(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
分裂促進ドメインおよび膜貫通ドメインをそれぞれが含む第１および第２の分裂促進性Ｔ細胞活性化膜貫通タンパク質を含むウイルスエンベロープを有するレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターであって、前記分裂促進性Ｔ細胞活性化膜貫通タンパク質は、ウイルスエンベロープ糖タンパク質の一部ではなく、前記第１の分裂促進性Ｔ細胞活性化膜貫通タンパク質はＣＤ３に結合し、前記第２の分裂促進性Ｔ細胞活性化膜貫通タンパク質はＣＤ２８に結合する、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクター。
【請求項２】
前記第１の分裂促進性Ｔ細胞活性化膜貫通タンパク質が、ＯＫＴ３からの結合ドメインを含む、請求項１に記載のレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクター。
【請求項３】
前記第２の分裂促進性Ｔ細胞活性化膜貫通タンパク質が、１５Ｅ８またはＴＧＮ１４１２からの結合ドメインを含む、請求項１に記載のレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクター。
【請求項４】
ＣＤ１３４またはＣＤ１３７に結合する分裂促進性Ｔ細胞活性化膜貫通タンパク質をさらに含む、請求項１から３のいずれかに記載のレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクター。
【請求項５】
ＩＬ２、ＩＬ７およびＩＬ１５から選択されるサイトカインを含む、サイトカインに基づくＴ細胞活性化膜貫通タンパク質も含む、請求項１から４のいずれかに記載のレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクター。
【請求項６】
偽型ウイルスベクターを与える異種のウイルスエンベロープ糖タンパク質を含む、請求項１から５のいずれかに記載のレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクター。
【請求項７】
前記エンベロープ糖タンパク質が、ＲＤ１１４またはその変異体の１つ、ＶＳＶ−Ｇ、テナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）からであるか、もしくはアンホトロピックエンベロープ、麻疹エンベロープまたはヒヒレトロウイルスエンベロープ糖タンパク質である、請求項６に記載のレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクター。
【請求項８】
前記ウイルスエンベロープはまた、
捕捉部分に結合する結合ドメイン；および
膜貫通ドメイン
を含むタグ化タンパク質を含み、前記タグ化タンパク質は前記タグ化タンパク質の前記捕捉部分への結合を介した細胞上清からの前記ウイルスベクターの精製を容易にする、請求項１から７のいずれかに記載のレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクター。
【請求項９】
前記タグ化タンパク質の前記結合ドメインが、１つまたは複数のストレプトアビジン結合エピトープを含む、請求項８に記載のレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクター。
【請求項１０】
前記ストレプトアビジン結合エピトープがビオチン模倣体である、請求項９に記載のレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクター。
【請求項１１】
前記ビオチン模倣体が、パッケージング細胞によって産生されたストレプトアビジン捕捉レトロウイルスベクターを溶出するためにビオチンを使用することができるように、ビオチンよりも低い親和性でストレプトアビジンに結合する、請求項１０に記載のレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクター。
【請求項１２】
前記ビオチン模倣体が、ＳｔｒｅｐｔａｇＩＩ（配列番号３６）、Ｆｌａｎｋｅｄｃｃｓｔｒｅｐｔａｇ（配列番号３７）およびｃｃｓｔｒｅｐｔａｇ（配列番号３８）の群から選択される、請求項１１に記載のレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクター。
【請求項１３】
Ｔ細胞受容体またはキメラ抗原受容体をコードする核酸配列を含む、請求項１から１２のいずれかに記載のレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクター。
【請求項１４】
ウイルス様粒子（ＶＬＰ）である、請求項１〜１３のいずれかに記載のレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクター。
【請求項１５】
細胞表面で、分裂促進ドメインおよび膜貫通ドメインをそれぞれが含む第１および第２の分裂促進性Ｔ細胞活性化膜貫通タンパク質を発現し、前記第１の分裂促進性Ｔ細胞活性化膜貫通タンパク質はＣＤ３に結合し、前記第２の分裂促進性Ｔ細胞活性化膜貫通タンパク質はＣＤ２８に結合し、その結果、宿主細胞によって産生されるレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターが請求項１から７までのいずれかに定義されたものとなる、宿主細胞。
【請求項１６】
細胞表面で、
捕捉部分に結合する結合ドメイン；および
膜貫通ドメイン
を含むタグ化タンパク質も発現し、前記タグ化タンパク質が、前記タグ化タンパク質の前記捕捉部分への結合を介した細胞上清からの前記ウイルスベクターの精製を容易にし、その結果、前記宿主細胞によって産生されたレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターが、請求項８から１２までのいずれかに定義されたものとなる、請求項１５に記載の宿主細胞。
【請求項１７】
下記の遺伝子：
ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖおよび／またはｒｅｖのうちの１つまたは複数も含む、請求項１５または１６に定義された宿主細胞である、パッケージング細胞。
【請求項１８】
ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖおよび必要に応じてｒｅｖ遺伝子を含み、ならびにレトロウイルスゲノムまたはレンチウイルスゲノムも含む、請求項１５または１６に定義された宿主細胞である、プロデューサー細胞。
【請求項１９】
請求項１５もしくは１６に記載の宿主細胞、請求項１７に記載のパッケージング細胞または請求項１８に記載のプロデューサー細胞を作製するための方法であって、第１および第２の分裂促進性Ｔ細胞活性化膜貫通タンパク質をコードする核酸を細胞に形質導入またはトランスフェクトするステップを含む方法。
【請求項２０】
請求項１５から１８までのいずれかに記載の細胞内にレトロウイルスゲノムまたはレンチウイルスゲノムを発現させるステップを含む、請求項１から１４までのいずれかに記載のレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターを作製するための方法。
【請求項２１】
Ｔ細胞またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が、第１および第２の分裂促進性Ｔ細胞活性化膜貫通タンパク質によって活性化されるように、請求項１から１４までのいずれかに記載のレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターを前記Ｔ細胞またはＮＫ細胞に形質導入するステップを含む、活性化されたトランスジェニックＴ細胞またはＮＫ細胞を作製するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法。
【請求項２２】
（ｉ）請求項１５または１６に定義された宿主細胞；
（ｉｉ）ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖおよび必要に応じてｒｅｖを含む核酸；ならびに
（ｉｉｉ）レトロウイルスゲノム
を含む、請求項１から１４までのいずれかに定義されたレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターを作製するためのキット。
【請求項２３】
（ｉ）請求項１７に定義されたパッケージング細胞；および
（ｉｉ）レトロウイルスベクターゲノムまたはレンチウイルスベクターゲノム
を含む、請求項１から１４までのいずれかに定義されたレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターを作製するためのキット。
【請求項２４】
（ｉ）第１および第２の分裂促進性Ｔ細胞活性化膜貫通タンパク質をコードする１つまたは複数の核酸；ならびに
（ｉｉ）レトロウイルスｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖおよび必要に応じてｒｅｖ遺伝子を含む核酸
を含む、請求項１７に記載のパッケージング細胞を作製するためのキット。
【請求項２５】
（ｉ）第１および第２の分裂促進性Ｔ細胞活性化膜貫通タンパク質をコードする１つまたは複数の核酸；
（ｉｉ）レトロウイルスｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖおよび必要に応じてｒｅｖ遺伝子を含む核酸；ならびに
（ｉｉｉ）レトロウイルスベクターゲノムまたはレンチウイルスベクターゲノム
を含む、請求項１８に記載のプロデューサー細胞を作製するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レトロウイルスベクターおよびレンチウイルスベクターならびにその生産のための細胞に関する。ベクターは、Ｔ細胞などの細胞に形質導入するために使用することができる。特に、本発明は、Ｔ細胞などの細胞の形質導入および活性化の両方を行うことができるレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターに関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子操作されたＴ細胞産物の生成は、典型的には、分裂促進因子による刺激、続いて、レンチウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターなどの組み込みベクターの形質導入を必要とする。
【０００３】
広く使用されているアプローチは、抗ＴＣＲ／ＣＤ３および抗ＣＤ２８などの可溶性の分裂促進性モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を細胞培養物に添加することである。代替のアプローチは、抗ＴＣＲ／ＣＤ３  ｍＡｂを抗ＣＤ２８  ｍＡｂとともにビーズに付着させることである。ビーズの表面は、可溶性抗体単独と比較して、改善されたＴ細胞活性化特性を有する。
【０００４】
さらに、サイトカイン（例えばＩＬ２、ＩＬ１５またはＩＬ７）が細胞培養物に一般的に添加される。
【０００５】
これらの分裂促進性抗体およびサイトカインは、一回使用の消耗品であり、典型的には、Ｔ細胞産生プロセスにおいて最も費用のかかる部分を示す。
【０００６】
Mauriceらは、ＣＤ３アゴニストＯＫＴ３がビリオン表面上に提示されるようなレンチウイルスエンベロープタンパク質の直接的な遺伝子操作を記載している（Mauriceら；Blood；２００２年；９９巻；２３４２〜２３５０頁）。Verhoeyenらは、レンチウイルスエンベロープタンパク質がＩＬ７を組み込むように遺伝子操作された同様のアプローチを記載している（Verhoeyenら；Blood；２００３年；１０１巻；２１６７〜２１７４頁）。
