(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アダマンタン骨格を有する二官能以上の重合性モノマに由来する構造単位及びスチレン系モノマに由来する構造単位を含む共重合体を含有する多孔質ポリマ粒子と、
該多孔質ポリマ粒子の表面の少なくとも一部を被覆する、水酸基を有する高分子を含む被覆層と、
を備え、
前記共重合体が、前記アダマンタン骨格を有する二官能以上の重合性モノマに由来する構造単位をモノマ全質量基準で１５〜９０質量％含む、分離材。
【請求項２】
５％圧縮変形弾性率が３００〜１５００ＭＰａである、請求項１に記載の分離材。
【請求項３】
前記共重合体が、前記スチレン系モノマに由来する構造単位をモノマ全質量基準で１０〜８５質量％含む、請求項１又は２に記載の分離材。
【請求項４】
比表面積が３０ｍ２／ｇ以上である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の分離材。
【請求項５】
平均細孔径が０．０５〜０．６μｍである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の分離材。
【請求項６】
前記多孔質ポリマ粒子の平均粒径が１０〜３００μｍである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の分離材。
【請求項７】
前記水酸基を有する高分子が多糖類又はその変性体である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の分離材。
【請求項８】
前記水酸基を有する高分子がアガロース又はその変性体である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の分離材。
【請求項９】
前記多孔質ポリマ粒子１ｇ当たり、３０〜４００ｍｇの前記被覆層を備える、請求項１〜８のいずれか一項に記載の分離材。
【請求項１０】
カラムに充填した場合、カラム圧０．３ＭＰａのときに通液速度が８００ｃｍ／ｈ以上である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の分離材。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の分離材を備えるカラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分離材及びカラムに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、タンパク質に代表される生体高分子を分離精製する場合、一般的には多孔質型の合成高分子を母体とするイオン交換体、親水性天然高分子の架橋ゲルを母体とするイオン交換体等が用いられている。多孔質型の合成高分子を母体とするイオン交換体の場合、塩濃度による体積変化が小さいため、カラムに充填してクロマトグラフィーで用いると、通液時の耐圧性に優れる傾向にある。しかし、このイオン交換体を、タンパク質等の分離に用いると、疎水的相互作用に基づく不可逆吸着等の非特異吸着が起きるため、ピークの非対称化が発生する、又は、疎水的相互作用でイオン交換体に吸着されたタンパク質が吸着されたまま回収できないという問題点がある。
【０００３】
一方、デキストラン、アガロース等の多糖に代表される親水性天然高分子の架橋ゲルを母体とするイオン交換体の場合、タンパク質の非特異吸着がほとんどないという利点がある。ところが、このイオン交換体は、水溶液中で著しく膨潤し、溶液のイオン強度による体積変化、及び、遊離酸形と負荷形との体積変化が大きく、機械的強度も十分ではないという欠点を有する。特に、架橋ゲルをクロマトグラフィーで使用する場合、通液時の圧力損失が大きく、通液によりゲルが圧密化するといった欠点がある。
【０００４】
親水性天然高分子の架橋ゲルの欠点を克服するため、例えば、多孔性高分子の細孔内に天然高分子ゲル等のゲルを保持した複合体が、ペプチド合成の分野で知られている（例えば、特許文献１参照）。このような複合体を用いることにより、反応性物質の負荷係数を高め、高収率の合成が可能となる。また、硬質な合成高分子物質でゲルを包囲するため、カラムベッドの形態で使用しても、容積変化がなく、カラムを通過するフロースルーの圧力が変化しないという利点を有する。
【０００５】
セライト等の無機多孔質体にデキストラン、セルロースといった多糖等のキセロゲルを保持させた分離材が知られている（例えば、特許文献２及び３参照）。このゲルには収着性能を付加するために、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基等が付与されており、ヘモグロビンの除去に用いられる。このような分離材は、カラムでの通液性が良好である。
【０００６】
マクロネットワーク構造のコポリマの細孔を、モノマから合成した架橋共重合体のゲルで埋めたハイブリッドコポリマのイオン交換体が知られている（例えば、特許文献４参照）。架橋共重合体ゲルは、架橋度が低い場合、圧力損失、体積変化等の問題があるが、ハイブリッドコポリマにすることで通液特性が改善され、圧力損失が少なく、イオン交換容量が向上し、リーク挙動が改善される。
【０００７】
また、有機合成ポリマ基体の細孔内に巨大網目構造を有する親水性天然高分子の架橋ゲルを充填した複合化充填材が提案されている（例えば、特許文献５及び６参照）。さらに、メタクリル酸グリシジルとアクリル架橋モノマとの共重合により形成される多孔質粒子の合成が知られている（例えば、特許文献７参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第４９６５２８９号明細書
【特許文献２】米国特許第４３３５０１７号明細書
【特許文献３】米国特許第４３３６１６１号明細書
【特許文献４】米国特許第３９６６４８９号明細書
【特許文献５】特開平１−２５４２４７号公報
【特許文献６】米国特許第５１１４５７７号明細書
【特許文献７】特開２００９−２４４０６７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、従来の分離材は、タンパク質の非特異吸着を低減し、かつ、カラムとして用いたときの通液性等のカラム特性に優れるといった特性を充分なレベルで兼ね備えるものではない。
【００１０】
そこで、本発明は、タンパク質の非特異吸着を低減し、かつ、カラムとして用いたときの通液性等のカラム特性に優れる分離材、及び該分離材を備えるカラムを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、下記［１］〜［１１］に記載の分離材を提供する。
