(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
げっ歯類であって、前記げっ歯類のゲノムは、改変ＤＰＰ４遺伝子を形成するための、内在性げっ歯類Ｄｐｐ４遺伝子座での、げっ歯類Ｄｐｐ４遺伝子のゲノム断片のヒトＤＰＰ４遺伝子のゲノム断片での置換を含み、前記改変ＤＰＰ４遺伝子は、前記ヒトＤＰＰ４遺伝子の前記ゲノム断片に作動可能に連結される内在性げっ歯類Ｄｐｐ４のエクソン１を含み、前記改変ＤＰＰ４遺伝子は、ヒトＤＰＰ４タンパク質をコードし、前記改変ＤＰＰ４遺伝子の発現は、前記内在性げっ歯類Ｄｐｐ４遺伝子座におけるげっ歯類調節エレメントの制御下にあり、前記げっ歯類は、マウスまたはラットであり、前記げっ歯類は、中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ−ＣｏＶ）に感染した場合に肺の炎症を示す、げっ歯類。
【請求項２】
前記ヒトＤＰＰ４遺伝子のゲノム断片が、前記ヒトＤＰＰ４遺伝子のエクソン２からエクソン２６を含む、請求項１に記載のげっ歯類。
【請求項３】
置換される前記げっ歯類Ｄｐｐ４遺伝子のゲノム断片が、前記げっ歯類Ｄｐｐ４遺伝子のエクソン２からエクソン２６を含む、請求項１または２に記載のげっ歯類。
【請求項４】
前記げっ歯類がマウスである、請求項１から３のいずれか一項に記載のげっ歯類。
【請求項５】
前記げっ歯類が、マウスＤｐｐ４タンパク質を発現することができないマウスである、請求項１から４のいずれか一項に記載のげっ歯類。
【請求項６】
前記げっ歯類が、改変ＤＰＰ４遺伝子についてヘテロ接合性である、請求項１から５のいずれか一項に記載のげっ歯類。
【請求項７】
前記げっ歯類が、改変ＤＰＰ４遺伝子についてホモ接合性である、請求項１から５のいずれか一項に記載のげっ歯類。
【請求項８】
ヒト化げっ歯類を作製するための方法であって、内在性げっ歯類Ｄｐｐ４遺伝子座におけるげっ歯類Ｄｐｐ４遺伝子のゲノム断片を、ヒトＤＰＰ４遺伝子のゲノム断片で置換して、改変ＤＰＰ４遺伝子を形成する工程を含み、前記改変ＤＰＰ４遺伝子は、前記ヒトＤＰＰ４遺伝子の前記ゲノム断片に作動可能に連結される内在性げっ歯類Ｄｐｐ４のエクソン１を含み、前記改変ＤＰＰ４遺伝子は、ヒトＤＰＰ４タンパク質をコードし、前記改変ＤＰＰ４遺伝子の発現は、前記内在性げっ歯類Ｄｐｐ４遺伝子座におけるげっ歯類調節エレメントの制御下にあり、前記げっ歯類は、マウスまたはラットであり、前記げっ歯類は、ＭＥＲＳ−ＣｏＶに感染した場合に肺の炎症を示す、方法。
【請求項９】
ヒト化げっ歯類を作製するための方法であって、
（ｉ）げっ歯類胚性幹細胞における内在性げっ歯類Ｄｐｐ４遺伝子座においてげっ歯類Ｄｐｐ４遺伝子のゲノム断片を、ヒトＤＰＰ４遺伝子のゲノム断片で置換して、改変ＤＰＰ４遺伝子を形成する工程であって、前記改変ＤＰＰ４遺伝子は、前記ヒトＤＰＰ４遺伝子の前記ゲノム断片に作動可能に連結される内在性げっ歯類Ｄｐｐ４のエクソン１を含み、前記改変ＤＰＰ４遺伝子は、ヒトＤＰＰ４タンパク質をコードし、前記改変ＤＰＰ４遺伝子の発現は、前記内在性げっ歯類Ｄｐｐ４遺伝子座におけるげっ歯類調節エレメントの制御下にあり、前記げっ歯類は、マウスまたはラットである、工程、および
（ｉｉ）工程（ｉ）の前記げっ歯類胚性幹細胞からげっ歯類を生成する工程であって、前記げっ歯類が、ＭＥＲＳ−ＣｏＶに感染した場合に肺の炎症を示す、工程
を含む、方法。
【請求項１０】
前記ヒトＤＰＰ４遺伝子のゲノム断片が、前記ヒトＤＰＰ４遺伝子のエクソン２からエクソン２６を含む、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
置換される前記げっ歯類Ｄｐｐ４遺伝子のゲノム断片が、前記げっ歯類Ｄｐｐ４遺伝子のエクソン２からエクソン２６を含む、請求項８から１０のいずれか一項に記載のげっ歯類。
【請求項１２】
前記げっ歯類がマウスである、請求項８から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記げっ歯類が、マウスＤｐｐ４タンパク質を発現することができないマウスである、請求項８から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記げっ歯類が、改変ＤＰＰ４遺伝子についてヘテロ接合性である、請求項８から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記げっ歯類が、改変ＤＰＰ４遺伝子についてホモ接合性である、請求項８から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
げっ歯類において、ヒト特異的ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ４）拮抗薬のインビボ治療有効性を決定するための方法であって、
（ａ）ＤＰＰ４拮抗薬を、請求項１から７のいずれか一項に記載のげっ歯類に投与する工程、および
（ｂ）前記げっ歯類がＭＥＲＳ−ＣｏＶに感染した場合に、前記ＤＰＰ４拮抗薬が、前記ＤＰＰ４拮抗薬が投与されていないＭＥＲＳ−ＣｏＶに感染した対照げっ歯類と比較して、ＭＥＲＳ−ＣｏＶ感染の１つ以上の症状を治療又は予防するかを決定する工程
を含む、方法。
【請求項１７】
前記ＤＰＰ４拮抗薬が小分子である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＤＰＰ４拮抗薬がペプチドまたは抗体である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＤＰＰ４拮抗薬が、ＭＥＲＳ−ＣｏＶタンパク質に対する抗体である、請求項１６または１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＭＥＲＳ−ＣｏＶタンパク質が、ＭＥＲＳ−ＣｏＶスパイクタンパク質である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記拮抗薬が、ＭＥＲＳ−ＣｏＶ感染前に投与される、請求項１６から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記拮抗薬が、ＭＥＲＳ−ＣｏＶ感染後に投与される、請求項１６から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記拮抗薬が、ＭＥＲＳ−ＣｏＶ感染と同時に投与される、請求項１６から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
工程（ｂ）における決定する工程が、ウイルス力価またはＲＮＡレベルを測定することを含む、請求項１６から２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
ウイルス力価又はＲＮＡレベルが、ｑＰＣＲ、ノーザンブロット、プラークアッセイ、及びインサイチュハイブリダイゼーションからなる群から選択される１つ以上の方法により査定される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
ＭＥＲＳ−ＣｏＶ感染の１つ以上の症状が、肺の炎症を含む、請求項１６から２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
肺の炎症が、組織化学的に評価される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
ＭＥＲＳ−ＣｏＶ感染の１つ以上の症状が、体重減少を含む、請求項１６から２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
遺伝子改変マウスであって、前記マウスのゲノムは、ヒト化ＤＰＰ４遺伝子を形成するための、マウスＤｐｐ４遺伝子のエクソン２から２６を含むマウスゲノム断片の、ヒトＤＰＰ４遺伝子のエクソン２から２６を含むヒトゲノム断片による置換を含み、前記ヒト化ＤＰＰ４遺伝子は、前記ヒトＤＰＰ４遺伝子の前記ゲノム断片に作動可能に連結される内在性マウスＤｐｐ４のエクソン１を含み、前記置換は、内在性マウスＤｐｐ４遺伝子座におけるものであり、前記ヒト化ＤＰＰ４遺伝子は、前記内在性Ｄｐｐ４遺伝子座における内在性マウスＤｐｐ４プロモーターの制御下にあり、前記マウスは、ＭＥＲＳ−ＣｏＶに感染した場合に肺の炎症を示す、マウス。
【請求項３０】
前記マウスが、マウスＤｐｐ４タンパク質を発現することができない、請求項２９に記載のマウス。
【請求項３１】
前記マウスが、前記置換についてヘテロ接合性である、請求項２９または３０に記載のマウス。
【請求項３２】
前記マウスが、前記置換についてホモ合性である、請求項２９または３０に記載のマウス。
【請求項３３】
マウスにおいて、ヒト特異的ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ４）拮抗薬のインビボ治療有効性を決定するための方法であって、
（ａ）ＤＰＰ４拮抗薬を、請求項２９から３２のいずれか一項に記載のマウスに投与する工程、および
（ｂ）ＭＥＲＳ−ＣｏＶに感染した場合の前記マウスにおいて、前記ＤＰＰ４拮抗薬が投与されていないＭＥＲＳ−ＣｏＶに感染した対照マウスと比較して、ＭＥＲＳ−ＣｏＶ感染の１つ以上の症状を低減させる前記ＤＰＰ４拮抗薬の効果を決定する工程
を含む、方法。
【請求項３４】
前記ＤＰＰ４拮抗薬が小分子である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記ＤＰＰ４拮抗薬がペプチドまたは抗体である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記ＤＰＰ４拮抗薬が、ＭＥＲＳ−ＣｏＶタンパク質に対する抗体である、請求項３３または３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記ＭＥＲＳ−ＣｏＶタンパク質が、ＭＥＲＳ−ＣｏＶスパイクタンパク質である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記拮抗薬が、ＭＥＲＳ−ＣｏＶ感染前に投与される、請求項３３から３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記拮抗薬が、ＭＥＲＳ−ＣｏＶ感染後に投与される、請求項３３から３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記拮抗薬が、ＭＥＲＳ−ＣｏＶ感染と同時に投与される、請求項３３から３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記決定する工程が、ウイルス力価またはＲＮＡレベルを測定することを含む、請求項３３から４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記１つ以上の症状が肺の炎症を含む、請求項３３から４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記マウスが、体重減少をさらに示す、請求項２９に記載のマウス。
【請求項４４】
肺の炎症が、組織化学的に評価される、請求項２９に記載のマウス。
【請求項４５】
組織または細胞のゲノムが前記置換を含む、請求項１から７のいずれか一項に記載のげっ歯類の単離された組織または細胞。
【請求項４６】
改変ＤＰＰ４遺伝子を形成するための、内在性げっ歯類Ｄｐｐ４遺伝子座での、げっ歯類Ｄｐｐ４遺伝子のゲノム断片の、ヒトＤＰＰ４遺伝子のゲノム断片での置換を含む、単離されたげっ歯類胚性幹（ＥＳ）細胞であって、前記改変ＤＰＰ４遺伝子は、前記ヒトＤＰＰ４遺伝子の前記ゲノム断片に作動可能に連結される内在性げっ歯類Ｄｐｐ４のエクソン１を含み、前記改変ＤＰＰ４遺伝子がヒトＤＰＰ４タンパク質をコードし、前記改変ＤＰＰ４遺伝子の発現は、内在性げっ歯類Ｄｐｐ４遺伝子座におけるげっ歯類制御エレメントの制御下にあり、前記げっ歯類ＥＳ細胞がマウスまたはラットのＥＳ細胞である、げっ歯類ＥＳ細胞。
【請求項４７】
前記ヒトＤＰＰ４遺伝子のゲノム断片が、前記ヒトＤＰＰ４遺伝子のエクソン２からエクソン２６を含む、請求項４６に記載のげっ歯類ＥＳ細胞。
【請求項４８】
置換される前記げっ歯類Ｄｐｐ４遺伝子のゲノム断片が、前記げっ歯類Ｄｐｐ４遺伝子のエクソン２からエクソン２６を含む、請求項４６または４７に記載のげっ歯類ＥＳ細胞。
【請求項４９】
前記げっ歯類ＥＳ細胞がマウスＥＳ細胞である、請求項４６から４８のいずれか一項に記載のげっ歯類ＥＳ細胞。
【請求項５０】
前記げっ歯類ＥＳ細胞が、前記改変ＤＰＰ４遺伝子についてヘテロ接合性である、請求項４６から４９のいずれか一項に記載のげっ歯類ＥＳ細胞。
【請求項５１】
前記げっ歯類ＥＳ細胞が、前記改変ＤＰＰ４遺伝子についてホモ接合性である、請求項４６から４９のいずれか一項に記載のげっ歯類ＥＳ細胞。
【請求項５２】
請求項４６から５１のいずれか一項に記載のげっ歯類ＥＳ細胞から生成される、げっ歯類胚。
【請求項５３】
ヒト化ＤＰＰ４げっ歯類胚であって、前記胚のゲノムは、改変ＤＰＰ４遺伝子を形成するための、内在性げっ歯類Ｄｐｐ４遺伝子座での、内在性げっ歯類Ｄｐｐ４遺伝子のゲノム断片の、ヒトＤＰＰ４遺伝子のゲノム断片での置換を含み、前記改変ＤＰＰ４遺伝子は、前記ヒトＤＰＰ４遺伝子の前記ゲノム断片に作動可能に連結される内在性げっ歯類Ｄｐｐ４のエクソン１を含み、前記改変ＤＰＰ４遺伝子は、ヒトＤＰＰ４タンパク質をコードし、前記改変ＤＰＰ４遺伝子の発現は、前記内在性げっ歯類Ｄｐｐ４遺伝子座における内在性げっ歯類調節エレメントの制御下にあり、前記げっ歯類胚は、マウス胚またはラット胚である、ヒト化ＤＰＰ４げっ歯類胚。
【請求項５４】
前記ヒトＤＰＰ４遺伝子のゲノム断片が、前記ヒトＤＰＰ４遺伝子のエクソン２からエクソン２６を含む、請求項５３に記載の胚。
【請求項５５】
置換される前記げっ歯類Ｄｐｐ４遺伝子のゲノム断片が、前記げっ歯類Ｄｐｐ４遺伝子のエクソン２からエクソン２６を含む、請求項５３または５４に記載の胚。
【請求項５６】
前記げっ歯類胚がマウス胚である、請求項５３から５５のいずれか一項に記載の胚。
【請求項５７】
前記げっ歯類胚が、マウスＤｐｐ４タンパク質を発現することができないマウス胚である、請求項５３から５６のいずれか一項に記載の胚。
【請求項５８】
前記げっ歯類胚が改変ＤＰＰ４遺伝子についてヘテロ接合性である、請求項５３から５７のいずれか一項に記載の胚。
【請求項５９】
前記げっ歯類胚が改変ＤＰＰ４遺伝子についてホモ接合性である、請求項５３から５７のいずれか一項に記載の胚。
【請求項６０】
前記げっ歯類胚がマウス胚であり、前記マウスが、
（ａ）Ｃ５７ＢＬ／Ａ、Ｃ５７ＢＬ／Ａｎ、Ｃ５７ＢＬ／ＧｒＦａ、Ｃ５７ＢＬ／ＫａＬｗＮ、Ｃ５７ＢＬ／６、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｃ５７ＢＬ／６ＢｙＪ、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＪ、Ｃ５７ＢＬ／１０、Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎ、Ｃ５７ＢＬ／１０Ｃｒ、及びＣ５７ＢＬ／Ｏｌａからなる群から選択されるＣ５７ＢＬ系統、
（ｂ）１２９Ｐ１、１２９Ｐ２、１２９Ｐ３、１２９Ｘ１、１２９Ｓ１（例えば１２９Ｓ１／ＳＶ、１２９Ｓ１／Ｓｖｌｍ）、１２９Ｓ２、１２９Ｓ４、１２９Ｓ５、１２９Ｓ９／ＳｖＥｖＨ、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）、１２９Ｓ７、１２９Ｓ８、１２９Ｔ１、１２９Ｔ２からなる群から選択される１２９系統、
（ｃ）１２９系統とＣ５７ＢＬ／６系統との混合物、
（ｄ）１２９系統の混合、または
（ｅ）ＢＬ／６系統の混合
である、請求項５３から５９のいずれか一項に記載の胚。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１４年５月３０日出願の米国仮特許出願第６２／００５，４７６号、２０１４年９月１７日出願の同第６２／０５１，６２６号、及び２０１４年１０月３０日出願の同第６２／０７２，６９２号に対する優先権を主張し、これらの各々の開示はそれらの全体として参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
（発明の分野）
ヒト配列を含むジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ４）タンパク質をコードする核酸配列を含む非ヒト動物。全体的に又は部分的にヒトであるＤＰＰ４遺伝子を含むトランスジェニック非ヒト動物。ヒト又はヒト化ＤＰＰ４タンパク質を発現する非ヒト動物。ヒト又はヒト化ＤＰＰ４核酸配列を含む非ヒト動物を作製及び使用するための方法。
【背景技術】
【０００３】
ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ４）は、例えば、高血糖（例えば、Ｇｅｒｉｃｈ（２０１３）Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐｏｓｔｐａｎｄｒｉａｌ  Ｈｙｐｅｒｇｌｙｃｅｍｉａ：Ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｉｎｃｒｅｔｉｎ−Ｂａｓｅｄ  Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ，Ｉｎｔｌ．Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｅｄ．６：８７７〜８９５を参照のこと）及び中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ−ＣｏＶ）感染（例えば、Ｒａｊ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ  Ｐｅｐｔｉｄａｓｅ  ４  ｉｓ  ａ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｏｒｏｎｏｖｉｒｕｓ−ＥＭＣ，Ｎａｔｕｒｅ  ４９５（７４４０）：２５１〜２５４を参照のこと）を含む、様々なヒト疾患、障害、及び状態の治療のための治療標的である。
【０００４】
ヒトＤＰＰ４タンパク質を特異的に標的とする治療分子の薬物動態（ＰＫ）及び薬力動態（ＰＤ）の評価は、非ヒト動物、例えばげっ歯類、例えばマウス又はラットで日常的に行われている。しかしながら、かかる分子のＰＤについて、これらの治療分子が内在性Ｄｐｐ４タンパク質も標的としないかをある特定の非ヒト動物では適切に決定することができない。