これらの遺伝子操作アプローチの各々は、ウイルスエンベロープタンパク質を複雑に遺伝子操作することが必要である。この複雑な遺伝子操作は、個々のペプチドがビリオン表面上に提示されるように行われなければならない。このアプローチは、ウイルス力価を低下させることも示されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Mauriceら；Blood；２００２年；９９巻；２３４２〜２３５０頁
【非特許文献２】Verhoeyenら；Blood；２００３年；１０１巻；２１６７〜２１７４頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
したがって、上述した欠点を伴わない遺伝子操作されたＴ細胞産物を生成するための新しいアプローチが必要とされている。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】ＲＤ１１４エンベロープ糖タンパク質およびｓｃＦｖまたは膜結合型サイトカインのような様々な分裂促進性の要素が散りばめられている脂質二重層によって囲まれたｒｅｔｒｏＳＴＩＭベクターの図。
【００１０】
【図２】ＯＫＴ３  ｓｃＦｖをレンチウイルスに組み込むことができることの実証。結果は、Ｔ細胞の活性化を示す。（ａ）非刺激−２９３Ｔ細胞からのレンチウイルスベクターを形質導入された；（ｂ）ＯＫＴ３、ＣＤ２８．２およびＩＬ２での刺激−２９３Ｔ細胞からのレンチウイルスベクターを形質導入された；（ｃ）非刺激−２９３Ｔ．ＯＫＴ３からの上清を形質導入され、導入ベクター（transfer vector）のみをトランスフェクトされた；（ｄ）非刺激−２９３Ｔ．ＯＫＴ３からのレンチウイルスベクターを形質導入した。上のパネルは、形質導入（ｘ軸）、およびＣＤ２５発現による活性化（ｙ軸）の散布図を示す。下のパネルは、Ｔ細胞培養の顕微鏡写真を示す。クランピングは活性化を示した。
【００１１】
【図３】Ｔ細胞の分裂促進刺激および形質導入がｇａｇｐｏｌに依存することの実証。表面結合型のＯＫＴ３を安定に発現する２９３Ｔ細胞に、ｇａｇｐｏｌ、ＲＤ−ＰＲＯ  ｅｎｖ、導入ベクターまたはｒｅｖと併せて３つのプラスミドの全てをトランスフェクトした。その後の上清を初代ヒトＴ細胞に適用した。Ｔ細胞を以下のパラメーターを用いてフローサイトメトリーにより試験した：Ｔ細胞活性化を測定するためのＣＤ２５；  Ｆｃスペーサーを有するＣＡＲである導入遺伝子を検出するための抗Ｆｃ；周期中の細胞を決定するためのｋｉ６７。ｇａｇｐｏｌが供給された条件だけが有意な分裂促進刺激をもたらした。（ｒｅｖと共に）全てのプラスミドが供給された条件のみが、Ｔ細胞の分裂促進刺激および形質導入をもたらした。
【００１２】
【図４】異なるレンチウイルスのシュードタイピングが分裂促進効果を支持することの実証。膜結合型ＯＫＴ３を安定に発現する２９３Ｔ細胞に、レンチウイルスの導入ベクター、レンチウイルスｇａｇｐｏｌ、ｒｅｖおよび異なるｅｎｖプラスミド：すなわちＶＳＶ−Ｇ、ＲＤ−ＰＲＯ、Ａｍｐｈｏ、ＧＡＬＶおよび麻疹Ｍ／Ｈをトランスフェクトした。その後の上清を初代ヒトＴ細胞に適用した。その後、細胞をｋｉ６７で染色し、フローサイトメトリーで試験した。全ての偽型は分裂促進効果を支持したが、麻疹のシュードタイピングでは効果は低下したようであった。
【００１３】
【図５】Ｔ細胞の分裂促進刺激および形質導入がガンマ−レトロウイルスベクターを用いて達成されることの実証。膜結合型ＯＫＴ３を安定に発現する２９３Ｔ細胞に、ＣＡＲをコードするガンマ−レトロウイルス導入ベクター、ガンマ−レトロウイルスｇａｇｐｏｌ発現プラスミドおよびＲＤ１１４発現プラスミドをトランスフェクトした。その後の上清を初代ヒトＴ細胞に適用した。その後、Ｔ細胞を抗Ｆｃ、抗ＣＤ２５およびｋｉ６７で染色し、フローサイトメトリーで試験した。分裂促進刺激は適用しなかったが、Ｔ細胞は活性化され、サイクルし（ｃｙｃｌｅ）、導入遺伝子を発現していた。
【００１４】
【図６】２つの異なる分裂促進刺激をウイルスベクターに組み込むことができることと、抗ＣＤ２８刺激と併せた抗ＣＤ３／ＴＣＲ刺激が、抗ＣＤ３／ＴＣＲ単独と比較して改善された効果を有することの実証。
【００１５】
【図７】細胞表面上に様々な要素を発現する２９３Ｔ細胞から生成された様々なレンチウイルスベクターで刺激されたＴ細胞の低解像度顕微鏡画像。
【００１６】
【図８】分裂促進性およびサイトカインペプチドの様々な組合せを示すｌｅｎｔｉＳＴＩＭベクターの形質導入後のＣＤ４およびＣＤ８  Ｔ細胞の活性化。活性化は、形質導入１２０時間後でのＣＤ２５発現によって決定される。
【００１７】
【図９】分裂促進性およびサイトカインペプチドの様々な組合せを示すｌｅｎｔｉＳＴＩＭベクターの形質導入後のＣＤ４およびＣＤ８  Ｔ細胞の増殖。増殖は、形質導入１２０時間後でのＫｉ６７発現によって決定される。
【００１８】
【図１０】分裂促進性およびサイトカインペプチドの様々な組合せを示すｌｅｎｔｉＳＴＩＭベクターの形質導入後のＴ細胞の拡大増殖。拡大増殖は、形質導入１２０時間後での絶対細胞数によって決定される。
【００１９】
【図１１】抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体を発現するｌｅｎｔｉＳＴＩＭベクターまたは抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体でコーティングしたビーズで活性化したＰＢＭＣのＴ細胞サブセット表現型の調査。ＮＭ−ＬＶ＝非改変レンチウイルス；ＳＴＩＭ−ＬＶ＝ｌｅｎｔｉＳＴＩＭベクター；Ｔｅｍ＝エフェクター記憶Ｔ細胞；Ｔｃｍ＝セントラル記憶Ｔ細胞；Ｔｓｃｍ＝記憶Ｔ幹細胞；Ｔｎ＝ナイーブＴ細胞。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明は、レトロウイルスまたはレンチウイルスのキャプシドに、これらのウイルスがＴ細胞を活性化し、かつＴ細胞に形質導入するように分裂促進刺激および／またはサイトカイン刺激を組み込むことが可能であるという知見に基づく。このことにより、ベクター、分裂促進因子およびサイトカインを添加する必要がなくなる。本発明は、プロデューサー／パッケージング細胞膜から出芽する際にレトロウイルスに組み込まれる、分裂促進性膜貫通タンパク質および／またはサイトカインに基づく膜貫通タンパク質をプロデューサーまたはパッケージング細胞に含めることを含む。分裂促進性膜貫通タンパク質および／またはサイトカインに基づく膜貫通タンパク質は、ウイルスエンベロープ糖タンパク質の一部としてではなく、プロデューサー細胞上の別個の細胞表面分子として発現される。これは、ウイルスエンベロープのリーディングフレームが影響を受けず、したがって機能的完全性およびウイルス力価を保つことを意味する。
【００２１】
したがって、第１の態様では、本発明は、
（ｉ）分裂促進ドメインおよび膜貫通ドメインを含む分裂促進性Ｔ細胞活性化膜貫通タンパク質；ならびに／または
（ｉｉ）サイトカインドメインおよび膜貫通ドメインを含む、サイトカインに基づくＴ細胞活性化膜貫通タンパク質
を含むウイルスエンベロープを有するレトロウイルスまたはレンチウイルスベクターであって、分裂促進性またはサイトカインに基づくＴ細胞活性化膜貫通タンパク質は、ウイルスエンベロープ糖タンパク質の一部ではない、レトロウイルスまたはレンチウイルスベクターを提供する。
【００２２】
レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターは、ｅｎｖ遺伝子によってコードされた別個のウイルスエンベロープ糖タンパク質を含んでもよい。
したがって、
（ｉ）ウイルスエンベロープ糖タンパク質：ならびに
（ｉｉ）構造：Ｍ−Ｓ−ＴＭを有する分裂促進性Ｔ細胞活性化膜貫通タンパク質
（ここで、Ｍは分裂促進ドメインであり、Ｓは任意選択のスペーサーであり、ＴＭは膜貫通ドメインである）；ならびに／または
（ｉｉｉ）サイトカインドメインおよび膜貫通ドメインを含む、サイトカインに基づくＴ細胞活性化膜貫通タンパク質
を含むウイルスエンベロープを有するレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターが提供される。
【００２３】
分裂促進性Ｔ細胞活性化膜貫通タンパク質および／またはサイトカインに基づくＴ細胞活性化膜貫通タンパク質は、ウイルスエンベロープ糖タンパク質の一部ではない。それらは、ウイルスエンベロープ中に別個のタンパク質として存在し、別個の遺伝子によってコードされる。
分裂促進性Ｔ細胞活性化膜貫通タンパク質は、構造：Ｍ−Ｓ−ＴＭを有してもよく、
ここで、Ｍは分裂促進ドメインであり、Ｓは任意選択のスペーサーであり、ＴＭは膜貫通ドメインである。
【００２４】
分裂促進性Ｔ細胞活性化膜貫通タンパク質は、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ１３４またはＣＤ１３７などの活性化Ｔ細胞表面抗原に結合し得る。分裂促進性Ｔ細胞活性化膜貫通タンパク質は、そのような活性化Ｔ細胞表面抗原に対するアゴニストを含んでいてもよい。
【００２５】
分裂促進性Ｔ細胞活性化膜貫通タンパク質は、ＯＫＴ３、１５Ｅ８、ＴＧＮ１４１２のような抗体からの結合ドメイン；またはＯＸ４０Ｌもしくは４１ＢＢＬのような共刺激分子を含んでいてもよい。
【００２６】
ウイルスベクターは、ウイルスエンベロープ中に２つまたはそれを超える分裂促進性Ｔ細胞活性化膜貫通タンパク質を含んでいてもよい。例えば、ウイルスベクターは、ＣＤ３に結合する第１の分裂促進性Ｔ細胞活性化膜貫通タンパク質およびＣＤ２８に結合する第２の分裂促進性Ｔ細胞活性化膜貫通タンパク質を含んでいてもよい。
【００２７】
サイトカインに基づくＴ細胞活性化膜貫通タンパク質は、例えば、ＩＬ２、ＩＬ７およびＩＬ１５から選択されるサイトカインを含んでいてもよい。
特に、
（ｉａ）ＣＤ３に結合する第１の分裂促進性Ｔ細胞活性化膜貫通タンパク質；および
（ｉｂ）ＣＤ２８に結合する第２の分裂促進性Ｔ細胞活性化膜貫通タンパク質
を含むウイルスエンベロープを有するレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターが提供される。
【００２８】
（ｉａ）ＣＤ３に結合する第１の分裂促進性Ｔ細胞活性化膜貫通タンパク質；
（ｉｂ）ＣＤ２８に結合する第２の分裂促進性Ｔ細胞活性化膜貫通タンパク質；および
（ｉｉ）ＩＬ２を含む、サイトカインに基づくＴ細胞活性化膜貫通タンパク質
を含むウイルスエンベロープを有するレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターも提供される。
【００２９】
（ｉａ）ＣＤ３に結合する第１の分裂促進性Ｔ細胞活性化膜貫通タンパク質；
（ｉｂ）ＣＤ２８に結合する第２の分裂促進性Ｔ細胞活性化膜貫通タンパク質；
（ｉｉａ）ＩＬ７を含む、サイトカインに基づくＴ細胞活性化膜貫通タンパク質；および
（ｉｉｂ）ＩＬ１５を含む、サイトカインに基づくＴ細胞活性化膜貫通タンパク質
を含むウイルスエンベロープを有するレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターも提供される。
【００３０】
ウイルスベクターは、偽型ウイルスベクターを与える異種のウイルスエンベロープ糖タンパク質を含んでいてもよい。例えば、ウイルスエンベロープ糖タンパク質は、ＲＤ１１４またはその変異体の１つ、ＶＳＶ−Ｇ、テナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）由来であってもよく、またはアンホトロピックエンベロープ、麻疹エンベロープまたはヒヒレトロウイルスエンベロープ糖タンパク質である。
【００３１】
本発明の第１の態様の第２の実施形態では、ウイルスベクターのウイルスエンベロープはまた、
（ｉｖ）捕捉部分に結合する結合ドメイン
スペーサー；ならびに
膜貫通ドメイン
を含むタグ化タンパク質を含むことがあり、タグ化タンパク質はタグ化タンパク質の捕捉部分への結合を介した細胞上清からのウイルスベクターの精製を容易にする。
