(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料内の物質の有無を判定する方法であって、前記方法が、
前記試料内の物質に結合し得る結合剤が固定された基板表面に前記試料を供するステップ、
結合剤が固定された前記基板の少なくとも一部分から未結合材料を除去するステップ、ならびに
前記基板上に固定された前記結合剤に結合した物質を検出したことに応答して、前記試料内に存在する前記物質を同定するステップ、および
前記基板上に固定された前記結合剤に結合した物質を検出しなかったことに応答して、前記物質が前記試料内に存在しないと判定するステップ
を含み、
前記基板表面に前記試料を供するステップが、前記基板の少なくとも一部分から未結合材料を除去するステップと同時であり、
前記基板表面に前記試料を供するステップおよび前記基板の少なくとも一部分から未結合材料を除去するステップが、流体力学的流動閉じ込めディスペンサーで行われ、
前記ディスペンサーが、複数のマイクロチャネルを有するマイクロ流体プローブである、方法。
【請求項２】
前記ディスペンサーが、前記マイクロ流体プローブのアレイである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記マイクロチャネルは、赤血球をサイズに基づいて排除する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記マイクロチャネルが、６マイクロメートル未満の直径を有する断面を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記マイクロチャネルが、４マイクロメートル未満の直径を有する断面を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記マイクロチャネルが、２マイクロメートル未満の直径を有する断面を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記マイクロチャネルの直径が、１〜２マイクロメートルの直径を有する断面を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
前記基板表面が湿っている、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記基板表面に試料を供するステップが、１つまたは複数の試料を少なくとも１つの別々のパスにそれぞれ分配するステップを含む、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記パスが直線である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記パスが２５ナノメートルから５００マイクロメートルの幅である、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記基板表面に試料を供するステップが、１つまたは複数の試料を少なくとも１つの別々のスポットにそれぞれ分配するステップを含む、請求項１から１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記試料が血液試料を含む、請求項１から１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記試料が、全血、赤血球、血漿、血清、および唾液からなる群から選択される成分を含む、請求項１から１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記結合剤が、赤血球の表面に結合した抗原に対する１つまたは複数の抗体を含む、請求項１から１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記結合剤が、１つまたは複数の非変性または溶血表現型の赤血球を含む、請求項１から１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記結合剤が、１つまたは複数の組換え抗原を含む、請求項１から１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記結合剤が、赤血球抗原に対する１つまたは複数の抗体、および１つまたは複数の非変性または溶血表現型の赤血球を含む、請求項１から１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記結合剤が別々の線上に固定されている、請求項１から１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記結合剤が別々のスポットに固定されている、請求項１から１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記結合剤が１〜５０の結合剤である、請求項１から２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記物質が、赤血球抗原に対する１つまたは複数の抗体を含む、請求項１から２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記物質が、１つまたは複数の赤血球抗原を含む、請求項１から２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記基板が、ポリエチレンテレフタレート、ポリプロピレン、ポリスチレン、デキストランポリマー、デンドリマー、オリゴヌクレオチド、ポリカーボネート、プラスチック、ガラス、シリコン、酸化シリコン、金属および金属酸化物、ならびにポリマー官能化された金属および金属酸化物、ＰＶＤＦ、ニトロセルロース、ナイロン、ならびにポリスルホンからなる群から選択される少なくとも１つの材料で形成される、請求項１から２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
試料内の物質に結合し得る結合剤が別々の場所に固定された基板と、
前記試料を前記基板上に分配しつつ同時に前記基板から未結合材料を除去するように構成された流体力学的流動閉じ込めディスペンサーであって、前記ディスペンサーは複数のマイクロチャネルを有するマイクロ流体プローブである、前記ディスペンサーと、
前記基板を照らすように構成された光源と、
前記結合剤に結合した前記物質の有無を検出するように構成された検出器と
を含む系。
【請求項２６】
前記ディスペンサーが、前記マイクロ流体プローブのアレイである、請求項２５に記載の系。
【請求項２７】
前記マイクロチャネルは、赤血球をサイズに基づいて排除する、請求項２５または２６に記載の系。
【請求項２８】
前記マイクロチャネルが、６マイクロメートル未満の直径を有する断面を含む、請求項２７に記載の系。
【請求項２９】
前記マイクロチャネルが、４マイクロメートル未満の直径を有する断面を含む、請求項２７に記載の系。
【請求項３０】
前記マイクロチャネルが、２マイクロメートル未満の直径を有する断面を含む、請求項２７に記載の系。
【請求項３１】
前記マイクロチャネルの直径が、１〜２マイクロメートル未満の直径を有する断面を含む、請求項２７に記載の系。
【請求項３２】
前記基板が、ポリエチレンテレフタレート、ポリプロピレン、ポリスチレン、デキストランポリマー、デンドリマー、オリゴヌクレオチド、ポリカーボネート、プラスチック、ガラス、シリコン、酸化シリコン、金属および金属酸化物、ならびにポリマー官能化された金属および金属酸化物、ＰＶＤＦ、ニトロセルロース、ナイロン、ならびにポリスルホンからなる群から選択される少なくとも１つの材料で形成される、請求項２５から３１のいずれか１項に記載の系。
【請求項３３】
ドナーの赤血球に結合し得る結合剤が固定された基板表面にドナーの赤血球を供するステップ、
結合剤が固定された前記基板の少なくとも一部分から未結合のドナー赤血球を除去するステップであって、前記基板表面に前記ドナー赤血球を供するステップが、前記基板の少なくとも一部分から未結合のドナー赤血球を除去するステップと同時である、ステップ、
患者の血漿を前記ドナー赤血球の上に載せるステップ、
患者の前記血漿の未結合部分を除去するステップであって、患者の血漿を載せるステップが、患者の前記血漿の未結合部分を除去するステップと同時である、ステップ、
前記ドナー赤血球に結合した抗体を検出したことに応答して、前記抗体が患者の前記血漿内に存在すると判定するステップ、および
前記ドナーの赤血球に結合した抗体を検出しなかったことに応答して、前記抗体が患者の前記血漿内に存在しないと判定するステップ、
を含む、クロスマッチングの方法であって、
前記基板表面に前記ドナー赤血球を供するステップと前記基板の少なくとも一部分から未結合のドナー赤血球を除去するステップは、流体力学的流動閉じ込めディスペンサーで行われ、
前記ディスペンサーは複数のマイクロチャネルを有するマイクロ流体プローブである、前記方法。
【請求項３４】
ドナーの赤血球を供するステップ、未結合のドナー赤血球を除去するステップ、患者の血漿を載せるステップ、および患者の血漿の未結合部分を除去するステップが、マイクロ流体プローブで行われる、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記ドナー赤血球が非変性または溶血表現型の赤血球である、請求項３３または３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記結合剤が、結合型レクチンまたはユニバーサル抗赤血球抗体を含む、請求項３３から３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
ドナー赤血球が別々の場所に固定された基板と、
ドナー赤血球または患者の血漿を前記基板上に分配しつつ同時に未結合のドナーＲＢＣまたは患者の前記血漿の未結合部分を前記基板から除去するように構成された流体力学的流動閉じ込めディスペンサーであって、前記ディスペンサーは複数のマイクロチャネルを有するマイクロ流体プローブである、前記ディスペンサーと、
前記基板を照らすように構成された光源と、
前記ドナー赤血球に結合した抗体の有無を検出するように構成された検出器と
を含む、クロスマッチングのための系。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、全体として、血液試料などの患者の試料の分析に関する。
【背景技術】
【０００２】
数百万人が毎年献血を行っている。ドナーの血液がレシピエントに輸血され得る前に、血液は型判定されなければならない。典型的には、血液は、ＡＢＯおよびＲＨ１（Ｒｈｅｓｕｓ  Ｄ抗原）血液型について試験され、臨床上重要な同種免疫抗体についてスクリーニングされる。血液型を判定するために、赤血球（red blood cells）（ＲＢＣまたは赤血球（erythrocytes））を抗Ａ、抗Ｂ、抗ＡＢ、および抗Ｄ抗体と別々に反応させる。このタイプの試験は、抗原型判定（例えば、グループ判定および表現型判定）として知られている。同一の血液試料から得た血清／血漿はまた、Ａ型およびＢ型試薬ＲＢＣ、ならびに臨床上重要な抗原のほとんどを持つ、少なくとも２つの異なるＯ型試薬細胞により個別に試験される。Ａ型およびＢ型試薬ＲＢＣによる試験のタイプはリバース型判定として知られており、Ｏ型試薬細胞による試験のタイプは抗体スクリーニングとして知られている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
１億５千万を超える試験が毎年、血液センターにおいて行われ、血液型および血清／血漿における臨床上重要な抗体が判定されている。通常、輸血は緊急の状況において必要とされ、この場合、可能な限り短い時間でドナーとレシピエントとの間の適合性を判定することが望ましい。複数の試料を一度に試験でき、迅速な試験結果を提供し得る、血液型判定の自動ハイスループット系および方法が、したがって望まれている。さらに、患者の血液試料をあまり要しないことも望ましい。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
一実施形態において、試料内の物質の有無を判定する方法が開示される。この方法は、試料内の物質に結合し得る結合剤が固定された基板表面に試料を供するステップ、結合剤が固定された基板の少なくとも一部分から未結合材料を除去するステップ、ならびに、基板上に固定された結合剤に結合した物質を検出したことに応答して、試料内に存在する物質を同定するステップ、および基板上に固定された結合剤に結合した物質を検出しなかったことに応答して、物質が試料内に存在しないと判定するステップを含み、ここで、基板表面に試料を供するステップは、基板の少なくとも一部分から未結合材料を除去するステップと同時である。基板表面に試料を供するステップおよび基板の少なくとも一部分から未結合材料を除去するステップは、流体力学的流動閉じ込めディスペンサーで行うことができる。一実施形態において、流体力学的流動閉じ込めディスペンサーは、マイクロ流体プローブである。一実施形態において、流体力学的流動閉じ込めディスペンサーは、複数のマイクロチャネルを有するマイクロ流体プローブである。別の実施形態において、流体力学的流動閉じ込めディスペンサーは、マイクロ流体プローブのアレイである。
