(57)【要約】【課題】Ｈｉｆ２α（ＥＰＡＳ１）遺伝子の発現を阻害するためのＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）トリガー及びＲＮＡｉトリガーコンジュゲートの提供。【解決手段】Ｈｉｆ２α（ＥＰＡＳ１）遺伝子の発現を阻害するためのＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）トリガー及びＲＮＡｉトリガーコンジュゲートを提供する。また１又は複数のＨｉｆ２αＲＮＡｉトリガーを、任意に１又は複数の追加の治療薬と共に含有する医薬組成物も、提供される。インビボにおける記載されたＨｉｆ２αＲＮＡｉトリガーの腫瘍細胞への送達は、Ｈｉｆ２α遺伝子発現の阻害及び癌の治療を提供する。【選択図】図１
2022001576.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｈｉｆ２α遺伝子の発現を阻害するためのＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）トリガーを含む組成物であって、ＲＮＡｉトリガーが、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、該アンチセンス鎖が、表１、表２又は表５のいずれかのアンチセンス鎖のヌクレオチド２−１９の塩基配列を含む、組成物。
【請求項２】
前記アンチセンス鎖が、配列番号：４(UUCAUGAAAUCGUUACGUUG)又は配列番号：３８(GUAAAACAAUUGUGUACUUU)のヌクレオチド２−２１のヌクレオチド塩基配列を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
ａ）前記アンチセンス鎖が、配列番号：４（UUCAUGAAAUCGUUACGUUG)のヌクレオチド２−２１のヌクレオチド塩基配列を含み、かつ、前記センス鎖が、配列番号：５３(ACGUAACGAUUUCAUGAAU)のヌクレオチド塩基配列を含むか、又は
ｂ）前記アンチセンス鎖が、配列番号：３８(GUAAAACAAUUGUGUACUUU)のヌクレオチドのヌクレオチド塩基配列を含み、かつ、前記センス鎖が、配列番号：５６(AGUACACAAUUGUUUUACA)のヌクレオチド１−１９のヌクレオチド塩基配列を含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記センス鎖及び／又はアンチセンス鎖が、長さが１〜６ヌクレオチドの３′及び／又は５’伸長を更に含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記アンチセンス鎖の３’伸長が、ｕＡｕ、ｕＧｕ、ｕｄＴｓｄＴ、ｕｓｄＴｓｄＴ、ＵｆＡｕ、Ａｕａ、Ａｆｓｕｓａ、ＵＡＵ、ｕＡｆｕ、ｕａｕ、ｕｄＡｕ、ｕｓｃｕ、ｕｓｇｕ、ｕｓｃｓｕ、ｃＡｕ、ａＵａ、ａｕａ、ｕ（ｉｎｖｄＡ）ｕ、ｃａｇ、ａｇｕ、ｇｃｇ、ｃａａ、ｕｓａｓｕ、ｕＡＭＴＭ、又はｕｓＴＭｓＡＭを含む、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記アンチセンス鎖の５’伸長が、ｄＡ、ｄＴ、ｐｄＴ、ｖｐｄＴ、又はｕを含む、請求項４〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
前記センス鎖の３’伸長が、Ａｆ、ｉｎｖｄＡ、ｉｎｖｄＴ、Ａ（ｉｎｖｄＴ）、Ａｆ（ｉｎｖｄＴ）、Ｕ（ｉｎｖｄＴ）、Ｕｆ（ｉｎｖｄＴ）、ＡｆＡｂｕＡｕ、ｄＴｄＴ、又はｄＴｓｄＴを含む、請求項４〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
前記センス鎖の５’伸長が、ｕＡｕＡｕｓ、ｕＡｕＡｕ、ＵＡＵＵＡＧｆｓ、ＵｆａＵｆａＡ、ｕａｕａＡ、ＡＵＡＵＵ、ＡｆｕＡｆｕＵ、ａｕａｕＵ、ｕａＵｆａｕ、ｕＡｕＡ（ＵUNA）、ｕａｕａｕ、ｕｄＡｕｄＡｕ、ｕｕＡｇａ、ｕｕＡｕｕ、ｕｕＧＡｕ、ｕｕａｇａ、ｕＡｕｇａ、ａＵａＧａｓ、ｕａｕａｕｓ、ｕＡｕａａｓ、ｕｄＡｕａｕ、ａｄＴａｇａ、ａｕａｇａ、ｕ（ｉｎｖｄＡ）ｕａｕ、ｇａｃａｕ、ｕｇａａｕ、ｇｃｇａｕ、ｕａｕｇａ、ｕｕｇｇａ、又はａｕａｇａを含む、請求項４〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
標的化基が、前記ＲＮＡｉトリガーにコンジュゲートされている、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記標的化基が、以下：インテグリン−結合化合物、αvβ3インテグリン−結合、ＲＧＤリガンド、ＲＧＤペプチド、及びＲＧＤ模倣物、からなる群から選択される化合物を含む、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
送達ポリマーが、前記ＲＮＡｉトリガーにコンジュゲートされている、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
連結基が、前記ＲＮＡｉトリガーにコンジュゲートされている、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
前記センス鎖及び／又はアンチセンス鎖が、独立して、１又は複数の修飾されたヌクレオチド又はヌクレオチド模倣物を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記修飾されたヌクレオチドが、以下：２’−Ｏ−メチル修飾されたヌクレオチド、５’−ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾されたヌクレオチド、２’−デオキシ−修飾されたヌクレオチド、ロックドヌクレオチド（locked nucleotides）、脱塩基（abasic）ヌクレオチド、デオキシチミジン、逆方向デオキシチミジン、２’−アミノ−修飾されたヌクレオチド、２’−アルキル−修飾されたヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、及び、ヌクレオチドを含む非天然の塩基、からなる群から選択される、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記センス鎖が、３’末端から１１、１２、及び／又は１３の位置に１、２又は３個の２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾されたヌクレオチドを含む、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記アンチセンス鎖が、５’末端から２の位置に２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾されたヌクレオチドを含む、請求項１４〜１５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１７】
前記アンチセンス鎖が、５’末端から１４の位置に２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾されたヌクレオチドを含む、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１８】
前記アンチセンス鎖が、５’末端から４、６、８、１０、及び１２の位置に１、２、３又は４個の２’−Ｆヌクレオチドを含む、請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１９】
前記ＲＮＡｉトリガーが、１又は複数のホスホロチオエートヌクレオチド間リンケージを含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２０】
前記センス鎖が、１又は２個のホスホロチオエートヌクレオチド間リンケージを含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２１】
前記アンチセンス鎖が、１、２、３又は４個のホスホロチオエートヌクレオチド間リンケージを含む、請求項１９〜２０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２２】
１又は複数の追加の治療薬又は治療を更に含む、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２３】
薬学的に許容される賦形剤を更に含む、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２４】
前記組成物が、キット、容器、パック、ディスペンサー、予め充填された注射器、又はバイアル内に包装されている、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２５】
（ＲＮＡｉトリガー）n−ポリ（Ａa-co-（Ｂb-グラフト-（Ｃc；  Ｄd）））を含む組成物であって、ここで、
Ａは、疎水性基−含有モノマーであり、
Ｂは、第一級アミン−含有モノマーであり、
Ｃは、可逆性の生理的に不安定なリンケージを介して第一級アミン−含有モノマーに連結されたインテグリン−結合リガンドを含み、
Ｄは、可逆性の生理的に不安定なリンケージを介して第一級アミン−含有モノマーに連結された立体安定剤を含み、
ａは、０を超える整数であり、
ｂは、２以上の整数であり、
ｃは、１以上の整数であり、
ｄは、１以上の整数であり、
ｃ＋ｄの値は、ｂの値の８０％よりも大きく、
ポリ（Ａa-co-Ｂb）は、膜活性ポリアミンであり、
ＲＮＡｉトリガーは、請求項１〜８及び１２〜２１のいずれか一項に記載のＨｉｆ２αＲＮＡｉトリガーを含み、並びに
ｎは、０．２５〜５．０の値を有する、組成物。
【請求項２６】
Ｃが、ＲＧＤ−ＰＥＧx−ＦＣｉｔＦＰｒｏを含み、ここでｘは、１〜５０である、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
Ｄが、ＰＥＧy−ＡＣｉｔ−ＰＡＢＣを含み、ここでｙが、４〜３０である、請求項２５〜２６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２８】
前記値ｃ＋ｄが、ｂの値の９０％よりも大きい、請求項２５〜２７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２９】
比ａ：ｂが、４０：６０〜６０：４０である、請求項２５〜２８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３０】
薬学的に許容される賦形剤を更に含有する、請求項２５〜２９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３１】
細胞、組織、又は対象におけるＨｉｆ２α発現を阻害するための方法であって、該対象に、請求項１〜２３及び２５〜３０のいずれか一項に記載のＲＮＡ干渉トリガーの治療的有効量を投与することを含む、方法。
【請求項３２】
前記組成物が、非経口投与される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記細胞又は組織が、腎細胞癌である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
医薬品を製造するための、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項３５】
Ｈｉｆ２α遺伝子の発現を阻害することが可能な（ＲＮＡｉ）トリガーであって、該ＲＮＡｉトリガーが、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、該アンチセンス鎖が、表１、表２、又は表５のアンチセンス配列のいずれかを含む、ＲＮＡｉトリガー。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
（背景）
ＥＰＡＳ１は、ＨＩＦ（低酸素誘導因子）遺伝子ファミリーの一員である。Ｈｉｆ２アルファ又はＨｉｆ２αとしても公知のＥＰＡＳ１は、酸素により調節された遺伝子の誘導に関与し、且つ酸素レベルが低下した際（低酸素症として知られる状態）に誘導される転写因子の半分をコードしている。
【０００２】
この遺伝子のある種の変異体は、高い標高で生活している人の保護を提供する。しかし、低い標高では、野生型（ＷＴ）ＥＰＡＳ１の過剰発現は、高血圧及び脳卒中の増加に関連し、且つ高山病に類似した症状に関連している。この遺伝子の突然変異は、４型家族性赤血球増加症及び肺高血圧症に関連している。ＥＰＡＳ１は、赤血球細胞の過剰な生成を引き起こし得、これは阻害された生殖能又は死亡にすらつながる。
【０００３】
ＥＰＡＳ１は、腫瘍の発達を含む疾患の仕分けに関与した様々な遺伝子の発現、又は発現の増強に必要であることが示されている。例えば、ＥＰＡＳ１は恐らく、オートクリンループＶＥＧＦ−ｐＶＥＧＦＲ２／ＫＤＲの促進により、及びＬＤＨＡの発現増強、結果としての成長優位をもたらすことにより、ブドウ膜メラノーマの進行において役割を果たし得る。
【０００４】
ＥＰＡＳ１はまた、以下を含む他の因子の発現に関与するか、又はこれらをアップレギュレートすることも示されている：ｃＭｙｃ（細胞の増殖、形質転換、新生物形成及び腫瘍形成を支持し、且つほとんどの癌において高度に発現されている）；インターロイキン８（例えば歯肉炎及び乾癬における、プロ炎症メディエーター）；ＳＰ−１（ＩＬ−８調節及びｃＭｙｃの共活性化因子に関与した転写因子）；ＬＤＨ５（これは、腫瘍壊死及び増大した腫瘍サイズに関連づけられている）；並びに、ＬＡＮＡ（潜伏期関連核抗原、これはカポジ肉腫関連ヘルペスウイルスに関連している）。加えて、ＨＩＦ（低酸素誘導因子）活性は、癌の腫瘍成長に必要な血管新生において役割を果たし得る。ＥＰＡＳ１はまた、炎症、慢性炎症、新生血管疾患、関節リウマチ、腎臓癌、明細胞型腎細胞癌（及びこれ及び他の癌の転移）、メラノーマ、ブドウ膜メラノーマ、軟骨肉腫、及び多発性骨髄腫を含む、いくつかの他の疾患に関与し得る。
【０００５】
ＥＰＡＳ１遺伝子における突然変異は、傍神経節腫、ソマトスタチン産生腫瘍及び／又は褐色細胞腫などの神経内分泌腫瘍の早期発症に関連づけられている。この突然変異は通常、ＨＩＦ−２αの一次(primary)ヒドロキシル化部位に位置した体細胞ミスセンス突然変異である。これらの突然変異は、タンパク質のヒドロキシル化／分解機構を破壊し、タンパク質安定化及び偽低酸素症のシグナル伝達に繋がると考えられる。加えて、神経内分泌腫瘍は、エリスロポエチン（ＥＰＯ）を循環血中に放出し、これは赤血球増加症につながる。
【発明の概要】
【０００６】
（概要）
Ｈｉｆ２α（ＥＰＡＳ、又はＨｉｆ２アルファとも称す）の発現を選択的且つ効果的に減少することができる、Ｈｉｆ２α遺伝子−特異的ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）トリガー分子（ＲＮＡｉ剤、ＲＮＡｉトリガー、又はトリガーとも称す）が、本明細書において記載されている。各ＲＮＡｉトリガーは、少なくともセンス鎖及びアンチセンス鎖を含む。このセンス鎖及びアンチセンス鎖は、互いに、部分的に、実質的に、又は完全に相補的であることができる。本明細書に記載されたＲＮＡｉトリガーセンス鎖及びアンチセンス鎖の長さは、１６〜３０ヌクレオチド長であることができる。一部の実施態様において、センス鎖及びアンチセンス鎖は、独立して１７〜２６ヌクレオチド長である。センス鎖及びアンチセンス鎖は、同じ長さ又は異なる長さのいずれかであることができる。本明細書に記載されたＲＮＡｉトリガーは、Ｈｉｆ２α遺伝子を発現している細胞への送達時に、インビトロ又はインビボにおいてＨｉｆ２α遺伝子の発現を阻害する。Ｈｉｆ２αＲＮＡｉトリガーにおいて使用することができるＨｉｆ２αＲＮＡｉトリガーセンス鎖及びアンチセンス鎖の例は、表１−２及び表５に提供されている。
【０００７】
Ｈｉｆ２αＲＮＡｉトリガーのセンス鎖は、Ｈｉｆ２αｍＲＮＡ配列に対して、少なくとも１６連続ヌクレオチドのコアストレッチ（core stretch）にわたり少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。一部の実施態様において、Ｈｉｆ２αｍＲＮＡ配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列は、長さ１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、又は２３のヌクレオチドである。Ｈｉｆ２αＲＮＡｉトリガーのアンチセンス鎖は、Ｈｉｆ２αｍＲＮＡの配列及び対応するセンス鎖に対して、少なくとも１６連続ヌクレオチドのコアストレッチにわたり少なくとも９０％の相補性を有するヌクレオチド配列を含む。一部の実施態様において、Ｈｉｆ２αｍＲＮＡ配列又は対応するセンス鎖に対して少なくとも９０％の相補性を有するヌクレオチド配列は、長さ１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、又は２３のヌクレオチドである。
【０００８】
一部の実施態様において、１又は複数のＨｉｆ２αＲＮＡｉトリガーが、当該技術分野において公知のいずれかのオリゴヌクレオチド送達技術を用いて、標的細胞又は組織へ送達される。核酸送達法は、リポソーム中の封入による、イオン導入法による、又はヒドロゲル、シクロデキストリン、生分解性ナノカプセル、及びバイオ接着ミクロスフェア、タンパク質性ベクターもしくはＤｙｎａｍｉｃ  Ｐｏｌｙｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ（商標）（ＤＰＣ）などの他のビヒクルへの組込みによるものを含むが、これらに限定されるものではない。一部の実施態様において、Ｈｉｆ２αＲＮＡｉトリガーは、インテグリン−結合化合物などの標的化基にコンジュゲートされている。一部の実施態様において、Ｈｉｆ２αＲＮＡｉトリガーは、送達ポリマー又はビヒクルへコンジュゲートされている。この送達ポリマーは、可逆的に修飾された膜活性ポリアミンであることができる。この送達ポリマーはまた、インテグリン−標的化された可逆性に修飾された膜活性ポリアミンであることもできる。
【０００９】
インテグリン標的化された可逆的に修飾された膜活性ポリアミンは、１又は複数のインテグリン−結合化合物へ、可逆性の生理的に不安定な共有的連結を介してコンジュゲートされた膜活性ポリアミンを含む。一部の実施態様において、インテグリン標的化された可逆的に修飾された膜活性ポリアミンは、可逆性の生理的に不安定な共有的連結により、１又は複数の立体安定剤へコンジュゲートされた膜活性ポリアミンを更に含む。インテグリン−結合化合物は、ＲＧＤペプチド及びＲＧＤ模倣物であることができるが、これらに限定されるものではない。可逆性の生理的に不安定な共有的連結は、ジペプチドアミドベンジルカルバメートリンケージ、テトラペプチドリンケージ、及び二置換マレアマート(maleamate)リンケージを含むが、これらに限定されるものではない。
【００１０】
前記Ｈｉｆ２αＲＮＡｉトリガーは任意に、１又は複数の追加の（すなわち、第二、第三などの）治療薬と組合せられる。第二の治療薬は、別のＨｉｆ２αＲＮＡｉトリガー（例えば、Ｈｉｆ２α標的内の異なる配列を標的化するＨｉｆ２αＲＮＡｉトリガー）であることができる。また追加の治療薬は、小分子薬剤、抗体、抗体断片、及び／又はワクチンであることもできる。１又は複数の追加の治療薬を伴う又は伴わないＨｉｆ２αＲＮＡｉトリガーは、１又は複数の賦形剤と組合せ、医薬組成物を形成することができる。
【００１１】
本開示はまた、少なくとも一部Ｈｉｆ２α発現により媒介された病態を有するヒト対象を治療する方法も包含しており、この方法は、Ｈｉｆ２αＲＮＡｉトリガー又はＨｉｆ２αＲＮＡｉトリガー−含有組成物の治療的有効量を対象へ投与する工程を含む。Ｈｉｆ２αＲＮＡｉトリガー又はＨｉｆ２αＲＮＡｉトリガー−含有組成物により対象を治療する方法は、任意に、１又は複数の追加の（すなわち、第二の）治療薬又は治療を投与する１又は複数の工程と組合せることができる。このＨｉｆ２αＲＮＡｉトリガー及び追加の治療薬は、単独の組成物において投与されるか、又はこれらは個別に投与されることができる。追加の治療薬の非限定的例は、ＶＥＧＦＲインヒビター（スーテント（登録商標）、ネクサバール（登録商標）、ＶＯＴＲＩＥＮＴ（登録商標）、アバスチン（登録商標）、ＩＮＬＹＴＡ（登録商標）、カボザンチニブ（登録商標）など）、サイトカイン（ＩＬ−２、ＩＦＮ−αなど）、ｍＴｏｒインヒビター（エベロリムス（登録商標）、テムシロリムス（登録商標）など）、抗−ＰＤ１薬（ＯＰＤＩＶＯ（登録商標）及びＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）など）、抗−ＣＴＬＡ４（ＹＥＲＶＯＹ（登録商標）など）、癌細胞のシグナル伝達経路成分（ＶＥＧＦ、ＰＩ−３−キナーゼ、ＭＥＫ、ＪＡＫ、Ａｋｔ、ＭＹＣ、Ｍｅｔ、Ｓｒｃ−ファミリーキナーゼ、Ａｂｌ、Ａｘｌ、Ｍｅｒなど）を標的化する薬剤、抗−ＰＤ−Ｌ１、抗−ＰＤ−Ｌ２、抗−ＴＩＭ３、抗−ＬＡＧ３、抗−ＣＤ２８、抗−ＯＸ４０、抗−ＯＸ−４０Ｌ、抗−ＣＤ３９、抗−ＣＤ４０、抗−ＣＤ８０、抗−ＣＤ８６、抗−ＣＤ１３７、抗−４１ＢＢＬ、抗−ＴＩＧＩＴ、抗−ＧＩＴＲ、抗−ＧＩＲＴＬ、抗−ＣＤ１５５、抗−Ｆａｓ、抗−ＦａｓＬ、抗−ＴＲＡＩＬ／ＴＲＡＩＬ−Ｌ、ＩＤＯ−１インヒビター、及びＴＤＯ−２インヒビターを含むが、これらに限定されるものではない。
【００１２】
本医薬組成物は、局所もしくは全身治療が望ましいかどうか、又は治療される面積に応じて、数多くの様式で投与されることができる。投与は、局所（例えば、経真皮貼付剤による）、肺内（例えば、ネブライザーを含む粉末もしくはエアロゾルの吸入又は吹送によるか、気管内、鼻腔内による）、表皮性、経真皮、経口又は非経口であることができる。非経口投与は、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内又は筋肉内の注射又は注入；皮下（例えば、埋植された装置による）、頭蓋内、実質組織内、髄腔内、及び脳室内投与を含むが、これらに限定されるものではない。
