(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナス科に属する植物であって、前記植物はフィトフトラ抵抗性を提供する遺伝的形質を含み、かつ前記抵抗性形質が、フィトフトラに対して感受性であるナス科に属する植物と比較して、少なくとも２つの遺伝子の減少した発現もしくは転写、または少なくとも２つの遺伝子によりコードされるタンパク質の減少した活性を有する、少なくとも２つの遺伝子の組み合わせによりコードされており、
前記植物がアマトウガラシ（カプシクム・アンヌム）またはカプシクム属であって、前記フィトフトラ抵抗性がフィトフトラ・カプシシに対する抵抗性であり、かつ少なくとも２つの遺伝子の組み合わせが、配列番号１６および配列番号１７に記載のタンパク質、または配列番号１６および配列番号１７と少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９９％の配列同一性を有するタンパク質をコードする遺伝子である、植物。
【請求項２】
少なくとも２つの遺伝子の組み合わせが、配列番号１６および配列番号１７と少なくとも９５％の配列同一性を有するタンパク質をコードする遺伝子である、請求項１に記載の植物。
【請求項３】
少なくとも２つの遺伝子の組み合わせが、配列番号１６および配列番号１７と少なくとも９９％の配列同一性を有するタンパク質をコードする遺伝子である、請求項１に記載の植物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ナス科に属するフィトフトラ抵抗性植物であって、当該抵抗性が２つの別個の遺伝子の組み合わせによりコードされている植物に関する。本発明は、さらに、ナス科に属するフィトフトラ抵抗性植物を提供するためのこれらの遺伝子の使用、および当該遺伝子によりコードされるタンパク質に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物病原体フィトフトラ（綱：卵菌綱、目：ツユカビ目、科：フハイカビ科）は、世界的に作物に大規模な経済的損失、ならびに自然生態系に環境破壊を引き起こすことができる植物損傷卵菌類（ミズカビ）の属である。フィトフトラ病原体は、ほとんど双子葉植物の病原体であり、かつ一般的に、宿主特異的寄生体である。当該属は、１８７５年にハインリッヒ・アントン・ド・バリーによって最初に記載された。これまでに約１００種が記載され、そのうち経済的に重要な植物病原体がフィトフトラ・カプシシ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｃａｐｓｉｃｉ）、フィトフトラ・インフェスタンス（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）、およびフィトフトラ・ニコチアナエ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ）として記載されている。
【０００３】
フィトフトラ・インフェスタンスは、アイルランドの大飢饉（１８４５−１８４９）を引き起こしたジャガイモ胴枯れ病の感染性の病原体であり、かつ未だにトマトおよびジャガイモを含むナス科作物の最も破壊的な病原体のままである。ダイズの根および茎の腐敗病原体のフィトフトラ・ソジャ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｓｏｊａｅ）も、農産業に対する長年の問題を引き起こしてきた。一般的に、この属に起因する植物病は、化学的にコントロールすることが困難であり、かつ従って抵抗性品種の増加は主要な管理戦略である。他の重要なフィトフトラ病は：フィトフトラ・カクトラム（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｃａｃｔｏｒｕｍ）−これは、シャクナゲ、ツツジに影響を与えるシャクナゲ根腐れを引き起こし、かつ、広葉樹の木においてブリーディング癌腫病（ｂｌｅｅｄｉｎｇ  ｃａｎｋｅｒ）を引き起こし；フィトフトラ・カプシシ−これは、キュウリおよびカボチャなどのウリ科の果実に感染し、フィトフトラ・シンナモミ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｃｉｎｎａｍｏｍｉ）−これは、ヒノキ科クロベ属の常緑樹（ａｒｂｏｒｖｉｔａｅ）およびツツジを含む木質観賞植物に影響を与えるシナモン根腐れを引き起こし、フィトフトラ・フラガリエ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｆｒａｇａｒｉａｅ）−これは、イチゴに影響を与える赤根腐れを引き起こし；フィトフトラ・ケルノヴィアエ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｋｅｒｎｏｖｉａｅ）−オークおよびトキワガシ（ｈｏｌｍ  ｏａｋ）を含む他の木および低木でも発生する、ブナおよびシャクナゲの病原体、ココアブラックポッド病（ｃｏｃｏａ  ｂｌａｃｋ  ｐｏｄ  ｄｉｓｅａｓｅ）種の１つのフィトフトラ・メガカリャ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｍｅｇａｋａｒｙａ）は、侵襲的であり、かつおそらくアフリカでの最大のココア作物の損失の原因であり；フィトフトラ・パルミヴォラ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｐａｌｍｉｖｏｒａ）−これは、ココナッツおよびビンロウ（ｂｅｔｅｌ  ｎｕｔｓ）で果実腐れを引き起こし、フィトフトラ・ラモラム（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｒａｍｏｒｕｍ）、フィトフトラ・ケルシナ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｑｕｅｒｃｉｎａ）−これらは、オークの死を引き起こし、ならびにフィトフトラ・ソジャ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｓｏｊａｅ）−これは、ダイズ根腐れを引き起こす、である。
【０００４】
フィトフトラは時々、真菌様の生物を指すが、別の界：クロムアルベオラータ（Ｃｈｒｏｍａｌｖｅｏｌａｔａ）（過去にはストラメノパイラ（Ｓｔｒａｍｅｎｏｐｉｌａ）および以前はクロミスタ（Ｃｈｒｏｍｉｓｔａ））に分類される。フィトフトラは、形態学的には「真の」真菌と非常に類似しているが、進化史は全く別個である。真菌（ｆｕｎｇｉ）とは対照的に、クロムアルベオラータは、動物よりも植物と近縁関係にある。真菌の細胞壁は主にキチンで作られる一方、クロムアルベオラータの細胞壁はほとんどセルロースで構成されている。倍数性レベルはこれらの２つの群間で異なっており；フィトフトラは、生活の栄養（増殖性、非生殖性の）期では二倍体の（対の）染色体を有し、真菌は、この状態においてほとんどいつも半数体である。生化学的経路もまた異なり、とりわけ高度に保存されている。
