(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）：
ＮＨ２−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ａ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ    ・・・（１）
［式（１）中、ａは６〜４０の整数を示す。］
で表される化合物を含有するヘテロ型単分散ポリエチレングリコールにおいて、
（Ａ）逆相クロマトグラフィーを用いて分離したときの、示差屈折率計で検出されるクロマトグラムの溶出開始点から溶出終了点までを結んだ直線をｂａｓｅＬ１とし、ｂａｓｅＬ１から上のポリエチレングリコール由来の全ピーク面積をａｒｅａＡ１とし、屈折率差最大ピークＰ１の頂点Ｐ１ｔｏｐのｂａｓｅＬ１からの高さをＰ１ｔｏｐＨとし、溶出開始点からＰ１ｔｏｐに向かうＰ１上の溶出曲線において、ｂａｓｅＬ１からの高さがＰ１ｔｏｐＨの１／４となる点と３／４となる点とを結んだ直線をＰ１Ｌａとし、Ｐ１ＬａとｂａｓｅＬ１とが交わる溶出時間をＴ１ａとし、Ｐ１ｔｏｐから溶出終了点に向かうＰ１上の溶出曲線において、ｂａｓｅＬ１からの高さがＰ１ｔｏｐＨの１／４となる点と３／４となる点とを結んだ直線をＰ１Ｌｂとし、Ｐ１ＬｂとｂａｓｅＬ１とが交わる溶出時間をＴ１ｂとし、ｂａｓｅＬ１から上のＴ１ａからＴ１ｂの間のピーク面積をａｒｅａＰ１としたとき、ａｒｅａＡ１とａｒｅａＰ１とが、下記式（Ｆ１）：
ａｒｅａＰ１／ａｒｅａＡ１≧０．９０    ・・・（Ｆ１）
で表される条件を満たし、
（Ｂ）陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて分離したときの、示差屈折率計で検出されるクロマトグラムの溶出開始点から溶出終了点までを結んだ直線をｂａｓｅＬ２とし、ｂａｓｅＬ２から上のポリエチレングリコール由来の全ピーク面積をａｒｅａＡ２とし、屈折率差最大ピークＰ２の頂点Ｐ２ｔｏｐのｂａｓｅＬ２からの高さをＰ２ｔｏｐＨとし、溶出開始点からＰ２ｔｏｐに向かうＰ２上の溶出曲線において、ｂａｓｅＬ２からの高さがＰ２ｔｏｐＨの１／２となる点と１／８となる点とを結んだ直線をＰ２Ｌとし、Ｐ２ＬとｂａｓｅＬ２とが交わる溶出時間をＴ２とし、ｂａｓｅＬ２から上の溶出開始点からＴ２の間のピーク面積をａｒｅａＢ２としたとき、ａｒｅａＢ２とａｒｅａＡ２とが、下記式（Ｆ２）：
ａｒｅａＢ２／ａｒｅａＡ２≦０．０２    ・・・（Ｆ２）
で表される条件を満たし、かつ、
（Ｃ）前記式（１）で表される化合物を含有するヘテロ型単分散ポリエチレングリコールを誘導体化し、下記式（２）：
ｔＢｏｃ−ＮＨ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ａ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ    ・・・（２）
［式（２）中、ｔＢｏｃはｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基を示し、ａは６〜４０の整数を示す。］
で表される化合物を含有する混合物を陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて分離したときの、示差屈折率計で検出されるクロマトグラムの溶出開始点から溶出終了点までを結んだ直線をｂａｓｅＬ３とし、ｂａｓｅＬ３から上のポリエチレングリコール由来の全ピーク面積をａｒｅａＡ３とし、屈折率差最大ピークＰ３の頂点Ｐ３ｔｏｐのｂａｓｅＬ３からの高さをＰ３ｔｏｐＨとし、溶出開始点からＰ３ｔｏｐに向かうＰ３上の溶出曲線において、ｂａｓｅＬ３からの高さがＰ３ｔｏｐＨの１／２となる点と１／８となる点とを結んだ直線をＰ３Ｌとし、Ｐ３ＬとｂａｓｅＬ３とが交わる溶出時間をＴ３とし、ｂａｓｅＬ３から上の溶出開始点からＴ３の間のピーク面積をａｒｅａＢ３としたとき、ａｒｅａＢ３とａｒｅａＡ３とが、下記式（Ｆ３）：
ａｒｅａＢ３／ａｒｅａＡ３≦０．０２    ・・・（Ｆ３）
で表される条件を満たす、ヘテロ型単分散ポリエチレングリコールの製造方法であり、
下記式（３）で表される化合物に下記式（４）で表される化合物を５℃以下の温度条件でマイケル付加反応させ、下記式（５）で表される化合物を得る工程Ａと、
ＴｓＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ａ−Ｈ    ・・・（３）
［式（３）中、Ｔｓはトシル基を示し、ａは６〜４０の整数を示す。］
【化１】
0006638970.tif 000037
［式（４）中、Ｒ１は炭素数１〜６の炭化水素基を示す。］
ＴｓＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ａ−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＯＯＲ１    ・・・（５）
［式（５）中、Ｔｓはトシル基を示し、Ｒ１は炭素数１〜６の炭化水素基を示し、ａは６〜４０の整数を示す。］
前記式（５）で表される化合物をフタルイミドカリウムと反応させ、下記式（６）で表される化合物を得る工程Ｂと、
ＰＩ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ａ−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＯＯＲ１    ・・・（６）
［式（６）中、ＰＩはフタルイミド基を示し、Ｒ１は炭素数１〜６の炭化水素基を示し、ａは６〜４０の整数を示す。］
前記式（６）で表される化合物を脱フタルイミド化し、下記式（７）で表される化合物を得る工程Ｃと、
Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ａ−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＯＯＲ１    ・・・（７）
［式（７）中、Ｒ１は炭素数１〜６の炭化水素基を示し、ａは６〜４０の整数を示す。］
前記工程Ｃで得られた前記式（７）で表される化合物を含有する反応生成物に分液抽出処理及び酸加水分解処理を施して前記式（１）で表される化合物を含有する前記ヘテロ型単分散ポリエチレングリコールを得る工程Ｄと、
を含むことを特徴とするヘテロ型単分散ポリエチレングリコールの製造方法。
【請求項２】
前記式（３）及び（５）〜（７）中のａが、それぞれ６〜１０の整数であり、
前記工程Ｄが、前記分液抽出処理の後に前記酸加水分解処理を施す工程であり、
前記分液抽出処理が、前記式（７）で表される化合物を含有する反応生成物に、酸性水溶液に溶解させて有機溶媒で分液洗浄する酸洗浄処理を施す洗浄工程（ｗ１）と、前記洗浄工程（ｗ１）の後に前記式（７）で表される化合物を分液抽出する抽出工程（ｅ１）と、を含む処理であり、かつ、
前記酸加水分解処理が、前記式（７）で表される化合物を酸加水分解して前記式（１）で表される化合物を含有する前記ヘテロ型単分散ポリエチレングリコールを得る処理である、
ことを特徴とする請求項１に記載のヘテロ型単分散ポリエチレングリコールの製造方法。
【請求項３】
前記式（３）及び（５）〜（７）中のａが、それぞれ１１〜４０の整数であり、
前記工程Ｄが、前記酸加水分解処理の後に前記分液抽出処理を施す工程であり、
前記酸加水分解処理が、前記反応生成物中の式（７）で表される化合物を酸加水分解して前記式（１）で表される化合物を含有する反応生成物を得る処理であり、かつ、
前記分液抽出処理が、前記式（１）で表される化合物を含有する反応生成物に、酸性水溶液に溶解させて有機溶媒で分液洗浄する酸洗浄処理及び塩基性水溶液に溶解させて有機溶媒で分液洗浄する塩基洗浄処理を施す洗浄工程（ｗ２）と、前記洗浄工程（ｗ２）の後に前記式（１）で表される化合物を含有する前記ヘテロ型単分散ポリエチレングリコールを分液抽出する抽出工程（ｅ２）と、を含む処理である、
ことを特徴とする請求項１に記載のヘテロ型単分散ポリエチレングリコールの製造方法。
【請求項４】
下記式（３）：
ＴｓＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ａ−Ｈ    ・・・（３）
［式（３）中、Ｔｓはトシル基を示し、ａは６〜４０の整数を示す。］
で表される化合物を含有するヘテロ型単分散ポリエチレングリコール製造用中間体において、
（Ｄ）逆相クロマトグラフィーを用いて分離したときの、示差屈折率計で検出されるクロマトグラムの溶出開始点から溶出終了点までを結んだ直線をｂａｓｅＬ４とし、ｂａｓｅＬ４から上のポリエチレングリコール由来の全ピーク面積をａｒｅａＡ４とし、屈折率差最大ピークＰ４の頂点Ｐ４ｔｏｐのｂａｓｅＬ４からの高さをＰ４ｔｏｐＨとし、溶出開始点からＰ４ｔｏｐに向かうＰ４上の溶出曲線において、ｂａｓｅＬ４からの高さがＰ４ｔｏｐＨの１／４となる点と３／４となる点とを結んだ直線をＰ４Ｌａとし、Ｐ４ＬａとｂａｓｅＬ４とが交わる溶出時間をＴ４ａとし、Ｐ４ｔｏｐから溶出終了点に向かうＰ４上の溶出曲線において、ｂａｓｅＬ４からの高さがＰ４ｔｏｐＨの１／４となる点と３／４となる点とを結んだ直線をＰ４Ｌｂとし、Ｐ４ＬｂとｂａｓｅＬ４とが交わる溶出時間をＴ４ｂとし、ｂａｓｅＬ４から上のＴ４ａからＴ４ｂの間のピーク面積をａｒｅａＰ４としたとき、ａｒｅａＡ４とａｒｅａＰ４とが、下記式（Ｆ４）：
ａｒｅａＰ４／ａｒｅａＡ４≧０．９２    ・・・（Ｆ４）
で表される条件を満たす、ヘテロ型単分散ポリエチレングリコール製造用中間体の製造方法であり、
下記式（８）で表される化合物と下記式（９）で表される化合物とを下記式（Ｆ５）で表される条件を満たすように求核置換反応させ、下記式（１０）で表される化合物を得る工程ａと、
ＨＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｂ−Ｈ    ・・・（８）
［式（８）中、ｂは３〜３７の整数を示す。］
ＬＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｃ−Ｒ２    ・・・（９）
［式（９）中、Ｌはトシル基又はメシル基を示し、Ｒ２はトリチル基又はベンジル基を示し、ｃは３〜３７の整数を示す。］
６≦ｂ＋ｃ≦４０    ・・・（Ｆ５）
［式（Ｆ５）中、ｂは式（８）中のｂを示し、ｃは式（９）中のｃを示す。］
ＨＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ａ−Ｒ２    ・・・（１０）
［式（１０）中、Ｒ２はトリチル基又はベンジル基を示し、ａは６〜４０の整数を示す。］
前記式（１０）で表される化合物をトシル化し、下記式（１１）で表される化合物を得る工程ｂと、
ＴｓＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ａ−Ｒ２    ・・・（１１）
［式（１１）中、Ｔｓはトシル基を示し、Ｒ２はトリチル基又はベンジル基を示し、ａは６〜４０の整数を示す。］
前記式（１１）で表される化合物を脱トリチル化又は脱ベンジル化し、前記式（３）で表される化合物を得る工程ｃと、
前記工程ｃで得られた前記式（３）で表される化合物を含有する反応生成物を精製して前記ヘテロ型単分散ポリエチレングリコール製造用中間体を得る工程ｄと、
を含むことを特徴とするヘテロ型単分散ポリエチレングリコール製造用中間体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヘテロ型単分散ポリエチレングリコール、ヘテロ型単分散ポリエチレングリコール製造用中間体及びそれらの製造方法、並びに、ヘテロ型単分散ポリエチレングリコール結合体に関する。より詳しくは、生体機能性高分子；ドラッグデリバリーシステムにおける薬物や薬物キャリア；診断用材料やデバイス等の修飾に用いられ、特に、抗体結合医薬用のリンカー材料として有用なヘテロ型単分散ポリエチレングリコールに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、医薬品分野においては、リンカーを介して薬剤と抗体とを結合させ、抗原提示細胞に薬物を能動的に運搬することが可能な抗体結合医薬（Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｒｕｇ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ：ＡＤＣ）が実用化されて高い注目を集めている（Ｔｏｘｉｎｓ、２０１１年、３、ｐ．８４８−８８３（非特許文献１）、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、２０１１年、５４、ｐ．３６０６−３６２３（非特許文献２））。
【０００３】
このＡＤＣのリンカー材料として利用が進められているものの１つが、ヘテロ型単分散ポリエチレングリコールである。ヘテロ型単分散ポリエチレングリコールは、両末端に互いに異なる官能基を有するヘテロ型ポリエチレングリコールを主成分として含有し、かつ、分子量が一定である単分散ポリエチレングリコールである。
【０００４】
前記ＡＤＣでは、前記ヘテロ型ポリエチレングリコールをリンカーとして、その各末端に抗体と薬剤とを区別して結合させるため、前記ヘテロ型単分散ポリエチレングリコール中に、両末端に互いに同じ官能基を有する化合物（ホモ型ポリエチレングリコール等）が不純物として存在すると、抗体が２つ結合した化合物又は薬剤が２つ結合した化合物が生成する。抗体が２つ結合した化合物は薬剤が結合していないためにＡＤＣとしての効果が奏されず、薬剤が２つ結合した化合物は抗体が結合していないために抗原提示細胞以外の箇所に運搬されて副作用を引き起こす原因となる。また、目的の官能基を有するヘテロ型ポリエチレングリコールと異なる組み合わせで官能基を有する他のヘテロ型化合物が不純物として存在する場合も、目的とする抗体又は薬剤のどちらかが欠損した化合物が生成するため、上記と同様の問題が生じる。したがって、薬剤の使用、効果の観点から、前記ヘテロ型単分散ポリエチレングリコールとしては、両末端に互いに異なる官能基を有するヘテロ型ポリエチレングリコールを１種のみ、高純度で含有することが重要といえる。
【０００５】
また近年、前記ＡＤＣの効果を向上させることを目的として、抗体に対して複数個の薬剤を結合させたＡＤＣを使用することが試みられている。このＡＤＣを製造する際は、通常、薬剤の結合個数を質量分析計やＨＰＬＣを用いて確認するため、リンカー材料として用いる前記ヘテロ型単分散ポリエチレングリコール中にエチレングリコール鎖長の異なる化合物が不純物として存在すると、その確認が困難になるという製造上の問題が生じる。その他にも、前記エチレングリコール鎖長の異なる化合物が不純物として存在すると、前記ＡＤＣ製造時に添加する抗体や薬剤の当量が不明確となるために高価な抗体や薬剤を過剰に使用する必要が生じるという問題や、前記エチレングリコール鎖長の異なる化合物は医薬品申請の際に主たる薬剤とは別の化合物として取り扱われるために、化合物の同定や各種試験の実施、許容量の評価等が更に必要になるという問題がある。したがって、前記ヘテロ型単分散ポリエチレングリコールとしては、互いにエチレングリコール鎖長が同じポリエチレングリコールを１種のみ、高純度で含有することも重要といえる。
【０００６】
このように、ＡＤＣのリンカー材料として用いるヘテロ型単分散ポリエチレングリコールとしては、主成分として、両末端に互いに異なる官能基を有するヘテロ型ポリエチレングリコールであって前記ヘテロ型ポリエチレングリコール間でエチレングリコール鎖長が互いに同じである化合物を、特に高純度で含有することが望まれていた。
【０００７】
また、前記官能基としては、抗体や薬物等のチオール基と反応するマレイミド基、ヨードアセトアミド基；抗体や薬物等のアミノ基と反応するカルボキシル基、活性エステル基、活性カーボネート基、アルデヒド基；抗体や薬物等のカルボキシル基と反応するアミノ基；クリック反応で使用されるアジド基、アルキニル基等が用いられている。これらの中でも、アミノ基及びカルボキシル基をそれぞれ末端に有するヘテロ型ポリエチレングリコールは、前記ＡＤＣのリンカーとしてそのまま使用可能であり、更にこれを原料として官能基変換して使用することが可能であるため、前記ヘテロ型単分散ポリエチレングリコールとして有用な化合物である。
【０００８】
前記へテロ型単分散ポリエチレングリコールの製造方法としては、末端官能基化工程と、Ｗｌｉｌｌｉａｍｓｏｎエーテル合成によるエチレングリコール鎖長の延長工程とを含む方法が挙げられる。例えば、米国特許第５６７２６６２号明細書（特許文献１）及び特表２００７−５３８１１１号公報（特許文献２）には、モノメトキシポリエチレングリコールの末端にカルボキシル基を導入する方法が開示されている。特許文献１では、モノメトキシポリエチレングリコールとアクリロニトリルとをマイケル付加反応させ、濃塩酸条件下でニトリルをアミドに変換し、水酸化カリウム水溶液条件下でアミドを加水分解することでカルボキシル基を導入している。しかしながら、このような強酸、強塩基条件下では、マイケル付加反応の逆反応によってカルボキシル基ではなく水酸基を有する化合物が生成したり、エチレングリコール鎖の切断によってエチレングリコール鎖長が短い化合物等が生成するため、純度や収率が不十分であった。なお、かかる純度については、特許文献２の比較例に追試を行った結果が記載されており、末端にメトキシ基のない化合物が生成されることが確認されている。他方、特許文献２では、モノメトキシポリエチレングリコールとｔｅｒｔ−ブチルアクリレートとをマイケル付加反応させ、トリフリルオロ酢酸条件下でカルボキシル基を導入している。しかしながら、同文献に開示されている手法では、ｔｅｒｔ−ブチルアクリレートの導入率が７０％以下と低く、末端が水酸基である化合物が残存するといという問題を有していた。
【０００９】
また、特許文献１〜２に記載の方法では、モノメトキシポリエチレングリコールを原料として用いているが、上記反応を用いた場合、ヘテロ型単分散ポリエチレングリコールを得る場合にも同様に、エチレングリコール鎖長が短い化合物や、末端にカルボキシル基ではなく水酸基を有する化合物が不純物として生成する。このような不純物を含有するヘテロ型単分散ポリエチレングリコールをＡＤＣの製造に用いると、エチレングリコール鎖長の短い化合物によって上記のＡＤＣ製造上の問題が生じたり、末端に水酸基を有する化合物によって抗体又は薬剤のどちらかが欠損した化合物が生成して薬剤としての有効性が低下する原因となる。
【００１０】
また、例えば、末端に水酸基を有する化合物と末端にカルボキシル基を有する目的の化合物との違いは該末端の構造のみであるため、分離精製をすることが困難である。特許文献２では、得られた生成物を陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて精製しているが、陰イオン交換クロマトグラフィーを用いた方法は汎用性が低い精製方法であること、及び、収率が更に低下することから、簡便性及び収率の点で問題を有していた。
【００１１】
さらに、エチレングリコール鎖長が５以上であるヘテロ型ポリエチレングリコールを含有するヘテロ型単分散ポリエチレングリコールを製造する場合、一般的にＷｉｌｌｉａｍｓｏｎエーテル合成によるエチレングリコール鎖長の延長反応が必要である。これは、エチレングリコール鎖長が４以下のトリエチレングリコールやテトラエチレングリコールは蒸留精製が可能であるため、純度が９８％以上の原料を入手可能であるが、エチレングリコール鎖長が５以上の化合物は蒸留精製が行えず、高純度品を安価に入手することが困難なためである。このＷｉｌｌｉａｍｓｏｎエーテル合成によるエチレングリコール鎖長の延長反応時には、副反応によって副生成物が生成することが知られている。例えば、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、１９９７年、５３、ｐ．１０９３９−１０９５２（非特許文献３）に記載されているように、エチレングリコールの脱離によって目的化合物よりもエチレングリコール鎖長が１つ短い化合物や、Ｅ２脱離によってエチレングリコール鎖長及び末端官能基の異なる化合物が生成する。実際に、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．、２００９年、４８、ｐ．１２４８−１２５２（非特許文献４）では、Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎエーテル合成時にエチレングリコールの脱離によって目的化合物よりもエチレングリコール鎖長が１つ短い化合物が３％生成することが記載されている。このようにエチレングリコール鎖長が１つ短い化合物を含有する混合物を用いてヘテロ型単分散ポリエチレングリコールを製造すると、得られるヘテロ型単分散ポリエチレングリコールは、目的とする主成分よりもエチレングリコール鎖長が１つ短い化合物を不純物として含有する。そのため、かかるヘテロ型単分散ポリエチレングリコールをＡＤＣの製造に用いると、上記のＡＤＣ製造上の問題が生じる。これらのエチレングリコール鎖長が異なる化合物同士は、化合物の構造が類似しているために分離精製をすることが困難であり、非特許文献４に記載されているように、複数回の逆相クロマトグラフィー等を実施することが必要である。
【００１２】
また、両末端の官能基が互いに異なる前記ヘテロ型ポリエチレングリコールを製造するためには、片末端に保護基や脱離基を有し、他方の片末端に水酸基を有するヘテロ型単分散ポリエチレングリコール製造用中間体を用いることが有用である。このような中間体を得る方法としては、例えば、Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．、２００２年、４、ｐ．２３２９−２３３２（非特許文献５）では、テトラエチレングリコールやヘキサエチレングリコールを原料とし、酸化銀を用いて片末端を選択的にトシル化する方法が開示されており、酸化銀を用いることによって効率よく片末端トシル体を得られることが記載されている。しかしながら、この方法では、両末端にトシル基を有する化合物が数％生成するという問題を有していた。
【００１３】
さらに、Ｐｏｌｙｍ．Ｃｈｅｍ．、２０１４年、５、ｐ．６９４−６９７（非特許文献６）では、エチレングリコール鎖長が８の片末端Ｄｍｔｒ体を合成することが開示されている。前記合成経路の一部は次式：
ＤｍｔｒＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）４−Ｔｓ  ＋  ＨＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）４−Ｈ
→  ＤｍｔｒＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）８−Ｈ  
＋  ＤｍｔｒＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）１２−Ｄｍｔｒ
［式中、Ｄｍｔｒは４，４’−ジメトキシトリチル基を示す。］
で表され、非特許文献６には、片末端トシル体とテトラエチレングリコールとの１：１の反応によって８量体の片末端Ｄｍｔｒ体が得られる際に、片末端トシル体とテトラエチレングリコールとの２：１の反応によって１２量体の両末端Ｄｍｔｒ体が生成することが記載されている。しかしながら、このように両末端にトシル基やＤｍｔｒ基を有する化合物を含む混合物を用いて両末端にそれぞれアミノ基とカルボキシル基とを有するヘテロ型ポリエチレングリコールを合成すると、両末端にアミノ基を有する化合物又は両末端にカルボキシル基を有する化合物が不純物として生成する。そのため、かかる不純物を含有するヘテロ型単分散ポリエチレングリコールをＡＤＣの製造に用いると、薬剤が２つ結合した化合物又は抗体が２つ結合した化合物が生成し、薬剤としての有効性が低下する原因となる。
【００１４】
他方、ヘテロ型単分散ポリエチレングリコールの純度の評価方法としては、１Ｈ−ＮＭＲ測定、ＭＳ測定、ＨＰＬＣ測定等を用いた方法が挙げられる。しかしながら、上記のように公知の製造方法によってヘテロ型単分散ポリエチレングリコールを製造した場合には複数の不純物が含有されるため、純度の評価は困難であるといえる。
【００１５】
