(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物に特異的免疫反応を誘発するための組成物であって、
前記組成物は、二重膜を含まない、単離ユビキチニル化タンパク質の溶液を含み、
前記単離ユビキチニル化タンパク質は、１つ以上の特異性抗原を含み、更に、閾値量のＫ４８結合型ポリユビキチニル化短寿命タンパク質およびＫ４８結合型ポリユビキチニル化欠陥リボソーム産物を含むことを特徴とする、組成物。
【請求項２】
前記単離ユビキチニル化タンパク質は、培養成長させた腫瘍由来細胞からアフィニティ精製されたものであることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記腫瘍由来細胞は、培養成長する間、プロテアソームによるユビキチニル化タンパク質の分解が抑制されたものであることを特徴とする、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記腫瘍由来細胞が、哺乳動物に由来する培養細胞であることを特徴とする、請求項２又は３に記載の組成物。
【請求項５】
前記腫瘍由来細胞が、前記腫瘍由来細胞に対して内在性でない１つ以上の特異性抗原を発現するよう改変されていることを特徴とする、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記腫瘍由来細胞に対して内在性でない前記１つ以上の特異性抗原が、ウイルス性抗原を含むことを特徴とする、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記腫瘍由来細胞に対して内在性でない前記１つ以上の特異性抗原が、細菌性抗原を含むことを特徴とする、請求項５に記載の組成物。
【請求項８】
免疫原性試薬の製造法であって、
培養成長させている腫瘍由来細胞中のユビキチニル化タンパク質のプロテアソーム分解を抑制する工程と、
培養成長させた前記腫瘍由来細胞から、二重膜の不在下で、ユビキチニル化タンパク質を単離する工程と、
を含み、
前記単離ユビキチニル化タンパク質は、１つ以上の特異性抗原を含み、更に、閾値量のＫ４８結合型ポリユビキチニル化短寿命タンパク質およびＫ４８結合型ポリユビキチニル化欠陥リボソーム産物を含むことを特徴とする、製造法。
【請求項９】
更に、
前記腫瘍由来細胞を溶解する工程と、
得られた細胞溶解物から、組み換えポリユビキチン結合ペプチドを用いてユビキチニル化タンパク質をアフィニティ精製する工程と、
前記組み換えポリユビキチン結合ペプチドから前記ユビキチニル化タンパク質を溶離する工程と、
を含むことを特徴とする、請求項８に記載の製造法。
【請求項１０】
前記腫瘍由来細胞が、前記腫瘍由来細胞によって内因性発現しない１つ以上の特異性抗原を発現するよう改変されていることを特徴とする、請求項８又は９に記載の製造法。
【請求項１１】
前記１つ以上の前記特異性抗原が、ウイルス性抗原を含むことを特徴とする、請求項１０に記載の製造法。
【請求項１２】
前記１つ以上の前記特異性抗原が、細菌性抗原を含むことを特徴とする、請求項１１に記載の製造法。
【請求項１３】
前記腫瘍由来細胞が、哺乳動物の腫瘍に由来する初代培養細胞であることを特徴とする、請求項９に記載の製造法。
【請求項１４】
前記閾値量は、インビボおよび／またはインビトロで、未感作Ｔ細胞に免疫反応を初回抗原刺激するのに十分な量を含むことを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項１５】
前記閾値量は、腫瘍特異性および／または癌特異性のＴ細胞の増殖を刺激するのに十分な量を含むことを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項１６】
前記閾値量は、抗原がＴ細胞に交差提示されるよう、インビボまたはインビトロで樹状細胞に負荷するのに十分な量を含むことを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項１７】
前記閾値量は、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラス１ａに依存しないＴ細胞のクロスプライミングを行うのに十分な量を含むことを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項１８】
前記閾値量は、インビボで抗腫瘍活性を刺激するのに十分な量を含むことを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項１９】
前記閾値量は、インビボで炎症反応を刺激するのに十分な量を含むことを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項２０】
さらに、Ｋ６３結合型ポリユビキチニル化短寿命タンパク質およびＫ６３結合型ポリユビキチニル化欠陥リボソーム産物を含むことを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項２１】
前記閾値量は、インビボおよび／またはインビトロで、未感作Ｔ細胞に免疫反応を初回抗原刺激するのに十分な量を含むことを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項２２】
前記閾値量は、腫瘍特異性および／または癌特異性のＴ細胞の増殖を刺激するのに十分な量を含むことを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項２３】
前記閾値量は、抗原がＴ細胞に交差提示されるよう、インビボまたはインビトロで樹状細胞に負荷するのに十分な量を含むことを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項２４】
前記閾値量は、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラス１ａに依存しないＴ細胞のクロスプライミングを行うのに十分な量を含むことを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項２５】