更に、非ヒト動物疾患モデルにおけるヒトＤＰＰ４特異的小分子、ペプチド、又はタンパク質（すなわち、生物学的）拮抗薬のインビボ治療有効性の評価は、種特異的拮抗薬が内在性Ｄｐｐ４と相互作用しないある特定の非ヒト動物においては問題である。更に、ヒトＤＰＰ４タンパク質と特異的に相互作用する分子を標的とする小分子、ペプチド、又はタンパク質（すなわち、生物学的）拮抗薬のインビボ治療有効性の評価も、治療標的分子自体が内在性Ｄｐｐ４タンパク質と相互作用しないある特定の非ヒト動物においては問題である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｇｅｒｉｃｈ（２０１３）Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐｏｓｔｐａｎｄｒｉａｌ  Ｈｙｐｅｒｇｌｙｃｅｍｉａ：Ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｉｎｃｒｅｔｉｎ−Ｂａｓｅｄ  Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ，Ｉｎｔｌ．Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｅｄ．６：８７７〜８９５
【非特許文献２】Ｒａｊ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ  Ｐｅｐｔｉｄａｓｅ  ４  ｉｓ  ａ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｏｒｏｎｏｖｉｒｕｓ−ＥＭＣ，Ｎａｔｕｒｅ  ４９５（７４４０）：２５１〜２５４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、ヒト又はヒト化ＤＰＰ４遺伝子を含む非ヒト動物、例えばげっ歯類、例えばマウス又はラットが必要とされている。例えば、非ヒト動物のＤｐｐ４遺伝子が全体的に若しくは部分的にヒト化された、又はヒト若しくはヒト化ＤＰＰ４タンパク質をコードする配列を含むヒトＤＰＰ４遺伝子で（例えば内在性非ヒト遺伝子座で）置換されている、非ヒト動物、例えばげっ歯類、例えばマウス又はラットが必要とされている。
【０００７】
また、ＤＰＰ４遺伝子が、ＤＰＰ４遺伝子の例えば５’隣接領域、例えばプロモーター及びエンハンサー（複数可）で、又は３’非翻訳領域で、非ヒト調節エレメント（例えば内在性調節エレメント）の制御下にある、ＤＰＰ４遺伝子（例えばヒト又はヒト化）を含む非ヒト動物も必要とされている。
【０００８】
また、ＤＰＰ４遺伝子が、ヒトＤＰＰ４遺伝子の例えば５’隣接領域、例えばプロモーター又はエンハンサー（複数可）で、又は３’非翻訳領域で、ヒト調節エレメントの制御下にある、ＤＰＰ４遺伝子（例えばヒト又はヒト化）を含む非ヒト動物も必要とされている。
【０００９】
また、免疫細胞、例えばＴ細胞の表面上に、かつ／又は免疫細胞、例えばＴ細胞の表面上のＤｐｐ４タンパク質のレベルと同様のレベルで、１つ以上の組織、例えば胎盤、腎臓、肺、肝臓、骨格筋、心臓、脳、及び／若しくは膵臓の細胞の表面上に、かつ／又は機能的Ｄｐｐ４タンパク質を発現するが、ヒト若しくはヒト化ＤＰＰ４遺伝子を含まない同齢の非ヒト動物の１つ以上の組織、例えば胎盤、腎臓、肺、肝臓、骨格筋、心臓、脳、及び／若しくは膵臓の細胞の表面上に、ヒト又はヒト化ＤＰＰ４タンパク質を発現するヒト化非ヒト動物も必要とされている。
【００１０】
加えて、免疫細胞、例えばＴ細胞の表面上に、かつ／又は免疫細胞、例えばＴ細胞の表面上のＤｐｐ４タンパク質のレベルより高い若しくは低いレベルで、１つ以上の組織、例えば胎盤、腎臓、肺、肝臓、骨格筋、心臓、脳、及び／若しくは膵臓の細胞の表面上に、かつ／又は機能的Ｄｐｐ４タンパク質を発現するが、ヒト若しくはヒト化ＤＰＰ４遺伝子を含まない同齢の非ヒト動物の１つ以上の組織、例えば胎盤、腎臓、肺、肝臓、骨格筋、心臓、脳、及び／若しくは膵臓の細胞の表面上に、ヒト又はヒト化ＤＰＰ４タンパク質を発現するヒト化非ヒト動物が必要とされている。
【００１１】
本明細書全体を通して、様々な特許、特許出願、及び他の種類の出版物（例えば、雑誌論文、電子データベースエントリ等）が参照される。本明細書で引用される全ての特許、特許出願、及び他の種類の出版物の開示は、全ての目的のためにそれらの全体として参照により本明細書に組み込まれる。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
ヒト配列を含むＤＰＰ４タンパク質をコードする核酸配列を含む非ヒト動物が提供される。
【００１３】
全体的に又は部分的にヒトであるＤＰＰ４遺伝子を含むトランスジェニック非ヒト動物が提供される。
【００１４】
ヒト又はヒト化ＤＰＰ４タンパク質を発現する非ヒト動物が提供される。
【００１５】
内在性非ヒト動物Ｄｐｐ４遺伝子の（全体的又は部分的）置換を有する非ヒト動物が提供される。
【００１６】
内在性非ヒトＤｐｐ４遺伝子座で（全体的又は部分的）ＤＰＰ４ヒト化を含む非ヒト動物が提供される。
【００１７】
ヒト又はヒト化ＤＰＰ４遺伝子を有する非ヒト動物が提供され、この非ヒト動物は、内在性Ｄｐｐ４タンパク質を発現せず、この非ヒト動物は、免疫細胞、例えばＴ細胞の表面上に、かつ／又は免疫細胞、例えばＴ細胞の表面上に存在するＤｐｐ４タンパク質のレベルと同様のレベルで、胎盤、腎臓、肺、肝臓、骨格筋、心臓、脳、及び／若しくは膵臓を含む１つ以上の組織の細胞の表面上に、かつ／又は機能的内在性Ｄｐｐ４タンパク質を発現するが、置換を含まない同齢の非ヒト動物の胎盤、腎臓、肺、肝臓、骨格筋、心臓、脳、及び／若しくは膵臓を含む１つ以上の組織の細胞の表面上に、ヒト又はヒト化ＤＰＰ４タンパク質を発現する。
【００１８】
一態様では、ヒト又はヒト化ＤＰＰ４核酸配列を含む非ヒト動物が提供される。
【００１９】
一態様では、内在性Ｄｐｐ４遺伝子座でのヒト又はヒト化ＤＰＰ４タンパク質をコードする内在性Ｄｐｐ４遺伝子をコードする遺伝子の置換を含む遺伝子改変非ヒト動物が提供される。内在性Ｄｐｐ４遺伝子座での、内在性Ｄｐｐ４遺伝子のヒトＤＰＰ４遺伝子での置換を含むげっ歯類、例えばマウス又はラットが提供される。一実施形態では、このげっ歯類は、内在性Ｄｐｐ４遺伝子座でのヒト又はヒト化ＤＰＰ４タンパク質をコードする内在性Ｄｐｐ４遺伝子の置換についてヘテロ接合性である。一実施形態では、このげっ歯類は、内在性Ｄｐｐ４遺伝子座でのヒト又はヒト化ＤＰＰ４タンパク質をコードする内在性Ｄｐｐ４遺伝子の置換についてホモ接合性である。一実施形態では、このげっ歯類はマウスである。一実施形態では、このげっ歯類はラットである。
【００２０】
一態様では、内在性げっ歯類Ｄｐｐ４遺伝子のヒト化を含む、遺伝子改変げっ歯類、例えばマウス又はラットが提供され、このヒト化は、改変ＤＰＰ４遺伝子を形成するための、内在性げっ歯類Ｄｐｐ４遺伝子座での、Ｄｐｐ４遺伝子のエクソンをコードするげっ歯類遺伝子の、ヒトＤＰＰ４遺伝子の少なくとも１個のエクソンをコードする核酸配列での置換を含み、この改変ＤＰＰ４遺伝子の発現は、内在性げっ歯類Ｄｐｐ４遺伝子座でげっ歯類調節エレメントの制御下にある。
【００２１】
一実施形態では、このげっ歯類は、改変ＤＰＰ４遺伝子を形成するためにヒトＤＰＰ４遺伝子の少なくとも１個のエクソンをコードする核酸配列についてヘテロ接合性である。一実施形態では、このげっ歯類は、改変ＤＰＰ４遺伝子を形成するためにヒトＤＰＰ４遺伝子の少なくとも１個のエクソンをコードする核酸配列についてホモ接合性である。
【００２２】
一実施形態では、このげっ歯類はマウス又はラットである。一実施形態では、このげっ歯類はマウスである。一実施形態では、このげっ歯類はラットである。
【００２３】
一実施形態では、ヒト又はヒト化ＤＰＰ４タンパク質をコードするヒトＤＰＰ４遺伝子は、ヒトＤＰＰ４遺伝子のエクソン２からエクソン２６を含む。
【００２４】
一実施形態では、ヒト化ＤＰＰ４タンパク質は、ヒトＤＰＰ４タンパク質の細胞外ドメインを含む。
【００２５】
一実施形態では、ヒト化ＤＰＰ４タンパク質は、マウスＤｐｐ４タンパク質の膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを含む。
【００２６】
一実施形態では、このげっ歯類は、マウスＤｐｐ４タンパク質を発現することができないマウスである。
【００２７】
一実施形態では、このげっ歯類は、マウスＤｐｐ４のエクソン２からエクソン２６をコードするマウスＤｐｐ４配列の連続したゲノム断片がヒトＤＰＰ４のエクソン２からエクソン２６をコードするヒトＤＰＰ４配列の連続したゲノム断片で置換されているマウスである。
【００２８】
一態様では、ヒト又はヒト化ＤＰＰ４タンパク質を発現する遺伝子改変げっ歯類、例えばマウス又はラットが提供され、ヒト又はヒト化ＤＰＰ４タンパク質を発現するげっ歯類は、正常な免疫系を含む、すなわち、ヒト又はヒト化ＤＰＰ４タンパク質を発現するげっ歯類の血液、血漿、又は血清中の免疫細胞、例えばＴ細胞の数は、機能的内在性Ｄｐｐ４タンパク質を発現するげっ歯類の血液、血漿、又は血清中の免疫細胞、例えばＴ細胞の数と同様である。一実施形態では、このげっ歯類はマウスである。一実施形態では、このげっ歯類はラットである。
【００２９】
一実施形態では、ヒト又はヒト化ＤＰＰ４タンパク質を発現するげっ歯類の血液は、機能的内在性Ｄｐｐ４タンパク質を発現するげっ歯類、例えば野生型マウス又はラットとおよそ同じ数の免疫細胞、例えばＴ細胞を有する。一実施形態では、このげっ歯類はマウスである。一実施形態では、このげっ歯類はラットである。
【００３０】
一実施形態では、Ｔ細胞の表面上にヒト又はヒト化ＤＰＰ４を発現するマウスは、機能的内在性ＤＰＰ４タンパク質を発現するが、内在性マウスＤｐｐ４遺伝子座での、内在性Ｄｐｐ４遺伝子のヒトＤＰＰ４遺伝子での置換を含まない同齢のマウスの血中に存在するＴ細胞の量の少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、又は２００％の血中に存在するＴ細胞の量を有する。
【００３１】
一実施形態では、Ｔ細胞の表面上にヒト又はヒト化ＤＰＰ４タンパク質を発現するマウスは、機能的内在性Ｄｐｐ４タンパク質を発現するが、内在性マウスＤｐｐ４遺伝子座での、内在性Ｄｐｐ４遺伝子のヒトＤＰＰ４遺伝子での置換を含まない同齢のマウスの血中に存在するＴ細胞の量の少なくとも約２０％〜約２００％、約４０％〜約１６０％、又は約８０％〜約１２０％の血中のＴ細胞の量を有する。
【００３２】
一態様では、ヒト又はヒト化ＤＰＰ４タンパク質を発現する遺伝子改変げっ歯類、例えばマウス又はラットが提供され、このげっ歯類は、免疫細胞、例えばＴ細胞の表面上に、かつ／又は機能的内在性Ｄｐｐ４タンパク質を発現する同齢のげっ歯類の１つ以上の組織、例えば胎盤、腎臓、肺、肝臓、骨格筋、心臓、脳、及び／若しくは膵臓の細胞の表面上に、ヒト又はヒト化ＤＰＰ４タンパク質を発現する。一実施形態では、このげっ歯類はマウスである。一実施形態では、このげっ歯類はラットである。
【００３３】
一実施形態では、ヒト又はヒト化ＤＰＰ４タンパク質を発現するげっ歯類の免疫細胞、例えばＴ細胞は、機能的内在性Ｄｐｐ４タンパク質を発現するげっ歯類、例えば野生型マウス又はラットの免疫細胞、例えばＴ細胞とおよそ同レベルのＤＰＰ４タンパク質をその表面上に有する。一実施形態では、このげっ歯類はマウスである。一実施形態では、このげっ歯類はラットである。
【００３４】
一実施形態では、このマウスは、機能的内在性Ｄｐｐ４タンパク質を発現するが、内在性マウスＤｐｐ４遺伝子座での、内在性Ｄｐｐ４遺伝子のヒトＤＰＰ４遺伝子での置換を含まない同齢のマウスの免疫細胞、例えばＴ細胞の表面上のＤｐｐ４タンパク質のレベルの少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、又は２００％のレベルで、免疫細胞、例えばＴ細胞の表面上にヒト又はヒト化ＤＰＰ４タンパク質を発現する。
【００３５】
一実施形態では、このマウスは、機能的内在性Ｄｐｐ４タンパク質を発現するが、内在性マウスＤｐｐ４遺伝子座での、内在性Ｄｐｐ４遺伝子のヒトＤＰＰ４遺伝子での置換を含まない同齢のマウスの免疫細胞、例えばＴ細胞の表面上に存在するマウスＤｐｐ４タンパク質のレベルの約２０％〜約２００％、約４０％〜約１６０％、又は約８０％〜約１２０％のレベルで、免疫細胞、例えばＴ細胞の表面上にヒト又はヒト化ＤＰＰ４タンパク質を発現する。
【００３６】
一実施形態では、ヒト又はヒト化ＤＰＰ４タンパク質を発現するげっ歯類の１つ以上の組織、例えば胎盤、腎臓、肺、肝臓、骨格筋、心臓、脳、及び／又は膵臓の細胞は、機能的内在性Ｄｐｐ４タンパク質を発現するげっ歯類、例えば野生型マウス又はラットの１つ以上の組織、例えば胎盤、腎臓、肺、肝臓、骨格筋、心臓、脳、及び／又は膵臓の細胞とおよそ同レベルのＤＰＰ４タンパク質をその表面上に有する。一実施形態では、このげっ歯類はマウスである。一実施形態では、このげっ歯類はラットである。
【００３７】
一実施形態では、このマウスは、機能的内在性Ｄｐｐ４タンパク質を発現するが、内在性マウスＤｐｐ４遺伝子座での、内在性Ｄｐｐ４遺伝子のヒトＤＰＰ４遺伝子での置換を含まない同齢のマウスの１つ以上の組織、例えば胎盤、腎臓、肺、肝臓、骨格筋、心臓、脳、及び／又は膵臓の細胞の表面上のＤｐｐ４タンパク質のレベルの少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、又は２００％のレベルで、１つ以上の組織、例えば胎盤、腎臓、肺、肝臓、骨格筋、心臓、脳、及び／又は膵臓の細胞の表面上にヒト又はヒト化ＤＰＰ４タンパク質を発現する。
【００３８】
一実施形態では、このマウスは、機能的内在性Ｄｐｐ４タンパク質を発現するが、内在性マウスＤｐｐ４遺伝子座での、内在性Ｄｐｐ４遺伝子のヒトＤＰＰ４遺伝子での置換を含まない同齢のマウスの１つ以上の組織、例えば胎盤、腎臓、肺、肝臓、骨格筋、心臓、脳、及び／又は膵臓の細胞の表面上に存在するマウスＤｐｐ４タンパク質のレベルの約２０％〜約２００％、約４０％〜約１６０％、又は約８０％〜約１２０％のレベルで、１つ以上の組織、例えば胎盤、腎臓、肺、肝臓、骨格筋、心臓、脳、及び／又は膵臓の細胞の表面上にヒト又はヒト化ＤＰＰ４タンパク質を発現する。
【００３９】
一態様では、げっ歯類Ｄｐｐ４細胞外ドメインをコードする配列のヒトＤＰＰ４細胞外ドメインをコードする配列での置換を含むヒト化ＤＰＰ４遺伝子を含む、遺伝子改変げっ歯類が提供され、このヒト化ＤＰＰ４遺伝子は、げっ歯類Ｄｐｐ４膜貫通配列及びげっ歯類Ｄｐｐ４細胞質配列を含み、このヒト化ＤＰＰ４遺伝子は、内在性Ｄｐｐ４遺伝子座で内在性げっ歯類Ｄｐｐ４調節エレメントの制御下にある。
【００４０】
一実施形態では、このげっ歯類は、ヒト化ＤＰＰ４遺伝子についてヘテロ接合性である。一実施形態では、このげっ歯類は、ヒト化ＤＰＰ４遺伝子についてホモ接合性である。
【００４１】
一実施形態では、このげっ歯類はマウス又はラットである。一実施形態では、このげっ歯類はマウスである。一実施形態では、このげっ歯類はラットである。
【００４２】
一実施形態では、このマウスは、マウスＤｐｐ４タンパク質を発現することができない。
【００４３】
一実施形態では、内在性げっ歯類Ｄｐｐ４遺伝子座でのげっ歯類調節エレメント又は配列は、マウス又はラット由来である。
【００４４】
一実施形態では、げっ歯類調節エレメント又は配列は、げっ歯類Ｄｐｐ４遺伝子座での内在性げっ歯類調節エレメント又は配列であり、マウス又はラット由来である。
【００４５】
一態様では、ヒト又はヒト化ＤＰＰ４タンパク質を発現する非ヒト動物、例えばげっ歯類、例えばマウス又はラットが提供され、この非ヒト動物は内在性非ヒトＤｐｐ４遺伝子座からヒト又はヒト化ＤＰＰ４タンパク質を発現する。一実施形態では、この非ヒト動物はげっ歯類である。一実施形態では、このげっ歯類はマウスである。一実施形態では、このげっ歯類はラットである。一実施形態では、このげっ歯類は、ヒト又はヒト化ＤＰＰ４タンパク質を発現する内在性非ヒトＤｐｐ４遺伝子座についてヘテロ接合性である。一実施形態では、このげっ歯類は、ヒト又はヒト化ＤＰＰ４タンパク質を発現する内在性非ヒトＤｐｐ４遺伝子座についてホモ接合性である。
【００４６】
一態様では、内在性マウスＤｐｐ４遺伝子座からヒト又はヒト化ＤＰＰ４タンパク質を発現する遺伝子改変マウスが提供され、内在性マウスＤｐｐ４遺伝子は、ヒトＤＰＰ４遺伝子で全体的に又は部分的に置換されている。
【００４７】
一実施形態では、エクソン２からエクソン２６の終止コドンを含む内在性マウスＤｐｐ４遺伝子座の約７８．８ｋｂは欠失され、ヒトＤｐｐ４遺伝子のエクソン２からエクソン２６及び３’非翻訳配列の一部を含む約８１．８ｋｂのヒトＤＰＰ４遺伝子配列で置換される。特定の実施形態では、ヒトＤＰＰ４遺伝子は、ヒトＢＡＣ  ＲＰ１１−６８Ｌ２２のヒトＤＰＰ４遺伝子のエクソン２からエクソン２６及び３’非翻訳配列の一部を含む。特定の実施形態では、ＤＰＰ４遺伝子は、マウスＤｐｐ４遺伝子５’調節エレメント、マウスＤｐｐ４タンパク質の最初の２つのアミノ酸Ｍｅｔ及びＬｙｓを含むマウスＤｐｐ４エクソン１、及びマウスＤｐｐ４  ３’調節エレメント（例えば３’非翻訳領域）、並びにヒトＤＰＰ４遺伝子エクソン２からエクソン２６（すなわち、マウスＤｐｐ４エクソン１に由来する最初の２つのアミノ酸を除いてヒトＤＰＰ４タンパク質をコードする配列）を含む。
【００４８】
一態様では、ヒト又はヒト化ＤＰＰ４タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子改変マウスが提供され、ヒト又はヒト化ＤＰＰ４タンパク質をコードする核酸配列は、内在性マウスＤｐｐ４タンパク質をコードする内在性ヌクレオチド配列を全体的に又は部分的に置換する。
【００４９】
一実施形態では、このマウスは、ヒト又はヒト化ＤＰＰ４タンパク質をコードするヌクレオチド配列についてヘテロ接合性である。一実施形態では、このマウスは、ヒト又はヒト化ＤＰＰ４タンパク質をコードするヌクレオチド配列についてホモ接合性である。
【００５０】
一態様では、げっ歯類Ｄｐｐ４タンパク質をコードするげっ歯類Ｄｐｐ４遺伝子配列を、ヒト又はヒト化ＤＰＰ４タンパク質をコードするヒトＤＰＰ４遺伝子配列の１個以上のエクソンを含むヒトＤＰＰ４遺伝子配列で置換することを含む、ヒト化ＤＰＰ４げっ歯類を作製するための方法が提供され、この置換は、内在性げっ歯類Ｄｐｐ４遺伝子座においてであり、ヒト又はヒト化ＤＰＰ４タンパク質をコードするヒトＤＰＰ４遺伝子配列の１個以上のエクソンを含むヒトＤＰＰ４遺伝子配列は、内在性げっ歯類Ｄｐｐ４遺伝子座でげっ歯類調節エレメント又は配列に作動可能に連結されている。
【００５１】
