(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的粒子（１１２）、特に関心粒子（１１２Ａ）を収容する試料（１１１；３１１）を分析する方法であって、前記試料は、第１の光源（１２０；３２０）と光学システム（１３１；３３１）間に配置され、前記光学システム（１３１；１３３）は、対物面（１３３；３３３）と、イメージセンサ（１３２；３３２）が位置する像平面との間の光学結合を行い、前記試料は、上側スライド（１１４；３１４）によって前記イメージセンサの側で範囲が定められた流体チャンバ内に位置し、
前記方法は、
前記上側スライド（１１４；３１４）の面（１１７；３１７；３１５）上に位置する基準点（１１８；３１８）を定義すると共に、前記光学システム（１３１；３３１）によって集束されたレーザビーム（３６３）によって前記基準点（１１８；３１８）を照明するステップと、ここで、前記レーザビーム（３６３）は、前記イメージセンサ（１３２；３３２）が前記上側スライド（１１４；３１４）上の前記レーザビーム（３６３）の鏡面反射によって形成されたスポットの画像を受けるように調整され、前記レーザビームと、前記イメージセンサと、前記光学システムは、前記レーザビームの集束点が前記対物面内にあるように配置され、
前記光学システムの光学軸に平行な軸に沿った、前記流体チャンバ内にある前記試料と前記光学システムとの間の距離を、前記鏡面反射の検出によって調整することで、前記基準点を前記光学システムの前記対物面内に位置決めするステップと、
前記光学システムの前記光学軸に平行な軸に沿って、前記光学システムの前記対物面（１３３；３３３）を前記基準点（１１８；３１８）に対して有効距離（Ｄ１）と呼ばれる既知の距離だけオフセットして、前記関心粒子（１１２Ａ）を前記光学システムの前記対物面（１３３；３３３）の外側に配置するようにするステップと、
前記第１の光源を用いて、照明領域（１１９）と呼ばれる前記関心粒子を収容する領域を照明するステップと、
前記イメージセンサ（１３２；３３２）を用いて、基準像又はデフォーカス像と呼ばれる前記照明領域のホログラム画像を取得するステップと、
前記基準像を用いて、前記光学システムの前記光学軸に沿った前記対物面の所定のオフセット（Ｄｉ１，Ｄｉ２，Ｄｉｎ，Ｄｉ−１，Ｄｉ−ｎ）のシミュレーションと各々が関連付けられた一連の再生像をデジタル構成するステップと、
前記一連の再生像を用いて、前記光学システムの前記光学軸に平行な軸に沿った、前記関心粒子と前記対物面間の距離（Ｄｒｅｆ）を決定するステップと、を含む分析方法。
【請求項２】
前記光学システムの前記対物面（１３３；３３３）を前記基準点（１１８；３１８）に対してオフセットするステップは、前記試料を前記流体チャンバ内に収容する支持体（１１０）を、前記光学システム（１３１；３３１）に対して並進させることによって実行される、請求項１に記載の分析方法。
【請求項３】
前記関心粒子（１１２Ａ）と前記対物面（１３３；３３３）間の前記距離（Ｄｒｅｆ）ならびに前記有効距離（Ｄ１）を用いて、前記関心粒子と前記基準点（１１８；３１８）との間の距離（ＤＦ）を決定するステップを含む、請求項１又は２に記載の分析方法。
【請求項４】
前記関心粒子と前記対物面間の距離（Ｄｒｅｆ）を用いて、前記試料中の前記関心粒子の存在を決定するステップを含む、請求項１〜３のいずれかに記載の分析方法。
【請求項５】
前記生物学的粒子（１１２）は、前記試料の下側（１１６；３１６）又は上側（１１７；３１７）境界面からなる前記試料の境界面（１１６，１１７；３１６，３１７）に付着する、請求項１〜４のうちいずれか一項に記載の分析方法。
【請求項６】
前記光学システムの前記光学軸に平行な軸に沿った、前記基準像と関連付けられた前記対物面の位置と、当該軸に沿い上側境界面（１１６，１１７；３１６，３１７）上の基準点（１１８；３１８）の投射との間の距離は、＋５μｍから+２０００μｍの範囲、又は−５μｍから−２０００μｍの範囲であって、
前記上側境界面（１１７；３１７）は、前記上側スライド（１１４）と前記試料（１１１）の境界によって定義されている、請求項１〜５のうちいずれか一項に記載の分析方法。
【請求項７】
前記照明領域（１１９）は、複数の生物学的粒子（１１２）を含む、請求項１〜６のうちいずれか一項に記載の分析方法。
【請求項８】
前記第１の光源（１２０；３２０）は、２００ｎｍ未満のスペクトル幅を有する、請求項１〜７のうちいずれか一項に記載の分析方法。
【請求項９】
前記一連の再生像を用いて、前記光学システムの前記光学軸に直交する平面内における前記関心粒子（１１２Ａ；３１２Ａ）の位置を決定するステップをさらに含む、請求項１〜８のうちいずれか一項に記載の分析方法。
【請求項１０】
各再生像は、実部と虚部によって構成され、
前記実部と虚部のうち前記再生像の前記虚部のみが、前記光学システムの前記光学軸と平行な軸に沿った、前記関心粒子（１１２Ａ；３１２Ａ）と前記基準点（１１８；３１８）間の距離（ＤＦ）を決定するために使用される、請求項３に記載の分析方法。
【請求項１１】
各再生像は、前記光学システムの前記光学軸（１３５；３３５）に沿ったオフセット及び有効パラメータの値と関連付けられて、前記オフセットによる前記有効パラメータの変化を示す関数を構成し、
前記関心粒子（１１２Ａ、３１２Ａ）と前記対物面（１３３，３３３）間の距離（Ｄｒｅｆ）を決定するステップは、注目値、詳細には、前記関数の極値、変曲点又はゼロ通過を調べる、請求項１〜１０のうちいずれか一項に記載の分析方法。
【請求項１２】
前記関心粒子（１１２Ａ；３１２Ａ）と前記対物面（１３３；３３３）との間の距離（Ｄｒｅｆ）を決定するステップは、
前記対物面（１３３；３３３）のシミュレートされたオフセットの第１のステップと関連付けられた第１の一連の再生像を用いて、前記関心粒子と前記対物面との間の概略距離を決定するサブステップと、
前記対物面（３３３）のシミュレートされたオフセットの第２ステップと関連付けられた第２の一連の再生像を用いて、前記関心粒子と前記対物面との間の正確な距離を決定するサブステップと、を含み、
前記第２ステップは、前記第１のステップより細かい、
請求項１〜１１のうちいずれか一項に記載の分析方法。
【請求項１３】
前記関心粒子（１１２Ａ、３１２）と前記対物面（１３３，３３３）との間の距離（Ｄｒｅｆ）を用いて、前記光学システム（１３１，３３１）は、前記レーザビーム（３６３）を前記関心粒子（１１２Ａ、３１２Ａ）上に集束させるように、前記関心粒子（１１２Ａ；３１２Ａ）に対して移動される、請求項１〜１２のうちいずれか一項に記載の分析方法。
【請求項１４】
前記関心粒子（１１２Ａ、３１２）と前記対物面（１３３，３３３）との間の前記距離（Ｄｒｅｆ）を用いて、前記光学システム（１３１，３３１）は、前記光学システムの前記画像面内に位置する前記イメージセンサ（１３２；３３２）の合焦を調整するように、前記関心粒子（１１２Ａ、３１２Ａ）に対して移動される、請求項１〜１３のうちいずれか一項に記載の分析方法。
【請求項１５】
前記試料（１１１；３１１）内に存在する生物学的粒子（１１２）の数を数えるステップをさらに含む、請求項１〜１４のうちいずれか一項に記載の分析方法。
【請求項１６】
前記生物学的粒子（１１２）は、細菌、胞子、細胞、酵母又は微生物からなる、請求項１〜１５のうちいずれか一項に記載の分析方法。
【請求項１７】
生物学的粒子（１１２）、詳細には関心粒子（１１２Ａ；３１２Ａ）を収容する試料（１１１；３１１）を分析する装置（１００；３００）であって、
第１の光源（１２０；３２０）と、
光学システム（１３１，３３１）とイメージセンサ（１３２，３３２）を備え、前記イメージセンサは、前記光学システムの像平面内に位置し、前記像平面が、前記光学システムを通じた対物面（１３３，３３３）の共役である、撮像ユニット（１３０，３３０）と、
前記第１の光源と前記撮像ユニットの間に配置され、前記試料を収容する流体チャンバを収容するように構成された支持体（１１０）と、ここで、上側スライド（１１４；３１４）は前記流体チャンバの範囲を定め、
