(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象遺伝子の変異の有無を判定するためにコンピュータによって実施される変異判定方法であって、
検体由来のポリヌクレオチドのシーケンシングによって得られた複数のリードから、該対象遺伝子の特定の領域に対応する対応リード、および、該対応リードのうち該特定の領域内の特定の変異を有する変異リードを抽出する抽出工程と、
所定の有意水準で変異の有無を判定するための閾値を、抽出した該対応リードの数を用いて算出する算出工程と、
抽出した該変異リードの数が算出した該閾値を超える場合に、該特定の変異が存在すると判定する判定工程と、を包含することを特徴とする変異判定方法。
【請求項２】
上記コンピュータには、上記特定の変異に対応付けられた統計モデルを示す統計モデル情報が記憶されており、
上記算出工程では、上記統計モデル情報を参照して、該対応リードの数から所定の有意水準の有意差の有無を判定するための閾値を算出することを特徴とする請求項１に記載の変異判定方法。
【請求項３】
上記統計モデル情報には、上記特定の変異に対応付けられた統計モデルの種別が含まれていることを特徴とする請求項２に記載の変異判定方法。
【請求項４】
上記統計モデル情報には、上記特定の変異に関する正常検体データがさらに含まれていることを特徴とする請求項３に記載の変異判定方法。
【請求項５】
上記コンピュータには、上記特定の変異に対応付けて、閾値の最小値を使用するか否かを示す最小値情報が記憶されており、
上記算出工程では、該最小値情報が閾値の最小値を使用することを示している場合、予め定められた統計モデルを参照して、該対応リードの数から算出される閾値の最小値を、上記閾値として算出することを特徴とする請求項１に記載の変異判定方法。
【請求項６】
上記コンピュータには、複数のリファレンス配列が記憶されており、
上記抽出工程は、上記複数のリードを、上記複数のリファレンス配列の各々にマッピングすることを含むことを特徴とする請求項１〜５の何れか一項に記載の変異判定方法。
【請求項７】
上記特定の変異は、一塩基置換変異であり、
上記リファレンス配列は、上記特定の領域の配列である特定リファレンス配列を含み、
上記抽出工程では、当該特定リファレンス配列にマッピングされた上記リードを上記対応リードとして抽出すると共に、抽出した当該対応リードの各々が上記特定の変異を有するか否かを判定し、上記特定の変異を有する当該対応リードを上記変異リードとして抽出することを特徴とする請求項６に記載の変異判定方法。
【請求項８】
上記特定の変異は、挿入および欠失の少なくとも一方の変異であり、
上記リファレンス配列は、上記特定の領域の配列である特定リファレンス配列と、当該特定リファレンス配列において挿入および欠失の少なくとも一方が生じている配列である検出用リファレンス配列とを含み、
上記抽出工程では、上記特定リファレンス配列にマッピングされた上記リードおよび上記検出用リファレンス配列にマッピングされた上記リードを上記対応リードとして抽出すると共に、上記検出用リファレンス配列にマッピングされた上記リードを上記変異リードとして抽出することを特徴とする請求項６に記載の変異判定方法。
【請求項９】
上記特定の変異は、予め定められた塩基の挿入および予め定められた塩基の欠失の少なくとも一方からなる変異であり、
上記検出用リファレンス配列には、互いに異なる変異に対応する複数の検出用リファレンス配列が含まれており、
上記抽出工程では、上記検出用リファレンス配列のうち、上記特定の変異に対応する検出用リファレンス配列にマッピングされた上記リードを上記変異リードとして抽出することを特徴とする請求項８に記載の変異判定方法。
【請求項１０】
上記抽出工程では、単一の上記検出用リファレンス配列にマッピングされた上記変異リードのうち、当該検出用リファレンス配列との間で配列の不一致がある不一致リードの割合が所定の割合を超えている場合、当該不一致リードを、上記対応リードおよび上記変異リードから除外することを特徴とする請求項８または９に記載の変異判定方法。
【請求項１１】
上記抽出工程では、複数の上記リファレンス配列にマッピングされた上記リードを、上記対応リードおよび上記変異リードから除外することを特徴とする請求項６〜１０の何れか一項に記載の変異判定方法。
【請求項１２】
上記抽出工程において、少なくとも一つの上記リードが、上記対応リードから除外された場合に、警告を出力する警告工程をさらに包含することを特徴とする請求項１０または１１に記載の変異判定方法。
【請求項１３】
上記対象遺伝子は、ＥＧＦＲ遺伝子であり、
上記複数のリファレンス配列は、配列番号１〜１０１に示される塩基配列の各々を含んでいることを特徴とする請求項６〜１２の何れか一項に記載の変異判定方法。
【請求項１４】
上記抽出工程の前に、上記リファレンス配列を、外部のデータベースから取得した情報に基づいて更新する更新工程をさらに包含することを特徴とする請求項６〜１３の何れか一項に記載の変異判定方法。
【請求項１５】
上記抽出工程では、上記対応リードの抽出の前に、所定の長さよりも短い上記リードを除去することを特徴とする請求項１〜１４の何れか一項に記載の変異判定方法。
【請求項１６】
上記ポリヌクレオチドは、ＰＣＲ産物であり、
上記シーケンシングは、同一の領域を重複して読むことにより複数の上記リードを取得するシーケンシングであることを特徴とする請求項１〜１５の何れか一項に記載の変異判定方法。
【請求項１７】
対象遺伝子の変異の有無を判定するためにコンピュータによって実行される変異判定プログラムであって、
検体由来のポリヌクレオチドのシーケンシングによって得られた複数のリードから、該対象遺伝子の特定の領域に対応する対応リード、および、該対応リードのうち該特定の領域内の特定の変異を有する変異リードを抽出する抽出工程と、
所定の有意水準で変異の有無を判定するための閾値を、抽出した該対応リードの数を用いて算出する算出工程と、
抽出した該変異リードの数が算出した該閾値を超える場合に、該特定の変異が存在すると判定する判定工程と、を実行することを特徴とする変異判定プログラム。
【請求項１８】
請求項１７に記載の変異判定プログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、対象遺伝子の変異の有無を判定するためにコンピュータによって実施される変異検出方法、対象遺伝子の変異の有無を判定するためにコンピュータによって実行される変異検出プログラム、および当該変異検出プログラムが記録された記録媒体に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、シーケンサーを用いた遺伝子の変異の有無の判定技術の開発が進められており、疾患の診断のツールとしても高い有用性が認められている。すなわち、特定の疾患関連遺伝子における既知の変異を含む領域をシーケンシングし、得られた配列データに基づいて当該変異の有無を判定することによって、疾患の診断が可能となる。
【０００３】
このような変異の有無の判定技術の一例として、次世代シーケンサーを用いたアンプリコンシーケンシングが挙げられる。アンプリコンシーケンシングでは、まず、対象遺伝子のエクソン領域をＰＣＲ増幅し、得られたＰＣＲ産物を次世代シーケンサーによってシーケンシングする。そして、所定のリファレンス配列に対し、シーケンシングで得られたリードをマッピングすることによって、変異の有無を評価および判定することができる。
【０００４】
このような変異の有無の判定技術は、多数のサンプルの変異の有無を安価に判定することができるという利点を有している一方、シーケンスエラー等に起因して、誤判定を生じ得るという問題がある。特に、癌患者の血流中の癌細胞由来のｃｔＤＮＡ（circulating tumor DNA）の変異を検出する場合のように、対象のＤＮＡを微量にしか含まない検体や、対象のＤＮＡ以外のコンタミネーションを多く含む検体などのバックグランドが高い検体において変異を検出する場合に、この問題は顕著となる。
【０００５】
これに対し、Kukitaらは、ｃｔＤＮＡにおいて、癌関連遺伝子である上皮成長因子受容体（epidermal growth factor receptor，ＥＧＦＲ）遺伝子の変異を検出する方法を確立したことを報告している（非特許文献１）。非特許文献１の方法では、変異箇所毎に、変異が存在しない正常検体のシーケンスデータから推定した統計モデルに基づいて閾値を算定し、判定対象となる検体のシーケンシング結果と当該閾値とを比較することによって変異を検出する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Kukita et al., PLoS One. 8(11) e81468, 2013.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
非特許文献１に記載の技術では、予め、正常検体のシーケンスデータから閾値を算定しておき、その後に、判定対象の検体のシーケンシングを行い、その結果に基づいて変異の検出を行う。詳細には、正常検体のシーケンスデータから１０００００リード中に検出される変異リードの数の確率分布として統計モデルを推定し、当該統計モデルから閾値を算定する。そして、検体について、１０００００リード以上のディープシーケンシングを行い、得られた結果を、１０００００リード中に検出される変異リードの数に変換してから，閾値と比較している。
【０００８】
このとき、検体毎および領域毎に、検体から得られるリード数が異なる場合がある。例えば、検体について複数の領域を同時にＰＣＲ増幅した後にシーケンシングを行う場合、各領域における増幅率が一定にならないことがあり、その結果、検体毎および領域毎に、検体から得られるリード数が異なってしまう。
【０００９】
非特許文献１に記載の技術では、固定された数のリード中に検出される変異リードの数の確率分布として統計モデルを予め推定し、検体のシーケンシング結果を、固定された数のリード中に検出される変異リードの数に変換して判定を行っているため、検体毎および領域毎にリード数が異なると、検体毎および変異毎に判定基準が変わり、正確な判定ができない場合がある。
【００１０】
上記の状況を鑑み、本発明の主たる目的は、検体から得られるリード数が検体毎および領域毎に異なる場合であっても、高精度に変異の有無を判定するための技術を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記の課題を解決するために、本発明の一態様に係る変異判定方法は、対象遺伝子の変異の有無を判定するためにコンピュータによって実施される変異判定方法であって、検体由来のポリヌクレオチドのシーケンシングによって得られた複数のリードから、該対象遺伝子の特定の領域に対応する対応リード、および、該対応リードのうち該特定の領域内の特定の変異を有する変異リードを抽出する抽出工程と、抽出した該対応リードの数から所定の有意水準で変異の有無を判定するための閾値を算出する算出工程と、抽出した該変異リードの数が算出した該閾値を超える場合に、該特定の変異が存在すると判定する判定工程と、を包含する。