【０００５】
フィトフトラは、有性的にまたは無性的に生殖し得る。多くの種において、性的構造（ｓｅｘｕａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ）は観察されていない、または研究室の接合において観察されただけである。同株性（ｈｏｍｏｔｈａｌｌｉｃ）種において、性的構造は単一培養において生じる。異株性（ｈｅｔｅｒｏｔｈａｌｌｉｃ）種は、Ａ１およびＡ２と称される接合株を有する。接合する時、蔵精器（ａｎｔｈｅｒｉｄｉｕｍ）を通過する蔵卵器（ｏｏｇｏｎｉｕｍ）（底着（ａｍｐｈｉｇｙｎｙ））、または蔵卵器の近位の（下）半分に付着する蔵精器（側着（ｐａｒａｇｙｎｙ））いずれかによって、蔵精器は蔵卵器に配偶子を導入し、ついで結合体（ｕｎｉｏｎ）が卵胞子を生産する。ほとんどの真菌類とは異なり、動物のように、減数分裂は配偶子性であり、かつ体細胞の核は二倍体である。無性（有糸分裂）胞子型は厚壁胞子および遊走子を生産する胞子嚢である。厚壁胞子は通常、球状であり着色されており、かつ生存構造としての役割において援助するための肥厚細胞壁を有してもよい。胞子嚢は、ｓｕｂｔｅｎｄｉｎｇ  ｈｙｐｈａｅによって保持されてもよく（非早落性）、または分散構造として作用する風もしくは水の張力によって容易に落ちてもよい（早落性）。また、胞子嚢は遊走子を放出してもよく、これは宿主植物に向かって泳ぐために使用する２つの異なる鞭毛を有する。
【０００６】
ナス科、またはナス属（ｎｉｇｈｔｓｈａｄｅｓ）は、経済的に重要な顕花植物の科である。当該科は、薬草から木までに及び、かつ多くの重要な農作物、薬用植物、香辛料、雑草、および観賞植物を含む。科の多くのメンバーは、強力なアルカロイドを含有し、かついくつかはきわめて有毒である。
【０００７】
ナス科はキク類群双子葉類（モクレン綱）のナス目に属する。ナス科は、生息地、形態および生態の大きな多様性を有する約９８属および約２，７００種からなる。
【０００８】
当該科は、南極大陸を除く全ての大陸で存在している世界的な分布を有する。当該種の最も大きな多様性は、南アメリカおよび中央アメリカで見つかっている。ナス科は、一般的に収集されたまたは栽培された多くの種を含む。おそらく、当該科の経済的に重要な属のほとんどはナス属であり、ジャガイモ（ソラヌム・ツベロスム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、実際には当該科の別の一般的な名称は“ジャガイモ科”）、トマト（ソラヌム・リコペルシクム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ））、ならびにナス（ａｕｂｅｒｇｉｎｅ）もしくはナス（ｅｇｇｐｌａｎｔ）（ソラヌム・メロンゲナ（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｍｅｌｏｎｇｅｎａ））を含む。別の重要な属は、トウガラシ（ｐｅｐｐｅｒｓ）ならびにアマトウガラシ（ｓｗｅｅｔ）もしくはシシトウガラシ（ｂｅｌｌ  ｐｅｐｐｅｒｓ）(カプシクム・アンヌム（Ｃａｐｓｉｃｕｍ  ａｎｎｕｕｍ））を含むカプシクム（Ｃａｐｓｉｃｕｍ）である。
【０００９】
ホオズキ属は、いわゆるグラウンドチェリー（ｇｒｏｕｎｄｃｈｅｒｒｉｅｓ）、ならびにトマティーヨ（ｔｏｍａｔｉｌｌｏ）（フィサリス・フィラデルフィカ（Ｐｈｙｓａｌｉｓ  ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉｃａ））、ケープグーズベリー（Ｃａｐｅ  ｇｏｏｓｅｂｅｒｒｙ）およびチャイニーズランタン（Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｌａｎｔｅｒｎ）を生産する。クコ属は、ボクストロン（ｂｏｘｔｈｏｒｎｓ）およびウルフベリー・リシウム・バルバルム（ｗｏｌｆｂｅｒｒｙ  Ｌｙｃｉｕｍ  ｂａｒｂａｒｕｍ）を含有する。タバコ属は、とりわけ、タバコ植物を含有する。いくつかの他の重要なナス科のメンバーは、ペチュニア、ブロワリア（Ｂｒｏｗａｌｌｉａ）およびリシアンサス（Ｌｙｃｉａｎｔｈｅｓ）などの多くの観賞植物、向精神アルカロイドの供給源であるチョウセンアサガオ、マンドラゴラ（マンドレーク）ならびにベラドンナ（Ａｔｒｏｐａ  ｂｅｌｌａｄｏｎｎａ）（デッドリーナイトシェード）を含む。特定の種は、医薬用途、向精神薬効果または有毒なものとして広く知られている。
【００１０】
タバコ（タバコ亜科（Ｎｉｃｏｔｉａｎｏｉｄｅａｅ））およびペチュニア（ペチュニア亜科（Ｐｅｔｕｎｉｏｉｄｅａｅ））を除いて、経済的に重要な属のほとんどは、ナス亜科に含有される。最後に述べるが重要でないということではなく、ナス科はタバコ、ペチュニアおよびＮ．ベンサミアナ（Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉｎｉａ）などの、細胞、分子および遺伝子レベルの基本的な生物学的疑問の研究において重要なモデル生物の多くを含む。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
ナス科の多くの植物メンバーの経済的な重要性およびこの科の多くのメンバーにおける植物病原体であるフィトフトラの破壊的影響を考慮すると、とりわけ、本発明の目的は、フィトフトラ抵抗性植物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
とりわけ、上記目的は添付の請求項に概説される植物を提供することにより、本発明によって達成される。
【００１３】
［図面の簡単な説明］
本発明は、さらに、図を参照して下記の実施例で例示されるだろう：
［図１］図１は、フィトフトラ・インフェスタンスによる感染後のコントロールジャガイモ植物の切断葉アッセイを示し、全ての葉はフィトフトラ・インフェスタンスに感染している。
［図２］図２は、フィトフトラ・インフェスタンスによる感染後の、配列番号７＆８が発現抑制されたジャガイモ植物の切断葉アッセイを示し、各葉は独立した植物由来である。図２ａは、配列番号７＆８の両方を発現抑制する、中央の構築物で発現抑制された植物由来の葉を示す。図２ｂは、キメラに発現抑制された植物由来の葉を示す。
［図３］図３は、フィトフトラ・インフェスタンスに感染している植物の割合を示し、第一の棒グラフは（約１０％が部分的に）感染したコントロール群を示し、第二の棒グラフは（約１０％が部分的に感染した）配列番号７のみが発現抑制された植物を示し、第三の棒グラフは配列番号７および８の両方がそれぞれの配列の中央の部分において発現抑制された植物を示し（約５０％がクリーン）、第四の棒グラフは配列番号７および８の両方が５’末端で発現抑制された植物を示す（約４０％がクリーン）。
［図４］図４は、フィトフトラ・ニコチアナエの接種後の生存ペチュニア植物の割合を示し、第一の棒グラフは野生型コントロール植物を示し（０％生存）、第二の棒グラフは配列番号９の変異体を示し（２０％が生存植物）、第三の棒グラフは配列番号１０の変異体を示し（２０％が生存植物）、かつ第四の棒グラフは二重変異体、すなわち配列番号９および１０の両方を示す（４５％が生存植物）。
