(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
NGN3/NKX2.2二重陽性内分泌始原細胞を得るための方法であって、膵臓内胚葉細胞を含む細胞集団が、基本培地中で、
a)TGF-βI型受容体阻害薬、
b)ノギンであるBMP拮抗薬、
c)アデニル酸シクラーゼ活性化物質、及び
d)ニコチンアミド
に同時に曝露される、方法。
【請求項２】
前記TGF-βI型受容体阻害薬が、SB431542である、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記アデニル酸シクラーゼ活性化物質が、ホルスコリンである、請求項1又は2に記載の方法。
【請求項４】
前記内分泌始原細胞が、少なくとも8%の作用率でNGN3/NKX2.2二重陽性である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記内分泌始原細胞が、少なくとも10%の作用率でNGN3/NKX2.2二重陽性である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記内分泌始原細胞が、10〜100%の作用率でNGN3/NKX2.2二重陽性である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記基本培地がRPMI1640である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
内分泌始原細胞が、DNA-PK阻害薬V、ゲフィチニブ、JNK阻害薬VIII若しくはDAPT又は前記分子の任意の組み合わせに更に曝露される、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ゲフィチニブ、JNK阻害薬VIII及びDNA-PK阻害薬Vが組み合わされる、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ゲフィチニブ、JNK阻害薬VIII及びDAPTが組み合わされる、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ゲフィチニブ、JNK阻害薬VIII、DAPT及びDNA-PK阻害薬Vが組み合わされる、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
1〜100μMのゲフィチニブ、1〜100μMのJNK阻害薬VIII、0.5〜50μMのDAPT及び1〜100μMのDNA-PK阻害薬Vが用いられる、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
1〜10μMのゲフィチニブ、5〜20μMのJNK阻害薬VIII、1〜10μMのDAPT及び1〜10μMのDNA-PK阻害薬Vが用いられる、請求項8〜12のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
TGF-βI型受容体阻害薬、アデニル酸シクラーゼ活性化物質及びニコチンアミドと組み合わせて膵臓内胚葉細胞からNGN3/NKX2.2二重陽性内分泌始原細胞を誘導するための剤であって、ノギンを含む剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト胚性幹細胞及び誘導多能性幹細胞等のヒト多能性幹細胞から内分泌始原細胞を作製する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ベータ細胞移植は、I型糖尿病に根本的な治癒をもたらす可能性がある。しかしながら、ドナーベータ細胞の限定された利用能は、この治療の臨床療法としての使用を制限する。
【０００３】
多能性幹(PS)細胞は、無限に増殖し、多くの細胞型へと分化することができるために、PS細胞はベータ細胞の有望な供給源である。しかしながら、糖尿病の治療にPS細胞を用いることができる前に、PS細胞は、効率的且つ再現性良く分化して膵臓ベータ細胞となる必要がある。脊椎動物の胚発生において、多能性細胞は、三胚葉、すなわち、外胚葉、中胚葉及び内胚葉を生じる。
【０００４】
胚体内胚葉(DE)の誘導は、膵臓組織等の内胚葉誘導組織の形成に向かう最初のステップである。DE細胞からの膵臓内胚葉(PE)の作製は、インスリン産生ベータ細胞の作製に必要である。内分泌始原細胞(EP)となる潜在性を有するPE細胞は、2つの重要な転写因子、PDX1及びNKX6.1の同時発現で特徴付けられる。
【０００５】
PS細胞から膵臓細胞を作製するために、段階的インビトロ分化プロトコルが確立された。
【０００６】
これらのプロトコルは、DE、原腸、後前腸、PE、EPの形成及び最終的には完全分化膵臓ベータ細胞の形成等の数段階を含む膵臓発生の主な事象を概ね模倣する。
【０００７】
ヒト胚性幹(hES)細胞及び誘導多能性幹(iPS)細胞から膵臓の(様の)細胞を得るためのプロトコルは、いくつかの科学論文(Aoiら、2008年;D'Amourら、2006年;Jiangら、2007年;Kroonら、2008年;Takahashiら、2007年;Takahashi及びYamanaka、2006年;並びにWerningら、2007年)に記載されるプロトコルによって例示されている。
【０００８】
現在まで、hES細胞の効率的なDE分化が、アクチビンA及びWnt治療によって達成されている。DE細胞は、レチノイン酸(RA)を用いて(Caiら、2010年;D'Amourら、2006年)及びBMP阻害を用いて(Kunisadaら、2012年;Schulzら、2012年;Zhangら、2009年)、PE細胞に更に分化され得る。
【０００９】
PE細胞の作製に次いで、膵臓ベータ細胞を作製する道筋における次のステップは、NGN3及びNKX2.2マーカーを発現するEP細胞を作製することである。
【００１０】
Nostroら(2012年)及びKunisadaら(2011年)は、PEをEPに分化させる方法を記載している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】WO 03/055992
【特許文献２】WO 2007/042225
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
