(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の段階を含む、SEQ ID NO:01の核酸配列を有するプロモーター核酸に機能的に連結された、ポリペプチドをコードする構造遺伝子を含む核酸を含有する、細胞クローン/細胞株を選択する方法：
(a)  第1の細胞クローン/細胞株群について、SEQ ID NO:01のヌクレオチド配列を有するプロモーター核酸に近接するヒストン3のレベルに対するヒストン3アセチル化のレベル(H3ac/H3)を測定する段階；
(b)  第2の細胞クローン/細胞株群について、SEQ ID NO:01の位置425でのCpG部位のメチル化頻度を測定する段階；および
(c)  段階(a)で測定されたヒストン3のレベルに対するヒストン3アセチル化のレベルが0.5を上回り、かつ段階(b)で測定された位置425でのCpG部位のメチル化頻度が5％未満である、SEQ ID NO:01の核酸配列を有するプロモーター核酸に機能的に連結された、ポリペプチドをコードする構造遺伝子を含む核酸を含有する、細胞クローン/細胞株を選択する段階。
【請求項２】
以下の段階を含む、SEQ ID NO:01の核酸配列を有するプロモーター核酸に機能的に連結された、ポリペプチドをコードする構造遺伝子を含む核酸を含有する、細胞クローン/細胞株を選択する方法：
(a)  SEQ ID NO:01の核酸配列を有するプロモーター核酸に機能的に連結された、ポリペプチドをコードする構造遺伝子を含む核酸を含有する、第1の細胞クローン/細胞株群の各細胞クローン/細胞株について、各細胞クローン/細胞株の培養物から得られた少なくとも10個の細胞で測定された、SEQ ID NO:01のヌクレオチド配列を有するプロモーター核酸に近接するヒストン3のレベルに対するヒストン3アセチル化のレベル(H3ac/H3)に基づいて、該ヒストン3のレベルに対するヒストン3アセチル化のレベル(H3ac/H3)の平均を測定する段階；
(b)  SEQ ID NO:01の核酸配列を有するプロモーター核酸に機能的に連結された、ポリペプチドをコードする構造遺伝子を含む核酸を含有する、第2の細胞クローン/細胞株群の各細胞クローン/細胞株について、各細胞クローン/細胞株の培養物から得られた少なくとも10個の細胞について測定されたメチル化に基づいて、SEQ ID NO:01の位置425でのCpG部位のメチル化頻度の平均を測定する段階；および
(c)  ヒストン3のレベルに対するヒストン3アセチル化のレベル(H3ac/H3)の平均が0.5以上であり、かつ位置425でのメチル化頻度が5％未満である、細胞クローン/細胞株を選択する段階。
【請求項３】
前記ポリペプチドが抗体軽鎖であり、
前記方法が、
(ab)  安定に組み込まれた軽鎖発現カセットのコピー数を測定する段階
をさらに含み、
段階(c)が、
段階(a)で測定されたヒストン3のレベルに対するヒストン3アセチル化のレベルが0.5を上回り、段階(b)で測定された位置425でのCpG部位のメチル化頻度が5％未満であり、かつ段階(ab)で測定された安定に組み込まれた軽鎖発現カセットのコピー数が10以下である、細胞クローン/細胞株を選択する段階
である、
請求項1または2記載の方法。
【請求項４】
第1の細胞群と第2の細胞群が同じ細胞群である、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
ヒストン3のレベルに対するヒストン3アセチル化のレベル(H3ac/H3)を測定する段階が、
(1)  細胞クローン/細胞株のそれぞれからクロマチンを単離する段階；
(2)  該クロマチンの第1のアリコートをヒストン3アセチル化特異的抗体またはヒストン3特異的抗体で処理して抗体-クロマチン沈降物を形成させる段階および該クロマチンの第2のアリコートをヒストン3特異的抗体で処理して抗体-クロマチン沈降物を形成させる段階；
(3)  リアルタイム定量的PCRを用いて、該クロマチンの未処理の第3のアリコートから、ならびに処理済みの第1および第2のアリコートからゲノムDNAを増幅する段階；ならびに
(4)  段階(3)で得られた結果を用いて、ヒストン3のレベルに対するヒストン3アセチル化のレベルを測定する段階
を含む、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
メチル化頻度を測定する段階が、
(1)  細胞クローン/細胞株のそれぞれからDNAを単離する段階；
(2)  単離した各DNAについてメチル化特異的ポリメラーゼ連鎖反応を個別に行う段階；および
(3)  段階(2)で得られた結果を用いて、メチル化頻度を測定する段階
を含む、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
段階(2)が、
(2)  単離した各DNAについてメチル化特異的プライマーおよびユニバーサルプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応を個別に行う段階
である、請求項6記載の方法。
【請求項８】
ユニバーサルプライマーがSEQ ID NO:09および11の配列を有し、メチル化特異的プライマーがSEQ ID NO:11および18の配列を有する、請求項7記載の方法。
【請求項９】
ヒストン3のレベルに対するヒストン3アセチル化のレベル(H3ac/H3)が基準遺伝子に対して正規化される、請求項1〜8のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
基準遺伝子がGusbであることを特徴とする、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
第2の細胞クローン/細胞株群が、第1の細胞クローン/細胞株群にも含まれる少なくとも1つの細胞クローン/細胞株を含む、請求項1〜10のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
第2の細胞クローン/細胞株群が第1の細胞クローン/細胞株群と同一である、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞クローン/細胞株がCHO細胞クローン/細胞株である、請求項1〜12のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
前記ポリペプチドが抗体、抗体フラグメント、または抗体コンジュゲートである、請求項1、2および4〜13のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５】
前記抗体が二重特異性抗体である、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
以下の段階を含む、ポリペプチドを生産する方法：
(a)  請求項1〜15のいずれか一項記載の方法を用いて細胞クローン/細胞株を選択する段階；
(b)  選択された細胞クローン/細胞株を培養する段階；ならびに
(c)  培養培地および/または該細胞クローン/細胞株からポリペプチドを回収し、それによって該ポリペプチドを生産する段階。
【請求項１７】
段階(a)の前に、
(a-3)  非ヒト哺乳動物細胞を準備する段階；
(a-2)   準備した細胞を、SEQ ID NO:01の核酸配列を有するプロモーター核酸に機能的に連結された、ポリペプチドをコードする構造遺伝子を含む核酸を含む核酸でトランスフェクトする段階；
(a-1)  (i)任意で、トランスフェクトされた細胞クローン/細胞株を選択剤の存在下で培養し、(ii)該トランスフェクト細胞を単一付着させ（single depositing）、そして(iii)該単一付着させたトランスフェクト細胞を選択剤の存在下で培養する段階
を含む、請求項16記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書で報告する方法は、細胞選択およびポリペプチド発現/生産の分野に関する。詳細には、本明細書では、ヒストンアシル化の測定に基づいて、長期にわたりポリペプチドを発現または分泌する細胞を選択するための方法が報告される。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
DNAは、あらゆる既知の生存生物の命令をコードする巨大分子である(Avery, O.T., et al., J. Exp. Med. 79 (1944) 137-158（非特許文献1）)。ヒト細胞において、DNAは約2メートルの長さを有しており、主に10μmの直径を有する核内に収納されている(Turner, B.M., Cell 111 (2002) 285-291（非特許文献2）)。この情報量を整理するために、DNAは高度に圧縮される必要がある。ヒストンと呼ばれる、保存された小さな塩基性タンパク質のグループは、DNAと複合体を形成して、クロマチンと称する秩序あるコンパクトな構造を形成している。これらの正に荷電したタンパク質は、DNA二重らせんの負に荷電したリン酸ジエステル骨格と相互作用する(Alberts, B.J.A., et al., Molecular Biology of the Cell（非特許文献3）; Meyers, R.A., Epigenetic Regulation and Epigenomics, WILEY-BLACKWELL, 1（非特許文献4）; Olins, E.D., Nat. Rev. Mol. Cell Biol. (2003)（非特許文献5）)。4種の「コア」ヒストンH2A、H2B、H3およびH4は、DNAと組み合わさって、ヌクレオソームと呼ばれる、クロマチンの基本的な繰り返し単位を形成している(Thomas, J.O. and Kornberg, R.D., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72 (1975) 2626-2630（非特許文献6）)。225kDaのヌクレオソームのコア構造は、2つのH2A/H2B二量体と1つのH3/H4四量体を含むヒストン八量体のまわりに1.67周左回りの超らせんターンで巻き付いた約147bpのDNAから構成されている(Arents, G., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991) 10148-10152（非特許文献7）; Arents, G. and Moudrianakis, E.N., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993), 10489-10493（非特許文献8）; Richmond, T.J., Scientist 13 (1999) 15-15（非特許文献9）)。DNAの接近可能性に応じて、クロマチンは2つのタイプに区別される。転写のために近づきにくい、高度に圧縮されたヘテロクロマチン、および緩く詰まった、転写的に活性なユークロマチン。条件的ヘテロクロマチンは、核内のどこでも形成することができ、多くの場合はプロモーターに局在し、発生的に調節された方法でまたは環境要因に応答して構築される(Chen, T. and Dent, S.Y., Nat. Rev. Genet. 15 (2014), 93-106（非特許文献10）)。
【０００３】
長期培養において生産性が徐々に失われることは、製造用の細胞株の開発に共通する問題である。組換えタンパク質発現の減少は、導入遺伝子のコピー数の損失および/または導入遺伝子プロモーターのサイレンシングに起因する可能性がある。サイレンシングは、プロモーターDNAのCpG部位での直接メチル化、およびクロマチンの主要なタンパク質成分であるヒストンの翻訳後修飾といった、クロマチンのエピジェネティックな修飾によって引き起こされる。ヒストンの不活性化修飾は、活性化する他の修飾によって相殺されている。
【０００４】
Barnes, L.M.らは、組換えNS0骨髄腫細胞における安定したタンパク質発現の予測指標の分子定義を報告している(Biotechnol. Bioeng. 85 (2004) 115-121（非特許文献11）)。Barnesらによって報告された相関は弱く、安定性の予測には十分でない。
【０００５】
WO 2004/056986（特許文献1）には、クロマチンを転写因子に接近しやすくすることが可能なクロマチンオープナーを介して、タンパク質を生産するための手段および方法が報告されている。
【０００６】
WO 2011/128377（特許文献2）には、ヒトサイトメガロウイルス主要前初期プロモーター(hCMV MIE)の直接メチル化は、組換えCHO細胞株の産生不安定性を予測するための初期マーカーとして使用できることが報告されている。
【０００７】
Osterlehner, A.らは、プロモーターのメチル化および導入遺伝子のコピー数が、組換えチャイニーズハムスター卵巣細胞株における不安定なタンパク質産生を予測する、ことを報告している(Biotechnol. Bioeng. 108 (2011) 2670-2681（非特許文献12）)。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】WO 2004/056986
【特許文献２】WO 2011/128377
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Avery, O.T., et al., J. Exp. Med. 79 (1944) 137-158
【非特許文献２】Turner, B.M., Cell 111 (2002) 285-291
【非特許文献３】Alberts, B.J.A., et al., Molecular Biology of the Cell
【非特許文献４】Meyers, R.A., Epigenetic Regulation and Epigenomics, WILEY-BLACKWELL, 1
【非特許文献５】Olins, E.D., Nat. Rev. Mol. Cell Biol. (2003)
【非特許文献６】Thomas, J.O. and Kornberg, R.D., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72 (1975) 2626-2630
【非特許文献７】Arents, G., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991) 10148-10152
【非特許文献８】Arents, G. and Moudrianakis, E.N., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993), 10489-10493
【非特許文献９】Richmond, T.J., Scientist 13 (1999) 15-15
【非特許文献１０】Chen, T. and Dent, S.Y., Nat. Rev. Genet. 15 (2014), 93-106
【非特許文献１１】Barnes, L.M., et al., Biotechnol. Bioeng. 85 (2004) 115-121
【非特許文献１２】Osterlehner, A., et al., Biotechnol. Bioeng. 108 (2011) 2670-2681
【発明の概要】
【００１０】
個別のポリペプチドの生産のために用いられる細胞または細胞株において、ポリペプチドをコードする構造遺伝子に機能的に連結されたプロモーター核酸中の特定のCpG部位のメチル化度の測定は、プロモーターに近接する、すなわちプロモータークロマチン中の、ヒストンアシル化の測定と組み合わせて、長期培養中の生産性の低下を予測するために使用できることが見いだされた。さらに、ゲノムに組み込まれた軽鎖発現カセットのコピー数が測定され得る。
【００１１】
本明細書で報告する一局面は、以下の段階を含む、プロモーター核酸に機能的に連結された、ポリペプチドをコードする構造遺伝子を含む核酸を含有する、細胞クローン/細胞株を選択する方法である：
(a)  第1の細胞クローン/細胞株群について、プロモーター核酸に近接するヒストン3のレベルに対するヒストン3アセチル化の(相対)レベル(H3ac/H3)を測定する段階；および
(b)  段階(a)で測定されたヒストン3のレベルに対するヒストン3アセチル化の(相対)レベルが0.1以上である、プロモーター核酸に機能的に連結された、ポリペプチドをコードする構造遺伝子を含む核酸を含有する、細胞クローン/細胞株を選択する段階。
【００１２】
本明細書で報告する一局面は、以下の段階を含む、プロモーター核酸に機能的に連結された、ポリペプチドをコードする構造遺伝子を含む核酸を含有する、細胞クローン/細胞株を選択する方法である：
(a)  プロモーター核酸に機能的に連結された、ポリペプチドをコードする構造遺伝子を含む核酸を含有する、第1の細胞クローン/細胞株群の各細胞クローン/細胞株について、各細胞クローン/細胞株の培養物から得られた少なくとも10個の細胞で測定された、プロモーター核酸に近接するヒストン3のレベルに対するヒストン3アセチル化の(相対)レベル(H3ac/H3)に基づいて、該ヒストン3のレベルに対するヒストン3アセチル化の(相対)レベル(H3ac/H3)の平均を測定する段階；および
(b)  ヒストン3のレベルに対するヒストン3アセチル化の(相対)レベル(H3ac/H3)の平均が0.1以上である細胞クローン/細胞株を選択する段階。
【００１３】
本明細書で報告する一局面は、以下の段階を含む、SEQ ID NO:01の核酸配列を有するプロモーター核酸に機能的に連結された、ポリペプチドをコードする構造遺伝子を含む核酸を含有する、細胞クローン/細胞株を選択する方法である：
(a)  第1の細胞クローン/細胞株群の各クローンについて、SEQ ID NO:01のヌクレオチド配列を有するプロモーター核酸に近接するヒストン3のレベルに対するヒストン3アセチル化の(相対)レベル(H3ac/H3)を測定する段階；
(b)  第2の細胞クローン/細胞株群の各クローンについて、SEQ ID NO:01の位置425でのCpG部位のメチル化頻度を測定する段階；および
(c)  段階(a)で測定されたヒストン3のレベルに対するヒストン3アセチル化の(相対)レベルが0.1以上であり、かつ段階(b)で測定された位置425でのCpG部位のメチル化頻度が5％未満である、SEQ ID NO:01の核酸配列を有するプロモーター核酸に機能的に連結された、ポリペプチドをコードする構造遺伝子を含む核酸を含有する、細胞クローン/細胞株を選択する段階。
【００１４】
本明細書で報告する一局面は、以下の段階を含む、SEQ ID NO:01の核酸配列を有するプロモーター核酸に機能的に連結された、ポリペプチドをコードする構造遺伝子を含む核酸を含有する、細胞クローン/細胞株を選択する方法である：
(a)   SEQ ID NO:01の核酸配列を有するプロモーター核酸に機能的に連結された、ポリペプチドをコードする構造遺伝子を含む核酸を含有する、第1の細胞クローン/細胞株群の各細胞クローン/細胞株について、各細胞クローン/細胞株の培養物から得られた少なくとも10個の細胞で測定された、SEQ ID NO:01のヌクレオチド配列を有するプロモーター核酸に近接するヒストン3のレベルに対するヒストン3アセチル化の(相対)レベル(H3ac/H3)に基づいて、該ヒストン3のレベルに対するヒストン3アセチル化の(相対)レベル(H3ac/H3)の平均を測定する段階；
(b)   SEQ ID NO:01の核酸配列を有するプロモーター核酸に機能的に連結された、ポリペプチドをコードする構造遺伝子を含む核酸を含有する、第2の細胞クローン/細胞株群の各細胞クローン/細胞株について、各細胞クローン/細胞株の培養物から得られた少なくとも10個の細胞について測定されたメチル化に基づいて、SEQ ID NO:01の位置425でのCpG部位のメチル化頻度の平均を測定する段階；
(c)  ヒストン3のレベルに対するヒストン3アセチル化の(相対)レベル(H3ac/H3)の平均が0.1以上であり、かつ位置425でのメチル化頻度が5％未満である、細胞クローン/細胞株を選択する段階。
【００１５】
一態様では、ヒストン3のレベルに対するヒストン3アセチル化の(相対)レベルは、0.2以上である。一態様では、ヒストン3のレベルに対するヒストン3アセチル化の(相対)レベルは、0.5以上である。一態様では、ヒストン3のレベルに対するヒストン3アセチル化の(相対)レベルは、0.75以上である。一態様では、ヒストン3のレベルに対するヒストン3アセチル化の(相対)レベルは、1.0以上である。
【００１６】
好ましい一態様では、ヒストン3のレベルに対するヒストン3アセチル化の(相対)レベルは、0.5以上である。
【００１７】
一態様において、プロモーター核酸はSEQ ID NO:01の配列を有するか、またはその機能性断片もしくはその機能性変異体を含む。一態様では、CpG部位は、SEQ ID NO:01の位置425にあるか、またはその断片もしくは変異体のそれに対応する位置にある。
【００１８】
全ての局面の一態様において、前記方法は、
(ab)  安定に組み込まれた軽鎖発現カセットの(コピー)数を測定する段階
をさらに含み、
段階(c)は、
段階(a)で測定されたヒストン3のレベルに対するヒストン3アセチル化のレベルが0.5を上回り、段階(b)で測定された位置425でのCpG部位のメチル化頻度が5％未満であり、かつ段階(ab)で測定された安定に組み込まれた軽鎖発現カセットの(コピー)数が10以下である、細胞クローン/細胞株を選択する段階
である。
【００１９】
好ましい一態様では、段階(ab)で測定された、安定に組み込まれた軽鎖発現カセットのコピー数は、6以下である。
【００２０】
一態様において、ヒストン3アセチル化の(相対)レベルの平均は、位置4および/または9および/または14および/または18および/または27のリジン残基でのヒストン3アセチル化の(相対)レベルの平均である。一態様では、リジン残基は位置9および/または14および/または27にある。
【００２１】
全ての局面の一態様において、前記方法は、最初の段階として、以下の段階を含む：
- 細胞の集団を、SEQ ID NO:01の核酸配列を有するプロモーター核酸に機能的に連結された、ポリペプチドをコードする構造遺伝子を含む核酸でトランスフェクトし、そこから第1および第2の、任意で第3の、細胞クローン/細胞株群を取得する段階。
【００２２】
一態様において、(選択された)細胞株は、培養の30〜60世代後に、培養開始時の生産量の60％を超える生産率を有する。
【００２３】
本明細書で報告する一局面は、以下の段階を含む、SEQ ID NO:01の核酸配列を有するプロモーター核酸に機能的に連結された、少なくとも抗体軽鎖をコードする構造遺伝子を含む核酸を含有する、細胞クローン/細胞株を選択する方法である：
(a)  第1の細胞クローン/細胞株群の各クローンについて、SEQ ID NO:01のヌクレオチド配列を有するプロモーター核酸に近接するヒストン3のレベルに対するヒストン3アセチル化の(相対)レベル(H3ac/H3)を測定する段階；
(b)  第2の細胞クローン/細胞株群の各クローンについて、安定に組み込まれた軽鎖発現カセットの(コピー)数を測定する段階；
(c)  第3の細胞クローン/細胞株群の各クローンについて、SEQ ID NO:01の位置425でのCpG部位のメチル化頻度を測定する段階；および
(d)  (i)段階(a)で測定されたヒストン3のレベルに対するヒストン3アセチル化の(相対)レベルが0.1以上であり、(ii)段階(b)で測定された位置425でのCpG部位のメチル化頻度が5％未満であり、かつ(iii)段階(ab)で測定された安定に組み込まれた軽鎖発現カセットの(コピー)数が10以下である、SEQ ID NO:01の核酸配列を有するプロモーター核酸に機能的に連結された、ポリペプチドをコードする構造遺伝子を含む核酸を含有する、細胞クローン/細胞株を選択する段階。
【００２４】
本明細書で報告する一局面は、以下の段階を含む、SEQ ID NO:01の核酸配列を有するプロモーター核酸に機能的に連結された、少なくとも抗体軽鎖をコードする構造遺伝子を含む核酸を含有する、細胞クローン/細胞株を選択する方法である：
(a)  SEQ ID NO:01の核酸配列を有するプロモーター核酸に機能的に連結された、ポリペプチドをコードする構造遺伝子を含む核酸を含有する、細胞クローン/細胞株群の各細胞クローン/細胞株について、各細胞クローン/細胞株の培養物から得られた少なくとも10個の細胞で測定された、SEQ ID NO:01のヌクレオチド配列を有するプロモーター核酸に近接するヒストン3のレベルに対するヒストン3アセチル化の(相対)レベル(H3ac/H3)に基づいて、該ヒストン3のレベルに対するヒストン3アセチル化の(相対)レベル(H3ac/H3)の平均を測定する段階；
(b)  該細胞クローン/細胞株群の各細胞クローン/細胞株について、各細胞クローン/細胞株の培養物から得られた少なくとも10個の細胞において安定に組み込まれた軽鎖発現カセットの(コピー)数を測定する段階；
(c)  SEQ ID NO:01の核酸配列を有するプロモーター核酸に機能的に連結された、ポリペプチドをコードする構造遺伝子を含む核酸を含有する、該細胞クローン/細胞株群の各細胞クローン/細胞株について、各細胞クローン/細胞株の培養物から得られた少なくとも10個の細胞で測定されたメチル化に基づく、SEQ ID NO:01の位置425でのCpG部位のメチル化頻度の平均を測定する段階；および
(d)  (i)ヒストン3のレベルに対するヒストン3アセチル化の(相対)レベル(H3ac/H3)の平均が0.1以上であり、(ii)位置425でのメチル化頻度が5％未満であり、かつ(iii)段階(ab)で測定された安定に組み込まれた軽鎖発現カセットの(コピー)数が10以下である、細胞クローン/細胞株を選択する段階。
【００２５】
一態様では、ヒストン3のレベルに対するヒストン3アセチル化の(相対)レベルは、0.2以上である。一態様では、ヒストン3のレベルに対するヒストン3アセチル化の(相対)レベルは、0.5以上である。一態様では、ヒストン3のレベルに対するヒストン3アセチル化の(相対)レベルは、0.75以上である。一態様では、ヒストン3のレベルに対するヒストン3アセチル化の(相対)レベルは、1.0以上である。
【００２６】
好ましい一態様では、ヒストン3のレベルに対するヒストン3アセチル化の(相対)レベルは、0.5以上である。
【００２７】
一態様において、ヒストン3アセチル化の(相対)レベルの平均は、位置4および/または9および/または14および/または18および/または27のリジン残基でのヒストン3アセチル化の(相対)レベルの平均である。一態様では、リジン残基は位置9および/または14および/または27にある。
【００２８】
一態様において、プロモーター核酸はSEQ ID NO:01の配列を有するか、またはその機能性断片もしくはその機能性変異体を含む。一態様では、CpG部位は、SEQ ID NO:01の位置425またはその断片もしくは変異体のそれに対応する位置にある。
【００２９】
好ましい一態様では、段階(b)で測定された、安定に組み込まれた軽鎖発現カセットの(コピー)数は、6以下である。
【００３０】
一態様において、ヒストン3のレベルに対するヒストン3アセチル化の(相対)レベル(H3ac/H3)の測定は、以下の段階を含む：
(1)  細胞クローン/細胞株のそれぞれからクロマチンを単離する段階；
(2)  該クロマチンの第1のアリコートを、ヒストン3アセチル化の(相対)レベルを測定するのに適した抗体、例えばヒストン3アセチル化特異的抗体で処理して抗体-クロマチン沈降物を形成させる段階および該クロマチンの第2のアリコートを、ヒストン3のレベルを測定するのに適した抗体、例えばヒストン3特異的抗体で処理して抗体-クロマチン沈降物を形成させる段階；
(3)  リアルタイム定量的PCRを用いて、該クロマチンの未処理の第3のアリコートから、ならびに処理済みの第1および第2のアリコートからゲノムDNAを増幅する段階；
(4)  段階(3)で得られた結果を用いて、ヒストン3のレベルに対するヒストン3アセチル化の(相対)レベルを測定する段階。
【００３１】
一態様において、メチル化頻度の測定は、以下の段階を含む：
(1)  細胞クローン/細胞株のそれぞれからDNAを単離する段階；
