(57)【要約】      （修正有）【課題】低コストで高精度に白血球分類計数を含む全血球計数（ＣＢＣ）を行うシステムを提供する。【解決手段】血液又は骨髄のための自動分析器は、スライド上に（希釈された）血液を２つのすじの形態で自動的に分注するピペッティングロボットを有する。血液のすじの顕微鏡画像が撮影され、画像認識システムによって細胞が計数され、識別される。分析器はまた、血液を染色し、フィルター又は波長可変ＬＥＤを使用して、規定された波長帯で画像を取得し得る。【選択図】図１
0003203413.tif 000002
【実用新案登録請求の範囲】
【請求項１】
血液から細胞を分析するシステムであって、
基板の上方に配置され、血液細胞を含む流体を前記基板上に分配する塗布チップと、
マイクロプロセッサを含むコンピューターと、
記憶デバイスに記憶された、前記システムを制御するためのソフトウェアと
を備え、
前記マイクロプロセッサが前記ソフトウェアを実行する際、前記コンピューターは、前記システムに、
既知の量の前記流体を前記塗布チップに充填することと、
前記既知の量の流体を前記塗布チップから分配し、前記基板への前記流体の排出が起こる一方で、前記塗布チップと前記基板との間の相対移動を維持して、前記流体中の細胞が１つの細胞の厚さの層に前記基板上へ沈降するように、前記既知の量の流体全体を２つ以上の列で前記基板の画定された領域上に載せることと
をさせるシステム。
【請求項２】
前記システムは、前記基板上の前記細胞の画像を撮像する受光デバイスをさらに備え、
前記コンピューターは、前記システムに、前記基板上の前記細胞を撮像させ、赤血球計数と、白血球計数と、血小板計数とのうちの１つ又は複数を決定させる、請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
前記システムは、前記基板上の前記細胞の画像を撮像する受光デバイスをさらに備え、
前記コンピューターは、前記システムに、前記基板上の前記細胞を撮像させ、全血球計数及び白血球分類計数の一方又は両方を決定させる、請求項１に記載のシステム。
【請求項４】
前記コンピューターは、前記システムに前記塗布チップの位置を変えるように指示することにより、前記基板に対する前記塗布チップの移動を制御する、請求項１に記載のシステム。
【請求項５】
前記システムは基板コントローラをさらに備え、
前記コンピューターは、前記基板コントローラに前記基板の位置を変えるように指示することにより、前記基板に対する前記塗布チップの移動を制御する、請求項１に記載のシステム。
【請求項６】
前記列に垂直な方向に該列間を前記塗布チップが移動する距離は、前記列のうちの１つの列の幅におおよそ等しい、請求項１に記載のシステム。
【請求項７】
前記システムは、
前記血液を貯める第１のリザーバと、
希釈剤を貯める第２のリザーバと、
前記血液と前記希釈剤とを混合させて希釈流体を形成するミキサと
を備える、請求項１に記載のシステム。
【請求項８】
前記システムは、前記基板上の前記細胞の画像を撮像する受光デバイスをさらに備え、
前記コンピューターは、前記システムに、
前記流体の列の画像を撮像することと、
前記流体の列の幅を決定するために前記画像を分析することと、
Ｘ方向又はＹ方向の前記基板に対する前記塗布チップの位置と、前記流体の列の幅に等しい距離とを変えることと
をさせる、請求項１に記載のシステム。
【請求項９】
前記基板はスライドを有し、
前記コンピューターは、前記システムに、固定されたＸ方向成分またはＹ方向成分を有する経路内に前記スライドにわたって流体の第３の列を塗布させ、該第３の列は、一つの細胞の厚さを有する細胞の層と、幅とを備え、
前記コンピューターは、前記システムに、固定されたＸ方向成分またはＹ方向成分を有する経路内に前記スライドにわたって流体の第４の列を塗布させ、該第４の列は、一つの細胞の厚さを有する細胞の層と、幅とを備え、
前記スライド上で、前記第３の列は前記第２の列に隣接すると共に前記第４の列は前記第３の列に隣接する、請求項１に記載のシステム。
【請求項１０】
前記基板はスライドを有し、
前記システムは、
前記スライドを清浄する放電装置と、
前記スライド上に染料を分配するディスペンサと、
過剰な染料を除去するために前記スライドを傾かせるティルタと、
前記スライド上の前記細胞の画像を撮像する受光装置と、
該受光装置の下方で前記スライドを位置決めするスライドムーバと、
前記スライド上で又は前記スライドを通して光を検出する発光装置と
をさらに備える、請求項１に記載のシステム。
【請求項１１】
前記コンピューターは、前記システムに、
前記スライドの上方約７０±４０ミクロンの位置に前記塗布チップを位置することと、
約１０から１００ｍｍ／秒の速度で前記塗布チップと前記スライドとの相対移動を維持することと
をさせる、請求項１に記載のシステム。
【請求項１２】
前記基板はスライドを有し、
前記システムは、
新たなスライドを保管するフィーダと、
前記塗布チップが前記スライド上へ流体の列を塗布する第１のステーションと、
前記スライドを染色、固定及び乾燥させる第２のステーションと、
前記スライドを照明すると共に画像化する第３のステーションと、
処理したスライドを受け取るコレクタと、
前記スライドを、前記フィーダから開始して、前記第１のステーション、前記第２のステーション、前記第３のステーション、次いで前記コレクタまで、前記システムを通して移動させるアドバンサと
をさらに備える、請求項１に記載のシステム。
【請求項１３】
前記システムは、
光源と、
前記基板上の前記細胞の画像を撮像する受光装置と
をさらに備え、
前記コンピューターは、前記光源に、
前記基板を照明するための白色光を発することと、
前記白色光の照射を第１の波長に制限するために前記白色光に第１の光フィルタを適用することと、
前記白色光の照射を第２の波長に制限するために前記白色光に第２の光フィルタを適用することと
をさせ、
前記コンピューターは、前記受光装置に、前記基板上の前記細胞の１つ又は複数の画像を撮像させる、請求項１に記載のシステム。
【請求項１４】
前記コンピューターは、前記光源に、前記白色光の照射を第３の波長に制限するために前記白色光に第３の光フィルターを適用させる、請求項１３に記載のシステム。
【請求項１５】