【００３２】
タグ化タンパク質の結合ドメインは、１つまたは複数のストレプトアビジン結合エピトープを含むことができる。ストレプトアビジン結合エピトープは、パッケージング細胞によって産生されるストレプトアビジン捕捉レトロウイルスベクターを溶出するためにビオチンを使用することができるように、ビオチンよりも低い親和性でストレプトアビジンに結合するビオチン模倣体などのビオチン模倣体であってよい。
【００３３】
適切なビオチン模倣体の例には、ＳｔｒｅｐｔａｇＩＩ（配列番号３６）、Ｆｌａｎｋｅｄｃｃｓｔｒｅｔａｇ（配列番号３７）およびｃｃｓｔｒｅｐｔａｇ（配列番号３８）が含まれる。
【００３４】
本発明の第１の態様のウイルスベクターは、Ｔ細胞受容体またはキメラ抗原受容体をコードする核酸配列を含んでいてもよい。
【００３５】
ウイルスベクターは、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）であってもよい。
【００３６】
第２の態様では、本発明は、細胞表面で、
（ｉｉ）分裂促進ドメインおよび膜貫通ドメインを含む分裂促進性Ｔ細胞活性化膜貫通タンパク質；ならびに／または
（ｉｉ）サイトカインドメインおよび膜貫通ドメインを含む、サイトカインに基づくＴ細胞活性化膜貫通タンパク質
を発現し、その結果、パッケージング細胞によって産生されたレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターが、本発明の第１の態様において定義されたものである、宿主細胞を提供する。
本発明の第２の態様の第２の実施形態では、宿主細胞はまた、細胞表面で、
（ｉｉｉ）捕捉部分に結合する結合ドメイン；および
膜貫通ドメイン
を含むタグ化タンパク質であって、タグ化タンパク質の捕捉部分への結合を介した細胞上清からのウイルスベクターの精製を容易にするタグ化タンパク質を発現し、その結果、パッケージング細胞によって産生されたレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターが、本発明の第１の態様の第２の実施形態において定義されたものであることがある。
【００３７】
タグ化タンパク質はまた、結合ドメインと膜貫通ドメインとの間にスペーサーを含んでいてもよい。
【００３８】
宿主細胞という用語は、パッケージング細胞またはプロデューサー細胞であり得る。
【００３９】
パッケージング細胞は、以下の遺伝子：ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖおよび／またはｒｅｖのうちの１つまたは複数を含み得る。
【００４０】
プロデューサー細胞は、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖおよび必要に応じてｒｅｖ遺伝子を含み、レトロウイルスまたはレンチウイルスゲノムも含む。
【００４１】
このことに関して、宿主細胞は、分裂促進性および／またはサイトカイン膜貫通タンパク質を安定に発現する任意の適切な細胞株であり得る。これは、複製の能力が無いレトロウイルス／レンチウイルスベクターを産生するために、導入ベクター、ｇａｇｐｏｌ、ｅｎｖ（およびレンチウイルスの場合はｒｅｖ）を一過性でトランスフェクトされ得る。
【００４２】
第３の態様では、分裂促進性Ｔ細胞活性化膜貫通タンパク質および／またはサイトカインに基づくＴ細胞活性化膜貫通タンパク質をコードする核酸を細胞に形質導入またはトランスフェクトするステップを含む、本発明の第２の態様に記載の宿主細胞を作製するための方法が提供される。
【００４３】
第４の態様では、レトロウイルスまたはレンチウイルスゲノムを本発明の第２の態様に記載の細胞において発現させるステップを含む、本発明の第１の態様に記載のウイルスベクターを産生するための方法が提供される。
【００４４】
第５の態様では、Ｔ細胞またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が、１つもしくは複数の分裂促進性Ｔ細胞活性化膜貫通タンパク質および／または１つもしくは複数のサイトカインに基づくＴ細胞活性化膜貫通タンパク質によって活性化されるように、本発明の第１の態様に記載のウイルスベクターをＴ細胞またはＮＫ細胞に形質導入するステップを含む、活性化されたトランスジェニックＴ細胞またはＮＫ細胞を作製するための方法が提供される。
【００４５】
第６の態様では、
（ｉ）本発明の第２の態様において定義される宿主細胞；
（ｉｉ）ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖおよび必要に応じてｒｅｖを含む核酸；ならびに
（ｉｉｉ）レトロウイルスゲノム
を含む、本発明の第１の態様において定義されるレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターを作製するためのキットが提供される。
【００４６】
（ｉ）本発明の第２の態様において定義されるパッケージング細胞；および
（ｉｉ）レトロウイルスゲノム
を含む、本発明の第１の態様において定義されるレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターを作製するためのキットも提供される。
【００４７】
（ｉ）分裂促進性Ｔ細胞活性化膜貫通タンパク質および／またはサイトカインに基づくＴ細胞活性化膜貫通タンパク質をコードする１つまたは複数の核酸；ならびに
（ｉｉ）レトロウイルスのｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子を含む核酸
を含む、本発明の第２の態様の第２の実施形態に記載のパッケージング細胞を作製するためのキットも提供される。
【００４８】
（ｉ）分裂促進性Ｔ細胞活性化膜貫通タンパク質および／またはサイトカインに基づくＴ細胞活性化膜貫通タンパク質をコードする１つまたは複数の核酸；
（ｉｉ）レトロウイルスのｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子を含む核酸；ならびに
（ｉｉｉ）レトロウイルスベクターゲノムまたはレンチウイルスベクターゲノム
を含む、本発明の第２の態様に記載のプロデューサー細胞を作製するためのキットも提供される。
【００４９】
したがって、本発明は、組み込みの分裂促進刺激および／またはサイトカイン刺激を有するウイルスベクターを提供する（図１を参照されたい）。このベクターは、Ｔ細胞を刺激し、遺伝子挿入にも作用する能力を有する。このことには多くの利点がある：（１）添加する必要があるのは１つの構成成分のみであるため、Ｔ細胞遺伝子操作のプロセスを簡潔にする；（２）ウイルスが不安定であり、除去する必要がないため、ビーズの除去および関連する収量の低減を回避する。（３）製造する必要があるのは１つの構成成分のみであるため、Ｔ細胞遺伝子操作のコストを低減する；（４）より大きな設計柔軟性を可能にする：各々のＴ細胞遺伝子操作プロセスは、遺伝子導入ベクターの作製を含むであろうし、分裂促進刺激で産物を「フィット」させ、同じ産物を作製することもできる；（５）産生プロセスの短縮が可能となる：可溶性の抗原／ビーズに基づくアプローチにおいて、分裂促進因子およびベクターは、典型的には、１、２または時には３日で順次、別個に与えられるが、本発明のレトロウイルスベクターでは、分裂促進刺激およびウイルス侵入は同期的かつ同時的に起きるため、これを回避することができる；（６）発現および機能性のために多くの異なる融合タンパク質を試験する必要が無いため、遺伝子操作がより容易である；（７）２つ以上のシグナルを同時に加えることが可能である；ならびに（８）各々のシグナル／タンパク質の発現および／または発現レベルを別々に調節することが可能である。
【００５０】
分裂促進刺激および／またはサイトカイン刺激は、ウイルスエンベロープ糖タンパク質から分離された分子に提供されるため、ウイルスエンベロープ糖タンパク質の完全性は維持され、ウイルス力価に悪影響が無い。
【００５１】
（詳細な説明）
レトロウイルス
レトロウイルスは、主にゲノムをＲＮＡからＤＮＡに「逆転写」する能力を特徴とする二本鎖ＲＮＡエンベロープウイルスである。ビリオンの長さは直径１００〜１２０ｎｍであり、ヌクレオキャプシドタンパク質と複合体を形成した同一のプラスＲＮＡ鎖の二量体ゲノムを含有する。ゲノムは、ウイルス感染に必要な酵素タンパク質、すなわち逆転写酵素、インテグラーゼおよびプロテアーゼも含有するプロテイックキャプシド（proteic capsid）に封入されている。マトリックスタンパク質は、ウイルス核粒子の周りを囲む、宿主細胞膜に由来する脂質二重層であるエンベロープと相互作用するキャプシドコアの外側の層を形成する。この二重層には、宿主細胞上の特異的受容体を認識し、感染プロセスを開始させる役割を担うウイルスエンベロープ糖タンパク質が固定されている。エンベロープタンパク質は、タンパク質を脂質膜内に固定させる膜貫通（ＴＭ）と細胞受容体に結合する表面（ＳＵ）の２つのサブユニットによって形成される。
【００５２】
ゲノム構造に基づき、レトロウイルスは、ＭＬＶおよびネズミ白血病ウイルスなどの単純レトロウイルス；またはＨＩＶおよびＥＩＡＶのような複合レトロウイルス（ｃｏｍｐｌｅｘ  ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）に分類分けされる。レトロウイルスは、ｇａｇ（群特異的抗原）、ｐｒｏ（プロテアーゼ）、ｐｏｌ（ポリメラーゼ）およびｅｎｖ（エンベロープ）の４つの遺伝子をコードする。ｇａｇ配列は、マトリックスタンパク質、ヌクレオキャプシドタンパク質、およびキャプシドタンパク質の３つの主要な構造タンパク質をコードする。ｐｒｏ配列は、粒子の集合、出芽および成熟の間にＧａｇおよびＧａｇ−Ｐｏｌを切断する役割を担うプロテアーゼをコードする。ｐｏｌ配列は、逆転写酵素およびインテグラーゼの酵素をコードし、前者は、感染プロセスの間にウイルスゲノムのＲＮＡからＤＮＡへの逆転写を触媒し、後者はプロウイルスＤＮＡを宿主細胞ゲノムへ組み入れる役割を担う。ｅｎｖ配列は、エンベロープ糖タンパク質のＳＵおよびＴＭサブユニットの両方をコードする。さらに、レトロウイルスゲノムは、遺伝子発現、逆転写および宿主細胞染色体への組み入れを促進するために必要な要素を含有する、２つのＬＴＲ（長い末端反復）；新たに形成するビリオンへのウイルスＲＮＡの特異的パッケージングに必要なパッケージングシグナル（Ψ）と名付けられる配列；ならびに逆転写の間にプラス鎖ＤＮＡ合成を開始する部位として機能するポリプリントラクト（polypurine tract；ＰＰＴ）のような非コーディングシス作用性配列を提示する。ｇａｇ、ｐｒｏ、ｐｏｌおよびｅｎｖに加えて、レンチウイルスなどの複合レトロウイルスは、ウイルス遺伝子発現、感染性粒子の集合を調節し、感染細胞におけるウイルス複製をモジュレートするｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｎｅｆ、ｔａｔおよびｒｅｖを含むアクセサリー遺伝子を有する。
【００５３】
感染のプロセスの間、レトロウイルスは最初に特定の細胞表面受容体に付着する。感受性の宿主細胞に侵入すると、レトロウイルスＲＮＡゲノムは、親ウイルス内に保有されている、ウイルスにコードされた逆転写酵素によってＤＮＡにコピーされる。このＤＮＡは宿主細胞核に輸送され、次いで宿主ゲノムに組み入れられる。この段階では、典型的に、それはプロウイルスと呼ばれる。プロウイルスは、細胞分裂中の宿主染色体において安定であり、他の細胞タンパク質のように転写される。プロウイルスは、より多くのウイルスを作製するために必要とされるタンパク質およびパッケージング機構をコードし、「出芽（budding）」として公知のプロセスによって細胞から離れることができる。
【００５４】
レトロウイルスおよびレンチウイルスなどのエンベロープウイルスが宿主細胞から出芽すると、それらは宿主細胞脂質膜の一部を占める。このようにして、宿主細胞由来膜タンパク質がレトロウイルス粒子の一部となる。本発明は、目的のタンパク質をウイルス粒子のエンベロープに導入するために、このプロセスを利用する。