［図５］図５は、フィトフトラ・インフェスタンスの病害検査からのトマト植物の葉を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
具体的に、本発明の上記目的はとりわけ、第一の態様によれば、ナス科に属する植物によって達成され、ここで、本発明の植物はフィトフトラ抵抗性を提供する遺伝的形質を含み、かつ本発明の抵抗性形質は、フィトフトラに対して感受性であるナス科に属する同一の植物と比較して、減少した発現もしくは減少した転写、または本発明の遺伝子によりコードされるタンパク質の減少した活性を有する、少なくとも２つの遺伝子の組み合わせによってコードされている。
【００１５】
この本発明の第一の態様の好ましい実施形態によれば、ナス科に属する本発明の植物は、ジャガイモ、ペチュニア、トマト、ナス（ａｕｂｅｒｇｉｎｅ）、ナス（ｅｇｇｐｌａｎｔ）、タバコおよびアマトウガラシ、より好ましくはジャガイモ、ペチュニア、トマト、アマトウガラシおよびタバコからなる群から選択される。
【００１６】
この本発明の第一の態様の好ましい別の実施形態によれば、本発明のフィトフトラ抵抗性は、フィトフトラ属、フィトフトラ・カプシシ、フィトフトラ・インフェスタンス、およびフィトフトラ・ニコチアナエからなる群から選択される植物病原体に対する抵抗性である。
【００１７】
この第一の態様の特に好ましい実施形態によれば、本発明はジャガイモに関し、本発明のフィトフトラ抵抗性はフィトフトラ・インフェスタンスに対する抵抗性であり、かつ少なくとも２つの遺伝子の本発明の組み合わせは、配列番号１および配列番号２に記載のタンパク質、または配列番号１および配列番号２と少なくとも８０％、８５％、もしくは９０％の配列同一性、例えば９１％、９２％、９３％および９４％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、例えば９６％、９７％、９８％および９９％の配列同一性を有するタンパク質をコードする遺伝子である。
【００１８】
この第一の態様の別の特に好ましい実施形態によれば、本発明はペチュニアに関し、本発明のフィトフトラ抵抗性はフィトフトラ・ニコチアナエ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ）に対する抵抗性であり、かつ少なくとも２つの遺伝子の本発明の組み合わせは、配列番号３および配列番号４に記載のタンパク質、または配列番号３および配列番号４と少なくとも８０％、８５％、もしくは９０％の配列同一性、例えば９１％、９２％、９３％および９４％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、例えば９６％、９７％、９８％および９９％の配列同一性を有するタンパク質をコードする遺伝子である。
【００１９】
この第一の態様の別の特に好ましい実施形態によれば、本発明はトマトに関し、本発明のフィトフトラ抵抗性はフィトフトラ・インフェスタンスに対する抵抗性であり、かつ少なくとも２つの遺伝子の本発明の組み合わせは、配列番号５および配列番号６に記載のタンパク質、または配列番号５および配列番号６と少なくとも８０％、８５％、もしくは９０％の配列同一性、例えば９１％、９２％、９３％および９４％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、例えば９６％、９７％、９８％および９９％の配列同一性を有するタンパク質をコードする遺伝子である。
【００２０】
この第一の態様の別の特に好ましい実施形態によれば、本発明はアマトウガラシ（カプシクム・アンヌム）またはカプシクム属に関し、フィトフトラ抵抗性はフィトフトラ・カプシシに対する抵抗性であり、かつ少なくとも２つの遺伝子の組み合わせは、配列番号１６および配列番号１７に記載のタンパク質、または配列番号１６および／もしくは配列番号１７と少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、もっとも好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するタンパク質をコードする遺伝子である。
【００２１】
この第一の態様の別の特に好ましい実施形態によれば、本発明はニコチアナ・ベンサミアナ（Ｎｉｃｏｔｉｎｉａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）に関し、フィトフトラ抵抗性は、フィトフトラ・カプシシ；フィトフトラ・インフェスタンス；またはフィトフトラ・ニコチアナエ；またはそれらの組み合わせに対する抵抗性であり、かつ少なくとも２つの遺伝子の組み合わせは、配列番号１８に記載のタンパク質および配列番号１８と少なくとも７０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、もっとも好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するタンパク質をコードする遺伝子である。
【００２２】
この第一の態様の別の特に好ましい実施形態によれば、本発明はタバコ（ニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉｎｉａ  ｔａｂａｃｕｍ））に関し、フィトフトラ抵抗性は、フィトフトラ・カプシシおよび／またはフィトフトラ・インフェスタンスおよび／またはフィトフトラ・ニコチアナエに対する抵抗性であり、かつ少なくとも２つの遺伝子の組み合わせは、配列番号１９に記載のタンパク質および配列番号１９と少なくとも７０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、もっとも好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するタンパク質をコードする遺伝子である。
【００２３】
この第一の態様のさらに別の特に好ましい実施形態によれば、本発明はナス科に属する植物に関し、本発明の植物はフィトフトラ抵抗性を提供する遺伝的形質を含み、かつ本発明の抵抗性形質は、フィトフトラ感受性の植物において、２つの遺伝子の組み合わせの活性を下方制御することによって、または本発明の遺伝子によってコードされるタンパク質の活性を減少させることによって得られ、ここで、本発明の２つの遺伝子は、配列番号１および２、もしくは配列番号３および４、もしくは配列番号５および６、またはそれらと少なくとも８０％、８５％、もしくは９０％の配列同一性、例えば９１％、９２％、９３％および９４％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、例えば９６％、９７％、９８％および９９％の配列同一性を有するタンパク質の組み合わせをコードする。
【００２４】
さらに好ましい実施形態によれば、ナス科に属する本発明の植物は、ジャガイモ、ペチュニアおよびトマトからなる群から選択される。