【００１３】
記載されたＨｉｆ２αＲＮＡｉトリガー及び／又は組成物は、以下を含むが、これらに限定されるものではない疾患の治療的処置のための方法において使用することができる：癌、腎臓癌、明細胞型腎細胞癌、非小細胞肺癌、星状細胞腫（脳腫瘍）、膀胱癌、乳癌、軟骨肉腫、結腸直腸癌、胃癌、膠芽細胞腫、頭頸部扁平上皮癌、肝細胞癌、肺腺癌、神経芽細胞腫、メラノーマ、多発性骨髄腫、卵巣癌、直腸癌、転移、歯肉炎、乾癬、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス、子癇前症、炎症、慢性炎症、新生血管疾患、及び関節リウマチ。かかる方法は、本明細書に記載されたようなＨｉｆ２αＲＮＡｉトリガーの、例えばヒト又は動物対象のような対象への投与を含む。
【００１４】
別に規定しない限りは、本明細書において使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により通常理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載された方法及び材料に類似したもしくはそれと同等の方法及び材料は、本発明の実践又は試験において使用することができるが、好適な方法及び材料が以下に記載されている。本明細書に言及された全ての刊行物、特許出願、特許及び他の参考文献は、それらの全体が引用により組み込まれている。矛盾する場合には、定義を含み本明細書が支配するであろう。加えて、材料、方法及び実施例は、単なる例証であり、限定を意図しない。
【００１５】
本発明の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明、及び請求項から明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、ＰＥＧn−ＦＣｉｔＦＰ−ＴＦＰ修飾剤を表す化学構造である。
【図２】図２は、ＲＧＤ−ＰＥＧn−ＦＣｉｔＦＰ−ＴＦＰ修飾剤を表す化学構造である。
【図３】図３は、ＲＧＤ−ＰＥＧn−ＡＣｉｔ−ＰＡＢＣ−ＰＮＰ修飾剤を表す化学構造である。
【図４】図４は、アルデヒド−ＰＥＧn−ＦＣｉｔ−ＰＡＢＣ−ＰＮＰ修飾剤を表す化学構造である。
【図５】図５は、アルデヒド−ＰＥＧn−ＡＣｉｔ−ＰＡＢＣ−ＰＮＰ修飾剤を表す化学構造である。
【図６】図６は、ＳＰＤＰ−ＰＥＧn−ＦＣｉｔ−ＰＡＢＣ−ＰＮＰ修飾剤を表す化学構造である。
【図７】図７は、ＰＥＧn−ＡＣｉｔ−ＰＡＢＣ−ＰＮＰ及びＰＥＧn−ＦＣｉｔ−ＰＡＢＣ−ＰＮＰ修飾剤を表す化学構造である。
【図８】図８は、マウスにおける治療時の血清ＳＥＡＰレベルを描くグラフである。血清ＳＥＡＰレベルの倍率変化は、投与前日（−１）レベルに対するものである。Ｇ１及びＧ２に関して、ｎ＝４である。Ｇ３に関して、ｎ＝３である。
【図９】図９は、マウスにおける３週間治療後の、腫瘍の肉眼形態である。Ｇ１  ビヒクル；Ｇ２  Ｈｉｆ２α−ＩＴＧ−ＤＰＣの４００μｇ；Ｇ３  Ｈｉｆ２α−ＩＴＧ−ＤＰＣの２８０μｇ。各動物からの両方の腎臓を示している。腫瘍は、右側に示された腎臓へ移植した。治療群からの腫瘍は、対照と比べた場合に、全て有意に小さくなっており、一部変色を示した。
【図１０】図１０は、ホルマリン固定したパラフィン切片の腫瘍のＨ＆Ｅ染色である。細い矢印は、アポトーシス細胞を示す。太い矢印は、マクロファージ浸潤を示す。パネルＡ  Ｇ１ビヒクルで処理した。アポトーシス細胞（細い矢印）が稀な、典型的管状ＲＣＣ形態。パネルＢ  Ｇ２  Ｈｉｆ２α−ＩＴＧ−ＤＰＣの４００μｇで処理した。周辺領域に数多くのアポトーシス細胞及び腫瘍構造の全般的喪失を伴う、巨大な壊死中心。パネルＣ  Ｇ３  Ｈｉｆ２α−ＩＴＧ−ＤＰＣの２８０μｇで処理した。マクロファージ浸潤及び数多くのアポトーシス細胞を伴う、典型的管状腫瘍構造の破壊。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
（詳細な説明）
Ｈｉｆ２α遺伝子の発現を阻害するためのＲＮＡｉトリガー（本明細書においてＨｉｆ２αＲＮＡｉトリガーと称す）が、本明細書において記載される。各Ｈｉｆ２αＲＮＡｉトリガーは、センス鎖及びアンチセンス鎖を含む。センス鎖及びアンチセンス鎖は、互いに、部分的に、実質的に、又は完全に相補的である。一部の実施態様において、本明細書に記載されたＲＮＡｉトリガーセンス鎖及びアンチセンス鎖の長さは、独立して１６〜３０ヌクレオチド長である。一部の実施態様において、本明細書に記載されたＲＮＡｉトリガーのセンス鎖及びアンチセンス鎖の長さは、独立して１７〜２６ヌクレオチド長である。一部の実施態様において、本明細書に記載されたＲＮＡｉトリガーのセンス鎖及びアンチセンス鎖は、独立して１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、又は２６ヌクレオチド長である。センス鎖及びアンチセンス鎖は、同じ長さであるか、又はこれらは異なる長さであるかのいずれかであることができる。一部の実施態様において、センス鎖は、約１９ヌクレオチド長であるが、アンチセンス鎖は、約２１ヌクレオチド長である。一部の実施態様において、センス鎖は、約２１ヌクレオチド長であるのに対し、アンチセンス鎖は、約２３ヌクレオチド長である。他の実施態様において、センス鎖及びアンチセンス鎖は、独立して１７〜２１ヌクレオチド長である。一部の実施態様において、センス鎖及びアンチセンス鎖の両方は、各々２１〜２６ヌクレオチド長である。Ｈｉｆ２αＲＮＡｉトリガー分子の形成に使用されるヌクレオチド配列の例は、表１−２及び５に提供されている。
【００１８】
ＲＮＡｉトリガーは、以下を含むが、これらに限定されるものではない：短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、及びダイサー基質（米国特許第８，０８４，５９９号、第８，３４９，８０９号及び第８，５１３，２０７号）。本明細書に記載されたＲＮＡｉトリガーは、Ｈｉｆ２α遺伝子を発現している細胞への送達時に、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の生物学的プロセスを通じて、Ｈｉｆ２α遺伝子のインビトロ又はインビボにおける発現を阻害又はノックダウンする。
【００１９】
Ｈｉｆ２αＲＮＡｉトリガーは、各々１６〜２３核酸塩基長のコア配列を含む、センス鎖及びアンチセンス鎖を含む。アンチセンス鎖コア配列は、Ｈｉｆ２αｍＲＮＡに存在するヌクレオチド配列（時には、例えば標的配列と称される）に対し、１００％（完全に）相補的又は少なくとも９０％（実質的に）相補的性である。センス鎖コア配列は、アンチセンス鎖の配列に対し、１００％（完全に）相補的又は少なくとも９０％（実質的に）相補的であり、従ってセンス鎖コア配列は、Ｈｉｆ２αｍＲＮＡに存在するヌクレオチド配列（標的配列）に対して、完全に同一又は少なくとも９０％同一である。センス鎖コア配列は、対応するアンチセンスコア配列と同じ長さであることができるか、又はこれは異なる長さであることができる。一部の実施態様において、アンチセンス鎖コア配列は、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、又は２３ヌクレオチド長である。一部の実施態様において、センス鎖コア配列は、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、又は２３ヌクレオチド長である。
【００２０】
Ｈｉｆ２αＲＮＡｉトリガーのセンス鎖及びアンチセンス鎖は典型的には、アニーリングし、二本鎖を形成する。相補的二本鎖領域内で、センス鎖コア配列は、アンチセンスコア配列に対し、少なくとも９０％相補的又は１００％相補的である。一部の実施態様において、センス鎖コア配列は、アンチセンス鎖コア配列の対応する１６、１７、１８、１９、２０、又は２１ヌクレオチド配列に対して、少なくとも９０％又は１００％相補的である、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、又は少なくとも２１ヌクレオチドの配列を含む（すなわち、Ｈｉｆ２αＲＮＡｉトリガーのセンス鎖とアンチセンスコア配列は、少なくとも９０％塩基対形成した又は１００％塩基対形成した少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、又は少なくとも２１ヌクレオチドの領域を有する）。
【００２１】
本明細書において使用される用語「配列」又は「ヌクレオチド配列」は、標準ヌクレオチド命名を使用する文字の連続により記載され、及び本明細書に記載された修飾されたヌクレオチドにとって重要な、核酸塩基、ヌクレオチド、及び／又はヌクレオシドの連続又は順番をいう。
【００２２】
本明細書において使用される用語「相補性」は、別に指定しない限りは、第一のヌクレオチド配列（例えば、ＲＮＡｉトリガーセンス鎖又はＨｉｆ２αｍＲＮＡ）を第二のヌクレオチド配列（例えば、ＲＮＡｉトリガーアンチセンス鎖）に関連して説明するために使用される場合は、第一のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの、第二のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドと、ある条件下で、ハイブリダイズし（塩基対水素結合を形成する）及び二本鎖又は二重らせん構造を形成する能力をいう。相補的配列は、ワトソン−クリック塩基対又は非ワトソン−クリック塩基対を含み、並びにそれらのハイブリダイズする能力に関して前記必要要件が満たされる限りは、天然もしくは修飾されたヌクレオチドもしくはヌクレオチド模倣物を含む。「完璧な相補性」又は「完全な相補性」は、第一のポリヌクレオチドの連続配列中の塩基の全て（１００％）が、第二のポリヌクレオチドの連続配列中の同数の塩基とハイブリダイズすることを意味する。この連続配列は、第一又は第二のヌクレオチド配列の全て又は一部を含んでよい。本明細書において使用される「部分的な相補性」は、核酸塩基配列のハイブリダイズされた対において、第一のポリヌクレオチドの連続配列の中の塩基の少なくとも７０％が、第二のポリヌクレオチドの連続配列中の同数の塩基とハイブリダイズすることを意味する。本明細書において使用される「実質的な相補性」は、核酸塩基配列のハイブリダイズされた対において、第一のポリヌクレオチドの連続配列の中の塩基の少なくとも８５％が、第二のポリヌクレオチドの連続配列中の同じ数の塩基とハイブリダイズすることを意味する。本明細書で使用される用語「相補性」、「完全な相補性」及び「実質的な相補性」は、ＲＮＡｉトリガーのセンス鎖とアンチセンス鎖の間の、又はＲＮＡｉトリガーのアンチセンス鎖とＨｉｆ２αｍＲＮＡの配列の間の塩基対のマッチングに関して使用される。配列同一性又は相補性は、修飾とは無関係である。同一性又は相補性を決定する目的で、例えば、ａ及びＡｆは、Ｕ（又はＴ）と相補的であり、並びにＡと同一である。
【００２３】
センス鎖及び／又はアンチセンス鎖は、任意に及び独立して、コア配列の３’末端、５’末端、又は３’及び５’末端の両方に、追加の１、２、３、４、５、又は６ヌクレオチド（伸長）を含む。アンチセンス鎖に追加ヌクレオチドが存在する場合は、これは、Ｈｉｆ２αｍＲＮＡ中の対応する配列と相補的であってもなくてもよい。センス鎖に追加ヌクレオチドが存在する場合は、これは、Ｈｉｆ２αｍＲＮＡ中の対応する配列と同一であってもなくてもよい。アンチセンス鎖に追加ヌクレオチドが存在する場合は、これは、対応するセンス鎖に追加ヌクレオチドが存在する場合に、これと相補性であってもなくてもよい。
【００２４】
本明細書において使用される伸長は、センス鎖コア配列及び／又はアンチセンス鎖コア配列の５’及び／又は３’末端に１、２、３、４、５、又は６ヌクレオチドを含む。センス鎖上の伸長ヌクレオチドは、対応するアンチセンス鎖中のコア配列ヌクレオチド又は伸長ヌクレオチドのいずれかのヌクレオチドに対して相補的であってもなくてもよい。逆に、アンチセンス鎖上の伸長ヌクレオチドは、対応するセンス鎖中のコア配列ヌクレオチド又は伸長ヌクレオチドのいずれかのヌクレオチドに対して相補的であってもなくてもよい。一部の実施態様において、ＲＮＡｉトリガーのセンス鎖及びアンチセンス鎖の両方は、３’及び５’伸長を含む。一部の実施態様において、１本鎖の１又は複数の３’伸長ヌクレオチドは、他方の鎖の１又は複数の５’伸長ヌクレオチドと塩基対形成する。他の実施態様において、１本鎖の１又は複数の３’伸長ヌクレオチドは、他方の鎖の１又は複数の５’伸長ヌクレオチドと塩基対形成しない。一部の実施態様において、Ｈｉｆ２αＲＮＡｉトリガーは、３’伸長を有するアンチセンス鎖及び５’伸長を有するセンス鎖を有する。
【００２５】
一部の実施態様において、Ｈｉｆ２αＲＮＡｉトリガー分子は、１、２、３、４、５、又は６ヌクレオチド長の３’伸長を有するアンチセンス鎖を含む。他の実施態様において、Ｈｉｆ２αＲＮＡｉトリガー分子は、１、２、又は３ヌクレオチド長の３’伸長を有するアンチセンス鎖を含む。一部の実施態様において、アンチセンス鎖伸長ヌクレオチドの１又は複数は、ウラシルもしくはチミジンヌクレオチド又は対応するＨｉｆ２αｍＲＮＡ配列に対して相補的であるヌクレオチドを含む。一部の実施態様において、アンチセンス鎖伸長は、ｕＡｕ、ｕＧｕ、ｕｄＴｓｄＴ、ｕｓｄＴｓｄＴ、ＵｆＡｕ、Ａｕａ、Ａｆｓｕｓａ、ＵＡＵ、ｕＡｆｕ、ｕａｕ、ｕｄＡｕ、ｕｓｃｕ、ｕｓｇｕ、ｕｓｃｓｕ、ｃＡｕ、ａＵａ、ａｕａ、ｕ（ｉｎｖｄＡ）ｕ、ｃａｇ、ａｇｕ、ｇｃｇ、ｃａａ、ｕｓａｓｕ、ｕＡＭＴＭ、又はｕｓＴＭｓＡＭ（各々５’から３’へ列記され、表記は表２と同じである）であることができるが、これらに限定されるものではない。
【００２６】
一部の実施態様において、Ｈｉｆ２αＲＮＡｉトリガー分子は、１、２、３、４、又は５ヌクレオチド長の５’伸長を有するアンチセンス鎖を含む。他の実施態様において、Ｈｉｆ２αＲＮＡｉトリガー分子は、１又は２ヌクレオチド長の５’伸長を有するアンチセンス鎖を含む。一部の実施態様において、１又は複数のアンチセンス鎖伸長ヌクレオチドは、ウラシルもしくはチミジンヌクレオチド、又は対応するＨｉｆ２αｍＲＮＡ配列に対して相補的であるヌクレオチドを含む。一部の実施態様において、アンチセンス鎖伸長は、ｄＡ、ｄＴ、ｐｄＴ、ｖｐｄＴ、又はｕを含むか又はこれらからなり、ここでｄＡ及びｄＴは、各々、デオキシアデノシン及びデオキシチミジンヌクレオチドを表し、ｐｄＴは、５’リン酸基を有するデオキシチミジンヌクレオチドを表し、ｖｐｄＴは、ビニルホスホネートデオキシチミジンヌクレオチドを表し、並びにｕは、２’−ＯＭｅ修飾されたウラシルヌクレオチドを表す。アンチセンス鎖は、先に記載した５’アンチセンス鎖伸長のいずれかが存在するならば、これと組合せて、先に記載した３’伸長のいずれかを有することができる。
【００２７】
一部の実施態様において、Ｈｉｆ２αＲＮＡｉトリガー分子は、１、２、３、４、又は５ヌクレオチド長の３’伸長を有するセンス鎖を含む。一部の実施態様において、１又は複数のセンス鎖伸長ヌクレオチドは、アデノシン、ウラシル、もしくはチミジンヌクレオチド、ＡＴジヌクレオチド、又はＨｉｆ２αｍＲＮＡ配列中のヌクレオチドに対応したヌクレオチドを含む。一部の実施態様において、３’センス鎖伸長は、Ａｆ、ｉｎｖｄＡ、ｉｎｖｄＴ、Ａ（ｉｎｖｄＴ）、Ａｆ（ｉｎｖｄＴ）、Ｕ（ｉｎｖｄＴ）、Ｕｆ（ｉｎｖｄＴ）、ＡｆＡｂｕＡｕ、ｄＴｄＴ、又はｄＴｓｄＴを含むか又はこれらからなり、ここでＡｆ及びＵｆは、各々、２’−フルオロアデノシン及びウラシルヌクレオチドを表し、ｉｎｖｄＡ及びｉｎｖｄＴは、各々、３’−３’連結した（逆方向）デオキシアデノシン及びデオキシチミジンヌクレオチドを表し、Ａｂは、脱塩基（abasic）リボースを表し、ｕは、２’−ＯＭｅ修飾されたウラシルヌクレオチドを表し、ｄＴは、デオキシチミジンヌクレオチドを表し、ｓｄＴは、５’ホスホロチオエートを有するデオキシチミジンヌクレオチドを表し、並びにＵ及びＡは、ウラシル及びアデノシンリボヌクレオチドを表す。
【００２８】
一部の実施態様において、Ｈｉｆ２αＲＮＡｉトリガー分子は、１、２、３、４、５又は６ヌクレオチド長の５’伸長を有するセンス鎖を含む。一部の実施態様において、１又は複数のセンス鎖伸長ヌクレオチドは、ウラシルもしくはアデノシンヌクレオチド、又はＨｉｆ２αｍＲＮＡ配列中のヌクレオチドに対応したヌクレオチドを含む。一部の実施態様において、センス鎖５’伸長は、ｕＡｕＡｕｓ、ｕＡｕＡｕ、ＵＡＵＵＡＧｆｓ、ＵｆａＵｆａＡ、ｕａｕａＡ、ＡＵＡＵＵ、ＡｆｕＡｆｕＵ、ａｕａｕＵ、ｕａＵｆａｕ、ｕＡｕＡ（ＵUNA）、ｕａｕａｕ、ｕｄＡｕｄＡｕ、ｕｕＡｇａ、ｕｕＡｕｕ、ｕｕＧＡｕ、ｕｕａｇａ、ｕＡｕｇａ、ａＵａＧａｓ、ｕａｕａｕｓ、ｕＡｕａａｓ、ｕｄＡｕａｕ、ａｄＴａｇａ、ａｕａｇａ、ｕ（ｉｎｖｄＡ）ｕａｕ、ｇａｃａｕ、ｕｇａａｕ、ｇｃｇａｕ、ｕａｕｇａ、ｕｕｇｇａ、又はａｕａｇａ（各々５’から３’へ列記され、表記は表２と同じである）であることができるが、これらに限定されるものではない。センス鎖は、３’伸長及び／又は５’伸長を有することができる。
【００２９】
修飾されないＨｉｆ２αＲＮＡｉトリガーのセンス鎖及びアンチセンス鎖の配列は、表１及び表５に提供される。Ｈｉｆ２αＲＮＡｉトリガーの形成において、表１及び５に列記された各配列の各ヌクレオチドは、修飾されたヌクレオチドであってよい。
【００３０】
【表１−１】
2022001576.tif 000003
【表１−２】
2022001576.tif 000004
【００３１】
本明細書に記載されたＨｉｆ２αＲＮＡｉトリガーは、アンチセンス鎖のセンス鎖とのアニーリングにより形成される。一部の実施態様において、Ｈｉｆ２αＲＮＡｉトリガーのアンチセンス鎖は、表１及び５の配列のいずれかのヌクレオチド配列を含む。一部の実施態様において、Ｈｉｆ２αＲＮＡｉトリガーのアンチセンス鎖は、表１及び５の配列のいずれかのヌクレオチド１−１７、２−１７、１−１８、２−１８、１−１９、２−１９、１−２０、２−２０、１−２１、２−２１、１−２２、２−２２、１−２３、２−２３、１−２４、２−２４、１−２５、２−２５、１−２６、又は２−２６の配列を含む。一部の実施態様において、Ｈｉｆ２αＲＮＡｉトリガーのセンス鎖は、表１及び５の配列のいずれかのヌクレオチド配列を含む。一部の実施態様において、Ｈｉｆ２αＲＮＡｉトリガーのセンス鎖は、表１及び５の配列のいずれかのヌクレオチド１−１７、２−１７、１−１８、２−１８、１−１９、２−１９、１−２０、２−２０、１−２１、２−２１、１−２２、２−２２、１−２３、２−２３、１−２４、２−２４、１−２５、２−２５、１−２６、又は２−２６の配列を含む。
【００３２】
一部の実施態様において、本明細書に記載されたＲＮＡｉトリガーのセンス鎖及びアンチセンス鎖は、同じ数のヌクレオチドを含む。一部の実施態様において、本明細書に記載されたＲＮＡｉトリガーのセンス鎖及びアンチセンス鎖は、異なる数のヌクレオチドを含む。一部の実施態様において、ＲＮＡｉトリガーのセンス鎖５’末端及びアンチセンス鎖３’末端は、平滑末端を形成する。一部の実施態様において、ＲＮＡｉトリガーのセンス鎖３’末端及びアンチセンス鎖５’末端は、平滑末端を形成する。一部の実施態様において、ＲＮＡｉトリガーの両端は、平滑末端を形成する。一部の実施態様において、ＲＮＡｉトリガーのいずれの末端も、平滑末端ではない。本明細書で使用される平滑末端は、２本のアニーリングされた鎖の末端ヌクレオチドが、相補性である（相補性塩基対を形成する）、二本鎖トリガー分子の末端をいう。一部の実施態様において、ＲＮＡｉトリガーのセンス鎖５’末端及びアンチセンス鎖３’末端は、ほつれた(frayed)末端を形成する。一部の実施態様において、ＲＮＡｉトリガーのセンス鎖３’末端及びアンチセンス鎖５’末端は、ほつれた末端を形成する。一部の実施態様において、ＲＮＡｉトリガーの両端は、ほつれた末端を形成する。一部の実施態様において、ＲＮＡｉトリガーのいずれの末端も、ほつれた末端ではない。本明細書で使用されるほつれた末端は、２本のアニーリングされた鎖の末端ヌクレオチドが、対形成する（すなわち、オーバーハングを形成しない）が、相補的ではない（すなわち、非相補的対を形成する）、二本鎖トリガー分子の末端をいう。本明細書において使用されるオーバーハングは、二本鎖ＲＮＡｉトリガー分子の１本鎖の末端の、１又は複数の不対のヌクレオチドのストレッチである。不対のヌクレオチドは、３’又は５’オーバーハングのいずれかを形成している、センス鎖又はアンチセンス鎖上にあってよい。一部の実施態様において、ＲＮＡｉトリガー分子は：平滑末端及びほつれた末端、平滑末端及び５’オーバーハング末端、平滑末端及び３’オーバーハング末端、ほつれた末端及び５’オーバーハング末端、ほつれた末端及び３’オーバーハング末端、２つの５’オーバーハング末端、２つの３’オーバーハング末端、５’オーバーハング末端及び３’オーバーハング末端、２つのほつれた末端、又は２つの平滑末端を含む。
【００３３】
ヌクレオチド塩基（又は核酸塩基）は、全ての核酸の構成要素である、複素環式ピリミジン又はプリン化合物であり、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、及びウラシル（Ｕ）を含む。本明細書で使用する「Ｇ」、「ｇ」、「Ｃ」、「ｃ」、「Ａ」、「ａ」、「Ｕ」、「ｕ」及び「Ｔ」は各々一般に、塩基としてグアニン、シトシン、アデニン、ウラシル及びチミジンを含む、核酸塩基、ヌクレオシド、ヌクレオチド又はヌクレオチド模倣物を表す。同じく本明細書で使用される用語「ヌクレオチド」は、修飾されたヌクレオチド又はヌクレオチド模倣物、脱塩基部位、又はサロゲート（surrogate）置換部位を含むことができる。
【００３４】
