(57)【要約】      （修正有）【課題】抗癌関連非腫瘍細胞剤を提供する。【解決手段】ｐ５３遺伝子を含む腫瘍溶解ウイルスを含む抗癌関連非腫瘍細胞剤、例えば、テロメラーゼ逆転写酵素プロモーター、Ｅ１Ａ遺伝子、ＩＲＥＳ配列、及びＥ１Ｂ遺伝子を含む第一の遺伝子カセット、並びにプロモーター、及びｐ５３遺伝子を含む第二の遺伝子カセットを含む組み換えウイルスを含む抗癌関連非腫瘍細胞剤を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
p53遺伝子を含む腫瘍溶解ウイルスを含む、抗癌関連非腫瘍細胞剤。
【請求項２】
テロメラーゼ逆転写酵素プロモーター、E1A遺伝子、IRES配列、及びE1B遺伝子を含む第一の遺伝子カセット、並びに
プロモーター、及びp53遺伝子を含む第二の遺伝子カセット
を含む組み換えウイルスを含む、抗癌関連非腫瘍細胞剤。
【請求項３】
組み換えウイルスが腫瘍溶解ウイルスである、請求項２に記載の抗癌関連非腫瘍細胞剤。
【請求項４】
第一の遺伝子カセットが、テロメラーゼ逆転写酵素プロモーター、E1A遺伝子、IRES配列、及びE1B遺伝子をこの順に含む、請求項２又は３に記載の抗癌関連非腫瘍細胞剤。
【請求項５】
第二の遺伝子カセットにおけるプロモーターがEgr1プロモーターである、請求項２〜４のいずれか一項に記載の抗癌関連非腫瘍細胞剤。
【請求項６】
癌関連非腫瘍細胞が、癌関連線維芽細胞である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗癌関連非腫瘍細胞剤。
【請求項７】
ウイルスが組み換えアデノウイルスである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗癌関連非腫瘍細胞剤。
【請求項８】
ウイルスが、癌関連非腫瘍細胞を傷害することにより癌を治療及び／又は予防する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗癌関連非腫瘍細胞剤。
【請求項９】
癌が、膵臓癌又は胃癌である、請求項８に記載の抗癌関連非腫瘍細胞剤。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗癌関連非腫瘍細胞剤を含む、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウイルスを含む抗癌関連非腫瘍細胞剤、及び抗癌関連非腫瘍細胞剤を含む医薬組成物等に関する。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍微小環境は、腫瘍の増殖、進行、浸潤、転移、血管新生、代謝、免疫抑制及び化学療法抵抗性等において重要な役割を果たすと考えられている。腫瘍微小環境は、癌関連非腫瘍細胞及び細胞外マトリックス等で構成され、癌関連非腫瘍細胞には、腫瘍関連線維芽細胞（Cancer-associated fibroblast、CAF）、腫瘍関連マクロファージ、免疫炎症細胞、及び間葉系幹細胞等が含まれる。
【０００３】
上記の通り、腫瘍微小環境は腫瘍の増殖等に関与することから、腫瘍微小環境を構成する癌関連非腫瘍細胞を傷害する薬剤は、癌の治療及び／又は予防に用い得ると考えられる。また、腫瘍微小環境は薬剤抵抗性等にも関与することから、癌関連非腫瘍細胞を傷害する薬剤は、薬剤抵抗性を有する癌等において、抗癌剤の効果を高めるためにも用いられ得ると考えられる。
【０００４】
しかしながら、これまでのところ有効な抗癌関連非腫瘍細胞剤は知られていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
一実施形態において、本発明は、抗癌関連非腫瘍細胞剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、p53遺伝子を含む腫瘍溶解ウイルス、並びにテロメラーゼ逆転写酵素プロモーター、E1A遺伝子、IRES配列、及びE1B遺伝子を含む第一の遺伝子カセット、並びにプロモーター、及びp53遺伝子を含む第二の遺伝子カセットを含む組み換えウイルスが、癌関連非腫瘍細胞を傷害することを見出し、本発明を完成させた。
【０００７】
本発明は、以下の実施形態を包含する。
（１）p53遺伝子を含む腫瘍溶解ウイルスを含む、抗癌関連非腫瘍細胞剤。
（２）テロメラーゼ逆転写酵素プロモーター、E1A遺伝子、IRES配列、及びE1B遺伝子を含む第一の遺伝子カセット、並びに
プロモーター、及びp53遺伝子を含む第二の遺伝子カセット
を含む組み換えウイルスを含む、抗癌関連非腫瘍細胞剤。
（３）組み換えウイルスが腫瘍溶解ウイルスである、（２）に記載の抗癌関連非腫瘍細胞剤。
（４）第一の遺伝子カセットが、テロメラーゼ逆転写酵素プロモーター、E1A遺伝子、IRES配列、及びE1B遺伝子をこの順に含む、（２）又は（３）に記載の抗癌関連非腫瘍細胞剤。
（５）第二の遺伝子カセットにおけるプロモーターがEgr1プロモーターである、（２）〜（４）のいずれかに記載の抗癌関連非腫瘍細胞剤。
（６）癌関連非腫瘍細胞が、癌関連線維芽細胞である、（１）〜（５）のいずれかに記載の抗癌関連非腫瘍細胞剤。
（７）ウイルスが組み換えアデノウイルスである、（１）〜（６）のいずれかに記載の抗癌関連非腫瘍細胞剤。
（８）ウイルスが、癌関連非腫瘍細胞を傷害することにより癌を治療及び／又は予防する、（１）〜（７）のいずれかに記載の抗癌関連非腫瘍細胞剤。
（９）癌が、膵臓癌又は胃癌である、（８）に記載の抗癌関連非腫瘍細胞剤。
（１０）（１）〜（９）のいずれかに記載の抗癌関連非腫瘍細胞剤を含む、医薬組成物。
（１１）p53遺伝子を含む腫瘍溶解ウイルスを被験体に投与することを含む、癌関連非腫瘍細胞を傷害する方法。
（１２）テロメラーゼ逆転写酵素プロモーター、E1A遺伝子、IRES配列、及びE1B遺伝子を含む第一の遺伝子カセット、並びに
プロモーター、及びp53遺伝子を含む第二の遺伝子カセット
を含む組み換えウイルスを被験体に投与することを含む、癌関連非腫瘍細胞を傷害する方法。
（１３）組み換えウイルスが腫瘍溶解ウイルスである、（１２）に記載の方法。
（１４）第一の遺伝子カセットが、テロメラーゼ逆転写酵素プロモーター、E1A遺伝子、IRES配列、及びE1B遺伝子をこの順に含む、（１２）又は（１３）に記載の方法。
（１５）第二の遺伝子カセットにおけるプロモーターがEgr1プロモーターである、（１２）〜（１４）のいずれかに記載の方法。
（１６）癌関連非腫瘍細胞が、癌関連線維芽細胞である、（１１）〜（１５）のいずれかに記載の方法。
（１７）ウイルスが組み換えアデノウイルスである、（１１）〜（１６）のいずれかに記載の方法。
（１８）ウイルスが、癌関連非腫瘍細胞を傷害することにより癌を治療及び／又は予防する、（１１）〜（１７）のいずれかに記載の方法。
（１９）癌が、膵臓癌又は胃癌である、（１８）に記載の方法。
（２０）ウイルスが、医薬組成物として投与される、（１１）〜（１９）のいずれかに記載の方法。
【０００８】
