(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
イノシトールを調製する方法であって、
（１）デンプン又はデンプン誘導体を基質として用い、α−グルカンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、イノシトール−３−リン酸合成酵素及びイノシトールモノホスファターゼを添加してインビトロ多酵素反応システムを確立し、酵素触媒反応を行うステップ；及び
（２）反応生成物を分離及び精製してイノシトールを得るステップ
を含み、前記酵素触媒反応が４０℃から１００℃で行われ、α−グルカンホスホリラーゼがテルモトガ・マリティマ由来、ホスホグルコムターゼがテルモトガ・マリティマ由来、イノシトール−３−リン酸合成酵素がアーケオグロブス・フルギダス由来及びイノシトールモノホスファターゼがテルモトガ・マリティマ由来である、方法。
【請求項２】
該多酵素反応システムが更にデンプン脱分枝酵素、マルトースホスホリラーゼ及びα−アミラーゼ、又はデンプン脱分枝酵素、グルカノトランスフェラーゼ及びα−アミラーゼを含み、デンプン脱分枝酵素がイソアミラーゼ又はプルラナーゼのいずれか一方又は両方であり、マルトースホスホリラーゼが腸球菌属由来及びα−アミラーゼがアスペルギルス・オリーゼ由来、グルカノトランスフェラーゼがテルモコッカス・リトラリス由来、イソアミラーゼがスルホロブス・トコダイイ由来及びプルラナーゼがクレブシラ・ニューモニエ由来である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
該多酵素反応システムが更に、ポリリン酸−グルコキナーゼ及びポリホスファートを含み、ポリホスファートがポリリン酸ナトリウムであり、ポリリン酸−グルコキナーゼがサーモビフィダ・フスカ由来である、請求項２記載の方法。
【請求項４】
ステップ（１）のデンプン誘導体が１以上の部分的に加水分解されたデンプン、デンプンデキストリン、マルトデキストリン、マルトオリゴ糖又はマルトースを含む、請求項１記載の方法。
【請求項５】
イノシトールを調製する方法であって、
（１）セルロース又はセルロース誘導体を基質として用い、セルラーゼ、セロデキストリンホスホリラーゼ、セロビオースホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、イノシトール−３−リン酸合成酵素及びイノシトールモノホスファターゼを添加してインビトロ多酵素反応システムを確立し、酵素触媒反応を行うステップ；及び
（２）反応生成物を分離及び精製してイノシトールを得るステップ
を含み、前記酵素触媒反応が４０℃から１００℃で行われ、セルラーゼがトリコデルマ・リーゼイ由来、セロデキストリンホスホリラーゼがクロストリジウム・サーモセラム由来、セロビオースホスホリラーゼがクロストリジウム・サーモセラム由来、ホスホグルコムターゼがテルモトガ・マリティマ由来、イノシトール−３−リン酸合成酵素がアーケオグロブス・フルギダス由来及びイノシトールモノホスファターゼがテルモトガ・マリティマ由来である、方法。
【請求項６】
ステップ（１）が：
セルロース又はセルロース誘導体をセルラーゼと混合し、遠心分離し、上澄みを除去してセルラーゼとセルロースの混合物を得るステップを含み；
セルラーゼとセルロースの混合物中のセルラーゼがグルコシダーゼを含有せず；
セロデキストリンホスホリラーゼ、セロビオースホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、イノシトール−３−リン酸合成酵素及びイノシトールモノホスファターゼをセルラーゼとセルロースの混合物に添加して多酵素反応システムを確立するステップを含む、請求項５記載の方法。
【請求項７】
該多酵素反応システムが更に、ポリリン酸−グルコキナーゼ及びポリホスファートを含み、ポリホスファートがポリリン酸ナトリウムであり、ポリリン酸−グルコキナーゼがサーモビフィダ・フスカ由来である、請求項６記載の方法。
【請求項８】
ステップ（１）のセルロース誘導体が、セルロース前処理後の生成物、セロデキストリン又はセロビオースのうち任意の１つを含む、請求項５記載の方法。
【請求項９】
該多酵素反応システムが更に、以下の成分：緩衝液、無機リン酸イオン、二価マグネシウムイオン、亜鉛イオン又はマンガンイオンを含む、請求項１又は５記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（技術分野）
本件開示は、イノシトールの調製方法、特にデンプン又はセルロース及びそれらの誘導体を、インビトロでの多酵素触媒を通じ、イノシトールに転換するための方法に関連し、酵素触媒イノシトール生産の分野に属する。
【背景技術】
【０００２】
（背景）
イノシトールは、シクロヘキサンヘキサオールとしても知られているが、水溶性ビタミンＢ群の一種である。イノシトールは、ヒト、動物及び微生物の成長に欠かせない物質であり、医薬品、食品、飼料及びその他の産業で幅広く用いられている。現在の世界需要は年間約５，０００トンである。イノシトールは現在高価であるため、イノシトールの市場展望は十分に発展していない。例えば、世界の飼料生産量は２０１３年に９６０百万トンであり、もし０．２から０．５％のイノシトールが添加されれば、飼料産業におけるイノシトールの需要量は、年間１９０から４８０百万トンに達するはずである。この場合、現在の国内及び世界においてさえ、生産量は全く需要を満たしていない。
