(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＦＧＦ−１及びＦＧＦ−２からなる群より選択される少なくとも１種（但し、ＦＧＦ−１が融合タンパク質である場合、及びＦＧＦ−２が融合タンパク質である場合を除く）を有効成分とし、肝癌以外の癌の治療予防乃至治療に使用される、サイトグロビン発現増強剤。
【請求項２】
ＦＧＦ−１及びＦＧＦ−２からなる群より選択される少なくとも１種を有効成分（但し、ＢＭＰ-２、ＢＭＰ-３、ＢＭＰ-４、ＢＭＰ-５、ＢＭＰ-６、ＢＭＰ-７、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、及びＴＧＦ−β３からなる群より選択される少なくとも１種と併用される場合を除く）とし、間質病変（但し、ゲンタマイシンが誘発する急性腎不全を除く）の予防乃至治療に使用される、サイトグロビン発現増強剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サイトグロビン発現増強剤に関する。より具体的には、本発明は、サイトグロビンの発現を増強し、生体内でサイトグロビンによる有益な機能を効果的に発揮させるサイトグロビン発現増強剤。
【背景技術】
【０００２】
近年、肝癌患者数の増大が問題となっている。２０１２年度国立がん研究センターの報告によると、国内の肝癌死亡者数は男女ともに全癌中４位であり、２０１０年には年間３３０００人にも及んでいる。肝癌は、Ｂ型、Ｃ型肝炎ウイルス感染、多量飲酒や糖尿病肥満と関連する非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）を土台として発生する。即ち、肝癌は慢性炎症と線維化肝を母地として生じ、病因の如何を問わず年率８％で発癌し、一旦肝癌が生じると再発と肝内転移を繰り返す。肝硬変とは、肝実質がＩ型コラーゲンなどの細胞外マトリックス蛋白で置換されて機能的肝細胞が減少する病態である。この線維性肝臓は、生理的状態ではビタミンＡ貯蔵を主機能とする肝星細胞（Ｈｅｐａｔｉｃ  ｓｔｅｌｌａｔｅ  ｃｅｌｌ、ＨＳＣ）が活性化して形質を変えた筋線維芽細胞（Ｍｙｏｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ、ＭＦＢ）で肝実質が置換される病態である。この形質転換には、トランスフォーミング増殖因子−β（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＴＧＦ）−β）や結合組織成長因子（ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ  ｔｉｓｓｕｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ、ＣＴＧＦ）が関与し、これらの因子が肝星細胞の持続活性化や実質での筋線維芽細胞の増加が肝細胞機能を低下させる要因であり、肝癌発症に寄与することが報告されている（非特許文献１及び２）。そのため、肝星細胞の活性化抑制と筋線維芽細胞の制御が肝線維化及び肝癌の治療法開発に繋がると考えられている。
【０００３】
一方、本発明者等は、ラットＨＳＣのプロテオミクス解析で、Ｓｔｅｌｌａｔｅ  ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎを発見し、第１７番染色体のヒト遺伝子も同定した。このタンパク質は、今ではサイトグロビン（Ｃｙｔｏｇｌｏｂｉｎ、ＣＹＧＢ）と呼ばれており、ヘモグロビン、ミオグロビン、ニューログロビンに次ぐ哺乳類第４番目のグロビンとして位置付けられている（非特許文献３及び４）。
【０００４】
サイトグロビンは、肝星細胞のみならず、膵臓（膵星細胞）や腎臓の尿細管上皮近傍の線維芽細胞等にも発現していることが知られており、これまでに、肝臓以外の生体組織でも、重要な役割を果たしていることが報告されている。
【０００５】
例えば、特許文献１には、サイトグロビンを欠損させたマウスが肝発癌物質であるジエチルニトロサミン投与に対して易発癌性を示し、サイトグロビンが肝癌の予防乃至治療作用を発揮していることが報告されており、サイトグロビンは、肝癌の予防乃至治療に有効であると考えられている。また、非特許文献５には、サイトグロビンには腫瘍の抑制作用を示すことが報告されている。非特許文献６には、サイトグロビンが、酸素や一酸化窒素等と結合して生体内ガスのリザーバーとして機能していることが報告されている。また、非特許文献７には、サイトグロビンが低酸素誘導因子（Ｈｙｐｏｘｉａ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  Ｆａｃｔｏｒ、ＨＩＦ）によって転写調節され、酸素センサーとなることも報告されている。更に、非特許文献８には、サイトグロビンには、ペルオキシダーゼ活性により過酸化水素を分解して細胞内酸化ストレス代謝を調節する役割を担っていることも報告されている。非特許文献９には、サイトグロビンは、低酸素状態や虚血状態の環境下において、亜硝酸を還元して一酸化窒素を発生させ、これにより可溶性グアニル酸シクラーゼを活性化し、血管の拡張をもたらし得ることが報告されている。更に、非特許文献１０には、虚血状態下での酸化ストレスに対して間質病変に対するサイトグロビンの治療応用効果が期待されることが開示されている。