【０００５】
一部の実施形態において、試料内の物質の有無を判定するための系（system）は、試料内の物質に結合し得る結合剤が別々の場所に固定された基板；試料を基板上に同時に分配し、未結合材料を基板から除去するように構成されたディスペンサー；基板を照らすように構成された光源；および結合剤に結合した物質の有無を検出するように構成された検出器を含む。
【０００６】
さらに、本明細書において、血液分析系、およびこれらの系を用いて血液試料を分析する方法が開示される。より具体的には、本開示は、赤血球型および表現型を検出する（抗原型判定）ための、典型的な抗赤血球抗体のリバース型判定および典型的ではない抗赤血球抗体（抗体スクリーニング）をスクリーニングおよび同定するための、ドナーとレシピエントとの間の適合性を判定する（クロスマッチング）ための、ならびに抗体および／または活性血清補体画分で被覆された赤血球を実証する（例えば直接抗グロブリン試験）ための、系および方法に関する。
【０００７】
一部の実施形態において、流体力学的流動閉じ込めディスペンサーは、全血試料内の赤血球から血漿を分離するための構造を含む。血漿から赤血球を分離するための一実施形態において、マイクロチャネルは６マイクロメートル未満の直径を有する。一部の実施形態において、直径は４マイクロメートル未満、または２マイクロメートル未満、または１〜２マイクロメートルである。マイクロチャネルの断面は、長方形、四角形、円形、長円形、および楕円形を含むあらゆる適切な形状、またはそれらの組み合わせであってよい。
【０００８】
一部の実施形態において、基板表面は湿っている。一実施形態において、基板表面に試料を供する（applying）ステップは、１つまたは複数の試料を少なくとも１つの別々のパスにそれぞれ分配するステップを含む。ある特定の実施形態において、パスは直線である。一部の実施形態において、パスは、約２５ナノメートルから約５００マイクロメートルの幅である。一実施形態において、基板表面に試料を供するステップは、１つまたは複数の試料を少なくとも１つの別々のスポットにそれぞれ分配するステップを含む。一部の実施形態において、少なくとも１つの別々のスポットは、約２５ナノメートルから約５００マイクロメートルの直径である。一部の実施形態において、試料は、全血、赤血球、血漿、血清、および唾液からなる群から選択される。
【０００９】
一実施形態において、１つまたは複数の結合剤は、１つまたは複数の抗体もしくはその断片、または赤血球抗原に特異的な一部のレクチンを含み、検出される試料内の物質は赤血球抗原である。
【００１０】
別の実施形態において、１つまたは複数の結合剤は、１つもしくは複数の非変性または溶血表現型の赤血球、化学合成されたポリペプチドおよび多糖血液型抗原、組換え赤血球抗原、または赤血球膜抽出物を含み、物質は、赤血球抗原、組換え赤血球抗原、または赤血球膜抽出物に対する１つまたは複数の抗体またはその断片である。
【００１１】
さらに別の実施形態において、結合剤は、複数部分からなる結合剤である。基板上に載せた第１の部分は、レクチン、または赤血球抗原に対する１つもしくは複数の抗体もしくはその断片を含む。抗体は、赤血球に対するユニバーサル抗体である。基板上に載せた結合剤の第２の部分は、潜在的血液ドナーの表現型判定されたまたは表現型判定されていない赤血球であり、結合剤に結合している。物質は、輸血を必要とする患者の血漿であり、患者の血漿内の抗体またはその断片は、ドナーの赤血球に結合する。
【００１２】
さらに別の実施形態において、１つまたは複数の結合剤は、ヒト免疫グロブリンおよび／または活性血清補体画分に対する１つまたは複数の抗体またはその断片を含み、物質は、抗体および／または活性血清補体画分で被覆された赤血球である。
【００１３】
一部の実施形態において、１つまたは複数の結合剤は、別々の線上に固定されている。一部の実施形態において、１つまたは複数の結合剤は、別々のスポットに固定されている。一部の実施形態において、１〜１００の結合剤が基板表面に結合している。
【００１４】
抗体スクリーニング、抗原型判定（直接抗グロブリン試験を含む）、およびクロスマッチングのための系であって、この系は、試料内の物質に結合し得る結合剤が別々の場所に固定された基板；試料を基板上に同時に分配し、未結合材料を基板から除去するように構成されたディスペンサー；基板を照らすように構成された光源；および結合剤に結合した物質の有無を検出するように構成された検出器を含む。
【００１５】
一部の実施形態において、クロスマッチングのための系は、ドナーの赤血球が別々の場所に固定された基板；ドナーの赤血球および／または患者の血漿を基板上に分配し、未結合のドナー赤血球または患者血漿の未結合部分を基板から同時に除去するように構成されたディスペンサー；基板を照らすように構成された光源；ならびにドナーの赤血球に結合した抗体の有無を検出するように構成された検出器を含む。
【００１６】
項目１．試料内の物質の有無を判定する方法であって、前記方法が、
試料内の物質に結合し得る結合剤が固定された基板表面に試料を供するステップ、
結合剤が固定された基板の少なくとも一部分から未結合材料を除去するステップ、ならびに
基板上に固定された結合剤に結合した物質を検出したことに応答して、試料内に存在する物質を同定するステップ、
および基板上に固定された結合剤に結合した物質を検出しなかったことに応答して、物質が試料内に存在しないと判定するステップ
を含み、基板表面に試料を供するステップが、基板の少なくとも一部分から未結合材料を除去するステップと同時である、方法。
【００１７】
項目２．基板表面に試料を供するステップおよび基板の少なくとも一部分から未結合材料を除去するステップが、流体力学的流動閉じ込めディスペンサーで行われる、項目１に記載の方法。
【００１８】
項目３．ディスペンサーがマイクロ流体プローブである、項目２に記載の方法。
【００１９】
項目４．ディスペンサーが、複数のマイクロチャネルを有するマイクロ流体プローブである、項目３に記載の方法。
【００２０】
項目５．ディスペンサーが、マイクロ流体プローブのアレイである、項目３または４に記載の方法。
【００２１】
項目６．ディスペンサーが、赤血球をサイズに基づいて排除するマイクロチャネルを有するマイクロ流体プローブである、項目３から５のいずれか１項に記載の方法。
【００２２】
項目７．マイクロチャネルが、６マイクロメートル未満の直径を有する断面を含む、項目６に記載の方法。
【００２３】
項目８．マイクロチャネルが、４マイクロメートル未満の直径を有する断面を含む、項目６に記載の方法。
【００２４】
項目９．マイクロチャネルが、２マイクロメートル未満の直径を有する断面を含む、項目６に記載の方法。
【００２５】
項目１０．マイクロチャネルの直径が、１〜２マイクロメートルの直径を有する断面を含む、項目６に記載の方法。
【００２６】
項目１１．基板表面が湿っている、項目１から１０のいずれか１項に記載の方法。
【００２７】
項目１２．基板表面に試料を供するステップが、１つまたは複数の試料を少なくとも１つの別々のパスにそれぞれ分配するステップを含む、項目１から１１のいずれか１項に記載の方法。
【００２８】
項目１３．パスが直線である、項目１２に記載の方法。
【００２９】
項目１４．パスが２５ナノメートルから５００マイクロメートルの幅である、項目１２または１３に記載の方法。
【００３０】
項目１５．基板表面に試料を供するステップが、１つまたは複数の試料を少なくとも１つの別々のスポットにそれぞれ分配するステップを含む、項目１から１４のいずれか１項に記載の方法。
【００３１】
項目１６．試料が血液試料を含む、項目１から１５のいずれか１項に記載の方法。
【００３２】
項目１７．試料が、全血、赤血球、血漿、および血清からなる群から選択される成分を含む、項目１から１６のいずれか１項に記載の方法。
【００３３】
項目１８．結合剤が、赤血球抗原に対する１つまたは複数の抗体を含む、項目１から１７のいずれか１項に記載の方法。
【００３４】
項目１９．結合剤が、１つまたは複数の非変性または溶血表現型の赤血球を含む、項目１から１８のいずれか１項に記載の方法。
【００３５】
項目２０．結合剤が、１つまたは複数の組換え抗原を含む、項目１から１９のいずれか１項に記載の方法。
【００３６】
項目２１．結合剤が、赤血球抗原に対する１つまたは複数の抗体、および１つまたは複数の非変性または溶血表現型の赤血球を含む、項目１から２０のいずれか１項に記載の方法。
【００３７】
項目２２．結合剤が別々の線上に固定されている、項目１から２１のいずれか１項に記載の方法。
【００３８】
項目２３．結合剤が別々のスポットに固定されている、項目１から２１のいずれか１項に記載の方法。
【００３９】
項目２４．結合剤が１〜５０の結合剤である、項目１から２３のいずれか１項に記載の方法。
【００４０】
項目２５．物質が、赤血球抗原に対する１つまたは複数の抗体を含む、項目１から２４のいずれか１項に記載の方法。
【００４１】
項目２６．物質が、１つまたは複数の赤血球抗原を含む、項目１から２５のいずれか１項に記載の方法。
【００４２】
項目２７．基板が、ポリエチレンテレフタレート、ポリプロピレン、ポリスチレン、デキストランポリマー、デンドリマー、オリゴヌクレオチド、ポリカーボネート、プラスチック、ガラス、シリコン、酸化シリコン、金属および金属酸化物、ならびにポリマー官能化された金属および金属酸化物、ＰＶＤＦ、ニトロセルロース、ナイロン、ならびにポリスルホンからなる群から選択される少なくとも１つの材料で形成される、項目１から２６のいずれか１項に記載の方法。
【００４３】
項目２８．試料内の物質に結合し得る結合剤が別々の場所に固定された基板、
試料を基板上に同時に分配し、基板から未結合材料を除去するように構成されたディスペンサー、および
結合剤に結合した物質の有無を検出するように構成された検出器
を含む系。
【００４４】
項目２９．ディスペンサーがマイクロ流体プローブである、項目２８に記載の系。
【００４５】
項目３０．ディスペンサーが、マイクロ流体プローブのアレイである、項目２８に記載の系。
【００４６】
項目３１．ディスペンサーが、複数のマイクロチャネルを有するマイクロ流体プローブである、項目２８に記載の系。
【００４７】
項目３２．ディスペンサーが、赤血球をサイズに基づいて排除するマイクロチャネルを有するマイクロ流体プローブである、項目２８から３１のいずれか１項に記載の系。
【００４８】
項目３３．マイクロチャネルが、６マイクロメートル未満の直径を有する断面を含む、項目３２に記載の系。
【００４９】
項目３４．マイクロチャネルが、４マイクロメートル未満の直径を有する断面を含む、項目３２に記載の系。
【００５０】
項目３５．マイクロチャネルが、２マイクロメートル未満の直径を有する断面を含む、項目３２に記載の系。
【００５１】
項目３６．マイクロチャネルの直径が、１〜２マイクロメートル未満の直径を有する断面を含む、項目３２に記載の系。
【００５２】
項目３７．基板が、ポリエチレンテレフタレート、ポリプロピレン、ポリスチレン、デキストランポリマー、デンドリマー、オリゴヌクレオチド、ポリカーボネート、プラスチック、ガラス、シリコン、酸化シリコン、金属および金属酸化物、ならびにポリマー官能化された金属および金属酸化物、ＰＶＤＦ、ニトロセルロース、ナイロン、ならびにポリスルホンからなる群から選択される少なくとも１つの材料で形成される、項目２８から３６のいずれか１項に記載の系。
【００５３】
項目３８．ドナーの赤血球に結合し得る結合剤が固定された基板表面にドナーの赤血球を供するステップ、
結合剤が固定された基板の少なくとも一部分から未結合のドナー赤血球を除去するステップであって、基板表面にドナー赤血球を供するステップが、基板の少なくとも一部分から未結合のドナー赤血球を除去するステップと同時である、ステップ、
患者の血漿をドナー赤血球の上に載せるステップ、および
患者の血漿の未結合部分を除去するステップであって、患者の血漿を載せるステップが、患者の血漿の未結合部分を除去するステップと同時である、ステップ、
ドナー赤血球に結合した抗体を検出したことに応答して、抗体が患者の血漿内に存在すると判定するステップ、および
ドナーの赤血球に結合した抗体を検出しなかったことに応答して、抗体が患者の血漿内に存在しないと判定するステップ、
を含む、クロスマッチングの方法。
【００５４】
項目３９．ドナーの赤血球を供するステップ、未結合のドナー赤血球を除去するステップ、患者の血漿を載せるステップ、および患者の血漿の未結合部分を除去するステップが、マイクロ流体プローブで行われる、項目３８に記載の方法。
【００５５】
