(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一対の融合蛋白質で構成される蛋白質二量体であって、それぞれの融合蛋白質は潜在関連ペプチド（ＬＡＰ）、薬学的に活性な作用薬、および二量体化領域を含むアミノ酸配列を含み、該二量体化領域は、ロイシンジッパー、イソロイシンジッパー、ジンクフィンガー、または抗体フラグメントポリペプチドで構成され、
該ＬＡＰと薬学的に活性な作用薬がタンパク質分解切断部位を含むアミノ酸配列によって結合され、
該二量体化領域は、ＬＡＰのＮ−末端に結合され、該融合蛋白質はそれぞれの融合蛋白質内の二量体化領域で結合され、薬学的に活性な作用薬の周囲に閉じられたシェルを形成する、蛋白質二量体。
【請求項２】
該抗体フラグメントポリペプチドが、Ｆｃ領域ポリペプチド、免疫グロブリンヒンジポリペプチド、ＣＨ３領域ポリペプチド、ＣＨ４領域ポリペプチド、ＣＨ１領域ポリペプチド、ＣＨ２領域ポリペプチド、あるいはＣＬ領域ポリペプチドである、請求項１記載の蛋白質二量体。
【請求項３】
該抗体フラグメントポリペプチドが、Ｆｃ領域ポリペプチドである、請求項１記載の蛋白質二量体。
【請求項４】
該Ｆｃ領域ポリペプチドが、ＩｇＧまたはＩｇＡ抗体から誘導される、請求項３記載の蛋白質二量体。
【請求項５】
該二量体化領域が、リンカー配列を介して潜在関連ペプチドへリンクされる、請求項１から４のいずれか１項記載の蛋白質二量体。  
【請求項６】
該潜在関連ペプチド（ＬＡＰ）が、ＴＧＦβの前駆体領域である、請求項１から５のいずれか１項記載の蛋白質二量体。
【請求項７】
該潜在関連ペプチド（ＬＡＰ）が、ＴＧＦβ−１，ＴＧＦβ−２，ＴＧＦβ−３，ＴＧＦβ−４，またはＴＧＦβ−５の前駆体領域である、請求項６記載の蛋白質二量体。
【請求項８】
該タンパク質分解切断部位が、マトリックスメタロプロテアーゼ切断部位、またはアグリカナーゼ切断部位である、請求項１から７のいずれか１項記載の蛋白質二量体。
【請求項９】
該薬学的に活性な作用薬がポリペプチドである、請求項１から８のいずれか１項記載の蛋白質二量体。
【請求項１０】
該薬学的に活性なポリペプチドが、成長因子、分化因子、サイトカイン、ケモカイン、サイトカイン阻害剤、サイトカインレセプター、フリーラジカルスカベンジング酵素、プロドラッグ転換酵素、ペプチドミミック、プロテアーゼ阻害剤、メタロプロテアーゼの組織阻害剤、セリンプロテアーゼ阻害剤、抗体または抗体フラグメントである、請求項９記載の蛋白質二量体。
【請求項１１】
請求項１から１０のいずれか１項記載の蛋白質二量体を含む、医薬品組成物。
【請求項１２】
薬学的に活性な作用薬をコード化する第１の核酸配列、ＬＡＰをコード化する第２の核酸配列、およびロイシンジッパー、イソロイシンジッパー、ジンクフィンガー、または抗体フラグメントポリペプチドで構成される二量体化領域をコード化する第３の核酸配列を含む、請求項１記載の融合蛋白質をコード化する核酸構成物。
【請求項１３】
該二量体化領域ポリペプチドが、ＩｇＧまたはＩｇＡ抗体から誘導されるＦｃ領域ポリペプチドである、請求項１２記載の核酸構成物。
【請求項１４】
該核酸構成物が、タンパク質分解切断部位をコード化する核酸配列をさらに含む、請求項１３記載の核酸構成物。
【請求項１５】
該薬学的に活性な作用薬が、成長因子、分化因子、サイトカイン、ケモカイン、サイトカイン阻害剤、サイトカインレセプター、フリーラジカルスカベンジング酵素、プロドラッグ転換酵素、ペプチドミミック、プロテアーゼ阻害剤、メタロプロテアーゼの組織阻害剤、セリンプロテアーゼ阻害剤、抗体または抗体フラグメントである、請求項１２から１４のいずれか１項記載の核酸構成物。
【請求項１６】
ベクターの形式である、請求項１２から１５のいずれか１項記載の核酸構成物。
【請求項１７】
請求項１２から１６のいずれか１項記載の核酸構成物によりコード化された融合蛋白質。
【請求項１８】
請求項１２から１６のいずれか１項記載の核酸構成物を含む細胞。
【請求項１９】
請求項１２から１６のいずれか１項記載の核酸構成物または請求項１８記載の細胞を含む、医薬品組成物。
【請求項２０】
炎症状態または癌を治療するための、請求項１１または１９記載の医薬品組成物。
【請求項２１】
炎症状態あるいは癌の治療に使用するための、請求項１から１０のいずれか１項記載の蛋白質二量体、請求項１６記載の核酸構成物、または請求項１８記載の細胞。
【請求項２２】
請求項１から１０のいずれか１項記載の蛋白質二量体、請求項１２から１６のいずれか１項記載の核酸構成物、または請求項１８記載の細胞と、適用のためのビヒクルを含むキット。
【請求項２３】
宿主細胞中の発現による組み換えの融合蛋白質の生産、発現された融合蛋白質の精製、およびＬＡＰのＮ−末端に融合蛋白質の二量体化領域を結合し、薬学的に活性な作用薬の周囲に閉じられたシェルを形成することを含む、請求項１から１０のいずれか１項記載の一対の融合蛋白質で構成される蛋白質二量体の調製方法。
【請求項２４】
潜在関連ペプチドをコード化する核酸配列、二量体化領域、タンパク質分解切断シーケンス、および薬学的に活性な作用薬を結合することを含み、任意にタンパク質分解切断部位の一方にリンカー・シーケンスを含む、請求項１２から１６のいずれか１項記載の核酸構成物を調製する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬学的に活性な作用薬へ刺激潜在性を与える、タンパク質、タンパク質誘導体およびＤＮＡ構成物の使用に関する。本発明は、さらに薬学的に活性な作用薬に刺激潜在性を供給する改良方法に関する。
【０００２】
ほとんどのサイトカインおよび成長因子は制御された管理機構の下で発現される。それらの遺伝子発現は環境上の刺激、たとえば感染、細胞間相互作用、細胞間マトリックス組成物の変化、接着分子との相互作用、または他のサイトカインとの刺激を介して厳密に制御することにより調整される。転写および転写後のレベルのコントロールに加えて、第２の信号が細胞を活性化しなければ、いくつかのサイトカインはメディアへ放されない。サイトカイン活性のための第３のレベルの調整は、潜在型の形態で分泌される分子に見い出され、炎症、創傷治癒および組織修復が起こるところで、サイトカイン部位を放出することにより「活性化される」(Khalil N,Microbes and Infection,1,1255-1263(1999))。この後者に関しては、形質転換増殖因子ベータ（transforming growth factor beta：ＴＧＦβ）は最も大きな考慮をされた。
【０００３】
アミノ末端潜在関連蛋白質（latency associated protein：ＬＡＰ）と活性なＴＧＦβサイトカインのＣＯＯＨ末端で結合した二量体の潜在期サイトカインとしてＴＧＦβが合成される(Roberts and Sporn,Peptide Growth Factors and their Receptors:Sporn,MB and Roberts,AB,Springer-Verlag,419-472(1996);Roth-Eicchorn et al.,Hepatology,28 1588-1596 (1998))。前駆物質ペプチドはタンパク質分泌に必要なシグナルペプチド（残基１−２９）を含み、ゴルジ装置を通して分子をガイドし、蛋白質分解切断とグリコシレーションによって処理されるようになる。ＬＡＰ領域はアルギニン（２７７−２７８）での蛋白質分解切断によってＴＧＦβから分けられる。成熟したＴＧＦβはアラニン２７９で始まる。ＬＡＰは、防御ＴＧＦβに加えて、他の分子との相互作用に必要な重要な残基を含んでいる。ＬＡＰ領域の突然変異は最近常染色体優性カムラチ・エンゲルマン病に関係していることが見いだされた(Janssens et al.,Nature Genetics,26,273-275(2000))。システイン２２４および２２６は２つのＬＡＰの間の分子内ジスルフィド結合において重要である。セリンへの突然変異は、分子を「活性」にする(Sanderson et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA,92,2572-2576(1995);Brunner et al.,Mol.Endocrinol.6,1691-1700 (1992);Brunner et al.,J.Biol.Chem,264,13660-13664(1989))。ＲＧＤモチーフ（２４５−２４７）は、インテグリンとの相互作用を促進する（Munger et al.,Mol,Biol.of the Cell,9,2627-2638(1998;Derynck R,TIBS,19,548-553(1994))。核酸エンコーディングＴＧＦβは米国５８０１２３１に述べられている。
【０００４】
間充織、上皮および内皮起源のものを含む研究されたほとんどの細胞タイプでは、ＴＧＦβはＴＧＦβおよび、潜在ＴＧＦβ−結合蛋白質（latent TGFb-binding proteins：ＬＴＢＰｓ）に共有結合された潜在関連ペプチド（ＬＡＰ）プロペプチド二量体から成る形式で分泌される。ＬＴＢＰもＴＧＦβの分泌および折畳に必要とされる。(Miyazano et al.,EMBO J.10,1091-1101(1991);Miyazano et al.,J.Biol.Chem.267,5668-5675(1992);Eklov et al.,Cancer Res.53,3193-3197(1993))。システイン３３は、潜在性ＴＧＦβ結合蛋白質（ＬＴＢＰ）の第３の８システインリッチの繰り返しとの二硫化物ブリッジにとって重要である(Saharinen et al.,The EMBO Journal,15,245-253(1996)。酵素、たとえばトロンボスポンジン−(Schultz et al.,The Journal of Biological Chemistry,269,26783-26788(1994);Crawford et al.,Cell,93,1159-1170(1998))，トランスグルタミナーゼ（Nunes et al.,J.Cell,Biol.136,1151-1163(1997);Kojima et al.,The Journal of Cell Biology,121,439-448(1993))、およびＭＭＰ９、並びにＭＭＰ２(Yu and Stamenkovic,Genes and Dev,14,163-176 2000)）によるＬＴＢＰの変性は、潜在型複合体からＴＧＦβの活性な部分を放出することを可能とする。
【０００５】
サイトカインは、細胞間相互作用の可溶性の局所的媒介物質を務める天然産物である。
それらは様々な多面発現性のアクションを有し、それらのうちのいくらかは治療目的のために利用することができる。ｓｃＦｖ(Lode et al.,Pharmacol.Ther,80,277-292(1998))およびｖＷＦ(Gordon et al.,Human Gene Therapy,8,1385-1394(1997))を使用する特定の細胞タイプへのサイトカインのターゲティングは、サイトカイン複合体の活性なサイトカイン部位の全体に注目した。ターゲットとされている組織で生物学上有効な濃度を達成するために非常に高濃度で体系的に適用されなければならない、薬理学的に活性なタンパク質あるいはそのような作用薬に基づいた他の薬は、それらの使用と効能を制限する不適当な全身性の影響（例えば毒性）の上昇を与える傾向がある。
【０００６】
