(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つのスルフェート基及び少なくとも１つの脂肪酸で置換された炭水化物である硫脂質−炭水化物を含む炭水化物エステル混合物と、薬学的に許容される担体と、を含み、
前記炭水化物エステル混合物の１０モル％未満が、２つ以上のスルフェート基で置換されている、
アジュバント。
【請求項２】
前記炭水化物エステル混合物の５モル％未満、好ましくは２モル％未満が、２つ以上のスルフェート基で置換されている、請求項１に記載のアジュバント。
【請求項３】
前記炭水化物エステル混合物は、５０モル％以下、好ましくは２５モル％以下、より好ましくは１０モル％以下の、スルフェート基を持たない炭水化物エステルを含む、請求項１又は２に記載のアジュバント。
【請求項４】
前記炭水化物は、単糖類、二糖類、三糖類、シクロデキストリン又はそれらの混合物である、請求項１から３のいずれか１項に記載のアジュバント。
【請求項５】
前記単糖類は、アロース、アルトロース、グルコース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、タロース、プシコース、フルクトース、ソルボース、タガトース、アラビノース、リボース、キシロース、リキソース、リブロース、キシルロース及びイノシトールからなる群から選択される１又は複数であり、
前記二糖類は、スクロース、マルトース、ラクトース、ラクツロース、セロビオース、トレハロース、ゲンチオビオース、ツラノース、イソマルツロース及びメリビオースからなる群から選択される１又は複数であり、
前記三糖類は、ラフィノース、メレジトース、マルトトリオース、イソマルトトリオース、ケストース及びニゲロトリオースからなる群から選択される１又は複数であり、及び／又は、
前記シクロデキストリンは、α−、β−若しくはγ−シクロデキストリンである、
請求項４に記載のアジュバント。
【請求項６】
前記炭水化物のヒドロキシル基の１つが、スルフェート基で置換されており、
前記炭水化物の残りのヒドロキシル基の実質的に全てが、脂肪酸で置換されている、
請求項１から５のいずれか１項に記載のアジュバント。
【請求項７】
前記脂肪酸は、６−１８の炭素原子を有する、請求項１から６のいずれか１項に記載のアジュバント。
【請求項８】
前記脂肪酸は、８−１２の炭素原子を有する、請求項７に記載のアジュバント。
【請求項９】
前記薬学的に許容される担体は、生理学的塩溶液、生理学的塩溶液中の不溶性有機若しくは無機化合物の懸濁液、又は、水不混和性化合物と生理学的塩溶液とのエマルジョンで
ある、請求項１から８のいずれか１項に記載のアジュバント。
【請求項１０】
前記水不混和性化合物と生理学的塩溶液とのエマルジョンは、水中油型エマルジョンを含む、請求項９に記載のアジュバント。
【請求項１１】
前記水中油型エマルジョンは、スクアラン、スクアレン、植物油及び鉱油からなる群から選択される油を含む、請求項１０に記載のアジュバント。
【請求項１２】
前記油は、スクアランである、請求項１１に記載のアジュバント。
【請求項１３】
医療用途のための、請求項１から１２のいずれか１項に記載のアジュバント。
【請求項１４】
抗原成分により引き起こされる免疫応答を増加させるための、請求項１３に記載のアジュバント。
【請求項１５】
前記抗原成分は、死滅した細菌、ウイルス若しくは寄生生物のような死滅した微生物、微生物に由来する成分若しくは成分の混合物、又は、化学的若しくは組み換えＤＮＡ技術により調製される微生物の関連抗原成分を模倣する成分若しくは成分の混合物であり、或いは、
前記抗原成分は、アレルゲン又は治療目的で宿主に対する免疫応答が望まれる当該宿主の成分である、
請求項１４に記載のアジュバント。
【請求項１６】
請求項１から１２のいずれか１項に記載のアジュバント及び抗原成分を含む、ワクチン。
【請求項１７】
前記抗原成分は、死滅した細菌、ウイルス若しくは寄生生物のような死滅した微生物、微生物に由来する成分若しくは成分の混合物、又は、化学的若しくは組み換えＤＮＡ技術により得られる微生物の関連抗原成分を模倣する成分若しくは成分の混合物であり、或いは、
前記抗原成分は、アレルゲン又は治療目的で宿主に対する免疫応答が望まれる当該宿主の成分である、
請求項１６に記載のワクチン。
【請求項１８】
請求項１から１３のいずれか１項に記載のアジュバント、及び必要に応じて抗原成分を含む、キット。
【請求項１９】
少なくとも１つのスルフェート基及び少なくとも１つの脂肪酸で置換された炭水化物である硫脂質−炭水化物を含む炭水化物エステル混合物であって、
当該炭水化物エステル混合物の１０モル％未満が、２つ以上のスルフェート基で置換されている、
炭水化物エステル混合物。
【請求項２０】
前記炭水化物のヒドロキシル基の１つが、スルフェート基で置換されており、
前記炭水化物の残りのヒドロキシル基の実質的に全てが、脂肪酸で置換されている、
請求項１９に記載の炭水化物エステル混合物。
【請求項２１】
炭水化物をスルホン化剤及び反応性脂肪酸アシル化合物と反応させ、炭水化物エステル混合物を得ることを含む、炭水化物のエステル化と、
前記炭水化物エステル混合物から２つ以上のスルフェート基を有する炭水化物エステルを除去して、モノスルフェート炭水化物脂肪酸エステルを含む混合物を得ることを含む、分画と、
前記モノスルフェート炭水化物脂肪酸エステルと薬学的に許容される担体との混合と、
を含む、
モノスルフェート炭水化物脂肪酸エステルを含む炭水化物エステル混合物を含有するアジュバントの調製方法であって、
当該炭水化物エステル混合物の１０モル％未満が２つ以上のスルフェート基で置換されている、アジュバントの調製方法。
【請求項２２】
前記分画は、前記炭水化物エステル混合物からのスルフェート基を持たない炭水化物エステルの除去を更に含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
モノスルフェート炭水化物脂肪酸エステルと、２つ以上のスルフェート基で置換された１０モル％未満の炭水化物エステルと、を含む炭水化物エステル混合物を含む、アジュバント。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ワクチンアジュバントとしてのスルフェート化炭水化物脂肪酸エステルの分野にある。
【背景技術】
【０００２】
ワクチン接種は、ヒト及び動物の両方の健康における感染症疾患を予防及び制御するための最も費用対効果の高い手段の１つである。ワクチンは、細菌、ウイルス、寄生生物、組み換え（微）生物等の改変させた生存抗原、若しくは、不活性化ウイルス、不活性化細菌、不活性化寄生生物、感染性（微）生物のサブユニット等の不活性化（非複製）抗原のいずれか、タンパク質、多糖類、ペプチド、糖タンパク質、多糖類−タンパク質結合体、ペプチド−タンパク質結合体等を含む。多くの場合では、抗原に対する免疫応答は低すぎる。そのような場合、免疫応答を刺激するためにアジュバントを添加することができ、それによってワクチンの保護作用を増加させることができる。
【０００３】
既存の新興及び再興感染症疾患の制御では、アジュバントは決定的な役割を果たす。アジュバントは、（保護）免疫応答を増加させ、応答のタイプを示し、（保護）免疫の持続時間を増加させ、（保護）免疫に対する遅延時間を短縮し、必要とされる抗原の用量を減少させ、及び必要なワクチン接種の回数を減少させる等の異なる機能を有してもよい。抗原をアジュバントと組み合わせることにより、抗原単独での治療では達成できない免疫のレベルを達成し得る。
【０００４】
また、アジュバントは、予め定められた保護レベルに達するために必要な抗原の用量を有意に減少させることもあり、それによって、製品、輸送及び貯蔵のコストを減少させ、生産能力及び利用可能性を増加させる。安価なアジュバントは、高価な抗原の大部分と置き換わり、貧困者へのこれらの医薬製品の流通を促す。
【０００５】
ミョウバン（水酸化アルミニウム）は、安全なアジュバントの古典的な例であり、いくつかのヒトワクチンにおいて適用されている。しかしながら、多くの場合、アジュバント活性は不十分であり、より強力であるが少なくとも安全なアジュバントが必要である。
【０００６】
更に、スルフェート置換炭水化物脂肪酸エステル誘導体が知られている。これらは、一般的に、硫脂質（ｓｕｌｐｈｏｌｉｐｉｄ）−炭水化物（ＳＬ−炭水化物）と呼ばれており、アジュバントとしてのそれらの合成及び機能は公知である。
【０００７】
公知のＳＬ−炭水化物は、脂肪酸（１又は複数）との炭水化物のヒドロキシル基のエステル化及びスルホン化剤との炭水化物のヒドロキシル基のエステル化といった、２つの合成ステップにより調製されることが共通している。これらの反応は、同時に又は任意の順序で実施されてもよい。両方の反応はランダムな反応であり、これは、エステル化に利用可能な炭水化物の異なるヒドロキシル基の間に区別がない、又は制限されていることを意味している。従って、スルフェート基（１又は複数）及び脂肪酸（１又は複数）は、置換された炭水化物にランダムに分布され、多くの異なる化学的化合物の混合物をもたらす。
【０００８】
ランダムな合成方法により形成される化学的に異なるＳＬ−炭水化物の数は、炭水化物骨格上の反応部位（ヒドロキシル基）の数に依存する。炭水化物をスルホン化剤の１当量（炭水化物１モル当たり１モル）と接触させると、異なる数のスルフェート基を有する炭水化物の形成と、異なる位置でスルフェート基を有する炭水化物の形成をもたらす。例えば、当該技術分野で公知のＳＬ−炭水化物混合物は、中でも、スルフェート基を持たない（ここでは“ＺＥＲＯ”として示される）、１つのスルフェート基を持つ（ここでは“ＭＯＮＯ”として示される）又は複数のスルフェート基を持つ（２つ以上のスルフェート基；ここでは“ＰＯＬＹ”として示される）炭水化物エステルの混合物からなる。ＺＥＲＯ：ＭＯＮＯ：ＰＯＬＹの比は、特許文献１に記述されている式を用いて統計的に決定することができる。二糖類（スルホン化に利用できる８つのヒドロキシル基を有する）１モル当たりスルホン化剤１モルでは、最終生成物におけるＺＥＲＯ：ＭＯＮＯ：ＰＯＬＹの理論モル比は、３７％：３７％：２６％である。炭水化物当たりのスルホン化剤のモル比がより低くなると、形成される％ＰＯＬＹが減少し、形成される％ＺＥＲＯが増加する。炭水化物１モル当たりスルホン化剤０．２モルでは、ＺＥＲＯ：ＭＯＮＯ：ＰＯＬＹの理論モル比は、８２％：１６％：２％である。
【０００９】
薬品としての成分の混合物の使用は、製品の品質、一貫性及び安全性に関する重要な欠点と関連し得る。特に、例えばワクチンにおけるアジュバントでは、健康な対象において大規模に適用されることを強調することが重要である。従って、毒性、有効性及び品質は重要な前提条件である。
【００１０】
アジュバント活性（有効性）と副作用（毒性）との間には関係性があり、有効性の増加には毒性の増加が伴うことが一般的に認められている（例えば、非特許文献１参照）。有効性と毒性との比はＥ／Ｔ比と呼ばれ、アジュバントの規定における重要なパラメータである。従来技術のＳＬ−炭水化物を含むアジュバントの欠点は、十分な安全性の欠如である（毒性が高すぎる又はＥ／Ｔ比が低すぎる）。
【００１１】
アジュバントの用量が増加すると、アジュバント活性及び毒性は増加する。アジュバントの用量を減少させることにより、副作用も減少する。しかしながら、許容される毒性のレベルにおいて十分な有効性が残っているかどうかは不確実である。従って、ＳＬ−炭水化物ベースのアジュバントを含む既存のものよりも高い有効性／毒性比を有するアジュバントが依然として必要とされている。このような改善は、同様の毒性を有するより高い有効性、同様の有効性を有するより低い毒性又はより低い毒性と組み合わされたより高い有効性を含み得る。
【００１２】
特許文献２には、ＳＬ−単糖類及びＳＬ−二糖類、これらのＳＬ−単糖類及びＳＬ−二糖類の調製方法、並びにワクチンアジュバントとしてのそれらの使用が記述されている。ＳＬ−二糖類混合物は、二糖類１モル当たりスルホン化剤１モル当量及び二糖類１モル当たり脂肪酸塩化物（アシルクロリド又はアコイルクロリドとしても示されている）７モル当量での反応において形成される。これにより、６５６１の異なる可能性のある化学的化合物の混合物が得られ、その相対的存在は統計学によって決定され得る。これらの製品は、“ＣｏＶａｃｃｉｎｅ  ＨＴ”（ＢＴＧ  ｐｌｃ、ＵＫ）の名称で鋭意研究されてきた対象である。スルホン化剤の１以上のモル当量及び脂肪酸塩化物の１以上のモル当量を用いて得られた混合物を、それらのアジュバント活性について試験した。しかし、試験したＳＬ−炭水化物誘導体の毒性は、ヒトにおける広範な使用のためには高すぎた。
【００１３】
Ｈｉｌｇｅｒｓら（非特許文献２）、ＢｌｏｍとＨｉｌｇｅｒｓ（非特許文献３）及び特許文献３は、ＳＬ−炭水化物ベースのアジュバント及び／又はワクチンの、体温上昇及び局所刺激等の望ましくない副作用を記述している。
【００１４】
Ｈｉｌｇｅｒｓら（非特許文献２のｐｐ．２２２−２２５）は、一方でのＳＬ−炭水化物の分子量と他方でのアジュバント活性及び局所反応源性との間の関係性を記述している。ＳＬ−炭水化物の分子量が増加すると、局所反応は増加するがアジュバント活性は増加しない。また、１．７℃までの体温における一過性の上昇及び４週間までにわたる注射部位での腫れが、非常に共通している。ワクチン接種後最初の１時間の間には、１−２５％の場合において嘔吐が起こる。ワクチン接種８週間後までには、軽度から中程度の持続的な筋肉線維の肉芽腫炎が注射側で観察される（ＳＬ−シクロデキストリンでアジュバント添加したブタサーコワクチンにおけるＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｐｕｂｌｉｃ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  Ｒｅｐｏｒｔ（ＥＰＡＲ））。
【００１５】
特許文献３には、局所有害反応及び体温上昇を含むＳＬ−三糖類の有害事象が記述されている。副作用は重大であり、健康な対象における製品の広範な予防適用を禁止する。また、ＳＬ−二糖類でも、Ｔｕｒｋｓｔｒａら（非特許文献３）及び特許文献３によって記述されているように、重大な局所及び全身の副作用が観察された。
【００１６】
ＳＬ−二糖類（ＣｏＶａｃｃｉｎｅ  ＨＴ）を使用するヒト臨床試験は、ＳＬ−二糖類を含むＳＬ−炭水化物で一般的に認められる有害反応と関連し得る理由、又はその結果であり得る理由のため、打ち切られている。公知のＳＬ−炭水化物ベースのアジュバントは、ヒトの使用には不適切であると考えられている。
【００１７】
特許文献４には、ナチュラルキラーＴ細胞アゴニスト及び生理学的に許容される媒体を含む組成物、並びにナチュラルキラーＴ細胞を刺激して、免疫応答を増強する方法が記述されている。記述されている化合物は、セラミド基及び任意に１又は複数のスルフェート基を含む単糖類及び二糖類の合成誘導体である。この化合物は、糖コア上に脂肪酸を含まず、従って、本請求の範囲の化合物とは異なる。