項目４０．ドナー赤血球が非変性または溶血表現型の赤血球である、項目３８または３９に記載の方法。
【００５６】
項目４１．結合剤が、結合型レクチンまたはユニバーサル抗赤血球抗体を含む、項目３８から４０のいずれか１項に記載の方法。
【００５７】
項目４２．ドナー赤血球が別々の場所に固定された基板、
ドナー赤血球または患者の血漿を基板に同時に分配し、未結合のドナーＲＢＣまたは患者の血漿の未結合部分を基板から除去するように構成されたディスペンサー、および
ドナー赤血球に結合した抗体の有無を検出するように構成された検出器
を含む、クロスマッチングのための系。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】本発明の実施形態に従った血液分析系の概略図である。
【図２】試料（例えばＲＢＣ）が本発明の実施形態に従ったマイクロ流体プローブで供されている、結合剤のアレイが適用された基板の平面図である。この実施形態は抗原型判定に使用することができ、結合剤はＲＢＣに対する抗体である。
【図３】試料（例えば、抗体を有する血漿）が本発明の別の実施形態に従ったマイクロ流体プローブで供されている、結合剤のアレイが適用された基板の平面図である。この実施形態は、抗体のスクリーニングおよび／または同定に使用することができ、結合剤は、非変性のもしくは溶血表現型のＲＢＣまたは組換え血液型抗原である。
【図４】試料（例えば、ＲＢＣおよび／または抗体を有する血漿）が本発明の別の実施形態に従ったマイクロ流体プローブによって供されている、結合剤のアレイが適用された基板の平面図である。この実施形態は、抗原型判定と抗体のスクリーニングおよび／または同定との両方に使用することができる。
【図５】先行技術のマイクロ流体プローブを示す図である。
【図６】本発明の実施形態に従ったマイクロ流体プローブの平面図である。
【図７】本発明の別の実施形態に従ったマイクロ流体プローブの平面図である。
【図８】本発明の実施形態に従った図１の系を用いる、非変性もしくは溶血表現型のＲＢＣおよび／またはＲＢＣに対する抗体が事前に固定された基板表面へ試料を供する方法を示すフローチャートである。
【図９】本発明の実施形態に従った、単一の試料または異なる試料に並列で接続された複数のマイクロ流体プローブを示す図である。
【図１０】本発明の実施形態に従った、単一の試料または異なる試料に並列で接続された複数のマイクロ流体プローブを示す図である。
【図１１】本発明の実施形態に従った、単一の試料または複数の試料に接続され得る、複数の処理液マイクロチャネルを有するマイクロ流体プローブを示す図である。
【図１２】本発明の実施形態に従った、患者の血漿と潜在的ドナーの赤血球とのクロスマッチングの方法を示すフローチャートである。
【図１３】実施例５Ａにおいて記載される、マイクロ流体プローブを用いるシングルプレックス抗原型判定の結果を示す図である。図１３Ｂは、図１３Ａで示されるスポットの１つの拡大図である。
【図１４】実施例５Ｂにおいて記載される、マイクロ流体プローブを用いるマルチプレックス抗原型判定の結果を示す図である。
【図１５】実施例６において記載される、マイクロ流体プローブを用いる直接抗グロブリン試験の結果を示す図である。
【図１６】実施例７Ａにおいて記載される、マイクロ流体プローブを用いる抗体スクリーニングの結果を示す図である。
【図１７】実施例７Ｂにおいて記載される、マイクロ流体プローブを用いるリバースＡＢＯグループ判定の結果を示す図である。
【図１８】実施例８において記載される、マイクロ流体プローブを用いるクロスマッチングの結果を示す図である。図１８Ａは、クロスマッチングスライド上の蛍光スポットの画像であり、図１８Ｂは、測定された、各スポットの蛍光強度である。
【発明を実施するための形態】
【００５９】
概説
血液型を構成する赤血球膜抗原の全ての抗原変異体のうち、抗原Ａ、Ｂ、およびＨを有するＡＢＯ系、特に抗原Ｄ（Ｄ抗原が存在しない場合はｄと示される）、Ｃ、Ｅ、ｃ、およびｅを有するＲｈｅｓｕｓ（ＲＨ）系、特に２つの抗原Ｋおよびｋを有するＫｅｌｌ（ＫＥＬ）系、特に抗原ＦｙａおよびＦｙｂを有するＤｕｆｆｙ（ＦＹ）系、特に抗原ＪｋａおよびＪｋｂを有するＫｉｄｄ（ＪＫ）系、または、ＭＮＳ系、Ｌｅｗｉｓ（ＬＥ）系などの、あまり一般的に実施調査されていない他の系などの、３０を超える赤血球抗原系がこれまでにヒトにおいて同定されている。
【００６０】
標準的な輸血は、通常、ＡＢＯ系およびＲｈｅｓｕｓ  Ｄ系（Ｄ＋ｏｒｄ）における型を考慮する。しかし、典型的ではない凝集素が現れるリスクがある状況では、Ｒｈｅｓｕｓ系のある特定の数の他の抗原、特にＣ、ｃ、Ｅ、およびｅ抗原、ならびにＫｅｌｌ、またはさらに他の系が考慮される。
【００６１】
赤血球抗原に対する抗体。自己免疫疾患のケースなどの病理学的状況以外では、個体の血清は、赤血球抗原に対する以下の２つのタイプの抗体を含有し得る。
（ｉ）典型的（または通常）と言われ、ＡＢＯ系の抗原に対する抗体（例えば、Ｂ型の個体における抗Ａ抗体）。
（ｉｉ）血清または血漿におけるその存在が偶然のものであり、より具体的には非ＡＢＯ系抗原に対するものである、典型的ではない（または免疫）と言われる抗体。
「典型的な」または「通常の」抗体は、赤血球をインビトロで凝集させ得るＭおよび／またはＡアイソタイプの免疫グロブリンであることが、より多い。「典型的ではない」または「不規則な」または「免疫」抗体は、最も一般的には、例えば、輸血の間の、または母親の血液型に属さない胎児赤血球抗原に対する母親の免疫反応に起因する妊娠中の、特に出産時の、１つまたは複数の抗原に対する免疫化の後、外来赤血球による抗原刺激がある場合に現れるＧアイソタイプのものである。
【００６２】
血液の分析において用いられる様々な試験には、以下のものが含まれる。
【００６３】
ＡＢＯグループ判定：この分析は、血漿または血清を用いる血清分析および血球ペレットを用いる細胞分析（それぞれ、リバースおよびフォワードグループ判定）という２つのタイプの分析の組み合わせおよび解釈の結果である。
−  フォワードグループ判定では、個体の赤血球を、ＡＢＯ系の抗原に対する正確な抗体特異性をそれぞれが有する試験抗体（抗Ａ、抗Ｂ、および抗ＡＢ抗体）と接触させる。
−  リバースグループ判定では、典型的な循環抗体を含有する個体の血清または血漿を、ＡＢＯ系の正確な抗原型にそれぞれが属する表現型判定された赤血球と接触させる。
【００６４】
表現型判定アッセイ：表現型判定に通常用いられる技術は、通常、調査対象の赤血球の表面にある抗原の有無を、特異的抗体を用いてスクリーニングすることにある。
【００６５】
典型的ではない抗赤血球抗体のスクリーニングおよび／または同定：この試験は、個体の血液における、様々な赤血球抗原に対する抗体の有無を検出するために用いられる。このために、その抗原が既知である表現型判定された赤血球または／および組換え血液型抗原への、これらの抗体（ＩｇＧおよび／またはＩｇＭ）の結合を実証することが目標とされる。表現型判定された赤血球または組換え抗原に結合すると、これらの典型的ではない抗赤血球抗体は、抗免疫グロブリン抗体によって明らかにされる。第１のステップにおいて、「スクリーニング」赤血球のパネル（典型的ではない抗体の有無を検出する（しかし同定はしない）ために輸血において重要な抗原の全てを含むように選択された２つまたは３つの赤血球）が使用される。スクリーニングが陽性である場合、存在する典型的ではない１つまたは複数の抗体の特異性は、次いで、既知の血液型系の大部分を占める１０から１５、またはさらに２０の異なる表現型判定された赤血球を通常含む「同定」赤血球の少なくとも１つのパネルによって同定される。
【００６６】
クロスマッチングアッセイ：この分析の目的は、レシピエントにドナー血液を注入する前にドナー−レシピエント適合性を予測することである。これは、ドナー血液に行われる基本的な型判定を超えて、適合性を確認するために用いられる。潜在的ドナーの赤血球を、潜在的な輸血されるレシピエントの血清／血漿と接触させる。潜在的レシピエントの試料が潜在的ドナーの赤血球に対する抗体を含有していれば、これらの抗体は、抗免疫グロブリン抗体で明らかにされる。このような分析は、抗体の有無の判定のみを行い、その特異性の判定は可能にしない。「マイナー」クロスマッチングと呼ばれる別のタイプのクロスマッチングにおいて、潜在的ドナーの血漿を、潜在的な輸血されるレシピエントの赤血球と接触させる。潜在的ドナーの試料が潜在的レシピエントの赤血球に対する抗体を含有していれば、抗体は抗免疫グロブリン抗体で明らかにされる。
【００６７】
直接抗グロブリン試験：特に、新生児、または例えば溶血性貧血もしくは自己免疫疾患に罹患している患者において、赤血球は、抗体によってまたは／および血清補体画分によってインビボで感作される。インビボで感作された赤血球の表面に存在するこれらの抗体または活性血清補体画分は、それ自体、赤血球によって運ばれる抗原を構成し得、抗免疫グロブリン抗体および／または抗補体抗体によって直接的に検出される。
【００６８】
本明細書において、上記の試験を含む血液分析のための系および方法が記載される。この系および方法は、血液分析の自動化を容易にする。この系および方法は、グループ判定および表現型判定の検出、抗体のスクリーニングおよび／または同定、クロスマッチング、ならびに直接抗グロブリン試験に用いることができる。
【００６９】
本明細書において記載される系および方法の利点には、限定はしないが、（１）ナノリットルからマイクロリットル容積の試薬および患者試料を送達するコンパクトなサイズの系を提供すること、（２）反応化学を限局化し、反応時間を短くする系を提供すること、（３）マルチプレックスアッセイを行い得る（例えば、複数の患者の試料を試験し得る、および／もしくは複数の分析物についての単一の試料を試験し得る）系を提供すること、（４）同時の表現型判定（例えば血液型フォワード型判定）および抗体のスクリーニング／同定（例えば血液型リバース型判定）を可能にする系を提供すること、（５）非変性または溶血赤血球の抗原性を維持しながら非変性または溶血赤血球を基板に載せ得る系を提供すること、（６）患者に輸血され得る赤血球をクロスマッチングし得る系を提供すること、ならびに／または（７）試料を供するステップおよび未結合材料を洗浄するステップを同時に行ってアッセイ時間を短くする系を提供することが含まれる。
【００７０】
本明細書および添付の特許請求の範囲において用いる場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」には、明らかにそうではないことが内容上明らかに示されない限り、複数形の言及が含まれる。したがって、例えば、「１つの（ａ）結合剤」を含む系に対する言及には、１つまたは複数の結合剤を含む系が含まれる。同様に、「１つの（ａ）物質」に対する言及には、１つまたは複数の物質が含まれる。本明細書において用いる場合、用語「約」は、列挙された数値および列挙された数値の１０％以内のあらゆる値に言及する。したがって、「約２５」は、２２．５および２７．５を含む、２２．５と２７．５との間のあらゆる値に言及する。
【００７１】
系
図１を参照すると、血液を分析するための系１００が示されている。一実施形態において、系１００は、表現型判定（抗原型判定としても知られている）、抗体のスクリーニングおよび同定、または患者血漿とドナー赤血球とのクロスマッチングに用いられる。系１００は、基板１０２、ディスペンサー１０４（例えばマイクロ流体プローブ）、光源１０６、および検出器１０８を含む。
【００７２】
基板１０２は、結合剤１１０が固定または結合された表面を提供する（図２に示す）。基板１０２は、通常、平面の形状であり、限定はしないが、ポリエチレンテレフタレート（例えばマイラー）、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、プラスチック、ガラス、シリコン、酸化シリコン、ならびに／あるいは、裸の、またはポリマーもしくは活性基、例えばカルボキシル基、アミン基、トシル基、および他の基で官能化された金属および金属酸化物を含む、１つまたは複数の材料で形成され得る。一部の実施形態において、基板は、限定はしないが、ポリエチレンテレフタレート（例えばマイラー）、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、プラスチック、ガラス、シリコン、酸化シリコン、ならびに／または、裸の、もしくはポリマーで官能化された金属および金属酸化物を含む、１つまたは複数の材料で形成されたスライドである。基板１０２は、マイクロウェルまたはナノウェルを含有し得る。金属または金属酸化物で形成された基板の表面を官能化するためのポリマーの例には、グリシドキシプロピルトリエトキシシラン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリブレン、ポリエチレングリコールポリマー、デキストランポリマー、アミノプロピルシラン、カロキシシラン（caroxysilane）、ヒドロゲルおよびポリマーブラシ、ならびに／または、例えば、官能化したアルキルチオール、デンドリマー、もしくはオリゴヌクレオチドの自己組織化した単層が含まれる。一実施形態において、基板１０２は金で被覆される。一実施形態において、基板１０２は、結合剤がその中に固定され得る複数のウェルを有するマイクロタイタープレートである。一部の実施形態において、基板１０２は、例えば、ニトロセルロース、ポリフッ化ビニリデン、ナイロン、またはポリスルホンを含む材料で形成される膜である。
