(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも３つのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）形成ポリペプチドを含む多量体ＣＡＲであって、各ＣＡＲ形成ポリペプチドが、
（ｉ）抗原結合ドメインと、
（ｉｉ）コイルドコイルスペーサードメインと、
（ｉｉｉ）膜貫通ドメインと、
（ｉｖ）エンドドメインと
を含む多量体ＣＡＲ。
【請求項２】
１つまたは複数の、請求項１に定義されるＣＡＲ形成ポリペプチドと、１つまたは複数の補助ポリペプチドとを含む多量体キメラ抗原受容体であって、前記補助ポリペプチド（複数可）またはそのそれぞれが、
（ｉ）コイルドコイルスペーサードメインと、
（ｉｉ）膜貫通ドメインと、
（ｉｉｉ）エンドドメインと
を含み、前記多量体ＣＡＲにおけるＣＡＲ形成ポリペプチドおよび補助ポリペプチドの総数が、少なくとも３つである、多量体ＣＡＲ。
【請求項３】
前記コイルドコイルスペーサードメインが、軟骨オリゴマー基質タンパク質（ＣＯＭＰ）、マンノース結合タンパク質Ａ、コイルドコイルセリンリッチタンパク質１、ポリペプチド放出因子２、ＳＮＡＰ−２５、ＳＮＡＲＥ、Ｌａｃリプレッサー、またはアポリポタンパク質Ｅに由来する、請求項１または２に記載の多量体ＣＡＲ。
【請求項４】
前記コイルドコイルスペーサードメインが、配列番号１もしくは３０〜４２に示される配列、もしくはその断片、または少なくとも９０％の配列同一性を有するそのバリアントのうちの１つを含み、前記断片またはバリアントがコイルドコイルオリゴマーを形成する能力を保持し、かつ、前記断片が、配列番号１もしくは３０〜４２の少なくとも５個のＣ末端アミノ酸を含む、請求項３に記載の多量体ＣＡＲ。
【請求項５】
請求項１から４のいずれかに記載のＣＡＲ形成ポリペプチドをコードする核酸。
【請求項６】
少なくとも１つの、請求項１、３または４に定義されるＣＡＲ形成ポリペプチド、ならびに少なくとも１つの、請求項２から４のいずれかに定義される補助ポリペプチドをコードする核酸構築物。
【請求項７】
請求項５に記載の核酸または請求項６に記載の核酸構築物を含むベクター。
【請求項８】
請求項５に記載の核酸または請求項６に記載の核酸構築物を含み、請求項１から４のいずれかに記載の多量体ＣＡＲを発現する、細胞。
【請求項９】
請求項８に記載の細胞を含む医薬組成物。
【請求項１０】
疾患の治療に使用するための、請求項８に記載の細胞を含む組成物。
【請求項１１】
前記疾患ががんである、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
請求項８に記載の細胞を作製する方法であって、請求項５に記載の核酸、請求項６に記載の核酸構築物、または請求項７に記載のベクターを、ｅｘ  ｖｉｖｏで前記細胞に導入するステップを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞表面において多量体キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）分子の形成をもたらす特定のスペーサードメインを含むＣＡＲに関する。多量体ＣＡＲ分子は、「超感受性」であり得、低密度の標的細胞に発現する抗原への結合に応答して、Ｔ細胞活性化を誘導することができる。
【背景技術】
【０００２】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
従来、抗原特異性Ｔ細胞は、標的抗原に元々特異的である末梢血Ｔ細胞の選択的増殖によって生成されていた。しかしながら、ほとんどのがん抗原に特異的なＴ細胞を選択し、大量に増殖させることは、困難であり、不可能であることが非常に多い。組込みベクターを用いた遺伝子療法は、この問題の解決策を提供するが、これは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）のトランスジェニック発現により、末梢血Ｔ細胞のバルク集団に対するｅｘ  ｖｉｖｏウイルスベクター形質導入によって、任意の表面抗原に特異的な大量のＴ細胞を生成することが可能となるためである。
【０００３】
キメラ抗原受容体は、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）などの抗原結合体（ａｎｔｉｇｅｎ  ｂｉｎｄｅｒ）の特異性を、Ｔ細胞のエフェクター機能へ移したタンパク質である。それらの通常の形態は、抗原を認識するアミノ末端、スペーサー、膜貫通ドメインがすべて、Ｔ細胞生存および活性化シグナルを伝達する複合エンドドメインに接続された、Ｉ型膜貫通ドメインタンパク質の形態である（図１Ａを参照されたい）。
【０００４】
これらの分子の最も一般的な形態は、標的抗原を認識するモノクローナル抗体由来の一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）が、スペーサーおよび膜貫通ドメインを介してシグナル伝達エンドドメインに融合された融合体である。そのような分子は、ｓｃＦＶがその標的を認識することに応答して、Ｔ細胞の活性化をもたらす。Ｔ細胞がそのようなＣＡＲを発現すると、それらは、標的抗原を発現する標的細胞を認識し、殺滅させる。腫瘍関連抗原に対して複数のＣＡＲが開発されており、そのようなＣＡＲ発現Ｔ細胞を使用した養子移入アプローチは、現在、様々ながんの治療に関する臨床試験中である。
【０００５】
ＣＡＲは、多くの場合、抗原結合ドメインと細胞膜との間に適切な距離を提供するため、ならびに好適な配向、到達範囲、およびリガンド結合時にホスファターゼからの分離を可能にするためのスペーサードメインを含む。
【０００６】
使用される一般的なスペーサーは、ＩｇＧ１のＦｃ、ＣＤ８αおよびＣＤ２８由来のストークであり、ＩｇＧ１ヒンジ単独またはＣＤ２４７のエクトドメインだけでも、抗原によっては十分な場合がある（図２ｂ）。
【０００７】
これらの一般的なスペーサーは、機能性スペーサーを形成するためにはドメイン構造をすべて含有しなければならないため、または重度にグリコシル化されており、アミノ酸長の変化によりスペーサーのサイズに予測できない変化が生じるため、限定される。例えば、ＩｇＧスペーサーは、免疫グロブリンドメインを全数含有しなければならない。構造ドメインの全数に対するこの必要性は、スペーサーに対して行うことができる変更が限定されることを意味する。
【０００８】
加えて、上述のスペーサーは、典型的に、長い一次アミノ酸配列であり、これが、フォールディングされて、必要とされる二次および三次構造体が形成する。そのため、これらは、典型的に、長い核酸配列によってコードされる。この長い核酸配列の必要性は、ＣＡＲをコードするベクターの構築にとって問題である。
【０００９】
古典的ＣＡＲは、ある特定の設計上の限定を有する。古典的ＣＡＲはホモ二量体であるため、一般に、２つの（同一な）結合特異性があり、抗原結合ドメイン対細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインの比が１：１である。これにより、特定の化学量論を課し、全体として系の柔軟性が限定される。
【００１０】
したがって、設計の点でより大きな柔軟性を提供する代替的なＣＡＲが必要とされている。
親和性の問題
【００１１】
ＣＡＲの結合ドメインは、通常、既存の抗体またはライブラリから選択された抗体のいずれかの可変領域に由来する。結果として、選択されるＣＡＲはほとんどが、ナノモルの親和性で同起源のリガンドに結合する。対照的に、ＴＣＲ：ペプチド：ＭＨＣ（ＴＣＲ−ｐＭＨＣ）結合の生物物理学的特性は、通常、１０〜１ｕＭである（親和性が数オーダー低い）。より高い親和性の相互作用が所与の受容体濃度におけるリガンドに対する特異性を向上させるが、Ｔ細胞が低密度の同起源のペプチドＭＨＣを発現する標的細胞を検出することができるように、ＴＣＲは進化して低い親和性を有するようになったという証拠が出てきている。
【００１２】
Ｔ細胞が、１０個ほどの少ない同起源のｐＭＨＣによって活性化され得ること、および１つのｐＭＨＣが、最大２００個のＴＣＲ分子において生産的シグナルをトリガーし得ることが、報告されている。これは、連続トリガリングとして知られているプロセスを通じて達成されると考えられており、このプロセスでは、標的細胞に存在する１つの同起源のｐＭＨＣが、結合、トリガリング、および続くＴＣＲからの解離のサイクルを、複数回行い、シグナルを効果的に増幅させることができる。結果として、生産的シグナルを伝達するためには、少数の同起源のｐＭＨＣのみを必要とする。
【００１３】
ＣＡＲのより高い親和性は、相互作用の分子の解離に数分から数時間かかることを意味し、これは、典型的にはおよそ数秒のオーダーであるＴＣＲとは異なる。この理由のため、ＣＡＲのシグナル伝達は、有効な連続トリガリング応答を経験する可能性は低く、代わりに、より多くの受容体のライゲーションに依存する。これは、標的細胞に高密度で発現するリガンドを標的とするようにＣＡＲを限定し得る。高親和性のＣＡＲは、有効な殺滅応答を誘起するには、標的細胞が１万個を上回るリガンド分子を発現することを必要とすると推測されている。より具体的には、第１世代のＣＡＲを使用して、Jamesらは、最大の溶解活性をトリガーするために約３０，０００個の標的分子／標的細胞を要する（約２０，０００個のＣＡＲ分子のエンドサイトーシスを誘導する）ことを示している（S.  Jamesら、The  Journal  of  Immunology、１８４巻（８号）４２８４〜４２９４頁、２０１０年）。殺滅の閾値を下回るリガンドを発現する標的細胞は、検出を逃れる可能性があり、疾患を再確立し得ることが、動物モデルにより示されている（U.  Anurathapanら、Molecular  Therapy、２２巻（３号）、６２３〜６３３頁、２０１４年）。
【００１４】
低密度リガンドに対するＣＡＲの感受性を向上させる１つの方法は、低親和性結合体ドメインを使用することであり、これにより、ＴＣＲ−ｐＭＨＣ連続トリガリング応答を模倣することができる。しかしながら、このアプローチにはいくつかの限定がある。低親和性ＣＡＲの使用は、現在のところ、共刺激性の疑似二量体（ｐｓｅｕｄｏｄｉｍｅｒ）形成および付着分子がＴＣＲ−ｐＭＨＣ連続トリガリング応答に及ぼす影響が未知であるため、予測不可能である。ＣＡＲ療法において、これらの分子の相互作用は、標的細胞に応じて変動し、したがって、強力な連続トリガリング応答を得ることは困難である。さらに、ＴＣＲと同等までＣＡＲの親和性を低減させる方法は、通常、高親和性ＣＡＲから出発し、その後でＣＤＲを変異させることを伴う。これは、予測できない結果をもたらし、オフターゲットな（ｏｆｆ  ｔａｒｇｅｔ）結合の危険性を増加させる可能性のある、冗長であり、成功しないことの多いアプローチである。
低密度リガンドの存在下でのトリガーが可能なＣＡＲを操作することにより、この療法が、より多くのがんを標的とすること、およびがんを見逃す可能性を低減することも可能となるであろう。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】S.  Jamesら、The  Journal  of  Immunology、１８４巻（８号）４２８４〜４２９４頁、２０１０年
【非特許文献２】U.  Anurathapanら、Molecular  Therapy、２２巻（３号）、６２３〜６３３頁、２０１４年
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１６】
したがって、上に概説した問題を伴わないＣＡＲが必要とされている。
【００１７】
第１の態様では、本発明は、
（ｉ）抗原結合ドメインと、
（ｉｉ）コイルドコイルスペーサードメインと、
（ｉｉｉ）膜貫通ドメインと、
（ｉｖ）エンドドメインと
を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）形成ポリペプチドを提供する。
【００１８】
本発明はまた、
（ｉ）コイルドコイルスペーサードメインと、
（ｉｉｉ）膜貫通ドメインと、
（ｉｖ）エンドドメインと
を含む補助ポリペプチド（ａｃｃｅｓｓｏｒｙ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）を提供する。
【００１９】
コイルドコイルドメインは、複数のＣＡＲ形成ポリペプチドおよび／または補助ポリペプチド、例えば、少なくとも３つのＣＡＲ形成ポリペプチド／補助ポリペプチドの多量体化により、多量体ＣＡＲを形成することを可能にする。
【００２０】
コイルドコイルドメインは、以下の：軟骨オリゴマー基質タンパク質（ＣＯＭＰ）、マンノース結合タンパク質Ａ、コイルドコイルセリンリッチタンパク質１、ポリペプチド放出因子２、ＳＮＡＰ−２５、ＳＮＡＲＥ、Ｌａｃリプレッサー、またはアポリポタンパク質Ｅのうちのいずれかに由来し得る。
【００２１】
コイルドコイルドメインは、配列番号１に示される配列もしくはその断片、または少なくとも８０％の配列同一性を有するそのバリアントを含み得る。
【００２２】
エンドドメインは、ＣＤ３ゼータエンドドメイン、ＣＤ２８エンドドメイン、４１ＢＢエンドドメイン、およびＯＸ４０エンドドメインのうちの少なくとも１つを含み得る。
【００２３】
エンドドメインは、配列番号７に示される配列、または少なくとも８０％の配列同一性を有するそのバリアントを含み得る。
【００２４】
抗原結合ドメインは、標的細胞に低密度で発現する抗原に結合することができる。例えば、抗原結合ドメインは、ＲＯＲ−１、Ｔｙｐｒ−１、またはＢＣＭＡに結合することができる。
【００２５】
ＣＡＲ形成ポリペプチドは、別のＣＡＲと架橋を形成することができるエレメントを含み得る。
【００２６】
例えば、エレメントは、そのようなエレメントを含有する別のＣＡＲとのジスルフィド架橋の形成が可能であり得る。
【００２７】
本発明の第２の態様は、コイルドコイルスペーサードメイン間またはＣＡＲ形成ポリペプチド（複数可）および／もしくは補助ポリペプチド（複数可）間の相互作用によって形成される多量体ＣＡＲに関する。
