(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）
【化Ｉ】
0006687282.tif 000028
の分子およびそれらのエナンチオマーであって、式中、
Ａは、レセプタ−リガンド系のレセプタまたはリガンドから選択され、
Ｘは、酸素原子（Ｏ）またはＣＨ２基から選択され、
ｙは０から１０までの整数であり、
Ｌは一般式（ＶＩ）の分子であり、
【化ＶＩ】
0006687282.tif 000029
Ｚは、２から１０までの範囲内に含まれる整数であり、
Ａは、以下の基
【化ＩＩ】
0006687282.tif 000030
【化ＩＩＩ】
0006687282.tif 000031
【化ＩＶ】
0006687282.tif 000032
【化Ｖ】
0006687282.tif 000033
から選択される、
分子。
【請求項２】
ｙは０に等しい、請求項１に記載の分子。
【請求項３】
Ｚは２に等しい、請求項１または請求項２に記載の分子。
【請求項４】
請求項１から請求項３のいずれか１項に記載の分子の、生体サンプルから少なくとも１種の活性リボソームを単離することへの使用。
【請求項５】
前記生体サンプルは、細胞または組織溶解物である、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
前記細胞は、細菌性細胞、古細菌細胞、または真核細胞であり得る、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
前記少なくとも１種の活性リボソームは、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、またはタンパク質に関連する、請求項４から請求項６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項８】
請求項１から請求項３のいずれか１項に記載の分子のリボソームプロファイリングへのインビトロの使用。
【請求項９】
生体サンプルから少なくとも１種の活性リボソームを単離するためのキットであり、前記キットは、
ｉ）請求項１から請求項３のいずれか１項に記載の分子を少なくとも１種含む第１試薬と、
ｉｉ）固相であって、前記固相はレセプタ−リガンド系の前記レセプタまたは前記リガンドのうちの他方によって官能化され、これにより前記第１試薬に結合する前記固相と、
を備える、キット。
【請求項１０】
前記第１試薬は、液体の状態または固体の状態である、請求項９に記載のキット。
【請求項１１】
前記キットは、
ａ）前記第１試薬が固体の状態である場合に、前記第１試薬を可溶化させるための可溶化溶液、
ｂ）前記第１試薬を前記生体サンプルとインキュベートするためのインキュベーション溶液、
ｃ）前記生体サンプルと接触させた後に、前記固相の表面を洗浄するための洗浄溶液、
ｄ）前記固相からＲＮアーゼを除去するためのＲＮアーゼ除去および再懸濁溶液、
ｅ）陰性対照、および
ｆ）使用のための使用説明書、
のうちの少なくとも１つをさらに備える、請求項９または請求項１０に記載のキット。
【請求項１２】
前記固相は、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、アビジン、アジド残基、アルキン残基のうちの１つにより官能化されている、請求項９から請求項１１のいずれか１項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、活性タンパク質合成に関与する天然ポリリボソームおよびリボソームのタグフリー単離のための新たな分子、それらの使用およびキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
リボソームは、新たなタンパク質の合成を触媒する巨大分子機械である。複数のリボソームがｍＲＮＡをリクルートする場合、それらはポリリボソームを形成する１，２。ごく最近になって科学者達は、この「アンサンブル」３−９（すなわち、核酸およびタンパク質の集合）の超分子構造的および機能的複雑さを解明しようと試みてきた。遺伝子発現の調節におけるポリリボソームの極めて重要な役割は、リボソームタンパク質、イニシエーション因子、並びにポリリボソームと相互作用する延長因子に影響を及ぼす多くの癌関連突然変異の発見によって強調されている１０。翻訳機構の多くの成分が、今日では、癌およびその他の病状（リボソーム病）の治療に対する重要な標的と考えられている１１。それに加えて、ストレス条件１２および薬物治療１３が、ポリリボソーム内の関連するｍＲＮＡを特異的に変えられることを、最近の発見が示してきた。これら全ての証拠は、タンパク質合成のプロセスおよび病状におけるポリリボソームの極めて重要な役割を明確に示している。さらに、ポリリボソームにおけるＲＮＡのリクルートメント（トランスレートーム）に関する植物１４、酵母菌１５、および哺乳類の細胞１６に対するますます多くの遺伝子発現研究が、遺伝子発現調節におけるポリリボソームの重要性を強調している。
【０００３】
残念ながら、翻訳を調査するための既存のツールおよび方法は依然として改良される必要があり、トランスレートームおよび複雑なポリリボソームを単離および調査するための革新的な方法が必要とされている。現在の手順は、高価であり、多くの時間と労力を要し、転写とタンパク質変化の間の転写後プロセスおよび翻訳プロセスを詳細に分析するのには十分に正確ではない（すなわち、天然型の活性ポリリボソームのみを捕捉することができない）。翻訳に関する情報を得るための可能性のある手法は、その発現が組織特異的プロモーターによって制御される、アフィニティータグされたリボソームタンパク質の発現によって表される。タグされたリボソーム（および、関連するｍＲＮＡ）がアフィニティー精製（ＲＡＰまたは翻訳ＲＡＰ、ＴＲＡＰ）によって精製され得る１７。この方法は、特異的マウスモデルおよび／または特異的遺伝子構成、最後には多用途性の乏しい系となる長いパスを必要とする。配列決定およびプロテオミクス技術における進歩は、リボソーム保護されたフラグメントの深い配列決定（リボソームプロファイリング）１８、開始リボソームの全体的且つ定量的プロファイリング（ＧＴＩ−ｓｅｑ、ＱＴＩ−ｓｅｑ）１９，２０、または、新たに合成されたプロテオームのゲノム規模での定量化（Ｐｕｎｃｈ−ＰおよびｐＳＩＬＡＣ）２１，２２を含む、翻訳をプロファイルするための高解像度（単一のヌクレオチドまたは単一のペプチド）の「オミク」技術の開発を呼び起こした。リボソームプロファイリングは、また、酸素欠乏下でトランスレートームをマッピングするためのＴＲＡＰ（遺伝子学的に操作された有機体を使用した翻訳リボソームアフィニティー精製）と組み合わせて使用されてきた２３。これに対して、Ｐｕｎｃｈ−ＰおよびｐＳＩＬＡＣは、タンパク質レベルでの遺伝子発現調節を研究するための相補的な技術である。これらの様々な手法によってカバーされる様々な生物学的疑問に加えて、これらの全ての技術は、通常、ポリリボソームに関連する（またはポリリボソームによって生成される）ｍＲＮＡおよびタンパク質の半定量的解析を必要とする２４。
【０００４】
線形ショ糖密度勾配における超遠心分離法によるポリリボソームの単離は、１９６０年代から使用されている技術であり、遺伝子発現翻訳の研究にとって現在の「究極の基準」である。ポリリボソームに関連するメッセンジャーＲＮＡが、未結合のＲＮＡ、小さな（４０Ｓ）リボソームサブユニット、大きな（６０Ｓ）リボソームサブユニット、および８０Ｓモノソームから分離される。ＲＮＡおよびタンパク質が勾配から抽出され、ＲＴ−ｑＰＣＲ、ＲＮＡ−ｓｅｑによって、または免疫ブロット法および質量分析法によって解析され得る。この手順は比較的安価（１サンプル当たり〜７０ユーロ）であり、トランスレートーム研究への道を開いたものの２５，２６、いくつかの欠点を有する。第１にこの技術は、高価な機器の操作経験を必要とし、時間がかかる（〜６時間）。第２は感度である。検出可能な信号プロファイルのためには、フラクションの収集の間に大きなサンプル量（＞１０５細胞）が必要である。第３は汚染である。不活性ポリリボソームの存在が依然として議論されているものの、少なくともニューロンにおいて、ポリリボソームフラクションが非翻訳（すなわち、タンパク質合成において活性ではない）ポリリボソームを含み得ることが知られている２７，２８。さらに、ショ糖フラクションが、他の高分子量複合物によってわずかに汚染され得る４。
【０００５】
従って、簡単で、速く、より正確かつ安価な技術は、全ての遺伝子発現研究に対して強い影響を及ぼすであろう。
【０００６】
この方向における革新的な手法は、リボソーム構造および機能の詳細な理解を含むことを無視できない。真核細胞リボソームは、それらの細菌性の同等物よりも〜４０％重く、全質量４．５ＭＤａに対して２つのサブユニット（６０Ｓおよび４０Ｓ）、４つのリボソームＲＮＡおよび７９のリボソームタンパク質を含む２９。リボソームは、Ａ部位、Ｐ部位、およびＥ部位と指定された、大サブユニット中に位置する３つの活性部位を含む。Ａ部位はアミノアシルｔＲＮＡ（ａａｔＲＮＡ）を受け入れ、Ｐ部位はペプチジルｔＲＮＡを受け入れ、Ｅ部位は遊離したｔＲＮＡがリボソームから抜け出ることを可能にする。大サブユニットによって触媒される反応の基質は、Ａ部位に入ってくるアミノアシルｔＲＮＡおよびＰ部位のペプチジルｔＲＮＡである。反応はペプチジルトランスフェラーゼ中心（ＰＴＣ）において起こる。ａａ−ｔＲＮＡのαアミノ基は、カルボニルの炭素を攻撃し、ペプチジルｔＲＮＡの３'−ヒドロキシル基をアシル化する。これは、分解して、Ａ部位に結合されたｔＲＮＡに対してエステル化されたアミノ酸を１つ分延長されたペプチド、およびＰ部位の脱アシル化されたｔＲＮＡを生じる。その後、リボソームは、１コドン前に転座させる。
【０００７】
真核細胞リボソームは、翻訳阻害剤として作用する多くの小さな分子の標的である。これらの分子の大フラクションが優先的にＰＴＣを標的にする３０。この領域は、リボザイム（すなわち、触媒活性リボソーム）の触媒コアであり３１、周囲のリボソームエリアに対して高次構造の系統的保存を共有する３２，３３。さらに、これは、ペプチド結合形成に必須なＲＮＡ構造要素によって形成される。小分子阻害剤の中で、ピューロマイシン（アミノヌクレオシド抗生物質３４）は、３'末端がチロシル化されたｔＲＮＡの類似体であり、原核細胞リボソームおよび真核細胞リボソームの両者においてリボソーム触媒活性を阻害することが可能であり３５、Ａ部位に入ることによってＰＴＣ中心を形成する対称Ｖ型キャビティを結合させる３１，３６。この薬剤は、ペプチド結合形成のメカニズムを理解することを目的とした生化学的実験において中心的役割を果たした３６−４０。もっと最近になって、リボソームと結合し、ポリペプチド新生鎖に効率的に組み込まれるその能力のため、ピューロマイシンが、放射性ピューロマイシン４１または抗ピューロマイシン抗体４２を用いてタンパク質合成機能をアッセイするためのツールとして、広範囲に使用されてきている。さらに、ピューロマイシンはまた、ｍＲＮＡをそのコード化されたタンパク質へ化学的に結合するためにも使用されてきている４３，４４。これらの方法は、ピューロマイシンのα−アミノ基の、カルボニルの炭素との不可逆反応に基づいており、ペプチジル−ｔＲＮＡの３'ヒドロキシル基をアシル化する。ピューロマイシンのアミドが開裂され得ないので、この反応は分解して、末端がピューロマイシン化されたペプチドを生じる。この後、タンパク質合成が停止する。作用のそのメカニズムを考えると、そのα−アミノ基の反応後、新生鎖にピューロマイシンが組み込まれる。
【発明の概要】
【０００８】
本発明の目的は、活性タンパク質合成において天然ポリリボソームおよびリボソームを捕捉することの可能な新たな分子（およびそれらのキット）を提供することである。
【０００９】
本発明によると、上記の目的は、本記載の不可欠な部分を形成するものと理解される、以降の特許請求項にて規定される方法のおかげで実現される。
【００１０】
一実施形態において、本開示は、一般式（Ｉ）の分子およびそれらのエナンチオマーを開示する。
【化Ｉ】
0006687282.tif 000002
式中、
Ａは、レセプタ−リガンド系のレセプタまたはリガンドから選択され、
Ｘは、酸素原子（Ｏ）または炭素原子（Ｃ）から選択され、
ｙは０から１０までの整数であり、
Ｌは一般式（ＶＩ）の分子であり、
【化ＶＩ】
0006687282.tif 000003
Ｚは２から１０の範囲に含まれる整数である。
【００１１】
さらなる実施形態によると、本記載は、生体サンプルから少なくとも１種の活性リボソームを単離するための、一般式（Ｉ）の分子の使用を開示する。
【００１２】
またさらなる実施形態によると、本記載は、生体サンプルから少なくとも１種の活性リボソームを単離するためのキットに関する。これは、
ｉ）一般式（Ｉ）の分子を少なくとも１種含む第１試薬、および、
ｉｉ）レセプタ−リガンド系のレセプタまたはリガンドの他方によって官能化されている固相であって、これにより、この固相が第１試薬に結合する、固相、
を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
ここで本発明は、単なる例としての添付の図面を参照して説明されよう。
【００１４】
【図１】３Ｐ構造のスキーム  ビオチンは表面に結合する残基である。２つの２，２'−エチレンジオキシ−ビス−エチルアミンユニットは、「Ｌ」リンカーを形成し、ピューロマイシンはリボソームに結合する残基である。ＮＨＳはＮ−ヒドロキシスクシンイミド、ＣＤＩはＮ，Ｎ'−ジシクロヘキシルカルボジイミド、ジェフアミン（ｊｅｆｆａｍｉｎｅ）は２，２'−エチレンジオキシ−ビス−エチルアミン。
【００１５】
【図２】３Ｐ分子のＬＣＥＳＩ−ＭＳ解析  上図：全イオン電流（ＴＩＣ）クロマトグラム（上）、およびλ２８０ｎｍにおけるＵＶクロマトグラム（中）が、ＲＰ１８カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｋｉｎｅｔｅｘ、＃００Ｇ−４６０１−Ｅ０、５μｍ  Ｃ１８  １００Å  −  ２５０×４．６ｍｍ）、溶出液  ９８％水  ２％アセトニトリルで５分間、その後、３５分間の１００％アセトニトリルへ、を使用して得られた。１７．５分におけるピーク（下）は、報告されている構造と一致するＥＳＩ（＋）ＭＳ（イオントラップ質量分析器）フルスキャン質量スペクトルを示す。特に、ｍ／ｚが１０４６．５における［Ｍ＋Ｈ］＋は、その分子式Ｃ４７Ｈ７２Ｎ１１Ｏ１４Ｓ＋と一致する。
【００１６】
【図３】３Ｐ分子のＵＶ−ＶＩＳスペクトル  図２に示されるクロマトグラムにおける主要なピーク（３Ｐ）の、フォトダイオードアレイによってオンラインで取得されたＵＶスペクトル。
【００１７】
【図４】３Ｐ分子の１Ｈ−ＮＭＲスペクトル  ＤＭＳＯｄ６中で５ｍＭの３Ｐの溶液の、３００Ｋで検出された４００ＭＨｚの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである（ｐｐｍスケールキャリブレーションに対する参照として残留信号が使用される、δＨ＝２．５０ｐｐｍ）。緩和遅延２０秒、パルス幅８μ秒、過渡数１２８。
【００１８】
【図５】３Ｐ分子の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル  ＤＭＳＯｄ６中で５ｍＭの３Ｐの溶液の、３００Ｋで検出された１００ＭＨｚの１３Ｃ−（１Ｈはデカップリングされている）ＮＭＲスペクトルである（ｐｐｍスケールキャリブレーションに対する参照として残留信号が使用される、δＣ＝３９．５ｐｐｍ）。緩和遅延１０秒、パルス幅１５μ秒、過渡数５６００。
【００１９】
【図６】３ＰのＣＯＳＹスペクトル  ＤＭＳＯｄ６中で５ｍＭの３Ｐの溶液の、３００Ｋで検出された４００ＭＨｚの１Ｈ−１Ｈ  ＣＯＳＹ−ＮＭＲである（ｐｐｍスケールキャリブレーションに対する参照として残留信号が使用される、δＨ＝２．５０ｐｐｍ）。緩和遅延３秒、２０４８×５１２取得マトリクス。
【００２０】
【図７】３Ｐ合成の全体の略図
【００２１】
【図８】ストレプトアビジンコーティングされた磁気ビーズによる３Ｐの枯渇  ストレプトアビジンコーティングされた磁気ビーズの添加後に、上澄みの吸光度（ａ．ｕ．、２７５ｎｍ）が測定される。ビーズは磁気ラックでプルダウンされる。ビーズ量の増加は、溶液中の遊離した３Ｐの漸進的減少を引き起こす（Ｎａｎｏｄｒｏｐ  ＮＤ−１０００  ＵＶ−ＶＩＳ分光光度計により測定される）。データは、三重反復実験（ｎ＝３）の平均を表す。
【００２２】
【図９】ルシフェラーゼ遺伝子のインビトロ無細胞発現に対する３Ｐおよびピューロマイシンの効果  様々な濃度のピューロマイシンおよび３Ｐが存在する中でのルシフェラーゼタンパク質生成（左のパネル）。εラベルしたビオチン化されたリジン−ｔＲＮＡを反応に対して添加して、蛍ルシフェラーゼがインビトロで発現される（９０分）。ストレプトアビジン−ＨＲＰによるインキュベーション後、化学発光によってタンパク質が視覚化される。散布図は、様々な濃度のピューロマイシン（０μＭ、０．０１μＭ、０．１μＭ、１μＭ、および１０μＭ）が存在する中でのルシフェラーゼ発現の阻害を示す（中央のパネル）。黒線は、ピューロマイシン濃度の関数としての、ルシフェラーゼ発現の減衰を説明する最良のフィッティングである（ｙ＝Ａ×ｅｘｐ（−ｘ／ｂ）、ここで、Ａ＝１００およびｂ＝０．０２０±０．００３）。ヒストグラムは、様々な濃度の３Ｐ（０μＭ、０．０１μＭ、０．１μＭ、１μＭ、および１０μＭ）が存在する中でのルシフェラーゼ発現の阻害を示す（右のパネル）。最終的な体積５０μＬ。エラーバーは、三重反復実験（ｎ＝３）から算出されたｓ．ｄ．を表す。（＊）＝ｔ検定ｐ値＜０．０１。
【００２３】
【図１０】３Ｐの存在下での蛍ルシフェラーゼおよび高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）の発現  （ａ、上図）ルシフェラーゼタンパク質発現に対する３Ｐの効果。εラベルされたビオチン化されたリジン−ｔＲＮＡが、タンパク質生成をＳＤＳ−ＰＡＧＥによってモニタリングするために使用される。（ａ、下図）対照（インプット、３Ｐ無しの反応混合物）に対し、ウエスタンブロット（上）に報告されるバンドの相対的定量化（密度倍率変化）を表したヒストグラム。反応は、最終的な体積５０μＬのＩＶＴＴ  ｅｕｋ−ｍｉｘ中で実行される。エラーバーは、二重反復実験から算出されたｓ．ｄ．を表す。（ｂ、上図−左）ＥＧＦＰ発現に使用されるプラスミドのスキーム。遺伝子をクローン化するために使用される制限部位が報告される。（ｂ、上図−右）ウエスタンブロット解析によってモニタリングされる、ＥＧＦＰ発現に対する３Ｐの効果。反応は、最終的な体積５０μＬのＩＶＴＴ  ｅｕｋ−ｍｉｘ（上）またはＩＶＴＴ  ｐｒｏ−ｍｉｘ（下）で実行される。（ｂ、下図）ＩＶＴＴ  ｅｕｋ−ｍｉｘ中でのＥＧＦＰ発現に対する３Ｐおよび３ＰＰの効果。
【００２４】
