(57)【要約】      （修正有）【課題】常在分解細菌群集を馴養することにより農地土壌中のＵＳＥＰＡ  ＰＡＨｓを効果的に除去する方法、および装置を提供する。【解決手段】１）常在分解細菌を集積培養すること、２）常在分解細菌を馴養すること、３）常在分解細菌を分離および純化すること、４）優勢な常在分解細菌を選択すること、５）常在分解細菌を接種すること、を含む方法による。【選択図】図１
2022001364.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１）ＰＡＨｓで汚染されていない土壌サンプルを土壌希釈液に調製し、土壌希釈液をそれ
ぞれ採取して好気集積培養と嫌気集積培養を行い、好気培地液と嫌気培地液を取得するス
テップと、
２）ＰＡＨｓで汚染された土壌サンプルを土壌懸濁液に調製し、土壌懸濁液を２つの部分
に分け、勾配濃度に従い好気培地液と嫌気培地液にそれぞれ接種して培養および増殖し、
ＰＡＨｓを唯一の炭素源として常在分解細菌を馴養し、馴養された好気常在分解細菌液と
嫌気常在分解細菌液を取得するステップと、
３）馴養された好気常在分解細菌液と嫌気常在分解細菌液を分離および純化し、複数の常
在分解細菌を取得するステップと、
４）分離および純化されて得られた複数の常在分解細菌を使用して、それぞれＰＡＨｓを
含む土壌抽出液を処理し、ＨＰＬＣを用いて処理された土壌のＰＡＨｓ含有量を測定し、
分解率が最も高い土壌分解細菌を優勢な菌として選択して増殖させ、優勢な常在分解細菌
液を取得するステップと、
５）優勢な常在分解細菌液をＰＡＨｓで汚染された農地土壌に接種し、常在分解細菌を使
用して農地土壌中のＰＡＨｓ含有量を低減するステップと、
を含む常在分解細菌群集を馴養することにより農地土壌中のＵＳＥＰＡ  ＰＡＨｓを効果
的に除去する方法。
【請求項２】
ステップ１）において、
土壌希釈液の調製：ＰＡＨｓで汚染されていない土壌サンプルを炎の隣で減菌水に加え、
ＰＡＨｓで汚染されていない土壌サンプルと減菌水の体積比が１：９であり、振動装置を
使用して１０〜２０ｍｉｎ均一に振動させ、土壌中の常在分解細菌を減菌水に均一に分散
させ、５〜８ｈ放置して上澄み液を取り、遠心分離機で０．４〜０．５ｈ遠心分離し、遠
心回転数を４０００〜５０００ｒｐｍとし、遠心上澄み液を取り土壌希釈液を取得し、土
壌希釈液の濃度が１０％である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップ１）において、
好気集積培養：オープンフラスコに好気培地を設置し、減菌ピペットを使用して土壌希釈
液を吸い上げて好気培地に接種し、オープンフラスコを培養箱（１）に入れ、培養箱（１
）の温度を３３〜３５℃範囲に制御し、１８〜２０ｈ振動培養して、好気培地液を取得し
、
嫌気集積培養：三角フラスコに嫌気培地を設置し、減菌ピペットを使用して土壌希釈液を
吸い上げて嫌気培地に接種し、ボルトプラグで三角フラスコを密閉して培養箱（１）に入
れ、培養箱（１）の温度を３３〜３５℃範囲に制御し、１８〜２０ｈ放置培養して、嫌気
培地液を取得する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ステップ２）において、
土壌懸濁液の調製：ＰＡＨｓで汚染された土壌サンプルを炎の隣で減菌水に加え、ＰＡＨ
ｓで汚染された土壌サンプルと減菌水の体積比が１：４であり、振動装置で１０〜２０ｍ
ｉｎ均一振動して土壌懸濁液を取得し、土壌懸濁液の濃度が２０％であり、
好気培地液の接種および馴養：濃度が２０％の土壌懸濁液を３つの部分に分け、その内の
２つの土壌懸濁液に減菌水を加え、それらの濃度を１０％と１５％にそれぞれ調整し、ま
ず減菌ピペットを使用して１０％濃度の土壌懸濁液を好気培地液に接種し、３３〜３５℃
の培養箱（１）で２０〜２４ｈ振動培養し、１級好気馴養液を取得し、次に減菌ピペット
を使用して１級好気馴養液を１５％濃度の土壌懸濁液に接種し、３３〜３５℃の培養箱（
１）で２０〜２４ｈ振動培養し、２級好気馴養液を取得し、最後に減菌ピペットを使用し
て２級好気馴養液を２０％濃度の土壌懸濁液に接種し、３３〜３５℃の培養箱（１）で２
０〜２４ｈ振動培養し、最終的に馴養された好気常在分解細菌液を取得し、
嫌気培地液の接種および馴養：濃度が２０％の土壌懸濁液を３つの部分に分け、その内の
２つの土壌懸濁液に減菌水を加え、それらの濃度を１０％と１５％に調整し、まず減菌ピ
ペットを使用して１０％濃度の土壌懸濁液を嫌気培地液に接種し、３３〜３５℃の培養箱
（１）で密閉して２０〜２４ｈ放置培養し、１級嫌気馴養液を取得し、次に減菌ピペット
を使用して１級嫌気馴養液を１５％濃度の土壌懸濁液に接種し、３３〜３５℃の培養箱（
１）で密閉して２０〜２４ｈ放置培養し、２級嫌気馴養液を取得し、最後に減菌ピペット
を使用して２級嫌気馴養液を２０％濃度の土壌懸濁液に接種し、３３〜３５℃の培養箱（
１）で密閉して２０〜２４ｈ放置培養し、最終的に馴養された嫌気常在分解細菌液を取得
する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ステップ３）において、
分離および純化の具体的なステップ：複数の減菌培養プレートを用意し、接種ループを使
用してそれぞれ馴養された好気常在分解細菌液と嫌気常在分解細菌液を粘着取り、減菌培
養プレート上に塗布し、塗布された減菌培養プレートを２０〜２４ｈ放置培養し、上記操
作を繰り返して複数回の希釈・塗布・分離を行い、常在分解細菌の数が希釈回数の増加に
従い減少し、徐々に純化され、分離されて得られた純化常在分解細菌をそれぞれ傾斜面に
保管する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ステップ４）において、
常在分解細菌を利用してＰＡＨｓを含む土壌抽出液を処理する具体的なステップ：ステッ
プ３）で分離および純化されて得られた複数の常在分解細菌をそれぞれ増殖させ、ＰＡＨ
ｓを含む土壌サンプルを土壌懸濁液に調製し、ＨＰＬＣを使用して土壌懸濁液中のＰＡＨ
ｓ含有量を検出し、それぞれ増殖した複数の常在分解細菌を土壌懸濁液に接種して処理し
