(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイコプラズマ・ボビス株を含む、有効な免疫原性組成物であって、前記株は、受け入れ番号ＰＴＡ−１２２１６７で、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関に寄託されている、免疫原性組成物。
【請求項２】
前記マイコプラズマ・ボビス株は、生の、および／または弱毒化されたマイコプラズマ・ボビス株である、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項３】
前記マイコプラズマ・ボビス株は不活化されている、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項４】
前記組成物は、追加的にアジュバントを含むことができる、請求項３に記載の免疫原性組成物。
【請求項５】
少なくとも１つの追加の抗原をさらに含む、請求項３に記載の免疫原性組成物。
【請求項６】
前記追加の抗原は、ウイルス、細菌、真菌類、および寄生生物からなる群から選択される、請求項５に記載の免疫原性組成物。
【請求項７】
前記組成物は、筋肉内、皮下、鼻腔内、気管内、経口、およびエアゾールからなる群から選択される経路による投与のために処方される、請求項１〜６のいずれかに記載の免疫原性組成物。
【請求項８】
ウシ属の動物におけるマイコプラズマ・ボビスに起因する疾病を防止する方法であって、免疫化する量の請求項１〜７のいずれかに記載の免疫原性組成物を前記動物に投与することを含む方法。
【請求項９】
ウシ属の動物のマイコプラズマ・ボビスおよび他の感染病原体により引き起こされる疾病を防止する方法であって、免疫化する量の請求項１〜７のいずれかに記載の免疫原性組成物を前記動物に投与することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイコプラズマ・ボビス免疫原性組成物に関する。本発明は、さらに、マイコプラズマ・ボビスに対する、動物における免疫応答を生じさせるのに使用するための免疫原性組成物、およびマイコプラズマ・ボビスに起因する哺乳類における感染症に対する防御反応を生じさせる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
マイコプラズマ・ボビスは、例えば、乳腺炎、肺炎、関節炎、耳炎、皮膚膿瘍、不妊症、流産、またはそれらの組み合わせを含む世界中のウシの群れに多発性疾患を引き起こす。疾病の各形態において、死亡が起こり得る。マイコプラズマ・ボビスは、したがって、乳製品や牛肉の生産者、世界中の獣医師にとって大きな懸念事項である。この病原体によって生じる経済的損失および死亡率を軽減するためのツールとして、様々な抗生物質が開発され提案されている。安全で有効なワクチンの適用による疾病の予防は、動物福祉の向上、生産者経済の改善、抗生物質の賢明な使用の支援を通じて、抗生物質療法に大きな利点をもたらす。不活性化された（例えば、死滅した）マイコプラズマ・ボビスを含むワクチンが開発されている。しかしながら、死滅したワクチンは、通常、防御反応の開始に長い遅延をもたらし、１回より多い投与を必要とすることがあり、場合によっては特定の用途に適さないアジュバントを必要とすることもある。
【発明の概要】
【０００３】
生の弱毒化された、または改変された生ワクチンは、より迅速な免疫応答の発達をもたらし、単回投与量で投与された場合にしばしば有効であり、一般に産生するのがより安価である。従って、生の弱毒化されたものを含む、改善されたマイコプラズマ・ボビスワクチンの必要性がある。
【０００４】
本出願人は驚くべきことに、哺乳類のマイコプラズマ・ボビス感染症に対する防御免疫応答を生成するのに有用な免疫原性組成物を同定した。それらは、追加的にアジュバントと組み合わせることもできる。上記組成物は、また、追加的な抗原と組み合わせることもでき、哺乳類における複合的な感染症と戦うための多価の組成物を得ることができる。
【０００５】
本発明の一実施形態は、弱毒化されたマイコプラズマ・ボビス株を含む、免疫原性組成物であって、前記株は、受け入れ番号ＰＴＡ−１２２１６７で、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関に寄託されている免疫原性組成物を提供する。
【０００６】
別の実施形態は、前記化学的に弱毒化されたマイコプラズマ・ボビス株が、親株と比較して、タンパク質ニトロレダクターゼ、酸性ヒスチジンホスファターゼ、エキシヌクレアーゼＡＢＣサブユニットＢ、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩサブユニットベータ、およびＡＴＰシンターゼＦ１サブユニットデルタの１つ以上において、１つ以上の突然変異を含む免疫原性組成物を提供する。
【０００７】
別の実施形態は、マイコプラズマ・ボビス株を含む免疫原性組成物であって、前記株はＰＴＡ−１２２１６７であり、さらに、前記株は、マイコプラズマ・ボビス株、Ｈｕｂｅｉ−１のリファレンスゲノムのヌクレオチドナンバリングによる、位置１１５２７３、１９４４７８、１９４４８４、１９４５２５、１９４７２４、２０４９６６、２０７６２９、２６２３２７、２７１４８７、２７１６６１、２７１６６６、２７２０８６、２７２１３３、３０９４６３、３１００７５、３１００７８、３１００８６、３１００９０、３１１９８８、３３４１８４、３５８０１３、３６５１０１、３６５１８８、３９７０１０、３９７９０１  、３９９１２９、４１０２４７、４１０２５３、４１０３３４、４１０５１４、４１０７３３、４１４６６６、４５３３８８、４６８４５７、５０２５７７、５０２６７８、５０２９６３、５４３８５９、５６０９８６、６３２３０９、６３２３６６、６３２６１２、６３３９９４、６８６０７４、６８７８７４、６８７９１５、６９６３４８、７２９８７４、７３００４６、７６１５８７、７６１６６３、７６１８１０、７６１８１５、７６５１７６、７６５３２８、および７６５４０３でのリファレンスマイコプラズマ・ボビス株、３６８３  ＃２２／３／１２でみられるいずれかのオリジナルヌクレオチドの１つ以上を含むようにリバースエンジニアリングされている、免疫原性組成物を提供する。
【０００８】
別の実施形態は、上記実施形態の弱毒化されたマイコプラズマ・ボビス株を含む免疫原性組成物であって、前記マイコプラズマ・ボビス株は不活化されている免疫原性組成物を提供する。
【０００９】
別の実施形態は、上記実施形態のいずれかの免疫原性組成物、および追加的なアジュバントをを提供する。
別の実施形態は、上記実施形態のいずれかの免疫原性組成物であって、少なくとも１つの追加の抗原をさらに含む免疫原性組成物を提供する。
【００１０】
別の実施形態は、上記実施形態のいずれかの免疫原性組成物であって、前記追加の抗原は、ウイルス、細菌、真菌類、および寄生生物からなる群から選択される免疫原性組成物を提供する。
【００１１】
別の実施形態は、上記実施形態のいずれかの免疫原性組成物であって、前記組成物は、筋肉内、皮下、鼻腔内、気管内、経口、およびエアゾールからなる群から選択される経路による投与のために処方される免疫原性組成物を提供する。
【００１２】
別の実施形態は、ウシ属の動物におけるマイコプラズマ・ボビスに起因する疾病を防止する方法であって、免疫化する量の上記実施形態のいずれかの免疫原性組成物を前記動物に投与する方法を含む方法を提供する。
【００１３】
別の実施形態は、ウシ属の動物のマイコプラズマ・ボビスおよび他の感染病原体により引き起こされる疾病を防止する方法であって、免疫化する量の上記実施形態のいずれかの免疫原性組成物および追加の抗原を前記動物に投与することを含む方法を提供する。
【００１４】
別の実施形態は、ウシ属の動物におけるマイコプラズマ・ボビスにより引き起こされる疾病を防止するための薬物の製造における、弱毒化マイコプラズマ・ボビス株または不活化された弱毒化マイコプラズマ・ボビス株の使用を提供する。
【００１５】
別の実施形態は、（Ａ）ＰＴＡ−１２２１６７として、ＡＴＣＣで寄託されたマイコプラズマ・ボビスの培養物を得ることと、（Ｂ）少なくとも１回、マイコプラズマ・ボビスの前記培養物をさらに継代し、（Ｃ）前記継代した培養物からクローンを単離し、（Ｄ）担体または賦形剤、および任意にアジュバントとともに、前記クローンを処方する、ステップにより生成される、マイコプラズマ・ボビスのワクチンを提供する。
【００１６】
別の実施形態は、前記継代された培養物から得られた前記クローンがＰＴＡ−１２２１６７よりもさらに弱毒化されている、上記実施形態のワクチンを提供する。
別の実施形態は、マイコプラズマ・ボビスのワクチンを提供する方法であって、前記ワクチンは、（Ａ）ＰＴＡ−１２２１６７として、ＡＴＣＣで寄託されたマイコプラズマ・ボビスの培養物を得ることと、（Ｂ）少なくとも１回、マイコプラズマ・ボビスの前記培養物をさらに継代し、（Ｃ）前記継代した培養物からクローンを単離し、（Ｄ）担体または賦形剤、および任意にアジュバントとともに、前記クローンを処方することを含むステップにより生成される方法を提供する。
【００１７】
別の実施形態は、マイコプラズマ・ボビスの親株を突然変異誘発する方法であって、前記株を化学変異原に供し、その後、インビトロでの連続継代の後に、生存したままの後代の株を選択する方法を提供する。
【００１８】
別の実施形態は、マイコプラズマ・ボビスの親株を突然変異誘発する方法であって、前記親株は、マイコプラズマ・ボビス株３６８３である方法を提供する。
別の実施形態は、マイコプラズマ・ボビスの親株を突然変異誘発する方法であって、前記後代の株は、受け入れ番号ＰＴＡ−１２２１６７でアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関に寄託されている方法を提供する。
【００１９】
別の実施形態は、マイコプラズマ・ボビスの親株を突然変異誘発する方法であって、前記株を化学変異原に供し、その後、インビトロでの連続継代の後に、生存したままの後代の株を選択し、前記後代の株は、マイコプラズマ・ボビス株、Ｈｕｂｅｉ−１のリファレンスゲノムのヌクレオチドナンバリングによる、位置１１５２７３、１９４４７８、１９４４８４、１９４５２５、１９４７２４、２０４９６６、２０７６２９、２６２３２７、２７１４８７、２７１６６１、２７１６６６、２７２０８６、２７２１３３、３０９４６３、３１００７５、３１００７８、３１００８６、３１００９０、３１１９８８、３３４１８４、３５８０１３、３６５１０１、３６５１８８、３９７０１０、３９７９０１  、３９９１２９、４１０２４７、４１０２５３、４１０３３４、４１０５１４、４１０７３３、４１４６６６、４５３３８８、４６８４５７、５０２５７７、５０２６７８、５０２９６３、５４３８５９、５６０９８６、６３２３０９、６３２３６６、６３２６１２、６３３９９４、６８６０７４、６８７８７４、６８７９１５、６９６３４８、７２９８７４、７３００４６、７６１５８７、７６１６６３、７６１８１０、７６１８１５、７６５１７６、７６５３２８、および７６５４０３におけるいずれかのオリジナルヌクレオチドの１つ以上を含む方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、野生型マイコプラズマ・ボビス株３６８３、マイコプラズマ・ボビス温度感受性の突然変異株  ＃２２／３／１２、およびマイコプラズマ・ボビス突然変異株Ｎ２８０５−１の３３℃および３８℃での増殖速度の比較を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、その全体が参照により組み込まれる。
