(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃｏｌｌ２−１ペプチド活性の阻害剤及び／又はＣｏｌｌ２−１ＮＯ2ペプチド活性の阻害剤を活性成分として含む、骨関節炎の予防及び／又は処置に用いるための医薬であって、
Ｃｏｌｌ２−１ペプチド活性又はＣｏｌｌ２−１ＮＯ2ペプチド活性の前記阻害剤は、アミノ酸配列ＨＲＧＹＰＧＬＤＧ（配列番号１）内に含まれるエピトープと免疫反応性である免疫学的結合パートナーであり、
前記免疫学的結合パートナーは、Ｃｏｌｌ２−１ペプチド又はＣｏｌｌ２−１ＮＯ2ペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体である、医薬。
【請求項２】
Ｃｏｌｌ２−１ペプチド活性の阻害剤及び／又はＣｏｌｌ２−１ＮＯ2ペプチド活性の阻害剤を活性成分として含む、リウマチ疾患及び筋骨格疾患（ＲＭＤ）の予防及び／又は処置に用いるための医薬であって、
Ｃｏｌｌ２−１ペプチド活性又はＣｏｌｌ２−１ＮＯ2ペプチド活性の前記阻害剤は、アミノ酸配列ＨＲＧＹＰＧＬＤＧ（配列番号１）内に含まれるエピトープと免疫反応性である免疫学的結合パートナーであり、
前記免疫学的結合パートナーは、Ｃｏｌｌ２−１ペプチド又はＣｏｌｌ２−１ＮＯ2ペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体である、医薬。
【請求項３】
骨関節炎の予防及び／又は処置に用いるための医薬を製造するためのＣｏｌｌ２−１ペプチド活性の阻害剤及び／又はＣｏｌｌ２−１ＮＯ2ペプチド活性の阻害剤の使用であって、
Ｃｏｌｌ２−１ペプチド活性又はＣｏｌｌ２−１ＮＯ2ペプチド活性の前記阻害剤は、アミノ酸配列ＨＲＧＹＰＧＬＤＧ（配列番号１）内に含まれるエピトープと免疫反応性である免疫学的結合パートナーであり、
前記免疫学的結合パートナーは、Ｃｏｌｌ２−１ペプチド又はＣｏｌｌ２−１ＮＯ2ペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体である、使用。
【請求項４】
リウマチ疾患及び筋骨格疾患（ＲＭＤ）の予防及び／又は処置に用いるための医薬を製造するためのＣｏｌｌ２−１ペプチド活性の阻害剤及び／又はＣｏｌｌ２−１ＮＯ2ペプチド活性の阻害剤の使用であって、
Ｃｏｌｌ２−１ペプチド活性又はＣｏｌｌ２−１ＮＯ2ペプチド活性の前記阻害剤は、アミノ酸配列ＨＲＧＹＰＧＬＤＧ（配列番号１）内に含まれるエピトープと免疫反応性である免疫学的結合パートナーであり、
前記免疫学的結合パートナーは、Ｃｏｌｌ２−１ペプチド又はＣｏｌｌ２−１ＮＯ2ペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体である、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨関節炎の予防及び／又は処置に用いる医薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨関節炎（ＯＡ）は、最も一般的な関節疾患であり、老年集団における関節痛及び関節障害の主な原因である。その原因は多元的であり（すなわち、年齢、肥満、関節損傷、遺伝的素因）、病態生理学的プロセスは、関節全体に影響を及ぼす。関節軟骨の破壊、軟骨下骨の硬化、骨増殖体の形成、滑膜炎症、並びに靭帯及び半月板の損傷が、ＯＡの主な特徴を構成するものである。
【０００３】
滑膜炎症は、骨関節炎の徴候及び構造的な進行において重要な役割を果たす。いくつかの研究により、関節組織間のクロストークが、先天性免疫炎症ネットワーク内で細胞レベルにて通信しており、関節滑膜炎及び軟骨退化を促進し得ることが明らかとなった。細胞のストレスに由来する内在性の分子産物、及び細胞外マトリックスの破壊が、ＤＡＭＰ（損傷関連分子パターン）として機能して、炎症応答及び異化誘発性（pro-catabolic）事象をインビトロで誘導し得、且つＰＲＲ（パターン認識受容体）を介して関節滑膜炎及び軟骨退化をインビボで引き起こし得る。
【０００４】
炎症誘発性サイトカインの作用下で、滑膜細胞及び軟骨細胞が、活性酸素種及びＮＯを発生し得る。これらは、翻訳後修飾（例えば、カルボニル基の形成又はコラーゲンＩＩ型が挙げられるマトリックスタンパク質のニトロ化）を誘導し得る。
【０００５】
滑膜新血管形成は、炎症を起こした滑膜の別の重要な特徴であり、血管形成誘発性（pro-angiogenic）因子と抗血管形成因子との間のアンバランスに由来するものである。新血管形成は、大部分が関節滑膜炎によって駆動され得る。
【０００６】
軟骨マトリックスが、まばらな軟骨細胞集団によって合成され、組織化され、維持され、且つ分解される。軟骨の特性は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の構造及び完全性に極めて依存的である。正常な軟骨において、ＥＣＭの形成及び分解の同化作用プロセス及び異化作用プロセスは、うまくバランスが保たれている。関節疾患、例えば慢性関節リウマチ（ＲＡ）及び骨関節炎（ＯＡ）において、ＥＣＭの分解速度は多くの場合、合成速度を上回る。これによって、組織の構造的完全性及び機械的強度は損なわれて、関節構造の不可逆性の破壊がもたらされる。
【０００７】
コラーゲン分解は、ＯＡ中の軟骨崩壊の主な特徴の１つである。ＩＩ型コラーゲンは、関節軟骨の細胞外マトリックスの主な成分であり、軟骨の湿重量の１５〜２５％を、そして総コラーゲン含有量の９０〜９５％を構成する。各分子は、３つの同じアルファ鎖の三重らせんから主に構成されて、分子間架橋によって安定化する原線維を形成する。この原線維メッシュワークに対する損傷が、ＯＡの病因において極めて重大な事象となる。
【０００８】
ＩＩ型コラーゲン分解産物は、疾患の進行及び活性の双方を評価することができるＯＡ特異的バイオマーカーである。三重らせんの、局所酸化ストレスと関連するマーカー、Ｃｏｌｌ２−１及びそのニトロ化形態Ｃｏｌｌ２−１ＮＯ２内に位置決めされる特定のペプチドを測定するための特異的免疫アッセイが開発されている。当該バイオマーカーは、マウス、モルモット、及びウマにおいて、そしてまた、健常なヒト及びＯＡ患者においてインビボ研究されてきた。
【０００９】
コラーゲンＩＩ型の分解は、コラゲナーゼ（ＭＭＰ１、ＭＭＰ８、及びＭＭＰ１３）を伴う。特徴的なコラゲナーゼ切断部位が、コラーゲンＩＩ型の残基７７５と７７６との間の三重らせん領域において見出され、これは、無傷のコラーゲン分子の３／４及び１／４に相当する２つのフラグメントを生じさせる。ＣＯＬ２−３／４フラグメントのＣ末端部分及びＣＯＬ２−１／４フラグメントのＮ末端部分を認識する抗体が開発されている。ＣＯＬ２−１／４エピトープでなくＣＯＬ２−３／４エピトープが、循環流において見出されることが実証されている。これはおそらく、ＣＯＬ２−３／４フラグメントのタンパク質分解に対する耐性がより高いことに起因するものである。体液中のＣＯＬ２−３／４ネオエピトープの検出のための特異的免疫アッセイが開発されている（特許文献１）。横断研究において評価されたＲＡ患者及びＯＡ患者が、このコラーゲンＩＩ型由来マーカーのレベルを高めたことが報告されている。
【００１０】
ＣＯＬ２−３／４フラグメント及びＣＯＬ２−１／４フラグメントは、それぞれおおよそ７５ｋＤａ及び２５ｋＤａである。（特許文献１）は、ＣＯＬ２−３／４フラグメント内に位置決めされるエピトープを利用した、滑液及び血清中のコラーゲンＩＩ型フラグメントの検出を記載している。
【００１１】
テロペプチド領域から生じたフラグメント（（特許文献２）、（特許文献３）、（特許文献４））もまた、より容易に体液中に濾過される。しかしながら、当該フラグメントは、関節疾患において見られる初期のコラーゲン崩壊を担うと考えられているコラゲナーゼ活性の結果として生じるものではない。
【００１２】
炎症性疾患によって冒された関節組織の破壊から生じる他の軟骨由来代謝物質、例えば遊離尿ピリジノリン、軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質（ＣＯＭＰ）、ヒアルロン酸、アグリカン、及びコラーゲンＩＩＩ型フラグメントの検出もまた報告されている（特許文献５）。
【００１３】
（特許文献６）は、軟骨分解を検出且つ／又は監視する方法を開示している。当該方法は、生体サンプルにおいて、アミノ酸配列ＨＲＧＹＰＧＬＤＧの全て又は関連部分が含まれるコラーゲンＩＩ型フラグメントを測定することによって、そのような検出を可能にするものである。当該方法は、免疫アッセイを利用して、コラゲナーゼ活性に由来するコラーゲンＩＩ型のフラグメントを検出するものであり、コラーゲンＩＩ型のらせん領域内に位置決めされるアミノ酸配列ＨＲＧＹＰＧＬＤＧ（Ｃｏｌｌ２−１ペプチド）内に含まれるエピトープに対して抗体を向けることを含む。ゆえに、（特許文献６）は、前記フラグメントを、アミノ酸配列ＨＲＧＹＰＧＬＤＧ内に含まれるエピトープと免疫反応性である免疫学的結合パートナーと接触させることと、結果として生じる免疫反応を検出することとを含む、生体サンプル中のコラーゲンＩＩ型の又はそのフラグメントの質的又は定量的アッセイ法を提供する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】米国特許第６１３２９７６号明細書
