(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルス様粒子を含む免疫誘導剤であって、
前記ウイルス様粒子が、
・SV40由来の外殻タンパク質VP1と、抗原結合タンパク質とを含み、
・前記外殻タンパク質VP1が前記ウイルス様粒子の外殻を構成し、前記抗原結合タンパク
質が前記外殻内に内包されており、
・前記抗原結合タンパク質が、抗原と、SV40由来の殻内ペプチドVP2及び／又はVP3との融合タンパク質であり、
・前記抗原に対する抗体の産生及び細胞傷害性Ｔ細胞を誘導する、
前記免疫誘導剤。
【請求項２】
固形製剤、半固形製剤、液状製剤、注射剤又は坐剤の形態にある、請求項１に記載の免疫誘導剤。
【請求項３】
経口投与、経鼻投与、鼻内投与、口腔投与、注腸投与、腹腔内注射、皮下注射、静脈内注射、筋肉内注射、組織の間隙の空間への注射又は経皮的投与により投与される、請求項１又は２に記載の免疫誘導剤。
【請求項４】
前記VP1が、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する、請求項１〜３のいずれか１つに記載の免疫誘導剤。
【請求項５】
抗原に対する抗体の産生及び細胞傷害性Ｔ細胞を誘導する免疫誘導剤の製造方法であって、
SV40由来の外殻タンパク質VP1と、抗原結合タンパク質とを混合することにより、ウイルス様粒子を調製する工程を含み、
前記外殻タンパク質VP1が前記ウイルス様粒子の外殻を構成し、前記抗原結合タンパク質が、抗原と、SV40由来の殻内ペプチドVP2及び／又はVP3との融合タンパク質であって前記外殻内に内包されている、
ウイルス様粒子を含む免疫誘導剤の製造方法。
【請求項６】
前記調製工程の前に
前記外殻タンパク質をコードするDNAと、前記抗原結合タンパク質をコードするDNAとを宿主細胞に導入し、前記宿主細胞に前記外殻タンパク質と前記抗原結合タンパク質とを発現させることにより、前記外殻タンパク質と前記抗原結合タンパク質とを取得する工程、
を含む、請求項５に記載の製造方法。
【請求項７】
前記宿主細胞が、昆虫細胞、大腸菌、酵母、植物細胞からなる群より選択される、請求項６に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫誘導剤およびその製造方法に関する。より具体的には、本発明は、その外殻に抗原を内包するウイルス様粒子を含む免疫誘導剤およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ウイルス様粒子（Virus Like Particle）を用いて細胞障害性T細胞(CTL)を誘導し、ウイルス性疾患やがんを治療できることが知られている。たとえば、特許文献１には、SV40のVP1のループ領域にCTLエピトープを導入し、それを発現させて得られたウイルス様粒子を免疫することでCTLエピトープ特異的なCTLを誘導できることが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】米国特許出願公開第２０１４−０２８６９７８号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかし、特許文献1では、VP1の特定領域にエピトープを組み込む必要があるため、エピトープが公知の抗原しか用いることができない。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、鋭意検討の結果、その外殻に抗原を内包するウイルス様粒子を用いても生体の免疫反応を誘導できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００６】
すなわち、本発明によれば、ウイルス様粒子を含む免疫誘導剤であって、前記ウイルス様粒子が、ウイルス由来の外殻タンパク質と、抗原結合タンパク質とを含み、前記外殻タンパク質が前記ウイルス様粒子の外殻を構成し、前記抗原結合タンパク質が前記外殻内に内包されており、前記抗原に対する生体の免疫作用を誘導する、前記免疫誘導剤が提供される。
【０００７】
また、本発明によれば、抗原に対する生体の免疫作用を誘導する免疫誘導剤の製造方法であって、ウイルス由来の外殻タンパク質と、抗原結合タンパク質とを混合することにより、ウイルス様粒子を調製する工程を含み、前記外殻タンパク質が前記ウイルス様粒子の外殻を構成し、前記抗原結合タンパク質が前記外殻内に内包されている、ウイルス様粒子を含む免疫誘導剤の製造方法が提供される。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によると、エピトープが公知であるか未知であるかに拘らず、特定の抗原に対する生体の免疫反応を誘導できる免疫誘導剤が提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】ウイルス様粒子の一例の模式図である。
【図２Ａ】組換えバキュロウイルスに感染した昆虫細胞から精製されたVLPにおいてVP2-M1およびwt VP1が存在することを示すSDS-PAGEの写真である。
【図２Ｂ】VP2-M1/wt SV40 VP1 VLPが形成されていることを示す電子顕微鏡写真である。
【図２Ｃ】昆虫細胞から精製したVP2-M1/wt SV40 VP1 VLPを投与されたマウスの脾臓から得たリンパ球について行ったICS解析の結果を示す図である。
【図３】pM01ベクターのベクターマップである。
【図４Ａ】VP2-M1/wt SV40 VP1 VLPを含むカイコ蛹磨砕液(リン酸緩衝液ベース)を腹腔内投与されたマウスの脾臓から得たリンパ球について行ったICS解析の結果を示す図である。
【図４Ｂ】VP2-M1/wt SV40 VP1 VLPを含むカイコ蛹磨砕液(Tris緩衝液ベース)を腹腔内投与されたマウスの脾臓から得たリンパ球について行ったICS解析の結果を示す図である。
【図４Ｃ】VP2-M1/wt SV40 VP1 VLPを含む加熱処理カイコ蛹磨砕液(リン酸緩衝液ベース)を腹腔内投与されたマウスの脾臓から得たリンパ球について行ったICS解析の結果を示す図である。
【図４Ｄ】VP2-M1/wt SV40 VP1 VLPを含む加熱処理カイコ蛹磨砕液(Tris緩衝液ベース)を腹腔内投与されたマウスの脾臓から得たリンパ球について行ったICS解析の結果を示す図である。
【図５】VP2-M1/wt SV40 VP1 VLPを含むカイコ蛹磨砕液(リン酸緩衝液ベース)を経鼻投与されたマウスの脾臓から得たリンパ球について行ったICS解析の結果を示す図である。
【図６Ａ】VP2-M1/wt SV40 VP1 VLPを含むカイコ蛹磨砕液(リン酸緩衝液ベース)を経口投与されたマウスの脾臓から得たリンパ球について行ったICS解析の結果を示す図である。
【図６Ｂ】VP2-M1/wt SV40 VP1 VLPを含むカイコ蛹磨砕液(Tris緩衝液ベース)を経口投与されたマウスの脾臓から得たリンパ球について行ったICS解析の結果を示す図である。
【図６Ｃ】VP2-M1/wt SV40 VP1 VLPを含む加熱処理カイコ蛹磨砕液(Tris緩衝液ベース)を経口投与されたマウスの脾臓から得たリンパ球について行ったICS解析の結果を示す図である。
【図７】VP2-M1/wt SV40 VP1 VLPを含むカイコ蛹磨砕液(リン酸緩衝液ベース)を注腸投与されたマウスの脾臓から得たリンパ球について行ったICS解析の結果を示す図である。
【図８Ａ】VP2-OVA/wt SV40 VP1 VLPを腹腔内投与されたマウスの血清中の抗OVA抗体産生測定の結果を示す図である。
【図８Ｂ】VP2-OVA/wt SV40 VP1 VLPを経鼻投与されたマウスの血清中の抗OVA抗体産生測定の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本実施形態の免疫誘導剤は、ウイルス由来の外殻タンパク質と、抗原結合タンパク質とを含むウイルス様粒子を含む。
ウイルス様粒子とは、当該技術分野において周知のように、通常はウイルスゲノムを有しない構造体である。後述の外殻タンパク質および殻内ペプチドは、ウイルスに由来するタンパク質を用いることができる。
【００１１】
