(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｔｒｏｐ−２＋循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）を検出する方法であって、
ａ）Ｔｒｏｐ−２＋癌を有する疑いのある対象由来の血液に、抗Ｔｒｏｐ−２抗体またはその抗原結合性断片を露出させることと、
ｂ）前記抗Ｔｒｏｐ−２抗体またはその断片を、前記Ｔｒｏｐ−２＋循環腫瘍細胞に結合させることと、
ｃ）前記抗Ｔｒｏｐ−２抗体またはその断片に結合した前記ＣＴＣを検出すること
を含み、
抗Ｔｒｏｐ−２抗体が利用される唯一の抗腫瘍関連抗原捕捉抗体であり、
更に、腫瘍関連抗原に結合する第２の抗体またはその抗原結合性断片に前記ＣＴＣを露出させることを含み、ここで前記第２の抗体またはその断片は、放射性同位体、色素、造影剤、発光剤、化学発光剤、蛍光剤、及び増強剤からなる群から選択される少なくとも１つの診断剤に結合され、
前記抗Ｔｒｏｐ−２抗体がＲＳ７抗体であり、前記第２の抗体が、ＲＳ７とは異なるエピトープに結合する抗Ｔｒｏｐ−２抗体である、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、更に、前記ＣＴＣを濃縮または単離することを含む方法。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の方法であって、前記抗Ｔｒｏｐ−２抗体またはその断片が磁性ナノ粒子に結合される方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法であって、更に、磁場を用いて前記磁性ナノ粒子に結合したＣＴＣを正常細胞から分離することを含む、方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法であって、前記抗Ｔｒｏｐ−２抗体またはその断片が、軽鎖ＣＤＲ配列のＣＤＲ１（ＫＡＳＱＤＶＳＩＡＶＡ、配列番号１）、ＣＤＲ２（ＳＡＳＹＲＹＴ、配列番号２）、及びＣＤＲ３（ＱＱＨＹＩＴＰＬＴ、配列番号３）、並びに重鎖ＣＤＲ配列のＣＤＲ１（ＮＹＧＭＮ、配列番号４）、ＣＤＲ２（ＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴＹＴＤＤＦＫＧ、配列番号５）及びＣＤＲ３（ＧＧＦＧＳＳＹＷＹＦＤＶ、配列番号６）を含むＲＳ７抗体である方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法であって、前記抗Ｔｒｏｐ−２抗体が、マウスＲＳ７、ｈＲＳ７、ＭＡＢ６５０、Ｋ５−７０、Ｋ５−１０７、Ｋ５−１１６−２−１、Ｔ６−１６、Ｔ５−８６、ＢＲ１１０、ＡＲ４７Ａ６．４．２、３Ｅ９、６Ｇ１１、７Ｅ６、１５Ｅ２、１８Ｂ１、ＰＤ０８０１９、ＰＤ０８０２０、ＰＤ０８０２１、７７２２０、ＫＭ４０９７、ＫＭ４５９０、Ａ１、Ａ４、１６２−２５．３、１６２−４６．２、およびＰｒ１Ｅ１１からなる群から選択される、方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法であって、前記抗Ｔｒｏｐ−２抗体が、マウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である、方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法であって、前記抗Ｔｒｏｐ−２抗体が、放射性同位元素、色素、造影剤、発光剤、化学発光剤、蛍光剤、及び増強剤からなる群から選択される少なくとも１つの診断剤に結合される、方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法であって、前記ＣＴＣが、蛍光顕微鏡法、ＦＩＳＨ（蛍光ｉｎ−ｓｉｔｕハイブリダイゼーション）、免疫組織化学、ＦＡＣＳ（蛍光活性化された細胞の選別）、フローサイトメトリー、マイクロ流体アッセイ、及びＲＴ−ＰＣＲからなる群から選択される方法により検出される、方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法であって、更に、蛍光標識抗体により、上皮癌マーカーについて前記ＣＴＣを分析することを含む、方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法であって、前記ＣＴＣが、ＦＩＳＨ（蛍光インサイチューハイブリダイゼーション）により上皮癌マーカーについて分析される、方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法であって、更に、ＲＴ−ＰＣＲにより上皮癌マーカーについてＣＴＣを分析することを含む、方法。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法であって、前記Ｔｒｏｐ−２＋癌が、膵臓癌、トリプルネガティブ乳癌、転移性結腸直腸癌、ＨＥＲ＋、ＥＲ＋、プロゲステロン＋乳癌、転移性非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、転移性膵臓癌、転移性食道癌、転移性尿路上皮癌、転移性腎細胞癌、転移性胃癌、転移性前立腺癌及び転移性小細胞肺癌を含む転移性Ｔｒｏｐ−２陽性癌からなる群から選択される、方法。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法であって、前記抗Ｔｒｏｐ−２抗体またはその断片が、エクスビボで血液試料に露出される、方法。
【請求項１５】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法であって、前記抗Ｔｒｏｐ−２抗体またはその断片が、インビボで血液試料に露出される、方法。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法であって、Ｔｒｏｐ−２＋ＣＴＣの存在は転移性癌のための診断に役立つ、方法。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法であって、前記対象がヒト対象である、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１５年４月２２日に出願された米国仮特許出願第６２／１５１，１６９号の３５ＵＳＣ１１９（ｅ）に基づく利益を主張し、その文全体を参照により本明細書に援用する。
【０００２】
配列表
本出願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩフォーマットで提出された、その全体が参照により本明細書に援用される配列表を含んでいる。２０１６年４月２１日に作成された当該ＡＳＣＩＩコピーは、ＩＭＭ３５９Ｗ０１＿ＳＬ．ｔｘｔと称され、またサイズは４４，９０６バイトである。
【０００３】
発明の分野
本発明は、好ましくは循環系由来のＴｒｏｐ−２＋癌細胞を単離し、検出し、診断し、及び／または特徴付けるための方法及び組成物に関する。当該方法及び組成物は抗Ｔｒｏｐ−２抗体を利用するものであり、当該抗体は１価、２価または多価であってよい。好ましい実施形態において、抗Ｔｒｏｐ−２抗体は当該アッセイで利用される唯一の抗ＴＡＡ（腫瘍関連抗原）捕捉抗体であり、これはＴｒｏｐ−２以外にはＴＡＡに対する抗体混合物の使用を含まない。別の実施形態において、当該捕捉抗体は、抗Ｔｒｏｐ−２抗体または断片及び異なるＴＡＡに対する第２の抗体または断片を含む二重特異性抗体であってよい。より好ましくは、当該抗体は、齧歯類類抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体もしくはヒト抗体、またはその抗原結合断片である。癌細胞におけるＴｒｏｐ−２の発現は既知の技術を用いて評価することができ、これにはフローサイトメトリーまたは免疫組織化学により検出される抗Ｔｒｏｐ−２抗体の結合、及び定量的ＲＴ−ＰＣＲを含むが、これらに限定されない。循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）を単離及び／または検出するために開発された自動システム及び装置を、特許請求の範囲に記載された方法を実施することにおいて利用することができ、これにはＭａｇＳｗｅｅｐｅｒ装置（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ＬＩＱＵＩＤＢＩＯＰＳＹ（登録商標）システム（Ｃｙｎｖｅｎｉｏ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｗｅｓｔｌａｋｅ  Ｖｉｌｌａｇｅ，ＣＡ）、ＣＥＬＬＳＥＡＲＣＨ（登録商標）システム（Ｖｅｒｉｄｅｘ  ＬＬＣ，Ｒａｒｉｔａｎ，ＮＪ）、ＧＩＬＵＰＩ  ＣＥＬＬＣＯＬＬＥＣＴＯＲ（商標）（ＧＩＬＵＰＩ  ＧｍｂＨ，Ｐｏｔｓｄａｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＡＰＯＳＴＲＥＡＭ（登録商標）システム（Ａｐｏｃｅｌｌ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）、ＯＮＣＯＣＥＥ（登録商標）マイクロ流体プラットフォーム（ＢｉｏＣｅｐｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）、ＶｅｒＩＦＡＳＴ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃａｓａｖａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ  １３：３９１−６；２０１４，Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ  １４：９９−１０５）またはＩＳＯＦＬＵＸ（商標）システム（Ｆｌｕｘｉｏｎ，Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）が含まれるが、これらに限定されない。最も好ましくは、抗Ｔｒｏｐ−２抗体は、軽鎖ＣＤＲ配列のＣＤＲ１（ＫＡＳＱＤＶＳＩＡＶＡ、配列番号１）、ＣＤＲ２（ＳＡＳＹＲＹＴ、配列番号２）、及びＣＤＲ３（ＱＱＨＹＩＴＰＬＴ、配列番号３）、並びに重鎖ＣＤＲ配列のＣＤＲ１（ＮＹＧＭＮ、配列番号４）、ＣＤＲ２（ＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴＹＴＤＤＦＫＧ、配列番号５）及びＣＤＲ３（ＧＧＦＧＳＳＹＷＹＦＤＶ、配列番号６）を含むマウス抗体、キメラ抗体またはヒト化ＲＳ７（ｈＲＳ７）抗体である。しかし、別の実施形態では、以下に述べるように、他の既知の抗Ｔｒｏｐ−２抗体を利用することができる。本方法及び組成物は、種々の転移性Ｔｒｏｐ−２発現癌、例えば乳癌（例えば、トリプルネガティブ乳癌）、卵巣癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、肺癌、前立腺癌、結腸癌、直腸癌、胃癌、食道癌、膀胱癌、腎臓癌、膵臓癌、甲状腺癌、上皮癌、及び頭頸部癌の濃縮、単離、���出、診断及び／または特徴付けのために適用可能である。抗Ｔｒｏｐ−２抗体は、１以上の標識された検出抗体と組み合わせて利用されてよく、または少なくとも１つの診断薬との結合によって直接標識されてもよい。或いは、二重特異性抗体は、Ｔｒｏｐ−２についての１つの結合部位、及び標的とすることが可能な構築物（典型的には少なくとも１つの診断薬で標識された小さなペプチド）上のハプテンについての別の結合部位を含み得る。ある特定の代替実施形態においては、Ｔｒｏｐ−２＋ＣＴＣの検出の後に、抗Ｔｒｏｐ−２抗体またはその断片を用いて、Ｔｒｏｐ−２＋癌の治療的処置を行ってよい。好ましくは、この抗体または断片は、少なくとも１つの治療剤、例えば抗体、抗体断片、薬物、毒素、ヌクレアーゼ、ホルモン、免疫調節剤、アポトーシス促進剤、抗血管新生剤、ホウ素化合物、光活性剤もしくは色素または放射性同位体へ複合体化される。より好ましくは、当該治療剤はＳＮ−３８またはＰ２ＰＤＯＸである。
【背景技術】
【０００４】
関連技術
Ｔｒｏｐ−２（ヒト栄養膜細胞表面マーカー）は、正常細胞及び悪性栄養膜細胞において最初に同定された細胞表面糖タンパク質である（Ｌｉｐｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：５１４７−５０）。Ｔｒｏｐ−２は、殆どのヒト癌、特に上皮癌及び腺癌において高度に発現される一方、正常組織においては発現が低く制限されると報告されている（例えば、Ｃｕｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｍｏｌｅｃ．Ｃａｎｃｅｒ  ９：２５３；Ｓｔｅｐａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．５９：７０１−１０；Ｖａｒｕｇｈｅｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ａｍ．Ｊ．Ｏｂｓｔ．Ｇｙｎ．２０５：５６７ｅ−ｅ７参照）。Ｔｒｏｐ−２の発現は、転移、腫瘍の攻撃性増加及び患者の生存低下と関連する（Ｃｕｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０；Ｖａｒｕｇｈｅｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。Ｔｒｏｐ−２の病原性効果は、ＥＲＫ  １／２  ＭＡＰＫ経路によって少なくとも部分的に媒介されることが報告されている（Ｃｕｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。
【０００５】
腫瘍進行の早期において、癌細胞が循環系に低濃度で見出され得ることが提案されている（例えば、Ｋｒｉｓｈｎａｍｕｒｔｈｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２：２２６−３３；Ａｌｉｘ−Ｐａｎａｂｉｅｒｅｓ  ＆  Ｐａｎｔｅｌ，２０１３，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．５０：１１０−１８；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｅｂ．２４，２０１５，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ，Ｅｐｕｂ  ａｈｅａｄ  ｏｆ  ｐｒｉｎｔを参照されたい）。血液試料採取の比較的非侵襲的性質に起因して、疾患初期の癌診断を促進するため、並びに腫瘍進行、疾患予後及び／または薬物療法に対する応答性の予測因子として、ＣＴＣの単離及び検出に大きな関心が寄せられている（例えば、Ａｌｉｘ−Ｐａｎａｂｉｅｒｅｓ  ＆  Ｐａｎｔｅｌ，２０１３，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．５０：１１０−１８；Ｗｉｎｅｒ−Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ９：ｅ８６７１７；米国特許出願公開番号２０１４／０３５７６５９参照）。
【０００６】
循環腫瘍細胞を単離及び／または検出するための種々の技術及び装置が開発されている。この分野に関する幾つかの総説が最近発表されている（例えば、Ａｌｉｘ−Ｐａｎａｂｉｅｒｅｓ  ＆  Ｐａｎｔｅｌ，２０１３，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．５０：１１０−１８；Ｊｏｏｓｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，ＥＭＢＯ  Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．７：１−１１；Ｔｒｕｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｆｒｏｎ．Ｏｎｃｏｌ．４：２４２を参照されたい）。この技術には、一般に腫瘍細胞上に発現された抗原に対する捕捉抗体、並びに磁性ナノ粒子、マイクロ流体デバイス、濾過、磁気分離、遠心分離、フローサイトメトリー及び／または細胞選別デバイス（例えば、細胞分離デバイス）を用いた、ＣＴＣの濃縮及び／または単離が含まれている（例えば、Ｋｒｉｓｈｎａｍｕｒｔｈｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２：２２６−３３；Ａｌｉｘ−Ｐａｎａｂｉｅｒｅｓ  ＆  Ｐａｎｔｅｌ，２０１３，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．５０：１１０−１８；Ｊｏｏｓｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，ＥＭＢＯ  Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．７：１−１１；Ｔｒｕｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｆｒｏｎ  Ｏｎｃｏｌ．４：２４２；Ｐｏｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ７：ｅ３３７８８；Ｗｉｎｅｒ−Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ９：ｅ８６７１７；Ｇｕｐｔａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，  Ｂｉｏｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ  ６：２４１３３；Ｓａｕｃｅｄｏ−Ｚｅｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．４１：１２４１−５０；Ｈａｒｂ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｔｒａｎｓｌ．Ｏｎｃｏｌ．６：５２８−３８）。次いで、濃縮または単離されたＣＴＣは、以下で更に述べるように、種々の既知の方法を用いて分析され得る。ＣＴＣの分離及び検出に使用されているシステムまたは装置には、ＣＥＬＬＳＥＡＲＣＨ（登録商標）システム（例えば、Ｔｒｕｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｆｒｏｎｔ  Ｏｎｃｏｌ．４：２４２）、ＭａｇＳｗｅｅｐｅｒ装置（例えば、Ｐｏｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ７：ｅ３３７８８）、ＬＩＱＵＩＤＢＩＯＰＳＹ（登録商標）システム（Ｗｉｎｅｒ−Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ９：ｅ８６７１７）、ＡＰＯＳＴＲＥＡＭ（登録商標）システム（例えば、Ｇｕｐｔａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｂｉｏｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ  ６：２４１３３）、ＧＩＬＵＰＩ  ＣＥＬＬＣＯＬＬＥＣＴＯＲ（商標）（例えば、Ｓａｕｃｅｄｏ−Ｚｅｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．４１：１２４１−５０）及びＩＳＯＦＬＵＸ（商標）システム（Ｈａｒｂ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｔｒａｎｓｌ．Ｏｎｃｏｌ．６：５２８−３８）が含まれる。
【０００７】
今日まで、ＣＴＣ検出のための唯一のＦＤＡ承認技術には、ＣＥＬＬＳＥＡＲＣＨ（登録商標）プラットフォーム（Ｖｅｒｉｄｅｘ  ＬＬＣ，Ｒａｒｉｔａｎ，ＮＪ）が含まれるが、これはＣＴＣｓを捕捉するために、磁気ナノ粒子に付着した抗ＥｐＣＡＭ抗体を利用する。結合された細胞の検出は、サイトケラチン（ＣＫ）及びＣＤ４５に対する蛍光標識抗体を用いて生じる。磁性粒子に結合された蛍光標識細胞を強い磁場を用いて分離し、デジタル蛍光顕微鏡で計数する。ＣＥＬＬＳＥＡＲＣＨ（登録商標）システムは、転移性乳癌、前立腺癌及び結腸直腸癌の検出についてＦＤＡ承認を受けている。
【０００８】
殆どのＣＴＣ検出システムは、抗ＥｐＣＡＭ捕捉抗体の使用に焦点を当てている（例えば、Ｔｒｕｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｆｒｏｎｔ  Ｏｎｃｏｌ．４：２４２；Ｐｏｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ７：ｅ３３７８８；Ａｌｉｘ−Ｐａｎａｂｉｅｒｅｓ  ＆  Ｐａｎｔｅｌ，２０１３，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．５０：１１０−１８；Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｂｉｏｓｅｎｓ  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ  ４０：６３−６７；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｅｂ．２４，２０１５，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．Ｅｐｕｂ．印刷前；Ｍａｇｂａｎｕａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ．Ｒｅｓ．２１：１０９８−１０５；Ｈａｒｂ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｔｒａｎｓｌ．Ｏｎｃｏｌ．６：５２８−３８を参照されたい）。しかしながら、全ての転移性腫瘍がＥｐＣＡＭを発現するわけではない（例えば、Ｍｉｋｏｌａｊｃｙｚｙｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．２０１１：２５２３６１；Ｐｅｃｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  １：５８０−８６；Ｇｕｐｔａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｂｉｏｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ  ６：２４１３３参照）。ＥｐＣＡＭ陰性のＣＴＣを単離し、検出するための代替スキーム、例えばＴＡＡに対する抗体の組み合わせ使用を利用する試みがなされている。転移性循環腫瘍細胞の回収を増加させる試みにおいて、１０種もの異なるＴＡＡに対する抗体が利用されている（例えば、Ｍｉｋｏｌａｊｃｙｚｙｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．２０１１：２５２３６１；Ｐｅｃｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  １：５８０−８６；Ｋｒｉｓｈｎａｍｕｒｔｈｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２：２２６−３３；Ｗｉｎｅｒ−Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ９：ｅ８６７１７参照）。
【０００９】
このようなアプローチには欠点が存在し、それには多くの異なる抗体の調製及び使用、並びにそれらの磁性ナノ粒子への結合、マイクロ流体装置もしくは他の分離技術、並びに広範囲の抗腫瘍抗体を使用するときの正常細胞集団に対する潜在的交差反応性が含まれる。当該技術においては、広範囲の腫瘍で発現される単一のＴＡＡに対する抗体を使用して、ＣＴＣを単離、検出、診断及び／または特徴付けするための改良された方法が必要とされている。
【発明の概要】
【００１０】
種々の実施形態において、本発明は、抗ＴＲＯＰ−２抗体及び／またはその抗原結合性断片を使用する、ＴＲＯＰ−２陽性の循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）の濃縮、分離、検出、診断及び／または特徴付けに関する。抗Ｔｒｏｐ−２抗体は、循環系から腫瘍細胞を濃縮及び／または単離するために使用し得る。結合されたＣＴＣは、以下に詳細に説明するように、様々な既知の技術及び／または装置によって検出され得る。単離されたＣＴＣのバイオマーカーを検出するための任意の既知の方法、例えば、ＦＩＳＨ、ＦＡＣＳ、蛍光顕微鏡検査、蛍光検出、フローサイトメトリー、免疫組織化学、マイクロチップベースのシステム、ＲＴ−ＰＣＲ、ＥＬＩＳＡ、または癌細胞の存在を検出するための当技術分野で知られた任意の他の技術を利用することができる。
【００１１】
特定の実施形態において、当該抗Ｔｒｏｐ−２抗体は、軽鎖ＣＤＲ配列のＣＤＲ１（ＫＡＳＱＤＶＳＩＡＶＡ、配列番号１）；ＣＤＲ２（ＳＡＳＹＲＹＴ、配列番号２）；及びＣＤＲ３（ＱＱＨＹＩＴＰＬＴ、配列番号３）、並びに重鎖ＣＤＲ配列のＣＤＲ１（ＮＹＧＭＮ、配列番号４）；ＣＤＲ２（ＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴＹＴＤＤＦＫＧ、配列番号５）；及びＣＤＲ３（ＧＧＦＧＳＳＹＷＹＦＤＶ、配列番号６）を備えた、マウス、キメラまたはヒト化のＲＳ７抗体であり得る（例えば、参照により本明細書に援用する米国特許第７，２３８，７８５号の図及び実施例の節を参照されたい）。しかし、以下で述べるように、他の抗Ｔｒｏｐ−２抗体が知られており、且つ使用することができる。
【００１２】
当該抗Ｔｒｏｐ−２抗体部分は、モノクローナル抗体、抗原結合性抗体断片、二重特異性抗体もしくは多価抗体、または他の抗体に基づく分子であってよい。当該抗体は、種々のアイソタイプ、好ましくはヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４、より好ましくはヒトＩｇＧ１のヒンジ及び定常領域配列を含むものであることができる。抗体またはその断片は、ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｎｅｕｔ  Ｋｏｌｆｓｃｈｏｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００７；  ３１７：１５５４−１５５７）に記載されるように、齧歯類、キメラ、ヒト化またはヒトの抗体、並びにその改変体、例えば半ＩｇＧ４抗体であることができる。より好ましくは、当該抗体またはその断片は、Ｇ１ｍ３、Ｇ１ｍ３，１、Ｇ１ｍ３，２またはＧ１ｍ３，１，２のような特定のアロタイプに属するヒト定常領域配列を含むように設計または選択されてよい。より好ましくは、当該アロタイプは、ｎＧ１ｍ１、Ｇ１ｍ３、ｎＧ１ｍ１，２及びＫｍ３アロタイプからなる群から選択される。
【００１３】
ＣＴＣを捕捉するために二重特異性抗体が使用される場合、当該抗体は、少なくとも１つの抗Ｔｒｏｐ−２抗体またはその断片、及び異なるＴＡＡに対する少なくとも１つの抗体またはその断片を含み得る。例示的ＴＡＡには、炭酸脱水素酵素ＩＸ、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２１、ＣＳＡｐ、ＣＤ１、ＣＤ１ａ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１１Ａ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＩＧＦ−１Ｒ、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ６４、ＣＤ６６ａ−ｅ、ＣＤ６７、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ９５、ＣＤ１２６、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１４７、ＣＤ１５４、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ７、ＣＸＣＬ１２、ＨＩＦ−１−α、ＡＦＰ、ＰＳＭＡ、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＥＡＣＡＭ−６、ｃ−ｍｅｔ、Ｂ７、フィブロネクチンのＥＤ−Ｂ、ファクターＨ、ＦＨＬ−１、Ｆｌｔ−３、葉酸受容体、ＧＲＯＢ、ＨＭＧＢ−１、低酸素誘導因子（ＨＩＦ）、インスリン様成長因子−１（ＩＬＧＦ−１）、ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＬ−２、ＩＬ−４Ｒ、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−１３Ｒ、ＩＬ−１５Ｒ、ＩＬ−１７Ｒ、ＩＬ−１８Ｒ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２５、ＩＰ−１０、ＭＡＧＥ、ｍＣＲＰ、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１Ａ、ＭＩＰ−１Ｂ、ＭＩＦ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５ａｃ、ＮＣＡ−９５、ＮＣＡ−９０、Ｉａ、ＥＧＰ−１、ＥＧＰ−２、ＨＬＡ−ＤＲ、テネイシン、Ｌｅ（ｙ）、ＲＡＮＴＥＳ、Ｔ１０１、ＴＡＣ、Ｔｎ抗原、トムソン−フリーデンライヒ抗原、腫瘍壊死抗原、ＴＮＦ−α、ＴＲＡＩＬ受容体（Ｒ１及びＲ２）、ＶＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ、Ｐ１ＧＦ、補体因子Ｃ３、Ｃ３ａ、Ｃ３ｂ、Ｃ５ａまたはＣ５を含み得る。好ましくは、ＴＡＡは、ＣＥＡＣＡＭ５、ＭＵＣ５ａｃ、ＣＤ７４、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＳＡｐ、ＡＦＰ（アルファ−フェトプロテイン）、ＨＥＲ２、ビメンチン、ＥＧＦＲ、ＩＧＦ−１Ｒ、ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２からなる群から選択される。
【００１４】
検出された腫瘍はＴｒｏｐ−２陽性であるので、抗Ｔｒｏｐ−２抗体、例えば抗Ｔｒｏｐ−２抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）で治療することができる。抗Ｔｒｏｐ−２抗体は、最初は、ＣＴＣにおけるＴｒｏｐ−２の発現または遺伝子コピー数を検出及び／または定量するために使用され得る。そのような分析は、治療用抗Ｔｒｏｐ−２抗体に対する応答を予測し、治療に対する腫瘍の応答をモニターするために使用し得る。以下に述べるように、抗Ｔｒｏｐ−２抗体の免疫複合体は、化学療法剤のような何れか既知の治療剤を含み得る。癌治療のために使用されるいくつかの細胞傷害性薬物が当技術において周知であり、そのような既知の薬物の何れもが対象とする抗体に複合体化され得る。好ましい実施形態において、抗体に複合体化した薬物はカンプトテシンまたはアントラサイクリン、最も好ましくはＳＮ−３８または２−ピロリノドキソルビシン（２−ＰＤｏｘ）のプロドラッグ形態である（例えば、それら各々の図面及び実施例の節を参照により本明細書に援用する米国特許第８，８７７，２０２号及び同第８，７５０，４９６号を参照されたい）。抗Ｔｒｏｐ−２抗体または抗体断片に複合体化させるべき薬物には、アントラサイクリン、カンプトテシン、チューブリン阻害剤、メイタンシノイド、カリケアマイシン、アウリスタチン、ナイトロジェンマスタード、エチレンイミン誘導体、アルキルスルホネート、ニトロソ尿素、トリアゼン、葉酸アナログ、タキサン、ＣＯＸ−２阻害剤、ピリミジン類似体、プリン類似体、抗生物質、酵素阻害剤、エピポドフィロトキシン、白金配位錯体、ビンカアルカロイド、置換尿素、メチルヒドラジン誘導体、副腎皮質抑制剤、ホルモン拮抗剤、代謝拮抗剤、アルカリ化剤、抗有糸分裂剤、抗血管新生剤、チロシンキナーゼ阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ９０）阻害剤、プロテアソーム阻害剤、及びＨＤＡＣ阻害剤、アポトーシス促進剤、及びそれらの組み合わせが含まれる。