ＴＧＦ−βのＬＡＰを使用する薬学的に活性な作用薬へ潜在性を提供するためのシステムの構築の基礎となる原理が、ＷＯ０２／０５５０９８およびＷＯ２００９／０７７７５５に述べられている。自然発生のＬＡＰ−ＴＧＦβ複合体では、潜在関連ペプチドは、それが分解されるのを防ぐためにＴＧＦβのまわりに保護シェルを形成する。シェルの閉鎖性はＬＡＰとＴＧＦβの間の内部相互作用のために保証される。「ペイロード」が別のサイトカイン、成長因子または、ペプチド、あるいは薬学的に活性化合物である時、これらの相互作用は必ずしも期待されず、シェル内へのモバイル標的分子の侵入を許可する浸透性のシェルに帰着することがてる。例えば、標的分子が可溶性のレセプターである場合、レセプターはシェルに入り、薬学的に活性な作用薬と相互作用することができ、薬学的に活性な作用薬がＬＡＰと結合している場合でさえ、相互作用することができる。これは、望ましくない副作用を生ずる、オフサイト活性に結びつくかもしれない。更に、ＷＯ  ２００９／０７７７５５により懸濁液細胞培養を利用するタンパク質産生が改善されたが、本発明者は二量体に加えて、ＬＡＰ融合蛋白質（LAP fusion proteins）も活性なモノマーを形成する傾向があることを見いだした。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者は、このシステムに基づいて潜在した形式で薬学的に活性な作用薬を提供するための改善された手段を開発した。
【０００８】
本発明の最初の態様によれば、潜在関連ペプチド（ＬＡＰ）、薬学的に活性な作用薬、および二量体化領域を含むアミノ酸配列を含み、該ＬＡＰと薬学的に活性な作用薬が、タンパク質分解切断部位（proteolytic cleavage site）を含むアミノ酸配列によって結合される融合蛋白質が提供される。
【０００９】
ＬＡＰ、タンパク質分解切断部位、薬学的に活性な作用薬および二量体化領域を含む融合蛋白質は、潜在した薬学的に活性な作用薬の部位特異性活性を提供することができる。用語「部位特異性活性(site specific activation)」の用語は、本明細書に使用される時、一般的な意味で使用され、タンパク質分解切断部位での部位特異的な分裂により薬学的に活性な作用薬に与えられる潜在性の除去または低下に限定されない。
【００１０】
タンパク質分解切断部位での部位特異的な分裂により、薬学的に活性な作用薬の回復された活性化が付随的に起こると予想される。
【００１１】
本明細書で使用される用語「潜在した薬学的に活性な作用薬(latent pharmaceutically active agent)」は、ＬＡＰおよびタンパク質分解切断部位を伴うことによる潜在した活性な作用薬を含むが、それに限定されるものではない。具体的には、薬学的に活性な作用薬は、潜在した融合蛋白質を形成するＬＡＰに関連するタンパク質分解切断部位への融合によって潜在することができるかもしれない。薬学的に活性な作用薬は自然由来または合成物であめことができる。
【００１２】
図４（ｃ）に示されるように、二量体化領域がＬＡＰに融合されている融合蛋白質が構成されてもよい。付加的なタンパク質分解切断部位および／またはリンカー・シーケンスも二量体化領域とＬＡＰの間に挿入されてもよい。分泌シグナルペプチド（つまり前駆物質ペプチド）は、二量体化領域のＮ末端で二量体化領域へ融合されてもよい。
【００１３】
用語「タンパク質」は、本明細書においては一般的な意味で使用され、ペプチド結合によってともに連結された複数のアミノ酸残基を意味する。タンパク質は、ペプチド、オリゴペプチド、オリゴマーあるいはポリペプチドと同じもの意味し、交換可能に使用することかでき、糖タンパク質およびその派生物を含む。用語「タンパク質」は、タンパク質のフラグメント、アナログおよび派生物を含むことを意図する。ここで、フラグメント、アナログおよび派生物は言及される蛋白質と同じ生物活性あるいは機能を本質的に保持する。
【００１４】
本明細書において定義されるタンパク質のフラグメント、アナログおよび派生物は、少なくとも６、好ましくは１０あるいは２０、あるいは最大５０あるいは１００までの長さのアミノ酸であることができる。
【００１５】
タンパク質のフラグメント、アナログおよび派生物は、（ｉ）アミノ酸残基の１つ以上が保存されたか保存されなかったアミノ酸残基（好ましくは保存されたアミノ酸残基）でありそのような置換されたアミノ酸残基は遺伝コードによってコード化されたか、あるいはコード化されないもの、（ｉｉ）アミノ酸残基の１つ以上が置換基を含むもの、（ｉｉｉ）成熟ポリペプチドが他の化合物、たとえばポリペプチドの半減期増加させる化合物（例えばポリエチレングリコール）と融合しているもの、または（ｉｖ）追加のアミノ酸が成熟ポリペプチドに融合されたもの、たとえばポリペプチドの浄化のために使用されるリーダーあるいは分泌シーケンスを含む。そのようなフラグメント、派生物およびアナログは、本明細書の開示から本発明の範囲内であると考えられる。
【００１６】
特に好ましいものは、たとえば５から１０、１から５、あるいは１から３、２、１または０のアミノ酸残基が置換されているか、削除されているか、または追加されている任意の組み合わせのタンパク質のアミノ酸配列を有する、変形、アナログ、派生物およびフラグメンである。特に好ましいものは、サイレントな置換、追加および欠失であり、これは本発明のタンパク質の特性および活性を変更しない。さらに特には、保存的置換が好ましい。
【００１７】
本発明の変形の一例は、１つ以上の他のアミノ酸での１つ以上のアミノ酸の置換とは異なる、上に定義されるような融合蛋白質である。当業者は、様々なアミノ酸に同様の特性があることに気づくだろう。物質のそのような１つ以上のアミノ酸は、しばしばその物質の希望の活性を失うことなく、１つ以上の他のそのようなアミノ酸によって置換することができる。
【００１８】
したがって、アミノ酸グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシン（脂肪族の側鎖があるアミノ酸）は、しばしば互いの代わりに用いることができる。これらの可能な置換のうち、グリシンとアラニンが（それらは比較的短い側鎖があるので）互いの代わりになるように使用され、バリン、ロイシンおよびイソロイシンが（それらは疎水性のより大きな脂肪族の側鎖があるので）互いの代わりになるように使用されることが好ましい。互いの代わりにしばしば用いることができる他のアミノ酸としては次のものを含んでいる：フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン（芳香族側鎖があるアミノ酸）；リジン、アルギニン、およびヒスチジン（塩基性側鎖があるアミノ酸）；アスパルテート、およびグルタメート（酸性側鎖があるアミノ酸）；アスパラギン、およびグルタミン（アミド側鎖があるアミノ酸）；またシステイン、およびメチオニン（硫黄を含む側鎖があるアミノ酸）。
【００１９】
この性質の置換は「保存的」あるいは「半−保存的」アミノ酸置換としばしば呼ばれる。
【００２０】
アミノ酸欠失あるいは挿入も、先に言及した融合蛋白質についてのアミノ酸配列に関連してあってもよい。例えば、ポリペプチドの活性に実質的な影響を与えないアミノ酸、あるいは少なくともそのような活性を損なわないアミノ酸は削除されてもよい。そのような欠失は、活性を保持しながらポリペプチドの全長または分子量を低減することができるので、有利となり得る。これは、特定の目的に必要なポリペプチドの量の低減を可能にする場合がある。例えば、投与量を低減することができる。
【００２１】
上記の融合蛋白質のシーケンスに関するアミノ酸挿入も行うことができる。これは本発明の物質の特性を変更（例えば融合蛋白質に関して上に説明されるように、同定、浄化あるいは発現を助けること）するために行われてもよい。
【００２２】
本発明の融合蛋白質についてのシーケンスに関するアミノ酸変化は、任意の適切な技術、例えば、部位特異的変異誘発の使用によって行うことができる。自然発生または非自然発生のアミノ酸を使用して、本発明の範囲内のアミノ酸置換あるいは挿入を行うことができることが認識されるべきである。自然または合成のアミノ酸が使用されるかに関わらず、Ｌ−アミノ酸のみが存在することが好ましい。
【００２３】
本発明によるタンパク質には追加のＮ末端および／またはＣ末端アミノ酸シーケンスがあってもよい。
【００２４】
様々な理由（例えばグリコシレーション）のためにそのようなシーケンスを提供することができる。
【００２５】
本明細書において用語「融合蛋白質(fusion protein)」は一般的な意味で使用され、水素結合または塩橋を含む化学的手段、あるいはタンパク質合成によるペプチド結合、あるいは両方によって連結された１つ以上のタンパク質を意味する。
【００２６】
本発明の潜在関連ペプチド（ＬＡＰ）は、ＴＧＦβの前駆物質領域のための暗号配列、あるいは本質的にそれと同一の配列を含むが、それに限定されない。
【００２７】
当該分野で知られているように、「同一性」は、２つ以上のポリペプチド配列あるいは２つ以上のポリヌクレオチド・シーケンスの関係であり、配列を比較して決定される。当該分野では同一性は、そのようなシーケンスのストリング間のマッチによって決定される、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドのシーケンス間でのシーケンスの関連性(relatedness)（相同）の程度をも意味する。２つのポリペプチドあるいは２つのポリヌクレオチド・シーケンスの間の同一性を測定する多くの方法が存在しているが、同一性を決定するために一般に使用される方法はコンピュータ・プログラムによるものである。２つのシーケンス間の同一性を決定する好ましいコンピュータ・プログラムとしては、ＧＣＧプログラムパッケージ(Devereux,et al.,Nucleic acids Research,12,387(1984)、BLASTP、BLASTN、FAST(Atschul et al.,J.Molec.Biol.215,403(1990)が挙げられるが、これらに制限されない。
【００２８】
本発明のＬＡＰは、ＴＧＦβの前駆物質領域を含んでもよく、たとえばヒトからのＴＧＦβ−１、２または３の前駆物質ペプチドを含んでもよい(Derynck et al., Nature,316,701-705(1985);De Martin et al.,EMBO J.6 3673-3677(1987);Hanks et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.85,79-82(1988);Derynck et al.,EMBO J.7,3737-3743(1988);Ten Dyke et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85,4715-4719(1988))、または鶏からのＴＧＦβ−４(Jakowlew et al.,Mol.Endocrinol.2,1186-1195(1988))、またはアフリカツメガエルからのＴGFβ-5(Kondaiah et al.,J.Biol.Chem.265,1089-1093(1990))を含んでもよい。用語「前駆物質領域(precursor domain)」は、成熟タンパク質(mature protein)をコード化するシーケンスを含んでいない、分泌シグナルペプチド(secretory signal peptide)（つまり前駆物質ペプチド）をコード化するシーケンスとして定義される。ＴＧＦβ１、２、３、４および５の前駆物質領域のアミノ酸配列は、図１に示される(Roberts and Sporn,Peptide Growth Factors and their Receptors:Sporn,MB and Roberts,AB,Springer-Verlag,Chapter 8,422(1996))。
