(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペプチドの治療有効量および第１抗体の治療有効量を含む医薬組成物であって、該ペプチドが配列番号１によって表される活性配列を有し、該第１抗体がＣＴＬＡ−４に対するものである、医薬組成物。
【請求項２】
ペプチドが、配列番号３に記載の構造を有する、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
第２抗体をさらに含み、第２抗体が、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、およびＰＤ−Ｌ２からなる群より選択される第２の免疫チェックポイントタンパク質に対するものである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
治療有効量が、対象の免疫応答を活性化するために十分な量である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
治療有効量が、がんを有する対象におけるがんを治療するために十分な量である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
がんが、膀胱がん、脳がん、乳がん、結腸がん、頭部および頸部がん、肝臓がん、肺がん、膵臓がん、前立腺がん、卵巣がん、腎臓がんおよび皮膚がんからなる群から選択される、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
がんが、結腸直腸腺癌、神経膠芽腫、肝細胞癌、ホルモン不応性前立腺がん、卵巣上皮癌、卵巣腺癌、メラノーマ、中皮腫、非小細胞肺がん、小細胞肺がんおよび腎細胞癌からなる群から選択される、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
治療有効量が、ウイルス、マイコバクテリアまたは寄生虫によって生じる感染症を治療するために十分な量である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
治療有効量が、腫瘍内の制御性Ｔ細胞集団を抑制するために十分な量である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
治療有効量が、エフェクターＴ細胞集団を増加させるために十分な量である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
治療有効量が、ＩＬ−２、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−２１、ＩＬ−２７、ＴＮＦαおよびＩＦＮγからなる群から選択される少なくとも１つの抗がんサイトカインのレベルを増大させるために十分な量である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
ペプチドの治療有効量が、約０．１ｎｍｏｌ／ｋｇ体重から約１５００ｎｍｏｌ／ｋｇ体重、約１ｎｍｏｌ／ｋｇ体重から約１０００ｎｍｏｌ／ｋｇ体重、または約１ｎｍｏｌ／ｋｇ体重である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
第１抗体が、ＣＴＬＡ−４に対するモノクローナル抗体である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
対象における免疫系を活性化するための医薬品の製造における組成物の使用であって、該組成物が免疫系を活性化するために十分な量のペプチドおよび第１抗体を含み、ペプチドが配列番号１によって表される活性配列を有し、第１抗体がＣＴＬＡ−４に対するものである、使用。
【請求項１６】
対象における免疫応答の活性化に使用するための、請求項１、２、４、および６〜１４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
対象ががんを有し、照射治療と組み合わせて用いられることを特徴とする、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
免疫応答を活性化するためのキットであって、請求項１、２、および１６のいずれか一項に記載の医薬組成物を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願のデータ
本出願は、本明細書に参考として全体を組み込んだ２０１４年１２月１９日出願の米国特許仮出願第６２／０９４９４４号の優先権の利益を主張する。
【０００２】
電子出願された文書の参照
本明細書と同時に提出し、以下に特定した、コンピュータによって読み取り可能なヌクレオチド／アミノ酸配列リスト、２０１５年１２月１６日作成の名称「配列リスト」のＡＳＣＩＩ（テキスト）ファイル８９５バイトを本明細書に参考として全体を組み込む。
【０００３】
技術分野
本発明は、免疫応答を活性化するペプチドを含む組成物およびがんの治療を含む免疫療法のためのこの組成物の使用方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
脊椎動物では、免疫系には、自然免疫系および適応免疫系が含まれる。自然免疫応答は、例えば、宿主の分子から病原体を区別するパターン関連分子パターンによって、非特異的な方法で病原体を認識する一方、適応免疫系は特異的な抗原を対象とする。適応免疫応答の特異性は、抗原との相互作用によって授けられ、抗原は適応免疫細胞に主要組織適合分子（ＭＨＣ）との複合体として提示される。抗原提示によっていくつかのＴ細胞サブグループが活性化され得る。
【０００５】
ナイーブＴ細胞とＭＨＣ複合体との相互作用には、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）に抗原が結合することに加えてＣＤ４またはＣＤ８と相互作用することも必要である。クラスＩＭＨＣは、体の有核細胞のほとんど全てにおいて発現することができ、細胞傷害性型のＴ細胞において主に発現するＣＤ８と相互作用する。これらの細胞は、細胞の活性化を引き起こす抗原を提示している細胞の死を誘導することができるので、組織損傷を防御するために強く制御されている。細胞傷害性Ｔ細胞の活性化には、ＭＨＣ複合体の強いシグナルまたはヘルパーＴ細胞によるさらなる活性化が必要である。ヘルパーＴ細胞はＣＤ４の発現により特徴付けられ、したがってクラスＩＩＭＨＣと相互作用する。これらの細胞は、その活性化を引き起こす抗原を有する細胞を殺滅する能力はないが、これらの細胞は抗原によって開始した免疫応答を管理する。ナイーブヘルパーＴ細胞の活性化によって、抗原提示細胞を活性化するか、または細胞傷害性Ｔ細胞を活性化することができるサイトカインの放出が引き起こされる。例えば、Ｔｈ１またはＴｈ２ヘルパーＴ細胞は異なる型の抗原に対して免疫応答を増強する。Ｔｈ１応答は、インターフェロン−γ（ＩＦＮγ）を放出することが特徴で、貪食細胞、細胞傷害性Ｔ細胞の活性化および抗原に応答して様々なサイトカインの放出を導く。Ｔｈ２応答は、インターロイキン−４（ＩＬ−４）を放出することが特徴で、細胞外液中に認められる分泌抗体、補体タンパク質およびある種の抗菌ペプチドなどの高分子が媒介する応答を導く。
【０００６】
免疫系はまた、免疫応答が損傷をもたらす可能性を制限する免疫抑制も提供する。Ｔ細胞の免疫抑制的な制御性Ｔ細胞亜集団は、細胞傷害性Ｔ細胞応答を弱め、通常は過剰刺激および自己免疫の発生を防ぐ。ナイーブＴ細胞への分化の前であっても、Ｔ細胞前駆体の一群は、自己ペプチドＭＨＣ複合体と適度に相互作用することによって胸腺中の天然の制御性Ｔ細胞に分化する。制御性Ｔ細胞には、胸腺の外側のＣＤ４＋Ｔ細胞から発生した誘導性制御性Ｔ細胞も含まれる。天然の制御性Ｔ細胞は、抗原提示細胞との相互作用によってＴ細胞活性化を抑制し、Ｔ細胞活性化に負のシグナルを与える一方、誘導性制御性Ｔ細胞はＴ細胞増殖を阻害するサイトカインを産生する。
【０００７】
活性免疫応答と抑制免疫応答との間の不均衡は、がん、免疫不全（例えば、後天性免疫不全症候群）、自己免疫疾患または過敏症反応もしくはより悪化した疾患および感染症、例えば、結核、リーシュマニアもしくはマラリアなどの疾患および病態を引き起こすことがある。
【０００８】
免疫細胞は、体に起こり得る危険性を見回るので、免疫細胞は腫瘍も排除する。強い抗がん免疫応答には、抗体（適応型、体液型）および活性細胞媒介型が必要である。これらの２つの型の間の相互関係は、樹状細胞（一次抗原提示細胞型、ＡＰＣ）の活性化およびその後のＢ細胞による抗体産生によって行われる。次に、がん細胞の破壊が２つのプロセス、好中球、ナチュラルキラー細胞、細胞傷害性Ｔ細胞およびマクロファージによる細胞傷害性細胞応答ならびに活性化マクロファージおよび好中球によって行われる抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）によって生じる。腫瘍細胞はしばしば、放射線治療または化学療法によって抗原提示のために消化されやすくすることができる。これらの細胞が活性化されると、がんの主要な特徴である免疫抑制または「免疫破壊の回避」を打ち負かす多岐にわたる取り組みが実現する（ＨａｎａｈａｎおよびＷｅｉｎｂｅｒｇ、２０１１年）。ＨａｎａｈａｎおよびＷｅｉｎｂｅｒｇががんの起源について「体細胞突然変異説」を提唱する一方、Ｓｏｎｎｅｎｓｃｈｅｉｎ等（２０１４）は、がんは組織の組織化の破綻、または「組織の組織化フィールド理論」から生じるというもう１つの案を提唱した。
【０００９】
免疫療法の目的は、免疫系がこれらの疾患を克服する能力を回復させることである。伝統的な免疫療法の標的は、腫瘍関連抗原（例えば、Ｔｎ抗原もしくはＴｆ抗原）あるいはウイルスもしくは細菌の表面上またはウイルスもしくは細菌が感染した細胞の表面上で発現した糖鎖付加基などの標的細胞に特異的な抗原であった。例えば、これらの抗原を使用するワクチン接種は、これらの抗原に対する抗体の体内産生を誘導し、免疫応答を開始させる。伝統的な取り組みはまた、免疫系の刺激を促進するためにアジュバントを使用するが、免疫応答をより理解することによって、免疫細胞を活性化して免疫系を直接または間接的に刺激して免疫応答を開始することができる潜在的な因子候補が増えた。免疫チェックポイントを理解することによって、免疫療法が免疫応答平衡の制御に関連するタンパク質を標的とすること、例えば、制御性Ｔ細胞集団を抑制または増強することが可能となった。したがって、免疫療法は現在、１）抗体の体内産生を誘導し、２）開始する免疫応答の型を操作する外来性抗体を提供し、３）免疫系チェックポイントからの因子によって特定の免疫細胞を活性化または抑制することができる。
