(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
圃場内のトウモロコシ植物中の大気由来窒素の量を増加させるための方法であって、
前記圃場内の前記トウモロコシ植物を複数の操作されたジアゾ栄養細菌に曝露するステップであって、前記複数の操作されたジアゾ栄養細菌が、窒素固定遺伝子調節ネットワークに導入された少なくとも１つの遺伝子変異を含み、それにより、前記複数の操作されたジアゾ栄養細菌と同種である同量の複数の操作されていないジアゾ栄養細菌に曝露されたトウモロコシ植物と比較して、前記複数の操作されたジアゾ栄養細菌に曝露された前記トウモロコシ植物中の大気由来窒素の量を増加させる、ステップを含み、
前記窒素固定遺伝子調節ネットワークに導入された前記少なくとも１つの遺伝子変異が、ＮｉｆＡの発現もしくは活性の増加、またはＮｉｆＬの発現もしくは活性の減少のうちの１つまたは複数をもたらす変異を含み；
前記窒素固定遺伝子調節ネットワークに導入された少なくとも１つの遺伝子変異が、前記複数の操作されたジアゾ栄養細菌の属に対応する属の細菌のゲノム内に見出される異種性配列の挿入を含み；
前記複数の操作されたジアゾ栄養細菌が、異なる属の生物から導入された遺伝物質を含まず；かつ
非窒素制限条件における前記複数の操作されたジアゾ栄養細菌の窒素固定活性が、類似の非窒素制限条件における、前記複数の操作されたジアゾ栄養細菌と同種である同量の前記複数の操作されていないジアゾ栄養細菌の窒素固定活性より高い、
方法。
【請求項２】
前記複数の操作されたジアゾ栄養細菌が、窒素同化遺伝子調節ネットワークに導入された少なくとも１つの遺伝子変異をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記複数の操作されたジアゾ栄養細菌が、前記トウモロコシ植物の種子が植栽される畝間内に適用される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記複数の操作されたジアゾ栄養細菌が、前記トウモロコシ植物の種子にコーティングされる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記複数の操作されたジアゾ栄養細菌が前記トウモロコシ植物の少なくとも根にコロニーを形成し、これにより、前記複数の操作されたジアゾ栄養細菌が前記トウモロコシ植物中に、組織の生重量１グラム当たり少なくとも１０５のコロニー形成ユニットの量で存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記複数の操作されたジアゾ栄養細菌が、植物内で、窒素固定の窒素含有産物を排出する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記複数の操作されたジアゾ栄養細菌が、植物内で、前記トウモロコシ植物中の固定窒素の少なくとも１％を産生する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記複数の操作されたジアゾ栄養細菌により産生された、前記トウモロコシ中の前記固定窒素が、１．２％の１５Ｎを含む肥料を用いて処理された圃場内で栽培されたトウモロコシ植物中での１５Ｎの希釈により測定される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記複数の操作されたジアゾ栄養細菌が、植物内で、前記トウモロコシ植物中の固定窒素の５％またはそれよりも多くを産生する、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記複数の操作されたジアゾ栄養細菌が、指定突然変異誘発およびランダム突然変異誘発からなる群から選択される少なくとも１つのタイプの操作を用いて操作される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
非窒素制限条件における前記複数の操作されたジアゾ栄養細菌の窒素固定活性が、同一の非窒素制限条件における、前記複数の操作されたジアゾ栄養細菌と同種である同量の複数の操作されていないジアゾ栄養細菌の窒素固定活性より高い、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記複数の操作されたジアゾ栄養細菌が、着生性ジアゾ栄養細菌、内部寄生性ジアゾ栄養細菌、および根圏性ジアゾ栄養細菌からなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項１３】
前記異種性配列が異種性調節配列である、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２０１５年７月１３日に出願された米国仮特許出願第６２／１９２，００９号および２０１５年９月２日に出願された米国仮特許出願第６２／２１３，５６７号の優先権を主張し、それらの全体は本明細書に参照により組み込まれる。
【０００２】
本発明は、米国国立科学財団により与えられたＳＢＩＲ助成金１５２０５４５の下、米国政府の支援によりなされた。政府は、本開示の主題における一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
植物は、共通のメタボロームを介してマイクロバイオームに繋がっている。特定の作物の形質と基本的なメタボロームとの多次元的な関係性は、多数の局所最大値を有するランドスケープにより特徴付けられる。メタボロームに対するマイクロバイオームの影響を変更することによって下位の局所最大値からより良好な形質を表す別の局所最大値へと最適化することは、作物最適化のため等の様々な理由で望ましい場合がある。増加し続ける世界人口の必要性を満たすため、経済的に、環境的に、さらに社会的に持続可能な農業および食糧生産の手法が求められている。国連食糧農業機関は、増加し続ける人口の必要性を満たすために、２０５０年までに総食糧生産が７０％増加しなければならないと予測している。この難問は、真水資源の減少、耕地競合の増加、エネルギー価格の上昇、投入コストの増加、および作物が、より乾燥し温暖化したより極端な全地球的気候の圧力に適応する必要がある可能性が高いことなど、多数の要因のためにさらに難しいものになっている。
【０００４】
興味深い１つの分野は、窒素固定の向上である。窒素ガス（Ｎ２）は、地球の大気の主成分である。加えて、窒素元素（Ｎ）は、生命体を形成する多数の化合物の重要な成分である。しかしながら、多くの生物は、成長および生殖等の生理学的なプロセスで使用される化学物質を合成するために、Ｎ２を直接使用することができない。Ｎ２を利用するためには、Ｎ２を水素と化合させなければならない。水素とＮ２の化合は、窒素固定と呼ばれる。窒素固定は、化学的に達成される場合でもまたは生物学的に達成される場合でも、大量のエネルギー投資を必要とする。生物系では、ニトロゲナーゼとして公知の酵素により、窒素固定をもたらす反応が触媒される。窒素固定研究の重要な目標は、この表現型を、非マメ科植物、特に、小麦、米、およびトウモロコシ等の重要な農業学的イネ科植物に拡張することである。根粒菌とマメ科植物との間で発達した窒素固定共生の理解が大きく進歩したにも関わらず、その知識を使用して非マメ科作物に窒素固定根粒を誘導する目処は依然として立っていない。そうするうちにも、例えば肥料に十分な補充的窒素供給源を提供するという課題は、食糧生産増加の必要性が増加すると共に増加し続けると予想される。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記に照らして、関連するマイクロバイオームにより付与される植物の形質を向上させる必要性が存在する。本開示は、この必要性に取り組むと共に、追加の利点を提供するものである。一部の場合では、マイクロバイオームを構成する種とそれらの基本的遺伝的特徴はどちらも、メタボロームに対する微生物影響を調整するための標的である。
【０００６】
一態様では、本開示は、非マメ科植物における窒素固定を増加させるための方法であって、植物を複数の細菌に曝露するステップを含み、複数の各メンバーが、細菌が外来性窒素の存在下で大気窒素を固定できるように、細菌の窒素固定または同化の遺伝子調節ネットワークの１つもしくは複数の遺伝子または非コードポリヌクレオチドに導入された１つまたは複数の遺伝子変異を含み、細菌が、属間微生物（ｉｎｔｅｒｇｅｎｅｒｉｃ  ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）ではなく、細菌が、植物における固定窒素の１％またはそれよりも多くを植物内で産生する、方法を提供する。
【０００７】
一部の実施形態では、細菌は、植物における固定窒素の５％またはそれよりも多くを植物内で産生する。一部の実施形態では、細菌は、植物における固定窒素の１０％またはそれよりも多くを植物内で産生する。
【０００８】
一部の実施形態では、１つまたは複数の遺伝子変異は、窒素固定または同化の遺伝子調節ネットワークのうちの１つまたは複数の遺伝子に作動可能に連結した導入制御配列を含む。さらなる実施形態では、制御配列は、プロモーターである。さらなる実施形態では、プロモーターは、誘導性プロモーターである。一部の実施形態では、細菌は、窒素固定または同化の遺伝子調節ネットワークの遺伝子に作動可能に連結した構成的プロモーターを含まない。一部の実施形態では、細菌は、ｎｉｆ遺伝子クラスターの遺伝子に作動可能に連結した構成的プロモーターを含まない。
【０００９】
一部の実施形態では、細菌は、窒素固定の窒素含有産物を植物内で排出する。一部の実施形態では、植物に曝露した複数の細菌は、外因性非大気窒素の取り込み増加を刺激しない。
【００１０】
一部の実施形態では、植物は、１エーカー当たり約５０ｌｂの窒素含有肥料を与えた圃場に由来する土壌で栽培され、窒素含有肥料は、少なくとも５重量％の窒素を含む。さらなる実施形態では、窒素含有肥料は、アンモニウムまたはアンモニウム含有分子を含む。一部の実施形態では、外来性窒素は、グルタミン、アンモニア、アンモニウム、尿素、硝酸塩、亜硝酸塩、アンモニウム含有分子、硝酸塩含有分子、および亜硝酸塩含有分子のうちの１つまたは複数を含む肥料から選択される。
【００１１】
一部の実施形態では、複数の細菌は、少なくとも２つの異なる種の細菌を含む。一部の実施形態では、複数の細菌は、同じ種の細菌の少なくとも２つの異なる菌株を含む。一部の実施形態では、複数の細菌は、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ属である。一部の実施形態では、複数の細菌は、内部寄生性、着生性、または根圏性（ｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｉｃ）である。一部の実施形態では、複数の細菌は、植物にコロニーを形成し、植物の生重量１グラム当たり少なくとも１０５ｃｆｕで植物中に存在する。
【００１２】
一部の実施形態では、細菌の窒素固定または同化の遺伝子調節ネットワークの１つもしくは複数の遺伝子または非コードポリヌクレオチドは、以下のものからなる群から選択される：ｎｉｆＡ、ｎｉｆＬ、ｎｔｒＢ、ｎｔｒＣ、グルタミン合成酵素をコードするポリヌクレオチド、ｇｌｎＡ、ｇｌｎＢ、ｇｌｎＫ、ｄｒａｔ、ａｍｔＢ、グルタミナーゼをコードするポリヌクレオチド、ｇｌｎＤ、ｇｌｎＥ、ｎｉｆＪ、ｎｉｆＨ、ｎｉｆＤ、ｎｉｆＫ、ｎｉｆＹ、ｎｉｆＥ、ｎｉｆＮ、ｎｉｆＵ、ｎｉｆＳ、ｎｉｆＶ、ｎｉｆＷ、ｎｉｆＺ、ｎｉｆＭ、ｎｉｆＦ、ｎｉｆＢ、およびｎｉｆＱ。一部の実施形態では、１つまたは複数の遺伝子変異は、以下のうちの１つまたは複数をもたらす突然変異である：ＮｉｆＡもしくはグルタミナーゼの発現もしくは活性の増加；ＮｉｆＬ、ＮｔｒＢ、グルタミン合成酵素、ＧｌｎＢ、ＧｌｎＫ、ＤｒａＴ、ＡｍｔＢの発現もしくは活性の減少；ＧｌｎＥのアデニリル除去活性の減少；またはＧｌｎＤのウリジリル除去活性の減少。一部の実施形態では、１つまたは複数の遺伝子変異は、（Ａ）ノックアウト突然変異であるか、（Ｂ）標的遺伝子の調節配列を変更もしくは消失させるか、または（Ｃ）異種性調節配列を挿入することを含む。
【００１３】
一部の実施形態では、植物は、農業作物植物である。さらなる実施形態では、農業作物植物は、ソルガム、キャノーラ、トマト、イチゴ、大麦、米、トウモロコシ、および小麦から選択される。さらなる実施形態では、植物は、遺伝子改変生物である。さらなる実施形態では、植物は、遺伝子改変生物ではない。一部の実施形態では、植物は、効率的な窒素使用のために遺伝子操作されているかまたは品種改良されている。
【００１４】
一態様では、本開示は、細菌が外来性窒素の存在下で大気窒素を固定できるように、細菌の窒素固定または同化の遺伝子調節ネットワークの１つもしくは複数の遺伝子または非コードポリヌクレオチドに導入された１つまたは複数の遺伝子変異を含む細菌を含む細菌集団であって、細菌が、属間微生物ではなく、細菌が、細菌の集団の存在下で栽培される植物における固定窒素の１％またはそれよりも多くを植物内で産生する細菌集団を提供する。
【００１５】
一部の実施形態では、細菌は、植物における固定窒素の５％またはそれよりも多くを植物内で産生する。一部の実施形態では、細菌は、植物における固定窒素の１０％またはそれよりも多くを植物内で産生する。
【００１６】
一部の実施形態では、１つまたは複数の遺伝子変異は、窒素固定または同化の遺伝子調節ネットワークのうちの１つまたは複数の遺伝子に作動可能に連結した導入制御配列を含む。さらなる実施形態では、制御配列は、プロモーターである。さらなる実施形態では、プロモーターは、誘導性プロモーターである。一部の実施形態では、細菌は、窒素固定または同化の遺伝子調節ネットワークの遺伝子に作動可能に連結した構成的プロモーターを含まない。一部の実施形態では、細菌は、ｎｉｆ遺伝子クラスターの遺伝子に作動可能に連結した構成的プロモーターを含まない。
【００１７】
一部の実施形態では、細菌は、窒素固定の窒素含有産物を植物内で排出する。一部の実施形態では、植物に曝露した複数の細菌は、外因性非大気窒素の取り込み増加を刺激しない。一部の実施形態では、外来性窒素は、グルタミン、アンモニア、アンモニウム、尿素、硝酸塩、亜硝酸塩、アンモニウム含有分子、硝酸塩含有分子、および亜硝酸塩含有分子のうちの１つまたは複数を含む肥料から選択される。
【００１８】
一部の実施形態では、細菌集団は、少なくとも２つの異なる種の細菌を含む。一部の実施形態では、細菌集団は、同じ種の細菌の少なくとも２つの異なる菌株を含む。一部の実施形態では、複数の細菌は、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ属である。一部の実施形態では、複数の細菌は、内部寄生性、着生性、または根圏性（ｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｉｃ）である。一部の実施形態では、複数の細菌は、植物にコロニーを形成し、植物の生重量１グラム当たり少なくとも１０５ｃｆｕで植物中に存在する。
【００１９】
一部の実施形態では、細菌の窒素固定または同化の遺伝子調節ネットワークの１つもしくは複数の遺伝子または非コードポリヌクレオチドは、以下のものからなる群から選択される：ｎｉｆＡ、ｎｉｆＬ、ｎｔｒＢ、ｎｔｒＣ、グルタミン合成酵素をコードするポリヌクレオチド、ｇｌｎＡ、ｇｌｎＢ、ｇｌｎＫ、ｄｒａｔ、ａｍｔＢ、グルタミナーゼをコードするポリヌクレオチド、ｇｌｎＤ、ｇｌｎＥ、ｎｉｆＪ、ｎｉｆＨ、ｎｉｆＤ、ｎｉｆＫ、ｎｉｆＹ、ｎｉｆＥ、ｎｉｆＮ、ｎｉｆＵ、ｎｉｆＳ、ｎｉｆＶ、ｎｉｆＷ、ｎｉｆＺ、ｎｉｆＭ、ｎｉｆＦ、ｎｉｆＢ、およびｎｉｆＱ。一部の実施形態では、１つまたは複数の遺伝子変異は、以下のうちの１つまたは複数をもたらす突然変異である：ＮｉｆＡもしくはグルタミナーゼの発現もしくは活性の増加；ＮｉｆＬ、ＮｔｒＢ、グルタミン合成酵素、ＧｌｎＢ、ＧｌｎＫ、ＤｒａＴ、ＡｍｔＢの発現もしくは活性の減少；ＧｌｎＥのアデニリル除去活性の減少；またはＧｌｎＤのウリジリル除去活性の減少。一部の実施形態では、１つまたは複数の遺伝子変異は、（Ａ）ノックアウト突然変異であるか、（Ｂ）標的遺伝子の調節配列を変更もしくは消失させるか、または（Ｃ）異種性調節配列を挿入することを含む。
【００２０】
一部の実施形態では、植物は、農業作物植物である。さらなる実施形態では、農業作物植物は、ソルガム、キャノーラ、トマト、イチゴ、大麦、米、トウモロコシ、および小麦から選択される。さらなる実施形態では、植物は、遺伝子改変生物である。さらなる実施形態では、植物は、遺伝子改変生物ではない。一部の実施形態では、植物は、効率的な窒素使用のために遺伝子操作されているかまたは品種改良されている。
【００２１】
一態様では、本開示は、本開示の細菌集団を含む組成物を提供する。一部の実施形態では、組成物は、種子の表面にコーティングされた細菌集団を含む。一部の実施形態では、組成物は、液剤または粉末として製剤化される。
【００２２】
一態様では、本開示は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２２２９３またはＰＴＡ−１２２２９４として寄託されている単離された細菌を提供する。
【００２３】
一態様では、本開示は、細菌が外来性窒素の存在下で大気窒素を固定できるように、細菌の窒素固定または同化の遺伝子調節ネットワークの１つもしくは複数の遺伝子または非コードポリヌクレオチドに導入された１つまたは複数の遺伝子変異を含む、非属間細菌（ｎｏｎ−ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を提供する。
【００２４】
一部の実施形態では、１つまたは複数の遺伝子変異は、窒素固定または同化の遺伝子調節ネットワークのうちの１つまたは複数の遺伝子に作動可能に連結した導入制御配列を含む。さらなる実施形態では、制御配列は、プロモーターである。さらなる実施形態では、プロモーターは、誘導性プロモーターである。一部の実施形態では、細菌は、窒素固定または同化の遺伝子調節ネットワークの遺伝子に作動可能に連結した構成的プロモーターを含まない。一部の実施形態では、細菌は、ｎｉｆ遺伝子クラスターの遺伝子に作動可能に連結した構成的プロモーターを含まない。
【００２５】
一部の実施形態では、細菌の窒素固定または同化の遺伝子調節ネットワークの１つもしくは複数の遺伝子または非コードポリヌクレオチドは、以下のものからなる群から選択される：ｎｉｆＡ、ｎｉｆＬ、ｎｔｒＢ、ｎｔｒＣ、グルタミン合成酵素をコードするポリヌクレオチド、ｇｌｎＡ、ｇｌｎＢ、ｇｌｎＫ、ｄｒａｔ、ａｍｔＢ、グルタミナーゼをコードするポリヌクレオチド、ｇｌｎＤ、ｇｌｎＥ、ｎｉｆＪ、ｎｉｆＨ、ｎｉｆＤ、ｎｉｆＫ、ｎｉｆＹ、ｎｉｆＥ、ｎｉｆＮ、ｎｉｆＵ、ｎｉｆＳ、ｎｉｆＶ、ｎｉｆＷ、ｎｉｆＺ、ｎｉｆＭ、ｎｉｆＦ、ｎｉｆＢ、およびｎｉｆＱ。一部の実施形態では、１つまたは複数の遺伝子変異は、以下のうちの１つまたは複数をもたらす突然変異である：ＮｉｆＡもしくはグルタミナーゼの発現もしくは活性の増加；ＮｉｆＬ、ＮｔｒＢ、グルタミン合成酵素、ＧｌｎＢ、ＧｌｎＫ、ＤｒａＴ、ＡｍｔＢの発現もしくは活性の減少；ＧｌｎＥのアデニリル除去活性の減少；またはＧｌｎＤのウリジリル除去活性の減少。一部の実施形態では、１つまたは複数の遺伝子変異は、（Ａ）ノックアウト突然変異であるか、（Ｂ）標的遺伝子の調節配列を変更もしくは消失させるか、または（Ｃ）異種性調節配列を挿入することを含む。
【００２６】
一部の実施形態では、細菌は、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ属に由来する。一部の実施形態では、細菌は、内部寄生性、着生性、または根圏性である。
【００２７】
一態様では、本開示は、１つまたは複数の細菌を産生するための方法を提供する。一実施形態では、方法は、（ａ）第１の植物の組織または土壌から細菌を単離するステップ；（ｂ）遺伝子変異（例えば、１つまたは複数の遺伝子変異）を、細菌のうちの１つまたは複数に導入して、１つまたは複数の変異細菌を産生するステップ；（ｃ）複数の植物を変異細菌に曝露するステップ；（ｄ）複数の植物のうち１つの組織または土壌から細菌を単離するステップであって、細菌を単離した植物が、複数の植物中の他の植物と比べて向上された形質を有する、ステップ；および（ｅ）ステップ（ｄ）で単離された細菌を用いてステップ（ｂ）〜（ｄ）を繰り返すステップを含む。向上された形質は、細菌を単離した植物中および／または細菌に曝露した植物における窒素固定の増強であってもよい。遺伝子変異は、以下のものからなる群から選択される遺伝子の変異であってもよい：ｎｉｆＡ、ｎｉｆＬ、ｎｔｒＢ、ｎｔｒＣ、ｇｌｎＡ、ｇｌｎＢ、ｇｌｎＫ、ｄｒａＴ、ａｍｔＢ、ｇｌｎＤ、ｇｌｎＥ、ｎｉｆＪ、ｎｉｆＨ、ｎｉｆＤ、ｎｉｆＫ、ｎｉｆＹ、ｎｉｆＥ、ｎｉｆＮ、ｎｉｆＵ、ｎｉｆＳ、ｎｉｆＶ、ｎｉｆＷ、ｎｉｆＺ、ｎｉｆＭ、ｎｉｆＦ、ｎｉｆＢ、およびｎｉｆＱ。遺伝子変異は、以下のものからなる群から選択される機能性を有するタンパク質をコードする遺伝子の変異であってもよい：グルタミン合成酵素、グルタミナーゼ、グルタミン合成酵素アデニリルトランスフェラーゼ、転写活性化因子、抗転写活性化因子、ピルビン酸フラボドキシンオキシドレダクターゼ、フラボドキシン、またはＮＡＤ＋二窒素レダクターゼＡＤＰ−Ｄ−リボシルトランスフェラーゼ。一部の実施形態では、遺伝子変異は、以下のうちの１つまたは複数をもたらす突然変異である：ＮｉｆＡもしくはグルタミナーゼの発現もしくは活性の増加；ＮｉｆＬ、ＮｔｒＢ、グルタミン合成酵素、ＧｌｎＢ、ＧｌｎＫ、ＤｒａＴ、ＡｍｔＢの発現もしくは活性の減少；ＧｌｎＥのアデニリル除去活性の減少；またはＧｌｎＤのウリジリル除去活性の減少。遺伝子変異は、ノックアウト突然変異であってもよく、タンパク質ドメインの活性の排除もしくは消失をもたらしてもよく、標的遺伝子の調節配列を変更もしくは消失させてもよく、および／または異種性調節配列の挿入を含んでもよい。一部の実施形態では、遺伝子変異は、遺伝子変異が導入されている細菌に対応する細菌種または属のゲノム内に見出される調節配列の挿入を含む。調節配列は、任意選択で、細菌培養物のまたは植物組織内の遺伝子の発現レベルに基づいて選択してもよい。遺伝子変異は、ランダムな位置でのランダム突然変異、標的部位でのランダム突然変異、または標的部位に特異的に導入される所定の遺伝子変異であってもよい。遺伝子変異は、１つまたは複数のヌクレオチドの挿入、欠失、または置換、またはそれらの任意の組合せを含んでもよい。遺伝子変異は、化学的突然変異誘発により生成してもよい。一部の実施形態では、方法は、植物を生物ストレス因子または非生物ストレス因子に曝露することをさらに含む。一部の実施形態では、ステップ（ｂ）〜（ｄ）を１回または複数回繰り返した後で単離された細菌は、第１の植物と同じタイプの第２の植物または細菌に曝露した植物における窒素の１％またはそれよりも多く（例えば、少なくとも２％、５％、１０％、またはそれよりも多く）を産生する。さらに、そのような産生は、第２の植物が、グルタミン、アンモニア、または窒素の他の化学的供給源で補充された肥料の存在下で栽培される場合に達成されてもよい。一部の実施形態では、ステップ（ｂ）〜（ｄ）を１回または複数回繰り返した後で単離された細菌は、第１の植物から単離された細菌と比較して、少なくとも２倍増（例えば、少なくとも５倍増）の窒素固定を示す。第１の植物または複数の植物中の植物は、大麦、米、トウモロコシ、小麦、ソルガム、スイートコーン、サトウキビ、玉ねぎ、トマト、イチゴ、またはアスパラガスから選択される植物等の農業作物植物であってもよい。第１の植物または複数の植物中の植物は、Ｓｅｔａｒｉａ属、Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ属、またはＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ属から選択される植物等のモデル植物であってもよい。一部の実施形態では、ステップ（ａ）は、単離された細菌の遺伝子分析を実施することをさらに含む。一部の実施形態では、ステップ（ｂ）は、選択圧を加えて、遺伝子変異を含む細菌を富化すること、および任意選択で、選択圧を生き残った細菌を単離することをさらに含む。選択圧は、標的部位に導入された遺伝子変異が欠如したゲノムを切断し、切断が、標的部位の１００ヌクレオチド内で生じることを含んでもよい。切断は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、ＴＡＬＥヌクレアーゼ、またはメガヌクレアーゼからなる群から選択されるヌクレアーゼ等の部位特異的ヌクレアーゼにより指示することができる。一部の場合では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼが好ましい場合がある。ステップ（ｂ）〜（ｄ）を１回または複数回繰り返した後で単離された細菌は、内部寄生性、着生性、または根圏性である。細菌は、植物組織（例えば、種子）から単離してもよい。細菌は、複数の異なる細菌分類群を含んでもよい。一部の実施形態では、ステップ（ａ）での細菌単離は、第１の植物の種子から細菌を単離することを含む。
【００２８】
一態様では、本開示は、植物における窒素固定を増加させるための方法を提供する。一実施形態では、方法は、植物を、窒素固定を調節する１つまたは複数の遺伝子に導入された１つまたは複数の遺伝子変異を含む細菌に曝露するステップを含み、細菌は、植物における窒素の１％またはそれよりも多く（例えば、少なくとも２％、５％、１０％、またはそれよりも多く）を産生する。細菌は、グルタミン、アンモニア、または補充窒素の他の化学的供給源で補充された肥料の存在下で窒素を産生することができる。一部の実施形態では、遺伝子変異は、以下のものからなる群から選択される遺伝子の変異である：ｎｉｆＡ、ｎｉｆＬ、ｎｔｒＢ、ｎｔｒＣ、グルタミン合成酵素、ｇｌｎＡ、ｇｌｎＢ、ｇｌｎＫ、ｄｒａＴ、ａｍｔＢ、グルタミナーゼ、ｇｌｎＤ、ｇｌｎＥ、ｎｉｆＪ、ｎｉｆＨ、ｎｉｆＤ、ｎｉｆＫ、ｎｉｆＹ、ｎｉｆＥ、ｎｉｆＮ、ｎｉｆＵ、ｎｉｆＳ、ｎｉｆＶ、ｎｉｆＷ、ｎｉｆＺ、ｎｉｆＭ、ｎｉｆＦ、ｎｉｆＢ、およびｎｉｆＱ。遺伝子変異は、以下のうちの１つまたは複数をもたらす突然変異であってもよい：ＮｉｆＡもしくはグルタミナーゼの発現もしくは活性の増加；ＮｉｆＬ、ＮｔｒＢ、グルタミン合成酵素、ＧｌｎＢ、ＧｌｎＫ、ＤｒａＴ、ＡｍｔＢの発現もしくは活性の減少；ＧｌｎＥのアデニリル除去活性の減少；またはＧｌｎＤのウリジリル除去活性の減少。一部の実施形態では、遺伝子変異（ａ）は、ノックアウト突然変異であるか、（Ｂ）標的遺伝子の調節配列を変更もしくは消失させるか、または（ｃ）異種性調節配列の挿入を含む。細菌は、内部寄生性、着生性、または根圏性であってもよい。一部の場合では、細菌は、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ属またはＲａｈｎｅｌｌａ属である。細菌は、複数の異なる細菌分類群を含んでもよい。一部の実施形態では、植物は、ソルガム、キャノーラ、トマト、イチゴ、大麦、米、トウモロコシ、および小麦から選択される植物等の農業作物植物である。植物は、非マメ科植物であってもよい。植物は、遺伝子改変生物（ＧＭＯ；例えば、異種性遺伝子を保持するように変更されたゲノムを有する植物）であってもよく、非遺伝子改変生物（非ＧＭＯ）であってもよく、または効率的な窒素使用のために遺伝子操作もしくは品種改良されていてもよい。