前記第１の波長は４００ｎｍから４７０ｎｍであり、前記第２の波長は４７０ｎｍから７５０ｎｍである、請求項１３に記載のシステム。
【請求項１６】
前記第１の波長は４３０ｎｍであり、前記第２の波長は５００ｎｍであり、前記第３の波長は５２５ｎｍから６００ｎｍである、請求項１４に記載のシステム。
【請求項１７】
前記コンピューターは、前記システムに、
空間シフト又は他の歪みを補償することによって前記画像を洗練することと、
白色光の少なくとも２つの別個の波長が前記スライドに誘導されるときに前記受光装置が撮像する２つ以上の画像を組み合わせて、マルチカラー画像を表示するために生成することと
をさせる、請求項１３に記載のシステム。
【請求項１８】
前記コンピューターは、前記システムに、前記細胞の空間的特徴と、濃度的特徴と、比色的特徴と、構造的特徴とを決定させて、細胞の種類を分類する、請求項１３に記載のシステム。
【請求項１９】
前記コンピューターは、前記システムに、
前記受光装置に前記スライドの白黒画像を撮像するように命令することと、
前記レンズの焦点距離を調整することによって焦点及び画質を補正することと、
複数のフィルターを前記スライドと前記光源との間に介在させながら前記レンズの焦点位置をシフトすることと
をさせる、請求項１３に記載のシステム。
【請求項２０】
前記光源は、
前記白色光を生成するハロゲン球と、
前記フィルターの位置を変える回転モータと
を備える、請求項１３に記載のシステム。
【請求項２１】
前記システムは、
光源と、
前記基板上の前記細胞の画像を撮像する受光装置と
をさらに備え、
前記コンピューターは、
前記光源に第１のＬＥＤに第１の波長で光を照射させ、
前記光源に第２のＬＥＤに第２の波長で光を照射させ、
前記受光装置に前記基板上の前記細胞の１つ又は複数の画像を撮像させる、請求項１に記載のシステム。
【請求項２２】
前記列は非接触列である、請求項１に記載のシステム。
【請求項２３】
前記２つ以上の列は、前記塗布チップによって形成され、該塗布チップは、第１の方向に第１の列に前記流体を分配し、その後、前記第１の方向と反対で該第１の方向に平行な第２の方向に向きを変えると共に移動して、前記第１の列に隣接するように第２の列を置く、請求項１に記載のシステム。
【請求項２４】
前記２つ以上の列は、前記基板上に螺旋パターンで置かれる、請求項１に記載のシステム。
【請求項２５】
前記２つ以上の列は、前記基板上に置かれ、互いに隣り合って沈降し、前記画定された領域に隣接した細胞の流れを形成する、請求項１に記載のシステム。
【請求項２６】
前記基板上の前記流体の列上に青色光と非青色光とを別々に照射するように配置された光源をさらに有する、請求項１に記載のシステム。
【請求項２７】
前記青色光は４００から４７０ｎｍの波長を有し、前記非青色光は４７０から７５０ｎｍの波長を有する、請求項２６に記載のシステム。
【請求項２８】
前記青色光は４３０ｎｍの波長を有し、前記非青色光は６００ｎｍの波長を有する、請求項２６に記載のシステム。
【請求項２９】
前記コンピューターは、前記システムに、前記塗布チップが流体を約０．１マイクロリットル／秒の速度で前記塗布チップから流出させるように命令させる、請求項１１に記載のシステム。
【請求項３０】
前記コンピューターは、前記光源に、第３のＬＥＤに第３の波長で光を照射させる、請求項２１に記載のシステム。
【請求項３１】
前記第１の波長は４００から４７０ｎｍであり、前記第２の波長は４７０から７５０ｎｍである、請求項２１に記載のシステム。
【請求項３２】
前記第１の波長は４３０ｎｍであり、前記第２の波長は５００ｎｍであり、前記第３の波長は５２５ｎｍから６００ｎｍである、請求項２９に記載のシステム。
【考案の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
１．考案の分野
白血球分類計数を含む全血球計数。
【背景技術】
【０００２】
２．従来技術の説明
全血球計数（ＣＢＣ）は、米国及び世界で最も一般的に実施されている臨床検査である。現行のＣＢＣ法及び機器は、非常に進化しかつ高価であり、全てが、同様のマルチチャネル、マルチ検出器フローシステムベースの技術を使用する。ベックマン・コールター社、ロッシュ・ダイアグノスティックス社、シスメックス社、シーメンス・メディカル・ソルーションズ社、アボット社は、ＣＢＣ用の自動化機器を製造している。ＣＢＣ技術に対する根本的に新しい手法は、２０年以上導入されていない。
【０００３】
現在市場に出ているＣＢＣ機器は、抗凝固処理された全血を吸引し、それを幾つかの分析ストリームに分割して、「フロー」システム（フローサイトメータ）内でＣＢＣの異なる要素を実施する。これらの要素は、
ｉ．赤血球（ＲＢＣ）数、ヘモグロビン（Ｈｂ）、ヘマトクリット（Ｈｃｔ）、赤血球指数（平均赤血球容積（ＭＣＶ）、平均赤血球ヘモグロビン量（ＭＣＨ）及び平均赤血球ヘモグロビン濃度（ＭＣＨＣ））、及び、網状赤血球数を含む赤血球形態と、
ｉｉ．白血球（ＷＢＣ）数及びＷＢＣ「分類」計数（好中球、リンパ球、好酸球、好塩基球、及び単球を含む異なる正常白血球のタイプ、並びに、種々の疾患状態において存在する異常なタイプのＷＢＣの計数）と、
ｉｉｉ．血小板数と
を含む。
【０００４】
他の測定値は、ＲＢＣ分布幅及び血小板分布幅のようなＲＢＣ及び血小板の主要な測定値から導出される幾つかのＣＢＣシステムに含まれる。
【０００５】
非血液起源の他の細胞又は寄生虫若しくは他の病原生物は、ＣＢＣの一部ではなく、「血液スミア」の目視検査中に得られる観察結果から観察され報告され得る。
【０００６】
フローベースＣＢＣ機器は、広範な較正及び制御、メンテナンス及び熟練したオペレーターを必要とし、また、試薬、消耗品、及び使い捨て用品に関連するかなりのコストがかかる。日常使用におけるこれらのシステムに関する１つの重要な問題は、血液検体の大部分が、ＣＢＣの形態的成分を完成するために更なる試験を必要とすることである。これは、自動化試験の結果が、更なる実験を必要とする結果を含むときはいつでも、熟練した技師によって実施されるスライドガラス上での血液細胞の直接視覚化を伴う。例えば、「人手による」分類計数は、有核の未成熟なＲＢＣが見出されるか、又は、感染、白血病、他の血液疾患が疑われるＷＢＣが見出されると、経験を積んだ観察者による細胞の直接視覚化によって実施される。
【０００７】
