(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
出血の治療におけるその使用のための注射用製剤であって、
-  血小板の接着及び活性化を誘導するタンパク質又はペプチドを含む、10μm未満の長さを有する粒子;並びに
-  少なくとも1種の薬学的に許容されるビヒクル又は賦形剤
を含み、
前記粒子が、自己組織化によって得られ、
前記粒子が、0.05μmから6μmの範囲の平均直径を有し、
前記タンパク質が、コラーゲン、又は配列が、
-  配列番号1のポリペプチド;
-  配列番号1の25〜184位の配列を有するポリペプチド;若しくは
-  その全長に沿って、配列番号1のポリペプチド、若しくは配列番号1の25〜184位の配列を有するポリペプチドとの少なくとも70%の同一性を有するポリペプチド
の中から選ばれる少なくとも1種のポリペプチドを含む組換え型タンパク質
の中から選ばれ、
前記ペプチドが、
-  配列番号1のポリペプチド;
-  配列番号1の25〜184位の配列を有するポリペプチド;又は
-  その全長に沿って、配列番号1のポリペプチド、若しくは配列番号1の25〜184位の配列を有するポリペプチドとの少なくとも70%の同一性を有するポリペプチド
の中から選ばれる、
注射用製剤。
【請求項２】
前記粒子が、コラーゲン又は組換え型タンパク質の中から選ばれるペプチド又はタンパク質からなる、請求項1に記載の使用のための注射用製剤。
【請求項３】
前記粒子が、1μmから6μmの範囲の平均直径を有する、請求項1又は2に記載の使用のための注射用製剤。
【請求項４】
前記コラーゲン又は前記タンパク質が、ペグ化又はパス化されている、請求項1から3のいずれか一項に記載の使用のための注射用製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、出血の治療におけるその使用のためのコラーゲンに基づいた注射用製剤に関する。この注射用製剤は、血小板自体の接着及び活性化、更に血小板の凝集すらも誘導することが可能な、コラーゲンに由来するタンパク質及びペプチドからなる。本発明はまた、緊急状況下(出血、外科手術)において抗血小板薬で治療した患者への、コラーゲンに由来するタンパク質及びペプチドの全身/一般経路による応急注射に関する。
【背景技術】
【０００２】
出血は、血液の正常な血流の外側への流出と定義される。出血は、単純な失血からなることも、ある状況、特に外傷において大量になることもあり、血圧の降下に伴う出血性ショックの状態に至ることもある。
【０００３】
様々な臨床的背景は、手術、外傷、治療、血小板減少症又は体質性若しくは機能性の欠乏(血友病等)等、出血のリスクをもたらす(Spahn Dら、Critical Care. 2013年、17:R76)。重症の大量出血において、凝固障害が観察される。凝固障害は、血小板及び凝固因子の消費に相当する。治療は必須であり、出血の結果は治療に依存する。様々な治療戦略は現在、以下の通りである。
【０００４】
ある手法は、新鮮凍結血漿(FFP)に基づいた輸血サポート、濃縮赤血球又は血小板を用いることからなる。それにもかかわらず、血小板に基づいた手法の成功は、血小板の利便性、それらの短い有効期間(平均5日)、貯蔵の条件に関連する問題、あるタイプの試料の汚染のリスク、これらの費用及び無効力のリスク、又は同種免疫による非寛容すら含めた、いくつかの因子によって制限される。
【０００５】
別の手法は、フィブリノゲン濃縮物及びプロトロンビン複合体濃縮物(II、VII、IX及びX因子)等の凝固因子濃縮物の使用に基づいている。研究によれば、VIIa因子[NovoSeven(登録商標)]の使用も提案されている。しかしながら、この最後の使用は、誘導性血栓症が高率であるため推奨されない。
【０００６】
最後に、緊急状況下における別の手法は、強力なプラスミノゲン活性化アンタゴニストであり、そのため、抗線溶薬として作用するトラネキサム酸を用いることからなる(Fries D. Transfusion. 2013年、53巻:91S〜95S)。
【０００７】
これらが失血を止める上で最重要な工程であるが、現在のところ提案されるいかなる手法も、出血エピソード中の血小板の活性化及び凝集を誘導することが可能でない。血管外傷が失血をもたらすとき、一次止血と称される一連の工程が導入される。これには、核がない直径およそ2〜5μmの両凸の円板状の細胞である血小板が関与する。様々な作用物質(actor)がこのプロセスに関与しており、これにより、止血性の血餅が形成される。接着と呼ばれる第1の相は、外傷部位で循環血小板の補充が可能である。この工程には、ウィルブランド因子、コラーゲン及びコラーゲン受容体(GpVI及びα2β1)と呼ばれる血小板受容体が関与する。血小板活性化と呼ばれる第2の相は、プロアグレゲント(pro-aggregant)因子の遊離及びP-セレクチン等のタンパク質の血小板表面の発現を含む。この相には、凝集と呼ばれる相が続き、フィブリノゲン及び血小板受容体GpIIb/IIIaが特に関与し、凝血原リン脂質の膜曝露によって、凝固因子のその部位への固定化、最終的なフィブリン/血小板血餅の形成及び失血の停止が可能になる。
【０００８】
止血のプロセスにおける血小板の活性化によって、プロアグレゲント及び凝血原と呼ばれる血小板の2つの集団が出現することが現在十分に確立されている。後者は、トロンビン生成の起源でのホスファチジルセリンの表面における発現を特徴とする。これらは、超活性血小板と呼ばれる。したがって、本発明者らは、トロンビン及びコラーゲン等のアゴニストに応答して血小板のこの集団を産生する各個体の能力を記載する血小板超活性化の可能性を述べている。最近の研究では、活性血小板のこの集団の出現を誘導することを目標としているいずれの治療戦略も、出血の状態を治療する大きな可能性を示すことが示唆されている[Mazepa Mら、ATVB 2013年、33巻(8号):1747〜52]。更に、輸血された血小板の止血効果が、この集団に依存していることを裏付けるデータによって、これらの関心が強まっている。しかしながら、現在のところ提案される手法は、本発明に記載のコラーゲン又はコラーゲンに由来するタンパク質及びペプチド等の生理的な又は天然の血小板アクチベーターを血流に注射することに基づいていない。
【０００９】
失血の停止における血小板の中心的な役割は、血小板に由来する又は血小板を模倣している生成物(合成の血小板)を開発することを目的としている最近の研究の原点である。提案される手法の中でも、血栓性赤血球(thromboerythrocyte)及びトロンボソーム等の細胞に由来する生成物に基づいたものと、血小板活性化カスケードに関与するタンパク質に由来するペプチドで被覆されたマイクロメーターサイズの粒子を用いたもの、例えばシントサイト(synthocyte)又はフィブリノゲンに由来するペプチド(RGDペプチド若しくはドデカペプチドH12)に基づいたFibrocaps(商標)等、或いはウィルブランド因子、コラーゲン及びGpIIb/IIIaへのペプチド結合で被覆されたものとの間で違いがある(Lashof-Sullivan Mら、Nanoscale 2013年、5巻、10719〜10728頁)。止血効果は、ウィルブランド因子、コラーゲン及びGpIIb/IIIaへのペプチド結合で被覆されたこれらの粒子について記載されており、これによって、適用を出血の状況において想定することが可能になる。しかしながら、この手法は、(キログラム当たり数十ミリグラム程度の)非常に高い用量を現在注射しなければならないという事実(Modery-Pawlowski Cら、Biomaterials 2013年:516〜541頁)を考慮しなくても、単一の粒子においていくつかのペプチドを組み合わせるこのタイプの生成物の工業化は、結合率及び各ペプチドに対する比、並びに注射後の生成物の安定性等のパラメーターに習熟する又はそれらを適させることが必要となり、大きな問題がある。
【００１０】
したがって、利用可能な形で血流に注射することができる出血の治療の新しい手段が必要である。これらは、工業的に容易に調製され、低濃度で用いることができるならば好ましい。
【００１１】
