(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０２８で寄託されたＴｈａｌａｓｓｏｓｐｉｒａ  ｓｐ．のＨＪ  ６．０３．１５株。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、発電細菌、及び海成堆積物（marine sediment）から発電細菌を選択するための方法に関する。特に、本発明は、発電性であって炭素基質を還元し、これにより電流を発生させることができるＴｈａｌａｓｓｏｓｐｉｒａ細菌に関する。
【背景技術】
【０００２】
細菌は一群として、広範な供給源から呼吸代謝用の電子を得、そして同様に、同じくらい多種多様のアクセプター分子にこれらの電子を伝達する。発電性であること、すなわち外部固体電子アクセプターを還元できることが認められている細菌は増加している。生物工学的観点からは、発電細菌は、微生物燃料電池（ＭＦＣ）の嫌気性の環境で効率的に化合物を酸化でき、これに伴い電流を発生させるので関心対象となる。
【０００３】
発電細菌の間では、外部電子アクセプターを還元するために様々な機構が採用されている。２種の「ナノ細線」、すなわち、Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．に認められるＩＶ型線毛と、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．に認められる外膜ヘムタンパク質伸長体（extensions）とが同定されており、これらにより細胞は細胞膜呼吸タンパク質から電子を伝達することができる。細菌は、付着したバイオフィルムとして固体電子アクセプター表面に安定に関連しうるか、又は細菌が電子を渡すこととアクセプター近傍で遊泳することの間を循環する動的プロセスである「エレクトロキネシス」によって一過性的に関連しうる。いくつかの細菌は、拡散性電子担持シャトル分子（これらのうちのいくつかは種間で交換可能である）を介して外部固体電子アクセプターを還元することもできる。外部に電子を伝達するための機構は、他にも未同定のものがほぼ確実に存在する。電子生成細菌（electrogen）をスクリーニング及び単離するための手段の開発は、このような機構の発見の一助となるはずである。
【０００４】
本発明者らは、いくつかの外部アクセプターが磁性である（たとえば、酸性条件下のマグネタイト）ので、発電細菌は磁気粒子に伴って見出され得ると推論した。本明細書において、本発明者らは海洋潮堆積物（marine tidal sediment）の磁気粒子濃縮（magnetic particle-enriched）部分由来の発電細菌Ｔｈａｌａｓｓｏｓｐｉｒａ  ｓｐ．  ＨＪ株の単離及び部分的特性解析を説明する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】ＵＳ ２０１３／０００８８０１
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Rowe, Annette R., et al. "Marine sediments microbes capable of electrode oxidation as a surrogate for lithotrophic insoluble substrate metabolism." Frontiers in Microbiology 5 (2015): 784.
【発明の概要】
【０００７】
本発明の一態様において、磁気粒子濃縮された海成堆積物から微生物群集を得るための方法が提供される。本発明の別の態様において、還元的発電挙動を示すＴｈａｌａｓｓｏｓｐｉｒａ細菌が提供される。特に、提供されるのは新規な株、Ｔｈａｌａｓｓｏｓｐｉｒａ  ｓｐ．  ＨＪ  ６．０３．１５株である。
【０００８】
より詳細には、本発明は、海洋潮堆積物の磁気粒子濃縮部分由来の細菌に関する。
【０００９】
前記細菌の特定の実施形態では、この細菌は発電性でありかつ炭素基質を還元し、これにより電流を発生させることができる、Ｔｈａｌａｓｓｏｓｐｉｒａ細菌である。
【００１０】
前記Ｔｈａｌａｓｓｏｓｐｉｒａ細菌の特定の実施形態では、細菌は受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０２８で寄託されたＴｈａｌａｓｓｏｓｐｉｒａ  ｓｐ．のＨＪ  ６．０３．１５株である。
【００１１】
別の態様では、本発明は、
Ｔｈａｌａｓｓｏｓｐｉｒａ細菌と
炭素基質と
