(57)【要約】      （修正有）【課題】浮遊細胞を培養し、かつ無菌状態を維持した上で空気を持続的に入れ換えることが可能な密閉状態の細胞培養システムを提供する。【解決手段】添加物の浮遊細胞を培養できる密閉式浮遊細胞培養システムは、無菌培養パック１０、コネクタ装置２０、無菌維持装置３０および接続装置４０を備える。無菌培養パック１０は、培養細胞の収容に用いられ、密閉可能な開口部１２を有する。コネクタ装置２０は、一端が無菌培養パック１０の密閉可能な開口部１２に差し込まれる。無菌維持装置３０は、培養システムの末端に装着される。接続装置４０は、コネクタ装置２０と無菌維持装置３０との間に連結されることで、密閉状態の細胞培養空間が形成される。【選択図】図１
0003175393.tif 000002
【実用新案登録請求の範囲】
【請求項１】
添加物の浮遊細胞を培養できる密閉式の細胞培養システムであって、
培養細胞の収容に用いられ、密閉可能な開口部を有する無菌培養パックと、
一端が無菌培養パックの密閉可能な開口部に差し込まれるコネクタ装置と、
当該細胞培養システムの末端に装着される無菌維持装置と、
コネクタ装置と無菌維持装置との間に連結されることで密閉状態の細胞培養空間が形成される接続装置と、
を備えることを特徴とする細胞培養システム。
【請求項２】
無菌培養パックは、可撓性材料から構成されることを特徴とする請求項１に記載の細胞培養システム。
【請求項３】
無菌維持装置は、ウェットフィルムを有することを特徴とする請求項１に記載の細胞培養システム。
【請求項４】
無菌維持装置は、さらに無菌フィルタを有することを特徴とする請求項３に記載の細胞培養システム。
【請求項５】
コネクタ装置と無菌維持装置との間に装着される導流装置をさらに備えることを特徴とする請求項１に記載の細胞培養システム。
【請求項６】
導流装置に接続され、導流装置を介して培養添加物および培養細胞を無菌培養パックに導入し、又は無菌培養パックから導出する補給装置をさらに備えることを特徴とする請求項５に記載の細胞培養システム。
【請求項７】
密閉可能な開口部は、密閉可能な第一開口部および密閉可能な第二開口部を有し、
接続装置は、第一管路および第二管路を有し、
コネクタ装置は、第一コネクタおよび第二コネクタを有し、
第一コネクタは、一端が密閉可能な第一開口部に差し込まれ、他端が第一管路の前端に接続され、
第二コネクタは、一端が密閉可能な第二開口部に差し込まれ、他端が第二管路の前端に接続されることを特徴とする請求項１に記載の細胞培養システム。
【請求項８】
無菌維持装置は、第一管路の末端に接続され、
且つ、第二管路の末端に接続され、培養添加物および培養細胞を無菌培養パックに導入し、又は無菌培養パックから導出する補給装置をさらに備えることを特徴とする請求項７に記載の細胞培養システム。
【請求項９】
補給装置は、蠕動ポンプまたは注射器から構成されことを特徴とする請求項６または請求項８に記載の細胞培養システム。
【請求項１０】
無菌培養パックは、第二管路によって保存装置に直列接続されることで、無菌培養パック内の培養細胞を保存装置に移転することを特徴とする請求項７に記載の細胞培養システム。
【考案の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本考案は、細胞培養システムに関し、詳しくは添加物の浮遊細胞を培養できる密閉式の細胞培養システムに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
再生医学が盛んに発展してきた現在では、特に生物体内の器官の特殊な幹細胞または自己複製（self-renewing）可能な細胞を探る様々な研究が継続的に進行している。自己複製可能な細胞にかかわる研究では、特に造血幹細胞にかかわる研究が最も注目されている。それは癌から代謝性疾患、免疫不全にいたるまで、造血幹細胞移植は新たな治療の選択肢だからである。
【０００３】