本明細書において他に定義されない限り、本実施形態に関連して使用される科学技術用語は、当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。さらに、文脈によって特に要求されない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。
【００２２】
本明細書で使用される用語「アジュバント」は、薬剤または免疫原性組成物などの他の薬剤の効果を改変する薬理学的または免疫学的薬剤を意味する。アジュバントは、供給された抗原に対するレシピエントの免疫応答を増強するために、免疫原性組成物に含まれることが多い。アジュバントのさらなる説明については以下を参照のこと。
【００２３】
本明細書で使用する「抗体」という用語は、エピトープの認識によって抗原に結合することができる免疫グロブリン分子を意味する。
免疫グロブリンは、「定常」および「可変」領域を有する「軽」および「重」ポリペプチド鎖からなる血清タンパク質であり、定常領域の組成物（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ）によりクラスに分類される。所与の抗原に対して「特異的」である抗体は、抗体の可変領域が特定の抗原のみを認識して結合することを示す。抗体は、ポリクローナル混合物またはモノクローナルであり得る。これらは、天然または組換え源由来のインタクトな免疫グロブリンであり得るか、またはインタクトな免疫グロブリンの免疫反応性部分であり得る。抗体は、Ｆｖ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｃ、ならびに一本鎖を含む様々な形態で存在し得る。抗体は、限定されるものではないが、抗体断片を含む抗原結合タンパク質に変換することができる。本明細書中で使用される場合、交換可能に使用され得る用語「抗原結合タンパク質」、「抗体」などは、抗原結合部位を含むポリペプチド、またはその断片をいう。「抗原結合タンパク質」または「抗体」という用語は、好ましくは、特定のタンパク質およびその断片に結合することができるモノクローナル抗体およびそのフラグメント、ならびにその免疫学的結合等価物を指す。本明細書中で使用される場合、その用語はインタクトなポリクローナルまたはモノクローナル抗体だけでなく、そのフラグメントも包含する。本発明の目的のために、「抗体」および「抗原結合タンパク質」は、他に記載がない限り、抗体フラグメントも含む。例示的な抗体フラグメントには、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆｄ、ｄＡｂ、ダイアボディ、それらの抗原認識フラグメント、小型モジュラー免疫医薬品（ＳＭＩＰ）ナノボディなどが含まれ、全ては、抗原結合タンパク質または抗体断片、ならびに上述の断片およびそれらの化学的または遺伝子操作された対応物のいずれか、ならびに他の抗体断片およびその突然変異株、抗体部分を含む融合タンパク質、および抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の変更された他のいずれかの構成であることが当業者により認識される。抗体および抗原結合タンパク質は、例えば、従来のハイブリドーマ技術（Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９９（１９７５））、組換えＤＮＡ法（米国特許第４，８１６，５６７号）、または抗体ライブラリーを用いるファージディスプレイ技術（Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８（１９９１）；Ｍａｒｋｓら、Ｊ．  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９１））により作成することができる。様々な他の抗体産生技術については、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、ｅｄｓ．  Ｈａｒｌｏｗら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８８、並びに当業者に周知の他の技術を参照されたい。
【００２４】
本明細書で使用される「抗原」は、対象に曝露されると、その抗原に特異的な免疫応答を誘導する１つまたは複数のエピトープ（線状、高次構造またはその両方）を含む分子を意味する。エピトープは、Ｔ細胞受容体または特異的Ｂ細胞抗体に結合する抗原の特異的部位であり、典型的には約３〜約２０個のアミノ酸残基を含む、「抗原」という用語は、そのままの、本質的に死滅した、弱毒化されたまたは不活性化された細菌、ウイルス、真菌、寄生生物または他の微生物と本質的に抗原が関連している生物全体から、個別に分離したサブユニット抗原−抗原ともいう。用語「抗原」はまた、抗イディオタイプ抗体またはそのフラグメントなどの抗体、および抗原または抗原決定因子（エピトープ）を模倣することができる合成ペプチドミモトープをも指す。「抗原」という用語はまた、ＤＮＡ免疫化用途のように、インビボで抗原または抗原決定基を発現するオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをも指す。本明細書で使用する「抗原」は、抗体または抗原と結合するタンパク質によって特異的に結合することができる分子または分子の一部分である。特に、抗体または抗原結合タンパク質は、抗原のエピトープに結合するであろう。本明細書で使用するエピトープは、抗体または抗原結合タンパク質の可変領域の超可変領域または相補性決定領域（ＣＤＲ）によって認識される抗原決定基を指す。
【００２５】
本明細書で使用される「動物」という用語は、マイコプラズマ・ボビス（家畜および野生の両方）による感染症の影響を受けやすい任意の動物を意味する。好ましくは、本明細書で使用される「動物」はウシを指す。
【００２６】
本明細書で使用される用語「弱毒化された」は病原性が低減されているため一般に免疫応答を開始するが疾病を引き起こさない微生物の株を指す。弱毒化された株は、それが由来する親株より毒性が低い。弱毒化された微生物をインビトロまたはインビボでスクリーニングして、それらがその親株より病原性が低いことを確認することができる。
【００２７】
従来の手段は、インビトロでの継代および化学変異誘発のような弱毒化突然変異を誘導するために使用される。代替の弱毒化手段は、部位特異的突然変異誘発を用いて所定の突然変異を作製することを含み、１つ以上の突然変異が導入され得る。本明細書で使用する「より弱毒化された」という用語は、それが由来する弱毒化された株を超えてさらに改変された株を指す。このさらなる弱毒化は、さらなるインビトロでの継代、または追加のラウンドの化学的もしくは部位特異的変異誘発によって達成することができる。生ワクチンとして有用であるために、あらゆる弱毒化された生物は、それにもかかわらず、生物のいくらかの増殖を必要とする、有効な免疫応答を開始するために、宿主免疫系を生じさせなければならない。
【００２８】
本明細書で使用する「細菌」、「細菌種」、「細菌」などの用語は、原核微生物の大きなドメインを意味する。
本明細書で使用される「ウシ」という用語は、一般に蹄鉄を有する中〜大規模な有蹄動物の多様な群を意味し、少なくとも１つの性が真の角を有するものを意味する。ウシには、家畜、バイソン、アフリカの水牛、水牛、ヤク、４角型または螺旋状の角虫が含まれるが、これらに限定されない。
【００２９】
本明細書中で使用される用語「化学変異誘発」は、自然のバックグラウンドレベルより上に生じるいくつかのタイプの突然変異の頻度を増加させる化合物の使用を意味する。使用される化合物はそれらの有効性で異なり、その理由は、それらが細胞に入る能力、核酸との反応性の程度、それらの一般的な毒性、および核酸内に導入される化学変化のタイプが内因性修復システムによって矯正される見込みで異なり得るためである。
【００３０】
本明細書で使用される用語「免疫原性組成物」または「免疫化量」は、単独で投与された場合に有効な免疫応答を生成する（すなわち、有効なおよび／または少なくとも部分的な保護免疫原性の活性を有する）組成物、または薬学的に許容される担体と共に、動物に投与することを意味する。免疫応答は、主として細胞傷害性Ｔ細胞によって媒介される細胞性免疫応答、または主にヘルパーＴ細胞によって媒介される体液性免疫応答であり得、抗体産生を導くＢ細胞を活性化する。さらに、免疫化された宿主の将来の保護を可能にするために、特異的なＴリンパ球または抗体を作製することができる。
【００３１】
本明細書で使用される用語「単離する」は、参照された材料が、それが通常見出される環境の成分のいくつかから除去されることを意味する。したがって、分離可能な生物学的材料は、いくつかの細胞成分、すなわち、その材料が見い出されまたは産生された細胞の成分がなくてもよい。核酸分子の場合、単離された核酸は、例えば、ＰＣＲ産物、単離されたｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、または制限断片を含む。別の実施形態では、単離された核酸は、好ましくは、それが見出され得る染色体から切り出され、より好ましくは、分子が染色体で発見されると、非調節性、非コード領域、または核酸分子の上流または下流に位置する他の遺伝子に対してもはや結合しない。さらに別の実施形態では、単離された核酸は１つ以上のイントロンを欠いている。単離された核酸分子は、プラスミド、コスミド、人工染色体などに挿入された配列を含む。したがって、特定の実施形態において、組換え核酸は、単離された核酸である。単離されたタンパク質は、細胞内で会合する他のタンパク質または核酸、またはその両方と会合することができ、または膜関連タンパク質であれば細胞膜と会合することができる。単離されたオルガネラ、細胞、または組織は、生物内に存在する解剖学的部位から除去される。単離された物質は精製されていてもよいが、精製されていなくてもよい。「単離された」または「精製された」ポリペプチドまたはポリヌクレオチド、例えば「単離されたポリペプチド」または「単離されたポリヌクレオチド」は、それが天然で存在する状態を超える状態に精製される。例えば、「単離された」または「精製された」ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、タンパク質またはポリヌクレオチドが由来する細胞または組織源由来の細胞物質または他の混入タンパク質を実質的に含まなくてもよく、または、化学合成時に化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まなくてもよい。約５０％未満の非抗原結合タンパク質（本明細書では「混入タンパク質」とも呼ばれる）または化学前駆体を有する抗原結合タンパク質の調製物は、「実質的に含まない」と考えられる。非抗原結合タンパク質または化学前駆体の４０％、３０％、２０％、１０％およびより好ましくは５％（乾燥重量で）が実質的に含まないと考えられる。
【００３２】
本明細書で使用される「薬物」という用語は、感染症、傷害または病気からの回復を促進する薬剤、薬を意味する。
本明細書で使用される「突然変異体」という用語は、生物の核酸または染色体内の塩基対配列の変化である突然変異の実例から生じたまたは突然変異した結果の個体または生物であって、野生型の個体または生物には見られない新しい性質または形質の創造をもたらす個体または生物を意味する。
【００３３】
本明細書で使用する「親」または「親株」という用語は、子孫または後代が由来する実体を意味する。本明細書で使用する「後代」という用語は、１つまたは複数の親または親株によって産生されるか、またはそれに由来するものを意味する。
【００３４】
本明細書において、「予防する」、「予防すること」または「予防」などの用語は、微生物の複製を阻害すること、微生物の伝染を阻害すること、または微生物がその宿主に定着するのを阻害することを意味する。これらの用語などは、感染症の１つ以上の徴候または症状を阻害またはブロックすることを意味することもできる。