しかしながら、PEをEPに分化させるより効率的な方法に対する要求が存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
従って、本発明は、既知のプロトコルからの特徴を組み合わせ、これによりNGN3/NKX2.2二重陽性細胞の割合を増加させることによって、膵臓内胚葉(PE)を内分泌始原(EP)細胞に分化させる改良された方法を提供する。前述の方法に小分子を添加することによって、該割合は更に増加させることができる。小分子の特定の組み合わせは、NGN3/NKX2.2二重陽性の割合における更なる有益な増加を可能にする。
【００１４】
本発明は、本発明の方法によって得られるEP細胞に更に関する。
【００１５】
本発明は、前記細胞の医学的利用、とりわけ、I型糖尿病の治療における利用に更に関する。
【００１６】
本発明は、内分泌細胞の運命に関与するEP細胞の証明となるものであるNGN3/NKX2.2二重陽性細胞の割合を増加させるための方法を提供することによって、ヒトPE細胞を完全分化ベータ細胞へと分化させる効率を改善するための代替アプローチを取る。
【００１７】
一実施形態では、本発明は、改善された膵臓ベータ細胞前駆細胞集団、すなわち、NGN3/NKX2.2二重陽性細胞の割合が増加したEP細胞を提供する。
【００１８】
別の実施形態では、本発明は、より均質なEP細胞集団を提供し、このことは、これらの細胞の完全分化膵臓ベータ細胞に向かう更なる発達に重要である。
【００１９】
別の実施形態では、本発明は、分化の次のステージ、すなわち、グルコース応答型完全分化ベータ細胞に進むために、より同期化されたEP細胞も提供する。
【００２０】
一態様では、本発明は、NGN3/NKX2.2二重陽性内分泌始原細胞を得るための方法であって、膵臓内胚葉細胞を含む細胞集団が、基本培地中でTGF-βI型受容体阻害薬及びBMP拮抗薬及びアデニル酸シクラーゼ活性化物質及びニコチンアミドに曝露される、方法を提供する。
【００２１】
一態様では、本発明は、NGN3/NKX2.2二重陽性内分泌始原細胞を得るための方法であって、膵臓内胚葉細胞を含む細胞集団が、ゲフィチニブ、JNK阻害薬VIII及びDAPTに曝露される、方法を提供する。
【００２２】
本発明はまた、例示の実施形態の開示から明らかになる更なる問題を解決することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】NGN3  mRNA導入における本発明の方法の有益な効果を示す図である。
【図２】NGN3/NKX2.2二重陽性内分泌始原細胞を作製する上での本発明の方法の有益な効果を示す図である。
【図３】本発明の小分子の個々の効果及び小分子を組み合わせることの有益な効果を示す図である。
【図４】本発明の数種の小分子の個々の効果及び数種の小分子を組み合わせることの有益な効果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明は、ヒト起源の胚性幹(ES)細胞及び誘導多能性幹細胞等の多能性幹細胞から内分泌始原(EP)細胞を作製する方法に関する。
【００２５】
幹細胞は、単細胞レベルにおいて自己複製し、分化して後代細胞を作製する、それら両方の能力で定義される未分化細胞であり、後代細胞には、自己複製始原細胞、非自己再生始原細胞、及び最終分化細胞が含まれる。幹細胞はまた、インビトロで複数の胚葉(内胚葉、中胚葉及び外胚葉)から様々な細胞系統の機能的細胞へ分化するための、並びに移植後に複数の胚葉の組織を生じさせるためのそれらの能力によっても特徴付けられる。
【００２６】
幹細胞は、発生上の能力によって、(1)全ての胚性及び胚体外性細胞型を生じさせることができることを意味する全能性、(2)全ての胚性細胞型を生じさせることができることを意味する多能性、(3)細胞系統のサブセットを生じさせることができるが、それらが全ての特定の組織、臓器、又は生理学的系内のものであることを意味する複能性(例えば、造血幹細胞(HSC)は、HSC(自己複製性)、血液細胞限定少能性始原細胞、及び血液の通常の成分である全ての細胞型及び要素(例えば、血小板)を含む後代を作製することができる)、(4)複能性幹細胞よりも細胞系統のより限定されたサブセットを生じさせることができることを意味する少能性、及び(5)単一の細胞系統(例えば、精子形成幹細胞)を生じさせることができることを意味する単能性に分類される。
【００２７】
成熟又は分化膵臓細胞は、増殖せず、高レベルの膵臓内分泌ホルモン又は消化酵素を分泌する。例えば、完全分化ベータ細胞は、グルコースに応答して、インスリンを高レベルで分泌する。細胞の相互作用及び成熟における変化は、未分化細胞の細胞損失マーカー又は分化細胞の増加マーカーとして現れる。単一マーカーの損失又は増加は、細胞が「成熟したか又は完全分化した」ことを示すことができる。
【００２８】
本発明は、EP細胞集団のマーカーであり、インスリン産生膵臓ベータ細胞に到達するために必要な細胞段階の1つである、NGN3/NKX2.2二重陽性細胞の割合を向上させる方法を提供することによって、ヒトPE細胞を完全分化ベータ細胞へと分化させる上での効率を改善するための代替アプローチを取る。
【００２９】
更に、本発明は、より均質且つ同期化されたEP細胞集団を提供し、このことは、これらの細胞のインスリン産生ベータ細胞へ向かう更なる発達に重要である。
【００３０】
本発明は、例示の実施形態の開示から明らかになる更なる問題も解決することができる。
【００３１】
本明細書で使用される「インスリン産生細胞」は、グルコースに応答して検出可能な量のインスリンを産生し且つ貯蔵し又は分泌する細胞を指す。
【００３２】
本明細書で使用される「ベータ細胞」は、膵臓内のランゲルハンス島と呼ばれる小分子クラスタ内に存在する細胞を指す。ベータ細胞は、ペプチドホルモンのインスリンを分泌することによって、高血糖レベルに応答し、インスリンは、血液からのグルコース取り込みを促進するように他の組織に作用する(例えば、肝臓において、インスリンはグリコーゲン合成によりエネルギー貯蔵を促進する)。
【００３３】
本明細書で使用される「分化する」又は「分化」は、細胞が未分化状態から分化状態に進行する、未成熟状態からより成熟した状態に進行する、若しくは未成熟状態から成熟状態に進行する過程を指す。例えば、初期未分化胚性膵臓細胞は、増殖し、PDX1、NKX6.1及びPTF1aのような特性マーカーを発現することができる。
