(57)【要約】【課題】  本発明の目的は、本発明の目的は、腫瘍細胞等に発現するＣＤ２６を標的とするＣＡＲとして、ＣＡＲ−Ｔ細胞をより効率的に増殖させ、新たな治療に有益なＣＡＲ等を提供することにある。【解決手段】  ＣＤ２６特異的キメラ抗原受容体（以下ＣＡＲと記す）であって、（ａ）モノクローナル抗ＣＤ２６抗体由来のＶＨおよびＶＬを含む細胞外リガンド結合ドメイン、（ｂ）ヒンジ、（ｃ）膜貫通ドメイン、ならびに（ｄ）ＣＤ３ζシグナリングドメインと、４−１ＢＢおよびＣＤ２８由来の共刺激ドメインとを含む細胞質ドメインを含む、前記ＣＡＲによって、上記課題が解決された。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤ２６特異的キメラ抗原受容体（以下ＣＡＲと記す）であって、
（ａ）モノクローナル抗ＣＤ２６抗体由来のＶＨおよびＶＬを含む細胞外リガンド結合ドメイン、
（ｂ）ヒンジ、
（ｃ）膜貫通ドメイン、ならびに
（ｄ）ＣＤ３ζシグナリングドメインと、４−１ＢＢおよびＣＤ２８由来の共刺激ドメインとを含む細胞質ドメイン
を含む、前記ＣＡＲ。
【請求項２】
細胞外リガンド結合ドメインが、ｓｃＦｖを含む、請求項１に記載のＣＡＲ。
【請求項３】
ヒンジが、ＦｃＲＩＩＩαヒンジ、ＣＤ８αヒンジ、およびＩｇＧ１ヒンジより選択される、請求項１または２に記載のＣＡＲ。
【請求項４】
ヒンジが、ＣＤ８αヒンジを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
【請求項５】
膜貫通ドメインが、ＣＤ２８を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
【請求項６】
ヒンジが、ＣＤ８αヒンジであり、および膜貫通ドメインが、ＣＤ２８である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
【請求項７】
細胞外リガンド結合ドメインが、配列番号（）のアミノ酸番号（２０〜２６０）で示されるアミノ酸配列からなるか、もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、もしくは付加されることにより、前記それぞれの配列に対して９５％の相当性を有するアミノ酸配列からなる、請求項１〜６のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
【請求項８】
ＶＨが、配列番号１のアミノ酸番号１４５〜２６０より選択されるアミノ酸配列からなり、かつＶＬが、配列番号２１〜１２９より選択されるアミノ酸配列からなるか、もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、もしくは付加されることにより、前記それぞれの配列に対して９５％の相当性を有するアミノ酸配列からなる、請求項１〜７のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
【請求項９】
膜貫通ドメインが配列番号１のアミノ酸番号３１４〜３８４のアミノ酸配列で示されるアミノ酸配列からなるか、もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、もしくは付加されることにより、前記それぞれの配列に対して９５％の相当性を有するアミノ酸配列からなる、請求項１〜８のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
【請求項１０】
ＣＤ３ζシグナリングドメインが、配列番号１のアミノ酸番号４２７〜５３９で示されるアミノ酸配列からなるか、もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、もしくは付加されることにより、前記それぞれの配列に対して９５％の相当性を有するアミノ酸配列からなる、請求項１〜９のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
【請求項１１】
４−１ＢＢ由来の共刺激ドメインが配列番号１のアミノ酸番号３８５〜４２６で示されるアミノ酸配列からなるか、もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換，もしくは付加されることにより、前記それぞれの配列に対して９５％の相当性を有するアミノ酸配列からなる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
【請求項１２】
ＣＤ２８由来の共刺激ドメインが配列番号１のアミノ酸番号３４４〜３８４で示されるアミノ酸配列からなるか、もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換，もしくは付加されることにより、前記それぞれの配列に対して９５％の相当性を有するアミノ酸配列からなる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
【請求項１３】
シグナルペプチドをさらに含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
【請求項１４】
シグナルペプチドが配列番号１のアミノ酸番号１〜２０で示されるアミノ酸配列からなるか、もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、もしくは付加されることにより、前記それぞれの配列に対して９５％の相当性を有するアミノ酸配列からなる、請求項１３に記載のＣＡＲ。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載のＣＡＲをコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項１６】
請求項１５記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
【請求項１７】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載のＣＡＲを細胞表面膜に発現している、免疫細胞。
【請求項１８】
炎症性Ｔリンパ球、細胞傷害性Ｔリンパ球、制御性Ｔリンパ球、またはヘルパーＴリンパ球に由来する、請求項１７に記載の遺伝子修飾された免疫細胞。
【請求項１９】
ＴＣＲの発現が抑制されている、請求項１８に記載の遺伝子修飾遺伝子修飾された免疫細胞。
【請求項２０】
ＣＤ２６の発現が抑制されている、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の遺伝子修飾された免疫細胞。
【請求項２１】
少なくとも１種の免疫抑制剤または化学療法剤に対して耐性になるよう修飾されている、請求項１７〜２０のいずれか一項に記載の遺伝子修飾された免疫細胞。
【請求項２２】
疾患の治療において使用するための、請求項１７〜２１のいずれか一項に記載の遺伝子修飾された免疫細胞を含む医薬組成物。
【請求項２３】
患者がヒトである、請求項２２に記載の治療において使用するための遺伝子修飾された免疫細胞を含む医薬組成物。
【請求項２４】
疾患が、ＣＤ２６発現細胞を特徴とする前癌性または癌疾患である、請求項２２または２３に記載の治療において使用するための遺伝子修飾された免疫細胞を含む医薬組成物。
【請求項２５】
疾患がＣＤ２６発現細胞の過剰量を特徴とする疾患である、請求項２２〜２４のいずれか一項の記載の治療において使用するための遺伝子修飾された免疫細胞を含む医薬組成物。
【請求項２６】
疾患が、腎臓癌、前立腺癌、または肺癌である、請求項２２〜２５のいずれか一項に記載の治療において使用するための遺伝子修飾された免疫細胞を含む医薬組成物。
【請求項２７】
疾患が、造血器腫瘍である、請求項２２〜２６のいずれか一項に記載の治療において使用するための遺伝子修飾された免疫細胞を含む医薬組成物。
【請求項２８】
造血器腫瘍が、白血病である、請求項２７に記載の治療において使用するための遺伝子修飾された免疫細胞を含む医薬組成物。
【請求項２９】
白血病が、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、および骨髄異形成症候群からなる群より選択される、請求項２８記載の治療において使用するための遺伝子修飾された免疫細胞を含む医薬組成物。
【請求項３０】
白血病が、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である、請求項２９に記載の治療において使用するための遺伝子修飾された免疫細胞を含む医薬組成物。
【請求項３１】
造血器腫瘍が、悪性リンパ増殖性障害である、請求項３１記載の治療において使用するための遺伝子修飾された免疫細胞を含む医薬組成物。
【請求項３２】
悪性リンパ増殖性障害がリンパ腫である、請求項３２記載の治療において使用するための遺伝子修飾された免疫細胞を含む医薬組成物。
【請求項３３】
リンパ腫が、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、ならびに濾胞性リンパ腫（小細胞型および大細胞型）からなる群より選択される、請求項３３記載の治療において使用するための遺伝子修飾された免疫細胞を含む医薬組成物。
【請求項３４】
（ａ）免疫細胞を準備する工程、
（ｂ）請求項１〜１４のいずれか一項に記載の少なくとも１種のＣＡＲを該細胞の表面に発現させる工程、
を含む、遺伝子修飾された免疫細胞を製造する方法。
【請求項３５】
（ｃ）ＣＡＲをｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖させる工程をさらに含む、請求項３４に記載の遺伝子修飾された免疫細胞を製造する方法。
【請求項３６】
前記免疫細胞がドナーから提供される、請求項３４または３５に記載の製造方法。
【請求項３７】
前記免疫細胞が患者自身から提供される、請求項３４〜３６のいずれか一項に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＣＤ２６特異的キメラ抗原受容体（以下ＣＡＲと記す）、前記ＣＡＲをコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、前記ＣＡＲを細胞表面膜に発現している、遺伝子修飾された免疫細胞で遺伝子修飾した免疫細胞、疾患の治療等に使用するため前記遺伝子修飾された免疫細胞等に関する。
【背景技術】
【０００２】
１９９３年にイスラエルのグループによって、遺伝子操作を加えた人工Ｔ細胞受容体を患者Ｔ細胞に遺伝子導入し、そのＴ細胞を体外で増幅した後に患者に輸注するという遺伝子、細胞治療法が考案された。この人工Ｔ細胞受容体はキメラ抗原受容体（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ：以下ＣＡＲと記す）と命名された。ＣＡＲは、腫瘍抗原に特異的なモノクローナル抗体可変領域の軽鎖（ＶＬ）と重鎖（ＶＨ）を直列に結合させた単鎖抗体（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔ：ｓｃＦｖ）をＮ末端側に、Ｔ細胞受容体（Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＴＣＲ）のＣＤ３ζ鎖をＣ末端側に持つキメラタンパクの総称である。ＣＡＲを発現させたＴ細胞はｓｃＦｖ領域で腫瘍抗原を認識した後、その認識シグナルを細胞内のＣＤ３ζドメインを通じてＴ細胞内に伝達することで活性化する。さらに、Ｔ細胞の活性化を増強するために、ｓｃＦｖとＣＤ３ζ鎖の間に共刺激分子（ＣＤ２８または４−１ＢＢの一方、あるいはその両者）を組み込まれたＣＡＲは第２世代、第３世代ＣＡＲとよばれ、ＣＡＲ−Ｔ細胞の細胞障害活性と増殖能が高いことが示されている（非特許文献１：Ｍａｓｕ  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｏｏｄ  ２０１３）。
【０００３】