［１］アダマンタン骨格を有する重合性モノマに由来する構造単位及びスチレン系モノマに由来する構造単位を含む共重合体を含有する多孔質ポリマ粒子と、該多孔質ポリマ粒子の表面の少なくとも一部を被覆する、水酸基を有する高分子を含む被覆層と、を備える分離材。
［２］５％圧縮変形弾性率が３００〜１５００ＭＰａである、［１］に記載の分離材。
［３］共重合体が、アダマンタン骨格を有する重合性モノマに由来する構造単位をモノマ全質量基準で１５〜９０質量％含む、［１］又は［２］に記載の分離材。
［４］比表面積が３０ｍ２／ｇ以上である、［１］〜［３］のいずれかに記載の分離材。
［５］平均細孔径が０．０５〜０．６μｍである、［１］〜［４］のいずれかに記載の分離材。
［６］多孔質ポリマ粒子の平均粒径が１０〜３００μｍである、［１］〜［５］のいずれかに記載の分離材。
［７］水酸基を有する高分子が多糖類又はその変性体である、［１］〜［６］のいずれかに記載の分離材。
［８］水酸基を有する高分子がアガロース又はその変性体である、［１］〜［６］のいずれかに記載の分離材。
［９］多孔質ポリマ粒子１ｇ当たり、３０〜４００ｍｇの被覆層を備える、［１］〜［８］のいずれかに記載の分離材。
［１０］カラムに充填した場合、カラム圧０．３ＭＰａのときに通液速度が８００ｃｍ／ｈ以上である、［１］〜［９］のいずれかに記載の分離材。
［１１］［１］〜［１０］のいずれかに記載の分離材を備えるカラム。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、タンパク質の非特異吸着を低減し、かつ、カラムとして用いたときの通液性等のカラム特性に優れる分離材、及び該分離材を備えるカラムを提供することが可能となる。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明の好適な実施形態について説明をするが、本発明はこれらの実施形態に何ら限定されるものではない。
【００１４】
＜分離材＞
本実施形態の分離材は、多孔質ポリマ粒子と、該多孔質ポリマ粒子の表面の少なくとも一部を被覆する被覆層とを備える。なお、本明細書中、「多孔質ポリマ粒子の表面」とは、多孔質ポリマ粒子の外側の表面のみでなく、多孔質ポリマ粒子の内部における細孔の表面を含むものとする。また、本明細書中、（メタ）アクリル酸とはアクリル酸又はメタクリル酸を意味し、（メタ）アクリレート等の他の類似の表現においても同様である。
【００１５】
（多孔質ポリマ粒子）
本実施形態に係る多孔質ポリマ粒子は、多孔質化剤、溶解性粒子等を含むモノマを硬化させた粒子であり、従来の懸濁重合、シード重合等で共重合することによって合成することができる。多孔質ポリマ粒子は、アダマンタン骨格を有する重合性モノマ及びスチレン系モノマを含むモノマを共重合することによって得られる。すなわち、多孔質ポリマ粒子は、アダマンタン骨格を有する重合性モノマに由来する構造単位及びスチレン系モノマに由来する構造単位を含む共重合体を含有する。モノマとして、アダマンタン骨格を有する重合性モノマを含むことにより、多孔質ポリマ粒子を高弾性化することが可能となり、カラムに充填した場合に、粒子の圧密化が起こらず、通液速度を高めることができる。
【００１６】
アダマンタン骨格を有する重合性モノマとしては、（メタ）アクリル酸アダマンチル、Ｎ−（１−アダマンチル）（メタ）アクリルアミド、アダマンタンジビニル、アダマンタンビニル、アダマンタンジ（メタ）アクリレート、アダマンタントリ（メタ）アクリレート、２−イソプロペニル−２−フェニルアダマンタン、１−（１−フェニルビニルオキシ）アダマンタン、１−アダマンチルビニルエーテル、１，３−ビス（ビニルオキシ）アダマンタン、４−（１−アダマンチル）スチレン、４−ビニル安息香酸１−アダマンチル等が挙げられる。これら中でも二官能以上の重合性モノマを使用することが好ましい。これらアダマンタン骨格を有する重合性モノマは、１種単独で又は２種類以上を組み合わせて用いることができる。
【００１７】
上記共重合体は、アダマンタン骨格を有する重合性モノマに由来する構造単位をモノマ全質量基準で、１５〜９０質量％含むことが好ましく、３０〜９０質量％含むことがより好ましく、４０〜８５質量％含むことが更に好ましい。共重合体がアダマンタン骨格を有する重合性モノマに由来する構造単位をモノマ全質量基準で１５質量％以上含むことにより、分離材の膨潤を抑え、カラム圧の上昇を抑え易くなる。
【００１８】
スチレン系モノマとしては、以下のような多官能性モノマ、単官能性モノマ等が挙げられる。本明細書において、スチレン系モノマは、アダマンタン骨格を有しないものを表す。
【００１９】
多官能性モノマとしては、例えば、ジビニルベンゼン、ジビニルビフェニル、ジビニルナフタレン、ジビニルフェナントレン等のジビニル化合物が挙げられる。これらの多官能性モノマは、１種単独で又は２種類以上を組み合わせて用いることができる。上記の中でも耐久性、耐酸性及び耐アルカリ性に優れることから、ジビニルベンゼンを使用することが好ましい。
【００２０】
単官能性モノマとしては、例えば、スチレン、ｏ−メチルスチレン、ｍ−メチルスチレン、ｐ−メチルスチレン、α−メチルスチレン、ｏ−エチルスチレン、ｍ−エチルスチレン、ｐ−エチルスチレン、２，４−ジメチルスチレン、ｐ−ｎ−ブチルスチレン、ｐ−ｔ−ブチルスチレン、ｐ−ｎ−ヘキシルスチレン、ｐ−ｎ−オクチルスチレン、ｐ−ｎ−ノニルスチレン、ｐ−ｎ−デシルスチレン、ｐ−ｎ−ドデシルスチレン、ｐ−メトキシスチレン、ｐ−フェニルスチレン、ｐ−クロロスチレン、３，４−ジクロロスチレン等のスチレン及びその誘導体が挙げられる。これらの単官能性モノマは、１種単独で又は２種類以上を組み合わせて用いることができる。これらのうち、耐酸性及び耐アルカリ性に優れるという観点から、スチレンを使用することが好ましい。また、カルボキシ基、アミノ基、水酸基、アルデヒド基等の官能基を有するスチレン誘導体も使用することができる。
【００２１】
上記共重合体は、スチレン系モノマに由来する構造単位をモノマ全質量基準で、８５質量％以下含むことが好ましく、７０質量％以下含むことがより好ましく、６０質量％以下含むことが更に好ましい。スチレン系モノマに由来する構造単位の含有量の下限値は、モノマ全質量基準で５質量％以上であることが好ましく、１０質量％以上であることが好ましく、１５質量％以上であることが更に好ましい。
【００２２】