【００１８】
特許文献２には、ＳＬ−単糖類及びＳＬ−二糖類誘導体の混合物を反応混合物から分離する方法が記述されている。列挙されている技術は、結晶化、沈殿、濾過、蒸発透析又は限外濾過を含む。これらの方法は、ＳＬ−単糖類及びＳＬ−二糖類誘導体の混合物を反応混合物から分離する、又はＳＬ−単糖類及びＳＬ−二糖類誘導体の混合物を特定の副産物から分けるのに適しているかもしれないが、ＰＯＬＹ異性体から本発明のＳＬ−炭水化物のＭＯＮＯ異性体を精製するのには適していない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１９】
【特許文献１】国際公開第９６／２０２２２号
【特許文献２】国際公開第０１／４０２４９０号
【特許文献３】欧州特許第０２５８０２２６号明細書
【特許文献４】国際公開第２００８／００５８２４号
【非特許文献】
【００２０】
【非特許文献１】Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．６２６、ｐｐ．２５１−９、２０１０年
【非特許文献２】Ｖａｃｃｉｎｅ  １７、ｐｐ．２１９−２２８、１９９９年
【非特許文献３】Ｖａｃｃｉｎｅ  ２９、ｐｐ．３７９１−３８０１、２０１１年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
要約すると、ＳＬ−炭水化物ベースの製品のような強力なアジュバントの欠点はそれらの相対的に高い毒性であり、ミョウバンのような安全なアジュバントの欠点はそれらの相対的に低いアジュバント活性である。
【００２２】
このように、ワクチン接種の間の免疫応答を更に増加させることを可能とする、同じ又はより低い毒性でより高い有効性を有するアジュバントが依然として必要とされている。本発明は、それを達成する化合物を記述する。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】従来技術のＳＬ−炭水化物と本発明のＭＯＮＯが富化された（ｅｎｒｉｃｈｅｄ）炭水化物エステル混合物のウサギで試験されたアジュバント製剤の高性能薄層クロマトグラフィー（ＨＰＴＬＣ）の図である。左から右に、ＣｏＶａｃｃｉｎｅ  ＨＴ（ＣｏＶａｃｃｉｎｅ  ＢＶより調製）、Ｓ１２（自社で調製したＣｏＶａｃｃｉｎｅ  ＨＴ様製剤）、Ｍ１０−ＭＯＮＯ（Ｍ１０から分離）、Ｇ１２−ＭＯＮＯ（Ｇ１２から分離）、Ｍ１２−ＭＯＮＯ（Ｍ１２から分離）、ＳＬ−炭水化物無しの水中スクアラン型エマルジョン、ＣｏＶａｃｃｉｎｅ  ＨＴ（複製）、及びＳ１２（複製）である。
【図２】異なるアジュバントを加えた組み換えＲ０．１０Ｃ抗原での第１（淡い灰色カラム）及び第２（暗い灰色カラム）の筋肉内の免疫の１日後のウサギにおける平均体温（℃）の図である。Ｓ１２（ＺＥＲＯ、ＭＯＮＯ及びＰＯＬＹの混合物）におけるＭＯＮＯであるＭ１０−ＭＯＮＯ、Ｇ１２−ＭＯＮＯ及びＭ１２−ＭＯＮＯの用量は、第１の免疫で４ｍｇ及び第２の免疫で８ｍｇであった。第１及び第２の免疫のミョウバンの用量は１１０μｇであった。
【図３】抗原単独（白抜きの菱形）、ミョウバン（灰色の菱形）、Ｓ１２（黒色の三角）、Ｍ１０−ＭＯＮＯ（白抜きの丸形）、Ｇ１２−ＭＯＮＯ（灰色の丸形）及びＭ１２−ＭＯＮＯ（黒色の丸形）のウサギにおける有効性／毒性比の図である。有効性（Ｙ−軸）は、第２の免疫の１週間後（２８日目）での、組み換えＲ０．１０Ｃ抗原（上パネル）、プラスモディウム・ファルシパルムの配偶子母細胞抽出物（中央パネル）及びＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍのシゾント抽出物（下パネル）に対する、幾何平均ＥＬＩＳＡ抗体価（１０ｌｏｇ値）として表される。毒性（Ｘ−軸）は、第１の免疫の１日後（１日目、左パネル）及び第２の免疫の１日後（２２日目、右パネル）の体温（℃）として表される。
【図４ａ】アジュバントとしてＧ１０−ＭＯＮＯであるＭＯＮＯを投与された１匹のウサギ（図４ａ）及びアジュバントとしてＧ１０−ＰＯＬＹ又はＭ１０−ＰＯＬＹのいずれかであるＰＯＬＹを投与された８匹のウサギ（図４ｂ−図４ｉ）における第２の免疫の１週間後の注射部位の写真の図である。図４ａ：動物８２１；グループ４；アジュバントＧ１０−ＭＯＮＯ；毒性スコア＝０．１０；ａｎｔｉｌｏｇ＝１。
【図４ｂ】アジュバントとしてＧ１０−ＭＯＮＯであるＭＯＮＯを投与された１匹のウサギ（図４ａ）及びアジュバントとしてＧ１０−ＰＯＬＹ又はＭ１０−ＰＯＬＹのいずれかであるＰＯＬＹを投与された８匹のウサギ（図４ｂ−図４ｉ）における第２の免疫の１週間後の注射部位の写真の図である。図４ｂ：動物８２５；グループ５；アジュバントＧ１０−ＰＯＬＹ；毒性スコア＝５．５１；ａｎｔｉｌｏｇ＝３２４，０００。
【図４ｃ】アジュバントとしてＧ１０−ＭＯＮＯであるＭＯＮＯを投与された１匹のウサギ（図４ａ）及びアジュバントとしてＧ１０−ＰＯＬＹ又はＭ１０−ＰＯＬＹのいずれかであるＰＯＬＹを投与された８匹のウサギ（図４ｂ−図４ｉ）における第２の免疫の１週間後の注射部位の写真の図である。図４ｃ：動物８３２；グループ７；アジュバントＭ１０−ＰＯＬＹ；毒性スコア＝５．２９；ａｎｔｉｌｏｇ＝１９４，４００。
【図４ｄ】アジュバントとしてＧ１０−ＭＯＮＯであるＭＯＮＯを投与された１匹のウサギ（図４ａ）及びアジュバントとしてＧ１０−ＰＯＬＹ又はＭ１０−ＰＯＬＹのいずれかであるＰＯＬＹを投与された８匹のウサギ（図４ｂ−図４ｉ）における第２の免疫の１週間後の注射部位の写真の図である。図４ｄ：動物８３４；グループ５；アジュバントＧ１０−ＰＯＬＹ；毒性スコア＝４．９９；ａｎｔｉｌｏｇ＝９７，２００。
【図４ｅ】アジュバントとしてＧ１０−ＭＯＮＯであるＭＯＮＯを投与された１匹のウサギ（図４ａ）及びアジュバントとしてＧ１０−ＰＯＬＹ又はＭ１０−ＰＯＬＹのいずれかであるＰＯＬＹを投与された８匹のウサギ（図４ｂ−図４ｉ）における第２の免疫の１週間後の注射部位の写真の図である。図４ｅ：動物８３９；グループ５；アジュバントＧ１０−ＰＯＬＹ；毒性スコア＝４．９１；ａｎｔｉｌｏｇ＝８１，０００。
【図４ｆ】アジュバントとしてＧ１０−ＭＯＮＯであるＭＯＮＯを投与された１匹のウサギ（図４ａ）及びアジュバントとしてＧ１０−ＰＯＬＹ又はＭ１０−ＰＯＬＹのいずれかであるＰＯＬＹを投与された８匹のウサギ（図４ｂ−図４ｉ）における第２の免疫の１週間後の注射部位の写真の図である。図４ｆ：動物８４１；グループ５；アジュバントＧ１０−ＰＯＬＹ；毒性スコア＝４．２９；ａｎｔｉｌｏｇ＝１９，４４０。
【図４ｇ】アジュバントとしてＧ１０−ＭＯＮＯであるＭＯＮＯを投与された１匹のウサギ（図４ａ）及びアジュバントとしてＧ１０−ＰＯＬＹ又はＭ１０−ＰＯＬＹのいずれかであるＰＯＬＹを投与された８匹のウサギ（図４ｂ−図４ｉ）における第２の免疫の１週間後の注射部位の写真の図である。図４ｇ：動物８４３；グループ５；アジュバントＧ１０−ＰＯＬＹ；毒性スコア＝４．７４；ａｎｔｉｌｏｇ＝５４，４３２。
【図４ｈ】アジュバントとしてＧ１０−ＭＯＮＯであるＭＯＮＯを投与された１匹のウサギ（図４ａ）及びアジュバントとしてＧ１０−ＰＯＬＹ又はＭ１０−ＰＯＬＹのいずれかであるＰＯＬＹを投与された８匹のウサギ（図４ｂ−図４ｉ）における第２の免疫の１週間後の注射部位の写真の図である。図４ｈ：動物８４５；グループ７；アジュバントＭ１０−ＰＯＬＹ；毒性スコア＝６．１１；ａｎｔｉｌｏｇ＝１，２９６，０００。
【図４ｉ】アジュバントとしてＧ１０−ＭＯＮＯであるＭＯＮＯを投与された１匹のウサギ（図４ａ）及びアジュバントとしてＧ１０−ＰＯＬＹ又はＭ１０−ＰＯＬＹのいずれかであるＰＯＬＹを投与された８匹のウサギ（図４ｂ−図４ｉ）における第２の免疫の１週間後の注射部位の写真の図である。図４ｉ：動物８５０；グループ７；アジュバントＭ１０−ＰＯＬＹ；毒性スコア＝５．０８；ａｎｔｉｌｏｇ＝１２１，５００。
【図５】第１の免疫の１週間後と第２の免疫の４週間後での個々の抗Ｈ３Ｎ２抗体価（ｙ−軸）対局所反応スコアのＥ／Ｔ−プロットの図である。６匹のウサギのグループに、０日目及び２１日目において、アジュバントとしてＧ１０−ＭＯＮＯ若しくはＭ１０−ＭＯＮＯ（菱形）又はＧ１０−ＰＯＬＹ若しくはＭ１０−ＰＯＬＹ（四角）を加えてＨ５Ｎ１で免疫化した。抗体価及び局所反応を２８日目に決定し、個々のデータがプロットされている。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
前述の観点から、本発明の目的は、優れた安全性及び有効性の特性を有し、調製が容易で安価であり、高品質及び安定性を有するアジュバントを提供することである。本発明の更なる目的は、アジュバント組成物、例えばワクチンを調製するために抗原成分との組み合わせにおいて使用され得る化合物を提供することである。
【００２５】
本発明は、少なくとも１つのスルフェート基及び少なくとも１つの脂肪酸で置換された炭水化物である硫脂質−炭水化物を含む炭水化物エステル混合物と、薬学的に許容される担体と、を含み、炭水化物エステル混合物の１０モル％未満が、２つ以上のスルフェート基で置換されている、アジュバントに関する。好ましくは、炭水化物エステル混合物の５０モル％未満、より好ましくは２５モル％以下、更により好ましくは１０モル％未満が、スルフェート基を持たない炭水化物エステルで構成される。
【００２６】
好ましくは、炭水化物エステル混合物の５モル％未満、より好ましくは２％未満、及び最も好ましくは約０％が、２つ以上のスルフェート基で置換されている。
【００２７】
本発明では、ＣｏＶａｃｃｉｎｅ  ＨＴ等の硫脂質炭水化物混合物の毒性が、主として、２つ以上のスルフェート基で置換された硫脂質炭水化物（“ＰＯＬＹ”として示される）の基に起因するものであることが見出された。１つのスルフェート基で置換された硫脂質炭水化物（“ＭＯＮＯ”として示される）は、優れたアジュバント活性を示すが、かなり低い毒性を有する。このように、ＭＯＮＯが富化された炭水化物エステル混合物の有効性／毒性比は、改善される。ＣｏＶａｃｃｉｎｅ  ＨＴでのヒト試験の中断は、ＣｏＶａｃｃｉｎｅ  ＨＴの主要構成の１つとしてのＰＯＬＹの許容できない高い毒性に少なくとも部分的に起因するので、混合物からＰＯＬＹを実質的に除去すると、新しいヒト試験において許容される毒性をもたらすはずである。
【００２８】
本文脈では、炭水化物は、単糖類、二糖類、三糖類又は直鎖状若しくは環状多糖類であり、好ましくは少なくとも４及び１０以下の単糖類単位を有する。好ましくは、炭水化物は、単糖類、二糖類、三糖類、シクロデキストリン又はそれらの混合物、より好ましくは単糖類、二糖類若しくはシクロデキストリン又はそれらの混合物、更により好ましくは二糖類及び／又は単糖類であり、及び最も好ましくは炭水化物は二糖類である。
【００２９】
単糖類は、一般式Ｃ５Ｈ１０Ｏ５を有するペントース及び一般式Ｃ６Ｈ１２Ｏ６を有するヘキソースから選択される糖である。或いは、単糖類は、アロース、アルトロース、グルコース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、タロース、プシコース、フルクトース、ソルボース、タガトース、アラビノース、リボース、キシロース、リキソース、リブロース、キシルロース及びイノシトールからなる群から選択される１又は複数である。好ましくは、単糖類は、フルクトース、ガラクトース及びグルコースから選択される１又は複数である。
【００３０】
二糖類は、一般式Ｃ１２Ｈ２２Ｏ１１を有する糖であり、好ましくは、スクロース、マルトース、ラクトース、ラクツロース、セロビオース、トレハロース、ゲンチオビオース、ツラノース、イソマルツロース及びメリビオースからなる群から選択される１又は複数である。好ましくは、二糖類は、ラクトース、マルトース及びスクロースから選択される１又は複数である。最も好ましくは、二糖類は、マルトース及び／又はラクトースである。
【００３１】
三糖類は、一般式Ｃ１８Ｈ３２Ｏ１６を有する糖であり、好ましくは、ラフィノース、メレジトース、マルトトリオース、イソマルトトリオース、ラフィノース、ケストース及びニゲロトリオース（ｎｅｇｅｒｏｔｒｉｏｓｅ）からなる群から選択される１又は複数である。好ましくは、三糖類は、ラフィノース、メレジトース及び／又はマルトトリオースから選択され得る。最も好ましくは、三糖類は、ラフィノース及び／又はマルトトリオースから選択される。
【００３２】
シクロデキストリンは、上記で定義したような様々な数の単糖類を有する環状多糖類である。シクロデキストリンは、好ましくは、α−、β−又はγ−シクロデキストリン（それぞれ、６、７又は８糖単位）である。
【００３３】
本文脈における炭水化物エステルは、置換された炭水化物である。置換は他の基がエステル結合により炭水化物のヒドロキシル基を介して炭水化物に付加されることを意味し、そのため、本文脈における置換された炭水化物は炭水化物エステルである。置換は、スルフェート基及び少なくとも１つの脂肪酸で行われる。従って、スルフェート基は、炭水化物ヒドロキシル基上でエステル化を介して炭水化物に共有結合され、同様に、脂肪酸は、炭水化物ヒドロキシル基でのエステル基を介して炭水化物に共有結合される。
【００３４】
本文脈におけるスルフェート基を持たない炭水化物エステルは、１又は複数の脂肪酸で置換されているが、スルフェート基で置換されていない、炭水化物エステルである。
【００３５】
本文脈における硫脂質炭水化物は、少なくとも１つのスルフェート基及び少なくとも１つの脂肪酸で置換された炭水化物である。本発明の炭水化物エステル混合物は、モノスルフェート炭水化物脂肪酸エステルが富化されており、２つ以上のスルフェート基で置換された炭水化物エステルを１０モル％未満で含む。
【００３６】
このように、本発明は、モノスルフェート炭水化物脂肪酸エステルが富化された炭水化物エステル混合物を含むアジュバント組成物、及び例えばワクチンにおけるアジュバントとしてのその使用に関する。
【００３７】
本発明による炭水化物エステル混合物は、ヒドロキシル基についてスルフェート基（−ＳＯ３−）で置換された炭水化物を含む。本文脈におけるスルフェート基は、一価カチオンを形成する原子及び／又は分子からなる群から選択される中性又はイオン性置換基を含んでもよい。この基のメンバーの例には、Ｈ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｌｉ＋及びＮＨ４＋並びにトリエチルアンモニウム（Ｅｔ３ＮＨ＋）が含まれる。従って、スルフェート基は、例えば、−ＳＯ３−、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ３Ｎａ、−ＳＯ３Ｋ、−ＳＯ３Ｌｉ又は−ＳＯ３ＮＨ４であり得る。
【００３８】