現在、世界中でＣＡＲ−Ｔ細胞を用いた治療法の開発が進められているが、どのような腫瘍抗原を標的とするのかは重要なポイントのひとつである。例えば、Ｂリンパ球に由来する腫瘍が発現するＣＤ１９分子は、このＣＡＲ−Ｔ療法の良い標的であり、Ｂ細胞性急性リンパ芽球性白血病やびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫などに対するＣＤ１９  ＣＡＲ−Ｔ療法は実臨床で高い効果を示している（非特許文献２：Ｍａｕｄｅ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ２０１８；３７８：４３９−４４８ＤＯＩ：１０．１０５６／ＮＥＪＭｏａ１７０９８６６）（非特許文献３：Ｓｃｈｕｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ２０１９；３８０：４５−５６ＤＯＩ：１０．１０５６／ＮＥＪＭｏａ１８０４９８０）。ＣＤ３３を標的とする第２世代のＣＡＲについては、公開されている（特許文献１：ＷＯ２０１５／０５７３３１）。また、より効果の期待できる、第３世代については、ＣＤ１９を標的とするＣＡＲが構築され、その臨床効果について、報告がされている（非特許文献４：Ｃａｒｌｏｓ  Ａ．  Ｒａｍｏｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｆｃｕｌａｒ−ｔｈｅｒａｐｙ，  ｖｏｌ．２６，  Ｎｏ．  １２，  ｐ．  ２７２７−２７３７，  ２０１８）。
【０００４】
一方、悪性中皮腫や腎癌、大腸癌、肝癌、肺癌、前立腺癌、消化管間質腫瘍、甲状腺癌、更にＴリンパ球に由来する造血器腫瘍などの腫瘍細胞は高率にＣＤ２６を発現することから、これらの治療ではＣＤ２６が良い標的となるものと考えられ、本発明者らは、ヒト化抗ＣＤ２６抗体であるＹＳ１１０を開発し（特許文献２：ＷＯ２００７０１４１６９）、悪性中皮腫や腎癌を対象とする第Ｉ相試験で優れた効果を報告した（Ａｎｇｅｖｉｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ２０１７）。また、ＹＳ１１０と他の抗がん剤とを組み合わせた癌治療用組成物についても、開示している（特許文献３：ＷＯ２０１７／０４３６１３）。このＹＳ１１０のＶＬとＶＨをｓｃＦｖとしてＣＡＲに用いるＣＤ２６  ＣＡＲ−Ｔ療法はＣＤ２６を発現する腫瘍に有効であろうと期待される。しかしながら、標的細胞が異なると、ＣＡＲ−Ｔ細胞の挙動も異なることが知られており、この試みは不成功に終わっている（Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｃｏｌ  ．２０１９，  Ａｕｇ；４１（４）：４９０−４９６）。Ｚｈｏｕらは、４−１ＢＢ  を共刺激分子とする第２世代ＣＤ２６  ＣＡＲを構築し（ＹＳ１１０−４−１ＢＢ）、これをＴ細胞に遺伝子導入したが、ＣＤ２６  ＣＡＲ−Ｔ細胞に特にｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて増殖が得られなかったと報告しており、この原因として、Ｚｈｏｕらは、Ｔ細胞がもともと発現しているＣＤ２６と強制発現されたＣＤ２６  ＣＡＲとが反応し、Ｔ細胞に細胞死が誘導されたものと考察している。
【０００５】
また、ＣＤ２６を標的とする、共刺激分子をＣＤ２８とする第２世代のＣＡＲについても報告がある（非特許文献５：Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｎｏｔｈｅｒａｐｙ，  ２０２０  Ａｐｒ  ２１．  ｄｏｉ：  １０．１０３８／ｓ４１３７５−０２０−０８２４−ｙ．  Ｏｎｌｉｎｅ  ａｈｅａｄ  ｏｆ  ｐｒｉｎｔ）。
【０００６】
しかし、より効果の期待できる、ＣＤ２６を標的とする第３世代のＣＡＲ−Ｔについては、４−１−ＢＢがｉｎ  ｖｉｖｏ  でｅｘｐａｎｓｉｏｎが得られないことから、他のマーカーを標的とするものについては、これまで報告がなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】ＷＯ２０１５／０５７３３１
【特許文献２】ＷＯ２００７／０１４１６９
【特許文献３】ＷＯ２０１７／０４３６１３
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｍａｓｕ  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｏｏｄ  ２０１３
【非特許文献２】Ｍａｕｄｅ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ２０１８
【非特許文献３】Ｃａｒｌｏｓ  Ａ．  Ｒａｍｏｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｆｃｕｌａｒ−ｔｈｅｒａｐｙ，  ｖｏｌ．２６，  Ｎｏ．  １２，  ｐ．  ２７２７−２７３７，  ２０１８
【非特許文献４】Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｃｏｌ  ．２０１９，  Ａｕｇ；４１（４）：４９０−４９６
【非特許文献５】Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｎｏｔｈｅｒａｐｙ，  ２０２０  Ａｐｒ  ２１．  ｄｏｉ：  １０．１０３８／ｓ４１３７５−０２０−０８２４−ｙ．  Ｏｎｌｉｎｅ  ａｈｅａｄ  ｏｆ  ｐｒｉｎｔ
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
悪性中皮腫や腎癌、大腸癌、肝癌、肺癌、前立腺癌、消化管間質腫瘍、甲状腺癌、更にＴリンパ球に由来する造血器腫瘍などの腫瘍細胞は高率にＣＤ２６を発現するが、これらの疾患はいずれも有効な治療が少なく新しい治療が期待されている。本発明者らは、このような状況の中でＣＤ２６を標的とする抗体に着目し、これをin vitroで効率よく増殖させることが前記の難治性疾患の新たな治療を開発するうえに有意義であるとの観点で研究を進めた。したがって、本発明の目的は、腫瘍細胞等に発現するＣＤ２６を標的とするＣＡＲとして、ＣＡＲ−Ｔ細胞をより効率的に増殖させ、新たな治療に有益なＣＡＲ等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、ＣＤ２６を標的とする抗体を研究する中で、驚くべきことに第３世代のＣＡＲで遺伝子修飾された免疫細胞が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで良好な増殖を示し、従来の第２世代のＣＡＲには見られない、優れた抗腫瘍効果を示すことを初めて見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は下記に掲げるものに関する：
【００１１】
［１］ＣＤ２６特異的キメラ抗原受容体（以下ＣＡＲと記す）であって、
（ａ）モノクローナル抗ＣＤ２６抗体由来のＶＨおよびＶＬを含む細胞外リガンド結合ドメイン、
（ｂ）ヒンジ、
（ｃ）膜貫通ドメイン、ならびに
（ｄ）ＣＤ３ζシグナリングドメインと、４−１ＢＢおよびＣＤ２８由来の共刺激ドメインとを含む細胞質ドメイン
を含む、前記ＣＡＲ。
［２］細胞外リガンド結合ドメインが、ｓｃＦｖを含む、［１］に記載のＣＡＲ。
［３］ヒンジが、ＦｃＲＩＩＩαヒンジ、ＣＤ８αヒンジ、およびＩｇＧ１ヒンジより選択される、［１］または［２］に記載のＣＡＲ。
【００１２】
［４］ヒンジが、ＣＤ８αヒンジを含む、［１］〜［３］に記載のＣＡＲ。
［５］膜貫通ドメインが、ＣＤ２８を含む、［１］〜［４］に記載のＣＡＲ。
［６］ヒンジが、ＣＤ８αヒンジであり、および膜貫通ドメインが、ＣＤ２８である、［１］〜［５］に記載のＣＡＲ。
［７］ 細胞外リガンド結合ドメインが、配列番号１のアミノ酸番号２０〜２６０で示されるアミノ酸配列からなるか、もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、もしくは付加されることにより、前記それぞれの配列に対して９５％の相当性を有するアミノ酸配列からなる、［１］〜［６］に記載のＣＡＲ。
［８］ＶＨが、配列番号１のアミノ酸番号１４５〜２６０より選択されるアミノ酸配列からなり、かつＶＬが、配列番号２１〜１２９より選択されるアミノ酸配列からなるか、もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、もしくは付加されることにより、前記それぞれの配列に対して９５％の相当性を有するアミノ酸配列からなる、［１］〜［７］に記載のＣＡＲ。
［９］膜貫通ドメインが配列番号１のアミノ酸番号３１４〜３８４のアミノ酸配列で示されるアミノ酸配列からなるか、もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換，もしくは付加されることにより、前記それぞれの配列に対して９５％の相当性を有するアミノ酸配列からなる、［１］〜［８］に記載のＣＡＲ。
［１０］ＣＤ３ζシグナリングドメインが、配列番号１のアミノ酸番号４２７〜５３９で示されるアミノ酸配列からなるか、もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、もしくは付加されることにより、前記それぞれの配列に対して９５％の相当性を有するアミノ酸配列からなる、［１］〜［９］に記載のＣＡＲ。
【００１３】
［１１］４−１ＢＢ由来の共刺激ドメインが配列番号１のアミノ酸番号３８５〜４２６で示されるアミノ酸配列からなるか、もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、もしくは付加されることにより、前記それぞれの配列に対して９５％の相当性を有するアミノ酸配列からなる、［１］〜［１０］に記載のＣＡＲ。
［１２］ＣＤ２８由来の共刺激ドメインが配列番号１のアミノ酸番号３４４〜３８４で示されるアミノ酸配列からなるか、もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、もしくは付加されることにより、前記それぞれの配列に対して９５％の相当性を有するアミノ酸配列からなる、［１］〜［１１］に記載のＣＡＲ。
［１３］シグナルペプチドをさらに含む、［１］〜［１２］に記載のＣＡＲ。
［１４］シグナルペプチドが配列番号１のアミノ酸番号１〜２０で示されるアミノ酸配列からなるか、もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、もしくは付加されることにより、前記それぞれの配列に対して９５％の相当性を有するアミノ酸配列からなる、［１３］に記載のＣＡＲ。
【００１４】
［１５］［１］〜［１４］に記載のＣＡＲをコードする、ポリヌクレオチド。
［１６］［１５］に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
［１７］［１］〜［１４］に記載のＣＡＲを細胞表面膜に発現している、免疫細胞。
［１８］炎症性Ｔリンパ球、細胞傷害性Ｔリンパ球、制御性Ｔリンパ球、またはヘルパーＴリンパ球に由来する、［１７］に記載の遺伝子修飾された免疫細胞。
［１９］ＴＣＲの発現が抑制されている、［１８］に記載の遺伝子修飾遺伝子修飾された免疫細胞。
［２０］ＣＤ２６の発現が抑制されている、［１７］〜［１９］に記載の遺伝子修飾された免疫細胞。
［２１］少なくとも１種の免疫抑制剤または化学療法剤に対して耐性になるよう修飾されている、［１７］〜［２０］に記載の遺伝子修飾された免疫細胞。
［２２］疾患の治療において使用するための、［１７］〜［２１］に記載の遺伝子修飾された免疫細胞を含む医薬組成物。
［２３］患者がヒトである、［２２］に記載の治療において使用するための遺伝子修飾された免疫細胞を含む医薬組成物。
［２４］疾患が、ＣＤ２６発現細胞を特徴とする前癌性または癌疾患である、［２２］または［２３］に記載の治療において使用するための遺伝子修飾された免疫細胞を含む医薬組成物。
［２５］疾患がＣＤ２６発現細胞の過剰量を特徴とする疾患である、［２２］〜［２４］に記載の治療において使用するための遺伝子修飾された免疫細胞を含む医薬組成物。
［２６］疾患が、腎臓癌、前立腺癌、または肺癌である、［２２］〜［２５］のいずれかに記載の治療において使用するための遺伝子修飾された免疫細胞を含む医薬組成物。
【００１５】
［２７］疾患が、造血器腫瘍である、［２２］〜［２６］のいずれかに記載の治療において使用するための遺伝子修飾された免疫細胞を含む医薬組成物。
［２８］造血器腫瘍が、白血病である、［２７］に記載の治療において使用するための遺伝子修飾された免疫細胞を含む医薬組成物。
［２９］白血病が、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、および骨髄異形成症候群からなる群より選択される、［２８］に記載の治療において使用するための遺伝子修飾された免疫細胞を含む医薬組成物。
