(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
調節可能な容積を有する細胞培養バッグ（３）を配置するためのトレイ（２）と、前記細胞培養バッグ（３）を覆い、加熱機能を備えている蓋（４）と、灌流ユニット（５、６）と、細胞ローディングユニット（８）と、自動化された細胞培養物のサンプリングのためのユニットとを備えており、単一の制御ユニットによって制御される細胞培養のためのバイオリアクタシステム（１）。
【請求項２】
前記トレイ（２）は、可動であり、静置細胞培養ならびに所望のｒｐｍでの振とう細胞培養を可能にする、請求項１に記載のバイオリアクタシステム（１）。
【請求項３】
２つ〜５つなど、いくつかのトレイ（２）が存在し、当該バイオリアクタシステム（１）上に垂直方向に積み重ねられる、請求項１または２に記載のバイオリアクタシステム（１）。
【請求項４】
前記細胞培養バッグ（３）の前記容積を、５０ｍＬから３０００ｍＬへと増加させることができる、請求項１乃至３のいずれか１項に記載のバイオリアクタシステム（１）。
【請求項５】
前記蓋（４）の上部の内側に、加熱素子が設けられている、請求項１乃至４のいずれか１項に記載のバイオリアクタシステム（１）。
【請求項６】
前記灌流ユニットは、培地供給バッグ（５）と、廃棄物バッグ（６）と、前記細胞バッグ（３）への接続のためのそれぞれの導管と、前記培地を前記バッグへと駆動するポンプと、前記バッグから廃棄物を駆動するポンプとを備える、請求項１乃至５のいずれか１項に記載のバイオリアクタシステム（１）。
【請求項７】
可動であり、着脱式カート（７）を備えている、請求項１乃至６のいずれか１項に記載のバイオリアクタシステム（１）。
【請求項８】
前記細胞ローディングユニット（８）は、システムの全重量を引き受ける圧縮式のロードセルが組み込まれたプラットフォームを備える、請求項１乃至７のいずれか１項に記載のバイオリアクタシステム（１）。
【請求項９】
前記トレイ（２）は、バーコードリーダを備え、前記細胞バッグ（３）は、バーコードを備える、請求項１乃至８のいずれか１項に記載のバイオリアクタシステム（１）。
【請求項１０】
請求項１乃至９に記載の複数のバイオリアクタシステム（１）が、垂直方向に互いに積み重ねられている、バイオリアクタシステム。
【請求項１１】
前記複数のバイオリアクタシステム（１）は、パーソナルコンピュータまたはモバイル機器からの遠隔監視および制御の柔軟性を伴って、単一の制御ユニットによって制御される、請求項１０に記載のバイオリアクタシステム（１）。
【請求項１２】
細胞を培養するための方法であって、
出発細胞培養物を、細胞培養バッグ（３）の容積を５０〜５００ｍＬに設定し、培養物を３７℃へと加熱して、静置状態の請求項１乃至１１のいずれか１項に記載のバイオリアクタシステムにおいて培養し、次いで、１〜６日後、好ましくは３〜４日後に、培養物のスケールアップのために、バッグの容積を１５００〜３０００ｍＬへと拡大して、室温において揺動運動のもとで培養を続けることを含み、
出発およびスケールアップの両方の培養が、同一の細胞培養バッグ（３）にて同一のバイオリアクタシステム（１）において実行される、方法。
【請求項１３】
前記出発細胞培養物は、幹細胞、免疫由来細胞、腫瘍浸潤細胞（ＴＩＬ）、または細胞療法に適した任意の他の細胞から選択される、請求項１２に記載の方法。 
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞培養のための新規なバイオリアクタシステムに関する。より具体的には、本発明は、いくつかの統合された機能を有し、小規模静置培養ならびにスケールアップ振とう培養を同じバイオリアクタにおいて可能にするコンパクトなバイオリアクタシステムに関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞療法は、生体内で治療効果を発揮する自己または同種異系細胞の投与を含むバイオテクノロジにおける新規であるが急速に拡大している分野である。同種造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）の場面における養子Ｔ細胞移入のプロトコルは、末梢血に含まれるＴ細胞が、ＨＳＣＴのレシピエントにおいて抗腫瘍活性および／または抗ウイルス活性を仲介できることを前提としている。
【０００３】
