(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の標的核酸配列の存在又は不存在を検出する方法であって、
（a）標的核酸を含む試料を
（i）アフィニティ標識をそれぞれ結合させたオリゴヌクレオチドプライマー対であって、第1のオリゴヌクレオチドプライマーは、前記標的核酸配列の1本鎖内の領域と相補的な配列を含んでおり、かつ第1の伸長産物の合成をプライミングし、そして、第2のオリゴヌクレオチドプライマーは、前記第1の伸長産物中の領域と相補的な配列を含んでおり、かつ前記第1の伸長産物に相補的な核酸鎖の合成をプライミングする、オリゴヌクレオチドプライマー対、及び
（ii）少なくとも2つの異なる部分を含むオリゴヌクレオチドプローブであって、
第1の部分は、前記標的核酸配列の領域と少なくとも部分的に相補的な配列を含む、ヌクレオチド類似体を伴う又は伴わない標準ヌクレオチドを含み、前記第1の部分は、前記オリゴヌクレオチドプライマー対により結合された標的核酸配列内でアニーリングし、前記第1の部分はさらに、アフィニティ標識、及び3'末端又はその近傍において3'→5'エキソヌクレアーゼによる切断を阻止するエキソヌクレアーゼ耐性修飾を含んでおり、かつ3'末端においてブロックされて核酸ポリメラーゼによる伸長が阻止され；そして
前記第1の部分の5'末端に結合している第2の部分は、ヌクレオチドもしくは非ヌクレオチド、又はヌクレオチドと非ヌクレオチドの両方を含み、かつ前記標的核酸配列と非相補的な配列を含み、前記第2の部分もまた、エキソヌクレアーゼ耐性修飾を含む、オリゴヌクレオチドプローブ、
に接触させる工程；
（b）ヌクレオチド三リン酸、及び5'→3'ヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼを含む反応混合物の中で、前記オリゴヌクレオチドプライマー対と前記オリゴヌクレオチドプローブの前記標的核酸配列へのアニーリングと、前記オリゴヌクレオチドプライマー対からのプライマー伸長産物の合成とを許容する一方、前記核酸ポリメラーゼの5'→3'ヌクレアーゼ活性は、アニーリングされたオリゴヌクレオチドプローブから、前記オリゴヌクレオチドプローブの第1の部分に由来する追加ヌクレオチドを伴う又は伴わないオリゴヌクレオチドプローブの第2の部分を含むフラグメントを切断し放出できる条件下にて、前記標的核酸配列を増幅する工程；
（c）前記反応混合物を、前記オリゴヌクレオチドプライマー対と前記オリゴヌクレオチドプローブにおける前記アフィニティ標識を認識しかつ結合するアフィニティマトリックスに曝露し、これにより、過剰なオリゴヌクレオチドプライマー及び未切断のオリゴヌクレオチドプローブを除去する工程；
（d）前記オリゴヌクレオチドプローブの第2の部分を含む前記フラグメントを、前記フラグメントを前記エキソヌクレアーゼ耐性修飾まで切断する3'→5'エキソヌクレアーゼで処理し、これにより、独自の質量識別可能なサイズを有する単一フラグメントを生成させる工程；及び
（e）前記単一フラグメントの存在又は不存在を検出し、これにより、試料中の標的核酸配列の存在又は不存在を検出する工程
を含む方法。
【請求項２】
2種類以上のオリゴヌクレオチドプローブを使用し、単一の多重化反応において2種類以上の標的核酸を検出する、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記エキソヌクレアーゼ耐性修飾が、ホスホロチオエート、2'-O-メチル-リボヌクレオチド、プロパンジオールスペーサ、HEGスペーサ、及び逆方向ヌクレオチドから成る群から選択される、請求項1又は2に記載の方法。
【請求項４】
前記処理工程（d）の間に、アルカリホスファターゼ酵素の添加により、組み込まれなかったヌクレオチド三リン酸が除去される、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５】
前記検出工程（e）が、電気泳動分離、液体クロマトグラフィ又は質量分析法によって行われる、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
【請求項６】
前記検出工程（e）が、マトリックス支援レーザー脱離イオン化-飛行時間（MALDI-TOF）MS、タンデムMS、エレクトロスプレーイオン化-飛行時間（ESI-TOF）、ESI-イオントラップ、液体クロマトグラフィ（LC）-MS、ガスクロマトグラフィ（GC）-MS、又はイオン移動度（IM）-MSを利用した質量分析法によって行われる、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
【請求項７】
前記検出工程（e）の前に、質量分析法の汚染物を除去するための前記反応混合物を精製する工程がある、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
前記核酸ポリメラーゼが熱安定DNAポリメラーゼである、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
【請求項９】
前記アフィニティ標識がビオチンを含み、前記アフィニティマトリックスがストレプトアビジンで被覆した粒子を含む、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１０】
請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法において使用するための、オリゴヌクレオチドプローブを含む組成物であって、前記オリゴヌクレオチドプローブが少なくとも2つの異なる部分を含み、第1の部分は、標的核酸配列の領域と少なくとも部分的に相補的な配列を含む、ヌクレオチド類似体を伴う又は伴わない標準ヌクレオチドを含み、これにより、前記第1の部分は、前記標的核酸配列の前記領域に結合することができ、そして前記第1の部分はさらに、アフィニティ標識と、3'末端又はその近傍において3'→5'エキソヌクレアーゼによる切断を阻止するエキソヌクレアーゼ耐性修飾を含み、かつ3'末端においてブロックされて核酸ポリメラーゼによる伸長が阻止され；そして、第2の部分は、前記第1の部分の5'末端に結合しており、かつヌクレオチドもしくは非ヌクレオチド、又はヌクレオチドと非ヌクレオチドの両方を含み、かつ前記標的核酸配列とは非相補的な配列を含み、前記第2の部分は、ホスホロチオエート、2'-O-メチル-リボヌクレオチド、プロパンジオールスペーサ、HEGスペーサ、及び逆方向ヌクレオチドから成る群から選択されるエキソヌクレアーゼ耐性修飾を含む、組成物。
【請求項１１】
アフィニティ標識をそれぞれ結合させたオリゴヌクレオチドプライマー対をさらに含み、第1のオリゴヌクレオチドプライマーは、標的核酸配列の1本鎖内の領域と相補的な配列を含んでおり、かつ増幅反応において第1の伸長産物の合成をプライミングさせ、第2のオリゴヌクレオチドプライマーは、前記第1の伸長産物中の領域と相補的な配列を含んでおり、かつ前記増幅反応中に前記第1の伸長産物に相補的な核酸鎖の合成をプライミングする、請求項10に記載の組成物。
【請求項１２】
前記アフィニティ標識がビオチンを含み、そして前記アフィニティマトリックスがストレプトアビジンで被覆した粒子を含む、請求項10又は11に記載の組成物。
【請求項１３】
前記アフィニティ標識がビオチンを含み、そして前記アフィニティマトリックスがストレプトアビジンで被覆した粒子を含む、請求項11又は12に記載の組成物。
【請求項１４】
試料に含まれる2種類以上の標的核酸のハイスループット多重検出を行う方法であって、
a）標的核酸を含む試料を提供する工程；
b）前記試料から全核酸を抽出する工程；
c）2種類以上のオリゴヌクレオチドプライマー対であって、それぞれのプライマー対は、2種類以上の標的核酸のうちの1種類と相補的であり、かつ前記標的核酸から伸長産物の合成をプライミングさせることができ、そして各オリゴヌクレオチドプライマーはアフィニティ標識が結合しているオリゴヌクレオチドプライマー対を提供する工程；
d）2種類以上のオリゴヌクレオチドプローブを提供する工程であって、各プローブは、少なくとも2つの異なる部分を含み、
（i）第1の部分は、前記2種類以上の標的核酸配列のうちの1種類の領域と少なくとも部分的に相補的な配列を含む、ヌクレオチド類似体を伴う又は伴わない標準ヌクレオチドを含み、前記第1の部分は、前記2種類以上のオリゴヌクレオチドプライマー対の1つが結合した標的核酸配列内にアニーリングし、前記第1の部分はさらに、アフィニティ標識と、3'末端又はその近傍において3'→5'エキソヌクレアーゼによる切断を阻止するエキソヌクレアーゼ耐性修飾を含んでいて、そして3'末端においてブロックされて核酸ポリメラーゼによる伸長が阻止され；
（ii）第2の部分は、ヌクレオチドもしくは非ヌクレオチド、又はヌクレオチドと非ヌクレオチドの両方を含む、前記第1の部分の5'末端に結合しており、かつ前記標的核酸配列とは非相補的な配列を含んでおり、前記第2の部分もエキソヌクレアーゼ耐性修飾を含み、各オリゴヌクレオチドプローブからの第2の部分は、他のオリゴヌクレオチドプローブからの第2の部分と比べて質量識別可能なサイズを有する、
ことを特徴とするオリゴヌクレオチドプローブを提供する工程；
e）前記2種類以上の標的核酸を、前記2種類以上のオリゴヌクレオチドプライマー対と前記2種類以上のオリゴヌクレオチドプローブを含む反応混合物の中で、多イオン性洗浄剤、塩と金属の緩衝液、ヌクレオチド三リン酸、5'→3'ヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼの存在下にて、各オリゴヌクレオチドプライマー対と各オリゴヌクレオチドプローブが対応する相補的標的核酸配列にアニーリングし、各オリゴヌクレオチドプライマー対からプライマー伸長産物を合成することを許容する一方で、前記核酸ポリメラーゼの5'→3'ヌクレアーゼ活性により、それぞれのアニーリングされたオリゴヌクレオチドプローブから、前記オリゴヌクレオチドプローブのそれぞれからの前記第1の部分からの追加ヌクレオチドを伴う又は伴わないオリゴヌクレオチドプローブのそれぞれからの第2の部分を含むフラグメントを切断し放出することを可能にする条件下で増幅する工程；
f）前記反応混合物を、前記2種類以上のオリゴヌクレオチドプライマー対と前記2種類以上のオリゴヌクレオチドプローブにおけるアフィニティ標識を認識し結合するアフィニティマトリックスに曝露する工程；
g）過剰なオリゴヌクレオチドプライマー及び未切断のオリゴヌクレオチドプローブを除去するために前記反応混合物を濾過し、そして、前記オリゴヌクレオチドプローブの第2の部分からのフラグメントを含む上清を回収する工程；
h）前記上清に、組み込まれていないヌクレオチド三リン酸を分解するアルカリホスファターゼ酵素と、前記オリゴヌクレオチドプローブの第2の部分からのフラグメントをエキソヌクレアーゼ耐性修飾まで切断する3'→5'エキソヌクレアーゼ酵素を添加し、これにより、前記オリゴヌクレオチドプローブの第2の部分のそれぞれからの単一のフラグメントが生成し、これにより、各単一フラグメントが標的核酸に対応し、かつ独自の質量識別可能なサイズを有するようになる工程；
i）カラムクロマトグラフィにより、多イオン性洗浄剤と、塩と金属の緩衝液を除去する工程；
j）試料中の前記2種類以上の標的核酸の存在に対応する前記単一フラグメントの存在を検出する工程を含む方法。
【請求項１５】
前記検出工程j）が、ゲル電気泳動、液体クロマトグラフィ、ミクロフルイディクス、又は質量分析法によって行われる、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
前記検出工程j）が、マトリックス支援レーザー脱離イオン化-飛行時間（MALDI-TOF）MS、タンデムMS、エレクトロスプレーイオン化-飛行時間（ESI-TOF）、ESI-イオントラップ、液体クロマトグラフィ（LC）-MS、ガスクロマトグラフィ（GC）-MS、又はイオン移動度（IM）-MSを利用した質量分析法により行われる、請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
工程i）及びj）が自動プロセスにより行われる、請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
