(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
がん幹細胞を標的とする合成ペプチドであって、配列番号１〜６および８のアミノ酸配列からなる群から選択される、合成ペプチド。
【請求項２】
がんを診断することにおける使用のための、請求項１に記載の合成ペプチド。
【請求項３】
治療薬をがん幹細胞に標的化することにおける使用のための、請求項１に記載の合成ペプチド。
【請求項４】
請求項１に記載の合成ペプチドおよび検出可能部分を含む融合ペプチド。
【請求項５】
請求項１に記載の合成ペプチドおよび治療薬を含む融合ペプチド。
【請求項６】
前記検出可能部分が、放射標識、蛍光色素分子または磁気撮像用造影剤である、請求項４に記載の融合ペプチド。
【請求項７】
前記治療薬が抗腫瘍薬である、請求項５に記載の融合ペプチド。
【請求項８】
前記抗腫瘍薬が、化学療法薬、放射線療法薬または免疫療法薬である、請求項７に記載の融合ペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はがん幹細胞を標的とする合成ペプチドに関し、本発明はさらに、前記合成ペプチドを治療薬とともに含有する医薬組成物に関する。別の一態様において、本発明はがん幹細胞を特異的に標的とするペプチドのスクリーニング法に関する。
【背景技術】
【０００２】
急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）のがん幹細胞（ＣＳＣ）が初めて１９９４年に発見されて以来、ＣＳＣの同定はさらに乳がん、脳腫瘍、肝臓がん、結腸がん、肺がん、すい臓がんで行なわれた。正常な幹細胞の自己再生活性のほかに、ＣＳＣは化学療法、放射線療法、低酸素、免疫監視機構に対して耐性を持つ。さらに、ＣＳＣはがん再発の主な原因と考えられている。
【０００３】
治療、イメージング及びその他目的のために、がん幹細胞を特異的に標的とする薬剤が必要とされている
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
一態様において、本発明は、配列番号１〜配列番号１５までのいずれかのアミノ酸配列からなる、がん幹細胞を標的とする合成ペプチドを提供する。
【０００５】
本発明の一実施態様において、前記合成ペプチドはがんを診断することにおける使用のためのものである。本発明の別のいくつかの実施態様によれば、前記ペプチドは治療薬をがん幹細胞に標的化することにおける使用のためのものである。
【０００６】
本発明によれば、前記合成ペプチドは検出可能部分（ｄｅｔｅｃｔａｂｌｅ  ｍｏｉｅｔｙ）に融合されて（ｆｕｓｅｄ）もよい。本発明の特定の実施態様において、前記検出可能部分は、放射標識、蛍光色素分子、または磁気撮像用造影剤である。
【０００７】
本発明によれば、前記合成ペプチドは治療薬に融合されてもよい。本発明の特定の好ましい実施態様において、前記治療薬は抗腫瘍薬である。前記抗腫瘍薬は、化学療法薬、放射線療法薬、または免疫療法薬を含むが、これらに限らない。
【０００８】
別の一態様において、本発明は、本発明に基づいた合成ペプチドと、薬学的に許容可能な担体または希釈剤を含む組成物を提供する。好ましくは、前記合成ペプチドが治療薬に融合される。
【０００９】
さらに一態様において、本発明はがん幹細胞を特異的に標的とするペプチドをスクリーニングする方法を提供し、前記方法は、ファージ発現システム（ｐｈａｇｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ）を使用してオリゴペプチドライブラリーを確立する工程と、前記ライブラリー中のファージをがん細胞株のバルク腫瘍細胞（ｂｕｌｋ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ）の培養物に接触させる工程と、バルク腫瘍細胞に結合しないファージを前記がん細胞株のがん幹細胞またはがん幹細胞様細胞の培養物に接触させる工程と、前記がん幹細胞またはがん幹細胞様細胞に結合するファージから、がん幹細胞を特異的に標的とするペプチドをスクリーニングする工程と、を含む。
【００１０】
前述の概要の説明と、以下の詳細な説明は、本発明を限定するものではなく、例示と説明のみを目的としていると理解されるべきである。
【００１１】