一実施形態では、このげっ歯類は、ヒト又はヒト化ＤＰＰ４タンパク質をコードするヌクレオチド配列についてヘテロ接合性である。一実施形態では、このげっ歯類は、ヒト又はヒト化ＤＰＰ４タンパク質をコードするヌクレオチド配列についてホモ接合性である。
【００５２】
一実施形態では、このげっ歯類はマウス又はラットである。一実施形態では、このげっ歯類はマウスである。一実施形態では、このげっ歯類はラットである。
【００５３】
一実施形態では、げっ歯類調節エレメント又は配列は、マウスに由来する。一実施形態では、げっ歯類調節エレメント又は配列は、ラットに由来する。
【００５４】
一実施形態では、げっ歯類調節エレメント又は配列は、げっ歯類Ｄｐｐ４遺伝子座での内在性げっ歯類調節エレメント又は配列である。一実施形態では、このげっ歯類はマウスである。一実施形態では、このげっ歯類はラットである。
【００５５】
一実施形態では、げっ歯類Ｄｐｐ４遺伝子配列を置換するヒトＤＰＰ４遺伝子配列は、ヒトＤＰＰ４遺伝子配列の少なくとも１個のエクソンを含む。他の実施形態では、げっ歯類Ｄｐｐ４遺伝子配列を置換するヒトＤＰＰ４遺伝子配列は、ヒトＤＰＰ４遺伝子配列の少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、又は少なくとも２５個のエクソンを含む。一実施形態では、げっ歯類Ｄｐｐ４遺伝子配列を置換するヒトＤＰＰ４遺伝子配列は、ヒトＤＰＰ４遺伝子配列の２６個全てのエクソンを含む。一実施形態では、このげっ歯類はマウスである。一実施形態では、このげっ歯類はラットである。
【００５６】
一実施形態では、げっ歯類Ｄｐｐ４遺伝子配列を置換するヒト又はヒト化ＤＰＰ４遺伝子配列は、ヒトＤＰＰ４と約８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は約９９％同一であるタンパク質をコードする。
【００５７】
一実施形態では、げっ歯類Ｄｐｐ４遺伝子配列を置換するヒト又はヒト化ＤＰＰ４遺伝子配列は、ヒトＤＰＰ４タンパク質の細胞外ドメインをコードするヒトＤＰＰ４遺伝子配列の少なくとも１個のエクソンを含む。他の実施形態では、げっ歯類Ｄｐｐ４遺伝子配列を置換するヒトＤＰＰ４遺伝子配列は、ヒトＤＰＰ４タンパク質の細胞外ドメインをコードするヒトＤＰＰ４遺伝子配列の少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、又は少なくとも２３個のエクソンを含む。一実施形態では、げっ歯類Ｄｐｐ４遺伝子配列を置換するヒトＤＰＰ４遺伝子配列は、ヒトＤＰＰ４タンパク質の細胞外ドメインをコードするヒトＤＰＰ４遺伝子配列の２４個全てのエクソンを含む。一実施形態では、このげっ歯類はマウスである。一実施形態では、このげっ歯類はラットである。
【００５８】
一実施形態では、げっ歯類Ｄｐｐ４遺伝子配列を置換するヒト又はヒト化ＤＰＰ４遺伝子配列は、ヒトＤＰＰ４タンパク質の細胞外ドメインと約８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は約９９％同一であるＤＰＰ４タンパク質の細胞外ドメインをコードする。
【００５９】
一実施形態では、この置換は、内在性げっ歯類Ｄｐｐ４遺伝子座においてであり、ヒト又はヒト化ＤＰＰ４タンパク質をコードするヒトＤＰＰ４遺伝子配列の１個以上のエクソンを含むヒトＤＰＰ４遺伝子配列は、内在性げっ歯類Ｄｐｐ４遺伝子座で内在性げっ歯類調節エレメント又は配列に作動可能に連結されている。
【００６０】
一態様では、マウスＤｐｐ４タンパク質をコードするマウスＤｐｐ４遺伝子配列を、ヒト又はヒト化ＤＰＰ４タンパク質をコードするヒトＤＰＰ４遺伝子配列で置換することを含む、ヒト化ＤＰＰ４マウスを作製するための方法が提供される。
【００６１】
一実施形態では、この置換は、内在性マウスＤｐｐ４遺伝子座においてであり、ヒト又はヒト化ＤＰＰ４タンパク質をコードするヒトＤＰＰ４遺伝子は、内在性マウスＤｐｐ４遺伝子座でマウス調節エレメント又は配列に作動可能に連結されている。
【００６２】
一実施形態では、この置換は、内在性マウスＤｐｐ４遺伝子座においてであり、ヒト又はヒト化ＤＰＰ４タンパク質をコードするヒトＤＰＰ４遺伝子は、内在性マウスＤｐｐ４遺伝子座で内在性マウス調節エレメント又は配列に作動可能に連結されている。
【００６３】
様々な態様では、本明細書に記載の遺伝子改変非ヒト動物、例えばげっ歯類、例えばマウス又はラットは、それらの生殖細胞系に遺伝子改変を含む。
【００６４】
一態様では、本明細書に記載の遺伝子改変を含む非ヒト動物、例えばげっ歯類、例えばマウス又はラットの胚が提供される。
【００６５】
一態様では、本明細書に記載の遺伝子改変を含むドナー細胞を含む非ヒト動物、例えばげっ歯類、例えばマウス又はラットの宿主胚が提供される。
【００６６】
一態様では、本明細書に記載の遺伝子改変を含む多能性又は全能性非ヒト動物、例えばげっ歯類、例えばマウス又はラットの細胞が提供される。一実施形態では、この細胞はげっ歯類細胞である。一実施形態では、この細胞はマウス細胞である。一実施形態では、この細胞はげっ歯類胚性幹（ＥＳ）細胞である。一実施形態では、この細胞はマウスＥＳ細胞である。
【００６７】
一態様では、非ヒト動物、例えばげっ歯類、例えばマウス又はラットの卵が提供され、この非ヒト動物の卵は、異所性非ヒト動物染色体を含み、この異所性非ヒト動物染色体は、本明細書に記載の遺伝子改変を含む。一実施形態では、この非ヒト動物はげっ歯類である。一実施形態では、このげっ歯類はマウスである。一実施形態では、このげっ歯類はラットである。
【００６８】
一態様では、ヒトＤＰＰ４遺伝子を含むように遺伝子改変されたマウスの胚、卵、又は細胞は、Ｃ５７ＢＬ／Ａ、Ｃ５７ＢＬ／Ａｎ、Ｃ５７ＢＬ／ＧｒＦａ、Ｃ５７ＢＬ／ＫａＬｗＮ、Ｃ５７ＢＬ／６、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｃ５７ＢＬ／６ＢｙＪ、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＪ、Ｃ５７ＢＬ／１０、Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎ、Ｃ５７ＢＬ／１０Ｃｒ、及びＣ５７ＢＬ／Ｏｌａから選択されるＣ５７ＢＬ系統のものであるマウスのものである。別の実施形態では、マウスは、１２９Ｐ１、１２９Ｐ２、１２９Ｐ３、１２９Ｘ１、１２９Ｓ１（例えば１２９Ｓ１／ＳＶ、１２９Ｓ１／Ｓｖｌｍ）、１２９Ｓ２、１２９Ｓ４、１２９Ｓ５、１２９Ｓ９／ＳｖＥｖＨ、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）、１２９Ｓ７、１２９Ｓ８、１２９Ｔ１、１２９Ｔ２である系統からなる群から選択される１２９系統である（例えば、Ｆｅｓｔｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｒｅｖｉｓｅｄ  ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  ｆｏｒ  ｓｔｒａｉｎ  １２９  ｍｉｃｅ，Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  １０：８３６を参照されたく、Ａｕｅｒｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ（２０００）Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｃｈｉｍｅｒａ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  １２９／ＳｖＥｖ−  ａｎｄ  Ｃ５７ＢＬ／６−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅｓも参照のこと）。特定の実施形態では、遺伝子改変マウスは、上記１２９系統と上記Ｃ５７ＢＬ／６系統との混合物である。別の特定の実施形態では、このマウスは、上記１２９系統の混合物、又は上記ＢＬ／６系統の混合物である。特定の実施形態では、この混合物の１２９系統は、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）系統である。別の実施形態では、このマウスは、ＢＡＬＢ系統、例えばＢＡＬＢ／ｃ系統である。更に別の実施形態では、このマウスは、ＢＡＬＢ系統と別の上記系統との混合物である。一実施形態では、このマウスは、Ｓｗｉｓｓマウス又はＳｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒマウスである。
【００６９】
様々な態様では、ヒト又はヒト化ＤＰＰ４核酸配列を含む非ヒト動物は、哺乳類及び鳥類から選択される。一実施形態では、この非ヒト動物は哺乳類である。一実施形態では、この哺乳類はげっ歯類である。一実施形態では、このげっ歯類はマウス又はラットである。
【００７０】
一態様では、ヒトＤＰＰ４遺伝子又はその断片を含む核酸配列を含むげっ歯類が提供され、ヒトＤＰＰ４遺伝子又はその断片は、ヒトＤＰＰ４遺伝子の少なくとも１個のエクソンを含み、ヒトＤＰＰ４遺伝子又はその断片は、ヒト又はヒト化ＤＰＰ４タンパク質をコードする。
【００７１】
一実施形態では、ヒトＤＰＰ４遺伝子又はその断片は、ヒトＤＰＰ４遺伝子の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、又は２５個のエクソンを含む。
【００７２】
一実施形態では、ヒトＤＰＰ４遺伝子又はその断片は、ヒトＤＰＰ４遺伝子の２６個全てのエクソンを含む。
【００７３】
一実施形態では、核酸配列は、ヒトＤＰＰ４遺伝子の５’隣接領域を更に含む。一実施形態では、ヒトＤＰＰ４遺伝子又はその断片は、ヒトＤＰＰ４遺伝子の５’隣接領域に作動可能に連結されている。一実施形態では、ヒトＤＰＰ４遺伝子の５’隣接領域は、長さで少なくとも１ｋｂ（例えば、長さで少なくとも１、２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０ｋｂ以上）を含む。一実施形態では、ヒトＤＰＰ４遺伝子の５’隣接領域は、長さで少なくとも１０ｋｂを含む。一実施形態では、ヒトＤＰＰ４遺伝子の５’隣接領域は、長さで少なくとも４０ｋｂを含む。
【００７４】
一実施形態では、ヒトＤＰＰ４遺伝子又はその断片の発現は、ヒトＤＰＰ４遺伝子の５’隣接領域の制御下にある。
【００７５】
一実施形態では、ヒト又はヒト化ＤＰＰ４タンパク質は、配列番号２４のアミノ酸配列又はその断片を含む。
【００７６】
一実施形態では、このげっ歯類は、機能的内在性げっ歯類Ｄｐｐ４タンパク質を発現するが、ヒトＤＰＰ４遺伝子もその断片も含まない同齢のげっ歯類のＴ細胞の表面上に存在するげっ歯類Ｄｐｐ４タンパク質のレベルの少なくとも約２０％（例えば、少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％以上）のレベルで、Ｔ細胞の表面上にヒト又はヒト化ＤＰＰ４タンパク質を発現する。
【００７７】
一実施形態では、このげっ歯類は、機能的内在性げっ歯類Ｄｐｐ４タンパク質を発現するが、ヒトＤＰＰ４遺伝子もその断片も含まない同齢のげっ歯類の胎盤、腎臓、肺、肝臓、骨格筋、心臓、脳、及び膵臓からなる群から選択される１つ以上の組織の表面上に存在するげっ歯類Ｄｐｐ４タンパク質のレベルの少なくとも約２０％（例えば、少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％以上）のレベルで、上記１つ以上の組織の細胞の表面上にヒト又はヒト化ＤＰＰ４タンパク質を発現する。
【００７８】
一実施形態では、このげっ歯類は、機能的内在性げっ歯類Ｄｐｐ４タンパク質を発現する。
【００７９】
一実施形態では、このげっ歯類はマウス又はラットである。
【００８０】
一態様では、ヒトＤＰＰ４遺伝子配列の１個以上のエクソンを含む核酸配列をげっ歯類の染色体に組み込むことを含む、ヒト化トランスジェニックげっ歯類を作製するための方法が本明細書で提供され、ヒトＤＰＰ４遺伝子配列の１個以上のエクソンは、ヒト又はヒト化ＤＰＰ４タンパク質をコードする。
【００８１】
一実施形態では、ヒトＤＰＰ４遺伝子又はその断片は、ヒトＤＰＰ４遺伝子の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、又は２５個のエクソンを含む。
【００８２】
一実施形態では、ヒトＤＰＰ４遺伝子又はその断片は、ヒトＤＰＰ４遺伝子の２６個全てのエクソンを含む。
【００８３】
一実施形態では、核酸配列は、ヒトＤＰＰ４遺伝子の５’隣接領域を更に含む。
【００８４】
一実施形態では、ヒトＤＰＰ４遺伝子配列は、ヒトＤＰＰ４遺伝子の５’隣接領域に作動可能に連結されている。
【００８５】
一実施形態では、ヒト又はヒト化ＤＰＰ４タンパク質は、配列番号２４のアミノ酸配列又はその断片を含む。
【００８６】
一実施形態では、このげっ歯類はマウス又はラットである。更なる態様では、本明細書に記載のヒト化ＤＰＰ４げっ歯類のいずれかにおけるヒト特異的ＤＰＰ４拮抗薬のインビボ治療有効性を決定するための方法が提供され、この方法は、げっ歯類ＤＰＰ４拮抗薬を投与することであって、このげっ歯類が中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ−ＣｏＶ）に感染している、投与することと、ＤＰＰ４拮抗薬が、ＤＰＰ４拮抗薬が投与されていないＭＥＲＳ−ＣｏＶに感染した対照げっ歯類と比較してＭＥＲＳ−ＣｏＶ感染の１つ以上の症状を治療又は予防するかを決定することと、を含む。
【００８７】
一実施形態では、ＤＰＰ４拮抗薬は、小分子、ペプチド、及び抗体からなる群から選択される。
【００８８】
一実施形態では、ＤＰＰ４拮抗薬は、ＭＥＲＳ−ＣｏＶタンパク質に対する抗体である。
【００８９】
一実施形態では、ＭＥＲＳ−ＣｏＶタンパク質は、ＭＥＲＳ−ＣｏＶスパイクタンパク質である。
【００９０】
一実施形態では、このげっ歯類は、Ａｌ−Ｈａｓａ＿１、Ａｌ−Ｈａｓａ＿２、Ａｌ−Ｈａｓａ＿３、Ａｌ−Ｈａｓａ＿４、Ａｌ−Ｈａｓａ＿１２、Ａｌ−Ｈａｓａ＿１５、Ａｌ−Ｈａｓａ＿１６、Ａｌ−Ｈａｓａ＿１７、Ａｌ−Ｈａｓａ＿１８、Ａｌ−Ｈａｓａ＿１９、Ａｌ−Ｈａｓａ＿２１、Ａｌ−Ｈａｓａ＿２５、Ｂｕｒａｉｄａｈ＿１、ＥＭＣ／２０１２、ＦＲＡ／ＵＡＥ、Ｈａｆｒ−Ａｌ−Ｂａｔｉｎ＿１、Ｈａｆｒ−Ａｌ−Ｂａｔｉｎ＿２、Ｈａｆｒ−Ａｌ−Ｂａｔｉｎ＿６、Ｊｅｄｄａｈ＿１、Ｊｏｒｄａｎ−Ｎ３／２０１２、Ｍｕｎｉｃｈ、Ｒｉｙａｄｈ＿３、Ｒｉｙａｄｈ＿４、Ｒｉｙａｄｈ＿５、Ｒｉｙａｄｈ＿１４、Ｔａｉｆ＿１、Ｗａｄｉ−Ａｄ−Ｄａｗａｓｉｒ＿１、Ｒｉｙａｄｈ＿９、ＫＦＵ−ＨＫＵ  １、ＫＦＵ−ＨＫＵ  １３、Ｑａｔａｒ３、Ｑａｔａｒ４、Ｅｎｇｌａｎｄ  １、Ｅｎｇｌａｎｄ−Ｑａｔａｒ／２０１２、Ｂｉｓｈａ＿１、Ｒｉｙａｄｈ＿１、及びＲｉｙａｄｈ＿２からなる群から選択されるＭＥＲＳ−ＣｏＶの１つ以上の株に感染している。
【００９１】
一実施形態では、この拮抗薬は、ＭＥＲＳ−ＣｏＶ感染前に投与される。一実施形態では、この拮抗薬は、ＭＥＲＳ−ＣｏＶ感染後に投与される。
【００９２】
一実施形態では、この拮抗薬は、ＭＥＲＳ−ＣｏＶ感染と同時に投与される。
【００９３】
一実施形態では、ＭＥＲＳ−ＣｏＶ感染の症状は、ウイルス力価又はＲＮＡレベルである。
【００９４】
一実施形態では、ウイルス力価又はＲＮＡレベルは、ｑＰＣＲ、ノーザンブロット、プラークアッセイ、及びインサイチュハイブリダイゼーションからなる群から選択される１つ以上の方法により評価される。
【００９５】
一実施形態では、ＭＥＲＳ−ＣｏＶ感染の症状は、肺の炎症である。
【００９６】
一実施形態では、肺の炎症は、組織化学的に評価される。
【００９７】
一実施形態では、ＭＥＲＳ−ＣｏＶ感染の症状は、体重減少である。
【００９８】
一実施形態では、このげっ歯類はマウス又はラットである。一実施形態では、このげっ歯類はマウスである。一実施形態では、このげっ歯類はラットである。
【００９９】
本明細書に記載の態様及び実施形態の各々は、その実施形態又は態様の文脈から明示的に又は明らかに除外されない限り、一緒に使用することができる。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
内在性げっ歯類Ｄｐｐ４遺伝子のヒト化を含むげっ歯類であって、前記ヒト化が、改変ＤＰＰ４遺伝子を形成するための、内在性げっ歯類Ｄｐｐ４遺伝子座での、Ｄｐｐ４遺伝子のエクソンをコードするげっ歯類遺伝子の、ヒトＤＰＰ４遺伝子の少なくとも１個のエクソンをコードする核酸配列での置換を含み、前記改変ＤＰＰ４遺伝子の発現が、前記内在性げっ歯類Ｄｐｐ４遺伝子座でげっ歯類調節エレメントの制御下にある、げっ歯類。
（項目２）
前記げっ歯類がマウス又はラットである、項目１に記載のげっ歯類。
（項目３）
ヒト又はヒト化ＤＰＰ４タンパク質をコードする前記ヒトＤＰＰ４遺伝子が、前記ヒトＤＰＰ４遺伝子のエクソン２からエクソン２６を含む、項目１に記載のげっ歯類。
（項目４）
前記ヒト化ＤＰＰ４タンパク質が、前記ヒトＤＰＰ４タンパク質の細胞外ドメインを含む、項目３に記載のげっ歯類。
（項目５）
前記ヒト化ＤＰＰ４タンパク質が、マウスＤｐｐ４タンパク質の膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを含む、項目４に記載のげっ歯類。
（項目６）
前記げっ歯類が、マウスＤｐｐ４タンパク質を発現することができないマウスである、項目１に記載のげっ歯類。
（項目７）
前記げっ歯類がマウスであり、マウスＤｐｐ４のエクソン２からエクソン２６をコードするマウスＤｐｐ４配列の連続したゲノム断片が、ヒトＤＰＰ４のエクソン２からエクソン２６をコードするヒトＤＰＰ４配列の連続したゲノム断片で置換されている、項目１に記載のげっ歯類。
（項目８）
前記げっ歯類が、Ｔ細胞の表面上にヒト又はヒト化ＤＰＰ４タンパク質を発現するマウスであり、血中に存在するＴ細胞の量が、機能的内在性マウスＤｐｐ４タンパク質を発現するが、前記置換を含まない同齢のマウスの血中に存在するＴ細胞の量の少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、又は２００％である、項目１に記載のげっ歯類。
（項目９）
前記げっ歯類が、Ｔ細胞の表面上にヒト又はヒト化ＤＰＰ４タンパク質を発現するマウスであり、血中に存在するＴ細胞の量が、機能的内在性Ｄｐｐ４タンパク質を発現するが、前記置換を含まない同齢のマウスの血中に存在するＴ細胞の量の約２０％〜約２００％、約４０％〜約１６０％、又は約８０％〜約１２０％である、項目１に記載のげっ歯類。
（項目１０）
