(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
内部流体回路を含む流体チップであって、その内部流体回路を介して、反応物の少なくとも１つがビーズである様々な反応物が、遠心力を使って移動され得る、流体チップにおいてビーズを分離する方法であって、前記流体チップは、前記流体回路に対して可変の方向を有する遠心力を提供することができる遠心機に配置されており、前記方法は、
ａ）少なくとも、密度ｍ１を有する第１のセットのビーズ（８ａ）及び密度ｍ２を有する第２のセットのビーズ（８ｂ）を、前記流体回路のセクション（７、１５、１８）において提供する工程であって、前記セクションは少なくとも第１の出口（１６、１３、１７）及び粒子保持エレメント（１９）を含む工程と、
ｂ）第１の液体媒体を前記セクションにおいて提供する工程であって、前記液体媒体は、ｍ１＜ｄ３＜ｍ２であるように密度ｄ３を有する工程と、
ｃ）前記第１のセットのビーズ（８ａ）及び前記第２のセットのビーズ（８ｂ）が前記セクション内で反対方向に遊走するように、遠心力（Ｇ）を加える工程であって、
前記第２のセットのビーズ（８ｂ）が前記粒子保持エレメント（１９）に向かって遊走し、前記粒子保持エレメント上に前記第２のセットのビーズの層を形成する工程、と
を含み、前記方法は、
ｄ）第２の液体媒体を前記セクションにおいて提供する工程であって、前記第２の液体媒体は、密度ｄ４＜ｍ１、ｍ２を有する工程と、前記第１のセットのビーズ（８ａ）が前記第２のセットのビーズ（８ｂ）に向かって遊走し、前記第１のセットのビーズ及び前記第２のセットのビーズの隣接層における積層をもたらすように遠心力（Ｇ）を加える工程、又は、
ｅ）前記セクションにおいて提供される前記第１の液体媒体が、前記粒子保持エレメントを介して流れて、前記第１のセットのビーズ及び前記第２のセットのビーズの隣接層における積層を得るように遠心力（Ｇ）を加える工程
を含む、方法。
【請求項２】
工程ｄ）を含み、工程ａ）において、密度ｍ３＜ｄ３、ｄ４を有する第３のセットのビーズ（８ｃ）を提供する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ｆ）第３の液体媒体を前記セクションにおいて提供する工程であって、前記第３の液体媒体は、密度ｄ５＜ｍ１、ｍ２、ｍ３を有する工程と、
ｇ）前記第３のセットのビーズ（８ｃ）が前記第１のセットのビーズ（８ａ）に向かって遊走し、前記第１のセットのビーズ及び前記第３のセットのビーズの隣接層における積層をもたらすように遠心力（Ｇ）を加える工程と
を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記セクションにおいて提供される第２の液体媒体が、粒子保持エレメントを介して流れて、前記第１のセットのビーズ（８ａ）及び第３のセットのビーズ（８ｃ）の隣接層における積層を得るように遠心力（Ｇ）を加える工程
を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記セクションが、分離セクション及び積層セクションを含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記積層セクションが、第１の終端で前記分離セクションに接続され、第２の終端で粒子保持エレメントを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
工程ｃ）が前記分離セクションにおいて行われる、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】
前記第２のセットのビーズ（８ｂ）における前記ビーズが、シリカビーズである、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
粒子保持エレメントがフィルタである、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記反応物が、１つ又は複数の分析物を含有する試料を含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、液体を処理及び移動させるために遠心力を利用する流体装置の分野に関し、より詳しくは、このような装置においてビーズを分離する方法に関する。好ましい使用分野は、試料中に存在する化合物の分析を行う分析方法の範囲内にある。分離方法は、流体又はマイクロ流体の処理が生じる分析装置（ラボチップ）を、遠心機と、好ましくは分析装置の配向を加える遠心力の方向に対して変えるための遠心力提供手段と関連付けて用いる場合に有利に用いられる。
【背景技術】
【０００２】
本発明の分離方法は、流体又はマイクロ流体チップ又はカートリッジにおいて用いるのに適する分析方法に関して調査する間に考え出された。本発明の利点をよりよく理解するために、このような分析方法を下記に詳しく記載する。
【０００３】
ある種の物質又は分析物を分析する一般的な方法は、標的物質又は分析物（典型的にはバイオマーカーである）に選択的に結合する固相の使用を伴う。いくつかのアッセイでは、固相は、その表面上に、バイオマーカーに特異的に結合する特異的な捕獲分子を保有し、表示し得る。前記バイオマーカーを検出し、定量するために、固相−バイオマーカー複合体は、１つ又は複数のトレーサー物質に付着している別のセットのバイオマーカー特異的結合分子とも反応し、固相−バイオマーカー−トレーサー複合体を形成し得る。競合的免疫アッセイ等の他のアッセイでは、試料中のバイオマーカーは、固相に対する結合において、トレーサー物質を保有する規定量のバイオマーカーと競合する。様々なタイプの固相材料及びトレーサー物質を含めた、関与する特異的なバインダー及び標的分析物を配置し、使用する方法は多数存在する。
【０００４】
多くの分析系では、固相は、空洞（マイクロタイタープレートのウェル若しくはマイクロチャネル及びマイクロキャビティ）の壁等の固定された統合体（ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）、又は支柱（ｐｉｌｌａｒ）若しくは多孔性膜等の固定された構造体を含み、その上に、抗原等のバイオマーカーに対して相補的である、抗体等の捕獲分子が付着している。標的のバイオマーカーを含有する試料の、多孔性膜を介した、外側の、又は横行する流れは、標的のバイオマーカーの結合に関して言えば、好ましい固相の概念である。これは、これらの膜の表面対体積比は非常に大きく、大過剰の捕獲分子（抗体等）を許容し、ゆえに標的のバイオマーカーが非常に効率的に結合するという事実のためである。しかし、これらの膜は、トレーサーがナノ粒子又はナノ粒子の凝集物である場合は特に、洗浄するのが困難である。この困難は、膜内のポケット様構造体におけるトレーサー物質の非特異的結合又は捕捉によって生じる。
【０００５】
他の分析系では、固相は、広い表面積を曝すポリマー材料において作成される、球形のナノサイズ又はマイクロサイズの粒子であり得るのが有利である。
【０００６】
トレーサーは、光学的、化学的、電気的、磁気的、放射性の手段又はこれらの組合せのいずれかにより検出し、測定することができるあらゆるタイプの物質であってよい。更に、トレーサー物質はまた、粒子として配合されても、又は粒子と会合していてもよい。光学的手段によって頻繁に用いられ、検出されるような粒子には、金属コロイド（金、銀、鉄等）、量子ドット、色素若しくは蛍光色素を含有若しくは担持するポリマー（ラテックス）粒子、ポリマー、シリカ、又はアップコンバージョンナノ粒子（ＵＣＮＰ）等の酵素若しくは無機結晶を含むシグナル産生分子を保有する他の粒子が含まれる。トレーサー物質又はキャリアとして用いる粒子は通常ナノメートル範囲、典型的には２ｎｍから２００ｎｍの間であるが、設定によっては最大１００μｍの大型粒子が用いられることもある。固相及びトレーサー物質にそれぞれ付着するバイオマーカー特異的分子は、例えば、標的のバイオマーカーに特異的に結合する抗体であってよく、バイオマーカーはその場合、抗原を指す。抗体の代わりに頻繁に用いられる代替には、核酸プローブ、アビジン／ストレプトアビジン、レクチン、及びアプタマー、並びにリガンド（即ち、分析物、又は分析物の一部）の規定された分子構造体を認識し、特異的に結合するあらゆる（バイオ）受容体が含まれる。実際、自然界内にある全タンパク質の大部分は、規定された構造の大型分子又は小型分子であり得る、いくつかのリガンドと多かれ少なかれ特異的に相互作用する。通常、結合の特異性が高く、親和性が高いほど、受容体のリガンド系は分析アッセイのデザインに適する。固相−バイオマーカー−トレーサー物質複合体（以下では、定量化可能なビーズ複合体とも呼ぶ）を定量するには、トレーサー物質は、同定及び測定を可能にするある種の性質を表さなければならない。光学読取り系は、検出器をアッセイ装置の外側に配置することができるため、特に便利であることが多い。光学的トレーサー物質の性質には、光吸収、透過若しくは反射により測定される光散乱及び光回折、並びに化学発光等の発光現象、蛍光、アップコンバージョン燐光、並びにこれらの組合せを含むその他が含まれる。色、蛍光及び燐光等の発光、回折、プラズモン効果等を測定する場合の現象に言及するのが典型的である。
【０００７】
最も不均一なタイプの分析アッセイでは、標的のバイオマーカーを最初に、過剰のトレーサー物質及び固相と反応させる。そして、固相に特異的に結合していないトレーサー物質を洗浄によって除去する。
【０００８】
標的のバイオマーカーを固相及びトレーサー物質にそれぞれ結合させるには、これらが直接、相互作用しなければならない。高親和性のバインダーでは、反応物、即ちバイオマーカー、固相、及びトレーサー物質の相互作用又は衝突が頻繁であるほど、結合反応は速い。よって、高速のアッセイを得るために、高親和性で特異的な結合物質の局所濃度が非常に高い反応条件を確立しなければならない。このような条件を確立するには、固相は、特異的な高親和性の受容体分子で混み合った広い表面積を曝さなければならない。同様に、第２セットの特異的で高親和性の受容体分子を保有するトレーサー物質は、高濃度で存在しなければならない。ナノ粒子及びマイクロ粒子の懸濁液は、多孔性膜等の多孔性構造体同様、大きな表面対体積比を曝す。関与する反応物間の衝突を更に促進する流体運動を適用しなければならない。このような運動は、中等度の加熱及び撹拌によって得ることができるが、非競合的アッセイの場合はトレーサー物質を含む試料及び試薬を、固相を通過させる／固相を介して流すのがより好ましい。多孔性膜、マイクロチャネル、マイクロピラー（ｍｉｃｒｏ−ｐｉｌｌａｒ）構造体、又は積層（ｓｔａｃｋｅｄ）粒子等の固相材料を介して流れる液体が、ゆえに効率的な結合アッセイをデザインする上で好ましい。