【００３４】
用語「分化因子」は、ES前駆細胞又は膵臓前駆細胞のEP細胞への分化を増強させるために、これらに添加される化合物を指す。分化因子はまた、成熟ベータ細胞への更なる分化に至らせてもよい。
【００３５】
例示の分化因子としては、肝細胞増殖因子、ケラチノサイト増殖因子、エキセンディン-4、塩基性線維芽細胞増殖因子、インスリン様増殖因子-1、神経成長因子、上皮増殖因子、血小板由来増殖因子、グルカゴン様ペプチド1、インドラクタムV、IDE1&2及びレチノイン酸が含まれる。
【００３６】
いくつかの態様では、細胞の分化は、1つ又は2つ以上の分化因子を含む培地中で細胞を培養することを含む。
【００３７】
一実施形態では、本発明は、少なくとも1つの膵臓ホルモンのその産生に欠陥がある哺乳動物に膵臓内分泌機能を提供する方法であって、本発明の方法のいずれかによって得られた細胞を、該哺乳動物における該少なくとも1つの膵臓ホルモンの測定可能な量を産生するのに十分な量で移植するステップを含む、方法に関する。
【００３８】
一実施形態では、本発明の方法により調製されたEP細胞集団は、糖尿病の治療に、例えば、このような治療を必要とする患者への移植によって、用いられてもよい。
【００３９】
本明細書で使用される用語「ヒト多能性幹(hPS)細胞」は、任意の供給源に由来してよく、適切な条件下で、三胚葉(内胚葉、中胚葉、及び外胚葉)の全ての誘導物である異なる細胞型のヒト後代を生み出すことができる細胞を指す。hPS細胞は、8〜12週齢のSCIDマウスにおいてテラトーマを形成する能力及び/又は組織培養中で三胚葉全ての識別可能な細胞を形成する能力を有する。ヒト多能性幹細胞の定義に含まれるものは、ヒト胚性幹(hES)細胞として文献中に頻繁に示されるヒト胚盤胞由来幹(hBS)細胞を含む種々の型の胚性細胞である。
【００４０】
本明細書に記載される種々の方法及び他の実施形態は、様々な供給源からのhPS細胞を必要としてもよく又は利用してもよい。例えば、使用に適したhPS細胞は、発生中の胚から得てもよい。これに加えて又は代えて、好適なhPS細胞は、確立された細胞系及び/又はヒト誘導多能性幹(hiPS)細胞から得てもよい。
【００４１】
本明細書で使用される用語「hiPS細胞」は、ヒト誘導多能性幹細胞を指す。
【００４２】
本明細書で使用される用語「ヒト胚盤胞由来幹細胞」はBS細胞と表わされ、ヒト型は「hBS細胞」と称される。文献中では、このような細胞は、多くの場合、胚性幹細胞、より具体的にはヒト胚性幹細胞(hESC)と称される。従って、同様に本発明で使用される多能性幹細胞は、例えば、WO 03/055992及びWO 2007/042225に記載されるように、胚盤胞から調製された胚性幹細胞であり得るか、或いは市販のhBS細胞又は細胞系であり得る。しかしながら、例えば、成体細胞をOCT4、SOX2、NANOG、及びLIN28等の特定の転写因子で処理することによって、多能性細胞へと再プログラムされる分化成体細胞を含む、任意のヒト多能性幹細胞も同様に本発明で使用することができることが更に考えられる。
【００４３】
本明細書で使用される「EP細胞集団」は、その中で細胞集団の少なくとも5%がNGN3/NKX2.2二重陽性である膵臓ベータ細胞前駆細胞の集団である。
【００４４】
本明細書で使用される用語「PDX1」は、膵臓の発生に関わるホメオドメイン転写因子を指す。本明細書で使用される「NGN3」は、ベーシックループ-へリックスループ転写因子のニューロゲニンファミリーの一員である。本明細書で使用される「NKX2.2」及び「NKX6.1」は、NKX転写因子ファミリーの構成員である。本明細書で使用される「Islet-1」及び「Isl-1」は、転写因子のLIM/ホメオドメインファミリーの一員であり、発生中の膵臓内で発現される。本明細書で使用される「MafA」は、膵臓中で発現される転写因子であり、インスリンの生合成及び分泌に関与する遺伝子の発現を制御する。
【００４５】
一実施形態では、本発明は、PE細胞をEP細胞に分化し、これによってより均質なEP集団をもたらすための、代替の且つ当該技術分野において既知の方法と比べてより効率的な方法を提供する。
【００４６】
均質なEP集団は、完全分化ベータ細胞への更なる分化の望ましい出発点である。
【００４７】
一実施形態では、PE細胞は、得られた集団内のNGN3/NKX2.2二重陽性の割合が、PE細胞集団をEP細胞集団に分化するための既知のプロトコルを用いて達成可能なものよりも高くなる様式で処理される。
【００４８】
一実施形態では、本発明の方法を用いると、基本培地による処理と比べると、NGN3  mRNAの600倍のアップレギュレーションが観察される。
【００４９】
一実施形態では、得られたEP細胞集団内のNGN3/NKX2.2二重陽性の割合を向上させるために、PEをEP細胞に分化させる既知の方法が用いられる。
【００５０】
一実施形態では、得られたEP細胞集団内のNGN3/NKX2.2二重陽性の割合を向上させるために、PEをEP細胞に分化させる既知の方法が相乗的に用いられる。
【００５１】
一実施形態では、得られたEP細胞集団内のNGN3/NKX2.2二重陽性の割合を向上させるために、PEをEP細胞に分化させる既知の方法からの要素が相乗的に用いられる。
【００５２】
一実施形態では、実施例2による方法は、少なくとも8%の作用率でNGN3/NKX2.2二重陽性である内分泌始原細胞の集団を作製する。
【００５３】
一実施形態では、実施例2による方法は、少なくとも9%の作用率でNGN3/NKX2.2二重陽性である内分泌始原細胞の集団を作製する。
【００５４】
一実施形態では、実施例2による方法は、少なくとも10%の作用率でNGN3/NKX2.2二重陽性である内分泌始原細胞の集団を作製する。
【００５５】
一実施形態では、実施例2による方法は、少なくとも15%の作用率でのNGN3/NKX2.2二重陽性である内分泌始原細胞の集団を作製する。
【００５６】
一実施形態では、本発明による方法は、15〜100%の作用率でNGN3/NKX2.2二重陽性である内分泌始原細胞の集団を作製する。
【００５７】
一実施形態では、PEのEPへの分化プロセスにおいてNGN3/NKX2.2二重陽性の割合を増加させるために、小分子が用いられる。
【００５８】