本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2020-106251号の開示内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図1は、実施例で用いた組み換えアデノウイルスの模式図である。図1Aは、OBP-702の模式図を示す。OBP-702は、E1遺伝子を欠失しており、その位置にhTERT-p、E1A、IRES、及びE1Bを含む遺伝子カセットを含む。また、OBP-702は、E3遺伝子を欠失しており、その位置にマウスEgr1プロモーター（Egr1-p）及びp53を含む遺伝子カセットを含む。図1Bは、OBP-301の模式図を示す。OBP-301は、E1遺伝子を欠失しており、その位置にhTERT-p、E1A、IRES、及びE1Bを含む遺伝子カセットを含む。図1Cは、Ad-p53の模式図を示す。Ad-p53は、E1及びE3遺伝子を欠失しており、E1遺伝子の位置にCMV-p及びp53を含む遺伝子カセットを含む。
【図２】図2は、線維芽細胞（FEF3又はGF）を、癌調製培地（CM）又はTGF-βで処置することにより調製したCAFモデルにおけるウェスタンブロッティングの結果（A）、及び免疫染色の結果（B）を示す。
【図３】図3は、正常胃線維芽細胞（GF）及びCAFモデル細胞（TGF-β活性化GF）に対する、OBP-702（A）及びパクリタキセル（PTX）（B）による処置後の細胞生存率を示す。
【図４】図4は、CAFモデル細胞の各種タンパク質の発現（A）及びIL-6（B）の産生に対するOBP-702の効果を、ウェスタンブロッティング（A）及びELISA（B）により測定した結果を示す。
【図５】図5は、CAF臨床検体（A）及び正常線維芽細胞（NF）（B）に対するOBP-702、OBP-301、PTX、Ad-p53による処置後の細胞生存率を示す。
【図６】図6Aは、膵星細胞（hPSC-5又はhPSC-14）を膵臓癌細胞（Panc-1、MIAPaCa-2、BxPC-3、又はCapan-1）により調製した癌調製培地で処置することにより得られたCAFモデルの細胞増殖アッセイの結果を示す。図6Bは、膵星細胞をPanc-1、MIAPaCa-2、BxPC-3、又はCapan-1により調製した癌調製培地で処置することにより得られたCAFモデルをOBP-301又はOBP-702で処置した後の細胞生存率を示す。
【図７】図7は、膵星細胞を、Panc-1の癌調製培地で処置することにより調製したCAFモデルに対してOBP-702を投与した際の各種タンパク質発現の変化を検出したウェスタンブロッティングの結果を示す。
【図８】図8Aは、膵星細胞をTGF-βで処置することにより得られたCAFモデルの細胞増殖アッセイの結果を示す。図8Bは、膵星細胞をTGF-βで処置することにより得られたCAFモデルをOBP-301又はOBP-702で処置した後の細胞生存率を示す。
【図９】図9Aは、膵星細胞（hPSC-5又はhPSC-14）を膵臓癌細胞（Panc-1、MIAPaCa-2、BxPC-3、又はCapan-1）により調製した癌調製培地で処置することにより得られたCAFモデルをAdDL312又はAd CMVp53で処置した後の細胞生存率を示す。図9Bは、膵星細胞をTGF-βで処置することにより得られたCAFモデルをAdDL312又はAd CMVp53で処置した後の細胞生存率を示す。
【図１０】図10は、膵星細胞（hPSC-5又はhPSC-14）を、TGF-βで処置することにより得られたCAFモデルに対してOBP-702を投与した際の各種タンパク質発現の変化を検出したウェスタンブロッティングの結果を示す。
【図１１】図11は、膵星細胞（hPSC-5又はhPSC-14）を、TGF-β阻害剤を含むPanc-1の癌調製培地で処置することにより調製したCAFモデルにおけるウェスタンブロッティングの結果（A）及び細胞生存率（B）を示す。
【図１２】図12は、3D培養組織におけるウイルス投与後のp53発現の観察結果（A）、及び腫瘍塊の変化を長径で評価した結果（B）を示す。
【図１３】図13は、3D培養組織におけるTUNEL発現の観察結果（A）、及びその定量結果（B）を示す。
【図１４】図14は、BxPC-3 mono-injection、BxPC-3+hPSC-14 co-injection皮下腫瘍モデルを作製した際の、腫瘍体積の比較結果（A）、腫瘍の写真及び腫瘍の重さの測定結果（B）、並びに腫瘍の倍数変化（C）を示す。
【図１５】図15は、BxPC-3+hPSC-14 co-injectionモデルに対して、Mock、OBP-301、OBP-702を投与した際の、腫瘍増殖を比較した結果（A）、並びに腫瘍の写真及び腫瘍の重さの測定結果（B）を示す。
【図１６】図16は、BxPC-3+hPSC-14 co-injectionモデルに対して、Mock、OBP-301、OBP-702を投与した際の、p53発現の観察結果（A）、及びその定量結果（B）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
一実施形態において、本発明は、p53遺伝子（及び任意に本明細書に記載のプロモーター）を含む腫瘍溶解ウイルス（例えば、組み換えウイルス）を含む、又はからなる、抗癌関連非腫瘍細胞剤に関する。
【００１１】
一実施形態において、本発明は、第一の遺伝子カセット及び第二の遺伝子カセットを含む組み換えウイルスを含む、又はからなる、抗癌関連非腫瘍細胞剤に関する。
【００１２】
以下、p53遺伝子を含む腫瘍溶解ウイルス、及び第一の遺伝子カセット及び第二の遺伝子カセットを含む組み換えウイルスを、単に「本明細書に記載のウイルス」とも記載する。
【００１３】
＜1．第一の遺伝子カセット＞
一実施形態において、本明細書に記載のウイルスは、下記第二の遺伝子カセットに加えて、又は第二の遺伝子カセットとは別に、第一の遺伝子カセットを含む。ウイルスが第二の遺伝子カセットを含まない場合にも、便宜的に当該遺伝子カセットを「第一の遺伝子カセット」と記載する。第一の遺伝子カセットは、テロメラーゼ逆転写酵素プロモーター、E1A遺伝子、IRES配列、及びE1B遺伝子を含む。
【００１４】
一実施形態において、本明細書に記載の組換えウイルスは、テロメラーゼ逆転写酵素のプロモーターにより、E1A遺伝子、IRES配列及びE1B遺伝子が駆動され得る。腫瘍細胞においてはテロメラーゼ逆転写酵素のプロモーターが活性化し、これにより本明細書に記載の組換えウイルスが増殖し得る。その結果、腫瘍細胞内では、ウイルス増殖による細胞傷害が起こり、これにより、テロメラーゼ逆転写酵素のプロモーターを有する組換えウイルスは腫瘍細胞を特異的に死滅させることができる。
【００１５】
テロメラーゼ逆転写酵素（TERT）プロモーターとしては、哺乳類動物由来のものを使用することができる。例えば、ヒト、マウス、ラット、又はウシ等に由来するTERTプロモーターを使用することができる。ヒトを含む哺乳類動物のTERTプロモーターはクローニングされており、その配列情報は、NCBI、GenBank等のデータベースから入手可能である。TERTプロモーターとしては、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素プロモーター（hTERTプロモーター）が好ましい。
【００１６】