【００３５】
本明細書中で使用される場合、用語「リバースエンジニア」または「逆突然変異誘発する」は、微生物のゲノムの特定の位置に存在するオリジナルヌクレオチド配列であって、その配列が前もって変更されている配列を遺伝的手段（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応またはＰＣＲ）によって再導入することを意味する。
【００３６】
本明細書で使用する「連続継代」または「連続継代」という用語は、クローン的に純粋な集団を得るために生物、好ましくは微生物を精製する方法を意味する。これらの用語は、生物、好ましくは微生物の病原性を弱毒化するまたは弱めるための技術を指すこともできる。
【００３７】
本明細書中で使用される場合、用語「治療上有効な量」（または「有効な量」）は、状況に応じて、アジュバントを伴うまたは伴わない活性成分、例えば本発明による薬剤の量を意味し、対象または患者に投与した場合に有益なまたは望ましい結果をもたらすのに十分な、単回または複数回の投与量で提供される。有効量は、１回以上の投薬、適用または投与で投与することができる。本発明による組成物の治療的に有効な量は、当業者によって容易に決定され得、同様の病原体によるその後のチャレンジから動物を保護するような、患者に測定可能な利益を提供する。
【００３８】
本明細書で使用される場合、用語「治療的」または「治療」は、疾病または疾患の治療の全範囲を包含する。例として、本発明の「治療的」薬剤は、ある方法で作用し得るか、または治療は、予防的または予防的な効果をもたらし得るが、リスク（薬理遺伝学）を有すると同定され得る標的動物へと設計される手順、本質的な改善的または治癒的な様式を含み、または治療されている疾病または疾患の症状の少なくとも１つの進行の速度もしくは程度を遅らせるように作用することを含む。
【００３９】
本明細書で使用される「獣医学的に許容される担体」という用語は、健全な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応などなしに、動物の組織と接触して使用するのに適した物質を指し、合理的な便益対リスク比に相応しく、意図された使用について有効である。
【００４０】
以下の説明は、本発明を実施する際の当業者を助けるために提供される。  それでも、本発明の発見の精神または範囲から逸脱することなく、本明細書で論じられた実施形態の改変および変形が当業者によってなされ得るため、この説明は本発明を不当に限定すると解釈されるべきではない。
細菌；免疫原性組成物
本発明の特定の実施形態において、ウシ由来のマイコプラズマ・ボビス株は、弱毒化されただけでなく、特徴付けられている。当該マイコプラズマ・ボビス株の単離物は、２０１５年５月１２日に米国バージニア州マナサスのアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）で寄託され、受付番号、ＰＴＡ−１２２１６７が付与された。
【００４１】
本発明の免疫原性組成物は免疫原性組成物に使用する前に弱毒化されていても、不活性化されていてもよい。弱毒化および不活性化の方法は、当業者に周知である。弱毒化のための方法としては、細胞培養における連続継代、紫外線照射、および化学変異誘発が挙げられるが、これらに限定されない。多数の化学変異原がＤＮＡと直接相互作用することとしてもよい。しかしながら、芳香族アミンやベンゼンのような多くの化学物質は必ずしもそれ自体で突然変異誘発性である必要はなく、細胞の代謝過程を経て変異原性化合物を産生する。化学変異原は、反応性酸素種（ＲＯＳ）も含むこともできる。これらは、スーパーオキシド、ヒドロキシルラジカルおよび過酸化水素を含み得る。多数のこれらの高度な反応性の種は、通常の細胞プロセス、例えばミトコンドリア電子輸送の副産物または脂質過酸化として生成される。多くの他の化学変異原がこれらのＲＯＳを生成することもある。これらのＲＯＳは、種々の塩基付加物ならびにＤＮＡ鎖切断および架橋の生成をもたらし得る。化学変異原はまた、脱アミノ剤、例えば亜硝酸を含むことができ、シトシンをウラシルに変換することによって塩基転位型突然変異を生じさせることができる。多環式芳香族炭化水素（ＰＡＨ）もまた化学変異原である。活性化されると、ＤＮＡに結合して付加物を形成することができる。化学変異原はまた、エチルニトロソウレアのようなアルキル化剤を含むことができる。これらの化合物は、メチル基またはエチル基を塩基またはリン酸基骨格に転移させる。グアニンは、アルキル化された場合、チミンと誤対合する可能性がある。これらのアルキル化剤のいくつかは、ＤＮＡ架橋および破損を引き起こし得る。ニトロソアミンは、タバコに見られるような突然変異原の重要なグループである。メチルニトロニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ、ＭＮＧ、またはＮＴＧ）は、グアニンのＯ６およびチミンのＯ４にアルキル基を付加することによって作用するアルキル化剤であり、ＧＣとＡＴとの間の塩基転位型突然変異を引き起こし得る。これらの変化は、ＤＮＡの二重らせんに大きなひずみを生じさせず、したがって、ＤＮＡミスマッチ修復システムによって検出することは困難である。他のアルキル化剤は、マスタードガスおよび塩化ビニルを含むこともできる。
【００４２】
不活性化のための方法としては、ホルマリン、ベータプロピオラクトン（ＢＰＬ）またはバイナリーエチレンイミン（ＢＥＩ）による治療、または当業者に公知の他の方法が挙げられるが、これらに限定されない。ホルマリンによる不活性化は、細菌懸濁液を３７％ホルムアルデヒドと混合して最終ホルムアルデヒド濃度を０．０５％にすることによって行うことができる。細菌−ホルムアルデヒド混合物を室温で約２４時間絶えず攪拌する。次いで、不活化された細菌混合物を、培養培地中の増殖をアッセイすることによって残留生菌について試験する。ＢＥＩによる不活性化は、細菌懸濁液を０．１Ｍ  ＢＥＩ（０．１７５Ｎ  ＮａＯＨ中の２−ブロモ−エチルアミン）と混合し、１ｍＭの最終ＢＥＩ濃度にすることによって行うことができる。細菌−ＢＥＩ混合物を室温で約４８時間絶え間なく攪拌し、続いて０．１Ｍのチオ硫酸ナトリウムを０．１ｍＭの最終濃度まで添加する。混合をさらに２時間続ける。不活性化された細菌混合物を、培養培地中の増殖についてアッセイすることによって、残留生菌について試験する。
【００４３】
本発明の有効な（すなわち保護する）免疫原性組成物は、任意のおよび全ての溶媒、分散媒、コーティング、アジュバント、安定化剤、希釈剤、防腐剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤、吸着遅延剤などの１つ以上の獣医学的に許容される担体を含むことができる。希釈剤は、水、生理食塩水、デキストロース、エタノール、グリセロールなどを含むことができる。
【００４４】
等張剤には、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、およびラクトースが含まれ、当業者に公知である。安定剤としては、アルブミンが挙げられ、とりわけ当業者に知られている。防腐剤には、当業者に公知の他のものの中でもメルチオレート（ｍｅｒｔｈｉｏｌａｔｅ）が含まれる。
【００４５】
本発明の有効な免疫原性組成物は、１つ以上のアジュバントを含むことができる。アジュバントには、ＲＩＢＩアジュバントシステム（Ｒｉｂｉ  Ｉｎｃ．、ハミルトン、ＭＴ）、ミョウバン、水酸化アルミニウムゲル、フロイント完全型および不完全アジュバントのような、水中油型エマルション、油中水型エマルション、などの油中水型エマルジョン、ブロック共重合体（ＣｙｔＲｘ；  Ａｔｌａｎｔａ、ＧＡ）、ＳＡＦ−Ｍ（Ｃｈｉｒｏｎ、Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、ＣＡ）、ＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）アジュバント、サポニン、Ｑｕｉｌ  Ａ、ＱＳ−２１（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．；  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，  ＭＡ）、ＧＰＩ−０１００（Ｇａｌｅｎｉｃａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｉｎｃ．、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ）または他のサポニン画分、モノホスホリルリピドＡ、アビジン脂質  −  アミンアジュバント、大腸菌（組換えまたは他のもの）からの熱不安定性エンテロトキシン、コレラ毒素またはムラミルジペプチド、当業者に知られている他の多くのものが含まれるが、これらに限定されない。
【００４６】
本発明の文脈において有用なアジュバントおよび添加剤の量および濃度は、当業者によって容易に決定することができ、そのような各物質の適切な量は一般に知られているか、または容易に決定することができる。一実施形態において、本発明は、約５０μｇ〜約２０００μｇのアジュバントを含む免疫原性組成物を意図する。別の実施形態において、アジュバントは、約１００μｇ〜約１５００μｇ、または約２５０μｇ〜約１０００μｇ、または約３５０μｇ〜約７５０μｇの量で含まれる。別の実施形態では、アジュバントは、免疫原性組成物の投薬量約５００μｇ／２ｍｌの量で含まれる。一般に、本発明のワクチンは、１〜２ＭＬの投与量として提供される。
【００４７】
いくつかのサイトカインまたはリンホカインの数は、免疫調節活性を有することが示されており、従って、アジュバントとして使用することができ、インターロイキン１−α、１−β、２、４、５、６、７、８、１０、１２（例えば、米国特許第５，７２３，１２７号参照）、１３、１４、１５、１６、１７および１８（および突然変異株形態）、インターフェロン−α、βおよびγ、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（例えば、米国特許第５，０７８，９９６号およびＡＴＣＣ受託番号３９９００参照）、マクロファージコロニー刺激因子、顆粒球コロニー刺激因子、ＧＳＦ、および腫瘍壊死因子αおよびβを含むが、これらに限定されるものではない。本発明において有用なさらに他のアジュバントには、限定されないが、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１βおよびＲＡＮＴＥＳを含むケモカインが含まれる。セレクチン、例えばＬ−セレクチン、Ｐ−セレクチンおよびＥ−セレクチンのような接着分子もまた、アジュバントとして有用であり得る。さらに他の有用なアジュバントには、ＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ−１、およびＭａｄＣＡＭ−１のようなムチン様分子、ＬＦＡ−１、ＶＬＡ−１、Ｍａｃ−１およびｐ１５０．９５のようなインテグリンファミリーのメンバー、ＰＥＣＡＭ、ＩＣＡＭ、例えば、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２およびＩＣＡＭ−３、ＣＤ２およびＬＦＡ−３のような免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバー、ＣＤ４０およびＣＤ４０Ｌなどの共刺激分子、血管成長因子、神経成長因子、線維芽細胞増殖因子、表皮成長因子、Ｂ７．２、ＰＤＧＦ、ＢＬ−１、および血管内皮増殖因子を含む成長因子、Ｆａｓ、ＴＮＦ受容体、Ｆｉｔ、Ａｐｏ−１、ｐ５５、ＷＳＬ−１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ−３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２およびＤＲ６を含む受容体分子を含むが、これらに限定されない。さらにもう一つのアジュバント分子には、カスパーゼ（ＩＣＥ）を含む。参照により本明細書に援用される、国際特許出願公開ＷＯ９８／１７７９９およびＷＯ９９／４３８３９も参照されたい。