【００７３】
基板１０２の表面は湿っていてよい。湿った表面は、結合剤が活性を維持するために水和を要する一部の実施形態において望ましい。基板１０２の表面を湿らせるために用いられる典型的な流体には、限定はしないが、緩衝液、水、生理食塩水、および／または油（例えば鉱油）が含まれる。
【００７４】
一部の実施形態において、基板１０２は、Ｘ方向、Ｙ方向、および／またはＺ方向に可動なプラットフォーム上に載せられる。
【００７５】
図２〜図４で示される実施形態において、１つまたは複数の結合剤１１０は、線のアレイの状態で基板１０２の表面に結合している。一実施形態において、線は、約２５ナノメートルから約５００マイクロメートルの幅である。ある特定の実施形態において、線は、約５０ナノメートルから約２００マイクロメートルの幅である。一部の実施形態において、１〜１００の結合剤が基板１０２の表面に結合している。一実施形態において、線のアレイは、基板１０２の幅いっぱいに広がっている。別の実施形態において、線のアレイは、基板１０２の長さいっぱいに広がっている。一部の実施形態において、１つまたは複数の結合剤１１０は、スポットおよび／またはドットのパターンで基板１０２に結合している。一実施形態において、スポット／ドットは、約２５ナノメートルから約５００マイクロメートルの幅である。ある特定の実施形態において、スポット／ドットは、約５０ナノメートルから約２００マイクロメートルの幅である。一実施形態において、スポットおよび／またはドットのアレイは、基板表面を覆っている。
【００７６】
一部の実施形態において、結合剤１１０は、基板１０２の表面全体に結合している。例えば、基板１０２がスライドである実施形態において、スライドの表面全体が結合剤１１０で被覆され得る（例えば赤血球または抗体）。
【００７７】
結合剤１１０は、血液試料内の１つもしくは複数の物質（例えば、全血、血漿、血清、またはＲＢＣ試料）または唾液試料に結合し得る。一部の実施形態において、結合剤１１０は、赤血球の表面に結合している抗原、またはヒト免疫グロブリン、または／および補体画分（被覆された、例えば赤血球上に吸着された）に対する抗体であり、物質は抗原である。一部の実施形態において、結合剤は、非変性もしくは溶血表現型の赤血球、または組換え抗原であり、物質は、赤血球の表面に結合した抗原に対する抗体である。一部の実施形態において、結合剤は、レクチンまたはユニバーサル抗赤血球抗体（例えば、抗グリコホリンＡ抗体）であり、物質は赤血球である。
【００７８】
一部の実施形態において、結合剤１１０または物質として使用される抗体は、特定の血液型に特徴的な様々な抗原決定基と特異的に反応する免疫グロブリンである。抗体は、ＩｇＡ抗体、ＩｇＭ抗体、ＩｇＧ抗体、またはその混合物であり得る。一部の実施形態において、抗体は、様々な主要なおよびマイナーな血液型系を特徴付ける赤血球抗原と特異的に反応し得る。このような血液型系には、限定はしないが、ＡＢＯ系、特に抗原Ｄ（Ｄ抗原が存在しない場合はｄと示される）、Ｃ、Ｅ、ｃ、ｅ、およびＣｗを有するＲｈｅｓｕｓ（ＲＨ）系、特に４つの抗原Ｋ、ｋ、Ｋｐａ、およびＫｐｂを有するＫｅｌｌ（ＫＥＬ）系、特に抗原ＦｙａおよびＦｙｂを有するＤｕｆｆｙ（ＦＹ）系、特に抗原ＪｋａおよびＪｋｂを有するＫｉｄｄ（ＪＫ）系、特に抗原Ｍ、Ｎ、Ｓ、およびｓ、およびＰ系の抗原Ｐ１を有するＭＮＳ系、特に抗原ＬｕａおよびＬｕｂを有するＬｕｔｈｅｒａｎ系、ならびに、特に抗原ＬｅａおよびＬｅｂを有するＬｅｗｉｓ（ＬＥ）系が含まれる。
【００７９】
抗体は、ポリクローナルおよび／またはモノクローナル、またはモノクローナルの混合物、または、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、およびＶＨＨナノボディのドメインを含むその機能的断片であり得る。機能的抗体断片は、（ｉ）由来源（例えばトランスジェニックマウス）に由来し得るか、または（ｉｉ）可変ドメインが例えば非ヒト由来であり定常ドメインが例えばヒト由来であるキメラであり得るか、または（ｉｉｉ）相補性決定領域（ＣＤＲ）グラフティングされていてよく、ここで、可変ドメインのＣＤＲは例えば非ヒト由来であるが可変ドメインの１つもしくは複数のフレームワークは例えばヒト由来であり、定常ドメイン（あれば）は例えばヒト由来である。抗体は、天然の由来源、すなわち生きた生物もしくは細胞培養物から単離することができるか、または完全にもしくは部分的に合成の抗体であり得る。合成の抗体は、既知の抗体配列の分析に基づいて全体または一部がインシリコで合成配列に由来する配列を有する抗体である。抗体配列またはその断片のインシリコ設計は、例えば、抗体または抗体断片の配列のデータベースを分析し、それから得られたデータを利用してポリペプチド配列をデバイス化することによって行うことができる。
【００８０】
一部の実施形態において、結合剤１１０として用いられる赤血球は、既知の血液型表面抗原を有する非変性表現型の赤血球である。他の実施形態において、溶血表現型の赤血球または「ゴースト」を結合剤１１０または物質として用いることができる。ゴーストは、穏やかに溶血し、抗原性を保ちながらそれらのヘモグロビンが除去された赤血球である。一部の実施形態において、酵素処理された赤血球を結合剤１１０として用いることができる。一部の実施形態において、膜から単離された血液型表面抗原を結合剤１１０として用いることができる。さらに他の実施形態において、化学合成されたポリペプチドおよび多糖血液型抗原ならびに組換え血液型抗原を結合剤１１０として用いることができる。
【００８１】
結合剤１１０は、限定はしないが、流体力学的流動閉じ込め、インクジェットプリント、スプレーにより載せること、マイクロスポッティング、および／またはマイクロ接触プリントなどの技術によって基板１０２の表面上に載せることができる。載せた間または後に、結合剤１１０は、例えば、静電引力、親和性相互作用、疎水性／親水性相互作用、または共有結合によって基板１０２の表面上に固定することができる。
【００８２】
一部の実施形態において、結合剤１１０に固定されておらず非特異的な結合部位を提供し得る基板１０２の領域は、例えば、緩衝液内の脱脂乳タンパク質、カゼイン、および／またはウシ血清アルブミンなどの遮断剤で処理することができる。
【００８３】
抗原型判定または表現型判定に使用され得る、図２で示される実施形態において、基板１０２の表面上に固定された結合剤１１０は、それぞれが異なる抗原に対する１つまたは複数の抗体のアレイである。一部の実施形態において、単一抗原に対する複数の抗体が、基板１０２の表面上に固定されている。各縦線は、異なる抗体、例えば、抗Ａ、抗Ｂ、抗ＡＢ、抗Ｄ、抗Ｃ、抗ｃ、抗Ｃｗ、抗Ｋ、抗ｋ、抗Ｋｐａ、抗Ｋｐｂ、抗Ｆｙａ、抗Ｆｙｂ、抗Ｊｋａ、抗Ｊｋｂ、抗Ｌｅａ、抗Ｌｅｂ、抗Ｐ１、抗Ｍ、抗Ｎ、抗Ｓ、抗ｓ、抗Ｌｕａ、または抗Ｌｕｂに相当し得る。
【００８４】
抗体のスクリーニングおよび／または同定に使用され得る、図３で示される実施形態において、基板１０２の表面上に固定された結合剤１１０は、１つまたは複数の非変性または溶血表現型の赤血球、膜抽出物、または／および組換え血液型抗原のアレイである。各縦線は、異なる赤血球、例えば、赤血球ＲＢＣＩ、ＲＢＣＩＩ、ＲＢＣＩＩＩ、・・・ＲＢＣＸＸに相当する。
【００８５】
抗原型判定ならびに抗体のスクリーニングおよび／または同定（例えば「コンボ」試験）に使用され得る、図４で示される実施形態において、結合剤１１０の２つ以上のアレイ（すなわち、赤血球抗原に対する抗体のアレイ、および赤血球のアレイ）もまた、基板１０２上に固定され得る。例えば、それぞれ抗Ａ、抗Ｂ、抗ＡＢ、抗Ｄ、抗Ｃ、抗ｃ、抗Ｃｗ、抗Ｋ、抗ｋ、抗Ｋｐａ、抗Ｋｐｂ、抗Ｆｙａ、抗Ｆｙｂ、抗Ｊｋａ、抗Ｊｋｂ、抗Ｌｅａ、抗Ｌｅｂ、抗Ｐ１、抗Ｍ、抗Ｎ、抗Ｓ、抗ｓ、抗Ｌｕａ、または抗Ｌｕｂ抗体の縦線は、基板１０２の表面に結合し得、それぞれ赤血球ＲＢＣＩ、ＲＢＣＩＩ、ＲＢＣＩＩＩ、・・・ＲＢＣＸＸの縦線は、基板１０２の表面に結合し得る。
【００８６】
再び図１を参照すると、ディスペンサー１０４は、１つまたは複数の試料のマイクロ流体またはサブマイクロ流体容積を基板１０２の表面上の別々のパスに分配するように構成されている。一部の実施形態において、パスは、基板１０２の長さいっぱいに広がっている。他の実施形態において、パスは、基板１０２の幅いっぱいに広がっている。ある特定の実施形態において、パスの幅は、約２５ナノメートルから約５００マイクロメートルの幅である。一実施形態において、ディスペンサー１０４はまた、１つまたは複数の結合剤１１０を基板１０２の表面上に分配するように構成されている。
【００８７】
一部の実施形態において、ディスペンサー１０４は、Χ方向、Ｙ方向、および／またはＺ方向に可動である。ディスペンサー１０４の動きおよび機能は、コンピュータで制御することができる。
【００８８】
一部の実施形態において、ディスペンサー１０４は、流体力学的流動閉じ込めディスペンサーである。一実施形態において、流体力学的流動閉じ込めディスペンサーは、本明細書に組み込まれる米国特許出願第１３／８８１９８９号明細書において記載されているようなマイクロ流体プローブ２００（または縦方向ＭＦＰ）である。図５Ａおよび図５Ｂで示される実施形態において、マイクロ流体プローブ２００は、処理液マイクロチャネル２２３、２２４と浸水液マイクロチャネル３２３、３２４とが共に提供されている基底層２２０を含み得る。各チャネルは、開口部２２１、２２２、３２１、３２２と流体連通し、各開口部は基底層の面に位置し（同一面である必要はない）、好ましくは近接している。チャネル２２３、２２４、３２３、３２４はまた、モーター付きポンプと開口部２２１、２２２、３２１、３２２との間を接続する。マイクロ流体プローブ２００を表面の近くで動かすと、開口部２２１を介して提供される処理液は浸水液と結び付き、好ましくは、図５Ｂの曲がった（太い）矢印で表されるように、開口部３２１および３２２を介して提供される浸水液内に入る。矢印は理解のために提供されており、それらの寸法は意図的に誇張されている。この点について、装置は、好ましくは、層流をもたらすように構成されている。一部の実施形態において、開口部の寸法は数十マイクロメートルであり得る。開口部は、５０マイクロメートル、または数百マイクロメートル程度離れていてよい。処理チャネル／開口部の対が本明細書において用いられるため、処理液は、開口部２２２で浸水液の一部と再吸引され得る。流体パスが開口部２２１と２２２との間で逆になること、すなわち、処理液は開口部２２２から注入され得るが開口部２２１は液体を吸引し得ることに留意されたい。処理液は、原則的に開口部２２１および２２２の近くに位置し、原則的にヘッド２００の近くに存在する浸水液に囲まれる。示されているように、被覆層２１０は、基底層の上面で開いているチャネルを閉じる。
【００８９】
さらに、処理液マイクロチャネルの部分は、好ましくは、基底層の上面で開いている基底層２２０の層厚内の溝２２３’、２２４’として提供される。このように、マイクロチャネルの形成は、その横方向の寸法にもかかわらず（おそらく小さい、例えば数十マイクロメートル）、簡単に行われる。組み立ての後、溝は被覆層２１０の部分によって閉じられる。溝は、道具によって、基底層２２０の上面に直接彫り込むことができる。溝はあらゆる適切な断面形状、例えば円形、四角形、ＵまたはＶ型の断面を有し得る。所要の道具は、典型的には基底層２２０の材料に従って選択される。変型において、レーザーアブレーションが検討され得る。しかし、最も有利には、深掘り反応性イオンエッチング（ＤＲＩＥ）がマイクロチャネルの製造に用いられる。
【００９０】
図５Ｂに示すように、溝２２３’、２２４’は、それぞれの開口部２２１、２２２まで延びている。同様に、浸水チャネル２２３、２２４は、それぞれの開口部３２１、３２４に達する。この実施例において、チャネルおよび開口部は、ヘッドの上面の主軸の周りに対称的に配置されている。開口部は、これも同様に容易に機械で作ることができる、基底層２２０の正面３２０のエッジ３１０の辺りで、溝の端部で直接形成される。前記フロントエンド３２０は典型的には鋭角で作られ、これは、目的の表面にコンパクトに液体を載せることを可能にし、容易に光学的モニタリングを行う余地を残す。
【００９１】
図５Ａを参照すると、バイアス２１１、２１２が被覆層２１０上に提供されている。浸水チャネル３２３、３２４への流体連通の中継を可能にするさらなる通路３１１が示されている（両浸水チャネルに注水する唯一の通路がここでは示されている）。バイアスに接続された対応するチューブポートが提供され得る（示されていない）。チャネルは、バイアスに面するように配置された端部を有する。