【００１２】
上記構成によれば、対応リードを抽出する毎に、抽出された対応リードの数に基づいて閾値を算出することにより、実際の対応リードの数を用いて、所定の有意水準で変異の有無を判定するための閾値をより適切に算出することができる。これにより、検体から得られるリード数が検体毎および領域毎に異なる場合であっても、高精度に変異の有無を判定することができる。
【００１３】
本発明の一態様に係る変異判定方法では、上記コンピュータには、上記特定の変異に対応付けられた統計モデルを示す統計モデル情報が記憶されており、上記算出工程では、上記統計モデル情報を参照して、該対応リードの数から所定の有意水準の有意差の有無を判定するための閾値を算出してもよい。
【００１４】
上記構成によれば、コンピュータに記憶されている統計モデル情報を参照することにより、特定の変異に対応付けられた統計モデルを用いて、所定の有意水準で変異の有無を判定するための閾値を好適に算出することができる。
【００１５】
本発明の一態様に係る変異判定方法では、上記統計モデル情報には、上記特定の変異に対応付けられた統計モデルの種別が含まれていてもよい。
【００１６】
上記構成によれば、統計モデル情報に、統計モデルの種別（例えば、ポアソン分布、負の二項分布など）が含まれているため、変異毎に適した確率分布モデルを使用して、より好適に閾値を算出することができる。
【００１７】
本発明の一態様に係る変異判定方法では、上記統計モデル情報には、上記特定の変異に関する正常検体データがさらに含まれていてもよい。
【００１８】
上記構成によれば、統計モデル情報に、正常検体データが含まれているため、所定の有意水準で変異の有無を判定するための閾値を好適に算出することができる。
【００１９】
本発明の一態様に係る変異判定方法では、上記コンピュータには、上記特定の変異に対応付けて、閾値の最小値を使用するか否かを示す最小値情報が記憶されており、
上記算出工程では、該最小値情報が閾値の最小値を使用することを示している場合、予め定められた統計モデルを参照して、該対応リードの数から算出される閾値の最小値を、上記閾値として算出してもよい。
【００２０】
上記構成によれば、閾値が過度に小さくなることを防ぐことができる。これにより、判定結果の信頼性を向上させることができる。
【００２１】
本発明の一態様に係る変異判定方法では、上記コンピュータには、複数のリファレンス配列が記憶されており、上記抽出工程は、上記複数のリードを、上記複数のリファレンス配列の各々にマッピングすることを含むことが好ましい。
【００２２】
上記構成によれば、上記複数のリードを、上記複数のリファレンス配列の各々にマッピングすることによって、当該複数のリードから、対象遺伝子の特定の領域に対応する対応リード、および、対応リードのうち特定の変異を有する変異リードを好適に抽出することができる。
【００２３】
本発明の一態様に係る変異判定方法では、上記特定の変異が、一塩基置換変異である場合には、上記リファレンス配列は、上記特定の領域の配列である特定リファレンス配列を含み、上記抽出工程では、当該特定リファレンス配列にマッピングされた上記リードを上記対応リードとして抽出すると共に、抽出した当該対応リードの各々が上記特定の変異を有するか否かを判定し、上記特定の変異を有する当該対応リードを上記変異リードとして抽出してもよい。
【００２４】
上記構成によれば、上記特定の変異が、一塩基置換変異である場合に、対応リードおよび変異リードを好適に抽出することができる。
【００２５】
本発明の一態様に係る変異判定方法では、上記特定の変異が、挿入および欠失の少なくとも一方の変異である場合には、上記リファレンス配列は、上記特定の領域の配列である特定リファレンス配列と、当該特定リファレンス配列において挿入および欠失の少なくとも一方が生じている配列である検出用リファレンス配列とを含み、上記抽出工程では、上記特定リファレンス配列にマッピングされた上記リードおよび上記検出用リファレンス配列にマッピングされた上記リードを上記対応リードとして抽出すると共に、上記検出用リファレンス配列にマッピングされた上記リードを上記変異リードとして抽出してもよい。
【００２６】
上記構成によれば、上記特定の変異が、挿入および欠失の少なくとも一方からなる変異である場合に、対応リードおよび変異リードを好適に抽出することができる。
【００２７】
本発明の一態様に係る変異判定方法では、上記特定の変異は、予め定められた塩基の挿入および予め定められた塩基の欠失の少なくとも一方からなる変異であり、上記検出用リファレンス配列には、互いに異なる変異に対応する複数の検出用リファレンス配列が含まれており、上記抽出工程では、上記検出用リファレンス配列のうち、上記特定の変異に対応する検出用リファレンス配列にマッピングされた上記リードを上記変異リードとして抽出してもよい。
【００２８】
上記構成によれば、上記特定の変異が、予め定められた塩基の挿入および予め定められた塩基の欠失の少なくとも一方からなる変異である場合、換言すれば、上記特定の変異が、特定のタイプの挿入および／または欠失変異である場合に、対応リードおよび変異リードを好適に抽出することができる。これにより、挿入および／または欠失変異が存在するか否かの判定しかできなかった従来技術に比べ、挿入および／または欠失変異をタイプ毎に検出することができるため、より詳細な変異情報を得ることができる。また、挿入および／または欠失の変異の有無を判定するための閾値を、タイプ毎に算出するため、より精度高い判定を行うことができる。
【００２９】
本発明の一態様に係る変異判定方法において、上記抽出工程では、単一の上記検出用リファレンス配列にマッピングされた上記変異リードのうち、当該検出用リファレンス配列との間で配列の不一致がある不一致リードの割合が所定の割合を超えている場合、当該不一致リードを、上記対応リードおよび上記変異リードから除外してもよい。
【００３０】
上記構成によれば、特定の変異が、挿入および欠失の少なくとも一方の変異である場合に、単一の検出用リファレンス配列との間で配列の不一致がある不一致リードを信頼性の低いリードとして除去することにより、判定の信頼性を向上させることができる。
【００３１】
特に、不一致リードが全体に占める割合が所定の割合を超えており、判定結果に対する影響が大きい場合に限って除外することにより、効率よく判定を行うことができる。
【００３２】
本発明の一態様に係る変異判定方法において、上記抽出工程では、複数の上記リファレンス配列にマッピングされた上記リードを、上記対応リードおよび上記変異リードから除外してもよい。
【００３３】
上記構成によれば、複数のリファレンス配列にマッピングされたリードを、信頼性の低いリードとして除去することにより、判定の信頼性を向上させることができる。
【００３４】
本発明の一態様に係る変異判定方法では、上記抽出工程において、少なくとも一つの上記リードが、上記対応リードから除外された場合に、警告を出力する警告工程をさらに包含してもよい。
【００３５】
上記構成によれば、信頼性の低いリードを除去した場合に、警告を出力することにより、ユーザに判定の信頼性を認識させることができる。
【００３６】
本発明の一態様に係る変異判定方法では、上記対象遺伝子は、ＥＧＦＲ遺伝子であってもよく、上記複数のリファレンス配列は、配列番号１〜１０１に示される塩基配列の各々を含んでいてもよい。
【００３７】
上記構成によれば、ＥＧＦＲ遺伝子の変異を好適に検出することができる。特に、上記リファレンス配列には、既知の挿入および／または欠失変異のほぼ全タイプに対応する検出用リファレンス配列（配列番号５〜１３、１５〜１８、２０〜３３、３５〜１０１）が含まれている上、リードエラーを考慮した検出用リファレンス配列（配列番号１４、１９、３４）が含まれているため、挿入および／または欠失変異を精度高く判定することができる。
【００３８】
本発明の一態様に係る変異判定方法では、上記抽出工程の前に、上記リファレンス配列を、外部のデータベースから取得した情報に基づいて更新する更新工程をさらに包含してもよい。
【００３９】
上記構成によれば、外部のデータベースから最新の知見に基づくリファレンス配列を使用することができるため、所望の変異を好適に検出することができる。
【００４０】
本発明の一態様に係る変異判定方法において、上記抽出工程では、上記対応リードの抽出の前に、所定の長さよりも短い上記リードを除去してもよい。
【００４１】
上記構成によれば、短いリードを除去することにより、判定の信頼性を向上させることができる。
【００４２】
本発明の一態様に係る変異判定方法では、上記ポリヌクレオチドは、ＰＣＲ産物であり、上記シーケンシングは、同一の領域を重複して読むことにより複数の上記リードを取得するシーケンシングであってもよい。
【００４３】
上記構成によれば、変異の判定を好適に行うことができる。
【００４４】
本発明の一態様に係る変異判定プログラムは、対象遺伝子の変異の有無を判定するためにコンピュータによって実行される変異判定プログラムであって、検体由来のポリヌクレオチドのシーケンシングによって得られた複数のリードから、該対象遺伝子の特定の領域に対応する対応リード、および、該対応リードのうち該特定の領域内の特定の変異を有する変異リードを抽出する抽出工程と、抽出した該対応リードの数から所定の有意水準で変異の有無を判定するための閾値を算出する算出工程と、抽出した該変異リードの数が算出した該閾値を超える場合に、該特定の変異が存在すると判定する判定工程と、を実行する。
【００４５】
上記構成によれば、本発明の一態様に係る変異判定方法と同等の効果を奏する。
【００４６】
また、本発明の一態様に係る変異判定プログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体も本発明の範疇である。
【発明の効果】
【００４７】
本発明によれば、検体から得られるリード数が検体毎および領域毎に異なる場合であっても、高精度に変異の有無を判定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】本発明の一実施形態に係る変異判定方法を実行するコンピュータ等の概略図である。
【図２】本発明の一実施形態に係る変異判定方法のフローを示す図である。
【図３】本発明の一実施形態に係るＳＮＶの検出処理のフローを示す図である。
【図４】本発明の一実施形態に係るＩｎＤｅｌの検出処理のフローを示す図である。
【図５】本発明の一実施形態に係る統計選択モデルの選択処理のフローを示す図である。
【図６】本発明の一実施形態に係る閾値決定処理のフローを示す図である。
【図７】本発明の一実施形態に係るポアソン分布の閾値決定処理のフローを示す図である。
【図８】本発明の一実施形態に係る負の二項分布の閾値決定処理のフローを示す図である。
【図９】本発明の実施例に係るテンプレート配列数とマッピングの状況を模式化した図である。