本発明の前述の概要、および以下の詳細な説明は、添付の図面を参照しながら読むことでより理解されるであろう。本発明の例示を目的として、現時点で好ましい実施形態が図面に記載されている。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１Ａ】がん幹細胞（ＣＳＣ）ホーミングペプチド（ＨＰ）のＣＳＣへの選択的結合を示す図である。ローダミンＢで標識されたＣＳＣ  ＨＰ１（Ｒｄ-ＣＳＣ  ＨＰ-１とＣＳＣ  ＨＰ２（Ｒｄ-ＣＳＣ  ＨＰ-２）、およびＦＩＴＣで標識されたＣＳＣ  ＨＰ１１（ＦＩＴＣ-ＣＳＣ  ＨＰ-１１）がＥＭＴ６  ＣＳＣとＣＣの染色に直接使用された。細胞はＤＡＰＩで対比染色された。同一の撮影条件で蛍光画像が撮影された。
【図１Ｂ】ＣＳＣ  ＨＰのＣＳＣへの選択的結合を示す図である。ＥＭＴ-６、ＣＴ２６、Ｈｅｐａ１-６、ＰＡＮＣ-１のＣＳＣが、Ｒｄ-ＣＳＣ  ＨＰ-１、Ｒｄ-ＣＳＣ  ＨＰ-２、ＦＩＴＣ-ＣＳＣ  ＨＰ-３、ＦＩＴＣ-ＣＳＣ  ＨＰ-８、ＦＩＴＣ-ＣＳＣ  ＨＰ-９、ＦＩＴＣ-ＣＳＣ  ＨＰ-１０またはＦＩＴＣ-ＣＳＣ  ＨＰ-１１で個別に染色された。同一の撮影条件で蛍光画像が撮影された。
【図２】ＣＳＣ  ＨＰ-ｈＰ１-ＤｓＲｅｄのＰＡＮＣ-１ ＣＣ及びＣＳＣへの結合を示す図である。最終濃度２５μｇ／ｍＬのＣＳＣ  ＨＰ-ｈＰ１-ＤｓＲｅｄ組換えタンパク質がＰＡＮＣ-１ ＣＣとＣＳＣの染色に使用された。矢印はＰＡＮＣ-１ ＣＣのケースで観察された弱いシグナルを示す。
【図３Ａ】グリカンマイクロアレイと免疫蛍光染色（ＩＦ）により分析されたＣＳＣ ＨＰの標的を示し、ビオチン標識されたＣＳＣ ＨＰ-ｈＰ１のグリカンマイクロアレイ分析結果を示す。
【図３Ｂ】ビオチン標識されたＣＳＣ ＨＰ-９のグリカンマイクロアレイ分析結果を示す。
【図３Ｃ】グロボ系グリカン（グリカン２６）対ラクト／ネオラクト系グリカン（グリカン１９）シグナルの相対強度を示すグラフである。１５のＣＳＣ ＨＰから収集された同じマイクロアレイの陽性対照シグナル３で標準化（ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ）されている。
【図３Ｄ】１５のＣＳＣ ＨＰからのグリカン６３とグリカン６９シグナルの相対強度を示すグラフである。
【図３Ｅ】ＣＳＣ  ＨＰ-１０、ＣＳＣ  ＨＰ-１１、ＣＳＣ  ＨＰ-ｈＰ２チップから収集された、グリカン６６（Gal−β-1,3-GalNAc-β-）、グリカン６７（Gal−β-1,3-(Neu5Ac-α−2,6)-GalNAc-β-）、グリカン６８（Neu5Ac-α−2,6-Gal−β-1,3-GalNAc-β-）、グリカン６９（Neu5Ac−α-2,6-Gal−β-1,3-(Neu5Ac−α-2,6)-GalNAc-β-）、グリカン７０（Neu5Ac−α-2,3-Gal-β−1,3-(Neu5Ac−α-2,6)-GalNAc-β-）シグナルの相対強度を示すグラフである。
【図３Ｆ】グロボ系（ＳＳＥＡ-４とＧｂＨ）、ラクト／ネオラクト（Ｌｃ／ｎＬｃ）系（ＳＳＥＡ-１とＳＳＥＡ-５）、ルイスＹに対するモノクローナル抗体で実施された、ＰＡＮＣ-１ ＣＳＣ上の幹細胞特異的グリカンマーカーのＩＦ画像である。
【図４Ａ】オリジナルのＭ１３  ＰｈＤ７ライブラリーからＥＭＴ６ ＣＳＣ  ＨＰ-ライブラリーを作製する一次スクリーニングと、ＣＴ２６ ＣＳＣ  ＨＰ-ライブラリー、Ｈｅｐａ１-６ ＣＳＣ  ＨＰ-ライブラリー、ＣＳＣ／ＥＳＣ  ＨＰ-ライブラリー、ＣＳＣ  ＨＰ-ライブラリーを生成するための二次スクリーニングを示すフローチャートである。
【図４Ｂ】ＰＡＮＣ-１ ＣＳＣ  ＨＰ-ライブラリーの確立を示すフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
別途定義されている場合を除き、ここで使用されるすべての技術的および科学的用語は、当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を持つ。
【００１４】
一態様において、本発明は、配列番号１〜配列番号１５までのいずれかのアミノ酸配列からなる、がん幹細胞を標的とする合成ペプチドを提供する。本発明の合成ペプチドは、選択的に、または特異的に、がん幹細胞にホーミングし、従って、全身投与された治療薬をがん幹細胞に選択的に標的化するためのコンジュゲートの形態で役立つ。そのような治療薬の選択的標的化は、がん幹細胞に送達される薬剤の有効量を増加すると同時に、体の他の細胞または他の部分にそのような薬剤が副作用を生じる可能性を減少する。
【００１５】
本明細書で使用される「がん幹細胞（ＣＳＣ）」という用語は、例えばマウスやヒトなど哺乳動物のがん幹細胞を指す。
【００１６】
本発明の合成ペプチドは、ＣＳＣにホーミングする、ＣＳＣを標的とする、またはＣＳＣに特異的に結合するが、（通常の）腫瘍細胞（ＣＣ）には結合しない、または非常に弱く結合する。前記がん幹細胞は、乳がん、肝臓がん、すい臓がん、結腸がんを含むがこれらに限らない、がんのものである。
