(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物の角膜を超臨界流体（ＳＣＦ）処理するステップを含む無細胞角膜の製造方法であって、
前記ＳＣＦ処理前に、前記角膜を０．５−４．０ＭのＮａＣｌを含有する塩溶液で少なくとも２４時間処理するステップを含み、
前記製造方法は、前記角膜をプロテアーゼ、キレート剤、洗剤、グリセロール、又はそれらの組み合わせのいずれかで処理するステップを含まず、
前記ＳＣＦ処理は、６０％（ｖｏｌ％）のエタノールの存在下で、約３５０ｂａｒの圧力、４５℃の温度で約８０分間行われることを特徴とする、無細胞角膜の製造方法。
【請求項２】
前記ＳＣＦは、超臨界二酸化炭素（ｓｃＣＯ２）、超臨界亜酸化窒素（ｓｃＮ２Ｏ）、超臨界アルカン、超臨界アルケン、超臨界アルコール、超臨界アセトン、又はそれらの組み合わせのいずれかである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＳＣＦはｓｃＣＯ２又はｓｃＮ２Ｏである請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記動物は、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、サル、又はヒトからなる群より選択される請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記動物はブタである請求項４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、2016年1月8日に出願された米国仮特許出願第62/276238号の優先権を主張し、その内容が参照によりすべて本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本開示は、移植のためのグラフトとして適切な無細胞角膜の製造方法、及び角膜損傷に関連する眼の病状に罹患している被験体を治療するための方法の分野に関する。
【背景技術】
【０００３】
角膜の機能に影響を与える疾患及び病状が多く存在しており、その多くは、手術及び角膜組織の移植を含む矯正処置を必要とする重篤な病状である。ブタ角膜は、ヒト角膜に匹敵する屈折率及びサイズを有するため、ヒト角膜の最も有望な代替物とみなされてきた。しかし、ブタ角膜異種グラフトは、天然角膜との構造及び/又は立体配座上の不一致、及び脱細胞化目的で使用される化学物質や酵素などの残留物質により、受容者宿主において重度の免疫応答(又は移植拒絶)を誘導することが報告されている。
【０００４】
従って、当分野では、角膜を製造するための改良された方法が必要である。該方法によれば、天然角膜の天然構造及び立体配座を保持できると共に、免疫原性物質(例えば、任意の残留細胞物質、化学物質及び/又は酵素)を、このように製造された角膜が移植後に宿主細胞に対して有意な免疫応答及び血管新生を誘発せず、宿主細胞が増殖するための三次元足場として働くことができるレベルに減少できる。
【発明の概要】
【０００５】
本開示は、無細胞角膜の製造及びその使用上の上記問題を克服するために、本発明者らによって創出されたものである。
【０００６】
従って、本開示の第1の態様は、無細胞角膜の製造方法を提供する。該方法は、動物の角膜を超臨界流体(SCF)処理するステップを含む。該方法は、角膜をプロテアーゼ、キレート剤、洗剤、グリセロール、又はそれらの組み合わせのいずれかで処理するステップを含まないことを特徴とする。
【０００７】
いくつかの実施形態によれば、上記方法は、SCF処理前に、角膜を水、又は0.5-4.0MのNaClを含有する塩溶液で少なくとも24時間処理するステップを含む
【０００８】
いくつかの実施形態によれば、共溶媒の存在下で角膜を超臨界流体(SCF)により、約73 - 500barの圧力、30-50℃の温度で約20-120分間処理する。
【０００９】
上記SCFは、超臨界二酸化炭素(ScCO2)、超臨界亜酸化窒素(ScN2O)、超臨界アルカン、超臨界アルケン、超臨界アルコール、超臨界アセトン、又はそれらの組み合わせのいずれかであり得る。一例では、上記SCFはScCO2である。別の例では、上記SCFはScN2Oである。上記共溶媒は、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、イソブタノール、sec-ブタノール、t-ブタノール、及びシクロブタノールからなる群より選択されるC1-4アルコールであり得る。上記共溶媒は、好ましくは、30-100％(v％)のエタノール、より好ましくは、50-98％のエタノール、最も好ましくは60-75％(v％)のエタノールである。
