(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生殖系列に以下：
（ａ）内在性免疫グロブリン重鎖遺伝子座における少なくとも１つの内在性免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子のＣＨ１ドメインをコードするヌクレオチド配列における欠失または不活性化変異であって、前記少なくとも１つの内在性免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子が、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、またはそれらの組み合わせである前記欠失または不活性化変異、及び
（ｂ）以下の（ｉ）または（ｉｉ）のいずれか、または両方：
（ｉ）少なくとも１つの再構成されていない免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）遺伝子セグメント及び少なくとも１つの再構成されていない免疫グロブリン軽鎖連結（ＪＬ）遺伝子セグメントを含む核酸配列であって、前記再構成されていないＶＬ及びＪL遺伝子セグメントが、前記ＣＨ１ドメインをコードする前記ヌクレオチド配列において前記欠失または不活性化変異を含む前記免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される再構成された免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ／ＪＬ）ヌクレオチド配列を形成するように組換え可能である、前記核酸配列、及び／または
（ｉｉ）生殖系列ＶＬ及びＪＬ遺伝子セグメント配列を含んでいる単一の再構成された免疫グロブリン軽鎖可変領域ＶＬ／ＪＬ遺伝子配列を含む免疫グロブリン軽鎖遺伝子座であって、前記単一の再構成された免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列が、免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される、前記免疫グロブリン軽鎖遺伝子座
を含む遺伝子改変された非ヒト動物であって、前記動物が、前記内在性免疫グロブリン重鎖遺伝子座に機能的ＣＨ１ドメインを含んでいるＩｇＭ重鎖遺伝子を更に含む、前記遺伝子改変された非ヒト動物。
【請求項２】
前記少なくとも１つの再構成されていないＶＬ遺伝子セグメント、前記少なくとも１つの再構成されていないＪＬ遺伝子セグメント、及び／または前記単一の再構成された免疫グロブリン軽鎖可変領域ＶＬ／ＪＬ遺伝子配列が各々、ヒトカッパ遺伝子セグメント配列を含むか、またはヒトλ遺伝子セグメント配列を含む、請求項１に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
【請求項３】
前記免疫グロブリン軽鎖定常領域及び／または前記免疫グロブリン重鎖定常領域が、非ヒト型である、請求項２に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
【請求項４】
前記遺伝子改変された非ヒト動物が、（ｂ）（ｉ）を含まず、（ｂ）（ｉｉ）を含み、且つ、前記内在性免疫グロブリン重鎖における１つ以上の内在性ＶＨ、ＤＨ、ＪＨ遺伝子セグメントは、前記重鎖免疫グロブリン遺伝子座の発現が、ヒトイディオタイプを含みかつ機能的ＣＨ１ドメインを欠く免疫グロブリン重鎖定常領域に連結されている重鎖可変ドメインを含むＶＨ単一ドメイン結合タンパク質を生じさせるようにヒト重鎖可変領域遺伝子セグメントで置き換えられているか、または
前記遺伝子改変された非ヒト動物が、（ｂ）（ｉ）を含み、且つ、前記内在性免疫グロブリン重鎖における１つ以上の内在性ＶＨ、ＤＨ、ＪＨ遺伝子セグメントは、前記重鎖免疫グロブリン遺伝子座の発現が、ヒトイディオタイプを含みかつ機能的ＣＨ１ドメインを欠く免疫グロブリン重鎖定常領域に連結されている免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含むＶL単一ドメイン結合タンパク質を生じさせるように前記少なくとも１つの再構成されていないＶＬ遺伝子セグメント及び前記少なくとも１つの再構成されていないＪＬ遺伝子セグメントで置き換えられている、請求項１に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
【請求項５】
全てのまたは実質的に全ての内在性重鎖可変領域遺伝子セグメント及び／または全てのまたは実質的に全ての内在性軽鎖可変領域遺伝子セグメントが、欠失されているか、または機能的に不活性化されている、請求項４に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
【請求項６】
前記単一の再構成された免疫グロブリン軽鎖可変領域ＶＬ／ＪＬ遺伝子配列が、ヒトＶκ１−３９／Ｊ遺伝子配列、またはヒトＶκ３−２０／Ｊ遺伝子配列である、請求項１に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
【請求項７】
前記ヒトＶκ１−３９／Ｊ遺伝子配列が、ヒトＪκ５遺伝子セグメントとともに再構成されたヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントを含む、請求項６に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
【請求項８】
ヒトＶκ３−２０／Ｊ遺伝子配列が、ヒトＪκ１遺伝子セグメントとともに再構成されたヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントを含む、請求項６に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
【請求項９】
前記免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列が、ヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列である、請求項１に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
【請求項１０】
前記単一の再構成された軽鎖ＶＬ／ＪＬ遺伝子配列が、前記非ヒト動物の全てのまたは実質的に全ての内在性免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントを置き換える、請求項１に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
【請求項１１】
前記単一の再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ＶＬ／ＪＬ遺伝子配列が、ヒト生殖系列ＶＬ及びヒト生殖系列ＪＬ遺伝子セグメント配列を含む、請求項１０に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
【請求項１２】
前記内在性免疫グロブリン重鎖遺伝子座が、不活性化されたヒンジ領域を更に含む、請求項１に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
【請求項１３】
ＣＨ１ドメインをコードするヌクレオチド配列における前記欠失または不活性化変異が、ＩｇＧ１配列におけるものであり、前記内在性免疫グロブリン重鎖遺伝子座が、ＩｇＤ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ２ｃ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される免疫グロブリン遺伝子の欠失または不活性化変異を更に含む、請求項１に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
【請求項１４】
前記免疫グロブリン重鎖遺伝子座が、前記ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂ免疫グロブリン遺伝子において欠失または不活性化変異を更に含む、請求項１３に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
【請求項１５】
前記免疫グロブリン重鎖遺伝子座が、前記ＩｇＧ２ｂ及びＩｇＧ２ｃ免疫グロブリン遺伝子において欠失または不活性化変異を更に含む、請求項１３に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
【請求項１６】
前記免疫グロブリン重鎖遺伝子座が、前記ＩｇＧ３、ＩｇＤ、ＩｇＡ、及びＩｇＥ免疫グロブリン遺伝子において欠失または不活性化変異を更に含む、請求項１３に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
【請求項１７】
前記非ヒト動物が、雄非ヒト動物において機能的なＡｄａｍ６遺伝子またはその一部を更に含み、前記Ａｄａｍ６遺伝子が、Ａｄａｍ６ａ遺伝子、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子、またはその両方である、請求項１に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
【請求項１８】
前記動物が、更にその血清中に、機能的ＣＨ１ドメインを欠いている抗原特異的単一ドメイン抗原結合タンパク質を含む、請求項１に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
【請求項１９】
前記単一ドメイン抗原結合タンパク質が、前記ＣＨ１ドメインをコードする前記ヌクレオチド配列における前記欠失または不活性化変異を含む前記免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子に作動可能に連結される前記再構成された免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ／ＪＬ）ヌクレオチド配列によってコードされるＶＬ単一ドメイン結合タンパク質である、請求項１８に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
【請求項２０】
ＶＬ及びＪＬ遺伝子セグメント配列を含む前記単一の再構成された免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列と、免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列とを含む軽鎖遺伝子座によってコードされる遺伝子操作されたユニバーサル軽鎖を更に含む、請求項１に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
【請求項２１】
前記単一ドメイン抗原結合タンパク質が、前記ＣＨ１ドメインをコードする前記ヌクレオチド配列における前記欠失または不活性化変異を含んでいる前記免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子に作動可能に連結される前記再構成された免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ／ＪＬ）ヌクレオチド配列によってコードされるＶＬ単一ドメイン抗原結合タンパク質であり、且つ、前記非ヒト動物が、ＶＬ及びＪＬ遺伝子セグメント配列を含んでいる前記単一の再構成された免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列と、免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列とを含む軽鎖遺伝子座によってコードされる遺伝子操作されたユニバーサル軽鎖を更に含む、請求項１に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
【請求項２２】
前記単一ドメイン抗原結合タンパク質の少なくとも１つの重鎖が、機能的ヒンジ領域を更に欠いている、請求項１８に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
【請求項２３】
前記単一ドメイン抗原結合タンパク質が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ２ｃ、及びＩｇＧ３からなる群より選択されるＩｇＧアイソタイプを有する、請求項１８に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
【請求項２４】
前記単一ドメイン抗原結合タンパク質が、ヒト可変ドメイン及び非ヒト定常ドメインを含む、請求項１８に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
【請求項２５】
前記単一ドメイン抗原結合タンパク質が、単量体である、請求項１８に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
【請求項２６】
ＩｇＭ重鎖が軽鎖と会合する、請求項１に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
【請求項２７】
前記軽鎖は、免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結されるＶＬ及びＪＬ遺伝子セグメント配列を含んでいる前記単一の再構成された免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列を含む軽鎖遺伝子座によってコードされるユニバーサル軽鎖である、請求項２６に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
【請求項２８】
前記動物が、げっ歯類である、請求項１に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
【請求項２９】
前記げっ歯類が、ラットである、請求項２８に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
【請求項３０】
前記動物が、マウスである、請求項２８に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
【請求項３１】
遺伝子改変されたマウスであって、
（ａ）マウス重鎖遺伝子座における、全てのまたは実質的に全ての内在性免疫グロブリン重鎖Ｖ、Ｄ、及びＪ遺伝子セグメントの、
（ｉ）１つ以上の再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖ＶＨ遺伝子セグメント、１つ以上の再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖ＤＨ遺伝子セグメント、及び１つ以上の再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖ＪＨ遺伝子セグメントであって、前記１つ以上の再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖ＶＨ、ＤＨ、及びＪＨ遺伝子セグメントがマウス重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される、前記遺伝子セグメント、または、
（ｉｉ）１つ以上の再構成されていないヒト軽鎖ＶL遺伝子セグメント及び１つ以上の再構成されていないヒト軽鎖ＪL遺伝子セグメントであって、前記１つ以上の再構成されていないヒト軽鎖ＶＬ、及びＪＬ遺伝子セグメントがマウス重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される、前記遺伝子セグメント、
のいずれかによる置き換えであって、
前記マウス重鎖定常領域遺伝子配列が、完全長ＩｇＭ遺伝子と、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ２ｃ、ＩｇＧ３、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される、ＣＨ１ドメインをコードするヌクレオチド配列における欠失または不活性化変異を含むＩｇＧ遺伝子とを含む、前記置き換え、
（ｂ）全てのまたは実質的に全ての内在性免疫グロブリン軽鎖Ｖ及びＪ遺伝子セグメントの、単一の再構成されたヒト可変Ｖκ／Ｊκ遺伝子配列による置き換え
を含み、
前記マウスが、同族軽鎖と会合するＩｇＭ重鎖を含むＢ細胞受容体を発現し、前記同族軽鎖は、免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結されるＶＬ及びＪＬ遺伝子セグメント配列を含んでいる前記単一の再構成された免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列を含む軽鎖遺伝子座によってコードされるユニバーサル軽鎖である、前記遺伝子改変されたマウス。
【請求項３２】
遺伝子改変された非ヒト動物の作製方法であって、以下：
（ａ）前記非ヒト動物の内在性免疫グロブリン重鎖遺伝子座において少なくとも１つの非ヒト重鎖定常領域を改変して、前記重鎖定常領域がＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、またはそれらの組み合わせのＣＨ１ドメインをコードするヌクレオチド配列の欠失または不活性化変異を含むようにすること、及び、
（ｂ）（ｉ）前記内在性免疫グロブリン重鎖遺伝子座を改変して、少なくとも１つの再構成されていない免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）遺伝子セグメント及び少なくとも１つの再構成されていない免疫グロブリン軽鎖連結（ＪＬ）遺伝子セグメントを含む核酸配列を含むようにすることであって、前記再構成されていないＶＬ及びＪＬ遺伝子セグメントが、前記ＣＨ１ドメインをコードする前記ヌクレオチド配列における前記欠失または不活性化変異を含んでいる前記免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される再構成された免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ／ＪＬ）ヌクレオチド配列を形成するように組換え可能である、こと、及び／または
（ｉｉ）ゲノムを改変して、生殖系列ＶＬ及びＪＬ遺伝子セグメント配列を含んでいる単一の再構成された免疫グロブリン軽鎖可変領域ＶＬ／ＪＬ遺伝子配列を含む免疫グロブリン軽鎖遺伝子座を含むようにすることであって、前記単一の再構成された免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列が免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される、こと
を含み、前記動物が、機能的ＣＨ１ドメインを含んでいるＩｇＭ重鎖を含む、前記方法。
【請求項３３】
ステップ（ａ）が、前記改変されたＣＨ１ドメインを含んでいる、前記ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、またはその組み合わせのヒンジ領域を欠失または不活性化させることを更に含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記遺伝子改変された非ヒト動物が、（ｂ）（ｉ）を含まず、（ｂ）（ｉｉ）を含み、且つ、前記内在性免疫グロブリン重鎖における１つ以上の内在性ＶＨ、ＤＨ、ＪＨ遺伝子セグメントは、前記重鎖免疫グロブリン遺伝子座の発現が、ヒトイディオタイプを含みかつ機能的ＣＨ１ドメインを欠く免疫グロブリン重鎖定常領域に連結されている重鎖可変ドメインを含むＶＨ単一ドメイン結合タンパク質を生じさせるようにヒト重鎖可変領域遺伝子セグメントにより置き換えられているか、または
前記遺伝子改変された非ヒト動物が、（ｂ）（ｉ）を含み、且つ、前記重鎖免疫グロブリン遺伝子座の１つ以上の内在性免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子セグメントは、前記重鎖免疫グロブリン遺伝子座の発現がヒトイディオタイプを含み且つ機能的ＣＨ１ドメインを欠いている免疫グロブリン重鎖定常領域に連結されている免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含んでいるＶＬ単一ドメイン結合タンパク質を生じるように、再構成されていないヒト軽鎖ＶL及びＪL遺伝子セグメントにより置き換えられている、請求項３２または請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記免疫グロブリン重鎖及び／または軽鎖の定常領域遺伝子配列が、非ヒトである、請求項３２〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記再構成されていない軽鎖ＶＬ及びＪＬ遺伝子セグメントが、前記内在性非ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座において、全てのまたは実質的に全ての機能的内在性非ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子セグメントを置き換える、請求項３２〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
ＣＨ１ドメインをコードするヌクレオチド配列の前記欠失または不活性化変異が、ＩｇＧ遺伝子においてである、請求項３２〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記ヒトＶＬ／ＪＬ遺伝子配列が、ヒトＶκ１−３９／Ｊ遺伝子配列、またはヒトＶκ３−２０／Ｊ遺伝子配列である、請求項３２〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記ヒトＶκ１−３９／Ｊ遺伝子配列が、ヒトＪκ５遺伝子セグメントとともに再構成されたヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントを含み、
前記ヒトＶκ３−２０／Ｊ遺伝子配列が、ヒトＪκ１遺伝子セグメントとともに再構成されたヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントを含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記単一の再構成された免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列が、ヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される、及び／または
前記単一の再構成された免疫グロブリン軽鎖可変領域が、前記非ヒト動物の全てのまたは実質的に全ての内在性免疫グロブリン軽鎖ＶＬ及びＪＬ遺伝子セグメントを置き換える、請求項３２に記載の方法。
【請求項４１】
前記核酸配列及び／または単一の再構成された免疫グロブリン軽鎖可変領域配列が、前記非ヒト動物の生殖系列にある、請求項３２〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記ＣＨ１の欠失または不活性化変異が、ＩｇＧ１におけるものであり、前記方法が、（ｃ）ＩｇＤ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ２ｃ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される免疫グロブリン遺伝子を欠失または不活性化させることを更に含む、請求項３２〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記非ヒト動物が、げっ歯類である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４４】
前記げっ歯類が、ラットである、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記げっ歯類が、マウスである、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
ＣＨ１ドメインを欠いている抗原特異的ＩｇＧ単一ドメイン結合タンパク質の生成方法であって、全部または一部において、前記方法が、以下のステップ：
（ａ）請求項１〜３１のいずれか一項に記載の遺伝子改変された非ヒト動物に前記抗原で免疫することと、
（ｂ）前記非ヒト動物が：
（ｉ）２つの同族軽鎖と会合された２つのＩｇＭ重鎖を含んでいるＩｇＭ抗体であって、前記同族軽鎖は、免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結されるＶＬ及びＪＬ遺伝子セグメント配列を含んでいる前記単一の再構成された免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列を含む軽鎖遺伝子座によってコードされるユニバーサル軽鎖である、前記ＩｇＭ抗体；及び
（ｉｉ）機能的ＣＨ１ドメインを欠いている少なくとも１つの重鎖を含んでいる単一ドメイン抗原結合タンパク質
を発現するように、前記非ヒト動物を維持することと、
を含む、前記方法。
【請求項４７】
（ｃ）前記非ヒト動物から前記抗原と特異的に結合する細胞またはタンパク質を単離することであって、前記細胞またはタンパク質が、前記単一ドメイン抗原結合タンパク質を含むこと、
（ｃ）前記単一ドメイン抗原結合タンパク質の可変ドメインをコードする核酸を単離すること、
（ｃ）ベクターを発現させるのに十分な条件で、前記ベクターをトランスフェクトした宿主細胞を培養することであって、前記ベクターが、ヒト重鎖定常領域遺伝子に作動可能に連結される核酸を含み、前記核酸が、前記単一ドメイン抗原結合タンパク質の可変ドメインをコードすること、または
（ｃ）ハイブリドーマ培養物から上清を採取することであって、前記ハイブリドーマが、前記単一ドメイン抗原結合タンパク質を含んでいる細胞から生成されること
を更に含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記重鎖定常領域遺伝子が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、及びＩｇＧ３からなる群より選択されるヒトＩｇＧ定常領域遺伝子である、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
請求項４７に記載の方法に従って単離された前記細胞から生成されるハイブリドーマ。
【請求項５０】
そのゲノム内に
（ａ）内在性免疫グロブリン重鎖における、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤまたはそれらの組合せのＣＨ１ドメインをコードするヌクレオチド配列の欠失または不活化変異、及び