【００２９】
一態様では、本開示は、細菌集団を提供する。一実施形態では、細菌集団は、窒素固定を調節する１つまたは複数の遺伝子に導入された１つまたは複数の遺伝子変異を含む細菌を含み、細菌は、細菌の集団の存在下で栽培された植物における窒素の１％またはそれよりも多く（例えば、少なくとも２％、５％、１０％、またはそれよりも多く）を産生する。細菌は、グルタミン、アンモニア、または補充窒素の他の化学的供給源で補充された肥料の存在下で窒素を産生することができる。一部の実施形態では、遺伝子変異は、以下のものからなる群から選択される遺伝子の変異である：ｎｉｆＡ、ｎｉｆＬ、ｎｔｒＢ、ｎｔｒＣ、グルタミン合成酵素、ｇｌｎＡ、ｇｌｎＢ、ｇｌｎＫ、ｄｒａＴ、ａｍｔＢ、グルタミナーゼ、ｇｌｎＤ、ｇｌｎＥ、ｎｉｆＪ、ｎｉｆＨ、ｎｉｆＤ、ｎｉｆＫ、ｎｉｆＹ、ｎｉｆＥ、ｎｉｆＮ、ｎｉｆＵ、ｎｉｆＳ、ｎｉｆＶ、ｎｉｆＷ、ｎｉｆＺ、ｎｉｆＭ、ｎｉｆＦ、ｎｉｆＢ、およびｎｉｆＱ。遺伝子変異は、以下のうちの１つまたは複数をもたらす突然変異であってもよい：ｎｉｆＡまたはグルタミナーゼの発現の増加；ｎｉｆＬ、ｎｔｒＢ、グルタミン合成酵素、ｇｌｎＢ、ｇｌｎＫ、ｄｒａＴ、ａｍｔＢの発現の減少；ＧｌｎＥのアデニリル除去活性の減少；またはＧｌｎＤのウリジリル除去活性の減少。一部の実施形態では、遺伝子変異は、（ａ）ノックアウト突然変異であるか、（Ｂ）標的遺伝子の調節配列を変更もしくは消失させるか、または（ｃ）異種性調節配列の挿入を含む。細菌は、内部寄生性、着生性、または根圏性であってもよい。一部の場合では、細菌は、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ属またはＲａｈｎｅｌｌａ属である。細菌は、複数の異なる細菌分類群を含んでもよい。
【００３０】
一態様では、本開示は、本明細書に記載の細菌集団等の細菌集団を含む組成物を提供する。組成物は、種子の表面にコーティングされた細菌集団を含んでもよい。一部の実施形態では、組成物は、液剤または粉末として製剤化される。
【００３１】
一態様では、本開示は、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１２２２９３を有する細菌を提供する。一態様では、本開示は、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１２２２９４を有する細菌を提供する。
【００３２】
参照による組込み
本明細書で述べられる刊行物、特許、および特許出願は全て、それぞれ個々の刊行物、特許、または特許出願が参照により具体的かつ個々に組み込まれることが示唆されるのと同程度に参照により本明細書に組み込まれる。
【００３３】
本発明の新規な特徴は、特に添付の特許請求の範囲に示される。本発明の特徴および利点は、本発明の原理が利用されている例示的な実施形態を示す以下の詳細な記載および添付の図面を参照すればより良好に理解されると予想される。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目１)
非マメ科植物中での窒素固定を増加させるための方法であって、
前記植物を複数の細菌に曝露するステップを含み、前記複数の各メンバーが、前記細菌が外来性窒素の存在下で大気窒素を固定できるように、前記細菌の窒素固定または同化の遺伝子調節ネットワークの１つもしくは複数の遺伝子または非コードポリヌクレオチドに導入された１つまたは複数の遺伝子変異を含み、前記細菌が、属間微生物ではなく、前記細菌が、前記植物における固定窒素の１％またはそれよりも多くを植物内で産生する、方法。
(項目２)
前記１つまたは複数の遺伝子変異が、前記窒素固定または同化の遺伝子調節ネットワークの前記１つまたは複数の遺伝子と作動可能に連結した導入された制御配列を含む、項目１に記載の方法。
(項目３)
前記制御配列が、プロモーターである、項目２に記載の方法。
(項目４)
前記プロモーターが、誘導性プロモーターである、項目３に記載の方法。
(項目５)
前記細菌が、前記窒素固定または同化の遺伝子調節ネットワークの遺伝子と作動可能に連結した構成的プロモーターを含まない、項目１に記載の方法。
(項目６)
前記細菌が、ｎｉｆ遺伝子クラスターの遺伝子と作動可能に連結した構成的プロモーターを含まない、項目１に記載の方法。
(項目７)
前記細菌が、窒素固定の窒素含有産物を植物内で排出する、項目１に記載の方法。
(項目８)
前記植物に曝露された前記複数の細菌が、外来性非大気窒素の取り込み増加を刺激しない、項目１に記載の方法。
(項目９)
前記植物が、１エーカー当たり少なくとも５０ｌｂの窒素含有肥料を与えた圃場に由来する土壌で栽培され、前記窒素含有肥料が、少なくとも５重量％の窒素を含む、項目１に記載の方法。
(項目１０)
前記窒素含有肥料が、アンモニウムまたはアンモニウム含有分子を含む、項目９に記載の方法。
(項目１１)
前記複数の細菌が、少なくとも２つの異なる種の細菌を含む、項目１に記載の方法。
(項目１２)
前記複数の細菌が、同じ種の細菌の少なくとも２つの異なる菌株を含む、項目１に記載の方法。
(項目１３)
前記外来性窒素が、グルタミン、アンモニア、アンモニウム、尿素、硝酸塩、亜硝酸塩、アンモニウム含有分子、硝酸塩含有分子、および亜硝酸塩含有分子のうちの１つまたは複数を含む肥料から選択される、項目１に記載の方法。
(項目１４)
前記細菌が、前記植物における前記固定窒素の５％またはそれよりも多くを植物内で産生する、項目１に記載の方法。
(項目１５)
前記細菌が、前記植物における前記固定窒素の１０％またはそれよりも多くを植物内で産生する、項目１に記載の方法。
(項目１６)
前記細菌の窒素固定または同化の遺伝子調節ネットワークの前記１つもしくは複数の遺伝子または非コードポリヌクレオチドが、ｎｉｆＡ、ｎｉｆＬ、ｎｔｒＢ、ｎｔｒＣ、グルタミン合成酵素をコードするポリヌクレオチド、ｇｌｎＡ、ｇｌｎＢ、ｇｌｎＫ、ｄｒａｔ、ａｍｔＢ、グルタミナーゼをコードするポリヌクレオチド、ｇｌｎＤ、ｇｌｎＥ、ｎｉｆＪ、ｎｉｆＨ、ｎｉｆＤ、ｎｉｆＫ、ｎｉｆＹ、ｎｉｆＥ、ｎｉｆＮ、ｎｉｆＵ、ｎｉｆＳ、ｎｉｆＶ、ｎｉｆＷ、ｎｉｆＺ、ｎｉｆＭ、ｎｉｆＦ、ｎｉｆＢ、およびｎｉｆＱからなる群から選択される、項目１に記載の方法。
(項目１７)
前記１つまたは複数の遺伝子変異が、ＮｉｆＡもしくはグルタミナーゼの発現もしくは活性の増加；ＮｉｆＬ、ＮｔｒＢ、グルタミン合成酵素、ＧｌｎＢ、ＧｌｎＫ、ＤｒａＴ、ＡｍｔＢの発現もしくは活性の減少；ＧｌｎＥのアデニリル除去活性の減少；またはＧｌｎＤのウリジリル除去活性の減少のうちの１つまたは複数をもたらす突然変異である、項目１に記載の方法。
(項目１８)
前記１つまたは複数の遺伝子変異が、（Ａ）ノックアウト突然変異であるか、（Ｂ）標的遺伝子の調節配列を変更もしくは消失させるか、または（Ｃ）異種性調節配列の挿入を含む、項目１に記載の方法。
(項目１９)
前記複数の細菌が、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ属、Ｒａｈｎｅｌｌａ属、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ属、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ属、またはＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ属を含む属である、項目１に記載の方法。
(項目２０)
前記複数の細菌が、内部寄生性、着生性、または根圏性である、項目１に記載の方法。
(項目２１)
前記複数の細菌が、少なくとも前記植物の根でコロニー化し、前記細菌が、組織の生重量１グラム当たり少なくとも約１０５ｃｆｕの量で前記植物中に存在する、項目１に記載の方法。
(項目２２)
前記植物が、農業作物植物である、項目１に記載の方法。
(項目２３)
前記農業作物植物が、ソルガム、キャノーラ、トマト、イチゴ、大麦、米、トウモロコシ、および小麦から選択される、項目２２に記載の方法。
(項目２４)
前記植物が、遺伝子改変生物である、項目２２に記載の方法。
(項目２５)
前記植物が、遺伝子改変生物ではない、項目２２に記載の方法。
(項目２６)
前記植物が、効率的な窒素使用のために遺伝子操作されているかまたは品種改良されている、項目２２に記載の方法。
(項目２７)
細菌が外来性窒素の存在下で大気窒素を固定できるように、前記細菌の窒素固定または同化の遺伝子調節ネットワークの１つもしくは複数の遺伝子または非コードポリヌクレオチドに導入された１つまたは複数の遺伝子変異を含む細菌を含む細菌集団であって、前記細菌が属間微生物ではなく、前記細菌が、前記細菌の集団の存在下で栽培される植物における固定窒素の１％またはそれよりも多くを植物内で産生する、細菌集団。
(項目２８)
前記１つまたは複数の遺伝子変異が、前記窒素固定または同化の遺伝子調節ネットワークの前記１つまたは複数の遺伝子と作動可能に連結した導入された制御配列を含む、項目２７に記載の細菌集団。
(項目２９)
前記制御配列が、プロモーターである、項目２８に記載の細菌集団。
(項目３０)
前記プロモーターが、誘導性プロモーターである、項目２９に記載の細菌集団。
(項目３１)
前記細菌が、前記窒素固定または同化の遺伝子調節ネットワークの遺伝子と作動可能に連結した構成的プロモーターを含まない、項目２７に記載の細菌集団。
(項目３２)
前記細菌が、前記ｎｉｆ遺伝子クラスターの遺伝子と作動可能に連結した構成的プロモーターを含まない、項目２７に記載の細菌集団。
(項目３３)
前記細菌が、窒素固定の前記窒素含有産物を植物内で排出する、項目２７に記載の細菌集団。
(項目３４)
前記植物に曝露された前記細菌が、外来性非大気窒素の取り込み増加を刺激しない、項目２７に記載の細菌集団。
(項目３５)
少なくとも２つの異なる種の細菌を含む、項目２７に記載の細菌集団。
(項目３６)
同じ種の細菌の少なくとも２つの異なる菌株を含む、項目２７に記載の細菌集団。
(項目３７)
前記外来性窒素が、グルタミン、アンモニア、アンモニウム、尿素、硝酸塩、亜硝酸塩、アンモニウム含有分子、硝酸塩含有分子、および亜硝酸塩含有分子のうちの１つまたは複数を含む肥料から選択される、項目２７に記載の細菌集団。
(項目３８)
前記細菌が、前記植物における前記固定窒素の５％またはそれよりも多くを植物内で産生する、項目２７に記載の細菌集団。
(項目３９)
前記細菌が、前記植物における前記固定窒素の１０％またはそれよりも多くを植物内で産生する、項目２７に記載の細菌集団。
(項目４０)
前記細菌の窒素固定または同化遺伝子調節ネットワークの前記１つもしくは複数の遺伝子または非コードポリヌクレオチドが、ｎｉｆＡ、ｎｉｆＬ、ｎｔｒＢ、ｎｔｒＣ、グルタミン合成酵素をコードするポリヌクレオチド、ｇｌｎＡ、ｇｌｎＢ、ｇｌｎＫ、ｄｒａｔ、ａｍｔＢ、グルタミナーゼをコードするポリヌクレオチド、ｇｌｎＤ、ｇｌｎＥ、ｎｉｆＪ、ｎｉｆＨ、ｎｉｆＤ、ｎｉｆＫ、ｎｉｆＹ、ｎｉｆＥ、ｎｉｆＮ、ｎｉｆＵ、ｎｉｆＳ、ｎｉｆＶ、ｎｉｆＷ、ｎｉｆＺ、ｎｉｆＭ、ｎｉｆＦ、ｎｉｆＢ、およびｎｉｆＱからなる群から選択される、項目２７に記載の細菌集団。
(項目４１)
前記１つまたは複数の遺伝子変異が、ＮｉｆＡもしくはグルタミナーゼの発現もしくは活性の増加；ＮｉｆＬ、ＮｔｒＢ、グルタミン合成酵素、ＧｌｎＢ、ＧｌｎＫ、ＤｒａＴ、ＡｍｔＢの発現もしくは活性の減少；ＧｌｎＥのアデニリル除去活性の減少；またはＧｌｎＤのウリジリル除去活性の減少のうちの１つまたは複数をもたらす突然変異である、項目２７に記載の細菌集団。
(項目４２)
前記１つまたは複数の遺伝子変異が、（Ａ）ノックアウト突然変異であるか、（Ｂ）標的遺伝子の調節配列を変更もしくは消失させるか、または（Ｃ）異種性調節配列の挿入を含む、項目２７に記載の細菌集団。
(項目４３)
前記複数の細菌が、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ属、Ｒａｈｎｅｌｌａ属、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ属、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ属、またはＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ属を含む属である、項目２７に記載の細菌集団。
(項目４４)
前記複数の細菌が、内部寄生性、着生性、または根圏性である、項目２７に記載の細菌集団。
(項目４５)
前記植物が、農業作物植物である、項目２７に記載の細菌集団。
(項目４６)
前記農業作物植物が、ソルガム、キャノーラ、トマト、イチゴ、大麦、米、トウモロコシ、および小麦から選択される、項目４５に記載の細菌集団。
(項目４７)
前記植物が、遺伝子改変生物である、項目４５に記載の細菌集団。
(項目４８)
前記植物が、遺伝子改変生物ではない、項目４５に記載の細菌集団。
(項目４９)
前記植物が、効率的な窒素使用のために遺伝子操作されているかまたは品種改良されている、項目４５に記載の細菌集団。
(項目５０)
前記複数の細菌が、前記植物でコロニー化し、前記細菌が、前記植物の生重量１グラム当たり少なくとも約１０５ｃｆｕの量で前記植物中に存在する、項目２７に記載の細菌集団。
(項目５１)
項目２７から５０のいずれか１項に記載の細菌集団を含む組成物。
(項目５２)
種子の表面にコーティングされた前記細菌集団を含む、項目５１に記載の組成物。
(項目５３)
液剤または粉末として製剤化されている、項目５１に記載の組成物。
(項目５４)
ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２２２９３またはＰＴＡ−１２２２９４として寄託されている単離された細菌。
(項目５５)
細菌が外来性窒素の存在下で大気窒素を固定できるように、前記細菌の窒素固定または同化の遺伝子調節ネットワークの１つもしくは複数の遺伝子または非コードポリヌクレオチドに導入された１つまたは複数の遺伝子変異を含む、非属間細菌。
(項目５６)
前記１つまたは複数の遺伝子変異が、前記窒素固定または同化の遺伝子調節ネットワークの前記１つまたは複数の遺伝子と作動可能に連結した導入された制御配列を含む、項目５５に記載の細菌。
(項目５７)
前記制御配列が、プロモーターである、項目５６に記載の細菌。
(項目５８)
前記プロモーターが、誘導性プロモーターである、項目５７に記載の細菌。
(項目５９)
前記細菌が、前記窒素固定または同化の遺伝子調節ネットワークの遺伝子と作動可能に連結した構成的プロモーターを含まない、項目５５に記載の細菌。
(項目６０)
前記細菌が、前記ｎｉｆ遺伝子クラスターの遺伝子と作動可能に連結した構成的プロモーターを含まない、項目５５に記載の細菌。
(項目６１)
前記細菌の窒素固定または同化遺伝子調節ネットワークの前記１つもしくは複数の遺伝子または非コードポリヌクレオチドが、ｎｉｆＡ、ｎｉｆＬ、ｎｔｒＢ、ｎｔｒＣ、グルタミン合成酵素をコードするポリヌクレオチド、ｇｌｎＡ、ｇｌｎＢ、ｇｌｎＫ、ｄｒａｔ、ａｍｔＢ、グルタミナーゼをコードするポリヌクレオチド、ｇｌｎＤ、ｇｌｎＥ、ｎｉｆＪ、ｎｉｆＨ、ｎｉｆＤ、ｎｉｆＫ、ｎｉｆＹ、ｎｉｆＥ、ｎｉｆＮ、ｎｉｆＵ、ｎｉｆＳ、ｎｉｆＶ、ｎｉｆＷ、ｎｉｆＺ、ｎｉｆＭ、ｎｉｆＦ、ｎｉｆＢ、およびｎｉｆＱからなる群から選択される、項目５５に記載の細菌。
(項目６２)
前記１つまたは複数の遺伝子変異が、ＮｉｆＡもしくはグルタミナーゼの発現もしくは活性の増加；ＮｉｆＬ、ＮｔｒＢ、グルタミン合成酵素、ＧｌｎＢ、ＧｌｎＫ、ＤｒａＴ、ＡｍｔＢの発現もしくは活性の減少；ＧｌｎＥのアデニリル除去活性の減少；またはＧｌｎＤのウリジリル除去活性の減少のうちの１つまたは複数をもたらす突然変異である、項目５５に記載の細菌。
(項目６３)
前記１つまたは複数の遺伝子変異が、（Ａ）ノックアウト突然変異であるか、（Ｂ）標的遺伝子の調節配列を変更もしくは消失させるか、または（Ｃ）異種性調節配列の挿入を含む、項目５５に記載の細菌。
(項目６４)
前記細菌が、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ属、Ｒａｈｎｅｌｌａ属、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ属、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ属、またはＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ属を含む属に由来する、項目５５に記載の細菌。
(項目６５)
前記細菌が、内部寄生性、着生性、または根圏性である、項目５５に記載の細菌。
(項目６６)
１つまたは複数の細菌を産生するための方法であって、
（ａ）第１の植物の組織または土壌から細菌を単離するステップ、
（ｂ）前記細菌のうちの１つまたは複数に遺伝子変異を導入して、１つまたは複数の変異細菌を産生するステップ、
（ｃ）複数の植物を前記変異細菌に曝露するステップ、
（ｄ）前記複数の植物のうち１つの組織または土壌から細菌を単離するステップであって、前記細菌を単離した前記植物が、前記複数の植物中の他の植物と比較して向上された形質を有する、ステップ、および
（ｅ）ステップ（ｄ）で単離された細菌を用いてステップ（ｂ）〜（ｄ）を繰り返すステップ
を含む方法。
(項目６７)
前記向上された形質が、細菌を単離した前記植物における窒素固定増強である、項目６６に記載の方法。
(項目６８)
前記遺伝子変異が、ｎｉｆＡ、ｎｉｆＬ、ｎｔｒＢ、ｎｔｒＣ、ｇｌｎＡ、ｇｌｎＢ、ｇｌｎＫ、ｄｒａＴ、ａｍｔＢ、ｇｌｎＤ、ｇｌｎＥ、ｎｉｆＪ、ｎｉｆＨ、ｎｉｆＤ、ｎｉｆＫ、ｎｉｆＹ、ｎｉｆＥ、ｎｉｆＮ、ｎｉｆＵ、ｎｉｆＳ、ｎｉｆＶ、ｎｉｆＷ、ｎｉｆＺ、ｎｉｆＭ、ｎｉｆＦ、ｎｉｆＢ、およびｎｉｆＱからなる群から選択される遺伝子の変異である、項目６６に記載の方法。
(項目６９)
前記遺伝子変異が、グルタミン合成酵素、グルタミナーゼ、グルタミン合成酵素アデニリルトランスフェラーゼ、転写活性化因子、抗転写活性化因子、ピルビン酸フラボドキシンオキシドレダクターゼ、フラボドキシン、またはＮＡＤ＋二窒素レダクターゼＡＤＰ−Ｄ−リボシルトランスフェラーゼからなる群から選択される機能性を有するタンパク質をコードする遺伝子の変異である、項目６６に記載の方法。
(項目７０)
前記遺伝子変異が、ＮｉｆＡもしくはグルタミナーゼの発現もしくは活性の増加；ＮｉｆＬ、ＮｔｒＢ、グルタミン合成酵素、ＧｌｎＢ、ＧｌｎＫ、ＤｒａＴ、ＡｍｔＢの発現もしくは活性の減少；ＧｌｎＥのアデニリル除去活性の減少；またはＧｌｎＤのウリジリル除去活性の減少のうちの１つまたは複数をもたらす突然変異である、項目６６に記載の方法。
(項目７１)
前記遺伝子変異が、ノックアウト突然変異である、項目６６に記載の方法。
(項目７２)
前記遺伝子変異が、タンパク質ドメインの活性の排除または消失をもたらす、項目６６に記載の方法。
(項目７３)
前記遺伝子変異が、標的遺伝子の調節配列を変更または消失させる、項目６６に記載の方法。
(項目７４)
前記遺伝子変異が、異種性調節配列の挿入を含む、項目６６に記載の方法。
(項目７５)
前記遺伝子変異が、前記遺伝子変異が導入されている前記細菌に対応する細菌種または属のゲノム内に見出される調節配列の挿入を含む、項目６６に記載の方法。
(項目７６)
前記調節配列が、細菌培養物のまたは植物組織内の遺伝子の発現レベルに基づいて選択される、項目７５に記載の方法。
(項目７７)
前記遺伝子変異が、化学的突然変異誘発により生成される、項目６６に記載の方法。
(項目７８)
ステップ（ｃ）が、前記植物を、生物ストレス因子または非生物ストレス因子に曝露することをさらに含む、項目６６に記載の方法。
(項目７９)
ステップ（ｂ）〜（ｄ）を１回または複数回繰り返した後で単離された細菌が、前記第１の植物と同じタイプの第２の植物における窒素の１％またはそれよりも多くを産生する、項目６７に記載の方法。
(項目８０)
ステップ（ｂ）〜（ｄ）を１回または複数回繰り返した後で単離された細菌が、前記第１の植物から単離された細菌と比較して、少なくとも２倍増の窒素固定を示す、項目６７に記載の方法。
(項目８１)
前記第２の植物が、グルタミン、アンモニア、または窒素の他の化学的供給源で補充された肥料の存在下で栽培される、項目８０に記載の方法。
(項目８２)
前記第１の植物が、農業作物植物である、項目６６に記載の方法。
(項目８３)
前記農業作物植物が、大麦、米、トウモロコシ、小麦、ソルガム、スイートコーン、サトウキビ、タマネギ、トマト、イチゴ、またはアスパラガスから選択される、項目８２に記載の方法。
(項目８４)
前記複数の植物における前記第１の植物が、モデル植物である、項目６６に記載の方法。
(項目８５)
前記モデル植物が、Ｓｅｔａｒｉａ属、Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ属、またはＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ属から選択される、項目８４に記載の方法。
(項目８６)
前記遺伝子変異が、標的部位に特異的に導入された所定の遺伝子変異である、項目６６に記載の方法。
(項目８７)
前記遺伝子変異が、前記標的部位内のランダム突然変異である、項目６６に記載の方法。
(項目８８)
ステップ（ａ）が、単離された細菌の遺伝子分析を実施することをさらに含む、項目６６に記載の方法。
(項目８９)
ステップ（ｂ）が、前記遺伝子変異を含む細菌を富化するように選択圧を加えることをさらに含む、項目６６に記載の方法。
(項目９０)
前記選択圧が、標的部位に導入された前記遺伝子変異が欠如したゲノムを切断し、切断が、前記標的部位の１００ヌクレオチド内で生じることを含む、項目８９に記載の方法。
(項目９１)
前記選択圧を生き残った細菌を単離することをさらに含む、項目８９に記載の方法。
(項目９２)
切断が、対抗選択可能なマーカー、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、ＴＡＬＥヌクレアーゼ、またはメガヌクレアーゼからなる群から選択される部位特異的ヌクレアーゼにより指示される、項目９１に記載の方法。
(項目９３)
前記部位特異的ヌクレアーゼが、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼである、項目９２に記載の方法。
(項目９４)
前記遺伝子変異が、１つまたは複数のヌクレオチドの挿入または欠失である、項目６６に記載の方法。
(項目９５)
ステップ（ｂ）〜（ｄ）を１回または複数回繰り返した後で単離された細菌が、内部寄生性、着生性、または根圏性である、項目６６に記載の方法。
(項目９６)
ステップ（ｂ）〜（ｄ）を１回または複数回繰り返した後で単離された細菌が、複数の異なる細菌分類群を含む、項目６６に記載の方法。
(項目９７)
前記細菌が、植物組織から単離される、項目６６に記載の方法。
(項目９８)
ステップ（ａ）での細菌単離が、前記第１の植物の種子から細菌を単離することを含む、項目６６に記載の方法。
(項目９９)
細菌種の細胞のゲノムを改変するための方法であって、
（ａ）前記細菌種に由来する配列からなる部分配列を含むポリヌクレオチドを提供するステップであって、前記部分配列が、５’から３’の方向で、第１の相同配列、プロモーター、および第２の相同配列を含む、ステップ；ならびに
（ｂ）前記ゲノムの標的遺伝子座と前記ポリヌクレオチドとの相同組換えを誘導して組換え配列を産出するステップであって、（ｉ）前記標的遺伝子座が、前記第１および第２の相同配列を端部に有する標的配列を含み、（ｉｉ）前記標的遺伝子座に隣接する１つまたは複数の第２の遺伝子の発現を増強する、ステップ
を含む方法。
(項目１００)
（ｂ）（ｉｉｉ）相同組換えが、前記標的配列を含む第１の遺伝子の発現を妨害することをさらに含む、項目９９に記載の方法。
(項目１０１)
（ｃ）前記組換え配列を含む細菌細胞を単離するステップをさらに含む、項目９９に記載の方法。
(項目１０２)
前記プロモーターが、環境条件下において閾値レベルを超える発現活性に基づいて選択される、項目９９に記載の方法。
(項目１０３)
前記環境条件が、栄養素利用能、栄養欠乏、窒素ストレス、窒素への曝露の増加、熱、寒さ、浸透圧ストレス、乾燥、洪水、塩分、種間シグナル伝達化合物の有無、病原体の有無、および殺虫剤、除草剤、殺昆虫剤、殺線虫剤、殺真菌剤、または殺細菌剤の有無からなる群から選択され、曝露の増加または減少が、基準状態に対するものである、項目１０２に記載の方法。
(項目１０４)
前記プロモーターの選択が、（ａ）前記細菌種の細胞を、前記環境条件に曝露すること、（ｂ）前記細胞の転写物の発現レベルを測定すること、および（ｃ）閾値レベルを超えるレベルを有する転写物の発現を駆動する前記プロモーターを特定することを含む、項目１０３に記載の方法。
(項目１０５)
前記部分配列が、前記細菌種のタンパク質をコードしない、項目９９に記載の方法。
(項目１０６)
前記部分配列が、選択可能なマーカーをコードしない、項目９９に記載の方法。
(項目１０７)
細菌細胞を単離するステップが、前記組換え配列が欠如した細胞に対してネガティブセレクションを適用することを含む、項目１０１に記載の方法。
(項目１０８)
ネガティブセレクションが、前記組換え配列が欠如したゲノムを切断することを含み、切断が、前記標的配列の１００ヌクレオチド内で生じる、項目１０７に記載の方法。
(項目１０９)
前記切断が、対抗選択可能なマーカー、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、ＴＡＬＥヌクレアーゼ、またはメガヌクレアーゼからなる群から選択される部位特異的ヌクレアーゼにより指示される、項目１０８に記載の方法。
(項目１１０)
前記部位特異的ヌクレアーゼが、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼである、項目１０９に記載の方法。
(項目１１１)
前記第１の遺伝子が、前記１つまたは複数の第２の遺伝子の負の調節因子である、項目９９に記載の方法。
(項目１１２)
前記第１の遺伝子、前記１つまたは複数の第２の遺伝子、または両方が、窒素固定経路のメンバーである、項目９９に記載の方法。
(項目１１３)
前記第１の遺伝子が、ＮｉｆＬ、ＮｔｒＢ、グルタミン合成酵素、ＧｌｎＢ、ＧｌｎＫ、ＤｒａＴ、およびＡｍｔＢからなる群から選択される、項目９９に記載の方法。
(項目１１４)
前記１つまたは複数の第２の遺伝子が、ＮｉｆＡおよびグルタミナーゼからなる群から選択される、項目９９に記載の方法。
(項目１１５)
前記単離された細菌細胞が、内部寄生性、着生性、または根圏性である、項目９９に記載の方法。
(項目１１６)
前記単離された細菌細胞が、宿主植物の細胞中の窒素の５％またはそれよりも多くを産生する、項目１１５に記載の方法。
(項目１１７)
