(57)【要約】【課題】本発明は、３−メチルグルタコニル−ＣｏＡを基質として３−メチルクロトニル−ＣｏＡを生成する活性を有し、３−ヒドロキシイソ吉草酸の生成に関与する蛋白質、及び該蛋白質を生産する微生物を用いた３−ヒドロキシイソ吉草酸の効率的な製造方法を提供することを目的とする。【解決手段】本発明によれば、アセトアセチル−ＣｏＡとアセチル−ＣｏＡを基質として３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ（以下、ＨＭＧ−ＣｏＡという。）を生成する活性を有する蛋白質、ＨＭＧ−ＣｏＡを基質として３−メチルグルタコニル−ＣｏＡを生成する活性を有する蛋白質、及び請求項４の［１］〜［４］のいずれか１つに記載の蛋白質を生産する微生物を用いることにより、効率的に３−ヒドロキシイソ吉草酸を製造することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２で表わされるアミノ酸配列において、６１番目のアミノ酸残基がＬ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、又はＬ−バリンに置換されたアミノ酸配列からなる蛋白質。
【請求項２】
配列番号２で表わされるアミノ酸配列において１〜２０個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ３−メチルグルタコニル−ＣｏＡを基質として３−メチルクロトニル−ＣｏＡを生成する活性（以下、メチルグルタコニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ活性という。）を有する変異蛋白質のアミノ酸配列において、配列番号２で表わされるアミノ酸配列の６１番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がＬ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、又はＬ−バリンに置換されたアミノ酸配列からなる蛋白質。
【請求項３】
配列番号２で表わされるアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつメチルグルタコニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ活性を有する相同蛋白質のアミノ酸配列において、配列番号２で表わされるアミノ酸配列の６１番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がＬ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、又はＬ−バリンに置換されたアミノ酸配列からなる蛋白質。
【請求項４】
アセトアセチル−ＣｏＡとアセチル−ＣｏＡを基質として３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ（以下、ＨＭＧ−ＣｏＡという。）を生成する活性（以下、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ活性という。）を有する蛋白質、ＨＭＧ−ＣｏＡを基質として３−メチルグルタコニル−ＣｏＡを生成する活性（以下、メチルグルタコニル−ＣｏＡヒドラターゼ活性という。）を有する蛋白質、及び以下の［１］〜［４］のいずれか１つに記載の蛋白質を生産する微生物を培地に培養し、培養物中に３−ヒドロキシイソ吉草酸を生成、蓄積させ、該培養物中から３−ヒドロキシイソ吉草酸を採取することを含む、３−ヒドロキシイソ吉草酸の製造方法。
［１］請求項１〜３のいずれか１項に記載の蛋白質
［２］配列番号２で表わされるアミノ酸配列からなる蛋白質
［３］配列番号２で表わされるアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸配列が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつメチルグルタコニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ活性を有する変異蛋白質
［４］配列番号２で表わされるアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつメチルグルタコニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ活性を有する相同蛋白質
【請求項５】
前記ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ活性を有する蛋白質が、以下の［５］〜［７］のいずれか１つに記載の蛋白質である、請求項４に記載の製造方法。
［５］配列番号４で表わされるアミノ酸配列からなる蛋白質
［６］配列番号４で表わされるアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸配列が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ活性を有する変異蛋白質
［７］配列番号４で表わされるアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ活性を有する相同蛋白質
【請求項６】
前記メチルグルタコニル−ＣｏＡヒドラターゼ活性を有する蛋白質が、以下の［８］〜［１０］のいずれか１つに記載の蛋白質である、請求項４又は５に記載の製造方法。
［８］配列番号６で表わされるアミノ酸配列からなる蛋白質
［９］配列番号６で表わされるアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸配列が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつメチルグルタコニル−ＣｏＡヒドラターゼ活性を有する変異蛋白質
［１０］配列番号６で表わされるアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつメチルグルタコニル−ＣｏＡヒドラターゼ活性を有する相同蛋白質
【請求項７】
前記微生物が、親株と比べ、アセチル−ＣｏＡを基質としてアセトアセチル−ＣｏＡを生成する活性が増強した微生物である、請求項４〜６のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項８】
前記微生物が、親株と比べ、３−メチルクロトニル−ＣｏＡを基質として３−ヒドロキシ−３−メチルブチリル−ＣｏＡを生成する活性が増強した微生物である、請求項４〜７のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項９】
前記微生物が、親株と比べ、３−ヒドロキシ−３−メチルブチリル−ＣｏＡを基質として３−ヒドロキシイソ吉草酸を生成する活性が増強した微生物である、請求項４〜８のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１０】
前記微生物が、エシェリヒア属に属する微生物である、請求項４〜９のいずれか１項に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、３−メチルグルタコニル−ＣｏＡを基質として３−メチルクロトニル−ＣｏＡを生成する活性を有し、３−ヒドロキシイソ吉草酸の生成に関与する蛋白質、及び該蛋白質を生産する微生物を用いた３−ヒドロキシイソ吉草酸の効率的な製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
３−ヒドロキシイソ吉草酸は、ロイシンの代謝産物であり、筋肉の合成促進作用及び分解抑制作用を有することが知られている。ヒト体内における、ロイシンから３−ヒドロキシイソ吉草酸への変換率は５％程度と低いことから、３−ヒドロキシイソ吉草酸を補給するためには、３−ヒドロキシイソ吉草酸を体外から直接摂取することが有効とされており、近年、３−ヒドロキシイソ吉草酸は欧米を中心に筋力向上効果を期待したサプリメント素材として需要が拡大している。
【０００３】
３−ヒドロキシイソ吉草酸の製造方法としては、これまでに、化学合成法、酵素法、及び菌体反応法による製造方法が報告されている。化学合成法としては、４，４−ジメチル−２−オキセタノンを水酸化ナトリウムにより加水分解する方法（特許文献１）及びジアセトンアルコールを次亜塩素酸ナトリウムにより酸化させる方法（特許文献２）が報告されている。
【０００４】
酵素法としては、アセトンとアセチル−ＣｏＡを基質として、３−ヒドロキシイソ吉草酸合成酵素等を用いて３−ヒドロキシイソ吉草酸を生成させる方法（特許文献３）が報告されている。菌体反応法としては、β−メチル酪酸を原料に、Ｇａｒａｃｔｏｍｙｃｅｓ  ｒｅｅｓｓｉｉの有する変換活性により３−ヒドロキシイソ吉草酸を生成する方法（非特許文献１）が報告されている。
【０００５】
特許文献４では、アセチル−ＣｏＡから３−ヒドロキシイソ吉草酸までの生合成経路及び組換え大腸菌を用いて該生合成経路により３−ヒドロキシイソ吉草酸が生産できることが開示されている。ここで、特許文献４の方法においては、３−メチルグルタコニル−ＣｏＡから３−メチルクロトニル−ＣｏＡを生成する反応を触媒する酵素としては、Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ  ｘａｎｔｈｕｓ由来の脱炭酸酵素が用いられている。
【０００６】
また、非特許文献２には、後述の配列番号２で表わされるアミノ酸配列と４４％の同一性を有するアミノ酸配列からなる蛋白質ＣｕｒＦが、３−メチルグルタコニル−ＡＣＰを基質として３−メチルクロトニル−ＡＣＰを生成する活性を有することが記載されているが、同時に、ＣｕｒＦは、３−メチルグルタコニル−ＡＣＰと比べて、ＣｏＡ体である３−メチルグルタコニル−ＣｏＡはほとんど基質としないことが示されている。そして、ＣｕｒＦの７３番目のＬ−チロシン残基が基質との結合に関与している可能性があること、７３番目のＬ−チロシン残基を他のアミノ酸残基に置換するとＣｕｒＦが不溶化してしまうことが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第０２／０９４２５５号
【特許文献２】米国特許第６２４８９２２号明細書
【特許文献３】国際公開第２０１１／０３２９３４号
【特許文献４】国際公開第２０１６／０４２０１２号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，（１９９７），Ｖｏｌ．６３，Ｎｏ．１１：ｐ４１９１−４１９５
【非特許文献２】Ｊ．Ｂｉｏl．Ｃｈｅｍ．，（２００７），Ｖｏｌ．２８２，Ｎｏ．４９：ｐｐ３５９５４−３５９６３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
配列番号２で表わされるアミノ酸配列からなる蛋白質は、データベース上においてエノイル−ＣｏＡイソメラーゼとしてアノテ―ションされており（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ｐ４０８０２）、（Ｓ）−３−メチルグルタリル基の脱炭酸に関与する可能性が示唆されているが、その機能に関して何ら実験的な検証はされておらず、該蛋白質を生産する微生物を用いて効率的に３−ヒドロキシイソ吉草酸を製造できるとの知見はない。
【００１０】
そして、配列番号２で表わされるアミノ酸配列からなる蛋白質の６１番目のＬ−チロシン残基を特定のアミノ酸残基に置換した変異蛋白質を生産する微生物を用いることで、配列番号２で表わされるアミノ酸配列からなる蛋白質を生産する微生物を用いた場合と比べて、より効率的に３−ヒドロキシイソ吉草酸を製造できるとの知見もない。
【００１１】
かかる状況において、本発明は、３−メチルグルタコニル−ＣｏＡを基質として３−メチルクロトニル−ＣｏＡを生成する活性を有し、３−ヒドロキシイソ吉草酸の生成に関与する蛋白質、及び該蛋白質を生産する微生物を用いた３−ヒドロキシイソ吉草酸の効率的な製造方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、以下の（１）〜（１０）に関する。
（１）配列番号２で表わされるアミノ酸配列において、６１番目のアミノ酸残基がＬ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、又はＬ−バリンに置換されたアミノ酸配列からなる蛋白質。
（２）配列番号２で表わされるアミノ酸配列において１〜２０個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ３−メチルグルタコニル−ＣｏＡを基質として３−メチルクロトニル−ＣｏＡを生成する活性（以下、メチルグルタコニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ活性という。）を有する変異蛋白質のアミノ酸配列において、配列番号２で表わされるアミノ酸配列の６１番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がＬ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、又はＬ−バリンに置換されたアミノ酸配列からなる蛋白質。
（３）配列番号２で表わされるアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつメチルグルタコニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ活性を有する相同蛋白質のアミノ酸配列において、配列番号２で表わされるアミノ酸配列の６１番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がＬ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、又はＬ−バリンに置換されたアミノ酸配列からなる蛋白質。
（４）アセトアセチル−ＣｏＡとアセチル−ＣｏＡを基質として３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ（以下、ＨＭＧ−ＣｏＡという。）を生成する活性（以下、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ活性という。）を有する蛋白質、ＨＭＧ−ＣｏＡを基質として３−メチルグルタコニル−ＣｏＡを生成する活性（以下、メチルグルタコニル−ＣｏＡヒドラターゼ活性という。）を有する蛋白質、及び以下の［Ｉ］〜［ＩＶ］のいずれか１つに記載の蛋白質を生産する微生物を培地に培養し、培養物中に３−ヒドロキシイソ吉草酸を生成、蓄積させ、該培養物中から３−ヒドロキシイソ吉草酸を採取することを含む、３−ヒドロキシイソ吉草酸の製造方法。
［Ｉ］前記（１）〜（３）のいずれか１に記載の蛋白質
［ＩＩ］配列番号２で表わされるアミノ酸配列からなる蛋白質
［ＩＩＩ］配列番号２で表わされるアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸配列が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつメチルグルタコニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ活性を有する変異蛋白質
［ＩＶ］配列番号２で表わされるアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつメチルグルタコニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ活性を有する相同蛋白質
（５）前記ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ活性を有する蛋白質が、以下の［Ｖ］〜［ＶＩＩ］のいずれか１つに記載の蛋白質である、前記（４）に記載の製造方法。
［Ｖ］配列番号４で表わされるアミノ酸配列からなる蛋白質
［ＶＩ］配列番号４で表わされるアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸配列が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ活性を有する変異蛋白質
［ＶＩＩ］配列番号４で表わされるアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ活性を有する相同蛋白質
（６）前記メチルグルタコニル−ＣｏＡヒドラターゼ活性を有する蛋白質が、以下の［ＶＩＩＩ］〜［Ｘ］のいずれか１つに記載の蛋白質である、前記（４）又は（５）に記載の製造方法。
［ＶＩＩＩ］配列番号６で表わされるアミノ酸配列からなる蛋白質
［ＩＸ］配列番号６で表わされるアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸配列が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつメチルグルタコニル−ＣｏＡヒドラターゼ活性を有する変異蛋白質
［Ｘ］配列番号６で表わされるアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつメチルグルタコニル−ＣｏＡヒドラターゼ活性を有する相同蛋白質
（７）前記微生物が、親株と比べ、アセチル−ＣｏＡを基質としてアセトアセチル−ＣｏＡを生成する活性が増強した微生物である、前記（４）〜（６）のいずれか１に記載の製造方法。
（８）前記微生物が、親株と比べ、３−メチルクロトニル−ＣｏＡを基質として３−ヒドロキシ−３−メチルブチリル−ＣｏＡを生成する活性が増強した微生物である、前記（４）〜（７）のいずれか１に記載の製造方法。
（９）前記微生物が、親株と比べ、３−ヒドロキシ−３−メチルブチリル−ＣｏＡを基質として３−ヒドロキシイソ吉草酸を生成する活性が増強した微生物である、前記（４）〜（８）のいずれか１に記載の製造方法。
（１０）前記微生物が、エシェリヒア属に属する微生物である、前記（４）〜（９）のいずれか１に記載の製造方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、３−メチルグルタコニル−ＣｏＡを基質として３−メチルクロトニル−ＣｏＡを生成する活性を有し、３−ヒドロキシイソ吉草酸の生成に関与する蛋白質、及び該蛋白質を生産する微生物を用いた３−ヒドロキシイソ吉草酸の効率的な製造方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、本発明の３−ヒドロキシイソ吉草酸の製造方法に用いる微生物における、グルコースから３−ヒドロキシイソ吉草酸に至る代謝経路を表わす。各化学反応は、それぞれ、ＡｔｏＢ、ＨｍｃＭ、ＬｉｕＣ、ＰｋｓＩ、ＦａｄＢ、ＴｅｓＢによって触媒される。Ａ：グルコース、Ｂ：アセチル−ＣｏＡ、Ｃ：アセトアセチル−ＣｏＡ、Ｄ：３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）、Ｅ：３−メチルグルタコニル−ＣｏＡ、Ｆ：３−メチルクロトニル−ＣｏＡ、Ｇ：３−ヒドロキシ−３−メチルブチリル−ＣｏＡ、Ｈ：３−ヒドロキシイソ吉草酸ＡｔｏＢ：アセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼ、ＨｍｃＭ：ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ、ＬｉｕＣ：メチルグルタニル−ＣｏＡヒドラターゼ、ＰｋｓＩ：３−メチルグルタコニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ、ＦａｄＢ：エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ、ＴｅｓＢ：チオエステラーゼ
【発明を実施するための形態】
【００１５】
１．本発明の蛋白質
本発明の蛋白質は、以下の［１］〜［３］に記載の蛋白質である。
