(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＦＳＨの生理活性、黄体形成ホルモン（ＬＨ）の生理活性、および絨毛性ゴナドトロピン（ＣＧ）の生理活性を増強する卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）リガンドであって、前記リガンドが抗体または抗体断片であり、
重鎖可変ドメインが次のＣＤＲを含み、
‐配列ＧＦＴＦＳＤＦＹ（配列番号９）によって規定されるＶＨ−ＣＤＲ１、
‐配列ＳＲＮＫＡＫＤＹＴＴ（配列番号１０）によって規定されるＶＨ−ＣＤＲ２、
‐配列ＡＲＤＡＲＦＡＹ（配列番号１１）によって規定されるＶＨ−ＣＤＲ３、且つ
軽鎖可変ドメインが次のＣＤＲを含む
‐配列ＱＳＬＬＹＳＳＮＱＫＮＹ（配列番号１２）によって規定されるＶＬ−ＣＤＲ１、‐配列ＷＡＳによって規定されるＶＬ−ＣＤＲ２、
‐配列ＱＱＹＹＳＹＰＲＴ（配列番号１３）によって規定されるＶＬ−ＣＤＲ３
ことを特徴とする前記リガンド。
【請求項２】
ＦＳＨの生理活性、黄体形成ホルモン（ＬＨ）の生理活性、および絨毛性ゴナドトロピン（ＣＧ）の生理活性を増強する卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）リガンドであって、前記リガンドが抗体または抗体断片であり、
重鎖可変ドメインが配列番号２または４７の配列を含み、および／または
軽鎖可変ドメインが配列番号４または４５の配列を含むことを特徴とする前記リガンド。
【請求項３】
ＦＳＨの生理活性、黄体形成ホルモン（ＬＨ）の生理活性、および絨毛性ゴナドトロピン（ＣＧ）の生理活性を増強する卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）リガンドであって、前記リガンドが抗体または抗体断片であり、
重鎖可変ドメインが次のＣＤＲを含み、
‐配列ＧＦＴＦＮＴＹＡ（配列番号１４）によって規定されるＶＨ−ＣＤＲ１、
‐配列ＩＲＳＫＳＮＮＹＡＴ（配列番号１５）によって規定されるＶＨ−ＣＤＲ２、
‐配列ＶＲＱＤＹＹＧＳＳＹＦＤＹ（配列番号１６）によって規定されるＶＨ−ＣＤＲ３、且つ
軽鎖可変ドメインが次のＣＤＲを含む
‐配列ＱＳＩＳＤＹ（配列番号１７）によって規定されるＶＬ−ＣＤＲ１、
‐配列ＹＡＳによって規定されるＶＬ−ＣＤＲ２、
‐配列ＱＮＧＨＳＦＰＹＴ（配列番号１８）によって規定されるＶＬ−ＣＤＲ３
ことを特徴とする前記リガンド。
【請求項４】
ＦＳＨの生理活性、黄体形成ホルモン（ＬＨ）の生理活性、および絨毛性ゴナドトロピン（ＣＧ）の生理活性を増強する卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）リガンドであって、前記リガンドが抗体または抗体断片であり、
重鎖可変ドメインが配列番号６の配列を含み、および／または
軽鎖可変ドメインが配列番号８の配列を含むことを特徴とする前記リガンド。
【請求項５】
前記リガンドがＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ディアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ナノボディ（登録商標）、軽鎖可変ドメイン、重鎖可変ドメインからなる群より選択されることを特徴とする、請求項１から４の何れか一項に記載のリガンド。
【請求項６】
前記リガンドがＣＮＣＭ  Ｉ−４８０１ハイブリドーマにより産生されるＣＡ５モノクローナル抗体であることを特徴とする、請求項１に記載のリガンド。
【請求項７】
前記リガンドがＣＮＣＭ  Ｉ−４８０２ハイブリドーマにより産生されるＣＨ１０モノクローナル抗体であることを特徴とする、請求項３に記載のリガンド。
【請求項８】
前記ｓｃＦｖのペプチド配列が配列番号２０または配列番号２２の配列であることを特徴とする、請求項５に記載のリガンド。
【請求項９】
請求項１から８の何れか一項に記載のリガンドとＦＳＨとの複合体、
請求項１から８の何れか一項に記載のリガンドとＬＨまたは絨毛性ゴナドトロピン（ＣＧ）ホルモンとの複合体
から選択されるリガンド−ゴナドトロピン複合体。
【請求項１０】
請求項１から８の何れか一項に記載のリガンドを含む医薬品。
【請求項１１】
請求項９に記載の複合体を含む医薬品。
【請求項１２】
メスの哺乳類動物において排卵または多排卵を誘導するための、請求項１０または１１に記載の医薬品。
【請求項１３】
メスの哺乳類動物において循環内在性プロゲステロンレベルを上昇させるための、請求項１０から１２の何れか一項に記載の医薬品。
【請求項１４】
メスの哺乳類動物において排卵または多排卵を誘導するための医薬組成物であって、請求項１から８の何れか一項に記載のリガンドおよび／または請求項９に記載の複合体および薬学的に許容可能な担体を含むことを特徴とする前記医薬組成物。
【請求項１５】
ＦＳＨ、ＬＨおよび／またはＣＧをさらに含むことを特徴とする、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
哺乳類動物の不妊症または低受胎症の治療および／または予防のための、請求項１４または１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
健康なメスの哺乳類動物における生殖を刺激するための請求項１４から１６の何れか一
項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）に対するものであり、且つ、ゴナドトロピンの生理活性を増強することができる抗体に関する。
【０００２】
本発明は、メスの哺乳類動物において排卵を誘導するための主に人間医学および獣医学におけるその抗体の用途を有する。
【０００３】
下の記述において、角括弧の間にある参照番号は本文書の末尾に提示されている参照文献のリストを指す。
【背景技術】
【０００４】
ゴナドトロピン（またはゴナドトロフィン）は、生殖腺（卵巣および精巣）の機能に作用することにより脊椎動物における生殖の制御に中心的な役割を果たす複雑な糖タンパク質ホルモンである。これらのホルモンのうちの２つ、すなわち黄体形成ホルモン（ＬＨ）と卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）は全ての脊椎動物において分泌されている。哺乳類動物のうちの２つのグループであるウマ科と霊長類のメンバーには胎盤によって分泌される絨毛性ゴナドトロピン（ＣＧ）であるヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）とウマ絨毛性ゴナドトロピン（ｅＣＧ）も存在し、両者ともＬＨ受容体を介して作用する。
【０００５】
黄体形成ホルモン（ＬＨ）は、視床下部によって産生されるＧｎＲＨの刺激の下で脳下垂体前葉の性腺刺激細胞によって産生される。ＬＨはオスではテストステロン生産を刺激し、一方でメスでは卵巣周期の調節に関与し、最終局面の卵胞成長と排卵およびその後の排卵された破裂卵胞の黄体への変換に関係する。月経周期の黄体期の間にＬＨは、胚の初期発生と着床に必須である、黄体によるプロゲステロン分泌を刺激する。ＬＨは全く同一の種の全ての糖タンパク質ホルモン（ＦＳＨ、ＣＧ、および甲状腺刺激ホルモンであるＴＳＨなど）に共通のαサブユニットとそのホルモン活性の特異性の原因となるβサブユニットからなり、そのホルモンの活性はそれらの２つのサブユニットが二量体として非共有結合によって結合している場合にのみ存在する。
【０００６】
卵胞刺激ホルモン（またはＦＳＨ）は、視床下部によって産生されるＧｎＲＨの刺激の下で脳下垂体前葉によって産生される。オスではそのホルモンは精子形成に必須であるセルトリ細胞を刺激する。メスではそのホルモンは顆粒膜細胞のＦＳＨ受容体を刺激することにより未成熟原始卵胞の動員、原始卵胞の成長、および原始卵胞の排卵前卵胞への分化に関係する。ＦＳＨはαとβの２つのサブユニットからなり、且つ、ＬＨの構造と類似の構造を有する。二量体だけがＦＳＨ受容体を刺激することができる。
【０００７】
メスではＬＨとＦＳＨのレベルは周期的であり、発情休止期または排卵期以外の間では非常に低く、排卵前の時期に分泌がピークに達する。
【０００８】
ゴナドトロピンはメスの哺乳類動物において排卵を誘導するために獣医学および人間医学において使用されている。有効ではあるが、生体液（血液、尿）または組織（脳下垂体）から抽出されたホルモンを使用するため、これらの処置には健康上のリスクが特に獣医学分野において提示されている。このことは妊娠した雌馬の血液から抽出されたウマ絨毛性ゴナドトロピン（ｅＣＧ）とブタ脳下垂体から抽出されたブタＬＨおよびＦＳＨに当てはまる。獣医学分野では妊婦の尿から抽出されたｈＣＧであるコルロン（登録商標）（ＭＳＤラボラトリー）も使用されている。
【０００９】
ヒトの臨床分野、特に生殖補助医療（すなわちＡＲＴ）の分野では、精製ＦＳＨであるフォスティモン（登録商標）（ラボラトワール・ジェニエーブル(Laboratoire Genevrier)）、およびｈＭＧ（ヒト閉経期ゴナドトロピン）であるメノピュール（登録商標）（フェリング・ファーマ・ラボラトリー）、ＦＳＨとＬＨの混合物、および精製ｈＣＧである絨毛性ゴナドトロピンＥｎｄｏ５０００（シェリングプラウ・ラボラトリー）などの閉経した女性の尿から抽出されたホルモンが使用されている。ゴナールＦ（登録商標）（メルクセローノ・ラボラトリー）およびピュレゴン（登録商標）（メルクシェリングプラウ・ラボラトリー）などの組換えヒトＦＳＨ、ならびにオビドレル（登録商標）およびルベリス（登録商標）（メルクセローノ・ラボラトリー）などの組換えｈＣＧおよびＬＨも使用されている。
【００１０】
加えて、これらのホルモンの反復使用はそれらのホルモンの効果を中和する免疫反応をたいてい引き起こし、そうして治療効力を減少させることになる。しかしながら、共投与されるとそのホルモンの活性を増強することができる抗体がその免疫反応によって産生され得ることもいくつかの事例において示されている（欧州特許第１５１８８６３号明細書）［１］。その後、ＬＨの作用を増強することができる３種類の抗ＬＨモノクローナル抗体も明らかにされており、それらの抗体のうちの２種類についてはＦＳＨの作用も増強することができることも明らかにされている（国際出願公開ＷＯ２０１２／０６６５１９号パンフレット）［２］。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明者らは今ではＦＳＨのβサブユニットに対して作製されたモノクローナル抗体であって、ＦＳＨの作用を増強することができ、且つ、ＬＨとｈＣＧの作用も増強することができるモノクローナル抗体を得ている。
【００１２】
これらのモノクローナル抗体はそれぞれＣＡ５およびＣＨ１０と呼ばれる。
【００１３】
ＣＡ５抗体を産生するハイブリドーマはブダペスト条約に準拠して２０１３年１０月３日にＣＮＣＭ（フランス、７５７２４、パリ１５区、ドクター・ルー通り２５番のパスツール研究所内のフランス微生物培養物保存機関）にＣＮＣＭ  Ｉ−４８０１の番号の下で寄託された。
【００１４】
ＣＨ１０抗体を産生するハイブリドーマはブダペスト条約に準拠して２０１３年１０月３日にＣＮＣＭ（フランス、７５７２４、パリ１５区、ドクター・ルー通り２５番のパスツール研究所内のフランス微生物培養物保存機関）にＣＮＣＭ  Ｉ−４８０２の番号の下で寄託された。
【００１５】
ＣＡ５抗体およびＣＨ１０抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域のヌクレオチド配列が決定されており、対応するペプチド配列が推定されている。それらが下の表１および表２にそれぞれ示されている。
【００１６】
【表１】
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【００１７】
【表２】
0006649385.tif 000003
【００１８】
上のＣＡ５抗体とＣＨ１０抗体の重鎖の可変領域（ＶＨ−ＣＤＲ）と軽鎖の可変領域（ＶＬ−ＣＤＲ）の配列からＣＤＲ（相補性決定領域）をコードする配列が決定されている。対応するペプチド配列が推定されており、下の表３および表４にそれぞれ示されている。
【００１９】
【表３】
0006649385.tif 000004
【００２０】
【表４】
0006649385.tif 000005
【００２１】
本発明の対象は、ＦＳＨの生理活性、黄体形成ホルモン（ＬＨ）の生理活性、および絨毛性ゴナドトロピン（ＣＧ）の生理活性を増強し、抗ＦＳＨ  βサブユニット抗体のパラトープを含むことを特徴とする卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）リガンドである。
【００２２】
本発明の目的のため、「抗ＦＳＨ  βサブユニット抗体」という用語は、ＦＳＨの初回注射とそれに続くＦＳＨ  βサブユニットの注射による数回のブースターに基づく動物の免疫によって得られたあらゆる抗体を意味するものとする。様々な哺乳類動物のＦＳＨ、例えばヒツジ、ヒト、ウシ、ヤギまたはブタ、ウマ、イヌ、マウス等のＦＳＨ、および同種起源または異種起源のＦＳＨのβサブユニットを使用してそれらの注射を行うことができる。そうしてＣＡ５モノクローナル抗体およびＣＨ１０モノクローナル抗体はヒツジＦＳＨおよびヒツジＦＳＨ  βサブユニットを使用する免疫の後に得られた。
【００２３】
したがって、具体的には本発明の対象は本発明に従うリガンドであって、
重鎖可変ドメインが次のＣＤＲを含み、
‐配列ＧＦＴＦＳＤＦＹ（配列番号９）によって規定されるＶＨ−ＣＤＲ１、
‐配列ＳＲＮＫＡＫＤＹＴＴ（配列番号１０）によって規定されるＶＨ−ＣＤＲ２、
‐配列ＡＲＤＡＲＦＡＹ（配列番号１１）によって規定されるＶＨ−ＣＤＲ３、且つ
軽鎖可変ドメインが次のＣＤＲを含む
‐配列ＱＳＬＬＹＳＳＮＱＫＮＹ（配列番号１２）によって規定されるＶＬ−ＣＤＲ１、‐配列ＷＡＳによって規定されるＶＬ−ＣＤＲ２、
‐配列ＱＱＹＹＳＹＰＲＴ（配列番号１３）によって規定されるＶＬ−ＣＤＲ３
ことを特徴とするリガンドである。
【００２４】
したがって、具体的には本発明の対象は本発明に従うリガンドであって、
重鎖可変ドメインが次のＣＤＲを含み、
‐配列ＧＦＴＦＮＴＹＡ（配列番号１４）によって規定されるＶＨ−ＣＤＲ１、
‐配列ＩＲＳＫＳＮＮＹＡＴ（配列番号１５）によって規定されるＶＨ−ＣＤＲ２、
‐配列ＶＲＱＤＹＹＧＳＳＹＦＤＹ（配列番号１６）によって規定されるＶＨ−ＣＤＲ３、且つ
軽鎖可変ドメインが次のＣＤＲを含む
‐配列ＱＳＩＳＤＹ（配列番号１７）によって規定されるＶＬ−ＣＤＲ１、
‐配列ＹＡＳによって規定されるＶＬ−ＣＤＲ２、
‐配列ＱＮＧＨＳＦＰＹＴ（配列番号１８）によって規定されるＶＬ−ＣＤＲ３
ことを特徴とするリガンドである。
【００２５】
本発明の目的のため、「ＣＤＲ」という用語は、前記パラトープの要素を構成し、且つ、抗原のエピトープとの抗体の相補性の決定を可能にする前記抗体の重鎖と軽鎖の可変領
域の３か所の超可変領域を意味するものとする。これらの３か所の超可変領域は、「フレームワーク」領域（ＦＲ）を構成し、且つ、安定した立体配置を可変ドメインに提供する４か所の定常領域によって縁どられている。
【００２６】
本発明に従うリガンドは、例えば、以下の通りである。
‐ＣＮＣＭ  Ｉ−４８０１ハイブリドーマにより産生されるＣＡ５モノクローナル抗体、‐ＣＮＣＭ  Ｉ−４８０２ハイブリドーマにより産生されるＣＨ１０モノクローナル抗体、
‐上の抗体のＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｄｓＦｖまたはｓｃＦｖ断片またはナノボディ。好ましくは、それはＦａｂ断片またはｓｃＦｖ断片である、