【０００９】
先の段落において論じたのと同じ考察が、不均一な競合的アッセイにおいて等しく適用される。このようなアッセイでは、固相が、結合しており、標識されているバイオマーカーで混み合っている広い表面積を曝している。
【００１０】
いくつかの理由で、球状のマイクロ粒子及びナノ粒子が固相材料としてしばしば好まれる：
−  粒子は、非常に大きな表面対体積比を有する。
−  粒子は、バッチにおいて効率的に官能化され、ゆえに均一な懸濁液を形成するように混合することができる。
−  粒子の懸濁液は、直接液体形態で用いることができるようにアリコートに分配することができ、又は錠剤若しくは凍結乾燥した球等、乾燥したアリコートとして配合することができる。
−  粒子は、粒子に明確な特徴を付与する材料が投入されていても、又は明確な特徴を付与する材料から作られていてもよい。これには、光吸収、光散乱、光放射（発光）等の明確な光学的特徴、並びに磁性、放射能、触媒／酵素、電気化学的、及びその他の測定可能な特徴が含まれる。
−  粒子は、懸濁液中にある場合、マイクロ流体系内に運搬され得る。
−  粒子は、溶液中の試料と効率的に混合することができる。
−  懸濁液中の粒子は、重力、遠心分離、ろ過、磁力（磁性粒子）、若しくは電気力、又はこれらの組合せによって溶液から分離することができる。
−  粒子は、粒子を分散させた媒体に対する密度に応じて、沈降し、懸濁液中に留まり、又は浮遊し得る。
−  粒子は、単分散にすることができ、多孔性、又は孔のない滑らかな固体表面を有する両方の完全な球体にすることができる。
−  粒子は、カラムを含めた様々な容器中に充填しても、又は積層させてもよい。
−  粒子は、不透明（着色）でも、又は実質的に透明で様々な光学ベースの測定系における互換性及び使用を許容してもよい。
−  緻密な単分散粒子をカラム等におけるフィルタ上に積層する場合、これらは規則的で規定された間隔を有する多孔性の格子構造体を形成し得る。液体は、このようなカラムを介して、制御され、再現性のよい様式で流れることができる。
【００１１】
分析物を、非競合的アッセイの場合は任意選択によりトレーサー物質を、固相粒子の表面に付着している固定化した捕獲分子と相互作用させる最も効率的な方法は、カラム形態のフィルタ又はスリット上に粒子を充填し、分析物を含有する溶液、及び／又はトレーサー物質等の試薬を、粒子のカラムを通過させることである。これは、逐次的に、反復性の工程において行うことができ、又は１工程において分析物及びトレーサー物質両方の混合物をアプライし、これらを通過させることによって行うことができる。
【００１２】
反応又は結合工程後、溶液を固相から分離し、固相を洗浄して、残存する過剰のトレーサー物質を除去し、非結合の分析物を標識（競合的アッセイ同様）する等して、一貫した、正確な分析を得る。
【００１３】
ビーズと様々なトレーサー物質及び／又は分析物との間の効率的な相互作用を得るためのビーズカラムの使用は、マイクロ流体チップを用いた分析方法から知られている。
【００１４】
ＵＳ  ２００９／０１０４０７７Ａ１は、マイクロ流体チップにおいてＥＬＩＳＡアッセイ（酵素結合免疫吸着検定法）を行うための方法を開示している。開示されているマイクロ流体チップは、固相として働くビーズで満たされたカラム構造体を含む流体回路を有する。ＥＬＩＳＡタイプの反応を、ビーズ−バイオマーカー−酵素標識した抗体複合体を最初に形成させることにより、カラム構造体におけるビーズ上で行う。次いで、遠心力を加えることによって、カラムを介して洗浄液を流すことにより、過剰の酵素標識した抗体を除去する。前記方法の重要な特徴は、洗浄工程の改善を得るために、複数回カラムを介して同じ洗浄流体を循環させる能力である。清浄又は洗浄工程後、色素産生物質を、酵素標識した複合体にアプライし、産生された色素を、例えば、カラム構造体で測定してもよい。カラム構造体の少なくとも一端は、制限された通路で終わり、固相ビーズがカラムから通過して出るのが妨げられる。
【００１５】
ＷＯ  ２０１１／０８１５３０Ａ１は、試験試料、例えば全血等の生物学的試料を分析するための処理カートリッジ（即ち、流体又はマイクロ流体チップ）を開示している。カートリッジは、遠心分析装置において用いるように適合されている。カートリッジは、トラップと記載される特定の流体回路エレメントを含むことができる。このようなエレメントを用いて固相粒子（ビーズ）のカラムを形成し、この場合、粒子は保持され得るが、流体はカラムを通過する。加える遠心力の方向をカートリッジに対して好適に変えることにより、固相粒子と反応する様々な反応物（例えば、バイオマーカー及びトレーサー物質）を含有する流体が、繰り返しカラムを通過する。粒子又はビーズのカラムを得るために、トラップのデザインにより、フィルタの、又は狭い流体通路の使用が回避される。粒子を繰り返し洗浄することにより、過剰の試薬が除去される。トラップ及びその使用の記載、並びに流体回路を有するマイクロ流体チップであって、流体回路を介して、分析物を含む試料、並びに様々な任意選択の試薬及び溶媒が、遠心力を使って移動することができる、マイクロ流体チップの概念は、参照により本明細書に援用される。
【００１６】
他のアッセイ系では、強磁性粒子が、洗浄又は分離工程を促進するための固相として用いられる。次いで、磁石を一時的に用いて粒子を反応容器の壁の１つに対して引っ張り、液体から分離する間、これらを引き留める。反応容器を磁石から離すと、粒子は溶液中に自由に再懸濁される。しかし、磁性粒子は、強磁性材料を含むため光学的に密であり、ゆえに光学的な読取りを大幅に消光する。このため、強磁性粒子は、アッセイを通して粒子に結合しているトレーサー標識と組み合わせて用いるのには適さない。
【００１７】
バイオマーカーの分析等、試料分析の技術分野では、アッセイにおいて静止性の（ｓｔａｔｉｏｎａｒｙ）固相及び移動性の固相両方の使用が知られている。本発明はとりわけ、その流体回路を介して、分析物を含む試料、並びに様々な任意選択の試薬及び溶媒が、遠心力を使って移動することができる流体回路を有するマイクロ流体チップ（即ち、処理カートリッジ）におけるこのようなアッセイの使用に関する。このようなマイクロ流体チップは、例えば、Ｓｃｈｕｌｔｚら、Ｃｌｉｎ．  Ｃｈｅｍ．、１９８５年、３１巻、１４５７頁、米国特許第４８８７６３号、並びに上記に言及した特許出願であるＵＳ  ２００９／０１０４０７７Ａ１及びＷＯ  ２０１１／０８１５３０Ａ１に開示されている。
【００１８】
不均一なタイプの分析アッセイでは、過剰の非結合のトレーサー物質を、固相に結合しているトレーサー物質から効率的で再現性よく分離（洗浄）することが、信頼できる分析結果に不可欠である。高感度の分析では、効率的な洗浄が特に重要である。
【００１９】
多孔性膜等の多孔性構造体を有する固相は、ウェル壁、マイクロピラー、又は球状粒子上で利用できるもの等の滑らかな表面を有する固相よりも、効率的に洗浄するのが困難である。しかし、カラム中に緊密に充填された球状粒子（例えば、ビーズ）を含む固相は、効率的で再現性のよい洗浄に関して、多孔性膜が遭遇するのと同じ困難をいくつか経験する。充填カラム中のビーズの緊密な相互作用により一時的な多孔性構造体がもたらされ（即ち、ビーズ間に形成された空隙のため）、この多孔性構造体内で非結合のトレーサー物質（即ち、固相に結合していないトレーサー物質）が非特異的に、容易に捕獲される。従来技術では、このようなカラムは、洗浄液を、カラムを通過させることによって洗浄される。しかし、このような洗浄を複数回繰り返しても（ＵＳ  ２００９／０１０４０７７Ａ１の開示を参照されたい）、非結合のトレーサー物質の少なくともいくらかが多孔性構造体に捕獲されたままであり、引き続きアッセイの再現性及び感度に対して負の影響がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２０】
【特許文献１】ＵＳ  ２００９／０１０４０７７Ａ１
【特許文献２】ＷＯ  ２０１１／０８１５３０Ａ１
【特許文献３】米国特許第４８８７６３号
【非特許文献】
【００２１】
【非特許文献１】Ｓｃｈｕｌｔｚら、Ｃｌｉｎ．  Ｃｈｅｍ．、１９８５年、３１巻、１４５７頁
【非特許文献２】Ｓ．  Ｚｅｎｇら；「Ａ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｎ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ  ｇｏｌｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  ｂｉｏｓｅｎｓｉｎｇ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．」Ｐｌａｓｍｏｎｉｃｓ、６巻（３）：４９１〜５０６頁
【非特許文献３】Ｃｈｅｎｇら、Ｎａｎｏｓｃａｌｅ、２０１３年、５巻、２３頁
【非特許文献４】Ａｎｇら、Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ、２０１１年、６巻、１２７３頁
【非特許文献５】Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（登録商標）Ｈａｎｄｂｏｏｋ−Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２２】
本発明は、異なる密度のビーズを分離する方法に関する。不均一な分析アッセイにおいて用いる場合、方法は、例えば、逐次的に、又は平行して、同じ試料から複数の分析物を分析する可能性を提供し得る。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
本発明は、流体又はマイクロ流体チップにおいて同じ試料から複数の分析物を分析することを可能にするビーズを分離する方法を提供する。方法は、添付の特許請求の範囲により、及び以下に規定するものである。
【００２４】
本発明は、内部流体回路を含む流体チップであって、内部流体回路を介して、反応物の少なくとも１つがビーズである様々な反応物が、遠心力を使って移動することができる、流体チップにおいてビーズを分離する方法であって、
ａ）少なくとも、密度ｍ１を有する第１のセットのビーズ及び密度ｍ２を有する第２のセットのビーズを、流体回路のセクションにおいて提供する工程であって、セクションは少なくとも第１の出口を含む工程と、
ｂ）第１の液体媒体をセクションにおいて提供する工程であって、液体媒体は、ｍ１＜ｄ３＜ｍ２であるように密度ｄ３を有する工程と、
ｃ）第１のセットのビーズ及び第２のセットのビーズがセクション内で反対方向に遊走するように、第１の遠心力を加える工程と
を含む、方法を提供する。