【００４８】
免疫応答を増強するために使用される適切なアジュバントには、限定されることなく、ＭＰＬ（商標）（３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡ；  Ｃｏｒｉｘａ、モンタナ州ハミルトン）が含まれ、これは、参照により本明細書に援用される、米国特許第４，９１２，０９４号に記載される。アジュバントとしての使用にも適しているのは、Ｃｏｒｉｘａ（モンタナ州ハミルトン）から入手可能であり、かつ、参照により本明細書に援用される、米国特許第６，１１３，９１８号に記載されている、合成脂質Ａ類似体またはアミノアルキルグルコシドホスフェート化合物（ＡＧＰ）、またはその誘導体または類似体である。そのようなＡＧＰの１つは２−［（Ｒ）−３−テトラデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］エチル２−デオキシ−４−Ｏ−ホスホノ−３−Ｏ−［（Ｒ）−３−テトラデカノオキシテトラデカノイル］−２−［（Ｒ）−３−テトラデカノイルオキシテトラデカノイル−アミノ］−ｂ−Ｄ−グルコピラノシドであり、５２９（以前はＲＣ５２９として知られている）としても知られている。この５２９アジュバントは、水性形態または安定したエマルジョンとして処方される。
【００４９】
さらに他のアジュバントは、鉱油および水エマルション、アルミニウム塩（ミョウバン）、例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムなど、アンフィゲン（Ａｍｐｈｉｇｅｎ）、アブリジン、Ｌ１２１／スクアレン、Ｄ−ラクチド−ポリラクチド／グリコシド、プルロニックポリオール、ムラミルジペプチド、死滅したボルデテラ、サポニン、例えば、米国特許第５，０５７，５４０号（参照により本明細書中に援用される）に記載されているＳｔｉｍｕｌｏｎ（商標）ＱＳ−２１（Ａｎｔｉｇｅｎｉｃｓ、Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ、ＭＡ）、およびこれらから生成される粒子、例えば、ＩＳＣＯＭＳ（免疫刺激複合体）、マイコバクテリウム・ツベルクローシス、細菌リポ多糖類、ＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチド（参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，２０７，６４６号）のような合成ポリヌクレオチド、百日咳毒素（ＰＴ）、または大腸菌の熱不安定性毒素（ＬＴ）、特に、ＬＴ−Ｋ６３、ＬＴ−Ｒ７２、ＰＴ−Ｋ９／Ｇ１２９を含む。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、国際特許公開公報ＷＯ９３／１３３０２およびＷＯ９２／１９２６５を参照されたい。
【００５０】
アジュバントとして有用であるものは、公開された国際特許出願番号ＷＯ００／１８４３４（アミノ酸の２９位のグルタミン酸がアスパラギン酸以外の他のアミノ酸、好ましくはヒスチジンで置換されているもの）に記載されているものを含むコレラ毒素（ＣＴ）および突然変異株である。類似のＣＴ毒素または突然変異株は、公開された国際特許出願番号ＷＯ  ０２／０９８３６８（アミノ酸１６位のイソロイシンが単独で、またはアミノ酸６８位のセリンの別のアミノ酸による置換と組み合わせて、別のアミノ酸で置換されている、および／またはアミノ酸の７２位のバリンが別のアミノ酸で置換されている）に記載されている。他のＣＴ毒素は、公開された国際特許出願ＷＯ０２／０９８３６９（アミノ酸の２５位のアルギニンが別のアミノ酸で置換されている；および／またはアミノ酸がアミノ酸４９位に挿入されている；および／または２つのアミノ酸がアミノ酸位置３５および３６に挿入されている）。に記載されている。前記ＣＴ毒素または突然変異株は、別個の実体として、または本発明の神経毒性ペプチドの融合パートナーとして免疫原性組成物に含まれ得る。
【００５１】
本発明の免疫原性組成物は、界面活性物質も含むことができる。適切な界面活性物質には、限定されることなく、キノン類似体、ヘキサデシルアミン、オクタデシルアミン、オクタデシルアミノ酸エステル、リゾレシチン、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド、メトキシヘキサデシルグリセロールおよびプルロニックポリオール、ポリアミン、例えばピラン、デキストラン硫酸、ポリＩＣ、カルボポール；  ペプチド、例えば、ムラミルペプチドおよびジペプチド、ジメチルグリシン、タフトシン；  オイルエマルジョン；リン酸アルミニウム等の鉱物ゲル、および免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）が挙げられる。
【００５２】
前述のアジュバントおよびさらなる物質はすべて、当業者が容易に決定することができる量で使用することができる。
本発明の免疫原性組成物は、抗生物質を含むこともできる。そのような抗生物質には、アミノグリコシド、カルバペネム、セファロスポリン、グリコペプチド、マクロライド、ペニシリン、ポリペプチド、キノロン、スルホンアミドおよびテトラサイクリンのクラスのものが含まれるが、これらに限定されない。一実施形態では、本発明は、約１ｐｇ／ｍｌ〜約６０ｐｇ／ｍｌの抗生物質を含む免疫原性組成物が考慮される。別の実施形態において、免疫原性組成物は、約５ｐｇ／ｍｌ〜約５５ｐｇ／ｍｌの抗生物質、または約１０ｐｇ／ｍｌ〜約５０ｐｇ／ｍｌの抗生物質、または約１５ｐｇ／ｍｌ〜約４５ｐｇ／ｍｌの抗生物質、または約２０ｐｇ／ｍｌ〜約４０ｐｇ／ｍｌの抗生物質、または約２５ｐｇ／ｍｌ〜約３５ｐｇ／ｍｌの抗生物質を含む。さらに別の実施形態において、免疫原性組成物は、約３０ｐｇ／ｍｌ未満の抗生物質を含む。
【００５３】
防腐剤、安定化成分などを含む、本発明の免疫原性組成物には他の添加物を含めることもできる。適切な例示的な防腐剤としては、クロロブタノール、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、二酸化硫黄、没食子酸プロピル、パラベン、エチルバニリン、グリセリン、フェノールおよびパラクロロフェノールが挙げられる。使用することができる適切な安定化成分には、例えば、カザミノ酸、スクロース、ゼラチン、フェノールレッド、Ｎ−Ｚアミン、モノリン酸二カリウム、ラクトース、ラクトアルブミン加水分解物、および乾燥ミルクが含まれる。免疫原性組成物は、免疫原性組成物として使用するためにリポソームに組み込むこともでき、組成物の選択された投与様式に適した他の添加物を含有することもできる。組成物は、粉末、液体または懸濁剤の剤形を開発するための他の薬学的に許容される活性剤を含むことができる。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，  Ｖｏｌ．  ２，  １９ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ  （１９９５），  例えば、Ｃｈａｐｔｅｒ  ９５  Ａｅｒｏｓｏｌ；および国際特許出願公開ＷＯ９９／４５９６６に記載されており、その教示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００５４】
本発明の免疫原性組成物は、他の抗原を含むことができる。抗原は、微生物の不活性化された全部または部分的な調製物の形態、または組換え技術または化学合成によって得られる抗原分子の形態であり得る。本発明に従って使用するのに適切な他の抗原としては、限定されるものではないが、病原性細菌由来のもの、例えば、ヘモフィルス・ソムヌス、ヘモフィルス・パラスイス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｐａｒａｓｕｉｓ）、気管支敗血症菌、炭疽菌、アクチノバチルス・プルロニューモニア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉｅ）、パスツレラ・ムルトシダ、マンヘミア・ヘモリチカ（Ｍａｎｎｈｅｍｉａ  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ）、マイコプラズマ・ボビス、マイコバクテリウム・ボビス、マイコバクテリウム・ヨーネ菌、クロストリジウム属、ストレプトコッカス・ウベリス、黄色ブドウ球菌、ブタ丹毒菌（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｈｕｓｏｐａｔｈｉａｅ）、クラミジア属、ブルセラ属、ビブリオ属、チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｅｒｏｖａｒｓ）およびレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）属を含む。また、抗原は、カンジダのような病原真菌、クリプトスポリジウム・パルブムのような原虫、ネオスポラ・カニュウム、トキソプラズマ・ゴンディ、エイメリア属、バベシア属、ジアルジア属、または、蠕虫、例えば、オステルタギア属、クーペリア属、ヘモンクス属、およびファスキオラ属由来である。追加の抗原は、病原ウイルス、例えば、ウシコロナウイルス、ウシロタウイルス、ウシヘルペスウイルス、ウシパラインフルエンザウイルス、ウシウイルス性下痢ウイルス、ウシアデノウイルス、ウシライノウイルス、ウシレオウイルス、ウシ呼吸器合胞体ウイルス、ウシ白血病ウイルス、牛疫ウイルス、口蹄疫ウイルスおよび狂犬病ウイルスを含み得る。
【００５５】
形態、投薬量、経路、および投与時期
本発明の免疫原性組成物は、マイコプラズマ・ボビスに対して有効な免疫応答を誘導するために動物に投与することができる。したがって、本発明は、本明細書に記載の本発明の免疫原性組成物の治療有効量を動物に投与することにより、マイコプラズマ・ボビスに対する有効な免疫応答を刺激する方法を提供する。
【００５６】
本発明の免疫原性組成物は、投与の経路に応じて様々な形態で作製することができる。例えば、免疫原性組成物は、注射可能な使用に適した滅菌水性溶液または分散液の形態で作製することができ、または凍結乾燥技術を用いて凍結乾燥形態で作製することができる。凍結乾燥された免疫原性組成物は、典型的には約４℃で維持され、アジュバントを含むまたは含まない安定化溶液、例えば生理食塩水またはＨＥＰＥＳ中で再構成することができる。免疫原性組成物は、懸濁液または乳濁液の形態で製造することもできる。
【００５７】
これらの免疫原性組成物は、任意の従来の投与経路を介して投与に適した添加物を含有することができる。本発明の免疫原性物は、例えば、液体、粉末、エアゾール、錠剤、カプセル、腸溶性錠剤またはカプセルまたは坐剤の形態で、被験者に投与するために調製することができる。したがって、免疫原性組成物は、懸濁液、溶液、油性または水性ビヒクル中のエマルジョン、ペースト、および移植可能な徐放性または生分解性の処方も含むことができるが、これらに限定されない。非経口投与のための処方の一実施形態では、有効成分は、再構成された組成物の非経口投与の前に適切なビヒクル（例えば、滅菌パイロジェンフリー水）で再構成するための乾燥（すなわち、粉末または顆粒）形態で提供される。他の有用な非経口投与可能な処方には、微結晶形態での、リポソーム製剤での、生分解性ポリマー系の成分として、活性成分を含むものが含まれる。持続放出または移植のための組成物は、エマルジョン、イオン交換樹脂、難溶性ポリマーまたは難溶性塩のような薬学的に許容されるポリマーまたは疎水性材料を含み得る。