(2)  単離した各DNAについてメチル化特異的ポリメラーゼ連鎖反応を個別に行う段階；
(3)  段階(2)で得られた結果を用いて、メチル化頻度を測定する段階。
【００３２】
一態様では、段階(2)は、
(2)  単離した各DNAについてメチル化特異的プライマーおよびユニバーサルプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応を個別に行う段階
である。
【００３３】
また、一態様では、段階(2)は、
(2)  単離したDNAを制限酵素で個別に消化し、消化したDNAのそれぞれについて、メチル化特異的プライマーおよびユニバーサルプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応を行う段階
である。
【００３４】
一態様において、前記プライマーは、互いに独立して、SEQ ID NO:06〜20からなる群より選択される。
【００３５】
一態様では、プライマーは、SEQ ID NO:11、14および15からなる群より選択され、ユニバーサルプライマーはSEQ ID NO:09の配列を有し、メチル化特異的プライマーはSEQ ID NO:17、18および19からなる群より選択される。
【００３６】
一態様では、ユニバーサルプライマーはSEQ ID NO:09および11の配列を有し、メチル化特異的プライマーはSEQ ID NO:11および18の配列を有する。
【００３７】
一態様では、ヒストン3のレベルに対するヒストン3アセチル化の(相対)レベル(H3ac/H3)は、基準遺伝子に対して正規化される。一態様では、基準遺伝子はGusbである。
【００３８】
一態様において、第2の細胞クローン/細胞株群は、第1の細胞クローン/細胞株群にも含まれる少なくとも1つの細胞クローン/細胞株を含む。一態様では、第2の細胞クローン/細胞株群は、第1の細胞クローン/細胞株群と同一である。
【００３９】
一態様において、細胞クローン/細胞株は、真核細胞クローン/細胞株である。一態様では、細胞クローン/細胞株は、哺乳動物細胞クローン/細胞株である。一態様では、細胞クローン/細胞株は、CHO、BHK、HEK、およびSp2/0から選択される。一態様では、細胞クローン/細胞株は、CHO細胞クローン/細胞株である。一態様では、細胞クローン/細胞株は、CHO K1細胞クローン/細胞株である。
【００４０】
好ましい一態様では、細胞クローン/細胞株は、CHO細胞クローン/細胞株である。
【００４１】
一態様において、前記ポリペプチドは、(i)抗体、(ii)抗体フラグメント、(iii)抗体コンジュゲート、または(iv)抗体軽鎖および抗体重鎖である。一態様では、抗体は二重特異性抗体である。
【００４２】
本明細書で報告する一局面は、以下の段階を含むポリペプチドの生産方法である：
(a)  本明細書で報告する方法を用いて細胞クローン/細胞株を選択する段階；
(b)  選択された細胞クローン/細胞株を培養する段階；ならびに
(c)  培養培地および/または細胞クローン/細胞株からポリペプチドを回収し、それによってポリペプチドを生産する段階。
【００４３】
一態様において、前記方法は、段階(a)の前に、以下の段階を含む：
(a-3)  非ヒト哺乳動物細胞を準備する段階；
(a-2)  準備し細胞を、SEQ ID NO:01の核酸配列を有するプロモーター核酸に機能的に連結された、ポリペプチドをコードする構造遺伝子を含む核酸を含む核酸でトランスフェクトする段階；
(a-1)  (i)任意で、トランスフェクトされた細胞クローン/細胞株を選択剤の存在下で培養し、(ii)トランスフェクトされた細胞を単一付着させ（single depositing）、そして(iii)該単一付着させたトランスフェクト細胞を選択剤の存在下で培養する段階。
【００４４】
本明細書で報告する一局面は、以下の段階を含むポリペプチドの生産方法である：
(a)  本明細書で報告する方法を用いて細胞クローン/細胞株を選択する段階；
(b)  選択された細胞/クローンを培養する段階；ならびに
(c)  培養培地および/または該細胞からポリペプチドを回収し、それによってポリペプチドを生産する段階。
【００４５】
一態様において、前記方法は、さらなる段階を含む：
(d)  回収されたポリペプチドを精製する段階。
【００４６】
一態様において、前記方法は、段階(a)の前に、以下の段階を含む：
(a-3)  細胞を準備する段階；
(a-2)  準備した細胞を、プロモーター核酸に機能的に連結された、ポリペプチドをコードする構造遺伝子を含む核酸でトランスフェクトする段階；
(a-1)  (i)任意で、トランスフェクトされた細胞を選択剤の存在下で培養して増殖させ、(ii)該細胞を単一付着させ、そして(iii)該単一付着させたトランスフェクト細胞を選択剤の存在下で培養する段階。
【００４７】
一態様において、段階(a)は、以下の段階を含む：
(i)  プロモーター核酸に機能的に連結された、ポリペプチドをコードする構造遺伝子を含む核酸を含有する、少なくとも1つの細胞を準備する段階；
(ii)  SEQ ID NO:01のプロモーター核酸内の位置425でのCpG部位のメチル化を測定する段階；および
(iii)  段階(b)で測定されたメチル化が閾値を下回る、ポリペプチドを産生する細胞を選択する段階。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
発明の詳細な説明
小規模から大規模への増殖中に高い生産性と安定した生産レベルを提供するために、経済的な細胞株が必要とされている。スケールアップ時の生産性の低下は、細胞株の開発における重大なリスクとなる(Barnes, L.M., et al., Biotechnol. Bioeng. 81 (2003) 631-639)。生産不安定性の一つの主な理由は、細胞周期にわたって活性なコピー数が減少することであり、これは、CHO細胞に固有の特徴としての染色体の破壊/再配置(Kim, M., et al., Biotechnol. Bioeng. 108 (2011) 2434-2446)および/または遺伝子増幅プロセスによる誘導(Kaufman, R.J., et al., Mol. Cell. Biol. (1983) 699-711)に起因する可能性がある。組換え遺伝子の一定のコピー数でのmRNAの減少は、生産性低下の別の主要な原因である(Barnes, L.M., et al., Biotechnol. Bioeng. 85 (2004) 115-121; Chusainow, J., et al., Biotechnol. Bioeng. 102 (2009) 1182-1196; Strutzenberger, K., et al., J. Biotechnol. 69 (1999) 215-226)。これが発生することの合理的な説明は、プロモーターのメチル化(Osterlehner, A., et al., Biotechnol. Bioeng. 108 (2011) 2670-2681; Yang, Y., et al., J. Biotechnol. 147 (2010) 180-185)と、脱アセチル化および特異的メチル化によって代表されるヒストン修飾(Mutskov, V. and Felsenfeld, G., EMBO J. 23 (2004) 138-149; Paredes, V., et al., Biotechnol. Lett. 35 (2013) 987-993)とによるエピジェネティックなサイレンシングである。また、組換え配列それ自体、配列のタンデムリピートの形成、および導入遺伝子のゲノム位置も、遺伝子サイレンシングの開始要素として提案されている(Kaufman, W.L., et al., Nuc. Acids Res. 36 (2008) e111)。このことから、組込み部位への隣接クロマチンの影響は、「位置効果」(position effect)と呼ばれている(Lattenmayer, C., et al., Cytotechnol. 51 (2006) 171-182; Yin, Z., et al., Genet. Mol. Res. 11 (2012) 355-369)。
【００４９】
組換え遺伝子の上流にあるプロモーターは、遺伝子転写を開始し、かつ遺伝子発現のレベルおよび安定性に影響を及ぼすことができる(Kaufman, W.L., et al., Nuc. Acids Res. 36 (2008) e111)。ヒトサイトメガロウイルスの主要前初期遺伝子プロモーター(hCMV-MIE)は、研究および製造用の哺乳動物細胞において組換え発現を推進して、一過性および安定したトランスフェクションで高い発現レベルを得るためによく使用されている(Boshart, M., et al., Cell 41 (1985) 521-530; Chapman, B.S., et al., Nuc. Acids Res. 19 (1991) 3979-3986; Foecking, M.K. and Hofstetter, H. Gene 45 (1986) 101-105; Wright, A., et al., Hum. Gene Ther. 16 (2005) 881-892)。hCMV-MIEプロモーターは高い遺伝子発現レベルをもたらすが、多くの研究は長期培養にわたる生産性の低下を報告している(Bailey, L.A., et al., Biotechnol. Bioeng. 109 (2012) 2093-2103; Barnes, L.M., et al., Biotechnol. Bioeng. 73 (2001) 261-270; He, L., et al., Biotechnol. Bioeng. 109 (2012) 1713-1722)。hCMV-MIEプロモーターのサイレンシングは、(コピー数の損失に加えて)主にプロモーターのDNAメチル化およびヒストン修飾のエピジェネティックな事象に起因している(Brooks, A.R., et al., J. Gene Med. 6 (2004) 395-404; Kim, M., et al., Biotechnol. Bioeng. 108 (2011) 2434-2446; Osterlehner, A., et al., Biotechnol. Bioeng. 108 (2011) 2670-2681; Paredes, V., et al., Biotechnol. Lett. 35 (2013) 987-993; Yang, Y., et al., J. Biotechnol. 147 (2010) 180-185)。
【００５０】
クロマチンは、遺伝子発現の調節に関与することが知られている。DNAの修飾、またはクロマチンおよび/もしくはクロマチン関連タンパク質、例えばヒストン、の修飾は、クロマチンの構造、それゆえに遺伝子発現、に影響を与える。哺乳動物細胞におけるDNAの修飾は、CpGジヌクレオチド中のシトシン残基のメチル化によるものであり得る。ヒストン、特にそれらのN末端部分は、アセチル化、メチル化、リン酸化またはユビキチン化によって修飾され得る。
【００５１】
細胞の核酸内容物、すなわち、そのDNAは、ヒストンと共に圧縮された形態で細胞核内に存在する。ヒストンはDNAを梱包して、ヌクレオソームへと形作る。ヒトでは5種類の主要なヒストンタンパク質が存在する。ヒストンは高度にアルカリ性のタンパク質である。ヒストンH3(ヒストン3)は主要な球状ドメインとN末端尾部を有する。それは137アミノ酸残基のサイズを有する。ヒストンは一般に、DNAが巻き付くコア構造を提供する機能を有し、遺伝子発現を制御している。
【００５２】
ヒストンは多くの異なる方法で修飾されることがあり、こうした修飾は、主に、個別のヒストンに応じて13〜40アミノ酸長の範囲であるN末端アミノ酸配列の残基に沿って起こる。この多数の修飾は、リジンのメチル化のような一部の修飾が最大3つの異なる状態を含むという事実のために、さらに増加する(Kouzarides, T., Cell 128 (2007) 693-705)。100を超えるヒストン修飾が発見されている(Zentner, G.E. and Henikoff, S., Nat. Struct. Mol. Biol. 20 (2013) 259-266)。ヒストンH3およびヒストンH4の尾部残基のアセチル化とメチル化は、最もよく研究されている修飾である。全体として、14の特徴的な修飾のタイプが見出されており(Dawson, M.A. and Kouzarides, T., Cell 150 (2012) 12-27)、以下の表に示される。
【００５３】
（表）K, リジン; R, アルギニン; S, セリン; T, トレオニン; E, グルタミン酸; P, プロリン; ac, アセチル化; me, メチル化; cit, シトルリン; cr, クロトニル化; pr, プロピオニル化; bu, ブチリル化; fo, ホルミル化; oh, ヒドロキシル化; a, 非対称; s, 対称; ＞, 変換。(Dawson & Kouzarides, 2012)から引用。
0006649276.tif 000002
【００５４】
PTM(翻訳後修飾)モチーフと称される、これらの修飾の組み合わせは、個々のマークよりもむしろ機能に関連している。修飾の組み合わせに関する研究は、200超の異なるPTMモチーフを提案している(Feller, C, et al., Mol. Cell 57 (2015) 559-571)。修飾は可逆的である。
【００５５】
ヒストンH3のリジン9(H3K9)および27(H3K27)でのメチル化は、遺伝子抑制をもたらす修飾であることが知られている。DNAのメチル化は、容易には逆転しない高度に安定したサイレンシングのマークであるのに対し、ヒストンの修飾は不安定な転写抑制をもたらすようである(Cedar, H. and Bergman, Y., Nat. Rev. Gen. 10 (2009) 295-304)。
【００５６】
ヒストンのアセチル化は、最初のヒストン修飾として1961年に発見された(Phillips, D.M., Biochem. J. 87 (1963) 258-263)。初期の研究は、活性な転写遺伝子をヒストンの高アセチル化と関連付けており、これは転写プロセスにおけるアセチル化の機能を示している(Allfrey, V.G., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 51 (1964) 786-794)。S期では、H3K56acなど、アセチル化部位の全体的増加が観察され、続いてG2期では減少が観察された。これは、ヒストンのアセチル化が新たに合成されたヒストンの取り込みを促進する可能性があるという結論につながった(Miller, K.M., et al., Cell Cycle 5 (2006) 2561-2565)。DNA複製時におけるそれらのグローバルな役割に加えて、ヒストンのアセチル化は、活性な転写に相関する特定のゲノムパターンを形成している。これにより、ヘテロクロマチン領域は低アセチル化され、ユークロマチンの転写活性遺伝子は高度にアセチル化される(Kouzarides, T., Cell 128 (2007) 693-705)。アセチル化のピークは、転写開始部位(TSS)に近いプロモーター中の特定の部位に見出される(Wang, Z., et al., Nat. Genet. 40 (2008) 897-903)。ヒストン3のN末端尾部の位置4、9、14、18のヒストンリジン残基およびヒストン4のリジン5、8および12は、主として、アセチル化される傾向がある。まとめると、遺伝子発現の調節、DNAの複製、修復および組換えは、ヒストンの異なるアセチル化状態によって影響を受けている(Dawson, M.A. and Kouzarides, T., Cell 150 (2012) 12-27)。
【００５７】
ヒストンアセチルトランスフェラーゼ(HAT)は、一般的に、遺伝子発現および転写活性化を媒介する(Cheung, P., et al., Cell 103 (2000) 263-271)。非メチル化DNAは、主に、オープンクロマチン(open chromatin)と関連する、アセチル化ヒストンを含むヌクレオソームに組み立てられるのに対して、同じDNA配列上のメチル基の存在は、よりコンパクトなクロマチンにつながる、非アセチル化ヒストンH3およびH4を含むヌクレオソームの組み立てと相関することが、クロマチン免疫沈降を用いて、見出されている(Cedar, H. and Bergman, Y., Nat. Rev. Gen. 10 (2009) 295-304; Eden, S., et al., Nature 394 (1998) 842-843; Hashimshony, T., et al., Nat. Gen. 34 (2003) 187-192)。ヒストンH3は、5種類の天然に存在するヒストンのうち最も過度に修飾されるヒストンである。
【００５８】
転写活性の高い領域では、高度のヒストンアセチル化が見られる。ヒストンのアセチル化は、酵素ヒストンアセチルトランスフェラーゼ(HAT)によって触媒され、この酵素は、アセチル-CoAのアセチル部分を、N末端領域にある特定のヒストンリジン残基のε-アミノ基に転移する。ヒストンのアセチル化は、リジン残基で、例えばH3K9(ヒストン3の9位のリジン)、H3K14、およびH3K27などで、もっぱら起こる(Koch, C.M., et al., Gen. Res. 17 (2007) 691-707; Creyghton, M.P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 107 (2010) 21931-21936)。
【００５９】
一般的に、細胞株の開発時および大規模生産の際には、長期的(大規模)な宿主細胞培養の間に組換え遺伝子発現のサイレンシングが起こることが観察される。哺乳動物細胞においては、これは、例えば、組換え遺伝子の転写を妨げるクロマチン誘導体の形成に起因する可能性がある。
【００６０】
これは、大規模生産(シードトレイン(seed train)発酵と主発酵を含む)におけるような、より長い培養時間の後に不均質な細胞集団をもたらす。この不均質な細胞集団では、一部の細胞は対象となる組換えタンパク質を高レベルで発現し続ける一方で、他の細胞は対象となるタンパク質を低レベルで発現するか、まったく発現しない(例えば、Martin, D.I. and Whitelaw, E., Bioessays 18, (1996) 919-923; McBurney, M.W., et al., Exp. Cell. Res. 274 (2002) 1-8を参照されたい)。
【００６１】
産生細胞株は、一般的に、1個の親細胞からの子孫である。これらの細胞は、多くの場合、培養中にスケールアップされ、大規模発酵(シードトレインおよび生産発酵)で長時間培養されて、結果的に、最大25,000リットルの培養液量および100万細胞/ミリリットルをしばしば超える細胞密度をもたらす。このような大規模発酵は、劇的な生産性の低下をきたすことがある(Migliaccio, A.R., et al., Gene 256 (2000) 197-214; Strutzenberger, K., et al., J. Biotechnol. 69 (1999) 215-226)。
【００６２】
産生細胞株/細胞クローン、すなわち、例えば抗体などの、ポリペプチドの大規模組換え生産に使用することが意図される細胞株/細胞クローン、を選択する場合は、その細胞株/細胞クローンの生産/発現安定性、すなわち世代から世代への生産性の低下、が重要である。かくして、組換えタンパク質生産用の哺乳動物細胞株は、長期培養時間にわたって生産性を維持する必要がある。一般に、細胞クローン/細胞株の生産安定性は、長期間にわたって、すなわち、何世代かにわたって、その細胞クローン/細胞株を培養することによって判定される。定期的に、培地を新鮮な培地で希釈し、細胞あたりの比生産性を産物の力価および生存細胞の密度に基づいて決定する。比生産性の変化(通常は減少)は、細胞クローン/細胞株の長期生産安定性の指標である。
【００６３】
長期安定性の研究は、時間集約的かつ資源集約的であるものの、細胞株の開発中に不安定な候補細胞を特定して排除するために、広く行われている。目標基準に応じて、この研究は30〜60回の細胞分裂を対象にしており、これは一般に30〜70日に相当する。このように、必要とされる材料および作業時間が半端ではない。このことはさらに、試験した細胞株/細胞クローンの最大75％が安定でなく、そのため、多数の細胞株/細胞クローンを評価しなければならないという事実によっても見て取れる。
【００６４】
導入遺伝子の損失のほかに、製造用細胞株の生産不安定性は、導入遺伝子の発現のために使用される異種プロモーターのメチル化およびサイレンシングと関連づけることができる(例えば、Escher, G., et al., J. Lipid Res. 46 (2005) 356-365; Krishnan, M., et al., FASEB J. 20 (2006) 106-108; Yang, Y., et al., J. Biotechnol. 147 (2010) 180-185を参照されたい)。プロモーターのサイレンシングは、クロマチン(細胞の核の内容物を構成するDNAとタンパク質の組み合わせまたは複合体)のエピジェネティックな修飾に起因し得る。これは、例えばヒトサイトメガロウイルス主要前初期プロモーター/エンハンサー(hCMV MIE)などの、プロモーター内のCpGジヌクレオチドの直接メチル化、および/またはヒストンの翻訳後修飾であり得る。ヒストン3のリジン9または27のメチル化などの不活性化ヒストン修飾のほかに、ヒストン3のリジン4のメチル化、またはヒストン3および4の全体的なアセチル化などの、活性化修飾が知られている(例えば、Cedar, H. and Bergman, Y., Nat. Rev. Genet. 10 (2009) 295-304を参照されたい)。
【００６５】
hCMV-MIEプロモーターのCpGメチル化のエピジェネティックな修飾は、長期的な生産安定性の指標として使用された(Osterlehner et al.参照)。
【００６６】
本明細書では、長期的な導入遺伝子サイレンシングの潜在的予測マーカーとしての局部的リジンアセチル化(H3ac)が同定された。
【００６７】
ヒトCMV(hCMV)主要前初期プロモーター/エンハンサー(SEQ ID NO:01)の位置425におけるCpGジヌクレオチドは、不安定な抗体産生チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞株においてしばしばメチル化されることが見出された。hCMV-MIEメチル化の迅速かつ高感度の測定を可能にするために、メチル化特異的なリアルタイムqPCRが確立された。
【００６８】
さらに、該プロモーターに隣接するヒストンの翻訳後修飾は、安定な発現/産生細胞株を同定するためのさらなるマーカーとして使用できることが見出された。不活性化修飾の存在は、それぞれの細胞クローン/細胞株が非常に不安定であり、今後の培養過程で平均を上回る生産性の低下を示すであろう(長期的に不安定な産生細胞クローン/細胞株)ということのマーカーである。一方、活性化修飾の存在は、それぞれの細胞クローン/細胞株が非常に安定であり、今後の培養過程で平均を下回る生産性の低下を示すであろう(長期的に安定な産生細胞クローン/細胞株)ということのマーカーである。
【００６９】
両方の上記マーカーの組み合わせ、すなわち、SEQ ID NO:01の位置425でのメチル化およびプロモーター核酸に近接するヒストン3のレベルに対するヒストン3アセチル化の相対レベル(H3ac/H3)を使用することによって、長期的に安定な産生組換え細胞株/細胞クローンの判定のさらなる改善を達成できることが見出された。さらなる改善は、安定に組み込まれた軽鎖発現カセットの(コピー)数を抗体のケースに含める場合にも、可能である。
【００７０】
したがって、本明細書には、細胞クローン/細胞株を選択するための方法、ならびにこのような細胞クローン/細胞株を用いてポリペプチドを生産するための方法が報告される。選択された細胞クローン/細胞株は長期産生細胞である。このような細胞クローン/細胞株は、本明細書に報告されるように、(i)プロモーター核酸に近接するヒストン3のレベルに対するヒストン3アセチル化の相対レベル(H3ac/H3)、または(ii)該ポリペプチドをコードする構造遺伝子に機能的に連結されたヒトCMV主要前初期(hCMV-MIE)プロモーター/エンハンサーの位置425でのメチル化、または(iii) (i)と(ii)の組み合わせに基づいて、選択することができる。
【００７１】
A. 定義
「ほぼ」という用語は、この表現の後に続く値が若干のばらつきのある中央値であることを示す。一態様において、ばらつきはその値の±40％であり、別の態様では、ばらつきは±30％であり、さらなる態様では、ばらつきは±20％である。したがって、「ほぼ一定」という用語は、ある値が一態様では60％〜140％の範囲にあり、別の態様では70％〜130％の範囲にあり、さらなる態様では80％〜120％の範囲にあることを示す。
【００７２】
「抗体」という用語は、少なくとも2本のいわゆる軽鎖ポリペプチド(軽鎖)と2本のいわゆる重鎖ポリペプチド(重鎖)を含む分子を意味する。重鎖および軽鎖ポリペプチドのそれぞれは、抗原と相互作用することができる結合領域を有する可変ドメイン(可変領域)(一般には、ポリペプチド鎖のアミノ末端部分)を含む。重鎖および軽鎖ポリペプチドのそれぞれはまた、定常領域(一般には、カルボキシ末端部分)を含む。重鎖の定常領域は、(i) Fcガンマ受容体(FcγR)を保有する細胞、例えば食細胞への、または(ii) Brambell受容体としても知られる新生児Fc受容体(FcRn)を保有する細胞への、抗体の結合を仲介する。それはまた、成分(C1q)などの古典的補体系の因子を含めて、いくつかの因子への結合をも仲介する。
【００７３】
本明細書において「抗体」という用語は最も広い意味で用いられ、かつ、所望の抗原結合活性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、および抗体断片を非限定的に含む様々な抗体構造を包含する。
【００７４】
重鎖の定常領域のアミノ酸配列に応じて、抗体は異なるクラスに分割される：IgAクラス、IgDクラス、IgEクラス、IgGクラス、およびIgMクラス。これらのクラスのいくつかはサブクラス(アイソタイプ)にさらに分割され、すなわち、IgGはIgG1、IgG2、IgG3、およびIgG4に、またはIgAはIgA1およびIgA2に分割される。抗体が属するクラスに応じて、重鎖の定常領域は、それぞれα(IgA)、δ(IgD)、ε(IgE)、γ(IgG)、およびμ(IgM)と呼ばれる。一態様において、抗体はIgGクラスの抗体である。別の態様では、抗体がヒト定常領域またはヒト起源に由来する定常領域を有する。さらなる態様では、抗体がIgG4サブクラス、またはFcγ受容体(例えば、FcγRIIIa)結合性および/もしくはC1q結合性が検出されないように修飾されたIgG1、IgG2もしくはIgG3サブクラスのものである。一態様では、抗体がヒトIgG4サブクラスまたは変異ヒトIgG1サブクラスのものである。一態様では、抗体が変異L234AおよびL235Aを含むヒトIgG1サブクラスのものである。別の態様において、抗体は、Fcγ受容体結合性に関して、L234、L235および/またはD265に変異を有するIgG4サブクラスまたはIgG1もしくはIgG2サブクラスのものであり、かつ/または、PVA236変異を含む。さらなる態様では、抗体はS228P、L234A、L235A、L235E、SPLE(S228PおよびL235E)、および/またはPVA236(PVA236は、IgG1のアミノ酸位置233〜236のアミノ酸配列ELLG(一文字アミノ酸コードで示す)またはIgG4のEFLGがPVAで置き換えられることを意味する)から選択される変異を有する。一態様では、抗体はIgG4サブクラスのもので、IgG4の変異S228Pを有するか、または抗体はIgG1サブクラスのもので、変異L234AおよびL235Aを有する。
【００７５】
免疫グロブリンの軽鎖または重鎖の可変ドメインはさらに、異なるセグメント、すなわち、4つのフレームワーク領域(FR)および3つの超可変領域(CDR)を含む。
【００７６】