本明細書で使用される「修飾されたヌクレオチド」は、リボヌクレオチド（２’−ヒドロキシルヌクレオチド）以外のヌクレオチドである。一部の実施態様において、Ｈｉｆ２αＲＮＡｉトリガーは、１又は複数の修飾されたヌクレオチドを含む。一部の実施態様において、これらのヌクレオチドの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％は、修飾されている。修飾されたヌクレオチドは、デオキシヌクレオチド、ヌクレオチド模倣物、脱塩基ヌクレオチド（本明細書ではＸ又はＡｂと表される）、２’−修飾されたヌクレオチド、３’−３’連結（逆方向）ヌクレオチド（本明細書ではｉｎｖｄＮ、ｉｎｖＮ、ｉｎｖｎ、ｉｎｖＸと表される）、非天然塩基を含むヌクレオチド、架橋したヌクレオチド、ペプチド核酸、２’，３’−セコヌクレオチド模倣物（アンロックド核酸塩基アナログ、本明細書ではＮUNA又はＮＵＮＡと表される）、ロックドヌクレオチド（locked nucleotides）（本明細書ではＮLNA又はＮＬＮＡと表される）、３’−Ｏ−メトキシ（２’ヌクレオチド間連結した）ヌクレオチド（本明細書では３′−ＯＭｅｎと表される）、２’−Ｆ−アラビノヌクレオチド（本明細書ではＮｆＡＮＡ又はＮｆANAと表される）、モルホリノヌクレオチド、ビニルホスホネートデオキシリボヌクレオチド（本明細書ではｖｐｄＮと表される）、並びにビニルホスホネートヌクレオチドを含むが、これらに限定されるものではない。２’−修飾されたヌクレオチド（すなわち、五員糖環の２’位にヒドロキシル基以外の基を持つヌクレオチド）は、２’−Ｏ−メチルヌクレオチド（本明細書ではヌクレオチド配列中の小文字’ｎ’で表される）、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチド（本明細書ではＮｆと表され、また本明細書では２’−フルオロヌクレオチドとも表される）、２’−デオキシヌクレオチド（本明細書ではｄＮと表される）、２’−メトキシエチル（２’−Ｏ−２−メトキシルエチル）ヌクレオチド（本明細書ではＮＭ又は２’−ＭＯＥと表される）、２’−アミノヌクレオチド、２’−アルキルヌクレオチドを含むが、これらに限定されるものではない。所与の化合物の全ての位置について均一に修飾されることは、必要ではない。逆に、２種以上の修飾が、単独のＨｉｆ２αＲＮＡｉトリガー中に、又はそれらの単独のヌクレオチド中でさえ組込まれてよい。Ｈｉｆ２αＲＮＡｉトリガーのセンス鎖及びアンチセンス鎖は、当該技術分野において公知の方法により、合成及び／又は修飾されてよい。１つのヌクレオチドでの修飾は、別のヌクレオチドの修飾とは無関係である。
【００３５】
修飾されたヌクレオチドはまた、修飾された核酸塩基を有するヌクレオチドも含む。修飾された核酸塩基は、合成及び天然の核酸塩基、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、並びにＮ−２、Ｎ−６及びＯ−６置換されたプリンで、２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシル及び５−プロピニルシトシンを含むもの、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニン及びグアニンの６−メチル及び他のアルキル誘導体、アデニン及びグアニンの２−プロピル及び他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミン及び２−チオシトシン、５−ハロウラシル及びシトシン、５−プロピニルウラシル及びシトシン、６−アゾウラシル、シトシン及びチミン、５−ウラシル（プソイドウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシル及び他の８−置換されたアデニン及びグアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチル及び他の５−置換されたウラシル及びシトシン、７−メチルグアニン及び７−メチルアデニン、８−アザグアニン及び８−アザアデニン、７−デアザグアニン及び７−デアザアデニン、並びに３−デアザグアニン及び３−デアザアデニンを含むが、これらに限定されるものではない。
【００３６】
一部の実施態様において、修飾されたヌクレオチドの２０％以下は、２’−フルオロ修飾されたヌクレオチドである。一部の実施態様において、Ｈｉｆ２αＲＮＡｉトリガーセンス鎖は、３’末端から１１の位置に、２’−Ｆヌクレオチドを含む。一部の実施態様において、Ｈｉｆ２αＲＮＡｉトリガーセンス鎖は、３’末端から１２の位置に、２’−Ｆヌクレオチドを含む。一部の実施態様において、Ｈｉｆ２αＲＮＡｉトリガーセンス鎖は、３’末端から１３の位置に、２’−Ｆヌクレオチドを含む。一部の実施態様において、Ｈｉｆ２αＲＮＡｉトリガーセンス鎖は、３’末端から１１、１２、及び１３の位置に、少なくとも２つの２’−Ｆヌクレオチドを含む。一部の実施態様において、Ｈｉｆ２αＲＮＡｉトリガーセンス鎖は、３’末端から１１及び１２の位置に、１１及び１３の位置に、又は１２及び１３の位置に、２’−Ｆヌクレオチドを含む。一部の実施態様において、Ｈｉｆ２αＲＮＡｉトリガーセンス鎖は、３’末端から１１、１２、及び１３の位置に、２’−Ｆヌクレオチドを含む。
【００３７】
一部の実施態様において、Ｈｉｆ２αＲＮＡｉトリガーアンチセンス鎖は、５’末端から２の位置に、２’−Ｆヌクレオチドを含む。一部の実施態様において、Ｈｉｆ２αＲＮＡｉトリガーアンチセンス鎖は、５’末端から１４の位置に、２’−Ｆヌクレオチドを含む。一部の実施態様において、Ｈｉｆ２αＲＮＡｉトリガーアンチセンス鎖は、５’末端から２及び１４の位置に、２’−Ｆヌクレオチドを含む。一部の実施態様において、Ｈｉｆ２αＲＮＡｉトリガーは、センス鎖の３’末端から１１、１２、及び１３の位置に、並びにアンチセンス鎖の５’末端から２及び１４の位置に、少なくとも２つの２’−Ｆヌクレオチドを含む。
【００３８】
一部の実施態様において、Ｈｉｆ２αＲＮＡｉトリガーアンチセンス鎖は、５’末端から４の位置に、２’−Ｆヌクレオチドを含む。一部の実施態様において、Ｈｉｆ２αＲＮＡｉトリガーアンチセンス鎖は、５’末端から６の位置に、２’−Ｆヌクレオチドを含む。一部の実施態様において、Ｈｉｆ２αＲＮＡｉトリガーアンチセンス鎖は、５’末端から８の位置に、２’−Ｆヌクレオチドを含む。一部の実施態様において、Ｈｉｆ２αＲＮＡｉトリガーアンチセンス鎖は、５’末端から１０の位置に、２’−Ｆヌクレオチドを含む。一部の実施態様において、Ｈｉｆ２αＲＮＡｉトリガーアンチセンス鎖は、５’末端から１２の位置に、２’−Ｆヌクレオチドを含む。一部の実施態様において、Ｈｉｆ２αＲＮＡｉトリガーアンチセンス鎖は、５’末端から４、６、８、１０、及び１２の位置に、少なくとも２つの２’−Ｆヌクレオチドを含む。一部の実施態様において、Ｈｉｆ２αＲＮＡｉトリガーアンチセンス鎖は、５’末端から４及び６の位置、４及び８の位置、４及び１０の位置、４及び１２の位置、６及び８の位置、６及び１０の位置、６及び１２の位置、８及び１０の位置、８及び１２の位置、又は１０及び１２の位置に、２’−Ｆヌクレオチドを含む。一部の実施態様において、Ｈｉｆ２αＲＮＡｉトリガーアンチセンス鎖は、５’末端から４、６、８、１０、及び１２の位置に、３つの２’−Ｆヌクレオチドを含む。一部の実施態様において、Ｈｉｆ２αＲＮＡｉトリガーアンチセンス鎖は、５’末端から４、６、８、１０、及び１２の位置に、少なくとも４つの２’−Ｆヌクレオチドを含む。一部の実施態様において、Ｈｉｆ２αＲＮＡｉトリガーアンチセンス鎖は、５’末端から４、６、８、及び１０の位置、４、６、８、及び１２の位置、４、６、１０、及び１２の位置、４、８、１０、及び１２の位置、又は６、８、１０、及び１２の位置に、２’−Ｆヌクレオチドを含む。
【００３９】
一部の実施態様において、Ｈｉｆ２αＲＮＡｉトリガーアンチセンス鎖は、５’末端から２の位置及び／又は１４の位置に２’−Ｆヌクレオチドを、並びに１１、１２、及び１３の位置に１、２又は３つの２’−Ｆヌクレオチドを含む。一部の実施態様において、Ｈｉｆ２αＲＮＡｉトリガーは、アンチセンス鎖の５’末端から２の位置及び／又は１４の位置に２’−Ｆヌクレオチドを、並びに１１、１２、及び１３の位置に１、２又は３つの２’−Ｆヌクレオチドを、並びにセンス鎖の３’末端から１１、１２、及び１３の位置に少なくとも２つの２’−Ｆヌクレオチドを含む。
【００４０】
一部の実施態様において、Ｈｉｆ２αＲＮＡｉトリガーの１又は複数のヌクレオチドは、鎖を形成しない(non-standard)リンケージ又は骨格により連結される（すなわち、修飾されたヌクレオシド間リンケージ又は修飾された骨格）。一部の実施態様において、修飾されたヌクレオシド間リンケージは、リン酸−非含有共有的ヌクレオシド間リンケージである。修飾されたヌクレオシド間リンケージ又は骨格は、ホスホロチオエート、５’−ホスホロチオエート基（本明細書ではヌクレオチドの前の小文字’ｓ’で、ｓＮ、ｓｎ、ｓＮｆ、又はｓｄＮのように表される）、キラルホスホロチオエート、チオホスフェート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキル−ホスホトリエステル、３’−アルキレンホスホネート及びキラルホスホネートを含むメチル及び他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’−アミノホスホロアミデート及びアミノアルキルホスホロアミデートを含むホスホロアミデート、チオノホスホロアミデート、チオノアルキル−ホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、モルホリノリンケージ、並びに通常の３’−５’リンケージを有するボラノホスフェート、これらの２’−５’連結されたアナログ、並びにヌクレオシド単位の隣接対が、３’−５’から５’−３’へ又は２’−５’から５’−２’へと連結される逆方向の極性を有するものを含むが、これらに限定されるものではない。他の実施態様において、修飾されたヌクレオシド間リンケージ又は骨格は、リン原子を欠いている。リン原子を欠いている修飾されたヌクレオシド間リンケージは、短鎖アルキル又はシクロアルキル糖鎖間リンケージ、混合されたヘテロ原子及びアルキル又はシクロアルキル糖鎖間リンケージ、もしくは１又は複数の短鎖ヘテロ原子又は複素環式糖鎖間リンケージを含むが、これらに限定されるものではない。一部の実施態様において、修飾されたヌクレオシド間骨格は、シロキサン骨格、スルフィド、スルホキシド及びスルホン骨格；ホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格、メチレンホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格、アルケン含有骨格、スルファメート骨格、メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノ骨格、スルホネート及びスルホンアミド骨格、アミド骨格；並びに、混合されたＮ、Ｏ、Ｓ、及びＣＨ2成分部分を有する他のものを含むが、これらに限定されるものではない。
【００４１】
一部の実施態様において、Ｈｉｆ２αＲＮＡｉトリガーは、１又は複数の修飾されたヌクレオチド及び１又は複数の修飾されたヌクレオシド間リンケージを含む。一部の実施態様において、２’−修飾されたヌクレオチドは、修飾されたヌクレオシド間リンケージと組合せられる。例えば、一部の実施態様において、Ｈｉｆ２αＲＮＡｉトリガーのセンス鎖は、１、２、３、４のホスホロチオエートリンケージを含むことができるか、Ｈｉｆ２αＲＮＡｉトリガーのアンチセンス鎖は、１、２、３、又は４のホスホロチオエートリンケージを含むことができるか、或いはセンス鎖及びアンチセンス鎖の両方は独立して、１、２、３、又は４のホスホロチオエートリンケージを含むことができる。
【００４２】
一部の実施態様において、Ｈｉｆ２αＲＮＡｉトリガーセンス鎖は、２つのホスホロチオエートヌクレオシド間リンケージを含む。一部の実施態様において、２つのホスホロチオエートヌクレオシド間リンケージは、センス鎖の３’末端から１−３の位置のヌクレオチド間である。一部の実施態様において、２つのホスホロチオエートヌクレオシド間リンケージは、センス鎖の５’末端から１−３、２−４、３−５、４−６、４−５、又は６−８の位置のヌクレオチド間である。一部の実施態様において、Ｈｉｆ２αＲＮＡｉトリガーアンチセンス鎖は、４つのホスホロチオエートヌクレオシド間リンケージを含む。一部の実施態様において、この４つのホスホロチオエートヌクレオシド間リンケージは、センス鎖の５’末端から１−３の位置のヌクレオチド間、並びに５’末端から１９−２１、２０−２２、２１−２３、２２−２４、２３−２５、又は２４−２６の位置のヌクレオチド間である。一部の実施態様において、Ｈｉｆ２αＲＮＡｉトリガーは、センス鎖の２つのホスホロチオエートヌクレオシド間リンケージ及びアンチセンス鎖の４つのホスホロチオエートヌクレオシド間リンケージを含む。
【００４３】
一部の実施態様において、Ｈｉｆ２αＲＮＡｉトリガーは、塩、混合塩、又は遊離酸として調製又は提供される。
【００４４】
修飾されたヌクレオチドを含むアンチセンス鎖の例は、表２Ａ及び表５Ｂに提供される。修飾されたヌクレオチドを含むセンス鎖の例は、表２Ｂ及び表５Ｂに提供される。表２Ａ、２Ｂ及び５Ｂにおいて、修飾されたヌクレオチドを示すために、以下の表記を使用する：
Ｎ＝２’−ＯＨ（修飾されない）リボヌクレオチド（ｆ又はｄ表示を伴わない大文字）
ｎ＝２’−ＯＭｅ修飾されたヌクレオチド
Ｎｆ＝２’−フルオロ修飾されたヌクレオチド
ｄＮ＝２’−デオキシヌクレオチド
ＮUNA＝２’，３’−セコヌクレオチド模倣物（アンロックド核酸塩基アナログ）
ＮＭ＝２’−メトキシエチルヌクレオチド
（ｉｎｖｄＮ）＝逆方向デオキシリボヌクレオチド（３’−３’連結されたヌクレオチド）
（ｉｎｖＡｂ）＝逆方向脱塩基ヌクレオチド
ｓ＝ホスホロチオエート連結したヌクレオチド
ｐ＝リン酸基
ｖｐｄＮ＝ビニルホスホネートデオキシリボヌクレオチド。
【００４５】
【表２Ａ−１】
2022001576.tif 000005
【表２Ａ−２】
2022001576.tif 000006
【００４６】
【表２Ｂ−１】
2022001576.tif 000007
【表２Ｂ−２】
2022001576.tif 000008
【表２Ｂ−３】
2022001576.tif 000009
【００４７】
【表３−１】
2022001576.tif 000010
【表３−２】
2022001576.tif 000011
【表３−３】
2022001576.tif 000012
【表３−４】
2022001576.tif 000013
【００４８】
表２Ｂに列記された配列を含むセンス鎖は、２つの配列が、連続１６、１７、１８、１９、２０又は２１ヌクレオチド配列にわたり少なくとも９０％の相補領域を有するという条件で、表２Ａに列記された配列を含む任意のアンチセンス鎖にハイブリダイズすることができる。代表的Ｈｉｆ２αＲＮＡトリガーは、表３に示された二本鎖ＩＤ番号により表される。一部の実施態様において、Ｈｉｆ２αＲＮＡｉトリガーは、任意の本明細書に提示された二本鎖ＩＤ番号からなる。一部の実施態様において、Ｈｉｆ２αＲＮＡｉトリガーは、任意の本明細書に提示された二本鎖ＩＤ番号を含む。一部の実施態様において、Ｈｉｆ２αＲＮＡｉトリガーは、本明細書に提供された二本鎖ＩＤ番号のいずれかのセンス鎖及びアンチセンス鎖のヌクレオチド配列を含む。一部の実施態様において、Ｈｉｆ２αＲＮＡｉトリガーは、本明細書に提供された二本鎖ＩＤ番号のいずれかのセンス鎖及びアンチセンス鎖のヌクレオチド配列、並びに標的化基及び／又は連結基を含み、ここで標的化基及び／又は連結基は、センス鎖又はアンチセンス鎖へ共有的に連結される。一部の実施態様において、Ｈｉｆ２αＲＮＡｉトリガーは、本明細書に提供された二本鎖ＩＤ番号のいずれかのセンス鎖及びアンチセンス鎖の修飾されたヌクレオチド配列を含む。一部の実施態様において、Ｈｉｆ２αＲＮＡｉトリガーは、本明細書に提供された二本鎖ＩＤ番号のいずれかのセンス鎖及びアンチセンス鎖の修飾されたヌクレオチド配列、並びに標的化基及び／又は連結基を含み、ここで標的化基及び／又は連結基は、センス鎖又はアンチセンス鎖へ共有的に連結される。
【００４９】
一部の実施態様において、Ｈｉｆ２αＲＮＡｉトリガーは、配列番号：４のヌクレオチド２−２１のヌクレオチド塩基配列を含むアンチセンス鎖を含む。一部の実施態様において、Ｈｉｆ２αＲＮＡｉトリガーは、配列番号：４のヌクレオチド２−２１のヌクレオチド塩基配列を含むアンチセンス鎖、及び配列番号：５３のヌクレオチド塩基配列を含むセンス鎖を含む。
【００５０】
一部の実施態様において、Ｈｉｆ２αＲＮＡｉトリガーは、配列番号：８８、配列番号：１５７、配列番号：１５９、又は配列番号：１６３のヌクレオチド塩基配列を含むアンチセンス鎖を含む。一部の実施態様において、Ｈｉｆ２αＲＮＡｉトリガーは、配列番号：８８のヌクレオチド塩基配列を含むアンチセンス鎖、及び配列番号：１７９のヌクレオチド塩基配列を含むセンス鎖を含む。一部の実施態様において、Ｈｉｆ２αＲＮＡｉトリガーは、配列番号：８８のヌクレオチド塩基配列を含むアンチセンス鎖、及び配列番号：１７７のヌクレオチド塩基配列を含むセンス鎖を含む。一部の実施態様において、Ｈｉｆ２αＲＮＡｉトリガーは、配列番号：１５７のヌクレオチド塩基配列を含むアンチセンス鎖、及び配列番号：１７５のヌクレオチド塩基配列を含むセンス鎖を含む。一部の実施態様において、Ｈｉｆ２αＲＮＡｉトリガーは、配列番号：１５９のヌクレオチド塩基配列を含むアンチセンス鎖、及び配列番号：１８５のヌクレオチド塩基配列を含むセンス鎖を含む。一部の実施態様において、Ｈｉｆ２αＲＮＡｉトリガーは、配列番号：１６３のヌクレオチド塩基配列を含むアンチセンス鎖、並びに配列番号：１８５のヌクレオチド塩基配列を含むセンス鎖を含む。
【００５１】
一部の実施態様において、Ｈｉｆ２αＲＮＡｉトリガーは、配列番号：８８、配列番号：１５７、配列番号：１５９、又は配列番号：１６３を含むアンチセンス鎖を含む。一部の実施態様において、Ｈｉｆ２αＲＮＡｉトリガーは、配列番号：８８を含むアンチセンス鎖、及び配列番号：１７９を含むセンス鎖を含む。一部の実施態様において、Ｈｉｆ２αＲＮＡｉトリガーは、配列番号：８８を含むアンチセンス鎖、及び配列番号：１７７を含むセンス鎖を含む。一部の実施態様において、Ｈｉｆ２αＲＮＡｉトリガーは、配列番号：１５７を含むアンチセンス鎖、及び配列番号：１７５を含むセンス鎖を含む。一部の実施態様において、Ｈｉｆ２αＲＮＡｉトリガーは、配列番号：１５９を含むアンチセンス鎖、及び配列番号：１８５を含むセンス鎖を含む。一部の実施態様において、Ｈｉｆ２αＲＮＡｉトリガーは、配列番号：１６３を含むアンチセンス鎖、及び配列番号：１８５を含むセンス鎖を含む。
【００５２】
一部の実施態様において、Ｈｉｆ２αＲＮＡｉトリガーは、配列番号：３８のヌクレオチド２−２１のヌクレオチド塩基配列を含むアンチセンス鎖を含む。一部の実施態様において、Ｈｉｆ２αＲＮＡｉトリガーは、配列番号：３８のヌクレオチド２−２１のヌクレオチド塩基配列を含むアンチセンス鎖、及び配列番号：５６のヌクレオチド１−１９のヌクレオチド塩基配列を含むセンス鎖を含む。
【００５３】
一部の実施態様において、Ｈｉｆ２αＲＮＡｉトリガーは、配列番号：８６、配列番号：１５５、配列番号：１５６のヌクレオチド塩基配列を含むアンチセンス鎖を含む。一部の実施態様において、Ｈｉｆ２αＲＮＡｉトリガーは、配列番号：１５６のヌクレオチド塩基配列を含むアンチセンス鎖、及び配列番号：１９５のヌクレオチド塩基配列を含むセンス鎖を含む。一部の実施態様において、Ｈｉｆ２αＲＮＡｉトリガーは、配列番号：８６のヌクレオチド塩基配列を含むアンチセンス鎖、及び配列番号：１９７のヌクレオチド塩基配列を含むセンス鎖を含む。一部の実施態様において、Ｈｉｆ２αＲＮＡｉトリガーは、配列番号：１５５のヌクレオチド塩基配列を含むアンチセンス鎖、及び配列番号：２０９のヌクレオチド塩基配列を含むセンス鎖を含む。
【００５４】
一部の実施態様において、Ｈｉｆ２αＲＮＡｉトリガーは、配列番号：８６、配列番号：１５５、配列番号：１５６を含むアンチセンス鎖を含む。一部の実施態様において、Ｈｉｆ２αＲＮＡｉトリガーは、配列番号：１５６を含むアンチセンス鎖、及び配列番号：１９５を含むセンス鎖を含む。一部の実施態様において、Ｈｉｆ２αＲＮＡｉトリガーは、配列番号：８６を含むアンチセンス鎖、及び配列番号：１９７を含むセンス鎖を含む。一部の実施態様において、Ｈｉｆ２αＲＮＡｉトリガーは、配列番号：１５５を含むアンチセンス鎖、及び配列番号：２０９を含むセンス鎖を含む。
【００５５】
一部の実施態様において、Ｈｉｆ２αＲＮＡｉトリガーは、標的化基、連結基、送達ポリマー、送達ビヒクル、及び／又は他の非−ヌクレオチド基を含むか、又はこれらにコンジュゲートされている。この標的化基、連結基、送達ポリマー、送達ビヒクル、及び／又は他の非−ヌクレオチド基は、センス鎖及び／又はアンチセンス鎖のいずれかの３’及び／又は５’末端へ共有的に連結され得る。一部の実施態様において、Ｈｉｆ２αＲＮＡｉトリガーは、センス鎖の３’及び／又は５’末端に連結された標的化基、連結基、送達ポリマー、送達ビヒクル、又は他の非−ヌクレオチド基を含むことができる。一部の実施態様において、標的化基、連結基、送達ポリマー、送達ビヒクル、又は他の非−ヌクレオチド基は、Ｈｉｆ２αＲＮＡｉトリガーセンス鎖の５’末端に連結される。一部の実施態様において、標的化基、連結基、送達ポリマー、送達ビヒクル、及び／又は他の非−ヌクレオチド基は、リンカー／連結基を介して、トリガーへ直接又は間接に連結される。一部の実施態様において、標的化基、連結基、送達ポリマー、送達ビヒクル、及び／又は他の非−ヌクレオチド基は、不安定な、切断可能な、又は可逆的な結合又はリンカーを介して、トリガーへ連結される。
【００５６】
標的化基は、コンジュゲートの細胞−又は組織−特異的分布及び細胞−特異的取込みを改善するために、それが付着されているＲＮＡｉトリガー又はコンジュゲートの薬物動態特性又は生態分布特性を増強することができる。一部の場合において、標的化基の細胞又は細胞受容体への結合は、エンドサイトーシスを開始することがある。標的化基は、一価、二価、三価、四価であるか、又はより高い価数であることができる。代表的標的化基は、非限定的に、細胞表面分子に親和性のある化合物、細胞受容体リガンド、ハプテン、抗体、モノクローナル抗体、抗体断片、及び細胞表面分子に親和性のある抗体模倣物を含む。
【００５７】