現在、イノシトールの伝統的な生産方法は、主としてフィチン酸（イノシトールヘキサホスファート）を高温高圧下で酸加水分解することによる。このプロセスには、設備、一度の巨額な投資、運転圧力は一定範囲内にしか管理できないこと、原材料の使用に制約があること、原材料の精製プロセスが複雑であること、生成物は高損失であり比較的製造コストが高いことという厳しい要件がある。また、該プロセスは、水源及び環境の深刻な汚染を引き起こす大量のリン酸汚染物質を生産する。近年、エネルギー消費量と汚染を低減するため、大気圧下での加水分解法が発達した。現在、イノシトール生産のホットスポットは、化学合成と微生物酵素発酵である。しかしながら、これらの方法は高コスト、低収率の同様の問題に苦しんでいる。
したがって、イノシトールを生産するための低コスト、低汚染及び高収率な新しい方法を開発する喫緊の必要性がある。
【発明の概要】
【０００３】
（概要）
本件開示によって解決すべき技術的な課題は、イノシトールの酵素触媒転換法、すなわち、デンプン又はセルロース及びそれらの誘導体並びにグルコースをインビトロで多酵素触媒することを通じイノシトールを生産する方法を提供することである。該方法は、高いイノシトール収率、高い転換率、低い生産コスト、汚染がない等の有利な点を有する。
上記技術的な課題を解決するため、本件開示によって採用された技術的解決策を以下に記述する。
本件開示はまず以下のステップを含むイノシトールの調製方法を開示する：
（１）デンプン又はデンプン誘導体を基質として用い、α−グルカンホスホリラーゼ（EC 2.4.1.1）、ホスホグルコムターゼ（EC 5.4.2.2）、イノシトール−３−リン酸合成酵素（inositol-3-phophate synthase）（EC 5.5.1.4）及びイノシトールモノホスファターゼ（EC 3.1.3.25）を添加して多酵素反応システムを確立し、酵素触媒反応を行うステップ；及び（２）分離及び精製の後、反応生成物からイノシトールを得るステップ。
ステップ（１）において、基質の濃度は１０ｇ／Ｌ；α−グルカンホスホリラーゼの量は０．０５Ｕ／ｍＬ；ホスホグルコムターゼの量は１Ｕ／ｍＬ；イノシトール−３−リン酸合成酵素の使用量は０．０５Ｕ／ｍＬ；イノシトールモノホスファターゼの量は２Ｕ／ｍＬである。酵素触媒反応の条件は：４０−８０℃で１０から１００時間反応させること；好ましくは６０℃で４０時間反応させることである。
【０００４】
デンプン脱分枝酵素とマルトースホスホリラーゼ（EC 2.4.1.8）、又はデンプン脱分枝酵素とグルカノトランスフェラーゼ（EC 2.4.1.25）を多酵素反応システムに添加することで、イノシトールの収率と転換率を増加させることができる。好ましくは、デンプン脱分枝酵素の量は１Ｕ／ｍＬ；マルトースホスホリラーゼ（EC 2.4.1.8）又はグルカノトランスフェラーゼの量は１Ｕ／ｍＬであり；その場合において、脱分枝酵素はイソアミラーゼ（EC 3.2.1.68）又はプルラナーゼ（EC 3.2.1.41）のいずれか一方又は両方である。
さらに好ましくは、基質の濃度は１０ｇ／Ｌ；α−グルカンホスホリラーゼの量は５Ｕ／ｍＬ；ホスホグルコムターゼの量は１Ｕ／ｍＬ；イノシトール−３−リン酸合成酵素の量は５Ｕ／ｍＬ；イノシトールモノホスファターゼの使用量は２Ｕ／ｍＬ；デンプン脱分枝酵素の使用量は１Ｕ／ｍＬ；マルトースホスホリラーゼ又はグルカノトランスフェラーゼの量は１Ｕ／ｍＬである。
酵素触媒の反応条件は：４０−１００℃で１０から１００時間反応させること；好ましくは、４０−８０℃で４０時間反応させること；最も好ましくは、８０℃で４０時間反応させることである。
イノシトールの収率を更に増加させるため、残ったグルコースをイノシトールに転換させるポリリン酸−グルコキナーゼ（EC 2.7.1.63）及びポリホスファートを多酵素反応システムに添加する。好ましくは、ポリリン酸−グルコキナーゼの量は１Ｕ／ｍＬ；ポリホスファートの量は１０ｍＭであり；その場合において、ポリホスファートは好ましくはポリリン酸ナトリウムである。
【０００５】
多酵素反応システムは更に下記成分を含む：緩衝液、無機リン酸イオン、二価のマグネシウムイオン及び亜鉛イオン又はマンガンイオン。好ましくは各成分の量は：緩衝液が１００ｍＭ、無機リン酸イオンが１０ｍＭ、二価のマグネシウムイオンが５ｍＭ、亜鉛イオン又はマンガンイオンが０．５ｍＭであり；緩衝液は好ましくはＨＥＰＥＳ緩衝液であり、更に好ましくは、ＨＥＰＥＳ緩衝液のｐＨは７．２である。
反応終了後、残ったデンプン残渣は純粋なアミロースであろう。この時点において、デンプン残渣の加水分解を促進し、イノシトールの生産を更に増加させるために、少量のα−アミラーゼ（EC 3.2.1.1）を添加することができる。好ましくは、α−アミラーゼの量は０．１Ｕ／ｍｌである。
【０００６】
本件開示において、デンプン又はデンプン誘導体は基質として用いられ、多酵素反応システムを調製するために、α−グルカンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、イノシトール−３−リン酸合成酵素及びイノシトールモノホスファターゼが添加される。多酵素触媒経路は以下を含む：デンプン又はデンプン誘導体中の１グルコース単位が、α−グルカンホスホリラーゼによってグルコース−１−リン酸に転換され；グルコース−１−リン酸がホスホグルコムターゼによってグルコース−６−リン酸に転換され；グルコース−６−リン酸がイノシトール−３−リン酸合成酵素によってイノシトール−３−ホスファートに転換され；及び、イノシトール−３−ホスファートがイノシトールモノホスファターゼによってイノシトールに転換される。グルコース−６−リン酸をイノシトール−３−リン酸合成酵素によってイノシトール−３−ホスファートに転換し、イノシトール−３−ホスファートをイノシトールモノホスファターゼによってイノシトールに転換する二つの反応は不可逆反応であるため、デンプンからのイノシトール収率は高い。高い収率及び高い転換率が、最終的なイノシトール分離のコストを著しく低減することを可能とする。
【０００７】