更に、炭水化物は、ヒドロキシル基について炭水化物１分子当たり少なくとも１つの脂肪酸で置換されている。好ましくは、炭水化物は、単糖類については２−４、二糖類については２−７、又は上記で定義したようなより大きい炭水化物については更に多くが、複数の脂肪酸で置換される。より好ましくは、スルフェート基で置換されていない炭水化物のヒドロキシル基の実質的に全てが、脂肪酸で置換されている。これは、炭水化物が、好ましくは、スルフェート基の存在に加えて、脂肪酸で実質的に飽和されていることを意味する。これに関して、実質的には、１つの炭水化物分子におけるスルフェートで置換されていない全てのヒドロキシル基の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％又は少なくとも９０％、及び更により好ましくは少なくとも９５％が、脂肪酸で置換されていることを意味する。
【００３９】
このように、本発明の炭水化物エステル混合物は、１つのスルフェート基及び少なくとも１つの脂肪酸で置換された炭水化物が富化された（即ち、モノスルフェート炭水化物脂肪酸エステルが富化された）混合物である。好ましくは、本発明の炭水化物エステル混合物は、炭水化物のヒドロキシル基の１つがスルフェート基で置換されており、及び炭水化物の残りのヒドロキシル基の実質的に全てが脂肪酸で置換されている炭水化物を含む。本発明の炭水化物エステル混合物は、１０モル％未満の２つ以上のスルフェート基で置換された炭水化物を含む。
【００４０】
脂肪酸は、本文脈では、当該技術分野において公知であり、任意の脂肪酸であり得る。一般的に、本文脈における脂肪酸は、６−１８の炭素原子、好ましくは８−１２の炭素原子を有する脂肪酸であり得る。脂肪酸は、飽和又は不飽和であってもよく、分岐していてもよいが、好ましくは線状である。一般的に、脂肪酸は、一般式−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−（ＣＨ２）ｘ−ＣＨ３（式中、ｘは４−１６である）による飽和脂肪酸であり得る。更に、脂肪酸は、式−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−（ＣＨ２）ｘ−ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ２）ｙ−ＣＨ３（式中、ｘ＋ｙは４−１４である）、又は、−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−（ＣＨ２）ｘ−ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ２）ｙ−ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ２）ｚ−ＣＨ３（式中、ｘ＋ｙ＋ｚは２−１２である）の１つによる不飽和脂肪酸であり得る。
【００４１】
好ましくは、脂肪酸は、−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−（ＣＨ２）ｘ−ＣＨ３の一般構造であって、式中、ｘは４（ヘキサン酸）、６（オクタン酸）、８（デカン酸）、１０（ドデカン酸；ここではラウリン酸としても示される）、１２（ミリスチン酸としても知られるテトラデカン酸）又は１４（パルミチン酸としても知られるヘキサデカン酸）であってもよい。更に好ましくは、脂肪酸は、−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−（ＣＨ２）ｘ−ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ２）ｙ−ＣＨ３の一般構造を有し、式中、ｘ＋ｙは１４であってもよい（例えばオレイン酸）。更に好ましくは、脂肪酸は、−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−（ＣＨ２）ｘ−ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ２）ｙ−ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ２）ｚ−ＣＨ３の一般構造を有し、式中、ｘ＋ｙ＋ｚは１２である（例えばリノール酸）。好ましくは、脂肪酸は線状であり、６−１８の炭素原子、より好ましくは８−１２の炭素原子を有する。最も好ましくは、脂肪酸は、デカン酸又はドデカン酸である。
【００４２】
炭水化物が２つ以上の脂肪酸で置換されている場合、上記で定義した脂肪酸の任意の組み合わせが可能である。一般的に、ここに記述された特徴の任意の組み合わせは、本発明の文脈において記載されているものとして考えられる。
【００４３】
１又は複数のスルフェート基及び脂肪酸で置換された炭水化物を製造する場合、これらの化合物の形成に必要な反応はランダムに進行することが一般に知られている。このように、Ｎヒドロキシル基を有する炭水化物を、スルフェート基及び少なくとも１つの脂肪酸で置換された炭水化物に変換する方法において、その結果得られるものは、炭水化物並びに添加されるスルフェート及び脂肪酸の量によって定義される単一の分子種ではない。代わりに、異なる炭水化物の混合物が得られ、個々の炭水化物分子は、０−Ｎスルフェート基、０−Ｎ脂肪酸基及び０−Ｎ未反応（遊離）ヒドロキシル基を含み得る。
【００４４】
本発明の炭水化物は、国際公開第０１／４０２４０号に記述されているものと同様の手順によって形成される。しかし、国際公開第０１／４０２４０号との差異は、本発明の炭水化物エステル混合物は、次いで、分画によって１つのスルフェート基及び少なくとも１つの脂肪酸で置換された炭水化物が富化され、そして、炭水化物エステル混合物の１０モル％未満が２つ以上のスルフェート基で置換されていることにある。好ましくは、炭水化物の５モル％未満が２つ以上のスルフェート基で置換されており、より好ましくは２モル％未満が２つ以上のスルフェート基で置換されており、更により好ましくは、炭水化物エステル混合物中の本質的に全てのスルフェート炭水化物エステルが１つのスルフェート基で置換されている。
【００４５】
この差異の効果は、アジュバントとしての炭水化物の有効性が安定に維持されたままである又は向上しつつ、毒性がかなり低くなる又は皆無でさえあることにある。従って、ＳＬ−炭水化物ベースのアジュバントのうちの公知のアジュバントと比較して、顕著に改善されたＥ／Ｔ比を有するアジュバントが得られる。
【００４６】
従って、本発明は、とりわけ、モノスルフェート炭水化物脂肪酸エステル（ここでは“ＭＯＮＯ”として示される）を含む炭水化物エステル混合物を調製する方法に関する。方法は、スルホ−及び脂肪酸−置換炭水化物の混合物の合成を含む。スルホ及び脂肪酸置換炭水化物はまた、硫脂質−炭水化物（ＳＬ−炭水化物）とも呼ばれる。次いで、１つのスルフェート基及び少なくとも１つの脂肪酸で置換されたＳＬ−炭水化物が富化された（モノスルフェート炭水化物脂肪酸エステルが富化された）炭水化物エステル混合物を、分画によって炭水化物エステル混合物から分離する。
【００４７】
このように、本発明は更に、モノスルフェート炭水化物脂肪酸エステルを含む炭水化物エステル混合物の調製方法に関し、炭水化物エステル混合物の１０モル％未満が２つ以上のスルフェート基で置換されており、好ましくは炭水化物エステル混合物の５０モル％未満がスルフェート基を持たない炭水化物エステルである。方法は、炭水化物のエステル化及び分画を含み、エステル化は、炭水化物をスルホン化剤及び反応性脂肪酸アシル化合物と反応させ、炭水化物エステル混合物を得ることを含み、分画は、炭水化物エステル混合物から２つ以上のスルフェート基を有する炭水化物エステルを除去して、モノスルフェート炭水化物脂肪酸エステルを含む当該混合物を得ることを含む。好ましくは、分画はまた、炭水化物エステル混合物からスルフェート基を持たない炭水化物エステルを除去することも含む。
【００４８】
好ましくは、炭水化物エステル混合物の５モル％未満、より好ましくは２％未満、更により好ましくは約０％が、２つ以上のスルフェート基で置換されている。更に好ましくは、炭水化物エステル混合物は、５０モル％未満、好ましくは２５モル％以下、更により好ましくは１０モル％未満の、スルフェート基を持たない炭水化物エステルを含む。加えて、本発明は、アジュバントとして使用されるこの方法により得られるモノスルフェート炭水化物脂肪酸エステルが富化された混合物に関し、並びにこのように得られたモノスルフェート炭水化物脂肪酸エステルが富化された混合物を含むアジュバントに関する。
【００４９】
炭水化物の置換は、好ましくは、炭水化物の１又は複数の遊離ヒドロキシル基を含む溶液中で、炭水化物のエステル化を介して起こる。これにより、炭水化物エステルが得られる。
【００５０】
スルフェート基での置換は、炭水化物とスルホン化剤の反応を介して起こる。好ましいスルホン化剤は、気体ＳＯ３、ＨＣｌＳＯ３（クロロスルホン酸）、ＳＯ３−ピリジン、ＳＯ３−２−メチルピリジン、ＳＯ３−２，６−ジメチルピリジン、ＳＯ３−ジメチルホルムアミド、ＳＯ３−トリメチルアミド、ＳＯ３−トリエチルアミン、ＳＯ３−ジメチルアニリン、ＳＯ３−Ｎ−エチルモルホリン、ＳＯ３−ジエチルアニリン及びＳＯ３−ジオキサンである。最も好ましくは、ＳＯ３−ピリジン及びＳＯ３−トリエチルアミンである。
【００５１】
脂肪酸での置換は、炭水化物と類似体の反応性アシル化合物、即ち反応性脂肪酸アシル化合物の反応を介して起こる。反応性脂肪酸アシル化合物は、脂肪酸塩化物、臭化物若しくはヨウ化物、脂肪酸チオエステル、脂肪酸無水物又は脂肪酸エステルであってもよい。好ましくは、反応性脂肪酸アシル化合物は、脂肪酸ハロゲン化合物、無水物又はチオエステル、より好ましくは脂肪酸塩化物（時にアコイル（ａｃｏｙｌ）クロリド又はアシルクロリドとも呼ばれる）である。
【００５２】
非常に好ましい反応性脂肪酸アシル化合物は、ヘキサノイルクロリド、オクタノイルクロリド、デカノイルクロリド、ドデカノイルクロリド（ラウロイルクロリド）、テトラデカノイルクロリド（ミリストイルクロリド）、ヘキサデカノイルクロリド（パルミトイルクロリド）及びオクタデカノイルクロリド（ステアロイルクロリド及びオレオイルクロリド）である。最も好ましくは、デカノイルクロリド又はドデカノイルクロリドである。
【００５３】
置換のための好ましい溶媒は、極性溶媒、好ましくは極性非プロトン性溶媒である。更に好ましくは、溶媒は無水物である。
【００５４】
好ましくは、溶媒は、ピリジン、ジメチルホルムアミド、Ｎ−メチルピロリジノン、ジメチルスルホキシド、アセトニトリル、ニトロメタン又はそれらの混合物である。好ましくは、溶媒は、ピリジン、ジメチルホルムアミド、Ｎ−メチルピロリジノン又はそれらの混合物であり、最も好ましくは、溶媒は、無水ピリジン及び無水ジメチルホルムアミドの混合物である。
【００５５】
反応は、一般的に、可能な限り少量の溶媒中でなされる。好ましくは、溶媒の容量は、脂肪酸塩化物等の反応性アシル化合物の量にほぼ等しい。好ましくは、溶媒（１又は複数）は、例えば沈殿、濾過、結晶化又は蒸発によって反応混合物から溶媒が容易に除去されるように選択される。
【００５６】
反応性アシル化合物での置換は、好ましくは、約６０−７０℃の温度で４−８時間、好ましくは約６時間の期間行われる。その後、反応混合物を周囲温度で最大１８時間放置することが望ましい場合がある。
【００５７】
スルホン化剤（１又は複数）との反応は、好ましくは、周囲温度と７０℃との間で１−４時間の期間行われる。その後、反応混合物を周囲温度で最大１８時間放置することが望ましい場合がある。
【００５８】
１つの実施の形態では、最初に炭水化物を周囲温度でスルホン化剤と反応させ、次いで反応性アシル化合物との反応のために温度を約５０−７０℃、好ましくは５５−７０℃、及びより好ましくは約６０℃にする。これに関して、温度は方法に重要ではないことに留意されたい。このような特徴は、付随する制約で広い温度の範囲及び広い条件の範囲において方法が実施されることを可能にする。低くとも約１０℃の周囲温度が許容され得ると考えられる。好ましい周囲温度は約１５℃以上であり、より好ましくは約１８℃以上である。更に、スルホン化剤との反応のための周囲温度は、好ましくは約５０℃以下、より好ましくは約４０℃以下、最も好ましくは約２５℃以下である。
【００５９】
最初に炭水化物をスルホン化剤と反応させ、次いで少なくとも１つの脂肪酸塩化物と反応させてもよく、又はその逆であってもよい。好ましくは、最初に炭水化物をスルホン化剤と反応させ、次いで反応性アシル化合物と反応させる。更に好ましくは、炭水化物は、炭水化物モノスルフェートの最大収率を与えるスルホン化剤の量と反応させる。無水炭水化物では、この量は、炭水化物１モル当たりスルホン化剤１モルである。炭水化物一水和物では、この量は、炭水化物１モル当たりスルホン化剤１−２モルである。
【００６０】
前述したように、可能な限り少量の溶媒を使用することが好ましい。この点では、炭水化物を加熱により溶媒（１又は複数）中に溶解させて透明で均質な溶液が得ることが好ましい。特に、均質溶液を調製するこの方法は、有機溶媒（１又は複数）中に相対的に難溶性である又は有機溶媒中に溶解することが困難である炭水化物に適しており、例えばスクロース及びラクトースに適している。これらの炭水化物を有機溶媒の最小量又は最小容積中に溶解させるために、温度を、好ましくは８０℃より高く、より好ましくは９０℃より高くまで上昇させる。
【００６１】
好ましい実施の形態では、置換が完了した後、有機溶媒（１又は複数）中の置換された炭水化物を、ＮａＯＨ、ＮＨ４ＯＨ、ＫＯＨ、トリエチルアミン又はアンモニア等の無機又は有機塩基の溶液で中和する。
【００６２】
置換された炭水化物は冷却によって回収され得、２又は３以上の別個の相の形成をもたらし、そのうちの１つが置換された炭水化物が富化されたものである。これは、ろ過、デカンテーション、蒸発、抽出等を含む当該技術分野で公知の方法により回収することができる。残留溶媒及び他の化合物は、例えば、上昇させた温度及び減圧下での蒸発又は水相での洗浄によって、この相から除去される。
【００６３】
この段階において、置換された炭水化物は、上述したように様々な数のスルフェート基及び様々な数の脂肪酸でランダムに置換された異なる炭水化物エステルの混合物を含む。全ての場合において、炭水化物は少なくとも１つの脂肪酸で置換されており、即ち未反応の炭水化物は本質的に存在しない。
【００６４】
炭水化物エステル混合物は、従って、次のものを含み得る。
・ＭＯＮＯ  炭水化物１分子当たり１つのスルフェート基で置換されており、及び少なくとも１つの脂肪酸エステルで置換された炭水化物エステル（モノスルフェート炭水化物脂肪酸エステル）。
・ＰＯＬＹ  炭水化物１分子当たり２つ以上のスルフェート基で置換されており、及び少なくとも１つの脂肪酸エステルで置換された炭水化物エステル。
・ＺＥＲＯ  少なくとも１つの脂肪酸エステルで置換されているが、スルフェート基を含まない炭水化物エステル。
【００６５】
好ましくは、本発明の炭水化物エステル混合物は、１０モル％未満のＰＯＬＹを含む。より好ましくは、前記混合物は５モル％未満のＰＯＬＹを含み、又は更により好ましくは、前記混合物は２モル％未満のＰＯＬＹを含む。最も好ましくは、前記混合物は検出可能なＰＯＬＹを含まない（約０％ＰＯＬＹ）。