、常在分解細菌培養液と土壌懸濁液の体積比が１：１０〜８０であり、３ｄ処理した後Ｈ
ＰＬＣを使用して土壌懸濁液中のＰＡＨｓ含有量を検出する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
土壌中のＰＡＨｓ含有量を検出するためのＨＰＬＣと、土壌希釈液と土壌懸濁液の振動処
理のための振動装置と、土壌希釈液を遠心分離し上澄み液を得るための遠心分離機と、土
壌中の菌液を好気集積培養するためのオープンフラスコと、接種および液取りのための減
菌ピペットと、常在分解細菌の培養のための培養箱（１）と、土壌中の菌液を嫌気集積培
養ための三角フラスコと、馴養された好気常在分解細菌液と嫌気常在分解細菌液を分離お
よび純化するための減菌培養プレートと、前記減菌培養プレートへの接種のための接種ル
ープと、を含む、請求項１〜５に記載の方法で使用される装置。
【請求項８】
前記培養箱（１）は、
好気常在分解菌を培養するための好気培養箱体（１１）と、
前記好気培養箱体（１１）の上方に配置されて嫌気常在分解細菌を培養するための嫌気培
養箱体（１２）と、
前記好気培養箱体（１１）と嫌気培養箱体（１２）の側部に配置された制御ボックス（１
３）と、
それぞれ好気培養箱体（１１）と嫌気培養箱体（１２）の内部に配置されて微生物容器を
固定するための固定装置（１４）と、固定装置（１４）は２つの半環状の固定アーム（１
４１）と前記固定アーム（１４１）の内外回転を制御するためのステッピングモーター（
１４２）を含み、固定アーム（１４１）とステッピングモーター（１４２）の接続箇所に
圧力センサ（１４３）がさらに設けられ、圧力センサ（１４３）は圧力に応じてステッピ
ングモーター（１４２）のオン／オフを制御し、
それぞれ前記好気培養箱体（１１）と嫌気培養箱体（１２）の内部に配置されて室内温度
を調節するための調温装置（１５）と、調温装置（１５）は好気培養箱体（１１）と嫌気
培養箱体（１２）の内壁に設けられた加熱コイル（１５１）と室内温度を監視するための
温度センサ（１５２）を含み、
培養箱（１）の通気および換気のための通気装置（１６）と、通気装置（１６）は嫌気培
養箱体（１２）の頂部に設けられた送気装置（１６１）と好気培養箱体（１１）の後壁の
下部に設けられた排気穴（１６２）を含み、前記送気装置（１６１）は外部空気を培養箱
（１）に吸い込む空気ポンプ（１６１１）と、空気ポンプ（１６１１）の送気口に設けら
れ空気中のほこりや微生物を濾過するための濾過溝（１６１２）を含み、前記排気穴（１
６２）の外側に排出空気中の常在菌を濾過するための濾過膜（１６２１）が設けられ、
制御ボックス（１３）内部に配置されたコントローラーと、制御ボックス（１３）の前側
面に配置された温度制御ノブ（１３１）と、を含む、請求項７に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、常在分解細菌群集を馴養することにより農地土壌中のＵＳＥＰＡ  ＰＡＨｓを
効果のに除去する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＰＡＨｓは天然資源と人工資源に分けられる。天然資源は主に土地、水生植物および微生
物の生物合成過程に由来し、さらに、森林、草地の自然火災、火山噴火や化石燃料、リグ
ニン、堆積物にも多環芳香族炭化水素が存在し、人工資源は主に様々な化石燃料、木材、
紙、その他の炭化水素の不完全な燃焼、または還元条件下での熱分解によって形成される
。
【０００３】
ＰＡＨｓは、催奇形性、発がん性、変異原性の影響があるため、呼吸器系、循環器系、神
経系の損傷、肝臓や腎臓の損傷など、人体に多くの害を及ぼす可能性がある。現在、微生
物による修復は、多環芳香族炭化水素を含む多くの汚染物質を除去するための重要な技術
になっている。
【０００４】
常在菌は私たちの周りの自然環境に生息しており、さまざまな有益な微生物の混合グルー
プであり、常在微生物は好気性細菌と好気性細菌に分類され、菌種によって酵母菌、アス
ペルギルスおよび放線菌。細菌、乳酸菌、胞子菌などに分かれる。３０億年の進化の後、
細菌はほとんどすべての化合物をエネルギーとして代謝することができ、自然の究極のス
カベンジャーと見なされる。その強力な適応性のために、細菌は環境を汚染する危険を減
らしたり修復したりするために広く使われる。
【０００５】
しかし、常在菌は様々な種類があり、農地の土壌を除去するために使用できる常在菌は入
手する前に分離して馴養する必要がある。
【発明の概要】
【０００６】
上記の問題を考慮して、本発明は、常在分解細菌群集を馴養することにより農地土壌中の
ＵＳＥＰＡ  ＰＡＨｓを効果のに除去する方法を提供する。
【０００７】
本発明の技術的解決策は、
常在分解細菌群集を馴養することにより農地土壌中のＵＳＥＰＡ  ＰＡＨｓを効果のに除
去する方法は、
１）ＰＡＨｓで汚染されていない土壌サンプルを土壌希釈液に調製し、土壌希釈液をそれ
ぞれ採取して好気集積培養と嫌気集積培養を行い、好気培地液と嫌気培地液を取得するこ
と、
２）ＰＡＨｓで汚染された土壌サンプルを土壌懸濁液に調製し、土壌懸濁液を２つの部分
に分け、勾配濃度に従い好気培地液と嫌気培地液にそれぞれ接種して培養および増殖し、
ＰＡＨｓを唯一の炭素源として常在分解細菌を馴養し、馴養された好気常在分解細菌液と
嫌気常在分解細菌液を取得すること、
３）馴養された好気常在分解細菌液と嫌気常在分解細菌液を分離および純化し、複数の常
在分解細菌を取得すること、
４）分離および純化されて得られた複数の常在分解細菌を使用して、それぞれＰＡＨｓを
含む土壌抽出液を処理し、ＨＰＬＣを用いて処理された土壌のＰＡＨｓ含有量を測定し、
分解率が最も高い土壌分解細菌を優勢な菌として選択して増殖させ、優勢な常在分解細菌
液を取得すること、
１）優勢な常在分解細菌液をＰＡＨｓで汚染された農地土壌に接種し、常在分解細菌を使
用して農地土壌中のＰＡＨｓ含有量を低減すること、を含む。
【０００８】
本発明の一態様では、１）において、
土壌希釈液の調製：ＰＡＨｓで汚染されていない土壌サンプルを炎の隣で減菌水に加え、
ＰＡＨｓで汚染されていない土壌サンプルと減菌水の体積比が１：９であり、振動装置を
