(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸増幅の精度管理方法であって、
核酸検出工程と、判定工程とを含み、
前記核酸検出工程は、
標的核酸と、精度管理用ポリヌクレオチドとを含む核酸試料を調製する工程、
前記標的核酸一分子を含む区画と、前記精度管理用ポリヌクレオチド一分子を含む区画とを調製する工程、
前記各区画において前記核酸試料に含まれる前記標的核酸または前記精度管理用ポリヌクレオチドの核酸増幅を行い、検出用プローブを用いて前記検出用プローブに起因するシグナルを検出する工程、
を含み、
前記判定工程において、前記シグナル検出工程の結果に基づいて、前記核酸検出工程が適切であったか不適切であったかが判定され、
前記標的核酸は検出配列を含み、
前記精度管理用ポリヌクレオチドは、
（１）第１領域、第２領域および第３領域を含み、前記第１領域が、標的核酸増幅用の第１プライマーが結合可能な配列を含み；前記第２領域が、標的核酸増幅用の第２プライマーが結合可能な配列に相補的な配列を含み；および前記第３領域が検出配列を含む一本鎖ポリヌクレオチド、
（２）前記（１）の配列と相補的な配列を含む一本鎖ポリヌクレオチド、または
（３）前記（１）のポリヌクレオチドと前記（２）のポリヌクレオチドとを含む二本鎖ポリヌクレオチド、
であり、
前記検出用プローブは、前記検出配列に相補的な配列を含み、
前記（１）の精度管理用ポリヌクレオチドにおける検出配列の数が、前記標的核酸における検出配列の数と異なり、
前記精度管理用ポリヌクレオチドにおいて前記第３領域は、前記第１領域と前記第２領域の間に位置する、前記精度管理方法。
【請求項２】
前記各区画が、前記第１プライマー、前記第２プライマー、ｄＮＴＰｓおよびポリメラーゼをさらに含む、請求項１に記載の精度管理方法。
【請求項３】
前記精度管理用ポリヌクレオチドが、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはポリヌクレオチド誘導体を含む、請求項１または２に記載の精度管理方法。
【請求項４】
前記精度管理用ポリヌクレオチドが、二本鎖である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の精度管理方法。
【請求項５】
前記精度管理用ポリヌクレオチドが、
前記第３領域の上流に第１スペーサー配列を含み、
前記第３領域の下流に第２スペーサー配列を含み、
前記第１スペーサー配列と、前記第２スペーサー配列とは、互いに異なる配列であり、
前記第１スペーサー配列と、前記第２スペーサー配列とは、相補的ではない、
請求項１〜４のいずれか一項に記載の精度管理方法。
【請求項６】
前記精度管理用ポリヌクレオチドにおける検出配列と前記検出配列に相補的な配列との合計数が、前記標的核酸における検出配列の数よりも少なくとも１つ多い、請求項１〜５のいずれか一項に記載の精度管理方法。
【請求項７】
前記検出用プローブが、蛍光物質、酵素およびハプテンからなる群から選択される少なくとも１つの標識物質で予め標識化されたオリゴヌクレオチドである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の精度管理方法。
【請求項８】
前記核酸増幅が、エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼの存在下で行われ、
前記検出用プローブが、蛍光物質およびクエンチャー物質で予め標識化されたオリゴヌクレオチドであり、前記検出用プローブにおいて、前記クエンチャー物質は前記蛍光物質が消光されるように配置され、
前記検出用プローブは、前記核酸増幅の際に、前記標的核酸および精度管理用ポリヌクレオチドにハイブリダイズし、ハイブリダイズした検出用プローブが前記エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼにより分解されて、前記蛍光物質が前記クエンチャー物質から離隔し、蛍光シグナルを発することが可能となる、請求項７に記載の精度管理方法。
【請求項９】
前記核酸試料がビーズを含み、
前記ビーズに前記第１プライマーおよび前記第２プライマーのいずれかまたは両方が結合されている、請求項２〜８のいずれか一項に記載の精度管理方法。
【請求項１０】
前記区画が前記ビーズを１つの区画につき１個含む、請求項９に記載の精度管理方法。
【請求項１１】
前記シグナル検出工程において、前記検出用プローブに起因するシグナルが、前記ビーズから生じるシグナル強度であり、
前記判定工程において、前記シグナル強度がシグナル強度に対応する所定の閾値以上のビーズを、前記精度管理用ポリヌクレオチドの増幅産物を含むビーズとして計数し、
計数結果が、ビーズ数に対応する所定の閾値未満の場合に、前記核酸検出工程が不適切であったと判定される、請求項９または１０に記載の精度管理方法。
【請求項１２】
前記シグナル検出工程において、前記検出用プローブに起因するシグナルが、前記区画から生じる蛍光シグナル強度である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の精度管理方法。
【請求項１３】
前記判定工程において、前記蛍光シグナル強度が、蛍光シグナル強度に対応する所定の閾値以上の区画を、前記精度管理用ポリヌクレオチドの増幅産物を含む区画として計数し、
計数結果が、区画数に対応する所定の閾値未満の場合に、前記核酸検出工程が不適切であったと判定される、請求項１２に記載の精度管理方法。
【請求項１４】
前記シグナル検出工程において、フローサイトメーターを用いる、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の精度管理方法。
【請求項１５】
標的核酸の変異検出における精度管理方法であって、
核酸検出工程と、判定工程とを含み、
前記核酸検出工程は、
標的核酸と、精度管理用ポリヌクレオチドとを含む核酸試料を調製する工程、
前記標的核酸一分子を含む区画と、前記精度管理用ポリヌクレオチド一分子を含む区画とを調製する工程、
前記各区画において前記核酸試料に含まれる前記標的核酸または前記精度管理用ポリヌクレオチドの核酸増幅を行い、検出用プローブを用いて前記検出用プローブに起因するシグナルを検出する工程、
前記判定工程において、前記シグナル検出工程の結果に基づいて、前記標的核酸における変異の有無が判定され、さらに、前記核酸検出工程が適切であったか不適切であったかが判定され、
前記標的核酸は検出配列を含み；
前記精度管理用ポリヌクレオチドは、
（１）第１領域、第２領域および第３領域を含み、前記第１領域が、標的核酸増幅用の第１プライマーが結合可能な配列を含み；前記第２領域が、標的核酸増幅用の第２プライマーが結合可能な配列に相補的な配列を含み；および前記第３領域が検出配列を含む一本鎖ポリヌクレオチド、
（２）前記（１）の配列と相補的な配列を含む一本鎖ポリヌクレオチド、または
（３）前記（１）のポリヌクレオチドと前記（２）のポリヌクレオチドとを含む二本鎖ポリヌクレオチド
であり、
前記（１）の精度管理用ポリヌクレオチドにおける検出配列の数が、前記標的核酸における検出配列の数と異なり、
前記精度管理用ポリヌクレオチドにおいて前記第３領域は、前記第１領域と前記第２領域の間に位置し、
前記標的核酸の増幅産物に結合した検出用プローブに起因するシグナルに基づいて、前記標的核酸中の変異の有無を検出し、
前記精度管理用ポリヌクレオチドの増幅産物に結合した検出用プローブに起因するシグナルに基づいて、前記変異の有無の検出結果の適否を判定する、精度管理方法。
【請求項１６】
前記精度管理用ポリヌクレオチドにおける検出配列と前記検出配列に相補的な配列との合計数が、前記標的核酸における検出配列の数よりも多い、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
前記シグナル検出工程において、前記検出用プローブに起因するシグナルが、前記区画から生じるシグナル強度であり、
前記標的核酸の増幅産物を含む区画のシグナル強度よりも高いシグナル強度を有する区画を、前記精度管理用ポリヌクレオチドの増幅産物を含む区画として計数し、
前記精度管理用ポリヌクレオチドの増幅産物を含む区画の計数結果が閾値未満の場合に、前記変異の有無の検出結果が適切ではないと判定する、
請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
前記核酸試料がビーズを含み、
前記ビーズに前記第１プライマーおよび前記第２プライマーのいずれかまたは両方が結合され、
前記区画が前記ビーズを１つの区画につき１個含み、
前記シグナル検出工程において、前記検出用プローブに起因するシグナルが、ビーズから生じるシグナル強度であり、
前記標的核酸の増幅産物を含むビーズのシグナル強度よりも高いシグナル強度を有するビーズを、前記精度管理用ポリヌクレオチドの増幅産物を含むビーズとして計数し、
前記精度管理用ポリヌクレオチドの増幅産物を含むビーズの計数結果が閾値未満の場合に、前記変異の有無の検出結果が適切ではないと判定する、
請求項１６記載の方法。
【請求項１９】
標的核酸の核酸増幅を行い、増幅産物に検出用プローブを結合させることにより前記標的核酸をデジタル核酸検出する方法において、
前記核酸増幅において精度管理用ポリヌクレオチドを鋳型とするデジタル核酸増幅を行い、
前記精度管理用ポリヌクレオチドの増幅産物に検出用プローブを結合させることにより前記精度管理用ポリヌクレオチドがデジタル核酸検出され、
前記精度管理用ポリヌクレオチドのデジタル核酸検出の結果に基づいて、前記標的核酸のデジタル核酸検出の結果が精度管理され、
前記精度管理用ポリヌクレオチドの増幅産物１分子に結合する検出用プローブの数が、前記標的核酸の増幅産物１分子に結合する検出用プローブの数と異なる、
精度管理方法。
【請求項２０】
前記精度管理用ポリヌクレオチドの増幅産物１分子に結合する検出用プローブの数が、前記標的核酸の増幅産物１分子に結合する検出用プローブの数よりも多い、請求項１９記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸増幅の精度管理方法、精度管理用試薬およびその試薬キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸増幅法においては、ポリメラーゼによる増幅エラー、夾雑物質等による増幅阻害、サンプル調製時の誤操作など、種々の要因により適切な結果が得られない場合がある。そのため、核酸増幅が適切に行われたか否かを精度管理する必要がある。
【０００３】
非特許文献１には、標的核酸と同じプライマーセットが結合する領域を有し、標的核酸を検出する検出用プローブとは異なるプローブが結合する領域を有する、コントロールポリヌクレオチドが開示されている。標的核酸を検出する検出用プローブとコントロールポリヌクレオチドを検出するプローブとで異なる蛍光色素を標識することにより、同一反応槽で同時にそれぞれの増幅産物を区別して検出することができる（第３９８６頁、右欄“Primes, Probes, and PCR assay”の項、および第３９９０頁、Ｆｉｇ．２）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Appl. Environ. Mocrobiol. 2001. 67, 3985-3993
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
近年、試料中の標的となる核酸分子（以下、「標的核酸」ともいう）を検出する方法として、デジタル核酸検出が開発されている。具体的には、マイクロウェルや液滴などの区画化された領域（以下、単に「区画」ともいう）に標的核酸を１分子ずつ収容し、各区画で核酸増幅を行うことにより、高感度に核酸分子を検出する方法である。非特許文献１に記載の方法はデジタル核酸検出法にも応用可能と思われるが、標的核酸とコントロールポリヌクレオチドとで異なるプローブを使用するため、標的核酸を検出するためのプローブが正しく機能しているか否かを評価することが難しい。
【０００６】
本発明者らは、デジタル核酸検出に好適に用いられる精度管理方法を完成させた。即ち、本発明者らはデジタル核酸検出においては、標的核酸と同一のプライマーセットが結合可能な領域、前記プライマーセットが結合可能な領域間に、標的核酸検出用プローブが結合可能な領域を、標的核酸とは異なる個数有するオリゴヌクレオチドを使用することにより、精度管理を行うことができることを見出した。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、以下の核酸増幅の精度管理方法、精度管理用試薬および精度管理用試薬キットに関する。
【０００８】
本発明の第１の態様は、核酸検出工程と、判定工程とを含む、核酸増幅の精度管理方法であって、前記核酸検出工程は、標的核酸と、精度管理用ポリヌクレオチドとを含む核酸試料を調製する工程、前記標的核酸一分子を含む区画と、前記精度管理用ポリヌクレオチド一分子を含む区画とを調製する工程、前記各区画において前記核酸試料に含まれる前記標的核酸または前記精度管理用ポリヌクレオチドの核酸増幅を行い、検出用プローブを用いて前記検出用プローブに起因するシグナルを検出する工程を含み、前記判定工程において、前記シグナル検出工程の結果に基づいて、前記核酸検出工程が適切であったか不適切であったかが判定され、前記標的核酸は検出配列を含み、前記精度管理用ポリヌクレオチドは、（１）第１領域、第２領域および第３領域を含み、前記第１領域が、標的核酸増幅用の第１プライマーが結合可能な配列を含み；前記第２領域が、標的核酸増幅用の第２プライマーが結合可能な配列に相補的な配列を含み；および前記第３領域が検出配列および前記検出配列に相補的な配列のいずれかまたは両方を含む一本鎖ポリヌクレオチド、（２）前記（１）の配列と相補的な配列を含む一本鎖ポリヌクレオチド、または（３）前記（１）のポリヌクレオチドと前記（２）のポリヌクレオチドとを含む二本鎖ポリヌクレオチドであり、前記検出用プローブは、前記検出配列に相補的な配列を含み、前記（１）の精度管理用ポリヌクレオチドにおける検出配列と前記検出配列に相補的な配列との合計数が、前記標的核酸における検出配列の数と異なる、前記精度管理方法を提供する。
【０００９】
本発明の第２の態様は、核酸増幅の精度管理用試薬であって、（１）第１領域、第２領域および第３領域を含み、前記第１領域が、標的核酸増幅用の第１プライマーが結合可能な配列を含み；前記第２領域が、標的核酸増幅用の第２プライマーが結合可能な配列に相補的な配列を含み；および前記第３領域が検出配列および前記検出配列に相補的な配列のいずれかまたは両方を含む一本鎖ポリヌクレオチド、（２）前記（１）の配列と相補的な配列を含む一本鎖ポリヌクレオチド、または（３）前記（１）のポリヌクレオチドと前記（２）のポリヌクレオチドとを含む二本鎖ポリヌクレオチドであり、前記（１）の精度管理用ポリヌクレオチドにおける検出配列と前記検出配列に相補的な配列との合計数が、標的核酸における検出配列の数と異なる、精度管理用試薬を提供する。
【００１０】
本発明の第３の態様は、第２の態様に係る精度管理用試薬を含む精度管理用試薬キットを提供する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、デジタル核酸検出法における精度管理方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】実施形態１に係る核酸検出工程を示す模式図。
【図２】実施形態２に係る核酸増幅の種類（ｂ）および検出シグナルの２Ｄスキャッタグラム（ａ）を示す模式図。
【図３】実施形態３に係る核酸検出工程を示す模式図。
【図４】実施形態４に係る核酸検出工程を示す模式図。
【図５】ヒトＫＲＡＳ遺伝子の核酸増幅における、例示的な精度管理方法の結果を示す２Ｄスキャッタグラム。２Ｄスキャッタグラムは、精度管理用ポリヌクレオチド（Ｗｔ，ｎ＝５）あり（＋）の場合（ａ）およびなし（−）の場合（ｂ）の、変異型（Ｍｕｔ）のＫＲＡＳ遺伝子由来の増幅産物を反映するシグナルをｘ軸に、野生型（Ｗｔ）のＫＲＡＳ遺伝子由来の増幅産物を反映するシグナルをｙ軸に示す。