【００２５】
本発明による方法の一実施形態において、第２のセットのビーズは、任意選択により、セクションに対する方向が第１の遠心力と異なる第２の遠心力を加えた後、セクションに配置される粒子保持エレメントに向かって遊走し、粒子保持エレメント上に第２のセットのビーズの層を形成する。
【００２６】
更なる一実施形態において、本発明による方法は、
ｄ）第２の液体媒体をセクションにおいて提供する工程であって、第２の液体媒体は、密度ｄ４＜ｍ１、ｍ２を有する工程と、
ｅ）第１のセットのビーズが第２のセットのビーズに向かって遊走し、第１のセットのビーズ及び第２のセットのビーズの隣接層における積層をもたらすように遠心力を加える工程と
を含む。
【００２７】
本発明による方法の更なる一実施形態において、工程ａ）において、密度ｍ３＜ｄ３、ｄ４を有する第３のセットのビーズを提供する。
【００２８】
更なる一実施形態において、本発明による方法は、
ｆ）第３の液体媒体をセクションにおいて提供する工程であって、第３の液体媒体は、密度ｄ５＜ｍ１、ｍ２、ｍ３を有する工程と、
ｇ）第３のセットのビーズが第１のセットのビーズに向かって遊走し、第１のセットのビーズ及び第３のセットのビーズの隣接層における積層をもたらすように遠心力を加える工程と
を含む。
【００２９】
第１のセットのビーズが第２のセットのビーズに向かって遊走した後、第３の液体媒体を提供する。
【００３０】
更なる一実施形態において、本発明による方法は、
セクションにおいて提供する液体媒体が、粒子保持エレメントを介して流れて、第１のセットのビーズ及び第２のセットのビーズ又は第１のセットのビーズ及び第３のセットのビーズの隣接層における積層を得るように遠心力を加える工程
を含む。
【００３１】
本発明による方法の更なる一実施形態において、第１のセットのビーズは、セクションの第１の出口に向かって遊走する。
【００３２】
更なる一実施形態において、本発明による方法は、
好ましくは第１のセットのビーズが第１の出口を介してデカントされるように、第１のセットのビーズを、遠心力の方向を変えることによってセクションの外へ移送し、第２のセットのビーズは前記セクションに留まる工程
を含む。
【００３３】
本発明による方法の更なる一実施形態において、セクションは第２の出口を含み、方法は、
第１のセットのビーズが第１の出口を介して移送され、第２のセットのビーズが第２の出口を介して移送されるように、遠心力の方向を変える工程
を含む。
【００３４】
更なる一実施形態において、本発明による方法は、
第２の液体媒体をセクションに提供する工程であって、液体媒体は密度ｄ４＞ｍ２を有する工程と、
第２のセットのビーズが、遠心力の方向と反対の方向に遊走するように、遠心力を加える工程と
を含む。
【００３５】
更なる一実施形態において、本発明による方法は、
好ましくは第２のセットのビーズが第１の出口を介してデカントされるように、第２のセットのビーズを、遠心力の方向を変えることによって、セクションの外へ移送する工程
を含む。
【００３６】
本発明による方法の更なる一実施形態において、セクションは分離セクション及び積層セクションを含む。
【００３７】
本発明による方法の更なる一実施形態において、積層セクションは、第１の終端で分離セクションに接続され、第２の終端で粒子保持エレメントを含む。
【００３８】
本発明による方法の更なる一実施形態において、工程ｃ）は分離セクションにおいて行われる。
【００３９】
本発明による方法の更なる一実施形態において、セクションに対する第２の遠心力の方向は、第１の遠心力の方向と異なる。
【００４０】
本発明による方法の更なる一実施形態において、流体チップはマイクロ流体チップである。
【００４１】
本発明による方法の更なる一実施形態において、流体チップは、セクションに対して可変の方向を有する遠心力を提供することができる遠心機に配置されている。
【００４２】
本発明による方法の更なる一実施形態において、第２のセットのビーズにおけるビーズは、シリカビーズ、好ましくは不活性なシリカビーズである。不活性なシリカビーズは、流体回路中に存在する他の反応物又はビーズとカップリングせず、又は複合体を形成しない。
【００４３】
本発明による方法の更なる一実施形態において、粒子保持エレメントはフィルタである。流体回路（適切なろ過材料で任意選択により満たされている）におけるベンド等、他のタイプの粒子保持エレメントも用いることができる。
【００４４】
本発明による方法の更なる一実施形態において、反応物は、１つ又は複数の分析物を含有する試料を含む。
【００４５】
２セット（又はそれ以上）のビーズが完全又は部分的に混合される、本発明の別の一実施形態において、それぞれ密度ｍ１及びｍ２を有するビーズセットを、密度ｄ３（第１の工程ではｍ１＜ｄ３＜ｍ２）の液体中、遠心力（又は重力）によって分離し、次いで、２セット（又はそれ以上）のビーズを、密度ｄ３の液体をフィルタ等の適切な粒子保持手段を介して排出する、及び／又は液体の密度をｄ３からｄ４（ｍ１＜ｍ２＜ｄ４）に変更するのいずれかにより、相互の上部の（即ち、カラムにおける）別々の層に積層させてもよい。
【００４６】
第１、第２、及び第３の液体媒体をそのまま提供してもよく、或いは、セクション中にすでに存在する液体媒体に、高密度若しくは低密度の液体を添加することによって、又は高密度の固体を溶解することにより必要とされる密度を得てもよい。換言すると、ある密度の液体媒体を提供する場合、セクションに対する液体媒体の添加は必ずしも必要とされないが、セクション中にすでに存在する液体媒体の密度を変更することによって、ある密度の液体媒体を提供することができる。
【００４７】
全ての態様において、本発明の方法において用いる流体チップがマイクロ流体チップであるのが有利であり得る。しかし、場合により、ｍｌ範囲の体積用の流体チップが好ましいことがあることが想定される。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１ａ】本発明での使用に適する分析方法において用いる工程を示す模式図である。
【図１ｂ】本発明での使用に適する分析方法において用いる工程を示す模式図である。
【図１ｃ】本発明での使用に適する分析方法において用いる工程を示す模式図である。
【図１ｄ】本発明での使用に適する分析方法において用いる工程を示す模式図である。
【図１ｅ】本発明での使用に適する分析方法において用いる工程を示す模式図である。
【図１ｆ】本発明での使用に適する分析方法において用いる工程を示す模式図である。
【図１ｇ】本発明での使用に適する分析方法において用いる工程を示す模式図である。
【図１ｈ】本発明での使用に適する分析方法において用いる工程を示す模式図である。
【図１ｉ】本発明での使用に適する分析方法において用いる工程を示す模式図である。
【図１ｊ】本発明での使用に適する分析方法において用いる工程を示す模式図である。
【図１ｋ】本発明での使用に適する分析方法において用いる工程を示す模式図である。
【図１ｌ】マイクロ流体回路中、ビーズを移動させるための本発明の概念を示す模式図である。この概念を、本発明による方法と組み合わせるのが有利であり得る。
【図１ｍ】マイクロ流体回路中、ビーズを移動させるための本発明の概念を示す模式図である。この概念を、本発明による方法と組み合わせるのが有利であり得る。
【図１ｎ】マイクロ流体回路中、ビーズを移動させるための本発明の概念を示す模式図である。この概念を、本発明による方法と組み合わせるのが有利であり得る。
【図１ｏ】マイクロ流体回路中、ビーズを移動させるための本発明の概念を示す模式図である。この概念を、本発明による方法と組み合わせるのが有利であり得る。
【図１ｐ】マイクロ流体回路中、ビーズを移動させるための本発明の概念を示す模式図である。この概念を、本発明による方法と組み合わせるのが有利であり得る。
【図２ａ】本発明の第１の実施形態を示す模式図である。
【図２ｂ】本発明の第１の実施形態を示す模式図である。
【図３ａ】本発明の第２の実施形態を示す模式図である。
【図３ｂ】本発明の第２の実施形態を示す模式図である。
【図３ｃ】本発明の第２の実施形態を示す模式図である。
【図３ｄ】本発明の第２の実施形態を示す模式図である。
【図３ｅ】本発明の第２の実施形態を示す模式図である。
【図３ｆ】本発明の第２の実施形態を示す模式図である。
【図３ｇ】本発明の第２の実施形態を示す模式図である。
【図３ｈ】本発明の第２の実施形態を示す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００４９】
語の定義
本出願において、「流体チップ」の語は、内部流体回路を含む、あらゆるタイプのチップ又はカートリッジであって、内部流体回路を介して、ビーズ、及び少なくとも１つの分析物を含有する試料を含む様々な反応物が、遠心力を使って移動することができる、チップ又はカートリッジを包含するものとされる。流体回路において様々な反応物が、液体媒体と一緒に、及び／又は液体媒体内を移動することができる。
【００５０】
本発明の文脈における「分析物」の語は、本発明による方法において定量的又は定性的に決定することができるあらゆる化合物を網羅するものと理解されたい。特に、「分析物」の語は、生物体、好ましくはヒトの身体の特定の疾患状態又はいくつかの他の生理学的状態の指標として用いることができるあらゆる化合物（即ち、バイオマーカー）を包含するものとされる。