前記閾値量は、インビボで抗腫瘍活性を刺激するのに十分な量を含むことを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項２６】
前記閾値量は、インビボで炎症反応を刺激するのに十分な量を含むことを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項２７】
さらに、Ｋ６３結合型ポリユビキチニル化短寿命タンパク質およびＫ６３結合型ポリユビキチニル化欠陥リボソーム産物を含むことを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２０１３年１０月１１日出願、米国仮特許出願番号第６１／８９０，０５４号、標題“Ubiquitinylated Proteins”に対して優先権を主張するものであり、その内容は全て本件に引用して援用する。
【０００２】
本願は、単離ユビキチニル化タンパク質組成物、および、単離ユビキチニル化タンパク質生成物を単独で、または、補完的治療剤と併用して投与することにより、免疫反応を刺激、増強、または促進する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
ホストプロフェッショナルな抗原提示細胞（ＡＰＣ）による外来性抗原の交差提示（cross-presentation）は、腫瘍細胞由来の自己抗原または変異した自己抗原などの腫瘍関連抗原や、感染物質由来の外来性抗原に対する、Ｔ細胞免疫反応の開始と発展において中心的な役割を果たしている。期待される癌ワクチンとして、外来性抗原の交差提示を利用して、腫瘍に対する特異的な免疫反応を引き起こそうとするものが開発されている。
【０００４】
オートファジーは、細胞質の一部が、オートファゴソームと呼ばれる、大きさの範囲が０．５〜２μｍの二重膜小胞で隔離される細胞プロセスである。このオートファゴソームの中身は溶解コンパートメント中で分解される。これは長寿命タンパク質の代謝回転を促し、同化に必要なアミノ酸プールの維持に不可欠である。オートファジー誘導の主要なマーカーは、サイトゾル型の微小管結合タンパク質１軽鎖３（ＬＣ３−Ｉ）を、一連のユビキチン様結合工程によって、オートファゴソームと強く結合する脂質化型（ＬＣ３−ＰＥ）へ変換することである。最近報じられたタンパク質、ｐ６２／ＳＱＳＴＭ１（セクエストソームまたはｐ６２）は、ポリユビキチンとＬＣ３の両者に結合して、オートファジーによるユビキチン化タンパク質の分解を促進する。ＬＣ３とｐ６２の相互作用は、オートファジーネットワークに一層の複雑さを加え、このバルク分解過程がこれまで考えられていたよりも選択的であるかもしれないことを示唆している。
【０００５】
Ｂ１６メラノーマモデルにおいて、腫瘍細胞中でのオートファジーは、効率的な交差提示と、それに続く腫瘍免疫の誘導に重要である。オートファジーがブロックされると交差提示は著しく抑制され、オートファジーが促進されると高まる。更に、腫瘍から単離した、ＤＲｉｂｂｌｅ（小胞中のＤＲｉＰｓ）と呼ばれる、オートファゴソームを含む小胞は、交差提示試験およびin vivoワクチン研究において有力な抗原供給源の役目を果たす。オートファゴソーム含有（ＤＲｉｂｂｌｅ）ワクチンを製造する工程の重要部分が、ボルテゾミブを用いた細胞の処理であり、これによりプロテアソームがブロックされてユビキチン化（Ｕｂ）タンパク質が蓄積するようになる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、本願の発明者は、先行技術に開示されているＤＲｉｂｂｌｅの製造および単離法が、オートファゴソームとその成分材料の数を多くしたものを製造および単離し、効果的なワクチンとして更に利用するには不十分であることに気付いた。データは、シャペロン（ｐ６２）と結合したユビキチン化タンパク質（ＳＬｉＰｓ、ＤＲｉＰｓなど）が、ワクチンの効果に関与することを指摘している。ユビキチン化タンパク質を単離することで、オートファゴソームの免疫原性の高い部分を濃縮し、免疫原化合物として効率良くパッケージすることができる。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
ある例では、哺乳動物に特異的免疫反応を誘発する方法を提示し、この方法は、膜結合オルガネラの不在下で、単離ユビキチニル化タンパク質を含む第１組成物の溶液を製造する工程を含み、単離ユビキチニル化タンパク質は１つ以上の特異性抗原を含み、更に、閾値量のポリユビキチニル化短寿命タンパク質およびポリユビキチニル化欠陥リボソーム産物を含んでいる。単離ユビキチニル化タンパク質は、培養成長させた腫瘍由来細胞からアフィニティ精製され、腫瘍由来細胞は、培養成長する間、プロテアソームによるユビキチニル化タンパク質の分解が抑制されている。このようにして、古典的または非古典的ＭＨＣのいずれかによって拘束される、抗原特異的Ｔ細胞の交差提示および初回抗原刺激（priming）を行うため、免疫原性の高い短寿命タンパク質および欠陥リボソーム産物を樹状細胞に負荷（load）し得る。
【０００８】
前述の長所およびその他の長所、また本件に記載の特徴は、以下の詳細な記述より、単独で、あるいは添付図と関連させると、容易に明らかとなろう。
【０００９】
上記の概要は、詳細な記述に更に述べられている概念から選択したものを簡略な形で紹介するために提示されていることは当然である。請求項に挙げた対象物の主要または基本的特徴を特定しようとするものではなく、その範囲は、詳細な記述の後の請求項によって一意的に定義される。更に、請求項に挙げた対象物は、上で、あるいは、本開示のいずれかの部分で指摘した不都合を解決するものに限定されない。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１Ａ】プロテアソーム抑制剤の不在下でユビキチニル化タンパク質を輸送する細胞径路を示す概略図である。
【図１Ｂ】プロテアソーム抑制剤の存在下でユビキチニル化タンパク質を輸送する細胞径路を示す概略図である。
【図２】ユビキチン結合タンパク質の例を示す概略図である。
【図３Ａ】ユビキチニル化タンパク質のアフィニティ精製に用いられる、ＧＦＰ融合タンパク質を示す概略図である。
【図３Ｂ】Ｖｘ３−ＧＦＰ融合タンパク質に結合した単離ユビキチニル化タンパク質の蛍光像を示すデジタル画像である。
