(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト血液に由来する濃厚血小板の生理活性分画を含む組成物であって
前記濃厚血小板がヒト血小板とヒト血漿を含有し、前記生理活性分画が、フィブリノーゲン、アルブミン、グロブリンを含み、且つＴＧＦ−β１、ＥＧＦ、ＦＧＦ−塩基性、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＳＤＦ−１α、及びＶＥＧＦの少なくとも１つを含む、前記濃厚血小板のネイティブな成分を含み、前記フィブリノーゲンが２．５μｇ／ｍＬ未満のレベルで存在し、添加されたヘパリンを実質的に含まない、組成物。
【請求項２】
前記ＴＧＦ−β１、ＥＧＦ、ＦＧＦ−塩基性、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＳＤＦ−１α、及びＶＥＧＦのそれぞれを含む請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記組成物がヘパリンを本質的に含まない請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
前記生理活性分画が、前記濃厚血小板に対してネイティブなＩＬ−１ｂ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ＩＦＮ−γ、及びＴＮＦ−αの少なくとも１つ、好ましくはそのそれぞれも含む請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
前記生理活性分画が液状生理活性分画であり、前記組成物が、
０．５〜２．５ｇ／ｄＬのグロブリン；
２〜５ｇ／ｄＬのアルブミン、
１００〜２００ミリモル／Ｌのナトリウム、
５０〜１２０ｍｇ／ｄＬのトリグリセリド、及び／または
１５０〜３００ｍｇ／ｄＬのグルコースを含む請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
界面活性剤残留物を含まない請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
前記生理活性分画が液状生理活性分画であり、前記ネイティブな成分が
前記液状生理活性分画の少なくとも５ｐｇ／ｍＬのレベルでのＦＧＦ−β、
前記液状生理活性分画の少なくとも２００ｐｇ／ｍＬのレベルでのＰＤＧＦ−ＡＡ、
及び
前記液状生理活性分画の少なくとも１０ｐｇ／ｍＬのレベルでのＶＥＧＦを含む請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
前記組成物が２６０〜３４０ミリモル／ｋｇの浸透圧を有する請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
前記組成物が６．８〜７．８の範囲でのｐＨを有する請求項１〜８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記組成物が、前記濃厚血小板に対してネイティブではないヘパリンを含まない請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の組成物を含む細胞培養培地。
【請求項１２】
ヘパリンを含まない請求項１１に記載の細胞培養培地。
【請求項１３】
生理活性組成物の調製方法であって、
血小板溶解物組成物に凝固剤を加えてゲル凝固物を形成することと、
ゲル凝固物を圧搾して前記ゲル凝固物から液体を搾り出して前記ゲル凝固物から液体を分離して、フィブリノーゲンを激減させた液体を形成することと、
前記フィブリノーゲンを激減させた液体を深層濾過に供して、生理活性分画を形成することと、
を含み、
前記生理活性分画が、少なくとも１０ｐｇ／ｍＬのレベルでのＶＥＧＦを含む前記血小板溶解物組成物のネイティブな成分を含む、調製方法。
【請求項１４】
前記深層濾過が正の表面電荷を有する深層濾過媒体で実施される請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記凝固剤が塩化カルシウム塩を含む請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記液体を無菌濾過に供することも含む請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記血小板溶解物組成物が、その中で血小板を溶解するように濃厚血小板組成物を凍結すること及び融解することを含む方法によって調製される請求項１３〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記濃厚血小板組成物が、血小板と血漿を含む、アフェレーシスで得たヒトの血小板組成物を含む請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
無菌容器にて前記生理活性組成物を包装することも含む請求項１３〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
人以外の動物の患者の治療方法であって、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の組成物を含む治療用物質を投与することを含む、前記治療方法。
【請求項２１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の組成物の調製方法であって、
血小板と血漿を含有するヒト血液由来の濃厚血小板の血小板を溶解して溶解血小板製剤を形成することと、
前記溶解血小板製剤にてフィブリノーゲンをフィブリンに変換することによって前記溶解血小板製剤からゲル凝固物を形成することと、
ゲル凝固物を圧搾してゲル凝固物から液体を搾り出すことと、
ゲル凝固物の固形物から液体を分離することとを含む、前記調製方法。
【請求項２２】
血小板溶解物組成物の処理方法であって、
ヒト血液由来の濃厚血小板を溶解して溶解調製物を形成することと、
ゲル凝固物を形成するように前記溶解調製物のフィブリノーゲンをフィブリンに変換することと、
遠心分離を行わずに前記ゲル凝固物を圧搾して、前記ゲル凝固物から、フィブリノーゲンが２０，０００ｎｇ／ｍＬ未満のレベルで存在し、フィブリノーゲン、アルブミン、グロブリン、ＴＧＦ−β１、ＥＧＦ、ＦＧＦ−β、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＳＤＦ−１α、及びＶＥＧＦを含む濃厚血小板のネイティブな成分を含むヒト血液由来の濃厚血小板の液状生理活性分画を搾り出すことと、
前記液状生理活性分画から懸濁したゲル凝固物の固形物を取り除くように、少なくとも第１の深層フィルターに通すことと、
を含み、
前記通すことの後に前記液状生理活性分画が少なくとも１０ｐｇ／ｍＬのレベルでのＶＥＧＦを維持している、前記処理方法。
【請求項２３】
前記圧搾することが、ゲル凝固物から液状生理活性分画を搾り出し、固形凝固塊を後に残すように第１の表面と第２の表面の間の及びそれらに接触した前記ゲル凝固物を圧搾することを含む請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記通すことが、ＴＧＦ−β−１、ＥＧＦ、ＦＧＦ−ｂ、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＳＤＦ−１α、及びＶＥＧＦの１つ、幾つかまたはすべてのレベルでの少なくとも２０％の低下、及び／または
ＴＧＦ−β−１のレベルでの少なくとも５０％の低下、及び／または
ＥＧＦのレベルでの少なくとも３０％の低下、及び／または
ＦＧＦ−ｂのレベルでの少なくとも２０％の低下、及び／または
ＰＤＧＦ−ＡＡのレベルでの少なくとも５０％の低下、及び／または
ＰＤＧＦ−ＢＢのレベルでの少なくとも５０％の低下、及び／または
ＳＤＦ−１αのレベルでの少なくとも２０％の低下、及び／または
ＶＥＧＦのレベルでの少なくとも３０％の低下を生じる請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２５】
細胞の凍結保存方法であって、
細胞を含む細胞組成物と請求項１〜１０のいずれか１項に記載の組成物とを凍結保存条件に供することを含む、前記凍結保存方法。
【請求項２６】
前記組成物が液体送達用具内に保存される請求項１〜１０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２７】
前記液体送達用具が点眼器を含む請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