【００１０】
本発明は、例えば、腫瘍の免疫原性を促進するために、免疫療法を改善するためのこれらの取り組みの組合せを対象とする。特に、本発明は、免疫チェックポイントタンパク質またはがんマーカーに対する外来性抗体などの抗体と組み合わせたペプチドの使用を対象とする。糖を模倣した、免疫系の重要な細胞によって発現される制御性レクチン型受容体に結合するペプチドは、免疫応答を増強することができ、外来性抗体は治療上有益となり得る。
【発明の概要】
【００１１】
本発明は、配列番号１（ＶＱＡＴＱＳＮＱＨＴＰＲ；本明細書では、「ｓｖＬ４」とも称する）によって表される活性ペプチド配列を有するペプチドの治療有効量および第１抗体の治療有効量を含む、適応免疫応答を活性化する組成物およびキットを提供する。このペプチドは４価であってもよい。例えば、このペプチドは構造「（ＶＱＡＴＱＳＮＱＨＴＰＲＧＧＧＳ）２Ｋ］２Ｋ−ＮＨ２（配列番号３）を有する。一部の実施形態では、第１抗体は免疫チェックポイントタンパク質に対するものである。一部の態様では、組成物およびキットは第２抗体を含み、この第２抗体は第１抗体とは異なる免疫チェックポイント経路の免疫チェックポイントタンパク質に対するものである。本発明の実施形態はさらに、薬学的に許容される担体を含んでいてもよい。免疫チェックポイントタンパク質は、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ−４）、プログラム死１（ＰＤ−１）または一部の実施形態におけるプログラム死−リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）およびプログラム死−リガンド２（ＰＤ−Ｌ２）などのＰＤ−１のリガンドの少なくとも１つから選択される。
【００１２】
治療有効量とは、対象における免疫応答を活性化するために十分な量である。一部の態様では、治療有効量とは、対象におけるがんを治療するために十分な量である。がんは、膀胱がん、脳がん、乳がん、結腸がん、頭部および頸部がん、肝臓がん、肺がん、膵臓がん、前立腺がん、卵巣がん、腎臓がんまたは皮膚がん、例えば、結腸直腸腺癌、神経膠芽腫、肝細胞癌、ホルモン不応性前立腺がん、卵巣上皮癌、卵巣腺癌、メラノーマ、中皮腫、非小細胞肺がん、小細胞肺がんまたは腎細胞癌であってもよい。
【００１３】
一部の実施形態では、治療有効量は制御性Ｔ細胞集団を抑制するために十分な量である。別の実施形態では、治療有効量はエフェクターＴ細胞集団を増加させるために十分な量である。さらに別の実施形態では、治療有効量はＩＬ−２、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−２１、ＩＬ−２７、ＴＮＦαおよびＩＦＮγなどの抗がんサイトカインのレベルを上昇させるために十分な量である。一部の態様では、抗がんサイトカインのレベルは数倍上昇する。一部の実施形態では、第１のペプチドおよび第２のペプチドの治療量は、約０．１ｎｍｏｌ／ｋｇ体重から約１５００ｎｍｏｌ／ｋｇ体重の間、約１ｎｍｏｌ／ｋｇ体重から約１  １０００ｎｍｏｌ／ｋｇ体重の間、または約１ｎｍｏｌ／ｋｇ体重である。
【００１４】
本発明はさらに、対象に配列番号１によって表される活性ペプチド配列を有するペプチドの治療有効量を投与するステップ、および免疫チェックポイントタンパク質に対する抗体の治療有効量を投与するステップによって、対象における適応免疫応答を活性化する方法を提供する。一部の態様では、抗体には、２つの異なる免疫チェックポイント経路の免疫チェックポイントタンパク質に対する抗体が含まれる。一部の実施形態では、投与するペプチドは４価である。これらの実施形態では、活性ペプチド配列はリンカー配列によってコアに連結される。好ましい実施形態では、コアは３リシンコアで、リンカー配列は−ＧＧＧＳ−（配列番号２）である。例えば、４価ペプチドは構造「（ＶＱＡＴＱＳＮＱＨＴＰＲＧＧＧＳ）２Ｋ］２Ｋ−ＮＨ２（配列番号３）を有する。
【００１５】
一実施態様では、この方法には、抗体を投与する前に、例えば、抗体を投与する少なくとも３日前にペプチドを投与するステップが含まれる。その後、ペプチドは抗体の投与と並行して投与する。その他の実施態様では、ペプチドおよび抗体は治療の開始時に一緒に投与する。一部の実施態様では、ペプチドは１日おきに、または週１回の頻度で投与する。一部の実施形態では、ペプチドの投与は、抗体治療期間後も継続される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１−１】４価ｓｖＬ４の構造および配列番号１（ＶＱＡＴＱＳＮＱＨＴＰＲ）で表される活性配列を示した図である。Ａ：ペプチドの概略図。活性配列を有する腕（１、２）はスペーサー配列（３）を介して３リシンコア（４）に連結している。
【図１−２】Ｂ：Ｃ末端アミドを有するペプチドの化学構造。ペプチドは全て、天然に生じるＬ−アミノ酸から構成され、Ａはアラニン、Ｇはグリシン、Ｈはヒスチジン、Ｋはリシン、Ｌはロイシン、Ｎはアスパラギン、Ｐはプロリン、Ｑはグルタミン、Ｒはアルギニン、Ｓはセリン、ＴはトレオニンおよびＶはバリンである。配列−ＧＧＧＳ−（配列番号２）は活性１２マー配列とトリリシンコアとの間のリンカーである。したがって、示された４価ペプチドは構造「（ＶＱＡＴＱＳＮＱＨＴＰＲＧＧＧＳ）２Ｋ］２Ｋ−ＮＨ２（配列番号３）を有する。
【図２】ｓｖＬ４のＨＰＬＣ観測結果を示した図である。クロマトグラフィーは、Ｃ８カラムで、０．１％ＴＦＡ／水に溶かしたアセトニトリルの勾配を用いてＣＢＬによって実施した。ペプチドの純度は＞９５％である。
【図３】ｓｖＬ４のエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）質量分析を示した図である。各シグナルのペプチドのイオン化状態を示す。
【図４】ＣＭ−セファデックスＣ５０のカラムから溶出したｓｖＬ４を示した図である。ｓｖＬ４は、ＤＥＡＥ−セファデックスＡ２５のカラムにＮａＣｌ  ２５ｍＭで通過させた。次に、ＮａＣｌの濃度を１００ｍＭに上昇させ、試料をＣＭ−セファデックスカラムに添加した。カラムを１００ｍＭ  ＮａＣｌ  ２５ｍＬ、次に２００ｍＭ  ＮａＣｌ  ５０ｍＬで洗浄し、その後、画分２４からはＮａＣｌ  ５００ｍＭで洗浄した。画分（１：１００希釈）は、ペプチド含量については２１０ｎｍのＯＤで、エンドトキシンについてはリムルスアメボサイトライセート（Ｌｏｎｚａ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ、ＵＳＡ）比色アッセイ法によって４０５ｎｍでモニターした。
【図５】ｓｖＬ４の（左から右へ）ＣＬＥＣ１０ａ、ランゲリン（Langerin）、ＡＳＧＰＲ１、デクチン−１（Dectin-1）、ＣＬＥＣ９ａ、ＤＣ−ＳＩＧＮ、ＣＤ４４、ＩＬ−４ＲおよびＳｉｇｌｅｃ−１への結合活性を示した図である。
【図６】ｓｖＬ４  １ｎｍｏｌ／ｇをＱ２Ｄで投与したＣ５７ＢＬ／６マウスの高度に染色した腹腔細胞マーカー集団の増加倍率を示した図である。未治療の値を１．０（灰色の棒）に正規化してｓｖＬ４投与による増加倍率（黒い棒）を示し、治療３日目の細胞型の間の応答を比較した。
【図７−１】経時的実験においてｓｖＬ４  １ｎｍｏｌ／ｇで治療したＣ５７ＢＬ／６マウスで見いだされた腹腔細胞型の増加を示した図である。各細胞型について、各群の３本の棒は、１日目、３日目および５日目、すなわち、それぞれ０日目、２日目および４日目に皮下注射した翌日のデータを示す。マクロファージ（Ｆ４／８０  ＣＤ１１ｂ）の細胞数は図Ａに示し、活性化マクロファージ（Ｆ４／８０  ＣＤ１１ｂ  ＣＤ８６）は図Ｂに、ＤＣ（ＣＤ１１ｃ）は図Ｃに、ＮＫＴ細胞（ＮＫ１．１  ＣＤ３＋）は図Ｄに、活性化ＮＫＴ細胞（ＮＫ１．１  ＣＤ３＋  ＣＤ６９）は図Ｅに、活性化ＮＫ細胞（ＮＫ１．１  ＣＤ３−  ＣＤ６９）を図Ｆに、活性化Ｔｈ細胞（ＣＤ４  ＣＤ６９）は図Ｇに、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８  ＣＤ６９）は図Ｈに、Ｂ細胞（ＣＤ１９）は図Ｉに、Ｂ記憶細胞（ＣＤ１９  ＣＤ７３  ＣＤ８０  ＣＤ２７３）は図Ｊに示す。データは分析した実際の細胞数として表す。
【図７−２】経時的実験においてｓｖＬ４  １ｎｍｏｌ／ｇで治療したＣ５７ＢＬ／６マウスで見いだされた腹腔細胞型の増加を示した図である。各細胞型について、各群の３本の棒は、１日目、３日目および５日目、すなわち、それぞれ０日目、２日目および４日目に皮下注射した翌日のデータを示す。マクロファージ（Ｆ４／８０  ＣＤ１１ｂ）の細胞数は図Ａに示し、活性化マクロファージ（Ｆ４／８０  ＣＤ１１ｂ  ＣＤ８６）は図Ｂに、ＤＣ（ＣＤ１１ｃ）は図Ｃに、ＮＫＴ細胞（ＮＫ１．１  ＣＤ３＋）は図Ｄに、活性化ＮＫＴ細胞（ＮＫ１．１  ＣＤ３＋  ＣＤ６９）は図Ｅに、活性化ＮＫ細胞（ＮＫ１．１  ＣＤ３−  ＣＤ６９）を図Ｆに、活性化Ｔｈ細胞（ＣＤ４  ＣＤ６９）は図Ｇに、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８  ＣＤ６９）は図Ｈに、Ｂ細胞（ＣＤ１９）は図Ｉに、Ｂ記憶細胞（ＣＤ１９  ＣＤ７３  ＣＤ８０  ＣＤ２７３）は図Ｊに示す。データは分析した実際の細胞数として表す。
【図８−１】分離したＢ１６メラノーマ腫瘍におけるＴｒｅｇ細胞の割合（Ａ）および腫瘍におけるエフェクターＴ細胞の制御性Ｔ細胞に対する比（Ｂ）を示す図である。ｓｖＬ４は、１日おきに１．０ｎｍｏｌ／ｇ体重の用量で皮下投与した。細胞傷害性Ｔリンパ球関連分子４（α−ＣＴＬＡ−４）に対する抗体を動物１匹当たり１００μｇの用量で３日間隔で腹腔内注射した。棒は、２回のフロー分析の平均を示す。
【図８−２】分離したＢ１６メラノーマ腫瘍におけるＴｒｅｇ細胞の割合（Ａ）および腫瘍におけるエフェクターＴ細胞の制御性Ｔ細胞に対する比（Ｂ）を示す図である。ｓｖＬ４は、１日おきに１．０ｎｍｏｌ／ｇ体重の用量で皮下投与した。細胞傷害性Ｔリンパ球関連分子４（α−ＣＴＬＡ−４）に対する抗体を動物１匹当たり１００μｇの用量で３日間隔で腹腔内注射した。棒は、２回のフロー分析の平均を示す。
【図９】Ｂ１６メラノーマ細胞を移植した動物の腫瘍細胞のフロー分析および図８の説明文で記載したように各動物が受けた治療を示した図である。
【図１０】マウスの脳内に神経膠腫細胞を移植して１９日後の腫瘍サイズ（Ａ）および脳に神経膠腫を移植したマウスの生存率（Ｂ）を示した図である。低用量の照射を７日目および９日目に行い、その後１日おきにｓｖＬ４（１ｎｍｏｌ／ｇ体重）を皮下注射した。
