(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルコースを含む最少培地で４８時間培養した際に、１リットル当たり６０グラム以上のコハク酸を生産するように予め操作された細菌であって、該コハク酸の生合成中間体の１つがホスホエノールピルビン酸であり、該細菌が、糖の促進拡散において機能するタンパク質をコード化する少なくとも１つの外来遺伝子であってｇｌｆ遺伝子を含む外来遺伝子、およびｐｔｓＨ、ｐｔｓＩおよびｇａｌＰ遺伝子における欠失をさらに含み、グルコースを含む最少培地で４８時間培養した際に、１リットル当たり４．２グラム未満の酢酸を生産し、その親株が大腸菌ＫＪ１２２株である細菌。
【請求項２】
糖取り込みのためのホスホトランスフェラーゼシステムにおいて機能するタンパク質をコード化する１つまたはそれ以上の遺伝子における変異または欠失をさらに含み、該変異または欠失遺伝子がｃｒｒ遺伝子以外である、請求項１に記載の細菌。
【請求項３】
プロトン共輸送体を用いて機能する糖取り込み体をコード化する遺伝子における欠失をさらに含む、請求項２に記載の細菌。
【請求項４】
該変異または欠失遺伝子が、ｐｔｓＨ遺伝子またはその相同体である、請求項２に記載の細菌。
【請求項５】
該外来遺伝子が複製プラスミド上に含まれる、請求項１に記載の細菌。
【請求項６】
該外来遺伝子が宿主染色体中に組み込まれる、請求項１に記載の細菌。
【請求項７】
機能的ｃｒｒ遺伝子またはｃｒｒ遺伝子の機能的相同体の２以上のコピーをさらに含む、請求項２に記載の細菌。
【請求項８】
コハク酸の生産方法であって、グルコースを含む最少培地で４８時間培養した際に、１リットル当たり６０グラム以上のコハク酸を生産するように予め操作された細菌を増殖させる工程、ここで該細菌は、糖の促進拡散において機能するタンパク質をコード化する少なくとも１個の外来遺伝子であってｇｌｆ遺伝子を含む外来遺伝子、およびｐｔｓＨ、ｐｔｓＩおよびｇａｌＰ遺伝子における欠失をさらに含み、グルコースを含む最少培地で４８時間培養した際に、１リットル当たり４．２グラム未満の酢酸を生産し、その親株が大腸菌ＫＪ１２２株である、および
要すれば、該発酵培地からコハク酸を精製する工程
を含む、方法。
【請求項９】
該ｇｌｆ遺伝子をコード化するｍＲＮＡの５’非翻訳リーダー領域に少なくとも１つの変異を含む、請求項１に記載の細菌。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１３年７月２３日に出願した米国仮特許出願第６１／８５７，３００号に基づく優先権を主張する。
【０００２】
発明の技術分野
本発明は、糖含有原料の使用においてそれらの効率を高めるように修飾され得る生体触媒（細菌および他の微生物）を用いて、特定のおよび汎用性の有機化合物を生産する技術分野に属する。より具体的には、本発明は、コハク酸および他の化合物の生物学的生産のための糖類の輸送および代謝を含む機能をコード化する遺伝子の遺伝子修飾に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
多くの有機化合物が、現在、石油化学原料から製造されている。再生可能な原料を用いて生物学的発酵プロセスを介して、これらの石油化学を利用している有機化合物の多くを生産することへの関心が高まっている。再生可能な原料から誘導することができる有機化合物のリストには、α, ω−二酸（コハク酸、フマル酸、リンゴ酸、グルカル酸、マロン酸、およびマレイン酸）、２，５−フランジカルボン酸、プロピオン酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、アスパラギン酸、グルカル酸、グルタミン酸、イタコン酸、レブリン酸、３−ヒドロキシブチロラクトン、グリセロール、ならびに１，４−ブタンジオール（米国特許出願公開第２００９００４７７１９号）、１，３−ブタンジオール（米国特許出願公開第２００９０２５３１９２号）、および２，３−ブタンジオールのようなブタンジオール類が含まれる。アミノ酸、ビタミン類、アルコール類（例えば、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、イソブタノール、および高級アルコール）、脂肪酸類、脂肪酸のエステル類、炭化水素類、イソプレノイド類、テルペン類、カロテノイド類、アミン類を含むが、これらに限定されない多くの他のタイプの有機化合物もまた、再生可能な原料を用いて生産可能である。任意のこれらの化合物を、本明細書中“所望の化合物”と言う。多くのこれらの所望の化合物のための発酵プロセスが開発されているが、石油化学プロセスに対抗するために、例えば、生成物の力価（１リットル当たりの生成物のグラム数での終濃度）および生成物の収量（グルコースなどの炭素源１グラム当たりの生成物のグラム数）を改善するため、および酢酸などの望ましくない副生成物の力価を減少させるための、発酵の全体的な経済性を改善するための一定の必要性がある。
【０００４】
大腸菌を含む多くの細菌は、ホスホトランスフェラーゼシステム（ＰＴＳ）と呼ばれる、グルコースおよび他の糖類を細胞内へ能動輸送するためのシステムを使用している。このシステムは、糖を同時に輸送およびリン酸化するためのエネルギー源およびリン酸源としてＰＥＰ（ホスホエノールピルビン酸）を用いる。ＰＴＳシステムは、通常、糖を取り込み、そしてそれをリン酸化するのに共に機能する４つ以上のタンパク質を必要とする。これらのタンパク質のいくつかは、所定の生物がＰＴＳにより取り込む糖類の全てに共通するが、ＰＴＳの他のタンパク質成分は、１つまたはそれ以上の特定の糖類に特異的である。
【０００５】
例えば、大腸菌において、全てのＰＴＳ経路に共通するタンパク質は、それぞれ遺伝子ｐｔｓＨおよびｐｔｓＩによってコード化されるＰｔｓＨおよびＰｔｓＩである。これらの２つの“共通の”ＰＴＳタンパク質に加えて、１つまたはそれ以上のさらなる糖特異的ＰＴＳタンパク質が、特定の糖類を取り込み、かつそれをリン酸化するのに必要とされる。例えば、ＰＴＳによるグルコースの取り込みは、ＣｒｒおよびＰｔｓＧと呼ばれる２つのさらなるタンパク質を必要とする。Ｃｒｒは単一ドメインＡを有する細胞質タンパク質であり、ＰｔｓＧは、２つのドメインＢおよびＣを有する膜タンパク質である。ＰＥＰ由来のリン酸基は、タンパク質からタンパク質へ中継され、最終的に、細胞内に取り込まれるグルコースに、その６位に転送されて、グルコース−６−リン酸が得られる。ＰＥＰから始まる中継の順番は、ＰｔｓＩ、ＰｔｓＨ、Ｃｒｒ、そして最後にＰｔｓＧである。歴史的には、これらのタンパク質は、それぞれＥＩ、ＨＰｒ、ＥＩＩＡＧｌｃ、およびＥＩＩＢＣなどの他の名前でも呼ばれていた。大腸菌由来の別の例としては、フルクトースは、ＰｔｓＩ、ＰｔｓＨ、ＦｒｕＡ、およびＦｒｕＢを用いる同様の中継によって取り込まれ、最後の２つはそれぞれＥＩＩＦｒｕおよびＥＩＩＦｒｕとしても公知である。ある糖類、例えば、マンニトールについて、グルコースについて上記のＡ、ＢおよびＣに対応する糖特異的タンパク質ドメインは、１つの膜結合ポリペプチドに融合されているが、他の糖類、例えば、マンノースについて、ＡおよびＢドメインは、１つの細胞質ポリペプチドに融合されており、一方で、膜結合成分は、ＣおよびＤと称される２つのサブユニットから構成されている。
【０００６】
全ての場合において、該システムは、“共通のサブユニット”（大腸菌において、ＰｔｓＩおよびＰｔｓＨ）に依拠し、ＰＥＰは、エネルギー源およびリン酸源である。結果として、ＰＴＳシステムによって取り込まれる糖分子は、１分子のＰＥＰを利用して、１分子のリン酸化された糖および１分子のピルビン酸を生産する。しかしながら、ＰＥＰはまた、１）ピルビン酸キナーゼによるピルビン酸およびＡＴＰの形成、２）ＴＣＡ（トリカルボン酸）回路にも炭素を供給する、ＰＥＰカルボキシキナーゼおよびＰＥＰカルボキシラーゼにより触媒されるアナプレロティック代謝経路、および３）３−デオキシ−Ｄ−アラビノヘプツロソネート−７−ホスフェートシンターゼ（ＤＡＨＰシンターゼ）の１つまたはそれ以上のアイソザイムによって触媒される共通の芳香族アミノ酸および芳香族ビタミン生合成経路の利用などの、いくつかの生化学的経路における必須中間体でもある。従って、本明細書に記載の糖取り込みおよび他の経路のためのＰＴＳシステム間のＰＥＰの競合は不可避である。
【０００７】
グラム陽性およびグラム陰性細菌の両方を含む多くの細菌がＰＴＳシステムを使用しているため、進化における種々の状況下で保存されてきたシステムであることは明らかである。しかしながら、嫌気的条件下では、グルコースのような糖類からのＡＴＰの生産は、好気的条件下よりもはるかに効率が低く、例えばピルビン酸キナーゼによる所謂“基質レベルの”リン酸化が、酸化的リン酸化がＡＴＰ収支（budget）の大部分を提供する好気的条件下よりも、ＡＴＰ収支の大部分を占める。このように、出芽酵母およびザイモモナス・モビリス(アルコール発酵菌)などの微生物は、両者とも、グルコースおよび他の糖類上での嫌気性増殖に適用されるＰＴＳシステムを有しないが、グルコースおよび他の糖類を取り込むために促進拡散タンパク質（facilitated diffusion protein）（パーミアーゼとも言う）を使用しているということに注目すべきである。さらに、ＰＴＳを天然で使用する生物(細菌)が発酵により特定の化合物を過剰生産するように遺伝子操作されているとき、多くの場合、該経路はＰＥＰを中間体として用い、そのため、ＰＴＳは、ＰＥＰについて所望の生合成経路と競合する。ＰＴＳの活性を低下させることによるこの競合の緩和は、所望の生合成経路への流入を増加させることが知られている。
【０００８】
例えば、ＰＥＰは、コハク酸をもたらすトリカルボン酸（ＴＣＡ）回路の分岐した還元的経路における中間体である。大腸菌のコハク酸生産体であるＫＪ１２２の代謝的進化（metabolic evolution）の間に、フレームシフト変異がｐｔｓＩ遺伝子に起こり、その結果、グルコースからのコハク酸生産の増加がもたらされた。野生型ｐｔｓＩ遺伝子の再挿入(reinstalling)は、コハク酸生産の大幅な減少を引き起こし、ｐｔｓＩ変異が該株の改良に大きく寄与していることを証明した。
【０００９】
