(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的試料を採取して安定化するためのデバイスであって、
（ａ）開端部と、閉端部と、内部空間とを備えるハウジングと、
（ｂ）前記ハウジングの前記内部空間内に挿入可能な保定器であって、溶液を受け取るための容器と、前記容器内に前記溶液を閉じ込めるための貫通可能シールとを備える保定器と、
（ｃ）前記ハウジングの前記開端部と着脱可能に係合可能であり、前記ハウジングの前記開端部を封止して閉じることを可能にする採取器であって、前記生物学的試料を採取するための吸収部材を備える採取器と
を備え、
前記採取器が前記ハウジングの前記開端部に係合されるとき、前記吸収部材が、前記ハウジング内に受け取られ、前記採取器が、前記ハウジングの前記内部空間内に挿入されている前記保定器の前記貫通可能シールを破壊し、前記吸収部材を通って流れるように前記溶液を推進し、それにより、前記生物学的試料を前記吸収部材から解放し、前記生物学的試料と前記溶液との混合を容易にし、
前記容器が、開いた上部と、閉じた底部であって、前記開いた上部に向けて内側に凹んだ中央部分を有する閉じた底部、又は前記開いた上部に向けて当該閉じた底部の中央部分から突出する突出部を有する閉じた底部と、を有し、前記容器の前記閉じた底部の前記内側に凹んだ中央部分又は前記突出部が、前記採取器が前記ハウジングの前記開端部に係合している又は係合されるときに前記吸収部材を圧縮し、それにより前記生物学的試料を前記吸収部材から圧搾する
デバイス。
【請求項２】
前記採取器が、
（ａ）生物学的試料を採取するときのハンドルとして、及びハウジングの開端部に係合する又は係合されるときのシールとして働く本体部分と、
（ｂ）前記本体部分と固定して結合された、又は前記本体部分とモノリシックに形成されたステム部分と
を備え、
（ｉ）前記ステム部分が、前記本体部分の近位の第１のセグメントと、前記本体部分の遠位の第２のセグメントとを含み、
（ｉｉ）前記吸収部材が、前記ステム部分の前記第２のセグメントに取り付けられ、
（ｉｉｉ）前記採取器が前記ハウジングの前記開端部に係合されるとき、前記吸収部材と、前記第２のセグメントの少なくとも一部分とが、前記保定器内に受け取られる
請求項１に記載のデバイス。
【請求項３】
前記採取器が、前記生物学的試料から血漿を生成するためのプラズマメンブレンをさらに備え、前記プラズマメンブレンが、前記ステム部分の前記第２のセグメント内に配設される請求項２に記載のデバイス。
【請求項４】
前記第１のセグメントが、１つ又は複数の開いたスロットを形成されて、前記解放された生物学的試料及び前記推進された溶液が前記スロットを通って流れるようにし、
前記本体部分の遠位の前記第２のセグメントが、前記吸収部材を収容するための空洞を形成される
請求項２に記載のデバイス。
【請求項５】
前記採取器が、前記生物学的試料から血漿を生成するためのプラズマメンブレンをさらに備え、前記プラズマメンブレンが、前記空洞内に配設される請求項４に記載のデバイス。
【請求項６】
前記ステム部分が、
（ｃ）前記採取器が前記ハウジングの前記開端部に係合している又は係合されるときに、前記吸収部材が前記第２のセグメント内に押し込まれるのを防止するための、前記第１のセグメントと前記第２のセグメントとの間に配設された区画であって、少なくとも１つの穴又はスロットを形成され、前記穴又はスロットを介して、前記第１のセグメントが前記第２のセグメントと流体連絡する区画
をさらに備える請求項４に記載のデバイス。
【請求項７】
前記本体部分の近位の前記第１のセグメントが、前記生物学的試料と前記溶液との混合を容易にし、前記生物学的試料と前記溶液との混合物を収容するためのリザーバを形成され、
前記本体部分の遠位の前記第２のセグメントが、前記吸収部材を収容するための空洞を形成される
請求項２に記載のデバイス。
【請求項８】
前記採取器が、前記生物学的試料から血漿を生成するためのプラズマメンブレンをさらに備え、前記プラズマメンブレンが、前記空洞内に配設される請求項７に記載のデバイス。
【請求項９】
前記採取器が、
（ｃ）前記生物学的試料と前記溶液との混合物が前記本体部分を通って流出するのを防止するための貫通可能セプタム
をさらに備える請求項２に記載のデバイス。
【請求項１０】
前記採取器が、
前記ステム部分の前記第２のセグメントの外面に配設された第１のエラストマーシールであって、前記採取器が前記ハウジングの前記開端部に係合している又は係合されるときに、前記ステム部分の前記第２のセグメントの前記外面と前記保定器の内面との封止を提供する第１のエラストマーシール
をさらに備える請求項２に記載のデバイス。
【請求項１１】
前記採取器が、
前記ステム部分の前記第１のセグメントの外面又は前記ステム部分に隣接する前記本体部分の外面に配設された第２のエラストマーシールであって、前記採取器が前記ハウジングの前記開端部に係合している又は係合されるときに、前記ステム部分の前記第１のセグメントの前記外面と前記ハウジングの内面との封止を提供する、又は前記本体部分の前記外面と前記ハウジングの前記内面との封止を提供する第２のエラストマーシール
をさらに備える請求項２に記載のデバイス。
【請求項１２】
前記保定器が、前記容器内に受け取られる前記溶液と前記貫通可能シールとの間に配設された溶液保定チャンバをさらに備える請求項１に記載のデバイス。
【請求項１３】
前記保定器の前記容器がテーパを付けられ、開いた上部が閉じた底部よりも広い請求項１に記載のデバイス。
【請求項１４】
前記ハウジングが、前記保定器が前記ハウジングの前記内部空間内に挿入されたときに前記保定器を支持するための、前記ハウジングの内面に形成された第１のシートを備え、
前記容器が、第１のシートに当接するために前記保定器の前記容器の外面に形成された第１のフランジを備える
請求項１に記載のデバイス。
【請求項１５】
前記ハウジングの前記開端部が、前記採取器との係合及び／又は前記保定器の挿入を容易にするために雌ねじとねじ留めされる請求項１に記載のデバイス。
【請求項１６】
前記ハウジングの前記開端部が、前記採取器と嵌合するためのロック手段を形成される請求項１に記載のデバイス。
【請求項１７】
前記ロック手段が、前記ハウジングの開端部に形成された１つ又は複数のスロットを含む請求項１６に記載のデバイス。
【請求項１８】
（ｉ）前記ハウジングの底面又は前記ハウジングの外面に印刷された又は取り付けられた２Ｄデータマトリックスバーコードと、（ｉｉ）前記ハウジングの前記底面又は前記ハウジングの前記外面に印刷された又は取り付けられた可読製品識別と、（ｉｉｉ）前記ハウジングの前記底面又は前記ハウジングの前記外面に印刷された又は取り付けられた無線周波数識別（ＲＦＩＤ）タグとの１つ又は複数をさらに備える請求項１に記載のデバイス。
【請求項１９】
前記吸収部材が、有孔又は吸い上げ材料から形成される請求項１に記載のデバイス。
【請求項２０】
請求項１〜１９のいずれか一項に記載のデバイスを備えるヘルスケア用のキット。
【請求項２１】
前記生物学的試料を解放するためにエンドユーザの膜に貫入するためのランセットをさらに備える請求項２０に記載のキット。
【請求項２２】
前記採取器と、前記ハウジングと、前記保定器とを収容するためのケーシングをさらに備える請求項２０に記載のキット。
【請求項２３】
採取部位を洗浄して準備するための準備パッドをさらに備える請求項２０に記載のキット。
【請求項２４】
生物学的試料を採取して安定化するための方法であって、
（ａ）請求項１〜１９のいずれか一項に記載のデバイスを提供する工程と、
（ｂ）前記採取器の前記吸収部材によって前記生物学的試料を採取する工程と、
（ｃ）前記採取器を前記ハウジングと封止係合する工程と
を含み、
前記採取器と前記ハウジングとの前記封止係合が、前記ハウジングの前記内部空間内に挿入されている前記保定器の貫通可能シールを破壊し、前記保定器内に保定された溶液を、前記吸収部材を通って流れるように推進し、それにより、前記生物学的試料を前記吸収部材から解放し、前記生物学的試料と前記溶液との混合を容易にする
方法。
【請求項２５】
前記生物学的試料を提供するためにランセットによって使用者の膜に貫入する工程
をさらに含む請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記採取器を前記ハウジングと封止係合した後に、前記採取器を受取人に輸送する工程をさらに含む請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記採取器によって採取された前記生物学的試料中のターゲット配列を検出する工程
をさらに含む請求項２６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
[0001]  本出願は、２０１４年６月１０日出願の米国仮特許出願第６２／０１０，３１４号の優先権を主張し、その仮特許出願の全体を、あらゆる目的で参照により本明細書に組み込む。
【０００２】
[0002]  本発明は、一般に、生物学的試料を採取して安定化するため、より詳細には、使用者の指先、耳たぶ、踵、又は他の場所から血液又は他の体液を採取して安定化するためのデバイス及び方法に関する。また、本発明は、生物学的試料を添加剤と混合するためのプロセスを単純化し、試料の効率的な貯蔵及び安全な輸送を提供し、後の処理のために試料への容易なアクセスを可能にする試料採取デバイスに関する。
【背景技術】
【０００３】
[0003]  患者からの生物学的流体試料（血液、唾液、尿など）の採取は、多くの診断処置における最初の工程である。血液試料を静脈から採取するために設計された予め排気された採取管が、一般に使用されているデバイスであり、いくつかの企業が、下流の試験プロセスを容易にするためにヘパリン、ＥＤＴＡ、核酸安定剤などの添加剤を予め充填された血液採取管の広範なポートフォリオを販売している。静脈採取製品に関わる問題は、試料を採取するに際して患者を支援するために熟練した人が必要であること、注射針で静脈を穿刺することに関わるリスク、及び診断試験を実施するのに必要なよりもかなり多くの患者試料の採取である。
【０００４】
[0004]  患者の指先又は踵から小体積の血液を採取するために、毛管ベースの採取デバイスが使用される。これらのデバイスは通常、開端部毛管の先端を流体の液滴に当てて保つことによって機能し、次いで、毛管力を使用して流体が管に引き込まれる。代替の採取法は、１枚の紙の上への、又は採取収容器内への患者の試料の滴下を含む。極微針ベースの排気式のデバイスも開発中である。排気式の管と同様に、これらのデバイスは、しばしば、将来の診断試験を容易にする又は試料取扱いを改良するために添加剤をコーティングされる。いくつかの場合には、生物学的流体は、添加剤と混合すること及び／又は後で使用するまで貯蔵することができるとき、二次収容器内に定量供給される。
【０００５】
[0005]  さらに、採取時点でゲノム材料の即時安定化を必要とする分子診断試験用の血液試料に対する要求が増している。適切な安定化は通常、血液と緩衝液の所定の比での、血液と安定化緩衝液との即時の混合を必要とする。現在のデバイスは、この用途に適合するようには設計されていない。
【０００６】
[0006]  上記の背景に鑑みて、生物学的試料の単純化された採取を可能にし、試料の安定化及び将来の処理を助ける添加剤との生物学的試料の混合を容易にする採取デバイス及び方法が当技術分野で必要である。
【０００７】
[0007]  この背景の項で開示した情報は、本発明の全般的な背景の理解を深めるためのものにすぎず、この情報が当業者に既に知られている従来技術を成すことを確認する又は何らかの形で示唆するものとみなすべきではない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
[0008]  本発明の様々な態様は、生物学的試料の単純化された採取を可能にし、生物学的試料の安定化及び将来の処理の助けとなる溶液又は添加剤との生物学的試料の混合を容易にする新規のデバイス及びキットを提供する。いくつかの実施形態では、本発明のデバイスは、エンドユーザ（例えば患者）又は医療従事者が容易に取り扱えるように、並びに、後の処理（例えば診断試験研究所）で採用される標準の自動化及び試験システムと一体化されるように設計される。
【０００９】
[0009]  一態様では、本発明は、生物学的試料を採取するための採取器を有する採取及び安定化デバイスを提供する。好ましい実施形態では、採取器は、生物学的試料を採取するための吸収部材を含む。別の好ましい実施形態では、採取器は、生物学的試料を採取する間に採取器を容易に把持できるようにするためのハンドルとして働くように構成される。さらに別の好ましい実施形態では、採取器は、ハウジングに封止係合するキャップとして働くように構成され、試料の安全な輸送を容易にする。いくつかの実施形態では、採取器は、ハウジングに完全に係合された後にハウジングと嵌合されるように構成され、ハウジングからの採取器の意図的でない脱落を防ぐ。いくつかの実施形態では、採取器は、採取器内に生物学的試料を封止する貫通可能又は穿刺可能なセプタムを設けられる。貫通可能又は穿刺可能なセプタムは、採取器をハウジングから取り外すことなく、後の処理のために生物学的試料にアクセスできるようにする。
【００１０】
[0010]  別の態様では、本発明は、生物学的試料の安定化及び将来の処理の助けとなる溶液、添加剤、又は試薬などを貯蔵するための保定器を有する採取及び安定化デバイスを提供する。好ましい実施形態では、保定器は、個別に製造され、デバイスの使用前にハウジングと予め組み立てられる。採取器、保定器、及びハウジングは、採取器がハウジングに係合している又は係合されるときに、採取器が、保定器内に貯蔵されている溶液（又は添加剤や試薬など）を、吸収部材を通って流れるように推進し、生物学的試料を解放し、生物学的試料と混合するように構成される。
【００１１】
[0011]  本発明の様々な他の態様は、生物学的試料を採取して安定化するために新規のデバイス及びキットを使用するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、（ｉ）採取器を使用して生物学的試料を採取する工程と、（ｉｉ）採取器をハウジング内に挿入する工程とを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、（ｉｉｉ）後の処理のために、採取器をハウジングと共に試験研究所などの受取人に輸送又は出荷する工程をさらに含む。
【００１２】
[0012]  本発明の方法及び装置は、本明細書に組み込まれる添付図面、及び以下の詳細な説明から理解される、又はそこにより詳細に示されている他の特徴及び利点を有する。添付図面及び詳細な説明は、共に本発明のいくつかの原理を説明するためのものである。
【００１３】
[0013]  本明細書に組み込まれて本明細書の一部を成す添付図面は、本出願の１つ又は複数の実施形態を示し、詳細な説明と共に、本出願の原理及び実装形態を説明するためのものである。さらに、米国特許出願公開第２０１０／０２６７５８５号と第２０１３／０００５５９４号はどちらも、全体を、特に全ての図面及び説明文を、参照により本明細書に明示的に組み込む。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１Ａ】[0014]本発明のいくつかの実施形態による、生物学的試料を採取して安定化するためのデバイスを示す側面図である。
【図１Ｂ】[0015]図１Ａのデバイスを示す斜視図である。
【図１Ｃ】[0016]図１Ａのデバイスを示す部分分解斜視図である。
【図１Ｄ】[0017]１Ｄ−１Ｄ線に沿った図１Ｃの断面図である。
【図２Ａ】[0018]本発明のいくつかの実施形態による、生物学的試料を採取して安定化するためのデバイスでの採取器を示す部分拡大側面図である。
【図２Ｂ】[0019]２Ｂ−２Ｂ線に沿った図２Ｂの断面図である。
【図２Ｃ】[0020]図２Ａの採取器を示す側面図である。
【図２Ｄ】[0021]２Ｄ−２Ｄ線に沿った図２Ｃの断面図である。
【図３Ａ】[0022]本発明のいくつかの実施形態による、生物学的試料を採取して安定化するためのデバイスでの保定器を示す拡大側面図である。
【図３Ｂ】[0023]３Ｂ−３Ｂ線に沿った図３Ｂの断面図である。
【図３Ｃ】[0024]図３Ａの保定器を示す側面図である。
