(57)【要約】【課題】神経細胞の遊走を抑制しつつ、神経細胞を基板上に精密に配置する技術を提供する。【解決手段】細胞接着性材料が配置された領域と、細胞非接着性材料が配置された領域とを有する基板上に、神経細胞を含む複数の液滴をインクジェット法により配置して、１つ又は複数の液溜りを形成する工程と、前記液溜り内の前記神経細胞が沈降し、前記基板上に仮接着して細胞集合体を形成するまで静置する工程と、を含み、前記液溜り１つあたりの直径が５００μｍ以下であり、前記液溜り１つあたりの神経細胞の密度が１０５個／ｃｍ２以上である、神経細胞が配置された基板の製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞接着性材料が配置された領域と、細胞非接着性材料が配置された領域とを有する基板上に、神経細胞を含む複数の液滴をインクジェット法により配置して、１つ又は複数の液溜りを形成する工程と、
前記液溜り内の前記神経細胞が沈降し、前記基板上に仮接着して細胞集合体を形成するまで静置する工程と、を含み、
前記液溜り１つあたりの直径が５００μｍ以下であり、
前記液溜り１つあたりの神経細胞の密度が１０５個／ｃｍ２以上である、
神経細胞が配置された基板の製造方法。
【請求項２】
前記液溜り１つあたり７〜１０，０００個の前記神経細胞を含む、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記液滴１つあたり１〜５０個の前記神経細胞を含む、請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記液滴が、前記細胞接着性材料に接して配置される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項５】
前記液溜り中の液体の蒸発を抑制する工程を更に含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項６】
前記細胞集合体が形成された基板に培地を供給する工程を更に含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項７】
前記液溜りを形成する工程において前記液溜りを複数形成し、
前記静置する工程において前記細胞集合体を複数形成し、
前記培地が供給された前記基板をインキュベートして、少なくとも２つの前記細胞集合体を機能的に結合させる工程を更に含む、請求項６に記載の製造方法。
【請求項８】
前記基板が、前記細胞非接着性材料が配置された領域と、前記細胞非接着性材料が配置されていない領域とを有し、
前記細胞非接着性材料が配置されていない領域が、線状形状を有しており、
前記線状形状の幅が１００μｍ以下である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項９】
前記基板が多孔質構造を有する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経細胞が配置された基板の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
神経細胞は生体内でネットワークを形成し機能的につながった状態で活動している。脳機能の解明や、神経系疾患への毒性評価、創薬開発等において、生体内の神経細胞の活動状態を、インビトロでなるべく正確に再現することは、試験結果の外挿性（臨床データとの相関性）を高めるうえで重要と考えられている。
【０００３】
このためには、任意の神経細胞を所定の位置に配置し、且つ該神経細胞同士が軸索を伸長し機能的に結合した、神経回路モデルを開発することが有効であると考えられる。しかしながら、手技により、基板上に神経細胞を精密に配置することは困難である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
特許文献１（特開２０１９−１６２０９７号公報）では、細胞接着性材料と細胞非接着性材料のパターンによる細胞配置を試みている。しかしながら、発明者らは、細胞接着性材料と細胞非接着性材料のパターンによる細胞配置を行った場合、特に、神経細胞においては、細胞接着部で遊走し、任意の位置に留めておくことが困難な傾向にあることを見出した。そこで、本発明は、神経細胞の遊走を抑制しつつ、神経細胞を基板上に精密に配置する技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明に係る、神経細胞が配置された基板の製造方法は、細胞接着性材料が配置された領域と、細胞非接着性材料が配置された領域とを有する基板上に、神経細胞を含む複数の液滴をインクジェット法により配置して、１つ又は複数の液溜りを形成する工程と、前記液溜り内の前記神経細胞が沈降し、前記基板上に仮接着して細胞集合体を形成するまで静置する工程と、を含み、前記液溜り１つあたりの直径が５００μｍ以下であり、前記液溜り１つあたりの神経細胞の密度が１０５個／ｃｍ２以上である。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、神経細胞の遊走を抑制しつつ、神経細胞を基板上に精密に配置する技術を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】図１は、インクジェットヘッドの一例を示す概略図である。
【図２】図２は、インクジェットヘッドへの入力波形の一例を示す概略図である。
【図３】図３は、インクジェットヘッドへの入力波形の一例を示す概略図である。
【図４】図４は、液滴配置装置の一例を示す概略図である。
【図５】図５は、液滴配置装置の一例を示す概略図である。
【図６】図６は、液滴配置装置の一例を示す概略図である。
【図７】図７は、液滴配置装置の一例を示す概略図である。
【図８】図８は、神経回路モデルの製造方法の一例を示すフロー図である。
【図９】図９は、神経回路モデルの製造方法を説明する模式断面図である。
【図１０】図１０（ａ）〜（ｃ）は、実験例１で撮影した顕微鏡写真である。
【図１１】図１１は、実験例２の結果を示すグラフである。
【図１２】図１２は、基板に細胞非接着性材料のパターン及び細胞接着性材料のパターンを配置し、細胞を配置する手順を説明する模式図である。
【図１３】図１３（ａ）〜（ｄ）は、実験例３で撮影した顕微鏡写真である。
【図１４】図１４は、実験例４で撮影した蛍光顕微鏡写真である。
【図１５】図１５（ａ）〜（ｅ）は、実験例５の手順を説明する模式図である。
【図１６】図１６（ａ）〜（ｄ）は、実験例６における細胞の配置を示す模式図である。
【図１７】図１７（ａ）は、実験例７で作製した神経回路モデルにおける、細胞非接着性材料及び神経細胞の配置パターンを示す模式図である。図１７（ｂ）は、実験例７において、細胞インクを吐出した直後の神経回路モデルの代表的な顕微鏡写真である。
【図１８】図１８は、実験例７で作製した神経回路モデルの蛍光顕微鏡写真である。
【図１９】図１９（ａ）及び（ｂ）は、実験例８で基板上に配置した細胞非接着性材料のパターンを示す図である。
【図２０】図２０（ａ）及び（ｂ）は、実験例８で撮影した蛍光顕微鏡写真である。
【図２１】図２１（ａ）及び（ｂ）は、実験例９で撮影した顕微鏡写真である。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
以下、場合により図面を参照しつつ、本発明の実施形態について詳細に説明する。なお、図面中、同一又は相当部分には同一又は対応する符号を付し、重複する説明は省略する。なお、各図における寸法比は、説明のため誇張している部分があり、必ずしも実際の寸法比とは一致しない。
【０００９】
［神経細胞が配置された基板の製造方法］
１実施形態において、本発明は、細胞接着性材料が配置された領域と、細胞非接着性材料が配置された領域とを有する基板上に、神経細胞を含む複数の液滴をインクジェット法により配置して、１つ又は複数の液溜りを形成する工程と、前記液溜り内の前記神経細胞が沈降し、前記基板上に仮接着して細胞集合体を形成するまで静置する工程と、を含み、前記液溜り１つあたりの直径が５００μｍ以下であり、前記液溜り１つあたりの神経細胞の密度が１０５個／ｃｍ２以上である、神経細胞が配置された基板の製造方法を提供する。
【００１０】
実施例において後述するように、発明者らは、基板上に配置された液溜り１つあたりの直径が５００μｍ以下であり、且つ、当該液溜り中の神経細胞の密度が１０５個／ｃｍ２以上であると、神経細胞の遊走が抑制され、神経細胞を基板上に精密に配置できることを明らかにした。また、インクジェット法により、細胞を含む液滴を基板上に吐出することにより、細胞を数個単位でマイクロメートルオーダーの微細な領域に安定して配置することができる。
【００１１】
液溜り１つあたりの直径は、４００μｍ以下であってもよく、３００μｍ以下であってもよく、２００μｍ以下であってもよい。液溜りの直径を小さくすると、高価な細胞の使用量を減らすことが容易となるため好ましい。
【００１２】
ここで、液滴とは、インクジェット法によりインクジェットヘッドから吐出される液滴をいう。また、液溜りとは、インクジェットヘッドから吐出された複数の液滴が基板上に着弾して形成された液滴をいう。また、液溜り１つあたりの直径とは、１つの液溜りが基板と接する領域の直径をいう。液溜りが基板と接する領域が円形でない場合には、液溜りが基板と接する領域と同面積の円を仮定し、その直径をいうものとする。また、液溜り１つあたりの神経細胞の密度とは、１つの液溜りが、基板と接する面積あたりの細胞数をいう。
【００１３】
上記の液滴は、液滴１つあたり１〜５０個の神経細胞を含むことが好ましい。また、液溜り１つあたりに含まれる神経細胞の数は７〜１０，０００個程度であることが好ましい。液溜り１つあたりに含まれる神経細胞の数は、７個以上であってもよく、３０個以上であってもよく、７０個以上であってもよい。また、液溜り１つあたりに含まれる神経細胞の数は１００個以下であってもよく、７０個以下であってもよく、３０個以下であってもよい。これらの上限と下限は任意に組み合わせることができる。
【００１４】
基板としては、細胞の培養に用いることができるものであれば特に限定されず、基板の材質としては、例えば、以下に記載の有機材料や無機材料が挙げられる。これらは１種を単独で使用してもよく、２種以上を併用して使用してもよい。
【００１５】
有機材料としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ＴＡＣ（トリアセチルセルロース）、ポリイミド（ＰＩ）、ナイロン（Ｎｙ）、低密度ポリエチレン（ＬＤＰＥ）、中密度ポリエチレン（ＭＤＰＥ）、塩化ビニル、塩化ビニリデン、ポリフェニレンサルファイド、ポリエーテルサルフォン、ポリエチレンナフタレート、ポリプロピレン、ウレタンアクリレート等のアクリル系材料、セルロース、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）等のシリコーン系材料、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、アルギン酸カルシウム等のアルギン酸金属塩、ポリアクリルアミド、メチルセルロース、アガロース等のゲル状材料等が挙げられる。