【図６】精度管理用ポリヌクレオチド（Ｍｕｔ，ｎ＝５）あり（＋）の場合（ａ）およびなし（−）の場合（ｂ）の、変異型（Ｍｕｔ）のＫＲＡＳ遺伝子由来の増幅産物を反映するシグナルをｘ軸に、野生型（Ｗｔ）のＫＲＡＳ遺伝子由来の増幅産物を反映するシグナルをｙ軸に示した２Ｄスキャッタグラム。
【図７】核酸増幅反応液中にスパイクした精度管理用ポリヌクレオチド（ａ：Ｗｔ，ｎ＝５、ｂ：Ｍｕｔ，ｎ＝５）のコピー数と、検出シグナル強度との相関関係を示す散布図。
【図８】精度管理用ポリヌクレオチドにおける検出配列の数と検出シグナル強度との相関関係を示す箱ひげ図。
【図９】精度管理用ポリヌクレオチド（Ｗｔ，ｎ＝６）あり（＋）の場合（ａ）およびなし（−）の場合（ｂ）の、変異型（Ｍｕｔ）のＫＲＡＳ遺伝子由来の増幅産物を反映するシグナルをｘ軸に、野生型（Ｗｔ）のＫＲＡＳ遺伝子由来の増幅産物を反映するシグナルをｙ軸に示した２Ｄスキャッタグラム。
【図１０】１つの実施形態に係る精度管理用試薬キットを示す模式図。
【図１１】１つの実施形態に係る標的核酸（ａ）および精度管理用ポリヌクレオチド（ｂ）を示す模式図。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
［精度管理方法］
本発明の第１の態様は、核酸検出工程と判定工程とを含む核酸増幅の精度管理方法に関する。第１の態様の核酸検出工程では、標的核酸と、精度管理用ポリヌクレオチドとを含む核酸試料を調製する。１つの実施形態において、核酸試料調製工程は、標的核酸を含む試料と、精度管理用ポリヌクレオチドを含む試料とを混合することにより、核酸試料を調製する。
【００１４】
本明細書において、「核酸」は、ＤＮＡまたはＲＮＡを意味する。核酸は、核酸増幅され得るものであれば特に限定されず、一部又は全部がヌクレオチド誘導体であってもよい。ヌクレオチド誘導体としては、Locked Nucleic Acid (LNA), Bridged Nucleic Acid (BNA)などが例示される。
【００１５】
「核酸試料」は核酸を含む試料であれば特に限定されない。核酸試料としては、たとえば、血液、リンパ球などの生体試料、尿、便などの排泄物、河川水、海水、土壌などの環境サンプルなどが例示される。核酸試料は通常は液状であるため、試料が液状でない場合は適宜前処理を行うことにより、液状としておくことが好ましい。ここで、「液状」の試料とは、溶質が完全に溶解した溶液に限られず、細胞や細胞の破片などの微細な固形物が懸濁した懸濁液、ゾルなども含む。前処理の方法は、適宜公知の方法が選択される。例えば、試料が生体から採取された組織である場合、前処理液中で組織中の細胞を破砕し、遠心分離等で破砕物を分離・除去することにより、核酸試料を調製することができる。
【００１６】
本明細書において、「標的核酸」は、興味対象の配列（以下、「検出配列」ともいう）を有する。標的核酸は、核酸試料に含まれる核酸だけでなく、核酸試料中のＤＮＡやＲＮＡを増幅した増幅産物（アンプリコン）や、核酸試料中のＲＮＡから逆転写反応により合成したｃＤＮＡなども含まれる。標的核酸は、通常、生物由来またはウイルス由来である。
【００１７】
本発明に係る精度管理用ポリヌクレオチドは、標的核酸における検出配列を含む領域を増幅し得るプライマー（以下、「標的核酸増幅用プライマー」ともいう）と同じプライマーを用いて増幅され得る。標的核酸増幅用プライマーセットは、第１の標的核酸増幅用プライマー（以下、「第１プライマー」ともいう）および第２の標的核酸増幅用プライマー（以下、「第２プライマー」ともいう）を含む。精度管理用ポリヌクレオチドにおいて、第１プライマーが結合可能な配列を含む領域を第１領域といい、第２プライマーが結合可能な配列に相補的な配列を含む領域を第２領域という。
前記標的核酸増幅用プライマーにより増幅される精度管理用ポリヌクレオチドの領域には、検出配列および前記検出配列に相補的な配列のいずれか又はその両方が含まれる。精度管理用ポリヌクレオチドにおいて、検出配列および前記検出配列に相補的な配列のいずれか又はその両方を含む領域を第３領域という。
精度管理用ポリヌクレオチドの第３領域に存在する検出配列と前記検出配列に相補的な配列との合計数は、前記標的核酸増幅用プライマーにより増幅される前記標的核酸の領域における検出配列の数と異なる。これにより、精度管理用ポリヌクレオチドの増幅産物にハイブリダイズする検出用プローブの数と、標的核酸の増幅産物にハイブリダイズする検出用プローブの数とが異なることになる。例えば、精度管理用ポリヌクレオチドの増幅産物を含む区画またはビーズから生じる検出用プローブに起因するシグナルの強度と、標的核酸の増幅産物を含む区画またはビーズから生じる検出用プローブに起因するシグナル強度とが異なることになる。精度管理用ポリヌクレオチドの増幅産物を含む区画またはビーズと、標的核酸の増幅産物を含む区画またはビーズとを区別することができる。
前記第１領域、第２領域および第３領域を含む一本鎖ポリヌクレオチドである精度管理用ポリヌクレオチドにおける検出配列と前記検出配列に相補的な配列との合計数が、標的核酸における検出配列の数よりも多い場合、精度管理用ポリヌクレオチドの増幅産物を含む区画またはビーズは、標的核酸の増幅産物を含む区画またはビーズよりも強いシグナルを生じる。標的核酸における検出配列の数が、前記精度管理用ポリヌクレオチドにおける検出配列と前記検出配列に相補的な配列との合計数よりも多い場合、標的核酸の増幅産物を含む区画またはビーズは、精度管理用ポリヌクレオチドの増幅産物を含む区画またはビーズよりも強いシグナルを生じる。以下、「検出配列と前記検出配列に相補的な配列との合計数」に対する言及は、第１領域、第２領域および第３領域を含む一本鎖ポリヌクレオチドである精度管理用ポリヌクレオチドにおける検出配列と前記検出配列に相補的な配列との合計数を意味する。
【００１８】
精度管理用ポリヌクレオチドにおける検出配列と前記検出配列に相補的な配列の合計数は、限定するものではないが、好ましくは標的核酸における検出配列の数よりも、少なくとも１つ多い。通常、標的核酸における検出配列の数は１であるため、精度管理用ポリヌクレオチドにおける検出配列と検出配列に相補的な配列との合計数は２以上に設定され得る。
精度管理用ポリヌクレオチドにおける検出配列と前記検出配列に相補的な配列との合計数は、限定するものではないが、２０個以下、１０個以下、好ましくは６個以下であってよく、例えば１個〜１０個、２個〜１０個、２個〜６個であってよい。精度管理用ポリヌクレオチドは、限定するものではないが、検出配列を少なくとも２個含む。
【００１９】
精度管理用ポリヌクレオチドは、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。一本鎖ポリヌクレオチドは、製造が容易で、安価かつ高純度に製造できる利点を有する。二本鎖ポリヌクレオチドは、一本鎖ポリヌクレオチドに比べて物理的に安定する傾向を示し得る。本発明に係る精度管理用ポリヌクレオチドは、目的に応じて、一本鎖で提供してもよく、二本鎖で提供してもよい。
【００２０】
精度管理用ポリヌクレオチドの鎖長は、限定するものではないが、調製の容易さの観点から、１０００ｂｐ以下、５００ｂｐ以下、２００ｂｐ以下であってよい。１つの実施形態において、精度管理用ポリヌクレオチドの鎖長は、５０ｂｐ以上２００ｂｐ以下、８０ｂｐ以上１７０ｂｐ以下、より好ましくは９０ｂｐ以上１６０ｂｐ以下である。精度管理用ポリヌクレオチドの鎖長と標的核酸の増幅産物との鎖長の差は、例えば、核酸増幅において同等の増幅効率を有する範囲であることが好ましい。
【００２１】
１つの実施形態において、精度管理用ポリヌクレオチドは、第３領域の上流に第１スペーサー配列を含み、第３領域の下流に第２スペーサー配列を含む。１つの実施形態において、前記第１スペーサー配列と前記第２スペーサー配列とは互いに異なる配列であり、前記第１スペーサー配列と前記第２スペーサー配列とは相補的ではない。ここで、「第１スペーサー配列と第２スペーサー配列とが互いに異なる」とは、一方の配列に完全に相補的な配列が、他方の配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズしないことを意味する。また、「第１スペーサー配列と第２スペーサー配列とが相補的ではない」とは、これらの配列がストリンジェントな条件下でハイブリダイズしないことを意味する。
精度管理用ポリヌクレオチドにおける検出配列と前記検出配列に相補的な配列との合計数が２つ以上の場合、精度管理用ポリヌクレオチドは、例えば１つの検出配列と他の検出配列との間に、さらなるスペーサー配列を含む。「さらなるスペーサー配列」は、前記第１スペーサー配列および前記第２スペーサー配列とはそれぞれと異なる配列であり、前記第１スペーサー配列および前記第２スペーサー配列の各々と相補的ではない。ここで、さらなるスペーサー配列に関する「配列が互いに異なる」および「配列が相補的ではない」は、上記した第１スペーサー配列および第２スペーサー配列で言及した「配列が互いに異なる」および「配列が相補的ではない」と同意義である。さらなるスペーサー配列の数は、精度管理用ポリヌクレオチドの第３領域に存在する検出配列および前記検出配列に相補的な配列の合計数に応じて増減し得る。上記した「さらなるスペーサー配列」に関する「配列が互いに異なる」および「配列が相補的ではない」は、さらなるスペーサー配列同士にも適用される。
各々のスペーサー配列が同一または相補的である場合、特に核酸増幅反応の後半にスペーサー配列とスペーサー配列の相補鎖とのハイブリダイゼーションや、スペーサー配列同士のハイブリダイゼーションが生じる可能性がある。この可能性を低減するために、第１スペーサー配列と第２スペーサー配列とが互いに異なり、且つ第１スペーサー配列と第２スペーサー配列とが相補的ではないことが好ましい。さらなるスペーサー配列についても同様である。
１つの実施形態において、前記スペーサー配列の長さは、例えば、１ｂｐ以上２０ｂｐ以下、１ｂｐ以上１０ｂｐ以下、２ｂｐ以上１０ｂｐ以下、３ｂｐ以上１０ｂｐ以下、または４ｂｐ以上１０ｂｐ以下であってよい。
【００２２】
例示を目的として、１つの実施形態に係る精度管理用ポリヌクレオチドおよび標的核酸の模式図を図１１に示す。図１１（ａ）は、増幅領域における検出配列の数が１である標的核酸を示す。図１１（ｂ）は、二本鎖の精度管理用ポリヌクレオチドを示し、前記精度管理用ポリヌクレオチドにおける検出配列と前記検出配列に相補的な配列との合計数は４である。具体的には、前記精度管理用ポリヌクレオチドは、第１プライマーが結合可能な配列を含む第１領域；第２プライマーが結合可能な配列に相補的な配列を含む第２領域；および、検出配列を２つ、前記検出配列に相補的な配列を２つ含む第３領域を含むポリヌクレオチドと、前記ポリヌクレオチドの配列と相補的な配列を含むポリヌクレオチドとで構成される。前記第３領域は、第１スペーサー配列を第３領域の上流に含み、第２スペーサー配列を第３領域の下流に含む。第３領域における、検出配列と前記検出配列に相補的な配列との合計数が２以上であるため、検出配列同士の間、検出配列と前記検出配列に相補的な配列の間、検出配列に相補的な配列同士の間にさらなるスペーサー配列を含む。
【００２３】
本明細書において、「ハイブリダイズする」または「ハイブリダイゼーション」は、塩基が水素結合により塩基対を形成し、二本鎖の核酸分子を形成することを意味する。検出用プローブと標的核酸の増幅産物とのハイブリダイゼーションは、配列とそれと相補的な配列との間に塩基対を形成しないミスマッチがあるとき、検出用プローブとミスマッチのある配列を有する核酸との二本鎖形成が抑制または防止される程度にストリンジェントな条件下で行われる。本明細書において、「ストリンジェントな条件」とは、ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションを行う際に当業者が一般的に用いる条件である。ストリンジェントな条件は、ある一本鎖ポリヌクレオチドが、当該一本鎖ポリヌクレオチドと一定の相補性を有する別の一本鎖ポリヌクレオチドにハイブリダイズし、相補性を有しない一本鎖ポリヌクレオチドには実質的にハイブリダイズしない条件である。ハイブリダイゼーション時のストリンジェンシーは、温度、塩濃度、ポリヌクレオチドの鎖長、ポリヌクレオチドのＧＣ含量、ハイブリダイゼーション緩衝液中のカオトロピック剤の濃度などが関与していることが知られている。ストリンジェントな条件としては、例えば、Sambrook, J. et al. (1998) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed.), ColdSpringHarborLaboratory Press, New Yorkに記載された条件を参考に、当業者が適宜設定することができる。
【００２４】
核酸検出工程において、後述の区画調製工程の前に、試料中の核酸の増幅を行ってもよい（以下、この工程を「プレ増幅工程」ともいう）。試料中の標的核酸が低濃度である場合などは区画調製工程の前に標的核酸を増幅しておくことにより、標的核酸の検出が容易となり得る。プレ増幅工程における核酸増幅の方法は特に限定されない。たとえば、Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）法、ＲＴ−ＰＣＲ法、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｂａｓｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＮＡＳＢＡ）法、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＴＭＡ）法などが例示される。プレ増幅工程は、試料調製工程前および／または試料調製工程後に行われ得る。試料調製工程後にプレ増幅工程が行われる場合は、プレ増幅により精度管理用ポリヌクレオチドも増幅されることになる。
【００２５】
第１の態様の核酸検出工程において、区画調製工程が行われる。「区画」は、例えば、基板上のマイクロウェルや油相中の水性液滴などが例示される。具体的には、米国特許７８４２４５７号明細書や米国特許８０４８６２７号明細書に記載の方法を用いて調製される区画が例示される。また、QuantStudio（商標）３ＤデジタルＰＣＲシステム(ThermoFisher Scientific社)、QX200(商標) Droplet Digital（商標）ＰＣＲ解析システム（バイオラッド社）、Biomark（商標）HD MX/HXシステム（フリューダイム社）、RainDropシステム（レインダンス社）など市販のデジタルＰＣＲ装置を用いて調製される区画であってもよい。
通常は、標的核酸や精度管理用ポリヌクレオチドの分子数よりも大多数の区画が用いられる。これにより、理論的には１区画につき標的核酸または精度管理用ポリヌクレオチドが一分子のみ含まれる区画が複数調製される。なお、標的核酸および精度管理用ポリヌクレオチドの何れも含まれない区画も多数調製される。
各区画は、後述の核酸増幅に必要な試薬を含有する。この試薬は、当業者が適宜選択可能であるが、通常は、核酸増幅用のプライマー、ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、および、ｄＴＴＰまたはｄＵＴＰ）、ポリメラーゼ、緩衝剤などを含む。プライマーは、基板やビーズなどの固相担体に固定されていてもよい。
【００２６】
第１の態様の核酸検出工程において、各区画において核酸試料に含まれる核酸の核酸増幅が行われる。区画中に標的核酸が存在する場合には、標的核酸の増幅産物が生成される。区画中に精度管理用ポリヌクレオチドが存在する場合は、精度管理用ポリヌクレオチドの増幅産物が生成される。その増幅産物がその区画内に生成される（本明細書中、「デジタル核酸増幅」ともいう）。