例えば、両末端にそれぞれアミノ基とカルボキシル基とを有するヘテロ型ポリエチレングリコールを主成分として含有するヘテロ型単分散ポリエチレングリコール中に、両末端にアミノ基を有する化合物と両末端にそれぞれアミノ基と水酸基とを有する化合物の２つが混在していた場合、１Ｈ−ＮＭＲ測定では水酸基のα位のプロトンがエチレングリコール鎖と重なって区別できないため、両末端にそれぞれアミノ基と水酸基とを有する化合物の含有量を測定することができず、それに伴い、両末端にアミノ基を有する化合物の含有量を特定することも困難となる。また、ＭＳ測定では、複数の不純物を同定することが可能であるが、化合物の構造によってイオン化の効率が異なるため、定量性が低いという問題がある。全ての不純物の標準化合物を合成して検量線を作成することによって定量することも可能ではあるが、エチレングリコール鎖長の異なる化合物や、末端官能基の組み合わせが異なる化合物の全てを合成して定量することは困難である。さらに、ＨＰＬＣ測定では、全ての不純物を分離することができれば定量することも可能であるが、エチレングリコール鎖長の異なる化合物や末端官能基の組み合わせが異なる化合物が複数存在する場合には当該分離は困難である。
【００１６】
このように、ヘテロ型単分散ポリエチレングリコールの純度を評価することは困難であり、従来の評価方法では、ヘテロ型単分散ポリエチレングリコールについて、ＡＤＣ製造用のリンカーとして用いる際に重要となる、両末端の官能基の組み合わせが目的の化合物と異なる化合物の含有量や、エチレングリコール鎖長が目的の化合物と異なる化合物の含有量を、正確に測定することが困難であるという問題を有していた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１７】
【特許文献１】米国特許第５６７２６６２号明細書
【特許文献２】特表２００７−５３８１１１号公報
【非特許文献】
【００１８】
【非特許文献１】Ｔｏｘｉｎｓ、２０１１年、３、ｐ．８４８−８８３
【非特許文献２】Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、２０１１年、５４、ｐ．３６０６−３６２３
【非特許文献３】Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、１９９７年、５３、ｐ．１０９３９−１０９５２
【非特許文献４】Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．、２００９年、４８、ｐ．１２４８−１２５２
【非特許文献５】Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．、２００２年、４、ｐ．２３２９−２３３２
【非特許文献６】Ｐｏｌｙｍ．Ｃｈｅｍ．、２０１４年、５、ｐ．６９４−６９７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
本発明は、上記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、両末端にそれぞれアミノ基とカルボキシル基とを有しており、エチレングリコール鎖長が互いに同じであるヘテロ型ポリエチレングリコールを、主成分として高純度で含有するヘテロ型単分散ポリエチレングリコール、前記ヘテロ型単分散ポリエチレングリコール製造用中間体、及びヘテロ型単分散ポリエチレングリコール結合体、並びに、前記ヘテロ型単分散ポリエチレングリコール及び前記ヘテロ型単分散ポリエチレングリコール製造用中間体を容易に得ることができる製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、両末端にそれぞれアミノ基とカルボキシル基とを有するヘテロ型ポリエチレングリコールの合成において、合成工程を特定の順序で組み合わせることにより、カラムクロマトグラフィー等の精製方法を用いなくとも、簡便な分液抽出のみで、両末端にそれぞれアミノ基とカルボキシル基とを有し、かつ、エチレングリコール鎖長が互いに同じである１種のヘテロ型ポリエチレングリコールを主成分として特に高純度で含有するヘテロ型単分散ポリエチレングリコールが得られることを見い出した。さらに、前記ヘテロ型ポリエチレングリコールを製造するための中間体を、合成工程を特定の順序で組み合わせて合成することにより、カラムクロマトグラフィー等の精製方法を用いなくとも、簡便な分液抽出のみで、前記中間体を高純度で得られることを見い出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、下記の［１］〜［９］を提供する。
【００２２】
［１］  下記式（１）：
ＮＨ２−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ａ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ    ・・・（１）
［式（１）中、ａは６〜４０の整数を示す。］
で表される化合物を含有するヘテロ型単分散ポリエチレングリコールにおいて、
（Ａ）逆相クロマトグラフィーを用いて分離したときの、示差屈折率計で検出されるクロマトグラムの溶出開始点から溶出終了点までを結んだ直線をｂａｓｅＬ１とし、ｂａｓｅＬ１から上のポリエチレングリコール由来の全ピーク面積をａｒｅａＡ１とし、屈折率差最大ピークＰ１の頂点Ｐ１ｔｏｐのｂａｓｅＬ１からの高さをＰ１ｔｏｐＨとし、溶出開始点からＰ１ｔｏｐに向かうＰ１上の溶出曲線において、ｂａｓｅＬ１からの高さがＰ１ｔｏｐＨの１／４となる点と３／４となる点とを結んだ直線をＰ１Ｌａとし、Ｐ１ＬａとｂａｓｅＬ１とが交わる溶出時間をＴ１ａとし、Ｐ１ｔｏｐから溶出終了点に向かうＰ１上の溶出曲線において、ｂａｓｅＬ１からの高さがＰ１ｔｏｐＨの１／４となる点と３／４となる点とを結んだ直線をＰ１Ｌｂとし、Ｐ１ＬｂとｂａｓｅＬ１とが交わる溶出時間をＴ１ｂとし、ｂａｓｅＬ１から上のＴ１ａからＴ１ｂの間のピーク面積をａｒｅａＰ１としたとき、ａｒｅａＡ１とａｒｅａＰ１とが、下記式（Ｆ１）：
ａｒｅａＰ１／ａｒｅａＡ１≧０．９０    ・・・（Ｆ１）
で表される条件を満たし、
（Ｂ）陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて分離したときの、示差屈折率計で検出されるクロマトグラムの溶出開始点から溶出終了点までを結んだ直線をｂａｓｅＬ２とし、ｂａｓｅＬ２から上のポリエチレングリコール由来の全ピーク面積をａｒｅａＡ２とし、屈折率差最大ピークＰ２の頂点Ｐ２ｔｏｐのｂａｓｅＬ２からの高さをＰ２ｔｏｐＨとし、溶出開始点からＰ２ｔｏｐに向かうＰ２上の溶出曲線において、ｂａｓｅＬ２からの高さがＰ２ｔｏｐＨの１／２となる点と１／８となる点とを結んだ直線をＰ２Ｌとし、Ｐ２ＬとｂａｓｅＬ２とが交わる溶出時間をＴ２とし、ｂａｓｅＬ２から上の溶出開始点からＴ２の間のピーク面積をａｒｅａＢ２としたとき、ａｒｅａＢ２とａｒｅａＡ２とが、下記式（Ｆ２）：
ａｒｅａＢ２／ａｒｅａＡ２≦０．０２    ・・・（Ｆ２）
で表される条件を満たし、かつ、
（Ｃ）前記式（１）で表される化合物を含有するヘテロ型単分散ポリエチレングリコールを誘導体化し、下記式（２）：
ｔＢｏｃ−ＮＨ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ａ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ    ・・・（２）
［式（２）中、ｔＢｏｃはｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基を示し、ａは６〜４０の整数を示す。］
で表される化合物を含有する混合物を陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて分離したときの、示差屈折率計で検出されるクロマトグラムの溶出開始点から溶出終了点までを結んだ直線をｂａｓｅＬ３とし、ｂａｓｅＬ３から上のポリエチレングリコール由来の全ピーク面積をａｒｅａＡ３とし、屈折率差最大ピークＰ３の頂点Ｐ３ｔｏｐのｂａｓｅＬ３からの高さをＰ３ｔｏｐＨとし、溶出開始点からＰ３ｔｏｐに向かうＰ３上の溶出曲線において、ｂａｓｅＬ３からの高さがＰ３ｔｏｐＨの１／２となる点と１／８となる点とを結んだ直線をＰ３Ｌとし、Ｐ３ＬとｂａｓｅＬ３とが交わる溶出時間をＴ３とし、ｂａｓｅＬ３から上の溶出開始点からＴ３の間のピーク面積をａｒｅａＢ３としたとき、ａｒｅａＢ３とａｒｅａＡ３とが、下記式（Ｆ３）：
ａｒｅａＢ３／ａｒｅａＡ３≦０．０２    ・・・（Ｆ３）
で表される条件を満たす、ヘテロ型単分散ポリエチレングリコールの製造方法であり、
下記式（３）で表される化合物に下記式（４）で表される化合物を５℃以下の温度条件でマイケル付加反応させ、下記式（５）で表される化合物を得る工程Ａと、
ＴｓＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ａ−Ｈ    ・・・（３）
［式（３）中、Ｔｓはトシル基を示し、ａは６〜４０の整数を示す。］
【００２３】
【化１】
0006638970.tif 000002
【００２４】
［式（４）中、Ｒ１は炭素数１〜６の炭化水素基を示す。］
ＴｓＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ａ−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＯＯＲ１    ・・・（５）
［式（５）中、Ｔｓはトシル基を示し、Ｒ１は炭素数１〜６の炭化水素基を示し、ａは６〜４０の整数を示す。］
前記式（５）で表される化合物をフタルイミドカリウムと反応させ、下記式（６）で表される化合物を得る工程Ｂと、
ＰＩ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ａ−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＯＯＲ１    ・・・（６）
［式（６）中、ＰＩはフタルイミド基を示し、Ｒ１は炭素数１〜６の炭化水素基を示し、ａは６〜４０の整数を示す。］
前記式（６）で表される化合物を脱フタルイミド化し、下記式（７）で表される化合物を得る工程Ｃと、
Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ａ−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＯＯＲ１    ・・・（７）
［式（７）中、Ｒ１は炭素数１〜６の炭化水素基を示し、ａは６〜４０の整数を示す。］
前記工程Ｃで得られた前記式（７）で表される化合物を含有する反応生成物に分液抽出処理及び酸加水分解処理を施して前記式（１）で表される化合物を含有する前記ヘテロ型単分散ポリエチレングリコールを得る工程Ｄと、
を含むことを特徴とするヘテロ型単分散ポリエチレングリコールの製造方法。
【００２５】
［２］  前記式（３）及び（５）〜（７）中のａが、それぞれ６〜１０の整数であり、
前記工程Ｄが、前記分液抽出処理の後に前記酸加水分解処理を施す工程であり、
前記分液抽出処理が、前記式（７）で表される化合物を含有する反応生成物に、酸性水溶液に溶解させて有機溶媒で分液洗浄する酸洗浄処理を施す洗浄工程（ｗ１）と、前記洗浄工程（ｗ１）の後に前記式（７）で表される化合物を分液抽出する抽出工程（ｅ１）と、を含む処理であり、かつ、
前記酸加水分解処理が、前記式（７）で表される化合物を酸加水分解して前記式（１）で表される化合物を含有する前記ヘテロ型単分散ポリエチレングリコールを得る処理である、
ことを特徴とする［１］に記載のヘテロ型単分散ポリエチレングリコールの製造方法。
【００２６】
［３］  前記式（３）及び（５）〜（７）中のａが、それぞれ１１〜４０の整数であり、
前記工程Ｄが、前記酸加水分解処理の後に前記分液抽出処理を施す工程であり、
前記酸加水分解処理が、前記反応生成物中の式（７）で表される化合物を酸加水分解して前記式（１）で表される化合物を含有する反応生成物を得る処理であり、かつ、
前記分液抽出処理が、前記式（１）で表される化合物を含有する反応生成物に、酸性水溶液に溶解させて有機溶媒で分液洗浄する酸洗浄処理、及び、塩基性水溶液に溶解させて有機溶媒で分液洗浄する塩基洗浄処理を施す洗浄工程（ｗ２）と、前記洗浄工程（ｗ２）の後に前記式（１）で表される化合物を含有する前記ヘテロ型単分散ポリエチレングリコールを分液抽出する抽出工程（ｅ２）と、を含む処理である、
ことを特徴とする［１］に記載のヘテロ型単分散ポリエチレングリコールの製造方法。
【００２８】
［４］  下記式（３）：
ＴｓＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ａ−Ｈ    ・・・（３）
［式（３）中、Ｔｓはトシル基を示し、ａは６〜４０の整数を示す。］
で表される化合物を含有するヘテロ型単分散ポリエチレングリコール製造用中間体において、
（Ｄ）逆相クロマトグラフィーを用いて分離したときの、示差屈折率計で検出されるクロマトグラムの溶出開始点から溶出終了点までを結んだ直線をｂａｓｅＬ４とし、ｂａｓｅＬ４から上のポリエチレングリコール由来の全ピーク面積をａｒｅａＡ４とし、屈折率差最大ピークＰ４の頂点Ｐ４ｔｏｐのｂａｓｅＬ４からの高さをＰ４ｔｏｐＨとし、溶出開始点からＰ４ｔｏｐに向かうＰ４上の溶出曲線において、ｂａｓｅＬ４からの高さがＰ４ｔｏｐＨの１／４となる点と３／４となる点とを結んだ直線をＰ４Ｌａとし、Ｐ４ＬａとｂａｓｅＬ４とが交わる溶出時間をＴ４ａとし、Ｐ４ｔｏｐから溶出終了点に向かうＰ４上の溶出曲線において、ｂａｓｅＬ４からの高さがＰ４ｔｏｐＨの１／４となる点と３／４となる点とを結んだ直線をＰ４Ｌｂとし、Ｐ４ＬｂとｂａｓｅＬ４とが交わる溶出時間をＴ４ｂとし、ｂａｓｅＬ４から上のＴ４ａからＴ４ｂの間のピーク面積をａｒｅａＰ４としたとき、ａｒｅａＡ４とａｒｅａＰ４とが、下記式（Ｆ４）：
ａｒｅａＰ４／ａｒｅａＡ４≧０．９２    ・・・（Ｆ４）
で表される条件を満たす、ヘテロ型単分散ポリエチレングリコール製造用中間体の製造方法であり、
下記式（８）で表される化合物と下記式（９）で表される化合物とを下記式（Ｆ５）で表される条件を満たすように求核置換反応させ、下記式（１０）で表される化合物を得る工程ａと、
ＨＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｂ−Ｈ    ・・・（８）
［式（８）中、ｂは３〜３７の整数を示す。］
ＬＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｃ−Ｒ２    ・・・（９）
［式（９）中、Ｌはトシル基又はメシル基を示し、Ｒ２はトリチル基又はベンジル基を示し、ｃは３〜３７の整数を示す。］
６≦ｂ＋ｃ≦４０    ・・・（Ｆ５）
［式（Ｆ５）中、ｂは式（８）中のｂを示し、ｃは式（９）中のｃを示す。］
ＨＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ａ−Ｒ２    ・・・（１０）
［式（１０）中、Ｒ２はトリチル基又はベンジル基を示し、ａは６〜４０の整数を示す。］
前記式（１０）で表される化合物をトシル化し、下記式（１１）で表される化合物を得る工程ｂと、
ＴｓＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ａ−Ｒ２    ・・・（１１）
［式（１１）中、Ｔｓはトシル基を示し、Ｒ２はトリチル基又はベンジル基を示し、ａは６〜４０の整数を示す。］
前記式（１１）で表される化合物を脱トリチル化又は脱ベンジル化し、前記式（３）で表される化合物を得る工程ｃと、
前記工程ｃで得られた前記式（３）で表される化合物を含有する反応生成物を精製して前記ヘテロ型単分散ポリエチレングリコール製造用中間体を得る工程ｄと、
を含むことを特徴とするヘテロ型単分散ポリエチレングリコール製造用中間体の製造方法。
【発明の効果】
【００３２】
本発明によれば、両末端にそれぞれアミノ基とカルボキシル基とを有しており、エチレングリコール鎖長が互いに同じであるヘテロ型ポリエチレングリコールを、主成分として高純度で含有するヘテロ型単分散ポリエチレングリコール、前記ヘテロ型単分散ポリエチレングリコール製造用中間体及びヘテロ型単分散ポリエチレングリコール結合体、並びに、前記ヘテロ型単分散ポリエチレングリコール及び前記ヘテロ型単分散ポリエチレングリコール製造用中間体を容易に得ることができる製造方法を提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】本発明に係る（Ａ）逆相クロマトグラフィーを用いて得られるクロマトグラムの模式図である。
【図２】本発明に係る（Ｂ）陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて得られるクロマトグラムの模式図である。
【図３】本発明に係る（Ｃ）陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて得られるクロマトグラムの模式図である。
【図４】本発明に係る（Ｄ）逆相クロマトグラフィーを用いて得られるクロマトグラムの模式図である。
【図５】実施例１−２で化合物１３を含有する精製物について（Ａ）逆相クロマトグラフィー測定を行って得られたクロマトグラムである。
【図６】実施例１−２で展開溶媒について逆相クロマトグラフィー測定を行って得られたクロマトグラムである。
【図７】実施例１−２で化合物１３を含有する精製物について（Ｂ）陽イオン交換クロマトグラフィー測定を行って得られたクロマトグラムである。
【図８】実施例１−２で化合物１３を含有する精製物について検出器に質量分析計を用いた陽イオン交換クロマトグラフィー測定を行って得られたクロマトグラムである。
【図９】実施例１−２で化合物１３を含有する精製物を誘導体化し、（Ｃ）陰イオン交換クロマトグラフィー測定を行って得られたクロマトグラムである。
【図１０】実施例１−２で化合物１３を含有する精製物を誘導体化し、検出器に質量分析計を用いた陰イオン交換クロマトグラフィー測定を行って得られたクロマトグラムである。
【図１１】実施例２−２で化合物２３を含有する精製物について（Ａ）逆相クロマトグラフィー測定を行って得られたクロマトグラムである。
【図１２】実施例２−２で化合物２３を含有する精製物について（Ｂ）陽イオン交換クロマトグラフィー測定を行って得られたクロマトグラムである。
【図１３】実施例２−２で化合物２３を含有する精製物について検出器に質量分析計を用いた陽イオン交換クロマトグラフィー測定を行って得られたクロマトグラムである。
【図１４】実施例２−２で化合物２３を含有する精製物を誘導体化し、（Ｃ）陰イオン交換クロマトグラフィー測定を行って得られたクロマトグラムである。
【図１５】実施例２−２で化合物２３を含有する精製物を誘導体化し、検出器に質量分析計を用いた陰イオン交換クロマトグラフィー測定を行って得られたクロマトグラムである。
【図１６】比較例２−２で比較精製物２について（Ａ）逆相クロマトグラフィー測定を行って得られたクロマトグラムである。
【図１７】比較例２−２で比較精製物２について（Ｂ）陽イオン交換クロマトグラフィー測定を行って得られたクロマトグラムである。
【図１８】比較例２−２で比較精製物２について検出器に質量分析計を用いた陽イオン交換クロマトグラフィー測定を行って得られたクロマトグラムである。
【図１９】比較例２−２で比較精製物２を誘導体化し、（Ｃ）陰イオン交換クロマトグラフィー測定を行って得られたクロマトグラムである。
【図２０】比較例４−２で比較精製物４について（Ａ）逆相クロマトグラフィー測定を行って得られたクロマトグラムである。
【図２１】比較例４−２で比較精製物４について（Ｂ）陽イオン交換クロマトグラフィー測定を行って得られたクロマトグラムである。
【図２２】比較例４−２で比較精製物４について検出器に質量分析計を用いた陽イオン交換クロマトグラフィー測定を行って得られたクロマトグラムである。
【図２３】比較例４−２で比較精製物４を誘導体化し、（Ｃ）陰イオン交換クロマトグラフィー測定を行って得られたクロマトグラムである。
【図２４】比較例４−２で比較精製物４を誘導体化し、検出器に質量分析計を用いた陰イオン交換クロマトグラフィー測定を行って得られたクロマトグラムである。
【図２５】比較例５でポリエチレングリコール１について（Ａ）逆相クロマトグラフィー測定を行って得られたクロマトグラムである。
【図２６】比較例５でポリエチレングリコール１について（Ｂ）陽イオン交換クロマトグラフィー測定を行って得られたクロマトグラムである。
【図２７】比較例５でポリエチレングリコール１について検出器に質量分析計を用いた陽イオン交換クロマトグラフィー測定を行って得られたクロマトグラムである。
【図２８】比較例５でポリエチレングリコール１を誘導体化し、（Ｃ）陰イオン交換クロマトグラフィー測定を行って得られたクロマトグラムである。
【図２９】比較例５でポリエチレングリコール１を誘導体化し、検出器に質量分析計を用いた陰イオン交換クロマトグラフィー測定を行って得られたクロマトグラムである。
【図３０】比較例６でポリエチレングリコール２について（Ａ）逆相クロマトグラフィー測定を行って得られたクロマトグラムである。
【図３１】比較例６でポリエチレングリコール２について（Ｂ）陽イオン交換クロマトグラフィー測定を行って得られたクロマトグラムである。
【図３２】比較例６でポリエチレングリコール２について検出器に質量分析計を用いた陽イオン交換クロマトグラフィー測定を行って得られたクロマトグラムである。
【図３３】比較例６でポリエチレングリコール２を誘導体化し、（Ｃ）陰イオン交換クロマトグラフィー測定を行って得られたクロマトグラムである。
【図３４】比較例６でポリエチレングリコール２を誘導体化し、検出器に質量分析計を用いた陰イオン交換クロマトグラフィー測定を行って得られたクロマトグラムである。
【図３５】実施例１−３で化合物８を含有する精製物について（Ｄ）逆相クロマトグラフィー測定を行って得られたクロマトグラムである。
【図３６】実施例１−３で展開溶媒について逆相クロマトグラフィー測定を行って得られたクロマトグラムである。
【図３７】実施例２−３で化合物１８を含有する精製物について（Ｄ）逆相クロマトグラフィー測定を行って得られたクロマトグラムである。
【図３８】比較例１−３で比較精製物１−１について（Ｄ）逆相クロマトグラフィー測定を行って得られたクロマトグラムである。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。本発明のヘテロ型単分散ポリエチレングリコールは、（Ａ）逆相クロマトグラフィー、（Ｂ）陽イオン交換クロマトグラフィー、及び（Ｃ）陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて分離したときのクロマトグラムにおいて、特定の条件を満たすことを特徴とするものである。
【００３５】
＜ヘテロ型単分散ポリエチレングリコール＞
本発明において、ヘテロ型単分散ポリエチレングリコールとは、両末端に互いに異なる官能基を有するヘテロ型ポリエチレングリコールを主成分として含有し、かつ、分子量が一定である単分散ポリエチレングリコールを指す。本発明においては、前記主成分として、下記式（１）：
ＮＨ２−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ａ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ    ・・・（１）
で表される化合物（ヘテロ型ポリエチレングリコール）を含有する。
【００３６】
前記式（１）において、ａは６〜４０の整数を表し、ＡＤＣ用のリンカーとして使用する観点からは、ａとしては６〜２４の整数であることが好ましい。本発明のヘテロ型単分散ポリエチレングリコールは、前記式（１）で表され、エチレングリコール鎖長（すなわちａの値）が互いに同じである化合物（ヘテロ型ポリエチレングリコール）を高純度で含有しており、具体的には、（Ａ）逆相クロマトグラフィー、（Ｂ）陽イオン交換クロマトグラフィー、及び（Ｃ）陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて分離したときの示差屈折率計で検出されるクロマトグラムにおいて、下記の特定の条件を満たす。
【００３７】
なお、以下、本発明において、「示差屈折率計で検出されるクロマトグラム」とは、縦軸（ｙ軸）が検出器である示差屈折率計から得られた信号強度を、横軸（ｘ軸）が溶出時間（カラム保持時間）を、それぞれ示すクロマトグラムである。また、「溶出開始点」とは、クロマトグラフィーのカラムを通過した試料が検出器によって最初に検出される溶出時間を示し、「溶出終了点」とは、カラムを通過した試料が検出器によって最後に検出される溶出時間を示す。
【００３８】