前記単離された細菌が、グルタミン、アンモニア、または補充窒素の他の化学的供給源で補充された肥料の存在下で前記窒素を産生する、項目１１６に記載の方法。
(項目１１８)
細菌種の細胞の標的遺伝子を妨害するための、前記細菌種に由来する配列からなる部分配列を含むポリヌクレオチドであって、
（ａ）前記部分配列が、５’から３’の方向で、第１の相同配列、プロモーター、および第２の相同配列を含み、
（ｂ）前記第１および第２の相同配列が、標的配列の端部にある配列に相当し、前記標的配列が、前記部分配列と前記標的配列を含む標的遺伝子座との間の相同組換え時に欠失され、
（ｃ）前記標的配列は、少なくとも第１の遺伝子の第１のタンパク質をコードする部分を含み、
（ｄ）前記部分配列が、前記細菌種のタンパク質をコードしない、ポリヌクレオチド。
(項目１１９)
前記部分配列が、選択可能なマーカーをコードしない、項目１１８に記載のポリヌクレオチド。
(項目１２０)
前記プロモーターが、環境条件下において閾値レベルを超える発現活性を有する遺伝子のプロモーターである、項目１１８に記載のポリヌクレオチド。
(項目１２１)
前記環境条件が、窒素への曝露の増加であり、曝露の増加が、基準条件に対するものある、項目１２０に記載のポリヌクレオチド。
(項目１２２)
前記標的配列が、１つまたは複数の第２の遺伝子に隣接している、項目１１８に記載のポリヌクレオチド。
(項目１２３)
前記第１の遺伝子、前記１つまたは複数の第２の遺伝子、または両方が、窒素固定経路のメンバーである、項目１２２に記載のポリヌクレオチド。
(項目１２４)
前記第１の遺伝子が、ＮｉｆＬ、ＮｔｒＢ、グルタミン合成酵素、ＧｌｎＢ、ＧｌｎＫ、ＤｒａＴ、およびＡｍｔＢからなる群から選択される、項目１１８に記載のポリヌクレオチド。
(項目１２５)
前記細胞が、内部寄生性、着生性、または根圏性である細菌である、項目１１８に記載のポリヌクレオチド。
(項目１２６)
項目１１８から１２５のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
(項目１２７)
項目１２６に記載の発現を含む細胞。
(項目１２８)
前記複数の細菌が、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ属である、項目１に記載の方法。
(項目１２９)
前記複数の細菌が、Ｒａｈｎｅｌｌａ属である、項目１に記載の方法。
(項目１３０)
前記複数の細菌が、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ属である、項目１に記載の方法。(項目１３１)
前記複数の細菌が、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ属である、項目１に記載の方法。
(項目１３２)
前記複数の細菌が、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属である、項目１に記載の方法。
(項目１３３)
前記複数の細菌が、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ属である、項目２７に記載の細菌集団。
(項目１３４)
前記複数の細菌が、Ｒａｈｎｅｌｌａ属である、項目２７に記載の細菌集団。
(項目１３５)
前記複数の細菌が、Ｋｏｓａｋｏｎｉａ属である、項目２７に記載の細菌集団。
(項目１３６)
前記複数の細菌が、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ属である、項目２７に記載の細菌集団。
(項目１３７)
前記複数の細菌が、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属である、項目２７に記載の細菌集団。
(項目１３８)
Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ属に由来する、項目５５に記載の細菌。
(項目１３９)
Ｒａｈｎｅｌｌａ属に由来する、項目５５に記載の細菌。
(項目１４０)
Ｋｏｓａｋｏｎｉａ属に由来する、項目５５に記載の細菌。
(項目１４１)
Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ属に由来する、項目５５に記載の細菌。
(項目１４２)
Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属に由来する、項目５５に記載の細菌。
(項目１４３)
（ｂ）（ｉｉｉ）相同組換えが、前記標的配列を含む第１の遺伝子の発現を妨害すること、および
（ｃ）前記組換え配列を含む細菌細胞を単離するステップをさらに含む、項目９９に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】図１Ａ〜Ｂは、窒素固定細菌の富化および単離を示す。（Ａ）Ｎｆｂ寒天プレートを使用して、窒素固定細菌の単一コロニーを単離した。（Ｂ）半固体Ｎｆｂ寒天をＢａｌｃｈチューブに流した。矢印は、豊化された窒素固定細菌のペリクルを指す。
【００３５】
【図２】図２は、代表的なｎｉｆＨ  ＰＣＲスクリーニングを示す。このスクリーニングでは２つのコロニーで、約３５０ｂｐに陽性バンドが観察された。その下にあるバンドは、プライマー二量体を表す。
【００３６】
【図３】図３は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ−選択突然変異誘発に由来するコロニーのＰＣＲスクリーニングの例を示す。ＣＩ００６コロニーを、ｎｉｆＬ遺伝子座に特異的なプライマーでスクリーニングした。野生型ＰＣＲ産物は、約２．２ｋｂであることが予想されるが、突然変異体は、約１．１ｋｂであることが予想される。スクリーニングした１０個のコロニーのうちの７個が、所望の欠失を明白に示す。
【００３７】
【図４−１】図４Ａ〜Ｄは、種々の菌株のｉｎ  ｖｉｔｒｏ表現型を示す。０〜１０ｍＭグルタミンで補充された窒素固定培地で増殖させた菌株ＣＩ０１０の突然変異体（図４Ａ）および菌株ＣＩ００６の突然変異体（図４Ｂ）のアセチレン還元アッセイ（ＡＲＡ）活性。図４Ｃには、追加の菌株のＡＲＡ活性が示され、図４Ｄには、２つの菌株の経時的なアンモニウム排出プロファイルが示される。
【図４−２】図４Ａ〜Ｄは、種々の菌株のｉｎ  ｖｉｔｒｏ表現型を示す。０〜１０ｍＭグルタミンで補充された窒素固定培地で増殖させた菌株ＣＩ０１０の突然変異体（図４Ａ）および菌株ＣＩ００６の突然変異体（図４Ｂ）のアセチレン還元アッセイ（ＡＲＡ）活性。図４Ｃには、追加の菌株のＡＲＡ活性が示され、図４Ｄには、２つの菌株の経時的なアンモニウム排出プロファイルが示される。
【００３８】
【図５】図５は、ジアゾトロフィック（ｄｉａｚａｏｔｒｏｐｈｉｃ）窒素固定に関与する菌株ＣＩ００６の９個の異なる遺伝子の培養発現プロファイルを示す。数値は、各転写物の計数を表す。種々の条件（０、１、１０ｍＭのグルタミン、および０％、１０％、２０％のＮ２中大気空気）が示される。
【００３９】
【図６】図６は、トウモロコシ根のＣＩ００６コロニー化を示す。トウモロコシ実生に、ＲＦＰ発現プラスミドを内包するＣＩ００６を接種した。適切な抗生物質と共に灌水することによる２週間の増殖およびプラスミド維持の後、根を回収し、蛍光顕微鏡で画像化した。根細胞間隙のコロニー化を観察する。
【００４０】
【図７】図７は、ＷＴ（ＣＩ０５０）菌株および最適化（ＣＭ００２）菌株の微生物レベルに由来する窒素を示す。
【００４１】
【図８】図８は、Ｍｉｃｒｏ−Ｔｏｍ果実質量アッセイの実験設定を示す。
【００４２】
【図９】図９は、Ｍｉｃｒｏ−Ｔｏｍ植物果実質量の増加に関する、１０個の菌株のスクリーニングを示す。６回の重複測定の結果が示されている。３列目は、ｐ＝０．０７。７列目は、ｐ＝０．０５。
【００４３】
【図１０−１】図１０Ａ〜Ｃは、０〜１０ｍＭグルタミンで補充された窒素固定培地で増殖した候補微生物および対応する候補突然変異体のＡＲＡ活性に関する追加の結果を示す。
【図１０−２】図１０Ａ〜Ｃは、０〜１０ｍＭグルタミンで補充された窒素固定培地で増殖した候補微生物および対応する候補突然変異体のＡＲＡ活性に関する追加の結果を示す。
【００４４】
【図１１】図１１は、それが由来した単一の突然変異体よりも高いアンモニア排出を示す二重突然変異体を示す。
【００４５】
【図１２】図１２は、施肥条件下のトウモロコシ植物のＮＤＦＡを測定するための１５Ｎガス取り込み実験から得られたＮＤＦＡを示す（曝露日数を使用して外挿した）。
【００４６】
【図１３】図１３は、施肥条件下のＳｅｔａｒｉａ属植物のＮＤＦＡを測定するための１５Ｎガス取り込み実験から得られたＮＤＦＡ値を示す（曝露日数を使用して外挿した）。
【００４７】
【図１４Ａ】図１４Ａは、１５Ｎガスの取り込み率を示す。進化させた菌株を接種した植物は、未接種の植物と比較して、１５Ｎガス取り込みの増加を示した。
【００４８】
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、植栽４週間後には、進化させた菌株を接種した植物における窒素の最大７％が、微生物的に固定された窒素に由来することを示す。
【００４９】
【図１４Ｃ】図１４Ｃは、葉面積（および他のバイオマス測定、データ非表示）が、未接種または野生型の接種済み植物と比較して、進化させた菌株を接種した植物で増加することを示す。
【００５０】
【図１５Ａ】図１５Ａは、進化させた菌株が、植物内トランスクリプトーム研究により測定すると、根組織において著しくより高いｎｉｆＨ産生を示すことを示す。
【００５１】
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、植物組織に見出される固定窒素の割合が、その特定の植物がＨｏＭＥ最適化菌株によりコロニー化されている割合と相関することを示す。
【００５２】
【図１６Ａ】図１６Ａは、コロニー化を試験した種々の圃場土壌の土壌テクスチャマップを示す。少数の微生物のそもそもの発生源である土壌には、星印が示されている。
【００５３】
【図１６Ｂ】図１６Ｂは、４つの異なる土壌タイプ（円）にわたって試験した菌株１および菌株５のコロニー化率を示す。両菌株は、多様な土壌タイプにわたって比較的ロバストなコロニー化プロファイルを示した。
【００５４】
【図１６Ｃ】図１６Ｃは、成長季節の期間にわたって圃場試験で試験した菌株１のコロニー化を示す。菌株１は、植栽後１２週目までトウモロコシ組織に存在し続け、その期間後、コロニー化の低下を示し始める。
【発明を実施するための形態】
【００５５】
用語「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」、「核酸」、および「オリゴヌクレオチド」は、同義的に使用される。それらは、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのいずれかの、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態、またはそれらの類似体を指す。ポリヌクレオチドは、あらゆる３次元構造も有してもよく、公知か未知かに関わらず、あらゆる機能を発揮してもよい。ポリヌクレオチドの非限定的な例としては、下記：遺伝子または遺伝子断片のコードまたは非コード領域、連鎖解析で規定された遺伝子座、エキソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマーが挙げられる。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体等のうちの１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含んでもよい。ヌクレオチド構造への修飾は、存在する場合、ポリマー構築の前に付与されてもよく、または後に付与されてもよい。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分により中断されてもよい。ポリヌクレオチドは、標識成分とのコンジュゲーション等によって、重合後にさらに修飾されてもよい。
【００５６】
「ハイブリダイゼーション」は、１つまたは複数のポリヌクレオチドを反応させて、ヌクレオチド残基の塩基間の水素結合により安定化される複合体を形成する反応を指す。水素結合は、ワトソン−クリック型塩基対により生じてもよく、フーグスティン結合により生じてもよく、または塩基相補性による任意の他の配列特異的様式で生じてもよい。複合体は、二本鎖構造を形成する２本の鎖、複数鎖複合体を形成する３本またはそれよりも多くの鎖、単一の自己ハイブリダイズ鎖、またはそれらの任意の組合せを含んでもよい。ハイブリダイゼーション反応は、ＰＣＲの開始、またはエンドヌクレアーゼによるポリヌクレオチドの酵素切断等の、より広範なプロセスのステップを構成してもよい。第１の配列に相補的な第２の配列は、第１の配列の「相補体」と呼ばれる。用語「ハイブリダイズ可能な」は、ポリヌクレオチドに適用される場合、ポリヌクレオチドが、ハイブリダイゼーション反応にて、ヌクレオチド残基の塩基間の水素結合により安定化される複合体を形成する能力を指す。
【００５７】
「相補性」は、核酸が、従来のワトソン−クリック型または他の非従来型のいずれかにより別の核酸配列と水素結合を形成する能力を指す。相補性パーセントは、第２の核酸配列と水素結合（例えば、ワトソン−クリック型塩基対）を形成することができる、核酸分子中の残基のパーセントを示す（例えば、１０個のうち５、６、７、８、９、１０個は、それぞれ５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、および１００％相補性である）。「完全に相補的」は、核酸配列の隣接残基が全て、第２の核酸配列中の同数の隣接残基と水素結合することになることを意味する。「実質的に相補的」は、本明細書で使用される場合、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０個、またはそれよりも多くのヌクレオチドの領域にわたって、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％である相補性の度合いを指すか、またはストリンジェントな条件下でハイブリダイズする２つの核酸を指す。相補性パーセントを評価する目的のため等の配列同一性は、これらに限定されないが、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（例えば、ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａ／ｅｍｂｏｓｓ＿ｎｅｅｄｌｅ／ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ．ｈｔｍｌで入手可能なＥＭＢＯＳＳ  Ｎｅｅｄｌｅアライナーを参照。任意選択で初期設定を使用してもよい）、ＢＬＡＳＴアルゴリズム（例えば、ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉで入手可能なＢＬＡＳＴアラインメントツールを参照。任意選択で初期設定を使用してもよい）、またはＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム（例えば、ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａ／ｅｍｂｏｓｓ＿ｗａｔｅｒ／ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ．ｈｔｍｌで入手可能なＥＭＢＯＳＳ  Ｗａｔｅｒアライナーを参照。任意選択で初期設定を使用してもよい）を含む任意の好適なアラインメントアルゴリズムにより測定することができる。初期設定パラメータを含む、選択したアルゴリズムの任意の好適なパラメータを使用して、最適なアラインメントを評価することができる。
【００５８】
一般的に、ハイブリダイゼーションのための「ストリンジェントな条件」は、標的配列との相補性を有する核酸が、主に標的配列とハイブリダイズするが、非標的配列とは実質的にハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントな条件は、一般的に配列依存性であり、幾つかの要因に応じて様々である。一般的に、配列が長いほど、その配列がその標的配列と特異的にハイブリダイズする温度は高くなる。ストリンジェントな条件の非限定的な例は、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３年）、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  Ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｐａｒｔ  Ｉ、第２章「Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｂｅ  ａｓｓａｙ」、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎ．Ｙ．に詳細に記載されている。
【００５９】
本明細書で使用される場合、「発現」は、ポリヌクレオチドがＤＮＡ鋳型から（ｍＲＮＡまたは他のＲＮＡ転写物へと等）転写されるプロセス、および／または転写されたｍＲＮＡが引き続きペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質へと翻訳されるプロセスを指す。転写物およびコードポリペプチドは、「遺伝子産物」と総称される場合がある。ポリヌクレオチドが、ゲノムＤＮＡに由来する場合、発現は、真核細胞でのｍＲＮＡスプライシングを含む場合がある。
【００６０】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、本明細書では同義的に使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指す。ポリマーは、直鎖であってもよくまた分岐していてもよく、修飾アミノ酸を含んでもよく、非アミノ酸により中断されてもよい。また、これら用語は、修飾されているアミノ酸ポリマー、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または標識成分とのコンジュゲーション等の任意の他の操作を包含する。用語「アミノ酸」は、本明細書で使用される場合、グリシンおよびＤまたはＬの両光学異性体を含む天然および／もしくは非天然または合成アミノ酸、ならびにアミノ酸類似体およびペプチド模倣体を含む。
【００６１】
本明細書で使用される場合、用語「約」は、用語「およそ」と同義的に使用される。例示的には、量に関する用語「約」の使用は、数値が、言及されている数値のわずかに外側にあること、例えば、プラスまたはマイナス０．１％〜１０％であることを示す。
【００６２】
用語「生物学的に純粋な培養物」または「実質的に純粋な培養物」は、培養物の複製を妨げたり、または通常の細菌学的技法によって検出されたりするほどの量の他の細菌種を含まない、本明細書に記載の細菌種の培養を指す。  
【００６３】
「植物生産性」は、一般的に、植物を成長させる根拠となる植物の成長または発達のあらゆる態様を指す。穀物または野菜等の食用作物の場合、「植物生産性」は、特定の作物から収穫される穀物または果実の収穫高を指す場合がある。本明細書で使用される場合、植物生産性の向上は、穀物、果実、花、または種々の目的で収穫される他の植物部分の収穫高の向上；茎、葉、および根を含む植物部分の成長の向上；植物成長の促進；葉における高葉緑素含有量の維持；果実数または種子数の増加；果実重量または種子重量の増加；窒素肥料使用量の削減によるＮＯ２排出削減；および植物の成長および発達の類似の向上を、幅広く指す。
【００６４】
食用作物内および周囲の微生物は、それら作物の形質に影響を及ぼす場合がある。微生物により影響を受ける場合がある植物形質としては、以下のものが挙げられる：収穫高（例えば、穀物生産、バイオマス生成、果実形成、着花）；栄養（例えば、窒素、リン、カリウム、鉄、微量栄養素の獲得）；非生物ストレス管理（例えば、乾燥耐性、耐塩性、耐熱性）；および生物ストレス管理（例えば、害虫、雑草、昆虫、真菌、および細菌）。作物形質を変更するための戦略としては、以下のものが挙げられる：重要な代謝物濃度を増加させること；重要な代謝物に対する微生物影響の経時的動態を変更すること；微生物代謝物産生／分解を新しい環境的要因と関連させること；負の代謝物を減少させること；および代謝物またはそれらの根底をなすタンパク質のバランスを向上させること。
【００６５】
本明細書で使用される場合、「制御配列」は、オペレーター、プロモーター、サイレンサー、またはターミネーターを指す。
【００６６】
本明細書で使用される場合、「植物内」は、植物の中を指し、植物は、葉、根、茎、種子、胚珠、花粉、花、果実等をさらに含む。
【００６７】
一部の実施形態では、本開示の遺伝子の天然または内因性制御配列は、１つまたは複数の属内制御配列と置換されている。
【００６８】
本明細書で使用される場合、「導入」は、天然の導入ではなく、現代的なバイオテクノロジーによる導入を指す。
【００６９】
一部の実施形態では、本開示の細菌は、修飾されており、天然の細菌ではない。
【００７０】
一部の実施形態では、本開示の細菌は、植物の生重量または乾燥重量の１グラム当たり、少なくとも１０３ｃｆｕ、１０４ｃｆｕ、１０５ｃｆｕ、１０６ｃｆｕ、１０７ｃｆｕ、１０８ｃｆｕ、１０９ｃｆｕ、１０１０ｃｆｕ、１０１１ｃｆｕ、または１０１２ｃｆｕの量で植物中に存在する。一部の実施形態では、本開示の細菌は、植物の生重量または乾燥重量の１グラム当たり、少なくとも約１０３ｃｆｕ、約１０４ｃｆｕ、約１０５ｃｆｕ、約１０６ｃｆｕ、約１０７ｃｆｕ、約１０８ｃｆｕ、約１０９ｃｆｕ、約１０１０ｃｆｕ、約１０１１ｃｆｕ、または約１０１２ｃｆｕの量で植物中に存在する。一部の実施形態では、本開示の細菌は、植物の生重量または乾燥重量の１グラム当たり、少なくとも１０３〜１０９、１０３〜１０７、１０３〜１０５、１０５〜１０９、１０５〜１０７、１０６〜１０１０、１０６〜１０７ｃｆｕの量で植物中に存在する。
【００７１】
本開示の肥料および外来性窒素は、以下の窒素含有分子：アンモニウム、硝酸塩、亜硝酸塩、アンモニア、グルタミン等を含んでもよい。本開示の窒素源としては、以下のものを挙げることができる：無水アンモニア、硫酸アンモニア、尿素、リン酸二アンモニウム、尿素の形態、リン酸一アンモニウム、硝酸アンモニウム、窒素溶液、硝酸カルシウム、硝酸カリウム、硝酸ナトリウム等。
【００７２】
本明細書で使用される場合、「外来性窒素」は、アンモニア、アンモニウム、硝酸塩、亜硝酸塩、尿素、尿酸、アンモニウム酸等を含む、非窒素制限条件下で存在する、土壌、圃場、または増殖培地で容易に利用可能な非大気窒素を指す。
【００７３】
本明細書で使用される場合、「非窒素制限条件」は、Ｋａｎｔら、（２０１０年、Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｂｉｏｌ．、６２巻（４号）：１４９９〜１５０９頁）に開示されているような、約４ｍＭ窒素を超える濃度で土壌、圃場、培地で利用可能な非大気窒素を指す。この文献は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００７４】
本明細書で使用される場合、「属間微生物」は、元々は異なる分類学的属の生物から単離された遺伝物質の意図的な組合せにより形成されている微生物である。「属間突然変異」は、「属間微生物」と同義的に使用される場合がある。例示的な「属間微生物」は、レシピエント微生物とは異なる属の微生物で最初に同定された可動遺伝要素を含有する微生物を含む。さらなる説明は、特に、連邦規則集第４０巻セクション７２５．３に見出すことができる。
【００７５】
本明細書で使用される場合、「属内微生物」は、元々は同じ分類学的属の生物から単離された遺伝物質の意図的な組合せにより形成されている微生物である。「属内突然変異」は、「属内微生物」と同義的に使用される場合がある。
【００７６】
本明細書で使用される場合、「導入された遺伝物質」は、レシピエントのゲノムに付加され、レシピエントのゲノムの成分として残留する遺伝物質を意味する。
【００７７】
一部の実施形態では、窒素固定および同化の遺伝子調節ネットワークは、遺伝子をコードするポリヌクレオチドならびに微生物の窒素固定および／または同化を指示、調整、および／または調節する非コード配列を含み、ｎｉｆクラスター（例えば、ｎｉｆＡ、ｎｉｆＢ、ｎｉｆＣ、．．．ｎｉｆＺ）のポリヌクレオチド配列、窒素調節タンパク質Ｃをコードするポリヌクレオチド、窒素調節タンパク質Ｂをコードするポリヌクレオチド、ｇｌｎクラスター（例えば、ｇｌｎＡおよびｇｌｎＤ）のポリヌクレオチド配列、ｄｒａＴ、およびアンモニア輸送体／パーミアーゼを含んでもよい。
【００７８】
一部の実施形態では、本開示の肥料は、重量で少なくとも５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の窒素を含む。
【００７９】
一部の実施形態では、本開示の肥料は、重量で少なくとも約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約１９％、約２０％、約２１％、約２２％、約２３％、約２４％、約２５％、約２６％、約２７％、約２８％、約２９％、約３０％、約３１％、約３２％、約３３％、約３４％、約３５％、約３６％、約３７％、約３８％、約３９％、約４０％、約４１％、約４２％、約４３％、約４４％、約４５％、約４６％、約４７％、約４８％、約４９％、約５０％、約５１％、約５２％、約５３％、約５４％、約５５％、約５６％、約５７％、約５８％、約５９％、約６０％、約６１％、約６２％、約６３％、約６４％、約６５％、約６６％、約６７％、約６８％、約６９％、約７０％、約７１％、約７２％、約７３％、約７４％、約７５％、約７６％、約７７％、約７８％、約７９％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の窒素を含む。
【００８０】
一部の実施形態では、本開示の肥料は、重量で約５％〜５０％、約５％〜７５％、約１０％〜５０％、約１０％〜７５％、約１５％〜５０％、約１５％〜７５％、約２０％〜５０％、約２０％〜７５％、約２５％〜５０％、約２５％〜７５％、約３０％〜５０％、約３０％〜７５％、約３５％〜５０％、約３５％〜７５％、約４０％〜５０％、約４０％〜７５％、約４５％〜５０％、約４５％〜７５％、または約５０％〜７５％の窒素を含む。
【００８１】
一部の実施形態では、窒素固定の増加および／または植物における窒素の１％またはそれよりも多くの産生は、本開示の細菌に曝露していない対照植物と比較して測定される。細菌の増加または減少は全て、対照細菌と比較して測定される。植物の増加または減少は全て、対照植物と比較して測定される。
【００８２】