別の例では、芳香族アミノ酸は、ＰＥＰおよびエリスロース−４−リン酸から構成されている。大腸菌株における３つのｐｔｓ遺伝子の欠失（ΔｐｔｓＨＩ、ｃｒｒ）は、細胞を炭素源としてグルコース上で増殖させたとき、芳香族アミノ酸生合成経路への流入を増加させることが示された。
【００１０】
上記の両方の例において、グルコースの取り込みは、所謂ガラクトースパーミアーゼ（ｇａｌＰ遺伝子によりコードされるＧａｌＰ）によりある程度のレベルで今後達成されると推測される。第一の例では、ｇａｌＰ遺伝子のリプレッサー（ＧａｌＳ）の活性を低下させる変異が、代謝的進化の結果もたらされることが見出された（ＷＯ２０１１／１２３１５４）。第二の例では、１つまたはそれ以上の変異が、増殖速度の増大をもたらすｐｔｓ遺伝子の欠失後に生じた。得られた株は、グルコース上で有意に増殖するためにｇａｌＰに依存し、該株における１つまたはそれ以上の変異が、ｇａｌＰの発現の増加に関係し得た（ＵＳ６，９６２，７９４）。しかしながら、この第二の例の株は、芳香族アミノ酸生産について“Ｐｔｓ−／Ｇｌｕ＋”株を操作した後においても、芳香族アミノ酸の力価は低かった。フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンは、それぞれ１．７、０．８、および２．２ｇ／ｌ生産された。これらの力価は、経済的に魅力的な商業的方法を支持する程十分高くないため、ＵＳ６，９６２，７９４に記載の発明が商業的生産に有用であるかは明らかではない。このように、経済的に実行可能な化合物の発酵による商業的生産のための発酵パラメータを改善することが依然として必要とされている。
【００１１】
グルコース取り込みのためのプロトン共輸送体であるＧａｌＰの使用はＰＥＰを節約するが、輸送される各グルコース分子に対して約１／３のＡＴＰを消費する。ある微生物、例えば、細菌ザイモモナス・モビリスおよび酵母サッカロマイセス・セレビシエは、グルコースを取り込むために促進拡散を使用する。Ｚ．モビリスは、グルコースおよびフルクトースの両方を取り込むために機能する１つのファシリテーター（facilitator）タンパク質を有する。Ｓ．セレビシエは、少なくとも１４種の異なるヘキソースインポーターを有し、その多くがグルコースを取り込み、少なくともいくつかが同様にフルクトースを取り込む。グルコース取り込みのためのこのモードは、糖が細胞質内に取り込まれ、その後、ＡＴＰが消費されてグルコース−６−リン酸が形成され、糖が解糖系に入るまで、ＡＴＰ消費を必要としない。最も重要なことには、ＰＴＳシステムとは異なり、ＰＥＰが消費されない。このように、促進拡散は、明らかにいくつかの生物に適しており、該細胞にて、ＰＴＳシステムまたはＧａｌＰなどのプロトン共輸送体のいずれかよりもＰＥＰおよびＡＴＰに関してコストが低い。Ingramら（ＵＳ５，６０２，０３０）は、ザイモモナス・モビリス由来のグルコキナーゼ（Ｇｌｋ、ｇｌｋ遺伝子によりコードされる）と共にマルチコピープラスミド上の遺伝子から発現される、同じくザイモモナス・モビリス由来の促進拡散タンパク質（Ｇｌｆ、ｇｌｆ遺伝子によりコードされる）は、親株が天然のグルコース促進拡散能を有しておらず、他のグルコース取り込みシステムが変異により無効にされている大腸菌株のグルコース最少培地での増殖を補助するためにＰＴＳを機能的に置き換えることができることを証明した。プラスミド上にＺ．モビリスの２つの遺伝子ｇｌｆおよびｇｌｋを含む組み換え大腸菌ｐｔｓＧ−、ｐｔｓＭ−、ｇｌｋ−株ＺＳＣ１１３は、グルコース最少培地上で好気的に増殖することができた。
【００１２】
これらの開示は、Ｚ．モビリスのタンパク質が、０．５３hr-1の比増殖速度で好気的に増殖するのを支持するのに十分に大腸菌において機能し得ることを証明した。しかしながら、グルコース取り込みに天然のＰＴＳを用いる野生型大腸菌は、１．０から１．２hr-1の好気的比増殖速度を有しており、ＵＳ５，６０２，０３０においてｇｌｆ遺伝子を用いて操作された株はグルコース取り込みにより顕著に制限されることが明らかである。さらに、この開示は、促進拡散システムが嫌気性の増殖を支持し得ることを示さなかった。発酵によって生産される重要な化合物の多くは、経済的に魅力的な商業的生産システムを支持するロバスト性の嫌気的増殖を必要とする（ＷＯ２０１２／０１８６９９）。ＵＳ５，６０２，０３０の実施例およびSnoepら(1994)は、緩やかな増殖が、マルチコピープラスミドからｇｌｆおよびｇｌｋを発現することによって得られ得ることを示したが、それは、増殖がｇｌｆおよびｇｌｋ遺伝子の組み込まれたコピー数によって支持され得ることを証明せず、商業的規模の生産には、プラスミドを含まない株を用いることが望ましいことが多い。最後に、ＵＳ５，６０２，０３０は、ｇｌｆベースのシステムが、促進拡散を天然で使用していない大腸菌または他の生物における、エタノールまたはコハク酸などの汎用化合物の高力価生産を支持することができることは証明しなかった。このように、ｇｌｆがＰＴＳに取って代わることができ、結果として、天然の促進拡散システムを有しない宿主株に所望の化合物を生産するための経済的に魅力的な発酵プロセスをもたらすことは、ＵＳ５，６０２，０３０のみの開示からは明らかではなかった。
【００１３】
Tangら(2013)は、コハク酸の嫌気的生産が、ΔｐｔｓＩ、ΔｌｄｈＡ、ΔｐｆｌＢ、ｐｃｋ＊である大腸菌株バックグラウンドにおいてグルコキナーゼと組み合わせてＺ．モビリスのｇｌｆの発現によって達成され得ることを示すためにさらに数工程を組み合わせた。しかしながら、このシステムで最高のコハク酸生産は、９６時間で僅か２２０ｍＭ（２６ｇ／ｌ）と多くはなかった。ｇｌｆおよびｇｌｋの発現を組み合わせて調節することにより最適化したにも関わらず、この力価および生産性は、ｇｌｆを用いずに８３ｇ／ｌのコハク酸を生産した既報の株の力価および生産性に及ばない。従って、Tangらのより優れた仕事にも関わらず、未だ、グルコース取り込みのための促進拡散の使用が、実際に、経済的に魅力的な商業的生産のために必要となるレベル（少なくとも８３ｇ／ｌがベンチマークとされる）で発酵生産パラメータを改善するのに有用であったことは、証明されていない（ＷＯ２０１２／０１８６９９）。大腸菌およびおそらく他の細菌において、ｇｌｆによるＰＴＳの潜在的置換をさらに複雑にしているのは、ＰＴＳの構成要素が、多くの異なる代謝経路に影響を与える多様な調節機能を有しているため、ＰＴＳ遺伝子群の１つまたはそれ以上の欠失がその結果として生じた改変株の全体的な生理学的特性および発酵特性にいかなる効果をもたらすのか予測不可能だからである。グルコースの取り込みに促進拡散を天然で使用する、天然のＺ．モビリス株は、グルコースから約６０ｇ／ｌまでのエタノールおよび同様の量の二酸化炭素を生産することができる。Ｚ．モビリスの操作された菌株は、グルコースから６４ｇ／ｌのコハク酸を生産することが報告されている（ＥＰ２００７０７１５３５１）。しかしながら、この発酵は、発酵培地中に１０ｇ／ｌの酵母抽出物を必要とし、その費用と酵母抽出物成分からのコハク酸の精製に要する増大したコストの両方の理由により、コハク酸の商業的生産に望ましくない。さらに、Ｚ．モビリスは、多くの場合、発酵プロセスでの使用に便利なまたは最適な宿主生物ではない。
【００１４】
従って、従来技術をまとめると、大腸菌は、好気性増殖を適度な速度に支持し、そして嫌気的コハク酸生産の適度なレベルを支持するために、グルコースの促進拡散を用いるように操作され得ることが示されているが、グルコース取り込みのための促進拡散の非天然の使用を付与するように操作され、発酵による化合物の生産のためにＰＴＳおよび／またはＧａｌＰなどの天然のグルコース取り込みシステムを用いる株よりも改善されている、細菌株または方法は開示されていない。さらに、グルコース取り込みのために促進拡散を使用し、グルコース最少培地などの商業的に魅力的な培地において十分高い力価、収量および速度で、コハク酸またはエタノールおよび二酸化炭素以外の化合物を生産することができる細菌株または方法は開示されていない。このように、生産性、培地のコスト、および後の精製を含む全ての要因を考慮すると、経済的に魅力的な方法でコハク酸および化合物を生産することができる改良された株が依然として必要とされている。
【００１５】
引用文献
全ての文献は、この明細書を読む者の便宜のために列記される。それぞれの文献は、引用によりその全体を本明細書に包含される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】米国特許第5,602,030号
【特許文献２】米国特許第6,962,794号
【特許文献３】米国特許第7,220,561号
【特許文献４】米国特許第8,389,214号
【特許文献５】米国特許第8,476,041号
【特許文献６】米国特許出願公開第20050079617号
【特許文献７】米国特許出願公開第20090047719号
【特許文献８】米国特許出願公開第20090253192号
【特許文献９】米国特許出願公開第20100184171号
【特許文献１０】欧州特許第EP20070715351号
【特許文献１１】欧州特許第EP0785275B1号
【特許文献１２】国際公開第WO 2010/115067号
【特許文献１３】国際公開第WO2011/123154号
【特許文献１４】国際公開第WO2012/018699号
【非特許文献】
【００１７】
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【発明の概要】
【００１８】
発明の概要
本発明は、商業的に重要な製品、例えば、それに限定されないが、特定の化合物および汎用性の化合物の発酵生産を改善するためのグルコースの促進拡散を用いるための生体触媒（例えば、遺伝子的に操作された微生物）および方法を提供する。具体的には、本発明は、糖を含む再生可能な原料を用いる、有機酸、アミノ酸および他の生化学物質の生合成経路において生化学的中間体としてＰＥＰを有する、該化合物の発酵生産に有用である。具体的な例として、本発明は、糖の促進拡散を使用するように構成されている生体触媒を用いる、グルコース、フルクトース、またはスクロースを含む再生可能な原料からのコハク酸の発酵生産に有用である。本発明の原理は、発酵により生産することができる多くの他の所望の化合物、特に、フマル酸、リンゴ酸、グルタミン酸、グルタミン酸誘導体、アスパラギン酸、アスパラギン酸誘導体、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン）、ならびにビタミン類およびｃｉｓ, ｃｉｓ−ムコン酸などの中心的芳香族経路における中間体から誘導される化合物のような、ＴＣＡの中間体化合物またはその誘導体にも適用することができる。