さらに、前記クロマトグラムにおいて、「ポリエチレングリコール由来のピーク」とは、展開溶媒等の試料以外の成分に起因するピーク、並びに、使用したカラムや装置に起因するベースラインの揺らぎによる擬似ピークを除いたピークのことを示す。このような展開溶媒等に起因するピークや、使用したカラムや装置に起因するベースラインの揺らぎによる擬似ピークは、試料を含まない展開溶媒のみをカラムにインジェクションして測定することにより特定することができる。
【００３９】
なお、本発明において、前記「ポリエチレングリコール」とは、次式：−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−［ｎは正の整数を示す］で表されるエチレングリコール鎖を有する化合物のことを示し、例えば、前記式（１）で表される化合物の他、前記式（１）中のアミノ基（ＮＨ２）に代えてカルボキシル基（ＣＯＯＨ）、水素原子、ハロゲン原子又は他の官能基を有する化合物；前記式（１）中のカルボキシル基に代えてアミノ基、水素原子、ハロゲン原子又は他の官能基を有する化合物；前記式（１）中のａが６〜４０以外の整数である化合物等の、後述する中間体や不純物等が挙げられる。なお、前記他の官能基としては、特に制限されないが、水酸基、トシル基（Ｔｓ）、メシル基（Ｍｓ）、フタルイミド基、トリチル基（Ｔｒｔ）、ベンジル基（Ｂｎ）、ＴｓＯで表される基、ＭｓＯで表される基、ＴｒｔＯで表される基、ＢｎＯで表される基、ＣＯＯＲで表される基［Ｒは炭化水素基を示す。］、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基（ｔＢｏｃ）が挙げられ、前記ハロゲン原子としては、塩素原子が挙げられる。
【００４０】
＜（Ａ）逆相クロマトグラフィー＞
本発明のヘテロ型単分散ポリエチレングリコールは、逆相クロマトグラフィーを用いて分離したときの、示差屈折率計で検出されるクロマトグラムの溶出開始点から溶出終了点までを結んだ直線をｂａｓｅＬ１とし、ｂａｓｅＬ１から上のポリエチレングリコール由来の全ピーク面積をａｒｅａＡ１とし、屈折率差最大ピークＰ１の頂点Ｐ１ｔｏｐのｂａｓｅＬ１からの高さをＰ１ｔｏｐＨとし、溶出開始点からＰ１ｔｏｐに向かうＰ１上の溶出曲線において、ｂａｓｅＬ１からの高さがＰ１ｔｏｐＨの１／４となる点と３／４となる点とを結んだ直線をＰ１Ｌａとし、Ｐ１ＬａとｂａｓｅＬ１とが交わる溶出時間をＴ１ａとし、Ｐ１ｔｏｐから溶出終了点に向かうＰ１上の溶出曲線において、ｂａｓｅＬ１からの高さがＰ１ｔｏｐＨの１／４となる点と３／４となる点とを結んだ直線をＰ１Ｌｂとし、Ｐ１ＬｂとｂａｓｅＬ１とが交わる溶出時間をＴ１ｂとし、ｂａｓｅＬ１から上のＴ１ａからＴ１ｂの間のピーク面積をａｒｅａＰ１としたとき、ａｒｅａＡ１とａｒｅａＰ１とが、下記式（Ｆ１）：
ａｒｅａＰ１／ａｒｅａＡ１≧０．９０    ・・・（Ｆ１）
で表される条件を満たす。
【００４１】
前記クロマトグラムにおいて、「屈折率差最大ピークＰ１」は、前記式（１）で表される化合物（ヘテロ型ポリエチレングリコール）に由来するピークを含むピークである。前記式（１）で表される化合物に由来するピークを含むピークであることは、検出器として前記示差屈折率計に代えて質量分析計を用いること以外は同一条件で測定することで確認することができる。
【００４２】
図１に、ヘテロ型単分散ポリエチレングリコールを逆相クロマトグラフィーを用いて分離したときの、示差屈折率計で検出されるクロマトグラムの模式図を示す。逆相カラムに試料溶液を注入して展開すると、試料溶液中に含まれる化合物が親水性の高い化合物から順に溶出される。このときの溶出開始点から溶出終了点までを結んだ直線をｂａｓｅＬ１とし、ｂａｓｅＬ１から上の全ピーク面積をａｒｅａＡ１とする。次に、屈折率差最大ピークＰ１の頂点をＰ１ｔｏｐとし、そのｂａｓｅＬ１からの高さをＰ１ｔｏｐＨとする。溶出開始点からＰ１ｔｏｐに向かうＰ１上の溶出曲線において、ｂａｓｅＬ１からの高さがＰ１ｔｏｐＨの１／４となる点と３／４となる点を結んだ直線をＰ１Ｌａとし、Ｐ１ＬａとｂａｓｅＬ１とが交わる溶出時間をＴ１ａとする。さらに、Ｐ１ｔｏｐから溶出終了点に向かうＰ１上の溶出曲線において、ｂａｓｅＬ１からの高さがＰ１ｔｏｐＨの１／４となる点と３／４となる点を結んだ直線をＰ１Ｌｂとし、Ｐ１ＬｂとｂａｓｅＬ１とが交わる溶出時間をＴ１ｂとする。ｂａｓｅＬ１から上のＴ１ａからＴ１ｂの間のピーク面積をａｒｅａＰ１とする。
【００４３】
本発明のヘテロ型単分散ポリエチレングリコールにおいては、このように求められるａｒｅａＰ１／ａｒｅａＡ１が、０．９０以上である。ａｒｅａＡ１の値はポリエチレングリコール由来の全ピーク面積を、ａｒｅａＰ１の値は屈折率差最大ピークＰ１のピーク面積を示すことから、屈折率差最大ピークＰ１が、前記式（１）で表される化合物のみに由来するピークである場合、ａｒｅａＰ１／ａｒｅａＡ１の値は、前記式（１）で表される化合物の含有量に相当する。なお、目的とする前記式（１）で表される化合物とエチレングリコール鎖長が１つ異なる化合物や、末端の官能基が一部異なる化合物等、逆相クロマトグラフィーで分離できない不純物が前記ヘテロ型単分散ポリエチレングリコール中に含有されている場合には、これらの化合物の含有量もａｒｅａＰ１／ａｒｅａＡ１の値内に含まれる場合がある。
【００４４】
ａｒｅａＰ１／ａｒｅａＡ１の値としては、ａが６〜２４であるときは０．９４以上が好ましく、ａが２５〜４０であるときは０．９０以上が好ましい。なお、本発明のヘテロ型単分散ポリエチレングリコールにおいては、前記式（１）中、ａの値が増加するに伴って製造工程数が増加するため、目的とする前記式（１）で表される化合物とエチレングリコール鎖長の異なる化合物の含有量が増加する傾向にある。ａｒｅａＰ１／ａｒｅａＡ１の値が前記下限未満である場合には、前記式（１）で表される化合物とエチレングリコール鎖長が異なる化合物や末端に前記式（１）の組み合わせと異なる官能基を有する化合物等の不純物の含有量が多くなることから、かかるヘテロ型単分散ポリエチレングリコールをＡＤＣのリンカー材料として用いると、薬剤の結合個数の確認が困難になる、薬剤添加量が不明確になる、医薬品申請の際に余分な評価が必要になるといった問題が生じたり、抗体又は薬剤のどちらかが欠損した化合物が生成し、薬剤としての有効性が低下する原因となる。
【００４５】
本発明において、前記逆相クロマトグラフィーの測定条件は、下記の条件：
機器：東ソー（株）社製  ビルドＧＰＣシステム  ＨＬＣ−８２２０
検出器：東ソー（株）社製  ＲＩ−８０２０
カラム：東ソー（株）社製  ＴＳＫｇｅｌ  ＯＤＳ−８０Ｔｓ  （粒子径  ５μｍ、カラムサイズ  ４．６ｍｍ×２５ｃｍ）
流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ
サンプル量：０．２ｍｇ／ｇ、４０μＬ
であり、さらに、前記式（１）で表される化合物のａが６〜１０の場合は、
展開溶媒：５ｍＭ酢酸アンモニウム  メタノール／蒸留水＝２５／７５
カラム温度：４０℃
であり、前記式（１）で表される化合物のａが１１〜２０の場合は、
展開溶媒：５ｍＭ酢酸アンモニウム  メタノール／蒸留水＝３０／７０
カラム温度：４０℃
であり、前記式（１）で表される化合物のａが２１〜４０の場合は、
展開溶媒：５ｍＭ酢酸アンモニウム  メタノール／蒸留水＝５０／５０
カラム温度：４５℃
で測定する。
【００４６】
＜（Ｂ）陽イオン交換クロマトグラフィー＞
本発明のヘテロ型単分散ポリエチレングリコールは、陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて分離したときの、示差屈折率計で検出されるクロマトグラムの溶出開始点から溶出終了点までを結んだ直線をｂａｓｅＬ２とし、ｂａｓｅＬ２から上のポリエチレングリコール由来の全ピーク面積をａｒｅａＡ２とし、屈折率差最大ピークＰ２の頂点Ｐ２ｔｏｐのｂａｓｅＬ２からの高さをＰ２ｔｏｐＨとし、溶出開始点からＰ２ｔｏｐに向かうＰ２上の溶出曲線において、ｂａｓｅＬ２からの高さがＰ２ｔｏｐＨの１／２となる点と１／８となる点とを結んだ直線をＰ２Ｌとし、Ｐ２ＬとｂａｓｅＬ２とが交わる溶出時間をＴ２とし、ｂａｓｅＬ２から上の溶出開始点からＴ２の間のピーク面積をａｒｅａＢ２としたとき、ａｒｅａＢ２とａｒｅａＡ２とが、下記式（Ｆ２）：
ａｒｅａＢ２／ａｒｅａＡ２≦０．０２    ・・・（Ｆ２）
で表される条件を満たす。
【００４７】
前記クロマトグラムにおいて、「屈折率差最大ピークＰ２」は、前記式（１）で表される化合物（ヘテロ型ポリエチレングリコール）に由来するピークを含むピークである。前記式（１）で表される化合物に由来するピークを含むピークであることは、検出器として前記示差屈折率計に代えて質量分析計を用いること以外は同一条件で測定することで確認することができる。
【００４８】
図２に、ヘテロ型単分散ポリエチレングリコールを陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて分離したときの、示差屈折率計で検出されるクロマトグラムの模式図を示す。陽イオン交換カラムに試料溶液を注入して展開すると、試料溶液中に含まれる化合物のうち、アミノ基を有さない化合物が先に溶出され、次にアミノ基を有する化合物が溶出される。このときの溶出開始点から溶出終了点までを結んだ直線をｂａｓｅＬ２とし、ｂａｓｅＬ２から上の全ピーク面積をａｒｅａＡ２とする。次に、屈折率差最大ピークＰ２の頂点をＰ２ｔｏｐとし、ｂａｓｅＬ２からの高さをＰ２ｔｏｐＨとする。溶出開始点からＰ２ｔｏｐに向かうＰ２上の溶出曲線において、ｂａｓｅＬ２からの高さがＰ２ｔｏｐＨの１／２となる点と１／８となる点とを結んだ直線をＰ２Ｌとし、Ｐ２ＬとｂａｓｅＬ２とが交わる溶出時間をＴ２とする。ｂａｓｅＬ２から上の溶出開始点からＴ２の間のピーク面積をａｒｅａＢ２とする。
【００４９】
本発明のヘテロ型単分散ポリエチレングリコールにおいては、このように求められるａｒｅａＢ２／ａｒｅａＡ２が、０．０２以下であり、好ましくは０．０１以下である。ａｒｅａＢ２／ａｒｅａＡ２の値は、前記式（１）で表される化合物に由来するピークを含む屈折率差最大ピークＰ２よりも前に溶出されるピークの割合であることから、本発明では、主に末端官能基としてアミノ基を有さない不純物の含有量に相当する。前記アミノ基を有さない不純物としては、例えば、前記式（１）中のアミノ基に代えてカルボキシル基を有するポリエチレングリコールや、同アミノ基に代えて水酸基を有するポリエチレングリコールが挙げられる。ａｒｅａＢ２／ａｒｅａＡ２の値が前記上限を超える場合には、アミノ基を有さない不純物の含有量が多くなることから、かかるヘテロ型単分散ポリエチレングリコールをＡＤＣのリンカー材料として用いると、抗体又は薬剤のどちらかが欠損した化合物が生成し、薬剤としての有効性が低下する原因となる。
【００５０】
本発明において、前記陽イオン交換クロマトグラフィーの測定条件としては、下記の条件：
機器：東ソー（株）社製  ビルドＧＰＣシステム  ＨＬＣ−８２２０
検出器：東ソー（株）社製  ＲＩ−８０２０
カラム：東ソー（株）社製  ＴＳＫｇｅｌ  ＳＰ−２ＳＷ  （粒子径  ５μｍ、カラムサイズ  ４．６ｍｍ×２５ｃｍ）
展開溶媒：５ｍＭ酢酸アンモニウム  メタノール／蒸留水＝１０／９０
流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度：３０℃
サンプル量：０．２ｍｇ／ｇ、２０μＬ
が挙げられる。
【００５１】
＜（Ｃ）陰イオン交換クロマトグラフィー＞
本発明のヘテロ型単分散ポリエチレングリコールは、前記式（１）で表される化合物を含有するヘテロ型単分散ポリエチレングリコールを誘導体化し、下記式（２）：
ｔＢｏｃ−ＮＨ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ａ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ    ・・・（２）
［式（２）中、ｔＢｏｃはｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基を示し、ａは６〜４０の整数を示す。］
で表される化合物を含有する混合物とし、陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて分離したときの、示差屈折率計で検出されるクロマトグラムの溶出開始点から溶出終了点までを結んだ直線をｂａｓｅＬ３とし、ｂａｓｅＬ３から上のポリエチレングリコール由来の全ピーク面積をａｒｅａＡ３とし、屈折率差最大ピークＰ３の頂点Ｐ３ｔｏｐのｂａｓｅＬ３からの高さをＰ３ｔｏｐＨとし、溶出開始点からＰ３ｔｏｐに向かうＰ３上の溶出曲線において、ｂａｓｅＬ３からの高さがＰ３ｔｏｐＨの１／２となる点と１／８となる点とを結んだ直線をＰ３Ｌとし、Ｐ３ＬとｂａｓｅＬ３とが交わる溶出時間をＴ３とし、ｂａｓｅＬ３から上の溶出開始点からＴ３の間のピーク面積をａｒｅａＢ３としたとき、ａｒｅａＢ３とａｒｅａＡ３とが、下記式（Ｆ３）：
ａｒｅａＢ３／ａｒｅａＡ３≦０．０２    ・・・（Ｆ３）
で表される条件を満たす。
【００５２】
前記式（１）で表される化合物を含有するヘテロ型単分散ポリエチレングリコールを、前記式（２）で表される化合物を含有する混合物に誘導体化する方法としては、公知の方法を使用可能であるが、例えば、前記式（１）で表される化合物を含有するヘテロ型単分散ポリエチレングリコールを水に溶解させ、塩基として水酸化ナトリウムを加え、次いで、二炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチルを加えて反応させることで、前記式（１）で表される化合物から前記式（２）で表される化合物を得ることができる。前記式（２）で表される化合物を含有する混合物は、反応後、例えば、塩酸等によってｐＨを４以下に調整後、塩化ナトリウムを飽和するまで加え、クロロホルム又はジクロロメタンを用いて分液抽出することにより得ることができる。なお、本発明において、前記誘導体化は前記式（１）で表される化合物が消失するまで十分に行うことが必要である。前記式（１）で表される化合物の消失は、質量分析計を用いた測定により確認することができる。
【００５３】
前記クロマトグラムにおいて、「屈折率差最大ピークＰ３」は、前記式（２）で表される化合物に由来するピークを含むピークである。前記式（２）で表される化合物に由来するピークを含むピークであることは、検出器として前記示差屈折率計に代えて質量分析計を用いること以外は同一条件で測定することで確認することができる。
【００５４】
図３に、前記式（２）で表される化合物を含有する混合物を陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて分離したときの、示差屈折率計で検出されるクロマトグラムの模式図を示す。陰イオン交換カラムに試料溶液を注入して展開すると、試料溶液中に含まれる化合物のうち、カルボキシル基を有さない化合物が先に溶出され、次にカルボキシル基を有する化合物が溶出される。このときの溶出開始点から溶出終了点までを結んだ直線をｂａｓｅＬ３とし、ｂａｓｅＬ３から上の全ピーク面積をａｒｅａＡ３とする。次に、屈折率差最大ピークＰ３の頂点をＰ３ｔｏｐとし、ｂａｓｅＬ３からの高さをＰ３ｔｏｐＨとする。溶出開始点からＰ３ｔｏｐに向かうＰ３上の溶出曲線において、ｂａｓｅＬ３からの高さがＰ３ｔｏｐＨの１／２となる点と１／８となる点とを結んだ直線をＰ３Ｌとし、Ｐ３ＬとｂａｓｅＬ３とが交わる溶出時間をＴ３とする。ｂａｓｅＬ３から上の溶出開始点からＴ３の間のピーク面積をａｒｅａＢ３とする。
【００５５】
本発明のヘテロ型単分散ポリエチレングリコールは、このように求められるａｒｅａＢ３／ａｒｅａＡ３が０．０２以下であり、好ましくは０．０１以下である。ａｒｅａＢ３／ａｒｅａＡ３の値は、前記式（２）で表される化合物に由来するピークを含む屈折率差最大ピークＰ３よりも前に溶出されるピークの割合であることから、本発明では、主に末端官能基としてカルボキシル基を有さない不純物の含有量に相当する。前記カルボキシル基を有さない不純物としては、例えば、前記式（２）中のカルボキシル基に代えてｔ−Ｂｏｃ−ＮＨで表される基を有するポリエチレングリコールや、同カルボキシル基に代えて水酸基を有するポリエチレングリコールが挙げられる。ａｒｅａＢ３／ａｒｅａＡ３の値が前記上限を超える場合には、カルボキシル基を有さない不純物の含有量が高くなることから、かかるヘテロ型単分散ポリエチレングリコールをＡＤＣのリンカー材料として用いると、抗体又は薬剤のどちらかが欠損した化合物が生成し、薬剤としての有効性が低下する原因となる。
【００５６】
本発明において、前記陰イオン交換クロマトグラフィーの測定条件としては、下記の条件：
機器：東ソー（株）社製  ビルドＧＰＣシステム  ＨＬＣ−８２２０
検出器：東ソー（株）社製  ＲＩ−８０２０
カラム：東ソー（株）社製  ＴＳＫｇｅｌ  ＤＥＡＥ−２ＳＷ  （粒子径  ５μｍ、カラムサイズ  ４．６ｍｍ×２５ｃｍ）
展開溶媒：５ｍＭ酢酸アンモニウム  メタノール／蒸留水＝１０／９０
流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度：３０℃
サンプル量：０．２ｍｇ／ｇ、３０μＬ
が挙げられる。
【００５７】
＜ヘテロ型単分散ポリエチレングリコールの製造方法＞
前記特定の条件を満たす本発明のヘテロ型単分散ポリエチレングリコールは、本発明のヘテロ型単分散ポリエチレングリコールの製造方法により得ることができる。本発明のヘテロ型単分散ポリエチレングリコールの製造方法は、下記の工程Ａ、工程Ｂ、工程Ｃ及び工程Ｄを含むことを特徴とするものである。
【００５８】
〔工程Ａ〕
本発明に係る工程Ａは、下記式（３）：
ＴｓＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ａ−Ｈ    ・・・（３）
で表される化合物に、下記式（４）：
【００５９】
【化２】
0006638970.tif 000003
【００６０】
で表される化合物を５℃以下の温度条件でマイケル付加反応させ、下記式（５）：
ＴｓＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ａ−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＯＯＲ１    ・・・（５）
で表される化合物を得る工程である。
【００６１】
前記式（３）中、Ｔｓはトシル基を表し、ａは６〜４０の整数を示す。また、前記式（４）中、Ｒ１は炭素数１〜６の炭化水素基を示す。前記炭素数１〜６の炭化水素基としては、具体的には、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基が挙げられる。塩基性条件下での安定性から、Ｒ１としては、イソプロピル基又はｔｅｒｔ−ブチル基であることが好ましい。また、前記式（５）中、Ｔｓはトシル基を示し、Ｒ１は炭素数１〜６の炭化水素基を示し、ａは６〜４０の整数を示す。前記式（５）中のＴｓは前記式（３）中のＴｓに由来するものであり、前記式（５）中のＲ１は前記式（４）中のＲ１に由来するものである。
【００６２】
また、前記式（３）で表される化合物としては、適宜公知の合成方法で得られたものを用いることができるが、前記特定の条件を満たす本発明のヘテロ型単分散ポリエチレングリコールを特に容易に得られるという観点から、後述するヘテロ型単分散ポリエチレングリコール製造用中間体を前記式（３）で表される化合物を含有する材料として用いることが好ましい。
【００６３】
前記マイケル付加反応は、溶媒中で反応を行うことができる。前記溶媒としては、前記式（３）で表される化合物及び前記式（４）で表される化合物と反応しない溶媒であれば特に限定されず、例えば、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、クロロホルム、ジクロロメタン、トルエン等の有機溶媒、及びこれらの混合物が挙げられる。前記溶媒の使用量としては、前記式（３）で表される化合物に対して、通常、質量比で１〜１００倍、好ましくは３〜５０倍、最も好ましくは５〜３０倍量である。前記溶媒の使用量が前記下限未満である場合には、前記式（３）で表される化合物同士が反応する恐れがあり、他方、前記上限を超える場合には、マイケル付加反応の進行が遅くなる傾向にある。
【００６４】
前記マイケル付加反応において、前記式（４）で表される化合物の使用量としては、前記式（３）で表される化合物に対して、通常、モル比で２〜５０倍、好ましくは５〜２５倍である。前記式（４）で表される化合物の使用量が前記下限未満である場合には、マイケル付加反応が完結しない可能性があり、他方、前記上限を超える場合には、前記式（４）で表される化合物の重合体が生成するといった副反応が生じる恐れがある。
【００６５】
前記マイケル付加反応においては、塩基触媒を用いる。前記塩基触媒としては、反応が進行すれば問題ないが、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等の無機触媒が挙げられ、これらの中でも、水酸化カリウムが好ましく、反応性の観点からは、パウダー状の水酸化カリウムがより好ましい。前記塩基触媒の使用量としては、前記式（３）で表される化合物に対して、通常、モル比で０．１〜１０倍、好ましくは０．５〜５倍量である。
【００６６】
前記マイケル付加反応の反応温度としては、通常１０℃以下であり、好ましくは５℃以下、最も好ましくは０℃以下である。前記反応温度が前記上限を超える場合には、前記式（３）で表される化合物同士が反応する恐れがある。また、前記マイケル付加反応の反応時間としては、前記反応温度、前記塩基触媒等の条件により異なるが、通常０．２〜１２時間程度であることが好ましい。
【００６７】
工程Ａにおいては、このようなマイケル付加反応により、前記式（５）で表される化合物を含有する反応生成物を得ることができる。前記反応生成物は、そのまま未精製で次の工程Ｂに用いてもよく、シリカゲルカラムクロマトグラフィーや分液抽出処理及び吸着剤処理等によって前記式（５）で表される化合物を精製してから用いてもよいが、本発明においては、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによる精製をしなくとも高純度の本発明のヘテロ型単分散ポリエチレングリコールを得ることができる。
【００６８】
〔工程Ｂ〕
本発明に係る工程Ｂは、前記式（５）で表される化合物をフタルイミドカリウムと反応させ、下記式（６）：
ＰＩ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ａ−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＯＯＲ１    ・・・（６）
で表される化合物を得る工程である。
【００６９】
前記式（６）中、ＰＩはフタルイミド基を示し、Ｒ１は炭素数１〜６の炭化水素基を示し、ａは６〜４０の整数を示す。前記炭素数１〜６の炭化水素基は、前記式（５）で表される化合物中のＲ１に由来するものであり、前記式（４）中のＲ１と同義である。
【００７０】
工程Ｂにおける反応は、溶媒中で行うことができる。前記溶媒としては、前記式（５）で表される化合物及びフタルイミドカリウムと反応しない溶媒であれば特に限定されず、例えば、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、クロロホルム、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）等の有機溶媒、及びこれらの混合物が挙げられる。これらの中でも、反応速度の観点からは、テトラヒドロフラン、ＤＭＦ又はアセトニトリルが好ましい。前記溶媒の使用量としては、前記式（５）で表される化合物に対して、通常、質量比で１〜１００倍、好ましくは３〜５０倍、最も好ましくは５〜３０倍量である。
【００７１】
工程Ｂにおいて、前記フタルイミドカリウムの使用量としては、前記式（５）で表される化合物に対して、通常、モル比で１．１〜１０倍、好ましくは１．５〜５倍である。フタルイミドカリウムの使用量が前記下限未満である場合には反応が完結しない可能性があり、他方、前記上限を超える場合には、未反応のフタルイミドカリウムが残存するため、これを除去する必要が生じる。
【００７２】
また、工程Ｂにおける反応温度としては、使用する溶媒により異なるが、通常、１０〜１００℃である。さらに、工程Ｂにおける反応時間としては、前記反応温度の条件により異なるが、通常１〜２４時間程度が好ましい。
【００７３】
