(57)【要約】      （修正有）【課題】載置部の識別が容易であり、融解後の細胞又は組織を回収する際の操作性に優れた、凍結保存用治具を提供する。【解決手段】把持部２と、該把持部２に固定され、かつ細胞又は組織を載置する載置部１とを少なくとも有し、該載置部１の先端部側および手元部側に、細胞又は組織を載置する載置エリアとこれらを載置しない非載置エリアの境界を示すマーキング部を有することを特徴とする。【選択図】図１
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【実用新案登録請求の範囲】
【請求項１】
把持部と、該把持部に固定され、かつ細胞又は組織を載置する載置部とを少なくとも有し、該載置部の先端部側および手元部側に、細胞又は組織を載置する載置エリアとこれらを載置しない非載置エリアの境界を示すマーキング部を有することを特徴とする凍結保存用治具。
【請求項２】
前記した載置部が保存液吸収体を有することを特徴とする前記請求項１記載の凍結保存用治具。
【考案の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本考案は、生物の細胞又は組織などを凍結保存する際に使用する凍結保存用治具に関する。より詳細には、細胞又は組織を載置する載置部の識別を容易にし、操作性に優れた凍結保存用治具に関する。
【背景技術】
【０００２】
生物の細胞又は組織の優れた保存技術は、様々な産業分野で求められている。例えば、牛の胚移植技術に用いられる胚は、受胚牛の発情周期に合わせて移植が行われており、発情周期に胚の移植を合わせるために、胚を凍結保存し、発情周期に合わせて胚を融解して移植することが行われている。また、ヒトの不妊治療においては、母体から卵子又は卵巣を採取後、移植に適したタイミングに合わせるために凍結保存しておき、移植時に融解して用いることがなされている。
【０００３】
一般に、生体内から採取された細胞又は組織は、たとえ培養液の中であっても、次第に活性が失われていくことから、生体外での細胞又は組織の長期間の培養は好ましくない。そのため、生体活性を失わせずに長期間保存するための技術が重要である。優れた保存技術によって、採取された細胞又は組織をより正確に分析することが可能になる。また優れた保存技術によって、より高い生体活性を保ったまま細胞又は組織を移植に用いることが可能となり、移植後の生着率が向上することが望める。さらには、生体外で培養した培養皮膚、生体外で構築したいわゆる細胞シートのような移植のための人工の組織を、順次生産して保存しておき、必要な時に使用することも可能となり、医療の面だけではなく、産業面においても大きなメリットが期待できる。
【０００４】
細胞又は組織の保存方法として、例えば緩慢凍結法が知られている。この方法では、まず、例えばリン酸緩衝生理食塩水等の生理的溶液に耐凍剤を含有させることで得られた保存液に、細胞又は組織を浸漬する。該耐凍剤としては、グリセロール、エチレングリコール等の化合物が用いられる。該保存液に、細胞又は組織を浸漬後、比較的遅い冷却速度（例えば０．３〜０．５℃／分の速度）で、−３０〜−３５℃まで冷却することにより、細胞内外又は組織内外の溶液が十分に冷却され、粘性が高くなる。このような状態で、該保存液中の細胞又は組織をさらに液体窒素の温度（−１９６℃）まで冷却すると、細胞内又は組織内とその外の周囲の微少溶液がいずれも非結晶のまま固体となるガラス化が起こる。ガラス化により、細胞内外又は組織内外が固化すると、実質的に分子の動きがなくなるので、ガラス化された細胞又は組織を液体窒素中に保存することで、半永久的に保存できると考えられる。
【０００５】
しかしながら、前記緩慢凍結法では、比較的遅い冷却速度で冷却する必要があるために、凍結保存のための操作に時間を要する。また、温度制御をするための装置又は治具を必要とする問題がある。加えて、前記緩慢凍結法では、細胞外又は組織外の保存液中に氷晶が形成されるので、細胞又は組織が該氷晶により物理的に損害を受けるおそれがある。
【０００６】