【００１６】
無機材料としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ガラス、セラミックス等が挙げられる。
【００１７】
基板の構造としては、細胞の培養に用いることができるものであれば特に限定されず、例えば多孔質構造や無孔構造が挙げられる。基板は多孔質構造を有するものであってもよく、無孔の平板部材に多孔質部材が積層されたものであってもよい。
【００１８】
多孔質構造の細孔の大きさや形に限定はなく、例えばメッシュ構造、凹凸構造、ハニカム構造等であってもよい。多孔質構造は、細胞非接着性材料又は細胞接着性材料が固定される表面積が大きくなる点、また、多量の溶液を保持することができ、乾燥を抑制できる点で、基板の構造として好ましい。
【００１９】
基板として多孔質構造を有する基板を用い、予め基板に培地等の液体を保持させた上で液溜りを形成すると、上記の多孔質構造により液体が保持されるため、液溜りの乾燥を抑制することができる。
【００２０】
また、乾燥した基板に液滴を吐出して液溜りを形成する場合には、液溜り中の液体の蒸発を抑制する工程（乾燥抑制工程）を実施することにより、液溜りの形状維持及び細胞の基板上への接着を安定して実現することが可能となる。
【００２１】
乾燥抑制工程としては、例えば、（ｉ）液溜り付近を高湿度化する工程、（ｉｉ）液体の蒸発を抑制する流体を基板上に配置した後に液溜りを形成する工程（ここで、液体の蒸発を抑制する流体としては、オイル、培地、緩衝液等が挙げられる。）、（ｉｉｉ）基板上に液溜りを形成した後に、液体の蒸発を抑制する流体（例えばオイル等）で、液溜りを被覆する工程、等が挙げられる。
【００２２】
高湿度化による蒸発抑制を行う場合、周囲への影響を最小に留めるために局所的な湿度制御を行うことが好ましい。また、乾燥抑制にオイルを使用する場合には、細胞への影響を抑える点で生体適合性があるオイルを使用することが好ましい。
【００２３】
本実施形態の製造方法は、細胞集合体が形成された基板に培地を供給する工程を更に含んでいてもよい。培地としては、使用する細胞に適したものを適宜選択して用いることができる。具体的な培地としては、例えば、ダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ、ＤＭＥＭ）、ハムＦ１２培地（Ｈａｍ’ｓ  Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  Ｆ１２）、Ｄ−ＭＥＭ／Ｆ１２培地、マッコイ５Ａ培地（ＭｃＣｏｙ’ｓ  ５Ａ  ｍｅｄｉｕｍ）、イーグルＭＥＭ培地（Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ、ＥＭＥＭ）、αＭＥＭ培地（ａｌｐｈａ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ、αＭＥＭ）、ＭＥＭ培地（Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ）、ＲＰＭＩ１６４０（Ｒｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ−１６４０）培地、イスコフ改変ダルベッコ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ、ＩＭＤＭ）、ＭＣＤＢ１３１培地、ウィリアム培地Ｅ、ＩＰＬ４１培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、Ｍ１９９培地、高性能改良１９９培地（Ｈｉｇｈｔ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｍｅｄｉｕｍ  １９９）、ＳｔｅｍＰｒｏ３４（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）、Ｘ−ＶＩＶＯ  １０（Ｃｈｅｍｂｒｅｘ社製）、Ｘ−ＶＩＶＯ  １５（Ｃｈｅｍｂｒｅｘ社製）、ＨＰＧＭ（Ｃｈｅｍｂｒｅｘ社製）、ＳｔｅｍＳｐａｎ  Ｈ３０００（ステムセルテクノロジーズ社製）、ＳｔｅｍＳｐａｎＳＦＥＭ（ステムセルテクノロジーズ社製）、ＳｔｅｍｌｉｎｅＩＩ（シグマ−アルドリッチ社製）、ＱＢＳＦ−６０（Ｑｕａｌｉｔｙ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社製）、ＳｔｅｍＰｒｏｈＥＳＣＳＦＭ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ８（登録商標）培地（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）、ｍＴｅＳＲ１又はｍＴｅＳＲ２培地（ステムセルテクノロジーズ社製）、ＲｅｐｒｏＦＦ又はＲｅｐｒｏＦＦ２（リプロセル社製）、ＰＳＧｒｏ  ｈＥＳＣ／ｉＰＳＣ培地（Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）、ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ（登録商標）培地（バイオロジカルインダストリーズ社製）、ＣＳＴＩ−７培地（細胞科学研究所社製）、ＭｅｓｅｎＰＲＯ  ＲＳ培地（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）、ＭＦ−Ｍｅｄｉｕｍ（登録商標）間葉系幹細胞増殖培地（東洋紡株式会社製）、Ｓｆ−９００ＩＩ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）、Ｏｐｔｉ−Ｐｒｏ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）等が挙げられる。
【００２４】
これらは、１種を単独で使用してもよく、２種以上を混合して使用してもよい。特に、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地の場合、ＤＭＥＭ培地とＦ１２培地を６：４〜４：６の範囲の質量比で混合することが好ましい。
【００２５】
また、培地に添加剤を添加してもよい。添加剤としては、神経細胞の培養に通常用いられるものが挙げられ、例えば、ＳＭ１サプリメント（ステムセルテクノロジーズ社）、Ｎ２サプリメントＡ（ステムセルテクノロジーズ社）、ラットアストロサイト培養上清（富士フイルム和光純薬）、ヒトアストロサイト培養上清（サイエンセルリサーチ社）、Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  Ｎ（Ｅｌｉｘｉｒｇｅｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  Ｇ２（Ｅｌｉｘｉｒｇｅｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  Ｐ（Ｅｌｉｘｉｒｇｅｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、Ｎ２  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）、ｉＣｅｌｌ  Ｎｅｕｒａｌ  ＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔＢ（ＣＤＩ社）、ｉＣｅｌｌ  Ｎｅｕｖｏｕｓ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ，Ｂ−２７  ｐｌｕｓ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）等が挙げられる。
【００２６】
また、本実施形態の製造方法は、液溜りを形成する工程において液溜りを複数形成し、静置する工程において細胞集合体を複数形成し、培地が供給された基板をインキュベートして、少なくとも２つの前記細胞集合体を機能的に結合させる工程を更に含んでいてもよい。
【００２７】
基板上に液溜りが複数形成される場合、それぞれの液溜り中で細胞集合体が形成される。そして、これらの細胞集合体に培地を供給してインキュベートした結果、これらの少なくとも２つの細胞集合体が機能的に結合すると、神経回路モデルを製造することができる。ここで、細胞集合体同士が機能的に結合するとは、神経細胞が軸索と呼ばれる突起を伸ばし、別の神経細胞の樹状突起との間でシナプス結合を形成することをいう。この結果、神経回路が形成される。
【００２８】
神経細胞は、例えば末梢神経と中枢神経に大別することもできる。末梢神経としては、例えば、感覚神経細胞、運動神経細胞、自律神経細胞が挙げられる。中枢神経としては、例えば、介在神経細胞、投射ニューロンが挙げられる。投射ニューロンとしては、例えば、皮質ニューロン、海馬ニューロン、扁桃体ニューロン等が挙げられる。また、中枢神経細胞は、興奮性ニューロンと抑制性ニューロンとに大別することもできる。中枢神経系で主に興奮性伝達を担うグルタミン酸作動性ニューロン、主に抑制性伝達を担うＧＡＢＡ（γ−ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃ  ａｃｉｄ）作動性ニューロン等が挙げられる。
【００２９】
その他、神経調節物質を放出するニューロンとして、コリン作動性ニューロン、ドーパミン作動性ニューロン、ノルアドレナリン作動性ニューロン、セロトニン作動性ニューロン、ヒスタミン作動性ニューロン等が挙げられる。
【００３０】
本実施形態の製造方法において、神経細胞が配置された基板上には、神経細胞以外の細胞を含む細胞集合体が更に配置されていてもよい。神経細胞が含まれる細胞集合体以外の細胞集合体は、神経細胞からの伝達シグナルを受信可能な細胞を含んでいてもよい。神経細胞からの伝達シグナルを受信可能な細胞としては、例えば神経細胞、筋細胞等が挙げられる。筋細胞としては、例えば、心筋細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞等が挙げられる。これらの細胞は、１種を単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００３１】
本実施形態の製造方法において、神経細胞は、初代培養細胞であってもよく、継代培養細胞であってもよく、株化された細胞であってもよく、不死化細胞であってもよく、各種遺伝子編集を施した神経細胞であってもよい。また、所望の神経細胞を多く含む細胞集団を得やすいという観点から、幹細胞から分化誘導された神経細胞であってもよい。
【００３２】
