(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）抗原をコードする核酸配列を含む核酸分子、及び
ｂ）ＩＬ−３３をコードする核酸配列を含む核酸分子であって、前記ＩＬ−３３をコードする核酸配列は、配列番号１に記載のヌクレオチド配列、及び配列番号３に記載のヌクレオチド配列からなる群から選択される配列を含む、核酸分子、
を含む、ワクチン。
【請求項２】
前記抗原は、第１の核酸によってコードされ、ＩＬ−３３は、第２の核酸によってコードされる、請求項１に記載の前記ワクチン。
【請求項３】
請求項２に記載の抗原としてコードされた核酸配列を伴う抗原ペプチド、及び、請求項２に記載のＩＬ−３３としてコードされた核酸配列を伴うＩＬ−３３ペプチドをさらに含む、請求項２に記載の前記ワクチン。
【請求項４】
ＩＬ−３３は、ｐｒｏＩＬ−３３及びｍｔｒＩＬ−３３からなる群から選択される、請求項１に記載の前記ワクチン。
【請求項５】
ＩＬ−３３は、ｐｒｏＩＬ−３３である、請求項４に記載の前記ワクチン。
【請求項６】
ｐｒｏＩＬ−３３は、配列番号３に記載のヌクレオチド配列によってコードされる、請求項５に記載の前記ワクチン。
【請求項７】
ＩＬ−３３は、ｍｔｒＩＬ−３３である、請求項４に記載の前記ワクチン。
【請求項８】
ｍｔｒＩＬ−３３は、配列番号１に記載のヌクレオチド配列によってコードされる、請求項７に記載の前記ワクチン。
【請求項９】
前記抗原は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）抗原、インフルエンザ抗原、熱帯熱マラリア原虫抗原、結核菌抗原、リンパ性脈絡髄膜炎（ＬＣＭＶ）抗原、及びそれらの断片からなる群から選択される、請求項１に記載の前記ワクチン。
【請求項１０】
前記ＨＰＶ抗原は、ＨＰＶ１６  Ｅ６抗原、ＨＰＶ１６  Ｅ７抗原、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項９に記載の前記ワクチン。
【請求項１１】
前記ＨＩＶ抗原は、Ｅｎｖ  Ａ、Ｅｎｖ  Ｂ、Ｅｎｖ  Ｃ、Ｅｎｖ  Ｄ、Ｂ  Ｎｅｆ−Ｒｅｖ、Ｇａｇ、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項９に記載の前記ワクチン。
【請求項１２】
前記インフルエンザ抗原は、Ｈ１  ＨＡ、Ｈ２  ＨＡ、Ｈ３  ＨＡ、Ｈ５  ＨＡ、ＢＨＡ抗原、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項９に記載の前記ワクチン。
【請求項１３】
前記熱帯熱マラリア原虫抗原は、サーカムスポロゾイト（ＣＳ）抗原を含む、請求項９に記載の前記ワクチン。
【請求項１４】
前記結核菌抗原は、Ａｇ８５Ａ、Ａｇ８５Ｂ、ＥｓｘＡ、ＥｓｘＢ、ＥｓｘＣ、ＥｓｘＤ、ＥｓｘＥ、ＥｓｘＦ、ＥｓｘＨ、ＥｓｘＯ、ＥｓｘＱ、ＥｓｘＲ、ＥｓｘＳ、ＥｓｘＴ、ＥｓｘＵ、ＥｓｘＶ、ＥｓｘＷ、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項９に記載の前記ワクチン。
【請求項１５】
前記ＬＣＭＶ抗原は、核タンパク質（ＮＰ）、糖タンパク質（ＧＰ）、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項９に記載の前記ワクチン。
【請求項１６】
薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、請求項１に記載の前記ワクチン。
【請求項１７】
前記第２の核酸は、発現ベクターをさらに含む、請求項２に記載の前記ワクチン。
【請求項１８】
免疫応答の増強を必要とする対象において免疫応答を増強するための、請求項１〜１７のいずれか１項に記載のワクチン。
【請求項１９】
前記ワクチンが、電気穿孔を介して投与される、請求項１８に記載のワクチン。
【請求項２０】
前記対象における前記免疫応答は、少なくとも約２倍増強される、請求項１８に記載のワクチン。
【請求項２１】
前記対象における前記免疫応答は、少なくとも約４倍増強される、請求項２０に記載のワクチン。
【請求項２２】
前記対象における前記免疫応答を増強することは、前記対象における細胞性免疫応答を増強することを含む、請求項１８に記載のワクチン。
【請求項２３】
癌の治療を必要とする対象において癌を治療するための、請求項１〜１７のいずれか１項に記載のワクチン。
【請求項２４】
前記対象における腫瘍の大きさを減少させるために用いられる、請求項２３に記載のワクチン。
【請求項２５】
前記対象における腫瘍退縮を増強するために用いられる、請求項２３に記載のワクチン。
【請求項２６】
前記癌は、ＨＰＶ関連癌、ＨＢＶ関連癌、卵巣癌、前立腺癌、乳癌、脳癌、頭頸部癌、咽喉癌、肺癌、肝臓癌、膵臓癌、腎臓癌、骨癌、メラノーマ、転移性癌、ｈＴＥＲＴ関連癌、ＦＡＰ抗原関連癌、非小細胞肺癌、血液癌、食道扁平上皮癌、子宮頸癌、膀胱癌、結腸直腸癌、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）、肛門癌、滑膜細胞腫、精巣癌、再発性呼吸器乳頭腫症、皮膚癌、神経膠芽腫、肝細胞癌、胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）、急性骨髄性白血病、トリプルネガティブ乳癌、及び原発性皮膚Ｔ細胞リンパ腫からなる群から選択される、請求項２３に記載のワクチン。
【請求項２７】
前記癌は、ＨＰＶ関連癌である、請求項２３に記載のワクチン。
【請求項２８】
配列番号１、配列番号３、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される１つ以上のヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
【請求項２９】
前記核酸分子は、プラスミドである、請求項２８に記載の前記核酸分子。
【請求項３０】
前記核酸分子は、１つ以上のプラスミドである、請求項２８に記載の前記核酸分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１３年１０月７日に出願された米国仮特許出願第６１／８８７，５０２号、及び２０１３年１０月２５日に出願された米国仮特許出願第６１／８９５，６７３号に対する優先権を主張するものであり、その全ては、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、抗原及びＩＬ−３３を含むワクチン、ならびにそのようなワクチンを投与する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
ワクチンは、個体において免疫応答を刺激し、特定の疾患に対する保護及び／または治療を提供するために使用される。いくつかのワクチンは、免疫応答を誘導するための抗原を含む。強い免疫応答を誘発する抗原もあれば、弱い免疫応答を誘発する抗原もある。抗原に対する弱い免疫応答は、ワクチンにアジュバントを含めることにより増強することができる。アジュバントには、例えば、アルミニウム塩、油乳剤、細菌または他の病原体の殺菌成分、サイトカイン等の多くの異なる形態がある。
【０００４】
サイトカインは、他の細胞の挙動に影響を及ぼす細胞によって作られるタンパク質であり、多くのアジュバントとは異なり、特定の免疫応答を調節することができる。そのようなサイトカインの１つは、インターロイキン−３３（ＩＬ−３３）である。ＩＬ−３３は、組織傷害または感染の際に免疫系に警告する内因性シグナル、すなわちアラーミンである。具体的には、全長ＩＬ−３３が細胞外空間内に放出され、その受容体ＳＴ２を活性化する。ＳＴ２の活性化が、炎症及び２型免疫応答をもたらす。
【０００５】
また、ワクチンは、多くの異なる様式（例えば、注射、経口的等）で多くの異なる組織に投与される（例えば、筋肉内、経鼻等）。しかしながら、全ての送達方法が等しいわけではない。個体集団内におけるより高いコンプライアンスを可能にする送達方法がある一方で、ワクチンの免疫原性及び／または安全性に影響を及ぼし得る送達方法もある。したがって、抗原に対する免疫応答を増強する、安全かつより効果的なアジュバントの開発の必要性が、依然として当該技術分野に存在する。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、抗原及びＩＬ−３３を含むワクチンを対象とする。ＩＬ−３３は、配列番号１に記載のヌクレオチド配列に対して少なくとも約９５％の同一性を有するヌクレオチド配列、配列番号１に記載のヌクレオチド配列、配列番号３に記載のヌクレオチド配列に対して少なくとも約９５％の同一性を有するヌクレオチド配列、及び配列番号３に記載のヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＩＬ−３３は、配列番号１に記載のヌクレオチド配列によってコードされてもよい。ＩＬ−３３は、配列番号３に記載のヌクレオチド配列によってコードされてもよい。
【０００７】
抗原は、第１の核酸によってコードされてもよく、ＩＬ−３３は、第２の核酸によってコードされ得る。第２の核酸は、発現ベクターをさらに含み得る。本ワクチンは、上記抗原と同じコードされた核酸配列及び抗原ペプチドと、上記ＩＬ−３３と同じコードされた核酸配列及びＩＬ−３３ペプチドとをさらに含むことができる。
【０００８】
ＩＬ−３３は、ｐｒｏＩＬ−３３及びｍｔｒＩＬ−３３からなる群から選択されてもよい。ＩＬ−３３は、ｐｒｏＩＬ−３３であり得る。ｐｒｏＩＬ−３３は、配列番号３に記載のヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＩＬ−３３は、ｍｔｒＩＬ−３３であり得る。ｍｔｒＩＬ−３３は、配列番号１に記載のヌクレオチド配列によってコードされ得る。
【０００９】
抗原は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）抗原、インフルエンザ抗原、熱帯熱マラリア原虫抗原、結核菌抗原、リンパ性脈絡髄膜炎（ＬＣＭＶ）抗原、及びそれらの断片からなる群から選択されてもよい。ＨＰＶ抗原は、ＨＰＶ１６  Ｅ６抗原、ＨＰＶ１６  Ｅ７抗原、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されてもよい。ＨＩＶ抗原は、Ｅｎｖ  Ａ、Ｅｎｖ  Ｂ、Ｅｎｖ  Ｃ、Ｅｎｖ  Ｄ、Ｂ  Ｎｅｆ−Ｒｅｖ、Ｇａｇ、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されてもよい。インフルエンザ抗原は、Ｈ１  ＨＡ、Ｈ２  ＨＡ、Ｈ３  ＨＡ、Ｈ５  ＨＡ、ＢＨＡ抗原、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されてもよい。熱帯熱マラリア原虫抗原は、サーカムスポロゾイト（ＣＳ）抗原を含んでもよい。結核菌抗原は、Ａｇ８５Ａ、Ａｇ８５Ｂ、ＥｓｘＡ、ＥｓｘＢ、ＥｓｘＣ、ＥｓｘＤ、ＥｓｘＥ、ＥｓｘＦ、ＥｓｘＨ、ＥｓｘＯ、ＥｓｘＱ、ＥｓｘＲ、ＥｓｘＳ、ＥｓｘＴ、ＥｓｘＵ、ＥｓｘＶ、ＥｓｘＷ、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されてもよい。ＬＣＭＶ抗原は、核タンパク質（ＮＰ）、糖タンパク質（ＧＰ）、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されてもよい。
【００１０】
本ワクチンは、薬学的に許容される賦形剤をさらに含むことができる。
【００１１】
本発明はまた、免疫応答の増強を必要とする対象において免疫応答を増強するための方法も対象とする。本方法は、抗原及びＩＬ−３３を含むワクチンを対象に投与することを含み得る。ＩＬ−３３は、配列番号１に記載のヌクレオチド配列に対して少なくとも約９５％の同一性を有するヌクレオチド配列、配列番号１に記載のヌクレオチド配列、配列番号３に記載のヌクレオチド配列に対して少なくとも約９５％の同一性を有するヌクレオチド配列、及び配列番号３に記載のヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＩＬ−３３は、配列番号１に記載のヌクレオチド配列によってコードされてもよい。ＩＬ−３３は、配列番号３に記載のヌクレオチド配列によってコードされてもよい。
【００１２】
本ワクチンを投与することは、電気穿孔を含み得る。対象における免疫応答は、少なくとも約２倍増強され得る。対象における免疫応答は、少なくとも約４倍増強され得る。対象における免疫応答を増強することは、対象における細胞性免疫応答を増強することを含み得る。
【００１３】
本発明は、癌の治療を必要とする対象において癌を治療するための方法をさらに対象とする。本方法は、抗原及びＩＬ−３３を含むワクチンを対象に投与することを含み得る。ＩＬ−３３は、配列番号１に記載のヌクレオチド配列に対して少なくとも約９５％の同一性を有するヌクレオチド配列、配列番号１に記載のヌクレオチド配列、配列番号３に記載のヌクレオチド配列に対して少なくとも約９５％の同一性を有するヌクレオチド配列、及び配列番号３に記載のヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列によってコードされ得る。ＩＬ−３３は、配列番号１に記載のヌクレオチド配列によってコードされてもよい。ＩＬ−３３は、配列番号３に記載のヌクレオチド配列によってコードされてもよい。
【００１４】
癌を治療するための方法は、対象における腫瘍の大きさを減少させることをさらに含み得る。癌を治療するための方法は、対象における腫瘍退縮を増強することをさらに含み得る。癌は、ＨＰＶ関連癌、ＨＢＶ関連癌、卵巣癌、前立腺癌、乳癌、脳癌、頭頸部癌、咽喉癌、肺癌、肝臓癌、膵臓癌、腎臓癌、骨癌、メラノーマ、転移性癌、ｈＴＥＲＴ関連癌、ＦＡＰ抗原関連癌、非小細胞肺癌、血液癌、食道扁平上皮癌、子宮頸癌、膀胱癌、結腸直腸癌、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）、肛門癌、滑膜細胞腫、精巣癌、再発性呼吸器乳頭腫症、皮膚癌、神経膠芽腫、肝細胞癌、胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）、急性骨髄性白血病、トリプルネガティブ乳癌、及び原発性皮膚Ｔ細胞リンパ腫からなる群から選択されてもよい。癌は、ＨＰＶ関連癌であり得る。
【００１５】
本発明は、配列番号１、配列番号３、配列番号１と９５％以上同一であるヌクレオチド配列、配列番号３と９５％以上同一であるヌクレオチド配列、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される１つ以上のヌクレオチド配列を含む核酸分子をさらに対象とする。核酸分子は、プラスミドであってもよい。核酸分子は、１つ以上のプラスミドであってもよい。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１−１】（Ａ）マウスｐｒｏＩＬ−３３及びマウスｍｔｒＩＬ−３３構築物の概略図、（Ｂ）ｐｒｏＩＬ−３３及びｍｔｒＩＬ−３３のウェスタンブロット検出、（Ｃ）分泌されたｐｒｏＩＬ−３３及びｍｔｒＩＬ−３３のＥＬＩＳＡ検出、ならびに（Ｄ）ｐｒｏＩＬ−３３及びｍｔｒＩＬ−３３の細胞局在を示す。
【図１−２】（Ａ）マウスｐｒｏＩＬ−３３及びマウスｍｔｒＩＬ−３３構築物の概略図、（Ｂ）ｐｒｏＩＬ−３３及びｍｔｒＩＬ−３３のウェスタンブロット検出、（Ｃ）分泌されたｐｒｏＩＬ−３３及びｍｔｒＩＬ−３３のＥＬＩＳＡ検出、ならびに（Ｄ）ｐｒｏＩＬ−３３及びｍｔｒＩＬ−３３の細胞局在を示す。
【図１−３】（Ａ）マウスｐｒｏＩＬ−３３及びマウスｍｔｒＩＬ−３３構築物の概略図、（Ｂ）ｐｒｏＩＬ−３３及びｍｔｒＩＬ−３３のウェスタンブロット検出、（Ｃ）分泌されたｐｒｏＩＬ−３３及びｍｔｒＩＬ−３３のＥＬＩＳＡ検出、ならびに（Ｄ）ｐｒｏＩＬ−３３及びｍｔｒＩＬ−３３の細胞局在を示す。
【図２−１】（Ａ）ＤＮＡワクチン免疫化スケジュール、（Ｂ）ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔ、及び（Ｃ）ＩＬ−４  ＥＬＩＳｐｏｔを示す。
【図２−２】（Ａ）ＤＮＡワクチン免疫化スケジュール、（Ｂ）ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔ、及び（Ｃ）ＩＬ−４  ＥＬＩＳｐｏｔを示す。
【図３−１】（Ａ）フローサイトメトリ分析のためのゲーティング計画、（Ｂ）ＩＦＮ−γを放出するＥ６／Ｅ７特異的ＣＤ４+Ｔ細胞、（Ｃ）ＴＮＦ−αを放出するＥ６／Ｅ７特異的ＣＤ４+Ｔ細胞、（Ｄ）ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αを放出するＥ６／Ｅ７特異的ＣＤ４+Ｔ細胞、ならびに（Ｅ）シングルポジティブ及びダブルポジティブのＣＤ４+Ｔ細胞の亜集団を示す。
【図３−２】（Ａ）フローサイトメトリ分析のためのゲーティング計画、（Ｂ）ＩＦＮ−γを放出するＥ６／Ｅ７特異的ＣＤ４+Ｔ細胞、（Ｃ）ＴＮＦ−αを放出するＥ６／Ｅ７特異的ＣＤ４+Ｔ細胞、（Ｄ）ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αを放出するＥ６／Ｅ７特異的ＣＤ４+Ｔ細胞、ならびに（Ｅ）シングルポジティブ及びダブルポジティブのＣＤ４+Ｔ細胞の亜集団を示す。
【図３−３】（Ａ）フローサイトメトリ分析のためのゲーティング計画、（Ｂ）ＩＦＮ−γを放出するＥ６／Ｅ７特異的ＣＤ４+Ｔ細胞、（Ｃ）ＴＮＦ−αを放出するＥ６／Ｅ７特異的ＣＤ４+Ｔ細胞、（Ｄ）ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αを放出するＥ６／Ｅ７特異的ＣＤ４+Ｔ細胞、ならびに（Ｅ）シングルポジティブ及びダブルポジティブのＣＤ４+Ｔ細胞の亜集団を示す。
【図４−１】（Ａ）ＩＦＮ−γを放出するＥ６／Ｅ７特異的ＣＤ８+Ｔ細胞、（Ｂ）ＴＮＦ−αを放出するＥ６／Ｅ７特異的ＣＤ８+Ｔ細胞、（Ｃ）ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αを放出するＥ６／Ｅ７特異的ＣＤ８+Ｔ細胞、（Ｄ）シングルポジティブ及びダブルポジティブのＣＤ８+Ｔ細胞の亜集団、（Ｅ）脱顆粒マーカーＣＤ１０７ａを発現するＥ６／Ｅ７特異的ＣＴＬ、ならびに（Ｆ）シングルポジティブ、ダブルポジティブ、及びトリプルポジティブのＣＤ８+Ｔ細胞の亜集団を示す。
【図４−２】（Ａ）ＩＦＮ−γを放出するＥ６／Ｅ７特異的ＣＤ８+Ｔ細胞、（Ｂ）ＴＮＦ−αを放出するＥ６／Ｅ７特異的ＣＤ８+Ｔ細胞、（Ｃ）ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αを放出するＥ６／Ｅ７特異的ＣＤ８+Ｔ細胞、（Ｄ）シングルポジティブ及びダブルポジティブのＣＤ８+Ｔ細胞の亜集団、（Ｅ）脱顆粒マーカーＣＤ１０７ａを発現するＥ６／Ｅ７特異的ＣＴＬ、ならびに（Ｆ）シングルポジティブ、ダブルポジティブ、及びトリプルポジティブのＣＤ８+Ｔ細胞の亜集団を示す。
【図４−３】（Ａ）ＩＦＮ−γを放出するＥ６／Ｅ７特異的ＣＤ８+Ｔ細胞、（Ｂ）ＴＮＦ−αを放出するＥ６／Ｅ７特異的ＣＤ８+Ｔ細胞、（Ｃ）ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αを放出するＥ６／Ｅ７特異的ＣＤ８+Ｔ細胞、（Ｄ）シングルポジティブ及びダブルポジティブのＣＤ８+Ｔ細胞の亜集団、（Ｅ）脱顆粒マーカーＣＤ１０７ａを発現するＥ６／Ｅ７特異的ＣＴＬ、ならびに（Ｆ）シングルポジティブ、ダブルポジティブ、及びトリプルポジティブのＣＤ８+Ｔ細胞の亜集団を示す。
【図５】（Ａ）Ｌｙ５．１発現の動態及び（Ｂ）エフェクターメモリーＣＤ８+Ｔ細胞の分布を示す。
【図６】ＧＰ３３／Ｌｙ５．１特異的ＣＤ８+Ｔ細胞応答の代表的な蛍光強度プロットを示す。
【図７−１】（Ａ）ＨＰＶ１６  Ｅ７に対する特異的な全ＩｇＧ抗体、（Ｂ）ＨＰＶ１６  Ｅ７に対する特異的な全ＩｇＥ抗体、及び（Ｃ）血清中で検出された全ＩｇＥ抗体を示す。
【図７−２】（Ａ）ＨＰＶ１６  Ｅ７に対する特異的な全ＩｇＧ抗体、（Ｂ）ＨＰＶ１６  Ｅ７に対する特異的な全ＩｇＥ抗体、及び（Ｃ）血清中で検出された全ＩｇＥ抗体を示す。
【図８】（Ａ）治療計画の予定表の概略図、及び（Ｂ）腫瘍細胞曝露後の経時的な平均的な腫瘍の大きさを示す。
【図９】腫瘍細胞曝露後のマウスの生存率を示す。
【図１０】ヒトｐｒｏＩＬ−３３及びヒトｍｔｒＩＬ−３３構築物の概略図を示す。
【図１１】（Ａ）ＬＣＭＶ曝露を調べる実験の予定表の概略図、（Ｂ）２０×ＬＤ50のＡｒｍｓｔｒｏｎｇ  ＬＣＭＶに頭蓋内（ｉ．ｃ．）曝露されたマウスの生存率、及び（Ｃ）４０×ＬＤ50のＡｒｍｓｔｒｏｎｇ  ＬＣＭＶに頭蓋内（ｉ．ｃ．）曝露されたマウスの生存率を示す。
【図１２−１】（Ａ）ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって決定されたときの、ＤbＮＰ３９６エピトープに応答してＩＦＮ−γを産生するＣＤ８+Ｔ細胞の能力、（Ｂ）フローサイトメトリによって測定されたときの、ＤbＮＰ３９６特異的ＣＤ８+Ｔ細胞の全サイトカイン（すなわち、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、及びＩＬ−２）発現頻度（ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）、（Ｃ）サイトカインＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、及びＩＬ−２を放出するシングルポジティブ、ダブルポジティブ、及びトリプルポジティブのＣＤ８+Ｔ細胞の亜集団、（Ｄ）ＩＦＮ−γを産生する、抗原特異的な細胞溶解性の脱顆粒Ｔ細胞の百分率（脱顆粒Ｔ細胞は脱顆粒マーカーＣＤ１０７ａによって特定され、ドットプロットは各マウス群に代表的なものであった）、（Ｅ）細胞トレーサーバイオレット及びフローサイトメトリによって測定されたときの、ＤbＮＰ３９６ペプチド、抗ＣＤ３、及び抗ＣＤ２８で刺激されたＣＤ８+Ｔ細胞の増殖率、ならびに（Ｆ）ＤbＮＰ３９６ペプチドで刺激されたときのエフェクターメモリーＣＤ８+Ｔ細胞の増殖率を示す（ドットプロットは、刺激後のＣＤ６２Ｌ-ＣＤ４４+ＣＤ８+Ｔ細胞に代表的なものであった）。
【図１２−２】（Ａ）ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって決定されたときの、ＤbＮＰ３９６エピトープに応答してＩＦＮ−γを産生するＣＤ８+Ｔ細胞の能力、（Ｂ）フローサイトメトリによって測定されたときの、ＤbＮＰ３９６特異的ＣＤ８+Ｔ細胞の全サイトカイン（すなわち、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、及びＩＬ−２）発現頻度（ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）、（Ｃ）サイトカインＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、及びＩＬ−２を放出するシングルポジティブ、ダブルポジティブ、及びトリプルポジティブのＣＤ８+Ｔ細胞の亜集団、（Ｄ）ＩＦＮ−γを産生する、抗原特異的な細胞溶解性の脱顆粒Ｔ細胞の百分率（脱顆粒Ｔ細胞は脱顆粒マーカーＣＤ１０７ａによって特定され、ドットプロットは各マウス群に代表的なものであった）、（Ｅ）細胞トレーサーバイオレット及びフローサイトメトリによって測定されたときの、ＤbＮＰ３９６ペプチド、抗ＣＤ３、及び抗ＣＤ２８で刺激されたＣＤ８+Ｔ細胞の増殖率、ならびに（Ｆ）ＤbＮＰ３９６ペプチドで刺激されたときのエフェクターメモリーＣＤ８+Ｔ細胞の増殖率を示す（ドットプロットは、刺激後のＣＤ６２Ｌ-ＣＤ４４+ＣＤ８+Ｔ細胞に代表的なものであった）。
【図１２−３】（Ａ）ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって決定されたときの、ＤbＮＰ３９６エピトープに応答してＩＦＮ−γを産生するＣＤ８+Ｔ細胞の能力、（Ｂ）フローサイトメトリによって測定されたときの、ＤbＮＰ３９６特異的ＣＤ８+Ｔ細胞の全サイトカイン（すなわち、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、及びＩＬ−２）発現頻度（ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）、（Ｃ）サイトカインＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、及びＩＬ−２を放出するシングルポジティブ、ダブルポジティブ、及びトリプルポジティブのＣＤ８+Ｔ細胞の亜集団、（Ｄ）ＩＦＮ−γを産生する、抗原特異的な細胞溶解性の脱顆粒Ｔ細胞の百分率（脱顆粒Ｔ細胞は脱顆粒マーカーＣＤ１０７ａによって特定され、ドットプロットは各マウス群に代表的なものであった）、（Ｅ）細胞トレーサーバイオレット及びフローサイトメトリによって測定されたときの、ＤbＮＰ３９６ペプチド、抗ＣＤ３、及び抗ＣＤ２８で刺激されたＣＤ８+Ｔ細胞の増殖率、ならびに（Ｆ）ＤbＮＰ３９６ペプチドで刺激されたときのエフェクターメモリーＣＤ８+Ｔ細胞の増殖率を示す（ドットプロットは、刺激後のＣＤ６２Ｌ-ＣＤ４４+ＣＤ８+Ｔ細胞に代表的なものであった）。
【図１２−４】（Ａ）ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって決定されたときの、ＤbＮＰ３９６エピトープに応答してＩＦＮ−γを産生するＣＤ８+Ｔ細胞の能力、（Ｂ）フローサイトメトリによって測定されたときの、ＤbＮＰ３９６特異的ＣＤ８+Ｔ細胞の全サイトカイン（すなわち、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、及びＩＬ−２）発現頻度（ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）、（Ｃ）サイトカインＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、及びＩＬ−２を放出するシングルポジティブ、ダブルポジティブ、及びトリプルポジティブのＣＤ８+Ｔ細胞の亜集団、（Ｄ）ＩＦＮ−γを産生する、抗原特異的な細胞溶解性の脱顆粒Ｔ細胞の百分率（脱顆粒Ｔ細胞は脱顆粒マーカーＣＤ１０７ａによって特定され、ドットプロットは各マウス群に代表的なものであった）、（Ｅ）細胞トレーサーバイオレット及びフローサイトメトリによって測定されたときの、ＤbＮＰ３９６ペプチド、抗ＣＤ３、及び抗ＣＤ２８で刺激されたＣＤ８+Ｔ細胞の増殖率、ならびに（Ｆ）ＤbＮＰ３９６ペプチドで刺激されたときのエフェクターメモリーＣＤ８+Ｔ細胞の増殖率を示す（ドットプロットは、刺激後のＣＤ６２Ｌ-ＣＤ４４+ＣＤ８+Ｔ細胞に代表的なものであった）。
【図１２−５】（Ａ）ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって決定されたときの、ＤbＮＰ３９６エピトープに応答してＩＦＮ−γを産生するＣＤ８+Ｔ細胞の能力、（Ｂ）フローサイトメトリによって測定されたときの、ＤbＮＰ３９６特異的ＣＤ８+Ｔ細胞の全サイトカイン（すなわち、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、及びＩＬ−２）発現頻度（ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）、（Ｃ）サイトカインＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、及びＩＬ−２を放出するシングルポジティブ、ダブルポジティブ、及びトリプルポジティブのＣＤ８+Ｔ細胞の亜集団、（Ｄ）ＩＦＮ−γを産生する、抗原特異的な細胞溶解性の脱顆粒Ｔ細胞の百分率（脱顆粒Ｔ細胞は脱顆粒マーカーＣＤ１０７ａによって特定され、ドットプロットは各マウス群に代表的なものであった）、（Ｅ）細胞トレーサーバイオレット及びフローサイトメトリによって測定されたときの、ＤbＮＰ３９６ペプチド、抗ＣＤ３、及び抗ＣＤ２８で刺激されたＣＤ８+Ｔ細胞の増殖率、ならびに（Ｆ）ＤbＮＰ３９６ペプチドで刺激されたときのエフェクターメモリーＣＤ８+Ｔ細胞の増殖率を示す（ドットプロットは、刺激後のＣＤ６２Ｌ-ＣＤ４４+ＣＤ８+Ｔ細胞に代表的なものであった）。
【図１３−１】（Ａ）０日目にプライムを用い、ワクチン接種後の日数（ｄｐｖ）２１日目にＧＰ単独とともにブーストを用いた（矢印）ＤＮＡワクチン接種後の血液中のＤbＧｐ３３（Ｔｅｔ+）特異的ＣＤ８Ｔ細胞の動態、（Ｂ）２１ｄｐｖにおけるＤbＧＰ３３  ＣＤ８+Ｔ細胞の発現頻度、（Ｃ）ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって測定されたときの、２１ｄｐｖにおけるＩＦＮ−γを産生するＧＰ特異的Ｔ細胞、（Ｄ）２１ｄｐｖにおけるＧＰ特異的ＩＦＮ−γ+ＣＤ８+Ｔ細胞の発現頻度、（Ｅ）２１ｄｐｖにおけるＧＰ特異的ＣＤ１０７ａ+ＣＤ８+Ｔ細胞の発現頻度、及び（Ｆ）２１ｄｐｖにおけるＧＰ特異的Ｔ−ｂｅｔ+ＣＤ８+Ｔ細胞の発現頻度を示す。
【図１３−２】（Ａ）０日目にプライムを用い、ワクチン接種後の日数（ｄｐｖ）２１日目にＧＰ単独とともにブーストを用いた（矢印）ＤＮＡワクチン接種後の血液中のＤbＧｐ３３（Ｔｅｔ+）特異的ＣＤ８Ｔ細胞の動態、（Ｂ）２１ｄｐｖにおけるＤbＧＰ３３  ＣＤ８+Ｔ細胞の発現頻度、（Ｃ）ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって測定されたときの、２１ｄｐｖにおけるＩＦＮ−γを産生するＧＰ特異的Ｔ細胞、（Ｄ）２１ｄｐｖにおけるＧＰ特異的ＩＦＮ−γ+ＣＤ８+Ｔ細胞の発現頻度、（Ｅ）２１ｄｐｖにおけるＧＰ特異的ＣＤ１０７ａ+ＣＤ８+Ｔ細胞の発現頻度、及び（Ｆ）２１ｄｐｖにおけるＧＰ特異的Ｔ−ｂｅｔ+ＣＤ８+Ｔ細胞の発現頻度を示す。
【図１３−３】（Ａ）０日目にプライムを用い、ワクチン接種後の日数（ｄｐｖ）２１日目にＧＰ単独とともにブーストを用いた（矢印）ＤＮＡワクチン接種後の血液中のＤbＧｐ３３（Ｔｅｔ+）特異的ＣＤ８Ｔ細胞の動態、（Ｂ）２１ｄｐｖにおけるＤbＧＰ３３  ＣＤ８+Ｔ細胞の発現頻度、（Ｃ）ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって測定されたときの、２１ｄｐｖにおけるＩＦＮ−γを産生するＧＰ特異的Ｔ細胞、（Ｄ）２１ｄｐｖにおけるＧＰ特異的ＩＦＮ−γ+ＣＤ８+Ｔ細胞の発現頻度、（Ｅ）２１ｄｐｖにおけるＧＰ特異的ＣＤ１０７ａ+ＣＤ８+Ｔ細胞の発現頻度、及び（Ｆ）２１ｄｐｖにおけるＧＰ特異的Ｔ−ｂｅｔ+ＣＤ８+Ｔ細胞の発現頻度を示す。
【図１３−４】（Ａ）０日目にプライムを用い、ワクチン接種後の日数（ｄｐｖ）２１日目にＧＰ単独とともにブーストを用いた（矢印）ＤＮＡワクチン接種後の血液中のＤbＧｐ３３（Ｔｅｔ+）特異的ＣＤ８Ｔ細胞の動態、（Ｂ）２１ｄｐｖにおけるＤbＧＰ３３  ＣＤ８+Ｔ細胞の発現頻度、（Ｃ）ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって測定されたときの、２１ｄｐｖにおけるＩＦＮ−γを産生するＧＰ特異的Ｔ細胞、（Ｄ）２１ｄｐｖにおけるＧＰ特異的ＩＦＮ−γ+ＣＤ８+Ｔ細胞の発現頻度、（Ｅ）２１ｄｐｖにおけるＧＰ特異的ＣＤ１０７ａ+ＣＤ８+Ｔ細胞の発現頻度、及び（Ｆ）２１ｄｐｖにおけるＧＰ特異的Ｔ−ｂｅｔ+ＣＤ８+Ｔ細胞の発現頻度を示す。
【図１４】（Ａ）ワクチン免疫化スケジュールを例示する概略図、及び（Ｂ）ＤＮＡワクチン接種後のＣＤ８+ＫＬＲＧ１+Ｔ細胞集団の動態を示す。
【図１５−１】（Ａ）０日目にプライムを用い、２１日目にＧＰ単独とともにブーストを用いた（矢印）ＤＮＡワクチン接種後のＤbＧＰ３３+ＣＤ８+ＣＤ１２２+Ｔ細胞発達の動態、ならびに２１日目及び３１日目の末梢血液中のＤbＧＰ３３+四量体特異的ＣＤ８+Ｔ細胞におけるＣＤ１２２細胞表面発現を示す代表的な等高線プロット、（Ｂ）２１ｄｐｖにおける採取されたマウス（ｎ＝４）の脾臓に由来するＧＰ抗原ペプチドプールを用いたエクスビボの再刺激の後の、ＣＤ８+ＣＤ１２２+Ｔ細胞によるＩＦＮ−γ産生、ならびに（Ｃ）２１ｄｐｖにおける採取されたマウスの脾臓（ｎ＝４）に由来するＤbＮＰ３９６ペプチドを用いたエクスビボの再刺激の後の、ＣＤ８Ｔ細胞サブセット（すなわち、ＣＤ８+ＫＬＲＧ１+、ＣＤ８+ＣＤ１２２+、ＣＤ８+ＫＬＲＧ１-、及びＣＤ８+ＣＤ１２２-）による代表的なＩＦＮ−γ産生を示す。