本明細書に記載のＲＮＡｉトリガー分子は、５’−末端にアミン基などの反応基を有するよう合成されてよい。反応基は、当該技術分野における典型的方法を用い、標的化部分を引き続き付着するために使用されてよい。
【００５８】
一部の実施態様において、Ｈｉｆ２αＲＮＡｉトリガーは、トリガーにコンジュゲートされた連結基を含む。この連結基は、トリガーの標的化基又は送達ポリマー又は送達ビヒクルへの共有的連結を促進する。連結基は、ＲＮＡｉトリガーセンス鎖又はアンチセンス鎖の３’又は５’末端に連結されることができる。一部の実施態様において、連結基は、ＲＮＡｉトリガーセンス鎖に連結される。一部の実施態様において、連結基は、ＲＮＡｉトリガーセンス鎖の５’又は３’末端へコンジュゲートされる。一部の実施態様において、連結基は、ＲＮＡｉトリガーセンス鎖の５’末端へコンジュゲートされる。連結基の例は、Ａｌｋ−ＳＭＰＴ−Ｃ６、Ａｌｋ−ＳＳ−Ｃ６、ＤＢＣＯ−ＴＥＧ、Ｍｅ−Ａｌｋ−ＳＳ−Ｃ６、及びＣ６−ＳＳ−Ａｌｋ−Ｍｅ、第一級アミン及びアルキンなどの反応基、アルキル基、脱塩基リボース、リビトール、並びに／又はＰＥＧ基を含むが、これらに限定されるものではない。
【００５９】
リンカー又は連結基は、１つの化学基（ＲＮＡｉトリガーなど）又は関心対象のセグメントを、別の化学基（標的化基又は送達ポリマーなど）又は関心対象のセグメントへ、１又は複数の共有結合を介して連結する、２つの原子の間の結合である。不安定なリンケージは、不安定な結合を含む。リンケージは任意に、２つの結合した原子の間の距離を増大するスペーサーを含んでよい。スペーサーは更に、リンケージへ可動性及び／又は長さを追加してよい。スペーサーは、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、アラルキル基、アラルケニル基、及びアラルキニル基を含むが、これらに限定されるものではなく；その各々は、１又は複数のヘテロ原子、ヘテロ環、アミノ酸、ヌクレオチド、及び糖類を含んでよい。スペーサー基は、当該技術分野において周知であり、且つ前述のリストは、説明の範囲を限定することを意味しない。
【００６０】
標的化基及び連結基は、（Ａｌｋ−Ｃ６）、（Ａｌｋ−Ｃ６−Ｃ６）、（Ａｌｋ−Ｃ６−ＳＭＰＴ−Ｃ６）、（Ａｌｋ−ＰＥＧ５−Ｃ６）、（Ａｌｋ−ＰＥＧ５−Ｃ６）（Ａｌｋ−ＰＥＧ５−Ｓｅｒ）、（Ａｌｋ−ＳＭＰＴ−Ｃ６）、（Ａｌｋ−ＳＳ−Ｃ６）、（Ｃ６−ＳＳ−Ａｌｋ−Ｍｅ）、（Ｃｈｏｌ−ＴＥＧ）、（ＤＢＣＯ−ＴＥＧ）、（Ｍｅ−Ａｌｋ−ＳＳ−Ｃ６）、（ＮＡＧ１３）、（ＮＨ２−Ｃ６）を含むが、これらに限定されるものではない。一部の実施態様において、３’又は５’標的化基又は連結基を含む、表２Ｂに列記された任意のＨｉｆ２αＲＮＡｉトリガーセンス鎖は、代わりに３’又は５’標的化基又は連結基を含まないか、或いは非限定的に表４に列記されたものを含む異なる３’又は５’標的化基又は連結基を含んでよい。
【００６１】
表４に示された標的化基及び連結基の構造の一部において、ＲＮＡｉトリガーが示され、且つＴｒｉｇｇｅｒ、ＲＮＡ、Ｒ、又はＲ１もしくはＲ２で表される（すなわち、Ｔｒｉｇｇｅｒ、ＲＮＡ又はＲ１もしくはＲ２の各々は、ＲＮＡｉトリガーを含む）。例えば、（Ａｌｋ−Ｃ６−Ｓｅｒ）、（Ａｌｋ−ＰＥＧ５−Ｓｅｒ）、及び（Ａｌｋ−ＰＥＧ１３−Ｓｅｒ）に関して、Ｒ１及びＲ２の一方は、ＲＮＡｉトリガーを含み、他方は、水素であることができる。
【００６２】
【表４Ａ−１】
2022001576.tif 000014
【表４Ａ−２】
2022001576.tif 000015
【表４Ａ−３】
2022001576.tif 000016
【表４Ａ−４】
2022001576.tif 000017
【表４Ａ−５】
2022001576.tif 000018
【表４Ａ−６】
2022001576.tif 000019
【００６３】
一部の実施態様において、送達ビヒクルは、ＲＮＡｉトリガーを細胞又は組織へ送達するために使用されてよい。送達ビヒクルは、ＲＮＡｉトリガーの細胞又は組織への送達を改善する化合物である。送達ビヒクルは、非限定的に、両親媒性ポリマー、膜活性ポリマーなどのポリマー、ペプチド、メリチンペプチド、メリチン−様ペプチド、脂質、可逆的に修飾されたポリマーもしくはペプチド、又は可逆的に修飾された膜活性ポリアミンを含むか、又はこれからなることができる。
【００６４】
一部の実施態様において、ＲＮＡｉトリガーは、脂質、ナノ粒子、ポリマー、リポソーム、ミセル、ＤＰＣｓ又は当該技術分野において入手可能な他の送達システムと組合せることができる。このＲＮＡｉトリガーはまた、標的化基、脂質（非限定的に、コレステロール及びコレステリル誘導体を含む）、ナノ粒子、ポリマー、リポソーム、ミセル、ＤＰＣ（例えば、ＷＯ２０００／０５３７２２、ＷＯ２００８／００２２３０９、ＷＯ２０１１／１０４１６９、及びＷＯ２０１２／０８３１８５、ＷＯ２０１３／０３２８２９、ＷＯ２０１３／１５８１４１を参照し、その各々は引用により本明細書中に組み込まれている）、又は当該技術分野において入手可能な他の送達システムに、化学的にコンジュゲートすることもできる。
【００６５】
一部の実施態様において、インビボにおいてＨｉｆ２αＲＮＡｉトリガーを腫瘍細胞へ送達するための医薬組成物が、記載されている。かかる医薬組成物は、非限定的に、ＲＮＡｉトリガー−送達ポリマーコンジュゲートを形成するために、送達ポリマーへコンジュゲートされたＨｉｆ２αＲＮＡｉトリガーを含むことができる。一部の実施態様において、送達ポリマーは、膜活性ポリアミンである。一部の実施態様において、送達ポリマーは、可逆的に修飾された膜活性ポリアミンである。
【００６６】
（Ｈｉｆ２αＲＮＡｉトリガー−送達ポリマーコンジュゲート）
一部の実施態様において、本発明者らは、下記式により表される組成物を説明している：
【化１】
2022001576.tif 000020
式中、ＲＮＡｉトリガーは、本明細書に記載されたＨｉｆ２αＲＮＡｉトリガーであり、Ｐは、膜活性ポリアミンであり、Ｍ1は、可逆性の生理的に不安定なリンケージＬ1を介してＰへ連結された標的化基を含み、並びにＭ2は、可逆性の生理的に不安定なリンケージＬ2を介してＰに連結された立体安定剤を含み、ｘは１よりも大きく、ｙは０よりも大きいか等しい。（Ｍ2−Ｌ2）y−Ｐ−（Ｌ1−Ｍ1）xは、膜活性ではない。本明細書で使用される（Ｍ2−Ｌ2）y−Ｐ-（Ｌ1-Ｍ1）xは、送達ポリマーをいう。（Ｌ1−Ｍ1）及び（Ｍ2−Ｌ2）の切断は、Ｐを膜活性状態に回復する。一部の実施態様において、ｘ＋ｙの値は、Ｐの第一級アミンの数の８０％を超えるか、９０％を超えるか、又は９５％を超える。一部の実施態様において、ｘ＋ｙの値は、Ｐの集団上の第一級アミンの数の８０％を超えるか、９０％を超えるか、又は９５％を超える。ｎの値は、０．２５〜５であることができる（各４ポリマー毎に１つのＲＮＡｉトリガーから、ポリマー毎に５つのＲＮＡｉトリガーまで）。一部の実施態様において、ｎの値は、０．５〜５である。一部の実施態様において、ｎは０．５〜２である。一部の実施態様において、ｎは０．８〜１．６である。一部の実施態様において、ｘは、１〜２０、２〜２０、３〜２０、４〜２０、５〜２０、６〜２０、７〜２０、８〜２０、９〜２０、１０〜２０、１１〜２０、１２〜２０、１３〜２０、１４〜２０、又は１５〜２０である。
【００６７】
一部の実施態様において、Ｍ1は、インテグリン−結合化合物を含む。一部の実施態様において、インテグリン−結合化合物は、αvβ3−結合化合物を含む。一部の実施態様において、インテグリン−結合化合物は、ＲＧＤリガンドを含む。一部の実施態様において、αvβ3−結合化合物は、ＲＧＤリガンドを含む。一部の実施態様において、ＲＧＤリガンドは、ＲＧＤ模倣物を含む。一部の実施態様において、立体安定剤は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。一部の実施態様において、Ｌ1及び／又はＬ2の切断は、Ｐ上の修飾されないアミンを回復する。一部の実施態様において、（Ｌ1−Ｍ1）及び（Ｌ2−Ｍ2）は、独立してテトラペプチド修飾剤及び／又はジペプチド修飾剤である。一部の実施態様において、Ｌ1及びＬ2は、独立してテトラペプチドリンケージ又はジペプチド−ＰＡＢＣ（ｐ−アミドベンジル−カルバメート）リンケージである。一部の実施態様において、Ｌ1及びＬ2は、テトラペプチドリンケージである。他の実施態様において、Ｌ1及びＬ2は、ジペプチド−ＰＡＢＣリンケージである。一部の実施態様において、Ｌ1は、ジペプチド−ＰＡＢＣリンケージであり、及びＬ2は、テトラペプチドリンケージである。他の実施態様において、Ｌ1は、テトラペプチドリンケージであり、及びＬ2は、ジペプチド−ＰＡＢＣリンケージである。一部の実施態様において、テトラペプチドリンケージは、ＦＣｉｔＦＰ（フェニルアラニン−シトルリン−フェニルアラニン−プロリン）テトラペプチドリンケージである。一部の実施態様において、ジペプチド−ＰＡＢＣリンケージは、ＡＣｉｔ−ＰＡＢＣリンケージである。ｘ＝２以上に関して、Ｌ1は、全てのテトラペプチドリンケージ、全てのジペプチド−ＰＡＢＣリンケージ、又はテトラペプチドリンケージとジペプチド−ＰＡＢＣリンケージの組合せであることができる。ｙ＝２以上に関して、Ｌ2は、全てのテトラペプチドリンケージ、全てのジペプチド−ＰＡＢＣリンケージ、又はテトラペプチドリンケージとジペプチド−ＰＡＢＣリンケージとの組合せである。
【００６８】
一部の実施態様において、記載されたＨｉｆ２αＲＮＡｉトリガーは、可逆的に修飾された膜活性ポリアミンにコンジュゲートされ、ＲＮＡｉトリガー−送達ポリマーコンジュゲートを形成する。一部の実施態様において、ＲＮＡｉトリガー−送達ポリマーコンジュゲートは、以下に示された式を含み：
(RNAiトリガー)n−ポリ(Aa-co-(Bb-グラフト-(Cc; Dd)))      (式2)
式中：
Ａは、疎水基−含有モノマー単位であり、
Ｂは、第一級アミン−含有モノマー単位であり、
Ｃは、可逆性の生理的に不安定なリンケージを介して、第一級アミン−含有モノマー単位に連結された（すなわちグラフトされた）インテグリン−結合リガンドを含み、
Ｄは、可逆性の生理的に不安定なリンケージを介して、第一級アミン−含有モノマー単位へ連結された（すなわちグラフトされた）立体安定剤を含み、
ａは、０を超える整数であり、
ｂは、２以上の整数であり、
ｃは、１以上の整数であり、
ｄは、１以上の整数であり、
ｃ＋ｄの値は、ｂの値の８０％を超えるか、８５％を超えるか、９０％を超えるか、又は９５％を超え、
ポリ（Ａa-co-Ｂb）は、Ａ及びＢモノマー単位を有する膜活性ポリアミンコポリマーであり、
ＲＮＡｉトリガーは、本明細書に記載されたＨｉｆ２αＲＮＡｉトリガーを含み、並びに
ｎは、０．２５（すなわち、４つの送達ポリマー毎にただ１つにコンジュゲートされた）〜５．０の値を有する。
【００６９】
ポリ（Ａa-co-（Ｂb-グラフト-（Ｃc；Ｄd）））は、膜活性ではない。一部の実施態様において、インテグリン−結合化合物は、αvβ3−結合化合物を含む。一部の実施態様において、インテグリン−結合化合物は、ＲＧＤ模倣物などの、ＲＧＤリガンドを含む。一部の実施態様において、αvβ3−結合化合物は、ＲＧＤ模倣物などの、ＲＧＤリガンドを含む。一部の実施態様において、立体安定剤は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。一部の実施態様において、ＰＥＧは、２〜２５のエチレングリコール単位を含む。一部の実施態様において、ｃは、１〜７５、１〜５０、５〜５０、５〜４０、５〜３０、５〜２５、５〜２０、５〜１５、１０〜３５、１０〜３０、１０〜２５、１０〜２０、又は１５〜２０の任意の整数である。一部の実施態様において、ｎは、０．５〜２の値を有する。一部の実施態様において、比Ａ：Ｂ（すなわちａ：ｂ）は、３０：７０〜６０：４０である。一部の実施態様において、比Ａ：Ｂは、６０：４０〜４０：６０である。一部の実施態様において、比Ａ：Ｂは、約４５±５：５５±５である。一部の実施態様において、比Ａ：Ｂは、約４４：５６である。一部の実施態様において、比Ａ：Ｂは、約４６：５４である。一部の実施態様において、ポリマーの分子量（Ｍｗ）は、３０ｋＤａ〜７０ｋＤａである。他の実施態様において、ポリマーのＭｗは、４０ｋＤａ〜６０ｋＤａである。他の実施態様において、ポリマーのＭｗは、４０ｋＤａ〜５０ｋＤａである。更に別の実施態様において、ポリマーのＭｗは、約４３ｋＤａ〜約４８ｋＤａである。一部の実施態様において、このポリマーは、多分散指数（ＰＤＩ）１．４未満、１．３未満、１．２５、１．２未満、１．１５未満又は１．１未満を有する。一部の実施態様において、ポリマーは、ＲＮＡｉトリガーの付着のための末端アジド基を含む。一部の実施態様において、ｎは、０．８〜１．６である。一部の実施態様において、ｎは、１±０．５である。一部の実施態様において、ｃは、１〜２０、２〜２０、３〜２０、４〜２０、５〜２０、６〜２０、７〜２０、８〜２０、９〜２０、１０〜２０、１１〜２０、１２〜２０、１３〜２０、１４〜２０、又は１５〜２０である。一部の実施態様において、ｃ＋ｄの値は、ｂの値の８０％を超えるか、９０％を超えるか、又は９５％を超える。一部の実施態様において、Ｃは、ＲＧＤ−ＰＥＧx−ＦｃｉｔＦＰｒｏであり、及びＤは、ＰＥＧy−ＡＣｉｔ−ＰＡＢＣであり、ここでｘは１〜５０であり、ｙは４〜３０である。一部の実施態様において、ｘはｙよりも大きい。
【００７０】
一部の実施態様において、ポリアミンポリ（Ａa-co-Ｂb）は、ポリ（アクリレート）ランダムコポリマーであり、ここでＡは、疎水基−含有アクリレートモノマーであり、及びＢは、第一級アミン−含有アクリレートモノマーである。一部の実施態様において、Ａはプロピルアクリレートモノマーであり、及びＢは、エトキシ−エチルアミンアクリレートモノマーである。
【００７１】
膜活性ポリアミンは、膜活性があり、従って形質膜又はリポソーム膜／エンドサイトーシス膜を破壊することが可能である。本明細書に使用される膜活性ポリアミンは、生体膜上で以下の作用の１又は複数を誘導することができる、表面活性のある両親媒性ポリマーである：膜非透過性分子の細胞への侵入もしくは膜の横断を可能にする膜の変化又は破壊、膜中の細孔形成、膜の分裂、又は膜の破壊もしくは溶解。本明細書に使用される膜又は細胞膜は、脂質二重層を含む。膜の変化又は破壊は、以下のアッセイの少なくとも一つにおいて、ペプチドの活性により機能的に規定され得る：赤血球溶解（溶血）、リポソーム漏出、リポソーム融合、細胞融合、細胞溶解、及びエンドソーム放出。形質膜を上回るエンドソーム又はリソソームの破壊を優先的に引き起こすペプチド又は修飾されたペプチドは、エンドソーム溶解性(endosomolytic)であると考えられる。可逆的に修飾された膜活性ポリアミンは、エンドソーム溶解性ペプチドの例である。膜活性ポリマーの細胞膜に対する作用は、一過性であってよい。膜活性ポリマーは、膜への親和性を有し、且つ二重層構造の変性又は変形を引き起こす。ＲＮＡｉトリガーの細胞への送達は、膜の細孔形成、又はエンドソームもしくはリソソームの小胞の破壊を含み、これにより小胞の内容物の細胞質への放出が可能になる、形質膜又は内部小胞膜（エンドソームもしくはリソソームなど）を破壊もしくは不安定化する膜活性ポリアミンにより媒介される。好ましいポリマーは、両親媒性ポリ（アクリレート）ランダムコポリマーである。
【００７２】
（インテグリン−結合化合物）
インテグリン−結合化合物は、細胞表面に発現された１又は複数のインテグリンに対し親和性を有する。インテグリンの非限定的例は、αvβ3インテグリンを含む。インテグリン−結合化合物の例は、αvβ3−結合化合物、ＲＧＤリガンドを含むが、これらに限定されるものではない。ＲＧＤリガンドは、ＲＧＤペプチド−含有化合物及びＲＧＤ模倣物−含有化合物を含む。本明細書に使用されるＲＧＤペプチドは、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸トリペプチドを含む。ＲＧＤペプチドは、立体的に拘束され得る。ＲＧＤペプチドは、ＲＧＤアミノ酸配列に連結された非ペプチド成分を有する。
【００７３】
本明細書に使用されるＲＧＤリガンドは、アルファｖ／ベータ３（αｖβ３又はαvβ3）インテグリンなどの、インテグリンに結合する（それへの親和性を有する）、サイズが＜１５００ｋＤａのＲＧＤペプチド又はＲＧＤ模倣物を含む。
【００７４】
本明細書に使用されるＲＧＤ模倣物は、ＲＧＤペプチドの活性決定基、インテグリン−結合タンパク質のインテグリン−結合ＲＧＤ部分、又はαvβ3インテグリン−結合ＲＧＤモチーフを生物学的に模倣するＲＤＧペプチド以外の、非−ペプチド合成分子である。ＲＧＤ模倣物は、アミド結合を介して連結された１又は２種の天然のアミノ酸を含んでよい。ＲＧＤ模倣物は、修飾されたペプチドであり、非鎖状アミノ酸又は非−鎖状アミノ酸側鎖を含んでよい。
【００７５】
一実施態様において、ＲＧＤリガンドは、アミド結合を介して、グリシン−アスパラギン酸ジペプチドへ連結されたグアニジニウム基を含む。本発明のグアニジニウム基は、下記構造を有し：
【００７６】
【化２】
2022001576.tif 000021
【００７７】
式中、Ｒ9及びＲ10は、独立して水素又はアルキルであり、且つ結合により環を形成し、並びにＲ11は、グアニジニウム基をグリシン−アスパラギン酸ジペプチドへ結合するリンカーである。グアニジニウム基は、先に記された構造及びその共鳴構造の両方を含む。好ましいリンカーは：−（ＣＲＲ’）−（ＣＲＲ’）−（ＣＲＲ’）−、又は−（ＣＲＲ’）−（ＣＲＲ’）−（ＣＲＲ’）−（ＣＲＲ’）−であり、式中：ａ）各Ｒは、独立して任意であり、且つ存在する場合、これは独立して、水素、アルキル、又はアリールであり、ｂ）Ｒ’は、独立して水素、アルキル、アリール、又はＮＨ2であり、並びにｃ）各炭素（Ｃ）は、単結合、単結合及び二重結合、又は芳香族結合により連結されてよい。
【００７８】
一部の実施態様において、ＲＧＤ模倣物は、アスパラギン酸アミノ酸に付着したフェノキシ基を含む。一部の実施態様において、ＲＧＤ模倣物は、グアニジニウム(quanidinium)−グリシン−アスパラギン酸−４−アミノフェノキシ化合物を含む。一部の実施態様において、グアニジニウム−グリシン−アスパラギン酸−４−アミノフェノキシ化合物は、下記構造を含み：
【００７９】
【化３】
2022001576.tif 000022
【００８０】
式中、Ｒ13は：
【００８１】
【化４】
2022001576.tif 000023
【００８２】
である。
【００８３】
一部の実施態様において、グアニジニウムは：
【００８４】
【化５】
2022001576.tif 000024
【００８５】
及びそれらの共鳴構造である。
【００８６】
一部の実施態様において、ＲＧＤ模倣物は、下記構造を含み；
【００８７】
【化６】
2022001576.tif 000025
【００８８】
式中、Ｒ14は：
【００８９】
【化７】
2022001576.tif 000026
【００９０】
であり、並びにＡは、リンカーを含む。このリンカーは、ＲＧＤ模倣物を、ジペプチドアミドベンジル−炭酸塩又はテトラペプチドなどの別の分子に結合し、増加した溶解度を提供するか、又は別の分子への共有的連結の手段を提供する。
【００９１】
（立体安定剤）
本明細書に使用される立体安定剤は、立体安定剤を含まないポリマーに比べ、それが付着したポリマーの分子内又は分子間の相互作用を防止又は阻害する、非イオン性親水性ポリマー（天然、合成、又は非−天然のいずれか）である。立体安定剤は、それが付着したポリマーが、静電気的相互作用に関与することを妨げる。静電気的相互作用は、正電荷と負電荷の間の引力による、２種以上の物質の非共有的会合である。立体安定剤は、血液成分との相互作用を阻害することができ、従ってオプソニン化、ファゴサイトーシス、及び細網内皮系における取込みを阻害することができる。立体安定剤は結果的に、それらが付着した分子の循環時間を増大する。立体安定剤はまた、ポリマーの凝集も阻害することができる。一部の実施態様において、立体安定剤は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はＰＥＧ誘導体である。一部の実施態様において、ＰＥＧは、約１〜５００エチレンモノマー又は単位を有することができる。一部の実施態様において、ＰＥＧは、２〜２５エチレン単位を含む。一部の実施態様において、ＰＥＧは、４〜３０エチレン単位を含む。一部の実施態様において、ＰＥＧは、５〜２４エチレン単位を含む。一部の実施態様において、ＰＥＧは、平均分子量約８５〜２０，０００ダルトン（Ｄａ）を有する。一部の実施態様において、ＰＥＧは、分子量約８５〜１０００Ｄａを有する。本明細書に使用される立体安定剤は、水溶液中に立体安定剤を含まないポリマーに比べ、それが付着したポリマーの分子内又は分子間の相互作用を防止又は阻害する。
【００９２】
（可逆性の生理的に不安定なリンケージ／修飾剤）
膜活性ポリアミンは、可逆的に修飾されてよい。可逆的修飾は、膜活性ポリアミンの第一級アミンへの修飾剤の可逆性の付着により達成され得る。
【００９３】
一部の実施態様において、可逆性の生理的に不安定なリンケージは、テトラペプチドリンケージを含む。一部の実施態様において、Ｐ-（Ｌ1-Ｍ1）x及び／又はＰ-（Ｌ2-Ｍ2）y（式１）は：
R5−A4−A3−A2−A1−R6
を含み、ここで
Ｒ5は、標的化基（Ｍ1）又は立体安定剤（Ｍ2）を含み、
Ａ4は、天然、非天然の異性体、又は合成の疎水性Ｌアミノ酸であり、ここでアミノ酸側鎖（Ｒ−基）の組成に関連する、グリシンに対して規準化された、ｐＨ７での疎水指数(Moneraら、J. Protein Sci. 1995, 1, 319)は、４１以上であり、
Ａ3は、非荷電親水性Ｌアミノ酸であり、ここでアミノ酸側鎖（Ｒ−基）の組成に関連する、グリシンに対して規準化された、ｐＨ７での疎水指数(Moneraら、J. Protein Sci. 1995, 1, 319)は、−２８以下であり、
Ａ2は、天然、非天然の異性体、又は合成の疎水性Ｌアミノ酸であり、ここでアミノ酸側鎖（Ｒ−基）の組成に関連する、グリシンに対して規準化された、ｐＨ７での疎水指数(Moneraら、J. Protein Sci. 1995, 1, 319)は４１以上であり、