工程Ｂにおいては、このような反応により、前記式（６）で表される化合物を含有する反応生成物を得ることができる。前記反応生成物は、そのまま未精製で次の工程Ｃに用いてもよく、シリカゲルカラムクロマトグラフィーや分液抽出処理及び吸着剤処理等によって前記式（６）で表される化合物を精製してから用いてもよいが、本発明においては、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによる精製をしなくとも高純度の本発明のヘテロ型単分散ポリエチレングリコールを得ることができる。
【００７４】
〔工程Ｃ〕
本発明に係る工程Ｃは、前記式（６）で表される化合物を脱フタルイミド化し、下記式（７）：
Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ａ−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＯＯＲ１    ・・・（７）
で表される化合物を得る工程である。
【００７５】
前記式（７）中、Ｒ１は炭素数１〜６の炭化水素基を示し、ａは６〜４０の整数を示す。前記炭素数１〜６の炭化水素基は、前記式（６）で表される化合物中のＲ１に由来するものであり、前記式（４）中のＲ１と同義である。
【００７６】
前記脱フタルイミド化反応は、溶媒中で反応を行うことができる。前記溶媒としては、前記式（６）で表される化合物及び前記式（７）で表される化合物と反応しない溶媒であれば特に限定されず、例えば、水、メタノール、エタノール、イソプロパノール、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、クロロホルム等の溶媒、及びこれらの混合物が挙げられる。これらの中でも、好ましくはメタノール、エタノールである。前記溶媒の使用量としては、前記式（６）で表される化合物に対して、通常、質量比で１〜１００倍、好ましくは３〜５０倍、最も好ましくは５〜３０倍量である。前記溶媒の使用量が前記下限未満である場合には、脱保護されたフタル酸類が析出して撹拌が困難となる恐れがあり、他方、前記上限を超える場合には反応の進行が遅くなる傾向にある。
【００７７】
前記脱フタルイミド化反応は塩基化合物存在下で行う。前記塩基化合物としては、反応が進行すれば問題ないが、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等の無機塩基；ヒドラジン・１水和物やエチレンジアミン等の１級アミン類が挙げられ、これらの中でも、副反応を抑制する観点からは、塩基性の弱いヒドラジン・１水和物やエチレンジアミン等の１級アミン類が好ましい。前記塩基化合物の使用量としては、使用する塩基化合物の種類により異なるが、前記式（６）で表される化合物に対して、通常、モル比で１．０〜２０倍、好ましくは２．０〜１５倍量である。
【００７８】
前記脱フタルイミド化反応の反応温度としては、使用する塩基化合物や溶媒により異なるが、通常１０〜１００℃である。また、前記脱フタルイミド化反応の反応時間としては、前記反応温度等の条件により異なるが、通常０．５〜１２時間程度が好ましい。
【００７９】
工程Ｃにおいては、このような脱フタルイミド化反応により、前記式（７）で表される化合物を含有する反応生成物を得ることができる。前記反応生成物は、そのまま未精製で次の工程Ｄに用いてもよく、シリカゲルカラムクロマトグラフィーや分液抽出処理及び吸着剤処理等によって前記式（７）で表される化合物を精製してから用いてもよいが、本発明においては、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによる精製をしなくとも高純度の本発明のヘテロ型単分散ポリエチレングリコールを得ることができる。
【００８０】
〔工程Ｄ〕
本発明に係る工程Ｄは、前記工程Ｃで得られた前記式（７）で表される化合物を含有する反応生成物に分液抽出処理及び酸加水分解処理を施して前記式（１）で表される化合物を含有する前記ヘテロ型単分散ポリエチレングリコールを得る工程である。
【００８１】
前記分液抽出処理及び前記酸加水分解処理としてはいずれが先であってもよいが、前記式（１）で表される化合物として、エチレングリコール鎖の短い化合物を製造する場合、具体的には、前記式（３）及び（５）〜（７）中のａがそれぞれ６〜１０の整数である場合（以下、場合により「製造Ｉ」という。）には、前記分液抽出処理の後に前記酸加水分解処理を施すことが好ましい。他方、前記式（１）で表される化合物として、エチレングリコール鎖の長い化合物を製造する場合、具体的には、前記式（３）及び（５）〜（７）中のａがそれぞれ１１〜４０の整数である場合（以下、場合により「製造ＩＩ」という。）には、前記酸加水分解処理の後に前記分液抽出処理を施すことが好ましい。
【００８２】
・酸加水分解処理
本発明に係る酸加水分解処理は、前記式（７）で表される化合物を酸加水分解して前記式（１）で表される化合物を得る処理である。前記酸加水分解は、溶媒中で反応を行うことができる。前記溶媒としては、例えば、水、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、クロロホルム、ジクロロメタン等の溶媒、及びこれらの混合物が挙げられる。これらの中でも、水又はジクロロメタンが好ましい。前記溶媒の使用量としては、前記式（７）で表される化合物に対して、通常、質量比で０．５〜５０倍、好ましくは０．８〜４０倍、最も好ましくは１〜３０倍量である。前記溶媒の使用量が前記下限未満である場合には粘度が高くなって撹拌効率が低下する恐れがあり、他方、前記上限を超える場合には反応の進行が遅くなる傾向にある。
【００８３】
前記酸加水分解においては、酸触媒を用いる。前記酸触媒としては、反応が進行すれば問題ないが、例えば、塩酸、リン酸、トリフルオロ酢酸等が挙げられ、これらの中でも、副反応を抑制する観点からは、塩酸が好ましい。前記酸触媒の使用量としては、使用する酸触媒の種類により異なるが、例えば、１Ｍ塩酸を使用する場合、前記式（７）で表される化合物に対して、通常、重量比で０．５〜１０倍である。
【００８４】
前記酸加水分解の反応温度としては、使用する酸触媒により異なるが、通常１０〜１００℃である。また、前記酸加水分解の反応時間としては、反応温度等の条件により異なるが、通常０．５〜１２時間程度であることが好ましい。
【００８５】
・分液抽出処理
前記分液抽出処理は、有機溶媒で分液洗浄する洗浄工程（ｗ）と、前記洗浄工程（ｗ）の後に目的の化合物を分液抽出する抽出工程（ｅ）と、を含む処理である。
【００８６】
（洗浄工程）
前記洗浄工程（ｗ）としては、目的の化合物を酸性水溶液に溶解させて有機溶媒で分液洗浄する酸洗浄処理、及び、目的の化合物を塩基性水溶液に溶解させて有機溶媒で分液洗浄する塩基洗浄処理が挙げられる。前記洗浄工程（ｗ）としては、前記製造Ｉの場合、前記式（７）で表される化合物を含有する反応生成物を酸性水溶液に溶解させて有機溶媒で分液洗浄する酸洗浄処理を施す洗浄工程（ｗ１）であることが好ましい。他方、前記製造ＩＩの場合、前記酸加水分解処理で得られた前記式（１）で表される化合物を含有する反応生成物に、酸性水溶液に溶解させて有機溶媒で分液洗浄する酸洗浄処理、及び、塩基性水溶液に溶解させて有機溶媒で分液洗浄する塩基洗浄処理を施す洗浄工程（ｗ２）であることが好ましい。また、洗浄工程（ｗ２）において、前記酸洗浄処理及び前記塩基洗浄処理としてはいずれの処理が先であってもよいが、前記酸加水分解処理の後の溶媒をそのまま前記酸性水溶液として用いることができるという観点から、前記酸洗浄処理の後に前記塩基洗浄処理を施すことが好ましい。
【００８７】
前記洗浄工程（ｗ）に用いる有機溶媒としては、酢酸エチル、トルエン、クロロホルム、ジクロロメタン等が挙げられ、不純物の溶解性の観点からは、クロロホルム、ジクロロメタンが好ましい。前記有機溶媒の使用量としては、目的の化合物（製造Ｉの場合：前記式（７）で表される化合物、製造ＩＩの場合：前記式（１）で表される化合物）に対して、通常、質量比で２〜３０倍、好ましくは３〜２０倍である。前記有機溶媒の使用量が前記下限未満である場合には洗浄効率が低下する恐れがあり、他方、前記上限を超える場合には、洗浄効率の向上が見込まれない。
【００８８】
前記酸洗浄処理に用いる酸性水溶液としては、目的の化合物（製造Ｉの場合：前記式（７）で表される化合物、製造ＩＩの場合：前記式（１）で表される化合物）を分解しない酸強度であれば問題ないが、ｐＨ  ５以下の酸性水溶液であることが好ましく、例えば、ｐＨ  ３に調整した塩酸水溶液や塩化アンモニウム水溶液等が挙げられる。前記酸性水溶液の使用量としては、目的の化合物（製造Ｉの場合：前記式（７）で表される化合物、製造ＩＩの場合：前記式（１）で表される化合物）に対して、通常、質量比で２〜３０倍、好ましくは３〜２０倍である。前記酸性水溶液の使用量が前記下限未満である場合には、前記目的の化合物が前記有機溶媒中に溶け込む恐れがあり、他方、前記上限を超える場合には、下記の抽出工程において抽出効率が低下する傾向にある。
【００８９】
前記塩基洗浄処理に用いる塩基性水溶液としては、前記式（１）で表される化合物を分解しない塩基性であれば問題なく、ｐＨ  ８以上の塩基性水溶液が好ましく、例えば、ｐＨ  ９に調整した水酸化ナトリウム水溶液や水酸化カリウム水溶液等が挙げられる。前記塩基性水溶液の使用量としては、前記式（１）で表される化合物に対して、通常、質量比で２〜３０倍、好ましくは３〜２０倍である。前記塩基性水溶液の使用量が前記下限未満である場合には、前記式（１）で表される化合物が前記有機溶媒中に溶け込む恐れがあり、他方、前記上限を超える場合には、下記の抽出工程において抽出効率が低下する。
【００９０】
前記洗浄工程（ｗ）においては、前記酸性水溶液又は前記塩基性水溶液に目的の化合物（製造Ｉの場合：前記式（７）で表される化合物、製造ＩＩの場合：前記式（１）で表される化合物）を含有する反応生成物を溶解させ、ここに前記有機溶媒を添加して攪拌した後に有機溶媒を除去する分液洗浄を行うことにより、前記有機溶媒中に不純物を溶解させて除去する。前記分液洗浄を行う回数としては、特に限定はなく、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）や質量分析（ＭＳ）測定等によって水溶液中に含まれる不純物を確認しながら複数回行うことが好ましい。
【００９１】
前記酸洗浄処理において、前記有機溶媒と前記酸性水溶液との比率としては、通常、質量比で有機溶媒／酸性水溶液の値が、０．２〜３．０であり、０．５〜２．０であることが好ましい。また、前記塩基洗浄処理において、前記有機溶媒と前記塩基性水溶液との比率としては、通常、質量比で有機溶媒／塩基性水溶液の値が、０．２〜３．０であり、０．５〜２．０であることが好ましい。
【００９２】
（抽出工程）
前記抽出工程（ｅ）では、目的の化合物を分液抽出する。前記抽出工程（ｅ）としては、前記製造Ｉの場合、前記洗浄工程（ｗ１）の後に前記式（７）で表される化合物を分液抽出する抽出工程（ｅ１）であることが好ましく、他方、前記製造ＩＩの場合、前記洗浄工程（ｗ２）の後に前記式（１）で表される化合物を含有するヘテロ型単分散ポリエチレングリコールを分液抽出する抽出工程（ｅ２）であることが好ましい。
【００９３】
前記抽出工程（ｅ）においては、前記洗浄工程（ｗ）後の水溶液の酸強度を必要に応じ調整し、塩で飽和させる。次いで、この水溶液に有機溶媒を添加して攪拌した後水溶液を除去することにより、前記有機溶媒中に目的の化合物を得ることができる。
【００９４】
前記抽出工程（ｅ）における前記水溶液の酸強度としては、目的の化合物（製造Ｉの場合：前記式（７）で表される化合物、製造ＩＩの場合：前記式（１）で表される化合物）を分解しない酸強度であれば問題ない。また、前記水溶液を塩で飽和させる際の塩濃度としては、前記目的の化合物を前記有機溶媒で抽出可能な塩濃度であれば問題ない。このような水溶液としては、例えば、ｐＨ  ３に調整した塩酸水溶液に塩濃度が２３％以上となるように塩化ナトリウムや塩化カリウムを加えた水溶液が挙げられる。前記水溶液の使用量としては、目的の化合物（製造Ｉの場合：前記式（７）で表される化合物、製造ＩＩの場合：前記式（１）で表される化合物）に対して、通常、質量比で２〜３０倍、好ましくは３〜２０倍である。前記水溶液の使用量が前記下限未満である場合には水溶液中の不純物が有機溶媒中に抽出される恐れがあり、他方、前記上限を超える場合には、抽出効率が低下する傾向にある。
【００９５】
前記抽出工程（ｅ）に用いる有機溶媒としては、酢酸エチル、トルエン、クロロホルム、ジクロロメタンが挙げられ、目的の化合物（製造Ｉの場合：前記式（７）で表される化合物、製造ＩＩの場合：前記式（１）で表される化合物）の溶解性の観点からは、クロロホルム、ジクロロメタンが好ましい。前記有機溶媒の使用量としては、前記目的の化合物に対して、通常、質量比で２〜３０倍、好ましくは３〜２０倍である。前記有機溶媒の使用量が前記下限未満である場合には抽出効率が低下し、他方、前記上限を超える場合には、抽出効率の向上が見込まれない。
【００９６】
前記抽出工程（ｅ）において、前記有機溶媒と前記水溶液との比率としては、通常、質量比で有機溶媒／水溶液の値が、０．２〜３．０であり、０．５〜２．０であることが好ましい。また、抽出工程（ｅ）を行う回数としては、特に限定はなく、ＴＬＣやＭＳ測定等によって水溶液中に含まれる前記式（１）で表される化合物又は前記式（７）で表される化合物を確認しながら複数回行うことが好ましい。
【００９７】
工程Ｄにおいては、前記工程Ｃで得られた前記式（７）で表される化合物を含有する反応生成物に、このような分液抽出処理及び酸加水分解処理を施すことにより、前記式（１）で表される化合物を高純度で含有する本発明のヘテロ型単分散ポリエチレングリコールを得ることができる。なお、前記製造Ｉの場合には、前記加水分解処理の後に水を、前記製造ＩＩの場合には、前記分液抽出処理の抽出工程（ｅ２）の後に有機溶媒を、それぞれ除去することにより、シリカゲルカラムクロマトグラフィー等による精製をしなくとも、前記ヘテロ型単分散ポリエチレングリコールを得ることができる。
【００９８】
＜ヘテロ型単分散ポリエチレングリコール製造用中間体＞
本発明のヘテロ型単分散ポリエチレングリコール製造用中間体は、前記本発明のヘテロ型単分散ポリエチレングリコール製造に用いられるものであり、主成分として、下記式（３）：
ＴｓＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ａ−Ｈ    ・・・（３）
で表される化合物を含有する。
【００９９】
前記式（３）において、Ｔｓはトシル基を示し、ａは６〜４０の整数を示す。本発明のヘテロ型単分散ポリエチレングリコール製造用中間体は、前記式（３）で表され、エチレングリコール鎖長（すなわちａの値）が互いに同じである化合物を高純度で含有しており、具体的には、（Ｄ）逆相クロマトグラフィーを用いて分離したときの示差屈折率計で検出されるクロマトグラムにおいて、下記の特定の条件を満たす。
【０１００】
＜（Ｄ）逆相クロマトグラフィー＞
本発明のヘテロ型単分散ポリエチレングリコール製造用中間体は、逆相クロマトグラフィーを用いて分離したときの、示差屈折率計で検出されるクロマトグラムの溶出開始点から溶出終了点までを結んだ直線をｂａｓｅＬ４とし、ｂａｓｅＬ４から上のポリエチレングリコール由来の全ピーク面積をａｒｅａＡ４とし、屈折率差最大ピークＰ４の頂点Ｐ４ｔｏｐのｂａｓｅＬ４からの高さをＰ４ｔｏｐＨとし、溶出開始点からＰ４ｔｏｐに向かうＰ４上の溶出曲線において、ｂａｓｅＬ４からの高さがＰ４ｔｏｐＨの１／４となる点と３／４となる点とを結んだ直線をＰ４Ｌａとし、Ｐ４ＬａとｂａｓｅＬ４とが交わる溶出時間をＴ４ａとし、Ｐ４ｔｏｐから溶出終了点に向かうＰ４上の溶出曲線において、ｂａｓｅＬ４からの高さがＰ４ｔｏｐＨの１／４となる点と３／４となる点とを結んだ直線をＰ４Ｌｂとし、Ｐ４ＬｂとｂａｓｅＬ４とが交わる溶出時間をＴ４ｂとし、ｂａｓｅＬ４から上のＴ４ａからＴ４ｂの間のピーク面積をａｒｅａＰ４としたとき、ａｒｅａＡ４とａｒｅａＰ４とが、下記式（Ｆ４）：
ａｒｅａＰ４／ａｒｅａＡ４≧０．９２    ・・・（Ｆ４）
で表される条件を満たす。
【０１０１】
前記クロマトグラムにおいて、「屈折率差最大ピークＰ４」は、前記式（３）で表される化合物に由来するピークを含むピークである。前記式（３）で表される化合物に由来するピークを含むピークであることは、検出器として前記示差屈折率計に代えて質量分析計を用いること以外は同一条件で測定することで確認することができる。
【０１０２】
図４に、ヘテロ型単分散ポリエチレングリコール製造用中間体を逆相クロマトグラフィーを用いて分離したときの、示差屈折率計で検出されるクロマトグラムの模式図を示す。逆相カラムに試料溶液を注入して展開すると、試料溶液中に含まれる化合物が親水性の高い化合物から順に溶出される。このときの溶出開始点から溶出終了点までを結んだ直線をｂａｓｅＬ４とし、ｂａｓｅＬ４から上の全ピーク面積をａｒｅａＡ４とする。次に、屈折率差最大ピークＰ４の頂点をＰ４ｔｏｐとし、ｂａｓｅＬ４からの高さをＰ４ｔｏｐＨとする。溶出開始点からＰ４ｔｏｐに向かうＰ４上の溶出曲線において、ｂａｓｅＬ４からの高さがＰ４ｔｏｐＨの１／４となる点と３／４となる点を結んだ直線をＰ４Ｌａとし、Ｐ４ＬａとｂａｓｅＬ４とが交わる溶出時間をＴ４ａとする。さらに、Ｐ４ｔｏｐから溶出終了点に向かうＰ４上の溶出曲線において、ｂａｓｅＬ４からの高さがＰ４ｔｏｐＨの１／４となる点と３／４となる点とを結んだ直線をＰ４Ｌｂとし、Ｐ４ＬｂとｂａｓｅＬ４とが交わる溶出時間をＴ４ｂとする。ｂａｓｅＬ４から上のＴ４ａからＴ４ｂの間のピーク面積をａｒｅａＰ４とする。
【０１０３】
本発明のヘテロ型単分散ポリエチレングリコール製造用中間体においては、このように求められるａｒｅａＰ４／ａｒｅａＡ４が、０．９２以上である。ａｒｅａＡ４の値はポリエチレングリコール由来の全ピーク面積を、ａｒｅａＰ４の値は屈折率差最大ピークＰ４のピーク面積を示すことから、屈折率差最大ピークＰ４が、前記式（３）で表される化合物のみに由来するピークである場合、ａｒｅａＰ４／ａｒｅａＡ４の値は、前記式（３）で表される化合物の含有量に相当する。なお、目的とする前記式（３）で表される化合物とエチレングリコール鎖長が１つ異なる化合物や、末端の官能基が一部異なる化合物等、逆相クロマトグラフィーで分離できない不純物が前記ヘテロ型単分散ポリエチレングリコール製造用中間体に含有されている場合には、これらの化合物の含有量もａｒｅａＰ４／ａｒｅａＡ４の値内に含まれる可能性がある。
【０１０４】
ａｒｅａＰ４／ａｒｅａＡ４の値としては、ａが６〜２４であるときは０．９５以上が好ましく、２５〜４０であるときは０．９２以上が好ましい。なお、本発明のヘテロ型単分散ポリエチレングリコール製造用中間体においては、前記式（３）中、ａの値が増加するに伴って製造工程数が増加するため、目的とする前記式（３）で表される化合物とエチレングリコール鎖長の異なる化合物の含有量が増加する傾向にある。ａｒｅａＰ４／ａｒｅａＡ４の値が前記下限未満である場合には、エチレングリコール鎖長が異なる化合物や末端に前記式（３）の組み合わせと異なる官能基を有する化合物等の不純物の含有量が多くなることから、かかるヘテロ型単分散ポリエチレングリコール製造用中間体を用いて合成したヘテロ型単分散ポリエチレングリコールをＡＤＣのリンカー材料として用いると、薬剤の結合個数の確認が困難になる、薬剤添加量が不明確になる、医薬品申請の際に余分な評価が必要になるといった問題が生じたり、抗体又は薬剤のどちらかが欠損した化合物が生成し、薬剤としての有効性が低下する原因となる。
【０１０５】
本発明において、前記逆相クロマトグラフィーの測定条件は、下記の条件：
機器：東ソー（株）社製  ビルドＧＰＣシステム  ＨＬＣ−８２２０
検出器：東ソー（株）社製  ＲＩ−８０２０
カラム：東ソー（株）社製  ＴＳＫｇｅｌ  ＯＤＳ−８０Ｔｓ  （粒子径  ５μｍ、カラムサイズ  ４．６ｍｍ×２５ｃｍ）
流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ
サンプル量：０．２ｍｇ／ｇ、４０μＬ
であり、さらに、前記式（３）で表される化合物のａが６〜１０の場合は、
展開溶媒：５ｍＭ酢酸アンモニウム  メタノール／蒸留水＝５０／５０
カラム温度：４０℃
であり、前記式（３）で表される化合物のａが１１〜２０の場合は、
展開溶媒：５ｍＭ酢酸アンモニウム  メタノール／蒸留水＝６０／４０
カラム温度：４０℃
であり、前記式（３）で表される化合物のａが２１〜４０の場合は、
展開溶媒：５ｍＭ酢酸アンモニウム  メタノール／蒸留水＝６５／３５
カラム温度：４５℃
で測定する。
【０１０６】
＜ヘテロ型単分散ポリエチレングリコール製造用中間体の製造方法＞
前記特定の条件を満たす本発明のヘテロ型単分散ポリエチレングリコール製造用中間体は、本発明のヘテロ型単分散ポリエチレングリコール製造用中間体の製造方法により得ることができる。本発明のヘテロ型単分散ポリエチレングリコール製造用中間体の製造方法は、下記の工程ａ、工程ｂ、工程ｃ及び工程ｄを含むことを特徴とするものである。
【０１０７】
〔工程ａ〕
本発明に係る工程ａは、下記式（８）：
ＨＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｂ−Ｈ    ・・・（８）
で表される化合物と下記式（９）：
ＬＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｃ−Ｒ２    ・・・（９）
で表される化合物とを下記式（Ｆ５）：
６≦ｂ＋ｃ≦４０    ・・・（Ｆ５）
で表される条件を満たすように求核置換反応させ、下記式（１０）：
ＨＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ａ−Ｒ２    ・・・（１０）
で表される化合物を得る工程である。
【０１０８】
前記式（８）中、ｂは３〜３７の整数を示し、前記式（９）中、Ｌはトシル基又はメシル基を示し、Ｒ２はトリチル基又はベンジル基を示し、ｃは３〜３７の整数を示す。また、式（８）中のｂ及び式（９）中のｃは、ｂ＋ｃ＝６〜４０であり、前記式（Ｆ５）で表される条件を満たす。
【０１０９】
前記式（８）で表される化合物及び式（９）で表される化合物は、市販品を利用できる他、公知の合成方法により得ることができる。また、前記式（９）で表される化合物としては、本工程ａにより得られる前記式（１０）で表される化合物をトシル化又はメシル化した化合物や、後述する工程ｂにより得られる式（１１）で表される化合物を利用することで、エチレングリコール鎖長の長い、すなわち前記式（１０）中のａの数が大きい化合物を合成することが可能である。
【０１１０】
前記式（８）で表される化合物と前記式（９）で表される化合物とを塩基存在下で求核置換反応させることにより、前記式（１０）で表される化合物を含む反応生成物を得ることができる。前記式（１０）中、Ｒ２はトリチル基又はベンジル基を示し、ａは６〜４０の整数を示す。また、前記式（１０）中のＲ２は前記式（９）中のＲ２に由来するものである。なお、前記反応生成物中には、下記式（１３）：
Ｒ２Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｄ−Ｒ２    ・・・（１３）
で表される化合物を不純物として含有する。前記式（１３）中、Ｒ２はトリチル基又はベンジル基を示し、ｄは８〜８０の整数を示す。また、前記式（１３）中のＲ２は前記式（９）中のＲ２に由来するものである。
【０１１１】
前記求核置換反応は、溶媒中で反応を行うことができる。前記溶媒としては、前記式（８）で表される化合物及び前記式（９）で表される化合物と反応しない溶媒であれば特に限定されず、例えば、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、ＤＭＦ、ジクロロメタン、クロロホルム等の非プロトン性極性溶媒、及びこれらの混合物が挙げられる。前記溶媒の使用量としては、前記式（９）で表される化合物に対して、通常、質量比で１〜１００倍、好ましくは２〜５０倍、最も好ましくは３〜３０倍量である。前記溶媒の使用量が前記下限未満である場合には、前記式（８）で表される化合物の両末端に前記式（９）で表される化合物が結合した、前記式（１３）で表される化合物の生成量が多くなる傾向にあり、他方、前記上限を超える場合には、求核置換反応の進行が遅くなる傾向にある。
【０１１２】