更なる検討を必要とするこれらの検体の割合は、研究所の方針、患者集団、及び「フラッギング」基準に応じて、約２７％の中央値（median rate）を有する１０％〜５０％の範囲にある。再試験の最も頻繁な理由は、異常な細胞タイプ又は細胞形態の存在、ウィルス若しくは細菌の感染の臨床上の若しくは他の疑い、又は、ＷＢＣ、ＲＢＣ若しくは血小板の数の減少である。
【０００８】
以下に述べる方法は、著しく簡略化されると共により多用途のＣＢＣ機器を可能にし、このＣＢＣ機器は、ＷＢＣ分類計数をもたらすＲＢＣ及びＷＢＣの全ての形態観察結果を含むＣＢＣの全てのパラメーターを求める。その方法は、分析のために単一層を調製する新しい方法を使用した画像分析に基づく。試料調製は、非常に容易であり、非常に少量の試薬及び簡単な使い捨てスライドガラスとともに非常に少量の全血しか必要としない。機器自体は、非常に少数の可動部を有する。フローベースシステムと比較して、この新しいシステムは、幾つかの重要な利点、すなわち、
機器の実質的により低いコストと、
消耗品及び試薬の実質的により低いコストと、
実質的により少ないオペレーター時間及び必要とされる熟練度と、
（人手によるＷＢＣ分類又は人手によるＲＢＣ形態を必要とする）反復試験のより低い割合と、
ＣＢＣパラメーターについての同等の精度（一部のパラメーターについては改善もあり得る）と、
同等又はそれ以上のスループットと、
可動部がより少ないことによる簡単な機器メンテナンスと
を有する。
【０００９】
重力によって沈降した又は軽く塗布された単一層内の細胞を可視化する能力のために、スライドガラス上にウェッジスミアを生成する従来のプロセスにおいて見られるような細胞の形態の破損及び変形を伴うことなく、画像分析から新しい診断情報を抽出する可能性が存在する。
【００１０】
細胞形態の保存は、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）又は急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）のような血液悪性疾患を有する患者について特に重要である。標準的なウェッジスミアの調製は、悪性リンパ球又は白血球（芽球）の深刻な形態変形をもたらす可能性がある。例えば、拡大した芽球の一部は、その細胞骨格脆性のためにウェッジスミアの調製中に破裂する可能性がある。これらの、いわゆる「破損細胞」の存在は、分類計数における表記を正当化するのに十分なほどＣＬＬにおいて頻繁に起こる。穏やかな単一層の生成システムは、芽球のより正確な認識又は白血病の早期検出を可能にするために、多数の形態学的によく保存された芽球の検出を可能にする可能性がある。
【００１１】
システムは、既知の量の血液からの事実上全てのＲＢＣ、ＷＢＣ、及び血小板が計数され、その形態が調査されることを可能にする外観を、従来の染色によって生成する。したがって、システムは、ＣＢＣの定量的成分と定性的成分がともに、１つのオペレーションで確定されることを可能にする。システムは、現行の任意の方法によって調製される従来のスミアに関して実施されるＷＢＣ分類計数に影響を及ぼすことが知られている分布アーチファクトを回避する。
【考案の概要】
【００１２】
一滴の血液又は一滴の希釈された血液を、スライドガラス又は他の基板上に置き、空気の存在下で又は適度の空気の流れの中でそれを乾燥させる方法。この技術は、スライドに移送された量で全ての細胞の単一層を生成する。この技術は、１つ１つの単一細胞が計数され、タイプ（ＲＢＣ、ＷＢＣ、血小板、又は他のもの）によって区別されるような定量的移送である。
【００１３】
調査される因子は、適切な希釈剤、適切な希釈係数、並びに、スライドガラスの親水性を改善することによって及び／又は液体滴を機械的に分散させることによって、比較的大きなエリアにわたって滴が分散することを可能にする手段を見出すことを含んでいた。このプロセスは、非常に薄い液体層を生成し、その液体層は、細胞の提示及び保存が、従来の血液「スミア」で見出される提示及び保存に似るように急速に乾燥する。実際には、ある脆性白血球の保存は、従来の血液スミアで見出される機械的せん断と比較して細胞の取り扱いが穏やかであることに起因して、この方法によって改善されるように思われる。
【００１４】
本考案の目的は、白血球分類計数を含む全血球計数（ＣＢＣ）を行うシステムを提供することである。
【００１５】
別の目的は、システムに、コンピューター画像処理と組合せた調製方法を利用させることである。
【００１６】
ここで、本考案のこれらの特徴及び目的並びに他の特徴及び目的を、添付図面を参照して更に詳細に述べる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】機器のプロトタイプの写真である。
【図２】疎水性リングを有する市販の２滴スライドの図である。
【図３】人手による細胞計数と自動化された細胞計数とを比較するために使用されるソフトウェアの「スクリーンショット」である。
【図４】赤血球についての自動化された計数と人手による計数との相関を示すグラフである。
【図５】白血球についての自動化された計数と人手による計数との相関を示すグラフである。
【図６】参照法（シスメックス社のＣＢＣ分析器）に対してプロットされた赤血球についての自動化された計数のグラフである。
【図７】参照法（シスメックス社のＣＢＣ分析器）に対してプロットされた白血球についての自動化された計数のグラフである。
【図８】画像サイズ全体を減少させながら、約４５０個の個々の画像を一緒にタイリングすることによって生成された「細胞スポット」の写真である。
【図９】後続の分析のためにデジタルカメラで取得された画像のうちの１つを示す図である。
【考案を実施するための形態】
【００１８】
全血球計数（ＣＢＣ）及び白血球分類計数を実施するシステム。このシステムは、コンピューター画像処理と組合せた調製方法を利用する。
【００１９】
全血球計数及び５分類のＷＢＣ分類計数を行う装置の完全な動作を実演するシステムを説明する。このシステムは、ロボットプラットフォームの周りに構築することができ、ロボットプラットフォームは、調製プロセス、染色プロセス、及び測定プロセスの異なるステージを示す異なる場所への、ガラス又はプラスチックの顕微鏡スライドのような基板の移動を可能にする。第１のステーションにおいて、この装置は、スライドを準備し、血液試料を希釈し、希釈された試料をスライドに移送する。第２のステーションにおいて、この装置は、小滴からの血液細胞の単一層を乾燥し、乾燥した血液フィルムを即座に染色する。最終ステーションにおいて、この装置は、明視野光学器及びマルチスペクトル撮像を使用して、染色した細胞を分析し、赤血球、白血球、及び血小板を計数し、白血球分類計数を行う。