人口の高齢化と共に、内科医は、抗凝血薬及び抗血小板薬で治療される患者と向き合うことがますます多くなっている。これらの治療を一時的に中止する戦略が、プログラムされた介入(新たな抗血小板薬の5〜7日の使用中止及び新たな抗凝血薬の5日の使用中止)について十分に規定されているが、このことにより、出血の状態(特に頭蓋の手術若しくは外傷)の患者の救急処置がひどく困難になる[Bonhomme Fら、Eur J Intern Med. 2014年3月;25巻(3号):213〜20]。緊急の回復(emergency reversion)の様々な戦略が提案されているが、新たな抗血小板薬の場合、これらは、血小板の輸血にほぼ限定される[Beynon Cら、Crit Care. 2012年7月26日;16巻(4号):228頁]。これらの新たな抗血小板薬の作用モードと無関係に、出血エピソード中に血小板機能の回復(recovery)を可能にすることができる新たな注射用止血生成物が必要である。コラーゲン依存性血小板活性化経路が、最も生理的であり、現在まで、市場における任意の抗血小板治療によって変更されていないという事実から、これらの状態において、全身経路によってコラーゲンに由来するタンパク質又はペプチドを投与することへの関心が高まっている。コラーゲン又は本発明のコラーゲンに由来するタンパク質若しくはペプチドへのGPVIの結合によって、血小板内で強いシグナル伝達がもたらされることが十分に確立されている。
【００１２】
軍事行動の海外戦域等、運搬上制約された背景において、出血の治療は、特に輸血(濃縮赤血球、血漿及び血小板)を含めた「ダメージコントロール蘇生法(damage control resuscitation)」の概念によって規定される。それにもかかわらず、この状況は、これらの血液製剤、特に血小板へのアクセスの困難を特徴とし、全血の使用を主な相違点とする、「リモートダメージコントロール蘇生法(remote damage control resuscitation)」という用語によって包含される修正された治療を要する(Jenkins DHら、Shock. 2014年5月;41 Suppl 1:3〜12)。この戦略は汚染のリスクを伴うが有望である。しかしこの戦略は、依然として現在、軍事分野に限られている(Murdock ADら、Shock. 2014年5月;41 Suppl 1:62〜9)。
【００１３】
したがって、本発明は、出血を伴う以下の3つの状況において、すなわち、
-  血流中で血小板を活性化させる能力を要する、大量失血、特に、非圧縮性のエピソード中;
-  特に全血又は血小板の輸血に基づいた手法の補完としての、医療センターから離れた輸血蘇生法中のアジュバントとして;
-  特に頭蓋内の手術又は出血用の解毒剤を含まない、現在市販されている新たな抗血小板薬(例えば、プラスグレル、チカグレロル)のための回復剤(reverting agent)として、
コラーゲンに由来する血小板活性化タンパク質又はペプチドを新たな注射用止血薬として静脈内投与することへの関心に関する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】国際特許出願WO2010/034718
【特許文献２】欧州特許出願EP2013/071816
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Spahn Dら、Critical Care. 2013年、17:R76
【非特許文献２】Fries D. Transfusion. 2013年;53巻:91S〜95S
【非特許文献３】Mazepa Mら、ATVB 2013年、33巻(8号):1747〜52
【非特許文献４】Lashof-Sullivan Mら、Nanoscale 2013年、5巻、10719〜10728頁
【非特許文献５】Modery-Pawlowski Cら、Biomaterials 2013年:516〜541頁
【非特許文献６】Bonhomme Fら、Eur J Intern Med. 2014年3月;25巻(3号):213-20
【非特許文献７】Beynon Cら、Crit Care. 2012年7月26日;16巻(4号):228頁
【非特許文献８】Jenkins DHら、Shock. 2014年5月;41 Suppl 1:3〜12
【非特許文献９】Murdock ADら、Shock. 2014年5月;41 Suppl 1:62〜9
【非特許文献１０】Clementson K. Thrombosis Research 2012年129巻220〜224頁
【非特許文献１１】Pires M and Chmielewski J. J. Am. Chem. Soc. 2009年131巻、2706〜2712頁
【非特許文献１２】Przybyla Dら、J. Am. Chem. Soc. 2013年、135巻、3418〜3422頁
【非特許文献１３】Kojima Cら、J. Am. Chem. Soc. 2009年131巻、30652〜6053
【非特許文献１４】Slatter Dら、Peptides 2012年36巻、86〜93頁
【非特許文献１５】Karら、Journal of Biological Chemistry 2006年281巻、no.44 33283〜33290
【非特許文献１６】An Bら、Frontiers in chemistry. 2014年6月;2 article 40
【非特許文献１７】Invitrogen INFORMAX、http://www.invitrogen.com
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、出血の治療におけるその使用のための注射用製剤であって、
-  長さ10μm未満の粒子又は原線維であって、かかる粒子又は原線維タンパク質若しくはペプチドは血小板の接着及び活性化、又はそれらの凝集を誘導する、粒子又は原線維;並びに
-  少なくとも1種の薬学的に許容されるビヒクル又は賦形剤
を含む注射用製剤に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】50倍に濃縮した後の配列番号1のポリペプチドのタンパク質抽出物の粒子のサイズのDLSによる測定を示す図である。
【図２】最終濃度2μg/mLで用いた異なるサイズの粒子の形態の配列番号1のポリペプチドへの、及び10μg/mLで用いたI型コラーゲン(SIRCOLコラーゲン、陽性対照)への、最終濃度2IU/dLで用いた精製されたウィルブランド因子(Willfactin、LFB)の結合について、ELISAによって得られた結果を示す図である。
【図３Ａ】配列番号1のポリペプチド及びI型コラーゲン(Horm)についてフローサイトメトリーによって得られた、血小板の表面におけるP-セレクチンの発現の典型的なプロファイルを表す図である。
【図３Ｂ】様々なアゴニストについて得られた平均蛍光強度を表す図である。
【図４】粒子の形態の配列番号1のポリペプチドで得られた凝集結果を示す図である。
【図５】様々な顕微鏡技法によって観察された、原線維の形態のI型コラーゲン(Horm)と比較した、粒子の形態の配列番号1のポリペプチドの高分子構造を示す図である。
【図６】配列番号1のポリペプチド及びI型コラーゲン(Horm)のマウスへの注射後に、試料採取した血小板の表面におけるP-セレクチンの発現についてのフローサイトメトリーによって得られた平均蛍光強度を表す図である。
【図７】エピネフリンの存在下で、マウスにおける誘導性肺塞栓形成(induced pulmonary embolism)モデルにおける、原線維の形態のI型コラーゲン(Horm)及び粒子の形態の配列番号1のポリペプチドのマウスへの静脈内注射の結果を示す図である。図7Aは、注射後にマウスの死亡について得られた結果を示し、図7Bは、試験された様々なコラーゲンの投与の少なくとも5分後に注射したテクネチウムで放射能標識したアルブミンの巨大凝集体の体内分布を示す。
【図８】マウスの尾からの誘導された失血のモデルにおける、配列番号1のポリペプチドのマウスへの注射の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
配列の説明
配列番号1:血小板の接着及び活性化を誘導することが可能である組換え型タンパク質のためのポリペプチドコーディング。
【００１９】