請求項14〜17のいずれか1項に記載の方法において使用するための、2種類以上のオリゴヌクレオチドプローブを含む組成物であって、前記オリゴヌクレオチドプローブのそれぞれが少なくとも2つの異なる部分を含み、第1の部分は、標的核酸配列の領域と少なくとも部分的に相補的な配列を含む、ヌクレオチド類似体を伴う又は伴わない標準ヌクレオチドを含み、これにより、前記第1の部分は、前記標的核酸配列の前記領域に結合することができ、そして前記第1の部分はさらに、アフィニティ標識と、3'末端又はその近傍において3'→5'エキソヌクレアーゼによる切断を阻止するエキソヌクレアーゼ耐性修飾を含み、かつ3'末端においてブロックされて核酸ポリメラーゼによる伸長が阻止され；そして、第2の部分は、前記第1の部分の5'末端に結合しており、かつヌクレオチドもしくは非ヌクレオチド、又はヌクレオチドと非ヌクレオチドの両方を含み、かつ前記標的核酸配列とは非相補的な配列を含み、前記第2の部分は、ホスホロチオエート、2'-O-メチル-リボヌクレオチド、プロパンジオールスペーサ、HEGスペーサ、及び逆方向ヌクレオチドから成る群から選択されるエキソヌクレアーゼ耐性修飾を含む、組成物。
【請求項１９】
アフィニティ標識をそれぞれ結合させた2種類以上のオリゴヌクレオチドプライマー対をさらに含む、請求項18に記載の組成物であって、前記ヌクレオチドプライマーの各対が、標的核酸配列の1本鎖内の領域と相補的な配列を含んでおり、かつ増幅反応において第1の伸長産物の合成をプライミングさせる第1のオリゴヌクレオチドプライマー、及び前記第1の伸長産物中の領域と相補的な配列を含んでおり、かつ前記増幅反応中に前記第1の伸長産物に相補的な核酸鎖の合成をプライミングする第2のオリゴヌクレオチドプライマーを含む、組成物。
【請求項２０】
前記アフィニティ標識がビオチンを含み、そして前記アフィニティマトリックスがストレプトアビジンで被覆した粒子を含む、請求項18又は19に記載の組成物。
【請求項２１】
前記アフィニティ標識がビオチンを含み、そして前記アフィニティマトリックスがストレプトアビジンで被覆した粒子を含む、請求項19又は20に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸検出の分野に関する。本発明は特に、標的核酸のハイスループット多重検出を実行する方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
標的核酸を検出する多くの方法が知られている。核酸の検出に現在利用できるホモジニアスアッセイとして、TaqMan（登録商標）アッセイ、Ampliflour（登録商標）アッセイ、染料結合アッセイ、アレル選択的動的PCRアッセイ、Scorpion（登録商標）プライマーアッセイがある。これらアッセイの手続きは、検出する各標的核酸に異なる染料が必要とされることが理由で容易に多重化できないため、改良の可能性は限られている。そうした制約を克服するため、いくつかの最近の研究には、容易に分離して検出できる切断可能な「タグ」部を含むオリゴヌクレオチドプローブを利用することが開示されている（例えばChenna他、アメリカ合衆国特許出願公開第2005/0053939号；Van Den Boom、アメリカ合衆国特許第8,133,701号）。しかしこれら研究の結果は、検出タグを標的核酸と正確に相関させることができる点に問題が残っていることを示しているため、標的核酸のハイスループット多重検出を実行する正確な方法が相変わらず必要とされている。
【発明の概要】
【０００３】
本発明により、核酸配列を検出するための新規な方法が提供される。この方法では、PCRの間に、DNAポリメラーゼの5'-ヌクレアーゼ活性により、増幅領域内の標的核酸に結合したオリゴヌクレオチドプローブから、同定を可能にする独自の切断フラグメントが生成する。これは、プローブの5'末端に非相補的「フラップ」領域を付着させることによって達成される。標的核酸の素性は、独自の切断フラグメントを同定することによって明らかにすることができる。例えばこれは、質量分析によって容易に実現できる。独自かつ容易に識別できる質量を有する可能な切断フラグメントの数は極めて多いため、核酸標的の高速ハイスループット多重検出が可能になる。
【０００４】
したがって1つの側面では、本発明により、試料中の標的核酸配列の存在又は不存在を検出する方法であって、（a）標的核酸を含む試料を（i）アフィニティ標識をそれぞれ結合させたオリゴヌクレオチドプライマー対であって、第1のオリゴヌクレオチドプライマーは、前記標的核酸配列の1本鎖内の領域と相補的な配列を含んでおり、かつ第1の伸長産物の合成をプライミングし、そして、第2のオリゴヌクレオチドプライマーは、前記第1の伸長産物中の領域と相補的な配列を含んでおり、かつ前記第1の伸長産物に相補的な核酸鎖の合成をプライミングする、オリゴヌクレオチドプライマー対、及び（ii）少なくとも2つの異なる部分を含むオリゴヌクレオチドプローブであって、第1の部分は、前記標的核酸配列の領域と少なくとも部分的に相補的な配列を含む、ヌクレオチド類似体を伴う又は伴わない標準ヌクレオチドを含み、前記第1の部分は、前記オリゴヌクレオチドプライマー対により結合された標的核酸配列内でアニーリングし、前記第1の部分はさらに、アフィニティ標識、及び3'末端又はその近傍において3'→5'エキソヌクレアーゼによる切断を阻止するエキソヌクレアーゼ耐性修飾を含んでおり、かつ3'末端においてブロックされて核酸ポリメラーゼによる伸長が阻止され；そして前記第1の部分の5'末端に結合している第2の部分は、ヌクレオチドもしくは非ヌクレオチド、又はヌクレオチドと非ヌクレオチドの両方を含み、かつ前記標的核酸配列と非相補的な配列を含み、前記第2の部分もまた、エキソヌクレアーゼ耐性修飾を含む、オリゴヌクレオチドプローブ、
に接触させることにより、反応混合物を調製する工程；
（b）ヌクレオチド三リン酸、及び5'→3'ヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼを含む反応混合物の中で、前記オリゴヌクレオチドプライマー対と前記オリゴヌクレオチドプローブの前記標的核酸配列へのアニーリングと、前記オリゴヌクレオチドプライマー対からのプライマー伸長産物の合成とを許容する一方、前記核酸ポリメラーゼの5'→3'ヌクレアーゼ活性は、アニーリングされたオリゴヌクレオチドプローブから、前記オリゴヌクレオチドプローブの第1の部分に由来する追加ヌクレオチドを伴う又は伴わないオリゴヌクレオチドプローブの第2の部分を含むフラグメントを切断し放出できる条件下にて、前記標的核酸配列を増幅する工程；
（c）前記反応混合物を、前記オリゴヌクレオチドプライマー対と前記オリゴヌクレオチドプローブにおける前記アフィニティ標識を認識しかつ結合するアフィニティマトリックスに曝露し、これにより、過剰なオリゴヌクレオチドプライマー及び未切断のオリゴヌクレオチドプローブを除去する工程；
（d）前記オリゴヌクレオチドプローブの第2の部分を含む前記フラグメントを、前記フラグメントを前記エキソヌクレアーゼ耐性修飾まで切断する5'→3'エキソヌクレアーゼで処理し、これにより、独自の質量識別可能なサイズを有する単一フラグメントを生成させる工程；及び
（e）前記単一フラグメントの存在又は不存在を検出し、これにより、試料中の標的核酸配列の存在又は不存在を検出する工程
を含む方法が提供される。
【０００５】
いくつかの実施態様では、工程（d）の間に、アルカリホスファターゼ酵素の添加により、組み込まれなかったヌクレオチド三リン酸を除去する。いくつかの実施態様では、工程（e）の前に、前記反応混合物を精製して質量分析法の汚染物を除去する工程がある。
【０００６】
別の一実施態様では、前記アフィニティ標識はビオチンを含み、前記アフィニティマトリックスはストレプトアビジンで被覆した粒子を含んでいる。別の一実施態様では、前記エキソヌクレアーゼ耐性修飾は、ホスホロチオエート、2'-O-メチル-リボヌクレオチド、プロパンジオールスペーサ、HEGスペーサ、逆方向ヌクレオチドから選択される。
【０００７】
別の1つの側面では、本発明により、オリゴヌクレオチドプローブを含む組成物であって、そのオリゴヌクレオチドプローブは少なくとも2つの異なる部分を含み、そのうちの第1の部分は、ヌクレオチド類似体を伴う又は伴わない標準ヌクレオチドを含み、標的核酸配列の領域と少なくとも部分的に相補的な配列を含んでいて、前記第1の部分は、前記オリゴヌクレオチドプライマー対が結合した標的核酸配列内にアニーリングし、前記第1の部分はさらに、アフィニティ標識と、3'末端又はその近傍において3'→5'エキソヌクレアーゼによる切断を阻止するエキソヌクレアーゼ耐性修飾を含んでいて、3'末端においてブロックされて核酸ポリメラーゼによる伸長が阻止され；第2の部分は、前記第1の部分の5'末端に結合しており、ヌクレオチドもしくは非ヌクレオチド、又はヌクレオチドと非ヌクレオチドの両方を含み、前記標的核酸配列とは非相補的な配列を含み、その第2の部分もエキソヌクレアーゼ耐性修飾を含む、組成物が提供される。
【０００８】
別の1つの側面では、前記組成物はさらに、アフィニティ標識をそれぞれ結合させたオリゴヌクレオチドプライマー対を含んでいる。そのうちの第1のオリゴヌクレオチドプライマーは、標的核酸配列の1本鎖内の領域と相補的な配列を含んでいて、増幅反応において第1の伸長産物の合成をプライミングさせる。第2のオリゴヌクレオチドプライマーは、前記第1の伸長産物中の領域と相補的な配列を含んでいて、前記増幅反応中に前記第1の伸長産物に相補的な核酸鎖の合成をプライミングする。
【０００９】
一実施態様では、前記アフィニティ標識はビオチンを含み、前記アフィニティマトリックスはストレプトアビジンで被覆した粒子を含んでいる。別の一実施態様では、前記エキソヌクレアーゼ耐性修飾部を、ホスホロチオエート、2'-O-メチル-リボヌクレオチド、プロパンジオールスペーサ、HEGスペーサ、逆方向ヌクレオチドから選択する。
【００１０】
別の1つの側面では、本発明により、オリゴヌクレオチドプローブを含む組成物であって、前記オリゴヌクレオチドプローブが少なくとも2つの異なる部分を含み、そのうちの第1の部分は、標的核酸配列の領域と少なくとも部分的に相補的な配列を含むヌクレオチド類似体を伴う又は伴わない標準ヌクレオチドを含み、前記第1の部分は、前記オリゴヌクレオチドプライマー対が結合した標的核酸配列内にアニーリングし、前記第1の部分は、前記第1の部分を一本鎖特異的5'→3'エキソヌクレアーゼによる切断に対して耐性にする修飾も5'末端に含み、第2の部分は、前記第1の部分の3'末端に結合しており、ヌクレオチドもしくは非ヌクレオチド、又はヌクレオチドと非ヌクレオチドの両方を含み、前記標的核酸配列とは非相補的な配列を含み、その第2の部分は、その第2の部分を一本鎖特異的5'→3'エキソヌクレアーゼによる切断に対して耐性にする修飾も含む、組成物が提供される。
【００１１】
いくつかの実施態様では、オリゴヌクレオチドプローブの第2の部分中のエキソヌクレアーゼ耐性修飾は、ホスホロチオエート、2'-O-メチル-リボヌクレオチド、プロパンジオールスペーサ、HEGスペーサ、逆方向ヌクレオチドから選択した切断できないヌクレオチド類似体を含むか、修飾の付着点よりも先はオリゴヌクレオチドフラグメントをエキソヌクレオチドによる切断に対して耐性にする他の任意の修飾部を含んでいる。別の実施態様では、オリゴヌクレオチドプローブの第2の部分は、任意の有機部分又は繰り返し単位（例えば(CH2-CH2-O)nなど）が可能な非ヌクレオチドを含む。
【００１２】