本実施形態の免疫誘導剤に含まれるウイルス様粒子の一例の模式図を図１に示す。この模式図で表されるウイルス様粒子は、外殻タンパク質VP1により構成される外殻を有する。外殻には、抗原を融合させたVP2が内包されている。VP1、VP2は何れもSV40に由来する。
【００１２】
外殻タンパク質および殻内ペプチドの由来となるウイルスの種類は、少なくとも１種の外殻タンパク質と、少なくとも１種の殻内ペプチドとを有するものであれば特に限定されない。ウイルスの種類としては、例えばポリオーマウイルス属ウイルス(SV40 (Simian virus 40)、JCウイルス、BKウイルス等を含む)、パピローマウイルス科に属するウイルス(α、β、γおよびμパピローマウイルス属ウイルス等を含む)、カウドウイルス目サイフォウイルス科に属するウイルス(HK97ウイルス等を含む)、レオウイルス科に属するウイルス(イネ萎縮ウイルス(RDV)、ブルータングウイルス等を含む)およびトンブスウイルス科に属するウイルス(トマトブッシースタントウイルス(TBSV)等を含む)等が挙げられる。ウイルスは、好ましくはポリオーマウイルス属のウイルスであり、より好ましくはSV40、JCウイルス、BKウイルス等であり、SV40が特に好ましい。外殻タンパク質と殻内ペプチドとは、同じウイルスに由来することが好ましい。
【００１３】
ポリオーマウイルス属(Genus: Polyomavirus)とは、国際ウイルス分類委員会(International Committee on Taxonomy of Viruses: ICTV)により2014年に公表されたウイルス分類における一属を意味する。
ウイルス分類においては、分類の再編や属名等の改変が頻繁に行われる。よって、将来ICTVまたはそれに準ずる学術的権威機関による分類において分類が再編されたり、属名等が改変されたりしたとしても、2014年のICTV分類におけるポリオーマウイルス属に属するウイルスの各々と同じ属(Genus)に分類されるウイルスは、本明細書でいうところのポリオーマウイルス属ウイルスに包含されるものとする。
また、当該分野においては新種のウイルスが度々発見されるため、将来ICTVまたはそれに準ずる学術的権威機関により公表されるウイルス分類において、現在のポリオーマウイルス属またはそれに相当する分類群に属することとなる新種のウイルスも本明細書でいうところのポリオーマウイルス属ウイルスに包含されるものとする。
【００１４】
ポリオーマウイルス属以外に上記で挙げたウイルスの目(Order)、科(Family)、属名等も2014年に公表されたICTV分類に基づくものである。これらの定義についてもポリオーマウイルス属について述べたことと同じことがあてはまる。
【００１５】
外殻タンパク質とは、ウイルス様粒子の外殻を構成し、かつ、構成された外殻に抗原結合タンパク質を内包し得るタンパク質である。ここで、「外殻タンパク質がウイルス様粒子の外殻を構成する」とは、外殻が実質的に外殻タンパク質からなることを意味する。すなわち、外殻は、外殻タンパク質のみで構成されていてもよいし、または外殻の構造が維持される範囲において外殻タンパク質および該外殻タンパク質に結合可能なペプチドまたはタンパク質で構成されていてもよい。例えば、野生型SV40ウイルスの外殻はVP1五量体ユニットが72個集合することによって構成され、構成された外殻の内側にはVP2およびVP3が裏打ちとして結合しているが、SV40のVP1は、VP2やVP3がなくてもそれだけで外殻を構成することが可能である。つまり、本実施形態において、外殻タンパク質は、SV40 VP1のように、実質的にそれらだけで外殻を構成し得るタンパク質を意味する。外殻タンパク質は、ウイルス由来の全長アミノ酸配列のうち外殻形成に最低限必須のアミノ酸配列を少なくとも含むペプチドまたはタンパク質であり得るが、全長アミノ酸配列を有するタンパク質であることが好ましい。このような外殻タンパク質としては、例えばポリオーマウイルス属、パピローマウイルス科、カウドウイルス目サイフォウイルス科、レオウイルス科およびトンブスウイルス科に属するウイルスの外殻タンパク質、より具体的にはポリオーマウイルス属ウイルスであるSV40 (Simian virus 40)やJCウイルス等のVP1、パピローマウイルス科に属するウイルスのL1、イネ萎縮ウイルス(RDV)のP8等が挙げられる。外殻形成に最低限必須のアミノ酸配列を少なくとも含むペプチドまたはタンパク質としては、例えばトマトブッシースタントウイルス(TBSV)由来のβ-アニュラス構造を形成する24マーのペプチド等が挙げられる。外殻タンパク質は、より好ましくはポリオーマウイルス属ウイルスの外殻タンパク質、更に好ましくはSV40、JCウイルス、BKウイルス等の外殻タンパク質であり、SV40 VP1であることが特に好ましい。外殻タンパク質は、１種以上であり得る。
【００１６】
なお、SV40のVP2やVP3のように、野生型ウイルスにおいてその外殻を構成するメンバーであるが、それらだけで外殻を構成し得ないタンパク質は、本実施形態においては、以下で説明する「殻内ペプチド」に包含され得る。しかしながら、上記のことは、SV40のVP2やVP3のような「殻内ペプチド」を含む他の物質が、外殻の構成要素から排除されることを意味するものではなく、このような他の物質は、外殻を構成する非必須のメンバーであるか、または何らかの形で外殻の形成に関与していてもよい。
「内包」とは、抗原結合タンパク質中の少なくとも抗原が、外殻タンパク質によって形成される外殻の内側に存在する状態をいう。
【００１７】
外殻タンパク質は、野生型ウイルスのものと完全に同一のアミノ酸配列を有している必要はなく、外殻形成に支障がなく、かつ、形成された外殻に抗原結合タンパク質を内包し得る限り、アミノ酸配列が変異していてもよい。ここで、アミノ酸配列の変異とは、野生型の配列に比べてアミノ酸残基の１つ又は複数が置換、欠失、または付加されていることを意味する。外殻タンパク質は、その自己集合化能により外殻を形成するものであってもよいし、宿主に内在する因子の作用によって外殻を形成するものであってもよい。外殻タンパク質は、単量体のまま外殻を形成するものであってもよいし、多量体から構成される外殻形成ユニット(カプソメア)を形成し、それが集合することによって外殻を形成するものであってもよい。外殻タンパク質は、好ましくは２〜10量体、より好ましくは３〜５量体のカプソメアが50〜500個程度集合して外殻を形成するものである。外殻タンパク質は、天然のタンパク質を抽出・精製したものであってもよいし、遺伝子工学的手法などにより人工的に合成されたものであってもよい。
【００１８】
外殻の形状は特に限定されない。球状であってもよいし、管状であってもよい。外殻は、たとえば、正八面体〜正二十面体の略球状である。
外殻が外殻タンパク質の単量体から構成される場合、１つの外殻を構成する単量体の数は特に限定されないが、好ましくは100〜1000個、より好ましくは150〜500個である。
外殻がカプソメアから構成される場合、１つの外殻を構成するカプソメアの数は、好ましくは50〜390個、より好ましくは72〜260個である。
外殻の直径は、特に限定されないが、好ましくは30〜300 nm、より好ましくは45〜200 nmである。
【００１９】
抗原結合タンパク質は、抗原と殻内ペプチドとの融合タンパク質である。抗原結合タンパク質は、所望の抗原のアミノ酸配列と、ウイルス由来の殻内ペプチドのアミノ酸配列とを含む。殻内ペプチドは、本実施形態のウイルス様粒子を構成するものであれば特に限定されない。殻内ペプチドは、ウイルス由来の全長アミノ酸配列のうち、本実施形態のウイルス様粒子を構成するために必要なアミノ酸配列を少なくとも含む。殻内ペプチドは、好ましくは、全長アミノ酸配列を有する。殻内ペプチドとしては、例えばSV40 (Simian virus 40)やJCウイルス等のVP2およびVP3、パピローマウイルス科に属するウイルスのL2、RDVのP3等が挙げられる。上記のウイルス由来の全長アミノ酸配列のうち、本実施形態のウイルス様粒子を構成するために必要なアミノ酸配列を少なくとも含むペプチドとしては、例えば配列番号８のアミノ酸配列からなるペプチド(具体的にはSV40のVP2およびVP3に共通のVP1結合ドメインからなるペプチド)等が挙げられる。より好ましくは、殻内ペプチドは、配列番号９のアミノ酸配列を有するタンパク質であり、更に好ましくは配列番号９又は１１のアミノ酸配列からなるタンパク質(具体的には、それぞれSV40のVP3およびVP2；核酸配列はそれぞれ配列番号１０および１２に示す)である。殻内ペプチドは、１種以上であり得る。
