(57)【要約】  【課題】ＨＮＶの不活化に有効なＨＮＶ不活化剤、及びそれを用いたＨＮＶの不活化方法を提供する。【解決手段】エタノール、及びアルカリ剤又は塩基性アミノ酸を含有し、エタノールの含有量が４０〜９０質量％で、アルカリ剤又は塩基性アミノ酸の含有量が０．０１〜２質量％である、ヒトノロウイルス不活化剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
エタノール、及びアルカリ剤又は塩基性アミノ酸を含有し、エタノールの含有量が４０〜９０質量％で、アルカリ剤又は塩基性アミノ酸の含有量が０．０１〜２質量％である、ヒトノロウイルス不活化剤。
【請求項２】
２５℃におけるｐＨが７以上、１３以下である請求項１記載のヒトノロウイルス不活化剤。
【請求項３】
アルカリ剤が炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸アンモニウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素アンモニウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸三カリウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、酢酸ナトリウム及び酢酸カリウムから選ばれる１種以上である、請求項１又は２記載のヒトノロウイルス不活化剤。
【請求項４】
塩基性アミノ酸がアルギニンである、請求項１〜３のいずれか１項記載のヒトノロウイルス不活化剤。
【請求項５】
有機酸を０．０１〜２質量％含有する、請求項１〜４記載のいずれか１項記載のヒトノロウイルス不活化剤。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項記載のヒトノロウイルス不活化剤をＨＮＶ汚染が懸念される対象に接触させる、ヒトノロウイルスの不活化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトノロウイルス（ＨＮＶ）の不活化剤及びその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ノロウイルスは、カリシウイルス科、ノロウイルス属に分類されているエンベロープ（膜状構造）を持たないＲＮＡウイルスであり、酸性（胃酸）に対して強い抵抗力を有し、少量（１０〜１００個程度）で感染することが知られている。
現状では、ノロウイルスに対するワクチンや治療薬は存在しないことから、ウイルスが付着し得る調理器具、衣服、手指等を洗浄・消毒することによる除ウイルスやウイルス不活性化により感染を予防することが重要である。
【０００３】
ノロウイルスは、物理化学的抵抗性が強いため、多くの細菌類に対して有効であるエタノールやカチオン界面活性剤を含む消毒剤等もノロウイルスに対しては一般的な使用法において十分な効果を得られない場合がある。そのため、ノロウイルスの不活化には、塩素系消毒剤（次亜塩素酸ナトリウム等）やヨード剤（ポビドンヨード等）、アルデヒド剤（グルタラール等）、過酢酸製剤等が使用されている。しかし、塩素系消毒剤等では繊維の色柄等を漂白する作用があり、繊維製品や衣類への使用においては制限が生じるという問題がある。
【０００４】
ところで、従来、ヒトに感染するノロウイルスは、実験室における培養系が確立されていなかったため、ノロウイルスの不活化効果を評価するために、その代替ウイルスとして、同じカリシウイルス科のネコカリシウイルス（ＦＣＶ）や、マウスノロウイルス（ＭＮＶ）が用いられていた。しかしながら、ＦＣＶは下痢症感染症でなく呼吸器感染症を引き起こすウイルスであり酸やアルカリに弱く、ＨＮＶとの違いも多数報告されている。また、ＭＮＶはＨＮＶを初めとする他のエンベロープウイルスと比較してアルコールに著しく弱いことが報告されている（非特許文献１）。実際に、非特許文献２では昨今確立されたＨＮＶの培養系において、一部の代替ウイルスにおいて効果があるように思われてきたアルコールはＨＮＶの不活化には不十分であることが報告された。
【０００５】
従来、エタノールとアミノ酸とアルカリ剤とを含む組成物が、ＦＣＶやＭＮＶに対して高いウイルス不活性化効果を示すがエタノールとアルカリ剤の併用ではウイルス不活性化効果は十分でないこと（特許文献１）、またエタノールとアルカリ性物質とカチオン界面活性剤とを含む組成物がＦＣＶに対して高いウイルス不活性化効果を示すがエタノールとアルカリ剤の併用ではウイルス不活性化効果は十分でないこと（特許文献２）が知られているが、上記の報告を勘案すれば、ＦＣＶやＭＮＶを用いてなされたこれらの評価が、ＨＮＶを用いて行った場合に同様の結果が得られるかは確かではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特許６５３１２３４号公報
【特許文献２】特開２００８−１８９６４５号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Cromeans Theresa et al., Appl. Environ. Microbiol. 80.18 (2014): 5743-5751.