［１］配列番号２で表わされるアミノ酸配列において、６１番目のアミノ酸残基がＬ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、又はＬ−バリンに置換されたアミノ酸配列からなる蛋白質
［２］配列番号２で表わされるアミノ酸配列において１〜２０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜１０個、最も好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつメチルグルタコニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ活性を有する変異蛋白質のアミノ酸配列において、配列番号２で表わされるアミノ酸配列の６１番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がＬ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、又はＬ−バリンに置換されたアミノ酸配列からなる蛋白質
［３］配列番号２で表わされるアミノ酸配列と９５％以上、好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつメチルグルタコニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ活性を有する相同蛋白質のアミノ酸配列において、配列番号２で表わされるアミノ酸配列の６１番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基がＬ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、又はＬ−バリンに置換されたアミノ酸配列からなる蛋白質
【００１６】
メチルグルタコニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ活性とは、３−メチルグルタコニル−ＣｏＡを基質として３−メチルクロトニル−ＣｏＡを生成する活性をいう。本明細書において、メチルグルタコニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ活性を有する蛋白質のことは、メチルグルタコニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼともいう。
【００１７】
変異蛋白質とは、元となる蛋白質中のアミノ酸残基を人為的に欠失若しくは置換、又は該蛋白質中に人為的にアミノ酸残基を挿入若しくは付加して得られる蛋白質をいう。
【００１８】
相同蛋白質とは、自然界に存在する生物が有する蛋白質であって、進化上の起源が同一の蛋白質に由来する一群の蛋白質をいう。相同蛋白質は、互いに構造及び機能が類似している。
【００１９】
変異蛋白質において、アミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたとは、同一配列中の任意の位置において、アミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されていてもよい。
【００２０】
欠失、置換、挿入又は付加されるアミノ酸は天然型と非天然型とを問わない。天然型アミノ酸としては、例えば、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、Ｌ−システインなどが挙げられる。
【００２１】
以下に、相互に置換可能なアミノ酸の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸は相互に置換可能である。
Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２−アミノブタン酸、メチオニン、о−メチルセリン、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン
Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、２−アミノアジピン酸、２−アミノスベリン酸
Ｃ群：アスパラギン、グルタミン
Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、２，４−ジアミノブタン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸
Ｅ群：プロリン、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン
Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン
Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン
【００２２】
アミノ酸配列の同一性は、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，５８７３（１９９３）］やＦＡＳＴＡ［Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１８３，６３（１９９０）］を用いて決定することができる。このアルゴリズムＢＬＡＳＴに基づいて、ＢＬＡＳＴＸとよばれるプログラムが開発されている［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３（１９９０）］。ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＸを使用してアミノ酸配列を解析する場合には、パラメータは、例えば、ｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。この解析方法の具体的な手法は公知である。
【００２３】
アミノ酸配列のアライメントは、例えば、公知のアライメントプログラムＣｌｕｓｔａｌＷ［Ｎｕｃｅｌｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２２，４６７３，（１９９４）］を用いて作成することができる。ＣｌｕｓｔａｌＷは、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ.ａｃ．ｕｋ／ｃｌｕｓｔａｌｗ／（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）より利用することができる。ＣｌｕｓｔａｌＷを用いてアライメントを作成する際のパラメータは、例えばデフォルトの値を用いることができる。
【００２４】
２．本発明の３−ヒドロキシイソ吉草酸の製造方法に用いる微生物、及び該微生物の造成方法
２−１．本発明の３−ヒドロキシイソ吉草酸の製造方法に用いる微生物
本発明の３−ヒドロキシイソ吉草酸の製造方法に用いる微生物は、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ活性を有する蛋白質、メチルグルタコニル−ＣｏＡヒドラターゼ活性を有する蛋白質、及び以下の［４］〜［７］のいずれか１つに記載の蛋白質を生産する微生物である。
【００２５】
［４］前記［１］〜［３］のいずれか１に記載の蛋白質
［５］配列番号２で表わされるアミノ酸配列からなる蛋白質
［６］配列番号２で表わされるアミノ酸配列において、１〜２０個、好ましくは１〜１０個、最も好ましくは１〜５個のアミノ酸配列が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつメチルグルタコニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ活性を有する変異蛋白質
［７］配列番号２で表わされるアミノ酸配列と９５％以上、好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつメチルグルタコニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ活性を有する相同蛋白質
【００２６】
ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ活性とは、アセトアセチル−ＣｏＡとアセチル−ＣｏＡを基質としてＨＭＧ−ＣｏＡを生成する活性をいう。本明細書において、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ活性を有する蛋白質のことは、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼともいう。
【００２７】
メチルグルタコニル−ＣｏＡヒドラターゼ活性とは、ＨＭＧ−ＣｏＡを基質として３−メチルグルタコニル−ＣｏＡを生成する活性をいう。本明細書において、メチルグルタコニル−ＣｏＡヒドラターゼ活性を有する蛋白質のことは、メチルグルタコニル−ＣｏＡヒドラターゼともいう。
変異蛋白質及び相同蛋白質については、前記１と同様である。
【００２８】
アミノ酸配列の同一性は、前記１と同様の方法で決定することができる。
前記の変異蛋白質又は相同蛋白質が、メチルグルタコニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ活性を有していることは、例えば、以下のように確認することができる。
【００２９】
まず、後述の方法により該蛋白質をコードするＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡを作製し、該組換え体ＤＮＡで、メチルグルタコニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ活性を有さない微生物、例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０株を形質転換する。続いて、形質転換した微生物を培養し、得られる培養物から該蛋白質を含む細胞抽出液を調製し、該画分を基質である３−メチルグルタコニル−ＣｏＡを含む水溶液と接触させ、結果として生成する３−メチルクロトニル−ＣｏＡを高速液体クロマトグラフィーによって検出する。
【００３０】
本発明の３−ヒドロキシイソ吉草酸の製造方法に用いる微生物は、前記の［４］〜［７］のいずれか１つに記載の蛋白質を生産すると同時に、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ及びメチルグルタコニル−ＣｏＡヒドラターゼを生産する微生物である。
【００３１】
ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼとしては、該活性を有する蛋白質であればいずれのものでもよいが、例えば、特許文献４に記載されているＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅのＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ（ＵｎｉＰｒｏｔ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．：Ｐ５４８７４）、及び以下の［８］〜［１０］のいずれか１つに記載の蛋白質が挙げられる。
【００３２】
［８］配列番号４で表わされるアミノ酸配列からなる蛋白質
［９］配列番号４で表わされるアミノ酸配列において、１〜２０個、好ましくは１〜１０個、最も好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ活性を有する変異蛋白質
［１０］配列番号４で表わされるアミノ酸配列と９５％以上、好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ活性を有する相同蛋白質
【００３３】
メチルグルタコニル−ＣｏＡヒドラターゼとしては、該活性を有する蛋白質であればいずれのものでもよいが、例えば、特許文献４に記載されているＭｙｘｏｃｏｃｃｕｓ  ｘａｎｔｈｕｓのメチルグルタコニル−ＣｏＡヒドラターゼ（ＵｎｉＰｒｏｔ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．：Ｑ１Ｄ５Ｙ４）、及び以下の［１１］〜［１３］のいずれか１つに記載の蛋白質が挙げられる。
【００３４】
［１１］配列番号６で表わされるアミノ酸配列からなる蛋白質
［１２］配列番号６で表わされるアミノ酸配列において、１〜２０個、好ましくは１〜１０個、最も好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつメチルグルタコニル−ＣｏＡヒドラターゼ活性を有する変異蛋白質
［１３］配列番号６で表わされるアミノ酸配列と９５％以上、好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつメチルグルタコニル−ＣｏＡヒドラターゼ活性を有する相同蛋白質
【００３５】
変異蛋白質及び相同蛋白質については前記１と同様である。該変異蛋白質又は相同蛋白質が、それぞれＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ活性又はメチルグルタコニル−ＣｏＡヒドラターゼ活性を有していることは、例えば、後述の方法によりそれぞれの蛋白質をコードするＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡを作製し、該組換え体ＤＮＡで、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ活性及びメチルグルタコニル−ＣｏＡヒドラターゼ活性を有さない微生物、例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０株を形質転換し、前記と同様の方法によって確認することができる。
【００３６】
２−２．本発明の３−ヒドロキシイソ吉草酸の製造方法に用いる微生物の具体例−１
前記２−１の［４］〜［７］のいずれか１つに記載の蛋白質を生産する本発明の３−ヒドロキシイソ吉草酸の製造方法に用いる微生物の具体例としては、例えば、以下の［１４］〜［１７］のいずれか１つに記載のＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡで親株を形質転換して得られる微生物が挙げられる。
【００３７】
［１４］前記［４］〜［７］のいずれか１つに記載の蛋白質をコードするＤＮＡ
［１５］配列番号１で表わされる塩基配列からなるＤＮＡ
［１６］配列番号１で表わされる塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつメチルグルタコニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ活性を有する相同蛋白質をコードするＤＮＡ
［１７］配列番号１で表わされる塩基配列と少なくとも９５％以上、好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつメチルグルタコニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ活性を有する相同蛋白質をコードするＤＮＡ
【００３８】
前記において、ハイブリダイズするとは、特定の塩基配列を有するＤＮＡ又は該ＤＮＡの一部にＤＮＡがハイブリダイズする工程である。該特定の塩基配列を有するＤＮＡ又は該ＤＮＡの一部の塩基配列は、ノーザン又はサザンブロット解析のプローブとして有用であるか、又はＰＣＲ解析のオリゴヌクレオチドプライマーとして使用できる長さのＤＮＡであってもよい。プローブとして用いるＤＮＡとしては、少なくとも１００塩基以上、好ましくは２００塩基以上、より好ましくは５００塩基以上のＤＮＡが挙げられる。プライマーとして用いられるＤＮＡとしては、少なくとも１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上のＤＮＡが挙げられる。
【００３９】
ＤＮＡのハイブリダイゼーション実験の方法はよく知られており、例えばモレキュラー・クローニング第４版［Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（２０１２）］、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ［ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ（１９９４）］、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｍａｎｕａｌ［Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９７）］の他、多数の他の標準的な教科書に従ってハイブリダイゼーションの条件を決定し、実験を行うことができる。
【００４０】
また、市販のハイブリダイゼーションキットに付属した説明書に従うことによっても、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを取得することができる。市販のハイブリダイゼーションキットとしては、例えば、ランダムプライム法によりプローブを作製し、ストリンジェントな条件でハイブリダイゼーションを行うランダムプライムドＤＮＡラベリングキット（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）などが挙げられる。
【００４１】
前記のストリンジェントな条件とは、例えばＤＮＡを固定化したフィルターとプローブＤＮＡとを５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％の硫酸デキストラン、及び２０μｇ／Ｌの変性させたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で４２℃にて一晩、インキュベートした後、例えば、約６５℃の０．２×ＳＳＣ溶液中で該フィルターを洗浄する条件が挙げられる。
【００４２】
前記した様々な条件は、ハイブリダイゼーション実験のバックグラウンドを抑えるために用いるブロッキング試薬を添加、又は変更することにより設定することもできる。前記したブロッキング試薬の添加は、条件を適合させるために、ハイブリダイゼーション条件の変更を伴ってもよい。
【００４３】
前記したストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、例えば、配列番号１で表わされる塩基配列と少なくとも９５％以上、好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡが挙げられる。
【００４４】
塩基配列の同一性は、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，５８７３（１９９３）］やＦＡＳＴＡ［Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１８３，６３（１９９０）］を用いて決定することができる。このアルゴリズムＢＬＡＳＴに基づいて、ＢＬＡＳＴＮとよばれるプログラムが開発されている［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３（１９９０）］。ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＮを使用して塩基配列を解析する場合には、パラメータは例えばＳｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。この解析方法の具体的な手法は公知である。
【００４５】
前記の［１４］〜［１７］のいずれか１つに記載のＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡとは、例えば、該ＤＮＡが、親株において自律複製可能なＤＮＡであって、前記の［１４］〜［１７］のいずれか１つに記載のＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有している発現ベクターに、前記の［１４］〜［１７］のいずれか１つに記載のＤＮＡが組み込まれているＤＮＡである。
