(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
膜タンパク質であるＮＭＤＡ受容体を標的にし、かつ調節する少なくとも１個のＮＭＤＡ受容体アゴニストまたはＮＭＤＡ受容体アンタゴニストである調節因子化合物と、
該調節因子化合物に結合したリンカーと、
前記リンカーを介して調節因子化合物に結合された、少なくとも１個のコアナノ構造物とを含むナノ構造物複合体であって、
その部分でない、全体の前記ナノ構造物複合体は、シナプス間隙間隔よりも大きい平均流体力学的直径を有し、かつ１０〜５０ｎｍの平均流体力学的直径を有し、シナプス外位置で膜タンパク質であるＮＭＤＡ受容体を標的にし、かつ調節するためのナノ構造物複合体。
【請求項２】
前記コアナノ構造物が、金、銀、鉄、酸化鉄、ランタニド酸化物、遷移金属、遷移金属酸化物、シリカ、多孔質シリカ、半導体、結晶性、非結晶性、層状のタンパク質、ヒト血清アルブミン、ヒアルロン酸、デキストラン、プロテオグリカン、硫酸化生体高分子、カルボキシベタインポリマー、スルホベタインポリマー、もしくはブロックコポリマーを含むか、
または、
前記コアナノ構造物が、ポリマーシェルを有する無機コア、ポリマーシェルを有する有機コア、もしくは無機シェルおよびポリマーシェルを有する無機コアである請求項１に記載のナノ構造物複合体。
【請求項３】
前記コアナノ構造物が、１２ｎｍの直径を有する粒子である請求項１または２に記載のナノ構造物複合体。
【請求項４】
前記ＮＭＤＡ受容体アンタゴニストが、ＡＰＶ、ＡＰ７、アトモキセチン、アマンタジン、ＡＺＤ６７６５、ＣＰＰｅｎｅ、デルセミン、デキソキサドロール、デキストラロル
ファン、デキストロメトルファン、デキストロルファン、ジフェニジン、ジゾシルピン、エリプロジル、エチシクリジン、エトキサドロール、ガシクリジン、イボガイン、ケタミン、メトキセタミン、ＨＵ−２１１、メトキシジン、ネラメキサン、フェンシクリジン、ロリシクリジン、テノシクリジン、チレタミン、レマセミド、レマセミド、リンコフィリン、セルホテルである請求項１〜３のいずれか１つに記載のナノ構造物複合体。
【請求項５】
前記調節因子化合物が、メマンチンまたはリマンタジンである請求項１〜３のいずれか１つに記載のナノ構造物複合体。
【請求項６】
前記リンカーは、前記ＮＭＤＡ受容体アゴニストまたはＮＭＤＡ受容体アンタゴニストがＮＭＤＡチャネル細孔内の結合部位にアクセスすることを可能にする柔軟性および長さを有する請求項１〜５のいずれか１つに記載のナノ構造物複合体。
【請求項７】
前記リンカーが、ポリエチレングリコールまたはポリ乳酸である請求項１〜６のいずれか１つに記載のナノ構造物複合体。
【請求項８】
前記コアナノ構造物が、エーテル結合、エステル結合、アミド結合、アルケン結合、アルキン結合、チオエーテル結合、イミン結合、ジスルフィド結合、金属−有機結合、キレート化、イオン結合、静電結合、水素結合またはそれらの組み合わせにより前記調節因子化合物に結合されている請求項１〜７のいずれか１つに記載のナノ構造物複合体。
【請求項９】
動物の以下の医学的症状の治療又は予防用の医薬組成物であって、
前記請求項１〜８のいずれか１つに記載のナノ構造物複合体を含み、
前記医学的症状は、アルツハイマー病；パーキンソン病；筋委縮性側索硬化症；ハンチントン病；ダウン症候群；自閉症；レット症候群；脆弱Ｘ症候群；脳性麻痺；癲癇；発作障害；睡眠障害；外傷性脳損傷；統合失調症；神経因性疼痛；依存性障害；多発性硬化症緑内障；血管性認知症またはＨＩＶ関連認知症である医薬組成物。
【請求項１０】
前記動物が、哺乳動物、ヒト、霊長類、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウシ、ウマまたはブタである請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記動物が、ヒトである請求項１０に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１３年１１月５日に出願された米国特許出願第６１，９６２，３３５号明細書に基づく優先権を主張するものであり、この米国特許出願の内容は、その全体が本明細書で援用される。
【背景技術】
【０００２】
グルタメートは、脳における主要な興奮性神経伝達物質である。グルタメートにより媒介されるニューロン間情報伝達の確実かつ迅速な伝達を提供するために、ニューロンは、精密な幾何学的構成の精巧な特殊化した構造を有する。シナプスと呼ばれるこうした構造は、ａ）シナプス前終末への活性電位の到来に応答してシナプス間隙中に直接一定数の神経伝達物質分子を放出すること、ｂ）それに応じてシナプス後終末上の神経伝達物質によりゲート制御される特定の受容体が活性化すること、およびｃ）次のシナプス前シグナルの準備において、特殊化した輸送体による再取り込みによって神経伝達物質分子を間隙体積から迅速に除去することにより、シナプス前シグナルを、シナプス後ニューロンにおける生化学的および電気的下流事象に変換する役割を果たしている。シナプス間隙（シナプス前ニューロンとシナプス後ニューロンとの間の空間）の狭い間隔および小さい体積は、シナプスの神経伝達物質濃度の制御を提供することによりシナプス伝達効率を最大化するのに役立っている。例えば、一般的な興奮性シナプスにおけるシナプス間隙の平均幅は、約２５±５ｎｍである。
【０００３】
グルタメートは、一連の膜貫通受容体（所謂グルタミン酸受容体）に結合し、それらを活性化することにより、複数のシグナル伝達経路を作動させる。これらの受容体は、正常な脳機能（興奮性グルタミン酸作動性神経伝達、発達可塑性、および高次認知機能（例えば、記憶の獲得、保持、および学習）を含む）にとって重要な多くの生理学的プロセスにおいて重要な役割を果たす。グルタミン酸受容体の低活性化または高活性化は、多くの神経学的および精神医学的状態（例えば、神経変性、脳卒中、疼痛、癲癇、統合失調症、および鬱病）に関わっている。
【０００４】
グルタミン酸受容体は、シナプス内およびシナプス外（それぞれ、シナプス位置およびシナプス外位置）の両方に存在する。グルタミン酸受容体の位置は一定ではなく、脳の発達の間におよびニューロン活性に応答して起こるシナプスへのおよびシナプスからの受容体輸送（側方受容体移動）が、グルタミン酸受容体のシナプス対シナプス外の分布の変化に繋がる。シナプス間隙を横切って放出されるグルタメートによるシナプスグルタミン酸受容体の活性化は、シナプス間隙中のグルタメートの存在の位相性によりデジタル信号情報処理を媒介する。他方において、周囲グルタメートによるシナプス外グルタミン酸受容体の活性化は、ニューロン出力、発火モード、および神経伝達の利得制御の動的調節に寄与することにより、シグナル統合を確実にし、ニューロンネットワークの全体の興奮性を決定する。シナプス外受容体は、シナプス外のグルタメート濃度を制御するための空間的に抑制された機構がないことにより、ニューロンの生化学的および電気的シグナル伝達を長期にわたって持続的に調節し得る。ａ）シナプスからの伝達物質の溢出（特に、高頻度発火の間または再取り込み輸送体が侵された場合）、ｂ）再取り込みではなくその放出を結果としてもたらす伝達物質輸送体の逆作動、ｃ）グリア細胞またはニューロン軸索のシナプス外結節状構造からの伝達物質放出をはじめとする、シナプス外の周囲グルタメート濃度の上昇に関わるいくつかの機構が存在する。
【０００５】