別の1つの側面では、本発明により、試料に含まれる2種類以上の標的核酸のハイスループット多重検出を行う方法であって、a）標的核酸を含む試料を提供する工程と；b）前記試料から全核酸を抽出する工程と；c）2種類以上のオリゴヌクレオチドプライマー対であって、それぞれの対は、2種類以上の標的核酸のうちの1種類と相補的でその標的核酸から伸長産物の合成をプライミングさせることができ、各オリゴヌクレオチドプライマーにはアフィニティ標識が結合している構成のオリゴヌクレオチドプライマー対を提供する工程と；d）2種類以上のオリゴヌクレオチドプローブであって、各プローブは、少なくとも2つの異なる部分を含み、（i）第1の部分は、標的核酸配列の領域と少なくとも部分的に相補的な配列を含むヌクレオチド類似体を伴う又は伴わない標準ヌクレオチドを含み、前記第1の部分は、前記オリゴヌクレオチドプライマー対が結合した標的核酸配列内にアニーリングし、前記第1の部分はさらに、アフィニティ標識と、3'末端又はその近傍において3'→5'エキソヌクレアーゼによる切断を阻止するエキソヌクレアーゼ耐性修飾を含んでいて、3'末端においてブロックされて核酸ポリメラーゼによる伸長が阻止され；（ii）第2の部分は、前記第1の部分の5'末端に結合しており、ヌクレオチドもしくは非ヌクレオチド、又はヌクレオチドと非ヌクレオチドの両方を含み、前記標的核酸配列とは非相補的な配列を含んでおり、その第2の部分もエキソヌクレアーゼ耐性修飾を含み、各オリゴヌクレオチドプローブからの第2の部分は、他のオリゴヌクレオチドプローブからの第2の部分と比べて質量識別可能なサイズを有することを特徴とする構成のオリゴヌクレオチドプローブを提供する工程と；e）前記2種類以上の標的核酸を、前記2種類以上のオリゴヌクレオチドプライマー対と前記2種類以上のオリゴヌクレオチドプローブを含む反応混合物の中で、多イオン性洗浄剤、塩と金属の緩衝液、ヌクレオチド三リン酸、5'→3'ヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼの存在下にて、各オリゴヌクレオチドプライマー対と各オリゴヌクレオチドプローブが対応する相補的標的核酸配列にアニーリングし、各オリゴヌクレオチドプライマー対からプライマー伸長産物を合成することを許容する一方で、前記核酸ポリメラーゼの5'→3'ヌクレアーゼ活性により、それぞれのアニーリングされたオリゴヌクレオチドプローブから、前記オリゴヌクレオチドプローブのそれぞれからの前記第1の部分からの追加ヌクレオチドを伴う又は伴わないオリゴヌクレオチドプローブのそれぞれからの第2の部分を含むフラグメントを切断し放出することを可能にする条件下で増幅する工程と；f）前記反応混合物を、前記2種類以上のオリゴヌクレオチドプライマー対と前記2種類以上のオリゴヌクレオチドプローブの表面にあるアフィニティ標識を認識してそのアフィニティ標識に結合するアフィニティマトリックスに曝露する工程と；g）過剰なオリゴヌクレオチドプライマー及び未切断のオリゴヌクレオチドプローブを除去するために前記反応混合物を濾過し、そして、前記オリゴヌクレオチドプローブの第2の部分からのフラグメントを含む上清を回収する工程と；h）その上清に、組み込まれていないヌクレオチド三リン酸を分解するアルカリホ��ファターゼ酵素と、前記オリゴヌクレオチドプローブの第2の部分からのフラグメントをエキソヌクレアーゼ耐性修飾まで切断する3'→5'エキソヌクレアーゼ酵素［プロパンジオールを含む］を添加し、これにより、前記オリゴヌクレオチドプローブの第2の部分のそれぞれからの単一のフラグメントが生成し、これにより、各単一フラグメントが標的核酸に対応し、かつ独自の質量識別可能なサイズを有するようになる工程と；i）カラムクロマトグラフィにより、多イオン性洗浄剤と、塩と金属の緩衝液を除去する工程と；j）質量分析法を利用して、試料中の前記2種類以上の標的核酸の存在に対応する前記単一フラグメントの存在を検出する工程を含む方法が提供される。
【００１３】
一実施態様では、増幅工程は、多重反応混合物の中で実施される。別の一実施態様では、洗浄剤除去工程と質量分析工程は、自動化プロセスで実施される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図1は、本発明の方法の図解である。
【図２Ａ】図2は、オリゴヌクレオチドT9JTTTGC（ただしJは、2'-O-メチル-ウリジン（A）、HEGスペーサ（B）、プロパンジオールスペーサ（C）のいずれかである）をエキソヌクレアーゼIで消化した後のオリゴヌクレオチドフラグメントを示す質量スペクトル図である。
【図２Ｂ】図2は、オリゴヌクレオチドT9JTTTGC（ただしJは、2'-O-メチル-ウリジン（A）、HEGスペーサ（B）、プロパンジオールスペーサ（C）のいずれかである）をエキソヌクレアーゼIで消化した後のオリゴヌクレオチドフラグメントを示す質量スペクトル図である。
【図２Ｃ】図2は、オリゴヌクレオチドT9JTTTGC（ただしJは、2'-O-メチル-ウリジン（A）、HEGスペーサ（B）、プロパンジオールスペーサ（C）のいずれかである）をエキソヌクレアーゼIで消化した後のオリゴヌクレオチドフラグメントを示す質量スペクトル図である。
【図３】図3は、EGFR T790M変異体5'-フラッププローブのフラグメントでLC-MSを実施した後の抽出イオンクロマトグラム（EIC）を、PCR増幅反応の後にエキソヌクレアーゼIによる消化なし（A）又は消化あり（B）の場合について示している。
【図４】図4は、標的核酸のハイスループット多重検出を実施するための本発明の方法の詳細なフローチャートである。
【図５】図5は、実施例3に記載した多重アッセイの単一イオンモニタリングクロマトグラムである。
【００１５】
発明の詳細な説明
定義
【００１６】
この明細書では、「試料」という用語に、核酸を含む検体又は培養物（例えば微生物培養物）が含まれる。「試料」という用語には、生物試料と環境試料の両方が含まれるものとする。試料には、合成始点の検体が含まれていてもよい。生物試料には、全血、血清、血漿、臍帯血、絨毛膜絨毛、羊水、脳脊髄液、脊髄液、洗浄液（例えば細気管肺胞、胃、腹膜、管、耳、関節鏡）、生検試料、尿、糞、痰、唾液、鼻粘液、前立腺液、精液、リンパ液、胆汁、涙、汗、母乳、乳汁、胚細胞、胎児細胞が含まれる。好ましい一実施態様では、生物試料は血液であり、より好ましいのは血漿である。この明細書では、「血液」という用語に、全血、又は血液の任意の一部、例えば一般的な定義の血清や血漿が包含される。血漿は、抗凝固剤で処理した血液の遠心分離から得られる、全血の一部を意味する。血清は、血液試料が凝固した後に残った流体の水性部分を意味する。環境試料には、表面物質試料、土壌試料、水試料、産業試料などの環境材料のほか、食品や乳製品を処理する器具、装置、設備、道具、廃棄可能物、廃棄不能物から得られた試料が含まれる。これらの例が本発明に適用できる試料のタイプを制限すると考えてはならない。
【００１７】
この明細書では、「標的」又は「標的核酸」という用語は、存在を検出又は測定したり、機能、相互作用、特性を研究したりするあらゆる分子を意味するものとする。したがって標的には、検出可能なプローブ（例えばオリゴヌクレオチドプローブ）又はアッセイが存在するか、それを当業者が作り出すことのできるほぼあらゆる分子が含まれる。例えば標的として、検出可能なプローブ（例えば抗体）に結合できるか、接触させることのできる生体分子、例えば核酸分子、ポリペプチド、脂質、炭水化物などが可能である。なおその検出可能なプローブは、本発明の方法で検出できる核酸も含んでいる。この明細書では、「検出可能なプローブ」は、興味の対象である標的生体分子にハイブリダイズ又はアニーリングすることのできるあらゆる分子又は薬剤を意味し、この明細書に記載した標的生体分子の特異的検出を可能にする。本発明の1つの側面では、標的は核酸であり、検出可能なプローブはオリゴヌクレオチドである。「核酸」と「核酸分子」という用語は、この明細書を通じて同じ意味で使用できる。これらの用語は、オリゴヌクレオチド、オリゴ、ポリヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド（DNA）、ゲノムDNA、ミトコンドリアDNA（mt DNA）、相補的DNA（c DNA）、細菌DNA、ウイルスDNA、ウイルスRNA、RNA、メッセンジャーRNA（m RNA）、トランスファーRNA（t RNA）、リボソームRNA（r RNA）、si RNA、触媒RNA、クローン、プラスミド、M13、P1、コスミド、細菌人工染色体（BAC）、酵母人工染色体（YAC）、増幅された核酸、アンプリコン、PCR産物とそれ以外のタイプの増幅された核酸、RNA/DNAハイブリッド、ポリアミド核酸（PNA）を意味し、これらのすべては一本鎖又は二本鎖の形態が可能であり、特に断わらない限り、天然のヌクレオチドと同様に機能することができる天然ヌクレオチドの既知の類似体と、その組み合わせおよび／又は混合物を包含すると考えられる。したがって「ヌクレオチド」という用語は、天然のヌクレオチドと修飾された／非天然のヌクレオチドの両方を意味し、その中には、ヌクレオシド一リン酸、ヌクレオシド二リン酸、ヌクレオシド三リン酸のほか、ポリ核酸又はオリゴヌクレオチドの中に存在する一リン酸モノマーが含まれる。ヌクレオチドは、リボ；2'-デオキシ；2',3'-デオキシのほか、本分野で周知の広い範囲の他のヌクレオチド模倣体であってもよい。模倣体には、3'-O-メチル、ハロゲン化された塩基、糖置換物などの鎖終結ヌクレオチド；糖でないアルキル環構造などの代替糖構造；イノシンなどの代替塩基；デアザ修飾したもの；カイとプサイ、リンカー修飾したもの；質量標識修飾したもの；ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ボラノホスフェート、アミド、エステル、エーテルなどのホスホジエステルによる修飾体又は置換体；塩基性の、又は完全なヌクレオチド間置換体、例えば光切断可能なニトロフェニル部分などの切断連結が含まれる。
【００１８】
標的の存在又は不存在は、定量的又は定性的に測定することができる。標的は異なる多彩な形態にすることができ、その中には、例えば単純な混合物又は複雑な混合物や、実質的に精製された形態が含まれる。例えば標的として、他の諸成分を含む試料の一部や、試料の唯一の成分又は主要な成分が可能である。したがって標的として、細胞全体又は組織全体の1成分、細胞又は組織の抽出物、それを分画したライセート、実質的に精製された分子が可能である。また、標的は、既知の配列又は構造や、未知の配列又は構造を有することができる。
【００１９】
「増幅反応」という用語は、核酸の標的配列のコピーを増幅するためのインビトロのあらゆる手段を意味する。
【００２０】
「増幅する」は、溶液を、増幅を可能にする条件に置く工程を意味する。増幅反応の成分には、例えばプライマー、ポリヌクレオチド鋳型、ポリメラーゼ、ヌクレオチド、dNTPなどを含めることができるが、これらに限定されない。「増幅する」という用語は、典型的には、標的核酸の「指数関数的な」増加を意味する。しかしこの明細書では、「増幅する」は、核酸の選択した標的配列の数の線形的増加も意味することができるが、一回での単一プライマー伸長工程とは異なる。
【００２１】
「ポリメラーゼ連鎖反応」又は「PCR」は、標的二本鎖DNAの特定の区画又は部分配列を幾何級数的に増幅する方法を意味する。PCRは当業者に周知である。例えばアメリカ合衆国特許第4,683,195号、第4,683,202号；『PCRプロトコル：方法と応用へのガイド』、Innis他編、1990年を参照のこと。
【００２２】
この明細書では、「オリゴヌクレオチド」は、ホスホジエステル結合又はその類似体によって連結した天然の、又は修飾されたヌクレオシドモノマーの線形オリゴマーを意味する。オリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド、そのアノマー形態、ペプチド核酸（PNA）などを含んでおり、標的核酸に特異的に結合することができる。通常は、モノマーはホスホジエステル結合又はその類似体によって連結されて、サイズが数モノマー単位（例えば3〜4個）から数十モノマー単位（例えば40〜60個）の範囲のオリゴヌクレオチドを形成する。オリゴヌクレオチドを「ATGCCTG」のように文字列で表わすときにはいつでも、特に断わらない限り、ヌクレオチドは左から右に5'-3'の順番であり、「A」はデオキシアデノシンを表わし、「C」はデオキシシチジンを表わし、「G」はデオキシグアノシンを表わし、「T」はデオキシチミジンを表わし、「U」はリボヌクレオシドであるウリジンを表わす。通常は、オリゴヌクレオチドは、これら4種類の天然のデオキシヌクレオチドを含むが、リボヌクレオシド又は非天然ヌクレオチド類似体も含んでいてよい。酵素が活性化のために特別なオリゴヌクレオチド基質又はポリヌクレオチド基質、例えば一本鎖DNAやRNA/DNA複合体などを必要とする場合、そのオリゴヌクレオチド基質又はポリヌクレオチド基質の適切な組成を選択することは、十分に当業者の知識の範囲内である。