前記組成物が、イヌ患者における疾患または病的状態を治療するのに有効である請求項１〜１０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２９】
前記病的状態が乾性角結膜炎を含む請求項２８に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般に、動物の血小板製剤に由来する生理活性物質の分野並びにその調製方法及び使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
治療療法のために細胞または細胞を含有する組成物を投与することはますます一般向けの治療法になっている。そのような治療には、たとえば、骨、脂肪、軟骨及び筋肉を含む間葉系列の細胞に分化する潜在力を有する間葉幹細胞（ＭＳＣ）の投与が挙げられ得る。
【０００３】
移植用の治療量の細胞を得るために、当初の集団から細胞の集団を大きくすることが必要であることが多い。細胞集団を拡大するのに使用される培養培地は細胞の代謝、成長及び増殖に必須の栄養を供給する。ウシ胎児血清（ＦＢＳ）は集団の拡大を促す補完剤として使用されることが多い。ＦＢＳは、その低レベルの抗体の故に、細胞の成長及び増殖を刺激する多数の増殖因子を含有するので、及び製造するのに相対的に安価であるので、好まれる補完剤である。しかしながら、ＦＢＳは、たとえば、ウシ海綿状脳症のような病原体を伝染させるリスクを含む認識された短所を有する。
【０００４】
ヒト血小板溶解物（ｈＰＬ）はＦＢＳに対する可能性のある非異種代替物として出現している。ｈＰＬは種々の増殖因子を含有することが知られる血小板に由来する。増殖因子に加えて、現在のｈＰＬ単離法は一般に、凝固形成に関与する糖タンパク質であるフィブリノーゲンを高濃度で保持する組成物を生じる。そのフィブリノーゲン含量と凝固する傾向のために、現在市販のｈＰＬ組成物は１以上の抗凝固添加剤、通常、ヘパリンと併せて使用されることが多い。ｈＰＬにおける抗凝固添加剤はｈＰＬの製造及び／または使用のコストを高め、ヘパリンの生理活性が有害である状況では問題であり得る。また、ｈＰＬを製造する種々の方法が提案されている一方で、ｈＰＬ製剤についての標的組成プロファイルまたは生理活性を達成する試みは方法の複雑さ及び／または広範な機器の要求をもたらすことが多い。ＦＢＳの代替物としてのｈＰＬの有意な採用は、それでもなお望ましく且つ有効な組成物を得る経済的に実践可能な方法を必要とするであろう。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
この背景を考慮して、実質的にフィブリノーゲンを含まない、細胞増殖に有益な増殖因子を保持し、容易に且つ経済的に製造することができるヒトの血小板溶解物組成物に対するニーズが存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本開示の特定の態様では、好ましくはヒトの血液に由来する濃厚血小板の有利な生理活性分画を濃厚血小板から独自に処理することができることが発見されている。生理活性分画は、増殖因子の新規の組成プロファイル及び／または出発濃厚血小板に存在する他の物質を有することができ、処理方法には、濃厚血小板の分画を凝固させ、分離する新規の技法及び／または濃厚血小板に由来する液体分画を澄ますための新規の深層濾過操作が関与し得る。
【０００７】
態様の１つでは、血小板溶解物組成物を処理する方法には、血小板と血漿を含有するヒト血液に由来する濃厚血小板の血小板を溶解して溶解された血小板製剤を形成する工程と、溶解された血小板製剤にてフィブリノーゲンをフィブリンに変換することによって凝固ゲルを形成する工程と、凝固ゲルから液体を搾り出すように凝固ゲルを圧搾する工程とが含まれる。
【０００８】
別の態様では、方法には、フィブリノーゲン、アルブミン、グロブリンを含む、及びＴＧＦ−β１、ＥＧＦ、ＦＧＦ−β、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＳＤＦ−１α及びＶＥＧＦの少なくとも１つ及び任意ですべてを含む濃厚血小板のネイティブの成分を含む血液に由来する濃厚血小板の液状生理活性分画を、生理活性分画から懸濁した固形物を取り除くように少なくとも第１の深層フィルターに通すことが含まれ、その際、フィブリノーゲンは２０，０００ｎｇ／ｍＬ未満のレベルで存在する。濃厚血小板は好ましくはヒトの濃厚血小板である。好まれる様式では、液状生理活性分画を第１の深層フィルターに通し、第２の深層フィルターにも通し、その際、第２の深層フィルターは任意で、第１の深層フィルターより小さい名目上のミクロン等級を有する。
【０００９】
別の態様では、提供されるのは、ヒトの血液に由来する濃厚血小板の生理活性分画を含む組成物であり、濃厚血小板はヒトの血小板及びヒトの血漿を含み、生理活性分画は、フィブリノーゲン、アルブミン、グロブリン、ＴＧＦ−β１、ＥＧＦ、ＦＧＦ−β、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＳＤＦ−１α及びＶＥＧＦを含む濃厚血小板のネイティブな成分を含む。生理活性分画は約２０，０００ｎｇ／ｍＬ未満の、たとえば、約５００ｎｇ／ｍＬ〜約２０，０００ｎｇ／ｍＬの範囲で存在するフィブリノーゲンを有することができ、及び／または生理活性分画若しくはそれを含有する細胞培養培地は、添加されるヘパリン（すなわち、濃厚血小板の出発材料に対してネイティブではないヘパリン）を含まなくてもよく、または本質的に含まなくてもよい。生理活性分画は本明細書で開示されるような増殖因子のレベルまたは比を有することができる。ある実施形態では、生理活性分画は、液状生理活性分画であり、ネイティブな成分は、
液状生理活性分画の約２０，０００ｎｇ／ｍＬ未満の、たとえば、約５００ｎｇ／ｍＬ〜約２０，０００ｎｇ／ｍＬの範囲でのレベルのフィブリノーゲン；
液状生理活性分画の少なくとも２ｍｇ／ｄＬのレベルでのアルブミン；
液状生理活性分画の少なくとも１ｇ／ｄＬのレベルでのグロブリン；
液状生理活性分画の少なくとも５０００ピコグラム／ｍＬ（「ｐｇ／ｍＬ」）のレベルでのＴＧＦ−β１；
液状生理活性分画の少なくとも２０ｐｇ／ｍＬのレベルでのＥＧＦ；
液状生理活性分画の少なくとも５ｐｇ／ｍＬのレベルでのＦＧＦ−β；
液状生理活性分画の少なくとも２００ｐｇ／ｍＬのレベルでのＰＤＧＦ−ＡＡ；
液状生理活性分画の少なくとも５０ｐｇ／ｍＬのレベルでのＰＤＧＦ−ＢＢ；
液状生理活性分画の少なくとも１００ｐｇ／ｍＬのレベルでのＳＤＦ−１α及び
液状生理活性分画の少なくとも１０ｐｇ／ｍＬのレベルでのＶＥＧＦを含む。
【００１０】
本開示はまた、血小板溶解物組成物に凝固剤を加えて凝固した物質を形成する工程と、凝固した物質における液体から凝固した固形物を分離する工程と、液体を深層無菌濾過に供する工程とを含む、生理活性組成物の調製方法も提供する。一部の形態では、方法は生理活性組成物を無菌容器に包装することも含む。
【００１１】
一部の実施形態では、生理活性分画は液状生理活性分画であり、ネイティブな成分は
約２００ｐｇ／ｍＬ〜約３５０ｐｇ／ｍＬの間のレベルでのＦＧＦ−２；
約１８００ｐｇ／ｍＬ〜約３１００ｐｇ／ｍＬの間のレベルでのＥＧＦ；
約２４，０００ｐｇ／ｍＬ〜約２８，０００ｐｇ／ｍＬの間のレベルでのＰＤＧＦ−ＡＡ；
約５０ｎｇ／ｍＬ〜約８０ｎｇ／ｍＬの間のレベルでのＰＤＧＦ−ＢＢ；
約５００ｐｇ／ｍＬ〜約８００ｐｇ／ｍＬの間のレベルでのＶＥＧＦ；
約６０ｎｇ／ｍＬ〜約９０ｎｇ／ｍＬの間のレベルでのＴＧＦ−ｂ；及び
２．５μｇ／ｍＬ未満のレベルでのフィブリノーゲンを含む。
【００１２】
本明細書で開示される追加の実施形態は、細胞培養、凍結保存または治療の目的での本明細書で記載される生理活性分画または生理活性組成物の使用に関する。
【００１３】
その上さらなる実施形態は、特徴及び利点と同様に本明細書の記載から当業者に明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ヒトの濃厚血小板組成物の液状生理活性分画の調製方法を説明する図である。
【図２】無菌の包装における本開示の液状生理活性分画の一実施形態の斜視図である。
【図３】点滴ボトルにおける本開示の液状生理活性分画の一実施形態の斜視図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明の原理を理解するのを促進する目的で、今やある実施形態を参照し、特定の言葉を使用してそれを説明する。にもかかわらず、それによって本発明の範囲の限定が意図されないことが理解されるであろう。記載される実施形態における任意の変更及びさらなる改変、及び本明細書で記載されるような本発明の原理の応用は、本発明が関係する当業者に対して普通に生じるかのように熟考される。