【００２９】
好ましくは、図１に示されるように、ＨＧＭＰ(Human Genome Mapping Project)により提供それるＢＬＡＳＴコンピュータ・プログラム(Atschul et al.,J.Mol.Biol.215,403-410(1990）のデフォルトパラメーターを使用して、アミノ酸レベルで、ＴＧＦβ１、２、３、４あるいは５の前駆物質領域と、ＬＡＰのアミノ酸配列は少なくとも５０％の同一性がある(Roberts and Sporn,Peptide Growth Factors and their Receptors:Sporn,MB and Roberts,AB,Springer-Verlag,Chapter 8,422(1996))。より好ましくは、ＬＡＰは、核酸またはアミノ酸レベルで、残基１から２７８を含む、図１に示された、ＴＧＦβ１、２、３、４あるいは５の前駆物質領域と、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、より好ましくは９５％（さらに好ましくは少なくとも９９％）の同一性を有することができる。
ＬＡＰは、図１に示されるようにＴＧＦβ１、２、３、４、あるいは５のＬＡＰを含んでもよい(Roberts and Sporn,Peptide Growth Factors and their Receptors:Sporn,MB and Roberts,AB,Springer-Verlag,Chapter 8,422(1996))。
【００３０】
ＬＡＰは、ジスルフィド結合の形成のために、少なくとも２、例えば少なくとも４、６、８、１０あるいは２０のシステイン残基を含んでもよい。
【００３１】
ＬＡＰは、さらに、ＨＧＭＰによって提供されるＢＬＡＳＴコンピュータ・プログラムのデフォルトパラメーターを使用して、図１のＬＡＰシーケンスと、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％あるいは９９％の同一性があるシーケンスを含んでもよい。
【００３２】
「二量体化領域(dimerisation domain)」は、第２のペプチドへ親和性があり、生理学的条件の下で２つのペプチドが二量体を形成するペプチドを指す。第２のペプチドは同じあるいは異なるペプチドであることができる。二量体化領域はさらにポリペプチドを含む。ペプチドまたはポリペプチドは共有結合および／または非共有結合によって互いに相互作用してもよい。
【００３３】
二量体化領域はリンカーによって潜在関連ペプチドに結合されてもよい。リンカー・サイズは薬学的に活性な作用薬に適合するために、シェルのサイズを変えるために変更することができる。リンカー・ペプチドはアミノ酸配列ＧＧＧＧＳあるいはそのマルチマー（例えば二量体、三量体あるいは四量体）含んでもよい。適切なリンカーは（ＧＧＧＧＳ）３であるか、あるいはＨＧＭＰによって提供されるＢＬＡＳＴコンピュータ・プログラムのデフォルトパラメーターを使用して、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％あるいは９９％の同一性を持っているヌクレオチドのシーケンスであることができる。
【００３４】
二量体化領域の例としては、以下が挙げられる：抗体フラグメント・ポリペプチド、たとえば免疫グロブリンＦｃポリペプチド、免疫グロブリンヒンジポリペプチド、ＣＨ３領域ポリペプチド、ＣＨ４領域ポリペプチド、ＣＨ１領域あるいはＣＬ領域ポリペプチド；ロイシンジッパー領域；（例えばｊｕｎ／ｆｏｓロイシンジッパー領域、例えばＫostelney et al.,J.Immunol.,148:1547-1553,1992を参照；あるいは酵母ＧＣＮ４ロイシンジッパー領域）、イソロイシン・ジッパー領域；二量化細胞表面受容体の二量化領域（たとえばインターロイキン８レセプター（ＩＬ−８Ｒ）；あるいはインテグリン・ヘテロダイマー、たとえばＬＦＡ−１あるいはＧＰＩＩＩｂ／ＩＩＩａ）；分泌二量化領域、二量化リガンド（例えば神経成長因子（ＮＧＦ）、神経栄養因子３（ＮＴ−３）(neurotrophin-3(NT-3)）、およびインターロイキン８（ＩＬ−８）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）；たとえばArakawa et al.,J.Biol.Chem.269:27833-27839,1994,Radziejewski et al.,Biochem.32:1350,1993を参照。あるいは少なくとも１つ（たとえば、１、２、あるいは３から約１０のシステイン残基）のシステイン残基を含み、ポリペプチドと、少なくとも１つのシステイン残基を含む第２のポリペプチドとの間にジスルフィド結合を形成する。適切な二量体化領域はＦｃポリペプチドであることができる。
【００３５】
免疫グロブリンヒンジポリペプチドは、典型的にはプロリンとシステインのアミノ酸残基に富んだ領域を含む。ヒンジポリペプチド領域の中にある共通配列モチーフは、ＣＰＸＣＰ（ここでＸは二量体化の邪魔をしない別の残基（例えばプロリン（Ｐ）、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）である）ことができる。ヒンジ領域ポリペプチドは１０〜７５のアミノ酸残基であってもよい。ヒンジ領域ポリペプチドは、たとえば２〜１５の、複数のシステイン・システイン・ジスルフィド結合を含んでもよい。ヒンジ領域ポリペプチド領域は、ＣＰＸＣＰ、ここでＸは二量体化の邪魔をしない別の残基（例えばプロリン（Ｐ）、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ））であることができる。複数のＣＰＸＣＰ配列の繰り返しが存在してもよく、例えば、２、３、４、あるいは５、あるいはより大きくてもよい。
【００３６】
Wypych et al.,J.Biol.Chem.28316194-16205,200８は、表１に示されるようなＩｇＧ抗体のための以下のヒンジ領域ペプチド配列を定義した：
【００３７】
【表１】
0006687548.tif 000002
【００３８】
「抗体」、「免疫グロブリン」という用語は本明細書においては交換可能に使用される。抗体分子は、２つの同一の重鎖（Ｈ）、およびジスルフィド結合によって一緒にされた２つの同一の軽鎖（Ｌ）から構成される。重鎖はそれぞれＦｃポリペプチドを含む。２つの重鎖からの２つのＦｃポリペプチドは二量化して抗体分子のＦｃ領域を形成する。用語「Ｆｃ領域」は、ＣＨ１−ＣＬ領域ペアを形成する軽鎖（ＣＬ）の一定の部分と相互作用する重鎖（ＣＨ１）の第１の定域免疫グロブリン領域以外の抗体の不変部領域を指す。したがって、Ｆｃ領域は、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＧの最後の２つの定域免疫グロブリン領域（ＣＨ２とＣＨ３）、およびＩｇＥおよびＩｇＭの最後の３つの定域免疫グロブリン領域（ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４）を含む。したがって、様々な免疫グロブリン不変領域のどんなポリペプチドも二量体化領域として本発明に従って使用されてもよい。
【００３９】
いくつかの抗体エフェクター機能は、多くの細胞（例えばリンパ球、マクロファージ、ナチュラルキラー細胞など）の表面で見られるＦｃ受容体（ＦｃＲ）へのＦｃ領域の結合を介して媒介される。ＦｃＲｓは抗体アイソタイプに対するそれらの特異性によって定義される。例えば、ＩｇＧ抗体のためのＦｃ受容体はＦｃγＲと呼ばれる。
【００４０】
ＩｇＧも新生のＦｃ受容体（ＦｃＲｎ）によって結合される。人間では、ＩｇＧは長い血清半減期を示す。研究は、これがＩｇＧのＦｃ領域に結合したＦｃＲｎの防護効果によることを示し、細胞内の再循環の許容によって分裂を防ぐことを示した。
【００４１】
Ｆｃポリペプチドは、例えば、融合蛋白質の半減期を増加あるいは減少させるように変化させるために選択されてもよい。本明細書において使用される時、用語「半減期」は特定のポリペプチドまたはタンパク質の生体内での生物学的半減期を指す。半減期は、投与された量の半分が動物中の循環系および／または他の組織から取り除かれるために必要な時間で表される。本発明の実施態様では、ＦｃポリペプチドはＩｇＧ  Ｆｃポリペプチドである。
【００４２】
ＩｇＧ抗体は、さらにＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４へ細分することができる。本発明の実施態様では、Ｆｃポリペプチドは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４ポリペプチド、例えばＩｇＧ１ポリペプチドであることができる。
【００４３】
Ｆｃポリペプチドは特定の組織（例えば粘膜）への融合蛋白質をターゲットとするように選択されてもよい。ＩｇＡ抗体は粘膜免疫に重要な役割を果たし、例えば、呼吸器官および胃腸の粘膜内層中で重要な役割を果たす。その分泌の形式では、ＩｇＡは粘液分泌、たとえば涙、唾液、初乳、胃腸・尿、生殖器での流体で見つかる。ＩｇＡ欠損症は多くの自己免疫性疾患、たとえば慢性関節リウマチ、全身性紅斑性狼瘡および免疫性血小板減少性紫斑病に関係している。ＩｇＡ欠損症はアレルギー性疾患、たとえば喘息にも関係している。本発明の別の実施態様では、ＦｃポリペプチドはＩｇＡポリペプチドであることができる。
【００４４】
Ｆｃポリペプチドは、同じ抗体アイソタイプに由来してホモ二量体のＦｃ領域を形成するか、または異なる抗体アイソタイプに由来して異種二量体のＦｃ領域を形成することができる。Ｆｃポリペプチドは、自然発生のポリペプチドであることができ、あるいは人工のポリペプチドであることができる。
【００４５】
ＬＡＰは、薬学的に活性な作用薬のまわりの保護「シェル」を提供することができ、それによりそれを保護し、細胞表面の他の分子あるいはその活動にとって重要な分子との相互作用を妨害するか防ぐことができる。
【００４６】
二量体化領域は、２つの潜在関連蛋白質のアミノ末端の融合を可能にし、それによりＬＡＰシェルを効果的に閉じる。したがって、二量体化領域は相補的であり、二量体化が生じることを可能にする。シェルの閉鎖は、薬学的に活性な作用薬とＬＡＰの相互作用に依存しない。その閉鎖は、さらにＬＡＰ融合蛋白質のモノマー形成を防ぐ。
【００４７】
もし薬学的に活性な作用薬が蛋白質分解を生ずる活性によってＬＡＰ融合蛋白質から遊離されなければ、シェルの閉鎖は、さらに薬学的に活性な作用薬とその標的分子の間のどんな相互作用も防ぐ。これは、薬学的に活性な作用薬の部位特異的なデリバリーを保証し、オフ−サイトの活性を低減することができる。
【００４８】
本発明の１つの他の実施態様では、したがって、本発明の最初の態様に定義される、二量体として存在する２つの融合蛋白質を含むタンパク質構造物(protein construct)が提供される。二量体は本発明の最初の態様のモノマーから構成されており、これらは潜在関連ペプチド（ＬＡＰ）、薬学的に活性な作用薬、およびタンパク質分解切断部位を含むアミノ酸配列に関して同じであっても違ってもよい。
【００４９】