造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）は、通常は、骨髄、末梢血、または臍帯血から由来する多能性造血幹細胞の移植である。それは、自己（患者自身の幹細胞が使用される）または同種異系（幹細胞がドナーからもたらされる）であってよい。これは、多発性骨髄腫または白血病などの血液または骨髄の特定の癌を有する患者のために最も頻繁に行われる血液学の分野における医療処置である。これらの場合、レシピエントの免疫系は、通常は、移植の前に、放射線または化学療法で破壊される。
【０００４】
養子細胞移入は、細胞（最も一般的には、免疫由来の細胞）を、免疫学的機能および特性を新たなホストへと移すことを目的として、同じ患者へと戻し、あるいは新たなレシピエントであるホストへと移すことを指すことができる。可能であれば、自己細胞の使用が、移植物対ホストの拒絶反応（ｇｒａｆｔ−ｖｅｒｓｕｓ−ｈｏｓｔ  ｄｉｓｅａｓｅ）（ＧＶＨＤ）の問題を最小限に抑えることで、レシピエントの役に立つ。
【０００５】
Ｔ細胞に基づく療法においては、これらの細胞を、インターロイキン−２の免疫調節作用に大きく依存する細胞培養法を使用して体外で増殖させ、活性化状態で静脈注射にて患者へと多数回にわたって戻す。抗ＣＤ３抗体が、培養におけるＴ細胞の増殖を促進するために、一般的に使用される。インターロイキン−２１の研究が、体外で準備されるＴ細胞に基づく療法の有効性を高めるうえで、インターロイキン−２１も重要な役割を果たし得ることを示唆している。種々の疾患についての新たな治療の様式は、治療効果を達成するための幹細胞の移入である。臨床において、この手法は、ウイルスおよび癌に対する免疫を増強し、あるいはＩ型糖尿病または関節リウマチなどの自己免疫疾患の状況において寛容を促進するために、免疫促進または寛容原性細胞（多くの場合、リンパ球）のいずれかを患者へと移入させるために利用されている。養子療法において使用される細胞を、いくつかの目的を達成するために、組み換えＤＮＡ技術を使用して遺伝子操作することができる。Ｔ細胞養子療法の場合のこの一例は、細胞傷害性Ｔ細胞およびヘルパーＴ細胞の特異性を向け直すためのキメラ抗原レセプタまたはＣＡＲの添加である。
【０００６】
自己腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）または遺伝子的に向け直された末梢血単核細胞の養子移入は、メラノーマおよび結腸直腸癌を含む進行性固形腫瘍の患者ならびにＣＤ１９発現血液悪性腫瘍の患者を首尾よく治療するために使用されている。
【０００７】
腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）は、腫瘍に見られる白血球の一種である。ＴＩＬは、腫瘍細胞の死滅に寄与し、腫瘍におけるリンパ球の存在は、多くの場合に、良好な臨床転帰に関連する。皮膚癌の致死的な一形態である転移性黒色腫の患者を治療するために、いくつかの臨床試験がＴＩＬを用いて実施されている。ＴＩＬでの治療が行われた黒色腫患者の約半数において、５０％以上の腫瘍減少が観察された。一部の患者においては、ＴＩＬ治療後数年にわたって検出可能な腫瘍が残らない完全寛解が得られた。
【０００８】
結腸直腸癌などの消化管癌、および子宮頸癌などのヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）に関連する癌を治療するためのＴＩＬを用いた臨床試験が、進行中である。科学者らは、肺癌、卵巣癌、膀胱癌、乳癌などの他の腫瘍の治療にＴＩＬを使用することができるかどうかも、研究している。
【０００９】
養子Ｔ細胞療法は、ワクチン接種単独によって得られるよりも多数のＴ細胞を達成するために、腫瘍特異的Ｔ細胞の単離および体外での増殖を含む。次いで、腫瘍特異的Ｔ細胞は、癌を攻撃して死滅させることができるＴ細胞によって残りの腫瘍を圧倒する能力を癌患者の免疫系に付与する試みにおいて、癌患者へと注入される。腫瘍浸潤リンパ球またはＴＩＬの培養、或る特定のＴ細胞またはクローンの単離および増殖、ならびに腫瘍を強力に認識して攻撃するように操作されたＴ細胞の使用など、癌治療に使用される養子Ｔ細胞療法の多数の形態が存在する。
【００１０】