【００１６】
一般に本開示は、たとえば、細胞培養補完剤及び／または治療剤として使用することができる生理活性組成物、及び生理活性組成物を作製する方法を提供する。本開示の組成物はヒト供給源に由来する組成物を含むのでＦＢＳのような異種組成物に関連する問題を克服する。さらに、本開示の好まれる組成物は、重要な増殖因子及び他の化学物質を保持しながら、低フィブリノーゲン含量を有し、使用中、問題のある凝固を防ぐヘパリンのような抗凝固剤の添加を必要としない。
【００１７】
今や図１を参照して、示されるのは濃厚血小板組成物から生理活性分画を調製する１つの説明に役立つ方法１００である。方法には、濃厚血小板を入手する工程０１と、濃厚血小板を凍結する工程０２と、濃厚血小板を融解する工程０３と、濃厚血小板に凝固剤を加える工程０４と、液体から凝固固形物を分離する工程０５と、第１の深層フィルターで液体を濾過する工程０６と、第２の深層フィルターで液体を濾過する工程０７と、無菌フィルターで液体を濾過する工程０８と、液体を包装する工程０９とが含まれる。幾つかの点での以下の議論はこれらの描かれる一般的な工程それぞれについての選択肢をさらに詳しく述べるが、描かれる一般的な工程のすべてが本明細書の実施形態すべてに必要とされるわけではなく、描かれる工程の１つ、幾つかまたはすべてに相当する特徴を含む新規の方法も本明細書の実施形態として熟考されることが理解されるであろう。
【００１８】
開示される方法及び生理活性分画のための供給源物質として使用される濃厚血小板組成物は任意の好適な方法で得られ得る。本明細書で使用されるとき、用語、濃厚血小板は血液供給源から濃縮されている血小板を含有する液状組成物を指す。血液供給源は好ましくはヒトの血液、たとえば、ヒトの全末梢血である。濃厚血小板は好ましくは血小板と血漿タンパク質の双方を含み、アフェレーシスによってヒトドナーの全末梢血から得られる血小板単位により提供されてもよい。他の種、たとえば、哺乳類種に由来する全血も本明細書で記載されるように処理される濃厚血小板の供給源として使用してもよい。ある実施形態では、異なるヒトまたは他のドナーに由来する血小板単位を処理の間のある時点でプールして生理活性分画を得ることができる。今日の典型的な実践では、各ヒトドナーのアフェレーシスで得た血小板単位は約１００〜約５００ｍＬの容量、さらに典型的には約１００〜４００ｍＬの容量を有し、アフェレーシス処置中に血小板と共に単離される血漿を伴って約１００〜５００×１０９個の血小板を含有する。供血されたヒトのアフェレーシス血小板単位は医療施設での使用について相対的に短い、通常約５日間の保存可能期間を有する。本明細書の方法で使用される血小板単位は医療施設から得られる最近有効期限切れになったアフェレーシス血小板単位であることができ、本明細書で記載されるような生理活性分画を調製するために使用するのに先立って好適な温度、たとえば、約−２０℃にて任意で凍結保存することができる。
【００１９】
生理活性分画を調製することにおいて、血小板の内容物は好適な方法によって放出され得る。一部の様式では、血小板は、少なくとも１回の凍結融解サイクルにそれを供して血小板の内容物を放出することによって、任意で複数回の凍結融解サイクル（たとえば、２または３回の凍結融解サイクル）に供することによって融解される。凍結融解サイクルの使用において、濃厚血小板を好適な温度で凍結することができる。一部の態様では、濃厚血小板は約−１０℃〜約−８０℃の間の温度で凍結させる。特定の好まれる実施形態では、濃厚血小板は約−２０℃で凍結させる。血小板を溶解するには、凍結した濃厚血小板を、たとえば、３７℃の水槽にてまたは他の効果的な手段によって融解して「未加工の」血小板溶解物組成物を形成する。未加工の血小板溶解物は溶解した血小板の膜及び増殖因子及び溶解した血小板から放出された他の物質を含有する。溶解される濃厚血小板が血小板と共に血漿を含有する場合、血小板溶解物はその中に血漿タンパク質を含む血漿も含有するであろう。血小板の内容物を放出する他の技法、たとえば、トロンビンによる活性化を本明細書の特定の態様で使用してもよい。しかしながら、血小板を溶解する凍結融解法または他の機械的な技法は、それらが濃厚血小板に対してネイティブではないタンパク質（たとえば、トロンビン）の添加を必要としない点で有利であり、その添加はコストを高めると共に下流の処理された物質におけるトロンビンの少なくとも一部の存在をもたらす。
【００２０】
未加工の血小板溶解物は、濃厚血小板出発材料に由来する複数の増殖因子を含有する。これらには、たとえば、形質転換増殖因子β１、表皮増殖因子、塩基性線維芽細胞成長因子、血小板由来増殖因子ＡＡ、血小板由来増殖因子ＢＢ、間質細胞由来因子−１α及び血管内皮増殖因子を挙げることができる。
【００２１】
形質転換増殖因子β１（ＴＧＦ−β１）は多数の細胞型で増殖、分化及び他の機能を制御する多機能のペプチドである。表皮増殖因子（ＥＧＦ）は細胞の増殖、分化及び生存を刺激する。塩基性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−ｂ）は血管形成を促進し、多種多様な細胞を刺激するヘパリンに結合する。血小板由来増殖因子ＡＡ（ＰＤＧＦ−ＡＡ）は細胞の増殖及び分裂を調節し、血管形成を促進する二量体の糖タンパク質である。血小板由来増殖因子ＢＢ（ＰＤＧＦ−ＢＢ）は細胞の増殖及び分裂を調節し、血管形成を促進する二量体の糖タンパク質である。間質細胞由来因子−１α（ＳＤＦ−１α）は白血球を活性化し、血管形成を促進する。
【００２２】
血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）は脈管形成及び血管形成に寄与する。
【００２３】
ある実施形態では、未加工の血小板溶解物には以下の増殖因子及びその量（元々の希釈していない濃厚血小板の容量に基づいて）：
約５０，０００〜約１５０，０００ｐｇ／ｍＬのＴＧＦ−β１、好ましくは約７０，０００〜約１２０，０００ｐｇ／ｍＬのＴＧＦ−β１；及び／または
約１００〜約６００ｐｇ／ｍＬのＥＧＦ、好ましくは約２００〜約６００ｐｇ／ｍＬのＥＧＦ；及び／または
約５〜約２５０ｐｇ／ｍＬのＦＧＦ−ｂ、好ましくは約５０〜２００ｐｇ／ｍＬのＦＧＦ−ｂ；及び／または
約５００〜約２０，０００ｐｇ／ｍＬのＰＤＧＦ−ＡＡ、好ましくは約５０００〜約１５０００ｐｇ／ｍＬのＰＤＧＦ−ＡＡ；及び／または
約１０００〜約２０，０００ｐｇ／ｍＬのＰＤＧＦ−ＢＢ、好ましくは約２０００〜約１５０００ｐｇ／ｍＬのＰＤＧＦ−ＢＢ；及び／または
約４００〜約１１００ｐｇ／ｍＬのＳＤＦ−１α、好ましくは約５００〜約１０００ｐｇ／ｍＬのＳＤＦ−１α；及び／または
約１０〜約８００ｐｇ／ｍＬのＶＥＧＦ、好ましくは約１００〜約６００ｐｇ／ｍＬのＶＥＧＦが含まれる。
【００２４】
好まれる形態では、未加工の血小板溶解物は、たとえば、フィブリノーゲン、グロブリン、アルブミン、トリグリセリド、グルコース、ナトリウム、カルシウム、及び／またはコレステロールを含む、濃厚血小板出発材料における血漿に由来する１以上の成分も含む。好まれる形態では、未加工の血小板溶解物は以下の成分及び量：
約０．５〜約２．５ｇ／ｄＬのグロブリン、好ましくは約１．５〜約２．５ｇ／ｄＬのグロブリン；
約２〜約５ｇ／ｄＬのアルブミン、好ましくは約３〜約４ｇ／ｄＬのアルブミン；
約１００〜約２００ミリモル／Ｌのナトリウム、好ましくは約１２０〜約１６０ミリモル／Ｌのナトリウム；
約４０〜約２００ｍｇ／ｄＬのトリグリセリド、好ましくは約５０〜約１２０ｍｇ／ｄＬのトリグリセリド；
約１５０〜約３００ｍｇ／ｄＬのグルコース、好ましくは約１５０〜約２５０ｍｇ／ｄＬのグルコース；
約５〜約１２ｍｇ／ｄＬのカルシウム、好ましくは約６〜約１０ｍｇ／ｄＬのカルシウム及び／または
約１００万〜３５０万ｎｇ／ｍＬのフィブリノーゲン、好ましくは約１５０万〜２５０万ｎｇ／ｍＬのフィブリノーゲンを含む。
【００２５】
未加工の血小板溶解物はまた、他の生理活性物質、たとえば、１以上のインターロイキン、インターフェロン及び／または腫瘍壊死因子も含有することができる。これらのインターロイキン、インターフェロン及び／または腫瘍壊死因子には、たとえば、インターロイキン（ＩＬ）−１ｂ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）及び腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）の１つ、幾つかまたはすべてが挙げられ得る。
【００２６】