【図３Ｄ】[0025]３Ｄ−３Ｄ線に沿った図３Ｃの断面図である。
【図４Ａ】[0026]本発明のいくつかの実施形態による、生物学的試料を採取して安定化するためのデバイスでの保定器及びハウジングを示す拡大側面図である。
【図４Ｂ】[0027]４Ｂ−４Ｂ線に沿った図４Ｂの断面図である。
【図４Ｃ】[0028]図４Ａの保定器及びハウジングを示す側面図である。
【図４Ｄ】[0029]４Ｄ−４Ｄ線に沿った図４Ｃの断面図である。
【図５Ａ】[0030]本発明のいくつかの実施形態による生物学的試料を採取して安定化するためのデバイスを示す断面図であって、一段階で採取器がハウジングに係合している図である。
【図５Ｂ】本発明のいくつかの実施形態による生物学的試料を採取して安定化するためのデバイスを示す断面図であって、一段階で採取器がハウジングに係合している図である。
【図５Ｃ】本発明のいくつかの実施形態による生物学的試料を採取して安定化するためのデバイスを示す断面図であって、一段階で採取器がハウジングに係合している図である。
【図６Ａ】[0031]本発明のいくつかの実施形態による、生物学的試料を採取して安定化するためのデバイスを示す側面図である。
【図６Ｂ】[0032]図６Ａのデバイスを示す斜視図である。
【図６Ｃ】[0033]図６Ａのデバイスを示す部分分解斜視図である。
【図６Ｄ】[0034]６Ｄ−６Ｄ線に沿った図６Ｃの断面図である。
【図７Ａ】[0035]本発明のいくつかの実施形態による、生物学的試料を採取して安定化するためのデバイスでの採取器を示す部分拡大側面図である。
【図７Ｂ】[0036]７Ｂ−７Ｂ線に沿った図７Ｂの断面図である。
【図７Ｃ】[0037]図７Ａの採取器を示す側面図である。
【図７Ｄ】[0038]７Ｄ−７Ｄ線に沿った図７Ｃの断面図である。
【図８Ａ】[0039]本発明のいくつかの実施形態による、生物学的試料を採取して安定化するためのデバイスでの保定器を示す拡大側面図である。
【図８Ｂ】[0040]８Ｂ−８Ｂ線に沿った図８Ｂの断面図である。
【図８Ｃ】[0041]図８Ａの保定器を示す側面図である。
【図８Ｄ】[0042]８Ｄ−８Ｄ線に沿った図８Ｃの断面図である。
【図８Ｅ】[0043]本発明のいくつかの実施形態による、生物学的試料を採取して安定化するためのデバイスでの採取器を示す切欠き部分拡大図である。
【図８Ｆ】[0044]本発明のいくつかの実施形態による、生物学的試料を採取して安定化するためのデバイスでの採取器を示す切欠き部分拡大図である。
【図８Ｇ】[0045]図８Ｆの保定器を示す切欠図である。
【図９Ａ】[0046]本発明のいくつかの実施形態による、生物学的試料を採取して安定化するためのデバイスでの保定器及びハウジングを示す拡大側面図である。
【図９Ｂ】[0047]９Ｂ−９Ｂ線に沿った図９Ｂの断面図である。
【図９Ｃ】[0048]図９Ａの保定器及びハウジングを示す側面図である。
【図９Ｄ】[0049]９Ｄ−９Ｄ線に沿った図９Ｃの断面図である。
【図１０Ａ】[0050]本発明のいくつかの実施形態による生物学的試料を採取して安定化するためのデバイスを示す断面図であって、一段階で採取器がハウジングに係合している図である。
【図１０Ｂ】図１０Ａの部分拡大図である。
【図１０Ｃ】本発明のいくつかの実施形態による生物学的試料を採取して安定化するためのデバイスを示す断面図であって、一段階で採取器がハウジングに係合している図である。
【図１０Ｄ】本発明のいくつかの実施形態による生物学的試料を採取して安定化するためのデバイスを示す断面図であって、一段階で採取器がハウジングに係合している図である。
【図１１】[0051]本発明のいくつかの実施形態による、生物学的試料を採取して安定化するためのデバイスを示す斜視図である。
【図１２】[0052]本発明のいくつかの実施形態による、生物学的試料を採取して安定化するためのデバイスを含むキットを示す斜視図である。
【図１３】[0014]本発明のいくつかの実施形態による、生物学的試料を採取して安定化するための方法を示す図である。
【図１４】[0054]本発明のいくつかの実施形態による、生物学的試料を採取して安定化するための方法を示す図である。
【図１５Ａ】[0055]本発明のいくつかの実施形態による、生物学的試料を採取して安定化するためのデバイスでの採取器を示す部分拡大側面図である。
【図１５Ｂ】[0056]１５Ｂ−１５Ｂ線に沿った図１５Ｂの断面図である。
【図１５Ｃ】[0057]組み立てられたときの図２Ａの採取器を示す断面図である。
【図１６】[0058]米国特許出願公開第２０１０／２６７５８５号及び第２０１３／０００５５９４号で論じられるように化学ライゲーション依存型プローブ増幅（「CLPA」）反応を利用するターゲット試料から核酸を検出する一方法の概略全体図である。上記の特許出願公開はどちらも、全体を参照により本明細書に組み込み、特に、限定はしないが、プローブ、アッセイ、緩衝液（反応緩衝液、安定化緩衝液など）を含めたＣＬＰＡアッセイ及び構成要素の論述を参照により本明細書に組み込む。この実施形態では、アッセイは血液試料を示すが、当業者に理解されるように、また本明細書で述べるように、追加の試料タイプを使用することもできる。この図は、２プローブシステムを示すが、米国特許出願公開第２０１０／０２６７５８５号の図３に示されるように、３つ（以上）のプローブシステムを使用することができる。
【図１７】[0059]検出のために固体支持システム（例えばアレイ又はビーズアレイ）が使用される、ＣＬＰＡ−ＭＤＭプロセスの概略全体図である。この実施形態では、ライゲーションプローブの少なくとも１つが、マイクロアレイプラットフォームでの適切な捕捉シーケンスに結合するようにアレイ結合配列を組み込むことが好ましい。ＣＬＰＡ−ＭＤＭに関して、様々なＣＬＰＡ反応生成物は、サイズの相違によっては分離されず、アレイ結合配列の相違によって分離される。この実施形態では、アレイ結合配列の配列は、各ＣＬＰＡプローブがＤＮＡマイクロアレイでの一意の部位に結合するように変えられる。ＣＬＰＡ−ＭＤＭでのアレイ結合配列の長さは通常、１５〜１５０個の塩基、より特定的には２０〜８０個の塩基、最も特定的には２５〜５０個の塩基である。
【図１８】[0060]プローブがサイズ可変型のスタッファ配列を含むＣＬＰＡアッセイに関するプローブ設計を示す概略図である。
【図１９】[0061]結合されたＣＬＰＡプローブセットを溶液相／未結合ＣＬＰＡプローブセットから分離するために使用されるターゲット捕捉法の概略図である。
【図２０】[0062]単一のターゲット捕捉プローブと共に試料ターゲットに結合される複数の一意のＣＬＰＡプローブセットの概略図である。
【図２１Ａ】[0063]ＣＬＰＡアッセイの使用のさらなる概略図であって、試料完全性を評価する際に特に使用することができるアッセイの取り得る向きを示す図である。図２１Ａは、図２０と同様の向きを示すが、ライゲーションプローブセットの「下流」に捕捉プローブがある点が異なる。ＣＭは、捕捉部分である。当業者に理解されるように、ＣＭは、捕捉プローブの３’末端部にあっても５’末端部にあってもよいが、通常は３’端部に示される。さらに、図２０に示されるように、ターゲット領域にハイブリッド化しない各ライゲーションプローブの部分は、限定はしないが、プライマ結合領域、サイズタグ、捕捉配列などを含めた、いくつかの異なる機能を含むことができる。図２１Ａは、試料完全性評価のために、約２５〜３０％増分したターゲットの長さにわたってライゲーションプローブセットが離隔配置される状況を示す。当業者に理解されるように、また米国特許出願公開第２０１３／０００５５９４号で述べられているように、様々なライゲーションプローブセットの間隔は、必要に応じて異なっていてよい。
【図２１Ｂ】代替の向きを示す図である。
【図２１Ｃ】完全性評価のため又は冗長のためのどちらにも使用することができる向きを示す図である。
【図２２Ａ】[0064]ＳＮＰ検出法で使用するためのＣＬＰＡ検出法の概略図である。
【図２２Ｂ】ＳＮＰ検出法で使用するためのＣＬＰＡ検出法の概略図である。
【図２２Ｃ】ＳＮＰ検出法で使用するためのＣＬＰＡ検出法の概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
[0065]  本発明は、小体積の生物学的流体の単純化された採取及び貯蔵を可能にする採取デバイスに関する新規の設計を述べる。生物学的試料、特に血液を採取すると同時に貯蔵することができることは、生物学的試料の安定した取扱いを可能にし、例えば、追加の貯蔵要件なしで、従来の運送会社を使用して試料を郵送できるようにする。これは、自宅採取環境でさえ採取時点でのゲノム材料の即時の安定化を必要とする発展中の分子診断分野に関して、容易なサンプリングを可能にすることができる。本発明のシステムの設計及び実装により、患者は、試料、特に血液を自宅で容易に自己採取して、その試料を郵送することが可能になり、そこで、いくつかの検出システムを使用して試料を処理及び分析することができる。
【００１６】
[0066]  いくつかの実施形態では、例えば、遺伝若しくは感染病の診断、一塩基多型（SNP）検出の検出、又は疾患の診断及び／又は予後のための遺伝子発現プロファイリング（例えばmRNA）を行うために、ＤＮＡ及びＲＮＡ（mRNAを含む）を含めたターゲット核酸配列に関してターゲット試料が分析される。
【００１７】
[0067]  いくつかの実施形態では、採取された試料から、疾患の診断及び／又は予後のためのタンパク質検出及び／又は定量化を行うことができる。
【００１８】
[0068]  一実施形態では、採取デバイスは、採取された生物学的流体の量の計測を可能にする。別の実施形態では、採取デバイスは、試料の安定化及び将来の処理の助けとなる添加剤との生物学的試料の混合を容易にする。別の実施形態では、デバイスは、血球から血漿を分離するために設計される。また、デバイスは、患者又は医療従事者が容易に取り扱えるように、及び診断試験研究所で採用される標準の自動化及び試験システムと一体化されるように設計される。
【００１９】
[0069]  本発明のいくつかの実施形態を、採取及び安定化デバイス及びキットの文脈で述べる。また、本発明のいくつかの実施形態を、そのような採取及び安定化デバイス及びキットを使用して生物学的試料を採取して安定化する採取及び安定化方法の文脈で述べる。
【００２０】
[0070]  様々な実施形態において、本発明の採取及び安定化デバイスは、一般に、試料を採取するための採取器と、安定化溶液又は添加剤を貯蔵するための保定器と、ハウジングとを含む。いくつかの実施形態では、採取器は、試料を取得する間のハンドルとして、及び／又はハウジング内に試料を封止するためのシールとして機能するように構成される。いくつかの実施形態では、採取器は、生物学的試料又は生物学的試料の特定の成分を採取するための吸収部材を有するように構成される。いくつかの実施形態では、採取器は、デバイス内に生物学的試料を封止するセプタムを有するように構成される。採取器をハウジングから取り外すことなく、後の使用又は試験のために生物学的試料にアクセス可能であるように、セプタムは貫通可能又は透過可能である。いくつかの実施形態では、採取器は、生物学的試料から血漿を生成又は分離するためのプラズマメンブレンを有するように構成される。
【００２１】
[0071]  様々な実施形態では、本発明の方法は、一般に、採取器を使用して生物学的試料を採取し、採取器をハウジング内に挿入することを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、後の処理のために、採取器をハウジングと共に試験研究所などの受取人に輸送又は出荷することをさらに含む。
【００２２】
[0072]  本出願の以下の詳細な説明が例示にすぎず、いかなる限定も意図されていないことを当業者には理解されたい。本出願の他の実施形態は、本開示の利益を享受する当業者には容易に想到されよう。次に、添付図面に示される本出願の実装形態を詳細に参照する。図面及び以下の詳細な説明を通じて、同一又は同様の部分に言及するために同一の参照符号を使用する。
【００２３】
[0073]  明瞭にするために、本明細書で述べる実装形態の慣例的な特徴について全ては図示及び説明しない。当然、任意のそのような実際の実装形態の開発においては、用途及びビジネス関連の制約の遵守など、開発者の特定の目標を実現するために実装形態に特有の多くの決定が下されなければならず、これらの特定の目標は、実装形態ごとに異なり、開発者ごとにも異なることを理解されたい。さらに、そのような開発努力は、複雑であり時間がかかることがあるが、それにも関わらず、本開示の利益を享受する当業者にとっての通常的な設計作業であることを理解されたい。
【００２４】
[0074]  当業者には明らかなように、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、本開示の多くの修正及び変形を行うことができる。本明細書で述べる具体的な実施形態は、単に例として提供されているにすぎず、本開示は、添付の特許請求の範囲、及びそのような特許請求の範囲に与えられる全均等範囲に従ってのみ限定されるものとする。
【００２５】
定義
[0075]  本明細書で使用するとき、用語「試料」又は「生物学的試料」は、人、動物、又はデバイス（例えば試験管）からの流体を表す。いくつかの実施形態では、生物学的試料は、使用者の指先、耳たぶ、踵、又は他の場所からの血液、唾液、又は尿などの体液である。いくつかの実施形態では、生物学的試料は、典型的には１μＬ〜２０００μＬ、好ましくは５μＬ〜２００μＬ、より好ましくは２０〜１００μＬ程度の少量の流体を表す。
【００２６】
[0076]  本明細書で使用するとき、用語「採取器」は、生物学的試料を採取又は取得するように設計された本発明の採取及び安定化デバイスの構成要素を表す。いくつかの実施形態では、採取器は、ハウジング内に生物学的試料を封止することなど他の機能を行うように構成され、又は生物学的試料を採取する間に使用者が採取器を保持するためのハンドルとして構成される。したがって、いくつかの場合には、用語「採取器」は、「キャップ」、「デバイスキャップ」、「採取器キャップ」、「ハンドル」、「フィンガスティック」、又は「スティック」などと交換可能である。
【００２７】
[0077]  本明細書で使用するとき、用語「保定器」は、溶液、添加剤、試薬、又は他の化学的／生物学的物質を保持するように設計された本発明の採取及び安定化デバイスの構成要素を表す。いくつかの実施形態では、溶液、添加剤、又は試薬は、以下にさらに概説するような、米国特許出願公開第２０１３／０００５５９４号で述べられているＤｘＴｅｒｉｔｙ  ＲＮＡ血液安定化緩衝液（DxCollect（商標））などの安定化緩衝液、又は血漿を溶離するための緩衝液を含む。したがって、いくつかの場合には、用語「保定器」は、「収容器」、「カップ」、「緩衝液収容器」、又は「緩衝液カップ」などと交換可能である。
【００２８】
[0078]  本明細書で使用するとき、用語「ハウジング」は、保定器を保持し、採取器に係合又は結合するように設計された本発明の採取及び安定化デバイスの構成要素を表す。いくつかの実施形態では、ハウジングは、管状構成を有し、デバイスを出荷又は輸送する間の生物学的試料の保護を提供する。したがって、いくつかの場合には、用語「ハウジング」は、「管」又は「輸送管」と交換可能である。
【００２９】
[0079]  本明細書で使用するとき、用語「吸収部材」は、生物学的試料を取得して一時的に保持するように設計された採取器の構成要素を表す。いくつかの実施形態では、吸収部材は、セルロース誘導体、ポリエステル、ポリビニルアルコール、発泡体、有孔媒体、又は他の適切な材料を含むスポンジ状の吸い上げ材料から形成される。したがって、いくつかの場合には、用語「吸収部材」は、「スポンジ」、「吸い上げスポンジ」、又は「吸い上げ材料」などと交換可能である。いくつかの実施形態では、吸収部材の材料及び構成（例えば形状やサイズ）の選択は、採取すべき生物学的試料のタイプ及び量に従う。いくつかの実施形態では、生物学的試料の特定の成分を採取するために材料が選択される。
【００３０】