本発明は、出血の治療におけるその使用のための注射用製剤であって、
-  血小板の接着及び活性化を誘導するタンパク質又はペプチドを含む、10μm未満の長さを有する粒子又は原線維;及び
-  少なくとも1種の薬学的に許容されるビヒクル又は賦形剤
を含む注射用製剤に関する。
【００２０】
本発明による注射用製剤によって、血小板活性を刺激することが可能になる。いくつかの実施形態において、粒子又は原線維には、血流への注射後、血小板の接着及び活性化、並びに血小板の凝集をも誘導するタンパク質又はペプチドが含まれる。後者は、アジュバントとして用いて、血小板濃縮物又は全血の輸血中、血小板を予め活性化させる(pre-activate)こともできる。
【００２１】
血小板の接着、活性化、更に凝集すらも誘導するタンパク質又はペプチド
本発明の製剤の配合物に入っているタンパク質又はペプチドは、血小板の接着及び活性化、又は血小板の凝集をも誘導する能力を有する。これら2つ若しくは3つの活性は、同一のタンパク質又はペプチドの特性であることが理解されるべきである。これらのタンパク質又はペプチドは、10μm未満の長さを有する粒子又は原線維の形態である。
【００２２】
好ましくは、原線維は、長さが、9μm未満、8μm、7μm、6μm、5μm、4μm、3μm、2μm、1μm又は0.5μmである。より好ましくは、原線維は、長さが0.5μmから9μmの間、1μmから5μmの間、又は2μmから4μmの間である。
【００２３】
これらのタンパク質又はペプチドは、血小板の接着を担うウィルブランド因子を結合する、又は活性化させることが可能であり、且つ血小板活性化のマーカーであるPセレクチン又はホスファチジルセリンの表面の発現を誘導することが可能である。いくつかの実施形態において、タンパク質又はペプチドは、in vitroにおいて血小板に富む血漿又は全血の凝集を誘導することが可能である。
【００２４】
いくつかの実施形態において、タンパク質又はペプチドは、血小板を刺激し、失血の停止を誘導することができるが、必ずしも凝固の活性化を誘導できるわけではない。凝固の活性化は、血小板の表面におけるホスファチジルセリンの発現、凝血原であるといわれる表面の形成、及びトロンビンの得られる生成に依存している。これによって、製剤の全身の注射後に誘発される血栓症のリスクを制限することが可能になる。凝血原血小板と呼ばれる、活性血小板のこの部分集団の活性化は、それにもかかわらず起こり得るが、古典的な試験により検出可能なトロンビンの生成のために必要なレベルを下回るレベルで起こり得る。
【００２５】
コラーゲンと呼ばれるタンパク質のファミリーは、いくつかのコラーゲンの配列、主に、循環ウィルブランド因子及び2種の血小板受容体GpVI及びα2β1に結合することが可能なペプチド配列のI型及びIII型のコラーゲンの配列の存在により、前述の3つの活性を誘導する能力を有する。これにより、血小板の接着、これらの活性化、次いでこれらの凝集をもたらす。このように、本発明の製剤の形成に入っているタンパク質は、コラーゲン、特にI型及びIII型のコラーゲンの中から選ぶことができる。
【００２６】
現在まで、出血を治療するためのコラーゲンの使用は、提案されていない。これは、天然コラーゲン(native collagen)のうち、原線維の形態のもののみが、血小板の接着、活性化及び凝集を誘導することが可能であると記載されているという事実によって説明することができる(Clementson K. Thrombosis Research 2012年、129巻220〜224頁)。しかしながら、長さ数マイクロメーターに達し得る線維を有するこの原線維の形態は、血流への注射に適合しない。本発明の特異的な形態は、血流への注射に適合する。
【００２７】
ミクロスフェア、ミクロフロレット(microflorette)及びデンドリマー等のコラーゲンの特異的な形態は、Pires M and Chmielewski J. J. Am. Chem. Soc. 2009年131巻、2706〜2712頁; Przybyla Dら、J. Am. Chem. Soc. 2013年、135巻、3418〜3422頁;Kojima Cら、J. Am. Chem. Soc. 2009年131巻、30652〜6053; Slatter Dら、Peptides 2012年36巻、86〜93頁; Karら、Journal of Biological Chemistry 2006年281巻、no.44 33283〜33290によって記載されるもの等の方法によって得ることができる。これらの特異的な形態を得るために、様々な手法は、特に金属又は塩の使用、ペプチド配列におけるシステイン(ジスルフィド架橋)若しくは芳香族アミノ酸の添加又は異なる性質(極性、無極性、酸性、塩基性)のアミノ酸間の比に基づいて用いられている。
【００２８】
コラーゲンとは別に、本発明の製剤の配合物に入っているタンパク質は、国際特許出願WO2010/034718に記載されているもの等の組換え型タンパク質であり得る。コラーゲンに由来するこれらの組換え型タンパク質は、天然コラーゲンと等価の方式において血小板凝集を誘導することが可能である。本発明に有用な及びコラーゲンに由来する他のタンパク質は、欧州特許出願EP2013/071816に記載されているものである。これらのタンパク質は、ウィルブランド因子への結合、傷害された血管部位における血小板の最初の接着に関与している結合が可能である。
【００２９】
このように、本発明の製剤の配合物に入っているタンパク質は、I型及びIII型コラーゲン等の天然コラーゲン、或いは配列が、
-  配列番号1のポリペプチド;
-  GXYトリプレットの反復から形成される配列を有するポリペプチドであって、Gは、グリシンを指定し、X及びYは、n回くり返される任意のアミノ酸を指定し、nは2以上である、ポリペプチド
-  配列番号1の25〜184位までの配列を有するポリペプチド;又は
-  その全長に沿って、配列番号1のポリペプチド、若しくは配列番号1の25〜184位までの配列を有するポリペプチドとの少なくとも70%の同一性を有するポリペプチド
の中から選ばれる少なくとも1種のポリペプチドを含む組換え型タンパク質の中から選ぶことができる。
【００３０】
更に、グリシン3種の各アミノ酸の配列を有する天然若しくは合成ペプチド又はポリペプチドは、コラーゲン誘導体として考慮され得る(An Bら、Frontiers in chemistry. 2014年6月;2 article 40)。鎖のこの主な構造は、アミノ酸(例えば、システイン)又は多量体の構造(例えば、MBL[マンノース-結合レクチン]タンパク質の三量体形成ドメイン)の形成を可能にするペプチド配列の存在下でコラーゲンの構造と類似のペプチド鎖のコンフォメーションを誘導する。
【００３１】
配列番号1の1位から24位までのペプチドは、宿主細胞による組換え型タンパク質の分泌を可能にするシグナルペプチドに対応する。このシグナルペプチドは、存在しなくてもよく、当業者に周知の技法による別のシグナルペプチドによって置き換えられていてもよい。当業者は、様々な原核生物又は真核生物発現系におけるポリペプチドの発現及び分泌のために適切である同種又は異種のシグナルペプチドを選ぶことができる。好ましくは、ポリペプチドは、真核生物細胞又は有機体、特に哺乳動物細胞において産生される。本発明の特定の実施形態において、ポリペプチドには、細胞外媒体へのこれらの分泌を可能にするシグナルペプチドが含まれる。別の実施形態では、成熟したポリペプチドは、シグナルペプチドの切断後に得られる。
【００３２】
いくつかの実施形態において、組換え型タンパク質の配列には、以下のペプチド配列を含有する少なくとも1種のポリペプチドが含まれる:
-  GX1X2GER(式中、X1及びX2は、独立に、A、R、N、D、Q、E、G、H、I、K、M、F、P、S、T、W、Y、V及びOの中から選ばれるアミノ酸を表す);
-  (GPX3)n(nは4から10の間であり、X3は、P又はOを表す);並びに
-  GPRGQX4GVMGFX5(X4及びX5は、独立にP又はOを表す)。
Pは、プロリンを表し、Oは、ヒドロキシプロリンを表す。
【００３３】
いくつかの実施形態において、組換え型タンパク質の配列には、以下のペプチド配列を含有する少なくとも1種のポリペプチドが含まれる:
-  GAPGER、
-  KPGEPGPK、
-  (GPP)n(nは、4から10の間である)、
-  RGD。
【００３４】
このように、組換え型タンパク質には、
(a)4GPOトリプレットの少なくとも1回の反復を有するペプチド配列;
(b)様々な血小板受容体への結合活性を有し、コラーゲンの天然配列中に存在するペプチド配列;及び
(c)配列(a)及び(b)の間のGXYトリプレットの反復から形成される結合配列(Gは、グリシンを指定し、X及びYは、任意のアミノ酸を指定する)
が含まれる。
【００３５】
本発明の製剤の配合物に入っている組換え型タンパク質は、その全長に沿って、配列番号1のポリペプチド、又は配列番号1の25〜184位までの配列を有するポリペプチドとの少なくとも70%の同一性を有する少なくとも1種のポリペプチドを含めた配列を示し得る。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、配列番号1のポリペプチドと少なくとも70%、80%、90%、95%、98%、好ましくは少なくとも99%の同一性を示す。同一率(percentage identity)は、同一のアミノ酸(2つの配列間でインバリアント又は不変であるアミノ酸)の百分率を指定する。これらのポリペプチドは、配列番号1のポリペプチドに対して少なくとも1種のアミノ酸の欠失、付加又は置換を示し得る。
【００３６】
ポリペプチド間の同一率の測定の方法は、当業者に公知である。Vector NTi 9.1.0、アラインメントプログラムAlignX(Clustal W algorithm)(Invitrogen INFORMAX、http://www.invitrogen.com)を用いることができる。好ましくは、デフォルトパラメーターが用いられる。
【００３７】
組換え型タンパク質は、当業者に周知の方法、特に、WO2010/034718及びEP2013/071816に記載されているものにより細菌及び哺乳動物細胞によって産生され得る。
【００３８】
いくつかの実施形態において、タンパク質はまた、特に、n回(n=3〜10)反復されるGPO配列の配列における存在によって、傷害された血管部位で存在するコラーゲンに結合することが可能である。
【００３９】
いくつかの実施形態において、タンパク質は、ペグ化又はパス化(PASylated)(n回のアミノ酸プロリン、アラニン及びセリンの付加)されていてもよい。
【００４０】
本発明の製剤の配合物に入っているペプチドは、前述のものであり得る。このように、ペプチドは、
-  配列番号1のポリペプチド;
-  GXYトリプレットの反復から形成される配列を有するポリペプチドであって、Gは、グリシンを指定し、X及びYは、n回くり返される任意のアミノ酸を指定し、nは2以上である、ポリペプチド;
-  配列番号1の25〜184位までの配列を有するポリペプチド;又は
-  その全長に沿って、配列番号1のポリペプチド、若しく配列番号1の25〜184位までの配列を有するポリペプチドとの少なくとも70%の同一性を有するポリペプチド
の中から選ぶことができる。
【００４１】
ポリペプチドは、自然環境から単離される又は精製される。ポリペプチドは、様々な方法によって調製することができる。これらの方法は、特に、適切な宿主細胞による組換え型ポリペプチドの産生及びそれらのその後の精製、化学合成による産生、又は最後にこれらの異なる手法の組合せである。これらの様々な産生方法は、当業者によく知られている。好ましくは、ポリペプチドは、原核生物又は真核生物の組換え細胞によって産生される。このように、ポリペプチドは、細菌中で又は哺乳動物の細胞中で産生することができる。
【００４２】
本発明のいくつかの実施形態において、ポリペプチドは、グリコシル化される。配列番号1のポリペプチドは、102位及び141位で(GXYトリプレットの3位で)存在するリジンアミノ酸においてO-グリコシル化部位を特に有する。好ましい実施形態において、配列番号1のポリペプチドの93位のアスパラギン残留物は、グリコシル化される。
【００４３】
原線維の形態におけるタンパク質
本発明による注射用製剤の配合物に入っているタンパク質は、長さ10μm未満の原線維の形態で構造化することができる。10μmを超える長さを有する線維が含まれ、長さ数マイクロメーターに達し得る原線維の形態は、血流への注射に適合しない。
【００４４】
原線維の長さは、当業者に周知の方法、特に、原子間力顕微鏡(AFM)等の顕微鏡法によって測定することができる。
【００４５】
粒子
本発明の製剤の配合物に入っている粒子には、血小板の接着及び活性化又はそれらの凝集を誘導するタンパク質又はペプチドが含まれる或いはそれらからなる。タンパク質及びペプチドは、前述した通りである。
【００４６】
いくつかの実施形態において、粒子は、タンパク質又はペプチドの支持体への接着によって得ることができる。このように、本発明の製剤の配合物に入っている粒子には、血小板の接着、活性化又は凝集を含めたタンパク質又はペプチドを接着させる支持体が含まれる。
【００４７】
支持体は、有機又は無機の微小粒子であり得る。微小粒子の例には、アルブミン、脂質、金、チタン、鉄、銀等の金属、若しくはそれらの酸化物、グラフェン、シリカ、又はポリマーが含まれる。
【００４８】
タンパク質又はペプチドの支持体への接着は、粒子の表面に存在する官能基を介した、又は二官能性スペーサー若しくは二官能性ポリマーを介した共有結合によってなされ得る。二官能性スペーサー又は二官能性ポリマーによって、微小粒子の官能化が可能になる。一方の末端で、それは、微小粒子の表面にそれ自体を共有結合的にグラフトすることを可能にする官能基を示し、もう一方の末端で、それは、タンパク質又はペプチドにそれ自体を共有結合的にグラフトすることを可能にする官能基を示す。
【００４９】
好ましくは、二官能性ポリマーは、ヘテロ二官能性(heterobifunctional)ポリマーである。異なる2つの官能基の存在は、ポリマーの両末端の微小粒子への付着等の望まれないカップリングを制限することを可能にする。好ましくは、これら2つの末端間の相互作用によりポリマーの自己縮合を制限するように、ポリマーの終端の官能基間の親和性はまた、弱い。
【００５０】
二官能性ポリマーの様々なタイプは、微小粒子を官能化するために用いることができる。このように、二官能性ポリマーは、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリ(乳酸-グリコール酸共重合体)(PLGA)、ポリ(カプロラクトン)(PLCL)、ポリ(乳酸)(PLA)、グリコリドポリマー(PGA)、キトサン、デキストラン等の中から選ぶことができる。好ましくは、ポリマーは、二官能性ポリエチレングリコール、好ましくはヘテロ二官能性である。ポリマーの分子量は、一般に、500Daから10,000Daまで、好ましくは2000〜8000Daまで変化し、より好ましくはおよそ5000Daである。ポリマーの分子量は、タンパク質又はペプチドが二官能性ポリマーによって微小粒子に付着される場合、ポリマー鎖が、タンパク質又はペプチドの特性が微小粒子の存在によって影響されない十分な長さを有するように、通常選ばれる。
【００５１】
いくつかの実施形態において、粒子は、タンパク質又はペプチドの自己組織化により得ることができる。かかる実施形態において、粒子は、支持体を含まず、単にタンパク質又はペプチドからなる。自己組織化は、コアセルベーションによって又は凝集によって、例えば、金属若しくは塩の沈澱、濃縮、付加、又は温度の変化によって等、異なる方法によって行うことができる。
【００５２】
本発明の粒子は、動的光散乱(DLS)によって測定した通り、平均直径が、0.05μmから6μm、又は1μmから5μm、又は2μmから4μmの範囲となり得る。有利には、本発明の粒子の平均直径は、0.02μmから0.05μmの間、例えば、0.025μmから0.045μmの間となり得、又は例えば、0.035μmに等しい。
【００５３】
粒子は、配列が、
-  配列番号1のポリペプチド;
-  配列番号1の25〜184位までの配列を有するポリペプチド;又は
-  その全長に沿って、配列番号1のポリペプチド、若しくは配列番号1の25〜184位までの配列を有するポリペプチドとの少なくとも70%の同一性を有するポリペプチド