【図１１】インビトロ転写／翻訳、タンパク質合成の単離および検出、使用された手法のスキーム  （ａ）陽性対照（蛍ルシフェラーゼ、ＬＵＣ  ＳＰ６、Ｇ）および陰性対照（空ｐＧＥＭＥＸベクター、Ｒ）として使用された２つのプラスミドの略図、および、ＲＮＡおよびタンパク質視覚化に使用されるベクターおよび方法の概略図。ビオチン化されたタンパク質測定のＰＣＲ、発光アッセイ、およびＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、ＲＮＡの発現および特異的に官能化されたビーズ上の転写産物の濃縮を検出することが可能となる。（ｂ）無細胞インビトロ転写−翻訳の間に生成された転写産物をプルダウンするために使用される手順。段階１から６まで次のとおり。（１）インビトロ転写−翻訳反応にプラスミドが加えられた。（２）３ＰおよびｍＰによってビーズが官能化された。（３）４０分のインキュベーション後、官能化されたビーズにＩＶＴＴ  ｅｕｋ−ｍｉｘが加えられ、４℃において、２ｒｐｍでの軌道回転中で１時間インキュベートされた。（４）非特異的な結合を除去するため、ビーズは、それらが磁石から分離しないように洗浄された。（５／ａ）Ｔｒｉｚｏｌ抽出およびイソプロパノール沈殿の後、（５／ｂ）ＤＮＡ汚染の可能性を回避すべくＲＮＡがＤＮアーゼＩによって消化され、（５／ｃ）ｃＤＮＡ合成に使用される。（６）ルシフェラーゼ遺伝子の存在および陰性対照転写産物を検出するため、ＲＴ−ｑＰＣＲによってサンプルが解析された。
【００２５】
【図１２】活性翻訳中のｍＲＮＡの選択的濃縮  （ａ）実験手順の略図。段階１から６まで次のとおり。（１）それぞれ０．２５μｇの蛍ルシフェラーゼプラスミド（Ｇ）および陰性対照プラスミド（Ｒ）に対するプラスミドエンコーディングが、製造業者の使用説明書（ＴＮＴ  Ｑｕｉｃｋ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ／ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ、Ｐｒｏｍｅｇａ）に従って、インビトロで転写および翻訳される。翻訳を阻害すべく、時間（ｔ）＝０において薬剤が加えられる。インキュベーション時間（Δｔ１）は、３４℃において４０分。Ｇ＋Ｈは、ハリントニン（Ｈ、２μｇ／ｍＬ）を有するルシフェラーゼ遺伝子。Ｇ＋Ｐは、ピューロマイシン（Ｐ、５μｇ／ｍＬ）を有するルシフェラーゼ遺伝子。（２）その後、サンプルは、シクロヘキサミド（ＣＨＸ、１０μｇ／ｍｌ）によって、３４℃において３分間インキュベートされる。（３）活性翻訳中のリボソームが３ＰビーズまたはｍＰビーズによってプルダウンされる。（４）ビーズが分離され、洗浄される。（５／ａ−ｃ）ＲＮＡが抽出され、ＤＮアーゼＩで処理され、ランダムヘキサマーによって単一ストランドのｃＤＮＡへと逆転写される。（６）各サンプルからの等しい量のＲＮＡ（６０ｎｇ）がＲＴ−ｑＰＣＲに使用される。手順の詳細な説明は「材料および方法」に報告される。（ｂ）対照ビーズ（ｍＰ）と比べて３Ｐビーズによって捕捉された転写産物の全量に対するＬｏｇ２スケールの倍率変化（ｆｏｌｄ  ｃｈａｎｇｅ）値であり、以下では「濃縮」と呼ばれる。（＊）＝ｔ検定ｐ値＝０．０３（Ｇ対Ｇ＋Ｈ）、ｐ値＝０．０２（Ｇ対Ｇ＋Ｐ）、ｐ値＝０．０４（Ｇ対Ｒ）。ｎ＝５。エラーバーは、ｓ．ｄ．を表す。使用されたビーズはＤｙｎａｂｅａｄｓ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、＃６５００１。
【００２６】
【図１３】インビトロ転写／翻訳系によって生成されたタンパク質およびＲＮＡ  （ａ）非放射性検出システム（Ｔｒａｎｓｃｅｎｄｅｎｔ、Ｐｒｏｍｅｇａ、＃Ｌ５０８０）と結合されたインビトロ転写／翻訳（ＴＮＴ  Ｑｕｉｃｋ  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ、Ｐｒｏｍｅｇａ、＃Ｌ２８８１）９０分の後での陽性ベクター（Ｇ、蛍ルシフェラーゼ）および陰性ベクター（Ｒ，空ベクター）の全翻訳。膜へのゲル移動が化学発光で視覚化された後、タンパク質がＳＤＳ−ＰＡＧＥにて移動された。（ｂ）ｍＰまたは３Ｐ官能化されたビーズによる精製後に得られた単一ストランドのｃＤＮＡから生成されたＰＣＲ生成物（詳細な手順は「材料および方法」を参照のこと）。ゲルはＴＡＥアガロース１％。分子量「ａ」およびフラグメント長「ｂ」が、明確さのためにラダーの側に報告されている。
【００２７】
【図１４】ＲＴ−ｑＰＣＲからのＰＣＲ生成物によるアガロースゲル  図１２のａに説明される手順に従って得られた陽性（Ｇ、蛍ルシフェラーゼ）、陰性（Ｒ、空ベクター）、および１８Ｓ  ｒＲＮＡのＰＣＲ増幅からのアンプリコン。陽性対照Ｇ、ハリントニン（２μｇ／ｍＬ）でインキュベートされた陽性対照Ｇ＋Ｈ、ピューロマイシン（１０μｇ／ｍＬ）でインキュベートされた陽性対照Ｇ＋Ｐ、陰性ラダーのフラグメント長Ｒが左に報告されている。アガロースゲルＴＡＥ１％。
【００２８】
【図１５】ＥＧＦＰタンパク質のインビトロ発現後の活性に翻訳されたＧＦＰ転写産物の単離  （ａ、左）ＥＧＦＰ発現に対して使用される２つのプラスミド（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ＋、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ；ｐＰＲ−ＩＢＡ２、ＩＢＡ、＃２−１３９１−０００）。このスキームは、ＥＧＦＰ遺伝子の上流側の特徴を示す（濃い灰色の長方形はＥＧＦＰ、黒はＬａｃＺ、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、白は翻訳エンハンサーリボソーム結合シーケンス、灰色はＴ７プロモーター）。（ａ、右）タンパク質発現に対する溶液中の遊離した３Ｐおよびハリントニンの効果を報告するウエスタンブロット（図に報告される濃度、インキュベーション時間は１時間、３０℃にて、２μｇのプラスミド、５０μＬのＩＶＴＴ  ｅｕｋ−ｍｉｘ）。（ｂ、左）ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ＋プラスミドからの反応５０μＬ中でのＥＧＦＰ発現の全免疫沈降（ＩＰ）を示すウエスタンブロット（混合物中２μｇのプラスミド、露出時間は５００秒。２０μＬのＤｙｎａｂｅａｄｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ、２μｇの抗ＧＦＰ抗体、Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈ、＃Ａ１１１２２によって官能化されたＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、  ＃１０００３ＤによってＩＰが実行される）。（ｂ、中央）ｐＰＲ−ＩＢＡ２プラスミドからのＥＧＦＰ発現（ＩＶＴＴ  ｅｕｋ−ｍｉｘ中の３００ｎｇのプラスミド、露出時間は５秒。１μＬの反応混合物がゲルに充填される）。（ｂ、右）２つの反応混合物中のＥＧＦＰ  ＲＮＡのＲＴ−ｑＰＣＲ解析：ｈ−およびｈ＋。相対存在量が２＾（３９−Ｃｑ）として報告される。ここで３９はサイクル数であり、Ｃｑは定量化サイクルである。（ｃ、左）ＩＶＴＴ  ｅｕｋ−ｍｉｘによる２５分間のインキュベーション後の、ｍＰビーズに対する３Ｐビーズでの活性に翻訳されたＥＧＦＰ  ＲＮＡの倍率変化濃縮（５０μＬの混合物中２μｇのプラスミド、３０℃）。（ｃ、右）タンパク質発現の様々な時点における、３Ｐビーズによって捕捉されたＥＧＦＰ  ＲＮＡの倍率変化濃縮（ＩＶＴＴ  ｅｕｋ−ｍｉｘ）。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ＋プラスミドからのＥＧＦＰ。反応条件は、５０μＬの混合物中２μｇのプラスミド、３０℃。使用したビーズはＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ｍａｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）。
【００２９】
【図１６】精製されたショ糖フラクションにおけるＲｉｂｏＬａｃｅ  （左）凡例に報告されるように、非処理の細胞（薬剤無しＩおよび薬剤無しＩＩ。ここで、ＩおよびＩＩは２つの独立な生物学的複製）、または、ハリントニンで処理された細胞（薬剤有り）から得られたポリソームプロファイル。ＴＥ＝全体の翻訳効率４５。ＭＣＦ７細胞の溶解物から得られたショ糖密度勾配ポリソームプロファイル。（右）全ｒＲＮＡに対する３Ｐビーズで抽出されたｒＲＮＡの間の比として各フラクションについて算出されたｒＲＮＡ濃縮。８０Ｓ（フラクション１）に対して正規化されている。これらの値は、１％のＴＢＥアガロースゲル中の１８Ｓおよび２８Ｓの両者のバンドのデンシトメトリー解析から得られている。使用したビーズはＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ｍａｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）。
【００３０】
【図１７】活性翻訳中のリボソームを細胞溶解物から捕捉するための最適化された手順  ストレプトアビジンでコーティングされた磁気ビーズが３Ｐ分子によって官能化される（段階１）。その後、３Ｐビーズは、粗製ＭＣＦ７溶解物に加えられる（段階２）（通常５−２０μＬ、〜０．４−１．５×１０５細胞に対応する）。ビーズプルダウン、上澄みの分離、および洗浄の後、タンパク質およびＲＮＡが回収され得る（段階３および４）。洗浄段階の間、ビーズは磁石から分離されない（詳細な手順は「材料および方法」を参照のこと）。
【００３１】
【図１８】官能化されたビーズにおけるタンパク質濃縮  （ａ、左）リボソームタンパク質（ＲＰＬ２６、ＲＰＳ６）および翻訳開始に関連するタンパク質（ｅＩＦ４Ｂ、ｅＩＦ４Ａ１）のウエスタンブロット。３Ｐビーズ（３Ｐ）および対照ビーズ（ｍＰ）によるプルダウンが、未結合フラクション（未結合、全未結合タンパク質含有量のうちの１／１０が各ウェルに充填されている）中の相対タンパク質含有量と一緒に報告されている。「材料および方法」に説明されるように、ＭＣＦ７細胞株から細胞溶解物が得られる。（ａ、右）リボソームタンパク質の捕捉に対する塩濃度の効果。１０ｍＭから５００ｍＭへのＮａＣｌ濃度の増加は、３Ｐビーズによるリボソームタンパク質の捕捉を阻止する。ＮＳＣ−３４細胞株からの細胞溶解物。（ｂ、左）捕捉効率に対する様々な刺激の効果。非処理の細胞（Ｎ）、１２時間の血清飢餓後にＥＧＦ（１μｇ／ｍＬ、４時間）で処理された細胞（Ｅ）、および、１２時間にわたる血清飢餓中の細胞（Ｓ）からの、３ＰビーズおよびｍＰビーズによるプルダウン後のＲＰＳ６およびＲＰＬ２６のウエスタンブロット。右側の最後の３つの線は、ショ糖密度勾配超遠心分離法の後で、全フラクション（Ｎ−全）、ポリリボソームフラクション（Ｎ−ポリ）、および、サブポリリボソームフラクション（Ｎ−サブ、右側のパネル）から抽出された全タンパク質を示す。（ｂ、右）左側は、密度倍率変化比を表した相対定量化（３Ｐ／ｍＰ、Ｌｏｇ２スケール）。データは全タンパク質含有量に正規化されている。右側は、ポリソームタンパク質含有量に対する３Ｐビーズおよび全サブポリソームタンパク質含有量についてのＲＰＬ２６倍率変化比（Ｌｏｇ２スケール）。（＊）ｔ検定ｐ値＝０．０２（ＲＰＬ２６）、ｔ検定ｐ値＝０．０１（ＲＰＳ６）、ｔ検定ｐ値＝０．０１（サブ／ポリ）。ｎ＝３。各サンプルに対して充填される体積は１０μＬ。
【００３２】
【図１９】ポリソームに関連した、または関連していないタンパク質の３ＰビーズまたはｍＰビーズによる分離  ビーズからのタンパク質抽出後、ＡＣＴＢおよびＧＡＰＤＨのようなポリリボソームに関連していないタンパク質は検出されなかった。
【００３３】
【図２０】官能化されたビーズにおけるＲＮＡ濃縮  （ａ、左）非処理の細胞（Ｎ）、１２時間の血清飢餓後にＥＧＦ（１μｇ／ｍＬ、４時間）で処理された細胞（Ｅ）、および、１２時間にわたる血清飢餓中の細胞（Ｓ）から、ショ糖密度勾配分画、酸−フェノール抽出、およびイソプロパノール沈殿によって全ＲＮＡが回収された。（ａ、右）３ＰビーズおよびｍＰビーズから抽出された全ＲＮＡ、ポリリボソーム（ポリ）フラクション、サブポリリボソーム（サブ）フラクション、および全ＲＮＡが、ＭＯＰＳ−ホルムアルデヒドアガロースゲル（１％のアガロース）において移動された。レーン：（Ｎ）非処理の細胞から抽出されたＲＮＡ、（Ｅ）ＥＧＦ処理された細胞、（Ｓ）血清飢餓細胞から抽出されたＲＮＡ。２８Ｓおよび１８Ｓ  ｒＲＮＡに対応するバンドが示されている。ＭＣＦ７細胞からの溶解物。（ｂ、左）「ａ」で報告されるＲＮＡのＮａｎｏｄｒｏｐ定量化（ｙ−左）およびＲＩＮ（ｙ−右）。各条件について、全ＲＮＡに対する各サンプルの収量率が薄い灰色で報告されている。ＲＩＮ値≧８（灰色の破線）はＲＮＡサンプルの良好な品質を示す。（ｂ、右）ｍＰビーズによって抽出された全ＲＮＡに対する、３Ｐビーズから抽出された全ＲＮＡの相対倍率変化（ｎ＝６、ｔ検定ｐ値＝０．０４、ｎ＝３。ＭＣＦ７非処理細胞からの溶解物）。
【００３４】
【図２１】ハリントニンで処理された、または処理されていない細胞溶解物から、ＲｉｂｏＬａｃｅによって抽出されたＲＮＡ  （左）３Ｐ官能化されたストレプトアビジンビーズ（＃２８−９８５７−９９、ＧＥ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）によってＭＣＦ７細胞溶解物がインキュベートされた。３Ｐビーズにおける全ＲＮＡがＴｒｉｚｏｌによって抽出され、アガロースゲルに充填された。（右）ＲｉｂｏＬａｃｅ精製後に抽出され、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｏｌｄ（＃Ｓ１１４９４、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により染色された１％アガロースゲルに充填されたＲＮＡ。Ｍは０．５−１０ｋｂ  ＲＮＡラダー、＃１５６２３２００、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ。ｈ＋はハリントニン（２μｇ／ｍＬ、２時間）で処理された細胞。ｈ−はハリントニンで処理されていない細胞。または代替的に、ＦＢＳ＋は指数関数的な成長にある細胞。ＦＢＳ−は血清飢餓（０．５％のＦＢＳ、１８時間）下の細胞。ＴＢＥアガロースゲル。
【００３５】
【図２２】ＲＮＡ−ｓｅｑ解析に使用される手順  それぞれ異なる条件からのＭＣＦ７細胞溶解物（非処理の細胞（Ｎ）、ＥＧＦ処理された細胞（Ｅ）、血清飢餓細胞（Ｓ））が以下のように処理された（段階１−４）。（１）ショ糖密度勾配または官能化されたビーズに対して溶解物が加えられる。（２）ポリリボソームがビーズによって分離される。ポリリボソームフラクションおよび全細胞質ＲＮＡが並行して抽出される。ポリリボソームはＰ、全はＴ。（３）プロテイナーゼＫ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、＃ＥＯ０４９１）消化の後、３Ｐビーズ（Ｂ）およびｍＰビーズ（Ｍ）から、およびショ糖密度勾配フラクション（それぞれ１ｍＬ）からＲＮＡが抽出され、同じプロファイルからポリリボソームと全ＲＮＡの両者を得る。酸−フェノール抽出によってＲＮＡが抽出される。（４）Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＴｒｕＳｅｑライブラリ調製キットを使用してライブラリが調製され、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ２０００によって配列決定が実行される。
【００３６】
【図２３】ＥＧＦ処理されたサンプルおよび血清飢餓サンプルの相関  ＥＧＦ処理されたもの（上）および血清飢餓（下）の読み（ＦＰＫＭ）の散布図。ｍＰ−ＦＰＫＭよりも高い３Ｐ−ＦＰＫＭ数を有する遺伝子のみが解析に含まれる。ＥＰはＥＧＦ処理された細胞からのポリソームＲＮＡ。ＥＴはＥＧＦ処理された細胞からの全ＲＮＡ。ＥＢはＥＧＦ処理された細胞からの３ＰビーズＲＮＡ。ＳＰは血清飢餓細胞からのポリソームＲＮＡ。ＳＴは血清飢餓細胞からの全ＲＮＡ。ＳＢは血清飢餓細胞からの３ＰビーズＲＮＡ。ピアソンの相関およびスピアマンの相関（ｐ値＜０．０５）が各グラフに対して報告されている。楕円は９５％信頼水準を表す。Ｒ２は自由度修正済み決定係数。
【００３７】
【図２４】対照サンプルの相関  （ａ、左）この表は、データセットの厳密性を増加させた場合の（１倍から２０倍まで、すなわち、対照に対して２０倍多くのビーズ−ＦＰＫＭ）、様々なスピアマンの相関を報告する。（ａ、右）それぞれ３倍、５倍、および２０倍のデータセットについての散布図。（ｂ）２０倍データセットに対するズームアウト（ｘ、ｙ、ｚの四角）。ＮＰは非処理の細胞からのポリソームＲＮＡ。ＮＴは非処理の細胞からの全ＲＮＡ。ＮＢは非処理の細胞からの３ＰビーズＲＮＡ。ピアソンの相関およびスピアマンの相関（規定されていない場合はｐ値＜０．０５）が各グラフに対して報告されている。楕円は９５％信頼水準を表す。ｍＰ−ＦＰＫＭ数よりも高い３Ｐ−ＦＰＫＭ数を有する遺伝子のみが解析に含まれる。Ｒ２は自由度修正済み決定係数。
【００３８】
【図２５】ＲＴ−ｑＰＣＲデータとのＲＮＡ−ｓｅｑデータの一致  ８つの遺伝子（ＰＡＬＬＤ、ＰＬＫ３、ＩＬ２７ＲＡ、ＮＣＳ１、ＶＥＧＦＡ、ＤＵＳＰ５、ＰＤＣＤ４、ＰＡＰＳＳ２）および４つの異なるＲＮＡ精製である３Ｐ、ｍＰ、ショ糖密度勾配、および全ＲＮＡについて、ピアソン倍率変化測定を使用した、ＲＴ−ｑＰＣＲデータ（ｙ軸）とのＲＮＡ−ｓｅｑ（ｘ軸）の相関。
【００３９】
【図２６】ＲＴ−ｑＰＣＲによるＮＧＳデータの解析および検証：ＤＥＧおよびＲＴ−ｑＰＣＲの相関  （ａ−左）３つのデータセットの共通部分によるベン図（左）。'＋＋'は、ＥＧＦ処理された細胞および血清飢餓細胞の両者において３Ｐ−ｆｐｋｍ＞ｍＰ−ｆｐｋｍを有する遺伝子。'ビーズＦＣ＞０'は、３Ｐビーズにおいて正の倍率変化（ＦＣ）を有する遺伝子。'ｐ値＜０．０５'は、ｐ値＜０．０５を有する遺伝子。各カテゴリに対する遺伝子の数が括弧内に報告されている。（ａ−右、上図）Ｌｏｇ２スケールの'＋＋'データセットに対する倍率変化の正規分布を説明する確率散布図（ｎ＝６，２２３遺伝子）。左から右へと向かって、３Ｐ−ＲＮＡ、ポリリボソームショ糖密度勾配、全ＲＮＡ、およびｍＰ−ＲＮＡに対して得られた倍率変化。正規分布パラメータはミュー、正規分布の平均。シグマ＝正規分布の標準偏差。破線は理論上の分布。３Ｐビーズにおいて正の倍率変化を有するＤＥＧは３，２４７（薄い灰色の四角）。（ａ−右、下図）３つのデータセットの共通部分から現れる共通の遺伝子（ｎ＝７０）が比較される。散布図は左から右の順で、ＥＢ／ＳＢ（３ＰビーズからのＲＮＡ）と比較したＥＰ／ＳＰ（ポリリボソームショ糖密度勾配ＲＮＡ）、ＥＢ／ＳＢと比較したＥＴ／ＳＴ（全ＲＮＡ）、およびＥＴ／ＳＴと比較したＥＰ／ＳＰ。ＥＰはＥＧＦ処理された細胞からのポリリボソームＲＮＡ。ＥＴはＥＧＦ処理された細胞からの全ＲＮＡ。ＥＢはＥＧＦ処理された細胞からの３ＰビーズＲＮＡ。ＳＰは血清飢餓細胞からのポリリボソームＲＮＡ。ＳＴは血清飢餓細胞からの全ＲＮＡ。ＳＢはＲＮＡ血清飢餓細胞からの３Ｐビーズ。楕円は９５％の信頼水準を表す。（ｂ）妥当性を確認された８つの遺伝子（図２６参照のこと）のうちから選択された４つの遺伝子（ＮＣＳ１、ＩＬ２７ＲＡ、ＤＵＳＰ５、ＶＥＧＦＡ）に対するＲＮＡ−ｓｅｑおよびＲＴ−ｑＰＣＲ倍率変化（ＦＣ）を表したヒストグラム。ヒストグラムにおいて、黒の棒はＲＴ−ｑＰＣＲ倍率変化、白の棒はＲＮＡ−ｓｅｑ倍率変化、ｔ検定（＊）＝ｐ値＜０．０５。