【００２３】
この明細書では、「オリゴヌクレオチドプライマー」又は単純に「プライマー」は、標的核酸鋳型上の配列にハイブリダイズしてオリゴヌクレオチドプローブの検出を容易にするポリヌクレオチド配列を意味する。本発明の増幅に関する実施態様では、オリゴヌクレオチドプライマーは、核酸合成の開始点として機能する。増幅しない実施態様では、オリゴヌクレオチドプライマーは、切断剤によって切断することのできる構造を作るのに利用できる。プライマーは、さまざまな長さにすることができ、長さが50個未満のヌクレオチド、例えば長さが12〜25個のヌクレオチドであることがしばしばある。PCRで用いるプライマーの長さと配列は、当業者に知られている原理に基づいて設計することができる。
【００２４】
この明細書では、「オリゴヌクレオチドプローブ」という用語は、興味の対象である標的核酸にハイブリダイズ又はアニーリングすることができて、その標的核酸の特異的な検出を可能にするポリヌクレオチド配列を意味する。
【００２５】
「アフィニティ」標識は、対応する分子結合パートナーに特異的に結合することのできる分子である。結合は、共有結合又は非共有結合（例えばイオン結合、水素結合など）を通じて可能になる。この明細書では、アフィニティ標識（例えばビオチン）は、アフィニティマトリックス（例えばストレプトアビジンで被覆したビーズや粒子）に選択的に結合させることができる。この明細書では、「ストレプトアビジンで被覆したビーズ」は、「アビジンで被覆したビーズ」と同じ意味で用いることができる。
【００２６】
この明細書では、「アフィニティマトリックス」は、固体支持体又は固体マトリックス（例えば磁性ラテックス粒子、ガラスビーズ）の表面に付着させてあって対応する分子結合パートナーに特異的に結合することのできる分子を意味する。結合は、共有結合又は非共有結合が可能である。この明細書では、アフィニティマトリックス（例えばアビジンで被覆した粒子）は、アフィニティ標識（例えばビオチン）に選択的に結合することができる。
【００２７】
「ミスマッチのヌクレオチド」又は「ミスマッチ」は、そのミスマッチがある1つ又は複数の位置で標的配列と相補的ではないヌクレオチドを意味する。オリゴヌクレオチドプローブには、少なくとも1つのミスマッチが存在する可能性があり、2個、3個、4個、5個、6個、7個、又はそれよりも多くのミスマッチヌクレオチドがあってもよい。
【００２８】
この明細書では、「多型」という用語は、アレル変異体を意味する。多型には、単一ヌクレオチド多型（SNP）と単純配列長多型を含めることができる。多型は、あるアレルと比べたときの別のアレルでの1つ以上のヌクレオチド置換が原因であるか、挿入又は欠失、重複、逆転や、本分野で知られている他の変化が原因である可能性がある。
【００２９】
この明細書では、「質量識別可能なサイズ」という用語は、「切断産物のサイズ」、「分解産物のサイズ」、「プローブフラグメントのサイズ」と同じ意味で使用することができ、この明細書に記載した方法によって記述されるように、オリゴヌクレオチドプローブが切断して放出されることで得られる1つ以上の分解産物のサイズを意味する。質量識別可能なサイズ（MDF）を有するフラグメントとして、分離を容易にする修飾タグ（例えば疎水性部分やアフィニティ部分）を含むオリゴヌクレオチドプローブフラグメント、ヌクレオチドオリゴヌクレオチドプローブフラグメント、非ヌクレオチドオリゴヌクレオチドプローブフラグメント、オリゴヌクレオチドプローブフラグメントなどが挙げられるが、これらに限定されない。1つだけの質量識別可能なサイズを有するフラグメントを生成させると感度が顕著に向上し、多重反応を実施する能力を増大させることが可能になる。
【００３０】
この明細書では、「修飾」という用語は、分子レベル（例えば塩基部分、糖部分、リン酸骨格）でのオリゴヌクレオチドプローブの変更を意味する。ヌクレオシド修飾には、切断ブロッカー又は切断インデューサーの導入、副溝バインダーの導入、同位体濃縮、同位体減損、重水素の導入、ハロゲン修飾が含まれるが、これらに限定されない。ヌクレオシド修飾には、ハイブリダイゼーションの厳格さを増大させる部分や、オリゴヌクレオチドプローブの融点を上昇させる部分も含まれていてよい。例えばヌクレオチド分子は、2'と4'の炭素を接続する追加のブリッジで修飾して、ヌクレアーゼによる切断に抵抗するロックされた核酸（LNA）ヌクレオチドを得ることができる。
【００３１】
1個の分子が別の分子（例えば標的ポリヌクレオチドのためのプローブ）に結合することに関係する「特異的」又は「特異性」という用語は、それら2分子間の安定な複合体の認識、接触、形成を意味するとともに、その1個の分子と他の分子群の間の実質的により少ない認識、接触、複合体形成を意味する。この明細書では、「アニーリング」という用語は、2つの分子間の安定な複合体の形成を意味する。
【００３２】
プローブは、そのプローブの少なくとも1つの領域が、ある核酸配列の相補体の少なくとも1つの領域と実質的に一致した配列を有する場合に、その核酸配列に「アニーリングすることができる」。「実質的に一致した配列」は、少なくとも約80％、好ましくは少なくとも約85％、より好ましくは少なくとも約90％、又は95％、又は99％、最も好ましくは100％一致した配列である。あるDNA配列とRNA配列の配列一致度を求めることを目的する場合には、UとTを同じヌクレオチドと見なすことがしばしばある。例えば配列ATCAGCを含むプローブは、配列GCUGAUを含む標的RNA配列にハイブリダイズすることができる。
【００３３】
この明細書では、「切断剤」という用語は、オリゴヌクレオチドプローブを切断させて質量識別可能なサイズのフラグメントを生じさせることのできるあらゆる手段を意味し、その中には酵素が含まれるが、それに限定されない。増幅が起こらない方法では、切断剤は、オリゴヌクレオチドプローブの第2の部分又はそのフラグメントを切断する、又は分解する、又は放出することだけに役立てることができる。切断剤として酵素が可能である。切断剤は、天然のもの、合成したもの、修飾されていないもの、修飾されたものが可能である。
【００３４】
増幅が起こる方法では、切断剤は、合成（又は重合）活性とヌクレアーゼ活性を有する酵素であることが好ましい。そのような酵素は核酸増幅酵素であることがしばしばある。核酸増幅酵素の一例は、テルムス・アクアティクス（Taq）DNAポリメラーゼや大腸菌DNAポリメラーゼIなどの核酸ポリメラーゼ酵素である。その酵素は、天然のもの、修飾されていないもの、修飾されたものが可能である。
【００３５】
「エキソヌクレアーゼ耐性修飾まで前記フラグメントを切断する」という表現は、エキソヌクレアーゼ耐性修飾そのものに到達するまでフラグメントを切断するか、エキソヌクレアーゼ耐性修飾の近傍に位置する規定のヌクレオチドの位置でフラグメントを切断すると考えられる切断活性を意味する。3'→5'エキソヌクレアーゼ活性に関しては、修飾の近傍にあるその規定のヌクレオチドは、その修飾から見て3'の直近の第1の位置に配置することができよう。あるいはその規定のヌクレオチドは、3'→5'エキソヌクレアーゼによる切断が常にその規定のヌクレオチドの位置で終わる限り、修飾から3'側の2箇所、又は3箇所、又はそれよりも多くの箇所に配置することができよう。
【００３６】
「プロパンジオール」又は「プロパンジオールスペーサ」という用語は、1,3-プロパンジオールを意味し、プロパン-1,3-ジオール、1,3-ジヒドロキシプロパン、トリメチレングリコールと同義語である。「HEG」又は「HEGスペーサ」は、ヘキサエチレングリコールを意味し、3,6,9,12,15-ペンタオキサヘプタデカン-1,17-ジオールと同義語である。逆方向ヌクレオチドという用語は、糖部分が隣接したヌクレオチドの糖部分に3'→3'ホスホジエステル連結を通じて連結したヌクレオチドを意味する。
【００３７】
「質量分析の汚染物」という用語は、質量分析計によって質量識別可能なサイズ（MDF）を有するフラグメントの検出を妨げることのできるあらゆる物質を意味する。質量分析のいくつかの汚染物の例は、Keller他、Analytica Chimica Acta（2008年）第627巻：71〜81ページに開示されている。
【００３８】
「核酸ポリメラーゼ」は、ヌクレオチドを核酸に組み込む触媒となる酵素を意味する。核酸ポリメラーゼの例には、DNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼ、ターミナルトランスフェラーゼ、逆転写酵素、テロメラーゼなどが含まれる。
【００３９】
「熱安定DNAポリメラーゼ」は、安定で（すなわち破壊又は変性に抵抗する）、選択された期間にわたって高温に曝されたときに十分な触媒活性を保持するDNAポリメラーゼを意味する。熱安定DNAポリメラーゼは、例えば、二本鎖核酸を変性させるのに必要な時間にわたって高温に曝すとき、その後プライマー伸長反応をさせるのに十分な活性を保持している。核酸の変性に必要な加熱条件は本分野では周知であり、アメリカ合衆国特許第4,683,202号、第4,683,195号に例示されている。この明細書では、熱安定DNAポリメラーゼは、典型的には、ポリメラーゼ連鎖反応（「PCR」）などの温度サイクリング反応で用いるのに適している。熱安定核酸ポリメラーゼの例には、テルムス・アクアティクスTaq DNAポリメラーゼ、テルムス種Z05ポリメラーゼ、テルムス・フラブスポリメラーゼ、テルモトガ・マリティマポリメラーゼ（TMA-25ポリメラーゼ、TMA-30ポリメラーゼなど）、Tth DNAポリメラーゼなどが含まれる。
【００４０】
「修飾された」ポリメラーゼは、少なくとも1つのモノマーが、参照配列（例えば天然形態又は野生形態のポリメラーゼ、又は別の修飾形態のポリメラーゼ）とは異なるポリメラーゼを意味する。修飾の例には、モノマーの挿入、欠失、置換が含まれる。修飾されたポリメラーゼには、2つ以上の親に由来する同定可能な部分配列（例えば構造ドメインや機能ドメインなど）を有するキメラポリメラーゼも含まれる。修飾されたポリメラーゼの定義には、参照配列の化学的修飾を含むものも含まれる。修飾されたポリメラーゼの例には、G46E E678G CS5 DNAポリメラーゼ、G46E L329A E678G CS5 DNAポリメラーゼ、G46E L329A D640G S671F CS5 DNAポリメラーゼ、G46E L329A D640G S671F E678G CS5 DNAポリメラーゼ、G46E E678G CS6 DNAポリメラーゼ、Z05 DNAポリメラーゼ、ΔZ05ポリメラーゼ、ΔZ05-金ポリメラーゼ、ΔZ05Rポリメラーゼ、E615G Taq DNAポリメラーゼ、E678G TMA-25ポリメラーゼ、E678G TMA-30ポリメラーゼなどが含まれる。
【００４１】
「5'→3'ヌクレアーゼ活性」又は「5'-3'ヌクレアーゼ活性」という用語は、典型的には核酸鎖合成に付随する核酸ポリメラーゼの活性を意味し、その活性によってヌクレオチドが核酸鎖の5'末端から除去される。例えば大腸菌DNAポリメラーゼIはこの活性を有するのに対し、クレノウフラグメントは持たない。5'→3'ヌクレアーゼ活性を有するいくつかの酵素は5'→3'エキソヌクレアーゼである。「一本鎖特異的5'→3'エキソヌクレアーゼ」という用語は、一本鎖核酸のほうを二本鎖核酸よりも好んでいて、5'末端から作用するエキソヌクレアーゼを意味する。そのような一本鎖特異的5'→3'エキソヌクレアーゼの例には、枯草菌からのエキソヌクレアーゼ、脾臓からのホスホジエステラーゼ、酵母からのエキソヌクレアーゼII、酵母からのエキソヌクレアーゼV、ニューロスポラ・クラッサからのエキソヌクレアーゼが含まれる。
【００４２】
「3'→5'エキソヌクレアーゼ」又は「3'→5'エキソヌクレアーゼ活性」は、酵素、又は酵素の活性を意味し、その活性によってヌクレオチドが核酸鎖の3'末端から除去される。3'→5'エキソヌクレアーゼの例には、大腸菌からのエキソヌクレアーゼI、大腸菌からのエキソヌクレアーゼIV、大腸菌からのエキソヌクレアーゼV、ファージT4からのエキソヌクレアーゼIV、ファージT4からのT4 DNAポリメラーゼ、酵母からのエキソヌクレアーゼI、酵母からのエキソヌクレアーゼIII、大腸菌からのDNAポリメラーゼI、クレノウフラグメント、ショウジョウバエからのDNAポリメラーゼα、ショウジョウバエからのDNAポリメラーゼγ、ヘビ毒ホスホジエステラーゼが含まれる。