hTERTは、その5'末端の上流1.4kbpの領域で、多くの転写因子結合配列が確認されており、その領域がhTERTプロモーターと考えられるが、中でも、翻訳開始部位の上流181bpの配列が下流の遺伝子発現に重要なコア領域である。hTERTプロモーターとして、このコア領域を含む配列を使用することができ、例えばこのコア領域を完全に含む上流378bp程度の配列をhTERTプロモーターとして使用することができる。この378bp程度の配列は、181bpのコア領域単独の場合と比べて、その遺伝子発現効率が同等であることが確認されている。455bpの長さのhTERTプロモーターの塩基配列を配列番号1に示す。また、181bpのコア領域の塩基配列を配列番号5に示す。
【００１７】
TERTプロモーターとしては、配列番号1又は5に示される塩基配列を含むヌクレオチドのほか、（a）配列番号1又は5に示される塩基配列を含むヌクレオチドに対し相補的な塩基配列を含むヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするヌクレオチド、（b）配列番号1又は5に示される塩基配列に対して80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、98％以上、又は99％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチド、（c）配列番号1又は5に示される塩基配列において、一又は数個の塩基が付加、欠失又は置換された塩基配列を含むヌクレオチドも用いることができる。前記（a）〜（c）のヌクレオチドは、TERTプロモーター活性を有することが好ましい。
【００１８】
本明細書において、「ストリンジェントな条件」としては、例えば、1×SSC〜2×SSC、0．1％〜0．5％SDS及び42℃〜68℃の条件が挙げられ、より詳細には、1×SSC〜2×SSC、0．1％〜0．5％SDS、60〜68℃で30分以上プレハイブリダイゼーションを行った後、2×SSC、0．1％SDS中、室温で5〜15分の洗浄を4〜6回行う条件が挙げられる。ハイブリダイゼーション法の詳細な手順は公知であり、例えば、「Molecular Cloning, A Laboratory Manual 4th ed．」（Cold Spring Harbor Laboratory  (2012)）等を参照することができる。
【００１９】
本明細書において、塩基の「配列同一性」とは、2つの配列を整列（アラインメント）し、必要に応じてギャップを導入して、両者の一致度が最も高くなるようにしたときの、2つの配列間での同一塩基の割合（%）をいう。
【００２０】
本明細書において「数個」とは、例えば2〜10個、2〜7個、2〜5個、2〜3個又は2個を意味する。
【００２１】
E1A遺伝子及びE1B遺伝子は、アデノウイルスのE1遺伝子に含まれる遺伝子である。E1遺伝子とは、ウイルスの有するDNA複製に関する初期遺伝子（early：E）と後期遺伝子（late：L）のうちの初期遺伝子の一つを意味し、ウイルスゲノムの転写の制御に係わるタンパク質をコードしている。E1A遺伝子によりコードされるE1Aタンパク質は、感染可能なウイルス産生に必要な遺伝子群（E1B、E2、E4等）の転写を活性化する。E1B遺伝子によりコードされるE1Bタンパク質は、後期遺伝子（L遺伝子）のmRNAが、感染した宿主細胞の細胞質へ蓄積するのを助け、宿主細胞のタンパク質合成を阻害することで、ウイルスの複製を促進する。E1A遺伝子、E1B遺伝子の塩基配列を、それぞれ配列番号2及び配列番号3に示す。E1A遺伝子及びE1B遺伝子としては、配列番号2又は3に示される塩基配列を含むヌクレオチドのほか、（a）それぞれ配列番号2又は3に示される塩基配列を含むヌクレオチドに対し相補的な塩基配列を含むヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするヌクレオチド、（b）それぞれ配列番号2又は3に示される塩基配列に対して80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、98％以上、又は99％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチド、（c）それぞれ配列番号2又は3に示される塩基配列において、一又は数個の塩基が付加、欠失又は置換された塩基配列を含むヌクレオチドも含まれる。前記（a）〜（c）のヌクレオチドは、E1A活性又はE1B活性を有するタンパク質をコードすることが好ましい。
【００２２】
IRES（Internal Ribosome Entry Site）とは、ピコルナウイルス科に特異的なタンパク質合成開始シグナルであり、18SリボソームRNAの3’末端と相補的な配列があるためリボソーム結合部位としての役割を果たすと考えられている。ピコルナウイルス科のウイルス由来mRNAはこの配列を介して翻訳されることが知られている。IRES配列からの翻訳効率は高く、mRNAの途中からでもキャップ構造非依存的にタンパク質合成が行われる。本明細書に記載のウイルスでは、ヒトテロメラーゼのプロモーターによりE1A遺伝子とE1B遺伝子の両方が独立に翻訳される。IRESを使用すると、TERTプロモーターの発現制御がE1A遺伝子、E1B遺伝子に独立して及ぶために、E1A遺伝子あるいはE1B遺伝子のいずれか一方をTERTプロモーターで制御する場合に比べて、ウイルスの増殖を、テロメラーゼ活性を有する細胞により厳格に限定することができる。IRES配列を配列番号4に示す。IRES配列としては、配列番号4に示される塩基配列を含むヌクレオチドのほか、（a）配列番号4に示される塩基配列を含むヌクレオチドに対し相補的な塩基配列を含むヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするヌクレオチド、（b）配列番号4に示される塩基配列に対して80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、98％以上、又は99％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチド、（c）配列番号4に示される塩基配列において、一又は数個の塩基が付加、欠失又は置換された塩基配列を含むヌクレオチドも含まれる。前記（a）〜（c）のヌクレオチドは、IRES活性を有することが好ましい。
【００２３】
テロメラーゼ逆転写酵素プロモーター、E1A遺伝子、IRES配列、及びE1B遺伝子の順序は、テロメラーゼ逆転写酵素プロモーターの制御下でE1A遺伝子及びE1B遺伝子が発現される限り限定しない。例えば、本明細書に記載のウイルスは、5'側から3'側にむかって、テロメラーゼ逆転写酵素プロモーター、E1A遺伝子、IRES配列、及びE1B遺伝子をこの順で含んでよく、あるいは、5'側から3'側にむかって、テロメラーゼ逆転写酵素プロモーター、E1B遺伝子、IRES配列及びE1A遺伝子をこの順で含んでよい。
【００２４】
＜2．第二の遺伝子カセット＞
一実施形態において、本明細書に記載のウイルスは、上記第一の遺伝子カセットに加えて、又は第一の遺伝子カセットとは別に、第二の遺伝子カセットを含む。ウイルスが第一の遺伝子カセットを含まない場合にも、便宜的に当該遺伝子カセットを「第二の遺伝子カセット」と記載する。第二の遺伝子カセットは、プロモーター、及びp53遺伝子を含む。
【００２５】