本明細書のある実施形態では、未加工の血小板溶解物は、特定の物質を取り除くように処理され、たとえば、血小板溶解物製剤として使用するために遠心分離され、滅菌される。そのような滅菌には、たとえば、特定の物質を激減させた未加工の血小板溶解物無菌フィルターに通すことを挙げることができる。
【００２７】
本明細書の一部の実施形態では、未加工の血小板溶解物を処理してフィブリノーゲン濃度の低下したその分画を回収する。たとえば、フィブリンを変換して、液状生理活性分画から分離することができる固形凝固物質の形成を生じることを含む好適な技法によってフィブリノーゲンを取り除いてもよい。そのようなフィブリンへの変換は凝固剤の添加によって誘導することができる。開示される方法を実践する一部の形態によれば、凝固剤、たとえば、塩化カルシウム塩を未加工の血小板溶解物に加えることができる。説明的には、未加工の血小板溶解物のリットル当たり約０．１ｇ〜２ｇの間の量で塩化カルシウム塩を未加工の血小板溶解物に加えることができる。好まれる実施形態では、未加工の血小板溶解物のリットル当たり約０．４ｇ〜約０．７５ｇの塩化カルシウム塩を加える。合わせた血小板溶解物と塩化カルシウムまたは他の凝固剤をシェーカーに入れ、またはさもなければ撹拌して凝固剤と濃厚血小板の十分な混合を保証する。次いで得られた混合物は、ある実施形態では少なくとも約８時間、または少なくとも約１２時間、通常、約８時間〜約３６時間の範囲での時間で固形凝固物質を形成させる。好まれる形態では、得られる凝固した物質の少なくとも優勢な量（５０％を超える）、及び潜在的には得られる凝固した物質の少なくとも８０％または少なくとも９０％が実質的に均質な凝固ゲルによって構成される。そのような実質的に均質な凝固ゲルは物質全体を通して一貫したゲル相を示すことができ、液体は連続するフィブリンマトリクスの中に取り込まれる。凝固した物質のこれらの好まれる形態は、その後の遠心分離に基づく分離法にとって望ましいことになるような、多数の別個の固形凝固粒子が液相に懸濁される凝固した濃厚血小板材料とは異なる。
【００２８】
凝固が生じた後、液状物質を固形の凝固物質から分離することができる。この目的で好適な技法が使用されてもよい。好まれる形態では、凝固した物質は２以上の表面間で圧迫されて液体から凝固した固形物を分離する。凝固した物質が本明細書で議論されるように実質的に均質な凝固ゲルの形態を示す場合、そのような圧迫は、ゲルのフィブリンマトリクスを圧搾し、濃縮しながら、ゲル物質から液体を搾り出すことができる。凝固した物質を圧迫することは、一部の形態では、プラスチック袋のような柔軟な容器にて実施することができる。凝固ゲルを、たとえば、手によって手動で、または装置の強制的な適用によって袋または他の柔軟な容器の一領域（たとえば、端）に圧迫することができ、固形フィブリンマトリクスから搾り出された液体を袋または他の柔軟な容器の別の領域（たとえば、端）に集めることができる。圧迫の途中でまたは後で圧迫が生じる第１の袋に第２の袋または他の容器を接続することができ、液状物質を第２の袋または他の容器に移すことができる。他の様式では、凝固ゲルをバケツのような硬い容器に入れることができ、手によってまたは装置の強制的な適用によって圧迫して固形のフィブリンマトリクスから液体を搾り出し、フィブリンマトリクスを圧搾し、濃縮することができる。
【００２９】
凝固させること及び凝固した濃厚血小板の液状物質と固形物質の分離の後、分離された液体は凝固前の未加工の血小板溶解物に比べて低下した濃度のフィブリノーゲンを有する。好まれる形態では、未加工の血小板溶解物は通常、約１，５００，０００〜３，５００，０００（１５０万〜３５０万）ｎｇ／ｍＬの範囲で少なくとも１００万ｎｇ／ｍＬのフィブリノーゲン含量を有するが、凝固及び分離の後、液体は、約５０，０００ｎｇ／ｍＬ未満、好ましくは約２０，０００ｎｇ／ｍＬ未満、さらに好ましくは約１０，０００ｎｇ／ｍＬ未満のフィブリノーゲン含量を有する。説明的には、この分離された液体は、約５００ｎｇ／ｍＬ〜約２０，０００ｎｇ／ｍＬまたは約５００ｎｇ／ｍＬ〜約１０，０００ｎｇ／ｍＬの範囲でのフィブリノーゲン含量を有することができる。さらにまたは代わりに、この分離された液体は、凝固前の濃厚血小板に存在するフィブリノーゲンの約５％未満、好ましくは約２％未満、さらに好ましくは約１％未満を含有することができる。その上、この分離された液体は、未加工の血小板溶解物の容積の少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約７５％、通常約７５％〜約９０％の範囲を構成することができる。
【００３０】
未加工の血小板溶解物の凝固及び固液分離による分離の後、回収されるフィブリノーゲンを激減させた液状生理活性分画は、未加工の血小板溶解物に由来する複数の増殖因子を含有する。これらにはＴＧＦ−β１、ＥＧＦ、ＦＧＦ−β、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＳＤＦ−１α、及びＶＥＧＦを挙げることができる。ある実施形態では、このフィブリノーゲンを激減させた液状生理活性分画には、未加工の血小板溶解物に由来する以下の増殖因子とその量：
約５０，０００〜約１５０，０００ｐｇ／ｍＬのＴＧＦ−β１、好ましくは約７０，０００〜約１２０，０００ｐｇ／ｍＬのＴＧＦ−β１；及び／または
約２０〜約８００ｐｇ／ｍＬのＥＧＦ、好ましくは約４００〜約８００ｐｇ／ｍＬのＥＧＦ；及び／または
約５〜約２５０ｐｇ／ｍＬのＦＧＦ−ｂ、好ましくは約５０〜２５０ｐｇ／ｍＬのＦＧＦ−ｂ；及び／または
約５００〜約２５，０００ｐｇ／ｍＬのＰＤＧＦ−ＡＡ、好ましくは約５０００〜約１８０００ｐｇ／ｍＬのＰＤＧＦ−ＡＡ；及び／または
約１０００〜約２５，０００ｐｇ／ｍＬのＰＤＧＦ−ＢＢ、好ましくは約２０００〜約１８０００ｐｇ／ｍＬのＰＤＧＦ−ＢＢ；及び／または
約４００〜約１０００ｐｇ／ｍＬのＳＤＦ−１α、好ましくは約５００〜約９００ｐｇ／ｍＬのＳＤＦ−１α；及び／または
約１０〜約６００ｐｇ／ｍＬのＶＥＧＦ、好ましくは約１５０〜約４５０ｐｇ／ｍＬのＶＥＧＦが含まれる。
【００３１】
他の実施形態では、フィブリノーゲンを激減させた液状生理活性分画には、未加工の血小板溶解物に由来する以下の増殖因子とその量：
約２００ｐｇ／ｍＬ〜約３５０ｐｇ／ｍＬの間のレベルでのＦＧＦ−２（すなわち、ＦＧＦ−ｂ）；及び／または
約１８００ｐｇ／ｍＬ〜約３１００ｐｇ／ｍＬの間のレベルでのＥＧＦ；及び／または
約２４，０００ｐｇ／ｍＬ〜約２８，０００ｐｇ／ｍＬの間のレベルでのＰＤＧＦ−ＡＡ；及び／または
約５０ｎｇ／ｍＬ〜約８０ｎｇ／ｍＬの間のレベルでのＰＤＧＦ−ＢＢ；及び／または
約５００ｐｇ／ｍＬ〜約８００ｐｇ／ｍＬの間のレベルでのＶＥＧＦ；及び／または
約６０ｎｇ／ｍＬ〜約９０ｎｇ／ｍＬの間のレベルでのＴＧＦ−ｂが含まれる。
【００３２】
一部の形態では、フィブリノーゲンを激減させた液状生理活性分画はまた、３μｇ／ｍＬ未満の、好ましくは２．５μｇ／ｍＬ未満のフィブリノーゲン含量も有する。
【００３３】
好まれる形態では、フィブリノーゲンを激減させた液状生理活性分画にはまた、たとえば、グロブリン、アルブミン、トリグリセリド、グルコース、ナトリウム及び／またはカルシウムを含む、濃厚血小板出発材料における血漿に由来する１以上の成分も含まれる。塩化カルシウム塩を用いて未加工の血小板溶解物を凝固させる場合、分離される液状生理活性剤に存在するカルシウムは溶解物及び添加されたカルシウム塩の双方に由来することができる。ある実施形態では、この分離される液状生理活性分画には未加工の血小板溶解物に由来する以下の成分及び量：
約０．５〜約２．５ｇ／ｄＬのグロブリン、好ましくは約１〜約２ｇ／ｄＬのグロブリン；
約２〜約５ｇ／ｄＬのアルブミン、好ましくは約３〜約４ｇ／ｄＬのアルブミン；
約１００〜約２００ミリモル／Ｌのナトリウム、好ましくは約１２０〜約１６０ミリモル／Ｌのナトリウム；
約４０〜約７０ｍｇ／ｄＬのトリグリセリド、好ましくは約５０〜約６５ｍｇ／ｄＬのトリグリセリド；
約１５０〜約３００ｍｇ／ｄＬのグルコース、好ましくは約１５０〜約２５０ｍｇ／ｄＬのグルコースが含まれる。
【００３４】
その上、塩化カルシウム塩が未加工の血小板溶解物のための凝固剤として使用される場合、この分離される液状生理活性分画は、一部の形態では、約１５〜３５ｍｇ／ｄＬ、好ましくは約１５〜２５ｍｇ／ｄＬのレベルでカルシウムを含む。
【００３５】
本発明を実践する一部の様式によれば、液状生理活性分画は無菌フィルターに通される。好まれる実施形態では、無菌フィルターは０．２μｍの無菌フィルターを含む。無菌フィルターを通過した後、液状生理活性分画は無菌容器内で密封されてもよい。
【００３６】