【００１９】
本発明により、グルコースなどの糖類の促進拡散に関与するタンパク質をコードする遺伝子は、促進拡散により発酵媒体から炭素源およびエネルギー源として糖を取り込むための新しい能力を付与するため、または糖輸送および代謝のための生体触媒の既存の能力を増大させるか、または改善するために、多種多様な生体触媒に導入され得る。促進拡散により糖を取り込むための追加された能力を有するように操作された株は、親株のパラメータと比較したとき、例えば、増加した力価（所望の生成物のｇ／ｌ）、増加した収量（消費される糖１グラム当たりの精製した生産物のグラム数）、増加した比生産性（生成物形成のｇ／ｌ-hr）、ならびに／あるいは酢酸、ピルビン酸および／またはアミノ酸のような望ましくない副生成物の減少した力価などの改善された発酵パラメータを有し得る。これらの改善されたパラメータは、結果として、エネルギーの保存（例えば、ＧａｌＰなどのプロトン共輸送体を駆動するためにプロトン勾配を形成するためのより少ないＡＴＰの使用）、コハク酸経路（複数可）などの中間体としてＰＥＰを使用する経路のためのＰＥＰの保存、ならびに酢酸生産経路または他の望ましくない経路へのオーバーフロー代謝の低下をもたらし得る。
【００２０】
この方法は、少なくとも部分的にＰＥＰから誘導されるか、またはＰＥＰを介して誘導される化合物、例えば、コハク酸、リンゴ酸、フマル酸、乳酸、エタノール、ブタノール、プロパンジオール、３−ヒドロキシプロピオン酸、アクリル酸、プロピオン酸、乳酸、グルタミン酸、アスパラギン酸、メチオニン、リシン、スレオニン、およびイソロイシンなどのアミノ酸、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、芳香族ビタミン、芳香族性ビタミン様化合物などの中心的芳香族経路から誘導される化合物、ならびに生合成中間体としてＰＥＰから誘導される任意の他の化合物の製造に特に有利である。
【００２１】
一態様において、本発明は、促進拡散によって糖を取り込むための能力を天然に有しない生体触媒に、促進拡散によって糖を取り込むための新しい能力を付与する追加の異種遺伝子（１個または複数の）を提供する。別の態様において、本発明は、親生体触媒よりも所望の発酵産物のより高い力価を生じる新規の生体触媒を提供する。別の態様において、本発明は、親生体触媒よりも所望の発酵産物のより高い収量を産する新規な生体触媒を提供する。別の態様において、本発明は、親生体触媒よりも所望の発酵産物に対するより高い比生産性を生じる新規の生体触媒を提供する。別の態様において、本発明は、親生体触媒よりも望ましくない副生成物の低い力価を生じる新規の生体触媒を提供する。
【００２２】
糖の促進拡散において機能するタンパク質または複数のタンパク質をコードする遺伝子または複数の遺伝子は、糖の促進拡散を実行する天然の能力を有する任意の生物に由来してよく、タンパク質または複数のタンパク質が新しい宿主において機能することができることが唯一の要件である。糖が細胞質に入った後、該糖をリン酸化するのに必要な糖キナーゼ、例えば、グルコキナーゼをコードする遺伝子は、促進拡散のための遺伝子（複数可）が由来する同じドナーに由来してよいか、またはレシピエント宿主由来の天然の糖キナーゼ遺伝子を使用することができるか、または両糖キナーゼの組み合わせを使用することができる。
【００２３】
別の態様において、本発明は、糖を取り込むために促進拡散を使用する遺伝子操作された微生物を培養することを含む、所望の発酵産物を生産するための方法を提供する。
【００２４】
別の態様において、本発明は、促進拡散を使用するように操作された株の発酵性能パラメータ（力価、収量、比生産性、最小化された副生成物形成）を改善する方法を提供する。
【００２５】
別の態様において、本発明は、糖を取り込むために促進拡散を使用する遺伝子操作された微生物における改善された増殖パラメータおよび発酵パラメータを導く促進拡散および糖キナーゼ活性の改善されたバランスを達成するための方法を提供する。
【００２６】
本発明により、１つの方法は、促進拡散により糖を取り込むための新しい能力を第１のレシピエント生物に付与するために、関連する遺伝子（例えば、ｇｌｆまたはｇｌｋまたはそれらの組み合わせ）を天然に含む第２のドナー生物から、該関連遺伝子を天然に含まない該第１のレシピエント生物に、該糖を取り込むための促進拡散システムを遺伝子的に転移することである。好ましい態様において、第１のレシピエントは、該第１のレシピエント株の親または祖先に存在する天然のシステムまたは複数のシステムにより糖を取り込む能力を欠失させるか、または実質的に低減させるように予め操作されているか、または構築されている。このような態様において、得られた株は、該糖上での増殖のために促進拡散を使用するように実質的に強制される。
【００２７】
このましい態様において、第１のレシピエント株は大腸菌株であり、第２のドナー株はザイモモナス・モビリスのＣＰ４株である。より好ましい態様において、該第１の株はＷＧ５３であり、これは、順にｐｔｓＨ、ｐｔｓＩ、およびｇａｌＰの欠失によりＫＪ１２２に由来する。ｐｔｓＨ、ｐｔｓＩ、およびｇａｌＰの欠失の正確な特性は広く変えることができ、およびＧａｌＰタンパク質の活性を排除するか、または実質的に低減させることが唯一の重要な基準である。
【００２８】
本発明の第一のレシピエント生物は多様であってよく、唯一の基準は、それがグルコースなどの糖のための促進拡散に機能するタンパク質を天然に含んでいないことである。大腸菌に加えて、第１のレシピエント生物の例としては、以下が含まれるが、これらに限定されない：グルコノバクター・オキシダンス、グルコノバクター・アサイ、アクロモバクター・デルマーベ、アクロモバクター・ビスコーサス、アクロモバクター・ラクティカム、アグロバクテリウム・ツメファシエンス、アグロバクテリウム・ラジオバクター、アルカリゲネス・フェカリス、アースロバクター・シトレウス、アースロバクター・ツメセンス、アースロバクター・パラフィネウス、アースロバクター・ヒドロカーボグルタミカス、アースロバクター・オキシダンス、オーレオバクテリウム・サペルダエ、アゾトバクター・インディカス、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス、ブレビバクテリウム・ディバリカタム（divaricatum）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム、ブレビバクテリウム・フラバム、ブレビバクテリウム・グロボサム、ブレビバクテリウム・フスカム、ブレビバクテリウム・ケトグルタミカム、ブレビバクテリウム・ヘルコルム、ブレビバクテリウム・プシルム、ブレビバクテリウム・テスタソイム、ブレビバクテリウム・ロゼウム、ブレビバクテリウム・インマリオフィラム、ブレビバクテリウム・リネン、ブレビバクテリウム・プロトファルミエ、コリネバクテリウム・アセトフィラム、コリネバクテリウム・グルタミカム、コリネバクテリウム・カルナエ、コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム、コリネバクテリウム・アセトグルタミカム、エンテロバクター・アエロゲネス、エルウィニア・アミロボーラ、エルビニア・カロトボーラ、エルビニア・ヘルビコーラ、エルウィニア・クリサンテミ、フラボバクテリウム・ペレグリナム、フラボバクテリウム・フカタム、フラボバクテリウム・アウランティナム、フラボバクテリウム・レナヌム、フラボバクテリウム・スワネンセ、フラボバクテリウム・ブレーベ、フラボバクテリウム・メニンゴセプティカム、ミクロコッカス種ＣＣＭ８２５、モルガネラ・モルガニ、ノカルジア・オパカ、ノカルジア・ルゴサ、プラノコッカス・ユーシナタス、プロテウス・レッゲリ、プロピオニバクテリウム・シェルマニ、シュードモナス・シンキサンサ、シュードモナス・アゾトフォルマンス、シュードモナス・フルオレッセンス、シュードモナス・オヴァリス、シュードモナス・スタッツェリ、シュードモナス・アシドボランス、シュードモナス・ムシドレン（mucidolens）、シュードモナス・テストステロニ、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、ロドコッカス・エリスポリ、ロドコッカス・ロドクラウス、ロドコッカス種ＡＴＣＣ １５５９２、ロドコッカス種ＡＴＣＣ １９０７０、スポロサルシナ・ウレアエ、黄色ブドウ球菌、ビブリオ・メチニコフィイ、ビブリオ・チロゲネス、アクチノマヅラ・マヅレ、アクチノマイセス・ビオラセオクロモゲネス、キタサトスポリア・パルロサ、ストレプトマイセス・コエリカラー、ストレプトマイセス・フラベラス、ストレプトマイセス・グリセウス、ストレプトマイセス・リビダンス、ストレプトマイセス・オリバセス、ストレプトマイセス・タナシエンシス、ストレプトマイセス・バージニアエ、ストレプトマイセス・アンチビオチクス、ストレプトマイセス・カカオイ、ストレプトマイセス・ラベンジュレ、ストレプトマイセス・ビリドクロモゲネス、アエロモナス・サルモニシダ、バチルス・プミルス、バチルス・サーキュランス、バチルス・チアミノリチカス、エシェリヒア・フロインディ、ミクロバクテリウム・アンモニアフィルム、セラチア・マルセッセンス、サルモネア・チフィムリウム、サルモネラ・ショットムレリ、枯草菌（Bacillus subtilis）、バチルス・リケニフォルミス、バチルス・アミロリケファシエンス、クレブシエラ・オキシトカ、クレブシエラ・ニューモニエ、アシネトバクター・バイリイ（Acinetobacter baylyi）、コリネバクテリウム・アセトグルタミカム、ブレビバクテリウム・フラバム、マンヘイミア・サクシニシプロデューセンス（Mannhemia succiniproducens）、アネロビオスピリラム・スクシニプロジュセン、およびキサントモナス・シトリ。