【特許文献２】米国特許第５６４１８３７号明細書
【特許文献３】米国特許第５９１９６３４号明細書
【特許文献４】米国特許第６３４２３６１号明細書
【特許文献５】ＰＣＴ出願国際公開第０１／３８８７２号パンフレット
【特許文献６】国際公開第２００３／０７６９４７号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明者らは、Ｃｏｌｌ２−１ペプチド及び誘導された代謝物質の影響を軽減し、引き下げ、又は妨げるための、そして骨関節炎を処置且つ／又は予防するための手段を提供することを試みた。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明に従う研究を実行する際に、発明者らは、炎症メディエータ（ＩＬ−８及びＩＬ−６）及び血管形成因子（ＴＳＰ１及びＶＥＧＦ；ＴＳＰ１：トロンボスポンジン−１；抗血管形成因子；ＶＥＧＦ：血管内皮増殖因子；血管形成誘発性因子）の発現に及ぼす、そしてＯＡ滑膜細胞中での活性酸素種の産生に及ぼすＣｏｌｌ２−１ペプチドの影響を調査した。用量が増大したＣｏｌｌ２−１ペプチドの存在下で、発明者らは、滑膜細胞中でのＨ２Ｏ２産生の増大、ＮＯ産生の引下げ、そしてまたＧＳＨの引下げを観察した。炎症メディエータの発現が増大することも観察された。最後に、血管形成に関して、本発明者らは、血管形成誘発性因子ＶＥＧＦの増大、及び抗血管形成因子ＴＳＰ１の引下げを観察した。これは、血管形成誘発性因子と抗血管形成因子との間のアンバランスの徴候である。
【００１７】
本発明に従って実行される研究は、Ｃｏｌｌ２−１ペプチドの炎症誘発性及び免疫調節性を明らかにする。これらの結果は極めて重大である。発明者らは、軟骨分解のマーカーであるＣｏｌｌ２−１もまた、骨関節炎及び関節リウマチの生理病理学に直接関与することを実証する。したがって、Ｃｏｌｌ２−１及びＣｏｌｌ２−１ＮＯ２のそれぞれの中和、又は軟骨からのその放出の引下げは、局所的炎症及び全身性炎症、並びに免疫反応を調節することができる。これに関連して（in this context）、Ｃｏｌｌ２−１及びＣｏｌｌ２−１ＮＯ２はそれぞれ、生物療法の治療標的を代表することが見出された。
【００１８】
いずれの先行技術文献も、Ｃｏｌｌ２−１ペプチドがＩＩ型コラーゲン崩壊を増強する活性を有することを開示も示唆もしていない。
【００１９】
骨関節炎を処置且つ／又は予防するために、Ｃｏｌｌ２−１放出の引下げを媒介し、又はＣｏｌｌ２−１ペプチドの活性を中和する手段が必要とされるが、これまでのところ先行技術に記載されていない。
【００２０】
したがって、本発明は、骨関節炎の予防及び／又は処置に用いられる、Ｃｏｌｌ２−１ペプチド活性の阻害剤及び／又はＣｏｌｌ２−１ＮＯ２ペプチド活性の阻害剤を活性成分として含む医薬を提供する。
【００２１】
さらに、本発明は、リウマチ疾患及び筋骨格疾患（ＲＭＤ：rheumatic and musculodsketal diseases）の予防及び／又は処置に用いられる、Ｃｏｌｌ２−１ペプチド活性の阻害剤及び／又はＣｏｌｌ２−１ＮＯ２ペプチド活性の阻害剤を活性成分として含む医薬を提供する。
【００２２】
Ｃｏｌｌ２−１ペプチド活性及び／又はＣｏｌｌ２−１ＮＯ２ペプチド活性の阻害剤は、それぞれ、Ｃｏｌｌ２−１ペプチド及びＣｏｌｌ２−１ＮＯ２ペプチドに起因し、又は、それぞれ、Ｃｏｌｌ２−１ペプチド及びＣｏｌｌ２−１ＮＯ２ペプチドを含むペプチドに起因する。Ｃｏｌｌ２−１ペプチドは、アミノ酸配列ＨＲＧＹＰＧＬＤＧ（配列番号１）からなる。Ｃｏｌｌ２−１−ＮＯ２ペプチドは、ＮＯ２基によって修飾されている。Ｃｏｌｌ２−１ペプチドを含むペプチドは、アミノ酸配列ＨＲＧＹＰＧＬＤＧを含むペプチドである。Ｃｏｌｌ２−１ＮＯ２ペプチドを含むペプチドは、アミノ酸配列ＨＲＧＹＰＧＬＤＧ−ＮＯ２を含むペプチドである。
【００２３】
本発明の医薬の好ましい実施形態において、Ｃｏｌｌ２−１ペプチド活性又はＣｏｌｌ２−１ＮＯ２ペプチド活性の阻害剤は、以下のいずれか１つ若しくはそれ以上、又は全てに及ぼすＣｏｌｌ２−１ペプチド活性又はＣｏｌｌ２−１ＮＯ２ペプチド活性の増強作用を阻害し、又は引き下げる：関節炎の滑膜線維芽細胞中での、活性酸素種（例えばＨ２Ｏ２）の産生、血管形成因子の発現、炎症誘発性サイトカイン（例えばＩＬ−６及びＩＬ−８）の発現。
【００２４】
血管形成因子に関して、Ｃｏｌｌ２−１ペプチド活性又はＣｏｌｌ２−１ＮＯ２ペプチド活性の阻害剤は、血管形成誘発性因子（ＶＥＧＦ）の発現に及ぼすＣｏｌｌ２−１ペプチド活性又はＣｏｌｌ２−１ＮＯ２ペプチド活性の増強作用を阻害し、又は引き下げる；一方で、Ｃｏｌｌ２−１ペプチド活性又はＣｏｌｌ２−１ＮＯ２ペプチド活性の阻害剤は、抗血管形成因子（ＴＳＰ１）の発現に及ぼすＣｏｌｌ２−１ペプチド活性又はＣｏｌｌ２−１ＮＯ２ペプチド活性の引下げ効果を阻害し、引き下げ、又は減少させる。
【００２５】
医薬の別の好ましい実施形態において、Ｃｏｌｌ２−１ペプチド活性又はＣｏｌｌ２−１ＮＯ２ペプチド活性の前記阻害剤は、アミノ酸配列ＨＲＧＹＰＧＬＤＧ（配列番号１）内に含まれるエピトープと免疫反応性である免疫学的結合パートナーである。
【００２６】
さらに好ましい実施形態において、免疫学的結合パートナーは、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、Ｆｃフラグメント、Ｆａｂフラグメント、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、キメラ抗体、バイオベター、Ｃｏｌｌ２−１ペプチド若しくはＣｏｌｌ２−１ＮＯ２ペプチドに特異的に結合する他の抗原特異的抗体フラグメント、又はｃｏｌｌ２−１ペプチド若しくはｃｏｌｌ２−１ＮＯ２ペプチドに特異的に結合する他のリガンド受容体フラグメントからなる群から選択される。
【００２７】
特に好ましい実施形態において、免疫学的結合パートナーは、Ｃｏｌｌ２−１ペプチド又はＣｏｌｌ２−１ＮＯ２ペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体である。
【００２８】
別の特に好ましい実施形態において、医薬は、Ｃｏｌｌ２−１ペプチドに特異的に結合する免疫学的結合パートナー、及びＣｏｌｌ２−１ＮＯ２ペプチドに特異的に結合する免疫学的結合パートナーの混合物を含む。
【００２９】
本発明はまた、骨関節炎の予防方法及び／又は処置方法であって、それを必要とする対象への、有効用量のＣｏｌｌ２−１ペプチド活性の阻害剤及び／又はＣｏｌｌ２−１ＮＯ２ペプチド活性の阻害剤の投与を含む方法を提供する。
【００３０】
さらに、本発明は、リウマチ疾患及び筋骨格疾患（ＲＭＤ）の予防方法及び／又は処置方法であって、それを必要とする対象への、有効用量のＣｏｌｌ２−１ペプチド活性の阻害剤及び／又はＣｏｌｌ２−１ＮＯ２ペプチド活性の阻害剤の投与を含む方法を提供する。
【００３１】
本発明の好ましい方法において、活性成分は、アミノ酸配列ＨＲＧＹＰＧＬＤＧ（配列番号１）内に含まれるエピトープと免疫反応性である免疫学的結合パートナーである。さらに、骨関節炎の予防方法及び／又は処置方法の好ましい実施形態は既に、各医薬について先に記載されている。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】図１は、ＯＡ滑膜線維芽細胞中でのＨ２Ｏ２産生に及ぼす（Ａ）Ｃｏｌｌ２−１ペプチド及び（Ｂ）Ｃｏｌｌ２−１ＮＯ２ペプチドの影響を示す。Ｃｏｌｌ２−１ペプチド（０．４５ｎｍｏｌ及び４．５ｎｍｏｌ）若しくはＣｏｌｌ２−１ＮＯ２ペプチド（４ｐｍｏｌ及び４０ｐｍｏｌ）の濃度を増大させずに（コントロール）、又は増大させて、滑膜線維芽細胞を２４時間培養した。結果を、平均±ＳＥＭ（Ｎ＝１０）として表す。＊Ｐ＜０．０５及び＊＊Ｐ＜０．０１。