【００１０】
好ましい一実施形態によれば、上記SCF処理は、共溶媒が60％(vol％)のエタノール、温度が約45℃、圧力が約350barである条件で、好ましくは約80分間実施される。
【００１１】
最も好ましくは、本発明の方法は、角膜をプロテアーゼ、キレート剤、洗剤、グリセロール溶液、又はそれらの組み合わせで処理するステップを含まない。
【００１２】
いくつかの実施形態によれば、角膜は、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、サル、又はヒトからなる群より選択される動物から得られる。好ましくは、角膜はブタから得られる。
【００１３】
本開示の第2の態様は、上記方法により製造された無細胞角膜を提供する。
【００１４】
好ましい実施形態によれば、上記無細胞角膜はブタ角膜に由来する。
【００１５】
本開示の第3の態様は、本開示で製造された無細胞角膜を用いて眼の病状に罹患している被験体を治療する方法に関する。該方法は、上記被験体の眼に本発明の無細胞角膜を移植して、眼の病状に関連する角膜損傷を修復するステップを含む。
【００１６】
任意の実施形態において、上記方法は、移植前に本発明の無細胞角膜上で細胞を培養するステップをさらに含む。本発明の無細胞角膜上で培養するのに適した細胞は、角膜内皮細胞、角膜間質細胞、角膜上皮細胞、胚性幹細胞、成体幹細胞からなる群より選択され得る。
【００１７】
本開示のいくつかの実施形態によれば、上記細胞は、自己由来である。
【００１８】
本開示の他の実施形態によれば、上記細胞は、同種異系である。
【００１９】
本開示のいくつかの実施形態によれば、本発明の方法によって治療可能な眼の病状は、フックスのジストロフィー、円錐角膜、格子状角膜ジストロフィー、上皮基底膜ジストロフィー、虹彩角膜内皮症候群、虹彩母斑(コーガン-リース)症候群、チャンドラー症候群、及び本態性虹彩萎縮症からなる群より選択される。
【００２０】
本開示の他の実施形態によれば、上記眼の病状は、単純ヘルペスウイルスにより引き起こされる感染の結果である。
【００２１】
本開示のさらなる実施形態によれば、上記眼の病状は、クラミジア・トラコマチスにより引き起こされる感染の結果である。
【００２２】
本開示のさらなる実施形態によれば、上記眼の病状は、化学熱傷の結果である。
【００２３】
以下、本開示の1つ以上の実施形態の詳細を説明する。本発明の他の特徴及び利点は、詳細な説明及び特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
上記の一般的な説明及び以下の詳細な説明は両方とも例示的なものであり、請求項に記載の本発明のさらなる説明を提供することが意図されることを理解されたい。
【００２５】
添付の図面は、本明細書に組み込まれ、明細書の一部を構成し、本発明の様々な態様の様々な例示的なシステム、方法、及び他の例示的な実施形態を示す。本説明は、添付の図面に照らして以下の詳細な説明を読むとよりよく理解されるであろう。
【００２６】
【図１】図1は、本開示の一実施形態に係る、(A)正常角膜組織及び(B)scCO2処理角膜組織から抽出された可溶性角膜全タンパク質に対するSDS PAGE分析を示す。
【図２Ａ】図2Aは、本開示の一実施形態に係る、正常角膜組織及びscCO2処理角膜組織のI型コラーゲンに対するウエスタンブロット分析である。
【図２Ｂ】図2Bは、本開示の一実施形態に係る、正常角膜組織及びscCO2処理角膜組織のII型コラーゲンに対するウエスタンブロット分析である。
【図３】図3は、40X(A)及び100X(B)の倍率での実施例1.2の無細胞角膜の組織学的染色写真である。
【図４】図4は、本開示の一実施形態に係る、hADCs播種前(A)後(B)の2000Xの倍率での実施例1.2の無細胞角膜のSEM写真である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
添付の図面に関連して以下に提供される詳細な説明は、本実施例の説明として意図されており、本実施例が構築又は利用され得る唯一の形態を表すものではない。
【００２８】
文脈で別途明記示されない限り、単数形「a」、「an」及び「the」は複数の言及を含む。
【００２９】