前記光学システム（１３１；３３１）によって集束されるレーザビーム（３６３）を出射するように配置されたレーザ（３６０）と、ここで、前記イメージセンサ（１３２；３３２）は、前記上側スライド（１１４；３１４）上の前記レーザビーム（３６３）の鏡面反射によって形成されたスポットの画像を受け取り、前記レーザビーム、前記イメージセンサ及び前記光学システムは、前記レーザビームの集束点が前記対物面内にあるように配置され、
前記光学システムの光学軸（１３５，３３５）に平行な軸に沿って前記光学システム（１３１；３３１）に対して前記支持体（１１０）を移動させるように構成された並進手段（１４０；３４０）と、
請求項１のステップを実行するように配置された計算手段（１５０；３５０）と、
を備え、
特に、前記計算手段（１５０；３５０）は、
前記上側スライド（１１４；３１４）の面（１１７；３１７；３１５）上に位置する基準点（１１８；３１８）に関する情報を記憶するメモリ（１５１；３５１）に接続され、
前記試料と前記光学システムの相対位置を特定するように構成され、前記イメージセンサ（１３２；３３２）が、前記基準点上に前記レーザビーム（３６３）の前記鏡面反射によって形成されたスポットの画像を受け取り、
前記対物面が前記基準点に対してオフセットされたときに、基準像と呼ばれる、前記イメージセンサによって取得されたホログラム画像を入力として受け取り、
前記基準像を用いて、前記光学システムの前記光学軸に沿った前記対物面の所定のオフセット（Ｄｉ１，Ｄｉ２，Ｄｉｎ，Ｄｉ−１，Ｄｉ−ｎ）のシミュレーションに各々が関連付けられた一連の再生像のデジタル構成を実行するように構成され、
前記光学システムの前記光学軸（１３５，３３５）に平行な軸に沿った、前記関心粒子（１１２Ａ；３１２Ａ）と前記対物面（１３３；３３３）との間の距離（Ｄｒｅｆ）を出力として供給する、装置（１００；３００）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物学的粒子を収容する試料を分析する分野に関し、この分析の本質は、詳細には、試料の深さの軸に沿った前記生物学的粒子の少なくとも１つの位置を決定することにある。
【背景技術】
【０００２】
従来技術では、生物学的粒子の位置をその粒子を収容している試料の深さの軸に沿って知ることが必要な多くの事例が知られている。
【０００３】
一般に使用されている解決策は、試料の様々な深さにおける試料の一連の画像を取得することにある。その場合、生物学的粒子の鮮明画像が見られる画像が求められる。
【０００４】
この解決策の欠点は、その鮮明画像が周囲環境の画像と混同される透明な生物学的粒子の位置を知りえないことである。
【０００５】
本発明の目的は、この欠点のない方法及び装置を提案することである。
【０００６】
詳細には、本発明の目的は、任意の生物学的粒子の位置を、三次元空間の少なくとも１つの軸に沿って決定することを可能にする方法及び装置を提案することである。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
この目的は、生物学的粒子、特に関心粒子を収容する試料を分析する方法によって達成され、この方法は、第１の光源と光学システムの間に配置された試料を含む装置で実施され、前記方法は、
試料の第１境界面上、又は光学システムの光学軸に平行な軸に沿った第１境界面から既知の距離にある基準点を定義するステップと、
第１の光源を使用して、照明領域と呼ばれる関心粒子を収容する領域を照明するステップと、
光学システムの像平面内にあるセンサを使用して、基準像と呼ばれる照明領域の画像を取得するステップであって、関心粒子が、光学システムの対物面の外側にあり、光学システムの光学軸に平行な軸に沿った前記対物面と基準点間の距離が、有効距離と呼ばれる既知の距離であるステップと、
基準像を使用して、前記光学システムの光学軸に沿った対物面の所定のオフセットとそれぞれ関連付けられた一連の再生像をデジタル構成するステップと、
一連の再生像を使用して、光学システムの光学軸に平行な軸に沿った関心粒子と前記対物面間の距離を決定するステップとを含む。
【０００８】
したがって、本発明は、有利には、光学システムを、その対物面が、基準点上、前記第１境界面上、又は前記第１境界面から既知の距離になるように配置し、関心粒子が光学システムの対物面の外側になるように光学システムを構成することによって基準点を検出するステップを含む。
【０００９】
基準像は、関心粒子が光学システムの対物面の外側になるように、光学システムのこの構成に合わせて取得される。
【００１０】
光学システムのこの構成は、基準点を検出するために実現された光学システムの構成に直接対応できる。この場合、基準像、すなわちデフォーカス像が、基準点の検出後に直接取得される。
【００１１】
あるいは、この方法は、基準点の検出後に、試料を収容する支持体を光学システムに対して並進させることによって、光学システムの対物面を前記基準点に対してオフセットするステップを含む。このオフセットステップの後、基準像、すなわちデフォーカス像が取得される。
【００１２】
本発明は、対物面と前記基準点間の距離を正確に知ることを可能にする。したがって、関心粒子と対物面間の距離を正確に知ることができ、それにより、分析装置を最良に位置決めして関心粒子を調べうる。
【００１３】
この方法は、有利には、関心粒子と前記対物面間の前記距離ならびに前記有効距離を使用して、関心粒子と前記基準点間の距離を決定するステップを含む。
【００１４】
更に、前記関心粒子と前記対物面間の距離から媒体中の前記関心粒子の存在を決定するステップを含みうる。
【００１５】
有効距離の決定は、
前記光学システムによって集束されるレーザビームにより基準点を照明するサブステップと、
試料の境界面上でのレーザビームの反射を表わすセンサ上の画像を取得するサブステップと、
センサ上に形成された画像の輝度に従って、光学システムの光学軸に平行な軸に沿った試料と光学システム間の有効距離を調整するサブステップとを含む。
【００１６】
典型的には、生物学的粒子は、試料の第２境界面に付着し、第１及び第２境界面は別個か又は混同される。
【００１７】
光学システムの光学軸に平行な軸に沿った、基準像と関連付けられた対物面の位置と、この軸に沿った第２境界面上の基準点の投射との間の距離は、例えば、＋５μｍから+２０００μｍ又は−５μｍから−２０００μｍである。
【００１８】
照明領域は、複数の生物学的粒子を含みうる。
【００１９】
第１の光源は、典型的には、２００ｎｍ未満のスペクトル幅を有する。
【００２０】
有利には、本発明による方法は、更に、前記一連の再生像を使用して、光学システムの光学軸に直角な平面内の関心粒子の位置を決定することを含む。
【００２１】
各再生像は、実部と虚部とによって構成され、実部と虚部のうち再生像の虚部だけが、光学システムの光学軸に平行な軸に沿った関心粒子と基準点間の距離を決定するために使用される。
【００２２】
各再生像は、前記オフセットによる有効パラメータの変化を示す関数を構成するように、光学システムの光学軸に沿ったオフセット及び有効パラメータの値と関連付けられてもよく、粒子と対物面間の距離の決定によって、注目値、詳細には前記関数の極値、変曲点又はゼロ通過の調査が実施される。
【００２３】
関心粒子と対物面間の距離の決定は、有利には、
対物面のオフセットの第１ステップと関連付けられた第１の一連の再生像を使用して、関心粒子と前記対物面間の概略距離を決定するサブステップと、
第１ステップより細かい対物面のオフセットの第２ステップと関連付けられた第２の一連の再生像を使用して、関心粒子と前記対物面間の正確な距離を決定するサブステップとを含む。
【００２４】
関心粒子と前記対物面間の距離を使用して、光学システムは、有利には、前記関心粒子に対して移動されて分析レーザビーム（３６３）が関心粒子上に集束される。
【００２５】
関心粒子と前記対物面間の前記距離を使用して、光学システムは、有利には、前記関心粒子に対して移動されて、平面画像内に位置された光検出器の合焦が調整される。
【００２６】
この方法は、更に、試料中にある生物学的粒子の数を数えるステップを含みうる。そのような生物学的粒子は、細菌、胞子、細胞、酵母又は微生物を含みうる。