「亜硫酸水素塩処理」という用語は、核酸内のシトシン塩基を亜硫酸水素イオンの存在下でウラシル塩基に変換するための反応を意味し、5-メチル-シトシン塩基はこれによって有意に変換されない。メチル化シトシンを検出するためのこの反応は、Frommerら(Frommer, M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 1827-1831)およびGriggとClark (Grigg, G.W. and Clark, S., Bioessays 16 (1994) 431-436; Grigg, G.W., DNA Seq. 6 (1996) 189-198)により詳細に説明されている。亜硫酸水素塩反応は脱アミノ化工程と脱スルホン化工程を含み、これらの工程は別々にまたは同時に行うことができる。5-メチル-シトシン塩基は有意に変換されないという記述は、(非メチル化)シトシン塩基を唯一かつ排他的に変換することが意図されるにもかかわらずわずかな割合の5-メチル-シトシン塩基がウラシルに変換されることを排除するわけにいかないという事実を考慮に入れたにすぎない。
【００７７】
「細胞」という用語は、核酸、例えば、(任意で異種の)ポリペプチドをコードする核酸が導入/トランスフェクションされ得るまたはされた細胞を意味する。「細胞」という用語には、プラスミドの増殖のために用いられる原核細胞と、核酸の発現のために用いられる真核細胞の両方が含まれる。一態様において細胞は真核細胞であり、さらなる態様において真核細胞は哺乳動物細胞である。別の態様では、哺乳動物細胞はCHO細胞(例えば、CHO K1、CHO DG44)、BHK細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、HEK 293細胞、HEK 293 EBNA細胞、PER.C6(登録商標)細胞、およびCOS細胞を含む哺乳動物細胞の群より選択される。本明細書中で用いる表現「細胞」には、対象の細胞とその子孫が含まれる。したがって、「細胞」という用語は、対象の初代細胞と、継代数には関係なく、それに由来する培養物を意味する。また、理解されるように、すべての子孫は、故意のまたは故意でない突然変異のため、DNAの内容が正確に同一でない可能性がある。最初に形質転換された細胞においてスクリーニングされたものと同じ機能または生物学的活性を有する変種子孫が包含される。
【００７８】
「CpG部位」という用語は、細胞のメチル化酵素によって認識され得る核酸内のジヌクレオチドCGを表し、ここでシトシンが5-メチルシトシンに変換され得る。一態様において、CpG部位はプロモーター核酸内にある。
【００７９】
「発現カセット」という用語は、少なくとも細胞内に含まれる核酸を発現させるための、プロモーターおよびポリアデニル化部位などの、必要な調節エレメントを含む構築物を表す。
【００８０】
「発現プラスミド」という用語は、細胞内に含まれる構造遺伝子を発現させるための、すべての必要なエレメントを提供する核酸を表す。一般的に、発現プラスミドは、例えば大腸菌(E. coli)の、複製起点を含む原核生物プラスミド増殖単位と、選択マーカーとしての真核生物選択マーカーと、関心対象の構造遺伝子を発現させるための1つ以上の発現カセット(それぞれがプロモーター核酸、構造遺伝子、およびポリアデニル化シグナルなどの転写ターミネーターを含む)を含有する。通常、遺伝子発現はプロモーター核酸の制御下に置かれ、そのような構造遺伝子はプロモーター核酸に「機能的に連結されている」と言われる。同様に、調節エレメントとコアプロモーター核酸は、該調節エレメントがコアプロモーター核酸の活性を調節する場合に、機能的に連結されている。
【００８１】
「世代時間」という用語は、細胞が分裂して娘細胞を生成するのに要する時間を表す。したがって、1回分裂した細胞は1世代の齢を有する。「世代」という用語は、細胞の細胞分裂数を表す。
【００８２】
「高頻度」という用語は、個々の細胞またはDNAクローンのそれぞれ統計的有意数のメチル化の解析に基づいて、そのメチル化部位でシトシンが他のメチル化部位よりも頻繁にメチル化されることを意味する。この統計的有意数とは、一態様では、それぞれ少なくとも10個の細胞またはDNAクローンであり、さらなる態様では、それぞれ少なくとも15個の細胞またはDNAクローンであり、別の態様では、それぞれ少なくとも20個の細胞またはDNAクローンである。一態様では、それぞれ最大400個の細胞またはDNAクローンが解析される。
【００８３】
「長期産生細胞」という用語は、比生産率が少なくとも30世代にわたってほぼ一定している、ポリペプチド(一態様では、異種ポリペプチド)を産生する細胞を意味する。長期産生細胞は、一態様では少なくとも30世代にわたって、別の態様では少なくとも45世代にわたって、さらなる態様では少なくとも60世代にわたって、ほぼ一定の比生産率を有する。長期産生細胞は、一態様では最大60世代にわたって、さらなる態様では最大75世代にわたって、別の態様では最大90世代にわたって、ほぼ一定の比生産率を有する。
【００８４】
「メチル化」という用語は、プロモーターに機能的に連結された、ポリペプチドをコードする構造遺伝子を含む核酸でトランスフェクトされた細胞内における、プロモーター核酸のシトシンが5-メチルシトシンに変換されるプロセスを意味する。少なくとも1個のシトシンが5-メチルシトシンに変換されているプロモーター核酸は、「メチル化」核酸として示される。
【００８５】
本明細書で使用する用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、該集団を構成する個々の抗体は、潜在的な変異型抗体(例えば、自然発生的な突然変異を含むか、またはモノクローナル抗体調製物の製造時に発生する変異体；こうした変異体は一般に少量で存在する)を除けば、同一であり、かつ/または同じエピトープに結合する。典型的には異なる決定基(エピトープ)に対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に向けられたものである。したがって、修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体の集団から得られるという抗体の特徴を示しており、いずれか特定の方法による抗体の作製が必要であると解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、さまざまな技術によって作製することができ、例えば、限定するものではないが、ハイブリドーマ法、組換えDNA法、ファージディスプレイ法、およびヒト免疫グロブリン遺伝子座の全てまたは一部を含むトランスジェニック動物を利用する方法が含まれ、モノクローナル抗体を作製するためのこうした方法および他の例示的な方法は、本明細書に記載される。一態様では、抗体はモノクローナル抗体である。
【００８６】
「機能的に連結された」という用語は、そのように記載された2つ以上の成分がそれらの意図される様式でそれらを機能させる関係にある、該2つ以上の成分の並置を意味する。例えば、プロモーターおよび/またはエンハンサーは、それが連結されたコード配列の転写を制御または調節するためにシスに作用する場合、そのコード配列に機能的に連結されている。一般的に、しかし必ずしもそうではないが、「機能的に連結された」DNA配列は隣接しており、分泌リーダーおよびポリペプチドのような2つのタンパク質コード領域を結合させる必要がある場合には、隣接していて、なおかつ同じ(読み)枠にある。しかしながら、機能的に連結されたプロモーターは一般にコード領域の上流に位置づけられるが、必ずしもコード領域と隣接していない。エンハンサーは隣接している必要がない。エンハンサーがコード配列の転写を高める場合、そのエンハンサーはコード配列に機能的に連結されている。機能的に連結されたエンハンサーは、コード配列の上流、内部または下流に、かつプロモーターからかなりの距離で、位置することができる。ポリアデニル化部位は、転写がコード配列を通ってポリアデニル化配列へと進行するように、コード配列の下流端に位置づけられる場合、コード配列に機能的に連結されている。翻訳停止コドンは、翻訳がコード配列を通って停止コドンまで進行し、そこで終止するように、コード配列の下流端(3'末端)に位置づけられる場合、エクソン核酸配列に機能的に連結されている。連結は、当技術分野で公知の組換え法により、例えばPCR法を用いておよび/または便利な制限部位でのライゲーションにより、達成される。便利な制限部位が存在しない場合は、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが従来の方法に従って用いられる。
【００８７】
「ポリペプチド」という用語は、天然でまたは合成的に生産されたかにかかわらず、ペプチド結合により結合されたアミノ酸からなるポリマーを意味する。約20個より少ないアミノ酸残基のポリペプチドは「ペプチド」と呼ばれることがあるのに対し、2本以上のポリペプチドからなる分子または100個より多いアミノ酸残基のポリペプチド1本を含む分子は「タンパク質」と呼ばれることがある。ポリペプチドはまた、非アミノ酸成分、例えば糖鎖、金属イオン、またはカルボン酸エステルを含んでもよい。非アミノ酸成分はポリペプチドが発現される細胞によって付加され、細胞の種類によって変化し得る。ポリペプチドは、本明細書では、そのアミノ酸主鎖構造またはそれをコードする核酸によって規定される。糖鎖のような付加物は一般に特定されないが、それにもかかわらず存在し得る。
【００８８】
プロモーター核酸の「変異体」という用語は、プロモーター核酸内の1個以上のヌクレオチドがプロモーター核酸の機能を妨げることなく変更されていることを意味する。そうした変更は制限部位を除去または導入するためであり得る。
【００８９】
「産生」という用語は、細胞内での発現カセットに挿入された構造遺伝子の発現を表す。この用語には、核酸の転写および翻訳のプロセスが含まれる。産生は適切な原核または真核細胞において行われ、発現された、すなわち産生されたポリペプチドは、溶解後の細胞からまたは培養上清から回収することができる。
【００９０】
「プロモーター核酸」という用語は、それに機能的に連結されている遺伝子/構造遺伝子または核酸配列の転写を制御する、ポリヌクレオチド配列を意味する。プロモーター核酸にはRNAポリメラーゼの結合および転写開始のためのシグナルが含まれる。用いられるプロモーター核酸は、選択された構造遺伝子の発現が意図される細胞内で機能するものである。さまざまな異なる供給源からの、構成的、誘導性および抑制性プロモーターを含む、多数のプロモーター核酸が当技術分野では周知であり(かつGenBankなどのデータベースで識別されており)、(例えば、ATCCのような寄託機関ならびに他の商業的または個別の供給源から)クローニングされたポリヌクレオチドとして、またはクローニングされたポリヌクレオチド内で利用可能である。
【００９１】
一般的に、プロモーター核酸は遺伝子の5'非コード領域または非翻訳領域に位置しており、構造遺伝子の転写開始部位に近接している。転写開始の段階で機能するプロモーター核酸内の配列エレメントは、しばしば、共通のヌクレオチド配列によって特徴付けられる。こうしたエレメントとしては、以下が挙げられる：RNAポリメラーゼ結合部位、TATA配列、CAAT配列、分化特異的エレメント(DSE)、サイクリックAMP応答エレメント(CRE)、血清応答エレメント(SRE)、グルココルチコイド応答エレメント(GRE)、ならびにCRE/ATF、AP2、SP1、cAMP応答エレメント結合タンパク質(CREB)およびオクタマー因子などの、他の転写因子の結合部位。プロモーター核酸が誘導性プロモーター核酸である場合、転写の速度は誘導剤に応答して増加する。例えば、2つのtetオペレーター部位が後に続くCMVプロモーター核酸、メタロチオネインプロモーター核酸および熱ショックプロモーター核酸など。プロモーター核酸が構成的に活性なプロモーター核酸である場合には、転写速度は誘導剤によって制御されない。中でも、発現用の強力なプロモーター核酸として同定されている真核生物プロモーター核酸は、SV40初期プロモーター核酸、アデノウイルス主要後期プロモーター核酸、マウスメタロチオネイン-Iプロモーター核酸、ラウス肉腫ウイルスのロングターミナルリピート、チャイニーズハムスター伸長因子1α(CHEF-1)、ヒトEF-1α、ユビキチン、およびヒトサイトメガロウイルスの主要前初期プロモーター核酸(hCMV MIE)である。
【００９２】
「選択マーカー」という用語は、それを保有する細胞が、対応する選択剤の存在下で特異的に選択されるようにさせる、核酸を意味する。一般的に、選択マーカーは薬物に対する耐性を付与するか、またはそれが導入される細胞における代謝または異化代謝欠陥を補償するものである。選択マーカーは正、負、または二機能性とすることができる。有用な正の選択マーカーは、対応する選択剤(例えば抗生物質)の存在下で形質転換細胞の選択を可能にする、抗生物質耐性遺伝子である。非形質転換細胞は選択条件下で、すなわち選択剤の存在下で、増殖または生存することができない。負の選択マーカーは、そのマーカーを保有する細胞を選択的に排除できるようにする。真核細胞で用いられる選択マーカーとしては、例えば、以下が挙げられる：アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ(APH)をコードする構造遺伝子、例えば、ハイグロマイシン(hyg)、ネオマイシン(neo)、およびG418選択マーカー、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)、チミジンキナーゼ(tk)、グルタミンシンテターゼ(GS)、アスパラギンシンテターゼ、トリプトファンシンテターゼ(選択剤インドール)、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ(選択剤ヒスチジノールD)、ならびにピューロマイシン、ブレオマイシン、フレオマイシン、クロラムフェニコール、ゼオシン、およびミコフェノール酸に対する耐性を付与する核酸。
【００９３】
「短期生産率」という用語は、所定の期間(その期間は短期である)および生細胞密度において産生されたポリペプチドの量から決定される、1日のうちに単一の細胞により産生されたポリペプチドの量を表す。一態様では、短期培養は2〜20日間であり、別の態様では4〜15日間であり、さらなる態様では10〜14日間である。
【００９４】
「比生産率」(specific production rate)または「生産率」という用語は、所定の期間および生細胞密度において産生されたポリペプチドの量から決定される、1日のうちに単一の細胞により産生されたポリペプチドの量を表す。比生産率(SPR)は次の式を用いて算出することができる：
SPR = P2-P1/((D2+D1)/2*Δt)        (式2)
式中、
SPR [pg/細胞/日]：比生産率
P1 [μg/ml]：その期間の開始時のポリペプチド濃度
P2 [μg/ml]：その期間の終了時のポリペプチド濃度
D1 [細胞/ml]：その期間の開始時の生細胞密度
D2 [細胞/ml]：その期間の終了時の生細胞密度
Δt [日]：その期間の持続日数。
【００９５】
「構造遺伝子」という用語は、シグナル配列を含まない遺伝子の領域、すなわちコード領域を表す。
【００９６】
B.  本明細書に報告される方法
ポリペプチドを産生する細胞株/細胞クローン、すなわち、異種ポリペプチドをコードする構造遺伝子を含む発現カセットを含有する核酸でトランスフェクトされた細胞は、異なるクラスに分類することができる：第1クラスの細胞では、比生産率が何世代にもわたってほぼ一定している。これとは対照的に、第2クラスの細胞では、比生産率が、何世代かにわたって世代ごとに、減少しており、特に単調に減少する。この理論に拘束されるものではないが、ポリペプチド産生細胞および細胞株の生産性の減少は、それぞれ、対象となるポリペプチドをコードする構造遺伝子に機能的に連結されたプロモーター核酸の着実に増加するメチル化と、それによる該プロモーターの不活性化/サイレンシングによって、少なくとも部分的に引き起こされる。さらに、こうした減少は、対象となるタンパク質をコードする構造遺伝子のコピー数の損失によることもある。
【００９７】
本発明は、少なくとも一部には、ヒトCMV主要前初期(hCMV-MIE)プロモーター/エンハンサー(SEQ ID NO:01)の位置425でのCpGジヌクレオチドが、不安定な抗体産生チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞株ではしばしばメチル化される、という知見に基づいている。これは、(例えば、SEQ ID NO:01の)hCMV-MIEプロモーターに機能的に連結された構造遺伝子によってコードされる対象のタンパク質を発現する組換え細胞クローン/細胞株の長期的な組換え生産の安定性を予測するためのマーカーとして使用することができる。
【００９８】
本発明は、少なくとも一部には、該プロモーターに隣接するヒストンの翻訳後修飾が安定な発現/産生細胞株を同定するためのさらなるマーカーとして使用され得る、という知見に基づいている。不活性化修飾の存在は、それぞれの細胞クローン/細胞株が非常に不安定であり、今後の培養過程で平均を上回る生産性の低下を示すであろう(長期的に不安定な産生細胞クローン/細胞株)ということのマーカーである。一方、活性化修飾の存在は、それぞれの細胞クローン/細胞株が非常に安定であり、今後の培養過程で平均を下回る生産性の低下を示すであろう(長期的に安定な産生細胞クローン/細胞株)ということのマーカーである。
【００９９】
本発明は、少なくとも一部には、SEQ ID NO:01の位置425でのメチル化と、プロモーター核酸に近接するヒストン3のレベルに対するヒストン3アセチル化の相対レベル(H3ac/H3)との組み合わせを使用することによって、長期的に安定な産生組換え細胞株/細胞クローンの判定のさらなる改善が達成され得る、という知見に基づいている。
【０１００】
B.1.  プロモーターのメチル化
ポリペプチドをコードする構造遺伝子に機能的に連結された位置425でのヒトCMV MIEプロモーターのプロモーター核酸のメチル化の存在が検出可能であることにより、細胞株または細胞クローンのそれぞれの長期生産性に関する情報が提供されることが見いだされた。
【０１０１】
構造遺伝子の発現に用いられる各プロモーター核酸は、保護エレメントによって遮蔽されない場合には、それが導入された細胞の酵素によりメチル化を受けやすい部位を含んでいる。メチル化の影響を受けやすい部位はCpG部位と呼ばれており、ジヌクレオチドCGを含む/からなる。しかし、すべてのCpG部位が同じ相対頻度でメチル化されるわけではない - CpG部位の一部は他よりも頻繁にメチル化される。例えば、ヒトCMV MIEプロモーター内の特定の部位は異なる頻度でメチル化されて、プロモーターのサイレンシングに異なる影響を及ぼすことが見いだされた。
【０１０２】
下記の方法は、核酸配列中のCpG部位を同定するために使用することができる：
(1) 細胞を準備する段階であって、選択剤の非存在下における細胞の30世代の培養時間の後のポリペプチドの生産率が、該培養の第1世代後の該細胞の該生産率の90％未満である、段階；
(2) 段階(1)の細胞の培養由来の少なくとも10個の細胞からDNAを別々に単離する段階；
(3) 該単離されたDNAのシトシンを亜硫酸水素塩処理により修飾する段階；
(4) 段階(3)で得られたDNAに基づいて、少なくとも0.2のメチル化頻度を有する、ポリペプチドをコードする構造遺伝子に機能的に連結されたプロモーター核酸内のCpG部位を識別し、それによってCpG部位を同定する段階。
【０１０３】
ある基準、すなわち、不安定な細胞クローン/細胞株に関する一態様における基準とは、30〜60世代の培養時間後の細胞クローン/細胞株の生産率が、該培養の第1世代後の細胞クローン/細胞株の生産率の60％またはそれより低いことである。
【０１０４】
一態様において、細胞株は、培養開始時点の生産率の60％を上回る、30〜60世代培養後の生産率を有する。
【０１０５】
単離されたDNAのシトシンを亜硫酸水素塩処理により修飾する段階は、
(3-a) 単離されたDNAを亜硫酸水素イオンの存在下でインキュベートし、それによりDNAを脱アミノ化する段階；および
(3-b) 脱アミノ化されたDNAをアルカリ性条件下でインキュベートし、それにより脱アミノ化DNAを脱スルホン化する段階
を含むことができる。
【０１０６】
ポリペプチドを産生する細胞クローン/細胞株を取得する方法は、少なくとも1回のトランスフェクション段階と少なくとも1回の選択段階を含むプロセスであり、該選択段階は、トランスフェクション直後または選択剤の存在下で増殖させた後の、トランスフェクションに成功した細胞の単一細胞付着を含む。選択段階では、細胞をその短期の比生産率に基づいて、すなわち短期培養後の上清中のポリペプチド濃度に基づいて識別する。選択された細胞の中には、比生産率が複数世代にわたってほぼ一定している細胞もあれば、比生産率が複数世代にわたって単調に減少し続ける細胞もある。したがって、一般的に適用される（短期）選択基準を用いて、安定した長期生産性を有する細胞(1個または複数)の特異的選択を行うことはできない。
【０１０７】
本明細書で報告する方法では、トランスフェクト細胞によって産生される関心対象のポリペプチドをコードする構造遺伝子に機能的に連結されたプロモーター核酸を含む発現カセットを含む発現プラスミドでトランスフェクトすることにより得られる細胞クローン/細胞株はどれも、解析することができる。発現プラスミドは一般的に選択マーカーをも含む。したがって、トランスフェクション段階の後で選択段階の前に、細胞を選択剤の存在下で培養する。あるいは、前記方法は、事前の単一細胞付着または限界希釈を行わずに、すなわちプールとして、選択剤の存在下で細胞を培養する段階を含み得る。さらに代替的には、前記方法は単一細胞付着または限界希釈の後で細胞を培養する段階を含み得る。
【０１０８】
プール培養/選択の後で、単一細胞付着を行う必要がある。単一細胞付着がプール培養段階の後に行われる場合には、細胞はその単一細胞付着の後でさらに培養される。
【０１０９】
複数世代にわたってほぼ一定の比生産率をもつ細胞株または細胞クローンを同定するために、複数世代にわたる長期培養の特定の培養時期に、上清中のポリペプチド濃度および生細胞密度を測定しなければならない。それぞれELISAおよびFACSなど、それに好適な方法が当業者には公知である。
【０１１０】
メチル化頻度の高いCpG部位は、例えばpH5での、一本鎖DNAの亜硫酸水素塩処理と、続いて起こるアルカリ脱硫によって同定することができる。ここでは、メチル化CpG部位と非メチル化CpG部位を識別することが可能である。特定の処理条件下で、シトシンはN-へテロ環の4位で脱アミノ化されてウラシルに変換されるが、5-メチル-シトシンは変換されない。相補的DNA鎖は、もはや相補的でない2本の鎖、A鎖とB鎖に変換される。前記測定はこれらの鎖のいずれかに基づくことができる。
【０１１１】
この長期培養は、そのプロモーター核酸またはプロモーター核酸と細胞株の組合せについて1度しか行う必要がない。同じプロモーター核酸または細胞とプロモーターの組合せを2度目に用いる場合、選択はすでに収集されたデータに基づくことができる。
【０１１２】
多くの技術を適用して、亜硫酸水素塩処理後のメチル化アレルと非メチル化アレル間の配列の違いを明らかにすることができる。例えば、関心対象の配列(A鎖またはB鎖のいずれか)を非メチル化特異的条件下で、すなわちメチル化部位に感受性でないプライマーを用いて、PCRで増幅し、続いてDNA配列決定(クローニングの有無にかかわらず)、高解像度融解温度分析またはマイクロアレイ解析などの方法により解析することができる。別の態様では、メチル化感受性であるかもしくはメチル化特異的であるプライマーまたはプローブを用いて定量的PCR(qPCR)を実施することができる。これに代わるアプローチとしては、5-メチルシトシン特異的抗体を用いてメチル化DNAを沈降させ、その後に定量的ポリメラーゼ連鎖反応を実施する。
【０１１３】
また、メチル化特異的PCR(MSP)を用いて、関心対象の領域の事前のPCR増幅を行わずに直接、亜硫酸水素塩処理DNAの配列に対処することも可能である。MSPで用いられるプライマーは1つまたは複数のCpG部位を含むものである。それらは、メチル化DNAの検出のために未変換の5-メチル-シトシンに相補的であるか、または非メチル化DNAの検出のためにシトシンから変換されたウラシルに相補的であるかのいずれかである。
【０１１４】
CpG部位のメチル化はいくつかの細胞について測定される。一態様では、細胞の数が少なくとも10個、別の態様では少なくとも15個、さらなる態様では少なくとも20個である。その後、CpG部位のメチル化頻度を計算する、すなわち、そのCpG部位でメチル化された細胞の数を解析した細胞の総数で割ることにより、算出する。メチル化頻度の高いCpG部位とは、少なくとも0.2の、一態様では少なくとも0.25の、一態様では少なくとも0.4の、好ましい一態様では少なくとも0.5のメチル化頻度を有する、CpG部位である。
【０１１５】
ポリペプチドの生産に用いた細胞または細胞株における、低レベルの、すなわち所定の閾値を上回るメチル化プロモーター核酸さえも、長期培養中の生産性の低下を予測するために使用可能であることが見いだされた。
【０１１６】
図1には、異なる細胞から得られた同じプロモーター核酸のメチル化CpG部位の数が示される。
【０１１７】
ヒトCMV MIEプロモーターの核酸配列を以下に示す(CpG部位には下線が引いてある)：
0006649276.tif 000003
(SEQ ID NO:01)。
【０１１８】
SEQ ID NO:01には、33箇所のCpG部位が存在し、これらは核酸メチル化の可能な部位である。上で説明した方法を用いて、主としてメチル化されるヒトCMV MIEプロモーター内のシトシン残基を同定することができる。
【０１１９】
すべてのCpG部位が保存されているA鎖はヌクレオチド配列
0006649276.tif 000004
(SEQ ID NO:02)を有し、完全に脱アミノ化されたA鎖はヌクレオチド配列
0006649276.tif 000005
(SEQ ID NO:03)を有する。すべてのCpG部位が保存されているB鎖はヌクレオチド配列
0006649276.tif 000006
(SEQ ID NO:04)を有し、完全に脱アミノ化された形のB鎖はヌクレオチド配列
0006649276.tif 000007
(SEQ ID NO:05)を有する。
【０１２０】
図4には、異なる細胞株における個々のCpG部位でのメチル化の頻度が示される。関心対象のポリペプチドを発現するための発現カセットを含むプラスミドでトランスフェクションした後の異なるCHO親細胞株から得られた19〜22個の異なるクローンを分析することによって、数値を決定した。各細胞株についての単一のDNAのメチル化パターン(下)および単一のCpG部位でのメチル化頻度(上)が示されている。例えば細胞株K18.1は高度にメチル化される(図4A)。メチル化の頻度は別々のCpG部位において等しい訳ではないが、3つのクラスター、すなわち、5'末端、3'末端、および位置400(のヌクレオチド)付近に集中しているようである。配列決定された22のインサートのうち14は位置425にシトシンを有した。細胞株43-16 A10におけるプロモーター核酸のメチル化は図4Eに示される。メチル化の分布は細胞株K18.1で観察された分布に類似している。K18.1と同様に、位置425が最も頻繁にメチル化され、配列決定された20のインサートのうち5つがその位置にシトシンを含んでいた。
【０１２１】
分析した他の3つの細胞株では、シトシンが散発的に、すなわち単一のイベントとして、異なるCpG部位で検出される(図4B、4Cおよび4D)。メチル化頻度が全体的に低い細胞株について統計的有意性を得るためには、数百ものインサートの配列決定が必要になるだろう。さらに、これらの単一のイベントは、実際のプロモーターメチル化ではなく、不完全なシトシン脱アミノ化による偽陽性のイベントを表す可能性もある。
【０１２２】
CpG位置特異的メチル化の信頼性の高い測定のために、メチル化特異的PCR法が開発されている。メチル化特異的PCRのために、以下の表1に示すプライマーを使用することができる。単独または組合せたこれらのプライマーもまた、本明細書で報告する局面である。