前記緩慢凍結法での問題点を解決するための方法として、ガラス化保存法が提案されている。ガラス化保存法とは、グリセロール、エチレングリコール、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）などの耐凍剤を多量に含む水溶液の凝固点降下により、氷点下でも氷晶ができにくくなる原理を用いたものである。この水溶液を急速に液体窒素中で冷却させると氷晶を生じさせないまま固体化させることができる。このように固体化することをガラス化凍結という。また、耐凍剤を多量に含む水溶液をガラス化液という。
【０００７】
前記ガラス化法の具体的な操作としては、ガラス化液に細胞又は組織を浸漬させ、その後、液体窒素の温度（−１９６℃）で冷却する。ガラス化法は、このような簡便かつ迅速な工程であるために、凍結保存のための操作に長い時間を必要としない他、温度制御をするための装置又は治具を必要としないという利点がある。
【０００８】
ガラス化保存法を用いると、細胞内外のいずれにも氷晶が生じないために凍結時及び融解時の細胞への物理的障害（凍害）を回避することができるが、ガラス化液に含まれる高濃度の耐凍剤には化学的毒性がある。このため、細胞又は組織の凍結保存時には細胞又は組織周囲に存在するガラス化液が少ない方が好ましく、細胞がガラス化液に暴露される時間、つまりは凍結までの時間が短時間であることが好ましい。さらには、解凍後ただちにガラス化液を希釈する必要がある。
【０００９】
ガラス化保存法を用いた細胞又は組織の凍結保存については、様々な方法で、様々な種類の細胞又は組織を用いた例が示されている。例えば、特許文献１では、動物又はヒトの生殖細胞又は体細胞へのガラス化保存法の適用が凍結保存及び融解後の生存率の点で、極めて有用であることが示されている。
【００１０】
ガラス化保存法は、主にヒトの生殖細胞を用いて発展してきた技術であるが、最近では、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞への応用も広く検討されている。また、非特許文献１では、ショウジョウバエの胚の保存にガラス化保存法が有効であったことが示されている。さらに、特許文献２では、植物培養細胞や組織の保存において、ガラス化保存法が有効であることが示されている。このように、ガラス化法は広く様々な種の細胞及び組織の保存に有用であることが知られている。
【００１１】
ガラス化保存法をより効率的に行うための治具及び操作方法としては、特許文献３、特許文献４ではヒトの不妊治療分野で使用されているいわゆるクライオトップ法という方法で、卵付着保持用ストリップとして短冊状の可撓性かつ無色透明なフィルムを使用した卵凍結保存用具を使用して、該フィルム上に極少量のガラス化液と共に卵子又は胚を顕微鏡下で付着させ、凍結保存する方法が提案されている。
【００１２】
特許文献５では、卵子又は胚をガラス化液と共にガラス化保存用除去材の上に載置し、下部から吸引することで卵子又は胚の周囲に付着した余分なガラス化液を除き、優れた生存率で凍結保存させる方法が提案されている。なお、ガラス化保存用除去材としては、金網、紙などの天然物や合成樹脂からなるフィルム状物で貫通孔を有したものが記載されている。
【００１３】
特許文献６では卵子又は胚の周囲に付着した余分なガラス化液を紙又は不織布からなる吸収体により吸収させることにより、凍結作業を容易にかつ確実に行うことが可能な凍結保存用治具が提案されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】特許第３０４４３２３号公報
【特許文献２】特開２００８−５８４６号公報
【特許文献３】特開２００２−３１５５７３号公報
【特許文献４】特開２００６−２７１３９５号公報
【特許文献５】国際公開第２０１１／０７０９７３号パンフレット
【特許文献６】特開２０１４−１８３７５７号広報
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Ｓｔｅｐｏｎｋｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４５：１７０−１７２（１９９０）
【考案の概要】
【考案が解決しようとする課題】
【００１６】