【００２９】
第２のドナー生物の例は、糖の天然の促進拡散システムを有する任意の株または種、例えば、ザイモモナス・モビリス株（ＣＰ４株に加えて）、ホモサピエンス、アゾスピリラム・アマゾネンセ、フラボバクテリウム属のＳ８５細菌、サッカロマイセス・セレビシエまたは他の酵母の属である。
【００３０】
別の態様において、第１の親株は、初めに、糖を取り込むのに促進拡散を使用するように構成され、その後、得られた株は、コハク酸などの商業的関心のある化合物を過剰生産するようにさらに操作される。
【００３１】
本発明の新たな面は、非病原性のロバストな糖利用微生物由来のｇｌｆ遺伝子が細菌の染色体中に安定に組み込まれ、そうして新たに構築された細菌は、経済的に実行可能な方法で商業的に実現可能な産物を生産することができることである。グルコースまたは他の糖からの産物の力価、収量および／または比生産性は、親生物のそれらのパラメータよりも大きい。ｇｌｆ遺伝子は、増殖または化合物生産の任意の関連する面と干渉しない染色体中の部位に組み込まれる。酢酸力価は、従来技術例とは異なり、約４５から４８時間の代表的な発酵、その後２日間の発酵サイクル時間で、親株の力価よりも小さい。糖取り込みのための促進拡散を使用する従来技術の株は、経済的に魅力的な所望の生成物の十分な力価を生じなかった。本発明の別の新規な面は、糖取り込みのために促進拡散を用いることにより、望ましくない副生成物酢酸塩または酢酸の生産が顕著に減少したことが予期せず見出されたことである。従来技術のＫＪ１２２株は、典型的な供給グルコース発酵（ＷＯ２０１２／０１８６９９）では約５から７ｇ／ｌの酢酸塩を生産するが、本発明の新規の株は、わずかに約４．２ｇ／ｌまたはそれ以下である。
【００３２】
本発明のさらなる利点は、以下の説明から容易に明らかになり得る。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】図１は、Ｚ．モビリスｇｌｆおよびｇｌｋの発現カセットの源であるプラスミドｐＡＣ１９の構造を示す。
【図２】図２は、ｃａｔ（クロラムフェニコール耐性）およびｓａｃＢ（レバンスクラーゼ）遺伝子を含む、選択用カセットおよび逆選択用カセットの源であるプラスミドｐＡＣ２１の構造を示す。
【図３】図３は、Ｚ．モビリスのｇｌｋ不含有のｇｌｆの発現カセットの源であるプラスミドｐＳＳ２の構造を示す。
【図４】図４は、ｐｆｌＤ遺伝子座での大腸菌ｃｒｒ遺伝子の第２のコピーの統合のための発現カセットの源であるプラスミドｐＭＨ６８の構造を示す。
【００３４】
表１は、７リットルの発酵槽でのＡＣ１５株によるコハク酸の生産を示す。
表２は、５００ｍｌの微好気性発酵槽内でのＡＣ１５株の赤色変異体によるコハク酸の生産を示す。
表３は、５００ｍｌの微好気性発酵槽内でのＳＳ８の２つの単離株によるコハク酸の生産を示す。
表４は、２０リットルの微好気性発酵槽内でのＹＳＳ４１によるコハク酸の生産を示す。
表５は、５００ミリリットル微好気性発酵槽でのＭＨ１４１によるコハク酸の生産を示す。
表６は、大腸菌株ＫＪ１２２およびＹＳＳ４１の両方に最適化された通気条件下での、２０リットルの発酵槽中での両大腸菌によるコハク酸の生産を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
参照態様の詳細な説明
定義。用語“例えば”または“のような（などの）”が用いられるとき、次に記載される用語は、開示されるアイデアや概念のための例示であることを意味する。その後に記載される項目は、アイデアや概念の一般化に該当し得る任意の他の特定のアイテムまたは例示が包含されることを意味するため、所定の例に限定されることを意味しない。任意の所定の化合物について、該化合物の塩を生産するのがより適当であってよく、例えば、コハク酸は、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、アンモニウムなど塩としてｐＨ７付近で生産され得るが、リシンは、塩酸塩、硫酸塩、重炭酸塩などとして生産され得る。このように、本明細書中、化合物が命名されたとき、該化合物の任意の塩が包含されることを意味し、塩が命名されるとき、その遊離酸または遊離塩基も包含されることを意味する。従って、例えば、“コハク酸塩”は、“コハク酸”およびコハク酸塩を包含することを意味し、そして“酢酸塩”は、“酢酸”および酢酸塩を包含することを意味する。
【００３６】
“促進拡散”は、典型的に、生体膜（例えば、グラム陰性細菌の内膜またはグラム陽性細菌の単一の膜）にある内在性膜タンパク質、または生体膜にある２以上のタンパク質分子の複合体を含むシステムの作用を意味し、それは、特に、“基質”（例えば、グルコースおよび／またはフルクトース）と称されるが、一般的に化合物（例えば、水および特定の基質以外の細胞質代謝物）である、１つまたはそれ以上の化合物が、細胞によってシステムに直接提供されるエネルギー（例えば、ＡＴＰまたはＰＥＰの加水分解により提供される）または異なる化合物の勾配（例えば、プロトン勾配）なしに、膜を通過するのを可能にするように機能する。濃度勾配がある場合には、例えば、基質の濃度が細胞内よりも細胞外のほうが高い場合、促進拡散システムが存在しない場合に起こり得るより早い速度で細胞内にその基質の正味の流入があり得る。促進拡散に機能するタンパク質(複数)は、典型的に、１つまたはそれ以上の基質に特異的で、かつ該システムが数ミリモル以下の比較的低濃度で基質が膜を通過するのを補助するのを可能にする結合親和性を有する。促進拡散の種類によっては、ある基質を優先的に区別する膜を通過する孔またはチャネルを形成することにより機能し、また、他方、他の種類では、タンパク質（複数可）は、膜の一方の側の基質に結合し、その後、回転して膜を通過させ、該膜の反対側に基質を放出することができるものもある。促進拡散タンパク質（単に、ファシリテーターと称されることもある）は、そのようなシステムのタンパク質成分である。従って、促進拡散のための熱力学的駆動力は、基質（例えば、糖）が細胞内の低濃度への細胞外の高濃度から流入する、基質濃度の勾配である。本発明者らは、促進拡散タンパク質ならびにグルコースに対する特異性を有するそのようなタンパク質をコード化する遺伝子をそれぞれ意味する、遺伝子記号Ｇｌｆおよびｇｌｆを使用する。本発明者らは、通常、Ｇｌｆは単一のポリペプチド鎖からなると考えるが、Ｇｌｆは、２以上のポリペプチド鎖からなる複合体であってもよい。本明細書に記載されるＧｌｆの特定の例は起源が細菌であるが、本発明者らの定義は、任意の生物由来の促進拡散システムを含むことを意味する。例えば、酵母サッカロマイセス・セレビシエおよび他の酵母が、ＨＸＴ１、ＨＸＴ２、ＨＴＸ３、ＨＴＸ４、ＨＴＸ５、ＨＴＸ６、ＨＴＸ７などと称される、ヘキソース（例えば、グルコースおよびフルクトース）を取り込むための１つまたはそれ以上の促進拡散タンパク質を有し、ヒト赤血球はＧＬＵＴ１と称されるタンパク質によりグルコースを取り込み、排出するために促進拡散を用いることがよく知られている。Ｇｌｆの作用機序は、細孔促進輸送および担体促進輸送を含めて、広く変わることができる。本明細書に記載の特定の例は、グルコースに対して良好な特異性を有するＧｌｆを開示するが、Ｇｌｆタンパク質は、２以上の糖上で作用可能であり、例えば、ザイモモナス・モビリスおよびサッカロマイセス・セレビシエ由来のＧｌｆは、フルクトースならびにグルコース上で作用し得ることが、当技術分野で公知である。
【００３７】
プロトン共輸送は、駆動力としてプロトン勾配を使用する、生体膜を通過して基質を取り込むためのシステムとして定義されている。より高濃度の細胞外プロトンは、細胞内へ拡散復帰する熱力学的傾向を有する。この熱力学的圧力は、糖などの基質を運搬するのに使用される。プロトン共輸送体は、プロトン共輸送を提供するために機能する、タンパク質またはタンパク質の複合体である。プロトン共輸送体の例は、大腸菌のＧａｌＰタンパク質であり、それは、ガラクトース、グルコース、および他の糖類の取り込みに機能することがよく知られている。
【００３８】
グルコキナーゼおよびフルクトキナーゼは、グルコース、フルクトース、または他の糖を、通常６位の炭素の位置でリン酸化を触媒する酵素であるが、１位の炭素または別の位置でも可能である。本発明者等は、グルコキナーゼおよびグルコキナーゼをコードする遺伝子をそれぞれ表すために遺伝子記号Ｇｌｋおよびｇｌｋを用いる。Ｆｒｋおよびｆｒｋは、フルクトキナーゼおよびフルクトキナーゼをコードする遺伝子をそれぞれ意味する。
【００３９】
ｃｒｒ遺伝子は、大腸菌株のｃｒｒ遺伝子またはバチルス・サブチリス株のｃｒｒ遺伝子またはかかるｃｒｒ遺伝子のホモログなどの、ＰＴＳのＥＩＩＡｇｌｃ成分をコードする遺伝子である。
【００４０】
ＰＴＳ（ホスホトランスフェラーゼシステム）は、リン酸源およびエネルギー源としてＰＥＰを用いて、細胞質内に糖を輸送し、同時に該糖をリン酸化するために共に作用するタンパク質群である。大腸菌由来のＰＴＳタンパク質をコードする遺伝子の例には、ｐｔｓＨ、ｐｔｓＩ、ｃｒｒ、ｐｔｓＧ、ｆｒｕＡ、ｆｒｕＢ、ｍａｎＸ、ｍａｎＹおよびｍａｎＺが含まれる。対応するタンパク質は、ＰｔｓＨ、ＰｔｓＩ、Ｃｒｒ、ＰｔｓＧ、ＦｒｕＡ、ＦｒｕＢ、ＭａｎＸ、ＭａｎＹおよびＭａｎＺと命名される。しかしながら、大腸菌および他の原核生物由来のより多くの例があり、これらのタンパク質は、別名を有していてよく、例えば、Ｃｒｒは、ＥＩＩＡｇｌｃと称されることも多い。ＰＴＳタンパク質のいくつかは、他の糖類よりも１つまたはそれ以上の特定の糖類により特異的であるが、いくつかのＰＴＳタンパク質、例えば、大腸菌由来のＰｔｓＨおよびＰｔｓＩは、多くの異なる糖類に汎用的に使用される。
【００４１】
本明細書中、用語“微好気性”は、空気の供給量が、１分当たりの液体培養物の体積当たり、０．１未満の空気量であることを意味する。本明細書に記載の７および２０リットルの発酵槽の例では、スパージャおよび流量計を用いて達成されるか、または任意の強制的な空気の流れなしでタンクの上部に取り付けられた滅菌膜を通して呼吸することを可能にするタンクにより達成される。本明細書に記載の５００ｍｌの発酵タンクの例では、空気を意図的に導入していないが、少量の空気が、漏れ、塩基溶液の供給、および試料の採取により導入される。