［３０］白血病が、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である、［２９］に記載の治療において使用するための遺伝子修飾された免疫細胞を含む医薬組成物。
［３１］造血器腫瘍が、悪性リンパ増殖性障害である、［３０］に記載の治療において使用するための遺伝子修飾された免疫細胞を含む医薬組成物。
［３２］悪性リンパ増殖性障害がリンパ腫である、［３１］に記載の治療において使用するための遺伝子修飾された免疫細胞を含む医薬組成物。
［３３］リンパ腫が、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、ならびに濾胞性リンパ腫（小細胞型および大細胞型）からなる群より選択される、［３２］に記載の治療において使用するための遺伝子修飾された免疫細胞を含む医薬組成物。
【００１６】
［３４］（ａ）免疫細胞を準備する工程、
（ｂ）［１］〜［１４］のいずれかに記載の少なくとも１種のＣＡＲを該細胞の表面に発現させる工程、
を含む、遺伝子修飾された免疫細胞を製造する方法。
［３５］
（ｃ）ＣＡＲをｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖させる工程をさらに含む、［３４］に記載の遺伝子修飾された免疫細胞を製造する方法。
［３６］
前記免疫細胞がドナーから提供される、［３４］または［３５］に記載の製造方法。
［３９］
前記免疫細胞が患者自身から提供される、［３４］〜［３６］のいずれかに記載の製造方法。
【発明の効果】
【００１７】
本発明により、従来のＣＤ２６を標的とするＣＡＲを遺伝子修飾した免疫細胞には見られない、良好な増殖効果、およびｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける優れた腫瘍抑制効果を有する、第３世代のＣＡＲ等を提供することができる。またそれにより、ＣＤ２６を発現する腫瘍細胞、特に造血器腫瘍細胞等に対して、従来にない臨床効果が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１はＣＤ２６ＣＡＲの構造を示す図である。第２世代ＣＤ２６ＣＡＲ（ＣＤ２６ＣＡＲ２ｎｄ：ＹＳ１１０−ＣＤ２８）は共刺激分子としてＣＤ２８を用いた。第３世代ＣＤ２６ＣＡＲ（ＣＤ２６ＣＡＲ３ｒｄ：ＹＳ１１０−ＣＤ２８−４−１ＢＢ）は共刺激分子としてＣＤ２８と４−１ＢＢの両者を用いた。これらに対するコントロールはそれぞれＣＤ８ＣＡＲ２ｎｄ（ＣＤ８−ＣＤ２８）、ＣＤ８ＣＡＲ３ｒｄ（ＣＤ８−ＣＤ２８−４−１ＢＢ）である。
【図２Ａ】図２Ａは、ＰＢＭＣｓに導入したＣＤ２６ＣＡＲの検出を示す図である。末梢血単核球（ＰＢＭＣｓ）に導入したＣＤ２６ＣＡＲの発現は、Ｔａｇ（Ｆｃ）が付加されたリコンビナントＣＤ２６とＰＥで蛍光標識された抗Ｆｃ抗体で検出した。ＣＤ２６ＣＡＲ２ｎｄとＣＤ２６ＣＡＲ３ｒｄのいずれにおいてもＣＤ２６ＣＡＲが検出された。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ＰＢＭＣｓに導入したＣＤ８ＣＡＲの検出を示す図である。末梢血単核球（ＰＢＭＣｓ）に導入したＣＤ８ＣＡＲの発現は、ＰＥで蛍光標識された抗ＣＤ８抗体で検出した。なお、ＣＡＲ導入前のＰＢＭＣｓは約３５％がもともとＣＤ８陽性である。ＣＤ８ＣＡＲ２ｎｄもしくはＣＤ８ＣＡＲ３ｒｄの導入によってＧＦＰ陽性となった細胞でＣＤ８ＣＡＲが検出された。
【図２Ｃ】図２Ｃは、ＣＤ２６ＣＡＲ導入後のＣＤ２６およびＣＤ８発現の実験方法を示す図である。
【図３Ａ】図３Ａは、ＣＤ２６ＣＡＲ導入後のＣＤ２６発現を示す図である。ＣＤ２６ＣＡＲ導入後のＣＤ２６発現は、抗ＣＤ２６抗体を用いて検討した。ＣＤ２６ＣＡＲ２ｎｄとＣＤ２６ＣＡＲ３ｒｄのいずれにおいてもＣＤ２６の発現は低下していた。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ＣＤ２６ＣＡＲ導入後のＣＤ２６発現の実験方法を示す図である。
【図４Ａ】図４Ａは、ＣＤ２６ＣＡＲ導入後の細胞増殖を示す図である。ＣＤ２６ＣＡＲ導入後の細胞増殖は、Ｄａｙ１０に細胞数をカウントして比較した。ＣＤ２６ＣＡＲ２ｎｄとＣＤ２６ＣＡＲ３ｒｄのいずれも、ＣＤ８ＣＡＲｎｄやＣＤ８ＣＡＲ３ｒｄと同様に増殖した。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ＣＤ２６ＣＡＲ導入後の細胞増殖の実験方法を示す図である。
【図５Ａ】図５Ａは、ＣＤ２６ＣＡＲ導入後のＣＤ６９発現を示す図である。リンパ球の活性化に伴って発現するＣＤ６９は、ＣＤ２６ＣＡＲ導入後のＰＢＭＣｓをＣＤ２６強制発現Ｊｕｒｋａｔ細胞（ＣＤ２６−Ｊｕｒｋａｔ）と共培養したのち、抗ＣＤ６９抗体で検出した。ＣＤ２６ＣＡＲ２ｎｄとＣＤ２６ＣＡＲ３ｒｄのいずれにおいてもＣＤ６９の発現誘導が認められた。
【図５Ｂ】図５Ｂは、ＣＤ２６ＣＡＲ導入後のＣＤ６９発現の実験方法を示す図である。
【図６Ａ】図６Ａは、ＣＤ２６ＣＡＲ導入後のＩＦＮ−γ産生を示す図である。リンパ球の活性化に伴って分泌されるＩＦＮ−γは、ＣＤ２６ＣＡＲ導入後のＰＢＭＣｓをＣＤ２６強制発現Ｊｕｒｋａｔ細胞（ＣＤ２６−Ｊｕｒｋａｔ）と共培養したのち、ＥＬＩＳＡ法で測定した。ＣＤ２６ＣＡＲ２ｎｄとＣＤ２６ＣＡＲ３ｒｄのいずれにおいてもＩＦＮ−γの分泌が認められた。
【図６Ｂ】図６Ｂは、ＣＤ２６ＣＡＲ導入後のＩＦＮ−γ産生の実験方法を示す図である。
【００１９】
【図７Ａ】図７Ａは、ＣＤ２６ＣＡＲの抗腫瘍効果（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）を示す図である。ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＣＤ２６ＣＡＲの抗腫瘍効果は、ＣＤ２６ＣＡＲ導入後のＰＢＭＣｓ（エフェクター細胞）を、ルシフェラーゼ遺伝子を導入したＣＤ２６陽性Ｋａｒｐａｓ２９９細胞（ターゲット細胞）と共培養したのち、ルシフェラーゼ活性の測定によりターゲット細胞数を定量した。その結果、エフェクター細胞とターゲット細胞の比１：１において、ＣＤ２６ＣＡＲ３ｒｄ  の抗腫瘍効果はＣＤ２６ＣＡＲ２ｎｄのそれに優っていた（ｐ＝０．００５）。
【図７Ｂ】図７Ｂは、ＣＤ２６ＣＡＲの抗腫瘍効果（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）の実験方法を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本明細書において特に定義されない限り、使用される技術用語および科学用語は、全て、遺伝子治療、生化学、遺伝学、および分子生物学の領域の当業者によって一般的に理解されるのと同一の意味を有する。
以下、本発明について説明する。
【００２１】
本発明の好ましい態様において、本発明は、
ＣＤ２６特異的キメラ抗原受容体（以下ＣＡＲと記す）であって、
（ａ）モノクローナル抗ＣＤ２６抗体由来のＶＨおよびＶＬを含む細胞外リガンド結合ドメイン、
（ｂ）ヒンジ、
（ｃ）膜貫通ドメイン、ならびに
（ｄ）ＣＤ３ζシグナリングドメインと、４−１ＢＢおよびＣＤ２８由来の共刺激ドメインとを含む細胞質ドメイン
を含む、前記ＣＡＲ、に関する。
【００２２】
本発明において、「キメラ抗原受容体」または「ＣＡＲ」は、特異的な抗標的細胞免疫活性を示すキメラタンパク質を生成するため、標的細胞上に存在する成分に対する結合ドメイン、例えば、所望の抗原（例えば、腫瘍抗原）に対する抗体に基づく特異性を、免疫細胞、好ましくはＴ細胞の受容体を活性化する細胞内ドメインと組み合わせた分子を表す。ＣＡＲは通常、細胞外単鎖抗体（ｓがＴ細胞抗原受容体複合体ζ鎖の細胞内シグナリングドメインに融合したものからなり、Ｔ細胞において発現された時に、モノクローナル抗体の特異性に基づき、抗原認識を向け直す能力を有している。本発明において使用されるＣＡＲの一例は、ＣＤ２６抗原に対するＣＡＲである。
本発明おいて、「ＣＤ２６特異的キメラ抗原受容体」または「ＣＤ２６特異的ＣＡＲ」は、ＣＤ２６抗原を特異的に抗原認識するペプチドを指すが、これに加えて他のマーカーを認識する場合もある。
【００２３】
本発明において、特に明記されない限り、「抗体」という用語はその機能的抗体断片を包含すると理解されるべきである。この用語はまた、ＩｇＧおよびそのサブクラス、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、およびＩｇＤを含む任意のクラスまたはサブクラスの抗体を含む、無傷または完全長抗体を包含する。
本発明において、「モノクローナル抗体」とは、単一の抗体産生細胞に由来するクローンから得られた抗体、あるいは抗体分子である。モノクローナル抗ＣＤ２６抗体とは、ＣＤ２６に対するモノクローナル抗体を意味する。
本発明において、モノクローナル抗ＣＤ２６抗体は、ヒト化抗体であってもよく、ヒ卜ＣＤ２６に特異的に結合する。
【００２４】
「ヒト抗体」は、抗原負荷に応答して特定のヒト抗体を産生するように遺伝子操作されたトランスジェニックマウス由来の抗体である。この技術において、ヒト重鎖及び軽鎖遺伝子座の要素は、内在性重鎖及び軽鎖遺伝子座の標的化された断絶を含有する胚幹細胞株から得られたマウスの株に導入される。トランスジェニックマウスは、ヒト抗原に特異的なヒト抗体を合成することができ、マウスを使用して、ヒト抗体分泌ハイブリドーマを産生することができる。トランスジェニックマウスからヒト抗体を得るための方法は、Ｇｒｅｅｎｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔ．７：１３（１９９４）、Ｌｏｎｂｅ
【００２５】
ｒｇｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３６８：８５６（１９９４）、及びＴａｙｌｏｒｅｔａｌ．，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎ．６：５７９（１９９４）により説明されている。ヒト抗体はまた、遺伝子または染色体トランスフェクション法、及びファージディスプレイ技術により構築することができ、これらは全て、当該技術分野において知られている。（例えば、非免疫化ドナーからの免疫グロブリン可変ドメイン遺伝子レパートリーからの、インビトロでのヒト抗体及びその断片の産生に関して、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙｅｔａｌ．，１９９０，Ｎａｔｕｒｅ３４８：５５２−５５３を参照されたい）。この技術において、抗体可変ドメイン遺伝子は、繊維状バクテリオファージの主要または微量外被タンパク質遺伝子にインフレームでクローニングされ、ファージ粒子の表面上に機能性抗体断片として表示される。繊維状粒子はファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含有するため、抗体の機能的特性に基づく選択はまた、それらの特性を示す抗体をコードする遺伝子の選択をもたらす。このようにして、ファージは、Ｂ  細胞の特性のいくつかを模倣する。
【００２６】
ファージディスプレイは、様々な形式で行うことができるが、それらの検討については、例えば、ＪｏｈｎｓｏｎａｎｄＣｈｉｓｗｅｌｌ，ＣｕｒｒｅｎｔＯｐｉｎｉｏｎｉｎＳｔｒｕｃｔｕｒａｌＢｉｏｌｏｇｙ３：５５６４−５７１（１９９３）を参照されたい。ヒト抗体はまた、インビトロ活性化Ｂ細胞により生成されてもよい。（米国特許第５，５６７，６１０号及び同第５，２２９，２７５号を参照されたい）。
【００２７】
本発明の抗ＣＤ２６抗体は、マウスモノクローナル抗体１４Ｄ１０と同じエピ卜一プに結合する。ある実施態様において、本明細書において記載される抗ＣＤ２６抗体は、競合アッセイにおいて、ヒ卜ＣＤ２６に対するマウスモノクローナル抗体１４Ｄ１０の結合を遮断する能力がある（マウスモノクロ一ナル抗体１４Ｄ１０と競合する）。本発明において、抗ＣＤ２６抗体は、競合アッセイにおいてヒ卜ＣＤ２６に対するマウスモノクローナル抗体１Ｆ７の結合を遮断する能力がある（マウスモノクローナル抗体１Ｆ７と競合する）。
【００２８】
本発明において、モノクローナル抗ＣＤ２６抗体は、ヒト化抗体である「ＹＳ１１０」であってもよいがこれに限定されない。ヒ卜化抗ＣＤ２６抗体である「ＹＳ１１０」とは、重鎖定常領域が配列番号１７に記載されたアミノ酸配列からなり、軽鎖定常領域が配列番号１８に記載されたアミノ酸配列からなる抗体を意味する。ＹＳ１１０についてはＷＯ２００８／１１４８７６を参照されたい。
【００２９】
