(57)【要約】      （修正有）【課題】サンプルの光学検出で使用される画像化モジュールのアライメント及び妥当性確認に有用な検査装置を提供する。【解決手段】（ａ）底面を有する半透明又は透明なプレートと、ここで、底面の少なくとも部分には、不透明材料が、少なくとも１個の透明又は半透明な部分を有するパターンで印刷され、（ｂ）底面の下に配置されたチャンバと、それによって、チャンバから発したか又はチャンバを介した光は、少なくとも１個の透明又は半透明な部分を通過することができる。【選択図】図７Ａ
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【実用新案登録請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）底面を有する半透明又は透明なプレートであって、前記底面の少なくとも一部には、不透明材料が、少なくとも１個の透明又は半透明な部分を有するパターンで印刷され、前記パターンは、複数の半透明又は透明な穴を整然としたアレイで含む、前記プレート、
（ｂ）前記底面の下に配置されたチャネルであって、単一チャンバを形成するように接続された複数の平行レーンを含む、前記チャネル
を含む検査装置であって、
前記チャネルから発したか又は前記チャネルを介した光は、前記少なくとも１個の透明又は半透明な部分を通過することができる、前記検査装置。
【請求項２】
（ｃ）前記チャネルの少なくとも一部を充填する流体をさらに含み、前記流体が、少なくとも１つの発光材料を含む、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記発光材料が、１以上の蛍光又は発光分子を含む、請求項２に記載の装置。
【請求項４】
前記蛍光分子が、ローダミン色素及びオキサジン色素からなる群から選択される、請求項３に記載の装置。
【請求項５】
前記半透明又は透明なプレートと接触する第２のプレートをさらに含み、前記チャネル開口が、前記半透明又は透明なプレートと前記第２のプレートの間に配置される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の装置。
【請求項６】
前記パターンが、基準要素を形成する少なくとも１個の半透明又は透明な特徴を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の装置。
【請求項７】
前記パターンが、前記半透明又は透明な穴の整然としたアレイに、比較的大きな開口を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の装置。
【請求項８】
前記検査装置を収容するカートリッジを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の装置。
【請求項９】
前記底面が、前記不透明材料を含む少なくとも１個の模様タイルを含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１０】
前記底面が、前記不透明材料を欠いた少なくとも１個の透明なタイルをさらに含む、請求項９に記載の装置。
【請求項１１】
前記少なくとも１個の模様タイルが、前記不透明材料によって完全に被覆される、請求項９又は１０に記載の装置。
【請求項１２】
前記不透明材料が、７５平方ミクロン未満の面積を有する複数の透明又は半透明な穴を含む、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１３】
前記不透明材料が、少なくとも１０ミクロンだけ離隔される複数の透明又は半透明な穴を含む、請求項９〜１２のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１４】
前記不透明材料が、７５平方ミクロン未満の面積を有する複数の透明又は半透明な穴を含み、前記不透明材料が、少なくとも３０，０００平方ミクロンの面積を有する透明又は半透明な窓を含む、請求項９〜１２のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１５】
前記底面が、前記不透明材料を含む少なくとも１個の基準タイルと、＋形状を有する基準とをさらに含む、請求項９〜１４のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１６】
前記タイルが、前記底面上にユニットで配置され、前記ユニットが、６回繰り返されて、前記底面上にパターンを形成する、請求項９〜１５のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１７】
前記チャネルが、単一チャンバを形成するように接続された４個の平行レーンを含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１８】
前記複数の平行レーンが、比較的狭い進入レーン及び退出レーンと比較して比較的広い検出レーンを含む、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１９】
前記進入及び退出レーンが、前記検出レーンを進入及び退出ポートにそれぞれ接続する、請求項１８に記載の装置。
【請求項２０】
光学検出デバイスであって、
（ａ）請求項１〜１９のいずれか１項に記載の検査装置と、
（ｂ）前記チャネルから発したか又は前記チャネルを介した前記光を受けるように前記プレートの上に配置された１個又は複数個の検出器と
を含む、前記光学検出デバイス。
【請求項２１】
前記１個又は複数個の検出器が、複数個の顕微蛍光測定器を含む、請求項２０に記載の光学デバイス。
【請求項２２】
前記複数個の顕微蛍光測定器が、モノリシック読取りヘッドに含まれる、請求項２１に記載の光学デバイス。
【請求項２３】
前記１個又は複数個の検出器が、６つの顕微蛍光測定器を含み、前記検査装置が、４個のレーンを含む、請求項２１に記載の光学デバイス。
【請求項２４】
前記６つの顕微蛍光測定器が、前記４個のレーンを検出するように位置決めされている、請求項２３に記載の光学デバイス。
【請求項２５】
前記検査装置の底面が、前記不透明材料を含む少なくとも１個の模様タイルを含み、前記６つの顕微蛍光測定器が、前記模様タイルの少なくとも１つを検出するように位置決めされている、請求項２３に記載の光学デバイス。
【請求項２６】
前記少なくとも１個の模様タイルが、前記不透明材料によって完全に被覆される、請求項２５に記載の光学デバイス。
【請求項２７】
前記不透明材料が、７５平方ミクロン未満の面積を有する複数の透明又は半透明な穴を含む、請求項２５に記載の光学デバイス。
【請求項２８】
前記透明又は半透明な穴が、少なくとも１０ミクロンだけ離隔される、請求項２７に記載の光学デバイス。
【請求項２９】
前記不透明材料が、少なくとも３０，０００平方ミクロンの面積を有する透明又は半透明な窓を含む、請求項２７に記載の光学デバイス。
【請求項３０】
画像化モジュールを評価する方法であって、
（ａ）請求項１〜１８のいずれか１項に記載の検査装置と光学アライメントで画像化モジュールを位置決めすることと、
（ｂ）１個又は複数個の前記透明又は半透明な部分を透過した光を検出すること
を含む、前記方法。
【請求項３１】
（ｃ）検出される前記光に基づいて、前記光学アライメントの精度を決定することをさらに含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
（ｃ）検出される前記光を検出する検出器の自動合焦精度を決定することをさらに含む、請求項３０又は３１に記載の方法。
【請求項３３】
（ｃ）検出される前記光に基づいて、前記検査装置上の基準を見つけることをさらに含む、請求項３０〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
（ｃ）前記検査装置を照射するための励起源を用いる際に、検出される前記光に基づいて、励起源電流を設定することをさらに含む、請求項３０〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
（ｃ）前記検査装置を照射するための励起源を用いる際に、検出される前記光に基づいて、前記励起源を較正することをさらに含む、請求項３０〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
（ｃ）検出される前記光を検出する検出器を較正することをさらに含む、請求項３０〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
（ｃ）検出される前記光に基づいて、画像均一性補正又は平坦視野補正を決定することをさらに含む、請求項３０〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
（ｃ）前記検査装置を照射するための励起源を用いる際に、検出される前記光に基づいて、前記励起源内のｚバイアスを決定することをさらに含む、請求項３０〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
（ｃ）検出される前記光に基づいて、カメラからカメラのｘｙオフセットを決定することをさらに含む、請求項３０〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
（ｃ）検出される前記光に基づいて、ｘｙステージ位置決めの再現性又はｘｙステージ位置決めにおけるヒステリシスを決定することをさらに含む、請求項３０〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
（ｃ）検出される前記光に基づいて、合焦再現性を決定することをさらに含む、請求項３０〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【考案の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権の請求
本出願は、２０１３年８月２８日に出願された米国仮特許出願第６１／８７１，１８１号に基づき、その利益を主張するものであり、その内容全体を参照によって本願明細書に援用したものとする。
【０００２】
本考案の実施態様は、広義には、例えば、核酸シークエンシング手順で検出されたサンプルなどのサンプルの光学検出で使用される画像化モジュールのアライメント及び妥当性確認に有用な装置及び方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
光学検出システムのアライメント及び妥当性確認の正確な較正を容易にするツールが求められている。本明細書に記載の本考案の実施態様は、このニーズを満たし、かつ、他の利点も提供する。
【考案の概要】
【０００４】
本開示は、（ａ）底面を有する半透明又は透明なプレートであって、底面の少なくとも一部には、不透明材料が、少なくとも１個の透明又は半透明な部分を有するパターンで印刷されている、前記プレートと、（ｂ）底面の下に配置されたチャンバとを含む検査装置であって、チャンバから発したか又はチャンバを介した光は、少なくとも１個の透明又は半透明な部分を通過することができる、前記検査装置を提供する。
【０００５】
検査装置は、（ｃ）チャネルの少なくとも部分を充填する流体を任意に含むことができ、流体は、少なくとも１個の発光材料を含む。発光材料は、１個又は複数個の蛍光又は発光分子を含むことができる。例えば、蛍光分子は、ローダミン色素又はオキサジン色素であってもよい。
【０００６】
本考案の検査装置は、半透明又は透明なプレートと接触する第２のプレートも含み得、チャネル開口は、半透明又は透明なプレートと第２のプレートの間に配置される。チャネルは、半透明又は透明なプレートの底面又は第２のプレートの上面でエッチングされていてもよい。幾つかの実施態様において、チャネルは、プレート間のスペーサにより形成される。
【０００７】
特定の実施態様において、プレートの表面上にある不透明材料のパターンは、不透明領域で基準要素を形成する少なくとも１個の半透明又は透明な特徴を含むことができる。
【０００８】
特定の実施態様において、プレートの表面上にある不透明材料のパターンは、半透明領域で基準要素を形成する少なくとも１個の不透明特徴を含むことができる。
【０００９】
特定の実施態様において、プレートの表面上にある不透明材料のパターンは、不透明領域上に整然としたアレイで複数の半透明又は透明な穴を含むことができる。
【００１０】
特定の実施態様において、プレートの表面上にある不透明材料のパターンは、半透明又は透明な領域上に整然としたアレイで複数の不透明パッチを含むことができる。
【００１１】
本考案の検査装置は、検出機器のフローセルカートリッジに座るように構成することができる。
【００１２】
検査装置は、単一チャンバを形成するように接続される複数の平行レーンを形成するチャネルを含むことができる。必要に応じて、複数の平行レーンは、比較的狭い進入及び退出レーンと比較して比較的広い検出レーンを含むことができる。進入及び退出レーンは、検出レーンを進入及び退出ポートにそれぞれ接続するように構成することができる。
【００１３】
幾つかの実施態様において、検査装置に存在するチャネルは、第１の圧力解放ポートを有する進入ポートと、第２の圧力解放ポートを有する退出ポートとを有することができる。必要に応じて、第１の圧力解放ポートは、進入レーンの方向とは異なる方向に延びるレーンに沿って位置決めされ、進入ポートは、進入レーンと、進入レーンの方向とは異なる方向に延びるレーンとの交点に位置する。例えば、第１の圧力解放ポートは、進入レーンの方向にほぼ直角に延びるレーンに沿って配置することができる。
【００１４】
所望の場合、第２の圧力解放ポートは、退出レーンの方向とは異なる方向に延びるレーンに沿って位置決めすることができ、退出ポートは、退出レーンと、退出レーンの方向とは異なる方向に延びるレーンとの交点に位置することができる。例えば、第２の圧力解放ポートは、退出レーンの方向にほぼ直角に延びるレーンに沿って配置することができる。
【００１５】
幾つかの実施態様において、プラグ材料は、圧力解放ポート、退出ポート、及び／又は進入ポートを介して液体の流れを防止するように存在することができる。
【００１６】
検査装置の上面板の底面には、不透明材料を含む少なくとも１個の模様タイルを含むことができる。代替的に又は付加的に、底面は、不透明材料を欠いた少なくとも１個の透明なタイルをさらに含むことができる。