【図３Ｃ】単離ユビキチニル化タンパク質を負荷した樹状細胞によるＴ細胞刺激を示すグラフである。
【図３Ｄ】単離ユビキチニル化タンパク質を負荷した樹状細胞によるＴ細胞刺激を示すグラフである。
【図４Ａ】単離ユビキチニル化タンパク質を負荷した樹状細胞によるＴ細胞刺激を示すグラフである。
【図４Ｂ】単離ユビキチニル化タンパク質を負荷した樹状細胞によるＴ細胞刺激を示すグラフである。
【図５】腫瘍細胞から単離した単離ユビキチニル化タンパク質による、ＯＶＡ特異性Ｔ細胞刺激を示すグラフである。
【図６Ａ】単離ユビキチニル化タンパク質による、腫瘍特異性ＤＲｉｂｂｌｅ初回抗原刺激Ｔ細胞刺激を示すグラフである。
【図６Ｂ】単離ユビキチニル化タンパク質による、腫瘍特異性ＤＲｉｂｂｌｅ初回抗原刺激Ｔ細胞刺激を示すグラフである。
【図７】単離ユビキチニル化タンパク質ワクチン接種を介した、in vivo腫瘍特異性Ｔ細胞誘導を示すグラフである。
【図８】単離ユビキチニル化タンパク質が誘導した炎症反応を示すグラフである。
【図９Ａ】ＭＨＣ１ａ依存性および非依存性ＣＤ８＋Ｔ細胞が、単離ユビキチニル化タンパク質によってクロスプライミングできることを明示する、フローサイトメトリープロットを示す図である。
【図９Ｂ】ＭＨＣ１ａ依存性および非依存性ＣＤ８＋Ｔ細胞が、単離ユビキチニル化タンパク質によってクロスプライミングできることを明示する、フローサイトメトリープロットを示す図である。
【図９Ｃ】ＭＨＣ１ａ依存性および非依存性ＣＤ８＋Ｔ細胞が、単離ユビキチニル化タンパク質によってクロスプライミングできることを明示する、フローサイトメトリープロットを示す図である。
【図９Ｄ】ＭＨＣ１ａ依存性および非依存性ＣＤ８＋Ｔ細胞が、単離ユビキチニル化タンパク質によってクロスプライミングできることを明示する、フローサイトメトリープロットを示す図である。
【図１０】単離ユビキチニル化タンパク質をワクチン接種した担癌マウスの生存数のプロットを示すグラフである。
【図１１】ＣＭＶ特異性抗原を発現している細胞から単離したＤＲｉｂｂｌｅが、これらの抗原を効率的に運搬および交差提示することを示すグラフおよび図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
この詳細な記述は、哺乳動物に特異的免疫反応を誘発する組成物および誘発方法に関する。特に、この記述は、１つ以上の特異性抗原を含む単離ユビキチニル化タンパク質を含む組成物に関する。例えば、プロテアソームでのユビキチニル化タンパク質の分解を抑制した腫瘍由来細胞から、ユビキチニル化タンパク質を単離してもよい。単離ユビキチニル化タンパク質には、短寿命タンパク質、欠陥リボソーム産物などの免疫原性の高い抗原が含まれ、これを哺乳動物に直接注射してもよく、あるいは、樹状細胞および／またはＴ細胞と共培養して、ワクチンとして、または他の免疫学的組成物として提供される細胞集団を得てもよい。
【００１２】
癌に対抗する非常に望ましい方法として、多くのタイプの癌性細胞で発現または過剰発現されるが、健康な正常細胞では発現されない、多数の腫瘍拒絶抗原に対する、広域スペクトラムの抗腫瘍Ｔ細胞反応を刺激することのできる、効果的な治療用癌ワクチンの開発が挙げられる。真の拒絶抗原である抗原の正体がまだ分かっていないため、これらの腫瘍拒絶抗原を濃縮する間接的方法が、有効な治療用癌ワクチンの開発に役立つと期待されている。腫瘍拒絶抗原としての役割を有し得る過剰発現抗原、非変異抗原、短寿命抗原の他にも、多くの癌細胞は、突然変異、転写、翻訳および／または翻訳後修飾のエラーのいずれかである、独自のタンパク質または誤訳タンパク質を産生する。これらのタンパク質は短寿命で、プロテアソーム依存型分解の標的となる。この詳細な記述では、プロテアソーム介在型分解に関わる普遍的なポリユビキチンタグを用いて腫瘍拒絶抗原を単離および濃縮する、新たな方法を開示する。単離したユビキチニル化タンパク質は、抗原特異的Ｔ細胞を刺激して、抗腫瘍Ｔ細胞介在免疫反応を引き出すことができる。実際に、これらのタンパク質を用いたワクチン接種は、乳癌の前臨床モデルで確立されている腫瘍の腫瘍退行に介在することができた。
【００１３】
図１Ａおよび図１Ｂに、プロテアソーム抑制剤の存在下および不在下でユビキチニル化タンパク質を輸送する細胞径路の概略図を示す。タンパク質は、オートファジー径路またはプロテアソーム径路のいずれかによる分解の標的となり得る。一般に、短寿命タンパク質（ＳＬｉＰｓ）及び欠陥リボソームタンパク質（ＤＲｉＰｓ）はポリユビキチンタグで修飾され、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ−９０など）に伴われて、分解のためのプロテアソームへ向かう。プロテアソーム介在型タンパク質分解径路は、細胞シグナリングの調整に、また、Ｔ細胞でのＭＨＣ−Ｉ拘束型抗原提示による直接細胞表面提示のためのペプチドの製造に、重要な役割を果たす。
【００１４】
損傷またはミスフォールドした長寿命タンパク質は、しばしば、オートファジー径路を経て処理される。タンパク質および損傷したオルガネラはファゴフォアに飲み込まれ、次にこれがリソソームと融合してオートファゴソームとなる。抗原提示細胞において、オートファジーは、内在性抗原と外来性抗原の両者の、ＭＨＣ−ＩＩ拘束型抗原提示に重要な役割を果たしている。食細胞では、トール様受容体が介在する認識と、先天性免疫反応の活性化に、オートファジーが必要である。
【００１５】
ＨＳＰ−９０が結合したペプチド（ＳＬｉＰｓ、ＤＲｉＰｓなど）には、免疫原性の高いペプチドが含まれる。しかしこれらはプロテアソームによってすぐに分解されるため、必ずしも効率良く交差提示されない。プロテアソームを阻害剤（ボルテゾミブなど）でブロックすると、ＳＬｉＰｓおよびＤＲｉＰｓはプロテアソーム分解から保護され、オートファジー径路へ向かう。オートファジーも阻害すると（塩化アンモニウムなどで）、ＳＬｉＰｓおよびＤＲｉＰｓをアフィニティ精製して、免疫原性化合物として使用できる。
【００１６】