【００６６】
更に好ましくは、前記混合物は、５０モル％未満、より好ましくは２５モル％以下、更により好ましくは１０モル％未満のＺＥＲＯを含む。
【００６７】
炭水化物エステル混合物は、ＳＬ−炭水化物混合物を含む反応混合物の分画によって、ＭＯＮＯが富化される。分画は、液体抽出、液体クロマトグラフィー、結晶化、電気泳動、超臨界抽出又はそのような方法の組み合わせ等の当該分野で公知の精製方法によって行うことができる。好ましくは、ＭＯＮＯが富化された炭水化物エステル混合物は、液体抽出又は液体クロマトグラフィーによって分離される。より好ましくは、本発明の炭水化物エステル混合物は、液体クロマトグラフィーによって分離される。
【００６８】
液体クロマトグラフィーの固定相は、シリカ、変性シリカ、アルミナ、フロリジル、陰イオン交換樹脂であってもよく、例えば商標名Ａｍｂｅｒｊｅｔ（商標）、Ａｍｂｅｒｓｅｔ（商標）及びＤｏｗ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社のＤｏｗｅｘ（商標）で入手可能な樹脂が挙げられる。
【００６９】
液体クロマトグラフィーの移動相（“溶離液”）は、ｎ−ヘキサン、ｎ−ヘプタン、イソプロパノール、エタノール、メタノール、トリエチルアミン、トリメチルアミン、アンモニア及び水等の当該分野で公知の有機液体から選択される、単一の溶媒又は２つ以上の溶媒の混合物であってもよい。好ましくは、溶媒は、例えば“制限されている溶媒”又は“低毒性の溶媒”として登録機関（例えばＦＤＡ又はＥＭＡ）による分類により証明されているような安全なものである。好ましい溶媒は、ｎ−ヘプタン、イソプロパノール及びトリエチルアミンの混合物であり、好ましくは９０：５：５と５０：３０：２０との間の容量比である。
【００７０】
本発明の炭水化物エステル混合物は、合成完了後の反応混合物から、又はその抽出物から分離される。好ましくは、置換された炭水化物及び副産物の混合物を含む反応混合物の抽出物から分離される。抽出物は、液−液抽出又は示差沈殿によって得ることができる。
【００７１】
好ましい方法は、ｎ−ヘプタン又はｎ−ヘキサン等の有機溶媒による反応混合物の抽出である。より好ましくは、相分離を促進するために水相を補充した反応混合物のｎ−ヘキサン又はｎ−ヘプタンでの抽出である。
【００７２】
本発明の炭水化物エステル混合物が分離される反応混合物又は抽出物は、好ましくは、液体クロマトグラフィーに使用される溶離液（移動相）中に溶解又は希釈される。
【００７３】
分画される反応混合物又は抽出物の容量は、液体クロマトグラフィーに使用されるカラム容積の１／１０から１／１００の間である。カラムは、カラム容積の１−１０倍で溶出される。溶出は、単一の溶媒、一定の組成での溶媒の混合物（アイソクラティック溶出）、又は、実行の間に変化して勾配を形成する溶媒の混合物（勾配溶出）を用いて行われてもよい。好ましくは、溶出は、単一の溶媒又は一定の組成での混合物を用いて行われる。カラムは、１−１００ｍＬ／分の流速で溶出される。回収される画分は、カラムの容積の１／１０から１／１００の間である。液体クロマトグラフィーは、４−６０℃、好ましくは１５−２５℃（周囲温度）で行われる。
【００７４】
好ましくは、脂肪酸での置換及び／又はスルフェート基での置換の間に形成される副産物を同時に除去できるように、分画は２つの化学反応の完了後に行う。
【００７５】
以下に記述する実施例では、モノスルフェート炭水化物脂肪酸エステルが富化された混合物が、ランダムな合成方法により調製された炭水化物エステル混合物から分離される。調製方法の条件は、ＷＯ９６／２００８及び特許文献３に詳細に記述されている。
【００７６】
ＭＯＮＯが富化された炭水化物混合物は、ＭＯＮＯ対ＰＯＬＹのモル比によって特徴付けることができる。好ましくは、ＭＯＮＯ対ＰＯＬＹのモル比は１０：１、より好ましくは２０：１、より好ましくは５０：１、及び更により好ましくは１００：１である。
【００７７】
ランダムな合成及び液体クロマトグラフィーによる精製を含む、本発明によるＭＯＮＯが富化された混合物の調製方法に加えて、モノスルフェート炭水化物脂肪酸エステルを含む炭水化物エステル混合物であって、その炭水化物エステル混合物の１０モル％未満が２つ以上のスルフェート基で置換される、炭水化物エステル混合物をもたらす他の調製方法も適用してもよい。
【００７８】
例えば、位置選択的合成は、ＭＯＮＯ（が富化された混合物）を調製する代替方法であり得る。位置選択的調製は、炭水化物分子のヒドロキシル基の一時的な保護（即ちヒドロキシル基の保護及び脱保護）又は酵素若しくは触媒の使用を含み得る。位置選択的合成の利点は、単一の異性体が生成されることである。
【００７９】
ＭＯＮＯが富化された混合物を調製する方法は、容易で安全で安価であるという利点を有し、炭水化物であって、その炭水化物の１０モル％未満が２つ以上のスルフェート基で置換されており、１つのスルフェート基及び少なくとも１つの脂肪酸で置換された、炭水化物が富化された多種多様な炭水化物エステル混合物を得るために使用することができる。そのような混合物を含むアジュバントは、公知の硫脂質−炭水化物アジュバントと比較して、ほとんど又は全く毒性を持たず、同等又は更に増加した有効性を有することが示された。この理由から、本発明は、１つのスルフェート基及び少なくとも１つの脂肪酸で置換された炭水化物と、薬学的に許容される担体とを含むアジュバントに関し、当該炭水化物の１０モル％未満は２つ以上のスルフェート基で置換されている。即ち、アジュバントは、１つのスルフェート基及び少なくとも１つの脂肪酸で置換された炭水化物である硫脂質−炭水化物を含む炭水化物エステル混合物と、薬学的に許容される担体とを含み、当該炭水化物エステル混合物の１０モル％未満が２つ以上のスルフェート基で置換されており、好ましくは当該炭水化物エステル混合物の５０モル％未満がスルフェート基を持たない炭水化物エステルである。
【００８０】
この文脈における薬学的に許容される担体は、アジュバント及び／又は抗原化合物を送達又は投与するために使用され得る任意の担体である。好ましくは、薬学的に許容される担体は、生理学的塩溶液、生理学的塩溶液中の不溶性化合物の懸濁液、又は、水不混和性化合物（例えば油）及び生理学的塩溶液のエマルジョン、好ましくは水中油型エマルジョンである。
【００８１】
生理学的塩溶液は、当該技術分野において公知であり、生体対象内への注射に適した任意の溶液であり、当該溶液はそれが注射される対象にその構成自体によっては悪影響を引き起こさない又はほとんど引き起こさないだろう。好ましくは、生理学的塩溶液は滅菌されている。更に好ましくは、生理学的塩溶液は、それが注射される対象の体液のイオン強度と同程度のｐＨ及びイオン強度を有する（“等張”）。
【００８２】
生理学的塩溶液は、例えば、塩化物、臭化物、リン酸塩及び／又はクエン酸塩の、Ｎａ、Ｋ、Ｌｉ、ＮＨ４、Ｃａ及び／又はＭｇ−塩等の塩を含んでもよい。好ましくは、生理学的塩溶液は、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、クエン酸緩衝生理食塩水、等張イオン性溶液、等張非イオン性溶液等である。より好ましくは、生理学的塩溶液は、生理食塩水又はリン酸緩衝生理食塩水であり得る。生理食塩水の例は、塩化ナトリウム水溶液０．９ｗ／ｖ％無菌溶液である。
【００８３】
或いは、薬学的に許容される担体は、生理学的塩溶液中の不溶性化合物の懸濁液である。この文脈における不溶性化合物は、例えば、モノスルフェート炭水化物脂肪酸エステルを吸収するために使用され得る不溶性有機又は無機化合物である。好ましくは、不溶性化合物は、水酸化アルミニウムである公知のアジュバントのミョウバンである。
【００８４】
別の好ましい実施の形態では、薬学的に許容される担体は、水不混和性化合物及び生理学的塩溶液を含むエマルジョンである。好ましくは、エマルジョンのタイプは、水中油型エマルジョンである。更に好ましくは、エマルジョンは滅菌されている。
【００８５】
水不混和性化合物は、好ましくは液体、より好ましくは油である。適切な油は、スクアラン、スクアレン、植物油及び鉱油からなる群から選択される１又は複数を含む。適切な油は、例えば、大豆油、落花生油、キャノーラ油、オリーブ油、ベニバナ油、コーン油、アーモンド油、綿実油、エチルオレエート、イソプロピルミリステート、イソプロピルパルミテート、鉱油、ミリスチルアルコール、オクチルドデカノール、パーシック油、セサム油、ミリスチルオレエート、セチルオレエート、ミリスチルパルミテートを含む。他の好適な油は、飽和、不飽和及び／若しくは部分的に水素化された脂肪酸の生体適合性の油、ケイ素ベースの油、例えばグリセロールトリグリセリドエステル等のＣ１２−Ｃ２４脂肪酸の飽和及び不飽和鎖からなるトリグリセリド等の合成油、オレイン酸、テルペン、リノレン、スクアラン、スクアレン、スクアラミン、並びに、ＦＣ−４０、ＦＣ−４３、ＦＣ−７２、ＦＣ−７０、ＦＣ−７５として知られるペルフルオロ化合物、ペルフルオロヘキサン、ペルフルオロオクチルブロミド（ペルフルオロブロンとしても知られている）、ペルフルオロオクチルヨードを含むフッ素化油、又は、それらの任意の混合物を含む。油がスクアランであると非常に好ましい。
【００８６】
エマルジョンの場合では、アジュバントは、１−６４０ｇ／Ｌ、好ましくは２−４８０ｇ／Ｌ、より好ましくは４−３２０ｇ／Ｌの濃度で油を含むことが一般的に好ましい。
【００８７】
エマルジョンに適した水相は、任意の注射可能な水溶液、好ましくは、例えば生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、クエン酸緩衝生理食塩水、等張イオン性溶液、等張非イオン性溶液等の生理学的塩溶液でよい。水相の量は変化してもよく、通常、好ましくは６１６−９８４ｇ／Ｌ又は６８０−９９６ｇ／Ｌ等の６１６−９９６ｇ／Ｌの間、より好ましくは６８０−９９６ｇ／Ｌの間だろう。
【００８８】
本発明による特に好ましいアジュバント製剤は、硫脂質−炭水化物を含む炭水化物エステル混合物であって、当該炭水化物の１０モル％未満が２つ以上のスルフェート基で置換されている、炭水化物エステル混合物を、１−６４０ｇ／Ｌ、好ましくは１−４８０ｇ／Ｌ、より好ましくは１−３２０ｇ／Ｌの濃度で含む。
【００８９】
油がスクアランであり水がリン酸緩衝生理食塩水（“ＰＢＳ”）である水中油型エマルジョンを含むアジュバントを用いると、優れた結果が達成された。
【００９０】
必要に応じて、アジュバントは、乳化剤若しくは安定剤、又は、乳化剤及び安定剤の組み合わせを含む。注射目的に適した任意の乳化剤又は安定剤を使用することができ、この目的に適した洗剤を含む。適切な乳化剤又は安定剤の例は、ポリソルベート８０（ＳｅｐｐｉｃのＭｏｎｔａｎｎｏｘ  ８０、パリ）である。乳化剤又は安定剤が使用される場合、それらは、典型的に、１−６４０ｇ／Ｌ、好ましくは２−４８０ｇ／Ｌ、より好ましくは４−３２０ｇ／Ｌの（合計）濃度で存在する。
【００９１】
好ましくは、本発明のアジュバントは安定しており無菌である。好ましくは、アジュバント製剤は、０．０５−０．４０μｍ、好ましくは０．１５−０．３０μｍ、好ましくは約０．２２μｍの孔径を有する滅菌フィルターを通過させることにより滅菌され得る。
【００９２】
好ましい実施の形態では、本発明のアジュバントは、１−８０ｇ／Ｌ、好ましくは４−６４ｇ／Ｌ又は２−４０ｇ／Ｌ、より好ましくは４−３２ｇ／Ｌ、最も好ましくは４−２０ｇ／Ｌの別途定義したようなＭＯＮＯが富化された炭水化物エステル混合物と、１−３２０ｇ／Ｌ、好ましくは２−１６０ｇ／Ｌ又は８−２５６ｇ／Ｌ、最も好ましくは４−８０ｇ／Ｌの好ましくはスクアランである油と、１−８０ｇ／Ｌ、好ましくは４−６４ｇ／Ｌ又は２−４０ｇ／Ｌ、最も好ましくは４−２０ｇ／Ｌの好ましくはポリソルベート８０である乳化剤又は安定剤とを含み、残りは好ましくはＰＢＳである水相である。
【００９３】
好ましくは、本発明のアジュバント組成物は、１−８０ｇ／ＬのＭＯＮＯ、より好ましくは２−４０ｇ／ＬのＭＯＮＯ、更により好ましくは４−２０ｇ／ＬのＭＯＮＯを含む。
【００９４】
本発明のアジュバントは、抗原成分により引き起こされる免疫応答を増加させるように、医学的に適切に使用され得る。このような使用は、ワクチン接種等の抗原成分に対する耐性を増加させるべき場合の適用において有益である。
【００９５】
抗原成分は、動物又はヒトにおいて適応免疫応答を引き起こす任意の物質である。抗原成分は、通常、身体に対して外来性（例えば細菌）であり、体内に入ると、抗原特異的Ｂ及びＴ細胞の活性化による特異的免疫応答を誘発する。或いは、抗原成分は、適応免疫系のＢ細胞受容体又はＴ細胞受容体等の抗原受容体によって認識され得る任意の分子又は分子断片としても定義され得る。
【００９６】
免疫応答の増加は、例えば、抗原成分に対する抗体の産生、抗原成分に対する抗体を産生するＢ細胞の数及び／又は抗原成分を認識するＴ細胞の数が、動物又はヒトが抗原成分のみに曝露される通常の状況と比較して、増加することを意味する。増加した免疫応答は、例えば、当該技術分野で知られているように、抗体価を測定することによって決定され得る。
【００９７】
この文脈における抗原成分は、ヒト又は動物において免疫応答を引き起こす任意の化合物であり、一般的に“免疫原”としても示される。
【００９８】
本発明のアジュバントは、ヒト及び動物における抗原成分に対する免疫応答を増加させる。１つの好ましい実施の形態では、本発明のアジュバントは、ヒトにおいて使用される。別の好ましい実施の形態では、本発明のアジュバントは、動物において使用される。好ましい動物種は哺乳動物であり、ブタ、ラット、ウサギ、フェレット、ウシ、ヒツジ、ポニー、サル、ネコ、イヌ及びゾウを含む。好ましくは、抗原成分は、少なくともヒトにおいて免疫応答を引き起こす。
【００９９】
アジュバント自体は免疫応答を引き起こさない又はほとんど引き起こさないが、アジュバントが抗原成分に対する免疫応答を増加させることは周知である。更に、アジュバントは免疫応答の対象となる抗原成分の種類にかかわらずこの効果を有することも知られている。従って、本発明のアジュバントは、免疫応答を増加させるために、任意の抗原成分と共に使用することができる。抗原成分は、予防及び治療ワクチンの両方に使用され得る。
【０１００】
抗原成分は、とりわけ、死滅した細菌、ウイルス又は寄生生物等の不活性化微生物、そのような微生物に由来する成分、及び、化学的又は生物工学的手段により調製されたそのような微生物の関連成分を模倣する成分であり得るが、これらに限定されない。抗原成分はまた、植物若しくは動物に由来するアレルゲン、又は、化学的若しくは生物工学的手段により調製されたアレルゲンを模倣する成分であり得る。抗原成分はまた、癌、免疫学的及び内分泌学的疾患の治療等の治療目的でそれ（宿主）に対する免疫応答が望まれる宿主由来の成分でもあり得る。