幹細胞としては、例えば、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞、間葉系幹細胞、臍帯血由来幹細胞、神経幹細胞等が挙げられる。人工多能性幹細胞としては、例えば、核移植胚性幹細胞（ｎｔＥＳ細胞）、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）等が挙げられる。間葉系幹細胞としては、例えば、骨髄間葉系幹細胞、脂肪組織由来間葉系幹細胞等が挙げられる。中でも、幹細胞としては、ｉＰＳ細胞が好ましい。
【００３３】
ｉＰＳ細胞は健常者由来のものであってもよく、各種神経系の疾患を有する患者由来のものであってもよい。また、各種遺伝子編集が施されたものであってもよく、例えば、遺伝子編集を施し各種神経系の疾患の原因又はリスク因子となる遺伝子を持つ細胞であってもよい。
【００３４】
ｉＰＳ細胞が各種神経系の疾患を有する患者由来の細胞である場合には、当該神経系の疾患モデルを構築するために利用することができる。神経系の疾患としては、特別に限定されないが、例えば、神経変性疾患、自閉症、てんかん、注意欠陥−多動性障害（Ａｔｔｅｎｔｉｏｎ−ｄｅｆｉｃｉｔ  ｈｙｐｅｒａｃｔｉｖｉｔｙ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ、ＡＤＨＤ）、統合失調症、双極性障害等が挙げられる。神経変性疾患としては、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症等が挙げられる。
【００３５】
神経細胞の由来となる動物種は、特に限定されず、例えば、ヒト、サル、イヌ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ウサギ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター等が挙げられる。中でも、ヒトが好ましい。
【００３６】
本実施形態の製造方法において、神経細胞は、生体から採取されたものであってもよく、株化され培養されたものであってもよく、幹細胞から分化誘導されたものであってもよい。
【００３７】
複数の種類の神経細胞を用いて神経回路モデルを製造する場合、１つの細胞集合体は１種類の神経細胞を含むことが好ましい。また、複数の細胞集合体のそれぞれは、目的に応じて異なる種類の神経細胞を含んでいてもよい。
【００３８】
以下、神経細胞を含む液滴を基板上に配置して、１つ又は複数の液溜りを形成する工程を説明する。本工程は、少なくとも神経細胞及び細胞乾燥抑制剤を含有する細胞懸濁液（細胞インク）を、インクジェット方式により液滴として吐出することにより行う。
【００３９】
インクジェット方式による液滴吐出手段としては、例えば、細胞インクを加圧する圧力発生手段として圧電素子を用いて細胞懸濁液の容積を変化させて液滴を吐出させる、いわゆるピエゾ方式（例えば、特公平２−５１７３４号公報参照）、発熱抵抗体を用いて細胞インクを加熱して気泡を発生させる、いわゆるサーマル方式（例えば、特公昭６１−５９９１１号公報参照）、振動板と電極とを対向配置し、振動板と電極との間に発生させる静電力によって振動板を変形させることで、細胞インクの容積を変化させて液滴を吐出させる静電方式（例えば、特開平６−７１８８２号公報参照）等が挙げられる。
【００４０】
（インクジェットヘッド）
神経細胞及び細胞乾燥抑制剤を含有する細胞インクを液滴として吐出するために使用するインクジェットヘッドの具体的態様について、以下説明する。図１は、インクジェットヘッドの一例を示す概略図である。図１では、圧力発生手段として圧電素子を用いている。図２及び図３は、インクジェットヘッドへの入力波形の一例を示す概略図である。
【００４１】
液滴吐出ヘッド１０は、細胞インク１１を保持する液室１２と、ノズル１５と、膜状部材のメンブレン１３と、メンブレン１３に振動を与える加振部１６と、加振部１６を振動させるため、加振部１６に特定の駆動信号として電圧を与える駆動部１４とを有する。
【００４２】
液室１２には、液室内を大気に開放するための大気開放部１７が設けられている。液滴吐出ヘッド１０は、細胞インクに振動を与えることで、ノズルから細胞インクの液滴が吐出される。
【００４３】
駆動部１４は、駆動信号として吐出波形Ｐｊを加振部１６に加えることができるようになっており、メンブレン１３の振動状態を制御することによって液室１２に保持された細胞インク１１を液滴状に吐出させることが可能となっている。吐出波形Ｐｊは、メンブレン１３を共振させて、細胞インク１１をより少ない電圧で吐出させるために、メンブレン１３の固有振動周期Ｔｏを含む駆動信号に設定するとよい。吐出波形Ｐｊは、三角波、正弦波のみでなく、ローパスフィルタにかけてエッジを緩やかにした三角波も用いることができる。更に、駆動部１４は、駆動信号として液滴吐出後のメンブレン残留振動を抑制する免振波形Ｐｓを加振部１６に加えることができるようになっている。これによって、液滴形成後のメンブレン残留振動が早く抑制されることにより、より高周波な連続吐出が可能となる。更に、サテライトやミストが減少することにより、液滴のより微小な量の制御が可能になる。免振波形Ｐｓは、三角波、正弦波のみでなく、ローパスフィルタにかけてエッジを緩やかにした三角波も用いることができる。
【００４４】
液室１２に保持される細胞インク１１の量は特に制限されず、例えば、１μＬから１ｍＬ程度の液を保持することが可能である。特に、細胞を分散させた細胞インクのように高価な液を使用する際には、少量の液量で液滴形成ができるようになっていることが好ましく、１μＬから５０μＬ程度の液量を保持することができる構成であるとよい。
【００４５】
メンブレン１３の形状としては、円形であっても、楕円状や四角形であってもよい。メンブレン１３の材質は、特に制限されないが、柔らかすぎるとメンブレンが簡単に振動してしまい、液滴が吐出しないときに直ちに振動を抑えることが困難となるため、ある程度の硬さがある材質であるとよい。メンブレン１３の材質としては、例えば、金属材料、セラミック材料、ある程度の硬さのある高分子材料等を用いることができる。
【００４６】
ノズル１５は、メンブレン１３の中心に実質的に真円状の貫通孔として形成されていることが好ましい。加振部１６としては、例えば、圧電素子が挙げられる。電圧を印加することによって紙面横方向に圧縮応力が加わりメンブレン１３を変形させることができる。圧電素子の材料としては、例えば、一般的に使用されているジルコン酸チタン酸鉛を用いることができる。この他にも、ビスマス鉄酸化物、ニオブ酸金属物、チタン酸バリウム、あるいはこれらの材料に金属や異なる酸化物を加えたもの等、様々な圧電材料を用いることができる。
【００４７】
メンブレン１３を変形させるためのメンブレン１３に振動を与える手段としては、圧電素子に限られず、例えば、メンブレン１３上にメンブレンとは異なる線膨張係数が異なる材料が貼り付けられており、加熱することによって線膨張係数の差を利用してメンブレン１３を変形させることも可能である。このとき、例えば、線膨張係数の異なる材料にはヒーターが形成されており、通電によってヒーターが加熱し、メンブレン１３が変形できるようになっている。
【００４８】
（細胞インク）
続いて、細胞インクについて説明する。細胞インクは、少なくとも神経細胞及び細胞乾燥抑制剤を含有する。更に、細胞懸濁液（細胞インク）は、細胞を分散させる分散媒を含有し、必要に応じて、分散剤、ｐＨ調整剤等のその他の添加材料を含有してもよい。神経細胞については上述したものと同様である。
【００４９】
細胞乾燥抑制剤とは、細胞の表面を覆い、細胞の乾燥を抑制する機能を有するものであり、例えば、多価アルコール類、ゲル状多糖類、及び、細胞外基質から選ばれるタンパク質等が挙げられる。
【００５０】
多価アルコールとしては、細胞へダメージを与えなければ特に制限はなく、例えば、グリセリン、ジグリセリン、ジエチレングリコール、１，３−ブタンジオール、１，２，３−ブタントリオール、１，２，４−ブタントリオール、トリエチレングリコール、テトラエチレングリコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなどが挙げられる。これらは、１種を単独で使用してもよいし、２種以上を混合して使用してもよい。これらの中でも、グリセリンが好ましい。グリセリンは、細胞への毒性が低く、低添加量であっても乾燥を抑制する効果が期待できる。
【００５１】
ゲル状多糖類とは、ゲル状態となっている多糖類をいう。ゲル状多糖類としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、アルギン酸カルシウム、ジェランガム、アガロース、グァーガム、キサンタンガム、カラギーナン、ペクチン、ローカストビーンガム、タマリンドガム、ダイユータンガム、カルボキシメチルセルロース等が挙げられる。これらは、１種を単独で使用してもよいし、２種以上を混合して使用してもよい。これらの中でも、アルギン酸カルシウムが好ましい。アルギン酸カルシウムは、アルギン酸のカルボキシル基にカルシウムイオンが結合した塩であり、カルシウムイオンは２価であるため、２つのカルボキシル基にまたがる形で結合（イオン架橋）して増粘することにより、細胞インクの乾燥を抑制することができる。このときカルシウムイオンは分散媒中に含まれており、乾燥による濃縮で過剰になったカルシウムイオンと結合すると考えられ、浸透圧を調整する役割も期待できる。
【００５２】
細胞外基質から選ばれるタンパク質としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、エラスチン、フィブリン等が挙げられる。これらは、１種を単独で使用してもよいし、２種以上を混合して使用してもよい。これらの中でも、コラーゲンが好ましい。コラーゲンには多様な種類が存在するが、濃度や温度によって増粘することが知られており、細胞インク中に含ませることで、濃度が上昇した際に増粘させることができる。
【００５３】
分散媒としては、細胞培養用の培地や緩衝液が好ましい。培地については上述したものと同様である。緩衝液は、ｐＨを調整するためのものであり、公知のものを適宜選択して使用することができる。
【００５４】
基板上に配置された液溜りは微小量であるため、数十秒から数分で液溜り中の液体の蒸発が進行し、液溜り内の成分濃度が急激に上昇してしまう。この濃度変化に起因する浸透圧等の急激な変化によって、液溜り内の細胞にダメージを与えてしまい、最悪の場合、細胞死に至る。したがって、下記のような方法により液溜り中の液体の蒸発を抑制することが好ましい。
【００５５】
例えば、基板として多孔質構造を有する基板を用い、予め基板に培地等の液体を保持させた上で液溜りを形成すると、上記の多孔質構造により液体が保持されるため、液溜りの乾燥を抑制することができる。
【００５６】
また、乾燥した基板に液滴を吐出して液溜りを形成する場合には、液溜り中の液体の蒸発を抑制する工程（乾燥抑制工程）を実施することにより、液溜りの形状維持及び細胞の基板上への接着を安定して実現することが可能となる。乾燥抑制工程としては、上述したものと同様の工程が挙げられる。
【００５７】
（液滴を配置する工程）