造血幹細胞は、骨髄、その周辺血液および臍帯血から採取されることが一般的である。現今、成人の骨髄およびその後方周辺血液および臍帯血移植による人体造血幹細胞は臨床上の血液がん（白血病および悪性リンパ腫）の治療に用いられるだけでなく、非血液がんの高薬量の化学治療によって免疫系を回復することを助ける。
しかしながら、効果的に移植を進めるには、採取源が異なる大量造血幹細胞が必要である。造血幹細胞の移植量が迅速な回復に足りるほど十分であれば、血液および免疫細胞の世代交代を均等に保ち、移植成功率を大幅に向上させることができる。一般的に言えば、造血幹細胞を効果的に移植するには、単核球（ＭＮＣ）の細胞数が８×１０6 ｃｅｌｌ／ｋｇに達し、ＣＤ３４造血幹細胞の細胞数が２×１０4 ｃｅｌｌ／ｋｇに達することが必要である。
【０００４】
臍帯血、周辺血液または骨髄から採集された一単位（パック）の造血幹細胞は細胞数が限られ、体重が２０〜３０ｋｇの人にしか対応できないため、新生児または幼児を対象にする移植に適用できるが、大人を対象にする移植には足りないことが明らかである。従って、効果的な移植量に達するには、体外培養方式で限られた造血幹細胞を増殖させることが必要である。
【考案の概要】
【考案が解決しようとする課題】
【０００５】
現今使用されている体外培養方式は、主に培養トレイまたは培養瓶を用いて培養するものである。この方式は半開放系の培養方式であり、培養細胞を補充または移転する際、培養トレイまたは培養瓶の蓋または栓を開けなければならないため、空気中の微生物が培養トレイまたは培養瓶内に混入し、培養トレイまたは培養瓶内の細胞または培養基を汚染する可能性がある。
一方、市販の血液パックを用いて細胞を体外増殖させる方式は培養環境が密閉状態であるため、培養細胞を補充または移転する際に生じた二次汚染を避けることができる。しかしながら、血液パックの内外の空気を入れ替えることはできないため、細胞の増殖効果に影響を与える。
【０００６】
本考案は、上述した体外培養方式の問題点に鑑み、研究開発精神および専門知識に基づいて添加物を培養できる密閉式培養システムを提供することによって半開放系の培養装置での二次汚染問題を改善し、比較的良好な細胞増殖効果を達成することを目的とする。
具体的には、浮遊細胞（例えば造血幹細胞）を培養し、かつ無菌状態を維持した上で空気を持続的に入れ換えることが可能な密閉状態の細胞培養システムを提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上述の目的を達成するために、本考案による添加物の浮遊細胞を培養できる密閉式の細胞培養システムは、無菌培養パック、コネクタ装置、無菌維持装置および接続装置を備える。無菌培養パックは、培養細胞の収容に用いられ、密閉可能な開口部を有する。コネクタ装置は、一端が無菌培養パックの密閉可能な開口部に差し込まれる。無菌維持装置は、培養システムの末端に装着される。接続装置は、コネクタ装置と無菌維持装置との間に連結されることで密閉状態の細胞培養空間が形成される。
【０００８】
本考案の一実施形態において、無菌培養パックは可撓性材料から構成される。無菌維持装置は、ウェットフィルムを有してもよく、また、無菌フィルタを有してもよい。
【０００９】
本考案の一実施形態において、培養システムはさらに導流装置を備える。導流装置は、コネクタ装置と無菌維持装置との間に装着され、補給装置との連結に用いられる。補給装置は、導流装置によって細胞培養添加物を注入し、かつ無菌培養パックに培養細胞を導入するか、無菌培養パックから培養細胞を導出することができる。
【００１０】
本考案の一実施形態において、無菌培養パックは、密閉可能な第一開口部および密閉可能な第二開口部を有する。接続装置は、第一管路および第二管路を有する。コネクタ装置は、第一コネクタおよび第二コネクタを有する。第一コネクタは、一端が密閉可能な第一開口部に差し込まれ、他端が第一管路の前端に接続される。第二コネクタは、一端が密閉可能な第二開口部に差し込まれ、他端が第二管路の前端に接続される。