【００１７】
必要に応じて、模様タイルは、不透明材料によって完全に被覆することができる。あるいは、該不透明材料は、７５平方ミクロン未満の面積を有する複数の透明又は半透明な穴を含むことができる。
【００１８】
幾つかの実施態様において、タイル上の不透明材料は、少なくとも１０ミクロンで離隔される複数の透明又は半透明な穴を含むことができる。一例において、該不透明材料は、７５平方ミクロン未満の面積を有する複数の透明又は半透明な穴を含むことができ、該不透明材料は、少なくとも３０，０００平方ミクロンの面積を有する透明又は半透明な窓を含むこともできる。
【００１９】
必要に応じて、検査装置は、＋形状を有する透明な基準で遮られる不透明材料を有する少なくとも１個の基準タイルをさらに含むことができる。所望の場合、検査装置の表面上のタイルは、底面上にユニットで配置されることができ、該ユニットは、６回繰り返されて、底面上にパターンを形成することができる。
【００２０】
また本開示は、画像化モジュールの妥当性確認検査をするための検査方法も提供する。該方法は、（ａ）本明細書に記載の検査装置と光学アライメントで画像化モジュールを位置決めするステップと、（ｂ）１個又は複数個の透明又は半透明な部分を透過した光を検出するステップを含むことができる。
【００２１】
検出装置においてカメラを位置合わせするための検査方法も提供する。該方法は、（ａ）本明細書に記載の検査装置と光学アライメントでカメラを位置決めするステップと、（ｂ）１個又は複数個の透明又は半透明な部分を透過した光を検出するステップを含むことができる。
【００２２】
１個又は複数個の実施態様の詳細は、添付図面及び以下の説明で述べられる。他の特徴、目的、及び利点は、説明及び図面から、及び請求項から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】互いに直交する励起ビーム経路及び発光ビーム経路を有する個々の顕微蛍光測定器の光学的レイアウトを示す。
【図２】検出装置用の８個の顕微蛍光測定器の配列の斜視図を示す。
【図３】検出装置用のＹステージの頂部から見た斜視図を示す。
【図４】検出装置用のＹステージの底部から見た斜視図を示す。
【図５】８個の顕微蛍光測定器の配列を保持するＹステージの頂部から見た斜視図を示す。
【図６Ａ】４個のチャネルを有するフローセルに関連する４個の顕微蛍光測定器の配列を示す。
【図６Ｂ】８個のチャネルを有するフローセルに関連する８個の顕微蛍光測定器の配列を示す。
【図７Ａ】ウーバーターゲット装置の頂面図を示す。
【図７Ｂ】ウーバーターゲット装置のチャネルの側面図を示す。
【図８】検査方法で用いた検査装置の裏面照射方式の図を示す。
【図９】検査方法で用いた検査装置の落射蛍光方式の図を示す。
【図１０】ウーバーターゲット装置の金属層の上で（パネルＡ）、該金属層で（パネルＢ）、及び該金属層の下（パネルＣ）で合焦させたＮｅｘｔＳｅｑ（登録商標）画像化モジュールから得た画像を示す。
【図１１】品質制御固定具内（パネルＡ）、及びＮｅｘｔＳｅｑ（登録商標）シーケンサに取り付けられたカートリッジ内（パネルＢ）のウーバーターゲットの写真を示す。
【図１２Ａ】多重チャネルを有する検査装置（左）と、マルチレーンをもつ単一チャネルを有する検査装置とを示す。
【図１２Ｂ】ＮｅｘｔＳｅｑ（登録商標）画像化モジュールの６台のカメラの画像領域に沿った、ウーバーターゲット装置上のプリントパターンの位置を示す。
【図１２Ｃ】図１２Ｂに示すウーバーターゲット装置のマスクＦ領域及びマスクＡ領域のさらなる詳細を示す。
【図１３】コンピュータ制御された画像化デバイス上の検査方法を制御するためのグラフィカルユーザインタフェース例を示す。
【図１４】ウーバーターゲット装置を使用してＮｅｘｔＳｅｑ（登録商標）シーケンサを検査するための自動化プロセスフローを示す。
【図１５】基準を有するウーバーターゲット装置を示す。
【図１６Ａ】基準を探してヒステリシスを決定するための移動方向を示す。
【図１６Ｂ】基準を探す際に得られた画像のヒステリシスを示す。
【図１７】ウーバーターゲット装置の自動合焦タイルの画像を示す。
【図１８】ウーバーターゲット装置の画質タイルの画像を示す。
【考案を実施するための形態】
【００２４】
（詳細な説明）
本考案は、例えば、核酸シークエンシング手順で検出されたサンプルなどのサンプルの光学検出で使用される画像化モジュールのアライメント（例えば、ｘ、ｙ、及び／又はｚ次元における光学アライメント）及び妥当性確認（例えば、光学特性の較正、定量化、又は特性化）のための検査装置を提供する。本明細書に記載の装置及び方法は、例えば、２０１３年２月１３日に出願された、ＵＳ２０１３／０２６０３７２Ａｌとして公開され、「ＩＮＴＥＧＲＡＴＥＤ  ＯＰＴＯＥＬＥＣＴＲＯＮＩＣ  ＲＥＡＤ  ＨＥＡＤ  ＡＮＤ  ＦＬＵＩＤＩＣ  ＣＡＲＴＲＩＤＧＥ  ＵＳＥＦＵＬ  ＦＯＲ  ＮＵＣＬＥＩＣ  ＡＣＩＤ  ＳＥＱＵＥＮＣＩＮＧ」と題された米国特許出願第１３／７６６，４１３号で述べられる画像化モジュールのアライメント及び妥当性確認に特に有用であり、その内容全体を参照によって援用したものとする。
【００２５】
画像化モジュール及び関連デバイス
米国特許出願第２０１３／０２６０３７２Ａｌ号で開示された画像化モジュールの例示的な実施態様及び特徴を以下に記載する。しかしながら、本明細書に記載の検査装置及び検査方法を、任意の他の適切な画像化モジュールのアライメント及び妥当性確認に使用することができることを理解されたい。
【００２６】
本開示は、基板表面上に存在するような平面状エリアの高解像度検出を行う方法及び装置を提供する。特に有用な用途は、表面上に存在する生体サンプルの光に基づく画像化である。例えば、本明細書に記載の方法及び装置を使用して、核酸シークエンシング用途で使用されるような核酸アレイに存在する核酸特徴の画像を取得することができる。光検出可能なサンプル及び／又は試薬を用いる様々な核酸シークエンシング技術を使用することができる。これら技術は、特に、本考案の方法及び装置によく適しており、したがって、本考案の特定の実施態様において様々な利点が浮かび上がる。これら利点のうち幾つかを以下に説明目的のために述べ、また核酸シークエンシング用途は例示的なものであるが、利点は他の用途にも拡張できる。
【００２７】
本明細書に記載の例の幾つかに関して、多くの核酸シークエンシング技術の際立った特徴は、（１）多色検出の使用（例えば、しばしば４つの異なる蛍光色素分子を使用し、異なるヌクレオチドタイプＡ、Ｃ、Ｇ及びＴ（又はＵ）毎に１つが核酸に存在する）、（２）アレイ表面上の核酸サンプルからの異なる多数の断片（例えば、ゲノムサンプル、ＲＮＡサンプル、又はそれらの誘導体からの断片）の分布、（３）アレイの流体処理及び画像化の繰返しのサイクルである。本明細書に開示の方法及び装置の実施態様は、特に、核酸シークエンシングに有用であり、それは、多色かつ多反復でアレイ表面の高解像度画像化能力を提供することができるからである。例えば、本明細書に記載の実施態様によれば、数百、数十又は一桁でさえものミクロンオーダー範囲内にある解像度で表面の画像を取得することができる。このように、最も近接する核酸特徴部の平均中心中心間隔が１００ミクロン、５０ミクロン、１０ミクロン、５ミクロン、又はそれより少ないミクロンで解像し得る。特定の実施態様において、表面の広視野画像を取得でき、例えば、アレイの１ｍｍ２又はそれ以上の面積にわたる画像を取得できる。画像は同時に又は順次に多色で取得でき、これにより、例えば、異なるヌクレオチドタイプに一意的に関連する蛍光ラベルを識別することができる。さらに、画像はシークエンシング技術の多数回サイクルにわたり順次に取得できる。アレイの或る領域からの画像は、各サイクルから信頼性高く比較でき、アレイ上における各核酸特徴に対して検出された色変化のシークエンス（配列）を決定することができる。次に、この色変化シークエンスを使用して各特徴における核酸断片のシークエンスを推察することができる。
【００２８】
特定の実施態様において、本考案の装置は、１個又は複数個の顕微蛍光測定器を含む。各顕微蛍光測定器は、励起放射源、検出器及び対物レンズを有して、読取りヘッドの一体化サブユニットを形成することができる。他の光学的コンポーネントを各顕微蛍光測定器に設けることができる。例えば、ビームスプリッタを設けてコンパクトな落射蛍光検出形態にし、これにより該ビームスプリッタは励起放射を励起放射源から対物レンズに指向させ、かつ対物レンズからの発光放射を検出器に指向させるよう配置する。
【００２９】
一体化顕微蛍光測定器の設計を使用する利点は、顕微蛍光測定器が、例えば、スキャニング操作における移動が都合よくでき、顕微蛍光測定器の視野より大きい基板の画像化を可能にする点である。特定の実施態様において、数個の顕微蛍光測定器を組み合わせて、読取りヘッドを形成することができる。読取りヘッドの組み合わせにおける様々な構成を以下に説明し、これらの構成は、画像化すべき基板の特別なフォーマットに適合するとともに、読取りヘッド全体を比較的コンパクトなサイズに維持するよう選択することができる。本考案の幾つかの実施態様における読取りヘッドの比較的小さいサイズ及び少ない質量によれば、慣性を比較的少なくし、したがって、読取りヘッドは移動後即座に停止できるようになり、これにより核酸アレイ又は他の基板の迅速なスキャニングに有利に作用する。幾つかのケースにおいて、顕微蛍光測定器は、核酸シークエンシングの実行のような解析用途の進行中に少なくとも若干の次元内で独立的に移動できないように、キャリッジに固定することができる。例えば、多重顕微蛍光測定器は、互いにｘ及びｙ次元（ｘ又はｙの少なくとも一方はスキャン方向である）に独立して移動できないよう恒久的に固定することができる。しかしながら、顕微蛍光測定器は、ｚ次元には独立して作動し、独立的合焦制御を行えるようにすることができる。本考案の装置における異なる顕微蛍光測定器の幾つかの間で自由度を減らすことにより、装置の輸送中、取扱い中、及び使用中におけるアライメント喪失に対する防護をもたらす。
【００３０】
幾つかの実施態様において、読取りヘッド又はキャリッジに設ける多重顕微蛍光測定器は、各個に専用の自動合焦モジュールを有することができる。したがって、各顕微蛍光測定器は独立的に合焦することができる。幾つかの実施態様において、読取りヘッドにおける特定自動合焦モジュールは、特定顕微蛍光測定器の動作に専用化したものであるが、読取りヘッドにおける少なくとも１個の他の合焦モジュールからの情報を受取ることができ、また、その特定自動合焦モジュールからの情報、及び少なくとも１個の他の自動合焦モジュールからの情報を使用して、適切な動作を決定してその特定顕微蛍光測定器の望ましい合焦を達成できるようにする。このように、任意の所定顕微蛍光測定器の焦点は、同一読取りヘッド又はキャリッジに存在する２個又はそれ以上の顕微蛍光測定器間の合意の下に決定することができる。
【００３１】
本明細書で提供されるのは、（ａ）複数個の顕微蛍光測定器を含むキャリッジと、ここで、各顕微蛍光測定器は、広視野画像検出用に構成した対物レンズを含み、複数個の顕微蛍光測定器は、共通平面で複数枚の広視野画像を同時に取得するよう配置し、各広視野画像は、共通平面の異なる領域からの画像であり、（ｂ）キャリッジを共通平面に平行な少なくとも１方向にキャリッジを移動するよう構成した並進ステージと、（ｃ）基板を共通平面上に保持するよう構成したサンプルステージとを有する検出装置である。
【００３２】
本考案の検出装置（又は個別顕微蛍光測定器）を使用して、特徴をミクロンスケールで区別するのに十分な解像度で１つ又は複数の画像を取得することができる。例えば、検出装置に使用される顕微蛍光測定器は大きくても５００μｍ、１００μｍ、５０μｍ、１０μｍ、５μｍ、４μｍ、３μｍ、２μｍ、又は１μｍで分離した特徴を区別するに十分な解像度を有することができる。より低い解像度も可能であり、例えば、５００μｍを超えて分離する特徴を区別する解像度にすることもできる。
【００３３】
本考案の検出装置（又は個別顕微蛍光測定器）は、表面の高解像度検出にもよく適する。したがって、ミクロンレンジの平均間隔を有する特徴があるアレイは、基板に特に有用である。特定の実施態様において、検出装置又は顕微蛍光測定器を使用して、最も近接する隣接部の中心‐中心間隔が平均で５００μｍ、１００μｍ、５０μｍ、１０μｍ、５μｍ、４μｍ、３μｍ、２μｍ、又は１μｍ、又はそれ未満の特徴があるアレイの画像を１つ又は複数を取得することができる。多くの実施態様において、アレイの特徴は、接触せずに、例えば、１００μｍ、５０μｍ、１０μｍ、５μｍ、１μｍ、又は０．５μｍ未満だけ分離しているものである。しかしながら、該特徴は必ずしも分離していなくともよい。その代わり、アレイの特徴のうち幾つか又はすべてが互いに接触していることがあり得る。
【００３４】
当該技術分野では既知の様々なアレイ（「マイクロアレイ」とも称する）のうち任意なものを使用することができる。代表的なアレイは特徴を有し、各特徴は個々のプローブ又はプローブ群を有する。後者の場合、それぞれの部位におけるプローブ群は、単一種のプローブを有し、均質であるのが一般的である。例えば、核酸アレイの場合、各特徴は、それぞれが共通配列を持つ複数の核酸種を有することができる。しかしながら、幾つかの実施態様において、アレイの各特徴における集団は不均質であり得る。同様に、タンパク質アレイは、単一のタンパク質又はタンパク質群を持つ特徴を有することができるが、一般的に必ずしも同一のアミノ酸配列を有している必要はない。プローブは、例えば、アレイ表面に対するプローブの共有結合により、又はアレイ表面に対するプローブの非共有結合的相互作用によりアレイ表面に対して付着し得る。幾つかの実施態様において、プローブ、例えば、核酸分子が、例えば、米国特許出願公開第２０１１／００５９８６５Ａ１号（参照により本明細書に組入れられるものとする）に記載のようなゲル層を介して表面に付着することができる。
【００３５】
アレイ又は他のサンプルを検出する構成であろうとなかろうと、検出装置に設ける１個又は複数個の顕微蛍光測定器は、広視野検出ができるよう構成することができる。個々の顕微蛍光測定器の視野直径は、例えば、少なくとも０．５ｍｍ、１ｍｍ、２ｍｍ、３ｍｍ、４ｍｍ、５ｍｍ、又はそれより大きい直径とすることができる。適切な光学的コンポーネントを選択することにより、同様に視野直径は最大面積に限定することができ、このように視野直径は、例えば、５ｍｍ、４ｍｍ、３ｍｍ、２ｍｍ、又は１ｍｍより大きくならないようにすることができる。したがって、幾つかの実施態様において、個々の顕微蛍光測定器によって取得される画像は、０．２５ｍｍ２〜２５ｍｍ２の範囲内の面積を有することができる。