【非特許文献２】Costantini, Veronica, et al. "Human norovirus replication in human intestinal enteroids as model to evaluate virus inactivation." Emerging infectious diseases 24.8 (2018): 1453.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、ＨＮＶの不活化に有効なＨＮＶ不活化剤、及びそれを用いたＨＮＶの不活化方法を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
２０１６年に、腸管上皮と似た三次元構造体であるヒト小腸オルガノイドｈＳＩＯ：ｈｕｍａｎ Ｓｍａｌｌ Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ Ｏｒｇａｎｏｉｄを用いてＨＮＶの培養に成功したこと（Science,353(6306),1387-1393,2016 Sep23）を受け、本発明者らは、ｈＳＩＯを立体培養し３Ｄオルガノイドを得た後に、３Ｄオルガノイドを分散させて単一細胞を調整し、前記単一細胞を細胞外マトリクス上で単層培養・分化誘導して得られる腸管オルガノイドにＨＮＶを感染させた評価系を構築し、これを用いてＨＮＶの不活化に有効な素材を探索したところ、従来ＦＣＶやＭＮＶを用いた評価では十分なウイルス不活化効果が得られないとされていたアルコール系組成物が、ＨＮＶに対して優れた不活化効果を発揮することを見出した。
【００１０】
すなわち、本発明は、以下の１）及び２）に係るものである。
１）エタノール、及びアルカリ剤又は塩基性アミノ酸を含有し、エタノールの含有量が４０〜９０質量％で、アルカリ剤又は塩基性アミノ酸の含有量が０．０１〜２質量％である、ヒトノロウイルス不活化剤。
２）１）のＨＮＶ不活化剤をＨＮＶ汚染が懸念される対象に接触させる、ＨＮＶの不活化方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、衣類、繊維品、調理器具等に付着したＨＮＶを確実に不活化でき、ＨＮＶ感染の拡大を防止又は低減することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明のＨＮＶ不活化剤は、エタノール、及びアルカリ剤又は塩基性アミノ酸を含有する。
本発明のＨＮＶ不活化剤中におけるエタノールの含有量は、ＨＮＶ不活化効果の点から、４０質量％以上であって、好ましくは４５質量％以上、より好ましくは５０質量％以上であり、また、９０質量％以下であって、好ましくは８０質量％以下、より好ましくは７５質量％以下である。また、４０〜９０質量％、好ましくは４５〜８０質量％、より好ましくは５０〜７５質量である。
【００１３】
原料エタノールとしては、発酵エタノール、合成エタノール、バイオエタノール、精製エタノール等の通常のものを使用可能であるが、消毒殺菌用途に応じた安全性を担保できる品質のものを採用することが好適である。
【００１４】
本発明のＨＮＶ不活化剤は、更にアルカリ剤又は塩基性アミノ酸を含む。アルカリ剤又は塩基性アミノ酸を配合することによりエタノールのウイルス不活性化効果が向上する。
アルカリ剤としては、炭酸塩、炭酸水素塩、リン酸二水素塩、リン酸水素二塩、リン酸三塩、アルカリ金属の水酸化物（例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等）及びアルカリ土類金属の水酸化物（例えば水酸化マグネシウム、水酸化カルシウム等）、アルカリ金属カルボン酸塩（例えば酢酸ナトリウム、酢酸カリウム等）等から選ばれる１種以上が挙げられる。このうち、炭酸塩、炭酸水素塩、リン酸二水素塩、リン酸水素二塩、リン酸三塩から選ばれる１種以上であるのが好ましい。
また、塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩又はアンモニウム塩等が挙げられる。
【００１５】
