(57)【要約】【課題】シナプス機能不全に起因する、又はシナプス機能不全を付随する疾病の発症の有無や重症度を早期かつ簡便に判定することのできる判定方法を提供するとともに、シナプス機能不全に起因する、又はシナプス機能不全を付随する疾病の治療剤、予防剤のスクリーニング方法を提供すること。【解決手段】ドレブリンＡ関連タンパク質（ＤＡＲＰｓ）を指標としてシナプス機能不全に起因する、又はシナプス機能不全を付随する疾病の発症の有無や重症度を判定する判定方法や、ドレブリンＡ関連タンパク質（ＤＡＲＰｓ）を指標としてシナプス機能不全に起因する、又はシナプス機能不全を付随する疾病の治療剤、予防剤のスクリーニングを行うスクリーニング方法により、これらの疾病を早期かつ簡便に判定することのできる判定方法を提供するとともに、これらの疾病に対する創薬研究に資することができる。【選択図】図３
2022001838.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程（ａ−１）〜（ｃ−１）を備えたことを特徴とするシナプス機能不全に起因する、若しくはシナプス機能不全を付随する疾病の発症リスク、又は発症の有無の判定方法。
（ａ−１）被験者から採取された生体試料中のドレブリンＡ関連タンパク質（ＤＡＲＰｓ）の濃度を測定する工程；
（ｂ−１）工程（ａ−１）で測定したＤＡＲＰｓの濃度を、シナプス機能不全に起因する、又はシナプス機能不全を付随する疾病を発症しない対照者におけるＤＡＲＰｓの濃度と比較する工程；
（ｃ−１）工程（ａ−１）で測定したＤＡＲＰｓの濃度が、前記対照者におけるＤＡＲＰｓの濃度よりも高いとき、前記被験者は、シナプス機能不全に起因する、若しくはシナプス機能不全を付随する疾病を発症するリスクが高い、又はシナプス機能不全に起因する、若しくはシナプス機能不全を付随する疾病を発症している可能性が高いと評価する工程；
【請求項２】
以下の工程（ａ−２）〜（ｃ−２）を備えたことを特徴とするシナプス機能不全に起因する、又はシナプス機能不全を付随する疾病の重症度の判定方法。
（ａ−２）シナプス機能不全に起因する、又はシナプス機能不全を付随する疾病を発症している被験者から採取された生体試料中のドレブリンＡ関連タンパク質（ＤＡＲＰｓ）の濃度を測定する工程；
（ｂ−２）工程（ａ−２）で測定したＤＡＲＰｓの濃度を、シナプス機能不全に起因する、又はシナプス機能不全を付随する疾病を発症している対照者におけるＤＡＲＰｓの濃度と比較する工程；
（ｃ−２）工程（ａ−２）で測定したＤＡＲＰｓ及び／又はＤＡＲＰｓ自己抗体の濃度が、前記対照者におけるＤＡＲＰｓ及び／又はＤＡＲＰｓ自己抗体の濃度よりも高いとき、前記被験者は、前記対照者よりもシナプス機能不全に起因する、又はシナプス機能不全を付随する疾病が重症化している可能性が高いと評価する工程；
【請求項３】
以下の工程（ａ−３）〜（ｃ−３）を備えたことを特徴とするシナプス機能不全に起因する、若しくはシナプス機能不全を付随する疾病の予防剤、又はシナプス機能不全に起因する、若しくはシナプス機能不全を付随する疾病の治療剤のスクリーニング方法。
（ａ−３）被検物質を投与したシナプス機能不全モデル非ヒト動物から採取された試料中のドレブリンＡ関連タンパク質（ＤＡＲＰｓ）の濃度を測定する工程；
（ｂ−３）工程（ａ−３）で測定したドレブリンＡ関連タンパク質（ＤＡＲＰｓ）の濃度を、前記被検物質を投与しないシナプス機能不全モデル非ヒト動物におけるドレブリンＡ関連タンパク質（ＤＡＲＰｓ）の濃度と比較する工程；
（ｃ−３）工程（ａ−３）で測定したドレブリンＡ関連タンパク質（ＤＡＲＰｓ）の濃度が、前記被検物質を投与しないシナプス機能不全モデル非ヒト動物におけるドレブリンＡ関連タンパク質（ＤＡＲＰｓ）の濃度よりも低いとき、前記被検物質は、シナプス機能不全に起因する、若しくはシナプス機能不全を付随する疾病の予防、又はシナプス機能不全に起因する、若しくはシナプス機能不全を付随する疾病の治療に有効であると評価する工程；
【請求項４】
以下の工程（ａ−４）〜（ｄ−４）を備えたことを特徴とするシナプス機能不全に起因する、若しくはシナプス機能不全を付随する疾病の予防剤、又はシナプス機能不全に起因する、若しくはシナプス機能不全を付随する疾病の治療剤のスクリーニング方法。
（ａ−４）シナプス機能不全モデル培養細胞に被検物質を投与し、培養する工程；
（ｂ−４）前記シナプス機能不全モデル培養細胞の培養液中のドレブリンＡ関連タンパク質（ＤＡＲＰｓ）の濃度を測定する工程；
（ｃ−４）工程（ｂ−４）で測定したＤＡＲＰｓの濃度を、前記被検物質を投与しないシナプス機能不全モデル培養細胞の培養液中のＤＡＲＰｓの濃度と比較する工程；
（ｄ−４）工程（ｂ−４）で測定したＤＡＲＰｓの濃度が、前記被検物質を投与しないシナプス機能不全モデル培養細胞の培養液中のＤＡＲＰｓの濃度よりも低いとき、前記被検物質は、シナプス機能不全に起因する、若しくはシナプス機能不全を付随する疾病の予防、又はシナプス機能不全に起因する、若しくはシナプス機能不全を付随する疾病の治療に有効であると評価する工程；
【請求項５】
生体試料が、脳脊髄液試料又は血液試料であることを特徴とする請求項１〜３に記載の方法。
【請求項６】
ＤＡＲＰｓが、ＤＡＲＰ４０、ＤＡＲＰ６０、ＤＡＲＰ７０、ＤＡＲＰ９０、及びＤＡＲＰ１００から選択される１又は２種以上であることを特徴とする請求項１〜５に記載の方法。
【請求項７】
シナプス機能不全に起因する、又はシナプス機能不全を付随する疾病が、神経変性疾患であることを特徴とする請求項１〜６に記載の方法。
【請求項８】
神経変性疾患が、アルツハイマー病、大脳皮質基底核症候群、パーキンソン病、脊髄小脳変性症及び筋萎縮性側索硬化症から選択されることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ＤＡＲＰｓの濃度が、ドレブリンＡ特異的エピトープを認識する抗体を用いて測定されることを特徴とする請求項１〜８に記載の方法。
【請求項１０】
ドレブリンＡ特異的エピトープを認識することを特徴とする請求項９に記載の方法に用いるための抗体。
【請求項１１】
請求項１０に記載の抗体を含むことを特徴とするシナプス機能不全に起因する、若しくはシナプス機能不全を付随する疾病の発症リスク、発症の有無、又は重症度の判定用キット。
【請求項１２】
ドレブリンＡ関連タンパク質（ＤＡＲＰｓ）自己抗体に対するドミナントネガティブペプチドを探索することを特徴とするシナプス機能不全に起因する、若しくはシナプス機能不全を付随する疾病の予防剤、又はシナプス機能不全に起因する、若しくはシナプス機能不全を付随する疾病の治療剤のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シナプス機能不全に起因する、又はシナプス機能不全を付随する疾病の発症の有無や重症度を早期かつ簡便に判定することのできる判定方法や、シナプス機能不全に起因する、若しくはシナプス機能不全を付随する疾病の予防剤及び／又は治療剤のスクリーニング方法や、該判定方法や該スクリーニング方法に用いるための抗体や、該判定方法を行うためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
認知症の主な原因であるアルツハイマー病は、不可逆的な進行性の脳疾患であり、脳におけるシナプスが機能不全に陥ることによって生じるとされている。アルツハイマー病患者の増加は、近年、大きな社会的関心事となっており、その早期診断方法や治療薬の確立が望まれている。アルツハイマー病患者の死後脳では老人斑が観察され、これは「アミロイドβ蛋白質」の凝集体（アミロイド斑）であることが知られている。アミロイドβ蛋白質の沈着が、病理学的に確認できる最も初期の病変であり、アミロイドβ蛋白質が凝集し、そして直接神経細胞毒性を示すことが報告されている。そして、家族性アルツハイマー病患者の遺伝子解析から、アミロイドβ蛋白質の産生及び蓄積の異常がアルツハイマー病の発症に広く関連しているということが現在広く受け入れられている。これは、アミロイドカスケード仮説と呼ばれている。このように、アミロイドβ蛋白質がアルツハイマー病の主原因であることは、数多くの研究により広く受け入れられている（非特許文献１）。また、脳へのアミロイドβ蛋白質の蓄積は、発症より２０年以上前から始まっていることがわかっている。