【００２７】
核酸増幅の方法は、限定するものではないが、ＰＣＲ法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＮＡＳＢＡ法、ＴＭＡ法が挙げられる。１つの実施形態において、核酸増幅法はＰＣＲである。核酸一分子レベルでのＰＣＲは、デジタルＰＣＲともいわれる。デジタルＰＣＲとしては、例えば、前記区画として液滴（ｄｒｏｐｌｅｔｓ）を用いるエマルジョンＰＣＲ（以下、「液滴型のデジタルＰＣＲ」ともいう）、または反応ウェルを用いるデジタルＰＣＲ（以下、「ウェル型のデジタルＰＣＲ」ともいう）であってよい。ＰＣＲは、例えば（１）熱変性、（２）アニーリング、（３）伸長の３ステップで行われてもよいし、（２）アニーリングまたはハイブリダイゼーションと（３）伸長を同一の温度条件で行う、（１）熱変性、（２’）アニーリングと伸長の２ステップで行われてもよい。各工程の条件は、適宜設定される。各ステップの温度変化は、例えば、Ｖｅｒｉｔｉ  サーマルサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）などのサーマルサイクラーを用いて自動的に制御することができる。
【００２８】
第１の態様の核酸検出工程において、検出用プローブを用いたシグナル検出工程が行われる。１つの実施形態に係るシグナル検出工程において、まず検出用プローブと増幅産物とが、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズされる。検出配列の存在を示すシグナルが検出された場合は検出配列を含む増幅産物ありと判定される。検出配列の存在を示すシグナルが検出されなかった場合は検出配列を含む増幅産物なしと判定される。
【００２９】
「検出用プローブ」は、検出配列に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドを含む。検出用プローブは複数種類用いてもよい。たとえば、標的配列のヌクレオチドの変異の有無を分析する場合、変異型の配列にハイブリダイズする検出用プローブ（以下、「変異型検出用プローブ」ともいう）と、野生型の配列にハイブリダイズする検出用プローブ（以下、「野生型検出用プローブ」ともいう）とが用いられ得る。これらの検出用プローブは互いに異なる種類のシグナルを発生する。一例では、変異型検出用プローブに起因する蛍光波長と、野生型検出用プローブに起因する蛍光波長が異なる。何れの波長がどの程度検出されるかによって、標的配列の変異の有無を分析することができる。
本発明において用いられる検出用プローブは、予め標識物質で標識されたオリゴヌクレオチドであってもよく、または非標識のオリゴヌクレオチドであってもよい。検出感度の観点から、標識されたオリゴヌクレオチドを用いることが好ましい。
【００３０】
標識物質としては、蛍光物質、酵素、ハプテンなどが例示される。本明細書において、予め標識化された検出用プローブを「標識化検出用プローブ」ともいう。標識物質として蛍光物質を用いる場合は、シグナルとして蛍光が検出され得る。蛍光物質としては、フルオレセイン、ローダミン、テキサスレッド、テトラメチルローダミン、カルボキシローダミン、フィコエリスリン、６−ＦＡＭ（商標）、Ｃｙ（登録商標）３、Ｃｙ（登録商標）５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）のシリーズなどが挙げられる。標識物質として酵素を用いる場合は、当該酵素の基質を反応させ、発光などのシグナルを生じる反応産物を生成することにより、シグナルが検出され得る。標識物質としてハプテンを用いる場合は、当該ハプテンに特異的に結合する物質を介して酵素や蛍光物質を検出用プローブに結合させる。これにより、蛍光や発光などのシグナルが検出され得る。なお、ハプテンに特異的に結合する物質としては、抗ハプテン抗体が挙げられる。また、ハプテンとしてビオチンを用いる場合はアビジン類（アビジン、ストレプトアビジン等）を用いることもできる。
標識化検出用プローブと検出配列を含む核酸とのハイブリダイゼーションに対する標識物質の影響（例えば立体障害）が小さいと考えられるため、標識化検出用プローブにおける標識物質は、その５’末端および／または３’末端で標識化（修飾）されていることが好ましい。検出用プローブは、検出配列に相補的な配列の５’末端および／または３’末端に追加の配列を含んでいてもよい。標識化検出用プローブは、検出配列に相補的な配列の５’末端および／または３’末端に追加の配列を含み、その５’末端および／または３’末端が標識物質で標識化されていてもよい。このような標識化検出用プローブでは、追加の配列を含まず、その５’末端および／または３’末端が標識物質で標識化された標識化検出用プローブと比べて、標識化検出用プローブと検出配列を含む核酸とのハイブリダイゼーションに対する標識物質の影響はより小さくなると考えられる。前記追加の配列は、標識化検出用プローブが検出配列を含む核酸にハイブリダイズした際に対向した配列と、その一部または全部が塩基対を形成しない非相補的な配列であってもよいし、その全部が塩基対を形成する相補的な配列であってもよい。
１つの実施形態において、標識化検出用プローブは、標識物質により、５’末端で標識化されている。
別の実施形態において、検出用プローブは、非標識のオリゴヌクレオチドである。非標識のオリゴヌクレオチドを用いる場合は、インターカレーターなどの蛍光物質を用いることによりシグナル検出を行うことができる。
【００３１】
他の実施形態において、標識物質として、蛍光物質と、クエンチャー物質との組合せを用いてもよい。このように２種類の標識物質を用いる場合、例えば、検出用プローブの５’末端に蛍光物質およびクエンチャー物質のいずれか一方を標識化し、その３’末端に他方の標識物質を標識化することができる。２種類の標識物質で標識化された検出用プローブとしては、例えば、ＴａｑＭａｎ（商標）プローブ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎなどが挙げられる。これらのプローブは公知であり、多くの刊行物、特許文献およびその他の文献に記載されている。例えば、ＴａｑＭａｎ（商標）プローブについては、例えば米国特許第５５３８８４８号を参照することができ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎについては、例えば米国特許第５９２５５１７号を参照することができ、これらの開示内容は出典明示により本明細書中に組み込まれる。本明細書において、「クエンチャー物質」は、蛍光を低減または消光する作用を有する物質を意味する。
【００３２】
検出用プローブに起因するシグナルの検出は、限定するものではないが、多数（例えば、数千万個）存在し得る区画またはビーズ（後述する実施形態１を参照）からのシグナルを検出するのに適した検出器により実施される。検出器としては、限定するものではないが、顕微鏡、フローサイトメーター、イメージセンサーなどを用いることができる。
【００３３】
「フローサイトメーター」は、フローセル中の粒子（例えば、ビーズ）または区画（例えば、液滴）に励起光を照射し、個々の粒子または区画から発せられる蛍光などの光学的情報を取得することで、粒子を計数することのできる装置である。フローサイトメーターは、短時間に多数の粒子または区画を測定できるため、好ましい。
顕微鏡やイメージセンサーを用いる場合は、視野を撮像し、撮像したデータを用いて個々のビーズや区画を検出することができる。ビーズを用いる場合、ビーズは静止していてもよいし、流動していてもよい。シグナルの種類に応じて、蛍光顕微鏡などが用いられ得る。
【００３４】
区画調製工程において調製された区画を維持したままシグナル検出を行う場合は、区画調製工程またはそれよりも前の工程において検出用プローブが反応系に添加される。
一方、ビーズなどに増幅産物を固定化する場合は、区画を維持したままシグナル検出を行うこともできるし、シグナル検出前に区画からビーズを取り出し水性溶媒中に分散させることもできる。シグナル検出前に区画からビーズを取り出す方法は特に限定されない。たとえば、油相中の水性液滴を区画とする場合は油相を除去して液相を水性溶媒中に分散させることができる。また、ビーズを含むウェルを区画とする場合は、各ウェルを洗浄して各ウェルに収容されたビーズを取り出し、水性溶媒中に分散させることもできる。区画からビーズを取り出す場合は、区画調製工程において検出用プローブを反応系に添加してもよいし、ビーズを取り出した後に検出用プローブを増幅産物にハイブリダイズしてもよい。
【００３５】
第１の態様の判定工程において、シグナル検出工程の結果に基づいて、前記核酸検出工程が適切であったか不適切であったかが判定される。ここでは、区画からシグナルが生じる場合の例について説明する。
判定工程では、まず各区画が核酸の増幅産物が生成された区画であるか否かが判定される。シグナルが検出された区画（陽性区画）は、核酸の増幅産物が生成された区画と判定され、シグナルが検出されなかった区画（陰性区画）は、核酸の増幅産物が生成されなかった区画と判定される。
陽性判定に際しては、所定の閾値と区画から検出されたシグナル強度とを比較することが好ましい（陽性判定に用いられる閾値を、「第１の閾値」ともいう）。ウェルなどの固相担体はそれ自体もともとシグナル（例えば自家蛍光）を有することがある。たとえば、ウェルがビーズを含み、そのビーズ自体が自家蛍光を有する場合、ウェルから微弱な蛍光がシグナルとして検出されることがある。このような区画を陰性区画と判定するために、上記の第１の閾値が用いられる。
標的核酸の増幅産物に起因する蛍光強度と、精度管理用ポリヌクレオチドの増幅産物に起因する蛍光強度は異なるため、これらを区別するため第２の閾値が用いられ得る。第２の閾値は、第１の閾値よりも高値となる。標的核酸の増幅産物に起因する蛍光強度よりも精度管理用ポリヌクレオチドの増幅産物に起因する蛍光強度が大きい場合は、第１の閾値以上第２の閾値未満の陽性区画（以下、「第１の陽性区画」ともいう）を、標的核酸の増幅産物が生成された区画と判定することができる。第２の閾値以上の陽性区画（以下、「第２の陽性区画」ともいう）を精度管理用ポリヌクレオチドの増幅産物が生成された区画と判定することができる。
また、シグナルが検出されない区画（陰性区画）を、核酸の増幅産物が生成されなかった区画と判定してもよい。シグナルが第１の閾値未満の場合に陰性区画と判定することができる。
【００３６】
プライマーを固定化したビーズを用い、ビーズから生じるシグナルを検出する場合は、区画からビーズを取り出し、区画毎ではなく、ビーズ毎に陽性・陰性の判定を行うこともできる。この場合も、上記した区画の陽性・陰性の判定と同様にしてビーズの陽性・陰性の判定を行うことができる。即ち、第１の閾値以上第２の閾値未満のビーズを第１の陽性ビーズと判定し、第２の閾値以上のビーズを第２の陽性ビーズと判定することができる。さらに第１の閾値未満のシグナルを生じるビーズを陰性ビーズと判定してもよい。
【００３７】
フローサイトメーターを用いてビーズから生じるシグナルを検出する場合は、区画から取り出したビーズをフローセルに流し、各ビーズから生じるシグナルが検出される。この場合、各ビーズのシグナル強度をプロットした２次元スキャッタグラム（以下、「２Ｄスキャッタグラム」ともいう）を作成し、スキャッタグラム上で第１の陽性ビーズのクラスターおよび第２の陽性ビーズのクラスターを識別し、第１の陽性ビーズおよび第２の陽性ビーズの判定を行ってもよい。ビーズの有無にかかわらず、区画自体をフローセルに流してシグナル検出を行う場合も同様である。
【００３８】
次に、判定工程において陽性区画または陽性ビーズの判定結果に基づいて、前記核酸検出工程が適切であったか不適切であったかが判定される。
たとえば、第２の陽性区画の個数を計数し、計数結果が第３の閾値以上の場合に、核酸検出工程が適切であったと判定することができる。計数結果が第３の閾値未満の場合は精度管理用ポリヌクレオチドが正常に増幅されていないと考えられるため、核酸検出工程が不適切であったと判定することができる。また、この例では第２の陽性区画の計数および計数結果と閾値との比較を行ったが、第２の陽性区画から生じる蛍光強度の総和または蛍光を生じている面積の総和などを用いても同様の判定を行うことができる。また、ビーズを用いた場合も同様の判定を行うことができる。
【００３９】
第１の閾値および第２の閾値は、標識物質の種類やシグナルの強度などによって適宜設定することができる。複数の核酸試料を用いて陽性区画または陽性ビーズがどの程度のシグナル強度となるか予め検出しておき、陰性と第１の陽性と第２の陽性とを最も精度よく分類できる閾値に設定することができる。
第３の閾値は、核酸試料における精度管理用ポリヌクレオチドの濃度（コピー数）などに基づいて適宜設定することができる。
【００４０】
［変異検出における精度管理］
本発明の第１の態様に係る核酸増幅の精度管理方法は、標的核酸の変異検出における精度管理方法に適用可能である。したがって、第１の態様の１つの実施形態は、標的核酸の変異検出における精度管理方法である。
なお、本明細書において、「変異」とは、核酸の塩基配列において一般的に野生型と認識されている配列とは異なることをいう。たとえば、核酸中のヌクレオチドの置換、欠失、付加、染色体転座などが挙げられる。より具体的には、突然変異や一塩基多型（ＳＮＰ）などが例示される。
変異検出においては、標的核酸が変異型核酸か野生型核酸かが検出される。変異検出のために、標的核酸の増幅産物に変異型核酸にハイブリダイズする検出用プローブと、野生型核酸にハイブリダイズする検出用プローブが用いられ、何れがハイブリダイズするかによって、変異型か野生型かが判定される。変異型の標的核酸には変異型の検出配列（以下、「Ｍｕｔ検出配列」ともいう）が含まれ、野生型の標的核酸には野生型の検出配列（以下、「Ｗｔ検出配列」ともいう）が含まれる。以下、本発明の一実施形態として標的核酸の変異検出における精度管理方法について説明する。
この実施形態の方法は、核酸検出工程と判定工程とを含む。核酸検出工程は、上記と同様、核酸試料の調製工程、区画の調製工程、核酸増幅工程およびシグナル検出工程を含む。
【００４１】
この実施形態に係る核酸試料の調製工程では、例えば、標的核酸を含む試料と、精度管理用ポリヌクレオチドとを含む試料とを混合することにより、核酸試料が調製される。
精度管理用ポリヌクレオチドとして、Ｍｕｔ検出配列の検出に係る精度管理用ポリヌクレオチド（以下、「Ｍｕｔ精度管理用ポリヌクレオチド」ともいう）およびＷｔ検出配列の検出に係る精度管理用ポリヌクレオチド（以下、「Ｗｔ精度管理用ポリヌクレオチド」ともいう）のいずれかまたは両方を用いる。Ｍｕｔ精度管理用ポリヌクレオチドは、後述の変異型検出用プローブが結合するＭｕｔ検出配列およびＭｕｔ検出配列に相補的な配列のいずれかまたは両方を含む。このため、Ｍｕｔ精度管理用ポリヌクレオチドの増幅産物は、変異型検出用プローブと結合し、変異型検出用プローブに起因するシグナルが生じる。Ｗｔ精度管理用ポリヌクレオチドは、後述の野生型検出用プローブが結合するＷｔ検出配列およびＷｔ検出配列に相補的な配列のいずれかまたは両方を含む。このため、Ｗｔ精度管理用ポリヌクレオチドの増幅産物は、野生型検出用プローブと結合し、野生型検出用プローブに起因するシグナルが生じる。
後述の変異型検出用プローブのみを検出用プローブとして用いる場合は、少なくともＭｕｔ精度管理用ポリヌクレオチドを用いることが好ましい。検出用プローブとして変異型検出用プローブおよび野生型検出用プローブの両方が用いられる場合は、Ｍｕｔ精度管理用ポリヌクレオチドおよびＷｔ精度管理用ポリヌクレオチドのいずれかまたは両方が用いられる。
上記した精度管理用ポリヌクレオチドに関するその他の特徴は、Ｍｕｔ精度管理用ポリヌクレオチド、Ｗｔ精度管理用ポリヌクレオチドにも適用される。
【００４２】
この実施形態の区画調製工程、核酸増幅工程およびシグナル検出工程は、第１の態様に関して上記したように実施される。