【００２０】
第１のステーションは、１）非常に少ない量の流体を取り扱うことを可能にする精密自動化ピペッタと、２）その量の希釈血液が、規定されたエリアにわたって分散することを可能にするための、ピペットチップの下でのガラス基板の自動化移動とを含む。
【００２１】
プログラム可能な精密ピペッタは、３つの直交方向へのスライドガラスの移動を可能にするＸ、Ｙ、Ｚコンピューター制御式ステージとともにコンピューターにインタフェースされている。写真（図１を参照）は、組み立てられたユニットを示している。中心には顕微鏡ステージがあり、ピペットチップホルダが、通常は顕微鏡の光学経路であるものの中に挿入されている。顕微鏡の背後には、プログラム可能な精密ピペッタユニットがある。右には、ラップトップコンピューターがあり、該ラップトップコンピューターによって、Ｘ、Ｙ、Ｚ移動及び「ピペット」の動作が制御される。左には、スライドの乾燥のために（低温で）使用される手持ち式乾燥器がある。顕微鏡ステージの左には、プロセスを監視し、ピペットチップのスライド上の高さを設定するために使用される小型カメラがある。
【００２２】
スライドは初めに、例えばコロナ放電装置を使用して清浄することによって「前処理する」ことができる。前処理は、スライドの疎水性又はスライドの「粘着性（stickiness）」を変更する他の方法を伴うことができる。血液試料は、その後、調製システムによってスライドに移送され、乾燥される。血液試料は、スライドに移送される前に、希釈剤によって希釈することができる。次に、スライドを染色する。外部染色器を使用することができるが、自動化分析器製品は、統合された自動化染色器を含むことになる。調製され染色された血液試料の明視野撮像のために、自動化顕微鏡の構成要素が含まれる。ソフトウェアアルゴリズムは、赤血球及び白血球の計数のために、白血球分類計数のために、血小板計数のために、並びにヘモグロビン含有量及び赤血球形態を確定するために、特定の波長で撮影されたデジタル画像を分析する。
【００２３】
このシステムは、自動化装置として組立てられると、「検体チューブ」、混合装置、血液のチューブから血液の一定分量を抽出するロボット機構、上述したハードウェア構成要素、並びにコンピューターユーザーインタフェース及び標準的な臨床検査情報システムとのインタフェースを含んでいる。こうした装置は、血液試料からＣＢＣ及び分類計数を自動的に行うことが可能である。最終的に、これらの構成要素は、改良され、製造可能な機器に組み付けることができる。
【００２４】
完全に自動化されたシステムでは、血液細胞の乾燥され染色された単一層は、コンピューター画像処理を使用して分析されて、赤血球数、白血球数、及び血小板数、並びにＣＢＣの測定され導出される他の成分が求められ、ＷＢＣ分類計数が行われる。スライドからのＲＢＣ及びＷＢＣの計数、形態測定、及び画像の結果が、モニター上に示される。数値データ及び細胞集団のヒストグラム又は散布図の表示だけを提供する今日の市販のシステムと違って、本考案者らのシステムはまた、モニター上に表示される血液細胞の画像から細胞形態を直接評価するという更なる能力を特徴とする。この重要な付加的な視覚能力は、技術者が細胞形態内の異常の存在を迅速に確立することを可能にし、これによって経験を積んだ技師又は他の専門家の人手による検討のために更なるスライドを調製することを正当化することができる。本出願で述べるシステムは、既存の市販システムと同等の又はそれより優れた測定を低コストで提供する。（現行のＣＢＣ機器上で見出される複雑な「散布図」を解釈しなければならない代わりに）モニター上で画像を観察することができることは、顕微鏡下で人手によって検討される必要がある試料の数を減少させる。これらの因子は、血液学分野に著しく寄与する技術の改善に役立つ。
【００２５】
より具体的には、この装置は、ＣＢＣ及び白血球分類計数を行う。この装置の一つの実施形態は、上述した幾つかのハードウェアステーションのそれぞれを通してスライドガラスを移動させるロボットプラットフォームを含む。ハードウェアステーションは、スライド及び小滴の調製、スライドの染色、並びに、赤血球計数及び白血球計数、白血球分類計数、血小板計数並びに更なる赤血球分析のための明視野撮像を含む。
【００２６】
ハードウェアステーション間でスライドを移動させるロボット装置を開発することができる。細胞の沈降及び形態の全体的な保存のためにタイミングが極めて重要であるため、ロボットプラットフォームが効率的であることが重要である。最終的な市販のシステムは、異なる患者からのスライドが、異なるハードウェアステーションで同時に処理されることを可能にする完全に「パイプライン化された」システムを必要とすることになり、これによって現行の市販のフローベースＣＢＣシステムのスループットレートと競合するか又はそれより優れることになり、現行の市販のフローベースＣＢＣシステムは、通常、８分〜１０分で最初の検体を報告し、その後、１検体／分のスループットレートを有する。
【００２７】
第１のステーションにおいて、このシステムは、患者の試料チューブから血液を分取し、必要であれば希釈し、おそらくガラス顕微鏡スライドの形態の基板上に血液試料の一定分量をピペッティングする。典型的な一定分量は、約１／２μｌ〜２μｌであるが、１／１０μｌ〜１０μｌの範囲であってもよい。単一ガラス顕微鏡スライド（８．４７ｍｍ（１×３インチ）、１ｍｍ厚）は、それぞれの検体に使用されるが、他の基板を使用してもよい。標準的な顕微鏡スライドフォーマットは、最終的な市販のシステム内の使い捨て基板の低コスト解決策である。塗布された（疎水性）リングを含むエリー・サイエンティフィック社（ポーツマス，ニューハンプシャー）からのスライドが図２に示されている。このリングは、血液試料を収容するのに役立ち、血液学者の注意を、細胞を含むエリアに向けさせる。おそらくは最終のスライドは、単一リングを含むか、又は他のスライドは、正方形又は長方形等の形状を含む。
【００２８】