【００１１】
さらに、無菌維持装置は第一管路の末端に接続され且つ、第二管路は末端が補給装置に接続され、培養添加物の供給に用いられるか、無菌培養パックに培養細胞を導入したり無菌培養パックから培養細胞を導出したりすることとしてもよい。
また、無菌培養パックは、第二管路によって保存装置に直列接続されることで、無菌培養パック内の培養細胞を保存装置に移転することができる。
【００１２】
本考案の上述した目的、特徴を明確するために以下の実施形態および図面に基づいて詳細な説明を進める。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本考案の第1実施形態による細胞培養システムの構成を示す模式図である。
【図２】本考案の第２実施形態による細胞培養システムの構成を示す模式図である。
【図３】本考案の第３実施形態による細胞培養システムの構成を示す模式図である。
【図４】本考案の第４実施形態による細胞培養システムの構成を示す模式図である。
【考案を実施するための形態】
【００１４】
以下、本考案を複数の実施形態によって説明する。図面および明細書に記載された内容、即ち比較的好ましい実施形態は、本考案を説明するための一例に過ぎない。本考案は、図面および明細書に記載された特定の実施形態に限定されない。
【００１５】
以下、本考案による密閉式浮遊細胞培養システム１を図面に基づいて説明する。
（第1実施形態）
図１は第１実施形態を示す模式図である。第1実施形態による密閉式浮遊細胞培養システム１は、無菌培養パック１０、コネクタ装置２０、無菌維持装置３０および接続装置４０を備える。
【００１６】
無菌培養パック１０は、浮遊細胞および培養基などの培養対象物の収容に用いられ、密閉可能な開口部１２を有する。コネクタ装置２０は、一端が無菌培養パック１０の密閉可能な開口部１２に差し込まれる。無菌維持装置３０は、培養システム１の末端に装着される。接続装置４０は、コネクタ装置２０と無菌維持装置３０との間に連結されることで、密閉状態の細胞培養空間が形成される。
【００１７】
本考案による密閉式浮遊細胞培養システム１において、無菌培養パック１０は収容細胞数に応じ容積の大きさが異なる。また無菌培養パック１０は、可撓性材料、例えば市販の血液パックから構成されることが比較的好ましい。
無菌維持装置３０は、ウェットフィルムを有する。培養システム１の内外の空気は浸透拡散作用によってウェットフィルムを介して入れ替わる。一方、液体は依然として培養システム１内に収容される。
無菌維持装置３０は、さらに無菌フィルタを有することが比較的好ましい。無菌フィルタは孔径が０．２２μｍであり、微生物が培養システム１に混入することを効果的に遮断し、無菌培養状態を維持することができる。
【００１８】
（第２実施形態）
図２は第２実施形態を示す模式図である。第１実施形態との違いは次の通りである。
第２実施形態による密閉式浮遊細胞培養システム１は、さらに導流装置５０を備える。導流装置５０は、コネクタ装置２０と無菌維持装置３０との間に装着される。また導流装置５０は三方弁を採用してもよい。接続装置４０を介してコネクタ装置２０および無菌維持装置３０に接続することができる。また導流装置５０は、Ｙ字型の接続装置４０（図中未表示）から構成されてもよい。
【００１９】
密閉式浮遊細胞培養システム１は、さらに補給装置６０を備える。補給装置６０は導流装置５０に接続される。培養添加物または培養細胞は補給装置６０によって導流装置５０を介して無菌培養パック１０に導入されるか、無菌培養パック１０から導出される。
補給装置６０は、蠕動ポンプまたは注射器から構成されてもよい。
【００２０】
（第３実施形態）
図３は第３実施形態を示す模式図である。上述の実施形態との違いは次の通りである。
無菌培養パック１０の密閉可能な開口部１２は、密閉可能な第一開口部１２ａおよび密閉可能な第二開口部１２ｂを有する。