【００２０】
殻内ペプチドは、野生型ウイルスのものと完全に同一のアミノ酸配列を有していてもよいし、本実施形態のウイルス様粒子を構成する限り、アミノ酸配列が変異していてもよい。殻内ペプチドは、外殻タンパク質の内側に外殻の裏打ちを形成するように結合するものであってもよいし、外殻タンパク質に結合することなく外殻に内包化されるものであってもよいし、例えばRDVのP3のように外殻の内側に内殻を形成するものであってもよい。なお、このような内殻を形成する殻内ペプチドを用いる実施形態においては、外殻内に存在する限り、「殻内」の用語が用いられる。また、殻内ペプチド以外の物質が内殻を形成する場合、殻内ペプチドが内殻内および内殻外の何れに存在しても、殻内ペプチドが外殻内に存在する限り、「殻内」に存在する、という。殻内ペプチドの一部は、外殻から露出していてもよい。殻内ペプチドには、例えば抗原結合タンパク質の発現を確認するためのタグ、例えばFLAGタグ等が付加されていてもよい。
【００２１】
好ましい実施形態において、ウイルスは、ポリオーマウイルス属SV40である。この実施形態では、外殻タンパク質はVP1であり、抗原結合タンパク質はVP2および／またはVP3と抗原との融合タンパク質である。VP1はメジャーカプシドタンパク質、VP2およびVP3はマイナーカプシドタンパク質とも呼ばれる。SV40のVP1ならびにVP2および/またはVP3を用いる場合、VP2およびVP3は、外殻タンパク質VP1の内側に外殻の裏打ちを形成するように結合する。一般に、ウイルスの外殻がしばしばカプシドと称されるため、SV40のVP2およびVP3等のように外殻形成に関与するタンパク質は広義には外殻タンパク質であるとも解され得る。しかしながら、本実施形態においては、SV40のVP1のように、それ自体で外殻そのものを構成するタンパク質を「外殻タンパク質」と称する。つまり、一般に外殻タンパク質またはカプシドタンパク質と称され得るタンパク質であっても、SV40のVP2およびVP3のように、本明細書においては「殻内ペプチド」に包含される場合がある。本実施形態では、VP2および／またはVP3に抗原を結合させることにより、抗原を外殻に内包させることが可能である。
【００２２】
抗原の種類は特に限定されず、ポリペプチド、糖鎖、核酸、脂質などが例示される。ただし、本明細書において、外殻タンパク質および殻内ペプチドは「抗原」に含まれない。これらのうち、ポリペプチドが好ましい。抗原としてポリペプチドを用いた場合は、遺伝子工学的に抗原と殻内ペプチドとを含む融合タンパク質を容易に生産することができる。また、抗原としては、病原体に由来するポリペプチドを用いることが好ましい。病原体に由来するポリペプチドは、全長ポリペプチドであってもよいし、一部の配列のみを含むポリペプチドであってもよい。例えば、インフルエンザウイルスのHA、NA、M1、M2、NP、NS1、NS2、PA、PB1、PB2、PB1-F2など、HIVのGag、Pol、Env、Tat、Nef、Revなど、C型肝炎ウイルス(HCV)のE1、E2、Core、NS2、NS3、NS4、NS5など、パピローマウイルス科に属するウイルスのE6、E7など、癌細胞に特異的なタンパク質であるMelan-A/MART-1、gp100、MAGEA3、MAGE-A10、CEA、HER2/new、NY-E50-1、WT-1、hTERTなどが挙げられる。これらの中では、インフルエンザウイルスのM1、NP、NS1、PA、PB1、PB2、癌細胞に特異的なタンパク質であるHER2/new、WT-１、MAGE-A3などが好ましい。
【００２３】
抗原は、ウイルス様粒子の外殻に内包されるように、殻内ペプチドに結合している。従来、外殻タンパク質が外殻を形成したときに当該外殻の外側に露出される上記外殻タンパク質中の部分に抗原エピトープを組み込んだウイルス様粒子(具体的には、SV40 VP1のDEループ又はHIループにエピトープを組み込んだウイルス様粒子)が知られている(特許文献１)。この場合、組み込まれる抗原エピトープのアミノ酸長が長すぎると外殻構造が破壊され得ることやエピトープを外殻タンパク質の特定領域に組み込む必要があること等から、現実的にはエピトープが短く(５〜15アミノ酸程度)、かつ、その配列が公知の抗原しか用いることができない。一方、本実施形態では、外殻に抗原を内包させるため、従来のエピトープを外殻構造中に組み込む方法と比較して、より長いアミノ酸長を有する抗原を内包させることが可能となり、全長の抗原を用いることもできる。しかも、抗原に対してアジュバントを加えることなく、免疫誘導することが可能である。このことは、本発明者らが意外にも見出した観点である。
【００２４】
抗原のサイズは、外殻に内包され得る限り特に限定されない。抗原のサイズは、好ましくは200〜600アミノ酸長である。
【００２５】
抗原と殻内ペプチドとを融合させる方法は特に限定されず、当業者に公知の方法、例えば遺伝子組換え技術等を用いることができる。抗原と殻内ペプチドとは、当業者に公知の１以上のリンカー、例えばGGGGSリンカーを介して融合させてもよい。
【００２６】
本実施形態の免疫誘導剤は、ウイルス様粒子の外殻に内包された抗原に対する生体の免疫作用を誘導する。ここで、「免疫作用を誘導する」とは、抗体や細胞傷害性T細胞を誘導することにより、生体の免疫を活性化することをいう。たとえば、疾患(がん等)の発症前または病原体(ウイルス等)への感染前に生体に投与して抗体を産生させる作用および/またはメモリーCTLを誘導する作用を増強し、将来の疾患を予防すること（予防ワクチンとして用いること）、疾患(がん、感染症等)を有する生体に投与することによって、生体の細胞傷害性T細胞（CTL）を誘導し、疾患を治療すること（免疫療法のために用いること）などが挙げられる。
【００２７】
免疫誘導剤は、ウイルス性疾患の予防又は治療用ワクチンや各種癌の予防又は治療用ワクチンとして使用できる。具体的には、免疫誘導剤は、疾患、例えば感染症(インフルエンザ、免疫不全症候群、C型肝炎等)、がん(子宮頸がん、咽頭乳頭腫等)、疣贅(尋常性疣贅、封入体疣贅、扁平疣贅等)、HPV関連表皮様嚢腫、疣贅状表皮発育異常症、尖圭コンジローマ、ボーエン様丘疹症等の予防又は治療用ワクチンとして用いることができる。
【００２８】
免疫誘導剤において、ウイルス様粒子は、当業者に公知の医薬品添加物と共に製剤化されていてもよい。このような医薬品添加物としては、限定されないが、賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、コーティング剤、カプセル基剤、可塑剤、着色剤、溶剤、安定剤、保存剤、緩衝剤、無痛化剤、基剤、乳化剤および懸濁化剤、その他矯味剤、甘味剤、吸着剤、溶解補助剤、pH調節剤、増粘剤、等張化剤、分散剤、防腐剤、湿潤剤、着香剤、抗酸化剤等が挙げられる。
【００２９】
賦形剤としては、限定されないが、例えばマンニトール、白糖、ブドウ糖、トウモロコシデンプン、結晶セルロース、リン酸水素カルシウムなどが挙げられる。
滑沢剤としては、限定されないが、例えばステアリン酸マグネシウム、タルク、コロイドシリカなどが挙げられる。
【００３０】
結合剤としては、限定されないが、例えばアラビアゴム、ヒドロキシプロピルセルロース(HPC)、ヒドロキシプロピルメチルセルロース(HPMC)、メチルセルロース(MC)、ポビドン(PVP)、ポリビニルアルコール(PVA)などが挙げられる。
崩壊剤としては、限定されないが、例えば架橋カルメロースナトリウム、カルメロースカルシウム、架橋ポビドン、カルボキシメチルスターチナトリウムなどが挙げられる。
【００３１】
コーティング剤としては、限定されないが、白糖、タルクなどの糖衣用コーティング剤、カルボキシメチルエチルセルロースなどの腸溶性コーティング剤、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテートなどの胃溶性コーティング剤などが挙げられる。