前記げっ歯類が、機能的内在性マウスＤｐｐ４タンパク質を発現するが前記置換を含まない同齢のマウスのＴ細胞の表面上に存在するマウスＤｐｐ４タンパク質のレベルの少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、又は２００％のレベルで、Ｔ細胞の表面上にヒト又はヒト化ＤＰＰ４タンパク質を発現するマウスである、項目１に記載のげっ歯類。
（項目１１）
前記げっ歯類が、機能的内在性Ｄｐｐ４タンパク質を発現するが前記置換を含まない同齢のマウスのＴ細胞の表面上に存在するマウスＤｐｐ４タンパク質のレベルの約２０％〜約２００％、約４０％〜約１６０％、又は約８０％〜約１２０％のレベルで、Ｔ細胞の表面上にヒト又はヒト化ＤＰＰ４タンパク質を発現するマウスである、項目１に記載のげっ歯類。
（項目１２）
前記げっ歯類が、機能的内在性マウスＤｐｐ４タンパク質を発現するが前記置換を含まない同齢のマウスの胎盤、腎臓、肺、肝臓、骨格筋、心臓、脳、及び膵臓からなる群から選択される１つ以上の組織の表面上に存在するマウスＤｐｐ４タンパク質のレベルの少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、又は２００％のレベルで、前記１つ以上の組織の細胞の表面上にヒト又はヒト化ＤＰＰ４タンパク質を発現するマウスである、項目１に記載のげっ歯類。
（項目１３）
前記げっ歯類が、機能的内在性Ｄｐｐ４タンパク質を発現するが前記置換を含まない同齢のマウスの胎盤、腎臓、肺、肝臓、骨格筋、心臓、脳、及び膵臓からなる群から選択される１つ以上の組織の表面上に存在するマウスＤｐｐ４タンパク質のレベルの約２０％〜約２００％、約４０％〜約１６０％、又は約８０％〜約１２０％のレベルで、前記１つ以上の組織の細胞の表面上にヒト又はヒト化ＤＰＰ４タンパク質を発現するマウスである、項目１に記載のげっ歯類。
（項目１４）
前記内在性げっ歯類Ｄｐｐ４遺伝子の前記ヒト化がヘテロ接合性である、項目１から１３のいずれか一項に記載のげっ歯類。
（項目１５）
前記内在性げっ歯類Ｄｐｐ４遺伝子の前記ヒト化がホモ接合性である、項目１から１３のいずれか一項に記載のげっ歯類。
（項目１６）
げっ歯類Ｄｐｐ４タンパク質をコードするげっ歯類Ｄｐｐ４遺伝子配列を、ヒト又はヒト化ＤＰＰ４タンパク質をコードするヒトＤＰＰ４遺伝子配列の１個以上のエクソンを含む前記ヒトＤＰＰ４遺伝子配列で置換することを含む、ヒト化げっ歯類を作製するための方法であって、前記置換が、内在性げっ歯類Ｄｐｐ４遺伝子座においてであり、ヒト又はヒト化ＤＰＰ４タンパク質をコードする前記ヒトＤＰＰ４遺伝子配列の１個以上のエクソンを含む前記ヒトＤＰＰ４遺伝子配列が、前記内在性げっ歯類Ｄｐｐ４遺伝子座でげっ歯類調節エレメント又は配列に作動可能に連結されている、方法。
（項目１７）
前記げっ歯類がマウス又はラットである、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記げっ歯類調節エレメント又は配列が、マウス又はラット由来である、項目１６に記載の方法。
（項目１９）
前記げっ歯類調節エレメント又は配列が、前記げっ歯類Ｄｐｐ４遺伝子座での内在性げっ歯類調節エレメント又は配列である、項目１６に記載の方法。
（項目２０）
前記げっ歯類Ｄｐｐ４遺伝子配列を置換する前記ヒトＤＰＰ４遺伝子配列が、前記ヒトＤＰＰ４遺伝子配列の少なくとも１個のエクソンを含む、項目１６に記載の方法。
（項目２１）
前記げっ歯類Ｄｐｐ４遺伝子配列を置換する前記ヒトＤＰＰ４遺伝子配列が、前記ヒトＤＰＰ４遺伝子配列の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１８、２０、２１、２２、２３、２４、又は２５個のエクソンを含む、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
前記げっ歯類Ｄｐｐ４遺伝子配列を置換する前記ヒトＤＰＰ４遺伝子配列が、前記ヒトＤＰＰ４遺伝子配列の２６個全てのエクソンを含む、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記げっ歯類Ｄｐｐ４遺伝子配列を置換する前記ヒトＤＰＰ４遺伝子配列が、前記ヒトＤＰＰ４タンパク質の細胞外ドメインをコードする前記ヒトＤＰＰ４遺伝子配列の少なくとも１個のエクソンを含む、項目１６に記載の方法。
（項目２４）
前記げっ歯類Ｄｐｐ４遺伝子配列を置換する前記ヒトＤＰＰ４遺伝子配列が、前記ヒトＤＰＰ４タンパク質の前記細胞外ドメインをコードする前記ヒトＤＰＰ４遺伝子配列の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１８、２０、２１、２２、又は２３個のエクソンを含む、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
前記げっ歯類Ｄｐｐ４遺伝子配列を置換する前記ヒトＤＰＰ４遺伝子配列が、前記ヒトＤＰＰ４タンパク質の前記細胞外ドメインをコードする前記ヒトＤＰＰ４遺伝子配列の２４個全てのエクソンを含む、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
前記置換が内在性げっ歯類Ｄｐｐ４遺伝子座においてであり、ヒト又はヒト化ＤＰＰ４タンパク質をコードする前記ヒトＤＰＰ４遺伝子配列の１個以上のエクソンを含む前記ヒトＤＰＰ４遺伝子配列が、前記内在性げっ歯類Ｄｐｐ４遺伝子座で内在性げっ歯類調節エレメント又は配列に作動可能に連結されている、項目１７に記載の方法。
（項目２７）
前記げっ歯類が、前記ヒト又はヒト化ＤＰＰ４タンパク質をコードする前記ヒトＤＰＰ４遺伝子配列の１個以上のエクソンを含む前記ヒトＤＰＰ４遺伝子配列についてヘテロ接合性である、項目１６から２６のいずれか一項に記載の方法。
（項目２８）
前記げっ歯類が、前記ヒト又はヒト化ＤＰＰ４タンパク質をコードする前記ヒトＤＰＰ４遺伝子配列の１個以上のエクソンを含む前記ヒトＤＰＰ４遺伝子配列についてホモ接合性である、項目１６から２６のいずれか一項に記載の方法。
（項目２９）
マウスＤｐｐ４タンパク質をコードするマウスＤｐｐ４遺伝子配列を、ヒト又はヒト化ＤＰＰ４タンパク質をコードするヒトＤＰＰ４遺伝子で置換することを含む、ヒト化ＤＰＰ４マウスを作製するための方法。
（項目３０）
前記置換が内在性マウスＤｐｐ４遺伝子座においてであり、ヒト又はヒト化ＤＰＰ４タンパク質をコードする前記ヒトＤＰＰ４遺伝子がマウス調節配列に作動可能に連結されている、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
前記置換が内在性マウスＤｐｐ４遺伝子座においてであり、ヒト又はヒト化ＤＰＰ４タンパク質をコードする前記ヒトＤＰＰ４遺伝子が内在性マウス調節配列に作動可能に連結されている、項目２９に記載の方法。
（項目３２）
前記マウスが、前記ヒト又はヒト化ＤＰＰ４タンパク質をコードする前記ヒトＤＰＰ４遺伝子についてヘテロ接合性である、項目２９から３１のいずれか一項に記載の方法。
（項目３３）
前記マウスが、前記ヒト又はヒト化ＤＰＰ４タンパク質をコードする前記ヒトＤＰＰ４遺伝子についてホモ接合性である、項目２９から３１のいずれか一項に記載の方法。
（項目３４）
ヒトＤＰＰ４遺伝子又はその断片を含む核酸配列を含むげっ歯類であって、前記ヒトＤＰＰ４遺伝子又はその断片が、前記ヒトＤＰＰ４遺伝子の少なくとも１個のエクソンを含み、前記ヒトＤＰＰ４遺伝子又はその断片が、ヒト又はヒト化ＤＰＰ４タンパク質をコードする、げっ歯類。
（項目３５）
前記ヒトＤＰＰ４遺伝子又はその断片が、前記ヒトＤＰＰ４遺伝子の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１８、２０、２１、２２、２３、２４、又は２５個のエクソンを含む、項目３４に記載のげっ歯類。
（項目３６）
前記ヒトＤＰＰ４遺伝子又はその断片が、前記ヒトＤＰＰ４遺伝子の２６個全てのエクソンを含む、項目３４に記載のげっ歯類。
（項目３７）
前記核酸配列が、前記ヒトＤＰＰ４遺伝子の５’隣接領域を更に含む、項目３４に記載のげっ歯類。
（項目３８）
前記ヒトＤＰＰ４遺伝子又はその断片が、前記ヒトＤＰＰ４遺伝子の前記５’隣接領域に作動可能に連結されている、項目３７に記載のげっ歯類。
（項目３９）
前記ヒトＤＰＰ４遺伝子の前記５’隣接領域が、長さで少なくとも１０ｋｂを含む、項目３８に記載のげっ歯類。
（項目４０）
前記ヒトＤＰＰ４遺伝子の前記５’隣接領域が、長さで少なくとも４０ｋｂを含む、項目３９に記載のげっ歯類。
（項目４１）
前記ヒトＤＰＰ４遺伝子又はその断片の発現が、前記ヒトＤＰＰ４遺伝子の前記５’隣接領域の制御下にある、項目３８に記載のげっ歯類。
（項目４２）
前記ヒト又はヒト化ＤＰＰ４タンパク質が、配列番号２４のアミノ酸配列又はその断片を含む、項目３４に記載のげっ歯類。
（項目４３）
前記げっ歯類が、機能的内在性げっ歯類Ｄｐｐ４タンパク質を発現するが、前記ヒトＤＰＰ４遺伝子もその断片も含まない同齢のげっ歯類のＴ細胞の表面上に存在するげっ歯類Ｄｐｐ４タンパク質のレベルの少なくとも約２０％のレベルで、Ｔ細胞の表面上に前記ヒト又はヒト化ＤＰＰ４タンパク質を発現する、項目３８に記載のげっ歯類。
（項目４４）
前記げっ歯類が、機能的内在性げっ歯類Ｄｐｐ４タンパク質を発現するが、前記ヒトＤＰＰ４遺伝子もその断片も含まない同齢のげっ歯類の胎盤、腎臓、肺、肝臓、骨格筋、心臓、脳、及び膵臓からなる群から選択される１つ以上の組織の表面上に存在するげっ歯類Ｄｐｐ４タンパク質のレベルの少なくとも約２０％のレベルで、前記１つ以上の組織の細胞の表面上に前記ヒト又はヒト化ＤＰＰ４タンパク質を発現する、項目３８に記載のげっ歯類。
（項目４５）
前記げっ歯類が、機能的内在性げっ歯類Ｄｐｐ４タンパク質を発現する、項目３４に記載のげっ歯類。
（項目４６）
前記げっ歯類がマウス又はラットである、項目３４に記載のげっ歯類。
（項目４７）
前記げっ歯類が、前記ヒトＤＰＰ４遺伝子又はその断片についてヘテロ接合性である、項目３４から４６のいずれか一項に記載のげっ歯類。
（項目４８）
前記げっ歯類が、前記ヒトＤＰＰ４遺伝子又はその断片についてホモ接合性である、項目３４から４６のいずれか一項に記載のげっ歯類。
（項目４９）
ヒトＤＰＰ４遺伝子配列の１個以上のエクソンを含む核酸配列をげっ歯類の染色体に組み込むことを含む、ヒト化トランスジェニックげっ歯類を作製するための方法であって、前記ヒトＤＰＰ４遺伝子配列の前記１個以上のエクソンが、ヒト又はヒト化ＤＰＰ４タンパク質をコードする、方法。
（項目５０）
前記ヒトＤＰＰ４遺伝子又はその断片が、前記ヒトＤＰＰ４遺伝子の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１８、２０、２１、２２、２３、２４、又は２５個のエクソンを含む、項目４９に記載の方法。
（項目５１）
前記ヒトＤＰＰ４遺伝子又はその断片が、前記ヒトＤＰＰ４遺伝子の２６個全てのエクソンを含む、項目４９に記載の方法。
（項目５２）
前記核酸配列が、前記ヒトＤＰＰ４遺伝子の５’隣接領域を更に含む、項目４９に記載の方法。
（項目５３）
前記ヒトＤＰＰ４遺伝子配列が、前記ヒトＤＰＰ４遺伝子の前記５’隣接領域に作動可能に連結されている、項目５２に記載の方法。
（項目５４）
前記ヒト又はヒト化ＤＰＰ４タンパク質が、配列番号２４のアミノ酸配列又はその断片を含む、項目４９に記載の方法。
（項目５５）
前記げっ歯類がマウス又はラットである、項目４９に記載の方法。
（項目５６）
前記げっ歯類が、ヒトＤＰＰ４遺伝子配列の１個以上のエクソンを含む前記核酸配列についてヘテロ接合性である、項目４９から５５のいずれか一項に記載の方法。
（項目５７）
前記げっ歯類が、ヒトＤＰＰ４遺伝子配列の１個以上のエクソンを含む前記核酸配列についてホモ接合性である、項目４９から５５のいずれか一項に記載の方法。
（項目５８）
項目１から１５又は３４から４８のいずれか一項に記載のげっ歯類におけるヒト特異的ＤＰＰ４拮抗薬のインビボ治療有効性を決定するための方法であって、
（ａ）前記げっ歯類にＤＰＰ４拮抗薬を投与することであって、前記げっ歯類が中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ−ＣｏＶ）に感染している、投与することと、
（ｂ）前記ＤＰＰ４拮抗薬が、前記ＤＰＰ４拮抗薬が投与されていないＭＥＲＳ−ＣｏＶに感染している対照げっ歯類と比較して、ＭＥＲＳ−ＣｏＶ感染の１つ以上の症状を治療又は予防するかを決定することと、を含む、方法。
（項目５９）
前記ＤＰＰ４拮抗薬が、小分子、ペプチド、及び抗体からなる群から選択される、項目５８に記載の方法。
（項目６０）
前記ＤＰＰ４拮抗薬が、ＭＥＲＳ−ＣｏＶタンパク質に対する抗体である、項目５８又は５９に記載の方法。
（項目６１）
前記ＭＥＲＳ−ＣｏＶタンパク質が、ＭＥＲＳ−ＣｏＶスパイクタンパク質である、項目６０に記載の方法。
（項目６２）
前記げっ歯類が、Ａｌ−Ｈａｓａ＿１、Ａｌ−Ｈａｓａ＿２、Ａｌ−Ｈａｓａ＿３、Ａｌ−Ｈａｓａ＿４、Ａｌ−Ｈａｓａ＿１２、Ａｌ−Ｈａｓａ＿１５、Ａｌ−Ｈａｓａ＿１６、Ａｌ−Ｈａｓａ＿１７、Ａｌ−Ｈａｓａ＿１８、Ａｌ−Ｈａｓａ＿１９、Ａｌ−Ｈａｓａ＿２１、Ａｌ−Ｈａｓａ＿２５、Ｂｕｒａｉｄａｈ＿１、ＥＭＣ／２０１２、ＦＲＡ／ＵＡＥ、Ｈａｆｒ−Ａｌ−Ｂａｔｉｎ＿１、Ｈａｆｒ−Ａｌ−Ｂａｔｉｎ＿２、Ｈａｆｒ−Ａｌ−Ｂａｔｉｎ＿６、Ｊｅｄｄａｈ＿１、Ｊｏｒｄａｎ−Ｎ３／２０１２、Ｍｕｎｉｃｈ、Ｒｉｙａｄｈ＿３、Ｒｉｙａｄｈ＿４、Ｒｉｙａｄｈ＿５、Ｒｉｙａｄｈ＿１４、Ｔａｉｆ＿１、Ｗａｄｉ−Ａｄ−Ｄａｗａｓｉｒ＿１、Ｒｉｙａｄｈ＿９、ＫＦＵ−ＨＫＵ  １、ＫＦＵ−ＨＫＵ  １３、Ｑａｔａｒ３、Ｑａｔａｒ４、Ｅｎｇｌａｎｄ  １、Ｅｎｇｌａｎｄ−Ｑａｔａｒ／２０１２、Ｂｉｓｈａ＿１、Ｒｉｙａｄｈ＿１、及びＲｉｙａｄｈ＿２からなる群から選択されるＭＥＲＳ−ＣｏＶの１つ以上の株に感染している、項目５８から６１のいずれか一項に記載の方法。
（項目６３）
前記拮抗薬が、ＭＥＲＳ−ＣｏＶ感染前に投与される、項目５８から６２のいずれか一項に記載の方法。
（項目６４）
前記拮抗薬が、ＭＥＲＳ−ＣｏＶ感染後に投与される、項目５８から６２のいずれか一項に記載の方法。
（項目６５）
前記拮抗薬が、ＭＥＲＳ−ＣｏＶ感染と同時に投与される、項目５８から６２のいずれか一項に記載の方法。
（項目６６）
ＭＥＲＳ−ＣｏＶ感染の前記症状が、ウイルス力価又はＲＮＡレベルである、項目５８から６５のいずれか一項に記載の方法。
（項目６７）
ウイルス力価又はＲＮＡレベルが、ｑＰＣＲ、ノーザンブロット、プラークアッセイ、及びインサイチュハイブリダイゼーションからなる群から選択される１つ以上の方法により査定される、項目６６に記載の方法。
（項目６８）
ＭＥＲＳ−ＣｏＶ感染の前記症状が、肺の炎症である、項目５８から６５のいずれか一項に記載の方法。
（項目６９）
肺の炎症が、組織化学的に評価される、項目６８に記載の方法。
（項目７０）
ＭＥＲＳ−ＣｏＶ感染の前記症状が、体重減少である、項目５８から６５のいずれか一項に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【０１００】
【図１Ａ】図１Ａは、原寸に比例していない、Ｄｐｐ４遺伝子座のヒト化戦略の図を提供する。示されるように、エクソン２からエクソン２６の終止コドンまでのマウスＤｐｐ４遺伝子の７８．８ｋｂ（上）が欠失しており、エクソン２からエクソン２６及び３’非翻訳領域の一部までのヒトＤＰＰ４遺伝子の８１．７ｋｂ（下）で置換されていることを示す概略図である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、原寸に比例していない、Ｄｐｐ４遺伝子座のヒト化戦略の図を提供する。示されるように、ヒト化ＤＰＰ４マウスが、（ｉ）調節配列、例えば、プロモーター及び転写開始部位、並びに開始ＡＴＧコドン等のエクソン１を含むマウスＤｐｐ４遺伝子の５’隣接領域、（ｉｉ）エクソン２から終止コドンを含むエクソン２６及びｌｏｘＰ部位を含む３’非翻訳領域の一部までのヒトＤＰＰ４遺伝子、並びに（ｉｉｉ）直ぐ３’側から終止コドンまでのマウスＤｐｐ４遺伝子の３’非翻訳領域を含むことを示す概略図である。
【図２】ヒト化ＤＰＰ４マウスにおいて発現されたヒト化ＤＰＰ４タンパク質のアミノ酸配列（配列番号１７）を示す。
【図３】感染から４日後の偽（ＰＢＳ）感染又はＭＥＲＳ−ＣｏＶ（Ｊｏｒｄａｎ株）感染のいずれかのＦ０ヒト化ＤＰＰ４マウス由来の肺組織から得られたＲＮＡで行われたリアルタイムＰＣＲの結果を示す。
【図４】感染から４日後の偽（ＰＢＳ）感染又はＭＥＲＳ−ＣｏＶ（Ｊｏｒｄａｎ株）感染のいずれかのＦ０ヒト化ＤＰＰ４マウスの肺由来の気道（１０倍率及び４０倍率）及び肺胞（４０倍率）のＨ＆Ｅ染色を示す。
【図５】トランスジェニックＭＡＩＤ７３２６／７３２７マウス（配列番号２６）によってコードされたヒトＤＰＰ４（ｈＤＰＰ４）タンパク質とのマウスＤｐｐ４（ｍＤｐｐ４）アミノ酸配列（配列番号２５）の配列アラインメントである。これらの配列間で異なる非相同残基に下線が引かれており、これらの配列間で異なる相同残基は太字のイタリック体で書かれており、ギャップはハイフンで示されている。これらの２つの配列間で同一の残基は、フォーマットされていないテキストで示されている。
【図６】ヒトＤＰＰ４の遺伝子、配列、及び染色体情報を示す表である。
【図７】ヒトＤＰＰ４遺伝子、並びにＢＡＣの各々、ＢＡＣ  ＲＰ１１−３４５Ｊ９及びＢＡＣ  ＲＰ１１−６８Ｌ２２の隣接ゲノム配列の被覆範囲を示す概略図である。ヒトＤＰＰ４遺伝子内の位置及びヒトＴａｑＭａｎ（商標）プライマー・プローブセットがアニールするプロモーター領域も示される（７３３３ｈＴＵが上流セットであり、７３３３ｈＴＤが下流セットである）。
【図８】ヒトＴａｑＭａｎ（商標）対立遺伝子獲得アッセイに使用されたプライマー・プローブセットを示す表であり、ここで、７３３３ｈＴＵが上流セットを指し、７３３３ｈＴＤが下流セットを指す。
【図９】トランスジェニックＭＡＩＤ７３３３及び７３３４マウス（配列番号２４）によってコードされたヒト化ＤＰＰ４タンパク質のアミノ酸配列である。
【図１０Ａ】感染後２日目（ｄｐｉ）及び４日目の感染マウスにおけるＭＥＲＳ−ＣｏＶゲノム（ＵｐＥ  ＲＮＡ）の定量ＰＣＲ測定値を示す棒グラフである。
【図１０Ｂ】２ｄｐｉ及び４ｄｐｉの感染マウスにおけるＭＥＲＳ−ＣｏＶ  ｍＲＮＡ転写物（リーダーＲＮＡ）の定量ＰＣＲ測定値を示す棒グラフである。
【図１０Ｃ】２ｄｐｉ及び４ｄｐｉの感染マウス肺のＭＥＲＳ−ＣｏＶウイルス力価を定量した棒グラフである。均質化されたマウス肺のＭＥＲＳ−ＣｏＶレベルを５０％組織培養感染用量（ＴＣＩＤ５０）アッセイによって定量し、１ｍＬ当たりのプラーク形成単位（ｐｆｕ）として表した。