【００４６】
親株において染色体への組込が可能なＤＮＡであって、前記の［１４］〜［１７］のいずれか１つに記載のＤＮＡを有するＤＮＡもまた、前記の［１４］〜［１７］のいずれか１つに記載のＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡである。
【００４７】
組換え体ＤＮＡが、染色体への組込が可能な組換え体ＤＮＡである場合は、プロモーターを含有していなくてもよい。
【００４８】
親株とは、遺伝子改変及び形質転換等の対象となる元株のことをいう。遺伝子導入による形質転換の対象となる元株は宿主株ともいう。
【００４９】
親株は、いずれの微生物であってもよいが、好ましくは原核生物又は酵母菌株を、より好ましくは、エシェリヒア属、セラチア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、若しくはシュードモナス属等に属する原核生物、又はサッカロマイセス属、シゾサッカロマイセス属、クルイベロミセス属、トリコスポロン属、シワニオミセス属、ピチア属、若しくはキャンディダ属等に属する酵母菌株を、最も好ましくは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１  ｃｏｄｏｎ  ｐｌｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＸＬ２−Ｂｌｕｅ（いずれもアジレント・テクノロジー社製）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（メルクミリポア社製）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ５α、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＳＴ０８  Ｐｒｅｍｉｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＳＴ０２、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＳＴ０４  ｄａｍ−／ｄｃｍ―、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉＣＪ２３６、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＭＨ７１−１８  ｍｕｔＳ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＭＶ１１８４、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＴＨ２（いずれもタカラバイオ社製）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｗ（ＡＴＣＣ９６３７）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＭＧ１６５５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＭＣ１０００、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｗ１４８５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＭＰ３４７、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＮＭ５２２、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｆｉｃａｒｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｆｏｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ  ＡＴＣＣ１４０６８、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１４０６６、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１４０６７、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ  ＡＴＣＣ１３８７０、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ  ＡＴＣＣ１５３５４、若しくはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．Ｄ−０１１０等の原核生物、又はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｐｕｌｌｕｌａｎｓ、Ｓ��ｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ａｌｌｕｖｉｕｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、若しくはＣａｎｄｉｄａ  ｕｔｉｌｉｓ等の酵母菌株が挙げられる。
【００５０】
細菌等の原核生物を親株として用いる場合は、親株において自律複製可能な組換え体ＤＮＡは、プロモーター、リボソーム結合配列、前記の［１４］〜［１７］のいずれか１つに記載のＤＮＡ、及び転写終結配列により構成された組換え体ＤＮＡであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
【００５１】
ここで、リボソーム結合配列であるシャイン−ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜１８塩基）に調節した組換え体ＤＮＡを用いることが好ましい。
【００５２】
また、親株において自律複製可能な組換え体ＤＮＡにおいては、該ＤＮＡの発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
【００５３】
親株にエシェリヒア属に属する微生物を用いる場合は、発現ベクターとしては、例えば、ｐＣｏｌｄＩ、ｐＳＴＶ２８、ｐＵＣ１１８(いずれもタカラバイオ社製)、ｐＥＴ２１ａ、ｐＣＤＦ−１ｂ、ｐＲＳＦ−１ｂ（いずれもメルクミリポア社製）、ｐＭＡＬ−ｃ５ｘ（ニューイングランドバイオラブス社製）、ｐＧＥＸ−４Ｔ−１、ｐＴｒｃ９９Ａ（いずれもジーイーヘルスケアバイオサイエンス社製)、ｐＴｒｃＨｉｓ、ｐＳＥ２８０（いずれもサーモフィッシャー・サイエンティフィック社製）、ｐＧＥＭＥＸ−１（プロメガ社製）、ｐＱＥ−３０、ｐＱＥ８０Ｌ（いずれもキアゲン社製）、ｐＥＴ−３、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（＋）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＫＳ（−）（いずれもアジレント・テクノロジー社製）、ｐＫＹＰ１０（特開昭５８−１１０６００号公報）、ｐＫＹＰ２００［Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４８，６６９（１９８４）］、ｐＬＳＡ１［Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，２７７（１９８９）］、ｐＧＥＬ１［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８２，４３０６（１９８５）]、ｐＴｒＳ３０ ［エシェリヒア・コリ  ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０７）より調整］、ｐＴｒＳ３２  ［エシェリヒア・コリ  ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０８）より調整］、ｐＴＫ３１［ＡＰＰＬＩＥＤ  ＡＮＤ  ＥＮＶＩＲＯＮＭＥＮＴＡＬ  ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ，２００７，Ｖｏｌ．７３，Ｎｏ．２０，ｐ６３７８−６３８５］、ｐＰＡＣ３１（国際公開第９８／１２３４３号）、ｐＵＣ１９［Ｇｅｎｅ，３３，１０３（１９８５）］、ｐＰＡ１（特開昭６３−２３３７９８号公報）等が挙げられる。
【００５４】
前記の発現ベクターを用いる場合のプロモーターとしては、エシェリヒア属に属する微生物の細胞中で機能するものであればいかなるものでもよいが、例えば、ｔｒｐプロモーター、ｇａｐＡプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、ＰＳＥプロモーター等の、エシェリヒア・コリやファージ等に由来するプロモーターを用いることができる。また、ｔｒｐプロモーターを２つ直列させたプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｌａｃＴ５プロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、ｌｅｔＩプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーターも用いることもできる。
【００５５】
親株にコリネ型細菌を用いる場合は、発現ベクターとしては、例えば、ｐＣＧ１（特開昭５７−１３４５００号公報）、ｐＣＧ２（特開昭５８−３５１９７号公報）、ｐＣＧ４（特開昭５７−１８３７９９号公報）、ｐＣＧ１１（特開昭５７−１３４５００号公報）、ｐＣＧ１１６、ｐＣＥ５４、ｐＣＢ１０１（いずれも特開昭５８−１０５９９９号公報）、ｐＣＥ５１、ｐＣＥ５２、ｐＣＥ５３［いずれもＭｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１９６，１７５（１９８４）］等が挙げられる。
【００５６】
前記の発現ベクターを用いる場合のプロモーターとしては、コリネ型細菌の細胞中で機能するものであればいかなるものでもよいが、例えば、Ｐ５４−６プロモーター［Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５３，ｐ６７４−６７９（２０００）］が挙げられる。
【００５７】
親株に酵母菌株を用いる場合には、発現ベクターとしては、例えば、ＹＥｐ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）、ＹＣｐ５０（ＡＴＣＣ３７４１９）、ｐＨＳ１９、ｐＨＳ１５などが挙げられる。
【００５８】
前記の発現ベクターを用いる場合のプロモーターとしては、酵母菌株の細胞中で機能するものであればいかなるものでもよいが、例えば、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ｇａｌ１プロモーター、ｇａｌ１０プロモーター、ヒートショックポリペプチドプロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＣＵＰ１プロモーター等のプロモーターが挙げられる。
【００５９】
親株を組換え体ＤＮＡで形質転換して得られる、メチルグルタコニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼを生産する微生物とは、該組換え体ＤＮＡが、親株において自律複製可能なプラスミドとして導入されることにより、又は親株の染色体中に組み込まれることにより、該ＤＮＡを転写し、該ＤＮＡがコードする蛋白質を生産するようになった微生物をいう。
【００６０】
前記の［１４］〜［１７］のいずれか１つに記載のＤＮＡを転写するようになったこと、及び該ＤＮＡがコードする蛋白質を生産するようになったことを確認する方法としては、例えば、該ＤＮＡを転写するようになったことについてはノーザン・ブロッティングを、該蛋白質を生産するようになったことについてはウェスタン・ブロッティングが挙げられる。
【００６１】
親株を前記の［１４］〜［１７］のいずれか１つに記載のＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡで形質転換して得られる、メチルグルタコニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼを生産する微生物は、以下の方法で造成することができる。
【００６２】
前記［１４］のＤＮＡのうち前記２−１の［５］の蛋白質をコードするＤＮＡ、及び前記［１５］のＤＮＡは、例えば、配列番号１で表わされる塩基配列に基づき設計することができるプローブＤＮＡを用いた、微生物、好ましくはバチルス属、より好ましくはＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  １６８株の染色体ＤＮＡライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーション、又は該塩基配列に基づき設計することができるプライマーＤＮＡを用いた、前記微生物の染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ［ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９０）］により取得することができる。
【００６３】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  １６８株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジーセンター（ＮＩＴＥ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒ）又はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）から入手することができる。
【００６４】
前記［１４］のＤＮＡのうち前記２−１の［７］の相同蛋白質をコードするＤＮＡ、並びに前記［１６］及び［１７］のＤＮＡは、例えば、各種の遺伝子配列データベースに対して配列番号１で表わされる塩基配列と９５％以上、好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列を検索し、又は各種の蛋白質配列データベースに対して配列番号２で表わされるアミノ酸配列と９５％以上、好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を検索し、該検索によって得られた塩基配列又はアミノ酸配列に基づいて設計することができるプローブＤＮＡ又はプライマーＤＮＡ、及び当該ＤＮＡを有する微生物を用いて、前記２−１の［５］の蛋白質をコードするＤＮＡ、及び前記［１５］のＤＮＡを取得する方法と同様の方法によって取得することができる。
【００６５】
前記［１４］のＤＮＡのうち前記２−１の［６］の変異蛋白質をコードするＤＮＡは、例えば、配列番号１で表わされる塩基配列からなるＤＮＡを鋳型としてエラープローンＰＣＲ等に供することにより取得することができる。
【００６６】
また、目的の変異（欠失、置換、挿入又は付加）が導入されるように設計した塩基配列をそれぞれの５'端に持つ１組のＰＣＲプライマーを用いたＰＣＲ［Ｇｅｎｅ，７７，５１（１９８９）］によっても、前記２−１の［６］の変異蛋白質をコードするＤＮＡを取得することができる。
【００６７】
すなわち、まず該ＤＮＡの５'端に対応するセンスプライマーと、５'端に変異の配列と相補的な配列を有する、変異導入部位の直前（５'側）の配列に対応するアンチセンスプライマーで該ＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲを行い、該ＤＮＡの５'端から変異導入部位までの断片Ａ（３'端に変異が導入されている）を増幅する。次いで、５'端に変異の配列を有する、変異導入部位の直後（３'側）の配列に対応するセンスプライマーと、該ＤＮＡの３'端に対応するアンチセンスプライマーで該ＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲを行い、５'端に変異が導入された該ＤＮＡの変異導入部位から３'端までの断片Ｂを増幅する。これらの増幅断片同士を精製後、混合して鋳型やプライマーを加えずにＰＣＲを行うと、増幅断片Ａのセンス鎖と増幅断片Ｂのアンチセンス鎖は変異導入部位が共通しているのでハイブリダイズし、プライマー兼鋳型としてＰＣＲの反応が進行し、変異が導入されたＤＮＡが増幅する。
【００６８】
前記［１４］のＤＮＡのうち前記１の［１］の蛋白質をコードするＤＮＡは、例えば、前記で取得される、前記２−１の［５］の蛋白質をコードするＤＮＡ、及び前記［１５］のＤＮＡを用いて、該ＤＮＡがコードするアミノ酸配列の６１番目のアミノ酸残基をコードする部分の塩基配列に、例えば、モレキュラー・クローニング第４版（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（２０１２））及びカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（ＪＯＨＮ  ＷＩＬＥＹ  ＆  ＳＯＮＳ，ＩＮＣ．）等に記載された部位特異的変異導入法により変異を導入し、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、又はＬ−バリンをコードする塩基配列に置換することにより取得することができる。
【００６９】
同様の方法により、前記２−１の［６］の変異蛋白質をコードするＤＮＡを用いて、前記［１４］のＤＮＡのうち前記１の［２］の蛋白質をコードするＤＮＡを取得することができる。
また、同様の方法により、前記２−１の［７］の相同蛋白質をコードするＤＮＡ、並びに前記［１６］及び［１７］のＤＮＡを用いて、前記［１４］のＤＮＡのうち前記１の［３］の蛋白質をコードするＤＮＡを取得することができる。
【００７０】
取得した前記の［１４］〜［１７］のいずれか１つに記載のＤＮＡは、そのまま、あるいは適当な制限酵素などで切断し、常法によりベクターに組み込み、得られた組換え体ＤＮＡを宿主細胞に導入した後、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばジデオキシ法 ［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７４，５４６３（１９７７）］、あるいはアプライド・バイオシステムズ３５００ジェネティックアナライザやアプライド・バイオシステムズ３７３０ＤＮＡアナライザ（いずれもサーモフィッシャー・サイエンティフィック社製）等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、該ＤＮＡの塩基配列を決定することができる。
【００７１】
該ＤＮＡの塩基配列を決定する際に用いることができる宿主細胞としては、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ５α、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＳＴ０８ Ｐｒｅｍｉｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＳＴ０２、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＳＴ０４  ｄａｍ−／ｄｃｍ―、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉＣＪ２３６、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＭＨ７１−１８  ｍｕｔＳ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＭＶ１１８４、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＴＨ２（いずれもタカラバイオ社製）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＸＬ２−Ｂｌｕｅ（いずれもアジレント・テクノロジー社製）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＭＣ１０００、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｗ１４８５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＭＰ３４７、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＮＭ５２２等が挙げられる。