【００２７】
本発明は、また、生物学的粒子、特に関心粒子を収容する試料を分析するための装置に関し、装置は、
第１の光源と、
光学システムとセンサを備え、センサが、光学システムの像平面内にあり、前記像平面が、光学システムによって対物面の共役である撮像ユニットと、
第１の光源と撮像ユニット間に配置された試料を収容するように構成された支持体と、
支持体を撮像手段に対して、光学システムの光学軸に平行な軸に沿って移動させるように構成された並進手段と、
計算手段と、
を備える。
計算手段は、
試料の第１境界面上又は光学システムの光学軸に沿った第１境界面から既知の距離に位置された基準点に関する情報を記憶するメモリに接続され、
前記対物面が前記基準点に対してオフセットされたときに、センサによって取得された、基準像と呼ばれる画像を入力として受け取り、
基準像を使用して、前記光学システムの光学軸に沿った対物面の所定のオフセットとそれぞれ関連付けられた一連の再生像をデジタル構成するように構成され、
光学システムの光学軸に平行な軸に沿った関心粒子と対物面間の距離を出力として供給する。
【００２８】
装置は、また、レーザを備え、このレーザは、光学システムの光学軸と合わされたレーザビームを提供するように構成され、レーザビームの集束点が対物面に一致するように光学システムに結合される。
【００２９】
本発明は、添付図面に関連して、単なる情報のために全く限定なしに提供される実施形態の記述を読むときによりよく理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】本発明による分析装置の第１の実施形態を示す図である。
【図２】本発明による分析装置の第１の実施形態を概略的に示す図である。
【図３】本発明による分析装置の第２の実施形態を示す図である。
【図４】本発明による分析装置の第２の実施形態を概略的に示す図である。
【図５Ａ】図４に示された方法の詳細を示す図である。
【図５Ｂ】図４に示された方法の詳細を示す図である。
【図５Ｃ】図４に示された方法の詳細を示す図である。
【図６】本発明による基準像の例を示す図である。
【図７】本発明による分析方法の第３の実施形態の詳細を示す図である。
【図８】本発明による方法の第４の実施形態で使用されるプロファイルを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本発明による分析方法と分析装置がまとめて記述され、本発明による分析装置は、本発明による分析方法を実施するように構成される。
【００３２】
図１は、本発明による分析装置１００の第１の実施形態を示す。図２は、分析装置１００で実施される本発明による分析方法の第１の実施形態を示す。
【００３３】
分析装置１００は、試料１１１を収容するように構成された支持体１１０を備える。
【００３４】
支持体１１０は、例えば、クランプ、透明板、又は光線を通す開口が穿孔された板である。
【００３５】
試料１１１は、透明又は半透明媒体、すなわち、可視スペクトル又はより一般には３００ｎｍ〜１０００ｎｍのスペクトルで７０％以上の透過率を有する媒体である。
【００３６】
試料１１１は、試料と、試料に直接接触している媒体との間の境界面、境界又は限界によって画定される。
【００３７】
試料は、水、緩衝液、試薬を含む液体、培地などの液体と、この液体中にある生物学的粒子１１２とから成る。あるいは、試料は、寒天培地などの固形培地と、この固形培地上に配置された生物学的粒子とから成る。別の代替案によれば、試料は、生物学的粒子が中にあるガスから成る。したがって、生物学的粒子は、試料内部にある（例えば、液体中にある）か、試料の表面と同一平面にありうる（例えば、寒天培地上にある）。
【００３８】
生物学的粒子１１２は、例えば、細菌、胞子、細胞、酵母又は任意のタイプの微生物を指す。そのような生物学的粒子の１つが、関心粒子１１２Ａと呼ばれる。
【００３９】
図１に示された例では、試料１１１は、下側スライド１１３（例えば、標準的な顕微鏡用スライド）、上側スライド１１４、及び試料１１１を横から取り囲み上側スライドと下側スライドをつなぐ接着剤１１５によって画定された流体チャンバ内に閉じ込められた培地を含む。上側及び下側スライド１１３，１１４は、可視域、及び適切な場合は他の有効波長で透明である。
【００４０】
試料と下側スライド１１３間の境界が、試料１１１の下側境界面１１６を定義する。上側スライド１１４と試料間の境界が、試料１１１の上側境界面１１７を定義する。
【００４１】
第１の光源１２０が、試料１１１の上流（第１の光源から試料１１１への光の伝搬方向で）にある。以下では、用語「上流」及び「下流」は、第１の光源１２０から試料１１１への光の伝搬方向を指す。
【００４２】
第１の光源１２０は、例えば、レーザ、発光ダイオード、白色電球、特に水銀灯（ろ波されるかどうかに関係なく）である。第１の光源は、下側スライド１１３の下で光を伝搬するための光ファイバを備えうる。
【００４３】
第１の光源１２０は、有利には時間干渉性である。第１の光源１２０は、有利には２００ｎｍ未満、更には１００ｎｍ未満、更には２５ｎｍのスペクトル幅を有する。
【００４４】
好ましくは、第１の光源１２０は、空間干渉性である。
【００４５】
以下では、第１の光源１２０の時間及び空間干渉性について更に詳細に示す。
【００４６】
第１の光源は、試料の領域１１９を透過照明する。関心粒子１１２Ａは、領域１１９内にある。
【００４７】
撮像ユニット１３０が、上側スライド１１４の下流（第１の光源から試料１１１への光の伝搬方向で）にある。示された実施形態では、撮像ユニット１３０は、試料１１１上にある。
【００４８】
撮像ユニット１３０は、光学システム１３１とセンサ１３２を含む。
【００４９】
光学システム１３１は、例えば、対物レンズ、詳細には顕微鏡対物レンズからなる。撮像ユニット１３０は、対物面１３３と像平面１３４を有する。像平面１３４は、光学システムによる対物面の共役（又は像）である。換言すると、対物面内にある物体は、像平面内の鮮明画像に対応する。
【００５０】
センサ１３２は、例えば、ＣＣＤ又はＣＭＯＳ型のマトリクスセンサである。センサ１３２は、像平面１３４内にある。したがって、センサ１３２は、対物面１３３の一部分の透過画像を得る。
【００５１】
無限平面構成では、対物面は、光学システムの物体焦点面であり、像平面は無限遠に広がる。近接光学素子（例えば、チューブレンズ）が、像平面をセンサ１３２上に合焦させることを可能にする。以下の説明では、用語「センサ１３２」は、センサ１３２とその近接光学素子をひとまとめにする。
【００５２】
光学システム１３１は、光学軸１３５を有する。光学軸は、対物面及び像平面に対して直角である。光学軸１３５は、試料１１１の深さを定義する。この軸は、試料１１１の下側及び上側境界面１１６，１１７をつなぐ。好ましくは、光学軸１３５は、下側及び上側境界面１１６，１１７に実質的に直角である。用語「境界面」は、研究試料１１１の境界を指す。
【００５３】
本発明による分析は、詳細には、光学軸１３５に平行な軸に沿った関心粒子１１２Ａの位置の決定を含む。
【００５４】
分析装置１００は、更に、撮像ユニット１３０を光学軸１３５に平行な軸に沿って移動させるように構成された並進手段１４０を備える。前に定義されたような無限平面構成では、並進手段１４０は、センサ１３２が固定されたままの状態で光学システム１３１だけを移動させうる。あるいは、並進手段１４０は、支持体１１０を光学軸１３５に平行な軸に沿って移動させるように構成される。
【００５５】
一実施形態によれば、並進手段１４０は、更に、光学軸１３５に直角な平面を定義する２つの他の軸に沿った並進を行う。
【００５６】
センサ１３２は、計算手段１５０、詳細にはプロセッサ又はマイクロプロセッサに接続される。
【００５７】
装置１００は、図２に概略図で示された本発明による方法を実施するように構成される。
【００５８】
方法は、基準点１１８を決定する第１ステップ２１を含む。このステップは、基準点１１８を選択又は定義することにある。この選択は、一般に任意である。
【００５９】