【図１０Ｄ】ＭＥＲＳ−ＣｏＶ感染マウス由来の肺のヘマトキシリン及びエオシンで染色された組織学的画像のパネルである。気道（１０倍率）、脈管構造（１０倍率）、及び間質（４０倍率）は、ＰＢＳマウス、２ｄｐｉマウス、及び４ｄｐｉマウスを示す。
【図１１Ａ】ウイルス感染前に抗ＭＥＲＳ−ＣｏＶスパイクタンパク質抗体（Ａｂ２又はＡｂ４）で前処理されたマウスの肺由来のＭＥＲＳ−ＣｏＶゲノム（ＵｐＥ  ＲＮＡ）の定量ＰＣＲ測定値を示す棒グラフである。
【図１１Ｂ】ウイルス感染前に抗ＭＥＲＳ−ＣｏＶスパイクタンパク質抗体で前処理されたマウスの肺由来のＭＥＲＳ−ＣｏＶ  ｍＲＮＡ転写物（リーダーＲＮＡ）の定量ＰＣＲ測定値を示す棒グラフである。ＭＥＲＳ−ＣｏＶゲノムに向けられたプライマーを使用してＲＮＡを定量し、ｈＩｇＧ１アイソタイプ対照処理マウスと比較した。全ての試料を１００％で設定されたｈＩｇＧ１対照と比較した。
【図１１Ｃ】ウイルス感染前に抗ＭＥＲＳ−ＣｏＶスパイクタンパク質抗体で前処理されたマウスの肺のウイルス力価を示す棒グラフである。ウイルス力価をプラークアッセイによって定量し、ｐｆｕ／ｍＬとして報告した。
【図１２Ａ】抗ＭＥＲＳ−ＣｏＶスパイクタンパク質抗体（Ａｂ２又はＡｂ４）で前処理されたＭＥＲＳ−ＣｏＶ感染Ｂ６／ｈＤＰＰ４マウスの肺の組織学的画像のパネルである。マウス肺のヘマトキシリン及びエオシン染色区分は、各群からの代表的なマウスの気道、脈管構造、及び間質を示す。
【図１２Ｂ】図１２Ａに示されるマウス肺の組織学的スコアリングを示す棒グラフである。これらのスコアは、各実験群及び時点における全てのマウス平均スコアである。
【図１３Ａ】感染した肺由来のＭＥＲＳ−ＣｏＶゲノム（ＵｐＥ  ＲＮＡ）の定量ＰＣＲ測定値を示す棒グラフである。ウイルス感染の１日前又はウイルス感染の１日後に注入された抗ＭＥＲＳ−ＣｏＶスパイクタンパク質抗体（Ａｂ２又はＡｂ４）の効果を比較した。図１３Ａについて、ＭＥＲＳ−ＣｏＶゲノムに向けられたプライマーを使用してＲＮＡを定量し、ｈＩｇＧ１アイソタイプ対照処理マウスと比較した。全ての試料を１００％で設定されたｈＩｇＧ１対照と比較した。
【図１３Ｂ】感染した肺由来のＭＥＲＳ−ＣｏＶ  ｍＲＮＡ転写物（リーダーＲＮＡ）の定量ＰＣＲ測定値を示す棒グラフである。ウイルス感染の１日前又はウイルス感染の１日後に注入された抗ＭＥＲＳ−ＣｏＶスパイクタンパク質抗体（Ａｂ２又はＡｂ４）の効果を比較した。図１３Ｂについて、ＭＥＲＳ−ＣｏＶゲノムに向けられたプライマーを使用してＲＮＡを定量し、ｈＩｇＧ１アイソタイプ対照処理マウスと比較した。全ての試料を１００％で設定されたｈＩｇＧ１対照と比較した。
【図１３Ｃ】ウイルス感染後に抗ＭＥＲＳ−ＣｏＶスパイクタンパク質抗体（Ａｂ２又はＡｂ４）で処理されたマウスの肺のウイルス力価を示す棒グラフである。ウイルス力価をプラークアッセイによって定量し、ＰＦＵ／ｍＬの肺として報告した。ウイルス感染の１日前又はウイルス感染の１日後に注入された抗体の効果を比較した。
【図１４Ａ】感染後１日目に抗ＭＥＲＳ−ＣｏＶスパイクタンパク質Ａｂ２抗体で処理されたＭＥＲＳ−ＣｏＶ感染Ｂ６／ｈＤＰＰ４マウス由来の肺の組織学的画像のパネルである。マウス肺のヘマトキシリン及びエオシン染色区分は、各群からの代表的なマウスの気道、脈管構造、及び間質を示す。
【図１４Ｂ】図１４Ａのマウス肺の組織学的スコアリングを示す棒グラフである。
【図１５】ヒト化ＤＰＰ４マウスにおけるＭＥＲＳ−ＣｏＶ感染後の時間の関数としての体重に対する用量反応研究を示す。１群当たり４〜５匹のマウスを使用する。
【図１６】ヘテロ接合体及びホモ接合体ヒト化ＤＰＰ４マウスにおけるＭＥＲＳ−ＣｏＶ（１×１０６ｐｆｕ／マウス、１群当たり４〜５匹のマウス）感染後の時間の関数としての体重に対する用量反応研究を示す。
【図１７】ＰＢＳ処理対照に対する高用量のウイルス（１×１０６ｐｆｕ／マウス）に曝露されたヒト化ＤＰＰ４マウスにおける７日目の組織学的試験によって見られる病変（炎症）を示す。
【発明を実施するための形態】
【０１０１】
ＤＰＰ４遺伝子及びタンパク質
ＤＰＰ４遺伝子は、セリンエキソペプチダーゼ活性を有し、Ｔ細胞の活性化及びいくつかの他の細胞型における細胞内情報伝達カスケードにおいて重要な役割を果たす、ＩＩ型膜貫通タンパク質、トリペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ４）（別名、ＣＤ２６、アデノシンデアミナーゼ複合タンパク質−２（ＡＤＣＰ２）、アデノシンデアミナーゼ結合タンパク質（ＡＤＡＢＰ）、及びＴＰ１０３）をコードする。
【０１０２】
ヒトＤＰＰ４。ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：１８０３、一次源：ＨＧＮＣ：３００９、基準配列転写物：ＮＭ＿００１９３５．３、ＵｎｉＰｒｏｔ  ＩＤ：Ｐ２７４８７、ゲノムアセンブリ：ＧＲＣｈ３８、位置：ｃｈｒ２：１６２，８４８，７５５−１６２，９３１，０５２  マイナス鎖。（図６を参照されたい）。
【０１０３】
ヒトＤＰＰ４遺伝子は、第２染色体２ｑ２４．３に位置する。ヒトＤＰＰ４遺伝子は、２６個のエクソンを有し、Ｎ末端６アミノ酸細胞質ドメイン、２２アミノ酸膜貫通ドメイン、及びＣ末端７３８アミノ酸細胞外ドメインを含む７６６アミノ酸長のＩＩ型膜貫通ポリペプチドをコードする。ヒトＤＰＰ４タンパク質の細胞外ドメイン（すなわち、外部ドメイン）は、ヒトＤＰＰ４遺伝子のコードエクソン３からエクソン２６によってコードされる。
【０１０４】
マウスＤｐｐ４４。ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：１３４８２、一次源：ＭＧＩ：９４９１９、基準配列転写物：ＮＭ＿０１００７４．３、ＵｎｉＰｒｏｔ  ＩＤ：Ｐ２８８４３、ゲノムアセンブリ：ＧＲＣｍ３８、位置：ｃｈｒ２：６２，３３０，０７３−６２，４１２，５９１  マイナス鎖。
【０１０５】
マウスＤｐｐ４遺伝子は、第２染色体２  ３５．８５ｃＭに位置する。マウスＤｐｐ４遺伝子は、２６個のエクソンを有し、Ｎ末端６アミノ酸細胞質ドメイン、２２アミノ酸膜貫通ドメイン、及びＣ末端７３２アミノ酸細胞外ドメインを含む７６０アミノ酸長のＩＩ型膜貫通ポリペプチドをコードする。マウスＤｐｐ４タンパク質の細胞外ドメイン（すなわち、外部ドメイン）は、マウスＤｐｐ４遺伝子のコードエクソン３からエクソン２６によってコードされる。
【０１０６】
ＤＰＰ４タンパク質の種特異性
以下の実施例２に論じられるように、マウスではないヒトＤＰＰ４タンパク質は、中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ−ＣｏＶ）感染の機能的受容体である。
【０１０７】
種特異的な様式でヒトＤＰＰ４タンパク質を標的とするか、又は種特異的な様式でヒトＤＰＰ４タンパク質と相互作用するＭＥＲＳ−ＣｏＶ等の分子を標的とする候補治療分子は、典型的には、非ヒト動物、例えば、げっ歯類、例えば、マウス又はラットにおける薬物動態（ＰＫ）及び薬力動態（ＰＤ）について評価される。かかる治療分子は、ＤＰＰ４が役割を果たすヒト疾患、障害、及び状態における非ヒト動物モデル、例えば、げっ歯類モデル、例えば、マウス又はラットモデルにおけるインビボ治療有効性についても試験される。
【０１０８】
しかしながら、ヒトＤＰＰ４タンパク質に特異的な治療分子、例えば、ヒト特異的ＤＰＰ４阻害剤は、これらの治療分子の標的が見当たらないため、げっ歯類、具体的にはマウスにおけるＰＤ及び／又はインビボ治療有効性について適切に評価されることができない。
【０１０９】
更に、ヒトＤＰＰ４タンパク質と特異的に相互作用する標的に特異的な治療分子、例えば、ヒトＤＰＰ４特異的ＭＥＲＳ−ＣｏＶは、これらの治療標的分子の標的（例えば、受容体、相互作用パートナー）が見当たらないため、げっ歯類、具体的にはマウスにおけるインビボ治療有効性について適切に評価されることができない。
【０１１０】
したがって、様々な実施形態では、非ヒト動物、例えば、げっ歯類、例えば、マウス又はラットにおけるヒト特異的ＤＰＰ４タンパク質拮抗薬又は阻害剤のＰＤ及び／又はインビボ治療有効性を査定するために、内因性Ｄｐｐ４タンパク質をヒト又はヒト化ＤＰＰ４タンパク質で置換することが望ましい。様々な実施形態では、非ヒト動物、例えば、げっ歯類、例えば、マウス又はラットにおけるヒトＤＰＰ４タンパク質と特異的に相互作用する標的分子の小分子、ペプチド、又は生物学的拮抗薬若しくは阻害剤のインビボ治療有効性を査定するために、内因性Ｄｐｐ４タンパク質をヒト又はヒト化ＤＰＰ４タンパク質で置換することが望ましい。
【０１１１】
更に、様々な実施形態では、ヒト若しくはヒト化ＤＰＰ４タンパク質の過剰発現若しくは過小発現、及び／又は内因性Ｄｐｐ４タンパク質が正常に発現されない細胞若しくは組織におけるヒト若しくはヒト化ＤＰＰ４タンパク質の不適切な発現といった潜在的な問題を避けるために、ヒトＤＰＰ４遺伝子を全体的に又は部分的に、内因性Ｄｐｐ４遺伝子の遺伝子座で、非ヒト動物、例えば、げっ歯類、例えば、マウス又はラットのゲノムに挿入し、内因性Ｄｐｐ４調節エレメントの少なくとも一部の制御下で、非ヒト動物、例えば、げっ歯類、例えば、マウス又はラットにおけるヒト又はヒト化ＤＰＰ４タンパク質を発現することが望ましい。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、内因性、例えば、マウス又はラットＤｐｐ４遺伝子のヒトＤＰＰ４遺伝子又はその断片での標的置換が望ましい。
【０１１３】
他の実施形態では、ヒトＤＰＰ４遺伝子又はその断片は、内因性Ｄｐｐ４遺伝子をヒトＤＰＰ４遺伝子又はその断片で置換する代わりに、げっ歯類、例えば、マウス又はラットゲノムにランダムに挿入される。いくつかの実施形態では、ヒトＤＰＰ４遺伝子又はその断片がそのゲノムにランダムに挿入されたげっ歯類、例えば、マウス又はラットにおいて、内因性げっ歯類Ｄｐｐ４の発現が保持される。
【０１１４】
内因性Ｄｐｐ４遺伝子座又は１つ以上の他の遺伝子座のいずれかに（すなわち、それを置換する）ヒトＤＰＰ４遺伝子又はその断片を含む非ヒト動物、例えば、げっ歯類、例えば、マウス又はラットが本明細書に提供される。内因性Ｄｐｐ４遺伝子座及び更なる遺伝子座（複数可）の両方に（すなわち、それを置換する）ヒトＤＰＰ４遺伝子又はその断片を含む非ヒト動物、例えば、げっ歯類、例えば、マウス又はラットも本明細書に提供される。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、ヒトＤＰＰ４遺伝子の断片は、２００キロベース（ｋｂ）又はそれ以下のヌクレオチド、例えば、１８０、１６０、１４０、１２０、１００、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、５、２．５、１ｋｂ又はそれ以下のヌクレオチド、例えば、１０００、８００、６００、４００、２００、又はそれ以下のヌクレオチドを含有する。
【０１１６】
ヒトＤＰＰ４を有する細胞及び非ヒト動物の生成
内因性非ヒトＤｐｐ４遺伝子又は断片のヒトＤＰＰ４遺伝子又は断片での標的置換の場合、標的構築物が生成される。例えば、Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，２１．６（２００３）：６５２〜６５９、米国特許第６，５８６，２５１号、及び同第８，７５９，１０５号を参照されたい。例えば、標的構築物は、置換ヒトＤＰＰ４遺伝子又はその断片に隣接する相同アームを含む。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、置換ヒトＤＰＰ４遺伝子又はその断片は、全ヒトＤＰＰ４遺伝子を含む。他の実施形態では、置換ヒトＤＰＰ４遺伝子又はその断片は、ヒトＤＰＰ４遺伝子の一部を含む。例えば、置換ヒトＤＰＰ４遺伝子又はその断片は、ヒトＤＰＰ４遺伝子の１個以上のエクソン、例えば、ヒトＤＰＰ４遺伝子の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、又は２６個のエクソンを含む。例えば、置換ヒトＤＰＰ４遺伝子又はその断片は、ヒトＤＰＰ４遺伝子のエクソン１からエクソン２６を含む。他の実施形態では、置換ヒトＤＰＰ４遺伝子又はその断片は、ヒトＤＰＰ４遺伝子のエクソン２からエクソン２６を含む。例えば、置換ヒトＤＰＰ４遺伝子又はその断片は、ヒトＤＰＰ４遺伝子のエクソン２からエクソン２６上流のイントロン１を含む。いくつかの実施形態では、置換ヒトＤＰＰ４遺伝子又はその断片は、ヒト調節エレメント（複数可）、例えば、ヒトＤＰＰ４遺伝子下流のヒト３’非翻訳領域（ＵＴＲ）の一部、例えば、下流領域の少なくとも１ｋｂ（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、１０、２０、３０、４０Ｋｂ、若しくはそれ以上）、及び／又はヒトＤＰＰ４遺伝子上流のヒトプロモーター又はエンハンサー領域、例えば、上流領域の少なくとも１０ｋｂ（例えば、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０Ｋｂ、若しくはそれ以上）を更に含む。
【０１１８】
相同アームは、所望の遺伝子改変／置換に隣接する、例えば、置換される内因性Ｄｐｐ４遺伝子又は断片に隣接する内因性染色体核酸配列と相同の配列である。相同核酸配列は、２つ以上の核酸配列であり得、これらは、同一であるか、あるいは互いにハイブリダイズするか、又は分子間交換を経ることができる程度に類似しているかのいずれかである。相同アームと対応する内因性配列との間の相同性により、相同アームは、標的構築物をゲノム内の特定の染色体位置、例えば、内因性Ｄｐｐ４遺伝子座に向ける。例えば、Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，２１．６（２００３）：６５２〜６５９、米国特許第６，５８６，２５１号、及び同第８，７５９，１０５号を参照されたい。
【０１１９】
任意に、標的構築物は、例えばこれらの２つの相同アーム間に選択マーカーを更に含む。例示の選択マーカーとしては、抗生物質耐性マーカー（例えば、ネオマイシン又はカナマイシン）及び蛍光タンパク質が挙げられる。いくつかの実施形態では、選択マーカーは、ｌｏｘＰに隣接している（floxed）、すなわち、２つのｌｏｘＰ部位に隣接している。ｌｏｘＰに隣接している選択マーカーは、例えばこの選択マーカーを含む、ｌｏｘＰに隣接しているセグメントの切除を触媒するＣｒｅリコンビナーゼの付加により除去され得る。
【０１２０】
ベクター／構築物
本発明のトランスジェニック非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、マウス又はラット）は、様々なベクター及び／又は構築物を使用して作製することができる。いくつかの実施形態では、標的構築物は、二本鎖ＤＮＡの円形片、例えば、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、プラスミド、又はＰ１誘導人工染色体（ＰＡＣ）の形態である。
【０１２１】
内因性Ｄｐｐ４遺伝子座の標的置換を含む非ヒト細胞を生成するために、本明細書に記載のヒトＤＰＰ４遺伝子又は断片を含有する標的構築物が、非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、マウス又はラット）細胞、例えば、胚幹（ＥＳ）細胞に導入される。
【０１２２】
ゲノムにランダムに挿入されたヒトＤＰＰ４遺伝子又は断片を含む非ヒト細胞を生成するために、ヒトＤＰＰ４遺伝子又はその断片を含有する円形ＤＮＡ構築物、例えば、ＢＡＣが、非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、マウス又はラット）細胞、例えば、ＥＳ細胞に導入される。ある場合には、円形ＤＮＡ構築物、例えば、ＢＡＣは、ヒトＤＰＰ４調節エレメント、例えば、ヒトＤＰＰ４遺伝子上流及び／又は下流のヒトプロモーター又はエンハンサー領域を更に含有する。例えば、円形ＤＮＡ構築物は、ヒトＤＰＰ４遺伝子のＡＴＧ開始コドン上流のプロモーター／エンハンサー領域の少なくとも１０ｋｂ（例えば、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０ｋｂ、又はそれ以上）を含有する。加えて又はあるいは、円形ＤＮＡ構築物は、ヒトＤＰＰ４遺伝子下流の非翻訳領域の少なくとも１ｋｂ（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、１０、２０、３０、４０ｋｂ、又はそれ以上）を含有する。例えば、ヒトＤＰＰ４遺伝子又は断片は、ヒトＤＰＰ４  調節エレメントに作動可能に連結されている。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、円形ＤＮＡ構築物（例えば、ＢＡＣ）におけるヒトＤＰＰ４遺伝子又はその断片は、全ヒトＤＰＰ４遺伝子を含む。他の実施形態では、ヒトＤＰＰ４遺伝子又はその断片は、ヒトＤＰＰ４遺伝子の一部を含む。例えば、ヒトＤＰＰ４遺伝子又はその断片は、ヒトＤＰＰ４遺伝子の１個以上のエクソン、例えば、ヒトＤＰＰ４遺伝子の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、又は２６個のエクソンを含む。例えば、ヒトＤＰＰ４遺伝子又はその断片は、ヒトＤＰＰ４遺伝子のエクソン１からエクソン２６を含む。他の実施形態では、ヒトＤＰＰ４遺伝子又はその断片は、ヒトＤＰＰ４遺伝子のエクソン２からエクソン２６を含む。例えば、ヒトＤＰＰ４遺伝子又はその断片は、ヒトＤＰＰ４遺伝子のエクソン２からエクソン２６上流のイントロン１を含む。
【０１２４】
例えば、細胞への導入工程は、電気穿孔又は脂質媒介トランスフェクションにより行われる。
【０１２５】
任意に、円形ＤＮＡ構築物、例えば、ＢＡＣは、細胞への導入前に線形化される。例えば、線形化は、希有切断制限酵素、例えば、ＳｇｒＤＩ、ＳｆｉＩ、ＮｏｔＩ、ＰａｃＩ、又はＳｗａＩを用いて行われる。
【０１２６】
標的構築物が抗生物質選択マーカー（例えば、ネオマイシン）を含む場合、標的構築物を取り込んだ細胞は、ネオマイシン／Ｇ４１８含有培地中で任意に選択される。ネオマイシン／Ｇ４１８含有培地中で生き残り、かつ／又は増殖する細胞が選択され、標的構築物に陽性である。
【０１２７】
いくつかの実施形態では、細胞集団は、ヒトＤＰＰ４遺伝子又はその断片がそれらのゲノムに組み込まれた、例えば、ゲノムにランダムに挿入されるか、又は内因性Ｄｐｐ４遺伝子座を標的とした（例えば、標的構築物により）細胞についてスクリーニングされる。
【０１２８】