グルタミン酸受容体は、それらの構造および下流活性化経路に従って、イオンチャネル型グルタミン酸受容体および代謝調節型グルタミン酸受容体として分類される。イオンチャネル型グルタミン酸受容体は、リガンドによりゲート制御されるイオンチャネルのファミリーに属し：それらのチャネルポアは、グルタメートの結合に応答して開き、カチオンの流入を可能にし、これが延いては、細胞膜の脱分極および下流電気シグナルの発生を結果としてもたらす。３つの薬理学的に異なる種類のイオンチャネル型グルタミン酸受容体が存在し、これらはそれらの好ましいアゴニスト：α−アミノ−３−ヒドロキシル−５−メチル−４−イソオキサゾール−プロピオン酸（ＡＭＰＡ）、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）、およびカイニン酸塩に従って分類される。代謝調節型グルタミン酸受容体（３つのグループの８つの異なる種類）はＧタンパク質結合受容体のファミリーに属し、グルタメートが結合するとＧタンパク質サブユニットの活性化を誘発し、これがその後の種々のエフェクター分子（例えば、酵素、イオンチャネル、および転写因子）の機能の調節に繋がる。
【０００６】
ＮＭＤＡ受容体（ＮＭＤＡＲ）は、カルシウムイオンに対するそれらの透過性および細胞膜電位へのそれらの機能活性の依存性によって多くの生理学的プロセスにおいて中心的役割を果たすように特異的に配置される。ＮＭＤＡＲはまた、それらがグルタメートにより誘導される興奮毒性を媒介する重要な受容体として広く認識されているように、多くの病理学的プロセスにも関与する。具体的には、ＮＭＤＡＲの高活性化は、多くの急性および慢性の神経学的障害（例えば、脳虚血、外傷性脳損傷、癲癇、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、ＨＩＶ関連神経認知障害、および筋委縮性側索硬化症）と関連することが認められる。ＮＭＤＡＲの低活性化は、脳の重要な領域における興奮性（コリン作動性／グルタミン酸作動性）投射の脱抑制の機構による、神経発達障害、特に統合失調症への関与が示されている。
【０００７】
ＮＭＤＡＲは、重要な治療標的として長く認識されており、いくつものＮＭＤＡＲアンタゴニストが、それらの神経保護能力を評価するために試験されてきた。試験を終えた薬物には、グルタメート部位アンタゴスト（セルホテル）、グリシン部位アンタゴニスト（ガベスチネル）、イオンチャネル部位アンタゴニスト（アプチガネル）、およびＮＲ２Ｂサブユニット選択的アンタゴニスト（トラキソプロジル）が含まれた。残念ながら、実質的に全てのＮＭＤＡＲアンタゴニストが、精神異常発現症状および運動障害からの範囲の重大な副作用を示し、その結果、臨床試験において失敗した。どうやら、これらの副作用は、ＮＭＤＡＲアンタゴニストが、病理学的活性を阻害することに加えて生理学的活性も遮断し、正常なシナプスシグナル伝達を妨げ、正常な脳機能に悪影響を及ぼすために起こるようである。したがって、神経科学界における現在の一致した見解は、臨床的に許容できかつ薬理学的に有効であるためには、ＮＭＤＡＲアンタゴニストは、それらの作用において高度に差別的であるべきであり、正常なシナプス活性を保存しながら過度の病理学的活性のみを遮断するものであるべきであるというものである。
【０００８】
最近の結果は、異なるサブ細胞位置のＮＭＤＡＲが、ニューロンの運命に対して異なる影響を与え得、時には逆の影響を与え得ることを示唆している。すなわち、生理学的シナプス活性は、グルタメート濃度が高度に調節された機能性シナプス中のシナプスＮＭＤＡＲ（ｓＮＭＤＡＲ）により維持されており、一方、病理学的活性は、シナプス外の高周囲グルタメート濃度および結果として起こるシナプス外ＮＭＤＡＲ（ｅＮＭＤＡＲ）の活性化により引き起こされる。一般的に、ｓＮＭＤＡＲの生理学的活性化は、抗酸化剤防御、ｃＡＭＰ応答配列結合タンパク質（ＣＲＥＢ）への核シグナル伝達、および細胞外シグナル制御キナーゼ（ＥＲＫ１／２）によるシグナル伝達を向上させる多数の経路の関与によって神経保護的である傾向がある。さらに、内因性アポトーシス経路がダウンレギュレートされる。これに対して、ｅＮＭＤＡＲ活性は、生存促進性経路を遮断し、シナプス損傷およびアポトーシス促進性分子を活性化し、ニューロンのＣＯＸ−２発現を増強し、タウ依存性神経変性を媒介することにより、ニューロン損傷に繋がるシグナル伝達カスケードを開始し得る。
【０００９】
虚血性脳損傷に関する近年の研究により、ｅＮＭＤＡＲ活性が神経保護経路を阻害してニューロン損傷を誘発するのに対して、生理学的ｓＮＭＤＡＲ活性は、一般的に神経保護的転写経路および抗酸化剤経路を刺激することが示唆されている。いくつかの神経変性障害（例えば、ハンチントン病およびＡＤ）についても同様のパターンが明らかになりつつある。したがって、ｅＮＭＤＡＲを調節し得る薬物は、病理学的活性には作用するが、生理学的活性には作用しないので、副作用なしに治療効果を提供するであろう。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
一実施形態において、ナノ構造物複合体は、シナプス外位置の膜タンパク質を標的化する少なくとも１個の調節因子化合物に結合された少なくとも１個のナノ構造物を含み得る。別の実施形態において、調節因子化合物は、ＮＭＤＡ調節因子である。一実施形態において、調節因子化合物は、アダマンタン化合物である。
【００１１】
別の実施形態において、ナノ構造物複合体を調製する方法は、少なくとも１個のナノ構造物を少なくとも１個のアダマンタン化合物に結合させることを含み得る。一実施形態において、ナノ構造物は、少なくとも１個のＮＭＤＡ調節因子に結合される。
【００１２】
さらなる実施形態において、シナプス外タンパク質を阻害する方法は、シナプス外タンパク質と、シナプス間隙間隔よりも大きな平均流体力学的直径を有するナノ構造物複合体とを接触させることを含み得る。一実施形態において、シナプス外タンパク質は、グルタミン酸受容体、グリシン受容体、ＧＡＢＡ受容体、コリン作動性受容体、オピオイド受容体、アドレナリン作動性受容体、ドパミン作動性受容体、セロトニン受容体、ヒスタミン受容体、神経伝達物質輸送体、カルシウムイオンチャネル、カリウムイオンチャネル、ナトリウムイオンチャネル、または塩化物イオンチャネルである。一実施形態において、グルタミン酸受容体は、ＮＭＤＡ受容体である。別の実施形態において、ナノ構造物複合体は、約５ｎｍ〜約１５０ｎｍ、または約２０ｎｍ〜約４０ｎｍの平均流体力学的直径を有する。
【００１３】
シナプス外タンパク質を阻害するさらなる方法は、シナプス外タンパク質と、シナプス間隙間隔よりも大きな平均流体力学的直径を有するアンタゴニストとを接触させることを含み得、このアンタゴニストは、シナプスタンパク質を阻害しない。一実施形態において、アンタゴニストは、約５ｎｍ〜約１５０ｎｍの平均流体力学的直径を有する。別の実施形態において、アンタゴニストは、約２０ｎｍ〜約４０ｎｍの平均流体力学的直径を有する。
【００１４】
ある医学的状態を有する動物を処置する方法は、少なくとも１個の調節因子化合物に結合された少なくとも１個のナノ構造物を含むナノ構造物複合体を動物に投与することを含み得；その医学的状態は、アルツハイマー病；パーキンソン病；筋委縮性側索硬化症；ハンチントン病；化学療法誘発性神経障害；老人性脳機能障害；ダウン症候群；自閉症；アスペルガー症候群；レット症候群；脆弱Ｘ症候群；コルサコフ病；脳性麻痺；癲癇および他の発作障害；情動障害；睡眠障害；外傷性脳損傷、脳症、および他の外傷性関連損傷または疾患；統合失調症および他の精神病性障害；疼痛、神経因性疼痛、痛覚過敏および侵害感覚の障害；依存性障害；多発性硬化症および他の自己免疫疾患を含むがこれらに限定されない種々の病理学的状態のいずれかである。状態はまた、虚血；ニューロンの再灌流傷害；神経外傷または出血；神経感染症；脳卒中；有毒物質へのニューロンの曝露；緑内症および他の眼障害；嘔吐障害および状態；脳放射線治療に起因する副作用；血管性認知症、またはＨＩＶ関連認知症であり得る。一実施形態において、調節因子化合物は、アダマンタン化合物である。