デンプンは、アミロース（２０−３０％）とアミロペクチン（７０−８０％）の混合物である。アミロペクチンの分枝鎖は主鎖にα−１，６グリコシド結合を通じて結合し、α−グルカンホスホリラーゼはα−１，６グリコシド結合を分解できない。イノシトールの収率を改善するために、本件開示では、デンプン中のα−１，６グリコシド結合を分解することができる脱分枝酵素、イソアミラーゼ又はプルラナーゼを多酵素反応システムに添加する。α−グルカンホスホリラーゼにより加水分解されたデンプンの最終生成物はマルトースであることから、マルトースを利用するためマルトースホスホリラーゼを反応システムに添加し、それによりマルトースがグルコース−１−リン酸とグルコースに分解される。更に好ましくは、本件開示において、グルコースをグルコース−６−リン酸に転換するため、ポリホスファート及びポリリン酸−グルコキナーゼを更に多酵素反応システムに添加する。該グルコース−６−リン酸は、イノシトール−３−リン酸合成酵素とイノシトールモノホスファターゼによってイノシトールに転換される。最後に、デンプン及びその誘導体中の全てのグルコース単位はイノシトールに転換され、これにより、イノシトールの収率と転換率は増加する。本明細書において、マルトースホスホリラーゼは、短鎖オリゴ糖を長鎖オリゴ糖へと重合させることができる4-α-グルカノトランスフェラーゼ (EC. 2.4.1.25)と置き換えることができ、長鎖のオリゴ糖はグルカンホスホリラーゼによって再利用されることが可能であり、このためデンプンの利用度を改善する。
本件開示におけるデンプンは好ましくは可溶性デンプンである；デンプン誘導体は、任意の１以上の、部分的に加水分解されたデンプン、デンプンデキストリン、マルトデキストリン、マルトオリゴ糖又はマルトースを含む。
【０００８】
本件開示はまた、以下のステップを含む、別のイノシトール調製方法についても記述する：
（１）セルロース又はセルロース誘導体を基質として用い、セルラーゼ、セロデキストリンホスホリラーゼ（EC 2.4.1.49）、セロビオースホスホリラーゼ（EC 2.4.1.20）、ホスホグルコムターゼ (EC 5.4.2.2)、イノシトール−３−リン酸合成酵素（EC 5.5.1.4）及びイノシトールモノホスファターゼ（EC 3.1.3.25）を添加して、多酵素反応システムを確立し、酵素触媒反応を行うステップ；及び（２）分離及び精製の後、反応生成物からイノシトールを得るステップ。
本件開示において、セルロースは基質として用いられる。セルラーゼ、セロデキストリンホスホリラーゼ、セロビオースホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、イノシトール−３−リン酸合成酵素及びイノシトールモノホスファターゼが多酵素反応システムを調製するために添加される。多酵素触媒経路は以下を含む：セルロースはセルラーゼによって加水分解され、セロデキストリン及びセロビオースを生産し；セロデキストリン又はセロビオースの１グルコース単位が、セロデキストリンホスホリラーゼ及びセロビオースホスホリラーゼによってグルコース−１−リン酸に転換され；グルコース−１−リン酸がホスホグルコムターゼによってグルコース−６−リン酸に転換され；グルコース−６−リン酸がイノシトール−３−リン酸合成酵素によってイノシトール−３−ホスファートに転換され：及び、イノシトール−３−ホスファートがイノシトールモノホスファターゼによってイノシトールに転換される。
【０００９】
好ましくは、ステップ（１）の反応条件は：１０ｇ／Ｌのセルロース又はセルロース誘導体及び５Ｕ／ｍｌのセルラーゼを氷水浴中で混合し、５分間氷水浴中に置く；混合物を４℃で遠心分離し、上澄みを捨ててセルラーゼとセルロースの混合物を得る。この処置はほとんど全てのグルコシダーゼを市販のセルラーゼより除去することを可能とし、セロビオースをグルコシダーゼによって加水分解することにより大量のグルコースが生成することが避けられ、主たる加水分解物がセロビオースとセロデキストリンとなる。
多酵素反応システムにおいて、セルラーゼとセルロースの混合物の濃度は１０ｇ／Ｌ；セロデキストリンホスホリラーゼの量は５Ｕ／ｍＬ；セロビオースホスホリラーゼの量は５Ｕ／ｍＬ；ホスホグルコムターゼの量は１Ｕ／ｍＬ；イノシトール−３−リン酸合成酵素の量は５Ｕ／ｍＬ；及びイノシトールモノホスファターゼの量は２Ｕ／ｍＬである。酵素触媒反応の条件は：２０−１００℃で１０から１００時間反応させること；好ましくは、４０−８０℃で７２時間反応させること：最も好ましくは、５０℃で７２時間反応させることである。
【００１０】
更にイノシトールの収率を増加させるため、ポリリン酸−グルコキナーゼ（EC 2.7.1.63）とポリホスファートをステップ（１）の多酵素反応システムに添加する。好ましくは、ポリリン酸−グルコキナーゼの量は５Ｕ／ｍＬ；ポリホスファートの量は１０ｍＭであり；この場合において、ポリホスファートは好ましくはポリリン酸ナトリウムである。
酵素触媒反応の効率と生成物の収率を改善するため、多酵素反応システムは更に以下の成分を含む：緩衝液、無機リン酸イオン、二価のマグネシウムイオン及び亜鉛イオン又はマンガンイオン。好ましくは各成分の量は：緩衝液が１００ｍＭ、無機リン酸イオンが１０ｍＭ、二価のマグネシウムイオンが５ｍＭ、亜鉛イオン又はマンガンイオンが０．５ｍＭであり；この場合において、緩衝液は好ましくはＨＥＰＥＳ緩衝液であり、更に好ましくは、ＨＥＰＥＳ緩衝液のｐＨは７．２である。
ポリリン酸−グルコキナーゼ及びポリホスファートを更に本件開示の多酵素反応システムに添加し、セルロース加水分解の最終生成物であるグルコースをグルコース−６−リン酸に転換し：次いでグルコース−６−リン酸をイノシトール−３−リン酸合成酵素及びイノシトールモノホスファターゼによってイノシトールに転換する。最終的には、セルロース及びその誘導体中の全てのグルコース単位がイノシトールに転換される。
【００１１】