本発明の広い範囲を示す数値範囲及びパラメーターが近似値であるにもかかわらず、特定の実施例に示された数値は可能な限り正確に報告される。しかし、数値も本質的に、それぞれの試験測定値に見られる標準偏差から必然的に生じる特定の誤差を含む。また、本明細書で使用する「約」という用語は、一般に、所与の値又は範囲の10％、5％、1％又は0.5％以内を意味する。或いは、用語「約」は、当業者によって考慮される場合、平均の許容可能な標準誤差内にあることを意味する。操作例／実施例以外で、又は特に明記しない限り、本明細書中に開示される材料の量、時間、温度、操作条件、量の比などについての、数値範囲、量、値及びパーセンテージの全てが、すべての場合において、用語「約」により修飾されているものと理解されるべきである。したがって、反対のことが示されない限り、本開示及び添付の請求項に記載される数値パラメーターは、所望に応じて変化することのできる近似値である。少なくとも、各数値パラメーターは、報告された有効数字の数に照らして、及び通常の丸め技法を適用することによって、少なくとも解釈されるべきである。
【００３０】
本開示は、とりわけ、新規な無細胞角膜の製造方法、該方法により製造された無細胞角膜、並びに、このようにして製造された無細胞角膜の、眼の障害及び/又は病状を治療するための使用に関する。
【００３１】
本開示の第1の態様は、無細胞角膜の製造方法に関する。該方法では、角膜の天然構造及び立体配座が保持されるため、移植後に宿主組織細胞が増殖するために最適なマイクロ環境を提供できる。 
【００３２】
従って、本発明の方法は、少なくとも動物の角膜を超臨界流体(SCF)処理するステップを含む。該方法は、角膜をプロテアーゼ、キレート剤、洗剤、グリセロール溶液、又はそれらの組み合わせで処理するステップを含まないことを特徴とする。
【００３３】
本発明の方法を開始する前に、いくつかの強膜組織と共に角膜を動物の眼球から除去する。本開示で適用される動物は、ブタ、ウシ、乳牛、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、サル、及びヒト含むが、これらに限定されない。  好ましい一実施形態において、ブタの眼球を組織ホルダーリングで保持し、トレフィンを用いていくつかの強膜組織と共に角膜を眼球から切除した直後、本発明の方法に用いる。
【００３４】
次いで、上記で得られた角膜を脱細胞化処理する。脱細胞化処理は、角膜組織の物理的及び生化学的特性を維持しながら、細胞材料を角膜から除去することにより、角膜組織が組織足場としてより良好に働けることを目的として行われる。従って、角膜を共溶媒の存在下で、超臨界流体(SCF)により約73-500barの圧力、30-50℃の温度で約20-120分間処理する。
【００３５】
上記SCFは、超臨界二酸化炭素(ScCO2)、超臨界亜酸化窒素(ScN2O)、超臨界アルカン、超臨界アルケン、超臨界アルコール、又は超臨界アセトンのいずれかであり得る。一例では、SCFはScCO2である。別の好ましい例では、SCFはScN2Oである。共溶媒は、C1-4アルコールであり得る。該C1-4アルコールは、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、イソブタノール、sec-ブタノール、t-ブタノール、及びサイクルブタノールを含むが、これらに限定されない。いくつかの好ましい例では、共溶媒は、30-100％(v％)のエタノール、例えば、30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99及び100％(vol％)のエタノールである。より好ましくは、共溶媒は、40-98％のエタノール、例えば、40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97及び98％(vol％)のエタノールである。さらに好ましくは、共溶媒は、60-75％(v％)のエタノール、例えば、60, 65, 70及び75％(v％)のエタノールである。最も好ましくは、共溶媒は、60％(v％)のエタノールである。
【００３６】