【０００６】
このようにサイトグロビンは様々な生体機能に関与しており、サイトグロビンの発現の減弱が一因となって発症している疾患、サイトグロビンの機能によって予防乃至治療効果が見込まれる疾患等に対して、生体内でのサイトグロビンの発現を増強させる方策が有効になると考えられている。
【０００７】
一方、従来、サイトグロビンを発現させる方法としては、細胞を低酸素条件下に晒す方法（非特許文献１１）、過酸化水素等によって細胞に酸化ストレスを与える方法（非特許文献１２）、カルシニューリンを細胞に導入して過剰発現させる方法（非特許文献１３）、アルンジン酸を細胞に暴露させる方法（非特許文献１４）等が知られている。これらの方法の内、通常の細胞条件や生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）において利用でき、臨床的に応用可能な技術は、アルンジン酸を用いる方法のみであり、必ずしも、汎用的な手法が確立されているとはいえず、他の手法の選択肢も存在していない。
【０００８】
このような従来技術を背景として、生体内でサイトグロビンの発現を増強させる新たな治療技術の開発が切望されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，２００１，１７：１６６８
【非特許文献２】Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，２０１２，５６：７６９
【非特許文献３】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００４，３３９：８７３
【非特許文献４】Ａｃｔａ．  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．  Ｄ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．，２００６，６２：６７１
【非特許文献５】Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，２００８，６８：７４４８
【非特許文献６】Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００３，４２：５１３３
【非特許文献７】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００９，２８４：１０４９
【非特許文献８】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００１，２７６：２５３１８
【非特許文献９】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２０１２，２８７：３６６２３−３６６３２
【非特許文献１０】Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２０１１，１７８；１２３−１３９
【非特許文献１１】Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２００４，３１９；３４２−３４８
【非特許文献１２】Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．，２００７，３２：１３７５−１３８０
【非特許文献１３】Ｊ．Ｂｉｏ．ｌ．Ｃｈｅｍ．，２００９，２８４：１０４０９−１０４２１．
【非特許文献１４】Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ，２０１２，４２５：６４２−８
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２０１０−５１２７７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、生体内でサイトグロビンの発現を増強させ得る新たなサイトクロビン発現増強剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、前記課題を解決するために鋭意研究を重ねたところ、線維芽細胞増殖因子（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）であるＦＧＦ−１及びＦＧＦ−２には、生体内でサイトグロビンの発現を増強させ得ることを見出した。本発明は、かかる知見に基づいて、更に検討を重ねることにより完成したものである。