‐それぞれ２つ、３つ、または４つのｓｃＦｖ断片からなる二価体、三価体、または四価体（ディアボディ、トリアボディ、テトラボディ）、
‐上の抗体のパラトープ、および意中の動物またはヒトに対する免疫原性を最小限にするように改変されている定常領域を含む組換え抗体。例えば、それはキメラ（ヒト化、ヒツジ化、ヤギ化、ウシ化、ブタ化等）抗体または完全ヒト化、ヒツジ化、ヤギ化、ウシ化、ブタ化抗体である。
【００２７】
非限定的な例として、ＣＡ５抗体およびＣＨ１０抗体に由来するｓｃＦｖのヌクレオチド配列が決定されており、対応するペプチド配列が推定されており、且つ、下の表５および表６にそれぞれ示されている。
【００２８】
【表５】
0006649385.tif 000006
【００２９】
【表６】
0006649385.tif 000007
【００３０】
本発明の対象は本発明に従うリガンドをコードするヌクレオチド配列でもある。
【００３１】
本発明の対象は本発明に従うヌクレオチド配列を含む組換えベクター、特に発現ベクターでもある。
【００３２】
本発明の対象は本発明に従うヌクレオチド配列または本発明に従う組換えベクターを含む宿主細胞でもある。例えば、その細胞はＣＮＣＭ  Ｉ−４８０１ハイブリドーマおよびＣＮＣＭ  Ｉ−４８０２ハイブリドーマ、または本発明に従うヌクレオチド配列もしくは組換えベクターで形質転換された細胞である。
【００３３】
本発明の対象は、本発明に従うリガンドを作製するための方法であって、本発明に従う宿主細胞を適切な培地中で培養すること、および前記培養物から前記リガンドを回収することを含むことを特徴とする前記方法でもある。
【００３４】
発明者らはＣＡ５抗体がブタ、ヒツジ、およびウシのＦＳＨを強力に増強し、有意ではあるがそれより低い程度でヒトＦＳＨを増強することを示した。加えて、発明者らはＣＡ５抗体およびＣＨ１０抗体から得られたｓｃＦｖが、それらが由来とする抗体と同じ結合特性および増強特性を有することを示した。
【００３５】
本発明の対象は医薬品として使用するための本発明に従うリガンド、特にメスの哺乳類
動物において排卵を誘導するために、およびオスまたはメスの哺乳類動物におけるホルモン依存的不妊問題または低受胎問題を軽減するためにＦＳＨの生理活性、ＬＨの生理活性、および絨毛性ゴナドトロピン（ＣＧ）の生理活性を増強するための本発明に従うリガンドでもある。
【００３６】
本発明の対象はリガンドとゴナドトロピンから形成される複合体、またはリガンドと前記リガンドに結合することができ、且つ、前記リガンドによって活性が増強されるゴナドトロピンの活性ペプチドから形成される複合体でもある。例えば、それは生体組織または生体液から抽出されたものであるＬＨ、絨毛性ゴナドトロピン（ＣＧ）ホルモン、またはＦＳＨとリガンドの複合体、または前記リガンドに結合することができ、且つ、前記リガンドによって活性が増強される前記ホルモンの組換えペプチドまたは活性ペプチドであるＬＨ、絨毛性ゴナドトロピン（ＣＧ）ホルモン、またはＦＳＨと前記リガンドとの複合体である。
【００３７】
本発明の対象は医薬品として使用するための本発明に従うリガンドまたは複合体、特にメスの哺乳類動物において排卵を、または多排卵をも誘導するために、またはオスもしくはメスの哺乳類動物におけるホルモン依存的不妊問題または低受胎問題を軽減するためにＦＳＨの生理活性、ＬＨの生理活性、および絨毛性ゴナドトロピン（ＣＧ）の生理活性を増強するための本発明に従うリガンドまたは複合体でもある。前記医薬品は、メスの哺乳類動物において１つ以上の黄体によって分泌される循環内在性プロゲステロンのレベルを上げ、それによって初期胚発生を促進し、且つ、流産のリスクを低減することも可能にする。
【００３８】
本発明の対象は、食肉生産のための方法であって、メスの非ヒト哺乳類動物への本発明のリガンドおよび／または複合体の投与を含む前記方法でもある。
【００３９】
本発明の対象は哺乳類動物におけるホルモン依存的不妊症または低受胎症の治療に使用するための本発明のリガンドおよび／または複合体でもある。不妊症または低受胎症に悩まされているメスの哺乳類動物の場合では、本発明のリガンドまたは複合体の投与によって自然生殖、医学補助生殖、または人工生殖を促進することが可能になる。健康なメスの哺乳類動物への本発明のリガンドまたは複合体の投与によって自然生殖または人工生殖の環境で排卵を引き起こすことも可能になることが留意されるべきである。
【００４０】
本発明の目的のため、「ホルモン依存的不妊症／低受胎症」という用語は、例えば外的原因（例えば、農薬）または内的原因（例えば、脳下垂体または視床下部の不全、またはＬＨ、ＦＳＨ、もしくはＣＧといったゴナドトロピンの受容体の異常、例えば受容体の変異または多型が原因の生殖腺によるＬＨおよび／またはＦＳＨの受容についての問題）により生じるホルモン不足、例えばＦＳＨおよびＬＨの低循環濃度、またはこれらのホルモンの不在に起因する不妊症／低受胎症を意味するものとする。
【００４１】
本発明のリガンドおよび複合体はヒトまたは動物、特にヒツジ、ウシ、ヤギ、ウマ、ブタ、マウス、イヌ、ラクダ等において使用可能である。
【００４２】
本発明に従うリガンド、ホルモン、または複合体は、それらの増強作用が変更されることなく、注射、例えば筋肉内注射、静脈内注射、腹膜内注射、皮下注射、経皮注射、皮内注射、眼窩内注射、眼内注射、または眼部注射によって、または経眼的経路を介して別々に、連続的に、または一緒に投与され得る。
【００４３】
本発明の対象は本発明のリガンドまたは複合体および薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物でもある。前記医薬組成物はＦＳＨおよび／またはＬＨおよび／または絨毛性ゴ
ナドトロピン（ＣＧ）ホルモンを含むこともできる。
【００４４】
例として提供されており、添付図面によって例示される以下の実施例を読むことで当業者はさらに他の利点を思いつくことができる。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】ウシ顆粒膜細胞上でのヒツジＦＳＨ（ｏＦＳＨ）の生理活性に対するＣＡ５モノクローナル抗体（Ａ）およびＣＨ１０モノクローナル抗体（Ｂ）のインビトロ増強作用を示す図である。
【図２】ヒトＦＳＨ受容体が安定的に形質移入されたＨＥＫ２９３細胞株上でのヒツジＦＳＨ（ｏＦＳＨ）の生理活性に対するＣＡ５モノクローナル抗体（Ａ）およびＣＨ１０モノクローナル抗体（Ｂ）のインビトロ増強作用を表す図である。
【図３−１】ヒトＦＳＨ受容体とＧｌｏｓｅｎｓｏｒ（登録商標）ベクターが安定的に形質移入されたＨＥＫ２９３細胞株上でのヒツジＦＳＨ（ｏＦＳＨ）の生理活性に対するＣＡ５モノクローナル抗体のインビトロ増強作用を表す図である。
【図３−２】図３−１の続き。
【図４】ヒトＦＳＨ受容体とＧｌｏｓｅｎｓｏｒ（登録商標）ベクターが安定的に形質移入されたＨＥＫ２９３細胞株上でのブタＦＳＨ（ｐＦＳＨ）の生理活性に対するＣＡ５モノクローナル抗体の増強作用を表す図である。
【図５−１】ヒトＦＳＨ受容体とＧｌｏｓｅｎｓｏｒ（登録商標）ベクターが安定的に形質移入されたＨＥＫ２９３細胞株上でのヒトＦＳＨ（ｈＦＳＨ）の生理活性に対するＣＡ５モノクローナル抗体（Ａ〜Ｅ）およびＣＡ５  ｓｃＦｖ（Ｆ）のインビトロ増強作用を表す図である。
【図５−２】図５−１の続き。
【図６】ヒトＦＳＨ受容体とＧｌｏｓｅｎｓｏｒ（登録商標）ベクターが安定的に形質移入されたＨＥＫ２９３細胞株上でのヒツジＦＳＨ（ｏＦＳＨ）の生理活性に対するＣＨ１０モノクローナル抗体のインビトロ増強作用を表す図である。
【図７】ヒトＦＳＨ受容体とＧｌｏｓｅｎｓｏｒ（登録商標）ベクターが安定的に形質移入されたＨＥＫ２９３細胞株上でのヒトＦＳＨ（ｈＦＳＨ）の生理活性に対するＣＨ１０モノクローナル抗体のインビトロ増強作用を表す図である。
【図８】ヒツジＦＳＨ（ｏＦＳＨ）の生理活性（Ａ）およびヒトＦＳＨ（ｈＦＳＨ）であるゴナールＦ（登録商標）、ピュレゴン（登録商標）およびフォスティモン（登録商標）の生理活性（Ｂ）に対するＣＡ５モノクローナル抗体のメスのラットにおけるインビボ増強作用を表す図である。
【図９】ヒトＦＳＨ（ｈＦＳＨ）であるゴナールＦ（登録商標）の生理活性に対するＣＡ５モノクローナル抗体のメスのラットにおけるインビボ増強作用（Ａ）、およびヒトＦＳＨ（ｈＦＳＨ）であるゴナールＦ（登録商標）（Ａ）、ピュレゴン（登録商標）およびフォスティモン（登録商標）（Ｂ）の生理活性に対するＣＡ５  ｓｃＦｖのメスのラットにおける増強作用を表す図である。
【図１０】ヒツジＦＳＨ（ｏＦＳＨ）の生理活性（Ａ）およびヒトＦＳＨ（ｈＦＳＨ）であるゴナールＦ（登録商標）の生理活性（Ｂ）に対するＣＨ１０モノクローナル抗体のメスのラットにおけるインビボ増強作用を表す図である。
【図１１】ヒトＦＳＨ（ｈＦＳＨ）であるピュレゴン（登録商標）およびフォスティモン（登録商標）の生理活性に対するＣＨ１０モノクローナル抗体のメスのラットにおけるインビボ増強作用（Ａ）、およびヒトＦＳＨ（ｈＦＳＨ）であるゴナールＦ（登録商標）の生理活性に対するＣＨ１０  ｓｃＦｖのメスのラットにおける増強作用（Ｂ）を表す図である。
【図１２】ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）であるコルロン（登録商標）とＥｎｄｏ５０００の生理活性に対するＣＡ５モノクローナル抗体のオスのラットにおけるインビボ増強作用を表す図である。
【図１３】ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）であるコルロン（登録商標）とＥｎｄｏ５０００（登録商標）の生理活性に対するＣＨ１０モノクローナル抗体のオスのラットにおけるインビボ増強作用を表す図である。
【図１４】発情期の終わりの雌羊における内在性ゴナドトロピンの生理活性に対するＣＡ５モノクローナル抗体のインビボ増強作用を表す図である。
【図１５】発情期の雌羊における内在性ゴナドトロピンの生理活性に対するＣＡ５モノクローナル抗体のインビボ増強作用を表す図である。
【図１６】若雌牛における内在性ゴナドトロピンに対する単独で注射されたＣＡ５モノクローナル抗体のインビボ増強作用、すなわち、エストラジオール分泌に対する作用を表す図である。
【図１７】若雌牛における内在性ゴナドトロピンに対する単独で注射されたＣＡ５モノクローナル抗体のインビボ増強作用、すなわち、排卵前ＬＨピークについての特性に対する作用を表す図である。
【図１８】若雌牛における内在性ゴナドトロピンに対する単独で注射されたＣＡ５モノクローナル抗体のインビボ増強作用、すなわち、プロゲステロン分泌に対する作用を表す図である。
【図１９】メスのサルにおける２５ＩＵのｈＦＳＨの後に単独で注射されたＣＡ５モノクローナル抗体の卵胞成長に対するインビボ増強作用を表す図である。
【図２０】ｈＦＳＨ、ｈＣＧ、ｈＬＨ、ｏＬＨ、ｐＬＨ、ｏＦＳＨおよびｐＦＳＨといったホルモンおよびヒトＦＳＨ受容体上のＣＡ５リガンド立体構造エピトープを表す図である。
【図２１】ｈＦＳＨ、ｈＣＧ、ｈＬＨ、ｏＬＨ、ｐＬＨ、ｏＦＳＨおよびｐＦＳＨといったホルモンおよびヒトＦＳＨ受容体上のＣＨ１０リガンド立体構造エピトープを表す図である。
【図２２−１】ヒツジＦＳＨおよびヒトＦＳＨの生理活性に対するＣＡ５モノクローナル抗体の様々な断片のインビトロ増強作用を表す図である。
【図２２−２】図２２−１の続き。
【図２３】メスのラットにおけるヒトＦＳＨの生理活性に対するＣＡ５モノクローナル抗体の様々な断片のインビボ増強作用を表す図である。
【実施例】
【００４６】
実施例１：本発明のリガンドの獲得、およびそれらのリガンドの特徴解析
（１）マウス免疫ストラテジー
注射は全て腹膜内注射でマウス（Ｂａｌｂ／ｃ）に行われた。各免疫ストラテジーに５匹のマウスを使用した。
【００４７】
ＣＡ５抗体およびＣＨ１０抗体向けのマウス免疫ストラテジー
完全フロイントアジュバントと共に１００μｇの精製ヒツジＦＳＨを用いて最初の注射（０日目）を行った。その後、次の順序で数回のブースター注射を行った。
‐２１日目および４４日目：不完全フロイントアジュバントと１００μｇの精製ヒツジＦＳＨ、
‐１３４日目および２０４日目：不完全フロイントアジュバントと５０μｇのヒツジＦＳＨ  βサブユニット、
‐２１７日目、２１８日目および２１９日目：アジュバント無しの３０μｇのヒツジＦＳＨ  βサブユニット、
‐２２０日目：融合。
【００４８】
（２）アイソタイピング
ＲＤ  Ｂｉｏｔｅｃｈが販売するＦａｓｔＥｌｙｓａアイソタイピングキット（参照番号ＲＤＢ３２５５）を製造業者の推奨に従って使用してＣＡ５抗体およびＣＨ１０抗体の
アイソタイピングを行った。
【００４９】
ＣＡ５抗体はＩｇＧ２ａクラスおよびκアイソタイプの免疫グロブリンである。得られた光学密度（ＯＤ）値はそれぞれ０．３３５および０．３７１であった。
【００５０】
ＣＨ１０抗体はＩｇＭクラスおよびκアイソタイプの免疫グロブリンである。得られた光学密度（ＯＤ）値はそれぞれ０．２および０．１２４であった。
【００５１】
（３）シーケンシング
ＣＮＣＭ  Ｉ−４８０１ハイブリドーマおよびＣＮＣＭ  Ｉ−４８０２ハイブリドーマによってそれぞれ分泌されるＣＡ５抗体およびＣＨ１０抗体の重鎖可変部分（ＶＨ）と軽鎖可変部分（ＶＬ）のヌクレオチド配列を以下のプロトコルに従ってそれらのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）から決定した。
【００５２】
Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ（登録商標）ＲＮＡキット（マッハライ・ナーゲル、ドイツ）を製造業者の推奨に従って使用して細胞からＲＮＡを抽出した。２６０ｎｍでの吸光度（Ａ）を測定することによって精製ＲＮＡの濃度を推定し、Ａ２６０ｎｍ／Ａ２８０ｎｍ比によって、およびアガロースゲルでの電気泳動後に視覚的にそれらのＲＮＡの品質を推定した。
【００５３】
その後、製造業者の推奨に従ってＭ−ＭＬＶ酵素（参照番号Ｍ１７０１、プロメガ、米国）を使用する逆転写反応によってｏｌｉｇｏ−ｄＴ１８を使用してそれらのｍＲＮＡの相補性ＤＮＡを合成した。
【００５４】
次のプロトコルに従うポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって第２ＤＮＡ鎖の合成を行った。次のもの、すなわち反応緩衝液（１×最終濃度）、２００μＭの各ｄＮＴＰ、３００ｎＭのフォワードプライマーとリバースプライマー、１．２５ＵのＧｏＴａｑポリメラーゼ（参照番号Ｍ３１７５、プロメガ、米国）を４μｌの逆転写反応に加えて５０μｌの最終体積にする。
【００５５】
軽鎖の可変部分の増幅のために９種類の異なるプライマーペア（ＭＫＲｅｖ２から８＋ＭＫＣ５Ｆｏｒ）を使用し、重鎖の可変部分には３種類の異なるペア（ＣＡ５：ＶＨＲｅｖ１＋ＶＨＦｏｒ、ＣＨ１０：ＶＨＲｅｖ１＋ＭμＣＦｏｒ）を使用した。
【００５６】
【表７】
0006649385.tif 000008
【００５７】
【表８】
0006649385.tif 000009
【００５８】
【表９】
0006649385.tif 000010
【００５９】
【表１０】
0006649385.tif 000011
【００６０】