【００５８】
本発明の免疫原性組成物は、治療有効量のマイコプラズマ・ボビスを含む。精製された細菌は、免疫原性組成物に直接使用することができ、さらに弱毒化されたものであっても不活化されたものであってもよい。典型的には、有効な免疫原性組成物は、約１×１０２〜約１×１０１２個の細菌粒子、または約１×１０３〜約１×１０１１個の細菌粒子、または約１×１０４〜約１×１０１０個の細菌粒子、または約１×１０５〜約１×１０９個の細菌粒子、または好ましくは約１×１０６〜約１×１０８個の細菌粒子を含む。防御効果を提供するための免疫原性組成物中の細菌の正確な量は、当業者によって決定され得る。
【００５９】
有効な免疫原性組成物は、一般に、約０．５ｍｌ〜約５ｍｌの容量の獣医学的に許容される担体を含む。別の実施形態において、担体の容量は、約１ｍｌ〜約４ｍｌ、または約２ｍｌ〜約３ｍｌである。別の実施形態では、担体の体積は約１ｍｌ、または約２ｍｌ、または約５ｍｌである。免疫原性組成物中での使用に適した獣医学的に許容される担体は、本明細書に記載されるもののいずれかであり得る。
【００６０】
このような担体には、水、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、リン酸緩衝液、アルコール／水溶液、乳濁液または懸濁液が含まれるが、これらに限定されない。他の慣用的に使用される希釈剤、アジュバントおよび促進剤は、従来の技術に従って添加することができる。このような担体は、エタノール、ポリオール、およびそれらの適切な混合物、植物油、および注入可能な有機エステルを含むことができる。緩衝剤およびｐＨ調整剤を使用することもできる。緩衝剤としては、限定されないが、有機酸または塩基から調製された塩が挙げられる。代表的な緩衝剤には、有機酸塩、例えば、クエン酸の塩、例えば、クエン酸塩、アスコルビン酸、グルコン酸、ヒスチジン−Ｈｅｌ、炭酸、酒石酸、コハク酸、酢酸、フタル酸、トリス、トリメタンミン（ｔｒｉｍｅｔｈａｎｍｉｎｅ）塩酸塩、またはリン酸塩緩衝液を含むが、これらに限定されない。非経口担体は、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロース、トレハロース、スクロース、乳酸リンゲル液、または固定油を含み得る。静脈内担体は、液体および栄養補充剤、リンガーデキストロースなどに基づくものなどの電解質補充剤を含むことができる。
【００６１】
例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）、不活性ガスなどのような防腐剤および他の添加剤もまた、薬学的担体で提供されることとしてもよい。本発明は、担体の選択に限定されない。適切なｐＨ、等張性、安定性および他の従来の特性を有する、上記の成分からのこれらの薬学的に許容される組成物の調製は、当業者の範囲内である。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，  ２０ｔｈ  ｅｄ．，  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，  ｐｕｂ．，  ２０００；およびＴｈｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，  ４．ｓｕｐ．ｔｈ  ｅｄｉｔ．，  ｅｄｓ．  Ｒ．  Ｃ．  Ｒｏｗｅ  ｅｔ  ａｌ，  ＡＰｈＡ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  ２００３のようなテキストを参照されたい。
【００６２】
当業者であれば、投与前に細菌を弱毒化させる、または、不活性化させる必要があるのかを容易に判定することができる。本発明の別の実施形態では、マイコプラズマ・ボビスは、さらなる減弱化なしに動物に直接投与することができる。治療的に有効な細菌の量は、使用される特定の細菌、動物の状態および／または感染症の程度に依存して変わり得、そして当業者によって決定され得る。
【００６３】
本発明の方法によれば、単回投与量を動物に投与することができ、あるいは、２回以上の接種を約２〜約１０週間の間隔で行うことができる。ブースティング・レジメンが要求され、最適な免疫化を提供するために投与計画を調整することができる。当業者は、最適な投与計画を容易に決定することができる。２つ以上の投与量が使用される場合、必ずしも第１および第２の投与量を動物の同じ場所に投与する必要はない。
【００６４】
有効な免疫原性組成物は、血流、筋肉、または内臓に直接投与することができる。非経口投与の適切な手段は、静脈内、動脈内、腹腔内、髄腔内、脳室内、尿道内、胸骨内、頭蓋内、筋肉内および皮下を含む。非経口投与に適したデバイスには、針（マイクロニードルを含む）インジェクタ、無針インジェクタおよび注入技術が含まれる。
【００６５】
非経口製剤は、典型的には、塩、炭水化物および緩衝剤（好ましくは、約３〜約９、または約４〜約８、または約５〜約７．５のｐＨ、または約６〜約７．５、または約７〜約７．５）のような賦形剤を含み得る水溶液であるが、いくつかの用途では、それらは、滅菌非水性溶液として、または滅菌したパイロジェンフリーの水のような適切なビヒクルと共に使用される乾燥形態として、より適切に処方され得る。無菌条件下、例えば凍結乾燥による非経口処方の調製は、当業者に周知の標準的な製薬技術を用いて容易に達成することができる。
【００６６】
非経口溶液の調製に使用される化合物の溶解性は、緩衝液、塩、界面活性剤、リポソーム、シクロデキストリン等を含む溶解性増強剤の組み込みのような当業者に公知の適切な処方技術の使用によって増加させることができる。
【００６７】
非経口投与のための処方は、即時および／または変更放出となるように処方され得る。変更放出処方には、遅延、持続、パルス、制御、標的放出およびプログラム放出が含まれる。このように、本発明の化合物は、活性化合物の変更放出を提供する、移植されたデポーとして、投与のための固体、半固体またはチキソトロープ液体として処方することができる。そのような処方の例としては、薬物被覆ステントおよびポリ（／／−乳酸−コグリコール）酸（ＰＬＧＡ）マイクロスフェアが挙げられる。
【００６８】
本発明の有効な免疫原性組成物は、皮膚または粘膜に局所的に、すなわち真皮または経皮的に投与することもできる。この目的のための典型的な処方には、ジェル、ヒドロゲル、ローション、溶液、クリーム、軟膏、粉剤、包帯、フォーム、フィルム、皮膚パッチ、ウエハー、インプラント、スポンジ、繊維、包帯およびマイクロエマルションが含まれ、また、リポソームも使用することができる。典型的な担体には、アルコール、水、鉱物油、流動パラフィン、白色ワセリン、グリセリン、ポリエチレングリコールおよびプロピレングリコールが含まれる。浸透増強剤を組み込むことができる。  例えば、Ｆｉｎｎｉｎ  ａｎｄ  Ｍｏｒｇａｎ，  Ｊ．  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ，  ８８  （１０）：９５５−９５８  （１９９９）を参照されたい。局所投与のための他の手段には、エレクトロポレーション、イオントフォレシス、フォノフォレシス、ソノフォレシスおよびマイクロニードルまたはニードルフリー（例えば、Ｐｏｗｄｅｒｊｅｃｔ（商標）、Ｂｉｏｊｅｃｔ（商標）など）注入による送達が挙げられる。局所投与のための処方は、即時および／または変更放出となるように設計することができる。変更放出処方には、遅延、持続、パルス、制御、標的放出およびプログラム放出が含まれる。
【００６９】
また、有効な免疫原性組成物は典型的には、乾燥粉末（単独で、または混合物として、例えば、ラクトースとの乾燥ブレンドにおいて、または混合成分粒子として、例えば、ホスファチジルコリンなどのリン脂質と混合したもの）の形態で、乾燥粉末吸入器から、または、細かいミストを産生するための加圧容器、ポンプ、スプレー、噴霧器（好ましくは電気流体力学を使用する噴霧器）からのエアゾルスプレーとして、鼻腔内にまたは吸入により投与することができる。また、１，１，１，２−テトラフルオロエタンまたは１，１，１，２，３，３，３−ヘプタフルオロプロパンのような適切な噴射剤の使用の有無にかかわらず、ネブライザーを介して投与することができる。鼻腔内使用のために、粉末は、生体接着剤、例えばキトサンまたはシクロデキストリンを含むことができる。加圧容器、ポンプ、スプレー、アトマイザー、またはネブライザーは、例えば、エタノール、水性エタノール、または活性剤、溶媒としての噴射剤、および場合によりトリオレイン酸ソルビタン、オレイン酸、またはオリゴ乳酸などの界面活性剤の放出を分散、可溶化または延長するための適切な代替薬剤を含む本発明の化合物の溶液または懸濁液を含有する。
【００７０】
乾燥粉末または懸濁処方での使用に先立って、製剤は一般に、吸入による送達に適したサイズ（典型的には約５ミクロン未満）に微粉化される。これは、螺旋ジェットミル、流動床ジェットミル、超臨界流体処理（ナノ粒子を形成する）、高圧均質化、または噴霧乾燥などの任意の適切な粉砕方法によって達成することができる。
【００７１】
吸入器または注入器で使用するためのカプセル（例えば、ゼラチンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース製）、ブリスター、およびカートリッジは、本発明の化合物の粉末混合物を含むように処方することができる。適切な粉末基剤は、ラクトースまたはデンプンであり得、性能改変剤は、ｌ−ロイシン、マンニトール、またはステアリン酸マグネシウムであり得る。ラクトースは、無水物であってもよく、または一水和物の形態であってもよい。  他の適切な賦形剤には、デキストラン、グルコース、マルトース、ソルビトール、キシリトール、フルクトース、スクロースおよびトレハロースが含まれる。
【００７２】
微細なミストを生成するために電気流体力学を使用するアトマイザーでの使用のための適切な溶液処方は、作動当たり本発明の化合物約１μｇ〜約２０ｍｇを含み、作動体積は約１μｌ〜約１００μｌの範囲で変化させることができる。別の実施形態において、作動１回当たりの化合物の量は、約１００μｇ〜約１５ｍｇ、または約５００μｇ〜約１０ｍｇ、または約１ｍｇ〜約１０ｍｇ、または約２．５μｇ〜約５ｍｇの範囲である。別の実施形態において、作動体積は、約５μｌ〜約７５μｌ、または約１０μｌ〜約５０μｌ、または約１５μｌ〜約２５μｌの範囲であり得る。典型的な処方は、本発明の化合物、プロピレングリコール、滅菌水、エタノールおよび塩化ナトリウムを含むことができる。プロピレングリコールの代わりに使用することができる別の溶媒としては、グリセロールおよびポリエチレングリコールが挙げられる。
【００７３】
吸入／鼻腔内投与のための処方は、例えばＰＬＧＡを用いて即時および／または変更放出となるように処方され得る。変更放出処方には、遅延、持続、パルス、制御、標的放出およびプログラム放出が含まれる。
【００７４】
乾燥粉末吸入器およびエアゾルの場合、投薬単位は、一般に、計量された量を送達するバルブによって決定される。本発明による単位は、典型的には、約１０ｎｇ〜約１００μｇの本発明の化合物を含有する計量投与量または「パフ」を投与するように構成される。別の実施形態において、計量投与量で投与される化合物の量は、約５０ｎｇ〜約７５μｇ、または約１００ｎｇ〜約５０μｇ、または約５００ｎｇ〜約２５μｇ、または約７５０ｎｇ〜約１０μｇ、または約１μｇ〜約５μｇである。全体の１日投与量は、典型的には、約１μｇ〜約１００ｍｇの範囲であり、これは、１回の投与量で、またはより通常には１日を通して分割投与量として投与することができる。別の実施形態では、１日総投与量は、約５０μｇ〜約７５ｍｇ、または約１００μｇ〜約５０ｍｇ、または約５００μｇ〜約２５ｍｇ、または約７５０μｇ〜約１０ｍｇ、または約１ｍｇ〜約５ｍｇの範囲である。