一実施形態では、PEのEPへの分化プロセスにおいてNGN3/NKX2.2二重陽性の割合を増加させるために、小分子が組み合わせて用いられる。
【００５９】
一実施形態では、PEのEPへの分化プロセスにおいてNGN3/NKX2.2二重陽性の割合を相乗的に増加させるために、小分子が組み合わせて用いられる。
【００６０】
以下の実施形態では、PEのEPへの分化を促進する上で有用である多数の小分子及び濃度が列挙されている。
【００６１】
一実施形態では、PEのEPへの分化を促進する上で有用であることが見出されている小分子は、ゲフィチニブである。一実施形態では、ゲフィチニブは、0.1〜100μMの濃度で用いられる。一実施形態では、ゲフィチニブは、1〜10μMの濃度で用いられる。一実施形態では、ゲフィチニブは、5μMの濃度で用いられる。
【００６２】
一実施形態では、PEのEPへの分化を促進する上で有用であることが見出されている小分子は、JNK阻害薬VIIIである。一実施形態では、JNK阻害薬VIIIは、0.1〜100μMの濃度で用いられる。一実施形態では、JNK阻害薬VIIIは、1〜10μMの濃度で用いられる。一実施形態では、JNK阻害薬VIIIは、10μMの濃度で用いられる。
【００６３】
一実施形態では、PEのEPへの分化を促進する上で有用であることが見出されている小分子は、DNA-PK阻害薬Vである。一実施形態では、DNA-PK阻害薬Vは、0.1〜100μMの濃度で用いられる。一実施形態では、DNA-PK阻害薬Vは、1〜10μMの濃度で用いられる。一実施形態では、DNA-PK阻害薬Vは、5μMの濃度で用いられる。
【００６４】
一実施形態では、PEのEPへの分化を促進する上で有用であることが見出されている小分子は、DAPTである。一実施形態では、DAPTは、0.1〜100μMの濃度で用いられる。
【００６５】
一実施形態では、DAPTは、1〜10μMの濃度で用いられる。一実施形態では、DAPTは、2.5μMの濃度で用いられる。
【００６６】
一実施形態では、PEのEPへの分化を促進する上で有用であることが見出されている小分子は、ゲフィチニブ及びJNK阻害薬VIIIの組み合わせである。一実施形態では、JNK阻害薬VIII及びゲフィチニブは、0.1〜100μMの濃度で用いられる。一実施形態では、JNK阻害薬VIII及びゲフィチニブは、1〜10μMの濃度で用いられる。一実施形態では、JNK阻害薬VIII及びゲフィチニブは、それぞれ5μM及び10μMの濃度で用いられる。
【００６７】
一実施形態では、ゲフィチニブの濃度は、JNK阻害薬VIIIの濃度の約2倍である。
【００６８】
一実施形態では、1つ又は2つ以上の小分子が、JNK阻害薬VIII及びゲフィチニブに加えて添加される。
【００６９】
一実施形態では、DAPTが、2.5μM等の上述したDAPTの濃度のいずれかで、ゲフィチニブ及びJNK阻害薬VIIIと共に用いられる。
【００７０】
一実施形態では、DNA-PK阻害薬Vが、5μM等の上述したDNA-PK阻害薬Vの濃度のいずれかで、ゲフィチニブ及びJNK阻害薬VIIIと共に用いられる。
【００７１】
一実施形態では、ゲフィチニブ、JNK阻害薬VIII及びDNA-PK阻害薬Vは、0.1〜100μMの個々の濃度で組み合わせて用いられる。一実施形態では、ゲフィチニブ、JNK阻害薬VIII及びDNA-PK阻害薬Vは、1〜10μMの個々の濃度で組み合わせて用いられる。
【００７２】
一実施形態では、1〜100μMのゲフィチニブ、1〜100μMのJNK阻害薬VIII、0.5〜50μMのDAPT及び1〜100μMのDNA-PK阻害薬Vが用いられる。一実施形態では、1〜10μMのゲフィチニブ、5〜20μMのJNK阻害薬VIII、1〜10μMのDAPT及び1〜10μMのDNA-PK阻害薬Vが、組み合わせて用いられる。一実施形態では、5μMのゲフィチニブ、10μMのJNK阻害薬VIII及び5μMのDNA-PK阻害薬Vが、組み合わせて用いられる。
【００７３】
一実施形態では、DAPT、DNA-PK阻害薬V、ゲフィチニブ及びJNK阻害薬VIIIは、それぞれの化合物についての上述した濃度のいずれかで、組み合わせて用いられる。
【００７４】
一実施形態では、ゲフィチニブ、JNK阻害薬VIII、DAPT及びDNA-PK阻害薬Vは、0.1〜100μMの個々の濃度で組み合わせて用いられる。一実施形態では、ゲフィチニブ、JNK阻害薬VIII、DAPT及びDNA-PK阻害薬Vは、1〜10μMの個々の濃度で組み合わせて用いられる。一実施形態では、5μMのゲフィチニブ、10μMのJNK阻害薬VIII、2.5μMのDAPT及び5μMのDNA-PK阻害薬Vが、組み合わせて用いられる。
【００７５】
一実施形態では、次の化合物の1つ又は2つ以上が、PEをEPに分化させるために用いられ、すなわちRockout、BPIQ-I、PD174265、p38阻害薬III、PD169316、DMBI、Syk阻害薬、PD98059、DNA-PK阻害薬V、TGF-β  RI阻害薬III、L-685,458、化合物Eである。一実施形態では、Rockoutは、5〜10μMの濃度で用いられる。一実施形態では、p38阻害薬IIIは、5〜10μMの濃度で用いられる。一実施形態では、PD169316は、1〜5μMの濃度で用いられる。
【００７６】
一実施形態では、DMBIは、1〜50μMの濃度で用いられる。一実施形態では、DMBIは、10μMの濃度で用いられる。
【００７７】
一実施形態では、Syk阻害薬は、1〜50μMの濃度で用いられる。一実施形態では、Syk阻害薬は、1μMの濃度で用いられる。
【００７８】
一実施形態では、BPIQ-Iは、0.1〜100μMの濃度で用いられる。
【００７９】
一実施形態では、BPIQ-Iは、1〜50μMの濃度で用いられる。一実施形態では、BPIQ-Iは、10μMの濃度で用いられる。
【００８０】
一実施形態では、PD174265は、0.1〜100μMの濃度で用いられる。一実施形態では、PD174265は、1〜50μMの濃度で用いられる。一実施形態では、PD174265は、10μMの濃度で用いられる。一実施形態では、PD174265は、1μMの濃度で用いられる。
【００８１】
一実施形態では、DNA-PK阻害薬Vは、0.1〜100μMの濃度で用いられる。一実施形態では、DNA-PK阻害薬Vは、1〜10μMの濃度で用いられる。一実施形態では、DNA-PK阻害薬Vは、5μMの濃度で用いられる。