本明細書のある発明の実施形態は、凝固及び固液分離の工程の後、回収される液状生理活性分画を濾過して、たとえば、残っている血小板残屑、細胞残屑及び凝固固形物のような懸濁された固形物を取り除くことを含む。好まれる様式では、そのような濾過することには、少なくとも１つの深層フィルター、好ましくは潜在的に異なるミクロン等級の２または３の深層フィルターのような複数の深層フィルターを介して液状生理活性分画を処理することが含まれる。この点で、本明細書で知られ、使用されるように、「深層フィルター」または「深層濾過」は、多孔性濾過媒体を利用して媒体の表面上だけではなく媒体全体にわたって粒子を保持する、それぞれフィルターまたは濾過を指す。さらに本明細書で知られ、使用されるように、「名目上のミクロン等級」はフィルターに適用されるとき、そのサイズを超えると懸濁された固形物すべての９８％がフィルターの定格出力全体を通して取り除かれる粒子サイズを意味する。特定の発明の変異形には少なくとも１つの深層フィルターとその後の少なくとも１つの無菌フィルターを介する濾過が挙げられる。追加の発明の変異形には少なくとも２つの深層フィルターとその後の少なくとも１つの無菌フィルターを介する濾過が挙げられる。好まれる形態では、使用される深層フィルター（単数）または深層フィルター（複数）は正の表面電荷を伴ったフィルター媒体を有する。
【００３７】
ある実施形態では、液状生理活性分画の深層濾過には第１と第２の深層フィルターが使用される。第１の深層フィルターは、第２の深層フィルターのそれよりも大きい名目上のミクロン等級を有する。一部の形態では、第１の深層フィルターは約１０〜０．１ミクロンの間の名目上のミクロン等級を有する。好まれる実施形態では、第１の深層フィルターは５〜０．１ミクロンの間、一層さらに好ましくは約３〜０．２ミクロンの間の名目上のミクロン等級を有する。ある実施形態では、第１の深層フィルターは、セルロース膜と、正の表面電荷を伴った、セルロース繊維及び珪藻土のような無機濾過助剤で構成されるフィルター媒体とを有する。
【００３８】
ある実施形態では、第２の深層フィルターは、第１の深層フィルターのそれ未満の名目上のミクロン等級、たとえば、一部の形態では、約０．５ミクロン未満のミクロン等級を有する。好まれる実施形態では、第２の深層フィルターは０．５〜０．００１ミクロンの間、さらに好ましくは約０．１〜０．００１ミクロンの間の名目上のミクロン等級を有する。ある実施形態では、第１の深層フィルターは、セルロース膜と、正の表面電荷を伴った、セルロース繊維及び珪藻土のような無機濾過助剤で構成されるフィルター媒体とを有する。
【００３９】
好まれる形態では、液状生理活性分画は、懸濁された固形物を取り除くための深層濾過または他の濾過の後、未加工の血小板溶解物に由来する複数の増殖因子を依然として含有する。これらにはＴＧＦ−β１、ＥＧＦ、ＦＧＦ−β、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＳＤＦ−１α、及びＶＥＧＦを挙げることができる。ある実施形態では、この濾過された液状生理活性分画には、未加工の血小板溶解物に由来する以下の増殖因子とその量：
約５０００〜約７５，０００ｐｇ／ｍＬのＴＧＦ−β１、好ましくは約５０００〜約６０，０００ｐｇ／ｍＬのＴＧＦ−β１；
約２０〜約３００ｐｇ／ｍＬのＥＧＦ、好ましくは約５０〜約２５０ｐｇ／ｍＬのＥＧＦ；
約５〜約１５０ｐｇ／ｍＬのＦＧＦ−β、好ましくは約３０〜１３０ｐｇ／ｍＬのＦＧＦ−ｂ；
約２００〜約４０００ｐｇ／ｍＬのＰＤＧＦ−ＡＡ、好ましくは約１０００〜約３０００ｐｇ／ｍＬのＰＤＧＦ−ＡＡ；
約５０〜約１０００ｐｇ／ｍＬのＰＤＧＦ−ＢＢ、好ましくは約１００〜約５００ｐｇ／ｍＬのＰＤＧＦ−ＢＢ；
約１００〜約７００ｐｇ／ｍＬのＳＤＦ−１α、好ましくは約３００〜約６００ｐｇ／ｍＬのＳＤＦ−１α；及び／または
約１０〜約４００ｐｇ／ｍＬのＶＥＧＦ、好ましくは約４０〜約２００ｐｇ／ｍＬのＶＥＧＦが含まれる。
【００４０】
好まれる形態では、この深層濾過されたまたは他の濾過された液状生理活性分画にはまた、たとえば、グロブリン、アルブミン、トリグリセリド、グルコース、ナトリウム及び／またはカルシウムを含む、濃厚血小板出発材料に由来する１以上の成分が依然として含まれる。再び、塩化カルシウム塩を使用して未加工の血小板溶解物を凝固させる場合、濾過した液状生理活性剤に存在するカルシウムは溶解物及び添加したカルシウム塩の双方に由来し得る。ある実施形態では、この濾過した生理活性液状分画には、未加工の血小板溶解物に由来する以下の成分及び量：
約０．５〜約２．５ｇ／ｄＬのグロブリン、好ましくは約１〜約２ｇ／ｄＬのグロブリン；
約２〜約５ｇ／ｄＬのアルブミン、好ましくは約３〜約４ｇ／ｄＬのアルブミン；
約１００〜約２００ミリモル／Ｌのナトリウム、好ましくは約１２０〜約１６０ミリモル／Ｌのナトリウム；
約５０〜約１２０ｍｇ／ｄＬのトリグリセリド、好ましくは約６０〜約１１０ｍｇ／ｄＬのトリグリセリド；及び／または
約１５０〜約３００ｍｇ／ｄＬのグルコース、好ましくは約１５０〜約２５０ｍｇ／ｄＬのグルコースが含まれる。
【００４１】
その上、塩化カルシウム塩が未加工の血小板溶解物のための凝固剤として使用される場合、この分離された生理活性液状分画には、一部の形態では、約１５〜６０ｍｇ／ｄＬ、好ましくは約２０〜５０ｍｇ／ｄＬのレベルでカルシウムが含まれ得る。
【００４２】
生理活性液状分画はまた、他の生理活性物質、たとえば、１以上のインターロイキン、インターフェロン及び／または腫瘍壊死因子も含むことができる。これらのインターロイキン、インターフェロン及び／または腫瘍壊死因子には、たとえば、インターロイキン（ＩＬ）−１ｂ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）及び腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）の１つ、幾つかまたはすべてが挙げられ得る。
【００４３】
上述のように、本明細書の方法の一部の実施形態では、液状生理活性分画を、好ましくは上記で議論されたように深層フィルターまたは他のフィルターを通して懸濁した固形物を取り除いた後、少なくとも１つの無菌フィルターに通す。種々の無菌フィルター及び関連する方法が既知であり、使用され得る。無菌フィルターによって取り除かれる例となる混入物には、たとえば、ｓｔａｐｈｙｌｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ、ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ、マイコプラズマ、及び／またはｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓが挙げられる。無菌フィルターは相対的に低いタンパク質結合を示すように選択され得る。無菌濾過の後、好まれる形態では、無菌濾過された液状生理活性分画は深層濾過されたまたは他の濾過された液状生理活性分画について上記で特定されたものと同じ成分を有することができ、深層濾過されたまたは他の濾過された液状生理活性分画について上記で特定された範囲内でのこれらのレベルを有することができる。しかしながら、無菌濾過の間に成分の一部またはすべてのレベルにおける若干の低下が生じ得ることが理解されるであろう。
【００４４】
特定の好まれる実施形態では、血小板の溶解、フィブリノーゲンの激減、及び懸濁した粒子状物質を取り除くための深層濾過または他の濾過の上述の工程によって得ることができる無菌の液状生理活性分画組成物は、
液状生理活性分画の２０，０００ｎｇ／ｍＬ未満のレベルでの、たとえば、約５００ｎｇ／ｍＬ〜約２０，０００ｎｇ／ｍＬの範囲でのフィブリノーゲンと、
液状生理活性分画の少なくとも２ｍｇ／ｄＬのレベルでのアルブミンと、
液状生理活性分画の少なくとも１ｇ／ｄＬのレベルでのグロブリンと、
液状生理活性分画の少なくとも５０００ｐｇ／ｍＬのレベルでのＴＧＦ−β１と、
液状生理活性分画の少なくとも２０ｐｇ／ｍＬのレベルでのＥＧＦと、
液状生理活性分画の少なくとも５ｐｇ／ｍＬのレベルでのＦＧＦ−βと、
液状生理活性分画の少なくとも２００ｐｇ／ｍＬのレベルでのＰＤＧＦ−ＡＡと、
液状生理活性分画の少なくとも５０ｐｇ／ｍＬのレベルでのＰＤＧＦ−ＢＢと、
液状生理活性分画の少なくとも１００ｐｇ／ｍＬのレベルでのＳＤＦ−１αと、
液状生理活性分画の少なくとも１０ｐｇ／ｍＬのレベルでのＶＥＧＦとを含む。
【００４５】
一部の形態では、本開示の液状生理活性分画組成物は以下の特徴：
約１０ＥＵ／ｍＬ未満のエンドトキシンレベル；
約２５ｍｇ／ｄＬ未満のヘモグロビン；
約４〜６ｇ／ｄＬの総タンパク質；
約２６０〜３４０ミリモル／ｋｇの浸透圧；及び／または
６．８〜７．８の間のｐＨも有する。