前記求核置換反応において、前記式（８）で表される化合物の使用量としては、前記式（９）で表される化合物に対して、通常、モル比で１．１〜５０倍、好ましくは１．５〜３０倍、更に好ましくは２．０〜２０倍である。前記式（８）で表される化合物の使用量が前記下限未満である場合には、前記式（８）で表される化合物の両末端に前記式（９）で表される化合物が結合した、前記式（１３）で表される化合物の生成量が多くなる傾向にあり、他方、前記上限を超える場合には、求核置換反応の進行が遅くなる傾向にある。
【０１１３】
前記求核置換反応に用いる塩基としては、反応が進行すれば問題ないが、例えば、金属ナトリウム、水素化ナトリウム、カリウムｔｅｒｔ−ブトキシドが挙げられる。前記塩基の使用量としては、前記式（９）で表される化合物に対して、通常、モル比で１．１〜１０倍、好ましくは１．２〜５倍量である。
【０１１４】
前記求核置換反応の反応温度としては、使用する溶媒等により異なるが、通常０〜１００℃である。前記反応温度が前記下限未満である場合には、反応の進行が遅くなる恐れがあり、他方、前記上限を超える場合には、過剰な温度によって副反応が進行する恐れがある。また、前記求核置換反応の反応時間としては、前記反応温度等の条件により異なるが、通常０．２〜４８時間程度が好ましい。
【０１１５】
工程ａにおいては、このような求核置換反応により、前記式（１０）で表される化合物及び前記式（１３）で表される化合物を含有する反応生成物を得ることができる。前記反応生成物は、そのまま未精製で次の工程ｂに用いてもよく、シリカゲルカラムクロマトグラフィーや分液抽出処理及び吸着剤処理等によって前記式（１０）で表される化合物を精製してから用いてもよいが、前記式（１３）で表される化合物は、後述する工程ｂにおける反応において反応性がなく、また、後述する工程で精製が可能であるため、未精製で用いることができる。
【０１１６】
〔工程ｂ〕
本発明に係る工程ｂは、前記式（１０）で表される化合物をトシル化し、下記式（１１）：
ＴｓＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ａ−Ｒ２    ・・・（１１）
で表される化合物を得る工程である。前記式（１１）中、Ｔｓはトシル基を示し、Ｒ２はトリチル基又はベンジル基を示し、ａは６〜４０の整数を示す。前記Ｒ２は、前記式（１０）中のＲ２に由来するものである。
【０１１７】
工程ｂにおいては、前記工程ａで得られた反応生成物とｐ−トルエンスルホン酸クロライドとを塩基存在下で反応させることにより、前記式（１１）で表される化合物と前記式（１３）で表される化合物とを含む反応生成物を得ることができる。
【０１１８】
工程ｂにおける反応は、溶媒中で反応を行うことができる。前記溶媒としては、例えば、水、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、ＤＭＦ、ジクロロメタン、クロロホルム、及びこれらの混合物が挙げられる。前記溶媒の使用量としては、前記式（１０）で表される化合物に対して、通常、質量比で１〜１００倍、好ましくは２〜５０倍、最も好ましくは３〜３０倍量である。前記溶媒の使用量が前記下限未満である場合には、反応を制御することが発熱により困難になる恐れがあり、他方、前記上限を超える場合には、反応の進行が遅くなる傾向にある。
【０１１９】
工程ｂにおけるｐ−トルエンスルホン酸クロライドの使用量としては、前記式（１０）で表される化合物に対して、通常、モル比で０．８〜５倍、好ましくは０．９〜３倍である。ｐ−トルエンスルホン酸クロライドの使用量が前記下限未満である場合には、未反応の前記式（１０）で表される化合物が多く残存するため収率が低下し、他方、前記上限を超える場合には、未反応のｐ−トルエンスルホン酸クロライドが残存し、これを除去することが困難となる。
【０１２０】
前記反応に用いる塩基としては、反応が進行すれば問題ないが、例えば、トリエチルアミン、水酸化ナトリウム、ピリジンが挙げられる。前記塩基の使用量としては前記式（１０）で表される化合物に対して、通常、モル比で１．１〜１０倍、好ましくは１．２〜５倍量である。
【０１２１】
前記反応の反応温度としては、使用する溶媒等により異なるが、通常０〜８０℃である。前記反応温度が前記下限未満である場合には反応の進行が遅くなる恐れがあり、他方、前記上限を超える場合には、生成した前記式（１１）で表される化合物が副反応を起こす恐れがある。また、前記反応の反応時間としては、反応温度等の条件により異なるが、通常０．２〜４８時間程度が好ましい。
【０１２２】
工程ｂにおいては、このような反応により、前記式（１１）で表される化合物と前記式（１３）で表される化合物とを含む反応生成物を得ることができる。前記反応生成物は、そのまま未精製で次の工程ｃに用いてもよく、シリカゲルカラムクロマトグラフィーや分液抽出処理及び吸着剤処理等によって前記式（１１）で表される化合物を精製してから用いてもよいが、本発明においては、後述する工程で精製が可能であるため、未精製で用いることができる。
【０１２３】
〔工程ｃ〕
本発明に係る工程ｃは、前記式（１１）で表される化合物を脱トリチル化又は脱ベンジル化し、前記式（３）で表される化合物を得る工程である。前記工程ｂで得られた反応生成物中の式（１１）中、Ｒ２がトリチル基である場合には脱トリチル化を、Ｒ２がベンジル基である場合には脱ベンジル化をすることにより、前記式（３）で表される化合物を含む反応生成物を得ることができる。なお、前記反応生成物中には、前記式（１３）で表される化合物が脱トリチル化又は脱ベンジル化された、下記式（１４）：
ＨＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｄ−Ｈ    ・・・（１４）
で表される化合物を不純物として含有する。前記式（１４）中、ｄは８〜８０の整数を示す。
【０１２４】
前記脱トリチル化及び脱ベンジル化の方法としては、公知の方法が利用可能であり、例えば、ＧＲＥＥＮＥ  ＷＵＴＳ著、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｓｎｔｈｅｓｉｓに記載されている方法が有効である。また、前記式（１１）及び（１３）中のＲ２がトリチル基である場合は、酸性条件下での変換反応、接触水素添加等により脱トリチル化させることが可能である。前記酸性条件下での変換反応としては、例えば、１Ｍ塩酸中、６０℃で反応を行う、又は、メタノール中、触媒量のｐ−トルエンスルホン酸・１水和物を添加することで反応を行うといった方法が挙げられる。また、前記接触水素添加による方法としては、メタノール溶媒中、水素雰囲気下、触媒量のパラジウム／炭素を加える方法が挙げられる。他方、前記式（１１）及び（１３）中のＲ２がベンジル基である場合は、接触水素添加により脱ベンジル化させることが可能であり、例えば、メタノール溶媒中、水素雰囲気下、触媒量のパラジウム／炭素を加えることで脱ベンジル化させることができる。
【０１２５】
工程ｃにおいては、このような脱トリチル化又は脱ベンジル化により、前記式（３）で表される化合物及び前記式（１４）で表される化合物を含有する反応生成物を得ることができる。前記反応生成物は、そのまま未精製で次の工程ｄに用いてもよく、シリカゲルカラムクロマトグラフィーや分液抽出処理及び吸着剤処理等によって前記式（３）で表される化合物を精製してから用いてもよいが、本発明においては、後述する工程で精製が可能であるため、未精製で用いることができる。
【０１２６】
〔工程ｄ〕
本発明に係る工程ｄは、前記工程ｃで得られた前記式（３）で表される化合物を含有する反応生成物を精製して前記ヘテロ型単分散ポリエチレングリコール製造用中間体を得る工程である。
【０１２７】
前記工程ｃで不純物として生成した前記式（１４）で表される化合物は、両末端がいずれも水酸基であることから、これを含有する反応生成物は、従来のヘテロ型単分散ポリエチレングリコール製造用中間体の合成方法で得られる、両末端の少なくともいずれかに保護基が結合している化合物を含有する組成物と比較して、含まれる化合物の極性差が大きいという特性を有する。したがって、シリカゲルカラムクロマトグラフィー、分液抽出処理、吸着剤処理等の精製操作によって従来よりも容易に分離除去することが可能である。特に、本発明の製造方法によれば、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによる精製をしなくとも、簡便な分液抽出処理のみで、高純度の本発明のヘテロ型単分散ポリエチレングリコール製造用中間体を得ることができる。
【０１２８】
前記分液抽出処理としては、前記工程ｃで得られた反応生成物を有機溶媒に溶解させた後に、２５℃以下において水溶液で分液洗浄する洗浄工程（ｗ３）を含む方法が挙げられる。前記有機溶媒としては、トルエン、クロロホルム、ジクロロメタンが挙げられ、これらの中でも、前記式（３）で表される化合物の溶解性の観点から、クロロホルム、ジクロロメタンが好ましい。前記有機溶媒の使用量としては、前記式（３）で表される化合物と前記式（１４）で表される化合物とを含む前記反応生成物に対して、通常、質量比で２〜３０倍、好ましくは３〜２０倍である。前記有機溶媒の使用量が前記下限未満である場合には、前記式（３）で表される化合物が水層に溶け込む恐れがあり、他方、前記上限を超える場合には、前記式（１４）で表される化合物が有機層に溶け込む恐れがある。
【０１２９】
前記洗浄工程（ｗ３）において、前記水溶液としては、前記式（１４）で表される化合物を溶解可能であれば特に限定されず、例えば、イオン交換水、塩化ナトリウム、塩化カリウム等の低塩濃度の水溶液が挙げられる。前記水溶液の使用量としては、前記式（３）で表される化合物と前記式（１４）で表される化合物とを含む反応生成物に対して、通常、質量比で２〜３０倍、好ましくは３〜２０倍である。前記水溶液の使用量が前記下限未満である場合には、前記式（１４）で表される化合物の洗浄効率が低下し、他方、前記上限を超える場合には、前記式（３）で表される化合物が水層に溶け込む恐れがある。
【０１３０】
前記洗浄工程（ｗ３）において、前記有機溶媒と前記水溶液との比率としては、通常、質量比で有機溶媒／水溶液の値が、０．２〜３．０であり、０．５〜２．０であることが好ましい。
【０１３１】
前記洗浄工程（ｗ３）の温度としては、１〜２５℃であることが好ましく、５〜２０℃であることが更に好ましい。前記温度が前記上限を超える場合には、前記式（１４）で表される化合物が有機層に溶解して除去することが困難になる傾向にある。また、前記分液洗浄を行う回数としては、特に限定はなく、ＴＬＣやＭＳ測定等によって有機溶媒中に含まれる前記式（１４）で表される化合物を確認しながら複数回行うことが好ましい。
【０１３２】
工程ｄにおいては、このような分液抽出処理により、前記式（３）で表される化合物を高純度で含有する本発明のヘテロ型単分散ポリエチレングリコール製造用中間体を容易に得ることができる。本発明によれば、このように簡便な精製によって工程ａ〜工程ｃで生成する不純物を除去することが可能であるため、各工程において、シリカゲルカラムクロマトグラフィー等による精製が不要である。なお、得られた前記式（３）で表される化合物を含有するヘテロ型単分散ポリエチレングリコール製造用中間体は、そのまま上記本発明のヘテロ型単分散ポリエチレングリコールの製造に用いることが可能であるが、更に晶析、吸着剤処理、シリカゲルカラムクロマトグラフィー等の処理により精製をして用いてもよい。
【０１３３】
＜ヘテロ型単分散ポリエチレングリコール、ヘテロ型単分散ポリエチレングリコール結合体＞
本発明のヘテロ型単分散ポリエチレングリコールを用いることにより、下記式（１２）：
Ｘ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ａ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｙ    ・・・（１２）
で表される化合物を含有するヘテロ型単分散ポリエチレングリコールを得ることができる。
【０１３４】
前記式（１２）中、Ｘ及びＹは、それぞれ、生体機能性分子に存在する官能基と共有結合を形成し得る官能基を含む原子団を示し、原子団Ｘに含まれる官能基と原子団Ｙに含まれる官能基とは互いに異なり、ａは６〜４０の整数を示す。
【０１３５】
前記原子団Ｘは、前記式（１２）で表されるヘテロ型単分散ポリエチレングリコールのポリエチレングリコール鎖末端に位置する原子団であって、生体機能性分子に存在する官能基と共有結合を形成し得る官能基（Ｘ’）を含む。Ｘは、前記官能基（Ｘ’）のみであっても、前記官能基（Ｘ’）と前記ポリエチレングリコール鎖への結合部位（Ｗ）とからなるものであってももよく、次式：
Ｘ−  ＝Ｘ’−Ｗ−
で表される。前記式中、Ｘ’は生体機能性分子に存在する官能基と共有結合を形成し得る官能基を示し、Ｗはポリエチレングリコール鎖への結合部位又は単結合を示す。
【０１３６】
原子団Ｙは、前記式（１２）で表されるヘテロ型単分散ポリエチレングリコールのポリエチレングリコール鎖末端に位置する原子団であって、生体機能性分子に存在する官能基と共有結合を形成し得る官能基（Ｙ’）を含む。Ｙは、前記官能基（Ｙ’）のみであっても、前記官能基（Ｙ’）と前記ポリエチレングリコール鎖への結合部位（Ｗ’）とからなるものであってもよく、次式：
Ｙ−  ＝Ｙ’−Ｗ’−
で表される。前記式中、Ｙ’は生体機能性分子に存在する官能基と共有結合を形成し得る官能基を示し、Ｗ’はポリエチレングリコール鎖への結合部位又は単結合を示す。
【０１３７】
結合部位Ｗ及びＷ’としては、それぞれ独立に、ポリエチレングリコール鎖との結合を担うリンカーであり、共有結合によって構成される部位であれば特に制限は無いが、好ましくは、エステル結合、ウレタン結合、アミド結合、エーテル結合、カーボネート結合、２級アミノ基を含んだ二価の炭化水素基、単結合、及び、二価の炭化水素基が挙げられる。前記炭化水素基としては、炭素数が１２以下であることが好ましく、メチレン基、エチレン基、トリメチレン基、プロピレン基、イソプロピレン基、テトラメチレン基、ブチレン基、イソブチレン基、ペンタメチレン基、ヘキサメチレン基等が挙げられる。
【０１３８】
官能基Ｘ’及びＹ’は、互いに異なる官能基であり、ヘテロ型単分散ポリエチレングリコールによる修飾の対象となる生体機能性分子（タンパク薬剤、ポリペプチド、酵素、抗体、抗体医薬、遺伝子、オリゴ核酸等を含む核酸化合物、核酸医薬、抗がん剤、低分子薬物等のその他薬剤）に存在する官能基と反応して共有結合を形成し得る官能基であれば特に制限されない。中でも、Ｘ’及びＹ’としては、それぞれ独立に、タンパク質に代表される天然の生体機能性分子に存在する基（アミノ基、チオール基、アルデヒド基、カルボキシル基等）や前記生体機能性高分子に人工的に導入可能な基（マレイミド基、ケトン基、アジド基、アルキニル基等）に温和な条件で、かつ、高い反応効率で反応可能な官能基であることが好ましく、より具体的には、アセタール基、アルデヒド基、マレイミド基、ビニルスルホン基、ヨードアセトアミド基、活性エステル基、活性カーボネート基、カルボキシル基、アミノ基、アミノオキシ基、チオール基、アリル基、ビニル基、アルキニル基、アジド基が好ましい。さらに、反応効率等を考慮すると、Ｘ’及びＹ’としては、アセタール基、アルデヒド基、マレイミド基、活性エステル基、活性カーボネート基、カルボキシル基、アミノ基、アミノオキシ基、アルキニル基、アジド基からなる群から選択される１種の官能基であることが好ましい。
【０１３９】
また、Ｘ’及びＹ’としては、それぞれ独立に、対象とする生体機能性分子に存在する官能基がアミノ基である場合には、アセタール基、アルデヒド基、活性カルボン酸、活性カーボネート基、カルボキシル基であることが好ましく、対象とする生体機能性分子に存在する官能基がチオール基である場合には、マレイミド基、ビニルスルホン基、ヨードアセトアミド基、アリル基、ビニル基であることが好ましく、対象とする生体機能性分子に存在する官能基がアルデヒド基、ケトン基である場合には、アミノ基、アミノオキシ基であることが好ましく、対象とする生体機能性分子に存在する官能基がカルボキシル基である場合には、アミノ基、アミノオキシ基、チオール基であることが好ましく、対象とする生体機能性分子に存在する官能基がマレイミド基である場合には、チオール基であることが好ましく、対象とする生体機能性分子に存在する官能基がアジド基である場合にはアルキニル基であることが好ましく、対象とする生体機能性分子に存在する官能基がアルキニル基である場合にはアジド基であることが好ましい。
【０１４０】
原子団Ｘ中のＸ’と原子団Ｙ中のＹ’との好ましい組み合わせとしては、Ｘ’がマレイミド基、アジド基、アルキニル基及びヨードアセトアミド基からなる群から選択される１つの官能基であり、Ｙ’がカルボキシル基又は活性エステル基からなる群から選択される１つの官能基であることが好ましい。
【０１４１】
本発明におけるマレイミド基とは、結合部位（Ｗ、Ｗ’）も含めて次式（１５）：
【０１４２】
【化３】
0006638970.tif 000004
【０１４３】
で表される基であり、チオール基等の求核性基と反応する基である。前記式（１５）中、Ｒ３としては、水素原子又はメチル基が好ましく、水素原子がより好ましい。本発明における原子団Ｘ中のＸ’がマレイミド基である場合、或いは、原子団Ｙ中のＹ’がマレイミド基である場合の原子団Ｘ及び原子団Ｙとしては、例えば、次式：
【０１４４】
【化４】
0006638970.tif 000005
【０１４５】
で表される原子団が挙げられる。前記式中、ｅは２〜５の整数を示し、Ｒ３は前記式（１５）中のＲ３と同義である。
【０１４６】
本発明における活性エステル基とは、結合部位（Ｗ、Ｗ’）も含めて次式（１６）：
【０１４７】
【化５】
0006638970.tif 000006
【０１４８】
で表される基であり、アミノ基等の求核性基と反応する。前記式（１６）中、Ｒ４としては、フェニル基、３−ピリジル基、スクシンイミド基、２−ベンゾチアゾール基、又は１−ベンゾトリアゾール基が好ましく、スクシンイミド基又は１−ベンゾトリアゾール基がより好ましく、スクシンイミド基が最も好ましい。本発明における原子団Ｘ中のＸ’が活性エステル基である場合、或いは、原子団Ｙ中のＹ’が活性エステル基である場合の原子団Ｘ及び原子団Ｙとしては、例えば、次式：
【０１４９】
【化６】
0006638970.tif 000007
【０１５０】
で表される原子団が挙げられる。前記式中、Ｒ４は前記式（１６）中のＲ３と同義である。
【０１５１】
本発明におけるアルキニル基とは、結合部位（Ｗ、Ｗ’）も含めて次式（１７）〜（２０）：
【０１５２】
【化７】
0006638970.tif 000008
【０１５３】
のうちのいずれかで表される基であり、アジド基等と反応する。前記式（１７）中、Ｒ５としては、炭素数８以下の飽和炭化水素基又は水素原子が好ましく、水素原子がより好ましい。本発明における原子団Ｘ中のＸ’がアルキニル基である場合、或いは、原子団Ｙ中のＹ’がアルキニル基である場合の原子団Ｘ及び原子団Ｙとしては、例えば、次式（２１）〜（２３）：
【０１５４】
【化８】
0006638970.tif 000009
【０１５５】
で表される原子団が挙げられる。前記式（２１）中、ｆは２〜５の整数を示し、Ｒ５は前記式（１７）中のＲ５と同義である。また、前記式（２３）中、ｇは１〜６の整数を示す。
【０１５６】
本発明における原子団Ｘ中のＸ’がヨードアセトアミド基である場合、或いは、原子団Ｙ中のＹ’がヨードアセトアミド基である場合の原子団Ｘ及び原子団Ｙとしては、次式：
【０１５７】
【化９】
0006638970.tif 000010
【０１５８】
で表される原子団が挙げられる。
【０１５９】
本発明における原子団Ｘ中のＸ’がカルボキシル基である場合、或いは、原子団Ｙ中のＹ’がカルボキシル基である場合の原子団Ｘ及び原子団Ｙとしては、次式：
【０１６０】
【化１０】
0006638970.tif 000011
【０１６１】
で表される原子団が挙げられる。
【０１６２】
前記式（１２）で表される化合物を得る方法としては、適宜公知の合成方法を利用することができる。例えば、マレイミド基を導入する方法としては、３−マレイミドプロピオン酸やマレイミド酪酸等を１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩等の縮合剤と反応させた後、式（１）で表される化合物を主成分として含有する本発明のヘテロ型単分散ポリエチレングリコールと反応させる方法や、トリエチルアミン等の塩基存在下、式（１）で表される化合物を主成分として含有する本発明のヘテロ型単分散ポリエチレングリコールに対して３−マレイミドプロピオン酸Ｎ−スクシンイミジルやマレイミド酪酸Ｎ−スクシンイミジルを反応させる方法が挙げられる。また、例えば、活性エステル基を導入する方法としては、式（１）で表される化合物を主成分として含有する本発明のヘテロ型単分散ポリエチレングリコールに対して、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩等の縮合剤存在下、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドを反応させる方法が挙げられる。さらに、例えば、ヨードアセトアミド基を導入する方法としては、式（１）で表される化合物を主成分として含有する本発明のヘテロ型単分散ポリエチレングリコールに対して、トリエチルアミン等の塩基存在下、二（ヨード酢酸）無水物等を反応させる方法が挙げられる。また、例えば、アルキレン基を導入する方法としては、式（１）で表される化合物を主成分として含有する本発明のヘテロ型単分散ポリエチレングリコールに対して、トリエチルアミン等の塩基存在下、Ｐｒｏｐａｒｇｙｌ  ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍａｔｅ、（１Ｒ，８Ｓ，９Ｓ）−Ｂｉｃｙｃｌｏ［６．１．０］ｎｏｎ−４−ｙｎ−９−ｙｌｍｅｔｈｙｌ  Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｃａｒｂｏｎａｔｅ、Ｄｉｂｅｎｚｏｃｙｃｌｏｏｃｔｙｎｅ−Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｅｓｔｅｒ等を反応させる方法が挙げられる。
【０１６３】
このようにして、前記式（１２）で表される化合物を主成分として含有するヘテロ型単分散ポリエチレングリコールを得ることができる。本発明の式（１）で表される化合物を含有するヘテロ型単分散ポリエチレングリコールを用いて得られたヘテロ型単分散ポリエチレングリコールは、前記式（１２）で表され、エチレングリコール鎖長（すなわちａの値）が互いに同じである化合物（ヘテロ型ポリエチレングリコール）を高純度で含有することができる。
【０１６４】
また、本発明の式（１）で表される化合物を含有するヘテロ型単分散ポリエチレングリコール、又は、式（１２）で表される化合物を含有するヘテロ型単分散ポリエチレングリコールを用いることにより、これらの化合物（ヘテロ型ポリエチレングリコール）と生体機能性分子とが結合されてなるヘテロ型単分散ポリエチレングリコール結合体を得ることができる。本発明においては、上記の本発明のヘテロ型単分散ポリエチレングリコールを用いることにより、両末端に薬剤が導入された化合物や、両末端にターゲッティング分子が導入された化合物の生成を十分に抑制することができる。
【０１６５】
前記生体機能性分子としては、タンパク薬剤、ポリペプチド、酵素、抗体、抗体医薬、遺伝子、オリゴ核酸等を含む核酸化合物、核酸医薬、抗がん剤、低分子薬物等のその他薬剤が挙げられる。
【０１６６】
前記ヘテロ型単分散ポリエチレングリコール結合体を得る方法としては、例えば、先ず、前記式（１）で表される化合物、又は、前記式（１２）で表される化合物の一方の末端、すなわち、前記式（１）中のアミノ基又はカルボキシル基、前記式（１２）中の原子団Ｘに対して抗体やペプチドリガンド等のターゲティング分子を導入し、もう一方の末端、すなわち、前記式（１）中のアミノ基又はカルボキシル基、前記式（１２）中の原子団Ｙに対して抗がん剤やタンパク薬剤といった薬剤を結合する方法が挙げられる。なお、薬剤及びターゲッティング分子を導入する末端は逆であってもよい。
【実施例】
【０１６７】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。なお、各合成例において、核磁気共鳴（１Ｈ−ＮＭＲ）測定には日本電子社製  ＪＭＴＣ−４００を用い、質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）測定にはＷａｔｅｒｓ（株）社製Ｑｕａｔｔｒｏ  ｍｉｃｒｏ  タンデム型質量分析計を用いた。
【０１６８】
＜ポリエチレングリコールの合成＞
（実施例１−１）
式（１）中のａが８である化合物１３の合成