【００１５】
ある医学的状態を有する動物を処置するさらなる方法は、シナプス間隙間隔よりも大きな平均流体力学的直径を有するＮＭＤＡアンタゴニストを動物に投与することを含み得る。一実施形態において、ＮＭＤＡアンタゴニストは、約５ｎｍ〜約１５０ｎｍまたは約２０ｎｍ〜約４０ｎｍの平均流体力学的直径を有する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、ｓＮＭＤＡＲに作用することなくｅＮＭＤＡＲを選択的または排他的に調節することが可能な薬理学的に活性なナノ構造物の合理的な設計のための戦略を示している。この戦略は、ＮＭＤＡ調節因子分子の大きさと特定のサブ細胞位置へのアクセスの容易性との間の空間的不整合に基づいている。具体的には、シナプス間隙の幅より大きな化学構造は、シナプス内に位置する受容体にはアクセスすることができないが、他の場所に位置する受容体とは相互作用することができる。
【図２】図２は、ナノ構造物複合体の実施例調製を示している。クエン酸金ナノ粒子（ＮＰ）を３ｋＤａのＨＳ−ＰＥＧ−Ｒリンカーと反応させる。次に、このＮＰ−リンカー中間体をメマンチンと反応させ、ＥＤＣ／ＮＨＡを用いて金（Ａｕ）ＮＰをメマンチン（Ｍｅｍ）分子に結合させて、メマンチンの第１級アミノ基を介してアミド結合を形成する。（Ｂ）透過型電子顕微鏡法により、１３ｎｍのＡｕコア直径が示される（スケールバー２０ｎｍ）。（Ｃ）Ａｕ−Ｍｅｍナノ構造物の動的光散乱（Ｚ平均３５ｎｍ）。
【図３】図３は、ＡｕＮＰと複合体化されたメマンチンが、ＮＭＤＡ受容体に対するその有効な薬理学的特性を保持することを示している。２００μＭ  ＮＭＤＡおよび２０μＭグリシンの同時適用によって誘発されたＮＭＤＡ電流は、Ａｕ−Ｍｅｍナノ構造物複合体の存在下で遮断された（図３Ａ）。同時に、メマンチンの代わりに薬理学的に不活性な分子（例えば、ＰＥＧポリマー（図３Ｂ）またはグルコサミン分子（図３Ｃ））が複合体化されたＡｕＮＰは、ＮＭＤＡＲによって媒介される電流に対して何ら影響を及ぼさない。記録は１μＭテトロドキシン（ＴＴＸ）の存在下で行った。灰色のボックスはＮＭＤＡの適用を表し、黒色のボックスは、上に示した化合物の適用を表す。
【図４】図４は、脳皮質ニューロンにおける自発的シナプス活動に対するＡｕ−メマンチンナノ構造物複合体からの阻害作用がないことを示している。ＮＭＤＡ受容体がこのシナプス活動を媒介し、遊離（複合体化されていない）メマンチンの適用は、それをほぼ完全に阻害し得る（図４Ａ）。同時に、ＡｕＮＰに結合されたメマンチン（Ａｕ−Ｍｅｍ）は、シナプス活動に対して何ら影響を及ぼさない（図４Ｂ）。遊離メマンチン分子およびＡｕ−Ｍｅｍの存在下におけるＮＭＤＡ受容体媒介ｓＥＰＳＣの電荷移動（図４Ｃ）、周波数（図４Ｄ）および振幅（図４Ｅ）の分析が示されている。データは、その同じ細胞に対するいずれの薬物処理もない中でのそれらのコントロール値に対して正規化された。データは、平均±ＳＥＭ（各場合においてｎ≧４細胞）；*、ｐ＜０．０１（生データに対する対応のあるｔ検定）として示されている。
【図５】図５は、Ａｕ−Ｍｅｍナノ構造物複合体が、海馬切片におけるＡβオリゴマーによる樹状突起棘の喪失を防いだことを示している。ＹＦＰ遺伝子導入マウスからの海馬ニューロンを、コントロール媒体、または１０μＭメマンチンもしくは５０ｎＭ  Ａｕ−Ｍｅｍの存在下もしくは非存在下で、合成Ａβ１−４２（５００ｎＭオリゴマー）に１０日間曝露した。データは、平均±ＳＥＭ（各場合においてｎ≧４細胞）；*、Ｐ＜０．０１（生データに対する対応のあるｔ検定）として示されている。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本開示は、記載される特定の系、デバイスおよび方法に限定されるものではなく、これらは様々であり得る。本明細書で使用される用語は、特定の型または実施形態のみを説明することを目的とするものであり、範囲を限定するように意図されるものではない。
【００１８】
本開示は、とりわけ、ナノ構造物複合体、そのナノ構造物複合体を調製する方法、シナプス外タンパク質（ＮＭＤＡ受容体を含む）を阻害する方法、およびある医学的状態を有する動物を処置する方法を提供する。一般的な設計戦略を図１に示す。
【００１９】
一実施形態において、ナノ構造物複合体は、少なくとも１個の調節因子化合物に結合された少なくとも１個のナノ構造物を含み得る。さらなる実施形態において、調節因子化合物は、アダマンタン化合物である。別の実施形態において、調節因子化合物は、ＮＭＤＡアンタゴニストである。
【００２０】
ナノ構造物は、一般的に、任意の種類のナノ構造物であり得る。一実施形態において、ナノ構造物は、一般的に、任意の種類のナノ粒子であり得る。ナノ粒子の例としては、金ナノ粒子、銀ナノ粒子、および鉄ナノ粒子などの、金属ナノ粒子が挙げられる。他の例としては、半導体ナノ粒子、コア−シェルナノ粒子、ポリマーシェルを有する無機コア、またはポリマーシェルを有する有機コアが挙げられる。あるいは、ナノ粒子は、架橋ポリマー、ヒドロゲルポリマー、生分解性ポリマー、ポリラクチド（ＰＬＡ）、ポリグリコリド（ＰＧＡ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、コポリマー、多糖、デンプン、セルロース、キトサン、ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）、ＰＨＢ、ＰＨＶ、またはそれらの組み合わせなどの、有機ナノ粒子であり得る。
【００２１】
アダマンタン化合物は、一般的に、任意のアダマンタン化合物であり得る。アダマンタン化合物は、アームチェア構成で配置された４つの連結されたシクロヘキサン環からなるコア構造に基づくものである。アダマンタンは、Ｃ10Ｈ16の化学構造を有する。メマンチンは、アダマンタン化合物の１種であり、３，５−ジメチルアダマンタン−１−アミンという化学名を有する。メマンチンは、その第１級アミノ基を介して他の部分と容易に複合体化または結合され得る。メマンチンは、アルツハイマー病および認知症の処置における使用向けに販売されている。リマンタジンは、その第１級アミノ基を介して他の部分と容易に複合体化または結合され得るさらに別のアダマンタン化合物である。リマンタジンは、（ＲＳ）−１−（１−アダマンチル）エタンアミンという化学名を有する。
【００２２】
ＮＭＤＡアンタゴニストは、一般的に、任意の種類のＮＭＤＡアンタゴニストであり得、ＡＰＶ（Ｒ−２−アミノ−５−ホスホノペンタノエート）、ＡＰ７（２−アミノ−７−ホスホノヘプタン酸）、アトモキセチン、アマンタジン、ＡＺＤ６７６５、ＣＰＰｅｎｅ（３−［（Ｒ）−２−カルボキシピペラジン−４−イル］−プロパ−２−エニル−１−ホスホン酸）、デルセミン、デキソキサドロール、デキストラロルファン、デキストロメトルファン、デキストロルファン、ジフェニジン、ジゾシルピン、エリプロジル、エチシクリジン、エトキサドロール、ガシクリジン、ＨＵ−２１１、イボガイン、ケタミン、メトキセタミン、メトキシジン（Ｍｅｔｈｏｘｙｄｉｎｅ）、ネラメキサン、フェンシクリジン、ロリシクリジン、テノシクリジン、チレタミン、レマセミド、レマセミド、リンコフィリン、セルホテルを含むが、これらに限定されない。
【００２３】