基準点は、試料１１１の第１境界面上又はこの第１境界面から既知の距離にあり、この距離は、光学軸１３５に沿って定義される。
【００６０】
詳細には、基準点は、上側境界面１１７又は下側境界面１１６上にある。図１に示された例では、基準点は、試料の上側境界面１１７上にある。
【００６１】
図示されてない代替案によれば、基準点は、試料の境界面上に接しておらず、境界面から既知の距離にある。例えば、基準点は、上側スライド１１４の、試料と反対側の面上にあり、上側スライド１１４の厚さは既知である。
【００６２】
装置１００において、計算手段１５０は、メモリ１５１に接続され、メモリ１５１は、基準点に関する情報、詳細には、光学軸１３５の平行な軸に沿った、この基準点と前記第１境界面間の距離と、必要に応じて、光学軸１３５に直角な平面内の基準点の座標を記憶する。
【００６３】
次に、試料１１１が、第１の光源１２０を使用して照明され、従って、試料内に前述したような照明領域１１９が形成される（ステップ２２）。
【００６４】
次に、照明領域１１９の透過画像が、撮像ユニット１３０を使用して取得される（ステップ２３）。この画像は、基準像と呼ばれる。この取得の際、対物面１３３は、関心点１１８からの既知の距離Ｄ１にあり、この距離は、光学軸１３５に平行な軸に沿って定義される。関心粒子１１２Ａは、対物面１３３の外側にある。好ましくは、基準像を取得する際、対物面は、試料１１１の外側にある。例えば、基準点１１８が上側境界面１１７上にあるとき、対物面は、基準点より５μｍ〜１５００μｍ、好ましくは５μｍ〜１０００μｍ、更には５μｍ〜８００μｍ上又は下（上流又は下流）にある。ここでやはり、距離は、光学軸１３５に平行な軸に沿って定義される。
【００６５】
一般に、基準像を取得する際、対物面は、試料１１１を定義する境界面から２μｍ超え、好ましくは５μｍ超える距離、好ましくは範囲［５μｍ〜１５００μｍ］、更には［５μｍ〜１０００μｍ］、更には［５μｍ〜８００μｍ］の距離にある。あるいは、粒子の位置に関するアプリオリ情報が入手可能である。その場合、対物面は、このアプリオリに対して、前に定義されたような値だけオフセットされる。
【００６６】
図１の示された実施形態では、アプリオリ情報の一例は、表面（例えば、試料１１１の範囲を定める上側スライド１１４）に付着する生物学的粒子の観察である。スライドの位置に関する知識は、粒子の位置に関するアプリオリを確立することを可能にし、粒子は、このスライドの、試料と隣接する面１１７に付着する。
【００６７】
基準像は、照明領域の一部分の画像であり、その理由は、基準像がこの照明領域から来る光線によって形成されるからである。基準像は、詳細には、第１の光源１２０から来て試料の生物学的粒子によって散乱された光線と、第１の光源１２０から来て散乱されることなく試料を通過した光線の干渉によって形成されるホログラムである。基準像は、詳細には、関心粒子と関連付けられたホログラムを含む。
【００６８】
装置１００において、計算手段１５０は、基準像を受け取るためにセンサ１３２に接続される。
【００６９】
ステップ２４で、一連の再生像のデジタル構成が実施される。各再生像は、対物面の、光学軸１３５に沿った基準像と関連付けられた対物面の位置に対する所定のオフセットに対応する。これらは、仮想オフセットであり、すなわち、デジタル構成によってシミュレートされ、物理的には実施されない。換言すると、各再生像は、対物面に対する所定のオフセットと関連付けられた再生面内で計算される。より正確には、各再生面は、対物面に対してこの所定オフセットだけオフセットされた対物面の画像（光学システムによる）に対応する。これは、一般にデジタル伝播（digital propagation）と呼ばれる。そのようなオフセットは、Ｄｉ１，Ｄｉ２，…Ｄｉｎ，Ｄｉ−１，…Ｄｉ−ｎと示される。好ましくは、オフセットは、対物面に対する２つの端位置間に広がり、これらの２つの端位置は、上側境界面１１７と、より一般には関心点を取り囲む。そのようなオフセットは、規則的ステップ、詳細には０．１０μｍ〜１μｍ（例えば、０．２５μｍ又は０．２０μｍ）のステップに従って分散されうる。したがって、センサ１３２によって取得される画像は、対物面が、基準像と関連付けられた対物面の位置から連続的に距離Ｄｉ１，Ｄｉ２，…Ｄｉｎ，Ｄｉ−１，…Ｄｉ−ｎにある場合に、デジタル形式で再生される。基準像は、実験的に取得された画像であり、一方、再生像は、デジタル伝播によって構成された画像を構成する。
【００７０】
これらのオフセットと関連付けられた２つの端位置間の差は、観察される試料１１１と、詳細にはその厚さに依存する。関心粒子の位置に関するアプリオリがないとき、２つの端位置は、試料１１１の両側にあるように決定される。試料内の関心粒子の位置に関するアプリオリがあるとき、２つの端位置は、この位置の両側に配置されるように確立される。
【００７１】
デジタル再構成は、基準像のフーリエ変換（前処理にかけられる可能性がある）を使用し、そのフーリエ変換に伝播演算子が適用された後で実空間に戻される。伝播演算子は、計算される再生像と関連付けられたオフセットの関数である。
【００７２】
本発明によれば、伝播演算子は、例えばレイリー・ゾンマーフェルト式に基づく積分である。
【００７３】
論文「3D Localization of weak scatterers in digital holographic microscopy using Rayleigh-Sommerfeld back-propagation」16 July 2012 / Vol.20, No 15 / OPTICS EXPRESS, 16735-16744, Wilsonらでは、ミクロスフェア画像を使用して実現されたデジタル伝播の例が記載されている。デジタル伝播の別の例は、Ｌｅｅらによる論文「Holographic microscopy of holographically trapped three-dimensional structures」19 February 2007 / Vol. 15, No. 4 / OPTICS EXPRESS 1505-1512に記載されている。
【００７４】
再生像は、複素画像であり、すなわち実部と虚部を有する画像である。再生像は１組の点を含み、画像の各点に複素マグニチュードが割り当てられる。
【００７５】
本発明による装置１００の計算手段１５０は、前述したように、基準像を使用して一連の再生像のデジタル構成を行うように構成される。
【００７６】
一連の再生像を使用して、関心粒子１１２Ａと基準点１１８間の距離が決定され、この距離は、軸１３５に平行な軸によって定義される（ステップ２５）。あるいは、この距離は、一連の再生像を使用して、関心粒子１１２Ａと対物面１３３間の距離Ｄｒｅｆに制限される。
【００７７】
これに関して、距離Ｄｒｅｆは、光学軸１３５に沿って、関心粒子１１２Ａと、基準像と関連付けられた対物面との間で計算される。光学軸１３５に沿ったこの対物面と基準点１１８間の距離Ｄ１が分かると、これから、光学軸１３５に沿った関心粒子１１２Ａと基準点１１８間の距離ＤＦが導出される。
【００７８】
光学軸１３５に沿った関心粒子１１２Ａと基準像と関連付けられた対物面との間の距離Ｄｒｅｆを決定するために、各再生像が有効パラメータの値と関連付けられ、この有効パラメータは、再生像に属する点の複素強度パラメータ（又は、複素振幅）の関数である。再生像の複素強度パラメータ（又は、複素振幅）は、例えば、再生像の虚部、実部、モジュラス又は位相である。好ましくは、有効パラメータのこれらの値は、プロファイルの形で収集され、このプロファイルは、光学軸１３５に沿った対物面１３３に対する各再生像のオフセットによる有効パラメータの値を表わす。
【００７９】
次に、このプロファイル上の注目値、例えば最大値、変曲点又はゼロ通過が求められる。この注目値は、光学軸１３５に沿った、関心粒子と、基準像と関連付けられた対物面１３３の位置との間のオフセットと関連付けられる。好ましくは、二次導関数による通過時の不確実性の影響を制限し（変曲点の検出）、測定バイアスの修正を克服する（ゼロ通過の検出）ために、調べられる注目値は、最大値と一般に極値であることが決められている。しかし、有効パラメータの注目値は、再生像と対物面１３３間のオフセットによるこのパラメータの変化を示す関数のゼロ通過、又はこの関数の変曲点、又は任意の他の基準でよい。