〔合成例Ｉ〕
式（３）中のａが８である化合物８の合成
〔合成例Ｉ−１〕
式（９）中のａが４であり、Ｌがトシル基であり、Ｒ２がトリチル基である化合物４の合成
【０１６９】
【化１１】
0006638970.tif 000012
【０１７０】
先ず、前記式に示す反応経路のとおり、化合物２を合成した。すなわち、二口ナスフラスコにテトラエチレングリコール１（２００ｍＬ、１．１５ｍｏｌ）を入れ、トルエン（５０ｍＬ×２回）を用いて共沸脱水を２回行った。ナスフラスコ内を窒素パージし、ピリジン（１８ｍＬ、０．２２ｍｏｌ）及びトリチルクロリド（ＴｒｔＣｌ、４０ｇ、０．１４４ｍｏｌ）を加え、室温で３時間撹拌した。３時間後、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ、ヘキサン：酢酸エチル＝１：１（体積比））を用いてＴｒｔＣｌの消失を確認し、イオン交換水  ２００ｍＬを加えた。得られた混合液にトルエン  １００ｍＬを加えた後に分液し、有機層をイオン交換水／飽和食塩水の混合溶液  １００ｍＬ（イオン交換水：飽和食塩水＝４：１（体積比））で１回、１Ｍ  塩酸水溶液  ５０ｍＬで１回、飽和食塩水  ５０ｍＬで４回洗浄した。得られた有機層に硫酸ナトリウムを加え、乾燥・ろ過し、ろ液にトルエン（５０ｍＬ×３回）を加えて共沸脱水を３回行い、淡黄色透明液体の化合物２を含有する反応生成物を得た。また、ＥＳＩ−ＭＳ測定により、得られた反応生成物中には上記化合物３も含まれていることを確認した。
【０１７１】
収量：６３．３ｇ
ＭＳ（ＥＳＩ＋）：  化合物２  ４５４．５［Ｍ＋ＮＨ４］＋、  化合物３  ６９６．９［Ｍ＋ＮＨ４］＋。
【０１７２】
【化１２】
0006638970.tif 000013
【０１７３】
次いで、前記式に示す反応経路のとおり、化合物４を合成した。すなわち、ナスフラスコに上記化合物２を含有する反応生成物（化合物２：  ６２．８ｇ、０．１４４ｍｏｌ未満）及びテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）２００ｍＬを入れ、０℃に冷却した。水酸化ナトリウム水溶液（２０．０ｇ、０．５０ｍｏｌ／６０ｍＬ）を加え、０℃で２０分間撹拌した。反応混合液にトシルクロリド（ＴｓＣｌ）／ＴＨＦ溶液（３０．０ｇ、０．１５７ｍｏｌ／６０ｍＬ）を３０分かけて滴下し、０℃で４時間撹拌した。４時間後、ＴＬＣ（ヘキサン：酢酸エチル＝１：１（体積比））を用いて化合物２の消失を確認した後、未反応のＴｓＣｌを消失させるため、室温で１５時間撹拌した。１５時間後、ＴＬＣでＴｓＣｌの消失を確認し、イオン交換水  ３０ｍＬとジエチルエーテル  ５０ｍＬを加えた。混合液を飽和重曹水  ５０ｍＬで１回、飽和食塩水  ５０ｍＬで３回洗浄した。有機層に活性炭  ０．５ｇと硫酸ナトリウムを加え、乾燥・ろ過した。ろ液を減圧濃縮し、淡黄色透明液体の化合物４を含有する反応生成物を得た。また、ＥＳＩ−ＭＳ測定により、得られた反応生成物中には上記化合物３も含まれていることを確認した。
【０１７４】
収量：８１．８ｇ
ＭＳ（ＥＳＩ＋）：  化合物４  ６０８．７［Ｍ＋ＮＨ４］＋、  化合物３  ６９６．８［Ｍ＋ＮＨ４］＋。
【０１７５】
〔合成例Ｉ−２（工程ａ）〕
式（１０）中のａが８であり、Ｒ２がトリチル基である化合物５の合成
【０１７６】
【化１３】
0006638970.tif 000014
【０１７７】
前記式に示す反応経路のとおり、化合物５を合成した。すなわち、二口ナスフラスコに水素化ナトリウム（８．１ｇ）を入れ、窒素置換した。脱水ヘキサン（５０ｍＬ×２回）で２回洗浄し、ＴＨＦ  １８０ｍＬを加えて０℃に冷却した。ここにトルエン  ５０ｍＬで３回共沸脱水したテトラエチレングリコール１（式（８）中のｂが４である化合物、２００ｍＬ、１．１５ｍｏｌ）を滴下ロートに入れ、３０分かけて滴下した。滴下終了後、トルエン  ５０ｍＬで３回共沸脱水した上記合成例Ｉ−１で得られた化合物４を含有する反応生成物（化合物４：  ８１．３ｇ、０．１４４ｍｏｌ未満）にＴＨＦ  １００ｍＬを混合し、同じ滴下ロートに入れ、１５分かけて滴下した。滴下終了後、反応混合液を４０℃に昇温し、１９時間撹拌した。１９時間後、ＴＬＣ（酢酸エチル）を用いて化合物４が消失したことを確認し、室温へと放冷した。反応混合液にイオン交換水  ２００ｍＬ及び飽和食塩水  ２００ｍＬを加え、分液した。水層にジエチルエーテル  ５０ｍＬを加えて抽出した。分液した有機層を混合し、イオン交換水／飽和食塩水の混合溶液  ５０ｍＬ（イオン交換水：飽和食塩水＝１：１（体積比））で１回、飽和食塩水  ５０ｍＬで５回洗浄した。有機層に活性炭  ０．５ｇと硫酸ナトリウムを加え、乾燥・ろ過した。ろ液を減圧濃縮し、淡黄色透明液体の化合物５を含有する反応生成物を得た。また、ＥＳＩ−ＭＳ測定により、得られた反応生成物中には上記化合物３及び６も含まれていることを確認した。
【０１７８】
収量：７８．８ｇ
ＭＳ（ＥＳＩ＋）：  化合物５  ６３０．８［Ｍ＋ＮＨ４］＋、  化合物３  ６９６．８［Ｍ＋ＮＨ４］＋、  化合物６  １０４８．４［Ｍ＋ＮＨ４］＋。
【０１７９】
〔合成例Ｉ−３（工程ｂ）〕
式（１１）中のａが８であり、Ｒ２がトリチル基である化合物７の合成
【０１８０】
【化１４】
0006638970.tif 000015
【０１８１】
前記式に示す反応経路のとおり、化合物７を合成した。すなわち、ナスフラスコに上記合成例Ｉ−２で得られた化合物５を含有する反応生成物（化合物５：  ７７．８ｇ、０．１４４ｍｏｌ未満）及びＴＨＦ  ２００ｍＬを入れ、０℃に冷却した。水酸化ナトリウム水溶液（２０．０ｇ、０．５０ｍｏｌ／６０ｍＬ）を加え、０℃で２０分間撹拌した。反応混合液にＴｓＣｌ／ＴＨＦ溶液（２９．５ｇ、０．１５７ｍｏｌ／６０ｍＬ）を３０分かけて滴下し、０℃で１．５時間撹拌した。１．５時間後、ＴＬＣ（酢酸エチル）を用いて化合物５が消失したことを確認した。過剰のＴｓＣｌを失活させるため、さらに室温で１２．５時間撹拌した。１２．５時間後、ＴＬＣでＴｓＣｌの消失を確認し、イオン交換水  ５０ｍＬ及びジエチルエーテル  ５０ｍＬを加えた。混合液を飽和重曹水  ５０ｍＬで１回、飽和食塩水  ５０ｍＬで３回洗浄した。有機層に硫酸ナトリウムを加え、乾燥・ろ過した。ろ液を減圧濃縮し、淡黄色透明液体の上記化合物７を含有する反応生成物を得た。また、ＥＳＩ−ＭＳ測定により、得られた反応生成物中には上記化合物３及び６も含まれていることを確認した。
【０１８２】
収量：８６．１ｇ
ＭＳ（ＥＳＩ＋）：  化合物７  ７８５．２［Ｍ＋ＮＨ４］＋、  化合物３  ６９７．０［Ｍ＋ＮＨ４］＋、  化合物６  １０４８．７［Ｍ＋ＮＨ４］＋。
【０１８３】
〔合成例Ｉ−４（工程ｃ〜ｄ）〕
式（３）中のａが８である化合物８の合成
【０１８４】
【化１５】
0006638970.tif 000016
【０１８５】
前記式に示す反応経路のとおり、化合物８を合成した。すなわち、先ず、ナスフラスコに上記合成例Ｉ−３で得られた化合物７を含有する反応生成物（化合物７：  ８５．６ｇ、０．１４４ｍｏｌ未満）、メタノール  ２００ｍＬ、パラジウム炭素（Ｐｄ／Ｃ）  ２ｇを入れ、ナスフラスコ内を水素置換して室温で１８時間撹拌した。１８時間後、ＴＬＣ（酢酸エチル）を用いて化合物７の消失を確認し、Ｐｄ／Ｃをセライトろ過により除去した。ろ液にイオン交換水  １３０ｍＬを加え、生成した固体（トリフェニルメタン）をろ過して除去した。ろ液にトリフェニルメタンが残存していたため、ヘキサン  １００ｍＬで５回洗浄し、トリフェニルメタンを除去した。メタノール／イオン交換水層を減圧濃縮し、化合物８を含む粗生成物を得た。ＥＳＩ−ＭＳ測定の結果、得られた粗生成物中には上記化合物１及び９も含まれていることを確認した。
【０１８６】
次いで、上記粗生成物にジクロロメタン  １２０ｍＬを加え、２０℃の条件下、イオン交換水  １００ｍＬで３回、飽和食塩水  １００ｍＬで２回洗浄した。有機層に硫酸ナトリウムを加え、乾燥・ろ過した。ろ液を減圧濃縮し、淡黄色透明液体の化合物８を含有する精製物を得た。
精製物
収量：５２．０ｇ
ＭＳ（ＥＳＩ＋）：  化合物８  ５４２．４［Ｍ＋ＮＨ４］＋
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）：  ７．８０（ｄ，２Ｈ），  ７．３５（ｄ，２Ｈ），  ４．１６（ｔ，２Ｈ），  ３．６５（ｍ，３０Ｈ），  ２．７３（ｔ，１Ｈ），  ２．４５（ｓ，  ３Ｈ）
粗生成物
ＭＳ（ＥＳＩ＋）：  化合物８  ５４２．４［Ｍ＋ＮＨ４］＋、  化合物１  ２１２．７［Ｍ＋ＮＨ４］＋、  化合物９  ５６４．５［Ｍ＋ＮＨ４］＋。
【０１８７】
〔合成例ＩＩ〕
式（１）中のａが８である化合物１３の合成
〔合成例ＩＩ−１（工程Ａ）〕
式（５）中のａが８であり、Ｒ１がｔｅｒｔ−ブチル基である化合物１０の合成
【０１８８】
【化１６】
0006638970.tif 000017
【０１８９】
前記式に示す反応経路のとおり、化合物１０を合成した。すなわち、ナスフラスコに上記合成例Ｉで得られた化合物８を含有する精製物（化合物８：  １．０ｇ、１．９１ｍｍｏｌ）、アクリル酸ｔｅｒｔ−ブチル（式（４）中のＲ１がｔｅｒｔ−ブチル基である化合物、１．８２ｍＬ、１９．１ｍｍｏｌ）及びトルエン（２５ｍＬ）を入れた。０℃まで冷却した後、水酸化カリウム（ｐｏｗｄｅｒ、５３ｍｇ、０．９ｍｍｏｌ）を加え、０℃で１時間攪拌した。１時間後、ＥＳＩ−ＭＳにより化合物８の消失を確認し、混合液にイオン交換水  ２０ｍＬを加え分液した。有機層を飽和食塩水  ２０ｍＬで１回洗浄した。有機層に硫酸ナトリウムを加え、乾燥・ろ過した。ろ液を減圧濃縮し、淡黄色透明液体の化合物１０を含有する反応生成物を得た。
【０１９０】
収量：１．０６ｇ
ＭＳ（ＥＳＩ＋）：  化合物１０  ６７０．６［Ｍ＋ＮＨ４］＋
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）：  ７．８０（ｄ，２Ｈ），  ７．３４（ｄ，２Ｈ），  ４．１６（ｔ，２Ｈ），  ３．６４（ｍ，３２Ｈ），  ２．５０（ｔ，２Ｈ），  ２．４５（ｓ，３Ｈ），  １．４５（ｓ，９Ｈ）。
【０１９１】
〔合成例ＩＩ−２（工程Ｂ）〕
式（６）中のａが８であり、Ｒ１がｔｅｒｔ−ブチル基である化合物１１の合成
【０１９２】
【化１７】
0006638970.tif 000018
【０１９３】
前記式に示す反応経路のとおり、化合物１１を合成した。すなわち、ナスフラスコに上記合成例ＩＩ−１で得られた化合物１０を含有する反応生成物（化合物１０：  １．０６ｇ、１．６０ｍｍｏｌ）及びアセトニトリル（ＭｅＣＮ）  ２５ｍＬを入れた。ナスフラスコ内を窒素パージし、フタルイミドカリウム塩（ＰＩＫ、５２０ｍｇ、２．８０ｍｍｏｌ）を加え、８０℃で８時間撹拌した。８時間後、ＥＳＩ−ＭＳ及び１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）により化合物１０の消失を確認し、反応溶液を減圧濃縮した。ジクロロメタン  ７ｍＬを加え固形分をろ過した後に、ろ液を０．１Ｍ  水酸化ナトリウム水溶液  ７ｍＬで１回、飽和食塩水  １０ｍＬで１回洗浄した。有機層に硫酸ナトリウムを加え、乾燥・ろ過した。ろ液を減圧濃縮し、淡黄色透明液体の化合物１１を含有する反応生成物を得た。
【０１９４】
収量：９６５ｍｇ
ＭＳ（ＥＳＩ＋）：  化合物１１  ９４５．７［Ｍ＋ＮＨ４］＋
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）：  ７．８５（ｄｄ，２Ｈ），  ７．７１（ｄｄ，２Ｈ），  ３．９０（ｔ，２Ｈ），  ３．６３（ｍ，３２Ｈ），  ２．５０（ｔ，２Ｈ），  １．４５（ｓ，９Ｈ）。
【０１９５】
〔合成例ＩＩ−３（工程Ｃ〜Ｄ（分液抽出処理））〕
式（７）中のａが８であり、Ｒ１がｔｅｒｔ−ブチル基である化合物１２の合成
【０１９６】
【化１８】
0006638970.tif 000019
【０１９７】
前記式に示す反応経路のとおり、化合物１２を合成した。すなわち、ナスフラスコに上記合成例ＩＩ−２で得られた化合物１１を含有する反応生成物（化合物１１：  ５１０ｍｇ，０．８０ｍｍｏｌ）、エタノール  １０ｍＬ、及びヒドラジン・１水和物（３３４ｍｇ、６．７０ｍｍｏｌ）を入れ、８５℃で４５分間撹拌した。４５分後、ＥＳＩ−ＭＳにより化合物１１の消失を確認し、室温まで冷却した。析出した白色固体を溶解させるため、１２％炭酸カリウム水溶液  ５ｍＬを加えた後に、この混合溶液を減圧濃縮してトルエン  ５ｍＬで２回共沸脱水し、固体の化合物１２を含有する反応生成物を得た。
【０１９８】
次いで、得られた反応生成物にイオン交換水  ３ｍｌを加え濃塩酸  ０．６ｍＬを滴下し、ｐＨ  ３に調整し、固形分をろ過した。ろ液をジクロロメタンで３回洗浄し、水層にＮａＣｌ  ２ｇを加え飽和させた。この水溶液をジクロロメタンで５回抽出し、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥・ろ過した。ろ液を減圧濃縮し、淡黄色透明液体の化合物１２を含有する精製物を得た。
【０１９９】
収量：４００ｍｇ
ＭＳ（ＥＳＩ＋）：  化合物１２  ４９８．４［Ｍ＋Ｈ］＋
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）：  ７．９７（ｓ，２Ｈ），  ３．９４（ｔ，２Ｈ），  ３．６６（ｍ，３０Ｈ），  ３．１９（ｔ，２Ｈ），  ２．５０（ｔ，２Ｈ），  １．４５（ｓ，９Ｈ）。
【０２００】
〔合成例ＩＩ−４（工程Ｄ（酸加水分解処理））〕
式（１）中のａが８である化合物１３の合成
【０２０１】
【化１９】
0006638970.tif 000020
【０２０２】
前記式に示す反応経路のとおり、化合物１３を合成した。すなわち、ナスフラスコに上記合成例ＩＩ−３で得られた化合物１２を含有する精製物（化合物１２：  ４００ｍｇ、０．８０ｍｍｏｌ）及び１Ｍ  塩酸水溶液  ５０２μＬを入れ、６０℃で５時間攪拌した。５時間後、ＥＳＩ−ＭＳにより化合物１２の消失を確認し、１Ｍ  水酸化ナトリウム水溶液を加え反応液をｐＨ  ５に調整した。水分をトルエン（５ｍＬ）で２回共沸脱水して得られた固形分にジクロロメタン  １０ｍＬを加え、ろ過した。ろ液を減圧濃縮し、淡黄色固体の化合物１３を含有する精製物を得た。
【０２０３】
収量：３２０ｍｇ
ＭＳ（ＥＳＩ＋）：  化合物１３  ４４２．４［Ｍ＋Ｈ］＋
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ、４００ＭＨｚ）：  ３．６０（ｍ，３２Ｈ），  ３．１２（ｔ，２Ｈ），  ２．５１（ｔ，２Ｈ）。
【０２０４】
（実施例２−１）
式（１）中のａが１２である化合物２３の合成
〔合成例ＩＩＩ〕
式（３）中のａが１２である化合物１８の合成
〔合成例ＩＩＩ−１〕
式（９）中のａが８であり、Ｌがメシル基であり、Ｒ２がトリチル基である化合物１４の合成
【０２０５】
【化２０】
0006638970.tif 000021
【０２０６】
先ず、前記式に示す反応経路のとおり、化合物１４を合成した。すなわち、ナスフラスコに合成例Ｉ−２で合成した化合物５を含有する反応生成物（化合物５：  ７２．７ｇ、０．１１９ｍｏｌ未満）及びトルエン（３５０ｍＬ）を入れ、ナスフラスコ内を窒素パージし、トリエチルアミン（１９．８ｍＬ、０．１４３ｍｏｌ）を加えた。０℃で塩化メタンスルホニル（１０．１ｍＬ、０．１３１ｍｏｌ）を滴下し、室温で２時間攪拌した。２時間後、ＥＳＩ−ＭＳ測定により化合物５の消失を確認し、１Ｍ  ＨＣｌａｑ．  １００ｍＬを加え、分液した。有機層を１Ｍ  塩酸水溶液  １００ｍＬで１回、飽和重曹水  １００ｍＬで２回、飽和食塩水  １００ｍＬで１回洗浄した。有機層に硫酸ナトリウムを加え、乾燥・ろ過した。ろ液を減圧濃縮し、淡黄色透明液体の化合物１４を含有する反応生成物を得た。また、ＥＳＩ−ＭＳ測定により、得られた反応生成物中には上記化合物３及び６も含まれていることを確認した。
【０２０７】
収量：８０．１ｇ
ＭＳ（ＥＳＩ＋）：  化合物１４  ７０８．３［Ｍ＋ＮＨ４］＋、化合物３  ６９６．４［Ｍ＋ＮＨ４］＋、  化合物６  １０４８．５［Ｍ＋ＮＨ４］＋。
【０２０８】
〔合成例ＩＩＩ−２（工程ａ）〕
式（１０）中のａが１２であり、Ｒ２がトリチル基である化合物１５の合成
【０２０９】
【化２１】
0006638970.tif 000022
【０２１０】
前記式に示す反応経路のとおり、化合物１５を合成した。すなわち、二口ナスフラスコに水素化ナトリウム（６．５８ｇ）を入れ、窒素置換した。脱水ヘキサン（５０ｍＬ×２回）で２回洗浄し、ＭｅＣＮ  ２００ｍＬを加えて０℃に冷却した。トルエン  ５０ｍＬで３回共沸脱水したテトラエチレングリコール１（式（８）中のｂが４である化合物、１８０ｇ、０．９２７ｍｏｌ）にＭｅＣＮ  ５０ｍＬを混合し、滴下ロートに入れて３０分かけて滴下した。滴下終了後、トルエン  ５０ｍＬで３回共沸脱水した上記合成例ＩＩＩ−１で得られた化合物１４を含有する反応生成物（化合物１４：８０．１ｇ、０．１１６ｍｏｌ未満）にＭｅＣＮ  ５０ｍＬを混合し、同じ滴下ロートに入れて１５分かけて滴下した。滴下終了後、反応混合液を８０℃に昇温し、３時間撹拌した。３時間後、１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）により化合物１４が消失したことを確認し、室温へと放冷した。反応混合液を減圧濃縮し、残渣にトルエン  ２００ｍＬを加えた。このトルエン溶液を飽和塩化アンモニウム水溶液  １００ｍＬで２回、飽和食塩水  １００ｍＬで３回洗浄した。有機層に硫酸ナトリウムを加え、乾燥・ろ過した。ろ液を減圧濃縮し、淡黄色透明液体の化合物１５を含有する反応生成物を得た。また、ＥＳＩ−ＭＳ測定により、得られた反応生成物中には上記化合物３、６及び１６も含まれていることを確認した。
【０２１１】
収量：８５．４ｇ
ＭＳ（ＥＳＩ＋）：  化合物１５  ８０６．４［Ｍ＋ＮＨ４］＋、  化合物３  ６９６．６［Ｍ＋ＮＨ４］＋、  化合物６  １０４８．１［Ｍ＋ＮＨ４］＋、  化合物１６  １４００．９［Ｍ＋ＮＨ４］＋。
【０２１２】
〔合成例ＩＩＩ−３（工程ｂ）〕
式（１１）中のａが１２であり、Ｒ２がトリチル基である化合物１７の合成
【０２１３】
【化２２】
0006638970.tif 000023
【０２１４】
前記式に示す反応経路のとおり、化合物１７を合成した。すなわち、ナスフラスコに上記合成例ＩＩＩ−２で得られた化合物１５を含有する反応生成物（化合物１５：５７．３ｇ、７２．７ｍｍｏｌ未満）及びジクロロメタン（２８０ｍＬ）を入れ、ナスフラスコ内を窒素パージし、トリエチルアミン（１０．１ｍＬ、７２．７ｍｍｏｌ）、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ、８８８ｍｇ、７．２７ｍｍｏｌ）、ＴｓＣｌ（１２．５ｇ、６５．５ｍｍｏｌ）を加え、室温で４．５時間攪拌した。４．５時間後、１Ｈ−ＮＭＲによりＴｓＣｌの消失を確認し、１Ｍ  塩酸水溶液  １５０ｍＬを加え、分液した。有機層を１Ｍ  塩酸水溶液  １５０ｍＬで１回、飽和重曹水  １５０ｍＬで２回、飽和食塩水  １５０ｍＬで１回洗浄した。有機層に硫酸ナトリウムを加え、乾燥・ろ過した。ろ液を減圧濃縮し、淡黄色透明液体の化合物１７を含有する反応生成物を得た。また、ＥＳＩ−ＭＳ測定により、得られた反応生成物中には上記化合物３、６及び１６も含まれていることを確認した。
【０２１５】
収量：６９．１ｇ
ＭＳ（ＥＳＩ＋）：  化合物１７  ９６０．３［Ｍ＋ＮＨ４］＋、  化合物３  ６９６．３［Ｍ＋ＮＨ４］＋、  化合物６  １０４８．２［Ｍ＋ＮＨ４］＋、  化合物１６  １４００．８［Ｍ＋ＮＨ４］＋。
【０２１６】
〔合成例ＩＩＩ−４（工程ｃ〜ｄ）〕
式（３）中のａが１２である化合物１８の合成
【０２１７】
【化２３】
0006638970.tif 000024
【０２１８】
前記式に示す反応経路のとおり、化合物１８を合成した。すなわち、先ず、ナスフラスコに上記合成例ＩＩＩ−３で得られた化合物１７を含有する反応生成物（化合物１７：  ６９．１ｇ、７３．３ｍｍｏｌ未満）及びメタノール（５５０ｍＬ）を入れた後、ＴｓＯＨ・Ｈ２Ｏ（６．９７ｇ、３６．７ｍｍｏｌ）、ヘキサン（２００ｍＬ）を加え、室温で３０分攪拌した。３０分後、ヘキサン層を除去した後にヘキサン（２００ｍＬ）を加え、室温で３０分攪拌した。同様の操作を６回行った後、ＥＳＩ−ＭＳにより化合物１７の消失を確認し、０℃で飽和重曹水  ２００ｍＬを加えた。この混合溶液をヘキサン  ２００ｍＬで２回洗浄し、トリチルメチルエーテルを除去した。メタノール溶液を減圧濃縮し、化合物１８を含む粗生成物を得た。ＭＳ測定の結果、得られた粗生成物中には上記化合物１、９及び１９も含まれていることを確認した。
【０２１９】
次いで、上記粗生成物にジクロロメタン  ２００ｍＬを加え、２０℃の条件下、イオン交換水  ２００ｍＬで３回、飽和食塩水  ２００ｍＬで１回洗浄した。有機層に硫酸ナトリウムを加え、乾燥・ろ過した。ろ液を減圧濃縮し、淡黄色透明液体の化合物１８を含有する精製物を得た。
精製物
収量：５２．０ｇ
ＭＳ（ＥＳＩ＋）：  化合物１８  ７１８．３［Ｍ＋ＮＨ４］＋
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）：  ７．８０（ｄ，２Ｈ），  ７．３４（ｄ，２Ｈ），  ４．１６（ｔ，２Ｈ），  ３．６５（ｍ，４６Ｈ），  ２．６５（ｔ，１Ｈ），  ２．４５（ｓ，３Ｈ）
粗生成物
ＭＳ（ＥＳＩ＋）：  化合物１８  ７１８．３［Ｍ＋ＮＨ４］＋、  化合物１  ２１２．３［Ｍ＋ＮＨ４］＋、  化合物９  ５６４．５［Ｍ＋ＮＨ４］＋、  化合物１９  ９１６．４［Ｍ＋ＮＨ４］＋。
【０２２０】
〔合成例ＩＶ〕
式（１）中のａが１２である化合物２３の合成
〔合成例ＩＶ−１（工程Ａ）〕
式（５）中のａが１２であり、Ｒ１がｔｅｒｔ−ブチル基である化合物２０の合成
【０２２１】
【化２４】
0006638970.tif 000025
【０２２２】
前記式に示す反応経路のとおり、化合物２０を合成した。すなわち、ナスフラスコに上記合成例ＩＩＩで得られた化合物１８を含有する精製物（化合物１８：  ４．９６ｇ、７．０８ｍｍｏｌ）、アクリル酸ｔｅｒｔ−ブチル（式（４）中のＲ１がｔｅｒｔ−ブチル基である化合物、３．０９ｍＬ、２１．２ｍｍｏｌ）及びトルエン（１００ｍＬ）を入れた。０℃で水酸化カリウム（ｐｏｗｄｅｒ、１９９ｍｇ、３．５４ｍｍｏｌ）を加え、０℃で１時間攪拌した。１時間後、ＥＳＩ−ＭＳにより化合物１８の消失を確認し、飽和塩化アンモニウム水溶液  ５０ｍＬを加えた。この混合溶液を分液後、有機層を飽和食塩水  ５０ｍＬで１回洗浄した。有機層に硫酸ナトリウムを加え、乾燥・ろ過した。ろ液を減圧濃縮し、無色透明液体の化合物２０を含有する反応生成物を得た。
【０２２３】
ＭＳ（ＥＳＩ＋）：  化合物２０  ８４７．０  ［Ｍ＋ＮＨ４］＋、  ４３２．６［Ｍ＋２ＮＨ４］２＋
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）：  ７．８０（ｄ，２Ｈ），  ７．３４（ｄ，２Ｈ），  ４．１６（ｔ，２Ｈ），  ３．６４（ｍ，４８Ｈ），  ２．４９（ｔ，２Ｈ），  ２．４５（ｓ，３Ｈ），  １．４５（ｓ，９Ｈ）。
【０２２４】
〔合成例ＩＶ−２（工程Ｂ）〕
式（６）中のａが１２であり、Ｒ１がｔｅｒｔ−ブチル基である化合物２１の合成
【０２２５】
【化２５】
0006638970.tif 000026
【０２２６】
前記式に示す反応経路のとおり、化合物２１を合成した。すなわち、ナスフラスコに上記合成例ＩＶ−１で得られた化合物２０を含有する反応生成物（化合物２０：  ５．４３ｇ、６．５５ｍｍｏｌ）、アセトニトリル（４５ｍＬ）を入れ、窒素置換した。フタルイミドカリウム塩（１．５８ｇ、８．５２ｍｍｏｌ）を加え、８０℃で１８時間攪拌した。１８時間後、１Ｈ−ＮＭＲにより化合物２０が消失したことを確認し、反応溶液を減圧濃縮した。残渣にジクロロメタン  ５０ｍＬを加え、不溶物をろ過した。ろ液を０．１Ｍ  水酸化ナトリウム水溶液  ５０ｍＬで１回、飽和食塩水  ５０ｍＬで１回洗浄した。有機層に硫酸ナトリウムを加え、乾燥・ろ過した。ろ液を減圧濃縮し、淡黄色透明液体の化合物２１を含有する反応生成物を得た。
【０２２７】
収量：４．２６ｇ
ＭＳ（ＥＳＩ＋）：  化合物２１  ８２１．８［Ｍ＋ＮＨ４］＋、  ４２０．０［Ｍ＋２ＮＨ４］２＋
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）：  ７．８４（ｄｄ，２Ｈ），  ７．７７（ｄｄ，２Ｈ），  ３．９０（ｔ，２Ｈ），  ３．６４（ｍ，４８Ｈ），  ２．５０（ｔ，２Ｈ），  １．４５（ｓ，９Ｈ）。