【図１１】１日おきに皮下投与したｓｖＬ４の用量の、脳内に神経膠腫細胞を移植したマウスの腫瘍サイズに対する効果の研究を示した図である。この実験では、ペプチド単独で治療した。腫瘍サイズは、未治療対照マウスにおける腫瘍のパーセントとして表す。
【図１２−１】卵巣がん細胞系を移植したマウスに対する治療効果を示した図である。Ａ：ｓｖＬ４  ０．１ｎｍｏｌ／ｇを４５日目から９８日目（下の線）に皮下治療した群または未治療群（上の線）のＣ５７ＢＬ／６マウスの、８匹の群における平均体重。９０日目頃の対照マウスの平均体重の迅速な減少は、動物の死を示している。興味深いことに、治療を終了すると、腹水は増加するように見えた。
【図１２−２】Ｂ：９５日目に治療終了した後の未治療マウスおよび治療マウスの生存曲線。未治療動物は全て１２９日目までに死亡したが、０．１ｎｍｏｌ／ｇ群の８匹の治療マウスのうち４匹は、治療を終了して８週間後の１５０日目でも生存していた。
【図１３】その他の薬物を終了した後、化学療法薬（列挙した）およびｓｖＬ４またはｓｖＬ４のみで治療したときの様々ながんを有するイヌの生存率を比較して示した図である。１ｍｇの注射を１週間毎の計画で静脈内投与した。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
この記述および特許請求の範囲で使用した動詞「含む」およびその活用形は、非限定的な意味で、その語に続く事項を含むことを意味するため使用されるが、明確に言及していない事項を排除しない。さらに、不定冠詞「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」によってある要素を参照する場合、要素の１つおよび１つのみが存在することを文脈が明らかに要求しない限り、複数の要素が存在する可能性を排除しない。したがって、不定冠詞「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」は通常「少なくとも１つ」を意味する。
【００１８】
本明細書では、「自然免疫応答」または「自然免疫」という用語は、病原体からの急性の脅威に対する免疫細胞の応答を意味する。この応答は病原体認識因子に対する遺伝性の反応であることが多い。
【００１９】
本明細書では、「適応免疫応答」または「適応免疫」という用語は、免疫記憶の形成を含む抗原特異的リンパ球（例えば、Ｔ細胞およびＢ細胞）の抗原に対する応答を意味する。適応免疫応答は、リンパ球のクローン選択によって生じる。
【００２０】
本明細書では、「エフェクターＴ細胞」という用語は、さらに分化することを必要とせず病原体または細胞の除去を媒介することができるＴ細胞を意味する。したがって、エフェクターＴ細胞はナイーブＴ細胞および記憶Ｔ細胞とは区別され、これらの細胞はエフェクター細胞になる前に分化し、増殖しなければならないことが多い。
【００２１】
本明細書では、「制御性Ｔ細胞」または「Ｔｒｅｇ細胞」という用語は、特に、エフェクターＴ細胞の誘導または増殖を抑制または下方制御することによって、Ｔ細胞応答を阻害するＴ細胞を意味する。したがって、これらの細胞は免疫寛容を誘導することができる。ＣＤ２５、ＣＤ３９、ＣＤ７３およびＦｏｘｐ３の少なくとも１つの発現は、制御性Ｔ細胞を誘導する。制御性Ｔ細胞の大部分はＣＤ４＋であるが、ＣＤ８＋であってもよい。制御性Ｔ細胞を示すもう１つのものは、細胞傷害性Ｔリンパ球関連分子−４（ＣＴＬＡ−４）または糖質コルチコイド誘導性ＴＮＦ受容体（ＧＩＴＲ）の高発現である。
【００２２】
本明細書では、「免疫チェックポイント」という用語は、付随する組織の損傷を最小限に抑えるために、自己寛容を維持し、末梢組織における生理学的免疫応答の期間および大きさを調節するために重要な免疫系の阻害経路を意味する。
【００２３】
本明細書では「免疫療法」という用語は、免疫応答を誘導、増強または抑制することによる疾患または病態の治療を意味する。
本明細書では、「病原体」という用語は、疾患を起こすことができるものなら何でも意味する。したがって、この用語には、腫瘍細胞に形質転換した宿主細胞と共に、ウイルス、細菌、プリオン、真菌または原虫などの感染因子が含まれる。
【００２４】
本発明は、免疫応答を活性化または増強するために免疫療法を組み合わせる取り組みに関する。最適な適応免疫応答には、病原体ならびにマクロファージ、細胞傷害性Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞および樹状細胞を含む活性化した細胞成分を標的とする抗体の存在が含まれる。本発明は、免疫抑制応答を阻害するか、エフェクターＴ細胞応答を増強してもよく、またはその両方であってもよい。一部の態様では、本発明は、例えば、腫瘍および腫瘍微小環境内の制御性Ｔ細胞に対するエフェクターＴ細胞の比を増加させることによって、エフェクターＴ細胞機能の有効性を増強する。本発明は、腫瘍および腫瘍微小環境内の制御性Ｔ細胞の集団を抑制することが好ましい。一部の態様では、本発明は、例えば、血清中のＩＬ−２、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−２１、ＩＬ−２７、ＴＮＦαおよびＩＦＮγを誘導して数倍増加させることよって、エフェクターＴ細胞機能の有効性を増強するために、対象のサイトカインプロファイルを変化させる。好ましい実施形態では、これらのサイトカインの血清レベルの増加は、併用療法の投与の約４時間以内に生じる。
【００２５】
本発明は、対象の免疫系が開始した免疫応答が外部からの支援なしでは対象を疾患または病態から防御することができない場合の対象の疾患または病態を治療する。このような疾患および病態は、がんおよび持続性の感染であってもよい。本発明によって治療することができるがんの非限定的な例は、膀胱がん、脳がん、乳がん、結腸がん、頭部および頸部がん、肝臓がん、肺がん、膵臓がん、前立腺がん、卵巣がん、腎臓がんまたは皮膚がんである。一部の態様では、がんは、結腸直腸腺癌、神経膠芽腫、肝細胞癌、ホルモン不応性前立腺がん、卵巣腺癌、卵巣上皮癌、メラノーマ、中皮腫、非小細胞肺がん、小細胞肺がんまたは腎細胞癌である。持続性の感染症の非限定的な例には、ウイルス感染症、マイコバクテリア感染症および寄生虫感染症が含まれる。一部の態様では、ウイルス感染症は、ＨＩＶなどのレトロウイルスによって引き起こされる。一部の態様では、マイコバクテリア感染症は結核であってもよい。一部の態様では、寄生虫感染はリーシュマニアまたはマラリアであってもよい。
【００２６】
併用療法のペプチド
免疫療法薬（例えば、抗体）によって誘導される所望の免疫応答を増強することができる「既成の」非毒性の根本的計画は、免疫療法の効果をより高め、毒性をより少なくする。免疫療法薬の作用は、免疫系が「刺激されて」療法薬の存在に対して最大限応答することが重要である。本発明の併用療法では、基本計画は、糖リガンド、例えば、グリカン複合体の末端の糖を模倣したペプチドを含む基本的なペプチド計画である。ペプチドは、免疫療法にとりわけ適している。ペプチドの設計は自由自在で、大規模に合成することが容易で、水溶性であり比較的安定で、高い結合力で受容体に選択的に結合する。免疫療法におけるペプチドの使用は、糖を模倣できること、したがって制御性レクチン型受容体、例えば、免疫系の細胞が発現するＣ型レクチン細胞表面受容体に結合することに基づいている（ＧｅｉｊｔｅｎｂｅｅｋおよびＧｒｉｎｇｈｕｉｓ、２００９年；Ｇａｒｃｉａ−Ｖａｌｌｅｊｏおよびｖａｎ  Ｋｏｏｙｋ、２００９年）。ペプチドはグリカンリガンドよりもずっと高い結合力で結合し、薬物としての開発に適している。免疫療法のこの取り組みには顕著なレベルの毒性が伴わないことは重要である。
【００２７】
好ましくは、本発明のペプチドは、免疫応答の増幅に特に有益な制御性レクチン型受容体に結合する。一実施形態では、ペプチドはＣＤ４５に見いだされるＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）を模倣し、例えば、ペプチドはｓｖＬ４（ＶＱＡＴＱＳＮＱＨＴＰＲ；配列番号１）である（実施例１〜７参照）。広く発現していて豊富な細胞表面タンパク質であるＣＤ４５のホスファターゼ活性は、リンパ球の活性化および発達に必要である（ＴｒｏｗｂｒｉｄｇｅおよびＴｈｏｍａｓ、１９９４年）。ＣＤ４５はＳｒｃファミリーシグナル伝達キナーゼから阻害ホスフェートを除去し（Ｒｏｓｋｏｓｋｉ、２００５年；ＭｃＮｅｉｌ等、２００７年）、Ｔ細胞活性化においてＴＮＦα分泌の増加として表れる（ｖａｎ  Ｖｌｉｅｔ等、２００６年）。マクロファージおよび未成熟ＤＣなどのヒト抗原提示細胞は受容体ＣＬＥＣ１０ａ（ＣＤ３０１）を発現し、これはＧａｌＮＡｃに特異的である（ｖａｎ  Ｖｌｉｅｔ等、２００８年）。免疫細胞の活性化の戦略的標的であるＣＬＥＣ１０ａを標的にすると、ＤＣによる抗原の内部移行、抗原のＣＤ４Ｔ細胞への提示およびＩＦＮγ産生ＣＤ４＋Ｔ細胞の分化が促進される（Ｓｔｒｅｎｇ−Ｏｕｗｅｈａｎｄ等、２０１１年）。リガンドがＣＬＥＣ１０ａに結合すると、抗原特異的ＩＦＮγ産生ＣＤ８＋Ｔ細胞応答が増強され、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞がＴｈ１細胞に傾き、Ｔ細胞の増殖が増加する。さらに、ＤＣはＮＫ細胞の活性化および増殖を媒介する（Ｄｅｇｌｉ−ＥｓｐｏｓｔｉおよびＳｍｙｔｈ、２００５年）。ＤＣ上のＣＬＥＣ１０ａのＴ細胞上のＣＤ４５のＧａｌＮＡｃ残基へのトランス結合は、Ｔ細胞阻害を引き起こす（ｖａｎ  Ｖｌｉｅｔ等、２００６年）。ＧａｌＮＡｃ含有因子の誘導は、ＣＤ４５を解放し、抑制性受容体を脱リン酸化（不活性化）し、シグナル伝達キナーゼから抑制性リン酸基を除去し、Ｔ細胞を活性化する。ＣＤ４５シグナル伝達によって不活性化され得る抑制性受容体には、ＣＴＬＡ−４およびＰＤ−１が含まれる。
【００２８】
併用療法の抗体
基本的ペプチド計画に加えて、本発明の併用療法には、免疫療法剤、例えば、抗体が含まれる。本発明の併用療法の好ましい実施形態では、抗体はモノクローナル抗体である。
【００２９】
一部の実施形態では、抗体は免疫チェックポイントタンパク質に対するモノクローナル抗体である。免疫チェックポイントの遮断は、腫瘍退縮を誘導し、疾患を安定化し、免疫系の操作によって生存を延長させる新しい有望な戦略である（Ｗｅｂｅｒ、２０１０年）。免疫チェックポイントタンパク質はＴ細胞、または抗原提示細胞が発現していてもよい。Ｔ細胞免疫チェックポイントタンパク質は、例えば、ＣＴＬＡ−４およびＰＤ−１であってもよい。抗原を提示している細胞免疫チェックポイントタンパク質は、例えば、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２であってもよい。
【００３０】
