif 000024
【０１０８】
表２３に示した様に、白糖添加濃度 １から４０ｇ／Ｌの範囲においてコロニー色および溶血の有無によるインフルエンザ菌、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・ヘモリティカスの識別が可能であり、また、インフルエンザ菌の検出が可能であった。
【実施例９】
【０１０９】
（アニリンブルー添加濃度の検討）
発色成分として白糖およびアニリンブルーを含有する培地にインフルエンザ菌、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・ヘモリティカスを接種し、これらの菌種を識別可能なアニリンブルー濃度を調べた。なお、使用した菌株名は表２５に記載した。
【０１１０】
（１）培地の準備
以下の表２４に示した培地成分６を秤量し、以下の（２）でβ−ＮＡＤ、ウマ血液および抗菌剤を添加した後の培地量が１Ｌとなるように精製水に懸濁後、１２１℃で１５分間高圧滅菌した。
【０１１１】
【表２４】
2022002547.tif 000025
【０１１２】
（２）β−ＮＡＤ、ウマ血液および抗菌剤の添加
実施例８と同様とした。
【０１１３】
（３）細菌の接種と培養
前培養した各菌株を滅菌生理食塩水に懸濁し、McFarland No. 1の菌液を作製した。その後、前記菌液を（１）、（２）で調製した培地に画線し、３５℃で２０時間、５％炭酸ガス環境下で培養を行い、細菌のコロニー色および溶血の有無を調べた。
【０１１４】
（４）結果
結果を表２５に示す。溶血有りを＋、溶血無しを−と表し、コロニー色とともに表示している。
【０１１５】
【表２５】
2022002547.tif 000026
【０１１６】
表２５に示した様に、アニリンブルー添加濃度４０から４００ｍｇ／Ｌの範囲においてコロニー色および溶血の有無によるインフルエンザ菌、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・ヘモリティカスの識別が可能であり、また、インフルエンザ菌の検出が可能であった。
【実施例１０】
【０１１７】
（緩衝剤の検討）
発色成分として白糖、アニリンブルーおよび５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドを含有する培地において、緩衝成分をリン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ、ＭＯＰＳまたはＡＣＥＳとし、インフルエンザ菌、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・ヘモリティカスを接種し、培地の性能を調べた。なお、使用した菌株名は表２６に記載した。
【０１１８】
（１）培地の準備
緩衝成分をリン酸二水素カリウム１ｇ／Ｌおよびリン酸水素二カリウム４ｇ／Ｌ、ＨＥＰＥＳ ５ｇ／Ｌ、ＭＯＰＳ ５ｇ／ＬまたはＡＣＥＳ ５ｇ／Ｌとする以外は実施例４と同様とした。
【０１１９】
（２）β−ＮＡＤ、ウマ血液および抗菌剤の添加
実施例１と同様とした。
【０１２０】
（３）細菌の接種と培養
前培養した各菌株を滅菌生理食塩水に懸濁し、McFarland No. 1の菌液を作製した。その後、前記菌液を（１）、（２）で調製した培地に画線し、３５℃で２０時間、５％炭酸ガス環境下で培養を行い、細菌のコロニー色および溶血の有無を調べた。
【０１２１】
（４）結果
結果を表２６に示す。溶血有りを＋、溶血無しを−と表し、コロニー色とともに表示している。
【０１２２】
【表２６】
2022002547.tif 000027
【０１２３】
緩衝成分としてリン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ、ＭＯＰＳおよびＡＣＥＳのいずれを用いた培地においても、コロニー色および溶血の有無によってインフルエンザ菌、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・ヘモリティカスを良好に識別可能であり、また、インフルエンザ菌を良好に検出可能であった。
【産業上の利用可能性】
【０１２４】
本発明のインフルエンザ菌の検出方法およびそれに用いる培地は、培地に発育した細菌のコロニー色および溶血の有無を確認するのみで、初代分離培養によるインフルエンザ菌、ヘモフィルス・ヘモリティカス、パラインフルエンザ菌およびヘモフィルス・パラヘモリティカスの容易な識別が可能になる。従来法に比べて、はるかに容易かつ正確にインフルエンザ菌を検出可能になり、その結果、初代分離培養および確認試験を含めた所要時間、操作上の手間および確認試験にかかるコストを従来に比べて大幅に削減可能である。そのため、本発明の方法および培地は、臨床現場や疫学研究その他の幅広い領域において有用である。