続いて、基板上に、細胞を含む１つ又は複数の液滴を配置して１つ又は複数の液溜りを形成する工程について説明する。液滴を配置する工程では、細胞インクの液滴を基板上の目的の位置に吐出する。神経細胞を含む液滴は、基板上の１か所に配置されてもよいし、基板上の複数の位置に配置されてもよい。インクジェットヘッドから吐出される細胞インクの複数の液滴が基板上の１か所に配置され、１つの液溜りが形成される。
【００５８】
液滴を吐出するタイミングを調整することにより、細胞接着性材料が配置された領域（細胞接着部）に接着される細胞の位置を調整することができる。また、その際の細胞インクの吐出量（液滴数や液滴量）や細胞濃度を調整することにより、基板上に配置する細胞の数を調整することができる。
【００５９】
基板上に配置された液溜り内の細胞は、沈降し、基板上に仮接着して細胞集合体を形成する。インクジェット法によれば、細胞インクの液滴が手技に比べて非常に小さいため、細胞が基板上に仮接着するまでの時間が非常に短時間である。また、インクジェット法により液滴を配置することにより、神経細胞を所定の位置に配置する、細胞パターンの形状精度が高い。所定の位置に所定数の神経細胞を配置できる確率、あるいは配置した細胞数が所望の数となっている確率が高く、所望の数の神経細胞を配置する精度が高い。また、配置された神経細胞の所定時間経過後における生存率も高い。
【００６０】
（液滴配置装置）
以下、基板上に液滴を配置する装置（以下、「液滴配置装置」という場合がある。）の具体的態様について説明する。しかし、本発明は、これらの実施態様に何ら限定されるものではない。
【００６１】
液滴配置装置は、ステージ部と、細胞インクの液滴を吐出する液滴吐出手段であるインクジェットヘッドを有する。ステージ部は、基板を保持する。液滴吐出ヘッドの構成は、上述したインクジェットヘッドと同様である。
【００６２】
図４から図７に、インクジェットヘッドを搭載した液滴配置装置の一例を示す。図４に示す液滴配置装置４００は、ステージ部３１と、インクジェットヘッド２１とを有する。インクジェットヘッド２１は、上述したように、液室部２５、加振部２７、駆動部２６、及び、メンブレン２８を有する。また、インクジェットヘッド２１には、大気開放部２４が形成されている。
【００６３】
液滴配置装置は、細胞インクだけでなく、細胞非接着性材料又は細胞接着性材料を含む溶液の液滴も吐出できる構成としてもよい。図５に示す液滴配置装置５００は、細胞インクの液滴を吐出するインクジェットヘッド２１の他に、細胞非接着性材料又は細胞接着性材料を含む溶液の液滴を吐出するインクジェットヘッド２３を備える。インクジェットヘッド２３の基本構成は、インクジェットヘッド２１と同様である。図５において、符号２９は駆動部を、符号３０は細胞非接着性材料又は細胞接着性材料の溶液を保持する液室を示す。インクジェットヘッド２３は、インクジェットヘッド２１と同様に、図示しない加振部やメンブレンを有する。
【００６４】
液滴配置装置では、２種類以上の細胞を含む液滴を配置することもできる。図６に示す液滴配置装置６００は、細胞インクの液滴を吐出するインクジェットヘッド２１を複数備えることができる。図６では、インクジェットヘッド２１、及び、インクジェットヘッド２１と同じ構成のインクジェットヘッド２２を備えた例を示す。また、図７に、インクジェットヘッド２１及び２２に加え、インクジェットヘッド２３も備えた液滴配置装置７００を示す。液滴配置装置は、上述した構成のほかにも、インクジェットヘッドを保持する保持部や、ステージとインクジェットヘッドの相対位置を制御する機構部等を備えていてもよい。
【００６５】
神経細胞を配置する基板は、細胞接着性材料が配置された領域と、細胞非接着性材料が配置された領域とを有する。本明細書において、細胞接着性材料が配置された領域を細胞接着部という場合がある。また、細胞非接着性材料が配置された領域を細胞非接着部という場合がある。実施例において後述するように、表面に細胞非接着性材料のパターンを配置することにより、神経細胞を配置した場合の軸索伸長をより柔軟に制御することが可能になる。
【００６６】
基板に細胞非接着性材料が配置されていることにより、細胞の成長方向を規定することができる。また、基板に細胞非接着性材料が配置されていることにより、複数種類の細胞を互いに混ざり合うことなく配置することができる。ここで、複数種類の細胞をインクジェット法により配置する場合、細胞同士のコンタミネーションを避ける観点から、細胞インクの液滴を吐出するインクジェットヘッドは、細胞１種類に対して１つ用意することが好ましい。
【００６７】
細胞非接着性材料のパターンは、細胞非接着性材料が配置された領域と、細胞非接着性材料が配置されていない領域とを有し、細胞非接着性材料が配置されていない領域が、線状形状（線状）を有していてもよい。この場合、線状形状の幅が１００μｍ以下であることが好ましい。
【００６８】
線状形状の幅が１００μｍ以下であると、細胞非接着性材料が配置されていない線状形状に沿って軸索を伸長させることができる。つまり、２つの線状形状の細胞非接着性材料のパターンで挟まれた領域を、軸索が伸長する経路にすることができる。
【００６９】
細胞を配置する基板は、表面に細胞非接着性材料のパターンを配置されているだけでなく、表面に細胞接着性材料のパターンが更に配置されている。細胞インクの液滴は、前記細胞接着性材料に接して配置されてもよい。細胞インクの液滴が、細胞接着性材料に接して配置され、基板上に配置された細胞インクの液溜りが基板と接する面積よりも、細胞接着性材料のパターンの面積の方が小さい場合、液滴に含まれた細胞は、沈降して基板上に仮接着した後、細胞接着性材料のパターン上に移動して集合する傾向がある。したがって、基板上に細胞接着性材料のパターンを配置することによって、細胞の配置を制御することができる。
【００７０】
（細胞非接着性材料）
細胞非接着性材料としては、例えば、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、アルギン酸金属塩（アルギン酸カルシウム等）のゲル、ポリヒドロキシエチルメタアクリレート（ｐＨＥＭＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、これらの誘導体等が挙げられる。
【００７１】
ここで、細胞非接着性材料がポリエチレングリコールである場合について説明する。この場合、例えば、ポリエチレングリコールを骨格とし、側鎖及び／又は末端に１以上の求核性官能基又は求電子性官能基のいずれか一方の官能基を有する多分岐型ポリマーを含む第１溶液と、ポリエチレングリコールを骨格とし、側鎖及び／又は末端に１以上の求核性官能基又は求電子性官能基の他方の官能基を有する多分岐型ポリマーを含む第２溶液とを接触させることにより、これらが架橋して細胞非接着性材料のパターンを形成することができる。
【００７２】
「ポリエチレングリコールを骨格とする多分岐型ポリマー」（以下、単に「多分岐型ポリマー」又は「Ｍｕｌｔｉ−Ａｒｍ  ＰＥＧ」という場合がある。）は、ゲル化材として用いられるポリマーである。複数のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分岐の末端に、求核性官能基と求電子性官能基をそれぞれ有する２種類のＭｕｌｔｉ−Ａｒｍ  ＰＥＧが、互いに架橋し合うことで、網目構造ネットワークを有するゲル（Ｍｕｌｔｉ−Ａｒｍ  ＰＥＧゲル）を形成することができる。
【００７３】
例えば、４つのＰＥＧ分岐の末端に求核性官能基と求電子性官能基をそれぞれ有する２種類の四分岐型ポリマー（以下、「Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ」という場合がある。）の場合であれば、均一な網目構造ネットワークを有する「Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧゲル」と称されるゲルを形成できる。
【００７４】
多分岐型ポリマーの分岐数は特に限定はされない。通常は求電子末端と求核末端を含む３分岐以上のＰＥＧであれば問題はなく、必要に応じて適宜選択することができる。求核性官能基と求電子性官能基をそれぞれ有していれば、Ｍｕｌｔｉ−Ａｒｍ  ＰＥＧを構成する２以上のＰＥＧは、それぞれ異なる分岐数を有していてもよい。Ｍｕｌｔｉ−Ａｒｍ  ＰＥＧの中でも、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧゲルは、理想的な均一網目構造を有することが知られている。
【００７５】
また、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧゲルは、第１溶液及び第２溶液に含まれる２種類のＴｅｔｒａ−ＰＥＧの単純な混合によって、その場で簡便かつ短時間で形成可能であり、さらに各Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧのｐＨや濃度を調節することで、ゲル化時間を制御することもできる。加えて、ＰＥＧを主成分とするため、生体適合性にも優れている。細胞とＴｅｔｒａ−ＰＥＧを含む溶液を液滴吐出装置で吐出し、２種類のＴｅｔｒａ−ＰＥＧを反応させて、Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧゲルを造形することで、細胞を三次元に配置することが可能になる。
【００７６】
Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧは、一実施形態として、以下の一般式（１）で表される構造を有する化合物であってよい。
【００７７】
【化１】
2022002504.tif 000002
【００７８】
上記式（１）中のｍは、それぞれ同一であってもよく、異なっていてもよい。ｍの値が近いほど均一な立体構造をとることができ、ゲルが高強度となる。このため、高強度のゲルを得るためには、同一であることが好ましい。ｍの値が高すぎるとゲルの強度が弱くなり、各ｍの値が低すぎると化合物の立体障害によりゲルが形成されにくい。そのため、各ｍとしては、２５〜２５０の整数値が挙げられ、３５〜１８０が好ましく、５０〜１１５がさらに好ましく、５０〜６０が特に好ましい。そして、その分子量としては、５×１０３〜５×１０４  Ｄａが挙げられ、７．５×１０３〜３×１０４  Ｄａが好ましく、１×１０４〜２×１０４  Ｄａがより好ましい。
【００７９】
上記式（１）中、Ｘ１は、官能基とコア部分を繋ぐリンカー部位である。各Ｘ１は、それぞれ同一であっても異なっていてもよいが、均一な立体構造を有する高強度なゲルを製造するためには同一であることが好ましい。Ｘ１は、Ｃ１−Ｃ７アルキレン基、Ｃ２−Ｃ７アルケニレン基、−ＮＨ−Ｒａ−、−ＣＯ−Ｒａ−、−Ｒｂ−Ｏ−Ｒｃ−、−Ｒｂ−ＮＨ−Ｒｃ−、−Ｒｂ−ＣＯ２−Ｒｃ−、−Ｒｂ−ＣＯ２−ＮＨ−Ｒｃ−、−Ｒｂ−ＣＯ−Ｒｃ−、又は、−Ｒｂ−ＣＯ−ＮＨ−Ｒｃ−を示す。ここで、ＲａはＣ１−Ｃ７アルキレン基を示し、ＲｂはＣ１−Ｃ３アルキレン基を示し、ＲｃはＣ１−Ｃ５アルキレン基を示す。
【００８０】