の中の少なくとも1種のポリペプチドを含む組換え型タンパク質を含む又はそれらからなる場合;
並びにDLSによって測定される通り、粒子が2μmを超える平均直径を示す場合、粒子は、血小板の接着、活性化及び凝集を誘導することが可能である。この効果は、平均直径が、2μmを下回る、例えば、0.02μmから1μmの間、0.05μmから0.5μmの間、又は0.1μmから0.3μmの間である分子でも見出される。
【００５４】
薬学的に許容されるビヒクル又は賦形剤
本発明による薬学的に許容されるビヒクル又は賦形剤、すなわち、個体への投与が、重大な有害作用を伴わないビヒクル又は賦形剤は、当業者によく知られている。
【００５５】
薬学的に許容される賦形剤又はビヒクルの例には、それだけには限らないが、溶媒、流動促進剤、懸濁剤、可溶化剤、安定剤、保存剤、緩衝液、酸化防止剤及びキレート化剤が含まれる。
【００５６】
本発明による注射用製剤は、当業者に周知の方法に従って調製することができる。
【００５７】
本発明による注射用製剤は、血小板活性化により及び/又は出血性症候群の場合において血小板の代用にすることにより失血を制御することが可能である。
【００５８】
したがって、本発明は、上記で定義した製剤の有効な量の、個体の血流への注射による投与を含む出血の治療のための方法に関する。
【００５９】
したがって、本発明に関連して、「注射」は、本発明の生成物の患者への全身投与(時には一般投与と呼ばれる)と同義であることが明らかである。
【００６０】
最後に、本発明は、出血を治療するための、医薬品の調製について上記で定義した製剤の使用に関する。
【実施例】
【００６１】
コラーゲンの産生及び粒子への自己組織化(DLSによる粒子のサイズの決定の方法)
CHO-S細胞(Invitrogen社)の3週間の前培養を、トランスフェクション前に行う。細胞を、CO2 5%で37℃のインキュベーターにおいて撹拌しながら(80rpm)125mLの振とうフラスコ(shake flask)中で4mM L-グルタミン(Lonza社)及び1×proHT(Lonza社)を補充したCHO細胞(Power-CHO、EXCEL 302、proCHO4、proCHO5等)に特異的な培地で維持する。トランスフェクションの2日前、細胞を、培地の完全な変化により5×105個の生細胞/mLで播種し、125mLの振とうフラスコ中でCHO細胞に特異的な補充された培地12.5mLで培養する。
【００６２】
トランスフェクション当日に、5×106個の生細胞を、遠心(1000gで5分)により分離し、次いで、4mM L-グルタミン(Lonza社)及び1×proHT(Lonza社)を補充したRPMI培地(Lonza社)5mLに溶解する。次いで、懸濁液4mLを、補充されたRPMI培地9mL(振とうフラスコ当たり1×106個の生細胞)を含有する、4つの25mLの振とうフラスコ(フラスコ当たり1mL)に分ける。次いで、CHO-S細胞に、前述の配列番号1のポリペプチドについての配列コーディングを含有するベクターをトランスフェクトする。細胞にpMAX-GFPベクターをトランスフェクトすることによってトランスフェクションの陽性対照とし、耐性の遺伝子を保有しないベクターを細胞にトランスフェクトすることにより及びいかなる処置をも行わないことにより2種の、トランスフェクションの陰性対照とする。トランスフェクションを、トランスフェクション剤Fecturine(PolyPlus Transfection社)又は任意の他の適切なトランスフェクション剤を用いて及び製品の最適化された工業用プロトコールに従って行う。Fecturineの場合、選ばれたトランスフェクション条件は、106個の生細胞について、Fecturine 12μLに対してDNA 6μg(DNA/トランスフェクション剤比=1/2)である。当業者は、一過性のトランスフェクション又は安定性のトランスフェクションのために最も適切なトランスフェクション剤を定義する方法を知っている。トランスフェクションのモードが一過性であろうと安定性であろうと、37℃及びCO2 5%での静置条件下でトランスフェクション複合体の存在下で細胞をインキュベートする。トランスフェクションの4時間後、CHO細胞に特異的な補充された培地に細胞を再懸濁し、撹拌される条件に戻す。トランスフェクションの24時間後、トランスフェクション効率の測定を、フローサイトメトリーによって、トランスフェクションの陽性及び陰性対照のアリコートに対して行う。
【００６３】
一過性のモードにおける配列番号1のポリペプチドの産生の場合、上澄みの最初の試料を、D+3(D0がトランスフェクションの日に対応する)に採取し、次いで、D+5で培養を停止させる。細胞及び細胞片の除去を可能にするため、細胞によって分泌される配列番号1のポリペプチドを含有する培養上澄みを3000gで10分間遠心分離後、回収し、次いで、-20℃で凍結する。
【００６４】
安定性モードにおける配列番号1のポリペプチドの産生の場合、細胞計数を、トランスフェクションの48時間後に行う。次いで、すべての細胞を5分間1000gで遠心分離し、次いで、CHO細胞+ジェネテシン(G418 Merck)700μg/mL(淘汰圧)に特異的な補充された培地中で3×105個の生細胞/mLで播種する。次いで、125mL振とうフラスコ中、最終体積12.5mL完全培地+G418 700μg/mLですべての細胞を播種することにより、細胞を週3回維持する。細胞濃度及び/又は細胞生存率の減少を、淘汰圧下で培養の第1週に観察する。細胞生存率は、淘汰圧下で2〜3週間後再び増加するが、これは、配列番号1のポリペプチドのための配列コーディングを含有するベクター又は空ベクターをトランスフェクトする細胞の場合のみである。非トランスフェクション細胞の生存率は、ゼロになるまで下降を続ける。培養が95%を超える生存率になった後、(10アンプル中)1アンプルにつき5×106個の生細胞の凍結保存を行う。細胞を、CHO細胞+10% DMSOに特異的な補充された培地中で凍結する。
【００６５】
配列番号1のポリペプチドを産生するために、配列番号1のポリペプチドを産生するように遺伝子改変されている細胞を解凍し、適切な培地で維持する。細胞を最終培地12.5mLに入れ、CO2 5%及び40%から80%の間の湿度に調節した、Kuhner LabTherm(登録商標)撹拌機で80rpmで125mL振とうフラスコに入れる。細胞を、1又は2週間3×105個の生細胞/mLで維持する。次いで、産生を行うために必要な含量であるように細胞を増幅する。増幅は、生存可能な濃度ですべての細胞を保つために、培地を交換する度により大容量で細胞を維持することからなる。
【００６６】
産生のために必要な細胞の量が得られた後、産生を開始することができる。細胞を3×105個の生細胞/mLで播種する。産生を、以下の様々な装置において行うことができる:Kuhner LabTherm(登録商標)撹拌機に入った振とうフラスコ、Cultibag RM 20/50(登録商標)(Sartorius社)、CellReady(登録商標)(Merck Millipore社)、BioBundle(登録商標)(Applikon社)及び同じ若しくはより大きなスケールの他の等価の装置。継代培養を、培養条件に従って5日以上、最大で10日間行う。産生パラメーター、細胞濃度及び細胞生存率を毎日モニターする。産生中、アミノ酸、ビタミン、ブドウ糖、又は産生若しくは細胞を利する任意の他の要素等の成分を加えることができる。この場合において、培養は、「流加」又は「半継続」であり、これは細胞を最大21日から培養することができる。化合物を培養中に加える場合、これは、「回分」又は「非連続」培養である。
【００６７】