レトロウイルスベクター
【００５５】
レトロウイルスおよびレンチウイルスは、１つの目的のヌクレオチド（ＮＯＩ）または複数のＮＯＩを標的細胞に導入するためのベクターまたは送達系として使用することができる。導入は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで起こり得る。この様式で使用される場合、ウイルスは、典型的にはウイルスベクターと呼ばれる。
【００５６】
本発明のウイルスベクターにおいて、ＮＯＩは、Ｔ細胞受容体またはキメラ抗原受容体および／または自殺遺伝子をコードし得る。
【００５７】
一般にレトロウイルスベクターと称されるガンマ−レトロウイルスベクターは、１９９０年に遺伝子療法の臨床試験に用いられた最初のウイルスベクターであり、依然として最も使用されているものの１つである。最近では、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）などの複合レトロウイルスに由来するレンチウイルスベクターについての関心が、その非分裂細胞に形質導入する能力のために増加している。遺伝子導入ツールとしてのレトロウイルスベクターおよびレンチウイルスベクターの最も魅力的な特徴としては、大きな遺伝的ペイロード（最大９ｋｂまで）容量、最小限の患者免疫応答、ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏでの高い形質導入効率、ならびに標的細胞の遺伝子含量を恒久的に改変し、送達された遺伝子の長期的な発現を持続させる能力が挙げられる。
【００５８】
レトロウイルスベクターは、遺伝情報を真核細胞に送達することができる任意の適切なレトロウイルスに基づくことができる。例えば、レトロウイルスベクターは、アルファレトロウイルスベクター、ガンマレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターまたはスプマレトロウイルスベクターであり得る。そのようなベクターは、遺伝子療法の治療および他の遺伝子送達の応用において広範に使用されてきた。
【００５９】
本発明のウイルスベクターは、レトロウイルスベクター、例えばガンマ−レトロウイルスベクターであってもよい。ウイルスベクターは、ヒト免疫不全ウイルスに基づくものであってもよい。
【００６０】
本発明のウイルスベクターは、レンチウイルスベクターであってもよい。このベクターは、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）のような非霊長類レンチウイルスに基づくものであってもよい。
【００６１】
本発明のウイルスベクターは、図１に例示されるように、分裂促進性Ｔ細胞活性化膜貫通タンパク質および／またはサイトカインに基づくＴ細胞活性化膜貫通タンパク質をウイルスエンベロープ中に含む。
【００６２】
分裂促進性Ｔ細胞活性化膜貫通タンパク質および／またはサイトカインに基づくＴ細胞活性化膜貫通タンパク質は、上記で説明したように、宿主細胞膜に由来する。
ウイルス様粒子（ＶＬＰ）
【００６３】
レトロウイルスベクターおよびレンチウイルスベクターについては、ビリオンの集合および放出を媒介するためにはＧａｇ前駆体の発現が十分である。Ｇａｇタンパク質、およびＧａｇの断片さえも、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで集合して、ビリオンコアに似た様々な構造を形成する能力があることが示されている。ウイルスの遺伝物質を欠き、故に非感染性であるこれらの粒子は、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）と呼ばれる。完全なウイルス粒子と同じ様に、これらは宿主細胞脂質−二重層（膜）で作られた外側のウイルスエンベロープを含有し、故に宿主細胞膜貫通タンパク質を含有する。
【００６４】
本発明の第１の態様のウイルスベクターは、ウイルス様粒子であっても、含んでいてもよい。
目的のヌクレオチド（ＮＯＩ）
【００６５】
本発明のウイルスベクターは、Ｔ細胞またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞のような標的細胞に目的のヌクレオチド（ＮＯＩ）を送達することができる。
【００６６】
ＮＯＩは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）および／または自殺遺伝子の全てまたは一部をコードし得る。
【００６７】
ＣＡＲは、細胞外抗原認識ドメイン（バインダー）を細胞内シグナル伝達ドメイン（エンドドメイン）に接続するキメラＩ型膜貫通型タンパク質である。バインダーは、典型的には、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）から由来した一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）であるが、抗体様抗原結合部位を含む他の形式に基づくこともできる。バインダーを膜から単離し、適切に配向させるためには、通常、スペーサードメインが必要である。膜貫通ドメインはタンパク質を細胞膜中に固定する。ＣＡＲは、細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインまたはエンドドメインを含むかまたはそれと会合してもよい。
【００６８】
ＣＡＲをコードする核酸は、本発明のレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターを用いて、Ｔ細胞などの細胞に導入することができる。このようにして、多数のがん特異的Ｔ細胞を養子細胞移植法のために生成することができる。ＣＡＲが標的抗原に結合すると、それが発現されるＴ細胞に活性化シグナルが伝達される。したがって、ＣＡＲは、標的抗原を発現する腫瘍細胞に対するＴ細胞の特異性および細胞傷害性を指示する。
【００６９】
自殺遺伝子は、例えば、アポトーシスを誘発させることによって、そのようなポリペプチドを発現する細胞を欠失させることを可能にするポリペプチドをコードする。自殺遺伝子の例は、国際公開第２０１３／１５３３９１号に記載されている。
宿主細胞
【００７０】
第２の態様では、本発明は、細胞表面で分裂促進性Ｔ細胞活性化膜貫通タンパク質またはサイトカインに基づくＴ細胞活性化膜貫通タンパク質を発現する宿主細胞を提供する。
【００７１】
宿主細胞は、本発明の第１の態様に記載のウイルスベクターの産生のためのものであってもよい。
【００７２】
宿主細胞は、パッケージング細胞であってもよく、下記の遺伝子：ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖおよびｒｅｖのうち１つまたは複数を含んでもよい。
【００７３】
レトロウイルスベクターについてのパッケージング細胞は、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子を含んでもよい。
【００７４】
レンチウイルスベクターについてのパッケージング細胞は、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖおよびｒｅｖ遺伝子を含んでもよい。
【００７５】
宿主細胞は、プロデューサー細胞であってもよく、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖおよび必要に応じてｒｅｖ遺伝子ならびにレトロウイルスゲノムまたはレンチウイルスベクターゲノムを含んでもよい。
【００７６】
遺伝子療法に使用するための典型的な組換えレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターにおいて、１つまたは複数のｇａｇ−ｐｏｌおよびｅｎｖタンパク質コード領域の少なくとも一部をウイルスから除去し、パッケージング細胞によって提供するようにしてもよい。ウイルスはそのゲノムを宿主ゲノムに組み入れることができるが、改変されたウイルスゲノムは構造タンパク質の欠損のために増殖することができないので、このことによりウイルスベクターが複製能欠如となる。
【００７７】
パッケージング細胞は、ウイルスベクターの量を増殖および単離するために、すなわち、標的細胞の形質導入のためのレトロウイルスベクターの適切な力価を調製するために使用される。
【００７８】
いくつかの例において、増殖および単離は、レトロウイルスｇａｇｐｏｌおよびｅｎｖ（ならびにレンチウイルスの場合には、ｒｅｖ）遺伝子の単離ならびにパッケージング細胞株を産生するための宿主細胞へのそれらの別個の導入を伴ってもよい。パッケージング細胞株は、レトロウイルスＤＮＡのパッケージングに必要なタンパク質を産生するが、プサイ領域（psi region）が欠損しているためにキャプシド形成を引き起こすことはできない。しかしながら、プサイ領域を保有する組換えベクターがパッケージング細胞株に導入される場合、ヘルパータンパク質はプサイポジティブ組換えベクターをパッケージングして組換えウイルスストックを産生することができる。
【００７９】
入手可能なパッケージング株の概要は、「レトロウイルス」（「Retroviruses」、１９９７年  Cold Spring Harbour Laboratory Press編：JMCoffin、SM Hughes、HE Varmus、４４９頁）に提示されている。
【００８０】
３つの組換え事象が野生型ウイルス産生に必要であるように、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ（ならびにレンチウイルスベクターの場合にはｒｅｖ）ウイルスコーディング領域が、パッケージング細胞株に独立してトランスフェクトされる別個の発現プラスミド上に乗っているパッケージング細胞も開発された。
【００８１】
一過性トランスフェクションは、安定なベクター産生細胞株を生成するために必要となるより長い時間を回避し、ベクターまたはレトロウイルスパッケージング構成成分が細胞に対して毒性がある場合に使用される。レトロウイルス／レンチウイルスベクターを生成するために典型的に使用される構成成分は、Ｇａｇ／Ｐｏｌタンパク質をコードするプラスミド、Ｅｎｖタンパク質をコードするプラスミド（およびレンチウイルスベクターの場合にはｒｅｖタンパク質）ならびにレトロウイルス／レンチウイルスベクターゲノムを含む。ベクター産生は、これらの構成成分のうちの１つまたは複数を、他の必要な構成成分を含有する細胞に一過性にトランスフェクトすることを含む。
【００８２】
本発明のパッケージング細胞は、レトロウイルス／レンチウイルスベクター粒子を産生することができる任意の哺乳動物細胞型であってもよい。パッケージング細胞は、２９３Ｔ細胞、または懸濁液中で増殖し、血清なしで増殖するように適合された２９３Ｔ細胞の変異体であってもよい。
パッケージング細胞は、
ａ）導入ベクター
ｂ）ｇａｇｐｏｌ発現ベクター
【００８３】
ｃ）ｅｎｖ発現ベクター
の一過性トランスフェクションによって作製されてもよい。
ｅｎｖ遺伝子は、偽型レトロウイルスベクターを生じる、異種のものであってもよい。例えば、ｅｎｖ遺伝子は、ＲＤ１１４またはその変異体の１つ、ＶＳＶ−Ｇ、テナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）、アンホトロピックエンベロープまたは麻疹エンベロープもしくはヒヒレトロウイルスエンベロープ糖タンパク質からのものであり得る。
【００８４】
レンチウイルスベクターの場合、ｒｅｖベクターを用いた一過性トランスフェクションも行われる。
分裂促進性Ｔ細胞活性化膜貫通タンパク質
【００８５】
本発明のウイルスベクターは、ウイルスエンベロープ中に分裂促進性Ｔ細胞活性化膜貫通タンパク質を含んでもよい。分裂促進性Ｔ細胞活性化膜貫通タンパク質は、レトロウイルスベクター産生期間内の宿主細胞に由来する。分裂促進性Ｔ細胞活性化膜貫通タンパク質は、パッケージング細胞により作られ、細胞表面で発現される。新生のレトロウイルスベクターが宿主細胞膜から出芽する（bud）と、分裂促進性Ｔ細胞活性化膜貫通タンパク質がパッケージング細胞由来脂質二重層の一部としてウイルスエンベロープに組み込まれる。