一実施形態では、抗体はＣＴＬＡ−４（α−ＣＴＬＡ−４）に対する抗体である。ＣＴＬＡ−４に対する完全なヒトモノクローナル抗体、イピリムマブまたはヤーボイ（Ｂｒｉｓｔｏｌ  Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）の使用は、がん治療の主要な免疫療法アプローチになった。マウスにおける研究で、腫瘍内のＴ細胞はＴｒｅｇ細胞の割合が高く、この細胞はＣＴＬＡ−４発現が高く、したがって腫瘍細胞に対する免疫応答を抑止することが示された。α−ＣＴＬＡ−４の導入はＴｒｅｇ細胞をタグ付けし、マクロファージによって抗体による破壊を受けるようにこれらの細胞を標的化した。したがって、α−ＣＴＬＡ−４はＴｒｅｇ細胞集団を減少させる。
【００３１】
別の実施形態では、抗体はＰＤ−１に対する抗体（α−ＰＤ−１）で、これはＰＤ−１とリガンドの相互作用を阻害してＴ細胞の阻害を妨害する。ＰＤ−１は、Ｔ細胞制御因子の広範なＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４ファミリーの１メンバーである（Ｉｓｈｉｄａ等、１９９２年）。免疫系を刺激するＰＤ−１を標的とするモノクローナル抗体はがん治療のために開発された［Ｗｅｂｅｒ、２０１０年］。ＦＤＡは、その他の薬物に対してもう応答しなくなった進行性の切除不能なメラノーマのためのメルク社製の抗ＰＤ−１薬、キイトルーダ（ペムブロリズマブ；ＭＫ−３４７５）を迅速に承認した。メラノーマは、メラノサイトと呼ばれる色素形成細胞から発生する皮膚がんである。この疾患は特に進行が速く、体のその他の部位、特に脳に転移すると命に関わる。米国では今年約７６０００人がメラノーマと診断され、約１００００人が亡くなった。キイトルーダは、イピリムマブ（ヤーボイ；Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）の後に使用するものとされているが、現在では、ＣＴＬＡ−４と呼ばれる別のＴ細胞受容体を遮断するヤーボイと組み合わせて臨床使用されている（上記参照）。Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂのα−ＰＤ−１薬、オプジーボ（ニボルマブ）は日本で承認され、米国で承認されたのが最初だったかもしれないとの憶測が生まれた。ニボルマブで永続的な腫瘍寛解を示すために詳細な研究が実施された（Ｔｏｐａｌｉａｎ等、２０１４年）。
【００３２】
抗体は、別の実施形態ではＰＤ−１リガンドに対する抗体であってもよい。ＰＤ−１の２つのリガンドであるＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２は、Ｂ７ファミリーのメンバーである（Ｆｒｅｅｍａｎ等、２０００年；Ｌａｔｃｈｍａｎ等、２００１年）。多くの腫瘍細胞は免疫抑制性ＰＤ−１リガンド、ＰＤ−Ｌ１を発現し、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との間の相互作用の阻害は、インビトロにおけるＴ細胞応答を増強し、前臨床抗腫瘍活性を媒介することができる。ＰＤ−Ｌ１は、ＩＦＮγによる治療のときに、ＰＡ１骨髄腫、Ｐ８１５肥満細胞腫およびＢ１６メラノーマを含むほとんど全てのマウス腫瘍細胞系で発現する。ＰＤ−Ｌ２発現はより限定的で、主にＤＣおよびいくつかの腫瘍系で発現する。ＰＤ−Ｌ１タンパク質は、マクロファージおよび樹状細胞（ＤＣ）ではリポ多糖（ＬＰＳ）およびＧＭ−ＣＳＦ治療に応答して、Ｔ細胞およびＢ細胞ではＴＣＲおよびＢ細胞受容体シグナル伝達に応答して上方制御される（Ｉｗａｉ等、２００２年）。ＬＰＳに対するこの応答は、がん治療薬から内毒素を確実に排除するための重大な理由である（図４参照）。
【００３３】
臨床研究によって、イピリムマブとニボルマブの組合せはそれぞれの単独よりも有効性が大きいことが示された（Ｃｕｒａｎ等、２０１０年；Ｗｏｌｃｈｏｋ等、２０１３年）。したがって、本発明の一部の実施態様の抗体は１つの免疫チェックポイント経路を攻撃する一方、本発明のその他の実施態様の抗体は２つ以上の免疫チェックポイント経路を攻撃してもよい。例えば、併用療法は、２つの明確に異なる免疫チェックポイント経路であるＣＴＬＡ−４経路およびＰＤ−１経路に対する抗体と共にペプチドを含んでいてもよい。
【００３４】
併用療法のキットまたは医薬組成物
併用療法は制御性レクチン型受容体を標的とするペプチドおよび免疫細胞に直接影響を及ぼす抗体を含むので、本発明の併用療法は免疫調節手段の組合せを標的とする。例えば、抗体が細胞表面のチェックポイントタンパク質に結合することによって作用する一方、ＣＤ４５によるホスファターゼ活性およびその他のホスファターゼの刺激はＣＴＬＡ−４およびＰＤ−１およびこれらのタンパク質の作用を媒介する付属タンパク質ＳＨＰ−１の脱リン酸化を引き起こし、したがって、本発明のペプチドおよび抗体を含む併用療法は細胞内の抑制性受容体も不活性化する。しかし、本発明の併用療法は複数のペプチドおよび／または複数の抗体を使用することによって免疫調節手段のより多くの組合せを標的とすることができる。したがって、併用療法は少なくとも１つのペプチドの治療有効量および少なくとも１つの抗体の治療有効量を含む。一部の実施形態では、併用療法のペプチドは、配列番号１（ＶＱＡＴＱＳＮＱＨＴＰＲ）によって表される活性ペプチド配列を有する。このペプチドは４価であってもよい。４価ペプチドの活性ペプチド配列はリンカー配列を介してコアに連結する。一部の実施形態では、コアは３リシンコアで、リンカー配列は−ＧＧＧＳ−（配列番号２）である。４価ペプチドの１例は構造「（ＶＱＡＴＱＳＮＱＨＴＰＲＧＧＧＳ）２Ｋ］２Ｋ−ＮＨ２（配列番号３）を有する。
【００３５】
キットまたは組成物の一部の実施形態では、ペプチドは同じ制御性レクチン型受容体を標的とする異なる模倣体である。例えば、２つのペプチドを含むキットまたは組成物の場合、両方のペプチドはＣＬＥＣ１０ａを標的とするが、それぞれはＧａｌＮＡｃまたはＧａｌのいずれかの模倣体である。キットまたは組成物のその他の実施形態では、ペプチドは異なる制御性レクチン型受容体を標的とする異なる模倣体である。
【００３６】
キットまたは組成物の一部の実施形態では、抗体は異なる免疫チェックポイント経路を標的とし、例えば、抗体はＣＴＬＡ−４チェックポイント経路またはＰＤ−１チェックポイント経路を標的とする。したがって、併用療法の抗体は、α−ＣＴＬＡ−４およびα−ＰＤ−１またはα−ＰＤ−Ｌ１の１つを含んでいてもよい。
【００３７】
ペプチドおよび抗体の薬学的に許容される誘導体およびそれらの塩ならびに本明細書で記載した方法のためのそれらの使用も本発明の範囲内である。このような塩は、製薬業界の知識を使用して調製することができる。医薬組成物は、個々の投与形態で調製することができる。したがって、本発明の医薬組成物および投与形態は、本明細書で開示した活性成分を含む。「医薬品」の表記は、本明細書で記載した本発明の化合物またはそれらの塩を示す。本発明の医薬組成物および投与形態はさらに、薬学的に許容される担体を含んでいてもよい。
【００３８】
一実施形態では、「薬学的に許容される」という用語は、連邦または州政府の規制当局によって承認されているか、あるいは動物、より詳細にはヒトにおいて使用するために米国薬局方またはその他の一般的に認識された薬局方に挙げられたことを意味する。「担体」という用語は、それらと共に活性成分を投与する希釈剤、アジュバント、賦形剤または媒体を意味する。このような医薬担体は、水および油などの液体であってもよく、ピーナツ油、ダイズ油、鉱物油、ゴマ油などの石油、動物、植物または合成由来のものが含まれる。医薬担体は、生理食塩水、アカシアゴム、ゼラチン、デンプン糊、タルク、ケラチン、コロイド状シリカ、尿素などであってもよい。もちろん、その他の賦形剤を使用してもよい。
【００３９】
本発明の投与形態の組成物、形状および型は典型的に、投与経路および治療する対象に応じて変化する。例えば、非経口投与形態は、同じ疾患を治療するために使用した経口投与形態が含むよりも少ない量の１つまたは複数の活性成分を含有していてもよい。本発明に包含される特定の投与形態が互いに異なるこれらおよびその他の方法は、当業者ならば容易に理解すると予想される。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、Ｅａｓｔｏｎ  Ｐａ．（１９９０年）を参照のこと。
【００４０】
典型的な医薬組成物および投与形態は、１つまたは複数の賦形剤を含む。適切な賦形剤は製薬業界の当業者には周知で、適切な賦形剤の非限定的な例を本明細書に挙げる。特定の賦形剤が医薬組成物または投与形態への組込に適しているかどうかは、限定はしないが、投与形態を患者に投与する方法を含む当業界で周知の様々な要素に左右される。例えば、錠剤などの経口投与形態は、非経口投与形態において使用するには適さない賦形剤を含有していてもよい。特定の賦形剤の適応性はまた、投与形態中の特異的な活性成分に左右される。例えば、いくつかの活性成分の分解は、ラクトースなどのいくつかの賦形剤によって、または水に曝露したとき、加速することがある。
【００４１】
本発明はさらに、活性成分を分解する割合を低下させる１つまたは複数の化合物を含む医薬組成物および投与形態を包含する。このような化合物は、本明細書では「安定化剤」と呼び、限定はしないが、アスコルビン酸などの抗酸化剤、ｐＨ緩衝剤または塩緩衝剤を含む。
【００４２】
特定の治療条件および方法について、投薬は公知の方法を使用して経験的に決定するが、使用した特定の化合物の生物学的活性、投与手段、宿主の年齢、健康状態および体重、症状の性質および範囲、治療頻度、その他の療法の投与および所望する効果などの事実に左右される。様々な可能性のある投薬および投与方法を以下に記載するが、以下は単なる例示にすぎないことを理解されたい。実際の投薬および投与または送達方法は、当業者が決定することができる。投薬の頻度はまた、使用する化合物および持続放出性製剤を使用するかどうかに応じて変化することがある。
【００４３】
経口投与に適した本発明の医薬組成物は、限定はしないが、錠剤（例えば、咀嚼型錠剤）、カプレット、カプセルおよび液剤（例えば、フレーバーシロップ剤）などの個別の投与形態として存在していてもよい。このような投与形態は、予め決定された量の活性成分を含有し、当業者に周知の製薬方法によって調製することができる。例えば、全般的に、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９０年）を参照のこと。
【００４４】