図２に、ユビキチン結合タンパク質の例を示す。ポリユビキチン鎖の各モノマーのＣ末端上の特異的リシン（Ｋ）結合が、タグの付いたタンパク質の運命を決定する。最も豊富なポリユビキチン鎖はＫ４８結合型であり、これは閉構造をとり、Ｓ５ａ（２６Ｓプロテアソームの調節複合体（１９Ｓ）の構成要素）による、標的タンパク質分解のためのシグナルとして働く。その次に多いポリユビキチン結合型（Ｋ６３）は、伸びた直線構造をとり、これは非プロテアソームドッキング部位として働くことができる。Ｋ６３結合型タンパク質は、最近、腫瘍形成疾患および神経変性疾患に関与することが報告されている。ｐ６２は、内在性Ｋ６３結合タンパク質で、これらのタンパク質をオートファゴソームへ輸送する働きをする。ｐ６２は、Ｋ４８結合型タンパク質にも結合できる。プロテアソームがブロックされてＫ４８結合型タンパク質の濃度が上昇すると、ｐ６２は、Ｋ６３結合型タンパク質だけでなく、Ｋ４８結合型タンパク質もオートファゴソームへ輸送し得る。このように、組み換えＳ５ａおよびｐ６２は、細胞溶解物からのポリユビキチニル化タンパク質のアフィニティ精製に利用できる。他のユビキチン結合タンパク質（ＴＵＢＥＳ、ＮＥＭＯ、オプチネウリン、ＴＯＬＬＩＰ、ＴＯＭ１、Ｖｘ３など）をアフィニティタグで組み換え発現させると、結合したユビキチニル化タンパク質を効率的に回収することができる。文中では、細胞溶解物からのユビキチニル化タンパク質の単離に、Ｓ５ａおよびＶｘ３を含む構造体を用いているが、他のこのような構造体も使用できる。特に、下流の用途のための特定集団のユビキチニル化タンパク質の単離には、Ｋ４８およびＫ６３に特異なタンパク質、抗体、および／または、これらの組み合わせが用いられる。
【実施例】
【００１７】
＜実施例１＞
［単離ユビキチニル化タンパク質の交差提示による未感作Ｔ細胞の刺激］
交差提示は、抗原をその中で合成していない細胞がその抗原を提示できることで、免疫反応を初回抗原刺激するための唯一の機構としての直接提示を不必要にする手段であることが明らかとなった。効果的な抗腫瘍免疫反応の発生には、ワクチン接種の際のメラノーマ抗原の交差提示が不可欠であることが実証されたことで、この知見が広がった。議論され、未だ分かっていない交差提示の要素の１つは、抗原の供給源と、それをプロフェッショナルな抗原提示細胞（ＡＰＣ）へ送達する方法である。いくつかのグループは、抗原供給源が細胞タンパク質であることを示したが、熱ショックタンパク質（ＨＳＰｓ）でシャペロン化されたペプチドであると主張するグループもある。更に、クロスプライミング（cross-priming）は、ＨＳＰ９０と併せて、プロテアソーム基質および安定な細胞質ペプチドの供与の両者から生じることが立証されている。短寿命モデル抗原系、およびタンパク質翻訳の阻害剤の両者を用いた実験は、短寿命タンパク質（ＳＬｉＰｓ）および／または欠陥リボソーム産物（ＤＲｉＰｓ）が、オートファジー依存型クロスプライミングに関連する抗原プールの不可欠な構成要素であることを示している。ＳＬｉＰｓの半減期が短く、ＡＰＣへ供与されにくいため、この抗原プールの交差提示は一般に効率が悪い。興味深いことに、ＳＬｉＰｓが細胞表面のペプチド：ＭＨＣ複合体の大部分を構成できるのは、ＳＬｉＰｓのこの時間的性質であり、これは、ＳＬｉＰｓがプロテアソームによってすぐに分解され、ＴＡＰ１／２によりＭＨＣクラスＩ分子上に負荷されるためである。プロテアソーム阻害剤（ボルテゾミブ）による腫瘍の処理は、これらの一時的なタンパク質を安定化して、これらを別の主要な分解径路、オートファゴソーム／リソソーム径路に向かわせる。
【００１８】
図３Ａに、ＧＦＰ−Ｖｘ３（Ａ７）融合タンパク質の概略図を示す。Ｖｘ３は、３つの比較的堅固なユビキチン結合Ｖｐｓ２７ ＵＩＭドメインを含むペプチドである。Ｖｘ３は、Ｌｙｓ６３結合型ユビキチン種と、Ｌｙｓ４８結合型ユビキチン種の両者と結合するが、Ｌｙｓ６３連結型ユビキチン種は、より高い特異性で結合する。このように、ＧＦＰ−Ｖｘ３（Ａ７）を用いて、細胞溶解物からユビキチニル化タンパク質を結合およびアフィニティ精製することができる。ＧＦＰ−Ｖｘ３（Ａ７）は更に、タンパク質のアフィニティ精製に用いることができるＮ−末端ポリＨｉｓタグも含んでいる。
【００１９】
ある実験では、ＵｂｉＬＴ３細胞を培養成長させ、２００ｎＭのボルテゾミブで２４時間処理し、集めて溶解させた。１０、３０、または１００μｇの精製ＧＦＰ−Ｖｘ３（Ａ７）をＵｂｉＬＴ３溶解物に加え、一晩共培養した。次に、この混合物にニッケル樹脂を加え、一晩共培養した。遠心分離してニッケル樹脂を分け、上澄み液を通過画分として保存した。次に、ニッケル樹脂を低濃度のイミダゾール溶液で洗い、次に、結合タンパク質を高濃度イミダゾール溶液で溶離した。図３Ｂに、１０、３０、および１００μｇの精製ＧＦＰ−Ｖｘ３（Ａ７）について、投入画分、通過画分および溶離画分のデジタル画像の例を示す。
【００２０】
次に、単離ユビキチニル化タンパク質を樹状細胞（ＤＣ）に提示し、次いで、これを用いてＴ細胞に抗原を交差提示することができる。ある実験では、ヒトＤＣに、ＵｂｉＬＴ３細胞、あるいは、サイトメガロウイルス構造タンパク質ｐｐ６５を発現するよう改変したＵｂｉＬＴ３細胞（ＵｂｉＬＴ３ｐｐ６５）からの、単離ユビキチニル化タンパク質を負荷した。陽性対照として、精製したＣＭＶタンパク質をＤＣに負荷し、陰性対照として、培地のみ（ＣＭ）を使用した。ＤＣに６時間負荷を行った後、増殖したエフェクターＴ細胞を加えて１６時間刺激した。次に、細胞内染色およびブレフェルジンＡ処理、次に、フローサイトメトリーを行って、ＩＦＮ−γ産生についてＴ細胞を分析した。図３Ｃおよび図３Ｄは、ＵｂｉＬＴ３ｐｐ６５細胞から単離したユビキチニル化タンパク質（ＬＴ３ｐｐ６５）では、ＣＤ８＋Ｔ細胞（図３Ｃ）およびＣＤ４＋Ｔ細胞（図３Ｄ）の両者で、ｐｐ６５特異性ＩＦＮ−γ産生を刺激できたが、ＵｂｉＬＴ３対照細胞（ＬＴ３）では刺激できなかったことを示している。この結果は、単離ユビキチニル化タンパク質が、ワクチンとして機能するほかにも、ワクチン、癌、および／または特定病原体の感染に対する免疫反応をin vitroで監視および評価するために使用できることを示している。これは、例えば、特異性抗原を発現している細胞から誘導した単離ユビキチニル化タンパク質を樹状細胞に負荷し、その特異性抗原に対するワクチンで治療した患者から採取したＴ細胞に、負荷した樹状細胞を提示し、次に、採取したＴ細胞によるＩＦＮ−γ産生を評価することにより、行われる。
【００２１】