【０００３】
アルツハイマー病のほかにも、脳の血流の低下（うつ病など）、脳出血、脳梗塞などが原因となってシナプス機能不全が生じることがわかっている。さらに、ミトコンドリアの遺伝子疾患、糖尿病に由来する認知症なども知られている。また、薬物依存などでもシナプス機能不全が起こる場合もある。これらのシナプス機能不全に起因する、又はシナプス機能不全を付随する疾病においても、シナプス機能不全によって認知機能が低下すると考えられているが、その診断は困難である。例えば、アルツハイマー病の診断は、死亡後に病理解剖を行うことによってのみ診断を確定することができ、生前の診断は質問式検査や画像検査によって行っているが、いずれも自覚症状が現れてからの診断となり、早期の治療開始ができていないのが実情である。また、脳脊髄液中のアミロイドβ４２蛋白質の濃度低下によりアルツハイマー病の診断を行うことができるとの報告もあるが（非特許文献２）、侵襲性の高い検査であり高齢者への適用が難しいという問題点がある。また、現状用いられているアルツハイマー病の治療薬は、いずれも症状を抑える薬であり、根本治療につながる医薬品は存在しない。また、その他のシナプス機能不全に起因する、又はシナプス機能不全を付随する疾病においても、質問式検査（うつ病、認知症等）や画像検査（脳出血等）に頼っており、簡便且つ早期に診断するための方法は存在しない。
【０００４】
本発明者らは、発生過程の神経細胞に多量発現するアクチン結合タンパクドレブリン（Drebrin）を世界に先駆けて発見し（例えば、非特許文献３及び４参照）、このドレブリンがアクチンファイバーの性状を変えることにより神経細胞の形態形成、特に突起形成に関わっていること（例えば、非特許文献５〜７参照）や、発生中で移動している神経細胞では、細胞体と突起全体に存在するが、成熟した神経細胞では棘構造（樹状突起スパイン）中に特異的に存在すること（例えば、非特許文献８〜１０参照）を既に証明している。ドレブリンには、胚性型（embryonic type）のドレブリンＥと成体型（adult type）のドレブリンＡという２つのアイソフォームが存在しており（例えば、非特許文献４参照）、成熟した神経細胞の樹状突起スパインに特異的に見られるドレブリンＡは、神経細胞にしか発現しないという特徴を有している（例えば、非特許文献９及び１０参照）。本発明者らは、さらに、アルツハイマー病などの痴呆性疾患では樹状突起スパインのドレブリンが広範囲に消失していることを報告している（非特許文献１１）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】斉藤  貴志，西道  隆臣「アルツハイマー病のモデルマウス」日薬理誌（Folia Pharmacol. Jpn.）144, 250-252, 2014
【非特許文献２】J. Neurol. Sci. 148, 41-45, 1997
【非特許文献３】J. Neurochem. 44, 1210-1216, 1985
【非特許文献４】J. Biochem. 117, 231-236, 1995
【非特許文献５】J. Neurosci. Res. 38, 149-159, 1994
【非特許文献６】Exp. Cell Res. 215, 145-153, 1994
【非特許文献７】J. Biol. Chem. 269, 29928-29933, 1994
【非特許文献８】J. Neurosci. 15, 7161-7170, 1996
【非特許文献９】Dev. Brain Res. 29, 233-244, 1986
【非特許文献１０】Brain Res. 413, 374-378, 1987
【非特許文献１１】J Neurosci. Res. 43(1), 87-92, 1996
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上述したとおり、現状ではシナプス機能不全に起因する、又はシナプス機能不全を付随する疾病を早期かつ簡便に判定することはできていない。さらに、シナプス機能不全を直接的に治療することはできておらず、例えばアルツハイマー病の治療においても根本治療には至っておらず、対症療法を行っているのが現状である。本発明は、かかる事情に鑑みなされたものであり、シナプス機能不全に起因する、又はシナプス機能不全を付随する疾病の発症の有無や重症度を早期かつ簡便に判定することのできる判定方法を提供するとともに、シナプス機能不全に起因する、又はシナプス機能不全を付随する疾病の治療剤、予防剤のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、アルツハイマー病などの痴呆性疾患では樹状突起スパインのドレブリンＡが広範囲に消失しているという知見に基づいて、アルツハイマー病患者においてはドレブリンＡが神経細胞から血液中に漏出していると考えた。そこで、血液中のドレブリンＡを検出するため、常法に従い血液中の抗体を除去するためにプロテインＡ／Ｇビーズ処理を行い、その後、ドレブリンＡ及びドレブリンＥを認識する抗ドレブリン抗体を用いてウェスタンブロッティング法に供したが、ドレブリンのバンドは確認できなかった。本発明者らは、血液試料のプロテインＡ／Ｇビーズによる沈降画分について念のため抗ドレブリン抗体を用いてウェスタンブロッティング法に供したところ、予想に反し、約１３０ｋＤａの位置にドレブリンのバンドを確認することができた。このドレブリンのバンドがドレブリンＡであるかどうか確認するため、血液試料のプロテインＡ／Ｇビーズによる沈降画分について抗ドレブリンＡ抗体でのウェスタンブロッティングを行ったところ、約１３０ｋＤａのバンドはドレブリンＡ全長ではなくドレブリンＥであったものの、抗ドレブリンＡ抗体により検出することのできる、ドレブリンＡ全長より小さい分子量のバンドを複数検出することができた。ここで検出されたバンドは、ドレブリンＡ遺伝子に特徴的なＩｎｓ２配列の翻訳ペプチドを有するドレブリンＡの断片、又はスプライスバリアントであると考えられた。本発明者らは、さらに検討を重ね、このようなドレブリンＡ関連タンパク質（ＤＡＲＰｓ：Drebrin A Related Proteins）がシナプス機能不全に起因する、又はシナプス機能不全を付随する疾病に罹患した患者由来の生体試料には多く存在していることを見いだした。さらに、本発明者らは、ＤＡＲＰｓが自己抗体を介してプロテインＡ／Ｇビーズに結合していることや、ドレブリンを認識する自己抗体が神経細胞を損傷し得ること、自己抗体による神経細胞の損傷を抑制することにより、シナプス機能不全に起因する、若しくはシナプス機能不全を付随する疾病を治療又は予防し得ることを見いだした。本発明は、これらの知見により完成したものである。
【０００８】
すなわち本発明は以下に関する。
〔１〕以下の工程（ａ−１）〜（ｃ−１）を備えたことを特徴とするシナプス機能不全に起因する、若しくはシナプス機能不全を付随する疾病の発症リスク、又は発症の有無の判定方法。
（ａ−１）被験者から採取された生体試料中のドレブリンＡ関連タンパク質（ＤＡＲＰｓ）の濃度を測定する工程；
（ｂ−１）工程（ａ−１）で測定したＤＡＲＰｓの濃度を、シナプス機能不全に起因する、又はシナプス機能不全を付随する疾病を発症しない対照者におけるＤＡＲＰｓの濃度と比較する工程；
（ｃ−１）工程（ａ−１）で測定したＤＡＲＰｓの濃度が、前記対照者におけるＤＡＲＰｓの濃度よりも高いとき、前記被験者は、シナプス機能不全に起因する、若しくはシナプス機能不全を付随する疾病を発症するリスクが高い、又はシナプス機能不全に起因する、若しくはシナプス機能不全を付随する疾病を発症している可能性が高いと評価する工程；
〔２〕以下の工程（ａ−２）〜（ｃ−２）を備えたことを特徴とするシナプス機能不全に起因する、又はシナプス機能不全を付随する疾病の重症度の判定方法。