【００２８】
第２の態様の第１の実施形態では、本発明は、複数の、上に定義されるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）形成ポリペプチドを含む多量体ＣＡＲを提供する。
【００２９】
本発明の第２の態様の第２の実施形態では、上に定義される１つまたは複数のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）形成ポリペプチドおよび１つまたは複数の補助ポリペプチドを含む多量体ＣＡＲが提供される。
【００３０】
多量体ＣＡＲ中のＣＡＲ形成ポリペプチド（複数可）および／または補助ポリペプチド（複数可）は、異なるエンドドメインを含み得る。
【００３１】
多量体ＣＡＲが２つまたはそれ超のＣＡＲ形成ポリペプチドを含む場合、それらは、異なる抗原結合ドメイン、例えば、異なる特異性を有する抗原結合ドメインを有し得る。
【００３２】
ＣＡＲ形成ポリペプチドおよび補助ポリペプチドのエンドドメインのうちの一方は、ＣＤ３ゼータエンドドメインを含み得、ＣＡＲ形成ポリペプチドおよび補助ポリペプチドの他方のエンドドメインは、４１ＢＢエンドドメインを含み得る。２つの補助ポリペプチドがある場合、一方が４１ＢＢエンドドメインを含み得、他方がＣＤ２８エンドドメインを含み得る。
【００３３】
多量体ＣＡＲは、例えば、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、または七量体であり得る。
五量体ＣＡＲは、以下のＣＡＲ形成ポリペプチドと補助ポリペプチド鎖との組合せのうちのいずれかを含み得る。
【表Ａ】
0006675417.tif 000002
【００３４】
多量体ＣＡＲが、第１および第２の、本発明の第１の態様によるＣＡＲ形成ポリペプチドを含む場合、第１のＣＡＲの抗原結合ドメインは、第２のＣＡＲの抗原結合ドメインとは異なるエピトープに結合し得る。
【００３５】
この実施形態では、第１のＣＡＲの抗原結合ドメインは、第２のＣＡＲの抗原結合ドメインとは異なる抗原に結合し得る。
【００３６】
本発明はまた、少なくとも２つの本発明の第２の態様による多量体ＣＡＲを含む結合複合体（ｅｎｇａｇｅｄ  ｃｏｍｐｌｅｘ）であって、第１の多量体ＣＡＲ上の第１のＣＡＲが、第２の多量体ＣＡＲ上の第２のＣＡＲと架橋を形成し、その結果、第１および第２の多量体ＣＡＲが結合して複合体が形成される、結合複合体を提供する。
【００３７】
架橋は、ジスルフィド架橋または追加のコイルドコイル構造体であってもよい。
第３の態様では、本発明は、
（ｉ）第１のヘテロ二量体化ドメインを含む、上に定義されるＣＡＲ形成ポリペプチドまたは補助ポリペプチドを含む多量体ＣＡＲと、
（ｉｉ）シグナル伝達ドメインおよび第２のヘテロ二量体化ドメインを含む細胞内シグナル伝達構成成分と
を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）シグナル伝達系であって、
第１および第２のヘテロ二量体化ドメイン間のヘテロ二量体化が、多量体ＣＡＲおよびシグナル伝達構成成分による機能性ＣＡＲ複合体の形成をもたらす、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）シグナル伝達系を提供する。
【００３８】
ＣＡＲ形成ポリペプチド（複数可）もしくは補助ポリペプチド（複数可）、またはそのそれぞれは、複数のヘテロ二量体化ドメインを含んでもよく、その結果、単一のＣＡＲ形成ポリペプチドまたは補助ポリペプチドは、複数のシグナル伝達構成成分とヘテロ二量体化することができる可能性がある。
【００３９】
ＣＡＲシグナル伝達系のシグナル伝達構成成分は、複数のシグナル伝達ドメインを含み得る。
【００４０】
第４の態様では、本発明は、本発明の第１の態様によるＣＡＲの形成ポリペプチドおよび／または上に定義される補助ポリペプチドをコードする核酸を提供する。
【００４１】
本発明の第５態様は、２つまたはそれ超の核酸配列を含む、核酸構築物に関する。
【００４２】
本発明の第５の態様の第１の実施形態では、２つまたはそれ超の、本発明の第１の態様によるＣＡＲ形成ポリペプチドをコードする核酸構築物が提供される。
【００４３】
本発明の第５の態様の第２の実施形態では、上に定義される少なくとも１つのＣＡＲ形成ポリペプチドおよび少なくとも１つの補助ポリペプチドをコードする核酸構築物が提供される。
【００４４】
本発明の第５の態様の第１の実施形態では、
（ｉ）本発明の第２の態様による多量体ＣＡＲを形成する、本発明の第１の態様による少なくとも１つのＣＡＲ形成ポリペプチド、および
（ｉｉ）本発明の第５の態様に関連して定義される細胞内シグナル伝達構成成分
をコードする核酸構築物が提供される。
【００４５】
第６の態様では、本発明は、本発明の第４の態様による核酸配列または本発明の第５の態様による核酸構築物を含むベクターを提供する。
【００４６】
ベクターは、例えば、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターまたはトランスポゾンであり得る。
【００４７】
第７の態様では、本発明は、本発明の第１の態様によるＣＡＲ形成ポリペプチドまたは補助ポリペプチド、本発明の第２の態様による多量体ＣＡＲ、本発明の第３の態様によるＣＡＲシグナル伝達系、または上に定義される結合複合体を発現する細胞を提供する。
【００４８】
細胞は、Ｔ細胞またはＮＫ細胞であり得る。
【００４９】
第８の態様では、本発明は、本発明の第７の態様による細胞を含む医薬組成物を提供する。
【００５０】
第９の態様では、本発明は、疾患の治療に使用するための本発明の第７の態様による細胞に関する。
【００５１】
第１０の態様では、本発明は、疾患を治療するための医薬品の製造における、本発明の第７の態様による細胞の使用に関する。
【００５２】
第１１の態様では、本発明は、本発明の第７の態様による細胞を被験体に投与するステップを含む、疾患を治療するための方法に関する。
【００５３】
疾患は、がん、例えば、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、黒色腫、または骨髄腫であり得る。
【００５４】
第１２の態様では、本発明は、本発明の第４の態様による核酸、本発明の第５の態様による核酸構築物、または本発明の第６の態様によるベクターを含む、キットに関する。
【００５５】
第１３の態様では、本発明は、本発明の第７の態様による細胞を含むキットを提供する。
【００５６】
第１４の態様では、本発明は、本発明の第７の態様による細胞を作製するための方法であって、本発明の第４の態様による核酸、本発明の第５の態様による核酸構築物、または本発明の第６の態様によるベクターを導入するステップを含む方法に関する。
【００５７】
細胞は、被験体から単離された試料に由来し得る。
【００５８】
ＣＡＲにおいてスペーサーとしてコイルドコイルドメインを使用することにより、ＩｇＧに由来するＦｃドメインなどのこれまで使用されていたスペーサーに勝るいくつかの利点が提供される。
【００５９】
例えば、コイルドコイルドメインの使用により、スペーサーの寸法を０．１５ｎｍ刻みで変化させることが可能となる。個々のアミノ酸またはいくつかのアミノ酸の付加または削減は、コイルドコイルスペーサーのサイズを徐々に変化させることができることを意味する。対照的に、ＩｇＧスペーサーの使用は、全免疫グロブリンドメインの付加または除去を可能にするだけである。これは、変化の最も小さな刻みが約４ｎｍ（すなわち、フォールディングされた免疫グロブリンドメインのサイズ）であることを意味する。
【００６０】
コイルドコイルドメインは、ＩｇＧに由来するＦｃドメイン（約７００ヌクレオチド）と比較して、より小さなＤＮＡ断片（例えば、約１００ヌクレオチド）によってコードされる。これにより、より小さなＤＮＡベクターが可能となり、これは、ウイルス力価および形質導入効率を改善するのに重要である。
【００６１】
コイルドコイルスペーサーを使用することにより、他のコイルドコイルドメインと交差ハイブリダイズしない、多数のコイルドコイルスペーサーからの選択が可能となる。これは、スペーサーの選択肢数がより限定されている他のスペーサーとは対照的である。
【００６２】
コイルドコイルスペーサーを使用することはまた、古典的ＣＡＲよりもＣＡＲ設計の点での柔軟性が大きい。例えば、ホモまたはヘテロオリゴマーＣＡＲ複合体の形成が可能となる。ヘテロオリゴマーＣＡＲ複合体は、ＣＤ２８／ＯＸ４０／４１ＢＢおよびＴＣＲｚエンドドメインを有する多重鎖ＣＡＲを操作する際に、エンドドメインのそれぞれが、膜に対して最適な近傍性で配置され、所望される比率で存在することを確実にするのに有用である。
【００６３】
本発明者らは、結合体ドメインの生物物理学的特性を変化させることなく、高感受性ＣＡＲを操作した。これは、ＣＡＲ結合体の親和性を低減させる方法が、予測不可能であり、特徴付けられていない特異性を有することが多いため、望ましい。
【００６４】
高感受性ＣＡＲは、ＣＡＲの価数（ｖａｌｅｎｃｙ）を増加させることによって提供される。具体的には、相互作用して、２つを上回るＣＡＲを含む多量体を形成することができるコイルドコイルスペーサードメインを使用することにより、ＩＴＡＭの増加およびオリゴマーＣＡＲ複合体に対する結合活性（ａｖｉｄｉｔｙ）の増加に起因して、低密度リガンドを発現する標的に対する感受性が増加する。
【００６５】
感受性は、コイル−シグナル対ｓｃＦｖ−コイルの比を増加させることによって増加し得、そうして、それぞれのｓｃＦｖが、多数のシグナル伝達エレメントに結合する（図１０ｃを参照されたい）。感受性は、多量体ＣＡＲの複合体の形成によって増加し得る（図１０ｆ）。
【００６６】
本発明の多量体ＣＡＲにおいて、シグナル伝達エンドドメインは、膜近傍の位置においてトランスに提供され、Ｔ細胞シグナル伝達ドメインの組合せの微調整を行うこと（図１０ａおよびｂ）、ならびに構造体が、第３世代ＣＡＲ（図１ｄ）よりも多くのエンドドメインシグナルを含むように、３つを上回る異なる細胞内シグナル伝達ドメインを組み込むこと（図１０ｄ）が可能である。
【００６７】
細胞内でＣＡＲとヘテロ二量体化する別個の細胞内シグナル伝達構成成分分子を使用することにより、抗原結合ドメイン１つ当たりのエンドドメインの数をさらに増幅させ、「超ＣＡＲ」（図１５）を生成することが可能である。
【００６８】
本発明の多量体ＣＡＲは、１つを上回る抗原結合特異性を含み得、複数のエピトープまたは抗原を標的とすることが可能である（図１０ｅ）。
【００６９】
複数の結合ドメインを有する多量体ＣＡＲは、古典的なホモ二量体ＣＡＲよりも高い結合活性を有するであろう。これは、例えば、低い親和性を有する結合ドメインにとって重要であり得るが、これは、複数の親和性の強度が積み重なって高い特異性の結合がもたらされるためである。多量体ＣＡＲは、複数の免疫グロブリンが共有結合して五量体または六量体構造を形成したものを含むＩｇＭに類似の様式で抗原に結合し得る。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
（ｉ）抗原結合ドメインと、
（ｉｉ）コイルドコイルスペーサードメインと、
（ｉｉｉ）膜貫通ドメインと、
（ｉｖ）エンドドメインと
を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）形成ポリペプチド。
（項目２）
前記抗原結合ドメインが、標的細胞に低密度で発現する抗原に結合する、項目１に記載のＣＡＲ形成ポリペプチド。
（項目３）
前記抗原結合ドメインが、ＲＯＲ−１、Ｔｙｐｒ−１、またはＢＣＭＡに結合する、項目２に記載のＣＡＲ形成ポリペプチド。
（項目４）
（ｉ）コイルドコイルスペーサードメインと、
（ｉｉｉ）膜貫通ドメインと、
（ｉｖ）エンドドメインと
を含む補助ポリペプチド。
（項目５）
前記コイルドコイルスペーサードメインが、少なくとも３つのＣＡＲ形成ポリペプチド／補助ポリペプチドの多量体化を可能にする、項目１から３のいずれかに記載のＣＡＲ形成ポリペプチドまたは項目４に記載の補助ポリペプチド。
（項目６）
前記コイルドコイルスペーサードメインが、軟骨オリゴマー基質タンパク質（ＣＯＭＰ）、マンノース結合タンパク質Ａ、コイルドコイルセリンリッチタンパク質１、ポリペプチド放出因子２、ＳＮＡＰ−２５、ＳＮＡＲＥ、Ｌａｃリプレッサー、またはアポリポタンパク質Ｅに由来する、項目５に記載のＣＡＲ形成ポリペプチドまたは補助ポリペプチド。
（項目７）
前記コイルドコイルスペーサードメインが、配列番号１もしくは３０〜４２に示される配列のうちの１つ、もしくはその断片、または少なくとも８０％の配列同一性を有するそのバリアントを含む、項目６に記載のＣＡＲ形成ポリペプチドまたは補助ポリペプチド。
（項目８）
前記エンドドメインが、ＣＤ３ゼータエンドドメイン、ＣＤ２８エンドドメイン、４１ＢＢエンドドメイン、およびＯＸ４０エンドドメインのうちの少なくとも１つを含む、先行項目のいずれかに記載のＣＡＲ形成ポリペプチドまたは補助ポリペプチド。
（項目９）
前記エンドドメインが、配列番号７に示される配列、または少なくとも８０％の配列同一性を有するそのバリアントを含む、先行項目のいずれかに記載のＣＡＲ形成ポリペプチドまたは補助ポリペプチド。
（項目１０）
前記エンドドメインが、細胞内シグナル伝達構成成分とヘテロ二量体化することができるヘテロ二量体化ドメインを含む、先行項目のいずれかに記載のＣＡＲ形成ポリペプチドまたは補助ポリペプチド。
（項目１１）
前記ヘテロ二量体化ドメインが、ロイシンジッパードメイン、ＤＤＤ１またはＡＤ１ドメイン、ＢａｒｎａｓｅまたはＢａｒｎｓｔａｒドメイン、ヒト膵臓ＲＮＡｓｅまたはＳペプチドドメインのうちの１つを含む、項目１０に記載のＣＡＲ形成ポリペプチドまたは補助ポリペプチド。
（項目１２）
別のＣＡＲと架橋を形成することができるエレメントを含む、先行項目のいずれかに記載のＣＡＲ形成ポリペプチドまたは補助ポリペプチド。
（項目１３）