アルカリ剤として、より具体的には、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸アンモニウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素アンモニウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸三カリウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム等が挙げられ、このうち、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸三カリウム、リン酸水素二ナトリウム及び酢酸ナトリウムから選ばれる１種以上が好ましく、より好ましくは、炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウムである。
【００１６】
塩基性アミノ酸としては、遊離の塩基性アミノ酸が挙げられ、具体的にはアルギニン、ヒスチジン及びリシンから選択される１種以上が挙げられるが、少なくともアルギニンを含むのが好ましい。
【００１７】
本発明のＨＮＶ不活化剤中のアルカリ剤又は塩基性アミノ酸の含有量は、ＨＮＶ不活化効果の点から、０．０１質量％以上、好ましくは０．０３質量％以上、より好ましくは０．１質量％以上であり、また、２質量％以下、好ましくは１．５質量％以下、より好ましくは１質量％以下である。また、０．０１〜２質量％、好ましくは０．０３〜１．５質量％、より好ましくは０．１〜１質量％である。
【００１８】
本発明のＨＮＶ不活化剤において、エタノールとアルカリ剤又は塩基性アミノ酸の質量比は、アルカリ剤又は塩基性アミノ酸／エタノールが、０．０００１〜０．１、好ましくは０．０００１〜０．０７、より好ましくは０．０００１〜０．００５である。
【００１９】
本発明のＨＮＶ不活化剤は、さらに酸剤を含むことができる。
酸剤としては、クエン酸、リンゴ酸、乳酸、酒石酸、フィチン酸、アジピン酸、グルコン酸及びコハク酸等の有機酸やリン酸等の無機酸から選ばれる１種以上が挙げられる。酸剤を含むことで、ウイルス不活性化効果の向上、ウイルス不活性化剤のｐＨ調整が容易となる。
【００２０】
ＨＮＶ不活化剤中の上記酸剤の含有量は、皮膚へのダメージの点から、好ましくは０．０１質量％以上、より好ましくは０．０３質量％以上、より好ましくは０．０５質量％以上であり、また、好ましくは２質量％以下、より好ましくは１質量％以下、より好ましくは０．５質量％以下である。また、好ましくは０．０１〜２質量％、より好ましくは０．０３〜１質量％、より好ましくは０．０５〜０．５質量％である。
【００２１】
また、本発明のＨＮＶ不活化剤は、ノロウイルス不活化効果の向上や持続性を図る点から、界面活性剤を含有することができる。
界面活性剤としては、グリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル等が挙げられる。
【００２２】
本発明のＨＮＶ不活化剤中における界面活性剤の含有量は、ウイルス除去性を確保する観点から、好ましくは０．０１質量％以上であって、より好ましくは０．０３質量％以上、より好ましくは０．０５質量％以上であり、また、好ましくは３質量％以下であって、より好ましくは２質量％以下、より好ましくは１質量％以下、更に好ましくは０．５質量％以下である。また、好ましくは０．０１〜３質量％、より好ましくは０．０３〜２質量％、より好ましくは０．０５〜１質量％、更に好ましくは０．０５〜０．５質量％である。
【００２３】
本発明のＨＮＶ不活化剤では、組成物のｐＨは、特に限定されないが、ＨＮＶ不活化効果の点から、２５℃におけるｐＨが、好ましくは７以上、より好ましくは８以上、より好ましくは９以上で、好ましくは１３以下、より好ましくは１２以下、より好ましくは１１以下である。また、好ましくは７〜１３、より好ましくは８〜１２、より好ましくは９〜１１である。ｐＨの調整は、上記アルカリ剤又は塩基性アミノ酸、酸剤及び無機塩等の配合比率を変えることにより行うことができる。
【００２４】
また、本発明のＨＮＶ不活化剤は、各種無機塩を含んでいてもよい。
無機塩としては、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、塩化アンモニウム、臭化ナトリウム、臭化カリウム、臭化カルシウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸アンモニウム、硫酸鉄、硫酸銅、硫酸アルミニウムカリウム、硫酸アルミニウムアンモニウム、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム、硝酸アンモニウム、亜硝酸ナトリウム、亜硝酸カリウム、亜硝酸アンモニウム、チオシアン酸ナトリウム、チオシアン酸カリウム、チオシアン酸アンモニウム、ヨウ化ナトリウム等が挙げられる。