【００７５】
本発明の有効な免疫原性組成物は、経オーラルでまたは経口的に、すなわち口でまたは口を介して対象の体内に投与することもでき、口腔粘膜を通して嚥下または輸送すること（例えば、舌下または頬側吸収、またはその両方）も含む。メントールおよびレボメントールなどの適切なフレーバー、またはサッカリンまたはサッカリンナトリウムなどの甘味料は、オーラルまたは経口投与が意図される本発明の処方に追加することができる。
【００７６】
本発明の有効な免疫原性組成物は、例えば座薬、ペッサリー、または浣腸の形態で直腸または膣に投与することができる。カカオバターは伝統的な坐薬基剤であるが、必要に応じて様々な代替物を使用することができる。直腸／膣内投与のための処方は、即時および／または変更放出となるように処方することができる。変更放出処方には、遅延、持続、パルス、制御、標的放出およびプログラム放出が含まれる。
【００７７】
本発明の有効な免疫原性組成物は、典型的には、微粉化された懸濁液の液滴または等張性、ｐＨ調整された滅菌生理食塩水の溶液の形態で、眼または耳に直接投与することもできる。眼および耳への投与に適した他の処方には、軟膏、生分解性（例えば、吸収性ゲルスポンジ、コラーゲン）および非生分解性（例えば、シリコーン）インプラント、ウエハー、レンズ、ニオソームまたはリポソームなどの微粒子または小胞系が挙げられる。架橋ポリアクリル酸、ポリビニルアルコール、ヒアルロン酸、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロースまたはメチルセルロースなどのセルロース系ポリマー、またはゲルマンガムなどのヘテロポリサッカライドポリマーなどのポリマーを、防腐剤、例えば、塩化ベンザルコニウムとともに組み込むことができる。このような処方は、イオントフォレシスによって送達することもできる。眼／耳の投薬のための処方は、即時および／または変更放出となるように処方することができる。変更放出処方には、遅延、持続、パルス、制御、標的放出およびプログラム放出が含まれる。
【００７８】
本発明の免疫原性組成物は、従来の生理学的に許容される担体、アジュバント、または上述のタイプの医薬製剤に有用な他の成分の選択によって制限されない。適切なｐＨ等張性、安定性および他の従来の特性を有する、上記の成分からのこれらの薬学的に許容される組成物の調製は、当業者の範囲内である。
【００７９】
一般に、本発明の免疫原性組成物の成分のための適切な「有効量」または投薬量の選択は、使用される免疫原性物における抗原の同一性、並びに、対象の体調、最も特に免疫化された対象の一般的な健康状態、年齢および体重に基づくであろう。また、免疫原性組成物中の追加の成分の存在および投与の方法および経路は、組成物の量および投与量に影響し得る。そのような選択、有効な投薬量の上方調整または下方調整は、当業者の技術範囲内である。有意な有害な副作用なしに、免疫応答、好ましくは防御反応を誘発するか、または対象に外因性効果を生じさせるのに必要な組成物の量は、これらの因子に依存して変化し得る。適切な投薬量は、当業者によって容易に決定される。
【００８０】
同様に、免疫原性組成物の投与順序および個々の投与間の時間間隔が複数であることが必要な場合は、宿主の物理的特徴および正確な応答に基づいて、本方法を適用することが当業者によって選択され得る。好ましくは、本発明の有効免疫原性組成物は、１日〜３週齢のウシ属の動物に投与することができる。より好ましくは、１〜２週齢のウシ属の動物に投与することができる。本発明のさらに好ましい態様は、本発明の改変された生（弱毒化された）ワクチンを、０〜３週齢、０〜２ヶ月齢、および０〜６ヶ月齢などの任意の年齢で、子ウシにワクチン接種することを含むことが、特定の育種または放牧作業に存在する特定の暴露の危険性に基づいていることに再度留意すべきである。変更された生のマイコプラズマ・ボビスを含む有効な免疫原性組成物については、一般的には一回の投与のみが必要であり、上述のような年齢でのウシ属の動物における投与が可能である。しかしながら、それは２回以上投与することができ、例えば、最初のワクチン接種後２〜４週間間隔で投与することができる。しかしながら、群れにおける疾病の有病率および特に病原性の循環系統株の存在を含む様々な要因に依存して、本発明の生ワクチンの１回または複数回の投与を、ワクチン接種された動物の年齢にかかわらず、所与の動物に対して、時間の経過とともに投与することが適切である。したがって、本発明の実施によれば、高齢動物にワクチン接種し、ワクチンを反復投与してもよく、これは妊娠前および妊娠中の両方において雌ウシの場合に特に重要である。したがって、１つのさらに好ましい例では、雌ウシは以前にワクチン接種されていても、妊娠開始の２〜４ヶ月前にワクチン接種され、子ウシは出生直後にワクチン接種される。場合によっては、妊娠中に母親にワクチンを接種することがさらに適切な場合がある。
【００８１】
他のタイプのマイコプラズマ・ボビスワクチン（例えば、死滅した、またはサブユニット）については、組成物の最初の投与は、上記に概説された年齢であり得、その後の投薬は、前回の投薬の２〜４週間後であり得る。
【００８２】
キット
免疫原性組成物を個々にまたは追加の化合物と組み合わせて、例えば特定の疾病または状態を治療する目的で投与することが望ましい場合があるため、本発明の範囲内で免疫原性組成物は、組成物の投与または共投与に適したキットの形態に含まれるか、または組み合わせられることが好都合である。本発明のキットは、少なくとも１つが本発明による免疫原性組成物である１種以上の別個の医薬品組成物、およびその組成物を別個に保持するための手段、例えば容器、分割されたボトル、または分割されたフォイルパケットを含むことができる。そのようなキットの例は、注射器および針などである。  本発明のキットは、異なる投薬形態、例えば、経口または非経口、異なる投薬間隔で別個の組成物を投与すること、または別個の組成物を互いに対して滴定することに特に適している。本発明の組成物の投与を補助するために、キットは典型的には投与のための指示を含む。
【００８３】
本発明の別のキットは、マイコプラズマ・ボビスの検出に有用な１つ以上の試薬を含むことができる。このキットには、マイコプラズマ・ボビスの全部、またはマイコプラズマ・ボビスのポリペプチド、エピトープもしくはポリヌクレオチド配列の存在について、サンプルを分析するための試薬が含まれ得る。特定の実施形態では、キットは、マイコプラズマ・ボビスに感染した動物の検出に有用であることを示す一連の印刷指示書またはラベルを含むことができる。
【００８４】
抗体
抗体は、モノクローナル、ポリクローナルまたは組換えのいずれかであり得る。抗体は、免疫原またはその一部に対して調製することができる。例えば、免疫原のアミノ酸配列に基づく合成ペプチド、またはクローニング技術によって組換えて調製された合成ペプチド、または天然の遺伝子産物および／またはその一部を単離して免疫原として使用することができる。免疫原は、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，”Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ，（１９８８）、およびＢｏｒｒｅｂａｅｃｋ，”Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  −  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ”，Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．（１９９２）に概説されているような、当業者に周知の標準抗体産生技術によって抗体を産生するために使用することができる。抗体フラグメントは、抗体から調製することもでき、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖを当業者に公知の方法によって調製されることとしてもよい。
【００８５】
本発明の一実施形態では、本発明の抗体は、免疫グロブリン分子の可変領域に位置する少なくとも１つの抗原認識部位により、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチドなどの標的への特異的結合が可能な無傷の免疫グロブリンをさらに提供する。インタクトな抗体は、２つの軽鎖および２つの重鎖を有する。したがって、単一の分離可能なインタクトな抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、合成抗体、組換え抗体、キメラ抗体、またはヘテロキメラ抗体であり得る。
【００８６】
抗体の産生において、所望の抗体のスクリーニングは、当該分野で公知の免疫学における標準的な方法によって達成され得る。具体的に記載されていない技術は、概して、Ｓｔｉｔｅｓ，  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ），”Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”（８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ）、Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ａｎｄ  Ｌａｎｇｅ，  Ｎｏｒｗａｌｋ，  ＣＴ  （１９９４）、およびＭｉｓｈｅｌｌ  ａｎｄ  Ｓｈｉｉｇｉ  （ｅｄｓ），”Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”，  Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９８０）に従う。概して、ＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロッティングがイムノアッセイの好ましいタイプであり、両方のアッセイは、当業者に周知である。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の両方をアッセイに使用することができる。抗体は、固体支持体基質に結合され得るか、または検出可能な部分と結合され得るか、または当技術分野で周知のように結合および共役され得る。（蛍光または酵素部分のコンジュゲーションに関する一般的な考察については、Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅ  ａｎｄ  Ｔｈｏｒｐｅ，“Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｉｎ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ”，  Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ  （１９８２）を参照されたい。）固体支持体基質への抗体の結合も、当技術分野において周知である。（一般的な議論については、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（１９８８），ａｓ  ｗｅｌｌ  ａｓ  Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ  （１９９２）を参照されたい。）本発明における使用が考慮される検出可能な部分には、これらに限定されないが、ビオチン、金、フェリチン、アルカリホスファターゼ、ｂ−ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ、ウレアーゼ、フルオレセイン、ローダミン、トリチウム、１４Ｃおよびヨウ素化などの、蛍光、金属、酵素および放射性マーカーを含むことができる。