【００１３】
即ち、本発明は、下記に掲げる態様の発明を提供する。
項１．  ＦＧＦ−１及びＦＧＦ−２からなる群より選択される少なくとも１種を有効成分とする、サイトグロビン発現増強剤。
項２．  肝癌、肝線維化、又は肝硬変の予防乃至治療に使用される、項１に記載のサイトグロビン発現増強剤。
項３．  肝癌以外の癌の治療予防乃至治療に使用される、項１に記載のサイトグロビン発現増強剤。
項４．  間質病変の予防乃至治療に使用される、項１に記載のサイトグロビン発現増強剤。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、生体内でサイトグロビンの発現を増強させることができるので、生体内でサイトグロビンの発現を増強できるので、サイトグロビンの発現増強によって予防乃至治療効果が期待される疾患や症状の予防乃至治療、具体的には、正常な状態でサイトグロビンが発現している臓器（例えば、肝臓、消化管、腎臓、肺臓等）における線維化や癌、肝硬変、腎尿細管間質性腎炎等の予防乃至治療に有効であり、更には細胞内の酸化ストレス代謝の調節、低酸素状態や虚血状態における血管収縮の抑制等に有効である。その他、
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】実施例１において、ＦＧＦ−２中和抗体存在下で培養したヒト肝星細胞について、形態観察、並びにサイトグロビン（ＣＹＧＢ）及び肝星細胞の活性化マーカーであるα平滑筋アクチン（αＳＭＡ）の発現量をウエスタンブロットにて分析した結果を示す。
【図２】実施例２において、ＦＧＦ−２存在下で培養したヒト肝星細胞について、サイトグロビン（ＣＹＧＢ）及び肝星細胞の活性化マーカーであるα平滑筋アクチン（αＳＭＡ）の発現量をウエスタンブロットにて分析した結果を示す。
【図３】実施例３において、ＦＧＦ−２存在下で培養したヒト肝星細胞について、サイトグロビンのｍＲＮＡの発現量を測定した結果を示す。
【図４】実施例４において、ＦＧＦ−２存在下で培養したヒト肝星細胞について、サイトグロビン（ＣＹＧＢ）、平滑筋アクチン（αＳＭＡ）、及び核（ＤＡＰＩ）を免疫染色した結果を示す。
【図５】実施例５において、ＦＧＦ−１存在下で培養したヒト肝星細胞について、サイトグロビン（ＣＹＧＢ）及び肝星細胞の活性化マーカーであるα平滑筋アクチン（αＳＭＡ）の発現量をウエスタンブロットにて分析した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明のサイトグロビン発現増強剤は、ＦＧＦ−１及びＦＧＦ−２からなる群より選択される少なくとも１種を有効成分とすることを特徴とする。以下、本発明のサイトグロビン発現増強剤について詳述する。
【００１７】
有効成分
本発明のサイトグロビン発現増強剤は、有効成分として、ＦＧＦ−１及びＦＧＦ−２からなる群より選択される少なくとも１種を使用する。
【００１８】
ＦＧＦ−１は、線維芽細胞増殖因子の１種として、生体内に存在しているタンパク質である。本発明で使用されるＦＧＦ−１としては、具体的には、ヒトＦＧＦ−１、そのオルソログ、及びそれらの変異体が挙げられる。
【００１９】
ヒトＦＧＦ−１は、配列番号１に示すアミノ酸配列からなることが知られている。また、ヒトＦＧＦ−１としては、配列番号１における第２〜１５位のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列からなるもの（配列番号２）も見出されておる。本発明では、これらのいずれのヒトＦＧＦ−１を使用してもよい。
【００２０】
ＦＧＦ−１のオルソログとしては、特に制限されないが、例えば、ラット、ハムスター、モルモット、マウス、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、サル、ウサギ等の哺乳動物；ニワトリ、ダチョウ等の鳥類等に由来するものが挙げられる。ＦＧＦ−１は、投与対象となる生物種に応じて、その由来を適宜設定すればよい。
【００２１】
ＦＧＦ−１の変異体としては、ＦＧＦ−１が本来有する生物活性を保持していることを限度として特に制限されず、例えば、突然変異したＦＧＦ−１、遺伝子工学的手法によって改変したＦＧＦ−１等が挙げられる。
【００２２】
ＦＧＦ−１は、遺伝子工学的手法により製造された組換え体であってもよく、また生体から抽出、精製したものを使用してもよい。
【００２３】
ＦＧＦ−２は、線維芽細胞増殖因子の１種として、生体内に存在しているタンパク質である。本発明で使用されるＦＧＦ−２としては、具体的には、ヒトＦＧＦ−２、そのオルソログ、及びそれらの変異体が挙げられる。