【０１０１】
予防ワクチンの抗原成分の例は、不活性化インフルエンザウイルス、不活性化ポリオウイルス、不活性化狂犬病ウイルス、不活性化細菌、インフルエンザウイルスのヘマグルチニン及びノイラミニダーゼ等のウイルス又は細菌のサブユニット又は組み換えＤＮＡ産物、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、Ｂ型肝炎ウイルス、マラリア、乳頭腫ウイルス、並びに、ストレプトコッカス・ニューモニエ、ヘモフィルスインフルエンザｂ型、ナイセリア・メニンギティディス由来の多糖類との多糖類−タンパク質結合体を含む。好ましくは、抗原成分は、インフルエンザ抗原及び／又はマラリア抗原を含む。
【０１０２】
治療上のアレルギーワクチンの抗原成分の例は、草、ヨモギ、樺、アルダー、ハシバミ、灌木、ハウスダスト、動物、真菌、食物及び昆虫由来のアレルゲンを含む。
【０１０３】
癌又は免疫学的若しくは内分泌学的疾患の治療のための治療上のワクチンの抗原成分の例は、ホルモン若しくは因子（例えば、ゴナドトロピン放出ホルモン、血管内皮増殖因子、アンギオテンシン）等の宿主成分を分離した又はそれを模倣する（グリコ−）タンパク質若しくはペプチド−タンパク質結合体、及び癌細胞抗原を含む。
【０１０４】
本発明はまた、上記に定義したようなアジュバント及び抗原成分を含むワクチンを提供する。好ましくは、ワクチンは、水中油型エマルジョンを含み、更に好ましくは、ワクチンは、１又は複数の上記に定義したような抗原成分を含む。
【０１０５】
ワクチンの調製では、使用準備済みの液体抗原成分を、使用準備済みの本発明によるアジュバント製剤と、１：１００−１００：１、好ましくは１：５０−５０：１、より好ましくは１：２５−２５：１、更に好ましくは１：１０−１０：１等の適切な容量比で混合してもよい。凍結乾燥された抗原成分の場合、凍結乾燥された抗原成分は１回のワクチンの用量で０．１−２ｍＬ等の、使用準備済みの本発明によるアジュバント製剤の適切な容量中に溶解させてもよい。
【０１０６】
ワクチンは、１用量当たり０．０１−８０ｍｇ、好ましくは０．０５−８０ｍｇ、より好ましくは０．０５−４０ｍｇ、より好ましくは０．１−２４ｍｇ、より好ましくは０．２５−２０ｍｇ、最も好ましくは０．２５−１６ｍｇのアジュバントとしての本発明による炭水化物エステル混合物（即ち、１つのスルフェート基及び少なくとも１つの脂肪酸で置換された炭水化物を含む炭水化物エステル混合物であり、炭水化物の１０モル％未満が２つ以上のスルフェート基で置換されている）を含んでもよい。これは更に、１用量当たり１−３２０ｍｇ、好ましくは２−１６０ｍｇ、より好ましくは４−８０ｍｇの好ましくは油、より好ましくはスクアランである水不混和性液相と、１用量当たり（合計で）０．２５−８０ｍｇ、好ましくは０．５−２４ｍｇ、より好ましくは１−２０ｍｇの好ましくはポリソルベート８０（Ｍｏｎｔａｎｎｏｘ  ８０  ＰＰＩ）である１又は複数の乳化剤又は安定剤とを含んでもよい。ワクチンの１用量とは単回の注射容量であり、例えば０．１−２．０ｍＬの注射液であり得る。ワクチンの１用量の抗原成分の量は、抗原成分の同一性に大きく依存し、好ましくは１用量当たり１−１００μｇ等の１用量当たり０．１−１０００μｇであり得る。
【０１０７】
本発明はまた、上記に記述したようなアジュバントを含み、及び必要に応じて、粉末、溶液又はエマルジョン等の抗原成分を含む調製物を更に含む、部品のキットも提供する。また、キットは、シリンジ、針、容量測定の構成要素及び／又は注射液、並びにキットに含めるのに適した当該技術分野で公知のワクチン接種の他の構成要素も含んでもよい。アジュバント及び抗原を別々に製造、輸送及び貯蔵すること又はアジュバント及び抗原を別々に投与することが望ましいかもしれない。そのような場合、アジュバント製剤は、別々のバイアル中に供給され得る又は予めシリンジに充填され得る。
【実施例】
【０１０８】
以下の実施例は、本発明を例示するものであり、本発明を限定するものではない。実施例は、本発明のアジュバントを含むワクチンを注射された動物において強力に増強された免疫応答と組み合わせて、本発明によるＭＯＮＯが富化された炭水化物エステル混合物の予想外に高い安全性を実証する。用語ＭＯＮＯ（ＭＯＮＯｓ（複数のＭＯＮＯ））は、炭水化物１分子当たり１つのスルフェート基を有する炭水化物脂肪酸スルフェートエステル（１又は複数）を含む。更に、実施例は、ＰＯＬＹが富化された炭水化物エステル混合物の予期せぬほど高い毒性を実証する。用語ＰＯＬＹ（ＰＯＬＹｓ（複数のＰＯＬＹ））は、炭水化物１分子当たり２つ以上のスルフェート基を有する炭水化物脂肪酸スルフェートエステル（１又は複数）を含む。ＭＯＮＯｓ及びＰＯＬＹｓは、例えばＣｏＶａｃｃｉｎｅ  ＨＴが挙げられる当該技術分野で公知の炭水化物エステル混合物の３つの主要構成のうちの２つである。
【０１０９】
本発明によるモノスルフェート炭水化物脂肪酸エステル誘導体の調製：
本発明によるモノスルフェート炭水化物脂肪酸エステルは、ＭＯＮＯが富化された混合物をＰＯＬＹ（２つ以上のスルフェート基で置換された炭水化物脂肪酸エステル）から分離するために分画ステップが組み込まれていることを除いて、ＳＬ−炭水化物の調製のための当該技術分野で公知の方法に従って調製される。好ましくは、ＭＯＮＯが富化された混合物はまた、ＺＥＲＯ（スルフェート基で置換されていない炭水化物脂肪酸エステル）の少なくとも一部からも分離される。
【０１１０】
モノスルフェート炭水化物脂肪酸誘導体の合成には、炭水化物をスルホン化剤と接触させる第１のステップと、当該炭水化物を反応性脂肪酸アシル化合物と接触させる第２のステップとを含ませた。
【０１１１】
ＺＥＲＯ及びＰＯＬＹからのＭＯＮＯの分離は、合成手順の第１のステップ後（即ち、炭水化物をスルホン化剤と接触させた後）又は合成手順の第２のステップ後（即ち、炭水化物の反応性脂肪酸アシル化合物との反応後）のいずれかの時に実施させる。
【０１１２】
ＺＥＲＯ及びＰＯＬＹからのＭＯＮＯの分離並びに他の副産物からのＭＯＮＯの（同時の）精製は、固定相としてシリカ及び移動相として有機溶媒の混合物を使用する液体クロマトグラフィーによって行うことができる。
【０１１３】
実施例１：モノスルフェートヘプタドデシルマルトース（“Ｍ１２−ＭＯＮＯ”）
マルトース一水和物（０．２モル；６８．４ｇ）を無水ピリジン（２００ｇ）中に溶解して、温かい（５０℃）無水ピリジン（３００ｇ）中の０．５当量のＳＯ３−ピリジン（０．１モル；１５．９ｇ）を添加した。反応混合物を室温で１時間撹拌して、無機スルフェート含量を、イオンクロマトグラフィー高性能液体クロマトグラフィー（ＩＣ−ＨＰＬＣ；Ｍｅｔｒｏｈｍ  ８２１；Ｍｅｔｒｏｓｅｐ  Ａ  ｓｕｐｐ  ５−２５０／４．０カラム、溶離液として０．１ｍＭ炭酸塩溶液、導電率により検出）によって決定した。無機スルフェートは、炭水化物と反応しなかったがその代わりに出発材料中に存在している又は処理間に反応混合物に入る水と反応したスルホン化剤の量を表す。
【０１１４】
シリカ（４００ｇ）を２２０℃で４時間乾燥し、無水ピリジン（８００ｍＬ）中に懸濁し、入口及び出口コネクタ並びにＰＶＤＦのコネクタを備えた乾燥ガラスカラムに供給した。シリカの定着後、無水ピリジン中のマルトースモノスルフェート５０ｍＬのサンプルを適用した。溶出は、無水ピリジン１Ｌ、続いて無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド１Ｌで行った。５０ｍＬの画分を乾燥アルゴン又は窒素下で回収し、マルトース、マルトースモノスルフェート又はマルトースポリスルフェートの存在について、ＨＰＴＬＣで試験した（シリカプレート、ブタノール：イソプロパノール：酢酸：ギ酸：水＝１０：３：２６：６：４で展開、メタノール中５％硫酸を噴霧、及び１００℃で２０分間加熱）。マルトースは無水ピリジンで溶出し、マルトースモノスルフェートは無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドで溶出した。
【０１１５】
純粋なマルトースモノスルフェートを含む画分を回収して貯めておき、更なる合成に使用した。マルトース含量は、Ｄｕｂｏｉｓら（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２８ｐｐ．３５０−３５５、１９５６年）に従ってオルシノール／硫酸試薬によって定量した。簡潔に言うと、０．１−１μｇ／ｍＬの炭水化物を含むサンプル５０μＬに、７０％硫酸中２ｇ／Ｌオルシノール溶液からなるオルシノール試薬９５０μＬを添加した。混合物を激しく混合し、１００℃で２０分間インキュベートした。冷却後、５５０ｎｍでの吸光度を測定した。炭水化物濃度は、マルトース一水和物である非置換炭水化物に基づく標準溶液を用いることにより計算した。無水ピリジンを加え、溶液を６０℃に温めた。８当量のドデカノイルクロリドを加え、反応混合物を７０℃で８時間保持した。モノスルフェートヘプタドデシルマルトースの形成を、ＨＰＴＬＣ（シリカプレート、２３３：１００：３．３の容量比でのｎ−ヘキサン：ジエチルエーテル：酢酸で展開、メタノール中５％硫酸を噴霧、及び１００℃で２０分間加熱）によって観察した。
【０１１６】
実施例２：モノスルフェートヘプタドデシルスクロース（“Ｓ１２”）
ＺＥＲＯ、ＭＯＮＯ及びＰＯＬＹを含むＣｏＶａｃｃｉｎｅ  ＨＴのＳＬ−スクロース（ここでは“Ｓ１２”として示される）を、欧州特許第０２１３３９６９号明細書に記述されているように調製した。１００℃で４時間乾燥させたスクロース（６８．６ｇ、０．２モル）を、無水ピリジン（１８８ｇ；２．４モル）及び無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（３８８；５．３モル）中に溶解した。反応混合物を乾燥窒素下に保ち、透明な溶液が得られるまで９０℃で２時間攪拌した。合成手順の間、水及び湿った空気との接触を避けるために予防措置を取った。室温に冷却した後、ＳＯ３−ピリジン（３２ｇ；０．２モル；１．０当量）を激しく撹拌しながら反応混合物に添加した。室温で１時間後、サンプルを採取して、実施例１に記述したようにＩＣ−ＨＰＬＣによって無機スルフェート濃度を測定した。その後、溶液を６０℃に温めて、ドデカノイルクロリド（３１１ｇ；１．４モル；７．１当量）を激しく攪拌しながら添加した。４時間後、サンプルを回収して、半定量ＨＰＴＬＣによって（シリカプレート、２３３：１００：３．３の容量比でのｎ−ヘキサン：ジエチルエーテル：酢酸で展開、メタノール中５％硫酸を噴霧、及び１００℃で２０分間加熱）、エステル化の程度を決定した。
【０１１７】
激しく攪拌しながら、ドデカノイルクロリドの追加分（７５ｇ；０．３モル；１．７当量；合計８．８当量）を添加した。７０℃で４時間後、サンプルを回収して、半定量ＨＰＴＬＣによる分析により、エステル化が完了したことを確かめた。溶媒は、ロータベーパー（Ｂｕｃｈｉ）において上昇させた温度（６０℃）及び減圧（＜２０ｍＢａｒ）で除去した。残留物を、２０ｗ／ｗ％の最終濃度になるように、冷メタノール（４℃）中に溶解させた。激しく撹拌した後、混合物を４℃で一晩保つと、褐色の粘性の下相及び液体の上相が生じた。上（メタノール）相は回収して、下相の抽出は、４℃で一晩にわたり冷メタノール（４℃）を用いた相分離を数回繰り返した。メタノール抽出物（上相）を貯めて、５０ｍＬポリプロピレンチューブ中において３０００ｒｐｍ（１２００ｇ）で５分間遠心分離することにより不純物を除去した。上清を回収して貯めておいて、ロータベーパー（Ｂｕｃｈｉ）において上昇させた温度（４０℃）及び減圧（＜２０ｍＢａｒ）での蒸発によりメタノールを除去した。
【０１１８】
Ｓ１２の組成は、実施例１に記述したような半定量ＨＰＴＬＣにより決定した。
【０１１９】
表１：ＨＰＴＬＣにより決定され、モル％として表される、ＣｏＶａｃｃｉｎｅ  ＨＴの自社の同等物である未分画のＳ１２の組成。比較のために、オリジナルのＣｏＶａｃｃｉｎｅ  ＨＴの組成を含む。
【表１】
0006765371.tif 000002
【０１２０】
実施例３：モノスルフェートテトラドデシルガラクトース（“Ｇ１２−ＭＯＮＯ”）
モノスルフェートテトラドデシルガラクトース（ここでは“Ｇ１２−ＭＯＮＯ”として示される）を、実施例２のスクロースについて記述した同様の方法でガラクトースを反応させることにより調製した。ガラクトース（３６．４ｇ；０．２モル）、無水ピリジン（１６１ｇ）、無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１９７ｇ）、ＳＯ３−ピリジン（３１．２ｇ；０．２モル；１当量）及びドデカノイルクロリド（２６８ｇ；１．２モル；６．２当量）を、実施例２に記述したように反応させた。ＩＣ−ＨＰＬＣにより決定される無機スルフェート含量は、ガラクトース１モル当たりスルフェート０．８９モルの平均比を与える１１％であった。ＺＥＲＯに富む画分（ここでは“Ｇ１２−ＺＥＲＯ”として示される）は、１００ｗ／ｗ％のＺＥＲＯを含んでいた（表２）。ＭＯＮＯに富む画分（ここでは“Ｇ１２−ＭＯＮＯ”として示される）は、２５モル％のＺＥＲＯ及び７５モル％のＭＯＮＯを含んでいた。
【０１２１】
表２：液体クロマトグラフィーにより得られ、ＬＣ−ＭＳにより分析され、モル％として表される、ドデシルガラクトース誘導体の３つの画分の組成。
【表２】
0006765371.tif 000003
【０１２２】
実施例４：モノスルフェートヘプタドデシルマルトース（“Ｍ１２−ＭＯＮＯ”）
モノスルフェートヘプタドデシルマルトース（ここでは“Ｍ１２−ＭＯＮＯ”として示される）を、マルトース一水和物（３６．６ｇ；０．１モル）、無水ピリジン（９７ｇ）、無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１９９ｇ）、ＳＯ３−ピリジン（３１．７ｇ；０．２モル；２当量）及びドデカノイルクロリド（２２４ｇ；１．０モル；１０．４当量）を用いて、モノスルフェートヘプタドデシルスクロースについて実施例２に記述されているように調製した。結果として、炭水化物エステル混合物Ｍ１２の無機スルフェート含量は６３％であって、それからマルトース１モル当たりスルフェート０．７６モルの平均比を計算した。
【０１２３】
Ｍ１２の分画の結果を表３に要約する。Ｍ１２−ＭＯＮＯは、７８モル％のモノスルフェートヘプタ−ドデシルマルトース及び２２モル％のモノスルフェートヘキサ−ドデシルマルトースを含み、これは、ＭＯＮＯが脂肪酸の飽和量未満で得られ得ることを確認するものである。
【０１２４】
表３：１又は２回のフラッシュクロマトグラフィーにより得られ、ＬＣ−ＭＳにより分析され、モル％として表される、ドデシルマルトース誘導体の３つの画分の組成。
【表３】
0006765371.tif 000004
【０１２５】
実施例５：モノスルフェートヘプタデシルマルトース（“Ｍ１０−ＭＯＮＯ”）