【００３６】
広視野検出できるよう構成することの他に、顕微蛍光測定器は、０．２より大きい開口数（ＮＡ）を有するよう構成することができる。例えば、本考案の顕微蛍光測定器で使用される対物レンズのＮＡは、少なくとも０．２、０．３、０．４、又は０．５とすることができる。代替的に又は付加的に、０．８、０．７、０．６、又は０．５より大きくならないよう対物レンズのＮＡを制限するのが望ましい場合がある。本明細書に記載の方法及び装置は、特に、０．２〜０．５の範囲内のＮＡを有する対物レンズを通して検出を生ずるときに有用である。
【００３７】
アレイ検出の実施態様において、検出装置（又は個々の顕微蛍光測定器）は、アレイのデジタル画像を取得するよう構成することができる。代表的には、デジタル検出装置（又は個々の顕微蛍光測定器）の各ピクセルは、任意の所定画像取得において、単に１つの特徴から信号を収集する。この構成によれば、画像における特徴間の望ましくない「クロストーク」を少なくする。各特徴から信号を検出するピクセルの数は、結像した特徴のサイズ及び形状に基づいて、かつ、デジタル検出装置（又は個々の顕微蛍光測定器）の構成に基づいて調整することができる。例えば、各特徴は、或る画像において、たったの約１６ピクセル、９ピクセル、４ピクセル、又は１ピクセルによって検出することができる。特定の実施態様において、各画像は、１特徴あたり平均６．５ピクセル、１特徴あたり平均４．７ピクセル、又は１特徴あたり平均１ピクセルを利用することができる。１特徴あたりに使用されるピクセルの数は、例えば、アレイのパターンにおける特徴の位置の変動性を減少し、かつ、アレイに対する検出装置のアライメント公差を厳密にすることによって減らすことができる。１特徴あたり４ピクセルより少ないピクセルを使用するよう構成したデジタル検出器を例にとると、画像品質は、ランダムに分布した核酸クラスタのアレイの代わりに、順序付けした核酸特徴のアレイを使用することによって、向上することができる。
【００３８】
多重顕微蛍光測定器を有する検出装置は、各顕微蛍光測定器が検出する広視野面積を顕微蛍光測定器の数に乗算した値にほぼ等しい共通平面の面積を検出できることが理解されるであろう。面積は必ずしも連続する必要はない。例えば、２個又はそれ以上の顕微蛍光測定器は、共通平面における検出されない面積部によって分離した離散領域を検出するよう配置することができる。しかしながら、所望に応じて、多重顕微蛍光測定器は、連続するがオーバーラップしない面積を検出するよう配置することができる。代替的実施態様において、多重顕微蛍光測定器を有する検出装置は、各顕微蛍光測定器が検出する広視野面積を顕微蛍光測定器の数に乗算した値よりも相当少ない共通平面の面積を検出することができる。このことは、例えば、少なくとも部分的にオーバーラップする面積を検出するよう多重顕微蛍光測定器を配置するときに得られる。本明細書におけるいずれかの部分でさらに詳細に述べるように、多重画像は、アレイの完全画像を再構築するのに使用される、又は再構築の支援さえもするフォーマットで、又は検出した他の共通平面で取得する必要はない。
【００３９】
顕微蛍光測定器１００の例示的な光学的レイアウトを図１に示す。顕微蛍光測定器１００は、流体が充填されるチャネル１７５によって分離される上側層１７１及び下側層１７３を有するフローセル１７０に指向させる。図示の構成において、上側層１７１は光透過性であり、顕微蛍光測定器１００は上側層１７１の内側表面１７２における面積部１７６に合焦される。代替的実施形態において、顕微蛍光測定器１００は下側層１７３の内側表面１７４に合焦することができる。これら表面のうち一方又は双方は顕微蛍光測定器１００が検出すべきアレイ特徴を含むことができる。検査装置は、フローセル１７０に代えて使用することができる。
【００４０】
顕微蛍光測定器１００は、放射源１０２からの励起放射をフローセル１７０に指向させ、かつ、フローセル１７０からの発光を検出器１０８に指向させるように構成される対物レンズ１０１を含む。例示的レイアウトにおいて、放射源１０２からの励起放射はレンズ１０５を通過し、次いでビームスプリッタ１０６を通過し、次に経路上の対物レンズを経てフローセル１７０に至る。図示の実施態様において、放射源は、２個の発光ダイオード（ＬＥＤ）１０３及び１０４を含み、これらＬＥＤは互いに異なる波長の放射を発生する。例えば、緑ＬＥＤ（ＬＥＤＧ）及び赤ＬＥＤ（ＬＥＤＲ）を使用してもよい。フローセル１７０からの発光放射を対物レンズ１０１によって捕捉し、ビームスプリッタによって調整光学系１０７を経て検出器１０８（例えば、ＣＭＯＳセンサ）に向かうよう反射されるように機能する。ビームスプリッタ１０６は励起放射の経路に直交する方向に発光放射を指向させる。対物レンズの位置は、顕微蛍光測定器の焦点を変化させるｚ次元に移動することができる。顕微蛍光測定器１００はｙ方向に往復移動して、フローセル１７０の上側層１７１における内側表面１７２のうち若干エリアの画像を捕捉することができる。繰り返すが、検査装置は、フローセル１７０に代わり使用することができる。
【００４１】
図１の例示的実施態様によって実証されるように、各顕微蛍光測定器は、ビームスプリッタ及び検出器を含むことができ、該ビームスプリッタは励起放射源からの励起放射を対物レンズに指向させ、かつ、対物レンズからの発光放射を検出器に指向させるように配置される。図面に示すように、各顕微蛍光測定器は、随意的に、ＬＥＤのような励起放射源を含むことができる。この場合、各顕微蛍光測定器は専用放射源を含み、読取りヘッドが数個の放射源を含み、これら放射源が個々の顕微蛍光測定器に向かうようにすることができる。幾つかの実施態様において、２個又はそれ以上の顕微蛍光測定器は、共通放射源からの励起放射を受取ることができる。このように、２個又はそれ以上の顕微蛍光測定器は放射源を共有することができる。例示的構成において、単独放射源は放射をビームスプリッタに指向させることができ、このビームスプリッタは、励起放射を２個又はそれ以上のビームに分離し、これらビームを２個又はそれ以上のそれぞれの顕微蛍光測定器に指向させるよう配置することができる。付加的に又は代替的に、励起放射を放射源から１個、又は２個又はそれ以上の顕微蛍光測定器に向けて１個又は複数個の光ファイバにより指向させることができる。
【００４２】
図に示す特定のコンポーネントは例示であり、同様な機能をもつコンポーネントで置き換えることができることが理解されるであろう。例えば、様々な放射源のうちの任意な放射源をＬＥＤの代わりに使用できる。特に有用な放射源は、アーク灯、レーザー、半導体光源（ＳＬＳ）、又はレーザーダイオードである。ＬＥＤは、例えば、ルミナス社（マサチューセッツ州ビルリカ）から購入できる。同様に、様々な検出器が有用であり、限定しないが、電荷結合デバイス（ＣＣＤ）センサ、光電子増倍管（ＰＭＴ）、又は相補金属−酸化物−半導体（ＣＭＯＳ）センサがある。特に有用な検出器は、アプティナ・イメージング社（カリフォルニア州サンホセ）から入手可能な５メガピクセルＣＭＯＳセンサ（ＭＴ９Ｐ０３１）である。
【００４３】
８個の顕微蛍光測定器による配列を有する読取りヘッド１０００の斜視図を図２に示す。各顕微蛍光測定器は、コンパクトな設計を有する。説明を分かり易くするため、図２では顕微蛍光測定器のうち１つのみにおけるコンポーネントに対して参照符号を付けて示し、ここで説明する。しかしながら、図２で視認できるように、各顕微蛍光測定器は同様のコンポーネント及び構成を有する。２個の励起源、すなわち、緑ＬＥＤ１０４０及び赤ＬＥＤ１０３０を各顕微蛍光測定器に設ける。ＬＥＤからの励起光は、緑ＬＥＤ集光レンズ１０７５及び赤ＬＥＤ集光レンズ１０７６をそれぞれ通過する。ＬＥＤ折畳みミラー１０７４は、緑励起放射をコンバイナダイクロイック１０７３に向けて反射し、このコンバイナダイクロイック１０７３は、緑励起放射をレーザーダイオードビームスプリッタ１０７２、次に励起投射レンズ１０７１に通過させて励起／発光ダイクロイック１０６０に向かうよう反射し、この励起／発光ダイクロイック１０６０は、緑励起放射を対物レンズ１０１０に通過させるよう反射する。赤励起放射は、赤ＬＥＤ集光レンズ１０７６からコンバイナダイクロイック１０７３に通過し、この後、赤励起放射は、緑励起放射と同一経路を辿る。対物レンズ１０１０は、発光放射を集光して励起／発光ダイクロイック１０６０に通過させるよう指向させるように配置し、この励起／発光ダイクロイック１０６０は、発光放射をＣＭＯＳ画像センサ１０８０に至らせる。レーザーダイオード１３０１は、放射をレーザーダイオード結合レンズ群１４０１経由でレーザーダイオードビームスプリッタ１０７２に指向させるよう配置し、このレーザーダイオードビームスプリッタ１０７２は、レーザーダイオード放射を、励起投射レンズ１０７１、励起／発光ダイクロイック１０６０、及び対物レンズ１０１０に通過させるよう反射する。自動合焦モジュール１６００は、対物レンズ１０１０の少なくとも一部に連結し、また対物レンズ１０１０を上下に（すなわち、ｚ次元に沿って）並進移動するよう構成する。自動合焦モジュールは、本明細書ですでに例示した自動合焦装置のコンポーネントを含むことができるが、必ずしもそうである必要はない。追加の光学的コンポーネントを、限定的ではないが、図１に例示するような読取りヘッド１０００に設けることができることが理解されるであろう。さらに、若干の光学的コンポーネントを読取りヘッド１０００から省く、又は読み取りヘッド１０００において変更して特別な用途に適合させることができる。プリント回路板１７０１及び１７０２は、検出器、自動合焦モジュール、及び／又は励起源と通信し合うよう構成することができる。
【００４４】
上述の例示的実施態様で説明したように、読取りヘッドは、多重対物レンズを含むことができ、各対物レンズは、単一の顕微蛍光測定器に対して専用化する。したがって、本考案の顕微蛍光測定器は、様々な光学的コンポーネント、例えば、１個又は複数個の検出器、励起放射源、ビームスプリッタレンズ、ミラー等を含むことができ、これら光学的コンポーネントは、励起放射を単独の対物レンズに指向させ、及び／又は単独の対物レンズから発光放射を受取る光学的連鎖を形成する。このような実施態様において、対物レンズは、広視野を有するマクロレンズとして構成することができる。代案として、本考案の顕微蛍光測定器は、励起放射を数個の対物レンズに指向させる及び／又は数個の対物レンズから発光放射を受取る様々な光学的コンポーネントを含むことができる。したがって、個々の顕微蛍光測定器は、数個の対物レンズを含む数個の光学的連鎖を含むことができる。１つの顕微蛍光測定器あたり数個の対物レンズを含む実施態様において、対物レンズは、随意的に、マイクロレンズのアレイとして構成することができる。特別な顕微蛍光測定器における数個あるうちの各対物レンズ（例えば、マイクロレンズのアレイにおける各マイクロレンズ）は、随意的に、独立的に合焦するよう構成し、これにより各対物レンズは、同一顕微蛍光測定器における他の対物レンズとは独立的にｚ次元に移動することができる。代替的に又は付加的に、数個の対物レンズは、すべてが一斉にｚ次元で移動する一斉合焦をするよう構成することができる。
【００４５】
本明細書に記載の読取りヘッドの様々なコンポーネントは、本明細書で例示したのと同様の機能を達成するよう様々なやり方で組合せ、また適合させることができることを理解されたい。例えば、上述の段落で示すように、読取りヘッドは数個の対物レンズを有し、各対物レンズは単独の顕微蛍光測定器に対して専用化することができ、又は代案として、数個の対物レンズを単独の顕微蛍光測定器が共有することができる。同様に、本明細書で上述したように、各顕微蛍光測定器は、少なくとも１個の専用励起源を有する、又は代案として、２個又はそれ以上の顕微蛍光測定器が共有の放射源からの励起放射を受けるようにすることができる。このように、特定読取りヘッドにおける顕微蛍光測定器の数と、任意の顕微蛍光測定器の実施態様につき本明細書に例示したコンポーネントの数との間で１対１に対応させる必要はない。その代わり、顕微蛍光測定器において有用であると本明細書に例示した１個又は複数個のコンポーネントは、特定読取りヘッドにおける数個の顕微蛍光測定器が共有することができる。
【００４６】
本考案の読取りヘッドは、走査方法及び走査装置に特に有用であり、その理由は、例えば、比較的コンパクトなサイズ及び小さい慣性をもたらす低質量である。減少した慣性は、読取りヘッドを移動に続いてより迅速に休止させ、これによって、より高い慣性を有する読取りヘッドの場合よりも速く高解像度の画像を取得でき、高い慣性の読取りヘッドでは、読取りヘッドの残留移動が解像度のぼやけ及び損失を生ずる。読取りヘッドを移動させる構成は、以下でより詳細に説明する。しかしながら、まず、低慣性の利点は、本明細書に記載の装置又は方法を限定するものではなく、また必須要件でもないことに留意されたい。むしろ、本考案の読取りヘッドは、検出プロトコルの全体又は一部にわたり静止状態に維持することができる。例えば、本明細書で説明する流体的ステップ及び画像化ステップを使用するようなシークエンシング方法は、シークエンシング方法におけるサイクルの少なくとも１つ及びおそらくすべてにわたり静止している読取りヘッドを使用して実施することができる。同様に、読取りヘッドは、本明細書に記載の検査方法の１個又は複数個のステップ中に静止していてもよい。
【００４７】
静止読取りヘッド実施態様の第１の実施例として、読取りヘッドは、表面又は他の対象物の所望部分を検出又は画像化する十分な数の顕微蛍光測定器を含むことができる。したがって、読取りヘッドはｘ又はｙ次元で移動する必要はない。例えば、数個の顕微蛍光測定器を線形に配列し、フローセルチャネル又は検査装置チャネルの全長（又は有効ターゲット長さに沿う少なくとも一部）に沿って画像フレームを捕捉することができる。同様に、本明細書に記載したような顕微蛍光測定器を数個の列に適切に詰める配列を使用して、数個のフローセルチャネル（１個又は複数個のフローセルに存在する）又は数個の検査装置チャネルを、それら全長（又は有効ターゲット長さに沿う少なくとも一部）に沿って画像化することができる。本明細書の以下に記載するように、個々のチャネルに対して取得される画像フレームは、連続することができるが、必ずしも連続しなくともよい。