Ａ1は、Ｌ−プロリン、Ｌ−ロイシン、又はＬ−Ｎ−メチルアラニンであり、並びに
Ｒ6は、Ｐであり、ここでＰは式１の膜活性ポリアミンである。
【００９４】
一部の実施態様において、Ａ1はプロリンであり、Ａ2及びＡ4は独立して、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン又はフェニルアラニンであり（各々、側鎖は−ＣＨ3、−ＣＨ（ＣＨ3）2、−ＣＨ2ＣＨ（ＣＨ3）2、−ＣＨ（ＣＨ3）ＣＨ2ＣＨ3、又は−ＣＨ2Ｃ6Ｈ6）、並びにＡ3は、シトルリン又はアスパラギン（各々、側鎖は、−（ＣＨ2）3ＮＨＣＯＮＨ2又は−ＣＨ2ＣＯＮＨ2）である。
【００９５】
一部の実施態様において、Ａ1はプロリンであり、Ａ2及びＡ4は、フェニルアラニンであり、並びにＡ3はシトルリンである（ＦＣｉｔＦＰｒｏ）。一部の実施態様において、Ａ1はプロリンであり、Ａ2はフェニルアラニンであり、並びにＡ3はシトルリンであり、並びにＡ4はアラニンである（ＡＣｉｔＦＰｒｏ）。
【００９６】
一部の実施態様において、テトラペプチド修飾剤は、下記に表される構造を有し：
【００９７】
【化８】
2022001576.tif 000027
【００９８】
式中：
Ｒ5は、標的化基（Ｍ1）又は立体安定剤（Ｍ2）を含み、
Ｒ4は、天然、非天然の異性体、又は合成の疎水性アミノ酸の側鎖であり、
Ｒ3は、非荷電親水性アミノ酸、好ましくはシトルリンの側鎖であり、
Ｒ2は、天然、非天然の異性体、又は合成の疎水性アミノ酸、好ましくはフェニルアラニンの側鎖であり、
Ｘ及びＹは
ａ）各々、（ＣＨ2）2（ＣＨ3）2及びＨであるか（テトラペプチドＡ1はロイシンである）、
ｂ）各々、ＣＨ3−及びＣＨ3−であるか（テトラペプチドＡ1はＮ−メチルアラニンである）、又は
ｃ）各々、ＣＨ2−及びＣＨ2−ＣＨ2−であり（テトラペプチドＡ1はプロリンであり）；並びに、
Ｒ’は、
【００９９】
【化９】
2022001576.tif 000028
【０１００】
である。
【０１０１】
テトラペプチド修飾剤のポリアミンとの反応は、Ｐ-（Ｌ-Ｍ）を生じる。
【０１０２】
一部の実施態様において、Ｒ4は、フェニルアラニン又はアラニンの側鎖である。一部の実施態様において、Ｒ3は、シトルリンの側鎖である。一部の実施態様において、Ｒ2は、フェニルアラニンの側鎖である。
【０１０３】
一部の実施態様において、膜活性ポリアミンは、一般形：
Ｒ−Ａ1Ａ2−アミドベンジル−炭酸塩
を有するジペプチド修飾剤（ジペプチド−ＰＡＢＣ−ＰＮＰ修飾剤）により、修飾されており、ここで、Ｒは、立体安定剤又は標的化基を含み、Ａ1は、疎水性アミノ酸であり、及びＡ2は、親水性非荷電アミノ酸である。修飾剤炭酸塩のポリマーアミンとの反応は、カルバメートリンケージを生じる。一部の実施態様において、アミドベンジル基は、ｐ−アミドベンジル基である。一部の実施態様において、炭酸塩は、活性化されたアミン反応性炭酸塩である。一部の実施態様において、ジペプチド−ＰＡＢＣ切断可能なリンカーは、以下に表された一般構造を有し：
【０１０４】
【化１０】
2022001576.tif 000029
【０１０５】
ここでＲ４は、標的化基又は立体安定剤を含み、Ｒ３は、パラ−ニトロフェニル基などの、アミン反応性炭酸塩部分を含み、Ｒ１は、フェニルアラニン又はアラニンなどの、疎水性アミノ酸の側鎖であり、並びにＲ２は、シトルリン（Ｃｉｔ）などの、親水性非荷電アミノ酸の側鎖である。一部の実施態様において、Ｒ１は、フェニルアラニン又はアラニンの側鎖である。一部の実施態様において、Ｒ２は、シトルリン（Ｃｉｔ）の側鎖である。
【０１０６】
一部の実施態様において、ＲＧＤ修飾剤は、以下に表された構造を含み：
【０１０７】
【化１１】
2022001576.tif 000030
【０１０８】
ここで、Ｒ14は、先に定義したグアニジニウム−含有基であり、Ａ’は、ＰＥＧ−含有リンカーを含み、Ｒ1は、フェニルアラニン又はアラニンの側鎖であり、Ｒ2は、シトルリンの側鎖であり、並びにＲ3は、アミン−反応性炭酸塩である。
【０１０９】
送達ポリマーは、ポリマー上の第一級アミンの二置換されたアルキルマレイン酸無水物との反応により、可逆的に修飾されたポリアミンを含むことができ：
【０１１０】
【化１２】
2022001576.tif 000031
【０１１１】
ここで、Ｒ１は、標的化基又は立体安定剤を含む。
【０１１２】
一部の実施態様において、二置換されたアルキルマレイン酸無水物は、以下に表された構造を有し：
【０１１３】
【化１３】
2022001576.tif 000032
【０１１４】
ここで、Ｒ１は、標的化基又は立体安定剤を含む。
【０１１５】
一部の実施態様において、標的化基（例えば、ＲＧＤリガンド）は、ＰＥＧリンカーなどのリンカーを介して、修飾剤に連結される。ＰＥＧリンカーは、１〜５０エチレン単位を有することができる。
【０１１６】
ＲＧＤ及びＰＥＧ修飾剤は、図１−７に示している。
【０１１７】
一部の実施態様において、本発明者らは、下記式により表された組成物を説明し：
【化１４】
2022001576.tif 000033
ここで：ＲＮＡｉトリガーは、Ｈｉｆ２αＲＮＡｉトリガーであり、ｎは、０．５〜５であり、Ｐは、膜活性ポリアミンであり、Ｌ1−Ｍ1は、ＲＧＤ−ＰＥＧa−ＦＣｉｔＦＰｒｏ−を含み、ａは１〜５０であり、ｘは１〜２０であり、Ｌ2−Ｍ2は、ＰＥＧb−ＡＣｉｔ−ＰＡＢＣ−を含み、ｂは４〜３０であり、並びにｙは０以上であり、並びに（Ｍ2−Ｌ2）y−Ｐ−（Ｌ1−Ｍ1）xは、膜活性ではない。一部の実施態様において、ｘ＋ｙの値は、Ｐの第一級アミンの数の８０％を超えるか、９０％を超えるか、又は９５％を超える。一部の実施態様において、ｎは０．５〜２である。一部の実施態様において、ｎは０．８〜１．６である。一部の実施態様において、ｘは、２〜２０、３〜２０、４〜２０、５〜２０、６〜２０、７〜２０、８〜２０、９〜２０、１０〜２０、１１〜２０、１２〜２０、１３〜２０、１４〜２０、又は１５〜２０である。一部の実施態様において、ａの値は、ｂの値よりも大きい。
【０１１８】
（医薬組成物）
一部の実施態様において、少なくとも一種の記載されたＨｉｆ２αＲＮＡｉトリガーが、Ｈｉｆ２α発現の減少又は阻害から恩恵を受けるであろう対象の治療のための医薬組成物（すなわち医薬品）の調製において使用される。これらの医薬組成物は、細胞、組織、又は臓器におけるＨｉｆ２α遺伝子の発現の阻害において有用である。一部の実施態様において、記載された医薬組成物は、Ｈｉｆ２α発現の減少又は阻害から恩恵を受けるであろう疾患又は障害を有する対象を治療するために使用される。
【０１１９】
本明細書に使用される医薬組成物又は医薬品は、少なくとも１種の記載されたＨｉｆ２αＲＮＡｉトリガー又はＨｉｆ２αＲＮＡｉトリガー−含有コンジュゲートの薬理的有効量、及び１又は複数の薬学的に許容される賦形剤を含有する。薬学的に許容される賦形剤（賦形剤）は、安全性について適切に評価され且つ薬物送達システムに意図的に含まれた医薬活性成分（ＡＰＩ、治療的製品、例えばＲＮＡｉトリガー）以外の物質である。賦形剤は、意図された用量では、治療効果を発揮しないか、又は発揮することが意図されていない。賦形剤は、ａ）製造時の薬剤送達システムの加工を補助するため、ｂ）ＡＰＩの安定性、生物学的利用能又は患者の容認性を保護、支援又は増強するため、ｃ）製品の同定を補助するため、及び／もしくは、ｄ）貯蔵又は使用時にＡＰＩの送達の全般的安定性、有効性の他の属性を増強するために、作用することができる。薬学的に許容される賦形剤は、不活性物質であってもなくてもよい。
【０１２０】
賦形剤は、吸収増強剤、付着防止剤、消泡剤、抗酸化剤、結合剤、結合剤、緩衝剤、担体、コーティング剤、着色剤、送達増強剤、デキストラン、デキストロース、希釈剤、崩壊剤、乳化剤、増量剤、充填剤、香味料、流動促進剤、保湿剤、滑沢剤、油分、ポリマー、保存剤、食塩水、塩類、溶媒、糖類、懸濁化剤、持続放出マトリクス、甘味料、増粘剤、等張化剤、ビヒクル、撥水剤、及び湿潤剤を含むが、これらに限定されるものではない。
【０１２１】
医薬組成物は、医薬組成物において通常認められる他の追加の成分を含むことができる。かかる追加成分は、抗掻痒剤、収斂剤、局所麻酔薬、又は抗炎症薬（例えば、抗ヒスタミン薬、ジフェンヒドラミンなど）を含むが、これらに限定されるものではない。また本明細書に規定されたＲＮＡｉトリガーを発現するか又は含む細胞、組織又は単離された臓器も、「医薬組成物」として使用されて良いことも、意図される。本明細書に使用される「医薬有効量」、「治療的有効量」又は単純に「有効量」は、意図された薬理学的、治療的又は予防的結果を生じるＲＮＡｉトリガーの量をいう。
【０１２２】
一部の実施態様において、記載されたＨｉｆ２αＲＮＡｉトリガーは、１又は複数の追加の治療薬又は治療と組合せられ、これは第二のＨｉｆ２αＲＮＡｉトリガー又は他のＲＮＡｉ剤、小分子薬剤、抗体、抗体断片、及び／又はワクチンを含むが、これらに限定されるものではない。
【０１２３】
記載されたＲＮＡｉトリガー及び本明細書に開示されたＨｉｆ２αＲＮＡｉトリガーを含有する医薬組成物は、キット、容器、パック、又はディスペンサー中に包装されるか又は含まれてよい。Ｈｉｆ２αＲＮＡｉトリガー及び該Ｈｉｆ２αＲＮＡｉトリガーを含有する医薬組成物は、予め充填された注射器又はバイアル内に包装されてよい。
【０１２４】
本明細書に記載されたＨｉｆ２αＲＮＡｉトリガーの少なくとも１種を含む細胞、組織、及び非ヒト生物が、意図されている。この細胞、組織、又は非ヒト生物は、当該技術分野において入手可能な任意の手段により、ＲＮＡｉトリガーを、細胞、組織、又は非ヒト生物へ送達することにより作製することができる。一部の実施態様において、細胞は、ヒト細胞を含むが、これに限定されるものではない哺乳動物の細胞である。細胞、組織、又は非ヒト生物は、研究に有用であり、又は研究道具（例えば、薬剤試験又は診断）として有用である。
【０１２５】
（治療方法）
一部の実施態様において、本明細書に記載されたＨｉｆ２αＲＮＡｉトリガーを使用し、Ｈｉｆ２α発現の減少又は阻害から恩恵を受けるであろう疾患又は障害を有する対象を治療する。一部の実施態様において、記載されたＨｉｆ２αＲＮＡｉトリガーを使用し、Ｈｉｆ２α発現の減少又は阻害から恩恵を受けるであろう疾患又は障害を有する対象において少なくとも１つの症状を治療又は予防する。対象には、治療的有効量の記載されたＲＮＡｉトリガーのいずれか１又は複数が投与され、これによりその症状を治療する。
【０１２６】
一部の実施態様において、Ｈｉｆ２αＲＮＡｉトリガーを使用し、臨床提示を治療又は管理し、ここではそのような治療、予防又は管理が必要な対象に、１又は複数のＨｉｆ２αＲＮＡｉトリガー又は本明細書に記載されたＨｉｆ２αＲＮＡｉトリガー−含有組成物の治療的又は予防的有効量が投与される。一部の実施態様において、この方法は、治療されるべき哺乳動物へ、本明細書に記載されたＨｉｆ２αＲＮＡｉトリガー分子を含有する組成物を投与することを含む。
【０１２７】
Ｈｉｆ２α遺伝子発現の減少及び／又は阻害から恩恵を受けるであろう代表的疾患は、癌、腎臓癌、明細胞型腎細胞癌、非−小細胞肺癌、星状細胞腫（脳腫瘍）、膀胱癌、乳癌、軟骨肉腫、結腸直腸癌、胃癌、膠芽細胞腫、頭頸部扁平上皮癌、肝細胞癌、肺腺癌、神経芽細胞腫、メラノーマ、多発性骨髄腫、卵巣癌、直腸癌、転移、歯肉炎、乾癬、カポジ肉腫−関連ヘルペスウイルス、子癇前症、炎症、慢性炎症、新生血管疾患、及び関節リウマチを含むが、これらに限定されるものではない。
【０１２８】
一部の実施態様において、Ｈｉｆ２αＲＮＡｉトリガーを使用し、細胞、細胞群、又は組織における、例えば対象における、Ｈｉｆ２αの発現を阻害することができる。一部の実施態様において、Ｈｉｆ２αＲＮＡｉトリガーを使用し、細胞、細胞群、又は組織における、例えば対象における、Ｈｉｆ２αの発現を阻害するための組成物を製剤化することができる。一部の実施態様において、本明細書に記載されたように、ひとつの型（又はいくつかの異なる型）のＨｉｆ２αＲＮＡｉトリガーの治療的有効量（例えば、対象においてＨｉｆ２αの発現を阻害するのに有効な量）を、対象へ投与し、これにより対象におけるＨｉｆ２αの発現を阻害する。
【０１２９】
Ｈｉｆ２α遺伝子に言及する場合、本明細書に使用される用語「サイレンス化」、「低下」、「阻害」、「ダウンレギュレート」又は「遺伝子発現のノックダウン」は、遺伝子から転写されたＲＮＡのレベルによるか、又はそこでＨｉｆ２α遺伝子が転写されている細胞、細胞群もしくは組織中のｍＲＮＡから翻訳されたポリペプチド、タンパク質、もしくはタンパク質サブユニットのレベルかにより測定された遺伝子の発現が、この細胞、細胞群、又は組織が、記載されたＨｉｆ２αＲＮＡｉトリガーにより処理された場合に、そのように処理されたかされていない第二の細胞、細胞群、もしくは組織と比べるか、又はＨｉｆ２αＲＮＡｉトリガーの投与前の、同じ細胞、細胞群、もしくは組織と比べ、低下することを意味する。
【０１３０】
一部の実施態様において、記載されたＨｉｆ２αＲＮＡｉトリガーが投与される対象におけるＨｉｆ２αの遺伝子発現レベル及び／又はｍＲＮＡレベルは、Ｈｉｆ２αＲＮＡｉトリガーが投与される前の対象又はＨｉｆ２αＲＮＡｉトリガーを受けていない対象に対して、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９８％低下する。この対象における遺伝子発現レベル及び／又はｍＲＮＡレベルは、対象の細胞、細胞群、及び／又は組織において低下され得る。一部の実施態様において、記載されたＨｉｆ２αＲＮＡｉトリガーが投与された対象におけるＨｉｆ２αのタンパク質レベルは、Ｈｉｆ２αＲＮＡｉトリガーが投与される前の対象又はＨｉｆ２αＲＮＡｉトリガーを受けていない対象に対して、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９８％低下する。この対象におけるタンパク質レベルは、対象の細胞、細胞群、組織、血液及び／又は体液において低下し得る。遺伝子発現、ｍＲＮＡ、又はタンパク質のレベルの低下は、当該技術分野において公知の任意の方法により評価することができる。Ｈｉｆ２αｍＲＮＡレベル及び／又はタンパク質レベルの低下又は減少は、Ｈｉｆ２αの低下もしくは減少、又はＨｉｆ２αの発現の阻害又は低下として、本明細書において集合的に言及される。
【０１３１】
ＲＮＡｉトリガーに言及する場合、「細胞への導入」は、ＲＮＡｉトリガーを細胞へ機能的に送達することを意味する。機能的送達により、ＲＮＡｉトリガーは、細胞へ送達され、且つ予想される生物活性（例えば、遺伝子発現の配列−特異的阻害）を有することを意味する。
【０１３２】
投与経路は、ＲＮＡｉトリガーが、身体と接触させられる経路である。概して、対象の治療のために薬物及び核酸を投与する方法は、当該技術分野において周知であり、且つ本明細書に記載された組成物の投与に適用することができる。本明細書に記載された化合物は、特定の経路にあうように作製された調製品において任意の好適な経路により投与することができる。従って、本明細書に記載された化合物は、例えば、静脈内、筋肉内、皮内、皮下、又は腹腔内での、注射により投与することができる。
【０１３３】
一部の実施態様において、本明細書に記載されたＨｉｆ２αＲＮＡｉトリガー分子又は組成物は、当該技術分野において公知のオリゴヌクレオチド送達技術を使用し、細胞、細胞群、組織、又は対象へ送達することができる。概して、核酸分子の送達（インビトロ又はインビボにおいて）に関して当該技術分野において認められる任意の好適な方法は、本明細書に記載されたＨｉｆ２αＲＮＡｉトリガーでの使用に適合させることができる。例えば、送達は、局所投与（例えば、直接注射、インプラント化、又は局所投与）、全身投与、又は皮下、静脈内、経口、腹腔内、もしくは頭蓋内（例えば、脳室内、脳実質内及び髄腔内）、筋肉内、経真皮、気道（エアロゾル）、経鼻、経直腸を含む非経口経路、又は局所（口腔内及び舌下）投与によることができる。いくつかの実施態様において、本組成物は、皮下又は静脈内への注入又は注射により投与される。
【０１３４】
先に提供された実施態様及び項目(item)は、以下の非限定的例によりここで例証される。
【実施例】
【０１３５】
（実施例）
（実施例１．  ＲＮＡｉトリガーの合成）
Ａ）合成  ＲＮＡｉトリガー分子は、オリゴヌクレオチド合成において使用される固相ホスホロアミダイト法に従い合成した。規模に応じて、ＭｅｒＭａｄｅ９６Ｅ（Ｂｉｏａｕｔｏｍａｔｉｏｎ社）又はＭｅｒＭａｄｅ１２（Ｂｉｏａｕｔｏｍａｔｉｏｎ社）のいずれかを使用した。合成は、制御された細孔のあるガラス（ＣＰＧ、５００Å又は６００Å、Ｐｒｉｍｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ社、アストン、ＰＡ、米国から入手）で製造された、固体支持体上で行った。全てのＤＮＡ、２’−修飾されたＲＮＡ、及びＵＮＡホスホロアミダイトは、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社（ミルウォーキー、ＷＩ、米国）から購入した。具体的には、以下の２’−Ｏ−メチルホスホロアミダイトを使用した：（５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ6−（ベンゾイル）−２’−Ｏ−メチル−アデノシン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）ホスホロアミダイト、５’−Ｏ−ジメトキシ−トリチル−Ｎ4−（アセチル）−２’−Ｏ−メチル−シチジン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−アミノ）ホスホロアミダイト、（５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ2−（イソブチリル）−２’−Ｏ−メチル−グアノシン−３’−Ｏ−（２−シアノ−エチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）ホスホロアミダイト、及び５’−Ｏ−ジメトキシ−トリチル−２’−Ｏ−メチル−ウリジン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）ホスホロアミダイト。２’−デオキシ−２’−フルオロ−ホスホロアミダイトは、２’−Ｏ−メチルＲＮＡアミダイトと同じ保護基を保有する。以下のＵＮＡホスホロアミダイトを使用した：５’−（４，４’−ジメトキシトリチル）−Ｎ−ベンゾイル−２’，３’−セコ−アデノシン、２’−ベンゾイル−３’−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホロ−アミダイト、５’−（４，４’−ジメトキシトリチル）−Ｎ−アセチル−２’，３’−セコ−シトシン、２’−ベンゾイル−３’−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホロアミダイト、５’−（４，４’−ジメトキシトリチル）−Ｎ−イソブチリル−２’，３’−セコ−グアノシン、２’−ベンゾイル−３’−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホロアミダイト、及び５’−（４，４’−ジメトキシ−トリチル）−２’，３’−セコ−ウリジン、２’−ベンゾイル−３’−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホロアミダイト。全てのアミダイトは、無水アセトニトリル（５０ｍＭ）中に溶解し、且つ分子篩（３Å）を加えた。これらのオリゴマーの５’−末端にＴＥＧ−コレステロールを導入するために、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社（スターリング、ＶＡ、米国）の１−ジメトキシトリチルオキシ−３−Ｏ−（Ｎ−コレステリル−３−アミノプロピル）−トリエチレングリコール−グリセリル−２−Ｏ−（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ，−ジイソプロピル）−ホスホロアミダイトを用いた。この５’−修飾は、合成サイクルを何ら変更せずに、導入した。５−ベンジルチオ−１Ｈ−テトラゾール（ＢＴＴ、アセトニトリル中２５０ｍＭ）を、アクチベータ��溶液として使用した。カップリング時間は、１０分（ＲＮＡ）、１８０秒（コレステロール）、９０秒（２’ＯＭｅ及びＵＮＡ）、並びに６０秒（２’Ｆ及びＤＮＡ）であった。ホスホロチオエートリンケージを導入するために、無水アセトニトリル中の３−フェニル  １，２，４−ジチアゾリン−５−オン（ＰＯＳ、ＰｏｌｙＯｒｇ社、レオミンスター、ＭＡ、米国から入手）の１００ｍＭ溶液を利用した。具体的配列については、表１−２及び５を参照されたい。
【０１３６】
Ｂ）支持体結合したオリゴマーの切断及び脱保護  固相合成の終了後、乾燥した固体支持体を、水中４０ｗｔ％メチルアミンと２８％水酸化アンモニウム溶液（Ａｌｄｒｉｃｈ社）の１：１容積の溶液で、３０℃で２時間処理した。この溶液を蒸発させ、固形残渣を水で再構成した（下記参照）。
【０１３７】
Ｃ）精製  粗コレステロール含有オリゴマーを、Ｗａｔｅｒｓ  ＸＢｒｉｄｇｅ  ＢＥＨ３００  Ｃ４  ５ｕ分取カラム及びＳｈｉｍａｄｚｕ  ＬＣ−８システムを用いる逆相ＨＰＬＣにより精製した。緩衝液Ａは、１００ｍＭ  ＴＥＡＡ（ｐＨ７．５）であり、５％アセトニトリルを含み、及び緩衝液Ｂは、１００ｍＭ  ＴＥＡＡであり、９５％アセトニトリルを含んだ。２６０ｎｍでのＵＶトレースを記録した。次に好適な画分を、ランニング緩衝液１００ｍＭ重炭酸アンモニウム（ｐＨ６．７）及び２０％アセトニトリルによる、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５媒体を充填したＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＸＫ  １６／４０カラムを使用する、サイズ排除ＨＰＬＣ上を流した。他の粗オリゴマーは、ＴＫＳｇｅｌ  ＳｕｐｅｒＱ−５ＰＷ  １３ｕカラム及びＳｈｉｍａｄｚｕ  ＬＣ−８システムを使用する、陰イオン交換ＨＰＬＣにより精製した。緩衝液Ａは、２０ｍＭトリス、５ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ９．０）であり、２０％アセトニトリルを含み、及び緩衝液Ｂは、１．５Ｍ塩化ナトリウムを添加した同じ緩衝液Ａであった。２６０ｎｍでのＵＶトレースを記録した。好適な画分をプールし、次にコレステロール含有オリゴマーについて記載したように、サイズ排除ＨＰＬＣを行った。