上記共重合体は、モノマとして、アダマンタン骨格を有する重合性モノマ及びスチレン系モノマ以外のモノマを含んでいてもよい。このようなモノマとしては、例えば、（ポリ）エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、（ポリ）プロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、（ポリ）テトラメチレングリコールジ（メタ）アクリレート等の（ポリ）アルキレングリコール系ジ（メタ）アクリレート；トリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、テトラメチロールメタントリ（メタ）アクリレート、テトラメチロールプロパンテトラ（メタ）アクリレート、ペンタエリスリトールトリ（メタ）アクリレート、１，１，１−トリスヒドロキシメチルエタントリ（メタ）アクリレート、１，１，１−トリスヒドロキシメチルプロパントリアクリレート等の３官能以上の（メタ）アクリレート；エトキシ化ビスフェノールＡ系ジ（メタ）アクリレート、プロポキシ化エトキシ化ビスフェノールＡ系ジ（メタ）アクリレート、トリシクロデカンジメタノールジ（メタ）アクリレート、１，１，１−トリスヒドロキシメチルエタンジ（メタ）アクリレート、エトキシ化シクロヘキサンジメタノールジ（メタ）アクリレート等のジ（メタ）アクリレート；ジアリルフタレート及びその異性体；トリアリルイソシアヌレート及びその誘導体；アクリル酸メチル、アクリル酸エチル、アクリル酸プロピル、アクリル酸ｎ−ブチル、アクリル酸イソブチル、アクリル酸ヘキシル、アクリル酸２−エチルヘキシル、アクリル酸ｎ−オクチル、アクリル酸ドデシル、アクリル酸ラウリル、アクリル酸ステアリル、アクリル酸２−クロロエチル、アクリル酸フェニル、α−クロロアクリル酸メチル、メタクリル酸メチル、メタクリル酸エチル、メタクリル酸プロピル、メタクリル酸ｎ−ブチル、メタクリル酸イソブチル、メタクリル酸ヘキシル、メタクリル酸２−エチルヘキシル、メタクリル酸ｎ−オクチル、メタクリル酸ドデシル、メタクリル酸ラウリル、メタクリル酸ステアリル等の（メタ）アクリル酸エステル；酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル、安息香酸ビニル、酪酸ビニル等のビニルエステル；Ｎ−ビニルピロール、Ｎ−ビニルカルバゾール、Ｎ−ビニルインドール、Ｎ−ビニルピロリドン等のＮ−ビニル化合物；フッ化ビニル、フッ化ビニリデン、テトラフルオロエチレン、ヘキサフルオロプロピレン、アクリル酸トリフルオロエチル、アクリル酸テトラフルオロプロピル等の含フッ素化モノマが挙げられる。これらは１種単独で又は２種以上組み合わせて用いることができる。
【００２３】
多孔質化剤としては、重合時に相分離を促し、粒子の多孔質化を促進する有機溶媒である脂肪族又は芳香族の炭化水素類、エステル類、ケトン類、エーテル類、アルコール類等が挙げられる。多孔質化剤として、具体的には、トルエン、キシレン、シクロヘキサン、オクタン、酢酸ブチル、フタル酸ジブチル、メチルエチルケトン、ジブチルエーテル、１−ヘキサノール、２−オクタノール、デカノール、ラウリルアルコール、シクロヘキサノール等が挙げられる。これらの多孔質化剤は、１種を単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００２４】
上記多孔質化剤は、モノマ全質量に対して０〜２００質量％使用できる。多孔質化剤の量によって、多孔質ポリマ粒子の空隙率をコントロールできる。さらに、多孔質化剤の種類によって、多孔質ポリマ粒子の細孔の大きさ及び形状をコントロールすることができる。
【００２５】
溶媒として使用する水を多孔質化剤とすることもできる。水を多孔質化剤とする場合は、モノマに油溶性界面活性剤を溶解させ、水を吸収することによって、粒子を多孔質化することが可能である。
【００２６】
多孔質化に使用される油溶性界面活性剤としては、分岐Ｃ１６〜Ｃ２４脂肪酸、鎖状不飽和Ｃ１６〜Ｃ２２脂肪酸又は鎖状飽和Ｃ１２〜Ｃ１４脂肪酸のソルビタンモノエステル、例えば、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノオレテート、ソルビタンモノミリステート又はヤシ脂肪酸から誘導されるソルビタンモノエステル；分岐Ｃ１６〜Ｃ２４脂肪酸、鎖状不飽和Ｃ１６〜Ｃ２２脂肪酸又は鎖状飽和Ｃ１２〜Ｃ１４脂肪酸のジグリセロールモノエステル、例えば、ジグリセロールモノオレエート（例えば、Ｃ１８：１（炭素数１８個、二重結合数１個）脂肪酸のジグリセロールモノエステル）、ジグリセロールモノミリステート、ジグリセロールモノイソステアレート又はヤシ脂肪酸のジグリセロールモノエステル；分岐Ｃ１６〜Ｃ２４アルコール（例えば、ゲルベアルコール）、鎖状不飽和Ｃ１６〜Ｃ２２アルコール又は鎖状飽和Ｃ１２〜Ｃ１４アルコール（例えば、ヤシ脂肪アルコール）のジグリセロールモノ脂肪族エーテル；及びこれらの混合物が挙げられる。
【００２７】
これらのうち、ソルビタンモノラウレート（例えば、ＳＰＡＮ（スパン、登録商標）２０、純度が好ましくは約４０％を超える、より好ましくは約５０％を超える、更に好ましくは約７０％を超えるソルビタンモノラウレート）、ソルビタンモノオレエート（例えば、ＳＰＡＮ（スパン、登録商標）８０、純度が好ましくは約４０％を超える、より好ましくは約５０％を超える、更に好ましくは約７０％を超えるソルビタンモノオレエート）、ジグリセロールモノオレエート（例えば、純度が好ましくは約４０％を超える、より好ましくは約５０％を超える、更に好ましくは約７０％を超えるジグリセロールモノオレエート）、ジグリセロールモノイソステアレート（例えば、純度が好ましくは約４０％を超える、より好ましくは約５０％を超える、更に好ましくは約７０％を超えるジグリセロールモノイソステアレート）、ジグリセロールモノミリステート（純度が好ましくは約４０％を超える、より好ましくは約５０％を超える、更に好ましくは約７０％を超えるソルビタンモノミリステート）、ジグリセロールのココイル（例えば、ラウリル基、ミリストイル基等）エーテル、又は、これらの混合物が好ましい。
【００２８】
これらの油溶性界面活性剤は、モノマ全質量に対して５〜８０質量％の範囲で用いることが好ましい。油溶性界面活性剤の含有量が５質量％以上であると、水滴の安定性が充分となることから、大きな単一孔を形成し難くなる。また、油溶性界面活性剤の含有量が８０質量％以下であると、重合後に多孔質ポリマ粒子が形状をより保持し易くなる。
【００２９】