脱細胞化処理は、以下の条件下で実施される。即ち、圧力が約70-500bar(例えば、70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490及び500bar)、好ましくは、約73 -450bar(例えば、73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440及び450bar)、より好ましくは、約250-400bar(例えば、250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390及び400bar)であり、温度が30-50℃（例えば、30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49及び50℃)、好ましくは、約35-48℃（例えば、35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47及び48℃)であり、時間が約20-120分間（例えば、20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110及び120分間、好ましくは、約30-90分間(例えば、30, 40, 50, 60, 70, 80及び90分間)である。好ましい実施形態において、ステップ(1)の溶液処理角膜を、さらに、60％(v％)のエタノールの存在下でScCO2により約350bar、45 ℃で約80分間処理する。脱細胞化処理後、角膜は透明性を失うか混濁になる。
【００３７】
本発明の方法は、従来方法(例えば、中国特許第104001215B号、及び米国特許第8,313,893B2号)に記載されているように角膜を酵素消化(例えば、プロテアーゼ又はヌクレアーゼによる処理)及び/又はイオンキレート処理(例えば、イオンキレート剤による処理)するステップを含まないことを特徴とする。また、本発明の角膜を洗剤で処理しない。上記酵素消化は、角膜をプロテアーゼ又はヌクレアーゼで処理することを指す。プロテアーゼは、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、キモパパイン、ブロメライン、アクチニダイン、プロテイナーゼA、プロテイナーゼK、ペプチダーゼ、フィシン、カルパイン、カスパーゼ及びそれらの組み合わせ等を含むが、これらに限定されない。上記ヌクレアーゼは、DNAヌクレアーゼ又はRNAヌクレアーゼであり得る。上記イオンキレート処理は、角膜を金属イオンキレート剤で処理することを指す。金属イオンキレート剤は、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、1, 4, 7, 10-テトラアザシクロドデカン-1, 4, 7, 10-四酢酸(DOTA)、1, 4, 7, 10-テトラアザシクロドデカン-1, 4, 7, 1-0-テトラキス（メチレンホスホン酸)(DOTP)、トランス-1,2-ジアミノシクロヘキサン-四酢酸(CDTA)、4,5-ジヒドロキシベンゼン-1, 3-ジスルホン酸(Tiron)、チオウレア、8-ヒドロキシキノリン-5-スルホン酸、3,6-ジスルホ-1,8-ジヒドロキシ-ナフタレン、Eriochromeschwarz T（1-(1-ヒドロキシ-2-ナフチルアゾ)-2-ヒドロキシ-5-ニトロ-4-ナフタレンスルホン酸)、及びプルプリン酸アンモニウムを含むが、これらに限定されない。上記洗剤処理は、角膜を洗剤、特に液体洗剤で処理することを指す。該液体洗剤は、カチオン性(例えば、第四級アンモニウム化合物)、アニオン性(例えば、アルキルベンゼンスルホネート、胆汁酸など)、又は非イオン性(例えば、トゥイーン、トリトン及び/又はブリジシリーズ)である界面活性剤などの両親媒性分子から構成される。さらに、本発明の角膜は、いくつかの従来のプロセスによって必要とされるように、グリセロール溶液に浸漬する必要はない。
【００３８】
任意の実施形態によれば、SCF処理前に、角膜を水又は塩溶液に浸漬して上皮層を除去する。本開示のいくつかの実施形態によれば、上記溶液は、一価の塩を含む。該一価の塩は、塩化リチウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化アンモニウム等を含むが、これらに限定されない。好ましくは、上記塩溶液は、濃度が約0.5-4M(例えば、0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9及び4.0M)、より好ましくは、約1.0-3.5M(例えば、1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4及び3.5M)、最も好ましくは、約1.5Mの塩化ナトリウム溶液である。好ましくは、角膜を1.5MのNaCl溶液（別途に金属キレート剤(例えば、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)が添加されない)中に室温で静かに振とうしながら約24時間浸漬する。他の実施形態において、SCF処理前に、角膜を純水に少なくとも24時間浸漬する。塩溶液又は純水された後、角膜は混濁又は不透明で膨潤しているように見える。水又は塩溶液処理の条件(例えば、処理時間及び/又は塩の濃度)について、当業者であれば、過度の実験をすることなく、処理される各角膜の状態に基づいて容易に調整することができる。他の例では、角膜をKCl溶液(0.5-4M)で少なくとも24時間処理する。