使用して１０〜２０ｍｉｎ均一に振動させ、土壌中の常在分解細菌を減菌水に均一に分散
させ、５〜８ｈ放置して上澄み液を取り、遠心分離機で０．４〜０．５ｈ遠心分離し、遠
心回転数を４０００〜５０００ｒｐｍとし、遠心上澄み液を取り土壌希釈液を取得し、土
壌希釈液の濃度が１０％であり、土壌希釈液のさらなる希釈に寄与し、炎の隣で操作すれ
ば空気中の他の細菌が土壌希釈液に混入して常在分解細菌の馴養に影響を及ぼす。
【０００９】
本発明の一態様では、１）において、
好気集積培養：オープンフラスコに好気培地を設置し、減菌ピペットを使用して土壌希釈
液を吸い上げて好気培地に接種し、オープンフラスコを培養箱に入れ、培養箱の温度を３
３〜３５℃範囲に制御し、１８〜２０ｈ振動培養して、好気培地液を取得し、好気菌の培
養は空気条件下で行われる必要があり、振動培養によりオープンフラスコの底部の好気常
在分解細菌が菌液表面に移動して酸素を取得し、優勢な土壌分解細菌が酸素不足により死
亡することを避け、
嫌気集積培養：三角フラスコに嫌気培地を設置し、減菌ピペットを使用して土壌希釈液を
吸い上げて嫌気培地に接種し、ボルトプラグで三角フラスコを密閉して培養箱に入れ、培
養箱の温度を３３〜３５℃範囲に制御し、１８〜２０ｈ放置培養して、嫌気培地液を取得
し、嫌気培養は密閉条件下で放置培養し、振動が嫌気菌の繁殖に悪影響を与える。
【００１０】
本発明の一態様では、２）において、
土壌懸濁液の調製：ＰＡＨｓで汚染された土壌サンプルを炎の隣で減菌水に加え、ＰＡＨ
ｓで汚染された土壌サンプルと減菌水の体積比が１：４であり、振動装置で１０〜２０ｍ
ｉｎ均一振動して土壌懸濁液を取得し、土壌懸濁液の濃度が２０％であり、懸濁液は土壌
中のＰＡＨｓを完全に保留でき、ＰＡＨｓを唯一の炭素源として常在分解細菌を馴養し、
高いＰＡＨｓ含有量であれば馴養効率を高めることができ、
好気培地液の接種および馴養：濃度が２０％の土壌懸濁液を３つの部分に分け、その内の
２つの土壌懸濁液に減菌水を加え、それらの濃度を１０％と１５％にそれぞれ調整し、ま
ず減菌ピペットを使用して１０％濃度の土壌懸濁液を好気培地液に接種し、３３〜３５℃
の培養箱で２０〜２４ｈ振動培養し、１級好気馴養液を取得し、次に減菌ピペットを使用
して１級好気馴養液を１５％濃度の土壌懸濁液に接種し、３３〜３５℃の培養箱で２０〜
２４ｈ振動培養し、２級好気馴養液を取得し、最後に減菌ピペットを使用して２級好気馴
養液を２０％濃度の土壌懸濁液に接種し、３３〜３５℃の培養箱で２０〜２４ｈ振動培養
し、最終的に馴養された好気常在分解細菌液を取得し、ＰＡＨｓの初期濃度が高すぎると
、好気常在分解細菌の生存に影響し、勾配濃度に従い土壌懸濁液中のＰＡＨｓの濃度を徐
々に高めることで、土壌希釈液中の常在分解細菌以外の微生物細菌の存在が益々難しくな
り、最後にすべて死亡し、好気常在分解細菌のみが残り、
嫌気培地液の接種および馴養：濃度が２０％の土壌懸濁液を３つの部分に分け、その内の
２つの土壌懸濁液に減菌水を加え、それらの濃度を１０％と１５％に調整し、まず減菌ピ
ペットを使用して１０％濃度の土壌懸濁液を嫌気培地液に接種し、３３〜３５℃の培養箱
で密閉して２０〜２４ｈ放置培養し、１級嫌気馴養液を取得し、次に減菌ピペットを使用
して１級嫌気馴養液を１５％濃度の土壌懸濁液に接種し、３３〜３５℃の培養箱で密閉し
て２０〜２４ｈ放置培養し、２級嫌気馴養液を取得し、最後に減菌ピペットを使用して２
級嫌気馴養液を２０％濃度の土壌懸濁液に接種し、３３〜３５℃の培養箱で密閉して２０
〜２４ｈ放置培養し、最終的に馴養された嫌気常在分解細菌液を取得し、ＰＡＨｓの初期
濃度が高すぎると、嫌気常在分解細菌の生存に影響し、勾配濃度に従い土壌懸濁液中のＰ
ＡＨｓの濃度を徐々に高めることで、土壌希釈液中の常在分解細菌以外の微生物細菌の存
在が益々難しくなり、最後にすべて死亡し、嫌気常在分解細菌のみが残る。
【００１１】
本発明の一態様では、３）において、
分離および純化の具体的なステップ：複数の減菌培養プレートを用意し、接種ループを使
用してそれぞれ馴養された好気常在分解細菌液と嫌気常在分解細菌液を粘着取り、減菌培
養プレート上に塗布し、塗布された減菌培養プレートを２０〜２４ｈ放置培養し、上記操
作を繰り返して複数回の希釈・塗布・分離を行い、常在分解細菌の数が希釈回数の増加に
従い減少し、徐々に純化され、分離されて得られた純化常在分解細菌をそれぞれ傾斜面に
保管し、分離および純化により馴養された常在分解細菌を個別に分離し、より高純度の常
在分解細菌を得ることができ、その後の優勢な土壌分解細菌の選択に便利である。
【００１２】
本発明の一態様では、４）において、
常在分解細菌を利用してＰＡＨｓを含む土壌抽出液を処理する具体的なステップ：３）で
分離および純化されて得られた複数の常在分解細菌をそれぞれ増殖させ、ＰＡＨｓを含む
土壌サンプルを土壌懸濁液に調製し、ＨＰＬＣを使用して土壌懸濁液中のＰＡＨｓ含有量
を検出し、それぞれ増殖した複数の常在分解細菌を土壌懸濁液に接種して処理し、常在分
解細菌培養液と土壌懸濁液の体積比が１：１０〜８０であり、３ｄ処理した後ＨＰＬＣを
使用して土壌懸濁液中のＰＡＨｓ含有量を検出し、ＰＡＨｓの除去効率が最も高い土壌分
解細菌を選択して、土壌中のＰＡＨｓの除去効率を高める。
【００１３】
本発明の一態様では、上記方法で使用される装置は、土壌中のＰＡＨｓ含有量を検出する
ためのＨＰＬＣと、土壌希釈液と土壌懸濁液の振動処理のための振動装置と、土壌希釈液
を遠心分離し上澄み液を得るための遠心分離機と、土壌中の菌液を好気集積培養するため
のオープンフラスコと、接種および液取りのための減菌ピペットと、常在分解細菌の培養
のための培養箱と、土壌中の菌液を嫌気集積培養ための三角フラスコと、馴養された好気
常在分解細菌液と嫌気常在分解細菌液を分離および純化するための減菌培養プレートと、
前記減菌培養プレートへの接種のための接種ループと、を含む。
【００１４】
本発明の一態様では、上記装置では、
前記培養箱は、好気常在分解菌を培養するための好気培養箱体と、
前記好気培養箱体の上方に配置されて嫌気常在分解細菌を培養するための嫌気培養箱体と
、