【００２５】
また、本発明のＨＮＶ不活化剤は、上記の成分以外に、例えば、キレート剤、シリコーン類、増粘剤、油分、天然抽出物、色素、香料等の添加剤を適宜配合することができる。
【００２６】
エタノール、及びアルカリ剤又は塩基性アミノ酸を含有する組成物は、後述する実施例に示すとおり、ＨＮＶに対して優れたウイルス不活性化効果を示す。したがって、当該組成物はＨＮＶを不活化するためのＨＮＶ不活化剤となり得る。そして、当該ＨＮＶ不活化剤を、ＨＮＶ汚染が懸念される対象に適用することにより、当該対象物に対してＨＮＶの不活化が可能となる。
ノロウイルスは、ゲノム塩基配列の相同性に基づき７つの遺伝子群（ｇｅｎｏｇｒｏｕｐ、ＧＩ〜ＧVII）に分けられ、ヒトに感染するＨＮＶはＧＩ９種（ＧＩ.1、ＧＩ.２、ＧＩ.３、ＧＩ.４、ＧＩ.５、ＧＩ.６、ＧＩ.７、ＧＩ.８、ＧＩ.９）、ＧII１９種（ＧII.１、ＧII.２、ＧII.３、ＧII.４、ＧII.５、ＧII.６、ＧII.７、ＧII.８、ＧII.９、ＧII.１０、ＧII.１２、ＧII.１３、ＧII.１４、ＧII.１５、ＧII.１６、ＧII.１７、ＧII.２０、ＧII.２１、ＧII.２２）、ＧIV１種（ＧIV.１）であるが、本発明におけるＨＮＶは、これらのいずれの遺伝子型のものであっても良い。
本発明において、ＨＮＶ不活化効果は、ヒト小腸オルガノイド（ｈＳＩＯ）を細胞外マトリクス上で三次元培養後、分化誘導して得られる腸管オルガノイドにＨＮＶを感染させた系により評価できる（実施例参照）。
【００２７】
本発明のＨＮＶ不活化剤を用いたＨＮＶの不活化は、ＨＮＶ汚染が懸念される対象、例えば、台所（厨房の床、壁等の厨房スペース等）、流し台、冷蔵庫等の食品を取り扱う場所、包丁、鍋等の調理器具、皿等の食器類、冷蔵庫、トイレ、バス、洗面所、居室、寝室等の居住空間、ソファー、クッション、寝具、カーテン等の繊維製品等に対して、これらに接触させることにより用いることができる。ここで、接触は、特に限定するものではなく、本発明のＨＮＶ不活化剤を対象へ直接かけること、トリガーやエアゾール等の噴霧装置に充填し噴霧することなどが挙げられる。
接触時間は限定されないが、例えば好ましくは５秒以上、より好ましくは１０秒以上、より好ましくは３０秒以上、より好ましくは６０秒以上で、好ましくは６０分以下放置することが挙げられる。
【００２８】
本発明のＨＮＶ不活化剤を接触させるに際しての使用形態に特に制限はない。例えば、液状、ゲル状、又はペースト状とすることができる。
液状の場合には、特にスプレー、ローション等として用いることができる。例えば、トリガースプレー容器（直圧又は蓄圧型）やディスペンサータイプのポンプスプレー容器等の公知のスプレー容器に充填し、噴霧量を調整して、ウイルスが存在する、又は存在すると考えられる場所に噴霧できるようにしたもの等が挙げられる。
【００２９】
また、ウェット拭取り用品（ぬれナプキン等）として使用することもできる。例えば、天然繊維、レーヨン等の再生繊維、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル等の合成繊維、又は天然繊維と合成繊維との混合物の織布又は不織布ウェブを含む基材に、本発明のＨＮＶ不活化剤、可溶化キャリア、及び必要に応じて各種添加剤を含ませて使用することができる。具体的には、ペットの手入れ用品、家庭の台所やバスルーム等の表面、運動器具等の表面の殺菌等に使用することができる。また、手洗い液、中性洗剤、消臭剤、皮膚コンディショナー等に加えて使用することもできる。
【００３０】
水溶性ゲルや油性ゲルを用いてゲル状にしたり、ペースト状とした場合には、医療用品として、人体、ペット等に直接塗布して使用したり、紙や不織布等に担持させたものを、空気清浄器のフィルターとして用いることもできる。
【００３１】
さらに、本発明のＨＮＶ不活化剤を樹脂に混練して使用することもできる。混練しうる樹脂としては、天然系、石油系、合成系のワックス、ロジン系樹脂、エチレン−酢酸ビニル共重合体、エチレン−ビニルアルコール共重合体、ポリエステル、ポリオレフィン、アクリル系樹脂等の合成樹脂等が挙げられる。