【００９２】
図５Ａおよび図５Ｂに示すように、マイクロ流体プローブ２００は、２つの処理液マイクロチャネルを含む。一部の実施形態において、マイクロ流体プローブ２００は、３つ以上の処理液マイクロチャネルを含む。一部の実施形態において、マイクロ流体プローブ２００は、２〜５０の処理液マイクロチャネルを含み得る（図１１を参照されたい）。一部の実施形態において、マイクロ流体プローブ２００は、処理液マイクロチャネルの少なくとも１つに加熱エレメントを含み得る。試料の加熱は抗原および抗体が反応する速度を増大させ得、これは試験時間を短くし得る。
【００９３】
典型的な処理液には、緩衝液、全血、ＲＢＣ、血漿、血清、または油（例えば鉱油）が含まれる。典型的な浸水液には、鉱油、緩衝液、水、および／または生理食塩水が含まれる。
【００９４】
一部の実施形態において、マイクロ流体プローブは、全血試料において赤血球から血漿を分離するための構造を含む。一部の実施形態において、分離は、サイズによっておよび／または毛管力によって行うことができる。図６は、異なる寸法の少なくとも２つの処理液マイクロチャネルを有するマイクロ流体プローブ６００の実施形態を示す。プローブは、目詰まりを起こすことなく全血試料またはＲＢＣ含有試料（すなわち血漿中のＲＢＣ）と使用され得るように構成されている。第１のマイクロチャネル６０２は、全血試料内の赤血球を排除するサイズになっている。第２のマイクロチャネル６０４は、試料の赤血球が通過できるサイズになっている。処理液マイクロチャネルが円形断面を有する一実施形態において、第１のマイクロチャネル６０２は、６マイクロメートル未満の直径を有する。一部の実施形態において、第１のマイクロチャネルの直径は、４マイクロメートル未満、または２マイクロメートル未満、または１〜２マイクロメートル未満である。一部の実施形態において、第２のマイクロチャネル６０４は、約７マイクロメートルを超える直径を有する。赤血球の直径は約６〜８マイクロメートルである。より大きな直径を有することで、第２のマイクロチャネル６０４は赤血球を通過させる。マイクロチャネルの断面は、円形、長円形、および楕円形を含む、あらゆる適切な形状であり得る。一部の実施形態において、処理液マイクロチャネル６０２および６０４の内面を、例えば、血液成分が内面に結合するのを防ぐヘパリンなどの材料で被覆することができる。全血試料はまた、血液の凝固を防ぐために、例えば、ヘパリン、クエン酸塩、またはＥＤＴＡで抗凝固処理され得る。
【００９５】
図７は、第１の開口部７０４と流体連通する蛇行マイクロチャネル７０２を有するマイクロ流体プローブ７００の実施形態を示す。蛇行マイクロチャネル７０２の直径は、全血試料のＲＢＣを保持するサイズになっている。より小さな直径の毛細管７０６は、蛇行マイクロチャネル７０２から分岐し、第２の開口部７０８と流体連通する。毛細管７０６は、赤血球を有さない血漿を通過させる。
【００９６】
マイクロ流体プローブは、チャネルを通過する流体に適合する材料で形成され得る。典型的な適合材料には、限定はしないが、シリコン、シリカ、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ヒ化ガリウム、ガラス、セラミック、石英、ポリマー、例えば、ネオプレン、Ｔｅｆｌｏｎ（商標）、ポリエチレンエラストマー、ポリブタジエン／ＳＢＲ、亜硝酸塩、ナイロン、および／または金属が含まれる。チャネルの内面はまた、流体成分とチャネル自体との間の親和性を低減させるために適切な材料で被覆することができる。
【００９７】
再び図１を参照すると、光源１０６は、基板１０２の表面を照射するように構成されている。検出される信号に応じて、光源１０６は、可視領域から近赤外領域までの範囲の光を提供し得る。典型的な光源には、レーザーおよび発光ダイオードが含まれる。
【００９８】
検出器１０８は、基板１０２の表面からの発光を検出するように構成されている。一部の実施形態において、検出は、発色、蛍光、または発光の検出によって行われる。一部の実施形態において、検出は、写真または電子検出器などによる画像化によって行われる。典型的な電子検出器には、フォトダイオード、電荷結合素子（ＣＣＤ）検出器、または相補的な金属酸化物半導体（ＣＭＯＳ）検出器が含まれる。
【００９９】
検出器１０８からのアナログ信号は、アナログ−デジタルコンバータ１１０によってデジタル化される。デジタル化された信号は、検出された光の少なくとも１つの値または強度を得るために、マイクロプロセッサ１１２によって処理され、前記値または強度は、メモリ１１４に記憶され、かつ／または任意選択のディスプレイ１１６に表示される。
【０１００】
適切なエレクトロニクスおよびソフトウェアを使用することによって、系１００を、基板１０２の表面上の結合剤１１０に結合した特異的物質の同一性および位置が分かるようにプログラムすることができる。物質の同一性および位置は、生じた信号で補正され得、それによって、特定の血液グループ判定をテスターに判定および同定することができる。さらに、統計ソフトウェアを含めて、基板１０２上に提供された結合剤１１０の様々な反復および／または希釈物から生じた結果を結び付け、かつ系統立てることができる。この様式で、多数の物質から得られた信号を共に関連付け、統計的に有意な結果をテスターに提示することができる。
【０１０１】
方法
系１００は、抗原型判定、抗体のスクリーニング／同定、抗原型判定とクロスマッチングとの組み合わせを行うために使用することができる。さらに、系１００は、グループ判定および表現型判定の検出、抗体のスクリーニングおよび／または同定、クロスマッチング、ならびに直接抗グロブリン試験に使用することができる。
【０１０２】
図８を参照すると、抗原型判定ならびに／または抗体のスクリーニングおよび／もしくは同定のための方法８００が示されている。方法８００は、例えば、図１で記載した前述の系で行うことができる。
【０１０３】
典型的なステップ８１０において、試料は、試料内の１つまたは複数の物質に結合し得る１つまたは複数の結合剤１１０が固定された、湿ったまたは乾燥した基板１０２に供される。図２に示す抗原型判定の実施形態において、試料および物質は、酵素処理されたまたはされていない、患者またはドナーのＲＢＣであり、基板１０２の表面上に固定された結合剤１１０は、赤血球（ＲＢＣ）抗原に対する抗体である。ＲＢＣ試料は、例えば遠心分離によって全血をＲＢＣおよび血漿に分離することによって得ることができる。得られたＲＢＣは、「そのまま」用いることができるか、または希釈することができる。一部の実施形態において、ＲＢＣは約０．１から５０％に希釈される。一部の実施形態において、ＲＢＣは約０．５〜２０％の間に希釈される。ある特定の実施形態において、ＲＢＣは約０．６から５％の間に希釈される。一部の実施形態において、ＲＢＣは５０％超に希釈される。
【０１０４】
図３に示す抗体のスクリーニングおよび／または同定の実施形態において、試料は患者またはドナーの血漿であり、基板１０２の表面上に固定された結合剤１１０は、非変性もしくは溶血表現型のＲＢＣ、化学合成されたポリペプチド、天然のもしくは合成された多糖血液型抗原、または組換え血液型抗原であり、１つまたは複数の物質は、ＲＢＣ抗原、組換え赤血球抗原、または赤血球膜抽出物に対する抗体である。
【０１０５】
図４に示す実施形態において、図２に示す抗原型判定の実施形態は、図３に示す抗体のスクリーニングおよび／または同定の実施形態と組み合わされている。この実施形態において（例えば「コンボ」アッセイ）、基板の第１の部分は、非変性であるかまたは溶血していてよい表現型判定されたＲＢＣが固定されており、第２の部分は、ＲＢＣ抗原に対する抗体が固定されている。
【０１０６】
一実施形態において、１つまたは複数の試料が１つまたは複数のマイクロ流体プローブで供される。別の実施形態において、１つのマイクロ流体プローブが各試料に用いられる（図２〜３）。各試料は、結合剤１１０で被覆された基板１０２に、結合剤１１０の線上に垂直の方向に供され、その結果、試料は、基板１０２に被覆された結合剤１１０のそれぞれに供される。さらに別の実施形態において、並列したプローブのアレイであるプローブアレイ９００は、同一のまたは異なる試料に接続される（図９〜１０）。プローブアレイ９００は、同一のまたは異なる試料を全ての結合剤１１０に一度に供する。新たな試料のために、プローブアレイ９００内のチャネルは例えば第１の試料を除去するためにすすがれ、プローブアレイ９００は別の結合剤１１０セットに向かって共に動き、新たな試料が新たな結合剤１１０セットに供される。各新たな試料のために、プローブアレイ９００をすすいで動かすプロセスが繰り返される。一部の実施形態において、複数のプローブアレイ９００が、複数の結合剤１１０にそれぞれ対する複数の試料を一度に試験するために使用される。
【０１０７】
図１１に示す実施形態において、マイクロ流体プローブ１１００は、複数の処理液マイクロチャネルを含む。複数の処理液マイクロチャネルは、１つまたは複数の試料（すなわち、同一のまたは異なる試料）および／または結合剤１１０を基板１０２の表面上に載せるために使用することができる。一部の実施形態において、マイクロ流体プローブは、２〜１００の処理液マイクロチャネルを含む。他の実施形態において、プローブアレイ９００におけるプローブのそれぞれ（図９〜１０に示す）は、複数のマイクロチャネルを含む。「コンボ」アッセイの実施形態において、図６で示すマイクロ流体プローブ６００は、１つまたは複数の試料を、基板の第１の部分に非変性であるかまたは溶血していてよい表現型判定されたＲＢＣが固定されており、第２の部分にＲＢＣ抗原に対する抗体が固定されている、図４で示す実施形態に載せるために使用される。
【０１０８】
典型的なステップ８２０において、未結合材料、例えば、赤血球および／または抗体は、結合剤が固定されている基板１０２の少なくとも一部分から除去される。未結合材料は、基板１０２の表面を、例えば、緩衝液、水、または生理食塩水で洗浄することによって除去され得る。一実施形態において、マイクロ流体プローブは、１つまたは複数の処理液マイクロチャネルを介して洗浄溶液（例えば浸水液）をポンプ吸い上げすることによって、未結合材料をステップ８１０と同時に除去するために使用することができる。
【０１０９】
典型的なステップ８３０において、基板１０２に固定された１つまたは複数の結合剤１１０に結合した物質が検出され、試料内に存在する物質が同定される。結合剤に結合した物質が存在しないことも判定され得る。抗原型判定の実施形態において、ＲＢＣ抗体に結合したＲＢＣの赤色が、視覚的にまたは分光光度的に検出され得る。ＲＢＣ抗体に結合したＲＢＣはまた、例えば、発色、蛍光、または化学発光コンジュゲート抗体を含む二次標識検出によっても検出され得る。抗体のスクリーニングおよび／または同定の実施形態において、ＲＢＣ抗原に結合した抗体は、特異的な二次標識検出によって検出され得る。
【０１１０】
図１２を参照すると、ドナーの赤血球および患者の血漿を載せるためにマイクロ流体プローブを用いるクロスマッチング方法１２００が示されている。この方法は、ドナーのＲＢＣと患者の血漿との適合性を試験する。方法１２００は、例えば、図１に記載した前述の系で行うことができる。
【０１１１】
典型的なステップ１２１０において、ドナーの赤血球が、マイクロ流体プローブを用いて、事前に湿潤処理された基板表面に供される。ドナーの赤血球は、非変性であるかまたは溶血していてよい。一部の実施形態において、ドナーの赤血球はまた、表現型判定されている。一部の実施形態において、これらのＲＢＣは、赤血球の抗原性を維持するために、浸水液内で基板表面に供される。一部の実施形態において、基板表面は、例えば、レクチン、化学的作用物質、または例えば抗グリコホリンＡ抗体などのユニバーサル抗ＲＢＣ抗体などの結合剤で事前に処理される。
【０１１２】
典型的なステップ１２２０において、未結合のドナー赤血球は、基板１０２の表面を、例えば、緩衝液、水、または生理食塩水で洗浄することによって除去される。一実施形態において、マイクロ流体プローブは、１つまたは複数の処理液マイクロチャネルを介して洗浄（浸水）溶液をポンプ吸い上げすることによって、未結合のドナー赤血球をステップ１２１０と同時に除去するために使用することができる。
【０１１３】
典型的なステップ１２３０において、患者の血漿試料は、ステップ１２１０において事前に処理された基板表面に供されたドナーＲＢＣの上に載せられる。一実施形態において、ステップ１２１０において使用されるものと同一のプローブが、患者の血漿を載せるために使用される。ステップ１２１０におけるものと同一のマイクロチャネルまたは異なるマイクロチャネルが、患者の血漿を載せるために使用され得る。ステップ１２１０におけるものと同一のマイクロチャネルが使用される場合、マイクロチャネルは、使用の間に例えば緩衝液で流すことができるか、または、緩衝液、油、もしくは空気の「小塊」を用いて、ドナーＲＢＣを患者試料から分離することができる。別の実施形態において、異なるマイクロ流体プローブが、相互汚染を防ぐために、このステップとステップ１２１０との間に使用される。