本発明の典型的な経口投与形態は、従来の製剤配合技術に従って、均一に混合した活性成分と少なくとも１種の賦形剤とを一緒にすることによって調製する。賦形剤は、投与に望ましい調製形態に応じて、多様な形態を取ることができる。例えば、経口液体またはエアロゾル投与形態での使用に適した賦形剤には、限定はしないが、水、グリコール、油、アルコール、矯臭剤、保存剤および着色剤が含まれる。固形経口投与形態（例えば、粉末、錠剤、カプセルおよびカプレット）での使用に適した賦形剤の例には、限定はしないが、デンプン、糖、微結晶セルロース、希釈剤、造粒剤、滑沢剤、結合剤および崩壊剤が含まれる。
【００４５】
投与が簡単なので、錠剤およびカプセルは最も有利な経口投与単位形態であり、この場合固形賦形剤を使用する。所望するならば、錠剤は標準的な水性または非水性技術によってコーティングすることができる。このような投与形態は、製薬方法のいずれかによって調製することができる。全体的に、医薬組成物および投与形態は、活性成分と液体担体、超微粒子状固形担体またはその両方とを均一かつ均質に混合し、次に、必要ならば、生成物を所望する状態に成形することによって調製する。
【００４６】
例えば、錠剤は圧縮または成型することによって調製することができる。圧縮した錠剤は、活性成分を、場合によっては賦形剤と混合して、適切な機械で粉末または顆粒などの易流動形態に圧縮することによって調製することができる。成型した錠剤は、不活性液体希釈剤で湿らせた粉末化化合物の混合物を適切な機械で成型することによって形成することができる。
【００４７】
本発明の経口投与形態で使用することができる賦形剤の例には、限定はしないが、結合剤、充填剤、崩壊剤および滑沢剤が含まれる。医薬組成物および投与形態での使用に適した結合剤には、限定はしないが、コーンスターチ、馬鈴薯デンプンもしくはその他のデンプン、ゼラチン、アカシアゴムなどの天然および合成ゴム、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸、その他のアルギン酸塩、粉末化トラガカント、グアガム、セルロースおよびその誘導体（例えば、エチルセルロース、酢酸セルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム）、ポリビニルピロリドン、メチルセルロース、アルファ化デンプン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（例えば、第２２０８、２９０６、２９１０番）、微結晶セルロースおよびそれらの混合物が含まれる。
【００４８】
微結晶セルロースの適切な形態には、限定はしないが、ＡＶＩＣＥＬ−ＰＨ−１０１、ＡＶＩＣＥＬ−ＰＨ−１０３、ＡＶＩＣＥＬ  ＲＣ−５８１、ＡＶＩＣＥＬ−ＰＨ−１０５（ＦＭＣ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｖｉｓｃｏｓｅ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、Ａｖｉｃｅｌ  Ｓａｌｅｓ、Ｍａｒｃｕｓ  Ｈｏｏｋ，Ｐａ．から市販されている）として販売されている物質およびそれらの混合物が含まれる。特異的な結合剤は、微結晶セルロースとＡＶＩＣＥＬ  ＲＣ−５８１として販売されているカルボキシメチルセルロースナトリウムとの混合物である。適切な無水または低水分賦形剤または添加物には、ＡＶＩＣＥＬ−ＰＨ−１０３およびデンプン１５００ＬＭが含まれる。
【００４９】
本明細書で開示した医薬組成物および投与形態で使用するために適した充填剤の例には、限定はしないが、タルク、炭酸カルシウム（例えば、顆粒または粉末）、微結晶セルロース、粉末セルロース、デキストレート（ｄｅｘｔｒａｔｅ）、カオリン、マンニトール、ケイ酸、ソルビトール、デンプン、アルファ化デンプンおよびそれらの混合物が含まれる。本発明の医薬組成物における結合剤または充填剤は典型的に、医薬組成物または投与形態の約５０から約９９重量パーセントで存在する。
【００５０】
崩壊剤は、水性環境に曝露したとき崩壊する錠剤を形成するために、本発明の組成物で使用する。含有される崩壊剤が多すぎると錠剤は貯蔵中に崩壊することがあるが、含有される崩壊剤が少なすぎると所望する速度または所望する条件下で崩壊しないことがある。したがって、多すぎたり、少なすぎたりして活性成分の放出を不利に変化させることのない十分な量の崩壊剤を使用して本発明の固形経口投与形態を形成するべきである。使用した崩壊剤の量は、製剤の種類に基づいて変化し、当業者は容易に確認することができる。典型的な医薬組成物は、約０．５から約１５重量パーセントの崩壊剤、好ましくは約１から約５重量パーセントの崩壊剤を含む。
【００５１】
本発明の医薬組成物および投与形態で使用することができる崩壊剤には、限定はしないが、寒天、アルギン酸、炭酸カルシウム、微結晶セルロース、クロスカルメロースナトリウム、クロスポピドン、ポラクリリンカリウム、デンプングリコール酸ナトリウム、馬鈴薯またはタピオカデンプン、その他のデンプン、アルファ化デンプン、その他のデンプン、粘土、その他のアルギン、その他のセルロース、ゴムおよびそれらの混合物が含まれる。
【００５２】
本発明の医薬組成物および投与形態で使用することができる滑沢剤には、限定はしないが、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、鉱物油、軽油、グリセリン、ソルビトール、マンニトール、ポリエチレングリコール、その他のグリコール、ステアリン酸、ラウリル硫酸ナトリウム、タルク、水添植物油（例えば、ピーナツ油、綿実油、ヒマワリ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油およびダイズ油）、ステアリン酸亜鉛、オレイン酸エチル、ラウリン酸エチル、寒天およびそれらの混合物が含まれる。他の滑沢剤には、例えば、シロイドシリカゲル（ＡＥＲＯＳＩＬ２００、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、ＭＤのＷ．Ｒ．Ｇｒａｃｅ  Ｃｏ．によって製造される）、合成シリカ凝集エアロゾル（Ｐｌａｎｏ、ＴＸのＤｅｇｕｓｓａ  Ｃｏ．より販売）、ＣＡＢ−Ｏ−ＳＩＬ（Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡのＣａｂｏｔ  Ｃｏ．より販売されている発熱性２酸化ケイ素製品）およびそれらの混合物が含まれる。もし使用するならば、滑沢剤は典型的に、組み込む医薬組成物または投与形態の約１重量パーセント未満の量で使用する。
【００５３】
本発明の好ましい固形経口投与形態は、活性成分、無水ラクトース、微結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、ステアリン酸、コロイド状無水シリカおよびゼラチンを含む。
投与方法
本発明はまた、ペプチドおよび抗体を別々に、または一緒にした薬物を１回の適用で投与することができる製剤で投与する、本発明の併用療法の投与方法を提供する。例えば、実施例８におけるように、本発明は、ｓｖＬ４およびモノクローナル抗体α−ＣＴＬＡ−４の１回の適用での投与を提供する。
【００５４】
一実施形態では、併用療法の投与は、抗体と同時にペプチドの投与を開始するステップを含む。別の実施形態では、適応免疫応答を活性化するための併用療法は、抗体を投与する前に免疫系を刺激するためにペプチドをまず投与するステップによって投与する。例えば、ペプチドは、抗体を投与する少なくとも２週間前、少なくとも１０日前、少なくとも１週間前、少なくとも５日前、少なくとも３日前または少なくとも１日目に投与される。一部の態様では、ペプチドの投与は、抗体の投与後も継続する。したがって、ペプチドの投与はまた、抗体の投与期間と並行する。例えば、イピリムマブは通常３週間毎に静脈内注射するので、イピリムマブ治療の期間中、ペプチドも投与される。
【００５５】
一部の実施態様では、ペプチドの投与は、抗体治療期間後も継続される。この方法の利点は、抗体でその後の治療を行わなくても、抗体治療の治療上の利点を維持できることである。
【００５６】
投与方法ならびに頻度および用量は、すでにＦＤＡ承認された抗体について先行技術で確立されている。例えば、イピリムマブは通常、９０分間にわたって静脈内注射し、各単位用量は３週間毎に投与し、１回の治療期間は投与４回までである。しかし、一部の態様では、ペプチドおよび抗体の並行投与は、毎週の頻度であってもよい。
【００５７】
ペプチドの単位用量は、１日おきに、または週１回の頻度で投与してもよい。本発明のペプチドの１回の単位投与形態は、患者への経口、粘膜（例えば、経鼻、舌下、経膣、頬側または直腸）、非経口（例えば、皮下、静脈内、大量瞬時投与、筋肉内または動脈内）または経皮投与に適している。投与形態の例には、限定はしないが、錠剤、カプレット、軟ゼラチンカプセルなどのカプセル、サシェ、トローチ、ドロップ、分散剤、坐剤、軟膏、パップ剤（湿布）、ペースト、粉末、ドレッシング剤、クリーム、硬膏剤、液剤、パッチ、エアロゾル（例えば、点鼻薬または吸入薬）、ジェル、懸濁剤（例えば、水性もしくは非水性液体懸濁剤、水中油エマルジョンまたは油中水液体エマルジョン）、液剤およびエリキシル剤を含む患者への経口もしくは粘膜投与に適した液体投与形態、患者への非経口投与に適した液体投与形態ならびに再構成して患者への非経口投与に適した液体投与形態を形成することができる滅菌固形物（例えば、結晶もしくはアモルファス固形物）が含まれる。ペプチドは、非経口経路、最も好ましくは皮下経路を介して投与することが好ましい。ペプチドはまた、静脈内投与することができる。ペプチドは、単独で、または抗体との組成物で投与してもよい。
【００５８】
ある特定の態様では、ペプチドは約０．１ｎｍｏｌ／ｋｇ体重から約１５００ｎｍｏｌ／ｋｇ体重の単位投与量で投与することができ、これは、約０．７μｇ／ｋｇ体重から約１０ｍｇ／ｋｇ体重に対応する。ペプチドの単位投与はまた、約１００ｎｍｏｌ／ｋｇ体重から約１５００ｎｍｏｌ／ｋｇ体重、約１００ｎｍｏｌ／ｋｇ体重から約１０００ｎｍｏｌ／体重、約３ｎｍｏｌ／ｋｇ体重から約１５００ｎｍｏｌ／ｋｇ体重、約３ｎｍｏｌ／ｋｇ体重から約１０００ｎｍｏｌ／ｋｇ体重、約３ｎｍｏｌ／ｋｇ体重から約１０ｎｍｏｌ／ｋｇ体重、約１ｎｍｏｌ／ｋｇ体重から約１０００ｎｍｏｌ／ｋｇ体重または約０．１ｎｍｏｌ／ｋｇ体重から約１ｎｍｏｌ／ｋｇ体重であってもよい。
【００５９】
その他の態様では、ペプチドは約１５００ｎｍｏｌ／ｋｇ体重未満、例えば、約１０００ｎｍｏｌ／ｋｇ体重、約５００ｎｍｏｌ／ｋｇ、約１００ｎｍｏｌ／ｋｇ、約１０ｎｍｏｌ／ｋｇ、約１ｎｍｏｌ／ｋｇ、または約０．１ｎｍｏｌ／ｋｇの単位投与量で投与してもよい。一態様では、ペプチドは約５ｎｍｏｌ、約１０ｎｍｏｌ、約１５ｎｍｏｌ、約２５ｎｍｏｌ、約３０ｎｍｏｌ、約５０ｎｍｏｌ、約７５ｎｍｏｌ、約１００ｎｍｏｌ、約２２５ｎｍｏｌ、約２５０ｎｍｏｌ、約５００ｎｍｏｌ、約７５０ｎｍｏｌ、約１μｍｏｌ、約１０μｍｏｌまたは約５０μｍｏｌの単位投与量で投与してもよい。