（ａ−２）シナプス機能不全に起因する、又はシナプス機能不全を付随する疾病を発症している被験者から採取された生体試料中のドレブリンＡ関連タンパク質（ＤＡＲＰｓ）の濃度を測定する工程；
（ｂ−２）工程（ａ−２）で測定したＤＡＲＰｓの濃度を、シナプス機能不全に起因する、又はシナプス機能不全を付随する疾病を発症している対照者におけるＤＡＲＰｓの濃度と比較する工程；
（ｃ−２）工程（ａ−２）で測定したＤＡＲＰｓ及び／又はＤＡＲＰｓ自己抗体の濃度が、前記対照者におけるＤＡＲＰｓ及び／又はＤＡＲＰｓ自己抗体の濃度よりも高いとき、前記被験者は、前記対照者よりもシナプス機能不全に起因する、又はシナプス機能不全を付随する疾病が重症化している可能性が高いと評価する工程；
〔３〕以下の工程（ａ−３）〜（ｃ−３）を備えたことを特徴とするシナプス機能不全に起因する、若しくはシナプス機能不全を付随する疾病の予防剤、又はシナプス機能不全に起因する、若しくはシナプス機能不全を付随する疾病の治療剤のスクリーニング方法。
（ａ−３）被検物質を投与したシナプス機能不全モデル非ヒト動物から採取された試料中のドレブリンＡ関連タンパク質（ＤＡＲＰｓ）の濃度を測定する工程；
（ｂ−３）工程（ａ−３）で測定したドレブリンＡ関連タンパク質（ＤＡＲＰｓ）の濃度を、前記被検物質を投与しないシナプス機能不全モデル非ヒト動物におけるドレブリンＡ関連タンパク質（ＤＡＲＰｓ）の濃度と比較する工程；
（ｃ−３）工程（ａ−３）で測定したドレブリンＡ関連タンパク質（ＤＡＲＰｓ）の濃度が、前記被検物質を投与しないシナプス機能不全モデル非ヒト動物におけるドレブリンＡ関連タンパク質（ＤＡＲＰｓ）の濃度よりも低いとき、前記被検物質は、シナプス機能不全に起因する、若しくはシナプス機能不全を付随する疾病の予防、又はシナプス機能不全に起因する、若しくはシナプス機能不全を付随する疾病の治療に有効であると評価する工程；
〔４〕以下の工程（ａ−４）〜（ｄ−４）を備えたことを特徴とするシナプス機能不全に起因する、若しくはシナプス機能不全を付随する疾病の予防剤、又はシナプス機能不全に起因する、若しくはシナプス機能不全を付随する疾病の治療剤のスクリーニング方法。
（ａ−４）シナプス機能不全モデル培養細胞に被検物質を投与し、培養する工程；
（ｂ−４）前記シナプス機能不全モデル培養細胞の培養液中のドレブリンＡ関連タンパク質（ＤＡＲＰｓ）の濃度を測定する工程；
（ｃ−４）工程（ｂ−４）で測定したＤＡＲＰｓの濃度を、前記被検物質を投与しないシナプス機能不全モデル培養細胞の培養液中のＤＡＲＰｓの濃度と比較する工程；
（ｄ−４）工程（ｂ−４）で測定したＤＡＲＰｓの濃度が、前記被検物質を投与しないシナプス機能不全モデル培養細胞の培養液中のＤＡＲＰｓの濃度よりも低いとき、前記被検物質は、シナプス機能不全に起因する、若しくはシナプス機能不全を付随する疾病の予防、又はシナプス機能不全に起因する、若しくはシナプス機能不全を付随する疾病の治療に有効であると評価する工程；
〔５〕生体試料が、脳脊髄液試料又は血液試料であることを特徴とする上記〔１〕〜〔３〕に記載の方法。
〔６〕ＤＡＲＰｓが、ＤＡＲＰ４０、ＤＡＲＰ６０、ＤＡＲＰ７０、ＤＡＲＰ９０、及びＤＡＲＰ１００から選択される１又は２種以上であることを特徴とする上記〔１〕〜〔５〕に記載の方法。
〔７〕シナプス機能不全に起因する、又はシナプス機能不全を付随する疾病が、神経変性疾患であることを特徴とする上記〔１〕〜〔６〕に記載の方法。
〔８〕神経変性疾患が、アルツハイマー病、大脳皮質基底核症候群、パーキンソン病、脊髄小脳変性症及び筋萎縮性側索硬化症から選択されることを特徴とする上記〔７〕に記載の方法。
〔９〕ＤＡＲＰｓの濃度が、ドレブリンＡ特異的エピトープを認識する抗体を用いて測定されることを特徴とする上記〔１〕〜〔８〕に記載の方法。
〔１０〕ドレブリンＡ特異的エピトープを認識することを特徴とする上記〔９〕に記載の方法に用いるための抗体。
〔１１〕上記〔１０〕に記載の抗体を含むことを特徴とするシナプス機能不全に起因する、若しくはシナプス機能不全を付随する疾病の発症リスク、発症の有無、又は重症度の判定用キット。
〔１２〕ドレブリンＡ関連タンパク質（ＤＡＲＰｓ）自己抗体に対するドミナントネガティブペプチドを探索することを特徴とするシナプス機能不全に起因する、若しくはシナプス機能不全を付随する疾病の予防剤、又はシナプス機能不全に起因する、若しくはシナプス機能不全を付随する疾病の治療剤のスクリーニング方法。
【０００９】
また本発明の実施の他の形態として、
被験者から採取された生体試料中のドレブリンＡ関連タンパク質（ＤＡＲＰｓ）の濃度を測定する工程（ａ−１）を備えた、シナプス機能不全に起因する、又はシナプス機能不全を付随する疾病の発症リスク、又は発症の有無の判定方法；や、
シナプス機能不全に起因する、又はシナプス機能不全を付随する疾病を発症している被験者から採取された生体試料中のドレブリンＡ関連タンパク質（ＤＡＲＰｓ）の濃度を測定する工程（ａ−２）を備えた、シナプス機能不全に起因する、又はシナプス機能不全を付随する疾病の重症度の判定方法；や、
１又は２以上のドレブリンＡ関連タンパク質（ＤＡＲＰｓ）からなる、シナプス機能不全に起因する、若しくはシナプス機能不全を付随する疾病の発症リスク、又は発症の有無の判定用、或いはシナプス機能不全に起因する、若しくはシナプス機能不全を付随する疾病の重症度の判定用バイオマーカー；や、
被検物質を投与したシナプス機能不全モデル非ヒト動物から採取された試料中のドレブリンＡ関連タンパク質（ＤＡＲＰｓ）の濃度を測定する工程（ａ−３）を備えた、シナプス機能不全に起因する、若しくはシナプス機能不全を付随する疾病の予防剤、又はシナプス機能不全に起因する、若しくはシナプス機能不全を付随する疾病の治療剤のスクリーニング方法；や、
上記工程（ａ−４）及び（ｂ−４）を備えた、シナプス機能不全に起因する、若しくはシナプス機能不全を付随する疾病の予防剤、又はシナプス機能不全に起因する、若しくはシナプス機能不全を付随する疾病の治療剤のスクリーニング方法；や、
上記工程（ａ−１）〜（ｃ−１）を備えた、シナプス機能不全に起因する、若しくはシナプス機能不全を付随する疾病の発症リスク、又は発症の有無を診断するためのデータを収集する方法；や、
上記工程（ａ−２）〜（ｃ−２）を備えた、シナプス機能不全に起因する、又はシナプス機能不全を付随する疾病の重症度を診断するためのデータを収集する方法；や、
上記工程（ａ−３）〜（ｃ−３）を備えた、シナプス機能不全に起因する、若しくはシナプス機能不全を付随する疾病の予防剤、又はシナプス機能不全に起因する、若しくはシナプス機能不全を付随する疾病の治療剤の有効性を判定する方法；や、
上記工程（ａ−４）〜（ｄ−４）を備えた、シナプス機能不全に起因する、若しくはシナプス機能不全を付随する疾病の予防剤、又はシナプス機能不全に起因する、若しくはシナプス機能不全を付随する疾病の治療剤の有効性を判定する方法；や、
ドレブリンＡ関連タンパク質（ＤＡＲＰｓ）自己抗体に対するドミナントネガティブペプチドを含む、シナプス機能不全に起因する、若しくはシナプス機能不全を付随する疾病の予防剤、又はシナプス機能不全に起因する、若しくはシナプス機能不全を付随する疾病の治療剤；
を挙げることができる。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の判定方法によれば、これまで質問式検査（うつ病、認知症等）や画像検査（脳出血等）に頼っていたシナプス機能不全に起因する、又はシナプス機能不全を付随する疾病の発症の有無や重症度を早期かつ簡便に判定することができるため、これらの疾病の発症を予防したり、早期治療することにつながる。さらに、ＤＡＲＰｓや抗ＤＡＲＰｓ自己抗体は、予防剤、治療剤のスクリーニング指標にもなるものであり、創薬研究に資することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】上段：実施例１の、ビーズ吸着画分（Beads Absorbed）、血漿（Plasma）及びプレクリア血漿（preclear plasma）をウェスタンブロッティングで解析した結果を示す図である。下段：実施例１の、各ＩＰ画分をウェスタンブロッティングで解析した結果を示す図である。