【００４２】
“最少培地”は、水、純粋な炭素源（例えば、実質的に純粋な糖または実質的に純粋な糖類の混合物）、無機塩類（例えば、炭酸塩、リン酸塩、硫酸塩および塩酸塩に加えて、カリウム塩、ナトリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、重炭酸塩）、アンモニウムもしくはウレアなどの純粋な窒素源、微量金属（鉄、銅、亜鉛、マンガン、コバルト、モリブデン、および必要に応じてホウ酸塩）、任意のグリシンベタイン（単にベタインとしても公知）、および必要に応じて消泡剤からなる微生物増殖培地である。最少培地は、酵母抽出物、コーンスティープリカー、大豆加水分解物、肉汁、カゼイン加水分解物、穀物、マメ科植物、または典型的に、物理的もしくは化学的精製もしくは分離工程を行うことなく農業供給源に由来し得る何らかの他の“定義されていない”栄養素の混合物などの任意の複合栄養源（“富”栄養源としても公知）を含まない。サトウキビ、コーンデンプン、モロコシデンプン、タピオカデンプン由来の適当に精製された糖類、または何れか他の適当に精製されたデンプン源は、最少培地に許容されると考えられている。最少培地は、特定の増殖要件（栄養要求性または栄養緩慢性（bradytrophy））を満たすためまたは生化学的経路を強化するために、１つまたはいくつかの純粋な化合物を含んでいてよい。例えば、ある株は、ビオチン等のビタミンを必要とし、それは、このようなプロセスに顕著な負の影響を与えることなく、低濃度で添加されてよい。別の例としては、チアミンなどのビタミンの添加は、増殖に絶対的に必要とされる訳ではないが、それでも、増殖または生化学的経路を増強し得る。最少培地は、構成要素が比較的低コストで、かつ所望の化合物の後段での精製のためのより有利な経済性を可能にするクリアな発酵ブロスを生じるため、多くの化合物の発酵生産に好まれる。エタノール生産は、下流精製を、複雑な媒体からでさえ、所望の生成物を精製するための経済的に魅力的な方法である蒸留を用いて達成することができるので例外である。
【００４３】
芳香族化合物とは、以下の１つまたはそれ以上を意味する。フェニルアラニン、チロシン、もしくはトリプトファン、またはそれらの誘導体（例えば、Ｌ−ジヒドロキシフェニルアラニン、メラトニン、インドール、インドール酢酸、インジゴ、セロトニン、桂皮酸、ヒドロキシスチレン）、ビタミンまたは芳香族部分を含むビタミン様化合物（例えば、ｐ−ヒドロキシ安息香酸、２，３−ジヒドロキシ安息香酸、ｐ−アミノ安息香酸、葉酸、トコフェロール、ピロロキノリンキノン）。
【００４４】
第１の遺伝子またはタンパク質のホモログは、第２のタンパク質または第２の遺伝子から翻訳されると推定されるタンパク質が、第１のタンパク質または第１の遺伝子から翻訳されると推定されるタンパク質と同一または類似の生化学的機能を有し、そして、第１および第２のタンパク質または第１および第２の推定翻訳タンパク質のアライメントが、ＢＬＡＳＴなどの公に利用可能なコンピュータアラインメントプログラムのデフォルトパラメータを使用する場合、少なくとも５０アミノ酸長の領域で２５％以上の同一性または類似性を有する、第２の遺伝子またはタンパク質と定義される。
【００４５】
変異は、関連する野生型または天然の遺伝子のＤＮＡ配列に対するＤＮＡ配列における何らかの変化である。変異は、中途の停止コドンまたはその位置の野生型アミノ酸とは異なるアミノ酸を導入する、単一塩基または複数塩基の変化であり得る。変異は、野生型タンパク質とは顕著に異なるタンパク質を生じるフレームシフトを形成する１つまたはそれ以上の塩基の挿入または欠失であり得る。変異は、多くの、ほとんどの、または全てのコーディング領域（オープンリーディングフレームまたはｏｒｆとしても公知）を取り除く欠失であり得る。変異の１つのタイプは、１つ以上の全体のｏｒｆに加えて、さらに該コーディング領域の上流もしくは下流または両方の非コーディングＤＮＡの除去である。変異は、比較的大きなＤＮＡ配列（約１００塩基以上）の挿入、例えば、挿入エレメント（例えば、ＩＳ１８６またはＩＳ４）またはトランスポゾン（例えば、Ｔｎ１０）の挿入に起因し得る。機能を除去することが目的であるとき、好ましい変異は、ｏｒｆの全てまたは大部分の欠失であるが、単一塩基の変化または挿入のようなより小さな変異は、多くの場合、全ての実用的な目的のために機能の排除を達成することができる。複数の変異が、自然発生的に、変異によって誘発されるか、または遺伝子工学的に構築され得る。株の改善を達成するために望ましいとき、ＰＴＳの特定の要素などの、いくつかの変異は、生物学的機能を低減または排除する変異である。しかしながら、株の改善を達成するために望ましいとき、いくつかの変異は、生物学的機能を増大させる変異であり、例えば、“プロモーターアップ変異（promoter up mutation）”は、ｇｌｆ遺伝子などの所望の遺伝子の発現を増加させることができる。
【００４６】
“外来の”は、第一の属に組み込まれた第二の属（ここで、該第二の属は、該第一の属とは異なる）に由来する遺伝子またはタンパク質を意味する。
【００４７】
遺伝子は、タンパク質または酵素をコード化する染色体の領域として定義され、該タンパク質または酵素に対応するオープンリーディングフレームと、タンパク質または酵素の生産レベルまたは生産速度の制御に寄与するオープンリーディングフレームを取り囲むＤＮＡ配列、例えばプロモーター、リボソーム結合部位、オペレーター、調節タンパク質結合部位、５’非翻訳ｍＲＮＡリーダー配列に対応するＤＮＡ、ターミネーター、およびアンチターミネーター部位の両方を含むことを意味する。タンパク質のコーディングＤＮＡ配列に対応する２つ以上のオープンリーディングフレームが、単一のプロモーターおよび単一のターミネーターの制御下にあるとき、プロモーター、タンパク質コーディングＤＮＡ配列に対応するオープンリーディングフレームおよびターミネーターを含む全領域は、オペロンと呼ばれる。例えば、外来遺伝子ｇｌｆおよびｇｌｋが単一のプロモーターおよび単一のターミネーターの制御下にあるとき、それは、ｇｌｆ−ｇｌｋオペロンと呼ばれる。
【００４８】
本発明は、炭素源として糖を含む最少培地を用いる、高力価、収量および生産性のコハク酸産生のための生体触媒を提供する。用語“収量”は、本発明で定義される通り、消費される糖（例えば、グルコースまたはスクロース）１グラム当たり、生産される生成物（例えば、コハク酸）のグラム数を意味する。用語“生産性”とは、本発明で定義される通り、１時間当たりの培養物１リットル当たりの、生産された生成物（例えば、コハク酸）のグラム数を意味する。用語“力価”は、１リットル当たりのグラム数での、発酵ブロス中の生成物（例えば、コハク酸）の濃度として定義される。コハク酸の望ましい収量は、消費される糖１グラム当たり、生産されるコハク酸０．８−１．２グラムの範囲である。本発明においてコハク酸の所望の生産性は、１時間当たり１リットル当たり、生産されるコハク酸が１グラム以上の範囲である。コハク酸の所望の力価は、４８時間以下の発酵時間で、２６ｇ／ｌ以上、またはより好ましくは６４ｇ／ｌ以上、最も好ましくは８３ｇ／ｌ以上である。
【００４９】
細菌の増殖速度は、細菌の増殖から得られる液体培養物の５５０または６００ナノメートルでの光学密度の増加率で測定される。細菌の増殖速度は、細菌細胞の倍増に必要な時間としても表される。本発明に適する細菌細胞において、細菌細胞は、２０分から３時間の倍加時間を有することが期待される。
【００５０】
本発明により、コハク酸生産のための生体触媒は、２つの異なる経路で製造され得る。第一の方法では、野生型の細菌種を遺伝子的に操作して、要すれば、進化させて、グルコースまたは他の糖の取り込みのために促進拡散を用いて効率的に増殖させる。一旦、そのような株が構築されると、その後の遺伝子操作が、例えば、以下の当技術分野で公知の方法により、代謝経路に行われて、高力価、収量および生産性でコハク酸または別の化合物を生産する細菌株が得られる。
【００５１】
国際公開番号第ＷＯ２０１０／１１５０６７号および米国特許出願公開第ＵＳ２０１００１８４１７１号にて公開された特許出願は、改善されたコハク酸生産能力を有する大腸菌株を製造するのに有用な遺伝子工学的手法についての詳細を提供する。これらの２つの特許出願は、引用により本明細書中に包含される。
【００５２】
第二の方法では、米国特許出願公開第ＵＳ２０１００１８４１７１号および国際公開番号第ＷＯ２０１０／１１５０６７に記載の通り、コハク酸などの化合物について商業的に魅力的な収量および生産性を有するように既に開発された細菌株が、親株として使用される。その後、さらなる遺伝子操作、および要すれば、進化をこの株に行い、商業的に魅力的な力価、収量および生産性でコハク酸を生産するために、グルコースまたは別の糖を取り込むための促進拡散を用いる能力を有する細菌株を得る。
【００５３】
具体的な例としては、本発明は、促進拡散により糖を取り込む新しい能力を獲得しながら、十分に高い力価、収量および生産性でコハク酸を産生する従来技術のものよりも改善された能力を有する生体触媒および方法を開示する。例えば、Jantamaらにより開示される大腸菌ＫＪ１２２株は、本発明の出発株として選択され得る。大腸菌ＫＪ１２２株は、高い力価および生産性で最少培地中でコハク酸を生産する能力を有することが報告されている。
【００５４】
大腸菌のＫＪ１２２株は、米国特許出願公開第２０１００１８４１７１号および国際公開番号第ＷＯ２０１０／１１５０６７号に記載の通り、大腸菌Ｃ株から遺伝子欠失および代謝的進化によって誘導された。大腸菌ＫＪ１２２株の開発に至る遺伝子変化についての詳細を提供するこれらの２つの特許出願公開文献は、引用により本明細書中に包含される。ＫＪ１２２は、コハク酸の生産において促進拡散によって炭素源としてグルコースを取り込む実質的な能力を有しない。ＫＪ１２２におけるこの機能の欠如は、Ｇｌｆタンパク質をコードする遺伝子の欠失に起因する。本発明者らは、ＫＪ１２２が、最少培地中で、高力価、収量および生産性でコハク酸を生産する元々の能力を保持または改善しながら、より効率的に炭水化物源としてグルコースを使用するのを可能にする遺伝的アプローチを発見した。
【００５５】