【００８２】
一実施形態では、TGF-β  RI阻害薬IIIは、0.1〜100μMの濃度で用いられる。
【００８３】
一実施形態では、TGF-β  RI阻害薬IIIは、1〜10μMの濃度で用いられる。一実施形態では、TGF-β  RI阻害薬IIIは、5μMの濃度で用いられる。
【００８４】
一実施形態では、L6は、0.1〜100μMの濃度で用いられる。一実施形態では、L6は、1〜10μMの濃度で用いられる。一実施形態では、L6は、5μMの濃度で用いられる。
【００８５】
一実施形態では、化合物Eは、50nM〜5μMの濃度で用いられる。一実施形態では、化合物Eは、100nM〜1μMの濃度で用いられる。一実施形態では、化合物Eは、500nMの濃度で用いられる。
【００８６】
一実施形態では、本発明による方法によって得られるEP細胞は、任意にグルカゴン、ソマトスタチン、膵臓ポリペプチド、及び/又はグレリン産生細胞に向かって分化された細胞を伴う、インスリン産生細胞である。
【００８７】
一実施形態では、EP細胞を含む細胞集団は、体細胞集団から得られる。いくつかの態様では、この体細胞集団は、胚様幹細胞(すなわち、多能性)に脱分化するように誘導されている。このような脱分化型細胞は、誘導多能性幹細胞(iPS)とも称される。
【００８８】
一実施形態では、EP細胞を含む細胞集団は、胚性幹細胞から同様に得られる。
【００８９】
一実施形態では、EP細胞を含む細胞集団は、hiPS細胞から同様に得られる。
【００９０】
一実施形態では、分化は、胚様体中で及び/又は単層細胞培養中で若しくはこれらの組み合わせで起こる。
【００９１】
NGN3/NKX2.2二重陽性細胞の量を増加させるために該小分子を用いることの効果の例が、本文書の実施例並びに図3及び図4に示されている。
【００９２】
一実施形態では、Nすされる。
【００９３】
一実施形態では、該小分子の添加を伴う、実施例2による方法は、150〜400%の作用率でNGN3/NKX2.2二重陽性である内分泌始原細胞の集団を作製する。
【００９４】
一実施形態では、該小分子の添加を伴う、実施例2による方法は、150〜300%の作用率でNGN3/NKX2.2二重陽性である内分泌始原細胞集団を作製する。
【００９５】
一実施形態では、該小分子の添加を伴う、実施例2による方法は、150〜300%の作用率でNGN3/NKX2.2二重陽性である内分泌始原細胞の集団を作製する。
【００９６】
一実施形態では、該小分子の添加を伴う、実施例2による方法は、少なくとも150%の作用率でNGN3/NKX2.2二重陽性である内分泌始原細胞の集団を作製する。
【００９７】
一実施形態では、該小分子の添加を伴う、実施例2による方法は、少なくとも200%の作用率でNGN3/NKX2.2二重陽性である内分泌始原細胞集団を作製する。
【００９８】
一実施形態では、該小分子の添加を伴う、実施例2による方法は、少なくとも300%の作用率でNGN3/NKX2.2二重陽性である内分泌始原細胞の集団を作製する。
【００９９】
一実施形態では、該小分子の添加を伴う、実施例2による方法は、最大400%の作用率でNGN3/NKX2.2二重陽性である内分泌始原細胞の集団を作製する。
【０１００】
一実施形態では、該小分子の添加を伴う、実施例2による方法は、本発明では、最大400%の作用率でNGN3/NKX2.2二重陽性である内分泌始原細胞の集団を作製する。
【０１０１】
一実施形態では、NGN3/NKX2.2二重陽性内分泌始原細胞への分化を起こしている細胞は、該小分子で処理される前に、基本培地中で、TGF-ベータI型受容体阻害薬、BMP拮抗薬、アデニル酸シクラーゼ活性化物質及びニコチンアミドに曝露される。
【０１０２】
一実施形態では、TGF-ベータI型受容体阻害薬はSB431542であり、BMP拮抗薬はノギンである。
【０１０３】
一実施形態では、アデニル酸シクラーゼ活性化物質はホルスコリンである。
【０１０４】
本発明の更なる実施形態
実施形態1:NGN3/NKX2.2二重陽性内分泌始原細胞を得るための方法であって、膵臓内胚葉細胞を含む細胞集団が、
基本培地中で、
TGF-βI型受容体阻害薬、及び
BMP拮抗薬、及び
アデニル酸シクラーゼ活性化物質、及び
ニコチンアミド
に曝露される、方法。
【０１０５】
実施形態2:TGF-βI型受容体阻害薬がSB431542であり、BMP拮抗薬がノギンである、実施形態1に記載の方法。
【０１０６】
実施形態3:アデニル酸シクラーゼ活性化物質がホルスコリンである、実施形態1又は2に記載の方法。
【０１０７】
実施形態4:基本培地がRPMI1640である、実施形態1〜3に記載の方法。
【０１０８】
実施形態5:内分泌始原細胞が、DNA-PK阻害薬V、ゲフィチニブ、JNK阻害薬VIII若しくはDAPT又は該分子の任意の組み合わせに更に曝露される、実施形態1〜4に記載の方法。
【０１０９】
実施形態6:ゲフィチニブ、JNK阻害薬VIII及びDNA-PK阻害薬Vが組み合わされる、実施形態1〜4に記載の方法。
【０１１０】
実施形態7:ゲフィチニブ、JNK阻害薬VIII及びDAPTが組み合わされる、実施形態1〜4に記載の方法。
【０１１１】
実施形態8:ゲフィチニブ、JNK阻害薬VIII及びDNA-PK阻害薬Vが組み合わされる、実施形態1〜4に記載の方法。
【０１１２】
実施形態9: 1〜100μMのゲフィチニブ、1〜100μMのJNK阻害薬VIII、0.5〜50μMのDAPT及び1〜100μMのDNA-PK阻害薬Vが用いられる、実施形態1〜4に記載の方法。
【０１１３】
実施形態10:1〜10μMのゲフィチニブ、5〜20μMのJNK阻害薬VIII、1〜10μMのDAPT及び1〜10μMのDNA-PK阻害薬Vが用いられる、実施形態9に記載の方法。
【０１１４】
実施形態11:実施形態1〜8に記載の方法により得られた細胞。
【０１１５】
実施形態12:医薬品で使用するための、実施形態1〜8に記載されるように得られた細胞。
【０１１６】
実施形態13:糖尿病の治療で使用するための、実施形態1〜8に記載されるように得られた細胞。
【０１１７】
実施形態14:実施形態1〜8に記載の方法により得られた細胞の、糖尿病の治療のための使用。
【０１１８】
実施形態15:NGN3/NKX2.2二重陽性内分泌始原細胞を得るための方法であって、膵臓内胚葉細胞を含む細胞集団が、ゲフィチニブ、JNK阻害薬VIII及びDAPTに曝露される、方法。