【図１０】本発明の実施例に係る文献の公開データの腫瘍検体を用いたテンプレート配列数の増加による、ミスマッピングの改善例を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００４９】
本発明の実施の形態について説明すれば、以下の通りである。なお、本発明は、これに限定されるものではない。
【００５０】
〔用語等の定義〕
本明細書において、「ポリヌクレオチド」は、「核酸」または「核酸分子」とも換言でき、ヌクレオチドの重合体を意図している。また、「塩基配列」は、「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」とも換言でき、特に言及のない限り、デオキシリボヌクレオチドの配列またはリボヌクレオチドの配列を意図している。また、一本鎖または二本鎖のポリヌクレオチドを包含している。
【００５１】
本明細書において、「検体」は、「サンプル」とも換言でき、当該分野において標本、調製物と同義で用いられ、供給源としての生物材料（例えば、個体、体液、細胞株、組織培養物もしくは組織切片）から得られる、任意の調製物が意図される。
【００５２】
本明細書において、「検体由来のポリヌクレオチド」は、「ポリヌクレオチド配列サンプル」とも称され、検体を処理することによって得られるポリヌクレオチドを意図する。ポリヌクレオチドを得るための処理としては、核酸抽出処理、核酸増幅処理、逆転写処理等の当該分野において公知の処理を含む。
【００５３】
本明細書において「リード（read）」「リード配列」または「シーケンスリード」は、シーケンシングによって得られたポリヌクレオチド配列を意味しており、シーケンサーから出力される配列を指している。本明細書において、遺伝子の特定の領域に対応するリードとは、当該遺伝子の特定の領域と同一または許容される範囲の変異を含む配列を有するリードを指す。本明細書において、遺伝子の特定の変異に対応するリードとは、当該遺伝子の特定の変異を含む領域に対応するリードであって、当該特定の変異を含む配列を有するリードを指す。
【００５４】
本明細書において、「ＩｎＤｅｌ（Insertion and/or Deletion）」は、挿入、欠失、または挿入および欠失の両方が含まれた変異を意味している。「挿入および／または欠失変異」と記載することもある。
【００５５】
本明細書において、「ＳＮＶ（Single Nucleotide Variant）」は、一塩基置換変異を意味している。
【００５６】
本明細書において、「ｄｅｐｔｈ」は、同一の配列または領域のシーケンシングによって得られた総リード数を意味している。
【００５７】
本明細書において「リファレンス（reference）」または「リファレンス配列」は、リードが遺伝子上のどの領域に対応するか、および／または、リードが遺伝子上のどの変異に対応するかを判定するために、リードをマッピングする対象となる配列である。変異がＳＮＶである場合には、リファレンス配列は、遺伝子の野生型の部分配列であり得る。変異がＩｎＤｅｌである場合には、リファレンス配列は、遺伝子の野生型の部分配列と、当該野生型の部分配列から、公知または非公知のＩｎＤｅｌが生じた配列とを含み得る。なお、本明細書においては、遺伝子の野生型の部分配列から、公知または非公知のＩｎＤｅｌが生じた配列を、「テンプレート（templete）」または「テンプレート配列」とも呼ぶ。
【００５８】
本明細書において「ＲＥＲ（read error rate）」は読み取りエラー率を意味し、シーケンシングによって得られた総シーケンスリード数に対する、塩基の読み取りエラーの生じたリード数の割合を指す。ここで、読み取りエラーとは、本来の配列とは異なる塩基として読み取ってしまうエラーのことであり、サンプルがＰＣＲ産物の場合には、シーケンシング時に生じたエラーおよびＰＣＲ時に生じたエラーの両方を包含する。
【００５９】
本明細書において「整列」は、既知配列であるリファレンス配列に対するサンプルのポリヌクレオチド配列中の１つ以上のヌクレオチドの順番の一致として同定される配列の状態を意図している。このような整列は、公知のコンピュータアルゴリズムによって行うことができる。
【００６０】
本明細書において「統計モデル」は、「分布モデル」、「確率分布モデル」とも称され、本明細書において用いられる場合、読み取りエラー率の確率分布を表す統計モデルを指している。
【００６１】
本明細書において「パラメータ」は、数量的データセットおよび／または数量的データセット相互間の数的関係性を特徴付ける変数を意味しており、例えば、分布モデルに適用される変数として記載されている。
【００６２】
本明細書において用語「閾値」は、以下の実施形態において説明する分布モデルを用いて算出され、サンプルのポリヌクレオチド配列中の変異の判定において、カットオフ値として作用するリード数としての任意の数値を意味する。本発明の閾値の設定方法は、以下の（工程６．閾値の設定）および実施例等において詳細に説明している。
【００６３】
本明細書において「マッピング」は、対象となるリファレンス配列に各リードを整列させる処理を意味している。
【００６４】
本明細書において「陽性」は、リード配列が判定対象となる真の変異を有していることを意味する。
【００６５】
本明細書において「偽陽性」は、リード配列が判定対象となる真の変異を有していないにもかかわらず、変異を有すると判断されることを意味する。
【００６６】
本明細書において「陰性」は、リード配列が対象となる変異を有していないことを意味する。
【００６７】
本明細書において「被検体」とは、ヒト被検体並びにヒトではない被検体、例えば、哺乳類、無脊椎動物、脊椎動物、菌類、酵母、細菌、ウイルスおよび植物などを指す。本明細書の実施例はヒト被検体に関しているが、本発明の概念はヒト以外の任意の動物または植物等の生物由来のゲノムに適用でき、医療、獣医学および動物科学等の分野において有用である。
【００６８】
本明細書において「診断する」または「診断」とは、医師によってなされる、患者の徴候および症状に基づく疾患、障害または病態の同定を指す。
【００６９】
本明細書中の「検査」とは、医師による同定（診断）を必須としない、検査対象のヒトを含む被検体における、疾患の素因の有無または発症の有無の検査を指す。
〔変異判定方法および変異判定プログラム〕
本発明の一実施形態に係る変異判定方法は、対象遺伝子の変異の有無を判定するためにコンピュータによって実施される変異判定方法であって、例えば、図１に示すコンピュータ１０によって実施され得る。
【００７０】
図１に示すように、コンピュータ１０は、処理部１１、記憶部１２および通信部１３を備えており、記憶部１２に記憶されている変異判定プログラム１００を処理部１１が実行することにより、本実施形態に係る変異判定方法が実施される。変異判定プログラム１００は、変異判定方法の各工程を実施するための命令群１０１、リファレンス配列１０２、最小値情報１０３および統計モデル情報１１０を含んでいる。統計モデル情報１１０は、統計モデル種別１１１および正常検体データ１１２を含んでいる。
【００７１】
また、コンピュータ１０は、シーケンサー２０に接続されており、シーケンサー２０からシーケンシングの結果を入力されるようになっている。なお、一実施形態において、コンピュータ１０は、ＩｏｎＰＧＭ（登録商標）を用いたシーケンシングデータの解析を行うようになっており、本実施形態に係る変異検出方法は、ＩｏｎＰＧＭ（登録商標）を用いたシーケンシングデータの解析完了後のランに対して実行するようになっている。また、通信部１３は、ネットワークを介して外部サーバ３０との間で通信を行うようになっている。
【００７２】
＜判定対象となる変異について＞
本実施形態に係る変異判定方法で判定可能な変異の種類は、ＩｎＤｅｌおよびＳＮＶである。よって、サンプルのポリヌクレオチド配列としては、ＩｎＤｅｌ、ＳＮＶおよびこれらの組み合わせの変異の何れかを有しているものが挙げられる。すなわち、サンプルのポリヌクレオチド配列は、挿入変異、欠失変異および一塩基置換変異のうちの何れかを有する配列であってもよく、これらの変異のうちの２種類以上の変異を同時に有する配列であってもよい。また、ＳＮＶおよびＩｎＤｅｌの変異の両方の変異を有するなど、２種類以上の変異を有する場合は、それぞれの変異毎に独立した検出フローを実行して各変異を個別に検出してもよい。また、例えば、ＩｎＤｅｌおよびＳＮＶの両方を有する配列、ならびに挿入が生じた後に、欠失が起こった配列なども、本実施形態の判定の対象である。なお、一塩基置換変異には、サイレント変異も含まれる。本実施形態に係る変異判定方法の対象とする変異型は、例えば、ＩｎＤｅｌが挙げられ、さらなる一例はＤｅｌｅｔｉｏｎである。本実施形態では所望の個数の、所望の配列を有するものをリファレンス配列として設定することができるため、マッピングにおけるミスマッチを減らすことができ、従来公知の技術と比較して、ＩｎＤｅｌの変異をより好適に検出することができる。
【００７３】
本実施形態に係る変異判定方法で判定対象となる欠失変異における欠失領域の長さは、特に限定されず、任意の長さであってよいが、一例としては５ｂｐ〜３０ｂｐであり、他の例としては１０ｂｐ〜３０ｂｐである。欠失領域が５ｂｐ以上または１０ｂｐ以上であれば、野生型のリファレンス配列との相違が十分に大きく、より高い精度で判定することができる。
【００７４】
また、本実施形態に係る変異判定方法で判定対象となる挿入変異における挿入領域の長さは、下限の長さが、例えば５ｂｐ以上、または１０ｂｐ以上である。挿入領域が５ｂｐ以上または１０ｂｐ以上であれば、野生型のリファレンス配列との相違が十分に大きく、より高い精度で判定することができる。また、上限の長さは、一本のシーケンスリード長より十分に短い長さである必要がある。
【００７５】
＜シーケンシング技術およびシーケンシング装置＞
本実施形態に係る変異判定方法は、好ましくは、次世代シークエンシング技術を用いたシーケンシングによって得られたシーケンシングデータを対象としている。すなわち、シーケンサー２０としては、次世代シーケンサーを用いることが好ましい。次世代シーケンサーは、近年開発の進められている一群の塩基配列解析装置であり、クローン的に増幅したＤＮＡテンプレート又は単独ＤＮＡ分子をフローセル内で大量に並列処理を行うことによって、飛躍に向上した解析能力を有している。具体的には、ライフテクノロジー社のＩｏｎ  ＰＧＭ（登録商標）などが挙げられるが、これらに限定されず、今後開発される装置も含まれる。
【００７６】
また、本実施形態において使用可能なシークエンシング技術は、同一の領域を重複して読むこと（ディープシーケンシング）により複数のリードを取得するシーケンシング技術であり得る。
【００７７】