（ｂ）（ｉ）内在性免疫グロブリン重鎖遺伝子座における、少なくとも１つの再構成されていない免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）遺伝子セグメント及び少なくとも１つの再構成されていない免疫グロブリン軽鎖連結（ＪＬ）遺伝子セグメントを含む核酸配列であって、前記再構成されていないＶＬ遺伝子セグメント及びＪＬ遺伝子セグメントは、前記ＣＨ１ドメインをコードする前記ヌクレオチド配列において前記欠失または不活化変異を含んでいる前記免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される再構成された免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ／ＪＬ）ヌクレオチド配列を形成するように組換え可能である、核酸配列、及び／または
（ｉｉ）生殖系列ＶＬ遺伝子セグメント配列及びＪＬ遺伝子セグメント配列を含んでいる単一の再構成された免疫グロブリン軽鎖可変領域ＶＬ／ＪＬ遺伝子配列を含む免疫グロブリン軽鎖遺伝子座であって、前記単一の再構成された免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列は、免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結されている、免疫グロブリン軽鎖遺伝子座
を含む細胞であって、前記細胞が、前記内在性免疫グロブリン重鎖遺伝子座に機能的ＣＨ１ドメインを含んでいるＩｇＭ重鎖遺伝子を更に含む、前記細胞。
【請求項５１】
前記細胞が、胚性幹（ＥＳ）細胞またはＢ細胞である、請求項５０に記載の細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下で、２０１４年３月２１日出願の米国仮出願シリアル番号第６１／９６８，９８６号及び２０１４年３月２１日出願の米国仮出願シリアル番号第６１／９６８，９０５号の利益を主張し、当該出願の双方は、参照によりその全体が本明細書に共に援用される。
【０００２】
発明の分野
免疫グロブリン重鎖遺伝子座の高い多様性を示し、且つ好適には免疫グロブリン軽鎖遺伝子座の低い多様性を示し、ＶＨ単一ドメイン結合タンパク質及びＶＬ単一ドメイン結合タンパク質を含む抗原と結合する単一ドメイン抗原結合タンパク質の選択を可能にする非ヒト動物を提供する。
【背景技術】
【０００３】
動物の大半では、正常な免疫グロブリン重鎖が十分に発現するのは、その同族軽鎖と結合した場合に限られる。ヒトでは、可変重鎖、ＣＨ１、または可変重鎖及びＣＨ１ドメインの配列を欠いている機能不全の重鎖が認められる重鎖病に孤立重鎖が見られる。軽鎖が欠如している重鎖は、ある特定の種の魚類及びラクダに見られる。係る重鎖は、機能的ＣＨ１ドメインを欠いており、重鎖可変ドメインにおいて非ヒト特徴を有する。ラクダまたはある特定の種の魚類に見られるＶＨＨドメインを模倣するラクダ化遺伝子を発現するようにマウスを改変することにより（部分的に、ＩｇＭ及びＩｇＧ  ＣＨ１ドメインを除去し、重鎖可変領域をラクダ及び／またはある特定の種の魚類のものと類似するように適合させることにより）、ラクダ化抗体を作製する試みがなされている。残念なことに、ラクダ化抗体は、非ラクダ動物において免疫応答を誘導することが予測される。不活性化されたＣＨ１ドメインを含むように遺伝子改変された非ヒト動物の以前のバージョンに関する別の問題は、抗原特異的単一ドメイン抗原結合タンパク質の発現レベルが従来の抗体よりも低いということにある。そのような発現レベルの低さは、重鎖可変領域にＶＬドメインの欠如を補わせることを可能にする、非ラクダ科重鎖可変領域が利用できる機構が欠落していることに起因すると考えられる。例えば、重鎖のみの結合タンパク質に見られるラクダＶＨＨドメインは、平均して、非ラクダ科抗体に見られるドメインよりも長く、全体的な抗原親和性及び抗原特異性に大きな影響を及ぼすと考えられ、且つラクダ科の重鎖のみの抗体におけるＶＬドメインの欠如を補うものと考えられるＣＤＲＨ３を含んでいる。
【０００４】
したがって、当該分野では非ラクダ科ＶＨドメインを有する多様な単一ドメイン結合タンパク質を作る遺伝子改変された非ヒト動物が必要である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本明細書に開示するように、軽鎖可変領域及び重鎖定常領域を含む免疫グロブリンポリペプチド鎖は、非ヒト動物によって発現することができ、ＶＬ単一ドメイン抗原結合タンパク質（例えば、重鎖定常ドメインに作動可能に連結される軽鎖可変ドメインを含む単一ドメイン抗原結合タンパク質）を形成することができ、ここで、重鎖定常ドメイン（複数可）は、例えばＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、またはそれらの組み合わせから選択される免疫グロブリン重鎖定常領域の機能的ＣＨ１ドメインを欠いている。該ＶＬ単一ドメイン抗原結合タンパク質は、機能的ＣＨ１ドメインを欠いている重鎖定常ドメインに作動可能に連結される重鎖可変ドメインを含むＶＨ単一ドメイン抗原結合タンパク質に比して、高い安定性を呈し得る。したがって、本明細書では、軽鎖可変ドメイン及び重鎖定常領域を含むＶＬ単一ドメイン抗原結合タンパク質（ここで重鎖定常領域は機能的ＣＨ１ドメインを欠いており、場合によっては、機能的ヒンジ領域を欠いていてもよい）を発現することができる非ヒト動物、及びＶＬ単一ドメイン抗原結合タンパク質を発現する非ヒト動物の作製及び使用方法を提供する。また、ＶＬ単一ドメイン抗原結合タンパク質を発現する非ヒト動物由来の細胞、タンパク質及び核酸、ならびに単離された細胞、タンパク質及び核酸の使用も提供する。
【０００６】
本明細書において開示するように、単一ドメイン抗原結合タンパク質（例えば、ＶＬまたはＶＨ単一ドメイン抗原結合タンパク質）を産生することができる非ヒト動物による単一の再構成された軽鎖の発現は、単一の再構成された軽鎖を発現しない単一ドメイン抗原結合タンパク質を発現することができる同様の非ヒト動物に比して、抗原刺激に応答して抗原特異的単一ドメイン抗原結合タンパク質の力価を増大させる。図５。このデータから、非ヒト動物による単一の再構成された軽鎖が存在することが、抗原特異的単一ドメイン抗原結合タンパク質を発生させる可能性を高めることが示唆される。したがって、本明細書では、単一ドメイン抗原結合タンパク質（例えば、ＶＨ及び／またはＶＬ単一ドメイン抗原結合タンパク質）及び単一の再構成された軽鎖を発現することができる非ヒト動物、及びＶＬ単一ドメイン抗原結合タンパク質を発現する非ヒト動物の作製及び使用方法を提供する。単一ドメイン抗原結合タンパク質及び単一の再構成された軽鎖を発現する非ヒト動物由来の細胞、タンパク質及び核酸、ならびに単離された細胞、タンパク質及び核酸の使用も提供する。
【０００７】
本明細書では、ＶＬ単一ドメイン抗原結合タンパク質及び単一の再構成された軽鎖を含む非ヒト動物、高力価の単一ドメイン抗原結合タンパク質を産生することができる非ヒト動物の作製方法及び／または係る結合タンパク質を産生することができる非ヒト動物によって単一ドメイン結合タンパク質の産生を増大させる方法、該非ヒト動物を用いて抗原特異的単一ドメイン抗原結合タンパク質を作製する方法、ならびにそのように作製された単一ドメイン抗原結合タンパク質も提供する。
【０００８】
遺伝子改変された細胞、非ヒト胚、非ヒト動物及びそれらを作製及び使用するための方法ならびに組成物が提供され、ここで、該動物は、単一ドメイン抗原結合タンパク質（例えば、機能的ＣＨ１配列を欠いており、場合によっては機能的ヒンジ領域配列を欠いている重鎖定常領域を含む結合タンパク質）を産生するように遺伝子改変され、ここで、該動物は、ＶＬ単一ドメイン抗原結合タンパク質（例えば、ＣＨ１ドメインをコードする配列を不活性化または欠失させるように改変された重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される再構成された軽鎖可変領域ヌクレオチド配列からコードされる）及び／または単一の再構成された軽鎖（例えば、該動物の生殖系列の軽鎖定常領域に作動可能に連結される単一の再構成されたＶＬ：ＪＬ配列からコードされる）として、単一ドメイン抗原結合タンパク質を発現するように更に遺伝子改変される。
【０００９】
本明細書に開示する動物は、一態様では、ＩｇＧアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ１アイソタイプなど）を含む単一ドメイン結合タンパク質を産生し得る。一部の実施形態では、該単一ドメイン抗原結合タンパク質はＶＨ単一ドメイン抗原結合タンパク質であり、例えば、機能的ＣＨ１を欠いている重鎖定常領域に作動可能に連結される重鎖可変領域を含む。他の実施形態では、該単一ドメイン抗原結合タンパク質はＶＬ単一ドメイン抗原結合タンパク質であり、例えば、機能的ＣＨ１を欠いている重鎖定常領域（例えば、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ４、またはそれらの組み合わせを含む重鎖定常領域）に作動可能に連結される軽鎖可変ドメインを含む。
【００１０】
したがって、一部の態様では、本明細書に記載の単一ドメイン抗原結合タンパク質は、重鎖定常領域（例えば、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ４、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される重鎖定常領域ドメイン）に作動可能に連結される１つ以上の再構成されていない免疫グロブリン軽鎖Ｖセグメント及び１つ以上の再構成されていない免疫グロブリン軽鎖Ｊセグメントに由来する核酸配列によってコードされ、ここで、重鎖定常領域は、ＣＨ１領域配列において欠失または不活性化変異を含む。一実施形態では、該再構成されていない軽鎖Ｖ及びＪセグメントは、内在性非ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座の１つ以上の、実質的に全ての、または全ての機能的内在性非ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子セグメントを置き換える。一部の実施形態では、本明細書に開示するようなＣＨ１領域配列における欠失または不活性化変異を含む重鎖定常領域に作動可能に連結される軽鎖可変領域遺伝子セグメントを含むように改変された重鎖遺伝子座は、該非ヒト動物の生殖系列に見出され得る。そのような改変された遺伝子座は、内在性重鎖遺伝子座にあるか、または該内在性重鎖遺伝子座以外の遺伝子座の導入遺伝子に（例えば、ゲノムのランダムな位置に挿入されて）存在し得る。
【００１１】
一態様では、ＶＬ単一ドメイン抗原結合タンパク質をコードする核酸配列（例えば、ＣＨ１領域配列において欠失または不活性化変異を含む重鎖定常領域に作動可能に連結される１つ以上の再構成されていない免疫グロブリン軽鎖Ｖセグメント及び１つ以上の再構成されていない免疫グロブリン軽鎖Ｊセグメント由来の核酸配列）を含む本明細書に記載の動物は、（軽鎖定常領域に作動可能に連結されるヒト軽鎖Ｖセグメント及びヒト軽鎖Ｊセグメントを含む第２の核酸配列によってコードされてもよい）軽鎖可変領域及び軽鎖定常領域を含んでいる第２の免疫グロブリンポリペプチド鎖を更に含んでいてもよい。係る第２の核酸配列は、該非ヒト動物の生殖系列にも見出されてもよい。係る核酸配列は、内在性軽鎖遺伝子座に存在していてもよいし、内在性軽鎖遺伝子座以外の遺伝子座における導入遺伝子に（例えば、ゲノムのランダムな位置に挿入されて）存在していてもよい。
【００１２】
別の態様では、ＣＨ１領域配列において欠失または不活性化変異を含む重鎖定常領域に作動可能に連結される１つ以上の再構成されていない免疫グロブリン軽鎖Ｖセグメント及び１つ以上の再構成されていない免疫グロブリン軽鎖Ｊセグメント由来の核酸配列を含むように改変された動物を、単一の再構成された軽鎖（例えば、共通軽鎖（ＵＬＣ））を発現するように更に改変してもよい。
【００１３】
一部の実施形態では、該単一ドメイン抗原結合タンパク質（例えば、限定するものではないが、ＶＬ単一ドメイン抗原結合タンパク質）及び／または単一の再構成された軽鎖は、ヒトイディオタイプを含む。例えば、本明細書に開示する単一ドメイン抗原結合タンパク質及び／または遺伝子操作された単一の再構成された軽鎖は、ヒト可変ドメインを含んでいてもよく、一実施形態では、非ヒト定常ドメインを含んでいてもよい。一実施形態では、該非ヒト定常ドメインは内在性非ヒト定常ドメインである。一実施形態では、該非ヒト定常ドメインは、げっ歯類定常ドメイン（例えば、ネズミ定常ドメイン、例えば、マウス定常ドメイン）である。別の実施形態では、該定常ドメインはヒト定常ドメインである。一態様では、該単一ドメイン抗原結合タンパク質は、ヒト軽鎖可変ドメイン及び非ヒト重鎖定常ドメインを含むＶＬ単一ドメイン抗原結合タンパク質である。一実施形態では、本明細書に開示するようなＶＬ単一ドメイン抗原結合タンパク質をコードする再構成されていない軽鎖Ｖ及び／またはＪセグメントは、ヒトセグメントである。
【００１４】
本明細書に開示するような単一ドメイン抗原結合タンパク質を産生するように遺伝子改変された動物は、１つ以上のまたは全ての内在性免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子セグメントの、１つ以上の再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子セグメント、または１つ以上の再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖Ｖセグメント及び１つ以上の再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖Ｊセグメントによる置き換えを有する重鎖遺伝子座を含んでいてもよい。一部の態様では、内在性ＶＨ、ＤＨ、及びＪＨ遺伝子セグメントは全て、１つ以上の再構成されていないヒトＶＨ、１つ以上の再構成されていないヒトＤＨ、及び１つ以上の再構成されていないヒトＪＨの遺伝子セグメントにより置き換えられている。他の態様では、内在性ＶＨ、ＤＨ、及びＪＨ遺伝子セグメントは全て、１つ以上の再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖ＶＬ遺伝子セグメント及び１つ以上の再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖ＪＬ遺伝子セグメント（例えば、ヒトカッパ（κ）Ｖκ及び／及びＪκ遺伝子セグメント及び／またはヒトラムダ（λ）Ｖλ及び／及びＪλ遺伝子セグメント）により置き換えられている。
【００１５】
ＣＨ１領域及び／またはヒンジ領域の欠失を含む重鎖定常領域の関連で重鎖可変領域または軽鎖可変領域を含む単一ドメイン結合タンパク質を産生するように遺伝子改変された動物は、内在性重鎖遺伝子座に改変（及び／または本明細書に記載の定常遺伝子の遺伝子座の他の改変）を有しても、導入遺伝子上に改変を有してもよく、ここで、該導入遺伝子はゲノムのどこかに位置づけられ、例えば、ランダム挿入によってゲノムに挿入される。一部の実施形態では、本明細書に記載の改変された重鎖遺伝子座は該動物の生殖系列に見出され得る。単一の再構成された軽鎖を発現するようにも改変されている動物では、単一の再構成された軽鎖可変領域は、内在性軽鎖遺伝子座の軽鎖定常領域に作動可能に連結され得るか、あるいは同族（例えば、該非ヒト動物に対して自家性）または異種軽鎖定常領域に作動可能に連結される単一の再構成された軽鎖可変領域を含み、且つ内在性軽鎖遺伝子座以外の遺伝子座に存在する（例えば、ゲノムにランダムに挿入された）導入遺伝子に存在し得る。
【００１６】
更なる実施形態では、本明細書に開示の動物の重鎖遺伝子座は、ヒンジ領域（複数可）において欠失または不活性化変異を含んでいてもよい。
【００１７】
更に、本明細書に開示の動物は、単一の再構成されたＶＬ：ＪＬ遺伝子配列を含んでいる軽鎖遺伝子座によってコードされてもよい、共通またはユニバーサル軽鎖（ＵＬＣ）とも呼ばれる軽鎖定常領域に作動可能に連結される単一の再構成された軽鎖可変遺伝子配列を含む及び／または発現するように改変されてもよい。一部の実施形態では、軽鎖遺伝子座は、ＶＬ配列がＶκ遺伝子配列である単一の再構成されたＶＬ：ＪＬ遺伝子配列を含む。一部の態様では、該Ｖκ配列はＶκ１−３９またはＶκ３−２０から選択される。一部の態様では、該ＪＬ配列はＪκ遺伝子配列（例えば、Ｊκ１配列、Ｊκ２配列、Ｊκ３配列、Ｊκ４配列、またはＪκ５配列等）である。一部の実施形態では、軽鎖遺伝子座は、Ｖκ１−３９Ｊκ５及びＶκ３−２０Ｊκ１からなる群より選択される単一の再構成されたＶκ：Ｊκ配列を含む。一実施形態では、軽鎖遺伝子座はＶκ１−３９Ｊκ５の単一の再構成されたＶκ：Ｊκ配列を含む。別の実施形態では、軽鎖遺伝子座はＶκ３−２０Ｊκ１の単一の再構成されたＶκ：Ｊκ配列を含む。一部の実施形態では、該単一の再構成された可変遺伝子配列は、非ヒト軽鎖定常領域遺伝子（例えば、内在性非ヒト軽定常領域遺伝子）に作動可能に連結される。別の実施形態では、該単一の再構成された可変遺伝子配列はヒト軽鎖定常領域遺伝子に作動可能に連結される。一部の態様では、該単一の再構成された可変遺伝子配列は、内在性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座に挿入されたヒトＶ：Ｊ配列であるので、得られる非ヒト動物は、１つ以上の軽鎖遺伝子座において、機能的な再構成されていないＶ及び／またはＪ遺伝子セグメントを含んでいない。
【００１８】
したがって、本明細書では、ＣＨ１をコードする領域における欠失または不活性化変異を含む重鎖定常領域、ならびに（ａ）ＣＨ１領域における欠失または不活性化変異を含む重鎖定常領域に関連する軽鎖可変領域及び（ｂ）該単一の再構成された軽鎖の一方または両方を含む非ヒト動物を提供する。例えば、本明細書に開示する非ヒト動物は、本明細書に記載のＣＨ１領域配列において欠失または不活性化変異を含む重鎖定常領域に作動可能に連結される１つ以上の再構成されていない免疫グロブリン軽鎖Ｖセグメント及び１つ以上の再構成されていない免疫グロブリン軽鎖Ｊセグメントに由来する核酸配列を含み得る。一態様では、本明細書に開示する非ヒト動物は、免疫グロブリンＣＨ１ドメインをコードする核酸配列における欠失または不活性化変異、及び本明細書に開示する軽鎖定常領域に作動可能に連結される単一の再構成された軽鎖可変遺伝子配列を含む。別の態様では、本明細書に開示する非ヒト動物は、ＣＨ１領域配列において欠失または不活性化変異を含む重鎖定常領域に作動可能に連結される１つ以上の再構成されていない免疫グロブリン軽鎖Ｖセグメント及び１つ以上の再構成されていない免疫グロブリン軽鎖Ｊセグメントに由来する核酸配列、及び軽鎖定常領域に作動可能に連結される単一の再構成された軽鎖可変遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、重鎖定常領域は、非ヒト定常領域（例えば、内在性非ヒト定常領域）である。他の実施形態では、重鎖定常領域はヒト定常領域である。
【００１９】
一部の態様では、非ヒト動物は、本明細書に開示する改変された重鎖遺伝子座及び／または遺伝子操作された再構成された軽鎖遺伝子座をその生殖系列に含む。該非ヒト動物は、次の免疫グロブリン遺伝子：ＩｇＤ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ２ｃ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、及びそれらの組み合わせのうちの１つ以上において欠失または不活性化変異を含んでいてもよい。一実施形態では、該非ヒト動物はＩｇＧ２ａ免疫グロブリン遺伝子及びＩｇＧ２ｂ免疫グロブリン遺伝子において欠失または不活性化変異を含む。別の実施形態では、該非ヒト動物は、ＩｇＧ３、ＩｇＤ、ＩｇＡ、及びＩｇＥ免疫グロブリン遺伝子において欠失または不活性化変異を含む。別の実施形態では、該非ヒト動物は、ＩｇＧ３、ＩｇＤ、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＡ、及びＩｇＥ免疫グロブリン遺伝子において欠失または不活性化変異を含む。
【００２０】
一部の態様では、本明細書に開示する非ヒト動物は、雄非ヒト動物の生殖能力を保持することのできるＡｄａｍ６ａ遺伝子（またはその断片）及び／またはＡｄａｍ６ｂ遺伝子（またはその断片）を更に含んでいてもよい。該Ａｄａｍ６ａ遺伝子、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子、あるいはその両方は、該非ヒト動物において、異所的に置かれてもよいし、該Ａｄａｍ６遺伝子（複数可）の位置近傍の位置に置かれてもよい。該Ａｄａｍ６ａ遺伝子、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子、またはその両方は、雄非ヒト動物において機能的である。例えば、該非ヒト動物はげっ歯類（例えば、マウスまたはラット）であり、該Ａｄａｍ６ａ遺伝子、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子、またはその両方は、それぞれマウス遺伝子またはラット遺伝子である。種々の実施形態では、該Ａｄａｍ６遺伝子（複数可）の維持または挿入は、生殖能力を維持するか、または雄非ヒト動物に（例えば、雄のマウスまたはラットに）生殖能力を与える。
【００２１】
一態様では、本明細書に開示する非ヒト動物は、同族軽鎖（例えば、遺伝子操作された単一の再構成された軽鎖）と会合してよい、機能的ＣＨ１ドメインをコードする配列を含んでいるＩｇＭ遺伝子配列によってコードされたＩｇＭ免疫グロブリンを含む。別の実施形態では、該非ヒト動物は、ＩｇＭ及びＩｇＧ１アイソタイプを有する重鎖のみを産生し、ここで、該ＩｇＭ重鎖は機能的ＣＨ１ドメインを含むが、該ＩｇＧ１重鎖は機能的ＣＨ１ドメインを欠いている。一態様では、ＩｇＭ重鎖と会合する同族軽鎖は、軽鎖定常領域に作動可能に連結される単一の再構成された軽鎖可変遺伝子配列によってコードされているか、それに由来するものである。
【００２２】
本明細書に開示する遺伝子操作された単一の再構成された軽鎖が発現することにより、該非ヒト動物により抗原免疫化後に、高力価の抗原特異的単一ドメイン抗原結合タンパク質が産生される。例えばＥＬＩＳＡによって測定した場合の、少なくとも１×１０２μｇ／ｍＬ、少なくとも１×１０３μｇ／ｍＬ、少なくとも１×１０４μｇ／ｍＬ、または少なくとも１×１０５μｇ／ｍＬの力価（例えば、抗体または結合タンパク質の濃度）は、高力価であるとみなされてもよい。あるいは、該結合タンパク質の濃度が遺伝子操作された再構成された軽鎖を含んでいない対応する対照動物の濃度の少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、または少なくとも１００倍である場合、非ヒト動物は高力価の結合タンパク質を産生する。
【００２３】
本明細書に開示する非ヒト動物の作製方法も提供する。係る方法は、該非ヒト動物の非ヒト重鎖定常領域を改変して、重鎖定常領域がＣＨ１ドメイン（例えば、ＩｇＧ１  ＣＨ１ドメイン）をコードするヌクレオチド配列の欠失または不活性化変異を含むようにすることを含む。
【００２４】
本明細書に開示する非ヒト動物の作製方法は、内在性免疫グロブリン重鎖遺伝子座において、１つ以上の、全ての、または実質的に全ての内在性非ヒト重鎖可変領域遺伝子セグメントを１つ以上の再構成されていない軽鎖Ｖ及び／または１つ以上の再構成されていない軽鎖Ｊ遺伝子セグメントにより置き換えて、軽鎖Ｖ及びＪ遺伝子セグメントがＣＨ１ドメインをコードするヌクレオチド配列の欠失または不活性化変異を含む重鎖定常領域に作動可能に連結されるようにすることを更に含んでいてもよい。一実施形態では、該再構成されていない軽鎖Ｖ及びＪ遺伝子セグメントは、生産的な再構成を受けることができ、例えば、改変された非ヒト動物が重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される再構成された免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ／ＪＬ）ヌクレオチド配列を含むように該再構成されていない軽鎖Ｖ及びＪ遺伝子セグメントが組み換えを起こすことを可能にする組換えシグナル配列（ＲＳＳ）を含み、ここで、重鎖定常領域核酸配列はＣＨ１ドメインをコードする配列において不活性化変異または欠失を含む。一実施形態では、該再構成されていない軽鎖Ｖ及びＪ遺伝子セグメントは、改変された非ヒト動物が１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれより多いＮ付加を含み、且つ重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される再構成された免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ／ＪＬ）ヌクレオチド配列を含むように組み換えを起こし、ここで、該重鎖定常領域核酸配列はＣＨ１ドメインをコードする配列において不活性化変異または欠失を含む。一実施形態では、該再構成されていない軽鎖Ｖ及びＪ遺伝子セグメントはヒトＶ及びＪセグメントである。本方法は、再構成されていない軽鎖Ｖ遺伝子セグメント、再構成されていない軽鎖Ｊ遺伝子セグメント、及び不活性化されているか欠失しているＣＨ１ドメインを有する重鎖定常領域に由来するＶＬ単一ドメイン結合タンパク質を該動物に発現させることも含んでいてもよい。
【００２５】
別の実施形態では、本明細書に開示する非ヒト動物を作製する本方法は、単一の再構成された軽鎖（例えば、ユニバーサル軽鎖（ＵＬＣ））をコードする核酸を含んだ遺伝子操作された単一の再構成された軽鎖遺伝子座を導入すること、及び場合によっては、不活性化されたＣＨ１ドメインを有する重鎖免疫グロブリン遺伝子座及び単一の再構成された軽鎖遺伝子座を該動物に発現させることを更に含んでいてもよい。
【００２６】
一態様では、本明細書に開示する非ヒト動物を作製する本方法は、（ａ）該非ヒト動物の非ヒト重鎖定常領域を改変して、重鎖定常領域がＣＨ１ドメインをコードするヌクレオチド配列の欠失または不活性化変異を含むようにすることと、（ｂ）内在性免疫グロブリン重鎖遺伝子座において、内在性非ヒト重鎖可変領域遺伝子セグメントの１つ以上、全て、または実質的に全てを１つ以上の再構成されていない軽鎖Ｖ及び／または１つ以上の再構成されていない軽鎖Ｊ遺伝子セグメントにより置き換えて、軽鎖Ｖ及びＪ遺伝子セグメントがＣＨ１ドメインをコードするヌクレオチド配列の欠失または不活性化変異を含む非ヒト重鎖定常領域に作動可能に連結されるようにすること及び／または（ｃ）遺伝子操作された単一の再構成された軽鎖遺伝子座をコードする核酸を導入することの一方または両方とを含む。本明細書に開示する各方法のステップは、任意の順序で、順次に、あるいは同時に行われてもよい。
【００２７】