【００８６】
用語「宿主細胞由来」は、分裂促進性Ｔ細胞活性化膜貫通タンパク質が上に記載したように宿主細胞に由来し、例えば、主要な構造タンパク質をコードするｇａｇ；またはエンベロープタンパク質をコードするｅｎｖのようなウイルス遺伝子の１つからの融合体またはキメラとして産生されないことを示す。
【００８７】
エンベロープタンパク質は、タンパク質を脂質膜に固定する膜貫通（ＴＭ）と細胞受容体に結合する表面（ＳＵ）の、２つのサブユニットによって形成される。本発明のパッケージング細胞由来の分裂促進性Ｔ細胞活性化膜貫通タンパク質は、表面エンベロープサブユニット（ＳＵ）を含まない。
【００８８】
分裂促進性Ｔ細胞活性化膜貫通タンパク質は、以下の配列の１つまたはその変異体を含み得る。
配列番号１（ＯＫＴ３−ＣＤ８ＳＴＫ−ＴＭ−Ａ）
【００８９】
【化１】
0006695347.tif 000002
配列番号２（１５Ｅ８−ＣＤ８ＳＴＫ−ＴＭ−Ａ）
【００９０】
【化２】
0006695347.tif 000003
配列番号３（ＴＧＮ１４１２−ＣＤ８ＳＴＫ−ＴＭ−Ａ）
【００９１】
【化３】
0006695347.tif 000004
【００９２】
分裂促進性Ｔ細胞活性化膜貫通タンパク質は、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも９８または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列番号１、２または３に示される配列の変異体を含み得るが、ただし、その変異体配列が、必要な特性、すなわちレトロウイルスベクターのエンベロープタンパク質中に存在する場合にＴ細胞を活性化する能力を有する分裂促進性Ｔ細胞活性化膜貫通タンパク質であることを条件とする。
【００９３】
配列アラインメントの方法は、当技術分野で周知であり、適切なアラインメントプログラムを用いて遂行される。％配列同一性は、２つの配列が最適に整列された場合に２つの配列において同一であるアミノ酸またはヌクレオチド残基のパーセンテージを指す。ヌクレオチドおよびタンパク質配列の相同性または同一性は、http://blast.ncbi.nlm.nih.govで公開されているデフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴプログラム（Basic Local Alignment Search Tool at the National Center forBiotechnology Information）のような標準アルゴリズムを用いて決定することができる。配列同一性または相同性を決定するための他のアルゴリズムとしては、ＬＡＬＩＧＮ（http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/lalign/およびhttp://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/lalign/nucleotide.html）、ＡＭＡＳ（Analysis of Multiply Aligned Sequences、http://www.compbio.dundee.ac.uk/Software/Amas/amas.htmlにて）、ＦＡＳＴＡ（http://www.ebi.ac.uk/Tools/sss/fasta/）、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｏｍｅｇａ（http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/）、ＳＩＭ（http://web.expasy.org/sim/）、ならびにＥＭＢＯＳＳ  Ｎｅｅｄｌｅ（http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/nucleotide.html）が挙げられる。
【００９４】
分裂促進性Ｔ細胞活性化膜貫通タンパク質は、構造：Ｍ−Ｓ−ＴＭを有し得、
ここで、Ｍは分裂促進性ドメインであり；Ｓは任意選択のスペーサードメインであり、ＴＭは膜貫通ドメインである。
分裂促進性ドメイン
【００９５】
分裂促進性ドメインは、Ｔ細胞活性化を引き起こす分裂促進性Ｔ細胞活性化膜貫通タンパク質の一部である。これは、Ｔ細胞と直接または間接的に結合またはさもなければ相互作用してもよく、Ｔ細胞活性化をもたらす。特に、分裂促進性ドメインは、Ｔ細胞表面抗原、例えばＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ１３４およびＣＤ１３７に結合し得る。
【００９６】
ＣＤ３は、Ｔ細胞共受容体である。それは、４つの別々の鎖からなるタンパク質複合体である。哺乳動物において、複合体はＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖、および２つのＣＤ３ε鎖を含む。これらの鎖は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）およびζ鎖と会合して、Ｔリンパ球において活性化シグナルを生成する。ＴＣＲ、ζ鎖、およびＣＤ３分子は共にＴＣＲ複合体を含む。
【００９７】
分裂促進性ドメインは、ＣＤ３ε鎖に結合し得る。
【００９８】
ＣＤ２８は、Ｔ細胞の活性化および生存に必要な共刺激シグナルを提供するＴ細胞上で発現されるタンパク質の１つである。Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）に加えてＣＤ２８を介したＴ細胞刺激は、様々なインターロイキン（特にＩＬ−６）の産生のための強力なシグナルを提供することができる。
【００９９】
ＯＸ４０としても公知のＣＤ１３４は、ＣＤ２８とは違って、休止中のナイーブＴ細胞上に構成的に発現されない受容体のＴＮＦＲスーパーファミリーのメンバーである。ＯＸ４０は、活性化後２４時間から７２時間後に発現する二次共刺激分子である：そのリガンドのＯＸ４０Ｌもまた、休止中の抗原提示細胞上では発現されないが、それらの活性化後には発現される。ＯＸ４０の発現は、Ｔ細胞の完全な活性化に依存する；ＣＤ２８が無ければ、ＯＸ４０の発現は遅れ、４倍低いレベルである。
【０１００】
４−１ＢＢとしても公知のＣＤ１３７は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体ファミリーのメンバーである。ＣＤ１３７は、活性化されたＴ細胞によって発現することができるが、ＣＤ４  Ｔ細胞よりもＣＤ８において、大きな規模である。さらに、ＣＤ１３７の発現は、樹状細胞、濾胞性樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、顆粒球および炎症部位の血管壁細胞において見出される。ＣＤ１３７の最も特徴付けられた活性は、活性化されたＴ細胞の共刺激活性である。ＣＤ１３７の架橋は、Ｔ細胞増殖、ＩＬ−２分泌生存および細胞溶解活性を高める。
【０１０１】
分裂促進性ドメインは、Ｔ細胞表面抗原に特異的に結合する抗体または他の分子の全部または一部を含んでいてもよい。抗体は、ＴＣＲまたはＣＤ２８を活性化し得る。抗体は、ＴＣＲ、ＣＤ３またはＣＤ２８に結合し得る。そのような抗体の例としては、ＯＫＴ３、１５Ｅ８およびＴＧＮ１４１２が挙げられる。他の適切な抗体としては、
抗ＣＤ２８：ＣＤ２８．２、１０Ｆ３
抗ＣＤ３／ＴＣＲ：ＵＣＨＴ１、ＹＴＨ１２．５、ＴＲ６６が挙げられる。
【０１０２】
分裂促進性ドメインには、ＯＫＴ３、１５Ｅ８、ＴＧＮ１４１２、ＣＤ２８．２、１０Ｆ３、ＵＣＨＴ１、ＹＴＨ１２．５またはＴＲ６６からの結合ドメインを含み得る。
【０１０３】
分裂促進性ドメインには、ＯＸ４０Ｌおよび４１ＢＢＬなどの共刺激分子の全部または一部を含み得る。例えば、分裂促進性ドメインは、ＯＸ４０Ｌまたは４１ＢＢＬからの結合ドメインを含み得る。
【０１０４】
Ｍｕｒｏｍｏｎａｂ−ＣＤ３としても公知のＯＫＴ３は、ＣＤ３ε鎖を標的とするモノクローナル抗体である。それは臓器移植患者の急性拒絶反応を低減するために臨床的に使用されている。それはヒトにおける臨床使用のために認可された最初のモノクローナル抗体であった。ＯＫＴ３のＣＤＲは下記の通りである：
【化４】
0006695347.tif 000005
１５Ｅ８は、ヒトＣＤ２８に対するマウスモノクローナル抗体である。そのＣＤＲは下記の通りである：
【化５】
0006695347.tif 000006
【０１０５】
（ＣＤ２８−ＳｕｐｅｒＭＡＢとしても公知である）ＴＧＮ１４１２は、ＣＤ２８受容体に結合するだけでなく、ＣＤ２８受容体に対する強力なアゴニストであるヒト化モノクローナル抗体である。そのＣＤＲは下記の通りである。
【化６】
0006695347.tif 000007
【０１０６】
ＯＸ４０ＬはＣＤ１３４に対するリガンドであり、Ｔｈ２細胞分化の増幅を可能にするＤＣ２ｓ（樹状細胞のサブタイプ）のような細胞上で発現される。ＯＸ４０Ｌはまた、ＣＤ２５２（表面抗原分類２５２）と称されている。
ＯＸ４０Ｌ配列（配列番号２２）
【化７】
0006695347.tif 000008
【０１０７】
４１ＢＢＬは、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）リガンドファミリーに属するサイトカインである。この膜貫通サイトカインは、Ｔリンパ球における共刺激受容体分子である４−１ＢＢのリガンドとして作用する双方向シグナルトランスデューサーである。４１ＢＢＬは、Ｔリンパ球増殖を促進することに加えて、アネルギー性のＴリンパ球を再活性化することが示されている。
４１ＢＢＬ配列（配列番号２３）
【０１０８】
【化８】
0006695347.tif 000009
スペーサードメイン
【０１０９】
分裂促進性Ｔ細胞活性化膜貫通タンパク質および／またはサイトカインに基づくＴ細胞活性化膜貫通タンパク質は、抗原結合ドメインを膜貫通ドメインに接続するためのスペーサー配列を含んでもよい。柔軟なスペーサーは、結合を容易にするために抗原結合ドメインが様々な方向に配向することを可能にする。
【０１１０】
スペーサー配列は、例えば、ＩｇＧ１  Ｆｃ領域、ＩｇＧ１ヒンジまたはヒトＣＤ８ストーク（stalk）もしくはマウスＣＤ８ストークを含んでもよい。代わりに、スペーサーは、ＩｇＧ１  Ｆｃ領域、ＩｇＧ１ヒンジまたはＣＤ８ストークと類似の長さおよび／またはドメイン間隔特性を有する代替のリンカー配列を含んでいてもよい。Ｆｃ結合モチーフを除去するために、ヒトＩｇＧ１スペーサーを変更することができる。
これらのスペーサーのアミノ酸配列の例を下記に示す：
【０１１１】
【化９】
0006695347.tif 000010
【０１１２】
スペーサー配列は、ヒトタンパク質に由来してもよい。スペーサー配列は、ウイルスタンパク質に由来していなくてもよい。特に、スペーサー配列は、レトロウイルスｅｎｖタンパク質の表面エンベロープサブユニット（ＳＵ）の一部ではなくても、由来していなくても、またはその一部を含んでいなくてもよい。
膜貫通ドメイン
【０１１３】
膜貫通ドメインは、膜にまたがる分裂促進性Ｔ細胞活性化膜貫通タンパク質および／またはサイトカインに基づくＴ細胞活性化膜貫通タンパク質の配列である。膜貫通ドメインは、疎水性アルファヘリックスを含んでいてもよい。膜貫通ドメインはＣＤ２８に由来していてもよく、そのことにより良好な受容体安定性を与える。
【０１１４】
膜貫通ドメインは、ヒトタンパク質に由来し得る。膜貫通ドメインは、ウイルスタンパク質に由来していなくてもよい。特に、膜貫通ドメインは、レトロウイルスのｅｎｖタンパク質の膜貫通エンベロープサブユニット（ＴＭ）ではなくても、由来していなくても、またはその一部を含んでいなくてもよい。
【０１１５】
膜貫通ドメインに対する代替的な選択肢は、ＧＰＩアンカーのような膜標的ドメインである。
【０１１６】