本実施形態において使用可能なシークエンシング技術の例としては、イオン半導体シークエンシング、ピロシークエンシング（pyrosequencing）、可逆色素ターミネータを使用するシークエンシング・バイ・シンセシス（sequencing-by-synthesis）、シークエンシング・バイ・リゲーション（sequencing-by-ligation）、およびオリゴヌクレオチドのプローブ結紮によるシークエンシングなどの、サンガー法以外のシーケンス原理に基づく、１ラン当たりに多数のリードを取得可能なシーケンシング技術が挙げられる。
【００７８】
シーケンシングに用いるシーケンシングプライマーは特に限定されず、目的の領域を増幅させるのに適した配列に基づいて、適宜設定される。また、シーケンシングに用いられる試薬についても、用いるシーケンシング技術およびシーケンシング装置に応じて好適な試薬を選択すればよい。
【００７９】
一実施形態および以下に示す実施例では、ライフテクノロジー社のＩｏｎ  ＰＧＭ（登録商標）を用いて、アンプリコンシーケンスを実施している。一実施例としては、ＥＧＦＲ遺伝子の変異を検出するためのシーケンシングプライマーは変異を含むエクソン（エクソン１８、１９、２０および２１）の領域に設定される。
【００８０】
なお、本発明に係るシーケンスシング技術には、複数のサンプル由来の配列を１ラン中で同時にシーケンスを行う、マルチプレックス法も含まれる。マルチプレックス法の場合は、各サンプル毎のデータを区別するために、各サンプルに固有の「バーコード」配列を付加することによって、データ解析時にサンプル毎にシーケンスデータを識別できる。このマルチプレックス法を用いれば、大量のサンプルの解析においても、データ取得までの時間を劇的に短縮することができる。
【００８１】
＜シーケンスデータ＞
上述のシーケンシンサー２０を用いたシーケンシングによって得られた全リード配列を、本実施形態におけるシーケンシングデータとして使用する。上述のシークエンシングにより、判定対象の各領域毎に、好ましくは１，０００個以上、より好ましくは１００，０００個以上またはそれ以上のリードを生成してもよい。なお、リード数が多いほど検出感度は上昇する。リード長は、使用するプラットフォームに依存した長さを有していればよい。例えば、配列リード長は、使用するマッピングソフトウェアに適合するものであればよく、例えば、１００〜２００ｂｐであってもよく、ペアエンドリードを含んでもよい。このシーケンスデータは、リファレンス配列に対して整列することによってマッピングされ、変異の判定処理が行われる。
【００８２】
なお、本発明に係るシーケンスデータは、例えばＦＡＳＴＡ形式、ＦＡＳＴＱ形式等で取得されたデータを使用することができる。
【００８３】
＜リファレンス配列の決定＞
本実施形態におけるリファレンス配列１０２は、少なくとも対象となる変異が存在する領域を含む配列から決定される。リファレンス配列の一例は、対象の配列に基づく、少なくとも変異を含む特定の領域の配列である。対象となるゲノム配列中の特に、エクソンの領域の変異を含む場合、リファレンス配列は、当該エクソンの領域に限定的に設定すればよい。ＳＮＶを検出するために用いるリファレンス配列は、対象となる遺伝子の野生型の配列（特定リファレンス配列）であり、ＩｎＤｅｌを検出するために用いるリファレンス配列は、対象となる遺伝子の野生型の配列（特定リファレンス配列）と公知のＩｎＤｅｌの変異を含む配列（検出用リファレンス配列）とである。なお、ＳＮＶを検出するために用いる特定リファレンス配列は、対象となる遺伝子の全長の野生型のゲノム配列であってもよい。
【００８４】
リファレンス配列の全長の長さは特に限定されず、目的に応じて所望の長さの配列を用いることができる。ただし、解析の完了までにかかる時間はリファレンス配列の長さに依存して長くなる。
【００８５】
また、本実施形態に係る変異判定方法において、１つの判定に使用するためのリファレンス配列の個数は特に限定されず、検出したい変異の数に応じて設定される。
【００８６】
一実施形態において、特定リファレンス配列は、判定対象の変異が含まれるエクソン毎に作成されているものであり得る。
【００８７】
このような特定リファレンス配列の一例として、変異判定方法が、ＥＧＦＲ遺伝子の変異の有無を判定するものであるときに、特定リファレンス配列には、配列番号１に示す野生型ＥＧＦＲエクソン１８の配列である特定リファレンス配列、配列番号２に示す野生型ＥＧＦＲエクソン１９の配列である特定リファレンス配列、配列番号３に示す野生型ＥＧＦＲエクソン２０の配列である特定リファレンス配列および配列番号４に示す野生型ＥＧＦＲエクソン２１の配列である特定リファレンス配列が含まれ得る。
【００８８】
また、一実施形態において、検出用リファレンス配列は、公共のデータベース上から入手された変異に関する情報に基づいて、頻度の高い変異型のみを選択して、予め作成されているものであり得る。
【００８９】
このような検出用リファレンス配列の一例として、変異判定方法が、ＥＧＦＲ遺伝子の変異の有無を判定するものであるときに、検出用リファレンス配列には、配列番号５〜１１、１３、１５〜１８、２２、２８、３１、３３、３５および３９に示す検出用リファレンス配列が含まれ得る。これらの検出用リファレンス配列は、配列番号２に示す野生型ＥＧＦＲエクソン１９の配列である特定リファレンス配列に対して、ＣＯＳＭＩＣデータベースから取得した頻度の高いＩｎＤｅｌ変異が反映されたものである。
【００９０】
また、別の実施形態において、検出用リファレンス配列の配列は、最新の公共のデータベース上から入手された変異に関する情報に基づいて得られたほぼ全ての変異型について、予め作成されているものである。このように対象となる変異に対応する多数のリファレンス配列を設定することによって、誤ったリファレンスにマッピングされて偽陽性として検出されることを防ぐことができる。結果として、サンプルに含まれる核酸配列をより適切な各変異型に対応する塩基配列にマッピングすることができる。
【００９１】
このような検出用リファレンス配列の一例として、変異判定方法が、ＥＧＦＲ遺伝子の変異の有無を判定するものであるときに、検出用リファレンス配列には、配列番号５〜１３、１５〜１８、２０〜３３、３５〜１０１に示す検出用リファレンス配列が含まれ得る。これらの検出用リファレンス配列は、配列番号２に示す野生型ＥＧＦＲエクソン１９の配列である特定リファレンス配列に対して、ＣＯＳＭＩＣデータベースから取得したほぼ全てのＩｎＤｅｌ変異が反映されたものである。
【００９２】
また、使用するシーケンサーの特性上、シーケンシングの際に、高い確率で特定のリードエラー（例えば、ＧＧをＧと読み間違えるなど）が生じることがある。マッピングする領域にそのようなリードエラーが生じ得る配列が存在する場合、当該リードエラーに対応するための検出用リファレンス配列をさらに準備してもよい。
【００９３】
リードエラーに対応するための検出用リファレンス配列は、本来の配列に対して、当該リードエラーが少なくとも一つ生じて誤配列となっている配列である。このようなリードエラーは、挿入変異、欠失変異および一塩基置換変異の何れであるかに依らず、使用するシーケンサーにおいて、高い確率で生じることが知られているものであり得る。また、リードエラーに対応するための検出用リファレンス配列としては、生じ得る全てのリードエラーが反映された配列である必要はなく、そのうちの一部が反映されたものであってよい。
【００９４】
このようなリードエラーに対応するための検出用リファレンス配列を用意することによって、本来変異として陽性判定されるべきリードが、リードエラーを含むために対象の変異に対応する検出用リファレンスにマッピングされなくなることを防ぐことができる。そのため、より高精度の判定を行うことができる。
【００９５】
このような検出用リファレンス配列の一例として、変異判定方法が、ＥＧＦＲ遺伝子の変異の有無を判定するものであるときに、検出用リファレンス配列には、（ｉ）配列番号５〜１３、１５〜１８、２０〜３３、３５〜１０１に示す検出用リファレンス配列に加えて、（ｉｉ）配列番号１３、１８および３３に示す検出用リファレンス配列に対して、ＧＧがＧとして読み間違えられるリードエラーが反映された、配列番号１４、１９および３４に示す、リードエラーに対応するための検出用リファレンス配列が含まれ得る。この場合、リファレンス配列には、配列番号１〜１０１に示されるリファレンス配列が含まれることになる。
【００９６】
一実施形態において、リファレンス配列の配列情報は公共の公開配列情報データベース上から入手された野生型配列をもとに、公共の公開既知変異情報データベース上から入手された変異に関する情報に基づいて予め作成されているものである。
【００９７】
公開配列情報データベースとしては、NCBI RefSeq（ウェブページ、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/）、NCBI GenBank（ウェブページ、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/）、UCSC Genome Browser（ウェブページ、https://genome.ucsc.edu/）などが挙げられる。公開既知変異情報データベースとしては、ＣＯＳＭＩＣデータベース（ウェブページ、http://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic/)、およびdbSNP（ウェブページ、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/）などが挙げられる。また、リファレンス配列は、その他の商業用データベース、公知文献および実験データ等に基づいて新たに作成したデータベースを用いてもよく、これらの複数のデータベースを組み合わせて用いてもよい。また、リファレンス配列の個数、各配列の長さなどは、これらのデータベース等から取得した配列および配列に関する詳細な情報を用い、目的に応じて適宜設定される。例えば、さらに公開既知変異に関し、人種あるいは動物種別毎の頻度情報を考慮してリファレンス配列を設定してもよい。このような情報を有する公開既知変異情報データベースとしては、HapMap Genome Browser release #28（ウェブページ、http://hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/cgi-perl/gbrowse/hapmap28_B36/）、Human Genetic Variation Browser（ウェブページ、http://www.genome.med.kyoto-u.ac.jp/SnpDB/index.html）および（1000 Genomes（ウェブページ、http://www.1000genomes.org/）が挙げられ、これらのデータベースからは、例えば、日本人の変異頻度情報などを入手することができる。
【００９８】