【００７２】
ベクターとしては、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＫＳ（＋）、ｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ  Ａｍｐ  ＳＫ（＋）（いずれもアジレント・テクノロジー社製）、ｐＴ７Ｂｌｕｅ（メルクミリポア社製）、ｐＣＲＩＩ（サーモフィッシャー・サイエンティフィック社製）、ｐＣＲ−ＴＲＡＰ（ジーンハンター社製）、及びｐＤＩＲＥＣＴ［Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１８，６０６９（１９９０）］等が挙げられる。
【００７３】
組換え体ＤＮＡの導入方法としては、宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）］、プロトプラスト法（特開昭６３−２４８３９４号公報）、エレクトロポレーション法［Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１６，６１２７（１９８８）］等が挙げられる。
【００７４】
塩基配列を決定した結果、取得されたＤＮＡが部分長であった場合は、該部分長ＤＮＡをプローブに用いた、染色体ＤＮＡライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーション法等により、全長ＤＮＡを取得することができる。
【００７５】
更に、決定されたＤＮＡの塩基配列に基づいて、８９０５型ＤＮＡ合成装置（パーセプティブ・バイオシステムズ社製）やオリゴメーカーＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置（タグ・コペンハーゲン社製）を用いて化学合成することにより目的とするＤＮＡを調製することもできる。
【００７６】
ここで、該ＤＮＡの塩基配列を宿主の発現に最適なコドンとなるように塩基を置換することにより、該ＤＮＡがコードする蛋白質の発現量を向上させることもできる。本発明の製造方法に用いられる親株におけるコドン使用頻度の情報は、公共のデータベースを通じて入手することができる。
【００７７】
前記のようにして調製したＤＮＡ断片を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、本発明の３−ヒドロキシイソ吉草酸の製造方法に用いる微生物が有する組換え体ＤＮＡを作製することができる。
【００７８】
このような組換え体ＤＮＡとしては、例えば、実施例において後述するｐＱＥ８０Ｌ＿ｈｍｃＭ＿ｌｉｕＣ＿ＰＴ５−ｐｋｓＩ、ｐＱＥ８０Ｌ＿ｈｍｃＭ＿ｌｉｕＣ＿ＰＴ５−ｐｋｓＩ（Ｙ６１Ｉ）、ｐＱＥ８０Ｌ＿ｈｍｃＭ＿ｌｉｕＣ＿ＰＴ５−ｐｋｓＩ（Ｙ６１Ｌ）、及びｐＱＥ８０Ｌ＿ｈｍｃＭ＿ｌｉｕＣ＿ＰＴ５−ｐｋｓＩ（Ｙ６１Ｖ）が挙げられる。
【００７９】
組換え体ＤＮＡを親株において自律複製可能なプラスミドとして導入させる方法としては、例えば、カルシウムイオンを用いる方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）］、プロトプラスト法（特開昭６３−２４８３９４号公報）、エレクトロポレーション法［Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１６，６１２７（１９８８）］等の方法が挙げられる。
【００８０】
組換え体ＤＮＡを親株の染色体中に組み込む方法としては、例えば、相同組換え法が挙げられる。相同組換え法としては、例えば、導入したい宿主細胞内では自律複製できない薬剤耐性遺伝子を有するプラスミドＤＮＡと連結して作製できる相同組換え用プラスミドを用いる方法が挙げられる。エシェリヒア・コリで頻用される相同組換えを利用した方法としては、例えば、ラムダファージの相同組換え系を利用して、組換え体ＤＮＡを導入する方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７，６６４１−６６４５（２０００）］が挙げられる。
【００８１】
さらに、組換え体ＤＮＡと共に染色体上に組み込まれた枯草菌レバンシュークラーゼによって大腸菌がスクロース感受性となることを利用した選択法や、ストレプトマイシン耐性の変異ｒｐｓＬ遺伝子を有する大腸菌に野生型ｒｐｓＬ遺伝子を組み込むことによって大腸菌がストレプトマイシン感受性となることを利用した選択法［Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５５，１３７（２００５）、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，７１，２９０５（２００７）］等を用いて、親株の染色体ＤＮＡ上の目的の領域が組換え体ＤＮＡに置換された微生物を取得することができる。
【００８２】
前記の方法で造成した微生物が、メチルグルタコニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼを生産する微生物であることは、上述の方法により、前記［１４］〜［１７］のいずれか１つに記載のＤＮＡを転写量、及び該ＤＮＡがコードする蛋白質の生産量を測定することで確認することができる。
【００８３】
このような微生物としては、例えば、実施例において後述するＷ３１１０ＡＦＴ／ｐＱＥ８０Ｌ＿ｈｍｃＭ＿ｌｉｕＣ＿ＰＴ５−ｐｋｓＩ株、Ｗ３１１０ＡＦＴ／ｐＱＥ８０Ｌ＿ｈｍｃＭ＿ｌｉｕＣ＿ＰＴ５−ｐｋｓＩ（Ｙ６１Ｉ）株、Ｗ３１１０ＡＦＴ／ｐＱＥ８０Ｌ＿ｈｍｃＭ＿ｌｉｕＣ＿ＰＴ５−ｐｋｓＩ（Ｙ６１Ｌ）株、及びＷ３１１０ＡＦＴ／ｐＱＥ８０Ｌ＿ｈｍｃＭ＿ｌｉｕＣ＿ＰＴ５−ｐｋｓＩ（Ｙ６１Ｖ）株が挙げられる。
【００８４】
２−３．本発明の３−ヒドロキシイソ吉草酸の製造方法に用いる微生物の具体例−２
ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼを生産する本発明の３−ヒドロキシイソ吉草酸の製造方法に用いる微生物の具体例としては、例えば、以下の［１８］〜［２１］のいずれか１つに記載のＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡで親株を形質転換して得られる微生物が挙げられる。
【００８５】
［１８］前記［８］〜［１０］のいずれか１つに記載の蛋白質をコードするＤＮＡ
［１９］配列番号３で表わされる塩基配列からなるＤＮＡ
［２０］配列番号３で表わされる塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ活性を有する相同蛋白質をコードするＤＮＡ
［２１］配列番号３で表わされる塩基配列と少なくとも９５％以上、好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ活性を有する相同蛋白質をコードするＤＮＡ
【００８６】
ハイブリダイゼーション及びストリンジェントな条件については、前記２−２と同様である。
前記ストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、例えば、前記２−２のＢＬＡＳＴ及びＦＡＳＴＡ等のプログラムを用いて、前記２−２のパラメータに基づいて計算したときに、配列番号３で表わされる塩基配列と少なくとも９５％以上、好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列が挙げられる。
【００８７】
ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼをコードするＤＮＡは、例えば、配列番号３で表わされる塩基配列に基づき設計することができるプローブＤＮＡを用いて、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓ  ＡＴＣＣ１３６７５株のゲノムＤＮＡを鋳型として、前記２−２と同様のＰＣＲを用いた方法等により取得することができる。
【００８８】
該ＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡは、前記２−２と同様の方法に従って取得することができる。親株を該組換え体ＤＮＡで形質転換して得られる、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼを生産する微生物は、前記２−２と同様の方法に従って造成することができる。
【００８９】
前記の方法で造成した微生物が、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼを生産する微生物であることは、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼをコードするＤＮＡの転写量及び該蛋白質の生産量を測定することにより確認することができる。
【００９０】
前記蛋白質をコードするＤＮＡの転写量及び該ＤＮＡがコードする蛋白質の生産量を確認する方法としては、例えば、該ＤＮＡの転写量についてはノーザン・ブロッティングを、該蛋白質の生産量についてはウェスタン・ブロッティングが挙げられる。
【００９１】
２−４．本発明の３−ヒドロキシイソ吉草酸の製造方法に用いる微生物の具体例−３
メチルグルタコニル−ＣｏＡヒドラターゼを生産する本発明の３−ヒドロキシイソ吉草酸の製造方法に用いる微生物の具体例としては、例えば、以下の［２２］〜［２５］のいずれか１つに記載のＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡで親株を形質転換して得られる微生物が挙げられる。
【００９２】
［２２］前記［１１］〜［１３］のいずれか１つに記載の蛋白質をコードするＤＮＡ
［２３］配列番号５で表わされる塩基配列からなるＤＮＡ
［２４］配列番号５で表わされる塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつメチルグルタコニル−ＣｏＡヒドラターゼ活性を有する相同蛋白質をコードするＤＮＡ
［２５］配列番号５で表わされる塩基配列と少なくとも９５％以上、好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつメチルグルタコニル−ＣｏＡヒドラターゼ活性を有する相同蛋白質をコードするＤＮＡ
【００９３】
ハイブリダイゼーション及びストリンジェントな条件については、前記２−２と同様である。前記ストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、例えば、前記２−２のＢＬＡＳＴ及びＦＡＳＴＡ等のプログラムを用いて、前記２−２のパラメータに基づいて計算したときに、配列番号５で表わされる塩基配列と少なくとも９５％以上、好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列が挙げられる。
【００９４】
メチルグルタコニル−ＣｏＡヒドラターゼをコードするＤＮＡは、例えば、配列番号５で表わされる塩基配列に基づき設計することができるプローブＤＮＡを用いて、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  ＫＴ２４４０株のゲノムＤＮＡを鋳型として、前記２−２と同様のＰＣＲを用いた方法等により取得することができる。
【００９５】
該ＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡは、前記２−２と同様の方法に従って取得することができる。親株を該組換え体ＤＮＡで形質転換して得られる、メチルグルタコニル−ＣｏＡヒドラターゼを生産する微生物は、前記２−２と同様の方法に従って造成することができる。
【００９６】
前記の方法で造成した微生物が、メチルグルタコニル−ＣｏＡヒドラターゼを生産微生物であることは、メチルグルタコニル−ＣｏＡヒドラターゼをコードするＤＮＡの転写量及び該蛋白質の生産量を測定することにより確認することができる。
【００９７】
該蛋白質をコードするＤＮＡの転写量及び該ＤＮＡがコードする蛋白質の生産量を確認する方法としては、例えば、該ＤＮＡの転写量についてはノーザン・ブロッティングを、該蛋白質の生産量についてはウェスタン・ブロッティングが挙げられる。
【００９８】
前記２−２のメチルグルタコニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼをコードするＤＮＡ、前記２−３のＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼをコードするＤＮＡ、及びメチルグルタコニル−ＣｏＡヒドラターゼをコードするＤＮＡは、同一の組換え体ＤＮＡ上に存在していてもよいし、別々の組換え体ＤＮＡ上に任意の組み合わせで存在していてもよい。
【００９９】
２−５．本発明の３−ヒドロキシイソ吉草酸の製造方法に用いる微生物の具体例−４
本発明の３−ヒドロキシイソ吉草酸の製造方法に用いる微生物は、前記２−１の［４］〜［７］のいずれか１つに記載の蛋白質、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ活性を有する蛋白質、及びメチルグルタコニル−ＣｏＡヒドラターゼ活性を有する蛋白質を生産し、さらに、糖からアセトアセチル−ＣｏＡを生成し、かつ３−メチルクロトニル−ＣｏＡから３−ヒドロキシイソ吉草酸を生成する微生物である。
【０１００】
糖からアセトアセチル−ＣｏＡを生成し、かつ３−メチルクロトニル−ＣｏＡから３−ヒドロキシイソ吉草酸を生成する微生物とは、後述の３の方法で該微生物を培地に培養したときに、該糖を出発物質としてアセトアセチル−ＣｏＡを該微生物内に生成し、かつ３−メチルクロトニル−ＣｏＡを基質として３−ヒドロキシイソ吉草酸を該微生物内に生成、蓄積する微生物をいう。
【０１０１】
そのような微生物としては、例えば、前記２−１〜２−４の方法により取得された、前記２−１の［４］〜［７］のいずれか１つに記載の蛋白質、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ、及びメチルグルタコニル−ＣｏＡヒドラターゼを生産する微生物を親株として用いて造成した、以下の（Ａ）〜（Ｄ）のいずれか１つに記載の微生物が挙げられる。
【０１０２】
（Ａ）該親株よりもアセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼ活性が増強した微生物
（Ｂ）該親株よりもエノイル−ＣｏＡヒドラターゼ活性が増強した微生物
（Ｃ）該親株よりもチオエステラーゼ活性が増強した微生物
（Ｄ）前記（Ａ）〜（Ｃ）の微生物の形質を任意の組み合わせで有する微生物
【０１０３】
２−５−１．アセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼ活性が増強した微生物
アセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼ活性とは、アセチル−ＣｏＡを基質としてアセトアセチル−ＣｏＡを生成する活性をいう。本明細書において、アセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼ活性を有する蛋白質のことは、アセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼともいう。 
【０１０４】
親株よりもアセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼ活性が増強した微生物としては、例えば、以下の（ａ）及び（ｂ）の微生物が挙げられる。
【０１０５】
（ａ）親株の染色体ＤＮＡ上にあるアセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼをコードするＤＮＡを改変することにより得られる、
ｉ）親株の微生物に比べ、該蛋白質の比活性が増強した微生物、又は
ｉｉ）親株の微生物に比べ、該ＤＮＡの転写量又は該蛋白質の生産量が増大した微生物
（ｂ）該蛋白質をコードするＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡで親株の微生物を形質転換することにより得られる、親株よりも該ＤＮＡのコピー数が増大した微生物
【０１０６】
（ａ）親株の染色体ＤＮＡ上にあるアセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼをコードするＤＮＡを改変することにより得られる、ｉ）親株の微生物に比べ、該蛋白質の比活性が増強した微生物としては、親株が有するアセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼのアミノ酸配列において１〜２０個のアミノ酸、好ましくは１〜１０個のアミノ酸、最も好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加しているアミノ酸配列を有する蛋白質を有しているため、親株の該蛋白質と比較して、その比活性が増強した変異蛋白質を有する微生物が挙げられる。
【０１０７】
（ａ）親株の染色体ＤＮＡ上にあるアセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼ活性をコードするＤＮＡを改変することにより得られる、ｉ）親株の微生物に比べ、該蛋白質の比活性が増強した微生物は、例えば、前記２−１の［４］〜［７］のいずれか１つに記載の蛋白質、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ、及びメチルグルタコニル−ＣｏＡヒドラターゼを生産する微生物を親株として、該親株のアセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼの比活性を、通常の突然変異処理法、組換えＤＮＡ技術による遺伝子置換法等を用いて増強させることにより得ることができる。
【０１０８】
突然変異処理法としては、例えば、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）を用いる方法（微生物実験マニュアル、１９８６年、１３１頁、講談社サイエンティフィック社）、紫外線照射法等が挙げられる。
【０１０９】
組換えＤＮＡ技術による遺伝子置換法は、例えば、アセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼをコードするＤＮＡに、試験管内における変異剤を用いた変異処理、又はエラープローンＰＣＲなどに供することにより変異を導入した後、親株の染色体ＤＮＡ上に存在する該蛋白質をコードするＤＮＡと、相同組換え法を用いて置換する方法、又は、アセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼをコードするＤＮＡに１以上の塩基の欠失、置換、挿入又は付加を導入し、相同組換え法を用いて親株の染色体ＤＮＡ上に存在する該蛋白質をコードするＤＮＡと置換する方法、が挙げられる。
【０１１０】
アセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼをコードするＤＮＡは、例えば、配列番号７で表わされる塩基配列に基づき設計することができるプローブＤＮＡを用いて、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０株のゲノムＤＮＡを鋳型として、前記２−２のＰＣＲを用いた方法等により取得することができる。
【０１１１】
親株に比べ、アセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼの比活性が増強した微生物であることは、例えば、以下のように確認することができる。