コネクタ装置２０は、第一コネクタ２２および第二コネクタ２４を有する。第一コネクタ２２は、一端が密閉可能な第一開口部１２ａに差し込まれる。第二コネクタ２４は、一端が密閉可能な第二開口部１２ｂに差し込まれる。
接続装置４０は、第一管路４２および第二管路４４を有する。第一管路４２は、前端が第一コネクタ２２の他端に接続される。第二管路４４は、前端が第二コネクタ２４の他端に接続される。
【００２１】
補給装置６０は第二管路４４の末端に接続され、無菌培養パック１０に培養細胞を導入したり無菌培養パック１０から培養細胞を導出したりすることができる。本実施形態は密閉可能な開口部１２ａ、１２ｂ、コネクタ２２、２４および管路４２、４４の数を培養の需要に応じて増やすことができる。
【００２２】
（第４実施形態）
図４は第４実施形態を示す模式図である。上述の実施形態との違いは次の通りである。
第二管路４４または導流装置５０によって無菌培養パック１０と保存装置７０とを直列接続することができる。保存装置７０は別の無菌培養パックであってもよい。増殖培養された造血肝細胞は第二管路４４を介して無菌培養パック１０から保存装置７０に移動し、造血幹細胞移植に応じることができる。保存装置７０は、培養技術者の要求に応じ、複数の直列接続によって拡充されてもよい。
【００２３】
続いて、異なる培養系統で細胞培養を進め、結果を比べる方式は下記の通りである。
まず冷凍保存された臍帯血の血液サンプルを３７℃の水浴で解凍する。続いて０．１％の重炭酸ナトリウムを含有した０．８３％の塩化アンモニウム（ｐＨ７．０）の臍帯血赤血球ライセート（ＲＢＣ lysis buffer）でサンプル内の赤血球を溶解除去する。続いて、３００ｇの量に対し、５分間の遠心分離を２回から３回（液体の透明度によって調整する）行い、単核球（ＭＮＣ）を採取する。或いは、磁気ビーズで特定対象を分離する方式によってＣＤ３４幹細胞を採取する。
【００２４】
採取した単核球およびＣＤ３４幹細胞を、１０％のＦＢＳを含有したＩＭＤＭ培養基に浮遊させ、続いて５ｎｇ/ｍｌのＩＬ−３、１０ｎｇ/ｍｌのＩＬおよび１５ｎｇ/ｍｌのＳＣＦなどのサイトカインを添加し、続いてそれらを培養トレイ、市販の培養パックおよび本考案による培養システムに保存して細胞培養を行う。
【００２５】
表１は、単核球およびＣＤ３４幹細胞を、異なる培養装置で増殖培養した結果である。実験結果により、培養を三日間進めた後、本考案による培養システムで培養された単核球の数は１５．２０×１０3μｌから３０．２９×１０3μｌに増加し、ＣＤ３４幹細胞の数は２１１から１０５３に増加することが判明した。従って本考案は増殖効果が市販の培養パックより優れるだけでなく、細胞増殖数が培養基で培養した結果に近くなる。
【００２６】
【表１】
0003175393.tif 000003
【００２７】
上述したとおり、単核球およびＣＤ３４幹細胞の培養結果により、本考案による浮遊細胞培養システムは、細胞増殖効果に影響を与えることなく、培養環境に求められた密閉性を達成し、二次汚染を避けることができることが判明した。
【００２８】
以上、本考案は、上記実施形態になんら限定されるものではなく、考案の趣旨を逸脱しない範囲において種々の形態で実施可能である。
【符号の説明】
【００２９】
１    ：密閉式浮遊細胞培養システム、
１０  ：無菌培養パック、
１２  ：密閉可能な開口部、
１２ａ：密閉可能な第一開口部、
１２ｂ：密閉可能な第二開口部、
２０  ：コネクタ装置、
２２  ：第一コネクタ、
２４  ：第二コネクタ、
３０  ：無菌維持装置、
４０  ：接続装置、
４２  ：第一管路、
４４  ：第二管路、
５０  ：導流装置、
６０  ：補給装置、
７０  ：保存装置。
【図１】
0003175393.tif 000004
【図２】
0003175393.tif 000005
【図３】
0003175393.tif 000006
【図４】
0003175393.tif 000007