例えば、本明細書に開示する方法は、（ａ）該非ヒト動物の非ヒト重鎖定常領域を改変して、該重鎖定常領域がＣＨ１ドメインをコードするヌクレオチド配列の欠失または不活性化変異を含むようにすること、及び（ｂ）内在性免疫グロブリン重鎖遺伝子座において、１つ以上の、全ての、または実質的に全ての内在性非ヒト重鎖可変領域遺伝子セグメントを１つ以上の再構成されていない軽鎖Ｖ及び／または１つ以上の再構成されていない軽鎖Ｊ遺伝子セグメントで置き換えて、軽鎖Ｖ及びＪ遺伝子セグメントが、ＣＨ１ドメインをコードするヌクレオチド配列の欠失または不活性化変異を含んでいる非ヒト重鎖定常領域に作動可能に連結されるようにすることを含んでいてもよい。一態様では、本明細書に開示する方法は、（ａ）該非ヒト動物の非ヒト重鎖定常領域を改変して、該重鎖定常領域がＣＨ１ドメインをコードするヌクレオチド配列の欠失または不活性化変異を含むようにすること、及び（ｂ）遺伝子操作された単一の再構成された軽鎖遺伝子座をコードする核酸を導入することを含む。別の態様では、本明細書に開示する非ヒト動物の作製方法は、（ａ）該非ヒト動物の非ヒト重鎖定常領域を改変して、該重鎖定常領域がＣＨ１ドメインをコードするヌクレオチド配列の欠失または不活性化変異を含むようにすること、（ｂ）内在性免疫グロブリン重鎖遺伝子座において、１つ以上の、全ての、または実質的に全ての内在性非ヒト重鎖可変領域遺伝子セグメントを１つ以上の再構成されていない軽鎖Ｖ及び／または１つ以上の再構成されていない軽鎖Ｊ遺伝子セグメントにより置き換えて、軽鎖Ｖ及びＪ遺伝子セグメントが、ＣＨ１ドメインをコードするヌクレオチド配列の欠失または不活性化変異を含んでいる非ヒト重鎖定常領域に作動可能に連結されるようにすること、及び（ｃ）遺伝子操作された単一の再構成された軽鎖遺伝子座をコードする核酸を導入することを含む。本明細書に開示する非ヒト動物の作製方法は、Ａｄａｍ６ａ遺伝子、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子、またはその両方を該非ヒト動物のゲノムに（例えば該動物の生殖系列に）導入することを更に含んでいてもよい。一態様では、本方法は、例えば該動物に免疫することによって、不活性化されたＣＨ１ドメインを有する重鎖免疫グロブリン遺伝子座及び／または遺伝子的に再構成された軽鎖遺伝子座（単一の再構成された軽鎖遺伝子座）を該動物に発現させることを更に含む。
【００２８】
一態様では、重鎖免疫グロブリン遺伝子座の、ＣＨ１ドメイン（複数可）及び場合によってはヒンジ領域（複数可）を不活性化させるステップは、該非ヒト動物が本明細書に開示する単一ドメイン抗原結合タンパク質を産生することを可能にする。一実施形態では、重鎖免疫グロブリン遺伝子座の、ＣＨ１ドメイン（複数可）及び場合によってはヒンジ領域（複数可）を不活性化させることは、重鎖遺伝子座の（例えばＩｇＧ重鎖遺伝子座の）ＣＨ１ドメイン（複数可）及び場合によってはヒンジ領域を欠失させるかまたはＣＨ１ドメイン（複数可）及び場合によってはヒンジ領域に不活性化変異を導入するターゲティングベクターを用いて、内在性重鎖免疫グロブリン遺伝子座を標的とすることを含む。一実施形態では、重鎖免疫グロブリン遺伝子座の、ＣＨ１ドメイン（複数可）及び場合によってはヒンジ領域（複数可）を不活性化させることは、相同組換えを含む。別の実施形態では、該不活性化ステップは、重鎖遺伝子座の内在性可変領域遺伝子セグメントの１つ以上、実質的に全て、または全てを、１つ以上の重鎖可変領域遺伝子セグメント、１つ以上の軽鎖可変領域遺伝子セグメント、１つ以上のヒト可変領域遺伝子セグメント及び１つ以上の再構成されていない可変領域遺伝子セグメントのうちの任意の１つ以上によって置き換えることを更に含んでいてもよい。重鎖遺伝子座のＣＨ１ドメイン（複数可）及び場合によってはヒンジ領域（複数可）を不活性化するステップは、該非ヒト動物の生殖系列において行われてもよい。
【００２９】
一態様において、本方法は、遺伝子操作された再構成された軽鎖遺伝子座（例えば、本明細書に記載する遺伝子操作されたユニバーサル軽鎖）をコードする核酸を導入することを含む。一態様では、遺伝子操作された再構成された軽鎖遺伝子座をコードする核酸を導入するステップは、該非ヒト動物の全てのまたは実質的に全ての内在性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座を置き換えることを更に含む。一態様では、遺伝子操作された再構成された軽鎖遺伝子座をコードする核酸を導入するステップは、該非ヒト動物の全てのまたは実質的に全ての内在性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座を機能的に不活性化することを更に含む。別の態様では、遺伝子操作された再構成された軽鎖をコードする核酸は、該動物の生殖系列に導入される。
【００３０】
一実施形態では、本明細書に開示する非ヒト動物の作製方法は、（ａ）第１の非ヒト動物であって、欠失または不活性化されたＣＨ１ドメイン（及び場合によっては欠失または不活性化されたＣＨ１ドメインを有する重鎖定常領域配列に作動可能に連結される軽鎖可変領域ヌクレオチド配列）を、場合によっては欠失または不活性化されたヒンジ領域を有する重鎖遺伝子座を含み、本明細書に開示する単一ドメイン抗原結合タンパク質（ＶＬ単一ドメイン結合タンパク質など）を産生するようにされている、第１の非ヒト動物を得ること、及び（ｂ）一態様では第１の非ヒト動物とは異なる系統であり得る第２の非ヒト動物と（ａ）の第１の非ヒト動物を交配させることを含み、ここで、該第２の非ヒト動物はユニバーサル軽鎖を発現し、ここで、該交配により、単一ドメイン抗原結合タンパク質及び遺伝子操作された再構成された軽鎖（単一の再構成された軽鎖；ＵＬＣ）を産生する（例えば、それらを含む）子孫が得られる。
【００３１】
一部の態様では、本明細書に開示する非ヒト動物の作製方法は、ＩｇＤ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ２ｃ、ＩｇＥ、及びＩｇＡからなる群より選択される１つ以上の免疫グロブリン遺伝子を不活性化または欠失させることを更に含む。一実施形態では、該ＩｇＧ２ｂ及びＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ２ｃ免疫グロブリン遺伝子を欠失させる。別の実施形態では、該ＩｇＤ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ２ｃ、ＩｇＥ、及びＩｇＡ遺伝子を欠失させられ、該非ヒト動物がＩｇＭまたはＩｇＧ１アイソタイプを有する免疫グロブリン重鎖を産生するようになり、ここで、該ＩｇＧ１アイソタイプはＣＨ１ドメインにおいて、場合によってはヒンジ領域において欠失または不活性化変異を有する。
【００３２】
一態様では、非ヒト動物は単一ドメイン抗原結合タンパク質を産生することが既に可能であり、本明細書では、該非ヒト動物による単一ドメイン抗原結合タンパク質産生の増大方法を提供する。係る方法は、該非ヒト動物のＢ細胞に遺伝子操作された単一の再構成された軽鎖（例えば、本明細書に記載の遺伝子操作されたユニバーサル軽鎖）をコードする核酸を発現させることを含む。該Ｂ細胞にそのような核酸を発現させることには、該Ｂ細胞による内在性軽鎖遺伝子の発現を不活化または阻止するステップも含んでいてもよい。
【００３３】
一態様において、本明細書に開示する非ヒト動物はラットまたはマウスである。別の実施形態では、本明細書に開示する非ヒト動物はマウスである。したがって、本明細書では、（ａ）マウス重鎖遺伝子座における全てのまたは実質的に全ての内在性免疫グロブリン重鎖Ｖ、Ｄ、及びＪ遺伝子セグメントの、１つ以上のヒト重鎖Ｖ、Ｄ、及びＪ遺伝子セグメントによる置き換えであり、ここで、該１つ以上のヒト重鎖Ｖ、Ｄ、及びＪ遺伝子セグメントはマウス重鎖定常領域（例えば、内在性マウス重鎖定常領域）に作動可能に連結され、ここで、該マウス重鎖定常領域は、完全長ＩｇＭ遺伝子と、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｃ、ＩｇＧ２ｂ、及びそれらの組み合わせからなる群より選択されるＩｇＧ遺伝子においてＣＨ１領域をコードするヌクレオチド配列において欠失または不活性化変異を含んでいるＩｇＧ遺伝子とを含み、ここで、該マウスはＣＨ１領域を有するＩｇＭを含むＢ細胞受容体を発現し、該ＩｇＭは同族軽鎖と会合する重鎖を含むものと、（ｂ）全てのまたは実質的に全ての内在性免疫グロブリン軽鎖Ｖ及びＪ遺伝子セグメント、単一の再構成された可変Ｖκ：Ｊκ遺伝子配列による置き換えとを含む、遺伝子改変されたマウスを提供する。一部の実施形態では、該同族軽鎖は該単一の再構成された可変Ｖκ：Ｊκ遺伝子配列由来のものである。一部の実施形態では、該単一の再構成された可変Ｖκ：Ｊκ遺伝子配列は、マウス軽鎖定常配列（例えば、内在性マウス軽鎖定常配列）に作動可能に連結される。
【００３４】
別の態様では、本明細書では、（ａ）全てのまたは実質的に全ての内在性免疫グロブリン重鎖Ｖ、Ｄ、及びＪ遺伝子セグメントのマウス重鎖遺伝子座における欠失または機能的不活性化、及び１つ以上のヒト重鎖Ｖ、Ｄ、及びＪ遺伝子セグメントの導入であり、（ここで、該１つ以上のヒト重鎖Ｖ、Ｄ、及びＪ遺伝子セグメントはマウス重鎖定常領域（例えば、内在性マウス重鎖定常領域）に作動可能に連結され、ここで、該マウス重鎖定常領域は、完全長ＩｇＭ遺伝子と、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｃ、ＩｇＧ２ｂ、及びそれらの組み合わせからなる群より選択されるＩｇＧ遺伝子においてＣＨ１領域をコードするヌクレオチド配列における欠失または不活性化変異を含んでいるＩｇＧ遺伝子とを含み、ここで、該マウスはＣＨ１領域を有するＩｇＭを含むＢ細胞受容体を発現し、ここで該ＩｇＭは同族軽鎖と会合する重鎖を含む）、及び／または（ｂ）全てのまたは実質的に全ての内在性免疫グロブリン軽鎖Ｖ及びＪ遺伝子セグメントの欠失または機能的不活性化及び単一の再構成された可変Ｖκ：Ｊκ遺伝子配列の導入を含む、非ヒト動物（例えば、ラットまたはマウス）を提供する。
【００３５】
本明細書では、（ａ）マウス重鎖遺伝子座における全てのまたは実質的に全ての内在性免疫グロブリン重鎖Ｖ、Ｄ、及びＪ遺伝子セグメントの、１つ以上のヒト軽鎖Ｖ及びＪ遺伝子セグメントによる置き換えであり、ここで、該１つ以上のヒト軽鎖Ｖ及びＪ遺伝子セグメントはマウス重鎖定常領域に作動可能に連結され、ここで、該マウス重鎖定常領域は、完全長ＩｇＭ遺伝子と、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｃ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、及びそれらの組み合わせからなる群より選択されるＩｇＧ遺伝子においてＣＨ１領域をコードするヌクレオチド配列における欠失または不活性化変異を含んでいるＩｇＧ遺伝子とを含み、ここで、該マウスはＣＨ１領域を有するＩｇＭを含むＢ細胞受容体を発現し、ここで該ＩｇＭは同族軽鎖と会合する重鎖を含むものと、（ｂ）全てのまたは実質的に全ての内在性免疫グロブリン軽鎖Ｖ及びＪ遺伝子セグメントの、単一可変Ｖκ：Ｊκ遺伝子配列による置き換えを含む、遺伝子改変されたマウスも提供する。一部の実施形態では、該同族軽鎖は単一の再構成された可変Ｖκ：Ｊκ遺伝子配列由来である。
【００３６】
一態様では、（ａ）結合タンパク質、該結合タンパク質を作る細胞、または該結合タンパク質の配列をコードするヌクレオチド配列を本明細書に記載の非ヒト動物から単離することを含む、ＣＨ１ドメインを欠いている該結合タンパク質の作製方法を提供する。一態様では、該単離ステップは、（ａ）抗原を用いて本明細書に記載の非ヒト動物に免疫するステップ、（ｂ）該非ヒト動物が結合タンパク質を作るのに十分な条件下に該非ヒト動物を維持するステップ、及び／または（ｃ）機能的ＣＨ１ドメインを欠いている及び／または機能的ヒンジ領域を欠いている該非ヒト動物によって作られた結合タンパク質を特定するステップのうちの１つ以上を含んでいてもよい。一部の態様では、そのように単離された結合タンパク質は、単一ドメイン抗原結合タンパク質である。一態様において、単一ドメイン抗原結合タンパク質は単量体である。
【００３７】
一態様では、（ａ）抗原を用いて本明細書に記載の非ヒト動物に免疫すること、（ｂ）抗原結合タンパク質を作るのに十分な条件下に該非ヒト動物を維持すること、（ｃ）該非ヒト動物によって作られた抗原結合タンパク質を特定することであり、該抗原結合タンパク質は機能的ＣＨ１ドメインを欠いているか、または機能的ＣＨ１ドメインを欠き、且つヒンジ領域を欠いている、特定すること、（ｄ）ＣＨ１ドメインを欠いているか、またはヒンジ領域及びＣＨ１ドメインを欠いている免疫グロブリンポリペプチド上の可変ドメインをコードする可変領域配列を特定することであり、該可変ドメインが該抗原と特異的に結合する、特定すること、（ｅ）適した発現系において、（ｄ）の可変領域配列と同一または実質的に同一の配列によってコードされたタンパク質を発現させることであり、（ｄ）の可変領域配列がＣＨ１領域を欠いているか、またはＣＨ１領域及びヒンジを欠いている重鎖可変配列の核酸配列に連結される、発現させること、及び／または（ｆ）（ｅ）の発現されたタンパク質を単離することを含む、抗原結合タンパク質の作製方法を提供する。一部の実施形態では、該可変領域配列によってコードされたタンパク質を発現させるステップ及び／または（ｆ）該発現されたタンパク質を単離するステップは、細胞（例えば、該可変領域配列をトランスフェクトした細胞）、本明細書に開示する動物から単離した細胞から形成されたハイブリドーマを培養すること及び／または培養細胞から上清を採取することを含む。
【００３８】
一態様では、抗原を用いて本明細書に記載の非ヒト動物に免疫すること、該抗原と特異的に結合する可変ドメインをコードする可変領域核酸配列を特定すること、及び適した発現系において該可変領域核酸配列を利用することを含む、抗原結合タンパク質の作製方法を提供し、ここで、該可変領域核酸配列はＣＨ１を欠いているか、またはＣＨ１及びヒンジを欠いている重鎖定常遺伝子に作動可能に連結され、ここで、該発現系は該抗原と特異的に結合する抗原結合タンパク質を発現する。
【００３９】
したがって、本明細書では、係る単離された結合タンパク質、細胞、及び核酸配列も提供する。
【００４０】
他の実施形態は、記載され、以下の詳細な説明を検討することによって当業者には明らかになろう。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
生殖系列に以下を含む、遺伝子改変された非ヒト動物：
（ａ）内在性免疫グロブリン重鎖遺伝子座における少なくとも１つの内在性免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子のＣＨ１ドメインをコードするヌクレオチド配列における欠失または不活性化変異であって、前記少なくとも１つの内在性免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子が、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、またはそれらの組み合わせである前記欠失または不活性化変異、及び
（ｂ）以下の（ｉ）または（ｉｉ）のいずれか、または両方：
（ｉ）少なくとも１つの再構成されていない免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）遺伝子セグメント及び少なくとも１つの再構成されていない免疫グロブリン軽鎖連結（ＪＬ）遺伝子セグメントを含む核酸配列であって、前記再構成されていないＶＬ及びＪL遺伝
子セグメントが、前記ＣＨ１ドメインをコードする前記ヌクレオチド配列において前記欠失または不活性化変異を含む前記免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子に作動可能に連結される再構成された免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ／ＪＬ）ヌクレオチド配列を形成するように組換え可能である、前記核酸配列、
（ｉｉ）ＶＬ及びＪＬ遺伝子セグメント配列を含んでいる単一の再構成された免疫グロブリン軽鎖可変領域ＶＬ／ＪＬ遺伝子配列を含む免疫グロブリン軽鎖遺伝子座であって、前記単一の再構成された免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列が、免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される、前記免疫グロブリン軽鎖遺伝子座。
（項目２）
前記少なくとも１つの再構成されていないＶＬ遺伝子セグメント、前記少なくとも１つの再構成されていないＪＬ遺伝子セグメント、及び／または前記単一の再構成された免疫グロブリン軽鎖可変領域ＶＬ／ＪＬ遺伝子配列が、ヒト型である、項目１に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目３）
前記免疫グロブリン軽鎖定常領域及び／または前記免疫グロブリン重鎖定常領域が、非ヒト型である、項目２に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目４）
前記少なくとも１つの再構成されていないＶＬ遺伝子セグメント及び前記少なくとも１つの再構成されていないＪＬ遺伝子セグメントが、ヒトカッパセグメントである、項目２に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目５）
前記少なくとも１つの再構成されていないＶＬ遺伝子セグメント及び前記少なくとも１つの再構成されていないＪＬ遺伝子セグメントが、前記内在性免疫グロブリン重鎖における１つ以上の内在性ＶＨ、ＤＨ、ＪＨ遺伝子セグメントを置き換える、項目１に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目６）
前記少なくとも１つの再構成されていないＶＬ遺伝子セグメント及び前記少なくとも１つの再構成されていないＪＬ遺伝子セグメントが、前記内在性非ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座における全てのまたは実質的に全ての内在性非ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子セグメントを置き換える、項目５に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目７）
全てのまたは実質的に全ての内在性重鎖可変領域遺伝子セグメント及び／または全てのまたは実質的に全ての内在性軽鎖可変領域遺伝子セグメントが、欠失されているか、または機能的に不活性化されている、項目１に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目８）
前記単一の再構成された免疫グロブリン軽鎖可変領域ＶＬ／ＪＬ遺伝子配列が、ヒトＶκ１−３９／Ｊ遺伝子配列、またはヒトＶκ３−２０／Ｊ遺伝子配列である、項目２に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目９）
前記ヒトＶκ１−３９／Ｊ遺伝子配列が、ヒトＪκ５遺伝子セグメントとともに再構成されたヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントを含む、項目８に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目１０）
ヒトＶκ３−２０／Ｊ遺伝子配列が、ヒトＪκ１遺伝子セグメントとともに再構成されたヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントを含む、項目８に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目１１）
前記動物が、（ｉ）少なくとも１つの再構成されていない免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）遺伝子セグメント及び少なくとも１つの再構成されていない免疫グロブリン軽鎖連結（ＪＬ）遺伝子セグメントを含む核酸配列を含まず、前記再構成されていないＶＬ及びＪL遺伝子セグメントが、前記ＣＨ１ドメインをコードする前記ヌクレオチド配列にお
ける前記欠失または不活性化変異を含む前記免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子に作動可能に連結される再構成された免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ／ＪＬ）ヌクレオチド配列を形成するように組換え可能であり、前記重鎖遺伝子座が、非ヒト重鎖可変領域遺伝子セグメントを含む、項目１に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目１２）
前記動物が、（ｉ）少なくとも１つの再構成されていない免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）遺伝子セグメント及び少なくとも１つの再構成されていない免疫グロブリン軽鎖連結（ＪＬ）遺伝子セグメントを含む核酸配列を含まず、前記再構成されていないＶＬ及びＪL遺伝子セグメントが、前記ＣＨ１ドメインをコードする前記ヌクレオチド配列にお
ける前記欠失または不活性化変異を含む前記免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子に作動可能に連結される再構成された免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ／ＪＬ）ヌクレオチド配列を形成するように組換え可能であり、前記重鎖遺伝子座が、ヒト重鎖可変領域遺伝子セグメントを含む、項目１に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目１３）
前記ヒト重鎖可変領域遺伝子セグメントが、全てのまたは実質的に全ての内在性免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子セグメントを置き換える、項目１２に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目１４）
前記免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列が、非ヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列である、項目１に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目１５）
前記免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列が、ヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列である、項目１に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目１６）
前記単一の再構成された軽鎖ＶＬ／ＪＬ遺伝子配列が、前記非ヒト動物の全てのまたは実質的に全ての内在性免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントを置き換える、項目１に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目１７）
前記単一の再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ＶＬ／ＪＬ遺伝子配列が、ヒト生殖系列ＶＬ及びヒト生殖系列ＪＬ遺伝子セグメント配列を含む、項目２に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目１８）
前記内在性免疫グロブリン重鎖遺伝子座が、不活性化されたヒンジ領域を更に含む、項目１に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目１９）
ＣＨ１ドメインをコードするヌクレオチド配列における前記欠失または不活性化変異が、ＩｇＧ１配列におけるものであり、前記内在性免疫グロブリン重鎖遺伝子座が、ＩｇＤ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ２ｃ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される免疫グロブリン遺伝子の欠失または不活性化変異を更に含む、項目１に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目２０）
前記免疫グロブリン重鎖遺伝子座が、前記ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂ免疫グロブリン遺伝子において欠失または不活性化変異を更に含む、項目１９に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目２１）
前記免疫グロブリン重鎖遺伝子座が、前記ＩｇＧ２ｂ及びＩｇＧ２ｃ免疫グロブリン遺伝子において欠失または不活性化変異を更に含む、項目１９に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目２２）
前記免疫グロブリン重鎖遺伝子座が、前記ＩｇＧ３、ＩｇＤ、ＩｇＡ、及びＩｇＥ免疫グロブリン遺伝子において欠失または不活性化変異を更に含む、項目１９に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目２３）
前記非ヒト動物が、雄非ヒト動物において機能的なＡｄａｍ６遺伝子またはその一部を更に含み、前記Ａｄａｍ６遺伝子が、Ａｄａｍ６ａ遺伝子、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子、またはその両方である、項目１に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目２４）
前記動物が、その血清中に、機能的ＣＨ１ドメインを欠いている抗原特異的単一ドメイン抗原結合タンパク質を更に含む、項目１に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目２５）
前記動物が、機能的ＣＨ１ドメインを含んでいるＩｇＭ重鎖を更に含む、項目２４に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目２６）
前記単一ドメイン抗原結合タンパク質が、前記ＣＨ１ドメインをコードする前記ヌクレオチド配列における前記欠失または不活性化変異を含む前記免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子に作動可能に連結される前記再構成された免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ／ＪＬ）ヌクレオチド配列によってコードされるＶＬ単一ドメイン結合タンパク質である、項目２４に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目２７）