【００４０】
【図２７】ＲＮＡ−ｓｅｑデータのサブセットの相関  それぞれの四角の左にあるベン図は、プロットされた倍率変化（Ｌｏｇ２スケール）データセットのサブグループを示す。'＋＋'は、ＥＧＦ処理された細胞および血清飢餓細胞のうち３Ｐ−ＦＰＫＭ＞ｍＰ−ＦＰＫＭを有する遺伝子。'ビーズＦＣ（Ｌｏｇ２）＞０'は、３Ｐビーズで正の倍率変化を有する遺伝子。'ｐ値＜０．０５'は、ｐ値＜０．０５を有する３Ｐビーズからの遺伝子。散布図は上図から下図への順で、'ｐ値＜０．０５'ＤＥＧデータセット（ｎ＝４８８、四角Ｉ）、'ｐ値＜０．０５'且つ'＋＋'データセット（ｎ＝１１２、四角ＩＩ）、'ｐ値＜０．０５'且つ'＋＋'且つ'ＦＣ（Ｌｏｇ２）＞０'遺伝子データセット（ｎ＝７０、四角ＩＩＩ）、'ｐ値＜０．０５'且つ'＋＋'且つ'ＦＣ（Ｌｏｇ２）＜０'遺伝子データセット（ｎ＝４２、四角ＩＶ）。ＥＰはＥＧＦ処理された細胞からのポリソームＲＮＡ。ＥＴはＥＧＦ処理された細胞からの全ＲＮＡ。ＥＢはＥＧＦ処理された細胞からの３ＰビーズＲＮＡ。ＳＰは血清飢餓細胞からのポリソームＲＮＡ。ＳＴは血清飢餓細胞からの全ＲＮＡ。ＳＢはＲＮＡ血清飢餓細胞からの３Ｐビーズ。各グラフに対してスピアマンの相関が報告されている。楕円は９５％の信頼水準を表す。Ｒ２は自由度修正済み決定係数。
【００４１】
【図２８】３Ｐビーズから抽出されたＲＮＡは、全タンパク質存在量における変化を予測するための、全ＲＮＡおよびポリソームＲＮＡに対するより良好な代理である。  （ａ）全（ＥＴ／ＳＴ）、ショ糖密度勾配ポリリボソームフラクション（ＥＰ／ＳＰ）および３Ｐ対ｍＰ比（Ｌｏｇ２（ＥＢ／ＳＢ）−Ｌｏｇ２（ＥＭ／ＳＭ））に対するＥＧＦ刺激に応答したＬｏｇ２スケールＦＣの散布図。左から右へと順に、ＥＴ／ＳＴ（全ＲＮＡ）と比較したＥＰ／ＳＰ（ショ糖密度勾配ポリリボソームＲＮＡ）、３Ｐ対ｍＰ比と比較したＥＰ／ＳＰ（ショ糖密度勾配ポリリボソームＲＮＡ）、３Ｐ対ｍＰ比と比較したＥＴ／ＳＴ（全ＲＮＡ）。ＥＰはＥＧＦ処理された細胞からのポリリボソームＲＮＡ。ＥＰはＥＧＦ処理された細胞からのポリリボソームＲＮＡ。ＥＴはＥＧＦ処理された細胞からの全ＲＮＡ。ＥＢはＥＧＦ処理された細胞からの３ＰビーズＲＮＡ。ＳＰは血清飢餓細胞からのポリリボソームＲＮＡ。ＳＴは血清飢餓細胞からの全ＲＮＡ。ＳＢはＲＮＡ血清飢餓細胞からの３Ｐビーズ。各プロットに対して相関値およびｐ値が報告されている。楕円は９５％の信頼水準を表す。（ｂ）タンパク質およびＲＮＡ倍率変化。黒の棒はＲＴ−ｑＰＣＲ倍率変化、白の棒はＲＮＡ−ｓｅｑ倍率変化、薄い灰色の棒はタンパク質倍率変化。タンパク質バンド強度の定量的解析が、各プロット（ｎ＝３）の右側のウエスタンブロットへ参照される。ＰＡＬＬＤは、通常のアクチン細胞骨格の組織に必要な細胞骨格タンパク質であり、細胞形態学、運動性、細胞接着、および、細胞−細胞外マトリクス相互作用に関与する。ＰＬＫ３（ポロ様キナーゼ）は、細胞周期調節およびストレス反応に関与するセリン／スレオニン−タンパク質キナーゼである。ハウスキーピングタンパク質はＡＣＴＢ、ＧＡＰＤＨ、ＲＰＬ２６。ＡＣＴＢはベータアクチン、ＲＰＬ２６はリボソームタンパク質Ｌ２６。ｔ検定（＊）＝ｐ値＜０．０５。ＥはＥＧＦ処理されたものであり、Ｓは血清飢餓。Ｒ２は自由度修正済み決定係数。
【００４２】
【図２９】倍率変化の相関  各欄の第２および第３のプロットは、３Ｐ倍率変化信号からバックグラウンド（対照ビーズ倍率変化）を引いたものを含んでいる。左から右へと順に、図２６には報告されなかった異常値を含む'ｐ値＜０．０５'遺伝子データセットの散布図（ｎ＝４３６、左の四角）、'ｐ値＜０．０５'且つ'＋＋'データセットの散布図（ｎ＝１０８、中央の四角）、'ｐ値＜０．０５'且つ'＋＋'且つ'ＦＣ＞０'遺伝子データセットの散布図（ｎ＝５９、右の四角）。ＥＰはＥＧＦ処理された細胞からのポリソームＲＮＡ。ＥＴはＥＧＦ処理された細胞からの全ＲＮＡ。ＥＢはＥＧＦ処理された細胞からの３ＰビーズＲＮＡ。ＳＰは血清飢餓細胞からのポリソームＲＮＡ。ＳＴは血清飢餓細胞からの全ＲＮＡ。ＳＢは血清飢餓細胞からの３ＰビーズＲＮＡ。Ｒ２は自由度修正済み決定係数。
【００４３】
【図３０】ＥＧＦ刺激に応答したＲＮＡおよびタンパク質倍率変化  右側のウエスタンブロットを参照してのタンパク質バンド強度の定量的解析（ｎ＝３）。ハウスキーピングタンパク質はＧＡＰＤＨ、ｔ検定（＊）＝ｐ値＜０．０５。ＥはＥＧＦ処理されたもの、Ｓは血清飢餓。白のヒストグラムはＲＮＡ−ｓｅｑ倍率変化。薄い灰色はタンパク質倍率変化。ｈｂ−ＥＧＦはヘパリン結合ＥＧＦ様成長因子（上図）。ＣＹＰ２７Ａ１はシトクロムＰ４５０ファミリ２７サブファミリＡメンバ１（下図）。
【００４４】
【図３１】ＲｉｂｏＬａｃｅによるリボソームプロファイリング  本文「３Ｐに対する追加的な用途：リボソームプロファイリング」で説明される段階１−７の略図。
【００４５】
【図３２】３ＰビーズＲＮＡにおけるリボソーム保護されたフラグメントの濃縮  （ａ、左）ハリントニン（２μｇ／ｍＬ）によって２時間にわたって処理されたＭＣＦ７細胞（ｈ＋）または処理されていないＭＣＦ７細胞（ｈ−）が、次のスキームに説明されるように処理される。（ｉ）溶解、（ｉｉ）ＲＮアーゼＩによる消化、（ｉｉｉ）３Ｐ−ｄｙｎａｂｅａｄｓビーズによる精製、（ｉｖ）ＴＢＥ１％アガロースゲルにおけるＲＮＡ単離。（ａ、中央）単離されたリボソーム保護されたフラグメント（ＲＰＦ）を報告するＴＢＥ−尿素ゲル（１５％）。灰色の四角は、Ｒｉｂｏ−ｓｅｑ解析にとっての対象となるバンドを特定し、長さが〜３０ヌクレオチドのフラグメントに対応する。（ａ、右）バイオアナライザに基づいた、３Ｐビーズによって捕捉されたＲＰＦの相対倍率変化（ｈ−／ｈ＋）。（ｂ）ＭＣＦ７細胞溶解物およびマウス脳（ＴＢＥ−尿素ゲル１５％）から得られたＲＰＦの間の比較。使用したビーズはＤｙｎａｂｅａｄｓ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、＃６５００１。
【００４６】
【図３３】３Ｐ活性に対して提案されるメカニズム  ｔＲＮＡ分子（上図、左）、ピューロマイシン（上図、中）、および３Ｐ（上図、右）。ｔＲＮＡ、ピューロマイシン、および３Ｐの間の相違が灰色で描かれている。リボソームに対する３Ｐの作用について提案されるメカニズム（下図）は、３Ｐ（薄い灰色のフォーク）が、活性翻訳中のリボソームのＰＴＣ中心に近いアクセプタ部位（Ａ）に結合する。黒のフォークはｔＲＮＡ。灰色ドットはアミノ酸鎖。ＲＮＡが黒線。５'末端が黒ドット。６０Ｓおよび４０Ｓリボソームサブユニットが楕円。Ｅは出口部位。Ｐはペプチジル転移部位。Ａはアクセプタ部位。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
以下の説明においては、実施形態の完全な理解を提供すべく、多くの具体的な詳細が与えられる。これらの実施形態は、具体的な詳細の１または複数が無くても実施され得る。または、その他の方法、成分、材料などによって実施され得る。他の場合において、周知の構造、材料、または工程は、これらの実施形態の態様を曖昧にすることを回避すべく、示されていないか、または、詳細には説明されていない。
【００４８】
本明細書を通して「１つの実施形態」または「一実施形態」との参照は、その実施形態に関連して説明される特定の特徴、構造、または特性が、少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。従って、本明細書を通した様々な箇所における「１つの実施形態において」または「一実施形態において」というフレーズの出現は、必ずしも全てが同一の実施形態を指すものではない。さらに、特定の特徴、構造、または特性は、任意の適切なやり方で、１または複数の実施形態において組み合わされてよい。
【００４９】
本明細書において提供される見出しは、単なる便宜上のものであって、実施形態の範囲または意味を解釈するものではない。
【００５０】
本記載において、活性ポリリボソームおよびリボソームの単離のための新たなピューロマイシン含有分子が開示される。この新たなピューロマイシン含有分子は、（ｉ）細胞溶解物からのポリリボソームに関連したリボソーム、タンパク質、およびＲＮＡの精製、および（ｉｉ）リボソームプロファイリング研究を可能にする。我々はこの技術を「ＲｉｂｏＬａｃｅ」と呼んだ。精製後、ポリリボソームに関連するＲＮＡおよび単離されたタンパク質の検出が、標準的な（免疫ブロット法またはＲＴ−ｑＰＣＲ）または「オミクス」技術（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳまたはＲＮＡ−ｓｅｑ）によって実行され得る。ＲｉｂｏＬａｃｅは、より高速（〜２時間）であり、３０倍−２０倍少ない材料を必要とし、標準的な手法よりも安価で、あらゆる細胞溶解物からのトランスレートームの定性的または定量的スナップショットを生成するために迅速に使用され得る。
【００５１】
ショ糖密度勾配分画を除くと、生体サンプルからのポリリボソームの多用途な単離に対して一般に使用されている他の技術は、現在のところ無い。より重要なこととして、抗体を使用せずに活性翻訳中の天然ポリリボソームを選択的に捕捉することのできる技術は無い。
【００５２】
本記載は、活性翻訳下にある天然ポリリボソームおよびリボソームの抗体フリーおよびタグフリーな単離の第１の例である。新たなピューロマイシン含有分子の使用が、従来の「オミクス」解析に対する準備となる。これは、従来のショ糖密度勾配精製を置き換え、研究および診断の両者における新たな用途を切り開く。従って、本記載において証明される結果は、実用的な示唆、並びに基本的な示唆を有する。
【００５３】
一実施形態によると、本記載は、一般式（Ｉ）の分子およびそれらのエナンチオマーに関する。
【化Ｉ】
0006687282.tif 000004
式中、
Ａは、レセプタ−リガンド系のレセプタまたはリガンドから選択され、
Ｘは、酸素原子（Ｏ）または炭素原子（Ｃ）から選択され、
ｙは０から１０までの整数であり、
Ｌは一般式（ＶＩ）の分子であり、
【化ＶＩ】
0006687282.tif 000005
Ｚは２から１０の範囲に含まれる整数である。
【００５４】
残基Ｌの末端基ＮＨおよびＮＨ−Ｃ（Ｏ）は、式（Ｉａ）に示されるように、式（Ｉ）のＣ（Ｏ）基およびＮＨ基とそれぞれ結合される。
【化Ｉａ】
0006687282.tif 000006
【００５５】
一実施形態によると、「Ａ」は、固相を結合させることの可能な反応基であり（共有結合または非共有結合によるものであり、レセプタ−リガンド系のリガンドまたはレセプタから選択される）、分子の十分な密度を固相に提供して、活性リボソームの結合を効果的に可能とする。
【００５６】
好ましい実施形態によると、このリガンド−レセプタ系は、ビオチン−アビジン、ビオチン−ストレプトアビジン、ビオチン−ニュートラアビジン（neutravidin）、アルキン残基−アジド残基から選択される。
【００５７】
さらなる好ましい実施形態において、「Ａ」は以下の基から選択される。
【化ＩＩ】
0006687282.tif 000007
【化ＩＩＩ】
0006687282.tif 000008
【化ＩＶ】
0006687282.tif 000009
【化Ｖ】
0006687282.tif 000010
ここで、式（ＩＩ）はビオチン（ＩＩ）を含む分子を表し、式（ＩＩＩ）および（ＩＶ）はアルキン残基を表し、式（Ｖ）はアジド残基（Ｖ）を表す。
【００５８】
好ましい実施形態において、「Ｌ」は、図１に示されるように、カルボニル基（ＣＯ）を伴って繰り返される２つの２，２'−エチレンジオキシ−ビス−エチルアミンユニット（ジェフアミン（ｊｅｆｆａｍｉｎｅ）、詳細は「材料および方法」を参照のこと）から成る。
【００５９】
ピューロマイシン分子（化学式（Ｉ）の右手側にある）は、リボソームにおいて活性な部分である。ピューロマイシンおよびその誘導体は、タンパク質合成を阻害し、その１級アミノ基によるｔＲＮＡのアミノアシル化に続いてリボソームを分解し４６，４７、新生ピューロマイシン化されたペプチドをリボソームから放出すること４８が知られている。本明細書において、我々は、「材料および方法」において説明されるように、結合剤カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）を使用することによって、Ｎ−ＢＯＣ保護されたジェフアミンを結合するピューロマイシンのα−アミノ基を化学的に保護する。
【００６０】
好ましい実施形態によると、式（Ｉ）の分子を含むピューロマイシン（３Ｐ分子と名付ける）が、一般式（Ｉ）から生成された。ここで、図１に示されるように、「Ａ」はビオチン残基において特定され、「ｙ」は０に等しく、ｎは２に等しい。完全な合成の概略図は、図７に報告されている。
【００６１】
本記載は、式（Ｉ）の新たなピューロマイシン含有分子を、高い結合能力を有する固相と一体化する手順を開示し、この手順を、活性タンパク質合成に関与するポリリボソームの濃縮の解析に対して許容できる信号対ノイズ比へと最適化する。
【００６２】
式（Ｉ）の新たなピューロマイシン含有分子は、適切に官能化された固相（すなわち、残基「Ａ」のレセプタ−リガンド系のレセプタまたはリガンドのうちの他方によってコーティングされている）を結合させる。これは、溶液中で遊離した場合、無細胞系における翻訳を阻害する。これは、翻訳を受けている転写産物を特異的に捕捉し、複雑な生体サンプル（すなわち、細胞溶解物）において使用され得る。その点に関しては、どんな１つの理論にも束縛されることは望まないが、発明者達は、式（Ｉ）の分子がリボソームにおけるピューロマイシンの結合部位、ほぼ確実にＡ部位、に可逆的に結合する（図３３）ということをこの結果が示唆していると信じる理由を有する。
【００６３】
全体的に見て、式（Ｉ）の新たなピューロマイシン含有分子の使用は、少なくとも３つの重要な利点を組み合わせる。（ｉ）必要なサンプルの量が小さい（Ａ２６０＜４５ａ．ｕ．、１００ｍｍΦペトリ皿において８０％コンフルエンスＭＣＦ７細胞からの３００μＬの全細胞溶解物の〜１／３０、すなわち、０．７５−１．５  １０５細胞を意味する）、（ｉｉ）簡単、迅速（〜２時間）、および安価（１サンプル当たり〜５ユーロ）な手順、並びに、（ｉｉｉ）「究極の基準」方法に対し、タンパク質レベルを画定することにおけるより高い精度。
【００６４】
最後に、我々は、ポリソームプロファイリングに対してのみでなく、リボソームプロファイリング研究に対してもまたこれが使用され得ることを示し、この技術の柔軟性を立証する。
【００６５】
本記載の別の実施形態は、本明細書に開示される式（Ｉ）の新たな分子を含む、ポリリボソーム単離／精製および／またはリボソームプロファイリングのためのキットもまた包含する。
【００６６】
一実施形態によると、このキットは以下を含む。
（ｉ）一般式（Ｉ）を有する分子を１または複数含む第１試薬。好ましい実施形態において、この分子は乾燥した固体状態である。バイアルを含む第１試薬への水性サンプルの添加は、乾燥した試薬の可溶化をもたらし、これを生体物質と相互作用させる。
（ｉｉ）式（Ｉ）の活性分子の機能的結合に適しており、その結果、任意の生体サンプルの溶液からポリリボソームを分離するのに適した固相。この固相はレセプタ−リガンド系のレセプタまたはリガンドのうちの他方によって官能化されているので、その結合能力によってこの固相は特徴付けられる。好ましくは、この固相は、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、アビジン、アジド残基、アルキン残基のうちの１つによって官能化される。
【００６７】
式（Ｉ）の活性分子に向けたこの固相の結合能力は、１０ｐｍｏｌ／μｇよりも高くなくてはならず、優先的には２００ｐｍｏｌ／μｇよりも高くなくてはならない。（固相に結合された）第１試薬を生体サンプルと混合した場合、後者は、（２６０ｎｍでの吸光度単位で測定して）０．００２ａ．ｕ．／μＬから２ａ．ｕ．／μＬまで濃縮されてよい。測定波長は、２３０から３００ｎｍの範囲から、好ましくは２４０から２９０ｎｍの範囲で適切に選択され得る。測定は、好ましくは、光の吸光度の強度を測定することの可能な光学的装置によって実行される。
【００６８】
第１試薬による生体サンプルのインキュベーション時間は、１０分から２４時間まで、優先的には２０分から１．５時間の間であってよい。
【００６９】
さらなる実施形態においてこのキットは、以下のうちの少なくとも１つを含んでよい。
（ｉｉｉ）活性分子を可溶化させて、固体表面での適切な結合を可能にするために使用され得る可溶化溶液。この溶液は、以下の組成物を有してよい。２ＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのトリスＨＣｌ、ＤＥＰＣ水中にてｐＨ７．５。エタノール有りまたは無し（エタノール／水  １：１）。銅（ＩＩ）有りまたは無し。アスコルビン酸ナトリウム有りまたは無し。銅のリガンド有りまたは無し（好ましくは、トリス（３−ヒドロキシプロピルトリアゾリルメチル）アミン、＃７６２３４２、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈのようなトリアゾリルメチルアミン誘導分子）。
（ｉｖ）官能化された固体表面によるポリリボソームの最適化されたインキュベーションのために使用され得るインキュベーション溶液。この溶液は、以下の組成物を有してよい。１０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、２０μｇ／ｍｌのシクロヘキシミド、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ＤＥＰＣ水中にてｐＨ７。インキュベーション時間は、約１０分から２４時間、優先的には２０分から１時間の間であってよい。インキュベーション温度は、１から２５℃の間、優先的には１から７℃の間であってよい。
（Ｖ）非特異的に結合された分子を洗い流すために使用され得る洗浄溶液。この試薬は、ｉｖ試薬の組成と同一のものを有してよい。洗浄剤有りまたは無し（好ましくは、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｒｉｔｏｎ  ｘ−１００、および４−ノニルフェニル−ポリエチレングリコールから選択され、濃度は０．００１％から５％、優先的には０．０１％から１％の間）。
（ｖｉ）もし、固相が無ＲＮアーゼではない場合、このキットは、活性分子による官能化の前または後に使用されるべき、固体表面からＲＮアーゼを除去するためのＲＮアーゼ除去溶液および再懸濁溶液をさらに含んでよい。ＲＮアーゼ除去溶液（Ａ）および再懸濁溶液（Ｂ）は、以下の組成物を有してよい。（Ａ）０．０５ＭのＮａＣｌ、０．０５−１ＭのＮａＯＨ、ＤＥＰＣ処理水中、好ましくは、ＮａＯＨの濃度は０．０５Ｍから０．２Ｍの間、より好ましくは約０．１Ｍ。および、（Ｂ）０．０５−１ＭのＮａＣｌ、ＤＥＰＣ処理水中、好ましくは、ＮａＣｌの濃度は０．０５から０．２Ｍの間、より好ましくは約０．１Ｍ。