溶解性粒子とは、例えば、酸、アルカリ、溶剤等に溶解性を示す粒子である。溶解性粒子としては、例えば、炭酸カルシウム、第三リン酸カルシウム、シリカ、ポリマ、金属コロイド等を使用することができる。除去のし易さの観点から、炭酸カルシウム又は第三リン酸カルシウムを用いることが好ましい。溶解性粒子の粒径は粒子内の通液性を向上させる観点から、０．６〜５μｍであることが好ましく、１〜５μｍであることがより好ましい。
【００３０】
重合反応に用いられる水性媒体としては、水、水と水溶性溶媒（例えば、低級アルコール）との混合媒体等が挙げられる。水性媒体には、界面活性剤が含まれていてもよい。界面活性剤としては、アニオン系、カチオン系、ノニオン系及び両性イオン系の界面活性剤のうち、いずれも用いることができる。
【００３１】
アニオン系界面活性剤としては、例えば、オレイン酸ナトリウム、ヒマシ油カリ等の脂肪酸油、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸アンモニウム等のアルキル硫酸エステル塩、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム等のアルキルベンゼンスルホン酸塩、アルキルナフタレンスルホン酸塩、アルカンスルホン酸塩、ジオクチルスルホコハク酸ナトリウム等のジアルキルスルホコハク酸塩、アルケルニルコハク酸塩（ジカリウム塩）、アルキルリン酸エステル塩、ナフタレンスルホン酸ホルマリン縮合物、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸エステル塩、ポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸ナトリウム等のポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩及びポリオキシエチレンアルキル硫酸エステル塩が挙げられる。
【００３２】
カチオン系界面活性剤としては、例えば、ラウリルアミンアセテート、ステアリルアミンアセテート等のアルキルアミン塩、ラウリルトリメチルアンモニウムクロライド等の第四級アンモニウム塩が挙げられる。
【００３３】
ノニオン系界面活性剤としては、例えば、ポリエチレングリコールアルキルエーテル類、ポリエチレングリコールアルキルアリールエーテル類、ポリエチレングリコールエステル類、ポリエチレングリコールソルビタンエステル類、ポリアルキレングリコールアルキルアミン又はアミド類等の炭化水素系ノニオン界面活性剤、シリコンのポリエチレンオキサイド付加物類、ポリプロピレンオキサイド付加物類等のポリエーテル変性シリコン系ノニオン界面活性剤、パーフルオロアルキルグリコール類等のフッ素系ノニオン界面活性剤が挙げられる。
【００３４】
両性イオン系界面活性剤としては、例えば、ラウリルジメチルアミンオキサイド等の炭化水素界面活性剤、リン酸エステル系界面活性剤及び亜リン酸エステル系界面活性剤が挙げられる。
【００３５】
界面活性剤は、１種を単独で又は２種以上を組み合わせて用いてもよい。上記界面活性剤の中でも、モノマ重合時の分散安定性の観点から、アニオン系界面活性剤が好ましい。
【００３６】
必要に応じて添加される重合開始剤としては、例えば、過酸化ベンゾイル、過酸化ラウロイル、オルソクロロ過酸化ベンゾイル、オルソメトキシ過酸化ベンゾイル、３，５，５−トリメチルヘキサノイルパーオキサイド、ｔｅｒｔ−ブチルパーオキシ−２−エチルヘキサノエート、ジ−ｔｅｒｔ−ブチルパーオキサイド等の有機過酸化物；２，２’−アゾビスイソブチロニトリル、１，１’−アゾビスシクロヘキサンカルボニトリル、２，２’−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）等のアゾ系化合物が挙げられる。重合開始剤は、モノマ１００質量部に対して、０．１〜７．０質量部の範囲で使用することができる。
【００３７】
重合温度は、モノマ及び重合開始剤の種類に応じて、適宜選択することができる。重合温度は、２５〜１１０℃が好ましく、５０〜１００℃がより好ましい。
【００３８】
多孔質ポリマ粒子の合成において、粒子の分散安定性を向上させるために、高分子分散安定剤を添加してもよい。
【００３９】
高分子分散安定剤としては、例えば、ポリビニルアルコール、ポリカルボン酸、セルロース類（ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース等）、ポリビニルピロリドンが挙げられ、トリポリリン酸ナトリウム等の無機系水溶性高分子化合物も併用することができる。これらのうち、ポリビニルアルコール又はポリビニルピロリドンが好ましい。高分子分散安定剤の添加量は、モノマ１００質量部に対して１〜１０質量部が好ましい。
【００４０】
モノマが単独で重合することを抑えるために、亜硝酸塩類、亜硫酸塩類、ハイドロキノン類、アスコルビン酸類、水溶性ビタミンＢ類、クエン酸、ポリフェノール類等の水溶性の重合禁止剤を用いてもよい。
【００４１】
多孔質ポリマ粒子の平均粒径は、好ましくは３００μｍ以下、より好ましくは１５０μｍ以下、更に好ましくは１００μｍ以下である。また、多孔質ポリマ粒子の平均粒径は、通液性の向上の観点から、好ましくは１０μｍ以上、より好ましくは３０μｍ以上であり、更に好ましくは５０μｍ以上である。
【００４２】
多孔質ポリマ粒子又は分離材の平均粒径は、以下の測定法により求めることができる。
（１）粒子を、超音波分散装置を使用して水（界面活性剤等の分散剤を含む）に分散させ、１質量％の多孔質ポリマ粒子を含む分散液を調製する。
（２）粒度分布計（シスメックスフロー、シスメックス株式会社製）を用いて、上記分散液中の粒子約１万個の画像により平均粒径を測定する。
【００４３】
多孔質ポリマ粒子の細孔容積は、多孔質ポリマ粒子の全体積基準で３０体積％以上７０体積％以下であることが好ましく、４０体積％以上７０体積％以下であることがより好ましい。多孔質ポリマ粒子は、細孔径が０．０１μｍ以上０．６μｍ未満である細孔、すなわちマクロポアー（マクロ孔）を有することが好ましい。多孔質ポリマ粒子の細孔径として、より好ましくは、０．１μｍ以上０．６μｍ未満である。細孔径が０．０１μｍ以上であると、細孔内に物質が入り易くなる傾向にあり、細孔径が０．６μｍ未満であると、比表面積が充分なものになる。これらは上述の多孔質化剤により調整可能である。
【００４４】
多孔質ポリマ粒子の比表面積は、３０ｍ２／ｇ以上であることが好ましい。より高い実用性の観点から、比表面積は３５ｍ２／ｇ以上であることがより好ましく、４０ｍ２／ｇ以上であることが更に好ましい。比表面積が３０ｍ２／ｇ以上であると、分離する物質の吸着量が大きくなる傾向にある。