免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結されるＶＬ及びＪＬ遺伝子セグメント配列を含む前記単一の再構成された免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列によってコードされる遺伝子操作されたユニバーサル軽鎖を更に含む、項目２５に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目２８）
前記単一ドメイン抗原結合タンパク質が、前記ＣＨ１ドメインをコードする前記ヌクレオチド配列における前記欠失または不活性化変異を含んでいる前記免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子に作動可能に連結される前記再構成された免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ／ＪＬ）ヌクレオチド配列によってコードされるＶＬ単一ドメイン抗原結合タンパク質であり、且つ、前記非ヒト動物が、免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結されるＶＬ及びＪＬ遺伝子セグメント配列を含んでいる前記単一の再構成された免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列によってコードされる遺伝子操作されたユニバーサル軽鎖を更に含む、項目２５に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目２９）
前記単一ドメイン抗原結合タンパク質の少なくとも１つの重鎖が、機能的ヒンジ領域を更に欠いている、項目２４に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目３０）
前記単一ドメイン抗原結合タンパク質が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ２ｃ、及びＩｇＧ３からなる群より選択されるＩｇＧアイソタイプを有する、項目２４に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目３１）
前記単一ドメイン抗原結合タンパク質が、ヒト可変ドメイン及び非ヒト定常ドメインを含む、項目２４に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目３２）
前記単一ドメイン抗原結合タンパク質が、単量体である、項目２４に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目３３）
ＩｇＭ重鎖が同族軽鎖と会合する、項目２５に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目３４）
前記同族軽鎖は、免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結されるＶＬ及び／またはＪＬ遺伝子セグメント配列を含んでいる前記単一の再構成された免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列によってコードされるユニバーサル軽鎖である、項目３３に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目３５）
高力価の前記単一ドメイン抗原結合タンパク質を更に含む、項目２４に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目３６）
前記抗原特異的単一ドメイン抗原結合タンパク質の前記力価が、少なくとも１×１０２μｇ／ｍＬ、少なくとも１×１０３μｇ／ｍＬ、少なくとも１×１０４μｇ／ｍＬ、または少なくとも１×１０５μｇ／ｍＬである、項目３５に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目３７）
前記単一ドメイン抗原結合タンパク質の前記力価が、免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結されるＶＬ及びＪＬ遺伝子セグメント配列を含んでいる前記単一の再構成された免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列によってコードされる遺伝子操作されたユニバーサル軽鎖を発現しない対応する対照動物の、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１００倍である、項目３５に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目３８）
前記力価が、酵素結合免疫測定法によって決定される、項目３５に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目３９）
前記動物が、げっ歯類である、項目１に記載の遺伝子改変された動物。
（項目４０）
前記げっ歯類が、ラットまたはマウスである、項目３９に記載の遺伝子改変された動物。
（項目４１）
前記動物が、マウスである、項目４０に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目４２）
遺伝子改変されたマウスであって、
（ａ）マウス重鎖遺伝子座における、全てのまたは実質的に全ての内在性免疫グロブリン重鎖Ｖ、Ｄ、及びＪ遺伝子セグメントの、
（ｉ）１つ以上の再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖ＶＨ遺伝子セグメント、１つ以上の再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖ＤＨ遺伝子セグメント、及び１つ以上の再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖ＪＨ遺伝子セグメントであって、前記１つ以上の再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖ＶＨ、ＤＨ、及びＪＨ遺伝子セグメントがマウス重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される、前記遺伝子セグメント、または、
（ｉｉ）１つ以上の再構成されていないヒト軽鎖ＶL遺伝子セグメント及び１つ以上の再構成されていないヒト軽鎖ＪL遺伝子セグメントであって、前記１つ以上の再構成されていないヒト軽鎖ＶＬ、及びＪＬ遺伝子セグメントがマウス重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結され、
前記マウス重鎖定常領域遺伝子配列が、完全長ＩｇＭ遺伝子、及びＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ２ｃ、ＩｇＧ３、及びそれらの組み合わせからなる群より選択されるＩｇＧ遺伝子においてＣＨ１ドメインをコードするヌクレオチド配列における欠失または不活性化変異を含む、前記遺伝子セグメント、
のいずれかによる置き換え、
（ｂ）全てのまたは実質的に全ての内在性免疫グロブリン軽鎖Ｖ及びＪ遺伝子セグメントの、単一の再構成されたヒト可変Ｖκ／Ｊκ遺伝子配列による置き換えを含み、前記マウスが、同族軽鎖と会合するＩｇＭ重鎖を含むＢ細胞受容体を発現する、前記遺伝子改変されたマウス。
（項目４３）
以下を含む項目１に記載の遺伝子改変された非ヒト動物の作製方法：
（ａ）前記非ヒト動物の内在性免疫グロブリン重鎖遺伝子座において少なくとも１つの非ヒト重鎖定常領域を改変して、前記重鎖定常領域がＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、またはそれらの組み合わせのＣＨ１ドメインをコードするヌクレオチド配列の欠失または不活性化変異を含むようにすること、及び、
（ｂ）以下の（ｉ）または（ｉｉ）のいずれか、または両方：
（ｉ）前記内在性免疫グロブリン重鎖遺伝子座に核酸配列を挿入することであって、前記核酸配列が、少なくとも１つの再構成されていない免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）遺伝子セグメント及び少なくとも１つの再構成されていない免疫グロブリン軽鎖連結（ＪＬ）遺伝子セグメントを含み、前記再構成されていないＶＬ及びＪＬ遺伝子セグメントが、前記ＣＨ１ドメインをコードする前記ヌクレオチド配列における前記欠失または不活性化変異を含んでいる前記免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子に作動可能に連結される再構成された免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ／ＪＬ）ヌクレオチド配列を形成するように組換え可能である、挿入すること、及び／または
（ｉｉ）ＶＬ及びＪＬ遺伝子セグメント配列を含んでいる単一の再構成された免疫グロブリン軽鎖可変領域ＶＬ／ＪＬ遺伝子配列を含む免疫グロブリン軽鎖遺伝子座を導入することであって、前記単一の再構成された免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列が免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される、導入すること。
（項目４４）
ステップ（ａ）が、前記改変されたＣＨ１ドメインを含んでいる、前記ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、またはその組み合わせのヒンジ領域を欠失または不活性化させることを更に含む、項目４３に記載の方法。
（項目４５）
ステップ（ａ）が、前記重鎖免疫グロブリン遺伝子座の１つ以上の内在性免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子セグメントをヒト重鎖可変領域遺伝子セグメントによって置き換え、前記重鎖免疫グロブリン遺伝子座の発現がヒトイディオタイプを含む重鎖可変ドメインを生じさせるようにすることを更に含み、前記方法が、（ｂ）（ｉ）前記内在性免疫グロブリン重鎖遺伝子座に核酸配列を挿入することを含まず、前記核酸配列が、少なくとも１つの再構成されていない免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）遺伝子セグメント及び少なくとも１つの再構成されていない免疫グロブリン軽鎖連結（ＪＬ）遺伝子セグメントを含み、ここで、前記再構成されていないＶＬ及びＪＬ遺伝子セグメントが、前記ＣＨ１ドメインをコードする前記ヌクレオチド配列における前記欠失または不活性化変異を含んでいる前記免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子に作動可能に連結される再構成された免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ／ＪＬ）ヌクレオチド配列を形成するように組換え可能である、項目４３に記載の方法。
（項目４６）
前記挿入ステップが、前記重鎖免疫グロブリン遺伝子座の１つ以上の内在性免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子セグメントを前記再構成されていない軽鎖ＶL及びＪL遺伝子セグメントにより置き換えて、前記重鎖免疫グロブリン遺伝子座の発現が、免疫グロブリン軽鎖可変ドメインと、ＣＨ１ドメインを欠いている免疫グロブリン重鎖定常ドメインとを含んでいるＶＬ単一ドメイン結合タンパク質を生じるようにすることを含む、項目４３に記載の方法。
（項目４７）
前記免疫グロブリン定常領域遺伝子が、非ヒトである、項目４６に記載の方法。
（項目４８）
前記再構成されていない軽鎖ＶＬ及びＪＬ遺伝子セグメントが、ヒトセグメントである、項目４７に記載の方法。
（項目４９）
前記再構成されていない軽鎖ＶＬ及びＪＬ遺伝子セグメントが、ヒトカッパセグメントである、項目４８に記載の方法。
（項目５０）
前記再構成されていない軽鎖ＶＬ及びＪＬ遺伝子セグメントが、ヒトラムダセグメントである、項目４８に記載の方法。
（項目５１）
前記再構成されていない軽鎖ＶＬ及びＪＬ遺伝子セグメントが、前記内在性非ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座において、全てのまたは実質的に全ての内在性非ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子セグメントを置き換える、項目４６に記載の方法。
（項目５２）
ＣＨ１ドメインをコードするヌクレオチド配列の前記欠失または不活性化変異が、ＩｇＧ遺伝子においてである、項目４３に記載の方法。
（項目５３）
ＣＨ１ドメインをコードするヌクレオチド配列の前記欠失または不活性化変異が、ＩｇＧ１遺伝子においてである、項目５２に記載の方法。
（項目５４）
前記重鎖免疫グロブリン遺伝子座が、ヒト可変ドメインをコードする可変領域遺伝子セグメント及び非ヒト定常ドメインをコードする定常領域遺伝子を含む、項目４３に記載の方法。
（項目５５）
免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される前記単一の再構成された免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列が、ユニバーサル軽鎖をコードする、項目４３に記載の方法。
（項目５６）
前記単一の再構成された免疫グロブリン軽鎖可変領域ＶＬ／ＪＬ遺伝子配列が、ヒトＶＬ／ＪＬ遺伝子配列である、項目５５に記載の方法。
（項目５７）
前記ヒトＶＬ／ＪＬ遺伝子配列が、ヒトＶκ１−３９／Ｊ遺伝子配列、またはヒトＶκ３−２０／Ｊ遺伝子配列である、項目５６に記載の方法。
（項目５８）
前記ヒトＶκ１−３９／Ｊ遺伝子配列が、ヒトＪκ５遺伝子セグメントとともに再構成されたヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントを含む、項目５７に記載の方法。
（項目５９）
前記ヒトＶκ３−２０／Ｊ遺伝子配列が、ヒトＪκ１遺伝子セグメントとともに再構成されたヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントを含む、項目５７に記載の方法。
（項目６０）
前記単一の再構成された免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列が、非ヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される、項目４３に記載の方法。
（項目６１）
前記単一の再構成された免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列が、ヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される、項目４３に記載の方法。
（項目６２）
前記単一の再構成された免疫グロブリン軽鎖可変領域が、前記非ヒト動物の全てのまたは実質的に全ての内在性免疫グロブリン軽鎖ＶＬ及びＪＬ遺伝子セグメントを置き換える、項目４３に記載の方法。
（項目６３）
前記核酸配列及び／または単一の再構成された免疫グロブリン軽鎖可変領域配列が、前記非ヒト動物の生殖系列にある、項目４３に記載の方法。
（項目６４）
前記ＣＨ１の欠失または不活性化変異が、ＩｇＧ１におけるものであり、前記方法が、（ｃ）ＩｇＤ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ２ｃ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される免疫グロブリン遺伝子を欠失または不活性化させることを更に含む、項目４３に記載の方法。
（項目６５）
前記ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂ免疫グロブリン遺伝子が、欠失または不活性化される、項目６４に記載の方法。
（項目６６）
前記ＩｇＧ２ｂ及びＩｇＧ２ｃ免疫グロブリン遺伝子が、欠失または不活性化される、項目６４に記載の方法。
（項目６７）
ＩｇＧ３、ＩｇＤ、ＩｇＡ、及びＩｇＥ免疫グロブリン遺伝子が、欠失または不活性化される、項目６４に記載の方法。
（項目６８）
前記非ヒト動物が、げっ歯類である、項目４３に記載の方法。
（項目６９）
前記げっ歯類が、ラットまたはマウスである、項目６８に記載の方法。
（項目７０）
前記げっ歯類が、マウスである、項目６９に記載の方法。
（項目７１）
ＣＨ１ドメインを欠いている抗原特異的ＩｇＧ単一ドメイン結合タンパク質の生成方法であって、全部または一部において、前記方法が、以下のステップを含む方法：
（ａ）遺伝子改変された非ヒト動物に前記抗原で免疫することであって、前記遺伝子改変された非ヒト動物が、
（ｉ）内在性免疫グロブリン重鎖遺伝子座における少なくとも１つの内在性免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子のＣＨ１ドメインをコードするヌクレオチド配列における欠失または不活性化変異であって、前記少なくとも１つの内在性免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子が、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、またはそれらの組み合わせである前記欠失または不活性化変異、及び
（ｉｉ）以下の１または２のいずれか、または両方：
１．少なくとも１つの再構成されていない免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）遺伝子セグメント及び少なくとも１つの再構成されていない免疫グロブリン軽鎖連結（ＪＬ）遺伝子セグメントを含んでいる核酸配列であって、前記再構成されていないＶＬ及びＪＬ遺伝子セグメントが、前記ＣＨ１ドメインをコードする前記ヌクレオチド配列における前記欠失または不活性化変異を含んでいる前記免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子に作動可能に連結される再構成された免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ／ＪＬ）ヌクレオチド配列を形成するように組換え可能である、前記核酸配列、及び／または
２．ＶＬ及びＪＬ遺伝子セグメント配列を含んでいる単一の再構成された免疫グロブリン軽鎖可変領域ＶＬ／ＪＬ遺伝子配列を含む免疫グロブリン軽鎖遺伝子座であって、前記単一の再構成された免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列が免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される、前記免疫グロブリン軽鎖遺伝子座、
を含む、前記免疫することと、
（ｂ）前記マウスが：
（ｉ）２つの同族軽鎖と会合された２つのＩｇＭ重鎖を含んでいるＩｇＭ抗体；及び
（ｉｉ）機能的ＣＨ１ドメインを欠いている少なくとも１つの重鎖を含んでいる単一ドメイン抗原結合タンパク質を発現するように、前記マウスを維持すること。
（項目７２）
前記少なくとも１つの重鎖定常領域遺伝子が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ２ａ、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される、項目７１に記載の方法。
（項目７３）
前記重鎖定常領域遺伝子が、ＩｇＧ１定常領域遺伝子である、項目７２に記載の方法。
（項目７４）
前記単一ドメイン抗原結合タンパク質が、前記ＣＨ１ドメインを全て欠いている、項目７１に記載の方法。
（項目７５）
前記単一ドメイン抗原結合タンパク質が、ヒト重鎖可変領域を含む、項目７１に記載の方法。
（項目７６）
前記単一ドメイン抗原結合タンパク質が、ヒト軽鎖可変領域を含む、項目７１に記載の方法。
（項目７７）
前記同族軽鎖が、免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される前記単一の再構成された免疫グロブリン軽鎖可変領域配列によってコードされたユニバーサル軽鎖である、項目７１に記載の方法。
（項目７８）
前記非ヒト動物が、内在性軽鎖を発現しない、項目７７に記載の方法。
（項目７９）
前記単一の再構成された免疫グロブリン軽鎖可変領域配列が、ヒトＶκ１−３９／Ｊ遺伝子配列またはヒトＶκ３−２０／Ｊ遺伝子である、項目７７に記載の方法。
（項目８０）
前記ヒトＶκ１−３９／Ｊ遺伝子配列が、ヒトＪκ５遺伝子セグメントとともに再構成されたヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントを含む、項目７９に記載の方法。
（項目８１）
前記ヒトＶκ３−２０／Ｊ遺伝子配列が、ヒトＪκ１遺伝子セグメントとともに再構成されたヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントを含む、項目７９に記載の方法。
（項目８２）
（ｃ）前記ヒト動物から前記抗原と特異的に結合する細胞またはタンパク質を単離することを更に含み、前記細胞またはタンパク質が、体細胞変異された単一ドメイン抗原結合タンパク質を含む、項目７１に記載の方法。
（項目８３）
（ｄ）（ｃ）で単離された前記細胞から、前記単一ドメイン抗原結合タンパク質の前記可変ドメインをコードする第１の核酸を単離することを更に含む、項目８２に記載の方法。
（項目８４）
最終ステップとして、（ｅ）ベクターを発現させるのに十分な条件で、前記ベクターをトランスフェクトした細胞を培養することを更に含み、前記ベクターが、ヒト重鎖定常領域遺伝子に作動可能に連結される第２の核酸を含み、前記第２の核酸が、ステップ（ｄ）で単離した前記第１の核酸と同一または実質的に同一である、項目８３に記載の方法。
（項目８５）
前記重鎖定常領域遺伝子が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、及びＩｇＧ３からなる群より選択されるヒトＩｇＧ定常領域遺伝子である、項目８４に記載の方法。
（項目８６）
（ｄ）ハイブリドーマ培養物から上清を採取するステップを更に含み、前記ハイブリドーマが、（ｃ）で単離された前記細胞から生成される、項目８２に記載の方法。
（項目８７）
（ｅ）（ｄ）で生成された前記ハイブリドーマから、前記単一ドメイン抗原結合タンパク質の前記可変ドメインをコードする第１の核酸を単離することを更に含む、項目８６に記載の方法。
（項目８８）
（ｆ）ベクターでトランスフェクトした細胞を、前記ベクターを発現させるのに十分な条件で培養することを更に含み、前記ベクターが、ヒト重鎖定常領域遺伝子に作動可能に連結される第２の核酸を含み、前記第２の核酸が、ステップ（ｅ）で単離した前記第１の核酸と同一または実質的に同一である、項目８７に記載の方法。
（項目８９）
前記重鎖定常領域遺伝子が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、及びＩｇＧ３からなる群より選択されるヒトＩｇＧ定常領域遺伝子である、項目８８に記載の方法。
（項目９０）
項目８２に記載の方法に従って単離された前記細胞から生成されるハイブリドーマ。
（項目９１）
項目８３に記載の方法に従って単離された核酸。
（項目９２）
項目８７に記載の方法に従って単離された核酸。
（項目９３）
項目８３に記載の核酸と同一または実質的に類似する核酸を含む細胞。
（項目９４）
項目８７に記載の核酸と同一または実質的に類似する核酸を含む細胞。
（項目９５）
項目１に記載の非ヒト動物の単離された細胞。
（項目９６）
前記細胞が、胚性幹（ＥＳ）細胞またはＢ細胞である、項目９５に記載の単離された細胞。
（項目９７）
機能的ＣＨ１ドメインを欠いている重鎖定常領域に作動可能に連結される軽鎖可変ドメインを含む、単一ドメイン抗原結合タンパク質。
（項目９８）
項目１に記載の非ヒト動物から単離される、単一ドメイン抗原結合タンパク質。
（項目９９）
項目４２に記載のマウスから単離される、単一ドメイン抗原結合タンパク質。
（項目１００）
項目７１に記載の方法に従って生成される、単一ドメイン抗原結合タンパク質。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１Ａ−Ｃ】図１Ａは、ＣＨ１ドメインを欠いているＩｇＧ１を発現する遺伝子改変されたマウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座を作製するためのマウスのＩｇＧ１遺伝子、ＩｇＧ２ｂ及びＩｇＧ２ａ遺伝子のターゲティングを示す図である（縮尺は正確ではない）。ヒト免疫グロブリン重鎖Ｖ、Ｄ及びＪセグメント（白抜きの三角で示す）をマウス定常遺伝子座に挿入する。ここで、ＩｇＧ１  ＣＨ１エキソン＊及びＩｇＧ２ａ／２ｂ＊＊は欠失しており、楕円はエンハンサーを表す。図１Ｂは、単一の再構成されたヒトＶＬ／ＪＬ遺伝子配列＊＊＊を含むマウス免疫グロブリン軽鎖遺伝子座を示す図である（縮尺は正確ではない）。図１Ｃは、図１Ｂ及び１ＣのＩｇ遺伝子座を有するマウスが発現したＩｇＭを示す図であり、ここで、ＩｇＭはインタクトなＣＨ１ドメインを含んでいる。図１Ｃは、クラススイッチされると、図１Ａ及び１ＣのＩｇ遺伝子座を有するマウスが発現したＩｇＧ１が、ＣＨ１ドメインを欠いている単一ドメイン重鎖抗原結合タンパク質であることも示す。
【図２】図２は、２つのユニバーサル軽鎖のゲノム構造を示し、一方はＶκ１−３９Ｊκ５を含む単一の再構成されたヒト可変領域を含み、他方はＶκ３−２０Ｊκ１を含む単一の再構成されたヒト可変領域を含む（縮尺は正確ではない）。
【図３】図３は、マウスの野生型ＩｇＧ１遺伝子座（ＩｇＧ１、上）の図であり、ＣＨ１遺伝子セグメントに融合されたＪＨ領域遺伝子セグメント、続いてヒンジ領域、ＣＨ２遺伝子セグメント及びＣＨ３遺伝子セグメント；ＣＨ１ドメインを欠失させるコンストラクトによりターゲティングされたＩｇＧ１遺伝子座（ＩｇＧ１ΔＣＨ１；Ｉ）；ＣＨ１ドメイン及びヒンジ領域の両方を欠失させるコンストラクトによりターゲティングされたＩｇＧ１遺伝子座（ＩｇＧ１ΔＣＨ１−Δヒンジ；ＩＩ）；ＩｇＧ１  ＣＨ１ドメイン、ＩｇＧ２ｂ及びＩｇＧ２ａを欠失させるコンストラクトによりターゲティングされた定常領域遺伝子座（ＩｇＧ１ΔＣＨ１ΔＩｇＧ２ｂ／２ａ；ＩＩＩ）；ＩｇＧ１  ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＩｇＧ２ｂ及びＩｇＧ２ａを欠失させるコンストラクトによりターゲティングされた定常領域遺伝子座（ＩｇＧ１ΔＣＨ１＆ΔヒンジΔＩｇＧ２ｂ／２ａ；ＩＶ）；またはＩｇＧ１  ＣＨ１ドメイン、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ３、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、及び場合によってはヒンジ領域を欠失させるコンストラクトによりターゲティングされた定常領域遺伝子座（ＩｇＧ１ΔＣＨ１ΔＩｇＧ２ｂ／２ａΔＩｇＧ３ΔＩｇＤ／Ａ／Ｅ（場合によってはΔヒンジ）；Ｖ）を示す。この遺伝子座の略図は正確な寸法ではない。マウスはその系統に応じてＩｇＧ２ａ対立遺伝子またはＩｇＧ２ｃ対立遺伝子のいずれかを有する場合があるので、ＩｇＧ２ａ／ｃは、ＩｇＧ２ａ遺伝子座またはＩｇＧ２ｃ遺伝子座のいずれかを指す。