【図１５−２】（Ａ）０日目にプライムを用い、２１日目にＧＰ単独とともにブーストを用いた（矢印）ＤＮＡワクチン接種後のＤbＧＰ３３+ＣＤ８+ＣＤ１２２+Ｔ細胞発達の動態、ならびに２１日目及び３１日目の末梢血液中のＤbＧＰ３３+四量体特異的ＣＤ８+Ｔ細胞におけるＣＤ１２２細胞表面発現を示す代表的な等高線プロット、（Ｂ）２１ｄｐｖにおける採取されたマウス（ｎ＝４）の脾臓に由来するＧＰ抗原ペプチドプールを用いたエクスビボの再刺激の後の、ＣＤ８+ＣＤ１２２+Ｔ細胞によるＩＦＮ−γ産生、ならびに（Ｃ）２１ｄｐｖにおける採取されたマウスの脾臓（ｎ＝４）に由来するＤbＮＰ３９６ペプチドを用いたエクスビボの再刺激の後の、ＣＤ８Ｔ細胞サブセット（すなわち、ＣＤ８+ＫＬＲＧ１+、ＣＤ８+ＣＤ１２２+、ＣＤ８+ＫＬＲＧ１-、及びＣＤ８+ＣＤ１２２-）による代表的なＩＦＮ−γ産生を示す。
【図１６−１】（Ａ）抗ＣＤ１２２  ｍＡｂを含むＤＮＡワクチンの送達の免疫化スケジュールの概略図、（Ｂ）無処置マウスならびに抗ＣＤ１２２処置マウスにおけるＣＤ８及びＣＤ１２２を発現するＴ細胞の評価、ならびに（Ｃ）抗ＣＤ１２２  ｍＡｂ処置後の脾臓内のＤbＧＰ３３四量体特異的ＣＤ８+Ｔ細胞の発現頻度、及び処置後のＤbＧＰ３３  ＣＤ８+Ｔ細胞を表す代表的な等高線プロットを示す。
【図１６−２】（Ａ）抗ＣＤ１２２  ｍＡｂを含むＤＮＡワクチンの送達の免疫化スケジュールの概略図、（Ｂ）無処置マウスならびに抗ＣＤ１２２処置マウスにおけるＣＤ８及びＣＤ１２２を発現するＴ細胞の評価、ならびに（Ｃ）抗ＣＤ１２２  ｍＡｂ処置後の脾臓内のＤbＧＰ３３四量体特異的ＣＤ８+Ｔ細胞の発現頻度、及び処置後のＤbＧＰ３３  ＣＤ８+Ｔ細胞を表す代表的な等高線プロットを示す。
【図１７−１】（Ａ）ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって測定されたときの、ワクチン接種後のＩＦＮ−γを分泌する抗原特異的細胞の検出、（Ｂ）マルチパラメータフローサイトメトリによって測定されたときの、多機能性ＣＤ４+Ｔ細胞の百分率（棒グラフは、サイトカインＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、及びＴＮＦ−αを分泌するトリプルポジティブ細胞、ダブルポジティブ細胞、及びシングルポジティブ細胞として表示されるＨＩＶ特異的Ｔ細胞の百分率を表し、円グラフは、各サイトカイン亜集団の相対的割合を表した）、ならびに（Ｃ）マルチパラメータフローサイトメトリによって測定されたときの、多機能性ＣＤ８+Ｔ細胞の百分率を示す（棒グラフは、サイトカインＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、及びＴＮＦ−αを分泌するトリプルポジティブ細胞、ダブルポジティブ細胞、及びシングルポジティブ細胞として表示されるＨＩＶ特異的Ｔ細胞の百分率を表し、円グラフは、各サイトカイン亜集団の相対的割合を表した）。
【図１７−２】（Ａ）ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって測定されたときの、ワクチン接種後のＩＦＮ−γを分泌する抗原特異的細胞の検出、（Ｂ）マルチパラメータフローサイトメトリによって測定されたときの、多機能性ＣＤ４+Ｔ細胞の百分率（棒グラフは、サイトカインＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、及びＴＮＦ−αを分泌するトリプルポジティブ細胞、ダブルポジティブ細胞、及びシングルポジティブ細胞として表示されるＨＩＶ特異的Ｔ細胞の百分率を表し、円グラフは、各サイトカイン亜集団の相対的割合を表した）、ならびに（Ｃ）マルチパラメータフローサイトメトリによって測定されたときの、多機能性ＣＤ８+Ｔ細胞の百分率を示す（棒グラフは、サイトカインＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、及びＴＮＦ−αを分泌するトリプルポジティブ細胞、ダブルポジティブ細胞、及びシングルポジティブ細胞として表示されるＨＩＶ特異的Ｔ細胞の百分率を表し、円グラフは、各サイトカイン亜集団の相対的割合を表した）。
【図１７−３】（Ａ）ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって測定されたときの、ワクチン接種後のＩＦＮ−γを分泌する抗原特異的細胞の検出、（Ｂ）マルチパラメータフローサイトメトリによって測定されたときの、多機能性ＣＤ４+Ｔ細胞の百分率（棒グラフは、サイトカインＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、及びＴＮＦ−αを分泌するトリプルポジティブ細胞、ダブルポジティブ細胞、及びシングルポジティブ細胞として表示されるＨＩＶ特異的Ｔ細胞の百分率を表し、円グラフは、各サイトカイン亜集団の相対的割合を表した）、ならびに（Ｃ）マルチパラメータフローサイトメトリによって測定されたときの、多機能性ＣＤ８+Ｔ細胞の百分率を示す（棒グラフは、サイトカインＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、及びＴＮＦ−αを分泌するトリプルポジティブ細胞、ダブルポジティブ細胞、及びシングルポジティブ細胞として表示されるＨＩＶ特異的Ｔ細胞の百分率を表し、円グラフは、各サイトカイン亜集団の相対的割合を表した）。
【図１８−１】（Ａ）ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって測定されたときの、ワクチン接種後のＩＦＮ−γを分泌する抗原特異的細胞の検出、（Ｂ）マルチパラメータフローサイトメトリによって測定されたときの、多機能性ＣＤ４+Ｔ細胞の百分率（棒グラフは、サイトカインＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、及びＴＮＦ−αを分泌するトリプルポジティブ細胞、ダブルポジティブ細胞、及びシングルポジティブ細胞として表示されるＴＢ特異的Ｔ細胞の百分率を表し、円グラフは、各サイトカイン亜集団の相対的割合を表した）、ならびに（Ｃ）マルチパラメータフローサイトメトリによって測定されたときの、多機能性ＣＤ８+Ｔ細胞の百分率を示す（棒グラフは、サイトカインＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、及びＴＮＦ−αを分泌するトリプルポジティブ細胞、ダブルポジティブ細胞、及びシングルポジティブ細胞として表示されるＴＢ特異的Ｔ細胞の百分率を表し、円グラフは、各サイトカイン亜集団の相対的割合を表した）。
【図１８−２】（Ａ）ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって測定されたときの、ワクチン接種後のＩＦＮ−γを分泌する抗原特異的細胞の検出、（Ｂ）マルチパラメータフローサイトメトリによって測定されたときの、多機能性ＣＤ４+Ｔ細胞の百分率（棒グラフは、サイトカインＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、及びＴＮＦ−αを分泌するトリプルポジティブ細胞、ダブルポジティブ細胞、及びシングルポジティブ細胞として表示されるＴＢ特異的Ｔ細胞の百分率を表し、円グラフは、各サイトカイン亜集団の相対的割合を表した）、ならびに（Ｃ）マルチパラメータフローサイトメトリによって測定されたときの、多機能性ＣＤ８+Ｔ細胞の百分率を示す（棒グラフは、サイトカインＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、及びＴＮＦ−αを分泌するトリプルポジティブ細胞、ダブルポジティブ細胞、及びシングルポジティブ細胞として表示されるＴＢ特異的Ｔ細胞の百分率を表し、円グラフは、各サイトカイン亜集団の相対的割合を表した）。
【図１８−３】（Ａ）ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって測定されたときの、ワクチン接種後のＩＦＮ−γを分泌する抗原特異的細胞の検出、（Ｂ）マルチパラメータフローサイトメトリによって測定されたときの、多機能性ＣＤ４+Ｔ細胞の百分率（棒グラフは、サイトカインＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、及びＴＮＦ−αを分泌するトリプルポジティブ細胞、ダブルポジティブ細胞、及びシングルポジティブ細胞として表示されるＴＢ特異的Ｔ細胞の百分率を表し、円グラフは、各サイトカイン亜集団の相対的割合を表した）、ならびに（Ｃ）マルチパラメータフローサイトメトリによって測定されたときの、多機能性ＣＤ８+Ｔ細胞の百分率を示す（棒グラフは、サイトカインＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、及びＴＮＦ−αを分泌するトリプルポジティブ細胞、ダブルポジティブ細胞、及びシングルポジティブ細胞として表示されるＴＢ特異的Ｔ細胞の百分率を表し、円グラフは、各サイトカイン亜集団の相対的割合を表した）。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は、ＩＬ−３３をアジュバントとして使用することにより、対象において抗原に対する免疫応答を増強するために使用することができるワクチンに関する。アジュバントとして使用されると、ＩＬ−３３は、Ｔヘルパー２（Ｔｈ２）ではなくＴヘルパー１（Ｔｈ１）の免疫応答を予想外に増強する。これは、自然免疫応答及びＴｈ２免疫応答の活性化におけるＩＬ−３３の生物学的機能とは全く対照的である。いくつかの例において、ＩＬ−３３は、抗ウイルス性サイトカインであるインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）及び腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）のレベルを上昇させることができる。ＩＬ−３３はまた、サイトカインＩＬ−２のレベルを上昇させることもできる。したがって、ＩＬ−３３は、多機能性ＣＤ４+Ｔ細胞及びＣＤ８+Ｔ細胞の亜集団を増加させて、細胞性免疫応答を促進することができる。
【００１８】
ＩＬ−３３は、エフェクターメモリーＴ細胞の拡大及び分化をさらに誘導して、細胞性免疫応答を促進することができる。ＣＤ１２２+ＣＤ８+制御性Ｔ細胞はワクチンの有効性を減少させ得るため、ＩＬ−３３によりこれらの細胞を抑制すると、ワクチンによって誘導される細胞性免疫応答をさらに促進することができる。
【００１９】
ＩＬ−３３は、ウイルス抗原及び細菌抗原、例えば、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）抗原、結核菌抗原、及びリンパ性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）抗原等の抗原に対する細胞性免疫応答を増大させることができる。このように、ＩＬ−３３は、そのような病原体に対する著しい保護を促進することができる。
【００２０】
本発明のワクチンは、癌または腫瘍の形成を予防することができる。本ワクチンはまた、定着癌または腫瘍の退縮を引き起こすこともできる。この退縮は、９０％以上の退縮であり得る。癌の退縮は、完全なものであり得る。本ワクチンは、ウイルス関連癌、例えばＨＰＶ関連癌をさらに予防し、その退縮を引き起こすことができる。したがって、癌の治療を必要とする対象に本ワクチンを投与することによる、癌の治療のための方法も本明細書に提供される。
１．定義
【００２１】
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。矛盾がある場合には、定義を含む本明細書が優先される。好ましい方法及び材料については後述するが、本明細書に記載されるものと類似するまたは均等な方法及び材料も、本発明の実施または試験に使用することができる。本明細書において言及される全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、参照により、それらの全体が本明細書に組み込まれる。本明細書に開示される材料、方法、及び実施例は、例示的であるに過ぎず、限定的であることを意図するものではない。
【００２２】
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「できる（ｃａｎ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」、及びそれらの変形は、本明細書で使用される場合、さらなる行為または構造の可能性を排除しない、開放式の移行句、用語、または語句であることが意図される。単数形「ａ」、「及び」、及び「ｔｈｅ」は、文脈上、そうではないという明確な指示がない限り、複数の指示対象を含む。本開示はまた、明示的に記載されているかどうかにかかわらず、本明細書に提示される実施形態または要素「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」、及び「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」他の実施形態も企図する。
【００２３】
本明細書で使用される「アジュバント」は、抗原の免疫原性を高めるために本明細書に記載されるワクチンに添加される任意の分子を意味する。
【００２４】
本明細書で使用される「断片」は、哺乳動物において免疫応答を誘発することができるポリペプチドをコードする核酸配列またはその一部を意味する。断片は、以下に記載するタンパク質断片をコードする種々のヌクレオチド配列のうちの少なくとも１つから選択されるＤＮＡ断片であってもよい。
【００２５】
本明細書で用いられる「免疫応答」は、抗原の導入に応答した、宿主の免疫系、例えば哺乳動物の免疫系の活性化を意味する。免疫応答は、細胞性応答もしくは液性応答、または両方の形態であり得る。
【００２６】
本明細書で使用される「核酸」は、一本鎖もしくは二本鎖であってもよく、または二本鎖及び一本鎖の両方の配列の部分を含有してもよい。核酸は、ゲノム及びｃＤＮＡの両方のＤＮＡ、ＲＮＡ、またはハイブリッドであり得、ここで、核酸は、デオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドの組み合わせ、ならびにウラシル、アデニン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシン、及びイソグアニンを含む、塩基の組み合わせを含有し得る。核酸は、化学合成法または組み換え法によって、得ることができる。
【００２７】
本明細書で用いられる「作動可能に連結された」は、遺伝子の発現が空間的につながったプロモーターの制御下にあることを意味する。プロモーターは、その制御下で遺伝子の５’（上流）または３’（下流）に位置し得る。プロモーターと遺伝子との間の距離は、そのプロモーターと、プロモーターが由来する遺伝子内でそれが制御する遺伝子との間の距離と、ほぼ同一であり得る。当該技術分野で公知の通り、この距離の変動は、プロモーター機能を喪失せずに適合させることができる。
【００２８】
本明細書で使用される「ペプチド」、「タンパク質」、または「ポリペプチド」は、アミノ酸の連結した配列を意味することができ、天然、合成、または天然及び合成の改変または組み合わせであってもよい。
【００２９】
本明細書に使用される「プロモーター」とは、細胞内で核酸の発現をもたらす、活性化する、または強化することが可能な、合成または天然由来の分子を意味する。プロモーターは、さらに、その発現を強化し、かつ／またはその空間的発現及び／もしくは一時的発現を変化させる、１つ以上の特定の転写制御配列を含んでもよい。プロモーターは、遠位のエンハンサーまたはレプレッサ要素を含んでいてもよく、それは転写開始部位から何千もの塩基対に位置することができる。プロモーターは、ウイルス、細菌、真菌、植物、昆虫、及び動物をはじめとする供給源に由来し得る。プロモーターは、発現が生じる細胞、組織、もしくは器官に関して、または発現が生じる成長段階に関して、または生理的ストレス、病原体、金属イオン、もしくは誘導剤等の外部刺激に応答して、構造的または特異的に遺伝子成分の発現を制御することができる。プロモーターの代表的な例としては、バクテリオファージＴ７プロモーター、バクテリオファージＴ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、ｌａｃオペレータ−プロモーター、ｔａｃプロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＲＳＶ−ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ  ＩＥプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーターまたはＳＶ４０後期プロモーター、及びＣＭＶ  ＩＥプロモーターが挙げられる。
【００３０】
本明細書で使用される「治療」または「治療すること」は、疾患を予防する、抑制する、制圧する、または完全に排除する手段を通した、疾患からの動物の保護を意味し得る。疾患の予防は、疾患の発症前に、本発明のワクチンを動物に投与することを含む。疾患の抑制は、疾患の誘導後ではあるが、その臨床的出現の前に、本発明のワクチンを動物に投与することを含む。疾患の制圧は、疾患の臨床的出現の後に、本発明のワクチンを動物に投与することを含む。
【００３１】
本明細書で使用される「対象」は、本明細書に記載のワクチンで免疫化されることを望むかまたは必要とする哺乳動物を意味することができる。哺乳動物は、ヒト、チンパンジー、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、マウス、またはラットであってもよい。
【００３２】
核酸に関して本明細書に使用される「変異体」とは、（ｉ）参照ヌクレオチド配列の一部分もしくは断片、（ｉｉ）参照ヌクレオチド配列の相補体もしくはその一部分、（ｉｉｉ）参照核酸もしくはその相補体と実質的に同一な核酸、または（ｉｖ）参照核酸、その相補体、もしくはそれと実質的に同一な配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、核酸を意味する。
【００３３】
変異体は、アミノ酸の挿入、欠失、または保存的置換によりアミノ酸配列が異なるが、少なくとも１つの生物活性を保持している、ペプチドまたはポリペプチドとしてさらに定義され得る。「生物学的活性」の代表的な例として、特異的な抗体によって結合される能力、または免疫応答を促進する能力が挙げられる。変異体はまた、少なくとも１つの生物学的活性を保持するアミノ酸配列を有する参照タンパク質と実質的に同一なアミノ酸配列を有するタンパク質を意味し得る。アミノ酸の保存的置換、すなわち、１つのアミノ酸を、類似の特性（例えば、親水性、荷電領域の程度及び分布）を有する別のアミノ酸と置き換えることは、典型的に小規模な変更を伴うとして、当該技術分野で認識されている。これらの小規模な変更は、当該技術分野において理解されるように、部分的に、アミノ酸の疎水性親水性インデックスを考慮することによって、特定することができる。Ｋｙｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１３２（１９８２）。アミノ酸の疎水性親水性インデックスは、その疎水性及び荷電の考慮に基づく。類似の疎水性親水性インデックスを有するアミノ酸が置換され得、タンパク質の機能を依然として保持できることは、当該技術分野で公知である。一態様において、±２の疎水性親水性インデックスを有するアミノ酸が、置換されている。アミノ酸の親水性を利用して、生物学的機能を保持したタンパク質を生じる置換を明らかにすることもできる。ペプチドにおいてアミノ酸の親水性を考慮することで、そのペプチドの最大の局所的平均親水性、つまり抗原性及び免疫原性と良好に相関することが報告されている有用な指標を計算することができる。当該技術分野で理解される通り、類似の親水性値を有するアミノ酸の置換により、生物活性、例えば免疫原性を保持したペプチドを得ることができる。置換は、互いに±２以内の親水性値を有するアミノ酸を用いて実施することができる。アミノ酸の疎水性インデックス及び親水性値の両方とも、そのアミノ酸の特定の側鎖により影響を受ける。その観察と一致して、疎水性、親水性、荷電、寸法、及び他の性質により明らかにされた通り、生物学的機能に適合性のあるアミノ酸置換が、アミノ酸、特にそれらアミノ酸の側鎖の相対的類似性に依存することは理解されている。
【００３４】
変異体は、完全な遺伝子配列の全長またはその断片にわたって実質的に同一な核酸配列であってもよい。核酸配列は、遺伝子配列の全長またはその断片にわたって８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であってもよい。変異体は、アミノ酸配列の全長またはその断片にわたって実質的に同一なアミノ酸配列であってもよい。アミノ酸配列は、アミノ酸配列の全長またはその断片にわたって８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であってもよい。
【００３５】
本明細書で使用される「ベクター」は、複製起点を含む核酸配列を意味する。ベクターは、ウイルスベクター、バクテリオファージ、細菌人工染色体、または酵母人工染色体であってもよい。ベクターは、ＤＮＡまたはＲＮＡベクターであってもよい。ベクターは、自己複製染色体外ベクターであってもよく、好ましくは、ＤＮＡプラスミドである。
【００３６】
本明細書における数値範囲の列挙の場合、それらの間に介在する同程度の正確さを有する各数値が明示的に企図される。例えば、６〜９の範囲では、６及び９に加えて、数値７及び８が企図され、範囲６．０〜７．０では、数値６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、及び７．０が、明示的に企図される。
２．ワクチン
【００３７】
抗原及びアジュバントを含むワクチンが本明細書に提供される。本ワクチンは、対象における抗原提示及び抗原に対する全体的な免疫応答を増強することができる。抗原及びアジュバントの組み合わせは、抗原を単独で含むワクチンよりも効率的に免疫系を誘導する。このより効率的な免疫応答は、後により詳細に記載される癌をはじめとする任意の疾患、病原体、またはウイルスの治療及び／または予防における効力の増加をもたらす。
【００３８】
本発明のワクチンは、ワクチン自体が疾病または死亡の原因とならないように安全であること；ウイルスまたは細菌等の生病原体への曝露から生じる疾病に対する保護作用があること；細胞の感染を予防するために中和抗体を誘導すること；細胞内病原体に対する保護Ｔ細胞応答を誘導すること；ならびに投与し易さ、少ない副作用、生物学的安定性、及び用量当たりの低コストを提供すること等の、有効なワクチンに要求される特徴を有することができる。後述のように抗原とアジュバントとを組み合わせることにより、本ワクチンは、これらの特徴の一部または全部を達成することができる。
【００３９】
本ワクチンは、抗原を単独で含むワクチンよりも高い抗原に対する免疫応答を誘導するように、抗原内におけるエピトープ提示をさらに改変することができる。本ワクチンは、筋肉または皮膚等の異なる組織に投与された場合に免疫応答をさらに誘導することができる。
ａ．アジュバント
【００４０】
本ワクチンは、アジュバントを含むことができる。アジュバントは、核酸配列、アミノ酸配列、またはそれらの組み合わせであってもよい。核酸配列は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、それらの変異体、それらの断片、またはそれらの組み合わせであってもよい。核酸配列はまた、ペプチド結合によってアジュバントに連結されたリンカーまたはタグ配列をコードするさらなる配列も含むことができる。アミノ酸配列は、タンパク質、ペプチド、それらの変異体、それらの断片、またはそれらの組み合わせであってもよい。
（１）ＩＬ−３３
【００４１】
アジュバントは、インターロイキン−３３（ＩＬ−３３）、その断片、その変異体、またはそれらの組み合わせであり得る。ＩＬ−３３は、組織傷害または感染後の初期免疫応答及び炎症反応に関与するサイトカインのインターロイキン−１（ＩＬ−１）ファミリーのメンバーである。ＩＬ−１ファミリーメンバーはまた、後の獲得免疫応答、すなわちＴヘルパー２（Ｔｈ２）免疫応答を協調させる。このファミリーの制御不全は、多くの疾患、例えば、喘息、リウマチ性関節炎、クローン病、歯周炎、及び敗血症に関係付けられている。具体的には、ＩＬ−３３レベルが、炎症性疾患である喘息及びリウマチ性関節炎において上昇し、ＩＬ−３３が、喘息、アトピー性皮膚炎、及びアナフィラキシー等のＴｈ２関連疾患の病態形成を促進する。対照的に、ＩＬ−３３は、アテローム性動脈硬化症、肥満、２型糖尿病、及び心臓リモデリング等の心血管疾患における保護作用を有し、寄生虫性及び細菌性の感染に対する宿主防御に寄与する。
【００４２】
全長ＩＬ−３３は、それがヘテロクロマチン及び有糸分裂クロマチンと関連する内皮細胞及び上皮細胞の核内で、構造的に発現される。全長ＩＬ−３３のアミノ末端は、クロマチン結合ドメインまたはモチーフ（ＣＢＤ）及び核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む。具体的には、ＣＢＤは、転写レプレッサとして作用するホメオドメイン様ヘリックス−ターン−ヘリックスモチーフである。
【００４３】
しかしながら、全長ＩＬ−３３はまた、組織傷害または感染の際にアラーミンとして細胞外空間内に放出される。細胞外ＩＬ−３３は、細胞表面受容体ＳＴ２に結合して、自然免疫系の細胞、例えば、マスト細胞及び好酸球を活性化させて、危険（すなわち、傷害または感染）を知らせ、炎症反応を誘導する。誘導される炎症促進性メディエータとしては、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ＩＬ−１β、及びインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）が挙げられる。ＩＬ−３３はまた、より近年発見された自然免疫細胞、すなわち自然リンパ球系細胞２型（ＩＬＣ２）も誘導する。ＩＬＣ２は非Ｂ非Ｔ細胞であり、Ｔｈ２型サイトカイン、例えば、インターロイキン４、５、及び１３（それぞれＩＬ−４、ＩＬ−５、及びＩＬ−１３）を産生する。
【００４４】
さらに、細胞外ＩＬ−３３は、プロテアーゼによって切断され、得られる断片はＳＴ２に結合し、初期「危険」シグナルを増幅させる。ＳＴ２はまた、多くの他の細胞型（主に造血性であるが）、例えば、ＣＤ４+Ｔ細胞、好塩基球、単核球、マクロファージ、ナチュラルキラー細胞、不変ナチュラルキラーＴ細胞、及び活性化好中球の異なるサブセットにおいて発現され、それによってＩＬ−３３に種々のサイトカイン及びケモカインの産生、ならびに細胞の活性化、分化、極性化、または化学遊走を誘導させる。ＳＴ２は、Ｔｈ２型細胞の選択的マーカーであり、膜結合形態及び可溶性形態として存在する。ＳＴ２の膜結合形態は、ＩＬ−３３によって結合されると、核因子（ＮＦ）−κＢ及びマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ経路（例えば、ｐ３８、ＪＮＫ、ＥＲＫ１、及びＥＲＫ２）に作用して細胞シグナル伝達を開始させる。可溶性ＳＴ２はＩＬ−３３にも結合するが、デコイ分子であり、それによってＩＬ−３３を阻害する。
【００４５】
さらに、ＩＬ−３３は、ＣＢＤ及びＮＬＳを欠く成熟型または切断型で存在することができる。成熟型ＩＬ−３３は、炎症促進性サイトカインとして作用して免疫応答を調節することができる。
【００４６】
ＩＬ−３３は、対象の抗原に対する免疫応答を増強またはブーストすることができる。抗原については、後により詳細に記載する。いくつかの例において、ＩＬ−３３は、抗原に対する免疫応答を約７５％〜約２００％増強することができる。代替として、ＩＬ−３３は、抗原に対する免疫応答を約９０％〜約１３０％増強することができる。さらに他の代替的な実施形態において、ＩＬ−３３は、抗原に対する免疫応答を約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、１０１％、１０２％、１０３％、１０４％、１０５％、１０６％、１０７％、１０８％、１０９％、１１０％、１１１％、１１２％、１１３％、１１４％、１１５％、１１６％、１１７％、１１８％、１１９％、１２０％、１２１％、１２２％、１２３％、１２４％、１２５％、１２６％、１２７％、１２８％、１２９％、または１３０％増強することができる。
【００４７】
他の実施形態において、ＩＬ−３３は、抗原に対する免疫応答を少なくとも約１．５倍、少なくとも約２．０倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３．０倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４．０倍、少なくとも約４．５倍、少なくとも約５．０倍、少なくとも約５．５倍、少なくとも約６．０倍、少なくとも約６．５倍、少なくとも約７．０倍、少なくとも約７．５倍、少なくとも約８．０倍、少なくとも約８．５倍、少なくとも約９．０倍、少なくとも約９．５倍、もしくは少なくとも約１０．０倍増強またはブーストすることができる。
【００４８】
ＩＬ−３３が対象の抗原に対する免疫応答を増強またはブーストするとき、対象のインターロイキン−４（ＩＬ−４）レベル（分泌）及びイムノグロビンＥ（ＩｇＥ）レベルは上昇しない。予想外に、アジュバントとしてのＩＬ−３３は、対象の抗原に対するＴｈ２免疫応答を増強またはブーストしない。その代わり、アジュバントとしてのＩＬ−３３は、対象の抗原に対するＴｈ１または細胞性免疫応答を増強もしくはブーストすることができる。
【００４９】
Ｔｈ１免疫応答は、Ｔ細胞応答の活性化を含む。これらのＴ細胞応答は、ＣＤ４+及びＣＤ８+Ｔ細胞応答、ならびにインターフェロン−γ、腫瘍壊死因子α、及び／またはインターロイキンｇ（ＩＬ−２）の分泌を含み得る。インターフェロン−γ及び腫瘍壊死因子αは、抗ウイルス特性、免疫制御特性、及び抗腫瘍特性を有し、複数の遺伝子において転写を変化させて、様々な生理応答及び細胞応答を生じさせることができる。インターフェロン−γによるこれらの作用は、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）の活性を促進すること、正常細胞にクラスＩ  ＭＨＣ分子の発現を増加させること、マクロファージにおける抗原提示及びリソソーム活性を増加させること、一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）を誘導すること、ならびに液性（抗体）免疫におけるＴｈ２の分化を抑制しながら、細胞傷害性ＣＤ８+Ｔ細胞に関して細胞性免疫におけるＴｈ１の分化を促進することを含む。
【００５０】
細胞傷害性ＣＤ８+Ｔ細胞（細胞傷害性Ｔリンパ細胞（ＣＴＬ））は、ウイルス及び他の病原体に感染した細胞の死を誘導するＴ細胞の亜群である。活性化すると、ＣＴＬは、クローン拡大を経て抗原特異的であるエフェクター細胞を産生する。エフェクターＣＴＬは、感染細胞または標的細胞を死滅させる定方向の開口分泌（すなわち、脱顆粒）分子、例えば、パーフォリン、グラニュライシン、及びグランザイムの過程を通じて放出する。必要でなくなると、多くのエフェクターＣＴＬは死滅するが、いくつかのエフェクター細胞は、抗原に再び接したときにメモリー細胞がエフェクター細胞へと分化して免疫応答をより素早く開始するように、メモリー細胞として保持される。
【００５１】