[0080]  本明細書で使用するとき、用語「生物学的試料を解放する」、「その生物学的試料を解放する」、又は「生物学的試料を溶離する」などは、採取器によって採取されている生物学的試料全ての完全な解放を必ずしも表さない。いくつかの実施形態では、用語「生物学的試料を解放する」、「その生物学的試料を解放する」、又は「生物学的試料を溶離する」などは、採取器によって採取されている生物学的試料の例えば３０％〜５０％の間、５０％〜７０％の間、又は７０％〜９０％の間のパーセンテージのみの解放を表す。いくつかの実施形態では、用語「生物学的試料を解放する」、「その生物学的試料を解放する」、又は「生物学的試料を溶離する」などは、生物学的試料のターゲット成分のみを解放することを表す。
【００３１】
[0081]  本明細書で使用するとき、用語「吸収部材を通って流れるように溶液を推進する」又は「吸収部材を通って流れるように溶液を押す」などは、保定器内に貯蔵されている溶液全てを吸収部材を通して推進することを必ずしも表さない。いくつかの実施形態では、用語「吸収部材を通って流れるように溶液を推進する」又は「吸収部材を通って流れるように溶液を押す」などは、保定器内に貯蔵されている溶液の例えば３０％〜５０％の間、５０％〜７０％の間、又は７０％〜９０％の間のパーセンテージのみを吸収部材を通して推進することを表す。
【００３２】
[0082]  本明細書で使用するとき、用語「溶液」、「添加剤」、又は「試薬」は、試料の安定化及び将来の処理の助けとなる化学的又は生物学的物質を表す。いくつかの実施形態では、保定器内の溶液は、生物学的試料の特性を変える添加剤を含み、特性の変化は、例えば、劣化しないように成分を安定化すること、生物学的試料の細胞を一部又は完全に溶解すること、生物学的試料から１つの成分又は種を分離すること、診断試験用の化学試薬を添加すること、又は凝固を減少することによって行われる。いくつかの実施形態では、溶液、添加剤、又は試薬は、米国特許出願公開第２０１３／０００５５９４号及び以下で述べられるＤｘＴｅｒｉｔｙ  ＲＮＡ血液安定化緩衝液（DxCollect（商標））などの安定化緩衝液、又は血漿を溶離するための緩衝液を含む。
【００３３】
[0083]  本明細書で使用するとき、用語「上部」若しくは「底部」、「内側」若しくは「外側」、又は「長手方向」、「垂直方向」、若しくは「周方向」などは、例示的実施形態の特徴部分を、図面に示されるそのような特徴部分の位置を参照して述べるために使用される。説明の便宜上、それらの用語が使用されるが、そのような位置に特徴部分を限定しない。
【００３４】
[0084]  本明細書で使用するとき、用語「公称直径」は、特徴部分の断面表面積の特徴的寸法を表す。例えば、円形断面を有する円柱形特徴部分に関する公称直径は、円形断面の直径と同じである。不規則又は複雑な断面を有する特徴部分に関しては、公称直径は、不規則又は複雑な断面に関して同じ面積を有する仮想円の直径によって定義されることがある。
【００３５】
[0085]  本明細書で使用するとき、用語「平均」は、特徴的な寸法の算術平均値又は何らかの他の代表値を表す。例えば、長手方向軸に沿って変化する断面を有する特徴部分（例えば、ハウジング又は採取器）の場合、特徴部分の平均公称直径は、その長さ全体にわたる特徴部分の平均公称直径である。
【００３６】
[0086]  本明細書で使用するとき、「試料」は、体液を表す（限定はしないが、実質的に任意の有機体の血液、尿、血清、リンパ液、唾液、肛門及び膣分泌液、汗、並びに精液を含み、哺乳類試料が好ましく、ヒト試料が特に好ましい）。試料は、ターゲット核酸及び／又はターゲットタンパク質を含む。
【００３７】
[0087]  本明細書では、「核酸」又は「オリゴヌクレオチド」又は文法的に同等の表現によって、互いに共有結合された少なくとも２つのヌクレオチドを意味する。ターゲット核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡを含んでいてよい。本発明の核酸は、一般に、（例えばターゲット配列の場合に）ホスホジエステル結合を含むが、いくつかの場合には、以下に概説するように、（特にリゲーション、ラベル、又は捕捉プローブと共に使用するための）交互バックボーンを有することがある核酸類似体が含まれ、例えばホスホラミド（Beaucage et al, Tetrahedron （1993） 49（10）: 1925及びその参考文献；Letsinger, J. Org. Chem. （1970） 35:3800；Sprinzl et al, Eur. J. Biochem. （1977） 81 :579；Letsinger et al, Nucl. Acids Res. （1986）14:3487；Sawai et al, Chem. Lett. （1984） 805；Letsinger et al, J. Am. Chem. Soc. （1988）110:4470；及びPauwels et al, Chemica Scripta （1986） 26: 141）、ホスホロチオエート（Mag et al, Nucleic Acids Res. （1991） 19: 1437；及び米国特許第５，６４４，０４８号）、ホスホロジチオエート（Briu et al, J. Am. Chem. Soc. （1989）111 :2321、Ｏ−メチルホスホラミデート連鎖（Eckstein, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, Oxford University Press参照）、並びにペプチド核酸バックボーン及び連鎖（Egholm, J. Am. Chem. Soc. （1992）1 14: 1895；Meier et al, Chem. Int. Ed. Engl. （1992） 31: 1008；Nielsen, Nature, （1993） 365:566；Carlsson et al., Nature （1996） 380:207参照。これらは全て参照により本明細書に組み込む）を含む。他の類似核酸は、ロックド核酸を含む二環式構造を有するもの（Koshkin et al, J. Am. Chem. Soc. （1998） 120: 13252 3）；正のバックボーン（Denpcy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA （1995）92:6097）；非イオンバックボーン（米国特許第５，３８６，０２３号、第５，６３７，６８４号、第５，６０２，２４０号、第５，２１６，１４１号、及び第４，４６９，８６３号；Kiedrowshi et al, Angew. Chem. Intl. Ed. English （1991） 30:423；Letsinger et al, J. Am. Chem. Soc. （1988）1 10:4470；Letsinger et al, Nucleoside & Nucleotide （1994） 13 : 1597; Chapters 2 and 3, ASC Symposium Series 580, Ed. Y. S. Sanghui and P. Dan Cook；Mesmaeker et al, Bioorganic & Medicinal Chem. Lett. （1994） 4:395；Jeffs et al, J. Biomolecular NMR （1994） 34: 17；Xu et al, Tetrahedron Lett. （1996）37:743）；及び非リボーズバックボーン（米国特許第5,235,033号、及び第5,034,506号、並びにChapters 6 and 7, ASC Symposium Series 580, Ed. Y. S. Sanghui and P. Dan Cookで述べられているものを含む）を含む。１つ又は複数の炭素環糖を含む核酸も、核酸の定義に含まれる（Jenkins et al, Chem. Soc. Rev. （1995） pp 169-176参照）。いくつかの核酸類似体が（Rawls, C & E News Jun. 2, 1997 page 35）で述べられている。これらの参考文献は全て、あらゆる目的で、特に核酸に関係付けられる全ての教示について、全体を参照により本明細書に明示的に組み込む。リボーズ−リン酸バックボーンのこれらの修飾は、ラベル又は他の部分の追加を容易にして、生理学的環境内でのそのような分子の安定性及び半減期を増減するために行うことができる。
【００３８】
[0088]  本明細書における「ターゲット配列」又は「ターゲット核酸」又は文法的に同等の表現によって、核酸の一本鎖での核酸配列を意味する。ターゲット配列は、遺伝子、調節配列、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、又はＲＮＡ（mRNA、MicroRNA、及びrRNAを含む）などの一部でよい。本明細書で概説するように、ターゲット配列は、試料からのターゲット配列、又は増幅反応の生成物などの二次ターゲットでよい。より長い配列がより特定的であるという理解の下で、ターゲット配列は任意の長さでよい。当業者に理解されるように、相補的ターゲット配列は、多くの形態を取ることがある。例えば、相補的ターゲット配列は、比較的大きい核酸配列、すなわち、とりわけ、遺伝子又はｍＲＮＡの全体又は一部や、プラスミド又はゲノムＤＮＡの制限断片などの中に含まれることがある。これらの全ての組合せが、特定のアッセイでのターゲット核酸となり得る。多くの場合、以下により詳細に述べるような遺伝子発現プロファイリングのためなどに多重アッセイが行われ、複数のターゲット配列が同時に検出される。
【００３９】
[0089]  一般に、各ターゲット配列は、複数の異なるターゲット領域から構成される。各ターゲット配列は、以下で述べるように、１組のライゲーションプローブへのハイブリダイゼーション用の少なくとも１対のライゲーション領域、又はより多くの領域を有する。例えば、試料ターゲット配列の第１のターゲット領域は、第１のライゲーションプローブにハイブリッド化することがあり、ターゲット配列の第２のターゲット領域は、第２のライゲーションプローブにハイブリッド化することがあり、それにより、自発化学ライゲーションを可能にするのに空間的に十分に近位に化学ライゲーション部分を位置させる。
【００４０】
[0090]  一般に、ターゲットライゲーション領域の各対が互いに隣接しており、すなわち、２つの領域を分離するヌクレオチドは存在しない。これは、ターゲット配列の全般的な検出（例えば、ターゲット配列としてｍＲＮＡを使用する遺伝子発現プロファイリング）で、以下に論じる転写反応で、及び一塩基多型（SNP）検出に関して使用される。ＳＮＰ検出に関して、ターゲット配列は、配列情報を要求される位置を含み、本明細書では一般に「検出位置」と呼ばれる。いくつかの実施形態では、検出位置は単一のヌクレオチドであるが、いくつかの実施形態では、複数のヌクレオチドを含むことがあり、それらのヌクレオチドは、互いに隣接している、又は１つ若しくは複数のヌクレオチドによって分離されている。本明細書で使用されるときの「複数」によって、少なくとも２つを意味する。本明細書で使用するとき、ハイブリッドでの検出位置塩基と塩基対を成すライゲーションプローブの塩基は、「インターロゲーション位置」と呼ばれる。
【００４１】
[0091]  各試料ターゲット核酸は、さらに、複数対のライゲーション領域を有することができる。すなわち、図１１又は１２に概して示されるように、１、２、３、又は４組以上のライゲーションプローブが、複数の場所で同じターゲット配列にハイブリッド化することができる。以下により完全に述べるように、ターゲット核酸当たりに複数のライゲーション領域を使用することは、試料中のターゲット核酸（及び／又は元の試料）の完全性を評価するための基礎となり得る。
【００４２】
[0092]  試料ターゲット核酸は、ライゲーション領域に加えて、他の領域を含むこともある。特定の実施形態では、本発明のターゲット核酸は、ターゲット捕捉領域を含み、そこにターゲット捕捉領域がハイブリッド化することができる。一般に、図１１に示されるように、アッセイの目的に応じて、ターゲット捕捉領域は、ターゲット核酸のライゲーション領域の１つ又は複数の「上流」、「下流」、又は「間」でよい。
【００４３】
[0093]  別段の指示がない限り、用語「第１」及び「第２」は、ターゲット配列の５’−３’向きに対する配列の向きを与えることを意味されない。例えば、相補的ターゲット配列の５’−３’向きを仮定して、第１のターゲット領域は、第２の領域に対して５’、又は第２の領域に対して３’に位置されることがある。参照しやすくするため、限定はせずに、これらの領域を時として「上流」及び「下流」と呼び、通常の慣例は、ターゲット配列が５’−３’向きで表されるものである。しかし、ライゲーションプローブセットの３’及び５’ライゲーション部分が（例えば介在するヌクレオ塩基なしで）完全に隣接してハイブリッド化するような向きをライゲーション領域が有すること、又はライゲーション部分同士を取り付けるリンカがライゲーションを可能にする距離内でライゲーション部分がハイブリッド化するような向きをライゲーション領域が有することに留意すべきである。
【００４４】
デバイス、キット、及び方法
[0094]  図１Ａ〜１Ｄは、本発明のいくつかの実施形態による生物学的試料を採取して安定化するための例示的なデバイス１００を示す。図示されるように、例示的なデバイス１００は、一般に、生物学的試料を採取するための採取器１０６と、生物学的試料の安定化及び将来の処理の助けとなる溶液、添加剤、又は試薬などを貯蔵するための保定器１０４と、保定器１０４を収容し、採取器１０６に係合するためのハウジング１０２とを含む。様々な実施形態において、採取器１０６は、生物学的試料を採取するための吸収部材１１８を含む。保定器１０４は、溶液を受け取るための容器１１４又は収容器と、容器１１４内に溶液を閉じ込めるための貫通可能シール１１６とを含む。保定器１０４は、ハウジング１０２内に挿入可能であるように構成される。いくつかの実施形態では、ハウジング１０２は、採取器１０６に係合するための開端部１０８と、閉端部１１０と、保定器１０４を受け取るための内部空間１１２とを含む。
【００４５】
[0095]  いくつかの実施形態では、採取器１０６は、ハウジング１０２、又はハウジング１０２の開端部に着脱可能に係合される。例えば、採取器１０６は、ハウジング１０２にねじ式に着脱することができる。いくつかの実施形態では、採取器１０６は、ハウジング１０２と対合するように構成され、ハウジング１０２と封止（例えば液密）係合されて、液体漏れを防止する。採取器１０６とハウジング１０２との封止係合は、ねじ係合、圧力嵌め、封止リングの使用、及び様々な他の適切な手段によって実現することができる。
【００４６】
[0096]  採取器１０６がハウジング１０２に係合している、又は係合されているとき、吸収部材１１８は、ハウジング１０２内に受け取られる。例えば図５Ａに示されるように特定の点で、採取器１０６（例えば採取器の先端）が、ハウジング１０２の内部空間１１２内に挿入されている保定器１０４の貫通可能シール１１６を破壊する。図５Ｂ及び５Ｃに示されるように採取器１０６がハウジング１０２内にさらに前進するにつれて、採取器１０６は、保定器１０４内に貯蔵されている溶液５０２を、吸収部材１１８を通って流れるように推進する。その結果、生物学的試料は、吸収部材１１８から解放され、溶液と混合されて、安定化された生物学的試料混合物５０４を生成する。
【００４７】
[0097]  いくつかの実施形態では、採取器１０６及び保定器１０４は、保定器１０４内への採取器１０６の挿入時に、溶液が吸収部材１１８を通して押されて、吸収部材１１８から生物学的試料（例えば血液）を溶離する助けとなるように構成される。好ましい実施形態では、保定器１０４内に採取器１０６を挿入するプロセス中、保定器１０４内の溶液は、溶離された生物学的試料と混合する。いくつかの実施形態では、保定器１０４内の溶液は、生物学的試料の特性を変える添加剤を含み、特性の変化は、例えば、劣化しないように成分を安定化すること、生物学的試料の細胞を一部又は完全に溶解すること、生物学的試料から１つの成分又は種を分離すること、診断試験用の化学試薬を添加すること、又は凝固を減少することによって行われる。
【００４８】