本発明において、「細胞外リガンド結合ドメイン」という用語は、本明細書において使用されるように、リガンドと結合することができるオリゴペプチドまたはポリペプチドとして定義される。好ましくは、ドメインは、細胞表面分子と相互作用することができる場合がある。例えば、細胞外リガンド結合ドメインは、特定の疾患状態に関連した標的細胞上の細胞表面マーカーとして働くリガンドを認識するよう選択され得る。好ましい態様において、細胞外リガンド結合ドメインは、フレキシブルリンカーによって接合された標的抗原特異的モノクローナル抗ＣＤ２６抗体の軽鎖（ＶＬ）および重鎖（ＶＨ）の可変断片を含む単鎖抗体断片を含むがこれに限定されない。さらに好ましい対応において、ＶＬおよびＶＨは、任意で、ヒト化されていてもよい。
【００３０】
本発明において、可変断片は、断片抗原結合（Ｆａｂ）断片、Ｆ（ａｂ’）２  断片、Ｆａｂ’断片、Ｆｖ断片、組換えＩｇＧ（ｒＩｇＧ）断片、抗原に特異的に結合することができる可変重鎖（ＶＨ）領域、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む一本鎖抗体断片、および単一ドメイン抗体（例えばｓｄＡｂ、ｓｄＦｖ、ナノボディ）断片を含む機能的（抗原結合）抗体断片を含む。この用語は、遺伝子操作されたおよび／または他の方法で修飾された形態の免疫グロブリン、例えばイントラボディ、ペプチボディ、キメラ抗体、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、およびヘテロコンジュゲート抗体、多重特異性、例えば二重特異性抗体、ダイアボディ、トリアボディ、およびテトラボディ、タンデムｄｉ−ｓｃＦｖ、タンデムｔｒｉ−ｓｃＦｖを包含する。特に好ましくは、ｓｃＦＶであるがこれに限定されない。
本発明において、「ドメイン」の用語は、一般的な意味を示し、タンパク質、ペプチド等の特定の機能を示す部分を指すが、これに限定されず、其の他の部分を含んでいてもよい。
【００３１】
本発明における好ましい態様において、本発明のＣＤ２６特異的キメラ抗原受容体またはＣＡＲは、ヒンジを含んでいてもよい。本発明におけるヒンジは、細胞外リガンド結合ドメインと膜貫通ドメインとの間にあってもよい。本明細書において使用される「ヒンジ」という用語は通常、膜貫通ドメインを細胞外リガンド結合ドメインに連結するために機能するオリゴペプチドまたはポリペプチドを意味する。具体的には、ヒンジ領域は、細胞外リガンド結合ドメインに、より多くの可動性および接近可能性を提供するために使用される。ヒンジ領域は、３００個までのアミノ酸、好ましくは、１０〜１００個のアミノ酸、最も好ましくは、２５〜５０個のアミノ酸を含み得る。ヒンジ領域は、天然に存在する分子の全部もしくは一部、例えば、ＣＤ８、ＣＤ４、ＣＤ２８の細胞外領域の全部もしくは一部、または抗体定常領域の全部もしくは一部に由来し得る。あるいは、ヒンジ領域は、天然に存在するヒンジ配列に相当する合成配列であってもよいし、または完全合成ヒンジ配列であってもよい。好ましい態様において、ヒンジドメインは、本明細書において、ヒトＣＤ８α鎖、ＦｃγＲＩＩＩα受容体、もしくはＩｇＧ１の一部、またはこれらのポリペプチドとの好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは、少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を示すヒンジポリペプチドを含む。好ましくは、ＣＤ８αヒンジであるが、これに限定されない。
本発明の好ましい態様において、ＣＤ２６特異的キメラ抗原受容体またはＣＡＲは、膜貫通ドメインを含んでもよい。適切な膜貫通ドメインの特徴的は、細胞、本発明において好ましくは、免疫細胞、特にＴ細胞、具体的には、リンパ球またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞等の表面に発現され、予定された標的細胞に対する免疫細胞の細胞性応答を指図するために共に相互作用する能力が含まれる。膜貫通ドメインは、天然起源または合成起源のいずれかに由来し得る。膜貫通ドメインは、任意の膜結合型タンパク質または膜貫通型タンパク質に由来し得る。非限定的な例として、膜貫通型ポリペプチドは、α、β、γ、またはδのようなＴ細胞受容体のサブユニット、ＣＤ３複合体を構成するポリペプチド、ＩＬ２受容体ｐ５５（α鎖）、ｐ７５（β鎖）、またはγ鎖、Ｆｃ受容体、具体的には、Ｆｃγ受容体ＩＩＩまたはＣＤタンパク質のサブユニット鎖であり得る。膜貫通領域には、Ｔ細胞受容体、ＣＤ２８、ＣＤ３ε、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４のα鎖、β鎖、またはζ鎖等に由来し、すなわち少なくともその膜貫通領域含むものが含まれる。あるいは、膜貫通ドメインは、合成であってもよく、ロイシンおよびバリンのような主に疎水性の残基を含んでいてもよい。特に好ましくは、ＣＤ２８であるが、これに限定されない。
本発明において、好ましいヒンジと膜貫通ドメインとの組み合わせは、ヒンジが、ＣＤ８αヒンジであり、および膜貫通ドメインが、ＣＤ２８であるが、これに限定されない。
本発明の一態様において、本発明のＣＤ２６特異的キメラ抗原受容体またはＣＡＲは、ＣＤ３ζシグナリングドメインと、４−１ＢＢおよびＣＤ２８由来の共刺激ドメインとを含む細胞質ドメインを含んでもよい。
【００３２】
本発明に使用される細胞内ドメインは、同一分子内に存在する細胞外ドメインが抗原と結合（相互作用）した際に、細胞内にシグナルを伝達することが可能な分子である。
本発明のＣＡＲは、細胞内ドメインとしてＧＩＴＲの細胞内ドメインを含むことがある。ＧＩＴＲの細胞内ドメインは、同一の機能を有するその変異体を含む。用語「変異体」は、１個又は数個〜複数個のアミノ酸置換、欠失又は付加を含む任意の変異体を意味するが、ただし、当該変異体は元の配列が保持していたものと同一の機能を実質的に保持する。例えば、本発明に使用するＧＩＴＲの細胞内ドメインは、ＧＩＴＲ（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿００４１８６．１）のアミノ酸番号１９３〜２４１（配列番号２８）を含む細胞内ドメインが例示される。本発明のＣＡＲはＧＩＴＲの細胞内ドメインに加えて他のポリペプチドに由来する細胞内ドメインを使用することができる。このような細胞内ドメインは、ＴＣＲ複合体及び共刺激分子に由来する細胞質配列、並びにそれらの配列の同一の機能を有する任意の変異体が含まれる。ＴＣＲ複合体のみを介して発生されたシグナルはＴ細胞の活性化に不十分であること、及び二次又は共刺激シグナルも必要であることが知られている。天然のＴ細胞活性化は、２つの異なる種類の細胞質シグナル伝達配列、すなわちＴＣＲ複合体を介して抗原依存的一次活性化を開始させる配列（一次細胞質シグナル伝達配列）及び抗原非依存的に作用して二次又は共刺激シグナルを提供する配列（二次細胞質シグナル伝達配列）によって伝達されている。好適な態様において、本発明のＣＡＲは、細胞内ドメインとして、前記一次細胞質シグナル伝達配列及び／又は二次細胞質シグナル伝達配列を含む。
一次細胞質シグナル伝達配列は、ＴＣＲ複合体の一次活性化を調節する。活性化を刺激する一次細胞質シグナル伝達配列は、免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）として知られるシグナル伝達モチーフを含むことがある［ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、第３３８巻、第３８３−３８４頁（１９８９）］。一方、抑制的に作用する一次細胞質シグナル伝達配列は、免疫受容体チロシンベース抑制モチーフ（ＩＴＩＭ）として知られるシグナル伝達モチーフを含む［ジャーナル  オブ  イムノロジー（Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．）、第１６２巻、第２号、第８９７−９０２頁（１９９９）］。本発明には、ＩＴＡＭ又はＩＴＩＭを有する細胞内ドメインが使用できる。
本発明で使用できるＩＴＡＭを有する細胞内ドメインは、例えば、ＣＤ３ζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、及びＣＤ６６ｄに由来するＩＴＡＭを包含する。
【００３３】
本発明によるＣＡＲのシグナリングドメインまたは細胞内シグナリングドメインは、免疫細胞の活性化および免疫応答をもたらす、細胞外リガンド結合ドメインの標的への結合の後の細胞内シグナリングを担う。換言すると、シグナリングドメインは、ＣＡＲが発現される免疫細胞の正常なエフェクター機能のうちの少なくとも１種の活性化を担う。例えば、Ｔ細胞のエフェクター機能は、細胞溶解活性、またはサイトカインの分泌を含むヘルパー活性であり得る。従って、「シグナリングドメイン」という用語は、エフェクターシグナル機能シグナルを伝達し、専門の機能を果たすよう細胞に指図するタンパク質の部分をさす。 ＣＡＲにおいて使用するためのシグナリングドメインの好ましい例は、抗原受容体会合後にシグナリングを開始するために協調的に作用するＴ細胞受容体および共受容体の細胞質配列、ならびに同一の機能的能力を有するこれらの配列の誘導体またはバリアントおよび合成配列であり得る。シグナリングドメインには、細胞質シグナリング配列の２種の別個のクラス（抗原依存性の一次活性化を開始するもの、および二次的または共刺激的なシグナルを提供するために抗原非依存的に作用するもの）が含まれる。一次細胞質シグナリング配列には、免疫受容活性化チロシンモチーフであるＩＴＡＭとして公知であるシグナリングモチーフが含まれ得る。ＩＴＡＭは、ｓｙｋ／ｚａｐ７０クラスチロシンキナーゼのための結合部位として役立つ、多様な受容体の細胞質内テールに見出される十分に定義されたシグナリングモチーフである。本発明において使用されるＩＴＡＭの例には、非限定的な例として、ＴＣＲζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＦｃＲε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、およびＣＤ６６ｄに由来するものが含まれ得る。ＣＤ３ζシグナリングドメインが含まれ得る。
【００３４】
本発明の別の形態において、細胞内シグナリングドメインは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の細胞質配列を含み、いくつかの態様では、天然の状況ではそのような受容体と協調して作用し、抗原受容体結合後、シグナリングを開始する共受容体の配列、および／またはそのような分子の任意の誘導体もしくは変異体、および／または同じ機能的能力を有する任意の合成配列も含む。天然のＴＣＲに関しては、完全活性化は一般に、ＴＣＲを介するシグナリングだけでなく、共刺激シグナルも必要とする。したがって、いくつかの実施形態では、完全な活性化を促進するために、二次シグナルまたは共刺激シグナルを生成するための成分もＣＡＲに含まれる。単一の免疫受容体活性化ドメイン（例えば、ＩＴＡＭ）、活性化ドメインと１つの共刺激ドメイン、または活性化ドメインと１もしくは複数の共刺激ドメインを有するＣＡＲに組み込むことができ、このＣＡＲはヘテロ二官能性ドメインの投与により分解される。  
本発明に含まれる共刺激ドメインは、特に限定されないが、いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＤＡＰ１０、およびＩＣＯＳなどの共刺激受容体のシグナル伝達ドメインおよび／または膜貫通部分を含む。好まし右派いくつかの態様では、同じＣＡＲは活性化成分と共刺激成分の両方を含み、他の態様では、活性化ドメインは１つのＣＡＲによって提供され、共刺激成分は別のＣＡＲまたは別の抗原を認識するリガンドによって提供される。
特定の実施形態では、細胞内シグナリングドメインは、ＣＤ３（例えば、ＣＤ３−ゼータ）細胞内ドメインに連結したＣＤ２８膜貫通ドメインおよびシグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータ細胞内ドメインに連結したキメラＣＤ２８およびＣＤ１３７（４−１ＢＢ、ＴＮＦＲＳＦ９）共刺激ドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、キメラＣＤ２８またはＣＤ１３７（４−１ＢＢ、ＴＮＦＲＳＦ９）共刺激ドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、キメラＣＤ２８およびＯＸ４０共刺激ドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインはキメラＣＤ２７共刺激ドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、キメラＣＤ２７およびＤＡＰ１０共刺激ドメインを含む。  