【０１２３】
（表１）メチル化特異的PCRに使用できるプライマー
0006649276.tif 000008
【０１２４】
プライマーの評価の過程で、位置425にシトシンを有する脱アミノ化CMVプロモーターDNAに対して高度に選択的であるメチル化特異的プライマー対は、異なる性質を有することが見いだされた(図6参照)。一態様において、メチル化特異的PCR用のプライマーはSEQ ID NO:14およびSEQ ID NO:18のヌクレオチド配列を有する。
【０１２５】
したがって、本明細書で報告する方法の一態様では、SEQ ID NO:01のヒトCMVプロモーター核酸がプロモーター核酸である。一態様では、メチル化頻度の高いCpG部位は、SEQ ID NO:01の位置425(bp)のCpG部位である。
【０１２６】
（表２）qPCRにおけるメチル化特異的(MSP)プライマー対とユニバーサルプライマー対の予想される結果
0006649276.tif 000009
【０１２７】
ユニバーサルプライマー対は4つすべての鋳型を増幅する一方、MSPプライマー対は鋳型#62(SEQ ID NO:22)と鋳型#01(SEQ ID NO:23)を選択的に増幅する。ΔCp値は、鋳型#62および鋳型#01ではMSPプライマー対とユニバーサルプライマー対の間で可能な限り小さくなる必要がある。これとは対照的に、鋳型#11(SEQ ID NO:21)および#04(SEQ ID NO:24)に対しMSPプライマー対を用いて得られるCp値は可能な限り高くなるべきであり、すなわち、ユニバーサルプライマー対を用いた増幅と比較したΔCpが最大になるべきである。
【０１２８】
メチル化特異的プライマーは、さらに2つのメチル化位置が位置416および437に存在するにもかかわらず、選択的に位置425の5-メチルシトシンを検出できる。
【０１２９】
メチル化の測定は1％から100％までのメチル化の頻度により可能である。
【０１３０】
メチル化の程度に関して同等の結果が、メチル化特異的PCRを用いて、ならびにクローニングおよび配列決定によって観察されたが、メチル化特異的PCRの方がはるかに高感度である。長期的生産において生産性が徐々に低下していく細胞株は、閾値を上回るメチル化頻度で位置425でメチル化されている。閾値は、一態様において、測定方法のバックグラウンドノイズの2倍である。安定的な長期生産性をもつ細胞株は、そのCpG部位でのメチル化頻度が閾値を下回る。
【０１３１】
高解像度融解温度分析では、プロモーター核酸は位置334から開始して位置487まで、つまり154bp増幅される。典型的な融解温度分析は図10Aに示され、その一次導関数が図10Bに示される。高解像度融解温度分析を用いると、メチル化プロモーター核酸(鋳型#16、SEQ ID NO:25)が非メチル化プロモーター核酸(鋳型#11)から区別され得ることがわかる。メチル化プロモーター核酸断片は50％以上の相対頻度で検出することができる。非メチル化プロモーター断片は10％以上の相対頻度で検出することができる。
【０１３２】
このデータから、その発現がヒトCMV主要前初期プロモーター/エンハンサーによって駆動される組換えにより導入された遺伝子を含む組換えCHO細胞株の生産安定性は、位置425のシトシンのメチル化状態を測定することにより予測可能であることが示される。
【０１３３】
こうして、C425メチル化の測定は、生成された組換え細胞クローンにおけるポリペプチド発現の安定性を判定するための予測マーカーとして使用できることが見いだされた。これによって、細胞株の開発中に安定的な生産性をもつ安定したクローンを選択することが可能になる。さらに、5％以下のC425メチル化が、安定した細胞クローンを選択するための適切な基準であることが判明した（これは、使用される検出法の閾値を考慮している）。また、安定であると誤って予測される細胞クローン(偽陰性細胞クローン)の割合は、試験前にそれらをMTXの非存在下で一定期間間培養することによって減らせることがわかった。
【０１３４】
したがって、本明細書には、SEQ ID NO:01の位置425での相対的プロモーターメチル化が5％以下である細胞を選択することによって、トランスフェクトされた細胞の集団から長期的に(安定した)組換えポリペプチドを発現する細胞株を富化するための方法が報告される。この相対的メチル化頻度は、本明細書で報告されるプライマーを用いて、本明細書に報告されるメチル化特異的qPCR法により測定することができる。
【０１３５】
CpG部位425でのhCMV-MIEヌクレオチドのメチル化を定量するための高感度で正確なPCR法が確立されたので、組換えCHO細胞株K18.1、43 16 A10およびG45-2におけるメチル化を評価する。配列決定により解析された亜硫酸水素塩処理DNAを直接、または完全なhCMV-MIE領域のPCR増幅後に、メチル化特異的リアルタイムqPCRにおいて鋳型として使用した(図8Aおよび8B)。これら2つのアッセイの構成は同等の結果をもたらした。さらに重要なことに、これらの結果は亜硫酸水素塩配列決定の結果とよく相関した。このことは、CpG部位425メチル化特異的qPCRアッセイが、組換えCHO細胞株においてCpG部位425でのhCMV-MIEメチル化を測定するために使用でき、かつ標的DNAの事前のPCR増幅なしで使用できることを実証している。
【０１３６】
原理上は、生産の不安定性を予測するために、CMV主要前初期プロモーター/エンハンサーDNA内の他のCpG部位を検討することもできた。しかし、C425でのメチル化はすべてのCpG部位のメチル化の平均より約5倍高いことが判明した。さらに、高度にメチル化された細胞クローンにおいてさえも、いくつかの部位、例えばC280およびC289はまったくメチル化されなかった(図4F、4Jおよび13)。プロモーターのメチル化解析のために正しい、すなわち頻繁に修飾されるCpG部位を選択することによって、そのアッセイはより高感度になる。クローンG25-17、G25-10および43-16 A10のメチル化は約10％と顕著であり、解析のためにCpG部位が無作為に選ばれるとしたら、見逃される可能性が高い。
【０１３７】
プロモーター核酸内の関連するCpG部位のメチル化状態を扱うことによる安定性の予測は、他の異種プロモーター核酸の場合にも使用することができる。
【０１３８】
初期プロモーターのメチル化と生産の不安定性との潜在的相関関係を評価するために、安定性試験の開始時のCpG 425部位メチル化を、選択剤（MTX）の存在下または非存在下で、qPの相対的変化に対してプロットした。相関プロットは図11A(MTXあり)および11B(MTXなし)に示される。評価のために、プロットエリアは、5％メチル化での限界(メチル化測定のバックグラウンドの2〜3倍に等しい、すなわち検出限界)およびqPの40％減少(生産安定性の許容限界を表す)（これは本明細書で報告される方法の一態様でもある）を用いて4つの区画に分けられた。異なる区画内のクローンの数を測定した。ピアソンのカイ二乗検定を用いるメチル化状態による安定性状態の偶然性解析は、MTXありの培養については有意な関連性(p値0.05)を、MTXなしの培養についてはある傾向(p値0.13)を示した。CpG部位425でのメチル化が5％未満であるクローンの大部分は、安定したクローンの画分(MTXの有無にかかわらずqPの40％未満の減少、左上の区画に表示)内に見いだされることが判明した。
【０１３９】
したがって上記を要約すると、長期培養中およびスケールアップ時の生産性の喪失は製造用細胞株の開発における主要なリスクである。そのため、迅速かつ簡便に判定および検査することができる生産不安定性の分子マーカーが必要である。プロモーターのメチル化は、組換えCHO細胞株における生産性の喪失を予測するために使用できることが判明した。それを評価するために、広く用いられるhCMV-MIEプロモーター/エンハンサーの603bp領域内の33箇所のCpG部位のDNAメチル化を解析した。検討された領域の全体的なメチル化レベルは、全CpG部位の約1％と18％の間で変化した。1％の見かけ上のメチル化は、非メチル化シトシンの不完全な脱アミノ化から生じる技術的に達成可能なバックグラウンドを表している。さらに、メチル化されたプロモーターでは、メチル化のレベルが個々のCpG部位間で大きく変化し、かつ3つのクラスターに蓄積して、CpG部位425で最大となる。CpG部位425でのメチル化は、他のすべてのCpG部位の平均的なメチル化度より約5倍高い。一方、いくつかのCpG部位は、高度にメチル化された細胞株においてさえも、全くメチル化されていないようである。hCMV-MIEの全体的なメチル化、ならびに個々のCpG部位間のメチル化の分布は、細胞型および組織間でかなり異なることがある(例えば、Kong, Q., et al., PLoS One 4 (2009) e6679; Krishnan, M., et al., FASEB J. 20 (2006) 106-108; Mehta, A.K., et al., Gene 428 (2009) 20-24を参照されたい)。
【０１４０】
CpG部位425の優勢なメチル化はhCMV-MIEのメチル化のためのマーカーとして適していることが見いだされた。ミディアムスループットの高速かつ高感度の方法として、CpG部位425メチル化特異的qPCRが確立された。多数の細胞株をCpG部位425メチル化特異的qPCRで分析すると、不安定な産生株の大多数は長期培養の前でさえCpG部位425で5％超のメチル化を示した一方、安定した産生株の大半はこの部位での5％未満のメチル化を示したことがわかった。
【０１４１】
CpG部位425の初期のメチル化は、異種プラスミドを10コピーより多く保有するクローンでもっぱら見られた。以前の報告により、導入遺伝子の複数コピーのタンデムリピートは、哺乳動物細胞においてメチル化とサイレンシングの影響を比較的受けやすい、という証拠がいくつか提供されている(Garrick, D., et al., Nat. Genet. 18 (1998) 56-59; McBurney, M.W., et al., Exp Cell Res 274 (2002) 1-8)。
【０１４２】
B.2.  ヒストンのアシル化
hCMV-MIEプロモーターに近接するヒストン修飾の相対量が測定された。H3acおよびH3K4me3マーク(活性化マーク)ならびにH3K9me3およびH3K27me3マーク(抑制マーク)を調べた。これらのヒストン修飾は、SEQ ID NO:01の位置404〜507：
0006649276.tif 000010
において調べたが、これは、転写開始部位の-97bpから-200bp上流の配列を示し、かつ位置C-425(すなわち、転写開始部位の-179bp上流)にCpG部位を含む配列であって、プライマー対396/397を用いて増幅することができる。
【０１４３】
ヒトCMV主要前初期プロモーター/エンハンサー断片に近接するヒストン3のレベルに対するヒストン3アセチル化の相対レベルは、選択剤の存在下および非存在下での生産安定性の予測マーカーとして検討された。
【０１４４】
培養の出発点(プライマリシードバンク(Primary Seed Bank))からの2つの例示的な凍結細胞株を解凍し、hCMV-MIEプロモーターに近接する特定のヒストン修飾の相対量を測定した。プロジェクトTおよびプロジェクトHが独立して実行され、各細胞株を、選択剤(250nMのメトトレキサート)あり(+)およびなし(-)の条件下で、少なくとも60世代にわたって培養した。
【０１４５】
hCMV-MIEプロモーターのメチル化率(mC-425)、(PSB)からの細胞あたりのコピー数、ならびに比生産性の60世代にわたる変化パーセント(ΔqP)のデータが測定された。データの記録は、以前にOsterlehnerらによって記載されたように行った。
【０１４６】
（表）12のプロジェクトT細胞株のデータ。mC-425は、培養期の開始時(PSB)におけるhCMV-MIEの転写開始部位(TSS)の上流の位置425(TSSに対して-179)でのシトシンのメチル化パーセントの平均である；ΔqPは、60細胞世代の期間にわたる比生産性(qP)の変化パーセントである；IgG導入遺伝子の軽鎖(LC)のコピー数の平均は、培養の開始時(PSB)に測定した。
0006649276.tif 000011
【０１４７】
（表）20のプロジェクトH細胞株のデータ。mC-425は、培養期の開始時(PSB)におけるhCMV-MIEのTSSの上流の位置425でのシトシンのメチル化パーセントの平均である；ΔqPは、60細胞世代の期間にわたる比生産性(qP)の変化パーセントである；IgG導入遺伝子の軽鎖(LC)のコピー数の平均は、培養の開始時(PSB)に測定した。
0006649276.tif 000012
0006649276.tif 000013
【０１４８】
ヒストン修飾の相対量を調べるために、hCMV-MIEプロモーターにより駆動される組換え遺伝子を有する生存CHO細胞を回収した。3.7％ホルムアルデヒドで固定した後、溶解したクロマチンを超音波処理し、架橋したDNA-ヒストン複合体を適切なヒストン修飾に応じて精製した。続いて、蓄積したDNA-ヒストン複合体をプロテイナーゼKで分解し、DNA断片を溶出した。種々のDNA断片の量は、特定のプライマー対を用いて、qPCRにより比較した。
【０１４９】
対応する基準領域(reference region)の修飾に関して抗体-ヒストン結合の一貫性を確認するために、さまざまな遺伝子を特定のヒストン修飾の蓄積について試験した。最初に、基準領域に近接する、抗体フィルタリングされたヒストン修飾の量を、1サンプルごとに、プロジェクトTとプロジェクトHにおいて非特異的な抗体なしの対照(mock)の精製サンプルと比較した。抗体精製されたサンプル、mockおよび未処理の投入サンプルのDNA断片をqPCRのためのテンプレートとして使用した。潜在的な基準領域のプライマー対を各サンプルに添加して、qPCRを三つ組で行った。得られたCq値は、投入サンプルの割合として比較した。両プロジェクトにおいて、抗体精製されたサンプルは、適切な領域でmockよりも高い値を得た。これにより、適切な結合が確認された。さらに、活性化マークH3acおよびH3K4me3は、活性領域Eif3iおよびGusbに蓄積した。これとは対照的に、サイレンシング領域Fox2aはH3K9me3のより高い濃度を有し、一方H3K27me3は際立ってGata5領域に位置していた。異なるヒストン修飾は、両プロジェクトにおいて、対応する対照領域に一致した。
【０１５０】
標的領域上のヒストン修飾の相対量の推定は、安定に修飾された基準領域に厳密に依存する。
【０１５１】
hCMV-MIEプロモーターに近接する特定のヒストン修飾の、基準配列に対する正規化は、異なる細胞株の比較を可能にする。この目的のために、基準配列は、それぞれのヒストン修飾の強固で再現可能なレベルを有していなければならない。
【０１５２】
以下の表には、3つの生物学的複製物(biological replicates)を含む、全ての細胞株の平均Cq値と変動係数(CV)がプロジェクトTおよびプロジェクトHについて表示される。
【０１５３】
（表）プロジェクトTおよびHにおける基準領域。生物学的トリプリケート(biological triplicates)を含むChIPサンプルのCq値の平均および適切な変動係数(CV)を両プロジェクトについて計算した；行(row)は、ゲノム内の異なる基準領域を示す；列(column)は、特定のヒストン修飾を含む；適切なエピジェネティック修飾に選ばれた対照領域は、太字でマークされる；したがって、mockまでのCq距離およびCVは決定的であった；両プロジェクトにおいて、活性化マークH3ac、H3K4me3ならびに総ヒストン3は、GusbおよびEif3i領域に安定に蓄積される(2％のCV)；より低いCq値は、活性化マークの基準としてGusbを決定する；全ての潜在的な基準領域は、安定した総ヒストン3値を有していた。
0006649276.tif 000014
0006649276.tif 000015
【０１５４】
活性ヒストン修飾H3acおよびH3K4me3の基準領域としてのGusb、ならびにH3K27me3の安定した領域としてのGata5は、適切なmock対照とは異なり、一貫性のあるCq値を有していた。活性対照領域Eif3iおよびGusbは非常に安定している。全ての対照領域では、総ヒストン3(H3)の安定した蓄積が観察された。
【０１５５】
抗体を組換え的に発現するCHO細胞株のプロジェクトの生物学的トリプリケートは、hCMV-MIEプロモーターの位置に近接するヒストン修飾について分析された。そのために、クロマチン断片を、特定のヒストン修飾に対する抗体を用いて精製し、消化してタンパク質フリーのゲノムDNAを取得し、リアルタイムPCRで定量化した(図26参照)。それぞれの使用した基準領域に対して正規化を実行した。各プライマー対の増幅効率を決定するために、LinReg PCRソフトウェア、バージョン2014.5を使用した(Ruijter, 2009, LinRegPCR)。全てのプライマー-テンプレート対の増幅効率はかなり似ている。したがって、同様の増幅効率であるとするLivak法が正規化のために使用された。
【０１５６】
（表）プライマー効率。増幅効率は、生物学的トリプリケートを含む全ての細胞株について測定された；プライマー対(396/397)を使用した；この目的のために、qPCRの生データをLinRegPCRソフトウェア、バージョン2014.5に適用して、効率を計算した；行は、異なるプライマー対によって区別される；平均の列は、各プライマー-テンプレート対の平均増幅効率を含み、Stdevの列は、適切な標準偏差を含む；全ての増幅効率間の距離は2％未満である；かくして、Livak法が正規化のために使用された。
0006649276.tif 000016
【０１５７】
Livakによる正規化は、2つの正規化ステップを含む：
-  第1ステップでは、hCMV-MIEプロモーターに近接するヒストン3修飾の量(Cq)を、基準領域でのヒストン3修飾の量(Cq)に対して正規化する→ΔCq
-  第2ステップでは、正規化されたヒストン3修飾を、正規化されたhCMV-MIEプロモーターに近接する総ヒストン3に設定する→ΔΔCq
【０１５８】
これは、最終的に、hCMV-MIEプロモーターに近接するヒストン3あたりの修飾の相対量を表示する。
【０１５９】
総ヒストン3は、全ての基準領域で安定しており、同じ基準領域を用いたヒストン修飾および総ヒストン3の正規化を可能にする。これは正規化プロセス内の変動を最小限に抑える。例えば、Gusb領域は修飾ヒストンと総ヒストン3の安定した量を含むので、ヒストン3あたりの相対ヒストンアセチル化は対照領域Gusbに対して正規化された。下記の式を計算のために使用した。
0006649276.tif 000017
【０１６０】
hCMV-MIEプロモーターに近接するヒストン3あたりのヒストン修飾の相対量(ΔΔCq)および総ヒストン3(ΔCq)は、ΔqP値に対してプロットした。hCMV-MIEプロモーターに近接する総ヒストン3はGusbに正規化し、ΔqP値に対してフィッティングさせた。さらに、相対コピー数あたりのヒストン3(H3/rCN)およびヒストン3あたりのmock(Mock/H3)を調べた。H3/rCNは、理想的にはコピー数を減算し、hCMV-MIEプロモーターに近接する相対ヒストン3密度(H3D)の測定である。Mock/H3は、ヒストン3あたりのバックグラウンドノイズの非特異的な効果である。
【０１６１】
相関は、標準的な最小二乗フィットモデルで検査した。この目的のために、ソフトウェアJMP10(JMP(登録商標)10.0.1リリース：2, 64ビット版; SAS Institute社)を使用した。
【０１６２】
（表）長期生産安定性に対するエピジェネティック修飾の効果の測定。選択圧(250nM MTX)あり(+)およびなし(-)でのΔqPに対する効果のp値は、列に表示される；全ての効果は、hCMV-MIEプロモーターに近接して測定され、行ごとに並べられる；正規化ヒストン3(H3)、相対コピー数あたりのヒストン3の密度(H3/rCN)、ヒストン3あたりのバックグラウンドノイズ(Mock/H3)およびヒストン3あたりの修飾(H3ac/H3、H3K4me3/H3、H3K27me3/H3およびH3K9me3/H3)の効果は、ソフトウェアJMP10を用いて標準的な最小二乗モデルで計算した；プロジェクトHでは、ヒストン3あたりのアセチル化(H3ac/H3)は、細胞を選択圧(+)の下で培養した場合に、ΔqPに対して高度に有意な効果を有し、また、H3/rCN、Mock/H3、H3K4me3、H3K27me3およびH3のイベントは、ΔqP+条件下で中程度から高度の有意な効果をもたらした。
0006649276.tif 000018
n.d.＝測定せず
【０１６３】
hCMV-MIEプロモーターでのヒストン3あたりのアセチル化(H3ac/H3)の程度は、選択剤MTXの存在下で60世代にわたって得られる生産性の損失に対して極めて大きな影響を及ぼす。
【０１６４】
さらに、有意な効果(最弱から最強の効果を示す)は、H3/rCN、Mock/H3、H3K4me3/H3、H3K27me3/H3およびH3について観察された。Mock/H3およびH3単独の効果レベルを考慮すると、H3は単独で、組み合わせ効果X/H3に支配的な影響を与える。H3単独よりも大きな効果を有するエピジェネティックなイベントは、良好な予測マーカーであることが判明した：→H3ac/H3。
【０１６５】
ジャックナイフ外れ値分析を行った。これにより、トリプリケート(三つ組)中の1つの外れ値は、両方の選択剤条件のΔqPを比較することによって発見された。この分析に関しては、細胞株H-18が効果の測定から除外された。その後、プロジェクトHのサンプルは、細胞株H-18の除外後に効果スクリーニングモデルで再度分析した。hCMV-MIEプロモーターでのヒストン3あたりのアセチル化(H3ac/H3)の損失は、両方の選択条件下で60世代にわたって得られる生産性の損失に最も大きな影響を及ぼすことが見出された。
【０１６６】
（表）外れ値の細胞株H-18を除外した後のプロジェクトHにおける長期安定性に対する修飾の効果の測定。選択圧(250nM MTX)あり(+)およびなし(-)でのΔqPに対する効果のp値は、列に表示される；全ての効果は、hCMV-MIEプロモーターに近接して測定され、行ごとに並べられる；正規化ヒストン3(H3)、相対コピー数あたりのヒストン3の密度(H3/rCN)、ヒストン3あたりのバックグラウンドノイズ(Mock/H3)およびヒストン3あたりの修飾(H3ac/H3、H3K4me3/H3、H3K27me3/H3およびH3K9me3/H3)の効果は、ソフトウェアJMP10を用いて標準的な最小二乗モデルで計算した；ΔqPに対する最も有意な効果は、両方の選択条件下でH3ac/H3について観察された。
0006649276.tif 000019
【０１６７】
プロジェクトTでは、ΔqPに対するH3ac/H3のプロットは、特に選択圧の下で、長期安定性とヒストン3あたりのアセチル化の同時増加を示す。
【０１６８】
hCMV-MIEプロモーターでのヒストン3の異なるレベルを考慮するため、ヒストン3アセチル化は、ヒストン3に対してさらに正規化された(H3ac/H3)。
【０１６９】
相対的なヒストン3アセチル化レベル(H3ac/H3)は、選択剤MSXの存在下(+)および非存在下(-)で60世代にわたる比生産性の変化(ΔqP)と比較された。外れ値分析の後、標準的な最小二乗回帰モデルは、生物学的複製物のH3ac/H3値および19のCHO細胞株のΔqP値を供給された。H3ac/H3とΔqPの有意な相関が検出された。
【０１７０】
H3ac/H3値について、決定木はJMPソフトウェアを用いて計算された。最良の分割ノード(split node)、それ故に最良のフィルターは、LogWorth統計を用いて計算した。(+)MSX条件下での最良の分割は、サンプルHではヒストン3のレベルに対するヒストン3アセチル化(H3ac/H3)が0.58であると計算された。偽陰性サンプルの数を減らすために、フィルターはA＞0.5 H3ac/H3のより低い値に設定された。
【０１７１】
選択剤MTXもしくはMSXありまたはなしの条件でのデルタSPR(ΔqP)の平均は、それぞれ、各正のゲートについて計算して、フィルタリングなしの平均と比較した;これを以下に示す。
0006649276.tif 000020
0006649276.tif 000021
【０１７２】
フィルターA＞0.5 H3ac/H3は、フィルタリングなしの条件と比較して、平均デルタSPRを増加させる。
【０１７３】
B.3.  プロモーターのメチル化とヒストンアセチル化の組み合わせ
ヒトCMV主要前初期プロモーター/エンハンサー断片に近接するヒストン3のレベルに対するヒストン3アセチル化の相対レベルおよびヒトCMV主要前初期プロモーター/エンハンサー断片のC-425メチル化の割合は、選択剤ありおよびなしでの生産安定性のための予測マーカーとして検討された。
【０１７４】
選択剤ありまたはなしの条件でのデルタSPRの平均は、各正のゲートについて計算して、フィルタリングなしの平均と比較した;これを以下に示す。
0006649276.tif 000022
0006649276.tif 000023
【０１７５】
フィルターA＞0.5 H3ac/H3とフィルターB＜5％mC-425[％] PSBとの組み合わせは、フィルタリングなしの条件と比較して、平均デルタSPRを増加させる。
【０１７６】
より詳細には、決定木は、不良産生株の排除を可能にする目的でH3ac/H3比の閾値を決定するために、JMP 10ソフトウェアを用いて計算された。LogWorth統計を用いて最良の分割ノードを特定した。LogWorthは次のように計算される：-log10(p値)、ここで、調整済みp値は、分割が起こり得る無数の異なる方法を考慮に入れる複雑な方法で計算される(Sall, 2002, Monte Carlo Calibration of Distributions of Partition Statistics; SASホワイトペーパー)。ΔqP+条件のための最良の分割は、ヒストン3あたり0.47のアセチル化であった。偽陽性の値を最小限に抑えるため、閾値を0.5 H3ac/H3に設定し、プロジェクトHおよびTにおいて両条件に移行させた。
【０１７７】
さらに、hCMV-MIEプロモーターのメチル化(％mC-425)の5％の閾値は、両予測マーカーの(相乗的)組み合わせを使用するために、記録されたメチル化データ(上記表参照)から決定された。こうして、hCMV-MIEプロモーターで5％超のDNAメチル化またはヒストン3あたり0.5未満のアセチル化を有するサンプルは除外した。
【０１７８】
ΔqPの平均は、陽性のフィルタリングサンプルについて計算して、フィルタリングなしのサンプルの平均ΔqPと比較した。これは、MTXを培地に添加したか否かを考慮して行った。
【０１７９】
予測マーカーH3ac/H3の使用は、含まれるサンプルの長期安定性の増加をもたらす。
【０１８０】
フィルタリング後の平均ΔqPは、両方のプロジェクトでほぼ同一であった。
【０１８１】
（表）不良産生株の排除。0.5 H3ac/H3を上回りかつ5％mC-425を下回る値を有するサンプルを使用して平均ΔqPを計算した；興味深いことに、フィルタリングされているΔqPは、両プロジェクトでほぼ同一であった。
0006649276.tif 000024
【０１８２】
hCMV-MIEプロモーターでのヒストン3アセチル化の程度は、安定性に大きな影響を及ぼした。また、総H3の量および位置C-425でのメチル化の程度(％mC-425)は、長期安定性に影響を与えた。さらに、発見されたH3ac/H3と％mC-425の逆の相関は、これらのマーカーの信頼性を確かなものにする。
【０１８３】
閾値の設定は、全ての不良産生株の排除につながる。この値を上回る細胞は主として安定している。
【０１８４】
B.4.  プロモーターのメチル化とヒストンアセチル化と導入遺伝子のコピー数の組み合わせ
ヒストン3アセチル化とDNAメチル化およびコピー数との相関は有意であり、これは、コピー数、DNAメチル化およびヒストン3アセチル化の相互関係を示す証拠を提供する。DNAメチル化度はヒストン3アセチル化に反することが判明した。さらに、コピー数対ヒストン3アセチル化およびDNAメチル化は、より高いコピー数を有する細胞株が主に非アセチル化されかつDNAメチル化されやすいという事実を提供する、ことが見出された。これは、コピー数と、選択剤の存在下および非存在下での長期安定性の変化との相関を明らかにした。したがって、コピー数はマークの程度と相互作用し、ひいては長期的な生産安定性に影響を与える。