本明細書で使用される場合、「構成的プロモーター」は、ほとんどの条件下でおよび／またはほとんどの発生段階中で活性なプロモーターである。バイオテクノロジーで使用される発現ベクターの構成的プロモーターを使用することには、トランスジェニック細胞または生物を選択するために使用されるタンパク質の高レベル産生；容易な検出および定量化を可能にするレポータータンパク質またはスコア化可能なマーカーの高レベル発現；転写調節系の一部である転写因子の高レベル産生；生物中で遍在活性が必要とされる化合物の産生；および全ての発生段階中に必要とされる化合物の産生等の幾つかの利点がある。非限定的で例示的な構成的プロモーターとしては、ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター、オパインプロモーター、ユビキチンプロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼプロモーター等が挙げられる。
【００８３】
本明細書で使用される場合、「非構成的プロモーター」は、ある特定の条件下で、ある特定のタイプの細胞で、および／またはある特定の発生段階中に活性なプロモーターである。例えば、組織特異的、組織優先的、細胞タイプ特異的、細胞タイプ優先的な誘導性プロモーター、および発生制御下にあるプロモーターは、非構成的プロモーターである。発生制御下にあるプロモーターの例としては、ある特定の組織で優先的に転写を開始させるプロモーターが挙げられる。
【００８４】
本明細書で使用される場合、「誘導性」または「抑制可能な」プロモーターは、化学因子または環境因子の制御下にあるプロモーターである。誘導性プロモーターによる転写に影響を及ぼし得る環境条件の例としては、嫌気条件、ある特定の化学物質、光の存在、酸性または塩基性条件等が挙げられる。
【００８５】
本明細書で使用される場合、「組織特異的」プロモーターは、ある特定の組織でのみ転写を開始させるプロモーターである。遺伝子の構成的発現とは異なり、組織特異的な発現は、幾つかの遺伝子調節レベルの相互作用の結果である。したがって、当技術分野では、時には、同種のまたは緊密に関連する種に由来するプロモーターを使用して、特定の組織における効率的で信頼性の高い導入遺伝子の発現を達成することが好ましい。これは、特定の組織から単離された組織特異的プロモーターが大量に、科学文献および特許文献の両方に見出されることの主な理由の１つである。
【００８６】
本明細書で使用される場合、用語「作動可能に連結した」は、一方の機能が他方により調節されるように、核酸配列を単一の核酸断片上で関連させることを指す。例えば、プロモーターは、コード配列の発現を調節することが可能な（つまり、コード配列がプロモーターの転写制御下にある）場合、そのコード配列と作動可能に連結している。コード配列は、センス配向性で調節配列に作動可能に連結してもよく、またはアンチセンス配向性で調節配列に作動可能に連結してもよい。別の例では、本開示の相補的ＲＮＡ領域は、標的ｍＲＮＡの５’に、または標的ｍＲＮＡの３’に、または標的ｍＲＮＡ内に、直接または間接のいずれかで作動可能に連結してもよい。または、第１の相補的領域が５’であり、その相補体は標的ｍＲＮＡの３’である。
【００８７】
本明細書に記載の方法による調節の標的となり得る１つの形質は、窒素固定である。窒素肥料は、農場における最も大きな運営上の出費であり、トウモロコシおよび小麦のような条植え作物の収穫高を向上させる最大の誘因である。本明細書には、非マメ科作物に再生可能な形態の窒素を送達することができる微生物製品が記載されている。一部の内部寄生菌は、純粋培養での窒素固定に必要な遺伝的特徴を有するが、根本的な技術的難問は、穀類およびイネ科植物の野生型内部寄生菌は、施肥圃場では窒素固定を中止してしまうことである。化学肥料の施肥および圃場土壌中の残留窒素レベルは、微生物に対して、窒素固定の生化学経路を停止するようにシグナルを送る。
【００８８】
肥料の存在下でも窒素を固定してトウモロコシへと移行させることが可能な微生物を開発するには、窒素固定調節ネットワークの転写レベルおよび翻訳後レベルを変更することが必要である。そのため、本明細書には、調節ネットワークを的確に進化させ、新規の表現型を誘発させるための宿主微生物進化（ＨｏＭＥ）技術が記載されている。また、本明細書には、トウモロコシから単離された窒素固定内部寄生菌の固有の独自ライブラリーが、窒素ストレスおよび窒素過剰のような異なる環境条件下での微生物および宿主植物の相互作用を取り巻く広範なオーミクスデータと対にして記載されている。これにより、内部寄生菌の遺伝子調節ネットワークを的確に進化させて、圃場に肥料が存在する場合であっても活発に窒素を固定する微生物を産生することが可能になる。また、本明細書には、トウモロコシ根組織をコロニー化し、施肥されている植物のために窒素を産生する微生物に進化させる技術的可能性のが評価ならびに微生物を現代的窒素管理戦略に統合する実現可能性を決定するために、内部寄生菌と、標準的製剤化慣例および多様な土壌との適合性の評価が記載されている。
【００８９】
窒素元素（Ｎ）を化学合成に利用するために、生命体は、窒素固定として公知であるプロセスにおいて、大気中で利用可能な窒素ガス（Ｎ２）を水素と化合させる。生物学的窒素固定は性質がエネルギー集約的であるため、ジアゾ栄養生物（大気窒素ガスを固定する細菌および古細菌）は、環境中の酸素および利用可能な窒素に応答してｎｉｆ遺伝子クラスターを精巧および厳密に調節するように進化している。Ｎｉｆ遺伝子は、窒素固定に関与する酵素（ニトロゲナーゼ複合体等の）および窒素固定を調節するタンパク質をコードする。Ｓｈａｍｓｅｌｄｉｎ（２０１３年、Ｇｌｏｂａｌ  Ｊ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、８巻（４号）：８４〜９４頁）には、ｎｉｆ遺伝子およびそれらの産物の詳細な記載が開示されている。この文献は、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書には、向上された形質を有する植物を産生するための方法であって、第１の植物から細菌を単離するステップ；単離された細菌のｎｉｆ遺伝子に遺伝子変異を導入するステップ；第２の植物を変異細菌に曝露するステップ；第１の植物と比べて向上された形質を有する第２の植物から細菌を単離するステップ；および第２の植物から単離された細菌を用いてステップを繰り返すステップを含む方法が記載されている。
【００９０】
プロテオバクテリアでは、ｎｉｆクラスターの正の転写制御因子である、σ５４依存性エンハンサー結合タンパク質ＮｉｆＡが、窒素固定の調節に中心的な役割を果たす。活性ＮｉｆＡの細胞内レベルは、２つの主な因子：ｎｉｆＬＡオペロンの転写およびＮｉｆＬとのタンパク質間相互作用によるＮｉｆＡ活性の阻害により制御される。これらプロセスは両方とも、ＰＩＩタンパク質シグナル伝達カスケードを介して、細胞内（ｉｎｔｒａｃｅｕｌｌａｒ）グルタミンレベルに応答性である。このカスケードは、ＧｌｎＤにより媒介され、ＧｌｎＤは、グルタミンを直接的に感知し、結合グルタミンの非存在または存在に応答して、２つのＰＩＩ調節タンパク質ＧｌｎＢおよびＧｌｎＫのウリジリル化または脱ウリジリル化をそれぞれ触媒する。窒素過剰条件下では、未修飾ＧｌｎＢが、ｎｉｆＬＡプロモーターの非活性化シグナルを送る。しかしながら、窒素制限条件下では、ＧｌｎＢは翻訳後修飾を受け、それによりその活性が阻害され、ｎｉｆＬＡオペロンの転写に結び付く。このように、ｎｉｆＬＡ転写は、ＰＩＩタンパク質シグナル伝達カスケードにより、環境窒素に応答して厳密に制御されている。ＮｉｆＡの翻訳後レベル調節では、ＧｌｎＫは、細胞内の遊離ＧｌｎＫの全体的レベルに依存する様式（ｍａｔｔｅｒ）でＮｉｆＬ／ＮｉｆＡ相互作用を阻害する。
【００９１】
ＮｉｆＡは、ｎｉｆＬＡオペロンから転写され、そのプロモーターは、別のσ５４依存性制御因子であるリン酸化ＮｔｒＣにより活性化される。ＮｔｒＣのリン酸化状態は、ヒスチジンキナーゼＮｔｒＢにより媒介され、ＮｔｒＢは、脱ウリジリル化ＧｌｎＢとは相互作用するが、ウリジリル化ＧｌｎＢとは相互作用しない。窒素過剰条件下では、高い細胞内（ｉｎｔｒａｃｅｕｌｌｕｌａｒ）レベルのグルタミンは、ＧｌｎＢの脱ウリジリル化に結び付き、脱ウリジリル化されたＧｌｎＢは、その後ＮｔｒＢと相互作用して、そのリン酸化活性を不活化し、そのホスファターゼ活性を活性化させて、ＮｔｒＣの脱リン酸化およびｎｉｆＬＡプロモーターの不活化がもたらされる。しかしながら、窒素制限条件下では、低レベルの細胞内グルタミンは、ＧｌｎＢのウリジリル化をもたらし、それにより、ＮｔｒＢとのその相互作用が阻害され、ＮｔｒＣのリン酸化およびｎｉｆＬＡオペロンの転写を可能にする。このように、ｎｉｆＬＡ発現は、ＰＩＩタンパク質シグナル伝達カスケードにより、環境窒素に応答して厳密に制御される。ｎｉｆＡ、ｎｔｒＢ、ｎｔｒＣ、およびｇｌｎＢは全て、本明細書に記載の方法で突然変異させることができる遺伝子である。
【００９２】
また、ＮｉｆＡの活性は、最も典型的にはＮｉｆＡ活性のＮｉｆＬ媒介性阻害により、環境窒素に応答して翻訳後に調節される。一般的に、ＮｉｆＬとＮｉｆＡとの相互作用は、ＧｌｎＫを介したＰＩＩタンパク質シグナル伝達カスケードにより影響を受けるが、ＧｌｎＫとＮｉｆＬ／ＮｉｆＡとの相互作用の性質は、ジアゾ栄養生物間で著しく異なる。Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅでは、両形態のＧｌｎＫが、ＮｉｆＬ／ＮｉｆＡ相互作用を阻害し、ＧｌｎＫとＮｉｆＬ／ＮｉｆＡとの相互作用は、細胞内の遊離ＧｌｎＫの全体的レベルにより決定される。窒素過剰条件下では、脱ウリジリル化ＧｌｎＫは、アンモニウム輸送体ＡｍｔＢと相互作用し、これは、ＡｍｔＢによるアンモニウム取り込みを阻止すると共に、ＧｌｎＫを膜に隔離し、ＮｉｆＬによるＮｉｆＡの阻害を可能にする役目を果たす。一方、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ  ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉでは、ＮｉｆＬ／ＮｉｆＡ相互作用およびＮｉｆＡ阻害には、脱ウリジリル化ＧｌｎＫとの相互作用が必要であるが、ＧｌｎＫのウリジリル化は、ＮｉｆＬとの相互作用を阻害する。ｎｉｆＬ遺伝子が欠如したジアゾ栄養生物では、ＮｉｆＡ活性は、窒素過剰条件下では、ＧｌｎＫおよびＧｌｎＢの両方の脱ウリジリル化形態との相互作用により直接的に阻害されるという証拠が存在する。その機序に関わらず、ほとんどの公知ジアゾ栄養生物では、ＮｉｆＡの翻訳後阻害は、ｎｉｆクラスターの重要な制御因子である。加えて、ｎｉｆＬ、ａｍｔＢ、およびｇｌｎＫは、本明細書に記載の方法で突然変異させることができる遺伝子である。
【００９３】
多くのジアゾ栄養生物は、ｎｉｆ遺伝子クラスターの転写調節に加えて、ニトロゲナーゼ遮断として公知である、ニトロゲナーゼ酵素自体の直接的翻訳後修飾および阻害の機序を進化させている。これは、窒素過剰条件下でのＦｅタンパク質（ＮｉｆＨ）のＡＤＰリボシル化により媒介される。それにより、ＭｏＦｅタンパク質複合体（ＮｉｆＤＫ）との相互作用が妨害され、ニトロゲナーゼ活性が消失する。ＤｒａＴは、Ｆｅタンパク質のＡＤＰリボシル化およびニトロゲナーゼの遮断を触媒し、ＤｒａＧは、ＡＤＰリボースの除去およびニトロゲナーゼの再活性化を触媒する。ｎｉｆＬＡ転写およびＮｉｆＡ阻害の場合と同様に、ニトロゲナーゼ遮断は、ＰＩＩタンパク質シグナル伝達カスケードによっても調節される。窒素過剰条件下では、脱ウリジリル化ＧｌｎＢは、ＤｒａＴと相互作用してＤｒａＴを活性化し、脱ウリジリル化ＧｌｎＫは、ＤｒａＧおよびＡｍｔＢの両方と相互作用して複合体を形成し、ＤｒａＧを膜に隔離する。窒素制限条件下では、ＧｌｎＢおよびＧｌｎＫのウリジリル化形態は、それぞれＤｒａＴおよびＤｒａＧと相互作用せず、ＤｒａＴの不活化およびＤｒａＧのＦｅタンパク質への拡散に結び付き、そこでＡＤＰリボースが除去され、ニトロゲナーゼが活性化される。また、本明細書に記載の方法では、ｎｉｆＨ、ｎｉｆＤ、ｎｉｆＫ、およびｄｒａＴ遺伝子に遺伝子変異を導入することが企図される。
【００９４】
一部の内部寄生菌は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで窒素を固定する能力を有するが、この遺伝的特徴は、しばしば、圃場では高レベルの外因性化学肥料によりサイレンシングされる。圃場に基づく窒素固定を容易にするために、外来性窒素の感知をニトロゲナーゼ酵素の発現と切り離すことができる。さらに、ニトロゲナーゼ活性の統合を経時的に向上させることは、作物により利用される窒素の産生を増大させる役目を果たす。本明細書に記載の方法を使用して圃場に基づく窒素固定を容易にする遺伝子変異のための具体的な標的としては、ｎｉｆＡ、ｎｉｆＬ、ｎｔｒＢ、ｎｔｒＣ、ｇｌｎＡ、ｇｌｎＢ、ｇｌｎＫ、ｄｒａＴ、ａｍｔＢ、ｇｌｎＤ、ｇｌｎＥ、ｎｉｆＪ、ｎｉｆＨ、ｎｉｆＤ、ｎｉｆＫ、ｎｉｆＹ、ｎｉｆＥ、ｎｉｆＮ、ｎｉｆＵ、ｎｉｆＳ、ｎｉｆＶ、ｎｉｆＷ、ｎｉｆＺ、ｎｉｆＭ、ｎｉｆＦ、ｎｉｆＢ、およびｎｉｆＱからなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子が挙げられる。
【００９５】
本明細書に記載の方法を使用して圃場に基づく窒素固定を容易にする遺伝子変異のための追加の標的は、ＮｉｆＡタンパク質である。ＮｉｆＡタンパク質は、典型的には、窒素固定遺伝子発現の活性化因子である。ＮｉｆＡの産生を増加させることにより（構成的にまたは高アンモニア条件中のいずれかで）、天然アンモニア感知経路が回避される。加えて、ＮｉｆＡの公知阻害剤であるＮｉｆＬタンパク質の産生を低減することは、遊離活性ＮｉｆＡレベルの増加にも結び付く。加えて、ｎｉｆＡＬオペロンの転写レベルを増加させることは（構成的にまたは高アンモニア条件中のいずれかで）、全体的により高いレベルのＮｉｆＡタンパク質にも結び付く。ｎｉｆＡＬ発現のレベル上昇は、プロモーター自体を変更することにより、またはＮｔｒＢ（元々は高窒素条件中にｎｉｆＡＬオペロンの遮断をもたらすことになるｎｔｒＢおよびｎｔｒＣシグナル伝達カスケードの一部）の発現を低減させることにより達成される。これらまたは本明細書に記載の任意の他の方法により達成される高レベルのＮｉｆＡは、内部寄生菌の窒素固定活性を増加させる。
【００９６】
本明細書に記載の方法を使用して圃場に基づく窒素固定を容易にする遺伝子変異のための別の標的は、ＧｌｎＤ／ＧｌｎＢ／ＧｌｎＫ  ＰＩＩシグナル伝達カスケードである。細胞内グルタミンレベルは、ＧｌｎＤ／ＧｌｎＢ／ＧｌｎＫ  ＰＩＩシグナル伝達カスケードにより感知される。ＧｌｎＤのウリジリル除去活性を消失させるＧｌｎＤの活性部位突然変異は、窒素感知カスケードを妨害する。加えて、ＧｌｎＢ濃度の低減は、グルタミン感知カスケードを短絡させる。こうした突然変異により、細胞を「騙して」窒素制限状態であると認識させ、それにより窒素固定レベル活性を増加させる。
【００９７】
ａｍｔＢタンパク質も、本明細書に記載の方法を使用して圃場に基づく窒素固定を容易にする遺伝子変異のための標的である。環境からのアンモニア取り込みは、ａｍｔＢタンパク質の発現レベルを減少させることにより低減させることができる。細胞内アンモニアが存在しないと、内部寄生菌は、アンモニアのレベルが高いことを感知することができず、窒素固定遺伝子の下方制御が防止される。細胞内区画への進入を果たしたアンモニアは全てグルタミンに変換される。細胞内グルタミンレベルは、窒素を感知するための主要な媒介物である。細胞内グルタミンレベルを減少させることにより、細胞が、環境中のアンモニウムレベルが高いことを感知することが防止される。これは、グルタミンをグルタメートに変換する酵素であるグルタミナーゼの発現レベルを増加させることにより行うことができる。加えて、細胞内グルタミンは、グルタミン合成酵素（アンモニアをグルタミンに変換する酵素）を減少させることによっても低減させることができる。ジアゾ栄養生物では、固定されたアンモニアは、細胞プロセスに使用されることになるグルタミンおよびグルタメートへと迅速に同化される。アンモニア同化の妨害は、固定窒素を転換して、アンモニアとして細胞から搬出されることを可能にする場合がある。固定されたアンモニアは、主にｇｌｎＡによりコードされているグルタミン合成酵素（ＧＳ）によりグルタミンへと、その後はグルタミンオキソグルタル酸アミノトランスフェラーゼ（ＧＯＧＡＴ）によりグルタミンへと同化される。一部の例では、ｇｌｎＳは、グルタミン合成酵素をコードする。ＧＳは、ＧＳアデニリルトランスフェラーゼ（ＧｌｎＥ）、つまり、それぞれアデニリルトランスフェラーゼ（ＡＴ）ドメインおよびアデニリル除去（ＡＲ）ドメインの活性によりＧＳのアデニリル化および脱アデニリル化の両方を触媒する、ｇｌｎＥによりコードされた二機能性酵素により、翻訳後に調節される。窒素制限条件下では、ｇｌｎＡが発現され、ＧｌｎＥのＡＲドメインは、ＧＳを脱アデニリル化し、ＧＳの活性化を可能にする。窒素過剰条件下では、ｇｌｎＡ発現は中止され、ＧｌｎＥのＡＴドメインは、グルタミンによりアロステリック的に活性化され、ＧＳのアデニリル化および非活性化が引き起こされる。
【００９８】
さらに、ｄｒａＴ遺伝子もまた、本明細書に記載の方法を使用して圃場に基づく窒素固定を容易にする遺伝子変異のための標的であってもよい。細胞により窒素固定酵素が産生されると、ニトロゲナーゼ遮断が、細胞が高窒素条件で固定活性を下方制御する別のレベルを表す。この遮断は、ＤｒａＴの発現レベルを減少させることにより除去することができる可能性がある。
【００９９】
新しい微生物表現型を付与するための方法は、転写レベル、翻訳レベル、および翻訳後レベルで実施することができる。転写レベルでは、プロモーターを変更すること（プロモーターの全てまたは一部の欠失を含む、転写因子に対するシグマ因子親和性または結合部位の変更等）または転写ターミネーターおよびアテニュエータを変更することが含まれる。翻訳レベルでは、リボソーム結合部位での変更、およびｍＲＮＡ分解シグナルを変更することが含まれる。翻訳後レベルでは、酵素の活性部位を突然変異させること、およびタンパク質間相互作用を変更させることが含まれる。こうした変更は、数多くの方法で達成することができる。発現レベルの低減（または完全な消失）は、天然リボソーム結合部位（ＲＢＳ）またはプロモーターを、強度／効率がより低いものと交換することにより達成することができる。ＡＴＧ開始部位を、ＧＴＧ、ＴＴＧ、またはＣＴＧ開始コドンと交換してもよい。それにより、コード領域の翻訳活性の低減がもたらされる。発現の完全な消失は、遺伝子のコード領域をノックアウト（欠失）することにより行うことができる。オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をフレームシフトすると、ＯＲＦに中途終止コドンがもたらされ、非機能性の短縮産物が作成されることになる可能性がある。同様に、インフレーム終止コドンの挿入も、非機能性の短縮産物を作成することになる。Ｎ末端またはＣ末端に分解タグを付加することでも、特定の遺伝子の有効濃度を低減することができる。
【０１００】
反対に、本明細書に記載されている遺伝子の発現レベルは、より強力なプロモーターを使用することにより達成することができる。高窒素レベル条件（または任意の他の条件）中のプロモーター活性を確実に高くするために、高窒素レベル条件における全ゲノムの転写プロファイルを取得し、そのデータセットから、所望の転写レベルを有する活性プロモーターを選択して、弱いプロモーターを置換してもよい。弱い開始コドンを、より良好な翻訳開始効率のＡＴＧ開始コドンと交換してもよい。また、弱いリボソーム結合部位（ＲＢＳ）を、より高い翻訳開始効率を有する異なるＲＢＳと交換してもよい。また、加えて、部位特異的突然変異を実施して、酵素の活性を変更してもよい。
【０１０１】
植物に生じる窒素固定のレベルを増加させることは、作物生産に必要とされる化学肥料の量の低減に結びつき、温室効果ガス排出（例えば、亜酸化窒素）を削減することができる。
【０１０２】
連続継代
植物形質（例えば、窒素固定）を向上させる細菌の産生は、連続継代により達成することができる。これは、１つまたは複数の植物に１つまたは複数の向上された形質を付与することが可能な細菌および／または組成物を同定することに加えて、微生物叢により影響を受ける特定の向上された形質を有する植物を選択することにより行うことができる。植物形質を向上させる細菌を産生するための１つの方法は、（ａ）第１の植物の組織または土壌から細菌を単離するステップ；（ｂ）細菌のうちの１つまたは複数に遺伝子変異を導入して、１つまたは複数の変異細菌を産生するステップ；（ｃ）複数の植物を変異細菌に曝露するステップ；（ｄ）複数の植物のうち１つの組織または土壌から細菌を単離するステップであって、細菌を単離した植物が、複数の植物中の他の植物と比べて向上された形質を有する、ステップ；および（ｅ）向上された形質を有する植物から単離された細菌（ステップ（ｄ））を用いて、ステップ（ｂ）〜（ｄ）を繰り返すステップを含む。ステップ（ｂ）〜（ｄ）は、植物の向上された形質が所望のレベルに達するまで、何回でも（例えば、１回、２回、３回、４回、５回、１０回、またはそれよりも多く）繰り返すことができる。さらに、複数の植物は、１０〜２０個の植物、または２０個もしくはそれよりも多く、５０個もしくはそれよりも多く、１００個もしくはそれよりも多く、３００個もしくはそれよりも多く、５００個もしくはそれよりも多く、または１０００個もしくはそれよりも多くの植物等の、２個を超える植物であってもよい。
【０１０３】
向上された形質を有する植物を得ることに加えて、１つまたは複数の遺伝子（例えば、窒素固定を調節する遺伝子）に導入された１つまたは複数の遺伝子変異を含む細菌を含む細菌集団が得られる。上述のステップを繰り返すことにより、目的の植物形質と相関する集団の最も適切なメンバーを含む細菌の集団を得ることができる。遺伝子分析および／または表現型分析等により、この集団内の細菌を同定して、それらの有益な特性を決定することができる。ステップ（ａ）にて、単離された細菌の遺伝子分析を行ってもよい。表現型および／または遺伝子型の情報は、以下のものを含む技法を使用して得ることができる：植物由来の化学成分のハイスループットスクリーニング；遺伝物質のハイスループット配列決定を含む配列決定技法；ディファレンシャルディスプレイ技法（ＤＤＲＴ−ＰＣＲおよびＤＤ−ＰＣＲを含む）；核酸マイクロアレイ技法；ＲＮＡ−ｓｅｑ（全トランスクリプトームショットガンシーケンシング）；およびｑＲＴ−ＰＣＲ（定量リアルタイムＰＣＲ）。得られた情報を使用して、系統発生分析、またはｒＲＮＡオペロンもしくは他の分類学的に有益な遺伝子座の成分をコードする核酸のマイクロアレイに基づくスクリーニング等、存在する細菌の同一性および活性に関する群生プロファイル情報を得ることができる。分類学的に有益な遺伝子座の例としては、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子、２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子、５Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子、５．８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子、１２Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子、１８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子、２８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子、ｇｙｒＢ遺伝子、ｒｐｏＢ遺伝子、ｆｕｓＡ遺伝子、ｒｅｃＡ遺伝子、ｃｏｘｌ遺伝子、ｎｉｆＤ遺伝子が挙げられる。集団に存在する分類群を決定するための分類学的プロファイリングの例示的な方法は、米国特許出願公開第２０１４０１５５２８３号に記載されている。細菌の同定は、窒素固定経路に関連する遺伝子等の、１つもしくは複数の遺伝子または１つもしくは複数のシグナル経路の活性を特徴付けることを含んでもよい。また、異なる細菌種間の相乗効果的な相互作用（２つの成分を組み合わせることにより、付加的な量を超えて所望の効果が増加すること）が、細菌集団に存在している場合がある。
【０１０４】
遺伝子変異は、以下のものからなる群から選択される遺伝子であってもよい：ｎｉｆＡ、ｎｉｆＬ、ｎｔｒＢ、ｎｔｒＣ、ｇｌｎＡ、ｇｌｎＢ、ｇｌｎＫ、ｄｒａＴ、ａｍｔＢ、ｇｌｎＤ、ｇｌｎＥ、ｎｉｆＪ、ｎｉｆＨ、ｎｉｆＤ、ｎｉｆＫ、ｎｉｆＹ、ｎｉｆＥ、ｎｉｆＮ、ｎｉｆＵ、ｎｉｆＳ、ｎｉｆＶ、ｎｉｆＷ、ｎｉｆＺ、ｎｉｆＭ、ｎｉｆＦ、ｎｉｆＢ、およびｎｉｆＱ。遺伝子変異は、以下のものからなる群から選択される機能性を有するタンパク質をコードする遺伝子の変異であってもよい：グルタミン合成酵素、グルタミナーゼ、グルタミン合成酵素アデニリルトランスフェラーゼ、転写活性化因子、抗転写活性化因子、ピルビン酸フラボドキシンオキシドレダクターゼ、フラボドキシン、またはＮＡＤ＋二窒素レダクターゼａＤＰ−Ｄ−リボシルトランスフェラーゼ。遺伝子変異は、以下のうちの１つまたは複数をもたらす突然変異であってもよい：ＮｉｆＡもしくはグルタミナーゼの発現もしくは活性の増加；ＮｉｆＬ、ＮｔｒＢ、グルタミン合成酵素、ＧｌｎＢ、ＧｌｎＫ、ＤｒａＴ、ＡｍｔＢの発現もしくは活性の減少；ＧｌｎＥのアデニリル除去活性の減少；またはＧｌｎＤのウリジリル除去活性の減少。遺伝子変異の導入は、１、２、３、４、５、１０、２５、５０、１００、２５０、５００個、またはそれよりも多くのヌクレオチド等の、標的部位のうちの１つまたは複数のヌクレオチドの挿入および／または欠失を含んでもよい。本明細書に開示されている方法の１つまたは複数の細菌に導入された遺伝子変異は、ノックアウト突然変異（例えば、プロモーターの欠失、中途終止コドンを生成する挿入または欠失、全遺伝子の欠失）であってもよく、または、タンパク質ドメインの活性の排除または消失（例えば、活性部位に影響を及ぼす点突然変異、またはタンパク質産物の関連部分をコードする遺伝子の部分の欠失）であってもよく、または標的遺伝子の調節配列の変更または消失であってもよい。また、異種性調節配列、および遺伝子変異が導入されている細菌に対応する細菌種または属のゲノム内に見出される調節配列を含む、１つまたは複数の調節配列を挿入してもよい。さらに、調節配列は、細菌培養物のまたは植物組織内の遺伝子の発現レベルに基づいて選択してもよい。遺伝子変異は、標的部位に特異的に導入される所定の遺伝子変異であってもよい。遺伝子変異は、標的部位内のランダム突然変異であってもよい。遺伝子変異は、１つまたは複数のヌクレオチドの挿入または欠失であってもよい。一部の場合では、形質向上を評価するために細菌を植物に曝露する前に、複数の異なる遺伝子変異（例えば、２、３、４、５、１０個、またはそれよりも多く）が、単離された細菌のうちの１つまたは複数に導入される。複数の遺伝子変異は、上記のタイプのいずれであってもよく、同じタイプであってもよく、または異なるタイプであってもよく、任意の組合せであってもよい。一部の場合では、複数の異なる遺伝子変異は、複数の遺伝子変異が細菌に蓄積され、向上された形質が関連する植物に徐々に付与されるように、連続的に、第１の単離ステップ後に第１の遺伝子変異を導入し、第２の単離ステップ後に第２の遺伝子変異を導入する等で導入される。