【００８０】
したがって、一般に、基準像の対物面１３３と関心粒子１１２Ａ間の距離Ｄｒｅｆは、連続した以下のステップ、すなわち、
基準像上で、前記関心粒子と関連付けられたホログラムを識別するステップと、
対物面１３３に対する複数の所定のオフセットＤｉ１，Ｄｉ２，…Ｄｉｎ，Ｄｉ−１，…Ｄｉ−ｎに関して、各オフセットにそれぞれ対応する再生像を取得するように、射影演算子を、前記基準像、又は前記ホログラムを構成する基準像の関心領域に適用することによって画像をデジタル再構成するステップと、
各再生像で、有効パラメータと呼ばれる画像の各点の複素数値を表わすパラメータを抽出するステップと、
この有効パラメータの変化を前記オフセットに従って分析し、この有効パラメータの注目値を識別するステップと、
この有効パラメータの前記注目値に対応するオフセットを決定し、関心粒子１１２Ａと対物面１３３間の距離Ｄｒｅｆがこのオフセットと等しいと見なされるステップとにより決定される。
【００８１】
対物面１３３と基準点１１８間の距離Ｄ１が分かれば、演算ＤＦ＝Ｄｒｅｆ−Ｄ１によって、関心粒子１１２Ａと基準点１１８間の距離ＤＦを導出できる。
【００８２】
各再生像上で有効パラメータを抽出することにより、画像を構成する様々な点を表すパラメータが、例えばそのような点のそれぞれと関連付けられた複素マグニチュードの合計又は平均をとることにより計算される。
【００８３】
有効パラメータは、画像を構成する様々な点の虚部の値を使用して決定された画像の虚部の自乗でよい。有効パラメータは、画像を構成する全ての点の虚部の自乗の平均に対応する。発明者は、そのようなパラメータが良好な位置決め精度を得ることを可能にすることが分かった。
【００８４】
撮像部に加えて、パラメータは、画像を構成する点の実部の値、そのモジュラス、又はそのような様々なマグニチュードの自乗を含みうる。発明者は、光学軸１３５に沿った関心粒子１１２Ａの位置を決定することを可能にすることを示し、この位置は、例えば、以下の有効パラメータの注目値に対応する。
最大値：光学軸１３５に沿って、虚部の自乗、モジュラス、又は画像のモジュラスの自乗の変化が見られるとき。
ゼロ通過：例えば、光学軸１３５に沿って、画像又はその自乗の実部の変化が見られるとき。
【００８５】
代替又は相補的に、前記関心パラメータの注目値を識別することにより、検討されるオフセット範囲で、媒体中の関心粒子１１２Ａの存在を判断でき、関心粒子１１２Ａと対物面間の距離Ｄｒｅｆは、必ずしも記憶されない。
【００８６】
各関心粒子１１２Ａに基準像上のホログラムが対応する。ホログラムに限定される関心領域を選択し、前述のステップをホログラムと関連付けられた各関心領域に適用できる。
【００８７】
計算手段１５０は、軸１３５に沿った関心粒子１１２Ａと基準点１１８間の距離ＤＦを出力として提供する。
【００８８】
デジタル伝播を利用して、取得される試料の画像の数を減らすことが可能である。詳細には、単一画像の取得で十分である。したがって、本発明による方法は、特に高速であり、自動化されうる。
【００８９】
場合によって、関心粒子が光学システムの対物面にあるときは、その画像を周囲媒体の画像から識別できない（周囲媒体は、関心粒子を取り囲む試料１１１の部分に対応する）。これは、例えば、関心粒子が、第１の光源のスペクトル内で同じ透過率又は近い屈折率（例えば、２０％以内）を有する媒体中にあるときに当てはまる。この場合、導入で述べたような先行技術による方法では、関心粒子の位置を決定できない。他方、本発明による再生像で関心粒子を識別でき、その理由は、この再生像が、取得された画像より多くの情報を含む複素画像だからである。したがって、本発明による方法により、粒子が光学システムの対物面にあるときに取得された画像内で周囲媒体から粒子を区別できないときでも、光学システムの光学軸に平行な軸に沿った粒子の位置を決定できる。
【００９０】
最後に、本発明による方法によって、光学軸１３５に沿って対物面の画像と位置を関連付けでき、この位置が高精度で決定される（ステップ２３で実施されたオフセットのステップと結合された）。そのような精度は、物理的及び非仮想オフセットを使用して容易に達成されない。
【００９１】
基準像は、本発明による関心粒子を定義する単一生物学的粒子のホログラムを含みうる。
【００９２】
あるいは、基準像は、幾つかの生物学的粒子のホログラムを含み、そのようなホログラムのうちの１つは、本発明による関心粒子を定義するために任意に選択され、再生像の一部分（すなわち、関心領域）が、そのようなホログラムの中心で使用される。
【００９３】
基準像を標準化する予備ステップを実施できる。このために、光学システムの欠点（内部反射、ほこりなど）を表わす、いわゆる背景画像が取得される。背景画像は、たとえば、画像を取得している間に対物面に平行な平面内で試料を移動させることにより取得される画像に対応する。あるいは、背景画像は、対物面に平行な平面内の試料の幾つかの位置に関して得られた幾つかの静止画像を使用して形成された平均画像である。基準像は、背景画像によって画素ごとに分割される。こうして標準化基準像が得られる。そのような標準化は、この方法の結果を改善する。
【００９４】
本発明の第１の代替案によれば、デジタル伝播は、直接使用される基準像を使用するか、前に定義された標準化基準像を使用して実行される。
【００９５】
オフセットｚと関連付けられた再生像は、以下のように示される。
【００９６】
Up(z) = TF-1{TF(U0)XH(z)}
【００９７】
ここで、Ｕ０はデジタル伝播を行うために使用される画像（ここでは、基準像又は標準化基準像）、ＴＦはフーリエ変換演算子、ＴＦ−１は逆フーリエ逆変換、Ｘは行列の項乗算（multiplication term by term）、Ｈはレイリー・ゾンマーフェルト積分に基づく伝播演算子である。
【００９８】
ここに示した例では、詳細には以下の式が得られる。
【００９９】
H(u,v,z) = exp[-|z|*Im(p(u,v)) + i*z*Re(p(u,v))]
【０１００】
ここで、
・Ｒｅは実部演算子、Ｉｍは虚部演算子、ｉ２＝−１であり、
・ｕとｖは、実空間内の軸１３５に直角な座標ｘ，ｙ平面と関連付けられたフーリエ空間内の座標であり、
【数１】
0006649379.tif 000002
である。
【０１０１】
座標ｕ及びｖは、以下のように定義される。
【０１０２】
【数２】
0006649379.tif 000003
【０１０３】
ここで、
・Δｐは、対物面内で定義されたサンプリングステップのサイズ（したがって、センサ１３２の画素ピッチ及び光学システム１３１の拡大率に関連する）、
・ＮｘとＮｙは、画像Ｕ０内のそれぞれｘ，ｙによる画素数、
・λは、第１の光源の中心波長である。
【０１０４】
光学システムの光学軸に沿った関心粒子の位置は、各再生像Ｕｐ（ｚ）の虚部を用いて決定される。詳細には、再生像又は再生像の一部分が求められ、そのうち虚部の自乗（すなわち、画像を構成する様々な点の虚部の自乗の平均値）が最大である。再生像の一部分は、関心粒子の画像に中心がある再生像の部分である。基準像が、幾つかの生物学的粒子に関する場合、同じ基準像を使用して、異なる生物学的粒子に中心がある時間ごとの再生像を使用することによって、そのような生物学的粒子それぞれの位置を決定できる。
【０１０５】
図３と図４に関連して、ここで本発明による方法及び装置３００の第２の実施形態について述べる。図３については、図１との違いのみ説明する。
【０１０６】
図１の参照番号１１１，１２０，１１２Ａ，１１６，１１７，１１８，１３０，１３１，１３２，１３５，１２０，１５０，１５１は、それぞれ図３の参照番号３１１，３２０、３１２Ａ，３１６，３１７，３１８，３３０，３３１，３３２，３３５，３２０，３５０，３５１に対応する。
【０１０７】