【００２４】
ヒトＦＧＦ−２は、配列番号３に示すアミノ酸配列からなることが知られている。また、ヒトＦＧＦ−２としては、配列番号１における第１〜１３４位のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列からなるもの（配列番号４）も見出されておる。本発明では、これらのいずれのヒトＦＧＦ−２を使用してもよい。
【００２５】
ＦＧＦ−２のオルソログとしては、特に制限されないが、例えば、ラット、ハムスター、モルモット、マウス、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、サル、ウサギ等の哺乳動物；ニワトリ、ダチョウ等の鳥類等に由来するものが挙げられる。ＦＧＦ−２は、投与対象となる生物種に応じて、その由来を適宜設定すればよい。
【００２６】
ＦＧＦ−２の変異体としては、ＦＧＦ−２が本来有する生物活性を保持していることを限度として特に制限されず、例えば、突然変異したＦＧＦ−２、遺伝子工学的手法によって改変したＦＧＦ−２等が挙げられる。
【００２７】
ＦＧＦ−２は、遺伝子工学的手法により製造された組換え体であってもよく、また生体から抽出、精製したものを使用してもよい。
【００２８】
本発明のサイトグロビン発現増強剤では、ＦＧＦ−１又はＦＧＦ−２のいずれか一方を単独で使用してもよく、またこれらを組み合わせて使用してもよい。
【００２９】
他の成分
本発明のサイトグロビン発現増強剤は、前記有効成分の他に、治療対象となる疾患の種類に応じて、他の薬理活性成分を含んでいてもよい。
【００３０】
また、本発明のサイトグロビン発現増強剤は、前記有効成分の他に、所望の投与形態及び製剤形態に調製するために、必要に応じて、薬学的に許容される担体や添加剤を含んでいてもよい。このような担体や添加剤としては、希釈剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、懸濁化剤、溶解補助剤、安定化剤、甘味剤、着色剤、矯味剤、矯臭剤、界面活性剤、保湿剤、保存剤、ｐＨ調整剤、緩衝剤、粘稠化剤等が挙げられる。
【００３１】
剤型
本発明のサイトグロビン発現増強剤の剤型については、特に制限されず、その投与形態等に応じて適宜設定すればよい。本発明のサイトグロビン発現増強剤の剤型として、具体的には、注射剤、シロップ剤、細胞懸濁液、リポソーム製剤等の液状製剤；錠剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、顆粒剤、散剤、丸剤等の固形状製剤等が挙げられる。また、注射剤にする場合には、使用前に生理食塩水等で溶解する用時調製用粉末（例えば凍結乾燥粉末）の形態であってもよい。
【００３２】
投与対象
本発明のサイトグロビン発現増強剤は、生体内でサイトグロビンの発現を増強できるので、サイトグロビンの発現増強によって予防乃至治療効果が期待される疾患に適用して使用される。
【００３３】
例えば、サイトグロビンが肝癌の予防乃至治療作用を発揮し得ることが報告されている（特許文献１）。また、肝星細胞の活性化抑制は肝癌の予防や治療に有効であると考えられており（非特許文献１及び２）、その一方で後述する実施例に示すように、サイトグロビンの発現増強によって肝星細胞の活性化を抑制できることが確認されている。従って、本発明のサイトグロビン発現増強剤は、肝癌の予防乃至治療目的で使用することができる。
【００３４】
また、肝星細胞の活性化抑制は肝線維化や肝硬変の予防や治療に有効であると考えられている（非特許文献１及び２）。一方、前述するように、サイトグロビンの発現増強によって肝星細胞の活性化を抑制できるので、本発明のサイトグロビン発現増強剤は、肝線維化や肝硬変の予防乃至治療目的で使用することもできる。
【００３５】
更に、サイトグロビンには、肝癌に止まらず、他の腫瘍に対しても予防や治療に有効であることが知られているので（非特許文献５）、本発明のサイトグロビン発現増強剤は、肝癌以外の癌の予防乃至治療目的で使用することもできる。本発明のサイトグロビン発現増強剤の予防乃至治療対象となる癌（肝癌以外）としては、例えば、肺癌、乳癌、胃癌、大腸癌、舌癌、甲状腺癌、腎臓癌、肺癌、前立腺癌、子宮癌、卵巣癌、骨肉腫、軟骨肉腫、横紋筋肉腫等が挙げられる。特に、本発明のサイトグロビン発現増強剤は、正常な状態でサイトグロビンが発現している臓器（例えば、肝臓、消化管、腎臓、肺臓等）における線維化や癌の予防乃至治療目的で好適に使用できる。
【００３６】
また、サイトグロビンには、ペルオキシダーゼ活性により過酸化水素を分解して細胞内酸化ストレス代謝を調節する役割を担っていることも報告されているので（非特許文献８）、本発明のサイトグロビン発現増強剤は、細胞内の酸化ストレス代謝の異常をきたしている疾患（例えば、肺線維症、慢性膵炎、炎症性腸疾患、慢性腎障害等）の予防乃至治療目的で使用することもできる。