図４Ａおよび図４Ｂに、ＤＣのサブセットに、ＵｂｉＬＴ３およびＵｂｉＬＴ３ｐｐ６５のＵｂ富化（enriched）画分、投入画分および通過画分を負荷した、同様の実験のグラフを示す。図４Ａから分かるように、ＵｂｉＬＴ３ｐｐ６５では、溶離した単離ユビキチニル化タンパク質（溶離）が、ＵｂｉＬＴ３ｐｐ６５細胞溶解物単独（投入）よりも、ＣＤ８＋Ｔ細胞によるＩＦＮ−γ産生の刺激に、より効果があった。ｐｐ６５特異性Ｔ細胞に誘発された刺激が最も小さかったのは、ＵｂｉＬＴ３ｐｐ６５細胞溶解物の通過画分、またはＵｂｉＬＴ３細胞溶解物のＵｂ富化画分、投入画分および通過画分であった。
【００２２】
図５に、単離ユビキチニル化タンパク質が、未感作ＣＤ８＋Ｔ細胞に対する抗原の交差提示の効率的な抗原供給源であることを明示する、フローサイトメトリー分布プロットを示す。マウスＢ１６メラノーマ細胞の１種であるＢ７８／Ｈ１細胞を、Ｒ−ＧＦＰ−ＯＶＡまたはＲ−ＧＦＰを発現するよう改変した。Ｂ７８／Ｈ１細胞を培養成長させ、ボルテゾミブで処理し、集めて溶解させた。Ｂ７８／Ｈ１溶解物だけでなく、正常肝組織溶解物からもユビキチニル化タンパク質をアフィニティ精製した。
【００２３】
マウスＭｕｔｕ−１９４０ ＤＣに、アルミニウムナノ粒子のほかに、精製ユビキチニル化タンパク質（３、１０、または３０μｇ）または精製ＯＶＡ（１０、３０、または１００μｇ）を負荷した。次に、この負荷したＤＣを、ＣＦＳＥ標識ＯＴ−１遺伝子組み換えＴ細胞に提示した。Ｔ細胞の活性化は、ＣＦＳＥ希釈後、６日間共培養して評価した。
【００２４】
図５から分かるように、抗原発現細胞から単離したユビキチニル化タンパク質（Ｕｂ−Ｖｅｌ−Ｂ７８Ｈ１−ＯＶＡ）でパルスしたＤＣは、低抗原濃度であっても、ＯＴ−１ ＣＤ８＋Ｔ細胞の刺激に効果がある一方、非抗原発現細胞または正常肝組織から単離したユビキチニル化タンパク質は効果がなかった。実際、低濃度（３μｇ／ｍｌ）において、Ｕｂ−Ｖｅｌ−Ｂ７８Ｈ１−ＯＶＡから単離したユビキチニル化タンパク質は、１０μｇ／ｍｌの濃度の精製ＯＶＡと同程度の効果で、ＯＴ−１ ＣＤ８＋Ｔ細胞を刺激した。図５に示すデータは、ひとつの独立した実験のものであるが、再試でも同じ結果であった（図示せず）。
【００２５】
これらの実験は、単離ユビキチニル化タンパク質が、樹状細胞に取り込まれ、他の細胞成分の不在下で、Ｔ細胞に交差提示され得ることを示している。このように、単離ユビキチニル化タンパク質は、in vivoまたはin vitroのいずれでも、未感作Ｔ細胞中の免疫反応の初回抗原刺激に利用できる。
【００２６】
＜実施例２＞
［単離ユビキチニル化タンパク質の交差提示による腫瘍特異性Ｔ細胞の刺激］
歴史的に、癌ワクチンで誘導したＴ細胞は腫瘍の根絶にあまり効果がない。誘導Ｔ細胞は、腫瘍を認識して腫瘍拒絶抗原を発現できたとしても、しばしば、封鎖され、消散し、アポトーシスを受け、あるいは、単に、腫瘍を根絶できる程までに増殖できない。あるスペクトルの腫瘍拒絶抗原に対するＴ細胞の刺激に使用可能な、効果の範囲の広い腫瘍拒絶抗原を作ることで、増殖Ｔ細胞の治療効果を高めることができる。更に、腫瘍は、多数の抗原の発現を同時に低下させる必要があるため、あるスペクトルの腫瘍抗原に対する広い免疫反応は、腫瘍が免疫異物除去から逃れる可能性を小さくすると考えられる。
【００２７】
図６Ａ〜図６Ｂに、単離ユビキチニル化タンパク質による、腫瘍特異性、ＤＲｉｂｂｌｅ初回刺激Ｔ細胞刺激のグラフを示す。Ｎｕ７７−ＧＦＰＣｒｅマウス（脾臓の骨髄細胞系列細胞中、並びにＴリンパ球およびＢリンパ球中でＧＦＰを発現するＣ５７ＢＬ／６マウスの株）に、零ベクトル（null vector）（図６Ａ）、または、Ｂ７８／Ｈ１細胞由来のＤＲｉｂｂｌｅ（図６Ｂ）をワクチン接種した。接種７日後、マウスを解剖して脾細胞を採取した。Ｍｕｔｕ １９４０ ＤＣに、アルミニウムナノ粒子と、更に、ＰＢＳ、あるいは、５、１０もしくは３０μｇの、正常肝細胞から単離したユビキチニル化タンパク質（Ｕｂ肝ＨＳ）、５、１０もしくは３０μｇの、Ｂ７８／Ｈ１細胞から単離したユビキチニル化タンパク質（Ｕｂ−Ｂ７８Ｈ１ ＨＳ）、５、１０もしくは３０μｇの、ボルテゾミブ処理Ｂ７８／Ｈ１細胞から単離したユビキチニル化タンパク質（Ｖｅｌ Ｕｂ−Ｂ７８Ｈ１ ＨＳ）、または、５、１０もしくは３０μｇの、Ｂ７８／Ｈ１−ＯＶＡ細胞由来のＤＲｉｂｂｌｅのいずれかとを負荷した。次に、負荷したＤＣを、採取した脾細胞と共培養した。次に、ＣＤ８＋細胞、ＣＤ６９＋細胞、ＧＦＰ＋細胞について、フローサイトメトリー分析により、エフェクターＴ細胞の活性化を測定した。予めワクチン接種したマウスから採取した脾細胞について、Ｂ７８／Ｈ１細胞から単離したユビキチニル化タンパク質では、エフェクターＴ細胞の濃度依存的活性化が見られ、ボルテゾミブ処理Ｂ７８／Ｈ１細胞から単離したユビキチニル化タンパク質では更に劇的な活性化が見られた。
【００２８】
この実験は、単離ユビキチニル化タンパク質がワクチンブースターとして使えることを示唆している。例えば、同種オートファゴソーム富化組成物を担癌患者に投与した後、患者自身の原発腫瘍細胞から誘導した単離ユビキチニル化タンパク質を含む組成物を投与してもよい。こうすると、ワクチン接種後にＴ細胞増殖を誘発できるため、ワクチンの効果を高めることができると考えられる。
【００２９】
図７は、単離ユビキチニル化タンパク質を用いたワクチン接種が介在する、腫瘍特異性Ｔ細胞のin vivo初回抗原刺激のグラフである。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、培地（ＨＳ）、正常肝細胞から単離したユビキチニル化タンパク質（ＨＳ Ｕｂ  肝臓）、または、Ｂ７８／Ｈ１細胞から単離したユビキチニル化タンパク質（ＨＳ Ｕｂ Ｂ７８Ｈ１）をワクチン接種した。接種７日後、マウスを解剖して脾細胞を採取した。次に、脾細胞を、Ｂ７８／Ｈ１細胞、Ｈ２−Ｄｂを発現するよう改変されたＢ７８／Ｈ１細胞（Ｂ７８Ｈ１Ｄｂ）、Ｈ２−Ｋｂを発現するよう改変されたＢ７８／Ｈ１細胞（Ｂ７８Ｈ１Ｋｂ）、Ｈ２−ＤｂとＨ２−Ｋｂの両者を発現するよう改変されたＢ７８／Ｈ１細胞（Ｂ７８Ｈ１ＤｂＫｂ）、または、抗ＣＤ３抗体（ＣＤ３）と共培養した。次に、ＣＤ８＋細胞、ＩＦＮ−γ＋細胞について、フローサイトメトリーによりＴ細胞の活性化を測定した。
【００３０】