検出用プローブとしては、Ｍｕｔ検出配列に相補的な配列を含む変異型検出用プローブが用いられる。標的核酸に変異が含まれる場合は、標的核酸の増幅産物に変異型検出用プローブが結合するため、変異型検出用プローブに起因するシグナルが検出される。検出用プローブとしてさらにＷｔ検出配列に相補的な配列を含む野生型検出用プローブも用いることが好ましい。変異型検出用プローブに起因するシグナルと、野生型検出用プローブに起因するシグナルは互いに異なる種類である。たとえば、野生型検出用プローブとしてＦＡＭを標識したオリゴヌクレオチドを用い、変異型検出用プローブとしてＣｙ５を標識したオリゴヌクレオチドを用いることができる。野生型検出用プローブおよび変異型検出用プローブに関する特徴は、これらの変異型検出用プローブ、野生型検出用プローブにも適用される。
この実施形態のシグナル検出工程では、検出用プローブに起因するシグナルの検出が行われる。変異型検出用プローブと野生型検出用プローブとを用いる場合は、変異型検出用プローブに起因するシグナルと、野生型検出用プローブに起因するシグナルが検出される。
【００４３】
この実施形態の判定工程では、シグナル検出工程の結果に基づいて、変異の有無と、前記核酸検出工程が適切であったか不適切であったかが判定される。
ここでは、まず、検出用プローブとして変異型検出用プローブのみを用いる例について説明する。この例において、核酸試料の調製工程で調製される核酸試料は、標的核酸とＭｕｔ精度管理用ポリヌクレオチドとビーズとを含む。核酸増幅工程において、標的核酸の増幅産物が結合したビーズと、Ｍｕｔ精度管理用ポリヌクレオチドの増幅産物が結合したビーズとが得られうる。ここでは、ビーズは、シグナル検出工程の前に区画から取り出す。区画から取り出したビーズを水性媒体へ分散させた後に、変異型検出用プローブを加える。
判定工程では、上記したように、まず、各ビーズが、核酸の増幅産物が結合したビーズであるか否かが判定される。標的核酸の増幅産物および精度管理用ポリヌクレオチドの増幅産物と検出用プローブとのハイブリダイズは、ストリンジェントな条件下で行なわれる。Ｍｕｔ検出配列を含む標的核酸の増幅産物が結合したビーズ、Ｍｕｔ精度管理用ポリヌクレオチドの増幅産物が結合したビーズからは、変異型検出用プローブに起因するシグナルが得られる。一方、Ｗｔ検出配列を含む標的核酸の増幅産物が結合したビーズからは、変異型検出用プローブに起因するシグナルは得られない。
変異型検出用プローブに起因するシグナルが検出されないビーズ（陰性ビーズ）は、核酸の増幅産物が結合していないビーズおよびＷｔ検出配列を含む標的核酸の増幅産物が結合したビーズのいずれかと判定される。変異型検出用プローブに起因するシグナルが検出されたビーズ（陽性ビーズ）は、Ｍｕｔ検出配列を含む核酸の増幅産物が結合したビーズと判定される。この陽性判定では、上記したように、シグナル強度に関する閾値（第１の閾値）を用いてもよい。
上記したように、標的核酸の増幅産物に基づくシグナル強度と、精度管理用ポリヌクレオチドの増幅産物に基づくシグナル強度とは異なる。これらを区別するための第２の閾値を用いてもよい。
Ｍｕｔ検出配列を含む標的核酸の増幅産物に基づくシグナル強度よりもＭｕｔ精度管理用ポリヌクレオチドの増幅産物に基づくシグナル強度の方が大きい場合は、第１の閾値以上第２の閾値未満の陽性ビーズ（以下、「第１の陽性ビーズ」ともいう）を、Ｍｕｔ検出配列を含む標的核酸の増幅産物が結合したビーズと判定することができる。第２の閾値以上の陽性ビーズ（以下、「第２の陽性ビーズ」ともいう）を、Ｍｕｔ精度管理用ポリヌクレオチドの増幅産物が結合したビーズと判定することができる。
【００４４】
判定工程において、標的核酸における変異の有無の判定が行なわれる。変異の有無の判定では、例えば、第１の陽性ビーズの個数を計数し、その計数結果が第３の閾値以上の場合に、変異あり（陽性）と判定することができる。第１の陽性ビーズの個数を計数し、その計数結果が第３の閾値未満の場合に、変異なし（陰性）と判定することができる。
この例では第１の陽性ビーズの計数結果と閾値との比較を行ったが、第１の陽性ビーズから生じる蛍光強度の総和などを用いても同様の判定を行うことができる。
また、この例では、ビーズを区画から取り出したが、ビーズを区画に保持したまま区画から生じるシグナル検出の結果に基づいて同様の判定を行うことができる。ビーズを用いずに、核酸試料の調製工程、区画の調製工程、核酸増幅工程を行ない、続いて、区画を維持したままシグナル検出工程を行って、区画から生じるシグナル検出の結果に基づいて同様の判定工程を行なうこともできる。
【００４５】
次に、判定工程において、核酸検出工程が適切であったか不適切であったかが判定される。
例えば、第２の陽性ビーズの個数を計数する。その計数結果が第３の閾値以上の場合、前記核酸検出工程は適切であったと判定することができる。第２の陽性ビーズの個数の計数結果が第３の閾値未満の場合、前記核酸検出工程が不適切であったと判定することができる。ビーズの個数に対応する第３の閾値は、核酸試料における精度管理用ポリヌクレオチドの濃度（コピー数）などによって適宜設定することができる。
核酸検出工程が適切であったと判定された場合、標的核酸における変異の有無の判定結果は信頼性があると判断することができる。核酸検出工程が不適切であったと判定された場合、標的核酸における変異の有無の判定結果は、信頼性を欠くと判断することができる。この場合、標的核酸における変異検出の判定結果、すなわち陽性および陰性は、それぞれ偽陽性および偽陰性の可能性があると判断され得る。このように、第１の態様の１つの実施形態によれば、標的核酸の変異検出の判定結果に対して偽陽性または偽陰性を疑う結果を提供できる。これにより、標的核酸の変異検出の精度を高めることができる。
加えて、核酸検出工程が不適切であったと判定された場合、核酸検出工程のいずれかの工程が不適切であったと予測される。したがって、この実施形態によれば、核酸検出工程が不適切であったとの判定結果を提供することにより、その標的核酸の変異検出における不適切な工程を適宜検証することができる。
【００４６】
次に、判定工程において、変異型検出用プローブと野生型検出用プローブとを用いる例について説明する。この例において、核酸試料の調製工程で調製される核酸試料は、標的核酸と、Ｍｕｔ精度管理用ポリヌクレオチドと、Ｗｔ精度管理用ポリヌクレオチドとビーズとを含む。核酸増幅工程において、標的核酸の増幅産物が結合したビーズと、Ｍｕｔ精度管理用ポリヌクレオチドの増幅産物が結合したビーズと、Ｗｔ精度管理用ポリヌクレオチドの増幅産物が結合したビーズとが得られる。ビーズは、シグナル検出工程の前に区画から取り出される。区画から取り出したビーズを水性媒体へ分散させた後に、変異型検出用プローブおよび野生型検出用プローブを加える。
Ｍｕｔ検出配列を含む標的核酸の増幅産物が結合したビーズ、Ｍｕｔ精度管理用ポリヌクレオチドの増幅産物が結合したビーズからは、変異型検出用プローブに起因するシグナルが得られるが、野生型検出用プローブに起因するシグナルは得られない。同様に、Ｗｔ検出配列を含む標的核酸の増幅産物が結合したビーズ、Ｗｔ精度管理用ポリヌクレオチドの増幅産物からは、野生型検出用プローブに起因するシグナルは得られるが、変異型検出用プローブに起因するシグナルは得られない。
変異型検出用プローブに起因するシグナルおよび野生型検出用プローブに起因するシグナルの何れも検出されないビーズ（陰性ビーズ）は、核酸の増幅産物が結合していないビーズと判定することができる。変異型および野生型検出用プローブのいずれか一方に起因するシグナルが検出され、他方に起因するシグナルが検出されないビーズ（陽性ビーズ）は、核酸の増幅産物が結合したビーズと判定することができる。この陽性判定では、上記したように、シグナル強度に関する閾値（第１の閾値）を用いてもよい。すなわち、野生型検出用プローブに起因するシグナル強度と比較する第１の閾値として「第１の閾値（Ｗｔ）」が用いられてもよい。また、変異型検出用プローブに起因するシグナル強度と比較する第１の閾値として「第１の閾値（Ｍｕｔ）」が用いられてもよい。
【００４７】
上記したように、標的核酸の増幅産物に基づくシグナル強度と、精度管理用ポリヌクレオチドの増幅産物に基づくシグナル強度とは異なる。これらを区別するための第２の閾値が、各検出用プローブに起因するシグナルごとに用いられ得る。すなわち、野生型検出用プローブに起因するシグナル強度に関する第２の閾値として「第２の閾値（Ｗｔ）」が用いられてもよい。変異型検出用プローブに起因するシグナル強度に関する第２の閾値として「第２の閾値（Ｍｕｔ）」が用いられてもよい。各シグナルに対応する第２の閾値は、それぞれ第１の閾値よりも高値となる。
以下この例において、Ｍｕｔ検出配列を含む標的核酸の増幅産物に基づくシグナル強度よりもＭｕｔ精度管理用ポリヌクレオチドの増幅産物に基づくシグナル強度の方が大きく、Ｗｔ検出配列を含む標的核酸の増幅産物に基づくシグナル強度よりもＷｔ精度管理用ポリヌクレオチドの増幅産物に基づくシグナル強度の方が大きい場合について説明する。
第１の閾値（Ｍｕｔ）以上第２の閾値（Ｍｕｔ）未満で第１の閾値（Ｗｔ）未満の陽性ビーズ（以下、「第１の陽性ビーズ（Ｍｕｔ）」ともいう）を、Ｍｕｔ検出配列を含む標的核酸の増幅産物が結合したビーズと判定することができる。第２の閾値（Ｍｕｔ）以上で第１の閾値（Ｗｔ）未満の陽性ビーズ（以下、「第２の陽性ビーズ（Ｍｕｔ）」ともいう）を、Ｍｕｔ精度管理用ポリヌクレオチドの増幅産物が結合したビーズと判定することができる。第１の閾値（Ｗｔ）以上第２の閾値（Ｗｔ）未満で第１の閾値（Ｍｕｔ）未満の陽性ビーズ（以下、「第１の陽性ビーズ（Ｗｔ）」ともいう）を、Ｗｔ検出配列を含む標的核酸の増幅産物が結合したビーズと判定することができる。第２の閾値（Ｗｔ）以上で第１の閾値（Ｍｕｔ）未満の陽性ビーズ（以下、「第２の陽性ビーズ（Ｗｔ）」ともいう）を、Ｗｔ精度管理用ポリヌクレオチドの増幅産物が結合したビーズと判定することができる。
【００４８】
判定工程において、上記したように、変異の有無の判定が行なわれる。変異の有無の判定では、例えば、標的核酸の濃度（全コピー数）のうち、どれだけの濃度（コピー数）の標的核酸がＭｕｔ検出配列を含むか（すなわち、標的核酸の全コピー数に対するＭｕｔ検出配列を含む標的核酸のコピー数の割合：（Ｍｕｔ検出配列を含む標的核酸のコピー数）／（標的核酸の全コピー数））を指標にして判定することができる。この割合は第１の陽性ビーズ（Ｍｕｔ）の個数と第１の陽性ビーズ（Ｗｔ）の個数の合計数で、第１の陽性ビーズ（Ｍｕｔ）の個数を除することで算出される（＝（第１の陽性ビーズ（Ｍｕｔ）の個数）／［（第１の陽性ビーズ（Ｍｕｔ）の個数＋（第１の陽性ビーズ（Ｗｔ）の個数）］）。算出した割合が、この割合に対応する第３の閾値以上の場合に、変異あり（陽性）と判定することができる。この割合が所定の閾値未満の場合、変異なし（陰性）と判定することができる。判定の指標としては、これに限定されるものではなく、上記したように、第１の陽性ビーズ（Ｍｕｔ）の個数が、ビーズの個数に対応する第３の閾値以上の場合に変異あり（陽性）と判定し、前記第３の閾値未満の場合に変異なし（陰性）と判定することもできる。
【００４９】
判定工程において、核酸検出工程が適切であったか不適切であったかが判定される。
例えば、第２の陽性ビーズ（Ｍｕｔ）の個数および第２の陽性ビーズ（Ｗｔ）の個数をそれぞれ計数する。
第２の陽性ビーズ（Ｍｕｔ）の計数結果が第３の閾値（Ｍｕｔ）未満であるか、第２の陽性ビーズ（Ｗｔ）の計数結果が第３の閾値（Ｗｔ）未満である場合、核酸検出工程が適切ではなかったと判定することができ、変異の有無の検出結果は信頼性が低いと判定することができる。この場合、変異の有無の検出結果を「信頼性が低い」旨を付記した上で出力してもよいし、出力しなくてもよい。
第２の陽性ビーズ（Ｍｕｔ）の計数結果が第３の閾値（Ｍｕｔ）以上であり、且つ第２の陽性ビーズ（Ｗｔ）の計数結果が第３の閾値（Ｗｔ）以上である場合、核酸検出工程が適切であったと判定することができ、変異の有無の検出結果に信頼性を付与することができる。
【００５０】
また、第２の陽性ビーズ（Ｍｕｔ）の計数結果が、第２の陽性ビーズ（Ｍｕｔ）に対応する第３の閾値未満の場合、Ｍｕｔ検出配列を含む標的核酸に関する核酸検出工程は不適切であったと判定することができる。これにより、標的核酸における変異の有無の判定結果は、信頼性を欠くと判断することができる。この場合、標的核酸における変異検出の判定結果、すなわち陽性および陰性は、それぞれ偽陽性および偽陰性の可能性があると判断され得る。上記したように、必要に応じて、核酸検出工程のいずれの工程が不適切であったかを検証するための追試を行なってもよい。
【００５１】
上記例では、ビーズを区画から取り出したが、ビーズを区画に保持したまま区画から生じるシグナル検出の結果に基づいて同様の判定を行うことができる。また、ビーズを用いずに、核酸試料の調製工程、区画の調製工程、核酸増幅工程を行ない、続いて、区画を維持したままシグナル検出工程を行って、区画から生じるシグナル検出の結果に基づいて同様に判定工程を行なうこともできる。
【００５２】
上記した変異検出の精度管理方法では２種類の精度管理用ポリヌクレオチドを使用したが、ここでは、１種類の精度管理用ポリヌクレオチドを用いて、変異検出の精度管理方法を実施することができる例について説明する。この例における精度管理用ポリヌクレオチドは、第３領域に、Ｗｔ検出配列および前記検出配列に相補的な配列のいずれか又はその両方を含み、かつ、Ｍｕｔ検出配列および前記検出配列に相補的な配列のいずれか又はその両方を含む（以下、「Ｗｔ ＆ Ｍｕｔ精度管理用ポリヌクレオチド」ともいう）。
この例において、核酸試料の調製工程で調製される核酸試料は、標的核酸と、Ｗｔ ＆ Ｍｕｔ精度管理用ポリヌクレオチドとビーズとを含む。核酸増幅工程では、標的核酸の増幅産物が結合したビーズと、Ｗｔ ＆ Ｍｕｔ精度管理用ポリヌクレオチドの増幅産物が結合したビーズとが得られうる。ここでは、ビーズは、シグナル検出工程の前に区画から取り出される。区画から取り出したビーズを水性媒体へ分散させた後に、変異型検出用プローブおよび野生型検出用プローブを加える。
【００５３】
この実施形態における検出工程では、上記と同様に、標的核酸の増幅産物が結合したビーズから同様のシグナルが取得される。
Ｗｔ ＆ Ｍｕｔ精度管理用ポリヌクレオチドは、Ｗｔ検出配列とＭｕｔ検出配列の両方を含む。したがって、Ｗｔ ＆ Ｍｕｔ精度管理用ポリヌクレオチドの増幅産物と、検出用プローブとを、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズさせると、変異型検出用プローブに起因するシグナルと、野生型検出用プローブに起因するシグナルとが得られうる。
【００５４】
変異型検出用プローブに起因するシグナルが検出されず、かつ、野生型検出用プローブに起因するシグナルが検出されないビーズ（陰性ビーズ）は、核酸の増幅産物が結合していないビーズと判定される。変異型検出用プローブと野生型検出用プローブとに起因する両方のシグナルが検出されたビーズは、Ｗｔ ＆ Ｍｕｔ精度管理用ポリヌクレオチドの増幅産物が結合したビーズ（以下、「Ｗｔ ＆ Ｍｕｔ陽性ビーズ」ともいう）と判定される。
この陽性判定では、上記したように、シグナル強度に関する閾値（第１の閾値）を用いてもよい。すなわち、野生型検出用プローブに起因するシグナル強度と比較する第１の閾値として「第１の閾値（Ｗｔ）」が用いられてもよい。また、変異型検出用プローブに起因するシグナル強度と比較する第１の閾値として「第１の閾値（Ｍｕｔ）」が用いられてもよい。