ナノ構造物は、調節因子化合物に直接結合されることもできるし、リンカーを介して間接的に結合されることもできる。結合は、典型的には共有結合であり得るが、非共有結合も可能である。リンカーは、一般的に、任意の種類のリンカーであり得、かつ任意の長さのものであり得る。リンカーの一例は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。他のリンカーとしては、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリ（アルキレングリコール）、ポリ（オキシエチル化ポリオール）、ポリ（オレフィンアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリルアミド）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリレート）、ポリ（サッカリド）、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリ（Ｎ−アクリロイルモルホリン）、ポリ（アクリル酸）、カルボキシメチルセルロース、ヒアルロン酸、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ならびにそれらのコポリマー、ターポリマーおよび混合物が挙げられる。リンカーは、一般的に、任意の幾何構造または形態（例えば、直鎖形態（例えば、アルコキシＰＥＧまたは二官能性ＰＥＧ）、分岐もしくはマルチアーム形態（例えば、フォーク状ＰＥＧまたはポリオールコアに結合されたＰＥＧ）、ペンダントＰＥＧ、または中に分解可能な結合を含むＰＥＧ）であり得る。一実施形態において、リンカーは、直鎖リンカーである。
【００２４】
調節因子化合物は、一般的に任意の種類の結合により、ナノ構造物またはリンカーに結合され得る。結合の例としては、エーテル結合、エステル結合、アミド結合、アルケン結合、アルキン結合、またはそれらの組み合わせが挙げられる。他の例としては、ヘテロ原子、−アルキレン−、−Ｏ−アルキレン−Ｏ−、−アルキレン−Ｏ−アルキレン−、−アリール−Ｏ−、−Ｏ−アリール−、（−Ｏ−アルキレン−）m、（−アルキレン−Ｏ−）m結合（ここで、ｍは、１〜１０００である）、チオエーテル、イミン、ジスルフィド、金属−有機結合、キレート化、イオン結合、静電結合、水素結合、またはそれらの組み合わせが挙げられる。
【００２５】
ナノ構造物複合体は、一般的に、各ナノ構造物に結合された任意の数の調節因子化合物を含有し得る。一例は、各ナノ構造物に結合された約５〜約２００個の調節因子化合物である。具体例は、約５個、約６個、約７個、約８個、約９個、約１０個、約２０個、約３０個、約４０個、約５０個、約６０個、約７０個、約８０個、約９０個、約１００個、約１１０個、約１２０個、約１３０個、約１４０個、約１５０個、約１６０個、約１７０個、約１８０個、約１９０個、約２００個、およびこれらの値のうちの任意の２つの間の範囲（端点を含む）、またはこれらの値のうちの任意の１つより上の範囲である。
【００２６】
ナノ構造物複合体は、一般的に、任意の平均流体力学的直径を有し得る。一実施形態において、平均流体力学的直径は、少なくとも約５ｎｍである。別の実施形態において、平均流体力学的直径は、約１５０ｎｍ以下である。別の実施形態において、平均流体力学的直径は、約５ｎｍ〜約１５０ｎｍまたは約２０ｎｍ〜約４０ｎｍである。流体力学的直径の具体例としては、約５ｎｍ、約１０ｎｍ、約２５ｎｍ、約５０ｎｍ、約７５ｎｍ、約１００ｎｍ、約１２５ｎｍ、約１５０ｎｍ、およびこれらの値のうちの任意の２つの間の範囲（端点を含む）が挙げられる。一部の実施形態において、ナノ構造物複合体は、シナプス間隙間隔よりも大きな平均流体力学的直径を有し得る。他の実施形態において、ナノ構造物複合体は、約５ｎｍ〜約１５０ｎｍまたは約２０ｎｍ〜約４０ｎｍの少なくとも１つの流体力学的径寸法を有し得る。
【００２７】
さらなる実施形態は、上に記載したナノ構造物複合体を調製する方法に関し、この方法は、少なくとも１個のナノ構造物を少なくとも１個の調節因子化合物に結合させることを含む。一部の実施形態において、結合は、ナノ構造物と調節因子化合物との間に共有結合を形成することを含み得る。他の実施形態において、結合は、ナノ構造物とリンカーとの間に共有結合を形成すること、およびリンカーと調節因子化合物との間に共有結合を形成することを含み得る。
【００２８】
さらなる実施形態は、シナプス外タンパク質を阻害する方法に関し、この方法は、シナプス外タンパク質と、約５ｎｍ〜約１５０ｎｍまたは約２０ｎｍ〜約４０ｎｍの平均流体力学的直径を有するナノ構造物複合体とを接触させることを含む。一部の実施形態において、ナノ構造物複合体は、シナプス間隙間隔よりも大きな平均流体力学的直径を有し得る。一部の実施形態において、ナノ構造物複合体は、シナプスタンパク質を阻害しない。ナノ構造物複合体は、一般的に、上に記載したナノ構造物複合体のいずれかであり得る。一実施形態において、シナプス外タンパク質は、ＮＭＤＡ受容体であり得る。
【００２９】
シナプス外タンパク質を阻害する他の方法は、シナプス外タンパク質と、約５ｎｍ〜約１５０ｎｍまたは約２０ｎｍ〜約４０ｎｍの平均流体力学的直径を有するそのアンタゴニストとを接触させることを含み得る。一部の実施形態において、アンタゴニストは、シナプスタンパク質を阻害しない。一実施形態において、シナプス外タンパク質は、ＮＭＤＡ受容体であり得る。
【００３０】
さらなる実施形態は、ある医学的状態を有する動物を処置する方法に関し、この方法は、少なくとも１個の調節因子化合物に結合された少なくとも１個のナノ構造物を含むナノ構造物複合体を動物に投与することを含み；その医学的状態は、種々の病理学的状態（アルツハイマー病；パーキンソン病；筋委縮性側索硬化症；ハンチントン病；化学療法誘発性神経障害；老人性脳機能障害；ダウン症候群；自閉症；アスペルガー症候群；レット症候群；脆弱Ｘ症候群；コルサコフ病；脳性麻痺；癲癇および他の発作障害；情動障害；睡眠障害；外傷性脳損傷、脳症、および他の外傷性関連損傷または疾患；統合失調症および他の精神病性障害；疼痛、神経因性疼痛、痛覚過敏および侵害感覚の障害；依存性障害；多発性硬化症および他の自己免疫疾患を含むが、これらに限定されない）のいずれかである。状態はまた、虚血；ニューロンの再灌流傷害；神経外傷または出血；神経感染症；脳卒中；有毒物質へのニューロンの曝露；緑内症および他の眼障害；嘔吐障害および状態；脳放射線治療に起因する副作用；血管性認知症、またはＨＩＶ関連であり得る。ナノ構造物複合体は、一般的に、上に記載したナノ構造物複合体のいずれかであり得る。動物は、一般的に、任意の動物であり得る。動物の例としては、哺乳動物、霊長類、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウシ、ウマ、およびブタが挙げられる。ナノ構造物複合体は、一般的に任意の有効な様式で送達され得る。投与方法の例としては、鼻腔内送達、腹腔内送達、組織内送達、大脳内薬物送達、髄腔内薬物送達、経頭蓋薬物送達、硬膜外薬物送達、脳リンパ管を介した薬物送達、硝子体内薬物送達、耳科学的薬物送達、吸入による薬物送達、静脈内薬物送達、またはそれらの組み合わせが挙げられる。
【００３１】
別の実施形態は、ある医学的状態を有する動物を処置する方法に関し、この方法は、約５ｎｍ〜約１５０ｎｍまたは約２０ｎｍ〜約４０ｎｍの平均流体力学的直径を有するＮＭＤＡアンタゴニストを動物に投与することを含み；その医学的状態は、種々の病理学的状態のいずれかである。
【００３２】
別の実施形態は、ある医学的状態を有する動物を処置する方法に関し、この方法は、約５ｎｍ〜約１５０ｎｍまたは約２０ｎｍ〜約４０ｎｍの平均流体力学的直径を有する少なくとも１個のアダマンタン化合物に結合された少なくとも１個のナノ構造物を含むナノ構造物複合体を動物に投与することを含み；その医学的状態は、種々の病理学的状態のいずれかである。
【実施例】
【００３３】
実施例１：化学合成