（ｖｉｉ）このキットは、サンプルを調製するための機器、計時手段、および、サンプルを希釈／再懸濁するための緩衝液をさらに含んでよい。
（ｖｉｉｉ）このキットは陰性対照をさらに含んでよい。この陰性対照に対して、活性分子（一般式Ｉ）によって得られた結果が比較されてよい。陰性対照は、
（１）一般式（ＶＩＩ）を有する分子、
【化ＶＩＩ】
0006687282.tif 000011
または、
（２）ｎ＝１８−２５の一般式（ＶＩＩＩ）を有する分子、または、一般式（Ｉ）の分子と等しい分子量（±５００ダルトン）を有する分子、
【化ＶＩＩＩ】
0006687282.tif 000012
であり得る。ここで、式（ＶＩＩ）または（ＶＩＩＩ）の分子は、固相上にコーティングされる。どちらの場合においても、「Ａ」は、一般式（Ｉ）におけるものと同一の意味を有する。
（ｉｘ）このキットを容易に使用するための詳細な使用説明書。
【００７０】
本記載に開示されるこのキットは、第１試薬を可溶化溶液および固相と混合して利用され得る。第１試薬がひとたび固相に結合されると、インキュベーション溶液中に生体サンプルの適切な希釈液が調製され、第１試薬に結合された固相と混合され得る。インキュベーション後、この固相は溶液から分離され、洗浄溶液によって洗浄され、単離された活性ポリリボソームがＲＮＡおよび／またはタンパク質の抽出によって解析され得る。
【００７１】
このキットは、様々な方法で使用され得る。
１）ポリリボソーム関連分子（すなわち、ＲＮＡおよびタンパク質）に関する機能的研究のための活性ポリリボソームの単離のための方法。
２）刺激に応答してその翻訳が変調されるｍＲＮＡの特定のための方法。
３）リボソームプロファイリング研究のための方法。遺伝子発現翻訳調節を研究するために使用される方法。
【００７２】
全ての方法おいて（「結果」のセクションで広範囲に説明される）、濃縮解析を実行すべく内部陰性対照が含まれてよい。
【００７３】
第１の方法は、（ａ）細胞の個体群の溶解物を、固相に適切に結合された第１試薬と接触させること、（ｂ）活性翻訳中のリボソームに試薬が選択的に結合するのを可能にすること、（ｃ）試薬へ結合されたポリリボソーム並びに関連するＲＮＡおよびタンパク質を単離すること、（ｄ）選択された標的に関する機能的な研究のためにＲＮＡまたはタンパク質を単離すること、を含む。
【００７４】
第２の方法は、次の段階を含む。（ａ）細胞の個体群の溶解物を、固相に適切に結合された第１試薬と接触させること、（ｂ）活性翻訳中のリボソームに試薬が選択的に結合するのを可能にすること、（ｃ）試薬へ結合されたポリリボソーム並びに関連するＲＮＡおよびタンパク質を単離すること、（ｄ）単離された材料中のｍＲＮＡを同定し、量を決定すること（例えば、ＲＮＡ−ｓｅｑ解析によって）、（ｅ）生体対照サンプル中のｍＲＮＡを同定し、量を決定すること、および、（ｆ）'（ｄ）'のｍＲＮＡの量を'（ｅ）'のｍＲＮＡの量と比較し、これにより、刺激に応答してその翻訳発現が変調されたｍＲＮＡを特定すること。
【００７５】
代替的な実施形態においては、細胞溶解物によって第１試薬をインキュベートし、溶解物中に含まれる活性リボソームに対して第１試薬を結合させた後にのみ、この溶解物が固相に対して加えられる。
【００７６】
第３の方法は、次の段階を含む。（ａ）固相に適切に結合された第１試薬の調製、（ｂ）（ＲＮアーゼＩによって予め消化され、その後ＲＮアーゼ阻害剤によって処理された）細胞の個体群の溶解物を、固相に結合された第１試薬と接触させること、（ｃ）活性リボソームに第１試薬が選択的に結合するのを可能にすること、（ｄ）第１試薬へ結合されたリボソームおよび関連するｍＲＮＡフラグメントを単離すること、（ｅ）リボソームＲＮＡを枯渇させ、ｍＲＮＡフラグメントを単離すること、（ｆ）変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルから抽出後のフラグメントの精製、（ｇ）それぞれの遺伝子の翻訳レベル、並びに、ｍＲＮＡに沿ったリボソームの位置を明らかにすべく、ゲノムに戻ってフラグメントを配列決定およびマッピングすること。
【００７７】
一実施形態によると、固相は、アガロースビーズ、アガロース−アクリルアミドビーズ、セルロースビーズ、酸化鉄ビーズ、グラフェンビーズ、シリカまたはシリカ混合物ビーズ、ポリスチレンビーズ、ポリカーボネートビーズ、ポリプロピレンビーズ、および／または、それらの組み合わせから選択され得る。
【００７８】
好ましい実施形態によると、固相は、マイクロウェル中に組み込まれ得る。
【００７９】
好ましい実施形態によると、固相は、マイクロビーズの形態である。
【００８０】
本明細書において、生体サンプルの例は、インビトロ無細胞溶解物、または、細菌、古細菌、もしくはヒト細胞を含む真核細胞からの任意の溶解物を含む。全ての方法が異所タンパク質の発現を必要とするものではない。故に、遺伝子発現の機能的組織をマッピングするための新たな手法を可能にさせる。説明された試薬、方法、およびキットは、以下の非限定的な例を参照して、さらに理解されるだろう。
【００８１】
結果
【００８２】
３Ｐ分子の合成
【００８３】
（ｉ）細菌性リボソームとの共結晶構造におけるペプチジルトランスフェラーゼ中心を特徴付けるため３１，３６，４９、（ｉｉ）新たに合成されたペプチドを捕捉するため２１，４４、または、（ｉｉｉ）細胞中のタンパク質合成を検出するために５０、ピューロマイシン類似体が広範囲に使用されてきた。
【００８４】
本明細書において、我々は、一般式（Ｉ）で示される化学構造を有する新たな分子（本明細書では、３Ｐと呼ばれる）を設計した。この構造において「Ａ」はビオチン化学基であり、ストレプトアビジン官能化された固相に結合することができる。「ｙ」は０に等しい。「Ｌ」部分は、２つの２，２'−エチレンジオキシ−ビス−エチルアミンユニット（本明細書においては、ジェフアミンユニットと呼ばれる）によって表される。ピューロマイシンはリボソームを結合する部分である（図１）。
【００８５】
（Ｐ部位の）ペプチジル−ｔＲＮＡのエステル基に対するピューロマイシンの１級アミノ基による求核攻撃を阻止すべく、ピューロマイシンのαアミノ基が、結合剤カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）を使用することによって、Ｎ−ＢＯＣ保護されたジェフアミンの一方の側に共有結合された。他方の側では、（そのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル誘導体として活性化された）ビオチンが、同一のジェフアミンユニットによってカルボキシル末端基においてアミド化された。ビオチン部分とピューロマイシン部分との間に組み込まれた２つのジェフアミンユニットの結合は、標的の生成物３Ｐを、９０％よりも高い純度で提供した（図２）。図３、図４、図５、および図６に説明されるように、１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）、１３Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ）、ＥＳＩ−ＭＳおよびイオントラップ質量分析器が分子式と一致している（ｍ／ｚ  １０４６．５における［Ｍ＋Ｈ］＋、λｍａｘ２７２ｎｍ）。完全な合成の概略図が図７に報告される（合成の詳細については「材料および方法」を参照のこと）。生成物３Ｐは、さらなるバイオアッセイの全てにおいてそのまま使用された。
【００８６】
３Ｐ分子：結合、活性、およびユーザのための手順。
【００８７】
固体表面にコーティングされたストレプトアビジンでの結合
３Ｐ分子のビオチン化された部分の活性を検証すべく、ストレプトアビジンコーティングされた磁気ビーズ上でのその結合活性を我々は試験した。増加する量のストレプトアビジンコーティングされた磁気ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＃６５００１）が、２ＭのＮａＣｌ中の１ｍＭの３Ｐ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのトリスＨＣｌ、ＤＥＰＣ水中にてｐＨ７．５を含む溶液５０μＬ中にて懸濁される。３Ｐは、２７２ｎｍに特異的な吸光度を持つ特徴的なピューロマイシンのＵＶ−ＶＩＳスペクトルを有するので、我々は、それを表面と結合させた後、溶液から３Ｐを引いたものをモニタリングすることによってその結合活性を評価した（図８）（詳細な手順については「材料および方法」を参照のこと）。我々は、３Ｐに対して結合能力を〜２５０ｐｍｏｌ／μｇと画定した。１ｍＭの溶液が、〜２００μｇのビーズを飽和させることができる。この結果は、ビオチン官能基の機能的活性を立証し、また、全てのさらなる実験におけるビーズ官能化に対する作用条件として、５より大きな３Ｐ／ビーズ比（３Ｐはｍｏｌ×ｌ−１、ビーズはｇ）を画定することを可能とした。
【００８８】
ポリリボソームに向けた３Ｐのインビトロ活性およびそれらの充填された転写産物
細菌性リボソームにおけるピューロマイシン誘導体の結合は十分に説明されているのに対し４９、今日まで、真核細胞リボソームとの複合物におけるピューロマイシン結合に関する構造的なデータは入手可能ではない。新たに合成された３Ｐ分子は、タンパク質合成の阻害剤によって官能化されているので、我々は、翻訳に対する３Ｐの阻害効果を試験した。特に、蛍ルシフェラーゼ遺伝子（Ｐｒｏｍｅｇａ  ＃Ｌ４７４１）を使用して、インビトロ無細胞翻訳系（以下、「ＩＶＴＴ  ｅｕｋ−ｍｉｘ」と呼ぶ：ＴＮＴ  Ｑｕｉｃｋ  ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ／Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｐｒｏｍｅｇａ  ＃Ｌ２８８１）に対する３Ｐの効果を我々は試験した。我々は、３Ｐの競合活性をピューロマイシンの阻害効果と比較した。９０分間のインキュベーション後、我々は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび発光アッセイによってタンパク質生成をモニタリングした（図９）。ピューロマイシン滴定すると、３Ｐが１μＭの濃度から始まって翻訳を著しく阻害できる間に、タンパク質合成の指数関数的減衰を我々は観測した（図９、図１０）。
【００８９】
原核インビトロ系および別のタンパク質、すなわち緑色蛍光タンパク質に対する３Ｐの効果を評価すべく、（図１０のｂ）前述のＩＶＴＴ  ｅｕｋ−ｍｉｘ中および原核のもの（以下、「ＩＶＴＴ  ｐｒｏ−ｍｉｘ」と呼ぶ：Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｔ７  Ｓ３０  Ｅｘｔｒａｃｔ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  Ｃｉｒｃｕｌａｒ  ＤＮＡ、Ｐｒｏｍｅｇａ、＃Ｌ１１３０）中で、ＥＧＦＰ（高感度緑色蛍光タンパク質）を我々は発現させた。このＥＧＦＰ遺伝子は、商用のベクター（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ（＋）、ＧｅｎｅＳｃｒｉｐｔ）へとクローン化され、原核発現および真核発現の両者に対して過去に使用された５１，５２。我々は、ＥＧＦＰ発現に対する、溶液中の遊離した３Ｐ−アルキンバリアント（３ＰＰ）の効果もまた試験した。３ＰＰにおいて、ビオチン部分はアルキン部分によって置換される（スキームＶを参照のこと）。
【００９０】
我々は、原核系および真核系の両者において、タンパク質合成の明らかな低下を観測した。そして、３Ｐ−アルキンバリアントの阻害効果は、３Ｐ分子に対して観測されたものと一致している（図１０のｂ）。
【００９１】
我々は、真核無細胞系および原核無細胞系の両者において、３Ｐが翻訳を妨げることができると結論付けた。
【００９２】
もし３Ｐが、ピューロマイシンと同様なやり方でＡ部位において相互作用する場合（但し、新生ポリペプチド鎖への共有結合性の結合は無い）、粗製無細胞抽出物から活性リボソームを探し出すために３Ｐを使用することを我々は提案する。これを証明するため、我々はまず、上記にて説明されたように、ストレプトアビジンでコーティングされたビーズ（１５０μｇ）を３Ｐで官能化し、立体的にアクセスできない結合部位を、市販のビオチン−メトキシポリエチレングリコールコンジュゲート（Ｃｒｅａｔｉｖｅ  Ｐｅｇｗｏｒｋｓ  ＃ＰＬＳ−２０５６、本明細書ではｍＰと呼ぶ、１１００Ｄａ、１ｍＭ作用濃度）によってエンドキャップした。非特異的結合に対する対照（陰性対照）として、我々は、ビーズの第２のバッチ（１５０μｇ）をｍＰのみによって官能化した（詳細な手順については「材料および方法」を参照のこと）。我々は、翻訳しているリボソームを、網赤血球溶解物（ＩＶＴＴ  ｅｕｋ−ｍｉｘ）を含むインビトロ無細胞転写／翻訳混合物から探し出すため、３Ｐ官能化ビーズおよびｍＰ官能化ビーズ（それぞれ、３ＰビーズおよびｍＰビーズと呼ぶ）を使用した。我々は、以下のように構成される６段階の手順を最適化した（図１１および図１２）。
（１）結合された転写／翻訳キット（Ｐｒｏｍｅｇａ  ＃Ｌ２８８１）を使用してＬＵＣ  ＳＰ６対照ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ、＃Ｌ４７４１）に挿入された蛍ルシフェラーゼ（Ｇ、図１２）に対する遺伝子エンコーディングの発現（４０分、３０℃にて）。
（２）延長の間にリボソームを失速させるためのシクロヘキシミド（ＣＨＸ、１０μｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ  ＃０１８１０）の添加（ＣＨＸは、翻訳の複数のパラメータを研究するのに広範囲にわたって使用されている２０，５３）。
（３）３ＰおよびｍＰによる磁気ビーズの官能化、および、４℃における１時間のインキュベーションを伴う混合物への３ＰビーズおよびｍＰビーズの添加。
（４）未結合フラクションのビーズからの分離。
（５）ＲＮＡの抽出、ＤＮアーゼＩ処理およびｃＤＮＡ合成。
（６）濃縮に基づいたＲＴ−ｑＰＣＲ解析（信号対ノイズ比、すなわち、３Ｐ−ΔΔｃｔとｍＰ−ΔΔｃｔとの間の比、ハウスキーピング遺伝子は１８Ｓ）。
【００９３】
我々のデータは、対照（ｍＰビーズ、図１２のｂ）に対して、３Ｐビーズにおいてルシフェラーゼ転写産物（Ｇ）の〜２倍の濃縮を示した。この結果は、翻訳を受けている転写産物を捕捉するために３Ｐが使用され得ることを立証する。そして、このデータは、ＲＮＡ結合タンパク質に対する特異的抗体によるｍＲＮＡ免疫沈降について観測された、報告されているＲＴ−ｑＰＣＲ倍率変化５４，５５と一致する。
【００９４】
トランスレートームを単離するための３Ｐビーズの効率をさらに調査するため、我々は、反応混合物に対して２つの異なる薬剤であるハリントニン（「Ｇ−Ｈ」と呼ぶ）またはピューロマイシン（「Ｇ＋Ｐ」と呼ぶ）を添加して、同じ実験を実行した。第１の薬剤は、翻訳開始の有効な阻害剤である５６。これに対して第２の薬剤は、リボソームを分解し、溶液中で３Ｐの直接的な競合物である。追加の対照として、我々は、空ベクター（ｐＧＥＭＥＸ−１、Ｐｒｏｍｅｇａ  ＃Ｐ２２１１）から生成された非翻訳転写産物（Ｒ、図１２）が存在する中で、並びに、ルシフェラーゼ遺伝子の同じプロモーター（ＳＰ６プロモーター）の対照のもとで、実験を実行した。Ｒは、リボソーム結合部位および終止コドンを有していない。我々は、ビオチン化されたリジンの組み込みに基づいて、Ｇは転写されるのに対し、Ｒは転写されないことを確認した（図１３のａ）。我々は、「Ｒ」および非処理サンプルに対し、「Ｇ」による３ＰビーズＲＮＡの濃縮、および、ｍＰビーズに対して３Ｐビーズにおけるより大きなＲＮＡの絶対量を観測した（図１３のｂおよび図１４）。ＲＴ−ｑＰＣＲ濃縮解析（信号対ノイズ比３Ｐ／ｍＰ倍率変化、すなわち、３Ｐ−ΔΔｃｔとｍＰ−ΔΔｃｔとの間の比、１８Ｓがハウスキーピング遺伝子、転写産物の全量に対して正規化されている）は、非処理サンプルに関し、サンプルに対するルシフェラーゼ転写産物の著しい濃縮が無いことを立証するものである（図１２）。「Ｇ＋Ｈ」（Ｌｏｇ２＝−０．６８±０．８１）、「Ｇ＋Ｐ」（Ｌｏｇ２＝−０．３２±０．３５）、および「Ｒ」（Ｌｏｇ２＝０．００±０．３９）。
【００９５】
この結果は、ルシフェラーゼ転写産物において、翻訳が行われる場合にのみ、３Ｐビーズが選択的に濃縮され得ることを裏付けるものである。信頼性のある結果のためには、信号対ノイズ比が解析に含まれなくてはならないことは注目に値する。
【００９６】
さらなる実験において、様々な動力学でインビトロ発現されたタンパク質に対する３Ｐの効果を評価するために、我々は、２つの異なるベクターであるｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ＋ベクターおよびｐＰＲ−ＩＢＡ２ベクターへとこの遺伝子をクローン化することにより、ＥＧＦＰを発現させた（図１５のａ）。
【００９７】
１時間のインキュベーションの後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＫＳ＋は、十分に検出可能なレベルのＥＧＦＰを発現させる（図１５のａ、右）。２５分後、ほんのわずかなレベルの全ＥＧＦＰが検出され得る（全タンパク質免疫沈降）のみである。これに対し、ｐＰＲ−ＩＢＡ２プラスミド中でクローン化された同じタンパク質は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ＋ベクター中へクローン化されたものに対し、推定で５００倍ものより大きな発現を有する（図１５のｂ）。結合された転写／翻訳反応の後、ハリントニンによって処理されていない３Ｐビーズおよび処理されている３Ｐビーズの両者におけるｅＧＦＰ  ＲＮＡの選択的な濃縮を我々はモニタリングした（ｈ＋、図１５のａおよび図１５のｂ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚからのハリントニン、＃ｓｃ−２０４０７７１）。ポリソームに関連するｍＲＮＡを精製し、この場合の非特異的結合を減少させるために、我々は、ポリスチレンビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）の代わりに、アガロース磁気ビーズ（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ｍａｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、＃２８−９８５７−３８）を使用した。
【００９８】