近年では、臨床試験において成功の兆しが見られており、Ｐｒｏｃｈｙｍａｌ（Ｏｓｉｒｉｓ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．）およびＣｈｏｎｄｒｏＣｅｌｅｃｔ（ＴｉＧｅｎｉｘ）などの製品が、規制の認可を得ている。しかしながら、多くの新しい細胞療法は、比較的少数の患者しか治療していないため、これらの製品を製造現場から診療所へと届けるための普遍的なシステムは、未だ確立されていない。普遍的なシステムが現実的であるかどうかを探求し、細胞療法の製品を診療所へと届けるための選択肢を探求することが、依然として必要である。また、この点に関して、業界が依然として直面している課題のうち、これらの治療法がより広く採用される場合に取り組む必要があるいくつかの課題が注目される。
【００１１】
細胞療法は、細胞の収集から患者への細胞の注入までの多数の必須の段階を含む。細胞治療のための細胞培養は、クリーンルーム環境で行われる。細胞培養およびクリーンルームには、クリーンルーム内の粒子のサイズおよび数、一度に処理される患者サンプルの数、ならびに各室および無菌環境ごとの機器数など、多数の守るべき規制が存在する。
【００１２】
現時点において利用することができる細胞培養のためのシステムは、スタンドアロンであり、大きなスペースを必要とし、複数の患者サンプルを同時に取り扱うことができない。細胞療法用の細胞培養のための現在の手順は、とりわけ小規模の細胞培養において、細胞培養物を汚染し、細胞増殖を損なう可能性がある人間の介入をかなり多く必要とする。したがって、より良好なバイオリアクタシステムの必要性が存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】国際公開第２０１２／１１５５８６号パンフレット
【発明の概要】
【００１４】
本発明は、サイズがコンパクトであり、いくつかの機器を制御する単一のシステムを備え、すなわちクリーンルームの空間を最適に利用するバイオリアクタを提供する。
【００１５】
したがって、第１の態様において、本発明は、調節可能な容積を有する細胞培養バッグ（３）を配置するためのトレイ（２）と、前記細胞培養バッグを覆い、加熱機能を備えている蓋（４）と、一体化された灌流ユニット（５、６）と、一体化された細胞ローディングユニット（８）と、自動化された細胞培養物のサンプリングのための一体化されたユニットとを備えており、単一の制御ユニットによって制御される細胞培養のためのバイオリアクタシステム（１）に関する。
【００１６】
トレイ（２）は、可動であり、静置細胞培養ならびに所望のｒｐｍでの振とう細胞培養を可能にする。随意により、２つ〜５つなど、いくつかのトレイ（２）が存在し、バイオリアクタシステム上に垂直方向に積み重ねられる。各トレイは、少なくとも１つの細胞培養バッグを保持することができる。随意により、トレイにバーコードリーダが設けられ、細胞バッグにバーコードが設けられる。
【００１７】
細胞培養バッグ（３）の容積を、例えば５０ｍＬから３０００ｍＬへと増加させることができる。これは、細胞バッグを所望の容積へと自動的にクランプすることによって行うことができる。クランプを、詳細の箇所において説明するとおり、蓋によって行うこともできる。
【００１８】
好ましい実施形態においては、蓋（４）の上部の内側に加熱素子が設けられる。これは、蓋がトレイの上へと閉じられて細胞培養バッグを囲むときに、インキュベータと同様の環境を形成する。
【００１９】
好ましくは、一体化された灌流ユニットは、培地供給バッグ（５）と、廃棄物バッグ（６）と、細胞バッグ（３）への接続のためのそれぞれの導管と、前記培地を前記バッグへと駆動するポンプと、前記バッグから廃棄物を駆動するポンプとを備える。一体化された細胞ローディングユニット（８）は、好ましくは、システムの全重量を引き受ける能力を有する圧縮式のロードセルが組み込まれたプラットフォームを備える。
【００２０】
一実施形態において、バイオリアクタシステムは、移動可能であり、コンパクトなバイオリアクタシステムの全体を移動可能にする着脱式カート（７）を備える。
【００２１】
さらなる実施形態においては、２つ〜５つなど、複数のバイオリアクタシステムが、垂直方向に互いに積み重ねられる。
【００２２】
これら複数のバイオリアクタシステムは、パーソナルコンピュータまたはモバイル機器からの遠隔監視および制御の柔軟性を伴って、単一の制御ユニットによって制御される。
【００２３】