【００１７】
本発明の一実施態様によれば、前記合成ペプチドは、アミノ酸配列ＳＱＰＴＷＭＦ（配列番号１）（ＣＳＣ ＨＰ-１とも呼ばれる）からなる。一実施態様において、ＣＳＣ ＨＰ-１は、乳がんのＣＳＣにホーミングする、ＣＳＣを標的とする、またはＣＳＣに特異的に結合する。別の一実施態様において、ＣＳＣ ＨＰ-１は、結腸がんのＣＳＣにホーミングする、ＣＳＣを標的とする、またはＣＳＣに特異的に結合する。
【００１８】
本発明の一実施態様によれば、前記合成ペプチドは、アミノ酸配列ＧＭＭＳＳＰＰ（配列番号２）（ＣＳＣ ＨＰ-２とも呼ばれる）からなる。一実施態様において、ＣＳＣ ＨＰ-２は、乳がんのＣＳＣにホーミングする、ＣＳＣを標的とする、またはＣＳＣに特異的に結合する。別の一実施態様において、ＣＳＣ ＨＰ-２は、結腸がんのＣＳＣにホーミングする、ＣＳＣを標的とする、またはＣＳＣに特異的に結合する。
【００１９】
本発明の一実施態様によれば、前記合成ペプチドは、アミノ酸配列ＦＳＧＧＧＮＨ（配列番号３）（ＣＳＣ ＨＰ-３とも呼ばれる）からなる。一実施態様において、ＣＳＣ ＨＰ-３は、乳がんのＣＳＣにホーミングする、ＣＳＣを標的とする、またはＣＳＣに特異的に結合する。別の一実施態様において、ＣＳＣ ＨＰ-３は、結腸がんのＣＳＣにホーミングする、ＣＳＣを標的とする、またはＣＳＣに特異的に結合する。別の一実施態様において、ＣＳＣ ＨＰ-３は、肝臓がんのＣＳＣにホーミングする、ＣＳＣを標的とする、またはＣＳＣに特異的に結合する。
【００２０】
本発明の一実施態様によれば、前記合成ペプチドは、アミノ酸配列ＦＰＦＴＫＮＬ（配列番号４）（ＣＳＣ ＨＰ-４とも呼ばれる）からなる。一実施態様において、ＣＳＣ ＨＰ-４は、乳がんのＣＳＣにホーミングする、ＣＳＣを標的とする、またはＣＳＣに特異的に結合する。
【００２１】
本発明の一実施態様によれば、前記合成ペプチドは、アミノ酸配列ＡＴＹＧＮＬＷ（配列番号５）（ＣＳＣ ＨＰ-５とも呼ばれる）からなる。一実施態様において、ＣＳＣ ＨＰ-５は、乳がんのＣＳＣにホーミングする、ＣＳＣを標的とする、またはＣＳＣに特異的に結合する。別の一実施態様において、ＣＳＣ ＨＰ-５は、結腸がんのＣＳＣにホーミングする、ＣＳＣを標的とする、またはＣＳＣに特異的に結合する。
【００２２】
本発明の一実施態様によれば、前記合成ペプチドは、アミノ酸配列ＹＨＭＰＡＬＭ（配列番号６）（ＣＳＣ ＨＰ-６とも呼ばれる）からなる。一実施態様において、ＣＳＣ ＨＰ-６は、乳がんのＣＳＣにホーミングする、ＣＳＣを標的とする、またはＣＳＣに特異的に結合する。別の一実施態様において、ＣＳＣ ＨＰ-６は、結腸がんのＣＳＣにホーミングする、ＣＳＣを標的とする、またはＣＳＣに特異的に結合する。
【００２３】
本発明の一実施態様によれば、前記合成ペプチドは、アミノ酸配列ＨＧＧＶＲＬＹ（配列番号７）（ＣＳＣ ＨＰ-７とも呼ばれる）からなる。一実施態様において、ＣＳＣ ＨＰ-７は、乳がんのＣＳＣにホーミングする、ＣＳＣを標的とする、またはＣＳＣに特異的に結合する。別の一実施態様において、ＣＳＣ ＨＰ-７は、結腸がんのＣＳＣにホーミングする、ＣＳＣを標的とする、またはＣＳＣに特異的に結合する。
【００２４】
本発明の一実施態様によれば、前記合成ペプチドは、アミノ酸配列ＥＬＴＰＬＴＬ（配列番号８）（ＣＳＣ ＨＰ-８とも呼ばれる）からなる。一実施態様において、ＣＳＣ ＨＰ-８は、乳がんのＣＳＣにホーミングする、ＣＳＣを標的とする、またはＣＳＣに特異的に結合する。別の一実施態様において、ＣＳＣ ＨＰ-８は、結腸がんのＣＳＣにホーミングする、ＣＳＣを標的とする、またはＣＳＣに特異的に結合する。
【００２５】
本発明の一実施態様によれば、前記合成ペプチドは、アミノ酸配列ＧＰＳＡＳＲＮ（配列番号９）（ＣＳＣ ＨＰ-１０とも呼ばれる）からなる。一実施態様において、ＣＳＣ ＨＰ-１０は、乳がんのＣＳＣにホーミングする、ＣＳＣを標的とする、またはＣＳＣに特異的に結合する。
【００２６】
本発明の一実施態様によれば、前記合成ペプチドは、アミノ酸配列ＧＬＡＰＦＮＡ（配列番号１０）（ＣＳＣ ＨＰ-１１とも呼ばれる）からなる。一実施態様において、ＣＳＣ ＨＰ-１１は、乳がんのＣＳＣにホーミングする、ＣＳＣを標的とする、またはＣＳＣに特異的に結合する。
【００２７】
本発明の一実施態様によれば、前記合成ペプチドは、アミノ酸配列ＫＩＹＴＴＬＤ（配列番号１１）（ＣＳＣ ＨＰ-９とも呼ばれる）からなる。
【００２８】
本発明の一実施態様によれば、前記合成ペプチドは、アミノ酸配列ＮＬＱＰＰＡＹ（配列番号１２）（ＣＳＣ ＨＰ-１２とも呼ばれる）からなる。
【００２９】