使用したＰＣＲプログラムは、９５℃で２分間の初期変性に続く３０サイクルの９５℃で３０秒間の変性、４７℃で３０秒間のハイブリダイゼーションと７２℃で１分間の増幅、および最後に７２℃で５分間の最終増幅から構成される。得られたＰＣＲ産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）ゲル抽出キット（参照番号２８７０４、Ｑｉａｇｅｎ  ＧｍｂＨ、ドイツ）で脱塩し、その後、細菌の形質転換に使用されるようにｐＧＥＭＴイージー・ベクタープラスミド（参照番号Ａ１３６０、プロメガ、米国）とライゲーションした。様々な細菌クローンから抽出されたプラスミドＤＮＡをシークエンス解析に送った（マクロジェン・ヨーロッパ、オランダ）。
【００６１】
その後、前記２種類の抗体のＶＨおよびＶＬの５’末端ヌクレオチド配列は、前記ｃＤＮＡのリーダー配列内に特異的なアンカープライマー（Ｆｗプライマー）を設計することを介して決定された。これらのプライマーは、それまでに得られたＶＬ配列およびＶＨ配列とＩＭＧＴ／Ｖ−ＱＵＥＳＴソフトウェアのデータベースとの間のアラインメントによる相同性の特定(Brochet et al., Nucl. Acids Res., 36: W503-508, 2008; Giudicelli et al., Cold Spring Harb Protoc., 2011(6): 695-715, 2011) ［３、４］、およびＩＭＧＴ／ＧＥＮＥ−ＤＢからの目的のリーダー配列の抽出 (Giudicelli et al., Nucl. Acids Res., 33: D256-261, 2005) ［５］の後に設計された。リバース（Ｒｅｖ）プライマーは、前記抗体の各々のそれまでに決定されたＶＨ配列とＶＬ配列のそれぞれの中に設計された。５’部分を得るために使用されたプロトコルは前段落において記載されたプロトコルと同じである。
【００６２】
ＭｕｌｔＡｌｉｎソフトウェア (Corpet, Nucl. Acids Res., 16(22): 10881-10890, 1988) ［６］を使用して配列のアラインメントからコンセンサスヌクレオチド配列を推定した。ＩＭＧＴ／Ｖ−ＱＵＥＳＴソフトウェアを使用してポリペプチド配列への書き換えとＣＤＲのアノテーションを行った。結果が表１１〜１４に示されている。
【００６３】
【表１１】
0006649385.tif 000012
【００６４】
【表１２】
0006649385.tif 000013
【００６５】
【表１３】
0006649385.tif 000014
【００６６】
【表１４】
0006649385.tif 000015
【００６７】
（４）ｓｃＦｖの構築、作製、および特徴解析
（ａ）ｓｃＦｖ抗体断片の構築
ＣＡ５抗体およびＣＨ１０抗体に由来する一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）の合成遺伝子がＡＴＧ：バイオシンセティクスＧｍｂＨ（ドイツ）によって合成された。
【００６８】
タンパク質の機能性を確保するペプチド（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３をコードする配列によって連結されており、且つ、ｓｃＦｖの精製を可能にするＨｉｓ６ペプチド（Ｈｉｓタグペプチド）をコードする配列で終わる重鎖可変部分と軽鎖可変部分（ＣＡ５については配列番号１／配列番号３；ＣＨ１０については配列番号５／配列番号７）の融合体から各配列を設計した。発現プラスミドへのそれらの挿入を可能にするため、それらの配列の両脇にＰｓｔＩとＳａｌＩの制限酵素部位が付加された。所望によりＨｉｓ６ペプチドの除去を可能にする追加の配列をＶＬの３’末端とＳａｌＩ部位との間に付加した。大腸菌での発現向けにコドンを最適化した。ｓｃＦｖ合成遺伝子の構築を図によって表現したものが下に詳述されている。
【００６９】
【化１】
0006649385.tif 000016
【００７０】
組換え抗体断片の遺伝子と読み枠に合わせて融合されると合成されたタンパク質の細菌ペリプラズムへの輸送を可能にするＰｅｌＢシグナル配列をＬａｃＺ誘導性プロモーターの制御下で含むＥ．Ｓ．Ｗａｒｄら(Ward et al., Nature, 341: 544-546, 1989) ［７］によるｐＳＷ１発現プラスミド（ＡＴＧ：バイオシンセティクスＧｍｂＨ、ドイツ）のＰｓｔＩとＸｈｏＩの酵素部位の間に前記抗体断片を挿入した。ペリプラズムにおいてこのシグナル配列はペプチダーゼによって除去される。
【００７１】
それらの構築物の品質のシーケンシングによる検証の後、コンピテントセルにした(Li et al., Afr. J. Biotechnol., 9(50): 8549-8554, 2010) ［８］ＨＢ２１５１細菌（Ｔ５３０４０、Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ、フランス）をヒートショックにより形質転換するためにｐＳＷ１−ＣＡ５プラスミドとｐＳＷ１−ＣＨ１０プラスミドを使用した。
【００７２】
【表１５】
0006649385.tif 000017
【００７３】
【表１６】
0006649385.tif 000018
【００７４】
（ｂ）組換え抗体断片の作製
細菌培養物
５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む５ｍｌの２×ＹＴ培地に前培養物を３７℃で一晩にわたって調製した。翌日、５００μｌのこの前培養物を５００ｍｌの同じ培地に接種し、１．４のＯＤ６００ｎｍが得られるまで１５０ＲＰＭ、３７℃で培養した。０．１ｍＭのＩＰＴＧを添加することでｓｃＦｖの合成を１５０ＲＰＭ、１６℃で１６時間にわったって誘導した。
【００７５】
抽出
その培養培地を４５００ｇ、４℃で３０分間にわたって遠心分離した。調製の後の部分は４℃で実施した。細菌のペリプラズムを抽出するため、沈殿物を１０ｍｌのＴＥＳ（０．２Ｍトリス、ｐＨ８、０．５Ｍ  ＥＤＴＡ、０．５Ｍショ糖）に再懸濁し、３０分間にわたってインキュベートし、その後で４分の１に希釈された１５ｍｌのＴＥＳをそれに添加し、続いて３０分間にわたってさらにインキュベートした。その細菌抽出物を１００００ｇで３０分間にわたって遠心分離した。上清をＰＢＳに対して一晩にわたって透析した。その透析された上清をｓｃＦｖの精製のためにすぐに処理するか、または使用するまで−２０℃で貯蔵した。
【００７６】
抗ＨｉｓタグＨＲＰ抗体（参照番号Ｒ９３１２５、ライフテクノロジーズ、フランス）を製造業者の使用推奨に従って使用するウエスタンブロッティングによりペリプラズム内にあるｓｃＦｖの生産量を分析した。
【００７７】
精製
前記ペリプラズムを５０００ｇ、４℃で２０分間にわたって遠心分離した。その上清をＨＩＳ−Ｓｅｌｅｃｔ（登録商標）ニッケルアフィニティーゲル（シグマ・アルドリッチ、ミズーリ州、米国）と共に４℃で１時間にわたって撹拌しながらインキュベートした。０に近いＯＤ２８０ｎｍが得られるまで、０．３ＭのＮａＣｌを含むｐＨ８の０．０５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液でそのゲルを洗浄し、その次にそのゲルに添加された２０ｍＭのイミダゾールを含む同じ緩衝液で洗浄した。その後で０．３ＭのＮａＣｌと２５０ｍＭのイミダゾールを含むｐＨ８の０．０５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液でｓｃＦｖを溶出した。その溶離液をＰＢＳに対して一晩にわたって透析した。その溶離液は−２０℃で貯蔵されている。
【００７８】
品質管理
その精製されたｓｃＦｖを１５％ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動によってクマシーブルーによる染色後に分析し、且つ、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（商標）７５  １０／３００
ＧＬカラム（参照番号１７−５１７４−０１、ＧＥヘルスケア、ドイツ）上での排除クロマトグラフィーによって分析した。
【００７９】
（５）特異性
前記抗体およびそれらのｓｃＦｖの特異性をＥＬＩＳＡ法により検討した。評価される各ホルモンはｐＨ９．６の０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液中に１０μｇ／ｍｌの濃度で調製され、ＥＬＩＳＡプレート上でウェル当たり１００μｌの割合で分配された。吸着時間は＋４℃で１８時間であった。洗浄を５回行った後に０．１％ツイーンおよび１％ＢＳＡを添加した１００μｌのＰＢＳでウェルを３７℃で４５分間にわたって処理し、その後、各抗体またはｓｃＦｖを１００μｌ／ウェルの割合で分配し、３７℃で１時間にわたってインキュベートした。評価される各ホルモンに対して、抗体については１０〜２５０μｇ／ｍｌの範囲、ｓｃＦｖについては１０〜１５０または２００μｇ／ｍｌの範囲に応じた様々な濃度でそれらの抗体およびｓｃＦｖを分配した。
【００８０】
洗浄を５回行った後にペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に結合した二次抗体を１００μｌ／ウェルの割合で分配し、３７℃で１時間にわたってインキュベートした。その二次抗体は検討するモノクローナル抗体のアイソタイプに応じて抗ＩｇＧ１  ＨＲＰ（参照番号１１５−０３５−２０５、ジャクソンイムノリサーチラボラトリーズ社）、抗ＩｇＧ２ａ  ＨＲＰ（参照番号１１５−０３５−２０６、ジャクソンラボラトリーズ）または抗ＩｇＭ  ＨＲＰ（参照番号１１５−０３５−０７５、ジャクソンラボラトリーズ）であった。ｓｃＦｖについては抗ＨｉｓタグＨＲＰ（参照番号Ｒ９３１２５、ライフテクノロジーズ、フランス）を使用した。洗浄を５回行った後に１００μｌ／ウェルの割合で分配されたＴＭＢによって酵素活性を発現させた。発現時間は反応速度に応じて外観温度において５分から３０分までであった。その反応を１ＭのＨ２ＳＯ４（５０μｌ／ウェル）によって停止させた後、ＥＬＩＳＡプレート用の分光光度計を使用してその発色反応の強度（光学密度）を測定した。
【００８１】
ＣＡ５抗体およびＣＨ１０抗体およびそれらのｓｃＦｖについて、１００％基準値であると見なされるヒツジＦＳＨ（ｏＦＳＨ）で得られた値について交差反応のパーセンテージを計算した。その交差反応のパーセンテージは前記抗体またはｓｃＦｖの濃度範囲で得られた用量応答曲線を比較することにより従来通りに算出された。基準ホルモンで得られた曲線に基づき、
‐Ａが最大光学密度の５０％（ＥＤ５０）を生じる濃度であるとする。別のホルモンで得られた曲線に基づき、
‐ＢがＡを規定するために使用された光学密度値と同じ光学密度値に対応する濃度である
とする。
交差反応のパーセンテージはＡ割るＢかける１００、つまり［（Ａ／Ｂ）×１００］に等しい。
【００８２】
ＣＡ５抗体およびそのｓｃＦｖの特異性
表１７はヒツジＦＳＨのαサブユニットとβサブユニット（ｓ．ｕ．）およびヒトＦＳＨのβサブユニットとのＣＡ５抗体の交差反応のパーセンテージを示している。
【００８３】
【表１７】
0006649385.tif 000019
【００８４】
ＣＡ５抗体は非常にわずかにしかヒツジαサブユニットを認識しないが、ヒツジＦＳＨのβサブユニットを強く（８０％）認識し、その抗体は、強さがやや劣るが（５０％）、ヒトＦＳＨのβサブユニットとも交差反応する。その抗体の特異性は抗ＦＳＨ  βサブユニットである。
【００８５】
表１８はブタＦＳＨ（ｐＦＳＨ）および様々なヒトＦＳＨとのＣＡ５およびＣＡ５  ｓｃＦｖの交差反応のパーセンテージを示している。
【００８６】
【表１８】
0006649385.tif 000020
【００８７】
ＣＡ５抗体はブタＦＳＨおよびヒトＦＳＨであるゴナールＦの強い認識を示している。その抗体は他のヒトＦＳＨとも６１％と７６％の間で大いに交差反応する。ＣＡ５抗体は二量体型の検査されたＦＳＨをより良好に認識し、立体構造エピトープに対して特異的であることを示す傾向がある。
【００８８】
ＣＡ５  ｓｃＦｖはｐＦＳＨ（６１％）を大いに認識し、それより弱くｈＦＳＨ（フォスティモン）とｈＭＧ（メノピュール）を認識する。他の２種類のヒトＦＳＨとの交差反応はあまりに弱い結合のために測定不可能（ＮＤ）である。したがって、ＣＡ５  ｓｃＦｖの結合はちょうど完全抗体の結合のように、おそらくはＥＬＩＳＡプレートのプラスチックへの吸着の間に変化する、前記ホルモンの立体構造に依存しているように見える。
【００８９】
ＣＡ５  ｓｃＦｖの特異性をブタＬＨ（ｐＬＨ）、ヒツジＬＨ（ｏＬＨ）、ウシＬＨ（ｂＬＨ）、ｅＣＧ、およびｈＣＧであるコルロンとＥｎｄｏ５０００に関して評価した。結果が表１９に示されている。
【００９０】
【表１９】
0006649385.tif 000021
【００９１】
ＣＡ５  ｓｃＦｖの結合は動物ＬＨに関して高く、交差反応は３５％と４０％の間である。逆に、ｈＣＧであるコルロンの認識だけが弱い（１０％）。吸着されている他の２種類のｈＣＧに対するあまりに弱い結合のため、交差反応を定量することができなかった。ＣＡ５およびそのｓｃＦｖのインビトロおよびインビボで得られたｈＣＧ活性に対する生物学的作用（実施例２および実施例３の結果を参照されたい）を考慮すると、立体構造エピトープに対して特異的であるという仮説がこれらの結果から補強される。
【００９２】
この仮説は、変性条件または非変性条件の下に５％ポリアクリルアミドゲル上を移動したｏＦＳＨに対してＣＡ５抗体をインキュベートすることによるウエスタンブロッティングより得られた結果によって補強される。β−ｏＦＳＨバンドは非変性条件の下でのみ認識され、有意なシグナルを生じた。変性条件の下で移動したｏＦＳＨではシグナルが観察されなかった。
【００９３】
検討した様々なＦＳＨ、ＬＨおよびＣＧに対するｓｃＦｖの解離定数Ｋｄの推定値が、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア社、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国、バージョン５）上で飽和結合モデル（「飽和結合実験モデル」、ＧｒａｐｈＰａｄ  ＰＲＩＳＭソフトウェア）内の「１サイト特異的結合」機能を使用して計算された。得られた様々な値が表２０および表２１に示されている。
【００９４】
【表２０】
0006649385.tif 000022
【００９５】
【表２１】
0006649385.tif 000023
【００９６】
このように推定された解離定数Ｋｄの比較により、ヒツジおよびブタのＦＳＨに対するＣＡ５  ｓｃＦｖのより高い親和性がそれぞれ０．５４μＭおよび１．２４μＭという値によって示されている。組換えヒトＦＳＨであるゴナールＦ（１．４３μＭのＫｄ）を例外として、ＣＡ５  ｓｃＦｖは前記ヒトＦＳＨに対して低めの親和性を示している（２．０３〜２．６７μＭのＫｄ）。ｏＦＳＨおよびｐＦＳＨと対照的に、ＣＡ５  ｓｃＦｖは
ヒツジＬＨおよびブタＬＨに関して中程度の親和性（それぞれ１．９５μＭおよび２．４７μＭのＫｄ）を示している。ｈＣＧおよびｅＣＧに関して推定されたＫｄ（３．１４〜４．０７μＭのＫｄ）はこれらのホルモンに対するＣＡ５  ｓｃＦｖの低めの親和性を示している。
【００９７】
ＣＨ１０抗体およびそのｓｃＦｖの特異性
表２２はヒツジＦＳＨのαサブユニットとβサブユニット（ｓ．ｕ．）およびヒトＦＳＨのβサブユニットとのＣＨ１０抗体の交差反応のパーセンテージを示している。
【００９８】
【表２２】
0006649385.tif 000024
【００９９】
ＣＨ１０抗体はヒツジＦＳＨのβサブユニットを優先的に認識し（８８％）、ヒトＦＳＨのβサブユニットおよびヒツジのαサブユニットを２倍弱く認識する（４０％および４３％）。これらの結果によると、ＣＨ１０の特異性は抗ＦＳＨ  βサブユニットであり、優先的には抗ｏＦＳＨ  βサブユニットである。その抗体は、ＣＡ５抗体と異なり、有意ではあるが低めの程度でヒツジのαサブユニットを認識する。これらの結果の全てより、エピトープに主にβが含まれるがαも含まれるという仮説、例えばエピトープがそれらの２つのサブユニットの連結領域上にあるという仮説を導き出すことができる。