【００８７】
組換え技術
本発明のさらに他の実施形態では、免疫原性組成物は組換えワクチンを含むことができる。そのような組換えワクチンは、概して、マイコプラズマ・ボビス抗原を含むベクターおよび異種インサートを含むであろう。適切なマイコプラズマ・ボビス抗原には、限定されないが、可変表面タンパク質（Ｖｓｐｓ）、シタデシン、リポタンパク質、例えばＰ４８およびＰ６８、並びに、調査され、特徴づけられるままである潜在的な他の仮定タンパク質、を含む膜および膜関連タンパク質が含まれ得る。
【００８８】
インサートは、任意に、異種プロモーター、例えば、当該分野で公知の合成プロモーターなどを含み得る。あるいは、宿主ベクターのプロモーターは、インサートの発現に対して転写制御を発揮し得る。プロモーターの適切な非限定的な例（ベクターの選択に応じて、天然または異種であり得る）は、Ｈ６ワクシニアプロモーター、Ｉ３Ｌワクシニアプロモーター、４２Ｋポックスウイルスプロモーター、７．５Ｋワクシニアプロモーター、およびＰｉワクシニアプロモーターである。
【００８９】
適切なベクターは、本出願の他の箇所に記載されている。  いくつかの実施形態では、ベクターは、限定するものではないが、パラボックス、ラクンポックス、豚痘および異なるアビポックスベクター（例えば、カナリアポックスおよび鶏痘株）などのワクシニアおよびポックスウイルスベクターを含むウイルスベクターであり得る。現在考えられているウイルス株には、Ｄ１７０１、ＡＬＶＡＣ、ＴＲＯＶＡＣ、ＮＹＶＡＣ株が含まれる。一般に、ウイルス宿主にとって必須ではない配列は、本発明の挿入物のための適切な挿入部位である。上記に列挙した菌株は、当該技術分野において十分に特徴付けられており、これらのベクター中のいくつかの挿入部位は周知である。例えば、米国特許第５，１７４，９９３号、米国特許第５，５０５，９４１号、米国特許第５，７６６，５９９号、米国特許第５，７５６，１０３号、米国特許第７，６３８，１３４号、米国特許第６，３６５，３９３号を参照されたい。
【００９０】
本発明のヌクレオチド配列をクローニングおよび発現するために使用することができるいくつかの既知の方法または技術が存在する。例えば、配列は制限断片として単離され、発現ベクターおよび／またはクローンへとクローニングすることができる。配列はまた、ＰＣＲ増幅され、発現ベクターおよび／またはクローンへとクローニングされ得るか、またはこれらの２つの方法の組み合わせによってクローニングされ得る。当該分野で公知であり、具体的には記載されていない標準的な分子生物学技術は、概して、以下のＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，  Ｍａｒｙｌａｎｄ  （１９８９）；  Ｐｅｒｂａｌ，  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８）；Ｗａｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ，  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；  Ｂｉｒｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ（ｅｄｓ）  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ，  Ｖｏｌｓ．  １−４  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９８）における記載、および米国特許第４，６６６，８２８号、第４，６８３，２０２号、第４，８０１，５３１号、第５，１９２，６５９号、および第５，２７２，０５７号に記載されている方法に従い得る。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、概して、ＰＣＲプロトコル：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ（１９９０）に記載されるように行われる。
【００９１】
本発明は、本発明のヌクレオチド配列によって発現された組換えポリペプチドの短縮形態および全長形態の両方を発現するために使用され得る、ベクターおよび宿主細胞を含む、原核および真核発現系の使用を包含する。様々な宿主−発現ベクター系を利用して、本発明のポリペプチドを発現させることができる。そのような宿主発現系はまた、目的のコード配列がクローン化され、続いて精製され得るビヒクルを表す。本発明はさらに、適切なベクターまたはヌクレオチド配列で形質転換またはトランスフェクトされたときに、本発明のコードされたポリペプチド遺伝子産物を発現し得る宿主細胞を提供する。そのような宿主細胞には、組換えバクテリオファージＤＮＡで形質転換された細菌（例えば、大腸菌、枯草菌）、プラスミドＤＮＡ、または、コード配列を含むコスミドＤＮＡ発現ベクターなどの微生物；  遺伝子産物コード配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換した酵母（例えば、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ））；コード配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；  組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶに感染した植物細胞系；  タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）、またはコード配列を含む組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換したもの；哺乳動物細胞のゲノム由来のプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）または哺乳動物ウイルス由来のプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を含む組換え発現構築物を含む哺乳動物細胞系（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、３Ｔ３）が含まれるが、これらに限定されない。
【００９２】
概して、本発明のベクターは、バクテリオファージ由来、酵母エピソーム由来、酵母染色体エレメント由来、ウイルス（例えば、上記のようなもの）由来、哺乳動物染色体由来、およびそれらの組み合わせ由来、例えば、限定されないが、コスミドおよびファージミドを含むプラスミドおよびバクテリオファージ遺伝子エレメントに由来するものなどの細菌プラスミド由来であり得るが、これらに限定されない。
【００９３】
本発明のベクターは、マイコプラズマ・ボビスのポリペプチドの発現に用いることができる。概して、本発明のベクターは、発現されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたシス作用調節領域を含む。調節領域は、構成的または誘導的であり得る。適切なトランスアクチベーション因子は、インビトロ翻訳系により、ベクターを補足することによって、または宿主に導入されるとベクター自体によって、宿主により供給される。
【００９４】
本発明のベクターは、発現ベクターまたはディスプレイベクターに典型的に含まれる任意のエレメントを含むことができ、限定されるものではないが、複製配列の起点、１つ以上のプロモーター、抗生物質耐性遺伝子、リーダーまたはシグナルペプチド配列、種々のタグ配列、ポリペプチドが抗生物質耐性を付与する遺伝子をコードするスタッファー配列、制限部位、リボソーム結合部位、翻訳後エンハンサー（ｍＲＮＡ安定性のためのステムループ構造を転写後に形成することができる配列）、終止コドンを欠くアミノ酸をコードする配列、および細菌コートタンパク質をコードする配列を含む。
【００９５】
本発明を以下の実施例によってさらに例示するが、これらに限定されるものではない。
実施例１．マイコプラズマ・ボビス突然変異株の生成と単離
ウシ（Ｍｉｌｌｅｒｒａｎ、Ｑｕｅｅｎｓｌａｎｄ、１９９９）の関節から単離したマイコプラズマ・ボビスを、マイコプラズマ・ボビス（「Ｂｏｖｉｓ」）ブロス（ＰＰＬＯ；酵母エキス；フェノールレッド；熱で不活化されたγ−照射ブタ血清）で２回継代し、Ｂｏｖｉｓ寒天培地上で４倍フィルタークローニングし、さらにブロスで継代培養した。菌株（１０ｍｌ）の培養物を調製し、適切な温度で２４時間インキュベートした。  その後、１３，０００ｇで１０分間、４℃で遠心分離することにより培養物を採取した。得られたペレットを１ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄した。  最終ペレットを１ｍｌのＰＢＳに再懸濁し、２つの１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに分けた。菌株（３６８３と指定）は、化学物質である、メチルニトロニトロソグアニジン（ＮＴＧ）を使用して突然変異誘発された。温度感受性のマイコプラズマ・ボビスの突然変異株は、もともとＮｏｎｏｍｕｒａ  およびＩｍａｄａ  （Ａｖｉａｎ  Ｄｉｓ．  ２６（４）：７６３−７７５；  １９８２）に記載されたプロトコルに従って生成され選択された。突然変異誘発および表現型選択の後、ボビスブロス中のフィルタークローニングおよび継代を行った。
【００９６】
３６８３＃２２／３／１２と命名された温度感受性突然変異体の精製クローンを子ウシに鼻腔接種した。マイコプラズマ・ボビス単離株Ｎ２８０５−１は、その後、以下の手順に従って、その特定の子ウシの鼻咽頭から集めたスワブから得た：感染から２８日後に収集した鼻スワブ材料を含有するマイコプラズマブロスをＰＰＬＯ寒天プレート上に播種し、次いでこれを５％ＣＯ２雰囲気中で３８．３℃でインキュベートした。個々のコロニーを採取し、ＰＰＬＯブロスに移し、３８．３℃、５％ＣＯ２雰囲気下で４８時間インキュベートした。次いで、ブロス培養物を滅菌０．４５ミクロンフィルターに通し、生理食塩水で希釈し、個々のコロニーを得るためにＰＰＬＯ寒天上にプレーティングした。プレーティング前にブロス相をろ過して、ブロスとプレートとを交互にし、全部で８継代を行い、個々のコロニーを得た。このことが、合計３回のフィルター／クローニングステップをもたらした。最後のブロスの継代を２つのアリコートに分け、−８０℃で保存した。その後、凍結されたアリコートを解凍し、６０ｍＬのＰＰＬＯブロスに接種して使用した。３８．３℃で５％ＣＯ２で４８時間インキュベートした後、培養物を１．２５ｍｌアリコートに分注し、−８０℃で凍結して作業ストックとして供した。１バイアルのストックを解凍し、ＰＰＬＯブロス２００ｍｌの接種に使用し、次いでこれを３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。次いで、培養物を１．２５ｍｌアリコートに分注し、−８０℃で凍結させた。すべてのその後の実験は、この物質を用いて行った（「継代１０」）。
【００９７】
Ｎ２８０５−１が最終的に回収された子ウシにワクチン接種するために使用された株は温度感受性であったため、制限的（３８．３℃）および許容（３３℃）温度の両方におけるＮ２８０５−１の表現型特性を評価した。制限温度でのＮ２８０５−１の増殖は、少なくとも許容温度での増殖と同程度に良好であった（表１）。これはＮ２８０５−１がもはや温度感受性表現型を呈さないことを示している。