【０１０５】
一般的に、用語「遺伝子変異」は、基準ゲノムもしくはその部分または基準遺伝子もしくはその部分等の基準ポリヌクレオチドと比べた、ポリヌクレオチド配列に導入される任意の変更を指す。遺伝子変異は、「突然変異」と呼ばれる場合もあり、遺伝子変異を含む配列または生物は、「遺伝子変異体」または「突然変異体」と呼ばれる場合がある。遺伝子変異は、遺伝子発現、代謝、および細胞シグナル伝達を含むある生物活性の増加または減少等の、任意の数の効果を示してもよい。遺伝子変異は、標的部位に特異的に導入されてもよく、またはランダムに導入されてもよい。遺伝子変異を導入するための様々な分子ツールおよび方法が利用可能である。例えば、遺伝子変異は、ポリメラーゼ連鎖反応突然変異誘発、オリゴヌクレオチド指定突然変異誘発、飽和突然変異誘発、断片シャッフリング突然変異誘発（ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）、相同組換え、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系、化学的突然変異誘発、およびそれらの組合せにより導入することができる。遺伝子変異を導入するための化学的方法としては、ＤＮＡを、化学的突然変異原、例えば、エチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）、メチルメタンスルホン酸（ＭＭＳ）、Ｎ−ニトロソ尿素（ＥＮＵ）、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロ−Ｎ’−ニトロソグアニジン、４−ニトロキノリンＮ−オキシド、硫酸ジエチル、ベンゾピレン、シクロホスファミド、ブレオマイシン、トリエチルメラミン、アクリルアミドモノマー、ナイトロジェンマスタード、ビンクリスチン、ジエポキシアルカン（例えば、ジエポキシブタン）、ＩＣＲ−１７０、ホルムアルデヒド、塩酸プロカルバジン、エチレンオキシド、ジメチルニトロソアミン、７，１２ジメチルベンズ（ａ）アントラセン、クロラムブシル、ヘキサメチルホスホラミド、およびビスルファン（ｂｉｓｕｌｆａｎ）等に曝露することが挙げられる。放射線突然変異誘導因子としては、紫外線、γ線、Ｘ線、および高速中性子衝撃が挙げられる。また、例えば、トリメチルソラレンを紫外光と共に使用して、核酸に遺伝子変異を導入することができる。可動ＤＮＡ要素、例えば転位因子のランダムな挿入または標的挿入は、遺伝子変異を生成するための別の好適な方法である。遺伝子変異は、例えば、エラープローンＰＣＲ等のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技法を使用して、無細胞ｉｎ  ｖｉｔｒｏ系での増幅中に核酸に導入してもよい。遺伝子変異は、ＤＮＡシャッフリング技法（例えば、エクソンシャッフリングおよびドメインスワッピング等）を使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで核酸に導入してもよい。また、遺伝子変異は、細胞のＤＮＡ修復酵素の欠損の結果として核酸に導入することができる。例えば、ＤＮＡ修復酵素突然変異体をコードする突然変異遺伝子が細胞に存在すると、その細胞のゲノムには、高頻度の突然変異（つまり、約１個の突然変異／１００遺伝子〜１個の突然変異／１０，０００遺伝子）が生成されることが予想される。ＤＮＡ修復酵素をコードする遺伝子の例としては、これらに限定されないが、Ｍｕｔ  Ｈ、Ｍｕｔ  Ｓ、Ｍｕｔ  Ｌ、およびＭｕｔ  Ｕ、ならびに他の種におけるそれらの相同体（例えば、ＭＳＨ  １６、ＰＭＳ  １２、ＭＬＨ１、ＧＴＢＰ、お��びＥＲＣＣ−１等）が挙げられる。遺伝子変異を導入するための種々の方法の例示的な記載は、例えば、Ｓｔｅｍｐｌｅ（２００４年）Ｎａｔｕｒｅ、５巻：１〜７頁；Ｃｈｉａｎｇら（１９９３年）ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌ、２巻（３号）：２１０〜２１７頁；Ｓｔｅｍｍｅｒ（１９９４年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、９１巻：１０７４７〜１０７５１頁；ならびに米国特許第６，０３３，８６１号および同第６，７７３，９００号に提供されている。
【０１０６】
サイクル増幅技法として、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）突然変異誘発では、変異原性プライマーを使用して、所望の突然変異を導入する。ＰＣＲは、変性、アニーリング、および伸長のサイクルで実施される。ＰＣＲによる増幅後、突然変異ＤＮＡの選択および親プラスミドＤＮＡの除去は、以下のようにして達成することができる：１）ＰＣＲ中にｄＣＴＰをヒドロキシメチル化ｄＣＴＰで置換し、その後制限酵素で消化して、非ヒドロキシメチル化親ＤＮＡのみを除去する；２）抗生物質耐性遺伝子および研究対象遺伝子を両方とも同時に突然変異誘発させ、プラスミドを異なる抗生物質耐性を有するように変化させ、新たな抗生物質耐性により、その後の所望の突然変異の選択が容易になる；３）所望の突然変異を導入した後、メチル化ＤＮＡのみを切断する制限酵素Ｄｐｎｌにより親メチル化鋳型ＤＮＡを消化し、それにより突然変異誘発非メチル化鎖を回収する；または４）突然変異ＰＣＲ産物を、追加のライゲーション反応で環状化して、突然変異ＤＮＡの形質転換効率を増加させる。例示的な方法のさらなる記載は、例えば、米国特許第７１３２２６５号、米国特許第６７１３２８５号、米国特許第６６７３６１０号、米国特許第６３９１５４８号、米国特許第５７８９１６６号、米国特許第５７８０２７０号、米国特許第５３５４６７０号、米国特許第５０７１７４３号、および米国特許出願公開第２０１００２６７１４７号に見出すことができる。
【０１０７】
指定部位突然変異誘発と呼ばれるオリゴヌクレオチド指定突然変異誘発では、典型的には、合成ＤＮＡプライマーが利用される。この合成プライマーは、所望の突然変異を含有し、目的の遺伝子のＤＮＡとハイブリダイズすることができるように、突然変異部位付近が鋳型ＤＮＡと相補的である。突然変異は、単一塩基の変更（点突然変異）、複数塩基の変更、欠失、または挿入、またはこれらの組合せであってもよい。その後、ＤＮＡポリメラーゼを使用して、一本鎖プライマーを伸長させ、それにより遺伝子の残りを複製する。このように複製された遺伝子は、突然変異部位を含有し、その後ベクターとしての宿主細胞に導入し、クローニングしてもよい。最後に、突然変異体をＤＮＡ配列決定により選択して、それらが所望の突然変異を含有することを確認することができる。
【０１０８】
遺伝子変異は、エラープローンＰＣＲを使用して導入してもよい。この技法では、目的の遺伝子は、配列複製のフィデリティーが不十分である条件下でＤＮＡポリメラーゼを使用して増幅される。その結果、増幅産物は、少なくとも１つのエラーを配列に含有する。遺伝子を増幅し、得られた反応産物が、鋳型分子と比較して１つまたは複数の変更を配列に含有する場合、得られた産物は、鋳型と比較して突然変異誘発されている。ランダム突然変異を導入する別の手段は、細胞を、ニトロソグアニジンまたはエチルメタンスルホン酸等の化学的突然変異原に曝露し（Ｎｅｓｔｍａｎｎ、Ｍｕｔａｔ  Ｒｅｓ、１９７５年６月；２８巻（３号）：３２３〜３０頁）、その後、その遺伝子を含むベクターを宿主から単離することである。
【０１０９】
飽和突然変異誘発は、別の形態のランダム突然変異誘発であり、特異的部位にまたは遺伝子の狭い領域に、全てのまたはほぼ全ての考え得る突然変異を生成しようするものである。一般的な意味では、飽和突然変異誘発は、突然変異誘発させようとする確定ポリヌクレオチド配列（突然変異誘発させようとする配列の長さは、例えば１５〜１００，０００塩基である）に変異原性カセットの完全なセット（各カセットの長さは、例えば１〜５００塩基である）を突然変異誘発させることで構成されている。したがって、一群の突然変異（例えば、１から１００個までの範囲の突然変異）が、突然変異誘発させようとする各カセットに導入される。１つのカセットに導入される突然変異のグループ分けは、飽和突然変異誘発の１ラウンドを施している間に第２のカセットに導入される突然変異の第２のグループ分けと異なっていてもよく、または同じであってもよい。そのようなグループ分けは、欠失、付加、特定のコドンのグループ分け、および特定のヌクレオチドカセットのグループ分けにより例示される。
【０１１０】
ＤＮＡシャッフリングとも呼ばれる断片シャッフリング突然変異誘発は、有益な突然変異を迅速に増幅させる方法である。シャッフリングプロセスの一例では、ＤＮＡｓｅを使用して、１セットの親遺伝子を、例えば長さが約５０〜１００ｂｐの小片に断片化する。その後、プライマーを用いないポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が続き、十分な重複相同性配列を有するＤＮＡ断片が互いにアニーリングすることになり、その後ＤＮＡポリメラーゼにより伸長される。ＤＮＡ分子の幾つかが親遺伝子のサイズに到達した後も、このＰＣＲ伸長を数ラウンド行う。その後、これら遺伝子を、今度は、鎖の末端に相補的になるように設計したプライマーを添加した別のＰＣＲで増幅してもよい。プライマーは、クローニングベクターへのライゲーションに必要とされる制限酵素認識部位の配列等の追加の配列が、それらの５’末端に付加されてもよい。シャッフリング技法のさらなる例は、米国特許出願公開第２００５０２６６５４１号に提供されている。
【０１１１】
相同組換え突然変異誘発は、外因性ＤＮＡ断片と標的ポリヌクレオチド配列との間の組換えを含む。二本鎖切断が生じた後、切断の５’末端付近のＤＮＡの区画は、切除と呼ばれるプロセスで切り離される。その後のストランド侵入ステップでは、切断されたＤＮＡ分子の突出３’末端が、切断されていない類似のまたは同一のＤＮＡ分子に「侵入」する。この方法を使用すると、遺伝子を欠失させ、エキソンを除去し、遺伝子を付加し、点突然変異を導入することができる。相同組換え突然変異誘発は、恒久的であってもよく、または暫定的であってもよい。典型的には、組換え鋳型も提供される。組換え鋳型は、別のベクターの成分であってもよく、別個のベクターに含有されていてもよく、または別個のポリヌクレオチドとして提供されてもよい。一部の実施形態では、組換え鋳型は、部位特異的ヌクレアーゼによりニックまたは切断される標的配列内または付近等で相同組換えの鋳型としての役目を果たすように設計されている。鋳型ポリヌクレオチドは、長さが約１０個もしくはそれよりも多く、約１５個もしくはそれよりも多く、約２０個もしくはそれよりも多く、約２５個もしくはそれよりも多く、約５０個もしくはそれよりも多く、約７５個もしくはそれよりも多く、約１００個もしくはそれよりも多く、約１５０個もしくはそれよりも多く、約２００個もしくはそれよりも多く、約５００個もしくはそれよりも多く、約１０００個もしくはそれよりも多く、またはそれよりも多くのヌクレオチド等、任意の好適な長さであってもよい。一部の実施形態では、鋳型ポリヌクレオチドは、標的配列を含むポリヌクレオチドの部分に相補的である。鋳型ポリヌクレオチドは、最適にアランメントされる場合、標的配列のうちの１つまたは複数のヌクレオチドと重複してもよい（例えば、約１個もしくはそれよりも多く、約５個もしくはそれよりも多く、約１０個もしくはそれよりも多く、約１５個もしくはそれよりも多く、約２０個もしくはそれよりも多く、約２５個もしくはそれよりも多く、約３０個もしくはそれよりも多く、約３５個もしくはそれよりも多く、約４０個もしくはそれよりも多く、約４５個もしくはそれよりも多く、約５０個もしくはそれよりも多く、約６０個もしくはそれよりも多く、約７０個もしくはそれよりも多く、約８０個もしくはそれよりも多く、約９０個もしくはそれよりも多く、約１００個もしくはそれよりも多く、またはそれよりも多くのヌクレオチド）。一部の実施形態では、鋳型配列および標的配列を含むポリヌクレオチドが最適にアランメントされる場合、鋳型ポリヌクレオチドの最も近いヌクレオチドは、標的配列から、約１個、５個、１０個、１５個、２０個、２５個、５０個、７５個、１００個、２００個、３００個、４００個、５００個、１０００個、５０００個、１００００個またはそれよりも多くのヌクレオチド内にある。相同組換えの方法に有用な部位指定ヌクレアーゼの非限定的な例としては、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、ＴＡＬＥヌクレアーゼ、およびメガヌクレアーゼが挙げられる。そのようなヌクレアーゼの使用に関するさらなる記載は、例えば、米国特許第８７９５９６５号および米国特許出願公開第２０１４０３０１９９０号を参照されたい。
【０１１２】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９（クラスターを形成し規則正しい間隔を持つ短いパリンドロームリピート、Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  ｓｈｏｒｔ  ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  ｒｅｐｅａｔｓ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）系は、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を使用して、侵入核酸のサイレンシングをガイドすることにより、ウイルスおよびプラスミドに対する適応免疫を細菌および古細菌に提供する。Ｃａｓ９タンパク質（またはその機能的等価体および／もしくは変異体、つまりＣａｓ９様タンパク質）は、このタンパク質と、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ（ガイドＲＮＡとも呼ばれる）と呼ばれる２つの天然または合成ＲＮＡ分子との結合に依存するＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を天然で含有する。一部の場合では、２つの分子は、共有結合で連結され、単一分子（単鎖ガイドＲＮＡ（「ｓｇＲＮＡ」）とも呼ばれる）を形成する。したがって、Ｃａｓ９またはＣａｓ９様タンパク質は、ＤＮＡを標的とするＲＮＡ（この用語は、２分子ガイドＲＮＡ構成および単一分子ガイドＲＮＡ構成を両方とも包含する）と結合し、それによりＣａｓ９またはＣａｓ９様タンパク質を活性化し、このタンパク質が標的核酸配列にガイドされる。Ｃａｓ９またはＣａｓ９様タンパク質は、その天然酵素機能が維持されている場合、標的ＤＮＡを切断して、二本鎖切断を作成し、それによりゲノム変更（つまり、編集：欠失、挿入（ドナーポリヌクレオチドが存在する場合）、置換等）をもたらすことができ、それにより遺伝子発現が変更される。Ｃａｓ９の一部の変異体（変異体は、用語Ｃａｓ９様により包含される）は、ＤＮＡ切断活性の減少を示すように変更されている（一部の場合では、標的ＤＮＡの両鎖ではなく１本の鎖を切断し、他の場合には、著しく還元されて、ＤＮＡ切断活性を示さない）。遺伝子変異を導入するためのＣＲＩＳＰＲ系のさらなる例示的な記載は、例えば、米国特許第８７９５９６５号に見出すことができる。
【０１１３】
化学的突然変異原または放射線を含む、主として点突然変異、ならびに短い欠失、挿入、転換、および／または転移を作成する突然変異原を使用して、遺伝子変異を作成してもよい。突然変異原としては、これらに限定されないが、エチルメタンスルホン酸、メチルメタンスルホン酸、Ｎ−エチル−Ｎ−ニトロソ尿素（ｎｉｔｒｏｓｕｒｅａ）、トリエチルメラミン、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソ尿素、プロカルバジン、クロラムブシル、シクロホスファミド、硫酸ジエチル、アクリルアミドモノマー、メルファラン、ナイトロジェンマスタード、ビンクリスチン、ジメチルニトロソアミン、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−ニトロソグアニジン、ニトロソグアニジン、２−アミノプリン、７，１２ジメチル−ベンズ（ａ）アントラセン、エチレンオキシド、ヘキサメチルホスホラミド、ビスルファン、ジエポキシアルカン（ジエポキシオクタン、ジエポキシブタン等）、２−メトキシ−６−クロロ−９［３−（エチル−２−クロロ−エチル）アミノプロピルアミノ］アクリジン二塩酸塩、およびホルムアルデヒドが挙げられる。
【０１１４】
遺伝子変異の導入は、不完全なプロセスであってもよく、細菌の処置集団中の一部の細菌は、所望の突然変異を保持するが、他のものは保持していない。一部の場合では、所望の遺伝子変異を保持する細菌が富化されるように、選択圧を加えることが望ましい。伝統的には、遺伝子変異が成功した変異体の選択は、抗生物質耐性遺伝子の挿入または非致死性化合物を致死性代謝物へと変換することが可能な代謝活性の消失の場合等、遺伝子変異により機能が付与または消失されたものを選択することまたはそれらに対して選択することを含んでいた。所望の遺伝子変異のみを導入すればよい（例えば、選択可能なマーカーさえ必要としない）ように、ポリヌクレオチド配列自体に基づく選択圧を加えることも可能である。この場合、選択圧は、遺伝子変異を導入することが求められている基準配列に対して選択が効果的に向けられるように、標的部位に導入される遺伝子変異が欠如したゲノムを切断することを含んでもよい。典型的には、切断は、標的部位の１００個ヌクレオチド内で生じる（例えば、標的部位から７５個、５０個、２５個、１０個、またはそれより少数のヌクレオチド内、標的部位でのまたは標的部位内での切断を含む）。切断は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、ＴＡＬＥヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、またはメガヌクレアーゼからなる群から選択される部位特異的ヌクレアーゼにより指示されてもよい。そのようなプロセスは、相同組換えの鋳型が提供されないこと以外は、標的部位での相同組換えを強化するためのプロセスに類似する。その結果、所望の遺伝子変異が欠如した細菌は、修復されずに細胞死に至る切断を受ける可能性がより高い。その後、選択を生き残った細菌を単離し、植物に曝露して、向上された形質の付与を評価するために使用することができる。
【０１１５】
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを部位特異的ヌクレアーゼとして使用して、標的部位に切断を指示してもよい。突然変異微生物の選択の向上は、Ｃａｓ９を使用して非突然変異細胞を死滅させることにより得ることができる。その後、植物に突然変異微生物を接種して共生を再確認し、進化的圧力を作成して、効率的な共生生物を選択する。その後、微生物を植物組織から再単離してもよい。非変異体に対する選択に用いられるＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ系は、相同組換えの鋳型が提供されないこと以外は、遺伝子変異の導入に関して上述されているものと同様のエレメントを用いることができる。したがって、標的部位に指示された切断は、影響を受ける細胞の死を増強する。
【０１１６】
標的部位での切断を特異的に誘導するための他の選択肢は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）系、およびメガヌクレアーゼ等が利用可能である。ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡ切断ドメインに融合させることにより生成された人工ＤＮＡエンドヌクレアーゼである。ＺＦＮは、所望のＤＮＡ配列を標的とするように操作することができ、それにより、ジンクフィンガーヌクレアーゼは、固有の標的配列を切断することが可能になる。ＺＦＮは、細胞内に導入される場合、二本鎖切断を誘導することにより細胞の標的ＤＮＡ（例えば、細胞のゲノム）を編集するために使用することができる。転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）は、ＴＡＬ（転写活性化因子様）エフェクターＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡ切断ドメインに融合させることにより生成された人工ＤＮＡエンドヌクレアーゼである。ＴＡＬＥＮは、事実上任意の所望のＤＮＡ配列に結合するよう迅速に操作することができ、ＴＡＬＥＮは、細胞内に導入される場合、二本鎖切断を誘導することにより細胞の標的ＤＮＡ（例えば、細胞のゲノム）を編集するために使用することができる。メガヌクレアーゼ（ホーミングエンドヌクレアーゼ）は、大型認識部位（１２〜４０塩基対の二本鎖ＤＮＡ配列）により特徴付けられるエンドデオキシリボヌクレアーゼである。メガヌクレアーゼを使用して、高度に標的化された様式で配列を置換、排除、または修飾することができる。タンパク質工学によりそれらの認識配列を修飾することにより、標的配列を変更することができる。メガヌクレアーゼは、細菌、植物、または動物に関わらず、あらゆるゲノムタイプの修飾に使用することができ、通例では、４つのファミリー：ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリー、ＧＩＹ−ＹＩＧファミリー、Ｈｉｓ−Ｃｙｓｔボックスファミリー、およびＨＮＨファミリーに分類される。例示的なホーミングエンドヌクレアーゼとしては、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、ＰＩ−Ｓｃｅ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＰａｎＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ、およびＩ−ＴｅｖＩＩＩが挙げられる。
【０１１７】
本開示の方法は、様々な望ましい形質のうちの１つまたは複数を導入または向上させるために用いることができる。導入または向上される形質の例としては、以下のものが挙げられる：根バイオマス、根長、植物丈、苗条長、葉数、水利用効率、全体的バイオマス、収穫高、果実サイズ、穀粒サイズ、光合成速度、乾燥耐性、耐熱性、耐塩性、線虫ストレス耐性、真菌病原体耐性、細菌病原体耐性、ウイルス病原体耐性、代謝物のレベル、およびプロテオーム発現。植物丈、全体的バイオマス、根および／または苗条バイオマス、種子発芽、実生生存、光合成効率、蒸散率、種子／果実数または質量、植物穀物または果実の収穫高、葉葉緑素含有量、光合成速度、根長、またはそれらの任意の組合せを含む望ましい形質を使用して、成長を測定することができ、同一条件下で栽培された基準農業植物（例えば、向上された形質を有していない植物）の成長速度と比較することができる。導入または向上される好ましい形質は、本明細書に記載されているような窒素固定である。一部の場合では、本明細書に記載の方法から生じる植物は、同じ土壌条件下で栽培された基準農業植物よりも少なくとも約５％大きな、例えば、少なくとも約５％、少なくとも約８％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも１００％、少なくとも約２００％、少なくとも約３００％、少なくとも約４００％、またはそれを超えて大きな形質の差異を示す。
【０１１８】
向上される形質は、１つまたは複数の生物ストレス因子または非生物ストレス因子を適用することを含む条件下で評価してもよい。ストレス因子の例としては、非生物ストレス（熱ストレス、塩ストレス、乾燥ストレス、寒冷ストレス、および低栄養ストレス等）および生物ストレス（線虫ストレス、昆虫草食ストレス、真菌病原体ストレス、細菌病原体ストレス、およびウイルス病原体ストレス等）が挙げられる。
【０１１９】
本開示の方法および組成物により向上された形質は、以前は窒素固定が可能ではなかった植物におけるものを含む窒素固定であってもよい。一部の場合では、本明細書に記載の方法により単離された細菌は、植物の窒素の１％またはそれよりも多く（例えば、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、またはそれよりも多く）を産生する。これは、一切の遺伝子変異を導入する前の第１の植物から単離された細菌と比較して、少なくとも２倍（例えば、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、１０００倍、またはそれよりも多く）の窒素固定能力の増加に相当する場合がある。一部の場合では、細菌は、植物の窒素の５％またはそれよりも多くを産生する。窒素固定の所望のレベルは、遺伝子変異を導入するステップ、複数の植物に曝露するステップ、および向上された形質を有する植物から細菌を単離するステップを、１回または複数回（例えば、１、２、３、４、５、１０、１５、２５回、またはそれよりも多く）繰り返した後で達成されてもよい。一部の場合では、窒素固定の増強されたレベルは、グルタミン（ｇｌｕａｍｉｎｅ）、アンモニア、または窒素の他の化学的供給源で補充された肥料の存在下で達成される。窒素固定の度合いを評価するための方法は公知であり、それらの例は、本明細書に記載されている。
【０１２０】
窒素固定
本明細書には、植物における窒素固定を増加させるための方法であって、植物を、窒素固定を調節する１つまたは複数の遺伝子に導入された１つまたは複数の遺伝子変異を含む細菌に曝露するステップを含み、細菌が、植物における窒素の１％またはそれよりも多く（例えば、２％、５％、１０％、またはそれよりも多く）を産生し、産生が、細菌の非存在下における植物と比較して、少なくとも２倍の窒素固定能力に相当してもよい方法が記載されている。細菌は、グルタミンまたはアンモニアで補充された肥料の存在下で窒素を産生することができる。遺伝子変異は、上記で提供されている例を任意の数および任意の組合せで含む、本明細書に記載されている任意の遺伝子変異であってもよい。遺伝子変異は、ｎｉｆＡ、ｎｉｆＬ、ｎｔｒＢ、ｎｔｒＣ、グルタミン合成酵素、ｇｌｎＡ、ｇｌｎＢ、ｇｌｎＫ、ｄｒａＴ、ａｍｔＢ、グルタミナーゼ、ｇｌｎＤ、ｇｌｎＥ、ｎｉｆＪ、ｎｉｆＨ、ｎｉｆＤ、ｎｉｆＫ、ｎｉｆＹ、ｎｉｆＥ、ｎｉｆＮ、ｎｉｆＵ、ｎｉｆＳ、ｎｉｆＶ、ｎｉｆＷ、ｎｉｆＺ、ｎｉｆＭ、ｎｉｆＦ、ｎｉｆＢ、およびｎｉｆＱからなる群から選択される遺伝子に導入されてもよい。遺伝子変異は、以下のうちの１つまたは複数をもたらす突然変異であってもよい：ＮｉｆＡもしくはグルタミナーゼの発現もしくは活性の増加；ＮｉｆＬ、ＮｔｒＢ、グルタミン合成酵素、ＧｌｎＢ、ＧｌｎＫ、ＤｒａＴ、ＡｍｔＢの発現もしくは活性の減少；ＧｌｎＥのアデニリル除去活性の減少；またはＧｌｎＤのウリジリル除去活性の減少。本明細書に開示されている方法のうちの１つまたは複数の細菌に導入される遺伝子変異は、ノックアウト突然変異であってもよく、または標的遺伝子の調節配列を消失させてもよく、または異種性調節配列の挿入、例えば、同じ細菌種または属のゲノム内に見出される調節配列の挿入を含んでもよい。調節配列は、細菌培養物のまたは植物組織内の遺伝子の発現レベルに基づいて選択することができる。遺伝子変異は、化学的突然変異誘発により生成されてもよい。ステップ（ｃ）にて栽培された植物を、生物ストレス因子または非生物ストレス因子に曝露してもよい。