前記エレメントが、そのようなエレメントを含有する別のＣＡＲ形成ポリペプチドまたは補助ポリペプチドとジスルフィド架橋を形成することができる、項目１０に記載のＣＡＲ形成ポリペプチドまたは補助ポリペプチド。
（項目１４）
先行項目のいずれかに定義される複数のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）形成ポリペプチドを含む多量体ＣＡＲ。
（項目１５）
１つまたは複数の項目１から１１のいずれかに定義されるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）形成ポリペプチドと、１つまたは複数の項目１から１１のいずれかに定義される補助ポリペプチドとを含む多量体ＣＡＲ。
（項目１６）
前記ＣＡＲ形成ポリペプチド（複数可）および／または補助ポリペプチド（複数可）が、異なるエンドドメインを含む、項目１２または１３に記載の多量体ＣＡＲ。
（項目１７）
異なる抗原結合ドメインを有する少なくとも２つのＣＡＲ形成ポリペプチドを含む、項目１２から１４のいずれかに記載の多量体ＣＡＲ。
（項目１８）
第１および第２の、項目１２から１５のいずれかに記載の多量体ＣＡＲを含む結合複合体であって、前記第１の多量体ＣＡＲが、前記第２の多量体ＣＡＲと架橋を形成し、その結果、前記第１および第２の多量体ＣＡＲが結合して複合体が形成される、結合複合体。
（項目１９）
前記架橋が、ジスルフィド架橋である、項目１６に記載の結合複合体。
（項目２０）
（ｉ）第１のヘテロ二量体化ドメインを含む項目１０または１１に定義されるＣＡＲ形成ポリペプチドまたは補助ポリペプチドを含む多量体ＣＡＲと、
（ｉｉ）シグナル伝達ドメインおよび第２のヘテロ二量体化ドメインを含む細胞内シグナル伝達構成成分と
を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）シグナル伝達系であって、
前記第１および第２のヘテロ二量体化ドメイン間のヘテロ二量体化が、前記多量体ＣＡＲとシグナル伝達構成成分による機能性ＣＡＲ複合体の形成をもたらす、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）シグナル伝達系。
（項目２１）
前記ＣＡＲ形成ポリペプチド（複数可）もしくは補助ポリペプチド（複数可）、またはそのそれぞれが、複数のヘテロ二量体化ドメインを含み、その結果、単一のＣＡＲ形成ポリペプチドまたは補助ポリペプチドは、複数のシグナル伝達構成成分とヘテロ二量体化することができる、項目２０に記載のＣＡＲシグナル伝達系。
（項目２２）
各シグナル伝達構成成分が、複数のシグナル伝達ドメインを含む、項目２０または２１に記載のＣＡＲシグナル伝達系。
（項目２３）
項目１から１３のいずれかに記載のＣＡＲ形成ポリペプチドまたは補助ポリペプチドをコードする核酸。
（項目２４）
２つまたはそれ超の、項目１から３および５から１３のいずれかに定義されるＣＡＲ形成ポリペプチドをコードする核酸構築物。
（項目２５）
少なくとも１つの、項目１から３および５から１３のいずれかに定義されるＣＡＲ形成ポリペプチド、ならびに少なくとも１つの、項目４から１３のいずれかに定義される補助ポリペプチドをコードする核酸構築物。
（項目２６）
（ｉ）項目２０から２２のいずれかに定義される多量体ＣＡＲを形成する少なくとも１つの、項目１から３および５から１３のいずれかに定義されるＣＡＲ形成ポリペプチド、ならびに
（ｉｉ）項目２０から２２のいずれかに定義される細胞内シグナル伝達構成成分
をコードする核酸構築物。
（項目２７）
項目２３に記載の核酸配列または項目２４から２６のいずれかに記載の核酸構築物を含むベクター。
（項目２８）
レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターまたはトランスポゾンである、項目２７に記載のベクター。
（項目２９）
項目１から１３のいずれかに記載のＣＡＲ形成ポリペプチドもしくは補助ポリペプチド、項目２０から２２のいずれかに記載のＣＡＲシグナル伝達系、項目１４から１７のいずれかに記載の多量体ＣＡＲ、または項目１８もしくは１９に記載の結合複合体を発現する細胞。
（項目３０）
Ｔ細胞またはＮＫ細胞である、項目２９に記載の細胞。
（項目３１）
項目２９または３０に記載の細胞を含む医薬組成物。
（項目３２）
疾患の治療に使用するための、項目３０または３１に記載の細胞。
（項目３３）
疾患を治療するための医薬品の製造における、項目２９または３０に記載の細胞の使用。
（項目３４）
項目２９または３０に記載の細胞を被験体に投与するステップを含む、疾患を治療するための方法。
（項目３５）
前記疾患ががんである、項目３２に記載の使用のための細胞、項目３３に記載の使用、または項目３４に記載の方法。
（項目３６）
前記がんが、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、黒色腫、または骨髄腫である、項目３５に記載の細胞、使用、または方法。
（項目３７）
項目２９または３０に記載の細胞を作製する方法であって、項目２３に記載の核酸、項目２４から２６のいずれかに記載の核酸構築物、または項目２７もしくは２８に記載のベクターを、前記細胞に導入するステップを含む方法。
（項目３９）
前記細胞が、被験体から単離された試料に由来する、項目３７に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】ａ）古典的ＣＡＲを示す概略図。（ｂ）から（ｄ）：異なる世代のＣＡＲエンドドメインおよび並び替えられたＣＡＲエンドドメイン：（ｂ）初期の設計は、ＦｃεＲ１−γもしくはＣＤ３ζエンドドメインを通じて単独でＩＴＡＭシグナルを伝達したが、一方、後の設計は、さらに、同じ複合エンドドメインにおいて（ｃ）１つ、または（ｄ）２つの共刺激シグナルを伝達した。
【００７１】
【図２】ａ）古典的ＣＡＲを示す概略図。ｂ）一般的なＣＡＲスペーサーを示す概略図。「Ｓ」は、ジスルフィド結合を示す。
【００７２】
【図３】天然の二量体、三量体、および四量体のコイルドコイル構造体（Andrei  N.  LupasおよびMarkus  Gruber、Adv  Protein  Chem.２００５年；７０巻：３７〜７８頁を改変）。
【００７３】
【図４】コラーゲンオリゴマー基質タンパク質（ＣＯＭＰ）およびヒトＩｇＧ１由来の五量体コイルドコイルモチーフの結晶構造。個々の鎖が、異なる色で示されている。コイルドコイルＣＯＭＰ構造体は、Ｎ末端からＣ末端が頁の中心に伸びた状態で、また、Ｃ末端を左側にし、Ｎ末端を右側にした外形により示されている。ヒトＩｇＧ１は、Ｎ末端（上）からＣ末端（下）の外形により示されている。
【００７４】
【図５−１】コイルドコイルスペーサーＣＡＲ。ａ）ＣＯＭＰに由来する五量体コイルドコイルスペーサーを有するＣＡＲを示す概略図。ｂ）ＣＯＭＰ  ＣＡＲおよび対照ＣＡＲのＯＲＦを示す構築物マップ。ｃ）抗ＣＤ３３  ＣＯＭＰ  ＣＡＲおよび抗ＲＯＲ−１  ＣＯＭＰ  ＣＡＲのＯＲＦのアミノ酸配列。ｄ）抗ＣＤ３３  ＣＯＭＰ  ＣＡＲおよび抗ＲＯＲ−１  ＣＯＭＰ  ＣＡＲのＯＲＦのＤＮＡ配列。
【図５−２】コイルドコイルスペーサーＣＡＲ。ａ）ＣＯＭＰに由来する五量体コイルドコイルスペーサーを有するＣＡＲを示す概略図。ｂ）ＣＯＭＰ  ＣＡＲおよび対照ＣＡＲのＯＲＦを示す構築物マップ。ｃ）抗ＣＤ３３  ＣＯＭＰ  ＣＡＲおよび抗ＲＯＲ−１  ＣＯＭＰ  ＣＡＲのＯＲＦのアミノ酸配列。ｄ）抗ＣＤ３３  ＣＯＭＰ  ＣＡＲおよび抗ＲＯＲ−１  ＣＯＭＰ  ＣＡＲのＯＲＦのＤＮＡ配列。
【図５−３】コイルドコイルスペーサーＣＡＲ。ａ）ＣＯＭＰに由来する五量体コイルドコイルスペーサーを有するＣＡＲを示す概略図。ｂ）ＣＯＭＰ  ＣＡＲおよび対照ＣＡＲのＯＲＦを示す構築物マップ。ｃ）抗ＣＤ３３  ＣＯＭＰ  ＣＡＲおよび抗ＲＯＲ−１  ＣＯＭＰ  ＣＡＲのＯＲＦのアミノ酸配列。ｄ）抗ＣＤ３３  ＣＯＭＰ  ＣＡＲおよび抗ＲＯＲ−１  ＣＯＭＰ  ＣＡＲのＯＲＦのＤＮＡ配列。
【００７５】
【図６】コイルドコイルＣＡＲの表面発現レベル。ａ）マウスＴ細胞株に、抗ＣＤ３３  ＣＯＭＰ  ＣＡＲまたは抗ＣＤ３３  ＩｇＧ１  ＣＡＲを形質導入した。これらの細胞を、次いで、マウスＦｃ  ＩｇＧ２ａに融合したキメラ可溶性ＣＤ３３で染色した後、抗マウスＩｇＧ  ＰＥで二次染色した。ｂ）マウスＴ細胞株に、抗ＲＯＲ−１  ＣＯＭＰ  ＣＡＲまたは抗ＲＯＲ−１  ＩｇＧ１  ＣＡＲを形質導入した。これらの細胞を、次いで、可溶性ＨｉｓタグＲＯＲ−１で染色した後、抗Ｈｉｓ−ビオチンで二次染色し、続いてストレプトアビジン−ＡＰＣで三次染色した。
【００７６】
【図７】固定化リガンドによる抗ＲＯＲ−１  ＣＯＭＰ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の刺激。形質導入を行ったマウスＴ細胞を、異なる濃度の可溶性ＨｉｓタグＲＯＲ−１上清で事前コーティングした抗Ｈｉｓビーズとともに共培養した。共培養上清中のＩＬ−２の量を、１６〜２４時間後にＥＬＩＳＡによって分析した。
【００７７】
【図８】標的細胞上のＲＯＲ−１の発現レベル。ＳＫＷ細胞株は、天然に、低いレベルのＲＯＲ−１を発現する。これらの細胞に、ＲＯＲ−１を形質導入して、発現レベルを高めた。これらの細胞を、抗ＲＯＲ−１  ＡＰＣで染色し、未染色細胞と比較した。
【００７８】
【図９】ＲＯＲ−１陽性ＳＫＷ細胞による抗ＲＯＲ−１  ＣＯＭＰ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の刺激。形質導入を行ったマウスＴ細胞を、ＲＯＲ−１リガンドを低密度または高密度で発現するＳＫＷ標的細胞とともに共培養した。Ｔ細胞を一定数に維持し、標的細胞の数を変化させた。共培養上清中のＩＬ−２の量を、１６〜２４時間後にＥＬＩＳＡによって分析した。灰色の網掛け領域は、その実験の標準曲線の範囲を示す。青色の破線は、ＰＭＡおよびイオノマイシンでの刺激からの平均のＩＬ−２分泌である。赤色の破線は、Ｔ細胞のみ（刺激なし）の培養物から検出された平均のＩＬ−２である。
【００７９】
【図１０−１】コイルドコイルＣＡＲの設計。ａ）１つのＣＡＲ形成ポリペプチドおよび１つの補助ポリペプチドからなるＣＡＲを示す概略図。ＣＡＲ形成ポリペプチドは、シグナル１をＴ細胞に提供し、Ｎ末端のｓｃＦｖ結合体、続いてＣＯＭＰスペーサー、膜貫通、およびＴＣＲｚからなる。補助ポリペプチドは、シグナル３をＴ細胞に提供し、Ｎ末端リガンド結合体がなく、ＣＯＭＰスペーサーで始まり、続いて膜貫通、および４１ＢＢのシグナル伝達モチーフからなる。ｂ）１つのＣＡＲ形成ポリペプチドおよび２つの補助ポリペプチドを含む、別のコイルドコイルＣＡＲ系を示す概略図。ＣＡＲ形成ポリペプチドは、シグナル１をＴ細胞に提供し、Ｎ末端のｓｃＦｖ結合体、続いてＣＯＭＰスペーサー、膜貫通、およびＴＣＲｚからなる。第１の補助ポリペプチドは、シグナル２をＴ細胞に提供し、Ｎ末端リガンド結合体がなく、ＣＯＭＰスペーサーで始まり、続いて膜貫通、およびＣＤ２８のシグナル伝達モチーフからなる。第２の補助ポリペプチドは、シグナル３をＴ細胞に提供し、Ｎ末端リガンド結合体がなく、ＣＯＭＰスペーサーで始まり、続いて膜貫通、および４１ＢＢのシグナル伝達モチーフからなる。「Ｓ」は、ジスルフィド結合を示す。この構成により、シグナル伝達エンドドメインが、膜近傍の位置においてトランスであり、より良好なシグナル伝達をもたらすことが可能となる。ｃ）別のコイルドコイルＣＡＲ系を示す概略図であり、ここでは、ｓｃＦｖ：コイルの比が、コイル：シグナルの比よりも大幅に低く、そのため各ｓｃＦｖが、多数のシグナル伝達エレメントに結合する。これは、増幅系であり、複合体１つ当たりのｓｃＦｖを１つに限定することにより、結合したリガンドそれぞれが、５つのＴＣＲｚ鎖を通じて（２つのリガンドが、１０個のＴＣＲｚを通じて）シグナル伝達を行うことになる。これは、２つのリガンドが２つのＴＣＲｚ鎖を通じてシグナル伝達を行う従来的な二量体ＣＡＲとは対照的である。この系は、本質的に、トリガー力を５倍増加させる。ｄ）第３世代のＣＡＲよりも多くのエンドドメインを含む、別のコイルドコイルＣＡＲ系を示す概略図。コイルドコイルスペーサーは、従来的な第３世代のＣＡＲに加えて、２つの追加のシグナル伝達ドメイン（「ＥＸＴＲＡ」）の導入を可能にする。ｅ）複数の標的を含む別のコイルドコイルＣＡＲシグナル伝達系を示す概略図（ここでは、１つがリガンドＡに結合し、１つがリガンドＢに結合する、２つの標的結合特異性が示されている）。この構成は、ＴａｎＣＡＲの代替的な構造である。ｆ）別のコイルドコイルスペーサーＣＡＲと、ジスルフィド架橋などの連結を形成するエレメントを含み、ｓｃＦｖ：シグナル伝達ドメインの価数をさらに増加させる結合複合体をもたらす、別のコイルドコイルＣＡＲ系を示す概略図。図１０ｃ）に示される構成と同様に、これは、増幅系である。結合複合体のそれぞれが、１０個のＴＣＲｚ鎖を通じてシグナル伝達を行うことになる。２つのＴＣＲｚ鎖を通じてシグナル伝達を行う従来的な二量体ＣＡＲとは対照的である。この系により、本質的に、トリガー力が５倍増加するであろう。ＩｇＧヒンジを三量体コイルドコイル構造体と置き換えることにより、これは８倍近く増加するが、四量体コイルドコイルでは１０倍増加するであろう。
【図１０−２】同上
【図１０−３】同上
【００８０】
【図１１】ＣＯＭＰスペーサーの切断。ａ）抗ＲＯＲ−１  ＣＯＭＰ  ＣＡＲを示す概略図であり、ＣＯＭＰスペーサーは、４５個のアミノ酸のＮ末端から「ｘ」アミノ酸まで切断した。  ｂ）２９３Ｔ細胞に、切断型構築物をトランスフェクトし、ＦＡＣＳによって分析した。
【００８１】
【図１２】実施例６において試験した多量体ＣＡＲおよび古典的ＣＡＲを示す概略図。
【００８２】
Ａ）抗ＣＤ１９抗原結合ドメイン、コイルドコイルスペーサードメイン、およびＣＤ３ゼータエンドドメインを有するポリペプチド、ならびにコイルドコイルスペーサードメインおよび４１ＢＢエンドドメインを有する補助ポリペプチドを含む、ヘテロ多量体ＣＡＲ。このＣＡＲは、構造：ａＣＤ１９ｆｍｃ６３−ＣＯＭＰ−ＣＤ２８ｔｍＺ−２Ａ−ＣＯＭＰ−ＣＤ２８ｔｍ−４１ＢＢを有するバイシストロン構築物によってコードされる。このＣＡＲ構造体において、４１ＢＢおよびＴＣＲゼータシグナル伝達モチーフは、平行である。