【００４５】
（被覆層）
本実施形態に係る被覆層は、水酸基を有する高分子を含む。水酸基を有する高分子で多孔質ポリマ粒子を被覆することによりカラム圧の上昇を抑制することができるとともに、タンパク質の非特異吸着を抑制することが可能となる上、分離材のタンパク質吸着量を、天然高分子を用いた場合と同等又はそれ以上とすることが可能となる。さらに、水酸基を有する高分子が架橋されていると、カラム圧の上昇をより抑制することが可能となる。
【００４６】
（水酸基を有する高分子）
水酸基を有する高分子は、１分子中に２個以上の水酸基を有することが好ましく、親水性高分子であることがより好ましい。水酸基を有する高分子としては、例えば、多糖類、好ましくはアガロース、デキストラン、セルロース、ポリビニルアルコール、キトサン等が挙げられ、例えば平均分子量１万〜２０万程度のものが使用できる。
【００４７】
また、水酸基を有する高分子は、界面吸着能を向上させる観点から、疎水基により変性された変性体であってもよい。疎水基としては、例えば、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数６〜１０のアリール基等が挙げられる。炭素数１〜６のアルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基等が挙げられる。炭素数６〜１０のアリール基としては、例えば、フェニル基、ナフチル基等が挙げられる。疎水基は、水酸基と反応する官能基（例えば、エポキシ基）及び疎水基を有する化合物（例えば、グリシジルフェニルエーテル）を、水酸基を有する高分子と従来公知の方法で反応させることにより、導入することができる。
【００４８】
（被覆層の形成方法）
本実施形態に係る被覆層は、例えば、以下に示す方法により形成することができる。
【００４９】
まず、水酸基を有する高分子の溶液を多孔質ポリマ粒子表面に吸着させる。水酸基を有する高分子の溶液の溶媒としては、水酸基を有する高分子を溶解することのできるものであれば、特に限定されないが、水が最も一般的である。溶媒に溶解させる高分子の濃度は、５〜２０（ｍｇ／ｍＬ）が好ましい。
【００５０】
この溶液を、多孔質ポリマ粒子に含浸させる。含浸方法は、水酸基を有する高分子の溶液に多孔質ポリマ粒子を加えて一定時間放置する。含浸時間は多孔質体の表面状態によっても変わるが、通常一昼夜含浸すれば高分子濃度が多孔質体の内部で外部濃度と平衡状態となる。その後、水、アルコール等の溶媒で洗浄し、未吸着分の水酸基を有する高分子を除去する。
【００５１】
（架橋処理）
次いで、架橋剤を加えて多孔質ポリマ粒子表面に吸着された水酸基を有する高分子を架橋反応させて、架橋体を形成する。このとき、架橋体は、水酸基を有する３次元架橋網目構造を有する。
【００５２】
架橋剤としては、例えばエピクロルヒドリン等のエピハロヒドリン、グルタルアルデヒド等のジアルデヒド化合物、メチレンジイソシアネート等のジイソシアネート化合物、エチレングリコールジグリシジルエーテル等のグリシジル化合物などのような水酸基に活性な官能基を２個以上有する化合物が挙げられる。また、水酸基を有する高分子としてキトサンのようなアミノ基を有する化合物を使用する場合には、ジクロロオクタンのようなジハライドも架橋剤として使用できる。
【００５３】
この架橋反応には通常触媒が用いられる。該触媒は架橋剤の種類に合わせて適宜従来公知のものを用いることができるが、例えば、架橋剤がエピクロルヒドリン等の場合には水酸化ナトリウム等のアルカリが有効であり、ジアルデヒド化合物の場合には塩酸等の鉱酸が有効である。
【００５４】
架橋剤による架橋反応は、通常、分離材を適当な媒体中に分散、懸濁させた系に架橋剤を添加することによって行われる。架橋剤の添加量は、水酸基を有する高分子として多糖類を使用した場合、単糖類の１単位を１モルとすると、それに対して０．１〜１００モル倍の範囲内で、分離材の性能に応じて選定することができる。一般に、架橋剤の添加量を少なくすると、被覆層が多孔質ポリマ粒子から剥離し易くなる傾向にある。また、架橋剤の添加量が過剰で、かつ、水酸基を有する高分子との反応率が高い場合、原料の水酸基を有する高分子の特性が損なわれる傾向にある。
【００５５】
また、触媒の使用量としては、架橋剤の種類により異なるが、通常、水酸基を有する高分子として多糖類を使用する場合に、多糖類を形成する単糖類の１単位を１モルとすると、これに対して０．０１〜１０モル倍の範囲、更に好ましくは０．１〜５モル倍で使用される。
【００５６】
例えば、該架橋反応条件を温度条件とした場合、反応系の温度を上げ、その温度が反応温度に達すれば架橋反応が生起する。
【００５７】
水酸基を有する高分子の溶液等を含浸させた多孔質ポリマ粒子を分散、懸濁させる媒体としては含浸させた高分子溶液から高分子、架橋剤等を抽出してしまうことなく、かつ、架橋反応に不活性なものである必要がある。その具体例としては水、アルコール等が挙げられる。
【００５８】
架橋反応は、通常、５〜９０℃の範囲の温度で、１〜１０時間かけて行う。好ましくは、３０〜９０℃の範囲の温度である。
【００５９】
架橋反応終了後、生成した粒子を濾別し、次いで水、メタノール、エタノール等の親水性有機溶媒で洗浄し、未反応の高分子、懸濁用媒体等を除去すれば、多孔質ポリマ粒子の表面の少なくとも一部が、水酸基を有する高分子を含む被覆層により被覆された分離材が得られる。
【００６０】
本実施形態の分離材は、多孔質ポリマ粒子１ｇ当たり３０〜４００ｍｇの被覆層を備えることが好ましく、５０〜４００ｍｇの被覆層を備えることがより好ましく、１００〜３５０ｍｇの被覆層を備えることが更に好ましい。被覆層の割合が多孔質ポリマ粒子１ｇに対して４００ｍｇ以下であると、被覆層を薄膜とすることができ、カラムとして用いたときの通液性がより向上する傾向にある。また、被覆層の割合が多孔質ポリマ粒子１ｇに対して３０ｍｇ以上であると、タンパク質吸着量がより高まる傾向にある。被覆層の量は熱分解の重量減少等で測定することができる。
【００６１】
（イオン交換基の導入）
被覆層を備える分離材は、イオン交換基、リガンド（プロテインＡ）等を表面上の水酸基等を介して導入することによりイオン交換精製、アフィニティ精製等に使用することができる。イオン交換基の導入方法として、例えば、ハロゲン化アルキル化合物を用いる方法が挙げられる。
【００６２】