【００３２】
カプセル基剤としては、限定されないが、ゼラチンなどが挙げられる。
可塑剤としては、限定されないが、トリアセチン、中鎖脂肪酸トリグリセリドなどが挙げられる。
着色剤としては、限定されないが、食用タール色素、レーキ色素、三酸化二鉄などが挙げられる。
【００３３】
溶剤としては、限定されないが、注射用水、滅菌精製水などの水性溶剤、植物油(オリーブ油、ダイズ油、ゴマ油等を含む)などの非水性溶剤などが挙げられる。
安定剤としては、限定されないが、窒素、二酸化炭素などの不活性ガス、EDTAなどのキレート剤、L-アスコルビン酸などの還元物質などが挙げられる。
保存剤としては、限定されないが、パラオキシ安息香酸エステル、クロロブタノールなどが挙げられる。
緩衝剤としては、限定されないが、クエン酸、酢酸、リン酸などのナトリウム塩などが挙げられる。
無痛化剤としては、限定されないが、ベンジルアルコール、プロカイン塩酸塩、ブドウ糖などが挙げられる。
【００３４】
基剤としては、限定されないが、カカオ脂、ゼラチンなどの坐剤用基剤および流動パラフィン、カルナウバロウなどの軟膏用基剤などが挙げられる。
乳化剤としては、限定されないが、アラビアゴム、ポリソルベート、ラウリル硫酸ナトリウムなどが挙げられる。
懸濁化剤としては、限定されないが、アラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、トラガント、モノステアリン酸アルミニウムなどが挙げられる。
【００３５】
免疫誘導剤は、それ自体で十分な免疫誘導効果を有するので、アジュバントを含まなくてもよいが、含んでいてもよい。免疫誘導剤がアジュバントを含む場合、使用するアジュバントとしては、水酸化アルミニウムゲル、完全フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバント、百日咳菌アジュバント、ポリ(I,C)、CpG-DNA等が挙げられる。
【００３６】
免疫誘導剤は、固形製剤、半固形製剤、液状製剤、注射剤、坐剤、その他当業者に公知の製剤形態のいずれであってもよい。具体的な剤形としては、限定されないが、例えば錠剤、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤、トローチ剤、注射剤、液剤、エリキシル剤、シロップ剤、リモナーデ剤、坐剤、軟膏剤、懸濁剤、乳剤、リニメント剤、ローション剤、経皮吸収型製剤、貼付剤、パップ剤、エアゾール剤などが挙げられる。
【００３７】
液状製剤は、たとえば、ウイルス様粒子を発現した宿主細胞からウイルス様粒子を抽出し、必要に応じて適切な溶媒で希釈することにより調製される。
懸濁剤は、たとえば、ウイルス様粒子を発現した宿主細胞をホモジナイズして得られたホモジネートを精製し、必要に応じて抽出、精製、溶媒による希釈などにより調製される。具体的には、カイコなどの鱗翅目昆虫固体を宿主とした場合、ウイルス様粒子を発現した個体を摩砕し、粗精製して調製され得る。
【００３８】
免疫誘導剤の投与経路は、特に限定されないが、例えば経口投与、経粘膜投与(例えば経鼻投与、鼻内投与、口腔投与及び注腸投与等)、非経口的投与(例えば腹腔内注射、皮下注射、静脈内注射、筋肉内注射、組織の間隙の空間への注射等)、経皮的投与等が挙げられる。即ち、本実施形態の免疫誘導剤は、負担の大きい注射等による投与だけでなく、経口での摂取、点鼻薬での投与、浣腸など負担の少ない投与も可能である。例えば、免疫誘導剤を動物の餌に混入させることによって、動物用ワクチンとして用いることができる。
【００３９】
免疫誘導剤の投与量および投与回数は、抗原の種類、投与対象の動物種、投与対象の症状、年齢、体重、投与形態等に応じて当業者が適宜設定できるが、通常0.01μg〜100mg、好ましくは0.1μg〜50mg、より好ましくは1.0μg〜10mgであり、これを数日ないし数月に１回投与するのが好ましい。
【００４０】
免疫誘導剤は、生体、より具体的にはヒトやヒト以外の動物(ヒト以外のほ乳類、鳥類、は虫類など)を投与対象とすることができる。ヒト以外の動物としては、例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ニワトリ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウサギ、サルなどを挙げることができる。
【００４１】
本実施形態の免疫誘導剤は、免疫誘導の観点から薬理学的に有効な量のウイルス様粒子を含有する医薬組成物である。ウイルス様粒子は、投与した際に医学的に許容できる副作用が生じてもよいが、投与対象の動物にとって病原性がなく、副作用が生じないことが好ましい。
本実施形態の免疫誘導剤は、当業者に公知の方法に従ってウイルス様粒子を調製し、必要に応じて医薬的に許容される賦形剤等と混合して製剤化することによって製造することができる。
【００４２】
ウイルス様粒子の調製は、例えば、ウイルス由来の外殻タンパク質と、抗原結合タンパク質とを混合することによって行うことができる。混合条件は、当業者が適宜設定できる。外殻タンパク質と抗原結合タンパク質とを混合することにより、抗原結合タンパク質は外殻タンパク質によって形成される外殻に内包化される。
【００４３】
ウイルス様粒子を調製する前に、外殻タンパク質をコードするDNAと、抗原結合タンパク質をコードするDNAとを宿主細胞に組み込み、前記宿主細胞に前記外殻タンパク質と前記抗原結合タンパク質とを発現させることにより、前記外殻タンパク質と前記抗原結合タンパク質とを取得してもよい。これらのタンパク質の取得は、当業者に公知の方法、例えば遺伝子組換え等によって行うことができる。
【００４４】
宿主細胞は、ウイルス様粒子の形成に支障がない限り特に限定されない。宿主細胞は、例えば昆虫細胞（カイコのような昆虫個体を含む）、大腸菌、酵母、植物からなる群より選択される。宿主細胞は、好ましくは昆虫細胞、より好ましくは鱗翅目昆虫個体、さらに好ましくはカイコである。
【００４５】
宿主細胞において外殻タンパク質および抗原結合タンパク質を発現させる場合、ウイルス様粒子は、宿主細胞内で発現された外殻タンパク質と抗原結合タンパク質とが接触することにより調製されてもよい。あるいは、宿主細胞に対するホモジナイズ、精製、抽出などの製造過程においてウイルス様粒子が形成されてもよい。
【００４６】
宿主細胞内で形成されたウイルス様粒子は、必要に応じて回収してもよい。回収方法は特に限定されないが、主に宿主細胞の種類によって当業者が適宜選択できる。例えば、宿主細胞が昆虫細胞や大腸菌細胞等である場合には超音波処理等による細胞溶解等、宿主細胞が鱗翅目昆虫の蛹である場合には磨砕等によってウイルス様粒子を溶出させ、遠心分離後に上清を回収する方法を用いることができる。
【００４７】
好ましい実施形態では、まず外殻タンパク質をコードするDNAおよび抗原結合タンパク質をコードするDNAが組み込まれたバキュロウイルスを昆虫細胞又は昆虫個体に感染させる。次に、昆虫細胞又は昆虫個体を超音波処理または磨砕し、その後遠心分離又は濾過して上清を回収することによってウイルス様粒子を取得することができる。あるいは、外殻タンパク質をコードするDNAおよび抗原結合タンパク質をコードするDNAが組み込まれたバキュロウイルスに代えて、外殻タンパク質をコードするDNAが組み込まれた第１バキュロウイルスおよび抗原結合タンパク質をコードするDNAが組み込まれた第２バキュロウイルスを宿主細胞に感染させてもよい。
【００４８】
ウイルス様粒子は、必要に応じて精製してもよい。精製方法としては特に限定されず、例えば密度勾配遠心分離、クロマトグラフィ等の当業者に公知の方法等が挙げられる。
【００４９】
ウイルス様粒子は、必要に応じて加熱処理してもよい。加熱方法としては特に限定されず、例えば宿主細胞としてのカイコ蛹を沸騰水中でインキュベートする方法等が挙げられる。
【００５０】
製剤化は、当業者に公知の方法によって、例えばウイルス様粒子と適切な医薬品添加物とを混合し、所望の剤形に成型し、必要に応じてコーティングすることによって行うことができる。
具体的には、剤形を固形製剤、例えば錠剤とする場合には、例えばウイルス様粒子と適切な賦形剤、結合剤および/または崩壊剤とを混合し、適切な滑沢剤を添加して更に混合し、混合物を打錠し、必要に応じてコーティングすることなどによって製剤化することができる。