本件開示のセルロース誘導体は、セルロース前処理後の生成物、セロデキストリン又はセロビオースのうち任意の１つを含み；多くの種類のセルロース前処理方法、例えば、酸加水分解、酵素加水分解、物理的方法等がある。本件開示におけるセルロース前処理後の生成物は、好ましくは、濃縮リン酸と一緒にセルロース処理を経た生成物である。
本件開示における多酵素反応システム中の任意の１つの酵素を同じ機能を有する任意の酵素、好ましくは、同じ機能を有する、タンパク質工学によって生成された変異酵素と置き換えることが可能である。
試験において、反応システム中でインビトロで多酵素触媒によってデンプンをイノシトールに転換する本件開示は、原材料として可溶性デンプンが用いられ、グルカンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、イノシトール−３−リン酸合成酵素及びイノシトールモノホスファターゼが反応を触媒するため添加された場合、最終的なイノシトールの収率は１６％であった。イソアミラーゼ、マルトースホスホリラーゼ、ポリリン酸−グルコキナーゼ及びポリリン酸ナトリウムを上記反応システムに合間に添加した後、グルカンホスホリラーゼ及びイノシトール−３−リン酸合成酵素の量を増やすと、最終的なイノシトールの収率は７２％に達し、収率を著しく改善した。
反応システム中でインビトロで多酵素触媒によってセルロースをイノシトールに転換する本件開示の試験において、微結晶セルロース（Ａｖｉｃｅｌ）が基質として用いられ、セルラーゼ、セロデキストリンホスホリラーゼ、セロビオースホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、イノシトール−３−リン酸合成酵素及びイノシトールモノホスファターゼが反応を触媒するために添加された場合、最終的なイノシトール転換率は１４％であり；再生アモルファスセルロースが基質として用いられ、セルラーゼ、セロデキストリンホスホリラーゼ、セロビオースホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、イノシトール−３−リン酸合成酵素及びイノシトールモノホスファターゼが反応を触媒するために添加された場合、最終的なイノシトール転換率は４８％であった。更にポリリン酸−グルコキナーゼ及びポリリン酸ナトリウムを添加すると、最終的なイノシトール転換率は６５％に達し、著しく転換率を改善した。
【００１２】
本件開示の技術的な解決策は、既存技術に比較して、以下の有利な効果を有する。
本件開示における多酵素反応システムにおいて、デンプン又はセルロース及びそれらの誘導体は原材料として用いられ、インビトロ多酵素触媒反応を通じてイノシトールに転換される；プロセス最適化を通じて、デンプン又はセルロースの加水分解を促進するための酵素及び副生成物（グルコース）を用いるための酵素を添加することによって、転換効率は著しく改善される。高収率は、イノシトールを分離するコストを大きく低減し、イノシトールの低い生産コストという結果をもたらす。本件開示の方法は、簡素なプロセス、高い原材料使用率、高い収率、低い生産コスト及び低汚染、並びにイノシトール生産を簡単にスケールアップできる等の利点を有する。
【００１３】
（本件開示で用いられる用語と定義）
別途定義されない限り、本明細書において用いられる全ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する当該技術分野の当業者が通常理解するのと同じ意味を有する。
「酵素触媒反応」という用語は、生体触媒−酵素の活動の下で行われる化学反応を指す。
「グルコースポリマー」という用語は、グルコース分子の重合によるデンプン又はセルロースを指す。
「グルコースオリゴマー」という用語は、部分的に加水分解されたデンプン、デンプンデキストリン、マルトオリゴ糖、マルトース、セロデキストリン又はセロビオース等を指す。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、インビトロでデンプンをイノシトールに転換する多酵素触媒経路の概略図である。該図において：IA、イソアミラーゼ；PA、プルラナーゼ；αGP、α−グルカンホスホリラーゼ；PGM、ホスホグルコムターゼ；IPS、イノシトール−３−リン酸合成酵素；IMP、イノシトールモノホスファターゼ；MP、マルトースホスホリラーゼ（グルカノトランスフェラーゼに置き換え可能）；PPGK、ポリリン酸−グルコキナーゼ、である。
【図２】図２は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）によって検出された４つの鍵となる酵素を示す。該図において：列１、α−グルカンホスホリラーゼ；列２、ホスホグルコムターゼ；列３、イノシトール−３−リン酸合成酵素；列４、イノシトールモノホスファターゼ、である。
【図３】図３は、ＨＰＬＣによるイノシトールの分析を示す。図３ａは、ＨＰＬＣによるイノシトール、グルコース、グルコース−１−リン酸及びグルコース−６−リン酸の同定を示す。図３ｂは、ＨＰＬＣ定量分析によりイノシトールのピーク強度から算出されたイノシトールの濃度を示す。
【図４】図４は、基質として可溶性デンプンが用いられた場合の、酵素触媒反応後にＨＰＬＣにより検出された生成物を示す。矢印はイノシトールの特性ピークを示す。
【図５】図５は、基質としてマルトデキストリンが用いられた場合の、酵素触媒反応後にＨＰＬＣにより検出された生成物を示す。矢印はイノシトールの特性ピークを示す。
【図６】図６は、インビトロでセルロースをイノシトールに転換する多酵素触媒経路の概略図である。該図において：セルラーゼ、セルラーゼ；CDP、セロデキストリンホスホリラーゼ；CBP、セロビオースホスホリラーゼ；PGM、ホスホグルコムターゼ；IPS、イノシトール−３−リン酸合成酵素；IMP、イノシトールモノホスファターゼ；PPGK、ポリリン酸−グルコキナーゼ、である。