プロモーターは、癌関連非腫瘍細胞においてp53遺伝子が駆動されるプロモーターであれば任意のものを使用することができる。プロモーターとしては、例えば放射線やウイルス感染などの細胞ストレスに伴って誘導されるプロモーター、細胞内で定常的に発現するプロモーターが挙げられる。プロモーターとしては、例えばEgr1（Early growth response protein 1）プロモーター、サイトメガロウイルス（CMV）プロモーター、テロメラーゼ逆転写酵素プロモーター、SV40後期プロモーター、MMTV LTRプロモーター、RSV LTRプロモーター、及びSRαプロモーター等を使用することができる。Egr1プロモーターとしては哺乳類動物由来のものを使用することができる。例えば、ヒト、マウス、ラット、又はウシ等に由来するEgr1プロモーターを使用することができる。各プロモーターの配列は公知であり、例えばマウスEgr1プロモーターは、配列番号6に示される塩基配列を含むヌクレオチドのほか、（a）配列番号6に示される塩基配列を含むヌクレオチドに対し相補的な塩基配列を含むヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするヌクレオチド、（b）配列番号6に示される塩基配列に対して80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、98％以上、又は99％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチド、（c）配列番号6に示される塩基配列において、一又は数個の塩基が付加、欠失又は置換された塩基配列を含むヌクレオチドも用いることができる。前記（a）〜（c）のヌクレオチドは、Egr1プロモーター活性を有することが好ましい。
【００２６】
p53遺伝子は、DNAが損傷を受けた際のDNA修復タンパク質の活性化、細胞周期の制御、DNAが修復不能な損傷を受けた際のアポトーシスの誘導等に関与する。p53遺伝子を含む組み換えウイルスを用いて発現させることによって、癌関連非腫瘍細胞を傷害することができることが、本発明者によってはじめて見いだされた。p53遺伝子は配列番号7に示される塩基配列を含むヌクレオチドのほか、（a）配列番号7に示される塩基配列を含むヌクレオチドに対し相補的な塩基配列を含むヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするヌクレオチド、（b）配列番号7に示される塩基配列に対して80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、98％以上、又は99％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むヌクレオチド、（c）配列番号7に示される塩基配列において、一又は数個の塩基が付加、欠失又は置換された塩基配列を含むヌクレオチドも用いることができる。前記（a）〜（c）のヌクレオチドは、p53活性を有するタンパク質をコードすることが好ましい。
【００２７】
第二の遺伝子カセットは、プロモーター及びp53遺伝子の下流に、さらにポリA配列を含むのが好ましい。ポリA配列を含むことにより、mRNAが細胞質での分解から保護され得、また転写終結、核外輸送、翻訳の少なくとも一つの機能が補助され得る。
【００２８】
＜3．ウイルスの他の構成＞
本明細書において、遺伝子カセットに含まれる各遺伝子は、通常の遺伝子工学的手法により得ることができる。例えは、遺伝子工学的手法として一般的に用いられているDNA合成装置を用いた核酸合成法を使用することができる。また、鋳型となる遺伝子配列を単離又は合成した後に、それぞれの遺伝子に特異的なプライマーを設計し、PCR装置を用いてその遺伝子配列を増幅するPCR法又はクローニングベクターを用いた遺伝子増幅法を用いることができる。上記方法は、「Molecular Cloning,A Laboratory Manual 4th ed.」（上掲）等に従い、当業者ならば容易に行うことができる。
【００２９】
その後、上記のようにして得られた各々の遺伝子を連結させることができる。まず、上記各々の遺伝子を公知の制限酵素等で切断し、切断した当該遺伝子のDNA断片を公知のベクターに公知の方法に従って挿入し、連結する。公知のベクターとしては、例えば、pIRESベクターを使用することができる。pIRESベクターは、脳心筋炎ウイルス（ECMV）のIRES配列が含まれており、1種類のmRNAから2箇所のオープンリーディングフレーム（ORF）を翻訳することが可能なベクターである。pIRESベクターを用いると、マルチクローニングサイトに、順次必要な遺伝子を挿入することにより、第一の遺伝子カセットを含むポリヌクレオチドを作製することができる。DNAの連結には、DNAリガーゼを用いることができる。hTERTプロモーターの制御下にアデノウイルスの増殖に必要なE1遺伝を発現させることによって、ウイルスを癌細胞特異的に増殖させることができる。このようにして作製した遺伝子カセットを、ウイルスに組み込むことにより、組み換えウイルスを作製することができる。
【００３０】
本明細書に記載の組換えウイルス（例えばアデノウイルス）は、ウイルス自身のE1領域を欠失していてもよい。アデノウイルスE1領域はウイルスの複製に関係していることから、当該領域を欠失させることで意図しないウイルスの複製を妨げることができる。一実施形態において、本明細書に記載の組換えアデノウイルスは、E1領域を欠失しており、当該位置に第一の遺伝子カセットを含む。E1領域はその全体が欠失していてもよく、その機能が失われるように部分的に欠失していてもよい。
【００３１】
本明細書に記載の組換えアデノウイルスは、ウイルス自身のE3領域を欠失していてもよい。アデノウイルスE3領域には11．6kDaのADP（adenovirus death protein）が存在し、ADPは細胞傷害及びウイルスの拡散を促進する機能を有しているが、アデノウイルスの増殖にとって不可欠な配列ではない。E3領域を欠失させることにより、組み換えウイルスのゲノムサイズを小さくし、導入可能な遺伝子のサイズをより大きくすることが可能となる。一実施形態において、本明細書に記載の組換えアデノウイルスは、E3領域を欠失しており、当該位置に第二の遺伝子カセットを含む。E3領域はその全体が欠失していてもよく、その機能が失われるように部分的に欠失していてもよい。
【００３２】
本明細書に記載のウイルスの種類は限定しないが、例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（AAV）、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ワクシニアウイルス、レオウイルス、ポックスウイルス、ピコルナウイルスなどが挙げられる。
【００３３】
本明細書に記載のウイルスは、当業者であれば容易に調製することができる。例えば、図1の遺伝子を含むウイルスは、In-fusionなどの遺伝子組み換え用のキットを利用し、5型アデノウイルスのE1領域とE3領域をそれぞれ図1に記載の遺伝子（E1：hTERT-p-E1A-IRES-E1B、E3:Egr1-p-p53-polyA）に置換することで、容易に作製することができる。
【００３４】