を含む、電気発生用組成物に関する。
【００１２】
前記組成物の特定の実施形態では、炭素基質は炭化水素である。
【００１３】
前記組成物の特定の実施形態では、炭化水素は油流出由来の石油である。
【００１４】
別の態様では、本発明は、細菌を含む微生物燃料電池に関する。
【００１５】
別の態様では、本発明は、電流を発生させるための方法に関し、この方法は、炭素基質を含有する培地において細菌を培養する工程を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】堆積物からの磁気粒子の濃縮、並びにマリンブロス培地及び微生物燃料電池の接種のための手順を示すフロースキームである。
【図２】海中道路ビーチ（日本の沖縄）から得られた潮汐浜堆積物（tidal beach sediment）由来の培養物を接種した微生物燃料電池からの電気出力。総アノード表面積、１５１cm2（アノードあたり７５．５cm2）；１７５mL容量。プロットした線は、混合培養物が接種されたＭＦＣ及びＨＪ株が接種されたＭＦＣからの活性を示す；Ｒ、右、及びＬ、左アノード−カソード対。
【図３】種々の特徴を示すＴｈａｌａｓｓｏｓｐｉｒａ  ｓｐ．  ＨＪ株の透過型顕微鏡写真。（Ａ）単一の極鞭毛；（Ｂ）細胞内電子高密度領域；（Ｃ）対称性細胞分裂；及び（Ｄ）非対称性細胞分裂。代表的な画像を示す。
【図４】ＨＪ株及び選択されたアルファプロテオ細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列に基づく系統樹。系統樹は、ＰｈｙＭＬ ３．０の最尤推定法を用いたＭＵＳＣＬＥによりアラインメントされた配列から構築された。スケールバーは、ヌクレオチド部位あたりの置換の単位で測定された進化距離を反映する。
【図５】Ｔｈａｌａｓｓｏｓｐｉｒａ  ｓｐ．  ＨＪ株、Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ  ｄａｌｔｏｎｉｉ、及びＤｅｓｕｌｆａｍｐｌｕｓ  ｍａｇｎｅｔｏｍｏｒｔｉｓの純粋培養物、又は１ｇ  Ｌ-1アジ化ナトリウムを含む培地のみ（コントロール）が接種された微生物燃料電池からの電圧及び電流読み取り値（±範囲；ｎ＝２）。アノード表面積、１９．６cm2；１７５ml容量。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
＜定義＞
本願明細書で使用する場合、「Ｔｈａｌａｓｓｏｓｐｉｒａ」の用語は、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌａｃｅａｅ科に含まれる細菌の属をいう。
【００１８】
本願明細書で使用する場合、「電気発生」又は「発電性」の用語は、生命体による電気の発生をいう。
【００１９】
本願明細書で使用する場合、「炭素基質」の用語は、所望の炭素最終生成物へと引き続き変換されるための中間体に、酵素により変換されることのできる少なくとも１つの炭素原子を含有する物質をいう。炭素基質の例としては、バイオマス、デンプン、デキストリン類、糖類、炭化水素、石油、及び放流排水が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい例は、炭化水素、石油及び放流排水である。
【００２０】
本願明細書で使用する場合、「炭化水素」の用語は広く、主に且つ／又は実質的に炭素及び／又は水素原子を含む物質をいう。炭化水素はさらに、窒素、酸素、硫黄及び／又は金属などの他の原子を含むことができる。炭化水素の供給源としては、化石燃料、原油、バイオマス、石油、及び放流排水、合成反応及び／又は任意の他の好適な材料の供給源を含むが、これらに限定されない。
【００２１】
本願明細書で使用する場合、「石油」の用語は、鉱物又は地質学的供給源から得られた炭化水素をいう。
【００２２】
本願明細書で使用する場合、「油流出」の用語は、保持されていた一定量（contained volume）の液体ベース炭化水素が環境中へ放出されることをいう。油流出の例としては、タンカーの船倉の破裂又は貯蔵タンクの破損開放が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２３】
本願明細書で使用する場合、「還元すること」の用語は、原子又はイオンに電子が付加されるプロセス（たとえば、酸素除去又は水素添加によるもの）をいう。
【００２４】
本願明細書で使用する場合、「海洋潮堆積物」の用語は、潮河又は浅海沿岸領域内の堆積物をいう。海洋潮堆積物は、砂浜を含む地球の表面（砂浜を含む）下に位置し得、又は海域の下にも存在し得る。