本発明の好ましい実施形態において、細胞外リガンド結合ドメインが、ｓｃＦＶを含む。本発明において「ｓｃＦＶを含む」とは一般的な意味を示し、ｓｃＦＶ以外のその他の断片を含んでいてもよく、また、断片に限らず慣用的な意味において、すべての抗体のいずれか１つ以上を含んでいてもよい。
【００３５】
本発明の別の態様において、本発明のＣＡＲのシグナル伝達ドメインは、共刺激シグナル分子を含む。共刺激分子とは、効率的な免疫応答のために必要とされる、抗原受容体またはそのリガンド以外の細胞表面分子である。「共刺激リガンド」とは、Ｔ細胞上の同族共刺激分子に特異的に結合し、それによって、例えば、ペプチドが負荷されたＭＨＣ分子とのＴＣＲ／ＣＤ３複合体の結合によって提供される一次シグナルに加えて、増殖活性化、分化等を含むが、これらに限定されないＴ細胞応答を媒介するシグナルを提供する抗原提示細胞上の分子をさす。共刺激リガンドには、ＣＤ７、Ｂ７−１（ＣＤ８０）、Ｂ７−２（ＣＤ８６）、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、誘導性共刺激リガンド（ＩＣＯＳ−Ｌ）、細胞間接着分子（ＩＣＡＭ、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０、ＣＤ７０、ＣＤ８３、ＨＬＡ−Ｇ、ＭＩＣＡ、Ｍ１ＣＢ、ＨＶＥＭ、リンホトキシンβ受容体、３／ＴＲ６、ＩＬＴ３、ＩＬＴ４、トールリガンド受容体に結合するアゴニストまたは抗体、およびＢ７−Ｈ３に特異的に結合するリガンドが含まれ得るが、これらに限定されない。共刺激リガンドには、とりわけ、以下に限定されないが、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＴＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤ８３に特異的に結合するリガンドのような、Ｔ細胞上に存在する共刺激分子と特異的に結合する抗体も包含される。
本発明の好ましい形態において、ヒンジは、ＦｃＲＩＩＩαヒンジ、ＣＤ８αヒンジ、およびＩｇＧ１ヒンジより選択されるがこれに限定されない。特に好ましくはヒンジは、ＣＤ８αヒンジを含むが、これに限定されない。
本発明の好ましい形態において、膜貫通ドメインは、ＣＤ２８を含むが、これに限定されいない。
本発明の好ましい形態において、ヒンジがＣＤ８αヒンであり、および膜貫通ドメインが、ＣＤ２８である場合があるが、これに限定されない。
【００３６】
本発明の好ましい形態において、本発明は、細胞外リガンド結合ドメインが、配列番号１アミノ酸番号２０〜２６０で示されるアミノ酸配列からなるか、もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、もしくは付加されることにより、前記それぞれの配列に対して９５％の相当性を有するアミノ酸配列からなるＣＡＲに関する。相当性は、９５％より低い場合であっても、機能を有する場合は問題なく、例えば８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のである場合がある。
本発明の別の態様において、本発明のＶＨおよびＶＬは腫瘍抗原の結合に寄与する。好ましくは本発明のＶＨおよびＶＬはＣＤ２６への結合に寄与する。
【００３７】
別の態様において、ＶＨが、配列番号１の１４５〜２６０より選択されるアミノ酸配列からなり、かつＶＬが、配列番号１の２１〜１２９より選択されるアミノ酸配列からなるか、もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、もしくは付加されることにより、前記それぞれの配列に対して９５％の相当性を有するアミノ酸配列からなる場合がある。相当性は、９５％より低い場合であっても、機能を有する場合は問題なく、例えば８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のである場合がある。
【００３８】
本発明の一態様において、膜貫通ドメインが配列番号１のアミノ酸番号３１４〜３８４のアミノ酸配列で示されるアミノ酸配列からなるか、もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換，もしくは付加されることにより、前記それぞれの配列に対して９５％の相当性を有するアミノ酸配列からなる場合がある。相当性は、９５％より低い場合であっても、機能を有する場合は問題なく、例えば８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のである場合がある。
【００３９】
本発明の一態様において、ＣＤ３ζシグナリングドメインが、配列番号１のアミノ酸番号４２７〜５３９で示されるアミノ酸配列からなるか、もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換，もしくは付加されることにより、前記それぞれの配列に対して９５％の相当性を有するアミノ酸配列からなる場合があるがこれに限定されない。
【００４０】
本発明の別の態様において、ＣＡＲは、膜貫通ドメインを含む。膜貫通ドメインは天然のポリペプチドに由来するものでもよく、人為的に設計したものでもよい。天然のポリペプチド由来の膜貫通ドメインは、任意の膜結合又は膜貫通タンパク質から取得することができる。例えば、Ｔ細胞受容体のα、β鎖、ＣＤ３ζ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３ε、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＩＣＯＳ、ＣＤ１５４、ＧＩＴＲの膜貫通ドメインを使用することができる。また、人為的に設計された膜貫通ドメインは、ロイシン及びバリンなどの疎水性残基を主に含むポリペプチドである。また、フェニルアラニン、トリプトファン及びバリンのトリプレットが、合成膜貫通ドメインの各末端に見出されることが好ましい。場合により、短いオリゴペプチドリンカー又はポリペプチドリンカー、例えば長さが２〜１０個のアミノ酸配列からなるリンカーを、膜貫通ドメインと前記（ｂ）の細胞内ドメインとの間に配置することができる。特にグリシン−セリン連続配列を有するリンカー配列を使用することができる。
本発明の一態様において、本発明の４−１ＢＢ由来の共刺激ドメインが配列番号（３８５〜４２６）で示されるアミノ酸配列からなるか、もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換，もしくは付加されることにより、前記それぞれの配列に対して９５％の相当性を有するアミノ酸配列からなっていてもよい。相当性は、９５％より低い場合であっても、機能を有する場合は問題なく、例えば８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のである場合がある。
【００４１】
本発明の別の態様において、ＣＤ２８由来の共刺激ドメインが配列番号（３４４〜３８４）で示されるアミノ酸配列からなるか、もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換，もしくは付加されることにより、前記それぞれの配列に対して９５％の相当性を有するアミノ酸配列からなる場合がある。
【００４２】
本発明の一側面として、本発明のＣＡＲはシグナルペプチドをさらに含んでもよい。シグナルペプチドは多くの分泌タンパク質、膜タンパク質のＮ末端に存在し、１５〜３０アミノ酸の長さを有する。細胞内ドメインとして前記に例示したタンパク質分子の多くはシグナルペプチド配列を有していることから、これらのシグナルペプチドを本発明のＣＡＲのシグナルペプチドとして使用することができる。
本発明の別の態様として、シグナルペプチドが配列番号１のアミノ酸番号１〜２０で示されるアミノ酸配列からなるか、もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換，もしくは付加されることにより、前記それぞれの配列に対して９５％の相当性を有するアミノ酸配列からなる場合があるがこれに限定されない。相当性は、９５％より低い場合であっても、機能を有する場合は問題なく、例えば８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のである場合がある。
【００４３】
ＣＡＲをコードする、ポリヌクレオチド
本発明は、好ましい態様として、本発明のＣＡＲをコードする、ポリヌクレオチドに関する。本発明は、本発明による抗ＣＤ２６ＣＡＲをコードするポリヌクレオチド、本発明による抗ＣＤ３３ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドのうちの少なくとも１種を含むベクター、好ましくは、レンチウイルスベクターにも関する。 ポリヌクレオチドは、発現カセットまたは発現ベクター（例えば、細菌宿主細胞への導入のためのプラスミド、または昆虫宿主細胞のトランスフェクションのためのバキュロウイルスベクターのようなウイルスベクター、または哺乳動物宿主細胞のトランスフェクションのためのレンチウイルスのようなプラスミドもしくはウイルスベクター）の中に存在し得る。
【００４４】
具体的な態様において、２Ａペプチドをコードする配列のようなリボソームスキップ配列をコードする核酸配列を含む一つのポリヌクレオチドまたはベクターに、異なる核酸配列を含めることができる。ピコルナウイルスのアフトウイルス亜群において同定された２Ａペプチドは、コドンによってコードされた２つのアミノ酸の間にペプチド結合が形成されない、あるコドンから次のコドンへのリボソーム「スキップ」を引き起こす（（Ｄｏｎｎｅｌｌｙ  ａｎｄ  Ｅｌｌｉｏｔｔ  ２００１；Ａｔｋｉｎｓ，Ｗｉｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．２００７；Ｄｏｒｏｎｉｎａ，Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．２００８）を参照されたい）。「コドン」とは、リボソームによって１つのアミノ酸残基へ翻訳されるｍＲＮＡ（またはＤＮＡ分子のセンス鎖）上の３ヌクレオチドを意味する。従って、ポリペプチドが、インフレームにある２Ａオリゴペプチド配列によって隔てられている時、ｍＲＮＡ内の単一の連続するオープンリーディングフレームから、２つのポリペプチドが合成され得る。そのようなリボソームスキップ機序は、当技術分野において周知であり、単一のメッセンジャーＲＮＡによってコードされた数種のタンパク質の発現のため、数種のベクターによって使用されることが公知である。
【００４５】
膜貫通ポリペプチドを宿主細胞の分泌経路へ差し向けるためには、（リーダー配列、プレプロ配列、またはプレ配列としても公知の）分泌シグナル配列が、ポリヌクレオチド配列またはベクター配列の中に提供される。分泌シグナル配列は、膜貫通核酸配列に機能的に連結される。即ち、２種の配列は、正確なリーディングフレームにおいて結合され、新たに合成されたポリペプチドが宿主細胞の分泌経路へ差し向けられるよう位置付けられる。分泌シグナル配列は概して、関心対象のポリペプチドをコードする核酸配列の５’に位置するが、ある種の分泌シグナル配列は、関心対象の核酸配列の他の場所に位置し得る（例えば、Ｗｅｌｃｈら、米国特許第５，０３７，７４３号；Ｈｏｌｌａｎｄら、米国特許第５，１４３，８３０号を参照されたい）。
【００４６】
当業者は、遺伝暗号の縮重を考慮して、これらのポリヌクレオチド分子において相当の配列変動が可能であることを認識する。好ましくは、本発明の核酸配列は、哺乳動物細胞における発現のため、好ましくは、ヒト細胞における発現のため、コドン最適化される。コドン最適化とは、関心対象の配列において、所定の種の高発現遺伝子において通常は稀であるコドンを、そのような種の高発現遺伝子において概して高頻度であるコドンへ交換することをさす。そのようなコドンは、交換されるコドンとしてアミノ酸をコードする。