【０１１２】
アセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼの変異蛋白質を有する微生物から該変異蛋白質を精製し、該変異蛋白質及びアセチル−ＣｏＡを水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中に生成、蓄積したアセトアセチル−ＣｏＡと該蛋白質量から比活性を測定する。また、変異が導入されていないアセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼ有する微生物からアセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼを精製し、同様にして比活性を測定し、変異蛋白質の比活性と比較する。
【０１１３】
（ａ）親株の染色体ＤＮＡ上にあるアセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼをコードするＤＮＡを改変することにより得られる、ｉｉ）親株の微生物に比べ、該ＤＮＡの転写量又は該蛋白質の生産量が増大した微生物としては、親株の染色体ＤＮＡ上に存在するアセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼをコードするＤＮＡの転写調節領域又はプロモーター領域の塩基配列において１塩基以上、好ましくは１〜２０塩基、より好ましくは１〜１０塩基、さらに好ましくは１〜５塩基の塩基が欠失、置換、挿入又は付加しているプロモーター領域を有しているため、親株と比較して、該ＤＮＡの発現量が増大した微生物、もしくは、親株の染色体ＤＮＡ上に存在する該ＤＮＡのプロモーター領域を公知の強力なプロモーター配列と置換して得られる、該ＤＮＡの発現量が増大した微生物が挙げられる。
【０１１４】
（ａ）親株の染色体ＤＮＡ上にあるアセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼをコードするＤＮＡを改変することにより得られる、ｉｉ）親株の微生物に比べ、該ＤＮＡの転写量又は該蛋白質の生産量が増大した微生物は、例えば、前記２−１の［４］〜［７］のいずれか１つに記載の蛋白質、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ、及びメチルグルタコニル−ＣｏＡヒドラターゼを生産する微生物を親株として、該親株のアセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼをコードするＤＮＡの転写量又は該蛋白質の生産量を、通常の突然変異処理法、組換えＤＮＡ技術による遺伝子置換法等を用いて、増強させることにより得ることができる。
【０１１５】
突然変異処理法としては、前記の方法が挙げられる。
【０１１６】
組換えＤＮＡ技術による遺伝子置換法は、親株が有するアセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼをコードするＤＮＡの転写調節領域及びプロモーター領域、例えば該蛋白質の開始コドンの上流側２００ｂｐ、好ましくは１００ｂｐの塩基配列を有するＤＮＡを試験管内における変異処理、又はエラープローンＰＣＲなどに供することにより該ＤＮＡに変異を導入した後、親株の染色体ＤＮＡ上に存在するアセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼをコードするＤＮＡと、相同組換え法を用いて置換する方法が挙げられる。
【０１１７】
また、親株のアセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼをコードするＤＮＡのプロモーター領域を公知の強力なプロモーター配列と置換することによっても、親株よりアセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼの生産量が向上した微生物を取得することもできる。
【０１１８】
そのようなプロモーターとしては、前記２−２のプロモーターが挙げられる。
【０１１９】
前記方法にて取得した微生物が、親株に比べ、アセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼをコードするＤＮＡの転写量又は該蛋白質の生産量が増大した微生物であることは、例えば、該微生物の該ＤＮＡの転写量をノーザン・ブロッティングにより、又は該微生物の該蛋白質の生産量をウェスタン・ブロッティングにより測定し、親株のそれと比較することにより確認することができる。
【０１２０】
（ｂ）アセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼをコードするＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡで親株の微生物を形質転換することにより得られる、親株よりも該ＤＮＡのコピー数が増大した微生物としては、アセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼをコードするＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡで親株の微生物を形質転換することにより、染色体ＤＮＡ上において前記ＤＮＡのコピー数が増大した微生物、及びプラスミドＤＮＡとして染色体ＤＮＡ外に前記ＤＮＡを保有させた微生物が挙げられる。
【０１２１】
アセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼとしては、該活性を有する蛋白質であればいずれでもよいが、例えば、特許文献４に記載されているＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍのアセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼ（ＵｎｉＰｒｏｔ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｐ４５３５９）、及び以下の［２６］〜［２８］のいずれか１つに記載の蛋白質が挙げられる。
【０１２２】
［２６］配列番号８で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質
［２７］配列番号８で表わされるアミノ酸配列において、１〜２０個、好ましくは１〜１０個、最も好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼ活性を有する変異蛋白質
［２８］配列番号８で表わされるアミノ酸配列と９５％以上、好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつアセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼ活性を有する相同蛋白質
【０１２３】
前記において、１〜２０個、好ましくは１〜１０個、最も好ましくは１〜５個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼ活性を有する変異蛋白質は、前記２−２の部位特異的変異導入法を用いて、例えば配列番号８で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡに部位特異的変異を導入することにより取得することができる。
【０１２４】
欠失、置換、挿入又は付加されるアミノ酸残基の数は特に限定されないが、前記２−２に記載の部位特異的変異法等の周知の方法により欠失、置換、挿入又は付加できる程度の数であり、１〜２０個、好ましくは１〜１０個、最も好ましくは１〜５個である。
【０１２５】
配列番号８で表わされるアミノ酸配列において１〜２０個、好ましくは１〜１０個、最も好ましくは１〜５個以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたとは、同一配列中の任意の位置において、アミノ酸残基が欠失、置換又は付加されていてもよい。
【０１２６】
前記の変異蛋白質又は相同蛋白質が、アセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼ活性を有することは、例えば、ＤＮＡ組換え法を用いて活性を確認したい蛋白質を発現する形質転換体を作製して培地で培養し、培養物中のアセトアセチル−ＣｏＡ量を測定することにより確認することができる。
【０１２７】
アセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼをコードするＤＮＡとしては、該活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡであればいずれでもよいが、例えば、以下の［２９］〜［３２］のいずれか１つに記載のＤＮＡが挙げられる。
【０１２８】
［２９］前記［２６］〜［２８］のいずれか１つに記載の蛋白質をコードするＤＮＡ
［３０］配列番号７で表わされる塩基配列を有するＤＮＡ
［３１］配列番号７で表わされる塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつアセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼ活性を有する相同蛋白質をコードするＤＮＡ
［３２］配列番号７で表わされる塩基配列と少なくとも９５％以上、好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつアセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼ活性を有する相同蛋白質をコードするＤＮＡ
ハイブリダイゼーション及びストリンジェントな条件については、前記２−２と同様である。
【０１２９】
前記ストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、例えば前記２−２のＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡ等を用いて計算したときに、配列番号７で表わされる塩基配列からなるＤＮＡと少なくとも９５％以上、好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するＤＮＡが挙げられる。
【０１３０】
アセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼをコードするＤＮＡは、例えば、配列番号７で表わされる塩基配列に基づき設計することができるプローブＤＮＡを用いて、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０株のゲノムＤＮＡを鋳型として、前記２−２のＰＣＲを用いた方法等により取得することができる。
【０１３１】
（ｂ）アセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼをコードするＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡで親株の微生物を形質転換することにより得られる、親株よりも該蛋白質をコードする遺伝子のコピー数が増大した微生物は、以下の方法で取得することができる。
【０１３２】
前記の方法で得られるアセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼをコードするＤＮＡをもとにして、必要に応じて、該蛋白質をコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製する。ここで、該蛋白質をコードする部分の塩基配列を、宿主細胞での発現に最適なコドンとなるように、塩基を置換することにより、生産率が向上した形質転換体を取得することができる。
【０１３３】
調製したＤＮＡ断片を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換え体ＤＮＡを作製する。該組換え体ＤＮＡで、前記２−１〜２−４の微生物を形質転換することにより、親株よりも該蛋白質をコードするＤＮＡのコピー数が増大した微生物を取得することができる。
【０１３４】
また、調製したＤＮＡ断片を有し染色体への組込が可能な組換え体ＤＮＡで、前記２−１〜２−４の微生物を形質転換し、アセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼをコードするＤＮＡを染色体の任意の位置に組み込むことによっても、親株よりも該蛋白質をコードするＤＮＡのコピー数が増大した微生物を取得することができる。染色体へＤＮＡ断片を組込む場合、組換え体ＤＮＡはプロモーターを含有していなくてもよい。
【０１３５】
原核生物を親株として用いる場合、親株において自律複製可能な組換え体ＤＮＡは、プロモーター、リボソーム結合配列、該ＤＮＡ、転写終結配列より構成された組換え体ＤＮＡであることが好ましい。プロモーターを制御するＤＮＡが含まれていてもよい。
【０１３６】
親株において自律複製可能な組換え体ＤＮＡを用いる場合、発現ベクター及び該発現ベクターのプロモーターとしては、前記２−２と同様の発現ベクター及びプロモーターが挙げられる。
【０１３７】
親株において自律複製可能な組換え体ＤＮＡを用いる場合、リボソーム結合配列であるシャイン−ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜１８塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。
【０１３８】
親株において自律複製可能な組換え体ＤＮＡにおいては、転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
【０１３９】
前記方法にて取得した微生物が、親株に比べ、アセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼをコードするＤＮＡのコピー数が増大した微生物であることは、例えば、該微生物の該ＤＮＡの転写量をノーザン・ブロッティングにより、又は該微生物の該蛋白質の生産量をウェスタン・ブロッティングにより測定し、親株のそれと比較することにより確認することができる。
【０１４０】
このような微生物の例としては、実施例において後述するＷ３１１０Ａ株が挙げられる。
【０１４１】
２−５−２．エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ活性が増強した微生物
エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ活性とは、３−メチルクロトニル−ＣｏＡを基質として３−ヒドロキシ−３−メチルブチリル−ＣｏＡを生成する活性をいう。本明細書において、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ活性を有する蛋白質のことは、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼともいう。
【０１４２】
親株よりもエノイル−ＣｏＡヒドラターゼ活性が増強した微生物としては、以下の（ｃ）及び（ｄ）の微生物が挙げられる。
【０１４３】
（ｃ）親株の染色体ＤＮＡ上にあるエノイル−ＣｏＡヒドラターゼをコードするＤＮＡを改変することにより得られる、
ｉ）親株の微生物に比べ、該蛋白質の比活性が増強した微生物、又は、
ｉｉ）親株の微生物に比べ、該ＤＮＡの転写量又は該蛋白質の生産量が増大した微生物
（ｄ）該蛋白質をコードするＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡで親株の微生物を形質転換することにより得られる、親株よりも該ＤＮＡのコピー数が増大した微生物
【０１４４】
（ｃ）親株の染色体ＤＮＡ上にあるエノイル−ＣｏＡヒドラターゼをコードするＤＮＡを改変することにより得られる、ｉ）親株の微生物に比べ、該蛋白質の比活性が増強した微生物としては、親株が有するエノイル−ＣｏＡヒドラターゼのアミノ酸配列において１〜２０個のアミノ酸、好ましくは１〜１０個のアミノ酸、最も好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加しているアミノ酸配列を有する蛋白質を有しているため、親株の該蛋白質と比較して、その比活性が増強した変異蛋白質を有する微生物が挙げられる。
【０１４５】
（ｃ）親株の染色体ＤＮＡ上にあるエノイル−ＣｏＡヒドラターゼ活性をコードするＤＮＡを改変することにより得られる、ｉ）親株の微生物に比べ、該蛋白質の比活性が増強した微生物は、前記２−５−１と同様の方法で取得することができる。
【０１４６】
エノイル−ＣｏＡヒドラターゼをコードするＤＮＡは、例えば、配列番号９で表わされる塩基配列に基づき設計することができるプローブＤＮＡを用いて、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０株のゲノムＤＮＡを鋳型として、前記２−２のＰＣＲを用いた方法等により取得することができる。
【０１４７】
親株に比べ、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼの比活性が増強した微生物であることは、例えば、以下のように確認することができる。
【０１４８】
エノイル−ＣｏＡヒドラターゼの変異蛋白質を有する微生物から該変異蛋白質を精製し、該変異蛋白質及び３−メチルクロトニル−ＣｏＡを水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中に生成、蓄積した３−ヒドロキシ−３−メチルブチリル−ＣｏＡと該蛋白質量から比活性を測定する。また、変異が導入されていないエノイル−ＣｏＡヒドラターゼ有する微生物からエノイル−ＣｏＡヒドラターゼを精製し、同様にして比活性を測定し、変異蛋白質の比活性と比較する。
【０１４９】
（ｃ）親株の染色体ＤＮＡ上にあるエノイル−ＣｏＡヒドラターゼをコードするＤＮＡを改変することにより得られる、ｉｉ）親株の微生物に比べ、該ＤＮＡの転写量又は該蛋白質の生産量が増大した微生物としては、親株の染色体ＤＮＡ上に存在するエノイル−ＣｏＡヒドラターゼをコードするＤＮＡの転写調節領域又はプロモーター領域の塩基配列において１塩基以上、好ましくは１〜２０塩基、より好ましくは１〜１０塩基、さらに好ましくは１〜５塩基の塩基が欠失、置換、挿入又は付加しているプロモーター領域を有しているため、親株と比較して、該ＤＮＡの発現量が増大した微生物、もしくは、親株の染色体ＤＮＡ上に存在する該ＤＮＡのプロモーター領域を公知の強力なプロモーター配列と置換して得られる、該ＤＮＡの発現量が増大した微生物が挙げられる。
【０１５０】
（ｃ）親株の染色体ＤＮＡ上にあるエノイル−ＣｏＡヒドラターゼをコードするＤＮＡを改変することにより得られる、ｉｉ）親株の微生物に比べ、該ＤＮＡの転写量又は該蛋白質の生産量が増大した微生物は、例えば、前記２−５−１と同様の方法により取得することができる。
【０１５１】
前記方法にて取得した微生物が、親株に比べ、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼをコードするＤＮＡの転写量又は該蛋白質の生産量が増大した微生物であることは、例えば、該微生物の該ＤＮＡの転写量をノーザン・ブロッティングにより、又は該微生物の該蛋白質の生産量をウェスタン・ブロッティングにより測定し、親株のそれと比較することにより確認することができる。
【０１５２】
（ｄ）エノイル−ＣｏＡヒドラターゼをコードするＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡで親株の微生物を形質転換することにより得られる、親株よりも該ＤＮＡのコピー数が増大した微生物としては、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼをコードするＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡで親株の微生物を形質転換することにより、染色体ＤＮＡ上において前記ＤＮＡのコピー数が増大した微生物、及びプラスミドＤＮＡとして染色体ＤＮＡ外に前記ＤＮＡを保有させた微生物が挙げられる。