【図７】図７は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）によって検出された、セルロースのイノシトールへの転換における２つの鍵となる酵素を示す。該図において：列１、セロビオースホスホリラーゼ；列２、セロデキストリンホスホリラーゼ、である。
【図８】図８は、基質として微結晶セルロース（Ａｖｉｃｅｌ）が用いられた場合の、酵素触媒反応後にＨＰＬＣにより検出された生成物を示す。矢印はイノシトールの特性ピークを示す。
【００１５】
（詳細な説明）
本件開示は、具体的な実施例との関連において更に記述され、本件開示の有利な点及び特性は該説明からより明らかとなろう。実施例は代表的なものにすぎず、それらは本件開示の範囲を限定することを意図していないことが理解されるべきである。当該技術分野の当業者には、本発明の詳細及び形式は本件開示の精神と範囲から逸脱することなく修正又は置き換えが可能であるが、そのような修正又は置き換えは本件開示の範囲に収まることが理解されよう。
（実験材料）
可溶性デンプン、アクロス社製、Cat No.424490020
マルトデキストリン、アルドリッチ社製、Cat No.419672
ｐＥＴ２０ｂベクター、ノヴァゲン社製（Madison、WI）
発現用大腸菌バクテリアBL21(DE3)、インビトロジェン社製（Carlsbad、CA）
本件開示のほとんどの酵素（イノシトールモノホスファターゼ、ポリリン酸−グルコキナーゼ及びグルカノトランスフェラーゼを除く）はシグマ社より市販されている。それらは全て、遺伝子工学の方法を通じ、原核発現によって得ることができる。
セルラーゼ、シグマ社より購入、Cat No. C2730
マルトースホスホリラーゼ、シグマ社より購入、Cat No. M8284
α−アミラーゼ、シグマ社より購入、Cat No. 10065
Ａｖｉｃｅｌ、微結晶セルロース、シグマ社より購入、Cat No. 11365
【実施例】
【００１６】
（実施例）
実施例１．インビトロでの多酵素触媒によるデンプンからイノシトールへの転換
インビトロ多酵素触媒システム（図１）によりデンプンをイノシトールに転換する。鍵となる酵素は以下を含む：（１）α−グルカンホスホリラーゼ (αGP、EC 2.4.1.1)、デンプンからグルコース−１−リン酸を放出する；（２）ホスホグルコムターゼ（PGM、EC 5.4.2.2）、グルコース−１−リン酸を触媒作用によりグルコース−６−リン酸に変える；（３）イノシトール−３−リン酸合成酵素（IPS、EC 5.5.1.4）、グルコース−６−リン酸を触媒作用によりイノシトール−３−リン酸に変える；（４）イノシトールモノホスファターゼ（IMP、EC 3.1.3.25）、イノシトール−３−リン酸からイノシトールへの脱リン酸化を触媒する。最後の二つの酵素反応は不可逆であるため、酵素触媒システムは非常に高い収率を有する。
本件開示において、α−グルカンホスホリラーゼはテルモトガ・マリティマ（Thermotoga maritime）由来であった。KEGG上の遺伝子番号はTM1168である；ホスホグルコムターゼもまたテルモトガ・マリティマ由来であり、KEGG上の遺伝子番号はTM0769であった；イノシトール−３−リン酸合成酵素はアーケオグロブス・フルギダス（Archaeoglobus fulgidus）由来であり、KEGG上の遺伝子番号はAF1794である；イノシトールモノホスファターゼもまたテルモトガ・マリティマ由来であり、KEGG上の遺伝子番号はTM1415である。これらすべてのゲノムＤＮＡは、ＡＴＣＣ公式ウェブサイト（www.atcc.org）から入手可能である。これら４つの遺伝子は、対応するゲノムＤＮＡからＰＣＲによって異なるプライマーを用いて得られ、対応する発現ベクター（pET20b-TmαGP、pET20b-AfIPS、pET20b-TmPGM及びpET20b-TmIMP）を得るためシンプルクローニング (You, C., 他 (2012), "Simple Cloning via Direct Transformation of PCR Product (DNA Multimer) to Escherichia coli and Bacillus subtilis." Appl. Environ. Microbiol. 78(5): 1593-1595.)により、ｐＥＴ２０ｂベクター（ノヴァゲン社製、Madison、WI）にクローンされた。これら４つのプラスミドを、発現用大腸菌バクテリアBL21(DE3)（インビトロジェン社製、Carlsbad、CA）に形質転換し、タンパク質発現及び精製を行った。タンパク質精製の結果は、図２に示した。
【００１７】
１００ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）、１０ｍＭの無機リン酸イオン、５ｍＭの二価マグネシウムイオン、０．５ｍＭの亜鉛イオン、０．０５Ｕ／ｍＬのα−グルカンホスホリラーゼ、１Ｕ／ｍＬのホスホグルコムターゼ、０．０５Ｕ／ｍＬのイノシトール−３−リン酸合成酵素、２Ｕ／ｍＬのイノシトールモノホスファターゼ及び１０ｇ／Ｌの可溶性デンプンを含む０．７５ｍｌの反応システムを６０℃で４０時間、触媒反応に供した。
反応溶液中のイノシトール、グルコース、グルコース−１−リン酸又はグルコース−６−リン酸を、保持時間によって、ＨＰＬＣを用いて識別することができる（図３ａ）；図３ｂに示すとおり、イノシトールはＨＰＬＣによって定量することができ、イノシトールの濃度は、ＨＰＬＣにおけるイノシトール特性ピークの強度に比例する。ＨＰＬＣの移動相は、５ｍＭの希硫酸であった。
反応終了後、最終的なイノシトールの最終濃度は１．６ｇ／Ｌであり（図４）、転換率は１６％であった。
【００１８】
実施例２．インビトロでの多酵素触媒によるデンプンからイノシトールへの転換