バイオマーカーは、例えば、貧血に対するバイオマーカー、例えば、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、フェリチン、可溶性トランスフェリン受容体（ｓＴｒＲ）、葉酸（フォレート）、トランスフェリン、ヘモグロビン、ビタミンＢ１２、骨疾患に対するバイオマーカー、例えば、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、オステオカルシン、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、骨特異的アルカリホスファターゼ（ＢＳＡＰ）、ビタミンＤ、１，２５ジヒドロキシ、Ｉ型コラーゲンＣ−末端テロペプチド（ＣＴｘ）、ビタミンＤ、２５ヒドロキシ、Ｉ型コラーゲンＮ−末端テロペプチド（ＮＴｘ）、心疾患に対するバイオマーカー、例えば、アポリポタンパク質Ｅ（Ａｐｏ  Ｅ）、脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）、ＬＤＨ、ＣＫ、ＣＫＭＢ、プロＢ型ナトリウム利尿ペプチド（Ｐｒｏ−ＢＮＰ）、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、トロポニンＩ、トロポニンＴ、ＣＲＰｈ（超高感度）、糖尿病に対するバイオマーカー、例えば、Ｃ−ペプチド、ＨｂＡ１ｃ、ＩＡ−２抗体、インスリン、フルクトサミン、インスリン成長因子（ＩＧＦ−１）、グルカゴン、ミクロアルブミン、グルコース、プロインスリン、抗体、内分泌科に関するバイオマーカー、例えば、アルファ−フェトプロテイン、成長ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、成長ホルモン放出因子（ＧＲＦ）、コルチコステロン、プロラクチン、コルチゾール、テストステロン、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、胃腸科に関するバイオマーカー、例えば、ガストリン、リパーゼ、感染症に関するバイオマーカー、例えば、抗ボレリア、抗風疹、抗ＨＢｓ、抗ＨＢｃ、抗ＨＢｅ、抗ＨＣＶ、抗ＨＩＶ  Ｉ／ＩＩ、並びに感染物質に対する他の抗体、及び感染物質の一部である特異的抗原、例えば、ＨＩＶ−ｐ２４、ＨＢｓＡｇ等、炎症／免疫に関するバイオマーカー、例えば、免疫グロブリン（ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、及びこれらのサブクラス）、クラステリン（アポリポタンパク質Ｊ）、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、ＣＲＰｈ（超高感度）、プロカルシトニン（ＰＣＴ）、ヘパリン結合タンパク質（ＨＰＢ）、カルプロテクチン、ヒト好中球リポカリン／好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ＨＮＬ／ＮＧＡＬ）、エンドセリン−１、フィブリノゲン、グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（Ｇ−６−ＰＤＨ）、ＩＦＮγによって誘発されるモノカイン（ＭＩＧ／ＣＸＣＬ９）、ＩＦＮ−アルファ、ネオプテリン、ＩＦＮγ（ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１０）−４−ｐｌｅｘ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１０（ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＦＮγ）−４−ｐｌｅｘ、ＩＬ−１β、Ｒａｎｔｅｓ／ＣＣＬ５、ＩＬ−２（ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＦＮγ）−４−ｐｌｅｘ、ＩＬ−４（ＩＬ−２、ＩＬ−１０、ＩＦＮγ）−４−ｐｌｅｘ、腫瘍成長因子（ＴＧＦ−β１）、ＩＬ−６、腫瘍壊死因子（ＴＮＦα）、ＩＬ−８、脂質代謝に関するバイオマーカー、例えば、アポリポタンパク質ＡＩ（Ａｐｏ  ＡＩ）、コレステロール、アポリポタンパク質ＡＩＩ（Ａｐｏ  ＡＩＩ）、ＨＤＬ−コレステロール、アポリポタンパク質Ｂ−１００（Ａｐｏ  Ｂ）、ＬＤＬ−コレステロール、アポリポタンパク質Ｂ４８（Ａｐｏ  Ｂ４８）、レシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）、アポリポタンパク質ＣＩＩ（Ａｐｏ  ＣＩＩ）、パラキソナーゼ（ＰＯＮ１）、アポリポタンパク質ＣＩＩＩ（Ａｐｏ  ＣＩＩＩ）、ホスファチジルイノシトールグリカンＦ（ＰＩＧＦ）、アポリポタンパク質Ｅ（Ａｐｏ  Ｅ）、トリグリセリド、腎臓学に関するバイオマーカー、例えば、アルファ−ＧＳＴ、ベータ−２−ミクログロブリン（血清）、ミクロアルブミン、ベータ−２−ミクログロブリン（尿）システインＣ、クレアチニン、腫瘍学に関するバイオマーカー、例えば、炭水化物抗原１９−９（ＣＡ１９−９）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、癌胎児抗原（ＣＥＡ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦｂ）、並びに甲状腺の状態に関するバイオマーカー、例えば、抗甲状腺ペルオキシダーゼＡｂ（ＴＰＯ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、抗サイログロブリンＡｂ、総チロキシン（Ｔ４）、遊離チロキシン（ＦＴ４）、総トリヨードチロニン（Ｔ３）、遊離トリヨードチロニン（ＦＴ３）、ＴＳＨ受容体Ａｂ、及びサイログロブリンであってよい。
【００５１】
「トレーサー物質」の語は、対象の分析物（例えば、バイオマーカー）又はビーズ（ビーズの語は下記に定義する）に結合することができ、分析化学／生物学の技術分野では一般的なあらゆる適切な技術によってこれらを定量化可能又は同定可能にする性質を表すことができるあらゆる物質を包含するものとされる（即ち、これらは光学的、磁気的、電気的、又は放射能により検出され得る）。とりわけ興味を引く性質は、光学的な検出を可能にする性質であり、例えば、トレーサー物質は発色団等の光を吸収及び／若しくは散乱し得、又は蛍光若しくは燐光等の発光の性質を表し得、或いはトレーサー物質は、直接光学的に検出可能ではないが更なる物質と反応して光学的に検出可能な反応生成物をもたらすことができる。対象の分析物（例えば、バイオマーカー）、又はビーズに結合するのに適するトレーサー物質の結合部分は、例えば、タンパク質、核酸、炭水化物、及びキレート化合物を含む。特異的な結合部分には、抗体、抗原、核酸プローブ、又は他の生体特異的な受容体リガンド系が含まれる。
【００５２】
本方法において用いるのに適するトレーサー物質の例には、ナノ粒子、好ましくは金属ベースのナノ粒子、及び酵素を含むものが含まれる。トレーサー物質のナノ粒子は、直径３から１００ｎｍが典型的である。好ましいナノ粒子には、金属ベースの粒子、例えば、金（ρ＝１９．３ｇ／ｃｍ３）、銀（ρ＝１０．５ｇ／ｃｍ３）、又は鉄（ρ＝７．９ｇ／ｃｍ３）のコロイド、及び無機結晶、例えば、アップコンバージョンナノ粒子（ＵＣＮＰ；ρ４から５ｇ／ｃｍ３が典型的）が含まれる。
【００５３】
金属ベースのナノ粒子のトレーサー物質としての使用はよく知られており、金ナノ粒子の総説には、例えば、Ｓ．  Ｚｅｎｇら；「Ａ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｎ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ  ｇｏｌｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  ｂｉｏｓｅｎｓｉｎｇ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．」Ｐｌａｓｍｏｎｉｃｓ、６巻（３）：４９１〜５０６頁を参照されたい。
【００５４】
本方法において用いるのに適するＵＣＮＰの総説には、例えば、Ｃｈｅｎｇら、Ｎａｎｏｓｃａｌｅ、２０１３年、５巻、２３頁、及びＡｎｇら、Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ、２０１１年、６巻、１２７３頁を参照されたい。
【００５５】
フルオロフォアのトレーサー物質としての使用は、例えば、Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（登録商標）Ｈａｎｄｂｏｏｋ−Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標）に包括的に言及されている。
【００５６】
それ自体光学的に検出可能ではない他の物質も、トレーサー物質として用いることができる。例えば、本方法を、ＥＬＩＳＡタイプのアッセイを行うために用いる場合、結果として生じたビーズ−分析物−トレーサー物質複合体の最終的な分析は、トレーサー物質の直接的な光学的検出によるものではなく、トレーサー物質上の酵素と適切な物質との間の反応からの反応生成物（着色又は蛍光又は電気化学的シグナルを提供する）によるものである。
【００５７】
適切なトレーサー物質を合成するための方法の例は従来技術に包括的に開示されており、本発明の方法に適するトレーサー物質を得る工程は、合成化学又は生化学の技術分野の技術者の知識の範囲内に十分ある。
【００５８】
「ビーズ」の語は、あらゆるタイプの固相粒子又はビーズを包含するものとされ、直径０．１から５０μｍ、０．５から５０μｍ、好ましくは直径２μｍから２０μｍを有する球状のマイクロ粒子又はサブマイクロ粒子が好ましい。これらの粒子は多孔性であっても、又は滑らかな固体表面を有してもよい。これらは密集していても、又は固体材料、液体、若しくは気体であり得るビーズ内の１つ若しくは複数の中央コア材料を取り囲む１つ若しくは複数のシェルを有していてもよい。ビーズは不透明でも、又は透明でもよい。ビーズが実質的に透明で、水の密度（ρ＝１．０ｇ／ｃｍ３）をわずかに上回る体積質量密度（ｖｏｌｕｍｅｔｒｉｃ  ｍａｓｓ  ｄｅｎｓｉｔｙ）（ρ）を有するポリマーから作られているのが好ましい。ビーズが、ポリスチレン（ρ＝１．０５ｇ／ｃｍ３）、ポリメチルメタクリレート（ρ＝１．１８ｇ／ｃｍ３）、又は他の適切な材料から作られるのが典型的である。本分離方法では、ビーズ（又は少なくとも１セットのビーズ）は、２．４〜２．８ｇ／ｃｍ３の範囲の大幅に高い密度を有し得るガラス（即ち、シリカビーズ）で作られているのが有利であり得る。更に、ビーズは、対象の分析物又はトレーサー物質に結合することができる、複数の共有結合性にカップリングしている分子構造体又は実体を含むことができる。このような分子構造体又は実体は、例えば、抗体又はそのフラグメント、核酸、アプタマー、キレート構造体、分析物の結合モチーフを表示する合成の分子構造体等であってよい。本開示において、ビーズは、競合的アッセイの場合、規定量の分析物−トレーサー物質単位（即ち、トレーサー物質に結合している分析物からなる単位）も含むことができる。「規定量」の語は、これに関して、ビーズが既知の分析結果又はシグナルを提供するように標準化されていることを意味するものとされる。規定量の分析物−トレーサー物質単位を最初に有するビーズを、試料からの競合性の分析物と相互作用させた後、分析し、分析結果を前記の既知の分析結果と比較することにより、分析物を決定／測定してもよい。
【００５９】