配列番号1のポリペプチドの精製は、例えば、その配列中に存在するタグ-6(His)等の精製標識を用いて行うことができる。このように、配列番号1のポリペプチドを含有する培地中に存在する細胞及び細胞片を、遠心分離又は深層ろ過(depth filtration)[Merck Millipore POD Millistak+(登録商標)又は任意の他のタイプの装置サポート]又はカットオフ0.2μmの膜上におけるタンジェンシャルろ過(tangential filtration)により除去する。そうして得られた上澄みを、ニッケル、コバルト、亜鉛又は銅等の金属で照合した(collated)カラムのアフィニティークロマトグラフィーによって精製する。配列番号1のポリペプチドの付着が起きやすくなるように、0〜50mMイミダゾール、0〜500mM NaCl、5〜20mM(Na2HPO4・2H2O)及び5〜20mM(NaH2PO4・H2O)を含有する緩衝液を上澄みに加え、pH 7から8の間に調整する。本発明によるポリペプチドの進展を、2種の緩衝液の混合物[緩衝液1: 500mMイミダゾール、500mM NaCl、10mM(Na2HPO4・2H2O)及び10mM(NaH2PO4・H2O); 緩衝液2: 20mMイミダゾール、500mM NaCl、10mM(Na2HPO4・2H2O)及び10mM(NaH2PO4・H2O)]を用いた勾配、又は50〜500mMイミダゾール、0〜500mM NaCl、5〜10mM(Na2HPO4・2H2O)及び5〜10mM(NaH2PO4・H2O)を含有する緩衝液による均一濃度のいずれかによって行う。配列番号1のポリペプチドの純度を改善するために他の精製工程を加えてもよい。これらは、ろ過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、疎水的相互作用クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー又は任意の他のタイプのクロマトグラフィーであり得る。
【００６８】
目的とする溶離画分を添加して未変性条件下の電気泳動ゲルで移動させ、クマシーブルーで染色した後、そのプロファイルに応じて回収し、水若しくはリン酸緩衝液、又は本発明によるポリペプチドの貯蔵に適切な任意の他の緩衝液で透析する。ポリペプチドの濃度を、製造業者の指示に従ってSircol(登録商標)キット(TebuBio社)により、又はブラッドフォード試験、若しくは配列番号1のポリペプチドの定量に適切な任意の他の試験により決定する。
【００６９】
限外ろ過により、配列番号1のポリペプチドをその最初の体積に対し複数倍(50倍)に濃縮して、配列番号1のポリペプチドの自己組織化及び粒子の形成を誘導するのに十分なタンパク質濃度にすることができる。カットオフが10,000Da(Vivaspin 4、Sartorius)である限外ろ過カラムで、4℃及び4000rpmで行われる遠心分離のくり返しによってこのように、ポリペプチド配列番号1を含有するタンパク質抽出物を濃縮する。溶液が濃縮された後、そうして形成された粒子のサイズの測定を、Malvern Zetasizerナノ機器を用いた動的光散乱(DLS)技法により行う。DLS測定は、液体中の懸濁液の粒子のサイズを測定することを可能にする非破壊スペクトル分析技法であり、配列番号1のポリペプチド等のタンパク質の自己組織化又は凝集の測定に特に適切である。
【００７０】
図1は、配列番号1のポリペプチドのタンパク質抽出物を50倍に濃縮した後の、DLSによる粒子のサイズの測定の特徴的な結果を示す。溶液中に存在する粒子の様々なサイズに対応して一連のピークを観察する。3つのピークが、際立つ。これらは、粒径1.25μm、3μm及び5.5μmに対応する。配列番号1のポリペプチドの生物活性を、こうして生成された粒子のサイズと関連づけるために、塩酸を、最終濃度20mMまで溶液に加える。すると、それまで測定されていた3つのピークは消失し、約500nm及び1.8μmの2つのピークが現れる。画分は、視覚的に、粒状の外観から透明の外観に移行し、「澄む」ことが観察される。
【００７１】
粒径の関数としてのウィルブランド因子結合活性の測定
粒子の形態の配列番号1のポリペプチドに基づいた製剤は、ウィルブランド因子を結合する能力を有する。ELISA技法による配列番号1のポリペプチドのウィルブランド因子結合活性の測定を、96-ウェルプレート(Nunc Maxisorp)において行う。これには、リン酸緩衝液又は任意の他の適切な緩衝液中に2μg/mLのポリペプチドを含有する100μLの体積の溶液を各ウェルに加え、22℃で18〜20時間インキュベートする。PBS-0.05% Tween 200μLで3回洗浄後、BSAのリン酸緩衝液1%溶液(Euromedex社、0.45μmでろ過した)200μLを、各ウェルに加え、室温(22℃)で2時間インキュベートする。PBS-0.05% Tween 200μLで3回洗浄後、100μLの様々な濃度(IU/dLで表される)の精製されたウィルブランド因子(Wilfactin 100IU/mL、LFB)及び/又はリン酸緩衝液若しくは任意の他の適切な緩衝液に希釈された患者の血漿を、室温(22℃)で1時間30分インキュベートする。更に3回洗浄した後、リン酸緩衝液又は任意の他の適切な緩衝液で1:8000に希釈された西洋ワサビペルオキシダーゼ(ウサギ抗ヒトVWF/HRP、DAKO)結合1次抗-vWF抗体を含有する溶液100μLを、22℃で1時間インキュベートし;次いで、4回の洗浄を前述した通り行う。次いで、テトラメチルベンジジン溶液(TMB、Sigma)125μLを、ペルオキシダーゼの基質として加え;プレートを暗所で最大10〜45分インキュベートする。反応を、2N HCL(Sigma)125μLを加えることによりクエンチする。直ぐに、450nmでの吸収度を、分光光度計(Wallacvictor 3)で測定する。精製されたvWF又は血漿をリン酸緩衝液若しくは任意の他の適切な緩衝液で置き換えることにより、ブランクを行う。
【００７２】
図2は、最終濃度2μg/mLで用いた異なるサイズの粒子の形態の配列番号1のポリペプチドへの、及び10μg/mLで用いたI型コラーゲン(SIRCOLコラーゲン、陽性対照)への、最終濃度2IU/dLで用いた精製されたウィルブランド因子(Willfactin、LFB)の結合について、ELISAによって得られた結果を示す。
【００７３】
これらの結果から、2μmより大きい粒子の大部分で構成される配列番号1のポリペプチドが、I型コラーゲンと同等の方式で、ウィルブランド因子に結合することができることが示される。配列番号1のポリペプチドが、2μmよりも小さい粒子の形態である場合、ウィルブランド因子結合活性は、大いに増加する。この後者の結果から、配列番号1のポリペプチドをより大型の粒子に自己組織化することにより、ウィルブランド因子認識部位の数が減少することが示唆される。ウィルブランド因子認識部位は、より大型の粒子ではその内側に恐らく「隠されている」。この結果から、サイズ1μmから5μmの間の粒子中で構造化される配列番号1のポリペプチドは、実際、ウィルブランド因子を結合することができることが示される。
【００７４】
粒子のサイズの関数としてコラーゲンによって誘導されるP-セレクチンの表面の発現の測定
粒子の形態の配列番号1のポリペプチドに基づいた製剤は、血小板の活性化を誘導する能力を有する。この活性化は、フローサイトメトリーによるP-セレクチンの血小板表面の発現を測定することにより全血において決定することができる。休止血小板において、P-セレクチンは、αグレイン(alpha grain)と呼ばれる顆粒中に貯蔵されている。血小板が様々なアゴニストによって活性化される場合、P-セレクチンは、これらの顆粒から放出され、血小板表面で検出可能である。
【００７５】
血液サンプルをクエン酸塩管(BD Vacutainer、BD Biosciences社)に採取し、次いで、使用する前に1時間安定させる。ガラス管において、配列番号1のポリペプチドを50μg/mLの濃度(最終濃度25μg/mL)で含有するリン酸緩衝液50μLに、血液50μLを加え;混合物を、室温で10分間インキュベートする。
【００７６】