【００３７】
更に、サイトグロビンは、低酸素状態や虚血状態の環境下において、亜硝酸を還元して一酸化窒素を発生させ、これにより可溶性グアニル酸シクラーゼを活性化し、血管の拡張をもたらし得ることも報告されているので（非特許文献９）、本発明のサイトグロビン発現増強剤は、低酸素状態や虚血状態における血管収縮が生じている疾患（例えば、心筋梗塞、腎不全、虚血性脳疾患等）の予防乃至治療目的で使用することもできる。
【００３８】
また、サイトグロビンは、間質病変に対して治療効果を示し得ることが報告されているので（非特許文献１０）、発明のサイトグロビン発現増強剤は、腎間病変の予防乃至治療目的で使用することもできる。本発明のサイトグロビン発現増強剤の予防乃至治療対象となる腎間病変としては、具体的には、慢性腎炎、糖尿病性腎炎等の尿細管間質性腎炎、薬剤性腎障害、腎不全等が挙げられる。
【００３９】
本発明のサイトグロビン発現増強剤において、投与対象となる生物は、サイトグロビン発現増強が求められる生物であればよく、ヒトの他、ラット、ハムスター、モルモット、マウス、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、サル、ウサギ等の哺乳動物等が挙げられる。本発明で使用される有効成分の由来は、投与対象となる生物の種類に応じて設定すればよい。例えば、ヒトに対して適用する場合であれば、有効成分は、ヒトＦＧＦ−１及び／又はヒトＦＧＦ−２を使用すればよい。
【００４０】
投与方法
本発明のサイトグロビン発現増強剤の投与形態としては、例えば、局所投与、皮下投与、腹腔内投与、筋肉内投与、静脈内投与、経直腸的、皮内投与等の非経口投与；経口投与が挙げられ、適用する疾患の種類等に応じて適宜設定すればよい。本発明のサイトグロビン発現増強剤の投与形態として、好ましくは非経口投与が挙げられる。
【００４１】
本発明のサイトグロビン発現増強剤の投与量については、適用する疾患の種類、投与対象者の年齢、性別、体重、症状の程度、投与形態等に応じて適宜設定すればよいが、例えば、ＦＧＦ−１及び／又はＦＧＦ−２が１日当たり、３〜１００μｇ／ｋｇμｇ程度となる量を１又は数回に別けて投与すればよい。
【実施例】
【００４２】
以下、本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって何ら限定されるものではない。
【００４３】
実施例１：ＦＧＦ−２によるサイトグロビン（ＣＹＧＢ）の発現増強効果の確認（１）
６０ｍｍプレートに、ヒト肝星細胞株（ＨＨＳｔｅＣ）細胞を５×１０5ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ播種し、Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＳｔｅＣＧＳ, Ｃａｔ. Ｎｏ. ５３５２）、２％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ペニシリン、及びストレプトマイシンを添加したＳｔｅＣＭ培地（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ，Ｃａｔ．Ｎｏ．５３００）にて、約２４時間培養した。
【００４４】
培養後、Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ無添加ＳｔｅＣＭ培地に交換し、Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ｘ１００）（ＳｔｅＣＧＳ, Ｃａｔ. Ｎｏ. ５３５２）及びＦＧＦ−２中和抗体の無添加、Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ｘ１００）（ＳｔｅＣＧＳ, Ｃａｔ. Ｎｏ. ５３５２）のみ添加、又はＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ｘ１００）（ＳｔｅＣＧＳ, Ｃａｔ. Ｎｏ. ５３５２）とＦＧＦ２中和抗体(Anti-FGF2/basic FGF (neutralizing), clone bFM-1 (Monoclonal antibody, Cat. NO.05-117, Millipore)（２μｇ/ｍｌ)の添加の条件で培養を行った。
【００４５】