【００４３】
本発明のさまざまな側面は、核酸ポリメラーゼの1つの特別な性質に基づいている。核酸ポリメラーゼは、いくつかの活性を有することができる。そのうちの5'→3'ヌクレアーゼ活性により、核酸ポリメラーゼは、より大きな相補的ポリヌクレオチドにアニーリングしたオリゴヌクレオチドからモノヌクレオチド又は小さなオリゴヌクレオチドを切断することができる。切断が効率的に起こるようにするには、上流オリゴヌクレオチドも同じより大きなポリヌクレオチドにアニーリングする必要がある。
【００４４】
5'→3'ヌクレアーゼ活性を利用した標的核酸の検出は、アメリカ合衆国特許第5,210,015号、第5,487,972号、第5,804,375号；Holland他、1998年、Proc. Natl. Acad. Sci. USA第88巻：7276〜7280ページに記載されているように、「TaqMan（登録商標）」又は「5'-ヌクレアーゼアッセイ」によって実施することができる。TaqMan（登録商標）アッセイでは、増幅される領域内でハイブリダイズする標識した検出プローブが増幅反応中に存在している。プローブを修飾し、それらプローブがDNA合成のためのプライマーとして作用するのを阻止する。増幅は、二本鎖核酸に対する5'→3'ヌクレアーゼ活性を有するDNAポリメラーゼを用いて実行する。増幅の各合成工程の間、伸長しているプライマーの下流にある標的核酸にハイブリダイズするあらゆるプローブが、DNAポリメラーゼの5'→3'ヌクレアーゼ活性によって分解される。したがって新しい標的鎖の合成によってもプローブの分解が起こるため、分解産物の蓄積が、標的配列の合成の指標となる。
【００４５】
分解産物を検出するための適切な任意の方法を5'ヌクレアーゼアッセイで利用できる。検出プローブは、2種類の蛍光染料で標識することがしばしばある。その一方の染料は、他方の染料の蛍光を消すことができる。染料は、典型的には5'末端に付着させたレポータ染料又は検出染料とともにプローブに付着させ、消光染料は内部部位に付着させる。するとプローブがハイブリダイズしていない状態のときには消光が起こり、DNAポリメラーゼの5'→3'ヌクレアーゼ活性によってプローブの切断が2つの染料の間で起こる。増幅の結果としてプローブが染料の間で切断し、それに付随して消光状態が除かれ、最初は蛍光が消えていた染料から蛍光の増加を観察できるようになる。分解産物の蓄積は、反応における蛍光の増加を測定することによってモニタされる。アメリカ合衆国特許第5,491,063号と第5,571,673号には、増幅に付随して起こるプローブの分解を検出する方法が記載されている。
【００４６】
標的核酸を検出するための5'ヌクレアーゼアッセイでは、5'→3'ヌクレアーゼ活性を有する任意のポリメラーゼを用いることができる。例えばいくつかの実施態様では、5'→3'ヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼは、熱安定かつ熱活性な核酸ポリメラーゼである。そのような熱安定ポリメラーゼには、真正細菌属テルムス、テルモトガ、テルモシフォの多彩な種からの天然形態と組み換え形態のポリメラーゼと、そのキメラ形態が含まれるが、それらに限定されない。例えば本発明の方法で使用できるテルムス種ポリメラーゼには、テルムス・アクアティクス（Taq）DNAポリメラーゼ、テルムス・テルモフィルス（Tth）DNAポリメラーゼ、テルムス種Z05（Z05）DNAポリメラーゼ、テルムス種sps17（sps17）、テルムス種Z05が含まれる（例えばアメリカ合衆国特許第5,405,774号、第5,352,600号、第5,079,352号、第4,889,818号、第5,466,591号、第5,618,711号、第5,674,738号、第5,795,762号に記載されている）。本発明の方法で使用できるテルモトガポリメラーゼには、例えば、テルモトガ・マリティマDNAポリメラーゼ、テルモトガ・ネアポリターナDNAポリメラーゼが含まれるのに対し、使用できるテルモシフォポリメラーゼの一例はテルモシフォ・アフリカヌスDNAポリメラーゼである。テルモトガ・マリティマとテルモシフォ・アフリカヌスのDNAポリメラーゼは、公開番号がWO 92/06200である国際特許出願PCT/US91/07035に公開されている。テルモトガ・ネアポリターナの配列は、国際特許出願公開WO 97/09451に見いだすことができる。
【００４７】
5'ヌクレアーゼアッセイでは、増幅検出は、典型的には増幅と同時である（すなわち「リアルタイム」）。いくつかの実施態様では、増幅検出は定量的であり、増幅検出はリアルタイムである。いくつかの実施態様では、増幅検出は定性的である（例えば標的核酸の存在又は不存在の終末点検出）。いくつかの実施態様では、増幅検出は増幅の後である。いくつかの実施態様では、増幅検出は定性的であり、増幅検出は増幅の後である。
【００４８】
本発明では、オリゴヌクレオチドプローブからの分解産物の検出には、蛍光レポータ染料と消光染料の利用が含まれておらず、代わりに2つの異なる部分を有するプローブの合成が含まれる。第1の部分は、少なくとも一部が標的核酸と相補的な部分であり、標準ヌクレオチド又はヌクレオチド類似体を含むため、この部分は、検出される標的核酸に結合することができる。さらに、プローブのこの第1の部分の3'末端は修飾されるかブロックされているため、その3'末端をDNAポリメラーゼで伸長させることはできない。ポリメラーゼによる伸長を阻止するため3'末端をブロックすることは、マッチングしない（すなわち非相補的）ヌクレオチドを3'末端に置くことによって、又は末端ヌクレオチドの3'-ヒドロキシルを改変するか除去することによって達成できる。以下に記載するように、第1の部分も3'→5'エキソヌクレアーゼ耐性修飾を含んでいる。第2の部分は、第1の部分の5'末端に付着された非相補的部分であり、標的核酸に結合することのできない「5'フラップ」領域を形成する（図1参照）。この5'フラップ領域は、ヌクレオチドで構成するか、非ヌクレオチドで構成するか、ヌクレオチドと非ヌクレオチドの両方で構成することができる。オリゴヌクレオチドプローブの5'フラップ形成第2の部分に存在できる非ヌクレオチドとして、任意の有機部分又は繰り返し単位（例えば(CH2-CH2-O)nなど）が可能である。第2の部分も、3'→5'エキソヌクレアーゼの活性に対する耐性を持たせる修飾（図1に「X」として示す）を含んでいる。この修飾として、3'→5'エキソヌクレアーゼによって切断することのできないヌクレオチド類似体が可能である。そのようなヌクレオチド類似体の例には、ホスホロチオエート、2'-O-メチル-リボヌクレオチド、プロパンジオールスペーサ、HEGスペーサ、逆方向ヌクレオチドや、オリゴヌクレオチドフラグメントがエキソヌクレアーゼによって修飾の付着点を超えて切断することに対する耐性を持たせる他の任意の修飾が含まれる。
【００４９】
本発明により、オリゴヌクレオチドプライマーとオリゴヌクレオチドプローブが提供される。これらのプローブとプライマーを生成させるのに利用する方法が何らかの形で制限されることは想定していない。当業者は、多彩な化学合成戦略と、プローブおよびプライマーを生成させる試薬に精通している。本発明のオリゴヌクレオチドプローブが天然のヌクレオチド構造、又は天然の塩基（例えばアデニン、グアニン、チミン、シトシン、ウラシル）に限定されることも想定していない。核酸に典型的に見いだされる天然の複素環塩基に加え、非天然の核酸類似体も本発明で用途がある。
【００５０】
非天然類似体には、非天然の複素環塩基又はそれ以外の修飾をされた塩基を有するものが含まれる。特に、多くの非天然の塩基が、例えばSeela他（1991年）Helv. Chim. Acta第74巻：1790ページ、Grein他（1994年）Bioorg. Med. Chem. Lett.第4巻：971〜976ページ、Seela他（1999年）Helv. Chim. Acta第82巻：1640ページにさらに記載されている。さらに説明すると、ヌクレオチドで用いられて融点（Tm）変更剤として作用するいくつかの塩基が、場合によっては含まれる。例えばそのうちのいくつかを挙げると、7-デアザプリン類（例えば7-デアザグアニン、7-デアザアデニンなど）、ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン、プロピニル-dN（例えばプロピニル-dU、プロピニル-dCなど）などである。例えばアメリカ合衆国特許第5,990,303号を参照されたい。他の代表的な複素環塩基には、例えば、ヒポキサンチン、イノシン、キサンチン：2-アミノプリン、2,6-ジアミノプリン、2-アミノ-6-クロロプリン、ヒポキサンチン、イノシン、キサンチンの8-アザ誘導体；アデニン、グアニン、2-アミノプリン、2,6-ジアミノプリン、2-アミノ-6-クロロプリン、ヒポキサンチン、イノシン、キサンチンの7-デアザ-8-アザ誘導体；6-アザシトシン；5-フルオロシトシン；5-クロロシトシン；5-ヨードシトシン；5-ブロモシトシン；5-メチルシトシン；5-プロピニルシトシン；5-ブロモビニルウラシル；5-フルオロウラシル；5-クロロウラシル；5-ヨードウラシル；5-ブロモウラシル；5-トリフルオロメチルウラシル；5-メトキシメチルウラシル；5-エチニルウラシル；5-プロピニルウラシル、4-アセチルシトシン、5-(カルボキシヒドロキシメチル)ウラシル、5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウリジン、5-カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β-D-ガラクトシルケオシン、イノシン、N6-イソペンテニルアデニン、1-メチルグアニン、1-メチルイノシン、2,2-ジメチルグアニン、7-デアザアデニン、2-メチルアデニン、2-メチルグアニン、3-メチルシトシン、5-メチルシトシン、N6-メチルアデニン、7-メチルグアニン、7-デアザグアニン、5-メチルアミノメチルウラシル、5-メトキシアミノメチル-2-チオウラシル、β-D-マンノシルケオシン、5'-メトキシカルボキシメチルウラシル、5-メトキシウラシル、2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデニン、ウラシル-5-オキシ酢酸（v）、ウィブトキソシン、シュードウラシル、ケオシン、2-チオシトシン、5-メチル-2-チオウラシル、2-チオウラシル、4-チオウラシル、5-メチルウラシル、ウラシル-5-オキシ酢酸メチルエステル、3-(3-アミノ-3-N-2-カルボキシプロピル)ウラシル、(acp3)w、2,6-ジアミノプリン、5-プロピニルピリミジンなどが含まれる。さらに説明すると、修飾されたオリゴヌクレオチドの別の例には、1つ以上のロックされた核酸（LNA（登録商標））モノマー（例えばExiqon A/S社（ヴェドベーク、デンマーク）からライセンスされていてLink Technologies, Ltd.社（ラナークシャー、スコットランド）から入手できるLNA（登録商標）モノマーを含むオリゴヌクレオチド）を有するものがある。これらのヌクレオチド類似体は、例えばアメリカ合衆国特許第6,639,059号、第6,303,315号、アメリカ合衆国特許公開第2003/0092905号にも記載されている。
【００５１】