【図４Ａ−Ｂ】図４Ａは、ヒト重鎖可変遺伝子セグメント（白抜き三角）を含み、且つ機能的ＩｇＧ１  ＣＨ１ドメインを欠いており、更にＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂ遺伝子座を欠いている遺伝子改変された遺伝子座（一部の実施形態では、１６７３と呼ぶ）を作製するためのマウス重鎖配列のターゲティングを示す図である（縮尺は正確ではない）。図４Ｂは、ＣＨ１ドメイン及びヒンジを欠いているＩｇＧ１を発現する遺伝子改変された遺伝子座（一部の実施形態では、１５７６と呼ぶ）作製するためのマウスＩｇＧ１遺伝子（可変遺伝子セグメントは全てマウスであり、塗り潰しの三角で示す）のターゲティングを示す図である（縮尺は正確ではない）。
【図４Ｃ】図４Ｃは、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＥ及びＩｇＡ遺伝子セグメントを欠いている遺伝子改変された遺伝子座を作製するためのマウス重鎖定常領域のターゲティングングを示す図である（ＩｇＧ１ΔＣＨ１ΔＩｇＧ２ｂ／ＩｇＧ２ａ、ΔＩｇＧ３、ΔＩｇＤ／Ａ／Ｅのクローニングの第一部であり、図４Ｄに続く）（縮尺は正確ではない）。ヒト可変遺伝子セグメントを白抜き三角で示す。
【図４Ｄ】図４Ｄは、ヒト重鎖可変遺伝子セグメント、完全な機能的ネズミＩｇＭ遺伝子領域、及び機能的ＣＨ１ドメインを欠いており、且つ場合によっては機能的ヒンジ領域を欠いているＩｇＧ１遺伝子領域を含む遺伝子改変された遺伝子座を作製するための図４Ｃのマウス定常領域のターゲティングを示す図である（このマウスは、ＩｇＧ２ｂ／ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ３、及びＩｇＤ／Ａ／Ｅも欠いている。一部の実施形態では６１８０と呼ぶ）（縮尺は正確ではない）。ヒト可変遺伝子セグメントを白抜き三角で示す。
【図５Ａ】図５Ａは、βガラクトシダーゼ（βｇａｌ）を用いた免疫化前後の種々の単一ドメインＩｇＧ１マウス間の総血清ＩｇＧ１力価の比較を示す図である：マウスカッパ鎖を有するｍＶＨＩｇＧ１ΔＣＨ１＆ヒンジについてホモ接合性のマウス（１５７６）；単一の再構成された軽鎖Ｖκ３−２０Ｊκ１  ＵＬＣであるカッパ鎖を有するｍＶＨＩｇＧ１ΔＣＨ１＆ヒンジについてホモ接合性のマウス（１５７６／１６３５）；または同じ遺伝子的バックグラウンドを有する野生型（ＷＴ）マウス。ＨＯは遺伝子改変についてホモ接合性である。
【図５Ｂ】図５Ｂは、ｍＶＨＩｇＧ１ΔＣＨ１＆ヒンジホモ接合マウスヒンジホモ接合マウス（１５７６ＨＯ）またはｍＶＨＩｇＧ１ΔＣＨ１−ヒンジ  ｘ  Ｖκ３−２０Ｊκ１  ＵＬＣ１ホモ接合マウス（１５７６ＨＯ  １６３５ＨＯ）と比較した、免疫化ＷＴマウスの抗原特異的ＩｇＧ１血清力価を示す。モデル抗原としてβガラクトシダーゼ（βｇａｌ）を用いてマウスに免疫し、ＥＬＩＳＡによって抗原特異的ＩｇＧ１力価を測定した。
【図６】図６は、２匹のｈＶＨＩｇＧ１ΔＣＨ１＆ヒンジΔＩｇＧ２ｂ／２ａ  ｘ  Ｖκ１−３９Ｊκ５  ＵＬＣホモ接合マウス（１８５９ＨＯ  １６３３ＨＯ）、３匹のｈＶＨＩｇＧ１ΔＣＨ１ΔＩｇＧ２ｂ／２ａ  ｘ  Ｖκ３−２０Ｊκ１  ＵＬＣホモ接合マウス（１６７３ＨＯ  １６３５ＨＯ）及びヒト可変領域（ＶＨ及びＶκ）を有する３匹のＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）対照マウス（ＶＩ３  ＩｇＧ１）からのマウス血清の、非還元条件下で調製し、抗マウスＩｇＧにより可視化したウエスタンブロット画像を、二量体単一ドメイン抗原結合タンパク質（３７−３７ホモ二量体）または単量体ΔＣＨ１単一ドメイン結合タンパク質（ＣＨ１ヒンジ欠失単鎖）のマウス定常領域を含んで示す。
【図７】図７は、ｈＶＨＩｇＧ１ΔＣＨ１ΔＩｇＧ２ｂ／２ａ  ｘ  Ｖκ１−３９Ｊκ５ホモ接合マウス（１６７３Ｘ１６３３）またはｈＶＨＩｇＧ１ΔＣＨ１ΔＩｇＧ２ｂ／２ａ  ｘ  Ｖκ３−２０Ｊκ１ホモ接合マウス（１６７３Ｘ１６３５）の、細胞表面タンパク質である抗原Ｘを用いた腹腔内免疫化後の異なる時点（ｘ軸）における動物の血漿に見られるＩｇＧ１力価（ｙ軸）を示す。
【図８】図８は、３匹のｈＶＨＩｇＧ１ΔＣＨ１ΔＩｇＧ２ｂ／２ａΔＩｇＧ３ΔＩｇＤ／Ａ／Ｅ  ｘ  Ｖκ１−３９Ｊκ５  ＵＬＣホモ接合マウス（６１８０ＨＯ  １６３４ＨＯ）、２匹のｈＶＨＩｇＧ１ΔＣＨ１ΔＩｇＧ２ｂ／２ａΔＩｇＧ３ΔＩｇＤ／Ａ／Ｅホモ接合マウス（６１８０ＨＯ）及びヒト可変領域（ＶＨ及びＶκ）を有する３匹のＶＩ３対照マウスからのマウス血清の、非還元条件下で調製し、抗マウスＩｇＧにより可視化したウエスタンブロット画像を二量体単一ドメイン抗原結合タンパク質（３７−３７ホモ二量体）または単量体ΔＣＨ１単一ドメイン結合タンパク質（ＣＨ１欠失単鎖）のマウス定常領域を含んで示す。
【図９】図９は、ｈＶＨＩｇＧ１ΔＣＨ１ΔＩｇＧ２ａ／２ｂΔＩｇＧ３ΔＩｇＤ／Ａ／Ｅ  ｘ  Ｖκ１−３９Ｊκ５（６１８０ＨＯ  ｘ  １６３４ＨＯ）マウス及びｈＶＨＩｇＧ１ΔＣＨ１ΔＩｇＧ２ａ／２ｂΔＩｇＧ３ΔＩｇＤ／Ａ／Ｅ（６１８０ＨＯ）及びＶＩ３対照動物の血漿中の定常状態のＩｇＭ及びＩｇＧの濃度を示す図である。
【図１０】図１０は、代表的なホモ接合性対照ＶＩ３及びｈＶＨＩｇＧ１ΔＣＨ１ΔＩｇＧ２ａ／２ｂΔＩｇＧ３ΔＩｇＤ／Ａ／Ｅ（６１８０ＨＯ）ｘ  Ｖκ１−３９Ｊκ５（６１８０ＨＯ  １６３４ＨＯ）マウスからのＣＤ１９及びＣＤ３について染色したシングレットにゲートした脾細胞の等高線図を示す（Ａ）。また、代表的な対照のＶＩ３マウス及び代表的なホモ接合性ｈＶＨＩｇＧ１ΔＣＨ１ΔＩｇＧ２ａ／２ｂΔＩｇＧ３ΔＩｇＤ／Ａ／Ｅ  ｘ  Ｖκ１−３９Ｊκ５（６１８０ＨＯ  ｘ  １６３４ＨＯ）マウスからの免疫グロブリンＤ（ＩｇＤ）及び免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）について染色したＣＤ１９＋  Ｂ細胞にゲートした脾細胞の等高線図も示す（Ｃ）。特記すべきは、Ｂ細胞はＩｇＤ定常ドメインが欠失しているのでＩｇＤ−であることである。したがって、この図の「成熟」という用語はＩｇＤが存在しないことを示しているに過ぎず、他の非ＩｇＭ免疫グロブリンが存在しないことを示すものではない。各群からの代表的な３匹のマウスのＣＤ１９＋Ｂ細胞（ｙ軸線；細胞／脾臓×１０７）の総数を示すグラフも提供する（Ｂ）。等高線図に含まれた動物を丸で囲む。
【図１１】図１１は、（Ａ）ＣＤ９３及びＢ２２０について染色した脾臓から単離したＣＤ１９＋ゲートＢ細胞、（Ｂ）ＩｇＭ及びＣＤ２３について染色した未成熟または成熟ゲートＢ細胞または（Ｃ）代表的な対照のＶＩ３マウス及び代表的なホモ接合性ｈＶＨＩｇＧ１ΔＣＨ１ΔＩｇＧ２ａ／２ｂΔＩｇＧ３ΔＩｇＤ／Ａ／Ｅ  ｘ  Ｖκ１−３９Ｊκ５（６１８０ＨＯ  ｘ  １６３４ＨＯ）マウスからのＣＤ２１／３５及びＩｇＭについて染色した未成熟または成熟ゲートＢ細胞の各等高線を示す。
【図１２】図１２は、ＣＤ１９及びＣＤ３で染色した代表的な対照のＶＩ３マウス及び代表的なホモ接合性ｈＶＨＩｇＧ１ΔＣＨ１＆ＩｇＧ２ａ／２ｂΔＩｇＧ３ΔＩｇＤ／Ａ／Ｅ  ｘ  Ｖκ１−３９Ｊκ５（６１８０ＨＯ  ｘ  １６３４ＨＯ）マウスの大腿骨から単離した骨髄の等高線を示す。各群からの代表的な３匹のマウスの大腿骨１本当たりの細胞またはＣＤ１９＋Ｂ細胞の総数も示す（ｙ軸線；細胞数／大腿骨×１０７）。等高線図に含まれた動物を丸で囲む。
【図１３】図１３は、ＩｇＭ及びＢ２２０で染色した代表的な対照のＶＩ３マウス及び代表的なホモ接合性ｈＶＨＩｇＧ１ΔＣＨ１ΔＩｇＧ２ａ／２ｂΔＩｇＧ３ΔＩｇＤ／Ａ／Ｅ  ｘ  Ｖκ１−３９Ｊκ５（６１８０ＨＯ  ｘ  １６３４ＨＯ）マウスの大腿骨から単離した骨髄の等高線を示す。各群からの代表的な３匹のマウスの大腿骨１本当たりの成熟（ＩｇＭ＋Ｂ２２０ｈｉ）及び未成熟（ＩｇＭ＋Ｂ２２０ｉｎｔ）Ｂ細胞の総数も示す（ｙ軸線；細胞数／大腿骨×１０７）。等高線図に含まれた動物を丸で囲む。
【図１４Ａ−Ｂ】図１４Ａは、マウス重鎖遺伝子座を示す略図である（縮尺は正確ではない）。このマウス重鎖遺伝子座は長さが約３Ｍｂであり、約２００個の重鎖可変（ＶＨ）遺伝子セグメント、１３個の重鎖多様性（ＤＨ）遺伝子セグメント及び４個の重鎖連結（ＪＨ）遺伝子セグメント、ならびに、エンハンサー（Ｅｎｈ）及び重鎖定常（ＣＨ）領域を含んでいる。図１４Ｂは、ヒトκ軽鎖遺伝子座の略図を示す（縮尺は正確ではない）。ヒトκ軽鎖遺伝子座は、それぞれ約４４０ｋｂ及び６００ｋｂに亘る反対の極性の遠位コンティグ及び近位コンティグに複製されている。この２つのコンティグ間には、Ｖκ遺伝子セグメントがないと考えられる約８００ｋｂのＤＮＡがある。このヒトκ軽鎖遺伝子座は、約７６個のＶκ遺伝子セグメント、５個のＪκ遺伝子セグメント、１個のイントロンエンハンサー（Ｅｎｈ）及び１個の単一定常領域（Ｃκ）を含んでいる。
【図１５】図１５は、内在性重鎖可変領域遺伝子セグメントが欠失されているマウス重鎖遺伝子座に４０個のヒトＶκ及び５個のヒトＪκ遺伝子セグメントを順に挿入するためのターゲティング戦略を示す図である（縮尺は正確ではない）。ハイグロマイシン（ＨＹＧ）選択カセット及びネオマイシン（ＮＥＯ）選択カセットをリコンビナーゼ認識部位（ＦＲＴ）と共に示す。Ａｄａｍ６ａ遺伝子、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子及びＩＧＣＲ１遺伝子の挿入のためのターゲティング戦略も示す（縮尺は正確ではない）。白抜きの三角でヒト可変遺伝子セグメントを示している。
【図１６】図１６は、図１５の改変されたマウス重鎖遺伝子座（ｈＪκ、４０ｈＶκ、Ａｄａｍ６；上）；図１５の改変されたマウス重鎖遺伝子座からＩｇＧ１遺伝子配列、ＩｇＧ２ｂ遺伝子配列、及びＩｇＧ２ａ遺伝子配列のＣＨ１ドメインの欠失及び／または不活性化（ｈＪκ、４０ｈＶκ、Ａｄａｍ６、ΔＣＨ１、ΔＩｇＧ２ｂ、ΔＩｇＧ２ａ；中）を生じさせるターゲティング戦略、及び再構成されていないヒトＪκ遺伝子セグメント及び４０個のヒトＶκ遺伝子セグメントを含んでいる改変されたマウス重鎖遺伝子座から、選択カセットの欠失を生じさせるターゲティング戦略を示し、改変されたマウス重鎖遺伝子座はＩｇＧ１遺伝子において機能的ＣＨ１ドメインを欠いており、機能的ＩｇＧ２ｂ及びＩｇＧ２ａ遺伝子も欠いている（ｈＪκ、４０ｈＶκ、Ａｄａｍ６、ΔＣＨ１、ΔＩｇＧ２ｂ、ΔＩｇＧ２ａ選択カセットの欠失；６０８２とも呼ぶ、下）。白抜きの三角でヒト可変遺伝子セグメントを示している。
【図１７Ａ】図１７Ａは、異なる３群の動物（ｘ軸線）、すなわち野生型（ＷＴ）マウス、図１６の改変された重鎖遺伝子座についてホモ接合性のマウス（ｈＪκ、４０ｈＶκ、Ａｄａｍ６、ΔＣＨ１ΔＩｇＧ２ｂΔＩｇＧ２ａ選択カセット欠失；ＫｏＨ  ＣＨ１  ｄｅｌ）、及びヒト重鎖Ｖ、Ｄ及びＪセグメントを発現し、ＩｇＧ１遺伝子において機能的ＣＨ１ドメインを欠き、更に機能的ＩｇＧ２ｂ遺伝子及びＩｇＧ２ａ遺伝子も欠き、且つ単一の再構成された軽鎖遺伝子座を含む、改変されたマウス重鎖遺伝子座について双方ホモ接合性のマウス（ＣＨ１  ｄｅｌ  ｘ  ＵＬＣ）の脾臓及び骨髄から単離したＢ細胞による相対的ｍＲＮＡ発現（ＨＰＲＴ１ｍＲＮＡに正規化；ｙ軸線）を示す。プローブは生産的な再構成を検出するために設計され、ヒトＪκセグメントとネズミＩｇＧ１ヒンジとの間の組み換えを検出したプローブ（ｈＪｋ／ｍＩｇＧ１ヒンジプローブ；左パネル）あるいはヒトＪＨセグメントとネズミＩｇＧ１ヒンジの間の組換えを検出したプローブ（ｈＪＨ／ｍＩｇＧ１ヒンジプローブ；右パネル）から構成された。ＮＤ＝検出せず（Ｃｔ≧３５）。ＷＴについてｎ＝２、ＫｏＨ  ＣＨ１  ｄｅｌについてｎ＝２及びＣＨ１  ｄｅｌ  ｘ  ＵＬＣについてｎ＝３。
【図１７Ｂ】図１７Ｂは、異なる３群の動物（ｘ軸線）、すなわち野生型（ＷＴ）マウス、図１６の改変された重鎖遺伝子座についてホモ接合性のマウス（ｈＪκ、４０ｈＶκ、Ａｄａｍ６、ΔＣＨ１ΔＩｇＧ２ｂΔＩｇＧ２ａ選択カセット欠失；ＫｏＨ  ＣＨ１  ｄｅｌ）、及びヒト重鎖Ｖ、Ｄ及びＪセグメントを発現し、ＩｇＧ１遺伝子配列において機能的ＣＨ１ドメインを欠き、更に機能的ＩｇＧ２ｂ遺伝子配列及びＩｇＧ２ａ遺伝子配列も欠き、且つ単一の再構成された軽鎖遺伝子座を含む、改変されたマウス重鎖遺伝子座について双方ホモ接合性のマウス（ＣＨ１  ｄｅｌ  ｘ  ＵＬＣ）の脾臓及び骨髄から単離したＢ細胞による相対的ｍＲＮＡ発現（ｍカッパＣ  ｍＲＮＡに正規化；ｙ軸線）を示す。プローブは生産的な再構成を検出するために設計され、ヒトＪκセグメントとネズミＩｇＧ１ヒンジとの組み換えを検出したプローブ（ｈＪκ／ｍＩｇＧ１ヒンジプローブ；左パネル）あるいはヒトＪＨセグメントとネズミＩｇＧ１ヒンジの組換えを検出したプローブ（ｈＪＨ／ｍＩｇＧ１ヒンジプローブ；右パネル）から構成された。ＮＤ＝検出せず（Ｃｔ≧３５）。ＷＴについてｎ＝２、ＫｏＨ  ＣＨ１  ｄｅｌについてｎ＝２、及びＣＨ１  ｄｅｌ  ｘ  ＵＬＣについてｎ＝３。
【図１８】図１８は、３匹のｈＶκＩｇＧ１ΔＣＨ１ΔＩｇＧ２ａ／２ｂ  ｘ  Ｖκ３−２０Ｊκ１  ＵＬＣホモ接合マウス（６０８２ＨＯ  １６３５ＨＯ）、マウス定常領域（ＷＴ）とともにヒト可変領域（ＶＨ及びＶκ）を有する３匹のＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウス（ＶＩ３  ＩｇＧ１）、及び２匹のｈＶＨＩｇＧ１ΔＣＨ１ΔＩｇＧ２ａ／２ｂΔＩｇＧ３ΔＩｇＤ／Ａ／Ｅマウス（６１８０ＨＯ）からのマウス血清の、非還元条件下で調製し、抗マウスＩｇＧにより可視化したウエスタンブロット画像を示し、二量体単一ドメイン抗原結合タンパク質（３７−３７ホモ二量体）または単量体ΔＣＨ１単一ドメイン結合タンパク質（ＣＨ１欠失単鎖）の存在または非存在を表す。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
詳細な説明
本発明は記載する特定の方法及び実験条件に限定されるものではなく、したがって、方法及び条件は変化し得る。本明細書で用いる専門用語は、特定の実施形態を説明する目的のために過ぎず、本発明の範囲は特許請求の範囲によってのみ限定されるので、限定を意図するものでない。
【００４３】
別段に定義していない限り、本明細書で用いる科学技術用語は全て、本発明が属する技術分野の当業者に一般的に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似するか、または等価な任意の方法及び材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、特定の方法及び材料を以下に記載する。本明細書において挙げた刊行物及び特許文書は全て、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００４４】
本発明は、遺伝子改変された非ヒト動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター等）であって、そのゲノム（例えば、その生殖系列）に、単一ドメイン抗原結合タンパク質（ＶＨ単一ドメイン抗原結合タンパク質及びＶＬ単一ドメイン抗原結合タンパク質を含む）をコードしているヌクレオチド配列（複数可）及び／または単一の再構成された軽鎖を含む、遺伝子改変された非ヒト動物、同非ヒト動物の作製方法、ならびに同非ヒト動物を用いる方法を提供する。別途定義されない限り、本明細書に使用される用語及び表現は全て、反対が明確に示されるか、または用語または表現が使用される文脈から明らかでない限り、その用語及び表現が当該技術分野において得ている意味を含む。
【００４５】
「抗体」という用語は、ジスルフィド結合によって相互に接続される４つのポリペプチド鎖、すなわち２つの重（Ｈ）鎖、及び２つの軽（Ｌ）鎖を含んだ、典型的な免疫グロブリン分子を含む。この用語はまた、抗原またはその断片と反応性を有する免疫グロブリンも含む。適した抗体には、限定するものではないが、ヒト抗体、霊長類化抗体、キメラ抗体、モノクローナル抗体、単一特異性抗体、ポリクローナル抗体、多特異性抗体、非特異的抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体、ヒト化抗体、合成抗体、組換え抗体、ハイブリッド抗体、変異抗体、移植された複合抗体（すなわち、他のタンパク質、放射性標識、細胞毒素に結合または融合された抗体）及びインビトロで生成した抗体が挙げられる。当業者であれば、一般的な抗原アイソタイプ、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、及びＩｇＥ、ならびにそれらの任意のサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４）からなる群より選択される重鎖定常領域を有する抗体を容易に認識できよう。
【００４６】
「重鎖」、または「免疫グロブリン重鎖」という表現は、任意の生物からの、免疫グロブリン重鎖定常領域配列を含む、免疫グロブリン重鎖配列を含む。重鎖可変ドメインは、別段に特定されない限り、３つの重鎖ＣＤＲ及び４つのＦＲ領域を含む。重鎖の断片としては、ＣＤＲ、ＣＤＲ及びＦＲ、ならびにそれらの組み合わせが挙げられる。典型的な重鎖は、可変ドメインの次に、（Ｎ末端からＣ末端へ）ＣＨ１ドメイン、ヒンジ、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン及びＣＨ４ドメイン（ＩｇＭまたはＩｇＥに関し）を有する。重鎖の機能的断片は、エピトープを特異的に認識する（例えば、マイクロモル、ナノモル、またはピコモル範囲内のＫＤでエピトープを認識する）ことができ、細胞から発現及び分泌することができ、少なくとも１つのＣＤＲを含む、断片を含む。重鎖可変ドメインは、概して、生殖系列中に存在するＶＨ、ＤＨ、及びＪＨセグメントのレパートリーに由来するＶＨ、ＤＨ、及びＪＨセグメントを含む、可変領域遺伝子配列によってコードされる。種々の生物に関するＶ、Ｄ、及びＪ重鎖セグメントに関する配列、位置、及び命名法は、ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇにあるＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＩＭＧＴ）のウェブサイトで閲覧することができる。
【００４７】
「軽鎖」という表現には、任意の生物からの免疫グロブリン軽鎖配列を含み、また別途特定されない限り、ヒトカッパ及びラムダ軽鎖ならびにＶｐｒｅＢ、ならびにサロゲート軽鎖を含む。軽鎖可変ドメインは、別途に特定されない限り、典型的には３つの軽鎖ＣＤＲ及び４つのフレームワーク（ＦＲ）領域を含む。概して、完全長軽鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端へ、ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４を含む可変ドメイン、及び軽鎖定常領域を含む。軽鎖可変ドメインは、概して、生殖系列中に存在するＶＬ及びＪＬ遺伝子セグメントのレパートリーに由来するＶＬ及びＪＬ遺伝子セグメントを含む軽鎖可変領域遺伝子配列によってコードされる。種々の生物に関するＶ及びＪ軽鎖セグメントに関する配列、位置、及び命名法は、ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇにあるＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＩＭＧＴ）のウェブサイトで閲覧することができる。軽鎖には、例えば、中にそれらが出現するエピトープ結合タンパク質によって選択的に結合される第１または第２のいずれのエピトープとも選択的に結合しないものが含まれる。軽鎖にはまた、中にそれらが出現するエピトープ結合タンパク質によって選択的に結合される１つ以上のエピトープと結合及びそれを認識するか、または重鎖がそのエピトープと結合及びをれを認識するのを助けるものが含まれる。軽鎖という表現は、「ユニバーサル軽鎖」（ＵＬＣ）とも呼ばれる「共通軽鎖」を含む。
【００４８】
共通軽鎖またはユニバーサル軽鎖（ＵＬＣ）には、軽鎖定常領域に作動可能に連結される単一の再構成された免疫グロブリン軽鎖可変領域をコードする配列を含んでいる免疫グロブリン軽鎖遺伝子座に由来するものが含まれ、ここで、該免疫グロブリン軽鎖遺伝子座の発現は、該免疫グロブリン軽鎖遺伝子座に他の核酸配列（例えば、他の軽鎖遺伝子セグメント）を包含しているかに関係なく、軽鎖定常領域に作動可能に連結される単一の再構成された免疫グロブリン軽鎖可変領域由来の軽鎖のみを産生する。ユニバーサル軽鎖には、ヒトＶκ１−３９Ｊκ遺伝子（例えば、Ｖκ１−３９Ｊκ５遺伝子）またはヒトＶκ３−２０Ｊκ遺伝子（例えば、Ｖκ３−２０Ｊκ１遺伝子）が含まれ、それらが体細胞変異（例えば、親和性成熟）したものを含む。
【００４９】
「遺伝子セグメント」または「セグメント」という表現は、Ｖ（軽鎖または重鎖）またはＤもしくはＪ（軽鎖または重鎖）免疫グロブリン遺伝子セグメントの言及を含み、再構成されたＶ／Ｊ（軽）またはＶ／Ｄ／Ｊ配列（重）を形成する再構成（例えば、内因性リコンビナーゼにより媒介される）に関与することができる免疫グロブリン遺伝子座（例えば、ヒト及びマウス）での再構成していない配列を含む。別段の指示がない限り、該Ｖ、Ｄ、及びＪセグメントは、１２／２３ルールに従ったＶ／Ｊ組換えまたはＶ／Ｄ／Ｊ組換えを可能にする組換えシグナル配列（ＲＳＳ）を含む。別段の指示がない限り、該セグメントは更に、天然の、またはその機能的等価物に関連する配列（例えば、Ｖセグメントについてはプロモーター（複数可）及びリーダー（複数可））を含む。
【００５０】
核酸配列に関する「再構成されていない」という用語には、動物細胞の、好適には、遺伝子改変されておらず、例えば野生型ゲノムを含む動物由来の細胞の生殖系列に存在する核酸配列が含まれる。概して、天然の生殖系列構成では、重鎖可変領域は再構成されていないＶＨ遺伝子セグメント、再構成されていないＤＨ遺伝子セグメント及び再構成されていないＪＨ遺伝子セグメントを含み、他方、軽鎖可変領域は再構成されていないＶＬ遺伝子セグメント及び再構成されていないＪＬ遺伝子セグメントを含む。Ｂ細胞の成熟過程中、これらの遺伝子セグメントは再構成して再構成された可変領域遺伝子を産生する。
【００５１】
免疫グロブリン核酸配列に関する「生殖系列」という用語には、後代に引き継がれ得る核酸配列を含む。
【００５２】
「相補性決定領域」という表現または「ＣＤＲ」という用語は、通常（すなわち、野生型動物において）免疫グロブリン分子（例えば、抗体またはＴ細胞受容体）の軽鎖または重鎖の可変領域内の２つのフレームワーク領域間に出現する生物の免疫グロブリン遺伝子の核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含む。ＣＤＲは、例えば、生殖系列配列、または再構成されたもしくは再構成されていない配列によって、例えば、未感作もしくは成熟したＢ細胞もしくはＴ細胞によって、コードされることができる。ＣＤＲは、体細胞変異され得る（例えば、動物の生殖系列でコードされる配列と異なる）、ヒト化され得る、及び／またはアミノ酸置換、付加、もしくは欠失で改変され得る。ある環境では（例えば、ＣＤＲ３に関して）、ＣＤＲは、例えば、連続していない（例えば、再構成されていない核酸配列内で）が、配列のスプライシングまたは接続（例えば、重鎖ＣＤＲ３を形成するようなＶ−Ｄ−Ｊ組換え）の結果、Ｂ細胞核酸配列内で連続している２つ以上の配列（例えば、生殖系列配列）によって、コードされることができる。
【００５３】
「体細胞変異された」という表現は、クラススイッチされたＢ細胞中の免疫グロブリン可変領域の核酸配列（例えば、重鎖可変ドメインをコードするか、または重鎖ＣＤＲまたはＦＲ配列を含むヌクレオチド配列）が、例えば、クラススイッチを受けていないＢ細胞とクラススイッチを受けたＢ細胞との間でのＣＤＲまたはフレームワーク核酸配列の差異など、クラススイッチ以前のＢ細胞中の核酸配列と同一ではない、クラススイッチを受けたＢ細胞からの核酸配列への言及を含む。「体細胞変異された」は、親和性成熟されていないＢ細胞中の対応する免疫グロブリン可変領域配列（すなわち、生殖系列細胞のゲノム中の配列）と同一ではない親和性成熟されたＢ細胞からの核酸配列への言及を含む。「体細胞変異された」という表現はまた、核酸配列が、関心のエピトープへのＢ細胞の曝露以前の対応する核酸配列と異なる、関心のエピトープへのＢ細胞の曝露後のＢ細胞からの免疫グロブリン可変領域核酸配列への言及も含む。「体細胞変異された」という表現は、免疫原攻撃に応答して、例えば、ヒト免疫グロブリン可変領域核酸配列を有するマウスなどの動物において生成され、また係る動物において本来作動する選択プロセスから得られる結合タンパク質からの配列を指す。
【００５４】
「と同族」の意味、例えば、第２のＶＬドメイン「と同族」である第１のＶＬドメインの意味で用いられる場合の「同族」という用語は、本発明に係るマウスにより作製される同じ結合タンパク質に由来する２つのＶＬドメイン間の関係に対する言及を包含することを意図する。例えば、本発明の実施形態に従い遺伝子改変されているマウス、例えば、ＶＨ、ＤＨ、及びＪＨ領域が、ＶＬ領域及びＪＬ領域によって置き換えられた重鎖遺伝子座を有するマウスにより、第１のヒトＶＬドメインと融合している同じマウスＣＨ領域（例えば、ＩｇＭアイソタイプ）で作製されている２つの同一のポリペプチド鎖、ならびに第２のヒトＶＬドメインと融合している同じマウスＣＬ領域で作製されている２つの同一のポリペプチド鎖を有する抗体様結合タンパク質が作製される。マウスにおけるクローン選択の間、単一の抗体様結合タンパク質との関係で共に現れるように、第１及び第２のヒトＶＬドメインを、クローン選択プロセスにより選択した。したがって、クローン選択プロセスの結果として、単一の抗体様分子において共に現れる第１及び第２のＶＬドメインを、「同族」と呼ぶ。これに対し、第１及び第２の抗体様分子が同一の重鎖を有するのでない限り（すなわち、第１のヒト重鎖領域に融合しているＶＬドメインと第２のヒト重鎖領域に融合しているＶＬドメインとが同一でない限り）、第１の抗体様分子において現れるＶＬドメインと第２の抗体様分子において現れるＶＬドメインとは同族ではない。
【００５５】
抗体発生の初期には、抗体重鎖は、種々の選択スキームを経て自然選択により適した重鎖が更なる選択を受けて最終的に機能的親和性成熟抗体が形成される選択プロセスを受ける。重鎖及び軽鎖可変遺伝子再構成から生じる多様性は骨髄で発生し、クラススイッチに先行する。前駆Ｂ細胞（すなわち、プロＢ細胞）の組換えられた重鎖遺伝子セグメントから発現した抗体重鎖は、通常はＩｇＭアイソタイプにおいて、プロＢ細胞の表面上への提示のためにサロゲート軽鎖と対を成し、プレＢ細胞受容体、すなわち、プレＢＣＲと呼ぶ構造（これは他の共受容体を含む）を形成する。プレＢＣＲが該細胞表面上に提示されると、プレＢＣＲは、その複合体の適切な形成を該細胞にシグナル伝達し、該細胞に対して、重鎖がこの初期の選択段階を通過したことを有効に指示すると考えられる。したがって、該細胞には、重鎖が更なる選択を受けるかもしれないことが伝達される。ＩｇＭ及びサロゲート軽鎖に関して提示された場合に重鎖がプレＢＣＲの形成に有害な欠陥を含む場合、該細胞はアポトーシスを受ける。該細胞がアポトーシスを受けると、重鎖の重鎖可変領域の有用性、または多様性への寄与が失われる。したがって、抗体選択の非常に初期の段階では、ＩｇＭアイソタイプに関して重鎖とともにサロゲート軽鎖の提示が必要となる。抗体を産生するＢ細胞の正常な発達には、概して、ＣＨ１ドメインが存在していることが必要である。ＩｇＭなど、重鎖アイソタイプは全てＣＨ１ドメインを含む。サロゲート軽鎖及び同族軽鎖は共に、ＩｇＭに関して重鎖のＣＨ１ドメインを介して所与の重鎖と相互作用すると考えられる。