一実施形態において、本明細書に記載のウイルスは、癌関連非腫瘍細胞を傷害することにより癌を治療及び／又は予防する。一実施形態において、本明細書に記載のウイルスは、癌関連非腫瘍細胞を傷害することにより癌を治療及び／又は予防するためのものであってよい。
【００３５】
腫瘍を構成する腫瘍微小環境は薬剤抵抗性等にも関与することから、本明細書に記載のウイルスは、薬剤抵抗性を有する癌等において、他の抗癌剤の効果を高めるためにも用いられ得る。他の抗癌剤としては、限定されないが、例えばアルキル化剤、白金製剤、トポイソメラーゼ阻害剤、代謝拮抗剤、微小管阻害剤、抗生物質抗癌剤、分子標的薬（低分子化合物及び抗体医薬を含む）、細胞療法、腫瘍溶解ウイルス、免疫療法（免疫チェックポイント阻害剤を含む）等が挙げられる。
【００３６】
本明細書において、癌の種類は限定しないが、例えば、胃、膵臓、大腸、肺、肝、前立腺、食道、膀胱、胆嚢・胆管、乳房、子宮、甲状腺、卵巣等における固形癌に有効である。中でも、腫瘍内にCAFが豊富に含まれている点で、膵臓癌、肺癌、胃癌、食道癌、大腸癌が好ましい。
【００３７】
本明細書において、「癌関連非腫瘍細胞」としては、腫瘍関連線維芽細胞（Cancer-associated fibroblast、CAF）、免疫細胞（腫瘍関連マクロファージ、T細胞、好中球等）、及び間葉系幹細胞が含まれ、好ましくはCAFである。
【００３８】
一実施形態において、本明細書に記載のウイルスは、腫瘍溶解ウイルスである。腫瘍溶解ウイルスにおいては、癌関連非腫瘍細胞の存在により癌細胞から癌細胞へのウイルスの拡散が阻害されてしまう場合がある。したがって、一実施形態において、本明細書に記載のウイルスは、癌関連非腫瘍細胞を傷害するため、優れたウイルス拡散阻害性及び／又は優れた抗腫瘍作用を有する。
【００３９】
＜4．医薬組成物及び方法＞
一実施形態において、本発明は本明細書に記載の抗癌関連非腫瘍細胞剤（以下、「本明細書に記載の傷害剤」とも記載する）を含む医薬組成物に関する。本発明の医薬組成物は、本明細書に記載の傷害剤に加えて、賦形剤、増量剤、結合剤、滑沢剤等公知の薬学的に許容される担体、公知の添加剤（緩衝剤、等張化剤、キレート剤、着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤等）から選択される一つ以上の成分を含んでもよい。
【００４０】
一実施形態において、本明細書に記載の医薬組成物は、他の抗癌剤と共に用いられる。一実施形態において、本明細書に記載の医薬組成物は、他の抗癌剤をさらに含む。他の抗癌剤については、上記の通りである。
【００４１】
一実施形態において、本明細書に記載の医薬組成物は、癌を治療及び／又は予防するために用いられる。がんの種類は上記の通りである。一実施形態において、本明細書に記載の医薬組成物は、癌関連非腫瘍細胞を傷害することにより癌を治療及び／又は予防するために用いられる。
【００４２】
本明細書に記載の傷害剤又は医薬組成物の投与経路は限定しないが、経口投与又は非経口投与のいずれであってもよく、例えば、静脈、筋肉、腹腔内、腫瘍内又は皮下注射；鼻腔、口腔又は肺からの吸入；又は坐剤、外用剤等により生体（対象となる細胞や臓器）に投与することもできる。
【００４３】
本明細書に記載の傷害剤又は医薬組成物の形態は限定されず、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、丸剤、液剤、シロップ剤、注射剤、外用剤、坐剤、点眼剤であってよい。
【００４４】
本明細書に記載の傷害剤又は医薬組成物の投与量は、有効成分の種類、投与経路、投与対象、患者の年齢、体重、性別、症状その他の条件により適宜選択されるが、一日投与量として、通常有効成分である本発明のウイルスの量を106〜1013PFU程度、例えば109〜1012PFU程度とすることができる。投与回数は限定されず、1日1回投与することもでき、数回に分けて投与することもできる。
【００４５】
本明細書に記載の傷害剤又は医薬組成物の投与対象は、例えば哺乳動物、例えばヒト等の霊長類、ラット、マウス、及びドブネズミ等の実験動物、ブタ、ウシ、ウマ、及びヒツジ等の家畜動物等が挙げられ、好ましくはヒトである。
【００４６】
一実施形態において、本発明は、本明細書に記載のウイルス、傷害剤又は医薬組成物を被験体に投与することを含む、癌関連非腫瘍細胞を傷害する方法、又は癌を治療及び／又は予防する方法に関する。本明細書に記載のウイルス、傷害剤又は医薬組成物は、癌を有する被験体に対して、治療有効量で投与され得る。
【実施例】
【００４７】
＜実施例1：CAFモデルの作製＞
（材料と方法）
細胞として、線維芽細胞（FEF3：ヒト胎児食道線維芽細胞（Wister Instituteより入手）、又はGF（gastric fibroblast）：胃組織から分離した線維芽細胞（臨床検体より入手）を用いた。GFは、6〜7mm角の組織を細かくミンチにして培養する方法により得た（詳細はTsuyoshi Hasegawa et al., International Journal of Cancer, 134, pp. 1785〜1795 ,2014を参照されたい）。FEF3又はGFを50000cells/mLの濃度で10cm2Dishに播種し、DMEM培地で37℃にて5%CO2条件下で12〜24時間培養した。その後、10ng/mlの濃度のTGF-βを含むDMEM培地、又は癌細胞を培養して回収したCancer-conditioned medium（CM）に交換した。CMは、28.5x104cells/mLの濃度でMKN7細胞を175Tフラスコに播種し、無血清のDMEM培地で37℃にて5%CO2条件下で72時間培養した後に遠心にて細胞成分を除いた培養上清を用いた。細胞播種の72〜96時間後、CAF（癌関連線維芽細胞：Cancer-associated fibroblast）のマーカーであるαSMA又はFAPの細胞中の発現をウェスタンブロッティングにて確認した。すなわち、まず20μgのタンパク質をSDS-PAGEにて分離した。続いて、1次抗体として抗αSMA抗体（CST）又は抗FAP抗体（abcam）を用いてタンパク質を検出した。
【００４８】
（結果）
ウェスタンブロッティングの結果を図2Aに、免疫染色の結果を図2Bに示す。図2Aに示す通り、線維芽細胞であるFEF3及びGFにCM又はTGF-βを作用させることで、αSMA及びFAPの発現が上昇した。また、図2Bに示す通り、GFにTGF-βを作用させることで、αSMAの発現が上昇した。
【００４９】
これらの結果は、線維芽細胞にCM又はTGF-βを作用させることで、細胞をCAF化できることを示している。
【００５０】
＜実施例2：CAF及び正常線維芽細胞に対するOBP-702の傷害効果＞
（材料と方法）
OBP-702の調製
OBP-702（オンコリスバイオファーマより入手）はDMEM培地によって濃度調整した。OBP-702に含まれる増殖カセット（hTERTp-E1A-IRES-E1B（スペーサー含む））の配列を配列番号8として、OBP-702の全長配列を配列番号9として示す。
XTTアッセイ