上記した特許文献３〜７に記載される凍結保存治具及び操作方法は、載置部に細胞又は組織を載置し凍結保存する方法であるが、細胞又は組織を凍結保存後、融解し、確実に回収するためには、凍結保存用治具の載置部に付着した細胞又は組織を顕微鏡下で観察・識別する必要がある。一方で、凍結操作者と融解操作者が異なる場合には、細胞または組織を載置した載置部の全域から細胞又は組織を探さなければならず、操作が煩雑であった。
【００１７】
本考案の目的は、載置部の識別が容易であり、融解後の細胞又は組織を回収する際の操作性に優れた、凍結保存用治具を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本考案者は、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、以下の構成を有する凍結保存用治具で解決できることが判明した。
（１）把持部と、該把持部に固定され、かつ細胞又は組織を載置する載置部とを少なくとも有し、該載置部の先端部側および手元部側に、細胞又は組織を載置する載置エリアとこれらを載置しない非載置エリアの境界を示すマーキング部を有することを特徴とする凍結保存用治具。
（２）上記した載置部が保存液吸収体を有することを特徴とする上記（１）記載の凍結保存用治具。
【考案の効果】
【００１９】
本考案により、載置部の識別が容易であり、融解後の細胞又は組織を回収する際の操作性に優れた、凍結保存用治具を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】本考案の凍結保存用治具の一例を示す全体概略図である。
【図２】図１中の載置部１を拡大した図
【図３】本考案における載置部の別の一例を示す概略図
【図４】本考案における載置部のまた別の一例を示す概略図
【図５】本考案における載置部のまた別の一例を示す概略図
【図６】本考案における載置部のまた別の一例を示す概略図
【図７】本考案における載置部のまた別の一例を示す概略図
【図８】本考案における載置部のまた別の一例を示す概略図
【図９】本考案における載置部のまた別の一例を示す概略図
【図１０】細胞又は組織を載置する載置部が保存液吸収体を有する一例を示した概略図
【図１１】図１０に示す載置部の立体概略図
【考案を実施するための形態】
【００２１】
以下に本考案の実施の形態を、図面を参照して詳細に説明するが、本考案は図示される実施形態に限定されるわけではない。
【００２２】
図１は、本考案の凍結保存用治具の一例を示す全体概略図である。本考案の凍結保存用治具３は、把持部２の先端部側（図中Ａ方向）に、細胞又は組織を載置する載置部１を有する。細胞又は組織の凍結操作の際、操作者は、載置部１上に細胞又は組織を載置し、該載置部１の先端部側から液体窒素等に浸漬することで、凍結保存作業を行うことができる。また凍結した細胞又は組織の融解操作の際、操作者は、把持部２を保持しつつ、凍結保存用治具３を液体窒素中から取り出す。クライオトップ法等のガラス化法では、優れた生存性で安定的に融解するために、凍結保存された細胞又は組織を液体窒素中のような極低温環境下から、素早く融解液中に移すことが求められるが、本考案の凍結保存用治具は、このような方法においても好適に用いることができる。すなわち、本考案の凍結保存用治具３は、把持部２を有することから、作業者は把持部２を保持しながら該凍結保存用治具を極低温環境下から取り出し、素早く融解液中に載置部１を浸漬させ、細胞又は組織を融解液中に移すことができる。
【００２３】
図２は、図１中の載置部１を拡大した図である。図２において載置部１ａは、細胞又は組織を載置する載置エリア４と、これら細胞又は組織を載置しない非載置エリア５を有しており、該載置エリア４と非載置エリア５の境界について、先端部側（図中Ａ側）にはこれらの境界を示すマーキング部６を有し、手元部側（図中Ｂ方向）にも、載置エリア４と非載置エリア５の境界を示す、マーキング部７を有する。載置エリア４の面積は、載置する細胞又は組織の種類によって適宜調整できるが、０．０２５ｍｍ２〜２５００ｍｍ２の範囲であることが好ましい。前記したマーキング部６やマーキング部７のマーキング幅Ｃは、マーキング部を目視又は顕微鏡下で視認できる範囲で任意の幅が設定でき、５０μｍ〜５０ｍｍであることが好ましい。細胞又は組織を載置する載置エリア４の領域をこのように示すことにより、例えば、細胞又は組織の融解操作の際に、操作者は載置部の識別が容易となり、また融解後の細胞又は組織を回収する際に、操作者は細胞又は組織を容易に認識できることから、融解後の細胞又は組織を回収する際の操作性が格段に向上する。