次いで、反応を、リン酸緩衝液500μLを各管に加えることにより安定させる。次いで、血球計算用の管において、先に論じた反応混合物20μLを、FITC(FITCマウス抗ヒトCD62P、BD Biosciences社)結合1次抗-CD62P抗体、又はFITC(FITCマウスIgG1κアイソタイプ対照、BD Biosciences社)結合アイソタイプ対照抗体のいずれかを含有する溶液20μLに加え、暗所で室温で10分間インキュベートする。次いで、リン酸緩衝液2mLを各管に加える。直ぐに、平均蛍光強度(MFI)を、フローサイトメーター(LSRII、BD Biosciences社)を用いて520nmで測定する。陰性対照は、配列番号1のポリペプチドをリン酸緩衝液で置き換えることにより行う。2つの陽性対照は、TRAPトロンビン由来血小板活性化因子(ヒト臨床診断キット:PLT Gp/Receptors Kit、Biocytex社)又はイオノフォア活性化因子A23187[Calbiochem、Merck社;ストレプトマイセス・カルトレウセンシス(Streptomyces chartreusensis)]で配列番号1のポリペプチドを置き換えることにより行う。50μg/mLで用いられるI型コラーゲン(Horm)でポリペプチドを置き換えることにより参照とする。
【００７７】
図3Aは、配列番号1のポリペプチド及びI型コラーゲン(Horm)についてフローサイトメトリーにより得られた、血小板の表面におけるP-セレクチンの発現の典型的なプロファイルを表したものに対応する。図3B中の表は、様々なアゴニストについて得られた平均蛍光強度を示す。TRAP及びカルシウムイオノフォアを、陽性活性化対照として用いる。
【００７８】
2μmを超える粒径を有する配列番号1のポリペプチドは、P-セレクチンの表面の発現を特徴とする血小板活性化を誘導することが可能である。この活性化は、同じ濃度で用いた原線維のI型コラーゲン(1μmより大きい線維)によって誘導されるものに相当する。2μmより小さい粒径を有する配列番号1のポリペプチド(配列番号1+20mM HCl)はまた、P-セレクチンの発現、したがって、血小板の活性化を誘導することが可能であるが、より程度が小さい(47.3対70.4 MFI)。
【００７９】
粒子のサイズの関数としてコラーゲンによって誘導される血小板凝集の測定
粒子の形態の配列番号1のポリペプチドに基づいた製剤は、参照技法(Born、1962年)に従って、血栓-血小板凝集計(Soderel社、Florange、France)で検出されたヒト血小板においてプロアグレゲント活性を有する。多血小板血漿(PRP)を、アゴニスト(PRP 290μL中の10μL)と接触させて入れ、培地が澄んでいく(凝集体の形成と関連する)のを、実時間でモニターする(凝集曲線)。血小板凝集の非存在下で、シグナルは、平らのままである(培地は混濁したままである)。測定の終了時にその管を検査することにより凝集体の存在又は非存在を検証することが可能である。血小板凝集試験反応の評価を、37℃で撹拌を続けながら(1000rpm)行う。器具を以下のように標準化する:多血小板血漿による0%凝集(ゆっくりとした遠心分離によって得られ、濃度が300×109/Lに調整された製剤)及び乏血小板血漿(platelet-poor plasma)による100%凝集(急速な遠心分離によって得られた製剤)。血小板製剤の品質は、抗血小板治療の開発のために用いられる参照アゴニスト(5μM ADP及びコラーゲン1μg/mL)への応答を検証することにより評価される。40%を超える不可逆的な凝集を誘導することが可能である場合に対して、タンパク質は、プロアグレゲントと考えられる。
【００８０】
図4は、粒子の形態の配列番号1のポリペプチドで得られた凝集結果を示す。経路1は、2μmを超える粒径を有する配列番号1のポリペプチドの製剤が、1分未満で及び原線維の形態の参照コラーゲンであるHorm I型コラーゲン(経路4)と同等の方式で、血小板凝集を誘導することが可能であるということを示す。これに対して、粒径2μm未満を有する配列番号1のポリペプチドは、10分後においてすら血小板凝集(経路2)を誘導することができない。活性のこの不在は、溶液中の20mM HClの存在と関連しない。経路3から、20mM HClの存在下で6分後に加えたI型コラーゲンによる刺激に対する正常な血小板凝集が示されるからである。
【００８１】
この結果は、配列番号1のポリペプチドが、プロアグレゲント活性を得るために2μmより大きい粒子の形態で構造化されなければならないということを示している。
【００８２】
結論として、これらの異なる例は、配列番号1のポリペプチドが、1μmから6μmの間のサイズの粒子の形態で自己構造化することが可能であるということ、これらの粒子が、ウィルブランド因子に結合して血小板活性化(P-セレクチンの表面発現)を誘導する能力を有し、粒径が2μmを超える場合のみ、血小板凝集を引き起こすということを示している。
【００８３】
様々な顕微鏡技法による原線維のI型コラーゲン(Horm)と比較した粒子の形態の配列番号1のポリペプチドの構造の観察。
分子の高分子構造を異なる解像度及びスケールで可視化することができる様々な顕微鏡技法がある。図5は、コラーゲン型タンパク質の構造の観察を可能にする3つの顕微鏡技法(透過型顕微鏡、走査型電子顕微鏡及び原子間力顕微鏡)を用いて得られた画像を示す。
【００８４】
透過型顕微鏡による観察、I型コラーゲン又は配列番号1のポリペプチドは、対物60×のZEISS逆相コントラスト顕微鏡を用いて観察する前に37℃で2時間にわたってスライドガラスに沈着させる。画像は、ZEISS AxioCam ICc 1カメラを用いて得る。
【００８５】
走査型電子顕微鏡による観察の場合、沈着のために選ばれる表面は、単結晶ケイ素(100)である。半導体でもあり原子的に平らでもあるため、これは、この方法によるコラーゲンの観察のための当然の選択である。試料調製を、ケイ素表面で6時間200μg.mL-1まで濃縮した原線維のI型コラーゲン又は配列番号1のポリペプチドの液滴10μLを入れることにより行う。次いで、表面を蒸留水ですすぎ、窒素下で乾燥する。乾燥した表面を、Edwards S150スパッターコーター(0.3mPaアルゴン雰囲気で25mA電流2分間)における金スパッタリングにより金属化する。試料表面を、放出電位20keV及び放出電流60μAを有するJEOL 6500F走査電子顕微鏡で観察する。
【００８６】
原子間力顕微鏡(AFM)による観察の場合、I型コラーゲン及び配列番号1のポリペプチドが観察される表面は、多結晶の金表面[マイカ、PHASIS、ref.20020022におけるエピタキシーにより得られるAu(111)テラス]である。沈着は、ずり速度300s-1で30分にわたって底流25μg.mL-1の濃度でex situで行った。この流通官能化(flow functionalization)を可能にするために、PDMSミクロ流体(microfluid) セルを、金表面に加圧し、タンパク質溶液を、ISMATEC IPC-4蠕動ポンプを通して表面に運ぶ。試料を、FESPAポイント(Bruker)を取り付けた、ばね定数kがN.m-1、共振周波数f=50〜100kHz及びレバーの長さL=200〜250μmのNanoscope IV Multimode原子間力顕微鏡(Digital Instrument、Veeco Inc.社、Santa Barbara、CA)で観察した。これらの生物試料に対して、低ノイズ取得が可能なダイナミックタッピングモードであるBruker PeakForce QNMモードで取得を行う。走査周波数を1Hzに固定する。得られる画像は、フラット化及び均一化ファンクション(flatten and equalize functions)を適用することによって、高解像度が得られるようにWSxMプログラムを用いて処理されたものである。
【００８７】
図5に示した観察は、DLSによって得られた結果を確認し、I型コラーゲンが原線維の構造であるのに比べ、配列番号1のポリペプチドが粒子の形態の構造であることを示している。観察された粒子のサイズは、これらの観察に用いられた実験条件下では、数10ナノメートル程度である。
【００８８】
粒子の形態の配列番号1のポリペプチド及び原線維の形態のI型コラーゲン(Horm)のマウスへの注射後におけるPセレクチンの血小板表面の発現の測定。