前記好気培養箱体と嫌気培養箱体の側部に配置された制御ボックスと、
それぞれ好気培養箱体と嫌気培養箱体の内部に配置されて微生物容器を固定するための固
定装置と、固定装置は２つの半環状の固定アームと前記固定アームの内外回転を制御する
ためのステッピングモーターを含み、固定アームとステッピングモーターの接続箇所に圧
力センサがさらに設けられ、圧力センサは圧力に応じてステッピングモーターのオンオフ
を制御し、
それぞれ前記好気培養箱体と嫌気培養箱体の内部に配置されて室内温度を調節するための
調温装置と、調温装置は好気培養箱体と嫌気培養箱体の内壁に設けられた加熱コイルと室
内温度を監視するための温度センサを含み、
培養箱の通気および換気のための通気装置と、通気装置は嫌気培養箱体の頂部に設けられ
た送気装置と好気培養箱体の後壁の下部に設けられた排気穴を含み、前記送気装置は外部
空気を培養箱に吸い込む空気ポンプと、空気ポンプの送気口に設けられ空気中のほこりや
微生物を濾過するための濾過溝を含み、前記排気穴の外側に排出空気中の常在菌を濾過す
るための濾過膜が設けられ、
制御ボックス内部に配置されたコントローラーと、制御ボックスの前側面に配置された２
つの温度制御ノブと、を含む。
【００１５】
本発明は有益な効果を有する。本発明は、それぞれ土壌希釈液中の常在分解細菌を好気培
養および嫌気培養し、ＰＡＨｓを含む土壌懸濁液を使用して土壌の分解細菌を勾配馴養し
、土壌中の他の他の細菌を全部除去し、そして馴養された常在分解細菌の菌種を分離およ
び純化し、ＰＡＨｓの除去効率が最も高い常在分解細菌を選択して増殖させ、汚染土壌に
接種してＰＡＨｓを分解し、分解効率が高い。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明の方法および装置のフローチャートである。
【図２】本発明の培養箱の構造の概略図である。
【００１７】
［符号の説明］
１          培養箱
１１        好気培養箱体
１２        嫌気培養箱体
１３        制御ボックス
１３１      温度制御ノブ
１４        固定装置
１４１      固定アーム
１４２      ステッピングモーター
１４３      圧力センサ
１５        調温装置
１５１      加熱コイル
１５２      温度センサ
１６        通気装置
１６１      送気装置
１６１１    空気ポンプ
１６１２    濾過溝
１６２      排気穴
１６２１    濾過膜
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明の技術的解決策の理解を容易にするために、本発明は、特定の実施例および添付の
図１〜２を参照して以下でさらに説明され、実施例は、本発明の保護範囲に対する制限を
構成しない。
【００１９】
実施例１：図１に示すように、常在分解細菌群集を馴養することにより農地土壌中のＵＳ
ＥＰＡ  ＰＡＨｓを効果のに除去する方法は、
１）ＰＡＨｓで汚染されていない土壌サンプルを土壌希釈液に調製し、土壌希釈液をそれ
ぞれ採取して好気集積培養と嫌気集積培養を行い、好気培地液と嫌気培地液を取得するこ
と、
土壌希釈液の調製：ＰＡＨｓで汚染されていない土壌サンプルを炎の隣で減菌水に加え、
ＰＡＨｓで汚染されていない土壌サンプルと減菌水の体積比が１：９であり、振動装置を
使用して２０ｍｉｎ均一に振動させ、土壌中の常在分解細菌を減菌水に均一に分散させ、
８ｈ放置して上澄み液を取り、遠心分離機で０．５ｈ遠心分離し、遠心回転数を５０００
ｒｐｍとし、遠心上澄み液を取り土壌希釈液を取得し、土壌希釈液の濃度が１０％であり
、
好気集積培養：オープンフラスコに好気培地を設置し、減菌ピペットを使用して土壌希釈
液を吸い上げて好気培地に接種し、オープンフラスコを培養箱１に入れ、培養箱１の温度
を３５℃に制御し、２０ｈ振動培養して、好気培地液を取得し、
嫌気集積培養：三角フラスコに嫌気培地を設置し、減菌ピペットを使用して土壌希釈液を
吸い上げて嫌気培地に接種し、ボルトプラグで三角フラスコを密閉して培養箱１に入れ、
培養箱１の温度を３５℃に制御し、２０ｈ放置培養して、嫌気培地液を取得し、
２）ＰＡＨｓで汚染された土壌サンプルを土壌懸濁液に調製し、土壌懸濁液を２つの部分
に分け、勾配濃度に従い好気培地液と嫌気培地液にそれぞれ接種して培養および増殖し、
ＰＡＨｓを唯一の炭素源として常在分解細菌を馴養し、馴養された好気常在分解細菌液と
嫌気常在分解細菌液を取得すること、
土壌懸濁液の調製：ＰＡＨｓで汚染された土壌サンプルを炎の隣で減菌水に加え、ＰＡＨ
ｓで汚染された土壌サンプルと減菌水の体積比が１：４であり、振動装置で２０ｍｉｎ均
一振動して土壌懸濁液を取得し、土壌懸濁液の濃度が２０％であり、
好気培地液の接種および馴養：濃度が２０％の土壌懸濁液を３つの部分に分け、その内の
２つの土壌懸濁液に減菌水を加え、それらの濃度を１０％と１５％にそれぞれ調整し、ま
ず減菌ピペットを使用して１０％濃度の土壌懸濁液を好気培地液に接種し、３５℃の培養
箱１で２４ｈ振動培養し、１級好気馴養液を取得し、次に減菌ピペットを使用して１級好
気馴養液を１５％濃度の土壌懸濁液に接種し、３５℃の培養箱１で２４ｈ振動培養し、２
級好気馴養液を取得し、最後に減菌ピペットを使用して２級好気馴養液を２０％濃度の土
壌懸濁液に接種し、３５℃の培養箱１で２４ｈ振動培養し、最終的に馴養された好気常在
分解細菌液を取得し、
嫌気培地液の接種および馴養：濃度が２０％の土壌懸濁液を３つの部分に分け、その内の
２つの土壌懸濁液に減菌水を加え、それらの濃度を１０％と１５％に調整し、まず減菌ピ
ペットを使用して１０％濃度の土壌懸濁液を嫌気培地液に接種し、３３〜３５℃の培養箱
１で密閉して２０〜２４ｈ放置培養し、１級嫌気馴養液を取得し、次に減菌ピペットを使
用して１級嫌気馴養液を１５％濃度の土壌懸濁液に接種し、３５℃の培養箱１で密閉して
２４ｈ放置培養し、２級嫌気馴養液を取得し、最後に減菌ピペットを使用して２級嫌気馴
養液を２０％濃度の土壌懸濁液に接種し、３５℃の培養箱１で密閉して２４ｈ放置培養し
、最終的に馴養された嫌気常在分解細菌液を取得し、