【図２】図２は、ＯＡ滑膜線維芽細胞中でのＧＳＨ産生に及ぼす（Ａ）Ｃｏｌｌ２−１ペプチド及び（Ｂ）Ｃｏｌｌ２−１ＮＯ２ペプチドの影響を示す。Ｃｏｌｌ２−１ペプチド（０．４５ｎｍｏｌ及び４．５ｎｍｏｌ）若しくはＣｏｌｌ２−１ＮＯ２ペプチド（４ｐｍｏｌ及び４０ｐｍｏｌ）の濃度を増大させずに（コントロール）、又は増大させて、滑膜線維芽細胞を２４時間培養した。結果を、平均±ＳＥＭ（Ｎ＝１０）として表す。＊＊Ｐ＜０．０１及び＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図３】図３は、ＯＡ滑膜線維芽細胞中でのＮＯ産生に及ぼす（Ａ）Ｃｏｌｌ２−１ペプチド及び（Ｂ）Ｃｏｌｌ２−１ＮＯ２ペプチドの影響を示す。Ｃｏｌｌ２−１ペプチド（０．４５ｎｍｏｌ及び４．５ｎｍｏｌ）若しくはＣｏｌｌ２−１ＮＯ２ペプチド（４ｐｍｏｌ及び４０ｐｍｏｌ）の濃度を増大させずに（コントロール）、又は増大させて、滑膜線維芽細胞を２４時間培養した。結果を、平均±ＳＥＭ（Ｎ＝１０）として表す。＊＊Ｐ＜０．０１及び＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図４】図４は、ＯＡ滑膜線維芽細胞中でのＴＳＰ１発現に及ぼす（Ａ）Ｃｏｌｌ２−１ペプチド及び（Ｂ）Ｃｏｌｌ２−１ＮＯ２ペプチドの影響を示す。Ｃｏｌｌ２−１ペプチド（０．４５ｎｍｏｌ及び４．５ｎｍｏｌ）若しくはＣｏｌｌ２−１ＮＯ２ペプチド（４ｐｍｏｌ及び４０ｐｍｏｌ）の濃度を増大させずに（コントロール）、又は増大させて、滑膜線維芽細胞を２４時間培養した。総ＲＮＡを、細胞抽出物中に単離して、ＴＳＰ１  ｍＲＮＡ発現を、リアルタイムＰＣＲ技術によって分析した。結果を、平均±ＳＥＭ（Ｃｏｌｌ２−１ペプチドについてＮ＝１０、そしてＣｏｌｌ２−１ＮＯ２ペプチドについてＮ＝５）として表す。＊＊Ｐ＜０．０１。
【図５】図５は、ＯＡ滑膜線維芽細胞中でのＶＥＧＦ発現に及ぼすペプチドＣｏｌｌ２−１及びＣｏｌｌ２−１ＮＯ２の影響を示す。Ｃｏｌｌ２−１ペプチド（０．４５ｎｍｏｌ及び４．５ｎｍｏｌ）若しくはＣｏｌｌ２−１ＮＯ２ペプチド（４ｐｍｏｌ及び４０ｐｍｏｌ）の濃度を増大させずに（コントロール）、又は増大させて、滑膜線維芽細胞を２４時間培養した。総ＲＮＡを、細胞抽出物中に単離して、ＶＥＧＦ  ｍＲＮＡ発現を、リアルタイムＰＣＲ技術によって分析した。結果を、平均±ＳＥＭ（Ｃｏｌｌ２−１ペプチドについてＮ＝１０、そしてＣｏｌｌ２−１ＮＯ２ペプチドについてＮ＝５）として表す。
【図６】図６は、ＯＡ滑膜線維芽細胞中での炎症メディエータ発現に及ぼすペプチドＣｏｌｌ２−１及びＣｏｌｌ２−１ＮＯ２の影響を示す。Ｃｏｌｌ２−１ペプチド（０．４５ｎｍｏｌ及び４．５ｎｍｏｌ）若しくはＣｏｌｌ２−１ＮＯ２ペプチド（４ｐｍｏｌ及び４０ｐｍｏｌ）の濃度を増大させずに（コントロール）、又は増大させて、滑膜線維芽細胞を２４時間培養した。総ＲＮＡを、細胞抽出物中に単離して、ＩＬ−８（Ａ〜Ｂ）及びＩＬ−６（Ｃ）のｍＲＮＡ発現を、リアルタイムＰＣＲ技術によって分析した。結果を、平均±ＳＥＭ（ＩＬ−８発現に及ぼすＣｏｌｌ２−１ペプチドの影響についてＮ＝１０、それ以外Ｎ＝５）として表す。＊Ｐ＜０．０５及び＊＊Ｐ＜０．０１。
【図７】図７は、Ｃｏｌｌ２−１ペプチドとのＡＳ０６１９の競合阻害、並びに（Ａ）Ｈ２Ｏ２、（Ｂ）ＧＳＨ、及び（Ｃ）ＮＯの酸化ストレスパラメータに及ぼす効果を示す。ＡＳ０６１９の存在下又は不在下で、Ｃｏｌｌ２−１ペプチドなし（コントロール）、又はＣｏｌｌ２−１ペプチド（４．５ｎｍｏｌ）ありで、滑膜線維芽細胞を２４時間培養した。総ＲＮＡを、細胞抽出物中に単離して、ＩＬ−８  ｍＲＮＡ発現を、リアルタイムＰＣＲ技術によって分析した。結果を、平均±ＳＥＭ（三反復において、患者Ｎ＝１）として表す。＊Ｐ＜０．０５。
【図８】図８は、Ｃｏｌｌ２−１ペプチドとのＡＳ０６１９の競合阻害、及びＩＬ８発現に及ぼす効果を示す。ＡＳ０６１９の存在下又は不在下で、Ｃｏｌｌ２−１ペプチドなし（コントロール）、又はＣｏｌｌ２−１ペプチド（４．５ｎｍｏｌ）ありで、滑膜線維芽細胞を２４時間培養した。結果を、平均±ＳＥＭ（三反復において、患者Ｎ＝１）として表す。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１及び＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図９】図９は、プロテインＡカラムでの精製後の１０８ＨＲＧＹＰＧＬＤＧ１１６ペプチドに向けられるポリクローナル抗体の、２２０ｎｍから６００ｎｍの波長での吸光度を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
本発明者らは、Ｃｏｌｌ２−１ペプチド及びＣｏｌｌ２−１ＮＯ２ペプチドが、骨関節炎（ＯＡ）及び慢性関節リウマチと直接関連する炎症誘発性、血管形成誘発性、及び免疫調節性を有することを見出した。これらの結果は、軟骨分解のマーカーであるＣｏｌｌ２−１が、ＯＡの生理病理学にも関与していることを実証している。したがって、Ｃｏｌｌ２−１放出の引下げ又はその中和が、局所的炎症及び全身性炎症、並びに免疫反応を引き下げることによる治療効果を有することとなる。したがって、本発明は、Ｃｏｌｌ２−１ペプチドの、そしてＣｏｌｌ２−１ＮＯ２ペプチドの影響を軽減し、引き下げ、又は妨げるための、そして骨関節炎を処置且つ／又は予防するための手段を提供する。
【００３４】
ペプチドのニトロ化形態もまた、本発明に関連する。ペプチドニトロ化は主に、一酸化窒素（ＮＯ）及びスーパーオキシドアニオン（Ｏ２−）の反応によって形成される強酸化剤ペルオキシ亜硝酸アニオン（ＯＮＯＯ−）との芳香族アミノ酸の相互作用によって生じる。チロシン残基、フェニルアラニン残基、及びトリプトファン残基が、ニトロ化に特に影響される。Ｉ型コラーゲンについて実証されたように、ＩＩ型コラーゲンは、ペルオキシニトライトによるニトロ化が可能である。高いレベルのニトライト／ニトレートが、ＯＡ及びＲＡの患者の血清及び関節液中に見出されている。このことは、ＯＮＯＯ−の産生が、これらの疾患において増大していることを示している。さらに、軟骨細胞は、Ｏ２−及びＮＯの双方を発生させることができ、ニトロチロシンが、関節炎患者の軟骨において見出されている。誘導可能な一酸化窒素シンターゼの選択的阻害剤Ｎ−イミノエチル−Ｌ−リシンが、イヌにおいて誘導される実験的ＯＡの進行を遅らせることも報告されている。全体として、これらの発見は、ＮＯ又は由来する活性酸素種が、関節炎の構造変化において主要な役割を果たしていることを示しており、そして、軟骨マトリックス成分がインサイチューでニトロ化された後に、滑液中に放出され得ることを示唆している。
【００３５】
ゆえに、本発明は、骨関節炎の予防及び／又は処置に用いられるＣｏｌｌ２−１ペプチド活性の阻害剤及び／又はＣｏｌｌ２−１ＮＯ２ペプチド活性の阻害剤を活性成分として含む医薬を提供する。
【００３６】
本明細書中で用いられる、Ｃｏｌｌ２−１ペプチド活性の阻害剤及び／又はＣｏｌｌ２−１ＮＯ２ペプチド活性の阻害剤は好ましくは、それぞれのペプチドの活性、特に、関節炎の滑膜線維芽細胞における、Ｈ２Ｏ２産生に及ぼす活性、血管形成因子の発現、並びに／又はＩＬ−６及びＩＬ−８の発現を選択的に引き下げ、又は阻止する剤である。
【００３７】
血管形成因子に関して、Ｃｏｌｌ２−１ペプチド活性又はＣｏｌｌ２−１ＮＯ２ペプチド活性の阻害剤は、血管形成誘発性因子（ＶＥＧＦ）の発現に及ぼす、Ｃｏｌｌ２−１ペプチド活性又はＣｏｌｌ２−１ＮＯ２ペプチド活性の増強作用を阻害し、又は引き下げる。さらに、Ｃｏｌｌ２−１ペプチド活性又はＣｏｌｌ２−１ＮＯ２ペプチド活性の阻害剤は、抗血管形成因子（ＴＳＰ１）の発現に及ぼす、Ｃｏｌｌ２−１ペプチド活性又はＣｏｌｌ２−１ＮＯ２ペプチド活性の引下げ効果を阻害し、又は引き下げる。
【００３８】
特に、本発明は、アミノ酸配列ＨＲＧＹＰＧＬＤＧ（配列番号１）内に含まれるエピトープと免疫反応性である免疫学的結合パートナー、好ましくは、Ｃｏｌｌ２−１ペプチド又はＣｏｌｌ２−１ＮＯ２ペプチドに特異的に結合するポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、Ｆｃフラグメント、Ｆａｂフラグメント、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、キメラ抗体、バイオベター、又は他の抗原特異的抗体フラグメントからなる群から選択される免疫学的結合パートナーを含む医薬を提供する。
【００３９】
特に好ましい実施形態において、免疫学的結合パートナーは、Ｃｏｌｌ２−１ペプチド又はＣｏｌｌ２−１ＮＯ２ペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体である。
【００４０】
医薬中にそのような阻害剤を与えることによって、関節炎の滑膜線維芽細胞におけるＨ２Ｏ２産生に及ぼす、血管形成因子の発現に及ぼす、且つ／又はＩＬ−６及びＩＬ−８の発現に及ぼす、Ｃｏｌｌ２−１又はＣｏｌｌ２−１ＮＯ２のペプチド活性は、引き下げられ、又は妨げられる。本発明についての研究中に調製されたポリクローナル抗体（ＡＳ０６１９）が、酸化ストレスパラメータ及びＩＬ８遺伝子発現に及ぼすＣｏｌｌ２−１ペプチドの影響を引き下げ、又は中和した。図７に示されるように、ポリクローナル抗体ＡＳ０６１９は、Ｈ２Ｏ２（図７Ａ）及びＧＳＨ（図７Ｂ）の細胞内産生に及ぼす、そしてＮＯ（図７Ｃ）及びＩＬ８発現（図８）の産生に及ぼすＣｏｌｌ２−１ペプチドの影響を有意に回復に向かわせた。特に、ポリクローナル抗体ＡＳ０６１９は、ＯＡ滑膜線維芽細胞中でのＩＬ８発現を有意に引き下げた。