ハロゲン化アルキル化合物としては、モノハロゲノ酢酸、モノハロゲノプロピオン酸等のモノハロゲノカルボン酸及びそのナトリウム塩、ジエチルアミノエチルクロライド等のハロゲン化アルキル基を少なくとも１つ有する１級、２級又は３級アミン、ハロゲン化アルキル基を有する４級アンモニウムの塩酸塩などが挙げられる。これらのハロゲン化アルキル化合物は、臭化物又は塩化物であることが好ましい。ハロゲン化アルキル化合物の使用量としては、イオン交換基を付与する分離材の全質量に対して０．２質量％以上であることが好ましい。
【００６３】
イオン交換基の導入には、反応を促進させるために、有機溶媒を用いることが有効である。有機溶媒としては、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、イソブタノール、１−ペンタノール、イソペンタノール等のアルコール類が挙げられる。
【００６４】
通常、イオン交換基の導入は、分離材表面の水酸基に行われるので、湿潤状態の粒子を、ろ過等により水切りした後、所定濃度のアルカリ性水溶液に浸漬し、一定時間放置した後、水−有機溶媒混合系で、上記ハロゲン化アルキル化合物を添加して反応させる。この反応は温度４０〜９０℃で、０．５〜１２時間行うことが好ましい。上記の反応で使用されるハロゲン化アルキル化合物の種類により、付与されるイオン交換基が決定される。
【００６５】
イオン交換基として、弱塩基性基であるアミノ基を導入する方法としては、上記ハロゲン化アルキル化合物のうち、水素原子の一部が塩素原子に置換されたアルキル基を少なくとも１つ有する、モノ−、ジ−又はトリ−アルキルアミン、モノ−、ジ−又はトリ−アルカノールアミン、モノ−アルキル−モノ−アルカノールアミン、ジ−アルキル−モノ−アルカノールアミン、モノ−アルキル−ジ−アルカノールアミン等を反応させる方法が挙げられる。これらのハロゲン化アルキル化合物の使用量としては、分離材の全質量に対して０．２質量％以上であることが好ましい。反応条件は、４０〜９０℃で、０．５〜１２時間であることが好ましい。
【００６６】
イオン交換基として、強塩基性基の４級アンモニウム基を導入する方法としては、まず、３級アミノ基を導入し、該３級アミノ基にエピクロルヒドリン等のハロゲン化アルキル化合物を反応させ、４級アンモニウム基に変換させる方法が挙げられる。また、４級アンモニウムの塩酸塩等を分離材に反応させてもよい。
【００６７】
イオン交換基として、弱酸性基であるカルボキシ基を導入する方法としては、上記ハロゲン化アルキル化合物として、モノハロゲノ酢酸、モノハロゲノプロピオン酸等のモノハロゲノカルボン酸又はそのナトリウム塩を反応させる方法が挙げられる。これらハロゲン化アルキル化合物の使用量は、イオン交換基を導入する分離材の全質量に対して０．２質量％以上であることが好ましい。
【００６８】
イオン交換基として、強酸性基であるスルホン酸基の導入方法としては、分離材に対してエピクロロヒドリン等のグリシジル化合物を反応させ、亜硫酸ナトリウム、重亜硫酸ナトリウム等の亜硫酸塩又は重亜硫酸塩の飽和水溶液に分離材を添加する方法が挙げられる。反応条件は、３０〜９０℃で１〜１０時間であることが好ましい。
【００６９】
一方、イオン交換基の導入方法として、アルカリ性雰囲気下で、分離材に１，３−プロパンスルトンを反応させる方法も挙げられる。１，３−プロパンスルトンは、分離材の全質量に対して０．４質量％以上使用することが好ましい。反応条件は、０〜９０℃で０．５〜１２時間であることが好ましい。
【００７０】
本実施形態の分離材又は多孔質ポリマ粒子の平均細孔径及び比表面積は、水銀圧入測定装置（オートポア：株式会社島津製作所製）にて測定した値であり、以下のようにして測定する。試料約０．０５ｇを、標準５ｍＬ粉体用セル（ステム容積０．４ｍＬ）に加え、初期圧２１ｋＰａ（約３ｐｓｉａ、細孔直径約６０μｍ相当）の条件で測定する。水銀パラメータは、装置デフォルトの水銀接触角１３０°、水銀表面張力４８５ｄｙｎｅｓ／ｃｍに設定する。また、細孔径０．０５〜５μｍの範囲に限定してそれぞれの値を算出する。
【００７１】
本実施形態の分離材は、タンパク質を静電的相互作用による分離、アフィニティ精製に用いるのに好適である。例えば、タンパク質を含む混合溶液の中に本実施形態の分離材を添加し、静電的相互作用によりタンパク質だけを分離材に吸着させた後、該分離材を溶液からろ別し、塩濃度の高い水溶液中に添加すれば、分離材に吸着しているタンパク質を容易に脱離、回収できる。また、本実施形態の分離材は、カラムクロマトグラフィーにおいて、使用することも可能である。
【００７２】
本実施形態の分離材を用いて分離できる生体高分子としては、水溶性物質が好ましい。具体的には、血清アルブミン、免疫グロブリン等の血液タンパク質などのタンパク質、生体中に存在する酵素、バイオテクノロジーにより生産されるタンパク質生理活性物質、ＤＮＡ、生理活性をするペプチド等の生体高分子などであり、好ましくは分子量が２００万以下、より好ましくは５０万以下である。また、公知の方法に従い、タンパク質の等電点、イオン化状態等によって、分離材の性質、条件等を選ぶ必要がある。公知の方法としては、例えば、特開昭６０−１６９４２７号公報等に記載の方法が挙げられる。
【００７３】
本実施形態の分離材は、多孔質ポリマ粒子上の被覆層を架橋処理後、分離材の表面にイオン交換基、プロテインＡを導入することにより、タンパク質等の生体高分子の分離において、天然高分子からなる粒子又は合成ポリマからなる粒子のそれぞれの利点を有する。特に本実施形態の分離材における多孔質ポリマ粒子は、上述の方法で得られるものであるため、耐久性及び耐アルカリ性を有する。また、本実施形態の分離材は、タンパク質の非特異吸着を低減し、タンパク質の吸脱着が起こり易い傾向にある。さらに、本実施形態の分離材は、同一流速下でのタンパク質等の吸着量（動的吸着量）が大きい傾向にある。
【００７４】
本明細書における通液速度とは、φ７．８×３００ｍｍのステンレスカラムに本実施形態の分離材を充填し、液を通した際の通液速度を表す。本実施形態の分離材は、カラムに充填した場合、カラム圧０．３ＭＰａのときに通液速度が８００ｃｍ／ｈ以上であることが好ましい。カラムクロマトグラフィーでタンパク質の分離を行う場合、タンパク質溶液等の通液速度としては、一般に４００ｃｍ／ｈ以下の範囲であるが、本実施形態の分離材を使用した場合は、通常のタンパク質分離用の分離材よりも速い通液速度８００ｃｍ／ｈ以上で使用することができる。
【００７５】
本実施形態の分離材の平均粒径は、１０〜３００μｍであることが好ましい。分取用又は工業用のクロマトグラフィーでの使用には、カラム内圧の極端な増加を避けるために、１０〜１００μｍであることが好ましい。
【００７６】