【００４８】
静止読取りヘッド実施態様の第２の実施例として、読取りヘッドは、ｘ及びｙ次元に対して固定位置に留めるとともに、読取りヘッドによって検出される基板をｘ又はｙ次元で並進移動させる。例えば、基板を読取りヘッドに提示するよう構成した並進ステージを有する装置を設けることができる。並進ステージは、ステップ・アンド・シュート動作又は連続動作で移動し、静止読取りヘッドによって基板をスキャンすることができる。特定の実施態様において、基板は並進ステージに固定できるフローセルとする。あるいは、基板は検査装置であってもよい。
【００４９】
上述の実施例によれば、スキャンヘッド（又は顕微蛍光測定器）と基板との相対移動は、スキャンヘッド（又は顕微蛍光測定器）の物理的移動、基板の物理的移動、又は双方の物理的移動によって達成することができる。上述した第１及び第２の例示的実施態様で言及した静止読取りヘッドは、必ずしもｚ次元での移動に関して静的である必要はないことが理解されるであろう。その代わり、静止読取りヘッドは、自動合焦モジュールを有する１個又は複数個の顕微蛍光測定器を含むことができる。代替的に又は付加的に、読取りヘッドは全体としてｚ次元で移動し、例えば、少なくとも粗接近する上での一斉合焦が得られるようにできる。
【００５０】
次に、読取りヘッドを並進させる実施態様に戻って、図３及び図４にはそれぞれ読取りヘッドのための例示的ｙ並進ステージ２００の頂面図及び底面図を示す。この例示的実施態様において、ｙステージは、ｘ次元ではなくｙ次元に並進移動するよう構成する。したがって、ｙ並進ステージ２００に担持した読取りヘッドは、ｙ次元に移動することができ、またこの並進ステージにおける読取りヘッド又は個々の顕微蛍光測定器はｚ次元（例えば、自動合焦により）に移動可能であるが、読取りヘッドは、ｘ次元では移動できない。読取りヘッドは、キャリッジ２０１に固定し、このキャリッジ２０１は、読取りヘッドの底面を支持するよう配置した底部領域２４１と、読取りヘッドの側方移動を抑止するよう構成したフレーム２４０とを有する。キャリッジ２０１は、さらに、フランジガイド２４３及びカラーガイド２４２を含む。底部領域２４１における開口２４４は、読取りヘッドと、読取りヘッドが検出すべき基板との間の窓をなす。キャリッジ２０１の上述のコンポーネントは、モノリシック構造体を形成することができる。
【００５１】
キャリッジは、ｙステージフレーム２０７に沿って、カラーガイド２４２が走行する第１シャフト２０３を介して、またフランジガイド２４３が走行する第２シャフト２０４を介して移動するよう構成する。これらシャフトはｙ軸方向に指向させて、キャリッジ２０１がｙ次元に沿ってガイドを介して往復摺動するよう指向させる。第１シャフト２０３はｙステージフレーム２０７に保持し、この保持は、第１側壁２５０における基準面２１５及び第２側壁２５１における基準面２１８に挿入することによって行う。第１シャフト２０３は、支持部材２５２によって基準面２１５にクランプし、かつ、支持部材２５３によって基準面２１８にクランプする。第２シャフト２０４はｙステージフレーム２０７に保持し、この保持は、第１側壁２５０における基準面２１４に、また第２側壁２５１における基準面２１７に挿入することによって行う。第２シャフト２０４は、シャフトクランプ２０６によって基準面２１４に、またシャフトクランプ２０５によって基準面２１７にクランプする。
【００５２】
キャリッジ２０１の移動は、リードねじ２０２の回転によって駆動し、このリードねじ２０２は、リードナット２６０に挿通し、また第１側壁２５０の基準面に挿入し、かつ第２側壁２５１の基準面２１９に挿入することによって、ｙステージフレーム２０７に固定する。リードねじ２０２は、第１シャフト２０３をクランプするのと同一の支持部材２５２及び２５３によって所定位置にクランプする。リードねじ２０２の回転は、支持部材２５２に取付けたモータ２１２によって駆動する。エンコーダ２０８は、ベルト２１０を介してモータ２１２と相互作用するよう構成し、ベルト２１０は、エンコーダにおけるロータ２０９及びモータ２１２におけるロータ２１１と相互作用する。ベルト張力付与装置２２０は、ベルト２１０と相互作用する。
【００５３】
開口２３０は、ｙステージフレーム２０７のフロア２１６に貫通する。開口２３０は、キャリッジ２０１がｙステージフレームを横行するときキャリッジ２０１の底部領域２４１における開口２４４の軌跡を収容するよう配置する。読取りヘッドのキャリッジにおける位置決めは、対物レンズがキャリッジの横行軌跡に沿う開口２４４及び開口２３０に指向するよう行う。したがって、開口２３０はキャリッジに取付けた読取りヘッドの移動を介してｙ軸に沿う細長領域の画像化に適応する。
【００５４】
ｙ並進ステージ２００と読取りヘッド１０００との間の構造的及び機能的関係を図５に示す。例えば、米国特許出願第２０１３／０２６０３７２Ａｌ号で述べられる顕微蛍光測定器の代案の配列も、本明細書に記載の検査装置及び検査方法と組み合わせて有用であり得る。
【００５５】
顕微蛍光測定器又は数個の顕微蛍光測定器を有する読取りヘッドは、本明細書で説明する幾つかの実施態様として例示するように、フローセル又は検査装置の上方（重力に対して）に配置することができる。しかしながら、顕微蛍光測定器又は読取りヘッドをフローセル又は検査装置の下方に配置することもできる。したがって、フローセル又は検査装置は、頂面サイド、底面サイド、又はその双方サイドを使用する励起放射及び発光放射の波長に対して透過性にすることができる。実際、幾つかの実施態様において、顕微蛍光測定器をフローセル又は検査装置の両面サイドに配置する、又は代わりに読取りヘッドをフローセル又は検査装置の両面サイドに配置するのが望ましいことがある。例えば、フローセルと顕微蛍光測定器（又は読取りヘッド）との間の側−側（サイド・トゥ・サイド）の向きを含めて、重力に対する他の向きも可能である。
【００５６】
顕微蛍光測定器又は読取りヘッドは、フローセル（又は検査装置）の片側サイドからフローセル（又は検査装置）の互いに対向する２つの内側表面を検出するよう構成することができる。例えば、顕微蛍光測定器又は読取りヘッドは、フローセル又は検査装置の表面を交互に検出するよう挿入及び取外しをする光学的補償器を使用することができる。光学的補償器を使用してチャネルの互いに対向する内側表面を検出する例示的方法及び装置は、米国特許第８，０３９，８１７号（参照により全体が本明細書に組入れられるものとする）に記載されている。補償器は随意的であり、例えば、ＮＡ及び／又は装置の光学的解像度に基づくものである。
【００５７】
本明細書に記載の装置又は方法に使用される顕微蛍光測定器は、自動合焦（オートフォーカス）モジュールを含むことができる。したがって、読取りヘッドに設ける多重顕微蛍光測定器は、各個に専用自動合焦モジュールを有することができる。顕微蛍光測定器に使用される自動合焦モジュールは、検出器及びアクチュエータを含むことができ、アクチュエータは、顕微蛍光測定器の共通平面に対する焦点を変化させるよう構成し、検出器は、アクチュエータの移動を管理するよう構成する。このように、自動合焦モジュールは、アクチュエータの移動を管理する専用検出器を含むことができる。専用検出器は、自動合焦を達成するため顕微蛍光測定器の外部又は検出ヘッドの外部とデータ通信をする必要なく、アクチュエータに対して閉ループで動作することができる。代替的に又は付加的に、広視野画像化に使用される画像化検出器のような、自動合焦モジュール外部の検出器がアクチュエータの移動を管理することができる。したがって、顕微蛍光測定器又は読取りヘッドの外部の処理ユニットに広視野の画像化を行うために、及び画像データを出力するために使用される同一検出器を使用して、自動合焦を達成することもできる。
【００５８】
特定の実施態様において、読取りヘッドにおける２個又はそれ以上の顕微蛍光測定器の自動合焦モジュールは、互いに通信し合うよう構成することができる。例えば、読取りヘッドの第１顕微蛍光測定器の自動合焦モジュールは、装置の第２顕微蛍光測定器の自動合焦モジュールからのデータを統合するよう構成することができる。このようにして、第１顕微蛍光測定器の自動合焦モジュールは、第１顕微蛍光測定器の把握した焦点位置及び第２顕微蛍光測定器の把握した焦点位置に基づいて、第１顕微蛍光測定器の焦点を変化させることができる。このように、自動合焦モジュールの検出器は、ほぼ読取りヘッドにわたる合焦を行うよう専用化して構成するとともに、解析用画像取得用には構成しないようにすることができる。２つの異なる自動合焦モジュールからの情報は、読取りヘッドの先端チルト（傾動）を決定するのに有用である。望ましくない先端チルトは、先端チルト情報に基づいて１個又は複数個の顕微蛍光測定器の補償的動作により補正することができる。
【００５９】
読取りヘッドは、２個又はそれ以上の顕微蛍光測定器を、例えば、キャリッジに取付けて設けることができる。多重チャネルフローセル（又は検査装置）を使用する実施態様に関して、読取りヘッドは、フローセル（又は検査装置）のチャネル数に対応する数の顕微蛍光測定器を含むことができる。チャネル１つあたり１個より多い数の顕微蛍光測定器を設けることができる。特定の実施態様において、読取りヘッドは、単一の顕微蛍光測定器チャネルを設けることができる。図６Ａに示す例示的構成において、フローセルは４個のチャネルを有し、読取りヘッドは４個の顕微蛍光測定器を有する。この図面は、フローセル、及び顕微蛍光測定器の対物レンズの頂面図を示す。説明を分かり易くするため、顕微蛍光測定器の対物レンズ以外の他のコンポーネントは図示しないが、それら他のコンポーネントは、例えば、本明細書におけるいずれかの箇所で例示するように、コンパクトな設計となるよう配置することができる。図６Ａに示すように、４個の対物レンズは、対物レンズを密に詰め、また仮想ラインが各対物レンズの中心ポイントを通過する線形的関係となるよう配列することができる。仮想ラインはｙ次元に対して角度をなすようオフセットすることができ、ｙ次元はフローセルの最も長い次元（又はスキャン方向）に対応する。この角度は、ｘ‐ｙクアドラント（quadrant）で０゜〜９０゜の範囲内の値とすることができ、フローセルにおけるチャネルの間隔（及び読取りヘッドにおける対物レンズの間隔）に適合するよう選択することができる。図６Ａは、比較的密に詰めたチャネルに適合する、密に詰めた対物レンズを通過するラインのオフセット角度が比較的小さいものを示す。より大きいオフセット角度を使用して、互いにより大きい距離で離れるチャネル又はそれほど密には詰めない対物レンズに適合させることができる。
【００６０】
図６Ｂは、２ライン多重対物レンズを配列した状況を示す。この場合、フローセルは８個のチャネルを有し、読取りヘッドは８個の顕微蛍光測定器を有する。２ラインにする対物レンズの全体的詰め合わせはほぼ直線的である。この配列は、密に詰めた対物レンズ及び密に詰めた２セットのチャネル（すなわち、４個の密に詰めたチャネルの第１セット及び４個の密に詰めたチャネルの第２セット）に適合する。この実施例において、密に詰めた２セットのチャネルは、４個の各セットにおける個別チャネルを隔てる間隔よりも大きい間隔で離れる。２ラインにする対物レンズ詰め全体は、異なるチャネル配列に適合する直線からオフセットすることができることが理解されるであろう。さらに、単一対物レンズラインにつき上述したように、双方の対物レンズ中心ラインを通過する仮想ラインのオフセット角度は変化し得る及び／又は対物レンズ間距離は、異なるチャネル配列に適合するよう変化し得る。
【００６１】
上の実施例によって実証されるように、読取りヘッドにおける各対物レンズは、個々のチャネル（フローセル又は検査装置）の少なくとも一部を画像化するよう配置することができる。各対物レンズは数個のチャネルを有するフローセル又は検査装置のうちただ１つのチャネルのみ画像化するよう配置することができる。個々の対物レンズは、例えば、特別なｙステージ位置にあるとき、ただ１つのチャネルのみの一部を画像化するよう配置することができる。ｙ次元におけるスキャンにより、対物レンズを通してチャネルのすべて又は一部を画像化することができる。幾つかのケースにおいて、例えば、対物レンズ（又は顕微蛍光測定器の他の制限光学的コンポーネント）の視野直径がチャネルの幅より小さいとき、対物レンズはｘ次元にもスキャンして、チャネルのすべて又は一部を画像化することができる。多重対物レンズ及びそれに対応する顕微蛍光測定器は、幾つかの対物レンズがそれぞれ単に１つのチャネルの少なくとも一部の画像を取得するよう配置されるよう、配置することができる。当然のことながら、多重対物レンズ及びそれらのそれぞれの顕微蛍光測定器を含む読取りヘッドの移動は、ｙ及び／又はｘ方向に生じて、それぞれに対応するチャネルのすべて又は一部を画像化することができる。これらの特別な構成は、多重チャネルフローセル又は多重チャネル検査装置に有用である。しかしながら、上述の構成及びそれらに内在する原理は、数個の個別フローセル又は検査装置であって、各フローセル又は検査装置が単独チャネルを有する適切な配列にも適用できることが理解されるであろう。さらに、本明細書に記載の方法及び装置に関し、概してこれらの配列はフローセル及び検査装置以外の基板にも適用することができる。
【００６２】
先に例示したように、キャリッジは、例えば、スキャン動作で読取りヘッドを移動するよう構成することができる。代替的に又は付加的に、キャリッジは、読取りヘッドの個々の顕微蛍光測定器相互間でｘ及びｙ次元での相対移動を防止するよう構成することができる。キャリッジは、例えば、読取りヘッドが顕微蛍光測定器相互間の横方向相対移動を防止する他の構体素子を含む場合には、この機能をもつ必要はない。例えば、読取りヘッドは、共成形アセンブリ（例えば、モノリシックアセンブリ）から形成することができる。共成形アセンブリは、次にキャリッジに固定することができる。それにもかかわらず、幾つかの実施態様において、キャリッジは、読取りヘッドの個別顕微蛍光測定器相互間の横方向相対移動を防止する少なくとも補助的な役割を果たすことができる。さらに、共成形アセンブリから形成した読取りヘッドを、キャリッジを用いない実施態様にも使用できることが理解されるであろう。
【００６３】