【０１２１】
本明細書に記載の植物に生じる窒素固定の量は、幾つかの方法で、例えばアセチレン還元（ＡＲ）アッセイにより測定することができる。アセチレン還元アッセイは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで実施することができる。特定の細菌が植物に固定窒素を提供している証拠としては、以下のものを挙げることができる：１）接種すると、総植物Ｎが著しく増加し、好ましくはそれに伴って植物におけるＮ濃度が増加すること；２）接種すると、窒素欠乏症状がＮ制限条件下で緩和されること（緩和には、乾燥物質の増加が含まれるべきである）；３）Ｎ２固定が、１５Ｎ手法（同位体希釈実験であってもよく、１５Ｎ２還元アッセイであってよく、または１５Ｎ天然存在量アッセイであってもよい）の使用により確認されること；４）固定されたＮが、植物タンパク質または代謝物に組み込まれること；および５）これら効果の全てが、未接種の植物または接種菌株の突然変異体を接種した植物で見られる訳ではないこと。
【０１２２】
野生型の窒素固定調節カスケードは、入力Ｏ２およびＮＨ４＋がＮＯＲゲートを通過し、その出力が、ＡＴＰに加えてＡＮＤゲートに入力されるデジタル論理回路として表すことができる。一部の実施形態では、本明細書に開示されている方法は、微生物が施肥圃場であっても窒素を産生することができるように、この回路に対するＮＨ４＋の影響を調節カスケードの複数地点で妨害する。しかしながら、本明細書に開示されている方法では、上記回路に対するＡＴＰまたはＯ２の影響を変更すること、または回路を細胞の他の調節カスケードと置換すること、または窒素固定以外の遺伝子回路を変更することも起想される。異種性調節系の制御下で機能性産物を生成するように遺伝子クラスターを再操作してもよい。遺伝子クラスターのコード配列の外部および内部の天然調節エレメントを排除することにより、およびそれらを代替調節系と置換することにより、複雑な遺伝子オペロンおよび他の遺伝子クラスターの機能性産物を制御することができ、および／または天然遺伝子が由来していた種以外の異なる種の細胞を含む異種性細胞に移動させることができる。合成遺伝子クラスターは、再操作されると、遺伝子回路または他の誘導可能な調節系により制御され、それにより産物の発現を所望のように制御することができる。ロジックゲート、パルス発生器、発振器、スイッチ、またはメモリデバイスとして作用するような発現カセットを設計してもよい。制御性発現カセットは、発現カセットが、酸素、温度、接触、浸透圧ストレス、膜ストレス、または酸化還元センサ等の環境センサとして機能するように、プロモーターに連結されてもよい。
【０１２３】
例として、ｎｉｆＬ、ｎｉｆＡ、ｎｉｆＴ、およびｎｉｆＸ遺伝子を、ｎｉｆ遺伝子クラスターから排除してもよい。各アミノ酸配列をコードするＤＮＡをコドンランダム化することにより合成遺伝子を設計してもよい。コドン選択を実施して、コドン使用頻度を天然遺伝子のコドン使用頻度からできるだけ逸脱するよう特定する。提案された配列を、制限酵素認識部位、トランスポゾン認識部位、反復配列、シグマ５４およびシグマ７０プロモーター、潜在性リボソーム結合部位、およびｒｈｏ非依存性ターミネーター等の、あらゆる望ましくない特徴について走査する。合成リボソーム結合部位を、遺伝子の開始コドンを取り囲む１５０ｂｐ（−６０から＋９０まで）が蛍光遺伝子に融合されている蛍光レポータープラスミドを構築すること等により、各々対応する天然リボソーム結合部位の強度と一致するように選択する。このキメラをＰｔａｃプロモーターの制御下で発現させ、フローサイトメトリーにより蛍光を測定することができる。合成リボソーム結合部位を生成するために、合成発現カセットの１５０ｂｐ（−６０〜＋９０）を使用するレポータープラスミドのライブラリーを生成する。手短に言えば、合成発現カセットは、ランダムＤＮＡスペーサー、ＲＢＳライブラリーをコードする縮重配列、および各合成遺伝子のコード配列からなってもよい。複数のクローンをスクリーニングして、天然リボソーム結合部位に最も良好に一致した合成リボソーム結合部位を同定する。このようにして天然オペロンと同じ遺伝子からなる合成オペロンを構築し、機能的な相補性について試験する。合成オペロンのさらなる例示的な記載は、米国特許出願公開第２０１４０３２９３２６号に提供されている。
【０１２４】
細菌種
本明細書に開示されている方法および組成物に有用な微生物は、天然植物の表面または組織から微生物を抽出することにより；種子を粉砕して微生物を単離することにより；多様な土壌試料に種子を植栽し、組織から微生物を回収することにより；または植物に外因性微生物を接種し、微生物が植物組織に出現するか否かを決定することにより得ることができる。植物組織の非限定的な例としては、種子、実生、葉、挿穂、植物、球根、または塊茎が挙げられる。一部の場合では、細菌は、種子から単離される。試料を処理するためのパラメータを変化させて、根圏菌、着生菌、または内部寄生菌等の、異なるタイプの付随微生物を単離することができる。また、細菌は、第１の植物から初期に分離する代わりに、環境菌株コレクション等のレポジトリを供給源としてもよい。微生物は、単離された微生物のゲノムを配列決定することにより；植物内群生の組成物をプロファイリングすることにより；群生もしくは単離された微生物のトランスクリプトーム機能性を特徴付けることにより；または選択培地もしくは表現型培地（例えば、窒素固定またはリン酸可溶化表現型）を使用して微生物の特徴をスクリーニングすることにより、遺伝子型および表現型を決定することができる。選択する候補菌株または集団は、配列データ；表現型データ；植物データ（例えば、ゲノム、表現型、および／または収穫高データ）；土壌データ（例えば、ｐＨ、Ｎ／Ｐ／Ｋ含有量、および／またはバルク土壌生物群生）；またはこれらの任意の組合せにより得ることができる。
【０１２５】
本明細書に記載の細菌および細菌を産生するための方法は、有害な植物防御反応を誘導せずに、葉表面、根表面、もしくは内部植物組織で効率的に自己増幅することができる細菌、または植物防御応答に耐性である細菌に適用してもよい。本明細書に記載の細菌は、窒素が添加されていない培地で植物組織抽出物または葉表面洗浄液を培養することにより単離してもよい。しかしながら、細菌は、培養可能でない場合があり、すなわち、培養可能かどうか公知でないか、当技術分野で公知の標準的方法の使用では培養が困難である場合がある。本明細書に記載の細菌は、内部寄生菌、または着生菌、または植物根圏に生息する細菌（根圏細菌）であってもよい。遺伝子変異を導入するステップ、複数の植物に曝露するステップ、および向上された形質を有する植物から細菌を単離するステップを、１回または複数回（例えば、１、２、３、４、５、１０、１５、２５回、またはそれよりも多く）繰り返した後で得られる細菌は、内部寄生性、着生性、または根圏性であってもよい。内部寄生菌は、疾患症状を引き起こさずに、または共生構造の形成を誘発せずに、植物の内部に進入する生物であり、植物成長を増強し、植物の栄養を向上させる（例えば、窒素固定により）ことができるため農耕学的に興味深い生物である。細菌は、種子伝染性内部寄生菌であってもよい。種子伝染性内部寄生菌としては、成熟し乾燥した無損傷の（例えば、ひび割れ、目に見える真菌性感染、または早期発芽がない）種子に見出される種子伝染性細菌性内部寄生菌等の、イネ化植物または植物の種子に付随するまたは由来する細菌が挙げられる。また、種子伝染性細菌性内部寄生菌は、種子の表面に付随もしくは由来してもよく、その代わりにまたはそれに加えて、内部種子区画（例えば、表面滅菌種子の）に付随もしくは由来してもよい。一部の場合では、種子伝染性細菌性内部寄生菌は、植物組織内で、例えば種子の内部で複製することが可能である。また、一部の場合では、種子伝染性細菌性内部寄生菌は、乾燥を生き抜くことが可能である。
【０１２６】
本開示の方法により単離される細菌は、複数の異なる細菌分類群を組合せで含むことができる。例として、細菌としては、プロテオバクテリア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｈｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｐａｎｔｏｅａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｒａｈｎｅｌｌａ、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ａｚｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｄｕｇａｎｅｌｌａ、Ｄｅｌｆｔｉａ、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、およびＨａｌｏｍｏｎａｓ等）、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ、およびＡｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ等）、およびＡｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅ）、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、およびＣｕｒｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ等）が挙げられる。本明細書に開示されている方法により産生することができる細菌としては、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐ．、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐ．、およびＳｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐ．が挙げられる。細菌は、以下のものからなる群から選択されてもよい：Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ  ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、およびＳｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ）。細菌は、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ属およびＲａｈｎｅｌｌａ属であってもよい。
【０１２７】
細菌は、その土壌、植物、真菌、動物（無脊椎動物を含む）、ならびに湖および川の堆積物、水、および生物相を含む他の生物相を含む任意の一般的陸生環境；海洋環境、その生物相および堆積物（例えば、海水、海泥、海洋植物、海洋無脊椎動物（例えば、海綿動物）、海洋脊椎動物（例えば、魚類））；陸生および海洋性地圏（表土および岩石、例えば、粉砕された地中岩石、砂、および粘土）；氷雪圏およびその融雪氷水；大気（例えば、濾過空気粉塵、雲、および雨滴）；都市環境、工業環境、および他の人為的環境（例えば、コンクリート、道路側溝、屋根表面、および道路表面に蓄積された有機物および無機物）から得ることができる。
【０１２８】
細菌が得られる植物は、１つまたは複数の望ましい形質を有する植物、例えば、特定の環境でまたはある特定の目的の条件下で自然に成長する植物であってもよい。例として、ある特定の植物は、砂質土壌および高塩分の砂地で、もしくは極端な温度下で、もしくは水がほとんどなくとも自然に成長することができ、または環境に存在するある特定の害虫または疾患に耐性であってもよく、商品作物は、そのような条件下で成長することが望ましい場合があり、そのような条件が、例えば特定の地理的位置において利用可能な唯一の条件である場合は特にそうである。さらなる例としては、細菌は、そのような環境で栽培された商品作物から、またはより具体的には、任意の特定の環境で栽培された作物のうち目的の形質を最も良好に示す作物植物個体：例えば、塩分制限土壌で栽培された作物のうち最も迅速に成長する植物、深刻な虫害もしくは疾患流行に曝露された作物のうち最も被害が少なかった植物、または繊維含量および油分含量等を含む、ある特定の代謝物および他の化合物の所望の量を有する植物、または望ましい色、味、もしくは匂いを示す植物から収集してもよい。細菌は、以前に参照されているような環境中の真菌および他の動物相および植物相、土壌、水、堆積物、ならびに他の要素を含む、目的の環境に生じる目的の植物または任意の物質から収集してもよい。
【０１２９】
細菌は、植物組織から単離してもよい。この単離は、例えば、根、茎葉、および植物再生組織を含む、植物の任意の適切な組織から行ってもよい。例として、植物から単離するための従来の方法は、典型的には、目的の植物物質（例えば、根長、または茎長、葉）を無菌切除すること、適切な溶液（例えば、２％次亜塩素酸ナトリウム）で表面を滅菌してから、植物物質を、微生物培養用の栄養培地に配置することを含む。あるいは、表面を滅菌した植物物質を滅菌液中（通常は、水）で粉砕し、粉砕した植物物質の小片を含む懸濁液を、選択的であってもよくまたは非選択的であってもよい（例えば、リンの供給源としてフィチン酸のみを含有する）１つまたは複数の好適な固体寒天培地の表面に播種してもよい。この手法は、単離されたコロニーを形成し、個々に摘取して栄養培地のプレートから分離することができ、さらに周知の方法により単一種に精製することができる細菌に特に有用である。あるいは、植物根または葉試料を表面滅菌せず、穏やかな洗浄のみを行って、表面に生息する着生微生物を単離プロセスに含めてもよく、または植物の根、茎、もしくは葉の小片を寒天培地の表面に押しつけてから離し、その後上述のように個々のコロニーを単離することにより、着生微生物を別々に単離してもよい。この手法は、例えば、細菌に特に有用である。あるいは、根に付着している少量の土を洗い流さずに、したがって植物根圏でコロニー化する微生物を含むように、根を処理してもよい。そうでなければ、根に付着している土壌を取り出し、希釈し、好適な選択的および非選択的培地の寒天上に播種して、根圏細菌の個々のコロニーを単離してもよい。
【０１３０】
Ｒａｈｎｅｌｌａ  ａｑｕａｔｉｌｉｓおよびＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓａｃｃｈａｒｉの生物学的な純粋培養物を、２０１５年７月１４日に、アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ；国際寄託機関）、マナサス、ＶＡ、米国に寄託し、それぞれＡＴＴＣ特許寄託指定番号ＰＴＡ−１２２２９３およびＰＴＡ−１２２２９４を割り当てられた。これら寄託は、特許手続きのための微生物寄託の国際承認および規制に関するブダペスト条約（Ｂｕｄａｐｅｓｔ  Ｔｒｅａｔｙ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｄｅｐｏｓｉｔ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｕｒｐｏｓｅ  ｏｆ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ）（ブダペスト条約）の条項に基づいてなされた。
【０１３１】
組成物
また、本明細書に記載の方法により産生される細菌または細菌集団を含み、および／または本明細書に記載のような特徴を有する組成物を使用して、植物形質を向上させることができる。細菌集団を含む組成物は、種子の表面にコーティングしてもよく、液体形態であってもよい。組成物としては、商業的に重要な農業作物、例えば、ソルガム、キャノーラ、トマト、イチゴ、大麦、米、トウモロコシ、および小麦の種子コーティング剤が挙げられる。また、組成物は、植物地上部分に噴霧してもよく、または植物種子が植栽される畝間内に挿入することにより、土壌に灌水することにより、または組成物の懸濁液に根を浸漬することにより根に適用してもよい。組成物は、細胞生存、および宿主植物での人為的接種およびコロニー化の能力を維持する好適な様式で脱水してもよい。細菌種は、１０８〜１０１０ＣＦＵ／ｍｌの間の濃度で組成物中に存在してもよい。組成物は、モリブデンイオン、鉄イオン、マンガンイオン、またはこれらイオンの組合せ等の微量金属イオンで補充されてもよい。本明細書に記載の組成物中のイオンの濃度は、約０．１ｍＭ〜約５０ｍＭの間であってもよい。また、組成物は、ベータ−グルカン、カルボキシルメチルセルロース（ＣＭＣ）、細菌性細胞外ポリマー物質（ＥＰＳ）、糖、畜乳、または他の好適な担体等の担体と共に製剤化されてもよい。あるいは、泥炭または植栽用物質を担体として使用してもよく、または組成物がバイオポリマーに捕捉されているバイオポリマーを担体として使用してもよい。本明細書に記載の細菌集団を含む組成物は、植物成長の促進、葉中の高葉緑素含有量の維持、果実数または種子数の増加、および果実単位重量または種子単位重量の増加等、植物形質を向上させることができる。
【０１３２】
本明細書に記載の細菌集団を含む組成物は、種子の表面上にコーティングしてもよい。そのため、本明細書に記載のうちの１つまたは複数の細菌でコーティングされた種子を含む組成物も企図される。種子コーティングは、細菌集団を、多孔性の化学的に不活性な粒状担体と混合することにより形成することができる。あるいは、組成物は、種子が植栽される畝間内に直接挿入してもよく、植物葉に噴霧してもよく、または根を組成物の懸濁液に浸漬することにより適用してもよい。有効量の組成物を使用して、植物の根に隣接する土壌下領域に生存可能な細菌増殖を定植させてもよく、または植物の葉に生存可能な細菌増殖を定植させてもよい。一般的に、有効量は、向上された形質（例えば、所望のレベルの窒素固定）を有する植物をもたらすのに十分な量である。
【０１３３】
本明細書に記載の細菌組成物は、農業的に許容される担体を使用して製剤化することができる。これら実施形態に有用な製剤は、粘着付与剤、微生物安定化剤、殺真菌剤、抗細菌剤、除草剤、殺線虫剤、殺昆虫剤、植物成長調節剤、肥料、殺鼠剤、防湿剤、および栄養素からなる群から選択される少なくとも１つのメンバーを含んでもよい。例えば、本明細書に記載の組成物はいずれも、農業的に許容される担体（例えば、非天然肥料等の肥料、非天然付着剤等の付着剤、および非天然殺虫剤等の殺虫剤のうちの１つまたは複数）を含んでもよい。非天然付着剤は、例えば、ポリマー、コポリマー、または合成ろうであってもよい。例えば、本明細書に記載されているコーティングされた種子、実生、または植物はいずれも、種子コーティングにそのような農業的に許容される担体を含有することができる。本明細書に記載されている組成物または方法のいずれにおいても、農業的に許容される担体は、非天然化合物（例えば、非天然肥料；ポリマー、コポリマー、もしくは合成ろう等の非天然付着剤；または非天然殺虫剤）であってもよく、または含んでもよい。農業的に許容される担体の非限定的な例は、下記に記載されている。農業的に許容される担体の追加の例は、当技術分野で公知である。
【０１３４】
一部の場合では、細菌は、農業的に許容される担体と混合されてもよい。担体は、固体担体であってもよくまたは液体担体であってもよく、ミクロスフェア、粉末、およびエマルジョン等を含む種々の形態であってもよい。担体は、安定性、湿潤性、または分散性の増加等の様々な特性を付与する幾つかの担体のいずれか１つまたは複数であってもよい。非イオン性界面活性剤であってもよく、またはイオン性界面活性剤であってもよく、またはそれらの組合せであってもよい天然または合成界面活性剤等の湿潤剤が、組成物中に含まれてもよい。また、単離された細菌を含む組成物を製剤化するために、油中水型エマルジョンを使用してもよい（例えば、米国特許第７，４８５，４５１号を参照）。調製することができる好適な製剤としては、水和性粉末、顆粒、ゲル、寒天片またはペレット、および増粘剤等、およびマイクロカプセル化粒子等、流動性水溶液、水性懸濁液、油中水型エマルジョン等の液体等が挙げられる。製剤は、穀物またはマメ科植物産物、例えば地上穀物または豆、穀物または豆に由来するブロスまたは粉末、デンプン、糖、または油を含んでもよい。
【０１３５】
一部の実施形態では、農業担体は、土壌であってもよく、または植物生育培地であってもよい。使用することができる他の農業担体としては、水、肥料、植物系の油、保湿剤、またはそれらの組合せが挙げられる。あるいは、農業担体は、顆粒、ペレット、または懸濁液を含む、ケイソウ土、ローム、シリカ、アルギン酸塩、粘土、ベントナイト、バーミキュライト、種嚢、他の植物および動物産物、または組合せ等の固形物であってもよい。これらに限定されないが、ローム、砂、または粘土等の中のペスタ（ｐｅｓｔａ）（粉末およびカオリン粘土）、寒天または粉末に基づくペレット等の、前述の成分のいずれかの混合物も担体として企図される。製剤は、大麦、米、または種子等の他の生物学的材料；植物部分；サトウキビバガス；穀物処理に由来する殻または柄；建築現場廃物に由来する地上植物材料または木材；紙、繊維、または木材の再利用に由来するおがくずまたは繊維片等の、細菌の食料源を含んでもよい。
【０１３６】
例えば、肥料を使用して、成長促進を支援してもよく、種子、実生、または植物への栄養素供給を支援してもよい。肥料の非限定的な例としては、窒素、亜リン酸（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｕｓ）、カリウム、カルシウム、硫黄、マグネシウム、ホウ素、塩化物、マンガン、鉄、亜鉛、銅、モリブデン、およびセレン（またはそれらの塩）が挙げられる。肥料の追加の例としては、１つまたは複数のアミノ酸、塩、炭水化物、ビタミン、グルコース、ＮａＣｌ、酵母抽出物、ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４、（ＮＨ４）２ＳＯ４、グリセロール、バリン、Ｌ−ロイシン、乳酸、プロピオン酸、コハク酸、リンゴ酸、クエン酸、酒石酸水素カリウム、キシロース、リキソース、およびレシチンが挙げられる。一実施形態では、製剤は、他の活性剤が物質（例えば、種子の表面）に結合するのを支援するために、粘着付与剤または粘着剤（接着剤と呼ばれる）を含んでもよい。そのような薬剤は、他の化合物（例えば、生物学的ではない制御因子）を含有してもよい担体を細菌と組み合わせて、コーティング組成物を産出するために有用である。そのような組成物は、植物または種子の周囲にコーティングを作成して、微生物および他の薬剤と植物または植物部分との接触の維持を支援する。一実施形態では、接着剤は、以下のものからなる群から選択される：アルギン酸塩、ゴム、デンプン、レシチン、ホルモノネチン、ポリビニルアルコール、アルカリホルモノネチネート、ヘスペリチン、ポリ酢酸ビニル、ケファリン、アラビアゴム、キサンタンガム、鉱油、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、アラビノ−ガラクタン、メチルセルロース、ＰＥＧ４００、キトサン、ポリアクリルアミド、ポリアクリレート、ポリアクリロニトリル、グリセロール、トリエチレングリコール、酢酸ビニル、ジェランガム、ポリスチレン、ポリビニル、カルボキシメチルセルロース、ガッチゴム、およびポリオキシエチレン−ポリオキシブチレンブロックコポリマー。
【０１３７】
一部の実施形態では、接着剤は、例えば、カルナウバろう、みつろう、中国ろう、セラックろう、鯨ろう、カンデリラろう、キャスターろう、オーリクリーろう、および米ぬかろう等のろう、ポリサッカライド（例えばデンプン、デキストリン、マルトデキストリン、アルギン酸塩、およびキトサン）、脂肪、油、タンパク質（例えば、ゼラチンおよびゼイン）、アラビアガム、ならびにシェラックであってもよい。接着剤は、非天然化合物、例えばポリマー、コポリマー、およびろうであってもよい。例えば、接着剤として使用することができるポリマーの非限定的な例としては、以下のものが挙げられる：ポリ酢酸ビニル、ポリ酢酸ビニルコポリマー、エチレン酢酸ビニル（ＥＶＡ）コポリマー、ポリビニルアルコール、ポリビニルアルコールコポリマー、セルロース（例えば、エチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、およびカルボキシメチルセルロース）、ポリビニルピロリドン、塩化ビニル、塩化ビニリデンコポリマー、リグノスルホン酸カルシウム、アクリルコポリマー、ポリビニルアクリレート、ポリエチレンオキシド、アシルアミドポリマーおよびコポリマー、ポリヒドロキシエチルアクリレート、メチルアクリルアミドモノマー、ならびにポリクロロプレン。
【０１３８】
一部の例では、付着剤、抗真菌剤、成長調節剤、および殺虫剤（例えば、殺昆虫剤）のうちの１つまたは複数は、非天然化合物（例えば、任意の組合せの）である。農業的に許容される担体の追加の例としては、分散剤（例えば、ポリビニルピロリドン／ビニルアセテートＰＶＰＩＶＡ  Ｓ−６３０）、界面活性剤、結合剤、および充填剤が挙げられる。
【０１３９】
また、製剤は、界面活性剤を含有してもよい。界面活性剤の非限定的な例としては、Ｐｒｅｆｅｒ２８（Ｃｅｎｅｘ）、Ｓｕｒｆ−Ｎ（ＵＳ）、Ｉｎｈａｎｃｅ（Ｂｒａｎｄｔ）、Ｐ−２８（Ｗｉｌｆａｒｍ）、およびＰａｔｒｏｌ（Ｈｅｌｅｎａ）等の窒素界面活性剤配合物が挙げられる。エステル化種子油としては、Ｓｕｎ−Ｉｔ  ＩＩ（ＡｍＣｙ）、ＭＳＯ（ＵＡＰ）、Ｓｃｏｉｌ（Ａｇｓｃｏ）、Ｈａｓｔｅｎ（Ｗｉｌｆａｒｍ）、およびＭｅｓ−１００（Ｄｒｅｘｅｌ）が挙げられる。有機シリコーン界面活性剤としては、Ｓｉｌｗｅｔ  Ｌ７７（ＵＡＰ）、Ｓｉｌｉｋｉｎ（Ｔｅｒｒａ）、Ｄｙｎｅ−Ａｍｉｃ（Ｈｅｌｅｎａ）、Ｋｉｎｅｔｉｃ（Ｈｅｌｅｎａ）、Ｓｙｌｇａｒｄ３０９（Ｗｉｌｂｕｒ−Ｅｌｌｉｓ）、およびＣｅｎｔｕｒｙ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ）が挙げられる。一実施形態では、界面活性剤は、０．０１％ｖ／ｖ〜１０％ｖ／ｖの間の濃度で存在する。別の実施形態では、界面活性剤は、０．１％ｖ／ｖ〜１％ｖ／ｖの間の濃度で存在する。
【０１４０】