正常線維芽細胞（GF）（臨床検体より入手）と、CAFモデル細胞（TGF-β活性化GF）（正常線維芽細胞を実施例1に記載の方法でTGF-βにより刺激することにより調製）を96well plateに10000cells/mLの濃度で播種し、DMEM培地で37℃にて5%CO2条件下で24時間培養した。1日後に1-100 MOIの濃度のOBP-702を加えるか、又は3日後に5-250 nM濃度のパクリタキセル（日本化薬より入手）を加えた。細胞の播種の4日後に、SpectraMax i3を用いてXTTアッセイで傷害率を確認した。
【００５１】
（結果）
OBP-702の結果を図3Aに、パクリタキセル（PTX）の結果を図3Bに示す。図3Aに示される通り、OBP-702では、正常細胞への傷害は少なく、CAFモデル細胞を用量依存的に傷害する傾向が認められた。一方、図3Bに示される通り、PTXでは、CAFモデル細胞には傷害が少なく、正常細胞を傷害している。
【００５２】
これらの結果は、OBP-702がPTXに比べて、正常細胞への傷害を抑えつつ効果的にCAFを傷害できることを示している。
【００５３】
＜実施例3：CAFモデル細胞の各種タンパク質の発現に対するOBP-702の効果＞
（材料と方法）
線維芽細胞（臨床検体より入手）を10cm2dishに50000cells/mLの濃度で播種し、DMEM培地で37℃にて5%CO2条件下で24時間培養した。1日後に10ng/mlの濃度のTGF-βを作用させた。4日後、0-100 MOIの濃度でOBP-702を加えた。OBP-702投与の4日後、以下の通りウェスタンブロッティングで各種タンパク質の発現を確認した。すなわち、まず20μgのタンパク質をSDS-PAGEにて分離した。続いて、1次抗体として抗αSMA抗体（CST）、抗FAP抗体（abcam）、抗p53抗体(CST)、抗E1a抗体(BD Pharmingen)、抗PARP抗体(CST)、抗p62抗体(CST)を用いてタンパク質を検出した。IL-6のELISAは、IL-6 ELISA Kit（R&D Systems）を用いて行った。
【００５４】
（結果）
結果を図4A〜Bに示す。図4Aに示す通り、OBP-702の投与によりp53、E1aの発現上昇がみられ、これはOBP-702が増殖したことを示している。また、p62の発現は減少していることから、オートファジーが促進されたことが示されている。また、PARP、cleaved PARP（C-PARP）の発現が増加したことから、アポトーシスが進行していることが示された。さらに、図4Bに示す通り、OBP-702の投与により、IL-6の産生が抑制された。
【００５５】
＜実施例4：CAF臨床検体及び正常線維芽細胞（NF）を用いた傷害効果確認＞
（材料と方法）
NF：胃組織から分離した線維芽細胞（臨床検体より入手）と胃癌患者から採取したCAF臨床検体（6〜7mm角の組織を細かくミンチにして培養する方法により得た。詳細はTsuyoshi Hasegawa et al.（上掲）を参照）を96wellplateに10000cells/mLの濃度で播種し、DMEM培地で37℃にて5%%CO2条件下で24時間培養した。1日後、OBP-702、特許第3867968号に記載の感染性のある組み換えアデノウイルスであるTRAD（OBP-301）、PTX（日本化薬より入手）、Ad-p53（Introgen Therapeuticsより入手）を所定の濃度で加えた後、SpectraMax i3によりXTTアッセイで傷害率を確認した。
【００５６】
（結果）
CAF臨床検体に対する結果を図5Aに、NFに対する結果を図5Bに示す。OBP-702では、NFへの傷害は少なく、CAFは用量依存的に傷害した。OBP-702と同様の増殖カセット（hTERT-p、E1A、IRES、及びE1Bを含む遺伝子カセット）を含むがp53の発現カセットを含まないOBP-301、p53の発現カセットを含むが増殖カセットを含まないAd-p53では、NF及びCAF共に傷害は少ない。一方、PTXでは、CAFを傷害しているが、それ以上にNFを傷害している。
【００５７】
これらの結果は、OBP-702がPTX等の他の薬剤に比べて、正常細胞への傷害を抑えつつ効果的にCAFを傷害できることを示している。
【００５８】
＜実施例5：膵星細胞に対する傷害効果＞
（材料と方法）
癌調製培地（CM）の調製
Panc-1、MIAPaCa-2、BxPC-3、Capan-1を175Tフラスコに2.0×106cells/mLの濃度で播種し、Panc-1とMIAPaCa-2はDMEM培地、BxPC-3はRPMI培地、Capan-1はIMDM培地で37℃にて5%CO2条件下で培養した。Capan-1以外は90〜95%コンフルエンスになったら、Capan-1は60〜70%コンフルエンスになったら無血清PSC培地（Thermo Fischer Scientific）に交換した。48時間後、培養上清を、Cancer-conditioned medium（CM）として得た。
細胞生存アッセイ
線維芽細胞（膵星細胞、hPSC-5又はhPSC-14）を96well プレートに3000cells/well(hPSC-5)、又は4000cells/well(hPSC-14)の濃度で播種し、PSC培地で37℃にて5%CO2条件下で培養した。24時間後、培地を上記のとおり調製したCM4種類のいずれかに交換し、72時間後、SpectraMax i3によりXTT assayで細胞増殖アッセイを行った。また、細胞増殖アッセイとは別に、細胞播種の24時間後、培地を1-200 MOIのOBP-301又は702を含む、上記のとおり調製したCM4種類のいずれかに交換し、72時間後、SpectraMax i3によりXTT assayで細胞生存アッセイを行った。
【００５９】
（結果）
細胞増殖アッセイの結果を図6Aに、細胞生存アッセイの結果を図6Bに示す。図6Aに示される通り、CMで活性化した細胞はControlに対し、より増殖していた。図6Bに示される通り、OBP-702の投与により、コントロール（無血清培地）を作用させた細胞よりもCMを作用させた細胞において有意に強い細胞傷害を示した。
【００６０】
＜実施例6：OBP-702の投与によるCAFモデル細胞における各種タンパク質の発現変化＞
（材料と方法）
線維芽細胞（膵星細胞、5×105 cellsのhPSC-5又は7×105cellsのhPSC-14）を10cm dishで、PSC培地で37℃にて5%CO2条件下で培養した。24時間後、培地を実施例5で調製したPanc-1 CMに交換し、25-100 MOIのOBP-702を投与した。72時間後、ウェスタンブロッティングによりタンパク質発現を解析した。ウェスタンブロッティングは、10％〜15％SDSポリアクリルアミドゲルを用い、実施例3と同様に行った。
【００６１】
（結果）
結果を図7に示す。OBP-702の投与によりP53の発現及びリン酸化、PARPの発現が促進されていた。これは、OBP-702がアポトーシス及びオートファジーにより細胞死を誘導していることを示している。
【００６２】
＜実施例7：TGF-βによる膵星細胞のCAFモデルに対する傷害効果＞
（材料と方法）
線維芽細胞（膵星細胞、hPSC-5又はhPSC-14）を96well プレートに3000cells/well(hPSC-5)、又は4000cells/well(hPSC-14)の濃度で播種し、PSC培地で37℃にて5%CO2条件下で培養した。24時間後、2.5-10 ng/mLのTGF-βを作用させ、72時間後、SpectraMax i3によりXTT assayで細胞増殖アッセイを行った。また、細胞増殖アッセイとは別に、細胞播種の24時間後、2.5-10 ng/mLのTGF-βと1-200 MOIのOBP-301又は702を作用させ、72時間後、SpectraMax i3によりXTT assayで細胞生存アッセイを行った。