Ｂ）抗ＣＤ１９抗原結合ドメイン、コイルドコイルスペーサードメイン、および組合せ４１ＢＢ／ＣＤ３ゼータエンドドメインを含むポリペプチドからなるホモ多量体ＣＡＲ。このＣＡＲは、構造：ａＣＤ１９ｆｍｃ６３−ＣＯＭＰ−ＣＤ８ＴＭ−４１ＢＢ−Ｚを有する構築物によってコードされる。このＣＡＲ構造体において、４１ＢＢおよびＴＣＲゼータシグナル伝達モチーフは、連続である。
Ｃ）抗ＣＤ１９抗原結合ドメイン、ＣＤ８ストークスペーサードメイン、および組合せ４１ＢＢ／ＣＤ３ゼータエンドドメインを有する２つのポリペプチドを含む、古典的な第２世代のホモ二量体ＣＡＲ。このＣＡＲは、バイシストロン構築物によってコードされ、これは、自殺遺伝子ＲＱＲ８もコードする。この構築物は、構造：ＲＱＲ８−２Ａ−ａＣＤ１９ｆｍｃ６３−ＣＤ８ＳＴＫ−４１ＢＢＺを有する。
【００８３】
【図１３】２日目における図１２に示されるＣＡＲによるＣＤ１９＋ＳｕｐＴ１標的細胞の殺滅。
【００８４】
【図１４】５日目における図１２に示されるＣＡＲによるＣＤ１９＋ＳｕｐＴ１標的細胞の殺滅。
【００８５】
【図１５】実施例７において試験したコイルドコイル超ＣＡＲ構築物の概略図：ａＣＤ１９−ＩｇＧＦｃ−Ｚ：１分子当たり２つのＴＣＲｚ分子を含み、ｆｍｃ６３  ａＣＤ１９結合体を有する、古典的ホモ二量体ＣＡＲ。コイルドコイル超ＣＡＲは、それぞれが４つの別個のＡＤ１ドメインを含む５つのポリペプチドからなる。コイルドコイル超ＣＡＲは、したがって、２０個のＡＤ１ドメインを含む。ＣＯＭＰ＿ｘ４ＡＤ１：コイルドコイル超ＣＡＲを、ＴＣＲゼータシグナル伝達ドメインのコピーを有さないシグナル伝達構成成分と組合せて試験した。これを、陰性対照として使用した。ＣＯＭＰ＿ｘ４ＡＤ１＋Ｚ−ＤＤＤ１−Ｚ：コイルドコイル超ＣＡＲを、ＴＣＲゼータシグナル伝達ドメインの２つのコピーを有するシグナル伝達構成成分と組合せて試験した。ＤＤＤ１は２：１の化学量論でＡＤ１に結合するため、このシグナル伝達ドメインは、５つのポリペプチドのコイルドコイルＣＡＲ標的成分のそれぞれに対して、ＴＣＲゼータドメインのコピーを８０個提供する。
【００８６】
【図１６】低、中、および高の異なる濃度で同起源の抗原（ＣＤ１９）を発現する標的細胞でチャレンジした後のＩＬ２の放出。
【発明を実施するための形態】
【００８７】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
図１に概略図で示されている古典的なＣＡＲは、細胞外抗原認識ドメイン（結合体）を細胞内シグナル伝達ドメイン（エンドドメイン）に接続する、キメラＩ型膜貫通タンパク質である。結合体は、典型的に、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）由来の一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）であるが、抗体様の、またはリガンドに基づく、抗原結合部位を含む他の形式に基づいていてもよい。膜貫通ドメインは、タンパク質を細胞膜に固定し、スペーサーをエンドドメインに接続する。
【００８８】
初期のＣＡＲの設計は、ＦｃεＲ１のγ鎖またはＣＤ３ζのいずれかの細胞内部分に由来するエンドドメインを有していた。結果として、これらの第１世代受容体は、免疫性シグナル１を伝達し、このシグナルは、Ｔ細胞による同起源の標的細胞の殺滅をトリガーするには十分であったが、Ｔ細胞を完全に活性化して増殖および生存させることはできなかった。この限定を克服するために、複合エンドドメインが構築されており、Ｔ細胞共刺激分子の細胞内部分を、ＣＤ３ζのものに融合させることにより、抗原認識後に活性化および共刺激のシグナルを同時に伝達することができる第２世代の受容体が得られる。最も一般的に使用されている共刺激ドメインは、ＣＤ２８のものである。これは、最も強力な共刺激シグナル、すなわち、免疫性シグナル２を提供し、このシグナルが、Ｔ細胞増殖をトリガーする。生存シグナルを伝達する、関係性の深いＯＸ４０および４１ＢＢなど、ＴＮＦ受容体ファミリーのエンドドメインを含むいくつかの受容体についても説明されている。現在では、活性化、増殖、および生存のシグナルを伝達することができるエンドドメインを有する、さらに強力な第３世代のＣＡＲについて説明されている。
【００８９】
ＣＡＲをコードする核酸を、例えば、レトロウイルスベクターを使用して、Ｔ細胞に移入することができる。これにより、多数の抗原特異性Ｔ細胞を、養子細胞移入のために生成することができる。ＣＡＲが標的抗原に結合する場合、ＣＡＲが発現されるＴ細胞への活性化シグナルの伝達が生じる。したがって、ＣＡＲは、Ｔ細胞の特異性および細胞傷害性を、標的抗原を発現する細胞へと向ける。
【００９０】
本ＣＡＲは、抗原結合ドメインと、コイルドコイルスペーサードメインと、膜貫通ドメインと、エンドドメインとを含む。コイルドコイルスペーサードメインは、当該技術分野において既述のスペーサーよりも優れた多数の利点を提供する。
【００９１】
コイルドコイルドメイン
ＣＡＲは、典型的に、抗原結合ドメインを膜貫通ドメインに接続するためのスペーサー配列を含む。スペーサーにより、抗原結合ドメインが、好適な配向および到達範囲を有することが可能となる。スペーサーはまた、リガンド結合時にホスファターゼからの分離を提供する。
【００９２】
本発明のＣＡＲは、コイルドコイルスペーサードメインを含む。
【００９３】
コイルドコイルは、２〜７個のアルファヘリックスが、ロープの撚り糸のように一緒に巻きついている、構造モチーフである（図３）。多くの内在性タンパク質は、コイルドコイルドメインを組み込んでいる。コイルドコイルドメインは、タンパク質のフォールディングに関与するか（例えば、同じタンパク質鎖内の複数のアルファヘリックスモチーフと相互作用する）、またはタンパク質間の相互作用を担う可能性がある。後者の場合において、コイルドコイルは、ホモまたはヘテロオリゴマー構造を開始し得る。
【００９４】
本明細書に使用されるとき、「多量体」および「多量体化」という用語は、「オリゴマー」および「オリゴマー化」と同義であり、互換可能である。
【００９５】
コイルドコイルドメインの構造は、当該技術分野で周知である。例えば、Lupas  &  Gruber（Advances  in  Protein  Chemistry、２００７年、７０巻、３７〜３８頁）に記載されている。
【００９６】
コイルドコイルは、通常、疎水性（ｈ）および荷電（ｃ）アミノ酸残基の反復パターンｈｘｘｈｃｘｃを含有し、７残基反復（ｈｅｐｔａｄ  ｒｅｐｅａｔ）と呼ばれている。この７残基反復内の位置は、通常、ａｂｃｄｅｆｇと標識され、ここで、ａおよびｄは、疎水性位置であり、イソロイシン、ロイシン、またはバリンが占めることが多い。この反復パターンを有する配列をアルファヘリックス二次構造体にフォールディングすることにより、疎水性残基が、左巻きで螺旋状に緩く巻いた「縞」として現れ、両親媒性構造が形成される。２つのこのようなヘリックスが細胞質内でそれらを配置する最も好ましい方法は、疎水性鎖を親水性アミノ酸の間に挟んで互いに巻きつけることである。したがって、疎水性表面を埋め込むことで、オリゴマー形成のための熱力学的駆動力が提供されている。コイルドコイルの接合面のつまり方は非常に緊密であり、ａ残基とｄ残基の側鎖間にはほぼ完全なファンデルワールス接触がある。
【００９７】
αヘリックスは、平行または逆平行であってもよく、通常、左巻きのスーパーコイルが用いられる。好ましくはないが、自然界および設計タンパク質において、いくつかの右巻きコイルドコイルも観察されている。
【００９８】
コイルドコイルドメインは、コイルドコイルドメインを含むＣＡＲまたは補助ポリペプチドの複合体が形成されるように、コイルドコイル多量体を形成することができる任意のコイルドコイルドメインであり得る。
【００９９】
コイルドコイルドメインの配列と最終的なフォールディングされた構造との間の関連性は、当該技術分野で十分に理解されている（Mahrenholzら、Molecular  &  Cellular  Proteomics、２０１１年、１０巻（５号）：M110.004994）。このように、コイルドコイルドメインは、合成により生成されたコイルドコイルドメインであってもよい。
【０１００】
コイルドコイルドメインを含有するタンパク質の例としては、キネシンモータータンパク質、Ｄ型肝炎デルタ抗原、古細菌ボックスＣ／Ｄ  ｓＲＮＰコアタンパク質、軟骨オリゴマー基質タンパク質（ＣＯＭＰ）、マンノース結合タンパク質Ａ、コイルドコイルセリンリッチタンパク質１、ポリペプチド放出因子２、ＳＮＡＰ−２５、ＳＮＡＲＥ、Ｌａｃリプレッサー、またはアポリポタンパク質Ｅが挙げられるがこれらに限定されない。
様々なコイルドコイルドメインの配列を、以下に示す。
キネシンモータータンパク質：平行型ホモ二量体（配列番号３０）
【化１】
0006675417.tif 000003
Ｄ型肝炎デルタ抗原：平行型ホモ二量体（配列番号３１）
【化２】
0006675417.tif 000004
古細菌ボックスＣ／Ｄ  ｓＲＮＰコアタンパク質：逆平行型ヘテロ二量体（配列番号３２）
【化３】
0006675417.tif 000005
マンノース結合タンパク質Ａ：平行型ホモ三量体（配列番号３３）
【化４】
0006675417.tif 000006
コイルドコイルセリンリッチタンパク質１：平行型ホモ三量体（配列番号３４）
【化５】
0006675417.tif 000007
ポリペプチド放出因子２：逆平行型ヘテロ三量体
【化６】
0006675417.tif 000008
ＳＮＡＰ−２５およびＳＮＡＲＥ：平行型ヘテロ四量体
【化７】
0006675417.tif 000009
Ｌａｃリプレッサー：平行型ホモ四量体
【化８】
0006675417.tif 000010
アポリポタンパク質Ｅ：逆平行型ヘテロ四量体
【化９】
0006675417.tif 000011
【０１０１】
コイルドコイルドメインは、オリゴマー化することができる。ある特定の実施形態では、コイルドコイルドメインは、三量体、四量体、五量体、六量体、または七量体を形成することができる場合がある。
【０１０２】
コイルドコイルドメインは、ロイシンジッパーとは異なる。ロイシンジッパーは、二量体化ドメインとして機能する超二次構造体である。それらの存在により、平行なアルファヘリックスに接着力が生じる。単一のロイシンジッパーは、およそ７残基間隔にある複数のロイシン残基からなり、これにより、疎水性領域が片側に並んだ両親媒性のアルファヘリックスが形成される。この疎水性領域が、二量体化のための領域を提供し、モチーフをひとまとめに「綴じる（ｚｉｐ）」ことが可能となる。ロイシンジッパーは、典型的に、長さが２０〜４０個のアミノ酸、例えば、およそ３０個のアミノ酸である。
【０１０３】
ロイシンジッパーは、典型的に、２つの異なる配列によって形成され、例えば、酸性ロイシンジッパーは、塩基性ロイシンジッパーとヘテロ二量体化する。ロイシンジッパーの例は、ドッキングドメイン（ｄｏｃｋｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ、ＤＤＤ１）およびアンカードメイン（ＡＤ１）であり、これらは、以下により詳細に記載されている。
【０１０４】
ロイシンジッパーは二量体を形成するが、本発明のコイルドコイルスペーサーは、多量体（三量体およびそれ超）を形成する。ロイシンジッパーは、配列の二量体化部分でヘテロ二量体化するが、コイルドコイルドメインは、ホモ二量体化する。
【０１０５】
一実施形態では、本発明は、高感受性ＣＡＲを提供する。
【０１０６】
高感受性ＣＡＲは、ＣＡＲの価数を増加させることによって提供される。具体的には、相互作用して、２つを上回るコイルドコイルドメインを含む、したがって２つを上回るＣＡＲを含む多量体を形成することができるコイルドコイルスペーサードメインを使用することにより、存在するＩＴＡＭの数の増加およびオリゴマーＣＡＲ複合体の結合活性の増加に起因して、低密度リガンドを発現する標的に対する感受性が増加する。
【０１０７】
したがって、一実施形態では、本ＣＡＲ形成ポリペプチドは、少なくとも３つのＣＡＲ形成ポリペプチドの多量体化を可能にするコイルドコイルスペーサードメインを含む。換言すると、ＣＡＲは、コイルドコイルドメインの三量体、四量体、五量体、六量体、または七量体を形成することができるコイルドコイルドメインを含む。
【０１０８】
２つを上回るコイルドコイルドメインを含む多量体を形成することができるコイルドコイルドメインの例としては、軟骨オリゴマー基質タンパク質（ＣＯＭＰ）、マンノース結合タンパク質Ａ、コイルドコイルセリンリッチタンパク質１、ポリペプチド放出因子２、ＳＮＡＰ−２５、ＳＮＡＲＥ、Ｌａｃリプレッサー、またはアポリポタンパク質Ｅ由来のコイルドコイルドメインが挙げられるがこれらに限定されない（上述の配列番号３０〜４２を参照されたい）。
【０１０９】
コイルドコイルドメインは、ＣＯＭＰコイルドコイルドメインであってもよい。
【０１１０】
ＣＯＭＰは、自然界における最も安定なタンパク質複合体の１つであり（０℃〜１００℃、広いｐＨ範囲で安定である）、４〜６Ｍの塩酸グアニジンでしか変性することができない。ＣＯＭＰコイルドコイルドメインは、五量体を形成することができる。ＣＯＭＰはまた、細胞外空間に自然に発現する、内在的に発現するタンパク質でもある。これは、合成のスペーサーと比較して、免疫原性の危険性を低減させる。さらに、ＣＯＭＰコイルドコイルモチーフの結晶構造が判明しており、それにより、スペーサーの長さの正確な推測が得られる（図４）。ＣＯＭＰ構造は、長さが約５．６ｎｍである（約８．１ｎｍであるヒトＩｇＧ由来のヒンジおよびＣＨ２ＣＨ３ドメインと比較）。
【０１１１】
コイルドコイルドメインは、配列番号１に示される配列またはその断片からなり得るか、またはそれを含み得る。
【化１０】
0006675417.tif 000012
【０１１２】