剤形を注射剤や液状製剤とする場合には、例えばウイルス様粒子を適切な溶剤に分散させ、必要により濾過または滅菌処理し、所定の容器に充填することなどにより製剤化することができる。
【００５１】
剤形を軟膏剤とする場合には、例えば、適切な軟膏用基剤を加温装置付き混合機中で溶融させ、加温をやめ、軟膏状に固まるまで低速で混合し、固まる直前にウイルス様粒子を加え、所定の容器に充填することなどにより製剤化することができる。
剤形を坐剤とする場合には、例えばウイルス様粒子と、予め低温で融解した適切な坐剤用基剤とを混合し、鋳型に注いで冷却し固めることなどにより製剤化することができる。
【００５２】
別の実施形態は、生体の免疫作用を誘導するためのウイルス様粒子に関する。より具体的には、ウイルス由来の外殻タンパク質と、抗原結合タンパク質とを含む、前記抗原に対する生体の免疫作用を誘導するためのウイルス様粒子であって、前記外殻タンパク質が前記ウイルス様粒子の外殻を構成し、前記抗原結合タンパク質が前記外殻内に内包されている、前記ウイルス様粒子に関する。
ウイルス様粒子、ウイルス、外殻タンパク質、外殻、抗原結合タンパク質、抗原等については上記したとおりである。
【００５３】
本実施形態のウイルス様粒子は、生体に投与することによりその外殻に内包された抗原に対する生体の免疫作用を誘導することによって、ウイルス性疾患の予防又は治療用ワクチンや各種癌の予防又は治療用ワクチンとして使用できる。したがって、上記のウイルス様粒子は、疾患、例えば感染症(インフルエンザ、HIV、C型肝炎等)、がん(子宮頸がん、咽頭乳頭腫等)、疣贅(尋常性疣贅、封入体疣贅、扁平疣贅等)、HPV関連表皮様嚢腫、疣贅状表皮発育異常症、尖圭コンジローマ、ボーエン様丘疹症等の予防又は治療用ワクチンとして用いることができる。
【００５４】
よって、別の実施形態は、疾患を治療するためのウイルス様粒子に関するということもできる。より具体的には、本実施形態は、ウイルス由来の外殻タンパク質と、抗原結合タンパク質とを含む、疾患を治療するためのウイルス様粒子であって、前記外殻タンパク質が前記ウイルス様粒子の外殻を構成し、前記抗原結合タンパク質が前記外殻内に内包されている、前記ウイルス様粒子に関する。
ウイルス様粒子、ウイルス、外殻タンパク質、外殻、抗原結合タンパク質、抗原、疾患等については上記したとおりである。
【００５５】
また、別の実施形態は、ウイルス様粒子を含む免疫誘導剤を生体に投与することを含む、生体の免疫作用を誘導する方法に関する。より具体的には、本実施形態は、ウイルス様粒子を含む免疫誘導剤を生体に投与することを含む、生体の免疫作用を誘導する方法であって、前記ウイルス様粒子が、ウイルス由来の外殻タンパク質と、抗原結合タンパク質とを含み、前記外殻タンパク質が前記ウイルス様粒子の外殻を構成し、前記抗原結合タンパク質が前記外殻内に内包されており、前記抗原に対する生体の免疫作用を誘導する、前記生体の免疫作用を誘導する方法に関する。
ウイルス様粒子、ウイルス、外殻タンパク質、外殻、抗原結合タンパク質、抗原、免疫誘導剤およびその投与方法、生体等については上記したとおりである。
【００５６】
また、別の実施形態は、ウイルス様粒子を含む免疫誘導剤を生体に投与することを含む、疾患を予防又は治療する方法に関するということもできる。より具体的には、本実施形態は、ウイルス様粒子を含む免疫誘導剤を生体に投与することを含む、疾患を予防又は治療する方法であって、前記ウイルス様粒子が、ウイルス由来の外殻タンパク質と、抗原結合タンパク質とを含み、前記外殻タンパク質が前記ウイルス様粒子の外殻を構成し、前記抗原結合タンパク質が前記外殻内に内包されており、前記抗原に対する生体の免疫作用を誘導する、疾患を予防又は治療する方法に関する。
ウイルス様粒子、ウイルス、外殻タンパク質、外殻、抗原結合タンパク質、抗原、免疫誘導剤およびその投与方法、生体、疾患等については上記したとおりである。
【００５７】
また、別の実施形態では、免疫誘導剤の製造におけるウイルス様粒子の用途に関する。
ウイルス様粒子、ウイルス、外殻タンパク質、外殻、抗原結合タンパク質、抗原、免疫誘導剤およびその投与方法、生体、疾患等については上記したとおりである。
【００５８】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。
【実施例】
【００５９】
実施例１：VP2-M1内包SV40 VP1 VLPの調製とその免疫によるFMP:58-66エピトープ特異的な細胞傷害性T細胞の誘導
【００６０】
野生型 (wt: wild type) simian virus 40 (SV40) VP1を発現するバキュロウイルスの作製
wt SV40 VP1遺伝子(配列番号１；アミノ酸配列は配列番号２に示す)をpFastBac1プラスミド(invitrogen)のSal Iサイト及びKpn Iサイトに挿入した。得られたプラスミドで、バキュロウイルスゲノムを保持する大腸菌DH10bac (invitrogen)を形質転換し、VP1を組込んだ組換えバキュロウイルスゲノムを調製した。組換えバキュロウイルスゲノムをSf-9細胞にトランスフェクションした。三日後にその上清を回収して、組換えバキュロウイルスを含む溶液とした。この溶液の一部を再び、Sf-9細胞(invitrogen)に感染させることで、組換えバキュロウイルスタイターを上昇させた。これを組換えバキュロウイルスのストック溶液とした。
【００６１】
VP2融合M1タンパク質を発現するバキュロウイルスの作製
wt SV40 VP2のアミノ末端 (N末端: amino terminus)をコードするコドンの上流にFLAGタグのコード配列(配列番号１３)を付加して更にその上流にBamHIサイトを導入した。また、wt SV40 VP2のストップコドンを除いてEcoRIサイトを導入した。得られたポリヌクレオチドをpFastBac1プラスミドのBamHIサイト、および、EcoRIサイトを介して挿入し、wt SV40 VP2遺伝子を含むプラスミドを作製した。M1タンパク質のN末端をコードするコドンの上流にGGGGSGGGGSGGGGSリンカー(配列番号３；核酸配列は配列番号１４に示す)のコード配列を導入し、更にその上流にEcoRIサイトを導入した。また、M1タンパク質コード配列の下流にストップコドンを付加して更にその下流にSal Iサイトを導入した。得られたポリヌクレオチドを、上記のwt SV40 VP2遺伝子を含むプラスミドのEcoRIサイト、および、Sal Iサイトを介して導入し、VP2コード配列の下流にM1コード配列を融合した遺伝子を保持したプラスミドを作製した。
【００６２】
このプラスミドで、バキュロウイルスゲノムを保持する大腸菌DH10bac (invitrogen)を形質転換し、wt SV40 VP2にM1を融合したタンパク質VP2-M1（配列番号４；核酸配列は配列番号５に示す）を発現する組換えバキュロウイルスゲノムを調製した。これらの組換えバキュロウイルスゲノムをSf-9細胞にトランスフェクションした。三日後にその上清を回収して、組換えバキュロウイルスを含む溶液とした。
【００６３】
上記で得られた溶液の一部を再び、Sf-9細胞に感染させることで、組換えバキュロウイルスタイターを上昇させた。これを組換えバキュロウイルスのストック溶液とした。
【００６４】
VP2-M1を含むwtSV40 VP1 VLPの調製
wt SV40 VP1を組込んだ組換えバキュロウイルス（M.O.I. (multiplicity of infection) = 0.05〜0.2）と、VP2-M1を組込んだバキュロウイルス（M.O.I. = 0.015〜0.06）とを、3x107個のSf-9細胞を撒いた15 cm 培養ディッシュ中で共感染させた(wt SV40 VP1 : VP2-M1 = 1 : 0.3の感染比率 (M.O.I.ベース))。これを計10枚作成した。感染3日後に、これら10枚のディッシュに撒いた計3x108個のSf-9細胞を回収した。PBS(-)で洗浄後、細胞を10 mlのVP1超音波処理用バッファー (20 mM Tris-HCl (pH7.9), 1% (w/vol)デオキシコール酸)で再懸濁した。その後、内在性のプロテアーゼ活性を抑制するため、2 mM フッ化フェニルメタンスルホニル (最終濃度2 μM) 、及び、キモスタチン (最終濃度1 μg/ml)、アプロチニン (最終濃度1 μg/ml)、ロイペプチン (最終濃度1 μg/ml)、アンチパイン (最終濃度1 μg/ml)、ペプスタチン (最終濃度1 μg/ml) を加えて、超音波破砕した。その後、15,000 rpm、4℃で5分間遠心分離して上清とペレットに分け、上清をライセート溶液とした。