【００２４】
図３は、本考案における載置部の別の一例を示す概略図である。図３において載置部１ｂは、載置エリア４の先端部側（図中Ａ方向）に位置する非載置エリアのマーキング部６が、先端部側の非載置エリアの全域にわたった実施形態を示したものである。このような形態では、例えば、クライオトップ法等のガラス化法において、凍結操作及び融解操作の際に、液体窒素中あるいは融解液中で載置部１ｂを目視及び顕微鏡下で視認しやすくなることから、操作性に優れた凍結保存用治具を提供することができる。
【００２５】
図４は、本考案における載置部のまた別の一例を示す概略図である。図４において載置部１ｃは、前述した図３と同様に、載置エリア４の先端部側（図中Ａ方向）に位置する非載置エリアのマーキング部６が、先端部側の非載置エリアの全域にわたった実施形態を示したものであるが、図４では、手元部側（図中Ｂ方向）におけるマーキング部７を複数（図４では２つ）とした例である。このような場合には、手元部側における載置エリア４と非載置エリア５の目視での識別が特に良好となり、好ましい。
【００２６】
図５は、本考案における載置部のまた別の一例を示す概略図である。図５の実施形態は、図３の実施形態に加えて、更に載置部１ｄの先端部側（図中Ａ方向）の形状が半楕円形の形状を有する。載置部１の先端部がこのような形状を有する場合では、後述するような、細胞又は組織を載置した載置部を有する凍結保存用治具をストローなどの被覆部材に収納する際の作業性が向上し、特に好ましい。
【００２７】
図６の実施形態では、細胞又は組織を載置する載置部１ｅの先端部側に位置するマーキング部６が、弧線状の形状を有する構造である。このような構造を有する場合には、特に顕微鏡下での観察において、細胞又は組織が載置される位置が、先端部側のマーキング部６の近傍であるか、あるいは手元部側のマーキング部７の近傍であるかの判別が容易となる。
【００２８】
図７および図８も、本考案における載置部のまた別の一例を示す概略図である。図７の実施形態では、細胞又は組織を載置する載置エリア４と、これらが載置されない非載置エリア５との境界について、先端部側（図中Ａ方向）および手元部側（図中Ｂ方向）のマーキング部６およびマーキング部７に加えて、載置エリア４の側面にもマーキング部８を加え、載置エリア４をマーキング部によって囲った構造である。図７では連続した線により載置エリア４を取り囲み、図８では、破線により載置エリア４を取り囲んだ。このような場合では、載置部１ｆあるいは載置部１ｇの、より中央部に近い位置に、細胞又は組織を載置できることから、該凍結保存用治具は、細胞又は組織をより確実に保持させることができる。
【００２９】
図９の載置部１ｈは、載置エリア４と非載置エリア５の境界を、円形状のマーキング部で示したものであり、このような形態においても該載置部１ｈは、先端部側（図中Ａ方向）および手元部側（図中Ｂ方向）のいずれにおいても、載置エリア４と非載置エリア５の境界に、マーキング部６およびマーキング部７を有するから、本考案はこのような形態も包括するものである。
【００３０】
図１０は、本考案の凍結保存用治具における細胞又は組織を載置する載置部が、保存液吸収体を有する一例を示した概略図であり、図１１は図１０の立体概略図である。図１０および図１１に記載される載置部１ｉは保存液吸収体９を有し、該保存液吸収体９は支持体１０上に接着層１１を介して貼り合わされている。本考案の細胞又は組織の載置部が保存液吸収体を有する場合、細胞又は組織に付着した保存液の量が多くても保存液吸収体が保存液を除くことができるため、保存液の除去操作が不要となり作業性が格段に向上する。またそのように操作された細胞又は組織は極少量の保存液に覆われており、凍結作業する場合でも速やかに凍結状態にすることができる。更に前述したクライオトップ法等のガラス化法においては、グリセロール、エチレングリコール、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）などの耐凍剤を多量に含む水溶液が保存液として利用され、この保存液には多量の耐凍剤による化学的毒性が存在するが、載置部が保存液吸収体を有する凍結保存用治具によれば、載置された細胞又は組織周辺の保存液が極少量となることで、細胞又は組織の生存率の向上が期待できる。