【００４６】
これらの特徴は、上述のように、未加工の血小板溶解物組成物（遠心分離または別の方法及び滅菌による固形物除去の後も潜在的に）、凝固及び固液分離（及び潜在的に滅菌）の後回収されるフィブリノーゲンを激減させた液状生理活性分画、または懸濁した固形物を取り除くための深層濾過または他の濾過（（及び潜在的に滅菌）の後のフィブリノーゲンを激減させた液状生理活性分画にて存在することができる。また、処理の好まれる形態は処理剤として界面活性剤を採用する必要がないので、これらの組成物は界面活性剤残留物を含まなくてもよく、または本質的に含まなくてもよい。
【００４７】
操作の一部の様式では、フィブリノーゲンを激減させた、濾過した（たとえば、深層濾過した）本開示の液状生理活性組成物を作製するのに利用される手順は、本明細書で特定される増殖因子、インターロイキン、インターフェロン及び／または腫瘍壊死因子のレベルで低下を生じる。例として、ある実施形態では、フィブリノーゲンを激減させた分画の深層濾過または他の濾過は懸濁した固形物を取り除くように実施され、ＴＧＦ−β−１、ＥＧＦ、ＦＧＦ−ｂ、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＳＤＦ−１α、及びＶＥＧＦの１つ、幾つかまたはすべてのレベルで（たとえば、ｐｇ／ｍＬで）少なくとも２０％の低下；及び／または
ＴＧＦ−β−１のレベルで（たとえば、ｐｇ／ｍＬで）少なくとも５０％の低下；及び／または
ＥＧＦのレベルで（たとえば、ｐｇ／ｍＬで）少なくとも３０％の低下；及び／または
ＦＧＦ−ｂのレベルで（たとえば、ｐｇ／ｍＬで）少なくとも２０％の低下；及び／または
ＰＤＧＦ−ＡＡのレベルで（たとえば、ｐｇ／ｍＬで）少なくとも５０％の低下；及び／または
ＰＤＧＦ−ＢＢのレベルで（たとえば、ｐｇ／ｍＬで）少なくとも５０％の低下；及び／または
ＳＤＦ−１αのレベルで（たとえば、ｐｇ／ｍＬで）少なくとも２０％の低下；及び／または
ＶＥＧＦのレベルで（たとえば、ｐｇ／ｍＬで）少なくとも３０％の低下を生じる。
【００４８】
加えてまたは代わりに、深層濾過または他の濾過は高度に有意なレベルのインターロイキン−１７（ＩＬ−１７）の除去を生じ得る。ある実施形態では、粒子状物質を取り除く深層濾過または他の濾過の後の、及びまた潜在的に、最終的な滅菌した液状生理活性分画におけるＩＬ−１７のレベルは、約１ピコグラム／ｍＬ未満、さらに好ましくは約０．７５ピコグラム／ｍＬ未満、一層さらに好ましくは約０．５ピコグラム／ｍＬ未満である。ＩＬ−１７は、他の炎症性サイトカインの放出を引き起こすカスケードの中にもある炎症性サイトカインである。本明細書で特定されるような低レベルのＩＬ−１７を有する好まれる製剤は、ＩＬ−１７の存在から始まる炎症性活性をほとんど伴わずにまたは伴わずに使用することができる。
【００４９】
加えてまたは代わりに、懸濁した固形物を取り除くためのフィブリノーゲンを激減させた分画の深層濾過または他の濾過は、１０００ｐｇ／ｍＬ未満のＰＤＧＦ−ＢＢの濃度、３０００ｐｇ／ｍＬ未満のＰＤＧＦ−ＡＡの濃度、少なくとも５０００ｐｇ／ｍＬのＴＧＦ−β１の濃度及び／または３００ｐｇ／ｍＬ未満のＶＥＧＦの濃度を有する液状生理活性分画製剤を生じることができる。これらの値は、懸濁した固形物を取り除くための深層濾過または他の濾過の後で（たとえば、無菌濾過によって）調製される無菌化製剤においても存在し得る。
【００５０】
本明細書で開示される一部の様式によれば、本明細書で記載される液状生理活性分画は血漿成分を有益に保持するように処理することができる。液状生理活性分画によって保持され得る血漿成分には、グロブリン、アルブミン、トリグリセリド、グルコース、ナトリウム及び／またはカルシウムが挙げられる。一部の形態では、液状生理活性分画は、以下の特徴：
液状生理活性分画の少なくとも２００ｐｇ／ｍＬのレベルでのＦＧＦ−２；
液状生理活性分画の少なくとも１８００ｐｇ／ｍＬのレベルでのＥＧＦ；
液状生理活性分画の少なくとも２４，０００ｐｇ／ｍＬのレベルでのＰＤＧＦ−ＡＡ；
液状生理活性分画の少なくとも５０ｎｇ／ｍＬのレベルでのＰＤＧＦ−ＢＢ；
液状生理活性分画の少なくとも５００ｐｇ／ｍＬのレベルでのＶＥＧＦ；
液状生理活性分画の少なくとも６０ｎｇ／ｍＬのレベルでのＴＧＦ−β１及び
液状生理活性分画の２．５μｇ／ｍＬ未満のレベルでのフィブリノーゲンを有する一方で、
１以上のそのような血漿成分、及び潜在的にそれらのすべてを含有する。
【００５１】
一部の形態では、本開示の液状生理活性分画組成物は保存または送達のための無菌包装にて包装されてもよい。液状生理活性分画をその完全な回復させた濃度で包装することができ、包装または後での使用のためにそれを水または水性媒体で希釈してもよく、たとえば、液状生理活性分画の元々の濃度の９０％〜１０％への希釈を調製することができ、そのような希釈された組成物及び本明細書で特定される成分レベルにおけるその得られる相当する低下は、本明細書で開示される追加の実施形態を形成する。そのような包装の一実施形態を図２で説明する。本開示を実践する一部の形態によれば、組成物２００は無菌の媒体ボトル２１０に保存される。無菌の媒体ボトルは、たとえば、５０ｍＬ〜５０００ｍＬの範囲での容積容量を有してもよい。例として、６０ｍＬ、１２５ｍＬ、２５０ｍＬ、５００ｍＬ、１０００ｍＬまたは２０００ｍＬのボトルが使用されてもよい。一部の形態では、無菌の媒体ボトル２１０のキャップ２２０は収縮包装２３０によって保護される。一部の形態では、ボトルが収縮包装される。ある実施形態では、ボトルは仕上げ製剤ラベル２４０によって標識される。一部の形態では、ボトルはドライアイスと共に製剤箱に入れられる。
【００５２】
ある実施形態では、本開示の液状生理活性分画は他の成分と組み合わせて細胞培養培地を形成してもよい。そのような細胞培養培地は、たとえば、最少必須培地（ＭＥＭ）またはダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）のような既知の細胞培養培地にて見いだされるようなものを含む細胞培養のための他の栄養物または培地と混合された本開示の液状生理活性分画を含む。本開示に係る細胞培養培地は、たとえば、間葉幹細胞のような幹細胞及び／または前駆細胞を含む細胞の増殖または維持に必要な栄養物（たとえば、増殖因子等）を提供するように処方される。そのような細胞培養培地は、好まれる形態では、添加されるヘパリンを含まず、にもかかわらず、凝固した物質（たとえば、拡大せずに裸眼で見える凝固粒子の出現によって明らかになるような）を含まない。
【００５３】
他の実施形態では、本開示の液状生理活性分画組成物またはその分画を治療用物質として使用することができる。たとえば、神経、腱、骨、筋肉、皮膚（たとえば、創傷治癒）、結合組織、眼及び／または循環器（たとえば、心臓または大動脈）の組織のような病んだまたは損傷した組織の治療を含む薬物療法のための治療用物質として組成物を使用することができる。本明細書で記載される液状生理活性分画またはそれを含む組成物は、たとえば、注射または他の外科的移植を含む好適な手段によってこれらの組織または他の組織に送達することができる。特定の使用では、眼組織を治療することにおいて、液状生理活性組成物またはそれを含む組成物は、たとえば、眼の移植片対宿主病（眼のＧＶＨＤ）、角膜潰瘍、ドライアイ（乾性角結膜炎）、または手術後若しくは外傷後の角膜修復のような眼の表面の欠陥または疾患の治療にて眼の表面に（たとえば、液状点眼剤の形態で）塗布される。
【００５４】
他の実施形態では、本開示の液状生理活性分画組成物またはその分画を治療用物質として使用することができる。たとえば、神経、腱、骨、筋肉、皮膚（たとえば、創傷治癒）、結合組織、眼及び／または循環器（たとえば、心臓または大動脈）の組織のような病んだまたは損傷した組織の治療を含む薬物療法のための治療用物質として組成物を使用することができる。本明細書で記載される液状生理活性分画またはそれを含む組成物は、たとえば、注射または他の外科的移植を含む好適な手段によってこれらの組織または他の組織に送達することができる。特定の使用では、眼組織を治療することにおいて、液状生理活性組成物またはそれを含む組成物は、たとえば、眼の移植片対宿主病（眼のＧＶＨＤ）、角膜潰瘍、ドライアイ（乾性角結膜炎）、または手術後若しくは外傷後の角膜修復のような眼の表面の欠陥または疾患の治療にて眼の表面に（たとえば、液状点眼剤の形態で）塗布される。
【００５５】