【０２２８】
〔合成例ＩＶ−３（工程Ｃ）〕
式（７）中のａが１２であり、Ｒ１がｔｅｒｔ−ブチル基である化合物２２の合成
【０２２９】
【化２６】
0006638970.tif 000027
【０２３０】
前記式に示す反応経路のとおり、化合物２２を合成した。すなわち、ナスフラスコに上記合成例ＩＶ−２で得られた化合物２１を含有する反応生成物（化合物２１：  ４．２６ｇ、５．３０ｍｍｏｌ）、ヒドラジン・１水和物（３．８６ｍＬ、７９．５ｍｍｏｌ）及びエタノール（６０ｍＬ）を入れ、８５℃で１時間攪拌した。１時間後、ＥＳＩ−ＭＳにより化合物２１の消失を確認し、室温まで冷却した。析出した白色固体を溶解させるため１２％炭酸カリウム水溶液  ５ｍＬを加えた後に、この混合溶液を減圧濃縮してトルエン  １０ｍＬで２回共沸脱水した。残渣をイオン交換水  ２０ｍＬに溶解させ、３５％塩酸を加えてｐＨ  ３とした。析出した固体をろ過し、ろ液に塩化ナトリウム  ６ｇを加えて飽和させた。この水溶液をジクロロメタン  ２０ｍＬで２回抽出した。有機層に硫酸ナトリウムを加え、乾燥・ろ過した。ろ液を減圧濃縮し、淡黄色透明液体の化合物２２を含有する反応生成物を得た。
【０２３１】
収量：３．１３ｇ
ＭＳ（ＥＳＩ＋）：  化合物２２  ６７４．８［Ｍ＋Ｈ］＋、  ３４６．４［Ｍ＋Ｈ＋ＮＨ４］２＋
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）：  ７．９５（ｓ，２Ｈ），  ３．９４（ｔ，２Ｈ），  ３．６６（ｍ，４６Ｈ），  ３．１８（ｔ，２Ｈ），  ２．５０（ｔ，２Ｈ），  １．４５（ｓ，９Ｈ）。
【０２３２】
〔合成例ＩＶ−４（工程Ｄ）〕
式（１）中のａが１２である化合物２３の合成
【０２３３】
【化２７】
0006638970.tif 000028
【０２３４】
前記式に示す反応経路のとおり、化合物２３を合成した。すなわち、先ず、ナスフラスコに上記合成例ＩＶ−３で得られた化合物２２を含有する反応生成物（化合物２２：  ３．１３ｇ、４．６５ｍｍｏｌ）及び１Ｍ  塩酸水溶液（３ｍＬ）を入れ、６０℃で２時間攪拌した。２時間後、ＥＳＩ−ＭＳ測定により化合物２２が消失したことを確認し、室温まで冷却した。
【０２３５】
次いで、反応溶液をイオン交換水  ５ｍＬで希釈し、ジクロロメタン  １０ｍＬで３回洗浄した。水層に２Ｍ  水酸化ナトリウム水溶液及び０．１Ｍ  水酸化ナトリウム水溶液を加え、ｐＨ  ９とした。この水溶液をジクロロメタン  １０ｍＬで３回洗浄し、水層に塩化ナトリウム  ２ｇを加えて飽和させた。この水溶液をクロロホルム  １０ｍＬで３回抽出し、有機層に硫酸ナトリウムを加え、乾燥・ろ過した。ろ液を減圧濃縮し、淡黄色透明液体の化合物２３を含有する反応生成物を２．３２ｇ得た。得られた反応生成物（１．９６ｇ）に酢酸エチル  １０ｍＬを加えて攪拌した。固体をろ過し、３時間減圧乾燥させて白色固体の化合物２３を含有する精製物を得た。
【０２３６】
収量：１．８２ｇ
ＭＳ（ＥＳＩ＋）：  化合物２３  ６１８．５［Ｍ＋Ｈ］＋、  ３１８．３［Ｍ＋Ｈ＋ＮＨ４］２＋
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ、４００ＭＨｚ）：  ３．６１（ｍ，４８Ｈ），  ３．１２（ｔ，２Ｈ），  ２．５６（ｔ，２Ｈ）。
【０２３７】
（比較例１−１）
合成例Ｉ−４における粗生成物（比較精製物１−１）をそのまま用いたこと以外は合成例ＩＩと同様にして固体状の精製物１−２を得た。
【０２３８】
（比較例２−１）
先ず、上記合成例ＩＩ−３と同様にして固体状の化合物１２を含有する反応生成物を得た。次いで、これにイオン交換水  ３ｍｌを加え濃塩酸  ０．６ｍＬを滴下し、ｐＨ  ３に調整し、固形分をろ過した後、ろ液に塩化ナトリウム  ２ｇを加えて飽和させた。この水溶液をジクロロメタンで５回抽出し、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥・ろ過した。ろ液を減圧濃縮し、淡黄色透明液体の化合物を含有する比較精製物を得た。上記合成例ＩＩ−３で得られた化合物１２を含有する精製物に代えてこの精製物を用いたこと以外は合成例ＩＩ−４と同様にして固体状の比較精製物２を得た。
【０２３９】
（比較例３−１）
先ず、上記合成例ＩＶ−３と同様にしてナスフラスコに上記合成例ＩＶ−３で得られた化合物２２を含有する反応生成物（化合物２２：  ３．１３ｇ、４．６５ｍｍｏｌ）及び１Ｍ  塩酸水溶液（３ｍＬ）を入れ、６０℃で２時間攪拌した。２時間後、ＥＳＩ−ＭＳ測定により化合物２２が消失したことを確認し、室温まで冷却した。次いで、得られた反応溶液をそのまま減圧濃縮して固体状の比較精製物３を得た。
【０２４０】
（比較例４−１）
アクリロニトリルを用いたヘテロ型単分散ポリエチレングリコールの合成
【０２４１】
【化２８】
0006638970.tif 000029
【０２４２】
先ず、前記式に示す反応経路のとおり、化合物２４を合成した。すなわち、ナスフラスコに上記合成例Ｉ−４で得られた化合物８を含有する精製物（化合物８：  １０．０ｇ、１９．１ｍｍｏｌ）を入れ、０℃にて水酸化カリウム（１．６ｇ、１．５ｅｑ．）の水溶液（１０ｍＬ）を加えた。アクリロニトリル（１４．６ｍＬ、１２ｅｑ．）を滴下ロートに入れ、０℃にて滴下した後、０℃で３時間攪拌した。３時間後、ＥＳＩ−ＭＳ測定により化合物８の消費を確認し、８５％リン酸を１．６ｍＬ加えてｐＨが６より小さくなるように調整した。この溶液をトルエン  １００ｍＬで希釈した後、イオン交換水  １００ｍＬで２回、飽和食塩水  １００ｍＬで１回洗浄した。有機層に硫酸ナトリウムを加え、乾燥・ろ過した。ろ液を減圧濃縮し、無色透明液体の化合物２４を含有する反応生成物を得た。
【０２４３】
収量：１０．８ｇ
ＭＳ（ＥＳＩ＋）：  化合物２４  ５９５．５［Ｍ＋ＮＨ４］＋
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）：  ７．８０（ｄ，２Ｈ），  ７．３４（ｄ，２Ｈ），  ４．１６（ｔ，２Ｈ），  ３．６４（ｍ，３２Ｈ），  ２．６２（ｔ，２Ｈ），  ２．３５（ｓ，３Ｈ）。
【０２４４】
【化２９】
0006638970.tif 000030
【０２４５】
次いで、前記式に示す反応経路のとおり、化合物２５を合成した。すなわち、ナスフラスコに上記化合物２４を含有する反応生成物（化合物２４：  ２．６２ｇ、４．５４ｍｍｏｌ）、アセトニトリル（２０ｍＬ）を入れ、窒素置換した。フタルイミドカリウム塩（１．２ｇ、１．２ｅｑ．）を加え、８０℃にて４．５時間攪拌した。４．５時間後、１Ｈ−ＮＭＲ測定によりＴｓ基のピークの消失を確認して化合物２４の消失を確認し、室温まで放冷した。反応溶液を減圧濃縮した後、残渣にジクロロメタン  ２０ｍＬを加え、固形分をろ過により除去した。ろ液を０．１Ｍ  水酸化ナトリウム水溶液  ２０ｍＬで１回、飽和食塩水  １０ｍＬで１回洗浄した。有機層に硫酸ナトリウムを加え、乾燥・ろ過した。ろ液を減圧濃縮し、無色透明液体の化合物２５を含有する反応生成物を得た。
【０２４６】
収量：２．１ｇ
ＭＳ（ＥＳＩ＋）：  化合物２５  ５７０．６［Ｍ＋ＮＨ４］＋
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）：  ７．８４（ｄｄ，２Ｈ），  ７．７１（ｄｄ，２Ｈ），  ３．９０（ｔ，２Ｈ），  ３．６４（ｍ，３２Ｈ），  ２．６３（ｔ，２Ｈ）。
【０２４７】
【化３０】
0006638970.tif 000031
【０２４８】
次いで、前記式に示す反応経路のとおり、化合物２６を合成した。すなわち、ナスフラスコに上記化合物２５を含有する反応生成物（化合物２５：  １．０３ｇ、１．８７ｍｍｏｌ）、エタノール（１５ｍＬ）を入れた。ヒドラジン・１水和物（１．４ｍＬ、１５ｅｑ．）を加え、８５℃で４５分間攪拌した。４５分後、ＥＳＩ−ＭＳ測定により化合物２５の消失を確認した。析出した白色固体を溶解させるため１２％炭酸カリウム水溶液  ７．５ｍＬを加えた後に、この混合溶液を減圧濃縮してトルエン  １０ｍＬで２回共沸脱水した。残渣をイオン交換水  ２０ｍＬに溶解させ、３５％塩酸を加えてｐＨ  ３とした。析出した固体をろ過し、ろ液を減圧濃縮してトルエン  １０ｍＬで２回共沸脱水した。残渣をジクロロメタン  ２０ｍＬに溶解し、硫酸ナトリウムを加え、乾燥・ろ過した。ろ液を減圧濃縮し、淡黄色透明液体の化合物２６を含有する反応生成物を得た。
【０２４９】
収量：７３６ｍｇ
ＭＳ（ＥＳＩ＋）：  化合物２６  ４２３．４［Ｍ＋Ｈ］＋
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）：  ７．９６（ｓ，２Ｈ），  ３．６９（ｍ，３２Ｈ），  ３．２０（ｔ，２Ｈ），  ２．６６（ｔ，２Ｈ）。
【０２５０】
【化３１】
0006638970.tif 000032
【０２５１】
次いで、前記式に示す反応経路のとおり、化合物１３を合成した。すなわち、ナスフラスコに上記化合物２６を含有する反応生成物（化合物２６：  ６２９ｍｇ、１．４９ｍｍｏｌ）、３５％塩酸（６ｍＬ）、及びギ酸（６ｍＬ）を加え、１００℃にて１．５時間攪拌した。１．５時間後、ＥＳＩ−ＭＳ測定により化合物２６の消失を確認し、室温まで放冷した。反応溶液を減圧濃縮し、トルエン  １０ｍＬで２回共沸脱水して淡黄色透明液体の化合物１３を含有する比較精製物４を得た。また、ＥＳＩ−ＭＳ測定により、得られた組成物中には［Ｍ＋Ｈ］＋が３７０．３の化合物が確認され、この化合物は化合物１３が分解されて生成した、末端にアミノ基及び水酸基を有する化合物であることを確認した。
【０２５２】
収量：５１２ｍｇ
ＭＳ（ＥＳＩ＋）：  化合物１３  ４４２．４［Ｍ＋Ｈ］＋、  ＮＨ２−ＥＧ８−ＯＨ  ３７０．３［Ｍ＋Ｈ］＋
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ、４００ＭＨｚ）：  ３．５６（ｍ，３２Ｈ），  ３．０８（ｔ，２Ｈ），  ２．５３（ｔ，２Ｈ）。
【０２５３】
＜カラムクロマトグラフィー測定＞
（実施例１−２）
実施例１−１で得られた化合物１３を含有する精製物について、（Ａ）逆相クロマトグラフィー測定、（Ｂ）陽イオン交換クロマトグラフィー測定、（Ｃ）陰イオン交換クロマトグラフィー測定を行った。
【０２５４】
（Ａ）逆相クロマトグラフィー測定
逆相クロマトグラフィー測定は、機器に東ソー（株）社製  ビルドＧＰＣシステム  ＨＬＣ−８２２０を、検出器（示差屈折率計）に東ソー（株）社製  ＲＩ−８０２０を、カラムに東ソー（株）社製  ＴＳＫｇｅｌ  ＯＤＳ−８０Ｔｓ  （粒子径  ５μｍ、カラムサイズ  ４．６ｍｍ×２５ｃｍ）を、展開溶媒に５ｍＭ酢酸アンモニウム  メタノール／蒸留水＝２５／７５を、それぞれ用い、流速  ０．６ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度  ４０℃、サンプル濃度  ０．２ｍｇ／ｇ、注入量  ４０μＬの条件で行った。
【０２５５】
得られたクロマトグラムを図５に示す。なお、以下、クロマトグラムの縦軸は検出器から得られた信号強度を、横軸は溶出時間（カラム保持時間）を示す。溶出開始点の溶出時間は９．１０分、溶出終了点の溶出時間は１５．５８分、Ｐ１ｔｏｐの溶出時間は１１．９８分であり、Ｔ１ａは１１．５８分、Ｔ１ｂは１２．３４分であった。ａｒｅａＰ１を算出したところ４０２５．４１９であり、ａｒｅａＡ１を算出したところ４２８８．５１１であり、ａｒｅａＰ１／ａｒｅａＡ１の値は０．９４であった。結果を表１に示す。
【０２５６】
なお、サンプルを含まない展開溶媒のみをインジェクションし、同一条件で測定して得られたクロマトグラムを図６に示す。これより、上記測定で溶出時間８．２５分より前に検出されたピークは、展開溶媒等に起因するピークや、使用したカラムや装置に起因するベースラインの揺らぎによる擬似ピークであることを確認した。
【０２５７】
（Ｂ）陽イオン交換クロマトグラフィー測定
陽イオン交換クロマトグラフィーの測定条件は、機器に東ソー（株）社製  ビルドＧＰＣシステム  ＨＬＣ−８２２０を、検出器（示差屈折率計）に東ソー（株）社製  ＲＩ−８０２０を、カラムに東ソー（株）社製  ＴＳＫｇｅｌ  ＳＰ−２ＳＷ  （粒子径  ５μｍ、カラムサイズ  ４．６ｍｍ×２５ｃｍ）を、展開溶媒に５ｍＭ酢酸アンモニウム  メタノール／蒸留水＝１０／９０を、それぞれ用い、流速  ０．６ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度  ３０℃、サンプル濃度  ０．２ｍｇ／ｇ、注入量  ２０μＬの条件で行った。
【０２５８】
得られたクロマトグラムを図７に示す。溶出開始点の溶出時間は３．９５分、溶出終了点の溶出時間は６．２４分、Ｐ２ｔｏｐの溶出時間は５．３８分であり、Ｔ２は５．１５分であった。ａｒｅａＢ２を算出したところ２１．６５１であり、ａｒｅａＡ２を算出したところ６６１０．７１４であり、ａｒｅａＢ２／ａｒｅａＡ２の値は０．００であった。結果を表１に示す。
【０２５９】
なお、同サンプルを、機器にＷａｔｅｒｓ（株）社製Ａｌｌｉａｎｃｅ２６９５を、検出器（質量分析計）にＷａｔｅｒｓ（株）社製Ｑｕａｔｔｒｏ  ｍｉｃｒｏ  タンデム型質量分析計を、カラムに東ソー（株）社製  ＴＳＫｇｅｌ  ＳＰ−２ＳＷ  （粒子径  ５μｍ、カラムサイズ  ４．６ｍｍ×２５ｃｍ）を、展開溶媒に５０ｍＭ酢酸アンモニウム  メタノール／蒸留水＝１０／９０を、それぞれ用い、流速  ０．６ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度  ３０℃、サンプル濃度  ０．０１ｍｇ／ｇ、注入量  ５μＬの条件で測定し、得られたクロマトグラムを図８に示す。これより、上記測定で溶出時間４．６０分に検出されたピークは、展開溶媒等に起因するピークや、使用したカラムや装置に起因するベースラインの揺らぎによる擬似ピークであることを確認した。
【０２６０】
（Ｃ）陰イオン交換クロマトグラフィー測定
（誘導体化）
実施例１で得られた化合物１３を含有する精製物（化合物１３：  ６０ｍｇ）イオン交換水  １ｍＬに溶解した。水酸化ナトリウム（１６．３ｍｇ、３ｅｑ．）、二炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（０．０８６ｍＬ、２．８ｅｑ．）を加え、室温で１８時間攪拌した。１８時間後、ＥＳＩ−ＭＳ測定により化合物１３の消費を確認し、１Ｍ  塩酸水溶液を加えてｐＨ  ３とした。この水溶液に塩化ナトリウム  ３００ｍｇを加えて飽和させた。この水溶液をジクロロメタン  ２ｍＬで２回抽出し、有機層に硫酸ナトリウムを加え、乾燥・ろ過した。ろ液を減圧濃縮し、無色透明液体の前記式（２）中のａが８である化合物を含有する混合物を得た（収量：４５ｍｇ）。これを下記の陰イオン交換クロマトグラフィーの試料に用いた。
【０２６１】
（陰イオン交換クロマトグラフィー）
陰イオン交換クロマトグラフィーの測定条件は、機器に東ソー（株）社製  ビルドＧＰＣシステム  ＨＬＣ−８２２０を、検出器（示差屈折率計）に東ソー（株）社製  ＲＩ−８０２０を、カラムに東ソー（株）社製  ＴＳＫｇｅｌ  ＤＥＡＥ−２ＳＷ  （粒子径  ５μｍ、カラムサイズ  ４．６ｍｍ×２５ｃｍ）を、展開溶媒に５０ｍＭ酢酸アンモニウム  メタノール／蒸留水＝１０／９０を、それぞれ用い、流速  ０．６ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度  ３０℃、サンプル濃度  ０．２ｍｇ／ｇ、注入量  ３０μＬの条件で行った。
【０２６２】
得られたクロマトグラムを図９に示す。溶出開始点の溶出時間は９．６０分、溶出終了点の溶出時間は１１．６４分、Ｐ３ｔｏｐの溶出時間は１０．４２分であり、Ｔ３は１０．１１分であった。ａｒｅａＢ３を算出したところ４６．０３６であり、ａｒｅａＡ３を算出したところ１１５８．２６７であり、ａｒｅａＢ３／ａｒｅａＡ３の値は０．００であった。結果を表１に示す。
【０２６３】
なお、同サンプルを、機器にＷａｔｅｒｓ（株）社製Ａｌｌｉａｎｃｅ２６９５を、検出器（質量分析計）にＷａｔｅｒｓ（株）社製Ｑｕａｔｔｒｏ  ｍｉｃｒｏ  タンデム型質量分析計を、カラムに東ソー（株）社製  ＴＳＫｇｅｌ  ＤＥＡＥ−２ＳＷ  （粒子径  ５μｍ、カラムサイズ  ４．６ｍｍ×２５ｃｍ）を、展開溶媒に５０ｍＭ酢酸アンモニウム  メタノール／蒸留水＝１０／９０を、それぞれ用い、流速  ０．６ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度  ３０℃、サンプル濃度  ０．０１ｍｇ／ｇ、注入量  ５μＬの条件で測定し、得られたクロマトグラムを図１０に示す。これより、上記測定で溶出時間３．９０〜８．００分の間に検出されたピークは、展開溶媒等に起因するピークや、使用したカラムや装置に起因するベースラインの揺らぎによる擬似ピークであることを確認した。
【０２６４】
（実施例２−２）
実施例２−１で得られた化合物２３を含有する精製物について、（Ａ）逆相クロマトグラフィー測定、（Ｂ）陽イオン交換クロマトグラフィー測定、（Ｃ）陰イオン交換クロマトグラフィー測定を行った。
（Ａ）逆相クロマトグラフィー測定
展開溶媒を５ｍＭ酢酸アンモニウム  メタノール／蒸留水＝３０／７０に変更したこと以外は、実施例１−２と同様にして測定を行った。得られたクロマトグラムを図１１に示す。溶出開始点の溶出時間は８．５０分、溶出終了点の溶出時間は２５．６７分、Ｐ１ｔｏｐの溶出時間は１９．３０分であり、Ｔ１ａは１８．９３分、Ｔ１ｂは２０．１９分であった。ａｒｅａＰ１を算出したところ１１０５３．３３２であり、ａｒｅａＡ１を算出したところ１１６５９．０２９であり、ａｒｅａＰ１／ａｒｅａＡ１の値は０．９５であった。結果を表１に示す。
【０２６５】
なお、サンプルを含まない展開溶媒のみをインジェクションし、同一条件で測定した結果、上記測定で溶出時間７．１０分より前に検出されたピークは、展開溶媒等に起因するピークや、使用したカラムや装置に起因するベースラインの揺らぎによる擬似ピークであることが確認された。
【０２６６】
（Ｂ）陽イオン交換クロマトグラフィー測定
実施例１−２と同様にして測定を行った。得られたクロマトグラムを図１２に示す。溶出開始点の溶出時間は４．９３分、溶出終了点の溶出時間は５．９０分、Ｐ２ｔｏｐの溶出時間は５．２８分であり、Ｔ２は５．１０分であった。ａｒｅａＢ２を算出したところ５２．５６１であり、ａｒｅａＡ２を算出したところ１１３７２．５１０であり、ａｒｅａＢ２／ａｒｅａＡ２の値は０．００であった。結果を表１に示す。
【０２６７】
なお、実施例１−２と同様にして、同サンプルを質量分析計により検出したクロマトグラムを図１３に示す。これより、上記測定で溶出時間４．６０分に検出されたピークは、展開溶媒等に起因するピークや、使用したカラムや装置に起因するベースラインの揺らぎによる擬似ピークであることが確認された。
【０２６８】
（Ｃ）陰イオン交換クロマトグラフィー測定
実施例１−２と同様にして誘導体化及び測定を行った。得られたクロマトグラムを図１４に示す。溶出開始点の溶出時間は８．０２分、溶出終了点の溶出時間は９．５６分、Ｐ３ｔｏｐの溶出時間は８．４７分であり、Ｔ３は８．１８分であった。ａｒｅａＢ３を算出したところ６０．６７５であり、ａｒｅａＡ３を算出したところ１２４８４．５３５であり、ａｒｅａＢ３／ａｒｅａＡ３の値は０．００であった。結果を表１に示す。
【０２６９】
なお、実施例１−２と同様にして、同サンプルを質量分析計により検出したクロマトグラムを図１５に示す。これより、溶出時間３．９０〜５．２０分に検出されたピークは、展開溶媒等に起因するピークや、使用したカラムや装置に起因するベースラインの揺らぎによる擬似ピークであることが確認された。
【０２７０】
（比較例１−２）
比較例１−１で得られた比較精製物１−２について、実施例１−２と同様にして（Ａ）逆相クロマトグラフィー測定、（Ｂ）陽イオン交換クロマトグラフィー測定、（Ｃ）陰イオン交換クロマトグラフィー測定を行った。
【０２７１】
（Ａ）逆相クロマトグラフィー測定
溶出開始点の溶出時間は９．１０分、溶出終了点の溶出時間は２４．２３分、Ｐ１ｔｏｐの溶出時間は１９．３１分であり、Ｔ１ａは１８．９４分、Ｔ１ｂは２０．２０分であった。ａｒｅａＰ１を算出したところ１１０００．１９０であり、ａｒｅａＡ１を算出したところ１２０８８．１２１であり、ａｒｅａＰ１／ａｒｅａＡ１の値は０．９１であった。結果を表１に示す。
【０２７２】
なお、上記測定では溶出時間２３．６１分にピークが検出されたが、同サンプルを、機器にＷａｔｅｒｓ（株）社製Ａｌｌｉａｎｃｅ２６９５を、検出器（質量分析計）にＷａｔｅｒｓ（株）社製Ｑｕａｔｔｒｏ  ｍｉｃｒｏ  タンデム型質量分析計を、カラムに東ソー（株）社製  ＴＳＫｇｅｌ  ＯＤＳ−８０Ｔｓ  （粒子径  ５μｍ、カラムサイズ  ４．６ｍｍ×２５ｃｍ）を、展開溶媒に５ｍＭ酢酸アンモニウム  メタノール／蒸留水＝１０／９０を、それぞれ用い、流速  ０．６ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度  ４０℃、サンプル濃度  ０．０１ｍｇ／ｇ、注入量  ５μＬの条件で測定した結果、上記の溶出時間２３．６１分に検出されたピークは化合物９の両末端がカルボン酸である化合物に由来するピークであることが確認された。
（Ｂ）陽イオン交換クロマトグラフィー測定
溶出開始点の溶出時間は３．４２分、溶出終了点の溶出時間は６．４６分、Ｐ２ｔｏｐの溶出時間は５．４０分であり、Ｔ２は５．１４分であった。ａｒｅａＢ２を算出したところ４４２．０５０であり、ａｒｅａＡ２を算出したところ１１０５１．２５１であり、ａｒｅａＢ２／ａｒｅａＡ２の値は０．０４であった。結果を表１に示す。
【０２７３】
なお、上記測定では溶出時間３．９７分にピークが検出されたが、実施例１−２と同様にして、同サンプルを質量分析計により検出した結果、上記の溶出時間３．９７分に検出されたピークは、化合物９の両末端がカルボン酸である化合物に由来するピークであることが確認された。
【０２７４】
（Ｃ）陰イオン交換クロマトグラフィー測定
溶出開始点の溶出時間は９．５５分、溶出終了点の溶出時間は１１．９９分、Ｐ３ｔｏｐの溶出時間は１０．３７分であり、Ｔ３は１０．４０分であった。ａｒｅａＢ３を算出したところ５０．４１４であり、ａｒｅａＡ３を算出したところ１１７０９．５４４であり、ａｒｅａＢ３／ａｒｅａＡ３の値は０．００であった。結果を表１に示す。
【０２７５】
（比較例２−２）
比較例２−１で得られた比較精製物２について、実施例１−２と同様にして（Ａ）逆相クロマトグラフィー測定、（Ｂ）陽イオン交換クロマトグラフィー測定、（Ｃ）陰イオン交換クロマトグラフィー測定を行った。
【０２７６】
（Ａ）逆相クロマトグラフィー測定
得られたクロマトグラムを図１６に示す。溶出開始点の溶出時間は９．１４分、溶出終了点の溶出時間は１５．６５分、Ｐ１ｔｏｐの溶出時間は１１．９０分であり、Ｔ１ａは１１．６２分、Ｔ１ｂは１２．４５分であった。ａｒｅａＰ１を算出したところ１１２３９．８７９であり、ａｒｅａＡ１を算出したところ１２１７８．５０７であり、ａｒｅａＰ１／ａｒｅａＡ１の値は０．９２であった。結果を表１に示す。
【０２７７】
なお、比較例１−２と同様に同サンプルを質量分析計により検出した結果、上記の溶出時間１５．１９分に検出されたピークは、化合物１３のアミノ基に代えて水酸基を有する化合物に由来するピークであることが確認された。
【０２７８】
（Ｂ）陽イオン交換クロマトグラフィー測定
得られたクロマトグラムを図１７に示す。溶出開始点の溶出時間は３．３９分、溶出終了点の溶出時間は６．４４分、Ｐ２ｔｏｐの溶出時間は５．３７分であり、Ｔ２は５．１７分であった。ａｒｅａＢ２を算出したところ５８３．１１５であり、ａｒｅａＡ２を算出したところ１０１４６．６８６であり、ａｒｅａＢ２／ａｒｅａＡ２の値は０．０６であった。結果を表１に示す。
【０２７９】
また、実施例１−２と同様にして、同サンプルを質量分析計により検出したクロマトグラムを図１８に示す。これより、上記測定で溶出時間４．０８分に検出されたピークは、化合物１３のアミノ基に代えて水酸基を有する化合物に由来するピークであることが確認された。
【０２８０】
（Ｃ）陰イオン交換クロマトグラフィー測定