【０１００】
表２３はブタＦＳＨ（ｐＦＳＨ）および様々なヒトＦＳＨで得られたＣＨ１０およびＣＨ１０  ｓｃＦｖの交差反応のパーセンテージを示している。 
【０１０１】
【表２３】
0006649385.tif 000025
【０１０２】
ＣＨ１０抗体およびそのｓｃＦｖは動物ＦＳＨの強い認識を示しており、且つ、ヒトＦＳＨについて３０〜１００％の範囲の交差反応を示している。
【０１０３】
ＣＨ１０  ｓｃＦｖの特異性をブタＬＨ（ｐＬＨ）、ヒツジＬＨ（ｏＬＨ）、ウシＬＨ（ｂＬＨ）、ｅＣＧ、およびｈＣＧであるコルロンとＥｎｄｏ５０００に関して評価した。結果が表２４に示されている。
【０１０４】
【表２４】
0006649385.tif 000026
【０１０５】
動物ＬＨに関するＣＨ１０  ｓｃＦｖの結合は高く、交差反応は５２％と６８％の間である。逆に、吸着されているｈＣＧおよびｅＣＧに対するあまりに弱い結合のため、交差反応を定量することができなかった。ＣＨ１０およびそのｓｃＦｖのインビトロおよびインビボで得られたｈＣＧであるコルロンとＥｎｄｏ５０００の活性に対する生物学的作用（実施例２および実施例３の結果を参照されたい）を考慮すると、立体構造エピトープに対して特異的であるという仮説がこれらの結果から補強される。
【０１０６】
検討した様々なＦＳＨ、ＬＨおよびＣＧに対するＣＨ１０  ｓｃＦｖの解離定数Ｋｄの推定値が、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア社、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国、バージョン５）上で飽和結合モデル（「飽和結合実験モデル」、ＧｒａｐｈＰａｄ  ＰＲＩＳＭソフトウェア）内の「１サイト特異的結合」機能を使用して計算された。得られた値が表２５および表２６に示されている。
【０１０７】
【表２５】
0006649385.tif 000027
【０１０８】
【表２６】
0006649385.tif 000028
【０１０９】
このように推定された解離定数Ｋｄはヒツジとブタの両方のＦＳＨ（７．５１μＭおよび５．２２μＭのＫｄ）ならびにヒトＦＳＨであるゴナールＦとフォスティモンおよびｈＭＧメノピュール（それぞれ１．８２μＭ、１．５９μＭおよび７．３６μＭのＫｄ）に対するＣＨ１０  ｓｃＦｖの親和性を示している。ｈＣＧｓおよびｅＣＧに関して推定されたＫｄ（１．４７〜２．０９μＭのＫｄ）はＦＳＨと比較して良好なこれらのホルモンに対するＣＨ１０  ｓｃＦｖの親和性を示している。
【０１１０】
実施例２：ＦＳＨの生理活性に対する本発明のリガンドの増強作用のインビトロ測定
ＦＳＨの生理活性に対する本発明のリガンドの増強作用の証明が、ＦＳＨ単独か、またはＦＳＨ／モノクローナル抗体（ＭＡｂ）複合体のどちらかで刺激された様々な細胞種または細胞株を用いて得られた生物学的応答を比較することにより行われた。
【０１１１】
それらの事例の各々において、得られた用量応答曲線の比較により、複合体化されたＦＳＨの生物活性に対する前記ＭＡｂのインビトロ増強作用を定量することが可能になった。Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア社、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国、バージョン５）を使用してそれらの結果の統計分析を行った。
【０１１２】
（１）ウシ顆粒膜細胞の初代培養物について
最初にヒツジＦＳＨ（ｏＦＳＨ）の生理活性に対するＣＡ５  ＭＡｂおよびＣＨ１０  ＭＡｂの増強作用の特徴がウシＦＳＨ受容体を内在的に発現するウシ顆粒膜細胞上で解析された。
【０１１３】
ＣＡ５抗体またはＣＨ１０抗体の最終濃度が０．１μｇ／ｍｌであるハイブリドーマ上清を３ｎｇ／ｍｌから２５ｎｇ／ｍｌまでの範囲のヒツジまたはヒトのＦＳＨと３７℃で３０分間にわたってインキュベートした。
【０１１４】
Ｃｈｏｐｉｎｅａｕら(Mol. Cell Endocrinol., 92(2): 229-39, 1993)［８］およびＷｅｈｂｉら(Endocrinology, 151(6): 2788-2799, 2010)［９］に記載のプロトコルに従ってウシ卵巣に対する卵巣穿刺により２〜６ｍｍまでの範囲の直径を有する卵胞からウシ顆粒膜細胞を採取した。ＭｃＣｏｙの５Ａ培地（Ｌｏｎｚａ、ベルギー、参照番号ＢＥ１２−６８８Ｆ）に懸濁状態の０．５ｍｌ当たり８００００細胞の割合で調製したウシ顆粒膜細胞を３ｎｇ／ｍｌから２５ｎｇ／ｍｌまでの範囲のＦＳＨ単独か、または上のプロトコルに従ってモノクローナル抗体と予め複合体化されたものによって４８μｇ／ｍｌのＩＢＭＸ（シグマ・アルドリッチ、フランス、参照番号Ｉ５８７９）の存在下で３７℃において３時間にわたって撹拌しながら刺激した。測定された生物学的応答はｃＡＭＰ分泌であった。
【０１１５】
遠心分離後、ＥＬＩＳＡキット（バイオメディカルテクノロジーズ社、マサチューセッツ州、米国、ＢＴ−７３０）を使用して、産生したｃＡＭＰを培養上清中にアッセイした。
【０１１６】
結果が図１に示されている。
【０１１７】
それらの結果はヒツジＦＳＨの活性に対するＣＡ５についての１．３倍の、およびＣＨ１０についての５．５倍のｃＡＭＰ分泌の増強を示している。二元配置分散分析（二元配置ＡＮＯＶＡ、ＧｒａｐｈＰａｄ  ＰＲＩＳＭソフトウェア）による統計分析によってＣＡ５についてのｐ＜０．０５（＊）からＣＨ１０についてのｐ＜０．０１（＊＊）およびｐ＜０．００１（＊＊＊）までの範囲の有意な効果が示されている。
【０１１８】
（２）ヒトＦＳＨ受容体が安定的に形質移入されたＨＥＫ２９３細胞株について
様々な種のＦＳＨに対する前記ＭＡｂの増強作用がヒトＦＳＨ受容体を安定的に発現するＨＥＫ２９３細胞上で測定された。この系により、３７℃で１時間にわたるＦＳＨ単独か、またはＦＳＨ／ＭＡｂ複合体による刺激の後のＦＳＨ受容体の活性化に続くｃＡＭＰ産生を測定することが可能になった。
【０１１９】
このために６００００個の細胞を９６ウェルプレート（ベクトンディッキンソン、ニュージャージー州、米国、参照番号３５３０７２）のウェルに分配し、１０％のＦＣＳ（Ｌｏｎｚａ、ベルギー、参照番号ＤＥ１４−８０１Ｆ）、１％のペニシリン／ストレプトマイシン（シグマ・アルドリッチ、フランス、参照番号Ｐ−４３３３）および４００μｇ／ｍｌのＧ４１８（シグマ・アルドリッチ、フランス、参照番号Ａ１７２０）を含む１００μｌのＭＥＭ培地（Ｏｚｙｍｅ、フランス、参照番号ＢＥ１２−６１１Ｆ）の中において湿潤環境中、５％ＣＯ２、３７℃で２４時間にわたってそれらの細胞を培養した。ＭＥＭ
培地中で２時間の休止の後、それらの細胞を３７℃で１時間にわたって刺激した。培養上清を回収し、ＥＬＩＳＡキット（バイオメディカルテクノロジーズ社、マサチューセッツ州、米国、ＢＴ−７３０）を使用してアッセイした。結果はエンドポイントにおけるｃＡＭＰの分泌量を表している。Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア社、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国、バージョン５）を使用してそれらの結果を分析した。
【０１２０】
図２はヒトＦＳＨ受容体が安定的に形質移入されたＨＥＫ２９３細胞上でのヒツジＦＳＨ（ｏＦＳＨ）の生理活性に対するＣＡ５モノクローナル抗体およびＣＨ１０モノクローナル抗体のインビトロでの増強作用を表している。このためにそれらの細胞を３ｎｇ／ｍｌから３２．５ｎｇ／ｍｌまでの範囲のヒツジＦＳＨか、またはそれらの細胞の刺激の前に前記モノクローナル抗体（０．１μｇ／ｍｌの最終濃度）と３７℃で３０分間にわたって予めインキュベートされた同じレンジポイントのＦＳＨのどちらかで刺激した。二元配置分散分析（二元配置ＡＮＯＶＡ、ＧｒａｐｈＰａｄ  ＰＲＩＳＭソフトウェア）により、ＦＳＨ単独か、またはＦＳＨ／モノクローナル抗体複合体を用いて得られた用量応答曲線を比較することが可能になった。ＣＡ５抗体はｏＦＳＨの活性に対して１６０％から２００％までの範囲の増強作用を示した。この作用は３２．５ｎｇ／ｍｌの濃度のｏＦＳＨに対して有意である（ｐ＜０．０５）。ＣＨ１０抗体は、３ｎｇ／ｍｌの点の２２５％（ｐ＜０．０１）から１０ｎｇ／ｍｌおよび３３ｎｇ／ｍｌの点のそれぞれ２６０％（ｐ＜０．００１）までにわたり、検査した濃度の全てについてｏＦＳＨに対してより高い増強作用を及ぼしている。
【０１２１】
（３）ヒトＦＳＨ受容体とＧｌｏｓｅｎｓｏｒ（登録商標）システムが安定的に形質移入されたＨＥＫ２９３細胞株について
様々な種のＦＳＨに対する前記ＭＡｂの増強作用が、ヒトＦＳＨ受容体およびＧｌｏＳｅｎｓｏｒ（商標）ベクター（プロメガ、フランス）を安定的に発現するＨＥＫ２９３細胞上でリアルタイムに測定された。この細胞系により、アゴニスト（ＦＳＨのみ、またはＦＳＨ／モノクローナル抗体複合体）でのＦＳＨ受容体の刺激の後のｃＡＭＰ産生をリアルタイムでモニターすることが可能になった。ＧｌｏＳｅｎｓｏｒ（商標）タンパク質へのｃＡＭＰの結合の後、ＧｌｏＳｅｎｓｏｒ（商標）基質（プロメガ、フランス、参照番号Ｅ１２９１）が加水分解され、それによりＰｏｌａｒＳｔａｒ  Ｏｐｔｉｍａリーダー（ＢＭＧ  Ｌａｂｔｅｃｈ、ドイツ）によって測定され、且つ、ＲＬＵ（相対発光単位）で表される発光が放射された。この安定株はフランス、３７３８０、ヌジリー、ヴァル・ド・ロワールにあるＩＮＲＡ（フランス国立農学研究所）センターのシグナル伝達システムのバイオロジーおよびバイオインフォマティクスチームによって開発され、これらのアッセイのために利用可能とさせてもらった。
【０１２２】
このためにＨＥＫ２９３細胞を透明底白色９６ウェルマイクロプレート（Ｄｏｍｉｎｉｑｕｅ  Ｄｕｔｓｃｈｅｒ、フランス、参照番号６５５９０３）のウェル当たり８００００細胞の割合で、１０％のＦＣＳ（Ｌｏｎｚａ、ベルギー、参照番号ＤＥ１４−８０１Ｆ）、１％のペニシリン／ストレプトマイシン（シグマ・アルドリッチ、フランス、参照番号Ｐ−４３３３）、２００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢ（ライフテクノロジーズ（商標）、フランス、参照番号１０６８７０１０）および４００μｇ／ｍｌのＧ４１８（シグマ・アルドリッチ、フランス、参照番号Ａ１７２０）を添加された１００μｌのＭＥＭ培地（Ｏｚｙｍｅ、フランス、参照番号ＢＥ１２−６１１Ｆ）の中で一晩にわたって培養した。暗所での外界温度において２時間にわたる１％のＢＳＡ（ＰＡＡ、フランス、参照番号Ｋ４５０１２）が添加されており、且つ、４％のＧｌｏＳｅｎｓｏｒ（商標）基質を含む１００μｌのＭＥＭ培地の中での２時間の休止の後に細胞を含むそのプレートをＰｏｌａｒＳｔａｒ  Ｏｐｔｉｍａリーダーに配置し、基底レベルの発光を測定するために５分間にわたって最初の読取りを行った。その後、そのプレートをそのリーダーから取り出し
、表示されている濃度を得るために１１μｌのリガンド（ＦＳＨのみ、またはＦＳＨ／モノクローナル抗体複合体）をそのプレートに添加した。その後、放射される発光を約１時間３０分にわたって測定した。
【０１２３】
Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェア社、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国、バージョン５）を使用して、得られた結果を分析した。非線形関数「ｌｏｇ（アゴニスト）対応答」を使用してＦＳＨ濃度の関数としての応答をプロットした。これによってＦＳＨ単独、および前記モノクローナル抗体と複合体化されたＦＳＨのＥＣ５０を特徴解析し、且つ、比較することが可能になった。各例について、二本の曲線をそれらの全体にわたって比較することにより、ＦＳＨ／増強抗体複合体の有意な効果を二元配置分散分析（二元配置ＡＮＯＶＡ、ＧｒａｐｈＰａｄ  ＰＲＩＳＭソフトウェア）によって評価した。
【０１２４】
ＣＡ５モノクローナル抗体
図３は、単独の、またはＣＡ５抗体と複合体化されたヒツジＦＳＨの０ｎＭ、０．１ｎＭ、０．３ｎＭ、１ｎＭおよび３ｎＭの濃度で得られた、時間（分）の関数として相対発光単位で表されるｃＡＭＰ産生カイネティクス曲線を示している。ＦＳＨを含まない単独の前記抗体によって「刺激」された細胞は応答を示さず、発光シグナルが基底レベルに留まっていることが観察されている（曲線３Ａ）。単独のＣＡ５抗体はＨＥＫ２９３細胞が発現するヒトＦＳＨ受容体に対してアゴニスト作用もアンタゴニスト作用も及ぼしていない。逆に、ｏＦＳＨと複合体化されたＣＡ５モノクローナル抗体（６ｎＭの最終濃度）は前記ホルモンの刺激活性を非常に大幅に、且つ、顕著に増強している。ｏＦＳＨの０．１ｎＭおよび０．３ｎＭの濃度における最大細胞応答の３５０％および３３０％の増加（曲線ＢおよびＣ）、およびｏＦＳＨの１ｎＭおよび３ｎＭの濃度におけるそれぞれ２３０％および１４０％の増加（曲線ＤおよびＥ）がこのように観察されている。細胞応答の飽和およびこの事例では１１０００ＲＬＵでの発光シグナルの飽和のため、ｏＦＳＨの濃度が高くなるほど（１ｎＭおよび３ｎＭ）増強作用の大きさが小さくなる。ＧｒａｐｈＰａｄ
Ｐｒｉｓｍによって測定されたＥＣ５０値はｏＦＳＨについては２．３６×１０-９Ｍであり、且つ、ｏＦＳＨ／ＣＡ５複合体については２．８３×１０-１０Ｍであり、前記ＦＳＨがＣＡ５抗体と複合体化したときの１単位のＬｏｇＥＣ５０の増加（１０-８．６から１０-９．５４まで）を反映している。ｏＦＳＨ／ＣＡ５と比較したｏＦＳＨのそれらの二本の曲線の間の差は検査されたｏＦＳＨ用量の全てについて非常に有意である（ｐ＜０．００１）。
【０１２５】
ブタＦＳＨに対して測定されたＣＡ５抗体の増強作用が図４によって示されている。ｐＦＳＨの０．０３ｎＭにおける最大応答の１９０％の増加が、前記ｐＦＳＨがＣＡ５抗体（６ｎＭの最終濃度）と複合体化された時に観察されているが（曲線Ａ）、この増加は有意ではない。その増強作用はｐＦＳＨの０．１ｎＭの濃度において２５０％に達し（曲線Ｂ）、且つ、有意である（ｐ＜０．０１）。ＣＡ５と複合体化した０．０３ｎＭのｐＦＳＨで得られた応答レベルは０．１ｎＭのｐＦＳＨ単独で得られた応答レベルと等しく（それぞれ５００ＲＬＵ対５８５ＲＬＵ）、これは０．０３ｎＭのｐＦＳＨ／ＣＡ５複合体によって３．３倍高い濃度（０．１ｎＭ；すなわち０．５Ｌｏｇ）の単独のｐＦＳＨと同じ大きさの応答が誘導されることを意味する。
【０１２６】
最後にＣＡ５の増強作用を組換えヒトＦＳＨ（ゴナールＦ、セローノ・ラボラトリー）の活性に対して検討した。図５は、単独のまたはＣＡ５抗体（６ｎＭ）と複合体化された０．０３ｎＭ、０．１ｎＭ、０．２ｎＭ、０．３ｎＭの濃度のＦＳＨを用いる刺激の間に得られた、時間（分）の関数として相対発光単位で表されるｃＡＭＰ産生カイネティクス曲線を示している。前記細胞系の飽和（最大１０５３０ＲＬＵ）のため、ｈＦＳＨの０．０３ｎＭの濃度で２３５％の増強作用が観察され、０．１ｎＭおよび０．２ｎＭのｈＦＳ