ＧＰＩアンカーリングは、小胞体において起こる翻訳後修飾である。組み立て済みのＧＰＩアンカー前駆体は、Ｃ末端ＧＰＩシグナル配列を持つタンパク質に導入される。処理中、ＧＰＩアンカーはＧＰＩシグナル配列を置き換え、アミド結合を介して標的タンパク質に連結される。ＧＰＩアンカーは、成熟タンパク質を膜に標的化する。
【０１１７】
本発明のタグ化タンパク質は、ＧＰＩシグナル配列を含んでもよい。
サイトカインに基づくＴ細胞活性化膜貫通タンパク質
【０１１８】
本発明のウイルスベクターは、ウイルスエンベロープ中にサイトカインに基づくＴ細胞活性化膜貫通タンパク質を含んでいてもよい。サイトカインに基づくＴ細胞活性化膜貫通タンパク質は、ウイルスベクター産生中の宿主細胞に由来する。サイトカインに基づくＴ細胞活性化膜貫通タンパク質は、宿主細胞によって作られ、細胞表面で発現される。新生のウイルスベクターが宿主細胞膜から出芽すると、サイトカインに基づくＴ細胞活性化膜貫通タンパク質がパッケージング細胞由来の脂質二重層の一部としてウイルスエンベロープに組み込まれる。
【０１１９】
サイトカインに基づくＴ細胞活性化膜貫通タンパク質は、主要構造タンパク質をコードするｇａｇまたはエンベロープタンパク質をコードするｅｎｖのようなウイルス遺伝子の１つから産生されない。
【０１２０】
サイトカインに基づくＴ細胞活性化膜貫通タンパク質は、サイトカインドメインおよび膜貫通ドメインを含んでもよい。それは構造Ｃ−Ｓ−ＴＭを有していてもよく、ここで、Ｃはサイトカインドメインであり、Ｓは任意選択のスペーサードメインであり、ＴＭは膜貫通ドメインである。スペーサードメインおよび膜貫通ドメインは、上で定義された通りである。
サイトカインドメイン
【０１２１】
サイトカインドメインは、ＩＬ２、ＩＬ７およびＩＬ１５などからのＴ細胞活性化サイトカインの一部または全部を含んでもよい。サイトカインドメインは、その特定の受容体に結合し、Ｔ細胞を活性化する能力を保持する限り、サイトカインの一部を含み得る。
【０１２２】
ＩＬ２は、Ｔ細胞およびある特定のＢ細胞の増殖および分化を調節するためにＴ細胞によって分泌される因子の１つである。ＩＬ２は、応答性Ｔ細胞の増殖を誘導するリンホカインである。それは、単一のグリコシル化ポリペプチドとして分泌され、その活性のためにシグナル配列の切断が必要である。溶液ＮＭＲは、ＩＬ２の構造が、２つの短いヘリックスおよびいくつかの不完全に定義されたループに隣接する４つのヘリックス（Ａ〜Ｄと名付けられる）の束を含むことを示唆している。ヘリックスＡおよびヘリックスＡとＢの間のループ領域の残基は、受容体結合に重要である。ＩＬ２の配列を配列番号２９として示す。
配列番号２９
【化１０】
0006695347.tif 000011
【０１２３】
ＩＬ７は、ＢおよびＴ細胞系統の両方の初期リンパ系細胞の増殖因子として働くサイトカインである。ＩＬ７の配列を配列番号３０として示す。
配列番号３０
【化１１】
0006695347.tif 000012
【０１２４】
ＩＬ１５は、ＩＬ−２と構造的類似性を持つサイトカインである。ＩＬ−２と同様に、ＩＬ−１５は、ＩＬ−２／ＩＬ−１５受容体ベータ鎖および共通のガンマ鎖から構成される複合体に結合し、それを介してシグナルを伝達する。ＩＬ−１５は、ウイルス（複数可）による感染後に、単核食細胞およびいくつかの他の細胞によって分泌される。このサイトカインは、ウイルスに感染した細胞を殺すことを主な役割とする先天性免疫系の細胞である、ナチュラルキラー細胞の細胞増殖を誘導する。ＩＬ−１５の配列を配列番号３１として示す。
配列番号３１
【化１２】
0006695347.tif 000013
サイトカインに基づくＴ細胞活性化膜貫通タンパク質は、下記の配列またはその変異体の１つを含み得る：
配列番号３２（膜−ＩＬ７）
【０１２５】
【化１３】
0006695347.tif 000014
配列番号３３（膜−ＩＬ１５）
【０１２６】
【化１４】
0006695347.tif 000015
【０１２７】
サイトカインに基づくＴ細胞活性化膜貫通タンパク質は、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも９８または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列番号３２または３３で示される配列の変異体を含んでもよいが、ただし、変異体配列が、必要な特性、すなわちレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターのエンベロープタンパク質中に存在する場合にＴ細胞を活性化する能力を有するサイトカインに基づくＴ細胞活性化膜貫通タンパク質であることを条件とする。
タグ化タンパク質
【０１２８】
ウイルスベクターのウイルスエンベロープはまた、捕捉部分および膜貫通ドメインに結合する結合ドメインを含むタグ化タンパク質を含んでもよい。
【０１２９】
タグ化タンパク質は、
捕捉部分に結合する結合ドメイン
スペーサー；ならびに
膜貫通ドメイン
を含んでもよい。
【０１３０】
タグ化タンパク質は、タグ化タンパク質の捕捉部分への結合を介して、細胞上清からのウイルスベクターの精製を容易にする。
【０１３１】
「結合ドメイン」は、標的実体、例えば捕捉部分を認識し、特異的に結合することが可能な実体、例えばエピトープを指す。
【０１３２】
結合ドメインは、捕捉部分に特異的に結合することが可能な１つまたは複数のエピトープを含み得る。例えば、結合ドメインは、捕捉部分に特異的に結合することが可能な少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つまたは少なくとも５つのエピトープを含んでもよい。結合ドメインが２つ以上のエピトープを含む場合、各々のエピトープは、本明細書に記載されるように、リンカー配列によって分離されていてもよい。
【０１３３】
結合ドメインは、結合ドメインと比較して捕捉部分に対してより高い結合親和性を有する実体を添加した時に、捕捉部分から放出可能であってもよい。
ストレプトアビジン結合エピトープ
【０１３４】
結合ドメインは、１つまたは複数のストレプトアビジン結合エピトープを含むことができる。例えば、結合ドメインは、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４または少なくとも５個のストレプトアビジン結合エピトープを含むことができる。
【０１３５】
ストレプトアビジンは、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｉｄｉｎｉｉ細菌から精製された５２．８ｋＤａタンパク質である。ストレプトアビジンホモ四量体はビオチン（ビタミンＢ７またはビタミンＨ）に対して非常に高い親和性を有し、解離定数（Ｋｄ）はおよそ１０−１５Ｍである。ストレプトアビジンは当技術分野において周知であり、ストレプトアビジン−ビオチン複合体の有機溶媒、変性剤、タンパク質分解酵素、ならびに極端な温度およびｐＨに対する耐性により、分子生物学およびバイオナノテクノロジーにおいて広範に使用されている。強力なストレプトアビジン−ビオチン結合は、様々な生体分子を互いにまたは固体支持体に付着させることに使用することができる。しかしながら、ストレプトアビジン−ビオチン相互作用を破壊するためには厳しい条件が必要であり、これは精製される目的のタンパク質を変性させる可能性がある。
【０１３６】
結合ドメインは、例えば、ビオチン模倣体であってもよい。「ビオチン模倣体」は、ストレプトアビジンに特異的に結合する短いペプチド配列（例えば、６から２０、６から１８、８から１８または８から１５アミノ酸）を指してもよい。
【０１３７】
上に記載したように、ビオチン／ストレプトアビジン相互作用の親和性は非常に高い。したがって、本発明の利点は、結合ドメインが、ビオチンそれ自体と比較してストレプトアビジンに対してより低い親和性を有するビオチン模倣体を含み得ることである。
【０１３８】
特に、ビオチン模倣体は、ビオチンよりも低い結合親和性でストレプトアビジンに結合することができるので、その結果、ビオチンは、ストレプトアビジン捕捉レトロウイルスベクターを溶出するために使用され得る。例えば、ビオチン模倣体は、ストレプトアビジンに、１ｎＭから１００ｕＭのＫｄで結合し得る。
【０１３９】
ビオチン模倣体は、表１に示す配列を含んでもよい。
【０１４０】
【表１】
0006695347.tif 000016
【０１４１】
ビオチン模倣体は、ＳｔｒｅｐｔａｇＩＩ、Ｆｌａｎｋｅｄｃｃｓｔｒｅｐｔａｇおよびｃｃｓｔｒｅｐｔａｇの群から選択されてもよい。
【０１４２】
結合ドメインは、２つ以上のビオチン模倣体を含んでもよい。例えば、結合ドメインは、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つまたは少なくとも５つのビオチン模倣体を含んでもよい。
【０１４３】
結合ドメインが２つ以上のビオチン模倣体を含む場合、各々の模倣体は、同じであるかまたは異なる模倣体であり得る。例えば、結合ドメインは、（例えば、配列番号４３によって示されるような）リンカーによって分離された２つのＳｔｒｅｐｔａｇＩＩビオチン模倣体または（例えば、配列番号４４によって示されるような）リンカーによって分離された２つのＦｌａｎｋｅｄｃｃｓｔｒｅｐｔａｇを含んでもよい。
【化１５】
0006695347.tif 000017
グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ
【０１４４】
結合ドメインは、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）ドメインを含んでもよい。
【０１４５】
ＧＳＴは、解毒の目的のために、還元型のグルタチオン（ＧＳＨ）が生体異物基質へコンジュゲートすることを触媒する真核生物および原核生物の第ＩＩ相の代謝アイソザイムのファミリーを含む。ＧＳＴファミリーは、細胞質ゾル、ミトコンドリア、およびミクロソーム（ＭＡＰＥＧとしても公知である）タンパク質の３つのスーパーファミリーからなる（Udomsinpraserら  Biochem. J.（２００５年）３８８巻（Ｐｔ  ３）：７６３〜７１頁）。
【０１４６】
ＧＳＴタンパク質はＧＳＨに対して強い結合親和性を有しており、この相互作用は、タンパク質混合物からＧＳＴタグ化タンパク質を単離することを可能にするために、分子生物学において一般に使用される。
【０１４７】
ＧＳＴのアミノ酸配列を配列番号４５に示す。
配列番号４５（ＧＳＴ）
【０１４８】
【化１６】
0006695347.tif 000018
リツキシマブ結合エピトープ
【０１４９】
本発明のタグ化タンパク質は、リツキシマブ結合エピトープ（Ｒエピトープ）および／またはＱｂｅｎｄ１０エピトープ（Ｑエピトープ）を含む結合ドメインを含んでもよい。
【０１５０】
リツキシマブ結合エピトープは、リツキシマブに特異的に結合するエピトープを指す。例えば、リツキシマブ結合エピトープは、ＣＤ２０  Ｂ細胞抗原に基づくものであってもよい。
ＣＤ２０からのリツキシマブ結合エピトープ配列は、ＣＥＰＡＮＰＳＥＫＮＳＰＳＴＱＹＣ（配列番号４６）である。
【０１５１】
Perosaら（２００７年、J.Immunol  １７９巻：７９６７〜７９７４頁）は、抗ＣＤ２０  ｍＡｂリツキシマブによって認識されるが、異なるモチーフに囲まれたアミノ酸を有する抗原性モチーフを持つ一連のシステイン制約の７量体環状ペプチドを記載している。下記の表に示されるような、全部で１１のペプチドが記載されている：
【表２】
0006695347.tif 000019
【０１５２】
Liら（２００６年、CellImmunol  ２３９巻：１３６〜４３頁）はまた、下記の配列を含むリツキシマブのミメトープ（mimetope）を記載している：
【０１５３】
【化１７】
0006695347.tif 000020
【０１５４】
本発明のポリペプチドは、配列番号４６〜５８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するリツキシマブ結合エピトープまたはリツキシマブ結合活性を保持するその変異体を含む。