【００１５】
抗Ｔｒｏｐ−２抗体は、Ｔｒｏｐ−２発現癌、例えば乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、肺癌、前立腺癌、結腸癌、直腸癌、胃癌、食道癌、膀胱癌、腎臓癌、膵臓癌、甲状腺癌、上皮癌または頭頸部癌の検出、診断、特徴付け及び／または治療のために使用されるものである。本方法及び組成物は、特に、転移性結腸直腸癌、トリプルネガティブ乳癌、ＨＥＲ＋、ＥＲ＋、プロゲステロン＋乳癌、転移性非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、転移性小細胞（ＳＣＬＣ）、転移性膵臓癌、転移性腎細胞癌、転移性胃癌、転移性食道癌、転移性尿路上皮癌または転移性前立腺癌の検出、診断、特徴付け及び／または治療のために使用されるものである。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ＦＩＳＨによるＴｒｏｐ−２コピー数の解析。ＭＣＦ−７（Ｔｒｏｐ−２陽性）細胞をＦＩＳＨにより解析した。Ｔｒｏｐ−２コピー数は、抗Ｔｒｏｐ−２特異的プローブ及び抗染色体−１特異的プローブ（Ｅｍｐｉｒｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｂｕｆｆａｌｏ，ＮＹ）を用いて決定した。
【図２】ＦＩＳＨによるＴｒｏｐ−２コピー数の解析。Ａ５４９（Ｔｒｏｐ−２陰性）細胞をＦＩＳＨにより解析した。Ｔｒｏｐ−２コピー数は、抗Ｔｒｏｐ−２特異的プローブ及び抗染色体−１特異的プローブ（Ｅｍｐｉｒｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｂｕｆｆａｌｏ，ＮＹ）を用いて決定した。
【図３】ＦＩＳＨによるトポイソメラーゼＩコピー数の解析。ＭＣＦ−７細胞をＦＩＳＨにより解析した。トポイソメラーゼＩ（ＴＯＰ１）コピー数は、抗ＴＯＰ１特異的プローブ及び抗染色体２０特異的プローブ（ＡＢＮＯＶＡ（登録商標），Ｔａｉｐｅｉ，Ｔａｉｗａｎ）を用いて決定した。
【図４】ＦＩＳＨによるトポイソメラーゼＩコピー数の解析。Ａ５４９細胞をＦＩＳＨにより解析した。トポイソメラーゼＩ（ＴＯＰ１）コピー数は、抗ＴＯＰ１特異的プローブ及び抗染色体２０特異的プローブ（ＡＢＮＯＶＡ（登録商標），Ｔａｉｐｅｉ，Ｔａｉｗａｎ）を用いて決定した。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
定義
別途特定しない限り、「ａ」または「ａｎ」は１以上を意味する。
【００１８】
本明細書で使用する場合、「約」はプラスまたはマイナス１０％を意味する。例えば、「約１００」は、９０〜１１０の間の任意の数を含む。
【００１９】
本明細書に記載の抗体は、全長（即ち、天然に存在するか、または正常な免疫グロブリン遺伝子断片組換えプロセスにより形成される）の免疫グロブリン分子（例えば、ＩｇＧ抗体）、または抗体断片のような免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な（即ち、特異的に結合する）部分を指す。
【００２０】
抗体断片は、Ｆ（ａｂ´）２、Ｆａｂ´、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓＦｖ等のような、抗体の一部である。抗体断片はまた、以下で述べるように、単一ドメイン抗体及びＩｇＧ４半分子を含み得る。構造にかかわらず、抗体断片は、全長抗体が認識するのと同じ抗原と結合する。「抗体断片」の用語にはまた、重鎖及び軽鎖の可変領域からなる「Ｆｖ」断片、及び軽鎖及び重鎖可変領域がペプチドリンカーにより接続される組換え一本鎖ポリペプチド分子（「ｓｃＦｖタンパク質」）が含まれうる
【００２１】
キメラ抗体は、１つの種、好ましくは齧歯類抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む可変ドメインを含む一方、当該抗体分子の定常ドメインは、ヒト抗体のそれに由来する組換えタンパク質である。獣医学的適用については、当該キメラ抗体の定常ドメインは、ネコまたはイヌのような他の種のものから誘導され得る。
【００２２】
ヒト化抗体は、或る種に由来する抗体、例えば齧歯類抗体からのＣＤＲが、齧歯類抗体の重鎖及び軽鎖可変ドメインから、ヒト重鎖及び軽鎖可変ドメイン（例えば、フレームワーク領域配列）の中に移される組換えタンパク質である。当該抗体分子の定常ドメインは、ヒト抗体の定常ドメインに由来する。ある特定の実施形態では、親（齧歯類）抗体由来の限定された数のフレームワーク領域アミノ酸残基を、ヒト抗体フレームワーク領域配列の中に置換することができる。
【００２３】
ヒト抗体は、例えば抗原チャレンジに応答して特異的ヒト抗体を産生するように「操作された」、トランスジェニックマウスから得られる抗体である。この技術では、ヒト重鎖及び軽鎖遺伝子座のエレメントを、内因性マウス重鎖及び軽鎖遺伝子座の標的化された攪乱を含む胚性幹細胞株由来のマウス株に導入する。当該トランスジェニックマウスは、特定の抗原について特異的なヒト抗体を合成することができ、当該マウスを用いてヒト抗体を分泌するハイブリドーマを作製することができる。トランスジェニックマウスからヒト抗体を得る方法は、Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．７：１３（１９９４）、Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６（１９９４）、及びＴａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎ．６：５７９（１９９４）によって記載されている。完全なヒト抗体はまた、遺伝子または染色体トランスフェクション法、ならびにファージディスプレイ技術によって構築することができ、これらの技術は何れも当該技術において知られている。例えば、免疫化されていないドナー由来の免疫グロブリン可変ドメイン遺伝子レパートリーからの、ヒト抗体及びその断片のインビトロでの製造について、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５３（１９９０）を参照されたい。この技術では、抗体可変ドメイン遺伝子を、インフレームで繊維状バクテリオファージの主または副コートタンパク質遺伝子の何れかにクローニングし、ファージ粒子の表面上に機能性抗体断片として提示する。当該繊維状粒子はファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含むので、当該抗体の機能的特性に基づく選択もまた、それら特性を示す抗体をコードする遺伝子の選択をもたらす。このようにして、ファージはＢ細胞の幾つかの性質を模倣する。ファージディスプレイは種々の形式で実行することができ、概説については、例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈｉｓｗｅｌｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３：５５６４−５７１（１９９３）を参照されたい。ヒト抗体は、インビトロで活性化されたＢ細胞によっても生成され得る。米国特許第５，５６７，６１０号及び同第５，２２９，２７５号を参照されたく、その実施例の節を参照により本明細書に援用する。
【００２４】
「診断剤」は、疾患の診断に有用な原子、分子または化合物である。有用な診断剤には、放射性同位体、染料、造影剤、発光剤、化学発光剤、蛍光性の化合物もしくは分子、及び増強剤（例えば、常磁性イオン）が含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、この診断剤は、放射性同位元素、増強剤、及び蛍光化合物からなる群から選択される。
【００２５】
治療剤は、抗体部分と別個に、同時にまたは連続して投与されるか、または抗体部分、すなわち抗体または抗体断片、またはサブ断片に複合体化される、病気の治療のために有用な化合物、分子または原子である。治療剤の例には、抗体、抗体断片、薬物、毒素、ヌクレアーゼ、ホルモン、免疫調節剤、アポトーシス促進剤、抗血管新生剤、ホウ素化合物、光活性剤または色素、及び放射性同位体が含まれる。使用される治療剤については、以下で更に詳細に説明する。
【００２６】
免疫複合体は、少なくとも１つの治療剤及び／または診断剤に複合体化された抗体、抗体断片または融合タンパク質である。
【００２７】
多重特異性抗体は、構造が異なる少なくとも２つの標的、例えば、２つの異なる抗原、同じ抗原上の２つの異なるエピトープ、またはハプテン及び／または抗原もしくはエピトープに同時に結合できる抗体である。多重特異性多価抗体は、２以上の結合部位を有し、且つこれら結合部位が異なる特異性を有する構築物である。
【００２８】
二重特異性抗体は、２つの異なる標的に同時に結合できる抗体である。二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）及び二重特異性抗体断片（ｂｓＦａｂ）は、例えば腫瘍関連抗原に特異的に結合する少なくとも１つのアーム、及び治療剤または診断剤を有する標的とすることができる複合体に特異的に結合する少なくとも１つの他のアームを有し得る。種々の二重特異性融合タンパク質を、分子工学を用いて作製できる。
【００２９】
抗Ｔｒｏｐ−２抗体
ＣＴＣの単離及び／または検出のための主題の方法及び組成物は、Ｔｒｏｐ−２に結合する少なくとも１つの抗体またはその断片を利用するものであり、これには齧歯類抗体、キメラ抗体、ヒト抗体またはヒト化抗体が含まれる。特定の好ましい実施形態において、抗Ｔｒｏｐ−２抗体は、ヒト化ＲＳ７抗体（例えば、その全体を本明細書の一部として得援用する米国特許第７，２３８，７８５号参照）であることができ、これは軽鎖ＣＤＲ配列のＣＤＲ１（ＫＡＳＱＤＶＳＩＡＶＡ、ＳＥＱ（配列番号１））；ＣＤＲ２（ＳＡＳＹＲＹＴ、配列番号２）；及びＣＤＲ３（ＱＱＨＹＩＴＰＬＴ、配列番号３）、並びに重鎖ＣＤＲ配列のＣＤＲ１（ＮＹＧＭＮ、配列番号４）；ＣＤＲ２（ＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴＹＴＤＤＦＫＧ、配列番号５）；及びＣＤＲ３（ＧＧＦＧＳＳＹＷＹＦＤＶ、配列番号６）を備えている。
【００３０】
ＲＳ７抗体は、ヒト原発扁平上皮細胞肺癌の粗製膜調製物に対して産生されたマウスＩｇＧ１であった（Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５０：１３３０，１９９０）。ＲＳ７抗体は、クラスター１３として特徴付けられる４６〜４８ｋＤａ糖タンパク質を認識する（Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｕｐｐ．８：９８−１０２，１９９４）。当該抗原はＥＧＰ−１（上皮糖蛋白質−１）と命名されたが、Ｔｒｏｐ−２とも称される。
【００３１】
Ｔｒｏｐ−２はＩ型膜貫通タンパク質であり、ヒト細胞（Ｆｏｒｎａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  １９９５；６２：６１０−８）及びマウス細胞（Ｓｅｗｅｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  １９９８；７５：３２４−３０）からクローン化されている。腫瘍関連カルシウムシグナルトランスデューサとしてのその役割（Ｒｉｐａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  １９９８；７６：６７１−６）に加えて、ヒトＴｒｏｐ−２の発現は腫瘍形成及び結腸癌の侵襲に必要であり、これはＴｒｏｐ−２の細胞外ドメインに対するポリクローナル抗体によって効果的に低減され得ることが示された（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ．Ｔｈｅｒ．２００８；７：２８０−５）。Ｔｒｏｐ−２は、大多数のヒト腫瘍及び癌の動物モデルにおいて高度に発現されている（ＭｃＤｏｕｇａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５，Ｄｅｖ．Ｄｙｎ．２４４：９９−１０９）。
【００３２】
固形癌のマーカーとしてのＴｒｏｐ−２の有用性（Ｃｕｂａｓら、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  ２００９；１７９６：３０９−１４）は、乳癌（Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００５；１１：４３５７−６４）、結腸直腸癌（Ｏｈｍａｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００６；１２：３０５７−６３；Ｆａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  Ｄｉｓ  ２００９；２４：８７５−８４）及び口腔扁平上皮細胞（Ｆｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｄｅｒｎ  Ｐａｔｈｏｌ  ２００８；２１：１８６−９１）における、Ｔｒｏｐ−２の過剰発現の臨床的意義を実証する更なる報告によって証明される。高レベルのＴｒｏｐ−２を発現する前立腺基底細胞が、インビトロ及びインビボの幹様活性について濃縮されるとの最新の証拠は、特に注目に値する（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２００８；１０５：２０８８２−７）。
【００３３】
フローサイトメトリー及び免疫組織化学的染色研究により、ＲＳ７  ＭＡｂは、種々の腫瘍型上の抗原を検出し、正常ヒト組織への結合は限定されることが示された（Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）。Ｔｒｏｐ−２は、肺、胃、膀胱、乳房、卵巣、子宮及び前立腺の癌のような癌種によって主に発現される。動物モデルにおいて放射性標識マウスＲＳ７  ＭＡｂを用いた局在化及び治療の研究は、腫瘍標的化及び治療効果を実証している（Ｓｔｅｉｎら、１９９０；  Ｓｔｅｉｎら、１９９１）。動物モデルにおける薬物に複合体化されたＲＳ７  ＭＡｂもまた、ヒト癌異種移植片の標的化及び治療効果を示している（Ｃａｒｄｉｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１７：３１５７−６９，２０１１））。
【００３４】
肺、乳房、膀胱、卵巣、子宮、胃及び前立腺に由来する腫瘍において、強いＲＳ７染色が実証されている（Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ５５：９３８，１９９３）。肺癌症例は、扁平上皮癌及び腺癌の両方を含んでいた（Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ５５：９３８，１９９３）。両方の細胞型が強く染色され、ＲＳ７抗体は肺の非小細胞癌腫の組織学的分類を区別しないことが示された。
【００３５】
ｈＲＳ７抗体が好ましいが、他の抗Ｔｒｏｐ−２抗体が既知、及び／または公に利用可能であり、別の実施形態では本発明の方法及び組成物において利用され得る。ヒト化抗体またはヒト抗体が低い免疫原性のために望ましいが、別の実施形態においては、キメラ抗体が使用され得る一方、齧歯類ＭＡｂはインビトロ及びエクスビボ研究において有用であり得る。以下で述べるように、抗体のヒト化方法は当技術において周知であり、入手可能なマウスまたはキメラ抗体をヒト化形態に変換するために利用することができる。
【００３６】
抗Ｔｒｏｐ−２抗体はいくつかの供給源から市販されており、これにはＬＳ−Ｃ１２６４１８、ＬＳ−Ｃ１７８７６５、ＬＳ−Ｃ１２６４１６、ＬＳ−Ｃ１２６４１７（ＬｉｆｅＳｐａｎ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）；１０４２８−ＭＭ０１、１０４２８−ＭＭ０２、１０４２８−Ｒ００１、１０４２８−Ｒ０３０（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｃ．，Ｂｅｉｊｉｎｇ，Ｃｈｉｎａ）；ＭＲ５４（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）；ｓｃ−３７６１８１、ｓｃ−３７６７４６、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）；ＭＭ０５８８−４９Ｄ６（Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ，ＣＯ）；ａｂ７９９７６及びａｂ８９９２８（ＡＢＣＡＭ（登録商標）、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）が含まれる。
【００３７】
他の抗Ｔｒｏｐ−２抗体が特許文献に開示されている。例えば、米国公開番号２０１３／００８９８７２は、日本国筑波の国際特許微生物寄託機関に寄託された抗Ｔｒｏｐ−２抗体Ｋ５−７０（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１２５１）、Ｋ５−１０７（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１２５２）、Ｋ５−１１６−２−１（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１２５３）、Ｔ６−１６（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３４６）、Ｔ５−８６（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１２５４）を開示している。米国特許第５，８４０，８５４号は、抗Ｔｒｏｐ−２モノクローナル抗体ＢＲ１１０（ＡＴＣＣ番号ＨＢ１１６９８）を開示した。米国特許第７，４２０，０４０号は、ＩＤＡＣ（カナダ国際寄託機関、Ｗｉｎｎｉｐｅｇ，Ｃａｎａｄａ）に受託番号１４１２０５−０５として寄託された、ハイブリドーマ細胞株ＡＲ４７Ａ６．４．２により産生された抗Ｔｒｏｐ−２抗体を開示した。米国特許第７，４２０，０４１号は、受託番号１４１２０５−０３としてＩＤＡＣに寄託されたハイブリドーマ細胞株ＡＲ５２Ａ３０１．５により産生された抗Ｔｒｏｐ−２抗体を開示した。米国公開番号２０１３／０１２２０２０は、抗Ｔｒｏｐ−２抗体３Ｅ９，６Ｇ１１，７Ｅ６，１５Ｅ２，１８Ｂ１を開示している。代表的な抗体をコードするハイブリドーマを、受託番号ＰＴＡ−１２８７１及びＰＴＡ−１２８７２でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託した。米国特許第８，７１５，６６２号は、受託番号ＰＤ０８０１９、ＰＤ０８０２０及びＰＤ０８０２１で、ＡＩＤ−ＩＣＬＣ（Ｇｅｎｏａ、Ｉｔａｌｙ）に寄託されたハイブリドーマにより産生される抗Ｔｒｏｐ−２抗体を開示している。米国出願公開番号２０１２０２３７５１８は、抗Ｔｒｏｐ−２抗体７７２２０、ＫＭ４０９７及びＫＭ４５９０を開示する。米国特許第８，３０９，０９４号（Ｗｙｅｔｈ）は、配列表により同定される抗体Ａ１及びＡ３を開示する。この段落において上記で引用した各特許または特許出願の実施例部分は、本明細書の一部として本願に援用される。非特許文献については、Ｌｉｐｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，７８：５１４７−５０）は、抗Ｔｒｏｐ−２抗体１６２−２５．３及び１６２−４６．２を開示した。より最近になって、ＰｒｌＥ１１抗Ｔｒｏｐ−２抗体は、Ｔｒｏｐ−２上の独特のエピトープを認識することが報告された（Ｉｋｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍ  ４５８：８７７−８２）。
【００３８】
多くの抗Ｔｒｏｐ−２抗体が当該技術において既知であり、及び／または公に利用可能である。以下述べるように、既知の抗原に対する抗体を調製するための方法は、当技術においては日常的なものあった。ヒトＴｒｏｐ−２タンパク質の配列も当技術において知られていた（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＣＡＡ５４８０１．１参照）。ヒト化抗体、ヒト抗体またはキメラ抗体を産生するための方法もまた知られていた。当該技術における一般的な知識に照らして、本開示を読む当業者は、抗Ｔｒｏｐ−２抗体の属を作製し、使用することができたであろう。
【００３９】
上記で述べた先行研究は何れも、Ｔｒｏｐ−２陽性ＣＴＣを単離または検出するために、抗Ｔｒｏｐ−２抗体を使用することの開示を含んでいなかった。Ｔｒｏｐ−２陽性ＣＴＣを濃縮、単離、検出、診断及び／または特徴付けるための組成物及び方法の必要性が存在している。
【００４０】
循環腫瘍細胞の単離及び検出
抗Ｔｒｏｐ−２抗体は、ＣＴＣの単離及び検出のための何れか既知の技術を使用して、Ｔｒｏｐ−２陽性ＣＴＣを濃縮、単離、検出及び／または診断するために利用することができる。多くのシステムが開発され、ＣＴＣ検出のために商業的に入手可能である。多くは特異的な抗ＥｐＣＡＭ抗体を使用して開発されたが、その代わりに、抗Ｔｒｏｐ−２抗体を利用するように組成及び方法を改変することができる。従って、Ｔｒｏｐ−２陽性ＣＴＣの単離及び検出は、そのような既知のシステム、または細胞単離及び検出の更に伝統的な方法を用いて実施することができる。そのような既知の技術の非限定的な例を以下に説明する。
【００４１】
本発明は、親和性に基づく濃縮ステップを伴って、並びにＭＡＩＮＴＲＡＣ（登録商標）（Ｐａｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００５、Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，７：Ｒ９７５）のような、濃縮ステップを伴わない方法と共に使用することができる。親和性に基づく濃縮のための磁気素子を使用する方法には、ＣＥＬＬＳＥＡＲＣＨ（登録商標）システム（Ｖｅｒｉｄｅｘ）、ＬＩＱＵＩＤＢＩＯＰＳＹ（登録商標）プラットフォーム（Ｃｙｎｖｅｎｉｏ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）及びＭａｇＳｗｅｅｐｅｒ素子（Ｔａｌａｓａｚ  ｅｔ  ａｌ，ＰＮＡＳ，２００９，１０６：３９７０）が含まれる。親和性に基づく濃縮のために磁気素子を使用しない方法には、ＣＴＣチップ（Ｓｔｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ，２：２５ｒａ２３）、ＨＢチップ（Ｓｔｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，ＰＮＡＳ，１０７：１８３９２）、ＮａｎｏＶｅｌｃｒｏチップ（Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｍｅｔｈｏｄｓ，６４：１４４）、ＧＥＤＩマイクロ素子（Ｋｉｒｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，ＰＬｏＳ  ＯＮＥ，７：ｅ３５９７６）、及びＢｉｏｃｅｐｔのＯＮＣＯＣＥＥ（商標）技術（Ｐｅｃｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｉｓｃｏｖ，１：５８０）のような種々の製造されたマイクロ流体素子が含まれる。
【００４２】
非小細胞肺癌患者及び小細胞肺癌患者におけるＣＴＣ検出のための、ＦＤＡに承認されたＣＥＬＬＳＥＡＲＣＨ（登録商標）システムの使用が、Ｔｒｕｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４，Ｆｒｏｎｔ  Ｏｎｃｏｌ  ４：２４２）において述べられている。末梢血の試料７．５ｍＬを、抗ＥｐＣＡＭ抗体で被覆した磁性鉄ナノ粒子と混合する。強い磁場を用いて、ＥｐＣＡＭ陽性細胞をＥｐＣＡＭ陰性細胞から分離する。結合したＣＴＣの検出は、細胞核のＤＡＰＩ（４´，６´ジアミジノ−２−フェニルインドール）蛍光標識と共に、蛍光標識された抗ＣＫ及び抗ＣＤ４５抗体を用いて行った。ＣＴＣは、蛍光検出によってＣＫ陽性、ＣＤ４５陰性及びＤＡＰＩ陽性として同定された。
【００４３】
ＶｅｒＩＦＡＳＴシステムを、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）における循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）の診断及び薬力学的分析に使用した（Ｃａｓａｖａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ  １３：３９１−６；２０１４，Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ  １４：９９−１０５）。ＶｅｒｌＦＡＳＴプラットフォームは、微小スケールでの重力に対する表面張力の相対的優位性を利用して、非混和相を並べてロードする。これは、隣接するチャンバ内の水フィールド及び油フィールドをピンで繋ぎ、２つの水性ウェルの間に仮想フィルターを作成する（Ｃａｓａｖａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ  １３：３９１−６）。結合した抗体または他の標的化部分を備えた常磁性粒子（ＰＭＰ）を使用して、特定の細胞集団を標的とし、油性障壁の単純な横断を介して複雑なバックグラウンドから単離することができる。ＮＳＣＬＣの例では、ストレプトアビジンをＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）、ＦＬＯＷＣＯＭＰ（商標）ＰＭＰ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＵＳＡ）に複合体化し、ビオチン化抗ＥｐＣＡＭ抗体を用いて細胞を捕捉した。手持ち式の磁石を使用して、ＰＭＰに結合したＣＴＣを水性チャンバ間で移動させた。収集されたＣＴＣは、ＰＭＰ解放バッファー（ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標））を用いて解放され、またＥｐＣＡＭ、ＥＧＦＲまたは転写終結因子（ＴＴＦ−１）について染色された。
【００４４】
ＶｅｒｌＦＡＳＴプラットフォームは、微孔質膜を水性チャンバに一体化して、細胞移動または遠心分離を必要とせずに複数の流体移動を可能にする。マクロスケール技術と比較して高い精度を可能にする物理的特性スケールを用いれば、このような微小流体技術は、最小の試料損失でＣＴＣを捕捉し、評価するのために十分に適合されている。ＶｅｒｌＦＡＳＴプラットフォームは、ＮＳＣＬＣ患者の血液からＣＴＣを効果的に捕捉した。
【００４５】
ＧＩＬＵＰＩ  ＣＥＬＬＣＯＬＬＥＣＴＯＲ（商標）（Ｓａｕｃｅｄｏ−Ｚｅｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｎｃｏｌ  ４１：１２４１−５０）は、キメラ抗ＥｐＣＡＭ抗体でコーティングされた官能化医療用セルジンガー案内ワイヤー（ＦＳＭＷ）に基づいている。この案内ワイヤは、ＥＤＣ及びＮＨＳで活性化されたポリカルボキシレートヒドロゲル層で官能化されて、抗体の共有結合が可能とされている。この抗体被覆されたＦＳＭＷを、標準静脈カニューレを介して３０分間、乳癌またはＮＳＣＬＣ肺癌患者の肘静脈に挿入した。案内ワイヤへの細胞の結合後、ＥｐＣＡＭ及び／またはサイトケラチンの免疫細胞化学的染色及び核染色によってＣＴＣを同定した。蛍光標識は、ＡｘｉｏＣａｍデジタルカメラシステム及びＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎ４．６ソフトウェアを備えた、Ａｘｉｏ  Ｉｍａｇｅｒ．Ａｌｍ顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ，Ｊｅｎａ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて解析された。当該ＦＳＭＷシステムは、遠隔転移が未だ診断されていない初期の癌患者を含む２４人の患者のうち２２人から、ＥｐＣＡＭ陽性ＣＴＣを濃縮することができた。健康なボランティアではＣＴＣは検出されなかった。ＦＳＭＷシステムの利点は、ＣＥＬＬＳＥＡＲＣＨ（登録商標）システムのような別の方法を使用して処理され得るエクスビボ血液試料の量によって制限されないことである。３０分間の露出中にＦＳＭＷと接触した推定血液量は、１．５〜３リットルであった。
【００４６】
ＭａｇＳｗｅｅｐｅｒ装置（例えば、Ｐｏｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ７：ｅ３３７８８）は、ＣＴＣ検出のための抗体被覆磁気粒子を利用する別のシステムである。９ミリリットルの全血を、ＢｅｒＥＰ４抗ＥｐＣＡＭ抗体でコーティングされた４．５μＭのＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）を用いて、室温で１時間、エクスビボで混合した。ＰＢＳで希釈した後、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）に結合した細胞を、スイーピング磁気装置（ＭａｇＳｗｅｅｐｅｒ，Ｐｏｗｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２の図１参照）によって捕捉した。非特異的に結合した白血球及びＲＢＣを放出した制御された剪断力を用いて、２サイクルの補色−洗浄−放出を行った。捕獲された細胞を新鮮な緩衝液中に解放し、ＡｘｉｏオブザーバＡｌ倒立顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）を用いて検査した。チップに基づく高処理量ｑＲＴ−ＰＣＲによる８７遺伝子の発現解析に先立って、単一のＣＴＣを手動で吸引し、凍結保存した。
【００４７】
Ｇｕｐｔａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２，Ｂｉｏｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ  ６：２４１３３）は、ＣＴＣの収集及び分析のためのＡＰＯＳＴＲＥＡＭ（商標）誘電泳動装置の使用について述べた。ＣＴＣを捕捉するために、誘電泳動（ＤＥＰ）技術を用いてマイクロ流体流チャンバが使用される（図１、Ｇｕｐｔａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２参照）。当該システムは、フロースルー分離及び末梢血からのＣＴＣの濃縮のために、連続モードで操作することができる。ＤＥＰは、形態学的特性及び電気伝導度の差から生じる異なる細胞型の周波数依存的誘電特性を利用して、異なる生物物理学的特性を有する細胞を分類する。これらの差異は、マイクロ流体チャンバ内において、ＣＴＣ及び正常細胞の異なる周波数依存的移動をもたらす。４５〜８５ｋＨｚの範囲のＡＣ周波数で、癌細胞は正（引力）のＤＥＰ力を受け、これにより当該細胞は電極面に向かって移動し、チャンバを通る流体力学的流れから離れる。同じ周波数において、正常細胞は負（斥力）のＤＥＰ力を受け、これは当該細胞を流体力学的な流速プロファイルへ、及びチャンバの外へと移動させる。収集ポートを用いて、分離されたＣＴＣを更なる分析のために取り出す。最初の最適化研究のために、培養された癌細胞を正常血液単核細胞に添加し、７０％以上の効率で回収した。Ｇｕｐｔａによって開示されたＡＰＯＳＴＲＥＡＭ（商標）システムは捕捉抗体を使用しないが、本発明の抗Ｔｒｏｐ−２抗体は、ＣＴＣ分離の効率を高め、及び／または単離されたＣＴＣの分離後の特徴付けのために潜在的に利用され得る。
【００４８】