Ｈで２００％の増強作用が観察され、そして最も高い０．３ｎＭのｈＦＳＨの濃度で１７０％の増強作用が観察された。ＧｒａｐｈＰａｄ  ＰｒｉｓｍによるＥＣ５０の計算によってｈＦＳＨについては５．８６×１０-１０Ｍの値、およびｈＦＳＨ／ＣＡ５複合体については１．３６×１０-１０Ｍの値が示された。これは前記ＦＳＨがＣＡ５抗体と複合体化したときの０．６３のＬｏｇＥＣ５０の増加（１０-９．２３から１０-９．８６まで）を反映している。ＣＡ５  ｓｃＦｖの増強作用も０．０１ｎＭのｈＦＳＨの生理活性に対して検討した。３６ｎＭのｓｃＦｖ濃度で１６０％という有意な増加（ｐ＜０．０１）が得られた（図５）。この増加は二価のＣＡ５完全抗体の増加と類似していた。この結果はその一価断片がＣＡ５抗体と同じＦＳＨ活性増強特性を有していることを意味している。
【０１２７】
ヒトＦＳＨの生理活性に対するＣＡ５抗体の増強作用は有意ではあるが（ｐ＜００１）、ｏＦＳＨのＥＣ５０とｏＦＳＨ／ＣＡ５複合体のＥＣ５０との間でＬｏｇ単位の増加が得られたヒツジＦＳＨの生理活性に対するものよりも依然として小さいままである。
【０１２８】
ＣＨ１０モノクローナル抗体
ＣＨ１０抗体の調節作用をヒツジＦＳＨ（ｏＦＳＨ）およびヒトＦＳＨ（ｈＦＳＨ）（ゴナールＦ、セローノ・ラボラトリー）に対して検討した。
【０１２９】
図６は０．０１ｎＭ、０．０３ｎＭ、および０．１ｎＭの濃度で調製されたｏＦＳＨの生理活性に対するＣＨ１０抗体（１０ｎＭ）の増強作用を示している。低い濃度（０．０１ｎＭおよび０．０３ｎＭ）に対しては細胞応答の１８５％の増加がｏＦＳＨ／ＣＨ１０複合体で得られている（曲線ＡおよびＢ）。０．１ｎＭのｏＦＳＨ濃度ではその増加はｏＦＳＨ／ＣＨ１０複合体で３１２％である（曲線Ｃ）。これらの増加は非常に有意である（ｐ＜０．００１）。
【０１３０】
ＣＨ１０（１．３ｎＭ）の増強作用を０．１ｎＭから３ｎＭまでの濃度で調製されたヒトＦＳＨに対して測定した（図７ＡおよびＢ）。１４０％から１５０％までの範囲の中程度だが有意な（ｐ＜０．００１）増加が観察された。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍによって測定されたＥＣ５０値はｈＦＳＨについては２．８５×１０−１０Ｍであり、且つ、ｈＦＳＨ／ＣＨ１０複合体については３．１７×１０−１０Ｍであった（図７Ｃ）。
【０１３１】
ＣＨ１０の増強作用はヒツジの動物ＦＳＨに対してより特異的に発揮されている。ヒトＦＳＨに対しては弱いＣＨ１０抗体の作用が観察された。
【０１３２】
実施例３：ラットモデルにおけるＦＳＨおよびＬＨ／ＣＧの生理活性に対する本発明のリガンドの増強作用のインビボ測定
インビトロで特徴解析された後、各モノクローナル抗体の増強作用をＦＳＨの生理活性に対するそれらの抗体の作用についてはメスのラットにおいて、およびそれらが同じく認識するＬＨ／ＣＧの生理活性に対するそれらの抗体の作用についてはオスのラットにおいてインビボで特徴解析した。
【０１３３】
ＦＳＨ生理活性を測定するため、使用したプロトコルはＳｔｅｅｌｍａｎとＰｏｈｌｅｙ(Steelman SL, Pohley FM. Endocrinology, 53: 604-616. 1953) ［１２］によって記載された生物学的アッセイのプロトコルであった。ＬＨ生理活性を測定するため、使用したプロトコルはＳｃｏｂｅｙら(Scobey et al., Reprod. Biol. Endocr. 3: 61, 2005) ［１３］によって記載されたアッセイのプロトコルであった。
【０１３４】
ヒツジおよびヒトのＦＳＨを使用してＦＳＨ活性に対するそれらの抗体の作用を評価した。ＬＨ活性に対するそれらの抗体の作用をｈＣＧ（ヒト絨毛性ゴナドトロピン）の２種
類の調製物に対して評価した。
【０１３５】
ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア社、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国、バージョン５）を使用して統計分析を行った。結果は５匹の動物からなるバッチに対して行われた実験に関連するものであったので、Ｄｕｎｎ補正付きのノンパラメトリック一元分散分析（クラスカル・ウォリス検定）、またはノンパラメトリックｔ検定（マン・ホイットニー検定）を適用した。数回のバイオアッセイをまとめたことによって数が大きくなった（ｎ＞３０）ものに関する結果についてはボンフェローニ補正付きのパラメトリック検定（対応のないスチューデントのｔ検定）を適用した。
【０１３６】
（１）メスのラットにおけるＦＳＨの生理活性に対する抗体の増強作用
ＣＡ５抗体およびＣＨ１０抗体およびそれらのｓｃＦｖの増強作用をヒツジＦＳＨに対して検討し、且つ、ヒトの生殖において使用されているヒトＦＳＨの様々な調製物であるゴナールＦとピュレゴン（それぞれメルクセローノ・ラボラトリーとメルクシェリングプラウ・ラボラトリーに由来する組換えＦＳＨ）、およびフォスティモンとメノピュール（それぞれラボラトワール・ジェニエーブルとメルクシェリングプラウによって販売されている抽出型ＦＳＨ）に対して検討した。
【０１３７】
ＳｔｅｅｌｍａｎとＰｏｈｌｅｙのプロトコルに記載されているように、２１日齢の未成熟なメスのラットが、一定量のｈＣＧ（３．５ＩＵ）を含み、ヒトＦＳＨ（ゴナールＦ、ピュレゴン、フォスティモン、メノピュール）については０．５〜１．５ＩＵまでの範囲で、またはヒツジＦＳＨ（抽出型ホルモン）については０．５〜２μｇまでの範囲で変えることができる量のＦＳＨを添加された１００μｌのｈＣＧとＦＳＨの混合物からなる注射を連続３日間にわたって朝と晩に２回受けた。うなじに皮下注射を行った。各実験は最小でも４つのバッチから構成された。１つのバッチは生理食塩水（血清Φ）で処置され、１つのバッチは抗体またはｓｃＦｖ単独で処置され、１つのバッチはｈＣＧ＋ＦＳＨ混合物で処置され、１つのバッチは２μｇの精製されたｓｃＦｖ抗体を添加したｈＣＧ＋ＦＳＨ混合物で処置された。
【０１３８】
ホルモン／抗体またはｓｃＦｖの複合体を用いる処置の場合、区別なく注射の前にそのＦＳＨ＋抗体混合物を３７℃または外界温度で２０分間にわたってプレインキュベートし、その後でｈＣＧに添加した。そのｈＣＧを前記複合体の保温時に区別なくＦＳＨと混合することができる。
【０１３９】
４日目にそれらのメスのラットの体重を測定し、それらの卵巣を取り出し、解剖し、そしてそれらの重量を量った。結果が体重１００グラム当たりのミリグラム単位の卵巣として表されている。卵巣重量の増加は注射した生理活性ＦＳＨの量に比例している。これにより、単独で、または抗体との複合体として注射された同量のホルモンの生理活性を定量し、比較することができる。
【０１４０】
単独で、または前記抗体もしくはｓｃＦｖと複合体化されて注射されたＦＳＨの生理活性の比較により、応答の差異を測定し、そうして前記抗体またはそのｓｃＦｖの増強作用を定量することが可能になる。
【０１４１】
ＣＡ５抗体およびそのｓｃＦｖの作用
図８ＡはヒツジＦＳＨの生理活性に対するＣＡ５抗体の作用の代表例を示している。各バッチは５匹のメスから構成された。単独で注射されたＣＡ５抗体で処置されたバッチは生理食塩水を受領した対照バッチのメスと同じ平均卵巣重量を示した（それぞれ２５．６ｍｇと２９．１５ｍｇ）。従来のホルモン処理（３．５ＩＵのｈＣＧ＋０．５μｇのｏＦ
ＳＨ）を受けたバッチは対照バッチよりも有意に高い（ｐ＜０．０５）８５．７ｍｇという平均卵巣重量を生じた。ＣＡ５抗体と予め複合体化されたヒツジＦＳＨで処置されたバッチは１９８ｍｇという平均重量を、すなわち従来のホルモン処理を受けたバッチと比較して非常に有意な（ｐ＜０．０００１）ＦＳＨ生理活性の２３１％の増加を示した。ヒツジＦＳＨの活性に対するＣＡ５のインビボ増強作用を数回の実験において分析した。それらの実験の結果の全てが表２７に示されている。３回の実験について記録された前記ホルモン／ＣＡ５複合体を用いる刺激の後の平均卵巣重量の増加は非常に有意である（ｐ＜０．０００１）。
【０１４２】
【表２７】
0006649385.tif 000029
【０１４３】
ヒトＦＳＨに対するＣＡ５の作用も、数を多くして数回の実験の中で分析した。それらの結果が下の表２８に示されている。
【０１４４】
【表２８】
0006649385.tif 000030
【０１４５】
ｈＦＳＨ  ゴナールＦ／ＣＡ５複合体で処置されたメスにおいて記録された平均卵巣重量の増加は１７３％であり、卵巣の平均重量が従来の処置を受けたメスにおける７３．９３ｍｇから前記ホルモン／ＣＡ５複合体で処置されたメスにおける１２８．３ｍｇへ推移している。この差は非常に有意である（ｐ＜０．０００１、対応のないｔ検定）。
【０１４６】
最後に前記増強作用をヒトＦＳＨの他の２種類の調製物（ピュレゴンおよびフォスティモン）について検討した。図８Ｂに示されている結果が代表例である。１５３％という有意な増加がヒトＦＳＨであるピュレゴンの活性（ｐ＜０．０５）について記録され、１４２％という有意な増加がヒトＦＳＨであるフォスティモンの活性について記録された（ＮＳ）。対照的に、ヒトＦＳＨであるゴナールＦの活性について記録された増加はこの実験では１７９％であった（ｐ＜０．０５）。
【０１４７】
結論として、ＣＡ５抗体はヒツジＦＳＨに対して大きな増強作用を及ぼし、様々な医薬調製物に由来するヒトＦＳＨの活性に対しても大きい増強作用を及ぼす。
【０１４８】
ＣＡ５  ｓｃＦｖの効果を完全抗体と同じプロトコルの中で検討した。図９Ａは得られた結果を示している。ヒトＦＳＨであるゴナールＦの活性に対する同一の増強作用が前記完全抗体またはそのｓｃＦｖで得られ、その作用は有意であった（ｐ＜０．０５）。
【０１４９】
前記ホルモン／ｓｃＦｖ混合物の注射の様々な方法を従来のプロトコル（皮下注射）と評価および比較した。したがって、前記ホルモン混合物の腹膜内注射を前記ホルモン混合物の腹膜内注射とそれに続き１５分後に行った２つ目の時間遅延型のＣＡ５  ｓｃＦｖの注射と比較することを目的としたバイオアッセイ（図９Ａ）を実施した。この事例では前記ホルモン／ｓｃＦｖ複合体で処置されたメスにおいて１４６％の増加が得られ、平均卵巣重量が６１ｍｇ（ｈＣＧ＋ｈＦＳＨ  ゴナールＦのバッチ）から８９ｍｇ（ｓｃＦｖとその後のｈＣＧ＋ｈＦＳＨ  ゴナールＦのバッチ）へ推移した。これらの結果は、ＣＡ５
ｓｃＦｖが前記ホルモンから独立して、且つ、時間をおいて単独で注射されてもそのｓｃＦｖの増強作用をインビボで立ち上げることができることを示しているので重要である。前記ホルモン／ｓｃＦｖ複合体は処置動物においてインビボで形成される可能性がある。
【０１５０】
ＣＡ５  ｓｃＦｖの増強作用をヒトＦＳＨであるフォスティモンとピュレゴンの活性についても検討した（図９Ｂ）。１４０％という有意な増加がＦＳＨであるピュレゴンの活性について得られ（ｐ＜０．０５）、１２６％という有意ではない増加がＦＳＨであるフォスティモンの活性について得られた（ＮＳ）。
【０１５１】
ＣＨ１０抗体およびそのｓｃＦｖの作用
ヒツジＦＳＨの活性に対するＣＨ１０のインビボ増強作用を数回の実験の間に分析した。それらの実験の結果の全てが図１０Ａに示されている。ｈＣＧ＋ｏＦＳＨ混合物で処置されたメスのラットと前記ホルモン／ＣＨ１０複合体で処置されたメスのラットとの間での応答についての３回の実験の比較から１４５％という有意な増加（ｐ＜０．０１）が示されている。記録された平均卵巣重量は前記ホルモン／ＣＨ１０複合体で処置されたメスのラット（ｎ＝１３）において１００ｇの体重当たり１２６．６±９．６ｍｇであるのに対し、ｈＣＧ＋ｏＦＳＨ混合物で処置されたメス（ｎ＝１２）では８７．５５±３．７２４ｍｇであった。卵巣応答について単独のＣＨ１０抗体の効果は観察されなかった。
【０１５２】
ヒトＦＳＨであるゴナールＦに対するＣＨ１０の増強作用も、数を多くして数回の実験の中で分析した。結果が下の表２９および図１０Ｂに示されている。
【０１５３】
【表２９】
0006649385.tif 000031
【０１５４】
卵巣の平均重量の１７０％の増加がゴナールＦ／ＣＨ１０複合体で処置されたメスにおいて記録された。この差は非常に有意である（ｐ＜０．０００１、対応のないｔ検定）。
【０１５５】
ＣＨ１０の増強作用をヒトＦＳＨであるピュレゴンとフォスティモンについても調べた（図１１Ａ）。それぞれ１４５％および１７４％という有意な増加が得られた（ｐ＜０．０５）。図１１Ｂは従来の皮下注射および時間遅延型の腹膜内注射によるｈＦＳＨ  ゴナールＦ／ＣＨ１０  ｓｃＦｖ複合体の効果を示している。１６０％という有意な増加（ｐ＜０．０５）が従来の注射によって得られ、有意ではないが、１５０％の増加がＣＨ１０
ｓｃＦｖとｈＦＳＨの独立した腹膜内注射によって得られた。ＣＨ１０  ｓｃＦｖを前記ホルモンと別々に注射するにしても、または前記ホルモンとプレインキュベートして注射するにしても、そのｓｃＦｖの増強作用はこのようにインビボで立ち上げられ得る。
【０１５６】
ラットにおけるＬＨ／ＣＧの生理活性に対する抗体の増強作用
ヒツジＬＨは非常に高価であるため、これらの生物学的アッセイは、容易に入手でき、非常に純粋であり、且つ、安価な形態であるｈＣＧを用いて実施された。前記抗体の作用を抽出型ヒトｈＣＧ（ヒト絨毛性ゴナドトロピン）の２種類の調製物、すなわち一方の生殖補助医療処置の背景でのヒトの生殖に使用されるＥＮＤＯ５０００（シェリングプラウ・ラボラトリー）と他方の獣医学で使用されるコルロン（ＭＳＤラボラトリー）に対して検討した。
【０１５７】
Ｓｃｏｂｅｙら［１３］のプロトコルにしたがって、アンドロゲン依存的に発生する精嚢の重量増に関してＬＨまたはｈＣＧの生理活性を定量した。その重量はｈＣＧの活性と比例して変化し、したがってそれにより、単独で、または試験抗体と複合体化されて注射されたホルモンの生物活性を定量および比較することが可能になる。１．５ＩＵのｈＣＧ、または３７℃で２０分間にわたってプレインキュベートされた１．５ＩＵのｈＣＧと２μｇの抗体の混合物の１００μｌを４日間にわたって一日一回皮下注射した２５日齢の若いラットを使用して前記プロトコルを実施した。５日目にそれらのラットの体重を測定し、その後で殺処理した。それらのラットの精嚢（ＳＶ）を取り出し、解剖し、そしてそれらの重量を量った。様々なバッチを用いて得られた結果を比較し、まとめるために精嚢重量が１００ｇの体重当たりのｍｇとして表されている。各実験において、５匹のラットからなるバッチに対して前記条件の各々を検査した。同じ実験を数回繰り返した。
【０１５８】
ｈＣＧの２種類の調製物、すなわちコルロンおよびＥｎｄｏ５０００に対するＣＡ５の作用が図１２に示されている。ヒストグラムＡは５匹のラットからなる６つのバッチに対して行われたバイオアッセイの代表例である。ｈＣＧ単独で処置されたバッチと比較した精嚢重量の１９６％の増加を含む非常に有意な増強作用（ｐ＜０．０００１、クラスタル・ウォリス検定）が、ｈＣＧコルロン／ＣＡ５複合体を用いて得られた。１９３％の重量増加を含む有意効果もｈＣＧＥＮＤＯ５０００／ＣＡ５複合体を用いて得られた（ｐ＜０．０１）。ＣＡ５抗体単独で処置されたバッチは生理食塩水で処置された対照動物と比較して精嚢重量の変化を示しておらず、単独のその抗体は前記複合体と対照的に標的器官に対して効果を発揮しないことが観察されている。
【０１５９】
それらの２種類のｈＣＧを用いたこのバイオアッセイを繰り返している間に得られた結果をまとめたものから前記ホルモン／ＣＡ５複合体の非常に有意な増強作用（ｐ＜０．０００１、対応のないｔ検定）が確認される。すなわち、
‐それぞれ５３匹および５６匹という数の動物について、ＳＶの平均重量はｈＣＧであるコルロンで処置されたラットでは２８．８ｍｇ／１００ｇであり、且つ、前記複合体で処置されたラットでは４６．７ｍｇ／１００ｇであり（１６２％の増加）（図１２Ｂ）、
‐それぞれ２６匹および３０匹という数の動物について、ＳＶの平均重量はｈＣＧであるＥＮＤＯ５０００で処置されたラットでは２４．６４ｍｇ／１００ｇであり、且つ、前記複合体で処置されたラットでは４８．１３ｍｇ／１００ｇであった（１９５％の増加）（図１２Ｃ）。