[0098]  吸収部材１１８は、様々な材料から形成することができ、様々な形状及びサイズで構成することができる。一般に、採取すべき生物学的試料のタイプ及び量に従って、材料が選択され、吸収部材１１８が構成される。いくつかの実施形態では、材料は、吸収部材１１８が生物学的試料の特定の成分に不可逆的に結合して保定することができるように選択される。代替として、吸収部材１１８が圧縮されたとき、又は生物学的試料が溶離されるときに、吸収部材１１８が生物学的成分のいくつか又は全ての最低保定量を有するように材料が選択されてもよい。いくつかの実施形態では、吸収部材１１８は、セルロース誘導体、ポリエステル、ポリビニルアルコール、発泡体、又は他の適切な材料を含む吸い上げ材料から形成される。一実施形態では、吸収部材１１８は、ポリビニルアルコール発泡体から形成されたスポンジである。
【００４９】
[0099]  いくつかの実施形態では、吸収部材１１８は、所定量の生物学的試料を吸収又は保定するように構成される。例えば、いくつかの実施形態では、吸収部材１１８は、１μＬ〜２０００μＬの間、５μＬ〜２００μＬの間、又は２０μＬ〜１００μＬの間の生物学的試料を採取する。吸収部材１１８は、採取器１０６に取り付ける又は嵌めることができる限り、立方体、シート、円柱、又は任意の適切な形状及びサイズでよい。好ましい実施形態では、吸収部材１１８は、採取器１０６の空洞２１２に適合する形状及びサイズを有する。
【００５０】
[00100]  例として、図２Ａ〜２Ｄに、本発明のいくつかの実施形態による生物学的試料を採取するための例示的な採取器１０６を示す。図示されるように、例示的な採取器１０６は、本体又は本体部分２０２と、ステム又はステム部分２０４とを備える。一実施形態では、本体部分２０２とステム部分２０４とは、別々に形成され、次いで互いに固定して結合される。好ましい実施形態では、本体部分２０２は、例えば射出成型又は他の既存の製造法によって、ステム部分２０４とモノリシックで又は一体に形成される。いくつかの実施形態では、本体部分２０２は、生物学的試料を採取するときのハンドルとして、及びハウジング１０２の開端部１０８に係合するときのシールとして働くように構成される。いくつかの実施形態では、ステム部分２０４は、本体部分２０２の近位の第１のセグメント２０６と、本体部分２０２の遠位の第２のセグメント２０８とを含むように構成される。そのような実施形態では、吸収部材１１８は、ステム部分２０４の第２のセグメント２０８に取り付けられる、又は嵌められる。採取器１０６が、（例えば図５Ｃに示されるように）ハウジング１０２又はハウジング１０２の開端部１０８に係合されるとき、吸収部材１１８と第２のセグメント２０８の少なくとも一部分とが、保定器１０４に受け取られて、吸収部材１１８を通って流れるように溶液を推進する。
【００５１】
[00101]  本発明での採取器１０６の本体部分２０２及びステム部分２０４は、様々な材料から形成することができる。例えば、本体部分及びステム部分２０４は、プラスチック、熱可塑材、又は金属から形成することができる。プラスチックの例は、不活性熱可塑材、ポリカーボネート、ポリエチレンテレフタレート、ポリウレタン、又は医療グレードポリプロピレンを含む。好ましくは、採取器１０６は、採取器１０６の容易で正確な取扱いを可能にするのに十分な剛性の材料から形成される。より好ましくは、採取器１０６は、医療グレードポリプロピレンなど、比較的不活性の熱可塑材で形成される。一実施形態では、本体部分２０２とステム部分２０４とは、異なる材料から形成される。別の実施形態では、本体部分２０２とステム部分２０４とは、医療グレードポリプロピレンなど、同じ材料から形成される。
【００５２】
[00102]  様々な実施形態において、本体部分２０２及びステム部分２０４は、実質的に円筒形であり、中空である。図１Ａ〜２Ｄに示されるものなど、いくつかの実施形態では、本体部分２０２及びステム部分２０４は実質的に円筒形であり、それぞれ実質的に円形の断面（すなわち、本体部分２０２又はステム部分２０４の長手方向軸に垂直な断面）を有する。本体部分２０２は、長さが約２ｃｍ〜８ｃｍでよく、平均公称直径が１ｃｍ〜３ｃｍの間である。ステム部分２０４は、長さが約１ｃｍ〜５ｃｍでよく、平均公称直径が０．５ｃｍ〜２．５ｃｍの間である。好ましい実施形態では、本体部分２０２は、長さが約４ｃｍであり、平均公称直径が約１．５ｃｍであり、ステム部分２０４は、長さが約２ｃｍであり、平均公称直径が約１ｃｍである。
【００５３】
[00103]  本体部分２０２及びステム部分２０４は、任意の適切な形状及びサイズでよく、実質的に円形の断面を必ずしも有さないことを理解されたい。例えば、本体部分２０２は、多角形（例えば六角形や八角形）の非対称又は不定の断面を有するセグメントを少なくとも有するように構成することができる。そのようなセグメントは、生物学的試料を採取する間又は採取器１０６をハウジング１０２に係合する間に使用者が採取器１０６を保持するためのハンドルとして使用されることがある。同様に、本体部分２０２は、溶液を推進して保定器１０４から出す助けとなるように保定器１０４に従った断面を有するセグメント（例えば第２のセグメント２０８）を少なくとも有するように構成することができる。
【００５４】
[00104]  いくつかの実施形態では、本体部分２０２の近位の第１のセグメント２０６は、リザーバ２１０を形成される。リザーバ２１０は、１μＬ〜５０００μＬの間、好ましくは２０μＬ〜１０００μＬの間、又はより好ましくは４０μＬ〜５００μＬの間の容積を有する。リザーバ２１０は、吸収部材１１８から解放された生物学的試料が、推進された溶液と混合できるようにする。リザーバ２１０は、生物学的試料と溶液との混合物（例えば図５Ｃでの参照符号５０４）を、後の処理のために混合物が取り出されるまで貯蔵するために使用することができる。
【００５５】
[00105]  いくつかの実施形態では、本体部分２０２の遠位の第２のセグメント２０８は、空洞２１２を形成され、吸収部材１１８は、空洞２１２内に配設又は挿入される。空洞２１２は、接着剤を使用して、又は単に摩擦力によって吸収部材１１８を保持することができる。そのような実施形態では、ステム部分２０４は、第１のセグメント２０６と第２のセグメント２０８との間に形成された区画２１４を有するように構成される。区画２１４は、採取器１０６がハウジング１０２に係合しているときに、吸収部材１１８が第１のセグメント２０６内に押し込まれるのを防止する。その一方で、区画２１４は、１つ又は複数の穴又はスロット２１６を形成され、スロット２１６を介して第１のセグメント２０６が第２のセグメント２０８と流体連絡する。いくつかの実施形態では、区画２１４は、区画２１４の中心軸に沿って周方向で分散された複数の穴又はスロット２１６を形成される。したがって、吸収部材１１８が第１のセグメント２０６内に押し込まれるのを防止する一方で、区画２１４は、解放された生物学的試料及び推進された溶液が、第１のセグメント２０６を通ってその中に流れることができるようにする。
【００５６】
[00106]  いくつかの実施形態では、区画２１４は、穴又はスロットを形成されておらず、第１のセグメント２０６を第２のセグメント２０８と流体連絡できるようにする有孔材料から形成される。いくつかの実施形態では、区画２１４は、生物学的試料から望ましくない成分を除去する、例えば血液試料から血球を除去することができる材料から形成される。
【００５７】
[00107]  生物学的試料と溶液との混合物が本体部分２０２を通って流出するのを防止するために、いくつかの実施形態では、採取器１０６は、セプタム２１８を含み、セプタム２１８は、本体部分２０２内部に配設され、好ましくはステム部分２０４に隣接する。セプタム２１８は、例えばピペットによって貫通可能又は穿刺可能であり、それにより、ハウジング１０２から採取器１０６を取り外すことなく、生物学的試料と溶液との混合物にアクセス可能であり、後の使用又は処理のために取り出すことができる。理想的には、貫通可能又は穿刺可能なセプタム２１８は自己再封止式であり、複数回貫通することができ、それでも、生物学的試料、又は生物学的試料と溶液との混合物に対する液密シールを提供する。セプタム２１８は、加硫ゴム、織布、又は熱可塑性エラストマーを含めた様々な材料から形成することができる。好ましい実施形態では、セプタム２１８は、熱可塑性エラストマーから形成される。
【００５８】
[00108]  さらに、又は任意選択により、採取器１０６は、１つ又は複数のシール、好ましくはエラストマーシールを含む。例えば、いくつかの実施形態では、採取器１０６は、ステム部分２０４の第２のセグメント２０８の外面に配設された第１のエラストマーシール２２０を含む。第１のエラストマーシール２２０は、採取器１０６がハウジング１０２の開端部１０８に係合している、又は係合されるときに、ステム部分２０４の第２のセグメント２０８の外面と保定器１０４の内面との封止を提供する。
【００５９】
[00109]  第１のエラストマーシール２２０に加えて、いくつかの実施形態では、採取器１０６は、第２のエラストマーシール２２２を含む。第２のエラストマーシール２２２は、様々な場所に配設することができる。一実施形態では、第２のエラストマーシール２２２は、ステム部分２０４の第１のセグメント２０６の外面に配設される。そのような実施形態では、第２のエラストマーシール２２２は、採取器１０６がハウジング１０２に係合している、又は係合されるときに、ステム部分２０４の第１のセグメント２０６の外面とハウジング１０２の内面との封止を提供する。別の実施形態では、第２のエラストマーシール２２２は、ステム部分２０４に隣接する本体部分２０２の外面に配設される。したがって、採取器１０６がハウジング１０２の開端部１０８に係合している、又は係合されるときに、第２のエラストマーシール２２０は、本体部分２０２の外面とハウジング１０２の内面との封止を提供する。いくつかの実施形態では、第２のエラストマーシール２２２は、本体部分２０２をステム部分２０４と結合する結合手段としても働く。
【００６０】
[00110]  第１及び第２のエラストマーシールは、限定はしないが、加硫ゴム、織布、又は熱可塑性エラストマーを含む様々な材料から形成することができる。第１と第２のエラストマーシールは、同じ材料から形成することも、異なる材料から形成することもできる。一実施形態では、第１と第２のエラストマーシールは、別々に形成されて、次いで採取器１０６に結合される。別の実施形態では、第１と第２のエラストマーは、例えば２つ以上の異なる材料を用いた射出成型によって、採取器１０６と一体に又はモノリシックに形成される。さらに別の実施形態では、第１と第２のエラストマーシールは、コーティングのように採取器１０６に塗布される。
【００６１】
[00111]  いくつかの実施形態では、採取器１０６はまた、採取器１０６がハウジング１０２に係合しているときに、保定器１０４の貫通可能シール１１６を破壊するための手段又はメカニズムを含む。保定器１０４の貫通可能シール１１６を破壊するための手段は、様々な形状及びサイズを有するように構成することができる。例えば、この手段は、ステム部分２０４の第２のセグメント２０８の突出した棒体、鋭い縁部、又は単に比較的剛性の壁でよい。好ましい実施形態では、保定器１０４の貫通可能シール１１６を破壊するための手段は、ステム部分２０４の第２のセグメント２０８の縁部から突出される１つ又は複数の歯２２４を含む。
【００６２】
[00112]  いくつかの実施形態では、採取器１０６は、様々な追加又は任意選択の特徴部分を有するように構成される。例えば、いくつかの実施形態では、リブ２２６が、ステム部分２０４の第２のセグメント２０８の外面に形成される。例示的実施形態では、リブ２２６は、ステム部分２０４の第２のセグメント２０８の外面に沿って周方向に形成される。採取器１０６がハウジング１０２の開端部１０８に係合しているとき、リブ２２６は、プランジャとして働き、吸収部材１１８を通って流れるように溶液を推進する助けとなる。シール（例えば第１のエラストマーシール２２０）がステム部分２０４の第２のセグメント２０８に配設されるいくつかの実施形態では、リブ２２６は、シールを定位置に保定する助けもする。そのような実施形態では、リブ２２６は、シールと共にプランジャとして働く。いくつかの実施形態では、複数のリブは、ステム部分２０４の第２のセグメント２０８の外面に形成される。
【００６３】
[00113]  いくつかの実施形態では、採取器１０６及びハウジング１０２は、採取器１０６をハウジング１０２にねじ留めすることができるように構成される。例えば、好ましい実施形態では、ハウジング１０２は、図４Ｂ及び４Ｄに示されるものなど、雌ねじ又はガイドトラック４０２を形成され、採取器１０６は、採取器１０６をハウジング１０２に案内してねじ留めするための１つ又は複数のピン２２８を有するように構成される。好ましくは、１つ又は複数のピン２２８は、本体部分２０２の側壁２３０に、ステム部分２０４の近位に形成される。より好ましくは、採取器１０６は、２つのピン２２８を有するように構成され、ピン２２８は、図２Ｃに示されるように、本体部分２０２の側壁２３０に、反対側又は実質的に反対側に形成される。いくつかの実施形態では、１つ又は複数のピン２２８はストッパとしても働いて、意図せず採取器１０６がハウジング１０２内に深く押し込まれすぎて、保定器１０４を損傷するのを防止する。採取器１０６とハウジング１０２は、他の方法で、例えば圧力嵌めによって係合することもできることを理解されたい。
【００６４】
[00114]  いくつかの実施形態では、採取器１０６及びハウジング１０２は、採取器１０６がハウジング１０２に係合された後に、採取器１０６をハウジング１０２と嵌合するためのロック手段又はメカニズムを有するように構成される。そのようなロック手段は、例えば様々な場所からのデバイス１００の出荷又は輸送中に、ハウジング１０２からの採取器１０６の意図的でない脱落を防止する。例えば、いくつかの実施形態では、ハウジング１０２は、少なくとも１つのスロット４１０を有するように構成され、採取器１０６は、ハウジング１０２に形成された少なくとも１つのスロット４１０に対応する少なくとも１つの戻り止め２３２を有するように構成される。好ましい実施形態では、ロック手段は、採取器１０６とハウジング１０２の適切な係合を示す視覚、触覚、又は聴覚信号を提供するように構成される。一例として、図４Ｃに、ハウジング１０２の開端部１０８に形成された２つのスロット４１０を示し、図２Ｄに、採取器１０６の本体部分２０２の側壁２３０に形成された２つの戻り止め又はクリップ２３２を示す。採取器１０６がハウジング１０２に係合されるとき、２つのクリップ２３２が２つのスロット４１０によって受け取られ、クリック音を発して、２つのクリップ２３２が２つのスロット４１０にスナップ留めされたことを示す。好ましくは、２つのスロットは、互いに反対側又は実質的に反対側に形成され、対応する２つのクリップも、互いに反対側又は実質的に反対側に形成される。
【００６５】
[00115]  いくつかの実施形態では、採取器１０６はハンドルとして働くように構成され、それにより、採取器１０６は、生物学的試料を採取するために使用されるとき、又はハウジング１０２に係合されるときにしっかりと保持することができる。例えば、いくつかの実施形態では、採取器１０６は、採取器１０６の本体部分２０２の側壁２３０に、好ましくはステム部分２０４の遠位の位置に形成された外側グリップ（例えば参照番号２３４、２３６）を有するように構成される。外側クリップ（例えば参照番号２３４、２３６）は、凹部、溝、リブ、ピン、突出部、又は凹部、溝、リブ、ピン、及び突出部の任意の組合せを含めた様々な構成で形成することができる。また、凹部、溝、リブ、ピン、及び突出部の数及びサイズは容易に変えることができる。例として、図２Ｃは、本体部分２０２の側壁２３０に、ステム部分２０４の遠位に形成されたリブ２３４及び溝２３６を含む外側グリップを示す。
【００６６】
[00116]  いくつかの実施形態では、採取器１０６は、表面２４０を有するように構成され、表面２４０に商標名又は他の識別／装飾２３８を配置できるようにする。表面２４０は、平坦形、湾曲形、凹形、又は凸形でよい。商標名又は他の識別／装飾２３８は、表面２４０に刻印、印刷、若しくは成型、又は他の適切な手段によって形成することができる。一例として、図２Ｃは、表面２４０に一体に又はモノリシックに成型された商標名２３８（すなわち、DxTerity）を示す。
【００６７】