【００４１】
先に述べられるように、Ｃｏｌｌ２−１ペプチド活性又はＣｏｌｌ２−１ＮＯ２ペプチド活性の前記阻害剤は、アミノ酸配列ＨＲＧＹＰＧＬＤＧ内に含まれるエピトープと免疫反応性である免疫学的結合パートナーである。
【００４２】
アミノ酸配列ＨＲＧＹＰＧＬＤＧ内に含まれるエピトープと免疫反応性である免疫学的結合パートナー、すなわちＣｏｌｌ２−１ペプチド又はＣｏｌｌ２−１ＮＯ２ペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体は、国際公開第２００３／０７６９４７号に既に記載されている。そこでは、当該抗体は、コラーゲンＩＩ型由来配列ＨＲＧＹＰＧＬＤＧの検出に有用であることが記載されている。
【００４３】
抗血清特異性
国際公開第２００３／０７６９４７号は、２つの抗血清、Ｄ３及びＤ３７がそれぞれ、Ｃｏｌｌ２−１及びＣｏｌｌ２−１ＮＯ２に対して特異性が高いことが同定されたことを記載している。抗血清Ｄ３は、ヒト固有のＩ型コラーゲン及びＩＩ型コラーゲン、ヒト熱変性Ｉ型コラーゲン及びＩＩ型コラーゲン、並びにＢＳＡを認識しなかった。これは、抗血清Ｄ３が、Ｃｏｌｌ２−１の線形形態に特異的であることを示唆した。親和性が同じＤ３はまた、Ｃｏｌｌ２−１のニトロ化形態を認識した。抗血清Ｄ３７は、Ｃｏｌｌ２−１ＮＯ２に対する高い親和性を示した。ゆえに、抗血清Ｄ３７との、非ニトロ化ペプチド（Ｃｏｌｌ２−１）及びヒトニトロ化ＩＩ型コラーゲンの交差反応性はそれぞれ、０．０２％及び０．０８％未満と算出された。さらに、抗血清Ｄ３７は、ヒトニトロ化Ｉ型コラーゲン、固有のヒトＩ型コラーゲン及びＩＩ型コラーゲン、ニトロ化ＢＳＡ、ＢＳＡ、並びに３−ニトロ−Ｌ−チロシン残基を認識しなかった。Ｃｏｌｌ２−１ＮＯ２／Ｄ３７結合を置換するのに必要な、Ｃｏｌｌ２−１及びニトロ化コラーゲンＩＩ型の濃度が非常に高いことは、Ｄ３７がＣｏｌｌ２−１ＮＯ２に特異的であることを示唆した。
【００４４】
本明細書中で用いられるように、「免疫学的結合パートナー」は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、又はヒト化抗体を含み、Ｆｃフラグメント、Ｆａｂフラグメント、キメラ抗体、バイオベター、又は他の抗原特異的抗体誘導体、例えば単鎖抗体ｓｃＦｖが挙げられる。
【００４５】
Ｃｏｌｌ２−１ペプチドは、以下の配列ＨＲＧＹＰＧＬＤＧの全てを含有する。ＨＲＧＹＰＧＬＤＧ配列は、コラーゲンＩＩ型の鎖に固有であり、コラーゲンＩＩ型のらせん部分内に位置決めされる（ＧｅｎｅＢａｎｋ登録番号ＮＰ−００１８３５アイソフォーム１の２８９〜２９７位、及びＧｅｎｅＢａｎｋ登録番号Ｎｕ−１４９１６２アイソフォーム２の２２０〜２２８位）。
【００４６】
本明細書に記載される特性を有する抗体は、ＨＲＧＹＰＧＬＤＧ配列を構成する合成ペプチド、又はこの配列を含有する別の適切なタンパク質若しくはペプチドフラグメントに対して作製された。そのような抗体は、このエピトープを含有するあらゆる種、とりわけウシ、イヌ、マウス、ヒト、ウマ、及びラット由来のコラーゲンＩＩ型タンパク質又はそのフラグメントに向けた反応性を有する。そのペプチドは、免疫化用の抗原として用いられた。そのペプチドは、アジュバント媒体、好ましくは不完全フロイントアジュバント中で乳化して、哺乳類宿主、好ましくは齧歯類、最も好ましくはウサギ、さらにより好ましくはマウスに皮下注射され、又はその腹膜腔中に注射される。抗原性ペプチドの免疫原性を高めるために、キャリアタンパク質に結合させてからアジュバント媒体中に乳化させることができる。有用なキャリアは、タンパク質、例えばキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、エデスチン、アルブミン、例えばウシ血清アルブミン又はヒト血清アルブミン（ＢＳＡ又はＨＳＡ）、破傷風トキソイド、及びコレラトキソイド、ポリアミノ酸、例えばポリ−（Ｄ−リシン−Ｄ−グルタミン酸）である。ブースター注射が、免疫反応が得られるまで一定の間隔をおいて与えられてよく、最後の注射は、最大Ｂ細胞刺激を確実にするために静脈内に与えられてよい。
【００４７】
抗血清が、ＨＲＧＹＰＧＬＤＧ配列内のエピトープに結合する能力の有無に関してスクリーニングされた。モノクローナル抗体が、抗体価が最も有望な免疫化マウスの脾臓から単離されたリンパ球を骨髄腫細胞株と融合することによって、当該マウスから生成された。生成されたハイブリドーマクローンは、ＨＲＧＹＰＧＬＤＧ配列内のエピトープに対する反応性により、抗体の有無に関してスクリーニングされて、細胞株が、モノクローナル抗体の生産及び精製のために確立された。
【００４８】
ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体の生産法及びスクリーニング法は、当該技術分野において周知であり、記載される以外の方法が利用されてもよい。
【００４９】
製剤及び医薬組成物
以下の記載は、本発明の１つ又は複数の活性剤を含有し得る医薬組成物を指す。
【００５０】
本発明の組成物は、当該技術分野において知られており、且つ哺乳類の対象、好ましくはヒトへの投与に許容可能な方法による投与用に製剤化されることとなる。本発明の一部の実施形態において、本発明の組成物は、経口投与、静脈内投与、腹膜内投与、筋肉内投与、経皮投与、経鼻投与、イオン導入での投与、皮下投与、腫瘍内投与によって、又は投与の他の許容可能なあらゆる経路によって投与され得る。本発明の更なる実施形態において、本発明の組成物は、「局所領域に」、すなわち、膀胱内、病巣内、且つ／又は局所的に投与される。本発明の好ましい実施形態において、本発明の組成物は、注射、吸入、坐薬、経皮送達その他によって全身投与される。本発明の更なる実施形態において、組成物は、注目する離れた組織、例えば内臓へのアクセスを可能にするために、カテーテル又は他の装置を通して投与される。本発明の組成物はまた、組成物の徐放又は持続放出を可能にするために、デポ型装置、移植片、又はカプセル化製剤内から投与されてもよい。
【００５１】
本発明に基づいて、又は本発明に由来する治療剤を投与するために、適切なキャリア、賦形剤、及び他の剤が、運搬、送達、及び寛容等の向上を実現するために製剤中に組み込まれてよいことは勿論である。
【００５２】
多数の適切な製剤が、全ての薬剤師に知られている処方集において見出され得る：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，（１５ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ（１９７５））、特にその中のＢｌａｕｇ，Ｓｅｙｍｏｕｒによる８７章。これらの製剤として、例えば、粉末、ペースト、軟膏、ゼリー、ワックス、油、脂質、無水吸収基材、水中油エマルジョン又は油中水エマルジョン、エマルジョンカルボワックス（種々の分子量のポリエチレングリコール）、半固体ゲル、及びカルボワックスを含有する半固体混合物が挙げられる。
【００５３】
前述のいずれの製剤も、本発明に従う処置及び療法に適し得るが、製剤中の活性剤が製剤によって不活化されないこと、そして製剤が生理的に相溶性であることを条件とする。
【００５４】
有効な療法に必須の活性成分の量は、投与手段、標的部位、患者の生理的状態、及び投与される他の医薬が挙げられる多くの様々な因子によって決まることとなる。ゆえに、処置投薬量は、安全性及び有効性を最適化するように滴定されるべきである。典型的には、インビトロで用いられる投薬量が、活性成分のインサイチュー投与に有用な量の有用なガイダンスを提供し得る。特定の障害の処置に有効な用量の動物試験が、ヒト投薬量の更なる予測的指標を提供することとなる。種々の考慮点が、例えば、Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，７ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８５），ＭａｃＭｉｌｌａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、及びＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，（１９９０）Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ，Ｅａｓｔｏｎ  Ｐｅｎｎに記載されている。その中で投与法が考察されており、経口投与、静脈内投与、腹膜内投与、筋肉内投与、経皮投与、経鼻投与、及びイオン導入での投与等が挙げられている。