α−グルカンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、イノシトール−３−リン酸合成酵素及びイノシトールモノホスファターゼの調製は実施例１と同じである。
１００ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）、１０ｍＭの無機リン酸イオン、５ｍＭの二価マグネシウムイオン、０．５ｍＭの亜鉛イオン、０．０５Ｕ／ｍＬのα−グルカンホスホリラーゼ、１Ｕ／ｍＬのホスホグルコムターゼ、０．０５Ｕ／ｍＬのイノシトール−３−リン酸合成酵素、２Ｕ／ｍＬのイノシトールモノホスファターゼ及び１０ｇ／Ｌの可溶性デンプンを含む０．７５ｍｌの反応システムを４０℃で４０時間、触媒反応に供した。
反応終了後、最終的なイノシトールの最終濃度（図４）は、０．９ｇ／Ｌであり転換率は９％であった。
【００１９】
実施例３．インビトロでの多酵素触媒によるデンプンからイノシトールへの転換
α−グルカンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、イノシトール−３−リン酸合成酵素及びイノシトールモノホスファターゼの調製は実施例１と同じである。
１００ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）、１０ｍＭの無機リン酸イオン、５ｍＭの二価マグネシウムイオン、０．５ｍＭの亜鉛イオン、０．０５Ｕ／ｍＬのα−グルカンホスホリラーゼ、１Ｕ／ｍＬのホスホグルコムターゼ、０．０５Ｕ／ｍＬのイノシトール−３−リン酸合成酵素、２Ｕ／ｍＬのイノシトールモノホスファターゼ及び１０ｇ／Ｌの可溶性デンプンを含む０．７５ｍｌの反応システムを８０℃で４０時間、触媒反応に供した。
反応終了後、最終的なイノシトールの最終濃度は、３．６ｇ／Ｌであり転換率は３６％であった。
【００２０】
実施例４．プロセス最適化及びデンプン加水分解を促進する酵素の添加を通じたインビトロでの多酵素触媒によるデンプンからイノシトールへの転換
グルカンホスホリラーゼのみを用いてもデンプンを完全に加水分解することはできない。デンプンには主鎖にα−１，６グリコシド結合で結合した分枝鎖があり、グルカンホスホリラーゼはα−１，４グリコシド結合にのみ作用するからである。このことが、α−１，６グリコシド結合を加水分解するためにイソアミラーゼ（EC 3.2.1.68）を添加することを必要とする。最終的に、これら二つの酵素によるデンプン加水分解の最終生成物は、マルトースとグルコースである。該最終生成物をイノシトールに転換するため、マルトースホスホリラーゼ（EC 2.4.1.8）及びポリリン酸−グルコキナーゼ（EC 2.7.1.63）を更に添加することが必要である。
本件開示において、イソアミラーゼは、スルホロブス・トコダイイ（Sulfolobus tokodaii）由来であり、KEGG上の遺伝子番号はST0928である：この株のゲノムDNAは、有難いことに、アルベルト・ルートヴィヒ大学フライブルク（ドイツ）のGeorg Fuchs教授により提供されている。ポリリン酸−グルコキナーゼは、サーモビフィダ・フスカ（Thermobifida fusca）由来であり、KEGG上の遺伝子番号はTfu1811である；この株のゲノムDNAは、有難いことに、コーネル大学（米国）のDavid Wilson教授により提供されている。グルカノトランスフェラーゼは、テルモコッカス・リトラリス（Thermococcus litoralis）由来であり、KEGG上の遺伝子番号はOCC_10078である；この株のゲノムＤＮＡは、ＡＴＣＣ公式ウェブサイト（www.atcc.org）から入手可能である。これら３つの遺伝子は、対応するゲノムＤＮＡからＰＣＲによって異なるプライマーを用いて得られ、対応する発現ベクター（pET20b-StIA、pET20b-TfuPPGK及びpET20b-Ti4GT）を得るためシンプルクローニング(You, C., 他 (2012), "Simple Cloning via Direct Transformation of PCR Product (DNA Multimer) to Escherichia coli and Bacillus subtilis." Appl. Environ. Microbiol. 78(5): 1593-1595.)によりｐＥＴ２０ｂベクターにクローンされた。これら３つのプラスミドを、発現用大腸菌バクテリアBL21 (DE3)（インビトロジェン,社製、Carlsbad、CA）に形質転換し、タンパク質発現及び精製を行った。
α−グルカンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、イノシトール−３−リン酸合成酵素及びイノシトールモノホスファターゼの調製は、実施例１と同じである。マルトースホスホリラーゼはシグマ社から購入した（Cat No. M8284）。
【００２１】
１００ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）、１０ｍＭの無機リン酸イオン、５ｍＭの二価マグネシウムイオン、０．５ｍＭの亜鉛イオン、５Ｕ／ｍＬのα−グルカンホスホリラーゼ、１Ｕ／ｍＬのホスホグルコムターゼ、５Ｕ／ｍＬのイノシトール−３−リン酸合成酵素、２Ｕ／ｍＬのイノシトールモノホスファターゼ、１Ｕ／ｍＬのイソアミラーゼ、１Ｕ／ｍＬのマルトースホスホリラーゼ、１Ｕ／ｍＬのポリリン酸−グルコキナーゼ、１０ｍＭのポリリン酸ナトリウム及び１０ｇ／Ｌの可溶性デンプンを含む０．７５ｍｌの反応システムを８０℃で４０時間、触媒反応に供した。最終的なイノシトールの最終濃度は７．２ｇ／Ｌであり（図４）、転換率は７２％に達した。
【００２２】
実施例５．プロセス最適化及びデンプン加水分解を促進する酵素の添加を通じたインビトロ多酵素触媒によるデンプンからイノシトールへの転換