本明細書に記載の方法又は装置に使用するｙステージは、非連続動作又は連続動作でスキャンするよう構成することができる。非連続スキャンは、しばしばステップ・アンド・シュートスキャンと称され、概して顕微蛍光測定器又はスキャンヘッドのｙ（又はｘ）方向への漸進移動及び移動相互間での検出（例えば、画像取得）を含むとともに、顕微蛍光測定器又はスキャンヘッドは一時的に静止状態をとる。他方、連続スキャンは、概して微蛍光測定器又はスキャンヘッドが移動している間に検出又は画像取得を行う。特定の実施態様において、連続スキャンは時間遅延積分（ＴＤＩ：ｔｉｍｅ  ｄｅｌａｙ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）モードで実施することができる。したがって、スキャン次元に沿ってピクセル要素が取得する信号を共通ビンに集積し、また単一値として読出しをする。ＴＤＩモードは、信号処理レートが増大し、また精度が向上するという利点が得られる。顕微蛍光測定器又は読取りヘッドに設けてＴＤＩモード検出に適合するようにできる例示的光学的構成は、例えば、米国特許第７，３２９，８６０号（参照により本明細書に組入れられるものとする）に記載されている。
【００６４】
読出し用プリント回路板（ＰＣＢ）は、読取りヘッドに設け（例えば、図２におけるＰＣＢ１７０１及び１７０２を参照されたい）、代表的には検出装置ハウジング内に収納する主ＰＣＢに接続する。代替的実施態様において、主ＰＣＢは機器の外部に配置することができる。データは、米国特許出願第２０１３／０２６０３７２Ａｌ号で述べられるように、読出しＰＣＢ及び／又は主ＰＣＢとの間で通信することができる。特定の実施態様において、主ＰＣＢは、外部一次解析パーソナルコンピュータ（ＰＣ）にも接続することができる。幾つかの実施態様において、一次解析コンピュータは、検出装置のハウジング内に配置することができる。しかしながら、機器外に一次解析コンピュータを配置すると、異なる用途向けの様々なコンピュータを互換的に使用することができ、検出装置の動作を中断する必要なく一次解析コンピュータの交換による都合のよい保守が行え、また検出装置の占有面積を小さくすることができる。様々なコンピュータのうち任意なものを使用することができ、例えば、デスクトップコンピュータ、ラップトップコンピュータ、又はアクセス可能なメモリと動作的に通信するプロセッサ及びコンピュータが本明細書に記載の方法を実施する実装命令を含むサーバーとすることができる。主ＰＣＢは、ユーザインタフェースにも接続することができる。
【００６５】
本考案の検査装置を用いて評価することができる他の画像化モジュールとしては、限定的ではないが、ＨｉＳｅｑ（登録商標）プラットフォーム、ＭｉＳｅｑ（登録商標）プラットフォーム、ＨｉＳｃａｎ（登録商標）プラットフォームにおけるもの、又はＰＣＴ特許出願国際公開公報第０７／１２３７４４号；米国特許出願公開第２０１２／０２７０３０５Ａｌ号；同第２０１３／００２３４２２Ａｌ号；及び同第２０１３／０２６０３７２Ａｌ号；及び米国特許第５，５２８，０５０号；同第５，７１９，３９１号；同第８，１５８，９２６号及び同第８，２４１，５７３号（各々の参照により本明細書に組入れられるものとする）に記載されるものが挙げられる。
【００６６】
画像化モジュールのアライメント及び妥当性確認の装置
以下の説明及び関連する図面は、検査装置及び方法の１個又は複数個の実施態様について説明する。幾つかの実施態様において、検査装置は、上で例示された画像化モジュールのアライメント又は妥当性確認に使用することができる。さらに、検査方法は、例示した画像化モジュール又はその光学的コンポーネントの妥当性確認及びアライメントを実施することができる。検査装置、検査方法、及び／又はそれらと共に使用される画像化モジュールには様々な変更を行なえることが理解されるであろう。画像化装置の１個又は複数個の光学特性（限定的ではないが、上述のものを含む）は、本明細書に記載の検査装置又は方法を用いて評価することができる。さらに、検査装置は、解析基板（例えば、フローセル）と組み合わせて使用することができる。幾つかの実施態様において、方法は、検査方法のステップ及び解析方法（例えば、核酸シークエンシング方法）のステップを含むように実施することができる。
【００６７】
例示的な検査装置は、本明細書では「ウーバーターゲット装置」と称される。ウーバーターゲット装置は、シーケンサ画像化モジュール試験用に使用することができる光学アライメントツールである。以下に例示するウーバーターゲット装置の組成、製造、及び使用は、他の検査デバイスにも拡張することができる。
【００６８】
幾つかの実施態様において、ウーバーターゲット装置は、（１）完全一体化核酸シーケンサシステム（ＮｅｘｔＳｅｑ（登録商標）シーケンサシステム（イルミナ社、サンディエゴ）など）で、（２）画像化モジュール（ＩＭ）の取り付け後にシーケンサの製造プロセスの任意の箇所で、（３）シーケンサシステムの取り付け又はサービス用の視野サービスツールとして、（４）ＮｅｘｔＳｅｑ（登録商標）シーケンサの様々なコンポーネントの製造を評価するための品質制御固定具で、又は（５）スタンドアロン型カメラモジュール試験ステーションで使用することができる。
【００６９】
ウーバーターゲット装置は、例えば、シーケンサのアライメント又は妥当性確認に使用する場合、シーケンサの一部である光源、例えば、ＮｅｘｔＳｅｑ（登録商標）シーケンサシステム（イルミナ社、サンディエゴ）のカメラモジュール（「顕微蛍光測定器」とも呼ばれる）の緑及び／又は赤ＬＥＤによって照明することができる。この例では、ＬＥＤ照明により、ウーバーターゲット装置の蛍光色素が励起される。シーケンサの外部の光源、例えば、ウーバーターゲット装置をシーケンサ機器に配置する場合にウーバーターゲット装置に至るまで照らすように位置決めされるバックライトを使用することも可能である。
【００７０】
ウーバーターゲット装置７０の図を図７Ａ及び図７Ｂに示す。図７Ａの頂面図に示すように、ＮｅｘｔＳｅｑ（登録商標）シーケンサに使用されるように設計されているウーバーターゲット装置７０は、シーケンサで使用されるフローセルと同様の寸法（１００ｍｍ×４０ｍｍ）を有する。したがって、ウーバーターゲット装置７０は、位置合わせ及び妥当性確認手順のためにシーケンサのステージ上に容易に位置決めすることができる。ウーバーターゲット装置７０の流体チャネル７３は、フローセル内のチャネルの寸法と同様の全体寸法を有する。この実施例によって実証されるように、検査装置（例えば、ウーバーターゲット装置）は、解析装置の使用中に画像化モジュール（例えば、ＮｅｘｔＳｅｑ（登録商標）シーケンサ）によって光学的に対処される解析装置（例えば、フローセル）のチャネルと同じ相対位置に位置するレーンを有することが有利である。当然のことながら、チャネルサイズ及び形状の小さい違いには対応することができ、必ずしも検査装置の診断能力の大幅な減少をもたらす必要はない。例えば、以下でさらなる詳細を述べるように、流体入口及び出口ポートを有するウーバーターゲットチャネル７５の一部は、入口及び出口ポートを有するフローセルの一部と異なる。しかしながら、入口領域及び出口領域はＮｅｘｔＳｅｑ（登録商標）シーケンサの画像化モジュールによって対処されないため、これらの違いは、フローセルの検出された一部の全体に沿ってＮｅｘｔＳｅｑ（登録商標）シーケンサ光学的コンポーネントの位置合わせ及び妥当性確認に使用されるウーバーターゲット装置の能力に直接影響を及ぼさない。ウーバーターゲット装置は、通し番号、パーツ番号、又はバーコードなどの標示を同定することも含み得る。
【００７１】
図７Ｂのウーバーターゲット装置７０の側面図から明らかなように、頂面ガラス７１の厚さ（７００μｍ＋／−１０μｍ）及び底面ガラス７２の厚さ（８００μｍ＋／−１５μｍ）は、ＮｅｘｔＳｅｑ（登録商標）フローセルのこれらの側面のそれぞれの厚さと同様である。ｚ次元におけるチャネル開口７３の厚さ（１００μｍ＋／−１０μｍ）は、フローセルで見られるものとも同様である。一般に、これを通して光学検査を生ずる検査装置の寸法は、これを通して解析検出を生ずる解析装置の寸法と同様であることが有利である。しかしながら、所望の場合又は必要な場合、これらのコンポーネントの１個又は複数個の寸法は、検査装置と関連する解析装置の間で異なり得る。この場合、理論又は事前パラメータを使用して、検査装置及び解析装置から得た測定値と相関させることができる。ウーバーターゲット装置は、頂面ガラスの底側の金属パッド（例えば、５０ｎｍ厚のクロムパッド）のパターンを有する少なくとも１個のタイルも含み得る。金属パッドは、以下でさらなる詳細を述べる光学解析に使用することができる。
【００７２】
検査装置の内面全体に金属パッドを含むことができる。しかしながら、必ずしも全表面にパッドを含む必要はない。むしろ、画像化される表面上の１個又は複数個のタイル（又は他の部分）には金属パッドが欠けていてもよい。金属パッドをもたないタイルは、視野にわたって一様な光を提供し、例えば、以下に記載のウーバーターゲット装置及びＮｅｘｔＳｅｑ（登録商標）シーケンサに例示した方法を用いて固定パターンノイズ較正又は平坦視野補正を行うことが可能である。そのような補正は、数個の励起源に対して個別に決定することができる。代替的に又は付加的に、検査装置の内面の１個又は複数個の部分に基準を含むことができる。
【００７３】
検査方法は、図８に図示するように検査装置の背面照射を使用することができる。この例では、ウーバーターゲット装置をＮｅｘｔＳｅｑ（登録商標）画像化モジュールのフローセルホルダーに載置し、外部バックライトがウーバーターゲット装置の下側を照射する。ランプからの白光を使用することができる。光は下部ガラスを通過し、チャネル開口を経て上部ガラスの下面に至る。この面で、光は金属パッドにより遮断されるか、あるいは上部ガラスを通過して、解析中の機器のカメラモジュールに至る。金属パッドは、カメラにより検出された光の視野で暗い影のように見える。光学的コンポーネントを金属パッドに合焦させ、合焦精度は、パッドによって生成される影の鮮鋭さから決定することができる。
【００７４】
別の検査方法を図９に示し、ここでは、ＮｅｘｔＳｅｑ（登録商標）画像化モジュールのＬＥＤを外部バックライトの代わりに使用する。この場合、ウーバーターゲット装置のチャネル開口に、ＬＥＤにより励起されて蛍光発光を生成する蛍光色素を充填する。チャネル開口には、２種以上の蛍光色素の混合物を充填することができる。例えば、ウーバーターゲット装置には、赤ＬＥＤにより励起される第１の色素と緑ＬＥＤにより励起される第２の色素とを充填することができる。これにより、ＮｅｘｔＳｅｑ（登録商標）画像化モジュールの赤及び緑チャネルの両方を評価することができる。図９の図に示すように、励起光が頂面ガラスの頂側に当たり、頂面ガラスの下面にまで透過するように、ウーバーターゲットは、落射蛍光検出用に載置することができる。ＬＥＤ光はチャネル開口を通過して蛍光色素を励起させるが、金属パッドに衝突するＬＥＤ光は色素を励起するのを防止している。色素からの発光は上部ガラスを経て戻り、その発光を検出するカメラに至る。繰り返すが、得られた画像は、蛍光発光の視野で金属パッドによって投じられた影のように見える。光学的コンポーネントを金属パッドに合焦させ、合焦は、パッドによって生成される影の鮮鋭さから決定することができる。
【００７５】
特定の実施態様において、ウーバーターゲット装置は、ローダミン５９０色素及びオキサジン７５０色素で充填することができる。ローダミン５９０色素は緑ＬＥＤにより５３２ｎｍで励起され、発光は５５０〜６１０ｎｍのバンドパスフィルタを通して集めることができる。オキサジン７５０色素は赤ＬＥＤにより６６０ｎｍで励起され、発光は６９５〜７３０ｎｍのバンドパスフィルタを通して集めることができる。これらの条件により、感知されないクロストークを持つ赤発光信号と緑発光信号を分離させることが分かった。
【００７６】
色素材料を以下のようにウーバーターゲットチャネルに導入することができる。グリコールは、ウーバーターゲット装置のチャネルを通じて流れて、チャネルをきれいにする。流れたグリコールの容量は２５ｍＬであり、これはチャネル容量の１００倍である。グリコールは、１５０μＬ／分の速度で注入される。次いで、色素溶液をレーンに注入する。色素溶液には、グリコール１ｍＬ当たり１．４６μｇの励起子ローダミン５９０（緑色素）と、グリコール１ｍＬ当たり１３μｇの励起子オキサジン７５０（赤色素）が含まれる。色素混合物１．２５ｍＬの容量を１５０μＬ／分の速度で注入する。次いで、チャネル開口を密閉し、シール材を２４時間硬化させた後、ウーバーターゲット装置はいつでも使用できる状態になる。有用なシール材は、ＤＡＰ（バルチモア、メリーランド州）からの白シリコーン（台所及び浴室）である。
【００７７】
ローダミン５９０及びオキサジン７５０の混合物は、非常に光安定性があることが分かった。画像化モジュールの適性化に使用したウーバーターゲット装置は、赤及び緑色素の蛍光は３％しか降下させないことが、光退色実験により示された。各画像化モジュールの適性化は、（１）平坦視野補正及び固定パターンノイズ用に、オープンレーンの画像３００枚を各色で取得すること、（２）最良合焦ダウンレーンを決定するために基準の画像９０枚を取得すること、（３）ＸＹステージのＸＹ位置試験用に基準の画像１２０枚を取得すること、及び（４）光学アライメント測定用に画質タイルの画像３０枚を取得することからなった。色素はチャネル全体を通じて拡散することができるため、局所的な漂白は起こらない。したがって、複数台のカメラを使用する場合、各々のカメラは、同じ見かけ上の色素強度を見ることが考えられる。したがって、ウーバーターゲット装置の色素溶液は、発光伝達効率と組み合わせた検出視野の各領域でのＬＥＤ相対出力を測定するのに有用なツールを提供する。色素の光安定性が比較的高いことで、ウーバーターゲット装置を用いてＬＥＤ較正を行うこともできる。
【００７８】
ローダミン５９０及びオキサジン７５０の混合物は、非常に熱安定性があることが分かった。６５℃で５日間焼成後、色素の強度のゼロ劣化が観察された。ウーバーターゲット装置が、ＮｅｘｔＳｅｑ（登録商標）シーケンサの通常動作温度条件（フローセルホルダーで６０℃）での画像化モジュール光学アライメント測定を通じて堅牢であることが色素の熱安定性により示された。
【００７９】