したがって、二量体は第１のモノマーおよび第２のモノマーからなってもよい。ここで第１のモノマーは潜在関連ペプチド（ＬＡＰ）、薬学的に活性な作用薬、および二量体化領域を含むアミノ酸配列を含み、該ＬＡＰと薬学的に活性な作用薬が、タンパク質分解切断部位を含むアミノ酸配列によって結合され、第２のモノマーが潜在関連ペプチド（ＬＡＰ）、薬学的に活性な作用薬、および二量体化領域を含むアミノ酸配列を含み、該ＬＡＰと薬学的に活性な作用薬が、タンパク質分解切断部位を含むアミノ酸配列によって結合される。
【００５０】
したがって、本発明は、第１の態様による２つの融合蛋白質を含む組成物であって、該融合蛋白質は各融合蛋白質中に二量体化領域を有する組成物を提供する。
【００５１】
タンパク質分解切断部位は任意のプロテアーゼ特異性切断部位も含んでもよい。タンパク質分解切断部位は以下を含むが、これらに制限されない：マトリックス・メタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）切断部位、セリンプロテアーゼ切断部位、アグリカナーゼ切断部位、病原体に由来するパラシティツクプロテアーゼ切断部位(parasitic protease)(Zhang et al.,J.Mol.Biol.289,1239-1251(1999);Voth et al.,Molecular and Biochemical Parasitology,93,31-41(1998);Yoshioka et al..,Folia Pharmacologica Japonica,110,347-355(1997);Tort et al,Advances in Parasitology,43,161-266(1999);McKerrow,International Journal for Parasitology,29,833-837(1999);Young et al.,International Journal for Parasitology,29,861-867(1999);Coombs and Mottram,Parasitology,114,61-80(1997))、または補体活性化経路のタンパク質（proteins of the complement cascade）による切断部位(Carroll,Annu.Rev.Immunol.16,545-568(1998);Williams et al.,Ann.Allergy,60,293-300(1988))。
【００５２】
適切には、融合蛋白質が炎症炎（例えば関節炎）と診断された疾病、あるいは炎症および／または組織リモデリングが特徴である癌の部位に位置するか、部位へ導入される場合、本発明の融合蛋白質のタンパク質分解切断部位は開裂される。
【００５３】
ＭＭＰ切断部位はＭＭＰによって認識しうる多くのアミノ酸残基を含んでもよい。好ましくは、ＭＭＰ切断部位は、ＭＭＰによる認識と分裂に必要なアミノ酸残基の最少数を含む。さらに、ＭＭＰ部位のアミノ酸は、ＭＭＰによって蛋白質に関して切断可能な１以上のペプチド結合によって結合されてもよい。ＭＭＰ部位を開裂することができるＭＭＰとしては以下が挙げられるが、これらに制限はされない：ＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ３、ＭＭＰ７、ＭＭＰ８、ＭＭＰ９、ＭＭＰ１０およびＭＭＰ１３(Yu and Stamenkovic,Genes and Dev.14,163-176(2000);Nagase and Fields,Biopolymers,40,399-416(1996);Massova et al.,J.Mol.Model.3,17-30(1997);reviewed in Vu and Werb;Genes and Dev.14,2123-2133(2000))。
【００５４】
ＭＭＰ切断部位、例えばＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ３、ＭＭＰ７、ＭＭＰ８、ＭＭＰ９あるいはＭＭＰ１０のうちのいずれか１つ以上は図２に示されるものであり、あるいはＨＧＭＰによって提供されるＢＬＡＳＴコンピュータ・プログラムのデフォルトパラメーターを使用して、図２に示されるシーケンスと、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％あるいは９９％の同一性がある、アミノ酸のシーケンスであることができる。実施態様では、ＭＭＰタンパク質分解切断部位にはアミノ酸配列ＰＬＧＬＷＡを有する。
【００５５】
タンパク質分解切断部位は、さらにアグリカナーゼによって切断される任意のアグリカナーゼ特異性切断部位を含んでもよい。アグリカナーゼ切断部位はアグリカナーゼによって認識しうる多くのアミノ酸残基を含んでもよい。さらに、アグリカナーゼ部位のアミノ酸は、アグリカナーゼにより蛋白質に関して切断可能な１以上のペプチド結合によって結合されてもよい
【００５６】
アグリカナーゼ部位を開裂することができるアグリカナーゼとしては以下が挙げられるが、これらに制限はされない：ＡＤＡＭＴＳ−４（アグリカナーゼ−１）、ＡＤＡＭＴＳ−５（アグリカナーゼ−２）およびＡＤＡＭＴＳ−１１；(Tortorella,M.D.,et al Osteoarthritis Cartilage,2001.9(6):p.539-552);Abbaszade,I., et al J Biol Chem,1999.274(33):p.23443-23450)。
【００５７】
ＡＤＡＭＴＳ−４（アグリカナーゼ−１）のタンパク質切断部位のシーケンスは、図３に示される。適切なＡＤＡＭＴＳ−４部位は次のものを含んでいる：
ＨＮＥＦＲＱＲＥＴＹＭＶＦ
ＤＶＱＥＦＲＧＶＴＡＶＩＲ
【００５８】
コンセンサスＡＤＡＭＴＳ−４分裂モチーフはHills et al(J. Biol.Chem.282 11101-11109(2007))によって次のように表わすことができる：
Ｅ−［ＡＦＶＬＭＹ］−Ｘ（０，１）−［ＲＫ］−Ｘ（２，３）−［ＳＴ］−［ＶＹＩＦＷＭＬＡ］
【００５９】
本発明のアグリカナーゼ(aggrecanase)蛋白質分解切断部位は、ＡＤＡＭＴＳ−４（アグリカナーゼ−１）、ＡＤＡＭＴＳ−５（アグリカナーゼ−２）あるいはＡＤＡＭＴＳ−１１によって開裂されてもよい。
【００６０】
アグリカナーゼ切断部位のアミノ酸配列は、ＨＧＭＰによって提供されるＢＬＡＳＴコンピュータ・プログラムのデフォルトパラメーターを使用して、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％あるいは９９％の同一性があるシーケンスを包含する。好ましくは、アグリカナーゼ切断部位をコード化する核酸配列は、アグリカナーゼによる認識と分裂に必要な残基の最少数を含む。
【００６１】
本発明はさらに「リンカー」ペプチドを提供してもよい。好ましくは、リンカー・ペプチドはタンパク質分解切断部位のアミノ酸配列に結合される。リンカー・ペプチドは、タンパク質分解切断部位をコード化するアミノ酸配列のＣ末端またはＮ末端に提供されてもよい。好ましくは、リンカー・ペプチドはタンパク質分解切断部位のアミノ酸配列と連続している。リンカー・ペプチドはアミノ酸配列ＧＧＧＧＳあるいはそのマルチマー（例えば二量体、三量体あるいは四量体）を含んでもよい。適切なリンカーは（ＧＧＧＧＳ）３、あるいはＨＧＭＰによって提供されるＢＬＡＳＴコンピュータ・プログラムのデフォルトパラメーターを使用して、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％あるいは９９％の同一性を持っているヌクレオチドのシーケンスであることができる。
【００６２】
用語「リンカー・ペプチド」は、発現されたタンパク質に含まれていた時に親水性の領域を提供するアミノ酸残基の任意のシーケンスも定義するように意図される。そのような親水性の領域はタンパク質分解切断部位での酵素による分裂を促進してもよい。
【００６３】
本発明の構成物は、さらに二量体化領域とＬＡＰの間の付加的なリンカー・シーケンスおよび／またはタンパク質分解切断部位を含んでもよい。
【００６４】
ここに使用される用語「潜在性(latency)」は、融合蛋白質と細胞表面の他の分子の間の相互作用を妨害することができる遮蔽効果に関係する。あるいは、用語「潜在性」は、融合蛋白質に関連した分子／作用薬の活性の低減（活性のアブレーションまで）について記述するために使用されてもよい。用語「潜在性」は、さらに融合蛋白質の安定効果に関係があってもよい。効果は活性な作用薬の潜在性を達成するのに完全であるかまたは十分である部分的な者であることができる。
【００６５】
用語「関連させること」は、本発明のコンテキスト中で、化学的架橋またはペプチド結合リンケージを含むが、これらに限定されない結合の手段をすべて含むように意図される。
【００６６】
薬学的に活性な作用薬は非制限的に以下を含む薬学的に活性タンパク質である：抗体、成長因子（例えば、ＴＧＦβ、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、プレートリット由来の成長因子（platelet derived growth factor：ＰＤＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、肝細胞増殖因子、インシュリン様成長因子、胎座成長因子）；分化因子；サイトカイン（例えばインターロイキン）（例えばＩＬ１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ１４、ＩＬ１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＩＬ−２５、ＩＬ−２６、ＩＬ−２７、ＩＬ−２８、ＩＬ−２９、ＩＬ−３０、ＩＬ−３１、ＩＬ−３２、またはＩＬ−３３）、あるいはインターフェロン（例えばＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ）、腫瘍壊死要因（ＴＮＦ）、ＩＦＮ−γ誘導因子（ＩＧＩＦ）、骨形態形成蛋白（ＢＭＰ、例えばＢＭＰ−１、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ−１１、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３）；インターロイキンレセプター・アンタゴニスト（例えばＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−１ＲＩＩ）、腫瘍壊死因子抑制剤（ＴＮＦ−Ｒあるいは抗ＴＮＦ）；ケモカイン（例えばＭＩＰｓ（マクロファージ炎症蛋白）、例えばＭＩＰ１αおよびＭＩＰ１β）；ＭＣＰｓ（モノサイト  ケモタクティック  タンパク質（Monocyte Chemotactic Proteins））、例えばＭＣＰ１、２または３；ＲＡＮＴＥＳ（regulated upon activation normal T-cell expressed and secreted：規制された活性化正常Ｔ細胞の発現と分泌）；栄養要因；サイトカイン阻害剤；サイトカインレセプター；フリーラジカルスカベンジング酵素（例えば超過酸化物不均化酵素、およびカタラーゼ）；プロドラッグ転換酵素（例えばアンギオテンシン転換酵素、デアミナーゼ、脱水素酵素、還元酵素、キナーゼ、尿酸オキシダーゼおよびホスファターゼ）；ペプチドミミック、プロテアーゼ阻害剤；メタロプロテアーゼ組織阻害剤（ＴＩＭＰｓ、例えばＴＩＭＰ１、ＴＩＭＰ２、ＴＩＭＰ３、ＴＩＭＰ４）、またはセプリン阻害剤（セリンプロテアーゼ阻害剤）。
【００６７】