【００３９】
本開示のさらなる態様は、上記の方法により製造された無細胞角膜を提供する。このように製造された無細胞角膜は、天然角膜のコラーゲン線維の完全性を保持し、宿主に対して免疫原性であり得る細胞物質を欠くため、移植後その宿主に望ましくない移植後応答を誘発することなく、宿主細胞が無細胞角膜上を増殖する、宿主細胞(特に角膜に由来の細胞)に対して優れたグラフトとして働ける。
【００４０】
本開示のさらなる態様は、眼疾患に罹患している被験体を治療する方法に関する。該方法では、被験体は無細胞角膜のグラフトから利益を得ることができる。無細胞角膜のグラフトは、細胞(例えば、角膜に由来の細胞)がそこを増殖することを可能にし、疾患、感染、又は事故(例えば、化学熱傷)に起因される角膜損傷を修復することができる。
【００４１】
本態様の方法は、無細胞角膜を被験体の眼に移植して眼の病状に関連する角膜損傷を修復することを含む。
【００４２】
上記の方法によって製造された無細胞角膜は、細胞が増殖するための生物学的足場として適用され得る。任意の実施形態において、本開示の無細胞角膜は、移植に使用される前に、予めインビトロで細胞培養され得る。細胞は、当該分野で公知の任意の細胞培養方法に従って培養することができる。そこで培養可能な細胞の例は、角膜に由来の細胞(例えば、角膜内皮細胞、角膜間質細胞、及び角膜上皮細胞)、胚性幹細胞、及び成体幹細胞を含むが、これらに限定されない。さらに、上記細胞は、自己由来(即ち、無細胞角膜をグラフトとして受けた宿主に由来するもの)又は同種異系(即ち、宿主以外の被験体に由来するもの)であり得る。
【００４３】
本発明の無細胞角膜は、適切な細胞で培養された後、角膜移植を必要とする、角膜損傷に関連する眼の病状に罹患している宿主に移植することができる。角膜損傷に関連する眼の病状は、疾患、感染又は事故に起因し得る。
【００４４】
いくつかの実施形態によれば、眼の病状は、フックスのジストロフィー、円錐角膜、格子状角膜ジストロフィー、上皮基底膜ジストロフィー、虹彩角膜内皮症候群、虹彩母斑(コーガン-リース)症候群、チャンドラー症候群、及び本態性虹彩萎縮症からなる群より選択される。フックスのジストロフィーは、内皮細胞の死亡に起因し、その結果、間質からの液体の除去が非効率となり、角膜が腫脹して視覚が歪み、最終的に、上皮層が腫脹して眼球が異常に湾曲し、視覚がさらに歪む。円錐角膜は、角膜の漸進的な薄化をもたらす障害であり、角膜が徐々に外側に膨らみ、異常な湾曲を生じる。本発明の方法によって治療可能な別の疾患は、格子状角膜ジストロフィーである。格子状角膜ジストロフィーは、アミロイド沈着物又は異常なタンパク質繊維の間質での蓄積を引き起こし、その結果、混濁度が上昇して視力が低下する。重度の症例では、外部上皮層の浸食が起こり、角膜移植を必要とする上皮浸食として知られる状態が生じる。上皮基底膜ジストロフィーは、コガンのジストロフィーとしても知られており、前角膜に影響を与える退化性疾患であり、視力の低下及び/又は再発性角膜侵食を招く特徴的なスリットランプの所見を引き起こす。 虹彩角膜内皮症候群は、女性において一般的であり、虹彩の色の変化、角膜腫脹及び緑内障の発症をもたらす。この症候群は、3つの関連した病状（即ち、虹彩母斑症候群、チャンドラー症候群、本態性虹彩萎縮症)の群によって定義される。しかし、この群の疾患の共通の特徴は、内皮細胞の角膜から虹彩への移動である。角膜の内皮細胞の損失は、角膜腫脹及び視覚の歪みを伴う虹彩変形を引き起こす。
【００４５】
他の実施形態において、角膜損傷に関連する眼の病状は、いくつかの病原体によって引き起こされ、例えば、単純ヘルペスウイルに起因するウイルス感染、又はクラミジア・トラコマチスに起因する細菌感染である。
【００４６】
さらなる実施形態において、角膜損傷に関連する眼の病状は、酸系化学物質(例えば、電池中における塩酸、硫酸)及び/又は塩基性化学物質(例えば、ライム、オーブンクリーナー、アンモニア)によって引き起こされる化学熱傷等の自己に起因する。重度の症例では、角膜は、角膜移植のみにより改善できるほど瘢痕化する。