[00117]  いくつかの実施形態では、採取器１０６は、特にターゲットされた細胞又は種を生物学的試料から生成又は分離するためのフィルタ又は膜を含む。一例として、図１５Ａ〜１５Ｃは、生物学的試料から血漿を生成又は分離するためのプラズマメンブレン１５０２を示す。いくつかの実施形態では、プラズマメンブレン１５０２は、ステム部分２０４の第２のセグメント２０８内に配設される。いくつかの実施形態では、プラズマメンブレン２０８は、空洞２１２内に配設され、空洞２１２は、ステム部分２０４の第２のセグメント２０８に形成される。一般に、プラズマメンブレン１５０２は、例えば、生物学的試料を採取する前に、又はデバイスをエンドユーザに出荷する前に製造施設の現場で、吸収部材１１８よりも前に空洞２１２内に挿入される。
【００６８】
[00118]  次に図３Ａ〜３Ｄを見ると、容器１１４及び貫通可能シール１１６を含む例示的な保定器１０４が示される。図示される容器１１４は、開いた上部３０２と、閉じた底部３０４とを有する。いくつかの実施形態では、閉じた底部３０４の中央部分３０８は、吸収部材１１８を圧縮するように、開いた上部３０２に向かって内側に凹んでいる。代替として、いくつかの実施形態では、閉じた底部３０４の中央部分３０８は、閉じた底部３０４から内側に突出した中実カラム又はポストなどの突出部である。内側に凹んだ中央部分又は突出部３０８を有することで、死容積を減少させ、生物学的試料の解放を高める。例えば、生物学的流体の採取後、採取器１０６は、保定器１０４を含むハウジング１０２内に挿入される。採取器１０６がハウジング１０２内に前進するとき、図５Ａに示されるように、採取器１０６（例えば歯２２４）が貫通可能シール１１６を破壊し、図５Ｂに示されるように、吸収部材１１８が、内側に凹んだ中央部分又は突出部３０８と接触する。採取器１０６がハウジング１０２内にさらに前進するとき、内側に凹んだ中央部分又は突出部３０８は、吸収部材１１８を圧縮し、その結果、吸収部材１１８から生物学的試料を絞り出す。
【００６９】
[00119]  容器１１４の中央部分に形成された内側に凹んだ中央部分又は突出部を有することで、他の利点もある。例えば、容器１１４に貯蔵されるときの溶液又は溶液の大半が、容器１１４の周縁空間を占める。したがって、溶液を容易に推進し、吸収部材１１８を通して出すことができ、生物学的試料の解放を向上させる。いくつかの実施形態では、保定器１０４の容器１１４はテーパを付けられ、開いた上部３０２が閉じた底部３０４よりも広く、例えば、開いた上部３０２が閉じた底部３０４よりも大きい公称直径を有する。
【００７０】
[00120]  いくつかの実施形態では、ハウジング１０２は、保定器１０４を支持するための手段を形成される。例えば、いくつかの実施形態では、ハウジング１０２は、図４Ｂ及び４Ｄに示される第１のシート４０４など、シートを有するように構成される。例として、図示される第１のシート４０４は、ハウジング１０２の内面に形成され、保定器１０４がハウジング１０２の内部空間１１２内に挿入されたときに保定器１０４を支持する。第１のシート４０４に対応して、いくつかの実施形態では、容器１１４は、図３Ｂ、３Ｄ、及び４Ｄに示される第１のフランジ３１０などのフランジを形成される。フランジは、好ましくは保定器１０４の容器１１４の外面に形成され、それにより、保定器１０４がハウジング１０２の内部空間１１２内に挿入されるとき、フランジは第１のショルダに当接する。好ましい実施形態では、第１のシート４０４は、ハウジング１０２の内面から半径方向内側に押出成型されたショルダ又はフランジの形状で形成され、第１のフランジ３１０は、保定器１０４の容器１１４の外面から半径方向外側に延びる。第１のシート４０４は、連続的な形態である必要は必ずしもなく、また周方向でハウジング１０２の内面の全周に沿っている必要も必ずしもない。例えば、一実施形態では、第１のシート４０４は、ハウジング１０２の内面に沿って周方向で（均等に又は不均等に）離隔された複数のリブを含む。同様に、フランジは、連続的な形態である必要は必ずしもなく、また周方向で保定器１０４の容器１１４の外面の全周に沿っている必要も必ずしもない。
【００７１】
[00121]  採取器１０６の本体部分２０２及びステム部分２０４と同様に、保定器１０４の容器１１４も様々な材料から形成することができる。例えば、容器１１４は、限定はしないがプラスチック又は金属を含む様々な材料から形成することができる。プラスチックの例は、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート（PET）、ポリスチレン、又はポリカーボネートを含む。好ましい実施形態では、容器１１４は、医療グレードポリプロピレンから形成される。
【００７２】
[00122]  本発明の保定器１０４は、ハウジング１０２内に挿入することができる限り、様々な形状及びサイズで構成することができる。好ましくは、保定器１０４の容器１１４は、実質的に円形又は多角形断面の円筒形状を有する。一実施形態では、容器１１４は、カップ形状である。いくつかの実施形態では、保定器１０４の容器１１４は、２０μＬ〜２０００μＬの間、好ましくは５０μＬ〜１０００μＬの間、又はより好ましくは１００μＬ〜５００μＬの間の容積を有する。
【００７３】
[00123]  いくつかの実施形態では、貫通可能シール１１６は、熱可塑材、箔コーティングされた熱可塑材、熱封止可能な材料、又は感圧接着剤でコーティングされた材料から形成される。貫通可能シール１１６は、熱によって容器１１４に貼着される。
【００７４】
[00124]  図４Ａ〜４Ｂは、本発明のいくつかの実施形態による例示的なハウジング１０２及び例示的な保定器１０４を示す。一般に、ハウジング１０２は細長く、開端部１０８と、閉端部１１０と、保定器１０４を収容して採取器１０６に係合するための内部空間１１２とを有する。好ましい実施形態では、ハウジング１０２は、実質的に円形又は多角形断面を有する略円筒形状を有する。ハウジング１０２は、長さが約４ｃｍ〜１２ｃｍでよく、平均公称直径が１ｃｍ〜４ｃｍの間でよい。好ましい実施形態では、ハウジング１０２は、長さが約７ｃｍであり、平均公称直径が約１．８ｃｍである。ハウジング１０２は、限定はしないがプラスチック及び金属を含む様々な材料から形成することができる。例えば、ハウジング１０２は、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート（PET）、ポリスチレン、又はポリカーボネートから形成することができる。一実施形態では、ハウジング１０２は、射出成型によって熱可塑材を用いて成型される。
【００７５】
[00125]  いくつかの実施形態では、ハウジング１０２は、任意選択の又は追加の特徴部分を有するように構成される。例えば、本明細書で述べるように、いくつかの実施形態でのハウジング１０２の開端部１０８は、雌ねじ４０２を切られて、採取器１０６との係合及び／又は保定器１０４の挿入を容易にする。いくつかの実施形態では、ハウジング１０２の開端部は、採取器１０６と嵌合するための１つ又は複数のスロットなどのロック手段も形成される。
【００７６】
[00126]  いくつかの実施形態では、ハウジング１０２は、追加の特徴部分を有するように構成され、それにより、ハウジング１０２は、例えば液体取扱いロボット又は他の標準の自動化及び試験システムを使用する下流での処理のためのラック内に配置及び／又は保定することができる。一実施形態では、ハウジング１０２の閉端部１１０は、ハウジング１０２の閉端部１１０の外面から半径方向内側に延ばされた溝を形成される。別の実施形態では、ハウジング１０２の閉端部１１０は、ハウジング１０２の閉端部１１０の外面から半径方向外側に延ばされたショルダ又はフランジを形成される。さらに別の実施形態では、ハウジング１０２の閉端部１１０は、ハウジング１０２の閉端部１１０の底部に凹部４０６を形成される。例として、図４Ａ〜４Ｂは、ハウジング１０２の閉端部１１０に形成された溝４０８及び凹部４０６を示す。図９Ａ〜９Ｄは、ハウジング１０２の閉端部１１０に形成されたリング状のリブ又はフランジ９０２及び凹部４０６を示す。溝、ショルダ、フランジ、又は凹部が、形状、サイズ、及び位置、並びにそれらの任意の組合せを含む様々な他の構成を取ることができることを理解されたい。
【００７７】
[00127]  いくつかの実施形態では、デバイス１００は、デバイスを識別及び追跡するための識別及び／又はタグを含む。識別及びタグの例は、図１１に示されるような、２Ｄデータマトリックスバーコード、可読製品識別、及び／又は無線周波数識別（RFID）タグを含む。例示的実施形態では、バーコード又はＲＦＩＤタグは、ハウジング１０２の底部に印刷又は取着され、製品識別は、ハウジング１０２の外面に印刷又は取着される。２Ｄデータマトリックスバーコード、可読製品タグ、及び／又はＲＦＩＤタグは、何らかの他の位置に、例えば開端部１０８の近位のハウジング１０２の外面に配置することもできることを理解されたい。また、デバイス１００は、ハウジング１０２又は採取器１０６に取着、印刷、又は刻印された他のコード、識別、又は情報を含むこともできることを理解されたい。
【００７８】
[00128]  図６Ａ〜６Ｄを見ると、本発明のいくつかの実施形態による生物学的試料を採取して安定化するための代替の例示的なデバイス６００が示されている。デバイス６００は、いくつかの特徴部分を有し、これらの特徴部分は、デバイス１００のものと同様又は実質的に同一である。例えば、デバイス１００と同様に、デバイス６００も、採取器６０６と、保定器６０４と、ハウジング６０２とを含む。採取器６０６は、生物学的試料を採取するための吸収部材１１８を含む。保定器６０４は、溶液を受け取るための容器６１４と、容器６１４内に溶液を閉じ込めるための貫通可能シール１１６とを含む。ハウジング６０２は、採取器に係合するための開端部６０８と、閉端部６１０と、保定器を受け取るための内部空間１１２とを有する。
【００７９】
[00129]  図７Ａ〜７Ｄに、本発明のいくつかの実施形態による生物学的試料を採取するための例示的な採取器６０６を示す。例示的な採取器６０６は、採取器１０６及びステム部分７０２に関して本明細書で述べたように本体部分２０２を含むように構成される。この例示的実施形態では、ステム部分７０２は、本体部分２０２の近位にある第１のセグメント７０４と、本体部分２０２の遠位にある第２のセグメント２０８とを含む。吸収部材１１８は、ステム部分７０２の第２のセグメント２０８に取り付けられる、接着される、又は嵌められる。採取器１０６のステム部分２０４と同様に、いくつかの実施形態では、ステム部分７０２は、第１のセグメント７０４と第２のセグメント２０８との間に形成された区画を有するように構成されて、吸収部材が第１のセグメント７０４内に押し込まれるのを防止すると共に、解放された生物学的試料及び推進された溶液が第１のセグメント７０４を通ってその中に流れるようにする。
【００８０】
[00130]  採取器１０６のステム部分２０４とは異なり、ステム部分７０２の第１のセグメント７０４は、リザーバを形成されていない。そうではなく、ステム部分７０２の第１のセグメント７０４は、１つ又は複数の開いたスロット７０６を形成されて、解放された生物学的試料及び推進された溶液がそこを通って流れるようにする。
【００８１】
[00131]  図８Ａ〜８Ｄに示されるように、ステム部分７０２に合わせて、保定器６０４は、好ましくは容器６１４の開いた上部３０２に隣接して形成されたリザーバ８０２を含むように構成される。図１０Ａ〜１０Ｂに示される実施形態などいくつかの実施形態では、リザーバ８０２は、ステム部分７０２の第１のセグメント７０４を受け取るように構成される。ステム部分７０２の第１のセグメント７０４と共に、リザーバ８０２は、生物学的試料と溶液との混合を容易にし、生物学的試料と溶液との混合物を貯蔵する。
【００８２】
[00132]  いくつかの実施形態では、保定器６０４は、保定器６０４内に溶液を保定するために、図８Ｅ〜８Ｇに示される保定具８０４などの保定具を含む。溶液保定具８０４は、好ましくは、容器内に受け取られた溶液と貫通可能シールとの間に配設される。図８Ｅ〜８Ｇに示されるように、溶液が容器内に受け取られた後、溶液保定具８０４は、貫通可能シール１１６で容器６１４を封止する前に容器内に押し込むことができる。溶液保定具８０４を支持するために、いくつかの実施形態では、容器６１４は、容器６１４の内面に形成されたシート又はショルダ８０８を有するように構成される。それに対応して、溶液保定具８０４は、溶液保定具８０４の外面に形成されたフランジ８０６を有するように構成される。溶液保定具８０４が容器６１４内に押し込まれるとき、フランジ８０６は、シート又はショルダ８０８に当接し、それにより、溶液保定具８０４を定位置に支持し、溶液保定具８０４が溶液内に押し込まれるのを防止する。
【００８３】
[00133]  次に図１２を見ると、本発明のいくつかの実施形態による、生物学的試料を採取して安定化するための例示的なキットを示す。キットは、エンドユーザの自宅、在宅医療、又は他の施設で使用することができる。キットは、使用者が、好きな場所（例えば自宅）で生物学的試料を自己採取し、次いで例えば後の処理のために試験研究所に試料を郵送できるようにする。また、キットは、試料を採取するためにヘルスケア専門家（例えば看護婦）又は他の従事者が使用することもできることを理解されたい。
【００８４】
[00134]  一般に、キットは、採取器（例えば採取器１０６、６０６）と、保定器（例えば保定器１０４、６０４）と、ハウジング（例えばハウジング１０２、６０２）とを含む。保定器は、独立して形成して、キットをエンドユーザに出荷する前にハウジングと予め組み立てることができる。好ましくは、保定器は、製造現場でハウジングと組み立てられる。
【００８５】
[00135]  いくつかの実施形態では、このキットは、１つ又は複数のランセット１２０２、例えば図１２に示されるように２つのランセットも含む。ランセット１２０２は、生物学的試料（例えば血液）を提供するためにエンドユーザの膜（例えば指の皮膚）に貫入するために使用することができる。いくつかの実施形態では、キットは、採取器、保定器を有するハウジング、及び／又はランセットを収容するためのボックスなどのケーシング１２０４を含む。いくつかの実施形態では、キットは、他の任意選択の又は追加の構成要素を含む。例えば、いくつかの実施形態では、キットは、生物学的試料を採取する前に採取部位（例えば指、脚）を洗浄して準備するための１つ又は複数の準備パッド１２０６を含む。準備パッドは、アルコール消毒パッドでよい。いくつかの実施形態では、キットは、生物学的試料の採取後に採取部位を保護するための１つ又は複数のバンドエイド１２０８を含む。
【００８６】
[00136]  本発明の採取及び安定化デバイス及びキットは、様々な用途で使用することができる。例えば、採取及び安定化デバイス及びキットは、患者の指先、耳たぶ、踵、又は他の場所から血液又は他の体液を採取して安定化するために使用することができる。例として、図１３は、生物学的試料を採取して安定化するために本発明のデバイス又はキットを使用する例示的な方法を示す流れ図である。いくつかの実施形態では、方法は、吸収部材と、ハウジングと、ハウジング内に挿入可能な保定器とを備える採取器を提供する工程Ｓ１３１０と、採取器の吸収部材によって生物学的試料を採取する工程Ｓ１３４０と、採取器をハウジングと封止係合する工程Ｓ１３５０とを含む。保定器は、溶液を含み、採取器をハウジングに係合する前にハウジングの内部空間内に挿入されている。デバイス１００、６００に関して本明細書で述べるように、採取器とハウジングとの封止係合は、保定器の貫通可能シールを破壊し、保定器内に保定された溶液を、吸収部材を通って流れるように推進する。その結果、生物学的試料（又は生物学的試料のあるパーセンテージ又は特定の成分）が、吸収部材から解放され、溶液と混合されて、生物学的試料と溶液との安定化された混合物を生成する。
【００８７】
[00137]  いくつかの実施形態では、封止係合は、採取器をハウジング内にねじ留めすることを含む。図５Ａ及び１０Ａ〜１０Ｂに示されるように、ハウジング内に前進して下がるにつれて、採取器は、保定器の封止フィルムを穿刺し、吸収部材を保定器内の溶液５０２に露出する。図５Ｂ及び１０Ｃに示されるように、採取器がハウジング内にさらに前進して下がるにつれて、吸収部材は、内側に凹んだ中央部分又は突出部と接触する。採取器のねじ留めプロセスが続き、図５Ｃ及び１０Ｄに示されるように、吸収部材は、ハードストップに当たるまで圧縮される。この時点で、いくつかの実施形態では、嵌合メカニズムが係合し、ハウジングからの採取器の意図的でない脱落を妨げる。