【００６５】
塩化セシウム密度勾配遠心分離用に20% CsCl溶液 (20 mM Tris-HCl (pH7.9), 20% (w/vol) 塩化セシウム), 30% CsCl溶液 (20 mM Tris-HCl (pH7.9), 30% (w/vol) 塩化セシウム), 40% CsCl溶液 (20 mM Tris-HCl (pH7.9), 40% (w/vol) 塩化セシウム), 50% CsCl溶液 (20 mM Tris-HCl (pH7.9), 50% (w/vol) 塩化セシウム) をUltra-Clear 遠心分離用チューブ (14 x 89 mm, Beckman coulter)に密度の高い方から順に1.5 mlずつ重層した。そして、更にVP2-M1を含むwt SV40 VP1を含むライセート溶液5 mlを重層した。その後、35,000 rpm, 3時間, 4℃で超遠心分離した (SW41Ti rotor, Beckman)。
【００６６】
超遠心分離後、中央に現れる白いバンドを23G, 1 mlのテルモシリンジ (0.60 x 32 mm、TERUMO)で回収した。この画分を37% CsCl溶液 (20 mM Tris-HCl (pH7.9), 37% (w/vol) 塩化セシウム) と混合し、Ultra-Clear 遠心分離用チューブ(11 x 60 mm, Beckman coulter)に移した。その後、50,000 rpm, 20時間, 4℃で超遠心分離した (SW60Ti rotor, Beckman)。超遠心分離後、中央に現れる白いバンドを23G, 1 mlのテルモシリンジ (0.60 x 32 mm、TERUMO)で回収した。この画分をPBS(-) の溶媒で透析(Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Units, 3,500MWCO, ThermoSCIENTIFIC)して、その画分を15,000 rpm, 5分, 4℃で遠心分離した。上清を回収して精製VP2-M1を含むwt SV40 VP1 VLP画分とした。この画分をSDS-PAGEで展開後、CBB染色した。その結果、確かにVP2-M1由来のバンドとwt SV40 VP1 VLP由来のバンドの2本が精製されていることが明らかとなった(図2A)。また、この画分に含まれるVP2-M1内包wt SV40 VP1 VLP (VP2-M1/ wt SV40 VP1VLP) 試料を電子顕微鏡で観察した。その結果、wt SV40 VP1 によって形成されたVLPが確認できた(図2B)。このVLP内部にVP2-M1が内包されていることが示唆された。
【００６７】
VP2-M1/wt SV40 VP1 VLPの免疫
以下の実験はC57BL/6をバックグラウンドとし、HLA-A*0201とH-2Dbのキメラでさらにヒトのβ2mを融合したものを発現しているトランスジェニックマウス（以下、HHDマウス）を使用した。このマウスは、マウスのβ2mおよびH-2Dbをノックアウトしているため、マウス由来のMHC class Iは細胞表面に露出していないと考えられる。
【００６８】
上記の100 μl のVP2-M1/ wt SV40 VP1 VLP (500μg/ml) を8週齢のトランスジェニックマウスに腹腔内の経路で免疫した。免疫には、27ゲージのニードルを挿入した1 mlのシリンジ (マイジェクター、注射針付きシリンジ、インスリン用、TERUMO, SS-10M2713)を用いた。
または、40 μl のVP2-M1/ wt SV40 VP1 VLP (500μg/ml)を、全身麻酔を施した8週齢のトランスジェニックマウスに点鼻投与の経鼻経路で投入した。
【００６９】
投入後1週間後に、免疫したマウスの脾臓を回収した。下記の方法でリンパ球を調製し、下に記すIntra-cellular staining (ICS) 解析を行った。
【００７０】
マウスの脾臓からのリンパ球の調製
免疫したマウスから脾臓を摘出し、5 mlのRPMI-1640 培地の入ったφ6 cm ディッシュに置いた。ピンセットを用いて脾臓を培地内で、良く揉みほぐし、培地に溶出されたリンパ球を含む溶液を15 ml チューブに移した。もう一度、φ6 cm ディッシュを5 mlのRPMI-1640 培地で洗浄した。上清を上記の15 ml チューブに加え、総量 10 mlとした。すぐに15 ml チューブの底にたまる組織断片を残して、上清を再び新しい15 ml チューブに移した。その後、室温、1,200 rpmで5分間遠心分離し、リンパ球を含むペレットを得た。上清を除いて、ペレットをほぐした。その後、赤血球を除くために、250 μlのNH4Cl-トリス溶液を加えかき混ぜた。その後、すばやく10 mlのRPMI-1640 培地を加え、室温、1,2000 rpmで5分間遠心分離し、リンパ球を含むペレットを得た。上清を除いて、ペレットをほぐした。その後、再び10 mlのRPMI-1640 培地を加えた。変性した赤血球を極力吸わないようにしてピペットでリンパ球を含む培地を新しい15 ml チューブに移した。その後、再び室温、1,200 rpmで5分間遠心分離した。上清を除いた後、ペレットをほぐした。もう一度10 mlのRPMI-1640 培地で懸濁し、室温、1,200 rpmで5分間遠心分離した。上清を除いて、最後に2 mlの10% FCS混入RPMI-1640 培地で懸濁した。リンパ球を数えるために、490 μlの2%酢酸溶液に10 μlの上記懸濁溶液を加えた。ビュルケルチュルク血球計算版で、細胞数を算出した。1x107 細胞/mlとなるように10%FCS混入RPMI-1640 培地で希釈した。
【００７１】
Intra-cellular staining (ICS) 解析
マウスへ免疫後に、脾臓から回収したリンパ球中に、M1のCTLエピトープ配列(GILGFVFTL) に反応して誘導されるCTLが存在することを調べるために、ICS解析を行った。96 ウェル丸底プレートに10% FCS混入RPMI-1640 培地で25倍希釈したBD GolgiPlug (商標)(BD) を1 ウェル当り5 μl加えた。そこにさらに10% FCS混入RPMI-1640 培地で希釈した20 μMのM1のCTLエピトープのペプチド(GILGFVFTL, Operon)を100 μl加えた。ネガティブコントロールとして、ペプチドを含まない10% FCS混入RPMI-1640 培地を100 μl加えた。このウェルに上記で調製したリンパ球を100 μl加えた。その後、5時間、37℃、5% CO2でインキュベートした。
【００７２】
インキュベート後4℃、1,400 rpmでスピンダウンして上清を除き、ボルテックスミキサーで細胞をほぐした。その後、FACS バッファー (2% FCS, 0.1%アジ化ナトリウム, 1xPBS(-))を1 ウェル当り200 μl加えた。再び4℃、1,400 rpmでスピンダウンして上清を除き、細胞をほぐした。その後、FACS バッファーで5 μg/mlに希釈したMouse BD Fc Block(商標)(BD Pharmingen) を100 μl加えて、４℃で10分間インキュベートした。
【００７３】
インキュベート後、4℃、1,400 rpmでスピンダウンして上清を除き、細胞をほぐした。その後、FACS バッファーを1 ウェル当り200 μl加え、再び4℃、1,400 rpmでスピンダウンして上清を除いた。もう一度FACS バッファーによる洗浄操作を行った。ほぐした細胞に、FACS バッファーで10 μg/mlに希釈したFITC Rat Anti-Mouse CD8a Clone: 53-6.7 (BD Pharmingen) を1 ウェル当り50 μl加えて、4℃暗所で30分間インキュベートした。