図１１に示されるように、ＣＯＭＰコイルドコイルドメインをＮ末端で切断し、表面発現を保持することが可能である。コイルドコイルドメインは、したがって、Ｎ末端で切断された、配列番号１の切断型のものを含み得るか、またはそれからなってもよい。切断型ＣＯＭＰは、配列番号１のＣ末端の５個のアミノ酸、すなわち、配列ＣＤＡＣＧを含み得る。切断型ＣＯＭＰは、５〜４４個のアミノ酸、例えば、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも３５個、または少なくとも４０個のアミノ酸を含み得る。切断型ＣＯＭＰは、配列番号１のＣ末端に対応し得る。例えば、２０個のアミノ酸を含む切断型ＣＯＭＰは、配列ＱＱＶＲＥＩＴＦＬＫＮＴＶＭＥＣＤＡＣＧを含み得る。切断型ＣＯＭＰは、多量体化に関与するシステイン残基（複数可）を保持し得る。切断型ＣＯＭＰは、多量体を形成する能力を保持し得る。
【０１１３】
ＨＩＶに由来するｇｐ４１およびN.  Zaccaiら（２０１１年）Nature  Chem.  Bio.、（７巻）９３５〜９４１頁）に記載の人工タンパク質設計型六量体コイルドコイルなど、六量体を形成する様々なコイルドコイルドメインが公知である。ＧＣＮ４−ｐ１ロイシンジッパーの変異形態は、七量体コイルドコイル構造を形成する（J.  Liu.ら、（２００６年）PNAS（１０３巻）１５４５７〜１５４６２頁）。
【０１１４】
コイルドコイルドメインは、上述のコイルドコイルドメインのうちの１つのバリアントを含んでもよいが、ただし、バリアントの配列が、コイルドコイルオリゴマーを形成する能力を保持することを条件とする。例えば、コイルドコイルドメインは、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも９８、または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列番号１または３０〜４２に示される配列のバリアントを含んでもよいが、ただし、バリアントの配列が、コイルドコイルオリゴマーを形成する能力を保持することを条件とする。
【０１１５】
２つのポリペプチド配列間の同一性の割合は、ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖから無料で入手可能なＢＬＡＳＴなどのプログラムによって容易に決定することができる。
【０１１６】
抗原結合ドメイン
抗原結合ドメインは、抗原を認識する、古典的なＣＡＲの部分である。
【０１１７】
抗体、抗体模倣体、およびＴ細胞受容体の抗原結合部位に基づくものを含む、多数の抗原結合ドメインが当該技術分野で公知である。例えば、抗原結合ドメインは、モノクローナル抗体由来の一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、標的抗原の天然のリガンド、標的に対して十分な親和性を有するペプチド、ラクダなどの単一ドメイン結合体、Ｄａｒｐｉｎなどの人工結合単体（ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｂｉｎｄｅｒ  ｓｉｎｇｌｅ）、またはＴ細胞受容体に由来する一本鎖を含み得る。
【０１１８】
以下の表１に示されるように、様々な腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）が公知である。本発明において使用される抗原結合ドメインは、表１に示されるＴＡＡに結合することができるドメインであり得る。
【表１】
0006675417.tif 000013
【０１１９】
ある特定の実施形態では、本発明は、標的細胞上に低密度で発現する抗原に応答して、細胞活性化を刺激することができる、高感受性ＣＡＲを提供する。
【０１２０】
抗原結合ドメインは、細胞、例えば、がん細胞上に低密度で発現するＴＡＡに結合し得る。低密度で発現するＴＡＡとは、例えば、細胞１つ当たり数十から数千個の分子のレベルで発現するＴＡＡを指し得る。
【０１２１】
ある特定のがんにおいて低密度で発現することが知られているＴＡＡの例としては、ＣＬＬにおけるＲＯＲ１、黒色腫におけるＴｙｐｒ−１、および骨髄腫におけるＢＣＭＡが挙げられるがこれらに限定されない。
これらのＴＡＡに結合する抗原結合ドメイン（ｓｃＦｖまたはｍＡｂなど）は、既に記載されており、例えば、以下の表に示されるものがある。
【表２】
0006675417.tif 000014
【０１２２】
膜貫通ドメイン
膜貫通ドメインは、膜をまたぐＣＡＲの配列である。これは、疎水性アルファヘリックスを含んでもよい。膜貫通ドメインは、ＣＤ２８に由来してもよく、それにより良好な受容体安定性が得られる。
【０１２３】
シグナルペプチド
本発明のＣＡＲ形成ポリペプチドおよび／または補助ポリペプチドは、それがＴ細胞などの細胞に発現したときに、新生タンパク質が、小胞体、続いて細胞表面に向けられ、そこで発現するように、シグナルペプチドを含み得る。
【０１２４】
シグナルペプチドのコアは、単一のアルファヘリックスを形成する傾向を有する、長いひと続きの疎水性アミノ酸を含有してもよい。シグナルペプチドは、短いひと続きの正に荷電したアミノ酸で始まっていてもよく、これは、移行の際にポリペプチドの適正なトポロジーを強制するのに役立つ。シグナルペプチドの末端には、典型的に、シグナルペプチダーゼによって認識され、切断される、ひと続きのアミノ酸がある。シグナルペプチダーゼは、移行の間またはその完了後のいずれかに、遊離シグナルペプチドおよび成熟タンパク質を生成するように切断することができる。遊離シグナルペプチドは、次いで、特異的なプロテアーゼによって消化される。
【０１２５】
シグナルペプチドは、分子のアミノ末端にあってもよい。
【０１２６】
シグナルペプチドは、配列番号２、３、もしくは４に示される配列、または５個、４個、３個、２個、もしくは１個のアミノ酸変異（挿入、置換、もしくは付加）を有するそのバリアントを含んでもよいが、ただし、シグナルペプチドが、依然として、ＣＡＲの細胞表面発現をもたらすように機能することを条件とする。
【化１１】
0006675417.tif 000015
【０１２７】
配列番号２のシグナルペプチドは、小型かつ高効率であり、ＴＣＲベータ鎖に由来する。末端グリシンの後、約９５％が切断され、シグナルペプチダーゼによる効率的な除去をもたらすことが予測される。
【化１２】
0006675417.tif 000016
【０１２８】
配列番号３のシグナルペプチドは、ＩｇＧ１に由来する。
【化１３】
0006675417.tif 000017
【０１２９】
配列番号４のシグナルペプチドは、ＣＤ８ａに由来する。
【０１３０】
エンドドメイン
エンドドメインは、膜の細胞内の側に位置する、古典的なＣＡＲの部分である。
【０１３１】
エンドドメインは、古典的なＣＡＲのシグナル伝達部分である。抗原結合ドメインによる抗原認識の後、個々のＣＡＲ分子がクラスタを形成し、天然のＣＤ４５およびＣＤ１４８がシナプスから除外され、シグナルが細胞に伝達される。
【０１３２】
コイルドコイルスペーサーＣＡＲのエンドドメインは、細胞内シグナル伝達ドメインであり得るか、またはそれを含み得る。代替的な実施形態では、本ＣＡＲのエンドドメインは、細胞質に存在する細胞内シグナル伝達分子と相互作用し、シグナル伝達をもたらすことができる場合がある。
【０１３３】
細胞内シグナル伝達ドメインまたは別個の細胞内シグナル伝達分子は、Ｔ細胞シグナル伝達ドメインであり得るか、またはそれを含み得る。
【０１３４】
最も一般的に使用されているシグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータエンドドメインのものであり、これは、３つのＩＴＡＭを含有する。これは、抗原が結合した後に、活性化シグナルをＴ細胞に伝達する。ＣＤ３ゼータは、完全に適格な活性化シグナルを提供しない場合があり、追加の共刺激シグナル伝達が必要な場合がある。例えば、キメラＣＤ２８およびＯＸ４０を、ＣＤ３ゼータとともに使用して、増殖／生存シグナルを伝達してもよく、または３つすべてを一緒に使用してもよい（図１Ｂに示される）。
【０１３５】
本ＣＡＲは、ＣＤ３ゼータエンドドメインを単独で、ＣＤ３ゼータエンドドメインをＣＤ２８もしくはＯＸ４０のいずれかのエンドドメインとともに、またはＣＤ２８エンドドメインとＯＸ４０およびＣＤ３ゼータのエンドドメインとを含んでもよい（図１）。
【０１３６】
エンドドメインは、ＩＣＯＳエンドドメイン、ＣＤ２７エンドドメイン、ＢＴＬＡエンドドメイン、ＣＤ３０エンドドメイン、ＧＩＴＲエンドドメイン、およびＨＶＥＭエンドドメインのうちの１つまたは複数を含み得る。
【０１３７】
エンドメイン（ｅｎｄｏｍａｉｎ）は、配列番号５〜１３に示される配列、または少なくとも８０％の配列同一性を有するそのバリアントを含み得る。
配列番号５−ＣＤ３  Ｚエンドドメイン
【化１４】
0006675417.tif 000018
配列番号６−ＣＤ２８およびＣＤ３ゼータエンドドメイン
【化１５】
0006675417.tif 000019
配列番号７−ＣＤ２８、ＯＸ４０、およびＣＤ３ゼータエンドドメイン
【化１６】
0006675417.tif 000020
配列番号８−ＩＣＯＳエンドドメイン
【化１７】
0006675417.tif 000021
配列番号９−ＣＤ２７エンドドメイン
【化１８】
0006675417.tif 000022
配列番号１０−ＢＴＬＡエンドドメイン
【化１９】
0006675417.tif 000023
配列番号１１−ＣＤ３０エンドドメイン
【化２０】
0006675417.tif 000024
配列番号１２−ＧＩＴＲエンドドメイン
【化２１】
0006675417.tif 000025
配列番号１３−ＨＶＥＭエンドドメイン
【化２２】
0006675417.tif 000026
【０１３８】
バリアントの配列は、配列番号５〜１３に対して少なくとも少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有し得るが、ただし、配列が、有効な細胞内シグナル伝達ドメインを提供することを条件とする。
【０１３９】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
一態様では、本発明は、本発明の第１の態様によるＣＡＲ形成ポリペプチド、ならびに（ｉ）コイルドコイルスペーサードメインと、（ｉｉ）膜貫通ドメインと、（ｉｉｉ）エンドドメインとを含む補助ポリペプチドを含むＣＡＲを提供し、ここで、補助ポリペプチドのコイルドコイルスペーサードメインは、ＣＡＲ形成ポリペプチドのコイルドコイルドメインと相互作用することができる。
【０１４０】
ＣＡＲ形成ポリペプチドは、抗原結合ドメインを提供し、したがって、抗原特異性を提供する。
【０１４１】
補助ポリペプチドは、所望されるシグナル伝達応答を生成するために使用することができる、追加のエンドドメインを提供する。これは、それぞれのシグナル伝達ドメインが、その他のシグナル伝達ドメインからの妨げを受けない（ｕｎｅｎｃｕｍｂｅｒｅｄ）ままであるため、複合シグナル伝達ドメインよりも有利である。加えて、これにより、それぞれのシグナル伝達ドメインが、膜に対してシグナル伝達に最適な近傍性で局在することが可能となる。
【０１４２】
ＣＡＲ形成ポリペプチドのエンドドメインは、少なくとも第１の細胞内シグナル伝達ドメインを含み得、補助ポリペプチドのエンドドメインは、少なくとも第２の細胞内シグナル伝達ドメインを含み得る。例えば、ＣＡＲ形成ポリペプチドおよび補助ポリペプチドのエンドドメインのうちの一方は、ＣＤ３ゼータエンドドメインを含み得、ＣＡＲおよび補助ポリペプチドの他方のエンドドメインは、４１ＢＢエンドドメインを含み得る。
【０１４３】
別の実施形態では、本発明は、（ｉ）コイルドコイルドメインと、（ｉｉ）膜貫通ドメインと、（ｉｉｉ）エンドドメインとを含む第２の補助ポリペプチドをさらに含む、本発明の第２の態様によるＣＡＲを提供し、ここで、第２の補助ポリペプチドのコイルドコイルドメインは、ＣＡＲ形成ポリペプチドおよび第１の補助ポリペプチドのコイルドコイルドメインと相互作用することができる。
【０１４４】
ＣＡＲ形成ポリペプチドのエンドドメインは、少なくとも第１の細胞内シグナル伝達ドメインを含み得、第１の補助ポリペプチドのエンドドメインは、少なくとも第２の細胞内シグナル伝達ドメインを含み得、第２の補助ポリペプチドのエンドドメインは、少なくとも第３の細胞内シグナル伝達ドメインを含み得る。
【０１４５】
例えば、ＣＡＲ、第１の補助ポリペプチド、および第２の補助ポリペプチドのエンドドメインは、それらの間に、ＣＤ３ゼータエンドドメイン、４１ＢＢエンドドメイン、およびＣＤ２８エンドドメインを含み得る。
【０１４６】
本発明はまた、本明細書に記載されるＣＡＲにおける使用に好適な補助ポリペプチドを提供する。
【０１４７】
多量体ＣＡＲ
本発明は、コイルドコイルスペーサードメイン間の相互作用に起因して複合体を形成する、複数の、本発明によるＣＡＲ形成ポリペプチドおよび必要に応じて補助ポリペプチド（複数可）を含む多量体ＣＡＲを提供する。
【０１４８】
多量体ＣＡＲは、例えば、三量体、四量体、五量体、六量体、または七量体であり得る。
各種のＣＡＲにおける補助タンパク質に対するＣＡＲ形成ポリペプチドの数を、以下の表にまとめる。
三量体ＣＡＲ：
【表３】
0006675417.tif 000027
【０１４９】
四量体ＣＡＲ：
【表４】
0006675417.tif 000028
【０１５０】
五量体ＣＡＲ：
【表５】
0006675417.tif 000029
【０１５１】
細胞内でのＣＡＲ形成ポリペプチドと補助ポリペプチドとの会合はランダムであり、そのため、上の表に示した選択肢は、ＣＡＲ形成ポリペプチドおよび補助ポリペプチドの数を正確に定義することができる、単一の多量体ＣＡＲに言及したものであることも、細胞上に発現した複合体ＣＡＲにおけるＣＡＲ形成ポリペプチドおよび補助ポリペプチドの平均数であることもある。補助ポリペプチド：ＣＡＲ形成ポリペプチドの比が高い系の場合、補助ポリペプチド単独でできたいくつかの複合体が、細胞表面に発現する可能性がある。これは、細胞表面に発現した複合体のうちの少なくともいくつかが、ＣＡＲ形成ポリペプチドを含む限りは、問題ではない。