【００３１】
載置部１ｉにおいては、先端部側（図中Ａ方向）および手元部側（図中Ｂ方向）のマーキング部６およびマーキング部７は、保存液吸収体９上に形成されており、このようなマーキング部６およびマーキング部７により良好な視認性にて認識される載置エリア４の下部（支持体１０に接する側の面）における接着層１１の固形分量は、載置エリア４以外の箇所における接着層１１の固形分量よりも少なくすることが好ましい。載置エリア４において接着層１１を形成するための接着剤の固形分量が多いと、該接着剤が保存液吸収体４に入り込み、保存液の吸収性が低下する場合があるためである。
【００３２】
本考案の凍結保存用治具が有する把持部は、耐液体窒素素材であることが好ましい。このような素材としては、例えばアルミ、鉄、銅、ステンレス合金などの各種金属、ＡＢＳ樹脂、ポリプロピレン樹脂、ポリエチレン樹脂、フッ素系樹脂や各種エンジニアプラスチック、更にはガラスなどを好適に用いることができる。
【００３３】
本考案の凍結保存用治具が有する載置部としては、例えば、各種樹脂フィルム、金属板、ガラス板、ゴム板等が挙げられる。載置部は１種類の素材からなるものでも良いし、２種類以上の素材からなるものでも良い。中でも樹脂フィルムは、取り扱いの観点で好適に用いられる。樹脂フィルムの具体例としては、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）やポリエチレンナフタレート（ＰＥＮ）等のポリエステル樹脂、アクリル樹脂、エポキシ樹脂、シリコーン樹脂、ポリカーボネート樹脂、ジアセテート樹脂、トリアセテート樹脂、ポリアクリレート樹脂、ポリ塩化ビニル樹脂、ポリスルフォン樹脂、ポリエーテルスルフォン樹脂、ポリイミド樹脂、ポリアミド樹脂、ポリオレフィン樹脂、環状ポリオレフィン樹脂等からなる樹脂フィルムが挙げられる。また載置部の全光線透過率が８０％以上であると、載置部に載置した細胞又は組織を、透過型顕微鏡を用いて容易に確認することができるため好ましい。
【００３４】
温度伝導性に優れ、急速な凍結を可能にするという観点で金属板も好適に用いることができる。金属板の具体例としては、銅、銅合金、アルミニウム、アルミニウム合金、金、金合金、銀、銀合金、鉄、ステンレスなどを挙げることができる。上記した各種樹脂フィルム、金属板、ガラス板、ゴム板等の厚さは１０μｍ〜１０ｍｍであることが好ましい。また、目的に応じて、各種樹脂フィルム、金属板、ガラス板、ゴム板等の表面をコロナ放電処理のような電気的な方法や、化学的な方法により易接着処理することもでき、さらには粗面化することもできる。
【００３５】
本考案の凍結保存用治具における、マーキング部の描画方法としては、顔料又は染料インクを用いた印刷方式、インクジェット方式、レーザープリント方式等の方法を用いることができる。また、レーザーマーキングのような表面の改質・表面の反応を用いた描画方法も好適に用いることができる。
【００３６】
本考案の凍結保存用治具が好ましく有する保存液吸収体としては、繊維からなるシート、多孔性樹脂シート、多孔性金属シート、および多孔性金属酸化物シート等の各種シートが挙げられる。本考案における「多孔性」とは、上記したシートが表面に気孔（細孔）を有する構造体であることを意味し、シート表面及び内部に連続的な気孔を有する構造体であることがより好ましい。また保存液吸収体（上記した各種シート）の厚みは１０μｍ〜５ｍｍであることが好ましく、より好ましくは２０μｍ〜２．５ｍｍである。
【００３７】
本考案において、保存液吸収体として用いる繊維からなるシートとしては、紙又は不織布が例示され、紙はバインダーなどの結着剤成分の紙全体に占める割合が１０質量％以下である紙が好ましく、より好ましくは５質量％以下であり、更に３質量％以下である紙が好ましい。これにより優れた保存液の吸収性が得られる。また、該紙に含まれる製紙用薬品の紙全体に占める割合は１質量％以下であることが好ましい。通常紙に含まれている製紙用薬品のうち、例えば蛍光増白剤や染料、カチオン系のサイズ剤などには細胞への影響が懸念される場合がある。