【００２５】
フィトフトラ抵抗性植物を提供するための本発明の遺伝子の有利な性質を考えると、第二の態様によれば、本発明は２つの遺伝子の組み合わせの使用に関し、ここで、２つの遺伝子の組み合わせは、ナス科に属する植物においてフィトフトラ抵抗性を提供するための、配列番号１および２；配列番号３および４；配列番号５および６；配列番号１６および１７；配列番号１８および配列番号１８と少なくとも７０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、もっとも好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するタンパク質；ならびに配列番号１９および配列番号１９と少なくとも７０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、もっとも好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するタンパク質からなる群から選択されるタンパク質の組み合わせをコードする。
【００２６】
本発明によれば、本発明の抵抗性は、好ましくはフィトフトラ属、フィトフトラ・カプシシ、フィトフトラ・インフェスタンスおよびフィトフトラ・ニコチアナエからなる群から選択される植物病原体に対する抵抗性である。
【００２７】
さらに好ましい実施形態によれば、ナス科に属する植物においてフィトフトラ抵抗性を提供するための本発明の使用は、フィトフトラに対して感受性であるナス科に属する植物と比較して、本発明の遺伝子の減少した発現もしくは減少した転写、または本発明の遺伝子によりコードされるタンパク質の減少した活性を含む。
【００２８】
この第二の態様のさらに好ましい実施形態によれば、ナス科に属する本発明の植物は、アマトウガラシ（カプシクム・アンヌム）、カプシクム属、ジャガイモ（ソラヌム・ツベロスム）、ペチュニア、トマト（ソラヌム・リコペルシクム）、ニコチアナ・ベンサミアナ、およびタバコ（ニコチアナ・タバカム）からなる群から選択される。
【００２９】
本発明のタンパク質および遺伝子の性質を提供するフィトフトラ抵抗性を考えると、本発明は、第三の態様によれば、植物にフィトフトラ抵抗性を提供するのに適したタンパク質および遺伝子に関する。具体的には、本発明は、この第三の態様によれば、配列番号１、２、３、４、５、６、１６、１７、１８、および１９、ならびにそれらと少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、もっとも好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するタンパク質からなる群から選択されるタンパク質に関する。
【実施例１】
【００３０】
実施例１（ジャガイモ）
ジャガイモ配列番号７および８を標的とするＲＮＡｉ構築物
３つの異なるＲＮＡｉ構築物を作製し、それらは以下を保有する／標的とする：
１．配列番号７の５’末端：コーディング配列−１５９−２００に相当する（開始から−１５９は、５’ｕｔｒ中にあることを意味する）。
２．配列番号７および８の５’末端のキメラ：コーディング配列４−１９９＋１−２０４に相当する。
３．配列番号７の中央部分（配列番号８の中央に高度に相同）：コーディング配列３３４−７４３に相当する。
【００３１】
ゲノムＤＮＡからフラグメントを増幅し、次いでｐＥＮＴＲ−Ｄ−ＴＯＰＯベクターにクローニングした。キメラな構築物のため、２つのフラグメントを相補的な突出末端を有するプライマー、続いて伸長および増幅を用いて結合し、融合したフラグメントを作製した。ゲートウェイＬＲ反応を用いて、ＲＮＡｉベクターｐＫ７ＧＷｉＷＧ２（Ｋａｒｉｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ  ７）にフラグメントを導入して、ヘアピン構造を有する逆方向反復を作製した。ｐＫ７ＧＷｉＷＧ２ベクターは、細菌の選択ためにストレプトマイシンを必要とし、かつジャガイモ形質転換のために使用されたアグロバクテリウム株（ＬＢＡ４４０４）は、既にストレプトマイシン選択マーカーを保有しているので、完全なＲＮＡｉ（ヘアピン）カセットを、様々な植物形質転換ベクター、ｐＧｒｅｅｎ００２９（細菌ならびに植物選択マーカー＝カナマイシン）（Ｈｅｌｌｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００，  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ４２）に導入した。最終的な構築物は、イントロンを形成するヘアピン−ループがスプライスアウトされた後に、発現抑制を誘導するｄｓＲＮＡを形成するヘアピンＲＮＡにより駆動される３５Ｓ−プロモーターの安定した発現を可能にする。少なくとも６つの独立したＴ１形質転換体を各構築物について維持した。
【００３２】
フィトフトラ・インフェスタンスアッセイの詳細
Ｔ１（第一世代トランスジェニック）植物から切断葉を採取し、次いで湿った綿−ウールまたはオアシスにおいて葉柄付きで１００％ＲＨでトレーに置いた。フィトフトラ・インフェスタンス（Ｐ．ｉｎｆ）培養物（ライ−スクロース−アガープレート）からＰ．ｉｎｆ遊走子／胞子嚢を採取し、次いで１０ｅ３の胞子嚢（１０ｅ５／ｍｌ）を含有する１０μｌ液滴の胞子懸濁液を中央脈（ｍｉｄｖｅｉｎ）の両側に滴下した。トレーを１８Ｃでインキュベートした。葉の感染率を、１１日目に、１．完全に感染／過剰生育、２．部分的に感染（１０−５０％の領域）、および３．クリーン（＜１０％の領域）としてスコア化した。
【００３３】
図１および２において示されるように、図２ａの二重に発現抑制された（配列番号７＆８）植物は、５０％のみが感染していることを示し、図２ｂの二重に発現抑制された（キメラな）植物は、６０％のみが感染していることを示す一方で、図１のコントロール群は、全ての植物が感染したことを示す。図３に示されたように、配列番号７および配列番号８の両方が発現抑制された植物の４０−５０％はクリーンであり、一方で、発現抑制された配列番号７のみを有する植物は、その植物の１０％のみが、部分的に感染をスコアしている。従って、配列番号７および８の両方を発現抑制することは、フィトフトラ・インフェスタンスに対する抵抗性を提供する。
【実施例２】
【００３４】
実施例２（ペチュニア）
トランスポゾン挿入系統をコレクション／ライブラリー（Ｖａｎｄｅｎｂｕｓｓｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８，  Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ５４）から同定した。２ｄＴｐｈ１トランスポゾン挿入アレルは配列番号９で、かつ３ｄＴｐｈ１トランスポゾン挿入アレルは配列番号１０で見出された。いくつかの交雑を行い、二重変異体を生成した。
【００３５】
フィトフトラ・ニコチアナエアッセイの詳細
植物を標準的な用土で、個別に鉢植えし、２３Ｃで生育させた。