【０１５３】
エノイル−ＣｏＡヒドラターゼとしては、該活性を有する蛋白質であればいずれでもよいが、例えば、特許文献４に記載されているＭｙｘｏｃｏｃｃｕｓ  ｘａｎｔｈｕｓのエノイル−ＣｏＡヒドラターゼ（ＵｎｉＰｒｏｔ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｑ１Ｄ５Ｙ４）、及び以下の［３３］〜［３５］のいずれか１つに記載の蛋白質が挙げられる。
【０１５４】
［３３］配列番号１０で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質
［３４］配列番号１０で表わされるアミノ酸配列において、１〜２０個、好ましくは１〜１０個、最も好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつエノイル−ＣｏＡヒドラターゼ活性を有する変異蛋白質
［３５］配列番号１０で表わされるアミノ酸配列と９５％以上、好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつエノイル−ＣｏＡヒドラターゼ活性を有する相同蛋白質
【０１５５】
前記において、１〜２０個、好ましくは１〜１０個、最も好ましくは１〜５個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつエノイル−ＣｏＡヒドラターゼ活性を有する変異蛋白質は、前記２−２の部位特異的変異導入法を用いて、例えば配列番号１０で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡに部位特異的変異を導入することにより取得することができる。
【０１５６】
前記の変異蛋白質又は相同蛋白質が、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ活性を有することは、例えば、ＤＮＡ組換え法を用いて活性を確認したい蛋白質を発現する形質転換体を作製して、３−メチルクロトニル−ＣｏＡを含む培地で培養し、培養物中の３−ヒドロキシ−３−メチルブチリル−ＣｏＡ量を測定することにより確認することができる。
【０１５７】
エノイル−ＣｏＡヒドラターゼをコードするＤＮＡとしては、該活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡであればいずれでもよいが、例えば、以下の［３６］〜［３９］のいずれか１つに記載のＤＮＡが挙げられる。
【０１５８】
［３６］前記［３３］〜［３５］のいずれか１つに記載の蛋白質をコードするＤＮＡ
［３７］配列番号９で表わされる塩基配列を有するＤＮＡ
［３８］配列番号９で表わされる塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつエノイル−ＣｏＡヒドラターゼ活性を有する相同蛋白質をコードするＤＮＡ
［３９］配列番号９で表わされる塩基配列と少なくとも９５％以上、好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつエノイル−ＣｏＡヒドラターゼ活性を有する相同蛋白質をコードするＤＮＡ
ハイブリダイゼーション及びストリンジェントな条件については、前記２−２と同様である。
【０１５９】
前記ストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、例えば、前記２−２のＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡ等を用いて計算したときに、配列番号９で表わされる塩基配列からなるＤＮＡと少なくとも９５％以上、好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するＤＮＡが挙げられる。
【０１６０】
エノイル−ＣｏＡヒドラターゼをコードするＤＮＡは、例えば、配列番号９で表わされる塩基配列に基づき設計することができるプローブＤＮＡを用いて、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０株のゲノムＤＮＡを鋳型として、前記２−２のＰＣＲを用いた方法等により取得することができる。
【０１６１】
（ｄ）エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ活性をコードするＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡで親株の微生物を形質転換することにより得られる、親株よりも該蛋白質をコードする遺伝子のコピー数が増大した微生物は、前記２−５−１と同様の方法で取得することができる。
【０１６２】
前記方法にて取得した微生物が、親株に比べ、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼをコードするＤＮＡのコピー数が増大した微生物であることは、例えば、該微生物の該ＤＮＡの転写量をノーザン・ブロッティングにより、又は該微生物の該蛋白質の生産量をウェスタン・ブロッティングにより測定し、親株のそれと比較することにより確認することができる。
【０１６３】
このような微生物としては、例えば、実施例において後述するＷ３１１０ＡＦ株が挙げられる。
【０１６４】
２−５−３．チオエステラーゼ活性が増強した微生物
チオエステラーゼ活性とは、３−ヒドロキシ−３−メチルブチリル−ＣｏＡを基質として３−ヒドロキシイソ吉草酸を生成する活性をいう。本明細書において、チオエステラーゼ活性を有する蛋白質のことは、チオエステラーゼともいう。
【０１６５】
親株よりもチオエステラーゼ活性が増強した微生物としては、以下の（ｅ）及び（ｆ）の微生物が挙げられる。
【０１６６】
（ｅ）親株の染色体ＤＮＡ上にあるチオエステラーゼをコードするＤＮＡを改変することにより得られる、
ｉ）親株の微生物に比べ、該蛋白質の比活性が増強した微生物、又は、
ｉｉ）親株の微生物に比べ、該ＤＮＡの転写量又は該蛋白質の生産量が増大した微生物
（ｆ）該蛋白質をコードするＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡで親株の微生物を形質転換することにより得られる、親株よりも該ＤＮＡのコピー数が増大した微生物
【０１６７】
（ｅ）親株の染色体ＤＮＡ上にあるチオエステラーゼをコードするＤＮＡを改変することにより得られる、ｉ）親株の微生物に比べ、該蛋白質の比活性が増強した微生物としては、親株が有するチオエステラーゼのアミノ酸配列において１〜２０個のアミノ酸、好ましくは１〜１０個のアミノ酸、最も好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加しているアミノ酸配列を有する蛋白質を有しているため、親株の該蛋白質と比較して、その比活性が増強した変異蛋白質を有する微生物が挙げられる。
【０１６８】
（ｅ）親株の染色体ＤＮＡ上にあるチオエステラーゼをコードするＤＮＡを改変することにより得られる、ｉ）親株の微生物に比べ、該蛋白質の比活性が増強した微生物は、前記２−５−１と同様の方法で取得することができる。
【０１６９】
チオエステラーゼをコードするＤＮＡは、例えば、配列番号１１で表わされる塩基配列に基づき設計することができるプローブＤＮＡを用いて、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０株のゲノムＤＮＡを鋳型として、前記２−２のＰＣＲを用いた方法等により取得することができる。
【０１７０】
親株に比べ、チオエステラーゼの比活性が増強した微生物であることは、例えば、以下のように確認することができる。
【０１７１】
チオエステラーゼの変異蛋白質を有する微生物から該変異蛋白質を精製し、該変異蛋白質及び３−ヒドロキシ−３−メチルブチリル−ＣｏＡを水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中に生成、蓄積した３−ヒドロキシイソ吉草酸と該蛋白質量から比活性を測定する。また、変異が導入されていないチオエステラーゼを有する微生物からチオエステラーゼを精製し、同様にして比活性を測定し、変異蛋白質の比活性と比較する。
【０１７２】
（ｅ）親株の染色体ＤＮＡ上にあるチオエステラーゼをコードするＤＮＡを改変することにより得られる、ｉｉ）親株の微生物に比べ、該ＤＮＡの転写量又は該蛋白質の生産量が増大した微生物としては、親株の染色体ＤＮＡ上に存在するチオエステラーゼをコードするＤＮＡの転写調節領域又はプロモーター領域の塩基配列において１塩基以上、好ましくは１〜２０塩基、より好ましくは１〜１０塩基、さらに好ましくは１〜５塩基の塩基が欠失、置換、挿入又は付加しているプロモーター領域を有しているため、親株と比較して、該ＤＮＡの発現量が増大した微生物、もしくは、親株の染色体ＤＮＡ上に存在する該ＤＮＡのプロモーター領域を公知の強力なプロモーター配列と置換して得られる、該ＤＮＡの発現量が増大した微生物が挙げられる。
【０１７３】
（ｅ）親株の染色体ＤＮＡ上にあるチオエステラーゼをコードするＤＮＡを改変することにより得られる、ｉｉ）親株の微生物に比べ、該ＤＮＡの転写量又は該蛋白質の生産量が増大した微生物は、例えば、前記２−５−１と同様の方法により取得することができる。
【０１７４】
前記方法にて取得した微生物が、親株に比べ、チオエステラーゼをコードするＤＮＡの転写量又は該蛋白質の生産量が増大した微生物であることは、例えば、該微生物の該ＤＮＡの転写量をノーザン・ブロッティングにより、又は該微生物の該蛋白質の生産量をウェスタン・ブロッティングにより測定し、親株のそれと比較することにより確認することができる。
【０１７５】
（ｆ）チオエステラーゼをコードするＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡで親株の微生物を形質転換することにより得られる、親株よりも該ＤＮＡのコピー数が増大した微生物としては、チオエステラーゼをコードするＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡで親株の微生物を形質転換することにより、染色体ＤＮＡ上において前記ＤＮＡのコピー数が増大した微生物、及びプラスミドＤＮＡとして染色体ＤＮＡ外に前記ＤＮＡを保有させた微生物が挙げられる。
【０１７６】
チオエステラーゼとしては、該活性を有する蛋白質であればいずれでもよいが、例えば、以下の［４０］〜［４２］のいずれか１つに記載の蛋白質が挙げられる。
【０１７７】
［４０］配列番号１２で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質
［４１］配列番号１２で表わされるアミノ酸配列において、１〜２０個、好ましくは１〜１０個、最も好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつチオエステラーゼ活性を有する変異蛋白質
［４２］配列番号１２で表わされるアミノ酸配列と９５％以上、好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつチオエステラーゼ活性を有する相同蛋白質
【０１７８】
前記において、１〜２０個、好ましくは１〜１０個、最も好ましくは１〜５個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつチオエステラーゼ活性を有する変異蛋白質は、前記２−２の部位特異的変異導入法を用いて、例えば配列番号１２で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡに部位特異的変異を導入することにより取得することができる。
【０１７９】
前記の変異蛋白質又は相同蛋白質が、チオエステラーゼ活性を有することは、例えば、ＤＮＡ組換え法を用いて活性を確認したい蛋白質を発現する形質転換体を作製して、３−ヒドロキシ−３−メチルブチリル−ＣｏＡを含む培地で培養し、培養物中の３−ヒドロキシイソ吉草酸量を測定することにより確認することができる。
【０１８０】
チオエステラーゼをコードするＤＮＡとしては、該活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡであればいずれでもよいが、例えば、以下の、［４３］〜［４６］のいずれか１つに記載のＤＮＡが挙げられる。
【０１８１】
［４３］前記［４０］〜［４２］のいずれか１つに記載の蛋白質をコードするＤＮＡ
［４４］配列番号１１で表わされる塩基配列を有するＤＮＡ
［４５］配列番号１１で表わされる塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつチオエステラーゼ活性を有する相同蛋白質をコードするＤＮＡ
［４６］配列番号１１で表わされる塩基配列と少なくとも９５％以上、好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつチオエステラーゼ活性を有する相同蛋白質をコードするＤＮＡ
ハイブリダイゼーション及びストリンジェントな条件については、前記２−２と同様である。
【０１８２】
前記ストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、例えば、前記２−２のＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡ等を用いて計算したときに、配列番号１１で表わされる塩基配列からなるＤＮＡと少なくとも９５％以上、好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するＤＮＡが挙げられる。
【０１８３】
チオエステラーゼをコードするＤＮＡは、例えば、配列番号１１で表わされる塩基配列に基づき設計することができるプローブＤＮＡを用いて、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０株のゲノムＤＮＡを鋳型として、前記２−２のＰＣＲを用いた方法等により取得することができる。
【０１８４】
（ｆ）チオエステラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡで親株の微生物を形質転換することにより得られる、親株よりも該蛋白質をコードする遺伝子のコピー数が増大した微生物は、前記２−５−１と同様の方法で取得することができる。
【０１８５】
前記方法にて取得した微生物が、親株に比べ、チオエステラーゼをコードするＤＮＡのコピー数が増大した微生物であることは、例えば、該微生物の該ＤＮＡの転写量をノーザン・ブロッティングにより、又は該微生物の該蛋白質の生産量をウェスタン・ブロッティングにより測定し、親株のそれと比較することにより確認することができる。
【０１８６】
このような微生物としては、例えば、実施例において後述するＷ３１１０ＡＦＴ株が挙げられる。
【０１８７】
３．本発明の３−ヒドロキシイソ吉草酸の製造方法
本発明の３−ヒドロキシイソ吉草酸の製造方法は、前記２の微生物を培地に培養し、培養物中に３−ヒドロキシイソ吉草酸を生成、蓄積させ、該培養物中から３−ヒドロキシイソ吉草酸を採取することを含む、３−ヒドロキシイソ吉草酸の製造方法である。
【０１８８】
前記２の微生物を培養する方法は、微生物の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。該微生物を培養する培地としては、該微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、該微生物の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
【０１８９】
炭素源としては、該微生物が資化し得るものであればよく、例えば、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類等が挙げられる。
【０１９０】
窒素源としては、例えば、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕及び大豆粕加水分解物、各種発酵菌体、及びその消化物等が挙げられる。
【０１９１】
無機塩としては、例えば、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が挙げられる。
【０１９２】
培養は、通常振盪培養又は深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行う。培養温度は１５〜４０℃がよく、培養時間は、通常５時間〜７日間である。培養中ｐＨは３．０〜９．０に保持する。ｐＨの調整は、無機又は有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行う。
【０１９３】
また、培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
【０１９４】
前記の培養により、培養物中に３−ヒドロキシイソ吉草酸を生成、蓄積させ、該培養物中から３−ヒドロキシイソ吉草酸を採取することにより、３−ヒドロキシイソ吉草酸を製造することができる。
【０１９５】
生成した３−ヒドロキシイソ吉草酸は、ＨＰＬＣやＬＣ−ＭＳにて分析することができる。反応液中に生成した３−ヒドロキシイソ吉草酸の採取は、活性炭やイオン交換樹脂などを用いる通常の方法によって行うことができる。
【０１９６】
該培養物中からの３−ヒドロキシイソ吉草酸の採取は通常イオン交換樹脂法、沈殿法その他の公知の方法を組み合わせることにより実施できる。なお、菌体内に３−ヒドロキシイソ吉草酸が蓄積する場合には、例えば菌体を超音波などにより破砕し、遠心分離によって菌体を除去して得られる上清からイオン交換樹脂法などによって、３−ヒドロキシイソ吉草酸を採取することができる。
【実施例】
【０１９７】
以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【０１９８】
［実施例１］
３−ヒドロキシイソ吉草酸の製造に用いる微生物の造成−１
（１）遺伝子欠損及び遺伝子置換の際にマーカーとして用いるＤＮＡ断片の取得
配列番号１３及び１４で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして、プラスミドｐＨＳＧ３９６（タカラバイオ社製）を鋳型として、また配列番号１５及び１６で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  １６８株のゲノムＤＮＡを鋳型として、それぞれＰＣＲを行い、ｃａｔ遺伝子を含むＤＮＡ断片及びｓａｃＢ遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。
【０１９９】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  １６８株のゲノムＤＮＡは定法により調製した。ｃａｔ遺伝子を含むＤＮＡ断片は、ｐＨＳＧ３９６に含まれるｃａｔ遺伝子の上流側約２００ｂｐから下流側約１００ｂｐを含む。ｓａｃＢ遺伝子を含むＤＮＡ断片は、ｓａｃＢ遺伝子の上流側約３００ｂｐから下流側約１００ｂｐを含む。また、配列番号１４及び１５で表わされる塩基配列からなるＤＮＡには、それぞれＳａｌＩ認識サイトが付与されている。
【０２００】
ｃａｔ遺伝子を含むＤＮＡ断片及びｓａｃＢ遺伝子含むＤＮＡ断片を制限酵素ＳａｌＩで切断し、ＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２（タカラバイオ社製）を用いて連結反応を行った。
【０２０１】
得られた連結反応液を鋳型とし、配列番号１３及び１６で表わされる塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして用いてＰＣＲを行い、ｃａｔ遺伝子及びｓａｃＢ遺伝子を含むＤＮＡ（以下、ｃａｔ−ｓａｃＢという。）断片を得た。
【０２０２】