【００３８】
繊維からなるシートが紙である場合、密度が０．１〜０．６ｇ／ｃｍ３であり、坪量が１０〜１３０ｇ／ｍ２の紙であることが好ましい。特に密度が０．１２〜０．３ｇ／ｃｍ３であり、坪量が１０〜１００ｇ／ｍ２である紙は、保存液の吸収性に優れ、更には、透過型顕微鏡を用いて本体部上に載置した細胞又は組織を観察することができるような、細胞又は組織の視認性に優れた凍結保存用治具を提供することが可能となるため好ましい。
【００３９】
繊維からなるシートが不織布である場合、該不織布が含有する繊維としては、セルロース繊維、セルロース繊維からなる再生繊維であるレーヨン繊維やキュプラ繊維、さらにはセルロース繊維からの半合成繊維であるアセテート繊維、ポリエステル繊維、ナイロン繊維、アクリル繊維、ポリプロピレン繊維、ポリエチレン繊維、ポリ塩化ビニル繊維、ビニリデン繊維、ポリウレタン繊維、ビニロン繊維、ガラス繊維、絹繊維などが挙げられ、これら繊維を各種混合した不織布も用いることができる。中でもセルロース繊維、セルロース繊維由来の繊維でセルロース再生繊維であるレーヨン繊維やキュプラ繊維、更にはセルロース繊維からの半合成繊維であるアセテート繊維が好ましい。
【００４０】
繊維からなるシートが不織布である場合、密度が０．１〜０．４ｇ／ｃｍ３であり、坪量が１０〜１３０ｇ／ｍ２の不織布であることが好ましい。特に密度が０．１２〜０．３ｇ／ｃｍ３であり、坪量が１０〜１００ｇ／ｍ２である不織布は、保存液の吸収性に優れ、さらには細胞又は組織の視認性に優れた凍結保存用治具を提供することが可能となるため好ましい。
【００４１】
保存液吸収体として用いられる不織布においても前記した紙と同様に、バインダーなどの結着剤成分の不織布に占める割合が１０質量％以下である不織布が好ましく、より好ましくは５質量％以下であり、更に３質量％以下である不織布が好ましい。特に結着剤を含有しない不織布が好ましい。
【００４２】
不織布は紙と異なり様々な製造方法があるが、上記した結着剤成分が低減された不織布としては、スパンボンド法、メルトブロー法で製造された不織布、更には湿式法又は乾式法で繊維を並べた後、水流交絡法又はニードルパンチ法で製造された不織布が好適に使用できる。また上記した通り、本考案において不織布が含有する好ましい繊維としては、セルロース繊維、セルロース繊維由来の繊維でセルロース再生繊維であるレーヨン繊維やキュプラ繊維、更にはセルロース繊維からの半合成繊維であるアセテート繊維が挙げられるが、これら繊維を用いて製造する場合は、湿式法、乾式法関わらず水流交絡法又はニードルパンチ法での製造方法が好適である。
【００４３】
本考案において、保存液吸収体として用いる多孔性樹脂シートとしては、例えば特公昭４２−１３５６０号公報や、特開平０８−２８３４４７号公報に記載される、少なくとも一軸方向に延伸し、樹脂の融点以上に加熱し焼結することで得た微細繊維状構造により多孔質構造を形成した樹脂シート、特開２００９−２３５４１７号公報に記載される、乳化重合又は粉砕等の方法によって得られた熱可塑性樹脂の固体粉末を金型に充填し、加熱、焼結して粉末粒子表面を融着させて冷却することにより、多孔質構造を形成した樹脂シート等が挙げられる。多孔性樹脂シートを保存液吸収体として用いた場合、保存液の吸収性に優れ、さらには細胞又は組織の視認性に優れた凍結保存用治具を提供することが可能となるため、好ましい。
【００４４】
上記した多孔性樹脂シートを形成する樹脂としては、低密度ポリエチレン、高密度ポリエチレン、超高分子ポリエチレン等の各種ポリエチレンやポリプロピレン、ポリメチルメタクリレート、ポリスチレン、ポリテトラフルオロエチレンやポリビニルジフロライド等のフッ素樹脂、エチレン−酢酸ビニル共重合体、ポリアミド、スチレン−アクリロニトリル共重合体、スチレン−ブタジエン−アクリロニトリル三元共重合体、ポリカーボネート、ポリ塩化ビニル等が挙げられる。中でもポリテトラフルオロエチレンやポリビニリデンジフロライド等のフッ素樹脂は、細胞又は組織を保存液と共に載置部に載置した場合、該多孔性樹脂シートの透明性が高くなり、透過顕微鏡観察下での細胞又は組織の視認性が飛躍的に高まり、細胞又は組織の視認性にとりわけ優れた凍結保存用治具を提供することが可能となるため好適である。また多孔性樹脂シートとしては、理化学実験用途や研究用途として市販されている、濾過用のメンブレンフィルターも使用できる。