ピペッティング操作について、市販のコンピューター制御式ピペッタが利用される。この装置は、使い捨てピペットチップ又は検体と検体との間で完全に洗浄されるチップを使用することができる。ピペッティング装置は、２％より良い精度で流体のマイクロリットル又はマイクロリットルの一部をピペッティングすることが可能でなければならない。最終システムが、５％より良い精度で血液成分を計数することができるべきであるため、２％未満の希釈の全体的な精度が望ましい。ピペッティング操作が完了した後、スライドが乾燥される。この乾燥は、制御された空気の流れによって補助することができる。血液をスライド上の薄い層に移送する他の手段を使用してもよいが、血液の全てのサンプリングされた量が基板に移送されることが極めて重要である。
【００２９】
全血用の希釈剤は、塩溶液又はタンパク質溶液を含むことができる。塩溶液は、「生理食塩水」（０．９Ｎ）から、複雑な塩の混合物、すなわちヒトの血清に見出される実質上全ての塩をシミュレートする市販の製剤プラズマライトまでの範囲におよぶ。こうした製剤は、塩濃度、緩衝剤、ｐＨ、容積モル浸透圧濃度、重量モル浸透圧濃度、緩衝能力、及び種々のタイプの添加剤が異なり得る。
【００３０】
タンパク質溶液は、ウシアルブミンの簡単な溶液から、選択されたヒトの血漿タンパク質を有する市販の製剤プラズマネートまでの範囲におよび得る。こうした製剤は、タンパク質濃度、緩衝剤、ｐＨ、容積モル浸透圧濃度、重量モル浸透圧濃度、緩衝能力、及び種々のタイプの添加剤が異なり得る。
【００３１】
フィコール又はデキストラン又は他の多糖類を含むこれらの溶液の合成又は「置換」バージョンも使用可能とすることができる。他の置換物を使用してもよい。好ましい希釈剤の例は、４：１の比でプラズマネートとプラズマライトとを足したものである。
【００３２】
第２のステーションは、染色プラットフォームである。固定及び染色のために、乾燥されたスライドは、通常、メタノール（固定）、ライト・ギムザ染色、及び緩衝溶液によってフラッディングされる、又は、その中に浸される。平坦に置かれたスライドのフラッディングが実施され得る。精密ピペッティングはこのステップには必要とされないため、低コストのコンピューター駆動式ぜん動ポンプを、試薬をスライドに塗布するために使用することができる。スライド上での疎水性リングの使用は、試薬の移送を比較的簡単にする。各試薬は、スライドを傾けることによって除去される。別の実施形態では、スライドは、固定及び染色用の試薬の槽内に浸され得る。別の実施形態では、反転スライドがプレートを横切って移動させられ、これによってスライドを下から試薬でフラッディングする。スライドの最終的な乾燥は、その後実施されることになる。
【００３３】
最後に、明視野撮像のために、電動式ＸＹＺ移動及び自動化対物レンズ選択に匹敵する顕微鏡又は同様の光学システムを使用することができる。適切なレンズ及びユーザーがマルチスペクトル画像を取得することを可能にする照明サブシステムが必要とされる。高速インタフェースを有する大視野（１６００×１２００ピクセル）カメラを使用することができる。
【００３４】
このシステムは、スライド移動、ピペッティング操作、顕微鏡移動、及び画像分析を指示する１つ又は複数のコンピューターによって駆動される。このシステムは、ステージ及びフォーカスモータ及び他の低レベル動作を制御するために、汎用コンピューター及び／又はマイクロプロセッサボードを含むことができる。
【００３５】
血液試験方法が適切に働くために、必要であればスライドを清浄し、血液試料を吸引し（かつ必要であれば希釈し）、血液の小滴をスライドに移送するための準備アセンブリを含む方法の各態様が対処されなければならない。撮像のために血液の希釈された小滴を調製するには制約が存在し、その制約は、１）真の単一層を形成し、２）患者の血球数を正確に反映し、３）計数するのが比較的容易であるというものである。血液懸濁液がどれほど薄く分散され得るかに応じて、多少の希釈が必要とされる場合がある。例えば、血液１部と希釈剤３部の割合の希釈液を使用することができ、この場合、希釈剤は、生理的に適合した溶液である。ピペット内に希釈試料の小さなサイズの小滴を取り、それを大きなエリア（通常、１／２平方センチメートル又は１平方センチメートル）にわたって分散させることによって、非常に平坦でかつ薄い小滴が形成される。細胞は、その後、表面に確実に急速に沈降し、急速に乾燥する（おそらく、移動空気の存在によって加速される）。この技術によって、ＷＢＣ及びＲＢＣが受ける物理的な力が最小になる。試料の量と堆積エリアのバランスをとることによって、赤血球の重なりが最小になる。
【００３６】
希釈プロセス及びスライド上に滴を置くことは自動化されるべきである。スライドは、最大限に親水性の表面を生成するために、コロナ放電デバイス（エレクトロ・テクニック・プロダクツ社、Sawicki PA）を使用して最初に清浄されることができる。これは、放電をオンにし、約１５秒の間、この装置の下で各スライドの「細胞スポット」を螺旋運動で移動させることによって達成される。
【００３７】
希釈が必要とされる場合、使い捨てキュベットを、患者のバイアルから吸引される試料を希釈するために使用することができるか、又は、希釈は、バイアルから試料を吸引するために使用される装置内で行うことができる。
【００３８】
基板上への血液細胞の塗布の場合、一つの実施形態では、コンピューター制御式ピペットが、１マイクロリットルの血液を取り、それを、３マイクロリットルの希釈剤を含むキュベットに入れる。ピペッタは、試料を混合し、１マイクロリットルの希釈血液をキュベットから取出すために使用される。１マイクロリットルの血液は、スライドが移動している間に、スライド上に分注される。これは、小滴が、比較的大きなエリアにわたって均一に分散することを可能にする。別の実施形態では、ピペットチップは、固定スライド上を移動することができる。
【００３９】
試料がスライド上に置かれると、これらの希釈液及びこれらの技術を使用して、この方法は、約９０００００個の赤血球、４５０００個の血小板、及び１０００個の白血球をスライド上に置く。
【００４０】