Ｗｉｎｅｒ−Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４，  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ９：ｅ８６７１７）は、ＣＴＣｓの分離及び特性決定のための、ＬＩＱＵＩＤＢＩＯＰＳＹ（登録商標）システムの使用を述べた。このＬＩＱＵＩＤＢＩＯＰＳＹ（登録商標）システムは、捕捉剤として抗ＥｐＣＡＭ抗体と組み合わせて、フローセルを通る高処理量シースフロー微小流体技術を使用する。ビオチン化された抗ＥｐＣＡＭを、ストレプトアビジン被覆したＩＭＡＧ（商標）ビーズ（ＢＤ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）に結合させ、ＣＦＳＥまたはＦＩＴＣで標識した添加された腫瘍細胞を含む血液試料と混合した。正常な有核細胞をＤＡＰＩで標識した。抗体結合後、ガラススライドに取り付けたＣＴＣフローセル上で当該血液試料を処理した。外部磁場を用いてガラス表面上の磁気ビーズに結合されＣＴＣを捕捉し、正常細胞を含む層流からそれらを分離する。エクリプス（Ｅｃｌｉｐｓｅ）Ｅ８０ｉ蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，ＮＹ）を用いて、捕捉された細胞を計数した。
【００４９】
当業者であれば、これらのシステムの何れも、またはＣＴＣの濃縮及び／または単離のための何れの他の既知のシステムも、ＣＴＣの濃縮、単離、検出及び／または特徴付けのために、本抗Ｔｒｏｐ−２抗体と共に使用してよいことを理解するであろう。抗Ｔｒｏｐ−２捕獲抗体が利用される場合、結合されたＣＴＣは、異なるＴｒｏｐ−２エピトープに対する、または他の既知の腫瘍関連抗原に対する標識抗体を使用して、検出及び／または特徴付けすることができ、これには炭酸脱水素酵素ＩＸ、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２１、ＣＳＡｐ、ＣＤ１、ＣＤ１ａ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１１Ａ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＩＧＦ−１Ｒ、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ６４、ＣＤ６６ａ−ｅ、ＣＤ６７、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ９５、ＣＤ１２６、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１４７、ＣＤ１５４、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ７、ＣＸＣＬ１２、ＨＩＦ−１−α、ＡＦＰ、ＰＳＭＡ、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＥＡＣＡＭ−６、ｃ−ｍｅｔ、Ｂ７、フィブロネクチンのＥＤ−Ｂ、ファクターＨ、ＦＨＬ−１、Ｆｌｔ−３、葉酸受容体、ＧＲＯＢ、ＨＭＧＢ−１、低酸素誘導因子（ＨＩＦ）、インスリン様成長因子−１（ＩＬＧＦ−１）、ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＬ−２、ＩＬ−４Ｒ、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−１３Ｒ、ＩＬ−１５Ｒ、ＩＬ−１７Ｒ、ＩＬ−１８Ｒ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２５、ＩＰ−１０、ＭＡＧＥ、ｍＣＲＰ、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１Ａ、ＭＩＰ−１Ｂ、ＭＩＦ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５ａｃ、ＮＣＡ−９５、ＮＣＡ−９０、Ｉａ、ＥＧＰ−１、ＥＧＰ−２、ＨＬＡ−ＤＲ、テネイシン、Ｌｅ（ｙ）、ＲＡＮＴＥＳ、Ｔ１０１、ＴＡＣ、Ｔｎ抗原、トムソン−フリーデンライヒ抗原、腫瘍壊死抗原、ＴＮＦ−α、ＴＲＡＩＬ受容体（Ｒ１及びＲ２）、ＶＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ、Ｐ１ＧＦ、補体因子Ｃ３、Ｃ３ａ、Ｃ３ｂ、Ｃ５ａ、及びＣ５が含まれるが、これらに限定されない。
【００５０】
抗体の調製
実質的に任意の標的抗原、例えばＴｒｏｐ−２に対するモノクローナル抗体を調製するための技術は、当技術分野で周知である。例えば、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５（１９７５）、及びＣｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，ＶＯＬ．１，ｐａｇｅｓ  ２．５．１−２．６．７（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  １９９１）を参照されたい。簡単に言えば、モノクローナル抗体は、抗原を含む組成物をマウスに注射すること、脾臓を除去してＢリンパ球を得ること、当該Ｂリンパ球をミエローマ細胞と融合させてハイブリドーマを産生すること、当該ハイブリドーマをクローニングすること、当該抗原に対する抗体を産生する陽性クローンを選択すること、当該抗原に対する抗体を産生するクローンを培養すること、及び当該ハイブリドーマ培養物から当該抗体を単離することによって得ることができる。
【００５１】
ＭＡｂは、十分に確立された種々の技術によって、ハイブリドーマ培養物から単離及び精製することができる。そのような単離技術には、プロテインＡまたはプロテインＧセファロースによるアフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、及びイオン交換クロマトグラフィーが含まれる。例えば、Ｃｏｌｉｇａｎの２．７．１〜２．７．１２頁ージ及び２．９．１〜２．９．３頁を参照されたい。また、Ｂａｉｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．「免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の精製」、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，ＶＯＬ．１０、７９〜１０４頁（Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９２）も参照されたい。
【００５２】
免疫原に対する抗体の最初の生成の後、当該抗体は配列決定され、続いて組換え技術により調製され得る。マウス抗体及び抗体断片のヒト化及びキメラ化は、以下に述べるように、当業者に周知である。
【００５３】
キメラ抗体
キメラ抗体は、ヒト抗体の可変領域が、例えば、マウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むマウス抗体の可変領域により置換されている組換えタンパク質である。キメラ抗体は、対象に投与された場合に減少した免疫原性及び増大した安定性を示す。マウス免疫グロブリン可変ドメインをクローニングするための一般的な技術は、例えば、Ｏｒｌａｎｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ６：３８３３（１９８９）．に開示されている。キメラ抗体を構築する技術は、当業者に周知である。一例として、Ｌｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  １３：４６９（１９９４）は、抗ＣＤ２２モノクローナル抗体であるマウスＬＬ２のＶκ及びＶＨドメインをコードするＤＮＡ配列を、それぞれヒトκ及びＩｇＧ１定常領域ドメインと組み合わせることによってＬＬ２キメラを製造した。
【００５４】
ヒト化抗体
ヒト化ＭＡｂを産生する技術は、当技術分野で周知である（例えば、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２（１９８６），Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３（１９８８），Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４（１９８８），Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ´ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：４２８５（１９９２），Ｓａｎｄｈｕ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１２：４３７（１９９２），及びＳｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．１５０：２８４４（１９９３）を参照されたい）。キメラまたはマウスモノクローナル抗体は、マウス免疫グロブリンにおける重鎖及び軽鎖の可変鎖由来マウスＣＤＲを、ヒト抗体の対応する可変ドメインに移植することによってヒト化され得る。キメラモノクローナル抗体中のマウスフレームワーク領域（ＦＲ）もまた、ヒトＦＲ配列で置換される。マウスＣＤＲをヒトＦＲに単に移植するだけで、しばしば抗体親和性の低下または消失が生じるので、マウス抗体の本来の親和性を回復させるために追加の修飾が必要となる可能性がある。これは、そのエピトープに対して良好な結合親和性を有する抗体を得るために、ＦＲ領域中の１以上のヒト残基をそのマウス対応物で置換することにより達成できる。例えば、Ｔｅｍｐｅｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：２６６（１９９１）及びＶｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４（１９８８）を参照されたい。好ましい置換残基には、ＣＤＲ残基側鎖の１，２または３オングストローム以内に位置するか、ＣＤＲ配列に隣接して位置するか、またはＣＤＲ残基と相互作用すると予測されるＦＲ残基が含まれる。
【００５５】
ヒト抗体
コンビナトリアルアプローチ、またはヒト免疫グロブリン遺伝子座において形質転換されたトランスジェニック動物の何れかを用いて、完全なヒト抗体を産生する方法は当技術において知られている（例えば、Ｍａｎｃｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｎｅｗ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２７：３１５〜２８；Ｃｏｎｒａｄ  ａｎｄ  Ｓｃｈｅｌｌｅｒ，２００５，Ｃｏｍｂ．Ｃｈｅｍ．Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎ．８：１１７〜２６；Ｂｒｅｋｋｅ  ａｎｄ  Ｌｏｓｅｔ，２００３，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３：５４４〜５０）。完全ヒト抗体はまた、遺伝子または染色体トランスフェクション法、ならびにファージディスプレイ技術によっても構築することができ、これらの技術は何れも当該技術において知られている。例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２〜５５３（１９９０）を参照されたい。抗体が、例えばＴｒｏｐ−２陽性癌の検出後の腫瘍療法においてインビボで利用される場合、このような完全ヒト抗体は、キメラ抗体またはヒト化抗体よりも副作用が更に少なく、本質的に内因性のヒト抗体としてインビボで機能することが期待される。
【００５６】
１つの代替法では、ファージディスプレイ技術を用いて、ヒト抗体を生成させることができる（例えば、Ｄａｎｔａｓ−Ｂａｒｂｏｓａ  ｅｔ  ａｌ．，２００５、Ｇｅｎｅｔ．Ｍｏｌ．Ｒｅｓ．４：１２６〜４０）。ヒト抗体は、正常なヒトまたは癌等の特定の疾患状態を示すヒトから生成され得る（Ｄａｎｔａｓ−Ｂａｒｂｏｓａ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。罹患した個体からヒト抗体を構築する利点は、循環抗体レパートリーが疾患関連抗原に対する抗体に偏っている可能性がある点である。
【００５７】
この方法の１つの非限定的な例において、Ｄａｎｔａｓ−Ｂａｒｂｏｓａ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）は、骨肉腫患者由来のヒトＦａｂ抗体断片のファージディスプレイライブラリーを構築した。一般に、総ＲＮＡは循環血液リンパ球から得られた（同上）。組換えＦａｂをμ、γ及びκ鎖抗体レパートリーからクローニングし、ファージディスプレイライブラリーに挿入した（同上）。ＲＮＡをｃＤＮＡに変換し、重鎖及び軽鎖免疫グロブリン配列に対する特異的プライマーを用いてＦａｂ・ｃＤＮＡライブラリーを作製するために使用した（Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１〜９７）。ライブラリーの構築は、Ａｎｄｒｉｓ−Ｗｉｄｈｏｐｆ  ｅｔ  ａｌ．（２０００，Ｉｎ：Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ），１ｓｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ  ｐｐ．９．１〜９．２２）に従って実施した。最終Ｆａｂ断片を制限エンドヌクレアーゼで消化し、バクテリオファージゲノムに挿入して、ファージディスプレイライブラリーを作製した。このようなライブラリーは、当該技術で知られた標準的なファージディスプレイ法によってスクリーニングすることができる。ファージディスプレイは、様々な形式で実施することができる。それらの概説については、  例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈｉｓｗｅｌｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３：５５６４〜５７１（１９９３）を参照されたい。
【００５８】
ヒト抗体は、インビトロで活性化されたＢ細胞によっても生成され得る。その全体をする米国特許第５，５６７，６１０号及び第５，２２９，２７５号を参照されたい（参照により本明細書に援用）。当業者は、これらの技術が例示的であり、ヒト抗体または抗体断片を作製及びスクリーニングするための何れか既知の方法を利用できることを理解するであろう。
【００５９】
別の代替法では、ヒト抗体を産生するように遺伝子操作されたトランスジェニック動物を、標準的な免疫化プロトコールを使用して、実質上任意の免疫原性標的に対する抗体を生成させるために使用することができる。トランスジェニックマウスからヒト抗体を得る方法は、Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．７：１３（１９９４），Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６（１９９４），及びＴａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎ．６：５７９（１９９４）によって開示されている。このような系の非限定的な例は、Ａｂｇｅｎｉｘ（Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）から提供されるＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）（例えば、されるＧｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３１：１１〜２３、参照により本明細書に援用）である。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）及び類似の動物ではマウス抗体遺伝子が不活性化され、機能的なヒト抗体遺伝子により置換される一方、残りのマウス免疫系は無傷のままである。
【００６０】
ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）は、生殖系列構成のＹＡＣ（酵母人工染色体）で形質転換されたが、当該ＹＡＣはアクセサリー遺伝子及び調節配列と共に、可変領域配列の大部分を含んだヒトＩｇＨ及びＩｇカッパ遺伝子座の部分を含んでいる。ヒト可変領域レパートリーは、既知の技術によりハイブリドーマへとプロセシングし得る抗体産生Ｂ細胞を生成するために使用できる。標的抗原で免疫化されたＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）は、正常な免疫応答によってヒト抗体を産生し、当該抗体は上記の標準的技術により採取及び／または製造し得る。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）の種々の株が利用可能であり、それぞれが異なるクラスの抗体を産生できる。遺伝子導入で作製されたヒト抗体は治療可能性を有することが示されており、正常なヒト抗体の薬物動態学的特性を保持している（Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。特許請求の範囲に記載の組成物及び方法は、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）システムの使用に限定されず、ヒト抗体を産生するように遺伝子操作された任意のトランスジェニック動物を利用し得ることを、当業者は理解するであろう。
【００６１】
既知の抗体及び標的抗原
上述のように、ある特定の代替実施形態において、抗Ｔｒｏｐ−２抗体は、循環Ｔｒｏｐ−２陽性腫瘍細胞の検出後に、Ｔｒｏｐ−２発現癌を治療するために使用される。幾つかの実施形態において、標的癌は、腫瘍療法の標的とされ得る１以上の追加の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を発現し得る。癌の治療のために使用され得る特定の抗体には、ＬＬ１（抗ＣＤ７４）、ＬＬ２もしくはＲＦＢ４（抗ＣＤ２２）、ベルツズマブ（ｈＡ２０、抗ＣＤ２０）、リツキシマブ（抗ＣＤ２０）、及びオビヌツズマブ（ＧＡ１０１、抗ＣＤ２０）、ランブロリズマブ（抗ＰＤ−１受容体）、ニボルマブ（抗ＰＤ−１受容体）、イピリムマブ（抗ＣＴＬＡ−４）、ＲＳ７（抗上皮糖タンパク質−１（ＥＧＰ−１、Ｔｒｏｐ−２としても知られる））、ＰＡＭ４もしくはＫＣ４（両方とも抗ムチン）、ＭＮ−１４（抗癌胎児性抗原（ＣＥＡ、ＣＤ６６ｅまたはＣＥＡＣＡＭ５としても知られる））、ＭＮ−１５もしくはＭＮ−３（抗ＣＥＡＣＡＭ６）、Ｍｕ−９（抗結腸特異的抗原−ｐ）、Ｉｍｍｕ３１（抗アルファフェトプロテイン）、Ｒ１（抗ＩＧＦ−１Ｒ）、Ａ１９（抗ＣＤ１９）、ＴＡＧ７２（例えばＣＣ４９）、Ｔｎ、Ｊ５９１もしくはＨｕＪ５９１（抗ＰＳＭＡ（前立腺特異的膜抗原））、ＡＢ−ＰＧ１−ＸＧ１−０２６（抗ＰＳＭＡ二量体）、Ｄ２／Ｂ（抗ＰＳＭＡ）、Ｇ２５０（抗炭酸脱水素酵素ＩＸ・ＭＡｂ）、Ｌ２４３（抗ＨＬＡ−ＤＲ）、アレムツズマブ（抗ＣＤ５２）、ベバシツマブ（抗ＶＥＧＦ）、セツキシマブ（抗ＥＧＦＲ）、ゲムツズマブ（抗ＣＤ３３）、イブリツモマブ・チウキセタン（ｉｂｒｉｔｕｍｏｍａｂ  ｔｉｕｘｅｔａｎ：抗ＣＤ２０）；パニツムマブ（抗ＥＧＦＲ）；トシツモマブ（抗ＣＤ２０）；ＰＡＭ４（別名クリバツズマブ、抗ムチン）及びトラスツズマブ（抗ＥｒｂＢ２）が含まれるが、これらに限定されない。このような抗体は当該技術において知られている（例えば、米国特許番号５，６８６，０７２；５，８７４，５４０；６，１０７，０９０；６，１８３，７４４；６，３０６，３９３；６，６５３，１０４；６，７３０．３００；６，８９９，８６４；６，９２６，８９３；６，９６２，７０２；７，０７４，４０３；７，２３０，０８４；７，２３８，７８５；７，２３８，７８６；７，２５６，００４；７，２８２，５６７；７，３００，６５５；７，３１２，３１８；７，５８５，４９１；７，６１２，１８０；７，６４２，２３９；及び米国特許出願公開番号２００５０２７１６７１；２００６０１９３８６５；２００６０２１０４７５；２００７００８７００１：これらの各々の実施例部分を参照により本明細書に援用する）。使用される特定の既知抗体には、ｈＰＡＭ４（米国特許第７，２８２，５６７号）、ｈＡ２０（米国特許第７，２５１，１６４号）、ｈＡ１９（米国特許第７，１０９，３０４号）、ｈＩＭＭＵ−３１（米国特許第７，３００，６５５号）、ｈＬＬ１（米国特許第７，３１２，３１８号）、ｈＬＬ２（米国特許第７，０７４，４０３号）、ｈＭｕ−９（米国特許第７，３８７，７７３号）、ｈＬ２４３（米国特許第７，６１２，１８０号）、ｈＭＮ−１４（米国特許第６，６７６，９２４号）、ｈＭＮ−１５（米国特許第７，５４１，４４０号）���ｈＲ１（米国特許出願第１２／７７２，６４５号）、ｈＲＳ７（米国特許第７，２３８，７８５号）、ｈＭＮ−３（米国特許第７，５４１，４４０号）、ＡＢ−ＰＧ１−ＸＧ１−０２６（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４４０５及びＰＴＡ−４４０６として寄託された米国特許出願第１１／９８３，３７２号）、及びＤ２／Ｂ（ＷＯ  ２００９／１３０５７５）が含まれ、各引用された特許または出願のテキストは、図及び実施例の部分に関して参照により本明細書に援用する。
【００６２】
使用される代替の抗体には、アブシキシマブ（抗糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ）、アレムツズマブ（抗ＣＤ５２）、ベバシズマブ（抗ＶＥＧＦ）、セツキシマブ（抗ＥＧＦＲ）、ゲムツズマブ（抗ＣＤ３３）、イブリツモマブ（抗ＣＤ２０）、パニツムマブ（抗ＥＧＦＲ）、リツキシマブ（抗ＣＤ２０）、トシツモマブ（抗ＣＤ２０）、トラスツズマブ（抗ＥｒｂＢ２）、ラムブロリズマブ（抗ＰＤ−１受容体）、ニボルマブ（抗ＰＤ−１受容体）、イピリムマブ（抗ＣＴＬＡ４）、アバゴボマブ（抗ＣＡ１２５）、アデカツムマブ（抗ＥｐＣＡＭ）、アトリツマブ（抗ＩＬ−６受容体）、ベナラリズマブ（抗ＣＤ１２５）、オビヌツズマブ（ＧＡ１０１、抗ＣＤ２０）、ＣＣ４９（抗ＴＡＧ−７２）、ＡＢ−ＰＧ１−ＸＧ１−０２６（抗ＰＳＭＡ、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４４０５及びＰＴＡ−４４０６として寄託された米国特許出願第１１／９８３，３７２号）、Ｄ２／Ｂ（抗ＰＳＭＡ，ＷＯ２００９／１３０５７５）、トチリズマブ（抗ＩＬ−６受容体）、バシリキシマブ（抗ＣＤ２５）、ダクリズマブ（抗ＣＤ２５）、エファリズマブ（ａｎｔｉ−ＣＤ１１ａ）、ＧＡ１０１（抗ＣＤ２０；Ｇｌｙｃａｒｔ  Ｒｏｃｈｅ）、ムロモナブＣＤ３（抗ＣＤ３受容体）、ナタリズマブ（抗α４インテグリン）、オマリズマブ（抗ＩｇＥ）、ＣＤＰ５７１のような抗ＴＮＦ−α抗体（Ｏｆｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ４５：８８１−８５）、ＭＴＮＦＡＩ、Ｍ２ＴＮＦＡＩ、Ｍ３ＴＮＦＡＩ、Ｍ３ＴＮＦＡＢＩ、Ｍ３０２Ｂ、Ｍ３０３（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）、インフリキシマブ（Ｃｅｎｔｏｃｏｒ，Ｍａｌｖｅｒｎ，ＰＡ）、セルトリズマブｐｅｇｏｌ（ＵＣＢ，Ｂｒｕｓｓｅｌｓ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）、抗ＣＤ４０Ｌ（ＵＣＢ，Ｂｒｕｓｓｅｌｓ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）、アダリムマブ（Ａｂｂｏｔｔ，Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，ＩＬ）、及びベンリスタ（Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）が含まれるが、これらに限定されない。
【００６３】
標的とされ得る他の有用な腫瘍関連抗原には、炭酸脱水酵素ＩＸ、Ｂ７、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２１、ＣＳＡｐ、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＢｒＥ３、ＣＤ１、ＣＤ１ａ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１１Ａ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０（例えば、Ｃ２Ｂ８、ｈＡ２０、１Ｆ５・ＭＡｂｓ）、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ４７、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ６４、ＣＤ６７、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ９５、ＣＤ１２６、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１４７、ＣＤ１５４、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＥＡＣＡＭ６、ＣＴＬＡ−４、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、ＶＥＧＦ（例えば、ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）、フィブロネクチンのスプライス変異体）、ＥＤ−Ｂフィブロネクチン（例えば、Ｌ１９）、ＥＧＰ−１（Ｔｒｏｐ−２）、ＥＧＰ−２（例えば、１７−１Ａ）、ＥＧＦ受容体（ＥｒｂＢ１）（例えば、ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標））、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ファクターＨ、ＦＨＬ−１、Ｆｌｔ−３、葉酸受容体、Ｇａ７３３，ＧＲＯ−β、ＨＭＧＢ−１、低酸素誘導因子（ＨＩＦ）、ＨＭ１．２４、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ヒストンＨ２Ｂ、ヒストンＨ３、ヒストンＨ４、インスリン様増殖因子（ＩＬＧＦ）、ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−λ、ＩＬ−２Ｒ、ＩＬ−４Ｒ、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−１３Ｒ、ＩＬ−１５Ｒ、ＩＬ−１７Ｒ、ＩＬ−１８Ｒ、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２５、ＩＰ−１０、ＩＧＦ−１Ｒ、Ｉａ、ＨＭ１．２４、ガングリオシド、ＨＣＧ、Ｌ２４３が結合するＨＬＡ−ＤＲ抗原、ＣＤ６６抗原、即ち、ＣＤ６６ａ−ｄまたはその組み合わせ、ＭＡＧＥ、ｍＣＲＰ、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１Ａ、ＭＩＰ−１Ｂ、マクロファージ遊走阻害因子（ＭＩＦ）、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５ａｃ、胎盤成長因子（ＰｌＧＦ）、ＰＳＡ（前立腺特異的抗原）、ＰＳＭＡ、ＰＡＭ４抗原、ＰＤ−１受容体、ＰＤ−Ｌ１、ＮＣＡ−９５、ＮＣＡ−９０、Ａ３、Ａ３３、Ｅｐ−ＣＡＭ、ＫＳ−１、Ｌｅ（ｙ）、メソテリン、Ｓ１００、テネイシン、ＴＡＣ、Ｔｎ抗原、トーマス−フリーデンライヒ抗原、腫瘍壊死抗原、腫瘍血管新生抗原、ＴＮＦ−α、ＴＲＡＩＬ受容体（Ｒ１及びＲ２）、Ｔｒｏｐ−２、ＶＥＧＦＲ、ＲＡＮＴＥＳ、Ｔ１０１、並びに癌幹細胞抗原、補体因子Ｃ３、Ｃ３ａ、Ｃ３ｂ、Ｃ５ａ、Ｃ５、及び癌遺伝子産物が含まれる。
【００６４】
より治療抵抗性の前駆体悪性細胞集団とみなされる癌幹細胞（Ｈｉｌｌ  ａｎｄ  Ｐｅｒｒｉｓ，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．２００７；９９：１４３５−４０）は、特定の癌で標的とされ得る抗原、例えば、前立腺癌（Ｍａｉｔｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｒｎｓｔ  Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｆｏｕｎｄ．Ｓｙｍｐｏｓ．Ｐｒｏｃ．２００６；５：１５５−７９）、非小細胞肺癌（Ｄｏｎｎｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ２００７；１２３（３）：３８５−９１）、及びグリア芽細胞腫（Ｂｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００７；６７（９）：４０１０−５）におけるＣＤ１３３、並びに結腸直腸癌（（Ｄａｌｅｒｂａ  ｅｒ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ２００７；１０４（２４）１０１５８−６３）、膵癌（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００７；６７（３）：１０３０−７）、頭頸部扁平上皮癌（Ｐｒｉｎｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ２００７；１０４（３）９７３−８）におけるＣＤ４４を有する。乳癌治療のための別の有用な標的は、Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．によって記載されたＬＩＶ−１抗原である（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２００３；３７５：５１−９）。
【００６５】
チェックポイント阻害剤抗体は、癌治療において使用されている。免疫チェックポイントは、自己寛容を維持し、末梢組織損傷を最小限に抑えるために免疫系応答の程度を調節することに関与する、免疫系における阻害経路を指す。しかしながら、腫瘍細胞も、免疫系チェックポイントを活性化して、腫瘍組織に対する免疫応答の有効性を減少させることもできる。細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ４、ＣＤ１５２としても知られる）、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ１、ＣＤ２７９としても知られる）、プログラム細胞死１リガンド１（ＰＤ−Ｌ１、ＣＤ２７４としても知られている）、およびプログラム細胞死１リガンド２（ＰＤ−Ｌ２）（Ｌａｔｃｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２：２６１−８）に対する例示的チェックポイント阻害剤抗体は、疾患細胞、組織または病原体に対する免疫応答の有効性を増強するために、１以上の他の薬剤と組み合わせて使用されてよい。例示的な抗ＰＤ１抗体には、ランブロリズマブ（ＭＫ−３４７５、ＭＥＲＣＫ）、ニボルマブ（ＢＭＳ−９３６５５８、ＢＲＩＳＴＯＬ−ＭＹＥＲＳ  ＳＱＵＩＢＢ）、ＡＭＰ−２２４（ＭＥＲＣＫ）及びピジリズマブ（ＣＴ−０１１、ＣＵＲＥＴＥＣＨ  ＬＴＤ）が含まれる。抗ＰＤ１抗体は、例えば、ＡＢＣＡＭ（登録商標）（ＡＢ１３７１３２）、ＢＩＯＬＥＧＥＮＤ（登録商標）（ＥＨ１２．２Ｈ７、ＲＭＰ１−１４）及びＡＦＦＹＭＥＴＲＩＸ  ＥＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ（Ｊ１０５、Ｊ１６６、ＭＩＨ４）から商業的に入手可能である。例示的な抗ＰＤ−Ｌ１抗体には、ＭＤＸ−１１０５（ＭＥＤＡＲＥＸ）、ＭＥＤＩ４７３６（ＭＥＤＩＭＭＵＮＥ）、ＭＰＤＬ３２８０Ａ（ＧＥＮＥＮＴＥＣＨ）及びＢＭＳ−９３６５５９（ＢＲＩＳＴＯＬ−ＭＹＥＲＳ  ＳＱＵＩＢＢ）が含まれる。抗ＰＤ−Ｌ１抗体はまた、例えば、ＡＦＦＹＭＥＴＲＩＸ  ＥＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ（ＭＩＨ１）から商業的に入手可能である。例示的な抗ＣＴＬＡ４抗体には、イピリムマブ（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）及びトレメリムマブ（ＰＦＩＺＥＲ）が含まれる。抗ＰＤ１抗体は、例えばＡＢＣＡＭ（登録商標）（ＡＢ１３４０９０）、ＳＩＮＯ  ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＩＮＣ．（１１１５９−Ｈ０３Ｈ、１１１５９−Ｈ０８Ｈ）及びサーモサイエンティフィックピアス（ＰＡ５−２９５７２、ＰＡ５−２３９７２、ＰＡ５−２６４６５、ＭＡ１−１２２０５、ＭＡ１−３５９１４）から商業的に入手可能である。イピリムマブは、最近、転移性黒色腫の治療のためのＦＤＡ承認を受けている（Ｗａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｊ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ  １１：８９）。