本発明で用いる用語“炭水化物”には、グルコース、フルクトース、キシロースおよびアラビノースなどの単糖類、スクロース、メリビオース、マルトースおよびラクトースなどの二糖類、ラフィノースおよびマルトトリオースなどの三糖類、ならびに高級少糖類、ならびにデンプンなどの多糖類の酵素的または化学的消化による加水分解物、セルロース、ならびにバイオマスが含まれる。例えば、グルコース、フルクトース、スクロース、マルトースなどの、１〜３個の糖単位の単純炭水化物は、本明細書中、“糖類”と称される。
【００５６】
用語“ＰＴＳ＋生物”または“ＰＴＳ＋細菌”は、ＰＴＳに基づく炭水化物の輸送のための能力を有する細菌を意味する。用語“非ＰＴＳ生物”または“非ＰＴＳ細菌”または“ＰＴＳ−細菌”は、そのＰＴＳの活性が野生型ＰＴＳの活性と比較して低減するように、ＰＴＳ機能をコード化する１つまたはそれ以上の遺伝子において変異を有する細菌細胞を意味する。
【００５７】
一面において、本発明は、糖の取り込み、および細胞によってさらに代謝され得る、グルコース−６−ホスフェート、グルコース−１−ホスフェート、フルクトース−６−ホスフェートまたはフルクトース−１−ホスフェートなどの代謝中間体への糖の変換に関与する１以上のタンパク質および／または酵素の活性を付与または増大させるために、生物に遺伝子を添加することを記載している。関連するタンパク質または酵素をコード化する遺伝子は、ｇｌｆ遺伝子、ＨＸＴ遺伝子、ｇｌｋ遺伝子およびｆｒｋ遺伝子からなる群から選択される。
【００５８】
別の態様において、本発明は、再生可能な原料としてグルコースのような糖を取り込むために促進拡散を用いてコハク酸または別の化合物を生産するための方法を提供する。一面において、本発明は、祖先株または親株と比較して、該生物の天然のＰＴＳシステムの少なくとも１つのタンパク質における低減された活性を有する生体触媒を用いる、糖含有培地からのコハク酸の生産方法を提供する。別の面において、本発明は、ＧａｌＰのようなタンパク質共輸送システムの使用を含む祖先株または親株と比較して、該生物の天然の糖輸送システムの少なくとも１つのタンパク質における低減された活性を有する生体触媒を用いる、糖含有培地においてコハク酸または別の化合物を生産する方法を提供する。
【００５９】
本発明は、ＰＴＳおよびその後の細菌の炭水化物取り込みシステムを操作するための方法を提供する。ＥＩおよびＨＰｒタンパク質は、ＰＴＳシステムの“一般的”または“共通の”要素として機能するため、ＥＩタンパク質をコード化するｐｔｓＩ遺伝子またはＨＰｒタンパク質をコード化するｐｔｓＨ遺伝子の何れかの不活性化は、ＰＴＳの完全な不活性化をもたらし得る。ｐｔｓＨまたはｐｔｓＩまたは両方の活性が低減または削除されている細菌細胞において、ＰＴＳシステムを介する実質的に低い炭水化物輸送が存在し得る。ＰＴＳが部分的または完全に不活性化されるとき、細菌細胞は、炭水化物輸送のための１つ以上の他の代替パーミアーゼシステムに依存しなければならない。
【００６０】
ＰＴＳを介する能動グルコース輸送がある場合、ＥＩＩＡＧｌｃは、そのリン酸基を受け入れる炭水化物基質があるので、非リン酸型のままである。しかしながら、培地にグルコースが存在しない場合、ＥＩＩＡＧｌｃのリン酸化型は、そのリン酸基をグルコースに転移することができず、従って、そのリン酸化状態のままである。非リン酸化型ＥＩＩＡＧｌｃは、炭素異化代謝産物抑制（ＣＣＲ）として一般的に公知の現象を仲介する。ＣＣＲ下、グルコースが増殖培地中に存在するとき、培地中の他の炭水化物の輸送および／または使用は、培地中のグルコースが低濃度に減少するまで阻止される。炭素異化代謝産物抑制は、炭素源を利用するパーミアーゼシステムまたは他のシステムでの非リン酸化型ＥＩＩＡＧｌｃの阻害効果からもたらされる。例えば、ＬａｃＹまたはラクトースパーミアーゼなどの、炭水化物輸送に関与する多数のパーミアーゼが、非リン酸化型ＥＩＩＡＧｌｃにより阻害されることが知られている。加えて、非リン酸化型ＥＩＩＡＧｌｃは、アデニレートシクラーゼシステムへの影響を介して炭水化物の輸送および代謝に関与する多くの遺伝子の転写に負の効果を有することが知られている。
【００６１】
良好なコハク酸産生株であるＫＪ１２２株は、ｐｔｓＩ遺伝子におけるフレームシフト変異を含み、この変異は、良好なコハク酸生産のために重要である。従って、コハク酸生産のさらなる改善が、ｐｔｓＨＩおよびｇａｌＰを欠失させ、次いで促進拡散システムを付与することによって可能であることは、本発明の流れにおいて驚くべきことであった。
【００６２】
別の態様において、本発明は、ＥＩＩＡＧｌｃタンパク質をコード化するｃｒｒ遺伝子の天然に存在しない重複を提供する。本発明者らは、ｐｔｓＨＩの欠失、ｇａｌＰの変異、および機能的ｇｌｆ遺伝子の付加を含む株が、ＥＩＩＡＧｌｃタンパク質の機能の低下または排除、その後の、コハク酸生産パラメータの予想外の望ましくない減少を引き起こす、ｃｒｒ遺伝子における変異を獲得する予期しない傾向を有することを見出した。天然のｃｒｒ遺伝子座から離れた遺伝子座でのｃｒｒの第二のコピーを組み込むことによるｃｒｒ遺伝子の重複は、表現型としてｃｒｒネガティブとなる変異の頻度を大幅に減らすことによってこの問題を解決する。
【００６３】
本発明を以下に詳細に説明する。本発明のエシェリヒア属に属する細菌の例は、最初は、糖取り込みのために促進拡散を利用し得ないが、本明細書に記載の遺伝子操作後にｇｌｆ遺伝子を有し、要すれば外来のｇｌｋ遺伝子を有し、そしてグルコースおよびフルクトースの取り込みに促進拡散を利用する能力を有する、親株から構築されている株である。
【００６４】
細胞に導入される外来遺伝子は、細胞内で自己複製プラスミド上に維持され得る。プラスミドは、抗生物質選択性または染色体変異の相補化（complementation）によって維持され得る。しかしながら、外来遺伝子が細胞内で自己複製プラスミド上の生体触媒内に維持されるとき、増殖の阻害に繋がるエネルギーおよび物質の不必要な無駄がなく、そして生体触媒を用いて生産される有機物質の収量または生産性の低下がないことが保証される必要がある。好ましくは、外来遺伝子は、細胞内でプラスミドを維持するために抗生物質を添加する必要がなく、かつプラスミドを維持するために細胞にほとんどまたは全く代謝負荷がないように、宿主染色体に組み込まれている。外来遺伝子の挿入が可能な遺伝子座が細胞内に多数存在する。大腸菌の染色体ＤＮＡ内への外来遺伝子の挿入に好ましい遺伝子座には、商業的発酵条件下で増殖および生成物生産のために必須の機能をコードしない領域が含まれる。
【００６５】
外来遺伝子がオペロンとして得られるとき、任意の予想される負の調節遺伝子またはタンパク質をオペロンから除去することが好ましい。促進拡散および代謝に積極的に機能する遺伝子およびタンパク質のみを有することが理想である。従って、促進拡散遺伝子の発現は、好ましくは、リプレッサーまたは異化代謝産物抑制によって阻止されない。
【実施例】
【００６６】
以下の実施例は、本発明を説明することを目的として提供され、限定するものではない。
【００６７】
糖取り込みのための促進拡散システムを天然で使用しない細菌は何れも、本発明により改良され得る。
【００６８】
本発明の細菌は、ＫＪ１２２のようなコハク酸生産株または所望の化合物を生産するように以前に操作された他の株に、促進拡散の利用を可能にする１つまたはそれ以上の遺伝子を挿入することにより得られる。あるいは、本発明の細菌は、遺伝子操作によって、要すれば、進化によって、促進拡散の利用が既に可能となっている細菌に、コハク酸または他の所望の化合物を生産する能力を付与することにより得ることができる。後者の代替法は、例えば、ＡＴＣＣ８７３９株から出発する代わりに、ＡＴＣＣ９６３７株もしくはＫ−１２タイプの大腸菌株、または任意の他の安全な大腸菌株から出発する以外は、ＫＪ１２２の構築に用いる全ての工程に従って、達成することができる。
【００６９】
実施例１
ザイモモナス・モビリスＣＰ４由来の遺伝子群からのｇｌｆおよびｇｌｋ遺伝子を含むＫＪ１２２の誘導体であるＡＣ１５のコンストラクション
ＤＮＡおよびプラスミド、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、形質転換、ならびに染色体挿入の全ての操作を、当技術分野で周知の標準的方法により実行した。ＤＮＡ配列をクローニングし、天然で容易に見出されない新しい組み合わせを形成するために、それらの配列を相互に連結し得ることがよく知られている。制限酵素およびＤＮＡリガーゼを用いる従来法に加えて、酵母リコンビニアリング技術を用いる新規方法、所謂、インビトロでのＤＮＡスプライシング法である“ギブソン法”または他の任意の適当な方法が、かかる新規のＤＮＡ配列を構築するために使用可能である。必要とされるＤＮＡ断片は、クローンのライブラリーから、または適当なテンプレートＤＮＡからのＰＣＲにより入手可能である。多くの所望のＤＮＡ配列を設計することができ、化学前駆体から合成可能であることもまた理解される。このようなサービスは、多くの企業、例えば、ＤＮＡ２．０およびＧｅｎｅＡｒｔ（Invitrogen）により、供給されている。
【００７０】
プラスミドｐＡＣ１９を、枯草菌ファージＳＰ０１由来のＰ２６プロモーターによって駆動される、Ｚ．モビリス由来のｇｌｆおよびｇｌｋ遺伝子を含む人工オペロンを含むように構築した。このオペロンは、遺伝子操作される株のｔｄｃＣＤＥ遺伝子座への挿入を促進するために、大腸菌ＣのｔｄｃＣ遺伝子に相同性の上流配列と、大腸菌ＣのｔｄｃＥ遺伝子に相同性の下流配列との間に組み込まれた。上記のカセットは、ｐＳＣ１０１  複製起点およびスペクチノマイシン耐性遺伝子を含む、ｐＣＬ１９２１に由来するローコピープラスミドベクター上に担持される。該カセットの構成要素は、Sigma社およびIntegrated DNA Technologies (IDT)社のような商業的供給者から得られる適当な合成ＤＮＡプライマーを用いるＰＣＲにより得られた。ザイモモナス遺伝子の供給源は、所望のｇｌｆおよびｇｌｋ遺伝子に加えて、ｚｗｆおよびｅｄｄ遺伝子を元々含む、ｐＬＯＩ１７４０である。ｇｌｆ、ｚｗｆ、ｅｄｄ、ｇｌｋ遺伝子群をｐＣＬ１９２１に転移させ、その後、不要なｚｗｆおよびｅｄｄ遺伝子を、インサイドアウトＰＣＲにより欠失させた。上流および下流のｔｄｃ配列は、テンプレートとしてＫＪ１２２染色体ＤＮＡからＰＣＲによって得た。Ｐ２６プロモーターは、バクテリオファージＳＰ０１から得た。ｐＡＣ１９の配列を配列番号１に示す。