好ましくは、薬学的に活性な作用薬は、治療される種に由来するだろう。例えば人間の治療のためにはヒト起源のものが使用される。好ましくは、薬学的に活性な作用薬はサイトカイン、例えばＩＦＮβ、ＩＬ−４あるいはＩＬ−１ｒａ、あるいはサイトカイン抑制剤、たとえば抗体または抗体フラグメント、例えばトラスツズマブ、および以下に定義されるものである。
【００６８】
インターロイキンとサイトカインは抗炎症性あるいは炎症促進性かもしれない。抗炎症性のサイトカインおよびある種のインターロイキン、たとえばＩＬ−４および／またはＩＬ−１０は、関節炎の治療に適している。しかし、炎症促進性のサイトカインおよび他のインターロイキン、たとえばＩＬ−１およびＩＬ−２は癌の治療に適している。
【００６９】
本明細書において使用されるとき「ペプチド・ミメティック（peptide mimetics）」は以下を含むが、これらに制限されない：特定の配座の中にペプチドを保持する、非ペプチド骨格へ希望のペプチドバックボーン構成を埋め込む作用薬。ペプチド・ミメティックは、ペプチドの欠点のうちのいくつかを持っていないので、ペプチドが医療用用途において適切でない場合に興味深い。ペプチド・ミメティックは、Ｌ−配座またはＤ  −配座であるペプチドバックボーンを含んでもよい。
【００７０】
ペプチド・ミメティックの例としては、メラノコルチン、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）および中枢神経系および内分泌系に作用する他のペプチド・ミメティック作用薬、信号伝達、感染および免疫で作用する他のペプチド・ミメティック作用薬を含む。
【００７１】
薬学的に活性な作用薬は化学化合物、たとえば化学療法剤あるいは他の合成薬品を含んでもよい。あるいは、薬学的に活性な作用薬はｓｉＲＮＡあるいはペプチド核酸（ＰＮＡ）シーケンス、例えば、核酸に結合し、脂質二分子膜透過性のポリ・リジン・シーケンス  (Wyman et al.,Biological Chemistry,379,1045-1052(1998))、あるい脂質二分子膜を通る移動を促進するＫＡＬＡペプチ(Wyman et al.,Biochemistry,36,3008-3017(1997))、あるいはポリペプチドが原形質膜を介して細胞に入ることを可能にするタンパク質形質導入領域（ＰＴＤ）(Pi et al Molecular Therapy 2,339-347(2000)）を含んでもよい。
【００７２】
薬学的に活性な作用薬は可溶性の標的分子と相互に作用するのにふさわしいかもしれない。可溶性の標的分子の例としては、サイトカイン、成長因子、シグナリングタンパク質、および他のリガンドおよびレセプターを含む。
【００７３】
薬学的に活性な作用薬はサイトカイン阻害剤であることができる。用語「サイトカイン阻害剤」は、サイトカインの機能、活性および／または発現をブロックするか、低減するか、阻害するか、中和することができる分子を指す。サイトカイン阻害剤はタンパク質（例えば可溶性のサイトカインレセプター・タンパク質）；抗体または抗体フラグメント；核酸（例えばｓｉＲＮＡあるいはアンチセンス核酸）あるいは有機的もしくは無機分子であることができる。
【００７４】
適切な抗体の例としては、抗ＴＮＦ（例えば抗ＴＮＦα、抗ＴＮＦβ）、抗インターロイキン（例えば抗−ＩＬ−１、抗−ＩＬ−２、抗−ＩＬ−３、抗−ＩＬ−４、抗−ＩＬ−５、抗−Ｉｌ−６、抗−ＩＬ−７、抗−ＩＬ−８、抗−ＩＬ−９、抗−ＩＬ−１０、抗−ＩＬ−１１、抗−ＩＬ−１２、抗−ＩＬ−１３、抗ＩＬ１４、抗ＩＬ１５、抗−ＩＬ−１６、抗−ＩＬ−１７、抗−ＩＬ−１８、抗−ＩＬ−１９、抗−ＩＬ−２０、抗−ＩＬ−２１、抗−ＩＬ−２２、抗−ＩＬ−２３、抗−ＩＬ−２４、抗−ＩＬ−２５、抗−ＩＬ−２６、抗−ＩＬ−２７、抗−ＩＬ−２８、抗−ＩＬ−２９、抗−ＩＬ−３０、抗−ＩＬ−３１、抗−ＩＬ−３２、抗−ＩＬ−３３、抗−ＩＬ−３４、抗−ＩＬ−３５およびＩＬ−３６）、抗インターフェロン（例えば抗ＩＮＦ−α、抗ＩＮＦ−β、抗ＩＮＦ−γおよび抗ＩＮＦ−ω）およびそのフラグメントが挙げられるが、これらに制限されない。
【００７５】
そのような分子の例はさらにトラスツズマブ（Ｈｅｒｃｌｏｎ（登録商標）／Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）としても知られている）、ＨＥＲ２／神経鞘レセプターのモノクローナル抗体を含んでいる。
【００７６】
薬学的に活性な作用薬は抗体または抗体フラグメントであることができる。ここに引用される「抗体フラグメント」は、全長抗体の任意の部分を意味する。抗体フラグメントの例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ′、Ｆ（ａｂ′）２、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄｓＦｖ  ダイアボディおよびＦｄフラグメントが挙げられるが、これらに制限されない。
【００７７】
用語「単一鎖バリアブルフラグメント」あるいは「ｓｃＦｖ」は、重鎖領域および軽鎖領域が結合しているＦｖフラグメントを指す。１つ以上のｓｃＦｖフラグメントが、他の抗体フラグメント（たとえば重鎖または軽鎖の不変領域）にリンクされ、１つ以上の抗原識別部位がある抗体構成物を形成することができる
【００７８】
抗体または抗体フラグメントは、炎症性の症状（たとえば、関節炎、痛風、アテローム性動脈硬化、同種異系移植片拒絶反応、クローン病、炎症性腸疾患、過敏性大腸症候群および大腸炎）の治療で使用するに適している。
【００７９】
他の実施態様では、本発明は、さらに任意に潜在ＴＧＦβ結合蛋白質（ＬＴＢＰ）を伴う本発明の融合蛋白質を提供する。典型的には、融合蛋白質は、ＬＴＢＰに共有結合で結合されて複合体を形成する。好ましくは、結合は、ＬＡＰのシステイン３３番とＬＴＢＰの第３の８システイン残基の間でジスルフィド結合によって媒介される。融合蛋白質に結合したＬＴＢＰは、これらには制限されないが、ＬＴＢＰ  １、２、３あるいは４を含んでいてもよい(Kanzaki et al.,Cell,61,1051-1061(1990);Tsuji et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87,8835-8839(1990);Moren et al.,J.Biol.Chem.269,32469-32478(1994);Yin et al.,J.Biol.Chem.270,10147-10160(1995); Gibson et al.,Mol.Cell.Biol.15,6932-6942(1995);Saharinen et al.,J.Biol.Chem.273,18459-18469(1998))。または、ＬＴＢＰのフラグメント、たとえば第３の８システインの繰り返しを含むもの、あるいはＨＧＭＰによって提供されるＢＬＡＳＴコンピュータ・プログラムのデフォルトパラメーターを使用して、ＬＴＢＰのそれと少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％あるいは９９％の同一性を持っているアミノ酸またはヌクレオチドのシーケンスを有する同族体を含んでいてもよい。
【００８０】
ＬＴＢＰの分裂はＬＴＢＰ複合体から融合蛋白質を遊離することができる。
このようにＬＴＢＰを開裂することのできる酵素としてはトロンボスポンジンが挙げられるが、これに制限はされない(Schultz et al.,The Journal of Biological Chemistry,269,26783-26788(1994);Crawford et al.,Cell,93,1159-1170(1998))，トランスグルタミナーゼ(Nunes et al.,J.Cell,Biol.136,1151-1163(1997);Kojima et al.,The Journal of Cell Biology,121,439-448(1993))、ＭＭＰ９およびＭＭＰ２(Yu and Stamenkovic,Genes and Dev,14,163-176(2000))。
【００８１】
本発明は、上に定義されるような本発明の第１の態様の融合蛋白質をコード化する核酸をさらに提供する。本発明の第２の態様は、薬学的に活性な作用薬をコード化する第１の核酸配列、ＬＡＰをコード化する第２の核酸配列、および二量体化領域ポリペプチドをコード化する第３の核酸配列を含む核酸構成物を提供する。
【００８２】
用語「核酸構成物(nucleic acid construct)」は、一般にＤＮＡ、ｃＤＮＡあるいはＲＮＡ、たとえばクローニングにより得られたか、化学合成によって生産されたｍＲＮＡ、であることができる任意の長さの核酸を言う。ＤＮＡは一本鎖あるいは二本鎖であることができる。一本鎖ＤＮＡはコーディングセンス鎖であることができ、または非コード化もしくはアンチセンス鎖であることができる。治療用途では、核酸構成物は好ましくは治療される被検者中で発現することができる形式である。
【００８３】
薬学的に活性な作用薬は可溶性の標的分子と相互作用するのにふさわしいものであることができる。可溶性の標的分子の例としては、サイトカイン、成長因子、シグナリングタンパク質、および他のリガンドおよびレセプターが挙げられる。
【００８４】
本発明の実施態様では、第１の核酸配列はサイトカイン阻害剤をコード化する。用語「サイトカイン阻害剤」は、サイトカインの機能、活性および／または発現をブロックするか、低減するか、禁じるか、無効にすることができる分子を言う。サイトカイン阻害剤はタンパク質（例えば可溶性のサイトカインレセプター・タンパク質）；抗体または抗体フラグメント；核酸（例えばｓｉＲＮＡあるいはアンチセンス核酸）であることができる。
【００８５】
第１の核酸構成物が抗体または抗体フラグメントをコード化する場合、抗体フラグメントはたとえば、Ｆａｂ、Ｆａｂ′、Ｆ（ａｂ′）２、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄｓＦｖ  二特異性抗体またはＦｄフラグメントであることができる。そのような分子の例としては、トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｌｏｎ（登録商標）／Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）としても知られている）、ＨＥＲ２／神経鞘レセプターへのモノクローナル抗体が挙げられる。
【００８６】
いくつかの実施態様では、第１の核酸配列はタンパク質ＩＦＮβ、ＩＬ−４あるいはＩＬ−１ｒａをコード化する。本発明の１つの実施態様では、第１の核酸配列は、マウスまたは人間からのＩＦＮβ、ＩＬ−４あるいはＩＬ−１ｒａをコード化する。
【００８７】
本発明の第２の態様の核酸構成物は、ベクター、例えば発現ベクターの形であることができ、さらに染色体ベクター、エピゾームベクターおよびウイルス由来のベクター、（例えば細菌性プラスミドに由来したベクター）、バクテリオファージからのベクター、トランスポゾンから、酵母エピソームから、挿入因子から、酵素の染色体の要素から、ウイルス（たとえばバキュロ−ウイルス、パポバウイルス（たとえばＳＶ４０、
ワクシニアウィルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルスおよびレトロウイルス）からのベクター、およびそれらの組み合わせに由来したベクター、たとえばプラスミドとバクテリオファージの遺伝要素（たとえばコスミドとファージミド）に由来するベクターを含むことができる。一般に、宿主の中でポリペプチドを発現する核酸を維持するか、広めるか、発現するのに適切な任意のベクターが、この点に関して発現のために使用されてもよい。ベクターは、上に定義された複数の核酸、たとえば２以上の核酸構成物を含んでもよい。