【００６６】
マクロファージ遊走阻害因子（ＭＩＦ）は、自然免疫及び適応免疫及びアポトーシスの重要な調節因子である。ＣＤ７４はＭＩＦの内因性受容体であることが報告されている（Ｌｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９７：１４６７−７６）。ＭＩＦ媒介細胞内経路に対する拮抗剤である抗ＣＤ７４抗体の治療効果は、広範囲の病状、例えば膀胱、前立腺、乳房、肺及び結腸の癌の治療のために使用し得る（例えば、Ｍｅｙｅｒ−Ｓｉｅｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，ＢＭＣ  Ｃａｎｃｅｒ  １２：３４；Ｓｈａｃｈａｒ  ＆  Ｈａｒａｎ，２０１１，Ｌｅｕｋ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ  ５２：１４４６−５４）。ミラツズマブ（ｈＬＬ１）は、ＭＩＦ媒介性疾患を治療するための治療的使用の例示的抗ＣＤ７４抗体である。
【００６７】
種々の他の抗体の使用が当該技術において知られている（例えば、米国特許第５，６８６，０７２号；同第５，８７４，５４０号；同第６，１０７，０９０号；同第６，１８３，７４４号；同第６，３０６，３９３号；同第６，６５３，１０４号；同第６，７３０．３００号；同第６，８９９，８６４号；同第６，９２６，８９３号；同第６，９６２，７０２号；同第７，０７４，４０３号；同第７，２３０，０８４号；同第７，２３８，７８５号；同第７，２３８，７８６号；同第７，２５６，００４号；同第７，２８２，５６７号；同第７，３００，６５５号；同第７，３１２，３１８号；同第７，５８５，４９１号；同第７，６１２，１８０号；同第７，６４２，２３９号、及び米国出願公開番号２００６０１９３８６５：それらの各々を参照により本明細書に援用する）。
【００６８】
使用する抗体は、広範囲の既知の供給源から商業的に入手することができる。例えば、種々の抗体を分泌するハイブリドーマ株を、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手可能である。腫瘍関連抗原を含む様々な疾患標的に対する多数の抗体がＡＴＣＣに寄託されており、及び／または可変領域配列を公表しており、本願特許請求の範囲に記載の方法及び組成物において使用するために利用可能である。例えば、米国特許番号７，３１２，３１８号；同第７，２８２，５６７号；同第７，１５１，１６４号；同第７，０７４，４０３号；同第７，０６０，８０２号；同第７，０５６，５０９号；同第７，０４９，０６０号；同第７，０４５，１３２号；同第７，０４１，８０３号；同第７，０４１，８０２号；同第７，０４１，２９３号；同第７，０３８，０１８号；同第７，０３７，４９８号；同第７，０１２，１３３号；同第７，００１，５９８号；同第６，９９８，４６８号；同第６，９９４，９７６号；同第６，９９４，８５２号；同第６，９８９，２４１号；同第６，９７４，８６３号；同第６，９６５，０１８号；同第６，９６４，８５４号；同第６，９６２，９８１号；同第６，９６２，８１３号；同第６，９５６，１０７号；同第６，９５１，９２４号；同第６，９４９，２４４号；同第６，９４６，１２９号；同第６，９４３，０２０号；同第６，９３９，５４７号；同第６，９２１，６４５号；同第６，９２１，６４５号；同第６，９２１，５３３号；同第６，９１９，４３３号；同第６，９１９，０７８号；同第６，９１６，４７５号；同第６，９０５，６８１号；同第６，８９９，８７９号；同第６，８９３，６２５号；同第６，８８７，４６８号；同第６，８８７，４６６号；同第６，８８４，５９４号；同第６，８８１，４０５号；同第６，８７８，８１２号；同第６，８７５，５８０号；同第６，８７２，５６８号；同第６，８６７，００６号；同第６，８６４，０６２号；同第６，８６１，５１１号；同第６，８６１，２２７号；同第６，８６１，２２６号；同第６，８３８，２８２号；同第６，８３５，５４９号；同第６，８３５，３７０号；同第６，８２４，７８０号；同第６，８２４，７７８号；同第６，８１２，２０６号；同第６，７９３，９２４号；同第６，７８３，７５８号；同第６，７７０，４５０号；同第６，７６７，７１１号；同第６，７６４，６８８号；同第６，７６４，６８１号；同第６，７６４，６７９号；同第６，７４３，８９８号；同第６，７３３，９８１号；同第６，７３０，３０７号；同第６，７２０，１５５号；同第６，７１６，９６６号；同第６，７０９，６５３号；同第６，６９３，１７６号；同第６，６９２，９０８号；同第６，６８９，６０７号；同第６，６８９，３６２号；同第６，６８９，３５５号；同第６，６８２，７３７号；同第６，６８２，７３６号；同第６，６８２，７３４号；同第６，６７３，３４４号；同第６，６５３，１０４号；同第６，６５２，８５２号；同第６，６３５，４８２号；同第６，６３０，１４４号；同第６，６１０，８３３号；同第６，６１０，２９４号；同第６，６０５，４４１号；同第６，６０５，２７９号；同第６，５９６，８５２号；同第６，５９２，８６８号；同第６，５７６，７４５号；同第６，５７２号；同第８５６号；同第６，５６６，０７６号；同第６，５６２，６１８号；同第６，５４５，１３０号；同第６，５４４，７４９号；同第６，５３４，０５８号；同第６，５２８，６２５号；同第６，５２８，２６９号；同第６，５２１，２２７号；同第６，５１８，４０４号；同第６，５１１，６６５号；同第６，４９１，９１５号；同第６，４８８，９３０号；同第６，４８２，５９８号；同第６，４８２，４０８号；同第６，４７９，２４７号；同第６，４６８，５３１号；同第６，４６８，５２９号；同第６，４６５，１７３号；同第６，４６１，８２３号；同第６，４５８，３５６号；同第６，４５５，０４４号；同第６，４５５，０４０号；同第６，４５１，３１０号；同第６，４４４，２０６号；同第６，４４１，１４３号；同第６，４３２，４０４号；同第６，４３２，４０２号；同第６，４１９，９２８号；同第６，４１３，７２６号；同第６，４０６，６９４号；同第６，４０３，７７０号；同第６，４０３，０９１号；同第６，３９５，２７６号；同第６，３９５，２７４号；同第６，３８７，３５０号；同第６，３８３，７５９号；同第６，３８３，４８４号；同第６，３７６，６５４号；同第６，３７２，２１５号；同第６，３５９，１２６号；同第６，３５５，４８１号；同第６，３５５，４４４号；同第６，３５５，２４５号；同第６，３５５，２４４号；同第６，３４６，２４６号；同第６，３４４，１９８号；同第６，３４０，５７１号；同第６，３４０，４５９号；同第６，３３１，１７５号；同第６，３０６，３９３号；同第６，２５４，８６８号；同第６，１８７，２８７号；同第６，１８３，７４４号；同第６，１２９，９１４号；同第６，１２０，７６７号；同第６，０９６，２８９号；同第６，０７７，４９９号；同第５，９２２，３０２号；同第５，８７４，５４０号；同第５，８１４，４４０号；同第５，７９８，２２９号；同第５，７８９，５５４号；同第５，７７６，４５６号；同第５，７３６，１１９号；同第５，７１６，５９５号；同第５，６７７，１３６号；同第５，５８７，４５９号；同第５，４４３，９５３号；同第５，５２５，３３８を参照されたい。これらは例示的なものに過ぎず、多種多様な他の抗体及びそれらのハイブリドーマが当該技術において知られている。当業者は、殆どの疾患関連抗原に対する抗体配列または抗体分泌ハイブリドーマが、関心のある選択された疾患関連標的に対する抗体についての、ＡＴＣＣ、ＮＣＢＩ及び／またはＵＳＰＴＯデータベースの簡単な検索によって入手できることを理解するであろう。クローニングされた抗体の抗原結合性ドメインは、当技術において周知の標準技術を使用して増幅され、切除され、発現ベクターに連結され、適応された宿主細胞にトランスフェクトされ、タンパク質産生のために使用され得る。
【００６９】
抗体アロタイプ
治療用抗体の免疫原性は、注入反応のリスク増大及び治療応答の持続時間低下に関連する（Ｂａｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３４８：６０２−０８）。治療用抗体が宿主において免疫応答を誘導する程度は、抗体のアロタイプによって部分的に決定され得る（Ｓｔｉｃｋｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １２：２１３−２１）。抗体アロタイプは、抗体の定常領域配列における特定の位置でのアミノ酸配列変化に関連する。重鎖γ型定常領域を含むＩｇＧ抗体のアロタイプをＧｍアロタイプと命名する（１９７６，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １１７：１０５６−５９）。
【００７０】
一般のＩｇＧ１ヒト抗体について、最も一般的なアロタイプはＧｌｍｌである（Ｓｔｉｃｋｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １２：２１３−２１）。しかし、Ｇ１ｍ３アロタイプも白人でも頻繁に発生する（Ｓｔｉｃｋｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。Ｇｌｍｌ抗体は、Ｇ１ｍ３患者のような非Ｇｌｍｌ（ｎＧｌｍｌ）レシピエントに投与したときに免疫応答を誘導する傾向のあるアロタイプ配列を含むことが報告されている（Ｓｔｉｃｋｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。非Ｇｌｍｌアロタイプ抗体は、Ｇｌｍｌ患者に投与したときに免疫原性ではない（Ｓｔｉｃｋｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。
【００７１】
ヒトＧ１ｍ１アロタイプは、重鎖ＩｇＧ１のＣＨ３配列中に、Ｋａｂａｔ位置３５６でアミノ酸アスパラギン酸、及びＫａｂａｔ位置３５８でロイシンを含んでいる。当該ｎＧ１ｍ１アロタイプは、Ｋａｂａｔ位置３５６にグルタミン酸及びＫａｂａｔ位置３５８にメチオニンのアミノ酸を含む．Ｇ１ｍ１及びｎＧ１ｍ１アロタイプの両者は、Ｋａｂａｔ位置３５７にグルタミン酸残基を含み、これらアロタイプはＤＥＬ及びＥＥＭアロタイプと呼ばれることがある。Ｇ１ｍ１及びｎＧ１ｍ１アロタイプ抗体の重鎖定常領域配列の非限定的な例を、例示的抗体リツキシマブ（配列番号７）及びベルツズマブ（配列番号８）について以下に示す。
【化１】
0006746845.tif 000002
【００７２】
Ｊｅｆｆｅｒｉｓ及びＬｅｆｒａｎｃ（２００９，ｍＡｂｓ１：１−７）は、ＩｇＧアロタイプに特徴的な配列変異及び免疫原性に対するそれらの効果を検討した。彼らは、Ｇ１ｍ１７アロタイプにおけるＫａｂａｔ位置２１４のリシン残基と比較して、Ｇ１ｍ３アロタイプは、Ｋａｂａｔ位置２１４のアルギニン残基により特徴づけられると報告した。ｎＧ１ｍ１，２アロタイプは、Ｋａｂａｔ位置３５６のグルタミン酸、Ｋａｂａｔ位置３５８のメチオニン、及びＫａｂａｔ位置４３１のアラニンによって特徴付けされた。Ｇ１ｍ１，２アロタイプは、Ｋａｂａｔ位置３５６のアスパラギン酸、Ｋａｂａｔ位置３５８のロイシン、及びＫａｂａｔ位置４３１のグリシンによって特徴づけされた。Ｊｅｆｆｅｒｉｓ及びＬｅｆｒａｎｃ（２００９）は、重鎖定常領域配列変異体に加えてカッパ軽鎖定常領域のアロタイプ変異体を報告したが、Ｋｍ１アロタイプはＫａｂａｔ位置１５３のバリンおよびＫａｂａｔ位置１９１のロイシンを特徴とし、Ｋｍ１，２アロタイプはＫａｂａｔ位置１５３のアラニン及びＫａｂａｔ位置１９１のロイシンを特徴とし、またＫｍ３アロタイプはＫａｂａｔ位置１５３のアラニンおよびＫａｂａｔ位置１９１のバリンを特徴とする。
【００７３】
治療用抗体に関して、ベルツズマブ及びリツキシマブは、それぞれＣＤ２０に対するヒト化及びキメラＩｇＧ１抗体であり、広範な血液悪性腫瘍及び／または自己免疫疾患の治療に使用される。表１は、リツキシマブ対ベルツズマブのアロタイプ配列を比較している。表１に示すように、リツキシマブ（Ｇ１ｍ１７，１）はＤＥＬアロタイプＩｇＧ１であり、Ｋａｂａｔ位置２１４（重鎖ＣＨ１）において、ベルツズマブのアルギニンに対するリツキシマブのリジンの追加の配列変異を有する。ベルツズマブは、リツキシマブよりも対象において免疫原性が低いことが報告されており（例えば、Ｍｏｒｃｈｈａｕｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２７：３３４６−５３；Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｂｌｏｏｄ  １１３：１０６２−７０；Ｒｏｂａｋ  ＆  Ｒｏｂａｋ，２０１１，ＢｉｏＤｒｕｇｓ  ２５：１３−２５参照）、これはヒト化抗体とキメラ抗体の間の相違に起因する効果である。しかしながら、ＥＥＭおよびＤＥＬアロタイプの間のアロタイプにおける相違はまた、ベルツズマブの低い免疫原性の原因でもある可能性が高い。
【表１】
0006746845.tif 000003
【００７４】
ｎＧ１ｍ１遺伝子型の個体における治療用抗体の免疫原性を低下させるためには、Ｋａｂａｔ２１４のアルギニンを特徴とするＧ１ｍ３アロタイプ、Ｋａｂａｔ位置３５６のグルタミン酸、Ｋａｂａｔ位置３５８のメチオニン、及びＫａｂａｔ位置４３１のアラニンを特徴とするｎＧ１ｍ１，２ヌルアロタイプに対応する抗体のアロタイプを選択することが望ましい。驚くべきことに、長期間に亘るＧ１ｍ３抗体の皮下投与は、有意な免疫応答をもたらさないことが見出された。別の実施形態では、Ｇ１ｍ３アロタイプと共通のヒトＩｇＧ４重鎖は、Ｋａｂａｔ２１４におけるアルギニン、Ｋａｂａｔ３５６におけるグルタミン酸、Ｋａｂａｔ３５９にけるメチオニン、Ｋａｂａｔ４３１におけるアラニンを有する。免疫原性は、少なくとも部分的にそれらの位置における残基に関連するように見えるので、治療用抗体のためのヒトＩｇＧ４重鎖定常領域配列の使用もまた好ましい実施形態である。Ｇ１ｍ３・ＩｇＧ１抗体とＩｇＧ４抗体との組み合わせもまた、治療的投与のためのものであり得る。
【００７５】
ナノボディ
ナノボディは、サイズが約１２〜１５ｋＤａ（約１１０アミノ酸長）の単一ドメイン抗体である。ナノボディは、フルサイズ抗体と同様に標的抗原に選択的に結合することができ、抗原に対して同様の親和性を有する。しかしながら、そのサイズが遥かに小さいため、固形腫瘍へのより良好な浸透が可能である可能性がある。より小さいサイズはまた、ナノボディの安定性に寄与し、これはフルサイズの抗体よりも極端なｐＨ及び温度に対してより耐性である（Ｖａｎ  Ｄｅｒ  Ｌｉｎｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔ  １４３１：３７−４６）。単一ドメイン抗体は、元々は、ラクダ科動物（ラクダ、アルパカ、ラマ）が軽鎖を持たない完全に機能的な抗体を有するとの発見（例えば、Ｈａｍｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ７７：１３−２２））に続いて開発された。重鎖抗体は、単一可変ドメイン（ＶＨＨ）及び２つの定常ドメイン（ＣＨ２及びＣＨ３）からなっている。抗体と同様に、ナノボディは、多価及び／または二重特異性の構築物として開発及び使用され得る。癌及び他の疾患における潜在的な臨床的用途を有する、ＩＬ−６Ｒ、ｖＷＦ、ＴＮＦ、ＲＳＶ、ＲＡＮＫＬ、ＩＬ−１７Ａ＆Ｆ、及びＩｇＥのような種々の標的抗原を標的とするヒト化形態のナノボディ（例えばＡＢＬＹＮＸ（登録商標）、Ｇｈｅｎｔ、ベルギー）が商業的開発の最中である。（例えば、Ｓａｅｒｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ８：６００−８；Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ，２０１３，Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ８２：７７５−９７；Ｉｂａｎｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  ２０３：１０６３−７２）。
【００７６】
ナノボディの血漿半減期は、フルサイズの抗体の血漿半減期よりも短く、除去経路は主に腎経路によるものである。それらはＦｃ領域を欠くので、補体依存性細胞傷害性を示さない。
【００７７】
ナノボディは、ラクダ、ラマ、アルパカまたはサメを標的抗原で免疫し、ｍＲＮＡを単離し、ライブラリーへとクローニングし、抗原結合性についてスクリーニングすることによって製造ができる。ナノボディ配列は、標準技術によってヒト化されてよい（例えば、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２，Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３  Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４，Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ´ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：４２８５，Ｓａｎｄｈｕ，１９９２，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１２：４３７，Ｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．１５０：２８４４）。ヒト化は、ラクダ科動物とヒトＦＲ配列との間の高い相同性のため、比較的簡単である。
【００７８】
様々な実施形態において、主題の抗体は、標的癌細胞に複合診断薬を標的送達するためのナノボディを含み得る。使用するナノボディは、例えば、米国特許第７，８０７，１６２号；同第７，９３９，２７７号；同第８，１８８，２２３号；同第８，２１７，１４０号；同第８，３７２，３９８号；同第８，５５７，９６５号；同第８，６２３，３６１号及び同第８，６２９，２４４号に開示されており、これら各々の実施例の節を参照により本明細書に援用する）。
【００７９】
抗体断片
抗体断片は、Ｆ（ａｂ´）２、Ｆａｂ´、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓＦｖ、ｓｃＦｖのような、抗体の抗原結合性部分である。特異的エピトープを認識する抗体断片は、既知の技術によって生成できる。例えば、Ｆ（ａｂ´）２断片は、抗体分子のペプシン消化によって製造し得る。これら及び他の方法は、例えば、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇによって、米国特許第４，０３６，９４５号及び同第４，３３１，６４７号及びそれに含まれる参照文献に記載されている。また、Ｎｉｓｏｎｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．８９：２３０（１９６０）；Ｐｏｒｔｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．７３：１１９（１９５９），Ｅｄｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ  ＶＯＬ．１，ｐａｇｅ  ４２２（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９６７），  ａｎｄ  Ｃｏｌｉｇａｎ  ａｔ  ｐａｇｅｓ  ２．８．１−２．８．１０および２．１０．−２．１０．４を参照されたい。或いは、望ましい特異性を備えたモノクローナルＦａｂ´断片の迅速かつ容易な同定を可能にするために、Ｆａｂ´発現ライブラリーを構築することができる（Ｈｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６：１２７４−１２８１）
【００８０】
一本鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）は、ＶＬドメイン及びＶＨドメインを備えている。ＶＬ及びＶＨドメインは会合して標的結合部位を形成する。これらの２つのドメインは、ペプチドリンカー（Ｌ）によって更に共有結合される。ｓｃＦｖ分子は、ＶＬドメインがｓｃＦｖ分子のＮ末端部分であればＶＬ−Ｌ−ＶＨ、またはＶＨドメインがｓｃＦｖ分子のＮ末端部分であればＶＨ−Ｌ−ＶＬの何れかで表される。ｓｃＦｖ分子を作製し、適切なペプチドリンカーを設計するための方法は、米国特許第４，７０４，６９２号、米国特許第４，９４６，７７８号、Ｒ．Ｒａａｇ及びＭ．Ｗｈｉｔｌｏｗの「一本鎖Ｆｖｓ」，ＦＡＳＥＢ  Ｖｏｌ  ９：７３−８０（１９９５）、並びにＲＥ  Ｂｉｒｄ及びＢＷ  Ｗａｌｋｅｒ、一本鎖抗体可変領域、ＴＩＢＴＥＣＨ、Ｖｏｌ  ９：１３２−１３７（１９９１）に記載されている。
【００８１】
他の抗体断片、例えば単一ドメイン抗体断片が当該技術において知られており、特許請求の範囲に記載の構築物において使用することができる。単一ドメイン抗体（ＶＨＨ）は、例えば、ラクダ、アルパカまたはラマから、標準的な免疫技術によって得ることができる。（例えば、Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＴＩＢＳ  ２６：２３０−２３５，２００１；Ｙａｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２８１：１６１−７５，２００３；Ｍａａｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３２４：１３−２５，２００７を参照されたい）。ＶＨＨは強力な抗原結合能力を有し、従来のＶＨ−ＶＬ対には接近できない新規エピトープと相互作用することができる。（Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００１））。アルパカ血清ＩｇＧは、約５０％のラクダ重鎖のみのＩｇＧ抗体（ＨＣＡｂ）を含む（Ｍａａｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。アルパカは、ＴＮＦ−αのような既知の抗原で免疫され、標的抗原に結合して中和するＶＨＨを単離することができる（Ｍａａｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。事実上全てのアルパカＶＨＨコード配列を増幅するＰＣＲプライマーが同定されており、これは当該技術において周知の標準的なバイオパンニング技術（Ｍａａｓｓら、２００７）により、アルパカＶＨＨファージディスプレイライブラリーを構築するために使用することができる。
【００８２】
抗体断片は、全長抗体のタンパク質加水分解によって、または大腸菌またはその断片をコードするＤＮＡを別の宿主中で発現させることによっても調製できる。抗体断片は、従来の方法による全長抗体のペプシン消化またはパパイン消化によって得ることができる。例えば、抗体断片は、ペプシンによる抗体の酵素的切断により産生され、Ｆ（ａｂ´）２で示される約１００ｋＤ断片を提供することができる。この断片は、ジスルフィド結合の切断から生じるスルフヒドリル基のためのチオール還元剤、及び場合によってはブロッキング基を用いて更に切断されて、約５０ＫｄのＦａｂ´一価断片を生成することができる。或いは、パパインを用いる酵素的切断によって、２つの一価Ｆａｂ断片及びＦｃ断片が直接製造される。
【００８３】
当該断片が完全な抗体によって認識される抗原に結合する限り、一価の軽鎖−重鎖断片を形成するための重鎖の分離、断片の更なる切断、または他の酵素的、化学的もしくは遺伝子的技術のような、抗体を切断する他の方法もまた使用することができる。
【００８４】
抗体クローニング及び産生のための一般的な技術
キメラまたはヒト化抗体の製造のような種々の技術は、抗体のクローニング及び構築の手順を含み得る。対象となる抗体の抗原結合性ＶＫ（可変軽鎖）及びＶＨ（可変重鎖）配列は、ＲＴ−ＰＣＲ、５´−ＲＡＣＥ及びｃＤＮＡライブラリースクリーニングのような、種々の分子クローニング手順によって得ることができる。マウスＭＡｂを発現する細胞由来のＭＡｂにおけるＶ遺伝子は、ＰＣＲ増幅によってクローニングされ、配列決定することができる。それらの真正性を確認するために、クローン化されたＶＬ及びＶＨ遺伝子は、Ｏｒｌａｎｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８６：３８３３（１９８９））が記載したように、細胞培養においてキメラＡｂとして発現することができる。次いで、Ｖ遺伝子配列に基づき、Ｌｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３２：１４１３（１９９５））が記載したようにして、ヒト化ＭＡｂを設計及び構築することができる。
【００８５】
ｃＤＮＡは、一般的な分子クローニング技術により、マウスｍＡｂを産生する任意の既知ハイブリドーマ株またはトランスフェクトされた細胞株から調製できる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，２ｎｄＥｄ（１９８９））。ＭＡｂのＶκ配列は、プライマーＶＫ１ＢＡＣＫ及びＶＫ１ＦＯＲ（Ｏｒｌａｎｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）またはＬｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１５：２８６（１９９３））により記載された延長プライマー組を使用して増幅され得る。ＶＨ配列は、プライマー対ＶＨ１ＢＡＣＫ／ＶＨ１ＦＯＲ（Ｏｒｌａｎｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）またはＬｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，１３：４６９（１９９４））により記載された、マウスＩｇＧの定常領域にアニーリングするプライマーを用いて増幅することができる。ヒト化Ｖ遺伝子は、長いオリゴヌクレオチド鋳型合成と、Ｌｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３２：１４１３（１９９５））に記載されたＰＣＲ増幅の組み合わせにより構築することができる。
【００８６】
ＶκのＰＣＲ産物は、Ｉｇプロモーター、シグナルペプチド配列及び便利な制限部位を含む病期分類ベクター、例えばｐＢＲ３２７に基づく病期分類ベクターＶＫｐＢＲ等にサブクローニングすることができる。ＶＨのＰＣＲ産物は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔに基づくＶＨｐＢＳのような同様の病期ベクターにサブクローニングすることができる。プロモーター及びシグナルペプチド配列と共にＶＫ及びＶＨ配列を含む発現カセットを、ＶＫｐＢＲ及びＶＨｐＢＳから切り出して、ｐＫｈ及びｐＧｌｇのような適切な発現ベクターにライゲーションすることができる（Ｌｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，１３：４６９（１９９４））。当該発現ベクターは、適切な細胞に同時トランスフェクトすることができ、上清液が、キメラ、ヒト化またはヒトＭＡｂの産生についてモニターされる。或いは、ＶＫ及びＶＨ発現カセットを切り出して、Ｇｉｌｌｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １２５：１９１（１９８９）により記載され、またＬｏｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃａｎｃｅｒ、８０：２６６０（１９９７））にも示されているように、ｐｄＨＬ２のような単一の発現ベクター中にサブクローニングすることができる。
【００８７】
代替実施形態において、発現ベクターは、トランスフェクション、増殖及び無血清培地中での発現に予め適合させた、宿主細胞にトランスフェクトすることができる。例示的な細胞系としては、Ｓｐ／ＥＥＥ、Ｓｐ／ＥＳＦ及びＳｐ／ＥＳＦ−Ｘ細胞株が挙げられる（例えば、米国特許第７，５３１，３２７号；第７，５３７，９３０号及び第７，６０８，４２５号を参照されたい；各々の実施例の節を参照により本明細書に援用する）。これらの例示的な細胞株は、変異体Ｂｃｌ−ＥＥＥ遺伝子をトランスフェクトされ、メソトレキセートに露出させてトランスフェクトされた遺伝子配列を増幅し、タンパク質発現のために血清フリーの細胞株に適合された、Ｓｐ２／０骨髄腫細胞株に基づいている
【００８８】
二重特異性及び多重特異性抗体
ある特定の代替実施形態では、抗Ｔｒｏｐ−２抗体またはその断片を、例えばハプテン結合性抗体またはその断片、例えば抗ＨＳＧまたは抗Ｉｎ−ＤＴＰＡ抗体と同時投与することができる。そのような二重特異性抗体は、インビボでＴｒｏｐ−２陽性腫瘍に対して診断剤及び／または治療剤を投与するための、プレターゲッティング技術において使用することができる。他の実施形態において、二重特異性抗体または多重特異性抗体は、抗癌療法のために直接的に利用され得る。
【００８９】
例えば、米国特許第７，４０５，３２０号に開示されているように、二重特異性または多重特異性抗体を産生するための多数の方法が知られており、その実施例の節を参照により本明細書に援用する。二重特異性抗体は、それぞれが異なる抗原部位を認識するモノクローナル抗体を産生する２つの異なるハイブリドーマの融合を含んだ、クアドローマ法によって産生され得る（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｃｕｅｌｌｏ，Ｎａｔｕｒｅ，１９８３；３０５：５３７−５４０）。
【００９０】
二重特異性抗体を作製するための別の方法は、２つの異なるモノクローナル抗体を化学的に繋ぎ合せるために、ヘテロ二官能性クロスリンカーを使用する（Ｓｔａｅｒｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９８５；３１４：６２８−６３１；Ｐｅｒｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９８５；３１６：３５４−３５６）。二重特異性抗体はまた、２つの親モノクローナル抗体の各々をそれぞれ半分の分子に還元し、次いでこれを混合し、再酸化させてハイブリッド構造を得ることにより産生することができる（Ｓｔａｅｒｚ  ａｎｄ  Ｂｅｖａｎ，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１９８６；８３：１４５３−１４５７）。他の方法には、レトロウイルス由来のシャトルベクターを介して、それぞれの親ハイブリドーマに異なる選択マーカーを遺伝子導入し、その後にこれら親を融合することにより、ハイブリッドハイブリドーマの生成効率を改善すること（ＤｅＭｏｎｔｅ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１９９０，８７：２９４１−２９４５）；または異なる抗体の重鎖遺伝子及び軽鎖遺伝子を含んだ発現プラスミドによる、ハイブリドーマ細胞株のトランスフェクションが含まれる。