【図２】実施例１の、ビーズ吸着画分に対して種々の抗ドレブリン抗体（Ｍ２Ｆ６、２８Ｄ８、３Ｄ９、２２Ｇ５、１７Ｃ３、３３Ａ４：自家製）及び抗ドレブリンＡ抗体（４Ｃ２：自家製；ＤＡＳ２：免疫生物学研究所）を用いてウェスタンブロッティングを行った結果を示す図である。
【図３】実施例２の、アルツハイマー病患者２名（ＡＤ０１、ＡＤ０２）、大脳皮質基底核症候群患者１名（ＣＢＳ）、パーキンソン病患者１名（ＰＤ０１）、健常６５歳男性（Ｈｅａｌｔｈｙ）より血液試料を取得し、プロテインＡ／Ｇビーズの吸着画分に対して抗ドレブリンＡ抗体ＤＡＳ２（免疫生物学研究所）を用いてウェスタンブロッティングを行った結果を示す図である。
【図４】実施例２の、ＡＤ０２とコントロール血漿（Ｃｔｒｌ）を用い、ウェスタンブロッティングによりＤＡＲＰｓの検出を行った結果を示す図である。ＤＡＲＰ４０、ＤＡＲＰ６０、ＤＡＲＰ７０、ＤＡＲＰ９０、ＤＡＲＰ１００のいずれのＤＡＲＰも、ＡＤ０２において濃度が上昇していた。
【図５】実施例２の、アルツハイマー病患者２名（ＡＤ０１、ＡＤ０２）、大脳皮質基底核症候群患者１名（ＣＢＳ）、パーキンソン病患者１名（ＰＤ０１）、健常６５歳男性（Ｈｅａｌｔｈｙ）より血液試料を取得し、プロテインＡ／Ｇビーズの吸着画分に対して抗ドレブリン抗体３Ｄ９（自家製）を用いてウェスタンブロッティングを行った結果を示す図である。図３と異なり、サンプル間での差が見いだせなかった。
【図６】実施例３の、アルツハイマー病患者３名（ＧＨＡＤ０１〜０３、いずれも軽度の認知症）、筋萎縮性側索硬化症患者１名（ＡＬＳ０１）、脊髄小脳変性症患者１名（ＳＣＤ０１）、及びうつ病患者１名（Ｄｅｐ０１）より脳脊髄液試料を取得し、プロテインＡ／Ｇビーズの吸着画分に対して抗ドレブリンＡ抗体ＤＡＳ２（免疫生物学研究所）を用いてウェスタンブロッティングを行った結果を示す図である。
【図７】実施例４の、表１に記載の６名のアルツハイマー病患者について、脳脊髄液試料中のＤＡＲＰｓをウェスタンブロッティングにより検出した結果を示す図である。
【図８】実施例５の、ＧＦＰタグを付加したヒトドレブリンＡ（ＧＦＰ−ｈＤＡ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、抗ドレブリン抗体（３Ｄ９：自家製）（左）及びアルツハイマー病患者由来の血漿（AD plasma）（右）を一次抗体としてウェスタンブロッティングにより検出した結果を示す図である。
【図９】実施例５の、抗ドレブリン抗体（２２Ｇ５：自家製）が、ラット海馬培養細胞に対して毒性を有し得るかを確認した結果を示す図である。（Ａ）は、２２Ｇ５処理を行ったラット海馬培養細胞を示し、（Ｂ）は、正常マウスＩｇＧ処理を行ったラット海馬培養細胞を示す。
【図１０】実施例６の、培養ラット大脳皮質細胞に、ＤＡＲＰｓが存在することを確認したウェスタンブロッティングの結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、以下の工程（ａ−１）被験者から採取された生体試料中のドレブリンＡ関連タンパク質（ＤＡＲＰｓ）の濃度を測定する工程；（ｂ−１）工程（ａ−１）で測定したＤＡＲＰｓの濃度を、シナプス機能不全に起因する、又はシナプス機能不全を付随する疾病を発症しない対照者におけるＤＡＲＰｓの濃度と比較する工程；及び（ｃ−１）工程（ａ−１）で測定したＤＡＲＰｓの濃度が、前記対照者におけるＤＡＲＰｓの濃度よりも高いとき、前記被験者は、シナプス機能不全に起因する、若しくはシナプス機能不全を付随する疾病を発症するリスクが高い、又はシナプス機能不全に起因する、若しくはシナプス機能不全を付随する疾病を発症している可能性が高いと評価する工程；を含むシナプス機能不全に起因する、若しくはシナプス機能不全を付随する疾病の発症リスク、又は発症の有無の判定方法（以下、「本件判定方法１」ということがある）や、
以下の工程（ａ−２）シナプス機能不全に起因する、又はシナプス機能不全を付随する疾病を発症している被験者から採取された生体試料中のドレブリンＡ関連タンパク質（ＤＡＲＰｓ）の濃度を測定する工程；（ｂ−２）工程（ａ−２）で測定したＤＡＲＰｓの濃度を、シナプス機能不全に起因する、又はシナプス機能不全を付随する疾病を発症している対照者におけるＤＡＲＰｓの濃度と比較する工程；及び（ｃ−２）工程（ａ−２）で測定したＤＡＲＰｓ及び／又はＤＡＲＰｓ自己抗体の濃度が、前記対照者におけるＤＡＲＰｓ及び／又はＤＡＲＰｓ自己抗体の濃度よりも高いとき、前記被験者は、前記対照者よりもシナプス機能不全に起因する、又はシナプス機能不全を付随する疾病が重症化している可能性が高いと評価する工程；を含むシナプス機能不全に起因する、又はシナプス機能不全を付随する疾病の重症度の判定方法（以下、「本件判定方法２」ということがある。また、本件判定方法１と本件判定方法２を総称して、以下、「本件判定方法」ということがある）であれば特に制限されない。ここで、「重症度」とは、シナプスの障害の進み方が速い急性増悪期を含む。一態様において、本件判定方法は、医師によるシナプス機能不全に起因する、若しくはシナプス機能不全を付随する疾病の発症リスクの診断、又は発症の有無や重症度の診断を補助する方法であって、医師による診断行為を含まないこともある。
【００１３】
また、本発明は、以下の工程（ａ−３）被検物質を投与したシナプス機能不全モデル非ヒト動物から採取された試料中のドレブリンＡ関連タンパク質（ＤＡＲＰｓ）の濃度を測定する工程；（ｂ−３）工程（ａ−３）で測定したドレブリンＡ関連タンパク質（ＤＡＲＰｓ）の濃度を、前記被検物質を投与しないシナプス機能不全モデル非ヒト動物におけるドレブリンＡ関連タンパク質（ＤＡＲＰｓ）の濃度と比較する工程；及び（ｃ−３）工程（ａ−３）で測定したドレブリンＡ関連タンパク質（ＤＡＲＰｓ）の濃度が、前記被検物質を投与しないシナプス機能不全モデル非ヒト動物におけるドレブリンＡ関連タンパク質（ＤＡＲＰｓ）の濃度よりも低いとき、前記被検物質は、シナプス機能不全に起因する、若しくはシナプス機能不全を付随する疾病の予防、又はシナプス機能不全に起因する、若しくはシナプス機能不全を付随する疾病の治療に有効であると評価する工程；を含むシナプス機能不全に起因する、若しくはシナプス機能不全を付随する疾病の予防剤、又はシナプス機能不全に起因する、若しくはシナプス機能不全を付随する疾病の治療剤のスクリーニング方法（以下、「本件スクリーニング方法１」ということがある）や、以下の工程（ａ−４）シナプス機能不全モデル培養細胞に被検物質を投与し、培養する工程；（ｂ−４）前記シナプス機能不全モデル培養細胞の培養液中のドレブリンＡ関連タンパク質（ＤＡＲＰｓ）の濃度を測定する工程；（ｃ−４）工程（ｂ−４）で測定したＤＡＲＰｓの濃度を、前記被検物質を投与しないシナプス機能不全モデル培養細胞の培養液中のＤＡＲＰｓの濃度と比較する工程；及び（ｄ−４）工程（ｂ−４）で測定したＤＡＲＰｓの濃度が、前記被検物質を投与しないシナプス機能不全モデル培養細胞の培養液中のＤＡＲＰｓの濃度よりも低いとき、前記被検物質は、シナプス機能不全に起因する、若しくはシナプス機能不全を付随する疾病の予防、又はシナプス機能不全に起因する、若しくはシナプス機能不全を付随する疾病の治療に有効であると評価する工程；を含むシナプス機能不全に起因する、若しくはシナプス機能不全を付随する疾病の予防剤、又はシナプス機能不全に起因する、若しくはシナプス機能不全を付随する疾病の治療剤のスクリーニング方法（以下、「本件スクリーニング方法２」ということがある。また、本件スクリーニング方法１と本件スクリーニング方法２を総称して、以下、「本件スクリーニング方法」ということがある）であれば特に制限されない。
【００１４】