ある特定の場合では、製剤は、微生物安定化剤を含む。そのような薬剤としては、乾燥剤として分類することができる任意の化合物または化合物の混合物を含む乾燥剤を挙げることができ、化合物は、液体接種物に対して実際に乾燥効果を有するような濃度で使用されるか否かを問わない。そのような乾燥剤は、理想的には、使用される細菌集団と適合性を有し、微生物集団が種子へと適用されても生存し、乾燥しても生存する能力を促進すると予想される。好適な乾燥剤の例としては、トレハロース、スクロース、グリセロール、およびメチレングリコールのうちの１つまたは複数が挙げられる。他の好適な乾燥剤としては、これらに限定されないが、非還元糖および糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）が挙げられる。製剤に導入される乾燥剤の量は、重量／容積で約５％から約５０％まで、例えば、約１０％〜約４０％の間、約１５％〜約３５％の間、または約２０％〜約３０％の間の範囲であってもよい。一部の場合では、製剤は、殺真菌剤、抗細菌剤、除草剤、殺線虫剤、殺昆虫剤、植物成長調節剤、殺鼠剤、または栄養剤等の薬剤を含有することが有利である。成長調節剤の非限定的な例としては、ブラシノステロイド、サイトカイニン（例えば、キネチンおよびゼアチン）、オーキシン（例えば、インドリル酢酸およびアスパラギン酸インドリルアセチル）、フラボノイドおよびイソフラボノイド（ｉｓｏｆｌａｖａｎｏｉｄ）（例えば、ホルモノネチンおよびジオスメチン）、フィトアレキシン（ｐｈｙｔｏａｉｘｉｎ）（例えば、グリセオリン）、およびフィトアレキシン誘導性オリゴ糖（例えば、ペクチン、キチン、キトサン、ポリガラクツロン酸（ｐｏｌｙｇａｌａｃｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、およびオリゴガラクツロン酸）、ならびにジベレリン（ｇｉｂｅｌｌｅｒｉｎ）が挙げられる。そのような薬剤は、理想的には、製剤が適用される農業種子または実生と適合性を有する（例えば、植物の成長または健康に有害であるべきではない）。さらに、薬剤は、理想的には、ヒト、動物、または工業使用に関して安全性の懸念を引き起こさないものである（例えば、安全性の問題がないか、または化合物は、十分に不安定であり、植物に由来する商品植物製品に含まれる化合物の量は無視できる程度である）。
【０１４１】
液体形態、例えば、溶液または懸濁液の場合、細菌集団は、水または水溶液に混合または懸濁されてもよい。好適な液体希釈剤または担体としては、水、水溶液、石油蒸留物、または他の液体担体が挙げられる。
【０１４２】
固形組成物は、泥炭、小麦、ふすま、バーミキュライト、粘土、タルク、ベントナイト、ケイソウ土、フラー土、および低温滅菌土等の適切に分割された固体担体内にまたは固体担体上に細菌集団を分散させることにより調製することができる。そのような製剤が水和性粉末として使用される場合、非イオン性、陰イオン性、両性、または陽イオン性の分散剤および乳化剤等の、生物学的に適合性の分散剤を使用することができる。
【０１４３】
製剤時に使用される固体担体としては、例えば、カオリン粘土、パイロフィライト、ベントナイト、モンモリロナイト、ケイソウ土、酸性白土、バーミキュライト、およびパーライト等の鉱物担体；ならびに硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素、塩化アンモニウム、および炭酸カルシウム等の無機塩が挙げられる。また、小麦粉、小麦ふすま、および米ぬか等の有機微細粉末を使用してもよい。液体担体としては、大豆油および綿実油等の植物油、グリセロール、エチレングリコール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、ポリプロピレングリコール等が挙げられる。
【０１４４】
植物種
本明細書に記載の方法および細菌は、Ｈｏｒｄｅｕｍ属、Ｏｒｙｚａ属、Ｚｅａ属、およびＴｒｉｔｉｃｅａｅ属の植物等の、様々な植物のいずれにも好適である。好適な植物の他の非限定的な例としては、コケ類、地衣類、および藻類が挙げられる。一部の場合では、植物は、食用作物、繊維作物、油用作物、森林またはパルプおよび製紙業界の植物、バイオ燃料生産用の原料、および／または観賞植物等の、経済的、社会的、および／または環境的な価値を有する。作物植物の非限定的な例としては、トウモロコシ、米、小麦、大麦、ソルガム、雑穀、オートムギ、ライ小麦、ソバ、スイートコーン、サトウキビ、玉ねぎ、トマト、イチゴ、およびアスパラガスが挙げられる。
【０１４５】
また、本明細書に開示されている方法および組成物を使用して得ることができるかまたは向上させることができる植物としては、パイナップル、バナナ、ココナッツ、ユリ、および芝生；ならびに、例えば、エンドウ、アルファルファ、オオブドウホオズキ、メロン、ヒヨコマメ、チコリー、クローバ、ケール、レンズマメ、大豆、タバコ、ジャガイモ、サツマイモ、ダイコン、キャベツ、アブラナ、リンゴの木、ブドウ、綿、ヒマワリ、シロイヌナズナ、キャノーラ、柑橘類（オレンジ、マンダリン、キンカン、レモン、ライム、グレープフルーツ、タンジェリン、タンジェロ、シトロン、およびザボンを含む）、コショウ、豆、およびレタス等の双子葉植物が挙げられる。
【０１４６】
一部の場合では、向上される植物は、実験条件に容易に適合しない。例えば、作物植物は、十分に成長するのに時間が長くかかり過ぎるため、向上された形質を複数の繰り返しで連続的に評価することが実際上できない場合がある。したがって、細菌が最初に単離される第１の植物および／または遺伝子操作した細菌を適用する複数の植物は、所望の条件下での評価をより行い易い植物等のモデル植物であってもよい。モデル植物の非限定的な例としては、Ｓｅｔａｒｉａ属、Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ属、およびＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ属が挙げられる。その後、モデル植物を使用して本開示の方法により単離された細菌の能力を、別のタイプの植物（例えば、作物植物）に適用して、向上された形質の付与を確認することができる。
【０１４７】
本明細書に開示されている方法により向上させることができる形質としては、例えば、成長速度、植物丈、重量、色、味、臭い、植物による１つまたは複数の化合物（例えば、代謝物、タンパク質、薬物、炭水化物、油、および任意の他の化合物を含む）の産生の変化を含む植物の任意の観察可能な特徴が挙げられる。遺伝子型情報に基づいて植物を選択することも起想される（例えば、細菌に応答した植物遺伝子発現のパターンを含むこと、または窒素固定の増加に関連するもの等の遺伝子マーカーの存在を同定すること）。また、植物は、ある特定の特徴または形質（望ましい特徴または形質等）の存在ではなく、ある特定の特徴または形質（望ましくない特徴または形質等）の非存在、抑制、または阻害に基づいて選択してもよい。
【実施例】
【０１４８】
本明細書に提供される実施例には、細菌単離、細菌および植物分析、および植物形質向上の方法が記載される。こうした実施例において、説明は目的であるに過ぎず、いかなる点でも限定として解釈されるべきではない。
【０１４９】
（実施例１）
植物組織からの微生物の単離
カリフォルニア中部の種々の農業地域から表土を得た。重粘土、泥炭粘土ローム、シルト質粘土、および砂質ロームを含む、多様なテクスチャ特徴を有する２０種の土壌を収集した。表１に示されているように、種々の飼料用トウモロコシ、スイートコーン、古代トウモロコシ、およびトマトの種子を、各土壌に植栽した。
【表１】
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【０１５０】
２〜４週間の栽培後に植物を引き抜き、根表面の過剰な土壌を脱イオン水で除去した。土壌を除去した後、植物を漂白剤で表面滅菌し、滅菌水で入念にすすいだ。洗浄された、１ｃｍ区画の根を植物から切除し、３ｍｍの鋼鉄ビーズを含有するリン酸緩衝生理食塩水に入れた。Ｑｉａｇｅｎ  ＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒ  ＩＩで溶液を激しく振とうすることにより、スラリーを生成した。
【０１５１】
根および生理食塩水スラリーを希釈し、種々のタイプの増殖培地に接種し、根圏微生物、内部寄生微生物、着生微生物、および他の植物関連微生物を単離した。Ｒ２ＡおよびＮｆｂ寒天培地を使用して、単一コロニーを得て、半固形Ｎｆｂ傾斜培地を使用して、窒素固定細菌の集団を得た。半固形Ｎｆｂ傾斜培地で２〜４週間インキュベーションした後、微生物集団を収集し、Ｒ２Ａ寒天にストリークして、図１Ａ〜Ｂに示されるように単一コロニーを得た。単一コロニーを、Ｒ２Ａとグリセロールの混合物に再懸濁し、ＰＣＲ分析にかけ、後の分析のために−８０℃で凍結した。およそ１，０００個の単一コロニーが得られ、それらを「単離された微生物」と称した。
【０１５２】
その後、ジアゾ栄養生物を同定するために、単離菌をコロニーＰＣＲスクリーニングにかけて、ｎｉｆＨ遺伝子の存在を検出した。スクリーニングで９０％を超えるジアゾ栄養生物が検出されることが示されている、以前に記載のプライマーセットＵｅｄａ  １９Ｆ／３８８Ｒを使用して、各単離菌におけるｎｉｆクラスターの存在を調査した（Ｕｅｄａら、１９９５年；Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７７巻：１４１４〜１４１７頁）。精製した単離菌の単一コロニーを摘取し、ＰＢＳに再懸濁し、図２に示されているように鋳型としてコロニーＰＣＲに使用した。陽性ＰＣＲのバンドを示した単離菌のコロニーを再びストリークし、コロニーＰＣＲおよび再ストリークプロセスを２回繰り返して、ジアゾ栄養生物の偽陽性同定を防止した。その後、精製された単離菌を、「候補微生物」と称した。
【０１５３】
（実施例２）
単離された微生物の特徴付け
配列決定、分析、および系統学的特徴付け
５１５ｆ−８０６ｒプライマーセットによる１６Ｓ  ｒＤＮＡの配列決定を使用して、単離された候補微生物の予備的な系統学的同一性を生成した（例えば、Ｖｅｒｎｏｎら、ＢＭＣ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２００２年１２月２３日；２巻：３９頁を参照）。微生物は、表２に示されているように、以下のものを含む多様な属を含む：Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｒａｈｎｅｌｌａ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ、Ｒａｏｕｌｔｅｌｌａ、Ｐａｎｔｏｅａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、およびＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ。
【表２】
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【０１５４】
続いて、３９個の候補微生物のゲノムを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｍｉｓｅｑプラットフォームを使用して配列決定した。純粋培養に由来するゲノムＤＮＡを、ＱＩＡｍｐ  ＤＮＡミニキット（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して抽出し、配列決定用の全ＤＮＡライブラリーを、サードパーティ供給業者（ＳｅｑＭａｔｉｃ、ヘイワード）により調製した。その後、Ａ５パイプラインによりゲノム構築を実施した（Ｔｒｉｔｔら、２０１２年；ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ、７巻（９号）：ｅ４２３０４頁）。遺伝子を同定し、注釈を付け、窒素固定の調節および発現と関連するものを、突然変異誘発の標的として記録した。
【０１５５】
候補微生物のトランスクリプトームプロファイリング
菌株ＣＩ０１０のトランスクリプトームプロファイリングを実施して、環境窒素の存在下で活性であるプロモーターを同定した。菌株ＣＩ０１０を、１０ｍＭグルタミンで補充された限定無窒素培地で培養した。これら培養から全ＲＮＡを抽出し（ＱＩＡＧＥＮ  ＲＮｅａｓｙキット）、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ（ＳｅｑＭａｔｉｃ、フリーモント、ＣＡ）によりＲＮＡｓｅｑ配列決定にかけた。配列決定リードを、Ｇｅｎｅｉｏｕｓを使用してＣＩ０１０ゲノムデータにマッピングし、近位転写プロモーターの制御下で高度に発現された遺伝子を同定した。表３Ａ〜３Ｃには、全ＲＮＡのＲＮＡＳｅｑ配列決定により測定された、遺伝子およびそれらの相対的発現レベルが列挙されている。ｎｉｆ経路、窒素利用関連経路、または所望の発現レベルを示す他の遺伝子の突然変異誘発に使用するための近位プロモーターの配列が記録されている。
【０１５６】
遺伝子取り扱い易さの評価
候補微生物を、形質転換性および遺伝子取り扱い易さに基づいて特徴付けた。最初に、至適炭素源利用を、少数パネルの関連培地での増殖ならびに無窒素培地および窒素富化培地の両方での増殖曲線により決定した。第２に、各菌株の天然抗生物質耐性を、スポットプレーティング、および突然変異誘発の選択マーカーとして使用される抗生物質のパネルを含有する液体培養での増殖により決定した。第３に、各菌株を、１群のプラスミドのエレクトロポレーションにより、その形質転換性に関して試験した。プラスミド群は、７個の複製開始点、つまりｐ１５ａ、ｐＳＣ１０１、ＣｌｏＤＦ、ｃｏｌＡ、ＲＫ２、ｐＢＢＲ１、およびｐＲＯ１６００、ならびに４個の抗生物質耐性マーカー、つまりＣｍＲ、ＫｍＲ、ＳｐｅｃＲ、およびＴｅｔＲのコンビナトリアル展開を含む。開始点および耐性マーカー適合性に関するこの系統的評価を使用して、候補微生物でのプラスミドに基づく突然変異誘発用のベクターを同定した。
【０１５７】
（実施例３）
候補微生物の突然変異誘発
Ｌａｍｂｄａ−Ｒｅｄ媒介性ノックアウト
プラスミドｐＫＤ４６またはカナマイシン耐性マーカーを含有する誘導体を使用して、候補微生物の幾つかの突然変異体を生成した（Ｄａｔｓｅｎｋｏら、２０００年；ＰＮＡＳ、９７巻（１２号）：６６４０〜６６４５頁）。標的遺伝子を端部に有する２５０ｂｐ相同性を有するノックアウトカセットを設計し、オーバーラップ伸長ＰＣＲにより生成した。候補微生物をｐＫＤ４６で形質転換し、アラビノースの存在下で培養して、Ｌａｍｂｄａ−Ｒｅｄ機械的発現を誘導し、エレクトロポレーション用に調製し、ノックアウトカセットで形質転換して、候補突然変異体菌株を産生した。表４に示されているように、４個の候補微生物および１個の実験室菌株Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａ  Ｍ５Ａ１を使用して、窒素固定調節遺伝子ｎｉｆＬ、ｇｌｎＢ、およびａｍｔＢの１３個の候補突然変異体を生成した。
【表４】
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【０１５８】
Ｃａｓ９選択によるオリゴ指定突然変異誘発
オリゴ指定突然変異誘発を使用して、Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ１０ＢのｒｐｏＢ遺伝子をゲノム変化の標的とし、突然変異体をＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系で選択した。ｒｐｏＢ遺伝子への４ｂｐ突然変異によりリファンピシン耐性を付与するように、変異原性オリゴ（ｓｓ１２８３：「Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｇ＊ＡＴＣＡＧＡＣＣＧＡＴＧＴＴＣＧＧＡＣＣＴＴＣｃａａｇＧＴＴＴＣＧＡＴＣＧＧＡＣＡＴＡＣＧＣＧＡＣＣＧＴＡＧＴＧＧＧＴＣＧＧＧＴＧＴＡＣＧＴＣＴＣＧＡＡＣＴＴＣＡＡＡＧＣＣ」、式中＊は、ホスホロチオエート結合を示す）を設計した。Ｃａｓ９をコードするプラスミドを含有する細胞を誘導してＣａｓ９を発現させ、エレクトロポレーション用に調製し、その後、変異原性オリゴ、およびＷＴ  ｒｐｏＢ配列のＣａｓ９切断を標的とするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の構成的発現をコードするプラスミドの両方と共にエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションした細胞を非選択的培地で一晩回復させ、得られた突然変異染色体の十分な分離を可能にした。プレーティングして、ｇＲＮＡをコードするプラスミドを選択した後、スクリーニングした１０個のコロニーのうちの２つが、所望の突然変異を含有することが示され、残りは、ｇＲＮＡプラスミド喪失またはＣａｓ９プラスミド喪失のプロトスペーサー突然変異により生成されたエスケープ突然変異体であることが示された。
【０１５９】
Ｃａｓ９選択によるＬａｍｂｄａ−Ｒｅｄ突然変異誘発
候補微生物ＣＩ００６およびＣＩ０１０の突然変異体を、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓによる選択を用いてｌａｍｂｄａ−ｒｅｄ突然変異誘発により生成した。ノックアウトカセットは、転写プロファイリングにより同定された内因性プロモーター（実施例２に記載され、表３に表示されている）および欠失標的を端部に有する約２５０ｂｐ相同性領域を含有した。ＣＩ００６およびＣＩ０１０を、アラビノース誘導性プロモーターの制御下にあるＬａｍｂｄａ−ｒｅｄ組換え系（エキソ、ベータ、ｇａｍ遺伝子）およびＩＰＴＧ誘導性プロモーターの制御下にあるＣａｓ９をコードするプラスミドで形質転換した。得られた形質転換体にてＲｅｄ組換えおよびＣａｓ９系を誘導し、菌株をエレクトロポレーション用に調製した。続いて、ノックアウトカセットおよびプラスミドにコードされた選択ｇＲＮＡを、コンピテント細胞に形質転換した。Ｃａｓ９プラスミドおよびｇＲＮＡプラスミドの両方に選択的な抗生物質にプレーティングした後、図３に示されるように、スクリーニングされた１０個のコロニーのうちの７個が、意図したノックアウト突然変異を示した。
【０１６０】
（実施例４）
候補分子のｉｎ  ｖｉｔｒｏ表現型決定
種々の突然変異体のニトロゲナーゼ生合成および活性に対する外来性窒素の影響を評価した。アセチレン還元アッセイ（ＡＲＡ）（Ｔｅｍｍｅら、２０１２年；１０９巻（１８号）：７０８５〜７０９０頁）を使用して、純粋培養条件でのニトロゲナーゼ活性を測定した。菌株を、気密試験チューブ内で増殖させ、アセチレンのエチレンへの還元を、Ａｇｉｌｅｎｔ６８９０ガスクロマトグラフで定量化した。０〜１０ｍＭグルタミンで補充された窒素固定培地で増殖させた候補微生物および対応する候補突然変異体のＡＲＡ活性は、図４Ａ〜Ｂおよび図１０Ａ〜Ｃに示されている。
【０１６１】
嫌気培養条件下で、様々なグルタミンおよびアンモニア濃度を試験して、窒素固定活性に対する影響を定量化した。野生型細胞では、活性は、グルタミン濃度が増加すると共に急速に減少した。しかしながら、一連の初期ノックアウト突然変異では、１種類の突然変異が、そうでなければ野生型では活性を遮断することになるグルタミン濃度下で窒素固定遺伝子の発現を可能にすることが確認された。このプロファイルは、図４Ｃで見られるように、４つの異なる種のジアゾ栄養生物で生成された。加えて、同定された遺伝子部分を使用して調節ネットワークを書き換えることにより、窒素固定活動レベルが予想通りに調整された。これは、図４Ｂで見られ、この図には、菌株ＣＭ０２３、ＣＭ０２１、ＣＭ０１５、およびＣＩ００６が例示されている。菌株ＣＭ０２３は、進化菌株ｌｏｗであり、菌株ＣＭ０２１は進化菌株ｈｉｇｈであり、菌株ＣＭ０１５は、進化菌株ｍｉｄであり、菌株ＣＩ００６は、野生型（菌株２）である。培養上清に排出されたアンモニアを、酵素に基づくアッセイ（ＭＥＧＡＺＹＭＥ）を使用して試験した。このアッセイでは、消費されたＮＡＤＰＨの量を、３４０ｎｍの吸光度で測定した。１Ｅ９  ＣＦＵ／ｍｌの開始密度を有する無窒素嫌気性環境で増殖させた細菌培養物でアッセイを実施した。図４Ｄで見られるように、６つの進化菌株のパネルのうち１つの菌株が、４８時間の期間の経過にわたって、最大１００μＭのアンモニアを排出した。さらに、図１１で見られるように、二重突然変異体は、それが由来した単一突然変異体よりも高いアンモニア排出を示した。これは、その生理学的な必要性よりも過剰なアンモニアを産生する微生物の能力を実証するものである。
【０１６２】
純粋培養の転写プロファイリング
ＣＩ００６の転写活性を、Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓプラットフォームを使用して測定した。細胞を無窒素培地で増殖させ、４時間インキュベーションした後、１０Ｅ８個の細胞を収集した。全ＲＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙキットを使用して抽出した。精製したＲＮＡを、図５に示されているように、プローブハイブリダイゼーションおよびデジタルアナライザ分析のために、Ｃｏｒｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、パロアルト、ＣＡに提出した。
【０１６３】
（実施例５）
候補微生物の植物内表現型決定
候補微生物による植物のコロニー化
候補微生物による所望の宿主植物のコロニー化を、短期間植物成長実験により定量化した。プラスミドまたはＴｎ５組込みＲＦＰ発現カセットのいずれかに由来するＲＦＰを発現する菌株をトウモロコシ植物に接種した。植物を滅菌砂培地および非滅菌泥炭培地の両方で栽培し、発芽３日後に１ｍＬの細胞培養を、出現しつつある植物子葉鞘に直接ピペットすることにより接種を実施した。適切な抗生物質を含有する溶液で植物を灌水することによりプラスミドを維持した。３週間後に、植物根を収集し、滅菌水で３回すすいで目に見える土壌を除去し、２つの試料に分割した。１つの根試料を蛍光顕微鏡で分析して、候補微生物の局在化パターンを同定した。図６に示されているように、顕微鏡検査は、長さが１０ｍｍの最も微細な完全な植物根で実施した。
【０１６４】
コロニー化を評価するための第２の定量化法を開発した。内部寄生菌を接種した植物の根に由来する全ＤＮＡ調製物で定量ＰＣＲアッセイを実施した。トウモロコシ（Ｄｅｋａｌｂ  ＤＫＣ−６６−４０）の種子を、２．５インチ×２．５インチ×１０インチの鉢の事前にオートクレーブした砂で発芽させた。植栽した１日後に、１ｍｌの内部寄生菌一晩培養物（ＳＯＢ培地）で、種子が位置していたまさしくそのスポットを浸した。この一晩培養物の１ｍＬは、約１０＾９ｃｆｕとほぼ等しく、使用されている菌株に応じて互いに３倍以内で変動する。各実生を、２．５ｍＭまたは０．２５ｍＭのいずれかの硝酸アンモニウムで補充した５０ｍＬ改変ホーグランド溶液で週３回施肥した。植栽した４週間後、ＤＮＡを抽出するために根試料を収集した。加圧水噴霧を使用して土壌残屑を洗い流した。その後、ＱＩＡＧＥＮ  Ｔｉｓｓｕｅｌｙｚｅｒを使用して、これら組織試料をホモジナイズしてから、推奨プロトコールに従ってＱＩＡｍｐ  ＤＮＡミニキット（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して、ＤＮＡを抽出した。内部寄生菌のゲノムの各々の遺伝子座に特異的であるように設計した（ＮＣＢＩのＰｒｉｍｅｒ  ＢＬＡＳＴを使用して）プライマーを使用し、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｍｘ３００５Ｐ  ＲＴ−ＰＣＲを使用して、これらＤＮＡ抽出物のｑＰＣＲアッセイを実施した。内部寄生菌のゲノムコピーの存在を定量化した。内部寄生菌の同一性をさらに確認するために、ＰＣＲ増幅産物を配列決定し、正しい配列を有することを確認する。候補微生物に由来する菌株ＣＩ００６およびＣＩ００８のコロニー化プロファイルの要約は、表５に提示されている。菌株ＣＩ００８において、１０＾７×ｃｆｕ／根ｇ  ｆｗと高いコロニー化率が実証された。
【表５】
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【０１６５】
植物内ＲＮＡプロファイリング
ｎｉｆ遺伝子の転写を測定することにより、植物内でのｎｉｆ経路成分の生合成を推定した。ＣＩ００６接種植物の根植物組織から全ＲＮＡを得た（以前に記載されているような植栽方法）。ＲＮＡ抽出は、推奨プロトコールに従ってＲＮＥａｓｙミニキット（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して実施した。その後、これら植物組織に由来する全ＲＮＡを、菌株ＣＩ００６のゲノムのｎｉｆ遺伝子に特異的なプローブを使用したＮａｎｏｓｔｒｉｎｇ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓキット（ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を使用してアッセイした。植物内でのｎｉｆ遺伝子発現のデータは、表６に要約されている。ｎｉｆＨ遺伝子発現は、ＣＭ０１３菌株によって接種された植物では検出されたが、ｎｉｆＨ発現は、ＣＩ００６接種植物では検出されなかった。菌株ＣＭ０１３は、ｎｉｆＬ遺伝子がノックアウトされている菌株ＣＩ００６の誘導体である。
【０１６６】
ＣＭ０１１の高度に発現された遺伝子を、１００万キロ塩基当たりの転写物（ＴＰＭ）で格付けし、施肥条件下の植物内で測定した。これら高度に発現された遺伝子の幾つかの発現を制御するプロモーターを、標的とする窒素固定および同化遺伝子座への相同組換え用の鋳型として使用した。温室栽培したＣＭ０１１接種植物に由来するＲＮＡ試料を抽出し、Ｒｉｂｏ−Ｚｅｒｏキットを使用してｒＲＮＡを除去し、ＩｌｌｕｍｉｎａのＴｒｕｓｅｑプラットフォームを使用して配列決定し、ＣＭ０１１のゲノムに対してマッピングし戻した。ＣＭ０１１に由来する高度に発現された遺伝子は、表７に列挙されている。
【表６】
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【表７−１】
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【表７−２】
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【０１６７】
１５Ｎアッセイ
固定を実証するための主要な方法では、１４Ｎに対して一定の割合で大気中に見出される窒素同位体１５Ｎが使用される。富化レベルの１５Ｎを有する肥料または大気のいずれかを補充することにより、１５Ｎ２ガスで補充された大気から固定された１５Ｎの増加量に比例した固定か（Ｙｏｓｈｉｄａ、１９８０年）、または植物組織中で大気Ｎ２ガスにより富化肥料が希釈されることによる反比例した固定（Ｉｎｉｇｕｅｚ、２００４年）のいずれかが観察され得る。希釈法では、植物成長の経過にわたって累積的な固定窒素を観察することができるが、１５Ｎ２ガス法では、植物を閉鎖大気中で栽培することができる短期間に生じる固定の測定（比率測定）に限定される。したがって、ガス法は、特異性に優れているが（大気中の割合を超える植物におけるあらゆる１５Ｎ２レベル上昇を、一義的に固定に帰属させることができるため）、累積的な活性を示すことができない。
【０１６８】