【００９１】
同系のＶＨ及びＶＬドメインは、上で述べたように、適切な組成及び長さ（通常は１２アミノ酸残基より多い）のペプチドリンカーを用いて結合させて、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）を形成することができる。ペプチドリンカーの長さを１２アミノ酸残基未満に減少させることは、同じ鎖上のＶＨ及びＶＬドメインの対形成を妨げ、ＶＨ及びＶＬドメインと他の鎖上の相補的ドメインとの対形成を強制し、機能的多量体の形成をもたらす。３〜１２個のアミノ酸残基のリンカーで連結されたＶＨ及びＶＬドメインのポリペプチド鎖は、主に二量体（ダイアボディーと呼ばれる）を形成する。アミノ酸残基が０〜２のリンカーでは、三量体（トリアボディーと呼ばれる）及び四量体（テトラボディーと呼ばれる）が有利であるが、オリゴマー化の正確なパターンは、リンカーの長さに加えて、Ｖドメインの組成並びに向き（ＶＨ−リンカー−ＶＬまたはＶＬ−リンカー−ＶＨ）に依存するように思える。
【００９２】
多重特異性抗体または二重特異性抗体を作製するためのこれらの技術は、低収率、精製の必要性、低い安定性または技術の労働集約性の点で様々な困難を示す。より最近では、以下で更に詳細に説明する「ドック−アンド−ロック（登録商標）」（ＤＮＬ（登録商標））として知られる技術が、実質的に任意の所望の抗体、抗体断片及び他のエフェクター分子の組み合わせを生成させるために利用されている。二重特異性または多重特異性の抗体を作製するための当該技術において既知の何れの技術も、本願の特許請求の範囲に記載されている方法の実施において利用することができる。
【００９３】
「ドック−アンド−ロック（登録商標）」（ＤＮＬ（登録商標））
二重特異性または多重特異性の抗体または構築物は、ＤＯＣＫ−ＡＮＤ−ＬＯＣＫ（登録商標）技術（例えば、米国特許第７，５５０，１４３号；第７，５２１，０５６号；第７，５３４，８６６；第７，５２７，７８７号、及び第７，６６６，４００号参照、各々の実施例の節を参照により本明細書に援用する）を用いて製造することができる。一般に、この技術は、ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＡ）の調節（Ｒ）サブユニットの二量体化およびドッキングドメイン（ＤＤＤ）配列と、様々なＡＫＡＰタンパク質の何れかに由来するアンカードメイン（ＡＤ）配列の間に生じる特異的かつ高親和性の結合相互作用を利用する（Ｂａｉｌｌｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ．２００５；５７９：３２６４．Ｗｏｎｇ  ａｎｄ  Ｓｃｏｔｔ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２００４；５：９５９）。ＤＤＤ及びＡＤペプチドは、任意のタンパク質、ペプチドまたは他の分子に対して、好ましくはＡＤまたはＤＤＤ配列を含む融合タンパク質として結合され得る。ＤＤＤ配列は自発的に二量体化してＡＤ配列に結合するので、この技術は、ＤＤＤまたはＡＤ配列に結合され得る何れかの選択された分子間での複合体の形成を可能にする。
【００９４】
標準的なＤＮＬ（登録商標）複合体は、１つのＡＤ連結分子に結合した２つのＤＤＤ連結分子を有する三量体を含むが、複合体構造の変化により二量体、三量体、四量体、五量体、六量体及び他の多量体の形成が可能になる。幾つかの実施形態において、ＤＮＬ（登録商標）複合体は、同じ抗原決定基または２以上の異なる抗原に結合する２以上の抗体、抗体断片または融合タンパク質を含み得る。ＤＮＬ（登録商標）複合体はまた、１以上の他のエフェクター、例えばタンパク質、ペプチド、免疫調節剤、サイトカイン、インターロイキン、インターフェロン、結合タンパク質、ペプチドリガンド、キャリアタンパク質、毒素、オンコナーゼ等のリボヌクレアーゼ、ｓｉＲＮＡ等の阻害性オリゴヌクレオチド、抗原もしくは異種抗原、ＰＥＧのようなポリマー、酵素、治療剤、ホルモン、細胞傷害剤、抗血管新生剤、アポトーシス促進剤、または何れか他の分子もしくは凝集体を含み得る。
【００９５】
ＰＫＡは、ＲサブユニットへのセカンドメッセンジャーｃＡＭＰの結合によって誘発される、最も研究されたシグナル伝達経路の１つにおいて中心的役割を果たすものであり、１９６８年にウサギ骨格筋から最初に単離された（Ｗａｌｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９６８；２４３：３７６３）。ホロ酵素の構造は、Ｒサブユニットによって不活性形態に保持された２つの触媒サブユニットからなる（Ｔａｙｌｏｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８９；２６４：８４４３）。ＰＫＡのアイソザイムは２つのタイプのＲサブユニット（ＲＩ及びＲＩＩ）で見出され、各タイプはαアイソフォーム及びβアイソフォームを有する（Ｓｃｏｔｔ，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．１９９１；５０：１２３）。従って、ＰＫＡ調節サブユニットの４つのアイソフォームは、ＲＩα、ＲＩβ、ＲＩＩα及びＲＩＩβである。Ｒサブユニットは、安定な二量体としてのみ単離されており、二量体化ドメインは、ＲＩＩαの最初の４４アミノ末端残基からなることが示されている（Ｎｅｗｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１９９９；６：２２２）。後述するように、他の調節サブユニットのアミノ酸配列の同様の部分は、二量体化及びドッキングに関与し、それぞれ、調節サブユニットのＮ末端近傍に位置する。ＲサブユニットへのｃＡＭＰの結合は、セリン／スレオニンキナーゼ活性の広いスペクトルのための活性触媒サブユニットの解放を導き、これはＡＫＡＰとのそのドッキングを介したＰＫＡの区画化を通して、選択された基質へと向けられる（Ｓｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９０；２６５；２１５６１）。
【００９６】
最初のＡＫＡＰである微小管関連タンパク質−２が１９８４年に特徴付けられて以来（Ｌｏｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１９８４；８１：６７２３）、細胞膜、アクチン細胞骨格、核、ミトコンドリア、及び小胞体を含むサブ細胞部位に位置する５０以上のＡＫＡＰが、酵母からヒトに及ぶ種において多様な構造で同定されている（Ｗｏｎｇ  ａｎｄ  Ｓｃｏｔｔ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２００４；５：９５９）。ＰＫＡに対するＡＫＡＰのＡＤは、１４〜１８残基の両親媒性ヘリックスである（Ｃａｒｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９１；２６６：１４１８８）。ＡＤのアミノ酸配列は個々のＡＫＡＰ間でかなり異なり、ＲＩＩ二量体について、２〜９０ｎＭに亘る結合親和性が報告されている（Ａｌｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２００３；１００：４４４５）。ＡＫＡＰは二量体Ｒサブユニットにのみ結合する。ヒトＲＩＩαについて、ＡＤは２３個のアミノ末端残基により形成される疎水性表面に結合する（Ｃｏｌｌｅｄｇｅ  ａｎｄ  Ｓｃｏｔｔ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９９９；６：２１６））。従って、ヒトＲＩＩαの二量体化ドメイン及びＡＫＡＰ結合ドメインは両方とも、同じＮ末端４４アミノ酸配列内に位置し（Ｎｅｗｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１９９９；６：２２２；Ｎｅｗｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．２００１；２０：１６５１）、これは本明細書ではＤＤＤと呼ばれる。
【００９７】
我々は、ヒトＰＫＡ調節サブユニットのＤＤＤ及びＡＫＡＰのＡＤを、以下ではＡ及びＢと称する任意の２つのエンティティを非共有結合複合体にドッキングするために、優れたリンカーモジュール対として利用できるプラットフォーム技術を開発したが、これはジスルフィド結合の形成を促進する戦略的位置でのＤＤＤ及びＡＤの両方へのシステイン残基の導入を介して、ＤＮＬ（登録商標）複合体に更にロックされ得る。このアプローチの一般的な方法論は以下の通りである。エンティティＡは、ＤＤＤ配列をＡの前駆体に連結することによって構成され、その結果、以下ではａと称する第１の成分が得られる。ＤＤＤ配列は二量体の自発的形成に影響を及ぼすので、Ａはａ２で構成されるであろう。エンティティＢは、ＡＤ配列をＢの前駆体に連結することにより構築され、以下ではｂと称する第２の成分が得られる。ａ２に含まれるＤＤＤの二量体モチーフは、ｂに含まれるＡＤ配列に結合するためのドッキング部位を生成して、ａ２ｂで構成される２元三量体複合体を形成するためのａ２とｂの容易な会合を促進するであろう。この結合事象は不可逆的とされ、その後の反応がジスルフィド架橋を介して二つのエンティティ―を共有結合的に固定するが、これは有効な局所濃度の原理に基づいて非常に効率的に起こるであろう。何故なら、最初の結合相互作用がＤＤＤ及びＡＤの両方に置かれた反応性チオール基を接近させて（Ｃｈｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２００１；９８：８４８０）、部位特異的に連結させるはずだからである。リンカー、アダプターモジュール及び前駆体の様々な組み合わせを使用して、異なる化学量論の多種多様なＤＮＬ（登録商標）構築物を作製及び使用することができる（例えば、米国特許第７，５５０，１４３号；同第７，５２１，０５６号；同第７，５３４，８６６号；同第７，５２７，７８７号；および同第７，６６６，４００号参照）。
【００９８】
ＤＤＤ及びＡＤを２つの前駆体の官能基から離間させて結合することにより、そのような部位特異的な連結が、２つの前駆体の元々の活性を保存することもまた期待される。このアプローチは本質的にモジュラーであり、ペプチド、タンパク質、抗体、抗体断片、及び広範囲の活性を備えた他のエフェクター部分を含む広範囲の物質を、部位特異的かつ共有結合的に連結するために適用することができる。以下に記載するＡＤ及びＤＤＤ複合体エフェクターを構築する融合タンパク質法を利用して、実質的に任意のタンパク質またはペプチドをＤＮＬ（登録商標）構築物に組み込むことができる。しかし、この技術は限定的なものではなく、他の結合方法を利用してもよい。
【００９９】
融合タンパク質を作製するための様々な方法が知られており、目的の融合タンパク質をコードする合成二本鎖核酸を生成するための核酸合成、ハイブリダイゼーション及び／または増幅が含まれる。そのような二本鎖核酸は、標準的な分子生物学的技術により、融合タンパク質の産生のための発現ベクターに挿入することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ，１９８９参照）。そのような好ましい実施形態において、ＡＤ及び／またはＤＤＤ部分は、エフェクタータンパク質またはペプチドのＮ末端またはＣ末端の何れかに結合され得る。しかし、エフェクター部分の化学的性質及び当該エフェクター部分の生理学的活性に関与する部分に応じて、ＡＤまたはＤＤＤ部分のエフェクター部分への結合部位が変化し得ることを当業者は理解するであろう。種々のエフェクター部分の部位特異的結合は、当技術分野で公知の技術を使用して、例えば、二価の架橋試薬および／または他の化学的複合体化技術を使用して行うことができる。
【０１００】
ＡＤ及びＤＤＤ部分における構造−機能の関係
異なるタイプのＤＮＬ（登録商標）構築物について、異なるＡＤまたはＤＤＤ配列を利用することができる。例示的なＤＤＤ及びＡＤ配列を以下に示す。
ＤＤＤ１
ＳＨＩＱＩＰＰＧＬＴＥＬＬＱＧＹＴＶＥＶＬＲＱＱＰＰＤＬＶＥＦＡＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＡ（配列番号９）
ＤＤＤ２
ＣＧＨＩＱＩＰＰＧＬＴＥＬＬＱＧＹＴＶＥＶＬＲＱＱＰＰＤＬＶＥＦＡＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＡ（配列番号１０）
ＡＤ１
ＱＩＥＹＬＡＫＱＩＶＤＮＡＩＱＱＡ（配列番号１１）
ＡＤ２
ＣＧＱＩＥＹＬＡＫＱＩＶＤＮＡＩＱＱＡＧＣ（配列番号１２）
【０１０１】
ＤＤＤ１及びＤＤＤ２が、プロテインキナーゼＡのヒトＲＩＩαアイソフォームにおけるＤＤＤ配列に基づくことを当業者は理解するであろう。しかしながら、代替実施形態において、ＤＤＤ及びＡＤ部分は、以下のＤＤＤ３、ＤＤＤ３Ｃ及びＡＤ３に例示されるように、プロテインキナーゼＡにおけるヒトＲＩα形態のＤＤＤ配列及び対応するＡＫＡＰ配列に基づき得る。
ＤＤＤ３
ＳＬＲＥＣＥＬＹＶＱＫＨＮＩＱＡＬＬＫＤＳＩＶＱＬＣＴＡＲＰＥＲＰＭＡＦＬＲＥＹＦＥＲＬＥＫＥＥＡＫ（配列番号１３）
ＤＤＤ３Ｃ
ＭＳＣＧＧＳＬＲＥＣＥＬＹＶＱＫＨＮＩＱＡＬＬＫＤＳＩＶＱＬＣＴＡＲＰＥＲＰＭＡＦＬＲＥＹＦＥＲＬＥＫＥＥＡＫ（配列番号１４）
ＡＤ３ 
ＣＧＦＥＥＬＡＷＫＩＡＫＭＩＷＳＤＶＦＱＱＧＣ（配列番号１５）
【０１０２】
他の代替実施形態において、ＡＤ及び／またはＤＤＤ部分の他の配列変異体を、ＤＮＬ（登録商標）複合体の構築に利用することができる。例えば、ＰＫＡ  ＲＩα、ＲＩＩα、ＲＩβ及びＲＩＩβのＤＤＤ部分に対応する、ヒトＰＫＡ  ＤＤＤ配列の僅か４つの変異体が存在する。ＲＩＩα  ＤＤＤ配列は、上記で開示したＤＤＤ１及びＤＤＤ２の基礎である。４つのヒトＰＫＡ  ＤＤＤ配列を以下に示す。当該ＤＤＤ配列は、ＲＩＩαの１〜４４残基、ＲＩＩβの１〜４４残基、ＲＩαの１２〜６１残基及びＲＩβの１３〜６６残基を表す。（ＤＤＤ１の配列は、ヒトＰＫＡ  ＲＩＩα・ＤＤＤ部分から僅かに改変されていることに留意されたい）。
ＰＫＡ  ＲＩα
ＳＬＲＥＣＥＬＹＶＱＫＨＮＩＱＡＬＬＫＤＶＳＩＶＱＬＣＴＡＲＰＥＲＰＭＡＦＬＲＥＹＦＥＫＬＥＫＥＥＡＫ（配列番号１６）
ＰＫＡ  ＲＩβ
ＳＬＫＧＣＥＬＹＶＱＬＨＧＩＱＱＶＬＫＤＣＩＶＨＬＣＩＳＫＰＥＲＰＭＫＦＬＲＥＨＦＥＫＬＥＫＥＥＮＲＱＩＬＡ（配列番号１７）
ＰＫＡ  ＲＩＩα
ＳＨＩＱＩＰＰＧＬＴＥＬＬＱＧＹＴＶＥＶＧＱＱＰＰＤＬＶＤＦＡＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＲＱ（配列番号１８）
ＰＫＡ  ＲＩＩβ
ＳＩＥＩＰＡＧＬＴＥＬＬＱＧＦＴＶＥＶＬＲＨＱＰＡＤＬＬＥＦＡＬＱＨＦＴＲＬＱＱＥＮＥＲ（配列番号１９）
【０１０３】
ＡＤ及びＤＤＤドメインの構造−機能の関係が研究の主題となっている（例えば、Ｂｕｒｎｓ−Ｈａｍｕｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ  １４：２９８２−９２；Ｃａｒｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７６：１７３３２−３８；Ａｌｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ１００：４４４５−５０；Ｈｕｎｄｓｒｕｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ３９６：２９７−３０６；Ｓｔｏｋｋａ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ４００：４９３−９９；Ｇｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ２４：３８３−９５；Ｋｉｎｄｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ２４：３９７−４０８、その各々の全体のテキストを参照により本明細書に援用する）。
【０１０４】
例えば、Ｋｉｎｄｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００６，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ２４：３９７−４０８）は、ＡＤ−ＤＤＤ結合相互作用の結晶構造を調べ、ヒトＤＤＤ配列は二量体形成またはＡＫＡＰ結合の何れかにおいて重要な、下記の配列番号９に下線を付した保存されたアミノ酸残基を含んでいると結論した。（Ｋｉｎｄｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６の図１を参照されたい。参照により本明細書に援用）。当業者は、ＤＤＤ配列の配列変異体を設計する際に、保存的アミノ酸置換が下線で囲まれた残基のいずれかを変化させることは望ましくない一方、二量体化及びＡＫＡＰ結合に重要ではない残基については保存的アミノ酸置換がなされ得ることを理解するであろう。
【化２】
0006746845.tif 000004
【０１０５】
以下で更に詳細に述べるように、保存的アミノ酸置換は、一般的な２０種類のＬ−アミノ酸のそれぞれについて特徴付けられている。従って、Ｋｉｎｄｅｒｍａｎ（２００６）及び保存的アミノ酸置換のデータに基づいて、配列番号９に基づく可能性のある代替ＤＤＤ配列を表２に示す。表２を考案する際に、高度に保存的なアミノ酸置換のみが考慮された。例えば、荷電残基は同じ電荷の残基のみで置換され、小さな側鎖を有する残基は同様のサイズの残基で置換され、ヒドロキシル側鎖は他のヒドロキシルでのみ置換される等であった。アミノ酸二次構造に対するプロリンの固有の効果のために、プロリンの代わりに置換される他の残基は存在しなかった。限定された数のそのような可能性のある代替ＤＤＤの部分配列を、以下の配列番号２０〜配列番号３９に示す。当業者であれば、標準技術によって、例えば市販のペプチド合成機または周知の部位特異的突然変異誘発技術を用いて、ＤＤＤ部分の属内の殆ど無制限の数の代替種が構築され得ることを理解するであろう。ＡＤ部分結合に対するアミノ酸置換の効果はまた、例えばＡｌｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００３，ＰｒｏｃＮａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １００：４４４５−５０）に記載された標準的な結合アッセイにより容易に決定できる。
【表２】
0006746845.tif 000005
ＴＨＩＱＩＰＰＧＬＴＥＬＬＱＧＹＴＶＥＶＬＲＱＱＰＰＤＬＶＥＦＡＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＡ（配列番号２０）
ＳＫＩＱＩＰＰＧＬＴＥＬＬＱＧＹＴＶＥＶＬＲＱＱＰＰＤＬＶＥＦＡＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＡ（配列番号２１）
ＳＲＩＱＩＰＰＧＬＴＥＬＬＱＧＹＴＶＥＶＬＲＱＱＰＰＤＬＶＥＦＡＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＡ（配列番号２２）
ＳＨＩＮＩＰＰＧＬＴＥＬＬＱＧＹＴＶＥＶＬＲＱＱＰＰＤＬＶＥＦＡＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＡ（配列番号２３）
ＳＨＩＱＩＰＰＡＬＴＥＬＬＱＧＹＴＶＥＶＬＲＱＱＰＰＤＬＶＥＦＡＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＡ（配列番号２４）
ＳＨＩＱＩＰＰＧＬＳＥＬＬＱＧＹＴＶＥＶＬＲＱＱＰＰＤＬＶＥＦＡＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＡ（配列番号２５）
ＳＨＩＱＩＰＰＧＬＴＤＬＬＱＧＹＴＶＥＶＬＲＱＱＰＰＤＬＶＥＦＡＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＡ（配列番号２６）
ＳＨＩＱＩＰＰＧＬＴＥＬＬＮＧＹＴＶＥＶＬＲＱＱＰＰＤＬＶＥＦＡＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＡ（配列番号２７）
ＳＨＩＱＩＰＰＧＬＴＥＬＬＱＡＹＴＶＥＶＬＲＱＱＰＰＤＬＶＥＦＡＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＡ（配列番号２８）
ＳＨＩＱＩＰＰＧＬＴＥＬＬＱＧＹＳＶＥＶＬＲＱＱＰＰＤＬＶＥＦＡＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＡ（配列番号２９）
ＳＨＩＱＩＰＰＧＬＴＥＬＬＱＧＹＴＶＤＶＬＲＱＱＰＰＤＬＶＥＦＡＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＡ（配列番号３０）
ＳＨＩＱＩＰＰＧＬＴＥＬＬＱＧＹＴＶＥＶＬＫＱＱＰＰＤＬＶＥＦＡＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＡ（配列番号３１）
ＳＨＩＱＩＰＰＧＬＴＥＬＬＱＧＹＴＶＥＶＬＲＮＱＰＰＤＬＶＥＦＡＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＡ（配列番号３２）
ＳＨＩＱＩＰＰＧＬＴＥＬＬＱＧＹＴＶＥＶＬＲＱＮＰＰＤＬＶＥＦＡＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＡ（配列番号３３）
ＳＨＩＱＩＰＰＧＬＴＥＬＬＱＧＹＴＶＥＶＬＲＱＱＰＰＥＬＶＥＦＡＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＡ（配列番号３４）
ＳＨＩＱＩＰＰＧＬＴＥＬＬＱＧＹＴＶＥＶＬＲＱＱＰＰＤＬＶＤＦＡＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＡ（配列番号３５）
ＳＨＩＱＩＰＰＧＬＴＥＬＬＱＧＹＴＶＥＶＬＲＱＱＰＰＤＬＶＥＦＬＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＡ（配列番号３６）
ＳＨＩＱＩＰＰＧＬＴＥＬＬＱＧＹＴＶＥＶＬＲＱＱＰＰＤＬＶＥＦＩＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＡ（配列番号３７）
ＳＨＩＱＩＰＰＧＬＴＥＬＬＱＧＹＴＶＥＶＬＲＱＱＰＰＤＬＶＥＦＶＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＡ（配列番号３８）
ＳＨＩＱＩＰＰＧＬＴＥＬＬＱＧＹＴＶＥＶＬＲＱＱＰＰＤＬＶＥＦＡＶＤＹＦＴＲＬＲＥＡＲＡ（配列番号３９）
【０１０６】
Ａｌｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００３，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １００：４４４５−５０）は、種々のＡＫＡＰタンパク質におけるＡＤ配列のバイオインフォマティクス解析を行って、ＤＤＤに対する０．４ｎＭの結合定数をもったＡＫＡＰ−ＩＳ（配列番号１１）と称するＲＩＩ選択的ＡＤ配列を設計した。当該ＡＫＡＰ−ＩＳ配列は、ＰＫＡへのＡＫＡＰ結合のペプチドアンタゴニストとして設計された。置換がＤＤＤへの結合を減少させる傾向のあるＡＫＡＰ−ＩＳ配列中の残基は、以下の配列番号１１において下線が付されている。当業者は、ＡＤ配列の配列変異体を設計する際に、ＤＤＤ結合にあまり重要ではない残基について保存的アミノ酸置換を行うことができる一方で、下線を付した残基の何れかを変えることは回避するのが望ましいことを理解するであろう。表３は、上記表２のＤＤＤ１（配列番号１６）について示されたものと同様の、ＡＫＡＰ−ＩＳ（ＡＤ１、配列番号１９）の配列における潜在的な保存的アミノ酸置換を示す。
【０１０７】
限定された数のそのような可能性のある代替ＡＤ部分配列を、以下の配列番号４０〜配列番号５７に示す。ここでもまた、Ａｌｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）のデータに基づいて、可能なＡＤ部分配列の属内の非常に多数の種が、当業者によって作製され、試験され、使用され得るであろう（２００３）。なお、Ａｌｔｏ（２００３）の図２は、実際の結合実験に基づき、ＤＤＤ部分への結合活性を保持しながら作製し得るさらに多数の可能性のあるアミノ酸置換を示していることに留意されたい。
【化３】
0006746845.tif 000006
【表３】
0006746845.tif 000007
ＮＩＥＹＬＡＫＱＩＶＤＮＡＩＱＱＡ（配列番号４０）
ＱＬＥＹＬＡＫＱＩＶＤＮＡＩＱＱＡ（配列番号４１）
ＱＶＥＹＬＡＫＱＩＶＤＮＡＩＱＱＡ（配列番号４２）
ＱＩＤＹＬＡＫＱＩＶＤＮＡＩＱＱＡ（配列番号４３）
ＱＩＥＦＬＡＫＱＩＶＤＮＡＩＱＱＡ（配列番号４４）
ＱＩＥＴＬＡＫＱＩＶＤＮＡＩＱＱＡ（配列番号４５）
ＱＩＥＳＬＡＫＱＩＶＤＮＡＩＱＱＡ（配列番号４６）
ＱＩＥＹＩＡＫＱＩＶＤＮＡＩＱＱＡ（配列番号４７）
ＱＩＥＹＶＡＫＱＩＶＤＮＡＩＱＱＡ（配列番号４８）
ＱＩＥＹＬＡＲＱＩＶＤＮＡＩＱＱＡ（配列番号４９）
ＱＩＥＹＬＡＫＮＩＶＤＮＡＩＱＱＡ（配列番号５０）
ＱＩＥＹＬＡＫＱＩＶＥＮＡＩＱＱＡ（配列番号５１）
ＱＩＥＹＬＡＫＱＩＶＤＱＡＩＱＱＡ（配列番号５２）
ＱＩＥＹＬＡＫＱＩＶＤＮＡＩＮＱＡ（配列番号５３）
ＱＩＥＹＬＡＫＱＩＶＤＮＡＩＱＮＡ（配列番号５４）
ＱＩＥＹＬＡＫＱＩＶＤＮＡＩＱＱＬ（配列番号５５）
ＱＩＥＹＬＡＫＱＩＶＤＮＡＩＱＱＩ（配列番号５６）
ＱＩＥＹＬＡＫＱＩＶＤＮＡＩＱＱＶ（配列番号５７）
【０１０８】
Ｇｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（２００６，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ２４：３８３−９５）は、結晶学及びペプチドスクリーニングを利用して、ＰＫＡのＲＩＩアイソフォームについて、ＲＩアイソフォームと比較して５桁高い選択性を示すＳｕｐｅｒＡＫＡＰ−ＩＳ配列（配列番号５８）を開発した。下線を付した残基は、ＲＩＩαのＤＤＤ部分への結合を増加させた、ＡＫＡＰ−ＩＳ配列に対するアミノ酸置換の位置を示す。この配列では、Ｎ末端Ｑ残基は残基番号４として付番され、Ｃ末端Ａ残基は残基番号２０である。残基がＲＩＩαに対する親和性に影響を及ぼすことができる残基は、残基８、１１、１５、１６、１８、１９、２０であった（Ｇｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。ある特定の代替実施形態において、ＳｕｐｅｒＡＫＡＰ−ＩＳ配列は、ＤＮＬ（登録商標）構築物を調製するためにＡＫＡＰ−ＩＳ  ＡＤ部分の配列を置換してよい。ＡＫＡＰ−ＩＳ  ＡＤ配列を置換し得る他の代替配列を、配列番号５９〜６１に示す。ＡＫＡＰ−ＩＳ配列に対する置換には下線が付されている。配列番号１２に示すＡＤ２配列と同様に、当該ＡＤ部分もまた、付加的なＮ末端残基のシステイン及びグリシン、並びにＣ末端残基のグリシン及びシステインを含み得ることが予想される。
【化４】
0006746845.tif 000008
【０１０９】
Ｇｏｌｄらの図２は、以下に示す様々なＡＫＡＰタンパク質由来の追加のＤＤＤ結合配列を開示した。
＜ＲＩＩ特異的ＡＫＡＰ＞
ＡＫＡＰ−ＫＬ
ＰＬＥＹＱＡＧＬＬＶＱＮＡＩＱＱＡＩ（配列番号６２）
ＡＫＡＰ７９
ＬＬＩＥＴＡＳＳＬＶＫＮＡＩＱＬＳＩ（配列番号６３）
ＡＫＡＰ−Ｌｂｃ
ＬＩＥＥＡＡＳＲＩＶＤＡＶＩＥＱＶＫ（配列番号６４）
＜ＲＩ特異的ＡＫＡＰ＞
ＡＫＡＰｃｅ
ＡＬＹＱＦＡＤＲＦＳＥＬＶＩＳＥＡＬ（配列番号６５）
ＲＩＡＤ
ＬＥＱＶＡＮＱＬＡＤＱＩＩＫＥＡＴ（配列番号６６）
ＰＶ３８
ＦＥＥＬＡＷＫＩＡＫＭＩＷＳＤＶＦ（配列番号６７）
＜二重特異性ＡＫＡＰ＞
ＡＫＡＰ７
ＥＬＶＲＬＳＫＲＬＶＥＮＡＶＬＫＡＶ（配列番号６８）
ＭＡＰ２Ｄ
ＴＡＥＥＶＳＡＲＩＶＱＶＶＴＡＥＡＶ（配列番号６９）
ＤＡＫＡＰ１
ＱＩＫＱＡＡＦＱＬＩＳＱＶＩＬＥＡＴ（配列番号７０）
ＤＡＫＡＰ２
ＬＡＷＫＩＡＫＭＩＶＳＤＶＭＱＱ（配列番号７１）
【０１１０】
Ｓｔｏｋｋａ  ｅｔ  ａｌ．（２００６，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ４００：４９３−９９）も、配列番号７２〜７４に示される、ＰＫＡに結合するＡＫＡＰのペプチド競合物を開発した。当該ペプチドアンタゴニストは、Ｈｔ３１（配列番号７２）、ＲＩＡＤ（配列番号７３）及びＰＶ−３８（配列番号７４）と命名された。Ｈｔ−３１ペプチドは、ＰＫＡのＲＩＩアイソフォームに対してより大きな親和性を示したが、ＲＩＡＤ及びＰＶ−３８は、ＲＩに対してより高い親和性を示した。
Ｈｔ３１
ＤＬＩＥＥＡＡＳＲＩＶＤＡＶＩＥＱＶＫＡＡＧＡＹ（配列番号７２）
ＲＩＡＤ
ＬＥＱＹＡＮＱＬＡＤＱＩＩＫＥＡＴＥ（配列番号７３）
ＰＶ−３８
ＦＥＥＬＡＷＫＩＡＫＭＩＷＳＤＶＦＱＱＣ（配列番号７４）
【０１１１】
Ｈｕｎｄｓｒｕｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００６，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ３９６：２９７−３０６）は、ＰＫＡのＲＩＩ形態のＤＤＤに対して０．４ｎＭという低い結合定数をもった、ＰＫＡに対するＡＫＡＰ結合のための更に別のペプチド競合剤を開発した。種々のＡＫＡＰアンタゴニストペプチドの配列が、下記の表４に再現されるＨｕｎｄｓｒｕｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．の表１に提供されている。ＡＫＡＰＩＳは、合成ＲＩＩサブユニット結合性ペプチドを表す。他の全てのペプチドは、示されたＡＫＡＰのＲＩＩ結合性ドメインに由来する。
【表４】
0006746845.tif 000009
【０１１２】
異なるＡＫＡＰタンパク質のＡＤドメイン間で高度に保存された残基を、ＡＫＡＰ  ＩＳ配列（配列番号１１）に関して下線を付して示す。この残基はＡｌｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）によって観察されたものと同じであり、Ｃ末端アラニン残基の付加を伴う。（するＨｕｎｄｓｒｕｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）の図４を参照されたい。参照により本明細書に援用）。ＲＩＩ  ＤＤＤ配列に対して特に高い親和性を有するペプチドアンタゴニストの配列は、ＡＫＡＰ−ＩＳ、ＡＫＡＰ７δ−ｗｔ−ｐｅｐ、ＡＫＡＰ７δ−Ｌ３０４Ｔ−ｐｅｐおよびＡＫＡＰ７δ−Ｌ３０８Ｄ−ｐｅｐのものであった。
【化５】
0006746845.tif 000010
【０１１３】
Ｃａｒｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００１，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７６：１７３３２−３８）は、ヒト及び非ヒトタンパク質由来の異なるＡＫＡＰ結合性ＤＤＤ配列間の配列相同性の程度を調べ、異なるＤＤＤ部分の間で最も高度に保存されていると思われるＤＤＤ配列中の残基を同定した。これらは、配列番号９のヒトＰＫＡ  ＲＩＩαＤＤＤ配列に対して下線を付すことにより示される。特に保存された残基は更にイタリック体で示される。この残基は、ＡＫＡＰタンパク質への結合にとって重要であることがＫｉｎｄｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）によって示唆された残基と重複するが、同一ではない。当業者は、ＤＤＤの配列変異体を設計する際に、最も保存された残基（イタリック体）を変更することを避けることが最も好ましく、また保存された残基（下線を付したもの）を変更することを避けるのが好ましいのに対して、下線も付されず且つイタリックにもされない残基については保存されたアミノ酸置換が考慮されることを理解するであろう。
【化６】
0006746845.tif 000011