ＩＬ−３３がＴｈ１または細胞性免疫応答を増強もしくはブーストするとき、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）レベル（分泌）は上昇する。いくつかの例において、ＩＬ−３３は、抗原に対するＴｈ１または細胞性免疫応答を約１．５倍〜約１０．０倍、約１．５倍〜約８．０倍、約１．５倍〜約６．０倍、約１．５倍〜約４．０倍、約２．０倍〜約１０．０倍、約２．０倍〜約８．０倍、約２．０倍〜約６．０倍、約２．０倍〜約４．０倍、約２．５倍〜約４．０倍、約４．０倍〜約１０．０倍、約６．０倍〜約１０．０倍、または約８．０倍〜約１０．０倍増強することができる。ＩＬ−３３はまた、抗原に対するＴｈ１または細胞性免疫応答を少なくとも約２．５倍、少なくとも約２．６倍、少なくとも約２．７倍、少なくとも約２．８倍、少なくとも約２．９倍、少なくとも約３．０倍、少なくとも約３．１倍、少なくとも約３．２倍、少なくとも約３．３倍、少なくとも約３．４倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約３．６倍、少なくとも約３．７倍、少なくとも約３．８倍、少なくとも約３．９倍、少なくとも約４．０倍、少なくとも約４．１倍、少なくとも約４．２倍、少なくとも約４．３倍、少なくとも約４．４倍、少なくとも約４．５倍、少なくとも約４．６倍、少なくとも約４．７倍、少なくとも約４．８倍、少なくとも約４．９倍、少なくとも約５．０倍、少なくとも約６．０倍、少なくとも約７．０倍、少なくとも約８．０倍、少なくとも約９．０倍、または少なくとも約１０．０倍増強することができる。ＩＬ−３３は、Ｔｈ１または細胞性免疫応答を約３．５倍もしくは４．０倍さらに増強することができる。
【００５２】
抗原に対する免疫応答の増強またはブーストは、ＣＤ４+Ｔ細胞応答の増強も含み得る。ＣＤ４+Ｔ細胞応答の増強は、対象において、ＩＦＮ−γ、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、ＩＬ−２、またはＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αの両方、またはＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、及びＩＬ−２の何らかの組み合わせを分泌するＣＤ４+Ｔ細胞（例えば、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、及びＩＬ−２を発現するトリプルポジティブ細胞）の集団または発現頻度を増加させることを含み得る。したがって、ＣＤ４+Ｔ細胞応答の増強は、多機能性ＣＤ４+Ｔ細胞の亜集団の増加を含み得る。
【００５３】
抗原に対する免疫応答の増強またはブーストは、ＣＤ８+Ｔ細胞応答の増強をさらに含み得る。ＣＤ８+Ｔ細胞応答の増強は、対象において、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−２、またはＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αの両方、またはＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、及びＩＬ−２の何らかの組み合わせを分泌するＣＤ８+Ｔ細胞（例えば、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、及びＩＬ−２を発現するトリプルポジティブ細胞）の集団または発現頻度を増加させることを含み得る。したがって、ＣＤ８+Ｔ細胞応答の増強は、多機能性ＣＤ８+Ｔ細胞の亜集団の増加を含み得る。
【００５４】
ＣＤ８+Ｔ細胞応答の増強は、細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔリンパ細胞（ＣＴＬ）応答の増強も含み得る。ＣＴＬ応答の増強は、対象において、脱顆粒を経るＣＤ８+Ｔ細胞の集団または発現頻度を増加させることを含み得る。ＣＴＬ応答の増強は、対象において、ＣＤ１０７ａを発現するＣＤ８＋Ｔ細胞の集団または発現頻度を増加させることをさらに含み得る。ＣＴＬ応答の増強は、対象において、ＣＤ１０７ａ、ＩＦＮ−γ、及びＴＮＦ−αを同時発現するＣＤ８+Ｔ細胞の集団または発現頻度を増加させることをさらに含み得る。
【００５５】
抗原に対する免疫応答の増強またはブーストは、対象におけるＣＤ８+Ｔ細胞の拡大及び分化をさらに含み得る。そのような拡大は、末梢で起こり得る。さらに、定着したメモリーＣＤ８+Ｔ細胞のリコールが対象において増強される。このように、ＩＬ−３３は、抗原に対して特異的であるエフェクター及びエフェクターメモリーＣＤ８+Ｔ細胞集団の両方を拡大させることによって、細胞性免疫応答を増強することができる。拡大したエフェクター及びエフェクターメモリーＣＤ８+Ｔ細胞集団は、ＫＬＲＧ１を発現する細胞の増加した発現頻度を有し得る。
【００５６】
抗原に対する免疫応答の増強またはブーストは、例えば、ＣＤ１２２+ＣＤ８+制御性Ｔ細胞の拡大を予防することによる、これらの細胞の抑制をさらに含み得る。ＣＤ１２２+ＣＤ８+制御性Ｔ細胞は、ワクチンによって誘導される免疫応答、ひいてはワクチンの有効性を抑制することができる。ＣＤ１２２+ＣＤ８+制御性Ｔ細胞を抑制することによって、ＩＬ−３３は、抗原に対する免疫応答、ひいてはワクチンによって提供される有効性（すなわち、保護）を増強する。
【００５７】
抗原に対する免疫応答の増強またはブーストは、抗原に関連する疾患に対する保護をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、抗原に対する免疫応答の増強またはブーストは、抗原に関連する疾患に対する完全な保護を含み得る。他の実施形態において、抗原に対する免疫応答の増強またはブーストは、抗原に関連する疾患に対する少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の生存率を含み得る。
（ａ）ｐｒｏＩＬ−３３
【００５８】
ＩＬ−３３は、ｐｒｏＩＬ−３３、その断片、またはその変異体であり得る。ｐｒｏＩＬ−３３は、全長すなわち非切断のＩＬ−３３である。したがって、ｐｒｏＩＬ−３３は、クロマチン結合ドメインまたはモチーフ（ＣＢＤ）及び核局在化シグナル（ＮＬＳ）の両方を含む。ｐｒｏＩＬ−３３は、核及び細胞質の両方において局在化し得る。具体的には、ｐｒｏＩＬ−３３は、核内で実質的に局在化し得る。
【００５９】
ＩＬ−３３に関して前述のように、ｐｒｏＩＬ−３３は、免疫応答を増強するときにＩｇＥのレベルを上昇させない。ｐｒｏＩＬ−３３は、後述するｍｔｒＩＬ−３３とは異なり、対象において、抗原に対して特異的な免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）のレベルを上昇させることができる。ｐｒｏＩＬ−３３は、抗原に対して特異的なＩｇＧのレベルを約１．５倍〜約１０．０倍、約２．０倍〜約６．０倍、または約２．０倍〜約４．０倍上昇させることができる。ｐｒｏＩＬ−３３はまた、抗原に対して特異的なＩｇＧのレベルを少なくとも約１．５倍、少なくとも約２．０倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３．０倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４．０倍、少なくとも約４．５倍、少なくとも約５．０倍、少なくとも約５．５倍、少なくとも約６．０倍、少なくとも約６．５倍、少なくとも約７．０倍、少なくとも約７．５倍、少なくとも約８．０倍、少なくとも約８．５倍、少なくとも約９．０倍、少なくとも約９．５倍、または少なくとも約１０．０倍上昇させることができる。
【００６０】
ｐｒｏＩＬ−３３をコードする核酸は、任意の数の生物、例えば、マウス（ハツカネズミ）及びヒト（ホモ・サピエンス）に由来してもよい。ｐｒｏＩＬ−３３をコードする核酸は、コドン使用頻度及び対応するＲＮＡ転写物に関して最適化され得る。ｐｒｏＩＬ−３３をコードする核酸は、発現のためにコドン最適化及びＲＮＡ最適化され得る。いくつかの実施形態において、ｐｒｏＩＬ−３３をコードする核酸は、翻訳の効率を高めるためにコザック配列（例えば、ＧＣＣ  ＡＣＣ）を含むことができる。ｐｒｏＩＬ−３３をコードする核酸は、翻訳終結の効率を高めるために複数の終止コドン（例えば、ＴＧＡ  ＴＧＡ）を含むことができる。ｐｒｏＩＬ−３３をコードする核酸は、免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）リーダー配列をコードするヌクレオチド配列も含むことができる。ＩｇＥリーダー配列は、核酸のｐｒｏＩＬ−３３の５’に位置してもよい。いくつかの実施形態において、ｐｒｏＩＬ−３３をコードする核酸は、ＩｇＥリーダー配列をコードするヌクレオチド配列を含まない、すなわち含有しない。
【００６１】
マウスｐｒｏＩＬ−３３は、配列番号６をコードする、最適化された配列番号５の核酸配列であってもよい。いくつかの実施形態において、マウスｐｒｏＩＬ−３３は、配列番号５に記載の核酸配列の全長にわたって少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する核酸配列であってもよい。他の実施形態において、マウスｐｒｏＩＬ−３３は、配列番号６に記載のアミノ酸配列の全長にわたって少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列であってもよい。マウスｐｒｏＩＬ−３３は、配列番号６に記載のアミノ酸配列の全長にわたって少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列であってもよい。
【００６２】
ヒトｐｒｏＩＬ−３３は、配列番号４をコードする、最適化された配列番号３の核酸配列であってもよい。いくつかの実施形態において、ヒトｐｒｏＩＬ−３３は、配列番号３に記載の核酸配列の全長にわたって少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する核酸配列であってもよい。他の実施形態において、ヒトｐｒｏＩＬ−３３は、配列番号４に記載のアミノ酸配列の全長にわたって少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列であってもよい。ヒトｐｒｏＩＬ−３３は、配列番号４に記載のアミノ酸配列の全長にわたって少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列であってもよい。
【００６３】
いくつかの実施形態は、配列番号３及び／または配列番号５の断片に関する。断片は、配列番号３及び／または配列番号５の少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％を構成し得る。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列、例えば、ＩｇＥリーダー配列等の免疫グロブリンリーダー配列をコードする配列を含むことができる。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列をコードするコード配列を含まない。
【００６４】
配列番号３及び／または配列番号５の断片に対して同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸の断片が提供され得る。そのような断片は、配列番号３及び／または配列番号５に対して９５％以上の同一性を有する核酸の少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％を構成し得る。いくつかの実施形態は、本明細書のｐｒｏＩＬ−３３核酸配列の断片に対して９６％以上の同一性を有する断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書のｐｒｏＩＬ−３３核酸配列の断片に対して９７％以上の同一性を有する断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書のｐｒｏＩＬ−３３核酸配列の断片に対して９８％以上の同一性を有する断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書のｐｒｏＩＬ−３３核酸配列の断片に対して９９％以上の同一性を有する断片に関する。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列、例えば、ＩｇＥリーダー配列等の免疫グロブリンリーダー配列をコードする配列を含む。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列をコードするコード配列を含まない。
【００６５】
配列番号４及び／または配列番号６の断片が提供され得る。断片は、配列番号４及び／または配列番号６の少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％を構成し得る。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列、例えば、ＩｇＥリーダー配列等の免疫グロブリンリーダー配列を含む。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列を含まない。
【００６６】
配列番号４及び／または配列番号６の断片に対して同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質の断片が提供され得る。そのような断片は、配列番号４及び／または配列番号６に対して９５％以上の同一性を有するタンパク質の少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％を構成し得る。いくつかの実施形態は、本明細書のｐｒｏＩＬ−３３タンパク質配列の断片に対して９６％以上の同一性を有する断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書のｐｒｏＩＬ−３３タンパク質配列の断片に対して９７％以上の同一性を有する断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書のｐｒｏＩＬ−３３タンパク質配列の断片に対して９８％以上の同一性を有する断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書のｐｒｏＩＬ−３３タンパク質配列の断片に対して９９％以上の同一性を有する断片に関する。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列、例えば、ＩｇＥリーダー配列等の免疫グロブリンリーダー配列を含む。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列を含まない。
（ｂ）ｍｔｒＩＬ−３３
【００６７】
ＩＬ−３３は、ｍｔｒＩＬ−３３、その断片、またはその変異体であり得る。ｍｔｒＩＬ−３３は、成熟型または切断型ＩＬ−３３であり、ＣＢＤ及びＮＬＳを欠く。ｍｔｒＩＬ−３３は、サイトゾル内に局在化する。
【００６８】
ｍｔｒＩＬ−３３は、ＩＬ−３３に関して前述のように、免疫応答を増強またはブーストすることができる。ｍｔｒＩＬ−３３はまた、ＩＬ−３３に関して前述のように、対象の抗原に対する細胞性免疫応答を増強またはブーストすることができる。
【００６９】
ｍｔｒＩＬ−３３をコードする核酸は、任意の数の生物、例えば、マウス（ハツカネズミ）及びヒト（ホモ・サピエンス）に由来してもよい。ｍｔｒＩＬ−３３をコードする核酸は、コドン使用頻度及び対応するＲＮＡ転写物に関して最適化され得る。ｍｔｒＩＬ−３３をコードする核酸はまた、発現のためにコドン最適化及びＲＮＡ最適化され得る。いくつかの実施形態において、ｍｔｒＩＬ−３３をコードする核酸は、翻訳の効率を高めるためにコザック配列（例えば、ＧＣＣ  ＡＣＣ）を含むことができる。ｍｔｒＩＬ−３３をコードする核酸は、翻訳終結の効率を高めるために複数の終止コドン（例えば、ＴＧＡ  ＴＧＡ）を含むことができる。ｍｔｒＩＬ−３３をコードする核酸は、ＩｇＥリーダー配列をコードするヌクレオチド配列も含むことができる。ＩｇＥリーダー配列は、核酸のｍｔｒＩＬ−３３の５’に位置してもよい。いくつかの実施形態において、ｍｔｒＩＬ−３３をコードする核酸は、ＩｇＥリーダー配列をコードするヌクレオチド配列を含まない、または含有しない。
【００７０】
マウスｍｔｒＩＬ−３３は、配列番号８をコードする、最適化された配列番号７の核酸配列であってもよい。いくつかの実施形態において、マウスｍｔｒＩＬ−３３は、配列番号７に記載の核酸配列の全長にわたって少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する核酸配列であってもよい。他の実施形態において、マウスｍｔｒＩＬ−３３は、配列番号８に記載のアミノ酸配列の全長にわたって少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列であってもよい。マウスｍｔｒＩＬ−３３は、配列番号８に記載のアミノ酸配列の全長にわたって少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列であってもよい。
【００７１】
ヒトｍｔｒＩＬ−３３は、配列番号２をコードする、最適化された配列番号１の核酸配列であってもよい。いくつかの実施形態において、ヒトｍｔｒＩＬ−３３は、配列番号１に記載の核酸配列の全長にわたって少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する核酸配列であってもよい。他の実施形態において、ヒトｍｔｒＩＬ−３３は、配列番号２に記載のアミノ酸配列の全長にわたって少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列であってもよい。ヒトｍｔｒＩＬ−３３は、配列番号２に記載のアミノ酸配列の全長にわたって少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列であってもよい。
【００７２】
いくつかの実施形態は、配列番号１及び／または配列番号７の断片に関する。断片は、配列番号１及び／または配列番号７の少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％を構成し得る。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列、例えば、ＩｇＥリーダー配列等の免疫グロブリンリーダー配列をコードする配列を含むことができる。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列をコードするコード配列を含まない。
【００７３】
配列番号１及び／または配列番号７の断片に対して同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸の断片が提供され得る。そのような断片は、配列番号１及び／または配列番号７に対して９５％以上の同一性を有する核酸の少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％を構成し得る。いくつかの実施形態は、本明細書のｍｔｒＩＬ−３３核酸配列の断片に対して９６％以上の同一性を有する断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書のｍｔｒＩＬ−３３核酸配列の断片に対して９７％以上の同一性を有する断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書のｍｔｒＩＬ−３３核酸配列の断片に対して９８％以上の同一性を有する断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書のｍｔｒＩＬ−３３核酸配列の断片に対して９９％以上の同一性を有する断片に関する。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列、例えば、ＩｇＥリーダー配列等の免疫グロブリンリーダー配列をコードする配列を含む。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列をコードするコード配列を含まない。
【００７４】
配列番号２及び／または配列番号８の断片が提供され得る。断片は、配列番号２及び／または配列番号８の少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％を構成し得る。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列、例えば、ＩｇＥリーダー配列等の免疫グロブリンリーダー配列を含む。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列を含まない。
【００７５】
配列番号２及び／または配列番号８の断片に対して同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質の断片が提供され得る。そのような断片は、配列番号２及び／または配列番号８に対して９５％以上の同一性を有するタンパク質の少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％を構成し得る。いくつかの実施形態は、本明細書のｍｔｒＩＬ−３３タンパク質配列の断片に対して９６％以上の同一性を有する断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書のｍｔｒＩＬ−３３タンパク質配列の断片に対して９７％以上の同一性を有する断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書のｍｔｒＩＬ−３３タンパク質配列の断片に対して９８％以上の同一性を有する断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書のｍｔｒＩＬ−３３タンパク質配列の断片に対して９９％以上の同一性を有する断片に関する。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列、例えば、ＩｇＥリーダー配列等の免疫グロブリンリーダー配列を含む。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列を含まない。
ｂ．抗原
【００７６】
前述のように、本ワクチンはまた、抗原またはその断片もしくは変異体と、アジュバントとを含むことができる。抗原は、対象において免疫応答を誘導するものであれば何であってもよい。精製された抗原は、通常、それらだけでは免疫原性が強くないため、前述のようなアジュバントと組み合わされる。抗原によって誘導される免疫応答は、アジュバントと組み合わせた場合にブーストまたは増強することができる。そのような免疫応答は、液性免疫応答及び／または細胞性免疫応答であり得る。いくつかの実施形態において、アジュバントと抗原との組み合わせは、対象において細胞性免疫応答をブーストまたは増強することができる。
【００７７】
抗原は、核酸配列、アミノ酸配列、またはそれらの組み合わせであってもよい。核酸配列は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、それらの変異体、それらの断片、またはそれらの組み合わせであってもよい。核酸配列はまた、ペプチド結合によって抗原に連結されたリンカーまたはタグ配列をコードするさらなる配列も含むことができる。アミノ酸配列は、タンパク質、ペプチド、それらの変異体、それらの断片、またはそれらの組み合わせであってもよい。
【００７８】
抗原は、任意の数の生物、例えば、ウイルス、寄生虫、細菌、真菌、または哺乳動物に由来するタンパク質、核酸、またはそれらの断片、またはそれらの変異体、またはそれらの組み合わせに含有されてもよい。抗原は、自己免疫疾患、アレルギー、または喘息に関連し得る。他の実施形態において、抗原は、癌、ヘルペス、インフルエンザ、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、またはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に関連し得る。好ましくは、抗原はインフルエンザまたはＨＩＶに関連し得る。
【００７９】
ある抗原は、強い免疫応答を誘導することができる。他の抗原は、弱い免疫応答を誘導することができる。抗原は、前述のようにアジュバントと組み合わせた場合により高い免疫応答を誘発することができる。
（１）ウイルス抗原
【００８０】
抗原は、ウイルス抗原、またはその断片、またはその変異体であってもよい。ウイルス抗原は、以下の科のうちの１つからのウイルスに由来してもよい：アデノウイルス科、アレナウイルス科、ブニヤウイルス科、カリシウイルス科、コロナウイルス科、フィロウイルス科、ヘパドナウイルス科、ヘルペスウイルス科、オルトミクソウイルス科、パポバウイルス科、パラミクソウイルス科、パルボウイルス科、ピコルナウイルス科、ポックスウイルス科、レオウイルス科、レトロウイルス科、ラブドウイルス科、またはトガウイルス科。ウイルス抗原は、パピローマウイルス、例えば、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ポリオウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、天然痘ウイルス（大痘瘡及び小痘瘡）、ワクシニアウイルス、インフルエンザウイルス、ライノウイルス、デング熱ウイルス、馬脳炎ウイルス、風疹ウイルス、黄熱病ウイルス、ノーウォークウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ−Ｉ）、ヘアリーセル白血病ウイルス（ＨＴＬＶ−ＩＩ）、カリフォルニア脳炎ウイルス、ハンタウイルス（出血熱）、狂犬病ウイルス、エボラ熱ウイルス、マールブルグウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）、単純ヘルペスウイルス１型（口腔ヘルペス）、単純ヘルペスウイルス２型（性器ヘルペス）、帯状疱疹（水痘帯状疱疹、別名は水疱瘡）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、例えば、ヒトＣＭＶ、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、フラビウイルス、口蹄疫ウイルス、チクングニアウイルス、ラッサ熱ウイルス、アレナウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）、または発癌性ウイルスに由来してもよい。
（ａ）肝炎抗原
【００８１】
ＩＬ−３３は、肝炎ウイルス抗原（すなわち、肝炎抗原）、またはその断片、またはその変異体と結合させるかまたは組み合わせることができる。肝炎抗原は、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｄ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）、及び／またはＥ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）に由来する抗原または免疫原であってもよい。いくつかの実施形態において、肝炎抗原は、ＨＡＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＤＶ、及びＨＥＶに由来する抗原のうちの１つ以上をコードする、プラスミド（複数可）等の異種核酸分子（複数可）であってもよい。肝炎抗原は、全長タンパク質、または全長タンパク質の免疫原性断片であってもよい。
【００８２】
肝炎抗原は、発現の向上のためにコンセンサス配列及び／または１つ以上の改変を含むことができる。構築物の免疫原性を増強するためのコドン最適化、ＲＮＡ最適化、及び高効率の免疫グロブリンリーダー配列の付加を含む遺伝的改変が、改変されたコンセンサス配列に含まれてもよい。コンセンサス肝炎抗原は、ＩｇＥまたはＩｇＧシグナルペプチド等の免疫グロブリンシグナルペプチド等のシグナルペプチドを含んでもよく、いくつかの実施形態において、ＨＡタグを含んでもよい。免疫原は、対応するコドン最適化免疫原よりも強く広範な細胞性免疫応答を誘発するように設計することができる。
【００８３】
肝炎抗原は、ＨＡＶ由来の抗原であってもよい。肝炎抗原は、ＨＡＶカプシドタンパク質、ＨＡＶ非構造タンパク質、それらの断片、それらの変異体、またはそれらの組み合わせであってもよい。
【００８４】
肝炎抗原は、ＨＣＶ由来の抗原であってもよい。肝炎抗原は、ＨＣＶヌクレオカプシドタンパク質（すなわち、コアタンパク質）、ＨＣＶエンベロープタンパク質（例えば、Ｅ１及びＥ２）、ＨＣＶ非構造タンパク質（例えば、ＮＳ１、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４ａ、ＮＳ４ｂ、ＮＳ５ａ、及びＮＳ５ｂ）、それらの断片、それらの変異体、またはそれらの組み合わせであってもよい。
【００８５】
肝炎抗原は、ＨＤＶ由来の抗原であってもよい。肝炎抗原は、ＨＤＶδ抗原、その断片、またはその変異体であってもよい。
【００８６】
肝炎抗原は、ＨＥＶ由来の抗原であってもよい。肝炎抗原は、ＨＥＶカプシドタンパク質、その断片、またはその変異体であってもよい。
【００８７】
肝炎抗原は、ＨＢＶ由来の抗原であってもよい。肝炎抗原は、ＨＢＶコアタンパク質、ＨＢＶ表面タンパク質、ＨＢＶ  ＤＮＡポリメラーゼ、遺伝子ＸによってコードされるＨＢＶタンパク質、それらの断片、それらの変異体、またはそれらの組み合わせであってもよい。肝炎抗原は、ＨＢＶ遺伝子型Ａコアタンパク質、ＨＢＶ遺伝子型Ｂコアタンパク質、ＨＢＶ遺伝子型Ｃコアタンパク質、ＨＢＶ遺伝子型Ｄコアタンパク質、ＨＢＶ遺伝子型Ｅコアタンパク質、ＨＢＶ遺伝子型Ｆコアタンパク質、ＨＢＶ遺伝子型Ｇコアタンパク質、ＨＢＶ遺伝子型Ｈコアタンパク質、ＨＢＶ遺伝子型Ａ表面タンパク質、ＨＢＶ遺伝子型Ｂ表面タンパク質、ＨＢＶ遺伝子型Ｃ表面タンパク質、ＨＢＶ遺伝子型Ｄ表面タンパク質、ＨＢＶ遺伝子型Ｅ表面タンパク質、ＨＢＶ遺伝子型Ｆ表面タンパク質、ＨＢＶ遺伝子型Ｇ表面タンパク質、ＨＢＶ遺伝子型Ｈ表面タンパク質、それらの断片、それらの変異体、またはそれらの組み合わせであってもよい。肝炎抗原は、コンセンサスＨＢＶコアタンパク質、またはコンセンサスＨＢＶ表面タンパク質であってもよい。
【００８８】
いくつかの実施形態において、肝炎抗原は、ＨＢＶ遺伝子型ＡコンセンサスコアＤＮＡ配列構築物、ＨＢＶ遺伝子型Ａコアタンパク質についてのコンセンサス配列に連結されたＩｇＥリーダー配列、またはＨＢＶ遺伝子型Ａコンセンサスコアタンパク質配列であってもよい。
【００８９】
他の実施形態において、肝炎抗原は、ＨＢＶ遺伝子型ＢコンセンサスコアＤＮＡ配列構築物、ＨＢＶ遺伝子型Ｂコアタンパク質についてのコンセンサス配列に連結されたＩｇＥリーダー配列、またはＨＢＶ遺伝子型Ｂコンセンサスコアタンパク質配列であってもよい。
【００９０】
さらに他の実施形態において、肝炎抗原は、ＨＢＶ遺伝子型ＣコンセンサスコアＤＮＡ配列構築物、ＨＢＶ遺伝子型Ｃコアタンパク質についてのコンセンサス配列に連結されたＩｇＥリーダー配列、またはＨＢＶ遺伝子型Ｃコンセンサスコアタンパク質配列であってもよい。
【００９１】
いくつかの実施形態において、肝炎抗原は、ＨＢＶ遺伝子型ＤコンセンサスコアＤＮＡ配列構築物、ＨＢＶ遺伝子型Ｄコアタンパク質についてのコンセンサス配列に連結されたＩｇＥリーダー配列、またはＨＢＶ遺伝子型Ｄコンセンサスコアタンパク質配列であってもよい。
【００９２】
他の実施形態において、肝炎抗原は、ＨＢＶ遺伝子型ＥコンセンサスコアＤＮＡ配列構築物、ＨＢＶ遺伝子型Ｅコアタンパク質についてのコンセンサス配列に連結されたＩｇＥリーダー配列、またはＨＢＶ遺伝子型Ｅコンセンサスコアタンパク質配列であってもよい。
【００９３】
いくつかの実施形態において、肝炎抗原は、ＨＢＶ遺伝子型ＦコンセンサスコアＤＮＡ配列構築物、ＨＢＶ遺伝子型Ｆコアタンパク質についてのコンセンサス配列に連結されたＩｇＥリーダー配列、またはＨＢＶ遺伝子型Ｆコンセンサスコアタンパク質配列であってもよい。