Ｗｔ ＆ Ｍｕｔ精度管理用ポリヌクレオチドの増幅産物におけるＷｔ検出配列と前記検出配列に相補的な配列の合計数は、Ｗｔ検出配列を含む標的核酸の増幅産物におけるＷｔ検出配列と前記検出配列に相補的な配列の合計数とは異なる。同様に、Ｗｔ ＆ Ｍｕｔ精度管理用ポリヌクレオチドの増幅産物におけるＭｕｔ検出配列と前記検出配列に相補的な配列の合計数は、Ｍｕｔ検出配列を含む標的核酸の増幅産物におけるＭｕｔ検出配列と前記検出配列に相補的な配列の合計数とは異なる。したがって、標的核酸の増幅産物に基づく各検出用プローブに起因するシグナル強度と、Ｗｔ ＆ Ｍｕｔ精度管理用ポリヌクレオチドの増幅産物に基づく各検出用プローブに起因するシグナル強度とは異なる。これら各シグナル強度の違いを区別するための第２の閾値が、各検出用プローブに起因するシグナルごとに用いられ得る。すなわち、野生型検出用プローブに起因するシグナル強度に関する第２の閾値として「第２の閾値（Ｗｔ）」を用いることができる。変異型検出用プローブに起因するシグナル強度に関する第２の閾値として「第２の閾値（Ｍｕｔ）」を用いることができる。各シグナルに対応する第２の閾値は、それぞれ第１の閾値よりも高値となる。
以下この例において、Ｗｔ検出配列を含む標的核酸の増幅産物に基づくシグナルよりもＷｔ ＆ Ｍｕｔ精度管理用ポリヌクレオチドの増幅産物に基づくシグナル強度の方が大きく、かつＭｕｔ検出配列を含む標的核酸の増幅産物に基づくシグナル強度よりもＷｔ ＆ Ｍｕｔ精度管理用ポリヌクレオチドの増幅産物に基づくシグナル強度の方が大きい場合について説明する。第１の閾値（Ｍｕｔ）以上第２の閾値（Ｍｕｔ）未満で第１の閾値（Ｗｔ）未満の陽性ビーズ（第１の陽性ビーズ（Ｍｕｔ））を、Ｍｕｔ検出配列を含む標的核酸の増幅産物が結合したビーズと判定することができる。第１の閾値（Ｗｔ）以上第２の閾値（Ｗｔ）未満で第１の閾値（Ｍｕｔ）未満の陽性ビーズ（第１の陽性ビーズ（Ｗｔ））を、Ｗｔ検出配列を含む標的核酸の増幅産物が結合したビーズと判定することができる。第２の閾値（Ｗｔ）以上であり、かつ、第２の閾値（Ｍｕｔ）以上の陽性ビーズ（以下、「第２の陽性ビーズ（Ｗｔ ＆ Ｍｕｔ）」ともいう）を、Ｗｔ ＆ Ｍｕｔ精度管理用ポリヌクレオチドの増幅産物が結合したビーズ（Ｗｔ ＆ Ｍｕｔ陽性ビーズ）と判定することができる。
【００５５】
判定工程において、上記実施形態と同様にして、変異の有無が判定される。例えば、第１の陽性ビーズ（Ｍｕｔ）の個数が、第１の陽性ビーズ（Ｍｕｔ）の個数に対応する第３の閾値以上の場合に変異あり（陽性）と判定し、前記第３の閾値未満の場合に変異なし（陰性）と判定することができる。また、上記したように、標的核酸の濃度（全コピー数）のうち、どれだけの濃度（コピー数）の標的核酸がＭｕｔ検出配列を含むかを指標に、変異の有無を判定することもできる。これらは例示であり、変異の有無を判定する方法はこれに限定されない。
【００５６】
判定工程において、前記核酸検出工程が適切であったか不適切であったかが判定される。
１種類のＷｔ ＆ Ｍｕｔ精度管理用ポリヌクレオチドを用いた精度管理方法における判定工程と、前記したＷｔ精度管理用ポリヌクレオチドとＭｕｔ精度管理用ポリヌクレオチドとの２種類を用いた精度管理方法における判定工程とは、下記する場合を除いて、同様にして行なわれる。
前記したＷｔ精度管理用ポリヌクレオチドとＭｕｔ精度管理用ポリヌクレオチドとの２種類を用いた精度管理方法では、第２の陽性ビーズ（Ｗｔ）から、Ｗｔ検出配列を含む標的核酸に関する核酸検出工程が適切であったか不適切であったかが判定される。また、第２の陽性ビーズ（Ｍｕｔ）から、Ｍｕｔ検出配列を含む標的核酸に関する核酸検出工程が適切であったか不適切であったかが判定される。すなわち、２種類の精度管理用ポリヌクレオチドを用いた場合、２種類の陽性ビーズに基づいて、Ｗｔ検出配列を含む標的核酸に関する核酸検出工程とＭｕｔ検出配列を含む標的核酸に関する核酸検出工程とが適切であったか不適切であったかが判定される。
これに対して、精度管理用ポリヌクレオチドとして、１種類のＷｔ ＆ Ｍｕｔ精度管理用ポリヌクレオチドを用いた精度管理方法では、１種類の陽性ビーズ（Ｗｔ ＆ Ｍｕｔ陽性ビーズ）から、Ｗｔ検出配列を含む標的核酸に関する核酸検出工程とＭｕｔ検出配列を含む標的核酸に関する核酸検出工程とが適切であったか不適切であったかが判定される。
例えば、Ｗｔ ＆ Ｍｕｔ陽性ビーズの個数を計数する。その計数結果が、Ｗｔ ＆ Ｍｕ陽性ビーズの個数に対応する第３の閾値以上の場合、核酸検出工程が適切であったと判定することができる。Ｗｔ ＆ Ｍｕｔ陽性ビーズの個数の計数結果が、Ｗｔ ＆ Ｍｕｔ陽性ビーズの個数に対応する第３の閾値未満の場合、核酸検出工程が不適切であったと判定することができる。
核酸検出工程が不適切であったと判定された場合、核酸試料の調製工程、区画の調製工程、核酸増幅工程およびシグナル検出工程を含む核酸検出工程のいずれかの工程が不適切であったと仮定される。いずれの工程が不適切であったかは、上記したように、追試などを行うことで適宜検証することができる。
１種類のＷｔ ＆ Ｍｕｔ精度管理用ポリヌクレオチドを用いた精度管理方法においても、前記した２種類の精度管理用ポリヌクレオチドを用いた精度管理方法と同様に、標的核酸の変異検出の判定結果に対して、信頼性がある又は信頼性を欠くとの判断を可能にする結果が与えられる。
【００５７】
添付する図面を参照しつつ、本発明の１つの態様に係る実施形態について以下に説明する。なお、以下の説明はすべて例示であって制限的なものではなく、添付する特許請求の範囲に記載の発明をいかようにも限定するものではない。
【００５８】
［実施形態１］
図１は、実施形態１に係る核酸検出工程を示す模式図である。実施形態１では、油相中の水性液滴にビーズを封入してデジタルＰＣＲを行い、核酸検出を行う。
本実施形態で用いられる「ビーズ」の材質は、特に限定されない。金属製粒子、樹脂製粒子などが用いられ得る。金属製粒子の材質の具体例としては、金、銀、銅、鉄、アルミ、ニッケル、マンガン、チタン、これらの酸化物などが例示される。また、これらの合金であってもよい。樹脂製粒子の材質の具体例としては、ポリスチレン、ラテックスなどが例示される。ビーズは磁性を帯びていてもよい（以下、「磁性ビーズ」ともいう）。
【００５９】
まず、標的核酸と、精度管理用ポリヌクレオチドと、標的核酸増幅用プライマーセットのうちの一方のプライマーを表面に結合したビーズと、その他の核酸増幅に必要な試薬とを含む核酸試料を調製する（図１（ｉ））。実施形態１で用いる標的核酸は検出配列を１つ（ｎ＝１）含み、精度管理用ポリヌクレオチドは検出配列を２つ（ｎ＝２）含む。水相である核酸試料、油相、および乳化剤を混合し、撹拌等により油相中の水性液滴（区画）を多数形成させる（図１（ｉｉ））。この水性液滴は標的核酸や精度管理用ポリヌクレオチドのコピー数に比べて大過剰形成するため、理論的に単一の水性液滴には精度管理用核酸一分子または標的核酸一分子が含まれることになる。また、水性液滴数は、ビーズ数よりも大過剰形成されるため、理論的に単一の水性液滴にはビーズが１個含まれることになる。通常、デジタルＰＣＲでは、数千万個の液滴が形成され、そのうちの０．１〜１％程度に、標的核酸一分子又は精度管理用ポリヌクレオチド一分子と、プライマーが結合したビーズ１個とが含まれることになる（図１（ｉｉ）（ｂ）、（ｃ））。その他の液滴には通常はいずれかの成分が欠けており（図１（ｉｉ）（ａ１）〜（ａ４））、ビーズ上での核酸増幅は行われない（図１（ｉｉｉ）（ａ１）〜（ａ４））。水性液滴集団に対してＰＣＲ法を実施することで、標的核酸一分子または精度管理用ポリヌクレオチド一分子と、プライマーが結合したビーズ１個とを含む水性液滴では、ビーズ上に、伸長された増幅産物が結合される（図１（ｉｉｉ）（ｂ）、（ｃ））。
【００６０】
次いで、水性液滴（区画）を、公知の手段（例えば、界面活性剤添加）により破壊し（破壊工程）、遠心分離等により、ビーズに結合されていない増幅産物や未反応成分を含む上清を除去して（Ｂ／Ｆ分離工程）、ビーズを回収する。回収したビーズ上の増幅産物に、蛍光物質で予め標識化された検出用プローブをストリンジェントな条件下でハイブリダイズさせる。再度、Ｂ／Ｆ分離を行ない、ハイブリダイズしていない検出用プローブを除去する。その後、個々のビーズに対して励起光（λ１）を照射し、各ビーズからの蛍光シグナル（λ２）を測定する（シグナル検出工程）。これにより、ビーズ上に結合した増幅産物に関するシグナルが得られる。シグナルの検出には、フローサイトメーターが用いられる。
【００６１】
精度管理用ポリヌクレオチドの増幅産物が結合したビーズ（図１（ｉｉｉ）（ｃ））には、標的核酸の増幅産物が結合したビーズ（図１（ｉｉｉ）（ｂ））よりも約２倍の数の検出用プローブがハイブリダイズし得る。このハイブリダイズした検出用プローブの数の相違により、精度管理用ポリヌクレオチドの増幅産物が結合したビーズからは、標的核酸の増幅産物が結合したビーズから得られる蛍光シグナル強度よりも計算上は約２倍強い蛍光シグナル強度が得られうる。
【００６２】
ここでは、区画の調製はマイクロエマルジョンの形成により行われる。マイクロエマルジョンは、核酸試料、油相および乳化剤の混合物をピペッティングなどの撹拌操作によって形成され得る。１つの実施形態において、形成されるマイクロエマルジョンは、限定するものではないが、水相が１０〜３０％（ｖ／ｖ）であり、油相が６０〜８５％（ｖ／ｖ）であり、乳化剤が５〜１０％（ｖ／ｖ）であってよい。デジタルＰＣＲは熱サイクルを伴うため、乳化剤は熱安定性であるものが好ましい。
【００６３】
実施形態１では、デジタルＰＣＲによる核酸増幅において、ビーズ上に標的核酸増幅用プライマーセットの一方のプライマーを結合させたが、本発明の実施形態に係る核酸増幅においてビーズ上に結合させるプライマーの種類は１種類に限定されるものではない。実施形態１の変形例では、ビーズ上に、標的核酸増幅用プライマーセットの両方を結合させてもよい。
【００６４】
実施形態１では、破壊工程後に、蛍光色素で予め標識化し、プローブ単独の状態でシグナルを示し、ハイブリダイズした後もシグナルを示す検出用プローブを用いた。このような標識化検出用プローブは、増幅産物とハイブリダイズしなかった検出用プローブをＢ／Ｆ分離により除去できる実施態様において、有利に使用される。
実施形態１の変形例では、プローブ単独の状態ではシグナルを示さず、ハイブリダイズした状態でシグナルを示すプローブ、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎプローブを、区画の調製前に核酸試料中に用いてもよい。この変形例によれば、水性液滴（区画）を破壊することなく、区画を維持した状態で、各区画からの核酸増幅に関するシグナルを検出することも可能である。
【００６５】
精度管理用ポリヌクレオチドの増幅産物が結合したビーズからのシグナルの検出結果に基づいて、核酸検出工程が適切であったか不適切であったかが判定される。上記したように、核酸検出工程が適切と判定された場合、標的核酸の検出結果に信頼性があると判断することができる。核酸検出工程が不適切であったと判定された場合、標的核酸の検出結果は信頼性を欠くと判断することができる。このように、実施形態１によれば、核酸の検出結果の精度・品質を管理することができる。
【００６６】
［実施形態２］
実施形態２は、標的核酸の変異検出における精度管理方法に関する。図２は、実施形態２における核酸増幅の種類（ｂ）および検出シグナルの２Ｄスキャッタグラム（ａ）を示す模式図である。
【００６７】
実施形態２では、変異型の標的核酸および野生型の標的核酸が混在する試料を用いた場合について説明する。精度管理用ポリヌクレオチドとして、Ｍｕｔ検出配列の検出用の精度管理用ポリヌクレオチド（Ｍｕｔ精度管理用ポリヌクレオチド）と、Ｗｔ検出配列の検出用の精度管理用ポリヌクレオチド（Ｗｔ精度管理用ポリヌクレオチド）の２種類を用いる。Ｍｕｔ精度管理用ポリヌクレオチドはＭｕｔ検出配列を５つ含み、Ｗｔ精度管理用ポリヌクレオチドはＷｔ検出配列を５つ含む。
【００６８】
実施形態２において、核酸試料の調製、区画調製および核酸増幅工程は、実施形態１と同様にして実施される。実施形態２における核酸増幅工程では、標的核酸増幅用プライマーセット（第１プライマーおよび第２プライマー）により、Ｗｔ精度管理用ポリヌクレオチド（図２（ｂ）（ｉ））、Ｗｔ検出配列を含む標的核酸（図２（ｂ）（ｉｉ））、Ｍｕｔ精度管理用ポリヌクレオチド（図２（ｂ）（ｉｉｉ））およびＭｕｔ検出配列を含む標的核酸（図２（ｂ）（ｉｖ））が増幅され得る。これにより、Ｗｔ精度管理用ポリヌクレオチドの増幅産物が結合したビーズ、Ｗｔ検出配列を含む標的核酸の増幅産物が結合したビーズ、Ｍｕｔ精度管理用ポリヌクレオチドの増幅産物が結合したビーズ、およびＭｕｔ検出配列を含む標的核酸の増幅産物が結合したビーズが得られうる。
実施形態１と同様にして、前記ビーズを区画から回収する。回収したビーズに、検出用プローブをストリンジェントな条件下でハイブリダイズさせる。実施形態２では、蛍光物質Ｃｙ５で標識化したＭｕｔ検出配列にハイブリダイズする検出用プローブと（以下、「Ｍｕｔ検出用プローブ（Ｃｙ５）」ともいう）、蛍光物質ＦＡＭで標識化したＷｔ検出配列にハイブリダイズする検出用プローブ（以下、「Ｗｔ検出用プローブ（ＦＡＭ）」ともいう）を用いる。異なる蛍光物質を標識化することにより、各検出用プローブは互いに異なる蛍光シグナルを発する。前記検出用プローブをハイブリダイズさせた後、Ｂ／Ｆ分離を行ない、ハイブリダイズしていない検出用プローブを除去する。フローサイトメーターにより、ビーズからのシグナルを検出する。
【００６９】
図２ａは、ｘ軸にＭｕｔ検出用プローブ（Ｃｙ５）由来の蛍光シグナル強度を割り当て、ｙ軸にＷｔ検出用プローブ（ＦＡＭ）由来の蛍光シグナル強度を割り当てた２Ｄスキャッタグラムを示す。
【００７０】
Ｍｕｔ検出配列を含む標的核酸はＭｕｔ検出配列を１つ（ｎ＝１）含み、Ｍｕｔ精度管理用ポリヌクレオチドはＭｕｔ検出配列を５つ（ｎ＝５）含むため、Ｍｕｔ検出用プローブ（Ｃｙ５）は、Ｍｕｔ検出配列を含む標的核酸の増幅産物が結合したビーズには１つ、Ｍｕｔ精度管理用ポリヌクレオチドの増幅産物が結合したビーズには５つハイブリダイズし得る。したがって、Ｍｕｔ精度管理用ポリヌクレオチドの増幅産物が結合したビーズから得られるＣｙ５由来の蛍光シグナル強度は、Ｍｕｔ検出配列を含む標的核酸の増幅産物が結合したビーズから得られるＣｙ５由来の蛍光シグナル強度より大きい。
標的核酸の増幅産物および精度管理用ポリヌクレオチドの増幅産物と、検出用プローブとのハイブリダイズはストリンジェントな条件下で行なわれる。従って、Ｍｕｔ検出配列を含む標的核酸の増幅産物とＭｕｔ精度管理用ポリヌクレオチドの増幅産物とからはＦＡＭ由来の蛍光シグナルは、検出限界以下か又はあっても僅かにしか検出されない。
図２ａにおいて、ビーズなどの自家蛍光と、Ｍｕｔ検出配列を含む標的核酸の増幅産物が結合したビーズからの蛍光シグナルとを区別するための閾値を第１の閾値（Ｃｙ５）として示す。また、Ｍｕｔ検出配列を含む標的核酸の増幅産物が結合したビーズからの蛍光シグナルと、Ｍｕｔ精度管理用ポリヌクレオチドの増幅産物が結合したビーズからの蛍光シグナルとを区別するための閾値を第２の閾値（Ｃｙ５）として示す。
Ｍｕｔ検出配列を含む標的核酸の増幅産物が結合したビーズは、第１の閾値（Ｃｙ５）と第２の閾値（Ｃｙ５）の間であって、後述する第１の閾値（ＦＡＭ）未満のエリア（ｉｖ）にプロットされ得る。Ｍｕｔ精度管理用ポリヌクレオチドの増幅産物が結合したビーズは、第２の閾値（Ｃｙ５）以上で、後述する第１の閾値（ＦＡＭ）未満のエリア（ｉｉｉ）にプロットされ得る。
【００７１】
同様に、Ｗｔ検出配列を含む標的核酸はＷｔ検出配列を１つ（ｎ＝１）含み、Ｗｔ精度管理用ポリヌクレオチドはＷｔ検出配列を５つ（ｎ＝５）含むため、Ｗｔ検出用プローブ（ＦＡＭ）は、Ｗｔ検出配列を含む標的核酸の増幅産物が結合したビーズには１つ、Ｗｔ精度管理用ポリヌクレオチドの増幅産物が結合したビーズには５つハイブリダイズし得る。核酸の増幅産物と、検出用プローブとのハイブリダイズはストリンジェントな条件下で行なわれる。したがって、Ｗｔ精度管理用ポリヌクレオチドの増幅産物が結合したビーズから得られるＦＡＭ由来の蛍光シグナル強度は、Ｗｔ検出配列を含む標的核酸の増幅産物が結合したビーズから得られるＦＡＭ由来の蛍光シグナル強度より大きい。また、それら増幅産物からは、Ｃｙ５由来の蛍光シグナルは、検出限界以下か又はあっても僅かにしか検出されない。