我々は、ＥＧＦＰ発現に対するハリントニンおよび３Ｐ（溶液中で遊離）の両者の阻害効果を確認した（図１５のａ）。転写の変化に起因するものではない、これら２つのサンプルの間のタンパク質レベルにおける相違を我々は観測した。実際のところ、全ｅＧＦＰ  ＲＮＡレベルは、ｈ＋（薬剤有り）およびｈ−（薬剤無し）の両者において等しく、ｐＰＲ−ＩＢＡ２ベクターからタンパク質が発現されるサンプルにおいて、より低い（図１５のｂ）。従って、タンパク質レベルの変化は、翻訳における異なる効率に基づいている。我々は、３Ｐビーズでの２５分のインキュベーション後のｅＧＦＰ  ＲＮＡの濃縮が、（ハリントニン処理されたサンプルと比較して）ＥＧＦＰが非常に多く発現されたサンプルにおいて、〜５倍高いことを観測した（図１５のｃ）。これは、タンパク質発現における変化と一貫した結果を立証している。その後、我々は、３Ｐビーズを使用してＲＮＡを単離して、ポリソームにおけるｍＲＮＡリクルートメントの時間的経過を検討した（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＫＳ＋プラスミドによるＩＶＴＴ  ｅｕｋ−ｍｉｘの８、２５、６０、１２０分および２４時間のインキュベーション）（図１５のｃ）。８分、２５分、および２４時間においては濃縮が観測されなかったのに対し、ＲＴ−ｑＰＣＲ解析は、６０分および１２０分後にｅＧＦＰ  ＲＮＡの濃縮を示した。この結果は、活性に翻訳されたＲＮＡを捕捉するための３Ｐの効率性を立証し、我々の技術の時間分解能を示唆する。２５分においては、混合物における転写産物の高いバックグラウンド（〜０．２μｇ／μＬ）に起因して、ＲＮＡ濃縮は観測されなかった。
【００９９】
全体として、インビトロで翻訳を受けている転写産物を伴うサンプルを選択的に濃縮するためにＲｉｂｏＬａｃｅ（新たな分子を含む、「手順および方法」）が使用され得ることを、我々は結論できる。
【０１００】
精製されたポリソームフラクションにおけるＲｉｂｏＬａｃｅ効率
【０１０１】
ＲＮＡ翻訳をより良好に調査すべく、我々は、乳癌細胞株から得られたポリソームプロファイルの各フラクションにおいて、全ｒＲＮＡに対して３Ｐビーズによって抽出された全ｒＲＮＡを定量化しようとした。
【０１０２】
ショ糖密度勾配中での沈降の後、指数関数的に成長するＭＣＦ７細胞溶解物を使用して、我々は、このプロファイルの各フラクションからの全ｒＲＮＡおよび３Ｐ−ｒＲＮＡ（３Ｐ官能化されたアガロースビーズから抽出されるｒＲＮＡ）の両者の濃縮を評価した。２つの異なる生体条件を我々は試験した。すなわち、非処理の細胞、および、２μｇ／ｍＬのハリントニンで２分間処理された細胞（ｈ＋）であり、両者ともに、続いてシクロヘキシミド（１０μｇ／ｍＬ、３分）によってインキュベーションした。生体対照のみを使用すること（すなわち、ｍＰビーズが無いこと）の利点は、より高速で、より安価且つより容易な手順であるという点にある。８０Ｓの倍率変化に対して正規化された相対存在量は、軽いポリリボソーム（フラクション８から１０まで）のレベルにおける濃縮を示す。これに対し、この効果は重いポリリボソームでは失われる（図１６）。
【０１０３】
これら２つの非処理のサンプルは、全体的な翻訳効率（ＴＥ）の相違を示す４５。これは、ほぼ確実に、細胞の代謝状態を反映している。どちらのサンプルにおいても、我々は、より軽いフラクションにおけるｒＲＮＡの一貫した濃縮、および、より高いＴＥを有するサンプルにおけるより顕著な効果を観測した。
【０１０４】
活性リボソームがプロファイルに沿ってどこに分散されているのかは、現在のところ知られていない。リボソームごとの翻訳活性は、ｍＲＮＡごとに結合されるリボソームの数とともに増加することを、いくつかの研究が報告している５７，５８。しかしこの研究結果は、幅広く再生されてきていない。
【０１０５】
我々のデータは、活性リボソームが、より軽いこれらのフラクションに集中しているであろうことを示唆する。
【０１０６】
ヒト細胞株の細胞溶解物からのポリリボソームでの活性
我々の研究結果に基づいて、我々は、この技術が、インビトロの翻訳系および精製されたポリソームフラクションよりも複雑な細胞質性の細胞溶解物から活性リボソームを捕捉するためにもまた作用し得るものと推測する。
【０１０７】
乳癌細胞株を使用することにより、我々は、まず、リボソームの構成成分であるタンパク質（すなわち、ＲＰＬ２６およびＲＰＳ６）、または、ポリリボソームに関連するものであると知られている翻訳開始因子（すなわち、ｅＩＦ４ＢおよびｅＩＦ４Ａ１）が、ｍＰビーズに対して３Ｐビーズにおいて実際に濃縮されているかどうかをチェックした。この理由から、我々は、以下のように手順を最適化した（図１７）。
（１）ビーズ（２００μｇ）が３Ｐ（３Ｐビーズ）およびｍＰ（ｍＰビーズ）によって官能化された。
（２）３ＰビーズおよびｍＰビーズが細胞溶解物（Ａ２６０＝０．３−１．７ａ．ｕ．／μＬ）に直接加えられ、懸濁液を４℃において１時間インキュベートした。
（３）その後ビーズは、磁気分離によってプルダウンされ、１０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、２０μｇ／ｍＬのシクロヘキシミド（ＣＨＸ）、ＤＥＰＣ水中にてｐＨ７によって、（磁石からそれらを分離させることなく）２回洗浄された。
（４）タンパク質および／またはＲＮＡが検出用に抽出された（詳細な手順は「材料および方法」を参照のこと）。
【０１０８】
我々は、対照ビーズに対して、ＲＰＬ２６については〜８倍、ＲＰＳ６については〜４倍という著しい濃縮を観測した（図１８）。翻訳開始の間にＲＮＡの二次構造をほどくことに関与する因子もまた、３Ｐビーズサンプルにおいて濃縮される（図１８のａ）。これに対し、リボソーム活性に関与しないタンパク質（すなわち、アクチンＢおよびＧＡＰＤＨ）は、ビーズ（３ＰビーズおよびｍＰビーズの両者、図１９）には存在しない。我々は、２つの異なる細胞株を試験し、乳癌細胞（ＭＣＦ７、ＡＴＣＣ、＃ＨＴＢ−２２）からの溶解物および運動ニューロン様細胞（ＮＳＣ−３４、ＣＥＤＡＬＡＮＥ  ＃ＣＬＵ１４０、図１８）からの溶解物の両者における濃縮を確認した。興味深いことに、１０ｍＭのＮａＣｌから５００ｍＭのＮａＣｌへのイオン強度の増加は、最後には精製活性の損失へと導く（図１８のａ）。異なる生体条件（ＭＣＦ７に対するＥＧＦ処理および血清飢餓）の細胞からの細胞溶解物の解析がこの結果を裏付ける（図１８のｂ）。これは、リボソームサブユニットの解離によって引き起こされるのだろう。最後に我々は、ｍＰビーズに対する３ＰビーズでのＲＰＬ２６およびＲＰＳ６の両者の著しい濃縮を観測した（図１８のｂ）。しかし我々は、２つのタンパク質の間に著しい相違は観測しなかった（図１８のｂ）。これは、３Ｐが、４０Ｓ（ＲＰＳ６はその成分）に結合された６０Ｓサブユニット（ＲＰＬ２６はその成分）を効率的に捕捉できることを示唆している。
【０１０９】
我々の分子の活性についてさらに特性を明らかにするため、我々は、２つの主なリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ  １８ＳおよびｒＲＮＡ  ２８Ｓ）に我々の解析を集中させた。３Ｐビーズが１８Ｓおよび２８Ｓ  ｒＲＮＡの両者において濃縮される。３Ｐは、ｍＰに対して、〜２倍多くのｒＲＮＡを捕捉することができる（図２０のａ）。この結果は、上記にて説明された我々のインビトロ実験と一致する。さらに、この手順は、回収されたＲＮＡの良好な品質を保証する（Ｒｎａインテグリティ・ナンバー（Ｒｎａ  Ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ  Ｎｕｍｂｅｒ）、ＲＩＮ≧８、図２０のｂ）。全体として、我々は、ＲｉｂｏＬａｃｅがポリリボソーム関連タンパク質およびＲＮＡを結合させることにおいて定量的に効率的であると結論する。
【０１１０】
生体対照のみによる細胞溶解物におけるＲｉｂｏＬａｃｅ
対照ビーズが必要であるかどうかを試験するために、我々は、以前に使用され、図１７において説明された手順を適用したが、対照ビーズは無しとした。我々は、指数関数的成長中のＭＣＦ７細胞株からの細胞溶解物（ｈ−／ＦＢＳ＋と呼ぶ）、１８時間にわたる血清飢餓（０．５％  ＦＢＳ）下にあるもの（ＦＢＳ−と呼ぶ）、または、２分間ハリントニン（２μｇ／ｍＬ）で処理されたもの（ｈ＋）まで、我々の解析を拡張した。
【０１１１】
ＦＢＳ−に対し、ＦＢＳ＋において、３ＰビーズにおけるｒＲＮＡの〜３倍の濃縮を我々は観測した。ｈ＋サンプル（図２１）は、対照（ｈ−）に対して、〜２０％多くのｒＲＮＡを示す。
【０１１２】
観測された小さな相違（精製されたショ糖フラクションにおける我々の結果に対して）は、ほぼ確実に、（ｉ）溶解物のより高い化学的複雑さ、（ｉｉ）溶解物から検出された翻訳信号の平均、（ｉｉｉ）溶解物中の、３Ｐ結合を阻止することのできる界面活性剤の存在、（ｉｖ）より良好なデータ解析のための対照ビーズが無いこと、に起因する。
【０１１３】
この実験は、翻訳が低下されないサンプルにおいてのみＲＮＡを選択するための３Ｐの活性を裏付け、より良好な結果を得るために対照ビーズの使用が好ましいことを裏付ける。
【０１１４】
ＮＧＳ解析：「究極の基準」とＲｉｂｏＬａｃｅ技術との間の比較
ＲｉｂｏＬａｃｅによって捕捉されるＲＮＡの品質および量に関するより多くの見識を得るため、および、活性翻訳に関与するリボソーム（すなわち、活性ポリリボソーム）を捕捉する能力を体系的にモニタリングするため、我々は、我々の技術を、ＲＮＡ配列決定（ＲＮＡ−ｓｅｑ）解析による標準的なショ糖密度勾配分画と比較した。我々は、３つの異なる生体条件にて実験を実行した（図２２）。
（１，Ｎ）１０％のＦＢＳ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＃１０２７０−０９８）、２ｍＭのＬ−グルタミン（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＃２５０３０−１４９）、１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌのペニシリン、および１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＃１５１４０−１２２）が補給された、レッドフェノール（Ｌｏｎｚａ  ＃ＢＥ１２−６１４Ｆ）を有するＤＭＥＭ中で指数関数的成長中の細胞。
（２，Ｅ）１２時間の血清飢餓（０．５％のＦＢＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌのペニシリン、および１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンが補給されたＤＭＥＭ−レッドフェノール）後に、４時間にわたって上皮成長因子刺激（ＥＧＦ、１μｇ／μＬ、ＲＤ系  ＃２３６Ｅ４）下におかれた細胞。
（３，Ｓ）１２時間にわたって血清飢餓にある細胞。
【０１１５】
ＥＧＦは、そのレセプタ（ＥＧＦＲ）へ結合することによる細胞成長、増殖、および分化の調節において重要な機能を有し、その効果が転写レベルおよび転写後レベルの両者において検討されてきた１６。ｍＲＮＡ上に延長するリボソームを捕捉するため、溶解前に、細胞は５分間にわたってＣＨＸ（１０μｇ／ｍＬ）で処理された。その後、３Ｐ官能化されたビーズ（「Ｂ」と呼ぶ）を使用して、ｍＰ対照ビーズ（「Ｍ」と呼ぶ）を使用して、および、標準的なショ糖密度勾配分画方法によって（「Ｐ」と呼ぶ）、ポリリボソームが抽出された。全細胞質性ＲＮＡ（「Ｔ」と呼ぶ）もまた、このプロファイルの全てのフラクションの集まりから抽出された（図２２）。１μｇの高品質ＲＮＡ（ＲＩＮ≧８）から始まって、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ  ２０００プラットフォームを使用して、ポリ−Ａ濃縮ＲＮＡ（すなわち、ｍＲＮＡ）の配列決定から結果が得られる（詳細な手順は「材料および方法」を参照のこと）。ＲＮＡ−ｓｅｑは、ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｐｅｒ  ｋｉｌｏｂａｓｅ  ｏｆ  ｅｘｏｎ  ｐｅｒ  ｍｉｌｌｉｏｎ  ｍａｐｐｅｄ  ｒｅａｄｓ（ＦＰＫＭ）５９で測定された、遺伝子の発現レベルの定量的測定を可能にする。非特異的結合について正規化するため、すなわち、バックグラウンドの影響を考慮するため、我々は、まず、ＥＧＦ処理すると特異的に発現した遺伝子（ＤＥＧ）を画定した。その後我々は、３Ｐ−ＦＰＫＭの数がｍＰ−ＦＰＫＭ数よりも高かった転写産物を解析した。我々は、ショ糖密度勾配から単離されたポリソーム転写産物（ＥＰ）のＦＰＫＭと３Ｐビーズから単離された転写産物（ＥＢ）のＦＰＫＭとの間に正の相関を観測した（スピアマンの相関＝０．７１）。この相関は、全ＦＰＫＭ（ＥＴ）と３Ｐ−ＦＰＫＭとの間ではより低い（ＥＧＦ処理された細胞および血清飢餓細胞の両者に対してスピアマンの相関＝０．６６）。ショ糖密度勾配ポリリボソーム−ＦＰＫＭ（ＥＰ）と全ＦＰＫＭ（ＥＴ）との間の相関は〜０．７６である（図２３）。血清飢餓条件に対して同じパターンが観測される（ＳＢとＳＰの間のスピアマンの相関＝０．６９、図２３）。非処理の細胞において、３Ｐ−ＦＰＫＭ（ＮＢ）と、ショ糖密度勾配ポリリボソーム−ＦＰＫＭ（ＮＰ）および全ＦＰＫＭ（ＮＴ）の両者との間の相関は、より高かった（図２４、ＳＢ、ＳＴおよびＳＰ間のスピアマンの相関〜０．９８）。ｍＰ−ＦＰＫＭよりも２０倍高く３Ｐ−ＦＰＫＭによって選択された遺伝子（図２４のａ）は、ショ糖密度勾配ポリリボソーム−ＦＰＫＭ（ＮＰ）と３Ｐ−ＦＰＫＭ（ＮＢ）との間では０．６１の、全ＦＰＫＭ（ＮＴ）と３Ｐ−ＦＰＫＭ（ＮＢ）との間では０．５８の、ショ糖密度勾配ポリリボソーム−ＦＰＫＭ（ＮＰ）と全ＦＰＫＭ（ＮＴ）との間では０．５４のスピアマンの相関を示した（図２４）。これらの全ての情報は、３Ｐビーズからのトランスレートームとショ糖密度勾配ポリリボソームｍＲＮＡとの間に、統計的に有意な関係があるという結論をもたらした。
【０１１６】
８つの特異的に発現した遺伝子（ＰＡＬＬＤ、ＰＬＫ３、ＩＬ２７ＲＡ、ＮＣＳ１、ＶＥＧＦＡ、ＤＵＳＰ５、ＰＤＣＤ４、ＰＡＰＳＳ２）がＲＴ−ｑＰＣＲによる検証のために選択された（図２５および図２６）。我々は、ＲＴ−ｑＰＣＲとＲＮＡ−ｓｅｑ  ＦＣ値との間に良好な一致を観測した（ピアソンのｒ＝０．８９、図２５および図２６のｂ）。
【０１１７】
（我々のインビトロ実験によって示唆されるように）アップレギュレートされた遺伝子が優先的に捕捉および検出されるべきなので、我々は、それらのアップレギュレートされた遺伝子に我々の解析を集中させることを決定した。従って、我々は、以下の特徴を有するＤＥＧのサブセットを選択した（図２６）。（ｉ）ＥＧＦ刺激（ＥＢ／ＳＢ）に応答して３Ｐ−ＦＰＫＭの正の倍率変化を有する（すなわち、アップレギュレートされた）ＤＥＧ（'ビーズＦＣ＞０'と表示する）、（ｉｉ）３Ｐ−ＦＰＫＭ  ｐ値＜０．０５を有する遺伝子（'ｐ値＜０．０５'と表示する）、および、（ｉｉｉ）ｍＰ−ＦＰＫＭよりも高い３Ｐ−ＦＰＫＭを有する遺伝子（'＋＋'データセットと表示する）。まず、我々は、全てのサンプルにおいて'＋＋'ＤＥＧの間に正規分布を観測した。３つのデータセットの共通部分から、我々は、３Ｐ倍率変化と全倍率変化との間の相関（スピアマン＝０．４６）よりも、３Ｐとショ糖密度勾配ポリリボソームとの間の倍率変化において著しく高い相関（スピアマン＝０．６０）を有する７０ＤＥＧを特定した（図２６のａ）。ＲＴ−ｑＰＣＲによって、それらのうちの４つが妥当性を確認された（図２６のｂ）。それとは逆に、ｐ値＜０．０５を有するが負の倍率変化を有する'＋＋'遺伝子（ｎ＝４２）は、相関値に何の相違も示さない（ＥＢ／ＳＢ対ＥＰ／ＳＰに対するスピアマン＝０．５５、ＥＢ／ＳＢ対ＥＴ／ＳＴに対するスピアマン＝０．５４、図２７）。最後に、データセットの共通部分によって特定された７０ＤＥＧのサブセットが、ＭＣＦ７細胞株におけるＥＧＦ刺激の後に転写レベルにおいてアップレギュレートされることが知られている転写産物６０，６１の濃縮を示したことに我々は気付いた。それらのうち、我々はＰＡＬＬＤ、ＰＬＫ３、ＶＥＧＦＡ、ＤＵＳＰ５、およびＭＡＰ３Ｋ１４について言及する。
【０１１８】
これらの全ての結果は、３Ｐ−ＲＮＡの相関が、全ＲＮＡに対するより、ポリリボソームＲＮＡと全体的により良好なことを裏付ける。
【０１１９】
濃縮（信号対ノイズ比  ３Ｐ／ｍＰ）はタンパク質変動に従う
酵母、マウス、およびヒト細胞株に関する研究が、全トランスクリプトームとプロテオームとの間の低い相関を報告しており６２−６４、全ＲＮＡ（トランスクリプトーム）が常にタンパク質変動を反映するものではないことを示唆した。３Ｐビーズによって抽出されたＲＮＡが、標準的な技術に対し、タンパク質レベルを予測するためのより良好な解決策であることを立証するために、インビトロ無細胞アッセイに対して我々が行ったように、比較濃縮解析（Ｌｏｇ２ｆｐｋｍ（ＥＢ／ＥＭ）−Ｌｏｇ２ｆｐｋｍ（ＳＢ／ＳＭ））を我々は実行した。信号対ノイズ比は、３Ｐ／ｍＰとポリソームＤＥＧとの間では０．２０の相関を示す（ｐ値＜０．０５を有する全てのＤＥＧに対して、ｎ＝４３７）のに対し、３Ｐ／ｍＰと全ＤＥＧとの間では相関は０．１５である（スピアマン、図２８のａおよび図２９）。これらのデータは我々の結果を裏付け、ヒト細胞株における全ｍＲＮＡとタンパク質との間の報告されている相関６４，６５と同等である。
【０１２０】
ショ糖密度勾配および全ＲＮＡの両者と比較して、翻訳を受けている転写産物のプールをＲｉｂｏＬａｃｅがより正確に捕捉するかどうかをさらに理解するため、我々はＥＧＦ刺激後の４つの遺伝子（ＰＡＬＬＤ、ＰＬＫ３、ｈｂ−ＥＧＦ、およびＣＹＰ２７Ａ１）のタンパク質レベルをモニタリングした。我々は、全タンパク質含有量を相対ＲＮＡ存在量と比較した。免疫ブロット法により評価され、３つの異なるハウスキーピング（ＡＣＴＢ、ＧＡＰＤＨ、およびＲＰＬ２６）に対して正規化されたＰＡＬＬＤおよびＰＬＫ３の全量は、ＥＧＦ処理しても変化しない（ｎ＝３、図２８のｂ）。倍率変化がＲＴ−ｑＰＣＲ値およびＲＮＡ−ｓｅｑ値の両者における変化を顕著に示さない唯一のサンプルは３Ｐ／ｍＰ濃縮である。２つの追加的なタンパク質（ｈｂ−ＥＧＦおよびＣＹＰ２７Ａ１）に対し、タンパク質レベルは、３Ｐ／ｍＰ値に対して一貫した倍率変化で増加する（図３０）。これらの結果は、細胞のタンパク質含有量を予測することにおいて我々の技術が現在の標準より良好であることを示し、インビトロ無細胞系によって得られた全ての結果と一貫している。
【０１２１】
全体として、我々の研究結果は、
（ｉ）３Ｐビーズによって捕捉されたリボソームのフラクションは、全ｍＲＮＡよりも、ショ糖密度勾配からのポリリボソームｍＲＮＡと、より良好に相関する転写産物を保持する、
（ｉｉ）ＲｉｂｏＬａｃｅは、タンパク質存在量をより良好に説明する活性翻訳中のポリリボソームを選択的に捕捉することができる、
ということを立証した。
【０１２２】
３Ｐに対する追加的な用途：リボソームプロファイリング
リボソーム保護されたフラグメントの高解像度配列決定（リボソームプロファイリング）１８，５３，５６が、単一ヌクレオチド分解能で翻訳を研究するために、最近最も使用されている技術である。エンドリボヌクレアーゼによる細胞溶解物の処理は、ポリリボソームを、ｍＲＮＡ保護された短いフラグメントをそれぞれが捕捉する単量体リボソームに転換する。リボソーム保護されたフラグメントが精製され、配列決定され、ゲノムに戻ってマッピングされることができ、各遺伝子の全翻訳レベル並びにｍＲＮＡに沿ったリボソームの位置を明らかにする。保護されたｍＲＮＡフラグメントの長さの分布は、平均で２８−２９ｎｔ（Ｓ．セレヴィシエ）または３０−３１ｎｔ（哺乳類細胞）を示す。しかしながら、〜１６ｎｔ、〜２１ｎｔ、および４０−６５ｎｔのフラグメントもまた得られた。これらのフラグメントはエンドリボヌクレアーゼ消化の副生成物であり得たが、いくつかの研究は、それらを、延長の間のリボソームの立体配座変化に関連付けた５６，６６，６７。