【００５５】
本発明の組成物は、投与法に応じて、種々の単位剤型で投与されてよい。例えば、経口投与に適した単位剤型として、固形の剤型、例えば粉末、錠剤、ピル、カプセル及びドラジェ（dragees）、並びに液体剤型、例えばエリキシル、シロップ及び懸濁液が挙げられる。活性成分はまた、滅菌液体剤型で非経口的に投与されてもよい。ゼラチンカプセルは、活性成分を、そして不活性成分として粉末キャリア、例えばグルコース、ラクトース、スクロース、マンニトール、デンプン、セルロース又はセルロース誘導体、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、サッカリンナトリウム、タルク、及び炭酸マグネシウム等を含有する。所望の色、味、安定性、緩衝能力、分散、又は知られている他の所望の特徴を与えるために加えられてよい更なる不活性成分の例として、赤色酸化鉄、シリカゲル、ラウリル硫酸ナトリウム、二酸化チタン、及び食用の白色インク等がある。圧縮錠剤を製造するのに、類似の希釈剤が用いられてよい。錠剤及びカプセルは双方とも、数時間にわたる医薬品の連続した放出を実現する持続放出産物として製造されてよい。圧縮錠剤は、あらゆる不快な味をマスクし、且つ大気から錠剤を保護するために糖衣又はフィルムコーティングされてもよいし、胃腸管における選択的崩壊のために腸溶性であってもよい。経口投与用の液体剤型は、患者の許容性が増すように着色剤及び調味料を含有してよい。
【００５６】
医薬製剤中の本発明の組成物の濃度は広く、すなわち、約０．１重量％未満から、通常約２重量％、又は少なくとも約２重量％、２０重量％から５０重量％以上にも変動し得、そして、選択される特定の投与モードに従って、主に流体容量、粘度その他によって選択されることとなる。
【００５７】
本発明の組成物は、固形の組成物の使用によって投与されてよい。固形の組成物について、従来の非毒性の固体のキャリアが用いられてよく、例えば、医薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、スクロース、及び炭酸マグネシウム等が挙げられる。経口投与のために、医薬的に許容可能な非毒性組成物が、通常使用されるあらゆる賦形剤、例えば、以前に記載されたキャリア、及び通常１０〜９５％、より好ましくは２５％〜７５％の濃度の活性成分、すなわち、本発明の１つ又は複数の組成物を組み込むことによって、形成される。
【００５８】
エーロゾル投与用に、本発明の組成物は好ましくは、微細に分割された形態で、界面活性剤及び噴射剤と共に供給される。本発明の組成物の典型的なパーセンテージは、０．０１重量％〜２０重量％、好ましくは１重量％〜１０重量％である。界面活性剤は、勿論、非毒性でなければならず、好ましくは噴射剤中に可溶性でなければならない。そのような剤の典型として、６から２２個の炭素原子を含有する脂肪酸、例えばカプロン酸、オクタン酸、ラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、オレステリン酸、及びオレイン酸の、脂肪族多価アルコール又はその環状無水物とのエステル又は部分エステルがある。混合エステル、例えば混合グリセリド、又は天然グリセリドが使用されてよい。界面活性剤は、組成物の０．１重量％〜２０重量％、好ましくは０．２５重量％〜５重量％を構成してよい。組成物の残部は通常、噴射剤である。所望の場合には、例えば、鼻腔内送達用のレシチンのようなキャリアが含まれてもよい。
【００５９】
本発明の組成物は加えて、当該技術分野において周知の技術によって、デポ型系、カプセル化形態、又は移植片内から送達されてよい。同様に、組成物は、ポンプを介して、注目する組織に送達されてよい。
【００６０】
本発明の組成物はまた、徐放性組成物としてキット内に提供されてもよく、例えば毎日の、毎週の、毎月の単位で、スポンジ（sponge）、真皮パッチ、及び皮下移植片等として、ラッピング又はコンテナ内に提供されてもよい。この場合、患者は、一単位の組成物をコンテナから放出することができ、これを、キットの説明書に示されるように投薬する。組成物は次に、特定の期間の終了時に、フレッシュな単位等によって置換されてよい。
【００６１】
本発明の化合物は、１つ又は複数の更なる薬物をも含む組成物内から投与されてよい。本発明の化合物の、他の薬物及びキャリアに対する割合は、然るべく調整されてよい。
【００６２】
抗体
本発明は特に、Ｃｏｌｌ２−１ペプチド又はＣｏｌｌ２−１ＮＯ２ペプチドに向けられる抗体を指し、当該抗体は、当該ペプチドの活性を部分的に、又は完全に引き下げることとなる。本発明はさらに、Ｃｏｌｌ２−１ペプチド又はＣｏｌｌ２−１ＮＯ２ペプチドに特異的に結合する抗体を含む組成物を提供する。抗体が特異的に結合するペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を有する。抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、Ｆｃフラグメント、Ｆａｂフラグメント、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、キメラ抗体、又は他の抗原特異的抗体フラグメントであってよい。特に、前記抗体は、一般的な抗体（２つのタンパク質重鎖及び２つの軽鎖で構成される）、一般的な抗体のＦａｂフラグメント、単鎖可変フラグメント、又は単ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）であってよい。抗体は、医薬的に許容可能なキャリアで製剤化さてよい。好ましい実施形態において、抗体は、配列番号１のアミノ酸配列を有するＣｏｌｌ２−１又はＣｏｌｌ２−１ＮＯ２を特異的に認識して、これに結合する。さらに、好ましい抗体は、エピトープ（配列番号１に示されるアミノ酸配列内の５つ以上の連続アミノ酸残基のストレッチ）を特異的に認識する。
【００６３】
本明細書中で用いられる「抗体」という用語は、全長（すなわち、天然に存在する、又は、正常な免疫グロブリン遺伝子のフラグメント組換えプロセスによって形成される）免疫グロブリン分子（例えば、ＩｇＧ抗体）、又は免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な（すなわち、特異的に結合する）部分（抗体フラグメントが挙げられる）を指す。「抗体」及び「免疫グロブリン」は、本明細書中で同義的に用いられる。抗体フラグメントは、抗体の部分、例えばＦ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、及びナノボディ等である。ナノボディ（又は単ドメイン抗体（ｓｄＡｂ））は、天然に存在する重鎖抗体の固有の構造特性及び機能特性を含有する抗体由来治療タンパク質である。ナノボディ技術は、当初、ラクダ科（ラクダ及びラマ）が、軽鎖を欠く完全に機能的な抗体を有するという発見の後に開発された。この重鎖抗体は、単一の可変ドメイン（ＶＨＨ）及び２つの定常ドメイン（ＣＨ２及びＣＨ３）を含有する。重要なことに、クローニングされて単離されたＶＨＨドメインは、当初の重鎖抗体の完全な抗原結合能力を有する、完全に安定したポリペプチドである。抗体は、ヒト及び動物（マウス、ウサギ、ラクダ、ラマ、雌鶏、ヤギ）における免疫化を用いて得られてよい。
【００６４】
本明細書中で用いられる「抗体」という用語はまた、バイオベター又はバイオベター抗体を含む。バイオベター抗体は、市販されている抗体と同じ有効なエピトープを標的とする抗体であるが、特性を向上させるように操作されており、例えば、グリコシル化プロファイルがエフェクタ機能を高めるように最適化され、又はＦｃドメインが、血清半減期を延ばすように操作されているものである。
【００６５】
先に述べられるように、本発明において用いられる「抗体」という用語はまたさらに、抗体のＨ鎖若しくはＬ鎖、又はそれらの組合せにおける可変領域で形成される少なくとも１つの抗原結合部位を含有するペプチド、一組のＨ鎖フラグメント及びＬ鎖フラグメントで構成されるＦａｂ、二組のＨ鎖フラグメント及びＬ鎖フラグメントで構成されるＦ（ａｂ’）２、並びに単一のペプチド中の連続的に結合するＨ鎖フラグメント及びＬ鎖フラグメントで構成される単鎖抗体（以下、「ｓｃＦｖ」と呼ばれてもよい）等を含む。本発明の「抗体」は、通常インビボで存在する形態の完全長の抗体であってよく、これは、二組の完全長のＨ鎖及び完全長のＬ鎖で構成される。
【００６６】