【００８８】
[00138]  いくつかの実施形態では、この方法は、いくつかの任意選択の又は追加の工程を含む。例えば、生物学的試料を採取する前に、工程Ｓ１３３０で、使用者又は専門家が、ランセットを使用して、採取部位で使用者の膜に貫入する（例えば指先又は脚を穿刺する）ことがある。いくつかの実施形態では、膜に貫入する前に、工程Ｓ１３２０で、例えば準備パッド、好ましくは予め準備されたアルコールパッドによって採取部位が洗浄されて準備される。採取器がハウジングと封止係合された後、工程１３６０で、デバイスは、ハウジング及び保定器と共に、受取人（例えば試験研究所、提供業者）に出荷又は輸送される。採取器が受け取られた後、工程Ｓ１３７０で、後の処理のために例えばピペットによって生物学的試料を取り出すことができる。いくつかの実施形態では、後の処理は、採取器によって採取された生物学的試料中のターゲット配列を検出することを含む。
【００８９】
[00139]  図１４は、指先から血液を採取して安定化するために本発明のデバイス又はキットを使用する例示的な方法１４００を示す。いくつかの場合に、石鹸及び温水で手をよく洗い、次いで、アルコール準備パッドを使用して採取部位を拭いて洗浄して準備してから、指先を穿刺することが好ましい。準備後、ランセットの先端を、ターゲットされた指先の採取部位に配置し、トリガを押して血液を引き抜く。採取器（例えば採取器の空洞内の吸収部材）を採取部位に触れさせて、血液を吸収する。いくつかの場合、指をマッサージして、血流を保ち、所定量（例えば８０μＬ）の血液の採取を保証することが好ましい。所定量の血液が採取された後、又は吸収部材がその満杯の容量に達した後、採取器（又は採取器のステム部分）をハウジング内に挿入して、ハウジングと完全に係合されるまで採取器をねじ留めする。後の処理のために、採取器をハウジングと共に受取人（例えば試験研究所）に出荷する。
【００９０】
試料の検出
[00140]  本発明の実践は、別段の指示がない限り、当技術分野に含まれる有機化学、ポリマー技術、分子生物学（組換え技法を含む）、細胞生物学、生物化学、及び免疫学の従来の技法及び説明を採用することがある。そのような従来の技法は、ポリマーアレイ合成、ハイブリダイゼーション、ライゲーション、ファージディスプレイ、及びラベルを使用したハイブリダイゼーションの検出を含む。適切な技法の特定の例は、本明細書で以下の例を参照して理解することができる。しかし、当然、他の同等の従来の処置も使用することができる。そのような従来の技法及び説明は、Genome Analysis: A Laboratory Manual Series （Vols. I-IV）、Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cells: A Laboratory Manual、PCR Primer: A Laboratory Manual, and Molecular Cloning: A Laboratory Manual （全てCold Spring Harbor Laboratory Pressから）、Stryer, L. （1995） Biochemistry （4th Ed.） Freeman, New York, Gait, "Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach" 1984, IRL Press, London, Nelson and Cox （2000）、 Lehninger, Principles of Biochemistry 3rd Ed., W. H. Freeman Pub., New York, N.Y. and Berg et al. （2002） Biochemistry, 5th Ed., W. H. Freeman Pub., New York, N.Y.などの標準の実験マニュアルで見ることができ、それらは全て、あらゆる目的で全体を参照により本明細書に組み込む。
【００９１】
[00141]  本発明のシステムは、分子診断分析を行うのに十分な細胞（ウイルスを含む）を含む生物学的試料、特に血液の採取を対象とする。
【００９２】
[00142]  当業者には理解されるように、ＰＣＲ（リアルタイム、多重、デジタルなど）、マイクロアレイ分析、毛細管電気泳動などを含め、分子診断で使用されるいくつかの既存の技術があり、それらの任意の１つを、本発明の採取された試料に対して行うことができる。
【００９３】
[00143]  一実施形態では、試料は、化学ライゲーションを使用して処理され、これは、米国特許出願公開第２０１０／２６７５８５号及び第２０１３／０００５５９４号で一般に述べられており、それらの特許文献の全体、特に図面及び説明文、緩衝液、ライゲーション部分、及びライゲーションプローブの向きの論述を、参照により本明細書に明示的に組み込む。
【００９４】
[00144]  図１６に全般的に示されるように、ＣＬＰＡで、方法は、２つ以上のライゲーションプローブ（本明細書では「オリゴヌクレオチドプローブ」とも呼ぶ）を利用し、これらのライゲーションプローブは、互いに近接するターゲット核酸を可逆的に結合し、相補的な反応ライゲーション部分を有する。ライゲーション反応において、プローブが適切な向きでターゲットに結合しているとき、プローブは、自発化学ライゲーション反応を行うことができ、この反応は、ライゲーションされたオリゴヌクレオチド生成物を生み出し、これはリガーゼ酵素の使用に依拠しない。次いで、対象のターゲットの存在は、いくつかの異なる方法で、ライゲーションされたオリゴヌクレオチド生成物（本明細書では「ライゲーション生成物」とも呼ぶ）の存在又は量を測定することによって判断することができる。以下に説明するように、ライゲーションプローブは、限定はしないが以下のものを含めた様々な追加の機能を含むことができる。ライゲーションされたオリゴヌクレオチド生成物の識別、定量化、又は検出の助けとなるような検出可能なラベル。これは、例えば、光学ラベル（蛍光ラベル、特に、当技術分野で知られているものなど共有結合で取り付けられた蛍光ラベルを含む）などの直接のラベル、及び電気化学ラベルなどを含む；並びに、特定のターゲットに特定的であるようにサイズ決定された核酸配列を含む任意選択の可変スペーサ配列又は「サイズタグ」。それにより、特定のサイズのライゲーション生成物の検出（又はそのようなライゲーション生成物から生成されるアンプリコン）が、（例えば１つの（非限定の）検出法である図１５に示される毛細管電気泳動（CE）分析で使用するために）特定のターゲット核酸配列の存在及び／又は量を識別する。ライゲーションプローブの１つ又は複数に備わる別の任意選択の機能は、固体支持体（例えばマイクロアレイ、マイクロビーズ、ナノ粒子など）での後の捕捉のために設計された捕捉部分であり、これは、限定はしないが、ビオチンなどの結合相手、アンカオリゴヌクレオチド配列（本明細書では「アンカ配列」又は「捕捉配列」とも呼ぶ）、ライゲーションされる生成物（磁性粒子、オリゴヌクレオチド符号化配列）の濃度又は操作を促進する分子ハンドル、及びＤＮＡ又はＲＮＡポリメラーゼなどの酵素によるライゲーションされた生成物の後の二次増幅を容易にするための促進剤及びプライマ配列を含む。
【００９５】
[00145]  好ましくは、本発明のライゲーション反応は、外から添加されるリガーゼの存在も、追加の酵素の存在も必要としないが、いくつかの二次反応は、以下で述べるように、ポリメラーゼなどの酵素の使用に依拠することがある。ターゲットの増幅は、ライゲーション生成物のターンオーバを含むこともあり、ここで、ライゲーション生成物は、テンプレート又はターゲット核酸に関して、個々のライゲーションプローブが有するよりも低い又は同等の親和性を有する。したがって、ハイブリッド化されたプローブのライゲーション時、ライゲーション生成物がターゲットから解放され、ターゲットは、新たなライゲーション反応のためのテンプレートとなることができるようになる。代替として、ターゲット配列からライゲーション生成物を除去するために、及び別のライゲーションサイクルに関して新たなライゲーションプローブがハイブリッド化できるようにするために熱循環を行うことができる。
【００９６】
[00146]  本発明は、限定はしないがＤＮＡ及びＲＮＡターゲットを含む試料中の１つ又は複数の核酸を検出するための組成物、装置、及び方法を提供する。核酸ターゲット検出に関して非酵素手法を使用する利点は、人工ＤＮＡ類似体構造に対するより低い感度と、ＲＮＡターゲット配列を使用することができる能力と、様々な条件下でのより低いコスト及びより大きいロバストネスとを含む。特に、本明細書で述べる方法は、それほどの試料準備を必要としない；すなわち、ライゲーション反応は、検出に関する酵素プロセスを阻止又は不活性化する汚染物質及び緩衝液の存在下で行うことができる。例えば、酵素プロセスを変性する条件下で、大きく変性された安定化緩衝液中に血液試料を採取することができ、プローブが添加されて反応が生じる。不純な試料中のターゲット核酸、特にＲＮＡを分析することができるこの能力は、医療診断（遺伝子発現プロファイリング及びSNP検出を含む）、法医学用途、並びに環境毒素及び／又は放射線による損傷に関する試験などの用途で特に使用される。さらに、本発明の方法及び組成は、パラフィン包埋試料を含めた、劣化された試料からの核酸の検出で有用である。パラフィン包埋試料では、パラフィン中に固定して包埋するプロセスが試料の核酸の劣化をもたらしている。
【００９７】
[00147]  さらに、本発明の一実施形態は、ターゲット核酸「完全性」に関係するアッセイを提供する。すなわち、例えばｍＲＮＡ、又は固定された試料中の核酸を用いる技術分野で知られているように、核酸は経時的に劣化される。図面に示されるように、検出のために化学ライゲーションが使用される場合、試料の完全性の評価を可能にするために複数のライゲーション錯体が使用される。同様に、例えば試料を２つ又は３つ用いるのと同様に、冗長によって、データ及びアッセイ完全性に関してターゲット配列当たりにこれらのライゲーション錯体を複数使用することもできる。
【００９８】
[00148]  さらなる態様では、本発明の採取システムは、試料中で核酸を安定化する働き及び他の機能を行う緩衝液を提供する。いくつかの実施形態では、デバイスは、核酸（本明細書では「試料核酸」又は「ターゲット核酸」とも呼ぶ）を安定化する試薬を含む。本明細書で使用される「安定化」によって、試料中の核酸が、ある期間にわたって周囲室温以上で貯蔵されるときでさえ、劣化に対して耐性があることを意味する。いくつかの実施形態では、本発明の緩衝液中に含まれる核酸は、約１日〜約３ヶ月間、室温以上で安定する。安定性は、以下でさらに論じるような核酸完全性に関するアッセイを含めた、当技術分野で知られている任意の手段を使用して測定することができる。さらなる実施形態では、緩衝液中に貯蔵された試料中の核酸の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％が、緩衝液中に貯蔵されなかった試料の劣化よりも小さい劣化を示す場合、本発明の緩衝液に含有される核酸を含む試料は、緩衝液中に貯蔵されなかった試料に比べて高い安定性を有するものと評価される。さらなる実施形態では、試料中の核酸の少なくとも大半、緩衝液中に貯蔵されなかった試料に比べて小さい劣化を示す場合、試料は、本発明の緩衝液によって安定化されたものと識別される。ＲＮＡ試料の安定性は、しばしば、核酸試料の平均サイズを測定することを狙いとする毛細管電気泳動法によって評価される。安定化された試料は、安定化されていない試料よりも長い平均サイズを有する。本明細書に含まれる別の態様は、ターゲット核酸の平均サイズ、及びそれと相関してターゲット核酸の劣化のレベルを評価するために使用することができる１つ又は複数のターゲット捕捉プローブと組み合わされた複数のライゲーションプローブの使用である。
【００９９】
[00149]  本発明の緩衝液は、任意選択により、及び任意の組合せで、変性剤、還元剤、表面活性剤、ｐＨ緩衝液、ＥＤＴＡなどのキレート剤の１つ又は複数、及びそれらの任意の組合せを含む。理解されるように、本発明の緩衝液は、同じクラス内の複数のタイプの成分を含むことがある。例えば、本発明の緩衝液は、１つ又は複数のタイプの表面活性剤と組み合わせた１つ又は複数の異なる種類の変性剤を含むことがある。
【０１００】
[00150]  本発明の緩衝液の利点は、それらの緩衝液を使用して、ＲＮＡなどの核酸を試料中で安定化することができ、次いで、本明細書で述べる方法に従って、緩衝溶液から試料を直接分析することができる。すなわち、本発明の緩衝溶液中に含まる試料は、ＲＮＡの隔離又は純化なしで、本明細書で述べる化学ライゲーション及び検出方法を施すことができる。本発明の緩衝液の別の利点は、緩衝液中の試料の採取時に細胞溶解が生じることであり、したがって、ターゲット核酸を試料から解放するために追加の溶解工程を必要としない。
【０１０１】
[00151]  例示的な実施形態では、ＲＮＡを含む試料を、ｐＨ７．５で、グアニジニウム塩酸塩、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）、ジチオトレイトール（DTT）、トリトンＸ−１００、及びＴｒｉｓ−ＨＣＬを含む緩衝溶液中に入れることができる。別の実施形態では、ＲＮＡを含む試料を、ｐＨ７．５で、グアニジニウムイソチオシアナート、ＥＤＴＡ、ＤＴＴ、トリトンＸ−１００、及びＴｒｉｓ−ＨＣｌを含む緩衝溶液中に入れることができる。ＲＮＡは、そのような緩衝溶液中で安定であり、ＲＮＡを他の試料成分から隔離する必要がない。そのような隔離は、ＲＮＡの劣化を強めることがある。
【０１０２】
[00152]  さらなる実施形態では、本発明の緩衝液は、好ましくは変性剤、特にカオトロピックカチオンを含み、この変性剤は、ＲＮＡの二次構造を開く助けをすることによって、本明細書で述べる方法及びアッセイにおける反応及び結合効率を高める効果を有する。一般的なカオトロピック分子は、グアニジニウム塩酸塩、グアニジニウムイソチオシアナート、ベタイン又はグリシンベタイン、尿素、チオ尿素、及び過塩素酸リチウムである。理論に束縛されずに、核酸での三次構造の破壊に効果的なカオトロピック剤が好ましく、溶液中での核酸ターゲットの溶解度も維持するカオトロピック剤が特に有益である。本発明の緩衝液、特にカオトロピックカチオンを含む緩衝液の利点は、緩衝液が、溶液中で試料の核酸を保つことである。これは、試料の核酸（特にRNA）の周りにカチオン性シェルを沈殿／生成する傾向がある血液ベースのテストのために輸送システムで使用される他の従来の緩衝液とは対照的である。本発明の緩衝液は溶液中で核酸を保つので、及び本発明のアッセイの化学ライゲーション方法は酵素を必要としないので、緩衝液中に試料を採取することができ、生成された試料及びライゲーション生成物にライゲーションプローブ（多くの実施形態では、ターゲット捕捉プローブ）を添加することができる。ハイブリダイゼーション条件を変え、次いで、さらなる分析のためにライゲーション生成物又はターゲット錯体を解放するために、試料と緩衝液を単純に希釈して、変性剤を希釈し、それによりハイブリダイゼーション条件を変えることができ、それにより、本明細書で述べる方法及び当技術分野で知られている方法の任意のものを使用した核酸の分析を可能にする。
【０１０３】
[00153]  さらなる実施形態では、本発明の緩衝液は、ｐＨが約５〜約８．５である。より好ましくは、緩衝溶液は、ｐＨが約６〜８であり、さらに好ましくはｐＨが約７．３又は７．５である。
【０１０４】
[00154]  以下の項は、例示的な緩衝液成分をさらに詳細に論じる。これらの成分をそれぞれ個別に論じるが、本発明は、以下の緩衝液成分及び当技術分野で知られている任意の他の成分の任意の組合せを包含する。
【０１０５】
[00155]  変性剤
[00156]  好ましい実施形態では、本発明の緩衝液は、１つ又は複数の変性剤を含む。本明細書で使用するときの「変性剤」によって、二次及び三次構造の損失を伴って核酸の二重螺旋を開く働きをする任意の物質を意味する。さらなる実施形態では、変性剤は、カオトロピックカチオンを含み、限定はしないが、グアニジニウム塩酸塩（GuHCl）及びグアニジニウムイソチオシアナートを含む。