金ＮＰを、クロロ金酸（ＨＡｕＣｌ4；Ａｃｒｏｓ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ；Ｇｅｅｌ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）のクエン酸塩還元により合成した。手短に言えば、１０ｍＬのＭｉｌｌｉ−Ｑ（１８．２オーム）水中の１９７ｍｇのＨＡｕＣｌ4を、５００ｍＬのさらなる水で希釈し、激しく沸騰させた。１３．７ｍｇ／ｍＬのクエン酸ナトリウム三水和物（Ｓｉｇｍａ；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）５０ｍＬを迅速に添加し、煮沸を３０分間継続した。結果として生じた５２０ｎｍに吸収ピークを有するＡｕＮＰ溶液を、室温まで冷却した。シトレートシェルを、４：１のメトキシ：カルボキシレートの公称モル比でメトキシまたはカルボキシレートを末端基とするチオール修飾ＰＥＧの混合物に置き換えた。合成収量を、アリコートの吸光度測定により、５２０ｎｍのプラズモンピークを用いて特徴付けた。１．９７×１０8Ｍ-1ｃｍ-1の吸光率を用いてＡｕＮＰの濃度を算出した。少なくとも５０個のＡｕＮＰを、それらの直径を求めるために、希釈水溶液を炭素被覆グリッド上に置き、続いて毛管作用で排水して窒素流下で乾燥させることにより、透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）によって分析した。
【００３４】
実施例２：複合体化
ＨＳ−ＰＥＧ−ＯＣＨ3、２ｋＤａ（Ｒａｐｐ  Ｐｏｌｙｍｅｒｅ；Ｔｕｅｂｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を、９５％エタノール中で、２４ｍｇ／ｍＬで調製し、ＨＳ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨ、３ｋＤａ（Ｒａｐｐ  Ｐｏｌｙｍｅｒｅ）を、９ｍｇ／ｍＬで調製した。４００μＬの各々を予め混合し、１００ｍＬのクエン酸Ａｕと合わせた（図１中の反応（ｉ））。翌日、ＰＥＧで被覆されたＡｕＮＰを、１００ｋＤａの分子量カットオフを有する（０．１×ＰＢＳで洗浄した）Ａｍｉｃｏｎ遠心フィルターを用いて遊離配位子から精製し、２ｍＬ（５２０ｎｍで２００光学濃度（Ｏ．Ｄ．））まで濃縮した。次に、薬物分子のＥＤＣカップリングを行った。メマンチンＨＣｌ、アマンタジンＨＣｌ、グルコサミン、アミノ−ＰＥＧ−ＯＣＨ3  ＭＷ７５０（Ｓｉｇｍａ；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を、各々２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸緩衝液（ＭＥＳ、０．１Ｍ、ＮａＯＨを加えてｐＨ４．３）に溶解させた。グルコサミンは、その類似した大きさおよび結合のための官能基、ならびに異なるクラスの受容体による潜在的な認識のため使用した。
【００３５】
１００μＬのＥＤＣ（ＭＥＳ中３０ｍｇ／ｍＬ）を３００μＬのＡｕＮＰに添加し、２分間インキュベートした。次いで、ＭＥＳ中のＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）１００μＬを添加した。５分後に１００μＬのアミン−薬物（水中７０ｍＭ）を合わせ、カップリングを１時間行った。ｐＨを高めて反応を促進するために、２５μＬの炭酸塩緩衝液を添加した（７．５％溶液、ｐＨ９．３；Ｇｉｂｃｏ；Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）。１時間後に、ＥＤＣおよびＮＨＳ溶液の各々をさらに５０μＬ添加し、一晩インキュベートした。ＡｕＮＰ生成物を２回ペレット成形し、２１ｋＲＣＦにて１×ＰＢＳ（０．００５％ｗ／ｗの濃度でＴｗｅｅｎ  ２０を含有）で洗浄し、４℃で一晩貯蔵した。翌日、徹底的な透析を、２０ｋＤａ  Ｓｌｉｄｅ−ａ−Ｌｙｚｅｒ（Ｐｉｅｒｃｅ；Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）を用いて１×ＰＢＳ（Ｔｗｅｅｎ  ２０なし）中に行い、４８時間の間に緩衝液を３回交換した。ＡｕＮＰ生成物を、ＤＰＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ；Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）で２７〜２００Ｏ．Ｄ．まで希釈し、濾過した（０．２２μｍ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，ＵＳＡ）。
【００３６】
動的光散乱（ＤＬＳ）を、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ；Ｍａｌｖｅｒｎ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，ＵＫ）を用いて行った。Ａｕ−ＰＥＧ−メマンチンの試料を、リン酸塩緩衝生理食塩水（Ｇｉｂｃｏ；Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）で希釈した。Ｚ平均流体力学的半径は、ソフトウェアにより示された。滅菌濾過し、密封エッペンドルフチューブ中で４℃にて貯蔵した場合、Ａｕ−Ｍｅｍ溶液は、少なくとも数ヶ月間は安定であった。僅かな沈降および容器壁への吸着は、短時間の超音波処理によって逆転させ得た。
【００３７】
１２ｎｍのＡｕＮＰに結合され得る分子のおよその数を定量化するために、チオール−ＰＥＧ−カルボキシレートの代わりにチオール−ＰＥＧ−アミン（３ｋＤａ、Ｒａｐｐ  Ｐｏｌｙｍｅｒｅ）を使用した。金−ＣＯＯＨを反応させる代わりに、金−ＮＨ２を、アミン反応性染料であるＯｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  ４８８スクシンイミジルエステル（ＯＲ４８８、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と反応させた。薬物の代わりにＯＲ４８８をＡｕＮＰと複合体化し、最終生成物を精製した後に、ジチオトレイトールを用いて染料分子を取り除き、それらの数を蛍光強度の測定により特徴付けた。
【００３８】
遊離メマンチンは、Ａｕ−Ｍｅｍの２１ｋＲＣＦでの遠心分離、繰り返しと繰り返しの間におけるＰＢＳへの再分散、および新しいチューブへの移動によって除去した。最低５回の繰り返しを、上清を除去した後の体積で除した初期体積により与えられる、少なくとも５０倍の精製倍率で行った。最終生成物は、２０ｎＭ未満の遊離メマンチン濃度を有するものと推定された。
【００３９】
実施例３：細胞培養
初代脳皮質培養物を、Ｅ１６ラット仔から作製し、１２ｍｍガラスカバースリップ上で培養した。手短に言えば、１〜２日齢のラットから皮質を切離し、酵素処理した（パパイン、２００Ｕ／ｍｌ；３０分、３７℃）。最少必須培地（ＭＥＭ；Ｇｉｂｃｏ；Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）中での機械的解離後に、細胞を培養フラスコ中に入れ、５％ＣＯ2／９５％空気の加湿雰囲気下において３７℃で培養した。
【００４０】
実施例４：電気生理学的記録