この方法の精度を確定するために、デジタル画像からＲＢＣ及びＷＢＣを計数するためのコンピューターアルゴリズムを開発した。そのアルゴリズムは、人手によって計数された顕微鏡視野を、自動化された計数と比較することによって、最初に検証した（図３、図４、及び図５を参照のこと）。著しく高い相関が、自動化された細胞計数の精度を立証した。次に、３４個の患者試料を、先に述べた調製技術を使用して処理し、赤血球及び白血球の自動化された計数を、自動化されたＣＢＣ「フロー」機器からの細胞計数と比較した。２つの方法の間の高い相関が、赤血球計数と白血球計数の両方について見出された（図６及び図７を参照のこと）。これによって、細胞を定量的に移送する新規な手法が成功したこと、及び、コンピューター画像処理からの自動化された細胞計数が正確な結果をもたらしたことが確認される。
【００４１】
このシステム全体の成功は、ピペッティングステップの精度並びに固定及び染色中に細胞がスライドに付着したままになる能力に依存する。既存の自動化システムに関するＲＢＣ計数は、通常、４％以内の正確さであり、ＷＢＣ計数は５％以内の正確さであり、血小板計数は７％以内の正確さである。これらの総合的な精度レベルに達するために、ピペッティングステップは、２％又は３％の正確さである必要がある。使い捨てチップを用いたこの小滴サイズ（１マイクロリットル又は２マイクロリットル）レベルでの高品質電子制御式ピペッティングは、約１％〜２％の精度及び約０．７％〜１％の繰返し性を有する（バイオヒット，ニュージャージー；www.biohit.com）。プロセスの更なる開発は、使い捨てチップなしの、より正確な異なるピペッティングの形態につながり、試薬コストを低減することができる。
【００４２】
血液の一定分量をスライドガラス上に分散した後、スライドは、乾燥され、固定され、染色される。細胞は、一旦スライドに塗布されると、数秒で沈降する。その後、細胞は乾燥の準備が整う。初期試験中に、市販の乾燥器の幾つかのモデルの低温設定を、手製のノズル及びバッフルとともに使用した。スライドに対して４５度の角度で吹き付ける冷たい空気の軽い（低温設定の）ストリームが、再現性のある乾燥条件を提供した。コンピューターで使用されるような電子的に可変の速度を有する小型ファンもまたノズル及びバッフルとともに使用することができる。最適品質の染色結果は、血球形態を評価するために使用される標準的なウェッジスミアの最良の部分でそれが得られるのとほぼ同じ時間でスライドが乾燥するときに、すなわち、１５秒〜２０秒で得られることがわかった。他の乾燥条件が、乾燥の均一性及び速度を最適化するために実験され得る。幾つかの条件では、強制空気は必要とされない場合がある。この方法によって調製される後続の分析に適する血液スミアは、図８に示される。
【００４３】
固定のために、スライドは、８５（容積）％のメタノールの槽内に設置してもよい。固定及び染色のためには、スライドを平坦のままにし、試薬でスライドをフラッディングさせることが適切に働く。染色のために、試薬は、単一溶液のライト・ギムザ染色液及びリンス緩衝液からなるものとしてもよく、又は、他のよく知られている血液染色液を使用してもよい。染色に続いて、スライドを、おそらく強制空気によって再び乾燥する。
【００４４】
染色された細胞は、従来の自動化染色器上で染色されたウェッジスミア上の細胞に匹敵しなければならない。研究所の染色器を使用して染色された人手によって調製されたウェッジスミアは、コントロールとして使用され得る。スライドは、視覚的に比較することができ、また、画像分析を使用して、染色の強度、色（臨界波長で染色強度を比較することによって）、及び細胞の形態を比較することができる。
【００４５】
スライドの初期の乾燥及び固定に続いて、自動化染色装置が使用される。スライドは、その後、明視野撮像を遂行する準備が整う。
【００４６】
撮像機器は、自動化ステージ及びフォーカスを有する標準的な明視野顕微鏡又は機能的に等価な装置を含むことができる。一つの実施形態では、顕微鏡は、メルツホイザー社（ドイツ）のステージ及びフォーカスモーターアタッチメント（プライア・サイエンティフィック社、ロックランド，マサチューセッツ）に取付けられる。顕微鏡は、電動式ノーズピースを有し、コンピューター制御下で異なる拡大レンズが選択されることを可能にする。フィルターホイール（プライア・サイエンティフィック社、ロックランド，マサチューセッツ）は、光経路内で狭帯域色フィルターが自動的に選択されることを可能にする。ＬＥＤ照明を、フィルターの代わりに用いることができる。切換え式ＬＥＤの使用は、フィルターホイール回転の場合に必要とされる時間と比較して、画像取得時間を大幅に短縮させる。１６００×１２００ピクセルｆｉｒｅｗｉｒｅカメラ（ポイント・グレイ社、バンクーバー，カナダ）を、狭帯域画像を取得するために使用することができる。
【００４７】
明視野ステーションの目的は２つある。第１に、撮像ソフトウェアは、総赤血球数及び総白血球数を確定するために明視野画像を使用する。この計数の場合、単一波長の光（例えば５７０ｎｍ）が使用され得る。血小板数の場合、２色の照明を使用することができる。例えば、血小板の非常に高いコントラストでかつ高品質の画像を、５７０ｎｍ画像から４３０ｎｍ画像を減算することによって得ることができる。赤血球、白血球、及び血小板の計数精度は、著しく高く、９８％を超えるように思われる。計数についての総合精度は、スライド調製物が、血液チューブから取り出された試料をどれほどよく表しているかに依存することになる。固定及び染色中に非常に少数の細胞しか失われていないことを評価が示した。これは、乾燥プロセスに起因する、スライドに対する沈降した細胞の優れた付着によるものである。現行の自動化ＣＢＣ機器に典型的である赤血球、白血球、及び血小板の計数についての誤り率が適合され得るか、又はそれが改善され得る。正確な計数は、赤血球及び白血球用の全調製物をスキャンすることによって行うことができるが、平均細胞堆積物が全部で約３００００個の血小板又は１視野当たり約５００個の血小板を有することになるため、正確な血小板計数は、減少した数の視野を使用してもよい。ＷＢＣ計数及びＲＢＣ計数が行われた視野の例は、図９に示される。
【００４８】