【００８８】
本発明はさらに、任意に本明細書に記載された潜在性ＴＧＦβ結合蛋白質（ＬＴＢＰ）と結合した、本発明の第２の態様の核酸構成物によってコード化されたタンパク質を提供する。典型的には、核酸構成物によってコード化されたタンパク質は、ＬＴＢＰに共有結合で結合して複合体を形成する。好ましくは、結合は、ＬＡＰのシステイン３３番とＬＴＢＰの第３の８システイン残基の間のジスルフィド結合によって媒介される。
【００８９】
本発明の第２の態様の核酸構成物は、核酸の発現をコントロールするプロモータあるいは他の調節配列を含んでいる。核酸の発現をコントロールするプロモータおよび他の調節配列は、認識されており、当該技術分野において公知であった。当業者は、プロモータあるいは他の調節配列の全体を利用することが必要ではないかもしれないと考えるだろう。最小の本質的な調整要素だけが必要であり、実際、そのような要素はキメラ的なシーケンスあるいは他のプロモータを構築するために使用することができる。必須条件は組織および／または一時的な特異性を保持することである。プロモーターは、任意の適切な既知のプロモーター、例えばヒト−サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＣＭＶ最初期プロモーター、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期および後期シミアンウイルス４０プロモーターあるいはレトロウイルスＬＴＲｓ（たとえばラウス肉腫ウィルス（ＲＳＶ）およびメタロチオネイン・プロモーター（たとえばマウス・メタロチオネイン−１プロモーター）であることができる。プロモータは、プロモーター作用のために含まれる最低要素（たとえばエンハンサーのないＴＡＴＡ要素）、例えばＣＭＶプロモータの最小のシーケンスから構成されてもよい。好ましくは、プロモータは第１および／または第２の核酸配列に隣接している。
【００９０】
ここに述べられるように、本発明の第２の態様の核酸構成物は、ベクターの形をしていてもよい。ベクターは、それらとトランスフェクトあるいはトランスフォームされる細胞の選択を可能にし、好ましくは異種のＤＮＡを組込むベクターを含む細胞の選択を可能にする１つ以上の発現マーカーをしばしば含む。適切なスタートおよび停止信号が一般に存在するだろう。
【００９１】
本発明の１つの実施態様は、本発明の第２の態様の核酸構成物を含む細胞に関する。
細胞は「宿主」細胞と名付けられてもよい。それはクローニングを含む核酸の操作に役立つ。あるいは、細胞は核酸の発現を得る細胞であることができる。本発明の核酸構成物の発現のための適切な宿主細胞の代表的な例は、ウイルス・ベクターの中への核酸のカプセル化を許可するウイルス・パッケージング細胞；細菌細胞（たとえば連鎖球菌、ブドウ球菌、大腸菌、ストレプトマイシーズおよび枯草菌）；単離細胞（たとえば酵母菌（例えばビール酵母菌、およびアスペルギルス細胞）；昆虫細胞（たとえばショウジョウバエＳ２およびハスモンヨトウ(Spodoptera)  Ｓｆ９細胞）；動物細胞（たとえばＣＨＯ、ＣＯＳ、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＰＨＫ．２９３およびＢｏｗｅｓ株メラノーマ細胞）および他の適切なヒト細胞；および植物細胞（例えばシロイヌナズナ）が挙げられる。
【００９２】
宿主細胞の中への発現ベクターの導入はリン酸カルシウム・トランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、ミクロ注入、カチオン−脂質媒介トランスフェクション、電気穿孔、形質導入、スクラップローディング、バリスティックイントロダクション、感染あるいは他の方法により影響を受ける。そのような方法は、多くの標準的実験手引き書（たとえばSambrook et al,Molecular Cloning,a Laboratory Manual,Second Edition,Coldspring Harbor Laboratory Press,Coldspring Harbor,N.Y.(1989)）に記載される。
【００９３】
成熟したタンパク質は哺乳動物細胞（たとえば適切なプロモータの管理の下での、ＣＨＯ細胞、酵母、バクテリアあるいは他の細胞）を含む宿主細胞の中で発現することができる。無細胞翻訳システムは本発明の第２の態様の核酸構成物に由来したＲＮＡｓを使用して、そのようなタンパク質を生産するために使用することができる。原核生物および真核生物の宿主との使用のための適切なクローニングおよび発現ベクターは、Sambrook et al,Molecular Cloning,a Laboratory Manual,Second Edition,Coldspring Harbor Laboratory Press,Coldspring Harbor,N.Y.(1989)に記述される。
【００９４】
タンパク質は硫酸アンモニウムまたはエタノール沈澱、酸抽出、陰イオンあるいは陽イオン交換クロマトグラフィー、フォスフォセルロース・クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイト・クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、レクチンおよび／またはヘパリン・クロマトグラフィーなどの公知の方法によって組み換えの細胞培養から回収し清浄化することができる。治療のために、核酸構成物、例えば組換えベクターの形式のものは、Ｓambrook et al,Molecular Cloning,a Laboratory Manual,Second Edition,Coldspring Harbor Laboratory Press,Coldspring Harbor,N.Y.(1989)に述べられているように、カラムクロマトグラフイーのような公知の技術によって清浄化されてもよい。
【００９５】
本発明の第３の態様によれば、炎症状態あるいは癌の治療で使用される本発明の第１の態様に従う組成物が提供される。したがって、本発明のこの態様は、潜在関連蛋白質、二量体化領域および薬学的に活性な作用薬を含む融合蛋白質を含む組成物の被検者への適用を含む、炎症状態あるいは癌の治療のための方法までに及ぶ。
【００９６】
本発明は炎症状態あるいは癌の治療に使用するための上に述べられているような組成物を提供する。炎症性状態は、非制限的に、アテローム性動脈硬化、急性および慢性の肺炎症（例えば慢性気管支炎、喘息、バクテリアおよびウイルス感染（たとえばＳＡＲＳおよびインフルエンザ、嚢胞性繊維症など）を含む肺感染症、ウイルスに感染した組織の炎症（例えばウイルス性肺感染症、ウイルス性心筋炎、ウイルス髄膜炎など）、潰瘍性大腸炎、内毒素性ショック、関節炎（例えば慢性関節リウマチ、若年性関節炎、骨関節炎、乾癬性関節炎、反応性関節炎、ウイルスまたはポストウイルス性関節炎、強直性脊椎炎など）、乾癬、クローン病、炎症性腸疾患、インスリン依存型糖尿病、傷独立性タイプＩＩ糖尿病、乏血により引き起こされた炎症(ischemia induced inflammation)、中耳炎（中耳感染）、痛風、多発性硬化症、悪液質および毛細血管拡張性運動失調を含む。関節炎は、損傷が体の関節にもたらされる一群の疾病状態（あるいは関節症）として定義され、外傷の結果、感染の結果、あるいは老化の結果としての骨関節炎（退行性骨関節症としても知られている）を含んでいる。関節炎の他の形式は慢性関節リウマチおよび乾癬性関節炎（それは自己免疫性疾患である）を含み、また、化膿性関節炎は関節中の感染によって引き起こされる。癌は、腫瘍（例えば神経膠腫）として定義することができる身体中の異常な細胞増殖が特徴である疾病のグループとして定義される。神経膠腫のタイプは脳室上衣腫、星状細胞腫、乏突起膠腫および混合神経膠腫を含んでいる。グレード４の星状細胞腫は膠芽腫としても知られている。
【００９７】
第４の態様では、本発明は、炎症状態あるいは癌の治療で使用される本発明の第２の態様に従う核酸配列を提供する。したがって、この態様は、本発明の第２の態様の核酸構成物を対象に投与することを含む炎症状態あるいは癌の治療のための方法に及ぶ。本発明の治療方法の中で核酸構成物が使用される場合、発現構成物の一部として使用されてもよく、例えば発現ベクター（たとえばプラスミドまたはウイルス）の形式で使用されてもよい。そのような方法では、構成物は静脈内に、皮内に、筋肉内に、口からあるいは他のルートで投与されてもよい。
【００９８】
本発明の第２の態様の核酸構成物、およびそれに由来するタンパク質は、単独で使用されてもよいし、あるいは他の化合物、たとえば治療用化合物、例えば、抗炎症薬、細胞毒性薬、細胞静止薬または抗生物質とともに使用されてもよい。本発明において有用な核酸構成物およびタンパク質は、好ましくは単離された形態で提供され、好ましくは均質に清浄化される。
【００９９】
本明細書において使用される時、用語「治療」は人間または非ヒト動物に役立つことができるあらゆる方法を含んでいる。「非ヒト動物」の治療は、馬およびコンパニオン・アニマル（例えば猫と犬）を含む家庭動物、および羊、ヤギ、豚、牛・ウマの類を含む牧場／農業用の動物の治療まで及ぶ。その治療は任意の既存の条件あるいは病気に関してあってもよいし、あるいは予防的（予防的治療）であることができる。治療は遺伝性、あるいは後天性疾患に対するものであることができる。その治療は急性または慢性症状に対するものであることができる。好ましくは、その治療は炎症に関連した状態／病気である。本発明の第３の態様の核酸構成物の第１の核酸配列は、骨関節炎、硬皮症、腎臓病、慢性関節リウマチ、炎症性腸疾患、多発性硬化症、アテローム性動脈硬化、癌あるいは任意の炎症性疾患を非限定的に含む病気の治療で使用されるタンパク質をコード化することができる。
【０１００】
本発明の第２の態様の核酸構成物は、遺伝子療法により本発明の方法の中で治療上使用されてもよい。あるいは、本明細書に記載されたように、核酸構成物によってコード化されたタンパク質は直接適用されてもよい。
【０１０１】
第２の態様の核酸構成物の投与は、物理的方法によって標的部位に向けられてもよい。これらの例は、適当なビヒクル中のベクターの形をしている「裸の」核酸の局所性投与を含み、たとえば薬学的に受理可能な補形薬（たとえば燐酸塩緩衝食塩水）中の溶液として、あるいは物理的方法（たとえば既知の方法による粒子ボンバードメント(particle bombardment)）によるベクターの投与を含んでいる。
【０１０２】
本発明の第３の態様の核酸構成物あるいはタンパク質の物理的投与方法としては、超音波、電気刺激、電気穿孔およびマイクロシーディングを含んでいる。適用のさらなる方法は吸入による投与または経口投与を含んでいる。
【０１０３】
特に、患者の中の細胞の場所に遺伝物質を運ぶためのシステムである、マイクロシーディング法が好まれる。この方法は米国特許５６９７９０１に述べられている。
【０１０４】
本発明の第２の態様による核酸構成物は、デリバリー・ベクターによって適用されてもよい。これらはウイルスデリバリー・ベクター（たとえば既知のアデノウイルス、レトロウイルスあるいはレンチウイルス・デリバリー・ベクター）を含んでいる。他の非ウイルスのデリバリー・ベクターは、既知のリポソーム・デリバリー・ベクターを含む脂質デリバリー・ベクターを含んでいる。