両タイプのアッセイを実施して、野生型および未接種トウモロコシ植物と比べた改良菌株の固定活性を測定し、改良菌株の幾つかで植物内で固定率の上昇が観察された（図１２、図１４Ａ、および図１４Ｂ）。これらアッセイは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで観察された菌株の活性が、ｉｎ  ｖｉｖｏ結果に変換されることを実証する手段となる。さらに、これらアッセイにより、菌株活性に対する肥料の影響を測定することが可能になり、農業設定での好適な機能性が示唆される。Ｓｅｔａｒｉａ属植物に野生型および改良菌株を接種した場合も同様の結果が観察された（図１３）。図１４Ａ〜１４Ｃに示されている植物内固定活性は、トランスクリプトームデータによりさらに支持されている。進化した菌株は、野生型相当物と比べてｎｉｆＨ転写レベルの増加を示す。さらに、植物内の微生物由来窒素レベルは、植物ベースによる植物でのコロニー化レベルとも相関している。これらの結果（図１２、図１３、図１４Ａ〜１４Ｃ、図１５Ａ、および図１５Ｂ）は、微生物が、ｎｉｆ遺伝子クラスターの調節向上により植物組織で見られた大気由来窒素増加の理由である可能性が高いという仮説を支持している。固定を直接測定することに加えて、植物に改良菌株を接種した影響を、窒素ストレス植物バイオマスアッセイで測定した。植物バイオマスは、植物との多くの考え得る微生物相互作用と関連する場合があり、固定窒素の追加は、窒素が制限されると植物表現型に影響を及ぼすことになると予想されるであろう。接種した植物を、窒素の完全な非存在下で栽培した。未接種対照と比べて、接種した植物の葉面積、苗条の生重量および乾燥重量、ならびに根の生重量および乾燥重量の著しい増加が観察された（図１４Ｃ）。こうした差は、全てを窒素固定だけに帰することはできないが、改良菌株が活発に窒素を植物に供給しているという結論を支持している。トウモロコシおよびＳｅｔａｒｉａ属植物を、上述のように栽培および接種した。１．２％の１５Ｎを含む肥料を、灌水により植物に定期的に供給した。微生物による窒素固定を、植物組織の１５Ｎレベルを測定することにより定量化した。第４の葉組織を、植栽の４週間後に収集および乾燥した。乾燥した葉試料を、ビーズ（ＱＩＡＧＥＮ  Ｔｉｓｓｕｅｌｙｚｅｒ）を使用してホモジナイズし、ＩＲＭＳ用のスズカプセル（ＭＢＬ  Ｓｔａｂｌｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ａｔ  Ｔｈｅ  Ｅｃｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｃｅｎｔｅｒ、ウッズホール、ＭＡ）に分取した。大気由来窒素（ＮＤＦＡ）を算出し、ＣＩ０５０およびＣＭ００２による窒素産生は、図７に示されている。
【０１６９】
植物ホルモン産生アッセイ
ドワーフトマト（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ栽培品種「Ｍｉｃｒｏ−Ｔｏｍ」は、果実成熟に対するインドール−３−酢酸の影響をｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいて研究するために以前に使用されている（Ｃｏｈｅｎ、１９９６年；Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｈｏｒｔｉｃ  Ｓｃｉ、１２１巻：５２０〜５２４頁）。候補微生物による植物ホルモン産生および分泌を評価するために、未熟Ｍｉｃｒｏ−Ｔｏｍ果実を使用した、プレートに基づくスクリーニングアッセイを開発した。図８に示されているように、ウェルを寒天培地で満たして固化させ、１０ｕＬの一晩微生物培養物を寒天表面にスポット播種することにより、１２ウェル組織培養試験プレートを調製した。増加量のジベレリン酸（ＧＡ）を含有する寒天を有するが、細菌培養物を有していないウェルを陽性対照および標準として使用した。成長中のＭｉｃｒｏ−Ｔｏｍ植物から離脱させた開花１日後の花を、細菌スポット培養の地点の寒天に、茎を先にして挿入した。これら花を２〜３週間モニターした後、果実を回収して計量した。図９に示されているように、幾つかの重複測定にわたって植物果実質量が増加したことは、接種した微生物により植物ホルモンが産生されたことを示している。
【０１７０】
（実施例６）
循環的宿主−微生物進化
トウモロコシ植物にＣＭ０１３を接種し、およそＶ５成長段階へと４週間栽培した。１５Ｎ分析により微生物源に由来する窒素蓄積の向上を実証したものを引き抜き、加圧水を使用して根を洗浄し、バルク土壌を除去した。根の０．２５ｇ区画を切断し、ＰＢＳ溶液ですすいで、微細土壌粒子および非付着微生物を除去した。組織試料を、ＱＩＡＧＥＮ  ＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒ  ＩＩで３ｍｍ鋼ビーズを使用してホモジナイズした。ホモジネートを希釈し、ＳＯＢ寒天培地にプレーティングした。単一コロニーを液体培地に再懸濁し、１６ｓ  ｒＤＮＡおよび接種菌株に固有な突然変異のＰＣＲ分析にかけた。微生物単離、突然変異誘発、接種、および再単離のプロセスを反復して繰り返して、微生物形質、植物形質、および微生物のコロニー化能力を向上させることができる。
【０１７１】
（実施例７）
地理学的特徴にわたる適合性
改良微生物が接種した植物でコロニー化する能力は、圃場条件下での植物の成功に重要である。記載されている単離方法は、トウモロコシ等の作物植物と緊密な関係性を有し得る土壌微生物から選択するように設計されているが、多くの菌株は、様々な植物遺伝子型、環境、土壌タイプ、または接種条件にわたって効果的にコロニー化することができない。コロニー化は、微生物菌株と宿主植物との様々な相互作用を必要とする複雑なプロセスであるため、コロニー化可能能力をスクリーニングすることは、さらなる開発のための優先菌株を選択するための中心的な方法になっている。コロニー化を評価するための初期努力では、菌株の蛍光タグ化が使用され、これは有効ではあるが、時間がかかり、菌株ベース毎に測定可能ではなかった。コロニー化活性は、簡単には向上させ難いため、天然コロニー菌である菌株から有望な産物候補を選択することが是非とも必要である。
【０１７２】
ｑＰＣＲと、群生試料で菌株特異的であるように設計されたプライマーとを使用して、任意の所与の宿主植物における野生型菌株のロバストなコロニー化を試験するためのアッセイを設計した。このアッセイは、トウモロコシ組織試料に由来する微生物のコロニー化率を迅速に測定することを目的とする。蛍光顕微鏡法およびプレートに基づく技法を使用してコロニー化の可能性があると評価した菌株を使用した初期試験は、ｑＰＣＲ手法が、定量的かつ測定可能であるだろうということを示した。
【０１７３】
典型的なアッセイを、以下のように実施する：ほとんどがトウモロコシおよび小麦の品種である植物を、１菌株当たり６つの重複試料を用いて、鉢植え用混合泥炭で温室栽培する。植栽した４日後または５日後に、０．６〜１．０のＯＤ５９０（およそ５Ｅ＋０８  ＣＦＵ／ｍＬ）に希釈した細菌の初期定常期培養の１ｍＬ液を、出現しつつある子葉鞘にピペットした。植物を水道水のみで灌水し、４週間栽培してから試料採取した。試料採取時には、植物を引き抜き、根を入念に洗浄して、ほとんどの残留泥炭を除去する。洗浄した根の試料を切除およびホモジナイズして、植物細胞残屑および関連細菌細胞のスラリーを作成する。本発明者らは、植物とｑＰＣＲの鋳型として使用するための細菌ＤＮＡとの混合物を効果的に産生するハイスループットＤＮＡ抽出プロトコールを開発した。細菌細胞スパイクイン実験に基づくこのＤＮＡ抽出プロセスは、根の生重量に対して定量化した細菌ＤＮＡ試料を提供する。各菌株を、Ｐｒｉｍｅｒ  ＢＬＡＳＴ（Ｙｅ、２０１２年）を使用して設計した菌株特異的プライマーを使用して評価し、未接種植物のバックグラウンド増幅と比較した。一部のプライマーは、未接種植物でオフターゲット増幅を示すため、コロニー化は、バックグラウンドレベルと比較した正しい産物の増幅の存在または増幅上昇のいずれかにより決定した。
【０１７４】
このアッセイを使用して、微生物製品の適合性を様々な土壌地理学的特徴にわたって測定した。圃場土壌特性および圃場条件は、微生物製品の効果に多大な影響を及ぼす場合がある。土壌ｐＨ、保水容量、および競合微生物は、接種菌生存およびコロニー化能力に影響を及ぼし得る土壌要因のほんの少数の例である。コロニー化アッセイは、植物生育培地としてカリフォルニアの農業圃場から試料採取した３つの多様な土壌タイプを使用して実施した（図１６Ａ）。中程度の接種密度を使用して、現実的な農業条件に近似させた。菌株５は、３週間以内に、全ての植物で１Ｅ＋０６〜１Ｅ＋０７  ＣＦＵ／ｇ  ＦＷにてコロニー化した。７週間の植物栽培後、菌株１の進化型は、全ての土壌タイプで高いコロニー化率（１Ｅ＋０６  ＣＦＵ／ｇ  ＦＷ）を示した。（図１６Ｂ）。
【０１７５】
加えて、複雑な圃場条件でのコロニー化を評価するために、２０１５年６月にサンルイスオビスポ市にて１エーカー圃場試験を開始して、飼料用トウモロコシの２つの品種における野生型菌株の７つの影響およびコロニー化を評価した。この試験の農耕学的設計および執行は、圃場研究受託会社であるＰａｃｉｆｉｃ  Ａｇ  Ｒｅｓｅａｒｃｈが実施した。接種は、接種法実験で試験したものと同じ泥炭培養種子コーティング技法を用いた。成長季節の期間中に、植物試料を収集して、根および茎内部のコロニー化を評価した。植栽の４週間または８週間後には各処理の３つの重複プロットから、１６週目に収穫する直前には各処理の６つの重複プロット全てから、試料を収集した。１２週目に、菌株１および菌株２で接種した処理の６つ全ての重複プロットならびに未処理対照から、追加の試料を収集した。ｑＰＣＲおよび菌株特異的プライマーを用いた他のコロニー化アッセイと同様に、洗浄した根の１グラム生重量当たりの細胞数を評価した。２つの菌株、菌株１および菌株２は、一貫して広範な根コロニー化を示し、１２週目でピークに達したが、その後急激に低下した（図１６Ｃ）。菌株２の存在数は、菌株１よりも１桁少ないように考えられたが、植物によっては数がより一貫していることが見出された。茎内部で効果的にコロニー化する菌株はなかったと考えられる。ｑＰＣＲコロニー化データを裏付けるものとして、プレーティングおよび１６Ｓ配列決定を使用して両菌株を根試料から再単離して、配列が一致する単離菌の同定に成功した。
【０１７６】
本発明を記載する状況（特に、以下の特許請求の範囲の状況）での用語「ａ」および「ａｎ」および「ｔｈｅ」および類似の参照対象の使用は、本明細書に別様の指示がない限り、または状況と明らかに矛盾しない限り、単数および複数を両方とも包含すると解釈されるべきである。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、および「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」は、別様の指示がない限り、非限定的用語として解釈されるべきである（つまり、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）が、限定されない」ことを意味する）。本明細書における数値範囲の記載は、本明細書で別様の指示がない限り、各別個の数値がその範囲内に入ることを個々に参照するための簡略的な方法としての役目を果たすことが意図されているに過ぎず、各別個の数値は、それが本明細書にあたかも個々に記載されているが如く、本明細書に組み込まれる。例えば、範囲１０〜１５が開示されている場合、１１、１２、１３、および１４も開示されている。本明細書に記載されている方法は全て、本明細書に別様の指示がない限り、または状況と明らかに矛盾しない限り、任意の好適な順序で実施することができる。本明細書で提供されているありとあらゆる例または例示的な文言（例えば、「等」）の使用は、本発明をより良好に説明するためのものに過ぎず、別様に特許請求されない限り、本発明の範囲を限定しない。本明細書中の文言は、任意の特許請求されていない要素を、本発明の実施にとって不可欠なものであることを示すものとして解釈されるべきでない。
【０１７７】
本発明の好ましい実施形態が、本明細書に表示および記載されているが、そのような実施形態は例示のために提供されているに過ぎないことは、当業者には明白であろう。当業者であれば、本発明から逸脱せずに多数の改変、変更、および置換を起想するであろう。本発明の実施には、本明細書に記載されている本発明の実施形態の種々の代替形態を用いることができることが理解されるべきである。本発明の範囲を規定するのは、以下の特許請求の範囲であり、それら請求項の範囲内にある方法および構造ならびにそれらの等価物が、それにより包含されることが意図されている。
【０１７８】
【表３Ａ】
0006796126.tif 000009
【０１７９】
【表３Ｂ】
0006796126.tif 000010
【０１８０】
【表３Ｃ−１】
0006796126.tif 000011
【表３Ｃ−２】
0006796126.tif 000012
【表３Ｃ−３】
0006796126.tif 000013
【表３Ｃ−４】
0006796126.tif 000014
【表３Ｃ−５】
0006796126.tif 000015
【表３Ｃ−６】
0006796126.tif 000016
【表３Ｃ−７】
0006796126.tif 000017
【表３Ｃ−８】
0006796126.tif 000018
【表３Ｃ−９】
0006796126.tif 000019
【表３Ｃ−１０】
0006796126.tif 000020
【０１８１】
【表Ａ−１】
0006796126.tif 000021
【表Ａ−２】
0006796126.tif 000022
【表Ａ−３】
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【表Ａ−４】
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【表Ａ−５】
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【表Ａ−６】
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【表Ａ−７】
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【表Ａ−８】
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【表Ａ−９】
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【表Ａ−１０】
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【表Ａ−１１】
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【表Ａ−１２】
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【表Ａ−１３】
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【表Ａ−１４】
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【表Ａ−１５】
0006796126.tif 000035
【表Ａ−１６】
0006796126.tif 000036
【表Ａ−１７】
0006796126.tif 000037
【表Ｂ】
0006796126.tif 000038
特許請求の範囲が添付されるが、本明細書に記載の開示は、以下の項によっても規定される。
１．１つまたは複数の細菌を産生するための方法であって、
（ａ）第１の植物の組織または土壌から細菌を単離するステップ、
（ｂ）前記細菌のうちの１つまたは複数に遺伝子変異を導入して、１つまたは複数の変異体細菌を産生するステップ、
（ｃ）複数の植物を前記変異体細菌に曝露するステップ、
（ｄ）前記複数の植物の１つの組織または土壌から細菌を単離するステップであって、前記細菌を単離した前記植物が、前記複数の植物中の他の植物と比較して向上された形質を有する、ステップ、および
（ｅ）ステップ（ｄ）で単離された細菌を用いてステップ（ｂ）〜（ｄ）を繰り返すステップ
を含む方法。
２．前記向上された形質が、前記細菌を単離した植物における窒素固定増強である、第１項に記載の方法。
３．前記遺伝子変異が、ｎｉｆＡ、ｎｉｆＬ、ｎｔｒＢ、ｎｔｒＣ、ｇｌｎＡ、ｇｌｎＢ、ｇｌｎＫ、ｄｒａＴ、ａｍｔＢ、ｇｌｎＤ、ｇｌｎＥ、ｎｉｆＪ、ｎｉｆＨ、ｎｉｆＤ、ｎｉｆＫ、ｎｉｆＹ、ｎｉｆＥ、ｎｉｆＮ、ｎｉｆＵ、ｎｉｆＳ、ｎｉｆＶ、ｎｉｆＷ、ｎｉｆＺ、ｎｉｆＭ、ｎｉｆＦ、ｎｉｆＢ、およびｎｉｆＱからなる群から選択される遺伝子の変異である、第１項に記載の方法。
４．前記遺伝子変異が、グルタミン合成酵素、グルタミナーゼ、グルタミン合成酵素アデニリルトランスフェラーゼ、転写活性化因子、抗転写活性化因子、ピルビン酸フラボドキシンオキシドレダクターゼ、フラボドキシン、またはＮＡＤ＋二窒素レダクターゼＡＤＰ−Ｄ−リボシルトランスフェラーゼからなる群から選択される機能性を有するタンパク質をコードする遺伝子の変異である、第１項に記載の方法。
５．前記遺伝子変異が、ＮｉｆＡもしくはグルタミナーゼの発現もしくは活性の増加；ＮｉｆＬ、ＮｔｒＢ、グルタミン合成酵素、ＧｌｎＢ、ＧｌｎＫ、ＤｒａＴ、ＡｍｔＢの発現もしくは活性の減少；ＧｌｎＥのアデニリル除去活性の減少；またはＧｌｎＤのウリジリル除去活性の減少のうちの１つまたは複数をもたらす突然変異である、第１項に記載の方法。
６．前記遺伝子変異が、ノックアウト突然変異である、第１項に記載の方法。
７．前記遺伝子変異が、タンパク質ドメインの活性の排除または消失をもたらす、第１項に記載の方法。
８．前記遺伝子変異が、標的遺伝子の調節配列を変更または消失させる、第１項に記載の方法。
９．前記遺伝子変異が、異種性調節配列の挿入を含む、第１項に記載の方法。
１０．前記遺伝子変異が、前記遺伝子変異が導入されている前記細菌に対応する細菌種または属のゲノム内に見出される調節配列の挿入を含む、第１項に記載の方法。
１１．前記調節配列が、細菌培養物のまたは植物組織内の遺伝子の発現レベルに基づいて選択される、第１０項に記載の方法。
１２．前記遺伝子変異が、化学的突然変異誘発により生成される、第１項に記載の方法。
１３．ステップ（ｃ）が、前記植物を、生物ストレス因子または非生物ストレス因子に曝露することをさらに含む、第１項に記載の方法。
１４．ステップ（ｂ）〜（ｄ）を１回または複数回繰り返した後で単離された細菌が、前記第１の植物と同じタイプの第２の植物における窒素の１％またはそれよりも多くを産生する、第２項に記載の方法。
１５．ステップ（ｂ）〜（ｄ）を１回または複数回繰り返した後で単離された細菌が、前記第１の植物から単離された細菌と比較して、少なくとも２倍増の窒素固定を示す、第２項に記載の方法。
１６．前記第２の植物が、グルタミン、アンモニア、または窒素の他の化学的供給源で補充された肥料の存在下で栽培される、第１４項に記載の方法。
１７．前記第１の植物が、農業作物植物である、第１項に記載の方法。
１８．前記農業作物植物が、大麦、米、トウモロコシ、小麦、ソルガム、スイートコーン、サトウキビ、タマネギ、トマト、イチゴ、またはアスパラガスから選択される、第１７項に記載の方法。
１９．前記複数の植物における前記第１または植物が、モデル植物である、第１項に記載の方法。
２０．前記モデル植物が、Ｓｅｔａｒｉａ属、Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ属、またはＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ属から選択される、第１９項に記載の方法。
２１．前記遺伝子変異が、標的部位に特異的に導入された所定の遺伝子変異である、第１項に記載の方法。
２２．前記遺伝子変異が、前記標的部位内のランダム突然変異である、第１項に記載の方法。
２３．ステップ（ａ）が、単離された細菌の遺伝子分析を実施することをさらに含む、第１項に記載の方法。
２４．ステップ（ｂ）が、前記遺伝子変異を含む細菌を富化するように選択圧を加えることをさらに含む、第１項に記載の方法。
２５．前記選択圧が、標的部位に導入された前記遺伝子変異が欠如したゲノムを切断し、切断が、前記標的部位の１００ヌクレオチド内で生じることを含む、第２４項に記載の方法。
２６．前記選択圧を生き残った細菌を単離することをさらに含む、第２４項に記載の方法。
２７．切断が、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、ＴＡＬＥヌクレアーゼ、またはメガヌクレアーゼからなる群から選択される部位特異的ヌクレアーゼにより指示される、第２５項に記載の方法。
２８．前記部位特異的ヌクレアーゼが、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼである、第２７項に記載の方法。
２９．前記遺伝子変異が、１つまたは複数のヌクレオチドの挿入または欠失である、第１項に記載の方法。
３０．ステップ（ｂ）〜（ｄ）を１回または複数回繰り返した後で単離された細菌が、内部寄生性、着生性、または根圏性である、第１項に記載の方法。
３１．ステップ（ｂ）〜（ｄ）を１回または複数回繰り返した後で単離された細菌が、複数の異なる細菌分類群を含む、第１項に記載の方法。
３２．前記細菌が、植物組織から単離される、第１項に記載の方法。
３３．ステップ（ａ）での細菌単離が、前記第１の植物の種子から細菌を単離することを含む、第１項に記載の方法。
３４．植物における窒素固定を増加させるための方法であって、前記植物を、窒素固定を調節する１つまたは複数の遺伝子に導入された１つまたは複数の遺伝子変異を含む細菌に曝露することを含み、前記細菌が、前記植物における窒素の１％またはそれよりも多くを産生する、方法。
３５．前記細菌が、前記植物における窒素の５％またはそれよりも多くを産生する、第３４項に記載の方法。
３６．前記細菌が、前記植物における窒素の１０％またはそれよりも多くを産生する、第３４項に記載の方法。
３７．前記細菌が、グルタミン、アンモニア、または補充窒素の他の化学的供給源で補充された肥料の存在下で前記窒素を産生する、第３４項に記載の方法。
３８．前記遺伝子変異が、ｎｉｆＡ、ｎｉｆＬ、ｎｔｒＢ、ｎｔｒＣ、グルタミン合成酵素、ｇｌｎＡ、ｇｌｎＢ、ｇｌｎＫ、ｄｒａＴ、ａｍｔＢ、グルタミナーゼ、ｇｌｎＤ、ｇｌｎＥ、ｎｉｆＪ、ｎｉｆＨ、ｎｉｆＤ、ｎｉｆＫ、ｎｉｆＹ、ｎｉｆＥ、ｎｉｆＮ、ｎｉｆＵ、ｎｉｆＳ、ｎｉｆＶ、ｎｉｆＷ、ｎｉｆＺ、ｎｉｆＭ、ｎｉｆＦ、ｎｉｆＢ、およびｎｉｆＱからなる群から選択される遺伝子の変異である、第３４項に記載の方法。
３９．前記遺伝子変異が、ＮｉｆＡもしくはグルタミナーゼの発現もしくは活性の増加；ＮｉｆＬ、ＮｔｒＢ、グルタミン合成酵素、ＧｌｎＢ、ＧｌｎＫ、ＤｒａＴ、ＡｍｔＢの発現もしくは活性の減少；ＧｌｎＥのアデニリル除去活性の減少；またはＧｌｎＤのウリジリル除去活性の減少のうちの１つまたは複数をもたらす突然変異である、第３４項に記載の方法。
４０．前記遺伝子変異が、（ａ）ノックアウト突然変異であるか、（Ｂ）標的遺伝子の調節配列を変更もしくは消失させるか、または（ｃ）異種性調節配列の挿入を含む、第３４項に記載の方法。
４１．前記細菌が、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ属である、第３４項に記載の方法。
４２．前記細菌が、Ｒａｈｎｅｌｌａ属である、第３４項に記載の方法。
４３．前記細菌が、内部寄生性、着生性、または根圏性である、第３４項に記載の方法。
４４．前記細菌が、複数の異なる細菌分類群を含む、第３４項に記載の方法。
４５．前記植物が、農業作物植物である、第３４項に記載の方法。
４６．前記植物が、非マメ科植物である、第３４から４５項のいずれか１項に記載の方法。
４７．前記農業作物植物が、ソルガム、キャノーラ、トマト、イチゴ、大麦、米、トウモロコシ、および小麦から選択される、第４５項に記載の方法。
４８．前記植物が、遺伝子改変生物（ＧＭＯ）である、第４５項に記載の方法。
４９．前記植物が、遺伝子改変生物（ＧＭＯ）ではない、第４５項に記載の方法。
５０．前記植物が、効率的な窒素使用のために遺伝子操作されているかまたは品種改良されている、第４５項に記載の方法。
５１．窒素固定を調節する１つまたは複数の遺伝子に導入された１つまたは複数の遺伝子変異を含む細菌を含み、前記細菌が、前記細菌の集団の存在下で栽培された植物における窒素の１％またはそれよりも多くを産生する、細菌集団。
５２．前記細菌が、グルタミン、アンモニア、または補充窒素の他の化学的供給源で補充された肥料の存在下で前記窒素を産生する、第５１項に記載の細菌集団。
５３．前記遺伝子変異が、ｎｉｆＡ、ｎｉｆＬ、ｎｔｒＢ、ｎｔｒＣ、グルタミン合成酵素、ｇｌｎＡ、ｇｌｎＢ、ｇｌｎＫ、ｄｒａＴ、ａｍｔＢ、グルタミナーゼ、ｇｌｎＤ、ｇｌｎＥ、ｎｉｆＪ、ｎｉｆＨ、ｎｉｆＤ、ｎｉｆＫ、ｎｉｆＹ、ｎｉｆＥ、ｎｉｆＮ、ｎｉｆＵ、ｎｉｆＳ、ｎｉｆＶ、ｎｉｆＷ、ｎｉｆＺ、ｎｉｆＭ、ｎｉｆＦ、ｎｉｆＢ、およびｎｉｆＱからなる群から選択される遺伝子の変異である、第５１項に記載の細菌集団。
５４．前記遺伝子変異が、ｎｉｆＡまたはグルタミナーゼの発現の増加；ｎｉｆＬ、ｎｔｒＢ、グルタミン合成酵素、ｇｌｎＢ、ｇｌｎＫ、ｄｒａＴ、ａｍｔＢの発現の減少；ＧｌｎＥのアデニリル除去活性の減少；またはＧｌｎＤのウリジリル除去活性の減少のうちの１つまたは複数をもたらす突然変異である、第５１項に記載の細菌集団。
５５．前記遺伝子変異が、（ａ）ノックアウト突然変異であるか、（Ｂ）標的遺伝子の調節配列を変更もしくは消失させるか、または（ｃ）異種性調節配列の挿入を含む、第５１項に記載の細菌集団。
５６．前記細菌が、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ属である、第５１項に記載の細菌集団。
５７．前記細菌が、Ｒａｈｎｅｌｌａ属である、第５１項に記載の細菌集団。
５８．前記細菌が、内部寄生性、着生性、または根圏性である、第５１項に記載の細菌集団。
５９．細菌が、複数の異なる細菌分類群を含む、第５１項に記載の細菌集団。
６０．第５１から５９項のいずれか１項に記載の細菌集団を含む組成物。
６１．種子の表面にコーティングされた前記細菌集団を含む、第６０項に記載の組成物。
６２．液剤または粉末として製剤化されている、第６０項に記載の組成物。
６３．ＰＴＡ−１２２２９３またはＰＴＡ−１２２２９４のＡＴＣＣ寄託番号を有する細菌。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
0006796126.tif 000047
【図８】
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【図９】
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【図１０−１】
0006796126.tif 000050
【図１０−２】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【配列表】
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