得られたクロマトグラムを図１９に示す。溶出開始点の溶出時間は９．５４分、溶出終了点の溶出時間は１２．１２分、Ｐ３ｔｏｐの溶出時間は１０．４０分であり、Ｔ３は１０．００分であった。ａｒｅａＢ３を算出したところ１２０．７３１であり、ａｒｅａＡ３を算出したところ１１００６．３３５であり、ａｒｅａＢ３／ａｒｅａＡ３の値は０．０１であった。結果を表１に示す。
【０２８１】
（比較例３−２）
比較例３−１で得られた比較精製物３について、実施例２−２と同様にして（Ａ）逆相クロマトグラフィー測定、（Ｂ）陽イオン交換クロマトグラフィー測定、（Ｃ）陰イオン交換クロマトグラフィー測定を行った。
【０２８２】
（Ａ）逆相クロマトグラフィー測定
溶出開始点の溶出時間は８．５０分、溶出終了点の溶出時間は２５．６９分、Ｐ１ｔｏｐの溶出時間は１９．３１分であり、Ｔ１ａは１８．９４分、Ｔ１ｂは２０．１９分であった。ａｒｅａＰ１を算出したところ１０３１９．２５６であり、ａｒｅａＡ１を算出したところ１１２１６．５８３であり、ａｒｅａＰ１／ａｒｅａＡ１の値は０．９２であった。結果を表１に示す。
【０２８３】
（Ｂ）陽イオン交換クロマトグラフィー測定
溶出開始点の溶出時間は３．１３分、溶出終了点の溶出時間は５．９２分、Ｐ２ｔｏｐの溶出時間は５．３０分であり、Ｔ２は５．１１分であった。ａｒｅａＢ２を算出したところ４３．７６９であり、ａｒｅａＡ２を算出したところ１００９４．２２４であり、ａｒｅａＢ２／ａｒｅａＡ２の値は０．０４であった。結果を表１に示す。
【０２８４】
なお、上記測定では溶出時間３．９８分にピークが検出されたが、実施例１−２と同様にして、同サンプルを質量分析計により検出した結果、上記の溶出溶出時間３．９８分に検出されたピークは、化合物２３のアミノ基に代えて水酸基を有する化合物に由来するピークであることが確認された。
【０２８５】
（Ｃ）陰イオン交換クロマトグラフィー測定
溶出開始点の溶出時間は３．３９分、溶出終了点の溶出時間は９．５９分、Ｐ３ｔｏｐの溶出時間は８．４８分であり、Ｔ３は８．１８分であった。ａｒｅａＢ３を算出したところ１１６．２１６であり、ａｒｅａＡ３を算出したところ１１６３９．９０７であり、ａｒｅａＢ３／ａｒｅａＡ３の値は０．０１であった。結果を表１に示す。
【０２８６】
（比較例４−２）
比較例４−１で得られた比較精製物４について、実施例１−２と同様にして（Ａ）逆相クロマトグラフィー測定、（Ｂ）陽イオン交換クロマトグラフィー測定、（Ｃ）陰イオン交換クロマトグラフィー測定を行った。
【０２８７】
（Ａ）逆相クロマトグラフィー測定
得られたクロマトグラムを図２０に示す。溶出開始点の溶出時間は９．０３分、溶出終了点の溶出時間は１８．２４分、Ｐ１ｔｏｐの溶出時間は１１．７８分であり、Ｔ１ａは１１．４４分、Ｔ１ｂは１２．３０分であった。ａｒｅａＰ１を算出したところ３２５５．８６９であり、ａｒｅａＡ１を算出したところ３４６０．４１３であり、ａｒｅａＰ１／ａｒｅａＡ１の値は０．９４であった。結果を表１に示す。
【０２８８】
なお、比較例１−２と同様に同サンプルを質量分析計により検出した結果、ピークＰ１の前方に重なるピークとして、化合物１３のカルボキシル基に代えて水酸基を有する化合物に由来するピークが確認された。
【０２８９】
（Ｂ）陽イオン交換クロマトグラフィー測定
得られたクロマトグラムを図２１に示す。溶出開始点の溶出時間は３．５６分、溶出終了点の溶出時間は１３．７０分、Ｐ２ｔｏｐの溶出時間は５．３４分であり、Ｔ２は５．１６分であった。ａｒｅａＢ２を算出したところ３６４．４２９であり、ａｒｅａＡ２を算出したところ８１１３．２２４であり、ａｒｅａＢ２／ａｒｅａＡ２の値は０．０４であった。結果を表１に示す。
【０２９０】
また、実施例１−２と同様にして、同サンプルを質量分析計により検出したクロマトグラムを図２２に示す。これより、上記測定で溶出時間４．６０分に検出されたピークは、展開溶媒等に起因するピークや、使用したカラムや装置に起因するベースラインの揺らぎによる擬似ピークであることが確認された。
【０２９１】
（Ｃ）陰イオン交換クロマトグラフィー測定
得られたクロマトグラムを図２３に示す。溶出開始点の溶出時間は３．５０分、溶出終了点の溶出時間は１１．２７分、Ｐ３ｔｏｐの溶出時間は１０．４１分であり、Ｔ３は１０．０８分であった。ａｒｅａＢ３を算出したところ４４９．５３２であり、ａｒｅａＡ３を算出したところ９５７２．４０５であり、ａｒｅａＢ３／ａｒｅａＡ３の値は０．０５であった。結果を表１に示す。
【０２９２】
また、実施例１−２と同様にして、同サンプルを質量分析計により検出したクロマトグラムを図２４に示す。これより、上記測定で溶出時間４．３０〜５．７０分に検出されたピークは、展開溶媒等に起因するピークや、使用したカラムや装置に起因するベースラインの揺らぎによる擬似ピークであり、溶出時間３．８３分に検出されたピークは、化合物１３のカルボキシル基に代えて水酸基を有する化合物が誘導体化された化合物に由来するピークであることが確認された。
【０２９３】
（比較例５）
実施例１−１で得られた化合物１３を含有する精製物に代えて、市販の化合物１３を含有するポリエチレングリコール１（和光純薬工業（株）社製、商品名：Ａｍｉｎｏ−ｄＰＥＧＲ８−ａｃｉｄ）を用いたこと以外は実施例１−２と同様にして（Ａ）逆相クロマトグラフィー測定、（Ｂ）陽イオン交換クロマトグラフィー測定、（Ｃ）陰イオン交換クロマトグラフィー測定を行った。
【０２９４】
（Ａ）逆相クロマトグラフィー測定
得られたクロマトグラムを図２５に示す。溶出開始点の溶出時間は９．４５分、溶出終了点の溶出時間は１７．８０分、Ｐ１ｔｏｐの溶出時間は１１．６８分であり、Ｔ１ａは１１．４３分、Ｔ１ｂは１２．２７分であった。ａｒｅａＰ１を算出したところ４７１９．５３３であり、ａｒｅａＡ１を算出したところ５０４４．８４４であり、ａｒｅａＰ１／ａｒｅａＡ１の値は０．９４であった。結果を表１に示す。
【０２９５】
（Ｂ）陽イオン交換クロマトグラフィー測定
得られたクロマトグラムを図２６に示す。溶出開始点の溶出時間は３．５６分、溶出終了点の溶出時間は５．９７分、Ｐ２ｔｏｐの溶出時間は５．３４分であり、Ｔ２は５．１７分であった。ａｒｅａＢ２を算出したところ６３１．３９１であり、ａｒｅａＡ２を算出したところ１０５９０．３９５であり、ａｒｅａＢ２／ａｒｅａＡ２の値は０．０６であった。結果を表１に示す。
【０２９６】
また、実施例１−２と同様にして、同サンプルを質量分析計により検出したクロマトグラムを図２７に示す。これより、上記測定で溶出時間４．６０分に検出されたピークは、展開溶媒等に起因するピークや、使用したカラムや装置に起因するベースラインの揺らぎによる擬似ピークであることが確認された。
【０２９７】
（Ｃ）陰イオン交換クロマトグラフィー測定
得られたクロマトグラムを図２８に示す。溶出開始点の溶出時間は３．７２分、溶出終了点の溶出時間は１１．３５分、Ｐ３ｔｏｐの溶出時間は１０．４０分であり、Ｔ３は１０．４０分であった。ａｒｅａＢ３を算出したところ５１１．８８２であり、ａｒｅａＡ３を算出したところ８３７８．７８１であり、ａｒｅａＢ３／ａｒｅａＡ３の値は０．０６であった。結果を表１に示す。
【０２９８】
また、実施例１−２と同様にして、同サンプルを質量分析計により検出したクロマトグラムを図２９に示す。これより、上記測定で溶出時間４．３０〜５．３０分に検出されたピークは、展開溶媒等に起因するピークや、使用したカラムや装置に起因するベースラインの揺らぎによる擬似ピークであることが確認された。
【０２９９】
（比較例６）
実施例２−１で得られた化合物２３を含有する精製物に代えて、市販の化合物２３を含有するポリエチレングリコール２（和光純薬工業（株）社製、商品名：Ａｍｉｎｏ−ｄＰＥＧＲ１２−ａｃｉｄ）を用いたこと以外は実施例２−２と同様にして（Ａ）逆相クロマトグラフィー測定、（Ｂ）陽イオン交換クロマトグラフィー測定、（Ｃ）陰イオン交換クロマトグラフィー測定を行った。
【０３００】
（Ａ）逆相クロマトグラフィー測定
得られたクロマトグラムを図３０に示す。溶出開始点の溶出時間は８．９０分、溶出終了点の溶出時間は２５．３６分、Ｐ１ｔｏｐの溶出時間は１９．１１分であり、Ｔ１ａは１８．７２分、Ｔ１ｂは２０．１８分であった。ａｒｅａＰ１を算出したところ１７９７７．８７５であり、ａｒｅａＡ１を算出したところ１８７５１．０６８であり、ａｒｅａＰ１／ａｒｅａＡ１の値は０．９６であった。結果を表１に示す。
【０３０１】
（Ｂ）陽イオン交換クロマトグラフィー測定
得られたクロマトグラムを図３１に示す。溶出開始点の溶出時間は３．２９分、溶出終了点の溶出時間は２５．３６分、Ｐ２ｔｏｐの溶出時間は５．２８分であり、Ｔ２は５．０９分であった。ａｒｅａＢ２を算出したところ６００．１９９であり、ａｒｅａＡ２を算出したところ９１１１．８４９であり、ａｒｅａＢ２／ａｒｅａＡ２の値は０．０７であった。結果を表１に示す。
【０３０２】
また、実施例２−２と同様にして、同サンプルを質量分析計により検出したクロマトグラムを図３２に示す。これより、上記測定で溶出時間４．６０分に検出されたピークは、展開溶媒等に起因するピークや、使用したカラムや装置に起因するベースラインの揺らぎによる擬似ピークであることが確認された。
【０３０３】
（Ｃ）陰イオン交換クロマトグラフィー測定
得られたクロマトグラムを図３３に示す。溶出開始点の溶出時間は７．９０分、溶出終了点の溶出時間は９．４６分、Ｐ３ｔｏｐの溶出時間は８．５０分であり、Ｔ３は８．２２分であった。ａｒｅａＢ３を算出したところ９２．９０３であり、ａｒｅａＡ３を算出したところ１１１６８．９３２であり、ａｒｅａＢ３／ａｒｅａＡ３の値は０．０１であった。結果を表１に示す。
【０３０４】
また、実施例２−２と同様にして、同サンプルを質量分析計により検出したクロマトグラムを図３４に示す。これより、上記測定で溶出時間４．３０〜５．１０分に検出されたピークは、展開溶媒等に起因するピークや、使用したカラムや装置に起因するベースラインの揺らぎによる擬似ピークであることが確認された。
【０３０５】
【表１】
0006638970.tif 000033
【０３０６】
上記の結果から、比較例１−２〜比較例６に用いたサンプル（比較例１−１〜４−１で得られた精製物及び市販のポリエチレングリコール１〜２）はａｒｅａＢ２／ａｒｅａＡ２の値が０．０２よりも大きく、アミノ基を有さない化合物が不純物として混在していることが確認された。また、比較例４−２〜５に用いたサンプル（比較例４−１で得られた精製物及び市販のポリエチレングリコール１）はａｒｅａＢ３／ａｒｅａＡ３の値が０．０２よりも大きく、カルボキシル基を有さない化合物が不純物として混在していることが確認された。
【０３０７】
（実施例１−３）
実施例１−１の合成例Ｉ−４で得られた化合物８を含有する精製物について、（Ｄ）逆相クロマトグラフィー測定を行った。
【０３０８】
（Ｄ）逆相クロマトグラフィー測定
逆相クロマトグラフィー測定は、機器に東ソー（株）社製  ビルドＧＰＣシステム  ＨＬＣ−８２２０を、検出器（示差屈折率計）に東ソー（株）社製  ＲＩ−８０２０を、カラムに東ソー（株）社製  ＴＳＫｇｅｌ  ＯＤＳ−８０Ｔｓ  （粒子径  ５μｍ、カラムサイズ  ４．６ｍｍ×２５ｃｍ）を、展開溶媒に５ｍＭ酢酸アンモニウム  メタノール／蒸留水＝５０／５０をそれぞれ用い、流速  ０．６ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度  ４０℃、サンプル濃度  ０．２ｍｇ／ｇ、注入量  ４０μＬの条件で行った。
【０３０９】
得られたクロマトグラムを図３５に示す。溶出開始点の溶出時間は１５．００分、溶出終了点の溶出時間は３２．３８分、Ｐ４ｔｏｐの溶出時間は２７．５７分であり、Ｔ４ａは２７．１３分、Ｔ４ｂは２８．６３分であった。ａｒｅａＰ４を算出したところ１６４８１．９８６であり、ａｒｅａＡ４を算出したところ１７１３０．９０５であり、ａｒｅａＰ４／ａｒｅａＡ４の値は０．９６であった。
【０３１０】
なお、サンプルを含まない展開溶媒のみをインジェクションし、同一条件で測定して得られたクロマトグラムを図３６に示す。これより、上記測定で溶出時間１０．５０分より前に検出されたピークは、展開溶媒等に起因するピークや、使用したカラムや装置に起因するベースラインの揺らぎによる擬似ピークであることを確認した。
【０３１１】
（実施例２−３）
実施例２−１の合成例ＩＩＩ−４で得られた化合物１８を含有する精製物について、（Ｄ）逆相クロマトグラフィー測定を行った。
【０３１２】
（Ｄ）逆相クロマトグラフィー測定
展開溶媒を５ｍＭ酢酸アンモニウム  メタノール／蒸留水＝６０／４０に変更したこと以外は、実施例１−３と同様にして測定を行った。得られたクロマトグラムを図３７に示す。溶出開始点の溶出時間は１２．０１分、溶出終了点の溶出時間は１６．３４分、Ｐ４ｔｏｐの溶出時間は１５．２４分であり、Ｔ４ａは１４．９６分、Ｔ４ｂは１５．７８分であった。ａｒｅａＰ４を算出したところ１０８９８．６７２であり、ａｒｅａＡ４を算出したところ１１４２７．９２１であり、ａｒｅａＰ４／ａｒｅａＡ４の値は０．９５であった。
【０３１３】
また、サンプルを含まない展開溶液のみをインジェクションし、同一条件で測定した結果、上記測定で溶出時間１０．５０分より前に検出されたピークは、展開溶媒等に起因するピークや、使用したカラムや装置に起因するベースラインの揺らぎによる擬似ピークであることが確認された。
【０３１４】
（比較例１−３）
比較例１−１で得られた比較精製物１−１について、実施例１−３と同様にして（Ｄ）逆相クロマトグラフィー測定を行った。
【０３１５】
（Ｄ）逆相クロマトグラフィー測定
得られたクロマトグラムを図３８に示す。溶出開始点の溶出時間は８．２０分、溶出終了点の溶出時間は３２．０２分、Ｐ４ｔｏｐの溶出時間は２７．５９分であり、Ｔ４ａは２７．１６分、Ｔ４ｂは２８．６６分であった。ａｒｅａＰ４を算出したところ１６６７７．１７８であり、ａｒｅａＡ４を算出したところ１８３０１．７７５であり、ａｒｅａＰ４／ａｒｅａＡ４の値は０．９１であった。
【０３１６】
なお、同サンプルを、機器にＷａｔｅｒｓ（株）社製Ａｌｌｉａｎｃｅ２６９５を、検出器（質量分析計）にＷａｔｅｒｓ（株）社製Ｑｕａｔｔｒｏ  ｍｉｃｒｏ  タンデム型質量分析計を、カラムに東ソー（株）社製  ＴＳＫｇｅｌ  ＯＤＳ−８０Ｔｓ  （粒子径５  μｍ、カラムサイズ  ４．６ｍｍ×２５ｃｍ）を、展開溶媒に５ｍＭ酢酸アンモニウム  メタノール／蒸留水＝１０／９０を、それぞれ用い、流速  ０．６ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度  ４０℃、サンプル濃度  ０．０１ｍｇ／ｇ、注入量  ５μＬの条件で測定した。これにより、上記測定で溶出時間８．５２分に検出されたピークは化合物９に由来するピークであることが確認された。
【０３１７】
（実施例３）
式（１２）中のａが８であり、原子団Ｘがマレイミド基を含む原子団であり、原子団Ｙが活性エステル基を含む原子団である化合物２７の合成
【０３１８】
【化３２】
0006638970.tif 000034
【０３１９】
前記式に示す反応経路のとおり、化合物２７を合成した。すなわち、先ず、実施例１−１で得られた化合物１３を含有する精製物（化合物１３：  １．００ｇ、２．２６ｍｍｏｌ）をアセトニトリル  １０ｍＬに溶解し、ここに３−マレイミドプロピオン酸−Ｎ−スクシンイミジル（０．５６ｇ、２．４９ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（０．２７５ｇ、２．７２ｍｍｏｌ）を加え、室温で３時間攪拌した。３時間後、ＥＳＩ−ＭＳ測定により化合物１３の消費を確認し、反応溶液を減圧濃縮した。残渣に０．１Ｍ  水酸化ナトリウム水溶液  １０ｍＬを加え、ジクロロメタン  １０ｍＬで３回抽出した。有機層に硫酸ナトリウムを加え、乾燥・ろ過した。ろ液を減圧濃縮し、無色透明液体のマレイミド化体を含有する反応生成物を１．２１ｇを得た。
【０３２０】
次いで、前記反応生成物をＤＭＦ  ５ｍＬに溶解し、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（０．４７ｇ、２．４５ｍｍｏｌ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（０．２３ｇ、２．４５ｍｍｏｌ）を加え、室温で１８時間攪拌した。１８時間後、ＥＳＩ−ＭＳ測定によってマレイミド化体の消費を確認し、酢酸エチル  １５ｍＬを加え、１Ｍ  塩酸  １０ｍＬで２回、飽和食塩水  １０ｍＬで２回有機層を洗浄した。有機層に硫酸ナトリウムを加え、乾燥・ろ過した。ろ液を減圧濃縮し、無色透明液体の化合物２７を含有する精製物を得た。
【０３２１】
収量：１．２０ｇ
ＭＳ（ＥＳＩ＋）：  化合物２７  ７０７．４  ［Ｍ＋ＮＨ４］＋
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）：  ６．６７  （ｓ，２Ｈ），  ３．８０（ｍ，４Ｈ），  ３．６０（ｍ，２８Ｈ），  ３．４９（ｔ，２Ｈ），  ３．３７（ｍ，２Ｈ），  ２．８６（ｔ，２Ｈ），  ２．８０（ｓ，４Ｈ），  ２．４６（ｔ，２Ｈ）。
【０３２２】
（実施例４）
式（１２）中のａが１２であり、原子団Ｘがヨードアセトアミド基を含む原子団であり、原子団Ｙがカルボキシル基を含む原子団である化合物２８の合成
【０３２３】
【化３３】
0006638970.tif 000035
【０３２４】
前記式に示す反応経路のとおり、化合物２８を合成した。すなわち、ナスフラスコに実施例２−１で得られた化合物２３を含有する精製物（化合物２３：  １．００ｇ、１．６２ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（０．１８ｇ、１．７８ｍｍｏｌ）及びジクロロメタン（８ｍＬ）を入れ、溶解させた。混合液を０℃に冷却し、ジクロロメタン（２ｍＬ）に溶解した、二（ヨード酢酸）無水物（０．６３ｇ、１．７８ｍｍｏｌ）を１０分間かけて滴下した。滴下終了後、反応混合液を室温まで昇温し、遮光下で１８時間反応させた。ＥＳＩ−ＭＳ測定により化合物２３が消失したことを確認し、反応混合液を飽和重曹水  ５ｍＬで１回、飽和食塩水  ５ｍＬで２回洗浄した。有機層に硫酸ナトリウムを加え、乾燥・ろ過した。ろ液を減圧濃縮し、淡黄色透明液体の化合物２８を含有する精製物を得た。
【０３２５】
収量：１．１６ｇ
ＭＳ（ＥＳＩ＋）：  化合物２８  ８０３．４［Ｍ＋ＮＨ４］＋、  ４１０．５［Ｍ＋２ＮＨ４］２＋
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）：  ８．０７（ｓ，１Ｈ），  ７．２３（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），  ３．７９（ｔ，２Ｈ），  ３．７４（ｓ，２Ｈ），  ３．６１（ｍ，４６Ｈ），  ３．４８（ｍ，２Ｈ），  ２．５６（ｔ，２Ｈ）。
【０３２６】
（実施例５）
式（１２）中のａが１２であり、原子団Ｘがアルキニル基を含む原子団であり、原子団Ｙがカルボキシル基を含む原子団である化合物２９の合成
【０３２７】
【化３４】
0006638970.tif 000036
【０３２８】
前記式に示す反応経路のとおり、化合物２９を合成した。すなわち、ナスフラスコに実施例２−１で得られた化合物２３を含有する精製物（化合物２３：  １．００ｇ、１．６２ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（０．１８ｇ、１．７８ｍｍｏｌ）及びジクロロメタン（８ｍＬ）を入れ、溶解させた。混合液を０℃に冷却し、ジクロロメタン（２ｍＬ）に溶解した（１Ｒ，８Ｓ，９ｓ）−Ｂｉｃｙｃｌｏ［６．１．０］ｎｏｎ−４−ｙｎ−９−ｙｌｍｅｔｈｙｌ  Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｃａｒｂｏｎａｔｅ（０．５２ｇ、１．７８ｍｍｏｌ）を１０分間かけて滴下した。滴下終了後、反応混合液を室温まで昇温し、５時間反応させた。ＥＳＩ−ＭＳ測定により（１Ｒ，８Ｓ，９ｓ）−Ｂｉｃｙｃｌｏ［６．１．０］ｎｏｎ−４−ｙｎ−９−ｙｌｍｅｔｈｙｌ  Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｃａｒｂｏｎａｔｅが消失したことを確認し、反応混合液を１Ｍ  塩酸  ５ｍＬで２回、飽和食塩水で２回洗浄した。有機層に硫酸ナトリウムを加え、乾燥・ろ過した。ろ液を減圧濃縮し、白色透明液体の化合物２９を含有する精製物を得た。
【０３２９】
収量：１．１６ｇ
ＭＳ（ＥＳＩ＋）：  化合物２９  ８１１．６［Ｍ＋ＮＨ４］＋、  ４１４．８［Ｍ＋２ＮＨ４］２＋
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）：  ５．２４（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），  ４．１４（ｄ，２Ｈ），  ３．７９（ｔ，２Ｈ），  ３．６５（ｍ，４４Ｈ），  ３．５６（ｔ，２Ｈ），  ３．３３（ｍ，２Ｈ），  ２．５６（ｔ，２Ｈ），  ２．２５（ｍ，６Ｈ），  １．６０（ｍ，２Ｈ），  １．３５（ｍ，１Ｈ），  ０．９５（ｍ，２Ｈ）。
【産業上の利用可能性】
【０３３０】
以上説明したように、本発明によれば、両末端にそれぞれアミノ基とカルボキシル基を有し、エチレングリコール鎖長が互いに同じである化合物を、主成分として、特に高純度で含有するヘテロ型単分散ポリエチレングリコールを提供することが可能となる。このように、本発明のヘテロ型単分散ポリエチレングリコールは、エチレングリコール鎖長の異なる化合物や末端官能基が異なる化合物の含有量が少ないという特徴を有するため、ＡＤＣのリンカー材料として用いた場合、エチレングリコール鎖長の異なる化合物に起因するＡＤＣ製造上の問題や医薬品申請上の問題が少なく、また、末端官能基が異なる化合物に起因する、ＡＤＣ製造時の薬剤が２つ結合した化合物や抗体が２つ結合した化合物、更には薬剤又は抗体が結合していない化合物といった薬剤として有効性のない副生成物の生成を十分に抑制することができる。
【０３３１】
さらに、本発明のヘテロ型単分散ポリエチレングリコールの製造方法は、シリカゲルカラムクロマトグラフィー等を用いず、分液抽出のみで上記の高純度なヘテロ型単分散ポリエチレングリコールを製造可能であることから、工業化に特に適した製造方法である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
0006638970.tif 000042
【図６】
0006638970.tif 000043
【図７】
0006638970.tif 000044
【図８】
0006638970.tif 000045
【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
0006638970.tif 000049
【図１３】
0006638970.tif 000050
【図１４】
0006638970.tif 000051
【図１５】
0006638970.tif 000052
【図１６】
0006638970.tif 000053
【図１７】
0006638970.tif 000054
【図１８】
0006638970.tif 000055
【図１９】
0006638970.tif 000056
【図２０】
0006638970.tif 000057
【図２１】
0006638970.tif 000058
【図２２】
0006638970.tif 000059
【図２３】
0006638970.tif 000060
【図２４】
0006638970.tif 000061
【図２５】
0006638970.tif 000062
【図２６】
0006638970.tif 000063
【図２７】
0006638970.tif 000064
【図２８】
0006638970.tif 000065
【図２９】
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【図３０】
0006638970.tif 000067
【図３１】
0006638970.tif 000068
【図３２】
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【図３３】
0006638970.tif 000070
【図３４】
0006638970.tif 000071
【図３５】
0006638970.tif 000072
【図３６】
0006638970.tif 000073
【図３７】
0006638970.tif 000074
【図３８】
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