【００４７】
本開示の好ましい実施形態によれば、本発明の方法によって製造された無細胞角膜は、角膜移植が必要とされる程度まで眼が傷ついている動物(即ち、ウサギ)の負傷した眼に直接適用される。。この実施形態において、無細胞角膜には上皮細胞が接種されていない。移植後、被験動物(即ち、ウサギ)の傷ついた目が完全に回復（即ち、傷ついた角膜の完全性が回復)することができる。 
【００４８】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。これらの実施例は、典型的に使用されるものであるが、その代わりに、当業者に知られている他の手順、方法、又は技術が使用されることができる。
【００４９】
実施例
【００５０】
実施例1  無細胞ブタ角膜の製造及び特性分析
【００５１】
1.1 無細胞ブタ角膜の製造
【００５２】
-20℃で保存した凍結した有核ブタの眼を、室温で3分間未満解凍した後、組織ホルダーによってクランプして所定位置に保持した。トレフィン（18mm)を用いて角膜及び強膜の一部を眼から切除した。切除した角膜を1.5MのNaCl又は水のみ(即ち、塩、キレート剤、又はプロテアーゼのいずれかも添加されない)を含む容器（7cm×5cm×4cm)に浸した。次いで、容器全体を室温で100rpmの速度で24時間穏やかに振盪し、上皮層（約50μm)を切除した。この段階で、NaCl又は水で処理した角膜は、腫脹し、混濁(即ち、不透明)であるように見えた。
【００５３】
NaCl又は水で処理された角膜を組織ホルダーに置き、そしてScCO2システム(Helix SFE Version R3U, Applied Separations Inc(Allentown, PA, USA))の容器（10mLのエタノール(75％)含有)に入れた。次いで、ScCO2システムを、圧力120bar、温度38℃で60分間操作(即ち、静的及び動的ScCO2処理)して無細胞角膜を製造した。
【００５４】
次いで、無細胞角膜を使用するまで滅菌状態で保存した。
【００５５】
1.2 無細胞ブタ角膜の製造
【００５６】
この実施例において、ScCO2システムを圧力350bar、温度45℃で80分間操作(即ち、静的及び動的ScCO2処理)して無細胞角膜を製造した以外、実施例1.1に記載の手順と同様に、無細胞ブタ角膜を製造した。
【００５７】
このようにして得られた無細胞角膜を、使用するまで無菌状態で保存した。
【００５８】
1.3  実施例1.2の無細胞ブタ角膜の特性分析
【００５９】
標準プロトコルに従って、ヘマトキシリン・エオジン染色(H&E染色)、4', 6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)染色、及びSDS-page分析により、実施例1.2の細胞角膜を分析した。
【００６０】
DAPI染色の定量的な結果は、正常角膜が比較的高いレベルのDNAカウントを有することを示した。測定されたDNA量は37.29 ± 5.3(ng/mg)であり、実施例1.2の無細胞角膜のDNA量はわずか11.51 ± 0.74(ng/mg)であった。それにより、本発明のScCO2処理が角膜組織から細胞物質を除去するのに有効であることが示唆された。
【００６１】
SDS PAGE分析は、また、ScCO2処理後の実施例1.2の角膜に残ったタンパク質が、ウエスタンブロット(図2B)により確認されたように、コラーゲン(図1)、特に、I型コラーゲンであることを確認した。
【００６２】
図3は、それぞれ40X(パネルA)及び100X(パネルB)の倍率での実施例1.2の角膜のH&E染色の写真である。実施例1.2の角膜は、比較的インタクトな繊維構造を有するため、移植後に細胞が増殖するための生物学的足場として働けることが明らかである。
【００６３】
実施例2:実施例1.2の無細胞ブタ角膜でのヒト脂肪細胞(hADC)の再増殖 
【００６４】
2.1  hADCの単離
【００６５】