【００６３】
（結果）
細胞増殖アッセイの結果を図8Aに、細胞生存アッセイの結果を図8Bに示す。図8Aに示される通り、TGF-βで活性化した細胞はControlに対し、より増殖していた。図8Bに示される通り、OBP-702の投与により、コントロール（無血清培地）を作用させた細胞よりもCMを作用させた細胞において有意に強い細胞傷害を示した。
【００６４】
＜実施例8：AdCMVp53によるCAF傷害効果＞
（材料と方法）
線維芽細胞（膵星細胞、hPSC-5又はhPSC-14）を96well プレートに3000cells/well(hPSC-5)、又は4000cells/well(hPSC-14)の濃度で播種し、PSC培地で37℃にて5%CO2条件下で培養した。細胞播種の24時間後、培地を1-2000 MOIのE1A領域を欠失した制限増殖型の5型アデノウイルスベクターであるdDL312（Patricia C Ryan et al., 2004, Cancer Gene Therapy, volume 11, pages 555〜569、及びYoung CSH et al, 1984, The adenoviruses., pp 125〜172を参照）又はAdCMVp53（実施例4に記載のAd-p53と同一）を含む、実施例5で調製したCM4種類のいずれかに交換し、72時間後、SpectraMax i3によりXTT assayで細胞生存アッセイを行った。また実施例5で調製したCM4種類とは別に、細胞播種の24時間後、2.5ng/mLのTGF-βと1-2000 MOIのAdDL312又はAdCMVp53を作用させ、72時間後、SpectraMax i3によりXTT assayで細胞生存アッセイを行った。
【００６５】
（結果）
4種類のCMで活性化したCAFの結果を図9Aに、TGF-βで活性化したCAFの結果を図9Bに示す。AdDL312はコントロール（無血清培地）を作用させた細胞と4種類のCMで活性化した細胞のいずれに対しても傷害効果がなかったが、AdCMVp53はコントロール（無血清培地）を作用させた細胞よりもCMで活性化した細胞において有意に強い傷害効果を有していた。これらの結果は、p53によりCMで活性化したCAFの傷害効果が生じていることを示している。一方、TGF-βで活性化したCAFに対しては、AdDL312、AdCMVp53のいずれも細胞傷害効果は示さなかった。
【００６６】
＜実施例9：p53発現に対するTGF-βシグナリングの関与＞
（材料と方法）
線維芽細胞（膵星細胞、5×105 cellsのhPSC-5又は7×105cellsのhPSC-14）を10cm dishで、PSC培地で37℃にて5%CO2条件下で培養した。24時間後、2.5ng/mlのTGF-βを含有するPSC培地に変更し、25-100 MOIのOBP-702を投与した。72時間後、ウェスタンブロッティングによりタンパク質発現を解析した。ウェスタンブロッティングは、10％〜15％SDSポリアクリルアミドゲルを用い、実施例3と同様に行った。
【００６７】
次に、線維芽細胞（膵星細胞、5×105 cellsのhPSC-5）を10cm dishに播種し、PSC培地で37℃にて5%CO2条件下で培養した。24時間後、100MOIのOBP-702と0.5-2.0μg/mlのTGF-β阻害剤（R&D Systems）含むPanc-1 CMに交換し、72時間後に実施例3と同様にウェスタンブロッティングによりp53の発現を比較した。また、線維芽細胞（膵星細胞、hPSC-5又はhPSC-14）を96well プレートに3000cells/well(hPSC-5)、又は4000cells/well(hPSC-14)の濃度で播種し、PSC培地で37℃にて5%CO2条件下で培養した。24時間後、100MOIのOBP-702と0.25-2.0 μg/mLのTGF-β阻害剤を含むPanc-1 CMまたはBxPC-3 CMに培地を交換し、72時間後、SpectraMax i3によりXTT assayで細胞増殖アッセイを行った。
【００６８】
（結果）
結果を図10に示す。TGF-β添加群では、OBP-702によるp53発現上昇が増加していた（図10）。これは、TGF-βによりCAF化した細胞においても、OBP-702によりp53の発現が増加することを示しており、実施例7で示したOBP-702による細胞傷害活性の増強にp53発現の増強が関わっていることを示している。
【００６９】
一方、Panc-1 CMに含まれるTGF-βを阻害剤で阻害すると、OBP-702によるp53の発現上昇は減弱し、細胞傷害活性もやや減弱していた（図11）。これは、癌調製培地（CM）に含まれるTGF-βがOBP-702によるp53発現及びCAF傷害効果に影響していることを示している。また、実施例8においてAdCMVp53がTGF-βで活性化したCAFに対して細胞傷害性を持たなかったことから、AdCMVp53と比較してOBP-702は、腫瘍微小環境において重要なサイトカインであるTGF-βの影響を受けたCAFに対して、より強くp53遺伝子を導入し、細胞傷害性を発揮することを示している。
【００７０】
＜実施例10：3D培養組織における腫瘍塊に対する効果＞
（材料と方法）
膵星細胞(hPSC-5、hPSC-14)を0.04mg/mlフィブロネクチン（Sigma Aldrich）と0.04mg/mlゼラチン（富士フイルム和光純薬）を含む 150mM等張Tris溶液（合計１ml）で30分間室温で振盪し、遠心分離（2000rpm、2分）した。前述の方法によりフィブロネクチン、ゼラチンでコーティングした2.5×105cellsの膵星細胞(hPSC-5、hPSC-14)と、5000cellsのCapan-2を24well用のカルチャーインサート(0.4μmポリエチレンテレフタラート透明メンブレン、CORNING)に播種し、PSC培地で37℃にて5%CO2条件下で共培養して作製した3D培養組織に対するOBP-702の効果を評価した（3D培養法の詳細については、Hiroyoshi Y Tanaka et al., Biomaterials, 2020, 30; 251: 120077を参照）。細胞播種後96時間後にウイルス（OBP-301又はOBP-702）を投与し、ウイルス投与後72時間（細胞播種後120時間）に3D組織を4％パラホルムアルデヒドで固定、さらに0.2％(v/v)Triton X-100/PBSで浸透化し、ブロッキングワン（ナカライテスク）によるブロッキングを行った上で1次抗体を入れて4℃、over nightで反応させた。PBSで3D組織を洗浄後、2次抗体を入れて4℃、over nightで反応させた。1次抗体はPan-Keratin (C11) Mouse mAb #4545（CST）、p53 (7F5) Rabbit mAb #2527（CST）を、2次抗体はAlexa Fluor 488 (anti mouse, Invitrogen)、Alexa Fluor 568 (anti rabbit, Invitrogen)を使用して多重染色を行った。PBSで3D組織を洗浄後、Hoechst33342を入れて4℃、over nightで反応させ、核染色を行った後、カルチャーインサートのメンブレンを切り取りスライドガラスにマウントして封入材（Dako/Agilent, Santa Clara）で封入し、共焦点レーザー顕微鏡で観察した。以上の方法により3D組織内の腫瘍塊（Tumor nest）の大きさは緑色に蛍光標識されたPan-Keratin陽性細胞の集簇により評価可能となり、ウイルス投与によるnestの大きさの変化を長径で評価した。ウイルスの投与量は、Low：1.0×106PFU、Middle：5.0×106PFU、及びHigh：1.0×107PFUとした（図12B中、301-LはOBP-301のLowでの投与、301-MはOBP-301のMiddleでの投与、301-HはOBP-301のHighでの投与を意味する。OBP-702についても同様である）。