ＱＢｅｎｄ１０
【０１５５】
ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  ＣＤ３４選択システムは、細胞選択を達成するためにＱＢＥｎｄ１０モノクローナル抗体を利用する。本発明者らは、以前にＣＤ３４抗原内からＱＢＥｎｄ１０結合エピトープをマッピングし（国際公開第２０１３／１５３３９１号参照）、それが配列番号５９として示されるようなアミノ酸配列を有することを決定した。
【０１５６】
【化１８】
0006695347.tif 000021
【０１５７】
本発明のタグ化タンパク質の結合ドメインは、配列番号５９として示されるようなアミノ酸配列を有するＱＢＥｎｄ１０結合エピトープまたはＱＢＥｎｄ１０結合活性を保持するその変異体を含んでもよい。
ＲＱＲ８
【０１５８】
タグ化タンパク質は、配列番号６０として示されるような１３６アミノ酸配列を含むかまたはそれからなる結合ドメインを含んでもよい。
配列番号６０（ＲＱＲ８）
【化１９】
0006695347.tif 000022
核酸
【０１５９】
本発明はまた、サイトカインに基づくＴ細胞活性化膜貫通タンパク質をコードする核酸または分裂促進性Ｔ細胞活性化膜貫通タンパク質をコードする核酸に関する。核酸は、分裂促進性Ｔ細胞活性化膜貫通タンパク質および／またはサイトカインに基づくＴ細胞活性化膜貫通タンパク質をコードする複数の配列を含む構築物の形態であってよい。
【０１６０】
本明細書中で使用される場合、「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」および「核酸」という用語は、互いに同義であることが意図される。
【０１６１】
多くの異なるポリヌクレオチドおよび核酸が遺伝コードの縮重の結果として同じポリペプチドをコードし得ることは、当業者に理解されるであろう。さらに、当業者は、ポリペプチドが発現する任意の特定の宿主生物のコドン使用頻度（ｃｏｄｏｎ  ｕｓａｇｅ）を反映させるために、通常の技術を使用して、本明細書に記載のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド配列に影響を及ぼさないヌクレオチド置換を作製し得ることが理解されるべきである。
【０１６２】
核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含んでもよい。それらは、一本鎖または二本鎖であってもよい。それらはまた、それらの中に合成ヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドであってもよい。オリゴヌクレオチドへの多くの異なるタイプの修飾が、当技術分野で公知である。これらには、メチルホスホネートおよびホスホロチオエート骨格、分子の３’および／または５’末端におけるアクリジンまたはポリリシン鎖の付加が含まれる。本明細書中に記載されるように使用する目的で、ポリヌクレオチドは、当技術分野で利用可能な任意の方法によって改変され得ることが理解されるべきである。このような修飾は、目的のポリヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｖｏ活性または寿命を増強するために行うことができる。
【０１６３】
ヌクレオチド配列に関連する「変異体」、「ホモログ」または「誘導体」という用語は、配列からの、または配列への１つ（または複数の）の核酸の任意の置換、変異、修飾、置き換え、欠失または付加を含む。
【０１６４】
核酸は、分裂促進性Ｔ細胞活性化膜貫通タンパク質をコードする１つまたは複数の配列および／またはサイトカインに基づくＴ細胞活性化膜貫通タンパク質をコードする１つまたは複数の配列を含むポリペプチドを産生し得る。切断部位は、ポリペプチドが産生されると、外的な切断活性を必要とすることなく受容体構成成分およびシグナル伝達構成成分に直ちに切断されるような、自己切断であってもよい。
【０１６５】
口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２ａ自己切断ペプチドおよび様々な変異体ならびに２Ａ様ペプチドを含む、様々な自己切断部位が公知である。このペプチドは、配列番号３４または３５として示される配列を有し得る。
【０１６６】
【化２０】
0006695347.tif 000023
【０１６７】
共発現配列は、内部リボソーム進入配列（ＲＥＳ）であってもよい。共発現配列は、内部プロモーターであってもよい。
ベクター
【０１６８】
本発明はまた、分裂促進性Ｔ細胞活性化膜貫通タンパク質をコードする１つもしくは複数の配列および／またはサイトカインに基づくＴ細胞活性化膜貫通タンパク質をコードする１つもしくは複数の配列を含むベクターまたはベクターのキットを提供する。そのようなベクターは、プロデューサー細胞またはパッケージング細胞などの宿主細胞に核酸配列（複数可）を導入するために使用することができる。
【０１６９】
ベクターは、例えば、プラスミドまたはレトロウイルスベクターもしくはレンチウイルスベクターなどのウイルスベクター、またはトランスポゾンに基づくベクターもしくは合成ｍＲＮＡであってもよい。
【０１７０】
ベクターは、宿主細胞にトランスフェクトまたは形質導入することができる。
方法
【０１７１】
本発明はまた、Ｔ細胞またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が、１つまたは複数の分裂促進性Ｔ細胞活性化膜貫通タンパク質および必要に応じて１つまたは複数のサイトカインに基づくＴ細胞活性化膜貫通タンパク質によって活性化されるように、Ｔ細胞またはＮＫ細胞に、本発明に記載のレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターを形質導入するステップを含む、活性化されたトランスジェニックＴ細胞またはＮＫ細胞を作製するための方法を提供する。
【０１７２】
Ｔ細胞またはＮＫ細胞（ＮＫ  ｃａｌｌ）に形質導入および活性化するための方法は、４８時間またはそれ未満、例えば２４時間から４８時間の間の時間かかり得る。
【０１７３】
本発明は、実施例によりここでさらに記載されるが、それは本発明を実施するにあたって当業者を支援することに役立てることを意味するものであって、本発明の範囲を限定することを意図するものでは決してない。
【実施例】
【０１７４】
（実施例１）ビリオン表面上にＯＫＴ３を提示するウイルスベクターの産生
パッケージング細胞上のＯＫＴ３  ｓｃＦｖの発現が、Ｔ細胞標的の分裂促進性活性化を引き起こすウイルスベクターの産生をもたらすことを実証する初期の概念証明実験を行った。
【０１７５】
ＯＫＴ３  ｓｃＦｖ  ２９３Ｔ細胞は、標的Ｔ細胞の活性化および形質導入を引き起こすレンチウイルスベクターを産生した。この分裂促進特性は、レンチウイルスヘルパー構成成分の存在に依存していた。すなわち、この効果は、パッケージング細胞上清の非特異的特性によるものではなかった（図２）。
【０１７６】
ＣＤ８ストークを介するか、またはレンチウイルスに組み込まれ分裂促進刺激を引き起こす、ＩｇＧ１ヒンジの能力を介して膜に付着したＯＫＴ３  ｓｃＦｖの比較もまた行ったところ、２つのスペーサーの間に差は認められなかった。
【０１７７】
表面結合型ＯＫＴ３を安定に発現する２９３Ｔ細胞に、レンチウイルスｇａｇｐｏｌ、ＲＤ−ＰＲＯ  ｅｎｖ、導入ベクターまたはレンチウイルスｒｅｖ発現プラスミドと併せて３つのプラスミドの全てをトランスフェクトした。その後の上清を初代ヒトＴ細胞に適用した。続いて、Ｔ細胞を以下のパラメーターを用いてフローサイトメトリーによって試験した：Ｔ細胞活性化を測定するためのＣＤ２５；導入遺伝子（Ｆｃスペーサーを有するＣＡＲ）を検出するための抗Ｆｃ；周期中の細胞を決定するためのｋｉ６７（図３）。ｇａｇｐｏｌが供給された条件だけが有意な分裂促進刺激をもたらした。
（ｒｅｖと共に）全てのプラスミドが供給された条件のみが、Ｔ細胞の分裂促進刺激および形質導入をもたらした。
【０１７８】
異なるレンチウイルスのシュードタイピングが分裂促進効果を支持するか否かを決定するために、さらなる実験も行った。膜結合型ＯＫＴ３を安定に発現する２９３Ｔ細胞に、レンチウイルスの導入ベクター、レンチウイルスｇａｇｐｏｌ、ｒｅｖならびに異なるｅｎｖプラスミド：すなわちＶＳＶ−Ｇ、ＲＤ−ＰＲＯ、Ａｍｐｈｏ、ＧＡＬＶおよび麻疹Ｍ／Ｈをトランスフェクトした。その後の上清を初代ヒトＴ細胞に適用した。その後、細胞をｋｉ６７で染色し、フローサイトメトリーで試験した。全ての偽型は分裂促進効果を支持したが、麻疹のシュードタイピングでは効果は低下したようであった（図４）。
（実施例２）２つの別個の分裂促進刺激をウイルスベクターに組み込むことができる
【０１７９】
抗体１５Ｅ８からの抗ＣＤ２８活性化ｓｃＦｖを含む追加の構築物を生成した。（上に記載した）ＯＫＴ３  ｓｃＦｖカセットはｅＧＦＰを発現し、１５Ｅ８  ｓｃＦｖカセットは青色蛍光タンパク質ｅＢＦＰ２を発現した。
【０１８０】
高レベルのｅＧＦＰおよびｅＢＦＰ２を共発現した２９３Ｔ細胞を生成し、２９３Ｔ細胞の表面上のＯＫＴ３および１５Ｅ８の両方の発現の成功を実証した。
【０１８１】
レンチウイルス上清を、野生型２９３Ｔ細胞、ＯＫＴ３  ｓｃＦｖだけを発現する２９３Ｔ細胞、およびＯＫＴ３および１５Ｅ８の両方を発現する２９３Ｔ細胞から生成した。活性化レベルおよび形質導入の効率は、２つの刺激でより大きかった（図６）。
（実施例３）ガンマ−レトロウイルスベクターにおける機能性の実証
【０１８２】
膜結合型ＯＫＴ３を安定に発現する２９３Ｔ細胞に、ＣＡＲ、ガンマ−レトロウイルスｇａｇｐｏｌ発現プラスミドおよびＲＤ１１４発現プラスミドをコードするガンマ−レトロウイルス伝達ベクターをトランスフェクトした。その後の上清を初代ヒトＴ細胞に適用した。Ｔ細胞を抗Ｆｃ、抗ＣＤ２５およびｋｉ６７で染色し、フローサイトメトリーで試験した。分裂促進刺激を適用しなかったが、Ｔ細胞は活性化され、サイクルし、導入遺伝子を発現していた（図５）。
（実施例４）レンチウイルスベクターに組み込まれたペプチドの組合せ
【０１８３】
異なる要素の組合せをパッケージング細胞株に組み込んだ。これには、スーパーアゴニスト抗ＣＤ２８  ｍＡｂであるＴＧＮ１４１２  ｓｃＦｖが含まれた。サイトカインＩＬ７およびＩＬ１５、ならびにＯＸ４０Ｌおよび４１ＢＢＬも、下記のように様々な組合せで組み込んだ：
１．（無し）
２．ＯＫＴ３
３．ＯＫＴ３＋１５Ｅ８
４．ＯＫＴ３＋ＴＧＮ１４１２
５．ＯＫＴ３＋１５Ｅ８＋ＯＸ４０Ｌ＋４１ＢＢＬ
６．ＯＫＴ３＋１５Ｅ８＋ＯＸ４０Ｌ＋４１ＢＢＬ＋ｍＩＬ１５
７．ＯＫＴ３＋１５Ｅ８＋ＯＸ４０Ｌ＋４１ＢＢＬ＋ｍＩＬ７
【０１８４】
これらの異なる２９３Ｔ細胞から生成されたレンチウイルスベクターを、Ｔ細胞に刺激／形質導入するために使用した。
【０１８５】
分裂促進性の可溶性抗体ＯＫＴ３およびＣＤ２８．２＋／−ＩＬ２を併せた遺伝子操作をしていない２９３Ｔ細胞から生成されたベクターを対照として使用した。５日目の活性化（ＣＤ２５）、増殖性画分（Ｋｉ６７）および絶対数を測定した（図７から１０）。
【０１８６】
１つではなく２つのシグナルを組み込むという顕著な利点があることが再び注目された。ビリオン表面に提示された分裂促進性ペプチドを用いた活性化が、Ｔ細胞に可溶性抗体を添加することによって達成された活性化よりも著しく優れていることもまた注目された。
【０１８７】
サイトカインでのｍＡｂ活性化のものと同様の増殖レベルも達成された。
方法論
分裂促進性抗体のＶＨおよびＶＬをｓｃＦｖとしてクローニングし、スペーサードメイン、ＴＭドメインおよびポーラーアンカー（polar anchor）（上記の配列番号１から３）と接続した。
【０１８８】
サイトカインは、スペーサー、ＴＭドメインおよびポーラーアンカー（上記の配列番号３２および３３）とインフレームで接続した。
【０１８９】
４１ＢＢＬおよびＯＸ４０Ｌのような天然の共刺激分子については、これらはその天然の形態でクローニングする。
【０１９０】