【００９８】
【表１】
0006675484.tif 000002
【００９９】
別の研究では、Ｎ２８０５−１の増殖速度は、温度感受性の突然変異株、３６８３＃２２／３／１２、およびそれが由来する親株（３６８３）の増殖速度と比較された。１０％ブタ血清を含有するＰＰＬＯブロスは、各株の解凍凍結ストック培養液１％（ｖ／ｖ）で接種された。２つのブロス培養液を調製し、一方を３３℃で、他方を３８℃で、５％ＣＯ２でインキュベートした。インキュベーションの４２時間後、各培養物から０．１ｍｌアリコートを取り出し、連続希釈およびＰＰＬＯ寒天上でのプレートカウントによりＣＦＵ／ｍｌを決定した。プレートを５％ＣＯ２で５〜７日間、対応するブロス培養と同じ温度でインキュベートした。図１の結果は、インキュベーション後４２時間で、Ｎ２８０５−１はもはや３６８３＃２２／３／１２のような温度感受性がないことを示す。
【０１００】
Ｎ２８０５−１を遺伝的に特徴づけるために、全ゲノムを配列決定し、それが由来する親野生型（ＷＴ、予め突然変異誘発された）株３６８３の配列と比較した。この努力の結果、３６８３マイコプラズマ・ボビス株と誘導されたＮ２８０５−１株との間で、１２の異なる単一ヌクレオチドの差異（単一ヌクレオチド多型またはＳＮＰ）が同定された。今日までに、これら１２のＳＮＰのうち５つがＰＣＲによって確認されている。これらの５つのＳＮＰのヌクレオチドおよびアミノ酸配列の両方の典型的な変化を表２に示す（株３６８３から行いＮ２８０５−１を単離する）。
【０１０１】
【表２】
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【０１０２】
実施例２．病原性マイコプラズマ・ボビス異種抗原チャレンジに対する改変生マイコプラズマ・ボビスワクチン株の効能
臨床的に健康な、初乳を摂取していない（ＣＤ）子ウシを試験に登録した。すべての子ウシは、ＥＬＩＳＡによるマイコプラズマ・ボビス抗体について血清陰性であり（＜１：１６００力価）、０日目より前に採取した鼻スワブのマイコプラズマ・ボビスについてＰＣＲ陰性であった。
【０１０３】
また、全ての子ウシは、耳ノッチ試験においてＢＶＤＶ持続性感染症が陰性であった。この研究のワクチン接種段階では、個々のペンで、治療グループによって動物を別々の部屋に収容した。治療グループは４つのチャレンジャールームに混在し、チャレンジフェイズ中にブロックで収容された。試験中に子ウシに発生したあらゆる有害事象は記録された。
【０１０４】
研究０日目（ＳＤ  ０）に、１−２週齢の動物を以下のワクチンの１つを鼻腔内（１つの鼻孔）に投与した（表３）：Ｔ０１、生理食塩水；Ｔ０２、マイコプラズマ・ボビスワクチン株Ｎ２８０５−１；Ｔ０３、参考実験マイコプラズマ・ボビスワクチン（生−弱毒化された）；Ｔ０４、温度感受性の、より早い継代のマイコプラズマ・ボビスワクチン株Ｎ２８０５−１。ＳＤ２９−ＳＤ３１では、すべての動物がマイコプラズマ・ボビスカンサス菌株１  １０ＬＡ−１  １−１０を有するエアゾールによりチャレンジされた。エアゾール化マイコプラズマ・ボビスチャレンジを含むチャンバーを介して、ネブライザーに接続された小さな顔面マスク（イヌ麻酔マスク）を用いて子ウシにチャレンジした。４つのネブライザーを各チャンバーに接続し、それぞれのチューブを４つの子ウシに接続した。その後、動物をＳＤ５６で検死した。収集された試料／組織は以下の：ＰＣＲ、肺スワブのための肺組織；１つはマイコプラズマ・ボビスの単離のために、１つはその他の細菌、扁桃腺組織、気管支管支のリンク節、および肺病変組織のためのものを含む。
【０１０５】
【表３】
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【０１０６】
結果。バックトランスフォーム最小自乗平均（ｂａｃｋ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ  ｌｅａｓｔ  ｓｑｕａｒｅ  ｍｅａｎｓ：ＢＴＬＳＭ）肺病変スコア（ＬＬＳ）の結果を表４に示す。治療グループＴ０２、Ｔ０３およびＴ０４に投与したワクチンは、Ｔ０１、生理食塩水対照（それぞれ０％、１％および１％、対１７％）と比較して肺病変の有意な減少を誘導した。
【０１０７】
【表４】
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【０１０８】
発熱の平均持続時間（＞  １０３．１°Ｆ）を表５に示す。３つすべてのワクチン接種された治療グループは、対照と比較して発熱の日数が著しく少なかった。
【０１０９】
【表５】
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【０１１０】
チャレンジの後、Ｔ０１グループは、平均４．７日間のマイコプラズマ・ボビス呼吸器疾患に関連する臨床的疾病の持続期間を有した。これは、Ｔ０２、Ｔ０３およびＴ０４グループについてそれぞれ０．７、１．２、および２．５日と対照的である（表６）。Ｔ０２およびＴ０３の子ウシは、Ｔ０１子ウシと比較して、少なくとも１つの臨床症状の平均期間が有意に減少した（Ｐ＜０．０００９およびＰ＜０．０２６５）。
【０１１１】
Ｔ０１グループと比較してより短い持続期間であり、せき、跛行および呼吸努力の臨床症状を示す動物がほとんどいなかったため、Ｔ０２、Ｔ０３、およびＴ０４グループは、マイコプラズマ・ボビスにより誘導される疾病から防御された。どのグループの動物も鼻汁を出さなかった。ワクチンはＴ０１グループよりやや頻繁に垂れ下がった耳／頭部後屈を呈した（表７）。
【０１１２】
【表６】
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【０１１３】
【表７】
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【０１１４】
試験にわたって、鼻スワブを採取し、毎週マイコプラズマ・ボビスのＰＣＲ検査を行った。ワクチン接種群の７日目から２１日目にかけてＰＣＲによる検出がピークに達した。Ｔ０１対照は、ワクチン接種段階の間、ＰＣＲ陰性のままであった。Ｔ０２およびＴ０４子ウシの１００％およびＴ０３子ウシの９３．３％は、試験中にＰＣＲ陽性であった（表８）。
【０１１５】
【表８】
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【０１１６】
全ての動物が、試験を始める前は、マイコプラズマ・ボビス（＜１：１６００のＥＬＩＳＡ力価または幾何平均＜８００）について血清陰性であった。血清変換は、７日目にＴ０２およびＴ０４子ウシについて検出され、１４日目はＴ０３グループについて検出された。力価の平均値は、チャレンジ後まで全グループにわたって低かった（表９）。
【０１１７】
ワクチン接種およびチャレンジに対する粘膜ＩｇＡ抗体応答を、マイコプラズマ・ボビス特異的ＩｇＡ  ＥＬＩＳＡを用いて鼻分泌物中でモニターした。＞１：５０のカットオフ値を用いて陽性応答を定義した。ＩｇＡ抗体価はワクチン接種によって誘導され、一般に研究の進行とともに増加した。ＩｇＡの力価は、Ｔ０２、Ｔ０３、およびＴ０４の子ウシについて、７日目から５５日目までのＴ０１動物よりも高かった。ピーク応答は、Ｔ０１およびＴ０２グループの４３日目およびＴ０３およびＴ０４グループの５５日目であった（表１０）。
【０１１８】
【表９】
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【０１１９】
【表１０】
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【０１２０】
肺、扁桃腺、および気管気管支のリンパ節サンプルが、マイコプラズマ・ボビス＊についてＰＣＲで試験された。（＊  マイコプラズマ・ガラクチアエも、このＰＣＲアッセイで増幅することができる。）マイコプラズマ・ボビスの回収は、対照と比較して、肺およびリンパ節サンプルでは、３つのワクチンを接種した治療グループすべてにおいて、頻度が少なくなった。扁桃腺からの回収は、すべての治療グループにおいて高かった（表１１）。
【０１２１】
【表１１】
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【０１２２】
肺のスワブからのマイコプラズマ・ボビスの単離率は（検死の日）、Ｔ０２、Ｔ０３、およびＴ０４の子ウシでは低く、Ｔ０１対照の８７．５％と比較して、３１．３％、４０．０％および３３．３％と低かった。肺のスワブは、試験された他の全ての病原性微生物について陰性であった（表１２）。
【０１２３】
【表１２】
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【０１２４】
ＩＦＮガンマＥＬＩＳＰＯＴアッセイは、ワクチン接種およびチャレンジ後の細胞性免疫の誘導を測定した。ミリオンＢＴＬＳＭあたりのＩＦＮガンマスポット形成細胞（ＳＦＣ）（−１日目および４２日目）並びに幾何平均（７日目および１４日目）が表１３に挙げられる。
【０１２５】
【表１３】
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【０１２６】
結果は、Ｎ２８０５−１ワクチン候補（Ｔ０２）は肺の病変における有意な低減を提供した。直腸温とチャレンジ後の疾病の臨床症状は、重症度および持続期間がＮ２８０５−１により低減された。血清抗体価、ＩｇＡの力価、およびＰＣＲ並びに培養結果は、また、この株の効能を支持する。したがって、Ｎ２８０５−１ワクチンは、安全性についての評価に対する、およびさらなる効能の研究における優良な候補である
実施例３．温度感受性の突然変異株、３８６３  ２２／３／１２、および非温度感受性突然変異株、Ｎ２８０５−１のゲノムの特徴化
３６８３＃２２／３／１２で接種した子ウシから単離された、マイコプラズマ・ボビス温度感受性の突然変異株、３６８３＃２２／３／１２および非温度感受性突然変異株、Ｎ２８０５−１間のゲノムの相違を特徴づけるための努力において、両方のゲノムがイルミナテクノロジーを用いてシーケンスされた。ＤＮＡライブラリーを調製し、バーコードされたサンプルを配列決定して、サンプルあたりの対の末端配列の平均６０Ｘ被覆率を得た。すべての読み取りの品質管理が行われ、マッピングおよび一塩基多型（ＳＮＰ）分析の前に、失敗および低品質の読み取りが除去された。シーケンス読み取りは、ＣＬＣゲノムワークベンチソフトウェア（Ｑｉａｇｅｎ；  Ｒｅｄｗｏｏｄ  Ｃｉｔｙ，  ＣＡ）を用いて、リファレンスゲノム（Ｈｕｂｅｉ−１；ジェンバンク受け入れ番号ＣＰ００２５１３）に対してマッピングされた。ＣＬＣゲノムワークベンチの変異検出モジュールをＳＮＰ発見に使用した。ＳＮＰの同一性および位置を表１４に示す。２つの突然変異株間で、５６ＳＮＰが特定され、そのうち１７がアミノ酸変化をもたらし（停止コドンの導入をもたらす２つを含む）、６がフレームシフト突然変異をもたらし、３３が非コード領域で生じた。
【０１２７】
【表１４】
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【０１２８】
ウシ由来のマイコプラズマ・ボビス株は、弱毒化され、並びに特徴化された。前記マイコプラズマ・ボビス株の単離物は、アメリカ合衆国バージニア州、マナサスにあるアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）に、２０１５年５月１２日に寄託され、受け入れ番号  ＰＴＡ−１２２１６７が付与される。
【図１】
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