図７から分かるように、Ｂ７８／Ｈ１細胞から単離したユビキチニル化タンパク質を接種されたマウスは、Ｈ２−Ｄｂ、Ｈ２−Ｋｂ、またはその両者を発現するよう改変されたＢ７８／Ｈ１細胞を認識するＴ細胞を初回刺激した。この結果は、Ｂ７８／Ｈ１細胞から単離したユビキチニル化タンパク質でのワクチン接種が、ＭＨＣ−Ｉに拘束される形で、その腫瘍型に特異的なＴ細胞を、in vivoで効果的に初回刺激することを示唆している。
【００３１】
＜実施例３＞
［単離ユビキチニル化タンパク質による炎症反応刺激］
免疫学的アジュバントは、免疫反応の増強および／または調節のために、免疫炎症性反応を利用するものである。図８に、単離ユビキチニル化タンパク質が誘導した炎症反応のグラフを示す。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣｓ）を、９６ウェルのプレートに、１０６細胞／ウェルで播いた。次に、ＰＢＭＣを、５ｍＭのＡＴＰおよび１０ｎｇ／ｍｌのリポ多糖類（ＡＴＰ／ＬＰＳ）、または、Ｂ７８／Ｈ１細胞から単離したユビキチニル化タンパク質（５μｇ／ｍｌまたは５０μｇ／ｍｌ）と共に、一晩培養した。次に、各ウェルの上澄み液を取り出し、ＥＬＩＳＡでＩＬ−１βを分析した。図８から分かるように、ＩＬ−１βは、Ｂ７８／Ｈ１細胞から単離したユビキチニル化タンパク質で濃度依存的に刺激された。ＩＬ−１βは炎症性サイトカインであり、このサイトカインの産生は、ユビキチニル化タンパク質の炎症性を証明している。炎症反応の誘導は、ワクチンアジュバントに良く知られる性質であり、ワクチン特異的免疫反応の発展を増強するよう働く。このように、単離ユビキチニル化タンパク質は、抗原の特性とアジュバントの特性の両者を備えることができる。Ｔ細胞が活動する部位において炎症を刺激することで、単離ユビキチニル化タンパク質由来のワクチンは炎症反応を起こし、これがワクチン特異的免疫反応の発生を強めると考えられる。
【００３２】
＜実施例４＞
［単離ユビキチニル化タンパク質が介在する、ＭＨＣクラス１ａ依存性および非依存性Ｔ細胞クロスプライミング］
腫瘍が免疫監視から逃れる主なメカニズムの１つは、ＭＨＣクラス１ａ分子の発現を低下または完全に欠失させることである。同時に、ＮＫ細胞またはＣＴＬによる排除を逃れるためのメカニズムとして、しばしば、腫瘍細胞上に非古典的ＭＨＣクラス１ｂ分子を発現増加する。従って、ＭＨＣクラス１ａに依存せずに腫瘍細胞を認識するＴ細胞を初回刺激するワクチンならば、Ｔ細胞の標的となり得る拒絶抗原のスペクトルを広げて、腫瘍細胞が免疫異物除去から逃れる可能性を小さくできると考えられる。
【００３３】
Ｂ１６メラノーマ細胞のＢ７８／Ｈ１クローンは、古典的ＭＨＣクラスＩ分子（ＭＨＣクラス１ａ）の発現欠損を持つが、非多型ＭＨＣクラスＩ分子（ＭＨＣクラス１ｂ）の発現は保有している。図９Ａ〜図９Ｄに、ＭＨＣクラス１ａ依存性および非依存性ＣＤ８＋Ｔ細胞が、単離ユビキチニル化タンパク質によってクロスプライミングできることを明示する、フローサイトメトリープロットを示す。Ｎｕｒｒ７７ＧＦＰレポーターマウスに、Ｂ７８Ｈ１メラノーマ細胞からのＤＲｉｂｂｌｅまたは単離ユビキチニル化タンパク質のいずれかを１５μｇ接種した。アルミナナノ粒子と共に、ＤＲｉｂｂｌｅは結節内に投与し、単離ユビキチニル化タンパク質は皮下に投与した。次に、初回刺激したＣＤ８＋Ｔ細胞が、親Ｂ７８Ｈ１細胞と、外来性Ｈ２−ＫｂまたはＤｂ分子を発現するよう形質転換されたＢ７８Ｈ１細胞とを認識する能力を分析した。免疫付与から７〜１０日後、注入したリンパ節または流入領域（draining）リンパ節を集め、リンパ球を、Ｈ２−ＤｂまたはＫｂを発現しているＢ７８Ｈ１またはＢ７Ｈ１腫瘍細胞を用いて刺激した。陰性対照および陽性対照は、培地のみ（ＣＭ）および抗ＣＤ３抗体（ＣＤ３）であった。フローサイトメトリー分析を行って、ＣＤ８＋Ｔ細胞がＩＦＮ−γを産生する割合（図９Ａ〜図９Ｃ）、または、ＧＦＰおよびＣＤ６９発現の発現増加の割合（図９Ｄ）を求めた。ＭＨＣクラス１ａ−Ｂ７８／Ｈ１を用いてex vivoで刺激すると、ＤＲｉｂｂｌｅ（図９Ｂ）またはＵｂタンパク質（図９Ｃ）のいずれかで初回刺激したＣＤ８＋Ｔ細胞の約４％がＩＦＮ−γを産生することができた。Ｄｂの発現は、ＩＦＮ−γＣＤ８＋Ｔ細胞の割合を更に上昇させた（Ｋｂの程度はより少ない）。マウスに正常マウス肝臓から単離したユビキチニル化タンパク質を免疫させた場合（図９Ａ）、Ｂ７８Ｈ１細胞またはＢ７８Ｈ−Ｄｂ細胞のいずれで刺激しても、ＩＦＮ−γ産生ＣＤ８＋Ｔ細胞は検出されなかった。Ｂ７８Ｈ１細胞はＴＡＰ−２欠損であるため、これらのＴ細胞は、ＴＡＰ−２に依存しないメカニズムで提示されるエピトープを認識する。ＧＦＰ発現試験から、Ｂ７８Ｈ１反応性ＩＦＮ−γ産生ＣＤ８＋Ｔ細胞の大部分は、ＭＨＣクラス１ａ分子によって拘束されないことが明らかとなった。
【００３４】
＜実施例５＞
［腫瘍ワクチンとしてのユビキチニル化タンパク質］
腫瘍由来オートファゴソームを材料とするワクチン（ＤＲｉｂｂｌｅなど）は、全細胞ワクチンよりも広い抗腫瘍免疫反応を起こすために使用してもよいが、免疫原性の高いユビキチニル化タンパク質を単離および再パッケージングすることで、オートファゴソーム内にパッケージされているものより効果が高く、レパートリーの異なるＴ細胞を初回刺激できる、亜優性（subdominant）の、新しい潜在性抗原を含むワクチンが可能となり、これはオートファゴソーム調製工程の際に共に単離される細胞成分によって拘束されると考えられる。古典的マウス腫瘍モデルの多く（例えば、４Ｔ１またはＢ１６ＢＬ６−Ｄ５）は免疫原性が乏しく、治療が難しい。ましてや、自然発生腫瘍は更に治療が困難となり得る。最近のデータは、腫瘍中に存在する変異の数が内在性免疫原性の程度に影響し得ることを示唆している。このことから、新しく自然発生した腫瘍にはほとんど変異が無く、免疫原性も更に低いと考えられる。
【００３５】
図１０に、単離ユビキチニル化タンパク質を接種した担癌マウスの生存数をプロットしたものを示す。マウスに４Ｔ１乳腺腫瘍を植え付けた後、培地（ワクチン無し、プロット１０１０）、４Ｔ１細胞由来の未処理ＤＲｉｂｂｌｅ（プロット１０２０）、ユビキチニル化タンパク質の欠乏した４Ｔ１ ＤＲｉｂｂｌｅ画分（プロット１０３０）、または、４Ｔ１ ＤＲｉｂｂｌｅから単離したユビキチニル化タンパク質（プロット１０４０）を用いて免疫療法を行った。マウスには、培養成長させた後採取した２５，０００個の生存４Ｔ１腫瘍細胞を植え付けた。植え付け５日後、マウスに、上記のワクチン類の１つを結節当たり１０μｇ加える免疫療法を行った。ワクチンを与えたマウスに、植え付け７日および９日後に同じ内容を追加投与した。