【０１５２】
複数のＣＡＲ形成ポリペプチドおよび必要に応じて補助ポリペプチド（複数可）は、同じエンドドメインを含んでもよい。
【０１５３】
あるいは、複数のＣＡＲ形成ポリペプチドおよび必要に応じて補助ポリペプチド（複数可）は、異なるエンドドメインを含んでもよい。そうすることで、複数の異なるエンドドメインを、同時に活性化することができる。これは、それぞれのシグナル伝達ドメインが、その他のシグナル伝達ドメインからの妨げを受けないままであるため、複合シグナル伝達ドメインよりも有利である。加えて、これにより、それぞれのシグナル伝達ドメインが、膜に対してシグナル伝達に最適な近傍性で局在することが可能となる。
【０１５４】
多量体ＣＡＲが、複数の抗原結合ドメインを含む場合、これは、抗原結合の結合活性を増加させるであろう。多量体ＣＡＲは、免疫グロブリンの五量体または六量体配置を含むＩｇＭによる抗原結合を模倣し得る。
ＣＡＲシグナル伝達系
本発明はまた、
（ｉ）第１のヘテロ二量体化ドメインを含む、上に定義されるＣＡＲ形成ポリペプチドまたは補助ポリペプチドを含む多量体ＣＡＲと、
（ｉｉ）シグナル伝達ドメインおよび第２のヘテロ二量体化ドメインを含む細胞内シグナル伝達構成成分と
を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）シグナル伝達系であって、
第１および第２のヘテロ二量体化ドメイン間のヘテロ二量体化が、多量体ＣＡＲおよびシグナル伝達構成成分による機能性ＣＡＲ複合体の形成をもたらす、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）シグナル伝達系を提供する。
【０１５５】
それぞれのＣＡＲ形成ポリペプチド（複数可）または補助ポリペプチド（複数可）は、複数のヘテロ二量体化ドメインを含み得、その結果、単一のＣＡＲ形成ポリペプチドまたは補助ポリペプチドは、複数のシグナル伝達構成成分とヘテロ二量体化することができる。そのような系の例は、図１５に示されている。
【０１５６】
シグナル伝達ドメイン：抗原結合ドメインをなおさらに増加させるために、それぞれのシグナル伝達構成成分は、複数のシグナル伝達ドメインを含んでもよい。
【０１５７】
ヘテロ二量体化は、例えば、ＷＯ２０１６／０３０６９１に記載されるものといった系を使用して、小分子の存在下でのみ起こり得る。
【０１５８】
あるいは、ヘテロ二量体化は、自発的に生じ得る。第１および第２のヘテロ二量体化ドメインは、互いに自発的に二量体化することができる。ヘテロ二量体化は、二量体化の「誘導物質」として作用する任意の別個の分子を必要とすることなく、第１および第２のヘテロ二量体化ドメイン単独で生じる。
【０１５９】
本発明のシグナル伝達系は、特定のヘテロ二量体化ドメイン対の配置に限定されない。標的化構成成分（すなわち、多量体ＣＡＲ）は、シグナル伝達構成成分が、標的化構成成分およびシグナル伝達構成成分が細胞膜に共局在することを可能にする同起源の相補的ドメインを含む限りは、ヘテロ二量体化ドメイン対に由来するいずれかのドメインを含めばよい。
【０１６０】
本ＣＡＲ系において使用するためのヘテロ二量体化ドメインは、１：１の比で相互作用するものに限定されない。例えば、ヘテロ二量体化ドメインは、相互作用して、多量体（例えば、三量体または四量体）を形成することができる。ドメインは、単一の第１のヘテロ二量体化ドメインを、複数の（例えば、２つまたは３つの）第２のヘテロ二量体化ドメインと共局在させる様式で、相互作用し得る。本明細書では、複数のシグナル伝達構成成分が単一の多量体ＣＡＲと共局在し得るように、第２のヘテロ二量体化ドメインを含むシグナル伝達ドメインを有することが、有利であり得る。これは、例えば、抗原が多量体ＣＡＲに結合する際に高いシグナル伝達レベルが必要とされる場合に、有利であり得る。
【０１６１】
多量体ＣＡＲは、複数のシグナル伝達構成成分と相互作用するように、複数のヘテロ二量体化ドメインを含んでもよい。例えば、多量体ＣＡＲは、２つを上回るヘテロ二量体化ドメイン、例えば、３〜１０個のヘテロ二量体化ドメインを含み得る。図１５は、１つのＣＡＲ形成ポリペプチド／補助ポリペプチドにつき４個ずつ、２０個のヘテロ二量体化ドメインを含む多量体ＣＡＲを示す。
【０１６２】
便宜上、ヘテロ二量体化ドメインという用語は、本明細書において、多量体ＣＡＲとシグナル伝達構成成分との共局在を媒介するすべてのドメインに対して使用される。
【０１６３】
非常に様々な適切なヘテロ二量体化ドメインが当該技術分野で公知であり、その例は、本明細書に提供される。
【０１６４】
第１および第２のヘテロ二量体化ドメインは、ロイシンジッパーであってもよい。
【０１６５】
ロイシンジッパーは、当該技術分野で周知である（例えば、Hakoshima、Encyclopedia  of  Life  Sciences、２００５年を参照されたい）。ロイシンジッパーは、二量体化ドメインとして機能する、超二次構造体である。その存在により、平行アルファヘリックスに接着力が生じる。単一のロイシンジッパーは、およそ７残基間隔にある複数のロイシン残基からなり、これにより、疎水性領域が片側に並んだ両親媒性のアルファヘリックスが形成される。この疎水性領域が、二量体化のための領域を提供し、モチーフをひとまとめに「綴じる」ことが可能となる。ロイシンジッパーは、典型的に、長さが２０〜４０個のアミノ酸、例えば、およそ３０個のアミノ酸である。
【０１６６】
第１および／または第２のヘテロ二量体化ドメインは、配列番号４３または４４として示される配列を含み得る。第１のヘテロ二量体化ドメインが、配列番号４３として示される配列を含み得、第２のヘテロ二量体化ドメインが、配列番号４４として示される配列を含み得、または逆も同様である。
【化２３】
0006675417.tif 000030
【０１６７】
ある特定の実施形態では、第１および第２のヘテロ二量体化ドメインは、酸性（例えば、配列番号４３）または塩基性（例えば、配列番号４４）のロイシンジッパーであり得る。具体的には、第１のヘテロ二量体化ドメインが酸性ロイシンジッパーである場合、第２のヘテロ二量体化は、塩基性ロイシンジッパーであり、逆もまた同様である。
【０１６８】
第１および第２のヘテロ二量体化ドメインは、二量体化およびドッキングドメイン（ＤＤＤ１）ならびにアンカードメイン（ＡＤ１）であり得る。これらのドメインおよびそれらの間の相互作用は、当該技術分野で公知である（Rossiら、PNAS、２００６年、１０３巻（１８号）、６８４１〜６８４６頁）。
【０１６９】
ＤＤＤ１は、プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）に由来する短いアルファヘリックス構造体である。ＡＤ１は、Ａキナーゼアンカータンパク質（ＡＫＡＰ）に由来する短いアルファヘリックス構造体である。
【０１７０】
ＤＤＤ１ドメインは、配列番号４５として示される配列を含み得る。
【化２４】
0006675417.tif 000031
ＡＤ１ドメインは、配列番号４６として示される配列を含み得る。
【化２５】
0006675417.tif 000032
【０１７１】
ＤＤＤ１／ＡＤ１の相互作用は、三量体性であるため、ＣＡＲエンドドメインに存在するＡＤ１ドメインは、ＤＤＤ１ドメインを含む３つのシグナル伝達ドメインをリクルートするであろう。したがって、特定の実施形態では、ＣＡＲエンドドメインはＡＤ１ドメインを含み、細胞内シグナル伝達構成成分はＤＤＤ１ドメインを含む。
【０１７２】
ヘテロ二量体化ドメインは、細菌リボヌクレアーゼ（Ｂａｒｎａｓｅ）およびＢａｒｎｓｔａｒペプチドに由来し得る。
【０１７３】
Ｂａｒｎａｓｅは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓリボヌクレアーゼタンパク質である。これは、１１０個のアミノ酸で構成される。Ｂａｒｎｓｔａｒは、Ｂａｒｎａｓｅのヌクレアーゼ活性を阻害するように機能し、したがって、非常に高い親和性でＢａｒｎｓｔａｒに結合する（結合速度（ｏｎ−ｒａｔｅ）１０８ｓ-１Ｍ-１）。
【０１７４】
ヘテロ二量体化ドメインは、ヒト膵臓ＲＮａｓｅおよびＳペプチドに由来してもよい。
【０１７５】
ヒト膵臓ＲＮａｓｅは、ピリミジン特異的エンドヌクレアーゼである。Ｓペプチドは、ＲＮａｓｅ  Ａの酵素的に不活性なタンパク質分解断片であり、ＲＮＡ結合部位を欠く。
【０１７６】
本発明はまた、同起源のヘテロ二量体化ドメインと二量体化する能力を保持する、本明細書に記載されるヘテロ二量体化配列のバリアントを包含する。ヘテロ二量体化ドメインは、配列番号４３、４４、４５、または４６に示される配列と比較して、５個、４個、３個、２個、もしくは１個のアミノ酸変異（挿入、置換、もしくは付加）を有するか、または少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列性同一性を有する、バリアントであり得るが、ただし、それらが、依然としてＣＡＲとシグナル伝達構成成分との間でヘテロ二量体化をもたらすことを条件とする。
【０１７７】
核酸
本発明はさらに、本発明の第１の態様によるＣＡＲ形成ポリペプチドおよび／または本発明の第１の態様に定義される補助ポリペプチドをコードする核酸を提供する。
【０１７８】
本明細書に使用されるとき、「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、および「核酸」という用語は、互いに同義であることが意図される。
【０１７９】
当業者であれば、多数の異なるポリヌクレオチドおよび核酸が、遺伝子コードの縮重の結果として、同じポリペプチドをコードし得ることを理解するであろう。加えて、当業者であれば、日常的な技法を使用して、本明細書に記載されるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド配列に影響を及ぼすことなく、ポリペプチドが発現される任意の特定の宿主生物のコドン使用頻度を反映するように、ヌクレオチド置換を行うことができることが、理解する。
【０１８０】
本発明による核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含み得る。これらは、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。これらはまた、それらの中に合成または修飾ヌクレオチドを含んだポリヌクレオチドであってもよい。オリゴヌクレオチドに対するいくつかの異なる種類の修飾が、当該技術分野で公知である。これらには、メチルホスホネートおよびホスホロチオエート骨格、分子の３’および／または５’末端へのアクリジンまたはポリリジン鎖の付加が含まれる。本明細書に記載される使用の目的で、ポリヌクレオチドが、当該技術分野で利用可能な任意の方法によって修飾されてもよいことを理解されたい。そのような修飾は、目的のポリヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｖｏ活性または生存期間を強化するために行われ得る。
【０１８１】
ヌクレオチド配列に関連して「バリアント」、「相同体」、または「誘導体」という用語には、配列から、または配列への、１つ（または複数）の核酸の任意の置換、変更、修飾、置き換え、欠失、または付加が含まれる。
【０１８２】
本発明はまた、本発明の第２の態様によるＣＡＲにおいて使用するのに好適な補助ポリペプチドをコードする核酸配列を提供する。
【０１８３】
核酸構築物
本発明はまた、複数の核酸配列をコードする核酸構築物を提供する。
【０１８４】
例えば、核酸構築物は、２つまたはそれ超の本発明の第１の態様に定義されるＣＡＲ形成ポリペプチドをコードし得る。
【０１８５】
この実施形態では、核酸構築物は、少なくとも２つの核酸配列：
（ｉ）第１のＣＡＲ形成ポリペプチドをコードする第１の核酸配列、および
（ｉｉ）第２のＣＡＲ形成ポリペプチドをコードする第２の核酸配列
を含み得る。
【０１８６】
核酸構築物は、少なくとも１つの本発明の第１の態様に定義されるＣＡＲ形成ポリペプチドおよび少なくとも１つの上に定義される補助ポリペプチドをコードし得る。
【０１８７】
この実施形態では、核酸構築物は、少なくとも２つの核酸配列：
（ｉ）ＣＡＲ形成ポリペプチドをコードする第１の核酸配列、および
（ｉｉ）補助ポリペプチドをコードする第２の核酸配列
を含み得る。
【０１８８】
核酸構築物は、
（ｉ）本発明の第２の態様に定義される多量体ＣＡＲを形成する少なくとも１つのＣＡＲ形成ポリペプチド、および
（ｉｉ）上に定義される細胞内シグナル伝達構成成分
をコードし得る。
【０１８９】
この実施形態では、核酸構築物は、少なくとも２つの核酸配列：
（ｉ）ＣＡＲ形成ポリペプチドをコードする第１の核酸配列、および
（ｉｉ）細胞内シグナル伝達構成成分をコードする第２の核酸配列
を含み得る。
【０１９０】
核酸構築物は、補助ポリペプチドをコードする第３の核酸配列を含み得る。
【０１９１】
核酸構築物は、したがって、切断部位（複数可）によって接続された２つまたはそれ超のポリペプチド（複数可）を生成し得る。切断部位は、新生翻訳産物が生成されるときに、任意の外部切断活性を必要とすることなく、個々のポリペプチドに即座に切断されるように、自己切断型であり得る。
【０１９２】
切断部位は、複数のＣＡＲおよび／または補助ポリペプチドを含むポリペプチドが分離することを可能にする、任意の配列であり得る。
【０１９３】
「切断」という用語が、便宜上本明細書において使用されているが、切断部位は、ペプチドが古典的な切断以外の機構によって個々の実体に分離することをもたらし得る。例えば、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａ自己切断型ペプチド（以下を参照されたい）について、「切断」活性：宿主細胞のプロテイナーゼによるタンパク質分解、自己タンパク質分解または翻訳作用を説明する様々なモデルが提案されている（Donnellyら（２００１年）、J.  Gen.  Virol.  ８２巻：１０２７〜１０４１頁）。このような「切断」の正確な機構は、切断部位が、タンパク質をコードする核酸配列の間に配置されたときに、タンパク質を別個の実体として発現させる限りは、本発明の目的にとって重要ではない。