Ｐ．ニコチアナエ（Ｐ．ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ）の胞子を培養物（リマ−マメ−アガーまたはＶ８−アガープレート）から採取し、次いで１０ｅ４（アッセイ  Ｓｅｐｔ）胞子を含有する、２ｍｌの胞子懸濁液を各植物の土壌に滴下した。植物崩壊（ｐｌａｎｔ  ｃｏｌｌａｐｓｅ）を定期的に監視した。
【００３６】
図４で示されるように、二重変異、すなわち配列番号９および配列番号１０の両方に変異を有する植物は、４５％の生存植物の割合を有し、一方で単一変異体（配列番号９または配列番号１０における変異体）の生存植物の割合は２０％のみである。
【実施例３】
【００３７】
実施例３（トマト）
配列番号１１および１２の両方の過剰発現を提供するため、または配列番号１１および１２の両方の発現抑制を提供するためのいずれかのために、２つの構築物でトマト植物を形質転換した。トマト配列番号１１を発現抑制する構築物を、配列番号１１のＣＤＳの中央の部分と同一の３００ｂｐフラグメントのゲートウェイクローニングを用いて生成した。
配列：
ＴＴＧＧＧＴＧＡＡＣＡＡＧＧＡＣＡＡＣＡＴＡＴＧＧＣＴＡＴＣＡＡＴＴＡＴＴＡＴＣＣＴＣＣＴＴＧＴＣＣＡＣＡＡＣＣＡＧＡＡＣＴＴＡＣＴＴＡＴＧＧＧＣＴＴＣＣＧＧＣＣＣＡＴＡＣＴＧＡＴＣＣＡＡＡＴＴＣＡＣＴＴＡＣＡＡＴＴＣＴＴＣＴＴＣＡＡＧＡＣＴＴＧＣＡＡＧＴＴＧＣＧＧＧＴＣＴＴＣＡＡＧＴＴＣＴＴＡＡＡＧＡＴＧＧＣＡＡＡＴＧＧＴＴＡＧＣＴＧＴＡＡＡＡＣＣＴＣＡＡＣＣＴＧＡＣＧＣＣＴＴＴＧＴＣＡＴＴＡＡＴＣＴＴＧＧＧＧＡＴＣＡＡＴＴＧＣＡＧＧＣＡＧＴＡＡＧＴＡＡＣＧＧＴＡＡＧＴＡＣＡＧＡＡＧＴＧＴＡＴＧＧＣＡＴＣＧＡＧＣＴＡＴＴＧＴＧＡＡＴＴＣＡＧＡＴＣＡＡＧＣＴＡＧＧＡＴＧＴＣＡＧＴＧＧＣＴＴＣＧＴＴＴ
使用プライマー：
Ｓ．Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ  ＡｔｔＢ１−Ｆ    ａａａａａｇｃａｇｇｃｔｔｃｔｔｇｇｇｔｇａａｃａａｇｇａｃａａｃａ
Ｓ．Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ  ＡｔｔＢ２−Ｒ    ａｇａａａｇｃｔｇｇｇｔａａａａｃｇａａｇｃｃａｃｔｇａｃａｔｃｃ
【００３８】
生成したエントリーベクターを、ｐＨｅｌｌｓｇａｔｅ１２バイナリーベクターにゲートウェイクローニングした。次いで、トマトのための標準的な手順に従ったアグロバクテリウム形質転換。発現抑制する構築物は、配列中の類似性により配列番号１１および１２の両方を発現抑制することができた。
【００３９】
形質転換されたトマト植物からの子孫を、フィトフトラ・インフェスタンス単離株ＵＳ１１の接種による病害検査に供した。接種後７日に、植物を、視覚的規模で１−９まで葉をスコア化することによって視覚的に分析した、ここで、１は感受性を意味し、かつ９は抵抗性を意味する。感受性に関するコントロールとして、植物ＴＳ３３、ＴＳ１９およびＯＴ９を用いた。抵抗性に関するコントロールとして、抵抗性と知られる野生系統ＬＡ１２６９を用いた。植物当たり８つの葉を測定した。下記の表は、植物当たり８つの葉からの平均スコアを提供する。
[表１]
【表１】
0006675332.tif 000002
【００４０】
表中では、配列番号１１および１２を過剰発現する植物が、単離株ＵＳ１１に対して感受性であることが示されている。発現抑制された植物は、感受性コントロールＯＴ９より有意に高いスコアを提供する。例えば、植物５５６−０１−０８は、８．５の平均スコアを有する。この植物の試料は図５のボックスＧ１０に示され、ボックスＤ８で示された抵抗性コントロール植物ＬＡ１２９６と同様に感染していない。従って、配列番号１１および１２の両方を発現抑制することは、フィトフトラ・インフェスタンスに対する抵抗性を提供する。
【実施例４】
【００４１】
実施例４（Ｎ．ベンサミアナ（Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ））
ＤＭＲ６がフィトフトラ・インフェスタンスに対するＮ．ベンサミアナにおける抵抗性を媒介するかどうかを調べるために、ＤＭＲ６オルソログをＶＩＧＳ発現ベクターにクローニングした。Ｎ．ベンサミアナ植物はＤＭＲ６について発現抑制され、その後Ｐ．インフェスタンスの胞子液と共に滴下播種（ｄｒｏｐｉｎｏｃｕｌａｔｅ）した。最大７ｄｐｉまで植物を病害進行についてスコア化した。この実験は３回行われ、同様の結果であった。ＤＭＲ６発現抑制は、明らかに空ベクターコントロールまたは野生型の発現抑制されていない植物と比較して、病原体による少ないコロニー形成をもたらす。
発現抑制構築物ＤＭＲ６の配列：
ａｃａａｃｔｃｇｇｇｔｔｃａｇａｔｔｇｃａｇｇａａｇｃｃａｔａｇｃａｇａｇａｇｃｃｔａｇｇｃｔｔａｇａｇａａａｇａｇｔｇｔａｔａａａｇｇａｔｇｔａｔｔｇｇｇｃｇａａｃａａｇｇｔｃａａｃａｃａｔｇｇｃｔａｔｃａａｔｔｔｃｔａｔｃｃｔｃｃｔｔｇｔｃｃａｃａａｃｃａｇａａｃｔｃａｃｔｔａｔｇｇｇｃｔｇｃｃａｇｃａｃａｔａｃｔｇａｔｃｃａａａｔｇｃｃｃｔｔａｃａａｔｔｃｔｔｃｔｔｃａａｇａｃｔｔａｇａａｇｔａｇｃｔｇｇｔｃｔｔｃａａｇｔｔｃｔｔａａａｇａｔｇｇｃｇａａｔｇｇｔｔｇｇｃｃｇｔｃａａｇｃｃｔｃａａｃｃａｇａｔｇｃｃｔｔｔｇｔｃａｔｔａａｔｃｔｔｇｇｔｇａｔｃａａｃｔｇｃａｇｇｃａｇｔｇａｇｔａａｔｇｇｇａｇａｔａｃａａａａｇｃｇｔａｔｇｇｃａｔｃｇａｇｃｔａｔｔｇｔａａａｔｔｃａｇａｃａａａｇｃｃａｇｇｔｔｇｔｃａｇｔｇｇｃｔｔｃｇｔｔｃｃｔｔｔｇｔｃｃｇｔｇｃｇａｔａｇｃｇｃｇａａａａｔｃａｇｔｇｃｔ
【００４２】
ＶＩＧＳを用いて、Ｎ．ベンサミアナ  ＤＭＲ６を発現抑制し、かつその機能を試験した。当該方法の視覚的コントロールとしてＰＤＳ遺伝子も標的とした。ＰＤＳが発現抑制された植物は、発現抑制が開始した時間を示すために使用した。植物においてタンパク質レベルがすでに確立しているので、発現抑制は退色が観察される前の±２日で開始していなければならない。しかし、発現抑制時間枠のはじめには発現抑制は高い割合ではなく、２日間待つことで良好な発現抑制率を確立するためのメカニズムの時間が得られる。ＰＤＳが発現抑制された植物を用いることの別の利点は、それらが植物のどの部分が発現抑制されるかの示唆を与えることである。退色は上記接種の全ての部分において観察された。真空接種された植物において、新たな組織は強い光退色を示し、かついくつかの子葉の一部は同様に白い領域を示した。シリンジ接種された植物では、退色は最も若い葉で最も強く、完全に生長した葉では色素がすでに合成されており、発現抑制が視覚的に観察されるのがより困難だろう。ＰＤＳが発現抑制された植物の退色は、ＴＲＶベクターを含有するアグロバクテリウム株の接種の８−１０日後に観察された。８日目に感染アッセイを開始した。
【００４３】