【０１１９】
驚くべきことに、PEをEP細胞に分化させることに関して、PE細胞のEP細胞への分化に好適であることが知られている2つの公開されたプロトコルからのステップを組み合わせることによって、有益な効果が達成され得る。更に驚くべきことに、特定の小分子及びこれらの組み合わせが、PEのEPへの分化を更に推進することができ、これによって、EP細胞の収量を増加させることができる(本発明の方法を用いて調製された細胞集団内のEPのより高い割合につながる)ことも示された。
【実施例】
【０１２０】
略語の一覧
DAPT:ジフルオロフェニルアセチル-アラニル-フェニルグリシン-t-ブチル-エステル
DMBI:(Z)-3-[4-(ジメチルアミノ)ベンジリデニル]インドリン-2-オン
CompE:化合物E
DE:胚体内胚葉
DEF-CS:DEF培養系
DNA-Pki:DNA-PK阻害薬V
EP:内分泌始原細胞
hBS:ヒト胚盤胞由来幹
hES:ヒト胚性幹
hESC:ヒト胚性幹細胞
hiPS:ヒト誘導多能性幹
HSC:造血幹細胞
iPS:誘導多能性幹
iPSC:誘導多能性幹細胞
KOSR:KnockOut(商標)血清代替物
PE:膵臓内胚葉
PEST:ペニシリンストレプトマイシン
SC:幹細胞
Rockout:Rhoキナーゼ阻害薬III
【０１２１】
(実施例1:PE細胞集団の調製)
hES細胞(DEF-hES SA121)又はiPS細胞(DEF-CHiPS2)を、30ng/mlのbFGF(Peprotech社  #100-18B)及び10ng/mlのノギン(Peprotech社  #120-10C)を補充したDEF培地(Cellectis社)中で培養した。DEF培地又はDEF-CS培地/系は、ヒト多能性幹細胞の確立及び増殖のための規定の平衡培地、DEF-CS培地/系である。
【０１２２】
hES細胞を、以下のプロトコルを用いて、T75フラスコ内でDEに分化させた:集密培養物をRPMI1640(Gibco社  #61870)中で1回洗浄し、RPMI1640,0.1%PEST(Gibco社  #15140)中の3μMのCHIR99021(Axon社  #1386)で処理した。24時間後に、細胞をRPMI1640,0.1%PESTで洗浄し、RPMI1640,0.1%PEST中の100ng/mlのアクチビンA(Peprotech社  #120-14E)で処理した。24時間後に、2%のB27(Invitrogen社  #17504-044)をアクチビンA培地に2日間添加し、毎日培地を交換した。分化の間に、細胞を加湿インキュベータ内で37℃及び5%のCO2にて維持した。
【０１２３】
DE細胞を、Tryple Select(Invitrogen社  #12563-029)を用いてトリプシン処理し、200K/cm2の光学96ウェルマルチディッシュ(Corning社  #3340)内で、100ng/mlのアクチビンA、2%のB27及び0.1%のPESTを補充したRPMI1640中に単一細胞として再播種した。
【０１２４】
DE細胞を付着させ、以下のプロトコルを用いてPE細胞に分化させた:DE培養物を、1回洗浄し、RPMI1640,0.1% PEST,12% KOSR(Gibco社  #10828)中、50nMのLDN-193189(Stemgen社  #04-0074)で処理した。4日後に、細胞をRPM1640で洗浄し、RPMI1640,0.1% PEST,12% KOSR中、1μMのAM580(Enzo社  #BML-GR104)、10μMのJNK阻害薬II(Calbiochem社  #420119)、50nMのLDN-193189及び64ng/mLのbFGFで、7日間分化させた。分化の間に、毎日培地を交換して、細胞を加湿インキュベータ内で37℃及び5%のCO2にて維持した。
【０１２５】
(実施例2:組み合わせプロトコルを用いるPEのEPへの分化)
実施例1により得られたPE細胞を、RPMI1640,0.1% PEST及び2% B27中、6μMのSB4311542(Sigma社  #S4317)、50ng/mlのノギン(Peprotech社  #120-10c)、10μMのホルスコリン(Sigma社  #F6886)及び10mMのニコチンアミド(Calbiochem社  #481907)で3日間分化させた。分化の間に、培地を毎日交換して、細胞を加湿インキュベータ内で37℃及び5%のCO2にて維持した。
【０１２６】
(実施例3:実施例2による方法の既知のプロトコルとの比較)
実施例2による方法を、それぞれKunisadaら(2011年)(プロトコルK)及びNostroら(2012年)(プロトコルN)に記載されている方法と比較した。
【０１２７】
プロトコルK
実施例1により得られたPE細胞を、RPMI1640,0.1% PEST及び2% B27中、10μMのホルスコリン(Sigma社  #F6886)及び10mMのニコチンアミド(Calbiochem社  #481907)で3日間分化させた。分化の間に、培地を毎日交換して、細胞を加湿インキュベータ内で37℃及び5%のCO2にて維持した。
【０１２８】
プロトコルN
実施例1により得られたPE細胞を、RPMI1640,0.1% PEST及び2% B27中、6μMのSB4311542(Sigma社  #S4317)及び50ng/mlのノギン(Peprotech社  #120-10c)で3日間分化させた。分化の間に、培地を毎日交換して、細胞を加湿インキュベータ内で37℃及び5%のCO2にて維持した。
【０１２９】
結果を以下のように得た:
プロトコルK及びプロトコルN並びに組み合わせプロトコルK&N(実施例2)による3日間のEP分化に応答する内分泌始原細胞マーカーNGN3についての相対的遺伝子発現レベル。遺伝子発現は、基本培地中で分化させた培養物中に存在する発現(1に設定した)に対するものとして示した。
【０１３０】
細胞をEPの4日目に採取し、RNeasy Plus Mini Kit(Qiagen社  #74134)を用いて総RNAを抽出し、NanoDrop ND-1000分光光度計(Thermo Scientific社)でRNA濃度を測定した。iScript cDNA Synthesis Kit(Bio-Rad社)を用いて、製造業者の使用説明書に従い、RNAをcDNAに逆転写した。各実験は、cDNA合成用に一定量のRNA(500ng)を使用した。反応混合物を25℃で5分間、42℃で30分間及び85℃で5分間インキュベートした。