モノスルフェートヘプタデシルマルトース（ここでは“Ｍ１０−ＭＯＮＯ”として示される）を、モノスルフェートヘプタドデシルスクロースについて実施例３に記述されているように調製した。マルトース一水和物（３６．６ｇ；０．１モル）、無水ピリジン（９７ｇ）、無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１９９ｇ）、ＳＯ３−ピリジン（３１．７ｇ；０．２モル；２当量）及びデカノイルクロリド（１５４．９ｇ；０．８モル；９．７当量）が使用された量であった。スルホン化後、無機スルフェート含量は６３％であって、それからマルトース１モル当たりスルフェート０．７６モルの平均比を計算した。デカノイルクロリドの添加前に、ＬｉＣｌの１当量を、無水ピリジン中の無水ＬｉＣｌ溶液として添加すると、硫酸リチウムの沈殿をもたらし、反応混合物から無機スルフェートが完全に除去された。
【０１２６】
分画されたＭ１０のＬＣ−ＭＳ分析では、ＭＯＮＯ画分が９８モル％のモノスルフェートヘプタデシルマルトース及び２モル％のジスルフェートヘキサ−デシルマルトースを含み、高純度を示していることが明らかとなった（表４）。
【０１２７】
表４：１又は２回のフラッシュクロマトグラフィーによって得られた、デシルマルトース誘導体３つの画分の組成（モル％）。
【表４】
0006765371.tif 000005
【０１２８】
実施例６：ＭＯＮＯｓのアジュバント効果
本発明のモノスルフェート炭水化物脂肪酸エステルのアジュバント効果をウサギで決定した。この目的のために、実施例３のＧ１２−ＭＯＮＯ画分（７５モル％Ｏ−モノスルフェートＯ−テトラドデシルガラクトース＋２５モル％Ｏ−ペンタドデシルガラクトース）、実施例４のＭ１２−ＭＯＮＯ画分（７８モル％Ｏ−モノスルフェートＯ−ヘプタドデシルマルトース＋２２モル％Ｏ−モノスルフェートＯ−ヘキサドデシルマルトース）及び実施例５のＭ１０−ＭＯＮＯ画分（９８モル％Ｏ−モノスルフェートＯ−ヘプタデシルマルトース＋２モル％Ｏ−ジスルフェートＯ−ヘキサデシルマルトース）を、水中スクアラン型のサブミクロンエマルジョン中で製剤化して、Ｓ１２（自社のＣｏＶａｃｃｉｎｅ  ＨＴ類似体）、ミョウバン（公知の安全なアジュバント）及びアジュバント無しのコントロールのアジュバント効果と比較した。
【０１２９】
各ＭＯＮＯ画分について、０．２２μｍを通過し得る製剤をもたらす、スクアラン（ＢＡＳＦ、ドイツ）及びＭｏｎｔａｎｎｏｘ  ８０  ＰＰＩ（Ｓｅｐｐｉｃ、パリ、フランス）の適切な量を決定した。アジュバント製剤は、１６．０ｇ／ＬのＭＯＮＯ画分（１６ｍｇ／ｍＬ）の最終濃度になるように、欧州特許第１２２３９６９号明細書に記述されているように調製した。ＭＯＮＯ、スクアラン、ポリソルベート８０、超純水及びリン酸緩衝生理食塩水の混合物を、高圧乳化、即ち連続冷却下のマイクロフルダイザーモデルＹ１１０に３回通した。得られたアジュバント製剤は、低粘度を有する白色又は青色エマルジョンであった。これらの製剤を０．２２μｍＰＥＳフィルター（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃ．）に通して、濾液を滅菌ボトルに回収した。アジュバント製剤のその後の取り扱いは、無菌条件下で行った。アジュバント製剤は、使用するまで密封ボトル中に４℃で保管した。
【０１３０】
アジュバントＭ１０−ＭＯＮＯは、４ｇのＭ１０−ＭＯＮＯ画分、８ｇのスクアラン、４ｇのＭｏｎｔａｎｎｏｘ  ８０  ＰＰＩ、２ｇの超純水及び２３２ｇのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）から調製した。
【０１３１】
アジュバントＧ１２−ＭＯＮＯは、４ｇのＧ１２−ＭＯＮＯ画分、８ｇのスクアラン、４ｇのＭｏｎｔａｎｎｏｘ  ８０  ＰＰＩ、２ｇの超純水及び２３２ｇのＰＢＳから調製した。
【０１３２】
アジュバントＭ１２−ＭＯＮＯは、４ｇのＭ１２−ＭＯＮＯ画分、１６ｇのスクアラン、４ｇのＭｏｎｔａｎｎｏｘ  ８０、２ｇの超純水及び２２４ｇのＰＢＳから調製した。
【０１３３】
アジュバントＳ１２（自社で調製した“ＣｏＶａｃｃｉｎｅ  ＨＴ”製剤）は、１１ｇの未分画のＳ１２（実施例２；約４．３ｇのＺＥＲＯ、５．１ｇのＭＯＮＯ及び１．７ｇのＰＯＬＹを含む）、４４ｇのスクアラン、１１ｇのＭｏｎｔａｎｎｏｘ  ８０  ＰＰＩ、２ｇの超純水及び１８２ｇのＰＢＳから調製した。
【０１３４】
アジュバントＳ１２は、強力なアジュバントの基準とした。
【０１３５】
ミョウバン（ＳＳＩ、デンマーク）は、安全なアジュバントの基準とした。
【０１３６】
アジュバント無しの抗原は、ネガティブコントロールとした。
【０１３７】
試験したアジュバント製剤の組成を表５に要約する。
【０１３８】
アジュバント製剤の組成を、実施例１に記述したように試薬としてオルシノール／硫酸を用い５５０ｎｍでの吸光度を測定して炭水化物濃度を決定することにより検証した。必要に応じて、アジュバント製剤中のＭ１０−ＭＯＮＯ、Ｇ１２−ＭＯＮＯ又はＭ１２−ＭＯＮＯの濃度を１６．０ｇ／Ｌに調整した。
【０１３９】
更に、アジュバント製剤をＨＰＴＬＣで分析した。結果を図１に示す。ＳＬ−炭水化物、スクアラン、ポリソルベート８０及びＰＢＳのエマルジョンを含むいずれかのアジュバント製剤の１μＬサンプルを、ＨＰＴＬＣプレートに適用した。プレートを、ｎ−ヘキサン、ジエチルエーテル及び酢酸（２３３：１００：３．３の容量比）で展開させ、乾燥し、続けてトリエチルアミン、２−イソプロパノール及びヘプタン（１：３：８の容量比）で展開させた。炭水化物スポットを、メタノール中５％硫酸溶液を噴霧してプレートを９０℃で３０分間加熱することによって可視化した。
【０１４０】
１．０の保持係数を有するスポット（プレートの上部）はＺＥＲＯｓを表し、ＣｏＶａｃｃｉｎｅ  ＨＴ及びＳ１２のアジュバント製剤で検出され得るが、Ｍ１０−ＭＯＮＯ、Ｇ１２−ＭＯＮＯ及びＭ１２−ＭＯＮＯのアジュバント製剤では検出されない。０．２−０．５の保持係数を有するスポットはＭＯＮＯｓを表し、薬学的担体として使用されコントロールとしてこのＴＬＣ分析に含まれているＳＬ−炭水化物を欠く水中スクアラン型エマルジョンを除いて、全てのアジュバント製剤において検出され得る。０．０−０．１の保持係数を有するスポット（プレートの底部）はＰＯＬＹｓを表し、及びより少ない程度のポリソルベート８０を表す。ＰＯＬＹｓはＣｏＶａｃｃｉｎｅ  ＨＴ及びＳ１２のアジュバント製剤において検出され得、ポリソルベート８０はＳＬ−炭水化物無しの水中スクアラン型エマルジョンを含む全ての製剤において検出され得る。
【０１４１】
ＴＬＣパターンの半定量分析では、ＺＥＲＯ、ＭＯＮＯ及びＰＯＬＹのｗ／ｗ％が、ＣｏＶａｃｃｉｎｅ  ＨＴにおいて各々３２％、４１％及び２８％であり、Ｓ１２（ＬｉｔｅＶａｘ  ＢＶによって自社で調製したＣｏＶａｃｃｉｎｅ  ＨＴ様製剤）において各々３９％、４６％及び１５％であることが明らかになった。従って、オリジナルのＣｏＶａｃｃｉｎｅ  ＨＴと比較すると、Ｓ１２アジュバント製剤は、類似した量のＭＯＮＯを含んでいるが、２分の１の少ない量のＰＯＬＹを含んでいた。
【０１４２】
新規化合物のアジュバント活性を証明するために使用された抗原は、Ｔｈｅｉｓｅｎらにより記述され（Ｖａｃｃｉｎｅ、３２、ｐｐ．２６２３−２６３０、２０１４年）、Ｒ０．１０Ｃとして知られている２つの重要なマラリア抗原の組み換え融合タンパク質とした。当該抗原は、異なる地理的起源のプラスモディウム・ファルシパルム株パネルの伝播及び無性増殖を阻害する抗体を誘発することが実証されている（Ｔｈｅｉｓｅｎら、Ｖａｃｃｉｎｅ、３２、ｐｐ．２６２３−２６３０、２０１４年）。１．３３ｍｇ／ｍＬの濃度でのＲ０．１０Ｃ抗原のストック溶液は、オランダのナイメーヘンのＲａｄｂｏｕｄ  ＵＭＣにより提供された。用量は１回の注射当たりＲ０．１０Ｃタンパク質１０μｇとした。ワクチン容量は１回の注射当たり０．５ｍＬであった。第１の免疫のワクチンは、抗原調製物８μＬ、ＰＢＳ２４２μＬ及びアジュバント製剤２５０μＬから構成した。第１の免疫後に副作用が観察されなかったので、実験のアジュバントの用量を増加させることを決め（グループ３−６）、第２の免疫では２倍を用いた。第１の免疫のＭ１０−ＭＯＮＯ、Ｇ１２−ＭＯＮＯ及びＭ１２−ＭＯＮＯアジュバントの用量は４．０ｍｇであり、第２の免疫の用量は８．０ｍｇであった。第１の免疫のＳ１２アジュバントの用量はＳＬ−スクロース１１ｍｇであり、第２の注射での用量はＳＬ−スクロース２２ｍｇであった。第２の免疫のワクチンは、抗原調製物８μＬとアジュバント製剤４９２μＬとから構成した。ミョウバン（Ｓｔａｔｅｎ  Ｓｅｒｕｍ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、デンマーク）の用量は、第１及び第２の注射の両方で１１０μｇであった。
【０１４３】
表５：アジュバント製剤の組成。
【表５】
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【０１４４】
ウサギのコホートは、ＳＬ−炭水化物ベースのアジュバントに対する適切な反応性について制御された。この目的のために、先立った動物実験で注射１日後に体温が１℃上昇することが証明されたＣｏＶａｃｃｉｎｅ  ＨＴのバッチが使用された。コホートの６匹の動物に、２０ｍｇの炭水化物（スクロース）脂肪酸スルフェートエステル（ＺＥＲＯ６．４ｍｇ、ＭＯＮＯ８．２ｍｇ及びＰＯＬＹ５．６ｍｇに対応）、８０ｇのスクアラン及び２０ｇのポリソルベート８０の用量で、ＣｏＶａｃｃｉｎｅ  ＨＴのこの参照バッチの０．５ｍＬを注射した。投与１日後の平均体温は、正常値より約０．８℃高い、４０．１（±０．４）℃であった。
【０１４５】
２−３ｋｇ及び２０週齢の６匹の雌ウサギのグループに、左大腿中へ０日目に（第１の免疫）及び右大腿中へ２１日目において（第２の免疫）、筋肉内への免疫付与を行った。体温は、処置前後の異なる時間間隔で測定した。第１及び第２の注射の１日後、体温のいくらかの増加が認められたが（表６及び図２参照）、他の時間間隔では正常値が認められた（データは示さず）。
【０１４６】
表６：第１及び第２の免疫の１日後の体温。
【表６】
0006765371.tif 000007
ａ共に測定された他の４つのアジュバントのグループよりも有意に高い。
【０１４７】
４及び８ｍｇの用量での３つのＭＯＮＯ画分（グループ４、５及び６）のいずれにおいても、平均体温の有意な増加を誘発しなかった。１１ｍｇ（ＺＥＲＯ４．３ｍｇ、ＭＯＮＯ５．１ｍｇ及びＰＯＬＹ１．７ｍｇを含む）及び２２ｍｇ（ＺＥＲＯ８．６ｍｇ、ＭＯＮＯ１０．２ｍｇ及びＰＯＬＹ３．４ｍｇを含む）の用量でのＳ１２（ＣｏＶａｃｃｉｎｅ  ＨＴ様）は、第１及び第２の免疫の１日後に約０．５℃の体温の上昇を与え、これは他のグループ（グループ１、２、４、５及び６）の全反応よりも有意に高かった。体温は１日後に正常値に戻った（データは示さず）。Ｓ１２での体温の上昇は、ＣｏＶａｃｃｉｎｅ  ＨＴで認められるものの約半分であり、これは、ＣｏＶａｃｃｉｎｅ  ＨＴと比較してＳ１２中のＰＯＬＹの用量が２分の１と少ないことによる結果であると考えられる。
【０１４８】
第２の免疫の１週間後、動物を安楽死させて、Ｈｉｌｇｅｒｓが記述したように（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．６２６、ｐｐ．２５１−９、２０１０年）両方の注射部位での局所反応を採点した。各注射部位のスコアは、局所反応のサイズ（長さ×幅×深さ（ｍｍ））及び以下の不定の（ａｒｂｉｔｒａｒｙ）スコアによる性質の積とした：浮腫、変色及び筋肉構造の損失については１、線維症、肉芽腫及び結合組織については３、壊死及び膿については９、ワクチン残留については１２。
【０１４９】
いずれの動物も、中程度又は重度の局所反応を示さなかった。いくつかの動物では、軽度の有害事象が認められた。１つの動物（グループ５）を除いて、局所反応の大きさは０から数ミリメートルの間であり、局所反応の不定のスコアはほとんど０及び場合によっては１（変色及び筋肉構造の損失を示す）であった。試験した全ての動物のうち、１匹の動物のみが１より高いスコアを有し、他の全ては１以下の総合スコアを有した。局所反応は予想外に低く、予測した採点システムの検出限界がこれらの低いスコア間を区別するのに適していなかった。従って、最小限ではあるが、検出可能な局所反応を有する１グループ当たりの動物の数を報告する（表７）。
【０１５０】
表７：第１の免疫の４週間後及び第２の免疫の１週間後の局所反応。
【表７】
0006765371.tif 000008
ａ局所反応は、最小限ではあるが有意な局所影響を示す１グループ当たりの６匹の動物のうちの動物の数を表す。
【０１５１】
ＭＯＮＯｓの局所反応は、ＣｏＶａｃｃｉｎｅ  ＨＴ又は類似の製品で従前に観察されたものよりも有意に低かった。
【０１５２】
第１の免疫の前（０日目）、第１の免疫の３週間後（２１日目）及び第２の免疫の１週間後（２８日目）に、血液サンプルを採取した。抗体価はＥＬＩＳＡによって測定し、Ｔｈｅｉｓｅｎらにより記述されたように（Ｖａｃｃｉｎｅ、３２、ｐｐ．２６２３−２６３０、２０１４年）、ＥＬＩＳＡプレートのコーティングのために、免疫に使用した抗原Ｒ０．１０Ｃを用いた。算術平均抗体価（ＡＭＴ）及び標準偏差（ＳＤ）を表８に示す。
【０１５３】
表８：抗原としてＲ０．１０Ｃを使用するＥＬＩＳＡによる第１の免疫の３週間後及び第２の免疫の１週間後の抗体応答ａ。
【表８】
0006765371.tif 000009
ａ０日目の第１の免疫の前のＡＭＴ±ＳＤは、２５．６±９．３であった。
【０１５４】
第１の免疫の３週間後（２１日目）及び第２の免疫の１週間後（２８日目）の幾何平均抗体価（ＧＭＴ）、標準偏差（ＳＤ）及びａｎｔｉｌｏｇ（１０ＧＭＴ）を表９に示す。
【０１５５】
表９：抗原としてＲ０−１０Ｃを使用するＥＬＩＳＡによる第１の免疫の３週間後及び第２の免疫の１週間後の抗体応答ａ。
【表９】
0006765371.tif 000010
ａ０日目の第１の免疫の前のＧＭＴ±ＳＤは、１．４±０．２であり、ａｎｔｉｌｏｇは２３．２であった。
【０１５６】
プラスモディウム・ファルシパルムの配偶子母細胞抽出物に対する抗体価を、Ｔｈｅｉｓｅｎらにより記述されたように（Ｖａｃｃｉｎｅ  ３２、ｐｐ．２６２３−２０３０、２０１４年）、測定した。第１の免疫の３週間後（２１日目）及び第２の免疫の１週間後（２８日目）の幾何平均抗体価（ＧＭＴ）、標準偏差（ＳＤ）及びａｎｔｉｌｏｇ値（１０ＧＭＴ）を表１０に示す。
【０１５７】
表１０：：抗原としてプラスモディウム・ファルシパルムの配偶子母細胞抽出物を使用するＥＬＩＳＡによる第１の免疫の３週間後及び第２の免疫の１週間後の抗体応答ａ。
【表１０】
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ａ０日目の第１の免疫の前のＧＭＴ±ＳＤは、１．５±０．１であり、ａｎｔｉｌｏｇは３２．５であった。
【０１５８】