【０１２３】
本明細書において、我々の手法の原理は、我々の精製の方策をリボソームプロファイリング技術と組み合わることである。この理由により、我々は、エンドヌクレアーゼ消化、活性単量体リボソームの選択、並びに、さらなる抽出およびＮＧＳ解析のためのゲル上のフラグメントの最終的な視覚化を含むべく、我々の手順を変更した。手短に言えば、我々は手順を以下のように最適化した（図３１を参照のこと）。
（１）細胞溶解物（Ａ２６０＝〜０．６ａ．ｕ．／μＬ、ＭＣＦ７細胞株より）が、５分間のＣＨＸによる処理後に新たに調製された。
（２）ビーズ（２００μｇ）が３Ｐ（３Ｐビーズ）およびｍＰ（ｍＰビーズ）によって官能化された。
（３）室温にて４５分間、ＲＮアーゼＩ（Ａ２６０における単位サンプル吸光度について０．０１−０．０２ａ．ｕ）によって細胞溶解物が消化された。
（４）氷上で１０分間、ＲＮアーゼ阻害剤（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＃ＡＭ２６９６）の添加によってエンドヌクレアーゼが阻害された。
（５）消化された細胞溶解物に対して３Ｐビーズが直接加えられ、４℃にて１時間、懸濁液をインキュベートした。
（６）ビーズは磁気分離によってプルダウンされ、１０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、２０μｇ／ｍＬのＣＨＸ、ＤＥＰＣ水中にてｐＨ７によって洗浄され、タンパク質がプロテイナーゼＫによって消化された。
（７）ＲＮＡがＴｒｉｚｏｌ（Ｓｉｇｍａ  ＃Ｔ９４２４）によって抽出された。もし必要であれば、この段階の後に、市販のｒＲＮＡ除去キット（例えば、Ｒｉｂｏ−Ｚｅｒｏ  ｒＲＮＡ除去キット、Ｉｌｌｕｍｉｎａ、＃ＭＲＺＨ１１１２４）によってＲＮＡは処理され得る。
（８）その後、さらなる解析のため、１５％のＰＡＧＥ  ＴＢＥ−尿素ゲルにおいてＲＮＡが移動される。
【０１２４】
さらに、ハリントニン（２分、２μｇ／ｍＬ）で処理された（ｈ＋）または処理されていない（ｈ−）ＭＣＦ７細胞溶解物からのリボソームを単離するために、３Ｐビーズが使用された。ＲＮＡが抽出され、ＴＢＥ−尿素ゲルにおいて移動され（図３２のａ）、その後フラグメントの定量化が実行された（Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００バイオアナライザ、Ｓｍａｌｌ  ＲＮＡチップ、＃５０６７−１５４８）。
【０１２５】
我々の結果は、３Ｐビーズが、非処理のサンプルに対して、翻訳が抑制されていない条件において、より多くのフラグメントを精製できることを示した（図３２のａ）。これらのフラグメントのいくつかは、以前に公開した研究１８と一致する長さを有する。特に、我々のフラグメント濃縮解析は、非処理のサンプルにおいて、〜３０ｎｔのフラグメントの〜７倍の増加を明らかにした。これらのフラグメントは、ｍＲＮＡに沿ったリボソームの位置を特定するために配列決定（Ｒｉｂｏ−ｓｅｑ解析）され得る。我々は、非処理のサンプルにおいて、〜２２ｎｔおよび〜６０ｎｔのより多くのフラグメントもまた観測した。
【０１２６】
最後に、我々は、マウス脳溶解物に対して同一の実験を実行した（図３２のｂ）。この実験は、標準的な公開されている手順18,68に対して、３０倍少ない材料によって実行された。我々は、ＴＢＥ−尿素ゲル上にて〜３０ｎｔのフラグメントの存在を明らかに観測した。
【０１２７】
全体として、これらの結果は、リボソームプロファイリング研究に対するＲｉｂｏＬａｃｅの適用が可能なことを裏付け、式（Ｉ）の分子が活性および天然リボソームを捕捉できることを裏付ける（図３３）。
【０１２８】
材料および方法
【０１２９】
インビトロ転写／翻訳に対するプライマー、Ｓｙｂｅｒ  ＲＴ−ｑＰＣＲ
【０１３０】
陽性対照（ルシフェラーゼ  ＳＰ６  ｃｏｎｔｒｏｌ  ＤＮＡ、＃Ｌ４７４１）の増幅に対するＲＴ−ｑＰＣＲにおいて使用されるプライマー対：
ＦＯＲ：ＣＧＧＣＧＣＣＡＴＴＣＴＡＴＣＣＴＣＴ  −  シーケンスＩＤ番号：１
ＲＥＶ：ＣＣＧＡＴＡＡＡＴＡＡＣＧＣＧＣＣＣＡＡ  −  シーケンスＩＤ番号：２
【０１３１】
陰性対照（ｐＧＥＭＥＸ−１ベクター  ＃Ｐ２２１１）の増幅に対するＲＴ−ｑＰＣＲにおいて使用されるプライマー対：
ＦＯＲ：ＧＣＡＧＴＡＣＣＴＡＡＧＣＣＣＴＣＧＡＴ  −  シーケンスＩＤ番号：３
ＲＥＶ：ＧＧＴＧＧＡＣＡＧＣＡＡＡＴＧＧＧＴＡＣ  −  シーケンスＩＤ番号：４
【０１３２】
１８Ｓ  ｒＲＮＡ（ハウスキーピング遺伝子）の増幅に対するＲＴ−ｑＰＣＲにおいて使用されるプライマー対：
ＦＯＲ：ＧＧＡＴＣＣＡＴＴＧＧＡＧＧＧＣＡＡＧＴ  −  シーケンスＩＤ番号：５
ＲＥＶ：ＡＣＧＡＧＣＴＴＴＴＴＡＡＣＴＧＣＡＧＣＡＡ  −  シーケンスＩＤ番号：６
【０１３３】
ｅＧＦＰ遺伝子の増幅に対するＲＴ−ｑＰＣＲにおいて使用されるプライマー対：
ＦＯＲ：ＡＡＧＣＡＧＣＡＣＧＡＣＴＴＣＴＴＣＡＡ  −  シーケンスＩＤ番号：７
ＲＥＶ：ＡＣＧＴＴＧＴＧＧＣＴＧＴＴＧＴＡＧＴＴ  −  シーケンスＩＤ番号：８
【０１３４】
ＴａｑＭａｎアッセイ
【０１３５】
ＴａｑＭａｎアッセイによって解析されるそれぞれの遺伝子に対し、遺伝子名、別名、染色体位置、およびＴａｑＭａｎ  ＩＤが表１に報告されている。全てのＴａｑＭａｎプローブはＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからのものであった。
【表１】
0006687282.tif 000013
【０１３６】
３Ｐ分子の化学合成（段階１−４）
【０１３７】
１．ビオチニル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドの合成（スキームＩ）
【０１３８】
Ｄ−ビオチン（０．４９ｇ、２．０ｍｍｏｌ、Ｓｉｇｍａ  ＃Ｂ４５０１）が２０ｍＬのＤＭＦ（Ｓｉｇｍａ  ＃２２７０５６）中でＮ−ヒドロキシスクシンイミド（０．３ｇ、２．７ｍｍｏｌ、Ｐｉｅｒｃｅ  ＃ＨＣ１０２０４０）に加えられ、材料のほとんどが溶解するまで、５０℃まで加熱された。５ｍＬのＤＭＦ中のＮ，Ｎ'−ジシクロヘキシルカルボジイミド（０．４５ｇ、２．１ｍｍｏｌ、Ｓｉｇｍａ  ＃Ｄ８０００２）の溶液が、前述の溶液に対して、滴下により加えられた。生じた溶液は室温にて一晩撹拌され、この時間の間に、白色沈殿物が形成された。反応混合物がセライトを通してろ過され、ろ液はジエチルエーテル（Ｓｉｇｍａ  ＃３０９９６６）によって粉砕された。この白色沈殿物は真空ろ過され、その後、ジエチルエーテルで洗浄されて白色の粉末を生じた。収量は０．５２ｇ（〜７０％の最終的な効率）であった。
0006687282.tif 000014
【０１３９】
２．ビオチン−ジェフアミン中間体の合成（スキームＩＩ）
【０１４０】
２，２'−（エチレンジオキシ）ビス（エチルアミン）（Ｓｉｇｍａ  ３８５５０６、以下ではジェフアミンと呼ばれる）（０．９ｍＬ、５．８ｍｍｏｌ）が５００ｍＬのアセトニトリル（ＭｅＣＮ、Ｓｉｇｍａ  ＃３４８８８）に溶解された。ビオチニル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（Ｂ−ＮＨＳ、０．３ｇ、０．８８ｍｍｏｌ）がＭｅＣＮ（１００ｍＬ）に溶解され、この溶液が滴下漏斗へと加えられた。このＢ−ＮＨＳ溶液は、その後、ジェフアミン溶液に対して滴下により加えられ、Ｎ２下、０−５℃にて一晩撹拌された。反応はろ過され、固体が、ＭｅＣＮ（２×１０ｍＬ）、その後ジエチルエーテル（２×１０ｍＬ）によって洗浄された。最後に、Ｎ２下の乾燥で引かれ、白色で吸湿性の固体を生じた。ＴＬＣ（１０％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ＋５ｄｐｓのＮＨ４ＯＨ）は、反応後には、明らかな出発原料を示さない。固体は、４０℃にて乾燥ＭｅＯＨ（３０ｍＬ）に溶解され、シリカに充填され、１０％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ＋１％のＥｔ３Ｎによって溶出された。フラクション２５−４５が収集され、黄色の固体／ゲルとなるまで気化された。最終的な収量は０．２５７ｇ（〜８０％の最終的な効率）。この生成物は、以下ではＢＪ１と呼ばれる。
【０１４１】
その後、Ｂｊ１（０．０１７ｇ、０．０４３ｍｍｏｌ）が乾燥ピリジン（５ｍＬ、Ｓｉｇｍａ  ＃２７０９７０）に溶解された。ＣＤＩ（Ｓｉｇｍａ  ＃２１８６０）が、同じ体積のピリジン（０．０７４ｇ、０．４５ｍｍｏｌ）に溶解され、Ｂｊ１に加えられた。生じた溶液は２０℃において２．５時間撹拌された。このとき、完全な反応であることをＴＬＣが明らかにした（１％のＥｔ３Ｎを伴う１０％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ、Ｓｉｇｍａ  ＃Ｔ０８８６、Ｒｆ＝０．３）。溶媒が気化され、粗製生成物が最小量のＤＣＭ（Ｓｉｇｍａ  ＃３２２２２）中で戻され、その後、エーテルが過剰に加えられた。沈殿物が収集され、さらに精製することなく、次の段階において使用された。この生成物は、以下ではＢＪ１'と呼ばれる。
0006687282.tif 000015
【０１４２】
３．ピューロマイシン−ジェフアミン中間体の合成（スキームＩＩＩ）
【０１４３】
クロロホルム（１３８ｍＬ）中のＢＯＣ無水物（Ｓｉｇｍａ  ＃３６１９４１）の溶液が０−５℃を維持しながらクロロホルム（２２９ｍＬ）中のジェフアミンの溶液に加えられた。添加は３０分で完了した。反応は、ゆっくりと温められ、１８−２０℃にて一晩撹拌された。その翌日、反応はＤＣＭ（４００ｍＬ）に溶解され、食塩水で洗浄され、乾燥され（ＭｇＳＯ４）、澄んだ油状物となるまで４０℃にて気化された（〜９３％の最終的な効率）。
【０１４４】
ピューロマイシン（０．２８ｇ、０．６１３ｍｍｏｌ、Ｓｉｇｍａ  ＃Ｐ８８３３）がピリジン（１ｍＬ）に溶解され、ＣＤＩ（ＤＣＭに溶解されている）がこの溶液（０．１０３ｇ、０．６３５ｍｍｏｌ）に加えられた。
【０１４５】
この溶液は、ＤＣＭ（２５０ｍＬ）中のＢＯＣ保護されたジェフアミン（ジェフアミン０．１８ｍＬ、１．２ｍｍｏｌ）の溶液に対して滴下により加えられ、反応溶液は０−５℃にて一晩撹拌された。ＴＬＣ（１０％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ）は、主生成物（Ｒｆ＝０．５）並びに少量の出発原料を示す。
【０１４６】
生成物はＤＣＭ（２５０ｍＬ）と水（１００ｍＬ）との間で分割され、水（２×１００ｍＬ）で洗浄され、粘着性の油状物を生じるまで４０℃にて気化された。生成物は、４０℃にて３時間にわたって酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ、４０ｍＬ）中で粉砕され、ゲル状の懸濁液を生じた。この懸濁液は０−５℃まで冷却され、ろ過され、ＥｔＯＡｃで洗浄され、真空中で４０℃にて乾燥されて、白色の固体を生じた。
【０１４７】
代替的に、この分離は、シリカカラム（ＤＣＭ中の１０％のＭｅＯＨ、１％のＥｔ３Ｎ）を通して実行され得る。この生成物は、以下ではＰＪ１と呼ばれる。
【０１４８】
トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ、Ｓｉｇｍａ  ＃３０２０３１）が、２５℃にてＤＣＭ（４０ｍＬ）中で撹拌されているＰＪ１の懸濁液に対して滴下によって加えられた。２時間後、この溶液は１５−１７℃に冷却され、一晩撹拌された。その翌日、溶液はクロロホルム（３００ｍＬ）で希釈され、真空中で４０℃にて気化された。黄色の油状物を生じるまで、これは３回繰り返された。この生成物は、以下ではＰＪ１'と呼ばれる。
0006687282.tif 000016
【０１４９】
４．３Ｐの最終的な合成（スキームＩＶ）
【０１５０】
ＢＪ１'（０．１４０ｍｍｏｌ）およびＰＪ１'（０．０８４ｇ、０．１３３ｍｍｏｌ）が６ｍＬのピリジンに溶解され、窒素（Ｎ２）下において５５℃にて一晩撹拌された。その後、（ｉ）真空下で６０℃にて溶媒が気化され、（ｉｉ）残留したピリジンがＥｔＯＡｃ（２×２５ｍＬ）と共沸され、（ｉｉｉ）油状の材料をＥｔＯＡｃ（３×２５ｍＬ）と水（５０ｍＬ）との間で分割し、（ｉｖ）ＤＣＭ（２×２５ｍＬ）によって水洗された。その後、水性相は１−ブタノール（２５ｍｌ）によって抽出された。
0006687282.tif 000017
【０１５１】
１−ブタノールが真空中で４０℃にて気化され、油状物を得た（ＴＬＣ、１０％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ、ＵＶ光の下でＲｆ＝０．５を有する主生成物を示す）。この最終的な油状の生成物は、シリカカラムクロマトグラフィによって精製され、フラクションが収集された（ＭｅＯＨ中に乾燥充填され、０．５％のＮＨ４ＯＨ／１０％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ中で溶出された）。所望の生成物はフラクション２５−５０中に存在し、気化後に０．００６ｇの黄色のろう状物質を生じる。生成物は、最後に分取ＨＰＬＣ（移動相は９８％の水：２％のアセトニトリルで５分間、その後、１ｍＬ／分の流量で３５分の間に１００％のアセトニトリルまで、λ２８０ｎｍにおけるＵＶ検出器）によって精製された。この生成物は、以下では３Ｐと呼ばれる。
【０１５２】
生成物３ＰのＮＭＲおよびＬＣＭＳデータ
【０１５３】
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ＝８．４３（ｓ、１Ｈ、Ｐｕｒ．）、８．２３（ｓ、１Ｈ、Ｐｕｒ．）、８．０８５（ｄ、Ｊ＝７．７、１Ｈ）、７．８３６（ｔ、Ｊ＝５．６、１Ｈ）、７．１１（ｄ、Ｊ＝８．６、２Ｈ、Ｐｕｒ．）、６．８３（ｄ、Ｊ＝８．６、２Ｈ、Ｐｕｒ．）、６．４１４（ｓ、１Ｈ）、６．３５２（ｓ、１Ｈ）、６．１６７（ｍ、２Ｈ）、５．９７３（ｓ、４Ｈ）、５．１６３（ｓ、１Ｈ）、４．４３３（ｍ、３Ｈ）、４．２９７（ｍ、１Ｈ）、４．１１９（ｍ、１Ｈ）、３．９０９（ｄｔ、Ｊ＝６．９、３．８、１Ｈ）、３．６４９（ｍ、１Ｈ）、３．４９１（ｓ、１１Ｈ）、３．３５６（ｍ、７Ｈ）、３．１１８（ｓ、９Ｈ）、２．８２０（ｍ、２Ｈ）、２．６８７（ｍ、１Ｈ）、２．０６０（ｓ、２Ｈ）、１．４８４（ｄ、Ｊ＝８．１、３Ｈ）、１．２９７（ｍ、２Ｈ）。
【０１５４】
１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ）  δ  １７２．５９、１６３．０４、１５８．１７、１５４．７２、１５２．２７、１５０．０７、１３８．２７、１３０．０３、１２０．０７、８９．７９、７８．０６、７０．２３、６９．３９、６１．５４、５９．７０、５５．９１、４０．３１、３９．７２、３８．９７、２８．９０、２５．８４。
【０１５５】
ＨＰＬＣ−ＭＳによって純度（＞９０％）を確立した。固定相はＲＰ１８（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｋｉｎｅｔｅｘ  ＃００Ｇ−４６０１−Ｅ０  Ｃ１８  ５μｍ  ２５０×４．６ｍｍ）、移動相は９８％の水：２％のアセトニトリルで５分間、その後、３５分の間に１００％のアセトニトリルまで、λ２８０ｎｍにおけるＵＶ検出器。化合物３Ｐは１７．５分の保持時間を示す。正イオンモードＥＳＩ検出を有するＭＳおよびイオントラップ質量分析器が、報告される構造と一致する、このピークのフルスキャン質量スペクトルを与える。特に、ｍ／ｚ  １０４６．５における［Ｍ＋Ｈ］＋は、その分子式Ｃ４７Ｈ７２Ｎ１１Ｏ１４Ｓ＋と一致する。
【０１５６】
ビーズ官能化
【０１５７】
Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）ＭｙＯｎｅ（商標）ストレプトアビジンＣ１（１０ｍｇ／ｍＬ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＃６５００１）が、磁気スタンドに固定された１．５ｍＬのエッペンドルフチューブに１分間にわたって入れられて上澄みを除去し、ＤＥＰＣ処理水中の０．０５ＭのＮａＣｌ、０．１ＭのＮａＯＨを３０μＬ使用して、３分間洗浄された。このチューブを１分間にわたって磁石上に置くことにより、この溶液が磁気ビーズから分離された。その後、ビーズは、ＤＥＰＣ処理水中の０．１ＭのＮａＣｌの溶液によって２回洗浄された（それぞれ３分間、磁石上で１分間）。最後に、ビーズは結合緩衝液（２ＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのトリスＨＣｌ、ＤＥＰＣ水中にてｐＨ７．５）に３分間浸漬された（１分の磁気分離）。
【０１５８】
その後、結合緩衝液（１ｍＭ、５０μＬ）中の３Ｐがビーズへ加えられ、サーモミキサーにおける室温（ＲＴ）での１０００ｒｐｍで１時間にわたるインキュベーションがこれに続いた。その後、室温において、１０００ｒｐｍで３０分にわたり、ビーズはｍＰ（１ｍＭ）によってエンドキャップされた。最後に、２００μＬのＷ緩衝液（１０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、２０μｇ／ｍｌのシクロヘキシミド、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ＤＥＰＣ水中にてｐＨ７）によってビーズは３回洗浄された（３分間の磁気分離）。その後、チューブは３分間にわたって磁石上に置かれ、上澄みを廃棄し、活性翻訳中のリボソームを探し出すために、官能化されたビーズの「ペレット」を使用した。陰性対照においては、以前に説明されたものと同一の条件を使用し、ｍＰのみによってビーズが官能化された（５０μＬ中で１ｍＭ、９０分、１０００ｒｐｍ、室温にて）。
【０１５９】
ストレプトアビジンコーティングされたビーズによる３Ｐの枯渇
【０１６０】
様々な量の磁気ビーズが、それらの懸濁液の溶液から、磁石を使用して分離される。２ＭのＮａＣｌ、１ｍＭの３Ｐ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのトリスＨＣｌ、ＤＥＰＣ水中にてｐＨ７．５から成る溶液５０μＬが、「乾燥」ビーズに対して加えられ、懸濁液を室温にて５分間インキュベートする。磁気ラック上でプルダウンした後、上澄みの吸光度が２７２ｎｍにおいて測定された。
【０１６１】
翻訳されたシーケンスおよび／または転写されたシーケンスのインビトロ無細胞選択
【０１６２】