【０１６０】
ＣＨ１０抗体は、ｈＣＧであるコルロンおよびｈＣＧであるＥＮＤＯ５０００に対してもラットにおいてインビボで有意な増強作用を示した。
【０１６１】
図１３Ａは５匹のラットからなる６つのバッチに対して行われたバイオアッセイの代表的な事例を示している。ｈＣＧ単独で処置されたバッチと比較した精嚢重量の１９３％の増加を含む非常に有意な増強作用（ｐ＜０．０００１、クラスタル・ウォリス検定）が、ｈＣＧ  コルロン／ＣＨ１０複合体を用いて得られた。ｈＣＧ  ＥＮＤＯ５０００／ＣＨ１０複合体で処置されたバッチについても１９９％の重量増加を含む有意効果が得られた（ｐ＜０．０００１）。ＣＨ１０抗体単独で処置されたバッチは、生理食塩水で処置され
た対照動物と比較して精嚢重量の変化を示していないことが観察されている。したがって、前記ホルモンに複合体化していないＣＨ１０は標的器官に対して特異的作用を持たない。
【０１６２】
それらの２種類のｈＣＧを用いたこのバイオアッセイを繰り返している間に得られた結果をまとめたものから前記ホルモン／ＣＨ１０複合体の非常に有意な増強作用（ｐ＜０．０００１、対応のないｔ検定）が確認される。すなわち、
‐それぞれ３４匹および３５匹という数の動物について、ＳＶの平均重量は前記複合体で処置されたラットでは５０．０４ｍｇ／１００ｇであったのに対し、ｈＣＧであるコルロンで処置されたラットでは２９．６ｍｇ／１００ｇであり（１６９％の増加）（図１３Ｂ）、
‐それぞれ１３匹および１５匹という数の動物について、ＳＶの平均重量はｈＣＧであるＥＮＤＯ５０００で処置されたラットでは２４．６４ｍｇ／１００ｇであり、且つ、前記複合体で処置されたラットでは５１．３９ｍｇ／１００ｇであった（２０８％の増加）（図１３Ｃ）。
【０１６３】
実施例４：雌羊における内在性ゴナドトロピンの生理活性に対する本発明のリガンドの増強作用のインビボ測定
げっ歯類動物（小動物）においてＣＡ５モノクローナル抗体およびＣＨ１０モノクローナル抗体の増強作用をインビボで実証し、特徴解析した後、多産でより大型の家畜、すなわち雌羊においてＦＳＨの活性に対する各抗体の作用を研究することを目的とした。
【０１６４】
このため、処置される雌羊自身のホルモン（内在性ホルモン）に対する前記抗体の増強作用を評価することを目的として全て同じ年齢の思春期のイル・ド・フランス種の雌羊に対して試験を行った。特異性試験によりＣＡ５抗体およびＣＨ１０抗体のヒツジＦＳＨへの強い結合とヒツジＬＨへのより可変的な結合が示された。この目的のため、抗体だけの注射のみを含む処置がその処置の有効性を評価するために開発された。
【０１６５】
雌羊に設定されたそれらのプロトコルでは、したがって各抗体は単独で注射され、メスのラットでの試験で行われたように外因性のＦＳＨとプレインキュベートされることがなかった。さらに、各抗体はそれ以前にどのような卵巣刺激も受けていない雌羊に、すなわち、ゴナドトロピンを用いる排卵刺激のためのホルモン処理をその抗体の注射の前に受けていない動物に注射された。
【０１６６】
抗ＦＳＨ抗体であるＣＡ５およびＣＨ１０の増強作用を発情期のちょうど真ん中（１月）または発情期の最後（３月末）に行われたプロトコルの間に評価した。それらのプロトコルは全て、プロゲストゲン（４５ｍｇの酢酸フルロゲストン（ＦＧＡ）；ＭＳＤ）を染み込ませた膣内スポンジを１４日間にわたって差し込むことにより排卵周期を予め同期させた雌羊に対して行われた。対照雌羊（生理食塩水バッチ）、ブタＦＳＨ処理で刺激された雌羊（ＦＳＨバッチ）、および抗体だけを用いて刺激された雌羊（抗体バッチ）において排卵応答（排卵回数）および高品質の１つ以上の機能的黄体の樹立（プロゲステロン分泌の程度）を比較することにより増強作用を分析した。
【０１６７】
各プロトコルではＬＨの排卵前のピークを検出し、その日付をつけるためにＥＬＩＳＡ法によって血漿中ＬＨアッセイを行った。排卵応答を評価するため、膣内スポンジの撤去から８日後に黄体の数を計数し、且つ、それらの黄体の外観を観察するために麻酔下で腹腔鏡検査法により卵巣の内視鏡観察を行った。
【０１６８】
その黄体または黄体の機能性と品質を評価するため、前記スポンジの撤去後の１日目から２１日目までの毎日の血液試料を使用して定量的プロゲステロンＥＬＩＳＡアッセイを
行った。
【０１６９】
ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍバージョン５．０ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国）を使用して全ての統計分析を行った。
【０１７０】
ＣＡ５抗体
ＣＡ５抗体（ＩｇＧ）の増強作用を２つのプロトコル（プロトコル１および２）において発情期中および発情期の終わりに評価した。
【０１７１】
発情期の終わりに実施されるプロトコル１では、
‐「ＣＡ５抗体」バッチ（ｎ＝６）は前記スポンジの撤去の４日前に２ｍｇ、その撤去前に１ｍｇ、およびそのスポンジの撤去時に１ｍｇの３回の精製ＣＡ５の筋肉内注射を受け、
‐「対照」バッチ（ｎ＝５）は前記スポンジの撤去の２４時間前に生理食塩水の筋肉内注射を受け、
‐「ＦＳＨ」バッチ（ｎ＝５）は前記スポンジの撤去の２４時間前に１００μｇのブタＦＳＨ（ｐＦＳＨ）の筋肉内注射を受け、そのスポンジの撤去の１２時間前に９０μｇの筋肉内注射を受けた。
【０１７２】
排卵応答の分析により下の表３０に示されている結果が得られた。
【０１７３】
【表３０】
0006649385.tif 000032
【０１７４】
フィッシャーの正確検定によって統計分析を行った。
【０１７５】
対照バッチおよびＦＳＨバッチと比較して、ＣＡ５バッチにおいて得られた結果は排卵応答に対するどんな有意な効果も示していない。測定されたパラメーターの中で傾向を示しているものは無い。
【０１７６】
前記３種類のバッチにおいて得られた黄体期におけるプロゲステロン分泌プロファイルが図１４に示されている。それぞれのバッチについて黄体の数に対してプロゲステロン濃度値（ｎｇ／ｍｌ）を正規化した。各曲線は時間ｔにおける各バッチのメスにおいて得られたプロゲステロン値の平均を表している。
【０１７７】
黄体当たりのプロゲステロン分泌の強度およびその分泌の成立の始まりに対するＣＡ５抗体の有意な効果が観察された（図１４Ａ）。実際に、ＦＳＨバッチおよび血清Φバッチの曲線と比較して、ＣＡ５曲線上には早くも４日目にプロゲステロン分泌の開始が観察さ
れ、それに続いて周期の最後まで黄体期を通して維持される分泌の著しい増加が観察されている。平均プロゲステロン値は１０日目ではＣＡ５バッチ、ＦＳＨバッチおよび血清Φバッチについてそれぞれ１．３８ｎｇ／ｍｌ、０．９２ｎｇ／ｍｌ、および０．５２ｎｇ／ｍｌであり、１５日目では２．５８ｎｇ／ｍｌ、１．７ｎｇ／ｍｌおよび１．１８ｎｇ／ｍｌである。対応のあるノンパラメトリックｔ検定（ウィルコクソン検定）を用いてそれらの３本の曲線の比較を行った。そうすると、ＣＡ５バッチの曲線はＦＳＨバッチの曲線よりも上にあり、且つ、有意に異なっており（ｐ＜０．０１）、同様に対照バッチの曲線とも有意に異なっている（ｐ＜０．００１）。ＦＳＨバッチの曲線は対照バッチの曲線よりも上にあり、且つ、有意に異なっている（ｐ＜０．００１）。
【０１７８】
ＣＡ５刺激下にある雌羊における周期の最後までのこの著しく、且つ、一定のプロゲステロン分泌レベルの増加を定量するため、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍバージョン５．０ソフトウェアを用いて曲線下面積（ＡＵＣ）を計算した。結果が図１４Ｂに示されており、それらの結果はＣＡ５曲線のＡＵＣ（２３．６１任意単位）が血清Φ曲線のＡＵＣ（８単位）よりも大きい傾向にあるが、この差は有意ではないことを示している。同様に、ＦＳＨ曲線のＡＵＣ（１２単位）は対照曲線と有意に異なっていない。
【０１７９】
結論として、雌羊におけるＣＡ５の注射はＦＳＨを用いる従来の処置と同じ結果を排卵誘導に関して生じるが、より早期のプロゲステロン分泌の成立、およびより高い循環プロゲステロンレベルを有するより有効な機能的黄体の維持を可能にし、初期胚発生のより確かな成功および妊娠の維持（流産リスクの低下）を保証する。
【０１８０】
発情期中に実施されるプロトコル２では、
‐「ＣＡ５抗体」バッチ（ｎ＝７）は前記スポンジの撤去の２４時間前に２ｍｇのＣＡ５の単回筋肉内注射を受け、
‐「対照」バッチ（ｎ＝９）は前記スポンジの撤去の２４時間前に生理食塩水の筋肉内注射を受け、
‐「ＦＳＨ」バッチ（ｎ＝１１）は前記スポンジの撤去の２４時間前に１００μｇのブタＦＳＨ（ｐＦＳＨ）の筋肉内注射を受け、そのスポンジの撤去の１２時間前に９０μｇの筋肉内注射を受けた。
【０１８１】
排卵応答の分析により下の表３１に示されている結果が得られた。フィッシャーの正確検定によって統計分析を行った。
【０１８２】
【表３１】
0006649385.tif 000033
【０１８３】
対照バッチおよびＦＳＨバッチと比較して、ＣＡ５バッチにおいて得られた結果は単独で注射された前記抗体の排卵応答に対する非常に有意な効果を示している。実際に、血清ΦバッチおよびＦＳＨバッチのそれぞれ４４％および３６％と比較して、２ｍｇの抗体の注射を受けたメスの１００％（７匹／７匹）が排卵した（ｐ＜０．０００１、フィッシャーの正確検定）。バッチの総数についてメス当たり得られた黄体の数は同様に「ＣＡ５」バッチにおいてほぼ有意に大きく（ｐ＝０．０６、マン・ホイットニーｔ検定）、それぞれ０．９個（ＦＳＨ）および０．６７個（血清Φ）であったのに対して１．５個の黄体であった。排卵したメス当たりの平均黄体数には前記３種類のバッチの間で有意差が無い。
【０１８４】
ＬＨピークが現れる平均時間には前記３種類のバッチの間で有意差が無い。それでも、ＬＨピークに到達する時間（およびしたがって排卵の時間）がＦＳＨバッチおよび特に血清Φバッチと比較してわずかに変化する傾向がＣＡ５バッチにおいて観察されている。
【０１８５】
排卵後の黄体期におけるプロゲステロン分泌プロファイルが図１５Ａに示されている。それぞれのバッチについて黄体の数に対してプロゲステロン濃度値（ｎｇ／ｍｌ）を正規化した。その図の各曲線は各バッチのメスにおいて得られたプロゲステロン値の平均を表している。ＣＡ５抗体の顕著な効果がプロゲステロン分泌の強度に対して観察され、黄体当たりのプロゲステロン分泌の大幅な、且つ、非常に有意な増加がＦＳＨバッチおよび血清Φバッチの曲線と比較して黄体期を通して観察された。平均値は１０日目ではＣＡ５バッチ、ＦＳＨバッチおよび血清Φバッチについてそれぞれ２．４４ｎｇ／ｍｌ、１．３ｎｇ／ｍｌおよび０．６２ｎｇ／ｍｌであり、１５日目では２．８８ｎｇ／ｍｌ、１．４２ｎｇ／ｍｌおよび１．１８ｎｇ／ｍｌである。対応のあるノンパラメトリックｔ検定（ウィルコクソン検定）によってそれらの３本の曲線の比較を行った。ＣＡ５バッチの曲線はＦＳＨバッチの曲線よりも有意に上であり、且つ、有意に異なり（ｐ＜０．０１）、同様に対照バッチの曲線よりも有意に上であり、且つ、有意に異なる（ｐ＜０．００１）。ＦＳＨバッチの曲線は対照バッチの曲線と有意に異なる（ｐ＜０．００１）。
【０１８６】
ＣＡ５刺激下にある雌羊における周期の黄体期を通して黄体当たりのプロゲステロン分泌レベルのこの顕著で、且つ、一定の増加を定量するため、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍバージョン５．０ソフトウェアを用いて曲線下面積（ＡＵＣ）を計算した。結果が図１５Ｂに示されており、それらの結果はＣＡ５曲線のＡＵＣ（２４．２０単位）が血清Φ曲線のＡＵＣ（８．１）よりも３倍有意に高い（ｐ＜０．０５、ノンパラメトリックマン・ホイットニーｔ検定）ことを示している。逆に、ＦＳＨ曲線のＡＵＣは対照曲線と有意に異なっていない。
【０１８７】
結論として、２ｍｇの単回筋肉内注射の形態でＣＡ５抗体を使用することにより、非常に有意なことに、
（１）刺激を受けたメスの１００％において排卵を誘導することができ、
（２）ＦＳＨ処理後に観察される分泌よりもずっと多いプロゲステロン分泌、および早くも４日目という非常に速いプロゲステロン分泌の成立を有する、より良好な品質の黄体を発生させることができる
という、ＦＳＨを用いる従来の処置よりも良好な結果が生じた。ＦＳＨ処理と比較して追加的なＣＡ５のこの特性の影響力は非常に重要であることが強調されるべきである。これは、血漿中プロゲステロン濃度が胚発生、特にその初期において重要な因子であるからである。
【０１８８】
より早期のプロゲステロン分泌の成立、およびより高い循環プロゲステロンレベルを有するより有効な機能的黄体の維持は、初期胚発生のより確かな成功、および流産リスクが低下した妊娠の維持を保証するものである。
【０１８９】
それらの結果の全てより、雌羊にインビボで注射された前記増強抗体、特にＣＡ５は動物の内在性性腺刺激ホルモンと複合体化することができ、且つ、動物自身のホルモンの生物活性を増強することができることが示されている。
【０１９０】
雌羊におけるＣＡ５抗体の増強作用は従来のＦＳＨホルモン処理より強い卵巣刺激を誘導することができる。排卵誘導は発情期において１００％であり、且つ、全ての事例において循環プロゲステロン濃度の大幅な増加、２００％から３００％の増加が黄体期を通して維持される。この追加的作用はプロゲストゲン依存性胚発生不全率および流産のリスクの低下にとって重要である。
【０１９１】
実施例５：若雌牛における内在性ゴナドトロピンの生理活性に対する本発明のＣＡ５リガンドの増強作用のインビボ測定
ラットおよび雌羊においてＣＡ５モノクローナル抗体の増強作用を実証し、特徴解析した後、より大型の動物、すなわち若雌牛において内在性ゴナドトロピンの活性に対するその抗体の作用を研究することを目的とした。このため、前記抗体の効力を評価するためにその抗体単独の注射のみを含む処置をプリム・ホルスタイン種の若雌牛において開発した。これらの若雌牛はそれ以前にどのような卵巣刺激も受けておらず、それらの動物はゴナドトロピンを用いる排卵刺激のためのホルモン処理をその抗体の注射の前に受けていなかった。
【０１９２】
プロゲストゲン移植錠（３．３ｍｇのノルゲストメット、Ｃｒｅｓｔａｒ（登録商標）、ＭＳＤ）を７日間にわたって留置することによって排卵周期を前もって同期させた２０〜２２か月齢のプリム・ホルスタイン種の若雌牛に対してＣＡ５抗体の増強作用の評価を目的とするプロトコルを実施した。その移植錠を留置した日にＧｎＲＨ（０．００４ｍｇの酢酸ブセレリン、Ｃｒｅｓｔａｒ（登録商標）パック、ＭＳＤ）の注射を行い、その後、その移植錠の撤去２４時間前にプロスタグランジン（Ｐｒｏｓｏｌｖｉｎ（登録商標）、Ｖｉｒｂａｃ）の注射を行った。
【０１９３】
それらの動物を２つのバッチに分けた。
‐  ２回の１１ｍｇの精製ＣＡ５抗体の筋肉内注射を受けた「ＣＡ５」バッチ（ｎ＝４）：前記移植錠の留置から２４時間後に１回目の注射が行われ、前記プロゲストゲン移植錠の撤去の２４時間前に２回目の注射が行われた。
‐  ２回の生理食塩水の筋肉内注射を受けた「対照」バッチ（ｎ＝３）：前記移植錠の留置から２４時間後に１回目の注射が行われ、前記プロゲストゲン移植錠の撤去の２４時間前に２回目の注射が行われた。
【０１９４】
対照若雌牛（生理食塩水バッチ）における排卵応答（排卵または無排卵）および良好な品質の機能的黄体の樹立（黄体のサイズおよびプロゲステロン分泌の程度）と前記抗体単独で処置された若雌牛（ＣＡ５バッチ）におけるそれらを比較することにより増強作用を分析した。
【０１９５】