発明のある変異形によれば、本開示の液状生理活性分画は哺乳類患者（たとえば、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ等）を治療するのに使用される。ある実施形態では、液状生理活性分画は標的患者に関して同種であり、他の実施形態では、液状生理活性分画は標的患者に関して異種である。たとえば、ある実施形態では、ヒトの血小板に由来する血小板溶解物組成物がイヌ患者を治療するのに使用されてもよい。イヌの血小板に由来する血小板溶解物組成物がイヌ患者を治療するのに使用されてもよいことも、及びヒトの血小板に由来する血小板溶解物組成物がヒト患者を治療するのに使用されてもよいことも想定される。一部の形態では、患者は乾性角結膜炎を患っている。特定の発明の変異形によれば、本開示の液状生理活性分画は乾性角結膜炎を患っているイヌ患者を治療するのに使用される。イヌ患者は、どのイヌの品種でもよいが、乾性角結膜炎に一般的に罹る品種には、キャバリア・キングチャールズ・スパニエル、ブルドッグ、チャイニーズ・シャーペイ、ラサ・アプソ、シーズー、ウエスト・ハイランド・ホワイト・テリア、パグ、ブラッドバウンド、コッカースパニエル、ペキニーズ、ボストンテリア、ミニチュアシュナイザー及びサモエドが挙げられる。
【００５６】
ある実施形態では、液状生理活性分画を含有するヒト血小板溶解物は、患者の眼に液状生理活性分画を送達するように構成された液体送達用具に保存される。一部の形態では、液体送達用具は無菌容器である。図３は液体送達用具の一実施形態を説明する。説明に役立つ実施形態では、液状生理活性分画は用具３００の中に保存される。用具３００は保存部分３１０と散布部分３２０を有する。説明に役立つ実施形態では、散布部分３２０は任意でフタ３２２によって覆われる。散布部分３２０は液状生理活性分画の一部（たとえば、個々の液滴）を分配するように構成されてもよい。一部の形態では、保存部分３１０は、ユーザーが絞ることができる変形可能なプラスチック材料を含む。他の好適な液体送達用具には、点眼器及びピペットが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５７】
ある実施形態によれば、本発明の液状生理活性分画は軟膏に製剤化される。一部の形態では、ｈＰＬを含有する軟膏が冒された領域（たとえば、患者の眼）に局所的に塗布される。
【００５８】
液状生理活性分画を、たとえば、細胞用の凍結保存剤として含む他の目的に使用することができる。そのような凍結保存の用途では、液状生理活性分画を細胞浮遊組成物に組み入れることができ、該細胞浮遊組成物を凍結保存して細胞の生存率を保つ。細胞は、たとえば、間葉幹細胞のような幹細胞、前駆細胞等を含む種々の細胞のいずれかであることができる。凍結保存は、たとえば、バッグまたはバイアルのような好適な容器にて行われる。
【００５９】
溶解した濃厚血小板に由来する回収された液状生理活性分画から導出する製剤に加えて、凝固及び固液分離の間に形成される固形凝固物質から有益な製剤を作製することができる。特定の形態では、分離された固形凝固物質は、増殖因子も豊富であり、十分な量のフィブリノーゲン及び凝固因子を含有して、たとえば、生物接着剤における凝固可能ビヒクルとして役立ち、及び／または医学応用のための止血材として役立つことが発見されている。これらのまたは他の目的で、回収された固形凝固物質を冷蔵条件または凍結条件にて保存することができ、及び／または凍結乾燥して任意で粉末形態に減量できる乾燥物質を形成することができる。医学応用、診断応用、研究応用またはその他の応用のために、たとえば、放射線または化学滅菌剤（たとえば、エチレンオキシド）への暴露を含む好適な手段によって固形凝固物質またはそれに由来する分画を滅菌することができる。
【００６０】
その上、液状生理活性分画の回収及び潜在的に、上記で議論した凝固及び固液分離の間に形成される固形凝固物質から作製される製剤に加えて、増殖因子または他のタンパク質のような生理活性物質を、血小板溶解物を処理するのに使用したフィルター（単数）またはフィルター（複数）から個々にまたは混合物で回収することができる。これは元々の出発材料から付加価値を回収することができる。説明的には、血小板溶解物組成物を濾過するのに使用された深層フィルター（たとえば、上文で記載された深層フィルター）をその後処理してフィルター上に捕捉された１以上の増殖因子または他の生理活性物質を回収することができる。好適な方法にてこれを達成することができる。説明的には、タンパク質のフィルター媒体への誘引を克服し、それによってタンパク質を含有する溶出液流を生成するように溶出する液体をフィルターに通すことによって、１以上のタンパク質、たとえば、増殖因子をフィルターから溶出することができる。少なくとも部分的にはタンパク質と荷電したフィルター媒体との間での電荷相互作用に基づいてタンパク質を保持する荷電した（たとえば、正に荷電した）深層フィルターが使用される場合、タンパク質は、塩溶液による溶出、溶出液体のｐＨの変化（最初の濾過の間に使用されたものに比べて）、または親和性溶出カラム（溶出されるタンパク質に対するリガンドを含有する）によって回収されてもよい。勾配溶出（たとえば、塩またはｐＨの勾配による）を用いて、特定のタンパク質または当該タンパク質について精製されるまたは濃縮される分画を順次溶出してもよい。回収されるタンパク質（単数）またはタンパク質（複数）は、たとえば、本明細書で特定されるもののいずれか、好ましくは本明細書で特定される増殖因子、インターロイキン、インターフェロン及び／または腫瘍壊死因子の１以上であってもよい。これらは、たとえば、治療目的、診断目的または研究目的に使用されてもよい。濾過媒体から回収した後、これらの目的または他の目的でそれらを任意で精製し、及び／または滅菌してもよい。
【００６１】
本開示の態様及びその特徴や利点のさらなる理解を促進する目的で、以下の特定の実施例が提供される。これらの実施例は説明に役立つものであって、本開示の実施形態の限定ではないことが理解されるであろう。
【実施例】
【００６２】
実施例１：ヒト血小板溶解物組成物の調製
５日間の保存可能期間後、期限切れになったばかりの、疾患のスクリーニングでのアフェレーシスで得たヒトの血小板単位（末梢血から得た）を集め、使用までフリーザーにて−２０℃で凍結する。多数の単位（たとえば、約１０単位）をフリーザーから取り出し、室温で融解し、こうして血小板を溶解し、「未加工のｈＰＬ」組成物を形成する。選択された単位に由来する未加工のｈＰＬをバッグにてプールする。プールした未加工のｈＰＬに０．７グラム／Ｌの塩化カルシウム（およそ６ｍＭのＣａＣｌ２）を加え、次いで室温にて２時間、振盪器で未加工のｈＰＬと十分に混合する。混合の後、ＣａＣｌ２処理した未加工のｈＰＬを室温で一晩凝固させ、その間に、その容量の未加工のｈＰＬから堅い実質的に均質な凝固したゲル塊が生じる。
【００６３】
閉じたままで、未加工のｈＰＬのゲル凝固物を含有するバッグを手によって手動で圧迫し、ゲル凝固物から液体を搾り出す。この圧迫を十分に行い、バッグの一方の端に固形凝固塊を生じ、排出口に隣接する、バッグの他方の端に別々になった液体容量を生じる。分離した液体は元々のプールした未加工のｈＰＬの容量のおよそ７５〜８０％を表し、固形凝固物質は残りを表す。液体をバッグから１００Ｌの容量を有する第２の冷蔵バッグに移す。十分な数のそのような融解／プール／凝固／搾り出しの実行を行って１００Ｌの冷蔵バッグを液体で満たす。
【００６４】
正の表面電荷及び３〜０．２ミクロンの間の名目上のミクロン等級を持つフィルター媒体を有する第１の深層フィルターと正の表面電荷及び０．１〜０．００１ミクロンの間の名目上のミクロン等級を持つフィルター媒体を有する第２の深層フィルターで構成されるフィルタートレインに１００Ｌバッグにおける液体を無菌的に接続し、それを介して処理する。時間当たりフィルターの表面積の平方メートル当たり約１００リットルの濾液流速（「ＬＭＨ」）で濾過を行う。第１の深層フィルターはＭｉｌｌｉｓｔａｃｋ  Ｐｏｄ  Ｆｉｌｔｅｒ，Ｇｒａｄｅ  Ｃ０  Ｓｅｒｉｅｓ  ＨＣ  Ｄｅｐｔｈ  Ｆｉｌｔｅｒによって提供され、第２の深層フィルターはＭｉｌｌｉｓｔａｃｋ  Ｐｏｄ  Ｆｉｌｔｅｒ，Ｇｒａｄｅ  ＸＯ  Ｓｅｒｉｅｓ  ＨＣ  Ｄｅｐｔｈ  Ｆｉｌｔｅｒによって提供され、双方ともＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから市販されている。これらフィルターのそれぞれは、セルロースの混合エステルで構成される膜と無機濾過助剤（珪藻土）と共にセルロース繊維で構成されるフィルター媒体とを有する。１００Ｌバッグの物質を処理するのに先立ってフィルタートレインに無菌の蒸留水で呼び水を差す。フィルタートレインを出るｈＰＬ液を第２の１００Ｌバッグに回収する。
【００６５】