本発明における「Ｆ（ａｂ’）２」及び「Ｆａｂ」という用語は、プロテアーゼ、例えばペプシン又はパパインによる免疫グロブリンの処置によって生じ、且つヒンジ領域中の２つのＨ鎖間に存在するジスルフィド結合周りの消化によって生成される抗体フラグメントを意味する。例えば、ＩｇＧ１がパパインで処理されると、ヒンジ領域中の２つのＨ鎖間に存在するジスルフィド結合の上流で切断が起こって、２つの同一の抗体フラグメントが生じ、その中では、ＶＬ（Ｌ鎖可変領域）及びＣＬ（Ｌ鎖定常領域）で構成されるＬ鎖、並びにＶＨ（Ｈ鎖可変領域）及びＣＨγ１（Ｈ鎖定常領域内のγ１領域）で構成されるＨ鎖フラグメントが、Ｃ末端領域にてジスルフィド結合によって結合する。これらの２つの同一の抗体フラグメントがそれぞれＦａｂ’と呼ばれる。また、ＩｇＧがペプシンで処理されると、ヒンジ領域中の２つのＨ鎖間に存在するジスルフィド結合の下流で切断が起こって、前記２つのＦａｂがヒンジ領域によって結合する組合せ産物よりも僅かに大きい抗体フラグメントが生じる。この抗体フラグメントは、Ｆ（ａｂ’）２と呼ばれる。
【００６７】
通常、抗体は、大きなポリペプチド及び小さなポリペプチドの２つのタイプからなる。大きなサブユニットは「Ｈ鎖（重鎖）」と呼ばれ、小さなサブユニットは「Ｌ鎖（軽鎖）」と呼ばれる。また、各ペプチドは、Ｎ末端側に存在し、且つ抗原結合部位を形成する「可変領域」、及び各抗体クラスに保存される「定常領域」で構成される。可変領域はさらに、抗原結合部位の形成に特に関与する相補性決定領域「ＣＤＲ」、及びその間に存在する「フレームワーク領域」に分割される。ＣＤＲは、Ｈ鎖及びＬ鎖のそれぞれについて、Ｎ末端側から「ＣＤＲ１」、「ＣＤＲ２」、及び「ＣＤＲ３」と呼ばれる３つの領域からなることが知られている。
【００６８】
本発明の医薬に用いられ得る単鎖抗体は、誘導可能なベクター、例えばｐＳＥ３８０プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）又はｐＥＴ２４ｄ（＋）プラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ）、及び宿主細菌細胞を適切に選択することによって、調製され得る。先の方法に加えて、本発明に用いられる抗体の生産において、動物細胞発現系、昆虫細胞発現系、及び酵母細胞発現系が用いられてもよい。Ｈ鎖とＬ鎖とを結合するためのリンカーもまた、当業者によって適切に選択され得る。
【００６９】
さらに、通常インビボで存在する形態の抗体が、ｓｃＦｖから調製され得る。例えば、Ｈ鎖及びＬ鎖の可変領域のみが、ＰＣＲによってｓｃＦｖプラスミドから増幅される。各フラグメントは、例えば、ヒト抗体のＨ鎖遺伝子及び／又はＬ鎖遺伝子を有するプラスミド中に組み換えられ、これによって、通常インビボで存在する形態の、可変領域を有する抗体のｓｃＦｖ上での形成が可能になる。詳細には、例えば、適切な制限酵素切断部位が、プラスミドからＨ鎖及びＬ鎖の可変領域を増幅するときに得られる遺伝子フラグメントの両末端に導入されて、ヒト抗体のＨ鎖及び／又はＬ鎖を有するプラスミド上の適切な制限酵素切断部位と結合されることによって、可変領域中の遺伝子を、フレームシフトを引き起こすことなく置換する。ゆえに、可変領域の配列をプラスミド上にそのまま有する、通常インビボで存在する形態の抗体が、調製され得る。さらに、抗体のＨ鎖若しくはＬ鎖、又はそれらの組合せの可変領域で形成される少なくとも１つの抗原結合部位を含有するペプチド、一組のＨ鎖フラグメント及びＬ鎖フラグメントで構成されるＦａｂ、並びに二組のＨ鎖フラグメント及びＬ鎖フラグメントで構成される（Ｆａｂ’２）もまた、抗体から調製され得る。
【００７０】
本発明の抗体の発現は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、酵母、昆虫細胞、及び動物細胞等を使用することによって、実行され得る。例えば、抗体がＣＯＳ細胞又はＣＨＯ細胞内で発現される場合、ｐＣＤＮＡ３．１（＋）が用いられてもｐＭＡＭｎｅｏ（ＣＬＯＮＥＴＥＣＨ）が用いられてもよい。例えば、先の方法で得られる抗体のＨ鎖の遺伝子が、ｐＣＤＮＡ３．１（＋）のマルチクローニングサイト中に組み込まれ、そしてＬ鎖の遺伝子がｐＭＡＭｎｅｏ中に組み込まれる。次に、プロモータとポリＡとの間にＬ鎖の遺伝子を有する発現ユニットが、Ｈ鎖を組み込んでいるベクターの適切な部位中に組み込まれる。従来の遺伝子工学技術による、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ−Ｋ１、又はＣＨＯ  ＤＧ４４中への当該ベクターの導入により、注目する抗体の産生が可能となる。さらに、ＤＨＦＲ遺伝子の発現ユニットは、例えば、ｐＳＶ２／ＤＨＦＲ（Ｎａｔｕｒｅ，１９８１．Ｖｏｌ．２９４，Ｌｅｅ  Ｆ．ｅｔ  ａｌ．）から切断されて、先に調製されたベクター中に入れられて、Ｈ鎖及びＬ鎖を発現するベクターに組み込まれる。当該ベクターは、従来の遺伝子工学技術によって、ＣＨＯ  ＤＧ４４中に導入される。このように選択された細胞が用いられて、ＭＴＸを用いるＤＨＦＲ遺伝子増幅系を利用することによって、抗体の生産性を大幅に向上させることができる。
【００７１】
ＣＯＳ細胞又はＣＨＯ細胞等の動物細胞は一般に、１０％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）を補ったダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で、５％ＣＯ２下で３７℃にて培養され得る。ＣＯＳ細胞中への遺伝子導入法として、エレクトロポーレーション、並びにＤＥＡＥ−デキストラン法、及びリポフェクチン等のトランスフェクション試薬を用いる方法があり得る。
【００７２】
本発明の医薬に用いられる抗体の生産時に、細胞は好ましくは、血清由来ウシ抗体の混入を妨げるために、無血清培地中で培養される。無血清培地中で順応されていないが、血清培地中で培養されるＣＯＳ細胞及びＣＨＯ細胞が、好ましくは、無血清ＤＭＥＭ中で培養される。このように培養液の上澄み中に得られる本発明の抗体は、例えばプロテインＡカラム及びプロテインＧカラムを用いて、ＩｇＧ抗体を精製する従来法によって、容易に精製され得る。
【００７３】
構造に関係なく、抗体フラグメントは、本発明に関連して、全長抗体によって認識されるのと同じ抗原と結合する。抗体フラグメントの製造法、及び抗体フラグメントのスクリーニング法が、当該技術分野において周知である。
【００７４】
本発明に従う抗Ｃｏｌｌ２−１抗体は、いくつかの様々な方法によって調製され得る。例えば、抗体は、組換えポリペプチド又はペプチドＨＲＧＹＰＧＬＤＧが投与された対象から得られ得る。一部の実施形態において、抗体は、組換え法によって製造されてよい。組換えモノクローナル抗体を製造する技術は、当該技術分野において周知である。組換えポリクローナル抗体は、米国特許出願公開第２００２／０００９４５３号明細書に記載されるのと類似の方法によって、本発明に従う組換えポリペプチドを免疫原として用いて、生産され得る。本発明に従って得られる前記抗体は、マウス抗体であっても、ヒト抗体であっても、ヒト化抗体であってもよい。ヒト化抗体は、一種由来の抗体；例えば、齧歯類、ウサギ、イヌ、ヤギ、ウマ、ラクダ、ラマ、又はニワトリの抗体（又は他の適切なあらゆる動物抗体）のＣＤＲが、齧歯類抗体の可変重鎖及び可変軽鎖から、ヒトの重可変ドメイン及び軽可変ドメイン中に移されている組換えタンパク質である。抗体分子の定常ドメインは、ヒト抗体の定常ドメインに由来する。ヒト化抗体の製造法は、当該技術分野において周知である。より最近では、ヒトＢ細胞から直接ハイブリドーマを生成することが可能であることが報告された。結果的に、組換えポリペプチド又はペプチドＨＲＧＹＰＧＬＤＧは、ハイブリドーマの生成に進む前に、ヒトＢ細胞の増殖を刺激するのに用いられ得る。
【００７５】
先に記載される抗体は、従来の方法によって得られ得る。例えば、本発明に従う組換えポリペプチドは、対象に投与され得、そして結果として生じるＩｇＧは、標準的な方法論によって、対象から収穫される血漿から精製され得る。
【００７６】
抗体組成物
本発明はまた、投与に適した抗体の調製物及び抗体組成物、例えば抗体及び医薬的に許容可能なキャリアを含む組成物を指す。抗体組成物は、当該技術分野において知られている方法によって、静脈内投与経路、筋肉内投与経路、皮下投与経路、及び経皮投与経路が挙げられるあらゆる投与経路用に製剤化され得る。一実施形態において、抗体組成物は、治療的に有効な量、すなわち、治療的に有益な効果を達成するのに十分な量の抗体を提供する。
【００７７】
一実施形態において、特定のＩＶＩＧ組成物は、Ｃｏｌｌ２−１ペプチド又はＣｏｌｌ２−１ＮＯ２ペプチドに特異的に結合する抗体を含む。抗体及び抗原は、以前に記載されるどの抗体及び抗原であってもよい。
【００７８】
抗体又は抗体組成物による、骨関節炎並びに他のリウマチ疾患及び筋骨格疾患の処置