【０１０６】
[00157]  さらなる実施形態では、変性剤は、グアニジニウム塩酸塩であり、これは、約１モル〜約８モルの濃度、より好ましくは約２モル〜約４モルの濃度、さらに好ましくは約３モルの濃度で存在する。さらなる実施形態では、本発明の緩衝液中のＧｕＨＣｌの濃度は、約０．２〜１０、０．５〜９、１〜８、１．５〜７、２〜６、２．５〜５、及び３．０〜４．０モルの範囲である。さらなる実施形態では、本発明の緩衝液中のＧｕＨＣｌの濃度は、約０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５モルである。
【０１０７】
[00158]  他の実施形態では、変性剤は、グアニジニウム塩酸塩であり、これは、約１モル〜約８モルの濃度、より好ましくは約２モル〜約４モルの濃度、さらに好ましくは約３モルの濃度で存在する。さらなる実施形態では、本発明の緩衝液中のグアニジニウムイソチオシアナートの濃度は、約０．２〜１０、０．５〜９、１〜８、１．５〜７、２〜６、２．５〜５、及び３．０〜４．０モルの範囲である。さらなる実施形態では、本発明の緩衝液中のグアニジニウムイソチオシアナートの濃度は、約０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５モルである。
【０１０８】
[00159]  理解されるように、当技術分野で知られている他の変性剤も、本発明の緩衝液中で、グアニジニウム塩酸塩及びグアニジニウムイソチオシアナートに関して上で列挙したのと同様の濃度で使用することができる。
【０１０９】
[00160]  グアニジニウム塩など高濃度の塩の使用によるものなど、いくつかの実施形態では、これらの試薬は溶解剤としても働く。当業者に理解されるように、一般に、細胞溶解剤としても働く変性剤の使用が特に用いられるが、本発明はまた、第１の個別の溶解工程と、それに続く変性剤の添加との使用も企図する。
【０１１０】
[00161]  表面活性剤
[00162]  いくつかの実施形態では、本発明の緩衝液は、１つ又は複数の表面活性剤を含む。さらなる実施形態では、表面活性剤は、限定はしないが、トリトンＸ−１００及びＮ−ラウロイルサルコシンナトリウムを含む。
【０１１１】
[00163]  さらなる実施形態では、表面活性剤は、本発明の緩衝液中に、重量で約０．１％〜約５％の濃度で存在する。さらなる実施形態では、表面活性剤は、重量で約０．１％〜１０％、０．５％〜９．５％、１％〜９％、１．５％〜８．５％、２％〜８％、２．５％〜７．５％、３％〜７％、３．５％〜６．５％、４％〜６％、及び４．５％〜５．５％の濃度で存在する。好ましい実施形態では、表面活性剤は、濃度が約０．５％〜約３％である。さらなる実施形態では、表面活性剤は、濃度が重量で約１．５％である。
【０１１２】
[00164]  ｐＨ緩衝液
[00165]  いくつかの実施形態では、本発明の緩衝液は、１つ又は複数のｐＨ緩衝液を含む。そのようなｐＨ緩衝液は、限定はしないが、トリスを含む。他の実施形態では、ｐＨ緩衝液は、当業者に知られている多くのうちの１つでよい。一般に、本発明で使用されるｐＨ緩衝液は、動作ｐＨの１ｐＨ単位内にｐＫａを有する化学剤を含む。
【０１１３】
[00166]  いくつかの実施形態では、ｐＨ緩衝液は、本発明の緩衝液中に、約１０ｍＭ〜約１００ｍＭの濃度で存在する。好ましい実施形態では、ｐＨ緩衝液は、濃度が約２０ｍＭ〜約５０ｍＭ、より好ましくは約３０ｍＭである。さらなる実施形態では、ｐＨ緩衝液は、濃度が約５〜１５０、１０〜１４０、１５〜１３０、２０〜１２０、２５〜１１０、３０〜１００、３５〜９０、４０〜８０、４５〜７０、及び５０〜６０ｍＭである。
【０１１４】
[00167]  還元剤
[00168]  いくつかの実施形態では、本発明の緩衝液は、１つ又は複数の還元剤を含む。そのような還元剤は、限定はしないが、ジチオトレイトール（DTT）及びメルカプトエタノールを含むことができる。
【０１１５】
[00169]  さらなる実施形態では、還元剤は、濃度が約１ｍＭ〜約１００ｍＭである。好ましい実施形態では、還元剤は、濃度が約４ｍＭ〜約７ｍＭであり、さらに好ましくは濃度が約５ｍＭである。さらなる実施形態では、還元剤は、濃度が約０．５〜１０、１〜９．５、１．５〜９、２〜８．５、２．５〜８、３〜７．５、３．５〜７、４〜６．５ｍＭである。さらなる実施形態では、還元剤は、濃度が約１〜１５０、１０〜１４０、１５〜１３０、２０〜１２０、２５〜１１０、３０〜１００、３５〜９０、４０〜８０、４５〜７０、及び５０〜６０ｍＭである。
【０１１６】
[00170]  ＥＤＴＡ
[00171]  さらなる実施形態では、本発明の緩衝液は、約１ｍＭ〜約１００ｍＭの濃度でＥＤＴＡを含む。より好ましくは、ＥＤＴＡは、濃度が約１０ｍＭ〜約５０ｍＭであり、より好ましくは濃度が約２０ｍＭである。さらなる実施形態では、ＥＤＴＡは、約１〜１５０、１０〜１４０、１５〜１３０、２０〜１２０、２５〜１１０、３０〜１００、３５〜９０、４０〜８０、４５〜７０、及び５０〜６０ｍＭの濃度で存在する。さらなる実施形態では、ＥＤＴＡは、濃度が約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０ｍＭである。
【０１１７】
[00172]  さらなる緩衝液成分
[00173]  本発明の緩衝液は、当技術分野で知られている任意の追加の成分、特に核酸に関わる反応で使用されるものとして当技術分野で知られている成分をさらに含むことがある。追加の成分は、限定はしないが、以下のものを含むことがある：補助剤、希釈剤、結合剤、安定剤、塩（NaCl及びMgC12を含む）、親油性溶媒、又は防腐剤など。緩衝液の成分は、製薬賦形剤及び添加剤、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、脂質、及び炭水化物（例えば、単糖類、ジ−、トリ−、テトラ−、及びオリゴ糖を含む糖；変性した糖、例えば、アルジトール、アルドン酸、エステル化された糖など；及び多糖又は糖ポリマー）を含むこともあり、これらは、単独で又は複合で存在していてよく、単独で又は複合で重量又は体積で１〜９９．９９％を占める。例示的なタンパク質賦形剤は、ヒト血清アルブミン（HSA）、組換え体ヒト血清アルブミン（rHA）、ゼラチン、及びカゼインなどの血清アルブミンを含む。緩衝能の面でも作用し得る代表的なアミノ酸／抗体成分は、アラニン、グリシン、アルギニン、ベタイン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、システアミン、リジン、ロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニン、フェニルアラニン、及びアスパルテームを含む。炭水化物賦形剤も、本発明の範囲内で意図されており、それらの例は、限定はしないが以下のものを含む。果糖、麦芽糖、ガラクトース、グルコース、Ｄ−マンノース、及びソルボースなどの単糖類；ラクトース、スクロース、トレハロース、及びセロビオースなどの二糖類；ラフィノース、メレチトース、マルトデキストリン、デキストラン、及び澱粉などの多糖類；並びに、マニトール、キシリトール、マルチトール、ラクチトール、キシリトールソルビトール（グルシトール）、及びミオイノシトールなどのアルジトール。
【０１１８】
[00174]  多くの実施形態において、ＤｘＣｏｌｌｅｃｔ緩衝液が使用され、これは、グアニジン塩酸塩４．５Ｍ、クエン酸ナトリウム１２０ｍＭ、クエン酸８０ｍＭ、ＥＤＴＡ２０ｍＭ、及び０．１％（ｖ／ｖ）のトリトンＸ−１００である。開始のｐＨは４．１であり、血液との混合後、約５．０である。ターゲット緩衝液と血液の比は、２部の緩衝液：１部の血液であるが、５部の緩衝液：１部の血液までを含む広い使用範囲を有する。２：１の緩衝液：血液で、安定化された血液ＧｕＨＣｌの濃度は３．０Ｍである。本明細書で論じるように、本明細書で述べる化学ライゲーションアッセイは、安定化緩衝液中で行うことができる。酵素（一般に高い塩濃度で変性するポリメラーゼやリガーゼなど）に依拠するものなど他のアッセイが使用されるとき、安定化された試料を、許容できるＧｕＨＣＬ濃度（通常は少なくとも１０倍希釈）まで希釈することができ、又は、ＰａｘＧｅｎｅ、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ（ビーズベース）、若しくはＮｏｒｇｅｎキットを含む標準のキットを使用して、ターゲット検体（例えば核酸）が隔離される（RNA又はDNA）。代替として、細胞を含まないＤＮＡ／ＲＮＡ試験を、商標名Ｃｅｌｌ  Ｆｒｅｅ  ＤＮＡ  ＢＣＴ（登録商標）及びＣｅｌｌ  Ｆｒｅｅ  ＲＮＡ  ＢＣＴ（登録商標）の下で、Ｓｔｒｅｃｋ  ｂｙ  Ｓｔｒｅｃｋによって販売されるものなど細胞安定化緩衝液を使用して行うことができる。
【０１１９】
[00175]  そのような緩衝液は、一般に、非限定の実施形態ではグアニジニウム塩酸塩を含めた、カオトロピックカチオンを含む変性剤を含む。本発明の特定の実施形態では、本発明の緩衝液中に試料が直接採取され、次いで、その緩衝液中で、試料からの核酸の純化を必要とせずに、ライゲーションプローブの後続のハイブリダイゼーション及びライゲーションが行われる。特定の実施形態では、まず、緩衝液中に採取された試料が希釈され、次いでその後、試料中のターゲット核酸を純化する必要なく、その希釈された試料中で、２つ以上のライゲーションプローブをハイブリッド化及びライゲーションする本明細書で述べる方法が行われる。
【０１２０】
[00176]  上で論じたように、本発明のライゲーションプローブはターゲット核酸にハイブリッド化され、次いで、リガーゼ酵素を使用せずにライゲーションされる。ライゲーション後、生成された新たな生成物（「ライゲーション生成物」）は、任意選択により、酵素又は化学反応によって増幅することができる。好ましい実施形態では、化学ライゲーション反応は、ＰＣＲプライマ部位、例えばユニバーサルＰＣＲプライマを有する２つのプローブを接合する。さらに、本発明の一実施形態では、１つ又は複数のライゲーションプローブは、スタッファ配列又は可変スペーサ配列を含み、これは、各プローブセット（すなわち各ターゲット配列）に関して異なる長さを有するように設計され、それにより、ターゲット特有の長さを有するライゲーション生成物を生じる。ライゲーション後、所定の長さのオリゴヌクレオチドを、ここでＰＣＲによって指数関数的に増幅することができる。本発明の一態様によれば、プローブは、ライゲーションされたオリゴヌクレオチド生成物の識別、純化、定量化、又は検出の助けとなるように、検出可能なラベル（例えば、蛍光ラベル、電気化学ラベル、磁気ビーズ、ナノ粒子、ビオチンなど）を有することができる。プローブはまた、任意選択により、それらの構造内に以下のものを含むこともできる：固体支持体（マイクロアレイ、マイクロビーズ、ナノ粒子）での後の捕捉のために設計されたアンカオリゴヌクレオチド配列、ライゲーションされる生成物（磁性粒子、オリゴヌクレオチド符号化配列）の濃度又は操作を促進する分子ハンドル、及びＤＮＡ又はＲＮＡポリメラーゼなどの酵素による、ライゲーションされた生成物の後の二次増幅を容易にするための促進剤配列。
【０１２１】
[00177]  本発明のライゲーション反応は急速に進み、対象のターゲットに特定的であり、各ターゲットに関するライゲーションされた生成物の複数のコピーを生成することができ、検出可能な信号の増幅（時として本明細書では「生成物ターンオーバ」と呼ぶ）をもたらす。本発明のライゲーション反応は、外から添加されるリガーゼの存在も、追加の酵素の存在も必要としないが、いくつかの二次反応は、以下に述べるように、ポリメラーゼなどの酵素の使用に依拠することがある。ライゲーション化学物質は、前に述べた化学的部分の多くから選択することができる。好ましい化学物質は、通常の製造技法に容易に組み込むことができ、貯蔵中に安定であり、適切に設計されたライゲーションプローブセットに組み込まれるときにターゲット特有のライゲーションに大きな選好性を示すことができるものである。さらに、酵素による後の増幅を含む実施形態に関しては、酵素によって効率的に処理することができるライゲーション生成物をもたらすライゲーション化学物質及びプローブ設計（人工ヌクレオチド類似体を含む）が好ましい。また、ターゲットの増幅は、例えばテンプレート又はターゲット核酸に対するライゲーション生成物の親和性が個別のライゲーションプローブよりも低い又は同等であるような不安定化によって、又は余剰プローブの存在下での標準の熱循環によって、ライゲーション生成物のターンオーバを含むこともある。したがって、ハイブリッド化されたプローブのライゲーション時、ライゲーション生成物がターゲットから解放され、ターゲットは、新たなライゲーション反応のためのテンプレートとなることができるようになる。
【０１２２】
[00178]  本発明のさらなる態様では、以下にさらに詳細に論じるように、本発明のアッセイの特異性は、任意選択により、ターゲット捕捉プローブの使用によって改良される。本発明のターゲット捕捉プローブは、ターゲット核酸及び捕捉部分での領域に相補的な領域を含む。ターゲット捕捉プローブは、ライゲーションプローブとのライゲーション反応に参与せず、ライゲーションプローブの上流又は下流でターゲット核酸にハイブリッド化するように設計される。ターゲット核酸へのターゲット捕捉プローブのハイブリッド化は、ターゲット核酸、ターゲット捕捉プローブ、及びターゲット核酸に生成される任意のライゲーション生成物を含むターゲット錯体を生成する。次いで、ターゲット錯体を（ビーズなどの）表面又は基質に結合することができ、任意の未結合の反応物を、表面又は基質に結合されたターゲット錯体から分離することができる。したがって、後の増幅及び／又は検出工程は、ライゲーションプローブで正常にハイブリッド化されたターゲット核酸の元の試料の一部に対して行われるので、後のアッセイの特異性が改良される。
【実施例】
【０１２３】
[00179]  以下の項では、本発明のデバイス又はキットを使用して行われる実験を述べる。
【０１２４】
実施例１：流体試料摂取の一貫性
[00180]  採取器先端に４ｍｍ×４ｍｍ×９ｍｍのオープンセル医療グレードポリビニルアルコールスポンジをそれぞれ含む１０個の採取器デバイスを、それらの流体吸収の一貫性に関して試験した。スポンジを採取器空洞内に圧力嵌めした。２００マイクロリットルの水を、疎水性パラフィルム表面上にピペットで落とし、水滴にした。試験前にフィルム／水を計量した。各採取器先端を水滴と接触させ、そこで１０秒間保ち、スポンジに水を吸収させた。採取器を取り外した後にフィルムを再計量し、吸収された水の重量を求めた。水の密度１ｇ／ｍｌを仮定することによって、重量をマイクロリットルに変換した（表１）。スポンジの平均吸水量は、１０７．２μｌ±１．６マイクロリットルであった。
【０１２５】
【表１】
0006695285.tif 000002
【０１２６】
実施例２：周囲温度でのＲＮＡ安定化と、それに続くＲＮＡ隔離
[00181]  ５個の採取器デバイスを組み立てた。ＤｘＣｏｌｌｅｃｔ（商標）ＲＮＡ安定化緩衝液２００μｌを保定器カップ内に装填し、上部を、穿刺可能なポリマーコーティングされた箔（製品コード4ti-0530-4titude LTD）で熱封止した。保定器カップを採取管内に配置した。Ｓｕｒｇｉｌａｎｃｅ  ＳＬ２５０安全ランセット（SLB250）を使用してボランティアが自分の指を穿刺した。最初の血液小滴を、ガーゼパッドで拭き取り、次いで、１００マイクロリットルの血液を、４ｍｍ×４ｍｍ×９ｍｍのポリビニルアルコールスポンジを有する採取器の先端を血液小滴に対して配置することによって採取した。スポンジの赤色によって示されるように血液採取スポンジが満杯になった後、採取器を輸送管内に挿入して、定位置に嵌まるまでねじ留めした。ねじ留めプロセス中、採取器の先端が、ポリマーコーティングされた箔を穿刺し、ＤｘＣｏｌｌｅｃｔ緩衝液が血液試料と混合できるようにした。この採取プロセスを、同じボランティアについてさらに４回繰り返した。
【０１２７】