（２）アセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼ活性が増強した微生物の造成
アセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼをコードするＤＮＡ（以下、ａｔｏＢ遺伝子という。）の推定プロモーター領域（以下、ＰａｔｏＤという。）をｔｒｐプロモーターに置換した大腸菌を、以下の方法で造成した。
【０２０３】
大腸菌において、ａｔｏＢ遺伝子はオペロンを形成しており、ａｔｏＢ遺伝子の上流には、アセトアセチル−ＣｏＡトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ（以下、ａｔｏＤ遺伝子という。）が存在する。ＰａｔｏＤは、ａｔｏＤ遺伝子の開始コドン上流３００ｂｐの領域を指す。
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０株のゲノムＤＮＡを鋳型として、表１の「プライマーセット」で表わされる塩基配列からなるＤＮＡをそれぞれプライマーセットとして用いてＰＣＲを行い、各ＤＮＡ断片を増幅した。
【０２０４】
【表１】
2022001556.tif 000002
【０２０５】
ＰａｔｏＤ上流１及びＰａｔｏＤ上流２は、ＰａｔｏＤの上流側約１０００ｂｐを含む。ＰａｔｏＤ下流１及びＰａｔｏＤ下流２は、ａｔｏＤ遺伝子の開始コドンからその下流側約１０００ｂｐを含む。
【０２０６】
ＰａｔｏＤ上流１、ＰａｔｏＤ下流１、及びｃａｔ−ｓａｃＢ断片を等モルの比率で混合したものを鋳型とし、配列番号１７及び２０で表わされる塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットに用いてＰＣＲを行い、ＰａｔｏＤ上流１、ｃａｔ−ｓａｃＢ断片、及びＰａｔｏＤ下流１が連結したＤＮＡ（以下、ＰａｔｏＤ：：ｃａｔ−ｓａｃＢという。）断片を得た。
【０２０７】
ＰａｔｏＤ上流２、ＰａｔｏＤ下流２、ｔｒｐプロモーターを等モルの比率で混合したものを鋳型とし、配列番号１７及び２０で表わされる塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットに用いてＰＣＲを行い、ＰａｔｏＤ上流２、ｔｒｐプロモーター、及びＰａｔｏＤ下流２が連結したＤＮＡ（以下、ＰａｔｏＤ：：Ｐｔｒｐという。）断片を得た。
【０２０８】
ＰａｔｏＤ：：ｃａｔ−ｓａｃＢ断片を、λリコンビナーゼをコードする遺伝子を含むプラスミドｐＫＤ４６［Ｄａｔｓｅｎｋｏ，Ｋ．Ａ．，Ｗａｒｎｅｒ，Ｂ．Ｌ．，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ，Ｖｏｌ．９７．ｐ．６６４０−６６４５（２０００）］を保持するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０株に、エレクトロポレーション法により導入し、クロラムフェニコール耐性、かつシュクロース感受性を示した形質転換体（ＰａｔｏＤがｃａｔ−ｓａｃＢに置換した形質転換体）を得た。
【０２０９】
得られた形質転換体に、ＰａｔｏＤ：：Ｐｔｒｐ断片を当該形質転換体にエレクトロポレーション法により導入し、クロラムフェニコール感受性かつシュクロース耐性を示した形質転換体（ｃａｔ−ｓａｃＢがｔｒｐプロモーターに置換した形質転換体）を得た。当該微生物をＷ３１１０Ａ株と命名した。
【０２１０】
（３）エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ活性が増強した微生物の造成
エノイル−ＣｏＡヒドラターゼをコードするＤＮＡ（以下、ｆａｄＢ遺伝子という。）の推定プロモーター領域（以下、ＰｆａｄＢという。）を、ｇａｐＡプロモーターに置換した大腸菌を、以下の方法で造成した。ＰｆａｄＢは、ｆａｄＢ遺伝子の開始コドン上流３００ｂｐの領域を指す。
【０２１１】
定法により調製したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０株のゲノムＤＮＡを鋳型として、表２の「プライマーセット」で表わされる塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして用いてＰＣＲを行い、各ＤＮＡ断片を増幅した。
【０２１２】
【表２】
2022001556.tif 000003
【０２１３】
ＰｆａｄＢ上流１及びＰｆａｄＢ上流２は、ＰｆａｄＢの上流側約１０００ｂｐを含む。ＰｆａｄＢ下流１及びＰｆａｄＢ下流２は、ｆａｄＢ遺伝子の開始コドンからその下流側約１０００ｂｐを含む。
【０２１４】
ＰｆａｄＢ上流１、ＰｆａｄＢ下流１、及びｃａｔ−ｓａｃＢ断片を等モルの比率で混合したものを鋳型とし、配列番号２５及び２８で表わされる塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットに用いてＰＣＲを行い、ＰｆａｄＢ上流１、ｃａｔ−ｓａｃＢ断片、及びＰｆａｄＢ下流１が連結したＤＮＡ（以下、ＰｆａｄＢ：：ｃａｔ−ｓａｃＢという。）断片を得た。
【０２１５】
ＰｆａｄＢ上流２、ＰｆａｄＢ下流２、ｇａｐＡプロモーターを等モルの比率で混合したものを鋳型とし、配列番号２５及び２８で表わされる塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットに用いてＰＣＲを行い、ＰｆａｄＢ上流２、ｇａｐＡプロモーター、及びＰｆａｄＢ下流２が連結したＤＮＡ（以下、ＰｆａｄＢ：：ＰｇａｐＡという。）断片を得た。
【０２１６】
ＰｆａｄＢ：：ｃａｔ−ｓａｃＢ断片を、λリコンビナーゼをコードする遺伝子を含むプラスミドｐＫＤ４６を保持するＷ３１１０Ａ株にエレクトロポレーション法により導入し、クロラムフェニコール耐性かつシュクロース感受性を示した形質転換体（ＰｆａｄＢがｃａｔ−ｓａｃＢに置換した形質転換体）を得た。
【０２１７】
得られた形質転換体に、ＰｆａｄＢ：：ＰｇａｐＡ断片をエレクトロポレーション法により導入し、クロラムフェニコール感受性かつシュクロース耐性を示した形質転換体（ｃａｔ−ｓａｃＢがｇａｐＡプロモーターに置換した形質転換体）を得た。当該形質転換体をＷ３１１０ＡＦ株と命名した。
【０２１８】
（４）チオエステラーゼ活性が増強した微生物の造成
チオエステラーゼをコードするＤＮＡ（以下、ｔｅｓＢ遺伝子という。）の推定プロモーター領域（以下、ＰｔｅｓＢいう。）を、ｔｒｐプロモーターに置換した大腸菌を、以下の方法で造成した。ＰｔｅｓＢは、ｔｅｓＢ遺伝子の開始コドン上流３００ｂｐを指す。
【０２１９】
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０株のゲノムＤＮＡを鋳型として、表３の「プライマーセット」で表わされる塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして用いてＰＣＲを行い、各ＤＮＡ断片を増幅した。
【０２２０】
【表３】
2022001556.tif 000004
【０２２１】
ＰｔｅｓＢ上流１及びＰｔｅｓＢ上流２は、ｔｅｓＢ遺伝子の推定プロモーター領域ＰｔｅｓＢの上流側約１０００ｂｐを含む。ＰｔｅｓＢ下流１及びＰｔｅｓＢ下流２は、ＰｔｅｓＢ遺伝子の開始コドンからその下流側約１０００ｂｐを含む。
【０２２２】
ＰｔｅｓＢ上流１、ＰｔｅｓＢ下流１、及びｃａｔ−ｓａｃＢ断片を等モルの比率で混合したものを鋳型とし、配列番号３３及び３６で表わされる塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットに用いてＰＣＲを行い、ＰｔｅｓＢ上流１、ｃａｔ−ｓａｃＢ断片、及びＰｔｅｓＢ下流１が連結したＤＮＡ（以下、ＰｔｅｓＢ：：ｃａｔ−ｓａｃＢという。）断片を得た。
【０２２３】
ＰｔｅｓＢ上流２、ＰｔｅｓＢ下流２、ｔｒｐプロモーターを等モルの比率で混合したものを鋳型とし、配列番号３３及び３６で表わされる塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットに用いてＰＣＲを行い、ＰｔｅｓＢ上流２、ｔｒｐプロモーター、及びＰｔｅｓＢ下流２が連結したＤＮＡ（以下、ＰｔｅｓＢ：：Ｐｔｒｐという。）断片を得た。
【０２２４】
ＰｔｅｓＢ：：ｃａｔ−ｓａｃＢ断片を、λリコンビナーゼをコードする遺伝子を含むプラスミドｐＫＤ４６を保持するＷ３１１０ＡＦ株に、エレクトロポレーション法により導入し、クロラムフェニコール耐性、かつシュクロース感受性を示した形質転換体（ＰｔｅｓＢがｃａｔ−ｓａｃＢに置換した形質転換体）を得た。
【０２２５】
続いて、ＰｔｅｓＢ：：Ｐｔｒｐ断片を、当該形質転換体にエレクトロポレーション法により導入し、クロラムフェニコール感受性かつシュクロース耐性を示した形質転換体（ｃａｔ−ｓａｃＢがｔｒｐプロモーターに置換した形質転換体）を得た。当該微生物をＷ３１１０ＡＦＴ株と命名した。
【０２２６】
（５）ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ、メチルグルタコニル−ＣｏＡヒドラターゼ、及びメチルグルタコニル−ＣｏＡカルボキシラーゼを生産する微生物の造成
Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓ  ＡＴＣＣ１３６７５株の染色体ＤＮＡを鋳型として、配列番号４１及び４２で表わされる塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして用いてＰＣＲを行い、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ（配列番号４で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質）をコードするＤＮＡを増幅した。その後、該ＰＣＲにより得られた増幅産物を制限酵素ＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩで処理後、発現ベクターｐＱＥ８０Ｌ（キアゲン社製）に連結することにより発現プラスミドｐＱＥ８０Ｌ＿ｈｍｃＭを造成した。
【０２２７】
また、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  ＫＴ２４４０株の染色体ＤＮＡを鋳型として、配列番号４３及び４４で表わされる塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして用いてＰＣＲを行い、メチルグルタコニル−ＣｏＡヒドラターゼ（配列番号６で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質）をコードするＤＮＡ（以下、ｌｉｕＣ遺伝子という。）を増幅した。その後、該ＰＣＲにより得られた増幅産物を制限酵素ＢｇｌＩＩ及びＳａｌIで処理後、発現ベクターｐＱＥ８０Ｌ（キアゲン社製）に連結することにより発現プラスミドｐＱＥ８０Ｌ＿ｌｉｕＣを造成した。
【０２２８】
さらに、造成したｐＱＥ８０Ｌ＿ｌｉｕＣを鋳型とし、配列番号４７及び４４で表わされる塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして用いてＰＣＲを行い、ｐＱＥ８０Ｌ由来のＳＤ配列及びｌｉｕＣ遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。
【０２２９】
続いて、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  １６８株の染色体ＤＮＡを鋳型として、配列番号４５及び４６で表わされる塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして用いてＰＣＲを行い、メチルグルタコニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ（配列番号２で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質）をコードするＤＮＡ（以下、ｐｋｓＩ遺伝子という。）を増幅した。その後、該ＰＣＲにより得られた増幅産物を制限酵素ＢｇｌＩＩ及ＨｉｎｄＩＩＩで処理後、発現ベクターｐＱＥ８０Ｌ（キアゲン社製）に連結することにより発現プラスミドｐＱＥ８０Ｌ＿ｐｋｓＩを造成した。
【０２３０】
さらに、造成したｐＱＥ８０Ｌ＿ｐｋｓＩを鋳型とし、配列番号４８及び４６で表わされる塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして用いてＰＣＲを行い、ｐＱＥ８０Ｌ由来のＴ５プロモーター配列及びｐｋｓＩ遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。
【０２３１】
前記ＰＣＲにより得られたｐＱＥ８０Ｌ由来のＳＤ配列及びｌｉｕＣ遺伝子を含むＤＮＡ断片を制限酵素ＳａｌＩ及びＫｐｎIで、ｐＱＥ８０Ｌ由来のＴ５プロモーター配列及びｐｋｓＩ遺伝子を含むＤＮＡ断片を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＳａｌIにて処理した後、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（タカラバイオ社製）により発現プラスミドｐＱＥ８０Ｌ_ｈｍｃＭに連結することにより、発現プラスミドｐＱＥ８０Ｌ＿ｈｍｃＭ＿ｌｉｕＣ＿ＰＴ５−ｐｋｓＩを得た。
【０２３２】
実施例１（４）で取得したＷ３１１０ＡＦＴ株を、ｐＱＥ８０Ｌ又はｐＱＥ８０Ｌ＿ｈｍｃＭ＿ｌｉｕＣ＿ＰＴ５−ｐｋｓＩで形質転換し、それぞれＷ３１１０ＡＦＴ／ｐＱＥ８０Ｌ株又はＷ３１１０ＡＦＴ／ｐＱＥ８０Ｌ＿ｈｍｃＭ＿ｌｉｕＣ＿ＰＴ５−ｐｋｓＩ株を得た。
【０２３３】
［実施例２］
３−ヒドロキシイソ吉草酸の製造−１
実施例１で取得したＷ３１１０ＡＦＴ／ｐＱＥ８０Ｌ株及びＷ３１１０ＡＦＴ／ｐＱＥ８０Ｌ＿ｈｍｃＭ＿ｌｉｕＣ＿ＰＴ５−ｐｋｓＩ株をＬＢプレート上で３０℃にて一晩培養した後、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含むＬＢ培地５ｍＬが入った太型試験管に植菌して、３０℃で１２時間、振盪培養した。
【０２３４】
その後、得られた培養液を生産培地［グルコース３０ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム七水和物２ｇ／Ｌ、カザミノ酸５ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム２ｇ／Ｌ、クエン酸１ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム１４ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム１６ｇ／Ｌ、チアミン塩酸塩１０ｍｇ／Ｌ、硫酸第一鉄七水和物５０ｍｇ／Ｌ、硫酸マンガン五水和物１０ｍｇ／Ｌ（グルコース及び硫酸マグネシウム七水和物以外については、水酸化ナトリウム水溶液によりｐＨ７．２に調整した後オートクレーブし、グルコース及び硫酸マグネシウム七水和物については、グルコース及び硫酸マグネシウム七水和物含有水溶液を別途調製した後オートクレーブし、それぞれ冷却後、混合した）］が５ｍＬ入った太型試験管に０．０５ｍＬ植菌した。これを、３０℃で６時間振盪培養した後、終濃度１ｍＭのイソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加して、さらに３０℃で４２時間、振盪培養した。
【０２３５】
培養終了後、培養液を遠心分離し、上清中の３−ヒドロキシイソ吉草酸量をＬＣ−ＭＳにて分析した。結果を表４示す。
【０２３６】
【表４】
2022001556.tif 000005
【０２３７】
表４に示すとおり、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ、メチルグルタコニル−ＣｏＡヒドラターゼ、及び配列番号２で表わされるアミノ酸配列からなる蛋白質を生産する微生物を用いることにより、糖から効率的に３−ヒドロキシイソ吉草酸を製造できることがわかった。
【０２３８】
［実施例３］
３−ヒドロキシイソ吉草酸の製造に用いる微生物の造成−２
特許文献４の実施例６では、３−メチルグルタコニル−ＣｏＡから３−メチルクロトニル−ＣｏＡを生成する反応を触媒する酵素として、Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ  ｘａｎｔｈｕｓ由来の脱炭酸酵素であるＱ１Ｄ４Ｉ４及びＱ１Ｄ４Ｉ３が挙げられている。また、非特許文献２には、配列番号２で表わされるアミノ酸配列と４４％の同一性を有するアミノ酸配列からなる蛋白質ＣｕｒＦが開示されている。
【０２３９】
そこで、ＣｕｒＦ、Ｑ１Ｄ４Ｉ４、Ｑ１Ｄ４Ｉ３、及びＣｕｒＦのアミノ酸配列と３６％の同一性を有するアミノ酸配列からなる蛋白質ＶｉｒＥ（非特許文献４）を生産する微生物を用いた場合の３−ヒドロキシイソ吉草酸の生産性を、配列番号２で表わされるアミノ酸配列からなる蛋白質を生産する微生物を用いた場合と比較した。
【０２４０】
また、配列番号２で表わされるアミノ酸配列の６１番目のアミノ酸残基がＬ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、又はＬ−バリンに置換された蛋白質を生産する微生物を用いた３−ヒドロキシイソ吉草酸の生産性についても評価を行った。
【０２４１】
（１）コントロールプラスミドの造成
実施例１（５）で造成したｐＱＥ８０Ｌ＿ｌｉｕＣを鋳型とし、配列番号４７及び４４で表わされる塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして用いてＰＣＲを行い、ｐＱＥ８０Ｌ由来のＳＤ配列及びｌｉｕＣ遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。
前記ＰＣＲにより得られたｐＱＥ８０Ｌ由来のＳＤ配列及びｌｉｕＣ遺伝子を含むＤＮＡ断片を制限酵素ＳａｌＩ及びＫｐｎIで処理した後、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（タカラバイオ社製）により、実施例１（５）で造成した発現プラスミドｐＱＥ８０Ｌ＿ｈｍｃＭに連結することにより、コントロールプラスミドｐＱＥ８０Ｌ＿ｈｍｃＭ＿ｌｉｕＣを得た。
【０２４２】
（２）３−メチルグルタコニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ発現プラスミドの造成−１
実施例１（５）で造成したｐＱＥ８０Ｌ＿ｐｋｓＩを鋳型とし、配列番号４８及び４９、５０及び４６で表わされる塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして用いてそれぞれＰＣＲを行い、配列番号２で表わされるアミノ酸配列の６１番目のアミノ酸残基がＬ−イソロイシンに置換された蛋白質をコードする遺伝子（以下、ｐｋｓＩ（Ｙ６１Ｉ）遺伝子という）の５'側、３'側のＤＮＡ断片を得た。この２つのＤＮＡ断片を等モルの比率で混合した後、これを鋳型として配列番号４８及び４６で表わされる塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして用いてそれぞれＰＣＲを行い、ｐＱＥ８０Ｌ由来のＴ５プロモーター配列及びｐｋｓＩ（Ｙ６１Ｉ）遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。
【０２４３】
実施例１（５）と同様の方法で造成した、ｐＱＥ８０Ｌ由来のＳＤ配列及びｌｉｕＣ遺伝子を含むＤＮＡ断片を制限酵素ＳａｌＩ及びＫｐｎIで、ｐＱＥ８０Ｌ由来のＴ５プロモーター配列及びｐｋｓＩ（Ｙ６１Ｉ）遺伝子を含むＤＮＡ断片を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＳａｌIにて処理した後、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（タカラバイオ社製）により発現プラスミドｐＱＥ８０Ｌ＿ｈｍｃＭに連結することにより、発現プラスミドｐＱＥ８０Ｌ＿ｈｍｃＭ＿ｌｉｕＣ＿ＰＴ５−ｐｋｓＩ（Ｙ６１Ｉ）を得た。