オリゴヌクレオチドプローブとオリゴヌクレオチドプライマーは、本分野で知られている任意の技術を利用して調製することができる。例えばいくつかの実施態様では、オリゴヌクレオチドプローブとオリゴヌクレオチドプライマーは、任意の核酸合成法を利用して化学的に合成され、その方法として、例えば、BeaucageとCaruthers（1981年）Tetrahedron Letts.第22巻(20)：1859〜1862ページに記載されている固相ホスホロアミダイト法に従う方法がある。さらに説明すると、オリゴヌクレオチドは、トリエステル法を用いて合成することもできる（例えばCapaldi他（2000年）「ホスホロジチオエート連結を含むオリゴヌクレオチド類似体の高効率固相合成」Nucleic Acids Res.第28巻（9）：e40ページと、Eldrup他（1994年）「トリエステル法によるオリゴデオキシリボヌクレオシドホスホロジチオエートの調製」Nucleic Acids Res.第22巻（10）：1797〜1804ページを参照のこと）。本分野で知られている他の合成技術も利用でき、その中には例えばNeedham Van Devanterら（1984年）Nucleic Acids Res.第12巻：6159〜6168ページに記載されている自動化合成装置を用いる方法が含まれる。自動化されたオリゴヌクレオチド合成のため、多彩な装置を市場で入手することができる。マルチ-ヌクレオチドを合成する方法（例えば3ヌクレオチド合成など）も場合によっては利用される。さらに、プライマー核酸は、場合によってはさまざまな修飾を含んでいる。例えばいくつかの実施態様では、プライマーは、例えばその後のアンプリコンのクローニングなどを容易にするため制限部位リンカーを含んでいる。さらに説明すると、プライマーは、アメリカ合衆国特許第6,001,611号に記載されているように、場合によっては修飾も実施して増幅反応の特異性を向上させる。プライマーとプローブは、この明細書に記載したようにして、又は本分野において別のやり方で知られているようにして、さまざまな他の修飾を有するものを合成することもできる。
【００５２】
本発明の反応混合物、方法、他の側面で利用されるプローブは、ヌクレオチドタグ又は非ヌクレオチドタグを有することができる。そのようなタグは、本分野で知られているさまざまな技術によって直接的又は間接的にオリゴヌクレオチドに付着させることができる。説明すると、使用するタグのタイプに応じ、タグは、末端のヌクレオチド（オリゴヌクレオチドプライマーおよび／又はオリゴヌクレオチドプローブの5'末端又は3'末端）又は非末端のヌクレオチドに付着させることができ、しかもさまざまなサイズと組成のリンカー又はスペーサアームを通じて間接的に付着させることができる。市販のホスホロアミダイト試薬を用いると、適切に保護されたホスホロアミダイトを通じて5'末端又は3'末端に官能基（例えばチオールや第一級アミン）を含むオリゴヌクレオチドを製造することができる。そのようなオリゴヌクレオチドには、例えばInnis他（編）『PCRプロトコル：方法と応用へのガイド』、エルゼヴィア・サイエンス＆テクノロジー・ブックス（1990年）（Innis）に記載されているプロトコルを利用してタグを付着させることができる。
【００５３】
本質的に、（標準又は非標準の、標識された、又は標識されていない）あらゆる核酸を、多彩な供給源（The Midland Certified Reagent Company社（ミッドランド、テキサス州）、Operon Technologies Inc.社（ハンツヴィル、アラバマ州）、Proligo LLC社（ボルダー、コロラド州）や、他の多くの会社）のいずれかから、カスタムで、又は標準品として注文することができる。
【００５４】
本発明により、本発明の方法を実施するのに必要な要素を含むキットも提供される。その要素には、本発明の組成物（本発明のオリゴヌクレオチドプローブとオリゴヌクレオチドプライマー）、酵素（DNAポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼ、アルカリホスファターゼ）、増幅のための試薬（ヌクレオチド三リン酸、塩類、洗浄剤）、精製のための試薬（アフィニティ樹脂）のうちの1つ以上を含めることができる。典型的には、キットは、使用しやすいように区画化されていて、本発明の方法を実施するための要素を提供する容器を含んでいる。いくつかの実施態様では、キットはさらに、1種類以上の標的核酸配列を含んでおり、その中には対照核酸配列（陽性対照および／又は陰性対照）が含まれる。
【００５５】
TaqMan（登録商標）PCRアッセイで本発明のオリゴヌクレオチドプローブを用いると、プローブのアニーリングされた第1の部分にある多数の切断部位が原因となってプローブのフラグメントが数多く生成する（図1）。これらのフラグメントは、質量分析法によるその後の検出において所定の標的核酸のための「質量識別可能な印」を生じさせるであろうが、試料中に多数の標的核酸が存在している（例えば10種類を超える標的核酸がある多重アッセイ）と、莫大な数の「質量識別可能な印」を有するフラグメントが生成すると考えられるため、異なる標的核酸から非常に似た質量のフラグメントが生じるであろう。したがって特定の標的核酸の存在又は不存在を正確に突き止めることは難しかろう。この問題は、3'→5'エキソヌクレアーゼを用いた処理工程を用意することで解決される。3'→5'エキソヌクレアーゼは、エキソヌクレアーゼ耐性修飾そのものに到達するまでそれらフラグメントを切断するか、5'フラップ部分上でエキソヌクレアーゼ耐性修飾の3'側に位置する規定のヌクレオチドの位置でそれらフラグメントを切断させ、それらフラグメントをそれ以上は切断させないと考えられる。その結果、個々の標的核酸について単一の「独自の質量」を有するフラグメントが生成するため、質量分析法によって検出されると考えられる。
【００５６】
質量識別可能なサイズ（MDF）のフラグメントは、特定の物理的属性又は検出特徴（長さ、質量、電荷、電荷と質量の比などが挙げられるが、それらに限定されない）によって識別される。一実施態様では、検出特徴は質量である。別の一実施態様では、検出特徴は電荷と質量である。MDFの分離と検出は、電気泳動で分離することによって、例えばゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、等電点電気泳動、マイクロフルイディクスによる電気泳動によって実現することができる。あるいは分離と検出は、液体クロマトグラフィ、例えば高性能液体クロマトグラフィ（HPLC）、逆相HPLC、超性能液体クロマトグラフィ（UPLC）などを利用して実現できる。関連する別の一実施態様では、MDFは、物理的属性に関係する挙動（MALDI-TOF質量分析法における質量、飛行時間などが挙げられるが、それらに限定されない）によって識別することができる。関連する一実施態様では、1つ以上のオリゴヌクレオチドプローブからのMDFが質量スペクトルマトリックスから放出されて選択的に脱離されるため、非選択的プライマーとオリゴヌクレオチドプローブ（すなわち標的核酸が存在しない）は脱離しない。これらの実施態様では、MDFは、オリゴヌクレオチドプローブ又は反応混合物に存在している他の非MDFよりも質量スペクトルマトリックスから効率的に脱離するはずである。好ましい質量スペクトルマトリックスには、2,5-ジヒドロキシ安息香酸、α-シアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸、3-ヒドロキシピコリン酸（3-HPA）、クエン酸ジ-アンモニウム（DAC）と、これらの組み合わせが含まれる。別の一実施態様では、質量スペクトルマトリックスは、タンパク質を分析するための設計にすることができる。タンパク質を分析するためのマトリックスの例にDHBとCHCAが含まれるが、これらに限定されない。
【００５７】
本発明の方法はさらに、切断していない、又は一部が切断したオリゴヌクレオチドプローブから1つ以上のオリゴヌクレオチドプローブフラグメント（すなわちMDF）を分離する追加工程を含んでいる。分離は、捕獲リガンド（例えばビオチンやそれ以外のアフィニティリガンド）と捕獲剤（例えばアビジン、ストレプトアビジン、抗体、受容体、MDFと相補的な捕獲プローブ、その機能フラグメントで捕獲リガンドに対する結合活性を有するもの）を用いて実現できる。MDFは、捕獲剤に対する特異的結合活性を有する捕獲リガンドを含むことができる。捕獲リガンドと捕獲剤は、MDFの残部に質量を付加するのに用いることもできる。すると質量分析計で検出されるMDFの質量範囲からそれを除外することができる。一実施態様では、捕獲プローブは、切断産物をすべて増幅するため万能プライマーを有することができる。
【００５８】
分離工程は、MDFから塩類、酵素、それ以外の緩衝液成分を除去するのにも使用できる。本分野で周知のいくつかの方法（例えばクロマトグラフィ、ゲル電気泳動、沈降）を利用して試料を清浄にすることができる。例えばサイズ除外クロマトグラフィ又はアフィニティクロマトグラフィを利用して試料から塩を除去することができる。分離法の選択は、試料の量による。例えば少量の試料を利用できるときや、小型化された装置を使用するときには、マイクロ-アフィニティクロマトグラフィ分離工程を利用できる。それに加え、分離工程が望ましいかどうかと分離法の選択は、利用する検出法によって異なる可能性がある。例えばマトリックス支援レーザー脱離／イオン化とエレクトロスプレーイオン化の効率は、試料から塩類を除去することによって向上させることができる。例えば塩類はマトリックス支援レーザー脱離／イオン化においてレーザーからエネルギーを吸収するため、イオン化効率がより低くなる。
【００５９】
本発明の質量識別可能なサイズ（MDF）を有するフラグメントを検出し、したがって標的核酸を同定および／又は定量するには質量分析法が好ましい方法である。MDFは質量分析計の中でイオン化することができ、そのイオンは、質量電荷比に基づいて空間的又は時間的に分離される。すると質量分析計が各イオンに付随する質量を計算する。したがって質量分析計に言及するとき、質量電荷比を記述するのに単に質量という用語を用いることができる。
【００６０】
質量分析法は、分子を分離して同定するための高感度かつ正確な技術である。一般に、質量分析計は2つの主要構成要素を有する。すなわち、イオンを生成させるイオン源と、イオンの質量電荷比を測定する質量選択分析装置であり、この比がこれらイオンの質量の測定値に変換される。いくつかのイオン化法が本分野では知られており、この明細書に記載されている。MDFは、オリゴヌクレオチドプローブから切断する前に、又は切断中に、又は切断させた後に帯電させることができる。それゆえ、質量分析法によって測定されることになるMDFは必ずしも電荷を必要としない。というのも電荷は質量分析手続きの間に獲得できるからである。質量分析法の分析では、MDFのオプションの要素である電荷や検出部分などを用いてMDFに質量を与えることができる。
【００６１】
この明細書に記載してあるように、さまざまな質量分析法、例えば四重極質量分析法、イオントラップ質量分析法、飛行時間質量分析法、ガスクロマトグラフィ質量分析法、タンデム質量分析法において、例えばイオン源と質量分析計のさまざまな組み合わせを利用することができる。するとカスタム化した検出プロトコルを設計する自由度を得ることができる。それに加え、質量分析計は、イオン源からすべてのイオンを質量分析計まで順番に、又は同時に送るようにプログラムすることができる。さらに、質量分析計は、特定の質量のイオンを選択してその質量分析計に送り、他のイオンは阻止するようにプログラムすることができる。
【００６２】
質量分析計の中ではイオンの運動を正確に制御することができるため、検出プロトコルにおいてより多くの選択肢が可能になる。すると、例えば多重実験からの多数のMDFを分析するときに有利になる。例えばMDFが多数ある多重実験では、一群の似たレポータから個々のレポータを選択した後にそれらレポータを別々に分析するのに有利である可能性がある。質量分析計で検出される質量範囲を制御することに基づく別の利点には、切断していない、又は一部が切断したタグ付きプローブを分析から除外できることが含まれる。するとアッセイからの背景雑音が低減する。
【００６３】
質量分析計は、質量差の小さいイオンを識別し、イオンの質量を高精度で測定することができる。したがって質量が似たMDFを同じ実験で同時に使用することができる。なぜなら質量分析計は、非常に近似したタグの質量さえ識別できるからである。質量分析法を利用して高分解能と質量の正確さを実現することで、タグ付きプローブの大きな集合を用いることが可能になる。なぜなら、得られるレポータタグを互いに識別することが可能だからである。タグ付きプローブの大きな集合を利用できるというのは、多重実験を設計するときの1つの利点である。
【００６４】