【０１１４】
Ｃａｒｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）のデータに基づいて、ＤＤＤ１（配列番号９）配列についての保存的アミノ酸置換の改変されたセットが、表５に示されている。この減少したセットの置換配列であさえも、過度の実験をすることなく、当業者によって製造、試験及び使用され得る、６５，０００を超える可能性な代替ＤＤＤ部分配列が存在する。当業者は、表２及び表３について上記で開示したような、そのような代替ＤＤＤアミノ酸配列を容易に誘導することができるであろう。
【表５】
0006746845.tif 000012
【０１１５】
当業者は、ＤＤＤまたはＡＤアミノ酸配列におけるのこれら及び他のアミノ酸置換は、当該分野で標準的で且つルーチンの実験に過ぎない技術を用いてＡＤまたはＤＤＤ部分の属内の代替種を産生するために利用し得ることを理解するであろう。
【０１１６】
代替ＤＮＬ（登録商標）構造
ある特定の代替的実施形態において、ＤＮＬ（登録商標）構築物は代替的に構築された抗体または抗体断片を用いて形成され得るものであり、ここではＡＤ部分が重鎖上におけるＦｃのＣ末端の代わりに、カッパ軽鎖のＣ末端（Ｃｋ）に結合し得る。代替的に形成されたＤＮＬ（登録商標）構築物は、２０１２年６月１日に出願された米国仮特許出願第６１／６５４，３１０号、２０１２年６月２０日に出願された第６１／６６２，０８６号、２０１２年７月１９日に出願された第６１／６７３，５５３号、２０１２年８月１３日に出願された第６１／６８２，５３１号に記載されており、それら各々は、参照により本明細書に援用する。軽鎖複合体化ＤＮＬ（登録商標）構築物は、インビトロでの向上したＦｃ−エフェクター機能活性及び改善された薬物動態、インビボでの安定性及び抗リンパ腫活性を示す（Ｒｏｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ  ２４：６３−７１）。
【０１１７】
Ｃｋ複合体化ＤＮＬ（登録商標）構築物は、米国仮特許出願第６１／６５４，３１０号、第６１／６６２，０８６号、第６１／６７３，５５３号、及び第６１／６８２，５３１号に開示されているようにして調製することができる。簡単に言えば、Ｃｋ−ＡＤ２−ＩｇＧを組換え技術により作製し、それによりＡＤ２ペプチドをκ軽鎖のＣ末端に融合させた。ＣＫの天然のＣ末端は、ＣＨ１へのジスルフィド架橋を形成するシステイン残基なので、１６アミノ酸残基の「ヒンジ」リンカーを用いて、ＡＤ２をＣＫ−ＶＨ１ジスルフィド架橋から離間させた。Ｃｋ−ＡＤ２−ＩｇＧ−ベルツズマブ及びＣｋ−ＡＤ２−ＩｇＧ−エプラツズマブの哺乳類発現ベクターは、相同性のＣＨ３−ＡＤ２−ＩｇＧモジュールの発現のために以前に使用されたｐｄＨＬ２ベクターを用いて構築された。ＶＫ／ＣＫイントロン内のＢａｍＨＩ制限部位からＣＫイントロンのＸｈｏＩ制限部位に亘るｐｄＨＬ２ベクター配列を含み、且つヒンジリンカーのためのコード配列（ＥＦＰＫＰＳＴＰＰＧＳＳＧＧＡＰ、配列番号９３）及びＡＤ２が、ＣＫのコード配列の３´末端にインフレームで挿入された状態で、２２０８塩基対のヌクレオチド配列が合成された。この合成配列を、ＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩ制限部位を介して、ベルツズマブ及びエプラツズマブのためのＩｇＧ−ｐｄＨＬ２発現ベクター中に挿入した。ＳｐＥＳＦＸ−１０を用いた産生クローンの作製は、ＣＨ３−ＡＤ２−ＩｇＧモジュールについて記載したように行った。Ｃｋ−ＡＤ２−ＩｇＧ−ベツツズマブおよびＣｋ−ＡＤ２−ＩｇＧ−エプラツズマブは、バッチローラボトル培養で安定にトランスフェクトされた産生クローンにより産生され、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを用いて上清から１段階で精製された。
【０１１８】
２２−（２０）−（２０）について以前に記載された同じＤＮＬ（登録商標）プロセス（Ｒｏｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｂｌｏｏｄ  １１３：６１６１−７１）に従って、Ｃｋ−ＡＤ２−ＩｇＧ−エプラツズマブを、ＣＨ１−ＤＤＤ２−Ｆａｂ−ベルツズママブ、即ち、ベルツズママブから誘導されたＦａｂベースのモジュールと複合体化させて、ｂｓＨｅｘＡｂ２２＊−（２０）−（２０）を生じさせ、ここでの２２＊はエプラツズマブのＣｋ−ＡＤ２モジュールを示し、各々の（２０）はベルツズママブＦａｂの安定化されたに二量体を象徴している。２２＊−（２０）−（２０）の特性を、類似の粗製及び分子サイズを有するが、アーキテクチャが異なる２２−（２０）−（２０）、即ちＣＨ３−ＡＤ２−ＩｇＧ−エプラツズマブを含む相同性Ｆｃ−ｂｓＨｅｘＡｂのそれと比較した。
【０１１９】
２０−２ｂについて以前に記載された同じＤＮＬ（登録商標）プロセス（Ｒｏｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｂｌｏｏｄ  １１４：３８６４−７１）に従って、Ｃｋ−ＡＤ２−ＩｇＧ−ベルツズマブを、ＩＦＮα２ｂ−ＤＤＤ２、即ち、ＤＤＤ２ペプチドがそのＣ末端で融合されたＩＦＮα２ｂのモジュールと複合体化して、各軽鎖に融合された二量体ＩＦＮα２ｂを有するベルツズママブを含む２０＊−２ｂを生成させた。２０＊−２ｂの特性を、相同性Ｆｃ−ＩｇＧ−ＩＦＮαである２０−２ｂのそれと比較した。
【０１２０】
ｂｓＨｅｘＡｂ及びＩｇＧ−ＩＦＮａの各々を、ＭａｂＳｅｌｅｃｔアフィニティークロマトグラフィーによりＤＮＬ（登録商標）反応混合物から単離した。２つのＣｋプ由来のプロトタイプ、即ち、エプラツズマブ（抗ＣＤ２２）及びベルツズマブの４つのＦａｂ（抗ＣＤ２０）を含む抗ＣＤ２２／ＣＤ２０二重特異性六価抗体、並びにベルツズマブ及びインターフェロンα２ｂの４つの分子を含むＣＤ２０ターゲッティング免疫サイトカインは、インビトロでの増強されたＦｃエフェクター機能、並びにそれらのＦｃ由来の対応物と比較して改善された薬物動態、インビボでの安定性及び抗リンパ腫活性を示した。
【０１２１】
アミノ酸置換
別の実施形態において、開示される方法及び組成物は、１以上の置換アミノ酸残基を有するタンパク質またはペプチドの製造及び使用を含み得る。例えば、ＤＮＬ（登録商標）構築物を作製するために使用されるＤＤＤ及び／またはＡＤ配列は、上で述べたようにして改変され得る。
【０１２２】
当業者は、一般に、アミノ酸置換は典型的には、アミノ酸が比較的類似の性質の別のアミノ酸で置換されること（即ち、保存的アミノ酸置換）を含むことを認識するであろう。種々のアミノ酸の特性、並びにタンパク質の構造及び機能に対するアミノ酸置換の効果は、当該技術における広範な研究及び知識の主題となっている。
【０１２３】
例えば、アミノ酸の疎水性指数を考慮することができる（Ｋｙｔｅ  ＆  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，１９８２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５７：１０５−１３２）。アミノ酸の相対的な疎水性特性は、結果として生じるタンパク質の二次構造に寄与し、これは次にタンパク質と他の分子との相互作用を決定する。各アミノ酸には、その疎水性及び電荷特性（Ｋｙｔｅ＆Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ、１９８２）に基づいてハイドロパシー指数が割り当てられており、これらはイソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リシン（−３．９）；及びアルギニン（−４．５）である。保存的置換を行う場合、疎水性指数が±２以内であるアミノ酸の使用が好ましく、±１以内がより好ましく、±０．５以内が更に好ましい。
【０１２４】
アミノ酸置換は、アミノ酸残基の親水性も考慮に入れることができる（例えば、米国特許第４，５５４，１０１号）。アミノ酸残基には親水性値が割り当てられる：即ち、アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０）；グルタミン酸（＋３．０）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；トリプトファン（−３．４）である。アミノ酸置換は、同様の親水性を有する他のアミノ酸との置換が好ましい。
【０１２５】
他の考察には、アミノ酸側鎖のサイズが含まれる。例えば、グリシンまたはセリンのようなコンパクトな側鎖を有するアミノ酸を、トリプトファンまたはチロシンのような嵩高い側鎖を有するアミノ酸と置換することは、一般的には好ましくないであろう。タンパク質二次構造に対する種々のアミノ酸残基の効果もまた検討事項である。経験的研究を通じて、タンパク質ドメインがアルファ−螺旋、ベータ−シートまたは逆方向の二次構造をとる傾向に及ぼす異なるアミノ酸残基の効果が決定されており、当該技術において既知である（例えば、Ｃｈｏｕ  ＆  Ｆａｓｍａｎ，１９７４，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１３：２２２−２４５；  １９７８，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，４７：２５１−２７６；１９７９，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．，２６：３６７−３８４参照）。
【０１２６】
このような考察及び広範な実験的研究に基づいて、保存的アミノ酸置換の表が構築されており、当該技術において知られている。例えば：アルギニン及びリジン；グルタミン酸及びアスパラギン酸；セリン及びスレオニン；グルタミン及びアスパラギン；バリン、ロイシン及びイソロイシンが挙げられる。或いは：Ａｌａ（Ａ）、ｌｅｕ、ｉｌｅ、ｖａｌ；Ａｒｇ（Ｒ）、ｇｌｎ、ａｓｎ、ｌｙｓ；Ａｓｎ（Ｎ）ｈｉｓ、ａｓｐ、ｌｙｓ、ａｒｇ、ｇｌｎ；Ａｓｐ（Ｄ）ａｓｎ、ｇｌｕ；Ｃｙｓ（Ｃ）、ａｌａ、ｓｅｒ；Ｇｌｎ（Ｑ）、ｇｌｕ、ａｓｎ；Ｇｌｕ（Ｅ）、ｇｌｎ、ａｓｐ；Ｇｌｙ（Ｇ）、ａｌａ；Ｈｉｓ（Ｈ）、ａｓｎ、ｇｌｎ、ｌｙｓ、ａｒｇ；Ｉｌｅ（Ｉ）、ｖａｌ、ｍｅｔ、ａｌａ、ｐｈｅ、ｌｅｕ；Ｌｅｕ（Ｌ）、ｖａｌ、ｍｅｔ、ａｌａ、ｐｈｅ、ｉｌｅ；Ｌｙｓ（Ｋ）、ｇｌｎ、ａｓｎ、ａｒｇ；Ｍｅｔ（Ｍ）、ｐｈｅ、ｉｌｅ、ｌｅｕ；Ｐｈｅ（Ｆ）、ｌｅｕ、ｖａｌ、ｉｌｅ、ａｌａ、ｔｙｒ；Ｐｒｏ（Ｐ）、ａｌａ；Ｓｅｒ（Ｓ）、ｔｈｒ；Ｔｈｒ（Ｔ）、ｓｅｒ；Ｔｒｐ（Ｗ）、ｐｈｅ、ｔｙｒ；Ｔｙｒ（Ｙ）、ｔｒｐ、ｐｈｅ、ｔｈｒ、ｓｅｒ；Ｖａｌ（Ｖ）、ｉｌｅ、ｌｅｕ、ｍｅｔ、ｐｈｅ、ａｌａである。
【０１２７】
アミノ酸置換に関する他の検討事項には、残基がタンパク質の内部に位置するか、または溶媒に露出されるか否かが含まれる。内部残基について、保存的置換には、Ａｓｐ及びＡｓｎ；Ｓｅｒ及びＴｈｒ；Ｓｅｒ及びＡｌａ；Ｔｈｒ及びＡｌａ；Ａｌａ及びＧｌｙ；Ｉｌｅ及びＶａｌ；Ｖａｌ及びＬｅｕ；Ｌｅｕ及びＩｌｅ；Ｌｅｕ及びＭｅｔ；Ｐｈｅ及びＴｙｒ；Ｔｙｒ及びＴｒｐが含まれるであろう（例えば、ＰＲＯＷＬ  ｗｅｂｓｉｔｅ  ａｔ  ｒｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ．ｅｄｕ参照）。溶媒に露出される残基の場合、保存的置換には、Ａｓｐ及びＡｓｎ；Ａｓｐ及びＧｌｕ；Ｇｌｕ及びＧｌｎ；Ｇｌｕ及びＡｌａ；Ｇｌｙ及びＡｓｎ；Ａｌａ及びＰｒｏ；Ａｌａ及びＧｌｙ；Ａｌａ及びＳｅｒ；Ａｌａ及びＬｙｓ；Ｓｅｒ及びＴｈｒ；Ｌｙｓ及びＡｒｇ；Ｖａｌ及びＬｅｕ；Ｌｅｕ及びＩｌｅ；Ｉｌｅ及びＶａｌ；Ｐｈｅ及びＴｙｒ（Ｉｄ）が含まれるであろう。アミノ酸置換の選択を助けるために様々なマトリックス、例えばＰＡＭ２５０スコアリングマトリックス、Ｄａｙｈｏｆｆマトリックス、Ｇｒａｎｔｈａｍマトリックス、ＭｃＬａｃｈｌａｎマトリックス、Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅマトリックス、Ｈｅｎｉｋｏｆｆマトリックス、Ｍｉｙａｔａマトリックス、Ｆｉｔｃｈマトリックス、Ｊｏｎｅｓマトリックス、Ｒａｏマトリックス、ＬｅｖｉｎマトリックスおよびＲｉｓｌｅｒマトリックス（Ｉｄｅｍ．）が構築されている。
【０１２８】
アミノ酸置換を決定する際には、分子間または分子内結合、例えば正に帯電した残基（例えば、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ）と負に荷電した残基（例えば、Ａｓｐ、Ｇｌｕ）の間のイオン結合（塩橋）、または近くのシステイン残基間のジスルフィド結合の形成が考慮され得る。
【０１２９】
コードされたタンパク質配列中の任意の他のアミノ酸を、任意の他のアミノ酸に置換する方法は周知で、且つ当業者にとっては、例えば、部位特異的突然変異誘発の技術による、またはアミノ酸置換をコードするオリゴヌクレオチドの合成及び組み立て、並びに発現ベクター構築物中へのスプライシングによるルーチンの実験の問題である。
【０１３０】
プレターゲティング
二重特異性抗体または多重特異性抗体は、プレターゲッティング技術において有用であり得る。この場合、１以上の診断薬及び／または治療薬を、１以上のハプテンを含む標的化可能な構築物に複合体化させることができる。当該ハプテンは、腫瘍関連抗原または他の疾患関連抗原にも結合する二重特異性または多重特異性抗体の少なくとも１つのアームによって認識される。この場合、当該治療剤は、当該標的化可能な構築物の結合を介して当該抗体に間接的に結合する。このプロセスは、プレターゲッティングと称される。
【０１３１】
プレターゲティングは、本来、直接ターゲッティング抗体の遅い血液クリアランスを解決するために開発された多段階プロセスであり、骨髄のような正常組織に対する望ましくない毒性に寄与する。プレターゲッティングでは、治療剤が、血液から数分以内に除去される小さな送達分子（標的化可能な構築物）に結合される。標的化可能な構築物及び標的抗原への結合部位を有する二重特異性または多重特異性のプレターゲッティング抗体が最初に投与され、遊離抗体が循環系から除去され、次いで標的化可能な構築物が投与される。
【０１３２】
プレターゲッティングの方法は、例えば、Ｇｏｏｄｗｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第４，８６３，７１３号；Ｇｏｏｄｗｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２９：２２６，１９８８；Ｈｎａｔｏｗｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２８：１２９４，１９８７；Ｏｅｈｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２９：７２８，１９８８；Ｋｌｉｂａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２９：１９５１，１９８８；Ｓｉｎｉｔｓｙｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．３０：６６，１９８９；Ｋａｌｏｆｏｎｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．３１：１７９１，１９９０；Ｓｃｈｅｃｈｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ４８：１６７，１９９１；Ｐａｇａｎｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５１：５９６０，１９９１；Ｐａｇａｎｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｃｏｍｍｕｎ．１２：２１１，１９９１；米国特許第５，２５６，３９５号；Ｓｔｉｃｋｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５１：６６５０，１９９１；Ｙｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５１：３１１９，１９９１；米国特許第６，０７７，４９９号；同第７，０１１，８１２号；同第７，３００，６４４号；同第７，０７４，４０５号；同第６，９６２，７０２号；同第７，３８７，７７２号；同第７，０５２，８７２号；同第７，１３８，１０３号；同第６，０９０，３８１号；同第６，４７２，５１１号；同第６，９６２，７０２号；および同第６，９６２，７０２号に記載されており、これらの各々を参照により本明細書に援用する。
【０１３３】
対象の疾患または障害を診断または治療するプレターゲティング方法は、（１）当該対象に二重特異性抗体または抗体断片を投与すること；（２）必要に応じて、当該対象にクリアリング組成物を投与し、当該組成物が当該抗体を循環系から除去することを可能にすること；および（３）当該対象に、１以上のキレート化または化学的に結合された治療剤または診断剤を含有する標的化可能な構築物を投与することによって提供される。
【０１３４】
標的化可能な構築物
ある特定の実施形態において、プレターゲッティングに使用するための１以上の治療剤または診断剤で標識された標的化可能な構築物ペプチドは、標的化可能な構築物ペプチドのための１以上の結合部位、及び疾患または状態に関連する標的抗原のための１以上の結合部位を備えた二重特異性抗体に結合するように選択することができる。二重特異性抗体はプレターゲッティング技術において使用することができ、ここでは抗体が最初に対象に投与され得る。二重特異性抗体が標的抗原に結合するために、及び未結合の抗体が循環系から消失するために、十分な時間が許容され得る。次に、標識されたペプチドのような標的化可能な構築物を対象に投与し、当該二重特異性抗体に結合させ、罹患した細胞または組織に局在させることができる。
【０１３５】
このような標的化可能な構築物は多様な構造のものであってよく、またプレターゲッティング法および二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）または多重特異性抗体において使用される場合、標的化可能な構築物に高親和性で結合する抗体または断片の利用可能性のためだけでなく、迅速なインビボクリアランスのために選択される。疎水性物質は強い免疫応答を誘発するのに最良であるのに対して、親水性物質は迅速なインビボクリアランスのために好ましい。従って、疎水性および親水性の間のバランスが確立される。これは部分的には、親水性キレート剤を使用して、多くの有機部分の固有の疎水性を相殺するとによって達成できる。また、反対の溶液特性を有する標的化可能な構築物のサブユニット、例えば、幾つかは疎水性で且ついくつかは親水性であるアミノ酸を含むペプチドが選択され得る。
【０１３６】
僅か２個のアミノ酸残基、好ましくは２〜１０個の残基を有するペプチドを使用することができ、またキレート剤のような他の部分に結合することもできる。当該リンカーは、好ましくは５０，０００ダルトン未満、有利には約２０，０００ダルトン未満、１０，０００ダルトン未満または５，０００ダルトン未満の分子量を有する低分子複合体とすべきである。より普通には、当該標的化可能な構築物ペプチドは、例えば二重特異性抗体に結合するための４以上の残基及び１以上のハプテンを有する。例示的なハプテンには、Ｉｎ−ＤＴＰＡ（インジウム−ジエチレントリアミン五酢酸）またはＨＳＧ（ヒスタミンスクシニルグリシン）が含まれ得る。標的化可能な構築物はまた、１以上のキレート化部分、例えばＤＯＴＡ（１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸）、ＮＯＴＡ（１，４，７−トリアザ−シクロノナン−１，４，７−三酢酸）、ＴＥＴＡ（ｐ−ブロモアセトアミド−ベンジル−テトラエチルアミン四酢酸）、ＮＥＴＡ（［２−（４，７−ビスカルボキシメチル［１，４，７］トリアザシクロノナン−１−イル−エチル）−２−カルボニルメチル−アミノ］酢酸）、または他の既知のキレート化部分を含むことができる。当該キレート化部分は、例えば、治療用及び／または診断用の放射性核種、常磁性イオンまたは造影剤を結合するために使用されてよい。
【０１３７】
当該標的化可能な構築物はまた、インビボでのペプチドの安定性を増大させるために、骨格構造中に非天然アミノ酸、例えばＤ−アミノ酸を含んでもよい。代替実施形態では、他の骨格構造、例えば非天然アミノ酸（例えばＤ−アミノ酸）またはペプトイドから構築されたものを使用することができる。
【０１３８】
標的化可能な構築物として使用されるペプチドは、固相支持体及び反復した直交脱保護及び連結の標準的技術を用いて、自動ペプチド合成機上で簡便に合成される。ペプチド中の遊離アミノ基は、後でキレート化部分または他の薬剤を複合体化するために使用され、Ｂｏｃ基等の標準的な保護基でブロックされるのが有利であり、またＮ末端残基は血清安定性を高めるためにアセチル化される。そのような保護基は当業者に周知である。Ｇｒｅｅｎｅ  ａｎｄ  Ｗｕｔｓ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，１９９９（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．）を参照されたい。ペプチドが二重特異性抗体系内における後での使用のために調製される場合、それらはインビボでのカルボキシペプチダーゼ活性を阻害するために、樹脂から切断されて対応するＣ末端アミドを生成させるのが有利である。
【０１３９】
当該抗体は、二重特異性抗体によるプレターゲッティングが使用される場合、標的組織によって産生される抗原、または当該組織に付随した抗原のための第１の結合部位、及び当該標的化可能な構築物上のハプテンのための第２の結合部位を含むであろう。例示的なハプテンとしては、ＨＳＧ及びＩｎ−ＤＴＰＡが含まれるが、これらに限定されない。ＨＳＧハプテンに対して産生された抗体は既知であり（例えば、６７９抗体）、適切な二重特異性抗体に容易に組み込むことができる（例えば、米国特許第６，９６２，７０２号、第７，１３８，１０３号及び第７，３００，６４４号の実施例の節を参照されたい）。しかしながら、他のハプテン及びこれに結合する抗体は、Ｉｎ−ＤＴＰＡ及び７３４抗体（例えば、その実施例の節を本明細の一部として援用する米国特許第７，５３４，４３１号）のように、当該技術において既知であり、且つ使用することができる。
【０１４０】
免疫複合体
様々な実施形態は、１以上の診断薬または治療薬に結合した抗Ｔｒｏｐ−２抗体またはその抗原結合性断片を備えた免疫複合体の使用を含み得る。幾つかの実施形態において、薬物または他の作用物質は、担体部分を介して抗体またはその断片に結合され得る。担体部分は、例えば還元されたＳＨ基及び／または炭水化物側鎖に結合することができる。担体成分は、ジスルフィド結合形成を介して、還元された抗体成分のヒンジ領域に結合することができる。或いは、このような薬剤は、Ｎ−スクシニル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）のようなヘテロ二官能性架橋剤を用いて結合させることができる（Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ５６：２４４（１９９４））。そのような複合体化のための一般的な技術は、当技術において周知である。例えば、Ｗｏｎｇ，ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  ＯＦ  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＣＯＮＪＵＧＡＴＩＯＮ  ＡＮＤ  ＣＲＯＳＳ−ＬＩＮＫＩＮＧ（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  １９９１）；Ｕｐｅｓｌａｃｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｂｙ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，”ｉｎ  ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ  ＡＮＤ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ，Ｂｉｒｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐａｇｅｓ１８７−２３０（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９９５）；Ｐｒｉｃｅ，“Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，”ｉｎ  ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ，ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ  ＡＮＤ  ＣＬＩＮＩＣＡＬ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮ，Ｒｉｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐａｇｅｓ６０−８４（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９９５）を参照されたい。或いは、担体部分は、抗体のＦｃ領域における糖鎖部分を介して結合させることができる。
【０１４１】
抗体の糖鎖部分を介して抗体に官能基を結合させる方法は、当業者に周知である。例えば、Ｓｈｉｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ４１：８３２（１９８８）；Ｓｈｉｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ４６：１１０１（１９９０）；ａｎｄ  Ｓｈｉｈ  ｅｔ  ａｌ．，その実施例の節を参照により本明細書に援用する、米国特許第５，０５７，３１３号を参照されたい。一般的な方法は、酸化された糖鎖部分を有する抗体を、少なくとも１つの遊離アミン官能基を有する担体ポリマーと反応させることを含んでいる。この反応は、初期のシッフ塩基（イミン）結合をもたらし、これは第２級アミンへの還元によって安定化されて、最終的な複合体を形成することができる。
【０１４２】
抗体成分が抗体断片である場合、Ｆｃ領域は存在しない可能性がある。しかし、全長抗体または抗体断片の軽鎖可変領域に糖鎖部分を導入することが可能である。例えば、Ｌｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：５９１９（１９９５）；その実施例の節を参照により本明細書に援用する米国特許第５，４４３，９５３号及び同第６，２５４，８６８号を参照されたい。この操作された糖鎖部分は、治療薬または診断薬を結合するために使用される。
【０１４３】
ターゲティング分子に担体部分を結合させる別の方法は、クリックケミストリー反応の使用を含んでいる。クリックケミストリーのアプローチは、もともと小さなサブユニットをモジュール方式で結合することによって、複雑な物質を迅速に生成する方法として着想された（例えば、Ｋｏｌｂ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  ４０：３００４−３１；Ｅｖａｎｓ，２００７  Ａｕｓｔ  Ｊ  Ｃｈｅｍ  ６０：３８４−９５を参照されたい）。クリックケミストリー反応の様々な形態は、例えばヒュスゲン１，３−双極子環化付加銅触媒反応（Ｔｏｒｎｏｅら、２００２、Ｊ有機ＣＨＥＭ  ６７：３０５７から６４）のように当該技術において既知であり、これは屡々「クリック反応」と称される。他の選択肢には、ディールス−アルダー（Ｄｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ）のような環状付加反応、求核置換反応（特に、エポキシ及びアジリジン化合物のような小さな歪み環）、尿素化合物のカルボニル化学形成、及びチオール−イン反応におけるアルキンのような炭素−炭素二重結合を含む反応が含まれる。
【０１４４】
アジドアルキンのヒュスゲン環状付加反応は、第１の分子に結合した末端アルキン基の反応を触媒するために、還元剤の存在下で銅触媒を使用する。アジド部分を含む第２の分子の存在下において、当該アジドは活性化されたアルキンと反応して１，４−二置換１，２，３−トリアゾールを形成する。この銅触媒反応は室温で起こり、十分に特異的なので、反応生成物の精製は必要とされないことが多い（Ｒｏｓｔｏｖｓｔｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  ４１：２５９６；Ｔｏｒｎｏｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｊ  Ｏｒｇ  Ｃｈｅｍ  ６７：３０５７．）。アジド官能基及びアルキン官能基は、水性媒体中の生体分子に対して概ね不活性であり、複雑な溶液中で反応を起こすことを可能にする。形成されたトリアゾールは化学的に安定であり、酵素的開裂を受けず、生物学的系においてクリックケミストリー生成物を非常に安定にする。銅触媒は生細胞に対して有毒であるが、銅ベースのクリック化学反応は免疫複合体形成のためにインビトロで使用され得る。
【０１４５】
生体分子の共有結合修飾のために、銅を用いないのクリック反応が提案されている（Ｓｅｅ，  ｅ．ｇ．，Ａｇａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  １２６：１５０４６−４７参照）。銅を用いない反応は、銅触媒の代わりに環歪を使用して、［３＋２］アジド−アルキン環状付加反応を促進する（同上）。例えば、シクロオクチンは、内部アルキン結合を含む８炭素環構造である。閉環構造は、アセチレンの実質的な結合角変形を誘発し、これはアジド基と高度に反応してトリアゾールを形成する。従って、シクロオクチン誘導体は、銅を用いないクリック反応に使用することができる（同上）
【０１４６】
歪みで促進されるアルキン−ニトロン環状付加を含んだ、別のタイプの銅フリーのクリック反応が、Ｎｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０，Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  ４９：３０６５−６８）によって報告された。シクロオクチン反応の元々の遅い速度に対処するために、電子吸引基が三重結合に隣接して結合されている（同上）。そのような置換シクロオクチンの例には、二フッ素化シクロオクチン、４−ジベンゾシクロオクチノール及びアザシクロオクチンが含まれる（同上）。別の銅フリー反応には、Ｎ−アルキル化イソキサゾリンを与えるための、歪みで促進されるアルキン−ニトロン環状付加が含まれる（同上）。この反応は、例外的に速い反応速度論を有すると報告され、またペプチドおよびタンパク質の部位特異的修飾のためのワンポット３段階プロトコールで使用された（同上）。ニトロンは、適切なアルデヒドとＮ−メチルヒドロキシルアミンとの縮合によって調製され、また環状付加反応は、アセトニトリルと水の混合物中で生じた（同上）。これら及び他の既知のクリックケミストリー反応を使用して、担体部分をインビトロで抗体に結合させることができる。
【０１４７】
Ａｇａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（２００４，Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  １２６：１５０４６−４７）は、過アセチル化Ｎ−アジドアセチルマンノーサミンの存在下でＣＨＯ細胞において発現された組換え糖タンパク質が、糖タンパク質の糖鎖中の対応するＮ−アジドアセチルシアル酸の生物学的取り込みをもたらすことを実証した。当該アジド誘導体化された糖タンパク質は、ビオチン化されたシクロオクチンと特異的に反応してビオチン化糖タンパク質を形成するが、アジド部分を有さない対照糖タンパク質は未標識のままである（同上）。Ｌａｕｇｈｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２０：６６４−６６７）は、過アセチル化Ｎ−アジドアセチルガラクトサミンと共にインキュベートしたゼブラフィッシュ胚において、細胞表面グリカンを代謝的に標識するために同様の技術を使用した。当該アジド誘導体化されたグリカンは、ジフルオロシクロオクチン（ＤＩＦＯ）試薬と反応して、インビボでグリカンを視覚化することができた。