【００２５】
本願明細書で使用する場合、堆積物の「磁気粒子濃縮部分」の用語は、磁気引力により陽性選択された堆積物の部分をいう。磁気引力による選択の例示的な方法は詳細に後述する。
【００２６】
本願明細書で使用する場合、「微生物燃料電池」の用語は、細菌を使用することにより電流を流す装置又はシステムをいう。典型的な微生物燃料電池において、生体触媒として作用する微生物の代謝により生じる電子が獲得又は抽出され、当該電子は電力発生のために電極に伝達される。微生物燃料電池を組み立てるために使用される技術は、当業者に公知である。
【００２７】
本願明細書で使用する場合、「培地」の用語は、長期間にわたって細菌を増殖させるために使用されることができる栄養素の水溶液をいう。
【００２８】
＜堆積物サンプリング及び調製＞
日本の沖縄の海中道路ビーチ（北緯２６°１９’５６．１”、東経１２７°５４’０”；２０１３年１０月）からの砂質堆積物を２５cmの深さまでサンプリングして、およそ半分の収容量まで５００mLのビンに入れ、ビンの残部に海水を満たした。実験室で、その試料を激しく撹拌し、撹拌前の堆積物表面の高さより上の位置において容器の外側に磁石を押し付けた状態で、沈降させた。堆積物が沈降した後、磁石に最も近い領域から４mLの液体及び付着磁気粒子を滅菌パスツールピペットを用いてサンプリングした。次いで「毛細管レーストラック（capillary racetrack）法」を使用して、試料から磁石に関連した（magnet-associated）細菌を濃縮させた。１０mLの培地（Difco Marine Broth 2216）に５０mg Ｌ-1 ＦｅＣｌ３を追加したもの（マリン−Ｆｅブロス）を含む試験管に、毛細管からの液体を接種し、振盪せずに２３℃で一晩増殖させた。試料をマリン−Ｆｅアガーに画線し、２日間インキュベーションして、得られた螺旋状細菌のコロニー（「ＨＪ ６．０３．１５」株と命名、以下、略して「ＨＪ」という）をマリン−Ｆｅブロスに継代培養した。毛細管レーストラック由来の元の混成群集及びＨＪ株の両方の継代培養物５０mLを、別々のＭＦＣ（１ｇ Ｌ-1酢酸ナトリウムを含有するリン酸緩衝生理食塩水培地で一杯に満たされている）の中へ注ぎ込んだ。
【００２９】
単離された細菌株は、Ｔｈａｌａｓｓｏｓｐ． ＨＪ ６．０３．１５として、製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）特許微生物寄託センター（#122, 2-5-8 Kazusakamatari, Kisarazu-shi, Chiba 292-0818, Japan）へ２０１５年３月２５日に寄託され、受領番号ＮＩＴＥ  ＡＢＰ−０２０２８（受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０２８）で登録された。
【００３０】
＜堆積物由来の培養物が接種された微生物燃料電池の作動＞
２つのＭＦＣ（高さ１０cm；長さ１２cm；幅１０cm）を、内部作業容量が１７５mLになるように調製した。内部ＭＦＣチャンバーは、２つのアノード（およそ６×８cm）（チャンバーの底から２〜３mm離して吊されており、より大きな表面積を有するように平均サイズ２mmの活性炭顆粒が導電性接着剤で結合された導電性炭素布の層からなっている）を備えていた。顆粒は、カバ材前駆体から調製され、中性赤触媒で前処理された。２つのカソードはグラファイトプレート（厚さ３mm；多孔度６０％）であり、液体に面する側に水性５％フミオン膜ポリマー（Fumatech, Bietigheim-Bissingen, Germany）がスプレーされており、一方、空気に面する側には活性炭顆粒（フタロシアニン鉄（ＩＩ）で処理）がネットフレームを使用して機械的に押圧されていた。カソードは、電解質溶液（１Ｎ ＨＣｌの規則的な添加で、ｐＨ２に維持）を含む槽の中にまで延長していた。
【００３１】
化学的酸素要求量（ＣＯＤ）分析のために週１回混成内容物１mLを取り出した後、ＣＯＤ分析が基質涸渇を示した場合は、１ｇ Ｌ-1酢酸ナトリウムを含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）およそ５mLをＭＦＣに供給した。カソード膜を通した蒸発に起因する損失を補うのにこの追加容量の供給が必要であった。作動の第６５日目にモニタリング期間が終了したら、ＭＦＣを解体した。アノード物質(anode material)をサンプリングし、ＨＪ株が接種されたＭＦＣから細菌が単離され、ＨＪ株の存在を確認した。
【００３２】
＜細菌の単離及び初期特性解析＞