明視野撮像の第２の目的は、白血球分類計数のための、また、血小板及びＲＢＣの形態を評価するための画像を取得することである。正確な分類計数のために、少なくとも２００個の白血球が必要とされる。白血球の位置を特定するために、単一波長において１０倍の倍率（０．７ミクロン／ピクセル）で全細胞スポットがスキャンされ得る。スキャニング、フォーカストラッキング、及び処理が可能な電動式ステージを使用する典型的なコンピューター化顕微鏡システムは、１０視野／秒より高い速度で１６００×１２００ピクセル画像を分析することができる。細胞堆積物のサイズに応じて、分析すべき２００個〜４００個の間の視野が存在する可能性がある。全体的な分析は、２０秒〜４０秒かかることになる。この時間の終わりに、コンピューターは、細胞スポット上での全ての白血球「候補」の場所をわかっていることになる。コンピューターは、その後、これらの場所のうちの２００以上の場所に戻り、リフォーカスし、より高い倍率で（すなわち、４０倍又は６０倍のレンズを使用して）白血球をデジタル化し、画像分析を使用して、白血球タイプを識別し、オペレーターが後で観察するために画像を記憶する。画像をデジタル化して、血液技師による分析とフルカラー観察の両方を最適化するために、少なくとも４つの狭帯域色の光が必要とされる可能性がある。従来から、コンピューター化された白血球分類作業の場合、４３０ｎｍ、５００ｎｍ、５２５ｎｍ、及び６００ｎｍの波長が使用される（ブレナー  １９７４年；ツァーニザー １９８３年；ツァーニザー １９８６年）。フィルターホイールシステムにおいて他の波長でも実験が行われ得る。２００個〜３００個の白血球の取得及び分析は、おそらく約１分で都合よく達成され得ることが予想される。同時に、赤血球形態及びヘモグロビン含有量の評価のために、十分な数のＲＢＣが画像内で利用可能である。
【００４９】
全体的に見て、明視野撮像（赤血球、白血球、及び血小板の計数＋白血球位置特定＋血球分類分析）は約２分かかることになる。これは、全体的な時間枠にピッタリ合い、８分〜１０分かけて全試料を処理することを可能にする。
【００５０】
プロセスのこの撮像ステージのタイミングは、機器全体のスループットについての現行の制限因子である。他のステップが全て、１分間隔に分けられ得る（染色の個々の構成要素を含む）ため、パイプライン式システムは、１分／試料スループットで達成され得る（「ファーストイン」から「ファーストアウト」まで８分〜１０分かかる）。このスループット時間は、１）更なる最適化によって、２）ステップを、２つ若しくは３つの「パイプライン式」光学プラットフォームに分けることによって、又は、３）機器内で２つ若しくは３つの並列の同一明視野システムを使用することによっておそらく改善されるであろう。
【００５１】
約０．２マイクロメートルのピクセル間隔が、正確な血球分類計数のために必要であることが過去の経験によって示されている（ランドウィアード  １９８１年）。非常に小さなピクセル間隔を有する今日のＣＣＤカメラを使用する場合、この分解能は、４０倍、５０倍、又は６０倍の対物レンズと適切なカメラカプラーを用いて得ることができる。６０倍は、乾燥対物レンズについて通常利用可能である最大倍率であるが、より高いコストで入手可能なより高い乾燥対物レンズが存在する。適切なレンズが、色補正及び視野の平坦性を保証するために使用される。０．１マイクロメートル／ピクセル〜０．２５マイクロメートル／ピクセルのピクセル間隔での実験が、対物レンズとカメラアダプターの組合せに応じて必要である可能性がある。
【００５２】
ＷＢＣ分類の目標は、最低５分類での分類を正確に行うことである。これは、このソフトウェアの最も複雑な態様である。このソフトウェアにとっての成功は、調製の品質及び画像の品質に大きく依存する。行われた以前の研究から、画像分析に基づく自動化されたＷＢＣ分類が可能であることがわかっている。より最近の研究が示したところによれば、（１９８０年代に使用された油浸対物レンズの代わりに）乾燥対物レンズを用いた画像品質は、色細胞分析及び観察（クロマビジョンのＡＣＩＳ）並びに分類計数及び観察（セラビジョンのＭＩＣＲＯ２１）について優れた品質を提供する。
【００５３】
上述した改善された調製技術は、画像分析に非常に役立つ。スパンスミア、又は、手若しくは機器が引張るウェッジスミアを使用した以前のシステムでは、細胞歪が、再現性のある画像分析を達成するときの重大な問題であった。細胞の単一層を軽く塗布するという本考案の方法は、本システムにおけるスライド調製中に細胞の歪が全く存在しないか又はほとんどないことを保証する。全ての調製法（ウェッジ法であれ、スピン法であれ、本考案の調製法であれ）において、細胞は、乾燥するにつれて形態を変化させるが、最適な乾燥条件が人手によって再現され得ることが示されており、また、一層良好な制御が、完全に自動化された調製によって利用可能であることが予想される。上述した改善された検体調製はまた、任意の方法によって調製されるウェッジスミアに関して起こることが分かっている分布アーチファクトをなくし、ＷＢＣ分類計数に不正確さをもたらす。
【００５４】
ＲＢＣ形態及びヘモグロビン含有量を評価し、次に、白血球に接触するいずれの赤血球をもデジタル的に除去するために、ヘモグロビンだけの画像を取得するためのフィルター（４３０ｎｍ）を含む少なくとも４つの狭帯域画像が画像分析のために使用される。５７０ｎｍフィルターが、血小板及び核について優れたコントラストを与えることが示されている。他の波長が、好塩基球、単球、リンパ球（全て青の色合い）、好酸球（赤）、及び好中球（中間色）の色を最もよく区別するために選択される。これらの波長はまた、適切である場合、色画像の表示のために使用される。そうでなければ、１つ又は２つの更なる画像が、２００超の細胞について撮影される必要がある場合があり、その画像は、分類計数のために分析され、また、モニター上に表示することができる。
【００５５】
取得された画像を使用して、核及び細胞質の位置を特定するために、細胞質及び核の区分化アルゴリズムが適用される。
【００５６】
一旦、核及び細胞質の区分化が終了すると、ソフトウェアは、白血球の核及び細胞質から色、形状、サイズ、テクスチャー、及び密度特徴の標準的な集合を抽出する。
【００５７】
画像分析ソフトウェア及び分類アルゴリズムを訓練するために、既知の対象物の大きなデータベースを組立てることが必要である。この対象物は、多数の異型細胞を含む数千の全てのタイプの細胞を含む。データベースが確立されると、市販の統計分析パッケージ及び分類子を開発するための判別ルーチンが使用される。分類子は、比較的複雑であり、通常、階層構造の複数の判別子からなる。
【００５８】