【０１４８】
ディールス・アルダー反応は、分子のインビボ標識にも使用されている。Ｒｏｓｓｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０，Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  ４９：３３７５−７８））は、トランス−シクロオクテン（ＴＣＯ）反応性部分を有する腫瘍局在化した抗ＴＡＧ７２（ＣＣ４９）抗体と、１１１Ｉｎ標識されたテトラジンＤＯＴＡ誘導体との間の、インビボでの収率５２％を報告した。ＴＣＯ標識されたＣＣ４９抗体を、結腸癌異種移植片を有するマウスに投与し、１日後に１１１Ｉｎ標識されたテトラジンプローブを注射した（同上）。放射線標識プローブ注射の３時間後には、生存マウスのＳＰＥＣＴ撮像により示されたように、放射性標識プローブと腫瘍局在化抗体との反応は腫瘍における顕著な放射能局在化をもたらし、腫瘍対筋肉比は１３：１であった（同上）。この結果により、ＴＣＯおよびテトラジン標識された分子のインビボ化学反応が確認された。
【０１４９】
標識部分の生物学的組み込みを用いる抗体標識技術は、米国特許第６，９５３，６７５号（その実施例の節を参照により本明細書に援用する）に更に開示されている。そのような「改善された（ｌａｎｄｓｃａｐｅｄ）」抗体は、グリコシル化部位に反応性ケトン基を有するように調製された。この方法は、ＣＨ１またはＶＫドメイン中の１以上のＮ−グリコシル化部位を有する抗体をコードする発現ベクターをトランスフェクトされた細胞を、糖または糖前駆体のケトン誘導体を含む培養培地中の発現させることを含んでいた。ケトン誘導体化された糖類または前駆体には、Ｎ−レブリノイルマンノーサミン及びＮ−レブリノイルフコースが含まれる。当該改善された抗体は、その後、標識されたターゲッティング分子を形成するために、ヒドラジド、ヒドラジン、ヒドロキシルアミノまたはチオセミカルバジドのようなケトン反応性部分を含む物質と反応された。当該改善された抗体に結合される例示的物質には、ＤＰＴＡのようなキレート化剤、ドキソルビシン−デキストラン及びアシル−ヒドラジド含有ペプチドのような大きな薬物分子が含まれる。当該改善技術はケトン部分を含む抗体を製造することに限定されず、ニトロン、アジドまたはシクロオクチンのようなクリックケミストリー反応性基を、抗体または他の生物学的分子に導入するために使用することができる。
【０１５０】
クリックケミストリー反応の改変は、インビトロまたはインビボでの使用に適している。反応性ターゲッティング分子は、化学的複合体化または生物学的組み込みの何れかによって形成され得る。抗体または抗体断片のような標的化分子は、アジド部分、置換シクロオクチンもしくはアルキン基、またはニトロン部分で活性化され得る。当該ターゲティング分子がアジド基またはニトロン基を含む場合、対応する標的化可能な構築物は置換シクロオクチンまたはアルキン基を含むであろうし、逆もまた同様である。そのような活性化分子は、上記で述べたように、生きた細胞における代謝的取り込みによって作製され得る。
【０１５１】
或いは、このような部分を生体分子に化学的に複合体化させる方法は当技術において周知であり、斯かる既知の方法何れかを利用することができる。免疫複合体形成の一般的な方法は、例えば、米国特許第４，６９９，７８４号；同第４，８２４，６５９；同第５，５２５，３３８；同第５，６７７，４２７；同第５，６９７，９０２；同第５，７１６，５９５；同第６，０７１，４９０；同第６，１８７，２８４；同第６，３０６，３９３；同第６，５４８，２７５；同第第６，６５３，１０４号；同第６，９６２，７０２；同第７，０３３，５７２；同第７，１４７，８５６；同第及び７，２５９，２４０に開示されており、各々の実施例の節を参照により本明細書に援用する。
【０１５２】
診断剤
診断剤は、検出抗体を標識するために、またはＣＴＣを直接標識するために使用され得る任意の検出可能な物質を含むことができ、好ましくは、放射性核種、放射線造影剤、常磁性イオン、金属、蛍光標識、化学発光標識、超音波造影剤及び光活性剤からなる群から選択される。そのような診断薬は周知であり、斯かる既知の診断薬の何れをも使用することができる。診断剤の非限定的な例には、１１０Ｉｎ、１１１Ｉｎ、１７７Ｌｕ、１８Ｆ、５２Ｆｅ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、８６Ｙ、９０Ｙ、８９Ｚｒ、９４ｍＴｃ、９４Ｔｃ、９９ｍＴｃ、１２０Ｉ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１５４−１５８Ｇｄ、３２Ｐ、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、５１Ｍｎ、５２ｍＭｎ、５５Ｃｏ、７２Ａｓ、７５Ｂｒ、７６Ｂｒ、８２ｍＲｂ、８３Ｓｒ、または他のガンマ放出体、ベータ放出体もしくはポジトロン放出体のような放射性核種が含まれ得る。使用される常磁性イオンには、クロム（ＩＩＩ）、マンガン（ＩＩ）、鉄（ＩＩＩ）、鉄（ＩＩ）、コバルト（ＩＩ）、ニッケル（ＩＩ）、銅（ＩＩ）、ネオジム（ＩＩＩ）、サマリウム（ＩＩＩ）、イッテルビウム（ＩＩＩ）、ガドリニウム（ＩＩＩ）、バナジウム（ＩＩ）、テルビウム（ＩＩＩ）、ジスプロシウム（ＩＩＩ）、ホルミウム（ＩＩＩ）またはエルビウム（ＩＩＩ）が含まれ得る。金属造影剤には、ランタン（ＩＩＩ）、金（ＩＩＩ）、鉛（ＩＩ）またはビスマス（ＩＩＩ）が含まれ得る。超音波造影剤には、ガス充填リポソームのようなリポソームが含まれ得る。放射線不透過性診断薬は、化合物、バリウム化合物、ガリウム化合物、及びタリウム化合物から選択することができる。
【０１５３】
ある特定の実施形態において、蛍光プローブは、ＤＹＬＩＧＨＴ（登録商標）色素（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）であり得る。ＤＹＬＩＧＨＴ（登録商標）染料シリーズは極性が強く（親水性）、水性バッファーに適合し、光安定性があり、高い蛍光強度を示す。それらは、広いｐＨ範囲にわたって高い蛍光性を維持し、種々の用途に好ましい。しかし、当業者は、様々な蛍光染料が知られ、及び／または市販されており、利用可能であることを理解するであろう。他の蛍光剤には、これらに限定されるものではないが、塩化ダンシル、ローダミンイソチオシアネート、Ａｌｅｘａ３５０、Ａｌｅｘａ４３０、ＡＭＣＡ、アミノアクリジン、ＢＯＤＩＰＹ６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ６５０／６６５、ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ−Ｒ６Ｇ、ＢＯＤＩＰＹ−ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ−ＴＲＸ、５−カルボキシ−４´，５´−ジクロロ−２´，７´−ジメトキシフルオレセイン、５−カルボキシ−２´，４´，５´、７´−テトラクロロフルオレセイン、５−カルボキシフルオレセイン、５−カルボキシローダミン、６−カルボキシローダミン、６−カルボキシテトラメチルアミノ、カスケード青、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５，６−ＦＡＭ、塩化ダンシル、フルオレセイン、ＨＥＸ、６−ＪＯＥ、ＮＢＤ（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール）、オレゴン緑４８８、オレゴン緑５００、オレゴン緑５１４、パシフィック青、フタル酸、テレフタル酸、イソフタル酸、クレシルファスト紫、クレシル青紫、ブリリアントクレシル青、パラアミノ安息香酸、エリスロシン、フタロシアニン、アゾメチン、シアニン、キサンチン、スクシニルフルオレセイン、希土類金属クリプテート、ユーロピウム・トリスビピリジンジアミン、ユーロピウムクリプテートもしくはキレート、ジアミン、ジシアニン、ＬａＪｏｌｌａ青色素、アロピコシアニン、アロコシアニンＢ、フィコシアニンＣ、フィコシアニンＲ、チアミン、フィコエリトロシアニン、フィコエリトリンＲ、ＲＥＧ、ローダミン緑、ローダミンイソチオシアネート、ローダミン赤、ＲＯＸ、ＴＡＭＲＡ、ＴＥＴ、ＴＲＩＴ（テトラメチルローダミンイソチオール）、テトラメチルローダミン、およびテキサス赤が含まれる（例えば、米国特許第５，８００，９９２号、同第６，３１９，６６８号を参照されたい）。これら及び他の発光標識は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇ．）及びＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）などの商業的供給源から得ることができる。
【０１５４】
使用される化学発光標識には、ルミノール、イソルミノール、芳香族アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩または、シュウ酸エステルが含まれ得る。
【０１５５】
治療剤
多種多様な治療試薬を、抗Ｔｒｏｐ−２または他の抗ＴＡＡ抗体と同時にまたは順次投与することができる。或いは、このような薬剤、例えば、薬物、毒素、オリゴヌクレオチド、免疫調節剤、ホルモン、ホルモンアンタゴニスト、酵素、酵素阻害剤、放射性核種、血管新生阻害剤等は、抗体に複合体化することができる。治療剤には、例えば、ビンカアルカロイド等の細胞毒性薬物、ドキソルビシン等のアントラサイクリン、２−ＰＤｏｘもしくはｐｒｏ−２−ＰＤｏｘ、ゲムシタビン、エピポドフィロトキシン、タキサン、代謝拮抗剤、アルキル化剤、抗生物質、ＳＮ−３８、ＣＯＸ−２阻害剤、抗有糸分裂剤、抗血管新生剤及びアポトーシス促進剤、特にドキソルビシン、メソトレキセート、タキソール、ＣＰＴ−１１、カンプトテカン、プロテオソーム阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、ＨＤＡＣ阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤ーおよび他のものが含まれる。他の有用な抗癌細胞毒性薬には、ナイトロジェンマスタード、アルキルスルホネート、ニトロソウレア、トリアゼン、葉酸類似体、ＣＯＸ−２阻害剤、代謝拮抗剤、ピリミジン類似体、プリン類似体、白金配位錯体、ｍＴＯＲ阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、プロテオソーム阻害剤、ＨＤＡＣ阻害剤、カンプトテシン、ホルモン等が含まれる。適切な細胞傷害剤は、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ‘Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ，１９ｔｈ  Ｅｄ．（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．１９９５）、およびＧＯＯＤＭＡＮ  ＡＮＤ  ＧＩＬＭＡＮ’Ｓ  ＴＨＥ  ＰＨＡＲＭＡＣＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＢＡＩＳＩＳ  ＯＦ  ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ，７ｔｈ  Ｅｄ．（ＭａｃＭｉｌｌａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．１９８５）、並びにこれらの改訂版を含む刊行物に記載されている。実験薬物等の他の適切な細胞毒性物質は、当業者に既知である。好ましい実施形態において、カンプトテシンおよびＳＮ−３８のようなの関連化合物の複合体は、抗Ｔｒｏｐ−２抗体または他の抗ＴＡＡ抗体に複合体化され得る。別の好ましい実施形態において、ゲムシタビンは、ＳＮ−３８−ｈＲＳ７および／または９０Ｙ−ｈＰＡＭ４と複合体化させて対象に投与される。
【０１５６】
毒素は、動物起源、植物起源または微生物起源のものであることができる。使用する毒素としては、リシン、アブリン、リボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）、ＤＮアーゼＩ、ブドウ球菌エンテロトキシンＡ、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、オンコナーゼ、ゲロニン、ジフテリア毒素、シュードモナス外毒素及びシュードモナス内毒素が挙げられる。例えば、Ｐａｓｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ４７：６４１（１９８６），Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ，ＣＡ−−Ａ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｆｏｒ  Ｃｌｉｎｉｃｉａｎｓ  ４４：４３（１９９４），Ｓｈａｒｋｅｙ  ａｎｄ  Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ，ＣＡ−−Ａ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｆｏｒ  Ｃｌｉｎｉｃｉａｎｓ  ５６：２２６（２００６）を参照されたい。使用に適した追加の毒素が当業者に知られており、米国特許第６，０７７，４９９号に開示されている。その実施例の節を、参照により本明細書に援用する。
【０１５７】
本明細書中で使用する場合、「免疫調節物質」の用語には、サイトカイン、リンホカイン、モノカイン、幹細胞増殖因子、リンホトキシン、造血因子、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、インターフェロン（ＩＦＮ）、副甲状腺ホルモン、チロキシン、インスリン、プロインスリン、リラキシン、プロリラキシン、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、肝臓成長因子、プロスタグランジン、線維芽細胞成長因子、プロラクチン、胎盤ラクトゲン、ＯＢタンパク質、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、インスリン様成長因子（ＩＬＧＦ）、エリスロポエチン、トロンボポエチン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ミュラー管阻害物質、マウスゴナンドトロピン関連ペプチド、インヒビン、阿口便、血管内皮成長因子、インテグリン、インターロイキン（ＩＬ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロンγ、インターフェロン−λ、Ｓ１因子、ＩＬ−１、ＩＬ−１ｃｃ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１及びＩＬ−２５、ＬＩＦ、キット−リガンド、ＦＬＴ−３、アンギオスタチン、トロンボスポンジン、エンドスタチン、及びリンホトキシン等が含まれる。
【０１５８】
特に有用な治療用放射性核種には、１１１Ｉｎ、１７７Ｌｕ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、２１１Ａｔ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、９０Ｙ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３２Ｐ、３３Ｐ、４７Ｓｃ、１１１Ａｇ、６７Ｇａ、１４２Ｐｒ、１５３Ｓｍ、１６１Ｔｂ、１６６Ｄｙ、１６６Ｈｏ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１８９Ｒｅ、２１２Ｐｂ、２２３Ｒａ、２２５Ａｃ、５９Ｆｅ、７５Ｓｅ、７７Ａｓ、８９Ｓｒ、９９Ｍｏ、１０５Ｒｈ、１０９Ｐｄ、１４３Ｐｒ、１４９Ｐｍ、１６９Ｅｒ、１９４Ｉｒ、１９８Ａｕ、１９９Ａｕ、２２７  Ｔｈ、および２１１Ｐｂが含まれるが、これらに限定されない。治療用放射性核種は、好ましくは、オージェ放射体については２０〜６，０００ｋｅＶの範囲、好ましくは６０〜２００ｋｅＶ、ベータ放射体については１００〜２５００ｋｅＶ、アルファ放射体については４，０００〜６，０００ｋｅＶの崩壊エネルギーを有する。有用なベータ粒子放出核種の最大崩壊エネルギーは、好ましくは２０〜５，０００ｋｅＶ、より好ましくは１００〜４，０００ｋｅＶ、最も好ましくは５００〜２，５００ｋｅＶである。オージェ放出粒子で実質的に崩壊する放射性核種もまた好ましい。例えば、Ｃｏ−５８、Ｇａ−６７、Ｂｒ−８０ｍ、Ｔｃ−９９ｍ、Ｒｈ−１０３ｍ、Ｐｔ−１０９、Ｉｎ−１１１、Ｓｂ−１１９、Ｉ−１２５、Ｈｏ−１６１、Ｏｓ−１８９ｍ、およびＩｒ−１９２である。有用なベータ粒子放出核種の崩壊エネルギーは、好ましくは１，０００ｋｅＶ未満、より好ましくは１００ｋｅＶ未満、最も好ましくは７０ｋｅＶ未満である。α粒子の生成により実質的に崩壊する放射性核種もまた好ましい。このような放射性核種には、Ｄｙ−１５２、Ａｔ−２１１、Ｂｉ−２１２、Ｒａ−２２３、Ｒｎ−２１９、Ｐｏ−２１５、Ｂｉ−２１１、Ａｃ−２２５、Ｆｒ−２２１、Ａｔ−２１７、Ｂｉ−２１３、Ｆｍ−２５５、およびＴｈ−２２７が含まれるが、これらに限定されない。有用なアルファ粒子放出放射性核種の崩壊エネルギーは、好ましくは２，０００〜１０，０００ｋｅＶ、より好ましくは３，０００〜８，０００ｋｅＶ、最も好ましくは４，０００〜７，０００ｋｅＶである。
【０１５９】
例えば、高エネルギーβ粒子を放出する９０Ｙは、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）を用いて、より好ましくはＤＯＴＡを用いて、抗体、抗体フラグメントまたは融合タンパク質に結合させることができる。抗体または標的化可能な構築物に９０Ｙを複合体化させる方法は、当該技術において既知であり、任意のそのような既知の方法を使用することができる。（例えば、その実施例の節を参照により本明細書に援用する、米国特許第７，２５９，２４９号を参照されたい。また、Ｌｉｎｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１１：５２１５−２２，２００５；Ｓｈａｒｋｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ．４６：６２０−３３，２００５；Ｓｈａｒｋｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ．４４：２０００−１８，２００３も参照されたい）。
【０１６０】
追加の可能性のある治療用放射性同位体には、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、７５Ｂｒ、１９８Ａｕ、２２４Ａｃ、１２６Ｉ、１３３Ｉ、７７Ｂｒ、１１３ｍＩｎ、９５Ｒｕ、９７Ｒｕ、１０３Ｒｕ、１０５Ｒｕ、１０７Ｈｇ、２０３Ｈｇ、１２１ｍＴｅ、１２２ｍＴｅ、１２５ｍＴｅ、１６５Ｔｍ、１６７Ｔｍ、１６８Ｔｍ、１９７Ｐｔ、１０９Ｐｄ、１０５Ｒｈ、１４２Ｐｒ、１４３Ｐｒ、１６１Ｔｂ、１６６Ｈｏ、１９９Ａｕ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、５１Ｃｒ、５９Ｆｅ、７５Ｓｅ、２０１Ｔｌ、２２５Ａｃ、７６Ｂｒ、および１６９Ｙｂ等が含まれる。
【０１６１】
別の実施形態において、放射線増感剤は、裸のまたは複合体化された抗体または抗体断片と組み合わせて使用することができる。例えば、放射線増感剤は、放射性標識された抗体または抗体断片と組み合わせて使用することができる。放射標識された抗体または抗体断片単独での治療と比較した場合、放射性増感剤の添加は効力を増強することができる。放射線増感剤は、ＤＭ  Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ（編）、ＣＡＮＣＥＲ  ＴＨＥＲＡＰＹ  ＷＩＴＨ  ＲＡＤＩＯＬＡＢＥＬＥＤ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５）に記載されている。この技術で使用される他の典型的な放射線増感剤には、ゲムシタビン、５−フルオロウラシル、及びシスプラチンが含まれ、様々な癌の治療における外部照射と組み合わせて使用されている。
【０１６２】
熱中性子活性化療法のためのホウ素付加物担持担体を有する抗体またはその断片は、通常、同様の影響を受ける。しかし、中性子照射を行う前に、非ターゲッティング免疫複合体が消失するまで待つことが有利であろう。クリアランスは、抗癌抗体に結合する抗イディオタイプ抗体を用いて加速することができる。この一般原則の説明については、米国特許第４，６２４，８４６号を参照されたい。例えば、カルボランのようなホウ素付加物を抗体に結合させることができる。カルボランは、当技術分野で周知のように、ペンダント側鎖上のカルボキシル官能基を用いて調製することができる。アミノデキストランのような担体へのカルボランの結合は、カルボランにおけるカルボキシル基の活性化及び担体上のアミンとの縮合によって達成することができる。次に、当該中間複合体を抗体に複合体化させる。当該抗体複合体の投与後に、ホウ素付加物は熱中性子照射により活性化されて、アルファ放出により崩壊する放射性原子に変換され、毒性の高い短距離効果を生じる。
【０１６３】
製剤及び投与
治療用抗体をインビボで投与する場合、適切な投与経路には、経口、非経口、直腸、経粘膜、腸内投与、髄内、髄腔内、直接的な脳室内、静脈内、硝子体内、腔内、腹腔内、腫瘍内注射が含まれるが、これ等に限定されない。好ましい投与経路は非経口、より好ましくは静脈内投与である。或いは、化合物を全身的ではなく局所的に、例えば、固形腫瘍または血液腫瘍への化合物の直接注射により投与することができる。
【０１６４】
抗体は、医薬的に有用な組成物を調製するための既知の方法に従って製剤化することができ、その際、抗体は医薬的に適切な賦形剤との混合物中で組み合わされる。滅菌リン酸緩衝生理食塩水は、医薬的に適切な賦形剤の一例である。他の適切な賦形剤は、当業者に周知である。例えば、Ａｎｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＤＯＳＡＧＥ  ＦＯＲＭＳ  ＡＮＤ  ＤＲＵＧ  ＤＥＬＩＶＥＲＹ  ＳＹＳＴＥＭＳ，５ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｌｅａ  ＆  Ｆｅｂｉｇｅｒ  １９９０），及びＧｅｎｎａｒｏ  （ｅｄ．），ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ‘Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ，１８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ  １９９０），並びにそれらの改訂版を参照されたい。
【０１６５】
好ましい実施形態において、当該抗体は、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）；Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸（ＡＤＡ）；Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）；４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）；２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）；３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）；３−（Ｎ−モルホリニル）−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）；ピペラジン−Ｎ，Ｎ´−ビス（２−エタンスルホン酸）［Ｐｉｐｅｓ］からなる群から選択される緩衝液を用いて、グッドの生物学的緩衝液（ｐＨ６〜７）中に処方される。より好ましい緩衝液は、ＭＥＳまたはＭＯＰＳであり、好ましくは２０〜１００ｍＭ、より好ましくは約２５ｍＭの濃度である。最も好ましいのは２５ｍＭ・ＭＥＳ、ｐＨ６．５である。当該製剤は、賦形剤として２５ｍＭトレハロース及び０．０１％ｖ／ｖポリソルベート８０を更に含むことができ、添加された賦形剤の結果として最終緩衝液濃度は２２．２５ｍＭに改変される。好ましい保存方法は、−２０℃〜２℃の温度範囲で保存された複合体の凍結乾燥製剤であり、最も好ましい保存は２℃〜８℃である。
【０１６６】
当該抗体は、例えば、ボーラス注射、低速輸液または連続注入を介した静脈内投与のために製剤化できる。好ましくは、本発明の抗体は、約４時間未満の期間にわたって、より好ましくは約３時間未満の期間にわたって注入される。例えば、最初の２５〜５０ｍｇを３０分以内、好ましくは１５分以内に注入し、残りを次の２〜３時間にわたって注入することができる。注射用製剤は、単位剤形、例えばアンプルまたは複数用量容器中において、防腐剤を加えて提供することができる。当該組成物は、油性または水性の賦形剤中の懸濁液、溶液またはエマルジョンのような形態をとることができ、また懸濁剤、安定化剤及び／または分散剤のような処方剤を含有することができる。或いは、活性成分は、使用前に適切な賦形剤（例えば、発熱物質を含まない滅菌水）と共に構成するための粉末形態であることができる。
【０１６７】
更なる医薬的方法を使用して、治療用複合体の作用持続時間を制御することができる。制御放出調製物は、抗体を複合体化または吸着させるためのポリマーの使用を介して調製することができる。例えば、生体適合性ポリマーには、ポリ（エチレン−ｃｏ−酢酸ビニル）のマトリックスと、ステアリン酸二量体およびセバシン酸のポリ酸無水物コポリマーのマトリックスが含まれる。Ｓｈｅｒｗｏｏｄｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１４４６（１９９２）を参照されたい。そのようなマトリックスからの抗体放出速度は、抗体の分子量、マトリックス内の抗体の量、及び分散した粒子のサイズに依存する。Ｓａｌｔｚｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．５５：１６３（１９８９）；Ｓｈｅｒｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，上掲。他の固体剤形は、Ａｎｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＤＯＳＡＧＥ  ＦＯＲＭＳ  ＡＮＤ  ＤＲＵＧ  ＤＥＬＩＶＥＲＹ  ＳＹＳＴＥＭＳ，５ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｌｅａ＆Ｆｅｂｉｇｅｒ  １９９０）、及びＧｅｎｎａｒｏ（編）、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ‘Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ，１８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ  １９９０）及びその改訂版に記載されている。
【０１６８】
一般に、ヒトについて投与される抗体の投与量は、患者の年齢、体重、身長、性別、一般的な医学的状態及び以前の病歴などの因子に応じて変化する。単回の静脈内注入として約０．３ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇの範囲の抗体投与量をレシピエントに与えることが望ましくあり得るが、より低いか、またはより高い用量もまた状況に応じて投与され得る。例えば、７０ｋｇの患者の場合、０．３〜５ｍｇ／ｋｇの投与量は、１．７ｍの患者の場合、２１〜３５０ｍｇまたは１２〜２０６ｍｇ／ｍ２である。この投与量は、必要に応じて、例えば、１週間に１回を２〜１０週間、１週間に１回を８週間、または１週間に１回を４週間、繰り返すことができる。また、維持療法の必要に応じて、数か月間隔週、または数か月の間毎月または四半期毎のように、より少ない頻度で投与することもできる。好ましい投与量には、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．７ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、１．２ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ、３．０ｍｇ／ｋｇ、３．５ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ、４．５ｍｇ／ｋｇ及び５．０ｍｇ／ｋｇが含まれる。より好ましい投与量は、毎週投与については０．６ｍｇ／ｋｇであり、より少ない投与頻度の場合には１．２ｍｇ／ｋｇである。０．３〜５ｍｇ／ｋｇの範囲の任意の量を使用することができる。この投与量が、好ましくは、１週間に１回、複数回投与される。主に血液毒性に関連した毒性副作用及びそれからの回復に依存する用量頻度で、４週間、より好ましくは８週間、より好ましくは１６週間以上の最小投与計画を使用することができる。この投与計画は、（ｉ）毎週；（ｉｉ）隔週；（ｉｉｉ）１週間の治療後に２，３または４週間の休薬；（ｉｖ）２週間の治療後に１，２，３または４週間の休薬；（ｖ）３週間の治療後に１，２，３，４または５週間の休薬；（ｖｉ）４週間の治療後に１，２，３，４または５週間の休薬；（ｖｉｉ）５週間の治療後に１，２，３，４または５週間の休薬；および（ｖｉｉｉ）毎月からなる群から選択されるサイクルに基づいて、週に１回または２回の投与を含んでよい。当該サイクルは、２，４，６，８，１０、または１２回以上繰り返されてよい。
【０１６９】
或いは、抗体は２週間または３週間毎に１回の投薬として投与することができ、合計で少なくとも３回の投薬を繰り返す。または、４週間から６週間毎に２回投与され得る。この投薬量は、１週間おきに、または更に少ない頻度で投与され得るので、患者は何れかの薬物関連毒性から回復することができる。或いは、投薬計画は、２〜３か月間について２〜３週間毎に減少させることができる。投薬スケジュールは、任意に、他の間隔で繰り返すことができ、用量は、投薬量及びスケジュールの適切な調整を伴って、様々な非経口経路によって与えられ得る。
【０１７０】
本明細書に記載され且つ特許請求される方法及び組成物は、悪性または前悪性状態を治療し、また新生物または悪性状態（上記で述べた疾患が含まれるが、それらに限定されない）への進行を防止するために使用することができる。そのような使用は、前述の新形成または癌への進行が既知または疑われる状態、特に過形成、異形成、または最も特別には形成異常からなる非新生物細胞増殖が起こっている状態においてその必要性が指示される（このような異常な増殖状態の検討については、Ｒｏｂｂｉｎｓ  ａｎｄ  Ａｎｇｅｌｌ，Ｂａｓｉｃ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２ｄ  Ｅｄ．，Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｃｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ｐｐ．６８−７９（１９７６）を参照されたい）。
【０１７１】
異形成はしばしば癌の先駆けであることが多く、主に上皮に見られる。これは、非新生物細胞増殖の最も無秩序な形態であり、個々の細胞の均一性及び細胞の構造的配向の喪失を含んでいる。異形成は、慢性的な刺激または炎症が存在する場合に特徴的に生じる。好ましい実施形態において、本発明の方法は、癌、特に上に列挙したものの成長、進行及び／または転移を阻害するために使用される。