【００３６】
この実験のため、４Ｔ１細胞からＤＲｉｂｂｌｅを誘導した。簡潔に言うと、細胞をボルテゾミブ（２００ｎｍｏｌ／Ｌ）と塩化アンモニウム（１０〜２０ｍｍｏｌ／Ｌ）で２４時間処理した。３００×ｇで７分間遠心分離し、細胞と細胞残屑を沈殿させた。正確なピペッティングにより、細胞または細胞残屑塊からＤＲｉｂｂｌｅを取り出した。次に、懸濁液を７５００×ｇで遠心分離して、ＤＲｉｂｂｌｅを沈殿させた。ナノベシクルとエクソソームを含む上澄み液を捨てた。
【００３７】
単離したＤＲｉｂｂｌｅの画分を、氷上、５ｘ−ＲＩＰＡ緩衝液に溶解させた後、超音波照射して膜を破壊した。４℃、１３，０００×ｇで１２分間遠心分離して、溶液から膜を除いた。得られた溶液をＰＢＳに１：１０で希釈した。次に、市販のＳ５ａ結合ビーズを用い、４℃で一晩培養して、溶液からユビキチニル化タンパク質を捕集した。Ｓ５ａ結合ビーズを９０％ ＰＢＳ／１０％細胞溶解緩衝液で２回洗浄した。Ｓ５ａ結合ビーズに結合したタンパク質を、２Ｍ ＮａＣｌを含むｐＨ６．０（リン酸塩）の溶液中、５６℃で３０分間溶離させた。溶離液をＰＢＳで繰り返し透析後、濃縮して１ｍｇ／ｍｌの溶液とした。Ｓ５ａはＫ−４８結合型ユビキチンにより高い親和性を持つが、ウエスタンブロット法によれば、Ｋ−４８結合型ユビキチン類およびＫ−６３結合型ユビキチン類の両者とも溶離液中で検出された（図示せず）。
【００３８】
プロット１０４０から分かるように、Ｕｂ富化ＤＲｉｂｂｌｅ画分をワクチン接種した６匹のマウスのうち５匹は、植え付け後４２日目も腫瘍が無かったが、対照群、未処理ＤＲｉｂｂｌｅ群、またはＵｂ欠乏ＤＲｉｂｂｌｅ画分群のマウスは全て腫瘍が大きくなった。この結果は、ＤＲｉｂｂｌｅ中に含まれるユビキチニル化タンパク質が、ＤＲｉｂｂｌｅワクチンの治療的性質に不可欠であることを示唆している。ユビキチニル化タンパク質を単離することで、ワクチンの濃縮が可能となり、また、抗腫瘍活性の刺激において、より効果のあるものにできる。
【００３９】
＜実施例６＞
［病原体関連タンパク質を発現している細胞からのワクチンの誘導］
標的特異性ユビキチニル化タンパク質を得るもうひとつの方法は、特定のヒトまたは動物病原体（例えばＨＩＶ）のゲノムまたはゲノム成分を、ユビキチニル化タンパク質の産生に使用する細胞株に挿入することである。ＨＩＶタンパク質を発現している細胞から単離したユビキチニル化タンパク質をワクチンとして使用すると、免疫性を高め、またＨＩＶゲノムを一掃できる可能性もある。このようなワクチンを、この病気に対抗するＣＭＶベクターと組み合わせて使用してもよい。別のシナリオでは、特定のヒト病原体（例えば、ヒト型結核菌またはエボラ）のゲノムまたはゲノム成分を、ユビキチニル化タンパク質の産生に使用する細胞株に挿入してもよい。別の例では、特定の動物病原体（例えば、豚繁殖・呼吸障害症候群ウイルス：ＰＲＲＳＶ）のゲノムまたはゲノム成分を、ユビキチニル化タンパク質の産生に使用する細胞株に挿入してもよい。
【００４０】
図１１に、ＣＭＶ特異性抗原を発現している細胞から単離したＤＲｉｂｂｌｅが、この抗原を効率良く運搬および交差提示することを明示する、グラフおよびプロットを示す。ＣＥＦ−ＤＲｉｂｂｌｅを負荷した単球は、対照のＥ６Ｅ７−ＤＲｉｂｂｌｅよりもＣＤ８＋Ｔ細胞を刺激し（２．４％対０．０６％；ｐ＜０．０１；プロット１１１０）、ＣＤ４＋Ｔ細胞を刺激した（０．５６％対０．０３％；ｐ＜０．０５；プロット１１２０）。Ｅ６Ｅ７−ＤＲｉｂｂｌｅによる刺激では、無抗原群での頻度を超える反応の増加は見られなかった。これらの結果は、単核に負荷した場合、ＨＥＫ ２９３ Ｔ由来ＤＲｉｂｂｌｅが、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞反応の両者にウイルス性抗原を交差提示したことを示している。ＣＥＦ抗原ペプチドを欠いたＨＥＫ ２９３ Ｔ細胞由来のＤＲｉｂｂｌｅによる記憶Ｔ細胞の明らかな非特異的刺激はなかった。
【００４１】
更に、癌患者から得たＵｂｉＬＴ３細胞株由来のＤＲｉｂｂｌｅを使用した。ＣＭＶのｐｐ６５タンパク質を発現したＵｂｉＬＴ３株を作製し、これをＣＭＶｐｐ６５抗原の供給源として用いてＤＲｉｂｂｌｅを調製し、２４人のドナーからのＰＢＭＣを刺激した。前述の細胞内染色法に従って、ＩＦＮ−γ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＩＦＮ−γ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の割合を計算した。ＩＦＮ−γ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の平均割合は、ＵｂｉＬＴ３ ｐｐ６５ ＤＲｉｂｂｌｅ刺激群では０．２４％であり、これと比べ、対照ＵｂｉＬＴ３ ＧＦＰ ＤＲｉｂｂｌｅで処理したＴ細胞の対応群では０．０８％であった（ｐ＜０．０１；プロット１１３０、フローチャート１１５０）。ｐｐ６５ ＤＲｉｂｂｌｅ刺激でＩＦＮ−γを産生したＣＤ４＋Ｔ細胞の平均割合は０．５４％であり、これに対し、対照ＤＲｉｂｂｌｅで刺激したものは０．０４％であった（ｐ＜０．０１；プロット１１４０、フローチャート１１５０）。精製した組み換えＣＭＶ ｐｐ６５タンパク質と比べて、ＵｂｉＬＴ３ ｐｐ６５ ＤＲｉｂｂｌｅは、記憶ＣＤ４＋Ｔ細胞のより良い刺激物であった（０．５４％対０．３９％、ｐ＜０．０５、図２Ｄ，Ｅ）が、記憶ＣＤ８＋Ｔ細胞に対しては刺激が小さかった（０．２４％対０．５８％、ｐ＜０．０１、図２Ｃ，Ｅ）。これらのデータは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞およびＵｂｉＬＴ３細胞からのＤＲｉｂｂｌｅを、溶出した（elutriated）単球に負荷、あるいは、ヒトＰＢＭＣに直接加えると、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞の抗原特異的活性化の強力な免疫原となることを示している。