【００５６】
Ｂ細胞が骨髄から出た後、抗原との会合（細胞表面ＩｇＭとして発現した再構成された抗体間で低親和性の相互作用を必要とする）は、体細胞超変異とクラススイッチの協調的誘導を刺激する。クラススイッチ後、表面Ｂ細胞受容体による差別的な抗原認識によって、元のＩｇＭの超変異誘導体のプールから親和性が増大された抗体を選択することが可能となる。
【００５７】
「重鎖のみの抗体」、「重鎖のみの抗原結合タンパク質」、「単一ドメイン抗原結合タンパク質」、「単一ドメイン結合タンパク質」等の用語は、重鎖定常領域は通常は機能的ＣＨ１ドメインを欠いているために軽鎖と会合することができない重鎖定常領域に作動可能に連結される可変ドメインを含んでいる免疫グロブリン様鎖を含んだ単量体またはホモ二量体免疫グロブリン分子を指す。したがって、「重鎖のみの抗体」、「重鎖のみの抗原結合タンパク質」、「単一ドメイン抗原結合タンパク質」、「単一ドメイン結合タンパク質」等の用語は、（ｉ）機能的ＣＨ１ドメインを欠いている重鎖定常領域に作動可能に連結される可変ドメインを含んでいる免疫グロブリン様鎖の１つを含んだ単量体単一ドメイン抗原結合タンパク質または（ｉｉ）機能的ＣＨ１ドメインを欠いている重鎖定常領域に作動可能に連結される可変ドメインを各々含んでいる２つの免疫グロブリン様鎖を含んだホモ二量体単一ドメイン抗原結合タンパク質の両方を包含する。種々の態様では、ホモ二量体単一ドメイン抗原結合タンパク質は、機能的ＣＨ１ドメインを欠いている同一の重鎖定常領域に作動可能に連結される同一の可変ドメインを各々含んでいる２つの同一の免疫グロブリン様鎖を含む。更に、単一ドメイン抗原結合タンパク質の免疫グロブリン様鎖の各々は、重鎖定常領域遺伝子（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、またはそれらの組み合わせ）のＣＨ１コード配列（及び、場合によっては、ヒンジ領域）において欠失または不活性化変異を含んでいる重鎖定常領域（ＣＨ）遺伝子配列に連結され、重鎖可変領域遺伝子セグメント（例えば、ＶＨ、ＤＨ、ＪＨ）、軽鎖遺伝子セグメント（例えば、ＶＬ、ＪＬ）、またはそれらの組み合わせに由来し得る、可変ドメインを含む。重鎖遺伝子セグメント由来の可変ドメインを含んでいる単一ドメイン抗原結合タンパク質は、「ＶＨ単一ドメイン抗体」または「ＶＨ単一ドメイン抗原結合タンパク質」と呼ばれることもある。軽鎖遺伝子セグメント由来の可変ドメインを含んでいる単一ドメイン抗原結合タンパク質は、または「ＶＬ単一ドメイン抗原結合タンパク質」と呼ばれることもある。
【００５８】
上に開示されたように、単一ドメイン抗原結合タンパク質を産生するように操作された非ヒト動物がそれを産生することによって、従来の抗体に比して、抗原に応答する抗原特異的な単一ドメイン抗原結合タンパク質の発現は比較的低くなる。当該技術からは、再構成された軽鎖の発現がほぼない場合に限り、高力価が可能となることが示唆される。具体的には、再構成された軽鎖を発現しない動物は、抗原と特異的に結合するより高いレベルの単一ドメイン抗原結合タンパク質を産生することができることが明らかとなっている（Ｊａｎｓｓｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）ＰＮＡＳ  １０３：１５１３０−１５１３５；Ｚｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０４：３２７１−３２）。当該技術とは反対に、本明細書に記載のデータは、遺伝子操作された単一の再構成された軽鎖を発現する動物は、攻撃後に高力価の抗原特異的単一ドメイン抗原結合タンパク質を生成することを示している。軽鎖可変領域遺伝子セグメントが再構成されて、ＣＨ１配列における欠失または不活性化変異を含んでいる重鎖定常領域遺伝子と組み換えられて、抗原と特異的に結合することが可能なＶＬ単一ドメイン抗原結合タンパク質をコードすることができることも本明細書に示す。係るＶＬ単一ドメイン抗原結合タンパク質の軽鎖可変ドメインは、再構成された軽鎖可変領域遺伝子配列に例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個以上のＮを付加することにより同族軽鎖の欠損を補うことが可能であり、これは内在性及び修飾されていない免疫グロブリン軽鎖遺伝子座から再構成された軽鎖可変領域遺伝子配列には通常は見られない。
【００５９】
したがって、一態様では、単一ドメイン抗原結合タンパク質及び遺伝子操作された単一の再構成された軽鎖（例えば、共通軽鎖）を含む非ヒト動物が提供され、ここで、該単一ドメイン抗原結合タンパク質の少なくとも１つの重鎖は、機能的ＣＨ１ドメインを欠いている。別の態様では、軽鎖可変領域、及び機能的ＣＨ１ドメインを欠いている重鎖定常領域を含むＶＬ単一ドメイン抗原結合タンパク質を含む非ヒト動物が提供される。別の態様では、軽鎖可変領域、及び機能的ＣＨ１ドメインを欠いている重鎖定常領域を含むＶＬ単一ドメイン抗原結合タンパク質及び遺伝子操作された単一の再構成された軽鎖（例えば、共通軽鎖）を含む非ヒト動物が提供される。遺伝子改変された非ヒト動物の作製方法、該遺伝子改変された非ヒト動物から単離したタンパク質（例えば、単一ドメイン抗原結合タンパク質）細胞、及び該遺伝子改変された動物からのタンパク質及び細胞の単離方法も提供する。
【００６０】
「高親和性」抗体という用語は、その標的エピトープに対して、約１０−９Ｍ以下（例えば、約１×１０−９Ｍ、１×１０−１０Ｍ、１×１０−１１Ｍ、または約１×１０−１２Ｍ）のＫＤを有する抗体を指す。一実施形態では、ＫＤは、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）などの表面プラズモン共鳴によって測定され、別の実施形態では、ＫＤはＥＬＩＳＡによって測定される。
【００６１】
「細胞」という用語は、組換え核酸配列を発現するために好適な任意の細胞を含む。細胞には、原核生物及び真核生物（単細胞または多細胞）の細胞、細菌細胞（例えば、大腸菌、バチルス属種、ストレプトマイセス属種の株など）、マイコバクテリウム細胞、真菌細胞、酵母細胞（例えば、出芽酵母、分裂酵母、Ｐ．パストリス、Ｐ．メタノリカなど）、植物細胞、昆虫細胞（例えば、ＳＦ−９、ＳＦ−２１、バキュロウイルス感染昆虫細胞、キンウワバなど）、非ヒト動物細胞、ヒト細胞、または、例えば、ハイブリドーマもしくはクアドローマなどの細胞融合物が挙げられる。一部の実施形態では、細胞は、ヒト、サル、類人猿、ハムスター、ラット、またはマウス細胞である。一部の実施形態では、細胞は、真核性であり、以下の細胞から選択される：ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ  Ｋ１、ＤＸＢ−１１  ＣＨＯ、Ｖｅｇｇｉｅ−ＣＨＯ）、ＣＯＳ（例えば、ＣＯＳ−７）、網膜細胞、Ｖｅｒｏ、ＣＶ１、腎臓（例えば、ＨＥＫ２９３、２９３ＥＢＮＡ、ＭＳＲ２９３、ＭＤＣＫ、ＨａＫ、ＢＨＫ）、ＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２、ＷＩ３８、ＭＲＣ５、Ｃｏｌｏ２０５、ＨＢ８０６５、ＨＬ−６０、（例えば、ＢＨＫ２１）、Ｊｕｒｋａｔ、Ｄａｕｄｉ、Ａ４３１（表皮性）、ＣＶ−１、Ｕ９３７、３Ｔ３、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、ＳＰ２／０、ＮＳ−０、ＭＭＴ０６０５６２、Ｓｅｒｔｏｌｉ細胞、ＢＲＬ３Ａ細胞、ＨＴ１０８０細胞、骨髄腫細胞、腫瘍細胞、及び前述の細胞に由来する細胞株。一部の実施形態では、細胞は、例えば、ウイルス遺伝子を発現する網膜細胞（例えば、ＰＥＲ．Ｃ６（商標）細胞）など、１つ以上のウイルス遺伝子を含む。
【００６２】
「保存」という用語は、保存的アミノ酸置換を説明するために使用されるとき、類似の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する側鎖Ｒ基を有する別のアミノ酸残基による、アミノ酸残基の置換を含む。概して、保存的アミノ酸置換は、例えば、所望の親和性で標的エピトープと特異的に結合する可変領域の能力など、タンパク質の関心の機能的特性を実質的に変化させないであろう。類似の化学的特性を有する側鎖を有するアミノ酸の群の例としては、脂肪族側鎖、例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシンなど、脂肪族ヒドロキシル側鎖、例えば、セリン及びトレオニンなど、アミド含有側鎖、例えば、アスパラギン及びグルタミンなど、芳香族側鎖、例えば、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンなど、塩基性側鎖、例えば、リジン、アルギニン、及びヒスチジンなど、酸性側鎖、例えば、アスパラギン酸及びグルタミン酸など、ならびに硫黄含有側鎖、例えば、システイン及びメチオニンなどが挙げられる。保存的アミノ酸置換基としては、例えば、バリン／ロイシン／イソロイシン、フェニルアラニン／チロシン、リジン／アルギニン、アラニン／バリン、グルタメート／アスパルテート、及びアスパラギン／グルタミンが挙げられる。一部の実施形態では、保存的アミノ酸置換は、例えば、アラニンスキャニング突然変異生成において使用される、タンパク質内の任意の天然の残基のアラニンでの置換であることができる。一部の実施形態では、参照により本明細書に援用したＧｏｎｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｅｘｈａｕｓｔｉｖｅ  Ｍａｔｃｈｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｎｔｉｒｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：１４４３−４５に開示された、ＰＡＭ２５０対数尤度マトリクスにおいて正の値を有する保存的置換が作製される。一部の実施形態では、置換は、置換が、ＰＡＭ２５０対数尤度マトリクスにおいて非負の値を有する中程度の保存的置換である。
【００６３】
一部の実施形態では、免疫グロブリン軽鎖または重鎖中の残基位置は、１つ以上の保存的アミノ酸置換だけ異なる。一部の実施形態では、免疫グロブリン軽鎖またはその機能的断片（例えば、例えば、Ｂ細胞からの、発現及び分泌を可能にする断片）中の残基位置は、そのアミノ酸配列が本明細書に記載されている軽鎖とは同一ではなく、１つ以上の保存的アミノ酸置換だけ異なる。
【００６４】
「エピトープ結合タンパク質」または「抗原結合タンパク質」という表現は、少なくとも１つのＣＤＲを有し、エピトープを選択的に認識することができる、例えば、約１マイクロモル以下のＫＤ（例えば、約１×１０−６Ｍ、１×１０−７Ｍ、１×１０−９Ｍ、１×１０−９Ｍ、１×１０−１０Ｍ、１×１０−１１Ｍ、または約１×１０−１２ＭのＫＤ）でエピトープと結合することができるタンパク質を含む。治療用エピトープ結合タンパク質（例えば、治療用結合タンパク質）は、ナノモルまたはピコモル範囲内のＫＤを必要とすることが多い。
【００６５】
「機能的断片」という表現は、発現され、分泌されて、マイクロモル、ナノモル、またはピコモル範囲内のＫＤでエピトープと特異的に結合することができる、エピトープ結合タンパク質の断片を含む。特定の認識としては、少なくともマイクロモル範囲、ナノモル範囲、またはピコモル範囲内のＫＤを有することが挙げられる。
【００６６】
配列の比較に関する「同一性」という用語は、当該技術分野において既知である、ヌクレオチド及び／またはアミノ酸配列同一性を測定するために使用することができる複数の異なるアルゴリズムのいずれかによって決定される同一性を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載の同一性は、１０．０の開放ギャップペナルティ、０．１の伸長ギャップペナルティを採用するＣｌｕｓｔａｌＷ  ｖ．１．８３（遅い）配列比較を使用して、且つＧｏｎｎｅｔ類似性マトリクス（ＭＡＣＶＥＣＴＯＲ（商標）１０．０．２、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ  Ｉｎｃ．、２００８）を使用して決定される。「同一性」という用語には、高分子間の、例えば、核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子及び／またはＲＮＡ分子）間及び／またはポリペプチド分子間の全体的な関連性を含む。一部の実施形態では、高分子は、それらの配列が少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％同一の場合に、相互に「実質的に同一」であるとみなされる。当業者には理解されるように、異なる配列においてどの残基が互いに「対応する」かを検討する際に、もう１つの配列に比べた一方の配列における指定された長さのギャップを許容することによることを含む、配列の相同性の程度を決定するために配列の比較を可能にする種々のアルゴリズムを利用することができる。２つの核酸配列間の同一性パーセントの計算は、例えば、最適な比較の目的で２つの配列を整列させることによって行うことができる（例えば、最適な配列比較のために第１及び第２の核酸配列の一方または両方にギャップを導入することができ、比較目的のために、対応していない配列を無視することができる）。ある特定の実施形態では、比較のために整列される配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または実質的に１００％である。対応するヌクレオチドの位置にあるヌクレオチドを次に比較する。第１の配列の位置が、第２の配列にある対応する位置の同じヌクレオチドによって占められている場合、その分子はその位置で同一である。２つの配列間の同一性パーセントは、ギャップの数を考慮し、その２つの配列が共有している同一の位置の数と、２つの配列を最適に整列させるのに導入する必要がある各ギャップの長さとの関数である。２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントを決定するのに有用な代表的アルゴリズム及びコンピュータプログラムとしては、例えば、ＰＡＭ１２０重み残基テーブル、ギャップ長ペナルティ１２及びギャップペナルティ４を用いてＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれているＭｅｙｅｒｓとＭｉｌｌｅｒのアルゴリズム（ＣＡＢＩＯＳ、１９８９、４：１１−１７）が挙げられる。あるいは、２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、例えば、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリクスを利用したＧＣＧソフトウェアパッケージにおけるＧＡＰプログラムを用いて決定することができる。
【００６７】
「マイクロモル範囲」という表現は、１〜９９９マイクロモルを意味することを意図し、「ナノモル範囲」という表現は、１〜９９９ナノモルを意味することを意図し、「ピコモル範囲」という表現は、１〜９９９ピコモル範囲を意味することを意図する。
【００６８】
「作動可能に連結される」という用語は、作動可能に連結される成分がその意図される様式で機能する関係を指す。一例では、タンパク質をコードする核酸配列は、適切な転写調節を保持するように、調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー配列など）に作動可能に連結されてもよい。一例では、免疫グロブリン可変領域（すなわち、Ｖ（Ｄ）Ｊセグメント）の核酸配列は、再構成された免疫グロブリン重鎖または軽鎖配列への配列間の適切な組換えを可能にするように、免疫グロブリン定常領域の核酸配列に作動可能に連結されてもよい。
【００６９】
遺伝子置換に関する「置き換え」という用語は、内在性遺伝子遺伝子座に外来性遺伝子物質を置き、それにより内在性遺伝子の全部または一部をオルソロガスな核酸配列または相同性核酸配列により置き換えることを指す。
【００７０】
「非ヒト動物」という用語は、任意の脊椎動物、例えば、円口類、硬骨魚、軟骨魚類、例えば、サメ及びエイ、両生類、爬虫類、哺乳類、及び鳥類を含むことを意図する。適した非ヒト動物は哺乳類を含む。適した哺乳類には、非ヒト霊長類、ヤギ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ウシ、及びげっ歯類が挙げられる。
【００７１】
本発明の一部の態様では、該非ヒト動物には、小型の哺乳動物、例えば、トビネズミ上科またはネズミの上科のものが挙げられる。一実施形態では、該遺伝子改変された動物はげっ歯類である。一実施形態では、げっ歯類は、マウス、ラット、リス、ヤマアラシ、またはハムスターから選択される。一実施形態では、該げっ歯類はネズミ上科から選択される。一実施形態では、該遺伝子改変された動物は、カンガルーハムスター科（例えば、マウス様ハムスター）、キヌゲネズミ科（例えば、ハムスター、新世界ラット及びマウス、ハタネズミ）、ネズミ科（トゥルーマウス及びラット、アレチネズミ、トゲマウス、タテガミネズミ）、アシナガマウス科（キノボリマウス、イワマウス、ホワイトテールドラット（ｗｈｉｔｅ−ｔａｉｌｅｄ  ｒａｔ）、マダガスカルラット及びマウス）、トゲヤマネ科（例えば、トゲヤマネ）、及びメクラネズミ科（例えば、メクラネズミ（ｍｏｌｅ  ｒａｔｅ）、タケネズミ、及びモグラネズミ）から選択される科に由来する。具体的な実施形態では、該遺伝子改変されたげっ歯類は、トゥルーマウス及びラット（ネズミ科）、アレチネズミ、トゲマウス、及びタテガミネズミから選択される。一実施形態では、該遺伝子改変されたマウスは、ネズミ科の仲間に由来する。一実施形態では、該動物はげっ歯類である。具体的な実施形態では、げっ歯類はマウス及びラットから選択される。一実施形態では、該非ヒト動物はマウスである。
【００７２】
特定の実施形態では、該非ヒト動物は、Ｃ５７ＢＬ／Ａ、Ｃ５７ＢＬ／Ａｎ、Ｃ５７ＢＬ／ＧｒＦａ、Ｃ５７ＢＬ／ＫａＬｗＮ、Ｃ５７ＢＬ／６、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｃ５７ＢＬ／６ＢｙＪ、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＪ、Ｃ５７ＢＬ／１０、Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎ、Ｃ５７ＢＬ／１０Ｃｒ、及びＣ５７ＢＬ／Ｏｌａから選択されるＣ５７ＢＬ系のマウスであるげっ歯類である。別の実施形態では、該マウスは、１２９Ｐ１、１２９Ｐ２、１２９Ｐ３、１２９Ｘ１、１２９Ｓ１（例えば、１２９Ｓ１／ＳＶ、１２９Ｓ１／ＳｖＩｍ）、１２９Ｓ２、１２９Ｓ４、１２９Ｓ５、１２９Ｓ９／ＳｖＥｖＨ、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）、１２９Ｓ７、１２９Ｓ８、１２９Ｔ１、１２９Ｔ２である系統からなる群より選択される１２９系である（例えば、Ｆｅｓｔｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｒｅｖｉｓｅｄ  ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  ｆｏｒ  ｓｔｒａｉｎ  １２９  ｍｉｃｅ，Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  １０：８３６を参照。またＡｕｅｒｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ（２０００）Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｃｈｉｍｅｒａ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  １２９／ＳｖＥｖ−  ａｎｄ  Ｃ５７ＢＬ／６−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅｓも参照のこと）。特定の実施形態では、該遺伝子改変されたマウスは、前述の１２９系と前述のＣ５７ＢＬ／６系との混合である。別の特定の実施形態では、該マウスは、前述の１２９系の混合、または前述のＢＬ／６系の混合である。特定の実施形態では、混合の１２９系は、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）系である。別の実施形態では、該マウスは、ＢＡＬＢ系、例えば、ＢＡＬＢ／ｃ系である。更に別の実施形態では、該マウスは、ＢＡＬＢ系と前述の別の系との混合である。
【００７３】
一実施形態では、該非ヒト動物は、ラットである。一実施形態では、該ラットは、Ｗｉｓｔａｒラット、ＬＥＡ系、Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ系、Ｆｉｓｃｈｅｒ系、Ｆ３４４、Ｆ６、及びＤａｒｋ  Ａｇｏｕｔｉから選択される。一実施形態では、該ラット系は、Ｗｉｓｔａｒ、ＬＥＡ、Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ、Ｆｉｓｃｈｅｒ、Ｆ３４４、Ｆ６、及びＤａｒｋ  Ａｇｏｕｔｉからなる群より選択される系統のうちの２つ以上の混合である。
【００７４】
本明細書で用いる場合「遺伝子操作された」、「遺伝子改変された」等は、核酸配列を人工的に操作、改変及び／または組み換えて、例えば動物によって非天然のポリペプチドを産生させることを含む。
【００７５】
単一ドメイン抗原結合タンパク質を作製するための遺伝子操作動物
本明細書では、（ａ）インタクトなＩｇＭ  ＣＨ１定常領域を保持しながら機能的ＣＨ１ドメインが不活性化及び／または除去された１つ以上の非ＩｇＭ免疫グロブリン定常領域を含む改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座の重鎖可変領域または軽鎖可変領域遺伝子配列によってそれぞれコードされてもよい、単一ドメイン抗原結合タンパク質（例えば、ＶＨまたはＶＬ単一ドメイン結合タンパク質）、及び／または（ｂ）軽鎖遺伝子座の単一の再構成された可変遺伝子配列（例えば、免疫グロブリンカッパ遺伝子座に挿入された単一の再構成されたＶκ：Ｊκ遺伝子配列）によってコードされてもよい、遺伝子操作された単一の再構成された軽鎖を含む遺伝子改変された非ヒト動物を提供する。
【００７６】
抗体はヒト治療薬として有用である。単一ドメイン結合タンパク質もヒト治療薬として有用である。単一ドメイン結合タンパク質は軽鎖を欠いているのでより小型であり、したがって、軽鎖を含む抗体よりも良好な組織浸透を示すが、従来の抗体と比較すると類似するか、またはより有利な薬物動態プロファイルを有し、類似したエフェクター機能が保持されていることが予期される。また、単一ドメイン結合タンパク質はより小型であるので、所与の体積でより高い用量での投与が可能になる。頻繁に使用される結合抗体投与方法は皮下注射であり、所与の投薬量の抗体に対して投与量を低減することにより、患者にとって有益であり、より多い量の皮下注射による合併症及び痛みが回避され得る。
【００７７】
単一ドメイン結合タンパク質の別の利点は、単一の治療薬において、２種類の異なるエピトープに対する特異性を有する免疫グロブリン鎖をヘテロ二量体化することにより二重特異性抗体を作製できることにある。単一ドメイン結合タンパク質は軽鎖を欠いていることから、その他の鎖の結合親和性または特異性を妨げる軽鎖を作り出す軽鎖再構成がないため、二重特異性抗体の作製に特に適している。
【００７８】
ラクダ科、ある特定の種の魚類、及び病理学的状態の観察から、ある環境下では、重鎖定常領域に機能的ＣＨ１ドメインを欠いている結合タンパク質は、同族軽鎖が存在せずに発現され得ることが明らかとなっている。したがって、一実施形態では、結合タンパク質は「単一ドメイン結合タンパク質」と呼ばれることもあり、軽鎖可変領域及び軽鎖定常領域を含む軽鎖がない抗体、すなわち重鎖定常領域を各々含んでいる１つまたは２つのみの免疫グロブリンポリペプチド鎖を含む「重鎖のみの抗体」として当該分野でも公知であり得、ここで、重鎖のみの抗体の免疫グロブリンポリペプチド鎖の少なくとも１つは機能的ＣＨ１ドメインを欠いている。重鎖のみの抗体に関する教示は当該技術に見出され、例えば、ＰＣＴ公報ＷＯ０２０８５９４４、ＷＯ０２０８５９４５、ＷＯ２００６００８５４８、及びＷＯ２００７０９６７７９を参照されたい。参照により本明細書に援用する米国特許第５，８４０，５２６号；米国特許第５，８７４，５４１号；米国特許第６，００５，０７９号；米国特許第６，７６５，０８７号；米国特許第５，８００，９８８号；ＥＰ１５８９１０７；ＷＯ９７３４１０３；及び米国特許第６，０１５，６９５号も参照されたい。
【００７９】
重鎖のみの抗原結合タンパク質を産生するように遺伝子改変された非ヒト動物は当該分野では公知である。例えば、Ｊａｎｓｓｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）ＰＮＡＳ  １０３：１５１３０−１５１３５；Ｚｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０４：３２７１−３２を参照されたい。例えば、例えば免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）遺伝子において機能的ＣＨ１配列を欠いているように遺伝子改変されている動物、特にげっ歯類（例えば、マウス）は、次いで単一ドメイン抗原結合タンパク質を発現した。
【００８０】
ラクダ類、ある特定の種の魚類及び病理学的状態における観察結果により、ある状況下では、同族軽鎖の非存在下では、重鎖定常領域のＣＨ１ドメインを欠いている結合タンパク質が発現され得ることが示されているが、抗体産生Ｂ細胞の正常な発生には、一般的にＣＨ１ドメインの存在が必要とされる。ＩｇＭを含む重鎖アイソタイプには全てＣＨ１ドメインが含まれている。サロゲート軽鎖及び同族軽鎖は共に、ＩｇＭの状況では重鎖のＣＨ１ドメインを介して所与の重鎖と相互作用すると考えられている。単一ドメイン結合タンパク質の発生がＩｇＭアイソタイプ重鎖の構造の完全性または機能性に依存するという点で、ＩｇＭの構造の完全性または機能のかく乱は望ましくないであろう。
【００８１】
抗体の正常な発生には、抗体が、機能的で有用な抗体の残存及び最終的な発現をもたらす数多くの複雑な選択スキームを経て残存することが必要になる。抗体構造のかく乱は、該構造のかく乱によって抗体が１つ以上の自然な抗体選択スキームの要求を満たして有効に競合して進化する能力の消失がもたらされるという点で、抗体の残存及び最終的な発現に有害であると示されることもあり得る。