また、他の実施形態として、リファレンス配列は、本実施形態に係る変異判定方法において、最新の公開配列情報データベースから入手した変異に関する情報に基づいて作成されたものであってもよい。すなわち、一実施形態において、本実施形態に係る変異判定方法は、通信部１３が、公開既知変異情報データベース等の外部サーバ３０から変異に関する情報を取得し、記憶部１２に記憶されている特定リファレンス配列（野生型の配列）に対して当該変異を反映させた検出用リファレンス配列（テンプレート配列）を作成して、記憶部１２に記憶させる工程を包含していてもよい。
【００９９】
例を挙げて説明すれば、一実施形態において、変異判定方法が、ＥＧＦＲ遺伝子の変異の有無を判定するものであるときに、通信部１３が、ＣＯＳＭＩＣデータベースから、未取得の変異として、ＥＧＦＲ遺伝子のエクソン１９における「c.2235_2249del15」という変異を取得した場合、通信部１３は、記憶部１２に記憶されているエクソン１９の野生型配列（配列番号２）に対して、「c.2235_2249del15」という変異を反映させて新規な検出用リファレンス配列（配列番号８）を作成し、記憶部１２に記憶させる。
【０１００】
このような構成を有する場合、サンプルに含まれる核酸配列は、最新の変異型にマッピングすることができるため、ミスマッチまたは誤判定を減らすことができ、より精度の高いマッピングが可能となる。
【０１０１】
また、リファレンス配列は、ある変異を有する配列が重複して２つ以上存在しないように、適宜設定する（マルチヒット可能性の除去）。つまり、１変異に対し、１つのリファレンス配列が対応するように決定すればよい。例えば、データベース上では異なるＩＤを付されて異なる検体として登録されているが、同じ変異を有する場合は何れかを除去する。
【０１０２】
＜データ解析フロー＞
以下、本発明の一実施形態に係る変異判定方法のフロー（データ解析フロー）の一例を詳細に説明する。以下では、対象遺伝子としてＥＧＦＲ遺伝子を用い、ＥＧＦＲ遺伝子の所定の変異を検出するフローについて説明するが、本発明はこれに限定されない。
【０１０３】
（工程１．シーケンスリードデータの入力）
図２は、本発明の一実施形態に係るデータ解析フローの一例を示す図である。まず、処理部１１は、判定に供するシーケンスリードデータを処理部１１に入力する（ステップＳ２０１）。本発明の解析に用いられる入力データは、公知のシーケンス解析プログラムを実行後に出力されるシーケンス結果ファイルを用いることが可能である。すなわち、処理部１１は、当該シーケンス結果ファイルを読み出すことによって、シーケンスリードデータを処理部１１に入力する。
【０１０４】
一実施形態では、ＩｏｎＰＧＭから出力されるシークエンス結果ファイル（ファイル名Unaligned BAM）を使用している。このファイルは、ＩｏｎＰＧＭでの通常のマッピング実施前のデータであるため、本発明のソフトウェアを実行するための入力データとして使用可能である。
【０１０５】
（工程２．リードの除去）
ステップＳ２０２に示す通り、解析を行う前に、処理部１１は、解析への使用に適さないリードデータの除去を行う。解析への使用に適さないリードは、例えば、短すぎるリードを意味する。例えば、処理部１１は、ステップＳ２０１において入力されたシーケンスリードデータに含まれるリードのうち、７０ｂｐ以下の長さのリードを除去する。なお、本実施形態はこれに限定されず、処理部１１は、他の一例として、８０ｂｐ以下の長さのリード、または、６０ｂｐ以下の長さのリードを除去してもよい。短すぎるリードを除去することにより、読み取りエラーなどになる可能性の高いリードが取り除かれるために、より高精度な解析を行うことができる。
【０１０６】
（工程３．ＳＮＶの検出処理）
続いて、ステップＳ２０３に示す通り、処理部１１は、ＳＮＶの検出処理を行う。図３は、本発明の一実施形態に係るＳＮＶの検出処理の詳細なフローを示す図である。
【０１０７】
図３に示すように、ＳＮＶの検出フローにおいては、まず、処理部１１は、シーケンスリードを、記憶部１２に記憶されているリファレンス配列（野生型のＥＧＦＲのエクソン１８、１９および２０の配列）に対しマッピングし、対象遺伝子（ＥＧＦＲ遺伝子）の特定の領域（エクソン１８、エクソン２０およびエクソン２１）に対応する対応リードおよび変異リードを抽出する（ステップＳ３０３、抽出工程）。
【０１０８】
マッピングは、リファレンス配列に対し、リードの配列をマッピングするための公知の手法およびコンピュータプログラムを用いて行うことが可能である。なお、本明細書において、「リファレンス配列に対し、リードの配列をマッピングする」とは、リードの配列と、各リファレンス配列とを比較し、リードの配列に対応するリファレンス配列として尤もらしい（例えば、マッピングスコアが最も高い）リファレンス配列を特定することを意味する。本実施形態では、ＩоｎＰＧＭの通常のシーケンシング結果解析プログラムを実行する装置において、BWA 0.6.2のbwaswコマンドを用いて行われる。
【０１０９】
マッピングには配列を整列させる多くの公知のソフトウェアまたはコンピュータアルゴリズムが利用可能である。このようなソフトウェアとしては、特に限定されないが、BWA、Bowtie2およびBFASTなどが挙げられる。アルゴリズムとしては、特に限定されないが、Burrows Wheeler Transform (BWT)、read hash、genome hash、merge sortおよびSmith-Watermanなどが使用可能である。
【０１１０】
処理部１１は、対象遺伝子（ＥＧＦＲ遺伝子）の特定の領域（エクソン１８、エクソン２０およびエクソン２１）のリファレンス配列にマッピングされたリードを対応リードとして抽出するとともに、当該リファレンス配列と当該対応リードの配列とを比較して、当該対応リードにおける変異を検出する。記憶部１２には、本実施形態において検出すべき特定の変異を規定する変異情報が記憶されており、処理部１１は、リファレンス配列と当該リファレンス配列にマッピングされた対応リードの配列とを比較して得られた変異と、変異情報に規定された変異とを比較することにより、対応リードが、本実施形態において検出すべき特定の変異を含んでいるか否かを判定することができる。これにより、処理部１１は、対応リードおよび変異リードを抽出することができる。
【０１１１】
続いて、ステップＳ３０４において、処理部１１は、信頼性の低いマッピング結果および曖昧なマッピング結果を除去する。具体的には、処理部１１は、ステップＳ３０３において抽出した対応リード（および変異リード）のうち、複数のリファレンス配列にマッピングされた対応リード（および変異リード）を除去する。これにより、判定結果の信頼性を向上させることができる。なお、本実施形態では、BWAを用いて得られたマッピング結果において、複数のリファレンスにヒットしたリードを、（mappingQuality=0）かつ（QC fail）としてＢＡＭ（シークエンス結果ファイル）に情報を付加させている。処理部１１は、これらの情報を参照してもよい。
【０１１２】
続いて、ステップＳ３０５において、処理部１１は、変数Ｒに、変異判定に必要な最低リード数を設定する。このような最低リード数の値は、例えば、１０００または１００００といった値に予め定義しておくことができる。
【０１１３】
続いて、処理部１１は、判定対象の変異（変異１、変異２、・・・、変異Ｎ）を順に変えながら、ステップＳ３０６とステップＳ３１４の間を繰り返す。
【０１１４】
まず、ステップＳ３０７において、処理部１１は、変数Ｘに変異毎に測定済みの正常検体データ、変数Ｍに変異毎に定義済みの分布モデル、変数Ｄに対象の変異箇所にマッピングされた総リード数（対応リードの数）、変数Ａに対象の変異箇所にマッピングされた変異リード数をそれぞれ代入する。
【０１１５】
次に、ステップＳ３０８において、処理部１１は、変数Ｄと変数Ｒとを比較し、変数Ｄ＜変数Ｒである場合（Ｙｅｓ）、すなわち、変数Ｄに対象の変異箇所にマッピングされた総リード数（対応リードの数）が、変異判定に必要な最低リード数に満たない場合、ステップＳ３１３において未検出（Ｎ／Ｄ）と判定し、次の変異の判定に移行する。変数Ｄ＜変数Ｒではない場合（Ｎｏ）には、ステップＳ３０９に進む。
【０１１６】
ステップＳ３０９では、処理部１１は、「対象の変異についての正常検体データ」として変数Ｘに代入されたデータ、「対象の変異の分布モデル」として変数Ｍに代入されたデータ、および「観測された総リード数」として変数Ｄに代入された値を用いて閾値決定フローを実行し、所定の有意水準で変異の有無を判定するための閾値を算出する（算出工程）。閾値決定フローの詳細については後述する。
【０１１７】
続いて、ステップＳ３１０において、処理部１１は、変数Ａと、ステップＳ３０９において算出した閾値とを比較し、変数Ａ≧閾値である場合（Ｙｅｓ）、陽性と判定し（ステップＳ３１１、判定工程）、変数Ａ≧閾値でない場合（Ｎｏ）、陰性と判定する（ステップＳ３１２）。
【０１１８】
以上を判定対象の各変異について行う。
【０１１９】
なお、変異が存在しない野生型の配列の場合は、野生型として判定すればよい。また、同一検体において、複数の異なる種類の変異の型が同時にマッピング候補として検出される場合は、各変異型についてそれぞれ独立して、上述した検出フローを実行することによって変異を検出してもよい。
【０１２０】
（工程４．ＩｎＤｅｌの検出処理）
続いて、ステップＳ２０４に示す通り、処理部１１は、ＩｎＤｅｌの検出処理を行う。図４は、本発明の一実施形態に係るＩｎＤｅｌの検出処理の詳細なフローを示す図である。
【０１２１】
図４に示すように、ＩｎＤｅｌの検出フローにおいては、まず、処理部１１は、シーケンスリードを、記憶部１２に記憶されているリファレンス配列（野生型のＥＧＦＲのエクソン１９の配列、および、検出対象のＩｎＤｅｌが反映されたＥＧＦＲのエクソン１９の配列）に対しマッピングして、対応リードおよび変異リードを抽出する（ステップＳ４０２、抽出工程）。
【０１２２】
処理部１１は、対象遺伝子（ＥＧＦＲ遺伝子）の特定の領域（野生型またはＩｎＤｅｌを有するエクソン１９）のリファレンス配列にマッピングされたリードを対応リードとして抽出するとともに、特定の変異（ＩｎＤｅｌ）を有するリファレンス配列にマッピングされた対応リードを変異リードとして抽出する。
【０１２３】
続いて、ステップＳ４０３において、処理部１１は、信頼性の低いマッピング結果および曖昧なマッピング結果を除去する。具体的には、処理部１１は、ステップＳ４０２において抽出した対応リード（および変異リード）のうち、複数のリファレンス配列にマッピングされた対応リード（および変異リード）を除去する。これにより、判定結果の信頼性を向上させることができる。
【０１２４】
また、ステップＳ４０４において、処理部１１は、ＩｎＤｅｌを有するリファレンス配列（テンプレート配列）にマッピングされたリードのうち１０％以上の割合のリードが、テンプレートに対してミスマッチ（不一致）を有している場合に、当該ミスマッチを有するリード（不一致リード）を対応リードおよび変異リードから除去する。なお、ＩоｎＰＧＭのシーケンシング結果解析プログラムでは、ミスマッチを有するリードは、例えば、QC failとしてＢＡＭに情報を付加させ、処理部１１はこれを参照してもよい。なお、本実施形態はこれに限定されず、処理部１１は、他の例として、５〜２０％の範囲以上の割合のリードがミスマッチを有している場合に、当該ミスマッチを有しているリードを除去してもよい。これにより、判定結果の信頼性を向上させることができる。