【００７１】
全てのコンストラクションは、抗生物質またはスクロースを適宜添加したＬＢ培地（１０グラムのバクト−トリプトン、５グラムのバクト−酵母抽出物、および５グラムの塩化ナトリウム）上で株を増殖させながら行われた。ＡＣ１５株を構築するために、ｐＡＣ１９の人工オペロンを含むカセットを、既報の２工程の遺伝子組換え法を用いて、ＷＧ５３株の染色体に挿入した。第一工程のｃａｔ、ｓａｃＢカセットは、配列番号２のプラスミドｐＡＣ２１上に含まれた。ｐＡＣ２１は、人工オペロンが、クロラムフェニコール耐性遺伝子およびレバンスクラーゼをコード化する対選択可能な（counterselectable）ｓａｃＢ遺伝子を含むｃａｔ、ｓａｃＢカセットで置き換えられていること以外、ｐＡＣ１９と同様である。形質転換ＤＮＡは、第一工程についてｐＡＣ２１からのＰＣＲにより、第二工程についてｐＡＣ１９からのＰＣＲにより得られた。
【００７２】
ＷＧ５３株は、上記と同様の２工程遺伝子組換え法を用いて、コハク酸を生産するＫＪ１２２株からｐｔｓＨ、ｐｔｓＩおよびｇａｌＰ遺伝子を欠失させることにより得た。ｐｔｓＨＩ欠失を含むＤＮＡ配列を、配列番号３に示す。この欠失はｃｒｒ遺伝子、ならびにｐｔｓＨ遺伝子の上流に天然に存在する天然のプロモーターをそのまま残すことが特記される。ｇａｌＰ欠失を含むＤＮＡ配列を、配列番号４に示す。
【００７３】
中間体株ＷＧ５３が、グルコース最少培地上で極めて不十分に増殖している間、ＫＪ１２２株およびＡＣ１５株は、グルコース最少培地上でよく増殖し、１）ｐｔｓＨＩおよびｇａｌＰ遺伝子がＷＧ５３において成功裏に欠失されたこと、および２）ｇｌｆ、ｇｌｋカセットが、ＡＣ１５において、グルコースを取り込むことが可能になるよう機能することが実証された。
【００７４】
実施例２
ＡＣ１５株ならびに親株ＫＪ１２２は、コハク酸を生産する
ＫＪ１２２株およびＡＣ１５株を、グルコース供給バッチシステムを含む最少培地を用いて、３９℃にて、７リットルの発酵槽中、微好気性条件下で増殖させた。３リットルの開始容量は、第一リン酸カリウム（１８ｍＭ）、硫酸マグネシウム（２ｍＭ）、ベタイン（１．３３ｍＭ）、微量必須元素、消泡剤２０４（８ｐｐｍ）および２５ｇ／ｌのグルコースを含んだ。ｐＨを最初にｐＨ７．０に調整し、その後、ｐＨ６．５で維持して、下記の水酸化アンモニウム／重炭酸アンモニウム溶液の添加により酸が生じた。１５０ｍｌの接種材料(inocula)を、グルコースが２０ｇ／ｌであり、塩化カルシウムが０．１ｍＭの終濃度で添加されること以外、好気的に、かつ上記の培地と同様の最少培地を含んで増殖させた。撹拌を７５０ＲＰＭ（毎分当たりの回転数）に設定した。グルコースを５ｇ／ｌに低減したとき、６５０ｇ／ｌのグルコース供給を開始し、グルコース濃度を約５ｇ／ｌ以下に維持することを目的とした速度で維持した。中和に使用されるストック溶液は、水酸化アンモニウムおよび重炭酸アンモニウムの両方を含んでいた（７Ｎ  ＮＨ４ＯＨおよび３Ｍ  ＮＨ４ＨＣＯ３）。ＡＣ１５を３５ｍｌ／分で通気し、一方、ＫＪ１２２は、通気性の滅菌膜フィルターを通して周囲空気で平衡化されたヘッドスペースに存在した空気以外の空気を提供されなかった。これらは、それぞれの株にうまく機能することが示されていた条件であった。４８時間のサンプルからの糖、コハク酸および副生成物を、ＨＰＬＣによりアッセイした。平均化複製の結果を表１に示す。ＡＣ１５は、親株ＫＪ１２２とほぼ同じ力価で生産するが、酢酸副生成物は顕著に低く、グルコース収量はＡＣ１５より高かった。
【００７５】
実施例３
ＡＣ１５由来の自発的な“赤色変異体”
ＫＪ１２２は、ＭａｃＣｏｎｋｅｙ ラクトースプレート（Beckton−Dickinson, Franklin Lakes, NJ）上の赤色コロニーの形成により証明される通り、ラクトースを発酵することができる。しかしながら、ＡＣ１５は、ＭａｃＣｏｎｋｅｙ ラクトースプレート上で“白色”（ベージュ）コロニーを生じることにより証明されるとおり、ラクトースを発酵しない。ＡＣ１５のこの白色コロニー表現型は、非リン酸化型ＥＩＩＡＧｌｃタンパク質の結合およびそれによるラクトースパーミアーゼ（ＬａｃＹ）の阻害の結果である。この白色コロニー表現型は、ＥＩＩＡＧｌｃをリン酸化するのに必要な酵素が存在しないため、ｐｔｓＨＩを欠く全ての株に存在し、その結果として、細胞内に存在する全てのＥＩＩＡＧｌｃは、非リン酸化型のままである。従って、意外にも、大腸菌ｐｔｓＨＩ変異体は、ラクトースが大腸菌におけるＰＴＳシステムにより取り込まれていなくても、表現型Ｌａｃ−である。
【００７６】
本発明者等は、ＭａｃＣｏｎｋｅｙラクトースプレートにＡＣ１５を植菌し、３７℃で一晩インキュベートし、その後、室温（約２２℃）でさらに１日置いたとき、植菌した密度の高い部分上に増殖した白色コロニーの層から多数の赤色コロニーが発生したことを、偶然見出した。赤色コロニーのいくつかを再植菌することにより、赤色コロニーの２つのクラスが進化したことが明らかになった。本発明者等は、第一のクラスを、個々のコロニーが、コロニー全体にひろがる赤一色であったため、“solid red”クラスと称した。第二のクラスを、個々のコロニーが、中央が赤く、コロニーの外側が白色またはベージュであったため、“fried egg red”型と呼ぶことにした。本発明者等は、ＭａｃＣｏｎｋｅｙラクトース上の赤色コロニーの全てのタイプを生じさせる株を総称して“赤色変異体”と呼ぶことにした。
【００７７】
ＡＣ１５の白色コロニー、ならびにＡＣ１５−Ｒ１、−Ｒ２、−Ｒ３および−Ｒ４と称する４つの赤色変異体（それらのうち２つは、solid redクラスであり、残り２つはfried egg redクラスである）を、最少培地の開始容量が２００ｍｌであり、グルコースを１００ｇ／ｌの開始培地中で全てバッチ処理し、グルコースの供給はなく、撹拌を磁気撹拌棒を用いて３５０ＲＰＭで行い、そして空気の意図的な導入または除去をしないことが異なる以外は、上記の７リットルの発酵槽で用いた培地および方法と同様の培地および方法を用いて、５００ｍｌの微好気性発酵槽（Fleakers, Corning Glass, Corning, NY）中でコハク酸生産について試験した。結果を表２に示す。２つのfried egg redクラスの変異体は親ＡＣ１５と同様の性能を示したが、２つのsolid redクラスの変異体は親ＡＣ１５よりも顕著に性能が悪かった。
【００７８】
親ＡＣ１５および該４つの赤色変異体のゲノムシーケンシングをＩｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ２０００システムを用いて行い、両solid redクラスの変異体が１つの変異をそれぞれ獲得しており、これらの変異の両方が、ＥＩＩＡＧｌｃをコード化するｃｒｒ遺伝子内にあることが明らかとなった。両者はヌル変異であると判断された。両fried egg redクラスの変異体が１つの変異をそれぞれ獲得し、これらの変異の両方が、ラクトースオペロン内にあった。これらの両方は、ラクトースオペロンのより高い発現レベルをもたらし得る変異であると判断された（１つは、ｌａｃＯオペレーター内の変異であり、もう１つは、Ｌａｃリプレッサーをコードする遺伝子であるｌａｃＩにフレームシフトを起こさせた）。４つ全ての変異が、ラクトースを発酵させる増加した能力の観察された表現型を説明することができる意味を成していた。ｃｒｒヌル変異は、ＬａｃＹパーミアーゼの阻害を緩和し得ると予想され、一方、ラクトースオペロン変異は、ＬａｃＹを過剰生産し、阻害から少なくとも逃れるのを可能にすると予期される。しかしながら、ｃｒｒヌル変異は明らかにさらなる多面的効果を有し、本発明の発酵条件下でコハク酸を生産する細胞の能力の低下を引き起こした。このことは予期されなかった予想外の効果であった。
【００７９】
実施例４
ザイモモナス・モビリスｇｌｋ遺伝子は、大腸菌におけるｇｌｆ遺伝子の機能に必須ではない
プラスミドｐＳＳ２を、ｐＡＣ１９について上記の方法と同様の方法を用いて構築した。ｐＳＳ２とｐＡＣ１９との違いは、Ｚ．モビリスｇｌｋ遺伝子が人工オペロンから欠失されていることだけである。他の面において、例えばベクター骨格、ｇｌｆのプロモーター駆動発現、人工オペロンのｔｄｃ隣接配列への組み込み、および種々の構成要素の配向において、ｐＳＳ２はｐＡＣ１９と同様である。ｐＳＳ２のＤＮＡ配列を配列番号５として示す。
【００８０】
ｐＳＳ２由来の人工オペロンを、ｐＡＣ１９由来のオペロンについて上記の通り、２工程遺伝子組換え法を用いてＫＪ１２２のｔｄｃ遺伝子座に挿入した。互いに恐らく同一である２つの単離体を、ＳＳ８−９およびＳＳ８−１１と命名した。これらの２つの新規株を、実施例３に記載の５００ｍｌの微好気性発酵槽におけるＡＣ１５と比較した。４８時間後にアッセイした発酵槽の倍加平均の結果を表３に示す。ＳＳ８−９およびＳＳ８−１１の両方とも、ＡＣ１５のそれと同様の増殖およびコハク酸力価を生じ、一方、両ＳＳ８単離体の酢酸生産は、ＡＣ１５のそれよりもやや低かった。従って、Ｚ．モビリスｇｌｋ遺伝子は、本文脈においてｇｌｆ遺伝子の機能に不必要であり、Ｚ．モビリスｇｌｋ遺伝子は、発酵パラメータに若干有害である可能性がある。恐らく、ＳＳ８単離体は、グルコースをリン酸化するために大腸菌の内在性ｇｌｋ遺伝子を使用している。
【００８１】
実施例５
ＡＣ１５株の代謝的進化
実施例３に上記の通り、ＡＣ１５株は、７リットルの発酵槽中、親ＫＪ１２２よりも高い通気性レベルを確保することが好ましかった。より少ない空気で増殖できるＡＣ１５の誘導体を得るために、ＡＣ１５を、５００ｍｌの発酵槽中、開始容量２００ｍｌで、意図的に通気することなく、代謝的進化を行った。条件は、酸素を除去しなかったため、微好気性であった。少量の空気が進化の過程で発酵容器に漏れると仮定した。増殖条件は実施例３に記載のとおりである。増殖の４８時間後、培養物を、２００ｍｌの新鮮な培地を含む新鮮な発酵槽中で１：１００に希釈し、その後、この工程を４０回繰り返した。これらの新鮮な培地への接種のそれぞれを、“転移（transfer）”と呼ぶことにする。従って、株を、新鮮な培地に計４１回移した。各転移は、細胞分裂の約７世代に相当する。最後の転移からの培養液のサンプルをＭａｃＣｏｎｋｅｙラクトース寒天ペトリ皿に植菌し、単一の白色コロニーを選択し、ＹＳＳ４１と命名した。