本発明の一実施態様によれば、前記合成ペプチドは、アミノ酸配列ＧＰＫＶＴＩＷ（配列番号１３）（ＣＳＣ ＨＰ-Ｈｐ１とも呼ばれる）からなる。一実施態様において、ＣＳＣ ＨＰ-Ｈｐ１は、すい臓がんのＣＳＣにホーミングする、ＣＳＣを標的とする、またはＣＳＣに特異的に結合する。
【００３０】
本発明の一実施態様によれば、前記合成ペプチドは、アミノ酸配列ＧＳＰＶＭＳＷ（配列番号１４）（ＣＳＣ ＨＰ-Ｈｐ２とも呼ばれる）からなる。一実施態様において、ＣＳＣ ＨＰ-Ｈｐ２は、すい臓がんのＣＳＣにホーミングする、ＣＳＣを標的とする、またはＣＳＣに特異的に結合する。
【００３１】
本発明の一実施態様によれば、前記合成ペプチドは、アミノ酸配列ＹＨＱＶＫＰＨ（配列番号１５）（ＣＳＣ ＨＰ-Ｈｐ３とも呼ばれる）からなる。一実施態様において、ＣＳＣ ＨＰ-Ｈｐ３は、すい臓がんのＣＳＣにホーミングする、ＣＳＣを標的とする、またはＣＳＣに特異的に結合する。
【００３２】
本発明の合成ペプチドは、例えば化学合成など、従来の方法で作製または合成することができる。
【００３３】
本発明の特定の実施態様によれば、前記合成ペプチドはがんを診断することにおける使用のためのものである。本発明の別のいくつかの実施態様によれば、前記合成ペプチドは治療薬をがん幹細胞に標的化することにおける使用のためのものである。
【００３４】
本発明によれば、前記合成ペプチドは検出可能部分（ｄｅｔｅｃｔａｂｌｅ  ｍｏｉｅｔｙ）に融合されて（ｆｕｓｅｄ）もよい。本発明の特定の実施態様において、前記検出可能部分は、放射標識、蛍光色素分子、または磁気撮像用造影剤である。
【００３５】
本発明によれば、前記合成ペプチドは治療薬に融合されてもよい。本発明の特定の好ましい実施態様において、前記治療薬は抗腫瘍薬である。前記抗腫瘍薬は、化学療法薬、放射線療法薬、または免疫療法薬を含むが、これらに限らない。本明細書で使用される「免疫療法薬」という用語は、その薬剤によって治療される被験者の免疫系を治療的に強化または抑制する薬剤を指す。
【００３６】
前述の検出可能部分または治療薬は、例えば、共有結合、またはイオン結合を通じた結合により、本発明の合成ペプチドに直接または間接的に結合または融合することができる。
【００３７】
別の一態様において、本発明は、本発明に基づいた合成ペプチドと、薬学的に許容可能な担体または希釈剤を含む組成物を提供する。好ましくは、前記合成ペプチドが治療薬に融合される。前記組成物は医薬組成物として使用してもよい。前記組成物は、前記合成ペプチドを薬学的に許容可能な担体または希釈剤と混合する、または前記ペプチドを薬学的に許容可能な担体または希釈剤と化学的に結合させることで作製することができる。
【００３８】
本発明の合成ペプチドまたは組成物は、静脈投与により必要とする被験者に投与することができる。
【００３９】
さらに一態様において、本発明はがん幹細胞を特異的に標的とするペプチドをスクリーニングする方法を提供し、前記方法は、ファージ発現システム（ｐｈａｇｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ）を使用してオリゴペプチドライブラリーを確立する工程と、ライブラリー中のファージをがん細胞株のバルク（通常の）腫瘍細胞の培養物に接触させる工程と、バルク腫瘍細胞に結合しないファージを前記がん細胞株のがん幹細胞またはがん幹細胞様細胞の培養物に接触させる工程と、前記がん幹細胞に結合するファージから、がん幹細胞を特異的に標的とするペプチドをスクリーニングする工程と、を含む。
【００４０】
本発明の好ましい実施態様によれば、前記がん幹細胞またはがん幹細胞様細胞は、通常の腫瘍細胞から作製された腫瘍塊（ｔｕｍｏｒｏｓｐｈｅｒｅ）に由来する（Weiswald et al.、Neoplasia、17(1): 1-15(2015)）。前記腫瘍塊は無血清培養法により作製することができる。例えば、Eramo et al.、Cell Death Differentiation、15: 504-514(2008)；Cioce et al.、Cell Cycle、9: 2878-2887(2010)；Cao et al.、BMC Gastroenterol.、11: 71(2011)；またはChen et al.,、Clin.Exp.Metastasis、28(8): 751-763(2011)に方法が開示されている。
【００４１】
先行技術において、一つには細胞培養によって取得できるがん幹細胞の量が少ないため、（通常の）がん細胞を標的とするペプチドまたはその他物質がほとんどの注目を集めてきた。さらに、発明者の知る限りにおいて、通常のがん細胞には結合せず、がん幹細胞またはがん幹細胞様細胞に結合するペプチドをスクリーニングする方法が提示されたことはない。しかしながら、発明者は、前述の方法を通じ、腫瘍塊に由来するがん幹細胞またはがん幹細胞様細胞を使用して、がん幹細胞に特異的に結合するペプチドを効果的にスクリーニングできることを予期せず発見した。