上記の混練物は、そのまま用いることもできるし、多孔質担体に担持させたり、シート状にしたり、該シート状物を積層体にして用いることもできる。多孔質担体としては、例えば、セルロース、キトサン等の天然高分子、上記の合成樹脂、ケイ酸カルシウム等の無機多孔性物質等を、粒状、シート状等の任意の形状にしたものが挙げられる。上記の混練物や積層体は、例えば、空調設備、トイレ、浴室、居間、病室、病院の待合室、ダストボックス等に設置して、抗ウイルス剤組成物を徐々に揮散させながら利用することもできる。
【実施例】
【００３２】
表１及び２に示す処方に従い、エタノール、アルカリ剤又は塩基性アミノ酸、及びその他の成分を混合して本発明組成物（実施例１〜２４）及び比較組成物（比較例１〜８）を調製した。なお、表中の単位は「質量％」である。
各組成物について、以下に示す方法により、ＨＮＶ及びＦＣＶに対する不活化効果を評価した。結果を表１及び２に併せて示す。
【００３３】
【表１】
2022001555.tif 000002
【００３４】
【表２】
2022001555.tif 000003
【００３５】
＜評価法＞
１．ＨＮＶ不活化効果の評価
（１）ｈｕｍａｎ  Ｓｍａｌｌ  Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ  Ｏｒｇａｎｏｉｄ（ｈＳＩＯ）の培養
ｈＳＩＯは２４ウェルプレート上でマトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ，  ３５６２３１）に包埋し３Ｄ培養した。培地はＩｎｔｅｓｔｉＣｕｌｔ  Ｏｒｇａｎｏｉｄ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｈｕｍａｎ）（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＳＴ−０６０１０）を用いた。培地交換・継代・９６ウェルプレートを用いた単層化の手技はユーザーマニュアルに従った。トリプシン処理後２日間はアノイキスを阻害するために培地に終濃度１０μＭとなるようにＲＯＣＫ（Ｒｈｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｋｉｎａｓｅ／Ｒｈｏ結合キナーゼ）阻害剤であるＣｕｌｔｕｒｅＳｕｒｅ  Ｙ−２７６３２（富士フィルム和光純薬，０３６−２４０２３）を添加した。５００ｍＬのＡｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ，１２６３４０１０）に５ｍＬのＧｌｕｔａＭＡＸ  Ｉ（１００×）（Ｇｉｂｃｏ，  ３５０５０−０６１）、５ｍＬの１Ｍ  ＨＥＰＥＳ（Ｇｉｂｃｏ，１５６３００８０）、５ｍＬのＰｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｇｉｂｃｏ，１５１４０１２２）を添加することで基本培地を作成した。基本培地とＩｎｔｅｓｔｉＣｕｌｔ  Ｏｒｇａｎｏｉｄ  Ｇｒｏｗｔｈ  ＭｅｄｉｕｍのコンポーネントＡとを等量混合することで分化培地を作成した。９６ウェルプレートで単層化させた細胞に分化培地を１ｗｅｌｌあたり２００μＬずつ２日間隔で交換しながら計６日間分化を誘導した。
【００３６】
（２）ＨＮＶ（ＨｕＮｏＶ）含有糞便の１０％乳剤の作成
糞便の１０％乳剤はＧII．４型のＨＮＶ罹患者糞便から作成した。プロテアーゼ阻害剤であるｃＯｍｐｌｅｔｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌ  ｔａｂｌｅｔｓ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，１１６９７４９８００１）１錠を５０ｍＬのＤ−ＰＢＳ（−）に懸濁した。糞便１ｇに対して１０ｍＬのｃＯｍｐｌｅｔｅ含有Ｄ−ＰＢＳ（−）で懸濁し、試験管ミキサーでよく混合した。４℃で２０分間静置した後に、２，０００×ｇ  ４℃で１０分間遠心した。上清を新たなチューブに回収し、感染実験に供するまで−８０℃に保存した。
【００３７】
（３）ＨＮＶの不活化処理と分化ｈＳＩＯへの感染