【００７４】
インキュベート後、200 μlのFACS バッファーでの洗浄操作を2回行った。その後、ほぐした細胞に、1 ウェル当り100 μlのBD Cytofix/Cytoperm(商標)(BD Biosciences)を加えて、4℃暗所で20分間インキュベートした。インキュベート後、FACS バッファーに代えて200 μlの1xBD Perm/Wash(商標)(BD biosciences)を用いて、上記と同様の洗浄操作を2回行った。その後、ほぐした細胞に、1xBD Perm/Wash(商標)で10 μg/mlに希釈したPE anti-mouse IFN-γClone: XMG1.2 (BioLegend) を50 μl加えて、4℃暗所で30分間インキュベートした。
【００７５】
インキュベート後、200 μlの1xBD Perm/Wash(商標)を用いて上記と同様の洗浄操作を2回行った。その後、ほぐした細胞に、1 ウェル当り100 μlのFACS固定バッファー (1% ホルムアルデヒド, 1xFACS バッファー)を加えて、4℃ 暗所で一晩インキュベートした。
【００７６】
インキュベート後、400 μlのFACS バッファーを5 mlのポリスチレンチューブ(BD Falcon, 5 ml polystyrene round-bottom tube 12 x 75 mm style)に加えた。そこに100 μlのFACS固定バッファーで固定したサンプルを加えた。その後、FACScan (BD) でドットプロット解析を行った。解析にはCell Quest (BD) のソフトウェアを使用した。ICSの2次元解析の結果を図2Cに示す。
【００７７】
ICS解析の結果、腹腔内(i.p.)ルートの免疫でも経鼻ルートの免疫でもFMP:58-66ペプチド添加依存的にCD8+IFN-γ+T細胞が出現した。このことから、確かにVP2-M1/ wt SV40 VP1VLP免疫によってM1タンパク質中に含まれるFMP:58-66 エピトープ特異的な細胞傷害性T細胞 (CTL: cytotoxic T lymphocyte) が誘導されることが明らかになった(図2C)。
【００７８】
これらの結果から、昆虫細胞から精製したVP2-M1/ wt SV40 VP1 VLPを腹腔内経路または経鼻的にHHDマウスに投与するとM1 CTL epitope特異的CTLが誘導できることが示された。
【００７９】
実施例２：VP2-M1、および、SV40 wild type VP1 が共発現しているカイコ蛹磨砕液の免疫(腹腔内、経鼻、経口、注腸投与)によるFMP:58-66エピトープ特異的な細胞傷害性T細胞の誘導
【００８０】
VP2-M1とwt SV40 VP1共発現カイコ蛹磨砕液の調製
wt SV40 VP1遺伝子断片をpM01ベクター（シスメックス株式会社；図３にベクターマップを示す）のマルチクローニングサイト（制限酵素SmaI）へ組み込んだ。得られたプラスミドコンストラクトをwtSV40 VP1_pM01と呼ぶ。
さらにVP2-M1遺伝子をpM01ベクター（シスメックス株式会社）のマルチクローニングサイト（制限酵素SmaI）へ組み込んだ。得られたプラスミドコンストラクトをVP2-M1_pM01と呼ぶ。
【００８１】
組換えバキュロウイルスの作製は、Maedaらの方法（InverterbrateCell system and Applications, Vol.1, p.167-181,CRC Press, Boca Raton(1989)）を改変して行った。具体的には、上記のプラスミドコンストラクトwtSV40 VP1_pM01、またはVP2-M1_pM01（各50ng）と直鎖化したCPdバキュロウイルス（システインプロテアーゼ欠損ウイルス株、シスメックス）のDNA（20ng）とをリポフェクション試薬（X-tremeGENE 9 DNATransfection Reagent：ロシュ社）を用いて、BmN細胞（Maeda, 1989）にコトランスフェクトした。感染兆候を確認した後、培養上清を回収した。これにより、wtSV40 VP1遺伝子、またはVP2-M1を組み込んだ組換えバキュロウイルスを得た。
【００８２】
組換えバキュロウィルスをカイコ蛹（品種：錦秋鐘和, 上田蚕種社より蚕卵を購入し、シスメックス株式会社にて蛹まで人工飼育）に接種した。ウイルス接種から6日後に蛹を回収し−80℃で凍結した。
【００８３】
凍結した蛹5頭、または凍結状態から10分間沸騰水中でインキュベートした蛹5頭あたりに25 mLのTris緩衝液 (20mM Tris-HCl (pH 8.0), 150mM NaCl, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 10%(w/v)グリセロール, 1mM DTT, プロテアーゼインヒビターカクテル(Roche社 Complete-EDTA-free))、またはリン酸緩衝液（137mM NaCl, 2.7mM KCl, 8.1mM Na2HPO4, 1.47mM KH2PO4(pH7.4)）を加えた。ホモジナイザー（エルメックス, 型式SH-IIM, パドル式破砕）を用いて蛹を破砕して懸濁液を得た。この懸濁液をメッシュで濾過することにより蛹表皮等の残渣を除去し、この濾液をカイコ蛹磨砕液とした。
【００８４】
(腹腔内投与)
VP2-M1/wt SV40 VP1 VLPの免疫
VP2-M1/ wt SV40 VP1 VLPを発現させたカイコから調製した磨砕液(リン酸緩衝液で調製したカイコ蛹磨砕液(図4A)、Tris緩衝液で調製したカイコ蛹磨砕液(図4B)、リン酸緩衝液で調製した加熱処理カイコ蛹磨砕液(図4C)、およびTris緩衝液で調製した加熱処理カイコ蛹磨砕液(図4D)) 100 μlを、8週齢のHHDマウスに腹腔内の経路で免疫した。免疫には、27ゲージのニードルを挿入した1 mlのシリンジ (マイジェクター、注射針付きシリンジ、インスリン用、TERUMO, SS-10M2713)を用いた。
【００８５】
投入後1週間後に、免疫したマウスの脾臓を回収した。実施例１に記載した方法でリンパ球を調製してIntra-cellular staining (ICS) 解析を行った。
【００８６】
ICS解析の結果、i.p.免疫において、FMP:58-66ペプチド添加依存的にCD8+IFN-γ+T細胞の出現が確認された(図4A〜4D)。これらの結果から、VP2-M1/ wt SV40 VP1 VLPを発現させたカイコ蛹から調製した磨砕液のi.p.免疫によって、M1タンパク質中に含まれるFMP:58-66 エピトープ特異的な細胞傷害性T細胞 (CTL: cytotoxic T lymphocyte) が誘導されることが明らかになった。このCTLの誘導は、蛹の加熱処理の有無に拘らず、また、調製に用いた緩衝液の種類（Tris緩衝液またはリン酸緩衝液）に拘らず検出された。
【００８７】
（経鼻投与）
VP2-M1/wt SV40 VP1 VLPの免疫
VP2-M1/ wt SV40 VP1 VLPを発現させたカイコから調製した磨砕液20 μlを、全身麻酔を施した8週齢のHHDマウスに点鼻投与の経鼻経路で投入した。投入から1週間後に、免疫したマウスの脾臓を回収した。実施例１に記載した方法でリンパ球を調製してIntra-cellular staining (ICS) 解析を行った。
【００８８】
ICS解析の結果、経鼻免疫において、FMP:58-66ペプチド添加依存的にCD8+IFN-γ+T細胞が出現した(図5)。このことから、確かにVP2-M1/ wt SV40 VP1VLPの経鼻免疫によって、M1タンパク質中に含まれるFMP:58-66 エピトープ特異的な細胞傷害性T細胞 (CTL: cytotoxic T lymphocyte) が誘導されることが明らかになった。
【００８９】
（経口投与）
VP2-M1/wt SV40 VP1 VLPの免疫