全長のルシフェラーゼ（ＳＰ６  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ＤＮＡ、Ｐｒｏｍｅｇａ  ＃Ｌ４７４Ａ）のインビトロ翻訳、および、陰性対照シーケンス（ｐＧＥＭＥＸ−１ベクター、Ｐｒｏｍｅｇａ  ＃Ｐ２２２１１）の転写が、それぞれ陽性対照および陰性対照として、ＴｎＴ  ＳＰ６  Ｑｕｉｃｋ  Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ／Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ  ＃Ｌ２８８１）を使用して、製造業者の使用説明書に従って得られた。手短に言えば、０．２５μｇのプラスミドが、４０μＬのＴＮＴ  ｑｕｉｃｋ  ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ、ＤＥＰＣ水中１μＬのメチオニンから成る、５０μＬのＩＶＴＴ  ｅｕｋ−ｍｉｘ反応に独立に加えられた。３４℃での１０００ｒｐｍにおける４０分間のインキュベーションの後、シクロヘキシミド（１０μｇ／ｍｌ）によって３分間にわたって反応がインキュベートされ、その後、４００μＬのＷ緩衝液（１０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、２０μｇ／ｍｌのシクロヘキシミド、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ＤＥＰＣ水中にてｐＨ７）によって、４５０μＬの全体積になるまで希釈された。この溶液は３つのバイアルに分けられた。そのそれぞれは反応の１５０μＬを有する。第１番目のものは全ＲＮＡ（Ｔｒｉｚｏｌ）の抽出に使用され、第２番目のものは３Ｐビーズに加えられ、第３番目のものはｍＰビーズに加えられた。
【０１６３】
並行して、以前に説明された（「ビーズ官能化」の段落）ように、１５μＬのビーズから始まって、ビーズ官能化が実行された。官能化されたビーズのペレットにＩＶＴＴ  ｅｕｋ−ｍｉｘ溶液が加えられ、１０℃において、２ｒｐｍでの軌道回転中で（ＳｔａｒＬａｂ  Ｒｏｔａｔｏｒ  Ｍｉｘｅｒ）懸濁液を１時間インキュベートした。その後、チューブは、磁気スタンド上の氷上に５分間維持され、ビーズ結合されたリボソームをペレット化した。上澄みが分離され、１つのアリコートが対照（未結合フラクション）として維持され、５００μＬのＷ緩衝液によって２回ビーズを洗浄した。最後に、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、Ｔｒｉｚｍａ  ＨＣＬ、ＤＥＰＣ水中にてｐＨ７．５の１００μＬ中でビーズが再懸濁された。Ｔｒｉｚｏｌおよびイソプロパノール沈殿によって、ビーズ結合されたリボソームから全ＲＮＡが抽出された。３０μＬの無ＲＮアーゼ水中で全ＲＮＡが再懸濁された。この溶液から、６００ｎｇのＲＮＡが、２μＬ（１Ｕ／μＬ）のＤＮアーゼＩ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｌ．Ｔ．  ＃ＥＮ０５２１）によって処理され、最終的な体積で１０μＬとした。消化されたサンプルが、製造業者の使用説明書に従ってｃＤＮＡ合成（ＲｅｖｅｒｔＡｉｄ  ＲＴ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｌ．Ｔ．  ＃Ｋ１６２２）に使用された。
【０１６４】
製造業者の使用説明書に従って、Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｅ２６１０）およびＩｎｆｉｎｉｔｅ  ２００  ＰＲＯ  ｒｅａｄｅｒ（Ｔｅｃａｎ）を使用した発光信号を用いて、ルシフェラーゼ翻訳効率がモニタリングされた。並行して、Ｔｒａｎｓｃｅｎｄ（商標）Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓを使用してε−ラベルされたビオチン化されたリジン−ｔＲＮＡ複合物により、合成されたタンパク質の全プールがラベルされ、製造業者の使用説明書（Ｐｒｏｍｅｇａ  ＃Ｌ５０８０）に従って、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより効果的翻訳を検証した。
【０１６５】
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ＋およびｐＰＲ−ＩＢＡ２プラスミドへとクローン化された全長ＥＧＦＰのインビトロ翻訳が、ルシフェラーゼ遺伝子と同じやり方で実行されたが、それぞれ２μｇおよび０．３μｇのＤＮＡをＩＶＴＴ  ｅｕｋ−ｍｉｘに添加した。
【０１６６】
ＭＯＰＳ−ホルムアルデヒドゲル
【０１６７】
２μＬの１０倍ＭＯＰＳ緩衝液（２００ｍＭのＭＯＰＳ、５０ｍＭの酢酸ナトリウム、１０ｍＭのＥＤＴＡ、ＮａＯＨを有しｐＨ７）、２μＬのホルムアルデヒド、９μＬの脱イオン化されたホルムアミド、および３．５μＬの無ＲＮアーゼ水を添加して、等しい体積のＲＮＡサンプル（２．５μＬ）が２０μＬにされた。サンプルは７０℃において１０分加熱され、ＭＯＰＳ−ホルムアルデヒドアガロースゲル（１％のアガロース、ＩＢＩ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＃１０Ｄ２００２）に充填する前に氷上で冷やされた。
【０１６８】
細胞培養および処理
【０１６９】
乳癌細胞株ＭＣＦ７（ＡＴＣＣ  ＃ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＴＢ−２２（商標））および神経芽細胞腫−脊髄（ＮＳＣ３４−ＣＥＤＡＲＬＡＮＥ  ＃ＣＬＵ１４０）ハイブリッド細胞株が粘着板に播種され、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌのペニシリン、および１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンが補給されたレッドフェノールを有するＤＭＥＭ中において、３７℃、５％のＣＯ２に維持された。溶解前に、８０％コンフルエンスまで細胞が成長された。ＥＧＦ処理のため、播種後、０．５％のＦＢＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌのペニシリン、および１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンが補給されたＤＭＥＭ−レッドフェノール（飢餓条件）によって培地を交換する前に、ＭＣＦ７細胞は８０％コンフルエンスまで培養を維持された。細胞は、４時間にわたるＥＧＦ（１μｇ／μＬ）の添加の前に、３７℃、５％のＣＯ２において、１２時間にわたって飢餓状態に維持された。
【０１７０】
官能化ビーズによる細胞溶解物からの活性リボソームの単離
【０１７１】
ＭＣＦ７またはＮＣＳ細胞が１．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈで播種され、それらを８０％コンフルエンスまで成長させた。その後、細胞は、翻訳延長を阻害するため、溶解前に、３７℃において５分間にわたり１０μｇ／ｍＬのシクロヘキシミドで処理された。その後、それぞれのディッシュに対し、細胞は、１０μｇ／ｍｌのシクロヘキシミドが補われたＰＢＳによって４℃にて洗浄され、３００μｌの溶解緩衝液（１０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ７．５、１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１％のデオキシコール酸ナトリウム、０．２Ｕ／ｍｌのＤＮアーゼＩ、ＲＮアーゼ阻害剤、１ｍＭのジチオスレイトール、および１０μｇ／ｍｌのシクロヘキシミド）によって、プレート上にこすり付けられた。核および細胞残屑が、４℃において、１２，０００ｇでの５分間にわたる遠心分離によって除去された（溶解物は等分され、２回以上の冷凍および解凍を回避しつつ、１ヶ月を超えない期間にわたり、−８０℃において保存され得る）。Ｎａｎｏｄｒｏｐ  ＮＤ−１０００  ＵＶ−ＶＩＳ分光光度計によって２６０ｎｍにおける吸光度が測定された。溶解物は、Ｗ緩衝液（１０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、２０μｇ／ｍｌのシクロヘキシミド、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ＤＥＰＣ水中にてｐＨ７）によって０．３−１．７ａ．ｕ．Ａ２６０／μＬに希釈された。得られた溶液は官能化されたビーズに直接加えられ、４℃において、２ｒｐｍでの軌道回転中で（ＳｔａｒＬａｂ  Ｒｏｔａｔｏｒ）懸濁液を車輪上で１時間インキュベートした。その後、チューブは、磁気スタンド上の氷上に５分間維持され、ビーズ結合されたリボソームをペレット化した。上澄みが捨てられ（未結合フラクション）、５００μＬのＷ緩衝液によって２回ビーズを洗浄した。最後に、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、３０ｍＭのＴｒｉｚｍａ  ＨＣＬ、ＤＥＰＣ水中にてｐＨ７．５の（再懸濁緩衝液）５０μＬ中でビーズが再懸濁された。
【０１７２】
ＲＮＡ抽出
【０１７３】
製造業者の手順に従って、ＴＲＩＺＯＬ試薬（Ｓｉｇｍａ  ＃Ｔ９４４２４）を添加することにより、２５μＬの再懸濁されたビーズ結合されたリボソームから、全ＲＮＡが抽出された。イソプロパノール沈殿の後、ペレットは、３０μＬの無ＲＮアーゼ水中で再懸濁され、Ｎａｎｏｄｒｏｐ  ＮＤ−１０００  ＵＶ−ＶＩＳ分光光度計により定量化され、その後、−８０℃において保存された。
【０１７４】
ＲＮＡ−ｓｅｑ実験のため、標準的なフェノール：クロロホルム（Ｓｉｇｍａ  ＃Ｐ１９４４）抽出によってＲＮＡが抽出された。ポリリボソームおよび全ＲＮＡ抽出のため、対応するフラクションが収集され、２００μｇ／ｍＬのプロテイナーゼＫ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＃ＥＯ０４９１）、ＤＥＰＣ水中の１％のＳＤＳ、およびＲＮアーゼ阻害剤（０．４ａ．ｕ．／μＬ）によって３７℃にて１．５時間にわたり処理された。フェノール：クロロホルム抽出およびイソプロパノール沈殿の後、ビーズで誘導された、ポリリボソームおよびサブポリリボソームＲＮＡサンプルが、Ｎａｎｏｄｒｏｐ  ＮＤ−１０００  ＵＶ−ＶＩＳ分光光度計によって定量化され、等分され、−８０℃で保存された。ＲＮＡ品質は、製造業者のガイドラインに従って、ＲＮＡ６０００ピコキット（Ａｇｉｌｅｎｔ  ＃５０６７−１５１３）を伴うＡｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒによって確認された。
【０１７５】
ウエスタンブロット解析
【０１７６】
実験のタイプによって、細胞溶解物は、（ｉ）ポリリボソーム溶解緩衝液中（１０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ７．５、１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１％のデオキシコール酸ナトリウム、０．２Ｕ／ｍｌのＤＮアーゼＩ、ＲＮアーゼ阻害剤、１ｍＭのジチオスレイトール、および１０μｇ／ｍｌのシクロヘキシミド）で調製され、官能化されたビーズで処理されたもの、または、（ｉｉｉ）放射性免疫沈降法アッセイ（ＲＩＰＡ）緩衝液（製造業者の手順に従って、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のＳＤＳ、０．５％のデオキシコール酸ナトリウム、１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ  １００、５０ｍＭのトリス、ｐＨ７．５であって、ペプスタチンＡ、Ｓｉｇｍａ、＃Ｐ５８１８、プロテアーゼ、Ｓｉｇｍａ、＃Ｐ８３４０、およびホスファターゼ阻害剤、Ｓｉｇｍａ、＃Ｐ００４４が加えられている）によって調製されたもの、であった。ブラッドフォード（Ｓｉｇｍａ  ＃Ｂ６９１６）によってタンパク質が定量化され、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離され、ＰＶＤＦ膜上に移された。手短に言えば、５μＬの６倍Ｌｅａｍｍｌｉローディング緩衝液（０．６Ｍのジチオスレイトール、１２％のＳＤＳ、６０％のグリセロール、０．０６％のブロモフェノール・ブルー、０．３７５Ｍのトリス、ＮａＯＨを伴ってｐＨ６．８）が、５μｇの全タンパク質に、または、２５μＬの再懸濁されたビーズに加えられた。２５ｍＭのトリス、１９２ｍＭのグリシン（Ｂｉｏｒａｄ  ＃４５６９０３３）中のＳＤＳ−ＰＡＧＥにて行われた簡単な遠心分離の後、サンプルは９５℃において５分間加熱された。２５ｍＭのトリス、１９２ｍＭのグリシン、２０％ｖ／ｖのメタノール、ｐＨ８．３中にて、一定の２８０ｍＡにおいて２．５時間にわたり、ＰＶＤＦ膜上（ＩＭＭＯＢＩＬＯＮ−Ｐ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＃ＩＰＶＨ２０２００）でブロッティングが実行された。膜は、ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（０．１％のＴｗｅｅｎ）中の５％のＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ、＃０５４７０）中で１時間にわたってブロックされ、一次抗体中で４℃において一晩インキュベートされ、その後、ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（０．１％、ＴＢＳＴ）中で３回、それぞれ１０分間洗浄された。ホースラディッシュペルオキシダーゼにコンジュゲートされた二次抗体によるインキュベーションの後、ブロットがＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中で３回（それぞれ５分間）洗浄され、サプライヤによって指示されたようにＥＣＬ  Ｐｌｕｓ検出キット（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＥＣＬ  Ｐｒｉｍｅ  ＃ＲＰＮ２２３２）によって処理された。
【０１７７】
ＳＰＳ６（＃２２１７）を認識する一次抗体はＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇからのものであった（１：１，０００希釈で使用）。ＲＰＬ２６（＃ａｂ５９５６７）、ｅＩＦ４Ｂ（ａｂ６８４７４）、ｅＩＦ４Ａ１（ａｂ３１２１７）、ｈｂ−ＥＧＦ（＃ａｂ１８５５５５）、ＣＹＰ２７Ａ１を認識する一次抗体はＡｂｃａｍからのものであった（１：５０希釈で使用）。ＰＬＫ３（＃ＰＡ５−１５２９０）およびＰＡＬＬＤ（＃ＭＡ５−１６４１）を認識する抗体はＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃからのものであった（１：１，０００希釈で使用）。ＥＧＦＰを認識する一次抗体はＲｏｃｈｅ（＃１３５３７４００）からのものであった（１：１，０００希釈で使用）。ＨＲＰコンジュゲートされた二次抗体はＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙからのものであった（１：１０，０００希釈で使用、＃ｓｃ−２００４、＃ｓｃ−２００５）。これに対し、ストレプトアビジン−ＨＲＰはＰｒｏｍｅｇａからのものであった（Ｔｒａｓｃｅｎｄｅｎｔ  ｋｉｔ、＃Ｌ５０８０、１：１，０００希釈で使用）。化学発光は、ＣｈｅｍＤｏｃ−Ｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）によって取得され、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ｖ１．４５ｓ）を用いて解析された。全ての実験は生物学的三重反復で行われた。ウエスタンブロット前のメタノール／クロロホルムタンパク質抽出および沈殿は、結果の精度を改善しない。Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｐｌｕｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｋａｌｅｉｄｏｓｃｏｐｅ標準（Ｂｉｏｒａｄ  ＃１６１−０３７５）が、ラダータンパク質マーカとして使用された。
【０１７８】
ＥＧＦＰ免疫沈降が、抗ＥＧＦＰ抗体（１：１００希釈で使用、＃Ａ１１１２２）により官能化された２０μＬのＤｙｎａｂｅａｄｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、＃１０００３Ｄ）を用いて実行され、エンドオーバーエンド回転機において、室温にて１−２時間にわたり、ＴＢＳ緩衝液（ｐＨ７．５）中にて２５０μＬまで希釈されたＩＶＴＴ  ｅｕｋ−ｍｉｘの５０μＬによりインキュベートされた。
【０１７９】
ポリソームプロファイリング
【０１８０】
ＭＣＦ７細胞が１．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈで播種された。処理（ＥＧＦで４時間）後、３７℃において１０μｇ／ｍｌのシクロヘキシミドによって５分間細胞がインキュベートされ、ｍＲＮＡにリボソームを捕捉した。細胞は、シクロヘキシミド（１０μｇ／ｍｌ）が補われたＰＢＳによって洗浄され、３００μＬの溶解緩衝液（１０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ７．５、１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１％のデオキシコール酸ナトリウム、０．２Ｕ／ｍｌ、ＤＮアーゼＩ、ＲＮアーゼ阻害剤、１ｍＭのジチオスレイトール、および１０μｇ／ｍｌのシクロヘキシミド）によってプレート上に直接こすり付けられた。核および細胞残屑が、４℃において、１２，０００ｇでの５分間にわたる遠心分離によって除去された。上澄みは、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、３０ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ７．５を含む１５−５０％の線形ショ糖密度勾配上に直接移され、スイングロータ上のＳｏｒｖａｌｌ超遠心分離機中で、４℃において、１８０，０００ｇで１００分間にわたり遠心分離された。４０Ｓ、６０Ｓ、および８０Ｓのピークに対応するフラクション、および、ポリソームに対応するフラクションが、２５４ｎｍでの吸光度をモニタリングしながら収集された。各フラクションが液体窒素中で急速冷凍され、ＲＮＡまたはタンパク質抽出用に−８０℃にて保存された。
【０１８１】
ＲＮＡ−ｓｅｑ
【０１８２】
酸性フェノールクロロホルム分離（Ｓｉｇｍａ）によって（ビーズおよびショ糖密度勾配フラクションから）ＲＮＡが抽出された。ＲＮＡサンプルの品質は、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ  ２１００およびＮａｎｏｄｒｏｐ  ＮＤ−１０００分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して評価された。全トランスクリプトームライブラリ調製が、ＲＩＮ≧８を有する１μｇの全ＲＮＡから始まって実行された。ポリ−ｄＴオリゴ付着磁気ビーズを使用したポリ−Ａ含有ｍＲＮＡ分子の濃縮に続いて、全ての回収されたＲＮＡが、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＴｒｕＳｅｑ  ＲＮＡ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＃ＦＣ−１２２−１００１  ＃ＦＣ−１２２−１００２）および手順ｖ２  Ｒｅｖ．Ｃ．を使用して処理された。完成したライブラリが、ＤＮＡ定量化およびバイオアナライザ解析（平均フラグメント長＝２７４ｂｐ）により評価され、その後、配列決定に提出された。バーコードを用いてＲＮＡ−ｓｅｑが構成され、レーンごとに１２サンプルの多重化を可能とした。単一読み出しにおける手順ＨＣＳ  １．５．１５．１を使用してＩｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ  ２０００で配列決定が実行された。