【０１８５】
さらに、意図しない不安定な細胞株の蓄積は、標準的な細胞株開発では、それらの抗体価に応じて細胞株を早期選択することにより促進される。低いコピー数を有する細胞株は主に活発である必要があるが、高いコピー数を有する産生株は、転写産物の合計が同等である限り、個々の導入遺伝子の非活性化から中等度を超えて高度の活性化までの異なるエピジェネティックな状態をふんだんに持つことができると想定される。このことを考慮して、抗体価による第1の選択では、偶然に安定した組込み部位を有する可能性がある高コピー数の細胞株、またはそれらを有することをやや強いられる低コピー数の細胞株のいずれかが選ばれる。培養期の開始からのコピー数を安定性に対してプロットしたところ、多数の導入遺伝子を有する細胞株は不安定になりがちであることが判明した。
【０１８６】
したがって、本明細書では、一局面として、3段階の細胞株選択方法/プロセスが報告される。第1段階では、低い軽鎖コピー数の抗体発現細胞を増やし、第2段階では、それらのヒストン3アセチル化度に応じて選択を行う。その後、選択剤の迅速な還元を行う。それにより、安定した組込み部位、遺伝子サイレンシングおよびコピー数損失のリスクの低減を有する細胞株が得られるだけでなく、予めストレスを加えられた不安定化機構を有する亜集団が同定される。
【０１８７】
一態様では、安定に組み込まれた軽鎖発現カセットのコピー数は50以下である。別の態様では、安定に組み込まれた軽鎖発現カセットのコピー数は25以下である。さらなる態様では、安定に組み込まれた軽鎖発現カセットのコピー数は10以下である。さらなる態様では、安定に組み込まれた軽鎖発現カセットのコピー数は6以下である。
【０１８８】
後述の実施例、配列表および添付の図面は本発明の理解を助けるために提供されるものであり、本発明の真の範囲は添付の特許請求の範囲に記載される。記載された方法には、本発明の精神から逸脱することなく変更がなされ得ることが理解される。
【図面の簡単な説明】
【０１８９】
【図１】異なる細胞株から得られたhCMV-MIEプロモーター/エンハンサーのメチル化CpG部位の数。
【図２】p5057のプラスミドマップ。
【図３Ａ】長期的な生産での複数世代にわたる細胞株K18.1の選択剤の非存在下での比生産率。
【図３Ｂ】長期的な生産での複数世代にわたる細胞株G25-10の選択剤の非存在下での比生産率。
【図３Ｃ】長期的な生産での複数世代にわたる細胞株G25-17の選択剤の非存在下での比生産率。
【図３Ｄ】長期的な生産での複数世代にわたる細胞株G42-5の選択剤の非存在下での比生産率。
【図３Ｅ】長期的な生産での複数世代にわたる細胞株43-16 A10の選択剤の非存在下での比生産率。
【図４Ａ】上図：19〜22の個々のプロモーター核酸の解析により測定された、異なるメチル化部位での組換えCHO細胞株由来のhCMV-MIE DNAプロモーター/エンハンサー内のメチル化の頻度；下図：組換えCHO細胞株由来のhCMV-MIEプロモーター/エンハンサーDNA内のメチル化CpG部位の配置図 - メチル化部位は黒で示される - 位置425は矢印で強調表示される。細胞株K18.1 - 全CpG部位のメチル化：12％、部位C425のメチル化：64％、部位C591のメチル化：27％、部位C96のメチル化：32％。
【図４Ｂ】上図：19〜22の個々のプロモーター核酸の解析により測定された、異なるメチル化部位での組換えCHO細胞株由来のhCMV-MIE DNAプロモーター/エンハンサー内のメチル化の頻度；下図：組換えCHO細胞株由来のhCMV-MIEプロモーター/エンハンサーDNA内のメチル化CpG部位の配置図 - メチル化部位は黒で示される - 位置425は矢印で強調表示される。細胞株G25-10 - 全CpG部位のメチル化：0.5％、部位C425のメチル化：0％、部位C591のメチル化：5％、部位C96のメチル化：0％。
【図４Ｃ】上図：19〜22の個々のプロモーター核酸の解析により測定された、異なるメチル化部位での組換えCHO細胞株由来のhCMV-MIE DNAプロモーター/エンハンサー内のメチル化の頻度；下図：組換えCHO細胞株由来のhCMV-MIEプロモーター/エンハンサーDNA内のメチル化CpG部位の配置図 - メチル化部位は黒で示される - 位置425は矢印で強調表示される。細胞株G25-17 - 全CpG部位のメチル化：0.3％、部位C425のメチル化：0％、部位C591のメチル化：0％、部位C96のメチル化：0％。
【図４Ｄ】上図：19〜22の個々のプロモーター核酸の解析により測定された、異なるメチル化部位での組換えCHO細胞株由来のhCMV-MIE DNAプロモーター/エンハンサー内のメチル化の頻度；下図：組換えCHO細胞株由来のhCMV-MIEプロモーター/エンハンサーDNA内のメチル化CpG部位の配置図 - メチル化部位は黒で示される - 位置425は矢印で強調表示される。細胞株G42-5 - 全CpG部位のメチル化：0.6％、部位C425のメチル化：0％、部位C591のメチル化：0％、部位C96のメチル化：0％。
【図４Ｅ】上図：19〜22の個々のプロモーター核酸の解析により測定された、異なるメチル化部位での組換えCHO細胞株由来のhCMV-MIE DNAプロモーター/エンハンサー内のメチル化の頻度；下図：組換えCHO細胞株由来のhCMV-MIEプロモーター/エンハンサーDNA内のメチル化CpG部位の配置図 - メチル化部位は黒で示される - 位置425は矢印で強調表示される。細胞株43-16 A10 - 全CpG部位のメチル化：4.4％、部位C425のメチル化：25％、部位C591のメチル化：15％、部位C96のメチル化：10％。
【図５Ａ】メチル化特異的リアルタイムqPCRによる、部位425でメチル化されていないhCMV-MIEからの部位425でメチル化されたhCMV-MIEプロモーター/エンハンサーの区別；鋳型#11のPCR増幅曲線。
【図５Ｂ】メチル化特異的リアルタイムqPCRによる、部位425でメチル化されていないhCMV-MIEからの部位425でメチル化されたhCMV-MIEプロモーター/エンハンサーの区別；鋳型#62のPCR増幅曲線。
【図５Ｃ】メチル化特異的リアルタイムqPCRによる、部位425でメチル化されていないhCMV-MIEからの部位425でメチル化されたhCMV-MIEプロモーター/エンハンサーの区別；鋳型#01のPCR増幅曲線。
【図５Ｄ】メチル化特異的リアルタイムqPCRによる、部位425でメチル化されていないhCMV-MIEからの部位425でメチル化されたhCMV-MIEプロモーター/エンハンサーの区別；鋳型#04のPCR増幅曲線。
【図６】異なるメチル化特異的プライマーおよびプライマー対のPCR増幅曲線。
【図７】メチル化特異的リアルタイムqPCRによる、非メチル化hCMV-MIEプロモーター/エンハンサーのバックグラウンドにおける部位425メチル化hCMV-MIEプロモーター/エンハンサーの回収率。
【図８】プレ増幅でプライマー#239および#267を用いて得られた(A)、および亜硫酸水素塩処理したゲノムDNAから直接得られた(B)、メチル化部位425でのhCMV-MIEプロモーター/エンハンサー核酸のメチル化。
【図９】プライマー(黒)239+237および239+267、(白)263+237および263+267、(水平線)264+237および264+267、ならびに(垂直線)239+237および239+266を用いて得られた、メチル化部位425でのhCMV-MIEプロモーター/エンハンサー核酸のメチル化。
【図１０】典型的な正規化された高解像度融解曲線分析(A)およびその一次導関数、すなわち融解ピーク(B)。
【図１１Ａ】長期培養前のC425でのメチル化度と、250nM MTXありでの60世代の培養後のSPRの相対変化との相関関係。
【図１１Ｂ】長期培養前のC425でのメチル化度と、MTXなしでの60世代の培養後のSPRの相対変化との相関関係。
【図１２】長期培養前のC425でのメチル化度と、250nM MTXありでの60世代の培養後のメチル化度との相関関係。
【図１３】クローン44-28由来のhCMV-MIEプロモーター/エンハンサーDNA内のメチル化CpG部位の配置図。メチル化部位は黒で示される。ヌクレオチド位置425は矢印で強調表示される。全CpG部位のメチル化：18％、C425のメチル化：80％、C591のメチル化：70％、C96のメチル化：60％。
【図１４】安定性試験の前とMTXなしでの安定性試験の後の軽鎖遺伝子のコピー数。
【図１５】基準遺伝子Gusbに対して正規化された、ヒトCMV主要前初期プロモーター/エンハンサー断片に近接するヒストン3のレベルに対するヒストン3アセチル化の相対レベル。3つの生物学的複製物間の変動は標準偏差で表示される。
【図１６】基準遺伝子Gusbに対して正規化された、ヒトCMV主要前初期プロモーター/エンハンサー断片に近接するヒストン3のレベルに対するヒストン3リジン4の3倍メチル化の相対レベル。3つの生物学的複製物間の変動は標準偏差で表示される。
【図１７】3つの生物学的複製物を含むサンプルH-1〜H-20についての効果H3K4me3/H3の予測値と実測値のプロット。フィットのラインの信頼曲線は、対象となる試験が5％レベルで有意であるかどうかの視覚的表示を提供するために、破線で示される。その曲線は、有意性の水平ラインを横切る必要がある。
【図１８】3つの生物学的複製物を含むサンプルH-1〜H-20についての効果H3ac/H3の予測値と実測値のプロット。フィットのラインの信頼曲線は、対象となる試験が5％レベルで有意であるかどうかの視覚的表示を提供するために、破線で示される。その曲線は、有意性の水平ラインを横切る必要がある。
【図１９】サンプルH-1〜H-20についての効果mC 425[％]の予測値と実測値のプロット。フィットのラインの信頼曲線は、対象となる試験が5％レベルで有意であるかどうかの視覚的表示を提供するために、破線で示される。その曲線は、有意性の水平ラインを横切る必要がある。
【図２０】条件としてMSXありおよびなしでのデルタSPRについてのジャックナイフ距離(Jackknife Distances)を用いたプロジェクトHの外れ値分析。サンプルH-18は上方管理限界(Upper Control Limit: UCL)をはるかに超えており、そのサンプルを外れ値として強く示している。
【図２１】3つの生物学的複製物を含むサンプルH-1〜H-17、H-19およびH-20についての効果H3K4me3/H3の予測値と実測値のプロット。フィットのラインの信頼曲線は、対象となる試験が5％レベルで有意であるかどうかの視覚的表示を提供するために、破線で示される。その曲線は、有意性の水平ラインを横切る必要がある。
【図２２】3つの生物学的複製物を含むサンプルH-1〜H-17、H-19およびH-20についての効果H3ac/H3の予測値と実測値のプロット。フィットのラインの信頼曲線は、対象となる試験が5％レベルで有意であるかどうかの視覚的表示を提供するために、破線で示される。その曲線は、有意性の水平ラインを横切る必要がある。
【図２３】サンプルH-1〜H-17、H-19およびH-20についての効果mC 425[％]の予測値と実測値のプロット。フィットのラインの信頼曲線は、対象となる試験が5％レベルで有意であるかどうかの視覚的表示を提供するために、破線で示される。その曲線は、有意性の水平ラインを横切る必要がある。
【図２４】ヒストグラムにプロットしたサンプルH-1〜H-17、H-19およびH-20のデルタSPR値。異なる選択およびフィルター条件が示される。ボックス内の水平ラインは中央値を表す。信頼のひし形(confidence diamond)には、平均値、平均の上下95％が含まれる。ひし形の中央は平均を表す。ひし形の上端と下端は第1四分位数と第3四分位数を表す。ボックスには、ひげ(whisker)と呼ばれる両端から延びる線がある。ひげは、ボックスの端から、第1四分位数-1.5*(四分位範囲)および第3四分位数+1.5*(四分位範囲)として計算された距離内にある最も外側のデータ点まで延びている。データ点が計算された範囲に達しない場合、ひげは上および下データ点の値(外れ値は含まない)によって決定される。ボックスの外にあるブラケットはshortest halfを特定しており、これは測定値の最も密度が高い50％である(Rousseuw and Leroy 1987)。
【図２５】ヒストグラムにプロットしたプロジェクトTのデルタSPR値。異なる選択およびフィルター条件が示される。
【図２６】CHO細胞株DNAのクロマチン免疫沈降（ChIP）のスキーム。
【図２７】エピジェネティックなマーク、コピー数および安定性の相関研究。A：hCMV-MIEプロモーターでのヒストン3あたりのアセチル化に対するC-425メチル化のプロット。B：細胞株H-18を除外した後の選択剤MSXの非存在下(-)および存在下(+)でのCHO細胞の60世代にわたる比生産性の変化のプロット。選択剤ありおよびなしでの細胞株の安定性の高い相関挙動が確定された。C：プロットはコピー数とヒストン3アセチル化の相関を示し、コピー数の低い細胞株のみがヒストン3でアセチル化されたことを示す。D：プロットはコピー数とDNAメチル化の相関を示すが、コピー数の高い細胞株のみがhCMV-MIEプロモーターで主にメチル化される。EおよびF：プロットはコピー数と選択剤の存在下(+)および非存在下(-)での60世代にわたる比生産性の変化との相関を示す。したがって、コピー数の高い細胞株はサイレンシングする傾向がある。
【図２８】IgGクラスのヒト抗体を発現するプラスミド。ヒト免疫グロブリンの軽鎖および重鎖発現カセットは、両方とも、ヒトCMV主要前初期プロモーターおよびエンハンサー(SEQ ID NO:01)(hCMV-MIE)の制御下に置いた。
【実施例】
【０１９０】
実施例1
一般的技術
溶液
0006649276.tif 000025
0006649276.tif 000026
【０１９１】
組換えDNA技術
標準方法を用いて、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)に記載されるようにDNAを操作した。分子生物学的試薬はメーカーの指示に従って使用した。
【０１９２】
DNA配列決定
DNA配列決定はSequiServe社(Vaterstetten, ドイツ)で行った。
【０１９３】
DNAとタンパク質の配列解析および配列データ管理
EMBOSS(ヨーロッパ分子生物学オープンソフトウェアスイート)ソフトウェアパッケージおよびInvitrogen社のVector NTIバージョン9.1を配列の作成、マッピング、解析、注釈および図解のために使用した。
【０１９４】
タンパク質定量
クロマトグラフ法を用いて、サンプル中に存在する抗体の量を定量化した。抗体のFc領域に結合するPoros Aカラムを使用した。抗体を該カラムに結合させ、その後低pH条件で溶出する。タンパク質濃度は、アミノ酸配列に基づいて計算されたモル吸光係数を用いて、320nmの参照波長で、280nmでの光学密度(OD)を測定することにより決定した。
【０１９５】
アガロースゲル電気泳動
アガロースゲル電気泳動は、直鎖状DNA断片の質、サイズおよび量を分析するために行った(Chong, 2001)。DNA断片のサイズに応じて、1％(w/v)のアガロース溶液を沸騰させることによって1×TAE溶液に溶解した。ゲルは、最終濃度0.5μg/mlの臭化エチジウムを含んでいた。サンプルは、1/6(v/v)の6×DNAローディング色素を添加することによって調製した。DNAラダーをサイズ標準として使用した。電気泳動は、10V/cmゲル長(250V以下)を印加することによって1×TAEで行った。分離後、DNAをゲルドキュメンテーションシステム(Intas Science Imaging Instruments社, Goettingen, ドイツ)でUV光(254〜366nm)の下で調べた。
【０１９６】
ゲル抽出
アガロースゲル電気泳動後、好ましいバンドを含むゲルスライスをメスで切り取り、そのゲルスライスをQIAquick(登録商標)ゲル抽出キット(Qiagen社, Hilden, ドイツ)によりさらに抽出した。これに続いて、3倍量のBuffer QGを1倍量のゲル(100mg〜100μl)に添加し、50℃で10分間インキュベートした。溶解したゲルに1倍ゲル量のイソプロパノールを添加して混合した。DNA断片を13,000rpmで1分の遠心分離によりQIAquickスピンカラムに付着させ、0.75mlのBuffer PEおよびその後の遠心分離(13,000rpm、1分)により洗浄した。別のコレクションチューブでの2回目の洗浄によって、残留する洗浄緩衝液を除去した。最後に、DNAを30μlのRNaseフリーのH20で遠心分離(13,000rpm、1分)によりサンプルチューブ中に溶出した。DNAは、Flashゲル(FlashGel(商標)システム, Lonza社, Cologne, ドイツ)上で確認することができる。
【０１９７】
DNA定量化
Nanodrop 2000(PEQLAB Biotechnologie社, Erlangen, ドイツ)を用いて、260nmの波長で光学密度(OD)を測定することによりDNA濃度を定量化した。DNAの純度は、OD 260/280および260/230の比によって評価することができる。純粋なDNA調製物は、比≧1.8および2.0を持つべきである。
【０１９８】
コンピテント細菌の形質転換
45μlの化学的コンピテント大腸菌(E.coli)NEB 5α(NEB社, ドイツ)を氷上で10分間解凍し、その後1pg〜100ngのプラスミドDNA(1〜5μl)と共に氷上で30分間インキュベートした。その細胞懸濁液に42℃で45秒間熱ショックを与え、直ちに氷上で5分間冷却した。室温にしたSOCまたはLB培地950μｌを添加し、懸濁液を撹拌(250rpm)しながら37℃で60分間インキュベートした。アンピシリンを含有する予め温めておいた寒天プレート上に形質転換細菌をまいた。プレートを37℃で一晩インキュベートした。
【０１９９】
プラスミドの調製
プラスミドは、Qiagen Plasmid MiniおよびMaxiキット(Qiagen社, Hilden, ドイツ)を用いて、メーカーの指示に従って調製した。
【０２００】
DNA精製
ゲノムDNAは、Allprep DNA/RNA Miniキット(50)(カタログ番号80204, Qiagen社, Hilden, ドイツ)およびDNase Blood & Tissueキット(Qiagen社, Hilden, ドイツ)を用いて、メーカーの推奨に従って分離・精製した。断片の精製は、High Pure PCR Product Purificationキット(Roche Diagnostics社, Mannheim, ドイツ)を用いて、メーカーの指示に従って行った。
【０２０１】
フェノール/クロロホルム抽出
プラスミドの濃縮および精製は、フェノール/クロロホルム抽出によって行った。全ての工程をドラフトの下で行った。500μlの線状プラスミドを、1倍量のRoti(登録商標)フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール(25：24：1)(カタログ番号A156, Roth社, ドイツ)と混合して、30秒間ボルテックスした。その後、このエマルションを遠心分離(13,000rpm、1分)のために事前に遠心分離したPhase Lock Gel(商標)Lightチューブ(カタログ番号0032005.101, Eppendorf社, Hamburg, ドイツ)に移した。上部の水相を新しいチューブに移し、抽出を繰り返した。その後、上部の水相を500μlのクロロホルム/イソアミルアルコール(24：1)と混合し、抽出工程をもう一度繰り返した。上部相を新しいチューブに移し、チューブを4〜6回反転させることにより、0.1倍開始量の3mol/L酢酸ナトリウム緩衝液(pH4.8〜5.2)および0.7倍開始量の100％イソプロパノール(20〜30℃)と混合した。-80℃で20分のインキュベーションと、これに続く遠心分離(13,000rpm、4℃で30分)の後、上清を捨てた。ペレットを冷却した1mlの70％エタノールで洗浄し、遠心分離(13,000rpm、4℃で5分)して、上清を捨てた。洗浄工程を無菌条件下で繰り返し、残留上清を完全に除去した。ペレットを滅菌空気で5〜10分間乾燥させ、続いて0.5倍開始量の再蒸留水に取り上げた。
【０２０２】
導入遺伝子のコピー数の測定
導入遺伝子のコピー数ならびにhCMV-MIEプロモーターのC-425のメチル化率の測定は、Osterlehnerら(前掲)の推奨に従って行った。
【０２０３】
相対コピー数(rCN)は、標的投入サンプルhCMV-MIEプロモーターのCq値からの基準投入サンプル(例えば、Gusb)のCq値の差の2のべき乗により計算した。
0006649276.tif 000027
【０２０４】
クロマチン免疫沈降
CHO細胞株は、90％以上、好ましくは97％以上の生存率を有するものを回収した。固定する前に、プレクリアリング(pre-clearing)用および沈降用のビーズを調製した。プレクリアリングビーズは、サンプルあたり120μlのChIP希釈緩衝液中で15μlのプロテインAアガローススラリー(Roche Diagnostics社, Mannheim, ドイツ)を2μlの精製ウサギIgG(カタログ番号PP64B, Millipore社, ドイツ)とインキュベーション(回転しながら室温で1時間)することにより調製した。各回1倍量のChIP希釈緩衝液を用いる2回の洗浄工程を精製のために行い、その後85μlのChIP希釈緩衝液中にビーズを再懸濁した。15μlの沈降用アガロースAビーズは、5mg/ml BSA(Roche Diagnostics社, Mannheim, ドイツ)および100μg/mlの事前加熱サケ精子DNA(95℃で10分および氷上で5分；カタログ番号15632-011, Invitrogen社, ドイツ)を含む1mlのChIP希釈緩衝液中でブロックした。再懸濁したペレットは、回転しながら4℃で4〜5時間インキュベートし、続いて3回洗浄して、2倍量のChIP希釈緩衝液中に装入した。
【０２０５】
サンプルあたり約1×107個の細胞は、ホルムアルデヒドを3.7％の最終濃度まで培地に添加することによって固定し、以前に記載されたように室温で10分間インキュベートした(Beneke, S., et al. PLoS One 7 (2012) e32914)。グリシンを1倍溶液まで添加することによって固定を停止させた。氷冷PBSを用いる2回の洗浄工程および2000×gで3分間の遠心分離の後、ペレットを、プロテアーゼ阻害剤Roche complete (Roche Diagnostics社, Mannheim, ドイツ)を含有する1mlのPBS中に再懸濁した。その懸濁液を遠心分離(3000×g、5分、4℃)によりペレット化した。上清を捨てた。
【０２０６】
ペレットの溶解は、1mlの細胞溶解緩衝液とRoche complete (Roche Diagnostics社, Mannheim, ドイツ)を添加して、氷上で10分間インキュベートすることにより行った。遠心分離(2300×g、4分、4℃)後、核ペレットを300μlの核溶解溶液に再懸濁して、超音波処理した(出力5、デューティサイクル90％、15秒の超音波処理とその後の氷上での2〜3分のインキュベーションを6サイクル；Branson Sonifier B15, Dietzenbach, ドイツ)。超音波処理した核に700μlの核溶解溶液を添加し、続いて遠心分離(13,000rpm、15分、4℃)した。上清は、使用するまで-80℃で保存するために新しいチューブに移した。超音波処理グレードは、アガロースゲル上でタンパク質の消化後に試験した。
【０２０７】
クロマチンは、80μlの調製されたプロテインAアガローススラリーを用いて、インキュベーション(回転しながら4℃で2時間)および遠心分離(13,000rpm、6分、4℃；Eppendorf社, Hamburg, ドイツ)によりプレクリアリングした。上清を新しいチューブに移して、タンパク質濃度を測定した(Pierce(登録商標)BCAタンパク質アッセイキット；Thermo Scientific社, Rockford, 米国)。免疫沈降(IP)あたり25〜100μgのクロマチンを200μlの核溶解緩衝液に入れて、適切な抗体3μgを含むChIP希釈緩衝液300μlに添加した。免疫沈降を、回転しながら4℃で一晩行った。未希釈の投入サンプルを-20℃で保存した。一晩のインキュベーション後、40μlのブロックされたプロテインAアガロースビーズをIP溶液に添加して、(回転しながら4℃で1時間)インキュベートした。沈降物を低塩洗浄緩衝液で2回、高塩洗浄緩衝液で1回、LiCl洗浄緩衝液で1回、TE洗浄緩衝液で1回洗浄した。各洗浄は、回転プラットフォーム上で1mlの緩衝液中にて5分間行い、続いて遠心分離(500×g、30秒、4℃)した。最後の洗浄工程後、ビーズを500×gで1分間遠心分離した。ビーズペレットを200μlのIP溶出緩衝液と組み合わせ、同時に25〜100μgのクロマチン投入サンプルをIP溶出緩衝液で200μlまで満たして、振とうしながら65℃で30分間インキュベートした。その後、各チューブに0.5μlのRNase DNaseフリー(Roche Diagnostics社, Mannheim, ドイツ)を添加した後、チューブを37℃で30分間インキュベートした。最終的なタンパク質消化のために、10μlの4M NaCl(最終濃度0.2M)および2μlのプロテイナーゼK(最終濃度100〜200μg/ml；Roche Diagnostics社, Mannheim, ドイツ)を反応サンプルに添加し、65℃で1.5時間インキュベートした。DNAをRoche PCR精製キット(Roche Diagnostics社, Mannheim, ドイツ)により精製した。
【０２０８】
亜硫酸水素塩変換
非メチル化シトシンをウラシルに変換するために、EZ-96 DNA methylation-lightning(商標)キット(ディープウェル型)(Zymo Resarch社, Freiburg, ドイツ)をメーカーの指示に従って使用した。簡単に述べると、gDNAをDNase blood & tissueキット(Qiagen社, Hilden, ドイツ)で抽出し、Nanodrop 2000 (PEQLAB Biotechnologie社, Erlangen, ドイツ)を用いて濃度を測定し、再蒸留水20μl中350ngのgDNAの濃度に設定した。20μlのgDNAを、変換プレートにおいて130μlのライトニング変換試薬と混合した。そのプレートを98℃で8分間、次に54℃で60分間インキュベートし、最後に4℃で一時的に保存した。ウェルあたり600μlのM結合緩衝液を含むZymo-Spin(商標)I-96結合プレートをコレクションプレート上に載せた。変換プレートからのサンプルをZymo-Spin(商標)I-96結合プレートに添加し、混合して、遠心分離(3000×g、5分)した。プレートを400μlのM洗浄緩衝液で洗浄し、遠心分離(3000×g、5分)した。200μlのL-脱スルホン化緩衝液を各ウェルに添加し、インキュベーション(20〜30℃、20分)して、その後遠心分離(3000×g、5分)した。追加の洗浄工程を3000×gで10分の遠心分離により完了させ、変換されたDNAを30μlのM溶出緩衝液で溶出した。変換されたDNAは、使用するまで-20℃で保存した。
【０２０９】
変換されかつ組み込まれたhCMV-MIEプロモーターの増幅
hCMV-MIEプロモーターのCpGメチル化を調べるために、遠位(F1 & R1)および近位(F2 & R2)プロモーター領域のプライマー対を次のように設計した。
0006649276.tif 000028
【０２１０】
各プライマー10ピコモル(0.5μl)を12.5μlのZymoTaq(商標)DNAポリメラーゼプレミックス(Zymo Resarch社, ドイツ)、3μlのgDNAテンプレートに添加し、再蒸留水を満たして25μlとした。Mastercycler nexus X1(Eppendorf社, Hamburg, ドイツ)を用いて、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を実施した；PCR条件は以下の通りであった。