VP2-M1/ wt SV40 VP1 VLPを発現させたカイコ磨砕液(リン酸緩衝液で調製した非加熱カイコ蛹磨砕液100 μl(図6A)、Tris緩衝液で調製した非加熱カイコ蛹磨砕液100 μl(図6B)、およびTris緩衝液で調製した加熱処理カイコ蛹磨砕液100 μl(図6C))を、全身麻酔を施した8週齢のHHDマウスに経口経路で投入した。投入には、経口ゾンデ (経口ゾンデ針  マウス用  φ0.9 x L50 mm (A), ナツメセイサク, KN-348) を挿入した1 mlのシリンジ (TERUMO)を用いた。投入から1週間後に、免疫したマウスの脾臓を回収した。実施例１に記載した方法でリンパ球を調製してIntra-cellular staining (ICS) 解析を行った。
【００９０】
上記ICS解析の結果から、経口免疫において、FMP:58-66ペプチド添加依存的にCD8+IFN-γ+T細胞が出現した(図6A〜6C)。このことから、確かに非加熱または加熱処理をしたVP2-M1/ wt SV40 VP1VLPを含むカイコ磨砕液の経口免疫によって、M1タンパク質中に含まれるFMP:58-66 エピトープ特異的な細胞傷害性T細胞 (CTL: cytotoxic T lymphocyte) が誘導されることが明らかになった。
【００９１】
（注腸投与）
VP2-M1/wt SV40 VP1 VLPの免疫
100 μl、 または、200 μlのVP2-M1/ wt SV40 VP1 VLPを発現させたカイコ磨砕液を、全身麻酔を施した8週齢のHHDマウスに注腸経路で投入した。投入には、経口ゾンデ (DISPOSABLE経口ゾンデ、マウス用減菌済、5200S, FUCHIGAMI) を挿入した1 mlのシリンジ (TERUMO)を用いた。
【００９２】
投入から1週間後に、免疫したマウスの脾臓を回収した。実施例１に記載した方法でリンパ球を調製してIntra-cellular staining (ICS) 解析を行った。
【００９３】
ICS解析の結果、注腸免疫において、FMP:58-66ペプチド添加依存的にCD8+IFN-γ+T細胞が出現した(図7)。このことから、確かにVP2-M1/ wt SV40 VP1VLP免疫によって、M1タンパク質中に含まれるFMP:58-66 エピトープ特異的な細胞傷害性T細胞 (CTL: cytotoxic T lymphocyte) が誘導されることが明らかになった。
【００９４】
実施例３：VP2-卵白アルブミン(Ovalbmin, OVA)内包wt SV40 VP1 VLPの免疫による抗OVA抗体産生誘導
【００９５】
野生型 (wt: wild type) simian virus 40 (SV40) VP1を発現するバキュロウイルスの作製
実施例１に記載したとおりにして、wt SV40 VP1を発現するバキュロウイルスを作製した。
【００９６】
VP2融合OVAタンパク質を発現するバキュロウイルスの作製
まず、wt SV40 VP2のアミノ末端 (N末端: amino terminus)をコードするコドンの上流にFLAGタグのコード配列(配列番号１３)を付加して更にその上流にBamHIサイトを導入した。また、wt SV40 VP2のストップコドンを除いてEcoRIサイトを導入した。得られたポリヌクレオチドをpFastBac1プラスミドのBamHIサイト、および、EcoRIサイトを介して挿入し、wt SV40 VP2遺伝子を含むプラスミドを作製した。OVAタンパク質のN末端をコードするコドンの上流にGGGGSGGGGSGGGGSリンカー(配列番号３；核酸配列は配列番号１４に示す)のコード配列を導入し、更にその上流にEcoRIサイトを導入した。また、OVAタンパク質コード配列の下流にストップコドンを付加して更にその下流にSal Iサイトを導入した。得られたポリヌクレオチドを、上記のwt SV40 VP2遺伝子を含むプラスミドのEcoRIサイト、および、Sal Iサイトを介して導入し、VP2コード配列の下流にOVAコード配列を融合した遺伝子を保持したプラスミドを作製した。
【００９７】
このプラスミドで、バキュロウイルスゲノムを保持する大腸菌DH10bac (invitrogen) を形質転換し、wt SV40 VP2にOVAを融合したタンパク質VP2-OVA（配列番号６；核酸配列は配列番号７に示す）を発現する組換えバキュロウイルスゲノムを調製した。組換えバキュロウイルスゲノムをSf-9細胞にトランスフェクションした。三日後にその上清を回収して、組換えバキュロウイルスを含む溶液とした。この溶液の一部を再び、Sf-9細胞に感染させることで、組換えバキュロウイルスタイターを上昇させた。これを組換えバキュロウイルスのストック溶液とした。
【００９８】
VP2-OVAを含むwtSV40 VP1 VLPの調製
実施例１の「VP2-M1を含むwtSV40 VP1 VLPの調製」と同じ方法で、VP2-OVAを含むwtSV40 VP1 VLPを調製した。
【００９９】
VP2-OVA/ wt SV40 VP1 VLPの免疫(腹腔内投与、および経鼻投与)
上記の100 μl VP2-OVA/ wt SV40 VP1 VLP (500μg/ml) を8週齢のHHDマウスに腹腔内の経路で免疫した。免疫には、27ゲージのニードルを挿入した1 mlのシリンジ (マイジェクター、注射針付きシリンジ、インスリン用、TERUMO, SS-10M2713)を用いた。また、VP2-OVA/ wt SV40 VP1 VLP 免疫の対象群として100μL  OVA 溶液 (1mg/mL)をマウスの皮下に接種した。
または、40 μl VP2-OVA/ wt SV40 VP1 VLP (500μg/ml)を全身麻酔を施した8週齢のHHDマウスに点鼻投与の経鼻経路で投入した。
【０１００】
免疫から1週間後に追加免疫を行った。初回免疫から2週間後にマウスを全身麻酔させた後、マウス心臓から血液を回収した。得られた血液において血餅形成を誘導し、上清のマウス血清を回収した。
【０１０１】
免疫により誘導された抗体の検出（ELISA法）
OVAに反応して血清中に誘導される抗OVA抗体が存在することを確認するために、上記のようにして回収したマウス血清を用いて、抗体検出を次のようにして行った。OVAをTBS (20mM Tris-HCl (pH 8.0), 150mM NaCl)に1μg/100μLになるように溶解した。これを96穴プレート(Nunc MaxiSorp flat-bottom 96 well plate)の各ウェルに100μLずつ添加した。室温で2時間、または4℃で一晩静置し、OVAをプレート底面に結合させた。OVA固定化後、TBS-T (20mM Tris-HCl (pH 8.0), 150mM NaCl、0.005%(w/v) Tween 20)でプレートを洗浄した。その後、5%(w/v)スキムミルク溶液を各ウェルに300μLずつ添加し室温で2時間、または4℃で一晩静置した。スキムミルク溶液を除いた後、TBS-Tで各ウェルを洗浄した。上記で得られたマウス血清をTBS-Tで所望の濃度に希釈した溶液を50μLずつ各ウェルに添加し室温で1時間静置した。マウス血清溶液を取り除き、TBS-Tで各ウェルを洗浄した。その後、TBS-Tで2,000倍に希釈したHRP標識抗マウスIgG (H+L鎖) (MBL社)を各ウェルに100μLずつ添加して室温で1時間静置した。静置後、各ウェルをTBS-Tで洗浄した。TMBパーオキシダーゼ EIA 複合体基質キット（Bio-Rad社）をキット付属の説明書にしたがって各ウェルに添加し、各ウェル中に存在するHRP標識抗マウスIgG (H+L鎖)を測定した。なお、測定はiMark microplate Absorbance Reader (Bio Rad 社)を用いて655nmの吸光値を測定した。
【０１０２】
結果を図8Aおよび図8Bに示す。図8Aに示されるように、VP2-OVA/SV40 wtVP1 VLPを腹腔内投与されたマウスでは抗OVA抗体の産生が誘導され、OVAを単独で投与されたマウスよりも高い抗体価を示した。抗OVA抗体産生の誘導は、VP2-OVA/SV40 wtVP1VLPを経鼻投与されたマウスにおいても見られた(図8B)。これらの結果から、VP2-OVA/SV40 wtVP1 VLPの腹腔内投与または経鼻投与により、OVAに特異的な抗体の産生を誘導できることが示された。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【配列表】
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