【０１９４】
切断部位は、フューリン切断部位であり得る。
【０１９５】
フューリンは、スブチリシン様プロタンパク質変換酵素ファミリーに属する酵素である。このファミリーのメンバーは、潜在性前駆体タンパク質をプロセシングしてそれらの生物学的に活性な生成物にするプロタンパク質変換酵素である。フューリンは、前駆体タンパク質をそれらの対となる塩基性アミノ酸プロセシング部位で効率的に切断することができるカルシウム依存性セリンエンドプロテアーゼである。フューリン基質の例としては、プロ副甲状腺ホルモン、形質転換成長因子ベータ１前駆体、プロアルブミン、プロベータセクレターゼ、膜型マトリックスメタロプロテイナーゼ１、プロ神経成長因子のベータサブユニット、およびフォンヴィレブラント因子が挙げられる。フューリンは、塩基性アミノ酸の標的配列（標準的に、Ａｒｇ−Ｘ−（Ａｒｇ／Ｌｙｓ）−Ａｒｇ’）のすぐ下流でタンパク質を切断し、ゴルジ体に豊富である。
【０１９６】
切断部位は、タバコエッチ病ウイルス（ＴＥＶ）切断部位であり得る。
【０１９７】
ＴＥＶプロテアーゼは、高度に配列特異的なシステインプロテアーゼであり、これはキモトリプシン様プロテアーゼである。これは、その標的切断部位に非常に特異的であり、したがって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの両方で、融合タンパク質の制御切断に使用されることが多い。コンセンサスＴＥＶ切断部位は、ＥＮＬＹＦＱ＼Ｓである（ここで、「＼」は、切断されるペプチド結合を示す）。哺乳動物細胞、例えばヒト細胞は、ＴＥＶプロテアーゼを発現しない。したがって、本核酸構築物がＴＥＶ切断部位を含み、哺乳動物細胞に発現する実施形態では、外因性ＴＥＶプロテアーゼはまた、哺乳動物細胞に発現するはずである。
【０１９８】
切断部位は、自己切断型ペプチドをコードし得る。
【０１９９】
「自己切断型ペプチド」は、ポリペプチドおよび自己切断型ペプチドを含む新生生成物が生成されるときに、生成物が、任意の外部切断活性を必要とすることなく、即座に「切断」または分離されて、異なる別個の第１および第２のポリペプチドになるように機能するペプチドを指す。
【０２００】
自己切断型ペプチドは、アフトウイルスまたはカルジオウイルスに由来する２Ａ自己切断型ペプチドであり得る。アフトウイルスおよびカルジオウイルスの一次２Ａ／２Ｂ切断は、それ自体のＣ末端での２Ａ「切断」によって媒介される。口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）およびウマ鼻炎Ａウイルスなどのアフトウイルスの場合、２Ａ領域は、約１８個のアミノ酸の短い区画であり、これは、タンパク質２ＢのＮ末端残基（保存されたプロリン残基）とともに、それ自体のＣ末端での「切断」を媒介することができる自発的なエレメントを表す（上述のDonellyら（２００１年））。
【０２０１】
「２Ａ様」配列が、アフトウイルスまたはカルジオウイルス以外のピコルナウイルス、「ピコルナウイルス様」の昆虫ウイルス、Ｃ型ロタウイルス、ならびにＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｓｐｐおよび細菌配列内の反復配列に見出されている（上述のDonnellyら（２００１年））。切断部位は、これらの２Ａ様配列、例えば、
【化２６】
0006675417.tif 000033
のうちの１つを含み得る。
【０２０２】
切断部位は、配列番号１９（ＲＡＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ）に示される２Ａ様配列を含み得る。
【０２０３】
本発明はまた、本発明の第１の態様によるＣＡＲ形成ポリペプチドおよび／または本発明の第２の態様によるＣＡＲを生成するのに好適な補助ポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸配列（複数可）を含むキットを提供する。
【０２０４】
ベクター
本発明はまた、ベクター、または上に定義される１つまたは複数の核酸配列（複数可）または核酸構築物を含む、ベクターのキットを提供する。そのようなベクターは、宿主細胞が本発明の第１の態様によるＣＡＲ形成ポリペプチドもしくは補助ペプチドおよび／または本発明の第２の態様によるＣＡＲを発現するように、核酸配列（複数可）を宿主細胞に導入するために使用することができる。
【０２０５】
ベクターは、例えば、プラスミドもしくはウイルスベクター、例えば、レトロウイルスベクターもしくはレンチウイルスベクター、またはトランスポゾンに基づくベクターもしくは合成ｍＲＮＡであり得る。
【０２０６】
ベクターは、Ｔ細胞またはＮＫ細胞などの免疫細胞にトランスフェクトまたは形質導入することができてもよい。
【０２０７】
細胞
本発明はまた、免疫細胞などの細胞であって、上述のＣＡＲ形成ポリペプチド、ＣＡＲ、またはＣＡＲシグナル伝達系を含む細胞に関する。
【０２０８】
細胞は、本発明の核酸、核酸構築物、またはベクターを含み得る。
【０２０９】
細胞は、免疫細胞、特に、細胞溶解性免疫細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞であり得る。
【０２１０】
Ｔ細胞またはＴリンパ球は、細胞媒介型免疫において中心的な役割を果たす、リンパ球の一種である。それらは、細胞表面におけるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の存在により、Ｂ細胞およびナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）などの他のリンパ球とは区別され得る。以下に要約されるように、様々な種類のＴ細胞が存在する。
【０２１１】
ヘルパーＴヘルパー細胞（ＴＨ細胞）は、Ｂ細胞の形質細胞およびメモリーＢ細胞への成熟、ならびに細胞傷害性Ｔ細胞およびマクロファージの活性化を含む免疫学的プロセスにおいて、他の白血球を補助する。ＴＨ細胞は、それらの表面にＣＤ４を発現する。ＴＨ細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面上のＭＨＣクラスＩＩ分子によって、それらにペプチド抗原が提示されると、活性化される。これらの細胞は、ＴＨ１、ＴＨ２、ＴＨ３、ＴＨ１７、Ｔｈ９、またはＴＦＨを含む、複数のサブタイプのうちの１つに分化し得、これらは、異なる種類の免疫応答を促進する異なるサイトカインを分泌する。
【０２１２】
細胞溶解性Ｔ細胞（ＴＣ細胞またはＣＴＬ）は、ウイルス感染した細胞および腫瘍細胞を破壊し、また移植片拒絶にも関係している。ＣＴＬは、それらの表面にＣＤ８を発現する。これらの細胞は、すべての有核細胞の表面に存在するＭＨＣクラスＩと関連する抗原に結合することによって、それらの標的を認識する。制御性Ｔ細胞によって分泌されるＩＬ−１０、アデノシン、および他の分子を通じて、ＣＤ８＋細胞は、不活性化されて免疫不応性状態となり得、これにより、実験的自己免疫性脳脊髄炎などの自己免疫疾患が予防される。
【０２１３】
メモリーＴ細胞は、感染が解消した後に長期間存続する、抗原特異的Ｔ細胞のサブセットである。それらは、同起源の抗原に再び曝露されると急速に増殖して多数のエフェクターＴ細胞となり、したがって、過去の感染に対する「記憶」を免疫系にもたらす。メモリーＴ細胞は、セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ細胞）、および２種類のエフェクターメモリーＴ細胞（ＴＥＭ細胞およびＴＥＭＲＡ細胞）の３つのサブタイプを含む。メモリー細胞は、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋のいずれかであり得る。メモリーＴ細胞は、典型的に、細胞表面タンパク質ＣＤ４５ＲＯを発現する。
【０２１４】
以前はサプレッサーＴ細胞として知られていた制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）は、免疫寛容の維持にとって非常に重要である。それらの主要な役割は、免疫反応の終盤にＴ細胞に媒介される免疫を停止させること、および胸腺における負の選択のプロセスをすり抜ける自己反応性Ｔ細胞を抑制することである。
【０２１５】
内在性Ｔｒｅｇ細胞（ｎａｔｕｒａｌｌｙ  ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ  Ｔｒｅｇ  ｃｅｌｌ）および適応Ｔｒｅｇ細胞の２つの主要なクラスのＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞が、記載されている。
【０２１６】
内在性Ｔｒｅｇ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇ細胞としても知られている）は、胸腺において生じ、発生するＴ細胞と、ＴＳＬＰで活性化されている骨髄（ＣＤ１１ｃ＋）および形質細胞（ＣＤ１２３＋）樹状細胞との両方との間の相互作用と関連付けられている。内在性Ｔｒｅｇ細胞は、ＦｏｘＰ３と称される細胞内分子の存在によって、他のＴ細胞と区別することができる。ＦＯＸＰ３遺伝子の変異は、制御性Ｔ細胞の発生を妨げ、死に至る自己免疫疾患ＩＰＥＸを引き起こし得る。
【０２１７】
適応Ｔｒｅｇ細胞（Ｔｒ１細胞またはＴｈ３細胞としても知られている）は、通常の免疫応答の際に発生し得る。
【０２１８】
細胞は、ナチュラルキラー細胞（またはＮＫ細胞）であり得る。ＮＫ細胞は、先天的な免疫系の一部を形成する。ＮＫ細胞は、ＭＨＣから独立した様式で、ウイルス感染した細胞からの先天的なシグナルに対する急速な応答をもたらす。
【０２１９】
ＮＫ細胞（自然リンパ系細胞のグループに属する）は、大きな顆粒性リンパ球（ＬＧＬ）として定義され、ＢおよびＴリンパ球を生じる一般的なリンパ系前駆体から分化する３種類目の細胞を構成する。ＮＫ細胞は、骨髄、リンパ節、脾臓、扁桃腺、および胸腺において分化および成熟することが公知であり、そこで、それらが、次いで、循環に入る。
【０２２０】
本発明のＣＡＲ細胞は、上述の細胞の種類のうちのいずれかであり得る。
【０２２１】
本発明によるＣＡＲまたはその構成成分を発現するＴ細胞またはＮＫ細胞は、患者自身の末梢血（第１団）、またはドナー末梢血由来の造血幹細胞移植片の環境において（第２団）、または無関係のドナーに由来する末梢血（第３団）のいずれかから、ｅｘ  ｖｉｖｏで作製することができる。
【０２２２】
あるいは、本発明によるＣＡＲまたはその構成成分を発現するＴ細胞またはＮＫ細胞は、誘導性前駆細胞または胚性前駆細胞のＴ細胞またはＮＫ細胞へのｅｘ  ｖｉｖｏ分化に由来してもよい。あるいは、溶解機能を保持し、治療薬として作用し得る不死化Ｔ細胞株を使用してもよい。
【０２２３】
これらの実施形態すべてにおいて、ＣＡＲ細胞は、ウイルスベクターを用いる形質導入、ＤＮＡまたはＲＮＡを用いるトランスフェクションを含む、多数の手段のうちの１つによって、本発明またはその構成成分（複数可）のＣＡＲもしくは１つの構成成分をコードするＤＮＡまたはＲＮＡを導入することによって生成される。
【０２２４】
本発明のＣＡＲ細胞は、被験体に由来するｅｘ  ｖｉｖｏ  Ｔ細胞またはＮＫ細胞であり得る。Ｔ細胞またはＮＫ細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）試料に由来し得る。Ｔ細胞またはＮＫ細胞は、例えば抗ＣＤ３モノクローナル抗体での処理によって本発明のＣＡＲまたはＣＡＲの構成成分（複数可）を提供する分子をコードする核酸を形質導入する前に、活性化および／または増殖し得る。
【０２２５】
本発明のＴ細胞またはＮＫ細胞は、
（ｉ）被験体または上に列挙される他の供給源からＴ細胞またはＮＫ細胞を含有する試料を単離すること、および
（ｉｉ）上述の１つまたは複数の核酸配列（複数可）または核酸構築物（複数可）をＴ細胞またはＮＫ細胞に形質導入またはトランスフェクションすること
によって、作製することができる。
【０２２６】
Ｔ細胞またはＮＫ細胞は、次いで、精製、例えば、抗原結合ポリペプチドの抗原結合ドメインの発現に基づいて、選択され得る。
【０２２７】
医薬組成物
本発明はまた、本発明によるＣＡＲまたはその構成成分を発現する複数の細胞を含有する、医薬組成物に関する。
【０２２８】
医薬組成物は、薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤をさらに含んでもよい。医薬組成物は、必要に応じて、１つまたは複数のさらなる薬学的に活性なポリペプチドおよび／または化合物を含んでもよい。そのような製剤は、例えば、静脈内注入に好適な形態であり得る。
【０２２９】
治療の方法
本発明は、疾患を治療および／または予防するための方法であって、（例えば、上述の医薬組成物中の）本発明の細胞を被験体に投与するステップを含む方法を提供する。
【０２３０】
疾患を治療するための方法は、本発明の細胞の治療的使用に関する。本明細書において、細胞は、疾患と関連する少なくとも１つの症状を緩和、低減、もしくは改善するため、および／または疾患の進行を遅延、低減、もしくは遮断するために、既存の疾患または状態を有する被験体に投与され得る。
【０２３１】
疾患を予防するための方法は、本発明の細胞の予防的使用に関する。本明細書において、このような細胞は、疾患の原因を予防もしくは減弱させるため、または疾患と関連する少なくとも１つの症状の発症を低減もしくは予防するために、まだ疾患を罹患していない被験体および／または疾患の症状をなんら示していない被験体に投与され得る。被験体は、疾患の素因を有し得るか、または疾患を発症する危険性にあると考えられ得る。
本方法は、