３）馴養された好気常在分解細菌液と嫌気常在分解細菌液を分離および純化し、複数の常
在分解細菌を取得すること、
分離および純化の具体的なステップ：複数の減菌培養プレートを用意し、接種ループを使
用してそれぞれ馴養された好気常在分解細菌液と嫌気常在分解細菌液を粘着取り、減菌培
養プレート上に塗布し、塗布された減菌培養プレートを２４ｈ放置培養し、上記操作を繰
り返して複数回の希釈・塗布・分離を行い、常在分解細菌の数が希釈回数の増加に従い減
少し、徐々に純化され、分離されて得られた純化常在分解細菌をそれぞれ傾斜面に保管し
、
４）分離および純化されて得られた複数の常在分解細菌を使用して、それぞれＰＡＨｓを
含む土壌抽出液を処理し、ＨＰＬＣを用いて処理された土壌のＰＡＨｓ含有量を測定し、
分解率が最も高い土壌分解細菌を優勢な菌として選択して増殖させ、優勢な常在分解細菌
液を取得すること、
常在分解細菌を利用してＰＡＨｓを含む土壌抽出液を処理する具体的なステップ：３）で
分離および純化されて得られた複数の常在分解細菌をそれぞれ増殖させ、ＰＡＨｓを含む
土壌サンプルを土壌懸濁液に調製し、ＨＰＬＣを使用して土壌懸濁液中のＰＡＨｓ含有量
を検出し、それぞれ増殖した複数の常在分解細菌を土壌懸濁液に接種して処理し、常在分
解細菌培養液と土壌懸濁液の体積比が１：８０であり、３ｄ処理した後ＨＰＬＣを使用し
て土壌懸濁液中のＰＡＨｓ含有量を検出し、
５）優勢な常在分解細菌液をＰＡＨｓで汚染された農地土壌に接種し、常在分解細菌を使
用して農地土壌中のＰＡＨｓ含有量を低減すること、を含む。
実施例２：実施例２は、実施例１と以下の通り異なり：
１）ＰＡＨｓで汚染されていない土壌サンプルを土壌希釈液に調製し、土壌希釈液を好気
集積培養して好気培地液を取得する、
土壌希釈液の調製：ＰＡＨｓで汚染されていない土壌サンプルを炎の隣で減菌水に加え、
ＰＡＨｓで汚染されていない土壌サンプルと減菌水の体積比が１：９であり、振動装置を
使用して１０ｍｉｎ均一に振動させ、土壌中の常在分解細菌を減菌水に均一に分散させ、
５ｈ放置して上澄み液を取り、遠心分離機で０．４ｈ遠心分離し、遠心回転数を４０００
ｒｐｍとし、遠心上澄み液を取り土壌希釈液を取得し、土壌希釈液の濃度が１０％であり
、
好気集積培養：オープンフラスコに好気培地を設置し、減菌ピペットを使用して土壌希釈
液を吸い上げて好気培地に接種し、オープンフラスコを培養箱１に入れ、培養箱１の温度
を３３℃に制御し、１８ｈ振動培養して、好気培地液を取得し、
２）ＰＡＨｓで汚染された土壌サンプルを土壌懸濁液に調製し、土壌懸濁液を勾配濃度に
従い好気培地液に接種して培養増殖し、ＰＡＨｓを唯一の炭素源として常在分解細菌を馴
養し、馴養された好気常在分解細菌液を取得する、
土壌懸濁液の調製：ＰＡＨｓで汚染された土壌サンプルを炎の隣で減菌水に加え、ＰＡＨ
ｓで汚染された土壌サンプルと減菌水の体積比が１：４であり、振動装置で１０ｍｉｎ均
一振動して土壌懸濁液を取得し、土壌懸濁液の濃度が２０％であり、
好気培地液の接種および馴養：濃度が２０％の土壌懸濁液を３つの部分に分け、その内の
２つの土壌懸濁液に減菌水を加え、それらの濃度を１０％と１５％にそれぞれ調整し、ま
ず減菌ピペットを使用して１０％濃度の土壌懸濁液を好気培地液に接種し、３３℃の培養
箱１で２０ｈ振動培養し、１級好気馴養液を取得し、次に減菌ピペットを使用して１級好
気馴養液を１５％濃度の土壌懸濁液に接種し、３３℃の培養箱１で２０ｈ振動培養し、２
級好気馴養液を取得し、最後に減菌ピペットを使用して２級好気馴養液を２０％濃度の土
壌懸濁液に接種し、３３℃の培養箱１で２０ｈ振動培養し、最終的に馴養された好気常在
分解細菌液を取得し、
３）馴養された好気常在分解細菌液を分離および純化して、複数の常在分解細菌を取得す
る、
分離および純化の具体的なステップ：複数の減菌培養プレートを用意し、接種ループ９を
使用してそれぞれ馴養された好気常在分解細菌液と嫌気常在分解細菌液を粘着取り、減菌
培養プレート上に塗布し、塗布された減菌培養プレートを２４ｈ放置培養し、上記操作を
繰り返して複数回の希釈・塗布・分離を行い、常在分解細菌の数が希釈回数の増加に従い
減少し、徐々に純化され、分離されて得られた純化常在分解細菌をそれぞれ傾斜面に保管
する。
【００２０】
実験例１：単一な好気常在分解細菌と好気・嫌気複合常在分解細菌による土壌中のＰＡＨ
ｓの除去効率に対する影響の検討
実験対象：実施例１で優勢な常在分解細菌液を調製して得られ、実施例２で優勢な常在分
解細菌液を調製して得られ、その内に、実施例１の優勢な常在分解細菌液には好気常在分
解細菌および嫌気常在分解細菌が含まれ、実施例２の優勢な常在分解細菌液には好気常在
分解細菌のみが含まれる。
実験条件：ＰＡＨｓで汚染された農地土壌からランダムに１０ｃｍ３の土壌サンプルを採
取し、土壌サンプルを平均に２つの部分に分け、それぞれ実施例１の優勢な常在分解細菌
液、実施例２の優勢な常在分解細菌液を２つの土壌サンプルに接種し、土壌サンプルを実
験室の模擬農地環境下で放置し、それぞれ１ｄ、３ｄ、５ｄおよび７ｄ経ったとき１ｃｍ
３の土壌サンプルを採取してＰＡＨｓ検出を行う。
実験結果：検出結果が表１に示される：
表１  単一な好気分解細菌と好気・嫌気複合分解細菌によるＰＡＨｓの除去効率の比較表
【００２１】
2022001364.tif 000003
【００２２】
実験結論：実施例１の好気・嫌気複合常在分解細菌を含む優勢な常在分解細菌液による土
壌中のＰＡＨｓの除去効率がより高いが、実施例２の好気常在分解細菌のみを含む優勢な
常在分解細菌液による土壌中のＰＡＨｓの除去効率は実施例１のそれと大差がなく、土壌
中のＰＡＨｓ除去には、好気常在分解細菌は主な役割を果たす。
【００２３】
実施例３：実施例３は、実施例１と以下の通り異なり：
１）ＰＡＨｓで汚染されていない土壌サンプルを土壌希釈液に調製し、土壌希釈液を嫌気
集積培養して嫌気培地液を取得する、
土壌希釈液の調製：ＰＡＨｓで汚染されていない土壌サンプルを炎の隣で減菌水に加え、
ＰＡＨｓで汚染されていない土壌サンプルと減菌水の体積比が１：９であり、振動装置を
使用して１０〜２０ｍｉｎ均一に振動させ、土壌中の常在分解細菌を減菌水に均一に分散