【００４５】
本考案において、保存液吸収体として用いる多孔性金属シートとしては、銅、銅合金、アルミニウム、アルミニウム合金、金、金合金、銀、銀合金、錫、亜鉛、鉛、チタン、ニッケル、ステンレス等の金属からなる多孔性金属シートが挙げられる。また多孔性金属酸化物シートとしては、シリカ、アルミナ、ジルコニウム、石英ガラスなどの金属酸化物からなる多孔性金属酸化物シートを好ましく利用することができる。また多孔性金属シートおよび多孔性金属酸化物シートは、上記した金属および金属酸化物をそれぞれ２種類以上含有する多孔性シートであっても良い。中でも多孔性金属酸化物シートは、細胞又は組織の視認性に優れた凍結保存用治具を提供することが可能となるため、好ましい。
【００４６】
本考案において、保存液吸収体として用いる多孔性金属シート、および多孔性金属酸化物シートの製造方法としては、一般に知られた方法を使用することができる。保存液吸収体が多孔性金属シートの場合には、粉末冶金法、スペーサー法などの方法を使用することができる。また、樹脂射出成型と粉末冶金法を組み合わせたいわゆるパウダースペースホルダー法も好ましく使用できる。例えば、国際公開第２００６／０４１１１８号パンフレットや特許第４５７８０６２号公報に記載された方法などを用いることができる。より具体的には、金属粉末とスペーサーとなる樹脂を混合後、圧力をかけて成型した後、高温環境下で焼成することで、金属粉末を焼き固め、スペーサーとなる樹脂を気化させて、多孔性金属シートを得ることができる。パウダースペースホルダー法等を用いる場合には、金属粉末とスペーサーとなる樹脂に加えて、樹脂のバインダーを混合することができる。また、金属粉末を高温で加熱した後に、ガスを注入して空隙を作製する発泡溶融法、ガス膨張法などの金属多孔質体の製造方法も使用することができる。さらには、発泡剤を用いて金属多孔質体を製造するスラリー発泡法のような製造方法も使用することができる。保存液吸収体が多孔性金属酸化物シートの場合には、例えば、特開２００９−２９６９２号公報や特開２００２−１６０９３０号公報に記載された方法などを用いることができる。
【００４７】
上記した多孔性樹脂シート、多孔性金属シート、および多孔性金属酸化物シート等の多孔質体の表面は、表面層との親和性を高めるために、親水化処理することもできる。親水化処理の方法としては、グラフト改質法、非溶出性の親水性物質を塗布することによるコーティング法、コロナ放電、プラズマ処理、エキシマレーザー等の各種エネルギーを用いた一般的な表面改質方法を使用することができる。
【００４８】
保存液吸収体が、上記した多孔性樹脂シート、多孔性金属シート、および多孔性金属酸化物シート等の多孔質体である場合には、該多孔質体の細孔径は、０．０２〜１３０μｍであることが好ましく、より好ましくは０．０５〜６０μｍである。細孔径が０．０２μｍ未満の場合、保存液の滴下時に保存液の吸収性能が十分でない場合がある。また、多孔性シートの製造が難しいという問題がある。一方、細孔径が１３０μｍを超える場合、保存液の吸収性能が十分でない場合がある。なお、多孔質体の細孔径は、多孔性樹脂シートの場合には、バブルポイント試験により測定される最も大きい細孔の直径である。また多孔性金属シートおよび多孔性金属酸化物シートの場合には、該多孔質体の表面及び断面の画像観察から測定した平均細孔直径である。
【００４９】
保存液吸収体の空隙率は２０容量％以上であることが好ましく、より好ましくは３０容量％以上である。また保存液吸収体が、上記した多孔性樹脂シート、多孔性金属シート、および多孔性金属酸化物シート等の多孔質体である場合、多孔質体の内部の気孔は、厚み方向のみならず、厚み方向に対して垂直な方向に対しても連続的な構造であることが好ましい。このような構造を有すると、多孔質体内部の気孔を有効に用いることができるために、保存液の高い吸収性能が得られる。保存液吸収体の厚み、多孔質体の空隙率は、用いる細胞又は組織の種類や細胞又は組織と共に滴下される保存液の滴下量等に応じて、適宜選択することができる。
【００５０】