【００９４】
他の実施形態において、肝炎抗原は、ＨＢＶ遺伝子型ＧコンセンサスコアＤＮＡ配列構築物、ＨＢＶ遺伝子型Ｇコアタンパク質についてのコンセンサス配列に連結されたＩｇＥリーダー配列、またはＨＢＶ遺伝子型Ｇコンセンサスコアタンパク質配列であってもよい。
【００９５】
いくつかの実施形態において、肝炎抗原は、ＨＢＶ遺伝子型ＨコンセンサスコアＤＮＡ配列構築物、ＨＢＶ遺伝子型Ｈコアタンパク質についてのコンセンサス配列に連結されたＩｇＥリーダー配列、またはＨＢＶ遺伝子型Ｈコンセンサスコアタンパク質配列であってもよい。
【００９６】
さらに他の実施形態において、肝炎抗原は、ＨＢＶ遺伝子型Ａコンセンサス表面ＤＮＡ配列構築物、ＨＢＶ遺伝子型Ａ表面タンパク質についてのコンセンサス配列に連結されたＩｇＥリーダー配列、またはＨＢＶ遺伝子型Ａコンセンサス表面タンパク質配列であってもよい。
【００９７】
いくつかの実施形態において、肝炎抗原は、ＨＢＶ遺伝子型Ｂコンセンサス表面ＤＮＡ配列構築物、ＨＢＶ遺伝子型Ｂ表面タンパク質についてのコンセンサス配列に連結されたＩｇＥリーダー配列、またはＨＢＶ遺伝子型Ｂコンセンサス表面タンパク質配列であってもよい。
【００９８】
他の実施形態において、肝炎抗原は、ＨＢＶ遺伝子型Ｃコンセンサス表面ＤＮＡ配列構築物、ＨＢＶ遺伝子型Ｃ表面タンパク質についてのコンセンサス配列に連結されたＩｇＥリーダー配列、またはＨＢＶ遺伝子型Ｃコンセンサス表面タンパク質配列であってもよい。
【００９９】
さらに他の実施形態において、肝炎抗原は、ＨＢＶ遺伝子型Ｄコンセンサス表面ＤＮＡ配列構築物、ＨＢＶ遺伝子型Ｄ表面タンパク質についてのコンセンサス配列に連結されたＩｇＥリーダー配列、またはＨＢＶ遺伝子型Ｄコンセンサス表面タンパク質配列であってもよい。
【０１００】
いくつかの実施形態において、肝炎抗原は、ＨＢＶ遺伝子型Ｅコンセンサス表面ＤＮＡ配列構築物、ＨＢＶ遺伝子型Ｅ表面タンパク質についてのコンセンサス配列に連結されたＩｇＥリーダー配列、またはＨＢＶ遺伝子型Ｅコンセンサス表面タンパク質配列であってもよい。
【０１０１】
他の実施形態において、肝炎抗原は、ＨＢＶ遺伝子型Ｆコンセンサス表面ＤＮＡ配列構築物、ＨＢＶ遺伝子型Ｆ表面タンパク質についてのコンセンサス配列に連結されたＩｇＥリーダー配列、またはＨＢＶ遺伝子型Ｆコンセンサス表面タンパク質配列であってもよい。
【０１０２】
さらに他の実施形態において、肝炎抗原は、ＨＢＶ遺伝子型Ｇコンセンサス表面ＤＮＡ配列構築物、ＨＢＶ遺伝子型Ｇ表面タンパク質についてのコンセンサス配列に連結されたＩｇＥリーダー配列、またはＨＢＶ遺伝子型Ｇコンセンサス表面タンパク質配列であってもよい。
【０１０３】
他の実施形態において、肝炎抗原は、ＨＢＶ遺伝子型Ｈコンセンサス表面ＤＮＡ配列構築物、ＨＢＶ遺伝子型Ｈ表面タンパク質についてのコンセンサス配列に連結されたＩｇＥリーダー配列、またはＨＢＶ遺伝子型Ｈコンセンサス表面タンパク質配列であってもよい。
（ｂ）ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原
【０１０４】
ＩＬ−３３は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原、またはその断片、またはその変異体と結合させるかまたは組み合わせることができる。ＨＰＶ抗原は、子宮頸癌、直腸癌、及び／または他の癌を引き起こす、ＨＰＶ１６、１８、３１、３３、３５、４５、５２、及び５８型に由来してもよい。ＨＰＶ抗原は、性器疣贅を引き起こし、また頭頸部癌の原因として知られる、ＨＰＶ６及び１１型に由来してもよい。
【０１０５】
ＨＰＶ抗原は、各ＨＰＶ型のＨＰＶ  Ｅ６またはＥ７ドメインであってもよい。例えば、ＨＰＶ１６型（ＨＰＶ１６）の場合、ＨＰＶ１６抗原は、ＨＰＶ１６  Ｅ６抗原、ＨＰＶ１６  Ｅ７抗原、それらの断片、変異体、または組み合わせを含むことができる。同様に、ＨＰＶ抗原は、ＨＰＶ６  Ｅ６及び／もしくはＥ７、ＨＰＶ１１  Ｅ６及び／もしくはＥ７、ＨＰＶ１８  Ｅ６及び／もしくはＥ７、ＨＰＶ３１  Ｅ６及び／もしくはＥ７、ＨＰＶ３３  Ｅ６及び／もしくはＥ７、ＨＰＶ５２  Ｅ６及び／もしくはＥ７、またはＨＰＶ５８  Ｅ６及び／もしくはＥ７、それらの断片、変異体、または組み合わせであってもよい。
（ｃ）ＲＳＶ抗原
【０１０６】
ＩＬ−３３は、ＲＳＶ抗原、またはその断片、またはその変異体と結合させるかまたは組み合わせることができる。ＲＳＶ抗原は、ヒトＲＳＶ融合タンパク質（本明細書において「ＲＳＶ  Ｆ」、「ＲＳＶ  Ｆタンパク質」、及び「Ｆタンパク質」とも称される）、またはその断片もしくは変異体であってもよい。ヒトＲＳＶ融合タンパク質は、ＲＳＶサブタイプＡとＢとの間に保存することができる。ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＸ２３９９４．１）からのＲＳＶ  Ｆタンパク質、またはその断片もしくは変異体であってもよい。ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ  Ａ２株（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＢ５９８５８．１）からのＲＳＶ  Ｆタンパク質、またはその断片もしくは変異体であってもよい。ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ  Ｆタンパク質、またはその断片もしくは変異体の単量体、二量体、または三量体であってもよい。ＲＳＶ抗原は、最適化されたアミノ酸ＲＳＶ  Ｆアミノ酸配列、またはその断片もしくは変異体であってもよい。
【０１０７】
ＲＳＶ  Ｆの融合後形態は、免疫化された動物において高力価の中和抗体を誘発し、動物をＲＳＶへの曝露から保護する。本発明は、特許請求されるワクチンにおいてこの免疫応答を利用する。本発明によれば、ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、融合前形態または融合後形態であってもよい。
【０１０８】
ＲＳＶ抗原はまた、ヒトＲＳＶ付着糖タンパク質（本明細書において「ＲＳＶ  Ｇ」、「ＲＳＶ  Ｇタンパク質」、及び「Ｇタンパク質」とも称される）、またはその断片もしくは変異体であってもよい。ヒトＲＳＶ  Ｇタンパク質は、ＲＳＶサブタイプＡとＢとの間で異なる。抗原は、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＸ２３９９３）からのＲＳＶ  Ｇタンパク質、またはその断片もしくは変異体であってもよい。ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶサブタイプＢ単離菌Ｈ５６０１、ＲＳＶサブタイプＢ単離菌Ｈ１０６８、ＲＳＶサブタイプＢ単離菌Ｈ５５９８、ＲＳＶサブタイプＢ単離菌Ｈ１１２３、またはそれらの断片もしくは変異体からのＲＳＶ  Ｇタンパク質であってもよい。ＲＳＶ抗原は、最適化されたアミノ酸ＲＳＶ  Ｇアミノ酸配列、またはその断片もしくは変異体であってもよい。
【０１０９】
他の実施形態において、ＲＳＶ抗原は、ヒトＲＳＶ非構造タンパク質１（「ＮＳ１タンパク質」）、またはその断片もしくは変異体であってもよい。例えば、ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＸ２３９８７．１）からのＲＳＶ  ＮＳ１タンパク質、またはその断片もしくは変異体であってもよい。ヒトＲＳＶ抗原はまた、ＲＳＶ非構造タンパク質２（「ＮＳ２タンパク質」）、またはその断片もしくは変異体であってもよい。例えば、ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＸ２３９８８．１）からのＲＳＶ  ＮＳ２タンパク質、またはその断片もしくは変異体であってもよい。ＲＳＶ抗原はさらに、ヒトＲＳＶヌクレオカプシド（「Ｎ」）タンパク質、またはその断片もしくは変異体であってもよい。例えば、ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＸ２３９８９．１）からのＲＳＶ  Ｎタンパク質、またはその断片もしくは変異体であってもよい。ＲＳＶ抗原は、ヒトＲＳＶリン酸化タンパク質（「Ｐ」）タンパク質、またはその断片もしくは変異体であってもよい。例えば、ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＸ２３９９０．１）からのＲＳＶ  Ｐタンパク質、またはその断片もしくは変異体であってもよい。ＲＳＶ抗原はまた、ヒトＲＳＶ基質タンパク質（「Ｍ」）タンパク質、またはその断片もしくは変異体であってもよい。例えば、ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＸ２３９９１．１）からのＲＳＶ  Ｍタンパク質、またはその断片もしくは変異体であってもよい。
【０１１０】
さらに他の実施形態において、ＲＳＶ抗原は、ヒトＲＳＶ小疎水性（「ＳＨ」）タンパク質、またはその断片もしくは変異体であってもよい。例えば、ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＸ２３９９２．１）からのＲＳＶ  ＳＨタンパク質、またはその断片もしくは変異体であってもよい。ＲＳＶ抗原はまた、ヒトＲＳＶ基質タンパク質２−１（「Ｍ２−１」）タンパク質、またはその断片もしくは変異体であってもよい。例えば、ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＸ２３９９５．１）からのＲＳＶ  Ｍ２−１タンパク質、またはその断片もしくは変異体であってもよい。ＲＳＶ抗原はさらに、ヒトＲＳＶ基質タンパク質２−２（「Ｍ２−２」）タンパク質、またはその断片もしくは変異体であってもよい。例えば、ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＸ２３９９７．１）からのＲＳＶ  Ｍ２−２タンパク質、またはその断片もしくは変異体であってもよい。ヒトＲＳＶ抗原は、ＲＳＶポリメラーゼＬ（「Ｌ」）タンパク質、またはその断片もしくは変異体であってもよい。例えば、ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＸ２３９９６．１）からのＲＳＶ  Ｌタンパク質、またはその断片もしくは変異体であってもよい。
【０１１１】
さらなる実施形態において、ＲＳＶ抗原は、ＮＳ１、ＮＳ２、Ｎ、Ｐ、Ｍ、ＳＨ、Ｍ２−１、Ｍ２−２、またはＬタンパク質の最適化されたアミノ酸配列を有することができる。ＲＳＶ抗原は、ヒトＲＳＶゲノムによってコードされるタンパク質のうちのいずれか１つ等の、ヒトＲＳＶタンパク質または組み換え抗原であってもよい。
【０１１２】
他の実施形態において、ＲＳＶ抗原は、限定されないが、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株からのＲＳＶ  Ｆタンパク質、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株からのＲＳＶ  Ｇタンパク質、最適化されたアミノ酸ＲＳＶ  Ｇアミノ酸配列、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株のヒトＲＳＶゲノム、最適化されたアミノ酸ＲＳＶ  Ｆアミノ酸配列、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株からのＲＳＶ  ＮＳ１タンパク質、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株からのＲＳＶ  ＮＳ２タンパク質、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株からのＲＳＶ  Ｎタンパク質、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株からのＲＳＶ  Ｐタンパク質、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株からのＲＳＶ  Ｍタンパク質、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株からのＲＳＶ  ＳＨタンパク質、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株からのＲＳＶ  Ｍ２−１タンパク質、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株からのＲＳＶ  Ｍ２−２タンパク質、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株からのＲＳＶ  Ｌタンパク質、ＲＳＶサブタイプＢ単離菌Ｈ５６０１からのＲＳＶ  Ｇタンパク質、ＲＳＶサブタイプＢ単離菌Ｈ１０６８からのＲＳＶ  Ｇタンパク質、ＲＳＶサブタイプＢ単離菌Ｈ５５９８からのＲＳＶ  Ｇタンパク質、ＲＳＶサブタイプＢ単離菌Ｈ１１２３からのＲＳＶ  Ｇタンパク質、またはそれらの断片、またはそれらの変異体であってもよい。
（ｄ）インフルエンザ抗原
【０１１３】
ＩＬ−３３は、インフルエンザ抗原、またはその断片、またはその変異体と結合させるかまたは組み合わせることができる。インフルエンザ抗原は、哺乳動物において１つ以上のインフルエンザ血清型に対する免疫応答を誘発することができる抗原である。抗原は、全長翻訳産物ＨＡ０、サブユニットＨＡ１、サブユニットＨＡ２、それらの変異体、それらの断片、またはそれらの組み合わせを含むことができる。インフルエンザヘマグルチニン抗原は、インフルエンザＡ血清型Ｈ１の複数の株に由来するコンセンサス配列、インフルエンザＡ血清型Ｈ２の複数の株に由来するコンセンサス配列、インフルエンザＡ血清型Ｈ１の異なるセットの複数の株に由来する２つの異なるコンセンサス配列の一部を含有するハイブリッド配列、またはインフルエンザＢの複数の株に由来するコンセンサス配列であってもよい。インフルエンザヘマグルチニン抗原は、インフルエンザＢに由来してもよい。
【０１１４】
インフルエンザ抗原は、免疫応答が誘導され得る特定のインフルエンザ免疫原に対して効果的であり得る少なくとも１つの抗原エピトープを含有することもできる。抗原は、免疫原性部位の全レパートリーと、インタクトなインフルエンザウイルス中に存在するエピトープとを提供することができる。抗原は、血清型Ｈ１または血清型Ｈ２の複数のインフルエンザＡウイルス株等の、１つの血清型の複数のインフルエンザＡウイルス株からのヘマグルチニン抗原配列に由来し得るコンセンサスヘマグルチニン抗原配列であってもよい。抗原は、２つの異なるコンセンサスヘマグルチニン抗原配列またはその一部を組み合わせることによって得ることができる、ハイブリッドコンセンサスヘマグルチニン抗原配列であってもよい。２つの異なるコンセンサスヘマグルチニン抗原配列の各々は、血清型Ｈ１の複数のインフルエンザＡウイルス株等の、１つの血清型の異なるセットの複数のインフルエンザＡウイルス株に由来してもよい。抗原は、複数のインフルエンザＢウイルス株からのヘマグルチニン抗原配列に由来し得るコンセンサスヘマグルチニン抗原配列であってもよい。
【０１１５】
いくつかの実施形態において、インフルエンザ抗原は、Ｈ１  ＨＡ、Ｈ２  ＨＡ、Ｈ３  ＨＡ、Ｈ５  ＨＡ、またはＢＨＡ抗原であってもよい。代替として、インフルエンザ抗原は、コンセンサスＨ１アミノ酸配列またはコンセンサスＨ２アミノ酸配列を含むコンセンサスヘマグルチニン抗原であってもよい。コンセンサスヘマグルチニン抗原は、それぞれ、互いとは異なるセットの配列に由来する２つの異なるコンセンサスＨ１配列の部分を含む合成ハイブリッドコンセンサスＨ１配列であってもよい。合成ハイブリッドコンセンサスＨ１タンパク質であるコンセンサスＨＡ抗原の一例は、Ｕ２アミノ酸配列を含むタンパク質である。コンセンサスヘマグルチニン抗原は、コンセンサスＢＨＡアミノ酸配列を含むタンパク質等の、インフルエンザＢ株からのヘマグルチニン配列に由来するコンセンサスヘマグルチニンタンパク質であってもよい。
【０１１６】
コンセンサスヘマグルチニン抗原は、１つ以上のさらなるアミノ酸配列要素をさらに含んでもよい。コンセンサスヘマグルチニン抗原は、そのＮ末端上にＩｇＥまたはＩｇＧリーダーアミノ酸配列をさらに含んでもよい。コンセンサスヘマグルチニン抗原は、容易に入手可能な抗体によって検出され得る固有の免疫原性エピトープである免疫原性タグをさらに含んでもよい。そのような免疫原性タグの一例は、コンセンサスヘマグルチニンＣ末端上で連結させることができる９アミノ酸インフルエンザＨＡタグである。いくつかの実施形態において、コンセンサスヘマグルチニン抗原は、そのＮ末端上にＩｇＥまたはＩｇＧリーダーアミノ酸配列、そのＣ末端上にＨＡタグをさらに含んでもよい。
【０１１７】
コンセンサスヘマグルチニン抗原は、コンセンサスインフルエンザアミノ酸配列またはその断片及び変異体からなるコンセンサスヘマグルチニンタンパク質であってもよい。コンセンサスヘマグルチニン抗原は、非インフルエンザタンパク質配列と、インフルエンザタンパク質配列またはその断片及び変異体とを含む、コンセンサスヘマグルチニンタンパク質であってもよい。
【０１１８】
コンセンサスＨ１タンパク質の例として、コンセンサスＨ１アミノ酸配列からなってもよいタンパク質、またはＩｇＥリーダー配列、もしくはＨＡタグ、もしくはＩｇＥリーダー配列及びＨＡタグの両方等の追加の要素をさらに含むタンパク質が挙げられる。
【０１１９】
コンセンサスＨ２タンパク質の例として、コンセンサスＨ２アミノ酸配列からなってもよいタンパク質、またはＩｇＥリーダー配列、もしくはＨＡタグ、もしくはＩｇＥリーダー配列及びＨＡタグの両方を含むタンパク質が挙げられる。
【０１２０】
ハイブリッドコンセンサスＨ１タンパク質の例として、コンセンサスＵ２アミノ酸配列からなってもよいタンパク質、またはＩｇＥリーダー配列、もしくはＨＡタグ、もしくはＩｇＥリーダー配列及びＨＡタグの両方を含むタンパク質が挙げられる。
【０１２１】
ハイブリッドコンセンサスインフルエンザＢヘマグルチニンタンパク質の例として、コンセンサスＢＨＡアミノ酸配列からなってもよいタンパク質が挙げられるか、または該例は、ＩｇＥリーダー配列、もしくはＨＡタグ、もしくはＩｇＥリーダー配列及びＨＡタグの両方を含んでもよい。
【０１２２】
コンセンサスヘマグルチニンタンパク質は、コンセンサスヘマグルチニン核酸、その変異体、またはその断片によってコードされ得る。異なる株及び変異体からの複数の異なるヘマグルチニン配列に由来するコンセンサス配列であり得るコンセンサスヘマグルチニンタンパク質とは異なり、コンセンサスヘマグルチニン核酸は、コンセンサスタンパク質配列をコードする核酸配列を指し、使用されるコード配列は、コンセンサスヘマグルチニンタンパク質配列が由来する複数の異なるヘマグルチニン配列中の特定のアミノ酸配列をコードするために使用される配列とは異なり得る。コンセンサス核酸配列は、コドン最適化及び／またはＲＮＡ最適化されてもよい。コンセンサスヘマグルチニン核酸配列は、５’非翻訳領域にコザック配列を含んでもよい。コンセンサスヘマグルチニン核酸配列は、リーダー配列をコードする核酸配列を含んでもよい。Ｎ末端リーダー配列のコード配列は、ヘマグルチニンコード配列の５’である。Ｎ末端リーダーは、分泌を促進することができる。Ｎ末端リーダーは、ＩｇＥリーダーまたはＩｇＧリーダーであってもよい。コンセンサスヘマグルチニン核酸配列は、免疫原性タグをコードする核酸配列を含むことができる。免疫原性タグは、タンパク質のＣ末端上にあってもよく、それをコードする配列は、ＨＡコード配列の３’である。免疫原性タグは、それに対して容易に入手可能な抗体が存在する固有のエピトープを提供するため、タンパク質の発現を検出及び確認するためのアッセイにおいてそのような抗体を使用することができる。免疫原性タグは、タンパク質のＣ末端のＨＡタグであってもよい。
（ｅ）ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）抗原
【０１２３】
ＩＬ−３３は、ＨＩＶ抗原、またはその断片、またはその変異体と結合させるかまたは組み合わせることができる。ＨＩＶ抗原は、免疫原について改変されたコンセンサス配列を含むことができる。構築物の免疫原性を増強するためのコドン最適化、ＲＮＡ最適化、及び高効率のイムノグロビンリーダー配列の付加を含む遺伝的改変が、改変されたコンセンサス配列に含まれてもよい。新規免疫原は、対応するコドン最適化免疫原よりも強く広範な細胞性免疫応答を誘発するように設計することができる。
【０１２４】
いくつかの実施形態において、ＨＩＶ抗原は、サブタイプＡコンセンサスエンベロープＤＮＡ配列構築物、サブタイプＡエンベロープタンパク質についてのコンセンサス配列に連結されたＩｇＥリーダー配列、またはサブタイプＡコンセンサスエンベロープタンパク質配列であってもよい。
【０１２５】
他の実施形態において、ＨＩＶ抗原は、サブタイプＢコンセンサスエンベロープＤＮＡ配列構築物、サブタイプＢエンベロープタンパク質についてのコンセンサス配列に連結されたＩｇＥリーダー配列、またはサブタイプＢコンセンサスエンベロープタンパク質配列であってもよい。
【０１２６】
さらに他の実施形態において、ＨＩＶ抗原は、サブタイプＣコンセンサスエンベロープＤＮＡ配列構築物、サブタイプＣエンベロープタンパク質についてのコンセンサス配列に連結されたＩｇＥリーダー配列、またはサブタイプＣコンセンサスエンベロープタンパク質配列であってもよい。
【０１２７】
さらなる実施形態において、ＨＩＶ抗原は、サブタイプＤコンセンサスエンベロープＤＮＡ配列構築物、サブタイプＤエンベロープタンパク質についてのコンセンサス配列に連結されたＩｇＥリーダー配列、またはサブタイプＤコンセンサスエンベロープタンパク質配列であってもよい。
【０１２８】
いくつかの実施形態において、ＨＩＶ抗原は、サブタイプＢ  Ｎｅｆ−ＲｅｖコンセンサスエンベロープＤＮＡ配列構築物、サブタイプＢ  Ｎｅｆ−Ｒｅｖタンパク質についてのコンセンサス配列に連結されたＩｇＥリーダー配列、またはサブタイプＢ  Ｎｅｆ−Ｒｅｖコンセンサスタンパク質配列であってもよい。
【０１２９】
他の実施形態において、ＨＩＶ抗原は、サブタイプＡ、Ｂ、Ｃ、及びＤ  ＤＮＡ配列構築物のＧａｇコンセンサスＤＮＡ配列、ＧａｇコンセンサスサブタイプＡ、Ｂ、Ｃ、及びＤタンパク質についてのコンセンサス配列に連結されたＩｇＥリーダー配列、またはコンセンサスＧａｇサブタイプＡ、Ｂ、Ｃ、及びＤタンパク質配列であってもよい。
【０１３０】
さらに他の実施形態において、ＨＩＶ抗原は、ＭＰｏｌ  ＤＮＡ配列またはＭＰｏｌタンパク質配列であってもよい。ＨＩＶ抗原は、Ｅｎｖ  Ａ、Ｅｎｖ  Ｂ、Ｅｎｖ  Ｃ、Ｅｎｖ  Ｄ、Ｂ  Ｎｅｆ−Ｒｅｖ、Ｇａｇ、またはそれらの組み合わせの核酸またはアミノ酸配列であってもよい。
（ｆ）リンパ性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）抗原
【０１３１】
ＩＬ−３３は、ＬＣＭＶ抗原、またはその断片、またはその変異体と結合させるかまたは組み合わせることができる。ＬＣＭＶ抗原は、発現の向上のためにコンセンサス配列及び／または１つ以上の改変を含むことができる。構築物の免疫原性を増強するためのコドン最適化、ＲＮＡ最適化、及び高効率の免疫グロブリンリーダー配列の付加を含む遺伝的改変が、改変された配列に含まれてもよい。ＬＣＭＶ抗原は、免疫グロブリンシグナルペプチド（例えば、ＩｇＥまたはＩｇＧシグナルペプチド）等のシグナルペプチドを含んでもよく、いくつかの実施形態において、ＨＡタグを含んでもよい。この免疫原は、対応するコドン最適化免疫原よりも強く広範な細胞性免疫応答を誘発するように設計することができる。
【０１３２】
ＬＣＭＶ抗原は、ＬＣＭＶ  Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ由来の抗原であってもよい。ＬＣＭＶ抗原は、ＬＣＭＶクローン１３由来の抗原であってもよい。ＬＣＭＶ抗原は、ＬＣＭＶ由来の核タンパク質（ＮＰ）、ＬＣＭＶ由来の糖タンパク質（ＧＰ；例えば、ＧＰ−１、ＧＰ−２、及びＧＰ−Ｃ）、ＬＣＭＶ由来のＬタンパク質、ＬＣＭＶ由来のＺポリペプチド、それらの断片、それらの変異体、またはそれらの組み合わせであってもよい。
（２）寄生虫抗原
【０１３３】
抗原は、寄生虫抗原またはその断片もしくは変異体であってもよい。寄生虫は、原虫、原生動物、または外寄生生物であってもよい。原虫（すなわち、蠕虫）は、扁形動物（例えば、吸虫及び条虫）、鉤頭虫、または線虫（例えば、蟯虫）であってもよい。外寄生生物は、シラミ、ノミ、マダニ、及びコダニであってもよい。
【０１３４】
寄生虫は、以下の疾患の原因となる任意の寄生虫であってもよい：アカントアメーバ角膜炎、アメーバ症、回虫症、バベシア症、バランチジウム症、アライグマ回虫症、シャーガス病、肝吸虫症、らせん虫感染症、クリプトスポリジウム症、裂頭条虫症、メジナ虫症、エキノコックス症、象皮症、腸蟯虫症、肝蛭症、肥大吸虫症、フィラリア症、ジアルジア症、顎口虫症、膜様条虫症、イソスポーラ症、片山熱、リーシュマニア症、ライム病、マラリア、横川吸虫症、ハエ幼虫症、オンコセルカ症、シラミ寄生症、疥癬、住血吸虫症、睡眠病、糞線虫症、条虫症、トキソカラ症、トキソプラズマ症、旋毛虫症、及び鞭虫症。
【０１３５】
寄生虫は、アカントアメーバ、アニサキス、回虫、ウマバエ、大腸バランチジウム、トコジラミ、サナダムシ（条虫）、ツツガムシ、ラセンウジバエ、赤痢アメーバ、肝蛭、ランブル鞭毛虫、鉤虫、リーシュマニア、鼻腔舌虫、肝吸虫、ロア糸状虫、パラゴニムス−肺吸虫、蟯虫、熱帯熱マラリア原虫、住血吸虫、糞線虫、コダニ、条虫、トキソプラズマ原虫、トリパノソーマ、鞭虫、またはバンクロフト糸状虫であってもよい。
（ａ）マラリア抗原
【０１３６】
ＩＬ−３３は、マラリア抗原（すなわち、ＰＦ抗原またはＰＦ免疫原）、またはその断片、またはその変異体と結合させるかまたは組み合わせることができる。抗原は、マラリアの原因となる寄生虫に由来し得る。マラリアの原因となる寄生虫は、熱帯熱マラリア原虫であってもよい。熱帯熱マラリア原虫抗原は、サーカムスポロゾイト（ＣＳ）抗原を含むことができる。
【０１３７】
いくつかの実施形態において、マラリア抗原は、熱帯熱マラリア原虫免疫原ＣＳ、ＬＳＡ１、ＴＲＡＰ、ＣｅｌＴＯＳ、及びＡｍａ１のうちの１つ以上をコードするプラスミド等の核酸分子であってもよい。免疫原は、全長タンパク質、または全長タンパク質の免疫原性断片であってもよい。免疫原は、発現の向上のためにコンセンサス配列及び／または改変を含む。
【０１３８】
他の実施形態において、マラリア抗原は、ＧｅｎＢａｎｋデータベース中の全ての全長熱帯熱マラリア原虫ＴＲＡＰ／ＳＳＰ２配列（合計２８配列）のコンパイルから設計された、ＳＳＰ２とも称されるＴＲＡＰのコンセンサス配列であってもよい。コンセンサスＴＲＡＰ免疫原（すなわち、ＣｏｎＴＲＡＰ免疫原）は、ＩｇＥまたはＩｇＧシグナルペプチド等の免疫グロブリンシグナルペプチド等のシグナルペプチドを含んでもよく、いくつかの実施形態において、ＨＡタグを含んでもよい。
【０１３９】
さらに他の実施形態において、マラリア抗原は、ＣｅｌＴＯＳであってもよく、これはまたＡｇ２とも称され、高度に保存されたマラリア原虫抗原である。コンセンサスＣｅｌＴＯＳ抗原（すなわち、ＣｏｎＣｅｌＴＯＳ免疫原）は、ＩｇＥまたはＩｇＧシグナルペプチド等の免疫グロブリンシグナルペプチド等のシグナルペプチドを含んでもよく、いくつかの実施形態において、ＨＡタグを含んでもよい。
【０１４０】
さらなる実施形態において、マラリア抗原は、高度に保存されたマラリア原虫抗原であるＡｍａ１であってもよい。マラリア抗原はまた、いくつかの例において、ＩｇＥまたはＩｇＧシグナルペプチド等の免疫グロブリンシグナルペプチド等のシグナルペプチドを含む、Ａｍａ１（すなわち、ＣｏｎＡｍａＩ免疫原）のコンセンサス配列であり得、いくつかの実施形態において、ＨＡタグを含んでもよい。
【０１４１】
いくつかの実施形態において、マラリア抗原は、いくつかの例において、ＩｇＥまたはＩｇＧシグナルペプチド等の免疫グロブリンシグナルペプチド等のシグナルペプチドを含む、コンセンサスＣＳ抗原（すなわち、コンセンサスＣＳ免疫原）であり得、いくつかの実施形態において、ＨＡタグを含んでもよい。
【０１４２】
他の実施形態において、マラリア抗原は、本明細書に記載されるＰＦタンパク質のうちの２つ以上の組み合わせを含む融合タンパク質であってもよい。例えば、融合タンパク質は、コンセンサスＣＳ免疫原、ＣｏｎＬＳＡ１免疫原、ＣｏｎＴＲＡＰ免疫原、ＣｏｎＣｅｌＴＯＳ免疫原、及び互いに直接隣接して連結するか、または間にスペーサーもしくは１つ以上のアミノ酸を伴って連結するＣｏｎＡｍａ１免疫原のうちの２つ以上を含んでもよい。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、２つのＰＦ免疫原を含み、いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、３つのＰＦ免疫原を含み、いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、４つのＰＦ免疫原を含み、いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、５つのＰＦ免疫原を含む。２つのコンセンサスＰＦ免疫原を有する融合タンパク質は、ＣＳ及びＬＳＡ１、ＣＳ及びＴＲＡＰ、ＣＳ及びＣｅｌＴＯＳ、ＣＳ及びＡｍａ１、ＬＳＡ１及びＴＲＡＰ、ＬＳＡ１及びＣｅｌＴＯＳ、ＬＳＡ１及びＡｍａ１、ＴＲＡＰ及びＣｅｌＴＯＳ、ＴＲＡＰ及びＡｍａ１、またはＣｅｌＴＯＳ及びＡｍａ１を含んでもよい。３つのコンセンサスＰＦ免疫原を有する融合タンパク質は、ＣＳ、ＬＳＡ１、及びＴＲＡＰ；ＣＳ、ＬＳＡ１、及びＣｅｌＴＯＳ；ＣＳ、ＬＳＡ１、及びＡｍａ１；ＬＳＡ１、ＴＲＡＰ、及びＣｅｌＴＯＳ；ＬＳＡ１、ＴＲＡＰ、及びＡｍａ１；またはＴＲＡＰ、ＣｅｌＴＯＳ、及びＡｍａ１を含んでもよい。４つのコンセンサスＰＦ免疫原を有する融合タンパク質は、ＣＳ、ＬＳＡ１、ＴＲＡＰ、及びＣｅｌＴＯＳ；ＣＳ、ＬＳＡ１、ＴＲＡＰ、及びＡｍａ１；ＣＳ、ＬＳＡ１、ＣｅｌＴＯＳ、及びＡｍａ１；ＣＳ、ＴＲＡＰ、ＣｅｌＴＯＳ、及びＡｍａ１；またはＬＳＡ１、ＴＲＡＰ、ＣｅｌＴＯＳ、及びＡｍａ１を含んでもよい。５つのコンセンサスＰＦ免疫原を有する融合タンパク質は、ＣＳまたはＣＳ−ａｌｔ、ＬＳＡ１、ＴＲＡＰ、ＣｅｌＴＯＳ、及びＡｍａ１を含んでもよい。
【０１４３】
いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、Ｎ末端に連結したシグナルペプチドを含む。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、各コンセンサスＰＦ免疫原のＮ末端に連結した複数のシグナルペプチドを含む。いくつかの実施形態において、融合タンパク質のＰＦ免疫原の間にスペーサーが含まれてもよい。いくつかの実施形態において、融合タンパク質のＰＦ免疫原の間のスペーサーは、タンパク質分解切断部位であってもよい。いくつかの実施形態において、スペーサーは、ワクチンが投与される及び／または取り込まれることが意図される細胞に見出されるプロテアーゼによって認識されるタンパク質分解切断部位であってもよい。いくつかの実施形態において、スペーサーが融合タンパク質のＰＦ免疫原の間に含まれてもよく、スペーサーは、ワクチンが投与される及び／または取り込まれることが意図される細胞に見出されるプロテアーゼによって認識されるタンパク質分解切断部位であり、切断されると、各コンセンサスＰＦ免疫原のシグナルペプチドが、コンセンサスＰＦ免疫原を細胞外に移動させるように、融合タンパク質は、各コンセンサスＰＦ免疫原のＮ末端に連結された複数のシグナルペプチドを含む。
（３）細菌抗原
【０１４４】