させ、５ｈ放置して上澄み液を取り、遠心分離機で０．４ｈ遠心分離し、遠心回転数を４
０００ｒｐｍとし、遠心上澄み液を取り土壌希釈液を取得し、土壌希釈液の濃度が１０％
であり、
嫌気集積培養：三角フラスコに嫌気培地を設置し、減菌ピペットを使用して土壌希釈液を
吸い上げて嫌気培地に接種し、ボルトプラグで三角フラスコを密閉して培養箱１に入れ、
培養箱１の温度を３３℃に制御し、１８ｈ放置培養して、嫌気培地液を取得し、
２）ＰＡＨｓで汚染された土壌サンプルを土壌懸濁液に調製し、土壌懸濁液を勾配濃度に
従い嫌気培地液に接種して培養増殖し、ＰＡＨｓを唯一の炭素源として常在分解細菌を馴
養し、馴養された嫌気常在分解細菌液を取得する、
土壌懸濁液の調製：ＰＡＨｓで汚染された土壌サンプルを炎の隣で減菌水に加え、ＰＡＨ
ｓで汚染された土壌サンプルと減菌水の体積比が１：４であり、振動装置で１０ｍｉｎ均
一振動して土壌懸濁液を取得し、土壌懸濁液の濃度が２０％であり、
嫌気培地液の接種および馴養：濃度が２０％の土壌懸濁液を３つの部分に分け、その内の
２つの土壌懸濁液に減菌水を加え、それらの濃度を１０％と１５％に調整し、まず減菌ピ
ペットを使用して１０％濃度の土壌懸濁液を嫌気培地液に接種し、３３℃の培養箱１で密
閉して２０ｈ放置培養し、１級嫌気馴養液を取得し、次に減菌ピペットを使用して１級嫌
気馴養液を１５％濃度の土壌懸濁液に接種し、３３℃の培養箱１で密閉して２０ｈ放置培
養し、２級嫌気馴養液を取得し、最後に減菌ピペットを使用して２級嫌気馴養液を２０％
濃度の土壌懸濁液に接種し、３３℃の培養箱１で密閉して２０ｈ放置培養し、最終的に馴
養された嫌気常在分解細菌液を取得し、
３）馴養された嫌気常在分解細菌液を分離および純化して複数の常在分解細菌を取得する
、
分離および純化の具体的なステップ：複数の減菌培養プレートを用意し、接種ループ９を
使用してそれぞれ馴養された好気常在分解細菌液と嫌気常在分解細菌液を粘着取り、減菌
培養プレート上に塗布し、塗布された減菌培養プレートを２０ｈ放置培養し、上記操作を
繰り返して複数回の希釈・塗布・分離を行い、常在分解細菌の数が希釈回数の増加に従い
減少し、徐々に純化され、分離されて得られた純化常在分解細菌をそれぞれ傾斜面に保管
する。
【００２４】
実験例２：単一な嫌気常在分解細菌と好気・嫌気複合常在分解細菌による土壌中のＰＡＨ
ｓの除去効率に対する影響の検討
実験対象：実施例１で優勢な常在分解細菌液を調製して得られ、実施例３で優勢な常在分
解細菌液を調製して得られ、その内に実施例１の優勢な常在分解細菌液には好気常在分解
細菌および嫌気常在分解細菌が含まれ、実施例３の優勢な常在分解細菌液には嫌気常在分
解細菌のみが含まれる。
実験条件：ＰＡＨｓで汚染された農地土壌からランダムに１０ｃｍ３の土壌サンプルを採
取し、土壌サンプルを平均に２つの部分に分け、それぞれ実施例１の優勢な常在分解細菌
液、実施例３の優勢な常在分解細菌液を２つの土壌サンプルに接種し、土壌サンプルを実
験室の模擬農地環境下で放置し、それぞれ１ｄ、３ｄ、５ｄおよび７ｄを経ったとき１ｃ
ｍ３の土壌サンプルを採取してＰＡＨｓ検出を行う。
実験結果：検出結果が表２に示される：
表２  単一な嫌気分解細菌と好気・嫌気複合分解細菌によるＰＡＨｓの除去効率の比較表
【００２５】
2022001364.tif 000004
【００２６】
実験結論：実施例１の好気・嫌気複合常在分解細菌を含む優勢な常在分解細菌液による土
壌中のＰＡＨｓの除去効率が高く、実施例３の嫌気常在分解細菌のみを含む優勢な常在分
解細菌液による土壌中のＰＡＨｓの除去効率が低く、土壌中のＰＡＨｓ除去には、嫌気常
在分解細菌の役割がそれほど大きくなく、嫌気常在分解細菌の調製には大量のコストおよ
び時間が必要することを考慮して、実際の応用には好気常在分解細菌液のみを調製して土
壌中のＰＡＨｓを除去すればよく、より高い除去効率を求めるときに、好気常在分解細菌
および嫌気常在分解細菌を含む常在分解細菌液を調製すればよい。
実施例４：実施例４は、実施例１と以下の通り異なり：
２）２）で馴養された好気常在分解細菌及び嫌気常在分解細菌を分離および純化すること
なく、２）で馴養された好気常在分解細菌液および嫌気常在分解細菌液をそのまま使用し
てそれぞれＰＡＨｓを含む土壌抽出液を処理し、処理された土壌ＰＡＨｓの分解率を検出
し、分解率が最も高い常在分解細菌液を選択して増殖させ、優勢な常在分解細菌液を得る
。
【００２７】
実験例３：馴養された常在分解細菌の分離および純化の土壌中のＰＡＨｓの除去効率に対
する影響の検討
実験対象：実施例１で優勢な常在分解細菌液を調製して得られ、実施例４で優勢な常在分
解細菌液を調製して得られ、その内に実施例１の優勢な常在分解細菌液については馴養さ
れた好気常在分解細菌液および嫌気常を分解細菌液で分離および純化した後優勢な分解細
菌を選択するし、実施例４の優勢な常在分解細菌液については馴養された好気常在分解細
菌液および嫌気常在分解細菌液を分離および純化することなくそのまま使用する。
実験条件：ＰＡＨｓで汚染された農地土壌からランダムに１０ｃｍ３の土壌サンプルを採
取し、土壌サンプルを平均に２つの部分に分け、それぞれ実施例１の優勢な常在分解細菌
液、実施例４の優勢な常在分解細菌液を２つの土壌サンプルに接種し、土壌サンプルを実
験室の模擬農地環境下で放置し、それぞれ１ｄ、３ｄ、５ｄおよび７ｄを経ったとき１ｃ
ｍ３の土壌サンプルを採取してＰＡＨｓ検出を行う。
実験結果：検出結果が表３に示される：
表３  常在分解細菌の分離および純化の土壌ＰＡＨｓの除去効率の比較表
【００２８】
2022001364.tif 000005
【００２９】
実験結論：実施例１の優勢な常在分解細菌液について、馴養された好気常在分解細菌液お
よび嫌気常在分解細菌液を分離および純化した後優勢な分解細菌を選択するため、土壌中
のＰＡＨｓの除去効率が実施例４よりも顕著に大きく、馴養された好気常在分解細菌液お
よび嫌気常を分解細菌液で分離および純化すれば、優勢な土壌分解細菌を取得でき、優勢
な土壌分解細菌を増殖させて土壌中のＰＡＨｓを除去し、効果がより良好である。
実施例５：実施例５は、実施例１と以下の通り異なり：