粒子の形態の配列番号1のポリペプチド又は原線維のI型コラーゲンに基づいた製剤は、フローサイトメトリーによって測定されたP-セレクチンの血小板表面の発現により示される通り、全血の血小板の活性化を誘導するex vivoにおける能力を有する。これらの製剤が、血流に注射した後この同じ活性化を実際、誘導することができることが評価するために、血液サンプルを、I型コラーゲン400μg/kg若しくは配列番号1のポリペプチド2mg/kgの投与の15分後又は塞栓症(窒息)の第1の徴候の際に、マウスからクエン酸塩管(BD Vacutainer、BD Biosciences社)に採取する。血液50μLをガラス管に入れ、次いで、リン酸緩衝液250μLで安定させる。次いで、血球計算用の管において、先に論じた反応混合物20μLを、FITC(FITCマウス抗ヒトCD62P、BD Biosciences社)結合1次抗-CD62P抗体、又はFITC(FITCマウスIgG1 κアイソタイプ対照、BD Biosciences社)結合アイソタイプ対照抗体のいずれかを含有する溶液20μLに加え、暗所で室温において10分間インキュベートする。次いで、リン酸緩衝液2mLを各管に加える。直ぐに、520nmにおける平均蛍光強度(MFI)を、フローサイトメーター(LSRII、BD Biosciences社)を用いて測定する。
【００８９】
図6は、エピネフリンの存在下又は非存在下における2つの粒径の場合、原線維のI型コラーゲン及び配列番号1のポリペプチドの注射後にマウスから採取された血液から測定されたPセレクチンの血小板発現を示す。配列番号1のポリペプチドが、いかなる粒径でも、マウスへのその投与の15分後又は塞栓症(窒息)の第1の徴候の時点において、血小板の活性化を実際誘導することを認めることができる。この活性化は、エピネフリンの同時投与によって変化せず、これは、エピネフリンによってその活性化が強く増加する原線維のI型コラーゲンと異なる。この結果によって、ex vivoにおいて示される通り、血流に投与された後、配列番号1のポリペプチドが、血小板の活性化を誘導することが実際可能であるということが確認される。
【００９０】
マウスにおいて誘導される肺塞栓症のモデルにおける配列番号1のポリペプチドの血流への注射に伴う血栓リスクの測定
本発明は、血小板の活性化に依存した機序による、出血の治療のための、コラーゲンに由来するタンパク質又はペプチドの使用を記載している。出血の状況とは無関係に、粒子の形態の、コラーゲンに由来するこれらのタンパク質又はペプチドの注射によって誘導されるin vivo血小板活性化が、血栓症のリスクを伴うか否か決定するために、コラーゲン及びエピネフリンの投与によりマウスにおいて誘導される肺塞栓症のモデルが用いた。本目的は、本発明のコラーゲンに由来するタンパク質又はペプチドによって誘導される血小板活性化が、注射後に血栓症を誘導することによりそれ自体有害となることはないと示すことである。この投与の潜在的血栓効果を特徴付けるために、動物が肺塞栓症により死亡するのにかかった時間を測定することからなる、本モデルにおいて古典的に用いられる観察基準に加えて、同位体画像(SPECT)によって可視化することができる放射性トレーサーを観察基準として用いた。静脈内注射後、テクネチウム-99mで標識されたヒトアルブミンの巨大凝集体は、血流中で循環し、肺又はいくつかの静脈のシンチグラフを撮ることを可能にする。血栓病巣が存在する場合、このトレーサーの正常な肺の分布は変更され、同位体画像は、肺においてトレーサーの減少又は非存在を示すことになる。
【００９１】
体重25〜30gの雄のSWISSマウスを、この肺塞栓症モデルのために用いる。マウスを、実験期間を通してイソフルラン麻酔下で保持する。初めに、2つの頸静脈を曝露した後、最終体積150μL中の配列番号1のポリペプチド(1mg/kg)/エピネフリン(60μg/kg)混合物又は原線維のI型コラーゲン(400μg/kg)/エピネフリン(60μg/kg)混合物を、頸静脈の1つに注射する。肺塞栓症が起こる場合、マウスは、窒息し始め、注射の10分以内に死亡する。15分より長いその(my)生存は、肺塞栓症でないことが考えられる。SPECT取得を行うために、テクネチウム-99m(最終体積100μL中マウス当たり30μCi)で標識されたヒトアルブミンの巨大凝集体を、肺塞栓症を伴うマウスについて心停止直後に又は生存するマウスについて15分後に他方の頸静脈に注射する。次いで、走査15分同位体画像取得を行う。
【００９２】
図7A中の表は、肺塞栓症が観察された動物の百分率及びこの塞栓症の出現についての平均時間に関して、エピネフリンの存在下で原線維のI型コラーゲン及び粒子の形態の配列番号1のポリペプチドのマウスへの投与後得られた結果を示す。結果からは、100%の動物が、原線維のI型コラーゲンの注射後平均して5分50秒後に死亡することが示される。これに対して、2.5倍高い濃度(1mg/kg対400μg/kg)で用いた場合でも、どの動物も、配列番号1のポリペプチドの注射後に肺塞栓症を発症しなかった。図7Bは、原線維のI型コラーゲンで注射したマウスにおいて塊状の肺塞栓症の存在を確認する放射能標識したアルブミン巨大凝集体の注射後に得られた画像、及び配列番号1のポリペプチドで注射したマウスにおけるトレーサーの正常な肺の分布を示し、誘導された血栓症の非存在を示す。
【００９３】
この結果から、血流への注射された、同じ血小板活性化活性を有する2種のコラーゲン型タンパク質のうち、粒子の形態のもののみ、血栓症を誘導するリスクを伴わず用いることができるということが確認される。
【００９４】
マウスの尾からの誘導された失血のモデルにおける配列番号1のポリペプチドの注射の効果の測定。
上記で示した結果から、粒子の形態の配列番号1のポリペプチドは、マウスの血流に投与された後血小板活性化を誘導することが実際可能であるということ、及び原線維のI型コラーゲンと違い、この活性化は、血栓形成効果がないことが確認される。本発明のコラーゲンに由来するタンパク質又はペプチドの血流への注射によって、血小板活性化に依存した機序によって失血の停止を誘導することが実際可能になることを評価するために、マウスにおける尾からの誘導された失血のモデルにおいて、配列番号1のポリペプチドの投与による、血液の喪失に対する効果を評価した。
【００９５】
体重25〜30gの雄のSWISSマウスを、尾からの失血の本モデルのために用いる。マウスを、実験期間を通してイソフルラン麻酔下で保持する。初めに2つの頸静脈の1つを曝露した後、リン酸緩衝液に希釈した異なる分子を注射する。3本の動脈及びこの頸静脈を切断するように、尾を末端から1.5cm切断する。切断を、リン酸緩衝液(ビヒクル対照)又は配列番号1のポリペプチド(1.6mg/kg)の注射の10分後及びヘパリン(抗凝血性、陽性失血対照、60IU/kg)の注射の20分後に行う。切断後、赤血球を損傷せずに16分にわたって血液を回収するために、尾を37℃で生理食塩水50mLに入れる。これらの管を放置して、室温で1時間にわたって沈降させた後、250gで15分間遠心分離する。上澄みを捨て、赤血球のペレットを、指定の細胞溶解緩衝液3mL(NH4Cl 8.3g/L、KHCO3 1g/L及びEDTA 37mg/L)に溶解する。ライセート200μLの550nmの光学密度を、プレートリーダーで読み込む。
【００９６】
検量線を、血液喪失の体積を決定するために作成している。この場合、体重25〜30gの雄のSWISSマウスは、腹大動脈から出血させた。血液をクエン酸塩管に収集して、凝固を回避した。諸血液体積からなる範囲を、生理食塩水50mLを含有する管において作製した。次いで、血液の処置を前述した通り行った(図8Aを参照のこと)。
【００９７】
図8Bに示される結果から、粒子の形態の配列番号1のポリペプチドは、天然の形態又は濃縮された形態のいずれでも、本モデルにおいて失血の停止を誘導することが実際可能であるということが確認される。配列番号1のポリペプチドの存在下の失血の停止前の平均の喪失体積は、未処置マウスの場合の11.6±2.4μL(未濃縮)及び12.6±6.1μL(10倍に濃縮)対42±18.4μLである。したがって、血液喪失の減少は、対照マウスと比較して約70%である。これに対して、ヘパリンの存在下の血液喪失は、大いに増加し、血液喪失の平均体積が257.9±87.5μLに達する。したがって、血液喪失の増加は、対照マウスと比較して514%であり、これにより本モデルが評価される。
(参考文献)
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【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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