排卵前ＬＨピークを検出し、その日付をつけるため、且つ、エストラジオール分泌をモニターするためにＥＬＩＳＡ法によって血漿中ＬＨおよびエストラジオールアッセイを行った。排卵応答および黄体のサイズを評価するため、卵巣超音波検査を毎日行った。最後に黄体の機能性および品質を評価するため、前記移植錠の留置日よりその移植錠の撤去から２１日後までの毎日の血液試料に対して定量的プロゲステロンＥＬＩＳＡアッセイを行った。
【０１９６】
若雌牛に人工授精を行い、人工授精から３５日後に超音波検査により妊娠の診断を行っ
た。
【０１９７】
ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍバージョン５．０ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国）を使用して全ての統計分析を行った。
【０１９８】
最初に循環エストラジオールレベルを測定することにより前記２種類のバッチの若雌牛において排卵応答を比較した。図１６Ａに示されている結果は各バッチを代表する２匹の若雌牛におけるエストラジオール分泌プロファイルを示している。０日目に観察されたエストラジオールピークは処置動物において高く、０日目では対照において６．６ｐｇ／ｍｌであるのに対して９．２ｐｇ／ｍｌの濃度であり、１．５日目では対照において８．８ｐｇ／ｍｌであるのに対して１０．５ｐｇ／ｍｌの濃度である（有意性無し）。各バッチの若雌牛の結果の平均が、前記移植錠が留置されたときに測定された基底エストラジオール濃度のパーセンテージとして表されている（図１６Ｂ）。エストラジオールピークの高さが対照バッチの若雌牛と比較してＣＡ５抗体で処置されたバッチにおいて高い傾向にあるという同じ傾向が見られている。すなわち、前記移植錠の撤去時（０日目）に１３３±７％であるのに対して１４９±１６％であり、前記移植錠の撤去から１．５日目に１４４±８％であるのに対して１６１±６％である（有意性無し）。３日目と８日目との間のエストラジオールレベルから、２つ目の卵胞波を反映する２つ目のより低い分泌ピークが両方のバッチにおいて示されている。ＣＡ５バッチではエストラジオール濃度の上昇は対照バッチにおけるものよりも早い傾向にあり、６日目にその濃度は対照において１０４±０．５％であるのに対してＣＡ５で処置された若雌牛では１１３±３％である。
【０１９９】
前記２種類のバッチの若雌牛におけるエストラジオールピークの曲線下面積の分析（図１６Ｃ）によっても、有意ではないが、対照バッチ（９７．５±１８単位の面積）よりもＣＡ５で処置されたバッチ（１２９．５±２０単位の面積）において高いエストラジオールピークが得られる傾向が示されている。
【０２００】
まとめると、それらの結果は、有意ではないが、より良好な質の卵胞期を反映し得るより良好なエストラジオール分泌がＣＡ５抗体で処置された若雌牛にある傾向を示している。
【０２０１】
排卵前ＬＨピークに関する結果が図１７に示されている。それらの結果はＬＨピークが現れる時間に関して何の差も示していない（図１７Ａ）。すなわち、ＬＨピークはＣＡ５抗体で処置されたバッチにおいて前記移植錠の撤去から４０．５時間±５．１時間に生じるのに対し、対照バッチでは４４時間±８時間に生じている。ＬＨピークの最大濃度はＣＡ５抗体で処置された若雌牛では９．８±１．２ｎｇ／ｍｌであるのに対して対照バッチでは４．８±１．８ｎｇ／ｍｌのＬＨである（図１７Ｂ）。排卵前ピーク時の最大ＬＨ濃度は前記抗体で処置されたバッチにおいてより高い傾向にあるが、この傾向は有意ではない。排卵前ＬＨピークの曲線下面積に関して同じ傾向が観察されており、その面積はＣＡ５抗体で処置された若雌牛において９８±４．８任意単位であるのに対して対照若雌牛では６４．５±５．８任意単位である（図１７Ｃ）。しかしながら、ＣＡ５で処置された若雌牛においてＬＨピークがより高くなるこの傾向は有意ではない。
【０２０２】
排卵後の超音波検査分析により、前記２種類のバッチの全ての若雌牛に一回の排卵があったことが示された。
【０２０３】
その後、黄体の発生をモニターするために超音波検査により黄体のサイズを定期的に測定することによって黄体期の質を分析した。図１８Ａに示されている結果は、ＣＡ５で処置された若雌牛のバッチは対照若雌牛のバッチのもの（２２±１ｍｍの直径）よりも大きい黄体（２６±２ｍｍの直径）を有する傾向があることを示している。それでもこの差は
有意ではない。
【０２０４】
黄体期を通した血漿中プロゲステロン濃度の測定が図１８Ｂに表されている。その測定は前記２種類のバッチの間の非常に有意な差を明らかにしている（ｐ＜０．００１）。循環プロゲステロンレベルが前記移植錠の撤去時に測定された基底濃度のパーセンテージとして表されている。撤去から９日目ではそのレベルは対照バッチでは６６８±８５％であるのに対して前記抗体で処置されたバッチでは１２６６±２５４％であり、すなわち対照バッチと比較して１．９倍の増加である。撤去から２０日目ではそのレベルは対照バッチでは６４６±７４％であるのに対して前記抗体で処置されたバッチでは１５９８±３２７％であり、すなわち対照バッチ．と比較して２．４７倍の増加である。これらの結果は、より大きな直径を有する傾向があり、特に、より高いプロゲステロン分泌を有する傾向がある、ＣＡ５抗体で処置された若雌牛における黄体のより良好な品質を反映している。黄体期において黄体の機能的品質がより良好であることは胚の着床および胚の初期発生の成功に重要であることが強調されるべきである。黄体の機能的品質がより良好であることによって早期流産のリスクが減少する。
【０２０５】
人工受精から３５日後に行われた妊娠の診断により、前記バッチの各々における全ての若雌牛が妊娠していることが示された。
【０２０６】
結論として、これらの結果は、有意ではないが、ＣＡ５抗体で処置された若雌牛が卵胞期の間により良好なエストロゲン応答を有し、且つ、および黄体期の間に有意に高いプロゲステロン分泌を有する傾向があることを示している。
【０２０７】
実施例６：メスのサルにおける内在性ゴナドトロピンの生理活性に対する本発明のＣＡ５リガンドの増強作用のインビボ測定
ラット、雌羊および若雌牛においてＣＡ５モノクローナル抗体のインビボ増強作用を実証し、特徴解析した後、そのモノクローナル抗体の増強作用をヒトに近い種、すなわちカニクイザル(Macaca fascicularis)において検討した。このため、ヒトＦＳＨおよび処置されるサルの内在性ホルモンに対する前記抗体の増強作用を評価することを目的として少なくとも３６か月齢の思春期のサルに対して試験を行った。
【０２０８】
このため、少なくとも３６か月齢の４匹の思春期のサルに対して試験を行った。外因性のＦＳＨの注射から２０分間後か、または単独のどちらかでＣＡ５抗体を注射した。月経期の１日目にそれらのサルが１．５ｍｇの持続放出性ＧｎＲＨ調製（デカペプチル（登録商標）ＬＰ、３ｍｇ、ＩＰＳＥＮファーマ）の筋肉内注射を受けた。１５日後にそれらの４匹のメスのサルが次の異なる処置を受けた。
‐８日間にわたって２５ＩＵで処置された動物（「２５ＩＵ×８」バッチ）：２５ＩＵのヒトＦＳＨ（ゴナールＦ（登録商標）プレフィルドペン、メルクセローノ）の毎日の皮下注射が８日間にわたって行われた。
‐１日だけ２５ＩＵで処置された動物（「２５ＩＵ×１」バッチ）：２５ＩＵのヒトＦＳＨ（ゴナールＦ（登録商標）プレフィルドペン、メルクセローノ）の単回皮下注射が処置の１日目に行われた。
‐ＣＡ５＋ｈＦＳＨで処置された動物（「ＣＡ５＋ｈＦＳＨ」バッチ）：処置の１日目だけに２５ＩＵのヒトＦＳＨ（ゴナールＦ（登録商標）プレフィルドペン、メルクセローノ）の注射から２０分後にＣＡ５抗体（８０μｇ）の単回皮下注射が行われた。
‐ＣＡ５単独で処置された動物（「ＣＡ５」バッチ）：処置の１日目だけにＣＡ５抗体単独（８８．５μｇ）の単回皮下注射が行われ、外因性のホルモンの注射は無かった。
【０２０９】
処置によって誘導された卵胞の成長を比較することにより増強作用を分析した。このため、卵胞を計数し、且つ、それらの表面積（ｍｍ２で表される）を測定するために経腹卵
巣超音波検査を４８時間毎に行った。
【０２１０】
２５ＩＵのｈＦＳＨの注射から２０分間後に行われたＣＡ５抗体の注射（「ＣＡ５＋ｈＦＳＨ」バッチ）によって得られた効果を２５ＩＵのｈＦＳＨの注射（「２５ＩＵ×１」バッチ）の効果、および２５ＩＵのｈＦＳＨの８日間の毎日の注射（「２５ＩＵ×８」バッチ）の効果と比較した。図１９Ａに示されている結果は、２５ＩＵのｈＦＳＨの単回注射で処置されたメスのサルがＦＳＨ処置の開始から９日目において被刺激卵胞を示していない（曲線下面積がゼロ）ことを示している。逆に、処置の１日目に「ＣＡ５＋ｈＦＳＨ」混合物で一度処置されたメスのサルは、ｈＦＳＨの８回の注射を受けたメスのサル（「２５ＩＵ×８」）において測定された１１個の被刺激卵胞で３５ｍｍ２である卵胞総面積に等しい３７ｍｍ２の卵胞総面積を有する８個の成長中の卵胞を示した。したがって、ＣＡ５＋２５ＩＵ  ｈＦＳＨ複合体の単回注射によって２５ＩＵのｈＦＳＨの８回の注射と同じ程度に効果的に卵巣が刺激された。この結果は卵胞を刺激することになるメスのサルにおけるＣＡ５のインビボ増強作用を示している。実際には、ＦＳＨの半減期は１時間未満なので、ＣＡ５で観察された効果は注射されたｈＦＳＨに対する効果だけによるものとすることができず、前記メスのサルの内在性ＦＳＨに対する効果も反映している。
【０２１１】
次に単独で注射されたＣＡ５抗体の注射（「ＣＡ５」）の効果を検討し、２５ＩＵのｈＦＳＨの注射（「２５ＩＵ×１」）の効果、および２５ＩＵのｈＦＳＨの３日間の毎日の注射（「２５ＩＵ×３」バッチ）の効果と比較した。単独で注射された前記抗体の刺激作用はその注射から３日後に最適に観察された。図１９Ｂに示されている結果は、抗体単独の単回注射を受けたメスのサル（「ＣＡ５」）が処置の３日目に３２．６ｍｍ２の面積である５個の成長中の卵胞を含む卵巣刺激を示していることを明らかにしている。対照的に、２５ＩＵのｈＦＳＨの３回の注射を受けたメスのサル（「２５ＩＵ×３」）は面積が１．６ｍｍ２であるちょうど１個の成長中の卵胞を含む非常に弱い刺激しか示さなかった。処置の３日目以降ではＣＡ５単独によって誘導された卵巣刺激は維持されず、被刺激卵胞が消失した。卵巣に対する刺激作用を維持するためにはおそらく抗体の追加注射または１日目に注射される用量の調節が必要だっただろう。それでもこの結果は、単独で注射されたＣＡ５抗体がメスのサルの内在性ＦＳＨと複合体化することができ、且つ、卵巣刺激の開始を誘導するほど充分に内在性ＦＳＨの生物活性を増強することができたことを示している。
【０２１２】
実施例７：本発明のＣＡ５リガンドとＣＨ１０リガンドが認識するエピトープの予測、およびそれらのパラトープの予測
ＣＡ５抗体およびＣＨ１０抗体のそれぞれのエピトープが、天然型立体構造と非天然型立体構造を区別することを可能にするボロノイ図と様々なスコア関数進化的学習法による最適化を用いるタンパク質構造モデリングに基づくプロテインドッキングアルゴリズム(Bernauer et al., Bioinformatics 2007, 5:555, [14]; Bernauer et al., Bioinformatics 2008, 24:652, [15]; Bourquard et al., PLoS One 2011, 6:e18541, [16] および Bourquard et al., Sci. Reports 2015, 5:10760 [17])を用いて様々な種の性腺刺激ホルモンに対して決定された。
【０２１３】
各抗体をヒトＦＳＨ（ｈＦＳＨ）、ヒトＬＨ（ｈＬＨ）、ヒトＣＧ（ｈＣＧ）、ヒツジＦＳＨ（ｏＦＳＨ）およびヒツジＬＨ（ｏＬＨ）、ブタＦＳＨ（ｐＦＳＨ）およびブタＬＨ（ｐＬＨ）とドッキングした。ｈＦＳＨおよびｈＣＧの結晶構造がそれぞれ４ＭＱＷおよび１ＱＦＷとしてプロテインデータバンク（ＰＤＢ）において入手可能である。ヒトＦＳＨ受容体の細胞外ドメインと複合体化されたヒトＦＳＨの構造 (Fan and Hendrickson,
Nature 2005, 433:269) ［１８］が使用された。他のホルモン（ｈＬＨ、ｏＦＳＨ、ｏＬＨ、ｐＦＳＨおよびｐＬＨ）については相同モデルを作製し、そしてドッキングのために使用した。
【０２１４】
（１）ＣＡ５リガンドのエピトープおよびパラトープ
ＣＡ５抗体の３Ｄ構造は入手できないのでＣＡ５の一価ＶＨ断片と一価ＶＬ断片の配列を使用して検討を行った。このために可変部分の相同モデルを作製した。ＶＨモデルとＶＬモデルを異なる構造から別々に作製し、ＶＨモデリングを支援するものとして働いたその構造からそれらのモデルの相対的配向を決定した。相同モデルのために使用した構造であるＣＡ５  ＶＨ用の３ＯＫＫとＣＡ５  ＶＬ用の３ＭＢＸはプロテインデータバンク（ＰＤＢ）において入手可能である。
【０２１５】
そのドッキングの結果が図２０に示されている。ＣＡ５リガンドは前記の７種類の標的ホルモンに同様にドッキングするようである。そのエピトープは検討されたゴナドトロピンの基本的にβサブユニット上に、且つ、２つの残基についてはαサブユニット上に断続的に局在する幾つかの領域によって規定されている。そのエピトープにはヒトＦＳＨ受容体のエクトドメインの１０残基も含まれている。したがって、ＣＡ５リガンドのそのエピトープは非常に立体構造的である。すなわち、そのエピトープは前記ホルモンの幾つかの連続する領域と前記受容体の配列から構成され、それらの領域は前記ホルモンとその活性化型受容体の天然の立体構造において空間的に近傍にある。
【０２１６】
ＣＡ５リガンドとの接触面に含まれる前記ホルモンと前記受容体の様々な残基が図２０中の長方形によって囲まれている。ｈＦＳＨのβサブユニット上の斜線部分によって表示されている５つの残基は主要な相互作用に関与し、且つ、抗体／抗原認識に主要な役割を有する。すなわち、これらの残基はｈＦＳＨのβサブユニット上の位置２２のセリン（Ｓｅｒ２２）、位置６５のグリシン（Ｇｌｙ６５）、位置６６のシステイン（Ｃｙｓ６６）、アルギニン９７（Ａｒｇ９７）およびグリシン９８（Ｇｌｙ９８）である。Ｇｌｙ６５残基およびＣｙｓ６６残基は他の全ての標的ホルモンの配列中に存在する。
【０２１７】
ＣＡ５リガンドはＦＳＨ  βサブユニットのＣ末端の残基９７〜１００および残基１０２〜１０９も認識する。この領域はシートベルトを構成し、前記ホルモンのα／β二量体の結合の安定化に主要な役割を果たす。したがって、前記ホルモンへのＣＡ５リガンドの結合によってそのシートベルトが確実に締められ、したがって、前記ホルモンの生理活性（二量体だけが活性を有する）にとって必須であるその二量体の安定性に寄与するようである。
【０２１８】
ＣＡ５抗体は基本的にｈＦＳＨのβサブユニットに対するものである。
【０２１９】
αサブユニットの２つの残基だけが前記接触面に含まれる。これらの残基は位置３５アルギニン残基（Ａｒｇ３５）および位置５６グルタミン酸残基（Ｇｌｕ５６）であり、前記天然ホルモンにおいて空間的に近傍にある。それらの残基の役割はαサブユニットの周りに「シートベルト」を保持するためにβサブユニットのＣ末端を固定することである。これらの２つの残基は全ての標的ホルモンにおいて常に存在し、且つ、認識される。それらの残基は前記ホルモンの生理活性に非常に重要な役割を果たす。
【０２２０】
ＣＡ５抗体のエピトープの別の特徴は、ＣＡ５抗体によって認識される接触面にヒトＦＳＨ受容体のＮ末端領域のＨｉｓ２−Ｈｉｓ３−Ａｒｇ４−Ｉｌｅ５残基、Ｈｉｓ７残基、Ｌｅｕ１４残基、Ｇｌｎ１６−Ｇｌｕ１７残基、Ｌｙｓ１９残基およびＡｒｇ３５残基が含まれることである。
【０２２１】
【表３２】
0006649385.tif 000034
【０２２２】
表３２はＣＡ５リガンドのエピトープを構成する様々な領域とそのリガンドのパラトープを構成する様々な領域を示している。
【０２２３】