図２ａにおいて、ビーズなどの自家蛍光と、Ｗｔ検出配列を含む標的核酸の増幅産物が結合したビーズからの蛍光シグナルとを区別するための閾値を第１の閾値（ＦＡＭ）として示す。また、Ｗｔ検出配列を含む標的核酸の増幅産物が結合したビーズからの蛍光シグナルと、Ｗｔ精度管理用ポリヌクレオチドの増幅産物が結合したビーズからの蛍光シグナルとを区別するための閾値を第２の閾値（ＦＡＭ）として示す。
Ｗｔ検出配列を含む標的核酸の増幅産物が結合したビーズは、第１の閾値（ＦＡＭ）と第２の閾値（ＦＡＭ）の間であって、第１の閾値（Ｃｙ５）未満のエリア（ｉｉ）にプロットされ得る。Ｗｔ精度管理用ポリヌクレオチドの増幅産物が結合したビーズは、第２の閾値（ＦＡＭ）以上で、第１の閾値（Ｃｙ５）未満のエリア（ｉ）にプロットされ得る。
【００７２】
実施形態２の判定工程において、変異の有無が判定される。例えば、標的核酸の濃度（全コピー数）のうち、どれだけの濃度（コピー数）の標的核酸がＭｕｔ検出配列を含むかを指標にして判定することができる。標的核酸の増幅産物が結合したビーズがプロットされ得るエリア（ｉｉ）とエリア（ｉｖ）の両方にドットがある場合に、エリア（ｉｉ）のドット数とエリア（ｉｖ）のドット数の合計に対するエリア（ｉｖ）のドット数の割合（＝（エリア（ｉｖ）のドット数）／［（エリア（ｉｉ）のドット数）＋（エリア（ｉｖ）のドット数）]）を算出する。その割合が所定の閾値以上の場合、変異ありと判定することができる。
【００７３】
判定工程において、核酸検出工程が適切であったか不適切であったかが判定される。
実施形態２において、Ｍｕｔ精度管理用ポリヌクレオチドの増幅産物が結合したビーズがプロットされ得るエリア（ｉｉｉ）に存在するドットの数が、所定の閾値以上の場合、Ｍｕｔ検出配列を含む標的核酸に関する核酸検出工程が適切であったと判定することができる。この判定結果は、標的核酸の変異の有無の判定結果に信頼性があることを示唆する。
実施形態２では、Ｗｔ精度管理用ポリヌクレオチドからの野生型検出用プローブに起因するシグナルも得られる。Ｗｔ精度管理用ポリヌクレオチドの増幅産物が結合したビーズがプロットされ得るエリア（ｉ）に存在するドットの数が、所定の閾値以上の場合、Ｗｔ検出配列を含む標的核酸に関する核酸検出工程が適切であったと判定することができる。このエリア（ｉ）に基づく判定結果は、前記した、エリア(ｉｉｉ)に基づく判定結果（Ｍｕｔ検出配列を含む標的核酸に関する核酸検出工程が適切であった）に対する信頼性を与えうる。
このように、２種類の精度管理用ポリヌクレオチドを用いることで、１種類の精度管理用ポリヌクレオチドを用いる場合に比べて、標的核酸における精度管理の信頼性をさらに高めることができ、結果的に、標的核酸の変異検出の精度がさらに向上し得る。
エリア（ｉｉｉ）に存在するドットの数が所定の閾値未満の場合、Ｍｕｔ検出配列を含む標的核酸に関する核酸検出工程が不適切であったと判定することができる。この判定結果は、標的核酸の変異の有無の判定結果が信頼性を欠くことを示唆する。核酸検出工程が不適切であったとの判定結果に鑑みて、要すれば、核酸検出工程のいずれの工程が不適切であったかを検証するために追試を行ってもよい。ここで、エリア（ｉ）に存在するドットの数が所定の閾値以上の場合、Ｗｔ検出配列を含む標的核酸に関する核酸検出工程が適切であったと判定することができる。この場合、上記したように、前記追試としては、核酸検出工程のうち、シグナル検出工程が不適切であったと仮定することができる。
このように、２種類の精度管理用ポリヌクレオチドを用いることで、１種類の精度管理用ポリヌクレオチドを用いる場合に比べて、標的核酸に関する核酸検出工程のいずれの工程が不適切であったかに関して付加的な情報を得ることができ、有利である。
【００７４】
［実施形態２の変形例］
実施形態２では、変異型検出用プローブと野生型検出用プローブの２種類の検出用プローブと、２種類の精度管理用ポリヌクレオチド（Ｍｕｔ精度管理用ポリヌクレオチドとＷｔ精度管理用ポリヌクレオチド）を用いた。ここでは、１種類の精度管理用ポリヌクレオチドと、上記した２種類の検出用プローブを用いた標的核酸の変異検出における精度管理方法を説明する。
この変形例では、精度管理用ポリヌクレオチドとして、Ｗｔ検出配列を２つと、Ｍｕｔ検出配列を２つとを含むポリヌクレオチドを用いる（以下、「Ｗｔ ＆ Ｍｕｔ精度管理用ポリヌクレオチド」ともいう）。標的核酸は、実施形態２と同様、Ｍｕｔ検出配列またはＷｔ検出配列を１つ含む。検出用プローブは、実施形態２と同様、Ｗｔ検出用プローブ（ＦＡＭ）、Ｍｕｔ検出用プローブ（Ｃｙ５）を用いる。この変形例において、核酸検出工程は、実施形態２と同様にして実施される。
図２ａにおいて、Ｗｔ検出配列を含む標的核酸の増幅産物が結合したビーズは、実施形態２と同様、エリア（ｉｉ）にプロットされる。また、Ｍｕｔ検出配列を含む標的核酸の増幅産物が結合したビーズはエリア（ｉｖ）にプロットされる。
Ｗｔ ＆ Ｍｕｔ精度管理用ポリヌクレオチドの増幅産物が結合したビーズには、Ｗｔ検出用プローブ（ＦＡＭ）が２つ、Ｍｕｔ検出用プローブ（Ｃｙ５）が２つハイブリダイズし得る。したがって、Ｗｔ ＆ Ｍｕｔ精度管理用ポリヌクレオチドの増幅産物が結合したビーズから得られるＦＡＭ由来の蛍光シグナル強度は、Ｗｔ検出配列を含む標的核酸の増幅産物が結合したビーズから得られるＦＡＭ蛍光シグナル強度よりも大きい。同様に、前記ビーズから得られるＣｙ５由来の蛍光シグナル強度は、Ｍｕｔ検出配列を含む標的核酸の増幅産物が結合したビーズから得られるＣｙ５蛍光シグナル強度よりも大きい。
この変形例において、標的核酸の増幅産物に基づく各検出用プローブに起因する蛍光シグナル強度と、Ｗｔ ＆ Ｍｕｔ精度管理用ポリヌクレオチドの増幅産物に基づく各検出用プローブに起因する蛍光シグナル強度とを区別するため第２の閾値が用いられる。Ｍｕｔ検出用プローブ（Ｃｙ５）に起因するシグナルについては第２の閾値（Ｃｙ５）といい、Ｗｔ検出用プローブ（ＦＡＭ）に起因するシグナルについては第２の閾値（ＦＡＭ）という（図２ａにおいて図示せず）。
Ｗｔ ＆ Ｍｕｔ精度管理用ポリヌクレオチドの増幅産物が結合したビーズは、第２の閾値（ＦＡＭ）以上で、かつ、第２の閾値（Ｃｙ５）以上のエリアにプロットされ得る（図２ａ、エリア（ｖ））。
この変形例における変異の有無の判定は、実施形態２と同様、エリア（ｉｉ）のドット数とエリア（ｉｖ）のドット数の合計に対するエリア（ｉｖ）のドット数の割合（＝（エリア（ｉｖ）のドット数）／［（エリア（ｉｉ）のドット数）＋（エリア（ｉｖ）のドット数）]）を算出し、その割合が所定の閾値以上の場合に、変異ありと判定することができる。
この変形例における核酸検出工程が適切であったか否かの判定は、Ｗｔ ＆ Ｍｕｔ精度管理用ポリヌクレオチドの増幅産物が結合したビーズがプロットされ得るエリア（ｖ）のドットの数が、所定の閾値未満の場合、標的核酸の変異検出における核酸検出工程が不適切であったと判定することができる。一方、エリア（ｖ）のドットの数が、所定の閾値以上の場合、標的核酸の変異検出における核酸検出工程が適切であったと判定することができる。これらの判定結果に基づいて、実施形態２において記載したように、標的核酸の変異検出の精度管理を行なうことができる。
【００７５】
［実施形態３］
図３は、実施形態３に係る核酸検出工程を示す模式図である。実施形態３では、実施形態１と異なり、液滴型のデジタルＰＣＲにより核酸増幅を行った後に、区画を壊すことなく各区画からシグナルを検出する例を示す。
実施形態３では、標的核酸と、精度管理用ポリヌクレオチドと、検出配列にハイブリダイズ可能なＴａｑＭａｎ（商標）プローブ（検出用プローブ）と、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ（図示せず）と、その他の核酸増幅に必要な試薬とを含む核酸試料を調製する（図３（ｉ））。実施形態３で用いた標的核酸および精度管理用ポリヌクレオチドは、実施形態１で用いたものと同様、標的核酸は検出配列を１つ（ｎ＝１）含み、精度管理用ポリヌクレオチドは検出配列を２つ（ｎ＝２）含む。
【００７６】
区画調製工程では、実施形態１と同様にして、油相中の水性液滴（区画）を形成される（図３（ｉｉ））。形成された多数の水性液滴のうち、標的核酸一分子または精度管理用ポリヌクレオチド一分子と、複数個のＴａｑＭａｎ（商標）プローブとを含む水性液滴が調製される（図３（ｉｉ）（ｂ）、（ｃ））。水性液滴集団に対してＰＣＲ法を実施することで、標的核酸一分子または精度管理用ポリヌクレオチド一分子を含む水性液滴では、その水性液滴中に核酸の増幅産物が生成される（図３（ｉｉｉ）（ｂ）、（ｃ））。その他の水性液滴には通常は標的核酸と精度管理用ポリヌクレオチドが欠けており（図３（ｉｉ）（ａ））、そのような水性液滴中では、ＰＣＲ法が実施されても、核酸増幅は行われない（図３（ｉｉｉ）（ａ））。核酸増幅工程中に、ＴａｑＭａｎ（商標）プローブはポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により分解される。ＴａｑＭａｎ（商標）プローブの分解に伴って蛍光物質がクエンチャー物質から離隔され、蛍光を発することが可能な状態になる。標的核酸の場合、一回の核酸増幅で、一本の鎖の増幅あたり一分子のＴａｑＭａｎ（商標）プローブが分解され得る。これにより、一分子の蛍光物質が蛍光の発光が可能な状態となる。精度管理用ポリヌクレオチドの場合、一回の核酸増幅で、１本の鎖の増幅あたり二分子のＴａｑＭａｎ（商標）プローブが分解され得る。これにより、二分子の蛍光物質が蛍光の発光が可能な状態となる。
【００７７】
シグナル検出工程では、個々の水性液滴に対して励起光（λ１）を照射し、各水性液滴からの蛍光シグナル（λ２）を測定する。測定される蛍光シグナル強度は、蛍光発光が可能となった蛍光物質の数を反映し得る。標的核酸一分子を含んだ水性液滴に存在し得る蛍光発光が可能な蛍光物質の数よりも、精度管理用ポリヌクレオチド一分子を含んだ水性液滴に存在し得る蛍光発光が可能な蛍光物質の数の方が約２倍多いと考えられる。この蛍光発光が可能な蛍光物質の数の相違により、精度管理用ポリヌクレオチド一分子を含んだ水性液滴からは、標的核酸一分子を含んだ水性液滴から得られる蛍光シグナル強度よりも計算上は約２倍強い蛍光シグナル強度が得られうる。
精度管理用ポリヌクレオチドの増幅産物が生成された区画（液滴）からのシグナルの検出結果に基づいて、核酸検出工程が適切であったか不適切であったかが判定される。上記したように、核酸検出工程が適切と判定された場合、標的核酸の検出結果に信頼性があると判断することができる。核酸検出工程が不適切であったと判定された場合、標的核酸の検出結果は信頼性を欠くと判断することができる。このように、実施形態３によれば、核酸の検出結果の精度・品質を管理することができる。
【００７８】
［実施形態４］
図４は、実施形態４に係る核酸検出工程を示す模式図である。実施形態４では、実施形態３と異なり、ウェル型のデジタルＰＣＲにより核酸増幅を行う例を示す。
実施形態４では、標的核酸と、精度管理用ポリヌクレオチドと、その他の核酸増幅に必要な試薬とを含む核酸試料を調製する（図４（ｉ））。実施形態４で用いた標的核酸および精度管理用ポリヌクレオチドは、実施形態３で用いたものと同様、標的核酸は検出配列を１つ（ｎ＝１）含み、精度管理用ポリヌクレオチドは検出配列を２つ（ｎ＝２）含む。
【００７９】
区画調製工程では、実施形態３と異なり、核酸試料をマイクロタイタープレートの多数のウェル（区画）に分注する。多数のウェルのうち、標的核酸一分子または精度管理用ポリヌクレオチド一分子を含むウェルが調製される（図４（ｉｉ）（ｂ）、（ｃ））。ウェルに分注された核酸試料に対してＰＣＲ法を実施することで、標的核酸一分子または精度管理用ポリヌクレオチド一分子を含むウェルでは、そのウェル中に核酸の増幅産物が生成される（図４（ｉｉｉ）（ｂ）、（ｃ））。その他のウェルには通常は標的核酸と精度管理用ポリヌクレオチドが欠けており（図４（ｉｉ）（ａ））、そのようなウェルではＰＣＲ法が実施されても核酸増幅は行われない（図４（ｉｉｉ）（ａ））。
実施形態４では、核酸増幅後に、単独ではシグナルを示さないがハイブリダイズすることでシグナルを示す検出用プローブ、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎをウェルに加え、存在する場合には増幅産物にストリンジェントな条件下でハイブリダイズさせる。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎプローブは、一方の末端が蛍光物質で標識化され、他方の末端がクエンチャー物質で標識化されたオリゴヌクレオチドであって、検出配列にハイブリダイズ可能な配列を含み、ヘアピン型二次構造をとり得るオリゴヌクレオチドである。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎプローブは、検出配列とハイブリダイズすることで、ヘアピン型二次構造が壊れ、伸びた構造をとり得る。これにより、標識化された蛍光物質が蛍光の発光が可能な状態になる。標的核酸の場合、検出配列が１つ（ｎ＝１）であるから、一分子のＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎプローブがハイブリダイズし得る。精度管理用ポリヌクレオチドの場合、検出配列が２つ（ｎ＝２）であるから、二分子のＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎプローブがハイブリダイズし得る。
【００８０】
シグナル検出工程では、個々のウェルに励起光（λ１）を照射し、各ウェルからの蛍光シグナル（λ２）を測定する。蛍光シグナルの検出には、マイクロタイタープレートリーダーが用いられる。測定される蛍光シグナル強度は、増幅産物にハイブリダイズしたＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎプローブの数（即ち、蛍光発光可能な蛍光物質の数）を反映し得る。標的核酸一分子を含んだウェル中でその増幅産物にハイブリダイズしたＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎプローブの数よりも、精度管理用ポリヌクレオチド一分子を含んだウェル中でその増幅産物にハイブリダイズしたＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎプローブの数の方が約２倍多いと考えられる。このハイブリダイズしたＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎプローブの数の相違により、精度管理用ポリヌクレオチド一分子を含んだウェルからは、標的核酸一分子を含んだウェルから得られる蛍光シグナル強度よりも計算上は約２倍強い蛍光シグナル強度が得られうる。
【００８１】
精度管理用ポリヌクレオチドの増幅産物が生成した区画（ウェル）からのシグナルの検出結果に基づいて、核酸検出工程が適切であったか不適切であったかが判定される。上記したように、核酸検出工程が適切と判定された場合、標的核酸の検出結果に信頼性があると判断することができる。核酸検出工程が不適切であったと判定された場合、標的核酸の検出結果は信頼性を欠くと判断することができる。このように、実施形態４によれば、核酸の検出結果の精度・品質を管理することができる。
【００８２】
実施形態４では、検出用プローブとしてＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎプローブを用いたが、本発明の実施形態は、これに限定されるものではない。例えば、実施形態４の核酸調製において、実施形態３で用いたＴａｑＭａｎ（商標）プローブおよび５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼをさらに含む核酸試料を調製し、調製した核酸試料を実施形態４に記載したようにウェルに分注（区画調製）して、核酸増幅してもよい。シグナル検出工程では、核酸増幅の際にクエンチャー物質から離隔して蛍光発光が可能となった蛍光物質からの蛍光シグナルが検出される。