【００４２】
以下、限定ではなく例示を目的として提供される次の実施例により、本発明についてさらに説明する。
【実施例】
【００４３】
材料および方法
【００４４】
１. がん細胞とがん幹細胞（ＣＳＣ）の培養
【００４５】
ＣＳＣはＣＤ４４やＣＤ１３３などの表面マーカーによってエンリッチできるが、研究にはＣＳＣを選択的に増殖できる実践的で簡潔な方法が不可欠であった。ヒト肺ＣＳＣを懸濁状態で選択的に増殖できる先駆的な無血清培養法が２００８年に開発された（Eramo et al.、Cell Death Differentiation、15: 504-514(2008)）。それ以降、乳房（Cioce et al.、Cell Cycle、9: 2878-2887(2010)）、肝臓（Cao et al.、BMC Gastroenterol.、11: 71(2011)）、結腸（Chen et al.、Clin.Exp.Metastasis、28(8): 751-763(2011)）のＣＳＣが報告された。ＣＳＣはスフィア様の凝集された形状で増殖し、腫瘍塊としての命名が示唆された（Weiswald et al.、Neoplasia、17(1): 1-15(2015)）。
【００４６】
組換え成長因子がＰｅｐｒｏＴｅｃｈより購入された。マウス乳がんＥＭＴ６、肝臓がんＨｅｐａ１-６、ヒト膵管腺がんＰＡＮＣ-１細胞株が１０％ＦＣＳを添加したＤＭＥＭで維持された。マウス結腸がんＣＴ２６細胞株が１０％ＦＣＳを添加したＲＰＭＩ１６４０で培養された。ＣＳＣ用基礎培地はグルタミン２ｍＭを添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２で、ＥＭＴ６ ＣＳＣ用添加物は２５ｎｇ／ｍＬのｒｍＥＧＦ、２５ｎｇ／ｍＬのｒｍＦＧＦ２、５μｇ／ｍＬのインスリン、４μｇ／ｍＬのヘパリン、０.５μｇ／ｍＬのヒドロコルチゾン、１％のＢＳＡで、ＣＴ２６ ＣＳＣ用添加物は、２０ｎｇ／ｍＬのｒｍＥＧＦ、５μｇ／ｍＬのインスリン、２％のＢ２７、０.４％のＢＳＡで、Ｈｅｐａ１-６ ＣＳＣ用添加物は、２０ｎｇ／ｍＬのｒｍＥＧＦ、１０ｎｇ／ｍＬのｒｍＦＧＦ２、２％のＢ２７、１％のＮ２で、ＰＡＮＣ-１ ＣＳＣ用添加物は、２％のＢ２７と２０ｎｇ／ｍＬのｒｈＦＧＦ２であった。腫瘍塊を作製するために、がん細胞が無血清培地で、低密度（例：＜１０４ 細胞／ｍＬ）培養された。７日間のインキュベーション後、腫瘍塊が４０μmの細胞ろ過フィルターを使用して採取され、それらは室温で９００×ｇ、５分間遠心分離された。腫瘍塊のペレットがトリプシンによって単細胞に解離され、その後得られた細胞が再び７日間腫瘍塊に増殖された。成長因子が１日おきに補充され、増殖の３〜５ラウンド目で単離された腫瘍塊が実験に使用された。
【００４７】
２. Ｍ１３ファージディスプレイ
【００４８】
１０９の独立クローンを含むＭ１３  ＰｈＤ-７ライブラリー（ＮＥＢ、Ｅ８１００）がＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｉｎｃ．より購入された。ＤＭＥＭ  １０ ｍＬ中のＭ１３  ＰｈＤ-７ファージの１０１３プラーク形成単位（ｐｆｕ）が、Ｔ７５フラスコで２回、毎回１時間ずつ、がん細胞により吸着処理された。続いて、上清が５×１０６のＣＳＣを含むＴ２５フラスコに移され、１時間培養された。非結合および弱結合のファージが遠心分離と、ＤＭＥＭ／０／２％ＢＳＡ中での３回の懸濁で除去された。細胞ペレットが１０９の大腸菌ＥＲ２７３８を含む１ｍＬのＰＢＳ中で懸濁され、振とう機で１時間培養された。その後１０ｍＬのＬＢ／５ｍＭ  ＭｇＣｌ２が添加された。３７℃でのオーバーナイト培養後、遠心分離で細胞が除去され、上清中のファージが滴定された。前述の選択手順がＥＭＴ６とＰＡＮＣ-１について３ラウンド実施され、それぞれプライマリＥＭＴ６ ＣＳＣホーミングペプチド（ＨＰ）-とＰＡＮＣ-１ ＣＳＣ ＨＰ-ライブラリーが取得された。その後、Ｍ１３プラークがピックアップされ、シークエンシングのためのＤＮＡが作製された。ＥＭＴ６ ＣＳＣ ＨＰ-ライブラリーがさらにＣＴ２６ ＣＳＣ、Ｈｅｐａ１-６ ＣＳＣ、およびマウス胚性幹細胞（ｍＥＳＣ）により再び選択され、セカンダリＣＴ２６ ＣＳＣ ＨＰ-、Ｈｅｐａ１-６ ＣＳＣ ＨＰ-、ＣＳＣ／ＥＳ  ＨＰ-ライブラリーが作製された。ｍＥＳＣ吸着後の非結合分画が収集され、ＣＳＣ  ＰＨ-ライブラリーとして割り当てられた。図４Ａと図４Ｂを参照する。
【００４９】
３. ＣＳＣ ＨＰのＣＳＣへの結合