【０１２５】
また、ミスマッチを有するリード除去について、例えば、１０％以上の不一致リードを除去後のデータに対して、さらにその中で１０％以上の不一致リードを除去する、という処理を不一致リードがなくなるまで繰り返す処理を行ってもよい。このように、繰り返し除去を行うことにより、不一致リードを可能な限り除去することができる。
【０１２６】
なお、ミスマッチとは、リファレンス配列に対するリード配列の１か所以上の相違の存在を指している。ここで、一か所以上の相違とは、少なくとも一つの塩基の相違、少なくとも一塩基以上の塩基の欠失および／または挿入、ならびにこれらの組み合わせである。上述の割合以上でミスマッチが存在する場合、これらのリードは偽陽性の要因となり得る。例えばリファレンス配列には存在しない新規な変異を含むリードは、ミスマッチとして除去され得る。
【０１２７】
続いて、ステップＳ４０５において、処理部１１は、変数Ｒに、変異判定に必要な最低リード数を設定する。
【０１２８】
続いて、処理部１１は、判定対象の変異（変異１、変異２、・・・、変異Ｎ）を順に変えながら、ステップＳ４０６とステップＳ４１４の間を繰り返す。
【０１２９】
まず、ステップＳ４０７において、処理部１１は、変数Ｘに変異毎に測定済みの正常検体データ、変数Ｍに変異毎に定義済みの分布モデル、変数Ｄに対象の変異箇所にマッピングされた総リード数（対応リードの数）、変数Ａに対象の変異箇所にマッピングされた変異リード数をそれぞれ代入する。
【０１３０】
次に、ステップＳ４０８において、処理部１１は、変数Ｄと変数Ｒとを比較し、変数Ｄ＜変数Ｒである場合（Ｙｅｓ）、すなわち、変数Ｄに対象の変異箇所にマッピングされた総リード数（対応リードの数）が、変異判定に必要な最低リード数に満たない場合、ステップＳ４１３において未検出（Ｎ／Ｄ）と判定し、次の変異の判定に移行する。変数Ｄ＜変数Ｒではない場合（Ｎｏ）には、ステップＳ４０９に進む。
【０１３１】
ステップＳ４０９では、処理部１１は、「対象の変異についての正常検体データ」として変数Ｘに代入されたデータを、「対象の変異の分布モデル」として変数Ｍに代入されたデータを、「観測された総リード数」として変数Ｄに代入された値を用いて閾値決定フローを実行し、所定の有意水準で変異の有無を判定するための閾値を算出する（算出工程）。閾値決定フローの詳細については後述する。
【０１３２】
続いて、ステップＳ４１０において、処理部１１は、変数Ａと、ステップＳ４０９において算出した閾値とを比較し、変数Ａ≧閾値である場合（Ｙｅｓ）、陽性と判定し（ステップＳ４１１、判定工程）、変数Ａ≧閾値でない場合（Ｎｏ）、陰性と判定する（ステップＳ４１２）。
【０１３３】
以上を判定対象の各変異について行う。なお、本実施形態において、判定対象となるＩｎＤｅｌ変異は、特定のタイプのＩｎＤｅｌ変異（すなわち、予め定められた塩基の挿入および予め定められた塩基の欠失の少なくとも一方からなる変異）である。そして、検出用リファレンス配列には、互いに異なる変異に対応する複数の検出用リファレンス配列が含まれており、ステップＳ４０２では、検出用リファレンス配列のうち、判定対象となる特定のタイプのＩｎＤｅｌ変異に対応する検出用リファレンス配列にマッピングされたリードを変異リードとして抽出する。これにより、特定のタイプのＩｎＤｅｌ変異の有無を首尾良く判定することができる。これにより、何らかのＩｎＤｅｌ変異が存在するか否かの判定しかできなかった従来技術に比べ、ＩｎＤｅｌ変異をタイプ毎に検出することができるため、より詳細な変異情報を得ることができる。また、ＩｎＤｅｌ変異の有無を判定するための閾値を、タイプ毎に算出するため、より精度高い判定を行うことができる。
【０１３４】
また、一実施形態において、上述のＩｎＤｅｌの検出処理と並行して、ステップＳ４０２において、従来技術と同様に、何れかの検出用リファレンスにマッピングされた対応リードを全て変異リードとして抽出することにより、何らかのＩｎＤｅｌ変異が存在するか否かの判定をおこなってもよい。これにより、検出用リファレンスに対応していないＩｎＤｅｌ変異が存在していた場合にも、何らかのＩｎＤｅｌ変異が存在することを検出することができる。
【０１３５】
また、一実施形態において、検出用リファレンス配列に、上述したリードエラーに対応するための検出用リファレンス配列が含まれている場合、ステップＳ４０２において、リードエラーを含まない判定対象の変異に対応する検出用リファレンス配列にマッピングされたリードと、当該検出用リファレンス配列に対してリードエラーが反映された、リードエラーに対応するための検出用リファレンス配列にマッピングされたリードとの両方のリードを、判定対象の変異に対応する変異リードとして抽出してもよい。これにより、リードエラーを含むために判定対象の変異に対応する検出用リファレンスにマッピングされなかったリードも、リードエラーに対応するための検出用リファレンス配列にマッピングされることにより、判定対象の変異に対応する変異リードとして抽出することができる。これにより、誤判定を防ぎ、より高精度の判定を行うことができる。
【０１３６】
最後に、得られた変異の判定結果を出力する。例えば、処理部１１は、Ｗｅｂブラウザに対してＨＴＭＬ形式で結果を出力してもよい。また、処理部１１は、変異の判定結果をテキスト形式のレポートとして出力してもよい。
【０１３７】
＜分布モデル選択作業フロー＞
ステップＳ３０９およびＳ４０９における閾値決定フローを説明する前に、変異毎に、閾値を算出するために用いる分布モデルを選択する分布モデル選択作業フローについて説明する。一実施形態において、分布モデル選択作業フローは、予め行われており、その結果が、変異判定プログラム１００の統計モデル情報１１０に格納されている。
【０１３８】
閾値設定のための統計モデルは、正常検体データからあらかじめ作成されているものが適用される。ここで正常検体とは、変異を有していないことが実証されている検体のことを指し、正常検体データは、正常検体を判定対象の検体として、本実施形態に係る変異判定方法における抽出工程（ステップＳ３０３、Ｓ４０２）までを行って得られる対応リードの数（総リード数）および変異リード数の組を指す。正常検体データには、複数の正常検体から得られたデータが含まれている。本実施形態では、このような正常検体データから、バックグラウンドノイズを予測できる統計モデルを予め作成しておく。具体的には、図５に示されているフローにしたがって、閾値決定に使用する分布モデルを選択する。
【０１３９】
以下に統計モデルを作成し、適切な統計モデルを選択するための手順および統計モデルを選択するための基準を説明する。以下では、コンピュータ１０が作業者の判断を補助し、最終的には作業者が判断する形態について説明する。
【０１４０】
処理部１１は、対象の変異について、正常検体データから総リード数および変異リード数の組を得る（ステップＳ５０１）。続いて、総合的な判断の補助とするため、処理部１１は、正常検体データにおける総リード数と変異リード数との関係を、データの散布図およびヒストグラムとして図示しない表示手段に表示させる（ステップＳ５０２）。そして、作業者が、各モデルにおける分布の様子を図として目視確認することによって、妥当性の検討の判断材料とする（ステップＳ５０３）。
【０１４１】
続いて、さらに分布モデルの妥当性を確認するために、各モデルのパラメータの推定と妥当性の検討を行う。例えば、処理部１１は、まず、分布モデルとしてポアソン分布を適用し、正常検体データの総リード数および変異リード数を、当該分布モデルの一般化線形モデル（ＧＬＭ）に当てはめる。そして、処理部１１、当てはめたモデルについて、ＰＰプロット、Ｋ−Ｓ（Kolmogorov-Smirnov（コルモゴロフ−スミルノフ））検定結果、逸脱度およびＡＩＣの各々を算出し、図示しない表示部に表示する。作業者は、表示されたデータを目視確認することによって妥当性の検討の判断材料とする（ステップＳ５０４）。次に、処理部１１は、分布モデルとして負の二項分布を適用し、ポアソン分布を適用した場合と同様に正常検体データの分布モデルへ当てはめる。その後、ステップＳ５０４と同様に、ＰＰプロット、Ｋ−Ｓ検定結果、逸脱度およびＡＩＣの表示を行い、作業者がこれを目視確認する（ステップＳ５０５）。
【０１４２】
次に、作業者は、処理部１１は、それぞれのモデルについて、疎なデータか否かを確認する（ステップＳ５０６）。ここで、疎なデータとは、ＲＥＲが、０がほとんどでわずかに小さい値が入る、またはすべて０で構成されているようなデータを指す。
【０１４３】
ステップＳ５０６において、疎なデータであると判断された場合（Ｙｅｓ）、「最小値」モデルを使用する（ステップＳ５０７）。具体的には、変異判定プログラム１００の最小値情報１０３には、閾値の最小値を使用することを示す情報を当該変異に対応付けて、格納する。
【０１４４】
ステップＳ５０６において、疎なデータではないと判断された場合（Ｎｏ）、作業者は、適合する統計モデルを選択する（ステップＳ５０８）。このとき、（ｉ）ＰＰプロットの形は直線に近い方が当てはまりが良い、（ｉｉ）Ｋ−Ｓ検定のｐ値は大きい方が当てはまりが良い、（ｉｉｉ）ＡＩＣは低い方が良い予測ができている、および（ｉｖ）残渣逸脱度／自由度が１を大きく超えるようであれば過分散となっている、などのポイントを踏まえて、総合的に判断すればよい。
【０１４５】
そして、処理部１１は、変異判定プログラム１００の統計モデル種別１１１に、作業者が選択した統計モデルの種別を格納し、正常検体データ１１２に正常検体データを格納する。また、他の実施形態において、正常検体データを格納する代わりに、ステップＳ５０４またはＳ５０５において作成した統計モデルを示す情報を、変異判定プログラム１００の統計モデル情報１１０に格納してもよい。また、変異判定プログラム１００の最小値情報１０３には、閾値の最小値を使用しないことを示す情報を当該変異に対応付けて格納してもよい。
【０１４６】
＜閾値の補正＞
本実施形態では、正常検体の解析結果のデータセットから統計モデルを作成し、閾値の算出に使用している。このデータセットから、一定の基準で外れ値を除外することで、閾値を補正してもよい。
【０１４７】
外れ値の決定方法の一例としては、まず、閾値算出に用いた正常検体のデータについて、使用する統計モデルとの適合度を算出する。統計モデルとの適合度はｐ値に基づいて判定される。ｐ値が低いほど統計モデルからは外れていることを示す。各変異全てについて、同様にｐ値を算出する。続いて、各変異全てのｐ値を数値の大きさ順に並べ、外れ値の基準となるｐ値を決定する。外れ値は、例えばｐ＜０．０２である。
【０１４８】
また、変異判定方法において新たに入力されたデータを供試データとして、フィードバックすることにより、統計モデルを修正してもよい。