ローダミン５９０及びオキサジン７２０は特定の利点をもたらすが、他の蛍光種を使用してもよい。有用な蛍光種の例としては、以下の部分：ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、テトラメチルローダミン、エオシン、緑色蛍光タンパク質、エリトロシン、クマリン、メチルクマリン、ピレン、マラカイトグリーン、スチルベン、ルシファーイエロー、Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｌｕｅ（商標）、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（商標）、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド、フィコエリトリン、蛍光ランタニド複合体を有するもの、例えば、ユーロピウム及びテルビウムを含むもの、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ナノ結晶、並びに、例えば、「蛍光分光学の原理（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）」，Ｊｏｓｅｐｈ  Ｒ．Ｌａｋｏｗｉｃｚ（編者），Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂ  Ｃｏｒｐ，第２版（Ｊｕｌｙ  １９９９）及び「分子プローブハンドブック（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ）」第６版  Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｐ．Ｈｏａｇｌａｎｄに記載される当該技術分野では既知の他のものが挙げられる。ルミナルなどの発光体も有用であり得る。
【００８０】
図１０は、ウーバーターゲット装置の金属層の上（パネルＡ）、金属層（パネルＢ）、及び金属層の下（パネルＣ）で合焦させたＮｅｘｔＳｅｑ（登録商標）画像化モジュールから得た基準画像を示す。画像によって実証されるように、金属領域は暗く見え、金属のない基準領域は白く見える（例えば、画像では「＋」のような形状）。カメラの焦点が合っていないパネルＡ及びＣにおいて金属の縁端部がぼやけているのに対して、パネルＢにおける金属の縁端部は、カメラがパッドに焦点が合っているためにシャープに見える。「＋」形状の対象物は、比較的大きいため、焦点がまったく合っていない場合でも見ることができるという利点を提供する。
【００８１】
図１１は、品質制御固定具１１０２内（パネルＡ）のウーバーターゲット１１０１と、ＮｅｘｔＳｅｑ（登録商標）シーケンサ用に適合されたカートリッジ１１０３内（パネルＢ）のウーバーターゲット１１０１との写真を示す。カートリッジ１１０３は、ＮｅｘｔＳｅｑ（登録商標）フローセルに用いたカートリッジと同じ寸法を有する。カートリッジ１１０３は、ＮｅｘｔＳｅｑ（登録商標）シーケンサのｘｙステージの下側にｚ−参照基準ピンの接触点１１０４ａ、１１０４ｂ、及び１１０４ｃを含む。これは、ｚ、シータｘ、及びシータｙ座標に対する機械的基準を提供する。ウーバーターゲット１１０１は、カートリッジ１１０３中に浮くが、カートリッジ１１０３をＮｅｘｔＳｅｑ（登録商標）シーケンサのヒータープレートに載置すると、３本のダウエルピンが開口１１０５ａ、１１０５ｂ、及び１１０５ｃを通過し、ウーバーターゲット１１０１の縁端部に接触して、ウーバーターゲット１１０１を画像化モジュール上に座らせる。これは、ｘ、ｙ及びシータｚに対する機械的基準を提供する。
【００８２】
本考案は、チャネルドライアウト及び気泡形成の問題を回避する検査装置を提供する。上に例示するように、ウーバーターゲット装置は、気泡を簡単に生じないグリコールを使用する。他の高粘度溶媒もこの利点をもたらすことができる。高粘度に加えて、高沸点を有する溶媒を使用することが有益であり得る。例えば、グリコールは、高粘度に加えて高沸点（１９０℃）を有することで、ウーバーターゲット装置を保存し、運搬し、使用する温度での蒸発を最小限にする。さらに、チャネルの進入及び退出ポートに注入した高対応シリコーンＲＴＶ（室温加硫）を用いて、チャネル密閉を達成することができる。シリコーンはウーバーターゲット装置に対応可能であるため、（１）硬化時に２５０ｎｍ未満のガラス変形をもたらし、（２）グリコール中に（例えば、耐環境性試験で１カ月以上）浸漬した際に劣化を阻止し、（３）グリコールと接触した際にシールを形成するために硬化することができ、（４）色素分子に不活性であり、及び（５）安価で、分散しやすく、かつ密閉品質の視覚指示をもたらすシリコーンは特に有用である。
【００８３】
特定の実施態様において、検査装置は、チャネルドライアウト及び気泡形成を最小限にするか又は防止する構体素子を含むことができる。例えば、ウーバーターゲット装置７０は、図１２Ａの図に示すように犠牲チャネル領域を含む。左側は、ＮｅｘｔＳｅｑ（登録商標）フローセルと同じ占有面積に４個の別個のチャネル１２２ａ〜１２２ｄを有する検査装置１２１である。チャネル１２２ｄを一例とすると、入口１２３は、検出タイル１２４の第１セットに比較的近い。入口１２３で成長が開始される気泡は、たった数ミリメータの直径に成長した後にタイル１２４に侵入する。これに対し、ウーバーターゲット装置７０は、入口ポート８０とチャネル７３の第１の検出レーンの間に進入レーンを形成する拡張犠牲レーン８２を含む。第１の検出レーンは、検査装置１２１のチャネル１２２ｃと相関させる占有面積及び位置を有する比較的広い領域である。示された例では、入口８０で形成される気泡を、ウーバーターゲット装置７０を用いた手順に悪影響を及ぼす前に大容量に拡張する必要があるように、犠牲領域は約１００ｍｍ長である。同様の犠牲領域を、出口８５とチャネル７３の第４の検出レーン（すなわち、装置１２１のチャネル１２２ｂに対応するレーン）の間に退出レーンを形成する。これにより、チャネル７３の反対側からの気泡侵入が防止される。図に示すように、ウーバーターゲット装置７０は、フローセル１２１のチャネル１２２ａ〜１２２ｄの画像化窓と相関させる広い部分が曲がりくねった形で接続される１個のチャネルを含む。単一チャネル構成により、ウーバーターゲット装置７０の充填しやすさ、及びフローセル１２１のチャネル１２２ａ〜１２２ｄと相関させる４個全ての領域にわたる色素溶液の均一さが提供される。
【００８４】
チャネルドライアウト及び気泡形成を最小限にするか又は防止するウーバーターゲット装置７０のさらなる構体素子は、入口ポート８０近くの圧力逃がしポート８１の存在である。圧力逃がしポート８１は、出口ポート８５を密閉する際に、入口ポート８０でのシールへの損傷を防止する（すなわち、損傷は、チャネルの反対側の端部の密閉により生成された閉じた系に密封流体が導入されることにより起こる）。以下の技術を用いることで、ウーバーターゲット装置７０内でのシールへの損傷を防止することができる。チャネル７３を色素溶液で充填した後、取り外し可能なテープ又は他のシールを、出口ポート８５及び出口圧力解放ポート８４の上に載置する。次いで、シール材を入口ポート８０に注入し、入口圧力逃がしポート８１から流出するまで流すことができる。次いで、テープ又は他の取り外し可能なシールを入口ポート８０及び入口圧力逃がしポート８１の上に載置する。入口をこのように密閉すると、シール材を出口ポート８５に注入し、出口圧力逃がしポート８４から流出するまで流すことができる。これにより、圧力逃がしポートは通気をもたらし、ポート８０と８１の間のシールへの損傷を回避することで、望ましくない気泡形成及び後の使用中の乾燥が防止される。
【００８５】
検査装置は、圧力逃がしポートを必ずしも含む必要はない。さらに、チャネルは、密閉流体（例えば、シリコーン）を用いて必ずしも密閉する必要はない。例えば、幾つかの実施態様において、単一進入ポートと単一退出ポートとが存在する。カプトンテープなどのフレキシブルテープを用いてポートを密閉することができる。テープは、ダイヤフラムのように作用する有利な性質を有し、シールを維持するが、内部レーン圧力（例えば、一般には、温度変化による圧力変化）に応じてポートから離れて拡張したり、あるいはポートに収縮することができる。テープは、例えば、気泡が経時的にレーンに形成された場合に、ウーバーターゲット装置を再充填又は手動通気することができる利点も有する。
【００８６】
ウーバーターゲット装置に装填される流体を脱気することで望ましくない気泡形成を回避することもできる。例えば、温度変化は、気泡形成をレーンの途中に引き起こすことがある。これは、溶液から出てきて永久気泡をつくる流体中の溶解ガスによって生じる。真空チャンバ中にグリコール−色素溶液を置き、ウーバーターゲット装置に溶液を注入する直前に溶液から空気を取り出すことで気泡形成が回避されている。
【００８７】
特定の実施態様において、検査装置は、高平坦度を有する。画像化される表面、例えば、チャネルの内面に面するウーバーターゲット装置の頂面ガラス及び底面ガラスの表面が高平坦度を有することは特に有利である。検出領域の長さにわたって平坦度の変動が１２μｍ未満であるウーバーターゲット装置は特に有用である。＋／−３μｍの変動を有するウーバーターゲット装置は、特に有用であることが分かっている。
【００８８】
図１２Ｂは、ＮｅｘｔＳｅｑ（登録商標）画像化モジュールの６台のカメラの画像領域とともに、ウーバーターゲット装置上のプリントパターンの位置を示す。同じパターンが、各々の６台のカメラの各々に印刷される。各画像領域の様々な領域を図に示す。例えば、実線と破線で交互に陰影付けられた領域は、任意の金属被膜（例えば、クロム無）を有せず透明であり；開放領域（陰影無）も、任意の金属被膜を有せず透明であり；マスクＦとして示された領域は、画質タイルであり；マスクＡとして示された領域は、金属パターン（例えば、クロム）を含む。図１２Ｃは、マスクＦ及びマスクＡに関するさらなる詳細を提供する。一般に、マスクＡ及びマスクＦは、以下のように任意の透明な特徴をもつクロム層（上部ガラスの内面）を有する。画質タイルとも呼ばれるマスクＦは、クロム層内に１５μｍの間隔を置いた１．０μｍスポットのグリッドを有する。マスクＡは、５つの視野点でＭＴＦターゲットを含むパターン１と；１５ミクロン間隔で５ミクロンの穴を有し、かつその中央に５００ミクロン角状開口を重ねたクロム層を有する自動合焦タイルであるパターン２と；全てがクロム層であるパターン３と；透明な「＋」形状の基準を有するクロム層であるパターン４と；１５ミクロン間隔で０．５ミクロンの穴を有するクロム層であるパターン５とを含む。
【００８９】
画像化装置は、様々な検査方法を実行するためのソフトウェアを含むことができる。試験は、グラフィカルユーザインタフェース（ＧＵＩ）との相互作用を介して個人によって命令することができる。ＧＵＩには、例えば、ユーザが幾つか又は全ての試験を選択することができる試験メニューが含まれ得る。例示的なＧＵＩを図１３に示す。ＧＵＩでは、ユーザは、チェックボックスアイコンをクリックして、４つのステージ試験（「カメラＸＹ位置」、「ＸＹ再現性」、「Ｚ走行制限」、及び「Ｚ−ステージステップ及び固定」）を選択している。ユーザは、「Ｚオフセットダウンレーン」試験の実行は選択していない。「実行」ボタンをクリックすることで、ユーザは、４つの試験を開始することができる。試験は、画像化装置によって実行することができ、結果は、例えば、ＸＭＬファイル形式でユーザに戻すことができる。試験報告の結果は、さらなる評価及び解析用に表計算シートにエクスポートすることができる。
【００９０】
検出能力が一体化されているかどうかにかかわらず、本明細書に記載の検査方法を実行することが可能なシステムは、本明細書に記載の方法、技術、又はプロセスの１個又は複数個のステップを行うための一組の命令を実行することが可能なシステムコントローラを含むことができる。例えば、命令により、ステップの性能を光学画像化装置のアライメント及び妥当性確認に向けることができる。有用なシステムコントローラには、マイクロコントローラ、縮小命令セット・コンピュータ（ＲＩＳＣ）、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）、フィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）、論理回路、及び本書で述べた機能を実行することの可能な任意の他の回路又はプロセッサを使用するシステムを含む、任意のプロセッサをベースとした又はマイクロプロセッサをベースとしたシステムを含むことができる。システムコントローラへの一組の命令は、ソフトウエアプログラムの形態であってよい。本明細書で用いられる用語「ソフトウエア」及び「ファームウエア」には、ＲＡＭメモリ、ＲＯＭメモリ、ＥＰＲＯＭメモリ、ＥＥＰＲＯＭメモリ、及び不揮発性ＲＡＭ（ＮＶＲＡＭ）メモリを含む、コンピュータによって実行するためにメモリに記憶されている任意のコンピュータプログラムを含むことができる。ソフトウエアは、システムソフトウエア又はアプリケーションソフトウエアのような様々な形態であってもよい。さらに、ソフトウエアは、一群の別々のプログラム、より大きなプログラム内のプログラムモジュール、又はプログラムモジュールの一部の形態であってもよい。ソフトウエアは、オブジェクト指向プログラミングの形態でモジュラープログラミングも含むことができる。ＮｅｘｔＳｅｑ（登録商標）シーケンサを動作させるための、イルミナ社（サンディエゴ）から市販されているソフトウェアは特に有用である。
【００９１】
ＮｅｘｔＳｅｑ（登録商標）シーケンサ上で、かつ、ウーバーターゲット装置を用いて実行できる例示的な自動化プロセスフローを図１４に示す。ユーザがＧＵＩ上で実行ボタンを押すと、プロセスがソフトウェアで開始される。画像化モジュールは、基準のｘｙ位置を見つけ、ｘｙ位置のオフセットをファームウェアに送る。このステップは、画像輝度又は合焦に敏感ではない。ｘｙオフセット情報により、コンピュータは、ウーバーターゲット装置の全ての特徴に対するｘｙ位置を決定することができる。次いで、検出領域をウーバーターゲット装置の開放領域（すなわち、金属パッドが存在しない領域）に動かし、適正な照明のためにＬＥＤ電流を較正する。このステップはｚ位置に敏感ではない。次のステップで、開放領域の画像を得て、画像均一性、固定パターンノイズ、及び平坦視野補正を決定する。これらの決定は、ｚ位置に敏感ではない。次いで、プロセスは画質タイルに移動し、画質試験を実行する。このステップで、コーススルーフォーカススタックを用いて最良ｚ位置を見つける。次いで、画像化窓を自動合焦タイルに動かし、自動合焦試験を実行する。その後、金属パッドを有するウーバーターゲット装置の領域の画像を撮像し、フィルタブレークスルー試験を実行する。次いで、ｘｙステージ試験を実行する。試験を実行した後、結果をＸＭＬファイルに出力する。