本発明は、脳に局在するヒトドレブリンＡ（配列番号１）の断片、若しくはスプライスバリアントであるドレブリンＡ関連タンパク質（ＤＡＲＰｓ：Drebrin A Related Proteins）が、シナプス機能不全に起因する、又はシナプス機能不全を付随する疾病に罹患した患者由来の生体試料に多く存在していることを初めて見いだしたことにより完成したものである。本発明において、ＤＡＲＰｓとは、ドレブリンＡに特徴的なＩｎｓ２翻訳配列RPYCPFIKASDSGPSSSSSSSSSPPRTPFPYITCHRTPNLSSSLPC（配列番号２）の少なくとも一部を有するドレブリンＡの断片若しくはスプライスバリアントであればよく、好ましくは分子量約１００ｋＤａのＤＡＲＰ１００、分子量約９０ｋＤａのＤＡＲＰ９０、分子量約７０ｋＤａのＤＡＲＰ７０、分子量約６０ｋＤａのＤＡＲＰ６０、及び分子量約４０ｋＤａのＤＡＲＰ４０を例示することができる。ＤＡＲＰｓは、単独で本件判定方法や本件スクリーニング方法に用いることもでき、１又は２以上のＤＡＲＰｓの組み合わせで本件判定方法や本件スクリーニング方法に用いることもできる。また、ＤＡＲＰｓの総濃度を測定し、本件判定方法や本件スクリーニング方法に用いることもできる。
【００１５】
本発明において、ＤＡＲＰｓ濃度は、公知のいかなる方法で測定することができる。好ましい態様において、ＤＡＲＰｓ濃度は、ＤＡＲＰｓを認識する抗体（以下「抗ＤＡＲＰｓ抗体」ということがある）を用いたウェスタンブロッティング法、ＥＬＩＳＡ（Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay）法、免疫沈降等により測定される。抗ＤＡＲＰｓ抗体としては、ＤＡＲＰｓの一部をエピトープとする抗体であればモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体のいずれでもよく、１種で用いても、２種以上を組み合わせて用いてもよい。また、全身に存在するドレブリンＥと区別するために、ドレブリンＡ特異的エピトープを認識する抗体を用いて測定されることが好ましい。一態様において、本発明は、本件判定方法及び／又は本件スクリーニング方法に用いるための、ドレブリンＡ特異的エピトープを認識する抗体（以下、「本件抗体」ということがある）に関する。ここで、「ドレブリンＡ特異的エピトープ」とは、ドレブリンＥには存在せず、ドレブリンＡに存在するエピトープを意味し、好ましくはＩｎｓ２翻訳配列RPYCPFIKASDSGPSSSSSSSSSPPRTPFPYITCHRTPNLSSSLPC（配列番号２）の、少なくとも一部を含む領域、及び／又は、ドレブリンＡがＩｎｓ２翻訳配列を含むために作られる特異的立体構造である。
【００１６】
ウェスタンブロッティング法やＥＬＩＳＡ法を行う場合、一次抗体として抗ＤＡＲＰｓ抗体を用い、一次抗体を認識する標識化二次抗体により検出する方法を好ましく使用することができる。例えば、一次抗体がラビット抗体である場合は標識化抗ラビットＩｇＧ抗体を、一次抗体がマウス抗体である場合は標識化抗マウスＩｇＧ抗体を、二次抗体として用いることができる。
【００１７】
上記標識化二次抗体における標識物質としては、酵素、放射線同位元素、蛍光物質、発光物質、金コロイド等が挙げられる。これらのうち、感度及び操作の簡便さの観点から酵素が好ましく、西洋わさび過酸化酵素（ＨＲＰ）、アルカリフォスファターゼ（ＡＰ）、グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）等がより好ましい。標識物質としてＨＲＰを用いる場合はＴＭＢ（３, ３’, ５, ５’−テトラメチルベンジジン）等を、ＡＰを用いる場合はＡＭＰＰＤ（３−（２'−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４−（３''−ホスホリルオキシ）フェニル−１，２−ジオキセタン・２ナトリウム塩）、９−（４−クロロフェニルチオホスホリルオキシメチリデン）−１０−メチルアクリダン二ナトリウム塩等を基質として使用することができる。また、標識物質としては、他にＦＩＴＣ（fluorescein isothiocyanate）、ローダミン等の蛍光色素等も使用することができる。
【００１８】
ＤＡＲＰｓの検出・定量方法は、標識の方法によって異なり、当業者に周知慣用の方法で行うことができる。例えば、標識物質としてＨＲＰ、ＡＰ、ＧＯＤ等を用いた場合は、発色基質や発光基質を添加し、吸光度や発光強度を測定して測定対象物質を定量することができる。また、標識物質として蛍光物質を用いた場合は、その蛍光強度を測定することで測定対象物質を定量することができる。また、標識物質として放射性同位元素を用いた場合は、放射能を測定することで測定対象物質を定量することができる。また、標識物質として金コロイドを用いた場合は、吸光度を測定することで測定対象物質を定量することができる。定量の際は、例えば、予め既知のＤＡＲＰｓ濃度の試料で検量線（標準曲線）を作成しておき、測定値を検量線に照合して試料中のＤＡＲＰｓ濃度を算出し、本件判定方法又は本件スクリーニング方法における比較に用いてもよいが、ＤＡＲＰｓ濃度を算出せず、吸光度、放射能、発光強度を直接本件判定方法又は本件スクリーニング方法における比較に用いてもよい。ここで、本件判定方法において、被験者におけるＤＡＲＰｓ濃度（上記算出したＤＡＲＰｓ濃度や、吸光度、放射能、発光強度）が、対照者におけるＤＡＲＰｓ濃度（上記算出したＤＡＲＰｓ濃度や、吸光度、放射能、発光強度）よりも高いか否か、或いは低いか否かを評価（判定）するために、閾値（カットオフ値）は任意のものを設定することができ、かかる閾値としては、例えば、対照者におけるＤＡＲＰｓ濃度の平均値、平均値＋標準偏差（ＳＤ）、平均値＋２ＳＤ、平均値＋３ＳＤ、平均値−ＳＤ、平均値−２ＳＤ、平均値−３ＳＤ、中央値、中央値＋ＳＤ、中央値＋２ＳＤ、中央値＋３ＳＤ、中央値−ＳＤ、中央値−２ＳＤ、中央値−３ＳＤ等を挙げることができる。また、本件スクリーニング方法において、被検物質を投与したシナプス機能不全モデル非ヒト動物又はシナプス機能不全モデル培養細胞におけるＤＡＲＰｓ濃度（上記算出したＤＡＲＰｓ濃度や、吸光度、放射能、発光強度）が、前記被検物質を投与しないシナプス機能不全モデル非ヒト動物又はシナプス機能不全モデル培養細胞におけるＤＡＲＰｓ濃度（上記算出したＤＡＲＰｓ濃度や、吸光度、放射能、発光強度）よりも高いか否か、或いは低いか否かを評価（判定）するために、閾値（カットオフ値）は任意のものを設定することができ、かかる閾値としては、例えば、被検物質を投与しないシナプス機能不全モデル非ヒト動物又はシナプス機能不全モデル培養細胞におけるＤＡＲＰｓ濃度の平均値、平均値＋標準偏差（ＳＤ）、平均値＋２ＳＤ、平均値＋３ＳＤ、平均値−ＳＤ、平均値−２ＳＤ、平均値−３ＳＤ、中央値、中央値＋ＳＤ、中央値＋２ＳＤ、中央値＋３ＳＤ、中央値−ＳＤ、中央値−２ＳＤ、中央値−３ＳＤ等を挙げることができる。
【００１９】
本発明において、生体試料とは、被験者や対照者から採取した体液を意味する。ここで、体液には、血液、リンパ液、組織液、体腔液、脳脊髄液等を挙げることができ、中でも脳脊髄液や血液が好ましい。血液には、血清、血漿等が含まれる。生体試料は、そのままＤＡＲＰｓ濃度の測定に供してもよいが、好ましくは測定前に、ＤＡＲＰｓの検出感度を高めるための前処理が施される。前処理の方法としては、生体試料中の測定対象タンパク質の検出感度を高める方法であればよく、例えば抗ＤＡＲＰｓ抗体を用いた免疫沈降を挙げることができる。また、本発明者らは、生体試料中をプロテインＡ／Ｇビーズで処理し、ビーズに吸着した画分を本件判定方法や本件スクリーニング方法に供することで、ＤＡＲＰｓの検出感度を高めることに成功した。プロテインＡ／Ｇビーズ処理は、免疫沈降に先立って、自己抗体によるバックグラウンドを低減することを目的として行うものであり、本来目的タンパク質はプロテインＡ／Ｇビーズ処理後のフロースルー画分から検出される。本発明者らによる、ＤＡＲＰｓがプロテインＡ／Ｇビーズに吸着するとの発見は、予想外な発見であるだけでなく、生体試料中に抗ＤＡＲＰｓ自己抗体が存在することを示唆するものである。本発明者らは、さらなる検討により生体試料中に抗ＤＡＲＰｓ自己抗体が存在することを確認し、さらに抗ＤＡＲＰｓ自己抗体が脳神経細胞を損傷し得ることを見いだした。これらの発見は、抗ＤＡＲＰｓ自己抗体に対するドミナントネガティブペプチドが、抗ＤＡＲＰｓ自己抗体による脳神経細胞の損傷を抑制し、シナプス機能不全に起因する、若しくはシナプス機能不全を付随する疾病を治療及び／又は予防し得ることを示すものである。したがって、一態様において、本発明は、抗ＤＡＲＰｓ自己抗体に対するドミナントネガティブペプチドを探索することを特徴とするシナプス機能不全に起因する、若しくはシナプス機能不全を付随する疾病の予防剤、又はシナプス機能不全に起因する、若しくはシナプス機能不全を付随する疾病の治療剤のスクリーニング方法に関する。