【０１３１】
定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)を、反応当たり1/100のcDNA、Taqman遺伝子発現アッセイ(NGN3又はハウスキーピング遺伝子GAPDHに対する在庫のプライマーセット)及び10μlの反応中、Taqman迅速汎用PCRマスターミックスを用いて、2回行った。qPCRは、迅速2段階プログラム:95℃の初期変性を3分間、続いて95℃で15秒間及び60℃で20秒間を40サイクル、を用いて、Mx3005P qPCR System(Agilent社)で実施した。生データをMxProソフトウェアからエクスポートし、マイクロソフトエクセル及びグラフパッドプリズムを用いて分析した。遺伝子発現の相対的定量を、GAPDHを内部標準として使用して、比較サイクル閾値(DDCt)法(Schmittgen及びLivak、2008年)を用いて行った。
【０１３２】
相対的NGN3発現の形式での結果を、以下のtable 1(表1)及び図1に示す。この結果は、内分泌始原細胞を作製するために2つの個々のプロトコルを組み合わせる場合(プロトコルK及びプロトコルN)、EP細胞集団中のNGN3  mRNA発現のレベルを相乗的に増強することができることを示している。
【０１３３】
【表１】
0006636427.tif 000002
【０１３４】
3日間のEPへの分化後、EPの4日目に、培地を吸引し、その後4%のパラホルムアルデヒド(VWR社、97.131.000)で室温にて30分間細胞を固定化した。細胞をPBSで洗浄し、0.5%のTriton X-100(Sigma社、9002-93-1)で10分間透過処理し、0.5%のTNB緩衝液(Perkin Elmer社)中で室温にて30分間、洗浄且つブロックした。一次抗体であるヒツジ抗NGN3(R&D systems社  #AF3444)及びウサギ抗NKX2.2(Sigma社  #HPA003468)を、PBS中0.1%のTriton X-100中でそれぞれ1:1000及び1:500に希釈し、各ウェルに添加し、4℃で一晩インキュベートした。細胞をPBSで3回洗浄した。DAPI(4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール、Applichem社、A4099.0010)並びに二次抗体であるAlexa Fluor 488標識ロバ抗ヤギ及びAlexa Fluor 594標識ロバ抗ウサギ抗体(両者ともInvitrogen社)を、PBS中0.1%のTriton X-100中で1:1000に希釈し、各ウェルに45分間添加した。細胞を5回洗浄し、画像撮影用に200μLのPBS中に放置した。
【０１３５】
画像撮影を、InCell Analyzer 2000(GE Healthcare社)を用いて行った。10倍の対物レンズを用いてウェル当たり4視野を捉えた。総細胞数は、DAPI対比色法に基づき、NGN3/NKX2.2二重陽性細胞の数を、InCell Developer Toolbox 1.8(GE Healthcare社)を用いて決定した。InCell developer toolboxソフトウェア(GE Healthcare社)を用いて、NGN3/NKX2.2二重陽性細胞のフラクションを定量し、各プレートの組み合わされたプロトコルK&N(実施例2)に対して正規化し、作用率(%)を計算した(NGN3/NKX2.2二重陽性の作用率(%)=((S-Sneg)/(|Spos-Sneg|))*100)。式中Sは、所与の化合物の組み合わせについてのNGN3/NKX2.2二重陽性細胞の%であり、Sneg及びSposは、それぞれ陰性対照及び組み合わされたプロトコルK&NについてのNGN3/NKX2.2二重陽性細胞の%である)。
【０１３６】
NGN3/NKX2.2二重陽性細胞の作用率(%)の形式における結果を、以下のtable 2(表2)及び図2に示す。
【０１３７】
【表２】
0006636427.tif 000003
【０１３８】
この結果は、内分泌始原細胞を作製するために2つの個々のプロトコル(プロトコルK及びプロトコルN)を組み合わせる場合、EP細胞集団中のNGN3/NKX2.2二重陽性細胞のレベルを相乗的に増強させ得ることを示している。
【０１３９】
(実施例4:小分子によって誘導されるEPの分化)
特定の分子のPEのEPへの分化を誘導し且つ増加させるための能力を、以下の条件下で試験した。
【０１４０】
EP細胞集団を、実施例1及び実施例2に従って調製した。しかしながら、実施例2で用いられた試薬に加えて、table 3(表3)に列挙された小分子を、以下のtable 3(表3)の示した濃度欄中に特定された濃度で、3日間にわたって添加した。
【０１４１】
3日間のEPへの分化後に、培地を吸引し、その後4%のパラホルムアルデヒド(VWR社、97.131.000)で室温にて30分間細胞を固定化した。細胞をPBSで洗浄し、0.5%のTriton X-100(Sigma社、9002-93-1)で10分間透過処理し、0.5%のTNB緩衝液(Perkin Elmer社)中で室温にて30分間、洗浄且つブロックした。
【０１４２】
一次抗体であるヒツジ抗NGN3(R&D systems社  #AF3444)及びウサギ抗NKX2.2(Sigma社  #HPA003468)を、PBS中0.1%のTriton X-100中でそれぞれ1:1000及び1:500に希釈し、各ウェルに添加し、4℃で一晩インキュベートした。細胞をPBSで3回洗浄した。DAPI(4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール、Applichem社、A4099.0010)並びに二次抗体であるAlexa Fluor 488標識ロバ抗ヤギ抗体及びAlexa Fluor 594標識ロバ抗ウサギ抗体(両者ともInvitrogen社)を、PBS中0.1%のTriton X-100中で1:1000に希釈し、各ウェルに45分間添加した。細胞を5回洗浄し、画像撮影用に200μLのPBS中に放置した。
【０１４３】