４）３）で分離および純化して得られた複数の常在分解細菌を直接増殖させ、常在分解細
菌液を取得し、
（５）常在分解細菌液をＰＡＨｓで汚染された農地土壌に接種し、常在分解細菌を使用し
て農地土壌中のＰＡＨｓ含有量を低減する。
実験例４：優勢な土壌分解細菌の選択の土壌中のＰＡＨｓの除去効率に対する影響の検討
実験対象：実施例１で優勢な常在分解細菌液を調製して得られ、実施例５で常在分解細菌
液を調製して得られ、その内に、実施例１で分離および純化した後分解率が最も高い土壌
分解細菌を優勢な菌増殖として選択し、優勢な常在分解細菌液を得、実施例５では分離お
よび純化して得られた複数の常在分解細菌を直接増殖させて常在分解細菌液を得る。
実験条件：ＰＡＨｓで汚染された農地土壌からランダムに１０ｃｍ３の土壌サンプルを採
取し、土壌サンプルを平均に２つの部分に分け、それぞれ実施例１の優勢な常在分解細菌
液、実施例５の優勢な常在分解細菌液を２つの土壌サンプルに接種し、土壌サンプルを実
験室の模擬農地環境下で放置し、それぞれ１ｄ、３ｄ、５ｄおよび７ｄを経ったとき１ｃ
ｍ３の土壌サンプルを採取しＰＡＨｓ検出を行う。
実験結果：検出結果が表４に示される：
表４  優勢な分解細菌の選択の土壌ＰＡＨｓの除去効率の比較表
【００３０】
2022001364.tif 000006
【００３１】
実験結論：実施例１の優勢な常在分解細菌液について、分離および純化した後分解率が最
も高い土壌分解細菌を優勢な菌として選択して増殖させ、土壌中のＰＡＨｓの除去効率が
より高く、実施例５では分離および純化して得られた複数の常在分解細菌を直接行増殖さ
せて常在分解細菌液を得、土壌中のＰＡＨｓの除去効率が比較的に低く、土壌中のＰＡＨ
ｓ除去には、優勢な常在分解細菌の除去効率がより高い。
特に明記しない限り、実施例で使用される材料および試薬はすべて、当該技術分野で従来
から使用されているかまたは市販されている。
実施例６：本実施例では、上記実施例１〜５の方法で使用される装置の構造を説明し、土
壌中のＰＡＨｓ含有量を検出するためのＨＰＬＣと、土壌希釈液と土壌懸濁液の振動処理
のための振動装置と、土壌希釈液を遠心分離し上澄み液を得るための遠心分離機と、土壌
中の菌液を好気集積培養するためのオープンフラスコと、接種および液取りのための減菌
ピペットと、常在分解細菌の培養のための培養箱１と、土壌中の菌液を嫌気集積培養ため
の三角フラスコと、馴養された好気常在分解細菌液と嫌気常在分解細菌液を分離および純
化するための減菌培養プレートと、減菌培養プレートへの接種のための接種ループと、を
含む。
【００３２】
実施例７：実施例１と以下の通り異なり、
図２に示すように、培養箱１は、好気常在分解菌を培養するための好気培養箱体１１と、
好気培養箱体１１の上方に配置されて嫌気常在分解細菌を培養するための嫌気培養箱体１
２と、
好気培養箱体１１と嫌気培養箱体１２の側部に配置された制御ボックス１３と、
それぞれ好気培養箱体１１と嫌気培養箱体１２の内部に配置されて微生物容器を固定する
ための固定装置１４と、固定装置１４は２つの半環状の固定アーム１４１と固定アーム１
４１の内外回転を制御するためのステッピングモーター１４２を含み、固定アーム１４１
とステッピングモーター１４２の接続箇所に圧力センサ１４３がさらに設けられ、圧力セ
ンサ１４３は圧力に応じてステッピングモーター１４２のオンオフを制御し、
それぞれ好気培養箱体１１と嫌気培養箱体１２の内部に配置されて室内温度を調節するた
めの調温装置１５と、調温装置１５は好気培養箱体１１と嫌気培養箱体１２の内壁に設け
られた加熱コイル１５１と室内温度を監視するための温度センサ１５２を含み、
培養箱１の通気および換気のための通気装置１６と、通気装置１６は嫌気培養箱体１２の
頂部に設けられた送気装置１６１と好気培養箱体１１の後壁の下部に設けられた排気穴１
６２を含み、送気装置１６１は外部空気を培養箱１に吸い込む空気ポンプ１６１１と、空
気ポンプ１６１１の送気口に設けられ空気中のほこりや微生物を濾過するための濾過溝１
６１２を含み、排気穴１６２の外側に排出空気中の常在菌を濾過するための濾過膜１６２
１が設けられ、
制御ボックス１３内部に配置されたコントローラーと、制御ボックス１３の前側面に配置
された２つの温度制御ノブ１３１と、を含む。
【００３３】
実験例５：実施例７によって提供される培養箱と通常培養箱の違いの検討
実験対象：実施例６中の培養箱と実施例７中の培養箱１について、発明の使用要件を満た
すことができる限り、実施例６中の培養箱は市販されている通常培養箱であり得る。
実験条件：１０人のオペレーターを自主的に募集し、各オペレーターは、実施例６および
実施例７に提供された培養箱を使用して、実施例１に提供された方法に従って優勢な常在
分解細菌液を調製し、１０人のオペレーターの使用感を調べた。
実験結果：１０人のオペレーターの応答：
実施例６中の市販の通常培養箱について、単独に好気・嫌気常在分解細菌を培養し、同時
培養を達成するために少なくとも２台の培養箱を必要とし、１台の培養箱では優勢な常在
分解細菌液の調製進行に深刻な影響を与え、そして実験室で調製するため、空気中の微生
物の含有量や種類が多く、培養過程で、培養箱内に他の細菌が増殖する状況があり、優勢
な常在分解細菌液の純度に影響を与える、
実施例７によって提供される培養箱について、同時に好気・嫌気常在分解細菌を培養でき
、培養時間を個別に記録する必要がなく、オペレーターの作業負荷を軽減でき、実施例７
によって提供される培養箱は空気中の微生物を濾過できるため、培養箱内に他の細菌の付
着や増殖がなく、調製して得られた優勢な常在分解細菌液の純度が９９％と高かった、常
在分解細菌が空気に逃げず、実験室の他のプロジェクトに影響を与えない。
実験結論：実施例７によって提供される培養箱は同時に好気・嫌気常在分解細菌を培養し
、オペレーターの作業負荷を軽減でき、外部空気中の微生物を濾過することにより、常在
分解細菌の調製純度を確保し、培養箱から排出された空気中の微生物を濾過することによ
り、常在分解細菌が外部空気に逃げて他の影響を与えるのを防ぐことができる。
【図１】
2022001364.tif 000007
【図２】