図３による装置を図１による装置と区別する特徴のそれぞれを分離し、図１の装置と独立に組み合わせて、本発明の多数の他の代替案を構成できる。
【０１０８】
図３に示されたような有利な実施形態によれば、生物学的粒子は、試料の第２境界面に直接付着する。
【０１０９】
軸３３５に平行で基準点３１８を通る直線が、この第２境界面を通る。
【０１１０】
この第２境界面は、有利には、前に定義されたような第１境界面と混同される。反対の場合、光学軸１３５に平行な軸に沿った第２境界面に対する第１境界面の位置は、既知であることが好ましい。詳細には、この位置は、光学軸１３５に平行で基準点３１８を通る軸に沿って延びる。
【０１１１】
そのような知識として、生物学的粒子に対して基準点３１８の光学軸３３５に沿った位置に関するアプリオリがある。
【０１１２】
第２境界面は、軸３３５に実質的に直角である。これは、詳細には、試料の下側又は上側境界面３１６，３１７である。
【０１１３】
実際には、例えば以下のものが調べられる。
・寒天培地、寒天培地の上側面に広がる生物学的粒子、又は
・試料を覆うスライド上に自然に付着する生物学的粒子。前記スライドは試料の上に配置される。
【０１１４】
図３に示された例では、生物学的粒子は、上側境界面３１７に付着する。
【０１１５】
上側境界面は、軸３３５に直角な平面に対して比較的わずかな角度、典型的には０．１ｒａｄ未満、更には０．０５ｒａｄ又は０．０２ｒａｄ度傾けられる。
【０１１６】
本発明による方法は、試料の上側境界面を定義する上側スライドが、軸３３５に直角の平面に対して傾けられたとき、軸３３５に沿った生物学的粒子の位置決めの不確実性を克服することを可能にする。
【０１１７】
より一般的には、本発明による方法は、試料の上側境界面を定義する上側スライドが、軸３３５に直角の平面に対して変形されたときに、軸３３５に沿った生物学的粒子の位置決めの不確実性を克服することを可能にする。この変形は、光学軸３３５に垂直で、この軸に沿って少なくとも１００μｍ、更には５０μｍ未満離された２つの平面によって範囲が定められた円筒内にある前記第２境界面に付着する生物学的粒子などの任意の変形を指しうる。
【０１１８】
好ましくは、光学軸３３５に平行な軸に沿った、基準像と関連付けられた対物面の位置と、この軸による第２境界面上の基準点３１８の投射との間の距離は、＋５μｍ〜＋１５００μｍ、又は−５μｍ〜−１５００μｍである。有利には、この距離は、＋５μｍ〜＋１０００μｍ又は−５μｍ〜−１０００μｍ、更には＋５μｍ〜＋８００μｍ又は−５μｍ〜−８００μｍ、更には＋５μｍ〜＋２００μｍ又は−５μｍ〜−２００μｍである。これにより、最適デフォーカス範囲が定義され、関心粒子と基準点間の距離の計算が容易になる。
【０１１９】
生物学的粒子が、前記第２境界面に付着し、高さが限られた円筒内にあるので、基準像を取得する際に、関心粒子が、最適デフォーカス範囲内にある対物面から遠くにあることを保証し易い。
【０１２０】
最適デフォーカス範囲の幅は、第１の光源３２０の特性、詳細にはその時間及び空間干渉性に依存しうる。
【０１２１】
したがって、第１の光源を、光学軸３３５に沿って調べようとする幾つかの関心粒子間の距離に従って、そのような関心粒子が最適デフォーカス範囲内に同時にあるように構成させうる。
【０１２２】
例えば、白色光光源を、＋５μｍ〜＋２００μｍと−５μｍ〜−２００μｍの最適デフォーカス範囲に使用できる。第１の光源のスペクトル幅が制限されるほど最適デフォーカス範囲の幅が大きくなる。
【０１２３】
更に、第１の光源３２０の見掛けの直径が小さいほど最適デフォーカス範囲が広くなる。
【０１２４】
図３に示された例では、分析装置３００は、光学軸３３５に平行な軸に沿った、基準点と、基準像と関連付けられた光学システムの対物面の位置との間の距離を決定する手段を備える。この距離は、有効距離と呼ばれる。
【０１２５】
これらの手段は、詳細には、基準点３１８を照明するように構成されたレーザ３６０を含む。レーザビーム３６３で基準点３１８を照明しないとき、並進板３６２に接続されたシャッタ３６１が、レーザの出力を閉じることを可能にする。
【０１２６】
レーザビーム３６３は、光学軸３３５に平行な軸に沿って基準点に入射すると有利である。
【０１２７】
レーザビーム３６３とイメージセンサ３３２は、レーザビームの集束点がセンサの対物面に一致するように同一光学システム３３１に光学的に結合される。
【０１２８】
図３に示された例では、基準点は上側境界面３１７上に位置され、その理由は、レーザビーム３６３が上側境界面３１７を通って試料に侵入するからである。
【０１２９】
レーザビーム３６３は、第１の分離スライド３７１を通過し、第２の分離スライド３７２で反射された後、上側境界面３１７に達する。各分離スライドは、二色性スライドでよい。あるいは、立方体又は半反射鏡が使用される。
【０１３０】
有効距離は、図４に示された以下のサブステップを実行することによって決定される。
【０１３１】
サブステップ４１で、基準点３１８が、レーザビームを使用して照明される。
【０１３２】
次に、センサ３３２が基準点上のレーザビーム３６３の鏡面反射によって形成されるスポットの画像を受け取るように、詳細には光学軸３３５に平行な軸に沿った試料と光学システム３３１間の距離が調整される（サブステップ４２）。この調整は、図１に関して述べた並進手段３４０の支援により実行されうる。
【０１３３】
実際には、基準点３１８の定義は、光学軸３３５に直角な平面内のレーザビーム３６３の任意の位置に依存しうる。
【０１３４】
この調整は、基準点を受ける表面でのレーザビーム３６３の鏡面反射の検出を実施する。そのような調整の例は、図５Ａ〜図５Ｃに示され、基準点は上側境界面３１７にある。
【０１３５】
画像５Ａは、上側境界面３１７より上の対物面５３３の位置に対応する。センサ上に得られた画像は、あまり明るくない大きいスポットである。
【０１３６】
画像５Ｂは、上側境界面３１７上の対物面の位置に対応する。センサ上に得られた画像は、狭くてきわめて明るいスポットである。
【０１３７】
画像５Ｃは、上側境界面３１７より下の対物面の位置に対応する。センサ上に得られた画像は、あまり明るくない大きいスポットである。
【０１３８】
光学システムを軸３３５に沿って移動させることによって、連続的に以下のものが観察される。
・あまり明るくない大きいスポット。
・第１の狭くきわめて高輝度のスポット。このスポットは、上側スライド３１４の、試料と反対側の面３１５上に光学システム３３１によって集束されたレーザビーム３６３の反射に対応する。このスポットは最大輝度を示す。
・第２の狭くて高輝度のスポット。このスポットは、上側スライド３１４の面３１７上に光学システム３３１によって集束されたレーザビーム３６３の反射に対応する。この面は試料に隣接し、したがってその境界面の１つを構成し、このスポットは第２の最大輝度を有する。
・試料３１１内のレーザビームの後方散乱に対応するあまり明るくない大きいスポット。
【０１３９】
したがって、光学システム３３１と試料３１１との相対的隔離によるレーザビームの鏡面反射信号の光強度の変化の分析は、基準点３１８の位置を決定することを可能にし、基準点３１８は、この例では、ビームを反射できる面（ここでは、面３１７又は面３１５）によるレーザビームの集束点に対応する。
【０１４０】
前述の例では、鏡面反射の最大輝度画像と、鏡面反射の第２最大輝度を有する画像は、対物面がレーザビームの交点を通る構成に対応し、それぞれ上側スライド３１４の試料と反対側の面と、上側スライド３１４の試料に隣接する面である。
【０１４１】
光学システムが液浸対系対物レンズによって構成されたときでも見えるように、上側スライドの試料に隣接した面上のレーザビームの反射を検出することが特に興味深いことが分かる。
【０１４２】
この方法は、光学軸３３５に沿って既知の距離だけ移動させるサブステップ４３を含みうる。支持体は、撮像手段に対して試料を収容する。ここでまた、図１に関して述べたような並進手段を使用できる。このサブステップは、関心粒子を前に定義されたような最適デフォーカス範囲内にあるようにするのに役立つ。
【０１４３】