「定量化可能なビーズ複合体」の語は、本開示において、ビーズと分析物との間の、又はいくつかのアッセイではビーズとトレーサー物質との間の相互作用によって形成された複合体を意味するものとされる。後者は、ビーズ及び分析物がトレーサー物質に対する結合を競合する、１タイプの競合的アッセイにおいて形成される。一般に、複合体は、ビーズ、分析物、及びトレーサー物質を含む。アッセイのタイプに関係なく、定量化可能なビーズ複合体を定性的及び／又は定量的に分析することで、試料から決定しようとする分析物の間接的な定性的及び／又は定量的な分析がもたらされる。定量化可能なビーズ複合体の特定の構造体は、行うアッセイのタイプにしたがって異なる。例えば、非競合的アッセイでは、複合体は理想的にビーズを含み、この場合ビーズは少なくとも１つの分析物−トレーサー物質単位にのみ結合しているが、競合的アッセイでは、複合体は、分析物−トレーサー物質単位、及び試料から生じた、トレーサー物質がない分析物の両方に結合しているビーズを含み得る。単にアッセイのタイプに応じて、定量化可能なビーズ複合体の更なる変形も可能である。殆どのアッセイでは、定量化可能なビーズ複合体は、定量化可能なビーズ−分析物複合体（即ち、複合体は分析物に結合しているビーズを含む）とも呼ぶことができる。
【００６０】
「サンドイッチ複合体」の語は、本開示において、ビーズ、分析物、及びトレーサー物質を含む複合体を意味するものとされる。「サンドイッチ複合体」は、定量化可能なビーズ複合体であるのが典型的であるが、この語は競合的アッセイと関連して、上記に記載した規定量の分析物−トレーサー物質単位を含むビーズも意味することもできる。
【００６１】
ｄ、ｄ１、ｄ２等の語は、ｇ／ｃｍ３における所与の液体媒体の体積質量密度を意味するものとされる。
【００６２】
ｍ、ｍ１、ｍ２等の語は、ｇ／ｃｍ３における所与の固体材料の体積質量密度を意味するものとされる。
【００６３】
「液体媒体」の語は、行われる特定のアッセイにおいて用いるのに適するあらゆる液体を包含するものとされる。特定の液体媒体の特定のアッセイにおける適合性は、当業者には容易に理解される。更に、あらゆる液体の必要とされる体積質量密度は、液体中に溶解され、又は液体と混合される添加物によって変更し得る。これは、様々な物質、塩、液体、又は気体等、関与するあらゆるタイプの材料が適切に混合され、溶解されるのであれば、関与するあらゆるタイプの材料にあてはまる。密度の変更は、関与する物質の濃度及び相対密度に関連する。溶媒と異なる密度を有する溶解可能な化合物は全て、溶液／液体の密度に影響を及ぼす。海水は、新鮮な純水（１．００ｇ／ｃｍ３）より高密度（表面１．０２５ｇ／ｃｍ３）であるのが典型的である。特に密度勾配遠心法の分野では、水溶液の密度を変えるのに様々な物質が用いられる。これらには、水中に高濃度で容易に溶解する、ショ糖、ショ糖ポリマー、様々なコーティングされたコロイド、及び塩化セシウム等の物質、並びに様々なヨウ素含有物質、例えば、イオジキサノール、イオヘキソール、メトリザミド等が含まれる。
【００６４】
「反応物」の語は、本出願の文脈において、分析物、トレーサー物質、又はビーズ上の結合分子実体等、分析方法に存在する構成成分に対する一般用語とされる。
【００６５】
「乾燥配合物」の語は、アッセイを操作するために用いられる装置中に組み入れることができる、ビーズ及びナノ粒子の調製物を含めた試薬を意味する。これらの乾燥配合物は、真空乾燥により、又は凍結乾燥により作成され得る。凍結乾燥配合物は、サイズ１μＬ未満から２００μＬの間の均一な球形のアリコートとして調製される。これらはバルクで生成され、次いで１個ずつ分析装置中に分配され得る。
【００６６】
本発明と組み合わせて用いるのに適する分析方法の一般的原理
本発明は、流体又はマイクロ流体チップ又はカートリッジにおいて、異なる密度のビーズ又は固相粒子を分離するための単純な方法に関する。分離方法は、以下に記載するもの等の分析アッセイと組み合わせるのが有利であり得る。開示する分析方法では、第１の溶液中の反応物と、固相粒子の表面に付着している反応物との間の非常に効率的な相互作用を、第２の溶液を用いて固相粒子を懸濁液にすることにより、非常に効率的な固相粒子の洗浄と組み合わせる。
【００６７】
固相粒子は、マイクロサイズのビーズ又は球状粒子である。
【００６８】
反応物は、溶液中にあり、且つ固相粒子の表面に付着しているが、行うアッセイのタイプにしたがって変動する。
【００６９】
サンドイッチタイプの非競合的免疫アッセイでは、溶液中の反応物は、分析物（例えば、生物学的試料中に存在するいくつかのタイプのバイオマーカー）、及びトレーサー物質（例えば、特定のバイオマーカーに対して選択的な標識された抗体）である。前記反応物を混合した後で、固相粒子と相互作用させてもよく、即ち、同時に、若しくは予め形成された分析物−トレーサー物質単位としてアプライしてもよく、又は逐次的にアプライしてもよい（即ち、分析物を固相粒子に付着させた後、トレーサー物質をアプライする）。固相粒子の表面上の反応物は、分析物及び／又は分析物−トレーサー物質単位に結合することができる分子構造体（例えば、抗体）である。
【００７０】
競合的免疫アッセイでは、溶液中の反応物は、試料中に存在する分析物と、試料の分析物によってビーズから置き換えられている、ある量の分析物−トレーサー物質単位との混合物であってよい。固相粒子（即ち、ビーズ）の表面上の反応物は、試料中に存在する分析物に結合することができる分子実体又は構造体（例えば、抗体）を含み、この場合、分子構造体は分析物−トレーサー物質単位に最初から結合している。
【００７１】
効率的な相互作用を得るために、固相粒子は、カラム等の構造体中に緊密に充填されている。これは、アッセイ装置（例えば、流体又はマイクロ流体チップ）における流体回路のセクション又は空洞に固相粒子を保留することによって実現されるのが好ましい。セクション又は空洞は実質的にカラム形状であるのが有利であり得るが、他の形状又は形態も適切である。固相粒子が、流体回路のセクション又は空洞に配置されるフィルタエレメント等の粒子保持エレメントによって、空洞に保留されるのが好ましい。ＷＯ  ２０１１／０８１５３０Ａ１に開示されているトラップは、フィルタエレメントの使用を必要としない粒子保持エレメントを含む空洞を提供する代替の解決法である。
【００７２】
フィルタエレメントは、固相粒子の通過を許さない孔サイズ又はスリットサイズを有するようにデザインされ、又は選択される。フィルタエレメントと反対のカラムの側から、前記エレメントに向かって作用する遠心力を加えることにより、固相粒子カラム又は粒子懸濁液から液体溶液を除去する。この様式で、液体溶液を、強制的に固相粒子カラム及びフィルタ構造体を通過させる。
【００７３】
積層ビーズを介した流れは、カラムに対して遠心力の角度を変動させることにより、又は粒子保持エレメントの流動抵抗を変動させることにより、制御してもよい。
【００７４】
フィルタを介した液体の流れは、フィルタを通過する液体の出口を制御するバルブを用いて制御してもよい。これは代替的に、固相粒子を含有するカラム形状の空洞に対して実質的に平行に沈めた液体カラムの出口液体に対して加える逆圧を制御することによって行ってもよい。次いで、遠心力に対してアッセイ装置（例えば、流体又はマイクロ流体チップ）の配向を変更することによって、液体を粒子から除去してもよい。
【００７５】
固相粒子の効率的な洗浄を得るために、第２の液体溶液を添加することによって粒子を懸濁する。第２の液体溶液の密度は、固相粒子の体積密度よりも高い。固相粒子は、この液体中で遠心力に曝されると、カラム形状の構造体から解かれ（ｕｎｐａｃｋ）始め、遠心の軸に最も近い高密度液体の表面に向かって浮遊により遊走する。このようにして、固相粒子は、表面に向かう道中、溶液中に分散され、また、溶液中の反応物が固相と相互作用する間、充填された固相粒子のカラム形状の構造体に捕捉された、あらゆる非結合のトレーサー試薬（例えば、非結合のトレーサー物質又は非結合の分析物−トレーサー物質単位）、及び他の可溶性又は分散性の構成成分から分離される。固相粒子は、浮遊によって得られる第２の液体溶液中に分散しているため、第２の液体溶液がろ過によってカラム様の空洞から排出されるとき、これらの粒子は効率的に洗浄される。
【００７６】
「低密度」の固相粒子と他の分散性材料との間の分離は、これら分散性材料が第２の液体より高密度の粒子を含む場合は、更に促進され得る。これらの粒子は、第２の液体より高密度の金属コロイド又はポリマーマイクロ粒子等の、高密度ナノ粒子であってよい。この場合、第２の液体より高密度の粒子は遠心の軸から遠くへ引き出され、低密度の粒子は回転の軸に向かって移動する。分離の度合いは、関与する構成成分及び関与する液体の密度、粒子のサイズ、加える遠心力、並びに遠心分離の時間における差による。
【００７７】
充填された固相粒子は、よって、粒子を取り囲む溶液の密度を変更することによって懸濁される。この溶液、即ち第２の液体溶液の密度が粒子自体の密度より高い場合、粒子は浮遊し、即ち加えた重力又は遠心力の方向と反対の方向に移動する。遠心力が、粒子を取り囲む液体より低密度の粒子に対して働く場合、粒子は遠心中心に最も近い溶液の表面に向かって徐々に遊走し、液体より高密度の構成成分は沈降する、即ち、遠心中心から最も遠い液体の体積に向かって遊走する傾向がある。アッセイの結合工程を行った後で固相粒子を懸濁することによって得られる主な利点は、固相粒子をカラムに充填することによって得られる多孔性の構造体のため、非特異的に捕捉又は捕獲されるあらゆる過剰のトレーサー物質が放出され、よって、より容易に除去されることである。
【００７８】
このようにして、例えば、液体より高密度のトレーサー物質を、液体より低密度の構成成分から効率的に分離することができる。次いで、液体中に分散している高密度の構成成分を含む液体を、フィルタを介して排出してもよく、固相粒子はフィルタに到達すると停止する。再懸濁及び排出工程を繰り返すことにより、固相粒子を繰り返し洗浄する工程を行ってもよい。
【００７９】
固相粒子より高密度のトレーサー物質があるのが有利であるが、カラム中に充填されている固相粒子を再懸濁することで、トレーサー物質の体積密度が固相粒子と等しい、又は固相粒子より低い場合、はるかに改善された洗浄工程がやはりもたらされる。後者の場合、トレーサー物質は、上記に論じた多孔性の構造から依然として放出され、よってフィルタエレメントを介して第２の液体溶液を排出する場合、固相粒子からより容易に除去される。
【００８０】
この溶液は、過剰のトレーサー物質を洗い流す簡単な手段となる。
【００８１】
固相粒子又はビーズをラボチップ装置（即ち、マイクロ流体チップ、処理カートリッジ等）において用いる付加的な一利点は、懸濁液中のビーズが、アッセイを通して、装置内の異なるポジション／位置に移送され得ることである。これには、トレーサー物質で予め汚染されていない流体回路の空洞若しくはセクションへの、及び／又は個々の工程の機能性を最適化するために特にデザインされた空洞への、粒子の流体移送が含まれ得る。これは、例えば、貯蔵に最適化させた空洞に最初にビーズを有し、次いで速やかな相互作用に最適化された空洞（即ち、カラム形状の構造体）にビーズを移送し、次いで洗浄に最適化された空洞に、更に読取りに最適化された空洞にビーズを移送し、最終的に廃棄物を貯蔵するための空洞に移送することを許容し得る。