【００５０】
２０μｇ／ｍＬのローダミンＢで標識されたＣＳＣ  ＨＰ１（Ｒｄ-ＣＳＣ  ＨＰ-１とＣＳＣ  ＨＰ２（Ｒｄ-ＣＳＣ  ＨＰ-２）、およびＦＩＴＣで標識されたＣＳＣ  ＨＰ１１（ＦＩＴＣ-ＣＳＣ  ＨＰ-１１）がＥＭＴ６  ＣＳＣとＣＣの染色に直接使用された。細胞はＤＡＰＩで対比染色された。
【００５１】
４. グリカンマイクロアレイ分析
【００５２】
下の表Ａに記載された配列を持つＮ末端ビオチン結合性ＣＳＣ ＨＰが純度９５％以上のＧｅｎｅＤｉｒｅｘにより合成された。ビオチン-ＣＳＣ ＨＰがＤＭＳＯ中で溶解され、１０ｍｇ／ｍＬのストックが作製された。
【００５３】
ビオチン標識されたＣＳＣ  ＨＰ
【表Ａ】
0006636413.tif 000002
【００５４】
Ｇｌｙｃａｎ  Ａｒｒａｙ  １００マイクロチップ（Ｃａｔ．＃  ＧＡ−Ｇｌｙｃａｎ−１００）がＲａｙＢｉｏｔｅｃｈより購入され、メーカーの指示に従い、かつ若干の変更を加えて処理された。簡単に説明すると、４００μＬのサンプル希釈剤（Ｓａｍｐｌｅ  Ｄｉｌｕｅｎｔ）（Ｉｔｅｍ  Ｅ）で、室温で３０分間ブロッキングした後、ビオチン結合性ＣＳＣ ＨＰがサンプル希釈剤１μｇ／４００μＬで希釈され、室温で２時間ハイブリダイゼーション反応が実施された。洗浄後、４００μＬの１×Ｃｙ３標識ストレプトアビジンが各ウェルに添加された。暗室での培養中光線への暴露を避けるため、培養チャンバがプラスチック粘着ストリップで覆われ、スライドがアルミホイルで覆われた。スライドがＣｙ３標識ストレプトアビジンとともに室温で１時間、そっと揺動または振とうさせながら培養された。しっかり洗浄した後、スライドは完全に流され、その上の蛍光シグナルがレーザースキャナーＡｘｏｎ  ＧｅｎｅＰｉｘで読み取られた。グリカンＸの相対強度が（Ｘの平均 - 陰性対照）／（陽性対照 - 陰性対照）×１００％として定義された。
【００５５】
５. 免疫蛍光染色（ＩＦ）アッセイ
【００５６】
一次抗体ウサギポリクローナル抗ＣＤ４４（ＧＴＸ１０２１１１）、抗Ｅ-カドヘリン（ＧＴＸ６１８２３）、抗ＣＤＳＮ（ＧＴＸ１１００９３）およびマウスモノクローナル抗ＳＳＥＡ-１（ＩｇＭ、ＧＴＸ４８０３８）、抗ＳＳＥＡ-５（ＩｇＧ、ＧＴＸ７００１９）、抗ルイスＹ（ＩｇＭ、ＧＴＸ７５９０３）がＧｅｎｅＴｅｘより購入され、マウスモノクローナル抗ＳＳＥＡ-４（ＩｇＧ、９０２３０）、抗ＴＲＡ-１-６０およびＴＲＡ-１-８１（ＩｇＭ、９０２３２中）がＭｉｌｌｉｐｏｒｅより購入され、マウスモノクローナル抗ＧｂＨ（ＩｇＭ、ＡＬＸ-８０４-５５０）がＥｎｚｏより購入された。二次抗体ＤｙＬｉｇｈｔ５９４標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（１１１-５１５-１４４）とＤｙＬｉｇｈｔ４８８標識ロバ抗マウスＩｇＧ（７１５-４８５-１５１）がＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂ．より取得され、ＤｙＬｉｇｈｔ５９４標識ヤギ抗マウスＩｇＭ（ＧＴＸ７６７５４）がＧｅｎｅＴｅｘより取得された。がん細胞と腫瘍塊が４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳにより固定され、０.５％ＮＰ-４０／１％ＢＳＡ／ＰＢＳ（ＰＢＳＮＢ）により透過処理された。その後、細胞はＰＢＳＮＢ中で５０〜１００倍希釈された一次抗体で２時間培養された。０.０５％ＮＰ-４０／ＰＢＳ（ＰＢＳＮ）で４回洗浄した後、細胞は二次抗体（ＰＢＳＮＢ中で１／２００希釈）で２時間培養された。ＰＢＳＮで４回洗浄し、水で１回簡単に洗浄した後、細胞はＤＡＰＩとともにマウントされた。
【実施例１】
【００５７】
マウスＥＭＴ６、ＣＴ２６、Ｈｅｐａ１-６  ＣＳＣの同定
【００５８】
がん幹細胞に特異的なM１３ファージによってディスプレイされたペプチドを選択する基準は、ＣＳＣとがん細胞（ＣＣ）間の表面の特徴の違いに依存する。腫瘍塊の形態で作製されたマウスＥＭＴ６、ＣＴ２６、Ｈｅｐａ１-６  ＣＳＣ（データは示されていない）は、特異的な幹細胞表面マーカーによって同定された。幹細胞表面マーカーＴＲＡ-１-６０は３つすべてのＣＳＣで高度に発現されたが、対応するＣＣでの発現が少ない、または検出不能であった一方で、構成的に発現された表面タンパク質コルネデスモシン（ＣＤＳＮ）はＣＳＣとＣＣの両方で検出された（データは示されていない）。ＥＭＴ６ ＣＳＣで弱く発現されたものとして示されたＳＳＥＡ-４を除き、すべてのヒトＣＳＣ一般マーカー、ＣＤ４４とＥ-カドヘリン、及び多能性幹細胞マーカー、ＳＳＥＡ-１、ＳＳＥＡ-５、ＴＲＡ-１-６０、ＴＲＡ-１-８１が３つのマウスＣＳＣのすべてで強く発現されることが示された（データは示されていない）。