【０１７２】
キット
種々の実施形態は、患者においてＴｒｏｐ−２陽性ＣＴＣを検出するのに適した構成要素を含むキットに関する。例示的キットは、本明細書に記載の少なくとも１つの抗Ｔｒｏｐ−２抗体を含み得る。ある特定の実施形態において、抗体は、少なくとも１つの診断薬に複合体化され得る。別の実施形態では、Ｔｒｏｐ−２陽性ＣＴＣに結合する第２の抗体を含めることができる。当該第２の抗体は、Ｔｒｏｐ−２の異なるエピトープまたは異なるＴＡＡに結合し、少なくとも１つの診断薬で標識することができる。ある特定の実施形態において、抗Ｔｒｏｐ−２抗体またはその抗原結合性断片は、抗体の滅菌液体製剤または凍結乾燥調製物を含有するプレフィルドシリンジまたはプレフィルドバイアルの形態で提供され得る（例えば、Ｋｉｖｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｔｈｅｒ．２００６，２８：１６１９−２９）。
【０１７３】
当該キットの構成要素は一緒に包装されてもよく、または２つ以上の容器の中に分離されてもよい。幾つかの実施形態において、当該容器は、再構成に適した組成物の滅菌凍結乾燥製剤を含むバイアルであってよい。キットはまた、他の試薬の再構成及び／または希釈に適した１以上の緩衝液を含み得る。使用され得る他の容器には、パウチ、トレイ、ボックス、チューブなどが含まれるが、これらに限定されない。キットの構成要素は、容器内で無菌的に包装し、維持することができる。含まれ得る別の構成要素は、キットの使用説明書である。
【実施例】
【０１７４】
以下の実施例は、本発明の実施形態を例示するものであり、特許請求の範囲に対する限定ではない。
【０１７５】
実施例１．抗Ｔｒｏｐ−２抗体の細胞結合アッセイ
ヒトＴｒｏｐ−２に対する２つの異なるマウスモノクローナル抗体が得られた。最初のもの、１６２−４６．２が、ローラーボトルで増殖させたハイブリドーマ（ＡＴＣＣ、ＨＢ−１８７）から精製された。第２の抗体であるＭＡＢ６５０は、Ｒ＆Ｄシステムズ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）から購入した。結合の比較のために、Ｔｒｏｐ−２陽性ヒト胃癌のＮＣＩ−Ｎ８７を標的として使用した。結合アッセイの前日に、細胞（１．５×１０５／ウェル）を９６ウェルプレートに播種した。翌朝、１６２−４６．２、ＭＡＢ６５０、及びマウスＲＳ７（０．０３〜６６ｎＭ）（図示せず）を用いて、用量／応答曲線を作成した。これらの一次抗体を細胞と共に１．５時間４℃でインキュベートした。ウェルを洗浄し、抗マウスＨＲＰ二次抗体を全てのウェルに４℃で１時間加えた。ウェルを再度洗浄し、続いて発光基質を添加する。Ｅｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダーを用いてプレートを読み取り、値を相対発光単位として報告する。
【０１７６】
３つの抗体は全て、ＲＳ７については０．５７ｎｍ、ＭＡＢ６５０については１６２−４６．２及び０．４９ｎｍ（図示せず）の同様のＫＤ値を有していた。しかし、１６２−４６．２及びＭＡＢ６５０の最大結合（Ｂｍａｘ）をＲＳ７と比較すると、それらはそれぞれ２５％及び５０％減少し（ＲＳ７についてはＢＭａｘ１１，２５０、１６２−４６．２については８，４７１、及びＭＡＢ６５０については６，０１８）、ＲＳ７と比較して異なる結合特性を示した（図示せず）。
【０１７７】
実施例２．血液試料の採取及び保存。
１０人の健常なドナー及び２０人の転移性乳癌患者それぞれから、１０ｍＬの血液試料を採取し、ＣＥＬＬＳＡＶＥ（商標）防腐チューブ（Ｊａｓｓｅｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＬＬＣ，Ｒａｒｉｔａｎ，ＮＪ）に分注する。試料を室温で保存し、採血から７２時間以内に処理する（Ａｌｌａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，１０：６８９７）。或いは、１０ｍＬの血液試料をＣＹＴＯＣＨＥＸ（登録商標）採血管（Ｓｔｒｅｃｋ，Ｏｍａｈａ，ＮＥ）に引き込み、室温で維持し、７日以内に処理する（Ｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，３８５：７９）。血液はまた、１０ｍＬのＫ２ＥＤＴＡ  ＶＡＣＵＴＡＲＮＥＲ（登録商標）（ＢＤ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）の中に抜き取り、採血の４時間以内にＬＩＱＵＩＤＢＩＯＰＳＹ（登録商標）固定剤（Ｃｙｎｖｅｎｉｏ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｗｅｓｔｌａｋｅ  Ｖｉｌｌａｇｅ，ＣＡ）で固定し、室温で保存し、固定の９６時間以内に処理することができる。
【０１７８】
実施例３．健康なドナー由来の血液試料中の癌細胞の添加。
何れも高レベルのＴｒｏｐ−２を発現するＳＫ−ＢＲ−３細胞及びＢｘＰＣ−３細胞を、それらの指定培地で培養し、トリプシンを用いて回収する。得られた細胞懸濁液の生存率及び細胞数を、Ｇｕａｖａ  ＥＡＳＹＣＹＴＥ（商標）フローサイトメーターによって評価する。当該細胞懸濁液は、生存率が９０％を超える場合にのみ使用される。正常血清に添加された細胞の数は、ｍＬ当たり１〜１００である。中程度のレベルのＴｒｏｐ−２を発現する癌細胞、例えばＭＣＦ−７、ＬｏＶｏ、及びＬＳ１７４Ｔ、低レベルのＴｒｏｐ−２を発現する癌細胞、例えばＨＴ−２９、またはＴｒｏｐ−２について陰性である癌細胞、例えばＡ５４９及びＨ４６０はまた、血液試料に添加するために使用することができる。
【０１７９】
実施例４．添加された血液試料からの、磁気装置を用いた上皮癌細胞の単離。
上皮癌細胞を添加した血液試料を、ビオチン化トリＦａｂ・ｈＲＳ７（上記のＤＮＬ（登録商標）技術により調製されたビオチン−Ｅ１／３）及びストレプトアビジンで被覆した強膜流体（ＦＦ−ＳＶ）と共にインキュベートして、上皮細胞を免疫磁気的に濃縮する。簡単に言えば、既知数の添加されたＢｘＰＣ−３またはＳＫ−ＢＲ−３を含有する７．５ｍＬの血液試料を６ｍＬの緩衝液と混合し、８００×ｇで１０分間遠心分離する。血漿及び緩衝液層を除去した後、ビオチン−Ｅ１／３及びＦＦ−ＳＶを添加し、１時間インキュベートする。続いて、磁気分離した後、未標識細胞を標識細胞から除去する。その後、ビオチン−Ｅｌ／３で標識された細胞を、更なる洗浄及び遠心分離でＦＦ−ＳＶから脱離させ、ＤＡＰＩ、ＰＥ−抗ＣＫ１８及びＡＰＣ−抗ＣＤ４５で標識した後にフローサイトメトリーによって分析する。ＣＤ４５を欠失し且つサイトケラチン（ＣＫ８、ＣＫ１８、ＣＫ１９）を発現しない有核細胞は、一般にＣＴＣｓと定義される（Ｓｗａｂｙ  ＆  Ｃｒｉｓｔｏｆａｎｉｌｌｉ，２０１１，ＢＭＣ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，９：４３）。
【０１８０】
実施例５．磁気装置を使用しない、添加された血液試料からの上皮癌細胞の単離。
Ｓｔｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０，ＰＮＡＳ，１０７：１８３９２）に記載されているように、上皮癌細胞を添加した血液試料を、アビジンで化学修飾した微小渦発生ヘリンボーンチップ（ＨＰ−Ｃｈｉｐ）中でビオチン−Ｅ１／３と共にインキュベートするか、或いは、より好ましくは、ビオチン−Ｅ１／３と１時間インキュベートした後、Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３，Ｍｅｔｈｏｄｓ，６４：１４４）が記載するようにして、ストレプトアビジンで官能化したＮａｎｏＶｅｌｃｒｏチップに添加する。未結合細胞を洗い流した後、実施例３に記載したようにして、結合した細胞をＣＴＣについて分析する。
【０１８１】
実施例６．予め濃縮しない添加された血液試料からの上皮癌細胞の検出。
ＢｘＰＣ−３を添加した血液試料中の赤血球を塩化アンモニウムで溶解し、遠心分離する。細胞ペレットを回収し、ＦＩＴＣ標識したＥ１／３と共にインキュベートする。次いで、懸濁液中の生細胞をポリリジン処理スライドに塗布し、レーザースキャニングサイトメーターで分析する（Ｐａｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，７：Ｒ９７５）。或いは、赤血球の溶解後に集めた細胞ペレットを、ＦＩＴＣ標識アビジンの存在下に、ビオチン化Ｅ１／３及び１つ以上の他のビオチン化ＤＮＬ（登録商標）複合体を含むカクテルと共にインキュベートする。次いで懸濁液中の生細胞をレーザー走査サイトメーターで分析する。
【０１８２】
実施例７．Ｔｒｏｐ−２及びＥＧＦＲの両方を標的とする二重特異性構築物を用いた、添加された血液試料からの上皮癌細胞の検出
高レベルのＴｒｏｐ−２及びＥＧＦＲを発現するＢｘＰＣ−３細胞を添加した血液試料を、実施例４に記載したように、（Ｅ１）−２２５と命名されたビオチン化二重特異性Ｔｒｉ−Ｆａｂ、及びストレプトアビジンでコーティングされた磁性流体（ＦＦ−ＳＶ）と共にインキュベートする。（Ｅ１）−２２５は、ＣＨ１−ＤＤＤ２−Ｆａｂ−ｈＲＳ７をＣＨ１−ＡＤ２−Ｆａｂ−ｃ２２５に結合させて、それぞれＴｒｏｐ−２及びＥＧＦＲに対する二価及び一価の結合を与えることにより生成される。単一特異性のｈＲＳ７またはｃ２２５（セツキシマブ）のみを使用した濃縮と比較した場合、二重特異性（Ｅ１）−２２５は、ＣＤ４５陽性白血球の汚染が少なく、血液試料中に添加されたＢｘＰＣ−３をより多く捕捉することができる。
【０１８３】
実施例８．ＬＩＱＵＩＤＢＩＯＰＳＹ（登録商標）システムを用いたＴｒｏｐ−２＋ＣＴＣの検出
リキッドバイオプシー（登録商標）装置（カタログ番号Ａ２８１８８）、リキッドバイオプシー（登録商標）血液採取キット（カタログ番号Ａ２８１７１）及びリキッドバイオプシー試薬及び消耗品キット（カタログ番号Ａ２８１８６、Ａ２８１８７）を、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ（グランドアイランド、ＮＹ）から入手した。リキッドバイオプシー（登録商標）キットには、血液試料を処理するためのバッファー、試薬、バイアル、溶出チューブ、及びフローセルのほか、試料の未冷蔵出荷（９６時間窓）を可能にする全血試料の安定化プロトコールが含まれている。
【０１８４】
ヒト化ＲＳ７（ｈＲＳ７）モノクローナル抗体（サシツズマブ）は、試薬及び消耗品（Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｏｎｓｕｍａｂｌｅｓ）キットと共に提供される、プロトコール及び試薬を用いてビオチン化される。ビオチニル化ｈＲＳ７（サシツズマブ）を、試薬及び消耗品キットと共に提供される抗ＥｐＣＡＭビオチン化抗体の代わりに使用する。或いは、抗ＴＲＯＰ−２ビオチン化抗体（カタログ番号ＢＡＦ６５０，Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を抗ＥｐＣＡＭの代わりに使用する。
【０１８５】
固形腫瘍を有する患者の血液からの循環腫瘍細胞を、抗ＴＲＯＰ−２ビオチン化抗体、並びに上記器具及び試薬を用いて、製造業者の指示に従って単離する。単離した腫瘍細胞をスライドから解放させ、実施例３に記載したように、ＤＡＰＩ、ＰＥ−抗ＣＫ１８、及びＡＰＣ−抗ＣＤ４５で標識した後、フローサイトメトリーにより確認する。第２の血液検体からの解放細胞を培養し、生きた細胞のコロニーを得、これをＥｍｐｉｒｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（Ｂｕｆｆａｌｏ，ＮＹ）から入手可能な特異的プローブを用いて、Ｔｒｏｐ−２及び染色体−１のコピー数についてＦＩＳＨにより単離及び分析する。図１及び図２は、ＭＣＦ−７（Ｔｒｏｐ−２陽性）細胞及びＡ５４９（Ｔｒｏｐ−２陰性）細胞で得られた代表的な結果であり、Ｔｒｏｐ−２遺伝子の３コピー及び２コピーをそれぞれ示している。加えて、トポイソメラーゼＩ（ＴＯＰ１）及び染色体２０のコピー数もまた、Ａｂｎｏｖａ（Ｔａｉｐｅｉ，Ｔａｉｗａｎ）により提供された特異的プローブを用いて決定され、記録される。図３及び図４は、ＭＣＦ−７及びＡ５４９細胞において得られた代表的な結果であり、それぞれＴＯＰ１遺伝子の７コピー及び３コピーを示している。Ｔｒｏｐ−２及びＴＯＰ１のコピー数の同時検出及び定量は、ＴＯＰ１をも発現する癌細胞の決定を可能にし、これは何れの患者の腫瘍が、イリノテカンのようなＴＯＰ１阻害薬療法に対して特に応答性または耐性であるかを示すであろう。これは、Ｔｒｏｐ−２発現癌細胞を標的とし、そのような細胞に選択的にＳＮ−３８を送達するサシツズマブ・ゴビテカン（ＩＭＭＵ−１３２）を用いる場合に特に有用である。血液試料からの腫瘍細胞の回収を、抗Ｔｒｏｐ−２・ｈＲＳ７抗体を用いて、当該キットと共に提供される抗ＥｐＣＡＭ抗体に対して比較する。驚くべきことに、ＣＴＣの回収率は、抗Ｔｒｏｐ−２抗体を用いる場合の方が抗ＥｐＣＡＭ抗体よりも高い。
【０１８６】
実施例９．ＩＭＡＧ（商標）磁性粒子を用いたＴｒｏｐ−２＋ＣＴＣの単離
精製マウス抗ヒトＴｒｏｐ−２抗体を、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）から購入したクローン１６２−４６から調製する。この抗Ｔｒｏｐ−２抗体を、実施例７に記載されるようにしてビオチン化する。ＩＭＡＧ（商標）磁性粒子（ストレプトアビジン粒子プラス−ＤＭ）及びＢＤ  ＩＭＡＧ（商標）細胞分離磁石は、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）から購入する。Ｋ２ＥＤＴＡ（カタログ番号３６６６４３）でスプレーコートされた１０ｍＬのプラスチック製全血チューブもまたＢＤから購入する。
【０１８７】
ＣＴＣの分離及び分析のために、１０ｍＬの血液試料を肺癌患者から採取し、Ｋ２ＥＤＴＡチューブに保存する。単核細胞を、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ溶液を用いた密度勾配遠心分離によって得る。Ｆｉｃｏｌｌ−ＨｙｐａｑｕｅからのＣＴＣの陽性選択のためのプロトコールは、ＢＤ技術データシート・ストレプトアビジン粒子プラス−ＤＭ材料番号：５５７８１２に開示されている通りである。ＢＤ  ＩＭＡＧ（商標）磁石上での最終洗浄ステップの後、解放された細胞を緩衝液に再懸濁させる。
【０１８８】
細胞を、蛍光標識抗サイトケラチン、蛍光標識されたアフィニティー精製ヤギ抗ＴＲＯＰ−２、ＤＡＰＩ及び／または抗ＣＤ４５で染色する。その後、捕捉された細胞の免疫蛍光画像を撮り、続いて蛍光強度及び細胞形態学に基づく包括的なコンピュータ支援分析を行う。捕捉された細胞の免疫蛍光画像が得られ、続いて蛍光強度及び細胞形態に基づく包括的なコンピュータ支援分析が行われる。
【０１８９】
実施例１０．Ｔｒｏｐ−２＋ＣＴＣの検出及び転移性Ｔｒｏｐ−２発現癌の治療
ＣＥＬＬＳＥＡＲＣＨ（登録商標）システム及び循環腫瘍細胞キットを、Ｖｅｒｉｄｅｘ  ＬＬＣ（Ｒａｒｉｔａｎ，ＮＪ）から入手する。ＮＳＣＬＣが疑われる６５歳の男性から７．５ｍＬの血液試料を採取し、ＣｅｌｌＳａｖｅチューブ（Ｖｅｒｉｄｅｘ  ＬＬＣ）中に保存する。抗Ｔｒｏｐ−２・ｈＲＳ７抗体を、ＣＥＬＬＳＥＡＲＣＨ（登録商標）キットと共に提供される抗ＥｐＣＡＭ抗体の代わりに用いる。血液試料を、抗Ｔｒｏｐ−２抗体に複合体化させた磁性ナノ粒子と混合する。細胞を蛍光標識抗ＣＤ４５及び抗ＣＫ抗体で染色し、細胞核をＤＡＰＩ核色素で蛍光標識する。強力な磁場をＣＥＬＬＳＥＡＲＣＨ（登録商標）システムで生成させ、磁気ナノ粒子に結合した細胞を分離するために使用し、次いで、上記実施例７に記載したようにして、Ｔｒｏｐ−２のコピー数を決定するためにＦＩＳＨにより分析する。結果は、１細胞当たり４コピーのＴｒｏｐ−２を備えた循環Ｔｒｏｐ−２＋腫瘍細胞の存在を示す。ＣＴＣにおけるＴｒｏｐ−２の高いコピー数の存在は、当該患者が抗Ｔｒｏｐ−２抗体による治療のための良好な候補であることを示す。
【０１９０】
更なる臨床検査は、ステージＩＩＩＢ・ＮＳＣＬＣ（扁平上皮細胞癌）の存在を示す。７０００ｃＧｙ・ＸＲＴと協働したカポプラチン／エトポシド（３か月）の初期治療は、１０か月間持続する応答をもたらす。その後、患者はタルセバ維持療法を開始し、これを、腰椎椎弓切除術を受けることに加えてＩＭＭＵ−１３２（ｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８）試験の対象となるまで継続する。患者はタルセバの５か月後にＩＭＭＵ−１３２の初回投与を受け、当時、彼は多量の胸水を伴って右肺に５．６ｃｍの病変を示す。最初のＣＴで主標的病変が３．２ｃｍに減少したことが示される２カ月後に、患者は６回目の投与を完了する。Ｔｒｏｐ−２＋ＣＴＣの定期的なアッセイは、ＩＭＭＵ−１３２による処置後にＣＴＣ数の実質的な減少を示す。
【０１９１】
この実施例は、個々の患者の血液中のＴｒｏｐ−２＋ＣＴＣをアッセイし、及び／またはＣＴＣにおけるＴｒｏｐ−２コピー数を決定することによって、ＩＭＭＵ−１３２または別の治療用抗Ｔｒｏｐ−２抗体での治療に応答する患者を選別することの可能性を示す。この実施例は更に、抗Ｔｒｏｐ−２に基づく療法の有効性の指標として、Ｔｒｏｐ−２＋ＣＴＣの相対的レベルをモニタリングする可能性を示す。好ましくは、限定されるものではないが、完全応答（ＣＲ）、部分応答（ＰＲ）及び／または安定疾患（ＳＤ）を含む陽性応答を示す患者は、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のレベルでのＴｒｏｐ−２＋ＣＴＣのレベル低下を示すであろう。当該治療が高度に有効であり、且つ完全な応答をもたらす場合、Ｔｒｏｐ−２における１００％の減少が観察され得る。
【０１９２】
実施例１１．ＶｅｒＩＦＡＳＴシステムを用いたＴｒｏｐ−２＋ＣＴＣの単離及び検出
Ｃａｓａｖａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３、Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ  １３：３９１−６；２０１４，Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ  １４：９９−１０５）において開示されたＶｅｒｌＦＡＳＴシステムを用いて、ＴＮＢＣにおけるＴｒｏｐ−２＋ＣＴＣを検出する。７．５ｍＬの血液試料を、ＴＮＢＣが疑われる一連の患者または対照の正常個体から採取し、ＣｅｌｌＳａｖｅチューブ（Ｖｅｒｉｄｅｘ  ＬＬＣ）の中に保存する。ビオチン化抗Ｔｒｏｐ−２・ｈＲＳ７抗体を、Ｃａｓａｖａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３、Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ  １３：３９１−６）に開示されたようにして調製する。当該血液試料を、ビオチン化抗Ｔｒｏｐ−２抗体及びストレプトアビジンに複合体化されたＰＭＰ（Ｃａｓａｖａｎｔら、２０１３、Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ  １３：３９１−６）と混合し、ＣＴＣを、ＶｅｒｌＦＡＳＴプラットフォーム及び手持ち型磁石を用いて分離する。細胞を腫瘍マーカーについて染色し、細胞核をＤＡＰＩ核色素で蛍光標識する。その結果は、ＴＮＢＣを持つ個体の血液試料中における循環Ｔｒｏｐ−２＋腫瘍細胞の存在を示す。
【０１９３】
実施例１２．ＳＮ−３８に複合体化されたｈＲＳ７抗体を含むＩＭＭＵ−１３２抗Ｔｒｏｐ−２ＡＤＣを用いた臨床試験
概要
本実施例は、ＩＭＭＵ−１３２（サシツズマブ・ゴビベカン）、即ち、ｐＨ感受性リンカーによりＳＮ−３８に複合体化された内在化ヒト化ｈＲＳ７抗Ｔｒｏｐ−２抗体の抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）を用いた、第Ｉ相臨床試験及び進行中の拡大第ＩＩ相試験の結果を報告する（平均薬物−抗体比＝７．６）。Ｔｒｏｐ−２は、を伴って、多くのヒト癌腫によって、高い密度（約１×１０５）、頻度及び特異性で発現され、限定された正常組織発現を示すＩ型膜貫通の、カルシウム形質導入タンパク質である。Ｃａｐａｎ−１ヒト膵臓腫瘍異種移植片を有するヌードマウスでの前臨床試験により、ＩＭＭＵ−１３２は、最大耐容性のイリノテカン療法（示されていない）から誘導されるよりも、１３６倍多いＳＮ−３８を腫瘍に送達できることが明らかになった。
【０１９４】
本実施例は、複数の以前の治療（幾つかはトポイソメラーゼＩ／ＩＩ阻害薬を含む）に失敗した２５人の患者（ｐｔｓ）の初期第Ｉ相試験を報告するものであり、また進行中の拡大第ＩＩ相試験は、小細胞肺癌及び非小細胞肺癌（それぞれＳＣＬＣ、ＮＳＣＬＣ）、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）、膵臓癌（ＰＤＣ）、食道癌及び他の癌を含む６９人の患者について報告するものである。
【０１９５】
以下で詳細に考察するように、Ｔｒｏｐ−２は血清中では検出されなかったが、殆どの記録された腫瘍において強く発現された（≧２＋）。３＋３試験設計において、ＩＭＭＵ−１３２は、反復する２１日サイクルにおいて第１日及び第８日に、８ｍｇ／ｋｇ／用量で開始し、次いで用量を制限する好中球減少症の前に、１２及び１８ｍｇ／ｋｇで与えられた。最小限の遅延で累積治療を最適化するために、第ＩＩ相は８及び１０ｍｇ／ｋｇに焦点を当てている（それぞれ、ｎ＝３０及び１４）。この時点で関連するＡＥを報告している４９人の患者では、好中球減少≧Ｇ３が２８％（４％Ｇ４）で発生した。これらの患者の最も一般的な非血液毒性は、疲労（５５％；≧Ｇ３＝９％）、悪心（５３％；≧Ｇ３＝０％）、下痢（４７％、≧Ｇ３＝９％）、脱毛症４０％、及び嘔吐（３２％；≧Ｇ３＝２％）となっている。ホモ接合性のＵＧＴ１Ａｌ＊２８／＊２８が６人の患者に認められ、そのうち２人は血液学的毒性及びＧＩ毒性がより重篤であった。当該第Ｉ相及び当該拡大相では、最良応答についてＲＥＣＩＳＴ／ＣＴにより評価可能な４８人の患者（ＰＤＣを除く）が現時点で存在する。ＣＲＣ（Ｎ＝１）、ＴＮＢＣ（Ｎ＝２）、ＳＣＬＣ（Ｎ＝２）、ＮＳＣＬＣ（Ｎ＝１）、及び食道癌（Ｎ＝１）の患者を含む７例の患者（１５％）、更に別の２７人（５６％）が安定した疾患（ＳＤ）を有し、合計３８人（７９％）が疾患反応を示した。１３人のＣＴで評価可能なＰＤＣ患者（６２％）のうち８人はＳＤを有し、その前の最後の治療での８．０週間に比べて、１２．７週間の進行時間（ＴＴＰ）中央値を有していた。残りの４８人の患者のＴＴＰは１２．６＋週（範囲６．０〜５１．４週）である。血漿ＣＥＡ及びＣＡ１９−９は応答性と相関した。抗ｈＲＳ７抗体または抗ＳＮ−３８抗体は、数か月にわたって投与されたにもかかわらず検出されなかった。複合体は３日以内に血清から除去され、これはＳＮ−３８の５０％が毎日放出され、血清中のＳＮ−３８の９５％超が非グルクロン酸形態のＩｇＧに結合され、ＳＮ−３８より１００倍も高い濃度でイリノテカンを与えられた患者で報告されたインビボの動物研究と一致した。これらの結果は、ｈＲＳ７−ＳＮ−３８含有ＡＤＣが、管理可能な下痢及び好中球減少を伴って、転移性固形癌において治療的に活性であることを示している。
【０１９６】
薬物動態学
２つのＥＬＩＳＡ法を用いて、ＩｇＧ（抗ｈＲＳ７イディオタイプ抗体での捕捉）及び完全な複合体（抗−ＲＳ−３８ＩｇＧ／抗ｈＲＳ７イディオタイプ抗体を備えたプローブでの捕捉）のクリアランスを測定した。ＳＮ−３８をＨＰＬＣで測定した。複合体からのＳＮ−３８の徐放を反映して、全ＩＭＭＵ−１３２画分（インタクトコンジュゲート）は、ＩｇＧ（図示せず）よりも速く消失した。ＳＮ−３８（非結合及び総）のＨＰＬＣ測定は、血清中のＳＮ−３８の＞９５％がＩｇＧに結合したことを示した。低濃度のＳＮ−３８Ｇは、ＩｇＧに結合したＳＮ−３８がグルコロニド化から保護されることを示唆している。複合体およびＳＮ−３８についてのＨＰＬＣのＥＬＩＳＡ比較は、両方の重複を明らかにし、ＥＬＩＳＡがＳＮ−３８クリアランスをモニターするための代用であることを示唆している。
【０１９７】
投薬計画及び患者調査の要約を表６に示す。
【表６】
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【０１９８】
臨床試験の現状
以前の３つの治療法の中央値を有する種々の転移性癌を有する合計６９人の患者（第Ｉ相における２５人の患者を含む）が報告された。８人の患者は臨床的進行を有し、ＣＴ評価の前に離脱した。１３人のＣＴ評価可能な膵臓癌患者が別々に報告された。ＰＤＣ患者の中央値ＴＴＰ（進行までの時間）は、以前の最後の治療についての中央値８週間のＴＴＰと比較して、１１．９週（範囲２〜２１．４週）であった。
【０１９９】
多様な癌を有する合計４８人の患者は、少なくとも１回のＣＴ評価を有しており、当該評価から最良反応（示さず）及び進行までの時間（ＴＴＰ；示さず）が決定された。ＴＮＢＣ（トリプルネガティブ乳癌）の評価可能な８人の患者の最良反応データを要約すると、２人のＰＲ（部分応答）、４人のＳＤ（安定した疾患）及び２人のＰＤ（疾患進行）であり、６／８（７５％）の合計応答［ＰＲ＋ＳＤ］であった。ＳＣＬＣ（小細胞肺癌）では、４人の評価可能な患者のうち、２人のＰＲ、０人のＳＤ及び２人のＰＤであり、２／４（５０％）の合計応答であった。ＣＲＣ（結腸直腸癌）では、１８人の評価可能な患者のうち、１人のＰＲ、１１人のＳＤおよび６人のＰＤであり、１２／１８（６７％）の合計応答であった。食道癌では、４人の評価可能な患者のうち、１人のＰＲ、２人のＳＤおよび１人のＰＤであり、３／４（７５％）の合計応答であった。ＮＳＣＬＣ（非小細胞肺癌）では、５人の評価可能な患者のうち、１人のＰＲ、３人のＳＤ、１人のＰＤであり、４／５（８０％）の合計応答であった。治療された全患者に亘って、４８人の評価可能な患者のうち、７人のＰＲ、２７人のＳＤ、及び１４人のＰＤであり、３４／４８（７１％）の合計応答であった。これらの結果は、抗ＴＲＯＰ−２  ＡＤＣ（ｈＲＳ７−ＳＮ−３８）が、ヒト患者の広範囲の固形腫瘍に対して有意な臨床効果を示したことを実証している。
【０２００】
報告された治療の副作用（有害事象）を表７に要約する。ｈＲＳ７−ＳＮ−３８の治療効果は、許容可能な低レベルの有害な副作用を示すＡＤＣ投与量で達成された。これと比較して、イリノテカン（１２５ｍｇ／ｍ２、週４回、Ｑ６Ｗ）の投与を受けた患者は、遥かに高い有害作用の発生を示し、３８％が等級３／４の下痢、３１％が好中球減少症、及び８％が好中球減少性発熱／感染であった。
【表７】
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【０２０１】
用量減少に関するデータも要約する。８ｍｇ／ｋｇの用量で開始した７６人の患者のうち、１２人（１６％）について用量を低減した。１０ｍｇ／ｋｇの開始用量の３３人の患者のうち、５人（１５％）について用量を低減した。１２ｍｇ／ｋｇの開始用量の９人の患者のうち、６人（６７％）について用量を低減した。１８ｍｇ／ｋｇの開始用量の３人の患者のうち、３人（１００％）について用量を低減した。我々は、８及び１０ｍｇ／ｋｇでは用量の低減は少ししかなく、治療的レベルのＡＤＣにおいては軽度の、予測可能で且つ管理可能な毒性プロファイルを反映していると結論付ける。現在、１４８人の患者から４２５の血清試料が分析されており、反復投与後でさえもＩＭＭＵ−１３２に対する抗体応答の証拠は検出されておらず、一部の患者では２０回を超えてＡＤＣの投与を受けている。
【０２０２】
現在までに治療されたＴＮＢＣを有する評価可能な４６人の患者（第Ｉ相及び第ＩＩ相）のうち、客観的応答が１２人の患者（２６％）に見られ、疾患抑制は３４人の患者（７４％）に見られ、臨床的利益比［ＣＲ＋ＰＲ＋（ＳＤ≧６か月）］は４６％、臨床的利益比［ＣＲ＋ＰＲ＋（ＳＤ≧４か月））は６３％に見られた。
【０２０３】
現在までに治療されたＮＳＣＬＣ患者１９人のうち、客観的応答が６人の患者（３２％）に見られ、疾患抑制は１４人の患者（７４％）に見られ、臨床的利益比［ＣＲ＋ＰＲ＋（ＳＤ≧４か月）］は５９％に見られた。
【０２０４】
現在までに治療されたＳＣＬＣ患者２０人のうち、客観的応答が６人の患者（３０％）に見られ、疾患抑制は１１人の患者（５５％）に見られ、臨床的利益比［ＣＲ＋ＰＲ＋（ＳＤ≧６か月）］は３７％に見られ、臨床的利益比［ＣＲ＋ＰＲ＋（ＳＤ≧４か月）］は５５％に見られた。
【０２０５】
現在までに治療されたＥＡＣ患者１６人のうち、客観的応答が２人の患者（１３％）に見られ、疾患抑制は９人の患者（５６％）に見られ、臨床的利益比［ＣＲ＋ＰＲ＋（ＳＤ≧４か月）］は４４％に見られた。
【０２０６】
抗Ｔｒｏｐ−２  ＡＤＣに対する例示的な部分応答は、ＣＴデータ（図示せず）によって確認された。ＣＲＣにおける典型的なＰＲとして、ＣＲＣで最初に診断された６２歳の女性は原発性半結腸切除術を受けた。４ヵ月後、肝転移の肝切除術を受け、ＦＯＬＦＯＸで７か月及び５ＦＵで１か月の治療を受けた。彼女は、主に肝臓に複数の病変を示し（免疫組織学による３＋Ｔｒｏｐ−２）、初回診断の約１年後に８ｍｇ／ｋｇの開始用量でｈＲＳ７−ＳＮ−３８試験に入った。彼女の最初のＣＴ評価では、ＰＲが達成され、標的病変が３７％減少した（図示せず）。患者は治療を続け、治療の１０か月後には６５％の最大減少を達成し（図示せず）、ＣＥＡは３月後に進む前に７８１ｎｇ／ｍＬから２６．５ｎｇ／ｍＬへと減少した。
【０２０７】
ＮＳＣＬＣにおける典型的なＰＲとして、６５歳の男性はＩＩＩＢ期のＮＳＣＬＣ（扁平細胞）と診断された。７０００ｃＧｙのＸＲＴと協働したカポプラチン／エトポシド（３カ月）の最初の治療は、１０か月の持続する応答を生じた。彼はその後、タルセバ維持療法を開始し、腰椎椎弓切除術を受けることに加えてＩＭＭＵ−１３２試験が考慮されるまで、彼はこれを続けた。彼は、タルセバの５か月後にＩＭＭＵ−１３２の初回投与を受けたが、当時、彼は右肺に多量の胸水を伴う５．６ｃｍの病変を示した。彼は、２ヵ月後に６回目の投与を完了したが、その時、最初のＣＴにより原発標的病変が３．２ｃｍに縮小したことが示された（図示せず）。
【０２０８】
ＳＣＬＣにおける典型的なＰＲとして、６５歳の女性が低分化ＳＣＬＣと診断された。応答がなく２カ月後に終了したカルボプラチン／エトポシド（Ｔｏｐｏ−ＩＩ阻害剤）に続いて、これも応答なしで２ヵ月後に終了したトポテカン（Ｔｏｐｏ−Ｉ阻害剤）を受けた後、彼女は局所ＸＲＴ（３０００ｃＧｙ）を受け、これは１月後に終了した。しかし、翌月にまで進行が続いた。患者は翌月にＩＭＭＵ−１３２（１２ｍｇ／ｋｇ；６．８ｍｇ／ｋｇに減少；Ｔｒｏｐ−２発現３＋）を開始し、ＩＭＭＵ−１３２の２か月後に、主肺病変の実質的な減少を含めて、標的病変が３８％縮小した（示さず）。患者は１２回の投薬を受けた後、３ヵ月後で進行した。
【０２０９】
これらの結果は、抗Ｔｒｏｐ−２  ＡＤＣが、以前の複数の治療の後に失敗または進行した患者においてさえ有効であることを実証する点で重要である。
【０２１０】
結論として、使用された用量では、主要な毒性は、管理可能な好中球減少症であり、等級３の毒性は少ししかなかった。ＩＭＭＵ−１３２は、トポイソメラーゼＩ阻害剤療法に対する再発の病歴を持った患者を含めて、トリプルネガティブ乳癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、大腸癌及び食道癌の再発／難治性患者における活性（ＰＲと耐久性のあるＳＤ）の証拠を示した。これらの結果は、既存の療法に対して耐性である広範囲の癌において抗Ｔｒｏｐ−２  ＡＤＣの有効性を示す。
【０２１１】
本発明の生成物、組成物、方法及びプロセスに対して種々の変更及び変形がなされ得ることは、当業者に明らかであろう。従って、本発明は、添付の特許請求の範囲及びその均等の範囲内にある限り、そのような変更及び変形を包含することが意図されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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