スクリーニング方法としては、定量ＰＣＲ及び蛍光インサイチュハイブリダイゼーションが挙げられる。例えば、米国特許第６，５８６，２５１号Ｂ２及び同第８，７５９，１０５号Ｂ２を参照されたい。例えば、スクリーニング方法としては、ヒトＤＰＰ４遺伝子又は断片の存在の検出が挙げられる。いくつかの実施形態では、スクリーニング方法としては、内因性Ｄｐｐ４遺伝子若しくは断片のコピー数の損失及び／又はヒトＤＰＰ４遺伝子若しくは断片のコピー数の獲得の検出が挙げられる。例示のスクリーニング方法が実施例１及び３に記載される。
【０１２９】
標的構築物がｌｏｘＰに隣接している選択マーカーを含むいくつかの実施形態では、正しく標的された細胞は、Ｃｒｅ発現ベクター、例えば、一過的に発現しているＣｒｅリコンビナーゼで任意に更に電気穿孔されて、ｌｏｘＰに隣接している選択マーカーを除去する。
【０１３０】
トランスジェニック動物を生成するために、陽性ＥＳ細胞クローン、例えば、ｌｏｘＰに隣接している選択マーカーを有さず、ヒトＤＰＰ４遺伝子又はその断片を含有する陽性ＥＳ細胞クローンが、げっ歯類胚、例えば、マウス又はラット胚、例えば、８細胞段階マウス胚に導入される。例えば、この導入工程は、胚盤胞注入技術、凝集技法、核移植及びクローニング、並びに／又はＶｅｌｏｃｉＭｏｕｓｅ（登録商標）方法により行われる。例えば、米国特許第８，７５９，１０５号Ｂ２、同第７，２９４，７５４号、同第７，５７６，２５９号、及び同第７，６５９，４４２号を参照されたい。例えば、ＥＳ細胞クローンは、ＤＮＡの導入及びその後の選択後のＥＳ細胞集団の単一の細胞由来の細胞の亜集団である。
【０１３１】
ある場合には、トランスジェニック非ヒト動物由来のＤＮＡが上述の方法と同様の方法でスクリーニングされて、生殖系列を通るヒトＤＰＰ４遺伝子／断片の伝達を確認する。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のヒト化ＤＰＰ４げっ歯類は、ヒトＤＰＰ４対立遺伝子についてヘテロ接合性である。したがって、これらのげっ歯類は、１つのヒトＤＰＰ４対立遺伝子及び１つの野生型げっ歯類ＤＰＰ４対立遺伝子を有する。他の実施形態では、ヒト化ＤＰＰ４げっ歯類は、ヒトＤＰＰ４対立遺伝子についてホモ接合性である。
【０１３３】
ヒト化ＤＰＰ４げっ歯類の使用
ヒト化ＤＰＰ４げっ歯類、例えば、マウス又はラットは、高血糖症の治療に有用なヒト特異的ＤＰＰ４拮抗薬、例えば、小分子、ペプチド、又は生物学的阻害剤の薬力動態（ＰＤ）の評価に有用である。
【０１３４】
ヒト化ＤＰＰ４げっ歯類、例えば、マウス又はラットにおける薬物動態（ＰＫ）及びＰＤアッセイは、当該技術分野において既知の標準の手順に従って行われる。
【０１３５】
ヒト化ＤＰＰ４げっ歯類、例えば、マウス又はラットは、高血糖症の治療における、ヒト特異的ＤＰＰ４拮抗薬、例えば、小分子、ペプチド、又は生物学的阻害剤のインビボ治療有効性の評価に有用である。
【０１３６】
ヒト化ＤＰＰ４げっ歯類、例えば、マウス又はラットは、ＭＥＲＳ−ＣｏＶ感染の治療又は予防（若しくは予防法）における、拮抗薬、例えば、小分子、ペプチド、又は生物学的阻害剤、例えば、ヒトＤＰＰ４と特異的に相互作用する、標的分子、例えば、ＭＥＲＳ−ＣｏＶ（例えば、ＭＥＲＳ−ＣｏＶのスパイクタンパク質（Ｓ）、例えば、ＭＥＲＳ−ＣｏＶのスパイクタンパク質の受容体結合ドメイン）に特異的な中和抗体のインビボ治療有効性の試験に有用である。いくつかの実施形態では、ヒトＤＰＰ４対立遺伝子についてヘテロ接合性であるげっ歯類を使用して、ＭＥＲＳ−ＣｏＶ感染の治療又は予防（若しくは予防法）における１つ以上の拮抗薬のインビボ治療有効性を試験する。他の実施形態では、ヒトＤＰＰ４対立遺伝子についてホモ接合性であるＤＰＰ４げっ歯類を使用して、ＭＥＲＳ−ＣｏＶ感染の治療又は予防（若しくは予防法）における１つ以上の拮抗薬のインビボ治療有効性を試験する。
【０１３７】
例示のＭＥＲＳ−ＣｏＶ株としては、ＭＥＲＳ−ＣｏＶ  Ｊｏｒｄａｎ株（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＫＣ７７６１７４．１、ＭＥＲＳ−ＣｏＶ−  Ｈｕ／Ｊｏｒｄａｎ−Ｎ３／２０１２）及びＭＥＲＳ−ＣｏＶ  ＥＭＣ／２０１２株（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＪＸ８６９０５９．２）が挙げられる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＭＥＲＳ−ＣｏＶウイルスは、ＭＥＲＳ−ＣｏＶ臨床単離体を含む。他の実施形態では、本明細書に記載のＭＥＲＳ−ＣｏＶウイルスは、本明細書に記載の臨床単離体と同じスパイクタンパク質受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）配列を含む株を含む。例示の臨床単離体が以下の表に示される。この表は、いくつかのＭＥＲＳ−ＣｏＶ臨床単離体のスパイクタンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）内のアミノ酸配列変異を示す。ＭＥＲＳ−ＣｏＶ臨床単離体の国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）寄託配列をアミノ酸３６７〜６０６で整列させ、ＥＭＣ／２０１２株の配列と比較した。Ａ４３１Ｐ、Ｓ４５７Ｇ、Ｓ４６０Ｆ、Ａ４８２Ｖ、Ｌ５０６Ｆ、Ｄ５０９Ｇ、及びＶ５３４Ａ置換を持つ臨床単離体（番号より前のアミノ酸（一文字表記）がＥＭＣ／２０１２株のアミノ酸であり、番号より後のアミノ酸（一文字表記）が臨床単離体のアミノ酸である）が表に示される。
【０１３８】
【表１】
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【０１３９】
いくつかの実施形態では、この拮抗薬は、げっ歯類のＭＥＲＳ−ＣｏＶ感染前（例えば、少なくとも１、２、４、６、１２、２４、４８時間前、２、３、４、５、６、若しくは７日前、又はそれよりも前）に投与される。他の実施形態では、この拮抗薬は、げっ歯類のＭＥＲＳ−ＣｏＶ感染後（例えば、少なくとも１、２、４、６、１２、２４、４８時間後、２、３、４、５、６、若しくは７日後、又はそれよりも後）に投与される。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、拮抗薬がＭＥＲＳ−ＣｏＶ感染後にげっ歯類に投与される場合、この拮抗薬の投与後のげっ歯類のより低い、例えば、対照レベルと比較して少なくとも５倍（例えば、少なくとも５、１０、５０、１００、５００、１０００、１０４、１０５、１０６、１０７倍、又はそれ以上）低いウイルス力価又はＲＮＡレベル（例えば、ウイルスＵｐＥ又はリーダー配列のＲＮＡレベル）は、この拮抗薬がＭＥＲＳ−ＣｏＶ感染の治療に有効であることを示す。例えば、対照レベルは、この拮抗薬の投与前のげっ歯類のウイルス力価又はＲＮＡレベルである。他の例では、対照レベルは、この拮抗薬で処理されていないウイルス感染げっ歯類のウイルス力価又はＲＮＡレベルである。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、拮抗薬がＭＥＲＳ−ＣｏＶ感染前にげっ歯類に投与される場合、この拮抗薬の投与後のげっ歯類のより低い、例えば、対照レベルと比較して少なくとも５倍（例えば、少なくとも５、１０、５０、１００、５００、１０００、１０４、１０５、１０６、１０７倍、又はそれ以上）低いウイルス力価又はＲＮＡレベル（例えば、ウイルスＵｐＥ又はリーダー配列ＲＮＡレベル）は、この拮抗薬がＭＥＲＳ−ＣｏＶ感染の予防に有効であることを示す。例えば、対照レベルは、この拮抗薬で処理されていないＭＥＲＳ−ＣｏＶに感染したげっ歯類のウイルス力価又はＲＮＡレベルである。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、げっ歯類肺のウイルスＲＮＡレベルは、フェノールを含有する溶液、例えば、フェノール及びグアニジンイソチオシアネートを含有する溶液（例えば、Ｔｒｉｚｏｌ（登録商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ））中での均質化によってげっ歯類肺からＲＮＡを抽出することにより決定することができる。例えば、肺は、製造業者の指示に従ってＭａｇｎａｌｙｚｅｒ（Ｒｏｃｈｅ）を使用して均質化することができる。いくつかの実施形態では、ＭＥＲＳ−ＣｏＶ  ＲＮＡのレベルは、ＭＥＲＳ−ＣｏＶゲノムを標的とするプライマー及び／又はＭＥＲＳ−ＣｏＶ  ｍＲＮＡ転写物を標的とするプライマーを使用する定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を使用して査定することができる。例えば、Ｔａｑｍａｎ（登録商標）Ｆａｓｔ  Ｖｉｒｕｓ  Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）は、製造業者の指示に従ってエンベロープ遺伝子（ＵｐＥ）上流のゲノム領域又はヌクレオカプシドメッセンジャーＲＮＡ（リーダープライマー）のリーダー配列を標的とするＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから得られた二本鎖プライマーを使用してｑＰＣＲにおいて使用することができ、げっ歯類（例えば、マウス）１８Ｓ  ｒＲＮＡ等の内因性対照と比較することができる。例えば、Ｍｉｃｒｏａｍｐ（登録商標）Ｆａｓｔ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｐｌａｔｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）におけるｑＰＣＲ反応は、７５００  Ｆａｓｔ  ＤＸリアルタイムＰＣＲ機器（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上で読み取ることができる。いくつかの例では、ｑＰＣＲデータは、感染していない対照を１に設定してデルタＣｔ法を使用して分析することができる。例えば、検出されたパーセントＭＥＲＳ−ＣｏＶ  ＲＮＡは、拮抗薬がＭＥＲＳ−ＣｏＶに対する抗体である場合に、この対照拮抗薬、例えば、アイソタイプ一致対照抗体で処理された感染マウスにおいて検出されたＲＮＡのレベルに対して表すことができる。
【０１４３】
いくつかの実施形態では、げっ歯類肺のウイルス力価は、遠心分離（例えば、１０，０００ｒｐｍで）された緩衝液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ））中でげっ歯類肺を均質化することによって決定することができる。上清は、Ｖｅｒｏ細胞（例えば、Ｖｅｒｏ  Ｅ６細胞）等の哺乳類細胞上でプラークアッセイにより分析されて、拮抗薬で処理した後に残ったウイルスレベルを定量することができる。標準のプラークアッセイ、例えば、Ｐａｇｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｌｙ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｓｅｖｅｒｅ  ａｃｕｔｅ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８６：１３３３４〜１３３４９に記載のプラークアッセイを使用することができる。いくつかの例では、Ｐａｇｅ  ｅｔ  ａｌ．のプラークアッセイは、プラークを出現させるためにプレートを３日間放置することによって修正されてもよい。
【０１４４】
いくつかの実施形態では、例えば組織学的分析によって決定される、対照肺試料と比較した、ＭＥＲＳ−ＣｏＶ感染前又は後に拮抗薬で処理されたげっ歯類の肺試料のより低い炎症（例えば、間質性又は血管周囲炎症）、より少ない炎症性細胞、及び／又はより低い細気管支細胞浸潤は、この拮抗薬がＭＥＲＳ−ＣｏＶ感染の治療又は予防に有効であることを示すことができる。例えば、対照肺試料は、拮抗薬で処理されていない、例えば、感染前及び／又は後に処理されていないＭＥＲＳ−ＣｏＶに感染したげっ歯類由来であり得る。
【０１４５】
本明細書に記載のげっ歯類は、例えばヒト臨床試験前に安全性及び有効性を実証するための、ＭＥＲＳ−ＣｏＶ用の薬物及びワクチンの効率的な試験に有用である。それらは、治療薬／予防薬の迅速な、例えば、試験後数週間以内の特定及び／又は検証を可能にする。
【０１４６】
定義
相同アミノ酸残基は、同様の特徴又は特性を共有する残基である。アミノ酸残基の特徴又は特性は、例えば、ポリペプチド主鎖の構造、例えば、シート若しくはらせん状立体構造、残基の電荷若しくは疎水性、及び／又は側鎖（複数可）のバルクに基づく。例えば、相同残基は、側鎖特性、例えば、極性、電荷、サイズ、芳香性、及び／又は疎水性が類似している。
【０１４７】
「約」という用語は、規定値±別の量を指し、それにより値域を確立する。ある特定の実施形態では、「約」は、ベース（又はコア若しくは基準）値又は量に対する範囲±最大１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．７５％、０．５％、０．２５％、又は０．１％を示す。例えば、「約」とは、列挙される数、例えば、ヌクレオチド塩基の数の＋／−５％未満の範囲及び＋／−５％を超える範囲を指す。
【０１４８】
本明細書で使用される場合、「作動可能に連結されている」という用語は、そのように記載される成分、例えば、ヌクレオチド配列が意図される様式で機能することを可能にする関係にある位置を指す。
【０１４９】
本明細書で使用される場合、「タンパク質」という用語は、ポリペプチド、ペプチド、ポリペプチド断片、及び融合ポリペプチドを包含する。
【０１５０】
本明細書で使用される場合、「核酸」とは、一本鎖形態又は二本鎖形態のいずれかで一緒に共有結合している２つ以上のデオキシリボヌクレオチド及び／又はリボヌクレオチドを指す。
【０１５１】
遺伝子置換に関して「置換」という用語は、外因性遺伝物質を内因性遺伝子座に置き、それにより内因性遺伝子の全て又は一部をオルソロガス又は相同核酸配列で置換することを指す。一例では、内因性非ヒト遺伝子又はその断片は、対応するヒト遺伝子又はその断片で置換されている。対応するヒト遺伝子又はその断片は、置換される内因性非ヒト遺伝子又はその断片のオルソログ、そのホモログ、又はそれと構造及び／又は機能が実質的に同一又は同じであるヒト遺伝子又は断片である。
【０１５２】
本明細書で使用される場合、「げっ歯類」という用語は、げっ歯目の任意のメンバーを指す。げっ歯類の例としては、マウス、ラット、リス、プレーリードッグ、ヤマアラシ、ビーバー、テンジクネズミ、及びハムスターが挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、げっ歯類は、ラットである。別の実施形態では、げっ歯類は、マウスである。
【０１５３】
本明細書において別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。
【０１５４】
本明細書で使用される場合、単数形用語「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が別途明確に示さない限り、複数指示物を包含する。
【０１５５】
本明細書全体を通して提示されるあらゆる最大数値限界は、より低い数値限界が本明細書に明確に書かれているかのように、あらゆるかかるより低い数値限界を包含することが意図される。本明細書全体を通して提示されるあらゆる最小数値限界は、より高い数値限界が本明細書に明確に書かれているかのように、あらゆるかかるより高い数値限界を包含する。本明細書全体を通して提示されるあらゆる数値域は、より狭い数値域が全て本明細書に明確に書かれているかのように、かかるより広い数値域に入るあらゆるかかるより狭い数値域を包含する。
【０１５６】
以下の実施例は、例証目的のためのみに提供されており、決して本発明を限定するようには意図されていない。
【実施例】
【０１５７】
（実施例１）
内因性マウスＤｐｐ４遺伝子のヒトＤＰＰ４遺伝子での置換
ヒトＤＰＰ４遺伝子のエクソン２からエクソン２６及び３’非翻訳領域の一部を含有する８１．８ｋｂのヒトＤＰＰ４遺伝子を、エクソン２からエクソン２６の終止コドンまでの７８．８ｋｂのマウスＤｐｐ４遺伝子座で置換した。図１Ａ及び１Ｂを参照されたい。
【０１５８】
単一の標的工程でマウスＤＰＰ４遺伝子をヒトＤＰＰ４遺伝子で置換するための標的構築物を、ＶｅｌｏｃｉＧｅｎｅ（登録商標）遺伝子工学技術（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，２１（６）：６５２〜６５９を参照のこと）を使用して構築した。マウス及びヒトＤＰＰ４  ＤＮＡを、それぞれ、細菌人工染色体（ＢＡＣ）クローンＲＰ２３−３６２Ｎ１５及びＲＰ１１−６８Ｌ２２から得た。簡潔に、エクソン２上流のイントロン１から終止コドンを含むエクソン２６及び３’非翻訳領域の一部まで延びる８２ｋｂのヒトＤＰＰ４配列（全ヒトＤＰＰ４遺伝子のゲノム座標：ＧＲＣｈ３８：ｃｈｒ２：１６２，８４８，７５５−１６２，９３１，０５２（マイナス鎖））に隣接する相同アーム上流及び下流のマウスＤｐｐ４、及びｌｏｘＰに隣接しているネオ選択カセットを含有するギャップ修復クローニングによって生成されたＳｇｒＤＩ線形化標的構築物を、ＶＧＢ６マウス胚幹（ＥＳ）細胞（Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウス由来）に電気穿孔した。正しく標的されたＥＳ細胞（ＭＡＩＤ７３２６）を一過性Ｃｒｅ発現ベクターで更に電気穿孔して、薬物選択カセットを除去した。薬物カセットを有しない標的されたＥＳ細胞クローン（ＭＡＩＤ  ７３２７）を、ＶｅｌｏｃｉＭｏｕｓｅ（登録商標）法で８細胞段階ＳＷマウス胚に導入した（米国特許第７，２９４，７５４号、同第７，５７６，２５９号、同第７，６５９，４４２号、及びＰｏｕｅｙｍｉｒｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｆ０  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｍｉｃｅ  ｔｈａｔ  ａｒｅ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｆｕｌｌｙ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｄｏｎｏｒ  ｇｅｎｅ−ｔａｒｇｅｔｅｄ  ＥＳ  ｃｅｌｌｓ  ａｌｌｏｗｉｎｇ  ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ａｎａｌｙｓｅｓ  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２５（１）：９１〜９９を参照のこと）。ヒト化ＤＰＰ４遺伝子を有するＶｅｌｏｃｉＭｉｃｅ（登録商標）（ドナーＥＳ細胞に完全に由来するＦ０マウス）を、対立遺伝子改変アッセイ（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）を参照のこと）を使用して遺伝子型決定によってマウス対立遺伝子の損失及びヒト対立遺伝子の獲得について特定した。