【０１０５】
投与は、さらにトランスフォームされた宿主細胞経由でされてもよい。そのような細胞は、核酸構成物が既知の遺伝子移入方法によって転送された被検者から収穫された細胞を含んでいる。被検者へ移植され培養された細胞中の形質転換細胞の成長が続いて行われる。
【０１０６】
ここに使用されるように、用語「遺伝子療法」は、患者のために菌体（身体の遺伝子療法）の組み換えの遺伝子工学により遺伝子の導入を指す。更に、遺伝子療法は生体外および生体内の技術に分割することができる。生体外遺伝子治療は、患者からの菌体の回収、ベクター（つまり組換えベクター）での回収された細胞の処理、および患者への治療された細胞の戻しに関する。生体内遺伝子治療は、例えば静脈内または血管内の手段による組み換え遺伝子ベクターの直接の適用に関する。好ましくは、本発明の遺伝子療法の方法は生体外で実行される。
【０１０７】
好ましくは、遺伝子療法では、本発明の発現ベクターは治療される被検者中で発現されるように適用される。したがって、人間の遺伝子療法については、プロモータは好ましくは人間の遺伝子からの人間のプロモータであるか、または、あるいは人間の中で典型的に発現する遺伝子（たとえば人間のＣＭＶからのプロモータ）からのプロモータである。
【０１０８】
遺伝子療法については、本発明は、人間および人類以外の哺乳動物の体細胞を操作する方法を提供する。
【０１０９】
本発明は、さらに人類以外の哺乳動物の生殖細胞系列細胞の操作を含むことのある遺伝子療法を提供する。
【０１１０】
したがって、本発明は、人間へ哺乳動物細胞を導入することを含む治療用タンパク質を人間に提供する方法を提供し、本発明の第２の態様の核酸構成物をその内部に挿入するためにヒト細胞が生体外で処理される。
【０１１１】
生体外の身体の遺伝子療法のそれぞれのステップも、本発明によってカバーされる。例えば適切なベクター中で、本発明の第３の態様の核酸構成物で、患者から採取された細胞を操作するステップがあげられる。ここに使用されるように、用語「操作された細胞」は組換えベクターでトランスフェクトされた細胞をカバーする。さらに、上に定義されるように炎症状態（関節炎または癌）の治療のための薬物の製造の際にトランスフェクトされた細胞の使用も意図される。
【０１１２】
本発明は、さらに馬およびコンパニオン・アニマル（例えば猫と犬）を含む家庭動物、および羊、豚、ヤギ、牛・ウマのファミリーをはじめとする哺乳動物を含む家畜の治療／予防用獣医学に適用されてもよい。
【０１１３】
本発明は、さらに本発明の第１および第２の態様のタンパク質および核酸構成物を含む組成物に関する。したがって、本発明の発明の第１および第２の態様の融合蛋白質または核酸構成物は、１つまたは複数の薬学的に受理可能なキャリアーと組み合わされて使用されてもよい。そのようなキャリアーの非制限的な例としては、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、リポソーム、水、グリセロール、それのエタノールおよびそれらの組み合わせが挙げられる。
【０１１４】
本発明の医薬品組成物は、第１の態様の２つの融合蛋白質を含んでもよく、該融合蛋白質はそれぞれの融合蛋白質中に二量体化領域を有するかまたは、本発明の第１の態様の２つの融合蛋白質をコード化する核酸配列を含む。
【０１１５】
医薬品組成物は、例えば、口内、局所的、静脈内、筋肉内、鼻腔内、皮内のルートによる適用により、患者の疾病の治療に有効な任意の有効で便利な方法で適用されることができる。療法薬あるいは予防薬として、活性な作用薬は、無菌の水性分散液で、好ましくは等張液の注入可能な組成物として個人に適用されてもよい。
【０１１６】
哺乳動物への適用および特に人間については、活性な作用薬の毎日の量が０．０１ｍｇ／体重ｋｇから１０ｍｇ／体重ｋｇ、典型的には約１ｍｇ／体重ｋｇであるだろうことが期待される。医師は、年齢、体重、性別および反応を含む要因に依存して、個人に対する実際の投与量を決定するだろう。上記の量は典型的な例である。もちろん、より多いかより少ない量も使用することができ、そのような場合も本発明の範囲内の例である。
【０１１７】
疾病（炎症性疾患または癌）の治療での本発明の融合タンパク質、核酸構成物、ベクター、あるいは宿主細胞の使用に関する記述は、前記疾病の治療のための薬物の製造における融合蛋白質、核酸構成物、ベクターあるいは宿主細胞の使用に関する実施態様を含んでいる。
【０１１８】
本発明の第５の態様は、炎症状態あるいは癌の治療で使用される、ＬＡＰ、薬学的に活性な作用薬、および二量体化領域を含むアミノ酸配列を含み、該ＬＡＰと薬学的に活性な作用薬が、タンパク質分解切断部位を含むアミノ酸配列によって結合される融合蛋白質であって、炎症状体または癌を治療するために使用される融合蛋白質を提供する。薬学的に活性な作用薬は上に記述された通りであることができる。本発明のこの態様のいくつかの実施態様では、薬学的に活性な作用薬はｓｉＲＮＡまたはＰＮＡ分子であることができる。本発明は、本発明の第５の態様の融合蛋白質をコード化する核酸構成物をさらに提供する。核酸構成物は好ましくは、タンパク質分解切断部位をコード化する核酸配列に隣接するＬＡＰをコード化する核酸配列を含む。好ましくは、ＬＡＰをコード化する核酸配列は、適切にタンパク質分解切断部位をコード化する核酸配列に操作可能に結合される。
【０１１９】
本発明は、さらに本発明の第５の態様の融合蛋白質は、任意に本明細書に記載された潜在ＴＧＦβ結合蛋白質（ＬＴＢＰ）と共同する融合蛋白質を提供する。
【０１２０】
本発明の第５の態様の融合蛋白質は、ペプチド結合リンケージにより薬学的に活性な作用薬と結合していてもよい。あるいは、融合蛋白質は、化学結合により薬学的に活性な作用薬に結合してもよく、例えば、化学化合物（たとえば化学治療薬、合成ドラッグあるいはＰＮＡ）へ融合蛋白質を架橋することができる。
【０１２１】
好ましくは、薬学的に活性な作用薬は、本発明の第７の態様の、融合蛋白質中のタンパク質分解切断部位のアミノ酸配列のＣ末端端部に結合される。より好ましくは、薬学的に活性な作用薬は、タンパク質分解切断部位のアミノ酸配列のＣ末端残基と連続している。
【０１２２】
本発明の第５の態様の融合蛋白質、および関連する薬学的に活性な作用薬は、単独であるいは他の化合物（治療用化合物（例えば抗炎症薬細胞毒性薬、細胞静止薬、抗生物質））と共に使用されてもよい。そのような適用は同時、個別、または連続して行われてもよい。成分は、適切な指示を含んでもよいキットの形で調製されていてもよい。
【０１２３】
好ましくは、本明細書に記載された、本発明の第５の態様の融合蛋白質および関連する薬学的に活性な作用薬は、患者に直接適用される。
【０１２４】
本発明は、さらに本発明の第５の態様の融合蛋白質および関連する薬学的に活性な作用薬を含む組成物に関する。したがって、融合蛋白質および関連する薬学的に活性な作用薬は薬学的に受理可能な１または複数のキャリアーと組み合わせて使用されてもよい。そのようなキャリアーの非制限的例としては、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、リポソーム、水、グリセロール、ポリエチレングリコール、エタノールおよびそれらの組み合わせが挙げられる。
【０１２５】
医薬品組成物は、例えば、口内、局所的、静脈内、筋肉内、鼻腔内、または皮内のルートにより、患者の疾病の治療に有効な任意の有効で便利な方法で適用されてもよい。療法薬あるいは予防薬として、活性な作用薬は、無菌の水性分散液で、好ましくは等張液の注射可能な組成物として個人に適用されてもよい。
【０１２６】
本発明の第６の態様は、本発明の第１の態様の融合蛋白質、第２態様の核酸構成物、あるいは本発明の第５の態様の融合蛋白質と薬学的に活性な作用薬との組み合わせ、および経口投与用タブレット、肺適用のための吸入器および静脈内投与用注射剤を含むが、これらに限定されない適当な投与ビヒクルを含むキットを提供する。
【０１２７】
本発明の第７の態様は、宿主細胞中の発現による組み換えの融合蛋白質の生産、発現された融合蛋白質の精製、およびペプチド結合リンケージ、水素あるいは塩結合または化学的架橋リンケージにより、精製された融合蛋白質への薬学的に活性な作用薬の結合を提供することを含む本発明の第１の態様の融合蛋白質を調製する方法を提供する。本発明のこの態様では、薬学的に活性な作用薬がペプチドである場合、ペプチドがマルチマー化（例えば二量体化、トリマー化）できる時、融合蛋白質は水素または塩の結合を使用して調製することができる。
【０１２８】
本発明の第８の態様は、本発明の第２の態様の核酸構成物を調製する方法であって、潜在関連ペプチドをコード化する核酸配列、タンパク質分解切断シーケンスおよび薬学的に活性な作用薬を結合することを含み、任意にタンパク質分解切断部位の一方にリンカー・シーケンスを含む方法を提供する。
【０１２９】
本発明の１つの実施態様は、サイトカイン、好ましくはインターフェロンあるいはインターロイキンまたはサイトカイン阻害剤（たとえばｓｃＦＶまたは可溶性のサイトカインレセプター）である薬学的に活性薬剤に潜在性を供給する方法を提供し、この方法は潜在関連ペプチドを有する融合蛋白質を構成することを含み、好ましくはＴＧＦβから構成され、タンパク質分解切断部位、好ましくはＡＤＡＭ−ＴＳ４切断部位および薬学的に活性薬剤を結合することを含む。例えば、タンパク質分解切断部位は以下のように薬学的に活性な作用薬およびＬＡＰに続いてもよい：Ｉｇ−ＬＡＰ−切断部位活性な作用薬。
【０１３０】
したがって、本発明は、浮遊培養中のタンパク質産生の問題を解決する二量体の形成を可能にする。本発明は、さらにＬＡＰ構成物の「シェル」の閉鎖により、治療薬として潜在性抗体フラグメント（例えばサイトカイン作用の阻害剤）の生産を可能にする。従来は、ＬＡＰと単一のペプチド治療薬の融合は「シェル」を部分的に開口したまま残し、したがって、潜在的に疾病の部位でプロテアーゼ作用（つまりＭＭＰ／アグリカナーゼ分裂）による遊離の必要なしで暴露された。例えば、治療のペプチドがサイトカイン阻害剤（ｓｃＦｖ）である場合、もし疾病の部位での遊離の前にサイトカインに暴露されれば、それは相互作用することができるだろう。
【０１３１】
本発明では、それらの構造が非常に類似しているので任意の種の任意のタイプの免疫グロブリン（Ｉｇ）を使用することができるが、ある臨床応用のためには特定のアイソタイプが有利かもしれない。たとえば粘膜の組織に対してはＩｇＡが使用でき、Ｆｃ受容体に結合するためにＩｇＧ２が使用されてもよい。さらに、もしそれが特定の臨床応用に望ましければ、それらのＦｃ受容体との結合を防ぐＦｃの突然変異形式、活性化細胞性免疫(activating cell mediated immunity)または、補足活性化(complement activation)を使用することができるだろう。
【０１３２】
本発明の第２および引き続く態様のすべての好ましい特徴は、第１の態様のものに準ずる。
【０１３３】
本発明は、添付の図面に関を参照してより詳細に説明される。
【図面の簡単な説明】
【０１３４】
【図１】図１は、ＴＧＦβ１、２、３（人間、Ｈｕ）、ＴＧＦβ４（鶏、Ｃｋ）、ＴＧＦβ（カエル、Ｆｇ）の前駆物質領域のアミノ酸配列を示す。矢は、ＴＧＦβ１、および成熟型ＴＧＦβｓのシグナルペプチドの分裂に帰着する、蛋白質分解処理の位置を示す。Ｎ−リンクした糖鎖付加部位には下線が付され、インテグリンセルの認識配列である(Roberts and Sporn,Peptide Growth Factors and their Receptors:Sporn,MB and Roberts,AB,Springer-Verlag,Chapter 8,422(1996)）。