本実施形態の分離材は、カラムクロマトグラフィーでカラム充填材として使用した場合、使用する溶出液の性質に依らず、カラム内での体積変化がほとんどないため、操作性に優れる。
【００７７】
本実施形態の分離材の５％圧縮変形弾性率は、以下のようにして算出することができる。
【００７８】
微小圧縮試験機（Ｆｉｓｈｅｒ製）を用いて、室温（２５℃）条件にて荷重負荷速度１ｍＮ／秒で、四角柱の平滑な端面（５０μｍ×５０μｍ）により粒子を５０ｍＮまで圧縮したときの荷重及び圧縮変位を測定する。得られた測定値から、粒子が５％圧縮変形したときの圧縮弾性率（５％Ｋ値）を下記式により求めることができる。また、上記測定中の変位量が最も大きく変化する点の荷重を破壊強度（ｍＮ）とする。
５％Ｋ値（ＭＰａ）＝（３／２１／２）・Ｆ・Ｓ−３／２・Ｒ−１／２
Ｆ：架橋ポリマ粒子が５％圧縮変形したときの荷重（ｍＮ）
Ｓ：架橋ポリマ粒子が５％圧縮変形したときの圧縮変位（ｍｍ）
Ｒ：架橋ポリマ粒子の半径（ｍｍ）
【００７９】
分離材を５％圧縮変形したときの圧縮弾性率（５％Ｋ値）は、３００〜１５００ＭＰａであることが好ましく、４００〜１５００ＭＰａであることがより好ましい。圧縮弾性率が３００ＭＰａ以上であると、多孔質ポリマ粒子の柔軟性が低くなるため、カラム内で液を流した際に変形しにくくなり、カラム圧を抑えることができる。
【００８０】
分離材の平均細孔径は、０．０５〜０．６μｍであることが好ましく、０．０５〜０．５μｍであることがより好ましく、０．１〜０．５μｍであることが更に好ましい。平均細孔径が０．０５μｍ以上であると、細孔内に物質が入り易くなる傾向にあり、平均細孔径が０．６μｍ以下であると、比表面積が充分なものになる。
【００８１】
分離材の比表面積は、３０ｍ２／ｇ以上であることが好ましい。より高い実用性の観点から、比表面積は３５ｍ２／ｇ以上であることがより好ましく、４０ｍ２／ｇ以上であることが更に好ましい。比表面積が３０ｍ２／ｇ以上であると、分離する物質の吸着量が大きくなる傾向にある。分離材の比表面積の上限値は、３００ｍ２／ｇ以下とすることができる。
【００８２】
分離材の５％変形弾性率、平均細孔径、比表面積等は、多孔質ポリマ粒子の原料、多孔質化剤、水酸基を有する高分子等を適宜選択することによって、調整することができる。
【００８３】
本実施形態の分離材は、カラムに用いることができる。すなわち、本実施形態のカラムは、上記分離材を備える。なお、本実施形態では、イオン交換基を導入する形態の分離材について説明したが、イオン交換基を導入しなくても分離材として用いることができる。このような分離材は、例えば、ゲルろ過クロマトグラフィーに利用することができる。
【実施例】
【００８４】
以下、本発明を実施例により説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００８５】
（多孔質ポリマ粒子１）
５００ｍＬの三口フラスコに、モノマとして、アダマンタントリメタクリレート（ＡＤＴＭＡ）９．６ｇ、純度９６％のジビニルベンゼン（ＤＶＢ、新日鉄住金化学株式会社製、商品名「ＤＶＢ９６０」）２．４ｇ、多孔質化剤として、ジエチルベンゼン１２ｇ、ヘキサノール１２ｇ、重合開始剤として、過酸化ベンゾイル０．５ｇを加え、モノマ溶液を調製した。ポリビニルアルコールを０．５質量％含む水溶液を溶媒として使用し、モノマ溶液をマイクロプロセスサーバーを使用して乳化させ、２５体積％の乳化液を得た。得られた乳化液をフラスコに移し、８０℃のウォーターバスで加熱しながら、撹拌機を用いて約８時間撹拌をした。得られた粒子をろ過後、アセトンで洗浄を行い、多孔質ポリマ粒子１を得た。多孔質ポリマ粒子１の粒径をフロー型粒径測定装置（ＦＰＩＡ−３０００、シスメックス株式会社製）で測定し、平均粒径を算出した。結果を表１に示す。
【００８６】
（多孔質ポリマ粒子２）
アダマンタントリメタクリレート、ジビニルベンゼン、ジエチルベンゼン及びヘキサノールの使用量を、それぞれ６ｇ、６ｇ、１０ｇ、１４ｇに変更した以外は、多孔質ポリマ粒子１の合成と同様にして、多孔質ポリマ粒子２を合成した。
【００８７】
（多孔質ポリマ粒子３）
アダマンタントリメタクリレート、ジビニルベンゼン、ジエチルベンゼン及びヘキサノールの使用量を、それぞれ３ｇ、９ｇ、８ｇ、１６ｇに変更した以外は、多孔質ポリマ粒子１の合成と同様にして、多孔質ポリマ粒子３を合成した。
【００８８】
（多孔質ポリマ粒子４）
アダマンタントリメタクリレート９．６ｇ、ジビニルベンゼン２．４ｇ、ジエチルベンゼン１２ｇ及びヘキサノール１２ｇを、アダマンタンジアクリレート（ＡＤＤＡ）６ｇ、ジビニルベンゼン６ｇ、ジエチルベンゼン１０ｇ及びヘキサノール１４ｇに変更した以外は、多孔質ポリマ粒子１の合成と同様にして、多孔質ポリマ粒子４を合成した。
【００８９】
（多孔質ポリマ粒子５）
アダマンタントリメタクリレート９．６ｇ、ジビニルベンゼン２．４ｇ、ジエチルベンゼン１２ｇ及びヘキサノール１２ｇを、アダマンタンメタクリレート（ＡＤＭＡ）６ｇ、ジビニルベンゼン６ｇ、ジエチルベンゼン１６ｇ及びヘキサノール８ｇに変更した以外は、多孔質ポリマ粒子１の合成と同様にして、多孔質ポリマ粒子５を合成した。
【００９０】
（多孔質ポリマ粒子６）
ヘキサノール１４ｇを、オクタノール１４ｇに変更した以外は、多孔質ポリマ粒子２の合成と同様にして、多孔質ポリマ粒子６を合成した。
【００９１】
（多孔質ポリマ粒子７）
ヘキサノール１４ｇを、イソアミルアルコール１４ｇに変更した以外は、多孔質ポリマ粒子２の合成と同様にして、多孔質ポリマ粒子７を合成した。
【００９２】
（多孔質ポリマ粒子８）
アダマンタントリメタクリレート９．６ｇ、ジビニルベンゼン２．４ｇ、ジエチルベンゼン１２ｇ及びヘキサノール１２ｇを、ジビニルベンゼン４ｇ、２，３−ジヒドロキシプロピルメタクリレート（ＧＭＡ）８ｇ及びスパン８０（４ｇ）に変更した以外は、多孔質ポリマ粒子１の合成と同様にして、多孔質ポリマ粒子８を合成した。
【００９３】
（多孔質ポリマ粒子９）
アダマンタントリメタクリレート９．６ｇ、ジビニルベンゼン２．４ｇ、ジエチルベンゼン１２ｇ及びヘキサノール１２ｇを、２，３−ジヒドロキシプロピルメタクリレート１１．２ｇ、エチレングリコールジメタクリレート（ＥＧＤＭＡ）４．８ｇ及びスパン８０  ５ｇに変更した以外は、多孔質ポリマ粒子１の合成と同様にして、多孔質ポリマ粒子９を合成した。
【００９４】
【表１】
0006746915.tif 000002
【００９５】
（実施例１）
＜被覆層の形成及び架橋＞