【０１３８】
Ｄ）アニーリング  相補鎖を、０．２×ＰＢＳ（リン酸−緩衝食塩水、１×、Ｃｏｒｎｉｎｇ社、セルグロ）中で（センス及びアンチセンス）等モル溶液を一緒にすることにより混合し、ＲＮＡｉトリガーを形成した。この溶液を、７０℃のサーモミキサー中に配置し、９５℃に加熱し、９５℃で５分間維持し、室温までゆっくり冷却した。一部のＲＮＡｉトリガーは、凍結乾燥し、−１５〜−２５℃で貯蔵した。二本鎖の濃度を、０．２×ＰＢＳ中のＵＶ−可視光度計で溶液の吸光度を測定することにより、決定した。次に２６０ｎｍでの溶液吸光度を、変換係数及び希釈係数により積算し、二本鎖濃度を決定した。特に指定しない限りは、全ての変換係数は、０．０３７ｍｇ／（ｍＬ・ｃｍ）であった。一部の実験に関して、変換係数は、実験により決定された吸光係数から算出した。
【０１３９】
【表４Ｂ】
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【０１４０】
Ａ）材料  ２，２’−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）（Ｖ−６５、ラジカル開始剤）は、Ｗａｋｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社から購入した。アクリル酸プロピルは、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ社から購入した。Ｎ−Ｂｏｃ−エトキシ−エチルアミンアクリレートは、ＷｕＸｉ社から入手した。２−（ドデシルチオ−カルボノチオイルチオ）−２−メチルプロピオン酸（ＤＤＭＡＴ、ＲＡＦＴ剤）、１，１’−アゾビス−（シクロ−ヘキサンカルボニトリル）（ＡＣＨＮ）、次亜リン酸１−エチルピペリジン（ＥＰＨＰ）、ペンタフルオロフェノール、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド及びＮ，Ｎ−ジイソプロピル−エチルアミンは、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社から購入した。Ｏ−（２−アミノエチル）−Ｏ’−（２−アジドエチル）トリエチレングリコール（アジド−ＰＥＧ4−アミン）は、Ｂｉｏｍａｔｒｉｋ社から購入した。
【０１４１】
Ｂ）Ｎ−Ｂｏｃ−エトキシエチルアミンアクリレート及びアクリル酸プロピル（ＥＡＰ）のＲＡＦＴコポリマー  酢酸ブチル中のＶ−６５（２ｍｇ／ｍＬ）及びＲＡＦＴ剤ＤＤＭＡＴ（１０ｍｇ／ｍＬ）の溶液を、調製した。モノマーモル供給量は、５２％Ｎ−Ｂｏｃ−エトキシエチルアミンアクリレート、４８％アクリル酸プロピルであった。理論的Ｍｗは、７５，０００であった。ＲＡＦＴ剤（ＤＤＭＡＴ）の開始剤（Ｖ−６５）に対するモル比は、６．６７：１であった。
【０１４２】
Ｎ−Ｂｏｃ−エトキシエチルアミンアクリレート（１．７７８ｇ、６．８６ｍｍｏｌ）、アクリル酸プロピル（０．７９４ｍＬ、０．７２２ｇ、６．３３ｍｍｏｌ）、ＤＤＭＡＴ溶液（１．２１５ｍＬ、０．０３３３ｍｍｏｌ）、Ｖ−６５溶液（０．６２１ｍＬ、０．００５ｍｍｏｌ）、及び酢酸ブチル（１０．２ｍＬ）を、攪拌子を備えた２０ｍＬガラスバイアルに添加した。このバイアルを、隔栓で密封し、溶液を、出口として第二針を備えた長い針を用い、窒素で１時間泡立てた。これらの針を取り外し、バイアルを、５０℃で２４時間、撹拌しながら、加熱した。溶液を、室温まで冷却し、２個の５０ｍＬ遠心チューブに均等に移し、その後ヘキサン（３５ｍＬ）を、両方のチューブへ加えた。この溶液を、４４００ｒｐｍで２分間遠心した。上清層を慎重にデカントし、底側層をヘキサンですすいだ。各チューブの底側層を次に、ジクロロメタン（７ｍＬ）中に再溶解し、ヘキサン（４０ｍＬ）中で沈殿させ、もう１回遠心した。上清をデカントし、底側層をヘキサンですすぎ、その後これらの層を、１個の５０ｍＬ遠心チューブ中で一緒にし、ポリマーを、減圧下で数時間乾燥した。粗ＥＡＰコポリマーの収量は、２．１ｇであった。このコポリマー試料を、多角度光散乱検出器（ＭＡＬＳ）、及び1Ｈ−ＮＭＲのために採取した。
【０１４３】
ポリマー００６：1Ｈ−ＮＭＲにより決定された組成は、５５％Ｎ−Ｂｏｃ−エトキシエチルアミンアクリレート及び４５％アクリル酸プロピルであった。ＭＡＬＳにより決定された００６のＭｗは、５８，６００ｇ／ｍｏｌで、多分散度（ＰＤＩ）１．０４であった。
ポリマー１００Ａ：1Ｈ−ＮＭＲによる組成：５６％Ｎ−Ｂｏｃ−エトキシエチルアミンアクリレート及び４４％アクリル酸プロピル。ＭＡＬＳによるＭＷ：６５，１５０、ＰＤＩ  １．１２２。
ポリマー０６４：1Ｈ−ＮＭＲによる組成：５４％Ｎ−Ｂｏｃ−エトキシエチルアミンアクリレート及び４６％アクリル酸プロピル。ＭＡＬＳにより決定された０６４のＭＷ：５７，９５７ｇ／ｍｏｌ、多分散度（ＰＤＩ）１．０７。
【０１４４】
Ｃ）ラジカル誘導したω−末端基除去（ポリマー００６及び０６４）  １，１’−アゾビス−（シクロヘキサンカルボニトリル）（ＡＣＨＮ、２０ｍｇ／ｍＬ）及び次亜リン酸１−エチルピペリジン（ＥＰＨＰ、１００ｍｇ／ｍＬ）の溶液を、トルエン中に調製した。ＥＡＰ（２ｇ、０．０３５ｍｍｏｌ）、ＡＣＨＮ（０．２１３ｍＬ、０．５当量、０．０１７４ｍｍｏｌ）、ＥＰＨＰ（１．２５ｍＬ、２０当量、０．６９７ｍｍｏｌ）、及びトルエン（２５．２ｍＬ）を、攪拌子を備えた４０ｍＬガラスバイアルに添加した。このバイアルを、隔栓で密封し、溶液を、出口として第二針を備えた長い針を用い、窒素で１時間泡立てた。これらの針を取り外し、バイアルを、１００℃で２時間、加熱した。溶液を、室温まで冷却し、〜２０ｍＬトルエンを回転蒸発器により除去した。残存する溶液を、５０ｍＬ遠心バイアルに移し、ヘキサン（３５ｍＬ）を加えた。溶液を、４４００ｒｐｍで２分間遠心した。上清層を慎重にデカントし、底側層をヘキサンですすいだ。底側層を次に、ジクロロメタン（７ｍＬ）中に再溶解し、ヘキサン（４０ｍＬ）中で沈殿させ、もう１回遠心した。上清をデカントし、底側層をヘキサンですすぎ、その後ポリマーを、減圧下で〜１時間乾燥した。ポリマーを、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（８０ｍＬ）中に溶解し、分液漏斗へ移した。次に溶液を、３×３０ｍＬ容積のＨ2Ｏで、引き続き３×３０ｍＬ容積の飽和ＮａＣｌで洗浄した。次にポリマー溶液を、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、０．４５μｍ  ＧＨＰフィルターを通して真空濾過した。ＭＴＢＥを、回転蒸発及び高圧により除去した。試料を、ＵＶ分光光度計を使用する、末端基除去のモニタリングのために採取した。末端基除去は、９９％であると計算した。試料を、ＭＡＬＳ、ＧＣ−ＦＩＤ、及び1Ｈ−ＮＭＲのために採取した。1Ｈ−ＮＭＲによる００６の組成は、５５％Ｎ−Ｂｏｃ−エトキシエチルアミンアクリレート及び４５％アクリル酸プロピルであった。ＧＣ−ＦＩＤにより決定された００６の変換は、Ｎ−Ｂｏｃ−エトキシエチルアミンアクリレートについて８１．４％、及びアクリル酸プロピルについて７７．３％であった。ＧＣ−ＦＩＤ変換により決定された１００Ａの変換は、Ｎ−Ｂｏｃ−エトキシエチルアミンアクリレートについて８７％、及びアクリル酸プロピルについて８３％であった。ＭＡＬＳにより決定されたポリマー００６のＭｗは、５７，７００ｇ／ｍｏｌで、多分散度（ＰＤＩ）１．０６であった。
【０１４５】
Ｄ）α−末端基のペンタフルオロフェノール活性化  ＥＡＰポリマー（２ｇ、０．０３４７ｍｍｏｌ）、ペンタフルオロフェノール（６３．８ｍｇ、０．３４６６ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（７１．５ｍｇ、０．３４６６ｍｍｏｌ）、及びジクロロメタン（４０ｍＬ）を、攪拌子を備えた１００ｍＬ丸底フラスコに添加した。フラスコを、ゴム栓で塞ぎ、このシステムを、窒素で１５分間パージした。この溶液を、室温で１６時間撹拌した。追加のペンタフルオロフェノール（６３．８ｍｇ、０．３４６６ｍｍｏｌ）及びＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（７１．５ｍｇ、０．３４６６ｍｍｏｌ）を添加し、フラスコをゴム栓で塞ぎ、このシステムを、窒素で１５分間パージした。溶液を、室温で３時間撹拌した。ポリマーを、ヘキサン（〜１０×容積）で沈殿させ、遠心し、溶媒をデカントした。ポリマーを、最小量のジクロロメタンに溶解し、ヘキサン（〜１０×容積）で沈殿させ、遠心し、溶媒をデカントした。ポリマーを、最小量の酢酸エチルに溶解し、ヘキサン（〜１０×容積）で沈殿させ、遠心し、溶媒をデカントした。ポリマー沈殿を、固形物が一定重量になるまで、高真空下で乾燥させた。
【０１４６】
Ｅ）α−末端基のアジド官能基化  ゴム栓及び攪拌子を装備した１００ｍｌの丸底フラスコ中で、先の工程からのポリマー（１．９ｇ、０．０３２９ｍｍｏｌ）を、ジクロロメタン（３８ｍＬ）中に溶解した。アジド−ＰＥＧ4−アミン（８６．４ｍｇ、０．３２９３ｍｍｏｌ）及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（４６．８ｍｇ、６３．１μＬ、０．３６２２ｍｍｏｌ）を、フラスコへ、撹拌しながら添加した。このシステムを、窒素で１５分間パージし、反応物を、室温で一晩攪拌しながら放置した。追加のアジドＰＥＧ4アミン（８６．４ｍｇ、０．３２９３ｍｍｏｌ）及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（４６．８ｍｇ、６３．１μＬ、０．３６２２ｍｍｏｌ）を、フラスコへ添加し、このシステムを、Ｎ2ガスでパージし、反応物を室温で３時間撹拌した。ポリマーを、ヘキサン（〜１０×容積）で沈殿させ、遠心し、溶媒をデカントした。ポリマーを、最小量のジクロロメタンに溶解し、ヘキサン（〜１０×容積）で沈殿させ、遠心し、溶媒をデカントした。ポリマー沈殿物を、固形物が一定重量になるまで、高真空下で乾燥させた。アジド官能基化されたＥＡＰの収量は、１．７７ｇであった。このコポリマーの試料を、多角度光散乱検出器（ＭＡＬＳ）、及び1Ｈ−ＮＭＲのために採取した。
【０１４７】
ポリマー００６：1Ｈ−ＮＭＲにより決定された組成は、５６％Ｎ−Ｂｏｃ−エトキシエチルアミンアクリレート及び４４％アクリル酸プロピルであった。ＭＡＬＳにより決定されたＭｗは、６０，３３０ｇ／ｍｏｌで、多分散度（ＰＤＩ）１．０５であった。
ポリマー１００Ａ：1Ｈ−ＮＭＲにより決定された組成は、５６％Ｎ−Ｂｏｃ−エトキシエチルアミンアクリレート及び４４％アクリル酸プロピルであった。ＭＡＬＳにより決定されたＭｗは、６４，４３０ｇ／ｍｏｌで、ＰＤＩは１．２１７であった。
ポリマー０６４：1Ｈ−ＮＭＲにより決定された組成は、５４％Ｎ−Ｂｏｃ−エトキシエチルアミンアクリレート及び４６％アクリル酸プロピルであった。ＭＡＬＳにより決定されたＭｗは、６５，１７０で、ＰＤＩは１．０５であった。
【０１４８】
モノ−アジド：用語「モノ−アジド」又は「モノ−アジドポリマー」は、先の手順の工程Ｄ及びＥが実行され、且つアジド基は、ポリマーのα−末端基にカップリングされることを指す。
【０１４９】
Ｆ）Ｂｏｃ脱保護及び接線流濾過  １００ｍＬの丸底フラスコ中で、酢酸中の２Ｍ  ＨＣｌ（２８ｍＬ）を、アジド官能基化されたＥＡＰコポリマー（１．６７ｇ、０．０２７７ｍｍｏｌ）へ添加した。この反応物を、室温で１時間撹拌した。脱イオン水（５６ｍＬ）を添加し、１０分間攪拌した。次に溶液を、１０等容積の５ｍＭリン酸−クエン酸緩衝液（ｐＨ５）と、接線流濾過システムに装備したｍＰＥＳ  ３０ｋＤ  １１５ｃｍ2フィルターモジュール（ＫｒｏｓＦｌｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社）を使用し、直ちに交換した。次に溶液を、装置を用いて最終容積５５ｍＬまで濃縮した。ｐＨ値５．１を記録した。試料を、ヘッドスペースガスクロマトグラフィーによる濃度決定のために採取した。アリコートを凍結乾燥させ、次に重水中の３３．３％アセトニトリル−ｄ中で再構成し、1Ｈ−ＮＭＲ分析のために濃度１０ｍｇ／ｍＬとした。理論的ＭＷは、００６及び１００Ａについて、各々、４３，０２６ｇ／ｍｏｌ及び４５，７６５ｇ／ｍｏｌであると計算した。
【０１５０】
Ｇ）  同様の技術を使用し、同様の両親媒性膜活性ポリアミンを、容易に形成することができる。特に、両親媒性膜活性ポリアミンは、保護型分子量（Ｍｗ）４０〜１２０ｋ（脱保護型２５ｋ〜８５ｋ）、ＰＤＩ範囲１．０３〜１．２、及びモノマー比は３５％アミンモノマー／６５％疎水基モノマー〜７０％アミンモノマー／３０％疎水基モノマーを伴う。
【０１５１】
【表４Ｃ】
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【０１５２】
ジチオベンゾアート部分ＲＡＦＴ剤及びＡＩＢＮ  ＲＡＦＴ開始剤を使用したＡＰＮ  １０９５−１２６の合成を、１００Ａ及び００６の合成に使用したトリチオカーボネート部分ＲＡＦＴ剤及びＶ−６５  ＲＡＦＴ開始剤と比較した。この重合のための条件は、異なる加熱温度及び時間を必要とした。加えて、このポリマーは、分別沈殿を必要とした。このポリマーは、末端キャップされないが、アジド付加法は、１００Ａ及び００６と同じであった。
【０１５３】
Ａ）材料  アクリル酸プロピルは、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ社から購入した。Ｎ−Ｂｏｃ−エトキシ−エチルアミンアクリレートは、ＷｕＸｉ社から入手した。４−シアノ−４−（フェニルカルボノチオイルチオ）ペンタン酸（ＣＰＣＰＡ、ＲＡＦＴ剤）、２，２’−アゾビス（２−メチルプロピオニトリル）（ＡＩＢＮ、ラジカル開始剤）、ペンタフルオロフェノール、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド及びＮ，Ｎ−ジイソプロピル−エチルアミンは、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社から購入した。Ｏ−（２−アミノエチル）−Ｏ’−（２−アジドエチル）トリエチレングリコール（アジド−ＰＥＧ4−アミン）は、Ｂｉｏｍａｔｒｉｋ社から購入した。
【０１５４】
Ｂ）Ｎ−Ｂｏｃ−エトキシエチルアミンアクリレート及びアクリル酸プロピル（ＥＡＰ）のＲＡＦＴコポリマー  下記の手順を、８回繰り返し、合計４．５５１３ｇの分別されたＥＡＰコポリマーを得た。酢酸ブチル中のＡＩＢＮ（１．０３５ｍｇ／ｍＬ）及びＲＡＦＴ剤ＣＰＣＰＡ（５０．５４ｍｇ／ｍＬ）の溶液を、調製した。モノマーモル供給量は、５２％Ｎ−Ｂｏｃ−エトキシエチルアミンアクリレート、４８％アクリル酸プロピルであった。理論的Ｍｗは、７５，０００であった。ＲＡＦＴ剤（ＣＰＣＰＡ）の開始剤（ＡＩＢＮ）に対するモル比は、６．６７：１であった。
【０１５５】
Ｎ−Ｂｏｃ−エトキシエチルアミンアクリレート（１．７８７９ｇ、６．９ｍｍｏｌ）、アクリル酸プロピル（０．７７４ｍＬ、０．７１２１ｇ、６．２４ｍｍｏｌ）、ＣＰＣＰＡ溶液（０．１８４ｍＬ、０．０３３３ｍｍｏｌ）、ＡＩＢＮ溶液（０．７９３ｍＬ、０．００５ｍｍｏｌ）、及び酢酸ブチル（１１．０２ｍＬ）を、攪拌子を備えた２０ｍＬガラスバイアルに添加した。このバイアルを、隔栓で密封し、溶液を、出口として第二針を備えた長い針を用い、窒素で１時間泡立てた。これらの針を取り外し、バイアルを、５０℃で２４時間、撹拌しながら、加熱した。溶液を、室温まで冷却し、５０ｍＬ遠心チューブに移し、その後ヘキサン（３５ｍＬ）を加えた。この溶液を、４４００ｒｐｍで２分間遠心した。上清層を慎重にデカントし、底側層をヘキサンですすいだ。各チューブの底側層を次に、ジクロロメタン（７ｍＬ）中に再溶解し、ヘキサン（４０ｍＬ）中で沈殿させ、もう１回遠心した。上清をデカントし、底側層をヘキサンですすぎ、その後ポリマーを、減圧下で数時間乾燥した。粗ＥＡＰコポリマーの収量は、１．７３４ｇであった。粗コポリマーの試料を、多角度光散乱検出器（ＭＡＬＳ）、及び1Ｈ−ＮＭＲのために採取した。乾燥した粗コポリマーを、ＤＣＭ（１００ｍｇ／ｍＬ）中に溶解した。ヘキサンを、正に曇点に到達するまで添加した。生じた乳白色の溶液を、遠心した。底側層を、ヘキサンに抽出し、且つ完全に沈殿させた。この画分を遠心し、その後コポリマーを単離し、真空下で乾燥した。単離されたＥＡＰコポリマー画分の収量は、０．６０２ｇであった。分画されたコポリマーの試料を、1Ｈ−ＮＭＲ及びＭＡＬＳのために採取した。1Ｈ−ＮＭＲにより決定された組成は、５６％Ｎ−Ｂｏｃ−エトキシエチルアミンアクリレート及び４４％アクリル酸プロピルであった。ＭＡＬＳにより決定されたＭｗは、６２，０１０ｇ／ｍｏｌで、多分散度（ＰＤＩ）１．１４であった。
【０１５６】
Ｃ）α−末端基のペンタフルオロフェノール活性化  ＥＡＰポリマー（２ｇ、０．０３４７ｍｍｏｌ）、ペンタフルオロフェノール（６３．８ｍｇ、０．３４６６ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（７１．５ｍｇ、０．３４６６ｍｍｏｌ）、及びジクロロメタン（４０ｍＬ）を、攪拌子を備えた１００ｍＬ丸底フラスコに添加した。フラスコを、ゴム栓で塞ぎ、このシステムを、窒素で１５分間パージした。この溶液を、室温で１６時間撹拌した。追加のペンタフルオロフェノール（６３．８ｍｇ、０．３４６６ｍｍｏｌ）及びＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（７１．５ｍｇ、０．３４６６ｍｍｏｌ）を添加し、フラスコをゴム栓で塞ぎ、このシステムを、窒素で１５分間パージした。溶液を、室温で３時間撹拌した。ポリマーを、ヘキサン（〜１０×容積）で沈殿させ、遠心し、溶媒をデカントした。ポリマーを、最小量のジクロロメタンに溶解し、ヘキサン（〜１０×容積）で沈殿させ、遠心し、溶媒をデカントした。ポリマーを、最小量の酢酸エチルに溶解し、ヘキサン（〜１０×容積）で沈殿させ、遠心し、溶媒をデカントした。ポリマー沈殿を、固形物が一定重量になるまで、高真空下で乾燥させた。
【０１５７】
Ｄ）α−末端基のアジド官能基化  ゴム栓及び攪拌子を装備した１００ｍｌの丸底フラスコ中で、先の工程からのポリマー（１．９ｇ、０．０３２９ｍｍｏｌ）を、ジクロロメタン（３８ｍＬ）中に溶解した。アジド−ＰＥＧ4−アミン（８６．４ｍｇ、０．３２９３ｍｍｏｌ）及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（４６．８ｍｇ、６３．１μＬ、０．３６２２ｍｍｏｌ）を、フラスコへ、撹拌しながら添加した。このシステムを、窒素で１５分間パージし、反応物を、室温で一晩攪拌しながら放置した。追加のアジドＰＥＧ4アミン（８６．４ｍｇ、０．３２９３ｍｍｏｌ）及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（４６．８ｍｇ、６３．１μＬ、０．３６２２ｍｍｏｌ）を、フラスコへ添加し、このシステムを、Ｎ2ガスでパージし、反応物を室温で３時間撹拌した。ポリマーを、ヘキサン（〜１０×容積）で沈殿させ、遠心し、溶媒をデカントした。ポリマーを、最小量のジクロロメタンに溶解し、ヘキサン（〜１０×容積）で沈殿させ、遠心し、溶媒をデカントした。ポリマー沈殿物を、固形物が一定重量になるまで、高真空下で乾燥させた。アジド官能基化されたＥＡＰの収量は、１．７７ｇであった。このコポリマーの試料を、多角度光散乱検出器（ＭＡＬＳ）、及び1Ｈ−ＮＭＲのために採取した。1Ｈ−ＮＭＲにより決定された組成は、５６％Ｎ−Ｂｏｃ−エトキシエチルアミンアクリレート及び４４％アクリル酸プロピルであった。ＭＡＬＳにより決定されたＭｗは、６６，６７０ｇ／ｍｏｌで、多分散度（ＰＤＩ）１．１１であった。
【０１５８】
Ｅ）Ｂｏｃ脱保護及び接線流濾過  １００ｍＬの丸底フラスコ中で、酢酸中の２Ｍ  ＨＣｌ（２８ｍＬ）を、アジド官能基化されたＥＡＰコポリマー（１．６７ｇ、０．０２７７ｍｍｏｌ）へ添加した。この反応物を、室温で１時間撹拌した。脱イオン水（５６ｍＬ）を添加し、１０分間攪拌した。次に溶液を、１０等容積の５ｍＭリン酸−クエン酸緩衝液（ｐＨ５）と、接線流濾過システムに装備したｍＰＥＳ  ３０ｋＤ  １１５ｃｍ2フィルターモジュール（ＫｒｏｓＦｌｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社）を使用し、直ちに交換した。次に溶液を、装置を用いて最終容積５５ｍＬまで濃縮した。ｐＨ値５．１を記録した。試料を、ヘッドスペースガスクロマトグラフィーによる濃度決定のために採取した。アリコートを凍結乾燥させ、次に重水中の３３．３％アセトニトリル−ｄ中で再構成し、1Ｈ−ＮＭＲ分析のために濃度１０ｍｇ／ｍＬとした。理論的ＭＷは、４３，０２６ｇ／ｍｏｌであると計算した。
【０１５９】
（実施例４．  ポリマー分析）
（ｉ）ＭＡＬＳ分析  コポリマーのおよそ１０ｍｇを、７５％ジクロロメタン、２０％テトラヒドロフラン、及び５％アセトニトリルの０．５ｍＬ中に溶解した。分子量及び多分散度（ＰＤＩ）を、Ｊｏｒｄｉ  ５μｍ  ７．８×３００  Ｍｉｘｅｄ  Ｂｅｄ  ＬＳ  ＤＶＢカラムを使用するＳｈｉｍａｄｚｕ  Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ  ＨＰＬＣに装着されたＷｙａｔｔ  Ｈｅｌｅｏｓ  ＩＩ多角度光散乱検出器を用いて測定した。脱保護前の分子量（ポリマー００６）：６０，３３０（ＰＤＩ  １．０５）。
【０１６０】