上記した空隙率とは、以下の式で定義される。ここで空隙容量Ｖは水銀ポロシメーター（測定器名称  Ａｕｔｏｐｏｒｅ  ＩＩ  ９２２０  製造者  ｍｉｃｒｏｍｅｒｉｔｉｃｓ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用い測定・処理された、保存液吸収体における細孔半径３ｎｍから４００ｎｍまでの累積細孔容積（ｍｌ／ｇ）に、保存液吸収体の乾燥固形分量（ｇ／平方メートル）を乗ずることで、単位面積（平方メートル）当たりの数値として求めることができる。また保存液吸収体の厚みＴは保存液吸収体の断面を電子顕微鏡で撮影し測長することで得ることができる。
Ｐ＝（Ｖ／Ｔ）×１００（％）
Ｐ：空隙率（％）
Ｖ：空隙容量（ｍｌ／ｍ２）
Ｔ：厚み（μｍ）
【００５１】
本考案の凍結保存用治具が上記した保存液吸収体を有する場合、該保存液吸収体は前述した各種樹脂フィルム、金属板、ガラス板、ゴム板等を支持体とし、該支持体上に接着層により固定されていることが好ましく、このような接着層を形成する接着組成物としては、湿気硬化性の接着物質に代表されるような瞬間接着組成物、ホットメルト接着組成物、光硬化性接着組成物などを含有することが可能であり、例えば、ポリビニルアルコール、ヒドロキシセルロース、ポリビニルピロリドン、澱粉糊のような水溶性高分子化合物、酢酸ビニル系樹脂、アクリル系樹脂、エポキシ系樹脂、ウレタン系樹脂、エラストマー系樹脂、シアノアクリレート系樹脂、フッ素系樹脂、シリコン系樹脂、ニトロセルロース系樹脂、ニトリルゴム系樹脂、スチレン−ブタジエン系樹脂、ユリア系樹脂、スチレン系樹脂、フェノール系樹脂、ポリイミド系樹脂、ポリアミド系樹脂、ポリエステル系樹脂、ビスマレイミド系樹脂、オレフィン系樹脂、ＥＶＡ系樹脂などの非水溶性樹脂を含有する組成物が好ましく利用できる。接着層は、一種類の樹脂を含有してもよいし、複数種類の樹脂を含有してもよい。接着層の固形分量は、０．０１〜１００ｇ／ｍ２の範囲が好ましく、更に０．１〜５０ｇ／ｍ２の範囲がより好ましい。
【００５２】
本考案の、細胞又は組織の凍結保存用治具により、細胞又は組織を長期間凍結保存する場合、細胞又は組織を外界と遮断するためにキャップを被せる、又は該凍結保存用治具を任意の形状の容器に入れて密閉することも可能である。更に、通常液体窒素は滅菌されておらず、細胞又は組織を直接液体窒素に接触させて凍結させる場合においては、凍結保存用治具が滅菌されていても滅菌状態を保証できない場合がある。よって凍結前に細胞又は組織を付着させた凍結保存用治具の少なくとも載置部にキャップをして、又は凍結保存用治具を容器中に密閉して、細胞又は組織を直接液体窒素に接触させないで凍結させることがある。また、欧州など海外先進国では前記のように液体窒素に直接接触させない凍結方法が主流である。このような理由からキャップ及び容器は耐液体窒素性のある素材である各種金属、各種樹脂、ガラス、セラミックなどで作製することが好ましい。形状としては特に限定されず、例えば、キャップは、鉛筆用のキャップのような半紡錘状又はドーム状等のキャップ、円柱状のストローキャップなど先端シート部と接触せず、細胞又は組織を外界と遮断できるような形状ならどのような形状でもよい。容器は、先端シート部上の細胞又は組織に接触せずに、凍結保存用治具を被包又は収納して密閉できるものであればよく、その形状は特に限定されない。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
本考案は、牛などの家畜や動物の胚移植や人工授精、人への人工授精などの他、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、一般に用いられている培養細胞、生体から採取した検査用又は移植用の細胞又は組織、生体外で培養した細胞又は組織などの凍結保存に用いることができる。
【符号の説明】
【００５４】
１  載置部
２  把持部
３  凍結保存用治具
４  載置エリア
５  非載置エリア
６，７，８  マーキング部
９  保存液吸収体
１０  支持体
１１  接着層
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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