２つの別個のＶＩＧＳ実験を行った。両方の実験からの植物は切断葉感染アッセイのために使用した。Ｐ．カプシシ感染アッセイはアグロ浸潤（Ａｇｒｏ−ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）の８日後に、上記浸潤された葉の２−６で行った。５＊１０３胞子／ｍｌ−１を含有する遊胞子液が、切断葉に適用された。第一のＶＩＧＳは７日後、Ｐ．カプシシの低い感染率を示した（表１を参照されたい。）。理想的には、発現抑制されていない葉の１００％が感染を示す。
表１  １ｓｔ  ＶＩＧＳ実験の感染アッセイからの結果。ＤＭＲ６が発現抑制されている葉は感染を示さなかった。発現抑制されていない葉の７つのうち３つは感染を示した。
[表１]
【表２】
0006675332.tif 000003
【００４４】
この低い胞子形成は、Ｎ．ベンサミアナの葉の低い感染の原因であると考えられる。しかしながら、発現抑制されなかった葉の４０％が感染を示したのとは対照的に、ＤＭＲ６が発現抑制された葉はいずれも感染症状を示さなかった。感染率を増加させるために、第２の感染アッセイ中に、より攻撃的な感染を引き起こす胞子および感染方法の獲得に変更が加えられた。１つの、ＤＭＲ６が発現抑制された感染していない葉が見つかり、他のＤＭＲ６が発現抑制された葉は、感染の遅延および感染のより遅い拡散を示した。
【実施例５】
【００４５】
導入
過剰な活性化を防ぐために、誘導性防御応答が調節され、下方制御されるように、免疫の負の制御因子をコードする多くの遺伝子は病原体感染の間活性化される。その例は、感染またはＭＡＭＰ処理で誘導される、Ｎｕｄｉｘ加水分解酵素をコードするＮＵＤＴ７および転写因子をコードするＷＲＫＹ４８である。同様に、ベト病抵抗性（ＤＯＷＮＹ  ＭＩＬＤＥＷ  ＲＥＳＩＳＴＡＮＴ）６遺伝子（ＤＭＲ６）は、ベト病菌ヒアルロペロノスポラ・アラビドプシディス（Ｈｙａｌｏｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｄｉｓ）の親和性単離株および非親和性単離株での感染の間、活性化される。変異によるＤＭＲ６の不活性化は、防御関連遺伝子の低い構成的な活性化およびベト病菌Ｈ．アラビドプシディスに対する抵抗性をもたらす。
【００４６】
ＤＭＲ６は、２−オキソグルタレートＦｅ（ＩＩ）依存オキシゲナーゼ（２ＯＧオキシゲナーゼ、Ｐｆａｍドメイン  ＰＦ０３１７１）のスーパーファミリーに属する。このスーパーファミリーは、アラビドプシスにおいて１５１個のメンバーを含む。しかしながら、ＤＭＲ６を含むこれらのタンパク質のうちのほとんどについて、それらの代謝活性は知られていない。２ＯＧオキシゲナーゼはＯ２分子を用いる基質の酸化を伴う反応過多を触媒することが知られている。それらは一般的に補因子として鉄を使用し、かつ２つの電子を供給するために補基質として２−オキソグルタレートを必要とする。これらの酵素の一般的な特徴は、二本鎖ベータシートに位置する保存されたＨｘＤ／ＥｘｎＨモチーフの存在である。それは２つの、４本鎖のベータシート（ジェリーロールフォールド）とともに活性中心をカプセル化する。２ＯＧオキシゲナーゼは、二次代謝ならびにシグナル分子の生合成、例えばフラボノイド、ジベレリン、およびアルカロイドの生合成に関与する。
【００４７】
この実施例では、我々はアラビドプシスＤＭＲ６オキシゲナーゼならびに関連ＤＭＲ６様オキシゲナーゼ（ＤＬＯ）１および２を機能的に解析する。ＤＭＲ６、ＤＬＯ１およびＤＬＯ２の過剰発現は病害感受性を増加させ、３つのタンパク質は免疫の負の制御因子として作用できることを示した。ＤＬＯ２ではなくＤＬＯ１は、ＤＭＲ６と高度に共制御されているが、それらはベト病感染の間のそれらの空間的発現において異なる。ｄｍｒ６−３＿ｄｌｏ１二重変異体はＨ．アラビドプシディスに完全に抵抗性であると見出され、かつ高いレベルのサリチル酸に関連して強く減少した生長を示した。
【００４８】
結果
ＤＭＲ６の過剰発現は、（半）生物栄養性病原体に対する感受性の増強をもたらす
ｄｍｒ６−１変異体の苗は、Ｐ．シリンガエ（Ｐ．ｓｙｒｉｎｇａｅ）に対してではなく、Ｈ．アラビドプシディスに対して、より抵抗性であることが以前に記載されている。しかしながら、成体ｄｍｒ６−１植物で試験した場合、Ｐ．シリンガエ  ＤＣ３０００に対する強い抵抗性が観察された。成体ｄｍｒ６−１植物はまた、苗と比較して偏性生物栄養生物Ｈ．アラビドプシス（Ｈ．ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）に対してより抵抗性であった。さらに、半生物栄養性卵菌類フィトフトラ・カプシシに対する強い抵抗性は、親系統Ｌｅｒ  ｅｄｓ１−２と比較する場合、ｄｍｒ６−１植物において明らかであった；全てのｄｍｒ６−１変異体植物は生存していた一方で、Ｐ．ｃａｐｓｉｃｉは、親系統および補完されたｄｍｒ６−１変異体の植物の大部分を破壊した。異なる（半）生物栄養生物に対するｄｍｒ６−１変異体の抵抗性は、野生型植物においてＤＭＲ６はこれらの病原体に対する免疫を負に制御することを示す。
【００４９】
これを調べるために、ＤＭＲ６をコードする配列をトランスジェニックＣｏｌ−０系統において、構成的な３５Ｓプロモーターから発現させた。ＤＭＲ６−過剰発現系統は、Ｈ．アラビドプシディスおよびＰ．シリンガエに対する病害感受性において明らかな増加を示した。ベト病感染の尺度であるＨ．アラビドプシディス胞子形成のレベルは、コントロールと比較して、ＤＭＲ６−過剰発現系統において倍増した。また、病害関連白化（ｃｈｌｏｒｏｓｉｓ）の進行は、非トランスジェニックＣｏｌ−０植物においてよりもＤＭＲ６−過剰発現系統において、より顕著であった。
【００５０】
Ｐ．シリンガエ細菌に対する６週齢植物の増加した感受性もまた、明確に視認された。コントロール系統（Ｃｏｌ−０）は接種後３日で、比較的低レベルの白化（ｃｈｌｏｒｏｓｉｓ）および病変を示した一方で、ＤＭＲ６−過剰発現系統は、より重篤な病害症状、すなわち、より多くの白化（ｃｈｌｏｒｏｓｉｓ）およびより多くの大きな病変を示した。Ｐ．シリンガエ感染に対するＤＭＲ６−過剰発現する系統の増加した感受性は、Ｃｏｌ−０コントロールと比較して接種後１日および３日で増加した細菌力価を示した細菌増殖アッセイにより確認された。さらに、感染していない葉組織において、防御マーカー遺伝子ＰＲ−１、ＰＲ−２およびＰＲ−５の発現は、すでに非常に低いレベルの発現を有する野生型Ｃｏｌ−０植物と比較して、ＤＭＲ６−過剰発現系統において５０から８０％まで減少した。ｄｒｍ６−１変異体の高められた抵抗性とともにＤＭＲ６−過剰発現系統の減少した免疫は、免疫の負の制御因子としてのＤＭＲ６の役割を強く支持する。
【００５１】
ＤＭＲ６およびＤＭＲ６様オキシゲナーゼは、顕花植物において異なる系統群（ｃｌａｄｅ）の別個の枝を示す