【００８２】
抗体発生の初期では、抗体重鎖は、様々な選択スキームを経て自然選択により適当な重鎖が更なる選択を受けて最終的に機能的の親和性成熟抗体が形成される選択プロセスを受ける。前駆Ｂ細胞（すなわち、プロＢ細胞）内で組換えを受けた重鎖遺伝子セグメントから発現された抗体重鎖は、通常、ＩｇＭアイソタイプにおいて、プロＢ細胞の表面上への提示のためにサロゲート軽鎖と対を形成し、プレＢ細胞受容体、すなわち、プレＢＣＲと称される構造（これは、他の共受容体を含む）を形成する。プレＢＣＲが該細胞表面上に提示されたら、プレＢＣＲは、その複合体の適切な形成を該細胞にシグナル伝達し、該細胞に対して、重鎖がこの初期の選択段階を通過したことを有効に指示すると考えられている。したがって、該細胞には、重鎖が更なる選択を受けるかもしれないことが情報伝達される。重鎖が、ＩｇＭ及びサロゲート軽鎖の状況において提示された場合にプレＢＣＲの形成に有害な欠陥を含む場合、該細胞はアポトーシスを受ける。該細胞がアポトーシスを受けると、重鎖の重鎖可変領域の有用性、または多様性に対する寄与が失われる。したがって、抗体選択の非常に初期の段階では、ＩｇＭアイソタイプの状況で重鎖とともにサロゲート軽鎖の提示が必要とされる。サロゲート軽鎖はＩｇＭと、少なくとも部分的にＩｇＭのＣＨ１ドメインを介して相互作用すると考えられている。この初期の接合部（例えば、非機能的ＣＨ１ドメイン）における抗体構造の機能不全またはかく乱により、クローン選択機能不全、重鎖を発現するプロＢ細胞の消失、及び有用な抗体において特定の重鎖可変ドメインが使用される可能性の消失がもたらされ得る。
【００８３】
プレＢＣＲを有する細胞がこの選択段階を経たら、次の選択段階で、重鎖は同族の軽鎖（例えば、マウス及びヒトのκまたはλのいずれか）と対合することが必要とされる。対合した重鎖／同族の軽鎖構造は、細胞、ここでは、ＩｇＭのＣＨ１ドメインを通してＩｇＭアイソタイプの状況において、ナイーブなプレＢ細胞の表面上に再度提示される。この表面上の複合体により、機能的な膜結合型Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）がもたらされる。このＢＣＲは、細胞に、該重鎖が更なる選択に適していること、及び該細胞は、今度は、この特定の軽鎖を発現するように確定され得、更なるＢ細胞成熟段階（例えば、親和性成熟及びクラススイッチを含む）に進み得ることをシグナル伝達すると考えられている。重鎖が、ＩｇＭ及びその同族の軽鎖の状況で提示された場合にＢＣＲの形成に対して有害な欠陥を含む場合、該細胞はアポトーシスを受ける。該細胞がアポトーシスを受けると、該重鎖の重鎖可変領域の有用性または多様性に対する寄与が失われる。したがって、抗体選択の非常に初期の段階では、重鎖とともにＩｇＭアイソタイプの状況の同族軽鎖の提示が必要とされる。この場合も、この初期の接合部の抗体構造（例えば、非機能的ＣＨ１ドメイン）の欠損またはかく乱により、クローン選択の失敗及び該重鎖を発現するプレＢ細胞の付随的な消失がもたらされることがあり得る。
【００８４】
ここまでの選択に残ったら、ＩｇＭの状況において同族の軽鎖と対合している該重鎖を提示しているプレＢ細胞は、次いで成熟プロセスを受け、該プロセスにより、最終的にクラススイッチ、及び該重鎖と同族の軽鎖がＩｇＧアイソタイプの状況でＢ細胞表面上に提示される更なる選択機構がもたらされる。ＣＨ１ドメインを欠いている、またはＣＨ１ドメインとヒンジ領域を欠いているＩｇＧ重鎖の選択が起こるのは、この段階となるであろう。本発明に係る動物では、重鎖遺伝子座の可変領域の増大したレパートリーが、可変ドメインが残って、ＣＨ１ドメインを欠いているか、またはＣＨ１ドメインとヒンジ領域を欠いているＩｇＧ重鎖に発現され得るかどうかに基づいた選択に利用可能であり得ると考えられる。対照的に、機能が損なわれたＩｇＭを有するマウスは、機能が損なわれたＩｇＭの状況で選択に残り得る可変領域のみがクラススイッチに利用可能となり得るため、おそらく、重鎖可変領域の完全なレパートリーを提示しないであろう。
【００８５】
したがって、機能的ＩｇＭを欠いている動物では、そうでない場合には適した重鎖可変遺伝子セグメントの再構成後にＢ細胞集団を作製する能力の著しい低下が起こり得る。そのような場合、豊富な供給量の可変領域が利用可能である（すなわち、再構成可能であり、重鎖定常領域に（例えば、重鎖免疫グロブリン遺伝子座において）作動的に連結可能な適した数の可変領域遺伝子セグメントを有する場合であっても、選択プロセス中の該重鎖の残存を抑制するＩｇＭの欠陥のため、望ましい度合の多様性を示す十分なＢ細胞集団が形成されないことがある。
【００８６】
対象免疫原で非ヒト動物に免疫することによる抗体の作製に十分な多様性をもたらすために、Ｂ細胞発生中に提示されたときにＩｇＭの状況で有効に選択に残り得る適当な数の再構成された重鎖免疫グロブリン遺伝子座の可変領域が維持されていることが望ましい。したがって、免疫グロブリン重鎖に非機能的ＣＨ１ドメインまたは非機能的ＣＨ１ドメイン及び場合によっては非機能的ヒンジ領域を含む遺伝子改変された非ヒト動物は、ＩｇＭ対立遺伝子の一方または両方にＣＨ１欠失を含むべきではない。本明細書に参照により援用するＵＳ２０１１／０１４５９３７に開示されている係る動物は、ＣＨ１ドメインが欠失または不活性化されているＩｇＧ定常遺伝子領域へのクラススイッチを呈し、抗原によって刺激され選択されるために、１）折り畳まれて、軽鎖パートナーなしに細胞表面に発現し、且つ２）軽鎖のない場合にも抗原を認識する単一ドメインの表面ＩｇＧ（Ｂ細胞受容体）を発現する。
【００８７】
本発明の種々の実施形態では、単一ドメイン抗原結合タンパク質（例えば、限定するものではないがＶＨ及びＶＬ単一ドメイン結合タンパク質）を含む、ＣＨ１ドメインを欠いている結合タンパク質を作る遺伝子改変された非ヒト動物を提供する。該遺伝子改変された非ヒト動物は、機能的免疫グロブリン重鎖ドメイン（ＣＨ１ドメイン）、例えば、ＩｇＧ１  ＣＨ１ドメインの欠損を含む遺伝子改変を含んでもよく、一部の実施形態では、機能的ＣＨ１ドメインを欠いている該免疫グロブリン重鎖においてヒンジ領域の欠失を含む更なる改変を含むものであり、該非ヒト動物は機能的ＩｇＭを発現する。他の改変には、ＩｇＧ１及びＩｇＭ以外のアイソタイプを非機能的にすること、例えば、ＩｇＤ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｃ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＡ、及びＩｇＥに対して遺伝子における欠失、または遺伝子の欠失、あるいは遺伝子における不活性化変異（ＩｇＤ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｃ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＡ、及びＩｇＥのＣＨ１ドメインまたはヒンジ領域の欠失または不活性化変異など）を行うことが挙げられる。該非ヒト動物、非ヒト胚、及び細胞を作成するための遺伝子改変された非ヒト胚、細胞、及びターゲティングコンストラクトも提供する。
【００８８】
ＶＨドメイン（例えば、内在性またはヒトＶＨドメイン）またはＶＬドメイン（例えば、ヒトＶＬドメイン）を含んでいてもよい、単一ドメイン抗原結合タンパク質を含む、免疫グロブリンＣＨ１ドメイン（及び場合によってはヒンジ領域）を欠いている結合タンパク質を作る動物を作製するための組成物及び方法も提供する。本方法には、選択的に、内在性非ＩｇＭ  ＣＨ１領域を（例えば、ＣＨ１ドメインの配列の欠失または不活性化によって）非機能的にし、内在性可変領域遺伝子座において再構成されていない内在性重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）遺伝子セグメント、再構成されていないヒト可変領域（ｈＨＣＶＲ）遺伝子セグメント、または再構成されていないヒト軽鎖可変領域（ｈＬＣＶＲ）のいずれかを利用して非ヒトにおいてキメラヒト結合タンパク質を作成することを含む。ＣＨ１ドメインの欠失は、１つ以上の免疫グロブリン定常領域遺伝子（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＤ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｃ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＡ、またはＩｇＥ遺伝子）において行われるが、ＩｇＭ遺伝子では行われない。欠失がＩｇＧにある一実施形態では、このアプローチは、機能的ＩｇＭを保持したままで、１つ以上のＩｇＧ  ＣＨ１ドメインを選択的に非機能的にする。１つ以上のＩｇＧ  ＣＨ１ドメインの欠失に加え、更なる実施形態は、機能的ＣＨ１ドメインを欠いているＩｇＧ（複数可）のヒンジ領域（複数可）を欠失させるか、または非機能的にする。
【００８９】
この特定の実施形態では、ＩｇＧ  ＣＨ１欠失アプローチは、遺伝子改変された非ヒト動物のＩｇアイソタイプの全てが非機能的ＣＨ１またはＣＨ１ドメイン（及び場合によってはヒンジ）の欠失を呈するというわけではないので、動物の天然のＢ細胞発生において比較的保存的なかく乱を利用する。したがって、上記のように、ＣＨ１改変はＩｇＭ分子では生じず、したがって、機能的ＣＨ１を有するＩｇＭに依存するＢ細胞発生の初期の段階に影響を及ぼさない。ＩｇＭは改変されないので、ＩｇＧのＣＨ１ドメイン（及び任意選択でＩｇＧのヒンジ領域）の１つ以上の欠失を有するが、ＩｇＭのＣＨ１ドメインの欠失は有しない動物では、ＩｇＧの状況の可変ドメインの提示前に、クローン選択段階において、可変領域の満足できる大量のレパートリーがプロセッシングされ得るはずである。したがって、種々の実施形態において、単一ドメイン結合タンパク質における使用に利用可能な可変領域の多様性に対する遺伝子改変（複数可）のいずれの有害な影響によっても、ＩｇＧに関連する選択に利用可能な可変領域のプールは、マイナスの影響を受けないはずである。更に、生殖系列において非機能的にされる（例えば、欠失される）ＣＨ１配列がＩｇＧ１である場合、該動物は、ＣＨ１ドメインをコードするＲＮＡの作製能を欠くこととなる。
【００９０】
非ヒト動物を遺伝的に改変して、１つ以上の非ＩｇＭ免疫グロブリンアイソタイプのＣＨ１ドメインまたはＣＨ１ドメイン及び場合によってはヒンジ領域を非機能的にすれば、Ｖ領域遺伝子セグメント（例えば、ＶＨまたはＶＬ領域）の完全または実質的に完全なレパートリーから、単一ドメイン結合タンパク質において発現するのに適したＶ領域を選択することのできる動物が得られるかもしれない。ＩｇＧアイソタイプを選択的に改変する（しかしＩｇＭは改変しない）ことで、ＩｇＭにおけるＣＨ１ドメインの欠落またはＣＨ１ドメインの欠落により選択を生き残る可変領域の数が減る可能性が回避される。したがって、ＩｇＧ（ＣＨ１ドメインを欠いているか、またはＣＨ１ドメインを欠き且つヒンジ領域を欠いている）に関する選択にＶ領域のより完全なレパートリーが利用できる。したがって、本発明に係る遺伝子改変された動物のＶドメインの選択は、例えば、どのＶドメインが改変されたＩｇＭ構造に起因する初期ＩｇＭ依存性Ｂ細胞発生上の障害を克服するのに有用であり得るかには左右されない。それに代わって、初期ＩｇＭ依存性の段階は正常に生じるはずであり、その結果、ＣＨ１ドメインを欠いているか、またはＣＨ１ドメインを欠き且つヒンジ領域を欠いているＩｇＧに関して発現するその適合性に関する選択に利用可能な重鎖の大きなレパートリーが得られる。
【００９１】
したがって、種々の実施形態では、本発明による遺伝子改変動物では機能的ＩｇＭの発現が維持されるはずであり、これにより、より自然なクローン選択プロセスの機会がもたらされるはずである。例えば、機能的ＩｇＭ（例えば、機能的ＣＨ１ドメインを含むＩｇＭ）がある場合、サロゲート軽鎖と同族の軽鎖の両方がＩｇＭのＣＨ１ドメインを介して結合することができ、初期のＢ細胞発生における選択プロセスに関与することができる。本発明による遺伝子改変動物では、ＩｇＧアイソタイプへのクラススイッチが最初の選択段階であり、ここでは、機能的ＣＨ１ドメインを欠いているか、または機能的ＣＨ１ドメインと機能的ヒンジを欠いている定常ドメインの状況で発現され得る重鎖可変ドメインの任意の選択がみられると考えられる。
【００９２】
種々の実施形態では、ＣＨ１ドメインにおける欠失または不活性化変異を含む該非ヒト動物の非ＩｇＭ重鎖定常領域は、非ヒト、例えば、内在性非ヒト重鎖定常領域である。別の実施形態では、ＣＨ１ドメインにおける欠失または不活性化変異を含む該非ヒト動物の非ＩｇＭ重鎖定常領域は、ヒト重鎖定常領域である。該動物が軽鎖定常領域に作動可能に連結される単一の再構成された軽鎖遺伝子配列を更に含む更に別の実施形態では、軽鎖定常領域は非ヒト、例えば内在性非ヒト軽鎖定常領域であるか、あるいは軽鎖はヒト軽鎖定常領域である。
【００９３】
ＶＬ単一ドメイン結合タンパク質（例えば、軽鎖可変ドメインを有する単一ドメイン抗原結合タンパク質）
本明細書では、２種類の単一ドメイン抗原結合タンパク質すなわち（１）再構成された重鎖可変領域遺伝子配列によってコードされるＶＨ単一ドメイン結合タンパク質及び（２）再構成された軽鎖可変領域遺伝子配列によってコードされるＶＬ単一ドメイン結合タンパク質を含む遺伝子改変された非ヒト動物を提供し、単一ドメイン抗原結合タンパク質の各々は、インタクトなＩｇＭ  ＣＨ１定常領域を保持しながら機能的ＣＨ１ドメインが不活性化及び／または除去された１つ以上の非ＩｇＭ免疫グロブリン定常領域を含む改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座によってもコードされている。
【００９４】
したがって、一実施形態では、本明細書では、重鎖定常領域に作動可能に連結される軽鎖可変領域遺伝子セグメント（例えば、Ｖκ、Ｊκ、Ｖλ、及び／またはＪλ遺伝子セグメント）を含むように遺伝子操作された重鎖遺伝子座を提供する。軽鎖可変領域を含むような重鎖遺伝子座の遺伝子改変については記載がある。例えば、１つ以上の軽鎖可変領域ＶＬ及び／またはＪＬ遺伝子セグメントによる１つ以上の、実質的に全ての、または全ての免疫グロブリン重鎖可変領域ＶＨ、ＤＨ、及び／またはＪＨ遺伝子セグメントの置き換えを含んだ免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含んでいる非ヒト動物の生成については参照により本明細書にその全体を援用する米国特許出願第２０１２００９６５７２号に記載されている。
【００９５】
当業者であれば、置き換えＶＬ及び／またはＪＬ遺伝子セグメントは、生産的な再構成を受けることができる再構成されていないＶＬ及び／または再構成されていないＪＬ遺伝子セグメントを含んでいてもよいことが容易に理解されよう。さらに、ＶＬ及び／またはＪＬ遺伝子セグメントはＶκ、Ｊκ、Ｖλ、Ｊλ遺伝子セグメントから選択される１つ以上のセグメントであってもよく、それらの組み合わせであってもよい。一実施形態では、１つ以上の重鎖可変領域遺伝子セグメントは、１つ以上のヒト軽鎖可変遺伝子セグメントにより置き換えられ、ヒトイディオタイプを有する可変ドメインの産生を可能にする。
【００９６】
本明細書に記載するように、重鎖定常領域に作動可能に連結される軽鎖可変領域遺伝子セグメント（例えば、Ｖκ、Ｊκ、Ｖλ、及び／またはＪλ遺伝子セグメント）を含むように遺伝子操作された重鎖遺伝子座は、重鎖定常領域の１つ以上のドメインまたは遺伝子セグメントが不活性化されているか、または欠失している場合であっても、生産的な遺伝子再構成を受けて免疫グロブリン鎖を形成し得る。本明細書に示すように、重鎖可変領域遺伝子セグメントを、ＣＨ１ドメインの欠失（例えば、ＩｇＧ１遺伝子における）を伴う軽鎖可変領域遺伝子セグメントによって置き換えることにより、軽鎖可変領域を有する単一ドメイン抗原結合タンパク質が得られる。具体的には、重鎖遺伝子座の内在性重鎖可変領域遺伝子セグメントをカッパ（κ）Ｖ及びＪ遺伝子セグメント（Ｖκ及びＪκ）によって置き換えることにより、重鎖定常領域（ＫｏＨ）に作動可能に連結されるカッパ可変領域が得られる。重鎖遺伝子座を更に改変してＣＨ１ドメイン（複数可）を欠失させると（ＣＨ１  ｄｅｌ）、軽鎖可変領域、及び機能的ＣＨ１ドメインを欠いている重鎖定常領域を含む免疫グロブリンポリペプチド鎖をコードする免疫グロブリン遺伝子座（ＫｏＨ  ＣＨ１  ｄｅｌ）が得られ、ここで、該免疫グロブリンポリペプチド鎖は、単一ドメイン抗原結合タンパク質（例えば、ＶＬ単一ドメイン抗原結合タンパク質）を形成し得る。
【００９７】
したがって、一部の実施形態では、機能的ＣＨ１ドメインを欠いている重鎖定常領域に作動可能に連結される軽鎖可変ドメインを含んでいるＶＬ単一ドメイン結合タンパク質を含んだ遺伝子改変された非ヒト動物が提供され、ここで、該免疫グロブリンポリペプチド鎖は単一ドメイン抗原結合タンパク質を形成し、これはインタクトなＩｇＭ定常領域を保持しながら機能的ＣＨ１ドメインが不活性化且つ／または除去されている１つ以上の非ＩｇＭ免疫グロブリン定常領域を含む改変された免疫グロブリン重鎖遺伝子座の軽鎖可変領域遺伝子配列によってコードされ得る。
【００９８】
本明細書に記載する態様は、１つ以上の重鎖定常領域遺伝子（例えば、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡまたはＩｇＥ）をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結され、好適には再構成されておらず、またより好適にはヒトのＪＬ遺伝子セグメント（またはその一部）により再構成された好適には再構成されておらず、またより好適にはヒトのＶＬ遺伝子セグメント（またはその一部）を含むか、これに由来するハイブリッド免疫グロブリン遺伝子によってコードされるハイブリッド鎖を含んだＶＬ結合タンパク質を含み、ここで、該ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡまたはＩｇＥ遺伝子はＣＨ１コード配列における欠失または不活性化変異を含む。ＶＬ結合タンパク質、抗原結合ＶＬタンパク質等は、２つの軽鎖可変ドメインを含む抗原結合部位を含んでいる抗原結合タンパク質を含む。一実施形態では、ＶＬ結合タンパク質の少なくとも２つの軽鎖可変ドメインは同族である。一部の実施形態では、２つの軽鎖可変ドメインの各々は、軽鎖可変領域（ＶＬ）遺伝子セグメント及び／または軽鎖連結領域（ＪＬ）遺伝子セグメントによってコードされているか、またはこれらのセグメントに由来するものである。好適な実施形態では、２つの軽鎖可変ドメインの一方はハイブリッド免疫グロブリン鎖であってもよく、２つの軽鎖可変ドメインの他方は免疫グロブリン軽鎖（Ｌ）の一部であってもよい。
【００９９】
本明細書で用いる場合、「免疫グロブリンハイブリッド鎖」、「ハイブリッド鎖」、「ハイブリッド免疫グロブリン鎖」等の表現は、アミノ末端からカルボキシルに軽鎖可変ドメイン（体細胞異変異されていても、体細胞変異されていなくてもよい）及び重鎖定常領域を含む免疫グロブリンタンパク質を指す。一般に、ハイブリッド鎖は重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される再構成された軽鎖可変領域遺伝子配列によってコードされている。本明細書に開示するように、ＶＬ単一ドメイン結合タンパク質はハイブリッド鎖を含み、ここで、該ハイブリッド鎖は、ＣＨ１コード配列において欠失または不活性化変異を有する重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される再構成された軽鎖可変領域遺伝子配列によってコードされている。
【０１００】
ハイブリッド免疫グロブリン鎖の軽鎖可変領域遺伝子配列は、概して、軽鎖可変（ＶＬ）遺伝子セグメント（またはその一部）及び軽鎖連結（ＪＬ）遺伝子セグメント（またはその一部）からの配列を含み得る。好適な実施形態では、該ハイブリッド鎖可変ドメインをコードしている軽鎖可変領域遺伝子配列（例えば、再構成されたＶＬ−ＪＬ遺伝子配列）は、再構成されていないＶＬ及びＪＬ遺伝子セグメント、好適には生殖系列の再構成されていないＶＬ及びＪＬ遺伝子セグメントのレパートリー由来のものであり、これらのセグメントは、（ａ）生産的な遺伝子再構成（例えば、インフレームの軽鎖可変領域遺伝子配列を形成するように再構成することができる）を受けることができ、且つ（ｂ）１つ以上の重鎖定常領域遺伝子セグメント（例えば、定常領域遺伝子セグメントの再構成されていないクラスタまたは１つの定常領域遺伝子セグメント）に作動可能に連結される。
【０１０１】
軽鎖遺伝子セグメントが再構成されると、重鎖定常領域をコードする配列に融合された軽鎖可変領域をコードする配列を含む再構成されたヌクレオチド配列が得られる。この配列は重鎖定常ドメインに融合された軽鎖可変ドメインを有するハイブリッド免疫グロブリン鎖をコードする。したがって、一実施形態では、本明細書に開示のハイブリッド免疫グロブリンは、Ｎ末端からＣ末端までＶＬドメイン及びＣＨドメインで実質的に構成されている。一実施形態では、該ＣＨドメインは、機能的ＣＨ１領域（ＩｇＭに関して）、ヒンジ、ＣＨ２領域、ＣＨ３領域を含み、場合によってはＣＨ４領域を含む。別の実施形態では、該ＣＨドメインは、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ及び／またはＩｇＤに関して、機能的ＣＨ１領域を欠いており（例えば、全体的または部分的にＣＨ１領域を欠いている）、更に、ヒンジ領域を欠いていてもよい。別の実施形態では、該ＣＨドメインは機能的ＣＨ１領域を欠いており（例えば、全体的または部分的にＣＨ１領域を欠いている）、更に、他の非ＩｇＭアイソタイプ定常領域を欠いていてもよい。
【０１０２】
本明細書に記載の改変された非ヒト動物は、ハイブリッド鎖と対になって抗体様のＶＬ結合タンパク質（例えば四量体でもよい）を作る同族軽鎖も含んでいるＩｇＭアイソタイプを有するＶＬ結合タンパク質を生成し得るが、ここでは、重鎖（または重鎖の対）の代わりに、該ＶＬ結合タンパク質は、ＩｇＭ  ＣＨドメインに融合したＶＬドメイン（ＶＨドメインではない）を含んでいるハイブリッド鎖（またはハイブリッド鎖の対）を含む。
【０１０３】
本明細書に開示する非ヒト動物は好適には、機能的ＣＨ１ドメインを有するＩｇＭ定常領域遺伝子を含むので、本明細書に開示する非ヒト動物は、一部の従来の抗体の四量体構造に似ているが結合特性は異なるＶＬ結合タンパク質の発現を生じさせ、且つ該非ヒト動物の細胞の膜表面上に前記ＶＬ結合タンパク質を発現させる、免疫グロブリン遺伝子座のヒト化も包含する。一部の実施形態では、本発明の非ヒト動物は、ＶＬ結合タンパク質のハイブリッド及び軽鎖の一方または両方で、抗原に結合するヒトＶＬドメインを産生することができる。一部の実施形態では、係る非ヒト哺乳動物は、いかなるＶＨ、ＤＨ、及び／またはＪＨ遺伝子セグメント配列によってもコードされていないか、またはいかなる該セグメントにも由来しない可変ドメインを含んだ結合タンパク質を発現するＢ細胞集団を発生する且つ／または有する。一部の実施形態では、係る非ヒト動物によって発現されるＶＬ結合タンパク質は、該抗原結合タンパク質がヒトＶＬドメインのみから構成されていることを特徴とする。一部の実施形態では、本発明の非ヒト動物は、内在性免疫グロブリン重鎖遺伝子座に非ヒト動物及び異種（例えば、ヒト）からの遺伝子物質を含み、内在性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座に非ヒト動物及び異種（例えば、ヒト）からの遺伝子物質を含む。
【０１０４】
種々の実施形態では、改変された非ヒト動物は、ＶＬ単一ドメイン結合タンパク質を作り、ここで、ハイブリッド鎖のＶＬドメインは、軽鎖のＶＬドメインに勝って増強された程度の体細胞超変異を呈する。一部の実施形態では、ハイブリッド鎖のＶＬ領域は、ＣＬ領域に融合されたＶＬ領域よりも約１．５倍、約２倍、約２．５倍、約３倍、約３．５倍、約４倍、約４．５倍または約５倍、またはそれより多い体細胞超変異を呈する。一部の実施形態では、改変された非ヒト動物（例えばマウス）は抗原に応答して、ハイブリッド鎖のＶＬドメインを含むＶＬ単一ドメイン結合タンパク質の集団を呈し、ここでＶＬ単一ドメイン結合タンパク質の集団はハイブリッド鎖のＶＬドメインにおいて、同じ抗原に応答して野生型マウスが呈する軽鎖集団（例えば軽鎖のＶＬドメイン）に観察されるよりも、平均して約１．５倍、約２倍、約２．５倍、約３倍、約３．５倍、約４倍、約４．５倍または約５倍、またはそれより多い体細胞超変異を呈する。
【０１０５】
一実施形態では、ハイブリッド鎖のＶＬドメインの体細胞超変異は、ＣＤＲ３に１つ以上または２つ以上のＮ付加を含む。種々の実施形態では、該ＶＬ結合タンパク質（例えば、ＶＬ単一ドメイン結合タンパク質）は、内在性軽鎖遺伝子座から再構成された軽鎖（例えば、重鎖定常領域遺伝子に作動可能に連結される再構成された可変領域遺伝子を形成するように再構成されたＶＬ及びＪＬ遺伝子セグメント）について天然に観察されるよりも多くのＮ付加を含んだ免疫グロブリン軽鎖配列によってコードされる可変ドメインを含んでいるハイブリッド鎖を含み、ここで、再構成された軽鎖可変領域は、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個以上のＮ付加を含む。
【０１０６】
種々の実施形態では、ＶＬ結合タンパク質（例えば、本明細書に開示するようなＶＬ単一ドメイン結合タンパク質、例えば、遺伝子改変された非ヒト動物によって、例えば、本明細書に開示するマウスによって産生されるもの）は、平均すると、それぞれ、従来の抗体または重鎖のみ抗体よりも小さいものであり得、小さなサイズに伴う有益性を有し得る。サイズの小型化は、少なくとも一部には、通常はＶＨドメインに存在するＤＨ領域によってコードされるアミノ酸配列が存在しないことにより達成される。サイズの小型化は、例えばＶκ領域及びＪκ領域に由来するＣＤＲ３の形成により実現することもできる
【０１０７】
一態様では、免疫グロブリンハイブリッド鎖遺伝子座を含む非ヒト動物（例えば、マウス）が提供される。一実施形態では、該ハイブリッド鎖遺伝子座は内在性重鎖遺伝子座内に作られ、ここで、内在性マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座にある１つ以上の免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）遺伝子セグメント、重鎖多様性（ＤＨ）遺伝子セグメント、及び重鎖連結（ＪＨ）遺伝子セグメントは、１つ以上の軽鎖可変領域（ＶＬ）遺伝子セグメント及び１つ以上の軽鎖連結領域（ＪＬ）遺伝子セグメントにより置き換えられて、それらは再構成して、再構成された可変領域ＶＬ／ＪＬ遺伝子配列を形成し、これは内在性マウスＣＨ遺伝子と組み換えて、ＶＬ遺伝子セグメント、ＪＬ遺伝子セグメント、及び内在性マウスＣＨ遺伝子に由来する再構成された遺伝子を形成する、ここで、ＣＨ遺伝子はＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥであり、ここで、該ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、またはＩｇＥは機能的ＣＨ１ドメインを欠いている。一態様では、内在性免疫グロブリン重鎖遺伝子座を置き換えるハイブリッド鎖遺伝子座を含んでいる非ヒト動物を提供し、例えば、重鎖遺伝子座の一方または両方の全てのまたは実質的に全ての内在性ＶＨ、ＤＨ、及びＪＨ遺伝子セグメントが、１つ以上のＶＬ遺伝子セグメント及び１つ以上のＪＬ遺伝子セグメントによって置き換えられ、それらは再構成された可変領域ＶＬ／ＪＬ遺伝子配列を形成し、これは内在性マウスＣＨ遺伝子と組み換えてＶＬ遺伝子セグメント、ＪＬ遺伝子セグメント、及び内在性マウスＣＨ遺伝子由来である再構成された遺伝子を形成する、ここで、ＣＨ遺伝子はＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥであり、該ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、またはＩｇＥは機能的ＣＨ１ドメインを欠いている。