上記のタイプの膜結合型タンパク質の各々は、その後、２９３Ｔ細胞上で、高レベルで安定に発現することができた。
【０１９１】
標準的な一過性トランスフェクションを使用して、これらの２９３Ｔ細胞からウイルスベクターを作製した。レンチウイルスベクターについては、導入ベクター、ｒｅｖ発現ベクター、レンチｇａｇｐｏｌ発現ベクターおよびＲＤ−ＰＲＯ発現ベクターを共トランスフェクトした。ガンマレトロウイルスベクターについては、２９３Ｔ細胞に、導入ベクター、ＭｏＭＬＶ  ｇａｇｐｏｌおよびＲＤ１１４発現プラスミドを共トランスフェクトした。上清は、遠心分離および０．４５ｕＭフィルターを用いた濾過により清澄化した。このウイルスをレトロネクチンプレート上の初代ヒトＴ細胞に適用した。ＩＬ２はいくつかの条件において添加されるか、または他の条件においては、サイトカインは添加されない。
（実施例５）レンチウイルスベクターで刺激した細胞と抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体でコーティングしたビーズで刺激した細胞からのＴ細胞サブセット表現型の比較
【０１９２】
単核細胞を、標準的な技術を用いて末梢血液から単離した。その後、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、
（ｉ）非改変レンチウイルスベクターおよびＩＬ１５／ＩＬ７の存在下、３：１の比で抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体でコーティングしたビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）ヒトＴアクチベータＣＤ３／ＣＤ２８）；または
（ｉｉ）ＩＬ１５およびＩＬ７の存在下、レトロネクチンでコーティングしたプレートの上でのＯＫＴ３および１５Ｅ８Ｂを発現するレンチウイルスベクター（実施例４に記載の組合せ３）
のいずれかで処理した。
４８時間後、細胞を収集し、下記のようにＴ細胞表現型抗体のパネルで染色した：
・  ａＣＤ４−ＢＶ６５０
・  ａＣＤ８−ＰＥ．Ｃｙ７
・  ａＣＤ４５ＲＯ−ＢＶ６０５
・  ａＣＤ４５ＲＡ−ＦＩＴＣ
・  ａＣＤ９５−ＰＢ
・  ａＣＤ１９７−ＢＶ６８５
【０１９３】
Ｔ細胞サブセットをＦＡＣＳにより分析し、その結果を図１１に要約する。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットの両方について、ウイルスで刺激された細胞は、抗体でコーティングされたビーズで刺激された細胞よりも高いナイーブＴ細胞（ＴｎおよびＴｓｃｍ）の割合を示した。
【０１９４】
上記の明細書文中に述べられた全ての刊行物は、参照により本明細書に組み込まれる。本発明の範囲および主旨から逸脱することのない、本発明の記載された方法およびシステムの様々な改変および変更は、当業者には明らかであろう。本発明は、特定の好ましい実施形態に関連して記載されているが、特許請求される本発明は、そのような特定の実施形態に不当に限定されるべきではないことが理解されるべきである。実際に、分子生物学、細胞免疫学または関連分野の当業者に明らかである本発明を実施するために記載された形式の様々な改変は、以下の特許請求の範囲内にあることが意図される。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
（ｉ）分裂促進ドメインおよび膜貫通ドメインを含む分裂促進性Ｔ細胞活性化膜貫通タンパク質；ならびに／または
（ｉｉ）サイトカインドメインおよび膜貫通ドメインを含む、サイトカインに基づくＴ細胞活性化膜貫通タンパク質
を含むウイルスエンベロープを有するレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターであって、前記分裂促進性またはサイトカインに基づくＴ細胞活性化膜貫通タンパク質は、ウイルスエンベロープ糖タンパク質の一部ではない、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクター。
（項目２）
ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ１３４またはＣＤ１３７に結合する分裂促進性Ｔ細胞活性化膜貫通タンパク質を含む、項目１に記載のウイルスベクター。
（項目３）
前記分裂促進性Ｔ細胞活性化膜貫通タンパク質が、ＯＫＴ３、１５Ｅ８、ＴＧＮ１４１２、ＯＸ４０Ｌまたは４１ＢＢＬからの結合ドメインを含む、項目２に記載のウイルスベクター。
（項目４）
前記ウイルスエンベロープ中に２つまたはそれを超える分裂促進性Ｔ細胞活性化膜貫通タンパク質を含む、項目１に記載のウイルスベクター。
（項目５）
ＣＤ３に結合する第１の分裂促進性Ｔ細胞活性化膜貫通タンパク質およびＣＤ２８に結合する第２の分裂促進性Ｔ細胞活性化膜貫通タンパク質を含む、項目４に記載のウイルスベクター。
（項目６）
ＩＬ２、ＩＬ７およびＩＬ１５から選択されるサイトカインを含む、サイトカインに基づくＴ細胞活性化膜貫通タンパク質を含む、前述の項目のいずれかに記載のウイルスベクター。
（項目７）
偽型ウイルスベクターを与える異種のウイルスエンベロープ糖タンパク質を含む、前述の項目のいずれかに記載のウイルスベクター。
（項目８）
前記エンベロープ糖タンパク質が、ＲＤ１１４またはその変異体の１つであるＶＳＶ−Ｇ、テナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）、もしくはアンホトロピックエンベロープ、麻疹エンベロープまたはヒヒレトロウイルスエンベロープ糖タンパク質である、項目７に記載のウイルスベクター。
（項目９）
ウイルスエンベロープはまた、
（ｉｉｉ）捕捉部分に結合する結合ドメイン；および
膜貫通ドメイン
を含むタグ化タンパク質を含み、前記タグ化タンパク質は前記タグ化タンパク質の前記捕捉部分への結合を介した細胞上清からの前記ウイルスベクターの精製を容易にするタグ化タンパク質も含む、前述の項目のいずれかに記載のウイルスベクター。
（項目１０）
前記タグ化タンパク質の前記結合ドメインが、１つまたは複数のストレプトアビジン結合エピトープを含む、項目９に記載のウイルスベクター。
（項目１１）
前記ストレプトアビジン結合エピトープがビオチン模倣体である、項目１０に記載のウイルスベクター。
（項目１２）
前記ビオチン模倣体が、パッケージング細胞によって産生されたストレプトアビジン捕捉レトロウイルスベクターを溶出するためにビオチンを使用することができるように、ビオチンよりも低い親和性でストレプトアビジンに結合する、項目１１に記載のウイルスベクター。
（項目１３）
前記ビオチン模倣体が、ＳｔｒｅｐｔａｇＩＩ（配列番号３６）、Ｆｌａｎｋｅｄｃｃｓｔｒｅｔａｇ（配列番号３７）およびｃｃｓｔｒｅｐｔａｇ（配列番号３８）の群から選択される、項目１２に記載のウイルスベクター。
（項目１４）
Ｔ細胞受容体またはキメラ抗原受容体をコードする核酸配列を含む、前述の項目のいずれかに記載のウイルスベクター。
（項目１５）
ウイルス様粒子（ＶＬＰ）である、前述の項目のいずれかに記載のウイルスベクター。
（項目１６）
細胞表面で、
（ｉ）分裂促進ドメインおよび膜貫通ドメインを含む分裂促進性Ｔ細胞活性化膜貫通タンパク質；ならびに／または
（ｉｉ）サイトカインドメインおよび膜貫通ドメインを含む、サイトカインに基づくＴ細胞活性化膜貫通タンパク質
を発現し、その結果、宿主細胞によって産生されるレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターが項目１から８までのいずれかに定義されたものとなる、宿主細胞。
（項目１７）
細胞表面で、
（ｉｉｉ）捕捉部分に結合する結合ドメイン；および
膜貫通ドメイン
を含むタグ化タンパク質も発現し、前記タグ化タンパク質が、前記タグ化タンパク質の前記捕捉部分への結合を介した細胞上清からの前記ウイルスベクターの精製を容易にし、その結果、前記パッケージング細胞によって産生されたレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターが、項目９から１４までのいずれかに定義されたものとなる、項目１６に記載の宿主細胞。
（項目１８）
下記の遺伝子：ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖおよび／またはｒｅｖのうちの１つまたは複数も含む、項目１６または１７に定義された宿主細胞である、パッケージング細胞。
（項目１９）
ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖおよび必要に応じてｒｅｖ遺伝子を含み、ならびにレトロウイルスゲノムまたはレンチウイルスゲノムも含む、項目１６または１７に定義された宿主細胞である、プロデューサー細胞。
（項目２０）
項目１６もしくは１７に記載の宿主細胞、項目１８に記載のパッケージング細胞または項目１９に記載のプロデューサー細胞を作製するための方法であって、分裂促進性Ｔ細胞活性化膜貫通タンパク質および／またはサイトカインに基づくＴ細胞活性化膜貫通タンパク質をコードする核酸を細胞に形質導入またはトランスフェクトするステップを含む方法。
（項目２１）
項目１７から１９までのいずれかに記載の細胞内にレトロウイルスゲノムまたはレンチウイルスゲノムを発現させるステップを含む、項目１から１５までのいずれかに記載のウイルスベクターを作製するための方法。
（項目２２）
Ｔ細胞またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が、１つもしくは複数の分裂促進性Ｔ細胞活性化膜貫通タンパク質および／または１つもしくは複数のサイトカインに基づくＴ細胞活性化膜貫通タンパク質によって活性化されるように、項目１から１５までのいずれかに記載のウイルスベクターを前記Ｔ細胞またはＮＫ細胞に形質導入するステップを含む、活性化されたトランスジェニックＴ細胞またはＮＫ細胞を作製するための方法。
（項目２３）
（ｉ）項目１６または１７に定義された宿主細胞；
（ｉｉ）ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖおよび必要に応じてｒｅｖを含む核酸；ならびに
（ｉｉｉ）レトロウイルスゲノム
を含む、項目１から１５までのいずれかに定義されたレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターを作製するためのキット。
（項目２４）
（ｉ）項目１８に定義されたパッケージング細胞；および
（ｉｉ）レトロウイルスベクターゲノムまたはレンチウイルスベクターゲノム
を含む、項目１から１５までのいずれかに定義されたレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターを作製するためのキット。
（項目２５）
（ｉ）分裂促進性Ｔ細胞活性化膜貫通タンパク質および／またはサイトカインに基づくＴ細胞活性化膜貫通タンパク質をコードする１つまたは複数の核酸；ならびに
（ｉｉ）レトロウイルスｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖおよび必要に応じてｒｅｖ遺伝子を含む核酸
を含む、項目１８に記載のパッケージング細胞を作製するためのキット。
（項目２６）
（ｉ）分裂促進性Ｔ細胞活性化膜貫通タンパク質および／またはサイトカインに基づくＴ細胞活性化膜貫通タンパク質をコードする１つまたは複数の核酸；
（ｉｉ）レトロウイルスｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖおよび必要に応じてｒｅｖ遺伝子を含む核酸；ならびに
（ｉｉｉ）レトロウイルスベクターゲノムまたはレンチウイルスベクターゲノム
を含む、項目１９に記載のプロデューサー細胞を作製するためのキット。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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