【００７１】
（結果）
結果を図12に示す。3D培養組織において、OBP-702の方がOBP-301より腫瘍塊の大きさを有意に低減していた。CAFとの共培養下では膵癌細胞の悪性度がより高まることが一般的に知られており、この結果はOBP-702がp53の発現を介して共培養下の癌細胞においても強い細胞傷害活性を発揮することを示している。また、OBP-702を投与したモデルにおいては、Pan-keratin陰性部分（間質部分）において、非常に強いp53の発現が可視化された。これらの結果は、OBP-702が、間質細胞組織中でもp53の発現をもたらすことを示している。
【００７２】
＜実施例11：3D培養組織におけるCAFに対する効果＞
（材料と方法）
実施例10と同様の工程で作成したhPSC5+Capan-2、hPSC-5+BxPC-3の3Dモデルを用いて、細胞播種後96時間後にウイルスを投与し、ウイルス投与後72時間（細胞播種後120時間）におけるアポトーシス細胞の量をTUNEL (TdT-mediated dUTP Nick End Labeling) assayを行い評価した。TUNEL assayはInvitrogen社製のClick-iTTM TUNEL Alexa FluorTM 594 Imaging Assay, for microscopy & HCSを入手し、Invitrogen社のプロトコールに従って行った。TUNEL反応後に実施例10と同様の工程で3D組織の多重染色を行った。
【００７３】
（結果）
結果を図13に示す。いずれの3Dモデルにおいても、pan cytokeratin陰性部分（間質部分、すなわちCAF）におけるTUNEL発現を定量化したところ、OBP-702はMock、OBP-301と比較して有意にTUNEL発現を増加させた。これは、OBP-702が腫瘍細胞のみではなく、CAFにもp53発現を介したアポトーシスを誘導していることを示している。
【００７４】
＜実施例12：in vivo腫瘍細胞＋間質細胞（CAF）混合皮下腫瘍モデルの作製＞
（材料と方法）
1.0×105cellsのBxPC-3をヌードマウス(BALB/c-nu/nu)の皮下に投与したBxPC-3 mono-injection 皮下腫瘍モデル、1.0×105cellsのBxPC-3と9.0×105cellsのhPSC-14をヌードマウス(BALB/c-nu/nu)の皮下に共投与したBxPC-3+hPSC-14co-injection皮下腫瘍モデルを作成し、腫瘍体積、腫瘍重量を比較した。
【００７５】
（結果）
結果を図14に示す。投与した腫瘍細胞数は同数であるが、co-injectionモデルはmono-injectionと比較して有意に大きな腫瘍を形成し、また腫瘍増殖速度も有意に上昇した。この結果は、PDAC-CAFの相互作用により、より悪性度の高い腫瘍性質が生じたことを示している。
【００７６】
＜実施例13：in vivo腫瘍細胞＋間質細胞（CAF）混合皮下腫瘍モデルに対する効果＞
（材料と方法）
実施例12にしたがって作製したBxPC-3+hPSC-14 co-injectionモデルに対して、細胞移植11日後から1日おきにMock、OBP-301(1.0×108PFUs)、OBP-702(1.0×108PFUs)を3回投与し、腫瘍体積を計測するとともに、最終投与から22日後に腫瘍を摘出して腫瘍重量を比較した。
【００７７】
（結果）
結果を図15に示す。OBP-301、OBP-702はいずれもMockと比較して腫瘍増殖を有意に抑制した。さらに、OBP-702はOBP-301と比較して有意に強い腫瘍増殖抑制効果を示した。過去のデータでは、BxPC-3 mono-injection皮下腫瘍モデルにおいてはOBP-301とOBP-702は同等の増殖抑制効果を有していた（Oncolytic Virus-Mediated Targeting 
of the ERK Signaling Pathway Inhibits Invasive Propensity in Human Pancreatic Cancer. Mol Ther Oncolytics.2020 Mar 31;17:107-117.）。したがって、本実験結果は、豊富な間質の存在下で悪性度が高くなった腫瘍においては、OBP-702が間質を制御しながら強い腫瘍増殖抑制効果を発揮することを示している。
【００７８】
＜実施例14：in vivo腫瘍細胞＋間質細胞（CAF）混合皮下腫瘍モデルに対する効果2＞
（材料と方法）
実施例12にしたがって作製したBxPC-3+hPSC-14 co-injectionモデルに対して、細胞移植21日後から1日おきにMock、OBP-301(1.0×108PFUs)、OBP-702(1.0×108PFUs)を投与し、最終投与から2日後に腫瘍を摘出した。摘出した腫瘍はパラフィン固定し、腫瘍組織中のpan-cytokeratinとp53をそれぞれ緑色蛍光、赤色蛍光で標識し、蛍光顕微鏡で観察した。1次抗体はPan-Keratin (C11) Mouse mAb #4545（CST）、p53 (7F5) Rabbit mAb #2527（CST）を、2次抗体はAlexa Fluor 488 (anti mouse, Invitrogen)、Alexa Fluor 568 (anti rabbit, Invitrogen)を使用して多重染色を行った。１次抗体、2次抗体の反応時間はそれぞれ1時間とした。
【００７９】
（結果）
結果を図16に示す。OBP-702投与群では、局所でp53の強い発現を認めた。Pan-keratinを蛍光標識することにより腫瘍細胞部と間質部を識別し、間質部におけるp53発現強度をmock群、OBP-301投与群と比較したところ、OBP-702投与群では間質におけるp53発現の有意な上昇を認めた。この結果は、in vivoにおいてもOBP-702が腫瘍細胞のみならず間質細胞にp53発現を介した影響を与えていることを示している。
【００８０】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。
【図１】
2022001041.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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