脂肪吸引手術を受けた患者から取得した脂肪組織からヒト脂肪細胞(hADC)を単離した。簡単に言えば、約50gの脂肪組織を過剰量のリン酸緩衝生理食塩水(PBS)ですすいで、残留赤血球を除去した。完全にすすがれた脂肪組織をPBSに懸濁し、遠心分離した後、上層を回収した。遠心分離を再度行い、上層を回収し、回収した上層を均一に複数の部分に分けた。脂肪組織の各部分を、40 mLダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)（コラゲナーゼ(1mg/mL)、N-アセチル-システイン(NAC)(2 mM)、及びL-アスコルビン酸2-リン酸(0.2 mM)を含む)を含有する別のクリア試験管に移した。試験管を37℃で一晩培養した後、遠心分離を行い、コラゲナーゼ含有上層を除去した。各管のペレットを回収し、5％CO2でDMEM(10％ウシ胎仔血清(FBS)、NAC(2mM)、及びL-アスコルビン酸2-リン酸(0.2 mM)を含有)中で培養した。翌日、付着していない細胞をPBSですすぎ、さらに5mLのK-NACを加えた。培地をコンフルエンスまで(約一週間)2日ごとに交換した。トリプシン処理により細胞を回収し、使用するまで液体窒素中で保存した。
【００６６】
2.2  実施例1.2の無細胞ブタ角膜は、hADCの増殖を支持する。
【００６７】
接種前に、実施例1.2の無細胞ブタ角膜を抗生物質の混合物(ペニシリン、ストレプトマイシン及びアンホテリシンB)を含有する70％のグリセロール溶液に3日浸漬した。抗生物質の混合物を含有するPBSで十分に洗浄した後、実施例2.1の約1x104のhADCを接種し、角膜を14日培養した。1、3、7、14日目にそれぞれ角膜の少量のサンプルを採取し、H&E染色及びSEM分析を行った。1つの代表的な結果を図4に示す。
【００６８】
図4のSEM写真は、それぞれ実施例1.2の無細胞角膜を、hADC接種前(図4A)及び接種後の7日目(図4B)に撮影したものである。実施例1.2の無細胞ブタ角膜は、hADCの増殖を支持する足場として作用することが明らかである。
【００６９】
実施例3:角膜異種移植モデルにおける、実施例1.2の無細胞ブタ角膜の使用
【００７０】
角膜異種移植モデルにおいて、移植を必要とする眼の病状の修復に対する実施例1.2の無細胞ブタ角膜の影響を評価した。
【００７１】
この目的のために、試験動物としてニュージーランドホワイトウサギ(Livestock Research Institute, Council of Agriculture, Executive Yuan)を使用し、研究用動物の使用ガイドラインに従って厳格に飼養した。ランダムに1つの眼に角膜移植を行う。体重2.0~3.0kgのウサギを0.5~0.7mL / kgの齧歯類カクテル(100mg / mLケタミン、20mg / mLキシラジン、及び10mg / mLアセプロマジン)の筋肉内注射により麻酔する。塩酸プロパラカインの局所麻酔薬(0.5％Ophthaine, Bristol-Myers Squibb)を、シクロペントラート点眼剤(1％,Cycloygl（登録商標), Alcon, Ft. Worth, Tex.)及びフェニレフリン(10.0％CibaVision, Duluth, Ga.)と共に動物の眼に注入して、瞳孔の最大拡張を達成する。全ての操作は、操作顕微鏡下で行われる。DALK(深層層状角膜移植)手術により、角膜に約5mmの創傷を生成した。次いで、実施例1.2の無細胞角膜(直径が約6mm)を創傷に覆い、10-0のナイロン縫合糸を用いて角膜に縫合した。1％プレドニゾロンを含有する局所点眼剤を1日3回で7〜10日間眼に投与した。手術3週間後、眼をフルオレセインで染色し、角膜の完全性を評価した。1,5,11,14及び21日目に、それぞれ眼の画像を撮影した。実験の終わりに、動物を犠牲にし、実施例1.2の移植角膜上で新たに増殖した上皮細胞について染色した。
【００７２】
驚くほど意外なことに、DALK手術、次いで、実施例1.2の無細胞角膜の移植を受けたウサギは、角膜の完全性を回復することができ、隣接領域(即ち、無傷領域)から新たに遊走した上皮細胞が、移植された角膜グラフト上で増殖することが見出された。
【００７３】
実施形態の上記の説明が単なる例として与えられており、当業者によって様々な変更がなされ得ることが理解されるだろう。上記の明細書、実施例及びデータは、本発明の例示的な実施形態の構造及び使用の完全な説明を提供する。本発明の様々な実施形態が、ある程度具体的に、又は1又は複数の個々の実施形態を参照して、上述されているが、当業者は、本発明の精神又は範囲から逸脱することなく、開示された実施形態に多数の変更を行うことができる。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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