抗原は、細菌抗原またはその断片もしくは変異体であってもよい。細菌は、以下の門のうちのいずれか１つであってもよい：アシドバクテリウム門、放線菌門、アクウィフェクス門、バクテロイデス門、カルディセリクム門、クラミジア門、緑色硫黄細菌門、緑色非硫黄細菌門、クリシオゲネス門、シアノバクテリア門、デフェリバクター門、デイノコックス・テルムス門、ディクチオグロムス門、エルシミクロビウム門、フィブロバクター門、ファーミキューテス門、フソバクテリウム門、ジェマティモナス門、レンティスファエラ門、ニトロスピラ門、プランクトミケス門、プロテオバクテリア門、スピロヘータ門、シネルギステス門、テネリクテス門、サーモデスルフォバクテリア門、テルモトガ門、及びウェルコミクロビウム門。
【０１４５】
細菌は、グラム陽性細菌またはグラム陰性細菌であってもよい。細菌は、好気性細菌または嫌気性細菌であってもよい。細菌は、独立栄養細菌または従属栄養細菌であってもよい。細菌は、中温菌、好中球菌、好極限性細菌、好酸球菌、好アルカリ菌、好熱菌、低温菌、好塩菌、または好濃菌であってもよい。
【０１４６】
細菌は、炭疽菌、抗生物質耐性菌、疾患原因菌、食中毒菌、感染性細菌、サルモネラ菌、ブドウ球菌、連鎖球菌、または破傷風菌であってもよい。細菌は、マイコバクテリア、破傷風菌、ペスト菌、バチルス・アントラシス、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）、またはクロストリジウム・ディフィシルであってもよい。細菌は、結核菌であってもよい。
（ａ）結核菌抗原
【０１４７】
ＩＬ−３３は、結核菌抗原（すなわち、ＴＢ抗原またはＴＢ免疫原）、またはその断片、またはその変異体と結合させるかまたは組み合わせることができる。ＴＢ抗原は、ＴＢ抗原のＡｇ８５ファミリー、例えば、Ａｇ８５Ａ及びＡｇ８５Ｂに由来してもよい。ＴＢ抗原は、ＴＢ抗原のＥｓｘファミリー、例えば、ＥｓｘＡ、ＥｓｘＢ、ＥｓｘＣ、ＥｓｘＤ、ＥｓｘＥ、ＥｓｘＦ、ＥｓｘＨ、ＥｓｘＯ、ＥｓｘＱ、ＥｓｘＲ、ＥｓｘＳ、ＥｓｘＴ、ＥｓｘＵ、ＥｓｘＶ、及びＥｓｘＷに由来してもよい。
【０１４８】
いくつかの実施形態において、ＴＢ抗原は、Ａｇ８５ファミリー及びＥｓｘファミリーからの結核菌免疫原のうちの１つ以上をコードするプラスミド等の核酸分子であってもよい。免疫原は、全長タンパク質、または全長タンパク質の免疫原性断片であってもよい。免疫原は、発現の向上のためにコンセンサス配列及び／または改変を含むことができる。コンセンサス免疫原は、ＩｇＥまたはＩｇＧシグナルペプチド等の免疫グロブリンシグナルペプチド等のシグナルペプチドを含んでもよく、いくつかの実施形態において、ＨＡタグを含んでもよい。
（４）真菌抗原
【０１４９】
抗原は、真菌抗原またはその断片もしくは変異体であってもよい。真菌は、コウジカビ種、ブラストミセス・デルマチチジス、カンジタ酵母（例えば、カンジダ・アルビカンス）、コクシジオイデス、クリプトコッカス・ネオフォルマンス、クリプトコッカス・ガッティ、皮膚糸状菌、フサリウム種、ヒストプラズマ・カプスラーツム、ケカビ亜門、ニューモシスチス・ジロベシ、スポロトリクス・シェンキイ、エクセロヒルム、またはクラドスポリウムであってもよい。
ｃ．ベクター
【０１５０】
本ワクチンは、抗原をコードする核酸を含む１つ以上のベクターと、アジュバントとを含むことができる。１つ以上のベクターは、抗原及びアジュバントを発現させることが可能であり得る。１つ以上のベクターは、一般的に、標的細胞に特定の遺伝子を導入するために使用されるプラスミドである、発現構築物であってもよい。一旦、発現ベクターが細胞内に入ると、細胞の転写及び翻訳機構であるリボソーム複合体によって、遺伝子によってコードされるタンパク質が産生される。プラスミドは、エンハンサー及びプロモーター領域として作用し、発現ベクター上に搭載された遺伝子の効率的な転写をもたらす制御配列を含有するように遺伝子操作されることが多い。本発明のベクターは、大量の安定なメッセンジャーＲＮＡ、ひいてはタンパク質を発現する。
【０１５１】
ベクターは、強力なプロモーター、強力な終止コドン、プロモーターとクローン化遺伝子との間の距離の調節、ならびに転写終結配列及びＰＴＩＳ（ポータブル翻訳開始配列）の挿入等の発現シグナルを有してもよい。
（１）発現ベクター
【０１５２】
ベクターは、環状プラスミドまたは線状核酸であってもよい。環状プラスミド及び線状核酸は、適切な対象細胞において特定のヌクレオチド配列の発現を導くことができる。ベクターは、終止シグナルに作動可能に連結されてもよい、抗原をコードするヌクレオチド配列またはアジュバントをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターを有することができる。ベクターはまた、ヌクレオチド配列の適切な翻訳に必要な配列を含有することもできる。対象となるヌクレオチド配列を含むベクターは、キメラであってもよく、すなわち、その成分のうちの少なくとも１つが、その他の成分のうちの少なくとも１つに対して異種であることを意味する。発現カセットにおけるヌクレオチド配列の発現は、宿主細胞がある特定の外的刺激に曝露されたときにのみ転写を開始する、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターの制御下にあってもよい。多細胞生物の場合、プロモーターはまた、特定の組織もしくは器官または発達段階に特異的であってもよい。
（２）環状及び線状ベクター
【０１５３】
ベクターは、細胞ゲノムへの取り込みによって標的細胞を形質転換することができるか、または染色体外に存在し得る、環状プラスミドであってもよい（例えば、複製起点を有するプラスミドの自律増殖）。
【０１５４】
ベクターは、ｐＶＡＸ、ｐｃＤＮＡ３．０、もしくはｐｒｏｖａｘであるか、または抗原もしくはアジュバントをコードするＤＮＡを発現することが可能であり、かつ細胞が配列を免疫系によって認識される抗原に翻訳できるようにする任意の他の発現ベクターであるか、またはアジュバントであってもよい。
【０１５５】
また、電気穿孔を介して対象に効率的に送達され得、１つ以上の所望の抗原または１つ以上の所望のアジュバントを発現することができる、線状核酸ワクチンまたは線状発現カセット（「ＬＥＣ」）も本明細書に提供される。ＬＥＣは、いずれのリン酸主鎖も持たない任意の線状ＤＮＡであってもよい。ＤＮＡは、１つ以上の抗原または１つ以上のアジュバントをコードすることができる。ＬＥＣは、プロモーター、イントロン、終止コドン、及び／またはポリアデニル化シグナルを含有してもよい。抗原またはアジュバントの発現は、プロモーターによって制御されてもよい。ＬＥＣは、いずれの抗生物質耐性遺伝子及び／またはリン酸主鎖も含有しなくてもよい。ＬＥＣは、所望の抗原遺伝子発現または所望のアジュバント発現と無関係の他の核酸配列を含有しなくてもよい。
【０１５６】
ＬＥＣは、直線化され得る任意のプラスミドに由来してもよい。プラスミドは、抗原またはアジュバントを発現することが可能であり得る。プラスミドは、アジュバントＩＬ−３３を発現することが可能であり得る。プラスミドは、ｐＮＰ（Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／３４）またはｐＭ２（Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／９９）であってもよい。プラスミドは、ＷＬＶ００９、ｐＶＡＸ、ｐｃＤＮＡ３．０、もしくはｐｒｏｖａｘであるか、または抗原をコードするかもしくはアジュバントをコードするＤＮＡを発現することが可能であり、かつ細胞が配列を免疫系によって認識される抗原に翻訳できるようにする任意の他の発現ベクターであるか、またはアジュバントであってもよい。
【０１５７】
ＬＥＣは、ｐｃｒＭ２であってもよい。ＬＥＣは、ｐｃｒＮＰであってもよい。ｐｃｒＮＰ及びｐｃｒＭＲは、それぞれ、ｐＮＰ（Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／３４）及びｐＭ２（Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／９９）に由来してもよい。
（３）プロモーター、イントロン、終止コドン、及びポリアデニル化シグナル
【０１５８】
ベクターは、プロモーターを有してもよい。プロモーターは、遺伝子発現を駆動すること及び単離核酸の発現を制御することが可能ないずれのプロモーターであってもよい。そのようなプロモーターは、本明細書に記載の抗原配列またはアジュバント配列を転写する、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを介した転写に必要なシス作用配列要素である。異種核酸の発現を導くために使用されるプロモーターの選択は、特定の用途に依存する。プロモーターは、その天然環境における転写開始部位からの距離とほぼ同じ距離だけベクターにおける転写開始部位から離れて位置してもよい。しかしながら、プロモーター機能を喪失することなく、この距離の変動は受け入れられ得る。
【０１５９】
プロモーターは、抗原をコードする核酸配列に作動可能に連結されてもよく、転写物の効率的なポリアデニル化、リボソーム結合部位、及び翻訳終結に必要なシグナルであってもよい。プロモーターは、アジュバントをコードする核酸配列に作動可能に連結されてもよく、転写物の効率的なポリアデニル化、リボソーム結合部位、及び翻訳終結に必要なシグナルであってもよい。
【０１６０】
プロモーターは、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳癌ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーター、または真核細胞における発現に効果的であることが示されている別のプロモーターであってもよい。
【０１６１】
ベクターは、エンハンサーと、機能的なスプライスドナー部位及びアクセプター部位を有するイントロンとを含んでもよい。ベクターは、効率的な終結を提供するために、構造遺伝子の下流に転写終結部位を含有してもよい。終結部位は、プロモーター配列と同じ遺伝子から得られてもよいか、または異なる遺伝子から得られてもよい。
ｄ．ワクチンの賦形剤及び他の成分
【０１６２】
本ワクチンは、薬学的に許容される賦形剤をさらに含んでもよい。薬学的に許容される賦形剤は、ビヒクル、ＩＬ−３３以外のアジュバント、担体、または希釈剤等の機能性分子であり得る。薬学的に許容される賦形剤は、トランスフェクション促進剤であってもよく、これには、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）等の界面活性剤、フロイント不完全アジュバント、モノホスホリルリピドＡを含むＬＰＳ類似体、ムラミルペプチド、キノン類似体、スクアレン及びスクアレン等の小胞体、ヒアルロン酸、脂質、リポソーム、カルシウムイオン、ウイルスタンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン、またはナノ粒子、あるいは他の既知のトランスフェクション促進剤が挙げられる。
【０１６３】
トランスフェクション促進剤は、ポリ−Ｌ−グルタマート（ＬＧＳ）をはじめとするポリアニオン、ポリカチオン、または脂質である。トランスフェクション促進剤は、ポリ−Ｌ−グルタマートであり、ポリ−Ｌ−グルタマートは、６ｍｇ／ｍｌ未満の濃度でワクチン中に存在し得る。トランスフェクション促進剤は、界面活性剤、例えば免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）、フロイント不完全アジュバント、モノホスホリル脂質ＡをはじめとするＬＰＳ類似体、ムラミルペプチド、キノン類似体、ならびにスクアレン及びスクアレン等の小胞体も含み得、ヒアルロン酸も、遺伝子構築物と一体化させて使用投与され得る。ＤＮＡプラスミドワクチンは、トランスフェクション促進剤、例えば脂質、レシチンリポソームまたはＤＮＡリポソーム混合物（例えば、ＷＯ０９３２４６４０を参照）として当該技術分野で公知の他のリポソームをはじめとするリポソーム、カルシウムイオン、ウイルスタンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン、もしくはナノ粒子、または他の公知のトランスフェクション促進剤を含んでもよい。トランスフェクション促進剤は、ポリ−Ｌ−グルタマート（ＬＧＳ）をはじめとするポリアニオン、ポリカチオン、または脂質である。ワクチン中のトランスフェクション剤の濃度は、４ｍｇ／ｍｌ未満、２ｍｇ／ｍｌ未満、１ｍｇ／ｍｌ未満、０．７５０ｍｇ／ｍｌ未満、０．５００ｍｇ／ｍｌ未満、０．２５０ｍｇ／ｍｌ未満、０．１００ｍｇ／ｍｌ未満、０．０５０ｍｇ／ｍｌ未満、または０．０１０ｍｇ／ｍｌ未満である。
【０１６４】
薬学的に許容される賦形剤は、ＩＬ−３３の他に、アジュバントであり得る。追加のアジュバントは、別のプラスミドに発現されるか、またはワクチンにおいて上述のプラスミドと組み合わせたタンパク質として送達される、他の遺伝子であってもよい。アジュバントは、α−インターフェロン（ＩＦＮ−α）、β−インターフェロン（ＩＦＮ−β）、γ−インターフェロン、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦα、ΤΝＦβ、ＧＭ−ＣＳＦ、上皮成長因子（ＥＧＦ）、皮膚Ｔ細胞誘引ケモカイン（ＣＴＡＣＫ）、上皮胸腺発現ケモカイン（ＴＥＣＫ）、粘膜関連上皮ケモカイン（ＭＥＣ）、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＭＨＣ、ＣＤ８０、シグナル配列が欠失したＩＬ−１５を含み、かつ任意でＩｇＥ由来のシグナルペプチドを含むＣＤ８６からなる群から選択することができる。アジュバントは、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２８、ＣＴＡＣＫ、ＴＥＣＫ、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＧＭ−ＣＳＦ、上皮成長因子（ＥＧＦ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、またはそれらの組み合わせであり得る。
【０１６５】
ＩＬ−３３の他に、アジュバントとして有用であり得る他の遺伝子としては、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１ａ、ＭＩＰ−１ｐ、ＩＬ−８、ＲＡＮＴＥＳ、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、ＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ−１、ＭａｄＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１、ＶＬＡ−１、Ｍａｃ−１、ｐｌ５０．９５、ＰＥＣＡＭ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、ＣＤ２、ＬＦＡ−３、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１８の突然変異体形態、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、血管成長因子、線維芽細胞成長因子、ＩＬ−７、ＩＬ−２２、神経成長因子、血管内皮成長因子、Ｆａｓ、ＴＮＦ受容体、Ｆｌｔ、Ａｐｏ−１、ｐ５５、ＷＳＬ−１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ−３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、ＤＲ６、Ｃａｓｐａｓｅ  ＩＣＥ、Ｆｏｓ、ｃ−ｊｕｎ、Ｓｐ−１、Ａｐ−１、Ａｐ−２、ｐ３８、ｐ６５Ｒｅｌ、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６、ＩｋＢ、不活性ＮＩＫ、ＳＡＰ  Ｋ、ＳＡＰ−１、ＪＮＫ、インターフェロン応答遺伝子、ＮＦｋＢ、Ｂａｘ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬｒｅｃ、ＴＲＡＩＬｒｅｃＤＲＣ５、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３、ＴＲＡＩＬ−Ｒ４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫ  ＬＩＧＡＮＤ、Ｏｘ４０、Ｏｘ４０  ＬＩＧＡＮＤ、ＮＫＧ２Ｄ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｆ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、及びそれらの機能性断片をコードする、遺伝子が挙げられる。
【０１６６】
本ワクチンは、参照により完全に組み込まれた、１９９４年４月１日出願の米国特許出願第０２１，５７９号に記載されるように遺伝子ワクチン促進剤をさらに含んでもよい。
【０１６７】
本ワクチンは、用いられる投与様式に従って配合できる。注射可能なワクチン医薬組成物は、滅菌されており、パイロジェンフリー及び微粒子フリーであり得る。等張性配合剤または溶液を、用いることができる。等張性のための添加剤として、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、及びラクトースを挙げることができる。本ワクチンは、血管収縮剤を含んでもよい。等張溶液には、リン酸緩衝食塩水を挙げることができる。本ワクチンは、ゼラチン及びアルブミンをはじめとする安定化剤をさらに含み得る。ＬＧＳまたはポリカチオンまたはポリアニオン等、安定化剤により、配合剤を室温または周囲温度で長時間安定させることができる。
３．ワクチン接種の方法
【０１６８】
本発明はまた、対象における免疫応答を増強する方法も対象とする。免疫応答の増強は、対象における疾患、例えば、後により詳細に記載される癌を治療及び／または予防するために使用され得る。本方法は、本明細書に開示されるワクチンを対象に投与することを含むことができる。ワクチンを投与された対象は、抗原を単独で投与された対象と比較したときに、増強またはブーストされた免疫応答を有することができる。いくつかの実施形態において、免疫応答は、約７５％〜約２００％増強され得る。代替として、ワクチンを投与された対象における免疫応答は、約９０％〜約１３０％増強され得る。さらに他の代替の実施形態において、ワクチンを投与された対象における免疫応答は、約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、１０１％、１０２％、１０３％、１０４％、１０５％、１０６％、１０７％、１０８％、１０９％、１１０％、１１１％、１１２％、１１３％、１１４％、１１５％、１１６％、１１７％、１１８％、１１９％、１２０％、１２１％、１２２％、１２３％、１２４％、１２５％、１２６％、１２７％、１２８％、１２９％、または１３０％増強され得る。
【０１６９】
他の実施形態において、ワクチンを投与された対象における免疫応答は、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２．０倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３．０倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４．０倍、少なくとも約４．５倍、少なくとも約５．０倍、少なくとも約５．５倍、少なくとも約６．０倍、少なくとも約６．５倍、少なくとも約７．０倍、少なくとも約７．５倍、少なくとも約８．０倍、少なくとも約８．５倍、少なくとも約９．０倍、少なくとも約９．５倍、または少なくとも約１０．０倍増強され得る。
【０１７０】
ワクチンの用量は、１μｇ〜１０ｍｇ活性成分／体重１ｋｇ／時間であってもよく、２０μｇ〜１０ｍｇ成分／体重１ｋｇ／時間であってもよい。本ワクチンは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、または３１日ごとに投与することができる。効果的な治療のためのワクチン服用回数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０回であってもよい。
ａ．癌の治療及び予防
【０１７１】
ワクチンを投与された対象は、抗原を単独で投与された対象と比較したときに、増強またはブーストされた免疫応答を有することができる。免疫応答の増強は、対象における疾患、例えば、後により詳細に記載される癌を治療及び／または予防するために使用され得る。疾患は、癌、例えば、ＨＰＶ関連癌、ＨＢＶ関連癌、卵巣癌、前立腺癌、乳癌、脳癌、頭頸部癌、咽喉癌、肺癌、肝臓癌、膵臓癌、腎臓癌、骨癌、メラノーマ、転移性癌、ｈＴＥＲＴ関連癌、ＦＡＰ抗原関連癌、非小細胞肺癌、血液癌、食道扁平上皮癌、子宮頸癌、膀胱癌、結腸直腸癌、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）、肛門癌、滑膜細胞腫、精巣癌、再発性呼吸器乳頭腫症、皮膚癌、神経膠芽腫、肝細胞癌、胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）、急性骨髄性白血病、トリプルネガティブ乳癌、及び原発性皮膚Ｔ細胞リンパ腫であり得る。癌は、ＨＰＶ関連癌であり得る。
【０１７２】
本方法は、対象における定着腫瘍の大きさまたは病変を減少させることをさらに含み得る。腫瘍の大きさは、約５０％〜約１００％、約６０％〜約１００％、約７０％〜約１００％、約８０％〜約１００％、約９０％〜約１００％、約５０％〜約９５％、約６０％〜約９５％、約７０％〜約９５％、約８０％〜約９５％、約９０％〜約９５％、約５０％〜約９０％、約６０％〜約９０％、約７０％〜約９０％、または約８０％〜約９０％減少し得る。腫瘍の大きさは、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約１００％減少し得る。
【０１７３】
本方法は、対象における腫瘍退縮を、抗原を単独で投与された対象と比較して増強することをさらに含み得る。本ワクチンの投与は、腫瘍退縮を約４０％〜約６０％、約４５％〜約５５％、または約５０％増強することができる。本ワクチンの投与は、腫瘍退縮の速度を上昇させることもできる。本ワクチンの投与は、対象における約８０％〜約１００％、約８５％〜約１００％、約９０％〜約１００％、約９５％〜約１００％、約８０％〜約９５％、約８５％〜約９５％、約９０％〜約９５％、約８０％〜約９０％、または約８５％〜約９０％の腫瘍退縮をさらに達成することができる。腫瘍退縮は、ワクチンを投与された対象において、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約１００％であり得る。ワクチンを投与された対象における腫瘍退縮は、さらに約９０％または約１００％であり得る。
【０１７４】
本方法は、ワクチンを投与された対象における癌または腫瘍の成長を予防することをさらに含み得る。この予防により、ワクチンを投与された対象は、将来の癌を克服し得る。換言すると、本ワクチンは、ワクチンを投与された対象に対して、癌からの保護を与える。ワクチンを投与された対象は、約９０％〜約１００％の癌生存率を有し得る。ワクチンを投与された対象は、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約１００％の癌生存率を有し得る。
ｂ．投与
【０１７５】
本ワクチンは、製薬技術の当業者に周知の標準的技術に従って製剤化することができる。そのような組成物は、特定の対象の年齢、性別、体重、及び状態、ならびに投与経路等の要因を考慮に入れて、医療技術の当業者に周知の投与量で、そのような技術によって投与することができる。対象は、ヒト、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ラット、またはマウス等の哺乳動物であってもよい。
【０１７６】
本ワクチンは、予防的にまたは治療的に投与することができる。予防的投与において、本ワクチンは、免疫応答を誘導するのに十分な量で投与することができる。治療的投与において、本ワクチンは、治療効果を誘発するのに十分な量で、それを必要とする対象に投与される。これを達成するための適切な量は、「治療有効用量」として定義される。この使用に効果的な量は、例えば、投与されるワクチン投与計画の特定の組成、投与様式、疾患の段階及び重症度、患者の一般的健康状態、ならびに処方医師の判断に依存する。
【０１７７】
本ワクチンは、Ｄｏｎｎｅｌｌｙら（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：６１７−６４８（１９９７））；Ｆｅｌｇｎｅｒら（米国特許第５，５８０，８５９号、１９９６年１２月３日発行）；Ｆｅｌｇｎｅｒ（米国特許第５，７０３，０５５号、１９９７年１２月３０日発行）；及びＣａｒｓｏｎら（米国特許第５，６７９，６４７号、１９９７年１０月２１日発行）（これら全ての内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるような当該技術分野で周知の方法によって投与することができる。本ワクチンのＤＮＡは、例えば、ワクチン銃を使用して個体に投与することができる粒子またはビーズに複合化することができる。当業者は、生理学的に許容される化合物を含む薬学的に許容される担体の選択は、例えば、発現ベクターの投与経路に依存することを知っている。
【０１７８】
本ワクチンは、様々な経路を介して送達することができる。典型的な送達経路は、非経口投与、例えば、皮内、筋肉内、または皮下送達を含む。他の経路は、経口投与、鼻腔内、及び膣内経路を含む。特定のワクチンのＤＮＡのために、個体の組織の間質空間にワクチンを送達することができる（Ｆｅｌｇｎｅｒら、米国特許第５，５８０，８５９号及び同第５，７０３，０５５号）（これら全ての内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）。本ワクチンはまた、筋肉に投与することができるか、または皮内もしくは皮下注射を介して投与することができるか、または経皮的に投与する（イオン導入法による等）ことができる。また、本ワクチンの表皮投与も用いることができる。表皮投与は、刺激物質に対する免疫応答を刺激するために表皮の最外層を機械的または化学的に刺激することを含むことができる（Ｃａｒｓｏｎら、米国特許第５，６７９，６４７号、その内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）。
【０１７９】
本ワクチンはまた、鼻腔を介した投与用に製剤化することもできる。担体が固体である場合、経鼻投与に好適な製剤は、鼻から吸い込む様式で、すなわち、鼻の近くに維持された粉末の容器から鼻腔を通して急速に吸入することによって投与される、例えば約１０〜約５００ミクロンの範囲の粒径を有する粗粉末を含むことができる。製剤は、鼻腔スプレー、点鼻薬、または噴霧器によるエアロゾル投与によるものであってもよい。製剤は、ワクチンの水性または油性溶液を含むことができる。
【０１８０】
本ワクチンは、懸濁液、シロップ剤、またはエリキシル剤等の液体製剤であってもよい。本ワクチンはまた、滅菌懸濁液または乳濁液等の、非経口、皮下、皮内、筋肉内、または静脈内投与（例えば、注射剤の投与）のための製剤であってもよい。
【０１８１】
本ワクチンは、リポソーム、微粒子、または他のポリマー基質に組み込むことができる（Ｆｅｌｇｎｅｒら、米国特許第５，７０３，０５５号；Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．Ｉｔｏ  ＩＩＩ（２ｎｄ  ｅｄ．１９９３）（これらの内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）。リポソームは、リン脂質または他の脂質からなってもよく、比較的単純に作製及び投与される、無毒性の、生理学的に許容される、代謝可能な担体であり得る。
【０１８２】
本ワクチンは、米国特許第７，６６４，５４５号（その内容は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載される方法等を用いて、電気穿孔により投与することができる。電気穿孔は、米国特許第６，３０２，８７４号、同第５，６７６，６４６号、同第６，２４１，７０１号、同第６，２３３，４８２号、同第６，２１６，０３４号、同第６，２０８，８９３号、同第６，１９２，２７０号、同第６，１８１，９６４号、同第６，１５０，１４８号、同第６，１２０，４９３号、同第６，０９６，０２０号、同第６，０６８，６５０号、及び同第５，７０２，３５９号（これらの内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）に記載される方法及び／または装置によるものであってもよい。電気穿孔は、低侵襲性デバイスによって実行されてもよい。
【０１８３】
低侵襲性電気穿孔デバイス（「ＭＩＤ」）は、前述のワクチン及び関連する流体を体組織に注入するための装置であってもよい。デバイスは、中空針、ＤＮＡカセット、及び流体送達手段を備えてもよく、デバイスは、体組織に針を挿入している間に同時に（例えば、自動的に）ＤＮＡを該体組織に注入するために流体送達手段を作動させて使用するように構成される。これは、針が挿入されている間にＤＮＡ及び関連する流体を徐々に注入する能力によって、体組織中に流体のより均一な分布をもたらすという利点を有する。注入中に経験される疼痛は、注入されるＤＮＡがより広い領域にわたって分布されるために軽減され得る。
【０１８４】
ＭＩＤは、針を使用することなく、ワクチンを組織に注入することができる。ＭＩＤは、ワクチンを小さな流れまたは噴流として注入することができ、そのような力を用いると、ワクチンは、組織表面を貫通して下層の組織及び／または筋肉に進入する。小さな流れまたは噴流の原動力は、一瞬のうちに微小開口部を通る二酸化炭素等の圧縮ガスの膨脹によって提供されてもよい。低侵襲性電気穿孔デバイス、及びそれらの使用方法の例は、公開されている米国特許出願第２００８０２３４６５５号、米国特許第６，５２０，９５０号、米国特許第７，１７１，２６４号、米国特許第６，２０８，８９３号、米国特許第６，００９，３４７号、米国特許第６，１２０，４９３号、米国特許第７，２４５，９６３号、米国特許第７，３２８，０６４号、及び米国特許第６，７６３，２６４号に記載される（それらの各々の内容は、参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１８５】
ＭＩＤは、疼痛を伴わずに組織を貫通する液体の高速噴流を形成する注射器を備えてもよい。そのような無針注射器は市販されている。本明細書で利用され得る無針注射器の例は、米国特許第３，８０５，７８３号、同第４，４４７，２２３号、同第５，５０５，６９７号、及び同第４，３４２，３１０号に記載されるものを含む（それらの各々の内容は、参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１８６】
直接的または間接的な電気輸送に好適な形態の所望のワクチンは、通常、ワクチンを組織内に浸透させるのに十分な力を用いて、薬剤の噴流の送達を始動させるために組織表面に注射器を接触させることにより、無針注射器を使用して治療されるべき組織内に導入（例えば、注入）することができる。例えば、治療されるべき組織が粘膜、皮膚、または筋肉である場合、薬剤は、角質層を通って真皮層内にまたは下層の組織及び筋肉に浸透させるのに十分な力で、それぞれ、粘膜表面または皮膚表面に向けて発射される。
【０１８７】
無針注射器は、全ての種類の組織、特に皮膚及び粘膜にワクチンを送達するのに非常に適している。いくつかの実施形態において、無針注射器は、表面及び対象の皮膚または粘膜内にワクチンを含有する液体を推進するために使用されてもよい。本発明の方法を使用して治療することができる種々の種類の組織の代表的な例は、膵臓、喉頭、鼻咽頭、下咽頭、中咽頭、唇、喉、肺、心臓、腎臓、筋肉、乳房、結腸、前立腺、胸腺、睾丸、皮膚、粘膜組織、卵巣、血管、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
【０１８８】