培養７２時間後に細胞の形態観察を行った。また、培養７２時間後の細胞を回収し、ＲＩＰＡ（Ｒａｄｉｏ−Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ）バッファーを用いて細胞溶解液１００μｌを調製した。調製された細胞溶解液（２０μｇ相当のタンパク質含有）に５×ローディングＢｕｆｆｅｒ（２−メルカプトエタノール含有）を添加し、９５℃で５分間熱処理後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。一次抗体として、マウス抗ヒトαＳＭＡ抗体（Ｃｌｏｎｅ  １Ａ４、ＤＡＫＯ製、１／１００  ｉｎ  ＰＢＳ）とウサギ抗ヒトＣＹＧＢ抗体（Ｒａｂｂｉｔ  Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ、ｉｎ  ｈｏｕｓｅ）を使用して反応させ、次いで、二次抗体として、其々ＰＯＤ（ｐｅｒｏｘｙｄａｓｅ）標識ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体（１：２００、Ｄａｋｏ製）とＰＯＤ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（１：２００、Ｄａｋｏ製）で反応させた後、化学発光基質ＥＣＬ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ）で処理し、高感度ＣＣＤイメージアナライザー（ＬＡＳ  １０００  ｄｅｖｉｃｅ、富士フィルム製）を用いて検出した。なお、タンパク質のローディングコントロールとしてＧＡＰＤＨを使用した。
【００４６】
得られた結果を図１に示す。図１の左図において、「Ｓ−」はＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔ及びＦＧＦ２中和抗体の無添加、「Ｓ＋」はＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔのみ添加、「２μg/ml Ant-FGF2 + Supplement」は、ＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔとＦＧＦ−２の添加の条件で培養した場合の形態観察の結果である。形態観察の結果、Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ添加によるヒト肝星細胞の形態変化はＦＧＦ−２中和抗体により阻害され、Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ無添加と同様の形態を示した。ウエスタンブロッティングの結果から、Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔで誘導されるヒト肝星細胞におけるサイトグロビンの発現増強が、ＦＧＦ−２中和抗体で抑制されることが分かった。また、サイトグロビンの発現増強に伴って、肝星細胞の活性化マーカーであるα平滑筋アクチン（αＳＭＡ）の減少も確認され、サイトグロビンの発現量の増加は、肝星細胞の活性化抑制をもたらしていると考えられた。
【００４７】
実施例２：ＦＧＦ−２によるサイトグロビン（ＣＹＧＢ）の発現増強効果の確認（２）
６０ｍｍプレートに、ヒト肝星細胞株（ＨＨＳｔｅＣ）細胞を５×１０5ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ播種し、Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＳｔｅＣＧＳ, Ｃａｔ. Ｎｏ. ５３５２）、２％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ペニシリン、及びストレプトマイシンを添加したＳｔｅＣＭ培地（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ，Ｃａｔ．Ｎｏ．５３００）にて、約２４時間培養した。
【００４８】
培養後、Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ無添加ＳｔｅＣＭ培地に交換し、Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ｘ１００）、又は以下に示す条件でヒトＦＧＦ−２（配列番号３）を添加して細胞の処理を行った。時間依存性試験（図２の左図）のために、ＦＧＦ−２の添加濃度を４ｎｇ／ｍｌにして、０、８、２４、４８、及び７２時間、細胞を処理した後に、細胞を回収した。濃度依存性試験（図２の右図）のために、ＦＧＦ−２の添加濃度を０．５、１、２、及び４ｎｇ／ｍｌを処理し７２時間後に細胞を回収した。回収した各細胞について、前記実施例１と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、サイトグロビン、αＳＭＡ、及びＧＡＰＤＨ（ローディングコントロール）の発現量の測定を行った。
【００４９】