【００６０】
非経口投与形態は、限定はしないが、皮下、静脈内、大量瞬時投与、筋肉内および動脈内を含む様々な経路によって患者に投与することができる。非経口投与形態は、皮下送達に適していることが好ましい。本発明の非経口用形態は、好ましくは無菌であるか、または患者に投与する前に滅菌することができる。非経口用形態の例には、限定はしないが、注射用溶液、注射用の薬学的に許容される媒体に溶解または懸濁するための乾燥製品、注射用懸濁液およびエマルジョンが含まれる。
【００６１】
本発明の非経口投与形態を提供するために使用することができる適切な媒体は、当業者に周知である。例には、限定はしないが、注射用水ＵＳＰ、限定はしないが、リン酸緩衝生理食塩水、塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、デキストロース注射液、デキストロースおよび塩化ナトリウム注射液および乳酸リンゲル注射液などの水性媒体、限定はしないが、エチルアルコール、ポリエチレングリコールおよびポリプロピレングリコールなどの水混和性媒体、ならびに、限定はしないが、トウモロコシ油、綿実油、ピーナツ油、ゴマ油、オレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピルおよび安息香酸ベンジルなどの非水性媒体が含まれる。
【実施例】
【００６２】
本発明はさらに、以下の実施例によって例示されるが、決して限定するものではない。本出願全体にわたって引用した全参考文献、特許および公開された特許出願の内容ならびに図面は、あらゆる目的のために全体が参考として本明細書に組み込まれる。
【００６３】
１．本発明のペプチド例、ｓｖＬ４
ｓｖＬ４と称されるＧａｌＮＡｃのペプチド模倣体は、Ｈｅｌｉｘ  ｐｏｍａｔｉａのＧａｌＮＡｃ特異的レクチンでファージディスプレイライブラリーをスクリーニングして見いだされた（ＥｇｇｉｎｋおよびＨｏｏｂｅｒ、２００９年、２０１０年）。このペプチドの４価型は構造「（ＶＱＡＴＱＳＮＱＨＴＰＲＧＧＧＳ）２Ｋ］２Ｋ−ＮＨ２（配列番号３、図１）を有する。このペプチドは、標準的固相化学法によって合成し、クロマトグラフィー手法によってエンドトキシンを除去して純度＞９５％で調製した（図２〜４）。
【００６４】
２．ヒトレクチン型受容体に対するｓｖＬ４の結合活性
ｓｖＬ４の結合活性は、組換えヒトＣＬＥＣ１０ａ、ＡＳＧＰＲ１およびランゲリンで測定した。図５は、ｓｖＬ４の様々な制御レクチンへの結合活性を表す。試験したレクチンのうち、ｓｖＬ４はＣＬＥＣ１０ａ、ランゲリン、ＡＳＧＰＲ−１およびＤｅｃｔｉｎ−１に強く結合する。
【００６５】
３．野生型マウスの免疫細胞の成熟に対するｓｖＬ４群ペプチドの効果
腹腔免疫細胞の成熟を調べるために、マウス（Ｃ５７ＢＬ／６種、雄、６〜８週齢）に４価ｓｖＬ４  １ｎｍｏｌ／ｇを０、２、４および６日目に皮下注射した。マーカーに対する抗体で染色した細胞のバイオマーカーの発現を図６に示す。これらの動物の免疫機能の主要部位である腹腔から得られた細胞で劇的な変化が生じた。図６で例示したように、２回の治療後、免疫細胞の成熟は細胞のいくつかの集団で見いだされ、３日目に、治療したＣ５７ＢＬ／６マウスでは強く染色した細胞の増加が示された。したがって、ｓｖＬ４を皮下投与すると腹腔における免疫細胞の成熟が増強される。
【００６６】
ＣＤ１１ｃ（樹状細胞）に対する抗体で染色した集団では増加が認められ、ほとんどの活性化抗原提示細胞（樹状細胞、マクロファージおよびＢ細胞）で上方制御されている。マクロファージ（Ｆ４／８０＋ＣＤ１１ｂ＋）細胞の集団は、治療の最初の３日間で劇的に増加した。樹状細胞（ＣＤ１１ｃ＋）および活性化樹状細胞の数も上昇した。ＣＤ８＋細胞はわずかに上昇し、ＣＤ４９ｂ＋ＣＤ６９＋（活性化）ＮＫは強く上昇した。１日おきに注射して３日目の変化を図６に示す。
【００６７】
第２の実験では、追加的細胞集団の変化の時間経過を調べ、それらには、マクロファージ（Ｆ４／８０  ＣＤ１１ｂ）、活性化マクロファージ（Ｆ４／８０  ＣＤ１１ｂ  ＣＤ８６）、ＤＣ（ＣＤ１１ｃ）、ＮＫＴ細胞（ＮＫ１．１  ＣＤ３＋）、活性化ＮＫＴ細胞（ＮＫ１．１  ＣＤ３＋  ＣＤ６９）、活性化ＮＫ細胞（ＮＫ１．１  ＣＤ３−  ＣＤ６９）、活性化Ｔｈ細胞（ＣＤ４  ＣＤ６９）、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８  ＣＤ６９）、Ｂ細胞（ＣＤ１９）およびＢ記憶細胞（ＣＤ１９  ＣＤ７３  ＣＤ８０  ＣＤ２７３）が含まれる。５日間にわたって１日おきに注射して、各細胞型の数によって表された応答を図７に示す。
【００６８】
４．乳がんを有するマウスの血清に対するｓｖＬ４の効果
血清タンパク質における応答が担がんマウスと健康なマウスとでは異なるかどうかを測定するために、乳がん４Ｔ１細胞を移植した雌マウスから血清を収集した。腫瘍が１０から１２日間の期間で約５００ｍｍ３のサイズに成長した後、４価ｓｖＬ４を０．１および１．０ｎｍｏｌ／ｇの用量で皮下注射した。血液を採取し、血清は注射の４時間後に調製した。４時間後の未治療動物の血清のサイトカインおよびケモカインのレベルは低かった。典型的な免疫細胞の活性化を反映する因子を表１に挙げる。ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−６およびＴＮＦαなどいくつかのタンパク質は、未治療動物では値が非常に低く、ｓｖＬ４で治療すると増加したもののアレイブロットではまだほとんど検出不可能であった。治療は全般的に、タンパク質の多くの増加、典型的には３から５倍の範囲の増加を引き起こした。増加したもののまだ量が少ないいくつかのサイトカインには、ＧＭ−ＣＳＦ、ＣＣＬ４、ＩＧＦＢＰ−１、ＩＬ−２１、リンホトキシン−αおよびＩＬ−１７が含まれた。主要なタンパク質には、ＣＣＬ１、ＣＣＬ８、ＣＣＬ２８、エンドスタチン、Ｆａｓ、ＨＶＥＭ、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−１６、ＩＬ−２７、ＩＬ−２８、ＭＩＰ−２、ＭＭＰ−９、ＮＯＶ、Ｓｏｇｇｙ−１、ＳＰＡＲＣ、ＴＩＭＰ−２、ＴＬＲ２およびＶＥＧＦ−Ｂが含まれる。場合によっては高用量では大量のタンパク質が生じたが、いくつかのタンパク質では高用量でも量が少なかった。ほとんどのサイトカインでは、変化の程度はこの範囲でも用量依存応答性を示唆した。いくつかの可溶性タンパク質は、Ｆａｓ、ＨＶＥＭおよびＴＬＲ２などの細胞表面受容体として同定され、活性化細胞によってかなりシェディング（shedding）されることが示された。可溶性ＨＶＥＭは、健康なマウスのように担がんマウスにおいて主要なタンパク質であるが、対照マウスでのレベルは乳がんを有するマウスよりも大きく、ｓｖＬ４で治療した後でも生じる増加は２倍にとどまった。
【００６９】
【表１】
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【００７０】
これらのタンパク質は、活性化ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞、樹状細胞ならびにマクロファージを含む様々な細胞型で発現し、ほとんど全てが免疫系の制御に関与する。サイトカイン／ケモカインの発現パターンは、強い抗がん免疫応答をもたらす。特に注意することは、多数のサイトカインおよびケモカインが治療に応答して血清中で増加するが、毒性のある「サイトカインストーム」の典型的なパターンは起こらなかったことである。
【００７１】
健康なマウスと担がんマウスの血清タンパク質の間で、顕著な差が認められた。健康なマウスでは、ＩＬ−１６、ＭＭＰ−９、Ｐ−セクレチン、Ｓｏｇｇｙ−１、ＴＬＲ２、ＴＲＡＩＬおよびＴＩＭＰ−２が減少した一方、これらの因子は担がんマウスではｓｖＬ４に応答して劇的に増加した。ＩＬ−１α、ＩＬ−６、ＩＦＮγ、ＴＮＦαおよびＴＧＦβは、健康なマウスでは非常に低レベルで存在し、増加しないが、担がんマウスでは検出可能で、ｓｖＬ４に応答して顕著に増加した。さらなる比較を表１に示す。表１の最も右の欄は、健康なＢａｌｂ／ｃマウスによる別の実験で得られた治療（１ｎｍｏｌ／ｇ）対未治療試料の比を示す。いくつかのタンパク質、特に、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−２１、ＩＬ−２８、ＩＬ−３１およびＣＣＬ８／ＭＣＰ−２は、未治療マウスでは無視できるほどの値であったので、治療した値は高い比となった。興味深いことに、担がんマウスで強く上昇したサイトカインは、健康なマウスではｓｖＬ４に応答して低下することが多いか、または変化を示さなかった。
【００７２】
５．ｓｖＬ４およびα−ＣＴＬＡ−４によるメラノーマの治療
研究によって、ＧＭ−ＣＳＦ源を追加しなければα−ＣＴＬＡ−４はマウスのメラノーマに対して効果がないことが示され、ＧＭ−ＣＳＦ源は、常法では、照射した遺伝子改変ＧＶＡＸ細胞の注射によって供給した（Ｑｕｅｚａｄａ等、２００６年）。抑制性受容体、ＣＴＬＡ−４は腫瘍内のＴｒｅｇ細胞によって高レベルで発現したが、α−ＣＴＬＡ−４が結合した細胞の破壊にはＦｃγＲＩＶを発現するマクロファージが必要であった（Ｓｉｍｐｓｏｎ等、２０１３年）。ｓｖＬ４の投与は、単球の増殖および成熟を引き起こすので、ｓｖＬ４がＧＭ−ＣＳＦの代わりとなるかどうかを試験した。この実験では、雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスの右側腹部にＢ１６腫瘍細胞１．５×１０５個を移植した。４価ｓｖＬ４  １ｎｍｏｌ／ｇの皮下注射を０日目に開始し、実験全体にわたってＱ２Ｄで投与した。α−ＣＴＬＡ−４モノクローナル抗体（ＢｉｏＸＣｅｌｌ社のクローン９Ｈ１０）１００μｇを３日目から開始してＱ３Ｄで腹腔内注射した。併用治療はこれらの注射頻度で維持した。
【００７３】
腫瘍増殖は１日おきに測定した。α−ＣＴＬＡ−４単独で治療した群内で生じた腫瘍量の増加は最も迅速であったが、α−ＣＴＬＡ−４と共に４価ｓｖＬ４  １ｎｍｏｌ／ｇで治療した群では生じた増加は最も遅かった（表２）。
【００７４】
【表２】
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【００７５】