本発明はまた、骨関節炎並びに他のリウマチ疾患及び筋骨格疾患（ＲＭＤ）を処置する方法であって、それを必要とする対象に、先に記載される抗体又は抗体組成物を投与することによって処置する方法を指す。骨関節炎の処置の標的患者集団として、骨関節炎を患う哺乳類、例えばヒトが挙げられる。
【００７９】
一実施形態に従えば、本発明は、本発明に従うＣｏｌｌ２−１又はＣｏｌｌ２−１ＮＯ２を対象とする抗体、及び医薬的に許容可能なキャリアを含む組成物を用いて、骨関節炎を処置する方法を提供する。骨関節炎を処置する医薬は、Ｃｏｌｌ２−１ペプチド又はＣｏｌｌ２−１ＮＯ２ペプチドに特異的に結合するポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、Ｆｃフラグメント、Ｆａｂフラグメント、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、キメラ抗体、又は他の抗原特異的抗体フラグメントを含む。さらに別の実施形態において、抗体は、Ｃｏｌｌ２−１ペプチド又はＣｏｌｌ２−１ＮＯ２ペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体である。
【００８０】
抗体組成物の治療的に有効な量は、当該技術分野においてルーチンである方法によって決定され得る。当業者であれば、当該量は、組成物内の特定の抗体、組成物中の抗体濃度、投与の頻度、処置されることになる疾患の重篤度、並びに対象の詳細、例えば年齢、体重及び免疫状態に従って変動し得ることを認識するであろう。治療的に有効な量は、１０ｎｇ／体重ｋｇから１００ｍｇ／体重ｋｇであろう。一部の実施形態において、投薬量は、少なくとも約０．５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約２０ｍｇ／ｋｇ、又は少なくとも約２５ｍｇ／ｋｇであろう。投与経路は、受動ワクチンに適したどの投与経路であってもよい。ゆえに、静脈内投与経路、皮下投与経路、筋肉内投与経路、腹膜内投与経路、腫瘍内投与経路、及び他の投与経路が想定される。先に述べられるように、抗体の治療的に有効な量は、治療的に有益な効果を達成するのに十分な量である。予防抗体組成物は、腫瘍サイズを縮小させ得、且つ拡大及び転移を予防し得る。
【００８１】
抗体組成物は、抗骨関節炎剤と併せて投与されてよい。抗骨関節炎剤は、抗体又は抗体組成物の投与前に、これと同時に、又はこれに引き続いて、併用されてよい。
【実施例】
【００８２】
実施例１：患者及び方法
１．１  患者。膝の骨関節炎（ＯＡ）の１０人の患者（８人の女性、２人の男性；平均年齢７０＋／−６歳）から、総膝関節置換手術時に、滑膜組織サンプルを得た。全対象が、インフォームドコンセントを提示した。
【００８３】
１．２  滑膜細胞の単離及び培養。関節滑膜生検を、完全培地（ＣＭ）（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、２ｍＭグルタミン、及び１０％ウシ胎児血清（Ｌｏｎｚａ，Ｖｅｒｖｉｅｒｓ、ベルギー）を補ったＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）低グルコース）において、トリスバッファ０．１Ｍ、ｐＨ  ７．４中０．６８ｍＭ  ＥＤＴＡを有する、ヒストリチクス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）由来コラゲナーゼ、Ｔｙｐｅ  ＩＡ（１ｍｇ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓａｉｎｔ−Ｌｏｕｉｓ、米国）及び０．２５％トリプシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓａｉｎｔ−Ｌｏｕｉｓ、米国）により、３７℃にて１時間消化した。細胞懸濁液を、７０μｍフィルタに通して、あらゆる未消化組織を除去した。次に、濾過した細胞懸濁液を、８００ｇでの遠心分離によって収集して、培養フラスコ内で培養した。２４時間後、培地を変更して、非付着性細胞を除去した。滑膜線維芽細胞（ＳＦＣ）を、３継代後に用いた。
【００８４】
１．３  滑膜線維芽細胞の処理。細胞を、２ｍｌのＣＭ中、２×１０５細胞／ウェルの密度にて、６ウェルプレート中に播種した。細胞がコンフルエンスに達したときに、ＣＭを１％血清培地と２４時間置換して、細胞を静止状態に維持した。細胞を、関節炎の患者の血液中に見出される広範な濃度のペプチドＣｏｌｌ２−１（１０８ＨＲＧＹＰＧＬＤＧ１１６；０．４５ｎｍｏｌ及び４．５ｎｍｏｌ）又はＣｏｌｌ２−１ＮＯ２（１０８ＨＲＧＹＰＧＬＤＧ−ＮＯ２１１６；４ｐｍｏｌ及び４０ｐｍｏｌ）と共に、又はペプチドＣｏｌｌ２−１無しで、２４時間インキュベートした。
【００８５】
１．４  ＲＮＡ抽出及びリアルタイム逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ  ＰＣＲ）。ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、オランダ）を用いて、総ＲＮＡを抽出して、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ベルギー）により、メーカーの説明書に従って、逆転写した。Ｒｏｔｏｒ  Ｇｅｎｅ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖｅｎｌｏ、オランダ）及びＳＹＢＲ  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑキット（Ｔａｋａｒａ，Ｖｅｒｖｉｅｒｓ、ベルギー）を用いて、リアルタイム定量ＰＣＲによって、ｃＤＮＡを定量化した。遺伝子発現レベルを、標準曲線による補間法によって判定した。ｍＲＮＡレベルを標準化するために、ハウスキーピング遺伝子であるＨＰＲＴを内部コントロールとして増幅した。オリゴヌクレオチドプライマー配列は、以下の通りであった：ＨＰＲＴフォワード、５’−ＴＧＴＡＡＴＧＡＣＣＡＧＴＣＡＡＣＡＧＧＧ−３’（配列番号２）；ＨＰＲＴリバース、５’−ＴＧＣＣＴＧＡＣＣＡＡＧＧＡＡＡＧＣ−３’（配列番号３）；ＴＳＰ−１フォワード、５’−ＣＡＧＡＣＣＧＣＡＴＴＧＧＡＧＡＴＡＣ−３’（配列番号４）；ＴＳＰ−１リバース、５’−ＣＣＡＴＣＧＴＴＧＴＣＡＴＣＡＴＣＧＴＧ−３’（配列番号５）；ＶＥＧＦフォワード、５’−ＴＧＣＣＴＴＧＣＴＧＣＴＣＴＡＣ−３’（配列番号６）；ＶＥＧＦリバース、５’−ＣＡＣＡＣＡＧＧＡＴＧＧＣＴＴＧＡＡ−３’（配列番号７）；ＩＬ−６フォワード、５’−ＡＡＡ  ＣＡＡ  ＡＴＴ  ＣＧＧ  ＴＡＣ  ＡＴＣ  ＣＴＣ  Ｇ−３’（配列番号８）；ＩＬ−６リバース、５’−ＣＣＡ  ＧＧＣ  ＡＡＧ  ＴＣＴ  ＣＣＴ  ＣＡＴ−３’（配列番号９）；ＩＬ−８フォワード、５’−ＧＧＡ  ＡＣＣ  ＡＴＣ  ＴＣＡ  ＣＴＧ  ＴＧＴ  ＧＴＡ  Ａ−３’（配列番号１０）；ＩＬ−８リバース、５’−ＴＧＧ  ＡＡＡ  ＧＧＴ  ＴＴＧ  ＧＡＧ  ＴＡＴ  ＧＴＣ  Ｔ−３’（配列番号１１）。
【００８６】
１．５  細胞内Ｈ２Ｏ２及びＯ２−の産生。細胞内スーパーオキシドアニオン（Ｏ２−）及び過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）のレベルを、特定のプローブ：それぞれジヒドロエチジウム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｌｅｉｄｅｎ、オランダ）及びＨ２ＤＣＦＨ−ＤＡ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｌｅｉｄｅｎ、オランダ）の酸化によって、蛍光分析法で評価した。９６ウェルプレート上に播種した滑膜細胞（ウェルあたり８×１０３細胞）を、リン酸緩衝食塩水で一度洗浄してから、２５０μＭジヒドロエチジウム又は２００μＭ  Ｈ２ＤＣＦＨ−ＤＡのいずれか一方を含有する５０μＬのリン酸緩衝食塩水とインキュベートした。蛍光強度を、６時間の間、１時間毎に測定した。Ｏ２−又はＨ２Ｏ２のレベルを、任意の単位／生細胞で表す。付着性細胞の数を、クリスタルバイオレットアッセイによって測定した。
【００８７】
１．６  ＧＳＨアッセイ。細胞内ＧＳＨのレベルを、モノクロロビマン染色によって評価した。９６ウェルプレート上に播種した滑膜細胞（ウェルあたり８×１０３細胞）を、リン酸緩衝食塩水で一度洗浄してから、リン酸緩衝食塩水中に希釈した５０μＭモノクロロビマンとインキュベートした。それぞれ３８０及び４８５ｎｍの励起波長及び発光波長を用いて、蛍光強度を３℃にて測定した。細胞内ＧＳＨレベルを、蛍光強度の任意の単位として表した。
【００８８】