【０１１４】
典型的なステップ１２４０において、患者の血漿試料の未結合の抗体は、基板１０２の表面を例えば緩衝液、水、または生理食塩水で洗浄することによって除去される。一実施形態において、マイクロ流体プローブは、１つまたは複数の処理液マイクロチャネルを介して洗浄溶液をポンプ吸い上げすることによって、ステップ１２３０で未結合の抗体を除去するために使用され得る。
【０１１５】
典型的なステップ１２５０において、ドナーの赤血球に結合した抗体を検出したことに応答して、患者の血漿内に存在する抗体が検出され（例えば、二次標識された抗体によって）、ドナーの赤血球に結合した抗体を検出しなかったことに応答して、患者の血漿内に存在しない抗体が判定される。
【０１１６】
別のクロスマッチング方法において（例えば、マイナーなクロスマッチング方法）、マイクロ流体プローブは、患者のＲＢＣおよびドナーの血漿を載せるために用いられる。この方法は、患者の血漿とドナーのＲＢＣとの適合性を試験するものであり、ＲＢＣのみではなく全血が患者に輸血される状況、または、医学的に関連する量のドナー血漿が、患者に輸血される分離されたＲＢＣ内に残っている状況で、重要である。マイナーなクロスマッチング方法は、例えば、図１に示す前述の系を用いて行うことができる。
【０１１７】
マイクロ流体プローブの１つの利点は、赤血球の抗原性の維持を可能にする、生理学的浸水液内に載せる能力である。これによって、プローブのさらなる使用可能性がもたらされる。一部の実施形態において、血液型判定のための系は、非変性のまたは溶血した赤血球に結合し得る１つまたは複数の結合剤が別々の場所に固定された基板；これらの非変性または溶血表現型の赤血球を基板上に分配し、未結合の赤血球を基板から除去するように構成されたディスペンサー；患者の血漿試料を表面に供された赤血球の上に載せ、未結合の抗体を除去するように構成されたディスペンサー；および抗体を検出するように構成された検出器を含む。先に記載したクロスマッチングは一実施例である。
【０１１８】
抗体のスクリーニングは別の実施例である。表現型判定されたＲＢＣは、クロスマッチングアッセイにおけるように、事前に処理された表面上にプローブによって載せられる。洗浄が適用され、次いで、抗体を含有する血漿が載せられ同定される。
［実施例］
［実施例１］
【０１１９】
抗原型判定
この分析の目的は、特異的モノクローナルまたはポリクローナル抗体によって、ドナーまたは患者の赤血球の表面に存在する血液型抗原（血液型ＡＢＯ、ＲＨ、Ｋｅｌｌ、Ｄｕｆｆｙ、Ｋｉｄｄ、Ｌｅｗｉｓなど）を同定することである。
【０１２０】
本発明の技術を使用する、赤血球の血液グループ判定／表現型判定の可能性を実証するために、基板１０２の表面を、抗赤血球抗体を固定するために用い、マイクロ流体プローブ２００を、患者の赤血球または全血試料を分配し、未結合の赤血球を除去するために用いる。抗赤血球抗体に結合したＲＢＣの赤色を次いで、視覚的に検出する。
【０１２１】
１．１−材料
この実施例において、結合剤１１０は抗赤血球抗体である。基板１０２の表面は、ポリスチレン９６ウェル平底プレートである。抗体を、インクジェットプリンターまたはコンタクトプリンターを用いて、ウェルの底上のスポットとして載せる。各ウェルは、各抗体特異性の少なくとも１つのスポットを含有する。この実施例において、抗体を、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）内に１０から５００μｇ／ｍＬの範囲の濃度で希釈し、受動吸収によって基板１０２の表面に結合させる。抗体を表面上に載せた後、基板を、試料成分の非特異的な結合を防ぐために、１％ＢＳＡを補ったＰＢＳと接触させることによって飽和させ、その後、空気乾燥する。
【０１２２】
この実施例において、以下の抗体を用いる。
−  抗Ａ  ＩｇＭクローン１５７５０Ｆ７（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）
−  抗Ｄ  ＩｇＧクローンＢＲＡＤ３（ＩＢＧＲＬ）
−  抗Ｋ１  ＩｇＧクローンＭＩＤ１１Ｇ４（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）
【０１２３】
１．２−試験の説明
本技術に従ったグループ判定の実現可能性を実証し、特異性を検証するために、各スポットを個別に試験する。適切な緩衝液（処理液）を、ウェル表面全体を覆うようにウェル内に分配する。マイクロ流体プローブを次いで抗体スポットの上に位置させる。第１のステップにおいて、ＲＢＣまたは全血の懸濁液をスポットの上に流して、ＲＢＣおよび抗体を接触させる。第２のステップにおいて、流れを洗浄緩衝液に切り替えて、未結合のＲＢＣを除去する。最後に、スポットした抗体に付着した赤血球の有無を視覚的にまたは分光光度的に検出する。
［実施例２］
【０１２４】
抗体のスクリーニング／同定
本発明の技術を使用する抗体のスクリーニングおよび同定の可能性を実証するために、基板１０２の表面を、ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）を介して非変性または溶血表現型の赤血球を固定するために用いる。この適用では、マイクロ流体プローブ２００は、加熱および連続的化学を行うように設計されている。プローブを、患者の血漿、血清、または全血試料を載せるため、非特異的抗体を除去するため、および標識された抗Ｆｃ抗体コンジュゲートを分配して結合抗体を検出するために使用する。
【０１２５】
２．１−材料および試薬
２．１．１．ＰＬＬでの基板１０２の表面の感作
この実施例において、基板１０２の表面は、ポリスチレン９６ウェル平底プレートである。ＰＢＳ（ｐＨ７．４）内の２５μｇ／ｍｌの分子量７万〜１３万のＰＬＬを各ウェルに分配し、１８時間、周囲温度でインキュベートする。このステップの最後に、ウェルを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を補ったＰＢＳ（ｐＨ７．４）内で洗浄し、次いで、細胞を固定するために使用する。
【０１２６】
２．１．２．表面上への細胞の固定
この実施例において、結合剤１１０は、非変性または溶血表現型の赤血球である。細胞を、インクジェットプリンターまたはコンタクトプリンターを用いて、ＰＬＬで被覆したウェル底上のスポットとして載せる。各ウェルは、各表現型の少なくとも１つのスポットを含有する。この実施例において、防腐成分を補った、緩衝液内で２０から５０％の細胞懸濁液。載せた後、基板を洗浄して未結合の細胞を除去し、次いで、試料成分および細胞防腐剤の非特異的な結合を防ぐために、１％ＢＳＡおよび１Ｍデキストロースを補ったＰＢＳと接触させることによって飽和させる。一晩インキュベーションした後、飽和緩衝液を除去し、表面を空気乾燥する。
【０１２７】
この実施例において、使用した結合剤は、抗体のスクリーニングに典型的に使用される、３つの非変性または溶血表現型の赤血球である。
【０１２８】
２．２．試験の説明
各細胞スポットを個別に試験する。適切な緩衝液（処理液）を、ウェル表面全体を覆うようにウェル内に分配する。マイクロ流体プローブを次いでスポットの上に位置させる。第１のステップにおいて、患者の血漿、血清、または全血をスポットの上に流して、試料およびＲＢＣを接触させる。プローブは、反応区域を３７℃に加熱するようにセットアップする。第２のステップにおいて、連続的なプロセスを適用する：非特異的抗体を除去するための洗浄、標識された抗Ｆｃ抗体コンジュゲートの分配、および未結合の標識された抗グロブリン抗体を除去するための最終洗浄。最後に、非変性または溶血表現型の赤血球に付着した抗体の有無を、発色、蛍光、または発光によって検出する。
［実施例３］
【０１２９】
クロスマッチング
本発明の技術を使用するクロスマッチングを行う可能性を実証するために、マイクロ流体プローブ２００を、ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）を介するドナー赤血球の固定から最終的な反応検出までの全てのステップを行うために用いる。このマイクロ流体プローブ２００は、加熱および連続的化学を行うように設計されている。プローブはまた、患者の血漿、血清、または全血試料を載せるため、および非特異的抗体を除去するために使用する。標識された抗Ｆｃ抗体コンジュゲートを用いて、結合した抗体を検出する。
【０１３０】
３．１−材料および試薬
３．１．１．ＰＬＬでの基板１０２の表面の感作
この実施例において、基板１０２の表面は、ポリスチレン９６ウェル平底プレートである。ＰＢＳ（ｐＨ７．４）内の２５μｇ／ｍｌの分子量７万〜１３万のＰＬＬを各ウェルに分配し、１８時間、周囲温度でインキュベートする。このステップの最後に、ウェルを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を補ったＰＢＳ（ｐＨ７．４）内で洗浄し、次いで、細胞を固定するために使用する。
【０１３１】
３．１．２．試験の説明
適切な緩衝液（処理液）を、ウェル表面全体を覆うように、ＰＬＬで被覆したウェル内に分配する。マイクロ流体プローブ２００を次いで表面の上に位置させ、以下の連続的なプロセスを適用する：事前に洗浄したドナー赤血球を載せること、未結合の細胞を除去するための洗浄ステップ、患者の血漿、血清、または全血を３７℃で流すこと、非特異的抗体を除去するための洗浄、標識された抗Ｆｃ抗体コンジュゲートの分配、および未結合の標識された抗グロブリン抗体を除去するための最終的な洗浄。最後に、ドナー赤血球に付着した抗体の有無を、発色、蛍光、または発光によって検出する。
［実施例４］
【０１３２】
直接抗グロブリン試験
この分析の目的は、特異的モノクローナルまたはポリクローナル抗体によって、インビボで感作されたＲＢＣに被覆されたＩｇＧおよび／またはＣ３ｄ補体画分を同定することである。
【０１３３】
本発明の技術を使用する、感作されたＲＢＣを検出する可能性を実証するために、基板１０２の表面を、抗ＩｇＧおよび抗Ｃ３ｄ抗体を固定するために用いる。マイクロ流体プローブ２００を、事前に洗浄した患者の赤血球を分配し、未結合の赤血球を除去するために用いる。特異的抗体に結合したＲＢＣの赤色を次いで、視覚的に検出する。
【０１３４】
４．１−材料
この実施例において、結合剤１１０は、抗ＩｇＧおよび抗Ｃ３ｄ抗体である。基板１０２の表面は、ポリスチレン９６ウェル平底プレートである。抗体を、インクジェットプリンターまたはコンタクトプリンターを用いて、ウェル底上のスポットとして載せる。各ウェルは、各抗体特異性の少なくとも１つのスポットを含有する。この実施例において、抗体を、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）内に１０から５００μｇ／ｍＬの範囲の濃度で希釈し、受動吸収によって基板１０２の表面に結合させる。抗体を表面上に載せた後、基板を、試料成分の非特異的な結合を防ぐために、１％ＢＳＡを補ったＰＢＳと接触させることによって飽和させて、その後、空気乾燥する。
【０１３５】
この実施例において、以下の抗体を用いる。
−  ポリクローナルウサギ抗ヒトＩｇＧ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）
−  抗Ｃ３ｄ  ＩｇＧクローン０５３Ａ７１４（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）
【０１３６】
４．２−試験の説明
試験の実現可能性を実証し、特異性を検証するために、反応を一体的な様式で行う。このケースにおいて、各スポットを個別に試験する。適切な緩衝液（処理液）を、ウェル表面全体を覆うようにウェル内に分配する。マイクロ流体プローブを次いで抗体スポットの上に位置させる。第１のステップにおいて、ＲＢＣの懸濁液をスポットの上に流して、ＲＢＣおよび抗体を接触させる。第２のステップにおいて、流れを洗浄緩衝液に切り替えて、未結合のＲＢＣを除去する。最後に、スポットした抗体に付着した赤血球の有無を視覚的にまたは分光光度的に検出する。
［実施例５］
【０１３７】
抗原型判定−シングルプレックスおよびマルチプレックスのグループ判定／表現型判定
この分析の目的は、特異的モノクローナルまたはポリクローナル抗体を用いることによって、ドナーまたは患者の赤血球の表面に存在する血液型抗原（血液型ＡＢＯ、ＲＨ、Ｋｅｌｌ、Ｄｕｆｆｙ、Ｋｉｄｄ、Ｌｅｗｉｓなど）を同定することである。
【０１３８】
本発明の技術を使用する、赤血球の表現型判定／グループ判定の可能性を実証するために、抗赤血球抗体を基板表面上に固定し、マイクロ流体プローブを、未結合の赤血球を除去すると同時に患者の赤血球を分配するために用いた。抗赤血球抗体に結合した赤血球の赤色を次いで、視覚的に検出し、抗原特異性を判定するために使用した。
【０１３９】
Ａ．  Ａ陽性赤血球のシングルプレックスグループ判定