「Ｃ１−Ｃ７アルキレン基」とは、分岐を有してもよい炭素数が１以上７以下のアルキレン基であって、直鎖Ｃ１−Ｃ７アルキレン基、又は、１又は２以上の分岐を有するＣ２−Ｃ７アルキレン基（分岐を含めた炭素数が２以上７以下）を含む。Ｃ１−Ｃ７アルキレン基の例は、メチレン基、エチレン基、プロピレン基、ブチレン基である。Ｃ１−Ｃ７アルキレン基の例は、−ＣＨ２−、−（ＣＨ２）２−、−（ＣＨ２）３−、−ＣＨ（ＣＨ３）−、−（ＣＨ（ＣＨ３））２−、−（ＣＨ２）２−ＣＨ（ＣＨ３）−、−（ＣＨ２）３−ＣＨ（ＣＨ３）−、−（ＣＨ２）２−ＣＨ（Ｃ２Ｈ５）−、−（ＣＨ２）６−、−（ＣＨ２）２−Ｃ（Ｃ２Ｈ５）２−、及び、−（ＣＨ２）３Ｃ（ＣＨ３）２ＣＨ２−等が挙げられる。
【００８１】
「Ｃ２−Ｃ７アルケニレン基」とは、鎖中に１個若しくは２個以上の二重結合を有する直鎖状又は分枝鎖状の炭素原子数２〜７個のアルケニレン基である。例えば、アルキレン基から隣り合った炭素原子の水素原子の２〜５個を除いてできる二重結合を有する２価基が挙げられる。
【００８２】
上記式（１）中、Ｙ１は、上述のように、共有結合による架橋反応であるクロスエンドカップリング反応によって網目構造ネットワークを形成させるための官能基であって、求核性官能基又は求電子性官能基から選択される。
【００８３】
「求核性官能基」としては、限定されないが、例えば、ゲル化時間を短くできる観点からチオール基が好ましい。当該官能基は、それぞれ同一であっても、異なっていてもよいが、同一であることが好ましい。官能基が同一であることによって、架橋反応の対象となる求核性官能基との反応性が均一になり、均一な立体構造を有する高強度のゲルを得やすくなる。以下、求核性官能基を有するＴｅｔｒａ−ＰＥＧを「求核性Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ」という場合がある。
【００８４】
「求電子性官能基」としては、限定されないが、例えば、ゲル化時間を短くできる観点からマレイミジル基が好ましい。当該官能基は、それぞれ同一であっても、異なっていてもよいが、同一であることが好ましい。官能基が同一であることによって、架橋反応の対象となる求核性官能基との反応性が均一になり、均一な立体構造を有する高強度のゲルを得やすくなる。以下、求電子性官能基を有するＴｅｔｒａ−ＰＥＧを「求電子性Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ」という場合がある。
【００８５】
求核性官能基と求電子性官能基のモル比は、０．５：１〜１．５：１となるように求核性Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧと求電子性Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧを混合すればよい。当該官能基はそれぞれ１：１で反応して架橋し得るので、混合モル比は１：１に近いほど好ましいが、高い強度のハイドロゲルを形成させるには０．８：１〜１．２：１が好ましい。また、第１又は第２溶液中の分散媒のｐＨが５〜１０のとき各溶液に含有されるＴｅｔｒａ−ＰＥＧの濃度は０．３〜２０％の範囲であればよく、ｐＨ６〜１０のときは１．７〜２０％の範囲が好ましい。
【００８６】
第１溶液が求核性Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ又は求電子性Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧのいずれか一方のＴｅｔｒａ−ＰＥＧで構成され、第２溶液が他方のＴｅｔｒａ−ＰＥＧで構成されていてもよい。
【００８７】
《第１溶液》
「第１溶液」とは、少なくとも側鎖及び／又は末端に１以上の、求核性官能基を有するポリエチレングリコール又は求電子性官能基を有するポリエチレングリコールのいずれか一方を骨格とする多分岐型ポリマー、及び、分散媒を構成要素として包含する水溶液であって、必要に応じて、細胞や細胞作用添加物を含むことができる。
【００８８】
第１溶液は複数種存在してもよい。その場合、各第１溶液に含まれる側鎖及び／又は末端に１以上の、求核性官能基を有するポリエチレングリコール又は求電子性官能基を有するポリエチレングリコールのいずれか一方を骨格とする多分岐型ポリマー、分散媒、細胞、及び細胞作用添加物は、その全部又は一部が異なっていてもよい。例えば、第１溶液ａに含まれる分散媒と第１溶液ｂに含まれる分散媒は、同一であってもよいし、異なっていてもよい。第１溶液が複数種存在する場合、例えば、ハイドロゲルを積層形成させる際に、各層において分散媒を任意に変更することができる。
【００８９】
《第２溶液》
「第２溶液」とは、ポリエチレングリコールを骨格とし、その側鎖及び／又は末端に１以上の第１溶液とは異なる方の官能基（求核性官能基又は求電子性官能基）を有する多分岐型ポリマー、及び分散媒を必須の構成要素として包含する水溶液であって、必要に応じて、細胞や細胞作用添加物を含むことができる。
【００９０】
第２溶液は複数種存在してもよい。その場合、各第２溶液に含まれる側鎖及び／又は末端に１以上の求核性官能基又は求電子性官能基を有するポリエチレングリコールを骨格とする第１溶液とは異なる官能基の多分岐型ポリマー、分散媒、細胞、及び細胞作用添加物は、その全部又は一部が異なっていてもよい。例えば、第２溶液ａに含まれる細胞と第２溶液ｂに含まれる細胞は、同一であってもよいし、異なっていてもよい。
【００９１】
《ゲル形成工程》
「ゲル形成工程」とは、第１溶液と第２溶液が混合することにより、それぞれに含まれるポリエチレングリコールを骨格とする多分岐型ポリマーが反応して、ハイドロゲルが形成される工程である。第１溶液と第２溶液のいずれか一方を液滴吐出装置で吐出してもよいし、第１溶液と第２溶液の双方を液滴吐出装置で吐出してもよい。
【００９２】
「液滴吐出装置」とは、液室中に収納された溶液を液滴にして射出し、対象部位に着弾させる手段である。吐出装置の吐出方法としてはインクジェット法、ゲル押し出し法のディスペンサ法などが挙げられる。インクジェット法では、溶液が吐出孔（ノズル）から射出される。吐出方法は、吐出孔からの微小な溶液（液滴と称すことがある）を吐出することが可能なため、高精度な三次元構造体を作製することができる。
【００９３】
吐出される液滴の量は、任意の液量とすることができる。好ましくは、９ｐＬ以上、１５ｐＬ以上、２０ｐＬ以上、３０ｐＬ以上、４０ｐＬ以上、５０以上、６０ｐＬ以上、７０ｐＬ以上、８０ｐＬ以上、９０ｐＬ以上、又は、１００ｐＬ以上であり、９００ｐＬ以下、８００ｐＬ以下、７００ｐＬ以下、６００ｐＬ以下、５００ｐＬ以下、４００ｐＬ以下、３００ｐＬ以下である。
【００９４】
「着弾」とは、溶液を標的部位に接触させることをいう。これは、吐出方法により標的部位に対して液滴を吐出することで達成される。溶液を吐出する位置は、特に制限されず、所望の標的位置に溶液が着弾するように吐出すればよい。また、それぞれの着弾部位は離れていてもよいし、一部が接触又は重なっていてもよい。
【００９５】
ゲル形成は、求核性官能基と求電子性官能基を有するポリエチレングリコールを骨格とする多分岐型ポリマーの反応によるため、第２溶液が第１溶液に着弾することでハイドロゲルが形成される。第２溶液を液滴吐出装置で吐出させた場合、１度の着弾で、ハイドロゲルは、限定はしないが、通常、ドット状ハイドロゲルとして形成され得る。本明細書において「ドット（形）状」とは、点状の形状をいう。したがって、真円形状や半球形状に限られず、略円形状や略半球形状の他、多角形状、略多角形状、不定形、又はそれらの組み合わせ等、いずれの形状であってもよい。また、ドット（形）状は、三次元構造的には、所定の長さと厚さを有していればよい。第２溶液が複数回吐出される場合は、ドット状ハイドロゲルを最小単位とする多彩な形状のハイドロゲルが形成される。
【００９６】
１回の着弾による架橋反応で形成されるハイドロゲル、すなわちドット状ハイドロゲルの体積は、第２溶液の同一箇所への吐出回数に依存する。また、吐出孔径が大きいほど、同一箇所への吐出回数が増えるほどドット状ハイドロゲルの体積は大きくなる。したがって、同一箇所への吐出回数、吐出孔径を変えることで、ドット状ハイドロゲルの体積を調製することができる。限定はしないが、本明細書におけるドット状ハイドロゲルの体積は、９ｐＬ以上、１５ｐＬ以上、２０ｐＬ以上、３０ｐＬ以上、４０ｐＬ以上、５０以上、６０ｐＬ以上、７０ｐＬ以上、８０ｐＬ以上、９０ｐＬ以上、又は１００ｐＬ以上であり、９００ｐＬ以下、８００ｐＬ以下、７００ｐＬ以下、６００ｐＬ以下、５００ｐＬ以下、４００ｐＬ以下、３００ｐＬ以下が好ましい。ドット状ハイドロゲルの直径は、限定はしないが、１０μｍ以上３００μｍ以下、厚さは５μｍ以上１５０μｍ以下の範囲であればよい。
【００９７】
第２溶液が任意回数吐出されるため、複数個のドット状ハイドロゲルが形成されることがある。ドット状ハイドロゲルは、全部又は一部が接触していてもよい。複数のドット状ハイドロゲルが連なって配置されることで、点状のみならず、任意形状のハイドロゲルを形成できる。形状は、目的に応じて適宜選択することができる。例えば、１軸方向にドットを並べることで、線状ハイドロゲルを形成することができる。また、線状ハイドロゲルを隙間なく同一平面状に並べることで膜状（面状）ハイドロゲルを形成することもできる。
【００９８】
《除去工程》
「除去工程」は、ゲル形成工程後、基板上やハイドロゲル上に存在する未反応、すなわち未架橋の前記多分岐型ポリマーを除去する工程である。本工程は、選択工程であり、必要に応じて行えばよい。
【００９９】
除去方法は、特に制限されず、形成されたハイドロゲルに物理的、生物学的、又は、化学的影響を与えない方法であれば、公知のいかなる除去方法を使用することもできる。通常行われる簡便な除去方法は、支持体又はハイドロゲルを適当な洗浄液で洗浄する方法である。
【０１００】
洗浄方法で使用する洗浄液は、ハイドロゲル及び細胞に影響を与えない溶液であれば、特に制限はない。ｐＨ、浸透圧等を考慮して、適宜定めればよい。好ましくは緩衝液又は培地等が挙げられる。
【０１０１】
洗浄方法は、支持体又はハイドロゲル上に洗浄液を掛け流してもよく、ハイドロゲルに対する物理的なダメージを軽減するために洗浄液中に浸漬する方法でもよい。洗浄は１度の工程で複数回行ってもよい。
【０１０２】
（細胞接着性材料）
細胞接着性材料としては、例えば、細胞外基質から選ばれるタンパク質などが挙げられる。細胞外基質から選ばれるタンパク質としては、上述したものと同様である。細胞接着性材料は、液滴吐出装置で吐出して基板上に配置してもよい。液滴吐出装置については上述したものと同様である。
【０１０３】
［神経回路モデル］
１実施形態において、本発明は、基板と、前記基板上に離散的に配置された複数の細胞集合体とを備え、前記複数の細胞集合体のそれぞれは神経細胞を含み、少なくとも２つの前記細胞集合体が機能的に結合している、神経回路モデルを提供する。本実施形態の神経回路モデルにおいて、細胞集合体のそれぞれは７〜１０，０００個の細胞を含むことが好ましい。