【実施例２】
【００５９】
プライマリＥＭＴ６ ＣＳＣ ＨＰ-ライブラリー
【００６０】
ＣＳＣ特異的ＨＰを調べるために、Ｍ１３  ＰｈＤ７ヘプタペプチドライブラリーがＥＭＴ６ ＣＣにより吸着処理され、一般的がんＨＰが除去された後、自由なファージがポジティブセレクションのためにＥＭＴ６ ＣＳＣに移された。ＥＭＴ６  ＣＳＣに結合したファージが捕捉され、大腸菌ER２７３８で増幅された。前述の選択手順が３ラウンド実施され、エンリッチされたプライマリＥＭＴ６ ＣＳＣ ＨＰライブラリーが作製された。独立したプラークが無作為に選ばれ、３１の有効な配列が読み取られ、下の表１にまとめられた。
【００６１】
プライマリ及びセカンダリＣＳＣ ＨＰ-ライブラリーでＣＳＣ ＨＰ配列が検出された回数
【表１】
0006636413.tif 000003
【００６２】
ペプチドＳＱＰＴＷＭＦ（ＣＳＣ ＨＰ-１と呼ばれる）（配列番号１）、ＧＭＭＳＳＰＰ（ＣＳＣ ＨＰ-２と呼ばれる）（配列番号２）、ＦＳＧＧＧＮＨ（ＣＳＣ ＨＰ-３と呼ばれる）（配列番号３）、ＦＰＦＴＫＮＬ（ＣＳＣ ＨＰ-４と呼ばれる）（配列番号４）、ＡＴＹＧＮＬＷ（ＣＳＣ ＨＰ-５と呼ばれる）（配列番号５）はそれぞれ１０、６、５、３、２回見られた。ペプチドＹＨＭＰＡＬＭ（ＣＳＣ ＨＰ-６と呼ばれる）（配列番号６）、ＨＧＧＶＲＬＹ（ＣＳＣ ＨＰ-７と呼ばれる）（配列番号７）、ＥＬＴＰＬＴＬ（ＣＳＣ ＨＰ-８と呼ばれる）（配列番号８）、ＧＰＳＡＳＲＮ（ＣＳＣ ＨＰ-１０と呼ばれる）（配列番号９）、ＧＬＡＰＦＮＡ（ＣＳＣ ＨＰ-１１と呼ばれる）（配列番号１０) は１回見られた。Ｍ１３  ＰｈＤ７ライブラリーは１０９の独立クローンを含むと予測されたため、選択手順は非常に効果的であると結論付けることができる。
【実施例３】
【００６３】
セカンダリＣＴ２６ ＣＳＣ ＨＰ-、Ｈｅｐａ１-６ ＣＳＣ ＨＰ-、ＣＳＣ／ＥＳＣ  ＨＰ-、ＣＳＣ ＨＰ-ライブラリー
【００６４】
異なる種類のがんに対するＣＳＣ ＨＰアフィニティのバイアスを試験するためにプライマリＣＳＣ ＨＰ-ライブラリーがＣＴ２６またはＨｅｐａ１-６ ＣＳＣのいずれかにより直接一度選択された。表１に示すように、ＣＳＣ ＨＰ-８とＣＳＣ ＨＰ-３はそれぞれＣＴ２６とＨｅｐａ１-６ ＣＳＣにより特異的であった。ＣＳＣと胚性幹細胞（ＥＳＣ）間のＣＳＣ ＨＰアフィニティのバイアスはもう１つの興味深い問題であった。ＣＳＣ ＨＰ-１はＥＳＣ結合分画（ＣＳＣ／ＥＳＣ-ＨＰ-ライブラリー）でさらにエンリッチされた。２つの新しいペプチド配列、ＫＩＹＴＴＬＤ（ＣＳＣ ＨＰ-９）（配列番号１１）とＮＬＱＰＰＡＹ（ＣＳＣ ＨＰ-１２）（配列番号１２）がＥＳＣ非結合分画（ＣＳＣ ＨＰ-ライブラリー）で読み取られた（表１）。
【実施例４】
【００６５】
ＣＳＣ ＨＰとＣＳＣ間の相互作用
【００６６】
上述の結果に従い、ＣＳＣ ＨＰ-１、ＣＳＣ ＨＰ-２、ＣＳＣ ＨＰ-３、ＣＳＣ ＨＰ-８、ＣＳＣ ＨＰ-９、ＣＳＣ ＨＰ-１０、ＣＳＣ ＨＰ-１１が選択され、Ｎ末端結合でローダミンＢまたはフルオレセインと化学合成された。これらペプチドのすべてがＥＭＴ６、ＣＴ２６、Ｈｅｐａ１-６  ＣＳＣと特異的に結合した。それらは並行ＣＣ実験では検出不能であった（図１Ａと図１Ｂ）。マウスのがんに由来するこれらＣＳＣ  ＨＰがヒトＣＳＣを認識できるか否かの判定は興味を引いた。ヒトすい臓がん細胞株ＰＡＮＣ-１から作製された腫瘍塊は７つのペプチドに確実に結合することが分かった（図１Ｂ）。
【実施例５】
【００６７】
プライマリＰＡＮＣ-１ ＣＳＣ ＨＰライブラリー
【００６８】
マウスＣＳＣによって選択されたＣＳＣ ＨＰがヒトＣＳＣとも交差反応するなら、ヒトＣＳＣにより選択されたＣＳＣ  ＨＰはマウスＣＳＣと結合できるだろうか。ＥＭＴ６ ＣＳＣ ＨＰスクリーニングと類似した手順に従い、ヒトすい臓ＰＡＮＣ-１ ＣＣでのネガティブセレクションと、ＰＡＮＣ-１ ＣＳＣでのポジティブセレクション３ラウンド後、プライマリＰＡＮＣ-１ ＣＳＣ ＨＰ-ライブラリーが確立された。独立したプラークが無作為に選ばれ、２０の有効な配列が読み取られた。ペプチドＧＰＫＶＴＩＷ（ＣＳＣ ＨＰ-ｈＰ１と記載）、ＧＳＰＶＭＳＷ（ＣＳＣ ＨＰ-ｈＰ２）、ＹＨＱＶＫＰＨ（ＣＳＣ ＨＰ-ｈＰ３）がそれぞれ１７、２、１回見られた。下の表２に示す。
【００６９】
プライマリＰＡＮＣ-１ＣＳＣ ＨＰ-ライブラリーでＣＳＣ ＨＰ配列が検出された回数
【表２】
0006636413.tif 000004
【００７０】