さらに小さな容器、たとえば、１００ｍＬまたは５００ｍＬのジャー（たとえば、Ｎａｌｇｅｎｅジャー）における無菌フィルターに第２の１００ＬのｈＰＬバッグを無菌的に接続し、ポンプでそれに通す。これは無菌充填条件下で行うことができる。ジャーを収縮包装してキャップをした端を覆い、ラベルを付けることができる。
【００６６】
この実施例に従って製造されるｈＰＬ製剤は本明細書で特定されるような組成プロファイルを有し、凝固形成を妨げるためにヘパリンを加えることを必要とせずに細胞培養への補完剤として使用することができる。このｈＰＬ製剤の細胞培養培地への添加は、ヘパリンを添加しなくても本質的に凝固を含まない培地を生じる。そのように製造された細胞培養培地は、好まれる用途で得られる所与の培養期間の後、相対的に高い細胞数またはパーセント集密度と共に、骨髄の間葉細胞、脂肪細胞幹細胞、胎盤由来の間葉幹細胞、及び筋肉由来の幹細胞または前駆細胞を含むがこれらに限定されない細胞の培養にて優れた特性を示す。
【００６７】
実施例２：ヒトの血小板溶解物組成物の調製
５日間の保存可能期間後、期限切れになったばかりの、疾患のスクリーニングでのアフェレーシスで得たヒトの血小板単位（末梢血から得た）を集め、使用までフリーザーにて−２０℃で凍結する。多数の単位（たとえば、約２３単位）をフリーザーから取り出し、室温で融解し、こうして血小板を溶解し、「未加工のｈＰＬ」組成物を形成する。選択された単位に由来する未加工のｈＰＬをバッグにてプールする。プールした未加工のｈＰＬに０．７５グラム／Ｌの塩化カルシウム（およそ６ｍＭのＣａＣｌ２）を加え、次いで室温にて２時間、振盪器で未加工のｈＰＬと十分に混合する。混合の後、ＣａＣｌ２処理した未加工のｈＰＬを室温で一晩凝固させ、その間に、その容量の未加工のｈＰＬから堅い実質的に均質な凝固したゲル塊が生じる。
【００６８】
閉じたままで、未加工のｈＰＬのゲル凝固物を含有するバッグを圧迫し、ゲル凝固物から液体を搾り出す。この圧迫を十分に行い、バッグの一方の端に固形凝固塊を生じ、排出口に隣接する、バッグの他方の端に別々になった液体容量を生じる。分離した液体は元々のプールした未加工のｈＰＬの容量のおよそ７５〜８０％を表し、固形凝固物質は残りを表す。液体をバッグから２５Ｌの容量を有する第２のフィルバッグに移す。十分な数のそのような融解／プール／凝固／搾り出しの実行を行って２５Ｌのフィルバッグを液体で満たす。
【００６９】
２５Ｌのフィルバッグを４℃の実験室冷蔵庫で一晩保存する。ペリスタポンプを用い、プレフィルター（２５μｍ）及び無菌フィルター（０．２μｍ）を介して２５Ｌのフィルバッグから流体を移す。濾過した液体を回収バッグにプールする。次いで、濾過した液体（ｈＰｌ）を無菌容器（１００ｍＬ〜５００ｍＬのＮａｌｇｅｎｅジャー）にて等分する。無菌充填条件下でこれを行うことができる。ジャーを収縮包装してキャップをした端を覆い、ラベルを付けることができる。
【００７０】
この実施例に従って製造されるｈＰＬ製剤は、本明細書で特定されるような組成プロファイルを有し、凝固形成を妨げるためにヘパリンを加えることを必要とせずに細胞培養培地への補完剤として使用することができ、液状生理活性分画について本明細書で特定される他の適用にて使用することもできる。このｈＰＬ製剤の細胞培養培地への添加は、ヘパリンを添加しなくても本質的に凝固を含まない培地を生じる。そのように製造された細胞培養培地は、好まれる用途で得られる所与の培養期間の後、相対的に高い細胞数またはパーセント集密度と共に、骨髄の間葉細胞、脂肪細胞幹細胞、胎盤由来の間葉幹細胞、及び筋肉由来の幹細胞または前駆細胞を含むがこれらに限定されない細胞の培養にて優れた特性を示す。
【００７１】
実施例３：イヌの血小板溶解物組成物の調製
イヌの血小板溶解物（ＣＰＬ）組成物は実質的に上述のように調製することができる。一般に、ＣＰＬ組成物の調製は末梢血から得られる、疾患をスクリーニングするアフェレーシスで得たイヌの血小板単位の調製で始まる。上記で詳述したように、そのような血小板単位は新鮮に調製されてもよいし、または期限切れの血小板単位から得られてもよい。血小板単位は使用までフリーザーにて−２０℃で凍結される。多数の単位（たとえば、約１０単位）をフリーザーから取り出し、室温で融解し、こうして血小板を溶解し、「未加工のＣＰＬ」組成物を形成する。選択された単位に由来する未加工のＣＰＬをバッグにてプールする。プールした未加工のＣＰＬに０．７グラム／Ｌのレベルで塩化カルシウム（およそ６ｍＭのＣａＣｌ２）を加え、次いで室温にて２時間、振盪器で未加工のＣＰＬと十分に混合する。混合の後、ＣａＣｌ２処理した未加工のＣＰＬを室温で一晩凝固させ、その間に、その容量の未加工のＣＰＬから堅い実質的に均質な凝固したゲル塊が生じる。
【００７２】
閉じたままで、未加工のＣＰＬのゲル凝固物を含有するバッグを手によって手動で圧迫し、ゲル凝固物から液体を搾り出す。この圧迫を十分に行い、バッグの一方の端に固形凝固塊を生じ、排出口に隣接する、バッグの他方の端に別々になった液体容量を生じる。分離した液体は元々のプールした未加工のＣＰＬの容量のおよそ７５〜８０％を表し、固形凝固物質は残りを表す。液体をバッグから１００Ｌの容量を有する第２の冷蔵バッグに移す。十分な数のそのような融解／プール／凝固／搾り出しの実行を行って１００Ｌの冷蔵バッグを液体で満たす。
【００７３】
集められた液体（たとえば、液状生理活性分画）を次いで無菌フィルターに通す。一部の形態では、集められた液体は実施例１で記載されたような一連の深層フィルターに通される。濾過した液体（ｃＰＬ）を次いで無菌容器（たとえば、１００ｍＬ〜５００ｍＬのＮａｌｇｅｎｅジャー）にて等分する。無菌充填条件下でこれを行うことができる。ジャーを収縮包装してキャップをした端を覆い、ラベルを付けることができる。
【００７４】
この実施例に従って製造されるＣＰＬ製剤は、本明細書で特定されるような組成プロファイルを有し、凝固形成を妨げるためにヘパリンを加えることを必要とせずに細胞培養培地への補完剤として使用することができ、液状生理活性分画について本明細書で特定される他の適用にて使用することもできる。このＣＰＬ製剤の細胞培養培地への添加は、ヘパリンを添加しなくても本質的に凝固を含まない培地を生じる。そのように製造された細胞培養培地は、好まれる用途で得られる所与の培養期間の後、相対的に高い細胞数またはパーセント集密度と共に、骨髄の間葉細胞、脂肪細胞幹細胞、胎盤由来の間葉幹細胞、及び筋肉由来の幹細胞または前駆細胞を含むがこれらに限定されない細胞の培養にて優れた特性を示す。ＣＰＬ溶液は本明細書で記載されるような治療剤としても使用されてもよい。
【００７５】
本発明を記載する文脈における、特に以下のクレームの文脈における用語「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」及び類似の指示対象の使用は、本明細書で指示されない限りまたは文脈によって明瞭に否定されない限り、単数及び複数の双方を取り扱うように解釈されるべきである。本明細書の値の範囲の引用は、本明細書で指示されない限り、その範囲に入る各別個の値を個々に参照する簡便法として役立つように単に意図され、各別個の値はそれが個々に本明細書で引用されるかのように本明細書に組み入れられる。本明細書で記載される方法はすべて、本明細書で指示されない限りまたは文脈によって明瞭に否定されない限り、任意の好適な順で実施することができる。本明細書で提供される任意の例及びすべての例または例となる言葉（たとえば、「のような」）の使用は単に、本発明をさらに良好に明らかにするように意図され、請求されない限り、本発明の範囲に限定を提示するものではない。本明細書の言葉は、任意の非請求の要素を本発明の実践に必須のものと指摘していると解釈されるべきではない。
【００７６】
本明細書で引用された出版物及び特許出願はすべて各個々の出版物及び特許出願が参照によって具体的に且つ個々に組み入れられるように指示されたかのように参照によって本明細書に組み入れられる。さらに、本明細書で述べられた任意の理論、操作のメカニズム、証明または知見は、本発明の理解をさらに高めるものであり、そのような理論、操作のメカニズム、証明または知見に本発明を限定するようには決して意図されるものではない。本発明が図面及び前述の記載にて詳細に説明され、記載されてきた一方で、同じことが性質において説明に役立つが制約ではないと見なされるべきであり、選択された実施形態だけが示され、記載されており、本明細書でまたは以下のクレームによって定義される本発明の精神の範囲内にある同等物、変更及び改変はすべて保護されるように望まれることが理解される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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