ＨＪ株からのＤＮＡを単離して、ゲノム配列決定に付した（L. Kiseleva, S. Garushyants, and I. Goryanin、未公開結果）。Ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ．ｆｒプラットフォームを用いて、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＫＰ７０４２１９）の系統発生解析を行った。増殖のための最低及び最高温度をマリンアガープレート上での培養によって決定した。標準の微生物学的方法を用い、カタラーゼ及びオキシダーゼ活性を調べ、グラム染色を実施した。
【００３３】
＜透過電子顕微鏡法＞
ＪＥＯＬ  ＪＥＭ−１２３０Ｒ電子顕微鏡にて、１００KVの加速電圧で透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）イメージングを実施した。５０mLのマリン−Ｆｅブロス中で室温（２３℃）においてＯＤ６００が１．０になるまで増殖させた培養物からＨＪ株細胞を調製した。ペレット状の細胞を０．１Ｍカコジル酸緩衝液（cacodilate buffer）（ｐＨ＝７．２）中１％四酸化オスミウム（osmium tetraoxide）で３０分間固定し、水で５分間３回洗浄した。固定された細菌細胞の一滴を、カーボン膜付きＨＦ３４  ２００メッシュ銅グリッド上に載せ、蒸留水で１回洗浄して１％酢酸ウラニルで３〜５秒間染色した。
【００３４】
＜細菌純粋培養物を接種した微生物燃料電池の接種及びモニタリング＞
３つの４cmマイクロチャンバーを備えたＰｌｅｘｉｇｌａｓ２パーツからマイクロ−ＭＦＣアレイを作成し、３種の細菌純粋培養物による電流発生について試験した。各チャンバーは、カチオン交換膜Nafion 117（１９．６cm2；Dupont Co., Delaware USA）によって分離されたアノード及びカソード区画（８mm深さ）から構成されていた。アノード及びカソード電極（３mm厚グラファイトプレート；多孔度４５〜５０％、Xinghe County Muzi Carbon Co., Ltd, China）を、毎日の電圧測定のためにマルチチャンネルデータロガー（Graphtech midi LOGGER GL820、Japan）に繋げた。アノード及びカソード区画間の封止のために、１mm厚のゴムガスケットを使用した。チタンネジが電極を膜に固定し、そして、電気コネクタとして作用した。各マイクロＭＦＣチャンバーには、培地及び電解質を供給するために、底部に内径（ＩＤ）２．５mmのポリウレタンインレットチューブ（FESTO, Germany）が一つ取り付けれ、バイオガス排出及び枯渇した電解質の置換のために、上端部にもう一つ取り付けた。マイクロＭＦＣは、開路モードで作動させ、接種の時間から開始して２４時間毎に電流測定をデジタルマルチメータ（Yokogawa TY530, Japan）で実施した。Ｎ２スパージングは行わず、５０mMフタロシアニン鉄（ＩＩ）をカソード電解質溶液として使用した。
【００３５】
細菌純粋培養物（Thallasospira sp. ＨＪ、Geobacter daltonii、Desulfamplus magnetomortis）を、１リットルあたり４．５８ｇ Ｎａ２ＨＰＯ４、２．４５ｇ ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ、０．３１ｇ ＮＨ４Ｃｌ、０．１３ｇ ＫＣｌ、５ｇグルコース、５ｇ酵母エキス、及び５ｇペプトンを含有するＰＢＳ培地において嫌気的に３７℃で１日間増殖させた。細菌細胞を回収し、１６mMリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄して、新鮮な嫌気性ＰＢＳ培地５０mLに再懸濁させた。初期細胞濃度は、濾過された無細胞培地を参照として用い、Ｓｐｅｃｔｒｏｎｉｃ  ＧＥＮＥＳＹＳ  ５分光光度計（Milton Roy Company, Rochester, NY, USA）によって測定して、６００nmでの光学密度０．３に調整された。
【００３６】
マイクロＭＦＣは先ず、細菌細胞を含有する培地１５mL（多孔性グラファイトがある程度の液体を吸収するので、アノードチャンバーの約１０mL容量を上回る）で接種した。０．１％ＮａＮ３を含有する無細菌ＰＢＳ培地をコントロール実験用に使用した。すべての実験が、二度の技術的反復及び二度の生物学的反復で構成された。実験は２３℃で実施した。
【００３７】
＜結果と考察＞