【００４２】
これらの結果は、発現したウイルスタンパク質がＤＲｉｂｂｌｅに向けられ、そこで交差提示のための抗原として使用され得ることを示している。ウイルスタンパク質を発現している細胞からユビキチニル化タンパク質を単離することで、より効果の高い免疫原を得ることができる。腫瘍抗原、ウイルス性抗原、細菌性抗原、その他の病原体抗原などの、様々な抗原を発現している細胞型を培養し、プロテアソームによるタンパク質の分解を抑制することができる。次に、ワクチン、免疫増強剤、Ｔ細胞プライマー、免疫学的監視薬、あるいはその他の免疫原性または治療用化合物として使用するため、これらの細胞からユビキチニル化タンパク質を単離することができる。
【００４３】
上に示した実験データおよび方法は、１つ以上の組成物および１つ以上の方法を可能にする。ある例では、哺乳動物に特異的免疫反応を誘発するよう形成された組成物を提示し、この組成物は、膜結合オルガネラを含まない、単離ユビキチニル化タンパク質の溶液を含み、単離ユビキチニル化タンパク質は１つ以上の特異性抗原を含み、更に、閾値量のポリユビキチニル化短寿命タンパク質（ＳＬｉＰｓ）およびポリユビキチニル化欠陥リボソーム産物（ＤＲｉＰｓ）を含んでいる。ＳＬｉＰｓおよびＤＲｉＰｓの閾値量は、in vivoおよび／またはin vitroで、未感作Ｔ細胞に免疫反応を初回抗原刺激するのに十分な量であってもよい。ＳＬｉＰｓおよびＤＲｉＰｓの閾値量は、腫瘍特異性Ｔ細胞の増殖を刺激するのに十分な量であってもよい。ＳＬｉＰｓおよびＤＲｉＰｓの閾値量は、抗原がＴ細胞に交差提示されるよう、in vivoまたはin vitroで樹状細胞に負荷するのに十分な量であってもよい。ＳＬｉＰｓおよびＤＲｉＰｓの閾値量は、ＭＨＣクラス１ａに依存しないＴ細胞のクロスプライミングを行うのに十分な量であってもよい。ＳＬｉＰｓおよびＤＲｉＰｓの閾値量は、in vivoで抗腫瘍活性を刺激するのに十分な量であってもよい。更に、ＳＬｉＰｓおよびＤＲｉＰｓの閾値量は、in vivoで炎症反応を刺激するのに十分な量であってもよい。
【００４４】
単離ユビキチニル化タンパク質は、培養成長させた腫瘍由来細胞からアフィニティ精製することができる。腫瘍由来細胞は、培養成長する間、例えば、プロテアソーム阻害剤（例えば、ボルテゾミブ）を使用することで、プロテアソームによるユビキチニル化タンパク質の分解が抑制されたものであってもよい。一部の例において、腫瘍由来細胞は、培養成長する間、例えばリソソーム阻害剤を使用することで、リソソームによるユビキチニル化タンパク質の分解が抑制されたものであってもよい。
【００４５】
腫瘍由来細胞は哺乳動物の腫瘍から得ることができる。一部の例において、腫瘍由来細胞は、哺乳動物の腫瘍に由来する初代培養細胞であってもよい。一部の例では、腫瘍由来細胞を腫瘍細胞株から得てもよい。腫瘍由来細胞を、その腫瘍由来細胞に対して内在性でない１つ以上の特異性抗原、例えば、腫瘍特異性抗原、ウイルス性抗原、細菌性抗原、病原体抗原などを発現するよう改変してもよい。
【００４６】
別の例では、免疫原性試薬の製造法を提示し、この方法は、培養成長させている腫瘍由来細胞中のユビキチニル化タンパク質のプロテアソーム分解を抑制する工程と、培養成長させた腫瘍由来細胞から、膜結合オルガネラの不在下で、ユビキチニル化タンパク質を単離する工程と、を含み、単離ユビキチニル化タンパク質は１つ以上の特異性抗原を含み、更に、閾値量のポリユビキチニル化短寿命タンパク質およびポリユビキチニル化欠陥リボソーム産物を含んでいる。この方法は更に、腫瘍細胞を溶解する工程と、得られた細胞溶解物から、組み換えポリユビキチン結合ペプチドを用いてユビキチニル化タンパク質をアフィニティ精製する工程と、組み換えポリユビキチン結合ペプチドからユビキチニル化タンパク質を溶離する工程と、を含むものであってもよい。
【００４７】
更に別の例では、哺乳動物に特異的免疫反応を誘発する方法を提示し、この方法は、単離ユビキチニル化タンパク質を含む第１組成物の溶液を製造する工程と、１つ以上の特異性抗原をＴ細胞に交差提示する工程と、を含み、単離ユビキチニル化タンパク質は１つ以上の特異性抗原を含み、更に、閾値量のポリユビキチニル化短寿命タンパク質およびポリユビキチニル化欠陥リボソーム産物を含んでいる。この方法は更に、in vitroにおいて樹状細胞に第１組成物を負荷し、負荷樹状細胞を生成する工程と、負荷樹状細胞からＴ細胞へ抗原を交差提示する工程と、を含むものであってもよい。抗原は、in vivoまたはin vitroで、負荷樹状細胞からＴ細胞へ交差提示されてもよい。第１組成物は、哺乳動物に皮下注射され、あるいは、結節内、鼻腔内、静脈内に、または適当な別の手段で投与される。哺乳動物に特異的免疫反応を誘発することのできる第２組成物を哺乳動物に注入後、暫くして、第１組成物を注入してもよい。第２組成物は、ＤＲｉｂｂｌｅワクチンなどの、同種オートファゴソーム富化組成物である。特異的免疫反応は、古典的および／または非古典的ＭＨＣに拘束される抗原を標的としてもよい。
【００４８】
次の請求項は、ある種の組み合わせおよび下位の組み合わせが、新規および非自明と見なされることを特に指摘している。これらの請求項は、“１つの（an）”要素または“第１の”要素、あるいはその同等物について言及しているかもしれない。そのような請求項は、１つ以上のこのような要素の結合を含み、このような要素が２つ以上必要なわけでも、２つ以上を除くわけでもないことを理解すべきである。開示されている特徴、機能、要素、および／または、特性の、別の組み合わせおよび下位の組み合わせは、本請求項の修正により、あるいは、本願または関連出願の新たな請求項の提示によって主張することができる。このような請求項は、元の請求の範囲より、広く、狭く、同じ、または異なっていようとも、本開示の対象物に含まれるものとする。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１０】
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【図１１】
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