【０１４９】
＜検出限界（limit of detection（ＬＯＤ))＞
本発明の方法において用いられる検出限界は、正常検体および陽性検体のデータから算出し得る。ただし、検出限界の設定は、完全に自動化せず、プログラムを実行する当業者が手動で設定を行ってもよい。
【０１５０】
上述の非特許文献１では、閾値は、正常検体のエラーのみを考慮して決められている。しかし、実際に検出限界を設定するためには、正常検体のみでなく、陽性検体のデータも必要となると考えられる。検出限界の設定方法については、例えば、判定対象サンプルにおける変異型リードの数が、閾値を下回る確率が一定水準以下となるような変異型リードの割合を求め、その最小値を検出限界とすることなどが考えられる。ただし、検出限界の設定は閾値の設定時と異なり、正常型を変異型と誤って判定してしまう可能性だけでなく、変異型を正常型と判定してしまう可能性も考慮する必要がある。
【０１５１】
本発明に適用されるＬＯＤの算出方法としては、公知の方法（therascreen（登録商標） KRAS RGQ PCRキットの説明書（http://www.accessdata.fda.gov/cdrh_docs/pdf11/P110027c.pdf））を改良した方法を用いることができ、例えば、予め、以下の１）〜５）の手順の方法によって算出する方法が挙げられる。
１）対象物質の濃度が既知であるサンプルの希釈を５〜１０段階について行う。
２）希釈段階毎に、１０〜２０回の反復実験を行えるようサンプルを準備する。
３）対象物質の検出を行い、各希釈段階において、反復回数に占める陽性の回数の割合を求める。
４）各希釈段階における濃度を独立変数、反復回数に占める陽性の回数の割合を従属変数とする関数を求める。
５）４）で求められた関数から、反復回数に占める陽性の割合が９５％となるような希釈濃度を求める。
【０１５２】
なお、上記１）について、サンプルの希釈段階の一例は、サンプル原液を１００％としたときに、０．０２５％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％および１００％の６段階である。また、上記２）において、反復実験回数（Ｎ）は例えば、Ｎ＝３、６または９である。上記３）において、具体的な例示としては陽性が１２回の反復中９回が陽性などの値から陽性の回数の割合を求める。
【０１５３】
また、上記４）について、関数は、例えば、ロジスティック回帰分析によって求められる。関数のモデルは以下式（１）の通りである。
【０１５４】
【数１】
0006675164.tif 000002
【０１５５】
ここで、Ｘは各希釈段階における濃度の対数（底は２）であり、ｐは１−反復回数に占める陽性の割合の閾値であり、β０、β１はそれぞれロジスティック回帰分析によって求められる係数である。例えば閾値を９５％としたい場合、ｐ＝０．０５となる。
【０１５６】
ここで、一例として、反復回数に占める陽性の割合が９５％となるような希釈濃度は、以下の式（２）から求められる。
【０１５７】
【数２】
0006675164.tif 000003
【０１５８】
さらに、ＬＯＤの９５％信頼区間をブートストラップ法などによって推定し、その信頼区間の右端が特定の値を下回っていることを確認する工程を実施してもよい。
【０１５９】
ブートストラップ法の工程は以下の１）〜４）の通りである。
１）元のデータセット（Ｎ＝ｎ）から同数（ｎ個）のサンプルを復元抽出する。
２）復元抽出によって得られた新たなデータセットを対象にロジスティック回帰分析を行い、閾値となる濃度を推定する。
３）１）および２）をＢ（＝１，０００〜１０，０００）回繰り返す。
４）３）によって得られたＢ個の推定値の分布から信頼区間を計算する。例えば９５％信頼区間であれば（１００±９５）／２として計算し、２．５と９７．５パーセンタイルで挟まれた区間とする。
【０１６０】
なお、すべての希釈段階で１００％陽性の結果であった場合、正しい計算ができない。そのため、この場合は例外として「＜０．０２５％」のように表記するように設定する。
【０１６１】
＜閾値決定フロー＞
次に、閾値を設定する。ここで、シーケンシングによって得られる総リード数は、サンプル間で異なる。例えば、上述のマルチプレックス法などでも、サンプル間でシーケンシングの反応のバラツキやサンプルの量の誤差などで総リード数のバラツキが生じる。また、総リード数は、シーケンシングされる配列長によっても異なる。従来のシーケンスデータ解析の手法では、このような総リード数のバラツキを均一化するため、従来技術では、サンプル間でリード数の正規化がされていた。例えば、Kukita et. al.（非特許文献１）では、閾値を設定および判定するために、実際のリード数（Ｄｅｐｔｈ）を、１００，０００リードに換算した値を用いている。しかし、閾値は実際にはｄｅｐｔｈの大きさによって変化する。ｄｅｐｔｈの値が大きい（つまり、リード数が多い）ほど、閾値は低下する。したがって、ｄｅｐｔｈの値によって、分布モデルにあてはめるときのパラメータが変化することによってリードの分布が変化し、閾値も変化する。本発明の方法では、これに対する対策として、（１）最低限必要なリード数を設定すること、および（２）閾値を固定せず、判定時に実際のリード数から閾値を計算することを実行する。
【０１６２】
図６に、本発明の一実施形態に係る閾値決定処理のフローを示す。処理部１１は、正常検体データに基づいて選択された分布モデルから閾値を算出する。なお、正常検体データが疎なデータ（殆どが０であるデータ）であった場合には、処理部１１は、予め定められた分布モデル（ポアソン分布）から算出した閾値の最小値を閾値として算出する。
【０１６３】
まず、処理部１１は、対象の変異についての正常検体データ、対象変異の分布モデル、観測された総リード数を、閾値を算出するためのワークメモリに入力する（ステップＳ７０１）。
【０１６４】
次に、処理部１１は、最小値情報１０３を参照して、対象の変異が上述の閾値の最小値を用いるものか、それ以外の分布モデルを用いるものかを判定する（ステップＳ７０２）。閾値の最小値を用いる場合、処理部１１は、λ＝観測された総リード数（Ｄｅｐｔｈ）／１００，０００としたポアソン分布から求めた値（閾値の最小値）を閾値として出力する（ステップＳ７１１）。
【０１６５】
このように、本実施形態では、データの信頼性を高めるため、（ｉ）分布モデルの判定時において、正常検体データが疎なデータ（殆どが０であるデータ）であった場合には、最小値情報１０３が閾値の最小値を使用することを示すようにし、（ｉｉ）閾値の決定時には、λ＝観測された総リード数（Ｄｅｐｔｈ）／１００，０００としたポアソン分布から求めた下記表１に示すような値を閾値の最小値として求め、当該閾値の最小値を閾値として用いる。
【０１６６】
【表１】
0006675164.tif 000004
【０１６７】
一方、分布モデルを用いる場合、処理部１１は、統計モデル種別１１１を参照して、ポアソン分布または負の二項分布のいずれかを選択する（ステップＳ７０３）。処理部１１は、選択したモデルを用いて、観測された総リード数に対する予測エラー数を推定し、閾値を出力する（ステップＳ７０４〜Ｓ７１３）。
【０１６８】
詳細には、ポアソンの分布モデルを選択した場合は、処理部１１は、正常検体データの総リード数および変異リード数を、ポアソンン分布の一般化線形モデル（ＧＬＭ）に当てはめる（ステップＳ７０４）。次いで、処理部１１は、当てはめたモデルを用いて観測された総リード数に対する予測エラー数を推定し、λに設定する（ステップＳ７０５）。この値に基づいて、処理部１１は、ポアソン分布に基づく閾値算出処理を行う（ステップＳ７０６）。
【０１６９】
処理部１１は、負の二項分布を選択した場合は、正常検体データの総リード数および変異リード数を、負の二項分布の一般化線形モデル（ＧＬＭ）に当てはめる（ステップＳ７０７）。処理部１１は、当てはめたモデルを用いて推定されたサイズパラメータを推定し、θに設定する（ステップＳ７０８）。処理部１１は、続いて当てはめたモデルを用いて観測された総リード数に対する予測エラー数を推定し、μに設定する（ステップＳ７０９）。処理部１１は、これらの値に基づいて負の二項分布の閾値算出処理を行う（ステップＳ７１０）。処理部１１は、その後閾値を出力する（ステップＳ７１３）。
【０１７０】
以下に、ポアソン分布および負の二項分布のそれぞれを用いた場合の閾値の設定フローについて、さらに詳細に記載している。
【０１７１】
＜ポアソン分布を用いた閾値の設定＞
図７に、本発明の一実施形態に係るポアソン分布の閾値決定処理のフローを示す。
【０１７２】
予測エラー数をλとし、端数を切り捨てた値をｉｎｔ（λ）（＝Ｎ）とする（ステップＳ８０２およびＳ８０３）。観測された総リード数（Ｄ）を入力する（ステップＳ８０１）。予測エラー数Ｎが、観測された総リード数Ｄよりも小さい場合（Ｎ＜Ｄ）（ステップＳ８０４）、パラメータλのポアソン分布を仮定したときのエラー数がＮ個以上である確率（ｐ）を算出する（ステップＳ８０５）。ｐが２−５以下である場合（ステップＳ８０６）、Ｎから閾値（Ｔ）を算出する（ステップＳ８０８およびＳ８１０）。また、予測エラー数Ｎが、観測された総リード数Ｄ以上の場合（ステップＳ８０４）、総リード数Ｄから閾値（Ｔ）を算出する（ステップＳ８０９およびＳ８１０）。ｐが２−５より大きい場合（ステップＳ８０６）、Ｎ＋１を用いて、確率ｐを算出し、確率ｐの算出後のフローは、上記の工程を繰り返す（ステップＳ８０７）。
【０１７３】
＜負の二項分布を用いた閾値の設定＞
図８に、本発明の一実施形態に係る負の二項分布の閾値決定処理のフローを示す。
【０１７４】
予測エラー数をμ、サイズパラメータをθとし、端数を切り捨てた値をint（μ）（＝Ｎ）とする（ステップＳ９０２およびＳ９０３）。観測された総リード数（Ｄ）を入力する（ステップＳ９０１）。予測エラー数Ｎが、観測された総リード数Ｄよりも小さい場合（Ｎ＜Ｄ）（ステップＳ９０４）、パラメータλのポアソン分布を仮定したときのエラー数がＮ個以上である確率（ｐ）を算出する（ステップＳ９０５）。ｐが２−５以下である場合（ステップＳ９０６）、Ｎから閾値（Ｔ）を算出する（ステップＳ９０８およびＳ９１０）。また、予測エラー数Ｎが、観測された総リード数Ｄ以上の場合、総リード数Ｄから閾値（Ｔ）を算出する（ステップＳ９０９）。ｐが２−５より大きい場合（ステップＳ９０６）、Ｎ＋１を用いて、確率ｐを算出し、確率ｐの算出後のフローは、上記の工程を繰り返す（ステップＳ９０７）。
【０１７５】
このように、作成したモデルから、所定の有意水準（本実施形態においては、偽陽性が５００００サンプル中１サンプル未満）となるように閾値を設定する。
【０１７６】
換言すれば、閾値の設定は、異なる変異毎、かつ、異なるリード数毎、かつ、異なるシーケンスリードサンプル毎について行われる。
【０１７７】
＜変異判定時のアラート＞