【０１８３】
ＮＧＳデータ解析
【０１８４】
Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ２０００によってサンプルが配列決定された。初期設定のパラメータを使用したＴｏｐＨａｔ（ｈｔｔｐ：／／ｃｃｂ．ｊｈｕ．ｅｄｕ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｔｏｐｈａｔ／ｉｎｄｅｘ．ｓｈｔｍｌ）によって、未処理の配列決定の読み出し（１００ｎｔの長さ）が、ヒトゲノムおよびトランスクリプトーム（バージョンＧＲＣｈ３７）に対してマッピングされた。
【０１８５】
Ｅｎｓｅｍｂｌ遺伝子アノテーション（Ｅｎｓｅｍｂｌリリース７４）に基づいて、Ｃｕｆｆｌｉｎｋｓパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｃｏｌｅ−ｔｒａｐｎｅｌｌ−ｌａｂ．ｇｉｔｈｕｂ．ｉｏ／ｃｕｆｆｌｉｎｋｓ／）中のＣｕｆｆｄｉｆｆを使用して、位置合わせされた読み出しからＦＰＫＭ値を算出し、差次的発現に対する試験を実行した。
【０１８６】
ＤＥＧ検証
【０１８７】
ランダムヘキサマー、単一ストランド逆転写酵素（ＲｅｖｅｒｔＡｉｄ  ＲＴ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、＃Ｋ１６２２）を使用してＲＴが実行され、ＴａｑＭａｎ遺伝子特異的プライマーを使用してリアルタイム定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）が実行された。１０μＬの２倍ＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  ＩＩ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＃４４４００３８７）、１μＬの２０倍ＴａｑＭａｎ  Ａｓｓａｙ、１μｌのｃＤＮＡ（１：４希釈）および無ＲＮアーゼ水により、２０μＬの最終的な体積で、９６−ウェルプレートにおいてＴａｑＭａｎ  ｑＰＣＲが実行された。実験は三重反復で行われた。エラーバーは、三重反復実験から算出された±ｓ．ｄ．を表す。
【０１８８】
インビトロ無細胞系から抽出されたＲＮＡに対するＲＴ−ｑＰＣＲ
【０１８９】
官能化されたビーズから、および、全ＩＶＴＴ  ｅｕｋ−ｍｉｘ反応から全ＲＮＡを抽出するために、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｓｉｇｍａ）が使用された。各サンプルに対し、６００ｎｇのＲＮＡがＤＮアーゼＩによって消化された。製造業者の使用説明書に従ってＲｅｖｅｒｔＡｉｄ  ＲＴ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔを使用した単一ストランドｃＤＮＡ合成のために、６０ｎｇの消化されたＲＮＡサンプルが使用された。ランダムヘキサマーを使用してＲＴが実行された。製造業者の使用説明書に従ってＫＡＰＡ  ＳＹＢＲ  ＦＡＳＴ  ｑＰＣＲ  ｋｉｔ（ＫＡＰＡ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ  ＃ＫＫ４６５１） を使用した、転写産物量の定量化のためのＲＴ−ｑＰＣＲが設計された。手短に言えば、反応は、１μＬのｃＤＮＡおよび以下のサイクル条件を使用して、２０μＬの最終的な体積で実行された。すなわち、３分、−９５℃の活性化、２秒、−９５℃の変性、２０秒、−５７℃のアニーリングおよび延長、２５サイクル、６５℃から９５℃までの融解上昇（ｍｅｌｔｉｎｇ  ｒａｍｐ）。データはＢｉｏ−Ｒａｄ  ＣＦＸ−Ｍａｎａｇｅｒ  １．６ソフトウェアによって処理された。標的遺伝子の相対的定量化が、Ｐｆａｆｆｌ法に従って、１８Ｓハウスキーピング遺伝子に対する交差閾値の差分（ΔＣｔ）、および全ＲＮＡサンプルに対して算出された相対ΔΔｃｔを算出して決定された。
【０１９０】
図１５のｃに報告される正規化された倍率変化比が、処理されたサンプルのΔΔＣｔと処理されていないサンプルのΔΔＣｔとの間の比として決定された。全ＲＮＡおよび対照（ｍＰビーズΔＣｔ）に対して算出された相対ΔΔＣｔに対し、交差閾値の差分（ΔＣｔ）が決定された。
【０１９１】
マウス脳溶解物の調製
【０１９２】
以前にＬｕｎｅｌｌｉ  Ｌ．ら（２０１６）６８において説明されたようにマウス脳溶解物が調製された。
【０１９３】
一般式（Ｉ）に対するその他の化学修飾
【０１９４】
好ましい実施形態において「Ａ」は、アルキン残基、アジド残基、またはビオチン残基であり得る。一般式（Ｉ）において「Ａ」を「Ｌ」と結合させる化学は、ジェフアミンに対して結合しているビオチン−ＮＨＳについて以前に説明されたように、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルとジェフアミンユニットの１級アミノ基との間の化学反応に基づいている。我々は、アジドおよびアルキン化学基を結合させるために同じ化学を使用した。
【０１９５】
３ＰＰと呼ぶアルキン−３Ｐ分子の合成（スキームＶ−Ｖａ）
0006687282.tif 000018
【０１９６】
アルキン残基を有する分子が、市販の前駆物質（例えば、アルキン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル、＃７６４２２１、Ｓｉｇｍａ；アルキン−ＰＥＧ５−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル、＃７６４１９１、Ｓｉｇｍａ）から選択される。ジェフアミン（７ｍｍｏｌ）が、５００ｍＬのアセトニトリル（ＭｅＣＮ、Ｓｉｇｍａ  ＃３４８８８）に溶解された。３ｍｍｏｌのアルキン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル（アルキン−ＮＨＳ）がＤＭＦ（１０ｍＬ）に溶解された。この溶液が滴下漏斗中に加えられた。その後、アルキン−ＮＨＳ溶液は、ジェフアミン溶液に滴下して加えられ、Ｎ２下で０−５℃において、一晩撹拌された。気化後、生成物がＭｅＣＮ中で再懸濁され、分取ＨＰＬＣによって精製された。全長分子の合成は、ＣＤＩと反応させておいたジェフアミン結合されたピューロマイシンに対してこの化合物を添加することによって実現された。後者の化合物は、段落「３Ｐ分子の化学合成」（材料および方法）の段階３において調製される。後者の手順は、この材料に対する精製手順も含む。
【０１９７】
３ＰＰの追加的な合成経路がスキームＶａに説明される。
0006687282.tif 000019
【０１９８】
１の合成（スキームＡ）
【０１９９】
２−［２−（２−アミノエトキシ）エトキシ］エタンアミン（４４０ｍＬのクロロホルム中１０モル当量）が、温度を４℃に維持しながらクロロホルム溶液中でＢＯＣ無水物によって処理された。３０分後、ゆっくりと温められ、１５−１８℃において撹拌された。有機溶液が飽和重炭酸塩で洗浄され、その後、飽和食塩水で洗浄され、最後にＭｇＳＯ４で乾燥された。４０℃における真空中（ｉｎ  ｖａｃｕｏ：ｉｖ）での気化により、澄んだ油状物として、所望のモノＢｏｃ保護されたアミンを生じる（１、６．８６ｇ、８０．４％）。ＣＤＣｌ３中の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルは、化合物１の構造と一致する。
0006687282.tif 000020
【０２００】
２の合成（スキームＢ）
【０２０１】
アミン（１）（２ｇ、ＭｅＣＮ溶液）が、ＥＤＣＩ．ＨＣｌを使用して、１８℃において週末にかけて撹拌することにより、１モル当量のヘプタ−６−イン酸に結合された。原料が４０℃にて真空中で気化され、ＥｔＯＡｃに溶解され、水、０．５ｍＭのＨＣｌ、水と飽和ＮａＨＣＯ３によって順番に洗浄された。有機部分がＭｇＳＯ４で乾燥され、澄んだ無色の油状物として、所望のアミドを生じた（２、２．３８ｇ、８２．９％）。ＣＤＣｌ３中の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルは、化合物２の構造と一致する。
0006687282.tif 000021
【０２０２】
３の合成（スキームＣ）
【０２０３】
２５℃にて撹拌されたＢｏｃアミン（２）の溶液（４８ｍＬのジクロロメタン中２．３８ｇ）に対して純粋なトリフルオロ酢酸（１０モル当量、ＴＦＡ）が滴下して加えられ、４２時間にわたって維持された。温度は４５℃まで上げられ、完全に２が見えなくなるまで維持された。標準的な検査の後、澄んだ無色の油状物としてアミンＴＦＡ塩（３、１００％）が得られた。最終的な質量は収量１００％を超えた。ＣＤＣｌ３中の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルは、化合物３の構造と一致する。
0006687282.tif 000022
【０２０４】
４の合成（スキームＤ）
【０２０５】
ピリジン（２１ｍＬ）中の０．８３７ｇのＣＤＩが、温度を５℃よりも低く維持して、１モル当量のアミン（１）（１．２８ｇ、７３ｍＬのジクロロメタン）に対して滴下して加えられた。この溶液は温められ、１モル当量のピューロマイシン２ＨＣｌ（２．９９７ｇ）によって２時間にわたって還流され、灰色がかった白色の粘着性の固体として所望の尿素を生じた（４、２．６４ｇ、６８．６％）。ＤＭＳＯｄ６中の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルは、化合物４の構造と一致する。
0006687282.tif 000023
【０２０６】
５の合成（スキームＥ）
【０２０７】
このＢｏｃアミン（４）（５３ｍＬのジクロロメタン中２．６４ｇ）が、１０モル当量の純粋なＴＦＡ（２．６６ｍＬ）によって脱保護され、澄んだ無色の油状物としてアミンＴＦＡ塩（５、〜６０％）を生じた。ＴＦＡの存在に起因して、最終的な質量は１００％の質量収量を超えた（スキームＸ）。脱保護は、プリン部分の開裂を伴った。そのため、反応は５７％の所望の生成物、２６％のＳＭにて停止された（ＬＣＭＳにより）。塩基を取り除き、（５）を精製する試みは分解につながる。
0006687282.tif 000024
【０２０８】
６の合成（スキームＦ）
【０２０９】
Ｎ２下、０−５℃において、ＣＤＩがピリジン（１０ｍｌ）中で撹拌された。ピリジン中のアミンＴＦＡ塩（３）は１０分を超えて充填され、ＬＣＭＳがイミダゾール中間体の完全な形成を示すまで、混合物は室温まで暖まることを許された。ピリジン中の粗製ピューロマイシンアミンＴＦＡ塩（５）の溶液が１分を超えて充填された。生じた混合物が室温まで温められ、所望の生成物（５７％の変換）の形成が失速したように見えるまで、ＬＣＭＳによって〜２４時間にわたって反応がモニタリングされた。混合物が検査され、所望の生成物が溶出するまで、２−２０％のＭｅＯＨ／ＤＣＭによって溶出するシリカでのカラムクロマトグラフィにより精製された。気化された生成物はＭｅＣＮ中で粉砕され、ベージュ色の固体として３ＰＰを生じ（１０１ｍｇ）、混合されたフラクションおよび母液のさらなる精製後に２番目の産出物を生じた（２７．４ｍｇ）。どちらの産出物とも品質制御（＞９２％、ＬＣ＿ＭＳ解析による）を満たした。
0006687282.tif 000025
【０２１０】
生成物３ＰＰのＮＭＲおよびＬＣＭＳデータ
【０２１１】
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δ＝８．４３（Ｓ、１Ｈ）、８．２３（Ｓ、１Ｈ）、８．０９（ｄ、Ｊ＝７．７、１Ｈ、ＣＯＮＨ）、７．８３６（ｔ、Ｊ＝５．６、１Ｈ、ＣＯＮＨ）、７．１１（ｄ、Ｊ＝８．６、２Ｈ）、６．８３（ｄ、Ｊ＝８．６、２Ｈ）、６．１６（ｍ、２Ｈ）、５．９７（ｍ、３Ｈ）、５．１６（ｔ、Ｊ＝５．３Ｈｚ、１Ｈ）、４．４３（ｍ、２Ｈ）、３．９２（ｍ、１Ｈ）、３．７２（ｓ、３Ｈ）、３．６５−３．０３（一連のｍ）、２．８６（ｄｄ、Ｊ＝５．５、１４．４、１Ｈ）、２．７３（ｔ、Ｊ＝２．７、１Ｈ、−Ｃ≡ＣＨ）、２．７０（ｄｄ、Ｊ＝８．５、１４．４、１Ｈ）、２．１４（ｄｔ、Ｊ＝２．７、７．０、２Ｈ、ＣＨ２−Ｃ≡）、２．０７（ｔ、Ｊ＝７．３Ｈｚ、２Ｈ、ＮＨＣＯ−ＣＨ２−Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ｃ≡）、１．５４（ｍ、２Ｈ、−ＣＨ２−Ｃ−Ｃ−Ｃ≡）、１．４０（ｍ、２Ｈ、−ＣＨ２−Ｃ−Ｃ≡）。
【０２１２】
ＨＰＬＣ−ＭＳによって純度（＞９０％）を確立した。特に、ＥＳＩ（−）負イオンモードにおいて観測されたｍ／ｚ  ９２７．５における［Ｍ−Ｈ］−は、その分子式がＣ４３Ｈ６５Ｎ１１Ｏ１２と一致する。また、ＥＳＩ（＋）正イオンモードにおいて観測されたｍ／ｚ  ９５１．４における［Ｍ＋Ｎａ］＋は、その分子式がＣ４３Ｈ６６Ｎ１１ＮａＯ１２＋と一致する。
【０２１３】
アジド−３Ｐ分子の合成
アジド残基を有する分子が、市販の前駆物質（例えば、アジド−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル、＃８８９０２、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）から選択される。ジェフアミン（７ｍｍｏｌ）が、５００ｍＬのアセトニトリル（ＭｅＣＮ、Ｓｉｇｍａ  ＃３４８８８）に溶解された。３ｍｍｏｌのアジド−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル（アジド−ＮＨＳ）がＤＭＦ（１０ｍＬ）に溶解された。この溶液が滴下漏斗中に加えられた。その後、アジド−ＮＨＳ溶液は、ジェフアミン溶液に滴下して加えられ、Ｎ２下で０−５℃において、一晩撹拌された。その後、生成物が分取ＨＰＬＣによって精製される。その後、全長分子の合成は、段落「３Ｐ分子の化学合成」（材料および方法）の段階３から開始することができる。
【０２１４】
固体表面の官能化および官能化された（レセプタ様の）固体表面への分子の結合（スキームＶＩおよびＶＩＩ）
アジドおよびアルキン官能基は、一般式（Ｉ）の「Ａ」部分において交換可能であるので、本明細書にて、我々は、表面官能化のための２つの異なる経路
−経路Ａ（アジド−３Ｐ分子を結合する固体表面のアルキン）、
−経路Ｂ（アルキン−３Ｐ分子を結合する固体表面のアジド）、
を説明する。
【０２１５】
経路Ａ
0006687282.tif 000026
【０２１６】
シリコンウエハが、水性フッ素溶液（２．５％のフッ化水素酸、１．５分）へ移される前に、熱ピラニア溶液（１００℃、硫酸３ｖｏｌに対して質量で３０％の水性過酸化水素１ｖｏｌ）中で３０分間にわたってクリーニングされる。続いて、これらのサンプルは、シュレンクフラスコから完全に空気を除くように十分に注意しながら、１，８−ノナジイン（Ｓｉｇｍａ、＃１６１３０６）の脱気されたサンプルへと移される。このサンプルは、１７０℃に設定されたオイルバス中に３時間にわたって反応槽が浸漬されていた間、アルゴンの流れの下に維持される。その後、フラスコは雰囲気に対して開かれる。そして、官能化された表面のサンプルを、解析するかまたは置換されたアジド種とさらに反応させるかのいずれかの前に、大量のクロロホルム、酢酸エチル、その後エタノールで連続してリンスした。
【０２１７】
典型的なクリック法において、アルキン官能化されたシリコン表面を含む反応バイアルに対し、（ｉ）１０ｍＭのアジド（Ｒ−Ｎ３、ここでＲはアジド３Ｐ−分子である）、エタノール／水１：１、（ｉｉ）硫酸銅（ＩＩ）・五水和物（アジドに対して１ｍｏｌ％）、および（ｉｉｉ）アスコルビン酸ナトリウム（アジドに対して２５ｍｏｌ％）が加えられる。反応は、反応環境から空気を除くことなく、室温で実行され、１７から１８時間後に停止される。調製された表面結合の［１，２，３］−トリアゾールサンプルが、大量の酢酸エチル、エタノール、および水によって連続してリンスされ、その後解析される。
【０２１８】
代替的に、アルキン残基によって官能化された市販の固体表面が、アジド官能化された分子を一般式（Ｉ）と共有結合させるために使用される。アルキンアガロースビーズ（＃ＣＬＫ−１０３２−２、Ｊｅｎａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）またはアルキン磁気ビーズ（ＣＬＫ−１０３５−１、Ｊｅｎａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）が、この分子を共有結合的に付着させるための効率的なマトリクスである。
【０２１９】
経路Ｂ
【０２２０】
シリコンウエハが、商用のクリーニングチャンバ中で、２０分間、超音波処理およびＵＶ／オゾン雰囲気に露出される。トルエン中の１１−ブロモウンデシルトリクロロシラン（代替的に（３−ブロモプロピル）トリクロロシランが使用され得る、Ｓｉｇｍａ、＃４３７８０８）の１ｍｍｏｌ溶液中にこれらのウエハを４５分間浸漬することによって、単分子層が吸着される。吸着質溶液から除去した後、これらのウエハは、トルエン中で超音波処理され、物理吸着した多分子層を除去するために、トルエンを染み込ませた織物によって穏やかにスクラブ処理され、トルエン、アセトン、およびエタノールでリンスされる。最後に、これらはエタノール中で超音波処理され、そして、高純度の窒素中で送風乾燥される。室温において４８時間にわたりＤＭＦ中のアジ化ナトリウムの飽和溶液中にウエハを浸漬し、これに続いて、蒸留水、エタノール、アセトン、およびトルエンによって完全にリンスすることによって、アジド基に対する臭素の交換が実行される。
【０２２１】
粉末の基質に対するものと同様なやり方で、１ｍＬの適切な末端アルキン（Ｒ−ＣＣＨ、ここでＲはアルキン３Ｐ−分子である）中に２４時間にわたってウエハを浸漬することによって、アジド官能化されたウエハによる付加環化反応が実行される。
0006687282.tif 000027
【０２２２】
代替的に、一般式（Ｉ）のアルキン官能化された分子が、アジド残基で官能化された市販の磁気ビーズ（＃ＣＬＫ−１０３６−１、Ｊｅｎａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）と共有結合的に結合され得る。
【０２２３】
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【０２２４】
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【配列表】
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