無性段階に対する抗体価についても、Ｔｈｅｉｓｅｎらにより記述されたように（Ｖａｃｃｉｎｅ  ３２、ｐｐ．２６２３−２０３０、２０１４年）、抗原としてプラスモディウム・ファルシパルムのシゾント抽出物を使用するＥＬＩＳＡによって測定した。第１の免疫の３週間後（２１日目）及び第２の免疫の１週間後（２８日目）の幾何平均抗体価（ＧＭＴ）、標準偏差（ＳＤ）及びａｎｔｉｌｏｇ値（１０ＧＭＴ）を表１１に示す。
【０１５９】
表１１：抗原としてプラスモディウム・ファルシパルムのシゾント抽出物を使用するＥＬＩＳＡによる第１の免疫の３週間後及び第２の免疫の１週間後の抗体応答ａ。
【表１１】
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ａ０日目の第１の免疫の前のＧＭＴ（ＳＤ）は測定していない。
【０１６０】
これらのｉｎ  ｖｉｖｏのデータを合わせると、図３に示すように、本発明のＭＯＮＯ画分のＥ／Ｔ比は、ＺＥＲＯ、ＭＯＮＯ及びＰＯＬＹの混合物である公知のＳ１２のＥ／Ｔ比よりも優れている。本発明のＭＯＮＯ画分は、Ｓ１２と同等又はわずかにより有効であり、ミョウバンより有意に有効である。更に、本発明のＭＯＮＯ画分は、ミョウバンと同等の又はわずかに低い毒性であり、Ｓ１２より有意に低い毒性である。言い換えれば、ＭＯＮＯが富化されたアジュバント製剤は、ＣｏＶａｃｃｉｎｅ  ＨＴの有効性（ＺＥＲＯ、ＭＯＮＯ及びＰＯＬＹの混合物で強力なアジュバントについての基準）に、ミョウバンの安全性（安全なアジュバントについての基準）を併せ持つ。そのようなＥ／Ｔ比を有するアジュバントは、ワクチンを含む既存及び新規の免疫学的製品における広範な適用の候補となるものである。
【０１６１】
Ｓ１２アジュバント製剤中のＭＯＮＯの用量は、Ｍ１０−ＭＯＮＯ、Ｇ１２−ＭＯＮＯ及びＭ１２−ＭＯＮＯの用量と同様である。データからの別の結論は、ＭＯＮＯのＥ／Ｔ比はＺＥＲＯ若しくはＰＯＬＹ又はその両方のＥ／Ｔ比よりも有意に高いということである。
【０１６２】
実施例７：液体クロマトグラフィーによるモノスルフェートヘプタデシルマルトース（“Ｍ１０−ＭＯＮＯ”）の精製の最適化
ＺＥＲＯ、ＭＯＮＯ及びＰＯＬＹの混合物からＭＯＮＯ画分を分離する方法を更に改良するために、固定相及び移動相の種々の組み合わせで液体クロマトグラフィーを行った。孔径６０Å、２３０−４００メッシュ粒子サイズ４０−６３μｍの乾燥シリカ高純度グレード（Ｆｌｕｋａ、カタログ番号６０７３７）と、１２ｖ／ｖ％トリエチルアミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号９０３４０）、１２ｖ／ｖ％２−イソプロパノール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号２４１３７；Ｐｈ．Ｅｕｒ）及び７６ｖ／ｖ％ヘプタン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号３２２８７；Ｐｈ．Ｅｕｒ）からなる溶離液とを用いると、純度及び収率に関して優れた結果が得られた。６０ｍＬ溶離液中Ｍ１０の２０ｇを、（真空オーブン中で１６０℃及び＜１００ｍＢａｒで少なくとも３時間乾燥させた）２６０ｇシリカから調製されたカラムに、約５００ｍＬの溶離液中において適用させた。カラムを約３Ｌ／ｈの流速で溶出させ、５０ｍＬの画分を回収した。各画分を、溶離液としてヘプタン中２０ｖ／ｖ％イソプロパノールを用いて、ＨＰＴＬＣ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｕｎｉｐｌａｔｅカタログ番号Ｚ２６５３１−４）により分析した。Ｍ１０−ＺＥＲＯは、４００−６００ｍＬの間で溶出された。Ｍ１０−ＭＯＮＯは、８００−３２００ｍＬの間で溶出された。ＰＯＬＹはカラム上に残り、１００％２−イソプロパノールで溶出させることができた。１回の液体クロマトグラフィーの実行では、半定量ＨＰＴＬＣ分析により決定すると、＜２％ＺＥＲＯ及び＜２％ＰＯＬＹを有する＞９０％Ｍ１０−ＭＯＮＯの回収の結果となった。
【０１６３】
実施例８：ＭＯＮＯ及びＰＯＬＹの比較
ＭＯＮＯｓ及びＰＯＬＹｓの調製
実施例１に記述したように、Ｄ−（＋）−ガラクトース、Ｄ−（＋）−マルトース及びマルトトリオースを、ＳＯ３−ピリジン及びデカノイルクロリド（いずれもＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手）に接触させることにより、ガラクトース脂肪酸スルフェートエステル、マルトース脂肪酸スルフェートエステル及びマルトトリオース脂肪酸スルフェートエステルを合成した。
【０１６４】
ＭＯＮＯｓであるガラクトーステトラデカン酸モノスルフェートエステル（ここより前ではモノスルフェートテトラデシルガラクトース（“Ｇ１０−ＭＯＮＯ”）として示されている）、マルトースヘプタデカン酸モノスルフェートエステル（ここより前ではモノスルフェートヘプタデシルマルトース（“Ｍ１０−ＭＯＮＯ”）として示されている）及びマルトトリオースノナ−／デカデカン酸モノスルフェートエステル（ここでは“Ｔ１０−ＭＯＮＯ”として示される）と、ＰＯＬＹｓであるガラクトースデカン酸ポリスルフェートエステル（ここでは“Ｇ１０−ＰＯＬＹ”として示される）、マルトースデカン酸ポリスルフェートエステル（ここでは“Ｍ１０−ＰＯＬＹ”として示される）及びマルトトリオースデカン酸ポリスルフェートエステル（ここでは“Ｔ１０−ＰＯＬＹ”として示される）とを、固定相として乾燥シリカを用いる分取液体クロマトグラフィーによって、それぞれ、ガラクトース脂肪酸スルフェートエステル、マルトース脂肪酸スルフェートエステル及びマルトトリオース脂肪酸スルフェートエステルから分離した。ＭＯＮＯｓをｎ−ヘプタン、イソプロパノール及びトリエチルアミン（７６：１２：１２容量％）の混合物で溶出し、ＰＯＬＹｓをイソプロパノール、トリエチルアミン、メタノール及び超純水の混合物（例えば５０：２０：２０：１０容量％）で溶出した。画分を、シリカプレート並びに溶離液としてｎ−ヘプタン、イソプロパノール及びトリエチルアミン（７６：１２：１２のｖｏｌ．％）を用いてＴＬＣにより分析した。スポットは、メタノール中５ｖ／ｖ％硫酸を噴霧し、１００℃で１０−２０分間加熱することによって可視化した。純粋なＭＯＮＯｓ又はＰＯＬＹｓを有する画分を貯めて、蒸発乾燥させた。
【０１６５】
ＭＯＮＯ又はＰＯＬＹ、Ｔｗｅｅｎ  ８０、スクアラン及びリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を混合し、その混合物を高圧乳化機に３回通し、当該サブミクロンエマルジョンを０．２μｍフィルターに通し、及びそのエマルジョンを滅菌容器中に回収することにより、滅菌された使用準備済みの水中油型のアジュバント製剤を調製した。ＭＯＮＯ又はＰＯＬＹ、Ｔｗｅｅｎ  ８０及びスクアランの濃度は４０ｇ／Ｌであった。
【０１６６】
ＰＢＳ中のＭＯＮＯｓ及びＰＯＬＹｓの水性製剤は、ＭＯＮＯ又はＰＯＬＹ１ｇ当たり、１ｇのポリソルベート８０を添加することによって調製した。
【０１６７】
ＭＯＮＯｓ及びＰＯＬＹｓを含むサブミクロンエマルジョンの安定性
４℃又は室温で２週間後、ＰＯＬＹｓのうちの１つを有するエマルジョンは相分離を示したが、ＰＯＬＹを含まない又はＭＯＮＯｓのうちの１つを有するエマルジョンは相分離を示さなかった。これは、ＰＯＬＹｓがエマルジョンの物理的安定性の有害な影響を持ち、ＭＯＮＯｓは持たないことを示す。
【０１６８】
ＭＯＮＯｓ及びＰＯＬＹｓのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの溶血活性
ＭＯＮＯｓ及びＰＯＬＹｓの溶血活性を、ＰＢＳ中のいずれかの化合物を段階希釈した水性製剤を、９６ウェルＶ字型マイクロタイタープレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）中で１ｖ／ｖ％ヒツジ赤血球と混合することによって決定した。周囲温度で１時間インキュベートした後、５０％溶血を与える化合物の濃度を決定した（表１２）。ＭＯＮＯｓであるＧ１０−ＭＯＮＯ、Ｍ１０−ＭＯＮＯ及びＴ１０−ＭＯＮＯの溶血活性は、ＰＯＬＹｓであるＧ１０−ＰＯＬＹ、Ｍ１０−ＰＯＬＹ及びＴ１０−ＰＯＬＹの溶血活性よりも１００分の１から３０００分の１未満まで低かった。
【０１６９】
表１２：種々のＭＯＮＯｓ及びＰＯＬＹｓの溶血活性。
【表１２】
0006765371.tif 000013
【０１７０】
ＭＯＮＯｓ及びＰＯＬＹｓのｉｎ  ｖｉｖｏでの効果
６匹のウサギのグループに、アジュバント有り又は無しの１５μｇＨＡの用量で、メイディン・イヌ腎細胞に増殖したＨ５Ｎ１（台湾のＭｅｄｉｇｅｎ  Ｖａｃｃｉｎｅ社より快く提供されたもの）を用いて、０日目（“免疫前”）及び２１日目に筋肉内に免疫付与を行った。免疫反応（表１３及び表１４ａ−表１４ｃ）、体温（表１５）、体重増加（表１６）及び局所反応（表１７及び図４ａ−図４ｉ）を、個々の動物において所定の時間間隔で決定した。ｉｎ  ｖｉｖｏ及びｅｘ  ｖｉｖｏの分析は単一の盲検試験として実施され、処置は試験の完了後に開示された。
【０１７１】
免疫応答におけるＭＯＮＯｓ及びＰＯＬＹｓの効果
６匹の動物の７グループの血液サンプルを、０日目、２１日目及び２８日目に採取した。２１日目及び２８日目の個々の血清サンプル並びに０日目の７つの血清サンプルの６つの貯蔵液（ｐｏｏｌ）における抗体価を測定した。
【０１７２】
Ｈ５Ｎ１に対する赤血球凝集阻害（ＨＩ）抗体価は、いくらか変形させて世界保健機構による実験室手順“Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｖｉａｎ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ（Ｈ７Ｎ９）  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ  ｂｙ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｈｏｒｓｅ  ｒｅｄ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌｓ  ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ−ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ”（２０１３年）に記述されているように測定した。簡潔に言うと、５６℃で３０分間前処理した血清サンプル１００μＬに、プロテアーゼフリーウシ血清アルブミン画分Ｖ０．５ｗ／ｖ％を含む冷ＰＢＳ（“ＰＢＳ／ＢＳＡ”；Ｓｉｇｍａ）４００μＬと、濃縮したウマ赤血球５０μＬとを添加した。冷却遠心分離を３０分間行った後、上清１００μＬを回収し、ＰＢＳ／ＢＳＡ中の受容体分解酵素溶液（コレラ濾液；Ｓｉｇｍａ）１００μＬを添加し、３７℃で一晩保った。その後、酵素を破壊するために、当該前処理した血清サンプルを５６℃で３０分間保った。１／１０に予め希釈したこれらの血清サンプル５０μＬを、ＰＢＳ／ＢＳＡ中に２倍に段階希釈した。８つの赤血球凝集価を有するＰＢＳ／ＢＳＡ中のＨ５Ｎ１懸濁液５０μＬを添加し、室温で３０分間保った。続いて、ＰＢＳ／ＢＳＡ中の０．７５％の濃縮したウマ赤血球懸濁液５０μＬを添加して、６０分後に凝集阻害を決定した。
【０１７３】
免疫前血清の貯蔵液は１３のＨＩ力価を与えた（表１３）。アジュバント無しの第１の免疫後では力価は３４であり、アジュバント有りでは５７から１１３の間であった。増加倍数は２から３の間であった。アジュバント無しの第２の免疫後、力価は１３５に上昇し、アジュバント有りでは３５９から１２０８の間まで上昇した。増加倍数は３から９までに変化した。
【０１７４】
表１３：異なるアジュバントを用いたＨ５Ｎ１での第１及び第２の免疫後のＨ５Ｎ１に対するＨＩ抗体応答ａ。
【表１３】
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ａ０日目の第１の免疫前のＧＭＴ±ＳＤは３．７±０．３であり、ａｎｔｉｌｏｇは１３であった。
【０１７５】
Ｈ５Ｎ１（“Ｈ５Ｎ１”と指定；Ｍｅｄｉｇｅｎ  Ｖａｃｃｉｎｅ社、台湾）に対する同種抗体価、並びに、Ａ／Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ  Ｈ１Ｎ１（“Ｈ１Ｎ１”と指定；オランダのウェースプのＳｏｌｖａｙ−Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓより快く提供された商業バッチ）及びＡ／Ｐａｎａｍａ  ２００７／１９９９  Ｈ３Ｎ２（“Ｈ３Ｎ２”と指定；オランダのウェースプのＳｏｌｖａｙ−Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓより快く提供された商業バッチ）に対する異種（交差反応性）抗体価を、コーティング抗原としてＨ５Ｎ１、Ｈ１Ｎ１及びＨ３Ｎ２を用いたＥＬＩＳＡによって決定した。
【０１７６】
試験条件は予備試験で検証された。ＥＬＩＳＡプレートを、コーティング緩衝液（炭酸緩衝液；０．１Ｍ；ｐＨ＝９．６）１ｍＬ当たり２μｇの抗原でコーティングした。洗浄後、リン酸緩衝生理食塩水中２ｗ／ｖ％ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）でプレートをブロックした。血清サンプルを予め希釈し、リン酸緩衝生理食塩水中１ｗ／ｖ％ウシ血清アルブミン中で段階希釈した。ヤギ抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰＯ複合体（ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）、アフィニティー精製されたＦ（ａｂ）２断片、ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合体、１ｍｇ／ｍＬ；Ｎｏｖｅｘ、米国）を、リン酸緩衝生理食塩水中１ｗ／ｖ％ウシ血清アルブミン中において、１／１００００に希釈した。３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンの使用準備済み溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を基質として使用した。酵素反応は、１Ｍ硫酸の１容量を用い、室温で２０分後に停止させた。血清濃度対消光の値のプロットの線形部分の回帰係数から力価を計算し、１．０の光学密度をもたらす血清濃度のｌｏｇ値として表した。コーティング抗原が存在しない場合、有意な応答（ｌｏｇ値＜１）は認められなかった。各グループについて、幾何平均力価（ＧＭＴ）、標準偏差（ＳＤ）及びａｎｔｉｌｏｇ値を計算した。増加倍数は、アジュバントグループのａｎｔｉｌｏｇ値を、コントロール（ＰＢＳ）グループのａｎｔｉｌｏｇ値で割ることによって計算した。０日目（免疫前）におけるＨ５Ｎ１、Ｈ１Ｎ１及びＨ３Ｎ２に対するＥＬＩＳＡ力価は低く、試験系のバックグラウンドと考えた。