【００８２】
記載する通り、試料を分析するために用いる装置は、特定の手順にしたがって試料及び試薬両方のマイクロ流体処理用に特にデザインされているマイクロ流体チップ又はカートリッジであってよい。これらのカートリッジは通常、ポンプ、バルブ、遠心力、又は他の物理的手段により、カートリッジ内で流体を処理する機器によって操作される。特に、本発明は、遠心力又は重力によりマイクロ流体チップ内で操作されるアッセイ系に関する。
【００８３】
本発明は、異なる密度のビーズ又は固相粒子を分離するための効率的な方法を開示する。この概念により、複数の分析物とビーズとが同時に相互作用できるようになり、結果として生じる定量化可能な異なる様々なビーズ複合体を引き続き容易に分離することができる。本発明を下記に更に記載する。
【００８４】
本発明の分離方法は、異なる密度の２セット（又は集団）以上のビーズが、低密度溶液中で部分的又は完全に混合される場合に用いることができる。「低密度」のセットのビーズより高密度であるが「高密度」のセットのビーズより低密度である液体を導入することにより、「低密度」のセットのビーズは「浮遊」し、「高密度」のセットのビーズは沈降する。次いで、ビーズ／粒子のセットを、デカントによって分離してもよい。或いは、「高密度」の液体を、粒子保持エレメント（若しくはフィルタエレメント）を介して排出し、又は「高密度」の液体を「低密度」の液体で希釈することにより、「低密度」のビーズは、次いで、「高密度」のビーズの上部（遠心軸のより近く）に完全に積層する。２つ以上の層におけるこの明らかなビーズの積層により、異なるビーズの層から、異なる分析物及び／又はトレーサーの読取りが可能になる。１つ又は複数のセットのビーズは、分析物及び／又はトレーサーに結合しない「不活性な」ビーズであり得る。これら不活性なビーズは、分析物及び／若しくはトレーサーを保有するビーズのセット間の、又は粒子保持エレメント（フィルターエレメント）と分析物及び／若しくはトレーサーを保有するビーズのセットとの間のスペーサーとして用いることができる。これは、分析物及び／又はトレーサーを保有するビーズを、粒子保持エレメント（即ち、フィルタ又はフィルタ材料）等の、流体回路のあらゆる汚染された領域から分離する上で、且つ読取りを最適化するのに有利である。
【００８５】
本出願は、ビーズより高密度の液体を用いることにより、ビーズを１つの空洞から別の空洞にデカントによって効率的に移送することができ、よって、液体の上部分画中に浮遊するビーズ、即ち遠心力を生じる回転の軸に向かう方向に遊走（又は浮遊）したビーズを、別の空洞中に移送する、本発明の概念も開示する。概念を下記に更に記載する。
【００８６】
本発明及び本発明の概念の両方を、上記に記載した分析方法と組み合わせるのが有利であり得るが、このような使用に決して限定されるものではない。
【００８７】
本発明の分離方法と用いるのに適する好ましい分析方法の詳しい記載
分析方法の模式図を図１ａ〜図１ｋに示す。方法は、１つ又は複数の対象の分析物に関して、試料を分析しようとするものである。方法は、液体中に溶解され得るあらゆるタイプの試料に適し、このような分析を行うためのアッセイに提供することができる前記試料中のあらゆるタイプの化合物又は物質を検出／定量するのにも適する。
【００８８】
以下では、試料を生物学的試料と仮定し、標的の化合物又は物質はバイオマーカーが好ましく、タンパク質（抗原、酵素、抗体）、核酸、薬物、ホルモン、栄養素、代謝物、微生物、細胞、又は１つ若しくは複数の選択的なバインダーを含めたアッセイで測定することができるような、あらゆる分子若しくは分子の集合であってよい。方法は、バイオマーカーを固相粒子（即ち、マイクロサイズのビーズ、球状粒子等）と反応させるよく知られている原理に基づき、この場合、固相粒子は、バイオマーカーと結合することができる分子構造体又は実体を含む。適切な分子実体は、例えば、バイオマーカーが抗原である場合は抗体である。固相粒子及びバイオマーカーに加えて、トレーサー物質が存在しなければならない。トレーサー物質は、バイオマーカーに結合することができる分子実体を特色として備えている。
【００８９】
固相粒子又はビーズは上記に規定した通りである。
【００９０】
トレーサー物質は上記に規定した通りである。
【００９１】
典型的な不均一な免疫アッセイの第１の工程は、定量又は同定しようとするバイオマーカーを含む生物学的試料を、第１の液体媒体中のビーズ及び／又はトレーサー物質と、相互作用させ、接触させ、インキュベートし、フラッシュし、又は混合する工程からなり、図１ａ〜図１ｅを参照されたい。この場合、標的のバイオマーカーが固相粒子とトレーサー物質との間のリンカーとして作用する、サンドイッチタイプの立体配置が確立される。これらの相互作用を、両方の順番で逐次的に行ってもよく、又は関与する反応物全てを一緒にアプライして行ってもよい。このような「サンドイッチ複合体」では、バイオマーカーとトレーサー物質との間に１：１の確立された固定の化学量論比が存在するのが好ましい。非競合的アッセイでは、ビーズ及びトレーサー物質の両方がバイオマーカーと結合することができる。トレーサー物質及び固相粒子は、バイオマーカー特異的受容体をいくつか保有することがあり、ゆえにいくつかのバイオマーカー分子に結合し得る。しかし、通常、アッセイは、バイオマーカーに対して大過剰のトレーサー物質を含有するようにデザインされる。統計的に、各バイオマーカー分子はそれによって、１つのトレーサー物質だけに結合する。しかし、微球型ビーズは各々非常に大きな表面を曝し、多数の標的のバイオマーカー、引き続きトレーサー物質に結合し得る。
【００９２】
この特定の単純化した実施形態において、原理の説明に示す通り、アッセイはＷ形状の空洞、流体回路、又は試験管構成体１で行われる。空洞１は、第１の出口２及び第２の出口３、入口４、並びに第１のフィルタエレメント５及び第２のフィルタエレメント６を含む。第１のフィルタエレメント５は、入口４と第１の出口２との間に配置される。入口と第１のフィルタエレメントとの間に配置されるセクションは、カラム構造体７を形成する。セクション又は空洞は、出口１６を含むと考えてもよい。矢印Ｇは、空洞又は試験管に対して加える遠心力（又は重力、しかし重力を使用しても大幅に遅いアッセイを提供するにすぎない）の方向を示す。空洞１は、本開示の背景技術の項に記載した従来技術に開示されるマイクロ流体チップ等、流体又はマイクロ流体チップにおける流体回路の一部であってもよい。その場合、空洞は、マイクロ流体チップの外部の回転軸に垂直である平面に配置されると考えてもよい。よって、必要とされる遠心力Ｇは、マイクロ流体チップを前記軸の周囲に回転させることによって得られ、マイクロ流体チップにおける空洞に対する遠心力の方向は、マイクロ流体チップ自体を回転させることにより変更することができる。
【００９３】
図１ａ〜図１ｅによって図示する特異的なアッセイは非競合的アッセイである。このようなアッセイでは、ビーズ８及びトレーサー物質９の両方とも（図１ｄを参照されたい）大過剰が提供され、これらは中間体のバイオマーカーが存在しなければ相互に反応しないため、アッセイの様々な構成成分を相互作用させ、接触させ、又は混合する順序を、任意に選択することができる。更に、混合、相互作用、又は接触（即ち、結合工程）は、確実にビーズ８、トレーサー物質９、及びバイオマーカーの間の反応ができるだけ完全であるように、上記に言及した第１の液体媒体を、ビーズによって形成されるプラグ又はカラムを通過させる工程を含むのが有利であり得る。プラグ又はカラムは、カラム形状の空洞７に充填されているビーズ又は体積を有することによって得られる。カラム形状の空洞７が、ラボチップ装置中の流体回路の一部（即ち、マイクロ流体チップ又は処理カートリッジにおける流体回路）であり得るのが好ましい。
【００９４】
図１ａ及び図１ｂでは、液体媒体に懸濁したビーズを、入口４を介して導入する。液体媒体の密度はビーズの密度より低い。ビーズの密度をｍ１ｇ／ｍ３と表す。遠心力Ｇのため、ビーズは、カラム形状の空洞７及び第１のフィルタエレメント５によって区切られるカラム形状の構造体中に充填され、図１ｃを参照されたい。ビーズは、前記空洞の一端に配置される第１のフィルタエレメント５のため、カラム形状の空洞に保留される。フィルタエレメントは、フィルタ、格子、篩、細いスリット等を含むことができ、ビーズがそれを通過するのを妨げる。
【００９５】
次の工程では、図１ｄを参照すると、バイオマーカーを含む液体媒体中に懸濁したトレーサー物質９を、入口４を介して導入する。この特定の実施形態において、バイオマーカーを含む試料をトレーサー物質と相互作用させた後、ビーズと相互作用させ、よって、試料は、トレーサー物質を懸濁させた液体媒体の一部を形成することができる。ビーズを懸濁させた液体媒体と、トレーサー物質を懸濁させた液体媒体から得た、合わせた液体媒体の密度はビーズより低い。合わせた液体媒体を第１の液体媒体と呼び、前記液体媒体の密度をｄ１ｇ／ｃｍ３と表す。
【００９６】
トレーサー物質及びバイオマーカーを含む第１の液体媒体、並びにトレーサー物質とバイオマーカーとの相互作用により形成された複合体を、充填ビーズを通過させる。第１の液体媒体が充填ビーズを通過するとき、ビーズ、バイオマーカー、及びトレーサー物質を含む「サンドイッチ複合体」が形成される。フィルタエレメント５は、トレーサー物質９、及びトレーサー物質とバイオマーカーとの相互作用により形成された複合体が通過することができるようになっており、図１ｄを参照されたい。第１の液体媒体はカラムを通過し、加える遠心力Ｇの方向を変えることにより、Ｗ形状の空洞１又は試験管の外に出され、図１ｆ〜図１ｈを参照されたい。代替の実施形態において、第１の液体媒体は、例えば、第１のフィルタエレメントの下に位置するバルブを使用することによって、空洞の外に出され得る。
【００９７】
ビーズ８、トレーサー物質９、及びバイオマーカーの間の相互作用の順序は、特定の場合、どの解決法が最も好適であり、又は適切であるかによる。よって、バイオマーカーを含む試料は、トレーサー物質９を懸濁させる液体媒体の一部であってもよく、又はビーズ８を懸濁させる液体媒体の一部であってもよい。
【００９８】
ビーズ、トレーサー物質、及びバイオマーカーの間の相互作用は、第１の液体媒体を、充填ビーズのカラムを１回通過させた後では完全ではないことがある。非反応のトレーサー物質、バイオマーカー、及びトレーサー物質とバイオマーカーとの相互作用により形成された複合体（即ち、分析物−トレーサー物質単位）を含み得る第１の液体媒体を、入口４に再導入することにより、充填ビーズを繰り返し通過させるのが有利である。このような再導入は、例えば、第１の出口２を入口４と接続するループ構造体（例えば、ループとして形成される流体回路）を有することにより、実現することができる。Ｗ形状の空洞がラボチップ装置における流体回路の一部である場合、後者の解決法が特に有利である。再導入後、図１ｅ〜図１ｈによる工程を繰り返してもよい。