（ｉｉ）ガスクロマトグラフィーによるモノマー変換  コポリマー溶液（Ｂ節）のおよそ４０μＬを、混合（Ｎ2泡立て前）後、Ｎ2泡立て後、及び反応完了後に採取した。試料を、酢酸エチルへ１００倍希釈した。試料を、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｚｅｂｒｏｎキャピラリーカラム（ＺＢ−５、３０ｍ、ＩＤ  ０．２５ｍｍ、フィルム厚０．５μｍ）を使用するフレームイオン化検出器を装着したＳｈｉｍａｄｚｕ  ＧＣ−２０１０プラスにより分析した。Ｎ2泡立て前試料を、較正の単独点として使用し、反応後のモノマー濃度を反応前／Ｎ2泡立て後のモノマー濃度と比較することにより、モノマー変換を測定した。
【０１６１】
（ｉｉｉ）ヘッドスペースガスクロマトグラフィー（ＨＳ−ＧＣ）を使用するプロパノール含量によるポリマー濃度  脱保護型ポリマー溶液（〜２０ｍｇ／ｍＬ）を、内部標準として１−ブタノールを使用し、３Ｍ  ＮａＯＨへ、５０倍希釈した。この反応チューブを密封し、１時間振盪した。その後反応物を、少なくとも６時間、室温でインキュベーションした。１０ｍＬのヘッドスペースバイアル内で、加水分解した被験物質（２５０μＬ）を、飽和ＮａＣｌ（５００μＬ）及びＨＣｌ（４Ｍ、２５０μＬ）へ添加し、このシステムを密封した。被験物質を、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  ＺＢ−ＷＡＸ  ｐｌｕｓ  ｇｃカラム（３０．０ｍ、ＩＤ  ０．２５ｍｍ、フィルム厚０．２５μｍ）を使用するＨＳ−２０ヘッドスペースサンプラーを備えたＳｈｉｍａｄｚｕ  ＧＣ−２０１０プラスを用い、分析した。その後プロパノール濃度を、外部標準曲線又は同じＮａＣｌ／ＨＣｌ／ＮａＯＨマトリクス含有プロパノールを用い、定量した。次にポリマー濃度を、プロパノール濃度を、モノマー組込により決定した１ポリマー当たりのプロパノールの量で除算することにより、計算した。
【０１６２】
（ｉｖ）ＵＶ分光法を使用するアジド定量  脱保護型ポリマー溶液（〜２０ｍｇ／ｍＬ）を、６０ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ６）中に〜５ｍｇ／ｍＬとなるよう希釈した。次にこのポリマーを、ＤＢＣＯ−アミン（２．５モル当量）と、室温で少なくとも６時間反応させた。３１０ｎｍでの吸光度の差を計算し、１ポリマー当たりのアジド含量を決定した。
【０１６３】
（実施例５．  接線流濾過及びコンジュゲートの分析）
コンジュゲート形成後、すなわちＲＧＤ及びＰＥＧ修飾剤の付加並びにＲＮＡｉトリガーの付着によるポリマーの修飾（下記実施例９参照）後、コンジュゲート溶液（２ｍｇ／ｍＬ、１０ｍＬ）を、接線流濾過システム（ＫｒｏｓＦｌｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を装着したｍＰＥＳ  ３０ｋＤ  ２０ｃｍ2フィルターモジュールを使用し、１０等量容積の１０ｍＭリン酸−クエン酸緩衝液（ｐＨ５）と交換した。ｐＨ値５．１を記録した。
【０１６４】
Ａ）コンジュゲートの特徴決定及び分析
（ｉ）コンジュゲーションを通じたポリマー濃度。Ｇ（ｉｉｉ）節と同じ方法を、コンジュゲートの集成を通じて使用し、ポリマー濃度をモニタリングした。
【０１６５】
（ｉｉ）ＨＰＬＣ−逆相クロマトグラフィーによる不純物定量。ポリマーコンジュゲート（ＴＦＦ精製後）を、Ｈ2Ｏにより１ｍｇ／ｍＬに希釈し、ＳＰＤ−２０Ａ  ＵＶ検出器及びＷａｔｅｒｓ  Ｘｂｒｉｄｇｅ  Ｃ１８  ５μｍ  ４．６×２５０ｍｍカラムを備えたＳｈｉｍａｄｚｕ  Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ  ＨＰＬＣ上に注入した。この方法は、検出を２４７ｎｍに設定した、Ｈ2Ｏ／アセトニトリル／０．１％ギ酸からなる、バイナリー勾配を使用した。ＰＥＧn−ＡＣｉｔ−ＰＡＢＯＨ、ＲＧＤ−ＰＥＧn−ＦＣＦＰ−ＣＯＯＨ、及びＰＮＰの濃度を、外部標準定量を用いて計算した。
【０１６６】
（ｉｉｉ）アミノ酸分析を通じたＲＧＤ−ＰＥＧn−ＦＣｉｔＦＰ−ＴＦＰ及びＰＥＧn−ＡＣｉｔ−ＰＡＢＣ−ＰＮＰ修飾。密封した加水分解チューブ内で、内部標準としてノルバリンを伴う、ポリマーコンジュゲート（ＴＦＦ精製後）を、ＨＣｌ（６Ｍ）中、１１０℃で、１６時間加水分解した。その後この加水分解溶液を、ＮａＯＨで中和し、ホウ酸緩衝液（ｐＨ１０．１）で希釈し、フタルジアルデヒド／３−メルカプトプロピオン酸により誘導体化した。次にこの試料を、ＳＩＬ−３０Ａ自動サンプラー、ＳＰＤ−２０Ａ光ダイオードアレイ検出器、及びＷａｔｅｒｓ  Ｘｂｒｉｄｇｅ  Ｃ１８  ５μｍ  ４．６×２５０ｍｍカラムを備えた、Ｓｈｉｍａｄｚｕ  Ｎｅｘｅｒａ  ＨＰＬＣシステムに注入した。試料は、１０ｍＭテトラホウ酸ナトリウム１０水和物／１０ｍＭ二塩基性リン酸ナトリウム／５ｍＭアジ化ナトリウム、及び４５％メタノール／４５％アセトニトリル／１０％Ｈ2Ｏのバイナリー勾配を用いて溶離した。ＵＶ検出は、３３８ｎｍに設定した。アラニン及びフェニルアラニン濃度を、外部標準曲線を用いて計算した。ポリマー濃度及びモノマー組込と連動した、アラニン及びフェニルアラニン濃度を使用し、総アミン基修飾、並びに両方のリガンド間の比を計算した。
【０１６７】
（ｉｖ）サイズ排除クロマトグラフィーによるＲＮＡトリガー定量及びコンジュゲート純度。Ａｃｃｌａｉｍ  ＳＥＣ−１０００  ４．６ｍｍ×３００ｍｍ、７μｍ、１０００Å（シリーズの二番目）サイズ排除カラムに接続した、ＳＰＤ−２０Ａ  ＵＶ検出器及びＡｃｃｌａｉｍ  ＳＥＣ−３００  ４．６ｍｍ×３００ｍｍ、５μｍ、３００Åサイズ排除カラム（シリーズの一番目）を装備したＳｈｉｍａｄｚｕ  Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ  ＨＰＬＣを、組立てた。使用した方法は、アイソクラチックであり、移動相として２００ｍＭ  ＮａＢｒ、１０ｍＭトリスｐＨ８、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、及び２０％アセトニトリルであり、２６０ｎｍで検出した。ポリマーコンジュゲート（ＲＮＡトリガー付加後）の試料を、移動相に希釈し、このシステムに注入した。別のコンジュゲート試料は、同じ希釈スキームに従うが、システムへの注入前に２００ｍＭジチオスレイトールで２時間処理した。両方の試料のＲＮＡトリガー濃度を、外部標準曲線を用いて計算した。コンジュゲートされたＲＮＡトリガーの量は、未処理のＲＮＡレベルから、ＤＴＴ処理したＲＮＡレベルを減算することにより、計算した。このコンジュゲートのＴＦＦ後の純度も、この方法を用い決定した。
【０１６８】
（実施例６．  ＲＧＤリガンド（ＲＧＤ模倣物））
【０１６９】
【化１５】
2022001576.tif 000036
。
【化１６】
2022001576.tif 000037
ｎ＝４〜２４（好ましくは、８〜１２）。
【化１７】
2022001576.tif 000038
【化１８】
2022001576.tif 000039
【０１７０】
（実施例７．  ＲＧＤ及びＰＥＧ修飾剤）
Ａ．  ジペプチドＲＧＤ−ジペプチド及びＰＥＧ−ジペプチド修飾剤は、ＵＳ−２０１２−０１７２４１２−Ａ１（ＷＯ２０１２／０９２３７３）及びＵＳ２０１５−００４５５７３Ａ１（ＷＯ２０１５／０２１０９２）に記載されたように製造した（これらは両方共引用により本明細書中に組み込まれている）。図３〜７。
【０１７１】
Ｂ．  ＲＧＤ−ＰＥＧn−ＦＣｉｔＦＰ−ＴＦＰ及びＰＥＧn−ＦＣｉｔＦＰ−ＴＦＰ修飾剤の合成。修飾剤前駆体（ジ−Ｂｏｃ）ＲＧＤ（ＯｔＢｕ）−ＡＰＢＡ−ＰＥＧn−ＦＣｉｔＦＰｒｏ−ＣＯＯＨを、Ｆｍｏｃ−プロリン−ＯＨが予め負荷された２−Ｃｌ−Ｔｒｔ樹脂を使用する、一般的Ｆｍｏｃ化学固相合成を用い、調製した。樹脂−Ｐｒｏ−Ｆｍｏｃに、以下を順次添加した（各工程でＦｍｏｃ脱保護した後）：ＦＭｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｃｉｔ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−ＮＨ−ＰＥＧn−ＣＯＯＨ、４−（Ｎ−Ｆｍｏｃ−ｐ−アミノフェノキシ）−酪酸（ＡＰＢＡ）、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、及びｄｉｂｏｃ−ｍ−グアニジノ安息香酸。
【０１７２】
（ｄｉｂｏｃ）ＲＧＤ（ＯｔＢｕ）−ＡＰＢＡ−ＰＥＧn−ＦＣｉｔＦＰｒｏ−ＣＯＯＨ（４５８ｍｇ、０．２００ｍｍｏｌ）及びＴＦＰ（６６．５ｍｇ、０．４００ｍｍｏｌ）を、無水ＤＣＭ（５．０ｍＬ）中に溶解し、アルゴン下で撹拌しながら、氷／水浴中で０℃まで冷却した。ＥＤＣ（７７ｍｇ、０．４００ｍｍｏｌ）を添加し、この反応混合物を、０℃の氷／水浴中で、３０分間攪拌した。反応の進行は、ＴＬＣ（８．５：１．５のＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ）によりモニタリングし、９０分後に、ＴＬＣにより出発材料が認められず、完了した。この反応混合物を、ＤＣＭにより総容積１００ｍＬに希釈し、ＤＩ  Ｈ2Ｏ（ｐＨ＝５）により３×４０ｍＬ洗浄し、飽和ＮａＣｌ水溶液により１×４０ｍＬ洗浄した。次に有機物を、Ｎａ2ＳＯ4上で乾燥させ、回転蒸発器（ｒｏｔｏｖａｐ）上で濃縮させ、褐色／オレンジ色泡状物４４８ｍｇ（収率９２％）を得た。構造は、1Ｈ  ＮＭＲ、及びＥＳＩ  ＭＳにより確認した（ＰＥＧ20（ｎ＝２０）について先に示した反応）。
【０１７３】
【化１９】
2022001576.tif 000040
（ｄｉｂｏｃ）ＲＧＤ（ＯｔＢｕ）−ＡＰＢＡ−ＰＥＧn−ＦＣｉｔＦＰｒｏ−ＴＦＰ（ｎ＝２０について示す）
【０１７４】
（ｄｉｂｏｃ）ＲＧＤ（ＯｔＢｕ）−ＰＥＧｎ−ＦＣｉｔＦＰｒｏ−ＴＦＰ（４９７ｍｇ、０．２０４ｍｍｏｌ）を、［９．２５：０．７５：０．５０］のＴＦＡ：Ｈ2Ｏ：チオアニソール（５．０ｍＬ）中に溶解し、密閉したフラスコ中で、室温で４５分間攪拌した。反応の完了は、ＭＳ（ＥＳＩ、負イオンスキャン、３００−３０００）により確認し、出発材料又は部分的に脱保護された中間体に関連した質量が認められなかった。次にこの反応混合物を、４５ｍＬジエチルエーテルに沈殿させ、回転沈降させ、上清を流し捨て、２×１０ｍＬジエチルエーテルで洗浄し、高真空で一晩乾燥した。最終生成物を、Ｔｈｅｒｍｏ  Ａｑｕａｓｉｌ  Ｃ１８  ５ｕｍセミ分取カラムを使用する、分取ＨＰＬＣ上で、移動相Ｈ2Ｏ及びＡＣＮ中の０．１％ＴＦＡにより精製した。各注入は、［６１：３９］のＨ2Ｏ：ＡＣＮ中０．１％ＴＦＡ  ３．０ｍＬ中に溶解した粗物質５０ｍｇであり、以下の勾配（％Ｂで記す）を流した：３９−（５）−３９−（３５）−４３−（５）−９５−（１０）−９５−（２）−３９−（５）−３９。注入のための各試料は、注入される１５分以内に調製（溶解）し、陽性画分を、１個のフラスコ中にプールし、その日の最終注入が終了するまで、冷凍庫中で冷却保存した。その後陽性画分を、浴の温度３２℃の回転蒸発器上で濃縮し、乾固させ、次にＡＣＮ／トルエンで２×、その後ＡＣＮで３×追跡し(chased)、その後高真空で一晩乾燥した。注入した粗物質２５７ｍｇから、１８０ｍｇ（７０％）が、純粋な物質として単離された（ＰＥＧ20（ｎ＝２０）について先に示した反応）。
【０１７５】
【化２０】
2022001576.tif 000041
ＲＧＤ−ＰＥＧn−ＦＣｉｔＦＰｒｏ−ＴＦＰ（ｎ＝２０について示す）
【０１７６】
４−（Ｎ−Ｆｍｏｃ−ｐ−アミノフェノキシ）−酪酸(１)の合成。ｐ−ニトロ−フェノール（２）（７．５ｇ、５３．９ｍｍｏｌｅ）を、ＤＭＦ（７５ｍＬ）中の４−ブロモ酪酸エチル（８．４５ｍｌ、５９ｍｍｏｌ）及びＫ2ＣＯ3（７．５ｇ、５４ｍｍｏｌｅ）と一緒にした。この混合物を、１００℃で２時間撹拌した。ＤＭＦを除去し、この粗生成物を、２Ｎ  ＮａＯＨとメタノールの３：１混合液の混合物中に希釈し、４時間ＲＴで撹拌した。反応混合物を、６Ｍ  ＨＣｌで酸性化した。白色沈殿を収集し、４−（ｐ−ニトロフェニルオキシ）−酪酸（３）（１０．９ｇ、収率９０％）を得た。
【０１７７】
４−（ｐ−ニトロフェニルオキシ）−酪酸（３）（３７．１ｇ、１６５ｍｍｏｌｅ）を、ＭｅＯＨ（１Ｌ）中に溶解し、ギ酸アンモニウム（３５ｇ、５５５ｍｍｏｌｅ）及び１０％Ｐｄ／Ｃ（Ｄｅｇｕｓｓａ  Ｔｙｐｅ社）（３．５ｇ）を添加した。この混合物を、６５℃で一晩還流した。この反応物を、セライトにより濾過し、赤味を帯びた茶色の固形物として、生成物４−（ｐ−アミノフェニルオキシ）−酪酸（４）（３０．５ｇ、収率９５％）を得た。
【０１７８】
４−（ｐ−アミノフェニルオキシ）−酪酸（４）（５．１ｇ、２６ｍｍｏｌｅ）を、Ｈ2Ｏ（４５０ｍＬ）中のＮａＨＣＯ3飽和水溶液（３．３６ｇ、４０ｍｍｏｌ）及びＴＨＦ（３００ｍｌ）の６：４混合液に溶解し、白色スラリーを形成した。Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ（８．８２ｇ、２６．１ｍｍｏｌｅ）を添加し、この反応物を４時間撹拌した。アセトンを除去し、反応物を酸性化し（ＨＣｌ）、帯黄白色沈殿を収集し、１Ｎ  ＨＣｌ中で摩砕し、生成物４−（Ｎ−Ｆｍｏｃ−ｐ−アミノフェノキシ）−酪酸（１）の９．６ｇ（収率８８％）を得た。
【０１７９】
【化２１】
2022001576.tif 000042
【０１８０】
ｄｉＢｏｃ−ｍ−グアニジノ−安息香酸（５）は、Riches AGらの文献、Tetrahedron、(2012) 68, p.9448-9455に従い、合成した。
【０１８１】
ＰＥＧn−ＦＣｉｔＦＰ修飾剤は、類似の化学を用い、生成した。図１−２。
【０１８２】
（実施例８．  テトラペプチドのペプチドリンケージ）
Ａ）テトラペプチド合成  全てのテトラペプチドは、標準固相Ｆｍｏｃ手順を使用する同じ様式で合成した。一部のペプチドは、プロリン、ロイシン、又はアラニンのいずれかを含む、商業的に入手可能な２−Ｃｌ−Ｔｒｔ樹脂（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、ビレリカ、ＭＡ）から合成した。他のペプチドに関して、２−Ｃｌ−Ｔｒｔ樹脂は、アミノ酸又はＰＥＧ（１当量）及びＤＩＥＡ（２当量）を含有するＤＭＦの溶液を２−Ｃｌ−Ｔｒｔ樹脂に１６時間添加することにより、ＦＭＯＣ−ＰＥＧn−ＣＯ2Ｈ又はＦＭＯＣ−Ｎ−メチル−Ａｌａ−ＣＯ2Ｈのいずれかを負荷した。完了時に、樹脂を、ＭｅＯＨでキャッピングした。カップリングのために、ＰＹＢＯＰ（４当量）、アミノ酸（４当量）、及びＤＩＥＡ（８当量）を、並びにＦｍｏｃ脱保護のために、ＤＭＦ中の２０％ピペリジンを用いて、段階的添加を行った。
【０１８３】
ペプチド合成後、このテトラペプチドを、４当量ＤＩＥＡを含有するＤＭＦ中で、保護されたＮ−アセチル−ガラクトスアミン、ＮＡＧ（ＯＡｃ）3(Rozema DBらの文献、「プロテアーゼ-トリガー型siRNA送達ビヒクル」、J Control Release. 2015 Vol. 209:57-66、及び米国特許第８８０２７７３号）、又はＰＥＧnのいずれかのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）活性化エステル２当量と反応させた。ＮＡＧ（ＯＡｃ）3又はＰＥＧの付着後、このペプチドを、ＤＣＭ中のＨＦＩＰ（３０％）を用い、０．５時間かけて、樹脂から除去した。溶媒除去後、残渣を、Ｅｔ2Ｏにより摩砕した。
【０１８４】
テトラペプチドは、精製し、且つ活性化エステルへコンジュゲートし、修飾剤を形成するか、或いは精製せずに、発色団Ｎ−（ｐ−ニトロフェニル）エチレンジアミン（ｐＮＡ）へコンジュゲートし、生理的不安定性試験のための基質を形成するかのいずれかを行った。精製前に、ＮＡＧ（ＯＡｃ）3−含有基質を、水（４５％）及びＭｅＯＨ（２０％）中のＴＥＡ（３５％）による処理により、脱アセチル化し、室温で撹拌した。精製のために、テトラペプチド基質を、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｑｕａｓｉｌ  Ｃ１８逆相カラム（２５０×２１．２、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を用い、アセトニトリル及び０．１％ギ酸緩衝された水の勾配で溶離する、ＨＰＬＣにより分離した。精製後、基質を凍結乾燥した。
【０１８５】
アミン−反応基のテトラペプチドへの付着。ＤＭＦ又はＤＣＭ中のＮ−末端にＮＡＧ（Ｒ5＝ＮＡＧ（ＯＨ）3）又はＰＥＧ（Ｒ5＝ＰＥＧn）を持つＨＰＬＣ精製したペプチド１当量を、火炎乾燥したフラスコへ、０℃で添加し、濃度０．２Ｍのペプチドを生じた。ＮＨＳ（３当量）及びＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）（３当量）を添加し、アルゴン下、室温で一晩撹拌させ、修飾剤を得た。この混合物を、部分的に濃縮し、−２０℃まで急冷し、濾過した。その後全ての溶媒を、真空除去した。残渣を、最小量のＤＣＭ及びＭｅＯＨ中に溶解し、冷Ｅｔ2Ｏに沈殿させ、遠心分離後溶媒をデカントすることにより収集した。残留ＤＣＵ（ジシクロヘキシル尿素）が検出されなくなるまで、Ｅｔ2Ｏへの沈殿を繰り返した。全ての調製した化合物は引き続き、更に精製することなく使用した。
【０１８６】
（実施例９．  ポリマー修飾  ＲＧＤ−ＰＥＧ−ＨｙＮｉｃ、ＲＧＤ−ＰＥＧ−ＡＣｉｔ−ＰＮＰ、又はＲＤＧ−ＰＥＧ−ＦＣｉｔＦＰ−ＴＦＰ及びＰＥＧ−ジペプチド修飾剤を使用するｓｉＲＮＡ送達コンジュゲートの形成）
１）プロトコール１  指定したポリマーを、ＳＭＰＴと、重量比１：０．０１５（ポリマー：ＳＭＰＴ）で、５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）緩衝液中、ＲＴで１時間反応させた。次にＳＭＰＴ−修飾されたポリマーを、アルデヒド−ＰＥＧ−ジペプチド修飾剤（アルデヒド−ＰＥＧ12−ＦＣｉｔ又はアルデヒド−ＰＥＧ24−ＡＣｉｔ）と、所望の比で、ＲＴで１時間反応させた。修飾されたポリマーを次に、ＰＥＧ12−ジペプチド修飾剤（ＰＥＧ12−ＦＣｉｔ、ＰＥＧ12−ＡＣｉｔ又はＰＥＧ24−ＡＣｉｔ）と、重量比１：２（ポリマー：ＰＥＧ）で、１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ９．０）緩衝液中、ＲＴで１時間反応させた。修飾されたポリマーを次に、ＳＡＴＡ−ＲＮＡｉトリガーと、重量比１：０．２（ポリマー：ＳＡＴＡ−ＲＮＡｉトリガー）で、１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ９．０）緩衝液中、ＲＴで一晩反応させ、ＲＮＡｉトリガーを付着させた。次に、修飾されたポリマーを、プロテアーゼ切断可能なＰＥＧ（ＰＥＧ12−ＦＣｉｔ又はＰＥＧ12−ＡＣｉｔ又はＰＥＧ24−ＡＣｉｔ）と、重量比１：６（ポリマー：ＰＥＧ）で、１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ９．０）緩衝液中、ＲＴで１時間反応させた。得られたコンジュゲートを、セファデックスＧ−５０スピンカラムを用い、精製した。
【０１８７】
ＲＧＤ−ＨｙＮｉｃ（実施例６Ｂ）を、修飾されたポリマーに付着させ、修飾されたポリマーとの重量比１：０．７（ポリマー：ＲＧＤ−ＨｙＮｉｃ模倣物）での、５０ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ５．０）緩衝液中、ＲＴで最低でも４時間の反応により、完全な送達コンジュゲートを形成した。このコンジュゲートを、セファデックスＧ−５０スピンカラムを用い、精製した。ＲＧＤリガンド付着効率は、先に記載したように決定した。
【０１８８】
２）プロトコール２  指定したポリマーを、ＳＭＰＴと、重量比１：０．０１５（ポリマー：ＳＭＰＴ）で、５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）緩衝液中、ＲＴで１時間反応させた。ＳＭＰＴ−修飾されたポリマーを次に、アルデヒド−ＰＥＧ−ジペプチド修飾剤（アルデヒド−ＰＥＧ24−ＡＣｉｔ）と重量比１：０．５（ポリマー：ＰＥＧ）で、並びにＰＥＧ−ジペプチド修飾剤（ＰＥＧ12−ＦＣｉｔ、ＰＥＧ12−ＡＣｉｔ又はＰＥＧ24−ＡＣｉｔ）と重量比１：２（ポリマー：ＰＥＧ）で、１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ９．０）緩衝液中、ＲＴで１時間反応させた。修飾されたポリマーを次に、ＳＡＴＡ−ＲＮＡｉトリガーと、重量比１：０．２（ポリマー：ＳＡＴＡ−ＲＮＡｉトリガー）で、１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ９．０）緩衝液中、ＲＴで一晩反応させ、ＲＮＡｉトリガーを付着させた。次に、修飾されたポリマーを、プロテアーゼ切断可能なＰＥＧ（ＰＥＧ12−ＦＣｉｔ又はＰＥＧ12−ＡＣｉｔ又はＰＥＧ24−ＡＣｉｔ）と、重量比１：６（ポリマー：ＰＥＧ）で、１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ９．０）緩衝液中、ＲＴで１時間反応させた。ＲＧＤ−ＨｙＮｉｃ（実施例６）を、修飾されたポリマーとの重量比１：０．７（ポリマー：ＲＧＤ−ＨｙＮｉｃ）での、６９ｍＭ塩化水素溶液（ＨＣｌ）中、ＲＴで一晩の反応により、修飾されたポリマーに付着させ、完全なコンジュゲートを形成した。ＲＧＤリガンド付着効率は、先に記載したように決定した。
【０１８９】