ＭＩＤは、組織を電気穿孔する針電極を有してもよい。例えば、長方形または正方形のパターンに設定された複数電極アレイにおいて複数対の電極間でパルスを発生させることにより、一対の電極間のパルシングよりも優れた改善された結果を提供する。例えば、米国特許第５，７０２，３５９号、標題「Ｎｅｅｄｌｅ  Ｅｌｅｃｔｒｏｄｅｓ  ｆｏｒ  Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｄｒｕｇｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｓ」に、治療的処置の間に複数対の針にパルスを印加できる針のアレイが開示されている。参照により完全に記載されるように本明細書に組み込まれるその出願において、針は、環状アレイに配置されたが、対向する針電極間でパルシングを可能にするコネクタ及び切替装置を有する。組み換え発現ベクターを細胞に送達するための一対の針電極が使用されてもよい。そのようなデバイス及びシステムは、米国特許第６，７６３，２６４号に記載されており、その内容は、参照により本明細書に組み込まれる。代替として、通常の注射針に似た単一針を用いてＤＮＡの注入及び電気穿孔を可能にし、現在使用されているデバイスによって送達されるよりも低い電圧のパルスを印加し、そのため患者が経験する電気刺激を軽減する、単一針デバイスが使用されてもよい。
【０１８９】
ＭＩＤは、１つ以上の電極アレイを備えてもよい。アレイは、同じ直径または異なる直径の２本以上の針を備えてもよい。針は、均一または不均一に離間されてもよい。針は、０．００５インチ〜０．０３インチ、０．０１インチ〜０．０２５インチ、または０．０１５インチ〜０．０２０インチであってもよい。針は、０．０１７５インチの直径であってもよい。針は、０．５ｍｍ、１．０ｍｍ、１．５ｍｍ、２．０ｍｍ、２．５ｍｍ、３．０ｍｍ、３．５ｍｍ、４．０ｍｍ、またはそれ以上離間されてもよい。
【０１９０】
ＭＩＤは、パルス発生器と、ワクチン及び電気穿孔パルスを単一ステップで送達する、２本以上の針を有するワクチン注射器とから構成されてもよい。パルス発生器は、フラッシュカードで操作されるパーソナルコンピュータを介したパルス及び注入パラメータの柔軟なプログラミング、ならびに電気穿孔及び患者データの包括的な記録及び格納を可能にし得る。パルス発生器は、短期間の間に様々な電圧パルスを送達することができる。例えば、パルス発生器は、１００ミリ秒の期間に１５電圧パルスを３回送達することができる。そのようなＭＩＤの一例は、Ｉｎｏｖｉｏ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによるＥｌｇｅｎ  １０００システムであり、米国特許第７，３２８，０６４号に記載されている（その内容は、参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１９１】
ＭＩＤは、体内または植物内の選択された組織の細胞へのＤＮＡ等の高分子の導入を促進するモジュール電極システムである、ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（Ｉｎｏｖｉｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｂｌｕｅ  Ｂｅｌｌ  ＰＡ）デバイス及びシステムであってもよい。モジュール電極システムは、複数の針電極、皮下注射針、プログラム可能な定電流パルス制御器から複数の針電極に導電性接続を提供する電気コネクタ、及び電源を備えてもよい。操作者は、支持構造体に載置された複数の針電極を把持し、それらを体内または植物内の選択された組織へしっかりと挿入することができる。次いで、選択された組織への皮下注射針により高分子が送達される。プログラム可能な定電流制御器が作動し、定電流電気パルスを複数の針電極に印加する。印加された定電流電気パルスは、複数の電極間において高分子の細胞内への導入を促進する。定電流パルスにより組織内の電力散逸を制限することによって、細胞の過熱による細胞死が最小限に抑えられる。Ｃｅｌｌｅｃｔｒａデバイス及びシステムは、米国特許第７，２４５，９６３号に記載されており、その内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１９２】
ＭＩＤは、Ｅｌｇｅｎ  １０００システム（Ｉｎｏｖｉｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）であってもよい。Ｅｌｇｅｎ  １０００システムは、中空針及び流体送達手段を提供するデバイスを備えてもよく、該装置は、体組織に針を挿入している間に同時に（例えば、自動的に）本明細書に記載の所望のワクチンを該体組織に注入するために流体送達手段を作動させて使用するように構成される。針が挿入されている間に流体を徐々に注入する能力によって、体組織を通して流体のより均一な分布がもたらされることは利点である。また、注入中に経験される疼痛は、注入される流体の体積がより広い領域にわたって分布されるために軽減されると考えられる。
【０１９３】
さらに、流体の自動注入が、注入される流体の実際量の自動監視及び登録を容易にする。このデータは、必要に応じて文書化の目的で制御装置によって格納されてもよい。
【０１９４】
注入の速度は、直線的または非直線的のいずれかであってもよいこと、ならびに、注入は、治療されるべき対象の皮膚を通して針が挿入された後、及びそれらが体組織内にさらに挿入されている間に実行され得ることを理解されたい。
【０１９５】
本発明の装置によって流体を注入することができる好適な組織は、腫瘍組織、皮膚、または肝組織を含むが、筋組織であってもよい。
【０１９６】
装置はさらに、体組織への針の挿入を誘導するための針挿入手段を備える。流体注入の速度は、針の挿入速度によって制御される。これは、挿入の速度が所望の注入の速度と一致し得るように針の挿入と流体の注入の両方を制御することができるという利点を有する。このことはまた、装置をユーザが操作し易くする。必要に応じて、体組織に自動的に針を挿入するための手段が提供されてもよい。
【０１９７】
ユーザは、流体の注入を開始する時を選択することができる。しかしながら、理想的には、針の先端が筋組織に到達したときに注入が開始され、装置は、流体の注入を開始するのに十分な深さまで針が挿入された場合に感知するための手段を含んでもよい。これは、針が所望の深さ（通常、筋組織が始まる深さ）に到達したときに流体の注入が自動的に開始するよう促すことができることを意味する。筋組織が始まる深さは、例えば、４ｍｍの値等の予め設定された針の挿入深さであると解釈されてもよく、それは針が皮膚層を通過するのに十分であると見なされる。
【０１９８】
感知手段は、超音波プローブを備えてもよい。感知手段は、インピーダンスまたは抵抗の変化を感知するための手段を備えてもよい。この場合、該手段は、それ自体では体組織内の針の深さを記録することはできないかもしれないが、むしろ、針が異なる種類の体組織から筋肉内へと移動した場合にインピーダンスまたは抵抗の変化を感知するように構成される。これらの代替手段のいずれも、注入が開始し得ることを感知する比較的正確で操作が単純な手段を提供する。針の挿入の深さは、必要に応じてさらに記録されてもよく、針挿入の深さが記録されながら注入される流体の体積が決定されるように流体の注入を制御するために使用することができる。
【０１９９】
装置は、針を支持するための基部と、その中に基部を受容するための筐体とをさらに備えてもよく、基部が筐体に対して第１の後方位置にある場合、筐体内で針が後退し、基部が筐体内で第２の前方位置にある場合、針が筐体から伸長するように、基部は筐体に対して移動可能である。筐体は、患者の皮膚上に並べることができ、次いで、筐体を基部に対して移動させることによって針を患者の皮膚内に挿入することができるため、これはユーザにとって有利である。
【０２００】
前述のように、針が皮膚に挿入されると流体が針の長さにわたって均一に分布されるように、制御された流体の注入速度を達成することが望ましい。流体送達手段は、制御された速度で流体を注入するように構成されるピストン駆動手段を備えてもよい。ピストン駆動手段は、例えば、サーボモータによって作動させることができる。しかしながら、ピストン駆動手段は、筐体に対して軸方向に移動させられる基部によって作動されてもよい。流体送達の代替手段が提供されてもよいことを理解されたい。したがって、例えば、制御されたまたは制御されない速度での流体送達のために圧搾できる密封容器が、シリンジ及びピストンシステムの代わりに提供されてもよい。
【０２０１】
前述の装置は、あらゆる種類の注入に使用することができる。しかしながら、電気穿孔の分野において特に有用であることが想定されるため、針に電圧を印加するための手段をさらに備えてもよい。これは、注入のためだけではなく、電気穿孔中の電極としても針が使用されることを可能にする。このことは、注入される流体と同じ領域に電場が印加されることを意味するため、これは特に有利である。従来、電気穿孔には、以前に注入された流体と電極を正確に位置合わせすることが非常に困難であるため、ユーザがより広い領域にわたって必要とされるよりも多くの体積の流体を注入し、注入された物質と電場との重複を確実にするためにより高い領域にわたって電場を印加する傾向があるという問題があった。本発明を使用すると、電場と流体との間の良好な適合を達成しながら、注入される流体の体積及び印加される電場の大きさの両方を減少させることができる。
【０２０２】
本発明は、以下の非限定的な実施例によって示される複数の態様を有する。
４．実施例
実施例１
実施例２〜１０の材料及び方法
【０２０３】
プラスミド構築。マウスＩＬ−３３にＧｅｎＢａｎｋ配列ＮＭ＿００１１６４７２４．１を使用して、全長（ｐｒｏＩＬ−３３）及び成熟型ＩＬ−３３（ｍｔｒＩＬ−３３）（アミノ酸１０９〜２６６）プラスミドＤＮＡ構築物を合成した（マウスｐｒｏＩＬ−３３及びマウスｍｔｒＩＬ−３３構築物の概略図については図１Ａを参照されたい。ヒトＩＬ−３３の配列も使用して、全長（ｐｒｏＩＬ−３３）及び成熟型（ｍｔｒＩＬ−３３）（アミノ酸１１２〜２７０）プラスミドＤＮＡ構築物を合成した（ヒトｐｒｏＩＬ−３３及びヒトｍｔｒＩＬ−３３構築物の概略図については図１０を参照されたい）。各構築物が、遺伝子の５’末端に挿入された高効率の免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）リーダー配列を有した。各構築物が、商業的に合成及び最適化された。最適化された配列番号５の核酸配列は、マウスｐｒｏＩＬ−３３（配列番号６）をコードした。最適化された配列番号７の核酸配列は、マウスｍｔｒＩＬ−３３（配列番号８）をコードした。最適化された配列番号１の核酸配列は、ヒトｍｔｒＩＬ−３３（配列番号２）をコードした。最適化された配列番号３の核酸配列は、ヒトｐｒｏＩＬ−３３（配列番号４）をコードした。これら４つの構築物の各々において、初めの１８個のアミノ酸（すなわち、残基１〜１８）がＩｇＥリーダー配列であった。ＨＰＶ１６  ＣｏｎＥ６Ｅ７を発現するプラスミド及びＧＰ３３構築物も調製した。
【０２０４】
プラスミドのトランスフェクション及び発現。ｐｒｏＩＬ−３３及びｍｔｒＩＬ−３３構築物の発現を、ウェスタンブロット及び免疫蛍光法によって確認した。ヒト横紋筋肉腫（ＲＤ）細胞株を培養し、トランスフェクトし、採取した。手短に述べると、ＲＤ細胞を６ウェルプレート内で培養し、製造業者のプロトコルに従ってＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、構築物（対照としてのｐＶＡＸ）をトランスフェクトした。４８時間後、変性されたＲＩＰＡ細胞溶解緩衝液を使用して細胞を溶解させ、細胞可溶化物を収集した。抗ＩＬ３３モノクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてウェスタンブロット分析を実施し、ＥＣＬウェスタンブロット分析システム（ＧＥ  Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用して西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）共役抗ラットＩｇＧ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）で可視化した。さらに、トランスフェクションの４８時間後に上清も収集し、製造業者のプロトコルに従ってマウス／ラットＩＬ−３３  Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）によりサイトカインの分泌を調べた。
【０２０５】
さらに、間接免疫蛍光アッセイも利用して、ｐｒｏＩＬ−３３及びｍｔｒＩＬ−３３の発現を確認した。手短に述べると、ＲＤ細胞を２ウェルチャンバスライド（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に蒔き、５％のＣＯ2を用いて摂氏３７度のインキュベーター内で７０％コンフルエンスまで一晩成長させた。製造業者の指示に従ってＴＵＲＢＯＦＥＣＴＩＯＮ  ８．０トランスフェクション試薬（ＯｒｉＧｅｎｅ）を使用して、１μｇのＩＬ−３３構築物及び対照プラスミドｐＧＸ０００１（１μｇ／ウェル）を細胞にトランスフェクトした。４８時間後、１０分間氷冷メタノールを使用してスライド上に細胞を固定した。細胞を抗ＩＬ−３３マウスモノクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）で染色し、その後、Ａｌｅｘａ  ５５５共役抗ラット二次抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）とともにインキュベートした。蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  ＤＭ４０００Ｂ、Ｌｅｉｃａ  Ｍｃｉｒｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ、ＵＳＡ）によって画像を分析し、ＳＰＯＴ  Ａｄｖａｎｃｅｄソフトウェアプログラム（ＳＰＯＴ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ）を使用して数量化を行った。
【０２０６】
動物。雌の８週齢のＣ５７ＢＬ／６（Ｂ６）マウスをＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ，ＵＳＡ）から購入した。ＤbＧＰ３３特異的Ｔ細胞受容体を有するＰ１４マウスを、ペンシルベニア大学（Ｊｏｈｎ  Ｗｈｅｒｒｙ博士の研究室）から得た。「Ｐ１４キメラ」マウスを生成するため、１．６×１０5ナイーブＴ細胞受容体トランスジェニックＴ細胞をナイーブＢ６マウスに養子移入した。
【０２０７】
マウスの免疫及び電気穿孔。マウスを前脛骨筋において３週間隔で３回免疫化した。同じ部位で起こったＣＥＬＬＥＣＴＲＡ適応性定電流ＥＰデバイス（Ｉｎｏｖｉｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｂｌｕｅ  Ｂｅｌｌ，ＰＡ）を用いたインビボ電気穿孔（ＥＰ）が、ワクチン接種の直後に続いた。５μｇのｐＶＡＸ１または５μｇのＣｏｎＥ６Ｅ７単独のいずれかを用いて、あるいは実験に応じて種々の量のｐｒｏＩＬ−３３及びｍｔｒＩＬ−３３構築物（例えば、５μｇ及び７μｇ）を用いて、マウス（ｎ＝４）を免疫化した。ＧＰ３３構築物は、５μｇで投与した。
【０２０８】
ＥＬＩＳｐｏｔアッセイ。まず、最終の免疫化の８日後に脾臓を採取した。脾臓を採取及び加工処理した後、ＩＦＮ−γ及びＩＬ−４  ＥＬＩＳｐｏｔアッセイの両方を実施して、免疫化されたマウスからの抗原特異的サイトカイン分泌を決定した。ＨＰＶ１６の全コンセンサスＥ６／Ｅ７融合タンパク質配列を表す一式のペプチド（８個のアミノ酸が重複する１５個のアミノ酸残基）を、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔから合成した。この一式のペプチドを、Ｅ６及びＥ７抗原の長さにわたって、２つのプールにプールした。５μｇ／ｍｌのＣｏｎｃａｖａｌｉｎ  Ａ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を陽性対照として使用し、完全培養培地を陰性対照として使用した。自動化ＥＬＩＳＰＯＴリーダー（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓｈａｋｅｒ  Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＯＨ）を使用してスポットを数えた。
【０２０９】
フローサイトメトリのための細胞内サイトカイン染色。リンパ細胞を脾臓及び末梢血液から単離した。ＬＣＭＶ−ＧＰ３３に対する主要組織適合複合体クラスＩペプチド四量体を使用した。具体的には、脾細胞を９６ウェルプレート（１×１０5／ウェル）に添加し、製造業者の指示に従って、タンパク質輸送阻害剤カクテル（ブレフェルジンＡ及びモネンシン）（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）の存在下で、３７℃／５％  ＣＯ2において５〜６時間にわたって、プールされたＨＰＶ−１６  Ｅ６／Ｅ７プールペプチドで刺激した。細胞刺激カクテル（加えてタンパク質輸送阻害剤）（ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）、イオノマイシン、ブレフェルジンＡ、及びモネンシン）（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を陽性対照として、Ｒ１０培地を陰性対照として使用した。脱顆粒を測定するために使用した培養物中に、抗ＣＤ１０７ａ（ＦＩＴＣ；クローン１Ｄ４Ｂ；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）をこのとき添加して、染色を強化させた。
【０２１０】
次いで、全ての細胞を表面及び細胞内のタンパク質について染色した。手短に述べると、蛍光色素共役抗体を用いた表面染色の前に、ＦＡＣＳ緩衝液（０．１％のアジ化ナトリウム及び１％のＦＣＳを含有するＰＢＳ）で細胞を洗浄した。製造業者のプロトコルに従ってＢＤ  ＣＹＴＯＦＩＸ／ＣＹＴＯＰＥＲＭ（ＢＤ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して、ＦＡＣＳ緩衝液固定及び透過を用いて細胞を洗浄し、続いて細胞内染色を行った。
【０２１１】
以下の抗体を表面染色に使用した：ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ  Ｆｉｘａｂｌｅ  Ｖｉｏｌｅｔ死細胞染色キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＣＤ１９（Ｖ５０；クローン１Ｄ３；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ４（Ｖ５００；クローンＲＭ４−５；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ８（ＰＥ−ＴｅｘａｓＲｅｄ；クローン５３−６．７；Ａｂｃａｍ）、ＣＤ４４（Ａ７００；クローンＩＭ７；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＫＬＲＧ１（ＦＩＴＣ；クローン２Ｆ１；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、及びＰＤ−１（ＰｅＣｙ７；クローンＲＭＰ１−３０；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）。ＬＣＭＶ−ＧＰ３３に対する主要組織適合複合体クラスＩペプチド四量体を使用した。細胞内染色には、以下の抗体を使用した：ＩＦＮ−γ（ＡＰＣ；クローンＸＭＧ１．２；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＴＮＦ−α（ＰＥ；クローンＭＰ６−ＸＴ２２；ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、及びＣＤ３（ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５；クローン１４５−２Ｃ１１；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）。
【０２１２】
全てのデータはＬＳＲＩＩフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して収集し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ、Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ）及びＳＰＩＣＥ  ｖ５．２（アメリカ国立衛生研究所（ＮＩＨ）、具体的には、アメリカ国立アレルギー・感染症研究所（ＮＩＡＩＤ）から入手可能）を使用して分析した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用してＢｏｏｌｅａｎゲーティングを実施して、ワクチン接種した動物のＴ細胞の多機能性を調べた。前方散乱（ＦＳＣ−Ａ）に対するＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ  Ｆｉｘａｂｌｅ  Ｖｉｏｌｅｔ死細胞染色キット（ｉｎｖｔｉｒｏｇｅｎ）でのゲーティングによって死細胞を除去した。
【０２１３】
Ａｇ特異的抗体の決定。ウイルス遺伝子Ｅ６及びＥ７に特異的なＩｇＧ抗体の測定を、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）によって免疫化マウス及び制御マウスの両方で実施した。プレートを１μｇ／ｍｌの各タンパク質（ＰｒｏｔｅｉｎＸ  Ｌａｂ）でコーティングし、摂氏４度で一晩インキュベートした。洗浄後、室温で１時間、１×リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）でプレートをブロックした。次いでプレートを再度洗浄し、１％のＦＢＳ＋ＰＢＳ＋０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０中で１：２５の希釈度で血清を添加し、室温で１時間インキュベートした。もう１度洗浄した後、１：５０００の希釈度のヤギ抗マウスＩｇＧ  ＨＲＰ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）を各ウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした。最終の洗浄の後、基質である３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて反応を展開し、１００μＬの２Ｎ硫酸／ウェルで停止させた。プレートをＧｌｏｍａｘ  Ｍｕｌｔｉ−Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で４５０ｎｍにおいて読み取った。全ての血清試料を２連で試験した。
【０２１４】
二次ラット抗マウスＩｇＥ  ＨＲＰ抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用する同様のＥＬＩＳＡプロトコルを使用して、抗原特異的ＩｇＥの量も決定した。ＧｅｎＷａｙのマウスＩｇＥキットを使用して全ＩｇＥを決定した。１：５０の血清の希釈度を用い、製造業者のプロトコルに従った。全ての血清試料を２連で試験した。
【０２１５】
腫瘍細胞株。ＴＣ−１細胞株は、Ｅ６及びＥ７を構造的に発現し、高度に腫瘍原性である。ＴＣ−１細胞を培養し、調製し、皮下（ｓ．ｃ．）腫瘍移植の前にＭａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）と混合した。
【０２１６】
インビボ腫瘍処置（退縮）研究。雌Ｂ６マウスを各々マウス１０匹の４つの群に分け、５×１０4ＴＣ−１細胞を各野生型雌Ｂ６マウスの側腹部に皮下移植した。４日目、（腫瘍移植後、かつ腫瘍が３ｍｍに達したとき）、各群のマウスをそれぞれｐＶＡＸ、ＣｏｎＥ６Ｅ７、ＣｏｎＥ６Ｅ７  ｐｒｏＩＬ−３３、及びＣｏｎＥ６Ｅ７  ｍｔｒＩＬ−３３で筋肉内電気穿孔（ｉ．ｍ．／ＥＰ、前述）によって免疫化し、１１日目及び１８日目にブーストした。腫瘍の測定による腫瘍の成長について、マウスを週２回監視した。腫瘍直径が２０ｍｍに達したとき、動物を屠殺した。
【０２１７】
統計分析。細胞性免疫応答及び腫瘍直径の定量的データの比較のために、スチューデントｔ検定を適用した。この研究では、ｐ＜０．０５を統計的有意と見なした。
実施例２
ＩＬ−３３アイソフォームの構築及び発現
【０２１８】
ＩＬ−３３がＤＮＡワクチン接種においてアジュバントとして機能し得るかどうかを調べるため、図１Ａに表されるように、かつ前述のように、ｐｒｏＩＬ−３３及びｍｔｒＩＬ−３３構築物を設計及び生成した。各構築物はサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターの制御下にあり、ＩｇＥリーダー配列を含有した。
【０２１９】
ｐｒｏＩＬ−３３及びｍｔｒＩＬ−３３形態の発現を決定するため、ヒト横紋筋肉腫（ＲＤ）細胞に各構築物を別個にトランスフェクトした。発現ベクターｐＶＡＸをトランスフェクトしたＲＤ細胞は、陰性対照として機能した。トランスフェクションの４８時間（ｈｒｓ）後に細胞可溶化物を採取した。ｐｒｏＩＬ−３３及びｍｔｒＩＬ−３３の発現を、抗ＩＬ−３３モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を使用するウェスタン免疫ブロット法によって、それぞれの細胞可溶化物において検出した。陰性ｐＶＡＸ対照に対応するレーンにおいてＩＬ−３３タンパク質は検出されなかった（図１Ｂ）。ｍｒｔＩＬ−３３に対応するレーンでは、予想されたバンドの大きさが観察された（約２０キロダルトン（ｋＤＡ））。ｐｒｏＩＬ−３３に対応するレーンでは、より大きなバンド（約３０ｋＤＡ）及びより小さなバンド（約２０ｋＤＡ）が観察され、それぞれｐｒｏＩＬ−３３及びｍｔｒＩＬ−３３について予測された大きさに対応した。したがって、これらのデータは、ｐｒｏＩＬ−３３及びｍｔｒＩＬ−３３が構築物から発現されたことを示した。
【０２２０】
ｐｒｏＩＬ−３３及びｍｔｒＩＬ−３３形態の分泌を調べるため、ＲＤ細胞のトランスフェクションの４８時間後に細胞上清を得た。細胞外環境へのタンパク質分泌の検出を、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって実行した。図１Ｃに示すように、ｍｔｒＩＬ−３３及びｐｒｏＩＬ−３３をトランスフェクトしたＲＤ細胞からの上清は、それぞれおよそ２０，０００ｐｇ／ｍｌ及び６００ｐｇ／ｍｌの濃度でｍｔｒＩＬ−３３及びｐｒｏＩＬ−３３を含有した。発現ベクターｐＶＡＸをトランスフェクトしたＲＤ細胞からの細胞上清は、陰性対照として機能し、これらの同じ細胞からＩＬ−３３は分泌されなかった。図１Ｃに示されるデータは、２つの複製アッセイについての平均と、平均値の標準誤差（ＳＥＭ）である。
【０２２１】
免疫蛍光染色を使用して、ｐｒｏＩＬ−３３及びｍｔｒＩＬ−３３両方の発現をさらに確認した。一次抗体は抗ＩＬ−３３マウスｍＡｂであり、二次抗体はＡｌｅｘａ  ５５５共役抗ラット抗体であった。ＤＡＰＩを使用して核を染色した。ｐｒｏＩＬ−３３構築物を一過性にトランスフェクトしたＲＤ細胞では、ｐｒｏＩＬ−３３のいくらかの細胞質内発現を伴う高度な核発現が観察され、ｐｒｏＩＬ−３３が主に核内に局在化することを示した（図１Ｄ、下パネル）。ｍｔｒＩＬ−３３構築物を一過性にトランスフェクトしたＲＤ細胞では、ｍｔｒＩＬ−３３の高度な細胞質内発現のみが観察され、ｍｔｒＩＬ−３３が細胞質に局在化することを示した（図１Ｄ、中央パネル）。発現ベクターｐＶＡＸを一過性にトランスフェクトしたＲＤ細胞は、陰性対照として機能し、これらの同じ細胞内でＩＬ−３３は検出されなかった（図１Ｄ、上パネル）。これらの染色データは、ｐｒｏＩＬ−３３とｍｔｒＩＬ−３３との間の１つの構造的差異、すなわちｍｔｒＩＬ−３３ではなくｐｒｏＩＬ−３３内に存在する核局在化シグナルを反映した。
実施例３
ＩＬ−３３はＤＮＡワクチンに対する細胞性免疫応答を強化した
【０２２２】
前述のように、ＩＬ−３３は、Ｔｈ２免疫応答を誘導及び支持する。Ｔｈ２免疫応答は、サイトカインであるインターロイキン−４（ＩＬ−４）の誘導を含む。したがって、抗原、例えば、コンセンサスに基づく融合ＨＰＶ１６  Ｅ６／Ｅ７（ＣｏｎＥ６Ｅ７）抗原に対するＴｈ２免疫応答の誘導をＩＬ−３３が増強し得るかどうかを決定するため、前述のｐｒｏＩＬ−３３及びｍｔｒＩＬ−３３構築物をさらに調べた。ＩＦＮ−γ分泌を調べることによって、ＣｏｎＥ６Ｅ７に対するＴｈ１免疫応答も研究した。具体的には、ＣｏｎＥ６Ｅ７抗原をコードするプラスミド（ＣｏｎＥ６Ｅ７構築物）を、単独で、またはｐｒｏＩＬ−３３またはｍｔｒＩＬ−３３構築物と組み合わせて、マウスに投与した。構築物（複数可）の投与には電気穿孔が続いた。
【０２２３】
図２Ａは、ＤＮＡワクチン免疫化スケジュールを示す。Ｃ５７ＢＬ／６（Ｂ６）マウス（各群につきｎ＝４）に、５μｇの薬用量のＣｏｎＥ６Ｅ７構築物を、単独で、または種々の用量（すなわち、５μｇ及び７μｇ）のｍｔｒＩＬ−３３もしくはｐｒｏＩＬ−３３構築物のいずれかと組み合わせて、筋肉内（ｉ．ｍ．）投与した。第４の群のマウスには、５μｇの薬用量のｐＶＡＸを筋肉内（ｉ．ｍ．）投与した。構築物（複数可）の筋肉内投与には電気穿孔が続いた。０週目、３週目、及び６週目に免疫化が起こった。最終の免疫化の１週間後（すなわち、７週目）、マウスを屠殺して脾臓を収集した。リンパ細胞を脾臓から単離し、定量的ＥＬＩＳｐｏｔアッセイを使用して各群のマウスの免疫応答を分析した。
【０２２４】
ＥＬＩＳｐｏｔアッセイを使用して、Ｅ６及びＥ７ペプチドプール（実施例１に前述）を用いた刺激に応答して抗原特異的ＩＦＮ−γまたはＩＬ−４を分泌する細胞の数を決定した。図２Ｂに示すように、ＩＬ−３３はＴｈ１極性化免疫応答を駆動した。Ｔｈ１免疫応答の誘導は、百万個の脾細胞当たりのＨＰＶ１６  Ｅ６特異的及びＥ７特異的ＩＦＮ−γスポット形成単位（ＳＦＵ）の発現頻度によって示される。ｐｒｏＩＬ−３３またはｍｔｒＩＬ−３３のいずれかをコードするプラスミドを用いた共免疫化（ｃｏ−ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）は、全ての用量（すなわち、５μｇ及び７μｇ）において、ＣｏｎＥ６Ｅ７構築物単独をワクチン接種したマウス（百万個の脾細胞当たり約５００ＳＦＵ）と比較したときに、より高い数のＥ６特異的及びＥ７特異的ＩＦＮ−γ分泌Ｔ細胞を誘導した。７μｇの用量のｍｔｒＩＬ−３３またはｐｒｏＩＬ−３３は、ＩＦＮ−γのＥＬＩＳｐｏｔの規模のそれぞれ合計４倍または３．５倍の増加をもたらした。
【０２２５】
図２Ｃに示すように、ｐｒｏＩＬ−３３またはｍｔｒＩＬ−３３のいずれも、ＩＬ−４の強力な分泌を駆動しなかった。Ｔｈ２免疫応答の誘導は、百万個の脾細胞当たりのＨＰＶ１６  Ｅ６特異的及びＥ７特異的ＩＬ−４スポット形成単位（ＳＦＵ）の発現頻度によって示される。
【０２２６】
前述のように、ＩＬ−３３は、Ｔｈ２免疫応答を誘導及び支持すると考えられた。その代わり、アジュバントとしてのｐｒｏＩＬ−３３及びｍｔｒＩＬ−３３の両方が、Ｔｈ２ではなくＴｈ１のサイトカイン関連免疫応答に偏った。したがって、ＩＬ−３３（ｐｒｏＩＬ−３３及びｍｔｒＩＬ−３３形態の両方）が、ＤＮＡワクチンに関するＴｈ１の誘導（ＩＦＮ−γにより証明される細胞性免疫応答）を増強したが、Ｔｈ２の誘導（ＩＬ−４により証明される液性免疫応答）を増強しなかったという点で、これらのデータは予想外かつ驚くべきものである。これらのデータは、ｐｒｏＩＬ−３３及びｍｔｒＩＬ−３３の両方が、細胞性免疫応答を誘導する効果的なアジュバントであることを示した。
実施例４
ＩＬ−３３はＨＰＶ抗原特異的ＣＤ４+Ｔ細胞免疫を強化した
【０２２７】