ＨＮＶ含有１０％糞便乳剤を分化培地で１０倍に希釈し、１ｍＬのシリンジとＭｉｌｌｅｘ  ＨＶ  Ｆｉｌｔｅｒ  ｕｎｉｔ  （Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＳＬＨＶＲ０４ＮＬ）を用いて濾過した。ＰＡ微量遠心チューブ（Ｂｅｃｋｍａｎ  ｃｏｕｌｔｅｒ，３５７４４８）中で濾過した糞便溶液５μＬ（２．８×１０６  ＨＮＶ  ｇｅｎｏｍｅ  ｃｏｐｙ相当）と表１に示す所定の組成物の懸濁液（処理液）４５μＬとを混合し室温で、６０秒間反応させた。次いでこの薬剤処理された糞便溶液に、１ｍｇ／ｍＬのｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ,Ａ９６４７）を含む基本培地  １．４５ｍＬを添加した。遠心チューブを固定角ロータＴＬＡ−５５（Ｂｅｃｋｍａｎ  ｃｏｕｌｔｅｒ）にセットしＯｐｔｉｍａ  ＭＡＸ−ＴＬ（Ｂｅｃｋｍａｎ  ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いてＲｍａｘにおいて１８６０４７×ｇの遠心力（５５，０００ｒｐｍ相当）で１．５時間超遠心した後に上清を除去した。ペレットを１００μＬの分化培地で懸濁し、ｈＳＩＯへの感染溶液とした。ウェル中の既存の培地を除去した６〜７日間分化誘導後のｈＳＩＯに上述の方法で調製した感染溶液をアプライした。インキュベートは３７℃で３時間実施した。３００μＬの基本培地で３回洗浄した後に、終濃度が１２５ｐｐｍとなるようにブタ胆汁抽出物（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｂ８６３１−１００Ｇ）を加えた分化培地を２５０μＬ添加し３７℃  ５％ＣＯ２の条件下でサンプリングのタイミングまで培養した。培養開始直後（ｄａｙ  ０）と培養３日後（ｄａｙ  ３）に１０μＬの上清を回収した。回収した上清はＲＴ−ｑＰＣＲに供するまで−８０℃で保存した。尚、薬剤溶液に代わり基本培地を用いて同様の操作を行い調製したｈＳＩＯへの感染溶液を薬剤非処理のコントロールとした。
【００３８】
（４）ＲＴ−ｑＰＣＲ
回収した上清中のＨＮＶ  ｇｅｎｏｍｅ  ｃｏｐｙ数の定量にはノロウイルス検出キット  Ｇ１／Ｇ２（東洋紡，ＦＩＫ−２７３）を用いた。操作はプロトコールに従った。ＰＣＲ増幅とデータ測定はＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０II（Ｒｏｃｈｅ）を用いた。
測定されたウイルス量に基づき、Ａ：ＨＮＶが検出下限にまで不活化されている、Ｂ：ＨＮＶを検出するがコントロール（薬剤処理無し）よりも減少、Ｃ：コントロール（薬剤処理無し）と同等にＨＮＶが増殖している、の３段階で評価した。
【００３９】
２．ＦＣＶ不活化効果の評価
ウイルスの不活性化評価の標準法として一般的に知られている「平成２７年度ノロウイルスの不活化条件に関する調査報告書」（国立医薬品食品衛生研究所）とＪＩＳ Ｌ １９２２を参考に行った。
５００μＬ容サンプルチューブにて、表１に示す所定の組成物の懸濁液（処理液）２７μＬと１．０×１０７ＰＦＵ／ｍＬに調整したネコカリシウイルス液（Ｆ−９株、ＡＴＣＣ  ＶＲ−７８２）を３μＬを入れ、よく混合した。３０秒経過後に、クエンチ液（Ｄ／Ｅ  Ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  Ｂｒｏｔｈ）で１／１０希釈して反応を停止した。尚、ブランクとして、処理液の代わりにＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）２７μＬを用い同様の操作を行った。反応停止後、混合物をＤＭＥＭ培地（ダルベッコ改変イーグル培地）でさらに１／１０希釈し、その０．５ｍＬを、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で洗ったＣＲＦＫ細胞（ネコ腎由来株化細胞）（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−９４）に感染させ、１時間後にメチルセルロース含有培地に置換した。２日後に、それぞれの所定時間のサンプルをクリスタルバイオレットで細胞を染色し、プラーク数をカウントして、対数減少量を求めた。
対数減少量＝ｌｏｇ（ブランクのプラーク数）−ｌｏｇ（試験サンプルのプラーク数）  本明細書において対数減少量は、例えば、対数減少量＝４の場合、Δ４ｌｏｇと表記する。判定基準は、以下の通りとし、結果を表１及び２に示した。
＜判定基準＞
４：プラークが1点も存在しない（検出下限以下：Δ４ｌｏｇよりも大きい）
３：Δ２〜３ｌｏｇ
２：Δ１〜２ｌｏｇ
１：Δ１ｌｏｇ未満