[00182]  １つの試料を−２０℃で冷凍庫に即座に配置し、他の試料は、３、６、９、及び１２日間、室温で貯蔵してから凍結させた。全ての室温時点に達した後、試料を解凍し、解放可能なセプタムを２００μｌピペット先端で穿刺することによって試料にアクセスした。安定化された血液１５０μＬを、採取から除去し、ヌクレアーゼを含まない１．７ｍＬマイクロファージ管内に添加し、そこに、ＤｘＣｏｌｌｅｃｔ  ＲＮＡ沈殿溶液（DxTerity；Rancho Dominguez, CA）５０μＬを添加した。全ＲＮＡを、Ｎｏｒｇｅｎ全ＲＮＡ純化キット（Norgen Biotek Corp, Cat. No. 37500）を使用してＤｘＣｏｌｌｅｃｔ緩衝液中に採取された全血から抽出した。簡潔に述べると、１５秒間撹拌することによってＲＮＡを混合し、その後、４℃で１５分間、微量遠心分離機内で１３０００ＲＰＭで遠心分離した。次いで、上澄み液を除去し、ＲＮＡペレットを、Ｎｏｒｇｅｎ溶解緩衝液中に再び懸濁し、製造業者の取扱説明書に従って、Ｎｏｒｇｅｎ全ＲＮＡ純化キットを用いて純化を完了させた。ＲＮＡ隔離後、抽出されたＲＮＡ試料全てを、製造業者の指示（７）に従って、Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ  ＲＮＡ  Ｎａｎｏキットを使用してＲＮＡ濃度及びＲＩＮ（RNA Integrity Number）スコアについて分析した。Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ  ＲＮＡアッセイは、マイクロ流体力学技術を利用し、試料１μｌのみを使用してＲＮＡの品質分析を可能にする。アッセイは、Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ機器で実行され、結果を分析及び表示するためにＡｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを利用する。ＲＩＮ（RNA Integrity Number；RINスコア）は、ＲＮＡ品質の表示として、各試料に関して１〜１０（１＝最低；１０＝最高）のスケールで生成される。１８ｓ／２８ｓの比、及び濃度の推定も生成される。
【０１２８】
[00183]  試料に関するＲＩＮスコアが表２に示されている。
【０１２９】
【表２】
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【０１３０】
実施例３：米国郵便によって出荷された試料からのＤＮＡ及びＲＮＡの隔離
[00184]  １０個の採取器デバイスを組み立てた。ＤｘＣｏｌｌｅｃｔ（商標）ＲＮＡ安定化緩衝液２００μｌを保定器カップ内に装填し、上部を、穿刺可能なポリマーコーティングされた箔（製品コード4ti-0530-4titude LTD）で熱封止した。保定器カップを採取管内に配置した。５人のボランティアそれぞれに、２つの採取デバイスを、使用指示書、料金前払い済みの小型の米国プライオリティ郵便フラットレートボックス、及び３インチ×３インチのユニバーサル吸収剤パッド（Uline S-7247）を含む小さいジップロックのバッグと共に提供した。ボランティアは、自宅でアイテムを受け取り、以下の工程を使用して２つの血液試料を自己採取した。１．）石鹸及び温水で手を良く洗う。２．）アルコール綿を用いて穿刺部位を洗浄する。３．）安全ランセット（Surgilance SLB250）の先端をターゲット指先に配置し、トリガを押す。４．）採取スティックを血液小滴に触れさせて、血液を吸収する。指のマッサージを続けて、スポンジが満杯になるまで血流を保つ。５．）採取スポンジが満杯になった後、採取スティックを輸送管内に挿入する。６．）採取スティックがしっかりと位置し、輸送管内に嵌まるまで、アプリケータをひねりながら押し下げる。
【０１３１】
[00185]  血液試料を採取した後、閉じた採取デバイスを、吸収剤を含有するジップロックのバッグに入れて封止した。バッグを、プライオリティメール用の箱に入れ、米国郵便ポストに投函した。投函後１〜５日で試料を受け取った。受け取った後、試料を−２０℃で凍結し、最後のデバイスを受け取るまで貯蔵した。管を室温で解凍し、ＲＮＡとＤＮＡの両方を血液試料から隔離した。
【０１３２】
[00186]  穿刺可能なセプタムを通してアクセスすることによって、封止された採取デバイスから血液１５０μｌをピペットすることによってＲＮＡを隔離した。安定化された血液１５０μＬを、ヌクレアーゼを含まない１．７ｍＬマイクロファージ管内に添加し、そこに、ＤｘＣｏｌｌｅｃｔ  ＲＮＡ沈殿溶液（DxTerity；Rancho Dominguez, CA）５０μＬを添加した。全ＲＮＡを、Ｎｏｒｇｅｎ全ＲＮＡ純化キット（Norgen Biotek Corp, Cat. No. 37500）を使用してＤｘＣｏｌｌｅｃｔ緩衝液中に採取された全血から抽出した。簡潔に述べると、１５秒間撹拌することによってＲＮＡを混合し、その後、４℃で１５分間、微量遠心分離機内で１３０００ＲＰＭで遠心分離した。次いで、上澄み液を除去し、ＲＮＡペレットを、Ｎｏｒｇｅｎ溶解緩衝液中に再び懸濁し、製造業者の取扱説明書に従って、Ｎｏｒｇｅｎ全ＲＮＡ純化キットを用いて純化を完了させた。ＲＮＡ隔離後、抽出されたＲＮＡ試料全てを、製造業者の指示（７）に従って、Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ  ＲＮＡ  Ｎａｎｏキットを使用してＲＮＡ濃度及びＲＩＮ（RNA Integrity Number）スコアについて分析した。Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ  ＲＮＡアッセイは、マイクロ流体力学技術を利用し、試料１μｌのみを使用してＲＮＡの品質分析を可能にする。アッセイは、Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ機器で実行され、結果を分析及び表示するためにＡｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを利用する。ＲＩＮ（RNA Integrity Number；RINスコア）は、ＲＮＡ品質の表示として、各試料に関して１〜１０（１＝最低；１０＝最高）のスケールで生成される。１８ｓ／２８ｓの比、及び濃度の推定も生成される。
【０１３３】
[00187]  ＧｅｎｅＣａｔｃｈｅｒ（商標）ｇＤＮＡ０．３〜１ｍｌ血液キット（Invitrogen）を使用して試料からＤＮＡを隔離した。製造業者の推奨に従ってゲノムＤＮＡ（gDNA）を隔離したが、ただし、（６０マイクロリットルではなく）３０マイクロリットルのＧｅｎｅＣａｔｃｈｅｒ磁気ビーズを用いて、（３００マイクロリットルではなく）１５０マイクロリットルの血液投入を使用し、ＤｘＣｏｌｌｅｃｔ安定化血液が既に溶解されているので溶解緩衝液の添加は省いた。簡潔には、磁気ビーズを使用してｇＤＮＡを捕捉し、次いで、磁気プレートを使用して、ｇＤＮＡコーティングされたビーズを隔離する。ビーズを隔離した後、血液を廃棄する。隔離したビーズを洗浄し、次いで、ＤＮＡをビーズから溶離する。血液試料のうちの４つからのみＤＮＡを隔離する。
【０１３４】
[00188]  ＤＮＡ及びＲＮＡの歩留まりが、表３に示されている。
【０１３５】
【表３】
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【０１３６】
実施例４：フィンガスティックで採取された血液試料の直接の試験
[00189]  ３つの採取器デバイスを組み立てた。ＤｘＣｏｌｌｅｃｔ（商標）ＲＮＡ安定化緩衝液２００μｌを保定器カップ内に装填し、上部を、穿刺可能なポリマーコーティングされた箔（製品コード4ti-0530-4titude LTD）で熱封止した。保定器カップを採取管内に配置した。Ｓｕｒｇｉｌａｎｃｅ  ＳＬ２５０安全ランセット（SLB250）を使用して３名のボランティア（ドナー１〜３）が自分の指を穿刺した。最初の血液小滴を、ガーゼパッドで拭き取り、次いで、１００マイクロリットルの血液を、４ｍｍ×４ｍｍ×９ｍｍのポリビニルアルコールスポンジを有する採取器の先端を血液小滴に対して配置することによって採取した。スポンジの赤色によって示されるように血液採取スポンジが満杯になった後、採取器を輸送管内に挿入して、定位置に嵌まるまでねじ留めした。ねじ留めプロセス中、採取器の先端が、ポリマーコーティングされた箔を穿刺し、ＤｘＣｏｌｌｅｃｔ緩衝液が血液試料と混合できるようにした。
【０１３７】
[00190]  安定化された血液試料５０μｌを、各デバイスから取り出し、１０遺伝子アッセイを使用して試験した（表４）。アッセイで使用されるプローブに関する配列が、表５〜８に示されている。別段の記載がない限り、全ての試薬を、ＤｘＴｅｒｉｔｙ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Rancho Dominguez, CA）（表８）によって提供した。初めに、ＤｘＣｏｌｌｅｃｔ安定化血液５０μＬを３２ウェルプレート（Axygen Scientific/Corning Inc., Union City, CA）内で混合し、これは、ＤｉｒｅｃｔＲｅａｃｔ緩衝液（CLPA Reaction Buffer）１５μＬ、Ｓ−プローブを含むＤｉｒｅｃｔＭｉｘ  Ａ（表５）１５μＬ、Ｌ−及びＴＣ−プローブを含むＤｉｒｅｃｔＭｉｘ  Ｂ（表６）１５μＬ、及びＤｉｒｅｃｔＭｉｘ  Ｃ（タンパク質消化溶液）５μＬを含む。ＤｉｒｅｃｔＭｉｘ  Ａは、表５に列挙される濃度で、Ｓ−プローブ及び減衰Ｓ−プローブ（SA）プローブを含む。希釈剤は、１Ｘ  ＴＥ緩衝液での１ｍＭ  ＤＴＴである。配合後、プローブは、９５℃で２分間、熱活性化される。ＤｉｒｅｃｔＭｉｘ  Ｂは、表６に列挙される濃度で、Ｌ−プローブ及びＴＣ−プローブを含む。希釈剤は、１Ｘ  ＴＥ緩衝液である。
【０１３８】
[00191]  プレートを、８ウェルストリップキャップ（Agilent Technologies, SantaClara, California）で封止し、５５℃で５分間、次いで８０℃で１０分間、さらに５５℃で２時間４５分間、Ｖｅｒｉｔｉ（登録商標）サーモサイクラ（Life Technologies, Carlsbad, CA）で培養した。次に、ＤｉｒｅｃｔＢｅａｄｓ（直径２．７ミクロンのストレプトアビジンコーティングされた常磁性ビーズ）５μＬを各ウェルに添加して、ピペット操作によって混合した。次いで、ビーズへのライゲーション錯体結合を可能にするために、５５℃でさらに１５分間、試料を培養した。プレートを、サーマルサイクラから取り外し、ウェルの側部にビーズを捕捉するために、９６ウェルの側部に裾の付いた磁性粒子濃縮器（Invitrogen, Carlsbad, CA）に２分間配置した。マルチチャネルピペット（Rainin, Columbus OH）を使用して液体反応混合物を吸引した。ＤｉｒｅｃｔＷａｓｈ緩衝液（ビーズ洗浄工程用の洗浄溶液）１８０μＬでビーズを３回洗浄し、洗浄緩衝液を除去した。次いで、ＤｉｒｅｃｔＴａｑ（Taq DNAポリメラーゼ、ＰＣＲ緩衝液、及びdNTPを含む）及びＤｉｒｅｃｔＰｒｉｍｅユニバーサルプライマ混合物（表４）を、洗浄済みのビーズに添加し、混合物をＰＣＲによって増幅した（９５℃で２分間、その後、９５℃で１０秒；５７℃で２０秒；及び７２℃で２０秒を３０サイクル）。ＣＥによる検出のために、最終増幅ＣＬＰＡ反応の２μＬアリコートを、Ｈｉ−Ｄｉ（商標）ホルムアミド（Life Technologies, Carlsbad, CA）１７．５μＬ、及びＧｅｎｅＳｃａｎ（商標）６００Ｌｉｚ（登録商標）Ｖ２色素、標準サイズ（Life Technologies）０．５μＬと混合し、製造業者のガイドラインに従って、断片分析モジュール（LifeTechnologies, Carlsbad, CA）を用いるＡＢＩ  ３５００ｘＬ  Ｄｘ遺伝子分析器で動作するＰＯＰ−６（商標）ポリマーを含む２４−毛細管アレイに注入した。標準注入時間は、（１８ｋＶで）１５秒であったが、製造上の推奨に基づいて、いくつかの試料に関しては飽和信号を回避するように短縮した。
【０１３９】
データ分析
[00192]  ＣＥ電気泳動図データファイルを、ＧｅｎｅＭａｒｋｅｒ（登録商標）ソフトウェアのバージョン２．４．０（SoftGenetics, StateCollege, PA）で処理して、ピーク高さ相対蛍光強度（RFU）値を生成した。ピークデータ表を、.txtファイルとして保存し、ＪＭＰ（登録商標）ｖｌ  １．０（SAS Institute, Cary, NC）を使用して分析した。ピーク高さの自然対数（ln）を取り、計器から得られたＲＦＵ値を、同じサンプルからのＭＲＰＳ５及びＭＲＰ１８Ａ遺伝子のＲＦＵ値の幾何平均で除算することによって、遺伝子正規化値を生成した。生のデータと正規化されたデータとを、表９に列挙する。
【０１４０】
【表４】
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【０１４１】
【表５−１】
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【０１４２】
【表５−２】
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【０１４３】
【表６−１】
0006695285.tif 000008
【０１４４】
【表６−２】
0006695285.tif 000009
【０１４５】
【表６−３】
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【０１４６】
【表７】
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【０１４７】
【表８】
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【０１４８】
【表９】
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【０１４９】
利点
[00193]  本発明は、米国特許出願公開第２００８／０１２４８１０号、第２０１０／０２６７５８５号、第２０１１／０３０６５１２号、及び第２０１３／０００５５９４号で述べられている化学ライゲーション緩衝液及びシステムを使用して、ターゲット検体、特に核酸の検出で特に使用され、それらの特許文献全ての全体、特にライゲーション部分及び緩衝液システムについて、参照により明示的に組み込む。すなわち、血液が採取されて試験設備に搬送された後、ターゲット検体の存在のために血液が処理及びアッセイされる。本発明のシステム及びアッセイの大きな利点は、少量の血液を使用することができること（したがって、注射針による抜き取りとは対照的に、フィンガスティックによる自宅での採取を容易にする）、及び血液試料が、試験センタに試料を郵送又はその他の方法で搬送するのに十分な時間にわたって採取デバイス内で緩衝液中で安定することである。さらに、上記の米国特許出願公開で述べられている化学ライゲーションアッセイの場合、試料のさらなる処理なしで試験を行うことができ、例えば、酵素アッセイの使用を含まない溶解緩衝液中でアッセイを行うことができる。
【０１５０】
参考文献
[00194]  本明細書で引用した全ての参考文献は、個々の刊行物又は特許若しくは特許出願それぞれがその全体をあらゆる目的で参照により組み込まれているものとして特定的に個別に示されているかのように、それらの全体をあらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
0006695285.tif 000030
【図５Ｂ】
0006695285.tif 000031
【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【図８Ｇ】
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【図９Ａ】
0006695285.tif 000048
【図９Ｂ】
0006695285.tif 000049
【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【配列表】
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