0006649276.tif 000029
【０２１１】
アンプリコンを30〜40μlの溶出緩衝液中でRoche PCR精製キット(Roche Diagnostics社, Mannheim, ドイツ)により精製した。Nanodrop 2000 (PEQLAB Biotechnologie社, Erlangen, ドイツ)を用いて濃度を規定し、アガロースゲル電気泳動でアンプリコンのサイズを表示させた。
【０２１２】
インバースPCR
インバース(inverse)ポリメラーゼ連鎖反応(iPCR)は、ランダムに組み込まれたベクターの組込み部位を決定するための方法である。このことから、切断部位の近くの既知のベクター配列を用いて、少なくとも20bpの長さのプライマーを作製する。これらのプライマーは、それぞれ反対の方向を向いている。
【０２１３】
ゲノムは、プライマー結合部位間およびベクターの線形化部位で切断しない頻繁切断型酵素(4bpカッター)を用いて消化した。得られた断片を、分子内ライゲーションに有利に働くように、非常に希薄な条件でライゲートさせる。環状化された配列は、今や、インバースプライマーにより増幅することができる。
【０２１４】
ゲノムDNAは、Qiagen blood & cell culture DNA prep, midiキット(Qiagen社, Hilden, ドイツ)を用いて、条件ごとに2×107個の細胞(約90μgのDNA)から単離して(ゲノムDNAは-20℃で数ヶ月間保存することができる)、90μlの再蒸留水中に溶解した。
【０２１５】
単離されたゲノムDNAは、異なる制限エンドヌクレアーゼを用いて、適切な使用温度で最低でも16時間消化した。gDNAの消化では、PvuI組込み部位の上流のiPCRのために酵素CviQI、MseIおよびMspIを使用し、PvuI組込み部位の下流のiPCRのために酵素MseI、BfaIおよびMluCIを使用した。消化ごとに10μgのゲノムDNAを用いた(3.8×106コピー)。
【０２１６】
消化：
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消化されたDNAは、Roche PCR精製キットを用いて精製し、xμl(200μl)の溶出緩衝液に溶出した。DNAの高い希釈グレードは分子内ライゲーションに有利に働く。
【０２１７】
ライゲーション：
0006649276.tif 000031
環状DNA断片を生成するために、消化されたDNAは、T4 DNAリガーゼ(NEB社, Frankfurt/Main, ドイツ)を用いて16℃で一晩ライゲートさせた。ライゲートされたDNAは、ハイピュアPCR精製キット(Roche Diagnostics社, Mannheim, ドイツ)の溶出緩衝液50μlで溶出し、10ngのテンプレートDNAに加えた。対照群として、CHO細胞株の非トランスフェクトgDNAを調べた。
0006649276.tif 000032
【０２１８】
5'iPCR条件のためのiPCRは、次のように記載される。
0006649276.tif 000033
【０２１９】
5μlのPCR断片をオレンジG(5μl)および再蒸留水(10μl)と混合し、アガロースゲル上にロードして断片の分布を検証した。MseIおよびMluCI切断された断片の5'iPCRでは、良好な結果が得られ、対照レーンには非特異的なバンドが検出されなかった。
【０２２０】
各サンプル(MseIおよびMluCIで切断)の5'アンプリコンは、一緒にして、40μlの溶出緩衝液中でハイピュアPCR精製キット(Roche Diagnostics社, Mannheim, ドイツ)を用いて精製した。
【０２２１】
定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応
各qPCRでは、LightCycler(登録商標)480インスツルメントIIシステム(Roche Diagnostics社, Mannheim, ドイツ)において非特異的蛍光色素LightCycler(登録商標)480 SYBR Green I Masterを使用した。SYBR Greenは青色光(λmax＝488nm)を用いて励起され、それは緑色の光(λmax＝522nm)を発する。SYBR Green色素は、PCRにおいて全ての二本鎖DNAに結合する。結果として、蛍光強度とDNA産物量が同時に増加し、それを各サイクル後にLightCycler(登録商標)システムで検出することができる。定量化のため、蛍光を対数尺度でサイクル数に対してプロットした。放出されたバックグラウンドよりもやや上に、DNAベースの蛍光を検出するための閾値をLightCycler(登録商標)システムで設定した。蛍光が閾値を上回るサイクルの数は、定量サイクル(quantification cycle: Cq)と呼ばれる(Bustin, S.A., et al., Clin. Chem. 55 (2009) 611-22)。指数関数的増幅段階の間、標的DNAの倍増が新しいサイクルごとに期待される。しかしながら、増幅の効率は、多くの場合、プライマーとテンプレートの間で変わりやすい。増幅されたDNA断片の融解温度の分析は、用いたプライマー対の特異性およびプライマーダイマーの量の最初の手掛りを提供する。
【０２２２】
プライマーとテンプレートの組み合わせの効率は、標準曲線を作成するためのタイトレーション実験により、またはLinRegPCRのような効率計算プログラムにより評価することができる。このプログラムは、LightCycler(登録商標)システムからの非ベースライン補正データを使用し、各サンプルに関して個別にベースライン補正を行い、window-of-linearityを決定し、その後線形回帰分析を用いて、PCRデータセットを通る直線に適合させる。この直線の傾きから個々のサンプルのPCR効率を計算する。
【０２２３】
相対的定量化では、標的配列の量を、Cq(基準)からCq(標的)を減算することによって、基準配列と比較した。この正規化はΔCq法と呼ばれる(Scheie, J.H., et al., J. Mol. Med. (Berlin) 84 (2006) 901-910)。基準配列は、バックグラウンド値(Mock)よりもかなり高い、非常に安定した値を持つ必要がある。したがって、各基準配列について、1つのプロジェクト内の全てのサンプルの平均および変動係数を算出して、バックグラウンドレベルと比較した。異なる条件のCq値は、投入サンプルに対する％として表示して、mock対照への距離を視覚化した。
投入サンプルに対する％ = 100*2ΔCq(投入サンプル-ChIPサンプル)
【０２２４】
多数のサンプルに関して、全てのqPCRは384ウェルプレートで実施された。各ウェルに、次の成分を導入した。
0006649276.tif 000034
【０２２５】
qPCRプログラムは次のように設計された。
0006649276.tif 000035
【０２２６】
ヒストン修飾の相対的定量化の場合には、サンプル(処理済み)の投入サンプル(未処理)への正規化は、処理済み標的配列の処理済み基準配列への正規化によって直接置き換えられる。ヒストンあたりのヒストン修飾の更なる計算は、投入サンプルへの正規化を冗長化する。
【０２２７】
ヒトCMV主要前初期プロモーター/エンハンサー断片に近接する特定のヒストン修飾の相対量は、プライマー-テンプレート効率が2に近くかつ互いに近い(＜2％のCq平均差)限り、デルタデルタCq(ΔΔCq)法としても知られるLivak法を用いて推定された(Livak, K.J. and Schmittgen, T.D., Methods 25 (2001) 402-408)。
【０２２８】
この方法は、基準に対する標的の相対的定量化のために使用することができる。ヒトCMV主要前初期プロモーター/エンハンサー断片に近接するヒストン3アセチル化およびヒストン3のレベルの相対的定量化は、基準遺伝子に近接するヒストン3アセチル化およびヒストン3のレベルに対して2段階で正規化された。最初のΔCqは次のように算出された。
ΔCq = 対照 - サンプル
ΔCqは、異なるプライマー対で増幅された、同じサンプルの対照(例えば、GusbのChIPサンプル値)と標的(例えば、hCMV-MIEのChIPサンプル値)の間の定量サイクル(Cq)の距離である。ヒストン3あたりのヒストン3修飾のレベルを特定するために、ΔΔCq法が使用された。
0006649276.tif 000036
【０２２９】
配列決定法
サンガー(Sanger)法による配列決定は、会社SequiServe (SequiServe社, Vaterstetten, ドイツ)により行われた。
【０２３０】
次世代シーケンシングは、イルミナ(Illumina)のシーケンシング技術を用いて、GATC社(GATC-biotech社, Konstanz, ドイツ)およびActive Motif社(La Hulpe, ベルギー)により行われた。
【０２３１】
タンパク質の定量化
タンパク質の濃度は、Pierce(登録商標)BCAタンパク質アッセイキット(Thermo Scientific社, Rockford, 米国)を用いて、タンパク質標準と比較して推定された。
【０２３２】
区画内のタンパク質の分画
タンパク質は膜/細胞質および核のタンパク質に分画された(Misawa, Y, 2006)。これに伴って、CHO細胞(1×107細胞/サンプル)を遠心分離(300×g、4℃で3分)により沈降させ、ペレットを、Roche Complete (Roche Diagnostics社, Mannheim, ドイツ)を補充した氷冷PBSで2回洗浄した。洗浄済みのペレットを1mlの0.5％Triton X-100溶解緩衝液で溶解し、氷上で15分間インキュベートした。不溶性の核を遠心分離(13,000rpm、4℃で15分)により分離した。膜/細胞質を含む上清を新しいチューブに移して、氷上で冷却した。核ペレットは溶解緩衝液で1回洗浄し、0.5％SDSを含有する溶解緩衝液300μl中に再懸濁し、続いて超音波処理(5秒、出力2、デューティサイクル90％；Branson Sonifier 450, Dietzenbach, ドイツ)を行った。700μlの溶解緩衝液を加えて、サンプルを13,000rpm、4℃で15分遠心分離した。核を含む上清を新しいチューブに移し、タンパク質画分を-80℃で保存した。
【０２３３】
SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)
変性SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動のために、NuPAGEゲル(4〜12％)(NuPAGE(登録商標)Novex(登録商標)10％Bis-Trisゲル 1.0mm×12ウェル, カタログ番号NP0302BOX, Invitrogen社, ドイツ)をNuPAGE(登録商標)電気泳動システムと組み合わせて使用した。クイックリファレンスカード(Quick Reference Card)(NuPAGE(登録商標)Bis-Tris Miniゲル)に従って、ゲルをチャンバー内で固定し、内側カセットを1×MOPSランニング緩衝液(20×NuPAGE MOPS SDSランニング緩衝液, カタログ番号NP0001, Invitrogen社, ドイツ)で満たした。外側チャンバーもその体積の3分の2まで満たした。コームを除去し、レーンを小さなピペットでパージした。30μlのサンプルを10μlの4×NuPAGE LDSサンプル緩衝液(カタログ番号NP0007, Invitrogen社, ドイツ)、2μlの1M DTT(最終濃度50mM)に加えて、95℃で5分間インキュベートした。サンプル(20μl/レーン)およびマーカー((10μl/レーン) SeeBlue Marker prestained, カタログ番号LC 5625, Invitrogen社; (5μl/レーン) MagicMark XP anti IgG, カタログ番号LC5602, Invitrogen社, ドイツ)をレーンに移して、ゲルにNuPAGE(登録商標)電気泳動システムを使って30ボルトで50分間印加した。
【０２３４】
SDS-PAGEおよびウェスタンブロット
SDS-PAGEにより誘導され分離されたタンパク質は、適切な試薬類を含むXCell IIブロットモジュール(Invitrogen社, ドイツ)において、変性電気泳動のためのNuPAGEプロトコル(NuPAGE(登録商標)技術ガイド, マニュアルパート番号IM1001, Invitrogen社, ドイツ)に従って、メタノール活性化ニトロセルロース膜にブロットした。ブロッティングは、SDS-PAGEチャンバーにおいて30ボルトで50分間実施した。ブロットされたタンパク質の膜を新しいチャンバーに移し、1×TBS洗浄緩衝液(10×TBS: 0.5M Tris-Base, 1.5M NaCl, pH7.5)中で10分間3回洗浄し、その後、一般的なタンパク質検出のためのポンソー(Ponceau)溶液(0.1％)中で5分間インキュベートした。ポンソー溶液を捨て、残留物を1分のTBS洗浄工程で2回洗い流した。
【０２３５】
膜は、1％ブロッキング溶液(ブロッキング溶液：1/10カゼイン(Roche Diagnostics社, Mannheim, ドイツ), 1×TBS)中20〜30℃で1時間ブロックした。続いて、膜を一次抗体溶液(1％ブロッキング溶液+抗体)中4℃で一晩振とうしながらインキュベートした。その膜を1×TBST中20〜30℃で10分間3回洗浄し、その後1×TBS中での1分の洗浄工程を1回行った。膜を二次抗体溶液(1％ブロッキング溶液+抗体)中20〜30℃で45分間または4℃で一晩撹拌しながらインキュベートした。膜を1×TBST中20〜30℃で10分間3回洗浄した後、Tweenを除くために1×TBS中での1分の洗浄工程を2回行った。
0006649276.tif 000037
抗体結合の検出は、Lumi-LightPLUSウェスタンブロッティングシステム(Roche社, Penzberg, ドイツ)を用いて行った。
【０２３６】
CHO細胞株の解凍
適切な培地5mlを含むファルコン(Falcon)チューブを用意した。クライオバイアル(Cryovial)は、水浴(37℃)中で解凍するまでドライアイス上で保存した。その後、用意したファルコンチューブにCHO細胞を取り、残留DMSOを除去するために500×gで3分間遠心分離した。ペレットを5mlの培地中に再懸濁し、使い捨て125ml振とうフラスコ(適切な培地20mlを含む)内で標準加湿条件(95％rH、37℃、5％〜8％CO2)下に120rpm/分〜150rpm/分の一定の撹拌速度で増殖させた。生存率(＞95％)および細胞濃度は、Cedex HiResアナライザー(Roche Diagnostics社, Mannheim, ドイツ)を用いて試験することができる。
【０２３７】
CHO細胞株の培養
非トランスフェクトCHO細胞を3〜4日ごとに分割し、培地中に2〜3×105細胞/mlの濃度で播種した。トランスフェクト細胞は、さまざまな濃度のメトトレキサート(MTX)またはメチオニンスルホキシミン(MSX)を選択剤として用いて播種した。細胞生存率の回復後(3〜4週間)、安定にトランスフェクトされた細胞を、20nM〜1200nMのメトトレキサート(MTX)または140〜160μMのメチオニンスルホキシミン(MSX)を選択剤として含有する、チミジンおよびタンパク質フリーの培地中で選択した。細胞は、125mlベント式振とうフラスコ内で標準加湿条件(95％rH、37℃、5％CO2)下に120rpm/分〜150rpm/分の一定の撹拌速度で増殖させた。3〜4日ごとに細胞を2〜3×105細胞/mlの細胞濃度で新鮮な培地に分割した。培養物の密度および生存率は、CASY TTまたはCedex HiRes細胞カウンター(Roche Innovates社, Bielefeld, ドイツ)を用いて測定した。
【０２３８】
一過性および安定なトランスフェクション
トランスフェクションは、Amaxa(登録商標)Cell line Nucleofector(登録商標)キットV (Lonza社, Cologne, ドイツ)ならびにトランスフェクションプラットフォームNucleofector(商標)2b装置および96ウェルShuttle(商標)システム(Lonza社, Cologne, ドイツ)を用いて行った。
【０２３９】
トランスフェクションあたり5×106個のCHO細胞を遠心分離(200×g、5分)し、上清を捨てた。ペレットを100μlの補充済みNucleofector溶液V中に再懸濁し、1.2pmolの無菌プラスミドをアップダウンのピペッティングにより添加した。安定なトランスフェクションのためにプラスミドを線状にし、一過性のトランスフェクションのために環状を維持した。懸濁液をバブルフリーのキュベットに入れ、CHO細胞株のトランスフェクションのためにプログラムU-24を活性化した。パルスの後、予め温めた培地500μlをキュベットに入れ、懸濁液全体を予め温めた培地8ml中に移した。細胞をインキュベーターに移し、2日後には細胞はいつでも最初の試験をする状態になった。
【０２４０】
Cellavistaによる細胞計数
60μlのCHO細胞懸濁液を96丸底ウェルで60μlのトリパンブルー(0.1μm)と混合し、20〜30℃で5分間インキュベートした。その後、処理したCHO細胞懸濁液を培地で1：50に希釈し、200μlを96平底ウェル(Greiner社, ドイツ)に移した。低速遠心分離(500×g、5分)は細胞の速い沈降をもたらした。
【０２４１】
正確な細胞計数のために、ウェルの真ん中からの画像を取得し、各ウェルの縁に接近している画像の表示エラーを回避した。Cellavista細胞イメージャー(SynenTec社, Munich, ドイツ)を細胞計数のために使用した。各サンプルを複製して行い、全10の画像を用いて細胞数を計算した。
【０２４２】
Cedex HiResアナライザーによる細胞計数
サンプル番号40までの細胞計数では、Cedex HiResアナライザー(Roche社, ドイツ)を使用した。これに従って、CHO細胞をHiRes培地中に1：5の比で希釈し、300μlをチューブに移した。細胞の計算はメーカーの推奨に従って行った。細胞数を検証するためにサンプルを2つ組で分析した。
【０２４３】
抗体分析用のサンプルの調製
細胞の濃度を算出し、サンプルあたり2mlを遠心分離した(500×g、20〜30℃で5分)。上清を新しい96ディープウェルプレートに移し、使用するまで-20℃で保存した。凍結された上清を4℃で一晩解凍し、6×反転および遠心分離(4,000rpm、20〜30℃で30分)を行った。310μlを、バーコード化96ラウンドウェルプレートの上でマルチスクリーンミリポア(Millipore)プレートを用いて遠心分離(1,200rpm、20〜30℃で3分)によりろ過した。
【０２４４】
HPLCでの抗体産生の定量化
クロマトグラフ法を用いてサンプル中に存在する抗体の量を定量した。抗体のFc領域に結合するPoros Aカラムを使用した。抗体を該カラムに結合させ、続いて低pH条件で溶出する。タンパク質濃度は、アミノ酸配列に基づいて計算されたモル吸光係数を使用し、基準波長を320nmとして、280nmでの光学密度(OD)を測定することによって達成した。
【０２４５】
ELISAでの抗体産生の定量化
ELISA(酵素結合免疫吸着アッセイ)技術は、抗体サンドイッチ原理に基づいている。関心対象のアナライト、例えばIgGのFc部分、に特異的な捕捉抗体をマイクロタイタープレートに結合させて固相を作製する。ブロッキングおよび洗浄工程の後、サンプル、標準(基準抗体の希釈系列)および対照を固相抗体(アナライトを捕捉する)とインキュベートする。未結合のアナライトを洗い流した後、コンジュゲート化検出抗体(例えば、PODコンジュゲート化)を添加する。この検出抗体は、測定される分子の異なるエピトープに結合して、サンドイッチを完成させる。BMケミルミネッセンスELISA基質POD(Roche Diagnostics社, Mannheim, ドイツ)は、ペルオキシダーゼベース(POD, HRP)の二次検出システムの基質溶液を提供する。イムノアッセイにおけるシグナル発生率は、固相に結合されたマーカー酵素の量に正比例する。抗体の濃度は標準希釈の傾きにより算出された。
【０２４６】
hCMV-MIEプロモーターを含む組換えCHO細胞株の作製
IgGクラスのヒト抗体構築物を発現する組換え細胞株は、CHO-K1懸濁増殖細胞の一過性または安定なトランスフェクションにより作製した。ヒト免疫グロブリンの軽鎖および重鎖発現カセットは両方とも、ヒトCMV主要前初期プロモーターおよびエンハンサーの制御下に置いた。
【０２４７】
ベクターは、マウスジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)をコードする核酸配列をも含んでいた。細胞のトランスフェクションは、Amaxa nucleofectionシステム(Lonza Cologne社, Cologne, ドイツ)により行った。
【０２４８】
CHO-K1 M懸濁液は、Nucleofector装置をNucleofectorキットV(Lonza Cologne社, Cologne, ドイツ)と組み合わせて使用して、メーカーのプロトコルに従って、抗体の一過性発現のための環状プラスミドDNAでトランスフェクトした。一過性にトランスフェクトされた細胞懸濁液を96ウェルプレートに播種し、5日間インキュベートした。
【０２４９】
安定にトランスフェクトされた細胞懸濁液は、選択剤として250〜1600nMのメトトレキサート(MTX)を加えたチミジンフリーの培地を含む384または6ウェルプレートに播種した。3〜4週間後、抗体発現細胞のプールを1〜3ヶ月の期間にわたる長期安定性について調べた。抗体を発現する単一細胞クローンを384および96ウェルプレートに播種した。3週間後、培地中の抗体価をELISAで測定することによって抗体発現細胞株を同定した。増殖中のウェルを無作為に採取し、長期安定性のアッセイのために、細胞クローンをより大きな体積(6ウェルプレートで3ml/ウェル)で増殖させ、各継代の終りにプロテインA HPLCおよびELISAで抗体濃度を測定した。
【０２５０】
細胞は、使い捨ての125mlベント式振とうフラスコまたは6ウェルプレートで標準加湿条件(95％rH、37℃、5％〜8％CO2)下に120rpm/分〜150rpm/分の一定の撹拌速度で増殖させた。3〜4日ごとに細胞を新鮮な培地に分割した。培養物の密度および生存率は、Cedex HiRes細胞カウンター(Roche Innovates社, Bielefeld, ドイツ)またはCellavista CV3.1(SynenTec Bio Services社, Munich, ドイツ)を用いて測定した。
【０２５１】
hCMV-MIEプロモーターを含むCHO細胞株の長期培養および生産
細胞は、選択剤MTXの存在下でのトランスフェクション後2〜3ヶ月間、表現型(すなわち生産)の安定性について試験した。細胞を、20〜40mlの培地を含有するベント式125ml振とうフラスコまたは選択剤を含む2〜4mlの培地を含有する6ウェルプレートで連続的に培養し、新鮮な培地で1週間に2回希釈した。播種密度は2〜3×105細胞/mlであった。継代の前に、生細胞密度および生存率を測定した。
【０２５２】
上清の抗体濃度(抗体価)は、各継代の終りにプロテインA HPLCおよびELISAにより測定した。これらのデータから、各継代の細胞の比生産性(qP)を、下記式を用いて算出した：
0006649276.tif 000038
qP [pg/細胞/日]：細胞の比生産性；
P1 [μg/ml]：継代の開始時の抗体価；
P2 [μg/ml]：継代の終了時の抗体価；
D1 [細胞/ml]：継代の開始時の生細胞密度；
D2 [細胞/ml]：継代の終了時の生細胞密度；
Δt [日]：継代の期間。 
【０２５３】
qP値は、各継代の終了時の培養齢(age of culture)に対してプロットした。線形トレンドライン(linear trend line)を全てのqPデータ点にわたって算出し、その期間にわたるqPの相対的変化(パーセント)を、下記式に従って、社内で計算した：
0006649276.tif 000039
ΔqP[％]：qPの変化パーセント；
m[pg/細胞/日/世代]：線形トレンドラインの傾き；
a[世代数]：培養齢；
qP0：線形トレンドラインのy軸切片。
【０２５４】
各サンプルにつき得られたデータ点のより少ない数に関しては、最後の3つのqP値の平均を最初の2つのqP値の平均で割り、ΔqPを得るためにパーセントで表示した。
0006649276.tif 000040
平均qP EOS：最後の3つのqP値の平均
平均qP PSB：最初の2つのqP値の平均
【０２５５】
エピジェネティックなマーカーを同定するために使用される組換えCHO細胞株の処理
2つのプロジェクトの32のCHO細胞株は、2ヶ月前に標的遺伝子の発現を予測するエピジェネティックなマーカーを同定するために使用された。両プロジェクトについて、抗体濃度、hCMV-MIEプロモーターのC-425メチル化状態、およびコピー数を含むデータを60世代(約2ヶ月)の期間にわたって収集した。プロジェクトHは、hCMV-MIEプロモーターの制御下でIgGクラスのヒト抗体を発現する20のCHO-K1細胞株を含む。そのベクターは、細胞をメチオニンスルホキシミン(MSX)選択に対して感受性にする、グルタミン合成酵素をコードする核酸配列をさらに含む。プロジェクトTは、hCMV-MIEプロモーターの制御下でIgGクラスのヒト抗体を発現する12のCHO-K1細胞株を含む。これらの細胞株は、マウスジヒドロ葉酸レダクターゼの導入遺伝子のため、メトトレキサート(MTX)選択を受けやすい。凍結された出発培養物を解凍し、250nMのMTXまたは140μMのMSXを含む適切な培地で培養した。培養の2週間後(時点PSB)、細胞を回収し、以下の抗体を用いてクロマチン免疫沈降を実施した。
【０２５６】
プロジェクトTのためのリスト
0006649276.tif 000041
プロジェクトHのためのリスト
0006649276.tif 000042
【０２５７】
定量PCRは、以下のプライマーを用いて行った。
0006649276.tif 000043
【０２５８】
導入遺伝子のコピー数の決定
導入遺伝子のコピー数の検査は、以前(Osterlehner, et al. 2011)に記載されたように行った。サンプルあたりの導入遺伝子コピー(LCsまたはHCs)を希釈系列の標準曲線から外挿した。各細胞が約6pgのDNAを含むと仮定して、細胞あたりの導入遺伝子数(LCcell)を次のように計算した。
0006649276.tif 000044
【０２５９】
JMPによるコンピュータ解析
培養期の開始時のC-179のメチル化パーセントおよびhCMV-MIEに近接するヒストン3あたりのアセチル化は、標準的な最小二乗フィットモデルで比生産性(ΔqP)の60世代にわたる変化に対してプロットした。そのためにソフトウェアJMP10(JMP(登録商標)10.0.1 リリース:2, 64ビット版; SAS Institute社)を使用して、効果レバレッジ(leverage)プロットのP値を計算した。さらに、外れ値の解析を、ジャックナイフ技術を用いて行った。LogWorth統計を行って最良の分割ノードを特定し、エピジェネティック修飾の安定性および程度により細胞集団をさらに分割した(Sall 2002)。
【０２６０】
実施例2
組換えCHO細胞株の作製
クラスIgGのヒト抗体を発現する組換え細胞株は、CHO-K1またはCHO-DG44懸濁培養細胞を、ヒト免疫グロブリンκ軽鎖とヒト免疫グロブリンγ1またはγ4重鎖とを含む抗体の該軽鎖と該重鎖とをコードするベクターで安定的にトランスフェクトすることにより作製した。このベクターはマウスジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)またはグルタミンシンテターゼ(GS)をコードする核酸をさらに含んでいた。軽鎖と重鎖の発現カセットはいずれも、ヒトCMV主要前初期プロモーター/エンハンサー(SEQ ID NO:01)の制御下にあった。細胞のトランスフェクションは、ヌクレオフェクション (Lonza Cologne社またはAmaxa Biosystems社)により、またはGene Pulser XCell (BIO-RAD社)を用いたエレクトロポレーションにより実施した。
【０２６１】