材料
この実施例において、結合剤は抗赤血球抗体であり、特に、マウスＩｇＭ抗Ａ  ｍＡｂ（Ｂｉｏ−Ｒａｄクローン１５７５０Ｆ７）であった。この実験および全てのその後の実験では、基板はポリスチレンスライド（ＴＥＤ  ＰＥＬＬＡ，ＩＮＣ．、製品番号２６０２２５）であった。抗体を、インクジェットプリンターを用いて、スライド上のスポットの列として載せた。各スポットを、Ｘ、Ｙ座標によって明らかに同定した。スポットのサイズは約２５０μｍの直径であった。スポットを互いにアラインし、約５０〜６０μｍ離した。精製した抗Ａ  ＩｇＭ抗体をＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）内に１０から５００μｇ／ｍＬの範囲の濃度で希釈し、受動吸収によって基板１０２の表面に結合させた。抗体を表面上に載せた後、基板を、試料成分の非特異的な結合を防ぐために、ＰＢＳ内の１％ＢＳＡで処理した。こうして調製されたスライドを空気乾燥し、使用するまで４℃で保存した。この実施例およびその後の実施例で使用したマイクロ流体プローブは、１００μｍ×１００μｍの寸法をそれぞれ有する４つのチャネルを有するプローブであった。適切な流体力学的流動閉じ込めを得るために、チャネル２を用いて試料を分配し、チャネル１および３を用いて試料を吸引した。異なる表現型（Ａ陽性およびＯ陽性赤血球）を有する赤血球懸濁液を試料として用いた。
【０１４０】
方法
本技術に従ったグループ判定の実現可能性を実証し、特異性および再現性を検証するために、各スポットを同一の赤血球溶液（例えば、２つのＡ陽性赤血球および２つのＡ陰性赤血球（Ｏ赤血球））を用いて次々に試験した。この実施例において、赤血球を０．９％等張生理食塩水で洗浄し、生理食塩水内に５０％で懸濁した。マイクロ流体プローブのチャネル２を用いて、２μｌの希釈した赤血球懸濁液を１．６μｌ／分で吸引した。スライドを湿らせるために、十分な緩衝液（処理液）を、表面全体を覆うようにスライド上に分配した。マイクロ流体プローブを次いでスライドの上に位置させ、流体力学的流動閉じ込めを次いでセットアップした。流体力学的流動閉じ込めが安定したら、マイクロ流体プローブの動きを、０．０２ｍｍ／秒の速度で動くように、かつアラインされたスポットを通る直線をなぞるようにプログラムした。プローブが動く間、分配された赤血球は、飽和した基板１０２の表面と接触するか、またはスポットされた抗体と接触していた。正確な抗原特異性を有する赤血球は、固定された抗体にすぐに結合した。細胞および緩衝処理流体の連続的に載せ吸引したため、未結合の赤血球を赤血球の結合と同時に除去した。赤血球を載せ／吸引した後、スポットした抗体に付着した赤血球の有無を、カメラ画像キャプチャによって検出した。基板上の各スポットの位置を知ることで、抗原が試験対象の赤血球の表面に存在しているかを確認すること、ひいては、試験対象の赤血球の血液型特異性を同定することが可能となった。
【０１４１】
抗原がＡ陽性およびＡ陰性のＲＢＣの表面に存在しているかを判定するために、２つのＡ陽性赤血球および２つのＡ陰性赤血球を、ＲＢＣを２０のスポットに載せることによって試験した。Ａ陽性赤血球が結合した２０のスポットのうち４つの試験結果を図１３Ａに示す。４つ目のスポットの拡大図を図１３Ｂに示す。Ａ陽性赤血球はスポット表面全体に強力に結合し、一方、Ａ陰性赤血球は全く結合しなかった（示していない）。これらの結果は、観察された結合が特異的であること、すなわち、赤血球の結合が、抗原−抗体対が関与する場合にのみ生じることを実証する。この結果はまた、Ａ陽性赤血球がＡ陰性赤血球と明らかに区別され得、その結果、赤血球の表面にあるＡ抗原が同定され得ることを実証する。さらに、これらの結果は、未結合のＲＢＣを除去すると同時に固体基板上の抗赤血球抗体にＲＢＣを供するためにマイクロ流体プローブが使用される、シングルプレックス抗原型判定方法において、マイクロ流体プローブが使用され得ることを示す。
【０１４２】
本出願人はまた、評価される赤血球の抗原密度が低いほど、赤血球に覆われているスポット表面の密度が低いことを見出した。
【０１４３】
Ｂ．  ＡおよびＤ陽性赤血球のマルチプレックスグループ判定
この実施例において、同一の赤血球アリコート（したがって試料が少ない）を用いて、固定されたマウスＩｇＭ抗Ａモノクローナル抗体（ｍＡｂ）および固定されたヒトＩｇＧ抗Ｄ  ｍＡｂと別々に反応させた。
【０１４４】
材料
結合剤は、抗赤血球抗体：マウスＩｇＭ抗Ａ（クローン１５７  ５０  Ｆ７）およびヒトＩｇＧ抗Ｄ  ｍＡｂ（クローンＢｒａｄ３）であった。抗体を、ポリスチレンスライド上のスポットとして手動で載せた。各スポットを、Ｘ、Ｙ座標によって明らかに同定した。このケースにおいて、スポットのサイズは約１．５ｍｍの直径であった。同一の抗体特異性を有するスポットを互いにアラインし、互いに約２００μｍ離した。用いた抗体は精製されており、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）内に１０から５００μｇ／ｍＬの範囲の濃度で希釈されていた。希釈した抗体を受動吸収によって基板表面に結合させた。抗体を表面上に載せた後、基板を、試料成分の非特異的な結合を防ぐために、１％ＢＳＡを補ったＰＢＳで飽和させた。スライドを空気乾燥し、使用するまで４℃で保存した。適切な閉じ込めを得るために用いた条件は、以下の通りである：チャネル１：吸引、チャネル２：分配、およびチャネル３：吸引。異なるＡおよびＤ表現型（Ａ＋、Ａ−、Ｏ＋、およびＯ−）を有する赤血球懸濁液を試料として用いた。
【０１４５】
方法
マイクロ流体プローブ技術を用いるグループ判定／表現型判定の実現可能性を実証し、特異性を検証するために、各スポットを同一の赤血球溶液を用いて次々に試験した。この実施例において、赤血球をまず０．９％等張生理食塩水で洗浄し、生理食塩水内に５０％で懸濁した。１．５μｌの赤血球懸濁液を１．５μｌ／分で吸引した。スライドを湿らせるために、十分なＰＢＳ緩衝液（処理液）を、表面全体を覆うようにスライド上に分配した。マイクロ流体プローブをスライドの上に位置させ、流体力学的流動閉じ込めを次いでセットアップした。流体力学的流動閉じ込めが安定したら、Ｘ軸またはＹ軸に従うマイクロ流体プローブの動きを、アラインされたスポットを通る直線を描くように、０．０２ｍｍ／秒でプログラムした。プローブが動く間、分配された赤血球は、飽和した基板表面と接触するか、またはスポットされた抗体の１つと接触していた。正確な抗原特異性を有する赤血球は、固定された抗体にすぐに結合した。細胞および緩衝処理流体の連続的に載せ吸引したため、未結合の赤血球を赤血球の結合と同時に除去した。赤血球を載せ／吸引した後、スポットした抗体に付着した赤血球の有無を、カメラ画像キャプチャによって検出した。基板上の各特異的抗体の位置を知ることで、抗原が試験対象の赤血球の表面に存在しているかを同定すること、ひいては、試験対象の赤血球の血液型特異性を同定することが可能となった。
【０１４６】
Ａ陽性赤血球（Ａ＋、Ａ−）およびＤ陽性赤血球（Ａ＋、Ｏ＋）、ならびにＡ陰性（Ｏ−およびＯ＋）およびＤ陰性赤血球（Ｏ−およびＡ−）を試料として用い、それぞれ２スポットに線状に載せた。Ａ陽性赤血球は、抗Ａ  ｍＡｂが固定されたスポット表面のスキャン領域に強力に結合し（図１４Ａ）、一方、Ａ陰性赤血球は全く結合しなかった（図１４Ｂ）。Ｄ陽性赤血球も、抗Ｄ  ｍＡｂが固定されたスポット表面のスキャン領域に強力に結合し（図１４Ｃ）、一方、Ｄ陰性赤血球は全く結合しなかった（図１４Ｄ）。これらの結果は、観察された結合が特異的であること、すなわち、スポット／赤血球の結合が、抗原−抗体対が関与する場合にのみ生じることを実証する。これらの結果はまた、本発明のマイクロ流体プローブ技術を用いる赤血球の２パラメータマルチプレックスグループ判定／表現型判定の実現可能性を実証する。さらに、これらの結果は、未結合のＲＢＣを除去すると同時に固体基板上の抗赤血球抗体にＲＢＣを供するためにマイクロ流体プローブが使用される、マルチプレックス抗原型判定方法において、マイクロ流体プローブが使用され得ることを示す。これらの結果はまた、同一の試料がマルチプレックス化反応の実行に使用され得ること、すなわち、同一の試料が全スポットに供され得ることを示す。
［実施例６］
【０１４７】
直接クームス陽性赤血球の表現型判定：直接抗グロブリン試験
この分析の目的は、特異的モノクローナルまたはポリクローナル抗体を用いることによって、インビボで感作された赤血球に吸着されたヒトＩｇＧおよび／またはＣ３ｄ補体画分を同定することであった。
【０１４８】
ここでは、本発明の技術を使用する、感作された赤血球の検出の可能性を実証するために、抗ヒトグロブリンｍＡｂ（マウスＩｇＧ  ｍＡｂ）を基板表面上に固定した。マイクロ流体プローブを、ヒトＩｇＧで感作された赤血球を分配し、未結合の赤血球を除去するために用いた。特異的抗体に結合した赤血球の赤色を次いで、カメラ画像キャプチャによって視覚的に検出した。
【０１４９】
材料
この実施例において、結合剤は抗ヒトグロブリン抗体（マウスＩｇＧ  ｍＡｂ）であった。ポリスチレンスライドの表面全体を、抗体を用いて手動で官能化した。精製した抗体をＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）内に１０から５００μｇ／ｍＬの範囲の濃度で希釈し、受動吸収によってポリスチレンスライドの表面に結合させた。抗体をスライドの表面上に載せた後、スライドを、試料成分の非特異的な結合を防ぐために、１％ＢＳＡを補ったＰＢＳと接触させることによって飽和させた。これらのスライドを乾燥させ、使用するまで４℃で保存した。適切な閉じ込めを得るために用いた条件は、以下の通りである：チャネル１：吸引、チャネル２：分配、およびチャネル３：吸引。感作された赤血球懸濁液および非変性の赤血球懸濁液を試料として用いた。
【０１５０】
方法
インビボで感作された赤血球を模倣するために、ヒト抗Ｄ  ＩｇＧを用いて赤血球を感作した。０．９％等張生理食塩水で洗浄したＤ陽性赤血球を、生理食塩水内に２％で懸濁した。並行して、２０μｇ／ｍｌのヒト抗Ｄ  ｍＡｂ溶液を調製した。洗浄したＤ陽性ＲＢＣ溶液をヒト抗Ｄ  ｍＡｂ溶液と混合し、４５分、３７℃でインキュベートした。未結合の抗体を除去するために、抗Ｄ感作されたＲＢＣを０．９％等張生理食塩水で洗浄し、１０％で懸濁した。抗Ｄ感作されたＲＢＣを直接クームスカード（ＩｇＧ＋Ｃ３ｄ）で試験し、強力な陽性反応を得た。２μｌの感作されたＲＢＣ懸濁液を次いで、マイクロ流体プローブのチャネル２を用いて１．８μｌ／分で吸引した。スライドの表面全体をＰＢＳで湿らせた。プローブを次いでスライドの上に位置させた。マイクロ流体プローブの流動閉じ込めが安定した後、マイクロ流体プローブを、Ｘ軸に沿った直線を速度０．０２ｍｍ／秒でなぞるようにプログラムした。
【０１５１】
抗Ｄ感作された赤血球およびいかなる感作もしていない同一の赤血球（すなわち非変性ＲＢＣ）を、抗ヒトグロブリン抗体の結合剤を有するスライド上にマイクロ流体プローブを用いて載せた。結合剤へ試料を供するのと同時に、未結合材料をプローブによって除去した。抗体に付着した赤血球の有無を、カメラ画像キャプチャによって検出した。抗Ｄ感作されたＲＢＣは抗ヒトグロブリン抗体に結合し、一方、感作されなかったＲＢＣは抗ヒトグロブリン抗体に結合しなかった。
【０１５２】
この結果は、抗Ｄ感作された赤血球のみがスキャン領域全体にわたって抗ヒトグロブリンｍＡｂに強力に結合し（図１５）、一方、非変性の赤血球は全く結合しなかった（示していない）ことを示す。これらの結果は、観察された結合が特異的であることを実証する。さらに、これらの結果は、未結合のＲＢＣを同時に除去しながら固体基板上の抗ヒトグロブリンモノクローナル抗体にヒトＩｇＧで感作された赤血球を供するためにマイクロ流体プローブが使用される、直接抗グロブリン試験において、マイクロ流体プローブが使用され得ることを示す。
［実施例７Ａ］
【０１５３】
抗体のスクリーニング／同定
典型的ではない抗赤血球抗体のスクリーニングは、ドナーとレシピエントとの間の適合性の輸血を可能にするために必要である。目的は、レシピエントの血漿が、輸血されなくてはならないドナー赤血球に対する抗体を含有していないことを検証することである。スクリーニングは、表面上の血液型抗原の分布によって特徴付けされるいくつかの赤血球を用いる必要がある。このようなスクリーニングは以下の通りである：表現型が分かっている赤血球を試験対象の血清または血漿試料とインキュベートする。存在する場合、特異的抗体は赤血球の表面に結合し、抗ヒトグロブリン抗体を含有する試薬で検出される。様々な抗原を有するまたは有さない赤血球のパネルを用いることによって、試料内に存在する抗体の特異性を判定することが可能である。本発明の技術を使用する抗体のスクリーニングおよび同定の可能性を実証するために、基板表面を、ユニバーサル抗体を介して非変性または溶血表現型の赤血球を固定するために用いた。マイクロ流体プローブを次いで、抗Ｄモノクローナル抗体を分配するために用いて、患者の血漿を模倣した。抗Ｄモノクローナル抗体を分配している間、プローブは、非特異的に結合した材料を同時に除去した。プローブはまた、１０μｇ／ｍｌのフィコエリトリン標識された抗ヒトグロブリン抗体（二次抗体）を分配して、結合した抗Ｄモノクローナル抗体を検出するために用いた。