第２の態様において、本発明は、細胞を培養するための方法であって、出発細胞培養物を、細胞培養バッグの容積を５０〜５００ｍＬに設定し、培養物を３７℃へと加熱して、静置状態の上述のとおりのバイオリアクタにおいて培養し、次いで、１〜６日後、好ましくは３〜４日後に、バッグの容積を１５００〜３０００ｍＬへと拡大して、室温において揺動運動のもとで培養を続行することを含み、出発および続行の両方の培養が、同一の細胞培養バッグにて同一のバイオリアクタシステムにおいて実行される、方法に関する。好ましくは、出発細胞培養容積が、３０〜３５０ｍＬであり、スケールアップ培養容積が、最大容積が２０００ｍＬの細胞培養バッグに適した５００〜１５００ｍＬである。
【００２４】
好ましくは、出発細胞培養物は、ヒト造血幹細胞などの幹細胞、Ｔ細胞またはＮＫ細胞などの免疫由来細胞、腫瘍浸潤細胞（ＴＩＬ）、または細胞療法に適した任意の他の細胞から選択される。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】本発明のバイオリアクタシステムの概略図であり、細胞培養バッグの蓋またはカバーは取り外されている。
【図２】図１と同様のバイオリアクタシステムの概略図であるが、着脱式カートを備えている。
【図３】図２と同様のバイオリアクタシステムの概略図であり、蓋またはカバーが細胞培養バッグを覆って配置されている。
【図４】互いに重ね合わせられたバイオリアクタのいくつかのトレイを示す概略図である。
【図５】バイオリアクタシステムの一体化された細胞ローディングユニットの概略図である。
【図６】小型細胞培養の静置培養に適した形状の細胞バッグを覆う蓋を示している。
【図７】スケールアップ細胞培養の振とう培養に適した形状の細胞バッグを覆う蓋を示している。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明の新規なバイオリアクタは、静置ならびに振とう細胞培養を提供し、ユーザは、個々の細胞培養に最も適切な選択肢を選択することができる。例えば、少量のスタートアップ培養については、通常は静置培養が望ましく、より大きい生産量については、振とう培養が望ましい。
【００２７】
さらに、本発明は、細胞バッグの容積を拡大することによって小容量から大容量へのスケールアウトを可能にし、すなわち単一のバッグが、小培養およびスケールアップ培養の両方に使用される。少量の静置培養のために、単一サイズのバッグの特定の容積が閉鎖され、残りの容積から隔てられる。静置培養の段階が完了すると、培養のスケールアップのために、閉鎖されていた小さな容積が開かれ、培養物がバッグの容積の全体を占めることが可能になる。
【００２８】
バイオリアクタは、とりわけ、統合された振とう、灌流、および培地の添加、ならびに細胞培養物の制御された加熱を提供する。蒸発および凝縮に起因する小さなサイズの培養物の損失を排除する新規な加熱方法が提供される。細胞培養バッグ内の温度およびガスなどの環境条件は、本発明のバイオリアクタの蓋の下方でインキュベータのように維持および制御される。静置の段階において細胞を熱でだめにしてしまう恐れが潜在的に存在する既存の加熱パッド式の温度制御と異なり、本発明のバイオリアクタは、細胞バッグを覆う蓋によって囲まれた閉鎖環境において空気の温度を維持しながら、高温の空気の循環による加熱制御を提供することによって、インキュベータと同様の加熱を提供する。
【００２９】
さらに、遠隔監視および制御の可能性が、細胞培養プロセスの物理的な管理を減少させ、クリーンルームへの進入によって引き起こされる汚染を回避する。
【００３０】
図１および図２が、カバーまたは蓋４が取り外され、培養バッグ３ならびに培地供給部５および廃棄物バッグ６への培養バッグ３の接続が示されている開放状態のバイオリアクタシステム１を示している。蓋４は、温度を維持し、培養物への光の入射を制限するために、トレイ２上の培養バッグ３を覆って再び配置されると考えられる。トレイ２は、固定状態またはラッキング（ｒａｃｋｉｎｇ）状態へと制御される。
【００３１】
図２に示されるように、コンパクトなバイオリアクタシステムを、移動可能であるようにカート７に取り付けることができる。バイオリアクタは、クリーンルームの内部または外部において、カートの助けを借りて容易に移動させることができる。カートに、細胞培養に使用される必要なすべての付属品および消耗品を積み込むことができる。
【００３２】
図３は、カート上に配置され、蓋４が閉じられた状態のバイオリアクタを示している。蓋４は、細胞培養バッグ３を囲んでおり、細胞培養バッグ３のためのインキュベータに類似した密閉された空間を形成するためにトレイ２に載せられている。蓋４の内部には、例えば高温の空気の循環による制御可能な加熱が設けられている。