ホールセル電圧固定記録を、インビトロで１４日後のニューロンから行った。細胞外溶液には、１３５ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ2、０〜０．０１ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１ｍＭ  ＮａＨＣＯ3、０．３４ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4、０．４４ｍＭ  ＫＨ2ＰＯ4、２０ｍＭグルコース、１０ｍＭヘペス（ｐＨ７．４）が含まれた。４〜７ＭΩの最終先端抵抗を有するパッチ電極に、１２０ｍＭ  ＣｓＣｌ、２０ｍＭテトラエチルアンモニウムクロリド（ＴＥＡ−Ｃｌ）、１０ｍＭヘペス、２．２５ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍＭ  ＣａＣｌ2、２ｍＭ  ＭｇＣｌ2、および０．００１ｍＭファロイジン（ｐＨ７．４）（単位ｍＭ）を含有する溶液を充填した。ｐＣＬＡＭＰ  １０ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ；Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を、データ取得および分析のために使用した。全ての記録を、保持電位を−７０ｍＶとして、室温にて、Ａｘｏｐａｔｃｈ  ２００Ｂ増幅器（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて行った。電流を、１０〜２０ｋＨｚでデジタルサンプリングし、２〜５ｋＨｚでフィルタリングした。
【００４１】
電流を、Ｄｉｇｉｄａｔａ  １３２２インターフェースおよびｐＣｌａｍｐ  １０．１ソフトウェアを用いて取得した。全ての記録を、−７０ｍＶの保持電位において室温で行った。細胞外溶液には、以下のもの、すなわち、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＮａＨＣＯ3、０．３４ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4、５．３６ｍＭ  ＫＣｌ、０．４４ｍＭ  ＫＨ2ＰＯ4、３ｍＭ  ＣａＣｌ2、５ｍＭヘペス、２２．２ｍＭグルコース、０．０１ｍＭグリシン、および０．００３ｍＭストリキニンが含まれ、ｐＨは７．２に調整された。細胞内溶液には、以下のもの、すなわち、１２０ｍＭ  ＣｓＣｌ、２０ｍＭテトラエチルアンモニウムクロリド、１０ｍＭヘペス、２．２５ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍＭ  ＣａＣｌ2、２ｍＭ  ＭｇＣｌ2、４ｍＭ  ＭｇＡＴＰ、０．３ｍＭ  ＧＴＰ、および１０ｍＭホスホクレアチンが含まれ、ｐＨは７．２に調整された。
【００４２】
電流を、Ｄｉｇｉｄａｔａ  １３２２インターフェースおよびｐＣｌａｍｐ  １０．１ソフトウェアを用いて取得した。全ての記録を、−７０ｍＶの保持電位において室温で行った。細胞外溶液には、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＮａＨＣＯ3、０．３４ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4、５．３６ｍＭ  ＫＣｌ、０．４４ｍＭ  ＫＨ2ＰＯ4、３ｍＭ  ＣａＣｌ2、５ｍＭヘペス、２２．２ｍＭグルコース、０．０１ｍＭグリシン、および０．００３ｍＭストリキニンが含まれ、ｐＨは７．２に調整された。細胞内溶液には、１２０ｍＭ  ＣｓＣｌ、２０ｍＭテトラエチルアンモニウムクロリド、１０ｍＭヘペス、２．２５ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍＭ  ＣａＣｌ2、２ｍＭ  ＭｇＣｌ2、４ｍＭ  ＭｇＡＴＰ、０．３ｍＭ  ＧＴＰ、および１０ｍＭホスホクレアチンが含まれ、ｐＨは７．２に調整された。
【００４３】
自発的ＮＭＤＡＲ媒介ｓＥＰＳＣは、通常、バーストとして生じ、各バーストは、多数のＥＰＳＣからなる。したがって、総「電荷移動」がＮＭＤＡＲ媒介ｓＥＰＳＣの規模の指標として使用され得る。というのは、このパラメータは、振幅および周波数の両方についての情報を含有するからである。ＮＭＤＡＲ媒介ｓＥＰＳＣの分析を行うために、まずｓＥＰＳＣの初期の過渡的成分を除外した。この成分は、Ｎａ+および／またはＡＭＰＡによって媒介される電流であり、時間的分離アプローチを用いて容易に単離され得る。次いで、最初のＮＭＤＡＲ媒介ｓＥＰＳＣのピークから始まりベースラインまで続く、各ＮＭＤＡＲ媒介ｓＥＰＳＣの電荷移動についての値を決定したのであるが、これは、分析したｓＥＰＳＣの大半において約２秒かかった。それに続いて、各条件についての個々のバーストの間に移動した電荷の総量を、その同じ細胞についてのコントロール値に対して正規化した。さらに、ＮＭＤＡＲ媒介ｓＥＰＳＣの周波数および振幅を、約１００秒の記録時間において、各実験条件について算出した。平均振幅を、各バーストにおける最大ＮＭＤＡ媒介電流の振幅を平均することにより算出した。平衡時の自発的シナプス活動を調べるために、各薬物適用の最初の１０秒を分析から除外した。全てのパラメータの正規化を、ニューロン間の実験上のばらつきをなくすために各細胞について行った。データは平均±ＳＥＭとして表しており、統計的有意性は、ペアワイズ比較のためのスチューデントのｔ検定を用いて決定した。
【００４４】
実施例５：統計的解析
データは、平均±ＳＥＭとして表した。適切な場合には、結果を、スチューデント−ニューマン−コイルス（ＳＮＫ）事後検定を伴う一元配置分散分析を用いて解釈した。遺伝子型／処理間のペアワイズ比較を、スチューデントのｔ検定を用いて評価した。差異は、Ｐ＜０．０５で統計的に有意と見なした。
【００４５】
実施例６：樹状突起棘解析
Ｔｈｙ１−ＹＦＰＨ遺伝子導入マウス（８〜１０日齢）を、界面法を用いて器官型海馬切片を調製するために使用した。脳をイソフルラン麻酔下で切離し、３５０μｍ厚の海馬切片を、２１２ｍＭスクロース；３ｍＭ  ＫＣｌ；５ｍＭ  ＭｇＣｌ2；０．５ｍＭ  ＣａＣｌ2；１ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4；２６ｍＭ  ＮａＨＣＯ3；および１０ｍＭ  Ｄ−グルコースを含有する氷冷切離緩衝液中に採取した。切離緩衝液に、９５体積％Ｏ2／５体積％ＣＯ2を通気した。切片をＭｉｌｌｉｃｅｌｌ細胞培養インサート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，ＵＳＡ）上に移し、イーグル最少必須培地［５０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）］、ウマ血清［２５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）］、イーグル平衡塩類溶液［１８％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）］、Ｄ−グルコース（３２〜３５ｍＭ）、へぺス（２５ｍＭ）、グルタミン（２ｍＭ）、アムホテリシンＢ（２．５μｇ／ｍＬ）、および硫酸ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）を含有する培地１に入れた。２４時間後、培養培地を、より低い濃度のウマ血清［５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）］を含有する以外は同様の組成の培地２に変更し、次いで、２〜３日毎に交換した。切片を、各培地交換により適宜補充された、オリゴマー化されたＡβ１−４２ペプチドを含有する５００ｎＭオリゴマー、１０μＭメマンチン、または５０ｎＭ  Ａｕ−Ｍｅｍに１０日間曝露した。樹状突起棘密度を、次のように評価した：切片を４％パラホルムアルデヒド中で固定し、ＹＦＰ発現細胞の画像を、ＳｌｉｄｅＢｏｏｋソフトウェアを用いてデコンボリューション顕微鏡法により取得した。ＹＦＰ発現ニューロン（各条件についてｎ＞５）について、少なくとも３０μｍの長さの２次または３次樹状突起の２つの異なる領域を無作為に選択し、ＳｌｉｄｅＢｏｏｋソフトウェアを用いて解析した。
【００４６】