【０２４４】
（３）３−メチルグルタコニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ発現プラスミドの造成−２
実施例１（５）で造成したｐＱＥ８０Ｌ_ｐｋｓＩを鋳型とし、配列番号４８及び５１、５２及び４６で表わされる塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして用いてそれぞれＰＣＲを行い、配列番号２で表わされるアミノ酸配列の６１番目のアミノ酸残基がＬ−バリンに置換された蛋白質をコードする遺伝子（以下、ｐｋｓＩ（Ｙ６１Ｖ）遺伝子という）の５'側、３'側のＤＮＡ断片を得た。この２つのＤＮＡ断片を等モルの比率で混合した後、これを鋳型として配列番号４８及び４６で表わされる塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして用いてそれぞれＰＣＲを行い、ｐＱＥ８０Ｌ由来のＴ５プロモーター配列及びｐｋｓＩ（Ｙ６１Ｖ）遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。
【０２４５】
実施例１（５）と同様の方法で造成した、ｐＱＥ８０Ｌ由来のＳＤ配列及びｌｉｕＣ遺伝子を含むＤＮＡ断片を制限酵素ＳａｌＩ及びＫｐｎIで、ｐＱＥ８０Ｌ由来のＴ５プロモーター配列及びｐｋｓＩ（Ｙ６１Ｖ）遺伝子を含むＤＮＡ断片を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＳａｌIにて処理した後、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（タカラバイオ社製）により発現プラスミドｐＱＥ８０Ｌ＿ｈｍｃＭに連結することにより、発現プラスミドｐＱＥ８０Ｌ＿ｈｍｃＭ＿ｌｉｕＣ＿ＰＴ５−ｐｋｓＩ（Ｙ６１Ｖ）を得た。
【０２４６】
（４）３−メチルグルタコニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ発現プラスミドの造成−３
実施例１（５）で造成したｐＱＥ８０Ｌ_ｐｋｓＩを鋳型とし、配列番号４８及び５３、５４及び４６で表わされる塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして用いてそれぞれＰＣＲを行い、配列番号２で表わされるアミノ酸配列の６１番目のアミノ酸残基がＬ−ロイシンに置換された蛋白質をコードする遺伝子（以下、ｐｋｓＩ（Ｙ６１Ｌ）遺伝子という）の５'側、３'側のＤＮＡ断片を得た。この２つのＤＮＡ断片を等モルの比率で混合した後、これを鋳型として配列番号４８及び４６で表わされる塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして用いてそれぞれＰＣＲを行い、ｐＱＥ８０Ｌ由来のＴ５プロモーター配列及びｐｋｓＩ（Ｙ６１Ｌ）遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。
【０２４７】
実施例１（５）と同様の方法で造成した、ｐＱＥ８０Ｌ由来のＳＤ配列及びｌｉｕＣ遺伝子を含むＤＮＡ断片を制限酵素ＳａｌＩ及びＫｐｎIで、ｐＱＥ８０Ｌ由来のＴ５プロモーター配列及びｐｋｓＩ（Ｙ６１Ｌ）遺伝子を含むＤＮＡ断片を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＳａｌIにて処理した後、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（タカラバイオ社製）により発現プラスミドｐＱＥ８０Ｌ＿ｈｍｃＭに連結することにより、発現プラスミドｐＱＥ８０Ｌ＿ｈｍｃＭ＿ｌｉｕＣ＿ＰＴ５−ｐｋｓＩ（Ｙ６１Ｌ）を得た。
【０２４８】
（５）３−メチルグルタコニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ発現プラスミドの造成−４
人工合成したＣｕｒＦをコードするＤＮＡ（以下、ＣｕｒＦ遺伝子という。）を鋳型として、配列番号５５及び５６で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットして用いて、ＰＣＲを行い、ＣｕｒＦ遺伝子を増幅した。その後、該ＰＣＲにより得られた増幅産物を制限酵素ＢｇｌＩＩ及ＨｉｎｄＩＩＩで処理後、発現ベクターｐＱＥ８０Ｌ（キアゲン社製）に連結することにより発現プラスミドｐＱＥ８０Ｌ＿ＣｕｒＦを造成した。
【０２４９】
さらに、造成したｐＱＥ８０Ｌ＿ＣｕｒＦを鋳型とし、配列番号４８及び５６で表わされる塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして用いてＰＣＲを行い、ｐＱＥ８０Ｌ由来のＴ５プロモーター配列及びＣｕｒＦ遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。
【０２５０】
実施例１（５）と同様の方法で造成した、ｐＱＥ８０Ｌ由来のＳＤ配列及びｌｉｕＣ遺伝子を含むＤＮＡ断片を制限酵素ＳａｌＩ及びＫｐｎIで、ｐＱＥ８０Ｌ由来のＴ５プロモーター配列及びＣｕｒＦ遺伝子を含むＤＮＡ断片を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＳａｌIにて処理した後、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（タカラバイオ社製）により発現プラスミドｐＱＥ８０Ｌ＿ｈｍｃＭに連結することにより、発現プラスミドｐＱＥ８０Ｌ＿ｈｍｃＭ＿ｌｉｕＣ＿ＰＴ５−ＣｕｒＦを得た。
【０２５１】
（６）３−メチルグルタコニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ発現プラスミドの造成−５
人工合成したＱ１Ｄ４Ｉ４をコードするＤＮＡ（以下、Ｑ１Ｄ４Ｉ４遺伝子という。）を鋳型として、配列番号５７及び５８で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットして用いてＰＣＲを行い、Ｑ１Ｄ４Ｉ４遺伝子を増幅した。その後、該ＰＣＲにより得られた増幅産物を制限酵素ＢｇｌＩＩ及ＨｉｎｄＩＩＩで処理後、発現ベクターｐＱＥ８０Ｌ（キアゲン社製）に連結することにより発現プラスミドｐＱＥ８０Ｌ＿Ｑ１Ｄ４Ｉ４を造成した。
【０２５２】
さらに、造成したｐＱＥ８０Ｌ＿Ｑ１Ｄ４Ｉ４を鋳型とし、配列番号４８及び５８で表わされる塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして用いてＰＣＲを行い、ｐＱＥ８０Ｌ由来のＴ５プロモーター配列及びＱ１Ｄ４Ｉ４遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。
【０２５３】
実施例１（５）と同様の方法で造成した、ｐＱＥ８０Ｌ由来のＳＤ配列及びｌｉｕＣ遺伝子を含むＤＮＡ断片を制限酵素ＳａｌＩ及びＫｐｎIで、ｐＱＥ８０Ｌ由来のＴ５プロモーター配列及びＱ１Ｄ４Ｉ４遺伝子を含むＤＮＡ断片を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＳａｌIにて処理した後、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（タカラバイオ社製）により発現プラスミドｐＱＥ８０Ｌ＿ｈｍｃＭに連結することにより、発現プラスミドｐＱＥ８０Ｌ＿ｈｍｃＭ＿ｌｉｕＣ＿ＰＴ５−Ｑ１Ｄ４Ｉ４を得た。
【０２５４】
（７）３−メチルグルタコニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ発現プラスミドの造成−６
人工合成したＱ１Ｄ４Ｉ３をコードするＤＮＡ（以下、Ｑ１Ｄ４Ｉ３遺伝子という。）を鋳型として、配列番号５９及び６０で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットして用いて、ＰＣＲを行い、Ｑ１Ｄ４Ｉ３遺伝子を増幅した。その後、該ＰＣＲにより得られた増幅産物を制限酵素ＢｇｌＩＩ及ＨｉｎｄＩＩＩで処理後、発現ベクターｐＱＥ８０Ｌ（キアゲン社製）に連結することにより発現プラスミドｐＱＥ８０Ｌ＿Ｑ１Ｄ４Ｉ３を造成した。
【０２５５】
さらに、造成したｐＱＥ８０Ｌ＿Ｑ１Ｄ４Ｉ３を鋳型とし、配列番号４８及び６０で表わされる塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして用いてＰＣＲを行い、ｐＱＥ８０Ｌ由来のＴ５プロモーター配列及びＱ１Ｄ４Ｉ３遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。
【０２５６】
実施例１（５）と同様の方法で造成した、ｐＱＥ８０Ｌ由来のＳＤ配列及びｌｉｕＣ遺伝子を含むＤＮＡ断片を制限酵素ＳａｌＩ及びＫｐｎIで、ｐＱＥ８０Ｌ由来のＴ５プロモーター配列及びＱ１Ｄ４Ｉ３遺伝子を含むＤＮＡ断片を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＳａｌIにて処理した後、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（タカラバイオ社製）により発現プラスミドｐＱＥ８０Ｌ＿ｈｍｃＭに連結することにより、発現プラスミドｐＱＥ８０Ｌ＿ｈｍｃＭ＿ｌｉｕＣ＿ＰＴ５−Ｑ１Ｄ４Ｉ３を得た。
【０２５７】
（８）３−メチルグルタコニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ発現プラスミドの造成−７
常法により調製したＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｇｉｎｉａｅ  ＭＡＦＦ １０−０６０１４のゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号６１及び６２で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットして用いて、ＰＣＲを行い、ＶｉｒＥをコードする遺伝子（以下、ＶｉｒＥ遺伝子という。）を増幅した。その後、該ＰＣＲにより得られた増幅産物を制限酵素ＢｇｌＩＩ及ＨｉｎｄＩＩＩで処理後、発現ベクターｐＱＥ８０Ｌ（キアゲン社製）に連結することにより発現プラスミドｐＱＥ８０Ｌ＿ＶｉｒＥを造成した。
【０２５８】
さらに、造成したｐＱＥ８０Ｌ＿ＶｉｒＥを鋳型とし、配列番号６２及び６３で表わされる塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして用いてＰＣＲを行い、ｐＱＥ８０Ｌ由来のＴ５プロモーター配列及びＶｉｒＥ遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。
【０２５９】
実施例１（５）と同様の方法で造成した、ｐＱＥ８０Ｌ由来のＳＤ配列及びｌｉｕＣ遺伝子を含むＤＮＡ断片を制限酵素ＳａｌＩ及びＫｐｎIで、ｐＱＥ８０Ｌ由来のＴ５プロモーター配列及びＶｉｒＥ遺伝子を含むＤＮＡ断片を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｈｏIにて処理した後、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（タカラバイオ社製）により発現プラスミドｐＱＥ８０Ｌ＿ｈｍｃＭに連結することにより、発現プラスミドｐＱＥ８０Ｌ＿ｈｍｃＭ＿ｌｉｕＣ＿ＰＴ５−ＶｉｒＥを得た。
【０２６０】
（９）形質転換による３−ヒドロキシイソ吉草酸の製造に用いる微生物の造成
実施例１（４）で取得したＷ３１１０ＡＦＴ株を、実施例１（５）で造成したｐＱＥ８０Ｌ＿ｈｍｃＭ＿ｌｉｕＣ＿ＰＴ５−ｐｋｓＩ、並びに、実施例３（１）〜（８）で造成したｐＱＥ８０Ｌ＿ｈｍｃＭ＿ｌｉｕＣ、ｐＱＥ８０Ｌ＿ｈｍｃＭ＿ｌｉｕＣ＿ＰＴ５−ｐｋｓＩ（Ｙ６１Ｉ）、ｐＱＥ８０Ｌ＿ｈｍｃＭ＿ｌｉｕＣ＿ＰＴ５−ｐｋｓＩ（Ｙ６１Ｌ）、ｐＱＥ８０Ｌ＿ｈｍｃＭ＿ｌｉｕＣ＿ＰＴ５−ｐｋｓＩ（Ｙ６１Ｖ）、ｐＱＥ８０Ｌ＿ｈｍｃＭ＿ｌｉｕＣ＿ＰＴ５−ＣｕｒＦ、ｐＱＥ８０Ｌ＿ｈｍｃＭ＿ｌｉｕＣ＿ＰＴ５−Ｑ１Ｄ４Ｉ４、ｐＱＥ８０Ｌ＿ｈｍｃＭ＿ｌｉｕＣ＿ＰＴ５−Ｑ１Ｄ４Ｉ３、及びｐＱＥ８０Ｌ＿ｈｍｃＭ＿ｌｉｕＣ＿ＰＴ５−ＶｉｒＥで形質転換し、それぞれＷ３１１０ＡＦＴ／ｐＱＥ８０Ｌ＿ｈｍｃＭ＿ｌｉｕＣ＿ＰＴ５−ｐｋｓＩ株、Ｗ３１１０ＡＦＴ／ｐＱＥ８０Ｌ＿ｈｍｃＭ＿ｌｉｕＣ株、Ｗ３１１０ＡＦＴ／ｐＱＥ８０Ｌ＿ｈｍｃＭ＿ｌｉｕＣ＿ＰＴ５−ｐｋｓＩ（Ｙ６１Ｉ）株、Ｗ３１１０ＡＦＴ／ｐＱＥ８０Ｌ＿ｈｍｃＭ＿ｌｉｕＣ＿ＰＴ５−ｐｋｓＩ（Ｙ６１Ｌ）株、Ｗ３１１０ＡＦＴ／ｐＱＥ８０Ｌ＿ｈｍｃＭ＿ｌｉｕＣ＿ＰＴ５−ｐｋｓＩ（Ｙ６１Ｖ）株、Ｗ３１１０ＡＦＴ／ｐＱＥ８０Ｌ＿ｈｍｃＭ＿ｌｉｕＣ＿ＰＴ５−ＣｕｒＦ株、Ｗ３１１０ＡＦＴ／ｐＱＥ８０Ｌ＿ｈｍｃＭ＿ｌｉｕＣ＿ＰＴ５−Ｑ１Ｄ４Ｉ４株、Ｗ３１１０ＡＦＴ／ｐＱＥ８０Ｌ＿ｈｍｃＭ＿ｌｉｕＣ＿ＰＴ５−Ｑ１Ｄ４Ｉ３株、及びＷ３１１０ＡＦＴ／ｐＱＥ８０Ｌ＿ｈｍｃＭ＿ｌｉｕＣ＿ＰＴ５−ＶｉｒＥ株を得た。
【０２６１】
［実施例４］
３−ヒドロキシイソ吉草酸の製造−２
実施例３で取得したＷ３１１０ＡＦＴ／ｐＱＥ８０Ｌ＿ｈｍｃＭ＿ｌｉｕＣ株、Ｗ３１１０ＡＦＴ／ｐＱＥ８０Ｌ＿ｈｍｃＭ＿ｌｉｕＣ＿ＰＴ５−ｐｋｓＩ株、Ｗ３１１０ＡＦＴ／ｐＱＥ８０Ｌ＿ｈｍｃＭ＿ｌｉｕＣ＿ＰＴ５−ｐｋｓＩ（Ｙ６１Ｉ）株、Ｗ３１１０ＡＦＴ／ｐＱＥ８０Ｌ＿ｈｍｃＭ＿ｌｉｕＣ＿ＰＴ５−ｐｋｓＩ（Ｙ６１Ｌ）株、Ｗ３１１０ＡＦＴ／ｐＱＥ８０Ｌ＿ｈｍｃＭ＿ｌｉｕＣ＿ＰＴ５−ｐｋｓＩ（Ｙ６１Ｖ）株、Ｗ３１１０ＡＦＴ／ｐＱＥ８０Ｌ＿ｈｍｃＭ＿ｌｉｕＣ＿ＰＴ５−ＣｕｒＦ株、Ｗ３１１０ＡＦＴ／ｐＱＥ８０Ｌ＿ｈｍｃＭ＿ｌｉｕＣ＿ＰＴ５−Ｑ１Ｄ４Ｉ４株、Ｗ３１１０ＡＦＴ／ｐＱＥ８０Ｌ＿ｈｍｃＭ＿ｌｉｕＣ＿ＰＴ５−Ｑ１Ｄ４Ｉ３株、及びＷ３１１０ＡＦＴ／ｐＱＥ８０Ｌ＿ｈｍｃＭ＿ｌｉｕＣ＿ＰＴ５−ＶｉｒＥ株をＬＢプレート上で３０℃にて一晩培養した後、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含むＬＢ培地５ｍＬが入った太型試験管に植菌して、３０℃で１２時間、振盪培養した。
【０２６２】
その後、得られた培養液を生産培地［グルコース３０ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム七水和物２ｇ／Ｌ、Ｂａｃｔｏ  Ｔｒｙｐｔｏｎｅ  １０ｇ／Ｌ、Ｂａｃｔｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ  ５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム  ５ｇ／Ｌ、炭酸カルシウム  ３０ｇ／Ｌ（グルコース、硫酸マグネシウム七水和物及び炭酸カルシウム以外については、水酸化ナトリウム水溶液によりｐＨ７．２に調整した後、炭酸カルシウムを加えてからオートクレーブし、グルコース及び硫酸マグネシウム七水和物含有水溶液は別途調製した後オートクレーブし、それぞれ冷却後、混合した）］が５ｍＬ入った太型試験管に０．０５ｍＬ植菌した。これを、３０℃で４時間振盪培養した後、終濃度１ｍＭのイソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加して、さらに３０℃で４４時間、振盪培養した。
【０２６３】
培養終了後、培養液を遠心分離し、上清中の３−ヒドロキシイソ吉草酸量をＬＣ−ＭＳにて分析した。結果を表５示す。
【０２６４】
【表５】
2022001556.tif 000006
【０２６５】
表５に示すとおり、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ、メチルグルタコニル−ＣｏＡヒドラターゼ、及び配列番号２で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質を生産する微生物を用いることにより、ＣｕｒＦ、Ｑ１Ｄ４１４、Ｑ１Ｄ４Ｉ３及びＶｉｒＥを生産する微生物を用いた場合と同等以上に、糖から３−ヒドロキシイソ吉草酸を製造できることがわかった。
【０２６６】
また、配列番号２で表わされる蛋白質の６１番目のアミノ酸残基がＬ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、又はＬ−バリンに置換された蛋白質を生産する微生物を用いることにより、配列番号２で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質を生産する微生物を用いた場合と比べて、さらに高効率で糖から３−ヒドロキシイソ吉草酸を製造できることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【０２６７】
本発明により、３−メチルグルタコニル−ＣｏＡを基質として３−メチルクロトニル−ＣｏＡを生成する活性を有し、３−ヒドロキシイソ吉草酸の生成に関与する蛋白質、及び該蛋白質を生産する微生物を用いた３−ヒドロキシイソ吉草酸の効率的な製造方法が提供される。
【配列表フリーテキスト】
【０２６８】
配列番号１３−人工配列の説明：合成ＤＮＡの塩基配列
配列番号１４−人工配列の説明：合成ＤＮＡの塩基配列
配列番号１５−人工配列の説明：合成ＤＮＡの塩基配列
配列番号１６−人工配列の説明：合成ＤＮＡの塩基配列
配列番号１７−人工配列の説明：合成ＤＮＡの塩基配列
配列番号１８−人工配列の説明：合成ＤＮＡの塩基配列
配列番号１９−人工配列の説明：合成ＤＮＡの塩基配列
配列番号２０−人工配列の説明：合成ＤＮＡの塩基配列
配列番号２１−人工配列の説明：合成ＤＮＡの塩基配列
配列番号２２−人工配列の説明：合成ＤＮＡの塩基配列
配列番号２３−人工配列の説明：合成ＤＮＡの塩基配列
配列番号２４−人工配列の説明：合成ＤＮＡの塩基配列
配列番号２５−人工配列の説明：合成ＤＮＡの塩基配列
配列番号２６−人工配列の説明：合成ＤＮＡの塩基配列
配列番号２７−人工配列の説明：合成ＤＮＡの塩基配列
配列番号２８−人工配列の説明：合成ＤＮＡの塩基配列
配列番号２９−人工配列の説明：合成ＤＮＡの塩基配列
配列番号３０−人工配列の説明：合成ＤＮＡの塩基配列
配列番号３１−人工配列の説明：合成ＤＮＡの塩基配列
配列番号３２−人工配列の説明：合成ＤＮＡの塩基配列
配列番号３３−人工配列の説明：合成ＤＮＡの塩基配列
配列番号３４−人工配列の説明：合成ＤＮＡの塩基配列
配列番号３５−人工配列の説明：合成ＤＮＡの塩基配列
配列番号３６−人工配列の説明：合成ＤＮＡの塩基配列
配列番号３７−人工配列の説明：合成ＤＮＡの塩基配列
配列番号３８−人工配列の説明：合成ＤＮＡの塩基配列
配列番号３９−人工配列の説明：合成ＤＮＡの塩基配列
配列番号４０−人工配列の説明：合成ＤＮＡの塩基配列
配列番号４１−人工配列の説明：合成ＤＮＡの塩基配列
配列番号４２−人工配列の説明：合成ＤＮＡの塩基配列
配列番号４３−人工配列の説明：合成ＤＮＡの塩基配列
配列番号４４−人工配列の説明：合成ＤＮＡの塩基配列
配列番号４５−人工配列の説明：合成ＤＮＡの塩基配列
配列番号４６−人工配列の説明：合成ＤＮＡの塩基配列
配列番号４７−人工配列の説明：合成ＤＮＡの塩基配列
配列番号４８−人工配列の説明：合成ＤＮＡの塩基配列
配列番号４９−人工配列の説明：合成ＤＮＡの塩基配列
配列番号５０−人工配列の説明：合成ＤＮＡの塩基配列
配列番号５１−人工配列の説明：合成ＤＮＡの塩基配列
配列番号５２−人工配列の説明：合成ＤＮＡの塩基配列
配列番号５３−人工配列の説明：合成ＤＮＡの塩基配列
配列番号５４−人工配列の説明：合成ＤＮＡの塩基配列
配列番号５５−人工配列の説明：合成ＤＮＡの塩基配列
配列番号５６−人工配列の説明：合成ＤＮＡの塩基配列
配列番号５７−人工配列の説明：合成ＤＮＡの塩基配列
配列番号５８−人工配列の説明：合成ＤＮＡの塩基配列
配列番号５９−人工配列の説明：合成ＤＮＡの塩基配列
配列番号６０−人工配列の説明：合成ＤＮＡの塩基配列
配列番号６１−人工配列の説明：合成ＤＮＡの塩基配列
配列番号６２−人工配列の説明：合成ＤＮＡの塩基配列
配列番号６３−人工配列の説明：合成ＤＮＡの塩基配列
【図１】
2022001556.tif 000007
【配列表】
2022001556000001.app