図３は、上側境界面３１７で反射され光学システム３３１によってセンサ上に結像されたレーザビーム３６４を示す。反射レーザビーム３６４は、第２の分離スライド３７２で反射され、次に第１の分離スライド３７１で反射される。
【０１４４】
計算手段３５１は、シャッタ３６１が開き、第１の光源３２０が消されたときに、センサ３５１によって取得される画像を入力として受け取る。計算手段３５１は、並進手段３４０を制御して、サブステップ４２と、適切な場合にサブステップ４３を実施する。
【０１４５】
好ましくは、本発明による方法は、また、一連の再生像を使用して、光学システムの光学軸に直角の平面内の関心粒子の位置を決定することを含む。そのような決定の一例は、図７に関して更に詳しく述べられる。
【０１４６】
並進手段３４０は、光学軸３３５に直角な平面を共に定義する２つの軸に沿った並進を実行できる。したがって、同じ試料の幾つかの関心粒子を連続的に位置決めできる。基準点を決定する単一ステップの後で、前述したような以下の一連のステップが数回実施される。
・試料の領域を照明するステップ。
・基準像を取得するステップ。
・一連の再生像をデジタル構成するステップ。
・関心粒子と基準点間の距離を決定しかつ／又は基準像又は関心粒子の１つ又は幾つかの再生像を使用して数と位置を検出するステップ。
【０１４７】
２つの連続したこれらのステップ間で、試料は、光学軸３３５に直角な平面内で並進される。
【０１４８】
図３は、また、本発明による方法及び装置で実施される分析の追加ステップを示すことを可能にする。
【０１４９】
装置３００は、関心粒子にレーザビーム３６３のウエスト（すなわち、レーザビームの直径が最も狭い場所）を位置決めする手段を備える。
【０１５０】
反応で関心粒子から出される放射は、光学システム３３１によって収集され、この放射を分析する分光計３８０によって受け取られる。分光計３８０は、例えば、ラマン散乱に基づいて分析する分光計又は蛍光分光計である。このタイプの分析では、励起レーザビームが、調べられる粒子上の中心にあることが望ましい。これは、粒子の近くでのラマン散乱スペクトルの外乱を防ぐ。
【０１５１】
レーザビーム３６３のウエストの位置決めは、試料を撮像手段３３１に対して移動させるように構成された並進板（図示せず）などの並進手段の支援により実行される。そのような並進手段は、並進手段３４０によって構成されうる。並進手段は、計算手段３５０によって制御される。計算手段３５０は、基準点に対する関心粒子の位置を使用して、光学システム３３１の対物面を関心粒子上に位置決めする。
【０１５２】
詳細には、撮像手段は、関心粒子に対して移動されて撮像手段の光学軸に直角の平面に分析レーザビームを集束させ、この平面は前記関心粒子を収容し、分析レーザビームのウエストは、この平面内で関心粒子上に正確に乗るように移動される。
【０１５３】
関心粒子上のレーザビームの正確な位置決めを必要とする他のタイプの分析を検討できる。レーザ３６０とは別のレーザ光源が、関心粒子を分析するために使用されうる。
【０１５４】
同じように、光学システム３３１に光学的に結合された光検出器３３２は、例えば、励起信号に応じて関心粒子１１２Ａから出される蛍光信号を収集するために使用されうる。前述した距離のうちの１つの知識（ＤＦ又はＤｒｅｆ）が、粒子上の光学システムの集束を可能にし、これにより、光検出器３３２による蛍光信号の収集が最適化される。
【０１５５】
ほとんどの場合、媒体は、複数の関心粒子を含む。第１フェーズで、試料の各関心粒子１１２Ａに対応する距離Ｄｒｅｆ又はＤＦが決定され記憶される。第２フェーズで、光学システム３３１の相対位置決めが、この光学システムの対物面が関心粒子を含むように調整される。この調整は、分析を最適化するために各関心粒子に連続的に実行される。
【０１５６】
図６は、本発明による基準像の例を示す。横座標及び縦座標の軸は、画素で目盛られている。幾つかの回折パターン６１が区別され、それぞれ生物学的粒子と関連付けられる。
【０１５７】
ここで、図７を参照し、第１の一連の再生像を使用して、光学システムの光学軸に平行な軸に沿った関心粒子と基準点の間の距離を決定するために実施されるステップの詳細な例について述べる。
【０１５８】
示された例では、前述したような実施形態であり、以下の式が得られる。
【０１５９】
H(u,v,z) = exp[-|z|*Im(p(u,v)) + i*z*Re(p(u,v))]
【０１６０】
次に、以下のサブステップが実行される。
【０１６１】
サブステップ７１：
第１の一連の再生像の再生像ごとに、虚部の自乗の計算が行われる。第１の一連のいわゆる有効再生像が得られる。したがって、再生像の虚部の自乗は、対応する有効再生像の輝度を定義する。
【０１６２】
サブステップ７２：
各有効再生像は、同じ画素マトリクスに対応する。有効再生像によって各画素と関連付けられた輝度が異なる。
【０１６３】
画素ごとに様々な有効再生像上の輝度から最大輝度が選択される。こうして最大値の画像が形成される。
【０１６４】
同様に、最小値の画像が形成される。
【０１６５】
次に、最大値の画像と最小値の画像との差に対応する勾配７２０の画像が計算される。
【０１６６】
このステップは、第１のマトリクスを使用して行なうことができ、そのうちある次元は画素に対応し、他の次元は、有効再生像と関連付けられた対物面のオフセットに対応する。このオフセットは、以下で軸（Ｏｚ）と呼ばれる光学システムの光学軸に沿って測定される。
【０１６７】
例えば、有効再生像がそれぞれ、幅Ｘ画素と高さＹ画素を有し、Ｎ個の有効再生像が再構成される場合、第１マトリクスはＸＹ列とＮ行を有する。
【０１６８】
次に、最小値の画像は、第２マトリクスのＸＹ列と１行に対応する。最大値の画像は、第３マトリクスのＸＹ列と１行に対応する。勾配の画像は、第４マトリクスのＸＹ列と１行に対応し、これは、第３マトリクスと第２マトリクスの差に等しい。
【０１６９】
サブステップ７３：
軸（Ｏｚ）に沿った強い輝度勾配を有する画素が選択される。これらの画素と関連付けられた平均勾配が定義される。この平均勾配の最大値の位置は、軸（Ｏｚ）に沿った生物学的粒子の位置を大雑把に定義する。
【０１７０】
これを行うため、第４マトリクスで、最高値（例えば、第１の百分位数）を有する列が選択されうる。このようにして一連のＭ個の画素が定義される。次に、第１マトリクス内のこれらの画素が選択され、軸（Ｏｚ）に沿った同じオフセットと関連付けられた選択された画素が組み合わせられる（例えば、合計又は平均）。こうして第５マトリクスのＮ行と１列が形成される。
【０１７１】
次に、この第５マトリクスの値の内の最大値が調べられ、軸（Ｏｚ）に沿ったオフセットが示され、この最大値と関連付けられる。
【０１７２】
図７３０は、プロファイルの形の第５マトリクスを示し、横座標の軸が軸（Ｏｚ）に沿ったオフセットであり、縦座標の軸が第５マトリクス上の対応する値である。
【０１７３】
サブステップ７３は、基準像上に画像化された幾つかの生物学的粒子の軸（Ｏｚ）に沿った平均位置を定義する。この平均位置は、生物学的粒子が軸（Ｏｚ）に直角の同一平面内に実質的にあることを仮定することにより、本発明による関心粒子の概略位置を定義する。
【０１７４】
この軸に沿った強い勾配をそれぞれ有する画素の選択と関連した軸（Ｏｚ）に沿った勾配が利用される。したがって、この選択と関連付けられた勾配の最大値の検出がますます容易になる。
【０１７５】
サブステップ７４：
第１の一連の有効再生像の画像から、サブステップ７３で計算された軸（Ｏｚ）に沿った位置と関連付けられた画像が選択される。
【０１７６】
二値画像７４０を得るために、この画像に対して閾値化が行われる。閾値化によって明らかにされた二値物体の座標が検出される。こうして、各生物学的粒子の概略位置が、軸（Ｏｚ）に直角の平面内で計算される。このステップは、各二値物体と、したがって各生物学的粒子の概略幾何学形状を更に計算するために、各二値物体を楕円によって補間するステップを含みうる。
【０１７７】
関心粒子は、二値物体のうちの１つを任意に選択することによって任意に選択される。したがって、関心粒子の概略位置が、軸（Ｏｚ）に直角の平面内で決定された。