例えば、CHO-K1またはCHO-DG44懸濁液は、NucleofectorキットVと組み合わせたNucleofectorデバイス(Lonza Cologne社, Cologne, ドイツ)を用いて、またはGene Pulser XCell (Bio-Rad社, Hercules, CA)を用いるエレクトロポレーションにより、メーカーのプロトコルに従って、線形化したプラスミドDNAでトランスフェクトした。トランスフェクト細胞を、各種濃度のメトトレキサート(MTX)を選択剤としてまたはメチオニンスルホキシミン(MSX)を選択剤として加えたチミジンフリー培地を含む96または384ウェルプレートに播種した。3週間後、培地中の抗体価をELISAで測定することにより、抗体を発現する細胞株を同定した。上位の産生株をより大きな体積まで増殖させ、限界希釈法によりサブクローニングして凍結保存した。
【０２６２】
安定的にトランスフェクトされた細胞は、選択剤として20nM〜1200nMのメトトレキサート(MTX)または140〜160μMのメチオニンスルホキシミン(MSX)を含有するチミジンおよびタンパク質フリーの培地中で選択した。抗体を発現する細胞または細胞株は、培地中の抗体価を測定することによって同定し、限界希釈法および/またはFACS単一細胞付着によりサブクローニングした。
【０２６３】
細胞は、使い捨ての50mlまたは125mlベント式振とうフラスコ内で標準加湿条件(95％rH、37℃、および5％〜8％CO2)下、120rpm/分〜150rpm/分の一定の撹拌速度で増殖させた。3〜4日ごとに細胞を新鮮な培地に分割した。培養物の密度と生存率はCASY TTまたはCedex HiRes細胞カウンター(Roche Innovates AG, Bielefeld, ドイツ)を用いて測定した。
【０２６４】
さらに、標準的な細胞培養技術が、例えばCurrent Protocols in Cell Biology, Bonifacino, J.S.ら(編), John Wiley & Sons, Inc., New York (2000)に記載されるように適用された。
【０２６５】
実施例3
長期培養および生産
実施例2に従って得られたCHO細胞株は長期的な生産性について検討された。
【０２６６】
細胞は選択剤の非存在下で35〜70世代にわたって表現型(すなわち、生産)安定性について試験された。細胞を、50mlの選択剤不含培地を含有するベント式125ml振とうフラスコ内で継続的に培養し、新鮮な培地で週2回希釈した。播種密度を2〜3×105細胞/mlとした。継代に先立って、生細胞密度と生存率を測定した。各継代の終了時の培養物の年齢(世代数で表される)を次の式に従って算出した：
a2 = a1+ln(D2/D1)/ln2        (式1)
式中、
a2 [世代数]：その継代の終了時の培養物の年齢
a1 [世代数]：その継代の開始時の培養物の年齢、すなわち、前の継代の終了時の培養物の年齢
D1 [細胞/ml]：その継代の開始時の生細胞密度
D2 [細胞/ml]：その継代の終了時の生細胞密度。
【０２６７】
上清中の抗体濃度(抗体価)は、各継代の終了時にプロテインA HPLCで測定した。これらのデータから、各継代の比生産率(SPR)を次の式に従って算出した：
SPR = P2-P1/((D2+D1)/2*Δt)        (式2)
式中、
SPR [pg/細胞/日]：比生産率
P1 [μg/ml]：その継代の開始時の抗体価
P2 [μg/ml]：その継代の終了時の抗体価
D1 [細胞/ml]：その継代の開始時の生細胞密度
D2 [細胞/ml]：その継代の終了時の生細胞密度
Δt [日]：その継代期間の持続日数。
【０２６８】
SPRの値は、各継代の終了時の培養物の年齢(世代数)に対してプロットされた。すべてのSPRデータ点にわたって線形傾向線を算出し、試験した期間にわたるSPR(％)の相対的な変化を次の式に従って算出した：
ΔSPR = m*a/SPR0*100        (式3)
式中、
ΔSPR [％]：SPRの変化パーセント
m [pg/細胞/日/世代]：線形傾向線の傾き
a [世代数]：培養物の年齢
SPR0：線形傾向線のy軸切片。
【０２６９】
ほぼすべての細胞株が生産性の低下を示し、選択剤なしの条件下では生産性喪失の傾向がより強かった。
【０２７０】
（表３）選択剤の存在下および/または非存在下での5つの細胞株の培養中のSPRの変化
0006649276.tif 000045
n.d.＝測定せず
0006649276.tif 000046
n.d.＝測定せず
0006649276.tif 000047
0006649276.tif 000048
e.i.m.＝測定の誤り
0006649276.tif 000049
【０２７１】
実施例4
亜硫酸水素塩処理およびDNA配列決定によるヒトCMV主要前初期プロモーター/エンハンサーDNA内のメチル化CpG部位の同定
抗体の軽鎖および重鎖遺伝子の発現のために用いたヒトCMV主要前初期プロモーター/エンハンサー断片(SEQ ID NO:01)には、33箇所のCpG部位が含まれる。
【０２７２】
ゲノムDNAを、Qiagen社(Hilden, ドイツ)からのAllprep DNA/RNA Miniキットを用いて、CHO細胞株K18.1、G25-10、G25-17、G42-5および43-16 A10から単離した。5μgのDNAを酵素DraIで切断し、260nmでの吸光を測定することにより定量化した。100ngのDNAを亜硫酸水素塩処理に供し、EpiTect Bisulfiteキット(Qiagen社, Hilden, ドイツ)を用いて精製した。亜硫酸水素塩処理したDNAを20μlのRNAseフリー水(Qiagen社, Hilden, ドイツ)中に回収した。
【０２７３】
ヒトCMV主要前初期プロモーター/エンハンサー断片のA鎖(フォワード)(SEQ ID NO:02)を増幅するために、1μlの亜硫酸水素塩処理したDNAを24μlのPCRマスターミックスと組み合わせて、GeneAmp(登録商標)PCRシステム9700 (Applied Biosystems社, 米国)を用いてPCRに供した。
【０２７４】
24μlのPCRマスターミックスに以下を含めた：
1μlのフォワードプライマー227(SEQ ID NO:06)(10pmol/μl)
1μlのリバースプライマー229(SEQ ID NO:08)(10pmol/μl)
22μlのPlatinum(登録商標)PCR SuperMix HighFidelty (Invitrogen社, 米国)。
【０２７５】
フォワードプライマー227は、ヒトCMV主要前初期プロモーター/エンハンサー断片の5'末端に相補的である。リバースプライマー229は、免疫グロブリン遺伝子の5'-UTR内の下流に結合する。
【０２７６】
PCR条件は次のとおりであった。
0006649276.tif 000050
【０２７７】
PCR産物はアガロースゲル電気泳動でサイズと純度を調べ、TOPO TAクローニングキット(Invitrogen社, 米国)を用いてベクターpCR4 (Invitrogen社, 米国)にクローニングした。プラスミドクローンを単離し、制限酵素消化とアガロースゲル電気泳動により解析した。各細胞株につき、19〜22のインサート含有プラスミドを配列決定した。非CpG部位での亜硫酸水素塩処理の脱アミノ化効率を推定するため、非CpG部位の残留シトシンの数を測定した。脱アミノ化効率(％)は次のように算出した：
Emod = 100-(Cres/Ctotal*100)        (式4)
式中、
Emod [％]：脱アミノ化効率
Cres：解析したすべてのインサート(PCRプライマー部位を除く)内の非CpG部位の残留シトシンの数
Ctotal：解析したインサートの数を乗じた、非亜硫酸水素塩処理CMVプロモーター/エンハンサー断片(PCRプライマー部位を除く)内のシトシンの数、すなわち107*20。
【０２７８】
非CpGシトシンでの脱アミノ化効率はすべてのサンプルにおいて99％より高いことが判明した(表4)。
【０２７９】
（表４）非CpGシトシンでの脱アミノ化効率
0006649276.tif 000051
【０２８０】
脱アミノ化からの5-メチルシトシンの保護は、dcm+大腸菌から単離されたプラスミドDNAの亜硫酸水素塩処理とその後のクローニングおよび配列決定により確認した。dcm+大腸菌は配列CCAGGまたはCCTGG(dcm部位)内の内部シトシン残基をメチル化する。脱アミノ化効率は非dcm部位で99％であり、dcm部位内の内部シトシンで5％未満であることが判明した。
【０２８１】
亜硫酸水素塩処理したCMVプロモーター/エンハンサー断片内のCpG部位でのDNAメチル化の程度を定量化するために、各CpG部位で見られたシトシンの数を測定して、解析した各細胞についてプロットした。
【０２８２】
細胞株K18.1は高度にメチル化される(図3A)。メチル化の頻度は3つのクラスター(すなわち、5'末端に1つ、3'末端に1つ、および位置400付近に1つ)に蓄積する。最も高いメチル化度は位置425に見られた。配列決定された22のインサートのうち14がここにシトシンを有した。
【０２８３】
細胞株43-16 A10由来のCMVプロモーターのメチル化は注目に値した(図3E)。メチル化の分布は細胞株K18.1で観察された分布に類似していた。位置425は最も頻繁にメチル化された。配列決定された20のインサートのうち5つがこの位置にシトシンを含んでいた。
【０２８４】
検討された他の3つの細胞株では、シトシンがCpG部位に散発的に検出されたにすぎなかった(図3B、3Cおよび3D)。
【０２８５】
実施例5
亜硫酸水素塩処理したヒトCMV主要前初期プロモーター/エンハンサーDNAの定量的メチル化特異的PCR
この実施例では、CpG位置でのメチル化、具体的にはhCMVプロモーター核酸の位置425でのメチル化、を検出する方法として、メチル化特異的リアルタイムqPCRを報告する。
【０２８６】
2セットのプライマーを設計した：
-  位置425でメチル化されたDNAを表す、位置425にシトシンを有する脱アミノ化CMVプロモーターDNAを選択的に増幅するメチル化特異的プライマー対(MSPプライマー対)、および
-  メチル化状態にかかわらず脱アミノ化CMVプロモーターDNAを増幅するユニバーサルプライマー対。
【０２８７】
ユニバーサルプライマー対を正規化のために使用した。同じPCRランで使用するために、両方のプライマー対は同様の融解温度をもつ必要がある。
【０２８８】
位置425でのメチル化を検出するプライマーの設計は、接近している2つの追加のCpG部位(位置416と位置437)の存在によって複雑になった。メチル化感受性プライマーは、位置416と位置437のメチル化状態とは無関係に、5mC425を検出すべきである。
【０２８９】
位置425および437での可能な配列変化を表す、実施例4で単離された4つの脱アミノ化ヒトCMV主要前初期プロモーター/エンハンサー断片、すなわち#11、#62、#01および#04(表5、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22)を、メチル化特異的PCRプライマー対およびユニバーサルプライマー対のためのqPCR鋳型として使用した。
【０２９０】
（表５）qPCRにおけるMSPプライマー対とユニバーサルプライマー対の予期される結果
0006649276.tif 000052
【０２９１】
ユニバーサルプライマーを用いると、4つすべての鋳型が同等に増幅されるのに対して、メチル化特異的プライマー対は鋳型#62と鋳型#01を選択的に増幅することができる。ΔCpは、鋳型#62および鋳型#01ではメチル化特異的プライマー対とユニバーサルプライマー対の間で可能な限り小さくなる必要がある。鋳型#11および鋳型#04に対しメチル化特異的プライマー対を用いて得られるCp値は可能な限り高くなるべきであり、すなわち、ユニバーサルプライマー対による増幅と比較したΔCpが最大になるべきである。
【０２９２】
qPCRのためにLightCycler(登録商標)480 IIシステムを使用し(Roche Diagnostics社, Mannheim, ドイツ)、LightCycler(登録商標)480 SYBR Green I Master (Roche Diagnostics社, Mannheim, ドイツ)を用いてサンプルを調製した。0.05ngのDNAを含む鋳型溶液5μlを、96ウェルのマルチウェルプレートのウェルにて15μlのPCRマスターミックスと混ぜ合わせた。
【０２９３】
15μlのPCRマスターミックスに以下を含めた：
-  4.2μlの水
-  0.4μlのフォワードプライマー239、263または264(プライマー227、228、240、238も可能)(10pmol/μl)
-  0.4μlのリバースプライマー237、254、262、265、266、267または268(プライマー229も可能)(10pmol/μl)
-  10μlのSYBR Green I Master。
【０２９４】
マルチウェルプレートをLightCycler(登録商標)480シーリングホイル(Roche Diagnostics社, Mannheim, ドイツ)で密封し、1,500×gで2分間遠心分離した。その後、プレートをLightCycler(登録商標)480システムに載せてqPCRに供した。各サンプルは二つ組、三つ組または四つ組で試験した。絶対コピー数の測定を可能にするために、標準として線状化発現プラスミドを用いて、LCおよびHC導入遺伝子のために標準曲線を作成した。標準希釈物に2.5×107、2.5×106、2.5×105、2.5×104または2.5×103のプラスミドコピーを含めた。ゲノムDNAは三つ組で試験した；標準は四つ組で試験した。
【０２９５】
使用したPCRの条件は次のとおりであった。
0006649276.tif 000053
【０２９６】
データの収集と解析は、LightCycler(登録商標)480ソフトウェアバージョン1.5を用いて行った。見かけ上のメチル化度は次の式を用いて算出し、ここで、理想的な増幅効率が仮定された(E＝2)。
mCapp = 2Cp(t)-Cp(m)*100        (式5)
式中、
mCapp [％]：見かけ上のメチル化度
Cp(t)：ユニバーサルプライマーを用いて得られたCp値
Cp(m)：メチル化特異的プライマーを用いて得られたCp値。
【０２９７】
プライマー評価の際に、位置425にシトシンを含む（「メチル化された」）脱アミノ化CMVプロモーターDNAに対して高度に選択的であるメチル化特異的プライマーの設計は慎重に行わなければならないことがわかった。プライマー266および267は、Cp(#11)とCp(#62)との最大差を示し、すなわち「メチル化」DNAに対して最高の選択性を示した。プライマー265、268および254が示した選択性は低いものであった。最小ΔCpのための対照としてユニバーサルプライマー対263/237を試験した(図6および表6)。
【０２９８】
（表６）プライマー評価の結果
0006649276.tif 000054
【０２９９】
図5には、メチル化特異的プライマー対239/267(SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:18)をユニバーサルプライマー対239/237(SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:09)と組み合わせて用いて得られた結果が示される。ユニバーサルプライマー対239/237は4つすべての鋳型をほぼ同等にうまく増幅したのに対し、メチル化特異的プライマー対239/267は鋳型#62および#01を増幅した。鋳型#11および#4はプライマー対239/267によってわずかに増幅されるにすぎない。
【０３００】
Cp値から算出されたメチル化頻度は、鋳型#62と鋳型#01がほぼ100％であり、鋳型#11と鋳型#04がほぼ0％であった(表7A)。このことは、位置425でメチル化されたCMVプロモーターDNAと位置425でメチル化されていないCMVプロモーターDNAとをリアルタイムqPCRによって区別するために、ユニバーサルプライマー対239/237と組み合わせたメチル化特異的プライマー対239/267を使用できることを示している。
【０３０１】
追加のユニバーサルプライマー対およびメチル化特異的プライマー対が見いだされ、表7Aおよび7Bで特性解析される。
【０３０２】
（表７Ａ）3つの異なるフォワードプライマーと組み合わせたメチル化特異的リバースプライマー267および非メチル化特異的リバースプライマー237
0006649276.tif 000055
【０３０３】
（表７Ｂ）2つの異なるフォワードプライマーと組み合わせたメチル化特異的リバースプライマー266および非メチル化特異的リバースプライマー237
0006649276.tif 000056
【０３０４】
広範囲にわたるメチル化度の定量化のために、鋳型#62をさまざまな比率で鋳型#11と混合した。プライマー対239/237および239/267を用いて上記のようにqPCRを実施し、鋳型#11をバックグラウンドとした鋳型#62の回収率を計算した。
【０３０５】
鋳型#62 DNAの割合を計算するために、使用した条件下でのプライマー対の増幅効率を測定した。鋳型#62および#11のn＝0.005ngから0.5ng DNAまでの連続希釈物をqPCRに供し、測定されたCp値をlog(n)に対してプロットした。回帰直線はXLfit (Microsoft)を用いて算出した。増幅効率は次の式を用いて計算した：
E = 10-1/m        (式6)
式中、
E：増幅効率
m：線形傾向線の傾き。
【０３０６】
両方のプライマー対の増幅効率は約1.7と計算された。以下の式は鋳型#62 DNAの割合を計算するために使用された：
mC = 1.7Cp(t)-Cp(m)*100        (式7)
式中、
mC [％]：位置425でメチル化されたDNAの割合
Cp(t)：ユニバーサルプライマー対を用いて得られたCp値
Cp(m)：メチル化特異的プライマー対を用いて得られたCp値。
【０３０７】
2つの独立した実験から測定された鋳型#62 DNAの割合を期待値に対してプロットした(図7)。1％と100％の間のメチル化の定量化を行うことができる。
【０３０８】
実施例6
亜硫酸水素塩処理およびリアルタイム定量的PCRによるヒトCMV主要前初期プロモーター/エンハンサーDNA内のC-425のメチル化状態の同定
CHO細胞株のゲノムDNAの亜硫酸水素塩処理
アッセイは、Osterlehner et al.(前掲)に記載されるように行った。ゲノムDNAを、Qiagen社(Hilden, ドイツ)からのAllprep DNA/RNA Miniキットを用いて、CHO細胞株から単離した。5μgのDNAを酵素DraIで切断し、260nmでの吸光度を測定することによって定量した。EpiTect Bisulfiteキット(Qiagen社, Hilden, ドイツ)を用いて、100ngのDNAを亜硫酸水素塩処理に供し、精製した。亜硫酸水素塩で処理されたDNAは、RNaseフリーの水(Qiagen社, Hilden, ドイツ)20μl中に回収した。
【０３０９】
ヒトCMV主要前初期プロモーター/エンハンサー断片(SEQ ID NO:02)のA鎖(フォワード)を増幅するために、1μlの亜硫酸水素塩処理DNAを24μlのPCRマスターミックスと合わせて、GeneAmp(登録商標)PCRシステム9700(Applied Biosystems社, 米国)を用いてPCRを行った。
【０３１０】
24μlのPCRマスターミックスは、以下を含んでいた：
1μlのSEQ ID NO:06のフォワードプライマー227(10pmol/μl)；
1μlのSEQ ID NO:08のリバースプライマー229(10pmol/μl)；
22μlのPlatinum(登録商標)PCR SuperMix HighFidelty
(Life Technologies社, Carlsbad, CA)。
【０３１１】
フォワードプライマー227は、ヒトCMV主要前初期プロモーター/エンハンサー断片の5'末端に相補的である。リバースプライマー229は、免疫グロブリン遺伝子の5'-UTR内の下流に結合する。
【０３１２】
PCR条件は、以下の通りであった。
0006649276.tif 000057
PCR産物を、アガロースゲル電気泳動でサイズと純度について確認した。
【０３１３】
メチル化特異的リアルタイム定量的PCR
qPCRを行うために、LightCycler 480 IIシステム(Roche Diagnostics社, Mannheim, ドイツ)をLightCycler 480 SYBR Green I Master(Roche Diagnosticsd社, Mannheim, ドイツ)と組み合わせて使用した。プラスミドDNA 50pg、亜硫酸水素塩処理ゲノムDNA 3μl、または亜硫酸水素塩処理ゲノムDNAを用いたプライマー227および229(SEQ ID NO:06/08)のPCR産物の1：50,000希釈物5μlをテンプレートとして使用した。qPCRのために、テンプレートを4または12pmolのフォワードおよびリバースプライマー、10μlのLightCycler 480 SYBR Green I Master、ならびにヌクレアーゼフリーの水と混合して、全量を20μlとした。総ヒトCMV主要前初期プロモーター/エンハンサー断片DNAを定量化するために、プライマー対239/237(SEQ ID NO:11/09)を使用し、位置C-425でメチル化されたDNA(SEQ ID NO:01)をプライマー対239/267(SEQ ID NO:11/18)で検出した。PCRミックスをマルチウェルプレートに添加した。
【０３１４】
マルチウェルプレートをLightCycler(登録商標)480シーリングホイル(Roche Diagnostics社, Mannheim, ドイツ)でシールし、1,500×gで2分間遠心分離した。その後、プレートをLightCycler(登録商標)480システムに載せて、qPCRを行った。各サンプルを二つ組、三つ組または四つ組で試験した。
【０３１５】
PCR条件は、以下の通りであった。
0006649276.tif 000058
【０３１６】
データの収集と解析は、LightCycler 480ソフトウェアのバージョン1.5(Roche Diagnostics社, Mannheim, ドイツ)を用いて行った。mCのメチル化は、次式によりパーセントで表された：
mC = ECq(t)-Cq(m)*100      (式8)
Cq(t)は、ユニバーサルプライマー対239/237を用いて得られた定量サイクルであり、Cq(m)は、メチル化特異的プライマー対239/267を用いて得られた定量サイクルを表し、Eは増幅効率である(MIQEガイドライン)。Eは、0.2pmol/μlのプライマー濃度に対して約1.7であり、0.6pmol/μlのプライマー濃度に対して2.0であった。
【０３１７】
実施例7
ヒトCMV主要前初期プロモーター/エンハンサーのメチル化と長期生産性との相関
プレ増幅したヒトCMV主要前初期プロモーター/エンハンサーのA鎖を用いるメチル化特異的qPCR
実施例4に報告したように、ゲノムDNAをCHO細胞株K18.1、G25-10、G25-17、G42-5および43-16 A10から単離し、酵素DraIで切断し、亜硫酸水素塩処理により脱アミノ化した。ヒトCMV主要前初期プロモーター/エンハンサーのA鎖はプライマー227および229を用いて増幅した。
【０３１８】
PCR産物を1：50,000に希釈した。5μlの各希釈物をリアルタイムqPCRに使用した。プライマー239および237を全CMVプロモーターDNAの定量化のために使用した；プライマー239および267を位置425でメチル化されたCMVプロモーター/エンハンサーDNAの定量化のために使用した。サンプルは三つ組で試験した。鋳型#11、#62および#01を対照として用いた。
【０３１９】
qPCRは、実施例5で報告したように、5μlの鋳型を15μlのPCRマスターミックスと混ぜ合わせることでセットアップされた。PCR条件は実施例5で報告したとおりである。プライマーのアニーリング温度は58℃とした。
【０３２０】
亜硫酸水素塩処理したゲノムDNAを用いるメチル化特異的qPCR
ゲノムDNAをCHO細胞株K18.1、G25-10、G25-17、G42-5および43-16 A10から抽出し、酵素DraIで切断して、亜硫酸水素塩処理により脱アミノ化した。3μlの水で希釈した2μlの脱アミノ化DNAをリアルタイムqPCRで鋳型として使用した。リアルタイムqPCRでは、全CMVプロモーター/エンハンサーA鎖の増幅のためにプライマー対239/237を適用し、位置425でメチル化されたCMVプロモーター/エンハンサーA鎖の増幅のためにプライマー対239/267を適用した。サンプルは三つ組で試験した。鋳型#11および#62を対照として用いた。
【０３２１】
PCRをセットアップし、実施例5で報告したようにqPCRを行った。プライマーのアニーリング温度は58℃とした。
【０３２２】
(a)および(b)について、位置425でメチル化されたプロモーターDNAの割合は次のように算出された：
mC = 1.7Cp(t)-Cp(m)*100        (式7)
式中、
mC [％]：位置425でメチル化されたDNAの割合
Cp(t)：ユニバーサルプライマー対239/237を用いて得られたCp値
Cp(m)：メチル化特異的プライマー対239/267を用いて得られたCp値。
【０３２３】
両方のアッセイの構成は同等の結果を与えた。三つ組試験内の標準偏差は、CMVプロモーターA鎖のプレ増幅なしでより高かった(図8Aおよび8B)。細胞株K18.1、G25-10、G25-17および43-16 A10におけるCMVプロモーター核酸の位置425のメチル化は、不完全な脱アミノ化のバックグラウンド(約1％であることがわかった)よりも高かった。細胞株G42-5でのメチル化は、バックグラウンドレベルより低いか、バックグラウンドレベルで最大であった。細胞株K18.1については、最高のメチル化が測定された(60％を上回る)。
【０３２４】
アッセイ設定(a)は、他のユニバーサルプライマー対およびメチル化特異的プライマー対を用いて実施された。位置425でメチル化されたDNAの割合を計算するために、すべてのプライマー対の増幅効率を2と仮定した：
mC = 2Cp(t)-Cp(m)*100        (式5')
式中、
mC [％]：位置425でメチル化されたDNAの割合
Cp(t)：ユニバーサルプライマー対を用いて得られたCp値
Cp(m)：メチル化特異的プライマー対を用いて得られたCp値。
【０３２５】
表8は、CMVプロモーターDNAのプレ増幅を行ってまたは行わずに、クローニングDNA鋳型またはゲノムDNAのいずれかに対して試験されたプライマー対の組合せの概要を示す。
【０３２６】
（表８）プライマー対の組合せ
0006649276.tif 000059
【０３２７】
実施例8
ヒトCMV主要前初期プロモーター/エンハンサーのメチル化および組換えCHO細胞株の生産不安定性の予測
CHO-K1細胞を、ヒトIgG4抗体をコードするプラスミドでトランスフェクトし、DHFR/MTXシステムを用いて安定したクローンを選択した。高生産性の親クローンを限界希釈法によりサブクローニングした。完全な細胞株の発生プロセスの間、MTXを増殖培地中に維持した。10個の親クローンから16個のサブクローンが選択された。
【０３２８】
選択した細胞を250nM MTXの存在下で再培養した。それらが安定した増殖を示したらすぐに、それらをMTXの存在下および非存在下での60〜80世代にわたる長期生産の安定性について試験した。60世代にわたるSPRの相対変化を計算した。C435のメチル化は、MTXの存在下で増殖させた細胞を用いる試験の開始時と、MTXなしで培養した細胞からの試験の終了時に測定した。
【０３２９】
試験の開始時のC425メチル化は、MTXの存在下(図11A)および非存在下(図11B)でのSPRの相対変化に対してプロットされた。C425でのメチル化が5％未満であるクローンの大部分は安定したクローン(MTXの有無にかかわらず、SPRの40％未満の低下)の画分に見いだされる一方、C425でのメチル化が5％を超えるクローンの大部分は不安定なクローンの画分にクラスター化された。これは、メチル化がMTXの存在下でまたは非存在下での安定性と相関していたか否かとは無関係であった(表9も参照のこと)。MTXの存在下で20％未満の生産性を、およびMTXの非存在下で30％未満の生産性を失う安定したクローンのほとんどは、5％未満のC425メチル化を示す。