【０１７７】
アジュバント無しの第１及び第２の免疫後の抗Ｈ５Ｎ１抗体価はそれぞれ１１６７６及び４８８２９９であり、アジュバント有りでは５倍まで増加した（表１４ａ）。
【０１７８】
アジュバント無しの第２の免疫後の抗Ｈ１Ｎ１抗体価は７９１１であり、アジュバント有りでは３倍まで増加した（表１４ｂ）。
【０１７９】
第１及び第２の免疫後の抗Ｈ３Ｎ２抗体価はそれぞれ４４４及び７７６であり、アジュバント有りでは応答において６倍まで増加した（表１４ｃ）。
【０１８０】
Ｇ１０−ＰＯＬＹと比較して、Ｇ１０−ＭＯＮＯは、Ｈ５Ｎ１、Ｈ３Ｎ２及びＨ１Ｎ１に対してより高いＥＬＩＳＡ抗体応答を与えた。Ｍ１０−ＰＯＬＹと比較して、Ｍ１０−ＭＯＮＯは、Ｈ３Ｎ２及びＨ１Ｎ１に対してより高い応答を与えたが、Ｈ５Ｎ１に対しては同様の応答を与えた。従って、ＭＯＮＯは、対応するＰＯＬＹと少なくとも同等及び多くはより優れた活性を示す。
【０１８１】
驚くべきことに、Ｇ１０−ＰＯＬＹ及びＭ１０−ＰＯＬＹを用いた免疫は、Ｈ３Ｎ２及びＨ１Ｎ１に対して低い力価をもたらし、時にはアジュバント無しの免疫よりも低くなることさえもある。これは、免疫原の抗原性部分がＧ１０−ＰＯＬＹ及びＭ１０−ＰＯＬＹによって破壊されるということで説明がつく。このようなＰＯＬＹｓの有害な影響は、ワクチンの品質及び安定性に悪影響を有するため、重大な欠点である。これらの劇的な影響は、抗原とアジュバントの混合及び低温（４℃）での混合物の保持の数日後以内に既に起こるので、ワクチン調製物中のＰＯＬＹの存在は可能な限り避けられるべきである。
【０１８２】
免疫に使用されるＨ５Ｎ１並びに検出に使用されるＨ３Ｎ２及びＨ１Ｎ１は、異なる基質上で増殖され精製されたので、抗Ｈ３Ｎ２及び抗Ｈ１Ｎ１抗体は、交差反応性ウイルス抗原を認識する。交差反応性抗原部分についての有害な影響は、交差反応性抗原をベースとする一般的なインフルエンザワクチンについてのアジュバントとして、ＰＯＬＹｓを不適切にするものである。
【０１８３】
表１４ａ：Ｈ５Ｎ１での免疫後のＨ５Ｎ１（免疫原）に対するＥＬＩＳＡ抗体応答における異なるアジュバントの効果ａ。
【表１４ａ】
0006765371.tif 000015
ａ０日目の第１の免疫前のＧＭＴ±ＳＤは１．２３±０．３８であり、ａｎｔｉｌｏｇは１７であった。
【０１８４】
表１４ｂ：ウサギにおけるＨ５Ｎ１での免疫後のＨ１Ｎ１に対するＥＬＩＳＡ抗体応答における異なるアジュバントの効果ａ。
【表１４ｂ】
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ａ０日目の第１の免疫前のＧＭＴ±ＳＤは０．２９±０．２３であり、ａｎｔｉｌｏｇは２であった。
【０１８５】
表１４ｃ：ウサギにおけるＨ５Ｎ１での免疫後のＨ３Ｎ２に対するＥＬＩＳＡ抗体応答における異なるアジュバントの効果ａ。
【表１４ｃ】
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ａ０日目の第１の免疫前のＧＭＴ±ＳＤは０．５２±０．３３であり、ａｎｔｉｌｏｇは３であった。
【０１８６】
体温におけるＭＯＮＯｓ及びＰＯＬＹｓの影響
個々のウサギの体温を、免疫前後の様々な日数間隔で測定した。第１の免疫の１及び２日後の体温の平均±ＳＤ増加を表１５に示す。対応するＰＯＬＹ対応物と比較して、Ｇ１０−ＭＯＮＯ及びＭ１０−ＭＯＮＯは体温の上昇が低かった。
【０１８７】
表１５：第１の免疫の１及び２日後の体温上昇。
【表１５】
0006765371.tif 000018
【０１８８】
体重増加におけるＭＯＮＯｓ及びＰＯＬＹｓの影響
個々のウサギの体重増加を観察し、第１の免疫の２週間後の平均±ＳＤ増加を表１６に示す。実験動物は若いものであり、まだ成長すると予測され、従って、より少ない体重増加は治療の望ましくない副作用としての成長阻害を反映する。動物の収容及び給餌の同様の条件下で、Ｇ１０−ＰＯＬＹはＧ１０−ＭＯＮＯよりも有意に少ない体重増加を与えたことが見出された。
【０１８９】
表１６：第１の免疫後の体重における増加。
【表１６】
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【０１９０】
免疫後の局所反応におけるＭＯＮＯｓ及びＰＯＬＹｓの影響
局所反応を２８日目に分析した。各グループの幾何平均スコア（ＧＭＳ）±ＳＤ及びａｎｔｉｌｏｇ値を表１７に示す。第２の免疫の１週間後、Ｇ１０−ＰＯＬＹ及びＭ１０−ＰＯＬＹはそれぞれ１２２６１及び２３６４のスコアを与えたが、一方、Ｇ１０−ＭＯＮＯ及びＭ１０−ＭＯＮＯはそれぞれ５１及び２２の有意に低いスコアを与えた。ＰＯＬＹｓについての局所反応の大きさは直径２ｃｍまでであって、図４ｂ−図４ｉに示すように肉芽腫及び壊死を示した。
【０１９１】
表１７：第１及び第２の免疫後の注射部位における局所反応。
【表１７】
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【０１９２】
ＭＯＮＯｓには無いＰＯＬＹｓのこれらの悪影響は、本発明を明確に示している。顕著な例は、Ｇ１０−ＭＯＮＯ対Ｇ１０−ＰＯＬＹである。Ｇ１０−ＰＯＬＹと比較すると、Ｇ１０−ＭＯＮＯは、第２の免疫の１週間後に４０倍大きい抗Ｈ３Ｎ２抗体応答及び５倍大きい抗Ｈ１Ｎ１抗体応答を現し、第１の免疫の２週間後に４倍多い体重増加を現し、第１の免疫後に２分の１の低い体温上昇を現し、及び第２の免疫の１週間後に２４０分の１の小さい局所反応スコアを現している。
【０１９３】
例えば第２の免疫の１週間後の抗Ｈ３Ｎ２抗体価での有効性と、局所反応スコアでの毒性とのデータを組み合わせると、Ｇ１０−ＭＯＮＯで２０５０／５１＝４０及びＧ１０−ＰＯＬＹで５４／１２２６１＝０．００４４である有効性／毒性（Ｅ／Ｔ）比が明らかとなる。これは、Ｇ１０−ＭＯＮＯのＥ／Ｔ比がそのＰＯＬＹ対応物のＥ／Ｔ比よりも９０８２倍大きいことを意味する。
【０１９４】
同様に、Ｍ１０−ＭＯＮＯ及びＭ１０−ＰＯＬＹの計算されたＥ／Ｔ比はそれぞれ４７１１／２２＝２１４及び６３５／２３６４＝０．２６８６であり、これは、Ｍ１０−ＰＯＬＹと比較して、Ｍ１０−ＭＯＮＯの７９７倍大きいＥ／Ｔ比を意味する。
【０１９５】
ＭＯＮＯｓ及びＰＯＬＹｓのＥ／Ｔ比におけるこの差異を、ＭＯＮＯ又はＰＯＬＹのいずれかで免疫化した動物の個々のデータを表す図５に更に示す。
【０１９６】
要するに、ＭＯＮＯｓとは対照的に、ＰＯＬＹｓは重大な不利益及び欠点を有する。高溶血活性、エマルジョンの急速な不安定化及び抗原性エピトープの破壊等の観察されたＰＯＬＹｓのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの有害影響は、ＰＯＬＹを含むワクチンの品質及び安定性に悪影響を有する。全身及び局所の有害事象等のＰＯＬＹｓのｉｎ  ｖｉｖｏでの有害影響は、ワクチンのｉｎ  ｖｉｖｏでの性能、Ｅ／Ｔ比及びそれ故の利益／リスク比に悪影響を有する。従って、ワクチンを含む医薬製品中のＰＯＬＹの存在は、可能な限り避けられるべきである。
【０１９７】
炭水化物ポリスルフェート脂肪酸エステル（ＰＯＬＹｓ）を欠く炭水化物スルフェート脂肪酸エステルは、医薬製品及び／又はワクチンアジュバントとして重要な利益を有することが見出された。一般的に、異なる活性特性を有する複数の活性成分を含む医薬製品の開発及び商業的開拓は極めて複雑であり、莫大な努力を必要とし、高い失敗のリスクを伴う。
【０１９８】
安全性、有効性及び品質は医薬製品の３つの鍵となる成功要因であり、これら３つの要因のうちの１つに悪影響を有するワクチン及び化合物を当該医薬品に含ませることは可能な限り避けるべきである。本発明は、有望なワクチンアジュバントとして、ポリスルフェートエステルを欠く炭水化物スルフェート脂肪酸エステルに関する。
【０１９９】
（付記）
（付記１）
少なくとも１つのスルフェート基及び少なくとも１つの脂肪酸で置換された炭水化物である硫脂質−炭水化物を含む炭水化物エステル混合物と、薬学的に許容される担体と、を含み、
前記炭水化物エステル混合物の１０モル％未満が、２つ以上のスルフェート基で置換されている、
アジュバント。
【０２００】
（付記２）
前記炭水化物エステル混合物の５モル％未満、好ましくは２モル％未満が、２つ以上のスルフェート基で置換されている、付記１に記載のアジュバント。
【０２０１】
（付記３）
前記炭水化物エステル混合物は、５０モル％以下、好ましくは２５モル％以下、より好ましくは１０モル％以下の、スルフェート基を持たない炭水化物エステルを含む、付記１又は２に記載のアジュバント。
【０２０２】
（付記４）
前記炭水化物は、単糖類、二糖類、三糖類、シクロデキストリン又はそれらの混合物である、付記１から３のいずれか１つに記載のアジュバント。
【０２０３】
（付記５）
前記単糖類は、アロース、アルトロース、グルコース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、タロース、プシコース、フルクトース、ソルボース、タガトース、アラビノース、リボース、キシロース、リキソース、リブロース、キシルロース及びイノシトールからなる群から選択される１又は複数であり、
前記二糖類は、スクロース、マルトース、ラクトース、ラクツロース、セロビオース、トレハロース、ゲンチオビオース、ツラノース、イソマルツロース及びメリビオースからなる群から選択される１又は複数であり、
前記三糖類は、ラフィノース、メレジトース、マルトトリオース、イソマルトトリオース、ケストース及びニゲロトリオースからなる群から選択される１又は複数であり、及び／又は、
前記シクロデキストリンは、α−、β−若しくはγ−シクロデキストリンである、
付記４に記載のアジュバント。
【０２０４】
（付記６）
前記炭水化物のヒドロキシル基の１つが、スルフェート基で置換されており、
前記炭水化物の残りのヒドロキシル基の実質的に全てが、脂肪酸で置換されている、
付記１から５のいずれか１つに記載のアジュバント。
【０２０５】
（付記７）
前記脂肪酸は、６−１８の炭素原子を有する、付記１から６のいずれか１つに記載のアジュバント。
【０２０６】
（付記８）
前記脂肪酸は、８−１２の炭素原子を有する、付記７に記載のアジュバント。
【０２０７】
（付記９）
前記薬学的に許容される担体は、生理学的塩溶液、生理学的塩溶液中の不溶性有機若しくは無機化合物の懸濁液、又は、水不混和性化合物と生理学的塩溶液とのエマルジョンである、付記１から８のいずれか１つに記載のアジュバント。
【０２０８】
（付記１０）
前記水不混和性化合物と生理学的塩溶液とのエマルジョンは、水中油型エマルジョンを含む、付記９に記載のアジュバント。
【０２０９】
（付記１１）
油は、スクアラン、スクアレン、植物油及び鉱油からなる群から選択される１又は複数である、付記９又は１０に記載のアジュバント。
【０２１０】
（付記１２）
前記油は、スクアランである、付記１１に記載のアジュバント。
【０２１１】
（付記１３）
医療用途のための、付記１から１２のいずれか１つに記載のアジュバント。
【０２１２】
（付記１４）
抗原成分により引き起こされる免疫応答を増加させるための、付記１３に記載のアジュバント。
【０２１３】
（付記１５）
前記抗原成分は、死滅した細菌、ウイルス若しくは寄生生物のような死滅した微生物、微生物に由来する成分若しくは成分の混合物、又は、化学的若しくは組み換えＤＮＡ技術により調製される微生物の関連抗原成分を模倣する成分若しくは成分の混合物であり、或いは、
前記抗原成分は、アレルゲン又は治療目的で宿主に対する免疫応答が望まれる当該宿主の成分である、
付記１４に記載のアジュバント。
【０２１４】
（付記１６）
付記１から１２のいずれか１つに記載のアジュバント及び抗原成分を含む、ワクチン。
【０２１５】
（付記１７）
前記抗原成分は、死滅した細菌、ウイルス若しくは寄生生物のような死滅した微生物、微生物に由来する成分若しくは成分の混合物、又は、化学的若しくは組み換えＤＮＡ技術により得られる微生物の関連抗原成分を模倣する成分若しくは成分の混合物であり、或いは、
前記抗原成分は、アレルゲン又は治療目的で宿主に対する免疫応答が望まれる当該宿主の成分である、
付記１６に記載のワクチン。
【０２１６】
（付記１８）
付記１から１３のいずれか１つに記載のアジュバント、及び必要に応じて抗原成分を含む、部品のキット。
【０２１７】
（付記１９）
少なくとも１つのスルフェート基及び少なくとも１つの脂肪酸で置換された炭水化物である硫脂質−炭水化物を含む炭水化物エステル混合物であって、
当該炭水化物エステル混合物の１０モル％未満が、２つ以上のスルフェート基で置換されている、
炭水化物エステル混合物。
【０２１８】
（付記２０）
前記炭水化物のヒドロキシル基の１つが、スルフェート基で置換されており、
前記炭水化物の残りのヒドロキシル基の実質的に全てが、脂肪酸で置換されている、
付記１９に記載の炭水化物エステル混合物。
【０２１９】
（付記２１）
炭水化物のエステル化及び分画を含み、
前記エステル化は、炭水化物をスルホン化剤及び反応性脂肪酸アシル化合物と反応させ、炭水化物エステル混合物を得ることを含み、
前記分画は、前記炭水化物エステル混合物から２つ以上のスルフェート基を有する炭水化物エステルを除去して、モノスルフェート炭水化物脂肪酸エステルを含む混合物を得ることを含む、
モノスルフェート炭水化物脂肪酸エステルを含む炭水化物エステル混合物であって、当該炭水化物エステル混合物の１０モル％未満が２つ以上のスルフェート基で置換されている、炭水化物エステル混合物の調製方法。
【０２２０】
（付記２２）
前記分画は、前記炭水化物エステル混合物からのスルフェート基を持たない炭水化物エステルの除去を更に含む、付記２１に記載の方法。
【０２２１】
（付記２３）
付記２１又は２２により得ることができる、炭水化物エステル混合物。
【０２２２】
（付記２４）
アジュバントとして使用される、付記２１又は２２により得ることができる、炭水化物エステル混合物。
【０２２３】
（付記２５）
付記２１又は２２により得ることができる炭水化物エステル混合物を含む、アジュバント。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図４ｄ】
0006765371.tif 000027
【図４ｅ】
0006765371.tif 000028
【図４ｆ】
0006765371.tif 000029
【図４ｇ】
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【図４ｈ】
0006765371.tif 000031
【図４ｉ】
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【図５】
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