【０１７８】
二値画像７４０上で、この単一二値物体を含む関心領域が定義される。関心領域は、画素の位置によって定義される。関心領域は、例えば、１６×１６画素の自乗である。
【０１７９】
サブステップ７５：
このステップは、各有効再生像内で、前に定義されたような関心領域に対応する領域を選択することによって、第１の一連の有効再生像を使用して実行される。
【０１８０】
あるいは、このステップは、第２の一連の有効再生像を使用して実行される。第２の一連の有効再生像の各画像は、第２の一連の再生像の画像の虚部の自乗によって形成される。
【０１８１】
第２の一連の再生像は、第１の一連の再生像のサンプリングステップより少ない、軸（Ｏｚ）に沿ったサンプリングステップと関連付けられる。第２の一連の再生像の各画像は、前に定義されたような関心領域に対応する。第２の一連の再生像と関連付けられた軸（Ｏｚ）に沿ったサンプリング範囲の広さは、第１の一連の再生像と関連付けられたサンプリング範囲の広さより小さい。第２の一連の再生像は、関心粒子の正確な位置を調べるためだけに計算されうる。
【０１８２】
サブステップ７２及び７３は、軸（Ｏｚ）に沿った関心粒子の正確な位置を計算するために、第２の一連の有効再生像に実行される。
【０１８３】
図７５０は、第１の一連の有効再生像を第２の一連の有効再生像と置き換えることによって、図７３０に対応する。
【０１８４】
サブステップ７６：
関心粒子の正確な位置が、軸（Ｏｚ）に直角の平面内で計算される。
【０１８５】
このため、第２の一連の有効再生像の画像から、軸（Ｏｚ）に沿った関心粒子の正確な位置と関連付けられた画像が選択される。
【０１８６】
新しい二値画像を得るために、この画像に対して閾値化が行われる。次に、閾値化によって明らかにされた二値物体の中心の座標が検出される。
【０１８７】
多くの代替案が検討されうる。
【０１８８】
詳細には、前述したような実施形態を検討でき、次の式が得られる。
【０１８９】
【数３】
0006649379.tif 000004
【０１９０】
したがって、有効再生像は、対応する再生像のモジュラスの自乗であると定義される。
【０１９１】
次に、前述のステップに類似のステップが実行され、その違いは、軸（Ｏｚ）に沿った位置の調査で、標準偏差の最大値を有する有効再生像の調査が行われることである。
【０１９２】
別の代替案によれば、前述のような実施形態を検討でき、次の式が得られる。
【０１９３】
【数４】
0006649379.tif 000005
【０１９４】
この場合、各有効再生像は、対応する再生像のモジュラスの自乗であると定義される。
【０１９５】
次に、勾配の画像が、前に定義されたように形成され、閾値化によって、軸（Ｏｚ）に直角の平面内で生物学的粒子の概略位置が導出される。ここで閾値化によって得られた画像は、第１の閾値化画像と呼ばれる。したがって、詳細には、関心粒子の概略位置が、軸（Ｏｚ）に直角の平面内で定義される。
【０１９６】
第１の閾値化画像で、生物学的粒子と関連付けられた第１の二値物体が任意に選択される。この単一の二値物体を収容する第１の関心領域が定義される。
【０１９７】
次に、この第１の関心領域に対応する領域が、各有効再生像内で選択される。そのように作成された第１の関心領域の一連の画像を使用して、最大標準偏差値を有する画像の軸（Ｏｚ）に沿った位置が求められる。全ての生物学的粒子が、軸（Ｏｚ）に直角の同一平面内に実質的にあると仮定して、この位置は、軸（Ｏｚ）に沿った関心粒子の概略位置を定義する。
【０１９８】
次に、勾配の画像に戻り、第１の閾値化画像を形成するために使用される閾値より大きい閾値（例えば、１．５倍大きい）を有する第２の閾値化画像が形成される。第２の閾値化画像内で、関心粒子が、第２の二値物体を任意に選択することによって定義される。この第２の二値物体の中心を調べることによって、軸（Ｏｚ）に直角な平面内の関心粒子の正確な位置が導出される。
【０１９９】
この第２の閾値化画像を使用して、この単一の第２の二値物体を収容する第２の関心領域が定義される。次に、各有効再生像内で、この第２の関心領域に対応する領域が選択される。そのように作成された一連の画像を使用して、最大標準偏差値を有する画像の軸（Ｏｚ）に沿った位置が求められる。この位置は、軸（Ｏｚ）に沿った関心粒子の正確な位置を定義する。
【０２００】
図８は、本発明の特定の事例を示すために使用される。図１の参照数字が参照される。
【０２０１】
軸１３５に平行な軸に沿った関心粒子と基準点の間の距離を決定するために、この軸に沿った距離が、関心粒子と、基準像と関連付けられた対物面との間で計算される。
【０２０２】
実際には、この計算は、関心粒子と、基準像と関連付けられた対物面との間で、軸１３５に平行な軸による距離の絶対値を決定することを可能にする。次に実験的実装が分かるどちらか一方の符号が選択される。
【０２０３】
例えば、
基準点が上側境界面１１７より上にある場合と、
基準像と関連付けられた対物面が、上側境界面１１７より上にある場合は、
関心粒子が、基準像と関連付けられた対物面の下にあることが分かる。
【０２０４】
この距離の符号を確実に決定できないときは、再生像の実部に関する軸（Ｏｚ）に沿ったプロファイルを使用できる。次に、前述のような実施形態を検討でき、次の式が得られる。
【０２０５】
H(u,v,z) = exp[-|z|*Im(p(u,v)) + i*z*Re(p(u,v))]
【０２０６】
詳細には、以下のステップを実行できる。
・一連の再生像を使用して、一連の第２の画像を決定するステップ。各第２の画像が、対応する再生像の実部によって構成される。
・図７に示されたサブステップ７２と同じように、一連の第２の画像（三次元を有するマトリクス）を二次元を有するマトリクスに変換し、そのうち１つの次元が画素に対応し、他の次元が軸（Ｏｚ）に沿ったオフセットに対応するステップ。
・二次元を有する前記マトリクスで、軸（Ｏｚ）に沿った強い輝度勾配を有する画素を選択するステップ。これにより、そのような画素と関連付けられた平均勾配が定義される。この勾配は、図８に示される。横座標の軸は、軸（Ｏｚ）に沿ったオフセット、詳細には、基準像と関連付けられた対物面の位置に対する対物面のオフセットである。縦座標の軸は、第２の画像の実部に関する。
・プロファイルの形により、関心粒子と、基準像と関連付けられた対物面との間で、軸１３５に平行な軸による距離の符号が決定されるステップ。
・増分横座標に関して、正最大から負最小に移動する場合（図８の場合）、基準像は、対物面より上にある（光の伝搬方向で）。
・増分横座標に関して、負最小値から正最大値に移動する場合（図８の場合）、基準像は、対物面より下にある（光の伝搬方向で）。
【０２０７】
本発明は、前述した実施例に限定されず、本発明の範囲から逸脱せずに多くの代替案を検討できる。例えば、一連の再生像をデジタル構成するステップは、例で示されたもの以外の伝播演算子を実施できる。また、基準像と関連付けられた対物面と関心粒子との距離を導出するために、一連の再生像を様々な方法で利用できる。
【符号の説明】
【０２０８】
１００，３００：装置
１１１，３１１：試料
１１２：生物学的粒子
１１２Ａ：関心粒子
１１６，１１７，３１６，３１７：第１境界面
１１８，３１８：基準点
１１９：照明領域
１２０，３２０：光源
１３１，３３１：光学システム
１３２，３３２：センサ
１３３，３３３：対物面
１３５，３３５：光学軸
【図１】
0006649379.tif 000006
【図２】
0006649379.tif 000007
【図３】
0006649379.tif 000008
【図４】
0006649379.tif 000009
【図５Ａ】
0006649379.tif 000010
【図５Ｂ】
0006649379.tif 000011
【図５Ｃ】
0006649379.tif 000012
【図６】
0006649379.tif 000013
【図７】
0006649379.tif 000014
【図８】
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