上に示したように、ｐｒｏＩＬ−３３及びｍｔｒＩＬ−３３の両方が、ワクチン接種によって誘導される抗原（Ａｇ）特異的ＩＦＮ−γ免疫応答を増幅させた。この免疫応答を、免疫応答によって生成されたエフェクターＴ細胞の表現型及びサイトカインのプロファイルを特性化することによってさらに調べた。具体的には、多機能性ＣＤ４+及びＣＤ８+Ｔ細胞免疫はＨＰＶ１６感染細胞の排除を促進するため、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−α分泌により、ＣＤ４+及びＣＤ８+（実施例５に後述する）Ｔ細胞免疫を調べた。
【０２２８】
Ｂ６マウスを、７μｇのｍｔｒＩＬ−３３またはｐｒｏＩＬ−３３構築物ありまたはなしで、５μｇの薬用量のＣｏｎＥ６Ｅ７構築物の筋肉内（ｉ．ｍ．）注射によって免疫化し、続いて電気穿孔を行った。第４の群のマウスには、５μｇの薬用量のｐＶＡＸを筋肉内（ｉ．ｍ．）投与した。構築物（複数可）の筋肉内投与には電気穿孔が続いた。０週目、３週目、及び６週目に免疫化が起こった。最終の免疫化の１週間後（すなわち、７週目）、マウスを屠殺して脾臓を収集した。したがって、免疫化は３週間隔で起こり、最終の免疫化の１週間後に脾細胞を収集した。プールされたＥ６及びＥ７ペプチドで脾細胞を刺激して、ワクチン誘導性Ａｇ特異的Ｔ細胞集団が刺激に応答してＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αを分泌する能力を決定した。刺激の後、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αに対する抗体を用いた細胞内染色の後にフローサイトメトリを使用して、脾細胞を分析した。ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αサイトカインに対して陽性のＣＤ４+Ｔ細胞の発現頻度を分析するためのゲーティング計画を、図３Ａに示す。
【０２２９】
図３Ｂ〜３Ｅは、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、またはＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αの両方に対して陽性のＣＤ４+Ｔ細胞の分析からのデータを示す。データは、１群当たり４匹のマウスの平均±ＳＥＭを表す。**Ｐ＜０．０１、*Ｐ＜０．０５（ＣｏｎＥ６Ｅ７と比較して）（スチューデントｔ検定）。陰性対照ｐＶＡＸ及びＣｏｎＥ６Ｅ７ワクチン接種単独と比較して、ｍｔｒＩＬ−３３またはｐｒｏＩＬ−３３と同時投与されたＣｏｎＥ６Ｅ７は、全ＩＦＮ−γ（ｍｔｒＩＬ−３３：０．２１％、ｐｒｏＩＬ−３３：０．２５％）、全ＴＮＦ−α（ｍｔｒＩＬ−３３：０．２５％、ｐｒｏＩＬ−３３：０．３９％）、及び二重のＩＦＮ−γ／ＴＮＦ−α（ｍｔｒＩＬ−３３：０．１２％、ｐｒｏＩＬ−３３：０．１５％）のいずれかを産生するＨＰＶ特異的ＣＤ４+Ｔ細胞のより高い発現頻度を誘発した（図３Ｂ〜３Ｄ）。ＩＦＮ−γ単独及びＴＮＦ−γ単独を産生するＡｇ特異的ＣＤ４+Ｔ細胞の発現頻度で、同様の傾向が観察された（図３Ｅ）。図３Ｅにおいて、棒グラフは、サイトカインＩＦＮ−γ及び／またはＴＮＦ−αを放出するシングルポジティブ及びダブルポジティブのＣＤ４+Ｔ細胞の複数機能性（ｐｌｕｒｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）亜集団を示す。シングルポジティブＣＤ４+Ｔ細胞は、ＩＦＮ−γまたはＴＮＦ−αのいずれかを放出する細胞であり、一方で、ダブルポジティブＣＤ４+Ｔ細胞は、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αの両方を放出する細胞である。図３Ｅの円グラフは、Ａｇ特異的刺激に対する各サイトカイン亜集団の相対的割合を示す。
【０２３０】
上記のデータは、ｐｒｏＩＬ−３３またはｍｔｒＩＬ−３３のいずれかがワクチン中のアジュバントであった際に、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、及び二重のＩＦＮ−γ／ＴＮＦ−αを産生するＣＤ４+Ｔ細胞の発現頻度が著しく増加したことを示した。ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−α等の抗ウイルス性サイトカインを分泌するエフェクターＴ細胞の高い発現頻度は、ワクチン効力を強化するｐｒｏＩＬ−３３及びｍｔｒＩＬ−３３両方のアジュバント作用を示す。これらのデータは、ｐｒｏＩＬ−３３及びｍｔｒＩＬ−３３両方が効果的なアジュバントとして作用する能力、すなわちＣＤ４+Ｔ細胞免疫ならびにＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αサイトカインの分泌を誘導することによる能力をさらに示した。
実施例５
ＩＬ−３３はＨＰＶ抗原特異的ＣＤ８+Ｔ細胞免疫を強化した
【０２３１】
ＣＤ４+Ｔ細胞免疫と同様に、多機能性ＣＤ８+Ｔ細胞免疫も、ＨＰＶ１６感染細胞の排除を促進する。したがって、ＣＤ８+Ｔ細胞に関して、ワクチン接種に応答するＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αの分泌も調べた。
【０２３２】
具体的には、Ｂ６マウスを、７μｇのｍｔｒＩＬ−３３またはｐｒｏＩＬ−３３構築物ありまたはなしで、５μｇの薬用量のＣｏｎＥ６Ｅ７構築物の筋肉内（ｉ．ｍ．）注射によって免疫化し、続いて電気穿孔を行った。第４の群のマウスには、５μｇの薬用量のｐＶＡＸを筋肉内（ｉ．ｍ．）投与した。構築物（複数可）の筋肉内投与には電気穿孔が続いた。０週目、３週目、及び６週目に免疫化が起こった。最終の免疫化の１週間後（すなわち、７週目）、マウスを屠殺して脾臓を収集した。したがって、免疫化は３週間隔で起こり、最終の免疫化の１週間後に脾細胞を収集した。プールされたＥ６及びＥ７ペプチドで脾細胞を刺激して、ワクチン誘導性Ａｇ特異的Ｔ細胞集団が刺激に応答してＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αを分泌する能力を決定した。刺激の後、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αに対する抗体を用いた細胞内染色の後にフローサイトメトリを使用して、脾細胞を分析した。ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αサイトカインに対して陽性のＣＤ８+Ｔ細胞の発現頻度を分析するためのゲーティング計画を、図３Ａに示す。
【０２３３】
図４Ａ〜Ｄは、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、またはＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αの両方に対して陽性のＣＤ８+Ｔ細胞の分析からのデータを示す。データは、１群当たり４匹のマウスの平均±ＳＥＭを表す。*Ｐ＜０．０５（ＣｏｎＥ６Ｅ７構築物と比較して）（スチューデントｔ検定）。陰性対照ｐＶＡＸ及びＣｏｎＥ６Ｅ７ワクチン接種単独と比較して、ｍｔｒＩＬ−３３またはｐｒｏＩＬ−３３と同時投与されたＣｏｎＥ６Ｅ７は、全ＩＦＮ−γ（ｍｔｒＩＬ−３３：３．６８％、ｐｒｏＩＬ−３３：３．５０％）、全ＴＮＦ−α（ｍｔｒＩＬ−３３：３．１１％、ｐｒｏＩＬ−３３：３．１３％）、及び二重のＩＦＮ−γ／ＴＮＦ−α（ｍｔｒＩＬ−３３：２．８３％、ｐｒｏＩＬ−３３：２．７５％）を産生するＨＰＶ特異的ＣＤ８+Ｔ細胞の実質的により高い発現頻度を誘発した（図４Ａ〜４Ｃ）。
【０２３４】
ＩＦＮ−γ単独及びＴＮＦ−α単独を分泌するＡｇ特異的ＣＤ８+Ｔ細胞の発現頻度で、同じ傾向が観察された（図４Ｄ）。図４Ｄにおいて、棒グラフは、サイトカインＩＦＮ−γ及び／またはＴＮＦ−αを放出するシングルポジティブ及びダブルポジティブのＣＤ８+Ｔ細胞の複数機能性亜集団を示す。シングルポジティブＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＩＦＮ−γまたはＴＮＦ−αのいずれかを放出する細胞であり、一方で、ダブルポジティブＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αの両方を放出する細胞である。図４Ｄの円グラフは、Ａｇ特異的刺激に対する各サイトカイン亜集団の相対的割合を示す。図４Ｄのドットプロットは４匹のマウスに代表的なものであり、プールされたＥ６／Ｅ７ペプチドを用いた刺激の後のダブルポジティブＣＤ８+Ｔ細胞を表す。Ｅ６Ｅ７刺激に応答するエフェクターＣＤ８+Ｔ細胞亜集団の比例順は、両方のサイトカインに対してダブルポジティブの細胞、ＩＦＮ−γ＋／ＴＮＦ−α＋で最大であり、続いてＩＦＮ−γ単独であり、これはＴＮＦα＋単独を分泌する細胞よりも大きかった（図４Ｄ）。
【０２３５】
上記のデータは、ｐｒｏＩＬ−３３またはｍｔｒＩＬ−３３のいずれかがワクチン中のアジュバントであった際に、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、及び二重のＩＦＮ−γ／ＴＮＦ−αを産生するＣＤ８+Ｔ細胞の発現頻度が著しく増加したことを示した。ｐｒｏＩＬ−３３及びｍｔｒＩＬ−３３との同時投与は、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、及び二重のＩＦＮ−γ／ＴＮＦ−αを産生する同様の量のＡｇ特異的ＣＤ４+及びＣＤ８+Ｔ細胞を産生し、サイトカイン産生は主にＣＤ８+Ｔ細胞によって媒介された。ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−α等の抗ウイルス性サイトカインを分泌するエフェクターＴ細胞の高い発現頻度は、ワクチン効力を強化するＩＬ−３３のアジュバント作用を示す。これらのデータは、ｐｒｏＩＬ−３３及びｍｔｒＩＬ−３３両方が効果的なアジュバントとして作用する能力、すなわちＣＤ８＋Ｔ細胞免疫ならびにＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αサイトカインの分泌を誘導することによる能力をさらに示した。
実施例６
ＩＬ−３３は細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔリンパ細胞（ＣＴＬ）を誘導した
【０２３６】
細胞傷害性ＣＤ８+Ｔリンパ細胞（ＣＴＬ）も、脱顆粒を経ることによって保護免疫をもたらす。ＣＤ１０７ａは、脱顆粒のマーカーである。ワクチンの細胞傷害能をよりよく理解するために、ＩＬ−３３がワクチン中のアジュバントであった際にＣＤ８+Ｔ細胞が脱顆粒を経るように誘導されるかどうかを調べた。
【０２３７】
Ｂ６マウスを、７μｇのｍｔｒＩＬ−３３またはｐｒｏＩＬ−３３構築物ありまたはなしで、５μｇの薬用量のＣｏｎＥ６Ｅ７構築物の筋肉内（ｉ．ｍ．）注射によって免疫化し、続いて電気穿孔を行った。第４の群のマウスには、５μｇの薬用量のｐＶＡＸを筋肉内（ｉ．ｍ．）投与した。構築物（複数可）の筋肉内投与には電気穿孔が続いた。０週目、３週目、及び６週目に免疫化が起こった。最終の免疫化の１週間後（すなわち、７週目）、マウスを屠殺して脾臓を収集した。したがって、免疫化は３週間隔で起こり、最終の免疫化の１週間後に脾細胞を収集した。プールされたＥ６及びＥ７ペプチドで脾細胞を刺激して、ワクチン誘導性Ａｇ特異的Ｔ細胞集団が刺激に応答してＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αを分泌する能力を決定した。ワクチン誘導性Ａｇ特異的Ｔ細胞集団が刺激に応答してＣＤ１０７ａを発現する能力も調べた。刺激の後、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、及びＣＤ１０７ａに対する抗体を用いた細胞内染色の後にフローサイトメトリを使用して、脾細胞を分析した。ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、及びＣＤ１０７ａに対して陽性のＣＤ８＋Ｔ細胞の発現頻度を分析するためのゲーティング計画を、図３Ａに示す。
【０２３８】
図４Ｅ及び４Ｆはそれぞれ、脱顆粒マーカーＣＤ１０７ａによって測定されたときのＴ細胞の抗原特異的な細胞溶解性の脱顆粒、及び細胞溶解性表現型のサイトカインのプロファイルを示す。データは、１群当たり４匹のマウスの平均±ＳＥＭを表す。*Ｐ＜０．０５（ＣｏｎＥ６Ｅ７構築物と比較して）（スチューデントｔ検定）。
【０２３９】
アジュバントとしてのｐｒｏＩＬ−３３またはｍｔｒＩＬ−３３をワクチン接種したマウスから単離したＣＤ８+Ｔ細胞は、ＣｏｎＥ６Ｅ７構築物単独を受けたマウスと比較して、脱顆粒マーカーであるＣＤ１０７ａのより高い発現頻度（ｍｔｒＩＬ−３３：４．４％、ｐｒｏＩＬ−３３：４．９％）を示した（図４Ｅ）。かなりの割合のＨＰＶ特異的エフェクター細胞が複数機能性であり、脱顆粒マーカーＣＤ１０７ａを発現し、かつ種々の組み合わせのＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αを同時に発現した（図４Ｆ）。アジュバントとしてｐｒｏＩＬ−３３またはｍｔｒＩＬ−３３を含むワクチンは、ＣＤ１０７ａ／ＩＦＮ−γ／ＴＮＦ−αを同時発現するエフェクターＣＤ８+Ｔ細胞の実質的により高い発現頻度を誘発した（ｍｔｒＩＬ−３３：２．５％、ｐｒｏＩＬ−３３：２．５％）。これらの結果は、ＨＰＶ１６感染細胞を除去する細胞の能力を示した表現型を有する、機能性エフェクター細胞傷害性ＣＴＬを誘導する、ｐｒｏＩＬ−３３及びｍｔｒＩＬ−３３両方のアジュバント能力を示した。これらのデータは、ｐｒｏＩＬ−３３及びｍｔｒＩＬ−３３両方が効果的なアジュバントとして作用する能力、すなわちＣＤ８+Ｔ細胞免疫ならびにＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αサイトカインの分泌を誘導することによる能力をさらに示した。
【０２４０】
まとめて、実施例４〜６のデータは、ｍｔｒＩＬ−３３またはｐｒｏＩＬ−３３構築物のいずれかをアジュバントとして用いたＨＰＶ  ＣｏｎＥ６Ｅ７構築物の共免疫化が、より強力なＨＰＶ特異的細胞性免疫をもたらしたことを示した。したがって、アジュバントとしてｐｒｏＩＬ−３３及びｍｔｒＩＬ−３３を含むワクチンは、治療可能性を示した。
実施例７
ｐｒｏＩＬ−３３はＣＤ８+Ｔ細胞の拡大を誘導した
【０２４１】
ｐｒｏＩＬ−３３がＣＤ８+Ｔ細胞の拡大を誘導し得るかどうかを決定するため、ワクチン中にアジュバントとしてｐｒｏＩＬ−３３を含めることによって誘導されるＣＤ８+Ｔ細胞応答をさらに調べた。Ｔ細胞サブセットの集団は、Ｐ１４（ＤbＧＰ３３特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ））マウスモデルを使用して追跡され得、それによってワクチン接種に応答するＣＤ８＋Ｔ細胞の拡大の監視が可能になる。後により詳細に記載されるように、アジュバントとしてのｐｒｏＩＬ−３３を含んだまたは含まなかったワクチンを用いた免疫化に応答するＧＰ３３／Ｌｙ５．１＋特異的ＣＤ８+Ｔ細胞の拡大を監視した。
【０２４２】
具体的には、約１５０，０００個のＬｙ５．１+ナイーブＰ１４  ＴＣＲトランスジェニックＣＤ８+Ｔ細胞をナイーブな野生型レシピエントに移植して「Ｐ１４キメラマウス」を作った。その後Ｐ１４キメラマウスに、ＧＰ３３単独またはｐｒｏＩＬ−３３構築物と組み合わせたＧＰ３３を、０日目（プライム）及び４１日目（ブースト）に２回ワクチン接種させた。ｐｒｏＩＬ−３３アジュバントありまたはなしのプライム及びブーストＤＮＡワクチン接種の過程の間に、Ａｇ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答の頻度を血液中で監視した（図５Ａ及び６）。具体的には、図５Ａは、末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）中のＰ１４特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞でのＬｙ５．１発現の動態を示す。図５Ａでは、エラーバーは１群当たり４匹のマウスの平均±ＳＥＭを表し、一方で、ＧＰ３３単独と比較して***Ｐ＜０．００１、**Ｐ＜０．０１、及び*Ｐ＜０．０５であった（スチューデントｔ検定）。図６は、第１のワクチン接種後１４日目、２１日目、及び３１日目、ならびに４８日目（第２のワクチン接種後７日目）における、ワクチン接種マウスの血液中のＧＰ３３／Ｌｙ５．１特異的ＣＤ８+Ｔ細胞の代表的な蛍光強度プロットを示す。図６中の数字は、全体のＣＤ８+Ｔ細胞集団内のＡｇ特異的ＣＤ８+Ｔ細胞の百分率を示す。
【０２４３】
図５Ａ及び６のデータは、ＧＰ３３及びｐｒｏＩＬ−３３構築物を投与されたマウスが、ＧＰ３３構築物のみを投与されたマウスと比較したときに、著しく増加した発現頻度のＰ１４  ＣＤ８+Ｌｙ５．１+Ｔ細胞を血液中に有したことを示した。ＧＰ３３及びｐｒｏＩＬ−３３構築物をワクチン接種したマウスにおけるＬｙ５．１+ＣＤ８+Ｔ細胞のこの著しく増加した発現頻度（約５倍）は、ＧＰ３３免疫化群と比較したときに、約１４ｄｐｖ（ワクチン接種後の日数）においてピークになった。具体的には、ＧＰ３３及びｐｒｏＩＬ−３３をワクチン接種した群に関する発現頻度の増加は、ＧＰ３３のみをワクチン接種した群が約２１ｄｐｖにおいてそのピークに達した７日前にピークになった。これらのデータは、ワクチン中にアジュバントとしてｐｒｏＩＬ−３３を含めると、Ａｇ特異的ＣＤ８+Ｔ細胞応答の規模が著しく拡大したことを示した。
【０２４４】
さらに、相同性ブーストの７日後（最初のワクチン接種の４８日後）、ｐｒｏＩＬ−３３免疫アジュバントは、ＧＰ３３単独ワクチンを受けたマウスと比較して、Ａｇ特異的ＣＤ８+Ｔ細胞の発現頻度を著しく増加させた（図５Ａ）。ブースト後のＡｇ特異的ＣＤ８+Ｔ細胞の発現頻度のこの増加は、定着したメモリーＣＤ８+Ｔ細胞プールのリコールを示した。これらのデータは、ワクチン中にアジュバントとしてｐｒｏＩＬ−３３を含めると、プライムワクチン接種後のＡｇ特異的ＣＤ８+Ｔ細胞応答の規模が著しく拡大するだけでなく、ブーストワクチン接種後のＡｇ特異的ＣＤ８+Ｔ細胞応答も著しく増加することをさらに示した。したがって、これらのデータは、エフェクター及びエフェクターメモリーＡｇ特異的ＣＤ８+Ｔ細胞応答の両方を拡大させることにより、Ａｇ特異的ＣＤ８+Ｔ細胞応答を著しく強化することによる、ワクチン中のアジュバントとして機能するｐｒｏＩＬ−３３の能力をさらに示した。
実施例８
ｐｒｏＩＬ−３３はＣＤ６２Ｌ-ＫＬＲＧ１+エフェクターメモリーＴ細胞を誘発した
【０２４５】
エフェクターＣＤ８+Ｔ細胞（例えば、ＣＤ６２Ｌ-ＫＬＲＧ１+エフェクターメモリーＴ細胞）は、保護免疫及び病原体制御をもたらし、上記のデータは、アジュバントとしてｐｒｏＩＬ−３３が、両方ともプライム及びブーストワクチン接種に応答してＡｇ特異的ＣＤ８+Ｔ細胞の発現頻度を増加させたことを示した。アジュバントとしてｐｒｏＩＬ−３３を含むワクチンの効力をさらに決定するため、Ｐ１４マウスモデルをＣＤ６２Ｌ-ＫＬＲＧ１+エフェクターメモリーＴ細胞応答に関して調べた。
【０２４６】
具体的には、Ｔ細胞サブセットの集団は、Ｐ１４（ＤbＧＰ３３特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ））マウスモデルを使用して追跡され得る。約１５０，０００個のＬｙ５．１+ナイーブＰ１４  ＴＣＲトランスジェニックＣＤ８+Ｔ細胞をナイーブな野生型レシピエントに移植して「Ｐ１４キメラマウス」を作った。その後Ｐ１４キメラマウスに、ＧＰ３３単独またはｐｒｏＩＬ−３３構築物と組み合わせたＧＰ３３を、０日目（プライム）及び４１日目（ブースト）に２回ワクチン接種させた。
【０２４７】
図５Ｂは、第１のワクチン接種後１４日目、２１日目、３１日目、及び４８日目（第２のワクチン接種後７日目）における、免疫化マウスのエフェクターメモリーＣＤ８+Ｔ細胞の分布を示す。エラーバーは１群当たり４匹のマウスの平均±ＳＥＭを表し、一方で、ＧＰ３３単独と比較して*Ｐ＜０．０５であった（スチューデントｔ検定）。
【０２４８】
具体的には、ワクチン誘導性Ｐ１４特異的ＣＤ８+Ｔ細胞集団内のエフェクターＣＤ８+Ｔ細胞の表現型を、１４ｄｐｖを始めとして調べた。以下の細胞表面発現マーカーを調べた：Ｌｙ５．１、ＣＤ６２Ｌ、及びＫＬＲＧ１（図５Ｂ）。図５Ｂに示すように、ＣＤ６２Ｌ-ＫＬＲＧ１+エフェクターメモリー細胞の百分率は、ＧＰ３３のみをワクチン接種した群と比較して、ｐｒｏＩＬ−３３アジュバント群において著しく高かった。Ａｇ特異的ＣＤ８+Ｔ細胞の発現頻度が１４ｄｐｖに漸進的な収縮を始めたことが観察されたが（図５Ａ）、両方のワクチン接種群におけるエフェクター集団は、３週間にわたり同じ状態に留まった（図５Ｂ）。まとめて、これらのデータは、ＣＤ８+Ｔ細胞によるＫＬＲＧ１の高い発現が反復的な抗原刺激に関連したことを示した。これらのデータは、継続的なＡｇの持続性曝露を強化するｐｒｏＩＬ−３３の能力も示した。
【０２４９】
さらに、二次メモリー細胞は、最初の免疫化の４８日後に起こった相同性ＤＮＡブースト後、両群（すなわち、ＧＰ３３単独ならびにＧＰ３３及びｐｒｏＩＬ−３３）において大きく拡大したＫＬＲＧ１＋Ｔ細胞の集団を示した。エフェクターメモリー応答は、ＧＰ３３単独群と比較して、ｐｒｏＩＬ−３３−アジュバント群において著しくより高い状態に留まった（図５Ｂ）。まとめて、図５Ａ、５Ｂ、及び６のデータは、実施例７及び８で本明細書に記載されるように、ｐｒｏＩＬ−３３がＡｇ特異的ＣＤ８+Ｔ細胞の形成を増強し、エフェクターメモリープールのクローン拡大を強化させたことを示した。これらのデータは、ｐｒｏＩＬ−３３が効果的なアジュバントであることをさらに支持した。
実施例９
ｐｒｏＩＬ−３３はＩｇＧ液性応答を誘導した
【０２５０】
実施例３に記載されるように、ｐｒｏＩＬ−３３及びｍｔｒＩＬ−３３は、Ｔｈ２または液性免疫応答の一部である、ＩＬ−４の分泌を誘導しなかった。したがって、ｐｒｏＩＬ−３３またはｍｔｒＩＬ−３３を含むワクチンに対する液性応答をさらに調べた。
【０２５１】
それぞれの群のマウス（ｎ＝４）を、ＣｏｎＥ６Ｅ７構築物単独、ｍｔｒＩＬ−３３構築物を伴うＣｏｎＥ６Ｅ７構築物、及びｐｒｏＩＬ−３３構築物を伴うＣｏｎＥ６Ｅ７構築物で免疫化した。陰性対照として、１つの群のマウス（ｎ＝４）には、ｐＶＡＸをワクチン接種した。具体的には、ワクチン接種は、構築物（複数可）の筋肉内注射、続いて電気穿孔を含んだ。０週目、３週目、及び６週目に免疫化が起こった。最後の免疫化の１週間後に、各群のマウスから血液を収集した。次いでＥＬＩＳＡを実施して、ＨＰＶ  Ｅ６及びＥ７に特異的なＩｇＧ及びＩｇＥ抗体のレベルを測定した。
【０２５２】
図７Ａに示すように、ｐｒｏＩＬ−３３を用いた共免疫化のみが、他の免疫化群と比較してＥ７特異的全ＩｇＧを著しく誘導した。***Ｐ＜０．００１（ＣｏｎＥ６Ｅ７構築物単独と比較して）（スチューデントｔ検定）。Ｅ６特異的抗体は誘導または検出されなかった（データは示さず）。
【０２５３】
さらに、ＩＬ−３３は、ＩｇＥ抗体を伴うアレルギー応答に関係付けられている。したがって、血清中のＥ７特異的ＩｇＥ応答及び全ＩｇＥ応答をＥＬＩＳＡによって測定した。図７Ｂ及び７Ｃに示すように、ｍｔｒＩＬ−３３及びｐｒｏＩＬ−３３は、対照ワクチン接種群と比較したときにＩｇＥのレベルを高めなかった。ＩｇＥクラス転換はＩＬ−４によって駆動され、したがって、この強化の欠如は、図２Ｃに示され実施例３に記載されるＩＬ−４の低い誘導と一致した。さらに、ＤＮＡワクチン接種の部位の慎重な評価では、検出可能なアレルギー性皮膚反応は示されなかった。これらの結果は、ＤＮＡワクチン接種設定におけるＩＬ−３３アジュバント作用が、Ｔｈ２関連応答を誘導しなかったことを支持した。
【０２５４】
要約すると、抗原とｐｒｏＩＬ−３３との組み合わせはＡｇ特異的ＩｇＧ液性応答を増強し、Ａｇ特異的細胞媒介性免疫応答と液性免疫応答との両方を強化する効果的なアジュバントとしてのｐｒｏＩＬ−３３の役割を示した。
実施例１０
ＩＬ−３３は抗腫瘍免疫及び定着腫瘍の退縮を誘導した
【０２５５】
ｐｒｏＩＬ−３３及びｍｔｒＩＬ−３３の両方が著しいＨＰＶ  Ａｇ特異的Ｔｈ１偏向性及びＣＤ８偏向性Ｔ細胞免疫応答を誘発した効果的なアジュバントであったという上記のデータを所与として、インビボ腫瘍療法研究を使用してＩＬ−３３アジュバントの治療効力を決定した。具体的には、インビボ腫瘍療法研究では、ｐｒｏＩＬ−３３またはｍｔｒＩＬ−３３のいずれかをアジュバントとして含むワクチンが、定着したＨＰＶ関連腫瘍または病変を除去し、新しいＨＰＶ関連腫瘍または病変の形成から保護する能力を調べた。
【０２５６】
定着腫瘍または病変のクリアランスを調べるため、ＨＰＶ１６  Ｅ６／Ｅ７発現ＴＣ−１腫瘍（５×１０4）細胞をナイーブＢ６レシピエントマウスに移植した。ＴＣ−１細胞移植の４日後、腫瘍を測定し（腫瘍は３ｍｍの平均サイズに達していた）、ｐＶＡＸ（５μｇ）、ＣｏｎＥ６Ｅ７（５μｇ）単独、または７μｇのｍｔｒＩＬ−３３もしくはｐｒｏＩＬ−３３と同時投与されたＣｏｎＥ６Ｅ７（５μｇ）、続いて図８Ａに概説されるように１週間隔で２回のブーストを用いて、マウスの群（ｎ＝１０）を免疫化した。ｐＶＡＸ免疫化マウスは、陰性対照として機能した。次いで、電子ノギスを用いて２つの寸法で腫瘍を週２回測定し、個別の各マウスに関する経時的なこれらの値の平均とともにデータを表す。腫瘍直径がほぼ２．０ｃｍに達したとき、マウスを屠殺した。
【０２５７】
図８Ｂは、経時的なミリメートル（ｍｍ）単位の平均的な腫瘍の大きさを示す。各時間点に対する腫瘍測定値は、生存したマウスに関してのみ示されている。最初の腫瘍移植後７日目、１４日目、２１日目、２８日目、及び３５日目においてマウスの群の対比較を行い、ｐ値を以下の表１に示す。ｍｔｒＩＬ−３３−アジュバント群において１０匹中９匹のマウスが最初の腫瘍移植の４２日後に無腫瘍であった一方で、ＣｏｎＥ６Ｅ７−ｐｒｏＩＬ−３３ワクチン接種マウス（すなわち、１０匹中１０匹のマウス）は、定着したＴＣ−１腫瘍の完全な退縮を誘導した（図８Ｂ）。
【表１】
0006649252.tif 000002
【０２５８】
ＮＳは「有意差なし」である。
【０２５９】
その一方で、ｐＣｏｎＥ６Ｅ７ワクチン接種群内の６匹のマウスのみが４２日後に無腫瘍であり、対照群では全てのマウスが２１日目までに死亡した。有意なことに、ｍｔｒＩＬ−３３またはｐｒｏＩＬ−３３で共免疫化したＣｏｎＥ６Ｅ７ワクチン接種動物は、第１の免疫化後１０日以内に定着腫瘍の退縮を示し始め、その過半数が第１の免疫化の１７日後に無腫瘍であった（図８Ｂ）。対照的に、ＣｏｎＥ６Ｅ７単独で処置されたマウスはより遅い腫瘍退縮を示し、１０匹中４匹のマウスのみが最初のワクチン接種後１７日目までに無腫瘍であった。ＩＬ−３３群は、ｍｔｒＩＬ−３３−アジュバント群の１匹のマウスを例外として、４２日目まで無腫瘍状態に留まった。さらに、ｐｒｏＩＬ−３３アジュバント群は、ワクチン接種後１７日目までに完全な腫瘍退縮を示し、これは、上記ならびに図５Ａ及び６に記載されるｐｒｏＩＬ−３３によって媒介されたＣＤ８+Ｔ細胞拡大のピーク（ワクチン接種後１４日目）と相関した。これらのデータは、アジュバントであるｍｔｒＩＬ−３３及びｐｒｏＩＬ−３３によって誘導されたＣＤ８+Ｔ細胞免疫が腫瘍退縮を促進したことを示した。
【０２６０】
新しい腫瘍または病変に対する保護もしくは予防を調べるため、それぞれの群のＢ６マウス（１群当たり１０匹のマウス）を、ｐＶＡＸ、ＣｏｎＥ６Ｅ７構築物単独、ｐｒｏＩＬ−３３構築物を伴うＣｏｎＥ６Ｅ７構築物、及びｍｔｒＩＬ−３３構築物を伴うＣｏｎＥ６Ｅ７構築物で、３週間隔で３回免疫化した。ｐＶＡＸを用いた免疫化は、陰性対照として機能した。ｍｔｒＩＬ−３３及びｐｒｏＩＬ−３３構築物の薬用量は７μｇであった。最後の免疫化の１週間後、マウスを５×１０4ＴＣ−１細胞に曝露して、本ワクチンの抗腫瘍性または予防的効力を評価した。図９に示すように、本ワクチンは移植の際の腫瘍成長を予防したが、ｐＶＡＸで免疫化したマウス（陰性対照）は移植後４０日以内に死亡した。ｐｒｏＩＬ−３３及びｍｔｒＩＬ−３３の両方が、ＣｏｎＥ６Ｅ７と同様の抗腫瘍メモリー応答を維持及び誘発した。
【０２６１】
これらのデータは、ＣｏｎＥ６Ｅ７はＥ６／Ｅ７腫瘍成長を予防したが、ｍｔｒＩＬ−３３またはｐｒｏＩＬ−３３がワクチン中のアジュバントであったときほど効果的に腫瘍退縮を引き起こさなかったことを示した。ワクチン中のアジュバントとして、ｍｔｒＩＬ−３３及びｐｒｏＩＬ−３３は、腫瘍成長を予防し、それぞれ９０％及び完全な定着腫瘍の退縮を引き起こした。ｐｒｏＩＬ−３３のみが液性免疫を誘導した（すなわち、前述のようにＩｇＧレベルを上昇させた）一方で、ｍｔｒＩＬ−３３及びｐｒｏＩＬ−３３の両方が、ＣＤ４+Ｔ細胞免疫、ＣＤ８+Ｔ細胞免疫、及び脱顆粒を経る細胞溶解性エフェクターＣＤ８+Ｔ細胞を誘導した（増加させた）。したがって、これらのデータはまとめて、ｍｔｒＩＬ−３３及びｐｒｏＩＬ−３３の両方が著しいレベルの腫瘍退縮をもたらしたため、ワクチン中にアジュバントとしてｐｒｏＩＬ−３３及びｍｔｒＩＬ−３３を含めることにより誘導されるＴ細胞免疫によって抗腫瘍保護が得られることを示した。要約すると、ｐｒｏＩＬ−３３及びｍｔｒＩＬ−３３アジュバントによって誘導されたＨＰＶ特異的Ｔ細胞免疫は、定着したＴＣ−１腫瘍を遅らせ、その完全な退縮を急速に誘導することにより、実質的な抗腫瘍性の保護免疫をもたらした。
実施例１１
実施例１２〜１５の材料及び方法
【０２６２】
構築物。成熟型ＩＬ−３３（ｍｔｒＩＬ−３３）をコードするＤＮＡ構築物は、実施例１に前述される。ＤＮＡ構築物は、ＨＩＶ（ＣｏｎＣ）、ＬＣＭＶ−ＧＰ構築物、及びＴＢ  Ａｇ８５Ｂ構築物も含んだ。全ての構築物が、遺伝子の５’末端に挿入された高効率の免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）リーダー配列を有した。構築物は、合成及び最適化された。
【０２６３】
動物。雌の８週齢のＣ５７ＢＬ／６（Ｈ−２b）マウスをＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）から購入した。
【０２６４】
動物の免疫化及び抗ＣＤ１２２処置。マウスを前脛骨筋の筋肉内（ｉ．ｍ．）で１回免疫化した。ワクチン接種の直後に同じ部位でＣＥＬＬＥＣＴＲＡ適応性定電流ＥＰデバイス（Ｉｎｏｖｉｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）を用いてインビボ電気穿孔（ＥＰ）を行った。
【０２６５】
マウスを、１１μｇのｍｔｒＩＬ−３３構築物ありまたはなしで、１０μｇのｐＶＡＸ１あるいは１０μｇのｐＬＣＭＶ−ＮＰのいずれかで免疫化した。最初の免疫化の３週間後、マウスを屠殺し、脾細胞を採取して免疫応答を測定した。
【０２６６】
ＬＣＭＶ−ＧＰ（ＧＰ）構築物を１０μｇで投与した。ＣＤ１２２+細胞の枯渇を、２０μｇの抗ＣＤ１２２モノクローナル抗体（ｍＡｂ）（ＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ）の皮下注射によって達成した。
【０２６７】
ＨＩＶ及びＴＢ免疫化のため、１１μｇのｍｔｒＩＬ−３３ありまたはなしで、１０μｇの各構築物（ＣｏｎＣ、Ａｇ８５Ｂ）で、２週間隔で３回マウスを免疫化した。免疫化の１週間後、マウスを屠殺し、脾細胞を採取して免疫応答を監視した。
【０２６８】
全ての研究を少なくとも２回繰り返した。
【０２６９】
ＬＣＭＶウイルス曝露。致死的曝露研究のため、最初のワクチン接種の２１日後、免疫化マウスを、３０μｌのウイルス希釈剤（２０％のＦＢＳ及び１×Ａｎｔｉ−Ａｎｔｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を含むＰＢＳ中の２０×ＬＤ50または４０×ＬＤ50のいずれかのＬＣＭＶ  Ａｒｍｓｔｒｏｎｇに頭蓋内（ｉ．ｃ．）曝露した。ＬＣＭＶに曝露された全てのマウスをＢＳＬ−２施設に収容し、２１日間毎日観察した。
【０２７０】
ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ。ＤＮＡをワクチン接種したマウスについては、全ての脾臓を加工処理し、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔアッセイを実施して、抗原特異的サイトカイン分泌を決定した。（１０％のＦＢＳ、１×抗菌抗真菌剤、及び１×β−ＭＥを補充した）ＲＰＭＩ  １６４０培地に脾臓を収集し、Ｓｔｏｍａｃｈｅｒ機（Ｓｅｗａｒｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｂｏｈｅｍｉａ，ＮＹ）を使用する脾臓の機械的破壊によって脾細胞を単離した。得られる圧潰された脾臓を、４０μｍの細胞漉し器を使用して濾過し、ＡＣＫ溶解緩衝液で５分間処理してＲＢＣを溶解させ、ＰＢＳ中で洗浄し、次いで、ＥＬＩＳｐｏｔまたはフローサイトメトリアッセイで使用するためにＲＰＭＩ培地中に再懸濁した。
【０２７１】
Ｈ−２bバックグラウンド（ＤbＮＰ396-404（ＮＰ３９６））または（ＤbＧＰ33-41（ＧＰ３３））（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からの免疫優性ＬＣＭＶエピトープで脾細胞を刺激することによって、ＬＣＭＶ特異的Ｔ細胞応答の測定値を評価した。プールされたペプチド（９個のアミノ酸が重複する１５量体、最終２．５μｇ／ｍｌ）を使用することによって、ＨＩＶ特異的Ｔ細胞応答を測定した。ＴＢ  Ａｇ８５Ｂ抗原全体にわたってプールされたペプチド（８個のアミノ酸が重複する１１量体、最終２．５μｇ／ｍｌ）を使用することによって、Ａｇ８５Ｂ特異的Ｔ細胞応答を測定した。全てのペプチドを、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔから合成した。Ｃｏｎｃａｖａｌｉｎ  Ａ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を陽性対照として使用し、完全培養培地を陰性対照として使用した。自動化ＥＬＩＳＰＯＴリーダー（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓｈａｋｅｒ  Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＯＨ）を使用してスポットを数えた。
【０２７２】
フローサイトメトリ。リンパ細胞を末梢血液から単離し、加工処理した。ＬＣＭＶ−ＧＰ３３（ＫＡＶＹＮＦＡＴＣ（配列番号９））に対するＣＤ８、ＣＤ４４、ＣＤ６２Ｌ、ＫＬＲＧ１、ＣＤ１２２、及びＭＨＣクラスＩペプチド四量体（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）で細胞を染色した。実験に応じてＬＣＭＶエピトープＤbＮＰ396-404またはＤbＧＰ33-41ペプチド、ＨＩＶプールペプチド、及びＡｇ８５Ｂプールペプチドのいずれかを用いたエクスビボ刺激の５時間（ｈｒ）後に、細胞内サイトカイン染色を実施した。
【０２７３】
以下の抗体を表面染色に使用した：ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ  Ｆｉｘａｂｌｅ  Ｖｉｏｌｅｔ死細胞染色キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＣＤ４（ＦＩＴＣ；クローンＲＭ４−５；ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＤ８（ＡＰＣ−Ｃｙ７；クローン５３−６．７；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ４４（Ａ７００；クローンＩＭ７；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）。細胞内染色には、以下の抗体を使用した：ＩＦＮ−γ（ＡＰＣ；クローンＸＭＧ１．２；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＴＮＦ−α（ＰＥ；クローンＭＰ６−ＸＴ２２；ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＤ３（ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５；クローン１４５−２Ｃ１１；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＩＬ−２（ＰｅＣｙ７；クローンＪＥＳ６−ＳＨ４；ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）。
【０２７４】
全てのデータはＬＳＲＩＩフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して収集し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ、Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ）及びＳＰＩＣＥ  ｖ５．２（アメリカ国立衛生研究所（ＮＩＨ）、具体的には、アメリカ国立アレルギー・感染症研究所（ＮＩＡＩＤ）から入手可能）を使用して分析した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用してＢｏｏｌｅａｎゲーティングを実施して、ワクチン接種した動物のＴ細胞の多機能性を調べた。
【０２７５】
Ｔ細胞増殖アッセイ。最初の免疫化の２１日後に免疫化Ｂ６マウスから単離された脾細胞を、細胞トレーサーバイオレットＶｉｏｌｅｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）で標識化し、１０μＭのペプチドで５日間パルス印加した。フローサイトメトリを使用してＣＤ８Ｔ細胞増殖を決定して、細胞トレースバイオレットの希釈度を評価した。
【０２７６】
統計分析。対応のあるｔ検定、両側ｔ検定、対応のないｔ検定によって群分析を完了し、ログランクマンテル−コックス検定によって生存曲線を分析した。非均一に分布した試料については、ノンパラメトリックなマン−ホイットニー検定を実施した（図１２Ｅ及び１２Ｆ）。全ての値は平均±ＳＥＭであり、統計分析はＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）によって実施した。
実施例１２
ＩＬ−３３は致死的ＬＣＭＶ曝露に対する保護を誘発した
【０２７７】
前述のように、ＩＬ−３３は、ワクチン中で投与されると、抗ウイルス性及び抗腫瘍性の両方のＣＤ８+Ｔ細胞応答を誘導し、したがってＩＬ−３３は、本ワクチン中のアジュバントとして機能した。ワクチン中に存在する場合、ＩＬ−３３によって得られる保護をさらに研究するため、ＬＣＭＶ感染モデル（本明細書において「頭蓋内（ｉ．ｃ．）ＬＣＭＶ曝露モデル」としても知られる）を使用した。ＬＣＭＶ感染モデルは、ワクチン誘発性保護においてウイルス特異的ＣＤ８+Ｔ細胞応答のためのモデルであった。ＬＣＭＶ  ＮＰ構造タンパク質は、中和抗体の標的ではなかったため、保護的ＬＣＭＶ免疫の構成要素及び標的であった。
【０２７８】
具体的には、３つの群のＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｂ６）（ｎ＝１０／群）に、１１μｇの成熟型ＩＬ−３３（ｍｔｒＩＬ−３３）構築物ありまたはなしで、１０μｇの空ベクター対照プラスミド（ｐＶＡＸ）または１０μｇのｐＬＣＭＶ−ＮＰ（ＮＰ）構築物を、電気穿孔（ＥＰ）によって１回筋肉内（ｉ．ｍ．）にワクチン接種した。空ベクターｐＶＡＸを陰性対照として使用した。
【０２７９】
全ての動物を、ワクチン接種後２１日目（ｄｐｖ）に致死的な２０×ＬＤ50の用量または致死的な４０×ＬＤ50のＬＣＭＶ  Ａｒｍｓｔｒｏｎｇに頭蓋内（ｉ．ｃ．）曝露した（図１１Ａ）。動物の生存を曝露後２１日間監視した。独立した実験において少なくとも２回実験を実施し、図１１に示すデータはその結果に代表的なものであった。
【０２８０】
ＮＰに加えｍｔｒＩＬ−３３をワクチン接種した動物は完全な保護を示したが、ＮＰ単独群は６０％の保護しか達成しなかった（図１１Ｂ）。図１１Ｂ中、*＜０．０５である。対照的に、全ての対照ｐＶＡＸワクチン接種動物が感染に屈した。したがって、これらのデータは、ｍｔｒＩＬ−３３をアジュバントとして使用するワクチンで免疫化されたマウスが、ＬＣＭＶ曝露に対して１００％の生存率を示したことを示した。
【０２８１】
ｍｔｒＩＬ−３３アジュバントを受けたワクチン接種マウスがさらにより高い致死的用量のＬＣＭＶ曝露に対して保護されるかどうかを決定するため、さらなる研究を完了した。したがって、単一のワクチン接種後２１日目、４０×ＬＤ50の用量のＬＣＭＶ  Ａｒｍｓｔｒｏｎｇに曝露された場合のマウス（図１１Ｃ）。ＮＰに加えｍｔｒＩＬ−３３の１回の免疫化を受けた動物は著しい８０％の保護を得たが、ＮＰ単独群はこの高度に致死的な用量のＬＣＭＶに対して１０％の保護しかもたらさなかった（図１１Ｃ）。図１１Ｃ中、**＜０．０１である。
【０２８２】
要約すると、上記のデータは、ＩＬ−３３がワクチン中に含まれたとき、致死的なＬＣＭＶ曝露に対する保護を誘発したことを示した。
実施例１３
ＩＬ−３３はＬＣＭＶ特異的ＣＤ８+Ｔ細胞応答を増強した
【０２８３】
前述のＬＣＭＶ曝露に対する保護がＣＤ８+Ｔ細胞の誘導によって媒介されたかどうかを決定するため、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって免疫化マウスにおける抗原特異的Ｔ細胞応答を調べた。具体的には、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの群（ｎ＝４〜５）を、１１μｇのｍｔｒＩＬ−３３ありまたはなしのいずれかで、１０μｇの核タンパク質（ＮＰ）で１回筋肉内（ｉ．ｍ．）免疫化し、続いて電気穿孔を行った。１０μｇのｐＶＡＸのみを受けたマウスは、陰性対照として機能した。ワクチン接種後２１日目に脾細胞を採取して細胞性免疫応答を評価した。具体的には、Ｈ−２bバックグラウンドにおける免疫優性のエピトープ：ＤbＮＰ396-40（ＮＰ３９６）を使用したペプチド再刺激に応答するＮＰ特異的免疫応答の規模を、ワクチン接種後２１日目（ｄｐｖ）に測定した。これらの実験の結果を、後により詳細に記載するように、図１２に示す。図１２では、少なくとも２〜３回繰り返された２つの独立した実験の平均値の標準誤差（ＳＥＭ）としてデータを示した。図１２中、ＮＰと比較して*はＰ＜０．０５であり、**はＰ＜０．０１であり、***はＰ＜０．００１である。
【０２８４】
ＮＰ単独ワクチン接種マウスと比較して、ｍｔｒＩＬ−３３をコードするプラスミドとの共免疫化は、２．５倍超より強力なＮＰ特異的Ｔ細胞応答を誘発した（図１２Ａ）。ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴ計数は、ＩＬ−３３ワクチン接種マウスにおいて１０6脾細胞当たり約２，５００個のスポット形成細胞（ＳＦＣ）と、ＮＰ単独群の約９８０個のＳＦＣ／１０6脾細胞であった。
【０２８５】
ＮＰ３９６ペプチド再刺激に応答するワクチン誘導性ＣＤ８+Ｔ細胞の表現型プロファイル及び機能的プロファイルも評価した。ワクチン接種の２１日後、ワクチン群の中でエフェクターサイトカインを産生するＣＤ８+Ｔ細胞の発現頻度の有意差が観察された（図１２Ｂ及び１２Ｃ）。ｍｔｒＩＬ−３３と同時投与されたＮＰワクチンは、３つのサイトカイン全て（すなわち、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、及びインターロイキン−２（ＩＬ−２）を産生する抗原（Ａｇ）特異的ＣＤ８+Ｔ細胞のより高い百分率を誘発し（図１２Ｂ）、著しい数のこれらのＣＤ８+Ｔ細胞が多機能性であった（図１２Ｃ）。ＮＰ単独ワクチン接種群と比較して、ＮＰ＋ｍｔｒＩＬ−３３ワクチン接種群は、２１ｄｐｖにおける脾臓内で、ＩＦＮ−γ単独（ＮＰ、１．３％；ＮＰ＋ｍｔｒＩＬ−３３、２．３％）、二重ＩＦＮ−γ+ＴＮＦ−α+（ＮＰ、０．７６％；ＮＰ＋ｍｔｒＩＬ−３３、１．６３％）、またはトリプルポジティブＩＦＮ−γ+ＴＮＦ−α+ＩＬ−２+（ＮＰ、０．２０％；ＮＰ＋ｍｔｒＩＬ−３３、０．４３％）のいずれかを産生するＮＰ特異的ＣＤ８+Ｔ細胞の実質的により高い発現頻度を誘発した（図１２Ｃ）。合わせて、ＩＬ−３３によって誘導されたＡｇ特異的ＣＤ８+Ｔ細胞応答の強化は、ＬＣＭＶ曝露に対する実質的な保護をもたらすＩＬ−３３の能力を示した。
【０２８６】
ワクチン誘導性ＣＤ８+Ｔ細胞の細胞傷害能も、これらの研究で調べた。ｍｔｒＩＬ−３３をワクチン接種したマウスから単離したＣＤ８+Ｔ細胞は、ＮＰ単独ワクチン接種マウス（ＩＦＮ−γ+ＣＤ１０７ａ+：１．２％）と比較して、著しくより高い頻度の抗原特異的（ＩＦＮ−γ+ＣＤ１０７ａ+：２．５％）脱顆粒を示した（図１２Ｄ）。
【０２８７】
さらに、２１ｄｐｖのマウスから単離され、インビトロでＮＰ３９６ペプチド再刺激に再曝露された脾細胞内の細胞トレースバイオレットの希釈度を監視することによって、ＣＤ８+Ｔ細胞の増殖能力を評価した。図１２Ｅは、ｍｔｒＩＬ−３３ワクチン接種マウスが、ＮＰ対照群より約２倍高い、ＣＤ８+Ｔ細胞の著しくより高いＡｇ特異的増殖を経たことを示す。アジュバントワクチン接種群における、エフェクターメモリーＣＤ８+Ｔ細胞（ＣＤ４４+ＣＤ６２Ｌ-）の濃縮もあった（図１２Ｆ）。総合すると、ｍｔｒＩＬ−３３を含めると、強力なレベルのＮＰ特異的Ｔ細胞免疫が誘発され、ＣＤ８+Ｔ細胞免疫応答の強化が強化された。
【０２８８】
ワクチン接種の過程の間のＡｇ特異的ＣＤ８+Ｔ細胞の誘導をさらに調べるため、Ａｇ特異的エフェクターメモリーＣＤ８+Ｔ細胞集団を拡大させるｍｔｒＩＬ−３３の能力を研究した。これらの研究では、ＤbＧＰ33-41ＭＨＣクラスＩ四量体を用いて、Ａｇ特異的ＣＤ８+Ｔ細胞が最初のプライミング後に発達するにつれてそれらを追った。具体的には、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝４〜８）に、ｍｔｒＩＬ−３３ありまたはなしで、１０μｇのＬＣＭＶ糖タンパク質ＬＣＭＶ−ＧＰ（ＧＰ）ＤＮＡワクチンを１回ワクチン接種した。ワクチン接種の過程の間、抗原特異的ＣＤ８Ｔ細胞集団を監視した。具体的には、ｍｔｒＩＬ−３３ありまたはなしのいずれかのワクチン接種の過程の間に、ＤbＧＰ３３特異的ＣＤ８+Ｔ細胞の発現頻度を末梢血液中で監視した（図１４Ａ）。２１日目に、脾臓（ｎ＝４）を採取し、ＧＰ３３ペプチドを用いて抗原特異的応答をエクスビボで監視した。これらの実験の結果を、後により詳細に記載するように、図１３に示す。図１３では、少なくとも２回繰り返された２つの独立した実験のＳＥＭとしてデータを示した。図１３中、*はＰ＜０．０５であり、**はＰ＜０．０１である。
【０２８９】
ワクチン中にｍｔｒＩＬ−３３を含めると、末梢血液中のＤbＧＰ３３四量体特異的ＣＤ８+Ｔ細胞の数の拡大がもたらされた（図１３Ａ）。図１３Ａでは、生きているＣＤ９+ＣＤ４４+Ｔ細胞に細胞をゲート設定した。末梢血液リンパ細胞（ＰＢＬ）中、ＧＰ３３特異的ＣＤ８+Ｔ細胞の発現頻度は、非アジュバント群と比較して１８及び２１ｄｐｖにおいて２倍高かった（図１３Ａ）。ワクチン中にｍｔｒＩＬ−３３を含めると、２１ｄｐｖの脾臓内のＧＰ３３特異的ＣＤ８+Ｔ細胞（図１３Ｂ）、及び、ＩＦＮ−γを分泌し、脱顆粒を経て、かつ転写因子Ｔ−ｂｅｔを発現するＡｇ特異的ＣＤ８+Ｔ細胞の数も増加した（図１３Ｃ、１３Ｄ、１３Ｅ、及び１３Ｆ）。
【０２９０】
さらに、全てのマウスをＧＰ構築物単独でブーストして（最初の免疫化の２１日後）、Ａｇ特異的リコール応答を数量化した。対照群と比較して、ｍｔｒＩＬ−３３ワクチン接種群は、Ａｇ特異的ＣＤ８+Ｔ細胞を著しく増加させた。ｍｔｒＩＬ−３３免疫化群では、ＧＰ３３四量体特異的Ｔ細胞は、ブーストワクチン接種後３日目（２４日目）を始めとして、ＮＰワクチン接種群と比較して約３倍高かった（図１３Ａ）。このＧＰ３３特異的ＣＤ８+Ｔ細胞の増幅の有意差は、ＤＮＡブーストの１０日後（３１日目）でも観察された。図１２と一致して、これらのデータは、Ａｇ特異的ＣＤ８+Ｔ細胞の急速な拡大及び増殖を誘導するＩＬ−３３の能力をさらに確証した。したがって、ＩＬ−３３は、２つの別個のウイルスタンパク質、すなわち、ＮＰ及びＧＰに対する、ＬＣＭＶ特異的ＣＤ８+Ｔ細胞免疫を著しく増強した。
【０２９１】
要約すると、上記のデータは、ｍｔｒＩＬ−３３がワクチン中のアジュバントであった際に、ＣＤ８+Ｔ細胞応答の頻度が著しく増加したことを示した。このＣＤ８+Ｔ細胞応答の増強は抗原特異性であり、サイトカインＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、及びＩＬ−２の産生の増加をもたらした。さらに、ｍｔｒＩＬ−３３がワクチン中のアジュバントであった際に、多機能性ＣＤ８+Ｔ細胞（すなわち、ＩＦＮ−γ+ＴＮＦ−α+及びＩＦＮ−γ+ＴＮＦ−α+ＩＬ−２+）の発現頻度の増加が観察された。このＣＤ８+Ｔ細胞応答の増強は、ｍｔｒＩＬ−３３がワクチン中のアジュバントであった際の、著しくより高い頻度の抗原特異的脱顆粒も含んだ。上記のデータは、ｍｔｒＩＬ−３３がワクチン中のアジュバントであった際に、エフェクターメモリーＣＤ８+Ｔ細胞を含む、抗原特異的ＣＤ８+Ｔ細胞の拡大が高められたことも示した。まとめて、これらのデータは、ｍｔｒＩＬ−３３が効果的なアジュバントとして作用する能力、すなわちＣＤ８+Ｔ細胞免疫を誘導することによる能力をさらに示した。
実施例１４
ＩＬ−３３はエフェクターメモリーＣＤ８+ＫＬＲＧ１  Ｔ細胞サブセットの分化を駆動し、ＣＤ８+ＣＤ１２２+制御性Ｔ細胞拡大を予防した
【０２９２】
侵襲性病原体に対する保護免疫は、メモリーＣＤ８+Ｔ細胞によって媒介され得る。エフェクター表現型メモリーＴ細胞（Ｔeff）は、血液媒介病原体のクリアランスを媒介し得る。ＣＤ４４及びＫＬＲＧ１はＴeff細胞分化の発現マーカーであり、したがって、ナイーブＣＤ８+Ｔ細胞ではなく活性化及びメモリーＣＤ８+Ｔ細胞上で発現される。前述のように、ワクチン中にＩＬ−３３を含めると、抗原特異的ＣＤ８+Ｔ細胞の拡大及び増殖が誘導された。後に詳述されるように、ワクチン接種の過程の間に誘導されるＡｇ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットにおけるメモリー分化を促進するＩＬ−３３の能力を調べるため、研究を行った（図１４及び１５）。具体的には、ワクチン中にＩＬ−３３を含めるとＴeff細胞の分化が誘導されるかどうかを決定するため、マーカーＣＤ４４及びＫＬＲＧ１をまず調べた（図１４Ａ）。
【０２９３】
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝４〜８）を、１１μｇのｍｔｒＩＬ−３３構築物ありまたはなしで、１０μｇのＧＰプラスミドで１回免疫化し、最初のワクチン接種の２１日後にＧＰのみでブーストした。図１４Ａに示すように、血液中の抗原特異的応答を監視した。図１４では、実験を２回繰り返した。図１４中、*はＰ＜０．０５であり、**はＰ＜０．０１であり、***はＰ＜０．００１である。
【０２９４】
ｍｔｒＩＬ−３３の投与は、ＧＰ単独ワクチン接種群と比較して、ＰＢＬ中のＣＤ８+ＫＬＲＧ１+Ｔeff細胞の百分率の著しい拡大をもたらした（図１４Ｂ）。図１４Ｂでは、ＤbＧｐ３３+ＣＤ８+ＣＤ４４+ＫＬＲＧ１+に集団をゲート設定した。ＤＮＡ−ＧＰブースト後のＤbＧＰ３３四量体特異的ＣＤ８+ＫＬＲＧ１+Ｔ細胞のリコール応答も、最初の免疫化の２１日後に評価した。ブースト後、ＧＰ３３特異的メモリーＣＤ８+ＫＬＲＧ１+Ｔ細胞の顕著な拡大が両群において観察されたが、ＣＤ８+ＫＬＲＧ１+Ｔ細胞の割合は、ｍｔｒＩＬ−３３アジュバント群において著しく高い状態に留まった（図１４Ｂ）。
【０２９５】
ＣＤ８+ＣＤ１２２+Ｔ細胞サブセット集団は、制御機能を有し、ワクチン誘導性免疫応答を抑制し得るため、この集団の分化を変化させるｍｔｒＩＬ−３３の能力を調べた。このように、そのようなＣＤ８+Ｔ細胞サプレッサー集団の拡大は、ワクチン接種計画の障害となり得る。
【０２９６】
ＰＢＬ中のワクチン接種の過程の間のワクチン誘導性ＤbＧＰ３３+ＣＤ８+ＣＤ１２２+特異的Ｔ細胞サブセットの動態は、際立った差を明らかにした（図１５Ａ）。ＧＰ単独ワクチン接種マウスは、ＧＰ＋ｍｔｒＩＬ−３３処置群と比較して、ワクチン接種の過程の間により高いＤbＧＰ３３四量体特異的ＣＤ８+ＣＤ１２２+Ｔ細胞応答を誘導した。各群が４〜８匹のマウスを有した。ＧＰ群におけるＧＰ３３特異的ＣＤ８+ＣＤ１２２+Ｔ細胞の発現頻度は、１４ｄｐｖを始めとして、ｍｔｒＩＬ−３３処置群と比較して約３倍高かった（図１５Ａ）。ワクチン中にｍｔｒＩＬ−３３を含めると、ワクチン接種の過程にわたって、四量体特異的ＣＤ８+ＣＤ１２２+Ｔ細胞サブセットの比較的一定した低いレベルが維持された。このように、ワクチン中にｍｔｒＩＬ−３３を含めると、ＣＤ１２２+ＣＤ８+制御性Ｔ細胞の拡大が抑制され、これが次に、ワクチンによって誘導される免疫応答を増強した。
【０２９７】
図１５では、示されるデータは、２回繰り返された３つの独立した実験の結果であった。図１５中、*はＰ＜０．０５であり、**はＰ＜０．０１であり、***はＰ＜０．００１である。
【０２９８】
このＧＰ特異的ＣＤ８+ＣＤ１２２+Ｔ細胞サブセットの機能性を脾臓内で２１ｄｐｖに調べたとき、Ａｇ特異的ＣＤ８+ＣＤ１２２+Ｔ細胞は、ＧＰ３３ペプチド再刺激の際にＩＦＮ−γを産生することができなかった（図１５Ｂ）。同様に、ＮＰ特異的ＣＤ８+ＣＤ１２２+Ｔ細胞は、ＮＰ特異的ＣＤ８+ＫＬＲＧ１+Ｔ細胞サブセットまたは他の性質不明のＡｇ特異的ＣＤ８+Ｔ細胞と比較して、非常に少ないＩＦＮ−γを分泌した（図１５Ｃ）。このように、ＮＰ特異的ＣＤ８+ＫＬＲＧ１+Ｔ細胞はＩＦＮ−γを誘導したが、ＣＤ８+ＣＤ１２２+制御性Ｔ細胞はそれを誘導しなかった。したがって、ワクチン中にｍｔｒＩＬ−３３を含めると、ＣＤ８+ＣＤ１２２+制御性集団が著しく変化した。したがって、ＣＤ８+ＣＤ１２２+制御性集団の調節は、ｍｔｒＩＬ−３３がワクチン誘導性ＣＤ８+Ｔ細胞応答を増強した機構の１つであった。
【０２９９】
この調節をさらに調べるため、研究を行って、ＣＤ８+ＣＤ１２２+制御性Ｔ細胞の枯渇がｍｔｒＩＬ−３３の投与と同様にＧＰワクチン接種群におけるＡｇ特異的応答を強化するかどうかを決定した。具体的には、２つの群のＣ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝１群当たり４）に、ＤＮＡをコードするＧＰ抗原単独をワクチン接種した。単一のワクチン接種後３日目、６日目、９日目、及び１２日目に、抗ＣＤ１２２モノクローナル抗体（ｍＡｂ）（２０μｇ）を、１つの群のマウスに腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した（図１６Ａ）。抗ＣＤ１２２  ｍＡｂを使用してＣＤ１２２を枯渇させた。他方の群のマウスは抗ＣＤ１２２  ｍＡｂを受けず、したがって対照として機能した。１４ｄｐｖにマウスを屠殺し、脾臓を採取してＣＤ８及びＣＤ１２２の発現を評価した。これらの実験の結果を図１６に示し、後により詳細に記載する。図１６では、２つのうち代表的な１つの結果としてデータを示した。
【０３００】
ＣＤ１２２枯渇は、抗ＣＤ１２２  ｍＡｂで処置されたマウスにおけるＣＤ８+ＣＤ１２２+Ｔ細胞の排除をもたらした（図１６Ｂ）。ワクチン接種後２週目において、ＣＤ１２２枯渇マウスは、対照群のＡｇ特異的ＣＤ８+Ｔ細胞と比較して、脾臓内のＤbＧＰ３３+特異的ＣＤ８+Ｔ細胞の数の明白な増加を示した（図１６Ｃ）。このように、抗ＣＤ１２２  ｍＡｂのインビボ投与によるＣＤ８+ＣＤ１２２+制御性Ｔ細胞の枯渇は、図１３に示されるｍｔｒＩＬ−３３アジュバントの同時投与と同様のワクチン誘導性免疫応答の増強をもたらした。
【０３０１】
要約すると、これらのデータは、これら制御性Ｔ細胞、すなわち、ＣＤ８+ＣＤ１２２＋Ｔ細胞サブセットの分化または拡大を予防するｍｔｒＩＬ−３３の能力を示した。そのような減少は、ｍｔｒＩＬ−３３が抗ウイルス性免疫を促進する別の機構であった。
【０３０２】
実施例１２、１３、及び１４は、ｍｔｒＩＬ−３３構築物の同時投与がＩＦＮ−γスポット形成ＮＰ３９６特異的ＣＤ８+Ｔ細胞の規模を増加させただけでなく、それらの多機能性を向上させ、ＣＤ８+Ｔ細胞の細胞溶解性表現型、及びそれらのエフェクターメモリー分化を増加させもしたことを示した。特異的ＣＤ８Ｔ細胞エピトープＤbＮＰ３９６−４０についてＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔによって測定されたとき、ｍｔｒＩＬ−３３の包含は、ＮＰ単独免疫化と比較して２．５倍高い応答を誘導した。さらに、これらの実施例は、ｍｔｒＩＬ−３３が、ＩＦＮ−γ+ＴＮＦ−α+ＩＬ２＋、ＩＦＮ−γ+ＴＮＦ−α+、及びＩＦＮ−γ+を分泌する多機能性ＣＤ８+Ｔ細胞集団を強化し、より高いＡｇ特異的ＣＤ８+細胞溶解性脱顆粒を誘発したことを示した（図１２）。このデータは、ＤＮＡワクチンと同時投与されたときにＩＬ−３３（ｐｒｏＩＬ−３３及びｍｔｒＩＬ−３３形態の両方）がＡｇ特異的細胞媒介性免疫応答を増強した実施例１〜１０の研究と一致した。
【０３０３】
実施例１〜１０の研究とさらに一致して、ｍｔｒＩＬ−３３が、ｐｒｏＩＬ−３３のように、ワクチン接種に応答して血液中のＧＰ３３+ＣＤ８+Ｔ細胞応答の著しい増幅を誘導したことが、実施例１２〜１４の研究において示された。このように、ＩＬ−３３は、ＣＤ８+Ｔ細胞の拡大を調節した。
【０３０４】
実施例１２〜１４のこれらの研究は、ブースト後の二次的なリコール応答が、ＧＰ単独ワクチン接種群と比較したときに、四量体特異的ＣＤ８+ＫＬＲＧ１+Ｔ細胞の急速な拡大を誘発したことも示した（図１３Ａ）。ブーストの８日後のＡｇ特異的エフェクターメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞のこの差及び急速なリコール応答は、図１１に示されるように、アジュバント作用を提供し、かつ抗ウイルス性保護を媒介するＩＬ−３３の能力と合致した。全体的に、これらの結果は、アジュバントとしてＩＬ−３３を含めると、即時のエフェクター機能を開始するエフェクターメモリーＴ細胞を誘導することにより、抗ウイルス性免疫が促進されたことを示した。
【０３０５】
さらに、これらの実施例は、ＣＤ８+ＣＤ１２２+制御性Ｔ細胞の枯渇が四量体特異的ＣＤ８+Ｔ細胞応答を増強したことを示し（図１６Ｃ）、これは、Ａｇ特異的ＣＤ８+Ｔ細胞の拡大及びＩＬ−３３ワクチン接種マウスにおける機能の増加が、ＣＤ８+ＣＤ１２２+制御性Ｔ細胞の拡大の予防に関連することを示した。
実施例１５
ＩＬ−３３はＨＩＶ特異的及びＴＢ特異的Ｔ細胞媒介性応答を増大させた
【０３０６】
ｍｔｒＩＬ−３３アジュバントが、ＴH１及びＣＤ８+Ｔ細胞応答の両方を必要とする他の病原体に対するワクチン効力を強化させたかどうかを決定するため、ＨＩＶまたはＴＢ  ＤＮＡ抗原と同時送達されたｍｔｒＩＬ−３３のＡｇ特異的Ｔ細胞媒介性応答を評価した（図１７及び１８）。Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝４〜５）に、単独あるいは１１μｇのｍｔｒＩＬ−３３と組み合わせて与えられた、１０μｇのＨＩＶコンセンサスクレードＣ（ＣｏｎＣ）またはＴＢ抗原８５Ｂ（Ａｇ８５Ｂ）のいずれかを、２週間隔で３回筋肉内（ｉ．ｍ．）ワクチン接種し、続いてＥＰを行った。最終の免疫化の１週間後、マウスを屠殺し、脾臓を加工処理した。これらの脾臓に由来する細胞を使用して抗原特異的免疫応答を測定した。
【０３０７】
ＬＣＭＶモデルにおける所見と一致して（図１２Ａ、１２Ｂ、及び１２Ｃ）、ワクチン中にｍｔｒＩＬ−３３を含めると、それぞれ、非アジュバント群（ＣｏｎＣ、約２，３００ＳＦＣ；Ａｇ８５Ｂ、約３３３ＳＦＣ）と比較したときに、ＨＩＶ特異的及びＴＢ特異的ＩＦＮ−γ分泌Ｔ細胞の数（ＣｏｎＣ、約３，８００ＳＦＣ；Ａｇ８５Ｂ、約１，０６２ＳＦＣ）が高まった（図１７Ａ及び１８Ａ）。
【０３０８】
図１７では、実験を少なくとも２回実施し、同様の結果であった。また、図１７中、ＣｏｎＣ群と比較して*はＰ＜０．０５であり、**はＰ＜０．０１であり、***はＰ＜０．００１であった。図１８では、実験を少なくとも２回実施し、同様の結果であった。また、図１８中、Ａｇ８５Ｂ群と比較して*はＰ＜０．０５であり、**はＰ＜０．０１であった。
【０３０９】
さらに、免疫化後のＣＤ４+及びＣＤ８+Ｔ細胞集団のサイトカイン産生表現型を、ＨＩＶ抗原及びＴＢ抗原の両方について調べた（それぞれ図１７Ｂ及び１７Ｃ、ならびに１８Ｂ及び１８Ｃ）。マウスでは、ＨＩＶ及びＴＢワクチン接種の両方の後のＡｇ特異的ＴH１応答は、脾臓内の高い発現頻度の多機能性トリプルポジティブ（ＩＦＮ−γ+ＴＮＦ−α+ＩＬ−２+）、ダブルポジティブ（ＩＦＮ−γ+ＴＮＦ−α+）、及びＩＦＮ−γシングルポジティブＣＤ４+Ｔ細胞からなった（それぞれ図１７Ｂ及び１８Ｂ）。ＣＤ８+Ｔ細胞に関して、ｍｔｒＩＬ−３３を用いたＨＩＶ及びＴＢワクチン接種の後の応答が、著しくより高い発現頻度の多機能性ダブルポジティブ（ＩＦＮ−γ+ＴＮＦ−α+）ならびにＴＮＦ−α−及びＩＦＮ−γ−シングルポジティブＣＤ８+Ｔ細胞を誘導したことが観察された（それぞれ図１７Ｃ及び１８Ｃ）。これらのデータは、上記実施例のデータと合わせて、ＩＬ−３３が、異なる病原体を標的にするワクチン中の効果的なアジュバントであったことを示した。
【０３１０】
要約すると、実施例１２〜１５は、ワクチン接種の間のＩＬ−３３の同時投与が、異なる抗原、例えば、ＬＣＭＶ  ＮＰならびにＨＩＶ及びＴＢ抗原に対する、抗原（Ａｇ）特異的Ｔ細胞の規模及び機能を増大させたことを示した。これらの応答は、細胞傷害性表現型を示したＴH１型多機能性Ｔ細胞のより高い発現頻度を特徴とした。これらのＴ細胞は、インビボのＡｇ特異的再刺激の際の強力な拡大が可能であり、高用量の致死的なＬＣＭＶ曝露に対して保護された。これらのＴ細胞は、強力な抗原特異的ＩＦＮ−γ産生も可能であった。
【０３１１】
さらに、ＩＬ−３３は、ＫＬＲＧ１+エフェクターメモリーＴ細胞を増幅すること、及びＣＤ１２２+制御性ＣＤ８+Ｔ細胞の拡大を予防することによって、Ａｇ特異的免疫を調節した。この様式で、アジュバントＩＬ−３３は、ワクチンによって誘導されるＴ細胞免疫を向上させた。
【０３１２】
上記の詳細な説明及び付随する実施例は、例示であるに過ぎず、添付の特許請求の範囲及びそれらの均等物によってのみ定義される本発明の範囲に対する制限であると解釈されるべきではないことを理解されたい。
【０３１３】
開示される実施形態に対する種々の変更及び改変は、当業者には明白であろう。限定されないが、本発明の化学構造、置換基、誘導体、中間体、合成、組成物、製剤、または使用方法に関連するものを含むそのような変更及び改変は、その主旨及び範囲から逸脱することなく行うことができる。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１２−３】
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【図１２−４】
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【図１２−５】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１３−３】
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【図１３−４】
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【図１４】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１７−３】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１８−３】
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【配列表】
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