【０３３０】
（表９）MTXの存在下または非存在下(A)およびプラスミドコピー数(B)におけるメチル化と安定性との相関
0006649276.tif 000060
【０３３１】
この知見は、生成された細胞クローンにおけるポリペプチド発現の安定性を判定し、それによって細胞株の開発中に安定的な生産性を有する安定したクローンの選択を可能にするための予測マーカーとして、C425メチル化の測定を使用できることを示している。5％以下のC425メチル化は、安定した細胞クローンを選択するための適切な基準であることが判明した。
【０３３２】
さらに、中間的に安定した2個の細胞クローンならびに試験の開始時にメチル化されていなかった非常に不安定な2個のクローンは、MTXなしでの安定性試験の間にメチル化が5％より高くなることが見いだされた(図12も参照のこと)。これは、試験前にMTXの非存在下で一定期間それらを培養することによって、誤って安定と予測される細胞クローン(偽陰性細胞クローン)の割合を減らせることを示している。
【０３３３】
C425メチル化を第2の方法で確認するために、本発明者らは、高度にメチル化されたクローン44-28を用いて亜硫酸水素塩配列決定を行った(図13)。C425でのメチル化度は80％であると判明した。これはメチル化特異的PCRの結果と一致した(両アッセイのばらつきを考慮した)。クローンK18.1および43-16 A10と同様に(図4)、C425はヒトCMV主要前初期プロモーター/エンハンサーDNA内のすべてのCpG部位の中で最も頻繁にメチル化されていた。他のメチル化イベントは5'末端と3'末端にクラスター化されていた。すべての部位での平均メチル化度は18％であった。
【０３３４】
実施例9
初期のメチル化は導入遺伝子の高コピー数と一致する
TaqMan原理に基づくマルチプレックスqPCRアッセイを用いて、安定性試験の開始時と終了時に免疫グロブリン軽鎖および重鎖遺伝子の組み込まれたコピー数を測定した。フォワードプライマー、リバースプライマーおよび加水分解プローブからなる2つのプライマーセットを使用した：一方はヒトκ鎖遺伝子に特異的であり、他方はヒトγ重鎖遺伝子に特異的である。絶対コピー数の決定を可能にするために、線状化発現プラスミド(トランスフェクションに用いたもの)を標準として使用した。サンプルおよび標準の等しい増幅効率を確保した。
【０３３５】
qPCRのためにLightCycler(登録商標)480 IIシステムを使用し(Roche Diagnostics社, Mannheim, ドイツ)、LightCycler(登録商標)480 Probes Master (Roche Diagnostics社, Mannheim, ドイツ)を用いてサンプルを調製した。
【０３３６】
50ngのゲノムDNAを含む鋳型溶液5μlを、96ウェルのマイクロタイタープレートのウェルにて15μlのPCRマスターミックスと混ぜ合わせた。標準の場合には、鋳型溶液には2.5×107、2.5×106、2.5×105、2.5×104および2.5×103コピーの対応する線状化プラスミドDNAを含めた。
【０３３７】
15μlのPCRマスターミックスに以下を含めた：
10μlのLightCycler(登録商標)480 Probes Master
1μlのフォワードプライマー#133 (10pmol/μl)
1μlのリバースプライマー#132 (10pmol/μl)
0.5μlのプローブ#166 (10pmol/μl)
1μlのフォワードプライマー#178 (10pmol/μl)
1μlのリバースプライマー#180 (10pmol/μl)
0.5μlのプローブ#185 (10pmol/μl)。
【０３３８】
プレートをLightCycler(登録商標)480シーリングホイル(Roche Diagnostics社, Mannheim, ドイツ)で密封し、1,500×gで2分間遠心分離した。その後、プレートをLightCycler(登録商標)480システムに載せてqPCRに供した。各サンプルは三つ組で試験し、標準は四つ組で行った。
【０３３９】
PCR条件は次のとおりであった。
0006649276.tif 000061
【０３４０】
データの収集と解析は、LightCycler(登録商標)480ソフトウェアバージョン1.5を用いて行った。基本的には、プラスミド標準希釈物の平均Cp値をそれぞれの遺伝子コピー数に対してプロットして標準曲線を作成し、その曲線からサンプル中の導入遺伝子の数を外挿した。
【０３４１】
細胞あたりの導入遺伝子数は、細胞あたりの平均DNA量がjpgであると仮定して算出した。
Nc = Ns/50000*6
Nc：細胞あたりの導入遺伝子のコピー数
Ns：サンプル中の導入遺伝子のコピー数
【０３４２】
（表１０）プライマー配列
0006649276.tif 000062
【０３４３】
図14は、安定性試験の前と後のメチル化細胞および非メチル化細胞の軽鎖遺伝子コピー数を示す。驚くことではないが、同一のコピー数が重鎖遺伝子で見出されたのは、細胞が両遺伝子を保有する二重遺伝子ベクターでトランスフェクトされていたからである(データは示さず)。初期のメチル化、すなわち安定性試験の前のメチル化は、10より多い導入遺伝子コピーを保有する細胞でもっぱら見られるのに対し、10未満の導入遺伝子コピーを保有するいくつかのクローンは安定性試験の間にメチル化を獲得した。結果として、安定性試験の前に導入遺伝子コピー数の低いクローンを等しく選択することで、安定した生産性をもつクローンが濃縮される(表11)。
【０３４４】
（表１１）MTXの存在下または非存在下での導入遺伝子コピー数と安定性との相関
0006649276.tif 000063
【０３４５】
本発明者らはさらに、生産の不安定性が、導入遺伝子コピー数の喪失と一般的に関連していないことを観察した。クローン1A5-05、1A5-21、1A5-24および2B1-02は導入遺伝子コピー数を失い、2B-13は安定しており、14-13および14-23は遺伝子コピー数が増加した(図11Bも参照のこと)。
【０３４６】
実施例10
クロマチン免疫沈降およびリアルタイムPCRによるヒトCMV主要前初期プロモーター/エンハンサーDNAに近接して存在するヒストン修飾の同定
CHO細胞株のクロマチン免疫沈降
抗体軽鎖および重鎖の発現のために使用されたヒトCMV主要前初期プロモーター/エンハンサー断片(SEQ ID NO:01)は、安定した産生細胞株内でDNA圧縮ヒストン(クロマチン)に近接している。ヒトCMV主要前初期プロモーター/エンハンサー断片に近接する修飾ヒストンの蓄積は、クロマチン免疫沈降アッセイ(ChIP)を用いて測定される。
【０３４７】
32のCHO細胞株(サンプルH-1〜H-20およびT-1〜T-12、表3参照)を3.7％ホルムアルデヒド中で室温にて10分間固定した。固定を10％グリシン中で5分間停止させた。細胞を細胞溶解緩衝液中で氷上にて10分間溶解し、5,000rpm、4℃で4分遠心分離した。ペレットを核溶解緩衝液中に再懸濁し、クロマチンをBranson Sonifier B15で超音波処理して200〜500bpの平均断片サイズにした。クロマチン断片の濃度は、Pierce(登録商標)BCAタンパク質アッセイキット(Thermo Scientific社, Rockford, 米国)を用いて測定した。2.5μg〜100μgのクロマチン断片を、3μl〜12μlの抗体を含有する1.5倍量のIP希釈緩衝液に添加し、25rpmで回転させながら4℃で一晩インキュベートした。
【０３４８】
プロテインAアガロースビーズ(Roche Diagnostics社, Mannheim, ドイツ)は、100μg/mlのサケ精子DNA(Invitrogen社, Carlsbad, 米国)および5mg/mlのBSA(ウシ血清アルブミン；Roche Diagnostics社, Mannheim, ドイツ)を含むIP希釈緩衝液中で4℃にて一晩ブロックした。抗体-クロマチン沈降物を、ブロックしたアガロースビーズ中で1時間インキュベートし、続いて2×低塩、1×高塩、1×LiClおよび1×TE洗浄緩衝液中でそれぞれ4℃にて5分間インキュベートすることにより精製した。抗体は、200μlのIP溶出緩衝液を用いて、アガロースビーズから65℃で30分間溶出した。0.5μlのRNase DNaseフリー(Roche Diagnostics社, Mannheim, ドイツ)を添加して、RNAを37℃で30分間消化した。タンパク質の消化のために、NaCl(最終濃度0.2M)およびプロテイナーゼK(最終濃度100〜200μg/ml)(Roche Diagnostics社, Mannheim, ドイツ)を加えて、溶液を65℃で1.5時間インキュベートした。DNAは、Roche PCR精製キットを用いて150μlのPCRグレードH20 (Roche Diagnostics社, Mannheim, ドイツ)中に回収した。
【０３４９】
（表１２）クロマチン免疫沈降(ChIP)用の緩衝液
0006649276.tif 000064
【０３５０】
（表１３）ヒストンまたはヒストン修飾に特異的な抗体
0006649276.tif 000065
【０３５１】
ChIP DNAの定量的リアルタイムPCR
リアルタイム定量的PCRは、クロマチン免疫沈降あたりのヒトCMV主要前初期プロモーター/エンハンサー断片(SEQ ID NO:01)の相対量を測定することによって、CHO細胞株におけるヒトCMV主要前初期プロモーター/エンハンサー断片の特定のヒストン修飾の蓄積を検出するために使用された。
【０３５２】
未処理の投入サンプル(Input Sample: IS)からのゲノムDNAおよび抗体精製されたクロマチン断片は、LightCycler 480 IIシステム(Roche Diagnostics社, Mannheim, ドイツ)をLightCycler 480 SYBR Green I Master(Roche Diagnostics社, Mannheim, ドイツ)と共に使用して、リアルタイム定量的PCRにより増幅させた。ヒトCMV主要前初期プロモーター/エンハンサー断片(SEQ ID NO:01)の量を定量するために、可能性のある基準遺伝子に特異的なプライマーおよびヒトCMV主要前初期プロモーター/エンハンサー断片に特異的なプライマーを使用した。
【０３５３】
（表１４）リアルタイム定量的PCRのためのプライマー配列
0006649276.tif 000066
【０３５４】
2.5μlの溶出されたDNA断片、ヒトCMV主要前初期プロモーター/エンハンサー断片(SEQ ID NO:01)のための1μl(10pmol/μl)のフォワードプライマー396(SEQ ID NO:32)と1μl(10pmol/μl)のリバースプライマー397(SEQ ID NO:33)、5μlのLightCycler 480 SYBR Green I Masterおよびヌクレアーゼフリーの水を混合して、全量を10μlとした。基準遺伝子を同じプレート上で定量化した。この混合物を384ウェルプレート(Roche Diagnostics社, Mannheim, ドイツ)に添加した。
【０３５５】
そのプレートをLightCycler(登録商標)480シーリングホイル(Roche Diagnostics社, Mannheim, ドイツ)でシールし、1,200×gで3分間遠心分離した。その後、プレートをLightCycler(登録商標)480システムに載せて、リアルタイムqPCRを行った。各サンプルを三つ組で試験した。
【０３５６】
PCR条件は、以下の通りであった。
0006649276.tif 000067
【０３５７】
データの収集と解析は、LightCycler(登録商標)480ソフトウェアのバージョン1.5を用いて行った。
【０３５８】
実施例11
リアルタイムPCRでのヒストン修飾のためのヒトCMV主要前初期プロモーター/エンハンサー断片の相対的定量化
基準遺伝子の安定性
この実施例では、特定のヒストン修飾のための潜在的基準遺伝子の安定性が、プログラム「Normfinder」を用いて計算された。「NormFinder」の根底にあるモデルおよび統計的枠組みは、Andersen, C.L., et al., Cancer Res.64 (2004) 5245-5250に記載されている。
【０３５９】
エクセル用の「NormFinder add on」は、推定上の発現変動の直接的な尺度である、各遺伝子についての安定性の値を提供する。最小の安定性値を持つ遺伝子が最も安定した遺伝子である。入力データは線形スケールであることが想定されるため、下記式を用いてスケール発現量を線形化するためにPercent Input Methodが使用された。
投入サンプルに対する％ = 100*2ΔCq(投入サンプル-ChIPサンプル)        (式9)
【０３６０】
5つの遺伝子(表15参照)を「Normfinder」で試験した。3つの生物学的複製物での20のサンプル(H-1〜H-20)は、ヒトCMV主要前初期プロモーター/エンハンサー断片および該基準遺伝子に近接するヒストン3のアセチル化、ヒストン3リジン4の3倍メチル化、およびヒストン3の安定性について検討した。
【０３６１】
（表１５）可能性のある基準遺伝子およびヒトCMV主要前初期プロモーター/エンハンサー断片の安定性の値
0006649276.tif 000068
【０３６２】
基準遺伝子Gusbは、所定のChIP条件において、他の対照よりも安定である。Gusbをヒストン3のアセチル化、ヒストン3リジン4の3倍メチル化、およびヒストン3のレベルの正規化のための基準遺伝子として採用した。
【０３６３】
LinRegPCRソフトウェアを用いたプライマー対の増幅効率の推定
この実施例では、ヒトCMV主要前初期プロモーター/エンハンサー断片に対するプライマー対396/397および基準遺伝子Gusbに対するプライマー対386/387の増幅効率が、LinRegPCRソフトウェア(http://www.hartfaalcentrum.nl)を用いてサンプルH-1〜H-20について推定された。このプログラムは、ベースライン蛍光を測定して、ベースライン減算を行うものである。その後、Window-of-Linearityを設定して、サンプルごとのPCR効率を算出する(Ramakers, et al., NeuroSci Lett. 2003; Ruijter et al., Nucleic Acids Research 2009を参照されたい)。
Eff = 10傾き        (式11)
【０３６４】
個々のPCR効率(Eff)は、線形回帰直線の傾きから推定され、サイクルごとの増加倍率と定義される。それは1と2の間で変動し得る。2の効率は、各サイクルでのアンプリコンの完全な倍増を表す。
【０３６５】
（表１６）基準Gusbプライマー対および標的hCMV-MIEプライマー対の増幅効率
0006649276.tif 000069
【０３６６】
プライマー対396/397および386/387は、ChIP投入サンプルがヒストン3、アセチル化ヒストン3、またはヒストン3リジン4の3倍メチル化に対する抗体を用いて測定されたか、つまりDNA沈降されたかにかかわらず、20のサンプルおよび3つの生物学的複製物において安定した同等の増幅効率をもたらした。プライマー対396/397および386/387は、基準遺伝子Gusbに近接するヒストン3およびヒストン3修飾のレベルに対する、ヒトCMV主要前初期プロモーター/エンハンサー断片に近接するヒストン3のアセチル化、ヒストン3リジン4の3倍メチル化およびヒストン3のレベルの相対的定量化のために使用された。
【０３６７】
ヒストンのレベルに対するヒストン修飾の相対的定量化のためのΔΔCq法
ヒトCMV主要前初期プロモーター/エンハンサー断片に近接するヒストン3のアセチル化、ヒストン3リジン4の3倍メチル化およびヒストン3のレベルの相対的定量化は、デルタデルタCq(ΔΔCq)法としても知られる、Livak法を用いて推定された。
【０３６８】
この方法は、基準(reference)に対する標的(target)の相対的定量化のために使用することができる。この例では、ヒトCMV主要前初期プロモーター/エンハンサー断片に近接するヒストン3のアセチル化、ヒストン3リジン4の3倍メチル化およびヒストン3のレベルの相対的定量化を、基準遺伝子Gusbに近接するヒストン3修飾およびヒストン3のレベルに対して2段階で正規化した。最初に、デルタCqを次のように算出した。
ΔCq = 投入サンプル - サンプル        (式12)
【０３６９】
デルタCq(ΔCq)は、同じプライマー対を用いて増幅させた、同じサンプルの未処理条件(投入サンプル)と処理条件(ChIPサンプル)の定量サイクル(Cq)間の差である。デルタCqは、同じサンプル内で未処理条件に対する相対値を示すために使用される。異なるサンプルを比較するために、デルタデルタCq法が使用された。
0006649276.tif 000070
【０３７０】
この例では、デルタデルタCqは、全てのサンプルH-1〜H-20についての標的hCMV-MIEのデルタCqと基準GusbのデルタCqとの差である。デルタデルタCq値を用いて決定されたDNAの相対量は、サンプル間で比較することが可能である。
【０３７１】
最後に、ヒストン3のアセチル化およびヒストン3リジン4の3倍メチル化のレベルは、3つの生物学的複製物で20のCHO細胞株H-1〜H-20についてのヒストン3のレベルに対して正規化された。標準偏差を含む結果を図15および16に示す。
【０３７２】
実施例12
ヒトCMV主要前初期プロモーター/エンハンサー断片に近接するヒストン3のアセチル化およびヒストン3リジン4の3倍メチル化ならびにヒトCMV主要前初期プロモーター/エンハンサー断片のC425のメチル化は長期安定性と相関する
ヒトCMV主要前初期プロモーター/エンハンサー断片に近接するヒストン3のレベルに対する相対的なアセチル化およびリジン4の3倍メチル化(H3ac/H3 & H3K4me3/H3)のレベル、ならびにヒトCMV主要前初期プロモーター/エンハンサー断片のC425のメチル化の割合(mC-425[％])は、産生細胞株H-1〜H-20の長期安定性に影響を与える効果を検出するために、パーソナリティ(personality)「標準最小二乗法」およびエンファシス(emphasis)「効果レバレッジモデル」を有するフィットモデルで検討された。計算のために、JMPソフトウェアのバージョン10(SAS社, Boeblingen, ドイツ)を使用した。
【０３７３】
サンプルH-1〜H-20のヒストン修飾値およびC-425メチル化の割合を、個々に、該モデルへの効果として供給した。60世代後の比生産率の変化パーセント(デルタSPR)を応答として供給した。結果として得られるレバレッジプロットを図17〜19に示す。効果に関連するパラメータの数(Nparm)および自由度は1である。
【０３７４】
RSquare(RSq)は、ランダム誤差にではなくモデルに起因し得る応答の変化の割合を推定する。1に近いR2は、より良いフィットを示す。0に近いR2は、そのフィットが全体的な応答平均と大して変わらない応答を予測していることを示す。二乗平均平方根誤差(RMSE)は、ランダム誤差の標準偏差を推定する。これは、分散分析の記録における平均二乗誤差の平方根である。Prob＞Fは、効果の有意性について知らせる効果試験のp値を示す。
【０３７５】
（表１７）効果試験で算出された供給効果H3K4me3/H3およびH3ac/H3のp値。サンプルHの3つの生物学的複製物で算出された。
0006649276.tif 000071
*  0.05以下の値は、このモデルでの有意な効果の証拠とみなした。
【０３７６】
表17は、(-)MTX条件下でのmC-425[％]の有意性を示す。H3ac/H3およびH3K4-me3/H3の効果は、(+)MSX条件下で有意である。
【０３７７】
デルタSPR実測値は、60世代にわたる効果および選択条件に関して、レバレッジプロットで予測値に対してプロットされた(図17〜19)。この実測値と予測値のプロットは、モデルがデータにいかに良くフィットするかを示している。最低のp値は、選択剤ありのH3ac/H3効果について検出され(図18)、次いで選択剤なしのmC-425[％]効果について検出された(図19)。
【０３７８】
サンプルH-1〜H-20のデルタSPR値について選択剤MSXありおよびなしの条件を比較する外れ値分析
選択剤なし((-)MSX)の条件のレバレッジプロットは、サンプルH-18においてデルタSPRの著しく異常な値を有する。そのため、ジャックナイフ距離(Jackknife Distance)を示す外れ値分析を行った(図20)。
【０３７９】
これは、(-)MSX条件下でのサンプルH-18におけるデルタSPRの増加が他の全てのサンプルと比較して異常である、ことを検証する。それゆえ、サンプルH-18なしでレバレッジ分析を繰り返した。19のサンプルH-1〜H-17およびH-19〜H-20について効果試験で算出されたp値を表18に示す。
【０３８０】
（表１８）効果試験で算出された供給効果H3K4me3/H3およびH3ac/H3のp値。3つの生物学的複製物で算出された19のサンプル(H-1〜H-17、H-19、H-20)のp値。
0006649276.tif 000072
*  0.05以下の値は、このモデルでの有意な効果の証拠とみなした。
【０３８１】
表18は、両方の選択条件でのH3ac/H3の高い有意性を示す。H3K4-me3/H3の効果は、(+)MSXの条件で有意である。
【０３８２】
デルタSPR実測値は、60世代にわたる効果および選択条件に関して、レバレッジプロットで予測値に対してプロットされた(図20〜22)。この実測値と予測値のプロットは、モデルがデータにいかに良くフィットするかを示している。最良のフィットは、H3ac/H3効果について観察された(図21)。
【０３８３】
実施例13
ヒトCMV主要前初期プロモーター/エンハンサーに近接するヒストン修飾およびヒトCMV主要前初期プロモーター/エンハンサー断片のC425のメチル化をマーカーとして使用することによる組換えCHO細胞株における生産不安定性の予測
フィルターを設定して不良産生細胞株を拒否することによるプロジェクトHサンプルの平均デルタSPRの増加
実施例12で報告したように、外れ値サンプルH-18は、予測マーカーを確立するためのさらなる研究から除外された。
【０３８４】
ヒトCMV主要前初期プロモーター/エンハンサー断片に近接するヒストン3のレベルに対するヒストン3アセチル化のレベルおよびヒトCMV主要前初期プロモーター/エンハンサー断片のC-425メチル化の割合は、選択剤ありおよびなしでの生産安定性のための予測マーカーとして検討された。
【０３８５】
Osterlehnerらに記載されるように、mC-425[％]値のフィルターは、5％に設定された。5％を上回る値は、残りのサンプルの平均デルタSPRを高めるために拒否された。
【０３８６】
サンプルH-1〜H-17、H-19およびH-20のH3ac/H3値について、決定木はJMPソフトウェアを用いて計算された。最良の分割ノード、それゆえに最良のフィルターは、LogWorth統計を用いて計算された。LogWorthは次のように計算される：
-log10(p値)        (式14)
ここで、調整済みp値は、分割が起こり得る異なる方法の数を考慮に入れる複雑な方法で計算される。この計算は、未調整のp値(多くのレベルを有するXに有利に働く)およびBonferroniのp値(少数のレベルを有するXに有利に働く)と比較して、非常に公平である(ホワイトペーパー："Monte Carlo Calibration of Distributions of Partition Statistics")。
【０３８７】
サンプルH-1〜H-17、H-19およびH-20についての(+)MSX条件下での最良の分割は、ヒストン3のレベルに対して0.58のヒストン3アセチル化(H3ac/H3)であった。偽陰性サンプルの数を減らすために、このフィルターはA＞0.5 H3ac/H3のより低い値に設定された。
【０３８８】
両方のフィルターを別々におよび組み合わせて使用した。選択剤MSXありまたはなしの条件でのデルタSPRの平均は、それぞれの正のゲートについて計算して、フィルタリングなしの平均と比較した(表19)。
【０３８９】
（表１９）A＞0.5 H3ac/H3およびB＜5％ mC-425[％]PSBのフィルター条件下での選択剤ありおよびなしのデルタSPRの平均の算出。値は、フィルターの設定に関してサンプルH-1〜H-17、H-19およびH-20について計算された。
0006649276.tif 000073
【０３９０】
各フィルターは、フィルタリングなしの条件と比較して、平均デルタSPRを増加させることができる。フィルターAおよびBの集合は、フィルターA＞0.5 H3ac/H3の平均デルタSPRを増加させる。変更されたデルタSPR値の可視化のために、各条件およびフィルターのヒストグラムを図23に示す。
【０３９１】
プロジェクトHの確立されたフィルター設定は、プラス効果を確認するために、プロジェクトTに採用された
12の細胞株(T-1〜T-12)もまた、上で決定されたフィルター設定を用いて分析された(表20参照)。変更されたデルタSPR値の可視化のために、各条件およびフィルターのヒストグラムを図25に示す。
【０３９２】
（表２０）選択剤ありおよびなしのデルタSPRの平均の算出。値は、フィルターの設定に関して12のサンプルT-1〜T-12について計算された。
0006649276.tif 000074
【０３９３】
フィルタリングされたサンプルをフィルタリングなしのサンプルと(-)MTX条件下で比較して、平均デルタSPRの増加が観察された。
【０３９４】
A＞0.5 H3ac/H3のフィルター設定の使用は、フィルタリングなしのデータと比較して、平均デルタSPRの増加をもたらす。
【０３９５】
これは、ヒトCMV主要前初期プロモーター/エンハンサー断片に近接するヒストン3のレベルに対するヒストン3アセチル化が有用な予測マーカーであることを示している。
【図１】
0006649276.tif 000075
【図２】
0006649276.tif 000076
【図３Ａ】
0006649276.tif 000077
【図３Ｂ】
0006649276.tif 000078
【図３Ｃ】
0006649276.tif 000079
【図３Ｄ】
0006649276.tif 000080
【図３Ｅ】
0006649276.tif 000081
【図４Ａ】
0006649276.tif 000082
【図４Ｂ】
0006649276.tif 000083
【図４Ｃ】
0006649276.tif 000084
【図４Ｄ】
0006649276.tif 000085
【図４Ｅ】
0006649276.tif 000086
【図５Ａ】
0006649276.tif 000087
【図５Ｂ】
0006649276.tif 000088
【図５Ｃ】
0006649276.tif 000089
【図５Ｄ】
0006649276.tif 000090
【図６】
0006649276.tif 000091
【図７】
0006649276.tif 000092
【図８】
0006649276.tif 000093
【図９】
0006649276.tif 000094
【図１０】
0006649276.tif 000095
【図１１Ａ】
0006649276.tif 000096
【図１１Ｂ】
0006649276.tif 000097
【図１２】
0006649276.tif 000098
【図１３】
0006649276.tif 000099
【図１４】
0006649276.tif 000100
【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
0006649276.tif 000105
【図２０】
0006649276.tif 000106
【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
0006649276.tif 000112
【図２７】
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【図２８】
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【配列表】
0006649276000001.app