【００９９】
アッセイデザイン、及び試料中のバイオマーカーの濃度に応じて、各ビーズはゼロから数千のバイオマーカー−トレーサー物質複合体を保有することができる。好ましい一実施形態における各ビーズの体積は、バイオマーカー−トレーサー物質複合体の体積より実質的に大きいため、ビーズ１個あたり多数のバイオマーカー−トレーサー物質複合体が結合しても、ビーズの体積質量密度に実質的に影響を及ぼさない。典型的な一例では、球状の５μｍ（直径）ビーズの体積は、４０ｎｍトレーサー物質の体積の２００万倍近い。
【０１００】
ビーズ、トレーサー物質、及びバイオマーカーの間の相互作用により、「サンドイッチ複合体」（即ち、定量化可能なビーズ複合体）及び非反応のトレーサー物質を含む充填ビーズのカラムがもたらされる。「サンドイッチ複合体」の密度はｍ２ｇ／ｃｍ３と表される。充填ビーズによって形成される多孔性の構造のため、相互作用の間、非反応のトレーサー物質９のいくらかが非特異的に捕捉又は捕獲される。高感度で再現性のよい分析結果を得るために、できるだけ多くの非反応のトレーサー物質を、ビーズ及び「サンドイッチ複合体」から分離しなければならない。従来技術では、非反応のトレーサー物質の分離は、洗浄液を充填ビーズのカラムを通過させることによる繰り返し洗浄によって行われる。しかし、上記に論じた通り、このような洗浄では捕捉された非反応のトレーサー物質は全て除去されず、又は過剰で時間のかかる数々の繰り返し洗浄を必要とする。
【０１０１】
非反応のトレーサー物質の、ビーズ及び「サンドイッチ複合体」からの分離を改善し、又は分離を更に許容するために、第２の液体媒体を充填ビーズに添加し、図１ｉを参照されたい。第２の液体媒体の密度はｄ２ｇ／ｃｍ３であり、この場合、ｄ２＞ｍ１及びｍ２である。第１の液体媒体をデカントによって（即ち、第１の液体媒体を、フィルタエレメントを通過させることによる代わりに）除去する、代替の分析系において用いる場合、小割合の第１の液体媒体及び第２の液体媒体を合わせたものの密度をｄ２’と表すことができる。しかし、第２の液体媒体と第１の液体媒体との体積間の比率が高いため、ｄ２’の数値はｄ２にほぼ等しく、即ち、ｄ２’＞ｍ１及びｍ２である。
【０１０２】
本分析方法の本質的な特徴は、第２の液体媒体の密度が、ビーズ及び「サンドイッチ複合体」よりも高いということである。次いで、第２の液体媒体を添加することで、充填ビーズのカラムが確実に崩壊し、したがってビーズ間の緊密な相互作用が破壊される。ビーズ間の緊密な相互作用が破壊されると、捕捉／捕獲された非反応のトレーサー物質が第２の液体媒体中に放出される。これらは第２の液体媒体の密度に比べて低密度であるため、ビーズ及び「サンドイッチ複合体」は、第１のフィルタエレメントから離れて、遠心力Ｇを加えた方向に対抗して移動し、図１ｊを参照されたい。充填ビーズ間に先に捕捉／捕獲された非反応のトレーサー物質を除去するには、加える遠心力Ｇの方向を変えることによって、第２の液体媒体を、第１の出口２を介してＷ形状の空洞又は試験管から出し、図１ｋを参照されたい。代替の実施形態において、第２の液体媒体を、例えば、第１のフィルタエレメント５の下に位置するバルブを用いることによって、空洞から出してもよい。
【０１０３】
異なる密度の第１及び第２の液体媒体を用いることによって得られる、最も重要な効果は、ビーズは第１の液体媒体ｄ１＜ｍ１中に「沈降」し、第２の液体媒体ｄ２＞ｍ１中に「浮遊」することである。「沈降」及び「浮遊」の語は、加える遠心力Ｇに対して、液体媒体中のビーズの位置を記載するのに用いるものであり、即ち、ビーズが「浮遊」する場合、ビーズは、加える遠心力の方向と反対の方向に遊走し、「沈降」の語では逆になる。
【０１０４】
非反応のトレーサー物質の残存量が、第２の液体媒体を除去した後に非常に高い場合、第２の液体媒体を添加する工程及び除去する工程を、図１ｉ〜図１ｋ（即ち、洗浄工程）にしたがって、第２の液体媒体の新鮮なアリコートを用いて所要の回数繰り返してもよい。
【０１０５】
この特定の分析方法に示す通り、トレーサー物質の体積質量密度はｎ  ｇ／ｃｍ３であるのが有利であり得、この場合、ｎ＞ｍ１、ｍ２、及びｄ２である。このような密度により、第２の液体媒体をビーズに供給すると、過剰のトレーサー物質は確実に「沈降」し、トレーサー物質の、ビーズ及び「サンドイッチ複合体」からの分離を更に促進する。これは、上記に言及した通り、カラム形状の空洞からデカントによりビーズを移動させる、代替の実施形態において特に有利であり得る。
【０１０６】
しかし、トレーサー物質が特定の密度であることは必要とされない。単に、ビーズ間の緊密な相互作用が破壊されるように充填ビーズのカラムが崩壊するという事実のため、第２の液体媒体を除去すると、確実に、過剰なトレーサー物質の除去の改善が実現される。体積質量密度に加えて、トレーサー物質の他の性質は、第２の液体媒体中のこれらの挙動の仕方を決定し得る。例えば、トレーサー物質がナノ粒子と会合し、又はナノ粒子を含む場合、これらの体積質量密度が第２の液体媒体の密度より低くても、これらは長期間にわたって液体媒体中に懸濁したままである傾向がある。トレーサー物質の挙動に影響を及ぼす他の性質又は特徴には、関与する液体媒体中のこれらの溶解度、又はこれらを浮遊するビーズから分離して維持し得る加えられるあらゆる力（即ち、磁気、電気）の存在が含まれる。
【０１０７】
上記に記載した通り、ビーズ、トレーサー物質、及び「サンドイッチ複合体」の第２の液体媒体中の混合物を、第１の方向を有する遠心力にかける。「サンドイッチ複合体」を含むビーズ（即ち、定量化可能なビーズ複合体）は、第２の液体（ｄ２）より低い体積質量密度（ｍ１及びｍ２）を有し、「浮遊」し（即ち、遠心系の回転軸に最も近い第２の液体媒体の液体表面に向かって移動する）、過剰の非結合のトレーサー物質は、密度ｎ、サイズ、溶解度等のその性質に応じて、上記に論じた通り、「沈降」し、即ち、遠心力を作り出す回転軸から離れて移動し、又は第２の液体媒体、ゆえに懸濁しているトレーサー物質をビーズ及び「サンドイッチ複合体」から分離するのに少なくとも十分な期間、懸濁して留まるのいずれかである。
【０１０８】
非反応のトレーサー物質を除去した後、複数の「サンドイッチ複合体」を分析することにより、バイオマーカーを、インサイチューで（即ち、カラム形状の空洞７において）定量しても、又は同定してもよい。
【０１０９】
代替の分析方法において、ビーズ及び「サンドイッチ複合体」は、分析のための異なる位置又は空洞に運搬される。本明細書において開示される分析方法を、内部流体回路を有する流体又はマイクロ流体チップであって、内部流体回路を介して、ビーズ、及び少なくとも１つの分析物を含有する試料を含む様々な反応物が遠心力を使って移動することができる、流体又はマイクロ流体チップを含むラボチップ装置において用いる場合、「サンドイッチ複合体」を含むビーズは、例えば、このようなビーズを分析するために特にデザインされた流体回路又は空洞に運搬され得る。
【０１１０】
この特定の分析方法では、「サンドイッチ複合体」を含むビーズを、セクション又は空洞７から第２のカラム形状の空洞１０に移送する。移送は、更なるアリコートの第２の液体媒体を、又は第２の液体媒体と密度が同じ又は高い、異なる液体媒体を、ビーズに添加することにより実現され、図１ｌ〜図１ｍを参照されたい。ビーズが空洞７の入口４（又は出口１６、図１ｌを参照されたい）のより近くを遊走することができるように、アリコートが、図１ｉ〜図１ｋの洗浄工程において用いられる量より多いのが好ましい。「サンドイッチ複合体」を含めたビーズを全て含有する、遠心の軸（又は入口４又は入口１６）に最も近い第２の液体媒体の分画は、デカントによって第２のカラム形状の空洞１０に移送され、図１ｏを参照されたい。デカントは、第１のカラム形状の空洞に対して遠心力Ｇの方向をわずかに変えることによって実現される。第２のカラム形状の空洞１０は、アッセイにおいて次に好ましい動作に対して最適にデザインされており、即ち、第２の空洞は、更に大規模な洗浄に、及び／又は「サンドイッチ複合体」の定量にデザインされ得る。
【０１１１】
この特定の分析方法において、その中にビーズが充填されている空洞７は、カラム形状であることが示され、記載されている。しかし、他の分析方法において、空洞が反応物間の緊密な相互作用、及び後続の液体媒体中の充填構造体の分散を許すビーズの充填構造体を提供するのであれば、空洞はあらゆる形状又は形態であってよい。
【０１１２】
本発明の詳しい記載；流体回路において異なる密度のビーズを分離する方法
図１ａ〜図１ｋに記載する分析方法では、方法を、一度に１つの分析物を分析するものとして示す。しかし、本発明による分離方法を用いることにより、分析方法は、一度にたった１つの分析物を分析することに制限されない。
【０１１３】
各タイプが、異なる分析物に、及び複数のタイプの分析物を含有する試料との相互作用におけるそれぞれの相補的なトレーサー物質に選択的である、異なる密度の複数のタイプのビーズを用いることにより、複数のタイプの分析物に相当する、複数のタイプの「サンドイッチ複合体」を同時に得ることができる。複数のタイプの「サンドイッチ複合体」は、同時に、又は逐次的に分析することができる。上記に記載した結合工程又は相互作用工程の後、充填ビーズのカラムは、分析しようとする様々な分析物を代表する、複数のタイプのビーズ及び相当する「サンドイッチ複合体」を含む。場合によっては、複数のタイプの「サンドイッチ複合体」は、相互に分離せずに分析してもよい。しかし、所望のレベルの感度及び再現性を得るには、複数のタイプの「サンドイッチ複合体」の分離が必要とされ得る。
【０１１４】
本発明は、本明細書を通して記載する「サンドイッチ複合体」を含む、複数のタイプのビーズ／固相材料の分離を実現するための方法を提供する。本発明は、上記に記載した分析方法に依存するものでも、上記に記載した分析方法の本質的な部分でもない。本発明は、内部流体回路を含む流体又はマイクロ流体チップであって、内部流体回路を介して、ビーズ、及び少なくとも１つの分析物を含有する試料を含む様々な反応物が遠心力を使って移動することができる、流体又はマイクロ流体チップ等のラボチップ装置において用いるのが特に有利である。
【０１１５】