また、プライマーを固定化したビーズを用いることもできる。この場合、マイクロタイタープレート１ウェルに１個ずつビーズを収容し、上記と同様に核酸増幅およびシグナル検出を行うことができる。
【００８３】
［精度管理用試薬］
本発明の第２の態様は、精度管理用ポリヌクレオチドを含む精度管理用試薬を提供する。第１の態様において精度管理用ポリヌクレオチドに関して記載した特徴は、前記試薬に含まれる精度管理用ポリヌクレオチドにも適用される。
【００８４】
［精度管理用試薬キット］
本発明の第３の態様の１つの実施形態において、精度管理用試薬キットは、精度管理用ポリヌクレオチドを収容した試薬容器を含む。この他、前記プライマーセット、前記検出用プローブ、ポリメラーゼ、ｄＮＴＰｓなど必要な試薬を収容した試薬容器を適宜含んでいてもよい。さらに、試薬の使用方法などを記載した添付文書を含んでいてもよい。図１０は、本実施形態の精度管理用試薬キットの一例を示す模式図である。このキットは、精度管理用ポリヌクレオチドを収容する試薬容器１１；第１プライマーを収容する試薬容器１２；第２プライマーを収容する試薬容器１３；検出用プローブを収容する試薬容器１４；ポリメラーゼを収容する試薬容器１５；ヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰｓ）を収容する試薬容器１６；および添付文書１８を含む。試薬容器１１〜１６および添付文書１８はケース１７に収容されている。
図１０に示すキットにおいては、それぞれの試薬類が異なる容器に収容されていたが、共存しても核酸増幅およびシグナル検出に問題がない試薬は、同一容器内に収容してもよい。何れの試薬を共存させるかは当業者が適宜選択することができる。たとえば、第１プライマー、第２プライマーおよびｄＮＴＰｓは同一容器内に収容することができる。
本明細書において、精度管理用ポリヌクレオチドおよび検出用プローブに関して記載した特徴は、前記キットに含まれる精度管理用ポリヌクレオチドおよび検出用プローブにも適用される。
【００８５】
本発明の１つの実施形態は、上記した精度管理用試薬または精度管理用試薬キットの製造のための、精度管理用ポリヌクレオチドの使用である。精度管理用試薬、精度管理用試薬キット、および精度管理用ポリヌクレオチドに関する特徴は、上述したとおりである。
【００８６】
本発明の１つの実施形態は、本発明の第１の態様に係る核酸増幅の精度管理方法における、上記した精度管理用ポリヌクレオチド、精度管理用試薬または精度管理用試薬キットの使用である。他の実施形態は、本発明の第１の態様に係る核酸増幅の精度管理方法に使用するための、上記した精度管理用ポリヌクレオチド、精度管理用試薬および精度管理用試薬キットである。精度管理用試薬、精度管理用試薬キット、精度管理用ポリヌクレオチド、および精度管理方法に関する特徴は、上述したとおりである。
【００８７】
以下、具体的な実施例を記載するが、それらは本発明の好ましい実施形態を示すものであり、添付する特許請求の範囲に記載の発明をいかようにも限定するものではない。本明細書に記載の具体的な実施形態、材料、組成物および方法から容易に認識される均等物、または変更、改変もしくは変形が本発明の範囲内にあることが意図される。
【実施例】
【００８８】
実施例において、以下の試薬、装置および解析ソフトを用いた。
＜試薬＞
Phusion II Hot-start High Fidelity DNA polymerase (Thermo Scientific社)
Platinum Taq DNA polymerase (Life Techonologies社)
QuantIt PicoGreen dsDNA Assay Kit (Life Technologies)
デオキシヌクレオシド三リン酸 (各10 mmol/L、Life Technologies)
10x PCRバッファ (670 mmol/L Tris-HCl pH 8.8、166 mmol/L 硫化アンモニウム、100 mmol/L 2-メルカプトエタノール、11.7 mmol/L 塩化マグネシウム)
EmulsiFIRE (7% (v/v) ABIL WE09, 20%(v/v) ミネラルオイル, 73%(v/v) Tegosoft DEC)
TE バッファ pH 7.5 (10 mmol/L Tris-HCl pH 7.0, 1 mmol/L エチレンジアミン四酢酸)
Breaking バッファ (10 mmol/L Tris-HCl pH 7.5、1% Triton X-100、1%ドデシル硫酸ナトリウム、100 mmol/L 塩化ナトリウム、1 mmol/L エチレンジアミン四酢酸)
0.1 mol/L 水酸化ナトリウム
TKバッファ (20 mmol/L Tris-HCl pH 8.4, 50 mmol/L 塩化カリウム)
5x ハイブリダイゼーションバッファ (75 mmol/L Tris-HCl pH 9.5、33.5 mmol/L 塩化マグネシウム、25% ホルムアミド)
Dynabeads MyOne Streptoavidin C1 (Dynal)
ステンレスビーズ (5 mm)
＜装置＞
Veriti サーマルサイクラー (Applied Biosystems社)
BD Accuri C6 フローサイトメーター (Beckton Dickinson社)
＜解析ソフトウェア＞
FlowJo (FlowJo社)
【００８９】
［実施例１］
＜ＫＲＡＳ増幅サンプルＤＮＡの調製＞
野生型ヒトＫＲＡＳの遺伝子配列を含むプラスミドと変異型ヒトＫＲＡＳ  ｃ．３８Ｇ＞Ａの遺伝子配列を含むプラスミドとを、９９：１の比率で混合したＤＮＡ試料を調製した。調製したＤＮＡ試料を、Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＩＩ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）および表１で示すプライマーセットを用いてＰＣＲ法により増幅した。ＰＣＲ反応は、Ｖｅｒｉｔｉサーマルサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて実施した。以下、ＰＣＲ反応を実施するにあたっては、同様にＶｅｒｉｔｉサーマルサイクラーを用いた。
【表１】
0006685138.tif 000002
表２は、野生型ヒトＫＲＡＳ遺伝子のエクソン２（配列番号８）および変異型ヒトＫＲＡＳ  ｃ．３８Ｇ＞Ａ  遺伝子のエクソン２（配列番号９）を示す。上記ＰＣＲ反応により、表２で示される配列中、大文字で示した配列部分が、表１で示すプライマーセットを用いた前記ＰＣＲにより増幅される。表２で示される配列中、下線を付した領域は後述する検出配列を示し、四角枠で囲った領域は、後述するコモンプローブがハイブリダイズ可能な領域を示す。
【表２】
0006685138.tif 000003
得られた増幅産物を、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ蛍光インターカレーターを用いて定量した（ＱｕａｎｔＩｔ  ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ  ｄｓＤＮＡ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ  （Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））。前記増幅産物は、以下、「ＫＲＡＳ増幅サンプルＤＮＡ」という。
【００９０】
＜精度管理用ポリヌクレオチドの調製＞
精度管理用ポリヌクレオチドとして、配列番号１０〜配列番号１５の各配列を含む一本鎖ＤＮＡを調製した。前記一本鎖ＤＮＡは、β−シアノエチルホスホロアミダイト法によりそれぞれ化学合成した。合成した各ＤＮＡをＰｈｕｓｉｏｎ  ＩＩ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）および表１で示すプライマーセットを用いてＰＣＲ法によりそれぞれ増幅した。各増幅産物を精製し、紫外吸光法を用いてそれぞれ定量した。前記増幅産物はそれぞれ、以下のように命名した（表３）。各精度管理用ポリヌクレオチドは、表３で示す数の、野生型（Ｗｔ）および変異型（Ｍｕｔ）ヒトＫＲＡＳ遺伝子配列における検出配列（以下、それぞれ「Ｗｔ検出配列」および「Ｍｕｔ検出配列」という。）を含んだ。Ｗｔ検出配列は、表２で示す配列番号８の配列において下線を付した配列であり、Ｍｕｔ検出配列は、表２で示す配列番号９の配列において下線を付した配列である。表３において、検出配列は下線を付して表示する。
【表３】
0006685138.tif 000004
【００９１】
＜プライマー結合磁性ビーズの調製＞
配列番号１の配列（５’−TCCCGCGAAATTAATACGAC−３’）を有する一本鎖ＤＮＡを調製した。前記一本鎖ＤＮＡの５’末端にビオチン二量体を結合させ、ビオチン化プライマーを調製した。前記ビオチン化プライマーを、ストレプトアビジンで修飾した磁性ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  ＭｙＯｎｅ  Ｓｔｒｅｐｔｏａｖｉｄｉｎ  Ｃ１  （Ｄｙｎａｌ））に加え、前記プライマーを前記磁性ビーズに結合させ、プライマー結合磁性ビーズを調製した。前記プライマー結合磁性ビーズを洗浄し、結合されなかったビオチン化プライマーを除去した。
【００９２】
＜ＢＥＡＭｉｎｇ法＞
磁性ビーズを利用した液滴型のデジタルＰＣＲであるＢＥＡＭｉｎｇ（Ｂｅａｄｓ，  Ｅｍｕｌｓｉｏｎｓ，  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｍａｇｎｅｔｉｃｓ）法により、核酸増幅を行う。以下で示すＰＣＲ反応溶液を調製した（濃度は終濃度）。
0006685138.tif 000005
次いで、このＰＣＲ反応溶液に、６４μＬのＥｍｕｌｓｉＦＩＲＥ（７％（ｖ／ｖ）  ＡＢＩＬ  ＷＥ０９、２０％（ｖ／ｖ）ミネラルオイル、７３％（ｖ／ｖ）  Ｔｅｇｏｓｏｆｔ  ＤＥＣ）を添加した。前記溶液を、ステンレスビーズ（５ｍｍ）存在下で転倒混和することにより、エマルジョンを形成させた。前記エマルジョンに対して、以下に示す条件のＰＣＲ反応を行った。
0006685138.tif 000006
ここで、前記プライマー結合磁性ビーズに結合されたプライマーは、前記ＰＣＲ反応溶液に用いられたフォワードプライマー５と同じ配列（配列番号１記載の配列）を有する。上記ＰＣＲにより、例えば、磁性ビーズに結合されたプライマーからそのプライマーにハイブリダイズしたＫＲＡＳ増幅サンプルＤＮＡを鋳型としてその相補鎖が伸長される。これにより、ＫＲＡＳ増幅サンプルＤＮＡの増幅産物が結合された磁性ビーズが得られる。
【００９３】
＜検出用プローブ溶液の調製＞
表４で示す配列番号の配列を含む一本鎖ＤＮＡをそれぞれ調製した。前記一本鎖ＤＮＡの各５’末端に、表４で示す蛍光物質をそれぞれ結合させ、蛍光物質で標識した検出用プローブを調製した。ここで、コモンプローブは、表１で示すプライマーセットを用いて増幅される野生型と変異型のヒトＫＲＡＳ遺伝子の増幅産物のいずれにもハイブリダイズ可能であり、配列番号５の配列は、前記増幅産物の双方に共通する配列に相補的な配列を含む（表２で示す配列中、四角枠で囲った配列を参照）。Ｗｔ検出用プローブは、前記プライマーセットにより増幅される野生型のヒトＫＲＡＳ遺伝子の増幅産物にハイブリダイズ可能であり、配列番号６の配列はＷｔ検出配列に相補的な配列を含む。Ｍｕｔ検出用プローブは、前記プライマーセットにより増幅される変異型のヒトＫＲＡＳ遺伝子の増幅産物にハイブリダイズ可能であり、配列番号７の配列はＭｕｔ検出配列に相補的な配列を含む。
【表４】
0006685138.tif 000007
調製した３種類の検出用プローブをハイブリダイゼーション溶液に各プローブの終濃度が０．１μｍｏｌ／Ｌとなるよう添加し、検出用プローブ溶液（合計プローブ濃度  ０．３μｍｏｌ／Ｌ）を調製した。
【００９４】
＜磁性ビーズの回収および検出用プローブとのハイブリダイゼーション＞
ＰＣＲ反応により合成された増幅核酸が結合した磁性ビーズを含む前記エマルジョンを、Ｂｒｅａｋｉｎｇバッファ（１０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１％ドデシル硫酸ナトリウム、１００ｍｍｏｌ／Ｌ  塩化ナトリウム、１ｍｍｏｌ／Ｌ  エチレンジアミン四酢酸）を用いて壊し、前記磁性ビーズを回収した。回収した磁性ビーズを０．１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウムで処理し、洗浄した。
洗浄後の磁性ビーズを、前記検出用プローブ溶液に懸濁した。懸濁液を５０℃にて１５分間処理し、前記磁性ビーズ上の増幅核酸と前記検出用プローブとをハイブリダイズさせた。この後、前記磁性ビーズをＴＫバッファ（２０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．４、５０ｍｍｏｌ／Ｌ  塩化カリウム）を用いて洗浄し、ＴＫバッファ中に懸濁した。
【００９５】
＜フローサイトメトリー解析＞
前記懸濁液中の磁性ビーズを、ＢＤ  Ａｃｃｕｒｉ  Ｃ６  フローサイトメーター（Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）により測定した。この実施例では、フローサイトメーター（ＦＣＭ）測定により、磁性ビーズに関するシグナル（前方散乱光および測定散乱光）が得られ、さらに増幅核酸に関するシグナル（検出用プローブおよびコモンプローブ由来の蛍光）が得られた。実施例では、コモンプローブ（Ｃｙ３標識）由来の蛍光を前記フローサイトメーターのＦＬ２チャンネルで受光し、Ｗｔ検出用プローブ（ＦＡＭ標識）由来の蛍光をＦＬ１チャンネルで受光し、Ｍｕｔ検出用プローブ（Ｃｙ５標識）由来の蛍光をＦＬ４チャンネルで受光した。
【００９６】
得られた前方散乱および側方散乱に基づいて、非凝集性の磁性ビーズを反映する測定データを選抜した。さらに、コモンプローブ（Ｃｙ３標識）由来の蛍光シグナル（ＬＦ２チャンネル）に基づいて、ＫＲＡＳ増幅サンプルＤＮＡの増幅産物が結合した磁性ビーズであることを確認した。実施例で使用した精度管理用ポリヌクレオチドはコモンプローブがハイブリダイズ可能な領域を含んでいないが、ＫＲＡＳ増幅サンプルＤＮＡより数倍多くの検出配列を含むことを利用して、磁性ビーズ由来の自家蛍光を排除することが可能であった。例えば、精度管理用ポリヌクレオチド（Ｗｔ，ｎ＝５）の増幅産物が結合した磁性ビーズには、後述するように、ＫＲＡＳ増幅サンプルＤＮＡの増幅産物が結合した磁性ビーズよりも計算上５倍の数のＷｔ検出用プローブ（ＦＡＭ標識）が結合し得る。その結果、精度管理用ポリヌクレオチド（Ｗｔ，ｎ＝５）の増幅産物が結合した磁性ビーズからは数倍強いＦＡＭ蛍光シグナル強度が得られる。この強いＦＭＡ蛍光シグナル強度により、ＬＦ２チャンネルへの漏れこみが生じた。このＦＡＭ蛍光シグナルのＬＦ２チャンネルへの漏れこみを利用することで、精度管理用ポリヌクレオチド（Ｗｔ，ｎ＝５）の増幅産物が結合した磁性ビーズであることを確認できた。
コモンプローブを用いることで、存在する場合には磁性ビーズ由来の自家蛍光を排除でき、より精度よくＫＲＡＳ増幅サンプルＤＮＡの分析を行うことが可能となる。また、精度管理用ポリヌクレオチドに存在する検出配列と前記検出配列に相補的な配列との合計数が標的核酸の増幅産物に存在する検出配列と前記検出配列に相補的な配列との合計数と相違することを利用して、存在する場合には磁性ビーズ由来の自家蛍光も排除可能である。
【００９７】