【００９２】
画像モジュールの様々な特性のいずれも、本考案の検査装置を用いて評価することができる。ウーバーターゲット装置でＮｅｘｔＳｅｑ（登録商標）シーケンサを試験することに関連する幾つかの例について以下に記載する。異なる検査装置を用いて、他の解析システムで同様の試験を実施することができることが理解されるであろう。さらに、以下に例示する原理を別の解析システム及び検査装置に適用する場合、当業者には明らかに分かるように、各試験の詳細は、全ての用途に必ずしも必要ではない。
【００９３】
幾つかの実施態様において、光学アライメントを決定することができる。評価することができる光学アライメントの例示的な態様としては、Ｄ５０／ＦＷＨＭによって判定される画質、使用可能被写界深度、使用可能視野、チルト、像面湾曲、均一性、色収差（すなわち、軸色）、光学的ひずみ、相対カメラ位置、及び最良合焦ｚ位置が挙げられる。Ｄ５０／ＦＷＨＭは、特徴（例えば、ウーバーターゲット装置の画質タイルの１．０ミクロン穴）を画像化し、画像内の各特徴の直径を何個のピクセルが占めているかを測定することで得られる。例えば、１ミクロン穴は、比較的高品質カメラで画像化される場合、画像内の直径（ＦＷＨＭ）で１．７０ピクセルに見えるであろう。カメラ画質が低い場合、より多い数のピクセル（例えば、２．００又はそれ以上のピクセル）が、画像内の１ミクロン穴の直径に見えるであろう。評価することができる光学アライメントの別の態様は、移動可能ステージ（例えば、ＮｅｘｔＳｅｑ（登録商標）シーケンサのＹステージ）におけるエンコーダ誤差である。
【００９４】
幾つかの実施態様において、較正を評価して、例えば、固定パターンノイズ、平坦視野補正、又はチャネルセンタリングを決定することができる。幾つかの実施態様において、自動合焦は、例えば、レーザースポットｚ位置、自動合焦ゲイン、レーザースポットｘｙ位置、レーザースポットｘｙ分離（分離された励起スポットを有する２本のレーザーを使用する場合）、レーザースポット輝度、レーザースポット同一性、及び自動合焦誤差を決定することによって評価することができる。評価することができる他の検証ステップには、例えば、画像バックグラウンド、有効視野、倍率、歪曲、ｚオフセットダウンチャネル、ｘｙスキュー、画像強度安定性、欠損カメラピクセルの同定、ＭＴＦ減衰時間、ｘｙ移動の再現性、及びｘｙ移動の精度が含まれる。
【００９５】
本考案の検査方法は、ビット誤差率を決定するルーチンを含むことができる。試験は、公知のデジタルパターンを、ＮｅｘｔＳｅｑ（登録商標）画像化モジュールの全電子データ経路を介してセンサからメインボードＲＡＭに送り、ＲＡＭからリードバックされたパターンが正しいことを確認する。
【００９６】
基準発見は、例えば、以下のように実行することもできる。スルーフォーカス試験は、ソフトウェアがレーン１／３、スワス２、タイル１で基準を見ようとするｘｙ位置上で２５ミクロンステップで行われる。コース最良合焦Ｚは、画像から得られる。次いで、基準のｘｙ位置を決定し、使用して、試験されるウーバーターゲット上の適切なＸＹ座標に各タイルを重ね合わせるようにウーバーターゲットタイルマップをオフセットする。
【００９７】
本考案の検査方法は、適切な画像強度の励起源電流を設定するためのルーチンを含むことができる。ルーチンには、チャネルの開放領域（すなわち、金属パッドがない）を検出するようにウーバーターゲット装置をＮｅｘｔＳｅｑ（登録商標）画像化モジュール内に配置すること、カメラ露光を１ｍｓに、ＬＥＤ電流を３０％に設定すること、１ｍｓ露光及びＬＥＤを消した状態で暗画像を取り込むこと、１ｍｓ露光で赤及び緑光学チャネルの画像を取り込むこと、画像の平均強度を算出すること、１ｍｓ露光で所望強度の２５００カウントにヒットするようにＬＥＤ電流を調整することとの逐次ステップを含むことができる。ＬＥＤ電流は、試験の残り部分に対してこれらの値に保たれる。全ての後続試験は、金属パッドパターンの幾何学形状に基づいて異なる露光時間を使用することができる。例えば、基準タイル及び均一性タイル（金属パッドを有しない）は、１ｍｓ露光で検出することができ、自動合焦タイルは、４ｍｓ露光で検出することができ、画質タイルは、１５０ｍｓ露光で検出することができ、（上部ガラスの内面上に金属で完全被膜）フィルタブレークスルータイルは、５００ｍｓ露光で検出することができる。
【００９８】
本考案の検査方法は、励起源較正のルーチンを含むことができる。ルーチンは、以下のように実施することができる。ＮｅｘｔＳｅｑ（登録商標）シーケンサのｘｙステージを、ウーバーターゲットのレーン１／３、スワス３、タイル１０で自動合焦タイルに移動させる。スルーフォーカススタックを赤色で生成し、最良合焦Ｚ高さを算出する（ステップサイズは６ミクロン、露光時間は４ｍｓ、スイープ範囲は１０８ミクロンである）。次いで、ｘｙステージを、レーン１／３、スワス３、タイル９で隣接タイルに移動させ、全てのレーザー画像を集める。これは、自動合焦タイルの５００ミクロン角状開口内部から全てのクロムが除去されていないウーバーターゲット装置の製造欠陥リスクを軽減するために行われる。この欠陥は、自動合焦タイルでのレーザースポット強度を明るくしすぎてしまう。次いで、プロセスは、（合焦モデル生成用の標準設定を用いて）レーザースルーフォーカス画像を集め、レーザースポット強度を確認する。これらの測定中のステップサイズは、＋／−１８ミクロンのＺ範囲で２ミクロンである。次いで、ＡＦスポットが（赤色最良合焦の＋／−１８ミクロン内で）「最も明るいスポット」に対して２０００＋／−２００カウントになるまでレーザー露光時間を調整する。「較正をセーブ」をユーザインタフェース上で選択した場合、シークエンシングに使用するレーザー露光時間を保存する。
【００９９】
検査方法に含むことができるさらなるルーチンは、検出器較正試験である。試験は、以下のように実施することができる。ウーバーターゲット装置の画像は、４つの異なるＬＥＤ強度：（１）暗強度（ＬＥＤオフ）、（２）中低強度、（３）中高強度、及び（４）輝度強度（約３０００カウント）でＮｅｘｔＳｅｑ（登録商標）シーケンサ上で得られる。これらの画像を撮像する場合、ｘｙステージを各画像間で移動する。レーン２／４の全てのタイル、全てのスワス、及びタイル４−１１を使用して、（ウーバーターゲットの頂面上のデブリ又は指紋による）任意の不均一な蛍光を平均化する。これがＧＵＩで選択された場合、カメラ補正をセーブする。カメラ補正は、選択された任意の後続試験に必ずしも適用する必要はない。
【０１００】
本考案の検査方法は、画像均一性補正及び平坦視野補正用のルーチンを含むことができる。金属パッドを有さないウーバーターゲットタイルの、ＮｅｘｔＳｅｑ（登録商標）シーケンサで撮像した画像は、視野にわたる光学部品の相対強度を示す。例えば、緑ＬＥＤの照明における微細構造は水平帯域として、赤ＬＥＤの照明における微細構造は外側に明るい輪として観察することができる。そのような画像を使用して、ＬＥＤ位置決めに基づいた均一性を決定すること、検出デバイスの固定パターンノイズを決定すること、及び、例えば、視野にわたる画像の強度が等しくなるように色ごとの全てのピクセルのゲイン及びオフセットを較正することによって、平坦視野補正を決定することができる。
【０１０１】
検査装置は、検出されるべき領域に１個又は複数個の基準を含むことができる。例えば、図１５のウーバーターゲット装置７０は、「＋」形状のように見える数個の基準を有する。基準１５０ａは、第１のタイル１５２の第２のスワス１５１にある位置に配置される。基準１５０ｂも、第２のスワス１５１に配置されるが、第１０のタイル１５３には配置されない。各カメラが、チャネルの各レーンのタイル１及び１０の第２のスワス（すなわち、レーンが、ＮｅｘｔＳｅｑ（登録商標）フローセルのチャネルの検出可能領域に対応する場所）で基準を観察するように、基準は、ＮｅｘｔＳｅｑ（登録商標）画像化モジュール読取りヘッド内の顕微蛍光測定器に対して配置される。基準位置公差は、ウーバーターゲット装置の基準縁端部に対して＋／−２０μｍである。
【０１０２】
検査装置の基準タイルを使用して、様々な評価、例えば、ｘ及びｙ次元の相対カメラ位置、ｘ及びｙのスキュー、及び正のｘ方向、負のｘ方向、正のｙ方向、及び負のｙ方向における再位置合わせの再現性を決定することができる。
【０１０３】
ＮｅｘｔＳｅｑ（登録商標）画像化モジュールは、ウーバーターゲット装置の基準を見つけるための高精度及び再現性を示す。基準は、必要なｘｙステージ動作を変化させることなく１０倍に配置された。画像化モジュールは、高コントラストのシャープな画像を生成する。バックグラウンド（すなわち、金属領域によって生成された陰影）は平均１９０カウントを生成するが、基準の開放「＋」形状部分は３０００カウントを生成する。
【０１０４】
検査方法は、画質試験を含むことができる。試験は、以下のように実施することができる。ＮｅｘｔＳｅｑ（登録商標）シーケンサのステージをウーバーターゲット装置の画質タイル（レーン１／３、スワス２、タイル４）に移動させる。赤色励起を用いてコースフォーカスを行い、数ミクロン以内で最良合焦を見つける（ステップサイズを６ミクロンに設定し、露光時間を１５０ｍｓに設定し、ＬＥＤ電流をＬＥＤ較正中に算出した値に設定する）。ファインスルーフォーカススタックを赤色及び緑色で集める（ステップサイズを１ミクロンに設定し、露光時間を１５０ｍｓに設定し、ＬＥＤ電流をＬＥＤ較正中に算出した値に設定する）。画像処理化をファインスルーフォーカス画像に行い、赤チャネルのＦＷＨＭ最良合焦平均、緑チャネルのＦＷＨＭ最良合焦平均、色収差、及び緑チャネルの最良合焦ｚ頂点を決定することができる。
【０１０５】
レーザーｚバイアス試験も、例えば、以下のように行うことができる。ＮｅｘｔＳｅｑ（登録商標）シーケンサのｘｙステージを、ウーバーターゲット装置のレーン１／３、スワス３、タイル１０で自動合焦タイルに移動させる。コーススルーフォーカスを赤チャネルで行い、赤色のおおよその最良合焦点を決定する。ファインスルーフォーカスを赤チャネルで行い、赤色の最良合焦Ｚ高さを決定する（ステップサイズは２ミクロン、露光時間は４ｍｓ、ＬＥＤ電流はＬＥＤ較正中に算出した値に設定する）。露光時間をレーザー較正中に決定した値に設定した状態で、レーザースルーフォーカスを５ミクロンのステップサイズで行う。レーザー画像を解析し、頂面からのレーザースポットが最良合焦であるｚ座標を決定する。望ましくない結果が得られると、レーザースルーフォーカススタックを、ウーバーターゲットのレーン１／３、スワス３、タイル９で隣接するタイルで繰り返す。
【０１０６】
本考案の検査方法は、カメラからカメラのＸＹオフセットを試験するためのルーチンを含むことができる。ＮｅｘｔＳｅｑ（登録商標）画像化モジュールは、モノリシック読取りヘッドに６台の顕微蛍光測定器を含み、各顕微蛍光測定器は、専用のカメラを有する。このルーチンの結果により、サンプルステージでのカメラ検出ゾーンの相対ｘｙ位置が示されるであろう。ルーチンは、以下のように実施することができる。全てのカメラがウーバーターゲット装置の第１のレーン、第１のタイル基準を見るように、ｘｙステージは位置決めされる。基準画像は全てのカメラが捕捉する。各カメラの基準ｘｙ位置を算出する。カメラ２は基準として使用し、カメラ２に対する他の全てのカメラのｘｙオフセットを算出する。このルーチンの再現性は、ｘ及びｙ次元に１μｍ未満の変動をもたらすことが分かった。
【０１０７】
検査方法に含むことができるさらなるルーチンは、ｘｙステージ位置再現性及びヒステリシスの決定である。ｘｙステージが異なる方向からある位置に接近する際にどのくらい繰り返して正確に位置決めすることができるかが、試験結果から示されるであろう。これは、ステージの移動中にどのくらいのヒステリシス（勾配）があるかを示す。ルーチンは、図１６Ａを参照しながら以下のように実施することができる。試験は、カメラ２、レーン１を用いて行い、図１６Ａの「＋」符号で示される基準を有するスワス２、タイル１０で開始される。ｘｙステージをターゲットタイル１０からタイル１枚分動かした後、ターゲットタイルに戻し、基準のｘｙ位置を記録する。この試験を３０回繰り返し、ターゲットタイルに図１６Ａの矢印に示すように４方向全てから接近させる。各ステージ位置のｘｙ位置再現性は、移動後の基準位置の標準偏差である。ヒステリシスは、正の方向及び負の方向から接近した際の基準平均位置の差異である。図１６Ｂは、ｙ次元に沿ったｘｙステージの正及び負の方向の移動による画像の基準位置変化から同定されるｙ次元のヒステリシスを示す。このルーチンの再現性は、ｘ及びｙ次元に１μｍ未満の変動をもたらすことが分かった。
【０１０８】
レーン沿い及びレーン間のｚウェッジに対するｘｙステージ試験も行うことができる。試験結果は、レーンの長さに沿って移行する最良合焦ｚ位置の変化、及びレーン１からレーン２（すなわち、フローセルの第１のチャネルに対応するウーバーターゲット装置の領域からフローセルの第２のチャネルに対応する領域）への移行による最良合焦ｚ位置の変化を示す。試験手順はカメラ２を使用する。スルーフォーカスを基準上で行い、最良合焦ｚを以下のタイル：レーン１、スワス２、タイル１及び１０、並びにレーン２、スワス２、タイル１で算出する。レーンに沿ったｚウェッジは、タイル１とタイル１０の間の最良合焦ｚの変化である。レーンからレーンのｚウェッジは、レーン１とレーン２の間の最良合焦ｚの変化である。ＮｅｘｔＳｅｑ（登録商標）画像化モジュール上のウーバーターゲット装置を用いた測定再現性は、各位置での最良合焦ｚ位置に対して１６ｎｍ（１σ）であることが分かった。
【０１０９】
自動合焦誤差の試験を行ってもよい。例えば、試験は、ＮｅｘｔＳｅｑ（登録商標）シーケンサのｘｙステージをウーバーターゲット装置のレーン１／３、スワス３、タイル１での自動合焦タイルに移動することによって行うことができる。コーススルーフォーカスを赤チャネルで行い、おおよその最良ｚを決定する。デフォルト設定（ステップサイズが２ミクロン、ｚ範囲が＋／−１８ミクロン）を用いて合焦モデルを生成する。ｚ次元の２００回の無作為運動を最良合焦から＋／−２０ミクロンの範囲で行う。各移動後、レーザー画像を捕捉し、最良合焦からの距離を合焦モデルを用いて算出する。算出した移動距離を、行った公知の無作為運動と比較する。ｚステージを、算出した距離だけ最良合焦から移動させる。別のレーザー画像を取得し、最良合焦からの距離を合焦モデルを用いて算出する。最良合焦からの算出距離を実際の最良合焦位置と比較する。