磁気粒子に関連した細菌（それらの一部は発電性であろう）を得るために、本発明者らは潮汐浜堆積物を、図１に示す濃縮手順に付した。一方のＭＦＣには磁気粒子濃縮された堆積物由来の混合培養物を接種し、他方のＭＦＣには濃縮された堆積物から単離された螺旋状細菌であるＨＪ株の純粋培養物を接種した。両方のＭＦＣが電力を生成することが見出され、混合培養物ＭＦＣから発生した電流及び電圧の方がかなり高かった（図２）。ＨＪ株で観察された比較的低い電力密度は、細菌純粋培養物をそれらの由来もとである群集の電力密度と比較した場合に典型的なものである。実験の終わりにＨＪ株をＭＦＣから再度単離して、その保持を確認した。
【００３８】
ＨＪ株は、顕微鏡解析（図３）及び１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列比較（図４）によって、Ｔｈａｌａｓｓｏｓｐｉｒａ属のものであると同定された。ＴＥＭ画像は、Ｔｈａｌａｓｓｏｓｐｉｒａ属に典型的である、単一の極鞭毛を有する０．５〜０．７μmの幅及び１．５〜５．７μmの長さの細胞を示し、対称性及び非対称性細胞分裂の両方のエビデンスがある（図３）。一以上の電子高密度染色領域を、ほとんどの細胞内に認めることができる（図３）。細胞は運動性であり、グラム染色に陰性で、またカタラーゼ及びオキシダーゼ活性に対して陽性の試験結果を示した。１２℃〜３９℃の範囲の温度にて、マリンアガー上で増殖が起こった。ＧｅｎＢａｎｋデータベースにおいて最近接にマッチングする１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列は、Ｔｈａｌａｓｓｏｓｐｉｒａ  ｓｐ．  ＭＡＣＬ１２Ｂ株のもの（１４７７／１４８８、同一性９９．３％）であった。
【００３９】
Ｔｈａｌａｓｓｏｓｐｉｒａ  ｓｐ．  ＨＪ株、並びに比較のためのＧｅｏｂａｃｔｅｒ  ｄａｌｔｏｎｉｉ及びＤｅｓｕｌｆａｍｐｌｕｓ  ｍａｇｎｅｔｏｍｏｒｔｉｓの純粋培養物を接種したＭＦＣチャンバーは、接種後直ちに電流生産を示したが、引き続いての生産曲線の強度及び形状は異なっていた（図５）。Ｔｈａｌａｓｓｏｓｐｉｒａ  ｓｐ．  ＨＪ株及びＤ．  Ｍａｇｎｅｔｏｍｏｒｔｉｓは、開始後電流の漸増を示したが、Ｇ．  Ｄａｌｔｏｎｉｉからの電流生産は経時的に減少した。１７２時間後、すべての純粋培養物に対する電流は５〜８ｍＡに減少したが、これは炭素源の枯渇が原因であると考えられた。電圧の降下がＨＪ株がマイクロＭＦＣに接種されてから１４４時間後に観察され、一方Ｇ．  ｄａｌｔｏｎｉｉ及びＤ．  Ｍａｇｎｅｔｏｍｏｒｔｉｓ  ＭＦＣは、４８時間後に電圧損失を示した。コントロールとして、電流及び電圧生産への増殖培地成分の寄与を調べるために、マイクロＭＦＣを無菌培地で満たした。観察可能な電流発生のバックグラウンドはなかったものの、電圧は観察された（図５）。マイクロＭＦＣからの最大の単一評価（ｓｉｎｇｌｅ−ｖａｌｕｅ）電力読み取り値は、Ｔｈａｌａｓｓｏｓｐｉｒａ  ｓｐ．  ＨＪ株については２．６Ｗ  ｍ-2（９６時間経過時）、Ｄ．  ｍａｇｎｅｔｏｍｏｒｔｉｓ  については５．５Ｗ  ｍ-2（１４４時間経過時）、及びＧ．  Ｄａｌｔｏｎｉｉについては４．６Ｗ  ｍ-2（２４時間経過時）のものであった。
【００４０】
Ｇｅｏｂａｃｔｅｒは、発電細菌のよく特徴付けられた属であるが、本発明者らは走磁性細菌Ｄ．  Ｍａｇｎｅｔｏｍｏｒｔｉｓによる発電性の先行する報告を認知していない。本発明者らは、マグネトソームは、細菌が強磁性の外部電子アクセプターに焦点を合わせることを可能ならしめることにより、選択的利益をもたらし得るという仮説を立てている。発電性（electrogenecity）についての走磁性（magentotactic）細菌のさらに広い調査が必要とされるであろう。
【００４１】
最近、海成堆積物由来のＴｈａｌａｓｓｏｓｐｒｉａ  ｓｐ．単離物が硫黄カソードから電子を受け取ることによって発電挙動を呈することが報告された；この研究では、この株の（Ｔｈａｌａｓｓｏｓｐｒｉａ  ｓｐ．  ＨＪ株に関して本発明者らが本明細書において見出したような）アノードを還元する能力は、調べられなかった。
【００４２】
本願は、２０１５年４月１日出願の米国仮出願第６２／１４１，６００号に基づく優先権を主張しており、この特許文献の内容全体が参照によって本願明細書に組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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