未治療群の腫瘍の大部分が１５００ｍｍ３の最大体積に達したとき、マウスを安楽死させ、各群の２匹の代表的動物の原発腫瘍を切除し、フローサイトメトリーによって分析した。エフェクターＴ（Ｔｅｆｆ）細胞は、ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５−ＣＤ３９−として規定し、一方、Ｔｒｅｇ細胞はＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ３９＋と規定した（Ｄｗｙｅｒ等、２０１０年）。特徴付けられていないＣＤ２５＋／ＣＤ３９−およびＣＤ２５−／ＣＤ３９＋細胞はＴｅｆｆ：Ｔｒｅｇ計算から排除した。Ｔ細胞分析を図８にまとめて示す。（フローサイトメトリーデータプロットの例は、図９に示す）。全Ｔ細胞集団の中で最も割合が低いＴｒｅｇ細胞は、ｓｖＬ４  １ｎｍｏｌ／ｇ単独で治療した動物の腫瘍で生じた（図８Ａ）。興味深いことに、治療群の中で最も高い割合はα−ＣＴＬＡ−４で治療した動物で生じた。α−ＣＴＬＡ−４による治療にｓｖＬ４  １ｎｍｏｌ／ｇを追加すると、Ｔｒｅｇ細胞の割合が劇的に低下した。同様に、治療群の中で最高のＴｅｆｆ：Ｔｒｅｇ細胞比は、ｓｖＬ４  １ｎｍｏｌ／ｇ単独で見いだされた（図８Ｂ）。
【００７６】
これらのデータは、ｓｖＬ４  １ｎｍｏｌ／ｇがＴｒｅｇ細胞集団を軽減することによってα−ＣＴＬＡ−４の活性を補完したことを示す。実際に、ｓｖＬ４はα−ＣＴＬＡ−４−依存性の機構によってＴｒｅｇ細胞の数を減少させた。Ｔｒｅｇ細胞が抗体に依存して強く減少することは、乳がんを有するＢａｌｂ／ｃマウスの血清によるサイトカインデータによって説明することができる（表１）。ｓｖＬ４は、４時間以内にＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−２１およびＩＬ−２７の数倍の増加を誘導した。これらのサイトカインは、Ｔｒｅｇ細胞増殖を抑制し、ＩＬ−２受容体発現を減少させるとされている（Ｚｈａｏ等、２０１２年）。ｓｖＬ４は、Ｔｒｅｇ細胞によって分泌される抑制性サイトカインであるＩＬ−１０の増加を誘導しなかった。臨床研究では、Ｔｒｅｇ細胞の減少は、好ましい治療成績のためにＴｅｆｆ：Ｔｒｅｇ比よりも有意であるものと考えられる（Ｓｉｍ等、２０１４年）。したがって、ｓｖＬ４で治療した群においてＴｒｅｇ細胞が減少すると、ｓｖＬ４投与に応答して認められたマクロファージ、樹状細胞、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞およびナチュラルキラー細胞の成熟（図６）と共に、がんに対する免疫系の攻撃が強力に増強されると予想される。
【００７７】
これらのデータは、ｓｖＬ４単独およびα−ＣＴＬＡ−４との組合せが、腫瘍における免疫抑制性制御性Ｔ細胞の低下に主要な役割を担うことを示す。これらのデータは、２つの因子が別々であるが補完的な活性を有することを示唆する。したがって、このような治療が様々ながんに適切であるという仮説が生じる。実際に、α−ＣＴＬＡ−４は、メラノーマにおける第ＩＩ相および第ＩＩＩ相の治験で、その他の腫瘍型では第Ｉ／ＩＩ相の治験で現在試験されている。腫瘍の退縮および長続きする応答の証拠は、卵巣がん、前立腺がんおよび腎細胞がんを有する患者におけるモノクローナルイピリムマブで認められた（Ｗｅｂｅｒ、２０１０年）。ＣＴＬＡ−４に対する抗体は、マウスよりもヒトのがんに対してより有効である。ｓｖＬ４は、マウスにおいて有効で、ヒトにおいても有効であることが予測される。ＣＴＬＡ−４に対する抗体（イピリムマブ）は、患者の２０から３０％にのみ有効で、有効性は別のチェックポイントマーカーＰＤ−１に対する抗体、ニボルマブと組み合わせたとき、約２倍である（Ｗｏｌｃｈｏｋ等、２０１３年）。これらの組合せでは、異なる抑制性受容体を標的とするので、有効性が増加した。したがって、メラノーマのマウス研究のデータに基づいて、α−ＣＴＬＡ−４、α−ＰＤ−１またはα−ＰＤ−Ｌ１による治療に対するｓｖＬ４の追加は、利益を高めると予想される。本発明は、一連の細胞を活性化し、免疫系を「刺激する」という非毒性の根本的または基本的な療法のために、腫瘍学者が述べた必要性を満足させる。次に、これらのチェックポイントを遮断する抗体は、より低い用量で、より毒性の少ない集中療法を提供することができる。
【００７８】
がんの治療は通常診断後に開始されるが、疾患が進行してしまっていることが多い。免疫系を初期に活性化するために、ｓｖＬ４は、１日おきに皮下注射によって投与される。免疫細胞の活性化は、２回目または３回目の注射の後、すなわち、治療開始後３または５日目にマウスで検出される。イピリムマブは通常、３週間毎に静脈内注射する。ｓｖＬ４の投与を１日おきに継続すると、免疫系が高い活性化状態で維持され、したがってα−ＣＴＬＡ−４の注射の利益を最大限実現する免疫系の状態が確立される。類似の方法がα−ＰＤ−１でも実現可能である。
【００７９】
６．ｓｖＬ４による神経膠芽腫の治療
神経膠芽腫および転移性脳腫瘍では、サイトカイン分泌およびエフェクターリンパ球の増殖を効率よく抑制する制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞の大量浸潤が認められた（Ｊｏａｎｎｅｓ等、２００９年）。最も悪性の細胞はＰＤ−Ｌ１を発現するが、ＰＤ−１はＴエフェクター細胞の一部で発現した。ｓｖＬ４が脳腫瘍に対して有効性を示すかどうかを試験するために、マウス（Ｃ５７ＢＬ／６種、雌、６〜８週齢）の脳の片方の半球に神経膠腫細胞（マウスＧＬ２６１細胞系）を移植した。１週間腫瘍を進行させた後、４価ｓｖＬ４を１ｎｍｏｌ／ｇの用量で１日おきに２週間皮下注射した（Ｋｕｓｈｃｈａｙｅｖ等、２０１２年ａ、２０１２年ｂ）。
【００８０】
神経膠腫細胞（マウスＧＬ２６１細胞系）を移植したマウス（Ｃ５７ＢＬ／６種、雌、６〜８週齢）の生存を、照射（７および９日目に４Ｇｙ）単独、７日目の開始から１日おきにペプチド（１ｎｍｏｌ／ｇ）単独、または照射およびペプチドによる治療の後に測定した。図１０Ａに示したように、腫瘍のサイズは、ペプチド治療動物でわずかに低下したが、動物の寿命はあまり延長しなかった（表３）。しかし、照射と組み合わせて、ペプチドは劇的に寿命を延長させ、治療開始から２倍に増加した（図１０Ｂ）。これらの結果は、腫瘍は最初のうちは貪食細胞の浸潤によって拡大するようだが、脳において活性化した貪食細胞は固形がんを効率よく攻撃することができないことを示唆している。照射後、腫瘍細胞は損傷を受けて貪食細胞によって十分に破壊されるようで、このことは腫瘍サイズの著しい低下によって示された。併用療法によって腫瘍の大きさが１９日目に最小限になったことは、腫瘍増殖が遅延したことを示唆しており、これは臨床上有望で重要な指標である（Ｔｅｉｃｈｅｒ、２００６年）。
【００８１】
【表３】
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【００８２】
７．ｓｖＬ４の投与応答研究
マウスによる実験のほとんどにおいて、４価ｓｖＬ４は１日おきに１ｎｍｏｌ／ｇの用量で常法通り投与したが、これは最大限有効であるが必ずしも最適な用量ではないと考えられる。その他の実験において、０．１から０．２ｎｍｏｌ／ｇ（０．６８から１．４ｍｇ／ｋｇ）の用量でより有効であることが見いだされた。神経膠腫細胞を脳に移植したマウスの実験において、１日おきに０．１ｎｍｏｌ／ｇを投与するだけで、より高い用量よりも神経膠芽腫の腫瘍サイズの低下を引き起こすのに有効であった（図１１）。
【００８３】
電離放射線は、図１０に示したように、免疫系に対してペプチドと相乗効果を有する。実際に、がん治療の成功は、放射線療法と宿主の免疫応答との相乗作用に大きく左右されることが見いだされた。しかし、１Ｇｙ超と規定した高用量の照射では、免疫は抑制される。それにも関わらず、照射はがん細胞におけるストレスタンパク質を上方制御し、抗原提示細胞が抗腫瘍応答を惹起して食作用または細胞溶解活性によって損傷を受けた細胞を除去する能力を高める（Ｍａｎｄａ等、２０１２年に概括されている）。
【００８４】
治療薬がα−ＰＤ−１抗体である類似の実験を実施した。ｓｖＬ４と同様に、α−ＰＤ−１療法と照射を組み合わせると生存の改善が示された。生存の中央値は対照マウスでは２５日で、α−ＰＤ−１のみの群は２７日、照射群は２８日、照射およびα−ＰＤ−１群は５３日であった（Ｚｅｎｇ等、２０１３年）。これらの実験を一緒に考えると、ｓｖＬ４およびα−ＰＤ−１と照射の併用治療によって長期生存が実現する。
【００８５】
したがって、免疫療法はｓｖＬ４の適切な用量の投与とα−ＰＤ−１、α−ＰＤ−Ｌ１および低用量照射などのその他との療法の組合せによって最適化することができる。この組合せによる治療は相乗的で、神経膠芽腫腫瘍の手術による減量を最初に行った患者の生存の劇的な改善を示すことが予測される。
【００８６】
８．ｓｖＬ４による卵巣がんの治療
ｓｖＬ４の最適な濃度が約０．１ｎｍｏｌ／ｇであることは、卵巣がんのマウスモデルによる実験でさらに立証された（Ｒｏｂｙ等、２０００年）。卵巣がん細胞系をＣ５７ＢＬ／６雌マウスの腹腔に移植し、ほとんどの女性が診断を受ける後期を模倣するために、４価ｓｖＬ４による治療を４５日後から開始した。治療は５０日間継続し、がんの進行は腹水の発生の徴候として動物の体重によってモニターした。（腹水は、浮遊性腫瘍細胞を含有する液体の腹部における異常な蓄積を示す用語である）。この系では、腹腔における腫瘍の進行は、最初はゆっくりであるが、その後迅速に進行し、最終的には腫瘍腹水が発生する。対照動物の体重は約７０日目から迅速に増加し（図１２Ａ）、１２９日目までには対照マウス全てが死亡した（図１２Ｂ）。０．１ｎｍｏｌ／ｇで治療した動物の体重は、正常な成長速度を上回って増加することはなく、８匹の動物全てが治療終了後２０日の１１０日目まで生きて（図１２Ｂ）、８匹のうち４匹は１５０日目でもまだ生きていた。１ｎｍｏｌ／ｇで治療した動物が１匹、治療中（約８０日目）に死亡したが、１３０日目までに死亡したのはさらに１匹だけだった。治療終了後、動物の体重は最終的に増加し、ｓｖＬ４による治療は腹水の発生を抑制するが、腫瘍は排除しなかったことが示唆された。しかし、治療中止後５週間、生存したマウスは健康そうであった。治療を継続すると、腹水の形成をいつまでも抑制することができる。マウスのほとんどは治療中止後数週間生き続けたことは重要で、記憶Ｂ細胞の発生が示唆される。
【００８７】
多種多様な免疫調節アプローチは、α−ＣＴＬＡ−４（イピリムマブ）、α−ＣＡ−１２５（オレゴボマブ）およびα−ＰＤ−Ｌ１などのいくつかのモノクローナル抗体を含めて、卵巣がんの治療について現在評価中である（Ｔｓｅ等、２０１４年）。臨床研究の早期の結果では、患者が通常疾患後期と診断されているので、ほとんどが芳しくなかった。図１２に示したように、ｓｖＬ４は後期卵巣がんをおそらくいつまでも制御し、したがって、チェックポイント遮断抗体を可能な範囲で補完すると予想される。この併用治療によって、抗体による免疫療法は短期の補助的な治療計画としての使用に制限されなくなると予想される。