【０１０４】
本実施形態の神経回路モデルは、生体内の神経細胞の活動状態を、インビトロで正確に再現できるものであり、脳機能の解明や、神経系疾患への毒性評価、創薬開発等に利用することができる。
【０１０５】
本実施形態の神経回路モデルにおいて、基板、神経細胞については上述したものと同様である。また、細胞集合体同士が機能的に結合するとは、上述したものと同様であり、神経細胞が軸索と呼ばれる突起を伸ばし、別の神経細胞の樹状突起との間でシナプス結合を形成することをいう。この結果、神経回路が形成される。
【０１０６】
本実施形態の神経回路モデルにおいて、基板は、表面に細胞非接着性材料のパターンが配置されたものであってもよい。また、基板は、表面に細胞接着性材料のパターンが配置されたものであってもよい。
【０１０７】
基板上の細胞集合体の配置のパターンや数は特に制限されず、例えば、サークル状であってもよいし、矩形状であってもよいし、格子状であってもよい。また、基板上に配置された細胞集合体同士の機能的な結合は、ランダムに結合していてもよいし、各細胞集合体を循環するように結合していてもよい。
【０１０８】
［神経回路モデルの製造方法］
１実施形態において、本発明は、基板上に細胞接着性材料及び細胞非接着性材料を配置して細胞配置用微細構造を形成する細胞培養担体形成工程と、前記基材上に神経細胞を配置する細胞配置工程と、配置した神経細胞が沈降し、前記基板上に仮接着して細胞集合体を形成するまで静置する工程と、前記細胞集合体が形成された前記基板に培地を供給する培地添加工程と、前記細胞集合体を培養し、神経回路モデルを形成する培養工程を含む、神経回路モデルの製造方法を提供する。
【０１０９】
本実施形態の製造方法において、基板は、上述したものであってもよく、無孔の平板部材に多孔質部材が積層されたものであってもよい。無孔の平板部材としては、上述した基板の材質から形成されたものが挙げられ、より具体的には、例えば、培養皿、ガラス等が挙げられる。
【０１１０】
多孔質部材は、例えば多孔質メンブレンであってもよい。多孔質部材のポアサイズは、細胞が埋没しない大きさであることが好ましく、例えば１μｍ以下のポアサイズであることが好ましい。
【０１１１】
図８は、本実施形態の製造方法のフロー図である。図８に示すように、まず、細胞培養担体形成工程において、基板上に細胞接着性材料及び細胞非接着性材料を配置して細胞配置用微細構造を形成する。細胞接着性材料、細胞非接着性材料については上述したものと同様である。
【０１１２】
続いて、細胞配置工程において、細胞配置用微細構造の細胞配置領域に細胞を配置する。細胞の配置はインクジェット法により行うことが好ましい。また、ここで、細胞配置用微細構造に複数種類の細胞を配置する場合には、全ての種類の細胞を配置する。
【０１１３】
本実施形態の製造方法において、乾燥抑制処置を行うことが好ましい。例えば、基板として多孔質構造を有する基板を用い、予め基板に培地等の液体を保持させた上で液溜りを形成すると、上記の多孔質構造により液体が保持されるため、液溜りの乾燥を抑制することができる。
【０１１４】
また、乾燥した基板に液滴を吐出して液溜りを形成する場合には、液溜り中の液体の蒸発を抑制する工程（乾燥抑制工程）を実施することにより、液溜りの形状維持及び細胞の基板上への接着を安定して実現することが可能となる。乾燥抑制工程としては、上述したものと同様の工程が挙げられる。乾燥抑制処置は、細胞配置工程の後に実施してもよく、細胞培養担体形成工程の前に実施してもよい。
【０１１５】
続いて、静置する工程において、全ての細胞が接着するまで静置する。続いて、培地添加工程において、培地を添加する。培地については上述したものと同様である。続いて、培養工程において、前記細胞集合体を培養し、神経回路モデルを形成する。
【０１１６】
図９は、神経回路モデルの製造方法を説明する模式断面図である。図９に示すように、細胞培養担体９３０は、平板部材９１０に多孔質部材９２０が積層されたものである。
【０１１７】
多孔質部材上に細胞配置用微細構造を形成する方法は特に限定されないが、図９の例では、上述した第１溶液９４０に多孔質部材９２０を浸漬させた後、平板部材９１０の上に配置し、インクジェットヘッドから第２溶液９５０を吐出している。
【０１１８】
第１溶液９４０と第２溶液９５０が反応すると、細胞非接着性材料であるハイドロゲル（Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧゲル）９６０が形成される。第１溶液９４０と第２溶液９５０との反応は、例えば高湿度環境下で３０分間静置することにより行うことができる。ここで、高湿度環境としては、相対湿度９０％以上が好ましい。
【０１１９】
続いて、細胞を配置する。図９の例では、インクジェット法により、上述した細胞インク９７０を吐出することにより、細胞９８０を配置している。このとき、多孔質部材９２０に培地が保持されていることにより、吐出された細胞インク９７０の微小液滴が着弾した際の衝撃を緩和し、細胞へのダメージを軽減させることができる。更に、多孔質部材９２０に培地が保持されていることにより、微小液滴が乾燥してしまうことを防ぐことができる。
【実施例】
【０１２０】
次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【０１２１】
［実験例１］
（細胞の遊走の評価１）
基板に細胞を播種し、遊走の発生を評価した。基板としては、表面にマトリゲル（登録商標、コーニング社製）をコートしたスライドガラスを使用した。細胞としては、ラット褐色細胞腫由来の細胞株であるＰＣ１２細胞を使用した。細胞の播種はインクジェット法により行った。
【０１２２】
《細胞インクの調製》
まず、細胞を染色した。緑色蛍光染料（商品名：Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｇｒｅｅｎ、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を１０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｍＭ）の濃度でジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）へ溶解させ、培地と混合し、濃度１０μｍｏｌ／Ｌ（μＭ）の緑色蛍光染料含有培地を調製した。
【０１２３】
続いて、培養したＰＣ１２細胞のディッシュに緑色蛍光染料含有無血清培地を５ｍＬ添加し、インキュベーター（ＫＭ−ＣＣ１７ＲＵ２、パナソニック株式会社製、３７℃、５体積％ＣＯ２環境）内で３０分間培養した。その後、トリプシン処理によりディッシュから細胞を剥離させて、細胞懸濁液を得た。続いて、細胞懸濁液の一部をＰＭＭＡ製プラスチックスライドに載せ、商品名：Ｃｏｕｎｔｅｓｓ  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｅｒ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を用いて細胞数を計測した。
【０１２４】
細胞インクの分散媒として、ＰＢＳ（−）に、細胞乾燥抑制剤としてグリセリン（分子生物学用グレード、富士フイルム和光純薬株式会社製）を０．５質量％添加したものを使用した。ＰＣ１２細胞を６×１０６個／ｍＬとなるように分散媒へ分散させて、細胞インクを得た。
【０１２５】
《細胞の吐出》
図４の装置の細胞吐出ヘッドの液室に細胞インクを充填した。続いて、基板上に、細胞インクの液滴を吐出し、液溜りを配置した。液溜り１つあたりの直径は約２００μｍであった。また、基板上に配置された液溜り中には、液溜り１つあたり細胞が約１００個含まれており、液溜り中の細胞密度は３×１０５個／ｃｍ２であった。なお、液溜り中の細胞密度とは、基板上に配置された液溜りが、基板と接する面積あたりの細胞数をいう。
【０１２６】
図１０（ａ）は細胞インクを吐出した直後の顕微鏡写真である。細胞インクの液滴を着弾し終えてから約１０分間、相対湿度９５％以上の高湿度環境で静置すると、液滴内の細胞が沈降し、基板上に仮接着して細胞集合体を形成した。続いて、培地を静かに加えた。図１０（ｂ）は培地を添加した直後の顕微鏡写真である。
【０１２７】
《細胞の培養》
続いて、３７℃、５体積％ＣＯ２環境のインキュベーター内で１日間培養した。図１０（ｃ）は培養開始から１日後の細胞中のＣｅｌｌ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｇｒｅｅｎの蛍光を観察した蛍光顕微鏡写真である。その結果、細胞が遊走し、吐出直後の位置から移動したことが明らかとなった。このような遊走が発生すると、細胞を所定の位置に留めておくことが困難である。
【０１２８】
［実験例２］
（細胞の遊走の評価２）
液溜り中の細胞数を変化させて基板に細胞を播種し、遊走の発生を評価した。基板としては、表面にマトリゲル（登録商標）をコートしたスライドガラスを使用した。細胞としては、ＰＣ１２細胞を使用した。細胞の播種はインクジェット法により行った。
【０１２９】
細胞インクの作製及び細胞の吐出は、実験例１と同様にして行った。但し、細胞の吐出において、液溜り中の細胞数を変化させた。具体的には、基板上に配置された液溜り１つあたり、１個以上３個未満（細胞密度２×１０４個／ｃｍ２）、３〜６個（細胞密度６×１０４個／ｃｍ２）、７〜１１個（細胞密度１×１０５個／ｃｍ２）の細胞を配置した。ここで、細胞密度とは、基板上に配置された液溜りが、基板と接する面積あたりの細胞数をいう。また、液溜り１つあたりの直径は１００μｍであった。
【０１３０】
続いて、３７℃、５体積％ＣＯ２環境のインキュベーター内で１日間培養し、倒立顕微鏡（型式「ＣＫＸ４１」、オリンパス株式会社製）を使用して個々の細胞を経時的に観察し、それぞれの細胞の遊走距離を測定した。図１１は、培養開始から１日後の細胞の遊走距離の測定結果を示すグラフである。グラフの縦軸は遊走距離（μｍ）を示す。
【０１３１】
その結果、液溜り１つあたりの細胞数が７個以上であり、且つ、前記液溜り中の細胞密度が１０５個／ｃｍ２以上であると、細胞の遊走が抑制されることが明らかとなった。
【０１３２】
［実験例３］
（神経細胞パターン制御）
基板に細胞非接着性材料のパターン及び細胞接着性材料のパターンを配置した。基板としては、スライドガラス上に直径１３ｍｍのポリエステル製多孔質培養メンブレン（商品名：ｉｐＣＥＬＬＣＵＬＴＵＲＥ  Ｔｒａｃｋ  Ｅｔｃｈｅｄ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ、ポアサイズ：０．４５μｍ、ポア密度：４×１０６個／ｃｍ２、厚さ：１２  μｍ、ｉｔ４ｉｐ社製）を積層したものを用いた。
【０１３３】
続いて、この基板に神経細胞を播種し、軸索の伸長を観察した。神経細胞としては、ヒトｉＰＳ細胞由来ＧＡＢＡ作動性神経細胞（エリクサジェン・サイエンティフィック社製）を使用した。図１２は、基板に細胞非接着性材料のパターン及び細胞接着性材料のパターンを配置し、細胞を配置する手順を説明する模式図である。