画像撮影を、InCell Analyzer 2000(GE Healthcare社)を用いて行った。10倍の対物レンズを用いてウェル当たり4視野を捉えた。総細胞数は、DAPI対比色法に基づき、InCell Developer Toolbox 1.8(GE Healthcare社)を用いて、NGN3/NKX2.2二重陽性細胞の数を決定した。InCell developer toolboxソフトウェア(GE Healthcare社)を用いて、NGN3/NKX2.2二重陽性細胞のフラクションを定量し、各プレートの組み合わされたプロトコルK&Nに対して正規化し、作用率(%)を計算した(NGN3/NKX2.2二重陽性の作用率(%)=((S-Sneg)/(|Spos-Sneg|))*100)。式中Sは、所与の化合物組み合わせについてのNGN3/NKX2.2二重陽性細胞の%であり、Sneg及びSposは、それぞれ陰性対照及び組み合わされたプロトコルK&NについてのNGN3/NKX2.2二重陽性細胞の%である)。作用率が150%を超える値を、ヒットとして分類した。
【０１４４】
多くの小分子が、PE細胞のEP細胞への分化を促進することが見出された。これら分子は、以下のtable 3(表3)に列挙されている。
【０１４５】
更に、NGN3/NKX2.2二重陽性細胞によって測定された、この組み合されたプロトコルの効率は、ガンマセクレターゼ、JNK、Rhoキナーゼ、P38MAPK、SYK、DNA-PK、PI3K、PDGFR、FGFR又はEGFRを標的とする小分子阻害薬の添加によって更にいっそう増強され得る。
【０１４６】
結果を以下のtable 4(表4)及び図3に示す。
【０１４７】
【表３Ａ】
0006636427.tif 000004
【０１４８】
【表３Ｂ】
0006636427.tif 000005
【０１４９】
【表３Ｃ】
0006636427.tif 000006
【０１５０】
【表３Ｄ】
0006636427.tif 000007
【０１５１】
【表３Ｅ】
0006636427.tif 000008
【０１５２】
【表３Ｆ】
0006636427.tif 000009
【０１５３】
【表３Ｇ】
0006636427.tif 000010
【０１５４】
【表３Ｈ】
0006636427.tif 000011
【０１５５】
【表４】
0006636427.tif 000012
【０１５６】
(実施例5:小分子の組み合わせによって誘導されるPEのEPへの分化)
table 3(表3)の特定の分子及びこの組み合わせのPEのEPへの分化を誘導し且つ増加させるための能力を、以下の条件下で試験した。
【０１５７】
EP細胞集団を、実施例2に従って調製した。しかしながら、実施例2で用いられた試薬に加えて、table 3(表3)に列挙された特定の小分子を、EPへの分化の3日間に、単独で又は組み合わせでのいずれかで添加した。
【０１５８】
3日間のEPへの分化後に、培地を吸引し、その後4%のパラホルムアルデヒド(VWR社、97.131.000)で室温にて30分間細胞を固定化した。細胞をPBSで洗浄し、0.5%のTriton X-100(Sigma社、9002-93-1)で10分間透過処理し、0.5%のTNB緩衝液(Perkin Elmer社)中で室温にて30分間、洗浄且つブロックした。
【０１５９】
一次抗体であるヒツジ抗NGN3(R&D systems社  #AF3444)及びウサギ抗NKX2.2(Sigma社  #HPA003468)を、PBS中0.1%のTriton X-100中でそれぞれ1:1000及び1:500に希釈し、各ウェルに添加し、4℃で一晩インキュベートした。細胞をPBSで3回洗浄した。DAPI(4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール、Applichem社、A4099.0010)並びに二次抗体であるAlexa Fluor 488標識ロバ抗ヤギ抗体及びAlexa Fluor 594標識ロバ抗ウサギ抗体(両者ともInvitrogen社)を、PBS中0.1%のTriton X-100中で1:1000に希釈し、各ウェルに45分間添加した。細胞を5回洗浄し、画像撮影用に200μLのPBS中に放置した。
【０１６０】
画像撮影を、InCell Analyzer 2000(GE Healthcare社)を用いて行った。10倍の対物レンズを用いてウェル当たり4視野を捉えた。総細胞数は、DAPI対比色法に基づき、InCell Developer Toolbox 1.8(GE Healthcare社)を用いて、NGN3/NKX2.2二重陽性細胞の数を決定した。InCell developer toolboxソフトウェア(GE Healthcare社)を用いて、NGN3/NKX2.2二重陽性細胞のフラクションを定量し、各プレートの組み合わされたプロトコルK&Nに対して正規化し、作用率(%)を計算した(NGN3/NKX2.2二重陽性の作用率(%)=((S-Sneg)/(|Spos-Sneg|))*100)。式中Sは、所与の化合物組み合わせについてのNGN3/NKX2.2二重陽性細胞の%であり、Sneg及びSposは、それぞれ陰性対照及び組み合わされたプロトコルK&NについてのNGN3/NKX2.2二重陽性細胞の%である)。
【０１６１】
NGN3/NKX2.2二重陽性細胞の作用率(%)の形式における結果を、以下のtable 5(表5)及び図4に示す。この結果は、DAPTがJNK阻害薬VIII又はゲフィチニブ若しくはJNK阻害薬VIII+ゲフィチニブと共に添加される場合、実施例2及び実施例4のプロトコルの分化効率が増加されることを示している。
【０１６２】
【表５】
0006636427.tif 000013
【０１６３】
本発明の特定の特徴が、本明細書に例示され、説明してきたが、当業者であれば多くの修正、代用物、変更、及び等価物をここで想起するであろう。従って、添付の特許請求の範囲は、このような修正及び変更を、本発明の真の趣旨の範囲内に収まるものとして全て包含するよう意図されていることを理解されたい。
(参考文献)
0006636427.tif 000014
0006636427.tif 000015
0006636427.tif 000016
【図１】
0006636427.tif 000017
【図２】
0006636427.tif 000018
【図３】
0006636427.tif 000019
【図４】
0006636427.tif 000020