【００８８】
全治療、３種類の用量および２種類の投与頻度（月曜日／水曜日、ＭＷまたは１日おき、Ｑ２Ｄ）の比較を表４に示す。生存中央値の比較は、１日おきに０．１ｎｍｏｌ／ｇの用量を投与すると生存が最大限延長されることを示した。
【００８９】
【表４】
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【００９０】
薬物投与中および投与後に、マウスの体重および挙動に変化がなかったことは重要で、治療に関連した明白な毒性がないことが示された。同じ領域に薬物を繰り返し注射しても、見かけ上刺激作用も繊維組織または肉芽腫組織の形成も生じなかった。さらに、１００日間ｓｖＬ４で治療したマウスの血清へのペプチドの結合を検出する試みは陰性で、ペプチドはマウスにとって抗原性ではないことが示唆された。
【００９１】
９．多様ながんのイヌへのｓｖＬ４の静脈注射の有効性
様々ながんのイヌにおける低用量ｓｖＬ４の効果の予備試験では、４価ｓｖＬ４を単独で毎週注射すると、標準的な化学療法薬よりも、さらにはｓｖＬ４と組み合わせた化学療法薬よりも単独の方が寿命が顕著に延長して有効であった（図１３）。これらのデータは、化学療法薬がｓｖＬ４の免疫刺激作用を妨害することを示唆する。したがって、この組合せ免疫療法は、化学療法なしで使用することが最も良い。したがって、ｓｖＬ４およびα−ＣＴＬＡ−４またはα−ＰＤ−１を混合物として１回の注射で提供することが有利であろう。各成分の用量は最適の利益を得るために個々に、例えば、週１回注射の頻度で調整することができる。
【００９２】
発明の態様
［１］ペプチドの治療有効量および第１抗体の治療有効量を含む医薬組成物であって、該ペプチドが配列番号１によって表される活性配列を有し、該抗体が免疫チェックポイントタンパク質に対するものである、医薬組成物。
［２］ペプチドが、配列番号３に記載の構造を有する、［１］に記載の医薬組成物。
［３］薬学的に許容される担体をさらに含む、［１］または［２］に記載の医薬組成物。
［４］第２抗体をさらに含み、第２抗体が第１抗体とは異なる免疫チェックポイント経路の免疫チェックポイントタンパク質に対するものである、［１］〜［３］のいずれかに記載の医薬組成物。
［５］治療有効量が、対象の免疫応答を活性化するために十分な量である、［１］〜［４］のいずれかに記載の医薬組成物。
［６］治療有効量が、がんを有する対象におけるがんを治療するために十分な量である、［１］〜［５］のいずれかに記載の医薬組成物。
［７］がんが、膀胱がん、脳がん、乳がん、結腸がん、頭部および頸部がん、肝臓がん、肺がん、膵臓がん、前立腺がん、卵巣がん、腎臓がんまたは皮膚がんである、［６］に記載の医薬組成物。
［８］がんが、結腸直腸腺癌、神経膠芽腫、肝細胞癌、ホルモン不応性前立腺がん、卵巣上皮癌、卵巣腺癌、メラノーマ、中皮腫、非小細胞肺がん、小細胞肺がんまたは腎細胞癌である、［７］に記載の医薬組成物。
［９］治療有効量が、ウイルス、マイコバクテリアまたは寄生虫によって生じる感染症を治療するために十分な量である、［１］〜［５］のいずれかに記載の医薬組成物。
［１０］治療有効量が、腫瘍内の制御性Ｔ細胞集団を抑制するために十分な量である、［１］〜［９］のいずれかに記載の医薬組成物。
［１１］治療有効量が、エフェクターＴ細胞集団を増加させるために十分な量である、［１］〜［５］のいずれかに記載の医薬組成物。
［１２］治療有効量が、ＩＬ−２、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−２１、ＩＬ−２７、ＴＮＦαおよびＩＦＮγからなる群から選択される少なくとも１つの抗がんサイトカインのレベルを増大させるために十分な量である、［１］〜［１１］のいずれかに記載の医薬組成物。
［１３］対象における免疫系を活性化するための医薬品の製造における組成物の使用であって、該組成物が免疫系を活性化するために十分な量のペプチドおよび第１抗体を含み、ペプチドが配列番号１によって表される活性配列を有し、第１抗体が免疫チェックポイントタンパク質に対するものである、使用。
［１４］対象における免疫系の活性化に使用するための組成物であって、組成物が免疫系を活性化するために十分な量のペプチドおよび第１抗体を含み、ペプチドが配列番号１によって表される活性配列を有し、第１抗体が免疫チェックポイントタンパク質に対するものである、組成物。
［１５］ペプチドが、配列番号３に記載の構造を有する、［１３］または［１４］に記載の組成物の使用または組成物。
［１６］免疫系を活性化するために十分な量が、対象におけるがんを治療するために十分な量である、［１２］〜［１５］のいずれかに記載の組成物の使用または組成物。
［１７］がんが、膀胱がん、脳がん、乳がん、結腸がん、頭部および頸部がん、肝臓がん、肺がん、膵臓がん、前立腺がん、卵巣がん、腎臓がんまたは皮膚がんである、［１６］に記載の組成物の使用または組成物。
［１８］がんが、結腸直腸腺癌、神経膠芽腫、肝細胞癌、ホルモン不応性前立腺がん、卵巣上皮癌、卵巣腺癌、メラノーマ、中皮腫、非小細胞肺がん、小細胞肺がんまたは腎細胞癌である、［１６］に記載の組成物の使用または組成物。
［１９］免疫系を活性化するために十分な量が、ウイルス、マイコバクテリアまたは寄生虫によって生じる感染症を治療するために十分な量である、［１３］または［１４］に記載の組成物の使用または組成物。
［２０］免疫系を活性化するために十分な量が、制御性Ｔ細胞集団を抑制するために十分な量である、［１３］〜［１９］のいずれかに記載の組成物の使用または組成物。
［２１］免疫系を活性化するために十分な量が、エフェクターＴ細胞集団を増加させるために十分な量である、［１３］〜［２０］のいずれかに記載の組成物の使用または組成物。
［２２］免疫系を活性化するために十分な量が、ＩＬ−２、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−２１、ＩＬ−２７およびＩＦＮγからなる群から選択される少なくとも１つの抗がんサイトカインの対象血清レベルを増大するために十分な量である、［１２］〜［２１］のいずれかに記載の組成物の使用または組成物。
［２３］ペプチドの治療量が約０．１ｎｍｏｌ／ｋｇ体重から約１５００ｎｍｏｌ／ｋｇ体重の間である、［１３］〜［２２］のいずれかに記載の組成物。
［２４］第１ペプチドおよび第２ペプチドの治療量が約１ｎｍｏｌ／ｋｇ体重から約１０００ｎｍｏｌ／ｋｇ体重の間である、［１３］〜［２２］のいずれかに記載の組成物。
［２５］第１ペプチドおよび第２ペプチドの治療量が約１ｎｍｏｌ／ｋｇ体重である、［１３］〜［２２］のいずれかに記載の組成物。
［２６］免疫チェックポイントタンパク質がＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２の少なくとも１つである、［１］〜［１２］のいずれかに記載の医薬組成物または［１３］〜［２２］のいずれかに記載の組成物の使用または［１４］〜［２５］のいずれかに記載の組成物。
［２７］抗体が、α−ＣＴＬＡ−４、α−ＰＤ−１、α−ＰＤ−Ｌ１およびα−ＰＤ−Ｌ２からなる群から選択されるモノクローナル抗体である、［２６］に記載の医薬組成物または組成物の使用または組成物。
［２８］対象における免疫応答を活性化する方法であって、
対象にペプチドの治療有効量を投与するステップ、ここで該ペプチドは配列番号１によって表される活性配列を有する、および
抗体の治療有効量を対象に投与するステップ、ここで該抗体は免疫チェックポイントタンパク質に対するものである、
を含む方法。
［２９］抗体がα−ＣＴＬＡ−４、α−ＰＤ−１、α−ＰＤ−Ｌ１、α−ＰＤ−Ｌ２およびそれらの組合せからなる群から選択される、［２８］に記載の方法。
［３０］ペプチドが、抗体の前に投与される、［２８］または［２９］に記載の方法。
［３１］ペプチドが、抗体の少なくとも５日前に投与される、［３０］に記載の方法。
［３２］ペプチドが、抗体の少なくとも３日前に投与される、［３０］に記載の方法。
［３３］ペプチドが、１日おきに投与される、［２８］〜［３２］のいずれかに記載の方法。
［３４］抗体が抗体治療期間に投与され、抗体治療期間の後、ペプチドの投与が継続される、［２８］〜［３３］のいずれかに記載の方法。
［３５］抗体が、少なくとも２つの異なる免疫チェックポイント経路の免疫チェックポイントタンパク質に対する抗体を含む、［２８］〜［３４］のいずれかに記載の方法。
［３６］対象ががんを有し、対象に照射治療を投与することをさらに含む、［２８］〜［３５］のいずれかに記載の方法。
［３７］免疫応答を活性化するためのキットであって、
ペプチドの治療有効量、ここで該ペプチドは配列番号１によって表される活性配列を有する、および
１つまたは複数の抗体の治療有効量、ここで該抗体は免疫チェックポイントタンパク質に対するものである、
を含む、キット。
［３８］少なくとも１つの抗体がα−ＣＴＬＡ−４、α−ＰＤ−１、α−ＰＤ−Ｌ１、α−ＰＤ−Ｌ２からなる群から選択される、［３７］に記載のキット。
［３９］ペプチドが、配列番号３に記載の構造を有する、［３７］または［３８］に記載のキット。
【００９３】
【表５−１】
0006649953.tif 000006
【００９４】
【表５−２】
0006649953.tif 000007
【００９５】
【表５−３】
0006649953.tif 000008
【図１−１】
0006649953.tif 000009
【図１−２】
0006649953.tif 000010
【図２】
0006649953.tif 000011
【図３】
0006649953.tif 000012
【図４】
0006649953.tif 000013
【図５】
0006649953.tif 000014
【図６】
0006649953.tif 000015
【図７−１】
0006649953.tif 000016
【図７−２】
0006649953.tif 000017
【図８−１】
0006649953.tif 000018
【図８−２】
0006649953.tif 000019
【図９】
0006649953.tif 000020
【図１０】
0006649953.tif 000021
【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３】
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【配列表】
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