【０１５９】
正しく標的されたＥＳ細胞クローンを、天然対立遺伝子損失（ＬＯＮＡ）アッセイ（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ  ｅｔ  ａｌ．２００３）によって特定し、ここで、天然の改変されていないＤｐｐ４遺伝子のコピー数を、欠失を標的としたマウスＤｐｐ４遺伝子の配列に特異的な２つのＴａｑＭａｎ（商標）定量ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）によって決定した。ｑＰＣＲアッセイは、以下のプライマー・プローブセット（５’から３’に書かれたもの）：上流順方向プライマー、ＴＣＧＣＣＡＣＴＧＴ  ＧＣＣＴＡＡＣＡＴＡ  Ｇ（配列番号１）；上流逆方向プライマー、ＣＣＧＧＧＡＣＴＡＡ  ＡＣＴＧＧＡＡＣＡＴ  ＴＣ（配列番号２）；上流プローブ、ＦＡＭ−ＴＣＡＧＴＣＡＡＣＴ  ＴＣＴＴＣＴＧＧＧＴ  ＴＧＴＴＴＣＣ−ＢＨＱ（配列番号３）；下流順方向プライマー、ＣＡＧＣＴＣＴＧＧＴ  ＧＧＡＧＡＡＣＴＡＧ  ＡＣ（配列番号４）；下流逆方向プライマー、ＧＧＡＧＧＴＣＣＴＣ  ＧＧＴＣＴＴＴＡＧＡ  ＡＧ（配列番号５）；下流プローブ、ＦＡＭ−ＴＣＡＣＡＣＴＴＡＧ  ＧＣＴＴＡＴＡＡＡＣ  ＣＡＴＴＣＣＣＧＴ−ＢＨＱ（配列番号６）を含み、ここで、ＦＡＭとは、５−カルボキシフルオレセイン蛍光プローブを指し、ＢＨＱとは、ブラックホールクエンチャー型の蛍光クエンチャー（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を指す。標的ベクターに取り込まれ、それらのゲノムに組み込まれたＥＳ細胞クローンから精製されたＤＮＡを、３８４ウェルＰＣＲプレート（ＭｉｃｒｏＡｍｐ（商標）Ｏｐｔｉｃａｌ  ３８４−Ｗｅｌｌ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｐｌａｔｅ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で製造業者の提案に従ってＴａｑＭａｎ（商標）Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と組み合わせ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｐｒｉｓｍ  ７９００ＨＴでサイクルし、ＰＣＲ過程中に蛍光データを収集して、蓄積した蛍光が事前に設定された閾値に達する閾値サイクル（Ｃｔ）、すなわち、分画ＰＣＲサイクルを決定した。上流及び下流ＤＰＰ４特異的ｑＰＣＲ及び２つの非標的基準遺伝子ｑＰＣＲをＤＮＡ試料毎に実行した。各ＤＰＰ４特異的ｑＰＣＲと各基準遺伝子ｑＰＣＲとの間のＣｔ値（ΔＣｔ）の差を計算し、その後、アッセイした全ての試料の各ΔＣｔと中央ΔＣｔとの間の差を計算して、各試料のΔΔＣｔ値を得た。各試料中のＤＰＰ４遺伝子のコピー数を以下の式：コピー数＝２×２−ΔΔＣｔから計算した。天然コピーのうちの１つを欠失した正しく標的されたクローンは、１に等しいＤｐｐ４遺伝子コピー数を有することになる。ヒトＤＰＰ４遺伝子配列がヒト化対立遺伝子において欠失したマウスＤｐｐ４遺伝子配列を置換したという確証を、以下のプライマー・プローブセット（５’から３’に書かれたもの）：ヒト上流順方向プライマー、ＧＣＧＧＴＣＴＣＣＣ  ＴＣＴＴＣＴＡＡＣＧ（配列番号７）；ヒト上流逆方向プライマー、ＧＣＡＡＧＣＣＧＡＧ  ＣＡＧＡＴＣＡＡＧ（配列番号８）；ヒト上流プローブ、ＦＡＭ−ＡＣＴＣＣＣＡＣＣＴ  ＧＣＡＡＡＴＣＣＴＧ  ＣＴＧＣ−ＢＨＱ（配列番号９）；ヒト下流順方向プライマー、ＡＡＣＣＧＣＡＣＴＧ  ＧＣＡＴＡＴＧＧＡ（配列番号１０）；ヒト下流逆方向プライマー、ＴＡＣＡＡＧＧＴＡＧ  ＴＣＴＧＧＧＡＴＴＡ  ＣＴＡＡＣＡＡＡＡ（配列番号１１）；ヒト下流プローブ、ＦＡＭ−ＡＣＡＴＴＴＡＴＣＴ  ＡＧＡＡＡＧＧＣＴＣ−ＢＨＱ（配列番号１２）を含むＴａｑＭａｎ（商標）ｑＰＣＲアッセイによって確認した。
【０１６０】
同じＬＯＮＡアッセイを使用して標的ＥＳ細胞由来のマウスの尾生検から精製されたＤＮＡをアッセイして、それらのＤＰＰ４遺伝子型を決定し、ヒト化ＤＰＰ４対立遺伝子が生殖系列を通って伝達されることを確認する。この置換についてヘテロ接合性の２匹の子マウスを繁殖させて、ヒトＤＰＰ４遺伝子による内因性マウスＤｐｐ４遺伝子の置換についてホモ接合性のマウスを生成する。この置換についてホモ接合性の子マウスを表現型決定に使用する。
【０１６１】
マウスＤｐｐ４遺伝子座とヒトＤＰＰ４遺伝子を含有する配列との上流接合点を、
【化１】
0006636486.tif 000003
内に入るように設計し、ここで、ヒトＤＰＰ４配列がイタリック体で書かれており、ＳｇｒＤＩ制限部位が括弧内に示されている。ヒトＤＰＰ４遺伝子を含有する配列とｌｏｘＰに隣接しているネオ選択カセットを含有する配列との下流接合点を、
【化２】
0006636486.tif 000004
内に入るように設計し、ここで、ヒトＤＰＰ４配列がイタリック体で書かれており、ネオカセット配列が小文字で書かれており、ｌｏｘＰ部位が括弧内に示されている。ｌｏｘＰに隣接しているネオ選択カセットの配列とマウスＤｐｐ４遺伝子座との下流接合点を、５’−ａｔｇｔｃｔｇｇａ（ａ  ｔａａｃｔｔｃｇｔａ  ｔａａｔｇｔａｔｇｃ  ｔａｔａｃｇａａｇｔ  ｔａｔ）ｇｃｔａｇｔａ  ａｃｔａｔａａｃｇｇ  ｔｃｃｔａａｇｇｔａ  ｇｃｇａｇｃｔａｇｃ  ＣＡＧＣＡＴＡＧＣＴ  ＣＴＣＣＡＴＡＧＣＴ  ＴＡＴＴＴＡＡＧＡＣ  ＣＡＣＡＴＴＴＧＴＴ  ＣＴＣＡＴＴＡＴＣＴ  ＣＡＡＡＡＧＴＧＣＡ  ＣＴＧＴＴＡＡＧＡＴ  ＧＡＡＧＡＴＣＴＴＡ（配列番号１５）内に入るように設計し、ここで、ネオカセット配列が小文字で書かれており、ｌｏｘＰ部位が括弧内に示されている。ネオ選択カセットを除去した後、ヒトＤＰＰ４遺伝子を含有する配列と、ネオ選択カセットを除去した後に残ったｌｏｘＰ部位と、マウスＤｐｐ４遺伝子座との接合点を、
【化３】
0006636486.tif 000005
内に入るように設計し、ここで、ヒトＤＰＰ４配列がイタリック体で書かれており、ネオカセット配列が小文字で書かれており、ｌｏｘＰ部位が括弧内に示されている。
【０１６２】
図２は、マウスＤｐｐ４コドン１がヒトＤＰＰ４コドン１によってコードされたものと同じＤＰＰ４の最初の２つのアミノ酸であるＭｅｔ及びＬｙｓのみをコードするため、ＭＡＩＤ７３２６／７３２７（配列番号１７）におけるヒト化ＤＰＰ４核酸配列によってコードされたＤＰＰ４のアミノ酸配列がヒトＤＰＰ４と同じであることを示す。
【０１６３】
（実施例２）
ＭＥＲＳ−ＣｏＶによるヒト化ＤＰＰ４マウスの感染
中東呼吸器症候群−コロナウイルス（ＭＥＲＳ−ＣｏＶ）は、重症急性呼吸器疾患を引き起こす新たに出現したウイルスである。ＭＥＲＳ−ＣｏＶの受容体は、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ４）である（Ｒａｊ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ  Ｐｅｐｔｉｄａｓｅ  ４  ｉｓ  ａ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ−ＥＭＣ，Ｎａｔｕｅｒｅ  ４９５（７４４０）：２５１〜２５４を参照のこと）。抗ウイルス分子のインビボ試験は、ＭＥＲＳ−ＣｏＶ感染にかかりやすい動物モデル、例えば、げっ歯類（例えば、マウス又はラット）等の小動物モデルを必要とする。しかしながら、最近の研究では、マウスＤｐｐ４がＭＥＲＳ−ＣｏＶ感染を支持することができないことが示されているが（例えば、Ｃｏｃｋｒｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｍｏｕｓｅ  Ｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ  Ｐｅｐｔｉｄａｓｅ  ｉｓ  Ｎｏｔ  ａ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  Ｍｉｄｄｌｅ  Ｅａｓｔ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ  Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ（ＭＥＲＳ−ＣｏＶ）Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８８（９）：５１９５〜５１９９、及びＣｏｌｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｗｉｌｄ−Ｔｙｐｅ  ａｎｄ  Ｉｎｎａｔｅ  Ｉｍｍｕｎｅ−Ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  Ｍｉｃｅ  ａｒｅ  Ｎｏｔ  Ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｍｉｄｄｌｅ  Ｅａｓｔ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ  Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．９５（２）：４０８〜４１２を参照のこと）、これは、少なくとも一部には、ＭＥＲＳ−ＣｏＶスパイクタンパク質がマウスＤＰＰ４ではなくヒトＤＰＰ４と相互作用するためである（例えば、Ｃｏｌｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）、及びＲａｊ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）を参照のこと）。マウスＤＰＰ４配列とヒトＤＰＰ４配列との配列比較により、以前はＭＥＲＳ−ＣｏＶスパイク（Ｓ）タンパク質とその受容体との間の接触部位と特定されていたアミノ酸がこれらの２つの種間で異なることが明らかになった。加えて、マウス細胞におけるヒトＤＰＰ４の発現により、ＭＥＲＳ−ＣｏＶウイルスの侵入及び増殖が可能になり、ウイルスの侵入がマウス細胞感染の限定的段階であり、マウスＤＰＰ４とＭＥＲＳ−ＣｏＶ糖タンパク質との間の相互作用の欠如がインビトロでの種指向性を定義することを示す。例えば、Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂａｓｉｓ  ｏｆ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｎｏｖｅｌ  ｈｕｍａｎ  ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ  ＭＥＲＳ−ＣｏＶ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＣＤ２６，Ｎａｔｕｒｅ．５００（７４６１）：２２７〜３１、及びＣｏｃｋｒｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｍｏｕｓｅ  Ｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ  Ｐｅｐｔｉｄａｓｅ  ｉｓ  Ｎｏｔ  ａ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  Ｍｉｄｄｌｅ  Ｅａｓｔ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ  Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ（ＭＥＲＳ−ＣｏＶ）Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８８（９）：５１９５〜５１９９を参照されたい。
【０１６４】
結果として、正常なマウス株を使用してＭＥＲＳ−ＣｏＶを標的とする治療薬の有効性を測定することができない。Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｒａｐｉｄ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｍｏｕｓｅ  Ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  Ｍｉｄｄｌｅ  Ｅａｓｔ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１１１（１３）：４９７０〜４９７５は、アデノウイルス形質導入によってマウスにおいてヒトＤＰＰ４を発現させており、それによりＭＥＲＳ−ＣｏＶ感染を可能にした。しかしながら、このアデノウイルスモデルは、（ａ）ウイルスが感染マウスから急速に除去されること、（ｂ）経時的にヒトＤＰＰ４発現の損失があること、（ｃ）ウイルスで形質導入されたＤＰＰ４の組織分布がマウス又はヒトにおいて見られる発現を反映しないこと、及び（ｄ）アデノウイルス感染がインターフェロン応答を誘導することを含む、いくつかの制限を有する。
【０１６５】
ＭＥＲＳ−ＣｏＶ感染のためのマウスモデルを生成するために、ヒト化ＤＰＰ４マウスを上の実施例１に記載されるように生成した。図１Ｂに示されるように、マウスＤｐｐ４のエクソン２から２６を、対応するヒトＤＰＰ４配列で置換した。エクソン１をコードする残りのマウスＤｐｐ４が、対応するヒトＤＰＰ４エクソン１におけるものと同じＤｐｐ４の最初の２つのアミノ酸Ｍｅｔ及びＬｙｓのみをコードするため、ヒト化ＤＰＰ４マウスにおいて発現されるＤＰＰ４タンパク質は、完全にヒトである（図２、配列番号１７を参照のこと）。したがって、ヒト化ＤＰＰ４マウスは、内因性マウス調節配列、すなわち、５’隣接領域配列（プロモーター及びエンハンサー（複数可））、並びに３’非翻訳領域配列の制御下で完全ヒトＤＰＰ４を発現する。ヒト化ＤＰＰ４が、ヒトＤＰＰ４核酸配列を欠く野生型マウスにおいて発現されたマウスＤｐｐ４と同じ細胞及び組織において、同じ又は同様のレベルで発現されることが予想される。
【０１６６】
２匹のＦ０ヒト化ＤＰＰ４マウスにＭＥＲＳ−ＣｏＶ（Ｊｏｒｄａｎ株）を鼻腔内感染させるか、又はＰＢＳで偽処理した。感染から４日後に、ＭＥＲＳ−ＣｏＶゲノムの複製型に特異的なプライマーを使用して、リアルタイムＰＣＲによって肺中のＭＥＲＳ−ＣｏＶ  ＲＮＡを定量した。データを、偽感染マウスの肺から得られたＰＣＲ生成物の量に正規化した（任意に１で設定した）。図３は、ＭＥＲＳ−ＣｏＶ  ＲＮＡをＭＥＲＳ−ＣｏＶ感染ヒト化ＤＰＰ４マウスの肺から増幅することができたことを示す。偽感染マウス及びＭＥＲＳ−ＣｏＶ感染マウス由来の肺組織を使用してＨ＆Ｅ染色も行った。図４は、ヒト化ＤＰＰ４マウスのＭＥＲＳ−ＣｏＶ感染が気道に影響を及ぼさなかったが、結果的に肺胞壁の肥厚及び肺胞細胞間の空間の減少をもたらし、ＭＥＲＳ−ＣｏＶ感染に関連する肺炎症を示したことを示す。
【０１６７】
加えて、６〜８週齢のマウスに、ＭＥＲＳ−ＣｏＶ、例えば、２×１０５ｐｆｕのＭＥＲＳ−ＣｏＶ（Ｊｏｒｄａｎ）を鼻腔内接種した。接種後４日目に疾患による死亡も臨床的兆候も観察されなかった。接種後２日目及び４日目にマウスを安楽死させ、それらの肺を解剖した。ウイルスのＲＮＡレベルを得るために、肺をＴｒｉｚｏｌ（登録商標）中で均質化し、ＲＮＡ抽出し、ＭＥＲＳ−ＣｏＶに特異的なプライマーを使用してリアルタイムＰＣＲで分析した（図１０Ａ及び１０Ｂ）。ある組のプライマーは、エンベロープ遺伝子（ＵｐＥ）上流のウイルスゲノム領域に特異的であり、別の組のプライマーは、ヌクレオカプシドｍＲＮＡのリーダー配列（リーダープライマー）に特異的であった。マウス１８Ｓ  ｒＲＮＡを内因性対照として使用した。
【０１６８】
ウイルス力価を得るために、肺をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で均質化し、遠心分離により精製し、Ｖｅｒｏ  Ｅ６細胞上で滴定した（図１０Ｃ）。例えば、上清をＶｅｒｏＥ６細胞上でプラークアッセイにより分析して、肺に存在するウイルスのレベルを定量した。例えば、プラークアッセイを、Ｐａｇｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｌｙ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｓｅｖｅｒｅ  ａｃｕｔｅ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８６：１３３３４〜１３３４９に記載されるように行い、プラークを出現させるためにプレートを３日間放置した。
【０１６９】
肺におけるロバストＭＥＲＳ−ＣｏＶ複製が、感染後２日目及び４日目に明らかであった。複製ＭＥＲＳ−ＣｏＶのみを増幅するように設計されたＭＥＲＳ−ＣｏＶリーダーに特異的なプライマーセットを使用したＲＮＡ定量により、２日目に収集された肺におけるＲＮＡを複製する高レベルのＭＥＲＳ−ＣｏＶが実証され、これらのレベルは感染後４日目まで維持された（図１０Ａ〜Ｂ）。Ｖｅｒｏ  Ｅ６細胞上での肺ホモジネートのプラークアッセイにより、感染後２日目に約７．２７×１０４ｐｆｕ／ｍＬ肺及び４日目に約３．７５×１０５ｐｆｕ／ｍＬ肺のＭＥＲＳ−ＣｏＶ（Ｊｏｒｄａｎ）レベルが定量され（図１０Ｃ）、感染ヒト化ＤＰＰ４マウスの肺におけるＭＥＲＳ−ＣｏＶの活性複製を実証した。
【０１７０】
また、ＭＥＲＳ−ＣｏＶ（Ｊｏｒｄａｎ株）又はＰＢＳ（偽感染）のいずれかを鼻腔内接種したヒト化ＤＰＰ４マウス由来の肺を、病理学的変化について分析した（図１０Ｄ）。感染後２日目に、細気管支周囲炎症が、肺全体にわたって見られる細気管支細胞構造の変化により明らかであった。肺胞構造への最小限の血管周囲炎症又は効果しかこの時点では観察されなかった。感染後４日目に、間質の浸潤が、血管周囲細胞浸潤及び広範囲に及ぶ肺胞の肥厚とともに観察された。細気管支の変化も同様に存在した。図１０Ｄを参照されたい。この病変は、ＭＥＲＳ−ＣｏＶを有するヒトに見られる間質性肺炎及び重大な肺疾患を発症したＸ線写真所見と一致する。
【０１７１】