得られた結果を図２に示す。図２の右図において「Ｓ＋」は、Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ添加且つＦＧＦ−２未添加の場合の条件を指す。この結果から、ＦＧＦ−２の添加によって、ヒト肝星細胞におけるサイトグロビンの発現量が経時的及び濃度依存的に増加しており、ＦＧＦ−２にはサイトグロビンの発現を増強させる作用があることが明らかとなった。また、肝星細胞の活性化マーカーであるα平滑筋アクチン（αＳＭＡ）は、サイトグロビンの発現量が増加するのに伴って、その発現量が低下しており、サイトグロビンの発現量の増強は、肝星細胞の活性化抑制をもたらし得ることも明らかとなった。
【００５０】
実施例３：ＦＧＦ−２によるサイトグロビン（ＣＹＧＢ）の発現増強効果の確認（３）
３５ｍｍプレートに、ヒト肝星細胞株（ＨＨＳｔｅＣ）細胞を５×１０5ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ播種し、Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＳｔｅＣＧＳ, Ｃａｔ. Ｎｏ. ５３５２）、２％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ペニシリン、及びストレプトマイシンを添加したＳｔｅＣＭ培地（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ，Ｃａｔ．Ｎｏ．５３００）にて、約２４時間培養した。
【００５１】
培養後、Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ無添加ＳｔｅＣＭ培地に交換し、Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ｘ１００）及びヒトＦＧＦ−２（配列番号３）（４ｎｇ／ｍｌ）を添加した。添加０、４、８、２４、及び４８時間後に、それぞれ、Ｔｒｉｚｏｌ５００μｌに溶解し、direct-Zol RNA miniPrep（ZYMO RESEARCH）キットでＲＮＡ抽出を行った。抽出されたRNA、１００ｎｇをSuperscript III Reverse Transcriptase (Invitrogen)でｃＤＮＡ合成し、Fast SYBR  Green Master mixを用いてリアルタイム定量ＰＣＲ（Applied Biosystems 7500 Fast Real-time PCR system）を行った。なお、本試験では、内在性コントロールとして１８Ｓを使用した。
【００５２】
得られた結果を図３に示す。この結果から、ＦＧＦ−２の添加によって、ヒト肝星細胞におけるサイトグロビンのｍＲＮＡの発現量が経時的に増加しており、ＦＧＦ−２にはサイトグロビンの発現を増強させる作用があることが明らかとなった。また、サイトグロビンの発現量が増加するのに伴いαＳＭＡ発現量が低下しており、ＦＧＦ−２によりサイトグロビンの転写が誘導され、肝星細胞の活性化が抑制された。
【００５３】
実施例４：ＦＧＦ−２によるサイトグロビン（ＣＹＧＢ）の発現増強効果の確認（４）
４ｗｅｌｌチャンバースライドに、ＨＨＳｔｅＣ細胞２×１０4ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように播種し、約２４時間培養した。培養は、Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、２％ＦＢＳ、ペニシリン、及びストレプトマイシンを添加したＳｔｅＣＭ培地（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製、Ｃａｔ．Ｎｏ．５３００）を用いて行った。
【００５４】
その後、Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ無添加ＳｔｅＣＭ培地に交換し、Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（×１００）及びヒトＦＧＦ−２（配列番号３）（４ｎｇ／ｍｌ）を添加して培養を継続し、７２時間後に４％パラフォルムアルデヒド／ＰＢＳＴで細胞を固定した。次いで、固定化した細胞に対して、一次抗体として、マウス抗ヒトＳＭＡ抗体（Ｃｌｏｎｅ  １Ａ４、ＤＡＫＯ製、１／１００  ｉｎ  ＰＢＳ）とウサギ抗ヒトＣＹＧＢ抗体（Ｒａｂｂｉｔ  Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ、ｉｎ  ｈｏｕｓｅ）１時間反応させた後、ＰＢＳＴ（Ｐｈｓｏｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ  ｗｉｔｈ  Ｔｗｅｅｎ  ２０）溶液で洗浄した。