本発明の一実施形態を図２ａ及び図２ｂに図示する。異なる密度を有するビーズを分離するのに適する空洞１５（又は内部流体回路のセクション）を、図２ａ及び図２ｂに示す。空洞１５は、入口１２、第１の出口１３、及び第２の出口１４を含む。この特定の場合では、空洞に、密度ｍ１を有する第１のセットのビーズ８ａ、及び密度ｍ２を有する第２のセットのビーズ８ｂを提供する。次いで、密度ｄ３、ｍ１＜ｄ３＜ｍ２を有する液体媒体１１を空洞中のビーズに添加する。遠心力Ｇにより、第１のセットのビーズ８ａの、第１の出口１３の方向への遊走（又は浮遊）が生じ、第２のセットのビーズ８ｂは第２の出口１４に向かって遊走（又は沈降）する。遠心力の方向、即ち遠心力に対する空洞の配向を変えることにより、第１のセットのビーズ８ａ及び液体媒体１１の部分は、第１の出口１３を介して移送され、第２のセットのビーズ８ｂ及び液体媒体１１の部分は、第２の出口１４を介して移送される。
【０１１６】
本発明は、図１ａにすでに示したもの等の他の空洞のデザインにも適用できる。図１ａに示す空洞において、密度ｄ３を有する液体媒体（図２ａ及び図２ｂに関して記載する通り）を最初に用いて、２セットのビーズを分離してもよい（図２ａにおける動作同様）。２セットのビーズを分離した後、加える遠心力Ｇの方向を変えることにより、第１のセットのビーズを、カラム形状の空洞７からデカントしてもよい（図１ｏにおけるビーズのデカント同様）。第１及び第２のセットのビーズを、このように分離してもよい。密度ｄ４、ｄ４＞ｍ２を有する更なる液体媒体をカラム形状の空洞７に添加することにより、第２のセットのビーズを、第１のセットのビーズに用いたのと同様に、前記空洞から引き続きデカントしてもよい。
【０１１７】
本発明は、即ち異なる密度のビーズを分離する方法は、異なる密度を有する２セットのみのビーズに制限されず、ビーズが異なる密度を有し、適切な密度の液体媒体をアプライすることによって分離できるのであれば、あらゆるセット数のビーズを分離するのに用いることができる。例えば、図１ａに示す空洞の場合、それぞれ密度ｍ１、ｍ２、ｍ３、及びｍ４を有する４セットのビーズを、密度ｄ３、ｍ４＜ｄ３＜ｍ３、ｍ２、ｍ１を有する液体媒体を最初に添加し、密度ｍ４を有するビーズをデカントし（図１ｏにおけるビーズ同様）、密度ｄ３を有する残存する液体媒体をろ去し、密度ｄ４、ｍ３＜ｄ４＜ｍ２、ｍ１を有する更なる液体媒体を添加し（或いは、密度ｄ３を有する残存する液体媒体はろ去せず、更なる高密度液体等の密度を増大する添加物を添加することによってその密度をｄ４に増大し）、密度ｍ３を有するビーズをデカントする等により、逐次的に分離してもよい。
【０１１８】
更なる一選択肢は、ビーズを、２つの組合せセットのビーズに分離することであり、この場合、第１の組合せセットは密度ｍ１及びｍ２のビーズを含み、他方の組合せセットは密度ｍ３及びｍ４のビーズを含む。これは、密度ｄ４、ｍ４、ｍ３＜ｄ４＜ｍ２、ｍ１を有する液体媒体を最初に添加し、密度ｍ４及びｍ３を有するビーズをデカントすることによって得ることができる。次いで、各組合せセットのビーズを、例えば、更なる分離のために図２ａに示す空洞に移送してもよい。本発明を、上記に記載した分析方法等の分析方法において用いる場合、１セットのビーズは、分析しようとする「サンドイッチ複合体」も含むことができる。
【０１１９】
ビーズを分離する本方法のまた更なる一実施形態を図３ａ〜図３ｈに図示する。この実施形態において、密度ｍ１、ｍ２、及びｍ３を有する３セットのビーズは、相互の上部に配置される３つの別々の層に分離される。方法を、流体チップにおける流体回路のセクションにおいて説明する。セクションは、出口１７（又は入口）及び分離セクション２０及び積層セクション２１を含み、積層セクションは第１の終端２２及び第２の終端２３を有し、この場合、第１の終端は分離セクションに接続され、フィルタエレメント１９は第２の終端に配置される。セクションの方向を、加える遠心力Ｇに対して図３ａ〜図３ｈに示す。第１の工程において、図３ｂを参照されたく、３セットのビーズ（第１のセットのビーズ８ａ（ｍ１）、第２のセットのビーズ８ｂ（ｍ２）、及び第３のセットのビーズ８ｃ（ｍ３））が、分離セクション２０において密度ｄ３を有する第１の液体媒体２４中に提供され、この場合ｍ１、ｍ３＜ｄ３＜ｍ２である。加える遠心力及び第１の液体媒体の密度のため、第１及び第３のセットのビーズは、第２のセットのビーズと反対の方向に遊走し、図３ｃ及び図３ｄを参照されたい。遠心力の方向を変えることにより、第２のセットのビーズはフィルタエレメント１９に向かって遊走し、ビーズの層を形成する。第１及び第３のセットのビーズは、加える遠心力と反対の方向（即ち、遠心力を提供する回転の軸に向かう方向）に遊走し、又は浮遊する。次いで、高密度の液体媒体２５をセクションに添加して、密度ｄ４を有する第２の液体媒体２６を提供し、この場合ｍ３＜ｄ４＜ｍ１、ｍ２であり、図３ｆを参照されたい。液体媒体（即ち、第２の液体媒体）の密度の増大により、密度ｍ１を有する第１のセットのビーズの、第２のセットのビーズの層に向かう遊走が生じ、したがって第２のセットのビーズの層に隣接して積層する第１のセットのビーズの層が形成され、図３ｇを参照されたい。最終工程において、図３ｈを参照されたく、第２の液体媒体がフィルタエレメントを通過するように、加える遠心力の方向を、セクションの方向に対して変える。第３のセットのビーズは、第１のセットのビーズの層に隣接して積層する第３のセットのビーズの層が形成されるように、フィルタエレメントに向かって第２の液体媒体に続く。本発明による分離方法のこの実施形態は、よって、複数のタイプのビーズを別々の隣接層に積層させることによる、複数のタイプのビーズの分離を提供することができる。ビーズは、例えば、同じ試料中のいくつかの分析物をアッセイすることによって得られる、複数のタイプ（又はセット）の定量化可能なビーズ複合体であってよい。複数のタイプ（又はセット）の定量化可能なビーズ複合体の積層により、例えば、同時の、又は逐次的なビーズの分析が可能になり得る。場合によっては、少なくとも１セットのビーズは「不活性な」ビーズからなり、分析物及び／又はトレーサーに結合せず、即ち定量化可能なビーズ複合体を形成することができない。これら不活性なビーズを、異なる層の定量化可能なビーズ複合体間のスペーサーとして、又はフィルタエレメントと定量化可能なビーズ複合体の層との間のスペーサーとして用いてもよい。このようなスペーサーは、妨害シグナルを提供し得るあらゆる物質から分離されるため、このようなスペーサーを用いることにより、定量化可能なビーズ複合体の後続の分析の感度を上げることができる。
【０１２０】
流体回路においてビーズを移送するための本発明の概念の詳しい記載
ビーズの運搬に関して、本開示は、本発明による方法に依存せず、本発明による方法の本質的な部分でもない、本発明の概念を表すものである。概念の一実施形態を図１ｌ〜図１ｐに開示する。概念は、マイクロ流体チップ等のラボチップ装置に関して本質的に関係がある問題を解決するものであり、この場合、ビーズは、遠心力を使って流体回路を介して運搬されなければならない。従来技術では、ビーズの運搬は常に、遠心力と同じ方向で行われ、流体回路のデザインに利用できる選択肢は、よって限られる。本発明の概念により、密度ｄ２を有する液体媒体を、ｍ１に等しく、又はｍ１より低い密度を有するビーズに添加することにより、加える遠心力と反対の方向にビーズを運搬することができ、この場合ｄ２＞ｍ１である。
【０１２１】
本発明の概念を、図１ｌ〜図１ｐのカラム形状の空洞を参照して説明するが、概念は広範囲の形状及び形態を有する空洞に等しく適する。適切な空洞の更なる一例を図２ａ及び図２ｂに示す。上記の本発明の第１の概念の記載に開示する通り、第１のセットのビーズ８ａは、第１の出口１３の方向における遊走（又は浮遊）を起こされ、方向は、加える遠心力Ｇの方向と反対である。
【０１２２】
本発明の概念は以下の通り規定することができる：
内部流体回路を含む流体チップであって、内部流体回路を介して、ビーズ、及び少なくとも１つの分析物を含有する試料を含む様々な反応物が遠心力を使って移動することができる、流体チップにおいてビーズを移送する方法であって、
−  ｍ１に等しく、又はｍ１より低い密度を有するビーズを、流体回路の空洞において提供する工程であって、空洞は少なくとも第１の出口を含む工程、
−  第１の液体媒体を空洞に提供する工程であって、液体媒体は、ｄ２＞ｍ１であるように、密度ｄ２を有する工程、及び
−  ビーズが遠心力の反対方向に遊走するように、遠心力を加える工程
を含む方法。
【０１２３】
流体チップにおいてビーズを移送する方法の一実施形態において、ビーズは第１の出口に向かって遊走する。
【０１２４】
流体チップにおいてビーズを移送する方法の一実施形態において、方法は、
−  好ましくはビーズが第１の出口を介してデカントされるように、遠心力の方向を変えることによってビーズを空洞の外に移送する工程
を含む。
【符号の説明】
【０１２５】
１  Ｗ形状の空洞
２  第１の出口
３  第２の出口
４  入口
５  第１のフィルタエレメント
６  第２のフィルタエレメント
７  カラム構造体、カラム形状の空洞
８  ビーズ
８ａ  第１のセットのビーズ
８ｂ  第２のセットのビーズ
８ｃ  第３のセットのビーズ
９  トレーサー物質
１０  第２のカラム形状の空洞
１１  液体媒体
１２  入口
１３  第１の出口
１４  第２の出口
１５  空洞
１６  第１の出口
１７  第１の出口
１９  フィルタエレメント
２０  分離セクション
２１  積層セクション
２２  第１の終端
２３  第２の終端
２４  第１の液体媒体
２５  高密度の液体媒体
２６  第２の液体媒体
【図１ａ】
0006649282.tif 000002
【図１ｂ】
0006649282.tif 000003
【図１ｃ】
0006649282.tif 000004
【図１ｄ】
0006649282.tif 000005
【図１ｅ】
0006649282.tif 000006
【図１ｆ】
0006649282.tif 000007
【図１ｇ】
0006649282.tif 000008
【図１ｈ】
0006649282.tif 000009
【図１ｉ】
0006649282.tif 000010
【図１ｊ】
0006649282.tif 000011
【図１ｋ】
0006649282.tif 000012
【図１ｌ】
0006649282.tif 000013
【図１ｍ】
0006649282.tif 000014
【図１ｎ】
0006649282.tif 000015
【図１ｏ】
0006649282.tif 000016
【図１ｐ】
0006649282.tif 000017
【図２ａ】
0006649282.tif 000018
【図２ｂ】
0006649282.tif 000019
【図３ａ−３ｄ】
0006649282.tif 000020
【図３ｅ−３ｈ】
0006649282.tif 000021