一実施形態において、例えば、ステップＳ３０４、Ｓ４０３およびＳ４０４において、対応リードから除外されたリードが存在する場合、処理部１１は、例えば判定結果にアラートを含めて出力するようにしてもよい（警告工程）。アラートは、何か異常な状態であることを知らせる表示であり、処理部１１は、公知のデータベースに存在しない変異の存在が検出された場合、またはシーケンシングエラーなどで多くのリードが同じ塩基置換を有している場合に出力する。一つの観点において、アラートは、対象遺伝子配列が癌関連遺伝子である場合に、例えばＣＯＳＭＩＣデータベースなどの癌遺伝子データベースにないマイナーな変異が存在した場合に表示され得る。また、別の観点において、アラートは、既知変異であるが、判定時に判定対象としなかった変異が存在した場合に表示され得る。
【０１７８】
具体的には、アラートを表示する条件としては、ステップＳ３０４、Ｓ４０３、Ｓ４０４において除外されたリードの中に、複数のリファレンス配列に対する一致度が同程度であり、複数のリファレンス配列にマッピング可能と判定されたリード、一致度が同じリファレンスが複数あるとされたもの、あるいは、あるリファレンス（ＩｎＤｅｌテンプレート）配列に割り振られたが、そのリファレンス配列に対してさらに変異（ＳＮＶおよび／またはＩｎＤｅｌ）が存在すると判断されたもの（False Positive）が存在する場合が挙げられる。
【０１７９】
＜コンピュータおよびプログラム＞
コンピュータ１０の処理部１１は、各機能を実現するソフトウェアであるプログラム（変異判定プログラム１００を含む）の命令を実行するＣＰＵ（Central Processing Unit）、上記プログラムを展開するＲＡＭ（Random Access Memory）などを備えている。コンピュータ１０の記憶部１２は、上記プログラムおよび各種データがコンピュータ（またはＣＰＵ）で読み取り可能に記録されたＲＯＭ（Read Only Memory）または記憶装置（これらを「記録媒体」と称する）を備えている。そして、コンピュータ１０（または処理部１１）が上記プログラムを記録部１２から読み取って実行することにより、本発明の目的が達成される。上記記録媒体としては、「一時的でない有形の媒体」、例えば、テープ、ディスク、カード、半導体メモリ、プログラマブルな論理回路などを用いることができる。また、上記プログラムは、該プログラムを伝送可能な任意の伝送媒体（通信ネットワークや放送波等）を介して上記コンピュータに供給されてもよい。なお、本発明は、上記プログラムが電子的な伝送によって具現化された、搬送波に埋め込まれたデータ信号の形態でも実現され得る。
【０１８０】
本実施形態に係る変異検出プログラムは、特に限定されないが、例えば、プラグイン、スタンドアローンアプリケーション、ミドルウェアまたはライブラリ等の形態で提供され得る。
【０１８１】
本実施形態に係る変異検出プログラムを記憶する記録媒体の例としては、読取り専用メモリ（ＲＯＭ）、フロッピー（登録商標）ディスク、ハードディスク等の磁気メディア、光ディスク、光磁気ディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、ＣＤーＲ、ＤＶＤＲＯＭ、ブルーレイディスク、等の光学メディアが挙げられる。
【０１８２】
また、コンピュータ１０は、表示手段にグラフィック情報を処理および出力するためのグラフィックボードを１つ以上含むこともできる。上記コンポーネントはコンピュータ１０内のバスにより適切に相互接続できる。コンピュータ１０はさらに、外部サーバ２０との通信のための通信部１３の他、モニタ、キーボード、マウス、プリンタ、ネットワーク等の汎用外部コンポーネントと通信するための好適なインタフェースを含む。
【０１８３】
＜変異の判定の対象となる遺伝子配列＞
本発明の変異の判定方法を適用する遺伝子配列は特に限定されないが、一例としては、特定の疾患関連遺伝子の配列である。疾患関連遺伝子配列としては、これに限定するものではないが、例えば、癌関連遺伝子配列などが挙げられる。癌関連遺伝子としては、これに限定するものではないが、例えば、上皮成長因子受容体（epidermal growth factor receptor，ＥＧＦＲ）遺伝子などが挙げられる。ＥＧＦＲは、膜貫通型糖タンパク質をコードしており、生体において癌の増殖および維持に関与していることが知られている。特に、ＥＧＦＲは、非小細胞肺癌などでその発現が確認されている。本発明は、例えば、このような遺伝子を対象とすることによって、遺伝子診断およびモニタリングに適用することができる。
【０１８４】
＜ポリヌクレオチド配列サンプル＞
変異を判定するのに使用するポリヌクレオチド配列サンプルは、細胞内に存在する配列由来であってもよく、無細胞（cell-free）系のポリヌクレオチド配列サンプルであってもよい。一実施形態において、ポリヌクレオチド配列サンプルは、生体試料から抽出し、調製されたポリヌクレオチド配列サンプルである。また、本発明のサンプルのポリヌクレオチド配列サンプルには、例えば、血中浮遊腫瘍ＤＮＡ（circulating tumor DNA、ｃｔＤＮＡ）も含まれている。
【０１８５】
本発明の一実施形態において、本発明に係る判定方法に適用する核酸サンプルは、例えば、組織、体液および細胞のような生体試料から調製されるものであり、好ましくは体液から調製されるものである。生体試料は被験者から採取される。また、生体試料からポリヌクレオチド配列サンプルを得る場合、従来公知の方法を用いて生体試料から核酸を精製または分離すればよい。なお、生体液としては、限定しないが、生体試料としては、例えば、細胞試料、組織試料、体液試料などが挙げられ、中でも体液試料が好ましい。体液試料としては、血液試料、リンパ液試料、髄液試料等が挙げられるが、血液試料が好ましく、特に末梢血試料が好ましい。末梢血試料は、例えば指先への穿刺等によって容易に採取が可能であるため、被験者の負担が少ない。同様に、生体試料は、生検、綿棒または塗抹等から採取することも可能である。また、血液試料を用いる場合は、採取した血液から分離した血清または血漿をポリヌクレオチド配列サンプルの調製に用いることが好ましい。
【０１８６】
また、生体試料は、必要に応じて凍結保存等の生体試料の種類に適した方法で保存されたものであってもよい。
【０１８７】
ポリヌクレオチド配列サンプルは公知の核酸配列情報ソースから入手したものでもよい。複数個の異なる個体、正常個体、特定の個体における疾患の異なる段階などで採取したサンプル、または病理学的素因を有する個体等の個体から採取した生体試料から調製されたものであり得る。
【０１８８】
また、ポリヌクレオチド配列サンプルは任意の好適なプライマーセットを用いたＰＣＲによって増幅されたＰＣＲ産物であってもよい。ＰＣＲに用いられるプライマーセットは、ＰＣＲを行う際に目的のＤＮＡ分子または遺伝子を増幅可能なフォワードプライマーとリバースプライマーとのセットである。また、本発明のサンプル調製に用いられるプライマーとしては、目的遺伝子を特異的に検出することができるものであれば特に限定されないが、例えば、１０ｂｐ〜５０ｂｐ好ましくは１８ｂｐ〜２４ｂｐからなるオリゴヌクレオチドである。オリゴヌクレオチド塩基配列は、対象遺伝子の配列情報に基づいて決定する。ここで、対象のゲノム配列のうち変異を含むエクソンの領域を増幅可能な位置に設計されたプライマーセットであり得る。
【０１８９】
また、大腸菌を用いた系で増幅およびクローニングされたプラスミドをサンプルとしてもよい。また、本発明に係るポリヌクレオチド配列サンプルはシーケンシングの対象とする遺伝子配列以外に、一定量のコンタミネーションを含んでいてもよい。
【０１９０】
＜診断への応用＞
上述した本発明のコンピュータプログラムおよび変異の判定方法を利用し、疾患、障害または症状を検査、予測、診断またはモニタリングすることが可能である。本発明のコンピュータプログラムおよび変異の判定方法によって得られた結果は、医師によってなされる疾患、障害または症状の診断、またはその治療に対する被検体の反応の予測するための一材料となり得る。
【０１９１】
また、本発明を用いて、検査、予測または診断することが可能な疾患、障害または症状としては、癌が挙げられるがこれらに限定されない。また、ヒト以外の他の動物、例えば、哺乳類、無脊椎動物、哺乳類以外の脊椎動物などの疾患、障害または症状の調査にも適用され得る。また本発明の方法は、例えば、出生前の遺伝子診断等にも適用することができる。
【０１９２】
さらに、本発明のコンピュータプログラムおよび変異の判定方法は、例えば、感染症の検出、ウイルス量モニタリング、ウイルス遺伝子型決定、環境試験、食品試験、疫学、法医学などのあらゆる特定のポリヌクレオチド配列検出を必要とする分野における、種々の核酸検出用途において利用され得る。
【０１９３】
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】
【０１９４】
（参考例１）
本発明者らは、対象遺伝子をＥＦＧＲ遺伝子としたとき、図９および図１０に示すように、多数のリファレンス配列を用いて、非常に良好な結果を得ることができた。すなわち、図９および図１０における「１０６種類版」が、ＣＯＳＭＩＣデータベースから取得したほぼ全ての変異に対応するリファレンス配列に相当し、「８種類版」が特許文献１において用いられたリファレンス配列に相当する。「８種類版」からリファレンス配列数を増加させ、ＣＯＳＭＩＣデータベースから取得した頻度の高い変異に対するリファレンスを用いた「２３種類版」を経て、最終的に「１０６種類版」とした。「１０６種類版」とすることによって、これより少ないリファレンス数の場合に生じ得たミスマッチおよび誤判定を防ぎ、好適な結果を得ることができる。
【０１９５】
（参考例２）
対象遺伝子をＥＦＧＲ遺伝子としたとき、いくつかの変異の正常検体データについて、ポアソン分布および負の二項分布に対する適合度を検定したところ、ポアソン分布に適合度が高い変異、および、負の二項分布に適合度が高い変異の両方が存在した。
【産業上の利用可能性】
【０１９６】
本発明は、癌をはじめとする種々の遺伝子関連疾患の検査、予測もしくは診断、または出生前の遺伝子診断等に利用することができる。また、あらゆる特定のポリヌクレオチド配列検出を必要とする分野における、種々の核酸検出用途において利用され得る。
【図１】
0006675164.tif 000005
【図２】
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【図３】
0006675164.tif 000007
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
0006675164.tif 000011
【図８】
0006675164.tif 000012
【図９】
0006675164.tif 000013
【図１０】
0006675164.tif 000014
【配列表】
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