アガロース水溶液（２質量％）１００ｍＬに水酸化ナトリウム４ｇ及びグリシジルフェニルエーテル０．１４ｇを投入して７０℃で１２時間反応させ、アガロースにフェニル基を導入した。得られた変性アガロースをイソプロピルアルコールで再沈殿させ、洗浄した。次に、２０ｍｇ／ｍＬの変性アガロース水溶液に多孔質ポリマ粒子１を、水溶液７０ｍＬに対して多孔質ポリマ粒子１を１ｇの割合で投入し、５５℃で２４時間撹拌して、多孔質ポリマ粒子１に変性アガロースを吸着させた。吸着後、ろ過を行い、熱水で洗浄した。
【００９６】
変性アガロースは次のようにして架橋した。エチレングリコールジグリシジルエーテル及び水酸化ナトリウムの濃度がそれぞれ０．６４Ｍ、０．４Ｍである水溶液に、水溶液３５ｍＬに対して変性アガロースが吸着した多孔質ポリマ粒子１を１ｇの割合で投入し、２４時間室温にて撹拌した。その後、２質量％の熱ドデシル硫酸ナトリウム水溶液で洗浄後、純水で洗浄した。
【００９７】
（タンパク質の非特異吸着能評価）
得られた粒子０．５ｇをＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ）濃度２０ｍｇ／ｍＬのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）５０ｍＬに投入し、２４時間室温で撹拌を行った。その後、遠心分離で上澄みをとり、分光光度計でろ液のＢＳＡ濃度より、粒子に吸着したＢＳＡ量を算出した。ＢＳＡの濃度は分光光度計により２８０ｎｍの吸光度から確認した。結果を表３に示す。
【００９８】
＜イオン交換基の導入＞
変性アガロースが架橋された粒子を含む水懸濁液から粒子をろ別した。得られた粒子（乾燥質量２０ｇ）を５Ｍの水酸化ナトリウム水溶液２００ｍＬに投入し、室温で１時間放置した。別途、ジエチルアミノエチルクロライド塩酸塩の所定量（６０ｇ）を２００ｍＬの水に添加し、ジエチルアミノエチルクロライド塩酸塩の水溶液を調製した。この水溶液を、上記水酸化ナトリウム水溶液に加え、温度を７０℃まで上げ、撹拌しながら２時間反応させた。反応終了後、生成物をろ別して水洗し、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基をイオン交換基として有する（ＤＥＡＥ変性）分離材を得た。得られた分離材の平均細孔径及び比表面積を水銀圧入法にて測定した。また、得られた分離材を乾燥後、熱重量分析により被覆層の質量（被覆量）を測定した。結果を表２に示す。
【００９９】
（５％圧縮変形弾性率）
分離材の５％圧縮変形弾性率は、上述の方法で測定した。結果を表２に示す。
【０１００】
（カラム特性評価）
得られた分離材を濃度３０質量％のスラリー（溶媒：メタノール）としてφ７．８×３００ｍｍのステンレスカラムに１５分かけて充填した。その後、カラムに流速を変えながら水を通し、流速とカラム圧との関係を測定し、０．３ＭＰａ時の通液速度を測定した。結果を表３に示す。
【０１０１】
また、動的吸着量は以下のようにして測定した。２０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）をカラムに１０カラム容量通した。その後、ＢＳＡ濃度２ｍｇ／ｍＬの２０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−塩酸緩衝液を通し、ＵＶ測定によってカラム出口でのＢＳＡ濃度を測定した。カラム入口と出口のＢＳＡ濃度が一致するまで緩衝液を通し、５カラム容量分の１Ｍ  ＮａＣｌ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液で希釈した。１０％ｂｒｅａｋｔｈｒｏｕｇｈにおける動的吸着量を以下の式を用いて算出した。結果を表３に示す。
ｑ１０＝ｃｆＦ（ｔ１０−ｔ０）／ＶＢ
ｑ１０：１０％ｂｒｅａｋｔｈｒｏｕｇｈにおける動的吸着量（ｍｇ／ｍＬ  ｗｅｔ  ｒｅｓｉｎ）
ｃｆ：注入しているＢＳＡ濃度（ｍｇ／ｍＬ）
Ｆ：流速（ｍＬ／ｍｉｎ）
ＶＢ：ベッド体積（ｍＬ）
ｔ１０：１０％ｂｒｅａｋｔｈｒｏｕｇｈにおける時間（ｍｉｎ）
ｔ０：ＢＳＡ注入開始時間（ｍｉｎ）
【０１０２】
（実施例２）
多孔質ポリマ粒子１を多孔質ポリマ粒子２に変更した以外は、実施例１と同様にして分離材を作製し、実施例１と同様に評価した。
【０１０３】
（実施例３）
多孔質ポリマ粒子１を多孔質ポリマ粒子３に変更した以外は、実施例１と同様にして分離材を作製し、実施例１と同様に評価した。
【０１０４】
（実施例４）
多孔質ポリマ粒子１を多孔質ポリマ粒子４に変更した以外は、実施例１と同様にして分離材を作製し、実施例１と同様に評価した。
【０１０５】
（実施例５）
多孔質ポリマ粒子１を多孔質ポリマ粒子５に変更した以外は、実施例１と同様にして分離材を作製し、実施例１と同様に評価した。
【０１０６】
（実施例６）
多孔質ポリマ粒子１を多孔質ポリマ粒子６に変更した以外は、実施例１と同様にして分離材を作製し、実施例１と同様に評価した。
【０１０７】
（実施例７）
多孔質ポリマ粒子１を多孔質ポリマ粒子７に変更した以外は、実施例１と同様にして分離材を作製し、実施例１と同様に評価した。
【０１０８】
（比較例１）
多孔質ポリマ粒子１を多孔質ポリマ粒子８に変更し、水酸基を有する高分子（アガロース）による被覆層の形成せずに、イオン交換基を導入した以外は実施例１と同様にして分離材を作製し、実施例１と同様に評価をした。
【０１０９】
（比較例２）
多孔質ポリマ粒子９  ４ｇを、デキストラン（分子量１５万）１ｇ、水酸化ナトリウム０．６ｇ及び水素化ホウ素ナトリウム０．１５ｇを蒸留水に溶解させた溶液６ｇに加えて、多孔質ポリマ粒子９の細孔内にデキストランを含浸させた。得られたデキストラン含浸重合体を、１質量％エチルセルローストルエン溶液１Ｌに加えて撹拌し、分散、懸濁した。得られた懸濁液中に、エピクロルヒドリン５ｍＬを加えて５０℃に昇温し、この温度で６時間撹拌して、多孔質ポリマ粒子９の細孔内に含浸されているデキストランを架橋した。反応終了後、懸濁液をろ過してゲル状物質を分離し、トルエン、エタノール、蒸留水で順次洗浄することによって、分離材を得た。この分離材について、実施例１と同様に評価をした。
【０１１０】
（比較例３）
多孔質ポリマ粒子７をそのまま分離材として用い、実施例１と同様に評価した。
【０１１１】
【表２】
0006746915.tif 000003
【０１１２】
【表３】
0006746915.tif 000004
【０１１３】
表３に示すとおり、本願実施例１〜７は、比較例１〜３に比べて、タンパク質の非特異吸着を低減し、耐久性に優れ、かつカラムとして用いたときの通液性等のカラム特性に優れることが判明した。