2022001364.tif 000008
【手続補正書】
【提出日】令和3年7月3日(2021.7.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１）ＰＡＨｓで汚染されていない土壌サンプルを土壌希釈液に調製し、土壌希釈液をそれ
ぞれ採取して好気集積培養と嫌気集積培養を行い、好気培地液と嫌気培地液を取得するス
テップと、
２）ＰＡＨｓで汚染された土壌サンプルを土壌懸濁液に調製し、土壌懸濁液を２つの部分
に分け、勾配濃度に従い好気培地液と嫌気培地液にそれぞれ接種して培養および増殖し、
ＰＡＨｓを唯一の炭素源として常在分解細菌を馴養し、馴養された好気常在分解細菌液と
嫌気常在分解細菌液を取得するステップと、
３）馴養された好気常在分解細菌液と嫌気常在分解細菌液を分離および純化し、複数の常
在分解細菌を取得するステップと、
４）分離および純化されて得られた複数の常在分解細菌を使用して、それぞれＰＡＨｓを
含む土壌抽出液を処理し、ＨＰＬＣを用いて処理された土壌のＰＡＨｓ含有量を測定し、
分解率が最も高い土壌分解細菌を優勢な菌として選択して増殖させ、優勢な常在分解細菌
液を取得するステップと、
５）優勢な常在分解細菌液をＰＡＨｓで汚染された農地土壌に接種し、常在分解細菌を使
用して農地土壌中のＰＡＨｓ含有量を低減するステップと、
を含み、
ステップ４）、５）において、それぞれの優勢な常在分解細菌液として好気性、嫌気性両
方のものを用い、
常在分解細菌群集を馴養することにより農地土壌中のＵＳＥＰＡ  ＰＡＨｓを効果的に除
去する方法。
【請求項２】
ステップ１）において、
土壌希釈液の調製：ＰＡＨｓで汚染されていない土壌サンプルを炎の隣で減菌水に加え、
ＰＡＨｓで汚染されていない土壌サンプルと減菌水の体積比が１：９であり、振動装置を
使用して１０〜２０ｍｉｎ均一に振動させ、土壌中の常在分解細菌を減菌水に均一に分散
させ、５〜８ｈ放置して上澄み液を取り、遠心分離機で０．４〜０．５ｈ遠心分離し、遠
心回転数を４０００〜５０００ｒｐｍとし、遠心上澄み液を取り土壌希釈液を取得し、土
壌希釈液の濃度が１０％である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップ１）において、
好気集積培養：オープンフラスコに好気培地を設置し、減菌ピペットを使用して土壌希釈
液を吸い上げて好気培地に接種し、オープンフラスコを培養箱（１）に入れ、培養箱（１
）の温度を３３〜３５℃範囲に制御し、１８〜２０ｈ振動培養して、好気培地液を取得し
、
嫌気集積培養：三角フラスコに嫌気培地を設置し、減菌ピペットを使用して土壌希釈液を
吸い上げて嫌気培地に接種し、ボルトプラグで三角フラスコを密閉して培養箱（１）に入
れ、培養箱（１）の温度を３３〜３５℃範囲に制御し、１８〜２０ｈ放置培養して、嫌気
培地液を取得する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ステップ２）において、
土壌懸濁液の調製：ＰＡＨｓで汚染された土壌サンプルを炎の隣で減菌水に加え、ＰＡＨ
ｓで汚染された土壌サンプルと減菌水の体積比が１：４であり、振動装置で１０〜２０ｍ
ｉｎ均一振動して土壌懸濁液を取得し、土壌懸濁液の濃度が２０％であり、
好気培地液の接種および馴養：濃度が２０％の土壌懸濁液を３つの部分に分け、その内の
２つの土壌懸濁液に減菌水を加え、それらの濃度を１０％と１５％にそれぞれ調整し、ま
ず減菌ピペットを使用して１０％濃度の土壌懸濁液を好気培地液に接種し、３３〜３５℃
の培養箱（１）で２０〜２４ｈ振動培養し、１級好気馴養液を取得し、次に減菌ピペット
を使用して１級好気馴養液を１５％濃度の土壌懸濁液に接種し、３３〜３５℃の培養箱（
１）で２０〜２４ｈ振動培養し、２級好気馴養液を取得し、最後に減菌ピペットを使用し
て２級好気馴養液を２０％濃度の土壌懸濁液に接種し、３３〜３５℃の培養箱（１）で２
０〜２４ｈ振動培養し、最終的に馴養された好気常在分解細菌液を取得し、
嫌気培地液の接種および馴養：濃度が２０％の土壌懸濁液を３つの部分に分け、その内の
２つの土壌懸濁液に減菌水を加え、それらの濃度を１０％と１５％に調整し、まず減菌ピ
ペットを使用して１０％濃度の土壌懸濁液を嫌気培地液に接種し、３３〜３５℃の培養箱
（１）で密閉して２０〜２４ｈ放置培養し、１級嫌気馴養液を取得し、次に減菌ピペット
を使用して１級嫌気馴養液を１５％濃度の土壌懸濁液に接種し、３３〜３５℃の培養箱（
１）で密閉して２０〜２４ｈ放置培養し、２級嫌気馴養液を取得し、最後に減菌ピペット
を使用して２級嫌気馴養液を２０％濃度の土壌懸濁液に接種し、３３〜３５℃の培養箱（
１）で密閉して２０〜２４ｈ放置培養し、最終的に馴養された嫌気常在分解細菌液を取得
する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ステップ４）において、
常在分解細菌を利用してＰＡＨｓを含む土壌抽出液を処理する具体的なステップ：ステッ
プ３）で分離および純化されて得られた複数の常在分解細菌をそれぞれ増殖させ、ＰＡＨ
ｓを含む土壌サンプルを土壌懸濁液に調製し、ＨＰＬＣを使用して土壌懸濁液中のＰＡＨ
ｓ含有量を検出し、それぞれ増殖した複数の常在分解細菌を土壌懸濁液に接種して処理し
、常在分解細菌培養液と土壌懸濁液の体積比が１：１０〜８０であり、３ｄ処理した後Ｈ
ＰＬＣを使用して土壌懸濁液中のＰＡＨｓ含有量を検出する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
土壌中のＰＡＨｓ含有量を検出するためのＨＰＬＣと、土壌希釈液と土壌懸濁液の振動処
理のための振動装置と、土壌希釈液を遠心分離し上澄み液を得るための遠心分離機と、土
壌中の菌液を好気集積培養するためのオープンフラスコと、接種および液取りのための減
菌ピペットと、常在分解細菌の培養のための培養箱（１）と、土壌中の菌液を嫌気集積培
養ための三角フラスコと、馴養された好気常在分解細菌液と嫌気常在分解細菌液を分離お
よび純化するための減菌培養プレートと、前記減菌培養プレートへの接種のための接種ル
ープと、を含む、請求項１〜４に記載の方法で使用される装置。