次いで、二次抗体として、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ４８８標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、ライフテクノロジーズ製）とＡｌｅｘａＦｏｕｒ  ５９４標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、ライフテクノロジーズ製）をそれぞれ使用し、反応させた。反応後、ＰＢＳＴ溶液で洗浄した後、ＤＡＰＩ（ｄｉ−ａｍｉｎおーｐｈｅｎｙｌ−ｉｎｄｏｌｅ）で核染色し、蛍光顕微鏡（ＢＺ−８０００、キーエンス製）にて観察を行った。また、比較のために、Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ及びヒトＦＧＦ−２を添加しない条件、及びＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔのみを添加した条件でも、前記と同様に試験を行った。
【００５５】
得られた結果を図４に示す。図４中、Ｓ（−）はＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔ及びヒトＦＧＦ−２を添加しなかった場合、Ｓ（＋）はＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔのみを添加した場合、ＦＧＦ２はＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔ及びヒトＦＧＦ−２を添加した場合の結果である。図４から明らかなように、ヒトＦＧＦ−２を添加した場合には、α−ＳＭＡが消失し、ＣＹＧＢが強く発現されていた。即ち、本試験結果からも、ＦＧＦ−２にはサイトグロビンの発現を増強させる作用があることが確認された。
【００５６】
実施例５：ＦＧＦ−１によるサイトグロビン（ＣＹＧＢ）の発現増強効果の確認（５）
６０ｍｍプレートに、ヒト肝星細胞株（ＨＨＳｔｅＣ）細胞を５×１０5ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ播種し、Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＳｔｅＣＧＳ, Ｃａｔ. Ｎｏ. ５３５２）、２％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ペニシリン、及びストレプトマイシンを添加したＳｔｅＣＭ培地（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ，Ｃａｔ．Ｎｏ．５３００）にて、約２４時間培養した。
【００５７】
培養後、Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ無添加ＳｔｅＣＭ培地に交換し、Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ｘ１００）、又は以下に示す条件でヒトＦＧＦ−１（配列番号１）を添加して細胞の処理を行った。時間依存性試験（図５の上図）のために、ＦＧＦ−１の添加濃度を４ｎｇ／ｍｌにして、０、８、２４、４８、及び７２時間、細胞を処理した後に、細胞を回収した。濃度依存性試験（図５の下図）のために、ＦＧＦ−１の添加濃度を０．５、１、２、及び４ｎｇ／ｍｌを処理し７２時間後に細胞を回収した。回収した各細胞について、前記実施例１と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、サイトグロビン、αＳＭＡ、及びＧＡＰＤＨ（ローディングコントロール）の発現量の測定を行った。
【００５８】
得られた結果を図５に示す。図５の下図において、「Ｓ−」はＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔ未添加且つＦＧＦ−２未添加の場合の条件を指し、「Ｓ＋」は、Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ添加且つＦＧＦ−２未添加の場合の条件を指す。この結果から、ＦＧＦ−１の添加によって、ヒト肝星細胞におけるサイトグロビンの発現量が、ＦＧＦ−２の場合と同様に、経時的及び濃度依存的に増加しており、ＦＧＦ−１にはサイトグロビンの発現を増強させる作用があることが明らかとなった。また、肝星細胞の活性化マーカーであるα平滑筋アクチン（αＳＭＡ）は、サイトグロビンの発現量が増加するのに伴って、その発現量が低下しており、サイトグロビンの発現量の増強は、肝星細胞の活性化抑制をもたらし得ることも明らかとなった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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