α−グルカンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、イノシトール−３−リン酸合成酵素及びイノシトールモノホスファターゼの調製は実施例１と同じである。ポリリン酸−グルコキナーゼの調製は、実施例４と同じである。プルラナーゼ（EC 3.2.1.41）はシグマ社から購入した（Cat No. P1067）；マルトースホスホリラーゼはシグマ社から購入した（Cat No. M8284）。
シグマ社から購入したプルラナーゼは高温（８０℃）で反応しないため、可溶性デンプンをプルラナーゼとともに３７℃で最初に処置し、続いて他の酵素を添加した。反応は８０℃で実施された。
１００ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）、１０ｍＭの無機リン酸イオン、５ｍＭの二価マグネシウムイオン、０．５ｍＭの亜鉛イオン、１Ｕ／ｍＬのプルラナーゼ、１０ｍＭのポリリン酸ナトリウム及び１０ｇ／Ｌの可溶性デンプンを含む０．７５ｍｌの反応システムを３７℃で触媒反応に供した。１０時間後、５Ｕ／ｍＬのα−グルカンホスホリラーゼ、１Ｕ／ｍＬのホスホグルコムターゼ、５Ｕ／ｍＬのイノシトール−３−リン酸合成酵素、２Ｕ／ｍＬのイノシトールモノホスファターゼ、１Ｕ／ｍＬのマルトースホスホリラーゼ及び１Ｕ／ｍＬのポリリン酸−グルコキナーゼを添加し、触媒反応を８０℃で４０時間実施した。最終的なイノシトールの最終濃度は７．３ｇ／Ｌであり（図４）、転換率は７３％に達した。
続いて、デンプン残渣の加水分解を促進しイノシトール生成量を増加させるため、少量のα−アミラーゼを反応システムに添加した。α−アミラーゼの量は０．１Ｕ／ｍｌであり、反応は３７℃で６時間、次いで８０℃で２４時間実施された。最終的なイノシトール（図４）の最終濃度は８．８ｇ／Ｌであり転換率は８８％に達した。
【００２３】
実施例６．インビトロでの多酵素触媒による、マルトデキストリンからイノシトールへの転換
α−グルカンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、イノシトール−３−リン酸合成酵素及びイノシトールモノホスファターゼの調製は実施例１と同じである。イソアミラーゼ及びポリリン酸−グルコキナーゼの調製は実施例４と同じである。マルトースホスホリラーゼはシグマ社から購入した（Cat No. M8284）。
１００ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）、１０ｍＭの無機リン酸イオン、５ｍＭの二価マグネシウムイオン、０．５ｍＭの亜鉛イオン、５Ｕ／ｍＬのα−グルカンホスホリラーゼ、１Ｕ／ｍＬのホスホグルコムターゼ、５Ｕ／ｍＬのイノシトール−３−リン酸合成酵素、２Ｕ／ｍＬのイノシトールモノホスファターゼ、１Ｕ／ｍＬのイソアミラーゼ、１Ｕ／ｍＬのマルトースホスホリラーゼ、１Ｕ／ｍＬのポリリン酸−グルコキナーゼ、１０ｍＭのポリリン酸ナトリウム及び１０ｇ／Ｌのマルトデキストリン（アルドリッチ社製、Cat No. 419672）を含む０．７５ｍｌの反応システムを８０℃で４０時間、触媒反応に供した。最終的なイノシトール（図５）の最終濃度は７．８ｇ／Ｌであり、転換率は７８％に達した。
【００２４】
実施例７．インビトロでの多酵素触媒による、セルロースからイノシトールへの転換
インビトロでの多酵素触媒による、セルロースからイノシトールへの転換の概略図を図６に示す。
セルラーゼはシグマ社から（Cat No. C2730）；ホスホグルコムターゼ、イノシトール−３−リン酸合成酵素及びイノシトールモノホスファターゼの調製は実施例１と同じである。
セロデキストリンホスホリラーゼ（Cthe_2989）及びセロビオースホスホリラーゼ（Cthe_0275）は両方ともクロストリジウム・サーモセラム（Clostridium thermocellum）由来である。これら二つの遺伝子は対応するゲノムＤＮＡ（ゲノムＤＮＡはＡＴＣＣの公式ウェブサイト(www.atcc.org)から入手できる)からＰＣＲによって異なるプライマーを用いて得られ、対応する発現ベクター（pET20b-CthCDP及びpET20b-CthCBP）を得るためシンプルクローニング（You, C., 他 (2012)）によりｐＥＴ２０ｂベクターにクローンされた。
２つのプラスミドの両方を、発現用大腸菌バクテリアBL21(DE3)に形質転換し、タンパク質発現及び精製を行った。タンパク質精製の結果は図７に示す。
本実験において、微結晶セルロース（Ａｖｉｃｅｌ）が基質として用いられた。最初に市販のセルラーゼ（５Ｕ／ｍｌ）及びセルロース（１０ｇ／Ｌ）を氷水浴中で混合し、５分間置いた；混合物を４℃で遠心分離し、上澄みを捨てた。ペレットは、セルロース及びセルロースに結合することができるセルラーゼの混合物であった。この処置は、ほとんど全てのグルコシダーゼを市販のセルラーゼから除去し、グルコシダーゼによるセロビオースの加水分解からの大量のグルコースの生成を避け、それにより主要な加水分解物はセロビオース及びセロデキストリンである。
１００ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）、１０ｍＭの無機リン酸イオン、５ｍＭの二価マグネシウムイオン、０．５ｍＭの亜鉛イオン、５Ｕ／ｍＬのセロデキストリンホスホリラーゼ、５Ｕ／ｍＬのセロビオースホスホリラーゼ、１Ｕ／ｍＬのホスホグルコムターゼ、５Ｕ／ｍＬのイノシトール−３−リン酸合成酵素、２Ｕ／ｍＬのイノシトールモノホスファターゼ及び１０ｇ／Ｌのセルロース及びセルラーゼの混合物を含む０．７５ｍｌの反応システムを５０℃で７２時間、触媒反応に供した。図８に示すとおり、最終的なイノシトールの最終濃度は１．４ｇ／Ｌであり、転換率は１４％に達した。
【００２５】