２本のＶＨ鎖とＶＬ鎖がそれらの３か所のＣＤＲとそれらのフレームワークの幾つかの残基を介して前記ホルモンの認識に関与している。
【０２２４】
主要な相互作用に関与する前記５残基がＶＨ鎖のＣＤＲ２のＡｓｎ５３、ＶＨ鎖のＣＤＲ１の残基Ａｓｐ３１、Ｐｈｅ２７およびＴｈｒ２８、ならびにＶＬ鎖のＣＤＲ１の残基Ｓｅｒ３３およびＡｓｎ３４によって認識される。
【０２２５】
そのＶＬ鎖だけがＦＳＨ受容体のエクトドメインの認識に関与し、特にその鎖のＣＤＲ１の残基Ｇｌｎ３５およびＬｙｓ３６、その鎖のＣＤＲ２の残基Ｓｅｒ５８およびフレームワーク３の幾つかの残基が関与する。
【０２２６】
結論として、ＣＡ５リガンドはｈＦＳＨのαサブユニットおよびβサブユニットおよびシートベルトを形成するそのサブユニットのＣ末端に関係し、且つ、ＦＳＨ受容体のエクトドメインにも関係する立体構造エピトープを認識する。ＶＬ鎖は前記受容体のエクトドメインとの相互作用に関与する唯一のものである。２本のＶＨ鎖とＶＬ鎖は前記ホルモンのサブユニットとの相互作用に関与する。ＣＡ５リガンドの立体構造エピトープによってそのリガンドは一方で前記ホルモン二量体の結合を安定化することができ、他方で前記ホルモンのその受容体への結合を安定化することができる。これらの２つの機構は、前記ホルモンの受容体上でのそのホルモンのより良好な相互作用と、したがって、より良好な効力の獲得の実現に関して相補的であり、且つ、その実現の基礎である。したがって、それらの機構はゴナドトロピンに対するＣＡ５リガンドの増強作用の機構的基礎を構成するようである。
【０２２７】
（２）ＣＨ１０リガンドのエピトープおよびパラトープ
ＣＨ１０抗体の３Ｄ構造は入手できないのでＣＨ１０の一価ＶＨ断片と一価ＶＬ断片の
配列を使用して検討を行った。このために可変部分の相同モデルを作製した。ＶＨモデルとＶＬモデルを異なる構造から別々に作製し、ＶＨモデリングを支援するものとして働いたその構造からそれらのモデルの相対的配向を決定した。相同モデルのために使用した構造であるＣＨ１０  ＶＨ用の４ＱＮＰとＣＨ１０  ＶＬ用の３Ｄ８５はプロテインデータバンク（ＰＤＢ）において入手可能である。
【０２２８】
そのドッキングの結果が図２１に示されている。ＣＨ１０リガンドは前記の７種類の標的ホルモンに同様にドッキングするようである。そのエピトープはＦＳＨのαサブユニットとβサブユニット上に断続的に局在する幾つかの領域によって規定されており、そのエピトープはヒトＦＳＨ受容体のＮ末端の８残基も含んでいる。したがって、ＣＨ１０リガンドのそのエピトープは立体構造的である。すなわち、そのエピトープは前記ホルモンの幾つかの連続する領域とＦＳＨ受容体のＮ末端の配列から構成される。これらの領域の全てが前記ホルモンとその活性化型受容体の天然の立体構造において空間的に近傍にある。
【０２２９】
ＣＨ１０リガンドとの接触面に含まれる前記ホルモンと前記受容体の様々な残基が図２１中の長方形によって囲まれている。αサブユニット上の斜線部分によって表示されている４つの残基（ｈＦＳＨ上のＡｓｐ６−Ｃｙｓ７−Ｐｒｏ８およびＧｌｕ５６）とβサブユニット上の斜線部分によって表示されている２つの残基（ｈＦＳＨ上のＳｅｒ２−Ｃｙｓ３）は主要な相互作用に関与し、且つ、抗体／抗原認識に主要な役割を有する。前記接触面に含まれる他の残基のうち、βサブユニットのＣ末端部分に局在する残基が前記ホルモンのα／β二量体の結合を安定化することが役割である「シートベルト」として知られる領域に含まれる。したがって、前記ホルモンへのＣＨ１０リガンドの結合によってそのシートベルトが確実に締められ、したがって、前記ホルモンの生理活性にとって必須であるその二量体の安定性に寄与するようである。さらに、ＣＨ１０リガンドは、αサブユニット上に「シートベルト」を固定することに関与するαサブユニット上の残基Ｇｌｕ５６の主要な認識を示す。
【０２３０】
ＣＨ１０抗体のエピトープの別の特徴は、前記抗体によって認識される接触面にヒトＦＳＨ受容体のＮ末端領域のＣｙｓ１−Ｈｉｓ２残基、Ｈｉｓ７−Ｃｙｓ８−Ｓｅｒ９残基、Ｌｙｓ１４残基、Ｇｌｎ１６残基およびＡｒｇ３５残基が含まれることである。
【０２３１】
【表３３】
0006649385.tif 000035
【０２３２】
表３３はＣＨ１０リガンドのエピトープを構成する様々な領域およびそのリガンドのパラトープを構成する様々な領域を示している。
【０２３３】
ＶＨ鎖のフレームワーク３ならびにＶＬ鎖のフレームワーク１およびフレームワーク２の幾つかの残基が関与するようにＶＨ鎖のＣＤＲ２およびＣＤＲ３およびＶＬ鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が前記ホルモンの認識に関与する。
【０２３４】
主要な相互作用に関与するそれらの残基がＶＨ鎖のＣＤＲ２の残基Ｔｈｒ６０、フレームワーク３の残基Ｔｙｒ６１−Ｔｙｒ６２−Ａｓｐ６４−Ｌｙｓ６７、ならびにＶＬ鎖のＣＤＲ３の残基Ｈｉｓ９２および残基Ｓｅｒ９３によって認識される。
【０２３５】
そのＶＬ鎖だけがその鎖のＣＤＲ１およびその鎖のフレームワーク１およびフレームワーク２を介して前記受容体のエクトドメイン上の相互作用に関与する。
【０２３６】
実施例８：本発明のＣＡ５リガンドの様々な断片の構築、作製、および特性解析
ヒツジＦＳＨおよびヒトＦＳＨ（ゴナールＦ（登録商標）、メルクセローノ）の生物活性を増強する能力を評価するためにＣＡ５抗体の様々な断片を構築した。「ＣＡ５  ＶＬ」と呼ばれる軽可変鎖だけを含む断片、「ＣＡ５  ＶＨ」と呼ばれる重可変鎖だけを含む断片、および本発明の実施例１第４段落に記載されているＣＡ５  ｓｃＦｖのＶＨ−ＶＬ配列（配列番号１９および配列番号２０）と比較して逆のＶＬ−ＶＨ順で構築された「リバースＣＡ５  ｓｃＦｖ」を作製した。
【０２３７】
（１）抗体断片の構築と作製
ＣＡ５抗体から得られたＣＡ５  ＶＬ断片およびリバースＣＡ５  ｓｃＦｖ断片をコードする合成遺伝子がＡＴＧ：バイオシンセティクスＧｍｂＨ（ドイツ）によって合成された。リバースＣＡ５  ｓｃＦｖはＣＡ５  ｓｃＦｖのＣＡ５  ＶＬ−リンカー−ＣＡ５  
ｓｃＦｖのＣＡ５  ＶＨという融合体（配列番号１９）から構成される。各合成遺伝子はｐＳＷ１プラスミド［７］の配列を融合することにより設計されており、ＨｉｎｄＩＩＩ部位とＰｅｌＢタンパク質をコードする配列の末端との間に含まれ、そして合成予定の目的のタンパク質の配列（配列番号４４および配列番号４８）にはＸｈｏＩ制限部位が横付けされる。それらの配列はｐＳＷ１プラスミドのＨｉｎｄＩＩＩ部位とＸｈｏＩ部位の間に挿入されている。大腸菌での発現向けにコドンを最適化した。
【０２３８】
ｐＳＷ１−ＣＡ５  ＶＨ発現プラスミドは、ｐＳＷ１リバースＣＡ５  ｓｃＦｖプラスミドの次の酵素による消化から生じた断片のｐＳＷ１プラスミド［７］ＰｓｔＩ−ＸｈｏＩ部位への挿入により得られた。
【０２３９】
それらの構築物の品質のシーケンシングによる検証の後、ｐＳＷ１−ＣＡ５  ＶＬプラスミド、ｐＳＷ１−ＣＡ５  ＶＨプラスミドおよびｐＳＷ１リバースＣＡ５  ｓｃＦｖプラスミドを使用して、コンピテントセルになった［８］ＨＢ２１５１細菌（Ｔ５３０４０、Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ、フランス）をヒートショックにより形質転換した。
【０２４０】
【表３４】
0006649385.tif 000036
【０２４１】
【表３５】
0006649385.tif 000037
【０２４２】
【表３６】
0006649385.tif 000038
【０２４３】
本発明の実施例１において先に記載された方法に従って断片の作製を行った。
【０２４４】
（２）ＦＳＨの生理活性に対するＣＡ５  ＶＬ断片、ＣＡ５  ＶＨ断片およびリバースＣＡ５  ｓｃＦｖ断片の作用のインビトロ測定
本発明の実施例２において先に記載されたプロトコルに従い、ヒトＦＳＨ受容体とＧｌｏｓｅｎｓｏｒ（登録商標）システムが安定的に形質移入されたＨＥＫ２９３細胞株を用いてヒツジおよびヒトＦＳＨの生理活性に対する「ＣＡ５  ＶＬ」断片、「ＣＡ５  ＶＨ」断片および「リバースＣＡ５  ｓｃＦｖ」断片のインビトロ作用を検討した。単独の、または混合物としての「ＣＡ５  ＶＬ」断片および「ＣＡ５  ＶＨ」断片をそれぞれ４０ｎＭで検査した。リバースＣＡ５  ｓｃＦｖをちょうど基準ＣＡ５  ｓｃＦｖのように８０ｎＭの濃度で検査した。ヒツジＦＳＨおよびヒトＦＳＨ（ゴナールＦ（登録商標））を０．１ｎＭで検査した。
【０２４５】
図２２は、０．１ｎＭのヒツジＦＳＨ（ｏＦＳＨ）が単独で、または様々なＣＡ５断片と複合体化されて存在する中で得られた、時間（分）の関数として相対発光単位で表されるｃＡＭＰ産生カイネティクス曲線を示している。４つの条件、すなわちｏＦＳＨ＋ＣＡ５  ＶＬ複合体（図２２Ａ）、ｏＦＳＨ＋ＣＡ５  ＶＨ複合体（図２２Ｂ）、ｏＦＳＨ＋リバースＣＡ５  ｓｃＦｖ複合体（図２２Ｃ）、および最後に、４０ｎＭのＣＡ５  ＶＬと４０ｎＭのＣＡ５  ＶＨからなる等モルの混合物とｏＦＳＨの複合体（図２２Ｄ）をｏＦＳＨ単独の条件と比較した。ＦＳＨ単独によって誘導された応答と比較して２．１〜２．４倍だけ３０ｍｎの刺激に対する細胞応答を増加させる非常に有意な増強作用が全ての事例において得られることが観察されている（ｐ＜０．００１）。これらの結果は、ＶＨ
断片およびＶＬ断片単独で完全ｓｃＦｖと同様にｏＦＳＨの生理活性に対して増強作用を及ぼすことができることを示している。それらの結果より、本発明の実施例７のモデルに記載されている、その増強作用におけるそれらの２本の可変鎖の関与が立証されている。リバースＣＡ５  ｓｃＦｖ（ＶＬ−ＶＨ）と同様にＣＡ５  ＶＨ＋ＣＡ５  ＶＬ混合物は元のＣＡ５  ｓｃＦｖ（ＶＨ−ＶＬ）と同じ増強作用を及ぼす。
【０２４６】
同じ試験を単独の、または様々なＣＡ５断片と複合体化した０．１ｎＭの濃度のヒトＦＳＨ（ゴナールＦ（登録商標））に対して行った。４つの条件、すなわちｈＦＳＨ＋ＣＡ５  ＶＬ複合体（図２２Ｅ）、ｈＦＳＨ＋ＣＡ５  ＶＨ複合体（図２２Ｆ）、ｈＦＳＨ＋リバースＣＡ５  ｓｃＦｖ複合体（図２２Ｇ）および最後に、４０ｎＭのＣＡ５  ＶＬと４０ｎＭのＣＡ５  ＶＨからなる等モルの混合物とｈＦＳＨの複合体（図２２Ｈ）をｈＦＳＨ単独の条件と比較した。
【０２４７】
ｈＦＳＨと複合体化された４０ｎＭの濃度の「ＣＡ５  ＶＬ」断片は有意な増強作用を及ぼさず、逆に、「ＣＡ５  ＶＨ」断片は非常に有意なことに（ｐ＜０．００１）ｈＦＳＨ単独による刺激と比較して、ＣＡ５  ｓｃＦｖ（２７５％増）と匹敵するように、２２５％の最大細胞応答を増強することが観察されている（図２２Ｅおよび図２２Ｆ）。同様に、ｈＦＳＨと複合体化されたリバースＣＡ５  ｓｃＦｖ「ＣＡ５  ＶＬ−ＶＨ」（図２２Ｇ）およびＶＨ鎖＋ＶＬ鎖の２本の鎖の混合物（図２２Ｈ）は、ｈＦＳＨと複合体化されたＣＡ５  ｓｃＦｖで得られる増加（２５０％と２６０％の間の増加）に近い、それぞれ２２５％および２３０％という細胞応答の有意な増加（ｐ＜０．００１）を誘導している。これらの結果は、ｈＦＳＨと複合体化されたＣＡ５  ＶＬ＋ＣＡ５  ＶＨ混合物が、ちょうど複合体化されたリバースＣＡ５  ｓｃＦｖのように基準ＣＡ５  ｓｃＦｖによって誘導されたものに近い有意な増強作用を誘導することを示している。ＣＡ５  ＶＬとは異なり、この検査ではＶＨ断片だけがｈＦＳＨに対して有意な増強作用を及ぼす。
【０２４８】
（３）メスのラットにおけるＦＳＨの生理活性に対するＣＡ５  ＶＬ断片、ＣＡ５  ＶＨ断片およびリバースＣＡ５  ｓｃＦｖ断片の増強作用のインビボ測定
インビトロで特徴解析された後、ｈＦＳＨの生理活性に対する様々なＣＡ５断片の作用を特徴解析するためにそれらの断片の増強作用がメスのラットにおいてインビボで特徴解析された。
【０２４９】
ＦＳＨ生理活性を測定するため、使用したプロトコルは本発明の実施例３に記載されたＳｔｅｅｌｍａｎとＰｏｈｌｅｙの生物学的アッセイ (Steelman SL, Pohley FM. Endocrinology, 53: 604-616. 1953) ［１２］のプロトコルであった。
【０２５０】
図２３はｈＦＳＨの生理活性に対する様々な断片の作用を示している。各バッチは５匹のメスのラットから構成された。リバースＣＡ５  ｓｃＦｖと複合体化されたｈＦＳＨで処置されたバッチはｈＦＳＨと複合体化されたＣＡ５  ｓｃＦｖで処置されたバッチの平均卵巣重量（２００ｍｇ）と同じく２１０ｍｇの平均卵巣重量を生じ、それは言わば、ホルモン処置を単独で受けたバッチと比較した１９０％の増加であった（ｐ＜０．０５）。ｈＦＳＨと複合体化されたＣＡ５  ＶＬ断片またはＣＡ５  ＶＨ断片で処置されたバッチはそれぞれ２４０ｍｇと２３０ｍｇの平均卵巣重量を有し、それは言わば、ホルモン処置を単独で受けたバッチと比較したそれぞれ２１８％と２０９％の増加であった（それぞれｐ＜０．００１およびｐ＜０．０１）。
【０２５１】
これらの結果は、ｈＦＳＨと複合体化されるｓｃＦｖの構築の順序（ＶＬ−ＶＨ対ＶＨ−ＶＬ）がＦＳＨの生理活性に対するそのｓｃＦｖの増強特性に影響しないことを顕著に示している。これらの結果は、前記ホルモンと複合体化されたＣＡ５  ＶＨ鎖またはＣＡ５  ＶＬ鎖は前記ホルモンの生理活性を増強することもできることも非常に顕著に示して
いる。このことは、本発明の実施例７に記載されている相互作用モデルによって予測されるように、それらの２本の鎖のこの作用へのそれぞれの関与を反映している。
【０２５２】
参照文献のリスト
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2-  International application WO 2012/066519
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18-  Fan and Hendrickson, Nature, 433: 269, 2005.
【図１】
0006649385.tif 000039
【図２】
0006649385.tif 000040
【図３−１】
0006649385.tif 000041
【図３−２】
0006649385.tif 000042
【図４】
0006649385.tif 000043
【図５−１】
0006649385.tif 000044
【図５−２】
0006649385.tif 000045
【図６】
0006649385.tif 000046
【図７】
0006649385.tif 000047
【図８】
0006649385.tif 000048
【図９】
0006649385.tif 000049
【図１０】
0006649385.tif 000050
【図１１】
0006649385.tif 000051
【図１２】
0006649385.tif 000052
【図１３】
0006649385.tif 000053
【図１４】
0006649385.tif 000054
【図１５】
0006649385.tif 000055
【図１６】
0006649385.tif 000056
【図１７】
0006649385.tif 000057
【図１８】
0006649385.tif 000058
【図１９】
0006649385.tif 000059
【図２０】
0006649385.tif 000060
【図２１】
0006649385.tif 000061
【図２２−１】
0006649385.tif 000062
【図２２−２】
0006649385.tif 000063
【図２３】
0006649385.tif 000064
【配列表】
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