【０１３４】
《第１溶液の調製》
Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＳＨ（商品名「ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＰＴＥ−１００ＳＨ」、油化産業式会社製）をＰＢＳ（−）に溶解後、平均孔径０．２μｍのフィルター（商品名「Ｍｉｎｉｓａｒｔ  Ｓｙｒｉｎｇｅ  Ｆｉｌｔｅｒ  １７５４９７Ｋ」、ザルトリウス社製）で濾過し、２％Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＳＨを含む第１溶液を得た。
【０１３５】
《第２溶液の調製》
Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−マレイミジル（商品名「ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＰＴＥ−１００ＭＡ」、油化産業式会社製）及びマトリゲル（登録商標、コーニング社製）をＰＢＳ（−）に溶解し、平均孔径０．２μｍのフィルターで濾過し、２％Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧ−マレイミジル及び１％マトリゲルを含む第２溶液を調製した。
【０１３６】
《パターン形成》
基板を第１溶液に浸漬して取り出し、基板上へ第１溶液の液相を形成した。続いてインクジェットヘッドの液室に第２溶液を充填し、基板上に、第２溶液を滴下し、幅が約２００μｍの線状のパターンを形成した。その結果、第１溶液に含まれるＴｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＳＨと、第２溶液に含まれるＴｅｔｒａ−ＰＥＧ−マレイミジルが、架橋してハイドロゲルのパターンを形成した。このハイドロゲルは細胞非接着性材料である。また、マトリゲル（登録商標）がコートされた部分は細胞接着性材料のパターンを形成した。続いて、基板をリン酸緩衝生理食塩水（ライフテクノロジーズ社製、以下、ＰＢＳ（−）とも称する）に浸漬し、余剰な第１溶液及び第２溶液を取り除いた。
【０１３７】
《細胞インクの調製》
細胞にヒトｉＰＳ細胞由来ＧＡＢＡ作動性神経細胞（エリクサジェン・サイエンティフィック社製）を使用した点以外は実験例１と同様にして細胞インクを調製した。
【０１３８】
《細胞の吐出》
図１の装置の細胞吐出ヘッドの液室に細胞インクを充填した。続いて、基板上の細胞接着性材料のパターン上に、細胞インクの液滴を吐出し、液溜りを配置した。
【０１３９】
細胞インクの液滴を着弾し終えてから約３０分間静置すると、液滴内の細胞が沈降し、基板上に仮接着して細胞集合体を形成した。続いて、培地を静かに加えた。
【０１４０】
《細胞の培養》
続いて、３７℃、５体積％ＣＯ２環境のインキュベーター内で培養した。図１３（ａ）は培養開始から４日後の細胞を観察した明視野顕微鏡写真である。スケールバーは１００μｍである。図１３（ｂ）、（ｃ）は、基板上のＣｅｌｌ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｇｒｅｅｎの蛍光を観察した蛍光顕微鏡写真である。スケールバーは１００μｍである。図１３（ｄ）は、細胞密度が低い領域のＣｅｌｌ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｇｒｅｅｎの蛍光を観察した蛍光顕微鏡写真である。スケールバーは５０μｍである。
【０１４１】
その結果、細胞は細胞非接着性材料のパターンが配置された領域には移動しないことが明らかとなった。また、軸索は、細胞非接着性材料のパターンを除く領域のみに形成されたことが明らかとなった。以上の結果から、基板上に細胞非接着性材料のパターンを配置することにより、神経細胞の軸索伸長を制御することができることが明らかとなった。
【０１４２】
［実験例４］
（神経細胞非パターン制御）
実験例３と同様の方法で細胞接着性材料のみを有する基板を作製した。続いて、実験例３と同様の方法で基板上の細胞接着性材料のパターン上に、細胞インクの液滴を吐出し、神経細胞を播種した。神経細胞としては、ヒトｉＰＳ細胞由来ＧＡＢＡ作動性神経細胞（エリクサジェン・サイエンティフィック社製）を使用した。
【０１４３】
続いて、３７℃、５体積％ＣＯ２環境のインキュベーター内で培養し、培養開始から７日後に神経細胞の軸索伸長を確認した。具体的には、まず、Ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）をＤＭＳＯで希釈したものを、終濃度が１０μＭになるよう培地中に添加し、３７℃、５％ＣＯ２環境下で３０分間インキュベートした。続いて、神経細胞を蛍光顕微鏡で観察した。
【０１４４】
図１４は、神経細胞の蛍光顕微鏡写真である。スケールバーは２００μｍである。その結果、基板上に細胞非接着性材料のパターンを配置しなかった場合には、神経細胞の軸索伸長方向が制御されないことが確認された。
【０１４５】
［実験例５］
（神経回路モデルの作製１）
基材上の液溜りの直径、液溜り中の細胞密度、液溜り１つあたりの細胞数、細胞非接着性材料のパターンのサイズ、細胞接着性材料のパターンのサイズを下記表１に示す組み合わせで様々に変更し、神経回路モデルを作製し、評価した。基板としては１０ｃｍディッシュを使用した。神経細胞としては、ヒトｉＰＳ細胞由来ＧＡＢＡ作動性神経細胞（エリクサジェン・サイエンティフィック社製）を使用した。
【０１４６】
図１５（ａ）〜（ｅ）は、本実験例の手順を説明する模式図である。図１５（ａ）〜（ｄ）は側面図であり、図１５（ｅ）は図１５（ｂ）の上面図である。図１５（ａ）〜（ｅ）に示すように、細胞接着性材料を円形に配置し、細胞接着部を形成した。また、細胞接着部を囲むように細胞非接着性材料を配置し、細胞非接着部を形成した。細胞非接着部の形状は、接着性材料と同心の略ドーナツ形状であった。
【０１４７】
図１５（ａ）は、神経細胞を含む液滴を基板上に配置する工程を説明する模式図である。図１５（ｂ）は、複数の液滴が基板上に着弾して液溜りが形成された状態を説明する模式図である。液溜りの端部は細胞非接着部上に位置していてもよいが、細胞非接着部を超えないことが好ましい。図１５（ｃ）は、液溜り内の神経細胞が沈降し、基板上に仮接着して細胞集合体を形成した状態を説明する模式図である。図１５（ｄ）は、細胞集合体が形成された基板に培地を供給する工程を説明する模式図である。
【０１４８】
表１中、「液溜りの直径」は基材上に配置した液溜りの直径を示し、「細胞密度」は液溜り中の細胞密度を示し、「細胞数」は液溜り１つあたりの細胞数を示し、「非接着部の内径／外径」は細胞非接着部のドーナツ形状部分の内径及び外径を示し、「接着部の直径」は細胞接着部の直径を示し、「細胞の配置方法」は、細胞の配置をインクジェット法（ＩＪ）により行ったか、手技により行ったかを示す。「細胞密度」は、基板上に配置された液溜りが、細胞接着部と接する面積あたりの細胞数とした。「Ｎ．Ｄ．」は測定不能であったことを示す。
【０１４９】
細胞非接着性材料のパターンは、実験例３と同様にして、第１溶液に含まれるＴｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＳＨ及び第２溶液に含まれるＴｅｔｒａ−ＰＥＧ−マレイミジルを架橋させて形成した。また、細胞接着性材料のパターンを形成する場合には、マトリゲル（登録商標、コーニング社）をインクジェットヘッドの液室に充填し、パターン状に吐出した。
【０１５０】
神経回路モデルの評価項目として、液溜りの直径、細胞の初期配置、細胞の固定を評価した。表１に、これらの評価結果も示す。
【０１５１】
液溜りの直径を５００μｍ以下に制御することを目標としたが、手技では困難であった。なお、インクジェット法による細胞の配置では、液溜りの直径を５００μｍより大きく制御することも５００μｍ以下に制御することも可能であった。
【０１５２】
細胞の初期配置の評価基準は次の通りであった。
−：細胞がランダムに配置された。
＋：細胞の離散パターンが形成された。
【０１５３】
また、細胞の固定の評価基準は次の通りであり、培養１〜７日における細胞の遊走を評価した。
−：細胞が基板に配置した液滴より外側に遊走したか、ランダムな配置であった。
＋：細胞が基板に配置した液滴の内側に留まった。
【０１５４】
【表１】
2022002504.tif 000003
【０１５５】
その結果、実施例１〜６の神経回路モデルでは、液溜りの直径、細胞の初期配置、細胞の固定の評価項目において良好な評価結果が得られた。一方、比較例１〜６の神経回路モデルでは、液溜りの直径が５００μｍを超えていたか、又は、いずれかの評価項目の評価結果が不良であった。
【０１５６】
以上の結果から、基板に配置する液滴が、液滴１つあたり７個以上の細胞を含み、且つ、液滴中の細胞密度が１０５個／ｃｍ２以上であると、前記液溜り１つあたりの直径を５００μｍ以下にした場合であっても細胞を基板上に安定して配置することができることが明らかとなった。
【０１５７】
［実験例６］
（神経回路モデルの作製２）
図１６（ａ）〜（ｄ）は、細胞非接着性材料及び細胞接着性材料の双方を配置した、実験例の神経回路モデルの細胞の配置を示す模式図である。図１６（ａ）及び（ｂ）は側面図であり、図１６（ｃ）及び（ｄ）は上面図である。図１６（ａ）及び（ｃ）は、細胞を配置した直後の状態を示し、図１６（ｂ）及び（ｄ）は細胞培養後に、細胞集合体同士の間に軸索が伸長し、シナプスが形成された状態を示す。
【０１５８】
本実験例では、図１６（ａ）〜（ｄ）に示す神経回路モデルを作製した。細胞非接着性材料のパターンは、実験例３と同様にして、第１溶液に含まれるＴｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＳＨ及び第２溶液に含まれるＴｅｔｒａ−ＰＥＧ−マレイミジルを架橋させて形成した。また、細胞接着性材料のパターンを形成する場合には、マトリゲル（登録商標、コーニング社）をインクジェットヘッドの液室に充填し、パターン状に吐出した。基板としては１０ｃｍディッシュを使用した。神経細胞としては、ヒトｉＰＳ細胞由来ＧＡＢＡ作動性神経細胞（エリクサジェン・サイエンティフィック社製）を使用した。その結果、神経回路モデルが得られた。
【０１５９】
［実験例７］
（神経回路モデルの作製３）
図１７（ａ）に示すように、２本の同心円形状に細胞非接着性材料を配置した基板に、図１７（ａ）に示すパターンで神経細胞を配置し、神経回路モデルを作製した。細胞非接着性材料のパターンは、実験例３と同様にして、第１溶液に含まれるＴｅｔｒａ−ＰＥＧ−ＳＨ及び第２溶液に含まれるＴｅｔｒａ−ＰＥＧ−マレイミジルを架橋させて形成した。神経細胞としては、ヒトｉＰＳ細胞由来ＧＡＢＡ作動性神経細胞（エリクサジェン・サイエンティフィック社製）を使用した。
【０１６０】