アラビドプシスゲノムは、１５０を超える２ＯＧオキシゲナーゼ遺伝子を含有し、それらの中にはＤＭＲ６と類似しているものがある。顕花植物におけるＤＭＲ６および関連オキシゲナーゼの進化的保存を解析するために、我々は２ＯＧ−Ｆｅ（ＩＩ）オキシゲナーゼスーパーファミリーＰｆａｍドメインＰＦ０３１７１を含有する２ＯＧオキシゲナーゼのファミリーを系統発生学的に解析した。シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、ならびにゲノム配列およびタンパク質モデルがＰｈｙｔｏｚｏｍｅ  ｖ７．０データベース（ｗｗｗ．Ｐｈｙｔｏｚｏｍｅ．ｎｅｔ）において利用可能であった１８の顕花植物から、ＰＦ０３１７１ドメインを含有する合計２９５１のタンパク質がＨＭＭＥＲ３アルゴリズムを用いて選択された。小タンパク質フラグメントを濾過し、かつ非常に大きなタンパク質を除去して、我々はＤＭＲ６と２０％の長さの差を超えないタンパク質のみを含めた。さらに、ＤＭＲ６と比較して２０％未満のオキシドレダクターゼドメインの長さの差を有するタンパク質のみを保持した。これは、全ての基準を満たす２０３８のタンパク質の選択をもたらし、１５１個の予測されたＡ．ｔｈａｌｉａｎａ  ２ＯＧオキシゲナーゼのうちの１１０個を含んだ。系統発生学的クラスター形成は、異なる酵素活性を示す多くの異なる系統群が示されるツリーをもたらした。よく特徴付けられたオキシゲナーゼは、ＤＭＲ６系統群と異なって、異なる系統群において存在する、フラバノン−３−ヒドロキシラーゼ（Ｆ３Ｈ）、１−アミノシクロプロパン−１−カルボン酸（ＡＣＣ）オキシダーゼおよびアントシアニジンシンターゼ（ＡＮＳ）を含む。２つの別個の枝（ｂｒａｎｃｈ）は、双子葉植物および単子葉植物来の２ＯＧオキシゲナーゼをそれぞれ含有するＤＭＲ６系統群において区別でき、これはこれらのサブクレード（ｓｕｂｃｌａｄｅ）が、全ての顕花植物の祖先またはそれ以前にすでに存在していた（８２％のブートストラップ信頼度）ことを示す。ＤＭＲ６系統群における遺伝子重複は、ツリーの上部における単子葉植物において、およびＤＭＲ６系統群の両方の枝におけるダイズおよびブドウにおいて頻繁である。より低いサブクレードにおいて、アラビドプシス・リラタ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｌｙｒａｔａ）由来の２つのタンパク質とともに、２つのＡ．ｔｈａｌｉａｎａ  ＤＭＲ６ホモログはクラスターを形成し、それらがこれらの２種の共通祖先における比較的最近の遺伝子重複の結果であるということを示唆する。
【００５２】
これらのＡ．ｔｈａｌｉａｎａタンパク質は、今やＤＭＲ６様オキシゲナーゼまたはＤＬＯ（遺伝子、ＤＬＯ１をコードするＡｔ４ｇ１０５００およびＤＬＯ２をコードするＡｔ４ｇ１０４９０）と命名されている。また、ＤＬＯサブクレードは、単子葉植物タンパク質および双子葉植物タンパク質の明確な分離を示し、全ての顕花植物の祖先がすでにＤＭＲ６以外のＤＬＯを有していることを示唆する。ＤＭＲ６に密接にグループ化され、ＤＬＯは、その後、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ  ＤＬＯ１遺伝子およびＤＬＯ２遺伝子に焦点を当てて、より詳細に解析される興味深い群を形成する。
【００５３】
ｄｍｒ６変異体を補完するＤＬＯ１およびＤＬＯ２の過剰発現
ＤＬＯはＤＭＲ６と同一の生物活性を有することができ、従って、ｄｍｒ６−１変異体の補完について試験された。この目的のために、ＤＬＯ１およびＤＬＯ２を、構成的な３５Ｓプロモーター下で発現させ、ｄｍｒ６−１変異体バックグラウンドに形質転換した。３５Ｓ：ＤＬＯ１または３５Ｓ：ＤＬＯ２で形質転換された、４つの独立したＴ３系統はそれらの発現レベルについて解析され、構築物あたり明らかな導入遺伝子発現を示した３系統が選択された。補完を確かめるために、２週齢植物を、Ｈ．アラビドプシディス単離株Ｃａｌａ２に感染させ、接種後５日（ｄｐｉ）にｍｇ苗あたり胞子の数が感受性の尺度としてスコア化した。
【００５４】
興味深いことに、ｄｍｒ６−１が明らかな抵抗性を示した一方で、３５Ｓ：：ＤＬＯ１および３５Ｓ：：ＤＬＯ２植物は、ｄｍｒ６−１変異体の親系統であるＬｅｒ  ｅｄｓ１−２と同様またはそれより高い高感受性であった。ＤＬＯ１とＤＬＯ２の両方がｄｍｒ６−１変異体表現型を補完できるので、我々は、ＤＬＯはＤＭＲ６の機能と同様の機能を有することを結論づける。
【００５５】
Ｃｏｌ−０バックグラウンドにおけるＤＭＲ６の過剰発現は、ベト病および他の病原体に対して高まった感受性をもたらすので、我々は、次にＤＬＯ１およびＤＬＯ２を過剰発現することもＣｏｌ−０をより感受性にするかどうかを調べた。３５Ｓ：ＤＬＯ１および３５Ｓ：ＤＬＯ２導入遺伝子を発現する形質転換体が選択され、かつコントロールとして、ＤＭＲ６過剰発現Ｃｏｌ−０および高感受性であるＣｏｌ  ｅｄｓ１−２変異体が含まれた。Ｈ．アラビドプシディスによる病害アッセイは、高いレベルの胞子形成により示されるように、ＤＬＯ１およびＤＬＯ２の過剰発現がＣｏｌ−０親系統と比較して感受性を高めたことを示した。観察された高められた感受性は、ＤＭＲ６過剰発現植物およびＣｏｌ  ｅｄｓ１−２変異体に匹敵した。これは、ＤＬＯ１およびＤＬＯ２タンパク質が同一の表現型効果をもたらすＤＭＲ６と同様のまたは同じ活性を有することを確認する。
【００５６】
ＤＬＯ２ではなく、ＤＬＯ１の発現は免疫関連である
ＤＬＯ１およびＤＬＯ２補完および過剰発現系統は、３５Ｓプロモーターを用いて全て作製された。しかしながら、野生型ＤＬＯの発現は、植物防御の間に強く活性化されるＤＭＲ６の発現と同様、高度に制御される可能性が高い。従って、我々は、ＤＬＯ１およびＤＬＯ２がＤＭＲ６と同様の免疫関連発現を示すかどうかを決定するために公的に利用可能な遺伝子発現データを解析した。この解析のために、病原体攻撃、防御関連ホルモン適用およびエリシター／エフェクター処理後の転写プロファイリングを扱う全ての、９つの異なるアフィメトリックスマイクロアレイ実験のデータを使用した。
【００５７】
発現解析は、ＤＬＯおよびＤＭＲ６を含有する大きな系統群に属する３０個の２ＯＧオキシゲナーゼに焦点が当てられた。遺伝子の階層的クラスター形成はそれらの発現パターンによる２ＯＧオキシゲナーゼ遺伝子のグループ化を可能にし、どの遺伝子が植物免疫応答の間に共制御されるかについて情報を提供する。驚くべきことに、ＤＬＯ１は、ＤＭＲ６とクラスターを形成し、一方でＤＬＯ２は、ＤＭＲ６またはＤＬＯ１とのいかなる共制御も示さなかった。ベト病菌Ｈ．アラビドプシディス、うどんこ病菌エリシフ・オロンチイ（Ｅｒｙｓｉｐｈｅ  ｏｒｏｎｔｉｉ）および細菌Ｐ．シリンガエの感染後並びにＳＡ処理後、ＤＭＲ６とＤＬＯ１は両方活性化される。ＤＬＯ２クラスターはＤＭＲ６とＤＬＯ１から十分離れており、異なる実験では非応答性であるようである。Ｇｅｎｅｖｅｓｔｉｇａｔｏｒを用いる利用可能なマイクロアレイデータのさらなる解析は、長角果（ｓｉｌｉｑｕｅ）を除いて、ＤＬＯ２はいかなる処理またはいかなる組織によっても発現されないことを明らかにし、ＤＬＯ２が栄養植物組織の免疫における役割を有しないことを示唆した。
【００５８】