実施例７：ｅＮＭＤＡＲの選択的阻害のためのハイブリッドナノ構造物
メマンチンを、ＮＭＤＡＲアンタゴニストの役割のために選択し、１２ｎｍのＡｕ−ＮＰを、ＮＭＤＡアンタゴニストを「大きくする」ために使用した。メマンチンを、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカーを介してＡｕＮＰに結合させた（図２）。
【００４７】
メマンチンをＡｕＮＰに結合させるための第１の方法：メトキシおよびカルボキシル酸を末端基とするＰＥＧチオールの混合物をＡｕコア上に固定化し、続いて、メマンチン（Ｍｅｍ）の第１級アミンとＰＥＧカルボキシレート基とのアミドカップリングを行った。メマンチンをＡｕＮＰに結合させるための第２の方法：メマンチン−ＰＥＧ−チオールをＡｕＮＰに直接結合させ、メトキシを末端基とするＰＥＧチオールを充填剤として使用した。ＮＰ上のメマンチン分子の数は、メマンチンを有するＰＥＧ分子とメトキシを末端基とするＰＥＧチオールとの比を変えることにより変更され得る。例えば、１：４の比の場合は、Ａｕ−Ｍｅｍは、およそ５０個のメマンチン分子を有すると推定された。結果として生じたＡｕ−ＰＥＧ−メマンチンナノ構造物は、動的光散乱測定により測定した場合に３５ｎｍの流体力学的半径を有していた。
【００４８】
実施例８：薬理学的効果の確認
その薬理学的プロファイルを評価するために、ＮＭＤＡＲ媒介電流に対するＡｕ−Ｍｅｍの影響を、パッチクランプホールセル記録を用いて脳皮質ニューロンにおいて評価した。ＮＭＤＡの非存在下で適用した場合には、１０ｎＭ  Ａｕ−Ｍｅｍは、その後に惹起されたＮＭＤＡ電流に対して何ら影響を及ぼさなかった。このことは、Ａｕ−Ｍｅｍが、閉鎖したＮＭＤＡＲとは相互作用しなかったということを示している。飽和濃度のＮＭＤＡ（２００μＭ）の存在下で適用した場合には、Ａｕ−Ｍｅｍ（１００ｎＭ）は、６２．５５±９．７２％（ｎ＝１５）のＮＭＤＡ媒介イオン電流を遮断した（図３Ａ）。同じ実験条件下において、５０ｎＭのＡｕ−グルコサミンおよびＡｕ−ＰＥＧは、ＮＭＤＡＲに対して何ら作用を及ぼさなかった（ｎ＝５）（図３Ｂ、Ｃ）。これらの結果を、ＮＭＤＡおよび上述のナノ構造物複合体の適用の結果としてのカルシウム流入における電荷をモニタリングした画像化実験（ｎ＝５）により、５００個を超えるニューロンにおいて確認した。これらの知見は、ａ）複合体化が開口チャネルＮＭＤＡＲアンタゴニストとしてのメマンチンの薬理学的特性に影響を及ぼさなかったということ；ｂ）メマンチン分子をＡｕＮＰと複合体化するために使用されるＰＥＧリンカーの特性（すなわち、柔軟性および長さ）が、ＮＭＤＡチャネルポア内の結合部位へのそれらの自由なアクセスを可能にするということ；ｃ）完全に組み立てられたナノ構造物の薬理学的特性が、ＡｕＮＰまたはそのポリマー被膜によるのではなく、単に、複合体化されたアンタゴニスト分子により決定されるということを示している。
【００４９】
Ａｕ−Ｍｅｍの存在下での自発的興奮性シナプス後電流（ｓＥＰＳＣ）のホールセルパッチクランプ記録により測定した場合に、Ａｕ−Ｍｅｍは、脳皮質ニューロンのシナプス活動に対して何ら顕著な影響を及ぼさなかったのに対して、１０μＭの遊離メマンチンはそれを確かに遮断した（図４Ａ、Ｂ）。時間的分離の戦略を用いて、ＡＭＰＡグルタミン酸受容体によって媒介されるｓＥＰＳＣの初期の過渡的成分を除外することにより、ｓＥＰＳＣのＮＭＤＡＲ媒介成分の分析を行った。Ａｕ−Ｍｅｍおよびメマンチンの存在下で示されたＮＭＤＡＲ媒介ｓＥＰＳＣの正規化された総電荷、周波数、および振幅の詳細な分析（図４Ｃ〜Ｅ）は、Ａｕ−ＭｅｍがｓＮＭＤＡＲを阻害することができなかったということを裏付けている。上で示したように、Ａｕ−ＭｅｍがＮＭＤＡＲ活性の極めて有効な阻害剤であることを考えると、ｓＮＭＤＡＲの阻害がないことは、Ａｕ−Ｍｅｍが簡単にはｓＮＭＤＡＲに到達し得ないということを意味している。その結果、これらの新規Ａｕ−Ｍｅｍは、ｓＮＭＤＡＲ以外の全てのＮＭＤＡＲを遮断し得ることから、ｓＮＭＤＡＲの活性を保存するであろうサブタイプ選択的ＮＭＤＡＲアンタゴニストを開発するという当初の目的を満たし得る。
【００５０】
ＮＭＤＡＲを阻害することにおけるＡｕ−Ｍｅｍの有効性を評価するために、異なる濃度のＡｕ−Ｍｅｍを、（２００μＮＭＤＡおよび１０μグリシンの存在下において）十分に活性化されたＮＭＤＡＲに対して適用し、用量−応答曲線を作成した。Ａｕ−Ｍｅｍについてのヒル係数は、ポアブロッカーに期待される約１である。Ａｕ−Ｍｅｍについての半最大阻害濃度（ＩＣ50）は約２０ｎＭであり、これにより、Ａｕ−Ｍｅｍは、ＮＭＤＡＲを遮断することにおいてメマンチン単独（ＩＣ50約１μＭ）よりも５０倍効果的になる。Ａｕ−Ｍｅｍのこのような高い見掛けの親和性は、ａ）１個のＡｕ−メマンチンＮＰの上に存在する多数のメマンチン分子の存在、およびｂ）ＮＭＤＡＲを阻害したメマンチン分子がＮＭＤＡＲから解離した後のＮＭＤＡＲに近接する多数のメマンチン分子の即時の利用可能性によるものであり、このことが、微小空間におけるメマンチン濃度の上昇を結果としてもたらすと考えられる。
【００５１】
実施例９：アルツハイマー病のための使用
シナプス喪失は、アルツハイマー病における神経病理学を認知低下と結び付ける基本的な特徴である。可溶性アミロイドベータ（Ａβ）オリゴマーが、海馬切片においてシナプス機能低下を生じさせることが知られている。ｅＮＭＤＡＲは、シナプス棘喪失に繋がるＡβ誘導シグナル伝達経路を媒介することが以前に立証された。したがって、ｅＮＭＤＡＲの阻害は、こうした神経変性経路を崩壊させ、Ａβオリゴマーの存在下であってもシナプスの喪失を防ぐことが予想される。ＹＦＰマウスからの器官型海馬切片を、１０μＭメマンチンおよび５０ｎＭ  Ａｕ−Ｍｅｍの存在下および非存在下において、５μＭ  Ａβオリゴマーで１０日間処理した。定量的蛍光イメージングを用いて、Ａｕ−Ｍｅｍが、シナプス樹状突起棘に対するＡβオリゴマーの有害な作用から保護することにおいて遊離メマンチンよりも著しく効果的に機能することを確認した（図５）。
【００５２】
実施例１０：アマンタジンを含有するナノ構造物
メマンチンと構造的に類似しているＮＭＤＡアンタゴニストであるアマンタジン（１−アダマンチルアミン）を含有するナノ構造物もまた調製され得る。
【００５３】
実施例１１：脳へのハイブリッドナノ構造物の送達
ハイブリッドナノ構造物は、様々な異なる経路（例えば、鼻腔内送達、腹腔内送達、組織内送達など）により脳に送達され得る。脳への薬物送達の特定の経路を促進するために、ハイブリッドナノ構造物は、脳内への標的化および／または脳への浸透の向上に繋がるさらなる分子の複合体化によるその表面特性の経路特異的最適化を受け得る。
【００５４】
上記の詳細な説明において、添付の図面が参照されており、それらの図面は本明細書の一部を構成する。図面において、同様の符号は、文脈が別のことを指示しない限り、典型的には、同様の要素を特定する。詳細な説明、図面、および特許請求の範囲に記載される例示的な実施形態は、限定するように意図されるものではない。本明細書に示される主題の趣旨または範囲から逸脱することなく、他の実施形態が使用され得、また他の変更がなされ得る。本明細書において一般的に記載され、図において例示される本開示の態様は、多種多様な異なる構成で配置され、置き換えられ、組み合わされ、分離され、設計され得るものであり、それらの全てが本明細書において明示的に企図されることが、容易に理解されるであろう。
【００５５】