【００８２】
７リットルの発酵槽で通気量を変化させることにより、ＹＳＳ４１が、５ｍｌ／分の通気で良好なコハク酸生産を行うことが分かり、これは、親ＡＣ１５株の最適な性能に必要な３５ｍｌ／分よりも実質的に少ない。５ｍｌ／分の空気流量で、ＹＳＳ４１は、９４ｇ／ｌのコハク酸および１．３ｇ／ｌの酢酸を生産し、コハク酸収量については、７リットルの発酵槽中、４８時間で、０．９５ｇ／ｇのグルコース収量であった。
【００８３】
ＹＳＳ４１を、２０リットルの発酵槽内のコハク酸生産についてＫＪ１２２と比較した。発酵プロトコルは、開始容量が９リットルであり、両株についての通気速度が、両株が生産性であると決定された条件である２５ｍｌ／分であること以外、７リットルの発酵槽について上記のものと同様であった。４８時間のサンプルの結果を表４に示す。ＹＳＳ４１のコハク酸力価は１００ｇ／ｌ（ＫＪ１２２よりも顕著に高い）であり、酢酸生産は２．２ｇ／ｌ（ＫＪ１２２よりも顕著に少ない）であり、そしてコハク酸収量は０．９５ｇ／ｇグルコース（ＫＪ１２２よりも少し少ない）であった。従って、進化した株ＹＳＳ４１は、２０リットルの発酵槽中、祖先株ＫＪ１２２よりも高くない通気性要件で、良好な性能を有した。
【００８４】
実施例６
ｃｒｒ遺伝子における変異に対するＹＳＳ４１の安定化
ＭａｃＣｏｎｋｅｙラクトースプレートに植菌したとき、ＹＳＳ４１は、未だ、solid redタイプおよびfried egg redタイプの両方の赤色変異体を生じた。ｃｒｒ遺伝子を、各タイプの１つの分離株について配列決定した。fried eggタイプの株ＭＹＲ２２２は、野生型ｃｒｒ遺伝子配列を有していた。solid redタイプのＭＹＲ２２３は、ｃｒｒオープンリーディングフレーム内に挿入された挿入要素を有していた。挿入要素のＤＮＡ配列は、ＩＳ１８６のそれと一致した。従って、ＡＣ１５赤色変異体について確立されたパターンは、ＹＳＳ４１赤色変異体にも適用されることが明らかになった。５００ｍｌの微好気性発酵槽において、実施例４の通りに増殖させたところ、ＭＹＲ２２２は、ＹＳＳ４１と同様の性能を示すが、ＭＹＲ２２３は、性能が悪かった（表５参照）。従って、集団内のsolid red変異体の蓄積による性能の低下の可能性が、株ＹＳＳ４１を用いるときの可能性として残った。
【００８５】
この低下の可能性を解決するために、ｃｒｒ遺伝子の第二のコピーを、天然のｃｒｒ遺伝子座から離れた部位に挿入した。ｃｒｒ遺伝子とその隣接プロモーターおよびターミネーターを、テンプレートとしてＹＳＳ４１染色体ＤＮＡ、ならびにプライマーＢＹ２４９（配列番号６）およびＢＹ２５０（配列番号７）を用いてＰＣＲにより増幅させた。その後、得られた平滑末端（blunt）フラグメントを、ｐｆｌＤ オープンリーディングフレーム内のユニークなＢｓｔＺ１７Ｉ制限部位に、大腸菌Ｃ由来のｐｆｌＤＣ領域の一部のクローンを含む、ｐＣＬ１９２１に由来する低コピープラスミドに連結させた。ｐｆｌＤＣ遺伝子は、ピルビン酸−ギ酸リアーゼおよびピルビン酸−ギ酸リアーゼ活性化酵素をコード化するｐｆｌＢＡ遺伝子に相同である。ｐｆｌＤＣ遺伝子は大腸菌に必須ではなく、ｐｆｌＤまたはｐｆｌＣの何れかの欠失は、増殖に重大な影響を与えないため、その遺伝子座におけるカセットの挿入は、増殖またはコハク酸生産のための任意のマイナスの影響を有しないであろう。得られた低コピープラスミド、ｐＭＨ６８は、低コピープラスミド内に、ｐｆｌＤＣ由来の隣接配列に組み込まれたＹＳＳ４１由来のｃｒｒ遺伝子を含む。ｐＭＨ６８のＤＮＡ配列を配列番号８に示す。
【００８６】
ｐＭＨ６８由来の組換えカセットを、初めにｐｆｌＤＣ遺伝子をクローニングするために用いられるのと同じプライマーであるプライマーＢＹ１２４（配列番号９）およびＢＹ１２５（配列番号１０）を用いてＰＣＲにより増幅させた。その後、組換えカセットを、２工程遺伝子組換え法を用いてＹＳＳ４１の染色体へ組込んだ。得られた、ｃｒｒの部分二倍体（merodiploid）である株をＭＨ１４１と名付け、それは、２コピーの野生型ｃｒｒ遺伝子を染色体の２つの異なる部位に含み、１つはその天然の遺伝子座であり、もう１つは、ｐｆｌＤオープンリーディングフレームに挿入されていることを意味する。
【００８７】
予期されたとおり、ＭＨ１４１株は、ＭａｃＣｏｎｋｅｙラクトースプレート上で白色コロニーを生じた。ヘビーストリーク(heavy streak)を行い、プレートを３７℃で一晩置き、その後、室温でさらに１日置いたとき、植菌した密度の高い部分上に増殖した白色コロニーの層から多数の赤色コロニーが発生した。しかしながら、ＭＨ１４１から生じる赤色変異体の数は、同じプレート上で行われたＹＳＳ４１の同様の植菌よりも顕著に少なかった。２３個の赤色変異体をＹＳＳ４１から採取し、１２個の赤色変異体をＭＨ１４１から採取し、全てをＭａｃＣｏｎｋｅｙラクトースプレート上に再度植菌した。赤色変異体のタイプを採点すると、２３個のＹＳＳ４１ 赤色変異体のうち１２個がsolid redタイプであり、残り１１個がfried eggタイプであった。これとは対照的に、ＭＨ１４１ 赤色変異体の１２個は全てfried eggタイプであった。従って、染色体においてｃｒｒ遺伝子を倍加することにより、solid red変異体の形成速度が、少なくとも１０分の１に低減された。ＭＨ１４１から単離されたfried eggタイプの赤色変異体の１つをＭＨ１４１−Ｒ１と名付け、５００ｍｌの微好気性発酵槽中、上記の通り試験した（表５参照）。ＭＨ１４１およびＭＨ１４１−Ｒ１の両方は、増殖、コハク酸力価および酢酸力価について親ＹＳＳ４１と同様の性能であった。従って、グルコース取り込みのために促進拡散を使用するより安定した株であるＭＨ１４１を構築し、それは、グルコース取り込みにＧａｌＰシステムを用いる祖先株ＫＪ１２２と比較したとき、コハク酸のより高い力価および副生成物である酢酸のより低い力価を生じる。
【００８８】
実施例７
ＹＳＳ４１は、代謝的進化中に、ｇｌｆ、ｇｌｋカセットにおける変異を獲得した
ＡＣ１５およびＹＳＳ４１におけるｇｌｆ、ｇｌｋ発現カセットのＤＮＡ配列を決定した。該領域をＰＣＲにより増幅させ、得られたフラグメントを、ジデオキシ鎖終結法によって、ｇｌｆおよびｇｌｋ遺伝子ならびに２００塩基以上の上流および下流の配列を含んで配列決定した。ｐＡＣ１９の塩基４９７６から７９２０に対応する配列決定された領域を配列番号１に示す。ＹＳＳ４１の進化中に獲得された２つの変異が見出された。第一の変異は、配列番号１の７７４２番目の塩基のＧからＡへの変化であった。この塩基は、ｇｌｆオープンリーディングフレームのすぐ上流の、ｇｌｆ、ｇｌｋ ｍＲＮＡ転写物の５’非翻訳領域にあり、ｇｌｆ ｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）における、ＡＴＧ開始コドンの２２塩基上流、または転写の開始部位の１５塩基下流でのＣからＵへの変化をもたらす。この変異は、ｇｌｆオープンリーディングフレームの翻訳速度を増減すると予期される。第二の変異は、配列番号１の６１７３番目の塩基のＧからＡへの変化である。この塩基は、ｇｌｋオープンリーディングフレームのすぐ上流の５’非翻訳領域にあり、ｇｌｋ ｍＲＮＡにおけるＡＴＧ開始コドンの１５塩基下流でのＣからＵへの変化をもたらす。この変異は、ｇｌｋオープンリーディングフレームの翻訳速度を増減すると予期される。従って、ＹＳＳ４１の進化は、ｇｌｆオープンリーディングフレームとｇｌｋオープンリーディングフレームのより最適な発現バランスをもたらし、結果として、親株ＡＣ１５を上回る増殖および性能の株をもたらした。
【００８９】
ｇｌｆ遺伝子およびｇｌｋ遺伝子の転写または発現速度を変えるか、またはｇｌｆおよびｇｌｋタンパク質の濃度、比活性または安定性を変える他の変異は、２つのコード化されたタンパク質間のより最適なバランスを同様に達成することができ、有利な増殖および所望の化合物の生産も達成し得る。これらの他の代替的変異は、ＹＳＳ４１について上記の方法を用いて達成され得る。この方法はまた、促進拡散または糖取り込みを使用する能力を該株に付与するように、コハク酸以外の生成物を生産するために操作された株にも適用できる。
【００９０】
実施例８
ＹＳＳ４１についての空気流量の最適化後の、ＫＪ１２２およびＹＳＳ４１の発酵
親株ＫＪ１２２に最適な空気流量は、２０リットルの発酵槽において、２５ｍｌ／分であると決定されている。２５ｍｌ／分の空気流量では、ＹＳＳ４１株は、ＫＪ１２２と比較したとき、より良好なコハク酸力価および収量を示した。ＹＳＳ４１株のコハク酸収量および力価のさらなる改善が、空気流量を５０ｍｌ／分に増加することにより得られた。従って、コハク酸収量および力価を参照してＹＳＳ４１株について最適な空気流量は、ＫＪ１２２のそれとは異なると考えられる。表６は、各株について最適化された空気流条件下での、２０リットルの発酵槽での発酵の結果を示す。ＹＳＳ４１は、力価、収量および副産物である酢酸の形成において親ＫＪ１２２を上回った。該発酵の開始容量は９５００ｍｌであった。グルコースを供給し、塩基で中和後、最終容量は１２５００ｍｌであった。
【００９１】
【表１】
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【００９２】
【表２】
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【００９３】
【表３】
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【００９４】
【表４】
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【００９５】
【表５】
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【００９６】
【表６】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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