【００３３】
本発明のバイオリアクタは、トレイの積み重ねによって一度に複数の患者サンプルを取り扱うことができる。図４に示されるとおり、２つ〜５つなど、いくつかのトレイを、第１のトレイの上方に平行に配置することができ、各々のトレイは、例えば細胞バッグの振とう能力および配置に関して、第１のトレイと同じ特性を有することができる。積み重ねられたトレイは、独立した動作条件にて各々のサンプルを分離する。積み重ねられたトレイの場合に、１つの共通の蓋が、存在するすべてのトレイを覆って配置されると考えられる。
【００３４】
好ましくは、トレイ２にバーコードリーダが設けられ、細胞バッグ３にバーコードが設けられる。細胞バッグのバーコードには、患者の詳細が記録され、トレイのバーコードリーダは、患者の細胞のトレーサビリティのために細胞バッグのバーコードを読み取る。
【００３５】
さらに、コンパクトなバイオリアクタを、スタンドアロンの機器として互いに積み重ねることができるため、垂直方向の空間の利点を利用して、専有面積を減らすことができる。
【００３６】
さらに、本発明のバイオリアクタシステムは、図５に示されるとおりの一体化された細胞ローディングユニット８を備える。一体化された細胞ローディングユニット８は、バイオリアクタシステムの全体的なサイズを縮小し、灌流の最中の容積を監視する役に立つ。
【００３７】
細胞増殖の際に、細胞は、制御された温度およびガスの環境下で、３〜４日間にわたる初期の静置段階を通過しなければならない。先行技術において、静置の段階は、インキュベータにおいて実行され、静置の段階における細胞増殖の後に、培養細胞は、インキュベータから取り出され、ｔフラスコまたは小型のバッグからスケールアップ用の大容量のバッグへと移される。本発明においては、静置培養が、細胞培養バッグ３のより小さな容積において実行され、スケールアップ培養が、同じバッグで、しかしながら拡大版にて実施される。静置培養の間、トレイ２は静止状態とされ、蓋４は閉じられる。スケールアップ培養の際には、トレイ２が揺動運動し、蓋４は、培養の必要性に応じて閉じられても、開かれてもよい。
【００３８】
図６および図７には、蓋４がどのようにして細胞培養バッグ３の容積を制御し得るのかが示されている。細胞培養バッグの小さな容積を、細胞培養バッグ３の容積を制限することができる蓋４によって制御することができる。図６に示されるように、蓋４ａは、図７に示される通常の蓋４よりも小さいサイズであってよい。蓋４ａの縁が、或るサイズ（例えば、２Ｌ）のバッグの容積を静置培養に適した３００ｍＬなどのより小さい容積へと制限する。蓋４ａは、細胞バッグ３に対して閉じられ、押し付けられると、細胞バッグの容積を所望のサイズに制限する。図７において、蓋４は、２Ｌの培養物の増殖における使用に適した容積制限機能を持たない通常のサイズの蓋である。５００〜１０００ｍＬなど、２Ｌよりも小さいスケールアップ培養が使用される場合、この培養容積に合わせた蓋、すなわち所望の培養容積への制限をもたらす蓋が使用される。
【００３９】
静置培養段階の後に、蓋４ａを取り外し、２Ｌまでのスケールアップを可能にすることによって、制限されたバッグの容積が解放される。チューブを介して、培地バッグ５が細胞バッグ３を培地で満たし、トレイ２が細胞増殖のために揺動する。廃棄物バッグ６が、灌流の際にチューブを介して細胞バッグ３から廃棄物を収集する。
【００４０】
細胞の培養の際には、細胞の増殖を監視することが重要であり、これは、主としてｐＨ、溶存酸素（ＤＯ）、および細胞密度に基づく。ｐＨおよびＤＯは、従来からの光学式センサなどの培養物に接触することがないセンサによって監視することができるが、細胞密度のサンプルについては、培養物から定期的に採取する必要がある。本バイオリアクタにおいては、一体化された自動サンプリングサブシステムが、サンプルを収集し、各々のサンプルを分離する。
【符号の説明】
【００４１】
１  バイオリアクタシステム
２  トレイ
３  細胞培養バッグ
４  蓋
４ａ  蓋
５  培地供給部、培地バッグ
６  廃棄物バッグ
７  カート
８  一体型の細胞ローディングユニット
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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