ＣＳＣ ＨＰ-ｈＰ系のアミノ酸配列はマウスＣＳＣ ＨＰのそれと一致しなかった。ヒトとマウス両方のＣＳＣに選択的に結合できる（データを示さない）化学合成されたＦＩＴＣ-ＣＳＣ ＨＰ-ｈＰ１に加え、ＣＳＣ ＨＰ-ｈＰ１とＰＡＮＣ-１ ＣＳＣ間の相互作用がＣＳＣ ＨＰ-ｈＰ１ペプチドのC末端に融合された大きな分子カーゴの影響を受けるか否かを試験するため、ＣＳＣ ＨＰ-ｈＰ１-ＤｓＲｅｄ組換えタンパク質が作製された。ＣＳＣ ＨＰ-ｈＰ１-ＤｓＲｅｄ組換えタンパク質は、ＰＡＮＣ-１ ＣＳＣに選択的に結合することが示された一方で、ＣＣ内のいくつかの細胞も、図２の矢印で示されるように、組換えタンパク質により染色された。
【実施例６】
【００７１】
ＣＳＣ ＨＰの標的
【００７２】
形成されたＣＳＣ ＨＰはＣＣからＣＳＣを区別することができ、この現象はヒトとマウスの異種間で確認された。これらＣＳＣ ＨＰの標的を見つけることに対する関心が高まった。ＳＤＳ  ＰＡＧＥにより分離されたＣＳＣ膜タンパク質でブロットされた（データは示さない）ニトロセルロースメンブレン上に残留するＦＩＴＣ-ＣＳＣ ＨＰの検出可能な蛍光シグナルはなかった。オリゴ糖１００種類が４回スポットされたグリカンマイクロアレイ（Ｇｌｙｃａｎ  Ａｒｒａｙ  １００マイクロチップ）を使用してオリゴ糖とＣＳＣ ＨＰ間の相互作用の可能性を分析した。表２に記載されたビオチン-ＣＳＣ ＨＰがチップ上でグリカンとハイブリダイズされた。チップ上に捕捉されたビオチン-ＣＳＣ ＨＰがＣｙ３標識ストレプトアビジンで調べられ、その蛍光シグナルがレーザースキャナーで読み取られた。２つの主要なパターンを図３Ａ〜図３Ｆに示す。最初のものはグリカン１６（Gal−β-1,4-Glc-β-）、１８（Gal-α−1,4-Gal-β−1,4-Glc-β-）、２６（GalNAc-β-１,3-Gal-α−1,4-Gal-β−1,4-Glc-β-）グロボ系を含む（図３Ａ）。典型ケースはＣＳＣ ＨＰ-１とＣＨＣ  ＨＰ-ｈＰ１であった（図３Ｃ）。グロボ系シグナルに加え、２つ目の主要なパターンは、グリカン２６のレベルに類似した、グリカン１９（GlcNAc−β-1,3-Gal−β-1,4-Glc-β-、すなわちラクト／イソラクト三糖主鎖）を含んだ（図３Ｂ）。典型ケースはＣＳＣ ＨＰ５、ＣＳＣ ＨＰ６、ＣＳＣ ＨＰ７、ＣＳＣ ＨＰ９であった（図３Ｃ）。２つの悪性腫瘍及び転移グリカンマーカー、グリカン６３（Fuc−α-1,2-Gal-β−1,4-(Fuc-α−1,3)-GlcNAc-β-、ルイスＹエピトープとも呼ばれる）と、グリカン６９（Neu5Ac−α-2,6-Gal−β-1,3-(Neu5Ac-α−2,6)-GalNAc-β-）も検出された。ＣＳＣ ＨＰ-１とＣＳＣ ＨＰ-ｈＰ１はグリカン６３においてより高いシグナルを示し、ＣＳＣ ＨＰ-９、ＣＳＣ ＨＰ-１０、ＣＳＣ ＨＰ-１１、ＣＳＣ ＨＰ-ｈＰ２、ＣＳＣ ＨＰ-ｈＰ３はグリカン６９においてより高いシグナルを示した（図３Ｄ）。２つのＮｅｕ５Ａｃ-α-２,６-残基両方がＣＳＣ ＨＰの結合に必要であった（図３Ｅ）。上述の結果によれば、ヒトすい臓がん細胞ＰＡＮＣ-１のＣＳＣが作製され、グロボ系のＣＳＣグリカンマーカー、ＳＳＥＡ-４とＧｂＨ、ラクト／イソラクト系のＳＳＥＡ-１とＳＳＥＡ-５、及びルイスＹのすべてが、図３Ｆに示すように、ＩＦアッセイによりＰＡＮＣ-１ ＣＳＣで示された。
【００７３】
グリカンマイクロアレイデータによれば、ＣＳＣ ＨＰ-１とＣＳＣ ＨＰ-ｈＰ１は強く、かつ特異的に、四糖のグロボ基本構造であるグリカン２６に結合した。一方で、ＣＳＣ ＨＰ５、ＣＳＣ ＨＰ６、ＣＳＣ ＨＰ７、ＣＳＣ ＨＰ９は、ラクト及びネオラクト基本構造四糖の母核三糖である、グリカン１９に強く結合した。それぞれ肝臓と結腸ＣＳＣに特異的と考えられたＣＳＣ ＨＰ-３とＣＳＣ ＨＰ-８は、グリカン２６に弱く結合することが分かった。ＣＳＣ ＨＰ-１とＣＳＣ ＨＰ-ｈＰ１は、グリカン６３、ルイスＹエピトープにより強く結合する２つのＣＳＣ ＨＰメンバーであった。
【図１Ａ】
0006636413.tif 000005
【図１Ｂ】
0006636413.tif 000006
【図２】
0006636413.tif 000007
【図３Ａ】
0006636413.tif 000008
【図３Ｂ】
0006636413.tif 000009
【図３Ｃ】
0006636413.tif 000010
【図３Ｄ】
0006636413.tif 000011
【図３Ｅ】
0006636413.tif 000012
【図３Ｆ】
0006636413.tif 000013
【図４Ａ】
0006636413.tif 000014
【図４Ｂ】
0006636413.tif 000015
【配列表】
0006636413000001.app