本発明の別の態様において、本発明は、本発明のＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを提供する。ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドは、特定されたＣＡＲのアミノ酸配列から常法により容易に作製することができる。前記に記載した各ドメインのアミノ酸配列を示すＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ  ＩＤやＧｅｎＢａｎｋのＡｃｃｅｓｓｉｏｎ番号からアミノ酸配列をコードする塩基配列を取得することが可能であり、標準的な分子生物学的及び／又は化学的手順を用いて本発明のポリヌクレオチドを作製できる。例えば、これらの塩基配列をもとに、ポリヌクレオチドを合成することができ、また、ｃＤＮＡライブラリーよりポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して得られるＤＮＡ断片を組み合わせて本発明のポリヌクレオチドを作製することができる。
【００４７】
本発明のポリヌクレオチドは、適当なプロモーターの制御下に発現されるように別のポリヌクレオチドと連結することができる。プロモーターとしては構成的に発現を促進するもの、薬剤等（例えば、テトラサイクリン又はドキソルビシン）により誘導されるもの等のいずれも用いることができる。また、ポリヌクレオチドの効率のよい転写を達成するために、プロモーター又は転写開始部位と協同する他の調節要素、例えば、エンハンサー配列又はターミネーター配列を含むポリヌクレオチドを連結してもよい。また、更に本発明のポリヌクレオチドに加えて、当該ポリヌクレオチドの発現を確認するためのマーカーとなりうる遺伝子（例えば薬剤耐性遺伝子、レポーター酵素をコードする遺伝子、又は蛍光タンパク質をコードする遺伝子等）を組み込んでもよい。
本発明の好ましい局面として、前記ポリヌクレオチドを含む、発現ベクターに関する。
【００４８】
「ベクター」という用語は、それが連結された別の核酸を輸送することができる核酸分子をさす。本発明における「ベクター」には、ウイルスベクター、プラスミド、ＲＮＡベクター、または染色体核酸、非染色体核酸、半合成核酸、もしくは合成核酸からなり得る直鎖状もしくは環状のＤＮＡ分子もしくはＲＮＡ分子が含まれるが、これらに限定されない。好ましいベクターは、それらが連結された核酸の自律複製が可能なもの（エピソームベクター）および／または発現が可能なもの（発現ベクター）である。多数の適当なベクターが、当業者に公知であり、市販されている。
【００４９】
ウイルスベクターには、レトロウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス（例えば、アデノ随伴ウイルス）、コロナウイルス、オルソミクソウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）、ラブドウイルス（例えば、狂犬病ウイルスおよび水疱性口内炎ウイルス）、パラミクソウイルス（例えば、麻疹およびセンダイ）のようなマイナス鎖ＲＮＡウイルス、ピコルナウイルスおよびアルファウイルスのようなプラス鎖ＲＮＡウイルス、ならびにアデノウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス１型および２型、エプスタイン・バーウイルス、サイトメガロウイルス）、およびポックスウイルス（例えば、ワクシニア、鶏痘、およびカナリアポックス）を含む二本鎖ＤＮＡウイルスが含まれる。他のウイルスには、例えば、ノーウォークウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、レオウイルス、パポーバウイルス、ヘパドナウイルス、および肝炎ウイルスが含まれる。レトロウイルスの例には、トリ白血病肉腫、哺乳動物Ｃ型、Ｂ型ウイルス、Ｄ型ウイルス、ＨＴＬＶ−ＢＬＶ群、レンチウイルス、スプーマウイルスが含まれる（Ｃｏｆｆｉｎ，Ｊ．Ｍ．，Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ：Ｔｈｅ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｉｎ  Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，１９９６）。
【００５０】
「レンチウイルスベクター」とは、比較的大きいパッケージング能力、低下した免疫原性、および広範囲の異なる細胞型を高い効率で安定的に形質導入する能力のため、遺伝子送達のために極めて有望である、ＨＩＶに基づくレンチウイルスベクターを意味する。レンチウイルスベクターは通常、３種（パッケージング、エンベロープ、および移入）またはそれ以上のプラスミドを産生細胞に一過性トランスフェクションした後、生成される。ＨＩＶと同様に、レンチウイルスベクターは、ウイルス表面糖タンパク質の細胞表面上の受容体との相互作用を通して標的細胞に侵入する。侵入後、ウイルスＲＮＡが、ウイルス逆転写酵素複合体によって媒介される逆転写を受ける。逆転写の産物は、感染細胞のＤＮＡへのウイルス組み込みのための基質となる二本鎖の直鎖状ウイルスＤＮＡである。「組込みレンチウイルスベクター（またはＬＶ）」とは、非限定的な例として、標的細胞のゲノムに組み込まれ得るそのようなベクターを意味する。反対に、「非組込みレンチウイルスベクター（またはＮＩＬＶ）」とは、ウイルスインテグラーゼの作用を通して標的細胞のゲノムに組み込まれない効率的な遺伝子送達ベクターを意味する。
【００５１】
送達ベクターおよびベクターは、ソノポレーション（ｓｏｎｏｐｏｒａｔｉｏｎ）もしくは電気穿孔のような細胞透過処理技術、またはこれらの技術の変法と関連しているかまたは組み合わせられていてよい。
細胞とは、真核生物の生存細胞、初代細胞、およびインビトロ培養のためのこれらの生物に由来する細胞株を表す。
「初代細胞」とは、集団倍化をほとんど受けておらず、従って、腫瘍形成性の連続細胞株または人為的に不死化された細胞株と比較して、それが由来した組織の主な機能的成分および特徴をよりよく表している、生存組織（即ち、生検材料）から直接採取され、インビトロでの増殖のために確立された細胞を表す。
【００５２】
非限定的な例として、細胞株は、ＣＨＯ−Ｋ１細胞；ＨＥＫ２９３細胞；Ｃａｃｏ２細胞；Ｕ２−ＯＳ細胞；ＮＩＨ３Ｔ３細胞；ＮＳＯ細胞；ＳＰ２細胞；ＣＨＯ−Ｓ細胞；ＤＧ４４細胞；Ｋ−５６２細胞、Ｕ−９３７細胞；ＭＲＣ５細胞；ＩＭＲ９０細胞；Ｊｕｒｋａｔ細胞；ＨｅｐＧ２細胞；ＨｅＬａ細胞；ＨＴ−１０８０細胞；ＨＣＴ−１１６細胞；Ｈｕ−ｈ７細胞；Ｈｕｖｅｃ細胞；Ｍｏｌｔ  ４細胞からなる群より選択される。
これらの細胞株は、全て、関心対象の遺伝子またはタンパク質を作製し、発現させ、定量化し、検出し、研究するための細胞株モデルを提供するため、本発明の方法によって改変され得；これらのモデルは、研究および作製、ならびに非限定的な例としての化学物質、生物燃料、治療薬、および農学のような様々な領域において、関心対象の生理活性分子をスクリーニングするためにも使用され得る。
【００５３】
ＣＡＲを細胞表面膜に発現している、免疫細胞
本発明の好ましい態様において、本発明は、本発明のＣＡＲを細胞表面膜に発現している、免疫細胞に関する。
本発明の、ＣＡＲを細胞表面膜に発現している、本発明のＣＡＲを発現する細胞は、前記のＣＡＲをコードするペプチドが導入、発現した細胞である。
本発明の細胞は、ＣＡＲを介して特定の抗原との結合により細胞内にシグナルが伝達され、活性化される。ＣＡＲを発現する細胞の活性化は、宿主細胞の種類やＣＡＲの細胞内ドメインにより異なるが、例えば、サイトカインの放出、細胞増殖率の向上、細胞表面分子の変化等を指標として確認することができる。例えば、活性化された細胞からの細胞傷害性のサイトカイン（腫瘍壊死因子、リンホトキシンなど）の放出は、抗原を発現する標的細胞の破壊をもたらす。また、サイトカイン放出や細胞表面分子の変化により、他の免疫細胞、例えば、Ｂ細胞、樹状細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ等を刺激する。  
本発明の別の態様において、本発明の遺伝子修飾された免疫細胞は、炎症性Ｔリンパ球、細胞傷害性Ｔリンパ球、制御性Ｔリンパ球、またはヘルパーＴリンパ球に由来する、遺伝子修飾された免疫細胞であってもよい。
本発明の別の態様において、本発明の遺伝子修飾された免疫細胞は、ＴＣＲの発現が抑制されている、遺伝子修飾された免疫細胞であってもよい。
本発明の別の態様において、本発明の遺伝子修飾された免疫細胞は、ＣＤ２６の発現が抑制されている、遺伝子修飾された免疫細胞であってもよい。
本発明の別の態様において、本発明の遺伝子修飾された免疫細胞は、少なくとも１種の免疫抑制剤または化学療法剤に対して耐性になるよう修飾されている、遺伝子修飾された免疫細胞であってもよい。
【００５４】
医薬組成物
本発明の好ましい態様において、本発明は、疾患の治療において使用するための、本発明に係の遺伝子修飾された免疫細胞を含む医薬組成物に関する。
本発明の一態様において、本発明は、患者がヒトである、前記の治療において使用するための遺伝子修飾された免疫細胞を含む医薬組成物でもよい。
本発明の一態様において、本発明は、疾患が、ＣＤ２６発現細胞を特徴とする前癌性または癌疾患である、前記の治療において使用するための遺伝子修飾された免疫細胞を含む医薬組成物でもよい。
本発明の一態様において、本発明は、疾患がＣＤ２６発現細胞の過剰量を特徴とする疾患である、前記の治療において使用するための遺伝子修飾された免疫細胞を含む医薬組成物でもよい。
本発明の一態様において、本発明は、疾患が、腎臓癌、前立腺癌、または肺癌である、前記の治療において使用するための遺伝子修飾された免疫細胞を含む医薬組成物でもよい。
本発明の一態様において、本発明は、 疾患が、造血器腫瘍である、前記の治療において使用するための遺伝子修飾された免疫細胞を含む医薬組成物でもよい。
本発明の一態様において、本発明は、造血器腫瘍が、白血病である、前記の治療において使用するための遺伝子修飾された免疫細胞を含む医薬組成物でもよい。
本発明の一態様において、本発明は、白血病が、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、および骨髄異形成症候群からなる群より選択される、前記の治療において使用するための遺伝子修飾された免疫細胞を含む医薬組成物でもよい。
本発明の一態様において、本発明は、白血病が、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である、前記の治療において使用するための遺伝子修飾された免疫細胞を含む医薬組成物でもよい。
本発明の一態様において、本発明は、造血器腫瘍が、悪性リンパ増殖性障害である、前記の治療において使用するための遺伝子修飾された免疫細胞を含む医薬組成物でもよい。
本発明の一態様において、本発明は、悪性リンパ増殖性障害がリンパ腫である、前記の治療において使用するための遺伝子修飾された免疫細胞を含む医薬組成物でもよい。
本発明の一態様において、本発明は、リンパ腫が、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、ならびに濾胞性リンパ腫（小細胞型および大細胞型）からなる群より選択される、前記の治療において使用するための遺伝子修飾された免疫細胞を含む医薬組成物でもよい。
【００５５】
本発明は、被験体におけるＣＤ２６発現に関連する状態を治療するための遺伝子修飾された免疫細胞を含む医薬組成物をさらに提供する。いくつかの実施形態では、被験体におけるＣＤ２６発現に関連する状態を治療するための遺伝子修飾された免疫細胞を含む医薬組成物は、本明細書中に記載される抗体等のポリペプチドを含む有効量の組成物を被験体に投与することを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ２６発現に関連する状態はＣＤ２６の異常発現に関連する。いくつかの実施形態では、ＣＤ２６発現に関連する状態は変更したまたは異常なＣＤ２６発現に関連する状態である（いくつかの実施形態では、上昇または減少したＣＤ２６発現（正常試料に比べて）ならびに／あるいはＣＤ２６発現を通常欠く組織および／もしくは細胞における発現の存在またはＣＤ２６発現を通常有する組織もしくは細胞におけるＣＤ２６発現の欠如等の不適切な発現）。いくつかの実施形態では、ＣＤ２６発現に関連する状態はＣＤ２６過剰発現に関連する状態である。いくつかの実施形態では、ＣＤ２６発現に関連する状態は少なくとも部分的にＣＤ２６により媒介される。いくつかの実施形態では、ＣＤ２６発現に関連する状態はＣＤ２６を発現する細胞に関連する状態である。いくつかの実施形態では、ＣＤ２６発現に関連する状態はＣＤ２６を発現する細胞の増殖に関連する状態である。いくつかの実施形態では、ＣＤ２６を発現する細胞の増殖は異常である。いくつかの実施形態では、ＣＤ２６を発現する細胞はＴ細胞である。いくつかの実施形態では、ＣＤ２６を発現する細胞は腫瘍細胞であり、腫瘍細胞は悪性または良性であってもよい。いくつかの実施形態では、ＣＤ２６発現に関連する状態は、癌細胞がＣＤ２６＋癌細胞であるかＣＤ２６を発現する（つまり、ＣＤ２６発現癌）癌である（ＣＤ２６を発現するさらなる細胞は上記に記載される）。