【００２０】
本発明において、シナプス機能不全に起因する、又はシナプス機能不全を付随する疾病とは、シナプス機能不全、すなわちシナプスにおける情報伝達に障害が生じることによって発症する疾病（アルツハイマー病、脳血管性認知症、レビー小体型認知症、パーキンソン病、大脳皮質基底核変性症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄小脳変性症等）や、疾病の発症後にシナプス機能不全が生じる疾病（脳出血、脳梗塞、脳腫瘍等）を意味する。脳の血流の低下によって生じるうつ病や、薬物依存、ミトコンドリアの遺伝子疾患、糖尿病等も、シナプス機能不全を付随し、認知機能が低下することが知られており、シナプス機能不全に起因する、又はシナプス機能不全を付随する疾病に包含される。さらに、脳への外傷が生じた場合の後遺症の評価にも、本件判定方法を用いることができる。好ましくは、シナプス機能不全に起因する、又はシナプス機能不全を付随する疾病とは神経変性疾患を意味し、中でもアルツハイマー病、大脳皮質基底核症候群、パーキンソン病、脊髄小脳変性症及び筋萎縮性側索硬化症から選択される神経変性疾患が好ましい。
【００２１】
本件判定方法１における被験者としては、シナプス機能不全に起因する、又はシナプス機能不全を付随する疾病の発症リスクを判定する場合、通常、シナプス機能不全に起因する、又はシナプス機能不全を付随する疾病を発症しておらず、かつ、将来シナプス機能不全に起因する、又はシナプス機能不全を付随する疾病を発症するか否かが不明な被験者を挙げることができ、また、シナプス機能不全に起因する、又はシナプス機能不全を付随する疾病の発症の有無を判定する場合、通常、シナプス機能不全に起因する、又はシナプス機能不全を付随する疾病を発症しているか否かが不明な被験者を挙げることができ、好ましくは、本発明の発症リスクの判定方法により、シナプス機能不全に起因する、又はシナプス機能不全を付随する疾病を発症するリスクが高いと評価（判定）された者である。本件判定方法１における対照者とは、シナプス機能不全に起因する、又はシナプス機能不全を付随する疾病を発症するリスクが低いか或いはほとんど無い、シナプス機能不全に起因する、又はシナプス機能不全を付随する疾病を発症していない健常者を意味する。また、上記閾値の設定に当たっては、（ｉ）ＤＡＲＰｓ濃度を測定済みの全ての健常者、又は無作為に抽出した健常者、（ii）被験者と同じ年齢又は年齢範囲の健常者（脳内ドレブリン量は年齢とともに減少する）及び（iii）疾病発症前の被験者、のうちのいずれか１種以上を対照者とすることができる。これらの対照者のＤＡＲＰｓ濃度より設定した閾値を使って、シナプス機能不全の急性増悪期を見分けてもよい。
【００２２】
本件判定方法２における被験者としては、例えば、シナプス機能不全に起因する、又はシナプス機能不全を付随する疾病を発症しているものの、シナプス機能不全に起因する、又はシナプス機能不全を付随する疾病の重症度が不明な被験者を挙げることができる。本件判定方法２における対照者とは、例えば、シナプス機能不全に起因する、又はシナプス機能不全を付随する疾病を発症しており、且つ重症度の判定がされている患者を意味する。ここで、「重症度の判定がされている患者」とは、公知の診療ガイドラインに基づいて重症度の判定がされている患者であってもよい。公知の診療ガイドラインとしては、対象疾患の診療ガイドラインを用いることが望ましく、例えば認知症の診療ガイドライン、脳出血・脳梗塞の診療ガイドライン等を挙げることができる。例えば、アルツハイマー病における認知症では、問診等で認知症を初期、中期、後期等に分けているが、血漿中のＤＡＲＰｓは発症初期から中期にかけて最大になると考えられる。実際、後期に神経細胞死が広範に起きた後（重症な認知症患者）ではＤＡＲＰｓがむしろ少なくなることが示されている（実施例２のＡＤ０１の患者）。また、脳出血では、出血が起きてしばらくはＤＡＲＰｓが高くなり、時間がたって、慢性期になると低くなって一定の値を取るようになると考えられる。このように、対象疾患によって、対照者のＤＡＲＰｓの変化と重症度の関係は異なるため、適切な診療ガイドラインにより重症度の判定を行うことが好ましい。
【００２３】
本件スクリーニング方法１におけるシナプス機能不全非ヒト動物としては、シナプス機能不全を自然に生じた非ヒト動物であってもよいし、シナプス機能不全の発症を誘導した非ヒト動物であってもよい。シナプス機能不全を誘導した非ヒト動物とは、具体的には、上記シナプス機能不全に起因する、又はシナプス機能不全を付随する疾病のモデル非ヒト動物であってもよい。上記非ヒト動物としては、マウスの他、ラット、ハムスター、モルモット、サル、ウシ、ブタ、ウマ、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、イヌ等の非ヒト哺乳動物を例示することができる。
【００２４】
本件スクリーニング方法２におけるシナプス機能不全モデル培養細胞としては、シナプス機能不全を自然に生じた培養細胞であってもよいし、シナプス機能不全を誘導した培養細胞であってもよい。シナプス機能不全の発症を誘導した培養細胞とは、具体的には、上記シナプス機能不全に起因する、又はシナプス機能不全を付随する疾病のモデル培養細胞であってもよい。上記培養細胞としては、好ましくは培養神経細胞を例示することができ、ヒトに由来する培養細胞の他、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、サル、ウシ、ブタ、ウマ、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、イヌ等の非ヒト哺乳動物に由来する培養細胞を例示することができる。
【００２５】
一態様において、本発明は、本件抗体を含むシナプス機能不全に起因する、若しくはシナプス機能不全を付随する疾病の発症リスク、発症の有無、又は重症度の判定用キット（以下、「本件キット」ということがある）に関する。好ましい態様において、本件キットは、本件判定方法に用いるためのキットである。本件キットは、本件抗体の他に、被験者から生体試料を取得するための手段や、本件抗体を認識する標識化二次抗体や、手順や診断基準を記載した添付文書を含んでもよい。
【００２６】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２７】
１．血液試料からのＤＡＲＰｓの検出
本発明者らは、アルツハイマー病患者の血漿中にドレブリンが存在していると考え、血漿に対して抗ドレブリン抗体を用いてウェスタンブロッティングを行ったが、ドレブリンを検出することはできなかった。そこで、血漿に夾雑している抗体成分を除去することを目的としてプロテインＡ／Ｇビーズ処理を行い、ウェスタンブロッティングに供した。
【００２８】
実験手順は、以下のとおりである。
（１）血漿１．８ｍｌとプロテインＡ／Ｇビーズ（Protein A/G PLUS-Agarose：サンタクルズ社製）２００μｌを懸濁して４℃で１時間ローテーターで反応（プレクリア）させた。
（２）遠心して上清（preclear plasma：プレクリア血漿）と沈査（Beads Absorbed：ビーズ吸着画分）を調製。
（３）ビーズ吸着画分にＳＤＳサンプルバッファー３０μｌを加えて熱変性して溶出した。