【０１１０】
合焦モデル再現性は、例えば、以下のようにルーチンで試験することができる。ＮｅｘｔＳｅｑ（登録商標）シーケンサのｘｙステージをウーバーターゲット装置のレーン１／３、スワス３、タイル１での自動合焦タイルに移動させる。コーススルーフォーカスを赤チャネルで行い、おおよその最良ｚを決定する。デフォルト設定（ステップサイズが２ミクロン、ｚ範囲が＋／−１８ミクロン）を用いて合焦モデルを生成する。ｘｙステージを両方の寸法の移動極限まで移動させ、レーン１／３、スワス３、タイル１での自動合焦タイルに戻す。これは、解析手順（例えば、核酸シークエンシング）中に生じ得るのと同じ光学部品の振動を刺激することが意図される。合焦モデルを生成し、ｘｙステージを移動極限に移動させるステップを２０回繰り返す。最良合焦でのｙスポット位置と合焦モデルゲインを、生成された合焦モデルの各々と比較する。
【０１１１】
図１７は、ウーバーターゲット装置の自動合焦タイルの画像を示す。タイルは、１５ミクロン間隔で５ミクロン穴を有するクロム被膜領域を含む。得られたパターンを使用して、最良合焦を決定することができる。画像の中央には、クロムパターンの比較的大きな開口が示される。開口により、ＮｅｘｔＳｅｑ（登録商標）画像化モジュールの各顕微蛍光測定器の自動合焦レーザーを通過させ、レーン頂面反射及びレーン底面反射を生成する。得られた画像の形状及びシャープネスを使用して、合焦を決定する。
【０１１２】
画質タイルの写真を図１８に示す。比較的大きな視野を、右側の高倍率画像とともに左側の画像に示す。１ミクロン穴が１５ミクロンで離隔されたクロム被膜を有するタイルから画像を生成する。特定の実施態様において、穴サイズ変動の公差は、＋／−５０ｎｍであり、較正測定において所望レベルの精度を可能にする。対象物の得られた正方グリッドは、画像化システムの樽型歪みを明らかにするのに有用である。穴は画像にスポットを生成し、画像化システム上に約３３００カウントを生成するが、バックグラウンド（格子間）領域は４００カウントを生成する。
【０１１３】
単一対象物の検出及び解析は、ウーバーターゲット画質スルーフォーカス試験を用いて成功した。ウーバーターゲット画質タイルにおける対象物間隔及び対象物サイズの一貫性によって、画像をより細かく詳細に解析することができる。画像を１８×２４グリッドで解析した。これにより、サブタイル１枚当たり約３０個の対象物を検出がもたらされる。
【０１１４】
ウーバーターゲット装置上のクロム層の光学密度を、フィルタブレークスルータイル上に合焦させたＮｅｘｔＳｅｑ（登録商標）画像化モジュールの緑レーザーを用いて測定した。クロムのないタイルを介して測定した出力は４．１０ｍＷであった。フィルタブレークスルータイル（全てクロム）を介して測定した出力は０．０２０ｍＷではるかに低かった。この試験から、５００中の１部の放射密度（すなわち、２．３の光学密度）がクロムを通過したことが確認された。
【０１１５】
本考案の検査方法は、自己蛍光及びフィルタブレークスルーを決定するためのルーチンを含むことができる。試験を使用して、どのくらいの（例えば、ＮｅｘｔＳｅｑ（登録商標）画像化モジュールのＬＥＤからの）励起光が検出器（例えば、ＮｅｘｔＳｅｑ（登録商標）画像化モジュールのカメラ）に到達するかを決定することができる。試験は、ウーバーターゲット装置ガラスがどのくらい自己蛍光するかについても示すことができる。試験は、以下のようにＮｅｘｔＳｅｑ（登録商標）画像化モジュール上で実施することができる。５０％電流のＬＥＤ及び９９９ｍｓの露光時間で測定を行う。ＬＥＤをオフにした状態で画像を得て、暗読取を提供する。次いで、フィルタブレークスルータイル（固体クロム層）で提供された鏡面で画像を得る。この測定は、ＬＥＤ光がどのくらいセンサに到達するのかを示す。次いで、クロムを有さないレーン（均一性タイル）の開放領域で画像を得る。この測定は、ウーバーターゲット装置ガラスがどのくらい自己蛍光するのかを示す。次いで、ウーバーターゲット装置を除去した状態で画像を得ることができる。この測定は、検出された信号のどのくらいが画像モジュールの固定によるものかを示す。得られた測定を表Ｉに示す。
【０１１６】
表Ｉ：自己蛍光及びフィルタブレークスルー実験結果
【表１】
0003206040.tif 000003
【０１１７】
表Ｉの結果は、ウーバーターゲット装置ガラスの自己蛍光が４００カウント（緑チャネル）及び２００カウント（赤チャネル）であることを示す。クロムに反射してセンサに衝突するＬＥＤ光の量は、７００カウント（緑チャネル）及び７００カウント（赤チャネル）である。
【０１１８】
ウーバーターゲット装置を用いたＮｅｘｔＳｅｑ（登録商標）画像化モジュール上で行ったほとんど全ての測定は、再現性が高く、画像システム性能を調査するためのロバストなツールであることが示された。
【０１１９】
本出願全体にわたり、様々な出版物、特許、及び特許出願について言及してきた。これら文献の開示全体は、本発明に関連する技術の状態をより完全に記載するため、参照により本明細書に組入れられるものとする。
【０１２０】
用語「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、本明細書において、無制限であることを意図し、記載した要素だけでなく、任意な付加的要素をも包含する。
【０１２１】
本考案を上述の実施例を参照しながら説明してきたが、本考案から逸脱することなく様々な変更を加えることができると理解されたい。したがって、本考案は特許請求の範囲によってのみ限定される。
【図１】
0003206040.tif 000004
【図２】
0003206040.tif 000005
【図３】
0003206040.tif 000006
【図４】
0003206040.tif 000007
【図５】
0003206040.tif 000008
【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
0003206040.tif 000010
【図７Ａ】
0003206040.tif 000011
【図７Ｂ】
0003206040.tif 000012
【図８】
0003206040.tif 000013
【図９】
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【図１０】
0003206040.tif 000015
【図１１Ａ】
0003206040.tif 000016
【図１１Ｂ】
0003206040.tif 000017
【図１２Ａ】
0003206040.tif 000018
【図１２Ａ−１】
0003206040.tif 000019
【図１２Ｂ】
0003206040.tif 000020
【図１２Ｃ】
0003206040.tif 000021
【図１２Ｃ−１】
0003206040.tif 000022
【図１３】
0003206040.tif 000023
【図１３−１】
0003206040.tif 000024
【図１４】
0003206040.tif 000025
【図１４−１】
0003206040.tif 000026
【図１５】
0003206040.tif 000027
【図１５−１】
0003206040.tif 000028
【図１６Ａ】
0003206040.tif 000029
【図１６Ａ−１】
0003206040.tif 000030
【図１６Ｂ】
0003206040.tif 000031
【図１６Ｂ−１】
0003206040.tif 000032
【図１７】
0003206040.tif 000033
【図１７−１】
0003206040.tif 000034
【図１８】
0003206040.tif 000035
【図１８−１】
0003206040.tif 000036
【手続補正書】
【提出日】平成28年5月2日(2016.5.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】実用新案登録請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【実用新案登録請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）底面を有する半透明又は透明なプレートであって、前記底面の少なくとも一部には、不透明材料が、少なくとも１個の透明又は半透明な部分を有するパターンで印刷され、前記パターンは、複数の半透明又は透明な穴を整然としたアレイで含む、前記プレート、
（ｂ）前記底面の下に配置されたチャネルであって、単一チャンバを形成するように接続された複数の平行レーンを含む、前記チャネル
を含む検査装置であって、
前記チャネルから発したか又は前記チャネルを介した光は、前記少なくとも１個の透明又は半透明な部分を通過することができる、前記検査装置。
【請求項２】
（ｃ）前記チャネルの少なくとも一部を充填する流体をさらに含み、前記流体が、少なくとも１つの発光材料を含む、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記発光材料が、１以上の蛍光又は発光分子を含む、請求項２に記載の装置。
【請求項４】
前記蛍光分子が、ローダミン色素及びオキサジン色素からなる群から選択される、請求項３に記載の装置。
【請求項５】
前記半透明又は透明なプレートと接触する第２のプレートをさらに含み、前記チャネル開口が、前記半透明又は透明なプレートと前記第２のプレートの間に配置される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の装置。
【請求項６】
前記パターンが、基準要素を形成する少なくとも１個の半透明又は透明な特徴を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の装置。
【請求項７】
前記パターンが、前記半透明又は透明な穴の整然としたアレイに、比較的大きな開口を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の装置。
【請求項８】
前記検査装置を収容するカートリッジを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の装置。
【請求項９】
前記底面が、前記不透明材料を含む少なくとも１個の模様タイルを含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１０】
前記底面が、前記不透明材料を欠いた少なくとも１個の透明なタイルをさらに含む、請求項９に記載の装置。
【請求項１１】
前記少なくとも１個の模様タイルが、前記不透明材料によって完全に被覆される、請求項９又は１０に記載の装置。
【請求項１２】
前記不透明材料が、７５平方ミクロン未満の面積を有する複数の透明又は半透明な穴を含む、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１３】
前記不透明材料が、少なくとも１０ミクロンだけ離隔される複数の透明又は半透明な穴を含む、請求項９〜１２のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１４】
前記不透明材料が、７５平方ミクロン未満の面積を有する複数の透明又は半透明な穴を含み、前記不透明材料が、少なくとも３０，０００平方ミクロンの面積を有する透明又は半透明な窓を含む、請求項９〜１２のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１５】
前記底面が、前記不透明材料を含む少なくとも１個の基準タイルと、＋形状を有する基準とをさらに含む、請求項９〜１４のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１６】
前記タイルが、前記底面上にユニットで配置され、前記ユニットが、６回繰り返されて、前記底面上にパターンを形成する、請求項９〜１５のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１７】
前記チャネルが、単一チャンバを形成するように接続された４個の平行レーンを含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１８】
前記複数の平行レーンが、比較的狭い進入レーン及び退出レーンと比較して比較的広い検出レーンを含む、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１９】
前記進入及び退出レーンが、前記検出レーンを進入及び退出ポートにそれぞれ接続する、請求項１８に記載の装置。
【請求項２０】
光学検出デバイスであって、
（ａ）請求項１〜１９のいずれか１項に記載の検査装置と、
（ｂ）前記チャネルから発したか又は前記チャネルを介した前記光を受けるように前記プレートの上に配置された１個又は複数個の検出器と
を含む、前記光学検出デバイス。
【請求項２１】
前記１個又は複数個の検出器が、複数個の顕微蛍光測定器を含む、請求項２０に記載の光学デバイス。
【請求項２２】
前記複数個の顕微蛍光測定器が、モノリシック読取りヘッドに含まれる、請求項２１に記載の光学デバイス。
【請求項２３】
前記１個又は複数個の検出器が、６つの顕微蛍光測定器を含み、前記検査装置が、４個のレーンを含む、請求項２１に記載の光学デバイス。
【請求項２４】
前記６つの顕微蛍光測定器が、前記４個のレーンを検出するように位置決めされている、請求項２３に記載の光学デバイス。
【請求項２５】
前記検査装置の底面が、前記不透明材料を含む少なくとも１個の模様タイルを含み、前記６つの顕微蛍光測定器が、前記模様タイルの少なくとも１つを検出するように位置決めされている、請求項２３に記載の光学デバイス。
【請求項２６】
前記少なくとも１個の模様タイルが、前記不透明材料によって完全に被覆される、請求項２５に記載の光学デバイス。
【請求項２７】
前記不透明材料が、７５平方ミクロン未満の面積を有する複数の透明又は半透明な穴を含む、請求項２５に記載の光学デバイス。
【請求項２８】
前記透明又は半透明な穴が、少なくとも１０ミクロンだけ離隔される、請求項２７に記載の光学デバイス。
【請求項２９】
前記不透明材料が、少なくとも３０，０００平方ミクロンの面積を有する透明又は半透明な窓を含む、請求項２７に記載の光学デバイス。