【００５６】
いくつかの実施形態では、被験体におけるＣＤ２６発現に関連する状態は増殖性障害である。いくつかの実施形態では、被験体におけるＣＤ２６発現に関連する状態は癌である。いくつかの実施形態では、癌はＣＤ２６＋血液悪性腫瘍である。いくつかの実施形態では、癌は、Ｔ細胞リンパ腫等のＴ細胞癌である。たとえば、いくつかの実施形態では、癌は、Ｔ細胞リンパ芽球性リンパ腫または急性リンパ芽球性白血病である。他の実施形態では、癌は、Ｔ細胞ＣＤ３０＋未分化大細胞リンパ腫である。いくつかの実施形態では、癌は、末梢Ｔ細胞リンパ腫、Ｔ細胞慢性リンパ性白血病、血管免疫芽細胞性Ｔ細胞リンパ腫、血管中心性Ｔ細胞リンパ腫、ＨＴＬＶ関連Ｔ細胞白血病、または成人Ｔ細胞白血病である。いくつかの実施形態では、癌は固形腫瘍である。いくつかの実施形態では、癌は、膵癌、腎臓癌、またはリンパ腫である。いくつかの実施形態では、癌は、Ｂ細胞癌、甲状腺癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、大腸癌、膀胱癌、肺癌、肝臓癌、胃癌、精巣癌、子宮癌、脳癌、リンパ癌、皮膚癌、骨癌、直腸癌、肉腫、肺癌、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病、またはＢ細胞リンパ腫である。いくつかの実施形態では、癌はＣＤ２６の過剰発現に関連する。いくつかの実施形態では、癌は中皮腫ではない。いくつかの実施形態では、癌は黒色腫ではない。いくつかの実施形態では、癌はリンパ腫、腎臓癌、前立腺癌、または肺癌である。いくつかの実施形態では、癌はリンパ腫である。いくつかの実施形態では、癌は腎癌腫である。いくつかの実施形態では、癌は前立腺癌腫である。いくつかの実施形態では、癌は肺癌腫である。
いくつかの実施形態では、ＣＤ２６発現に関連する状態は炎症性疾患または炎症性障害である。いくつかの実施形態では、炎症性疾患はＣＤ２６の過剰発現に関連する。
他の実施形態では、ＣＤ２６発現に関連する状態は血管新生である。
【００５７】
さらなる実施形態では、ＣＤ２６発現に関連する状態は、これらに限定されないが、移植片対宿主疾患および自己免疫疾患または自己免疫障害等の活性化された免疫状態を伴う状態である。いくつかの実施形態では、状態は、アジソン病、脱毛、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、ベーチェット病、慢性疲労症候群、クローン病、潰瘍性大腸炎、糖尿病、線維筋痛、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、狼瘡、メニエール多発性硬化症、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、関節リウマチ、リウマチ熱、サルコイドーシス、強皮症、脈管炎、白斑、またはヴェーゲナー肉芽腫症である。いくつかの実施形態では、活性化された免疫状態を伴う状態は、ＣＤ２６の過剰発現に関連する。
【００５８】
遺伝子修飾された免疫細胞の製造
本発明の好ましい態様において、本発明は、
（ａ）免疫細胞を準備する工程、
（ｂ）請求項１〜１５のいずれか一項に記載の少なくとも１種のＣＡＲを該細胞の表面に発現させる工程、
を含む、遺伝子修飾された免疫細胞を製造する方法の関する。
本発明のさらなる態様において、本発明は、
（ｃ）ＣＡＲをｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖させる工程をさらに含む、前記の遺伝子修飾された免疫細胞を製造する方法に関する。
本発明のさらなる態様において、本発明は、
本発明の一態様において、本発明のＣＡＲを発現する細胞の製造方法は、前記に記載するＣＡＲをコードするポリペプチドを細胞に導入する工程を包含することを特徴とする。当該工程は生体外（ｅｘ  ｖｉｖｏ）で実施される。例えば、本発明のポリペプチドを含むウイルスベクター又は非ウイルスベクターを利用して、細胞を生体外で形質転換することにより製造することができる。
【００５９】
本発明の方法は、哺乳動物、例えばヒト由来の細胞又はサル、マウス、ラット、ブタ、ウシ、イヌ等の非ヒト哺乳動物由来の細胞が使用できる。本発明の方法に使用される細胞に特に限定はなく、任意の細胞を使用することができる。例えば、血液（末梢血、臍帯血など）、骨髄などの体液、組織又は器官より採取、単離、精製、誘導された細胞を使用することができる。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、免疫細胞［樹状細胞、Ｂ細胞、造血幹細胞、マクロファージ、単球、ＮＫ細胞又は血球系細胞（好中球、好塩基球）］、臍帯血単核球、線維芽細胞、前駆脂肪細胞、肝細胞、皮膚角化細胞、間葉系幹細胞、脂肪幹細胞、各種がん細胞株又は神経幹細胞を使用することができる。本発明においては、特にＴ細胞、Ｔ細胞の前駆細胞（造血幹細胞、リンパ球前駆細胞等）又はこれらを含有する細胞集団の使用が好ましい。Ｔ細胞には、ＣＤ８陽性Ｔ細胞、ＣＤ４陽性Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、又は腫瘍浸潤リンパ球が含まれる。Ｔ細胞及びＴ細胞の前駆細胞を含有する細胞集団には、ＰＢＭＣが含まれる。前記の細胞は生体より採取されたもの、それを拡大培養したもの又は細胞株として樹立されたもののいずれでもよい。製造されたＣＡＲを発現する細胞又は当該細胞より分化させた細胞を生体に移植することが望まれる場合には、その生体自身又は同種の生体から採取された細胞にポリペプチドを導入することが好ましい。
【００６０】
本発明のＣＡＲをコードするポリペプチドをベクターに挿入して、このベクターを細胞に導入することができる。例えば、レトロウイルスベクター（オンコレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、シュードタイプベクターを包含する）、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、シミアンウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター又はセンダイウイルスベクター、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）ベクター、ＨＳＶベクターなどのウイルスベクターが使用できる。上記ウイルスベクターとしては、感染した細胞中で自己複製できないように複製能を欠損させたものが好適である。
【００６１】
また、リポソーム及び国際公開第９６／１００３８号パンフレット、国際公開第９７／１８１８５号パンフレット、国際公開第９７／２５３２９号パンフレット、国際公開第９７／３０１７０号パンフレット及び国際公開第９７／３１９３４号パンフレット（いずれも、出典明示により本明細書の一部とする）に記載されている陽イオン脂質などの縮合剤との併用により、非ウイルスベクターも本発明に使用することができる。更に、リン酸カルシウム形質移入、ＤＥＡＥ−デキストラン、エレクトロポレーション、パーティクルボンバードメントにより細胞に本発明のポリペプチドを導入することができる。
【００６２】
例えばレトロウイルスベクターを使用する場合、ベクターが有しているＬＴＲ配列及びパッケージングシグナル配列に基づいて適切なパッケージング細胞を選択し、これを使用してレトロウイルス粒子を調製して実施することができる。例えばＰＧ１３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１０６８６）、ＰＡ３１７（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−９０７８）、ＧＰ＋Ｅ−８６やＧＰ＋ｅｎｖＡｍ−１２（米国特許第５，２７８，０５６号公報）、Ｐｓｉ−Ｃｒｉｐ［米国科学アカデミー紀要、第８５巻、第６４６０−６４６４頁（１９８８）］のパッケージング細胞が例示される。また、トランスフェクション効率の高い２９３細胞や２９３Ｔ細胞を用いてレトロウイルス粒子を作製することもできる。多くの種類のレトロウイルスを基に製造されたレトロウイルスベクター及び当該ベクターのパッケージングに使用可能なパッケージング細胞は、各社より広く市販されている。
【００６３】
ポリペプチドを細胞に導入する工程で、導入効率を向上させる機能性物質を用いることもできる［例えば、国際公開第９５／２６２００号パンフレット、国際公開第００／０１８３６号パンフレット（いずれも出典明示により本明細書の一部とする）］。導入効率を向上させる物質としては、ウイルスベクターに結合する活性を有する物質、例えばフィブロネクチン又はフィブロネクチンフラグメントなどの物質が挙げられる。好適には、ヘパリン結合部位を有するフィブロネクチンフラグメント、例えばレトロネクチン（ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ、登録商標、ＣＨ−２９６、タカラバイオ社製）として市販されているフラグメントを用いることができる。また、レトロウイルスの細胞への感染効率を向上させる作用を有する合成ポリカチオンであるポリブレン、線維芽細胞増殖因子、Ｖ型コラーゲン、ポリリジン又はＤＥＡＥ−デキストランを使用することができる。
【００６４】
本発明の好適な態様において、前記の機能性物質は適切な固相、例えば細胞培養に使用される容器（プレート、シャーレ、フラスコ又はバッグ等）又は担体（マイクロビーズ等）に固定化された状態で使用することができる。
【００６５】
本発明のＣＡＲを発現する細胞は、前記（３）の製造方法により、前記のＣＡＲをコードするポリペプチドが導入・発現した細胞である。本発明の細胞は、ＣＡＲを介して特定の抗原との結合により細胞内にシグナルが伝達され、活性化される。ＣＡＲを発現する細胞の活性化は、宿主細胞の種類やＣＡＲの細胞内ドメインにより異なるが、例えば、サイトカインの放出、細胞増殖率の向上、細胞表面分子の変化等を指標として確認することができる。例えば、活性化された細胞からの細胞傷害性のサイトカイン（腫瘍壊死因子、リンホトキシンなど）の放出は、抗原を発現する標的細胞の破壊をもたらす。また、サイトカイン放出や細胞表面分子の変化により、他の免疫細胞、例えば、Ｂ細胞、樹状細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ等を刺激する。
【００６６】
ＣＡＲを発現する細胞は疾患の治療剤として使用することができる。該治療剤は、ＣＡＲを発現する細胞を活性成分として含み、さらに、適当な賦形剤を含んでいてもよい。該賦形剤としては、例えば、本発明のポリペプチドを活性成分として含む組成物に関して記載された上述の薬学的に許容できる賦形剤、種々の細胞培養培地、等張食塩水などが挙げられる。ＣＡＲを発現する細胞が投与される疾患としては、当該細胞に感受性を示す疾患であればよく特に限定はないが、例えば、がん［血液がん（白血病）、固形腫瘍など］、炎症性疾患／自己免疫疾患（喘息、湿疹）、肝炎や、インフルエンザ、ＨＩＶなどのウイルス、細菌、真菌が原因となる感染性疾患、例えば結核、ＭＲＳＡ、ＶＲＥ、深在性真菌症が例示される。前記の疾患において減少もしくは消失が望まれる細胞が有している抗原、すなわち腫瘍抗原、ウイルス抗原、細菌抗原等に結合する本発明のＣＡＲを発現する細胞がこれら疾患の治療のために投与される。また、本発明の細胞は、骨髄移植や放射線照射後の感染症予防、再発白血病の寛解を目的としたドナーリンパ球輸注などにも利用できる。ＣＡＲを発現する細胞を活性成分として含む治療剤は、限定するものではないが、非経口投与、例えば、注射又は注入により、皮内、筋肉内、皮下、腹腔内、鼻腔内、動脈内、静脈内、腫瘍内、又は輸入リンパ管内などに投与することができる。本発明の別の形態において、本発明は、前記免疫細胞がドナーから提供される、前記の製造方法にも関する。
【実施例】
【００６７】
例１．ＰＢＭＣｓに導入したＣＤ２６  ＣＡＲの検出