図１７（ｂ）は細胞インクを吐出した直後の神経回路モデルの代表的な顕微鏡写真である。図１７（ｂ）中、「配置：＋」は細胞の初期配置が良好であったことを示し、「配置：−」は細胞の初期配置が不良であったことを示す。
【０１６１】
細胞を良好に初期配置できる条件で配置した後、４週間培養し、軸索を伸長させて神経回路モデルを得た。図１８は、神経回路モデルのＣｅｌｌ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｇｒｅｅｎの蛍光を観察した蛍光顕微鏡写真である。
【０１６２】
［実験例８］
（神経回路モデルの作製４）
図１９（ａ）及び（ｂ）にそれぞれ示すように、基板上に細胞非接着性材料（Ｔｅｔｒａ−ＰＥＧゲル）を配置した。
【０１６３】
基板としては、スライドガラス上に、実験例３におけるものと同様の第１溶液を含浸させた、直径１３ｍｍのポリエステル製多孔質培養メンブレン（商品名：ｉｐＣＥＬＬＣＵＬＴＵＲＥ  Ｔｒａｃｋ  Ｅｔｃｈｅｄ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ、ポアサイズ：０．４５μｍ、ポア密度：４×１０６個／ｃｍ２、厚さ：１２μｍ、ｉｔ４ｉｐ社製）を積層したものを用いた。
【０１６４】
続いてインクジェットヘッドの液室に実験例３におけるものと同様の第２溶液を充填し、基板上に、第２溶液を滴下し、図１９（ａ）及び（ｂ）に示す幅が約２００μｍのパターンをそれぞれ形成した。
【０１６５】
図１９（ａ）に示すパターンでは、直線形状のパターンを６本形成した。これらの直線と直線の間の距離は約０．５ｍｍであった。また、直線の長さは約５ｍｍであった。図１９（ｂ）に示すパターンでは、同心円状の３本のパターンを形成した。各パターンの直径は中心から外側に向かって、それぞれ、約１ｍｍ、約２ｍｍ、約３ｍｍであった。
【０１６６】
続いて、図１９（ａ）及び（ｂ）にそれぞれに示すパターンで２種類の神経細胞を配置し、神経回路モデルを作製した。神経細胞としては、ヒトｉＰＳ細胞由来ＧＡＢＡ作動性神経細胞（エリクサジェン・サイエンティフィック社製）とＰＣ１２細胞を使用した。
【０１６７】
細胞を良好に初期配置できる条件で配置した後、１週間培養し、神経突起を伸長させて神経回路モデルを得た。続いて、神経回路モデルを免疫染色により解析した。
【０１６８】
まず、得られた各神経回路モデルをＰＢＳで洗浄し、４℃の４％パラホルムアルデヒド（富士フイルム和光純薬社）で３０分間固定した。固定後、ＰＢＳで１回洗浄し、１％ウシ血清アルブミン（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いて室温で２０分ブロッキング処理を行った。ブロッキング後、ＰＢＳで１回洗浄し、１次抗体として、抗βＩＩＩチューブリン抗体（シグマアルドリッチ社）及び抗チロシンヒドロキシラーゼ抗体（アブカム社）を、それぞれＰＢＳで２００倍に希釈した混合液を加え、４℃で一晩インキュベートした。
【０１６９】
続いて、ＰＢＳで３回洗浄し、２次抗体として、ＡＰＣ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）及びアレクサフルオロ５９４標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を、それぞれＰＢＳで５００倍に希釈した混合液を加え、室温で１時間インキュベートし、その後ＰＢＳで２回洗浄した。
【０１７０】
続いて、封止液（製品名「ＰｒｏＬｏｎｇ  Ｄｉａｍｏｎｄ  Ａｎｔｉｆａｄｅ  Ｍｏｕｎｔａｉｎ」、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いてカバーガラスをサンプル上にかぶせて封入し、蛍光顕微鏡で観察した。
【０１７１】
図２０（ａ）及び（ｂ）は、得られた神経回路モデルの神経骨格であるβＩＩＩチューブリンと、ＰＣ１２のみで発現するチロシンヒドロキシラーゼの蛍光を観察した蛍光顕微鏡写真である。図２０（ａ）は、図１９（ａ）に示すパターンで神経細胞を配置した神経回路モデルの蛍光顕微鏡写真であり、図２０（ｂ）は、図１９（ｂ）に示すパターンで神経細胞を配置した神経回路モデルの蛍光顕微鏡写真である。
【０１７２】
その結果、いずれのパターンで神経細胞を配置した神経回路モデルにおいても、βＩＩＩチューブリンの蛍光が全細胞配置領域で観察された。また、神経突起が成長していることが確認された。また、チロシンヒドロキシラーゼの蛍光は、ＰＣ１２細胞を配置した領域のみで観察され、細胞配置のパターンが維持されていることが確認された。
【０１７３】
［実験例９］
（乾燥抑制プロセスの改善）
乾燥基板に細胞を播種し、液溜りの乾燥抑制と細胞定着の発生を評価した。基板としては、スライドガラスを使用した。細胞としては、ラット褐色細胞腫由来の細胞株であるＰＣ１２細胞を使用した。細胞の播種はインクジェット法により行った。
【０１７４】
《細胞インクの調製》
培養したＰＣ１２細胞のディッシュに緑色蛍光染料含有無血清培地を５ｍＬ添加し、インキュベーター（ＫＭ−ＣＣ１７ＲＵ２、パナソニック株式会社製、３７℃、５体積％ＣＯ２環境）内で３０分間培養した。その後、トリプシン処理によりディッシュから細胞を剥離させて、細胞懸濁液を得た。続いて、細胞懸濁液の一部を使用し、商品名：ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ  ＮＣ−３０００（ＣｈｅｍｏＭｅｔｅｃ社製）を用いて細胞数を計測した。
【０１７５】
細胞インクの分散媒として、ＰＢＳ（−）に、細胞乾燥抑制剤としてグリセリン（分子生物学用グレード、富士フイルム和光純薬株式会社製）を０．５質量％添加したものを使用した。ＰＣ１２細胞を３×１０６個／ｍＬとなるように分散媒へ分散させて、細胞インクを得た。
【０１７６】
《細胞の吐出》
図４の装置の細胞吐出ヘッドの液室に細胞インクを充填した。続いて、基板上に、細胞インクの液滴を吐出し、液溜りを配置した。液溜り１つあたりの直径は約４００μｍであった。また、基板上に配置された液溜り中には、液溜り１つあたり細胞が約１００個含まれており、液溜り中の細胞密度は８×１０４個／ｃｍ２であった。
【０１７７】
図２１（ａ）は細胞インクを吐出した直後に液溜りを生体適合性オイル（Ｏｉｌ  ｆｏｒ  Ｅｍｂｒｙｏ  Ｃｕｌｔｕｒｅ、富士フイルム和光純薬株式会社製）で被覆し、乾燥を防止した液溜りの顕微鏡写真である。オイルで被覆することにより、３７℃で６０分間静置しても微小量の液溜りが乾燥することはなく、液滴内の細胞が沈降し、基板上に仮接着して細胞集合体を形成する事ができた。本手法は、ＰＣ１２細胞に限らず多くの細胞種に適用することができる。
【０１７８】
その後、オイルを静かに除去した上で培地を静かに加えた。図２１（ｂ）は培地を添加した直後の顕微鏡写真である。液溜りは微小量であるため、通常の実験室環境では数分で乾燥し、液溜りの体積が９０％以上減少する。
【０１７９】
実験例１〜２のように高湿度環境で静置する方法、実験例３〜８のように湿潤基板に液溜りを生成する方法等に加え、オイル等で液溜りを被覆することにより、乾燥した基板を用いた場合であっても、細胞の沈降、仮接着を安定して実施することが可能となることが確認された。
【０１８０】
続いて、液溜り１つあたりの細胞数、乾燥基板上の液溜りへの乾燥抑制処置の有無を下記表２に示す組み合わせで様々に変更し、参考例１〜４の神経回路モデルを、それぞれ作製して評価した。基板としては、３５ｍｍディッシュを使用した。神経細胞としては、ヒトｉＰＳ細胞由来ＧＡＢＡ作動性神経細胞（エリクサジェン・サイエンティフィック社製）を使用した。
【０１８１】
下記表２中、「液溜りの乾燥抑制」は基材上に配置した液溜りへの乾燥抑制工程の有無と種類を示し、「液溜りの形状維持」は３７℃で６０分間静置後の液溜りの形状を維持していたか否かを示す。その他の項目は上記表１で示したものと同様である。「液溜りの形状維持」の評価基準は次の通りであった。
＋：液溜りの形状が維持されていた。
−：液溜りが８０％以上乾燥し細胞死が見られた。
【０１８２】
【表２】
2022002504.tif 000004
【０１８３】
本発明は、以下の態様を含む。
［１］細胞接着性材料が配置された領域と、細胞非接着性材料が配置された領域とを有する基板上に、神経細胞を含む複数の液滴をインクジェット法により配置して、１つ又は複数の液溜りを形成する工程と、前記液溜り内の前記神経細胞が沈降し、前記基板上に仮接着して細胞集合体を形成するまで静置する工程と、を含み、前記液溜り１つあたりの直径が５００μｍ以下であり、前記液溜り１つあたりの神経細胞の密度が１０５個／ｃｍ２以上である、神経細胞が配置された基板の製造方法。
［２］前記液溜り１つあたり７〜１０，０００個の前記神経細胞を含む、［１］に記載の製造方法。
［３］前記液滴１つあたり１〜５０個の前記神経細胞を含む、［１］又は［２］に記載の製造方法。
［４］前記液滴が、前記細胞接着性材料に接して配置される、［１］〜［３］のいずれかに記載の製造方法。
［５］前記液溜り中の液体の蒸発を抑制する工程を更に含む、［１］〜［４］のいずれかに記載の製造方法。
［６］前記細胞集合体が形成された基板に培地を供給する工程を更に含む、［１］〜［５］のいずれかに記載の製造方法。
［７］前記液溜りを形成する工程において前記液溜りを複数形成し、前記静置する工程において前記細胞集合体を複数形成し、前記培地が供給された前記基板をインキュベートして、少なくとも２つの前記細胞集合体を機能的に結合させる工程を更に含む、［６］に記載の製造方法。
［８］前記基板が、前記細胞非接着性材料が配置された領域と、前記細胞非接着性材料が配置されていない領域とを有し、前記細胞非接着性材料が配置されていない領域が、線状形状を有しており、前記線状形状の幅が１００μｍ以下である、［１］〜［７］のいずれかに記載の製造方法。
［９］前記基板が多孔質構造を有する、［１］〜［８］のいずれかに記載の製造方法。
【符号の説明】
【０１８４】
１０…液滴吐出ヘッド、１１，９７０…細胞インク、１２，２５…液室、１３，２８…メンブレン、１４，２６…駆動部、１５…ノズル、１６，２７…加振部、１７，２４…大気開放部、２１，２２，２３…インクジェットヘッド、３１…ステージ部、液滴配置装置…４００，５００，６００，７００、９１０…平板部材、９２０…多孔質部材、９３０…細胞培養担体、９４０…第１溶液、９５０…第２溶液、９６０…細胞非接着性材料、９８０…細胞、Ｐｊ…吐出波形、Ｐｓ…免振波形。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０１８５】
【特許文献１】特開２０１９−１６２０９７号公報
【図１】
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【図２】
2022002504.tif 000006
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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