【０１５４】
材料
この実施例において、ポリスチレンスライドの表面全体を、ユニバーサル抗赤血球抗体を用いて手動で官能化した。用いた抗赤血球抗体を精製し、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）内に１００μｇ／ｍＬの濃度で希釈し、受動吸収によってスライドの表面に結合させた。スライドを次いで、試料成分の非特異的な結合を防ぐために、１％ＢＳＡを補ったＰＢＳと接触させることによって飽和させた。空気乾燥の後、スライドを使用するまで４℃で保存した。表現型判定された赤血球を０．９％等張生理食塩水で洗浄し、次いで、０．５％で懸濁した。この赤血球懸濁液を次いで、２０分間、３７℃で、湿潤室内で、スライドとインキュベートした。次いで、スライドを０．９％等張生理食塩水で洗浄して、未結合の赤血球を除去した。マイクロ流体プローブを次いで、低イオン強度緩衝液内に希釈した４μｇ／ｍｌのモノクローナル抗Ｄ  ｍＡｂ（一次抗体）および１０μｇ／ｍｌのフィコエリトリン標識された抗ヒトグロブリンｍＡｂ（二次抗体）の試料混合物を載せるために用いた。試料混合物は何らかの標識がないと検出不可能であったため、マイクロ流体プローブは二重の流動閉じ込めモードでランし、このことは、試料混合物が、それ自体が浸水液（ＰＢＳ）内に閉じ込められている別の形状の液体の内部に入れ子状になっていたことを意味する。このケースにおいて、第２の閉じ込めは可視的なフルオレセイン溶液で行い、試料混合物の適切な閉じ込めを保証した。マイクロ流体プローブを用いて、試料混合物はチャネル２で分配し、チャネル３で吸引し、フルオレセイン溶液はチャネル１で分配し、チャネル４で吸引した。
【０１５５】
方法
モノクローナル抗Ｄ  ｍＡｂと１０μｇ／ｍｌのフィコエリトリン標識された抗ヒトグロブリンｍＡｂとの混合物（３μｌ）を、マイクロ流体プローブのチャネル２を用いて３．５μｌ／分で吸引した。適切な量のＰＢＳ緩衝液（処理液）を分配して、スライドの表面全体を湿らせた。マイクロ流体プローブを次いでスライドの上に位置させ、二重の流動閉じ込めモードをセットアップした。二重の流動閉じ込めが安定した後、プローブを、３０秒から１８０秒の間、同一の位置に留まるようにセットアップした。試料の供給および未結合材料の除去は同時であった。抗ヒトグロブリンｍＡｂによって標識され、非変性の赤血球に付着した抗体の有無を、蛍光マイクロアレイ分析器ＳｅｎｓｏＳｐｏｔ（Ｓｅｎｓｏｖａｔｉｏｎ  ＡＧ、Ｒａｄｏｌｆｚｅｌｌ、ＧＥ）で蛍光を読み取ることによって検出した。
【０１５６】
図１６で示すように、抗Ｄ  ｍＡｂは、プローブがいかに長く同一の位置に留まっても、Ｄ陽性ＲＢＣに結合した。類似の結果が、モノクローナル抗Ｄ  ｍＡｂおよび標識された抗ヒトグロブリンｍＡｂが別々にＤ陽性ＲＢＣに供された場合にも得られた。この実験は、マイクロ流体プローブが、未結合材料の除去と同時に試料が供される抗体のスクリーニング／同定方法において使用され得ることを実証する。
［実施例７Ｂ］
【０１５７】
リバースＡＢＯグループ判定試験
この分析の目的は、血液試料におけるＡおよび／またはＢ血液型抗原に対する天然の抗体の有無を示すことであった。この分析の結果は、直接試験で得られた結果と組み合わせると、試料のＡＢＯ血液型の確立を可能にする。リバースＡＢＯグループ判定試験において用いられる試料は、血清、血漿、または全血試料であり得る。本発明の技術を使用するリバースＡＢＯグループ判定の可能性を実証するために、基板表面を、ユニバーサル抗体を介して非変性表現型の赤血球を固定するために用いた。この適用では、マイクロ流体プローブを、患者の血漿血清を載せ、未結合材料を除去するために用いた。
【０１５８】
材料
先の実施例にあるように、ポリスチレンスライド全体の表面をユニバーサル抗赤血球抗体で完全に官能化した。ユニバーサル抗赤血球抗体をスライド表面上に載せた後、スライドを、試料の非特異的な結合を防ぐために、１％ＢＳＡを補ったＰＢＳと接触させることによって飽和させた。これらのスライドを空気乾燥し、使用するまで４℃で保存した。表現型判定されたＡ陽性赤血球を０．９％等張生理食塩水で洗浄し、懸濁して最終濃度０．５％とした。この赤血球懸濁液を次いで、２０分、３７℃で、湿潤室内で、スライドとインキュベートした。次に、スライドを０．９％等張生理食塩水で洗浄して、未結合の赤血球を除去した。マイクロ流体プローブを次いで、Ｂ血液型の人の血漿を載せるために用いた。血漿は何らかの標識がないと検出不可能であったため、先の実施例におけるように、マイクロ流体プローブをここでも二重の流動閉じ込めモードで用いた。
【０１５９】
方法
血漿試料をマイクロ流体プローブのチャネル２を用いて３．２μｌ／分で吸引した。適切な緩衝液（処理液）を、表面全体を湿潤させるためにスライド上に分配した。マイクロ流体プローブをスライドの上に位置させ、二重の流動閉じ込めモードを次いでセットアップした。二重の流動閉じ込めが安定したら、プローブを、３０秒から１８０秒の間、同一の位置に留まるようにセットアップした。ここでも、試料の供給および未結合材料の除去は同時に生じた。スライドを次いで、１５分、３７℃で、１０μｇ／ｍｌのフィコエリトリン標識された抗ヒトＨ＋Ｌ  Ａｂと浴内でインキュベートした。抗ヒトＨ＋Ｌ  Ａｂによって標識され、非変性の赤血球に結合した血漿抗体の有無を、蛍光マイクロアレイ分析器ＳｅｎｓｏＳｐｏｔ（Ｓｅｎｓｏｖａｔｉｏｎ  ＡＧ、Ｒａｄｏｌｆｚｅｌｌ、ＧＥ）で蛍光を読み取ることによって検出した。
【０１６０】
図１７に示すように、抗Ｄ  ｍＡｂはＡ陽性ＲＢＣに結合し、プローブが同一の位置に留まっていた時間に応じて結合の強度は増大する。この実験は、マイクロ流体プローブが、未結合の血漿材料の除去と同時に患者の血漿が表現型判定された赤血球に供されるリバースグループ判定方法において使用され得ることを実証した。
［実施例８］
【０１６１】
クロスマッチ
この分析の一目的は、ドナーからレシピエントへの１つまたは複数の血球濃縮物の輸血の背景において、完全なドナー−レシピエント適合性があることを確実にすることであった。別の目的は、ドナーの赤血球によって運ばれる血液型構造に対するレシピエント血漿内の抗体の存在に関連する不適合性を実証することであった。マイクロ流体プローブを、ユニバーサル抗体を介してドナー赤血球を固定し、患者の血漿を載せ、かつ非特異的に結合した患者の血漿材料を除去するために用いた。赤血球に結合した血漿抗体の有無の検出を、標識された抗ヒトグロブリンＡｂで行った。
【０１６２】
材料
ポリスチレンスライド全体の表面を、実施例７Ａにおけるように、ユニバーサル抗赤血球抗体で完全に官能化した。ユニバーサル抗赤血球抗体をスライド表面上に載せた後、スライドを、試料成分の非特異的な結合を防ぐために、１％ＢＳＡを補ったＰＢＳと接触させることによって飽和させた。スライドを空気乾燥し、使用するまで４℃で保存した。Ａ＋ドナー赤血球を０．９％等張生理食塩水で洗浄し、５０％の濃度で懸濁した。Ａ＋ドナーＲＢＣを分配するために、マイクロ流体プローブを流体力学的流動閉じ込めモードで以下のように操作した：チャネル１：吸引、チャネル２：分配、およびチャネル３：吸引。次いで、二重の閉じ込めモードを用いて、Ａ＋またはＯ＋患者血漿を以下のように分配した：血漿はチャネル２で分配し、チャネル３で吸引し、フルオレセイン溶液はチャネル１で分配し、チャネル４で吸引した。
【０１６３】
方法
この実施例において、２．５μｌのＡ＋ドナー赤血球懸濁液（５０％の希釈懸濁液）を、マイクロ流体プローブを用いて１．５μｌ／分で吸引した。ＰＢＳ緩衝液（処理液）を、表面全体を湿潤させるためにスライド上に分配した。マイクロ流体プローブを次いでスライドの上に位置させ、流動閉じ込めを次いでセットアップした。流動閉じ込めが安定したら、マイクロ流体プローブの動きを、Ｘ軸に沿った直線を描くように０．０３ｍｍ／秒でプログラムした。線の長さは約１２ｍｍであった。プローブが動く間、Ａ＋ドナーの赤血球は、スライド表面に結合したユニバーサル抗赤血球抗体にすぐに結合した。連続的な流れのため、赤血球が分配されると、未結合の赤血球は同時に除去された。マイクロ流体プローブを次いで、Ａ＋またはＯ＋患者の血漿を先に記載したように二重の流動閉じ込めモードで載せるために用いた。マイクロ流体プローブを用いて、２μｌの血漿を３μｌ／分で吸引した。マイクロ流体プローブを、Ａ＋血漿では６０秒、Ｏ＋血漿では３０または６０秒、同一の位置に留まるようにセットアップした。事前に供されたＲＢＣへの血漿の供給と同時に、未結合材料をプローブで除去した。スライドを次いで、１５分、３７℃で、１０μｇ／ｍｌのフィコエリトリン標識された抗ヒトグロブリンＡｂと浴内でインキュベートした。最後に、フィコエリトリン標識された抗ヒトグロブリンＡｂによって標識され、非変性の赤血球に結合した抗体の有無を、蛍光マイクロアレイ分析器ＳｅｎｓｏＳｐｏｔ（Ｓｅｎｓｏｖａｔｉｏｎ  ＡＧ、Ｒａｄｏｌｆｚｅｌｌ、ＧＥ）で蛍光を読み取ることによって検出した。
【０１６４】
図１８Ａおよび図１８Ｂに示すように、Ａ＋血漿はＡ＋赤血球に結合しなかった（例えば、偽スポットのみが検出された）。しかし、結合は、３０秒のインキュベーション時間であっても、Ｏ＋血漿で観察された。この実験は、マイクロ流体プローブが、未結合の血漿材料の除去と同時にドナー血漿が固定された赤血球に供されるクロスマッチング方法において使用され得ることを実証した。
【０１６５】
本明細書および本明細書に添付の特許請求の範囲（および本明細書における用語）において用いる場合、用語「含む（comprise）」およびそれらの変型、例えば「含む（comprises）」および「含む（comprising）」は、ステップまたはエレメントの列挙に先行する場合、さらなるステップまたはエレメントの追加が任意選択であり排除されないことを意味するものである。本明細書において引用される全ての特許、特許出願、および他の刊行された参考文献は、ここで、参照することによってその全体が本明細書に組み込まれる。本明細書において引用されるあらゆる参考文献またはあらゆる通常の先行技術と、本明細書の明確な教示との間のあらゆる不一致は、本明細書の教示が優先されることで解決されるものとする。これには、ある語または表現の本技術分野で理解されている定義と、同一の語または表現の本明細書において明確に提示されている定義との間のいかなる不一致も含まれる。
【０１６６】
米国特許出願第１３／８８１９８９号明細書の本文は、以下に組み込まれる。
【符号の説明】
【０１６７】
１００  系
１０２  基板
１０４  ディスペンサー
１０６  光源
１０８  検出器
１１０  ＡＤＣ、結合剤
１１２  マイクロプロセッサ
１１４  ディスプレイ
１１６  メモリ
２００  マイクロ流体プローブ
２１０  被覆層
２１１  バイアス
２１２  バイアス
２２０  基底層
２２１  開口部
２２２  開口部
２２３  処理液マイクロチャネル
２２３’  溝
２２４  処理液マイクロチャネル
２２４’  溝
３１０  エッジ
３１１  通路
３２０  正面
３２１  開口部
３２２  開口部
３２３  浸水液マイクロチャネル
３２４  浸水液マイクロチャネル
６００  マイクロ流体プローブ
６０２  マイクロチャネル
６０４  マイクロチャネル
７００  マイクロ流体プローブ
７０２  マイクロチャネル
７０４  開口部
７０６  毛細管
７０８  開口部
８００  方法
９００  プローブアレイ
１１００  マイクロ流体プローブ
１２００  クロスマッチング方法
【図１】
0006746059.tif 000002
【図２】
0006746059.tif 000003
【図３】
0006746059.tif 000004
【図４】
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【図５】
0006746059.tif 000006
【図６】
0006746059.tif 000007
【図７】
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【図８】
0006746059.tif 000009
【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
0006746059.tif 000015
【図１５】
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【図１６】
0006746059.tif 000017
【図１７】
0006746059.tif 000018
【図１８】
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