（ｉ）Ｔ細胞またはＮＫ細胞を含有する試料を単離するステップ、
（ｉｉ）そのような細胞に、本発明の核酸配列、核酸構築物、またはベクターを形質導入またはトランスフェクションするステップ、
（ｉｉｉ）（ｉｉ）由来の細胞を被験体に投与するステップ
を含み得る。
【０２３２】
Ｔ細胞またはＮＫ細胞を含有する試料は、被験体または他の供給源から、例えば上述のように、単離することができる。Ｔ細胞またはＮＫ細胞は、被験体自身の末梢血（第１団）、またはドナー末梢血由来の造血幹細胞移植片の環境において（第２団）、または無関係のドナーに由来する末梢血（第３団）から、単離することができる。
【０２３３】
本発明は、疾患の治療および／または予防において使用するための、本発明のＣＡＲ細胞を提供する。
【０２３４】
本発明はまた、疾患の治療および／または予防のための医薬品の製造における、本発明のＣＡＲ細胞の使用に関する。
【０２３５】
本発明の方法によって治療および／または予防される疾患は、がん疾患、例えば、膀胱がん、乳がん、結腸がん、子宮内膜がん、腎臓がん（腎がん）、白血病、肺がん、黒色腫、非ホジキンリンパ腫、膵臓がん、前立腺がん、および甲状腺がんであり得る。
【０２３６】
本発明のＣＡＲ細胞は、標的細胞、例えば、がん細胞を殺滅させることができる可能性がある。標的細胞は、ＴＡＡの発現、例えば、表１に上述のＴＡＡの発現によって、認識可能であり得る。
【０２３７】
本発明のＣＡＲ細胞は、低密度のＴＡＡを発現する標的細胞、例えば、がん細胞を殺滅させることができる可能性がある。ある特定のがんにおいて低密度で発現することが知られているＴＡＡの例としては、ＣＬＬにおけるＲＯＲ１、黒色腫におけるＴｙｐｒ−１、および骨髄腫におけるＢＣＭＡが挙げられるがこれらに限定されない。
【０２３８】
本発明のＣＡＲ細胞および医薬組成物は、上述の疾患の治療および／または予防において使用するためのものであり得る。
【０２３９】
本発明のＣＡＲ細胞および医薬組成物は、上述の方法のいずれかにおいて使用するためのものであり得る。
【０２４０】
本発明を、これより、実施例を用いてさらに説明するが、これらの実施例は、当業者が本発明を実施するのを補助するように機能することを意図し、決して本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【実施例】
【０２４１】
（実施例１）
細胞表面におけるＣＯＭＰ  ＣＡＲの発現
マウスＴ細胞株に、抗ＣＤ３３  ＣＯＭＰ  ＣＡＲ（アミノ酸配列は図５ｃに示され、核酸配列は図５ｄに示される）または抗ＣＤ３３  ＩｇＧ１  ＣＡＲを形質導入した。
これらの細胞を、次いで、マウスＦｃ  ＩｇＧ２ａに融合したキメラ可溶性ＣＤ３３で染色した後、抗マウスＩｇＧ  ＰＥで二次染色した（図６ａ）。
【０２４２】
マウスＴ細胞株に、抗ＲＯＲ−１  ＣＯＭＰ  ＣＡＲ  ＣＡＲ（アミノ酸配列は図５ｃに示され、核酸配列は図５ｄに示される）または抗ＲＯＲ−１  ＩｇＧ１  ＣＡＲを形質導入した。
【０２４３】
これらの細胞を、次いで、可溶性ＨｉｓタグＲＯＲ−１で染色した後、抗Ｈｉｓ−ビオチンで二次染色し、続いてストレプトアビジン−ＡＰＣで三次染色した（図６ｂ）。
【０２４４】
４つすべてのＣＡＲは、細胞表面において首尾よく発現した。これらのデータはまた、ＣＡＲ結合ドメインが、ＣＯＭＰスペーサーへの結合時にリガンドの結合を損なわないように配向していることを実証する。
（実施例２）
固定化リガンドによるＣＯＭＰ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の刺激
【０２４５】
固定化リガンドでコーティングしたビーズを伴うＴ細胞を使用して、ＣＯＭＰ  ＲＯＲ−１  ＣＡＲ  Ｔ細胞を刺激した。これを達成するために、可溶性ＨｉｓタグＲＯＲ−１を構築し、発現させた。次いで、これらの可溶性リガンドを含有する上清を、固定数の抗Ｈｉｓビーズとともに、様々な濃度でインキュベートした。続いて、ビーズを洗浄して、未結合のリガンドを除去し、これらのビーズを使用して、ＣＯＭＰ  ＣＡＲプラットフォームまたはＩｇＧスペーサーを有する同等のＣＡＲのいずれかを形質導入したＴ細胞を刺激した。
【０２４６】
形質導入を行ったマウスＴ細胞を、異なる濃度の可溶性ＨｉｓタグＲＯＲ−１上清で事前コーティングした抗Ｈｉｓビーズとともに共培養した。共培養上清中のＩＬ−２の量を、１６〜２４時間後にＥＬＩＳＡによって分析した（図７）。
（実施例３）
ＲＯＲ−１標的細胞の発現レベル
【０２４７】
ＳＫＷ細胞株は、天然に、低いレベルのＲＯＲ−１を発現する。これらの細胞に、ＲＯＲ−１を形質導入して、発現レベルを高めた。これらの細胞を、抗ＲＯＲ−１  ＡＰＣで染色し、未染色細胞と比較した（図８）。
（実施例４）
ＲＯＲ−１陽性ＳＫＷ細胞による抗ＲＯＲ−１  ＣＯＭＰ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の刺激
【０２４８】
形質導入を行ったマウスＴ細胞（実施例１および２に記載）を、ＲＯＲ−１リガンドを低密度または高密度のいずれかで発現するＳＫＷ標的細胞とともに共培養した。Ｔ細胞を一定数に維持し、標的細胞は変化させた。共培養上清中のＩＬ−２の量を、１６〜２４時間後にＥＬＩＳＡによって分析した（図９）。
【０２４９】
抗ＲＯＲ−１  ＣＯＭＰ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を、低密度のＲＯＲ−１リガンドを発現するＳＫＷ標的細胞と共培養した場合に、抗ＲＯＲ−１  ＩｇＧ１  ＣＡＲと比較してより高いレベルのＩＬ−２を検出した。
【０２５０】
いずれのＣＡＲも、高ＳＫＷの標的細胞で活性化応答を開始することができた。
（実施例５）
ＣＯＭＰスペーサーの切断
【０２５１】
ＣＯＭＰスペーサーを有するａＲＯＲ−１  ＣＡＲを、その本来の長さである４５個のアミノ酸から切断した。これらのＣＯＭＰ切断型構築物を、２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした後、ＣＡＲ表面発現に関してｓＲＯＲ−１  Ｈｉｓで染色し、続いて抗Ｈｉｓ−ビオチン、続いてストレプトアビジン−ＰＥ．Ｃｙ７で染色した。これらの細胞を、ＲＱＲ８マーカーに関して抗ＣＤ３４−ＦＩＴＣ抗体でも染色した。これらのＦＡＣＳプロットは、ＣＯＭＰスペーサーの様々な切断形態の安定な表面発現を示し、コイルドコイルスペーサーの長さを一度に１個から数個のアミノ酸で変化させる能力を示す（図１１）。
（実施例６）
多量体コイルドコイルスペーサーＣＡＲと古典的二量体ＣＡＲとの比較
【０２５２】
本発明のＣＡＲのコイルドコイルスペーサーの機能を従来のＣＡＲと比較するために、同じ抗原結合ドメインおよび同等のエンドドメインを用いるが、異なるスペーサーを用いるため、完全に異なるＣＡＲ構造体となる一連の構築物を作製した。様々なＣＡＲを図１２に示す。
【０２５３】
すべてのＣＡＲは、ｆｍｃ６３に基づく抗ＣＤ１９抗原結合ドメインならびに４１ＢＢおよびＣＤ３ゼータエンドドメインを含む「第２世代」のエンドドメインを含んでいた。以下の形式を試験した：
ａ）抗ＣＤ１９抗原結合ドメイン、コイルドコイルスペーサードメイン、およびＣＤ３ゼータエンドドメインを有するポリペプチド、ならびにコイルドコイルスペーサードメインおよび４１ＢＢエンドドメインを有する補助ポリペプチドを含むヘテロ多量体ＣＡＲ（図１２Ａ）、
ｂ）抗ＣＤ１９抗原結合ドメイン、コイルドコイルスペーサードメイン、および組合せ４１ＢＢ／ＣＤ３ゼータエンドドメインを含むポリペプチドからなるホモ多量体ＣＡＲ（図１２Ｂ）、ならびに
ｃ）抗ＣＤ１９抗原結合ドメイン、ＣＤ８ストークスペーサードメイン、および組合せ４１ＢＢ／ＣＤ３ゼータエンドドメインを有する２つのポリペプチドを含む、古典的な第２世代のホモ二量体ＣＡＲ（図１２Ｃ）。
図１２に示されるＣＡＲをコードするベクターであった。
【０２５４】
様々なＣＡＲ構造体をコードするＲＤ１１４疑似タイプのレトロウイルスを生成した。
【０２５５】
Ｔ細胞からＣＤ５６発現細胞を枯渇させ、同じ数のＳｕｐＴ１とともに共培養して、１：１のエフェクター：標的の比を達成した。フローサイトメトリーによる分析の前に、同じ数の蛍光計数ビーズを各共培養物に添加して、細胞数の標準化を可能にし、取り込み量における任意の差の把握を可能にした。ＣＡＲに媒介される細胞傷害性を、フローサイトメトリーによって次のように評価した。Ｔ細胞を、ＦＣＳと対比してＣＤ３の発現に関して染色することによって腫瘍細胞から区別し、腫瘍細胞を、ＣＤ３の欠如および高いＦＣＳシグナルによって識別した。生存率を、死細胞排除色素７−ＡＡＤで染色し、色素を取り込まなかったものを生存細胞として定義することによって、評価した。生存腫瘍細胞を、各共培養条件に関して列挙し、生存腫瘍細胞の数を、形質導入を行っていないＰＢＭＣを用いて行った共培養物から回収したもの（１００％）に対して標準化することによって、細胞傷害性の割合を計算した。標的細胞の殺滅を、２日目および５日目に評価した。
【０２５６】
結果を、図１３（２日目）および図１４（５日目）に示す。２日後に、３つのＣＡＲ構造体が、ＣＤ１９＋ＳｕｐＴ１標的細胞の殺滅を示した。２つの多量体ＣＡＲは、同等な古典的ホモ二量体ＣＡＲよりも優れた殺滅を示した。ホモ多量体ＣＡＲ（Ｆｍｃ６３−ＣＯＭＰ−４１ＢＢｚ）が、最も高い殺滅を示した。５日目に、古典的ホモ二量体ＣＡＲ（Ｆｍｃ６３−ＣＤ８ＳＴＫ−４１ＢＢｚ）では一部の残存標的細胞が残っていたが、いずれの多量体ＣＡＲでも、生存標的細胞は事実上検出不可能であった。
（実施例７）
コイルドコイル超ＣＡＲの生成および試験
【０２５７】
ＣＡＲ技術の主な課題は、標的細胞上に低密度で存在する抗原の検出である。この問題に対処するために、本発明者らは、各抗原相互作用のために複数のＴＣＲゼータ鎖をリクルートするコイルドコイルスペーサー形式に基づく「超ＣＡＲ」を設計した。
【０２５８】
コイルドコイルＣＡＲ構造体を形成するポリペプチドの細胞内部分は、複数のヘテロ二量体化ドメインを含み、そのそれぞれが、１つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインを含む１つまたは複数の細胞内シグナル伝達構成成分と相互作用することができる。
【０２５９】
図１５に示される構築物において、細胞内二量体化は、二量体化およびドッキングドメイン（ＤＤＤ１）とアンカードメイン（ＡＤ１）との間のものである。コイルドコイルスペーサーＣＡＲを形成するそれぞれのポリペプチドは、４つの別個のＡＤ１ドメインを含む。５つのポリペプチドを含むコイルドコイルＣＡＲは、したがって、２０個のＡＤ１ドメインを含むことになる。
【０２６０】
コイルドコイル超ＣＡＲを、ＴＣＲゼータシグナル伝達ドメインのコピーを有さないか、または２つのＴＣＲゼータシグナル伝達ドメインのコピーを有する、異なるシグナル伝達構成成分と組合せて試験した。ＤＤＤ１は２：１の化学量論でＡＤ１に結合するため、これらのシグナル伝達ドメインは、５つのポリペプチドコイルドコイルＣＡＲ標的構成成分それぞれに対して、それぞれ、０および８０個のＴＣＲゼータドメインのコピーを提供する。
【０２６１】
対照として、同じ抗原結合ドメインを有する古典的なホモ二量体抗ＣＤ１９  ＣＡＲを使用した（図１５、ａＣＤ１９−ＩｇＧＦｃ−Ｚ）。
【０２６２】
マウスＴ細胞株ＢＷ５に、各ＣＡＲを形質導入し、低、中、および高の異なる濃度で、同起源の抗原（ＣＤ１９）を発現するＳｕｐＴ１細胞でチャレンジを行った。これらのＳｕｐＴ１細胞は、最適以下のシグナルペプチドの使用、および／またはＴｙｒｐ−１（膜の近傍に挿入）もしくはアデノウイルス由来の糖タンパク質Ｅ３−１９ｋ（Ｃ末端に挿入）に由来する細胞質保持モチーフの導入により、異なるレベルでＣＤ１９を発現するように操作した。ＩＬ−２放出を、抗原チャレンジ後に測定した。
【０２６３】
結果を、図１６に示す。５量体コイルドコイルＣＡＲ１つ当たり８０個のＴＣＲゼータのコピーを含むコイルドコイル超ＣＡＲが、１つの分子当たり２つのＴＣＲゼータのコピーを含む同等な古典的ＣＡＲよりもはるかに高い、抗原に対する応答をもたらしたことがわかった。
【０２６４】
上述の本明細書に言及されたすべての刊行物は、参照により本明細書に組み込まれる。本発明の範囲および趣旨を逸脱することなく、記載された本発明の方法および系の様々な修飾形態および変更形態が、当業者には明らかであろう。本発明は、特定の好ましい実施形態と関連して記載されているが、特許請求される本発明は、そのような特定の実施形態に不当に限定されるべきではないことが理解されるはずである。実際に、分子生物学、細胞生物学、または関連する分野の当業者には明白である本発明を実施するための記載された様式の様々な修飾形態は、以下の特許請求の範囲内であることが意図される。
【図１】
0006675417.tif 000034
【図２】
0006675417.tif 000035
【図３】
0006675417.tif 000036
【図４】
0006675417.tif 000037
【図５−１】
0006675417.tif 000038
【図５−２】
0006675417.tif 000039
【図５−３】
0006675417.tif 000040
【図６】
0006675417.tif 000041
【図７】
0006675417.tif 000042
【図８】
0006675417.tif 000043
【図９】
0006675417.tif 000044
【図１０−１】
0006675417.tif 000045
【図１０−２】
0006675417.tif 000046
【図１０−３】
0006675417.tif 000047
【図１１】
0006675417.tif 000048
【図１２】
0006675417.tif 000049
【図１３】
0006675417.tif 000050
【図１４】
0006675417.tif 000051
【図１５】
0006675417.tif 000052
【図１６】
0006675417.tif 000053
【配列表】
0006675417000001.app