（４）遠心した上清（preclear plasma：プレクリア血漿）の一部はＩｎｐｕｔ用に保存、残りのプレクリア血漿と４種類の抗体（抗ドレブリン抗血清ＤＥｐ：自家製；ドレブリンＡ及びＥを認識する抗ドレブリンモノクローナル抗体２８Ｄ８と３Ｄ９：自家製；コントロールＩｇＧ：富士フイルム和光純薬株式会社製）をそれぞれ混合してｏ／ｎで反応（ＩＰ：免疫沈降）。
（５）ｏ／ｎで反応させた上記（４）のＩＰチューブに、さらにプロテインＡ／Ｇビーズ３０μｌを懸濁して４℃で１時間ローテーターで反応させ、その後ビーズを洗浄して、ビーズ画分にＳＤＳサンプルバッファー３０μｌを加えて熱変性して溶出（ＩＰ、免疫沈降画分）。
（６）各サンプル（上段：Beads absorbed、Plasma、Preclear Plasma；下段：各ＩＰ画分）をウェスタンブロットで解析（検出用抗体はモノクローナル抗体２８Ｄ８と３Ｄ９のｍｉｘｔｕｒｅを使用した）
【００２９】
結果を図１に示す。免疫沈降を行った下段のウェスタンブロットではドレブリンが検出できなかったのに対し、プレクリアに用いたプロテインＡ／Ｇビーズの吸着画分（Beads absorbed）からは、予想に反してドレブリンのバンドを確認することができた（上段、矢印）。そこで、かかるバンドが、全身に存在するドレブリンＥか、脳のシナプスに局在するドレブリンＡかを確認するため、プロテインＡ／Ｇビーズの吸着画分に対してドレブリンＡ及びＥの両方を認識する種々の抗ドレブリン抗体（Ｍ２Ｆ６、２８Ｄ８、３Ｄ９、２２Ｇ５、１７Ｃ３、３３Ａ４：自家製）及びドレブリンＡにおいてＩｎｓ２の少なくとも一部を含む領域を認識する抗ドレブリンＡ抗体（４Ｃ２、自家製；ＤＡＳ２：免疫生物学研究所）を用いてウェスタンブロッティングを行ったところ、約１３０ｋＤａのドレブリン全長のバンドはドレブリンＡ特異的抗体である４Ｃ２やＤＡＳ２では染色されず、ドレブリンＥのバンドであることがわかった（図２）。このドレブリンＥは、腎腫瘍に由来すると考えられた。一方で、ドレブリンＥのバンドよりも低分子量側に、抗ドレブリンＡ抗体である４Ｃ２やＤＡＳ２でも染まるドレブリンＡの断片又はスプライスバリアントであると考えられるバンドが複数見いだされた。これらを、ドレブリンＡ関連タンパク質（Drebrin A Related Proteins、ＤＡＲＰｓ）と命名した。なお、図２において、ドレブリンＥと、ＤＡＲＰｓのうち分子量約４０ｋＤａのＤＡＲＰ４０を矢印で示す。ＤＡＲＰ４０は、コントロールＩｇＧやドレブリンの汎用抗体であるＭ２Ｆ６では明確に染色されず、本発明者らが初めて見いだしたものである。ドレブリンＡは脳の樹状突起スパインに局在していることから、ＤＡＲＰｓが、アルツハイマー病患者において損傷した樹状突起スパインから漏出して、血液脳関門を通過して血液中に移行することが示唆された。
【実施例２】
【００３０】
２．血液試料中ＤＡＲＰｓの診断バイオマーカーとしての使用
実施例１より、ＤＡＲＰｓがアルツハイマー病患者において損傷した樹状突起スパインから漏出したものであると考えられた。その他のシナプス機能不全に起因する、又はシナプス機能不全を付随する疾病においても、損傷した樹状突起スパインからＤＡＲＰｓが漏出し、血液中に移行する可能性がある。そこで、血液試料中ＤＡＲＰｓが、シナプス機能不全に起因する、又はシナプス機能不全を付随する疾病の診断バイオマーカーとして使用し得るかを確認するため、以下の実験を行った。
【００３１】
アルツハイマー病患者２名（ＡＤ０１（発症後５年経過、腎腫瘍あり）、ＡＤ０２（発症後３年、ＭＭＳＥ２１点））、大脳皮質基底核症候群患者１名（ＣＢＳ）、パーキンソン病患者１名（ＰＤ０１）、健常６５歳男性（Ｈｅａｌｔｈｙ）より血液試料を取得し、実施例１と同様にプロテインＡ／Ｇビーズの吸着画分をウェスタンブロッティングに供した。検出は、抗ドレブリンＡ抗体ＤＡＳ２（免疫生物学研究所）を用いて行った。
【００３２】
結果を図３に示す。いずれの血液試料からもＤＡＲＰｓのバンドが多数見いだされた。確認できたＤＡＲＰｓを、分子量に応じて、ＤＡＲＰ４０、ＤＡＲＰ６０、ＤＡＲＰ７０、ＤＡＲＰ９０、ＤＡＲＰ１００と命名した。ＡＤ０１を除く疾患患者由来の血液試料では、健常６５歳男性（Ｈｅａｌｔｈｙ）よりもＤＡＲＰｓ濃度が増加していた。さらに図４に示すように、ＡＤ０２とコントロール血漿（Ｃｔｒｌ：コージン・バイオ（ＫＪＢ）社製、正常ヒト血漿・プール  EDTA-2Na、ロット：HMN389081）を用い、同様の手順によりＤＡＲＰｓの検出を行ったところ、ＤＡＲＰ４０、ＤＡＲＰ６０、ＤＡＲＰ７０、ＤＡＲＰ９０、ＤＡＲＰ１００のいずれのＤＡＲＰも、ＡＤ０２において濃度が上昇していた。したがって、これらのＤＡＲＰｓが、シナプス機能不全に起因する、又はシナプス機能不全を付随する疾病の診断バイオマーカーとして使用し得ることが示された。一方で、ＡＤ０１ではＤＡＲＰｓ濃度がＨｅａｌｔｈｙよりも低かった（図３）。これは、神経細胞死が起きて、痴呆の最終段階（タウが高く、ＭＭＳＥの点数が悪い）に進んでしまったような慢性期のＡＤ患者では、急性増悪期のようなＤＡＲＰｓの急速な漏出は起こっておらず、ＤＡＲＰｓ濃度が低くなっていると考えられた。
【００３３】
さらに、図３と同じサンプルを、ドレブリンＡ及びＥの両方を認識する抗ドレブリン抗体３Ｄ９（自家製）で染色したところ、疾患患者と健常６５歳男性（Ｈｅａｌｔｈｙ）とでバンドの濃さに差が見られなかった（図５）。ここでの結果より、ドレブリンＥに由来するドレブリン関連タンパク質は診断バイオマーカーとして使用できないこと、及び、ドレブリンＡにおいてＩｎｓ２の少なくとも一部を含む領域を認識する抗体（ＤＡＳ２等）が、疾患の診断に使用し得ることが示された。
【実施例３】
【００３４】
３．脳脊髄液試料中ＤＡＲＰｓの診断バイオマーカーとしての使用
実施例２より、血液試料中のＤＡＲＰｓが、シナプス機能不全に起因する、又はシナプス機能不全を付随する疾病の診断バイオマーカーとして使用し得ることが確認できた。ＤＡＲＰｓは脳に局在するドレブリンＡに関連するため、シナプス機能不全に起因する、又はシナプス機能不全を付随する疾病の患者においては脳脊髄液中にもＤＡＲＰｓが多く存在すると考えられる。そこで、脳脊髄液試料中ＤＡＲＰｓが、シナプス機能不全に起因する、又はシナプス機能不全を付随する疾病の診断バイオマーカーとして使用し得ることを確認するため、以下の実験を行った。
【００３５】
アルツハイマー病患者３名（ＧＨＡＤ０１〜０３、いずれも軽度の認知症）、筋萎縮性側索硬化症患者１名（ＡＬＳ０１）、脊髄小脳変性症患者１名（ＳＣＤ０１）、及びうつ病患者１名（Ｄｅｐ０１）より脳脊髄液試料を取得し、血液試料に代えて脳脊髄液試料を用いたほかは実施例２と同様にプロテインＡ／Ｇビーズの吸着画分をウェスタンブロッティングに供した。検出は、抗ドレブリンＡ抗体ＤＡＳ２（免疫生物学研究所）を用いて行った。
【００３６】
結果を図６に示す。いずれの脳脊髄液試料からもＤＡＲＰｓのバンドが多数見いだされ、血液試料と同様に、ＤＡＲＰ４０、ＤＡＲＰ６０、ＤＡＲＰ７０、ＤＡＲＰ９０、ＤＡＲＰ１００が確認できた。神経変性疾患であるアルツハイマー病患者２名（ＧＨＡＤ０１及び０３）、筋萎縮性側索硬化症患者１名（ＡＬＳ０１）、脊髄小脳変性症患者１名（ＳＣＤ０１）では、うつ病患者１名（Ｄｅｐ０１）よりＤＡＲＰｓ濃度が多かった。また、同じアルツハイマー病に罹患した患者であっても、ＧＨＡＤ０１及び０３の比較から示されるようにＤＡＲＰｓ濃度に差があることから、ＤＡＲＰｓ濃度が疾患の重症度（樹状突起スパインの損傷度合い）を反映し得ることが示唆された。一方で、ＧＨＡＤ０２は、うつ病患者１名（Ｄｅｐ０１）と同程度のＤＡＲＰｓ濃度であった。ＧＨＡＤ０２はＡＤ進行が慢性期に移行しており、急性増悪期のようなＤＡＲＰｓの急速な漏出は起こっておらず、ＤＡＲＰｓ濃度が低くなっていると考えられる。また、うつ病患者におけるＤＡＲＰｓ濃度は他の神経変性疾患と比較して少なかったが、うつ病から認知機能障害に移行する場合があることに鑑みると、うつ病患者においてもＤＡＲＰｓ濃度の上昇により認知機能障害への移行を評価できると考えられる。
【実施例４】
【００３７】
４．アルツハイマー病患者の他の指標とＤＡＲＰｓ量との関係