１．７  ＮＯ産生。ＤＡＦ２−ＤＡ蛍光プローブ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｌｅｉｄｅｎ、オランダ）を用いて、一酸化窒素の産生を評価した。９６ウェルプレート上に播種した細胞、滑膜細胞（ウェルあたり８×１０３細胞）を、リン酸緩衝食塩水で一度洗浄してから、５０μｌの２００μＭ  ＤＡＦ２−ＤＡ溶液とインキュベートした。蛍光強度を、６時間の間、１時間毎に測定した。ＮＯレベルを、任意の単位／生細胞で表す。付着性細胞の数を、クリスタルバイオレットアッセイによって測定した。
【００８９】
１．８  抗血清ＡＳ０６１９。配列Ｃｏｌｌ２−１ペプチド（１０８ＨＲＧＹＰＧＬＤＧ１１６）によるウサギの免疫化後、ポリクローナル抗体を得た。血清を、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｇｅｎｔ、ベルギー）で精製して、血清ＩｇＧのみを保持した。２８０ｎｍでのＩｇＧの吸光度は、１．９７４であった（図９）。そして、その濃度は、２．６６４９ｍｇ／ｍｌ（１．９７４Ｘモル吸光係数（ＩｇＧ＝１．３５））であった。
【００９０】
１．９  抗血清ＡＳ０６１９とのＣｏｌｌ２−１ペプチドの競合阻害。滑膜細胞培養に加える前に、Ｃｏｌｌ２−１ペプチドを、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、２ｍＭグルタミンを補った低グルコースＤＭＥＭ中の精製ポリクローナル抗体ＡＳ０６１９（Ｃｏｌｌ２−１ペプチドに特異的に結合するポリクローナル抗体）と、一定の撹拌下で４℃にて一晩、プレインキュベートした。この溶液の容量は、滑膜線維芽細胞の処理に必要とされる容量の１／４であった。
【００９１】
１．１０  統計分析。Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定の使用によって、陽性ならば、続くＤｕｎｎの多重比較事後検定によって、データを分析且つ比較した。Ｐ＜０．０５のとき、Ｐ値は有意であると考えた。ＧｒａｐｈＰａｄ  ＰｒｉｓｍソフトウェアＶ５．０を用いて、全てのデータを分析した。
【００９２】
実施例２：ＯＡ滑膜線維芽細胞中の酸化ストレスパラメータに及ぼすペプチドＣｏｌｌ２−１及びＣｏｌｌ２−１ＮＯ２の影響
蛍光プローブを用いて、酸化ストレスに及ぼすＣｏｌｌ２−１ペプチド及びＣｏｌｌ２−１ＮＯ２ペプチドの影響を調査した。これを行うために、いくつかのパラメータを研究した。第１の結果は、滑膜線維芽細胞によるＨ２Ｏ２の細胞内産生であった。図１Ａ及び図１Ｂに示すように、Ｃｏｌｌ２−１ペプチド（０．４５ｎｍｏｌ及び４．５ｎｍｏｌ）及びＣｏｌｌ２−１ＮＯ２ペプチド（４ｐｍｏｌ及び４０ｐｍｏｌ）の双方によるＨ２Ｏ２の細胞内産生は、４．５ｎｍｏｌの濃度（＊Ｐ＜０．０５）のＣｏｌｌ２−１によって、そして４ｐｍｏｌ（＊＊Ｐ＜０．０１）及び４０ｐｍｏｌ（＊＊Ｐ＜０．０１）の濃度のＣｏｌｌ２−１ＮＯ２によって、有意に増大した。
【００９３】
同時に、グルタチオン、ＧＳＨの形態の細胞内レベルの引下げに及ぼすこれらのペプチドの影響を評価した。Ｃｏｌｌ２−１（０．４５ｎｍｏｌ及び４．５ｎｍｏｌ；＊＊Ｐ＜０．０１）及びＣｏｌｌ２−１ＮＯ２（４ｐｍｏｌ及び４０ｐｍｏｌ；＊＊＊Ｐ＜０．００１）の存在下で、ＧＳＨの有意な引下げを観察した（図２Ａ及び図２Ｂ）。最後に、Ｃｏｌｌ２−１ペプチド及びＣｏｌｌ２−１ＮＯ２ペプチドはまた、滑膜線維芽細胞におけるＮＯ（一酸化窒素）の産生を有意に引き下げた（図３Ａ及び図３Ｂ）。この影響は、細胞をＣｏｌｌ２−１ＮＯ２で処理した場合、かなり大きかった（図３Ｂ）。
【００９４】
実施例３：ＯＡ滑膜線維芽細胞中の血管形成因子の発現に及ぼすペプチドＣｏｌｌ２−１及びＣｏｌｌ２−１ＮＯ２の影響
リアルタイムＰＣＲ技術を用いて、血管形成因子の発現に及ぼすＣｏｌｌ２−１ペプチド及びＣｏｌｌ２−１ＮＯ２ペプチドの影響を調査した。Ｃｏｌｌ２−１ペプチド（０．４５ｎｍｏｌ及び４．５ｎｍｏｌ）若しくはＣｏｌｌ２−１ＮＯ２ペプチド（４ｐｍｏｌ及び４０ｐｍｏｌ）の濃度を増大させずに、又は増大させて、滑膜線維芽細胞を２４時間インキュベートした。ＴＳＰ１（トロンボスポンジン（ＴＳＰ）−１；抗血管形成因子）遺伝子及びＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子；血管形成誘発性因子）遺伝子の発現を分析した。図４に示されるように、Ｃｏｌｌ２−１ペプチド及びＣｏｌｌ２−１ＮＯ２ペプチドは双方とも、ＴＳＰ１発現を引き下げた。この影響は、４０ｐｍｏｌの濃度のＣｏｌｌ２−１ＮＯ２で有意であった（＊＊Ｐ＜０．０１；図４Ｂ）。対照的に、ＶＥＧＦ発現は、図５に示すように、濃度が増大するＣｏｌｌ２−１ペプチド及びＣｏｌｌ２−１ＮＯ２ペプチドの存在下で、増大する傾向があった。興味深いことに、これらの２つの遺伝子の差別的発現は、血管形成プロセスに有利になる血管形成誘発性因子と抗血管形成因子との間のアンバランスを明らかにした。
【００９５】
実施例４：ＯＡ滑膜線維芽細胞中の炎症メディエータの発現に及ぼすペプチドＣｏｌｌ２−１及びＣｏｌｌ２−１ＮＯ２の影響
さらに、炎症プロセスに及ぼすＣｏｌｌ２−１ペプチド及びＣｏｌｌ２−１ＮＯ２ペプチドの影響も調査した。ＯＡ生理病理学プロセスに関係する２つの遺伝子、ＩＬ（インターロイキン）−８遺伝子及びＩＬ−６遺伝子の発現を分析した。図６に示すように、Ｃｏｌｌ２−１ペプチド及びＣｏｌｌ２−１ＮＯ２ペプチドの濃度の増大は、ＯＡ滑膜線維芽細胞による双方のサイトカインの発現を増大させた。特に、０．４５ｎｍｏｌ（＊＊Ｐ＜０．０１）及び４．５ｎｍｏｌ（＊Ｐ＜０．０５）でのＣｏｌｌ２−１は、用量依存的に、ＩＬ８遺伝子発現を増大させた。これらのデータは、Ｃｏｌｌ２−１ペプチドの炎症誘発性を強調する。
【００９６】
実施例５：Ｃｏｌｌ２−１ペプチドとのＡＳ０６１９の競合阻害
ＩＩ型コラーゲンペプチドを中和する抗体又は他の剤を、関節炎を処置する生物療法として用いることができるという仮説を実証するために、Ｃｏｌｌ２−１ペプチドに向けられる特異的ポリクローナル抗体を試験した。実施例１の項１．８に記載するように、Ｃｏｌｌ２−１ペプチド（１０８ＨＲＧＹＰＧＬＤＧ１１６）でウサギを免疫化した。ポリクローナル抗体を得て、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｃｏｌｕｍｎｓ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｇｅｎｔ、ベルギー）で精製して、血清ＩｇＧのみを保持した。精製したＩｇＧの吸光度は、２８０ｎｍにて測定して、１．９７４であった。濃度は、２．６６４９ｍｇ／ｍｌ（１．９７４Ｘモル吸光係数（ＩｇＧ＝１．３５））であった。ポリクローナル抗体を、ＡＳ０６１９と名付けた。
【００９７】
ポリクローナル抗体ＡＳ０６１９による、酸化ストレスパラメータ（図７）及びＩＬ８遺伝子発現（図８）に及ぼすペプチド中和の効果を調査した。図７に示すように、ＡＳ０６１９は、Ｈ２Ｏ２（＊Ｐ＜０．０５；図７Ａ）及びＧＳＨ（＊＊＊Ｐ＜０．００１；図７Ｂ）の細胞内産生に及ぼす、ＮＯ（＊Ｐ＜０．０５；図７Ｃ）の産生に及ぼす、そしてＩＬ８発現（図８）に及ぼすＣｏｌｌ２−１ペプチドの影響を有意に回復に向かわせた。特に、ＡＳ０６１９は、ＯＡ滑膜線維芽細胞において、ＩＬ８発現（＊Ｐ＜０．０５）を有意に引き下げた。
【００９８】
競合アッセイにおいて、ポリクローナル抗体ＡＳ０６１９とのＣｏｌｌ２−１ペプチドの競合阻害をアッセイした。滑膜細胞培養に加える前に、Ｃｏｌｌ２−１ペプチドを、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、２ｍＭグルタミンを補った低グルコースＤＭＥＭ中の精製ポリクローナル抗体ＡＳ０６１９と、一定の撹拌下で４℃にて一晩、プレインキュベートした。この溶液の容量は、滑膜線維芽細胞の処理に必要とされる容量の１／４であった。結果として、競合アッセイにおいて、１．３３μｇ／ｍｌのポリクローナル抗体ＡＳ０６１９が、５００ｎＭ  Ｃｏｌｌ２−１ペプチドに結合することが示された。
【００９９】
初めて、ＩＩ型コラーゲンペプチドが、骨関節炎及び慢性関節リウマチと直接関連する炎症誘発性、血管形成誘発性、及び免疫調節誘発性を有することが示された。これらの結果は極めて重大である。これらは、軟骨分解のマーカーであるＣｏｌｌ２−１が、ＯＡの生理病理学にも関係することを実証している。したがって、例えば抗体による、Ｃｏｌｌ２−１放出の引下げ、又はその中和は、局所的炎症及び全身性炎症、並びに先天性免疫反応を引き下げることによる治療効果を有し得る。本文脈において、Ｃｏｌｌ２−１及びそのニトロ化形態は、生物療法の潜在的治療標的を代表する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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