実施例８．インビトロでの多酵素触媒による、セルロースからイノシトールへの転換
セルラーゼはシグマ社から（Cat No. C2730）；ホスホグルコムターゼ, イノシトール-3-リン酸合成酵素及びイノシトールモノホスファターゼの調製は実施例１と同じである；セロデキストリンホスホリラーゼ及びセロビオースホスホリラーゼの調製は実施例７と同じである。
本実験では、再生アモルファスセルロース（ＲＡＣ）を基質として用いた。これは、Ａｖｉｃｅｌの製品を濃縮リン酸処置（Zhang, Y. H. P., et al. (2006), "A Transition from Cellulose Swelling to Cellulose Dissolution by o-Phosphoric Acid: Evidence from Enzymatic Hydrolysis and Supramolecular Structure." Biomacromolecules 7(2): 644-648.）したものである。最初に市販のセルラーゼ（５Ｕ／ｍｌ）及びセルロース（１０ｇ／Ｌ）を氷水浴中で混合し、氷水浴中に５分間置いた；混合物を４℃で遠心分離し、上澄みを除去した。ペレットは、セルロース及びセルロースに結合することができるセルラーゼの混合物であった。
１００ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）、１０ｍＭの無機リン酸イオン、５ｍＭの二価マグネシウムイオン、０．５ｍＭの亜鉛イオン、５Ｕ／ｍＬのセロデキストリンホスホリラーゼ、５Ｕ／ｍＬのセロビオースホスホリラーゼ、１Ｕ／ｍＬのホスホグルコムターゼ、５Ｕ／ｍＬのイノシトール−３−リン酸合成酵素、２Ｕ／ｍＬのイノシトールモノホスファターゼ及び１０ｇ／Ｌのセルロース及びセルラーゼの混合物を含む０．７５ｍｌの反応システムを５０℃で７２時間、触媒反応に供した。最終的なイノシトールの最終濃度は４．８ｇ／Ｌであり、転換率は４８％に達した。
【００２６】
実施例９．インビトロでの多酵素触媒による、セルロースからイノシトールへの転換
セルラーゼはシグマ社から（Cat No. C2730）である。ホスホグルコムターゼ、イノシトール-3-リン酸合成酵素及びイノシトールモノホスファターゼの調製は実施例１と同じである；セロデキストリンホスホリラーゼ及びセロビオースホスホリラーゼの調製は実施例７と同じである。
１００ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）、１０ｍＭの無機リン酸イオン、５ｍＭの二価マグネシウムイオン、０．５ｍＭの亜鉛イオン、５Ｕ／ｍＬのセロデキストリンホスホリラーゼ、５Ｕ／ｍＬのセロビオースホスホリラーゼ、１Ｕ／ｍＬのホスホグルコムターゼ、５Ｕ／ｍＬのイノシトール−３−リン酸合成酵素、２Ｕ／ｍＬのイノシトールモノホスファターゼ及び１０ｇ／Ｌの実施例８のセルロース及びセルラーゼの混合物を含む０．７５ｍｌの反応システムを４０℃で７２時間、触媒反応に供した。最終的なイノシトールの最終濃度は２．３ｇ／Ｌであり転換率は２３％に達した。
実施例１０．インビトロでの多酵素触媒による、セルロースからイノシトールへの転換  セルラーゼはシグマ社からである（Cat No. C2730）；ホスホグルコムターゼ、イノシトール−３−リン酸合成酵素及びイノシトールモノホスファターゼの調製は実施例１と同じである；セロデキストリンホスホリラーゼ及びセロビオースホスホリラーゼの調製は実施例７と同じである。
１００ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）、１０ｍＭの無機リン酸イオン、５ｍＭの二価マグネシウムイオン、０．５ｍＭの亜鉛イオン、５Ｕ／ｍＬのセロデキストリンホスホリラーゼ、５Ｕ／ｍＬのセロビオースホスホリラーゼ、１Ｕ／ｍＬのホスホグルコムターゼ、５Ｕ／ｍＬのイノシトール−３−リン酸合成酵素、２Ｕ／ｍＬのイノシトールモノホスファターゼ及び１０ｇ／Ｌの実施例８のセルロース及びセルラーゼの混合物を含む０．７５ｍｌの反応システムを８０℃で７２時間、触媒反応に供した。最終的なイノシトールの最終濃度は１．９ｇ／Ｌであり転換率は１９％に達した。
【００２７】
実施例１１．インビトロでの多酵素触媒による、セルロースからイノシトールへの転換  セルロース加水分解の最終生成物はグルコースであるので、これをイノシトールに転換するためにポリリン酸−グルコキナーゼ及びポリリン酸を添加する必要がある。
セルラーゼはシグマ社からのものである（Cat No. C2730）；ホスホグルコムターゼ、イノシトール−３−リン酸合成酵素及びイノシトールモノホスファターゼの調製は実施例１と同じである；ポリリン酸−グルコキナーゼの調製は実施例４と同じである；セロデキストリンホスホリラーゼ及びセロビオースホスホリラーゼの調製は実施例７と同じである。
１００ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）、１０ｍＭの無機リン酸イオン、５ｍＭの二価マグネシウムイオン、０．５ｍＭの亜鉛イオン、５Ｕ／ｍＬのセロデキストリンホスホリラーゼ、５Ｕ／ｍＬのセロビオースホスホリラーゼ、１Ｕ／ｍＬのホスホグルコムターゼ、５Ｕ／ｍＬのイノシトール−３−リン酸合成酵素、２Ｕ／ｍＬのイノシトールモノホスファターゼ、１０ｇ／Ｌの実施例８のセルロース及びセルラーゼの混合物、５Ｕ／ｍＬのポリリン酸−グルコキナーゼ並びに１０ｍＭのポリリン酸ナトリウムを含む０．７５ｍｌの反応システムを５０℃で７２時間、触媒反応に供した最終的なイノシトールの最終濃度は６．５ｇ／Ｌであり（図８）、転換率は６５％に達した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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