本開示は、本出願に記載された特定の実施形態によって限定されるべきではなく、それらの実施形態は、種々の態様の例示として意図されている。当業者には明らかであるように、多くの改変および変更が、その趣旨および範囲から逸脱することなくなされ得る。本明細書に列挙されるものに加えて、本開示の範囲内の機能的に等価な方法および装置が、前述の説明から当業者には明らかであろう。そのような改変および変更は、添付の特許請求の範囲の範囲内に入るように意図される。本開示は、添付の特許請求の範囲の用語と、かかる特許請求の範囲にその権利が与えられる等価物の全範囲とによってのみ限定されるべきである。本開示は、特定の方法、試薬、化合物、組成物または生物系に限定されるものではなく、これらは当然様々であり得ることが理解されるべきである。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的とするものであり、限定するように意図されるものではないことも理解されるべきである。
【００５６】
本文書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに別のことを指示しない限り、複数の指示対象を含む。別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、当業者により一般的に理解されているのと同じ意味を有する。本開示におけるいずれのものも、先行発明であることによりそのような開示に先行する権利が本開示に記載される実施形態に与えられないことを認めるものとして解釈されるべきではない。本文書で使用される場合、用語「含む」は、「含むがこれ（ら）に限定されない」を意味する。
【００５７】
種々の組成物、方法、およびデバイスが種々の成分または工程を「含む」（「含むがこれらに限定されない」を意味すると解釈される）ことに関して記載されるが、それらの組成物、方法、およびデバイスはまた、その種々の成分および工程「から実質的になる」または「からなる」こともでき、このような用語は、実質的に限定的な構成要素の群を規定するものと解釈されるべきである。
【００５８】
本明細書における実質的に任意の複数形および／または単数形の用語の使用に関して、当業者は、文脈および／または用途に適切となるように、複数形から単数形におよび／または単数形から複数形に変換し得る。様々な単数形／複数形の置換が、理解をはっきりさせるために本明細書において明示的に示され得る。
【００５９】
一般的に、本明細書で使用される用語、特に、添付の特許請求の範囲（例えば、添付の特許請求の範囲の本体部）で使用される用語は、一般的に、「非限定的な」用語として解釈されることが当業者により理解されるであろう（例えば、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は、「含むがこれ（ら）に限定されない」として解釈されるべきであり、用語「有する」は、「少なくとも有する」として解釈されるべきであり、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」は、「含むがこれに限定されない」として解釈されるべきである、など）。さらに、導入されるクレーム記載物の特定の数が意図される場合はそのような意図はクレームに明示的に記載されており、そのような記載が存在しない場合はそのような意図が存在しないことが、当業者により理解されるであろう。例えば、理解の助けとなるものとして、以下の添付の特許請求の範囲は、クレーム記載物を導入するための導入句「少なくとも１つの」および「１つ以上の」の使用を含み得る。しかしながら、そのような句の使用は、同じクレームが「１つ以上の」または「少なくとも１つの」という導入句および「ａ」または「ａｎ」のような不定冠詞を含む場合であっても、不定冠詞「ａ」または「ａｎ」によるクレーム記載物の導入が、そのような導入されるクレーム記載物を含有する任意の特定のクレームを、そのような記載物を１つだけ含有する実施形態に限定することを含意すると解釈されるべきではなく（例えば、「ａ」および／または「ａｎ」は、「少なくとも１つの」または「１つ以上の」を意味すると解釈されるべきである）、同じことがクレーム記載物を導入するために使用される定冠詞の使用にも当てはまる。さらに、導入されるクレーム記載物の特定の数が明示的に記載されている場合であっても、そのような記載が少なくともその記載された数であることを意味すると解釈されるべきであることを、当業者は認識するであろう（例えば、他の修飾語のない「２つの記載物」という最低限の記載は、少なくとも２つの記載物、または２つ以上の記載物を意味する）。さらに、「Ａ、Ｂ、およびＣなどのうちの少なくとも１つ」に類似の慣習が使用される場合において、一般的に、そのような構文は、当業者がその慣習を理解するであろう意味で意図される（例えば、「Ａ、Ｂ、およびＣのうちの少なくとも１つを有する系」は、Ａのみを有する系、Ｂのみを有する系、Ｃのみを有する系、ＡおよびＢを共に有する系、ＡおよびＣを共に有する系、ＢおよびＣを共に有する系、ならびに／またはＡ、Ｂ、およびＣを共に有する系などを含むであろうが、これらに限定されない）。「Ａ、Ｂ、またはＣなどのうちの少なくとも１つ」に類似の慣習が使用される場合において、一般的に、そのような構文は、当業者がその慣習を理解するであろう意味で意図される（例えば、「Ａ、Ｂ、またはＣのうちの少なくとも１つを有する系」は、Ａのみを有する系、Ｂのみを有する系、Ｃのみを有する系、ＡおよびＢを共に有する系、ＡおよびＣを共に有する系、ＢおよびＣを共に有する系、ならびに／またはＡ、Ｂ、およびＣを共に有する系などを含むであろうが、これらに限定されない）。さらに、２つ以上の選択可能な用語を表す実質的に任意の離接的な語および／または句は、明細書中であろうと、特許請求の範囲中であろうと、図面中であろうと、その用語のうちの１つ、その用語のいずれか、または両方の用語を含む可能性を企図することが理解されるべきであることが、当業者により理解されるであろう。例えば、「ＡまたはＢ」という句は、「Ａ」または「Ｂ」または「ＡおよびＢ」の可能性を含むと理解されるであろう。
【００６０】
さらに、本開示の特徴または態様がマーカッシュグループに関して記載される場合、当業者は、それによって本開示がマーカッシュグループの任意の個々の構成要素または構成要素の任意のサブグループに関しても記載されていることを認識するであろう。
【００６１】
当業者により理解されるように、明細書を提供することに関してなど、あらゆる目的のために、本明細書に開示される全ての範囲は、あらゆる可能な部分範囲およびその部分範囲の組み合わせも包含する。いずれの列挙された範囲も、その同じ範囲が少なくとも２等分、３等分、４等分、５等分、１０等分などにされることを十分に説明しており、それを可能にするものとして容易に認識され得る。非限定的な例として、本明細書で述べられる各範囲は、下位の３分の１、中位の３分の１および上位の３分の１などに容易に分けられ得る。同様に当業者により理解されるように、「まで」、「少なくとも」などの全ての用語が、記載された数を含み、上で述べたように部分範囲に後に分けられ得る範囲を指す。最後に、当業者により理解されるように、範囲は各個々の構成要素を含む。したがって、例えば、１〜３個の細胞を有する群とは、１個、２個、または３個の細胞を有する群を指す。同様に、１〜５個の細胞を有する群とは、１個、２個、３個、４個、または５個の細胞を有する群を指す、などとなる。
【００６２】
上に開示した特徴および機能ならびに他の特徴および機能またはそれらの代替物のうちのいくつかは、組み合わされて、多くの他の異なる系または適用にされ得る。現在予期されないまたは予想されない様々な代替、改変、変更またはそれらにおける改善が後に当業者によりなされ得るが、その各々も、開示された実施形態に包含されるように意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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