【０１３５】
【図２】図２は、マトリックス・メタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）のタンパク質切断部位のシーケンスを示す(Nagase and Fields,Biopolymers,40,399-416(1996))。
【０１３６】
【図３】図３は、ファージミド分裂の対応する平均パーセンテージを備えたＡＤＡＭＴＳ−４エピトープ・シーケンスおよび派生したＡＤＡＭＴＳ−４分裂モチーフのマルチプル配列アラインメントを示す。４０％以上の頻度で特定の位置で見つけられる優勢なアミノ酸は黒色の背景で示され、関連するアミノ酸は対照的に灰色の背景で示される（reproduced from Hills et al J.Biol.Chem.282 11101-11109(2007))。
【０１３７】
【図４】図４ａは、ＬＡＰの理論的な構造を示す。図４ｂは、Ｉｇ−ＬＡＰの理論的な構造を示す。図４ｃは、Ｉｇ−ＬＡＰの模式図を示す。
【０１３８】
【図５】図５は、マウスＩｇＧ１（Ｆｃ）−ＬＡＰ−ＭＭＰ−ＩＦＮのＤＮＡ塩基配列および予測されたアミノ酸配列を示す。イニシエーターＡＴＧは位置１０にあり、停止コードンは位置２０２５にある。
【０１３９】
【図６】図６は、ＣＨＯ細胞の中でのＩｇ−ＬＡＰ−ＩＦＮの発現を示す。ＬＡＰ−ＩＦＮ（スロット１）あるいはＩｇ−ＬＡＰ−ＩＦＮ（スロット２）のウェスタンブロッティングである。懸濁液ＣＨＯ細胞からの２０μｌの上済みが非変性状態(non-denaturing conditions)で４−１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で実行され、ＰＤＶＦ細胞膜上にブロットされた。その後、ヤギ抗ＬＡＰ抗体でプローブされた。バンドは、化学発光（ＥＣＬ、Ａｍｅｒｓｈａｍ）によってＨＲＰを結合した抗ヤギ抗体を使用し、オートラジオグラフィーに暴露されて検知された。
【０１４０】
【図７】図７は、ＭＭＰ１によるＩｇ−ＬＡＰ−ＩＦＮの分裂を示す。ＣＨＯ細胞上澄みの２０μｌが、ＭＭＰ１なし（スロット１）、あるいはＭＭＰ１有り（スロット１）で、３７℃で一晩インキュベートされた。その後、生成物は、非変性条件で４−１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥグラジエントゲル上で実行され、ＰＤＶＦ薄膜にブロットされた。抗ＬＡＰ抗体が、非開裂生成物（スロット１）と開裂された生成物（スロット２）を検知するために使用された。開裂されたＩｇ−ＬＡＰの分子量は約１６０  ｋＤａの予期されたサイズに相当する。
【０１４１】
【図８】図８は、抗ｈｅｒＮｅｕ２（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））抗体を備えたヒトＩｇ−ＬＡＰのＤＮＡ塩基配列を示す。この構成物中の切断部位はアグリカナーゼ特異性部位である。分泌シグナルペプチドは、ＩＬ−２（ヌクレオチド１−５４）に由来し、ヒトＣＨ２およびＣＨ３領域はＩｇＧ１（ヌクレオチド５５−７５７）に由来し、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｃｏ１（ヌクレオチド７５８−７７１）の独特な制限部位を備えたスペーサーに続き、ヒトＬＡＰシーケンス（ヌクレオチド７７２−１５１５）はＧＧＧＧＳリンカー（ヌクレオチド１５１６−１５８４）にフランクされたアグリカナーゼ切断部位に続き、最後にポリ  Ｈｉｓ  テイルで終わるＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）ｓｃＦｖ（ヌクレオチド１５８５−２３７０）に続く。
【０１４２】
【図９】図９は、蛍光団でラベルを付けた抗−Ｈｉｓ抗体による、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）の検知を示す。Ｉｇ−ＬＡＰ  Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）は懸濁液中でＣＨＯ細胞の中で生産された。また、プロテインＡカラムを使用して、親和性クロマトグラフィーにより細胞上澄みから融合蛋白質が純化された。純化された材料からのフラクションは、アグリカナーゼによる分裂の前に、あるいはその分裂の後に、Ｈｅｒ／ｎｅｕ２（ＳＫＢＲ３）を発現する乳癌細胞あるいは発現しないもの（ＭＤＡ−ＭＤ−２３１）に適用された。Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）ｓｃＦｖは、ｈｕＩｇ−ＬＡＰ融合からのＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）のアグリカナーゼ遊離の後にだけ、乳癌細胞上のＰ１８５  ＨｅｒＮｅｕ２に結合する。
【発明を実施するための形態】
【０１４３】
本発明は、以下の非制限的な例を参照して記述される：
実施例１：
ＩＬ−２およびマウスＬＡＰのシグナルペプチド間のＩｇＧ１  Ｆｃのクローニング
本発明の構成物の調製の一例は、以下のとおりである。マウスＩｇＧ１のＰＣＲが、ｍｕＬＡＰ−ＭＭＰ−ＩＦＮのシグナルペプチドの後にＥｃｏＲ１部位へＩｇＧ１  Ｆｃのクローンを作るために使用された。次のオリゴヌクレオチドはコード領域フレームにリンクするために設計された。
センスオリゴ：
５’ＡＴＧ  ＡＡＴ  ＴＣＣ  ＧＧＴ  ＴＧＴ  ＡＡＧ  ＣＣＴＴＧＣＡＴＡ
アンチセンスオリゴ：
５’  ＧＴ  ＧＡ  ＡＴＴ  ＣＣＴ  ＣＣＡ  ＴＧＧ  ＡＡＧ  ＣＴＴ  ＴＴＴ  ＡＣＣ  ＡＧＧ  ＡＧＡ  ＧＴＧ  ＧＧＡ  ＧＡＧ
【０１４４】
オリゴの中のＥｃｏＲ１部位には下線が付される。また、Ｎｃｏ１とＨｉｎｄＩＩＩの部位は太線で示された。後者の部位は補足ＭＭＰまたはアグリカナーゼ切断部位の直接のクローニングを許容するために導入された。インフレーム翻訳に必要とされるものと反対のオリエンテーションでＩｇＧ１フラグメントを挿入することができたので、結果として生じるクローンは制限分析によって分析され、正しいオリエンテーションのＩｇＧ１フラグメントを含むものがＤＮＡ塩基配列決定に送られた。
【０１４５】
図５は、代表的な陽性のクローンのＤＮＡ塩基配列を表す。Ｉｇ−ＬＡＰ−ＭＭＰ−ＩＦＮは、懸濁液中で成長したＣＨＯ細胞から有効に分泌される：一時的にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞からの上澄みはヤギ抗ＬＡＰ抗体（研究開発システム）（図６）を使用して、ウエスタンブロットによって非還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥの後に分析された。Ｉｇ−ＬＡＰ−ＩＦＮの分子量はＬＡＰ−ＩＦＮより大きかった（つまり糖鎖形成した二量化タンパク質から期待される２００ｋＤａ以上）。
【０１４６】
Ｉｇ−ＬＡＰ融合は組み換えＭＭＰ１によって開裂される：Ｉｇ−ＬＡＰ−ＩＦＮ融合がＭＭＰによって依然として開裂されるかどうか確証するために、発明者は、３７℃で組み換えＭＭＰ−１で、上澄み中のＣＨＯの中のタンパク質を一晩消化した。その反応は２５のｍＭ  ＥＤＴＡにより停止され、次に、非変性のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図７）の後にウエスタンブロットによって分析された（図７）。
【０１４７】
ＭＭＰによる分裂の後に、Ｉｇ−ＬＡＰ−ＩＦＮはＩＦＮ生物活性を示した：マウスＬ９２９細胞は９６ウェルプレート中で１０４個の細胞／ウェルで培養された。細胞は、１：１０からスタートするダブル稀釈液でＭＭＰ−１で処理されたか、ＭＭＰ−１で処理されていない、Ｉｇ−ＬＡＰ−ＩＦＮトランスフェクトされたＣＨＯ細胞培養の上澄みで一晩培養された。その後、ミディアムは取り除かれた。また、記述される(Adams et al. 2003)ように、細胞は１６時間５０μｌの体積中の脳心筋炎ウイルスで感染された。細胞は、ＰＢＳおよび１００ｍｌの細胞タイター−Ｇｌｏ(Promega)溶菌バッファーの中で洗われた。
２０分の室温の後、５０μｌが不透明なプレートに転送され、照度計でルミネセンス（内因的なＡＴＰレベル）が読まれた。５０％の細胞の生存率は感染していないＬ９２９細胞と比較したルシフェラーゼ活性の半分として評価された（ＭＭＰ分裂がＩｇ−ＬＡＰ−ＩＦＮからＩＦＮ活性を示ことを示す表２を参照）。
【０１４８】
【表２】
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【０１４９】
実施例２：
懸濁液中のＣＨＯ細胞内のアグリカナーゼ特異性切断部位を有する、抗ｈｅｒＮｅｕ２（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）−Ｍａｒｋｉｖら、ＢＭＣバイオテクノロジー、１１：１１７  ２０１１）抗体を備えたＩｇ−ヒトＬＡＰ構成物が作成された。分泌のシグナルペプチドは、ＩＬ−２（ヌクレオチド１−５４）に由来し、ヒトＣＨ２およびＣＨ３領域はＩｇＧ１（ヌクレオチド５５−７５７）に由来した。構成物内では、ユニークな制限部位ＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｃｏ１（ヌクレオチド７５８−７７１）を備えたスペーサーがヒトＣＨ２およびＣＨ３領域に続く。ヒトＬＡＰシーケンス（ヌクレオチド７７２−１５１５）は、ＧＧＧＧＳリンカー（ヌクレオチド１５１６−１５８４）によってフランクされたアグリカナーゼ切断部位に続く。Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）ｓｃＦｖはポリＨｉｓテイル（ヌクレオチド１５８５−２３７０）内で終わる。プロテインＡカラムを使用して、親和性クロマトグラフィーにより細胞上澄みから融合蛋白質は純化された。純化された材料からのフラクションは、アグリカナーゼによる分裂の前に、あるいはその分裂の後に、Ｈｅｒ／ｎｅｕ２（ＳＫＢＲ３）を発現している乳癌細胞あるいは発現していない（ＭＤＡ−ＭＤ−２３１）に適用された。Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）は、蛍光団でラベルが付けられた抗Ｈｉｓ抗体によって検知された（図９）。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【図５−５】
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【図６】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図８−４】
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【図８−５】
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【図８−６】
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【図９】
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【配列表】
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