MDFの質量を検出するのに質量分析法を利用することの別の利点は、このタイプの質量分析が高感度であることに基づいている。質量分析計は、イオン源によって形成されるイオンの大半を利用し、それらイオンを質量分析計から検出器へと効率的に送ることによって高感度を実現している。このように高感度であるため、少量の試料でさえ、質量分析計を用いて測定することができる。これは、各MDF種の量が少ない可能性のある多重実験において利点になりうる。
【００６５】
質量分析法は本分野で周知である（Burlingame他、Anal. Chem.第70巻：647R〜716Rページ（1998年）；KinterとSherman、『タンデム質量分析法を利用したタンパク質のシークエンシングと同定』、Wiley-Interscience社、ニューヨーク（2000年）を参照のこと）。質量分析法に付随する基本的なプロセスは、試料に由来する気相イオンの生成と、それらの質量の測定である。
【００６６】
気相イオンの運動は、質量分析計の中で発生させる電磁場を利用して正確に制御することができる。その電磁場中のイオンの運動はイオンのm/zに比例し、それが、m/zを、したがって試料の質量を測定する基礎を形成する。この電磁場中でイオンが運動することにより、イオンを収容して集中させることが可能になるため、それが、質量分析法の高感度を説明する。m/zの測定中、イオンは高い効率で粒子検出器に送られて、それらイオンの到着が記録される。各m/zに対応するイオンの量が、x軸をm/z、y軸を相対量とするグラフ上のピークによって示される。異なる質量分析計は、異なるレベルの解像度、すなわち質量が非常に近いイオン間のピークを分離する能力を有する。解像度は、R＝m／Δmとして定義される。ただしmはイオンの質量であり、Δmは、質量スペクトルにおける2つのピーク間の質量差である。例えば解像度が1000の質量分析計は、m/zが100.0のイオンを、m/zが100.1のイオンから分離することができる。
【００６７】
いくつかのタイプの質量分析計を利用することや、いくつかのタイプの質量分析計をさまざまな配置で製造することができる。一般に、質量分析計は、主要要素として、試料導入口、イオン源、質量分析計、検出器、真空系、装置制御システム、データシステムを有する。試料導入口、イオン源、質量分析計の違いが、一般に、装置のタイプとその能力を規定する。例えば入口をキャピラリー-カラム液体クロマトグラフィ源にすること、又はマトリックス支援レーザー脱離で用いられているような直接的なプローブ又はステージにすることができる。一般的なイオン源は、例えばエレクトロスプレーであり、その中にはナノスプレー、マイクロスプレー、マトリックス支援レーザー脱離が含まれる。質量分析計の例には、四重極質量フィルタ、イオントラップ質量分析計、飛行時間質量分析計が含まれる。
【００６８】
イオン形成プロセスは、質量スペクトル分析の出発点である。いくつかのイオン化法を利用できるが、イオン化法の選択は、分析する試料に依存する。例えばポリペプチドを分析するには、比較的穏やかなイオン化法、例えばエレクトロスプレーイオン化（ESI）が望ましい。ESIのためには、試料を含む溶液を、高電圧になった細い針を通過させる。その高電圧が強い電場を発生させる結果として、大きく帯電した液滴の細かいスプレーが得られ、質量分析計に向かう。他のイオン化法として、例えば、中性原子の高エネルギービームを用いて固体試料にぶつけ、解離とイオン化を引き起こす高速原子衝撃（FAB）法がある。エレクトロスプレーイオン化-飛行時間（ESI-TOF）法は、レーザーパルスを、UV吸収化合物マトリックスの中に結晶化させてある試料にぶつける方法である。本分野で知られている他のイオン化法には、例えば、プラズマとグロー放電法、プラズマ脱離イオン化法、共鳴イオン化法、二次イオン化法が含まれる。MDFは、タグ付きプローブから切断する前に、又は切断中に、又は切断した後にイオン化状態になることができる。
【００６９】
エレクトロスプレーイオン化（ESI）は、この明細書に記載した本発明にとって有用ないくつかの性質を有する。ESIは、例えばイオン化や気化が難しいポリペプチドなどの生体分子に対して利用することができる。それに加え、ESIの効率は非常に大きくできるため、高感度測定の基礎となる。さらに、ESIによって溶液から帯電分子が生成するが、それは溶液中のMDFを分析するのに好都合である。それとは逆に、MALDIなどのイオン化法では、イオン化の前に試料を結晶化させる必要がある。
【００７０】
ESIによって溶液から帯電分子を直接生成させることができるため、液体クロマトグラフィ系からの試料と相性がよい。例えば質量分析計に、HPLCなどの液体クロマトグラフィ系からの入口を設けることができる。するとクロマトグラフィのカラムからの分画が質量分析計に流入する。液体クロマトグラフィ系と質量分析計を直列にしたこの配置は、LC-MSと呼ばれることがときにある。LC-MS系を利用して、質量分析法による分析の前に、例えば切断していない、又は一部が切断したMDFを切断したMDFから分離することができる。それに加え、クロマトグラフィを利用して、質量分析法による分析の前にMDF試料から塩類やそれ以外の緩衝液成分を除去することができる。例えば直列になった、又は直列ではない逆相HPLCカラムを利用して試料の脱塩を行なうことで、イオン化プロセスの効率を向上させ、したがって質量分析法による検出の感度を向上させることができる。
【００７１】
多彩な質量分析計をさまざまなイオン源と対にして用いることができる。異なる質量分析計は、当業者に知られているように、そしてこの明細書にも記載されているように、異なる利点を有する。検出のために選択する質量分析計と方法は、アッセイが具体的にどのようなものであるかに依存し、例えばより感度の高い質量分析計は、検出用に発生するイオンが少量のときに使用できる。いくつかのタイプの質量分析計と質量分析法を以下に記載する。
【００７２】
イオン移動度（IM）質量分析法は、質量分析法（MS）に新たな次元を追加する気相分離法である。IMは、衝突断面積に基づいて気相イオンを分離し、飛行時間（TOF）質量分析法と組み合わせることで、タンパク質とペプチドの同定と特徴付けに使用する強力なツールを生み出すことができる。したがってIM-MSは、MDFがタンパク質又はペプチドであるとき、本発明にとって特に有用である。IM-MSは、VerbeckらによりJournal of Biomolecular Techniques（第13巻、第2号、56〜61ページ）の中でより詳しく議論されている。
【００７３】
四重極質量分析法では、四重極質量フィルタ又は四重極分析装置を利用する。このタイプの質量分析計は、4つのロッドが、電気的に接続された2つのロッドを含む2つのセットとして配置された構成である。rf電圧と直流電圧の組み合わせが各対のロッドに印加されて場が発生することで、イオンが質量フィルタの始点から終点まで移動するときにイオンの振動運動が引き起こされる。その場の結果として、一方の対のロッドで高帯域通過質量フィルタが生成し、他方の対のロッドで低帯域通過質量フィルタが生成する。高帯域通過フィルタと低帯域通過フィルタが重複することで、両方のフィルタを通過して四重極の長さを横断することのできる規定のm/zが残る。このm/zは四重極質量フィルタの中に選択されて安定に残るのに対し、他のすべてのm/zは不安定な軌道を有するため質量フィルタの中には残らない。印加する場に勾配をつけることで、増加していくm/zが選択されて質量フィルタを通過して検出器に到達できるようにすると、質量スペクトルが得られる。それに加え、四重極は、rfだけの場を印加することにより、あらゆるm/zのイオンが含まれて送られる設定にすることもできる。こうすると、質量フィルタリングなしでイオンを送ることが必要な質量分析計内の領域で四重極をレンズ又は集束系として機能させることが可能になる。これは、以下に説明するように、タンデム質量分析法で有用であろう。
【００７４】
四重極質量分析計とこの明細書に記載したそれ以外の質量分析計は、規定のm/z又は質量範囲を分析するようにプログラムすることができる。質量分析計のこの性質は、この明細書に記載した本発明にとって有用である。切断したMDFの質量範囲がアッセイの前にわかることになるため、質量分析計は、予定した正しい質量範囲のイオンを送るようにする一方で、より大きな質量範囲又はより小さな質量範囲のイオンは除外するようにプログラムすることができる。質量範囲を選択できることで、アッセイにおける背景雑音を低減させ、したがって信号／雑音比を大きくすることができる。それに加え、規定された質量範囲を利用して、MDFの質量よりも大きな質量であると考えられる切断していないあらゆるオリゴヌクレオチドプローブの分析を除外することができる。したがって質量分析計は、本来の分離工程のほか、MDFの検出と同定を実現することができる。
【００７５】
イオントラップ質量分析法では、イオントラップ質量分析計を利用する。この質量分析計では、質量分析計の中で最初はあらゆるm/zのイオンが捕獲されて振動するように場を印加する。イオンは、イオン源から、八重極レンズ系などの集束装置を通過してイオントラップの中に入る。イオンの捕獲が捕獲領域で起こった後、励起と放出によりイオンが電極を通過して検出器に到達する。質量分析は、増加していくm/zを有するイオンがトラップから放出されて検出器に入るように振動の振幅が増大する電圧を順次印加することによって実現する。四重極質量分析法とは異なり、選択されたm/zを有するイオン以外のすべてのイオンが質量分析計の場に保持される。イオントラップの1つの利点は、一度に捕獲されるイオンの数を注意深く制限する限り、感度が非常に高いことである。イオン数の制御は、イオンをトラップに注入する時間を変えることによって実現できる。イオントラップの質量解像度は四重極質量フィルタと同様だが、イオントラップは小さいm/zの制約が確かに少ない。
【００７６】
飛行時間質量分析法では飛行時間質量分析計を利用する。この方法でm/zを分析するため、（高電圧によって発生させた）電場中での加速によってイオンに決められた量の運動エネルギーを最初に与える。イオンは、加速された後、場のない領域、すなわち「ドリフト」領域に入り、その領域を、そのイオンのm/zに逆比例する速度で移動する。イオンが場のない領域の長さを移動するのに要する時間を測定して、そのイオンのm/zを計算するのに用いる。
【００７７】
このタイプの質量分析で考慮すべき1つのことは、調べるイオンの集団を分析器に同時に導入することである。例えばこのタイプの質量分析は、イオンを短い明確なパルスとして生成させるMALDIなどのイオン化技術によく適している。考慮すべき別のことは、イオンの運動エネルギーの大きさに幅があることによって生じる速度の広がりを制御することである。より長い飛行管、又はイオン反射装置、又はより大きな電圧を用いると、速度が広がる効果を最小にするのに役立つ。飛行時間質量分析計は高感度であり、m/zの範囲が四重極質量分析計又はイオントラップ質量分析計よりも広い。また、このタイプの質量分析計では、質量分析計の走査が不要であるためデータを迅速に取得することができる。
【００７８】
ガスクロマトグラフィ質量分析法は、標的をリアルタイムで検出するときに素晴らしい解決法を提供する。システムのガスクロマトグラフィ（GC）部が化学的混合物を分析物（例えばMDF）のパルスに分離し、質量分析計（MS）がその分析物を同定して定量する。
【００７９】
タンデム質量分析法では、上記の質量分析計を組み合わせて利用することができる。タンデム質量分析計では、興味の対象であるイオンを単離してさらに分析するため、イオンをそのイオンのm/zに従って分離する第1の質量分析計を用いることができる。単離された興味の対象であるイオンは次に破壊されて複数のフラグメントイオン（衝突活性化解離又は衝突誘導解離と呼ばれる）になった後、それらフラグメントイオンは第2の質量分析計で分析される。こうしたタイプの質量分析計システムは、2つの質量分析計が通常は衝突室によって空間的に分離されているため空間的タンデムシステムと呼ばれる。タンデム質量分析計システムには、時間的タンデムシステムも含まれる。しかしこの場合には1つの質量分析計が用いられており、その質量分析計を使用して、順番に1個のイオンを単離し、フラグメント化を誘導し、次いで質量分析を実行する。
【００８０】