存在する赤血球の数を計数することに加えて、ＣＢＣ機器は、ヘモグロビン含有量及び赤血球形態の評価を提供する。ヘモグロビン含有量を、４３０ｎｍで個々の赤血球の積分光学濃度を測定することによって求めることができることが確立している（バッカス， １９８５年）。赤血球形態もまた、以前の自動化された分類機器上で成功裏に求められており（バッカス，１９８０年、１９８２年）、その方法はよく知られている。
【００５９】
図４は、赤血球についての自動化計数と人手による計数との相関を示すグラフである。各視野は、２００個〜１５００個の赤血球を含む。０．９９３のＲ平方値が、データの回帰モデルから計算され、０．９９６の非常に良好なピアソン相関係数を与える。
【００６０】
図５は、白血球についての自動化計数と人手による計数との相関を示すグラフである。０．９６０のＲ平方値が計算され、０．９８０のピアソン相関係数を与える。
【００６１】
図８に示す写真は、自動化ピペッティングシステム上で生成されるスライドからの細胞スポットである。通常、正方形細胞スポットの縁部の視野は、ピペットチップが次の列に載るために急速に向きを変えるため少数の細胞を含む。最後の列の端部において、幾つかの細胞スポットは、細胞の「ブロブ」を示し、そこで、ピペットチップが停止し、スライドの表面から持上げられる。こうした混雑した視野において、ソフトウェアは、依然として赤血球数の推定を行うことができるが、コンピューターの計数は、混雑したエリアにおいてわずかに低くなる可能性があるように思われる。この方法は、細胞のより均等な分布を生成するように改良され得る。図９は、細胞スポットからの１つのデジタル画像の詳細を示す。
【００６２】
画像分析プログラムは、それぞれの個々の視野を分析し、総赤血球数と総白血球数を合計する。患者バイアル内の総計数／マイクロリットルを計算するために、スライド上で計数された数が、希釈係数で乗算される。
【００６３】
以下の表１は、３４個のスライドについてのデータ要約を示す。「シスメックス」データは、市販の「フローベース」自動化ＣＢＣ分析器からの赤血球数及び白血球数を示している。自動化計数及びスケーリングされた計数は、赤血球と白血球の両方について提供される。赤血球数は通常、「百万個の細胞／マイクロリットル」の単位で与えられるため、位置特定された赤血球の数を、「スケーリングされた」赤血球数を得るために１００００００で除算した。白血球の場合、計数は、「千個の細胞／マイクロリットル」の単位で与えられるため、その数を、「スケーリングされた」白血球数を得るために１０００で除算した。
【００６４】
検体は、非常に高いものから非常に低いものまでの赤血球数及び白血球数を含むことに留意されたい。
【００６５】
【表１】
0003203413.tif 000003
【００６６】
図６のグラフは、赤血球についてのシスメックス計数と自動化スライドベース計数との相関を示している。未処理計数は、６８２４４９白血球／スライドと１２４１７６５白血球／スライドとの間で変動した。９７．９５％のＲ平方値が計算された。
【００６７】
図７に示すグラフは、白血球についてのＳｙｓｍｅｘ計数と自動化スライド計数との相関を示している。未処理計数は、１４７白血球／スライドから１１２５０白血球／スライドとの間で変動した。９９．７０％のＲ平方値が計算された。
【００６８】
データは、スライドを調製する２つのセッション中に３４の患者試料から得られた。データは、典型的な患者を表すが、チューブは、赤血球数及び白血球数の広い分布を有する患者から選択された。３４個の試料のうちの、全てではないがほとんどが、日中に冷凍庫に「保管されていた」検体から得られ、その後、夕方近くに引き出され本考案の機器上で調製された。チューブは、一旦引き出されると、連続して処理された。
【００６９】
スライドは、半自動的に調製され、染色され、計数され得る。細胞は、形態学的によく保存され、スライド上での計数は、現行の技術水準のシスメックスＣＢＣ機器上で得られる計数と相関がある。
【００７０】
スライドガラス上の制限されたエリアへの血液細胞の定量的移送が達成され得ることが示された。十分な細胞が移送されて、スライド上に堆積した平均して９０００００個を超える赤血球及び１０００個を超える白血球に基づいて、正確なＲＢＣ数及びＷＢＣ数が与えられる。全ての細胞が計数され測定され得る。各細胞の形態は、画像分析によって又は直接可視化によって評価され得る。細胞内の細部の保存は、手又は現行の市販の自動化機器によって行われる従来のスライドガラス調製に関して見られる保存に等しいか又はそれより優れる。移送される細胞の集団全体は、乾燥、固定、及び染色後でも、スライド上に残っているように見える。初期撮像努力による細胞計数は、ほとんどの現行の技術水準のＣＢＣ機器に非常によく対応する。
【００７１】
ＣＢＣ機器についてのこの基礎は、現行の技術水準の機器に対して、非常に単純であり、費用がかからず、同等の品質か又は優れた品質であるものとすることができる。
【００７２】
以下に述べる方法は、全血球計数、ヘモグロビン含有量、赤血球形態、並びに、血液検体内の血球の直接観察によってこれらの細胞の真の数及び血球形態を反映するＷＢＣ分類計数を提供する。これに関して、本考案は、電気インピーダンス、光の吸収及び光の散乱の測定を行う既存のＣＢＣ機器及び方法、並びに、血液細胞の直接観察にはよらないが、血液細胞に起因する他の手段と区別される。
【００７３】
上記に照らして、添付の特許請求の範囲によって規定される本考案の概念から逸脱することなく、開示のために選択される本明細書の実施形態に対して種々の変更が行われ得ることがここで当業者によって認識されるであろう。こうした変更の非限定的な例は、異なるレベルの希釈、種々の希釈剤、種々の基板、細胞を固定し染色する種々の手段、及び細胞を撮像する種々の手段を使用することを含む。
【図１】
0003203413.tif 000004
【図２】
0003203413.tif 000005
【図３】
0003203413.tif 000006
【図４】
0003203413.tif 000007
【図５】
0003203413.tif 000008
【図６】
0003203413.tif 000009
【図７】
0003203413.tif 000010
【図８】
0003203413.tif 000011
【図９】
0003203413.tif 000012