実施例３より、脳脊髄液試料中ＤＡＲＰｓが、アルツハイマー病の診断バイオマーカーとして使用できることが示された。一方で、アルツハイマー病が進行して慢性期に移行した患者では、急性増悪期のようなＤＡＲＰｓの急速な漏出は起こっておらず、ＤＡＲＰｓ濃度が低くなると考えられる。そこで、以下の表１に記載の６名のアルツハイマー病患者について、実施例３と同様に脳脊髄液試料中のＤＡＲＰｓをウェスタンブロッティングにより検出した。なお、表中「ＴＡＵ↑」は、タウの濃度が高くタウ蓄積に至っていることを意味し、「Ａβ↑」は、アミロイドβの濃度が高くアミロイドβ蓄積に至っていることを意味する。
【００３８】
【表１】
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【００３９】
結果を図７に示す。全ての患者由来の脳脊髄液試料からＤＡＲＰ１００、ＤＡＲＰ７０及びＤＡＲＰ４０を確認できた。タウ蓄積に至っていない増悪期の患者（症例番号１１０７〜１１１０）でＤＡＲＰｓ濃度が高かったが、タウが最も高い症例登録番号１１１１の患者ではＤＡＲＰｓ濃度が低かった。ここでの結果からも、アルツハイマー病が進行して慢性期に移行した患者では、ＤＡＲＰｓ濃度が低くなることが示された。
【実施例５】
【００４０】
５．ＤＡＲＰｓ自己抗体の存在確認及び神経細胞毒性の検証
実施例１より、ＤＡＲＰｓが、抗体（ＩｇＧ、ＩｇＡ）への結合能を有するプロテインＡ／Ｇビーズに吸着することが示された。かかる吸着が、ＤＡＲＰｓが直接プロテインＡ／Ｇビーズに吸着しているのか、血液試料中のＤＡＲＰｓ自己抗体を介したものかどうかを確認するために、ＧＦＰタグを付加したヒトドレブリンＡ（ＧＦＰ−ｈＤＡ：ＨＥＫ２９３で発現させ、ＳＤＳバッファーでホモゲナイズしたサンプル）をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、抗ドレブリン抗体（３Ｄ９：自家製）及びアルツハイマー病患者由来の血漿（AD plasma）を一次抗体として検出した。
【００４１】
結果を図８に示す。図８左の３Ｄ９で検出した場合と、図８右のアルツハイマー病患者由来の血漿（AD plasma）で検出した場合とで、同じ位置（図中矢印）にバンドを確認することができた。この結果より、アルツハイマー病患者由来の血漿にはドレブリンＡを認識することができる自己抗体が存在していることが明らかになった。ＤＡＲＰｓは、該自己抗体を介してプロテインＡ／Ｇビーズに吸着していたと考えられる。
【００４２】
脳脊髄液のＤＡＲＰｓもプロテインＡ／Ｇビーズに吸着することから、抗ＤＡＲＰｓ自己抗体は、脳脊髄液にも存在していると考えられる。そこで、抗ＤＡＲＰｓ自己抗体が、脳の神経細胞に毒性を有し得るかを確認するために、抗ドレブリン抗体（２２Ｇ５：自家製）又は市販の正常マウスＩｇＧ（富士フイルム和光純薬株式会社製）をＤＩＶ２３（インビトロでの培養日数）のラット海馬培養細胞（自家製）に投与して１時間インキュベート後にＰＢＳで洗浄して固定後、抗ＭＡＰ２抗体（アブカム社製）と反応させて、抗マウスＩｇＧ−Ａｌｅｘａ５６８（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）で２２Ｇ５及び正常マウスＩｇＧを可視化し、抗ウサギＩｇＧ−Ａｌｅｘａ４８８（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）でＭＡＰ２を可視化することで、抗ドレブリン抗体の神経細胞への影響を検証した。
【００４３】
結果を図９に示す。市販の正常マウスＩｇＧ（富士フイルム和光純薬株式会社製）を１時間投与して洗浄して固定したラット海馬培養細胞は、マウスＩｇＧ（赤色。検出されず）は細胞内に取り込まれておらず、正常細胞と同様なＭＡＰ２の染色（緑色）が認められた（図９Ｂ）。一方、抗ドレブリン抗体（２２Ｇ５）を1時間投与して洗浄して固定した培養神経細胞では、２２Ｇ５は細胞体や一部の樹状突起に入り込んでいる像（赤色）が認められた。さらに、２２Ｇ５を取り込んだ領域では微小管に異常が生じ正常のＭＡＰ２の染色（緑色）が消失していた（図９Ａ）。ここでの結果より、ＤＡＲＰｓ自己抗体がシナプス機能不全に起因する、又はシナプス機能不全を付随する疾病の発症により体内に多量に生産されると、脳の神経細胞を損傷し、病状をさらに進行させることが示唆された。したがって、ＤＡＲＰｓ自己抗体による脳神経細胞損傷作用を抑制するドミナントネガティブペプチドは、脳の神経細胞損傷を抑制することのできる上記疾病の治療剤及び／又は予防剤の候補化合物になると考えられる。
【実施例６】
【００４４】
６．ラット神経細胞におけるＤＡＲＰｓの存在確認
疾患モデル動物や、疾患モデル動物由来の培養神経細胞が、疾患の治療剤、予防剤のスクリーニングに使用し得るかを確認するため、以下の手順によりラット神経細胞にＤＡＲＰｓが存在するか検証した。
（１）ＤＩＶ８（インビトロでの培養日数）の培養ラット大脳皮質細胞を２ｄｉｓｈ分（６０ｍｍ  ｄｉｓｈ）、ＰＢＳで回収してソニケーションを行い細胞を破砕した。
（２）１５０００ｒｐｍで２０ｍｉｎ遠心後、上清を回収した（図１０左レーン、Ｉｎｐｕｔ）。
（３）免疫沈降は、上清に抗ドレブリン抗体（２８Ｄ８：自家製）とプロテインＡ／Ｇビーズ３０μｌを加えてＲｏｔａｔｅ（１時間）、その後ビーズはＰＢＳで３回洗浄（ＰＢＳを加えて混和して、１５００ｇで１０秒遠心して上清を除く）して、ＳＤＳバッファー５０μｌで結合物を溶出した（図１０中央レーン、２８Ｄ８  ＩＰ）。
（４）ネガティブコントロールとして上清にプロテインＡ／Ｇビーズ３０μｌを加えてＲｏｔａｔｅ（１時間）、その後ビーズはＰＢＳで３回洗浄（ＰＢＳを加えて混和して、１５００ｇで１０秒遠心して上清を除く）して、ＳＤＳバッファー５０μｌで結合物を溶出した（図１０右レーン、Ａ／Ｇ  ｂｅａｄｓ）。
（５）得られた各画分をウェスタンブロッティングに供した。検出は、抗ドレブリンＡ抗体ＤＡＳ２（免疫生物学研究所）を用いて行った。
【００４５】
結果を図１０に示す。抗ドレブリン抗体により免疫沈降した画分にＤＡＲＰｓのバンドを確認することができ、ヒト以外のドレブリンを有する動物や、その培養細胞においてもＤＡＲＰｓが存在することが明らかになった。ここでの結果より、シナプス機能不全により細胞外（培養液中）に漏出するＤＡＲＰｓの濃度変化を、シナプス機能不全に起因する、若しくはシナプス機能不全を付随する疾病の予防剤、又はシナプス機能不全に起因する、若しくはシナプス機能不全を付随する疾病の治療剤のスクリーニングの指標として使用し得ることが示された。
【実施例７】
【００４６】
７．アルツハイマー病モデルマウスにおけるＤＡＲＰｓの存在確認
本発明者らは、５ｘＦＡＤマウス（家族性アルツハイマー病の遺伝子を５個持つマウス）とドレブリンノックアウトマウス（ホモ）を掛け合わせることにより５ｘＦＡＤ遺伝子とドレブリン遺伝子（＋／−）をヘテロに持つマウス（５ｘＦＡＤ／ＤＸＫＯ＋／−）を報告している（特願２０１９−１８５２４５）。このマウスから血液試料を取得し、実施例１と同様にプロテインＡ／Ｇビーズの吸着画分をウェスタンブロッティングに供した。検出は、抗ドレブリンＡ抗体ＤＡＳ２（免疫生物学研究所）を用いて行ったところ、５ｘＦＡＤ／ＤＸＫＯ＋／−のＤＡＲＰ１００濃度が野生型マウスよりも高いことが確認できた。
【産業上の利用可能性】
【００４７】
本発明の判定方法によれば、これまで質問式検査（うつ病、認知症等）や画像検査（脳出血等）に頼っていたシナプス機能不全に起因する、又はシナプス機能不全を付随する疾病の発症の有無や重症度を早期かつ簡便に判定することができるため、これらの疾病の発症を予防したり、早期治療することにつながる。さらに、ＤＡＲＰｓや抗ＤＡＲＰｓ自己抗体は、予防剤、治療剤のスクリーニング指標にもなるものであり、創薬研究に資することができる。
したがって、本発明の、医療・製薬分野における産業上の利用可能性は極めて高い。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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