選抜した測定データについて、ｘ軸にＭｕｔ検出用プローブ由来の蛍光シグナル強度を割り当て、ｙ軸にＷｔ検出用プローブ由来の蛍光シグナル強度を割り当てた２Ｄスキャッタグラムを作成した（図５ａ）。作成した２Ｄスキャッタグラムにおいて、Ｗｔ検出用プローブ由来の蛍光を発する磁性ビーズに対応するエリア内のドット数（野生型ＫＲＡＳ遺伝子の存在を示す磁性ビーズの個数に対応する）、およびＭｕｔ検出用プローブ由来の蛍光を発する磁性ビーズに対応するエリア内のドット数（変異型ＫＲＡＳ遺伝子の存在を示す磁性ビーズの個数に対応する）がそれぞれ計数される。図５ａにおいて、２Ｄスキャッタグラムを４つのエリアに分け（Ｑ１〜Ｑ４）、計数された各エリアのドット数の、２Ｄスキャッタグラム中のドット総数に対する割合（％）を、各エリアに表示する。以下同様に、２Ｄスキャッタグラムにおいて各エリア（Ｑ１〜Ｑ４）におけるドットの割合を表示する。
【００９８】
［比較例１］
比較例１では、精度管理用ポリヌクレオチド（Ｗｔ，ｎ＝５）を添加しないＰＣＲ反応溶液を調製したことを除いて、実施例１と実質的に同じ方法で、ＢＥＡＭｉｎｇ法、磁性ビーズの回収、ハイブリダイゼーション、およびフローサイトメトリー（ＦＣＭ）解析を行った（図５ｂ）。
【００９９】
実施例１（精度管理用ポリヌクレオチド（Ｗｔ，ｎ＝５）を含む（＋））の結果を示す図５ａにおいて、ｙ軸の値が３×１０３〜１×１０４［ｅｖｅｎｔ］の間に多数のドットが観察された（実線の丸で囲われたエリア）。比較例１（精度管理用ポリヌクレオチド（Ｗｔ，ｎ＝５）を含まない（−））の結果を示す図５ｂおいても同様に、ｙ軸の値が３×１０３〜１×１０４［ｅｖｅｎｔ］の間に多数のドットが観察された（実線の丸で囲われたエリア）。このエリア内のドット集団は、Ｗｔ検出用プローブ（ＦＡＭ標識）由来の蛍光シグナル強度が比較的強く、一方、Ｍｕｔ検出用プローブ（Ｃｙ５標識）由来の蛍光シグナル強度が比較的弱いことを示す。これにより、このエリア内のドットに対応する磁性ビーズは、ＤＮＡ試料中の野生型ＫＲＡＳ遺伝子の存在を反映することが示唆される。ここで、２Ｄスキャッタグラム中のドット総数に対するこのエリア内のドット数の割合（［エリア内のドット数］／［ドット総数］×１００）を算出できる。前記割合は、試験したＤＮＡ試料中の野生型ＫＲＡＳ遺伝子の含有率が反映され得る。実施例１では、野生型ヒトＫＲＡＳの遺伝子配列を含むプラスミドと変異型ヒトＫＲＡＳ  ｃ．３８Ｇ＞Ａの遺伝子配列を含むプラスミドとを、９９：１の比率で混合したＤＮＡ試料の増幅産物が用いられた。
【０１００】
図５ａおよび図５ｂの２Ｄスキャッタグラムにおいて、ｘ軸の値が１×１０４〜３×１０４の間にドット集団が観察された（実線の四角で囲われたエリア）。このエリア内のドット集団は、Ｍｕｔ検出用プローブ（Ｃｙ５標識）由来の蛍光シグナル強度が比較的強く、一方、Ｗｔ検出用プローブ（ＦＡＭ標識）由来の蛍光シグナル強度が比較的弱いことを示す。これにより、このエリア内のドットに対応する磁性ビーズは、ＤＮＡ試料中の変異型ＫＲＡＳ遺伝子の存在を反映することが示唆される。上記したように、２Ｄスキャッタグラム中のドット総数に対するこのエリア内のドット数の割合を算出できる。前記割合は、試験したＤＮＡ試料中の変異型ＫＲＡＳ遺伝子の含有率が反映され得る。
【０１０１】
図５ａ（精度管理用ポリヌクレオチド（Ｗｔ，ｎ＝５）（＋））において、ｙ軸の値が３×１０３〜１×１０４の間の実線の丸で囲われたエリアに存在したドット集団から区別可能なドット集団が、ｙ軸の値が１×１０４〜３×１０４の間に観察された（破線の丸で囲われたエリア）。図５ｂ（精度管理用ポリヌクレオチド（Ｍｕｔ，ｎ＝５）（−））では、図５ａの破線の丸で囲われたエリアに対応するエリアにドットは観察されなかった。図５ａの破線の丸で囲われたエリア内のドット集団は、Ｗｔ検出用プローブ（ＦＡＭ標識）由来の蛍光シグナル強度が、実線の丸で囲われたエリア内のドット集団が示す蛍光シグナル強度よりも数倍大きいことを示す。
これは、図５ａ、ｂの破線の丸で囲われたエリアのドットに対応する磁性ビーズは、実線の丸で囲われたエリアのドットに対応する磁性ビーズよりも、数倍多くのＷｔ検出用プローブでハイブリダイズされていることを示唆する。したがって、図５ａの破線の丸で囲われたエリア内のドット集団は、Ｗｔ検出用プローブがハイブリダイズ可能な検出配列を５つ有する精度管理用ポリヌクレオチド（Ｗｔ，ｎ＝５）の増幅産物が結合した磁性ビーズを反映し得ることが理解される。図５ａ、ｂの実線の丸で囲われたエリア内のドット集団は、Ｗｔ検出用プローブがハイブリダイズ可能な検出配列を１つ有する野生型のＫＲＡＳ増幅ＤＮＡの増幅産物が結合した磁性ビーズを反映し得ることが理解される。
【０１０２】
［実施例２および比較例２］
実施例２では、精度管理用ポリヌクレオチド（Ｗｔ，ｎ＝５）に代えて精度管理用ポリヌクレオチド（Ｍｕｔ，ｎ＝５）を用いたＰＣＲ反応溶液を調製したことを除いて、実施例１と実質的に同じ方法で、ＢＥＡＭｉｎｇ法、磁性ビーズの回収、ハイブリダイゼーション、およびＦＣＭ解析を行った（図６ａ）。
比較例２では、精度管理用ポリヌクレオチド（Ｍｕｔ，ｎ＝５）を添加しないＰＣＲ反応溶液を調製したことを除いて、実施例２と実質的に同じ方法で、ＢＥＡＭｉｎｇ法、磁性ビーズの回収、ハイブリダイゼーション、およびＦＣＭ解析を行った（図６ｂ）。
【０１０３】
実施例２および比較例２の結果は、実施例１および比較例１の結果と同様に、ＤＮＡ試料中の野生型ＫＲＡＳ遺伝子の存在を反映するエリア内に多数のドットが観察され（図６ａおよびｂ、実線の丸で囲われたエリア）、また、変異型ＫＲＡＳ遺伝子の存在を反映するエリア内にドット集団が観察された（図６ａおよびｂ、実線の四角で囲われたエリア）。
【０１０４】
図６ａ（精度管理用ポリヌクレオチド（Ｍｕｔ，ｎ＝５）（＋））において、ｘ軸の値が１×１０４〜２×１０４の間の実線の四角で囲われたエリアに存在したドット集団から区別可能なドット集団が、ｘ軸の値が３×１０４〜６×１０５の間の破線の四角で囲われたエリアに観察された。図６ｂ（精度管理用ポリヌクレオチド（Ｍｕｔ，ｎ＝５）（−））では、図６ａの破線の四角で囲われたエリアに対応するエリアにドットは観察されなかった。図６ａの破線の四角で囲われたエリア内のドット集団は、Ｍｕｔ検出用プローブ（Ｃｙ５標識）由来の蛍光シグナル強度が、実線の四角で囲われたエリア内のドット集団が示す蛍光シグナル強度よりも数倍大きいことを示す。
これは、図６ａ、ｂの破線の四角で囲われたエリアのドットに対応する磁性ビーズは、実線の四角で囲われたエリアのドットに対応する磁性ビーズよりも、数倍多くのＭｕｔ検出用プローブでハイブリダイズされていることを示唆する。図６ａの破線の四角で囲われたエリア内のドット集団は、Ｍｕｔ検出用プローブがハイブリダイズ可能な検出配列を５つ有する精度管理用ポリヌクレオチド（Ｍｕｔ，ｎ＝５）の増幅産物が結合した磁性ビーズを反映し得ることが理解される。図６ａ、ｂの実線の四角で囲われたエリア内のドット集団は、Ｍｕｔ検出用プローブがハイブリダイズ可能な検出配列を１つ有する変異型のＫＲＡＳ増幅ＤＮＡの増幅産物が結合した磁性ビーズを反映し得ることが理解される。
【０１０５】
実施例１および実施例２の結果から、本発明の１つの態様に係る核酸増幅の精度管理方法によれば、標的核酸を増幅させるためのプライマーセットと同一のプライマーセットを用いて核酸増幅可能であって、標的核酸由来の増幅産物を検出するための検出用プローブと同一の検出用プローブを用いて標的核酸由来の増幅産物からを区別可能に検出できる精度管理用ポリヌクレオチドを用いるため、核酸調製、区画調製、核酸増幅およびシグナル検出を含む一連の工程が適切であったか否かを判定することが可能であることが理解される。
【０１０６】
また、実施例１および実施例２の結果から、本発明の１つの態様に係る精度管理用ポリヌクレオチドは、変異検出の精度管理方法においても使用可能であることが理解される。
【０１０７】
［実施例３］
＜精度管理用ポリヌクレオチドのコピー数とＦＣＭ検出シグナル強度との相関関係＞
実施例１のＰＣＲ反応溶液において、精度管理用ポリヌクレオチド（Ｗｔ，ｎ＝５）をそれぞれ２５，０００コピー、５０，０００コピー、１００，０００コピー、２００，０００コピー、４００，０００コピー、８００，０００コピーをスパイクし、実施例１と実質的に同じ方法で、ＢＥＡＭｉｎｇ法、磁性ビーズの回収、ハイブリダイゼーション、およびＦＣＭ解析を行った。ＦＣＭ解析で得られたデータをＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＦｌｏｗＪｏ社）でさらに解析し、ＰＣＲ反応後の各精度管理用ポリヌクレオチド由来の蛍光シグナル強度の平均値を算出した（図７ａ）。
図７ａは、ｘ軸にスパイクした精度管理用ポリヌクレオチドのコピー数を割り当て、ｙ軸にはＦＣＭ測定で検出された蛍光シグナル強度を割り当てた散布図を示す。図７ａにおける破線は回帰直線を示し、その方程式はｙ＝０．００９８ｘ−３５７であった。図７ａは、スパイクした精度管理用ポリヌクレオチドの増幅産物の量に対応し得る蛍光シグナル強度が、スパイクした精度管理用ポリヌクレオチドのコピー数に比例して増加していることを示す。
【０１０８】
同様に、実施例２のＰＣＲ反応溶液において、精度管理用ポリヌクレオチド（Ｍｕｔ，ｎ＝５）をそれぞれ２５，０００コピー、５０，０００コピー、１００，０００コピー、２００，０００コピー、４００，０００コピー、８００，０００コピーをスパイクし、実施例２と実質的に同じ方法で、ＢＥＡＭｉｎｇ法、磁性ビーズの回収、ハイブリダイゼーション、およびＦＣＭ解析を行った。ＦＣＭ解析で得られたデータをＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＦｌｏｗＪｏ社）でさらに解析し、ＰＣＲ反応後の各精度管理用ポリヌクレオチド由来の蛍光シグナル強度の平均値を算出した（図７ｂ）。
図７ｂは、ｘ軸にスパイクした精度管理用ポリヌクレオチドのコピー数を割り当て、ｙ軸にはＦＣＭ測定で検出された蛍光シグナル強度を割り当てた散布図を示す。図７ｂにおける破線は回帰直線を示し、その方程式はｙ＝０．０１１ｘ−６８であった。図７ｂもまた、スパイクした精度管理用ポリヌクレオチドの増幅産物の量に対応し得る蛍光シグナル強度が、スパイクした精度管理用ポリヌクレオチドのコピー数に比例して増加していることを示す。
図７ａ、ｂで示されるように、スパイクした精度管理用ポリヌクレオチドのコピー数とＦＣＭで検出された蛍光シグナル強度との間には正の相関があった。この結果は、本発明に係る精度管理用ポリヌクレオチドを用いた核酸増幅の精度管理方法の定量性を実証するものである。
【０１０９】
［実施例４］
＜精度管理用ポリヌクレオチドにおける検出配列の数とＦＣＭ検出シグナル強度との相関関係＞
精度管理用ポリヌクレオチド（Ｗｔ，ｎ＝５）、（Ｗｔ，ｎ＝４）、（Ｗｔ，ｎ＝３）、（Ｗｔ，ｎ＝２）をそれぞれ４０，０００コピー含むＰＣＲ反応溶液、および精度管理用ポリヌクレオチドを含まないＰＣＲ反応溶液（野生型ヒトＫＲＡＳ遺伝子におけるＷｔ検出配列の数（ｎ）＝１）を調製し、実施例１と実質的に同じ方法で、ＢＥＡＭｉｎｇ法、磁性ビーズの回収、ハイブリダイゼーション、およびＦＣＭ解析を行った。ＦＣＭ解析で得られたデータをＦｌｏｗＪｏソフトウェアでさらに解析し、ＰＣＲ反応後の各精度管理用ポリヌクレオチド由来の蛍光シグナル強度の平均値および標準偏差（ＳＤ）を算出した（図８）。
図８は、ｘ軸にＷｔ検出配列の数を割り当て、ｙ軸にＷｔ検出用プローブ（ＦＡＭ標識）由来の蛍光シグナル強度を割り当てた箱ひげ図を示す。箱ひげ図において、箱の両端は平均値±１ＳＤを示し、ひげ両端は平均値±３ＳＤを示す。
図８で示されるように、増幅された精度管理用ポリヌクレオチドにおける検出配列の数に対応し得る蛍光シグナル強度と、精度管理用ポリヌクレオチドにおける検出配列の数との間には正の相関があることが理解される。
【０１１０】
実施例４において、精度管理用ポリヌクレオチドが互いに区別して検出可能であることを示す基準を、例えば、蛍光シグナル強度の平均値±１ＳＤが重ならないこととして、図８で示された結果を参照する。標的核酸に検出配列が１つ存在すると仮定した場合（ｎ＝１）、精度管理用ポリヌクレオチドには少なくとも２つの検出配列が存在すれば（ｎ≧２）、１種類の検出用プローブを用いて、前記標的核酸と前記精度管理用ポリヌクレオチドとを区別して検出可能であることを示唆する。同様の基準に基づいて、例えば標的核酸に検出配列が２つ存在すると仮定した場合には（ｎ＝２）、前記標的核酸と精度管理用ポリヌクレオチドとを区別するためには、精度管理用ポリヌクレオチドには１つの検出配列が存在してもよく（ｎ＝１）、または少なくとも３つの検出配列が存在してもよいこと（ｎ≧３）が理解できる。
実施例４は、本発明の１つの態様に係る精度管理用ポリヌクレオチドを用いた核酸増幅の精度管理方法が、標的核酸に存在し得る検出配列と前記検出配列に相補的な配列との合計数と異なる合計数の検出配列と前記検出配列に相補的な配列を含む精度管理用ポリヌクレオチドを用いることで、１種類の検出用プローブを用いて、互いに区別して検出可能であることが理解される。
【０１１１】
［実施例５および比較例３］
実施例５では、実施例１のＰＣＲ反応溶液において、１００，０００コピーの精度管理用ポリヌクレオチド（Ｗｔ，ｎ＝５）をスパイクしたことに代えて、５０，０００コピーの精度管理用ポリヌクレオチド（Ｗｔ，ｎ＝６）をスパイクしたことを除き、実施例１と実質的に同じ方法で、ＢＥＡＭｉｎｇ法、磁性ビーズの回収、ハイブリダイゼーション、およびＦＣＭ解析を行った（図９ａ）。比較例３では、精度管理用ポリヌクレオチド（Ｗｔ，ｎ＝６）を添加しないＰＣＲ反応溶液を調製したことを除いて、実施例５と実質的に同じ方法で、ＢＥＡＭｉｎｇ法、磁性ビーズの回収、ハイブリダイゼーション、およびＦＣＭ解析を行った（図９ｂ）。
【０１１２】
図９ａ（精度管理用ポリヌクレオチド（Ｗｔ，ｎ＝６）（＋））において、ｙ軸の値が約３×１０３〜約１×１０４の間の実線の丸で囲われたエリアに存在した多数のドットから区別可能なドット集団が、ｙ軸の値が約１．５×１０４〜約３×１０４の間の破線の丸で囲われたエリアに観察された。図９ｂ（精度管理用ポリヌクレオチド（Ｗｔ，ｎ＝６）（−））では、図９ａの破線の丸で囲われたエリアに対応するエリアにドットは観察されなかった。図９ａの破線の丸で囲われたエリア内のドット集団は、Ｗｔ検出用プローブ（ＦＡＭ標識）由来の蛍光シグナル強度が実線の丸で囲われたエリア内のドット集団が示す蛍光シグナル強度よりも数倍大きいことを示す。
これは、図９ａ、ｂの破線の丸で囲われたエリアのドットに対応する磁性ビーズが、実線の丸で囲われたエリアのドットに対応する磁性ビーズよりも、数倍多くのＷｔ検出用プローブでハイブリダイズされていることを示唆する。図９ａの破線の丸で囲われたエリア内のドット集団は、Ｗｔ検出用プローブがハイブリダイズ可能な検出配列を６つ有する精度管理用ポリヌクレオチド（Ｗｔ，ｎ＝６）の増幅産物が結合したビーズを反映し得ることが理解される。図９ａ、ｂの実線の丸で囲われたエリア内のドット集団は、Ｗｔ検出用プローブがハイブリダイズ可能な検出配列を１つ有する野生型のＫＲＡＳ増幅ＤＮＡの増幅産物が結合した磁性ビーズを反映し得ることが理解される。
【０１１３】
実施例５で使用したコントロールポリヌクレオチド（Ｗｔ，ｎ＝６）は、Ｗｔ検出配列の間のスペーサー配列が２ｂｐであった（表３、配列番号１５の配列中、下線を付した検出配列間の塩基の数（鎖長）を参照）。実施例１〜４で使用したコントロールポリヌクレオチド（Ｗｔ，ｎ＝５）、（Ｗｔ，ｎ＝４）、（Ｗｔ，ｎ＝３）、（Ｗｔ，ｎ＝２）、および（Ｍｕｔ，ｎ＝５）では、各検出配列の間のスペーサー配列は５ｂｐであった（表３、配列番号１０〜１４の配列中、下線を付した検出配列間の鎖長を参照）。実施例５の結果から、本発明の１つの態様に係る精度管理用ポリヌクレオチドを用いた核酸増幅の精度管理方法が、検出配列または前記検出配列に相補的な配列間のスペーサー配列が２ｂｐであっても、精度管理用ポリヌクレオチドの増幅産物を標的核酸の増幅産物から区別して検出可能であることが理解される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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