形質導入Ｄａｙ−２に末梢血単核球（ＰＢＭＣｓ）はＣＤ３／ＣＤ２８Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を２５μＬ／１×１０６ｃｅｌｌｓで刺激し、リコンビナントＩＬ−２  ３０Ｕ／ｍＬを添加したＲＰＭＩ１６４０培地（１０％ＦＣＳ）で培養を開始した。形質導入Ｄａｙ１に２４穴ノントリートメントプレートに２０μｇ／ｍｌに調整したレトロネクチン（Ｔａｋａｒａ  ｂｉｏ）を１ｗｅｌｌあたり２００μＬ加え、４℃で１２時間静置した。２％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）５００μＬをｗｅｌｌに加え、３０分室温でブロッキングを行った。２％ＢＳＡ／ＰＢＳでｗｅｌｌを洗浄後、レトロウイルス上清をレトロネクチン処理プレートに加え、２０００×ｇ、３２℃で２時間遠心した。２％ＢＳＡ／ＰＢＳで洗浄し、末梢血単核球（ＰＢＭＣｓ）を５×１０５ｃｅｌｌｓ／１ｍｌ／１ｗｅｌｌずつ加え、５００×ｇ、２２℃で１０分間遠心し、細胞をｗｅｌｌの底面に接着させた。細胞は適宜培地を添加し、導入３日後から適宜フラスコ等に拡大培養した。ＰＢＭＣｓに導入したＣＤ２６ＣＡＲの発現は、導入３日後に細胞をＰＢＳ５０μＬに懸濁し、Ｔａｇ（Ｆｃ）が付加されたリコンビナントＣＤ２６（Ａｂｃａｍ）０．５μＬ（１μｇ／μＬ）を加えたのち２０分室温で静置し、その後ＰＥで蛍光標識された抗Ｆｃ抗体（ＲｏｃｋＬａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ）１μＬを添加し、２０分氷冷後にＦＡＣＳ  Ｃａｎｔ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で検出した。結果はＦｌｏｗ  Ｊｏで解析した。ＣＤ２６  ＣＡＲ  ２ｎｄとＣＤ２６  ＣＡＲ  ３ｒｄのいずれにおいてもＣＤ２６  ＣＡＲが検出された（図２Ａ）。
【００６８】
例２．ＰＢＭＣｓに導入したＣＤ８ＣＡＲの検出
形質導入Ｄａｙ−２に末梢血単核球（ＰＢＭＣｓ）はＣＤ３／ＣＤ２８Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を２５μＬ／１×１０６ｃｅｌｌｓで刺激し、リコンビナントＩＬ−２  ３０Ｕ／ｍＬを添加したＲＰＭＩ１６４０培地（１０％ＦＣＳ）で培養を開始した。形質導入Ｄａｙ１に２４穴ノントリートメントプレートに２０μｇ／ｍｌに調整したレトロネクチン（Ｔａｋａｒａ  ｂｉｏ）を１ｗｅｌｌあたり２００μＬ加え、４℃で１２時間静置した。２％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）５００μＬをｗｅｌｌに加え、３０分室温でブロッキングを行った。２％ＢＳＡ／ＰＢＳでｗｅｌｌを洗浄後、レトロウイルス上清をレトロネクチン処理プレートに加え、２０００×ｇ、３２℃で２時間遠心した。２％ＢＳＡ／ＰＢＳで洗浄し、末梢血単核球（ＰＢＭＣｓ）を５×１０５ｃｅｌｌｓ／１ｍｌ／１ｗｅｌｌずつ加え、５００×ｇ、２２℃で１０分間遠心し、細胞をｗｅｌｌの底面に接着させた。細胞は適宜培地を添加し、導入３日後から適宜フラスコ等に拡大培養した。ＰＢＭＣｓに導入したＣＤ２６ＣＡＲの発現は、導入３日後に細胞をＰＢＳ１００μＬに懸濁し、ＡＰＣで蛍光標識された抗ＣＤ８抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１μＬを添加し、２０分氷冷後にＦＡＣＳ  Ｃａｎｔ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で検出した。結果はＦｌｏｗ  Ｊｏで解析した。
なお、ＣＡＲ導入前のＰＢＭＣｓ  は約３５％がもともとＣＤ８陽性である。ＣＤ８ＣＡＲ２ｎｄもしくはＣＤ８ＣＡＲ３ｒｄの導入によってＧＦＰ陽性となった細胞でＣＤ８ＣＡＲが検出された（図２Ｂ）。
【００６９】
例３．ＣＤ２６ＣＡＲ導入後のＣＤ２６発現
ＣＤ２６ＣＡＲ導入後のＣＤ２６発現は、形質導入後３日目にＡＰＣで標識された抗ＣＤ２６抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を用いて検討した。細胞をそれぞれＰＢＳ１００μＬに懸濁し、ＡＰＣで蛍光標識された抗ＣＤ２６抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）１．０μＬを添加し２０分氷冷した後、ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で検出した。結果はＦｌｏｗ  Ｊｏで解析した。ＣＤ２６ＣＡＲ２ｎｄとＣＤ２６ＣＡＲ３ｒｄのいずれにおいてもＣＤ２６の発現は低下していた（図３Ａ）。
【００７０】
例４．ＣＤ２６ＣＡＲ導入後の細胞増殖
形質導入Ｄａｙ−２に末梢血単核球（ＰＢＭＣｓ）はＣＤ３／ＣＤ２８ｙｎａｂｅａｄｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を２５μＬ／１×１０６ｃｅｌｌｓで刺激し、リコンビナントＩＬ−２  ３０Ｕ／ｍＬを添加したＲＰＭＩ１６４０培地（１０％ＦＣＳ）で培養を開始した。形質導入Ｄａｙ１に２４穴ノントリーメントプレートに１ｗｅｌｌあたりＰＢＭＣｓ５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌを１ｍｌ加えて形質導入した。なお、形質導入しない細胞、ＣＤ８ＣＡＲを形質導入する細胞、ＣＤ２６ＣＡＲを形質導入する細胞は各２ｗｅｌｌずつ形質導入した。適宜リコンビナントＩＬ−２  ３０Ｕ／Ｌを含むＲＰＭＩ１６４０培地（１０％ＦＣＳ）を添加し、Ｄａｙ３に２ｗｅｌｌずつ形質導入していた細胞を回収し、１つのフラスコに拡大し細胞培養した。以後、適宜培地を足して拡大し、Ｄａｙ６にＣＤ３／ＣＤ２８Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ）を１サンプルにつき２５μＬ加えた。ＣＤ２６ＣＡＲ導入後の細胞増殖は、Ｄａｙ１０に細胞数をカウントして比較した。ＣＤ２６ＣＡＲ２ｎｄとＣＤ２６ＣＡＲ３ｒｄのいずれも、ＣＤ８ＣＡＲ２ｎｄやＣＤＣＡＲ  ３ｒｄと同様に増殖した（図４Ａ）。
【００７１】
例５．ＣＤ２６ＣＡＲ導入後のＣＤ６９発現
ＣＡＲ導入後Ｄａｙ１０のＰＢＭＣｓを１×１０５ｃｅｌｌｓ／１００μＬ、ＣＤ２６強制発現Ｊｕｒｋａｔ細胞（ＣＤ２６−Ｊｕｒｋａｔ）を１×１０５ｃｅｌｌｓ／１００μＬにＲＰＭＩ１６４０培地で調整し、９６穴プレートに、それぞれ１ｗｅｌｌあたり１００μＬ加えて１２時間共培養したのち、プレートを４００×ｇ、３分遠心分離した。上清を除去した後、ＡＰＣで蛍光標識された抗ＣＤ６９抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）１μＬを加え、２０分氷冷した後に、ＰＢＳ２００μＬを加えてプレートを４００×ｇ，３ｍｉｎ遠心分離した。遠心分離後、上清を除去しＰＢＳ２００μＬを加え、再度４００×ｇ、３分遠心分離し、上清を除去しＰＢＳ２００μを加えてＦＡＣＳ  Ｃａｎｔ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で検出した。結果はＦｌｏｗ  Ｊｏで解析した。リンパ球の活性化に伴って発現するＣＤ６９は、ＣＤ２６ＣＡＲ２ｎｄとＣＤ２６ＣＡＲ３ｒｄのいずれにおいてもＣＤ６９の発現誘導が認められた（図５Ａ）。
【００７２】
例６．ＣＤ２６ＣＡＲ導入後のＩＦＮ−γ産生
リンパ球の活性化に伴って分泌されるＩＦＮ−γは、Ｈｕｍａｎ  ＩＦＮ−ｇａｍｍａ  Ｄｕｏ  Ｓｅｔ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ）を使用し、プロトコールに沿ってＥＬＩＳＡ法で確認した。まず、ＣＡＲ導入後Ｄａｙ１０のＰＢＭＣｓを１×１０５ｃｅｌｌｓ／１００μＬ、ＣＤ２６強制発現Ｊｕｒｋａｔ細胞（ＣＤ２６−Ｊｕｒｋａｔ）を１×１０５ｃｅｌｌｓ／１００μＬにＲＰＭＩ１６４０培地で調整し、９６穴プレートに、それぞれ１ｗｅｌｌあたり１００μＬ加えて１２時間共培養した。また、ＥＬＩＳＡ前日にプレートに４μｇ／ｍｌになるようにＰＢＳで調整したＣａｐｔｕｒｅ  Ａｂ  １００μＬ  を加えて室温で一晩静置した。上清を除去した後、１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）３００μＬを加えてブロッキングを行い、室温で１時間静置した後、１％ＢＳＡ／ＰＢＳで洗浄した。プレートに細胞培養後の上清１００μＬを加え、２時間静置した後、１％ＢＳＡ／ＰＢＳで洗浄した。１％ＢＳＡ／ＰＢＳで４００ｎｇ／ｍｌとなるよう調整したＤｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｂを１００μＬ加えた後１時間室温で静置し、１％ＢＳＡ／ＰＢＳで洗浄した。Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰを１００μＬ加え、３０分室温で静置した後、１％ＢＳＡ／ＰＢＳで洗浄し、ＴＭＢ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  １００μＬを加えた。３０分室温で静置後、ＴＭＢ  ｓｔｏｐ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ５０μＬを加えて、Ｏ．Ｄ．４５０ｎｍで測定した。ＣＤ２６ＣＡＲ２ｎｄとＣＤ２６ＣＡＲ３ｒｄのいずれにおいてもＩＦＮ−γの分泌が認められた（図６Ａ）。
【００７３】
例７．ＣＤ２６ＣＡＲの抗腫瘍効果（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＣＤ２６ＣＡＲの抗腫瘍効果は、ＣＤ２６ＣＡＲ導入後のＰＢＭＣｓ（エフェクター細胞）を、ルシフェラーゼ遺伝子を導入したＣＤ２６陽性Ｋａｒｐａｓ２９９細胞（ターゲット細胞）と共培養したのち、ルシフェラーゼ活性の測定によりターゲット細胞数を定量した。
【００７４】
まず、ターゲット細胞を１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌにＲＰＭＩ１６４０培地で調整し、９６穴プレートに１００μＬずつ加えた。エフェクター細胞を、Ｅｆｆｅｃｔｏｒ：Ｔａｒｇｅｔ比（Ｅ；Ｔ）を１０：１、５：１、１：１となるように細胞濃度を調整して１００μＬずつ各３ｗｅｌｌに添加した。陰性コントロールとして、Ｅ：Ｔ＝０：１の群として、ＲＰＭＩ１６４０培地１００μＬを各３ｗｅｌｌ添加した。プレートを２４時間培養し、Ｓｔｅａｄｙ  Ｇｒｏ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、プロトコールに沿って確認した。まず、培養後のプレートを４００×ｇ、５分遠心分離し、上清を除去した。ＰＢＳ５０μＬを加えて、よくピペッティングした後、細胞を別プレートに移した。再度４００×ｇ、５分遠心分離した後上清を除去し、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅを２５μＬずつ添加し、５分室温で静置し、Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅを測定した。その結果、エフェクター細胞とターゲット細胞の比１：１において、ＣＤ２６ＣＡＲ３ｒｄの抗腫瘍効果はＣＤ２６ＣＡＲ２ｎｄのそれに優っていた（ｐ＝０．００５）。このことは、エフェクター細胞とターゲット細胞の比５：１においても確認された（ｐ＝０．０１３）。一方、コントロールのＣＤ８  ＣＡＲ  ３ｒｄには、１：１、５：１、１０：１のいずれにおいても細胞傷害性を認めなかったが、ＣＤ８ＣＡＲ２ｎｄはその比が高まるにつれて細胞傷害性を発揮し、１０：１においてはＣＤ８ＣＡＲ３ｒｄとの間に有意差を認めた（ｐ＝０．０１３）。この事は、第２世代ＣＡＲの導入によって活性化したエフェクター細胞は非特異的に細胞を傷害することを意味しており、ＣＤ２６ＣＡＲ２ｎｄがターゲット細胞に発揮する抗腫瘍効果はＣＤ２６の発現によって制御されない可能性、すなわち実臨床においては副作用の可能性を示唆している（図７Ａ）。
【産業上の利用可能性】
【００７５】
本発明は、ＣＤ２６を発現する腫瘍細胞を対象としたＣＡＲ−Ｔ療法を臨床において行うための基礎的な技術となる。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
2022001021.tif 000007
【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【配列表】
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