Ｈ．アラビドプシディス感染に対するＤＬＯの応答性は、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）により実験的に確認された。ＤＭＲ６とＤＬＯ１は、Ｈ．アラビドプシディスの親和性単離株、または非親和性単離株に感染した植物において高度に活性化される。また、ＳＡ模倣ＢＴＨでの処理後、ＤＭＲ６とＤＬＯ１の両方が強く活性化される。対照的に、ＤＭＲ６とＤＬＯ１は、ジャスモン酸誘導遺伝子を活性化すると知られるジャスモン酸メチル（ＭｅＪＡ）に非応答性である。ＤＬＯ２発現は、Ｇｅｎｅｖｅｓｔｉｇａｔｏｒデータを確認する異なる実験条件において検出できない（３５より高いｃＴ値）。ＤＭＲ６とＤＬＯ１の両方が植物の免疫応答の間に活性化されるという事実は、野生型植物の葉において、ＤＬＯ１もまた、防御の負の制御因子として作用することを示唆する。しかしながら、ＤＭＲ６機能を引き継ぐことができる完全な（ｉｎｔａｃｔ）ＤＬＯ１遺伝子の存在下で、ｄｍｒ６変異体がなぜそのような明らかな抵抗性表現型を有するのかという疑問が残っている。
【００５９】
ＤＬＯ１およびＤＭＲ６は、感染した葉において異なる空間的発現を示す
ベト病感染の間のＤＬＯ１の組織特異的発現を解析するために、我々はＧＵＳレポーター遺伝子に融合されたＤＬＯ１プロモーター（ｐｒｏＤＬＯ１：ＧＵＳ）を有する構築物を含有するトランスジェニック系統を作製した。我々はＤＬＯ２のいかなる発現も観察しなかったので、ＤＬＯ２のプロモーターを有するＧＵＳ融合体を構築しなかった。Ｈ．アラビドプシディス感染後、ＤＭＲ６の空間的発現は、以前に記載されているように、病原体と直接接触している部位に特異的に検出された。対照的に、ＤＬＯ１発現は病原体と密接に接触している細胞においてではなく、感染した子葉および葉の主脈において、またはその周りでのみ誘導された。興味深いことに、ＤＬＯ１発現は、Ｈ．アラビドプシディス感染部位の近くの葉の領域においてのみ観察され、これはＤＬＯ１の活性化は当該病原体の存在に依存することを示唆する。吸器含有細胞におけるＤＬＯ１活性の不存在は、なぜＤＬＯ１がｄｍｒ６変異体においてＤＭＲ６活性の喪失について完全に補完できないのかを説明できるだろう。これらのデータはＤＭＲ６とＤＬＯ１遺伝子の異なる活性を示す一方で、これらの遺伝子の重複性（ｒｅｄｕｎｄａｎｃｙ）の程度は不明確であり、従って、さらに遺伝的に研究された。
【００６０】
ＤＬＯ１機能はＤＭＲ６と部分的に重複的である
変異体系統における重複性解析は、同一の遺伝的バックグラウンドにおいて最もよく行われる。従って、我々はＤＭＲ６（ＧＡＢＩ−ＫＡＴ系統ＧＫ−２４９Ｈ０３．０１、変異体ｄｍｒ６−３と命名された）およびＤＬＯ１（ＳＡＬＫ系統０５９９０７、ｄｌｏ１と命名された）について、Ｃｏｌ−０バックグラウンドにおいて変異体を得た。ｄｍｒ６−３＿ｄｌｏ１二重変異体が作製され、ｄｍｒ６−３単一変異体およびｄｌｏ１単一変異体、並びに親Ｃｏｌ−０系統とともに表現型解析された。Ｈ．アラビドプシディス  Ｗａｃｏ９に対する感受性のレベルはｄｍｒ６−３変異体において強く減少したが、ｄｌｏ１変異体においてはわずかにしか減少しなかった。ｄｍｒ６−３＿ｄｌｏ１二重変異体における２つの変異を組み合わせることは、Ｈ．アラビドプシディスに対する完全な抵抗性を示す植物をもたらした。
【００６１】
ｄｍｒ６−１変異体およびｄｍｒ６−２変異体に関する以前の研究がＰＲ−１および他の防御遺伝子の発現のレベルの増加を示したので、我々は次に変異体における防御遺伝子発現のレベルを試験した。ｄｍｒ６−３変異体もまた、ＰＲ−１、ＰＲ−２およびＰＲ−５の上昇した発現を示し、以前の結果を確認した。ｄｌｏ１変異体は、３つのＰＲ遺伝子の発現の顕著な誘導を示さなかっただけである。
【００６２】
対照的に、ｄｍｒ６−３＿ｄｌｏ１二重変異体は非常に高レベルの防御遺伝子発現を示した。ＰＲ−１転写物は、ｄｍｒ６−３＿ｄｌｏ１変異体における方がＣｏｌ−０においてよりも３０，０００倍超高く、ｄｍｒ６−３単一変異体においてよりも１００倍超高かった。試験された変異体において、ベト病に対する抵抗性のレベルと防御遺伝子発現における増加との間に明確な相関があり、抵抗性が植物免疫応答の活性化により引き起こされることを示唆する。我々のデータは、ｄｌｏ１変異はｄｍｒ６−３単一変異体の免疫を高めることを示し、ＤＬＯ１およびＤＭＲ６が部分的に重複的に作用することを示唆する。
【００６３】
これは変異体の生長表現型によりさらに裏付けられた。短日条件下で５．５週間生長した植物は遺伝型間で顕著な差異を示した。ｄｌｏ１変異体はＣｏｌ−０と同様に生長し、ｄｍｒ６−３変異体は、わずかな生長減少を示す一方で、ｄｍｒ６−３＿ｄｌｏ１二重変異体は、矮小植物をもたらす、強い生長減少を示した。生長減少およびベト病に対する抵抗性のレベルは試験された変異体において相関し、これらの２つの表現型は機能的につながることを示唆する。
【００６４】
植物免疫の強い活性化は、重大な生長減少を伴い得ることはよく知られており、これは多くの場合、高いＳＡレベルに関連し得る。確かに、ＳＡのレベルはｄｍｒ６−３＿ｄｌｏ１二重変異体における方がＣｏｌ−０対照においてよりも２００倍超高く、ｄｍｒ６−３変異体においてよりも〜２０倍まで高かった。単一変異体ｄｍｒ６−３はＣｏｌ−０対照と比較してＳＡにおいて中程度に〜１０倍の増加を示したが、ｄｌｏ１変異体はＣｏｌ−０より多くのＳＡを蓄積しなかった。
【００６５】
ｄｍｒ６−３＿ｄｌｏ１における高ＳＡレベルが、矮小表現型およびベト病に対する高レベルの抵抗性の原因であるかを試験するために、当該二重変異体を、イソコリスミ酸シンターゼ１の喪失の結果として、ＳＡ生合成において強く損傷を受けているｓｉｄ２変異体と交配した。三重変異体ｄｍｒ６−３＿ｄｌｏ１＿ｓｉｄ２はｓｉｄ２変異体より少し小さいままであったが、ｄｍｒ６−３＿ｄｌｏ１二重変異体の生長表現型のほぼ完全な回復を示した。病害アッセイは、ｄｍｒ６−３＿ｄｌｏ１二重変異体およびｄｍｒ６−３単一変異体の高レベルの抵抗性が、ＳＩＤ２の不存在下で強く減少もしたことを示した。低いＳＡレベルのせいで、ｓｉｄ２変異体は、野生型Ｃｏｌ−０よりもＨ．アラビドプシディスに対してより感受性である。Ｈ．アラビドプシディスに対する感受性のレベルは、変異体における総ＳＡレベルとよく相関する。ｄｍｒ６とｄｍｒ６−３＿ｄｌｏ１二重変異体の両方は、５ｄｐｉで胞子形成が無く、もっとも高いＳＡレベルを有することを示す。三重変異体ｄｍｒ６−３＿ｄｌｏ１＿ｓｉｄ２はＣｏｌ−０よりもさらに多くのＳＡを生産し、ベト病に対するより低い感受性を説明し得る。
【００６６】
ｄｍｒ６−３＿ｄｌｏ１変異体の、Ｈ．アラビドプシディスに対する抵抗性と生長減少の両方は、増加したＳＡレベルの結果であると結論づけられた。二重変異体の極端な表現型は、ＤＬＯ１およびＤＭＲ６遺伝子が重複的に作用することを実証する。しかしながら、ｄｍｒ６単一変異体は、ｄｌｏ１変異体よりも、ベト病菌に対してより抵抗性である。ＤＭＲ６とＤＬＯ１遺伝子の発現の観察された異なる局在とともに、本データは、ＤＭＲ６とＤＬＯ１遺伝子は、植物免疫の負の制御因子として別個であるが部分的に重複的に機能することを示す。
【配列表】
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