上述のデータは、本明細書に記載のもの等のヒト化ＤＰＰ４マウスがＭＥＲＳ−ＣｏＶ感染にかかりやすいことを示す。このデータは、本明細書に記載のヒト化ＤＰＰ４マウスが、ＭＥＲＳ−ＣｏＶヒト感染に見られる病変、例えば、病理学的続発症を繰り返すＭＥＲＳ−ＣｏＶ感染のインビボモデルであることも実証する。
【０１７２】
したがって、ヒト化ＤＰＰ４マウスは、インビボでのＭＥＲＳ−ＣｏＶ治療の査定に有用なＭＥＲＳ−ＣｏＶのロバストモデルである。例えば、ヒト化ＤＰＰ４マウスは、ＭＥＲＳ−ＣｏＶを標的とする治療分子の薬物動態、薬力動態、及び治療有効性を測定するのに適切な宿主動物である。
【０１７３】
図５は、マウスＤｐｐ４（配列番号２５）及びヒトＤＰＰ４（７３２６／７３２７トランスジェニックマウスによってコードされたもの）（配列番号２６）のタンパク質配列アラインメントを示す。
【０１７４】
次に、ＭＥＲＳ−ＣｏＶ感染後の時間の関数としての体重に対する用量反応研究をヒト化ＤＰＰ４マウスで行った。マウスに上述のようにＭＥＲＳ−ＣｏＶ（Ｊｏｒｄａｎ株）又はＰＢＳ（偽感染）のいずれかに感染させ、７日間にわたって増殖感染の兆候である体重減少について分析した。図１４に示されるように、ヒト化ＤＰＰ４マウスは、増殖感染を呈し（すなわち、疾患病変が現れ）、感染から４日後に体重が減少し始めた。１群当たり４〜５匹のマウスを使用した。図１５は、ヒト化ＤＰＰ４対立遺伝子についてヘテロ接合性のマウスがホモ接合体と比較して同様の程度の体重減少を示したため、それらが同等にＭＥＲＳ−ＣｏＶ感染にかかりやすいことを示す。これによりヘテロ接合体マウスを使用して研究を行うことができることが示されるため、この所見は有意である。更に、ヘテロ接合体マウスの使用は、ホモ接合体ヒト化ＤＰＰ４マウス中に潜在的に存在し得る機能的マウスＤｐｐ４ノックアウトに関するいかなる潜在的な問題も避ける。
【０１７５】
これらのマウスの肺を上述の方法に従って炎症について組織学的に試験した。図１６に示されるように、高用量のウイルス（１×１０ｅｘｐ６ｐｆｕ／マウス）に曝露されたｈＤＰＰ４マウスは、ＰＢＳ対照と比較して病変の増加を呈した。
【０１７６】
（実施例３）
ＢＡＣのランダム挿入を使用したヒトＤＰＰ４遺伝子を含有するトランスジェニックマウスの生成
ヒトＤＰＰ４遺伝子を含有するトランスジェニックマウスを生成し、その配列及びゲノム情報を図６に示す。ヒトＤＰＰ４遺伝子を含有する２つの異なる重複ＢＡＣ：ＢＡＣ  ＲＰ１１−６８Ｌ２２及びＢＡＣ  ＲＰ１１−３４５Ｊ９（図７）を使用した。両ＢＡＣは、ヒトＤＰＰ４遺伝子のコード領域、並びにＤＰＰ４遺伝子のＡＴＧ開始コドン上流の４０ｋｂを超えるプロモーター領域及びＤＰＰ４遺伝子の終止コドンの数キロベース下流の領域を含有した（図７）。
【０１７７】
ＢＡＣトランスジェニックマウスを生成するために、各ＢＡＣ  ＤＮＡをＶＧＢ６マウス胚幹（ＥＳ）細胞（Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウス由来のもの）に電気穿孔した。ヒトＤＰＰ４遺伝子のコード領域、並びにその遺伝子のプロモーター領域を含有するＥＳ細胞を、ＶｅｌｏｃｉＭｏｕｓｅ（登録商標）法により８細胞段階ＳＷマウス胚に導入した（例えば、米国特許第７，２９４，７５４号、同第７，５７６，２５９号、同第７，６５９，４４２号、及びＰｏｕｅｙｍｉｒｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｆ０  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｍｉｃｅ  ｔｈａｔ  ａｒｅ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｆｕｌｌｙ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｄｏｎｏｒ  ｇｅｎｅ−ｔａｒｇｅｔｅｄ  ＥＳ  ｃｅｌｌｓ  ａｌｌｏｗｉｎｇ  ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ａｎａｌｙｓｅｓ  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２５（１）：９１〜９９を参照のこと）。
【０１７８】
ヒト対立遺伝子獲得アッセイを使用して、ヒトＤＰＰ４遺伝子のコピーに加えてその遺伝子のプロモーター領域を含有したものについてＥＳ細胞クローンをスクリーニングした。ヒト対立遺伝子獲得アッセイを使用して、ヒト化ＤＰＰ４遺伝子に加えてその遺伝子のプロモーター領域を持つＶｅｌｏｃｉＭｉｃｅ（登録商標）（ドナーＥＳ細胞に完全に由来するＦ０マウス）も特定した。
【０１７９】
簡潔に、標準の方法を使用してゲノムＤＮＡをＥＳ細胞クローンから抽出し、２つのプライマー・プローブセットを使用してＴａｑＭａｎ（商標）定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）アッセイにより試験して、ヒトＤＰＰ４コード配列上流（７３３３ｈＴＵ）及び下流（７３３３ｈＴＤ）のヒトＤＮＡ配列を検出した（図８）。ヒトＤＰＰ４遺伝子の位置及び各プライマー・プローブセットがアニールした隣接領域（例えば、プロモーター領域）を図７に示す。ＴａｑＭａｎ（商標）ｑＰＣＲアッセイにおけるバックグラウンドを超える蛍光読み出しは、トランスジェニックマウスゲノムに組み込まれたヒトＤＰＰ４遺伝子及びヒトＤＰＰ４遺伝子の少なくとも４０ｋｂの５’隣接領域の存在を示した。
【０１８０】
７３３３ｈＴＵプライマー・プローブセット（５’から３’に書かれたもの）は、ヒト上流順方向プライマー、ＴＧＧＣＴＴＡＴＴＣＴＣＴＡＴＴＣＣＴＣＡＣＣＴＡ（配列番号１８）；ヒト上流プローブ、ＦＡＭ−ＴＧＣＴＴＴＣＣＣＴＣＣＴＣＣＣＴＴＣＴＧＡ−ＢＨＱ（配列番号１９）；ヒト上流逆方向プライマー、ＧＧＣＣＴＴＡＧＣＣＣＡＧＡＡＡＣＴＧ（配列番号２０）であった。７３３３ｈＴＤプライマー・プローブセット（５’から３’に書かれたもの）は、ヒト下流順方向プライマー、ＴＧＣＡＧＡＣＴＴＧＴＣＴＴＧＡＣＡＴＴＣＡＴＡ（配列番号２１）；ヒト下流プローブ、ＣＡＬ−ＡＧＣＣＴＣＴＧＣＡＧＡＣＡＣＡＧＧＡＡＴＧＧＣ−ＢＨＱ（配列番号２２）；及びヒト下流逆方向プライマー、ＴＣＴＧＧＧＣＡＣＴＧＧＴＧＴＡＣＴＣ（配列番号２３）であり、ここで、ＦＡＭ及びＣＡＬは、それぞれ、５−カルボキシフルオレセイン及びＣＡＬ橙色蛍光プローブを指し、ＢＨＱは、ブラックホールクエンチャー型の蛍光クエンチャーを指す（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。
【０１８１】
例えば、ＥＳ細胞クローン由来のゲノムＤＮＡを、３８４ウェルＰＣＲプレート（ＭｉｃｒｏＡｍｐ（商標）Ｏｐｔｉｃａｌ  ３８４−Ｗｅｌｌ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｐｌａｔｅ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で製造業者の提案に従ってＴａｑＭａｎ（商標）Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と組み合わせ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｐｒｉｓｍ  ７９００ＨＴでサイクルし、ＰＣＲ過程中に蛍光データを収集して、蓄積した蛍光が事前に設定された閾値に達する閾値サイクル（Ｃｔ）、すなわち、分画ＰＣＲサイクルを決定した。上流及び下流ＤＰＰ４特異的ｑＰＣＲ及び２つのｑＰＣＲ  ｆｏｒ  非ＤＰＰ４基準遺伝子をＤＮＡ試料毎に実行した。各ＤＰＰ４特異的ｑＰＣＲと各基準遺伝子ｑＰＣＲとの間のＣｔ値（ΔＣｔ）の差を計算し、その後、アッセイした全ての試料の各ΔＣｔと中央ΔＣｔとの間の差を計算して、各試料のΔΔＣｔ値を得た。各試料中のＤＰＰ４遺伝子のコピー数を以下の式：コピー数＝２×２−ΔΔＣｔから計算した。少なくとも１つのヒトＤＰＰ４コピー及びその染色体に組み込まれたプロモーター領域を含有するクローンは、１以上のＤＰＰ４遺伝子コピー数を有した。
【０１８２】
同じヒト対立遺伝子獲得アッセイを使用して、ＥＳ細胞由来のマウスの尾生検から精製されたＤＮＡをアッセイして、ヒト化ＤＰＰ４対立遺伝子に加えてヒト５’隣接領域が生殖系列を通って伝達されたことを確認した。
【０１８３】
本明細書に記載のＢＡＣ挿入及びスクリーニング法を使用して、ヒトＤＰＰ４をコードするＤＮＡを有するトランスジェニックマウスを２匹確認した。ＢＡＣ  ＲＰ１１−６８Ｌ２２を使用して、ＥＳ細胞クローン及びＭＡＩＤ７３３３と称されるトランスジェニックマウスを生成し、ＢＡＣ  ＲＰ１１−３４５Ｊ９を使用して、ＥＳ細胞クローン及びＭＡＩＤ７３３４と称されるトランスジェニックマウスを生成した。
【０１８４】
ＭＡＩＤ７３３３及び７３３４マウスにおけるヒト化ＤＰＰ４核酸配列によってコードされたタンパク質は、図９に示されるアミノ酸配列（配列番号２４）を有し、これは、ヒトＤＰＰ４（転写物ＮＭ＿００１９３５．３によってコードされたもの）と同じであった。
【０１８５】
（実施例４）
ＭＥＲＳ−ＣｏＶウイルスに感染したヒト化ＤＰＰ４マウスの処理
ヒト化ＤＰＰ４遺伝子及び隣接プロモーター領域を有するトランスジェニックマウスを、ＭＥＲＳ−ＣｏＶに感染する能力及びＭＥＲＳ−ＣｏＶを治療又は予防するための治療分子の査定用のモデルとしての役割を果たす能力について試験した。
【０１８６】
トランスジェニックＭＡＩＤ７３３３マウス（例えば、実施例３に記載の方法により生成されたもの）を、腹腔内注入（ｉｐ）により２００μｇのＭＥＲＳ−ＣｏＶスパイクタンパク質に向けられた抗体又はアイソタイプ対照で処理した。抗体注入から１日後に、マウスにＭＥＲＳ−ＣｏＶを鼻腔内感染させた。感染から４日後に、マウスの肺を採取し、リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を使用してウイルスＲＮＡレベルを測定した。具体的には、ＭＥＲＳ−ＣｏＶのゲノムＲＮＡ（ＵｐＥ）又は複製ＲＮＡ（リーダー）（ＭＥＲＳ−ＣｏＶゲノムの複製型に特異的なもの）のレベルを測定した。
【０１８７】
ＲＴ−ＰＣＲデータを以下の表に示す。
【０１８８】
【表２】
0006636486.tif 000006
１平均値（％アイソタイプ対照）
【０１８９】
この抗体でのトランスジェニックマウスの処理が、ウイルスＲＮＡレベル（ＵｐＥ及びリーダーの両方）を約５０倍〜約５００倍低下させた。
【０１９０】
本明細書に記載のデータは、標的組み込み法（実施例１）及びランダムＢＡＣ挿入法（実施例３）により生成されたヒトＤＰＰ４を有するトランスジェニックマウスがＭＥＲＳ−ＣｏＶ感染にかかりやすいことを示す。加えて、抗ＭＥＲＳ−ＣｏＶ抗体は、トランスジェニックマウスにおけるインビボでの感染を阻止した。したがって、ヒトＤＰＰ４を有するトランスジェニックマウス（例えば、本明細書に記載の方法により生成されたもの）は、ＭＥＲＳ−ＣｏＶウイルスを標的とする治療薬（例えば、抗体）の有効性の評価に有用である。
【０１９１】
（実施例５）
ヒト化ＤＰＰ４マウスにおけるＭＥＲＳ−ＣｏＶ感染への抗ＭＥＲＳ−ＣｏＶ抗体の予防効果
本明細書に記載のヒト化ＤＰＰ４マウスを使用して、これらの２つのモノクローナル抗体のインビボでの予防能力を評価した。マウスに、１×１０５ｐｆｕのＭＥＲＳ−ＣｏＶ（Ｊｏｒｄａｎ株）への鼻腔内感染前の２４時間時点で、以下の抗ＭＥＲＳ−ＣｏＶ抗体用量範囲：２００μｇ、２０μｇ、又は２μｇの抗ＭＥＲＳ−ＣｏＶスパイクタンパク質抗体２（Ａｂ２）、抗ＭＥＲＳ−ＣｏＶスパイクタンパク質抗体４（Ａｂ４）、又は２００μｇのヒトＩｇＧ１（ｈＩｇＧ１）アイソタイプ対照抗体をｉｐ注入した。Ａｂ２及びＡｂ４は、完全ヒト抗ＭＥＲＳ−ＣｏＶスパイクタンパク質抗体であった。ＲＮＡをマウス肺から抽出し、上述の定量ＰＣＲにより分析した。例えば、感染していない対照を１に設定してデルタＣｔ法を使用してｑＰＣＲデータを分析した。検出されたパーセントＭＥＲＳ−ＣｏＶ  ＲＮＡを、アイソタイプ一致対照抗体で処理された感染マウスにおいて検出されたＲＮＡのレベルに対して表した（図１１Ａ〜Ｂ）。また、マウス肺のウイルス力価を上述のように決定した。
【０１９２】
両抗体は、アイソタイプ一致対照抗体と比較して、２００μｇ／マウス用量で肺におけるＭＥＲＳ−ＣｏＶ特異的ＲＮＡレベルを、２ｌｏｇを超えて著しく低下させた（図１１Ａ〜Ｂ）。Ａｂ２は、２０μｇ用量でのＡｂ４と比較して、同じ用量でのＭＥＲＳ−ＣｏＶ  ＲＮＡレベルの低下により有効であった。２μｇ用量でのいずれかの抗体は、アイソタイプ対照処理マウスと比較して、ウイルスＲＮＡレベルの低下に無効であった。肺におけるＭＥＲＳ−ＣｏＶ力価を分析したときに（図１１Ｃ）、Ａｂ２の２００μｇ用量及び２０μｇ用量の両方が、このアッセイにおける検出レベル近くまでウイルスレベルまで低下させた（２×１０３ｐｆｕ／ｍＬ）。Ａｂ４は、２００μｇ用量でＡｂ２と同等に効率的であったが、２０μｇ用量及び２μｇ用量では、ウイルスの用量依存的阻害を呈した。これらのデータは、抗ＭＥＲＳ−ＣｏＶ抗体、例えば、Ａｂ２及びＡｂ４が、ＭＥＲＳ−ＣｏＶ感染をインビボで有効に阻止したことを示す。
【０１９３】
感染の２４時間前にＡｂ２、Ａｂ４、又はｈＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体で処理されたマウス由来の肺の組織学的分析も感染後４日目に行った（図１２Ａ）。例えば、間質炎症、細気管支周囲、及び血管周囲炎症の程度を０〜５でスコアリングする。他の組織学的特徴、例えば、細気管支上皮及び肺胞損傷の存在、胸膜変化、並びに気管支肺胞周囲炎症の程度も分析した。各マウスの総炎症スコアを実験群毎に平均化し、それらのスコアを各群及び時点における全てのマウスの平均スコアとして提示した（図１２Ｂ）。
【０１９４】
ｈＩｇＧ１アイソタイプ対照マウスで前処理されたマウス由来の肺は、間質炎症の増加、血管周囲細胞浸潤、及び肺胞中隔の肥厚といった著しい肺病変を呈した。２００μｇのＡｂ２又はＡｂ４のいずれかで処理されたマウスは、炎症の軽減（間質において炎症性細胞の最小限局化）、軽度の細気管支細胞浸潤、及び肺胞壁のわずかな肥厚を有した。２０μｇのＡｂ２及びＡｂ４で前処理されたマウスにおいて、より高用量の抗体群と比較して、中程度のレベルの血管周囲細胞浸潤及び間質炎症が存在した。２μｇの抗体で前処理された群は、ｈＩｇＧ１アイソタイプ対照と同様の症状を有し、著しい間質炎症及び優勢な血管周囲炎症を呈した。盲検組織学的スコアリングは、処理されたマウスの炎症スコアの低下を実証した（図１２Ｂ）。これらの所見は、Ａｂ２及びＡｂ４等の抗ＭＥＲＳ−ＣｏＶ抗体が、ＭＥＲＳ−ＣｏＶ感染後に肺病変に用量依存的軽減を与えることを実証し、これらのマウスにおけるウイルスＲＮＡレベル及びウイルス力価を確証した。
【０１９５】
したがって、Ａｂ２及びＡｂ４等の抗ＭＥＲＳ−ＣｏＶ抗体は、ＭＥＲＳ−ＣｏＶ感染のインビボモデルに有効であり、これらの抗体は、感染前、例えば、感染の１日前に注入した場合、ＭＥＲＳ−ＣｏＶ感染及び疾患をインビボで阻止した。
【０１９６】
（実施例６）
ＭＥＲＳ−ＣｏＶに感染したヒト化ＤＰＰ４マウスの抗体処理
抗ＭＥＲＳ−ＣｏＶ抗体（例えば、Ａｂ２又はＡｂ４）の治療効果（例えば、感染後のＭＥＲＳ−ＣｏＶ複製及び肺病変を阻害する能力）を決定するために、ヒト化ＤＰＰ４マウスをＭＥＲＳ−ＣｏＶに感染させた。感染後２４時間時点で、マウスに５００μｇのｈＩｇＧ１アイソタイプ対照又は５００μｇ若しくは２００μｇのＡｂ２のいずれかをｉｐ注入した。感染後４日目に、マウスを安楽死させ、マウス肺をウイルスＲＮＡ、ウイルス力価、及び肺病変について分析した。Ａｂ２の５００μｇ用量及び２００μｇ用量の両方が、対照抗体で処理されたマウスと比較して、マウス肺におけるウイルスＲＮＡレベルを約１０倍低下させた（図１３Ａ〜Ｂ）。同じマウスの肺力価は、肺におけるウイルスレベルの著しい低下を実証し、感染後４日目に２ｌｏｇを超えて低下した（図１３Ｃ）。これらのデータは、感染後、例えば、感染から２４時間後に、抗ＭＥＲＳ−ＣｏＶ抗体（例えば、Ａｂ２）がウイルス複製を著しく阻害したことを実証する。
【０１９７】
感染から２４時間後にｈＩｇＧ１対照抗体、５００μｇのＡｂ２、又は２００μｇのＡｂ２で処理されたマウスの組織学的分析も行った（図１４Ａ〜Ｂ）。対照抗体で処理されたマウスは、著しい間質炎症、血管周囲細胞浸潤、及び肺胞中隔の肥厚といった実施例２及び５における対照と同様の病変を呈した。２００μｇのＡｂ２又は５００μｇのＡｂ２のいずれかで処理されたマウスは、最小限の間質炎症（肺全体にわたる血管周囲炎症の軽減及び限局化のみ）しか有さなかった。盲検組織学的スコアリングは、処理されたマウスの炎症スコアの低下を実証した（図１４Ｂ）。このデータは、治療用量の抗ＭＥＲＳ−ＣｏＶ抗体（例えば、Ａｂ２）が、感染後、例えば、感染から２４時間後に与えられた場合でも、ＭＥＲＳ−ＣｏＶ誘導肺病変を軽減したことを実証する。
【図１Ａ】
0006636486.tif 000007
【図１Ｂ】
0006636486.tif 000008
【図２】
0006636486.tif 000009
【図３】
0006636486.tif 000010
【図４】
0006636486.tif 000011
【図５】
0006636486.tif 000012
【図６】
0006636486.tif 000013
【図７】
0006636486.tif 000014
【図８】
0006636486.tif 000015
【図９】
0006636486.tif 000016
【図１０Ａ】
0006636486.tif 000017
【図１０Ｂ】
0006636486.tif 000018
【図１０Ｃ】
0006636486.tif 000019
【図１０Ｄ】
0006636486.tif 000020
【図１１Ａ】
0006636486.tif 000021
【図１１Ｂ】
0006636486.tif 000022
【図１１Ｃ】
0006636486.tif 000023
【図１２Ａ】
0006636486.tif 000024
【図１２Ｂ】
0006636486.tif 000025
【図１３Ａ】
0006636486.tif 000026
【図１３Ｂ】
0006636486.tif 000027
【図１３Ｃ】
0006636486.tif 000028
【図１４Ａ】
0006636486.tif 000029
【図１４Ｂ】
0006636486.tif 000030
【図１５】
0006636486.tif 000031
【図１６】
0006636486.tif 000032
【図１７】
0006636486.tif 000033
【配列表】
0006636486000001.app