３）プロトコール３  指定したポリマーを、ＳＭＰＴと、重量比１：０．０１５（ポリマー：ＳＭＰＴ）で、５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）緩衝液中、ＲＴで１時間反応させた。ＳＭＰＴ−修飾されたポリマーを次に、アルデヒド−ＰＥＧ−ジペプチド修飾剤（アルデヒド−ＰＥＧ24−ＡＣｉｔ）と重量比１：０．５（ポリマー：ＰＥＧ）で、並びにＰＥＧ−ジペプチド修飾剤（ＰＥＧ12−ＦＣｉｔ、ＰＥＧ12−ＡＣｉｔ又はＰＥＧ24−ＡＣｉｔ）と重量比１：２（ポリマー：ＰＥＧ）で、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ９．０）緩衝液中、ＲＴで１時間反応させた。修飾されたポリマーを次に、ＳＡＴＡ−ＲＮＡｉトリガーと、重量比１：０．２（ポリマー：ＳＡＴＡ−ＲＮＡｉトリガー）で、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ９．０）緩衝液中、ＲＴで一晩反応させ、ＲＮＡｉトリガーを付着させた。次に、修飾されたポリマーを、プロテアーゼ切断可能なＰＥＧ（ＰＥＧ12−ＦＣｉｔ又はＰＥＧ12−ＡＣｉｔ又はＰＥＧ24−ＡＣｉｔ）と、重量比１：６（ポリマー：ＰＥＧ）で、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ９．０）緩衝液中、ＲＴで１時間反応させた。ＲＧＤ−ＨｙＮｉｃ（実施例６）を、修飾されたポリマーとの重量比１：０．７（ポリマー：ＲＧＤ−ＨｙＮｉｃ模倣物）での、１００ｍＭ  ＭＥＳ非含有酸溶液中、ＲＴで一晩の反応により、修飾されたポリマーに付着させ、完全な送達コンジュゲートを形成した。ＲＧＤ標的化リガンドコンジュゲーション効率は、先に記載したように決定した。
【０１９０】
４）プロトコール４  指定したポリマーを、アジド−ＰＥＧ４−ＮＨＳと、重量比１：０．０１５（ポリマー：アジド）で、５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）緩衝液中、ＲＴで１時間反応させた。アジド−修飾されたポリマーを次に、アルデヒド−ＰＥＧ−ジペプチド修飾剤（アルデヒド−ＰＥＧ24−ＡＣｉｔ）と重量比１：０．５（ポリマー：ＰＥＧ）で、並びにＰＥＧ−ジペプチド修飾剤（ＰＥＧ12−ＡＣｉｔ）と重量比１：２（ポリマー：ＰＥＧ）で、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ９．０）緩衝液中、ＲＴで１時間反応させた。修飾されたポリマーを次に、アルキン−ＲＮＡｉトリガーと、重量比１：０．２（ポリマー：アルキン−ＲＮＡｉトリガー）で、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ９．０）緩衝液中、ＲＴで一晩反応させ、ＲＮＡｉトリガーを付着させた。次に、修飾されたポリマーを、プロテアーゼ切断可能なＰＥＧ（ＰＥＧ12−ＡＣｉｔ）と、重量比１：６（ポリマー：ＰＥＧ）で、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ９．０）緩衝液中、ＲＴで１時間反応させた。ＲＧＤ−ＨｙＮｉｃ（実施例６）を、修飾されたポリマーとの重量比１：０．７（ポリマー：ＲＧＤ−ＨｙＮｉｃ模倣物）での、１００ｍＭ  酢酸ナトリウム−酢酸緩衝溶液（ｐＨ５．０）中、ＲＴで一晩の反応により、修飾されたポリマーに付着させ、完全な送達コンジュゲートを形成した。ＲＧＤ標的化リガンドコンジュゲーション効率は、先に記載したように決定した。
【０１９１】
５）プロトコール５  モノアジド−ポリマーを、アルデヒド−ＰＥＧ−ジペプチド修飾剤（アルデヒド−ＰＥＧ24−ＡＣｉｔ）と重量比１：０．５（ポリマー：ＰＥＧ）、並びにＰＥＧ−ジペプチド修飾剤（ＰＥＧ12−ＡＣｉｔ）と重量比１：２（ポリマー：ＰＥＧ）で、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ９．０）緩衝液中、ＲＴで１時間反応させた。修飾されたポリマーを次に、アルキン−ＲＮＡｉトリガーと、重量比１：０．２（ポリマー：アルキン−ＲＮＡｉトリガー）で、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ９．０）緩衝液中、ＲＴで一晩反応させ、ＲＮＡｉトリガーを付着させた。次に、修飾されたポリマーを、プロテアーゼ切断可能なＰＥＧ（ＰＥＧ12−ＡＣｉｔ）と、重量比１：６（ポリマー：ＰＥＧ）で、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ９．０）緩衝液中、ＲＴで１時間反応させた。ＲＧＤ−ＨｙＮｉｃ（実施例６）を、修飾されたポリマーとの重量比１：０．７（ポリマー：ＲＧＤ−ＨｙＮｉｃ模倣物）での、１００ｍＭ  酢酸ナトリウム−酢酸緩衝溶液（ｐＨ５．０）中、ＲＴで一晩の反応により、修飾されたポリマーに付着させ、完全な送達コンジュゲートを形成した。ＲＧＤ標的化リガンドコンジュゲーション効率は、先に記載したように決定した。
【０１９２】
６）プロトコール６  モノアジド−ポリマーを、プロテアーゼ切断可能な−ＲＧＤ剤（ＲＧＤ−ＰＥＧ8−ＡＣｉｔ−ＰＮＰ、ＲＤＧ−ＰＥＧ8−ＦＣｉｔＦＰ−ＴＦＰ、ＲＧＤ−ＰＥＧ15−ＦＣｉｔＦＰ−ＴＦＰ、ＲＧＤ−ＰＥＧ19−ＦＣｉｔＦＰ−ＴＦＰ、又はＲＧＤ−ＰＥＧ20−ＦＣｉｔＦＰ−ＴＦＰ）と、重量比１：０．１２５、１：０．２５、１：０．５、１：１、１：１．５、１：２（ポリマー：ＲＧＤ）で、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．５）緩衝液中、ＲＴで４時間反応させた。修飾されたポリマーを次に、プロテアーゼ切断可能な−ＰＥＧ剤（ＰＥＧ6−ＡＣｉｔ−ＰＡＢＣ−ＰＮＰ、ＰＥＧ12−ＡＣｉｔ−ＰＡＢＣ−ＰＮＰ、ＰＥＧ12−ＦＣｉｔ−ＰＡＢＣ−ＰＮＰ、ＰＥＧ12−ＦＣｉｔＦＰ−ＴＦＰ）と、重量比１：８（ポリマー：ＰＥＧ）で、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．５）緩衝液中、ＲＴで２時間反応させた。アルキン−ＲＮＡｉトリガーを、修飾されたポリマーに、重量比１：０．３（ポリマー：アルキン−ＲＮＡｉトリガー）で、１００ｍＭ酢酸ナトリウム−酢酸緩衝溶液（ｐＨ５．０）中、ＲＴで５日間付加させた。完成したコンジュゲートを、ＴＦＦ精製し、且つコンジュゲーション効率を決定した。
【０１９３】
７）プロトコール７  モノアジド−ポリマーを、プロテアーゼ切断可能な−ＲＧＤ剤（ＲＧＤ−ＰＥＧ20−ＦＣｉｔＦＰ−ＴＦＰ）と重量比１：１（ポリマー：ＲＧＤ）で、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．５）緩衝液中、ＲＴで２時間反応させた。修飾されたポリマーを次に、プロテアーゼ切断可能な−ＰＥＧ剤（ＰＥＧ12−ＡＣｉｔ−ＰＡＢＣ−ＰＮＰ）と重量比１：８（ポリマー：ＰＥＧ）で、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．５）緩衝液中、ＲＴで２時間反応させた。修飾されたポリマーを次に、ＴＦＦ精製した。アルキン−ＲＮＡｉトリガーを、ＴＦＦ精製したポリマーへ、重量比１：０．４（ポリマー：アルキン−ＲＮＡｉトリガー）で、３７℃で３日間付加させた。
【０１９４】
（実施例１０．  Ｈｉｆ２αＲＮＡｉトリガーのインビトロ分析）
候補配列を、インシリコ解析により同定し、且つインビトロにおいて化学的に修飾された基準の(canonical)ｓｉＲＮＡとしてスクリーニングした。スクリーニング目的で、ヒトＥＰＡＳ１（Ｈｉｆ２α）ｃＤＮＡ配列（寄託番号＃ＮＭ＿００１４３０）を、合成し、且つ、市販のレポーターベースのスクリーニングプラスミドであるｐｓｉＣＨＥＣＫ２（Ｐｒｏｍｅｇａ社、マジソン、ＷＩ）へクローニングし（ＤＮＡ  ２．０、メンローパーク、ＣＡ）、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ／ＥＰＡＳ１融合ｍＲＮＡを作製した。これはＲＮＡｉトリガー有効性評価のために、ヒト肝細胞癌株であるＨｅｐ３Ｂ細胞を、９６ウェルフォーマットにおいて、１ウェル当たり〜１０，０００個細胞を播種した。２つのサブセットにおいて、１８７種のＥＰＡＳ１  ＲＮＡｉトリガーの各々は、２種の濃度１ｎＭ及び０．１ｎＭで、１ウェル当たり２５ｎｇ  ＥＰＡＳ１−ｐｓｉＣＨＥＣＫ２プラスミドＤＮＡ、及び１ウェル当たり０．２μＬリポフェクタミン２０００（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）と、同時トランスフェクションした。遺伝子のノックダウンを、デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、マジソン、ＷＩ）を使用し、同じくｐｓｉＣＨＥＣＫ−２プラスミドに存在する、構成的に発現されたホタルルシフェラーゼのレベルに対し規準化された、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼレベルを測定することにより決定した。表５。
【０１９５】
【表５Ａ−１】
2022001576.tif 000043
【表５Ａ−２】
2022001576.tif 000044
【表５Ａ−３】
2022001576.tif 000045
【表５Ａ−４】
2022001576.tif 000046
【表５Ａ−５】
2022001576.tif 000047
【０１９６】
【表５Ｂ−１】
2022001576.tif 000048
【表５Ｂ−２】
2022001576.tif 000049
【表５Ｂ−３】
2022001576.tif 000050
【表５Ｂ−４】
2022001576.tif 000051
【０１９７】
【表５Ｃ−１】
2022001576.tif 000052
【表５Ｃ−２】
2022001576.tif 000053
【０１９８】
（実施例１１．  Ｈｉｆ２αＲＮＡｉトリガーＥＣ50決定）
８つの最良の基準の配列を、ＥＣ50濃度を決定することにより、更に評価した。各トリガーを、前述のものと同じ条件及びアッセイ下であるが、０．０００５１ｎＭ〜１０ｎＭの範囲の１０種の異なる濃度でのノックダウンについて評価した。ＥＣ50は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用し決定した。上位５つの基準の配列の各々は、６位及び７位にＵＮＡを含むように、修飾した。これらのトリガーは、それらの親の基準の配列と共に、前述のものと同じ条件及びアッセイを用い、ＥＣ50濃度決定について、並行して評価した。表６。
【０１９９】
【表６】
2022001576.tif 000054
【０２００】
（実施例１２．  ＳＥＡＰ−発現している明細胞型腎細胞癌（ｃｃＲＣＣ）Ａ４９８細胞の作製）
ＣＭＶプロモーター下でアルカリホスファターゼ分泌（ＳＥＡＰ）レポーター遺伝子を発現しているｐＣＲ３．１発現ベクターを、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社ｐＳＥＡＰ２−基本ベクターからＰＣＲ増幅されたＳＥＡＰコーディング配列の方向性のあるクローニングにより調製した。都合の良い制限部位を使用したプライマー上に追加し、ｐＣＲ３．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）へのクローニングのためのＳＥＡＰコーディング配列を増幅した。生じた構築体ｐＣＲ３−ＳＥＡＰを使用し、ＳＥＡＰを発現しているＡ４９８  ｃｃＲＣＣ細胞株を作製した。簡単に述べると、ｐＣＲ３−ＳＥＡＰプラスミドを、製造業者の推奨に従い、電気穿孔法により、Ａ４９８  ｃｃＲＣＣ細胞へトランスフェクションした。安定したトランスフェクタントを、Ｇ４１８耐性により選択した。選択されたＡ４９８−ＳＥＡＰクローンを、ＳＥＡＰ発現及び組込み安定性について評価した。
【０２０１】
（実施例１３．  ＳＥＡＰを安定して発現しているＡ４９８細胞による同所性ＲＣＣ腫瘍を有するマウス）
雌の無胸腺ヌードマウスに、〜３％イソフルランにより麻酔をかけ、右側臥位位置に置いた。左脇腹に小さい０．５〜１ｃｍの縦方向の腹部切開を行った。湿った綿スワブを使用し、左腎臓を、腹膜から持ち上げ、且つ優しく固定した。注射直前に、１．０ｍｌシリンジに、細胞／Ｍａｔｒｉｇｅｌ混合物を充填し、２７ゲージ針カテーテルを、シリンジ先端に取り付けた。その後充填したシリンジを、シリンジポンプ（Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ社、モデルＰＨＤ２０００）に取付け、且つ空気の除去を開始した。シリンジに取付けた２７ゲージ針カテーテルの先端を、尾極近傍の腎被膜の真下に挿入し、次に針の先端を、被膜に沿って３〜４ｍｍ頭側に慎重に進めた。約３００，０００個細胞を含む２：１（容積：容積）細胞／マトリゲル混合物の１０μｌアリコートを、シリンジポンプを使用し、腎実質へ、ゆっくり注入した。針を、腎臓内に１５〜２０秒間放置し、注入が完了したことを確実にした。その後針を腎臓から取りだし、綿スワブを注射部位の上に３０秒間放置し、細胞の漏出又は出血を防いだ。腎臓をその後、腹部へ優しく戻し、腹壁を閉じた。血清を、移植後７〜１４日毎に採取し、市販のＳＥＡＰアッセイキットを用い、腫瘍成長をモニタリングした。ほとんどの試験に関して、腫瘍マウスは、移植後５〜６週間使用し、その時点での腫瘍の測定値は、典型的にはおよそ４〜８ｍｍであった。
【０２０２】
（実施例１４．  同所性ＲＣＣ腫瘍を有するマウスにおけるＨｉＦ２α−ＲＮＡｉトリガーの評価）
ＲＧＤ標的化されたＨｉＦ２α−ＲＮＡｉトリガー送達コンジュゲート。送達ポリマーを、ＲＧＤ−ＰＥＧ−ＨｙＮｉｃ、ＲＧＤ−ＰＥＧ−ＡＣｉｔ−ＰＮＰ、又はＲＤＧ−ＰＥＧ−ＦＣｉｔＦＰ−ＴＦＰ、及びＰＥＧ−ジペプチド修飾剤を用いて、修飾した。指定された量のポリマー１２６又は１００Ａポリマーを、８×ＰＥＧ12−ＡＣｉｔ−ＰＡＢＣ−ＰＮＰ／０．５×アルデヒド−ＰＥＧ24−ＦＣｉｔ−ＰＡＢＣ−ＰＮＰ（プロトコール＃１を使用し、ＲＧＤ模倣物＃１−ＰＥＧ−ＨｙＮｉｃによる）、並びに指定された量の指定されたＨｉｆ２αＲＮＡｉトリガーにより、修飾した。ポリマー０６４は、プロトコール７に従い修飾した。腎臓ＲＣＣ腫瘍を有するマウスを、記載したように作製し、且つ等張グルコース（Ｇ１）又は指定されたＨｉｆ２αＲＮＡｉトリガー−送達ポリマーコンジュゲートの単回尾静脈注射により処置した。マウスを、注射後指定された時点で安楽死させ、総ＲＮＡを、Ｔｒｉｚｏｌ試薬を製造業者の推奨に従い使用し、腎臓腫瘍から調製した。相対ＨｉＦ２αｍＲＮＡレベルを、以下に記載したようにＲＴ−ｑＰＣＲにより決定し、且つ送達緩衝液（等張グルコース）のみで処置したマウスと比較した。
【０２０３】
【表７−１】
2022001576.tif 000055
【表７−２】
2022001576.tif 000056
【表７−３】
2022001576.tif 000057
【０２０４】
定量的リアルタイムＰＣＲアッセイ。定量的ＰＣＲのための調製において、総ＲＮＡを、ＴｒｉＲｅａｇｅｎｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ社、シンシナティ、ＯＨ）中にホモジナイズした組織試料から、製造業者のプロトコールに従い単離した。およそ５００ｎｇ  ＲＮＡを、高性能ｃＤＮＡ逆転写キット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用い、逆転写した。ヒト（腫瘍）Ｈｉｆ２α（ＥＰＡＳ１）発現に関して、ヒトＨｉｆ２α（カタログ＃４３３１１８２）及びＣｙｃＡ（ＰＰＩＡ）（カタログ＃４３２６３１６Ｅ）のために予め製造したＴａｑＭａｎ遺伝子発現アッセイを、ＴａｑＭａｎ遺伝子発現マスターミックス（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）又はＶｅｒｉＱｕｅｓｔプローブマスターミックス（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）を使用する、３つ組の二重(biplex)反応において使用した。ヒト（腫瘍）ＶｅｇＦａ（ＶＥＧＦＡ）発現に関して、ヒトＶｅｇＦａ（カタログ＃４３３１１８２、アッセイＩＤ：Ｈｓ００９０００５５）及びＣｙｃＡ（パート＃：４３２６３１６Ｅ）のために予め製造したＴａｑＭａｎ遺伝子発現アッセイを、ＴａｑＭａｎ遺伝子発現マスターミックス（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）又はＶｅｒｉＱｕｅｓｔプローブマスターミックス（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）を使用する、３つ組の二重反応において使用した。定量的ＰＣＲを、７５００Ｆａｓｔ又はＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓリアルタイムＰＣＲシステム（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて行った。ΔΔＣT法を使用し、相対遺伝子発現を算出した。
【０２０５】
（実施例１５．  同所性ＲＣＣ腫瘍を有するマウスにおける腫瘍成長を阻害する反復投与量Ｈｉｆ２αＲＮＡｉトリガー−送達ポリマーコンジュゲート）
Ｈｉｆ２αＲＮＡｉトリガー−送達ポリマーコンジュゲートを、プロトコール＃１を使用し、ＲＮＡｉトリガー二本鎖ＩＤ  ＡＤ０１０３１及びポリマーＡｎｔ  １２６により、調製した。次にこのコンジュゲートを、ＴＦＦ精製し、ポリマー濃度、ＲＮＡｉトリガー、ＲＧＤ及び修飾コンジュゲーション有効性を、先に記載した様に決定した。４００μｇ（ポリマー重量）又は２８０μｇ（ポリマー重量）のいずれかを含むＨｉｆ２αＲＮＡｉトリガー−送達ポリマーコンジュゲートの毎週の投与量を、腫瘍を有するマウスの２つの異なる群へ、静脈内投与した。等張グルコース（ＩＧ）を受ける腫瘍を有するマウスを、処置対照として使用した。合計３回の毎週投与量を、試験期間中、投与した。腫瘍成長速度を、処置期間中５〜７日間隔で採取した血清ＳＥＡＰにより評価した。腫瘍重量及び容積を、剖検時に決定した。腫瘍の肉眼形態及びＨ＆Ｅ組織病理を、評価した。
【０２０６】
【表８】
2022001576.tif 000058
【０２０７】
４００μｇ又は２８０μｇのＨｉｆ２αＲＮＡｉトリガー−送達ポリマーコンジュゲート群におけるＨｉｆ２αの発現は、対照処置と比較し、各々、８２％及び８１％減少した（表８）。下流Ｈｉｆ２α調節遺伝子として良く特徴付けられたＶＥＧＦａの発現もまた、各々、５５％及び６１％減少した（表８）。
【０２０８】
まとめると、３週間のＨｉｆ２αＲＮＡｉトリガー−送達ポリマーコンジュゲートの注射後、評価された両方の用量で、腫瘍成長は、劇的に阻害された。このことは、全体的腫瘍サイズ及び血清ＳＥＡＰレベルにより裏付けられた（図８−９及び１２、表９）。３回目の注射後のＳＥＡＰレベルの減少傾向は、腫瘍退縮が始まることを示唆している。加えて、Ｈ＆Ｅ染色したホルマリン固定したパラフィン切片からの腫瘍組織病理試験は、典型的ＲＣＣ管状構造の破壊を示した。アポトーシス細胞の数は、処置群において増加した。一部の腫瘍試料は、大きい腫瘍壊死面積を含んだ（図１０）。
【０２０９】
【表９】
2022001576.tif 000059
【０２１０】
（実施例１６．  同所性ＲＣＣ腫瘍を有するマウスにおけるＨｉＦ２α−ＲＮＡｉトリガーの評価）
ＲＧＤ標的化されたＨｉＦ２α−ＲＮＡｉトリガー送達ポリマーコンジュゲートを、ポリマー１２６、１００Ａ、又は００６を用いて形成した。ＲＮＡｉトリガーのμｇは、ポリマーと反応させたトリガーの量を示す。ポリマーは、先に記載したように指定したＲＧＤ模倣物及びＰＥＧ修飾剤により、修飾した。腎臓ＲＣＣ腫瘍を有するマウスは、記載したように作製し、等張グルコース（Ｇ１）又は指定されたＨｉｆ２αＲＮＡｉトリガー−送達ポリマーコンジュゲートの単回尾静脈注射により処置した。マウスを、注射後７２時間（４日目）に安楽死させ、総ＲＮＡを、腎臓腫瘍から、Ｔｒｉｚｏｌ試薬を製造業者の推奨に従い用い、調製した。相対ＨｉＦ２αｍＲＮＡレベルを、記載したようにＲＴ−ｑＰＣＲにより決定し、送達緩衝液（等張グルコース）のみで処置したマウスと比較した（表１１）。
【０２１１】
（実施例１７．  ＨｉＦ２αＲＮＡｉトリガー／第二の治療薬の組合せ試験）
ＨｉＦ２αＲＮＡｉトリガー−送達ポリマーコンジュゲート（１２５μｇポリマー）を、プロトコール７の二本鎖ＩＤ  Ｎｏ．  ＡＤ１８８４及びポリマー０６４を用いて調製した。ＨｉＦ２αＲＮＡｉトリガー−送達ポリマーコンジュゲートを、４週間毎に、ｉｖ注射により、合計４投与量投与した。ＬＣ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社から得たスニチニブ（リンゴ酸塩）を、Ｏｒａ−ｐｌｕｓ／Ｏｒａ  ｓｗｅｅｔ（５０：５０、容積：容積）中に懸濁した。初回ＨｉＦ２αＲＮＡｉトリガー投与後２週目に開始するスニチニブ処置を、投与した。マウスには、５日／週で２週間強制経口投与し、その後２週間休薬し、合計３サイクル行った。
【０２１２】
腫瘍成長速度は、処置期間中５〜７日間隔で採取した血清ＳＥＡＰにより評価した。腫瘍重量及び容積を、剖検時に決定した。腫瘍の肉眼形態及びＨ＆Ｅ組織病理を、評価した。相対ＨｉＦ２α発現レベルは、スニチニブのみ、ＤＰＣ＋スニチニブ及びＤＰＣのみの処置群において、各々、１１．４％、７３．８％、及び７７．６％減少した（表１０Ａ）。ＨｉＦ２αＲＮＡｉトリガー及びスニチニブの組合せ処置は、増大した腫瘍成長阻害反応を生じた。全般的により小さい腫瘍サイズでは、より小さく、並びにより低い全般的成長（ＳＥＡＰ中の全体の増加倍数により測定）が認められた（表１０Ｂ）。
【０２１３】
【表１０−１】
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【０２１４】
【表１０−２】
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【０２１５】
他の実施態様：本発明は、その詳細な説明と共に記載されているが、前述の説明は、例証することを意図し、本発明の範囲を限定するものではなく、本発明の範囲は添付された請求の範囲により規定されることは、理解されるべきである。他の態様、利点、及び修飾は、以下の請求の範囲内である。
【０２１６】
【表１１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和3年10月15日(2021.10.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載された発明。
【外国語明細書】
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