空間的タンデムのカテゴリーの質量分析計は、2つ以上の質量分析計を有する。例えばタンデム四重極質量分析計システムは、第1の四重極質量フィルタと、それに続く衝突室と、それに続く第2の四重極質量フィルタと、その後の検出器を備えることができる。別の配置は、第1の質量分析計として四重極質量フィルタを用い、第2の質量分析計として飛行時間質量分析計を用い、衝突室によってそれら2つの質量分析計を分離するというものである。他のタンデムシステムが本分野で知られており、その中には、レフレクトロン飛行時間質量分析法、タンデムセクター質量分析法、セクター-四重極質量分析法が含まれる。
【００８１】
時間的タンデムのカテゴリーの質量分析計は、異なる時刻に異なる機能を実行する1つの質量分析計を有する。例えばイオントラップ質量分析計を用いるとあらゆるm/zのイオンを捕獲することができる。一連のrf走査機能を適用すると、トラップから、興味の対象であるイオンのm/zを除くあらゆるm/zのイオンが放出される。興味の対象であるm/zを単離した後、rfパルスを印加してトラップ内でガス分子と衝突させることでイオンのフラグメント化を誘導する。その後、フラグメント化されたイオンのm/z値を質量分析計で測定する。イオンサイクロトロン共鳴装置（フーリエ変換質量分析計としても知られる）が、時間的タンデムシステムの一例である。
【００８２】
実験の各段階で選択されるイオンを制御することにより、いくつかのタイプのタンデム質量分析実験を実施することができる。異なるタイプの実験では、質量分析計の異なる操作モード（「走査」と呼ばれることがときにある）を利用する。質量スペクトル走査と呼ばれる第1の例では、第1の質量分析計と衝突室が、質量分析のためにすべてのイオンを第2の質量分析計に送る。生成イオン走査と呼ばれる第2の例では、興味の対象であるイオンを第1の質量分析計の中で質量によって選択した後、衝突室の中でフラグメント化する。その後、形成されたイオンは第2の質量分析計を走査することによって分析される。前駆イオン走査と呼ばれる第3の例では、第1の質量分析計を走査し、質量が分析されたイオンを順番に衝突室に送ってフラグメント化する。第2の質量分析計は、興味の対象である生成イオンを質量によって選択し、検出器に送る。したがって検出器の信号は、フラグメント化して共通生成イオンにすることのできるあらゆる前駆イオンの結果である。他の実験形式には、一定の質量差が質量走査で考慮されるコンスタントニュートラルロススキャンが含まれる。こうしたさまざまなタンデム質量分析走査手続きの利用は、多重実験の場合と同様、大きな集団のレポータタグを単一の実験で測定するときに有利である可能性がある。
【００８３】
典型的な応用では、反応中に生成したMDFの量をサイクル閾（Ct）値に基づいて求める。この値は、検出可能な量の核酸を生成させるのに必要なサイクルの数を表わす。Ct値の求め方は本分野で周知である。簡単に述べると、PCRの間、形成されるアンプリコンの量が増加するにつれて信号強度が測定可能なレベルまで増大し、後期サイクルで反応が非対数相に入ったときにプラトーに達する。反応が対数相である間にサイクル数に対して信号強度をプロットすることにより、測定可能な信号が得られる具体的なサイクルを導出し、PCRの開始前に標的の量を計算するのに用いることができる。Ctを求める方法の例は、例えばHeid他、Genome Methods第6巻：986〜994ページ、1996年に、加水分解プローブに言及して記載されている。
【実施例】
【００８４】
実施例１
エキソヌクレアーゼ耐性修飾の評価
【００８５】
本発明の方法を実施するのに使用できるさまざまなエキソヌクレアーゼ耐性修飾を評価するため、オリゴヌクレオチドT9JTTTGC（配列ID番号1）を合成した。ただしT9は5'フラップ部を表わし、Jは修飾を表わす。個々の実験で用いる修飾には、ホスホロチオエート、2'-アミノ-ウリジン、2'-フルオロ-ウリジン、2'-O-メチル-ウリジン、プロパンジオールスペーサ、HEG（ヘキサエチレングリコール）スペーサが含まれていた。1μMの各オリゴヌクレオチドを1×エキソヌクレアーゼI緩衝液（New England Biolabs社）と2単位のエキソヌクレアーゼI（New England Biolabs社）に懸濁させ、37℃で30分間インキュベートした。氷の上で冷やすことによって反応を終了させ、エキソヌクレアーゼで消化させた生成物をAgilent Q-TOF 6530装置の中で液体クロマトグラフィ-質量分析法（LC-MS）によって分析した。3つの修飾、すなわち2'-O-メチル-ウリジン、HEGスペーサ、プロパンジオールスペーサを含むオリゴヌクレオチドからエキソヌクレアーゼで消化させた生成物を図2A〜図2Cの質量スペクトル図に示す。これらの結果から、これらの修飾が、修飾の付着点を超えてオリゴヌクレオチドが消化されるのを阻止するのに有効であることがわかる。
【００８６】
実施例２
5'-フラッププローブを用いたEGFR T790M増幅の検出
【００８７】
PCRアッセイを実施してヒト上皮増殖因子受容体（EGFR）遺伝子のT790M変異（ヌクレオチド変化2369 C→T）を検出した。以下のプライマーをEGFR遺伝子でT790M変異の位置を含む領域の増幅に用いた：
順プライマー：5'-CCTCCCTCCAGGAAGCCTACGTGA-3'（配列ID番号2）
逆プライマー：5'-CAGTCGAAGGGCATGAGCTGEA-3'（E＝t-ブチルベンジルdC、配列ID番号3）。
【００８８】
検出のため、以下の5'-フラッププローブを使用した：
5'-C6ECCTGCACGGTGGAGGTGAGGCAGP-3'（配列ID番号4）。ただしC6は非相補的5'フラップ部を表わし、Eは1,3-プロパンジオールを表わし、Pはリン酸を表わす。96ウエルのプレート上で以下の最終濃度を有するPCR反応混合物を調製した：50mMのトリス-HCl（pH 8.0）、80〜100 mMの塩化カリウム、それぞれ200μMのdATP、dCTP、dGTP、400μMのdUTP、200nMの各プライマー、200 nMの5'-フラッププローブ、標的DNA（1,000〜100,000コピーのEGFRプラスミド）、20 nMのDNAポリメラーゼ（5'ヌクレアーゼ活性を有する）、0.1 mMのEDTA、2.5 mMの酢酸マグネシウム。増幅と分析は、Roche LightCycler（登録商標）480装置（Roche Applied Science社、インディアナポリス、インディアナ州）を用いて実施した。以下の温度プロファイルを使用した：95℃で1分間（又は95℃（10秒間）から62℃（25秒間）へを2サイクル）の後、92℃（10秒間）から62℃（25〜30秒間）へのサイクルを99回。PCR反応が終わると、10単位のエキソヌクレアーゼI（New England Biolabs社）をいくつかの試料エルに添加し、溶液を37℃で30分間インキュベートした後、氷の上で冷やした。
【００８９】
洗浄剤とそれ以外の汚染物を除去するため、反応生成物を、TopTip（Glygen Corp社）アニオン交換スピンカラムを通過させた後、Agilent Q-TOF 6530装置に装填してLC-MSによってフラグメントを分析した。図3に、エキソヌクレアーゼIによる消化前（A）と消化後（B）の5'-フラッププローブのフラグメントの抽出イオンクロマトグラム（EIC）を示す。エキソヌクレアーゼIによる消化なしの反応では、予想質量が配列C6ECCを有するプローブフラグメントと配列C6ECCTを有するプローブフラグメントに対応する2つの明確なピークが観察された。しかしエキソヌクレアーゼIによる消化の後は、プローブフラグメントC6ECに対応する質量を有する単一の明確なピークだけが観察され、C6ECCとC6ECCTに対応するピークはもはや観察されなかった。
【００９０】
実施例３
多重5'-フラッププローブを用いた多重アッセイ
【００９１】
本発明の方法を用いていかにして標的核酸のハイスループット多重検出を実施したかの詳細なフローチャートを図4に示す。ヒト上皮増殖因子受容体（EGFR）遺伝子のエキソン19欠失配列、T790M変異（ヌクレオチド変化2369C→T）、L858R変異、エキソン28内部対照配列を同時に検出するためのPCRアッセイを実施した。それぞれの場合に、EGFR遺伝子で上記変異の位置を含む領域を増幅するのにアレル特異的プライマーを用いた。検出のため、以下の5'-フラッププローブを使用した：
T790M：5'-GGTGGAGETTTGCACGGTGGAGGTGAGGCAGEBT-3'（配列ID番号5）
エキソン19欠失：5'-GGGAGGGEGCCCAGAGCCATGGACCCCCACACAGEBT-3'（配列ID番号6）
L858R：5'-TTCTTCTTECTTTACTGGTGAAAACACCGCAGCATGTEBT-3'（配列ID番号7）
エキソン28：5'-ACCACCACCECTTAAAGGCCCGCTGGCTCTGTGCAGAAEBT-3'（配列ID番号8）。各プローブの配列において、Eは1,3-プロパンジオールを表わし、Bは、プロパンジオールリンカー（E）を通じてオリゴヌクレオチドに付着したビオチンを表わす。
【００９２】
96ウエルのプレート上で以下の最終濃度を有するPCR反応混合物を調製した：50 mMのトリス-HCl（pH 8.0）、80〜100 mMの塩化カリウム、それぞれ200μMのdATP、dCTP、dGTP、400μMのdUTP、50 nMの各プライマー、50 nMの各5'-フラッププローブ、標的DNA（各変異につき10コピーのEGFRプラスミド）、20 nMのDNAポリメラーゼ（5'ヌクレアーゼ活性を有する）、0.1 mMのEDTA、2.5mMの酢酸マグネシウム。増幅と分析は、Roche LightCycler（登録商標）480装置（Roche Applied Science社、インディアナポリス、インディアナ州）を用いて実施した。以下の温度プロファイルを使用した：95℃で1分間（又は95℃（10秒間）から62℃（25秒間）へを2サイクル）の後、92℃（10秒間）から62℃（25〜30秒間）へのサイクルを55回。PCR反応が終わると、反応混合物を、エッペンドルフ管の中の1×エキソヌクレアーゼI緩衝液にあらかじめ移しておいた75μlの固定化したアビジン樹脂（G Biosciences社、パート376A-A、ロット112106）とともにインキュベートした。試料（PCRウエル、50μl）を添加し、反応混合物を10分間インキュベートした。次に試料をスピンカラムフィルタに移し、500×g（2400 rpm）で回転させた。樹脂を廃棄し、以下に記載するようにしてさらにフロースルーを処理した。
【００９３】
上記の試料に1μlの20単位/μlのエキソヌクレアーゼIと3μlの1単位/μlのエビアルカリホスファターゼを添加し、この反応混合物を37℃で15分間インキュベートした。反応は、溶液を氷の上に置いて終了させた。
【００９４】
洗浄剤とそれ以外の汚染物を除去するため、反応生成物を、TopTip（Glygen Corp社）アニオン交換スピンカラムを通過させた後、SIMモードのAgilent Q-TOF 6530装置に装填してLC-MSによってフラグメントを分析し、M/z 1518.7、1383.3、1345.8、1320.5をモニタした。図5に、エキソヌクレアーゼIで消化した後のそれぞれの5'-フラップのフラグメントの単一イオンモニタリングクロマトグラム（SIM）を示す。予想質量が以下に示す配列を有するプローブのフラグメントに対応する4つの明確なピークが、反応消化物で観察された：
エキソン28_ ACCACCACC<プロパン1,3ジオールスペーサ>C（M/z 1518.7、第2の帯電状態）
L858R_ TTCTTCTT<プロパン1,3ジオールスペーサ>C（M/z 1383.3、第2の帯電状態）
エキソン19欠失_GGGAGGG<プロパン1,3ジオールスペーサ>G（M/z 1345.8、第2の帯電状態）
T790M_GGTGGAG<プロパン1,3ジオールスペーサ>T（M/z 1320.5、第2の帯電状態）。
【００９５】
これらのピークは、対応する標的が存在しているときだけ観察された。標的なしの対照はピークを示さなかった（データは示さず）。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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