【０１０８】
一部の実施形態では、本発明の非ヒト動物は、再構成されていないヒトＶＬ遺伝子セグメント及び／またはヒトＪＬ遺伝子セグメントを有する免疫グロブリンハイブリッド鎖遺伝子座と、再構成されていないヒトＶＬ遺伝子セグメント及び／またはヒトＪＬ遺伝子セグメントを有する免疫グロブリン軽鎖遺伝子座とを、含む。一部の実施形態では、本発明の非ヒト動物は、再構成されていないヒトＶＬ遺伝子セグメント及び／またはヒトＪＬ遺伝子セグメントを有する免疫グロブリンハイブリッド鎖遺伝子座と、好適には、軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される単一の再構成されたヒトＶＬ／ＪＬ可変領域遺伝子配列を有し、例えば共通軽鎖をコードする免疫グロブリン軽鎖遺伝子座と、を含む。
【０１０９】
単一ドメイン結合タンパク質及び再構成された軽鎖を発現する遺伝子操作された非ヒト動物
更なる実施形態では、本明細書では、（ａ）内在性免疫グロブリン重鎖遺伝子座の少なくとも１つの内在性免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子のＣＨ１ドメインをコードするヌクレオチド配列における欠失または不活性化変異であり、ここで、該少なくとも１つの内在性免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、またはそれらの組み合わせであるものと、（ｂ）ＶＬ及びＪＬ遺伝子セグメント配列を含んでいる単一の再構成された免疫グロブリン軽鎖可変領域ＶＬ／ＪＬ遺伝子配列を含む免疫グロブリン軽鎖遺伝子座であり、ここで、該単一の再構成された免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列は免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結され、例えば、単一軽鎖をコードするものと、場合によっては、更に（ｃ）内在性免疫グロブリン重鎖遺伝子座の内在性ＶＨ、ＤＨ、ＪＨ遺伝子セグメントの、少なくとも１つの再構成されていない免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）遺伝子セグメント及び少なくとも１つの再構成されていない免疫グロブリン軽鎖連結（ＪＬ）遺伝子セグメントを含む核酸配列による置き換えであり、該再構成されていないＶＬ及びＪＬ遺伝子セグメントの各々は、ＣＨ１ドメインをコードするヌクレオチド配列における欠失または不活性化変異を含む免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子に作動可能に連結される再構成された免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ／ＪＬ）ヌクレオチド配列を形成するように組換え可能であるものと、を含む非ヒト動物を提供する。
【０１１０】
単一の再構成された軽鎖（例えば、再構成された軽鎖可変領域を含む軽鎖）の遺伝子操作については記載がある。例えば、単一の再構成された可変遺伝子配列ＶＬ：ＪＬを含むユニバーサル軽鎖マウス（ＵＬＣ）の作製及びそれらのマウスにおける抗原特異的抗体の作製については、例えば、それぞれを参照により全体として本明細書に援用する米国特許出願第１３／０２２，７５９号、第１３／０９３，１５６号、第１３／４１２，９３６号、第１３／４８８，６２８号、第１３／７９８，３１０号、及び第１３／９４８，８１８号（それぞれ公開番号２０１１／０１９５４５４、２０１２／００２１４０９、２０１２／０１９２３００、２０１３／００４５４９２、ＵＳ２０１３０１８５８２１、及びＵＳ２０１３０３０２８３６）に記載されている。遺伝子操作された単一の再構成された軽鎖（例えば、ユニバーサル軽鎖）の発現により、初期ＩｇＭ段階での抗体の増殖が生じ、この段階では、多様性の、ひいては抗原認識の大部分が重鎖で生じる。本発明に関して限定するものでないが、遺伝子改変された単一の再構成された軽鎖を用いた初期ＩｇＭ段階での増殖は、生き延びてＩｇＧアイソタイプへのクラススイッチを受け、機能的ＣＨ１ドメインを欠いているか、または機能的ＣＨ１ドメインを欠いており、且つ機能的ヒンジ領域を欠いているＩｇＧの状況において選択を受けることが可能な重鎖または軽鎖可変領域を有する細胞がより多く得られることを提唱する。
【０１１１】
したがって、遺伝子改変された非ヒト動物を、該動物を作製するための方法及び組成物とともに提供し、ここでは、遺伝子改変によってＩｇＭドメインではないＩｇドメインにおける機能的ＣＨ１ドメインの欠落（更なる実施形態では、機能的ヒンジ領域の欠落）が生じ、ここで、該動物は更に、遺伝子操作された単一の再構成された軽鎖、例えば改変された共通軽鎖（ＵＬＣ）を発現し、これはインタクトなＩｇＭに会合し得る。
【０１１２】
米国特許出願公開第２０１１／０１９５４５４号、第２０１２／００２１４０９号、第２０１２／０１９２３００号及び第２０１３／００４５４９２号に記載されている改変された共通軽鎖マウスは、軽鎖選択肢の限られたレパートリー（例えば、２を超えないＶＬ遺伝子セグメントまたは単一の再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列を含んだ共通またはユニバーサル軽鎖「ＵＬＣ」）をコードする核酸配列を含んだ。係る限られたレパートリーを達成するために、マウスを操作して、天然のマウス軽鎖可変ドメインを作製または再構成する能力を非機能的または実質的に非機能的にした。一態様では、これは、例えば、マウスの軽鎖可変領域遺伝子セグメントを欠失させることによって達成された。前述のように、内在性マウス遺伝子座は、次に、内在性マウス軽鎖定常ドメインに作動可能に連結される、選択された外来性の適したヒト軽鎖可変領域遺伝子セグメント、好適にはヒト軽鎖可変領域遺伝子セグメントによって、外来性可変領域遺伝子セグメントが内在性マウス軽鎖定常領域遺伝子と結合して、再構成されたリバースキメラ軽鎖遺伝子（ヒト可変、マウス定常）を形成することができる態様で、改変され得る。様々な実施形態では、軽鎖可変領域は、体細胞変異させることができる。種々の実施形態では、体細胞変異を得る軽鎖可変領域の能力を最大にするために、適切なエンハンサー（複数可）がマウスに保持される。一態様では、マウスκ軽鎖遺伝子座を改変して内在性マウスκ軽鎖遺伝子セグメントをヒトκ軽鎖遺伝子セグメントによって置き換える際に、マウスのκイントロンエンハンサー及びマウスκ３’エンハンサーは機能的に維持されるか、またはかく乱されない。
【０１１３】
したがって、多様なリバースキメラ（ヒト可変、マウス定常）重鎖と会合する限られたレパートリーのリバースキメラ（ヒト可変、マウス定常）軽鎖を発現する遺伝子操作マウスが提供された。様々な実施形態では、内因性マウスκ軽鎖遺伝子セグメントが欠失され、内因性マウスＣκ遺伝子に作動可能に連結される単一の（または２つの）再構成されたヒト軽鎖領域によって置き換えられる。再構成されたヒト軽鎖領域の体細胞超変異を最大にするための実施形態では、マウスκイントロンエンハンサー及びマウスκ３’エンハンサーが維持される。様々な実施形態では、マウスは非機能的なλ軽鎖遺伝子座、またはその欠失、またはその遺伝子座がλ軽鎖を作製できないようにする欠失を更に含む。
【０１１４】
したがって、一実施形態では、本明細書では、非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、マウスまたはラット）であって、そのゲノムに（例えば、その生殖系列に）、好適にはヒト軽鎖可変遺伝子セグメントの限られたレパートリーからの、好適にはヒト軽鎖可変領域の限られたレパートリー、または単一の再構成されたヒト軽鎖可変領域を含む非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、マウスまたはラット）を提供し、ここで、該非ヒト動物は、そのゲノム（例えば、その生殖系列）に、ＣＨ１ドメインをコードするヌクレオチド配列における欠失または不活性化変異も含む。
【０１１５】
ヒト軽鎖可変領域遺伝子配列の限られたレパートリーからの、ヒト軽鎖可変ドメインの限られたレパートリー、または単一ヒト軽鎖可変ドメインを発現する遺伝子操作動物を提供する。一実施形態では、該単一の再構成されたＶ／Ｊヒト軽鎖配列は、Ｖκ１−３９Ｊκ及びＶκ３−２０Ｊκ（例えば、Ｖκ１−３９Ｊκ５及びＶκ３−２０Ｊκ１）から選択される。一部の実施形態では、本明細書に開示する非ヒト動物は、単一の再構成されたＶ／Ｊ軽鎖配列による全ての内在性ＶＬ及び全ての内在性ＪＬ遺伝子セグメントの置き換えを含んでいる改変された軽鎖遺伝子座を含み、ここで、単一の再構成されたＶ／Ｊ軽鎖配列は、内在性軽鎖定常領域遺伝子に作動可能に連結される。一部の実施形態では、該改変された軽鎖遺伝子座は、該非ヒト動物の生殖系列ゲノムに存在する。一実施形態では、該非ヒト動物は、その生殖系列ゲノムに、軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される単一の再構成された軽鎖可変遺伝子配列を含み、ここで、該単一の再構成された軽鎖可変領域遺伝子配列は、ヒト生殖系列ＶＬ及びヒト生殖系列ＪＬ遺伝子セグメント（例えば、ヒト生殖系列Ｖκ１−３９及びヒト生殖系列Ｊκ５またはヒト生殖系列Ｖκ３−２０及びＪκ１）を含む。一部の実施形態では、本明細書に開示する非ヒト動物は、内在性軽鎖定常領域遺伝子に作動可能に連結される単一の再構成されたＶ／Ｊ軽鎖配列をそのゲノムに含んでいるＢ細胞（例えば、クラススイッチが行われなかったＢ細胞）を含み、ここで、該非ヒト動物の生殖系列ゲノムに見られる内在性軽鎖定常領域遺伝子に作動可能に連結される単一の再構成されたＶ／Ｊ軽鎖配列と比較して、該単一の再構成されたＶ／Ｊ軽鎖は、体細胞変異を含まない。他の実施形態では、本明細書に開示する非ヒト動物は、内在性軽鎖定常領域遺伝子に作動可能に連結される単一の再構成されたＶ／Ｊ軽鎖配列をそのゲノムに含んでいるＢ細胞（例えば、クラススイッチが行われたＢ細胞）を含み、ここで、該単一の再構成されたＶ／Ｊ軽鎖は、非ヒト動物の生殖系列ゲノムに見られる内在性軽鎖定常領域遺伝子に作動可能に連結される単一の再構成されたＶ／Ｊ軽鎖配列と比較して体細胞変異を含んでいる。
【０１１６】
遺伝子改変された動物の作製
本明細書に開示する非ヒト動物の作製方法も提供する。係る方法は、（ａ）該非ヒト動物の重鎖免疫グロブリン遺伝子座（ＩｇＧ１重鎖遺伝子座など）の、ＣＨ１ドメイン、及び場合によってはヒンジ領域（複数可）を不活性化または欠失させること、遺伝子操作された再構成された軽鎖遺伝子座をコードする核酸を導入すること、及び該動物に、不活性化されたＣＨ１ドメインを有する重鎖免疫グロブリン遺伝子座と遺伝子的に再構成された軽鎖遺伝子座（ＵＬＣ）とを発現させることを含む。
【０１１７】
単一ドメイン結合タンパク質を発現する動物を作製する遺伝子改変について、例示説明としてマウスを用いることにより本明細書に便宜上記載しているが、係る改変は他の動物に容易に適応且つ適用することができる。本発明に係る遺伝子改変された動物は種々の方法で作製することができ、その具体的な実施形態を以下で考察する。
【０１１８】
ＩｇＧ１遺伝子座の例示の略図（縮尺は正確ではない）を図１（上）に示し、ＩｇＧ１遺伝子座におけるＣＨドメインの配置を示す。図示のように、ドメインＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３ならびにヒンジ領域は、スイッチ領域の下流の容易に識別可能なヌクレオチド範囲に存在している。
【０１１９】
ＩｇＧ１のＣＨ１ドメインをコードする機能的ヌクレオチド配列を欠いているがヒンジ領域を含んでいる遺伝子改変された非ヒト動物（例えばマウス）を、当該分野では公知の方法を用いて作製することができる。例えば、ＩｇＧ１遺伝子を、ＣＨ１ドメインを欠いているがヒンジを含む短縮型ＩｇＧ１によって置き換えるターゲティングベクターが作製され得る。一例では、内在性ＣＨ１ドメインの上流側の配列を含み、続いて、ＩｇＧ１ヒンジ、ＩｇＧ１  ＣＨ２ドメイン、ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメイン、薬剤選択カセット（例えば、ｌｏｘｅｄ耐性遺伝子）、及びＩｇＧ１膜貫通ドメインをコードする核酸配列を含んだ５’（ゲノムＩｇＧ１遺伝子の転写方向に対して）相同性アームと、膜貫通ドメインに対して下流側の配列を含む３’相同性アームとを有するターゲティングコンストラクトによって、マウスゲノムを標的とする。該遺伝子座で相同組換えが起こり、（例えば、Ｃｒｅ処理によって）薬剤選択カセットが除去されると、内在性ＩｇＧ１は、ＣＨ１ドメインを欠いているＩｇＧ１によって置き換えられる（図３）（ＩｇＧ１ΔＣＨ１；Ｉ）。一部の実施形態では、ＩｇＧ１を発現する得られた遺伝子座の構造は、ヒンジ配列と融合されたＪ領域配列を有する。
【０１２０】
ＩｇＧ１のＣＨ１ドメインをコードしているヌクレオチド配列を欠いており、ヒンジ領域をコードしているヌクレオチド配列を欠いている遺伝子改変された非ヒト動物（例えば、マウス）を、当該分野では公知の方法によって作製することができる。例えば、ＩｇＧ１遺伝子を、ＣＨ１ドメインをコードしている配列を欠いており、ヒンジ領域をコードしている配列を欠いている短縮型ＩｇＧ１によって置き換えるターゲティングベクターが作製され得る。別の実施形態では、マウスゲノムは、内在性ＣＨ１ドメインの上流側の配列を含み、続いて、ＩｇＧ１  ＣＨ２ドメイン、ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメイン、薬剤選択カセット（例えば、ｌｏｘｅｄ耐性遺伝子）、及びＩｇＧ１膜貫通ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む５’（ゲノムＩｇＧ１遺伝子の転写方向に対して）相同性アームと、該膜貫通ドメインに対して下流側の配列を含む３’相同性アームとを有するターゲティングコンストラクトによってターゲティングされる。該遺伝子座で相同組換えが行われ、薬剤選択カセットが除去（例えば、Ｃｒｅ処理によって）されると、内在性ＩｇＧ１遺伝子はＣＨ１ドメインをコードしている配列を欠いているＩｇＧ１遺伝子によって置き換えられる（図３）（ＩｇＧ１ΔＣＨ１＆ヒンジ；ＩＩ）。一部の実施形態では、得られた遺伝子座の構造は、ＣＨ２ドメインに融合されたＪ領域配列を有するＩｇＧ１を発現する。
【０１２１】
１つ以上の他のＩｇＧアイソタイプ、例えば、ＩｇＧ２ｂ及びＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ２ｃ、及びまたは１つ以上の他のＩｇアイソタイプ、例えば、ＩｇＤ、ＩｇＡ、及び／またはＩｇＥを欠失させ、これらのアイソタイプをコードする配列を欠失させるか機能的に無効にすることによって、ＩｇＧ１  ＣＨ１配列を欠いている（ＩｇＧ１ΔＣＨ１）か、またはＩｇＧ１  ＣＨ１配列を欠き且つヒンジを欠いている（ＩｇＧ１ΔＣＨ１＆ヒンジ）遺伝子改変された非ヒト動物（例えば、マウス）を更に改変して、該改変されたＩｇＧ１アイソタイプを使用することに好都合であるようにすることができる。例えば、内因性ヒンジ領域配列の上流側（または内因性ＣＨ１ドメイン配列の上流側）の配列、ＩｇＧ１  ＣＨ２及びＣＨ３ドメインをコードする配列、薬剤選択カセット、続いてＩｇＧ１膜貫通ドメインをコードする配列、続いて所望であれば別の薬剤選択カセットを含む５’相同性アームと、ＩｇＧ２ａ／ｃ遺伝子に対して下流側の配列を含む３’相同性アームとを有するターゲティングコンストラクトを作製する。該遺伝子座で相同組換えが起こり、薬剤選択カセット（複数可）が除去（例えば、Ｃｒｅ処理によって）されると、内因性重鎖定常遺伝子座は、２つのみのＩｇＧ遺伝子を含む：内因性ＩｇＧ３及びＩｇＧ１ΔＣＨ１またはＩｇＧ１ΔＣＨ１＆ヒンジ（図３）（ＩｇＧ１ΔＣＨ１ΔＩｇＧ２ｂ／２ａ；ＩＩＩまたはＩｇＧ１ΔＣＨ１＆ヒンジΔＩｇＧ２ｂ／２ａ；ＩＶ）。
【０１２２】
上記のように操作した動物を、重鎖遺伝子座のＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ２ｃ、ＩｇＧ３、ＩｇＤ、ＩｇＡ、及び／またはＩｇＥ遺伝子セグメントにおいて欠失または不活性化変異を含むように、更に改変してもよい。例えば、重鎖遺伝子座の定常領域遺伝子配列を欠失させるターゲティングベクターが作製され得る。一例では、内在性ＩｇＭドメインの上流側の配列、続いて薬剤選択カセット（例えば、ｌｏｘｅｄ耐性遺伝子）をコードするヌクレオチド配列を含む５’（ゲノム定常領域遺伝子配列の転写方向に対して）相同性アームと、ＩｇＡ遺伝子セグメントの下流側の配列を含む３’相同性アームとを有するターゲティングコンストラクトによって、マウスゲノムを標的とする。該遺伝子座で相同組換えが起こり、薬剤選択カセットが除去（例えば、Ｃｒｅ処理によって）されると、内在性定常領域は欠失され且つ／または選択可能なマーカーによって置き換えられる（図４Ｃ）。ターゲティングベクターを用いて該動物を更に改変し、ＩｇＭ遺伝子セグメント及び機能的ＣＨ１ドメイン配列を欠き且つ場合によっては機能的ヒンジ領域を欠いているＩｇＧ１遺伝子を再導入することができる。（図４Ｄ）。一例では、選択可能なマーカー遺伝子の上流側の配列、続いて完全なＩｇＭ定常領域及び機能的ＣＨ１ドメインを欠き且つ場合によっては機能的ヒンジを欠いているＩｇＧ１定常領域をコードするヌクレオチド配列、薬剤選択カセット（例えば、ｌｏｘｅｄ耐性遺伝子）を含む５’相同性アームと、該選択可能なマーカー遺伝子に対して下流側の配列を含む３’相同性アームを有するターゲティングコンストラクトによって、動物のゲノムを標的とする。該遺伝子座で相同組換えが起こり、薬剤選択カセットが除去（例えば、Ｃｒｅ処理によって）されると、ＩｇＭ遺伝子セグメント及び機能的ＣＨ１ドメイン配列を欠き且つ場合によっては機能的ヒンジ領域を欠いているＩｇＧ１遺伝子を再導入する。（図３）（ＩｇＧ１ΔＣＨ１ΔＩｇＧ２ｂ／２ａΔＩｇＧ３ΔＩｇＤ／Ａ／Ｅ（場合によってはΔヒンジ）；Ｖ）。内在性免疫グロブリン遺伝子座のその他の操作、例えば、種々の非ＩｇＭ免疫グロブリンアイソタイプのＣＨ１領域（複数可）の欠失または不活性化変異も提供する。
【０１２３】
適した定常領域コンストラクトを設計することによって、非ＩｇＭ免疫グロブリン定常領域のＣＨ１ドメインに、場合によってはヒンジに欠失または不活性化を導入し、上記のような相同性組換えにより遺伝子座に前記コンストラクトを導入する遺伝子操作に加え、非ＩｇＭ  ＣＨ１における欠失または不活性化は、当該分野では公知の他の方法（例えば、抗原免疫化時のみにマウスにおいて誘導される条件付き非ＩｇＭ  ＣＨ１欠失など）によって行うこともできる。遺伝子座の条件付き不活性化方法は当該分野では公知である。
【０１２４】
上記のような重鎖遺伝子座の遺伝子改変には、内在性重鎖可変遺伝子セグメント（例えば、ＶＨ遺伝子セグメント、ＤＨ遺伝子セグメント及び／またはＪＨ遺伝子セグメント）の１つ以上、実質的に全て、または全てを、（ａ）ヒトイディオタイプを有する結合タンパク質をコードするために再構成され得るか、または再構成を受けることができる、ヒトＶＨ遺伝子セグメント、ＤＨ遺伝子セグメント及び／またはＪＨ遺伝子セグメント、（ｂ）機能的ＣＨ１ドメインを欠いている重鎖定常領域に連結された軽鎖可変領域を有する免疫グロブリンポリペプチド鎖、例えばＶＬ単一ドメイン結合タンパク質（例えば軽鎖可変領域を含んでいる単一ドメイン抗原結合タンパク質）をコードするように再構成されてもよいか、または再構成を受けることができる軽鎖可変遺伝子セグメント、例えば、軽鎖Ｖ遺伝子セグメント及び／または軽鎖Ｊ遺伝子セグメント、または（ｃ）機能的ＣＨ１ドメインを欠いている重鎖定常領域に連結されたヒト軽鎖可変領域を有する免疫グロブリンポリペプチド鎖、例えばＶＬ単一ドメイン結合タンパク質（例えば、ヒトイディオタイプを有するヒト軽鎖可変領域を含んでいる単一ドメイン抗原結合タンパク質）をコードするように再構成されてもよいか、または再構成を受けることができるヒト軽鎖可変遺伝子セグメント（例えば、ヒト軽鎖Ｖ遺伝子セグメント及び／またはヒト軽鎖Ｊ遺伝子セグメント）によって置き換えることを更に含んでいてもよい。
【０１２５】
図１４にはマウス重鎖及びヒトκ軽鎖遺伝子座の略図（縮尺は正確ではない）を示し、マウス遺伝子座の約２００個の重鎖可変（ＶＨ）遺伝子セグメント、１３個の重鎖多様性（ＤＨ）遺伝子セグメント及び４個の重鎖連結（ＪＨ）遺伝子セグメント、ならびにエンハンサー（Ｅｎｈ）及び重鎖定常（ＣＨ）領域、ならびにヒトκ遺伝子座の約７６個のＶκ遺伝子セグメント、５個のＪκ遺伝子セグメント、イントロンエンハンサー（Ｅｎｈ）及び単一の定常領域（Ｃκ）を示している。
【０１２６】
図１５には、相同性組換えを行ってｍＶＨ、ｍＤＨ及びｍＪＨ遺伝子セグメントのターゲティングされた欠失を通して内在性マウス重鎖遺伝子座を不活性化させることによって改変された、ヒトκ遺伝子セグメントのネズミ重鎖遺伝子座への挿入の略図を示している（縮尺は正確ではない）。図１５に示すように、当該分野では公知の標準的な分子技術を用いることにより、別個の４つのターゲティングベクターを用いてヒトＶκ遺伝子セグメント及びヒトＪκ遺伝子セグメントを不活性化されたマウス重鎖遺伝子座に連続的に挿入することができる。該４つのターゲティングコンストラクトを操作するのに用いたヒトκ遺伝子セグメントは、生殖系列のヒトκ軽鎖遺伝子座の近位コンティグに天然に見い出され得る。
【０１２７】
遺伝子操作により再構成された軽鎖を含む遺伝子的に改変されたマウスは、当該分野では公知の任意の方法によって作製することができる。例えば、内在性軽鎖遺伝子座の再構成されていない内在性軽鎖可変Ｖ及びＪ遺伝子セグメントを単一の再構成されたＶ：Ｊ遺伝子によって置き換えるか、再構成されていない軽鎖遺伝子座全体を軽鎖定常領域に作動可能に連結される単一の再構成されたＶ：Ｊ遺伝子を含む遺伝子操作された軽鎖遺伝子座によって置き換える、ターゲティングベクターを作製することができる。
【０１２８】
別の態様では、本明細書に記載の非ヒト動物は、ＡＤＡＭ６（ＡＤＡＭ６ａ及び／またはＡＤＡＭ６ｂ）をコードする異所性ヌクレオチド配列、その機能的断片、ホモログまたはオルソログを含むように更に操作される。一部の実施形態では、本明細書に記載の非ヒト動物の重鎖遺伝子座は、マウスＡＤＡＭ６（ＡＤＡＭ６ａ及び／またはＡＤＡＭ６ｂ）をコードする異所性ヌクレオチド配列、その機能的断片、ホモログまたはオルソログを含むように更に操作される。種々の実施形態では、該ＡＤＡＭ６タンパク質は非ヒト雄動物において機能的である。係る非ヒト動物を操作する方法及び組成物については、例えば、参照により本明細書に援用される、米国特許第８，６４２，８３５号に記載されている。
【０１２９】
一部の実施形態では、上記及び他の遺伝子改変動物は、適切なターゲティングコンストラクトを（１回以上の独立したターゲティングで）適切な動物ＥＳ細胞内に導入することにより作製され、該ターゲティングコンストラクトのマーカーまたは選択カセットを含む陽性クローンを確認し、増殖させる。次いで、該クローンを宿主胚において、キメラ動物または完全ＥＳ細胞由来動物の作製に適した条件下でドナーＥＳ細胞として使用する。該マーカーまたは選択カセットは、ＥＳ細胞の段階のまたはキメラもしくはＥＳ細胞由来マウスのいずれかにおいて、例えば、ｌｏｘｅｄカセットを用い、Ｃｒｅ含有系統と交配するか、またはＥＳ細胞をＣｒｅ発現ベクターでエレクトロポレーションすることにより、場合によっては除去してもよい。したがって、一部の実施形態では、該遺伝子改変は該動物の生殖系列で行われる。
【０１３０】
一部の実施形態では、本明細書に記載の動物の作製方法は、単一ドメイン抗原結合タンパク質を産生することのできる第１の動物（例えば、機能的ＣＨ１ドメインを欠いているＩｇＧ重鎖遺伝子座をその生殖系列に含む第１の動物）を、遺伝子操作された再構成された軽鎖を産生することのできる第２の動物（例えば、軽鎖定常領域に作動可能に連結される単一の再構成されたＶ：Ｊ可変領域を有する遺伝子操作された軽鎖遺伝子座をその生殖系列に含む第２の動物）と交雑させてＦ１遺伝子操作動物を作製することを含み、ここで、該Ｆ１動物は、第１の動物のＩｇＧ重鎖遺伝子座及び第２の動物の軽鎖遺伝子座を含む。該交雑は、動物交配、あるいは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ操作など、それ以外の配偶子の組み合わせによって行われてもよい。
【０１３１】
適切に遺伝子改変可能なＥＳ細胞が容易に入手できない非ヒト動物の場合、本明細書に記載の方法とは異なる方法を利用して、該遺伝子改変を含む非ヒト動物を作製する。係る方法には、例えば、非ＥＳ細胞ゲノム（例えば、線維芽細胞または誘導多能性細胞）を改変すること、及び核移植を利用して、改変ゲノムを適切な細胞（例えば、卵母細胞）へ移植し、胚を形成するのに好適な条件下で、改変細胞（例えば、改変された卵母細胞）を非ヒト動物内で懐胎させることが挙げられる。
【０１３２】
単一ドメイン抗原結合タンパク質の作製
一旦、単一ドメイン抗原結合タンパク質及び／または遺伝子操作された単一の再構成された軽鎖を産生することができる遺伝子操作された動物が得られると、ある抗原に対する免疫グロブリンと結合タンパク質調製物は、該動物にその抗原によって免疫することによって容易に得られる。本明細書で用いられる場合「ポリクローナル抗血清組成物」には、親和性精製されたポリクローナル結合タンパク質調製物を含む。
【０１３３】
一態様では、（ａ）本明細書に記載の非ヒト動物にある抗原で免疫すること、（ｂ）非ヒト動物にとって結合タンパク質を作るのに十分な条件下に該非ヒト動物を維持すること、（ｃ）機能的ＣＨ１ドメインを欠いている且つ／または機能的ヒンジ領域を欠いているマウスによって作られた結合タンパク質を特定すること、及び（ｄ）該結合タンパク質、該結合タンパク質を作る細胞、または該結合タンパク質の配列をコードするヌクレオチド配列を該非ヒト動物から単離することを含む、ＣＨ１ドメインを欠いている結合タンパク質の作製方法を提供する。
【０１３４】
種々の抗原を用いてトランスジェニック動物に免疫することができる。係る抗原には、限定するものではないが、細胞タンパク質、微生物、例えば、ウイルス及び単細胞生物（細菌及び真菌類など）（生きている、弱っているまたは死滅した）、該微生物の断片あるいは該微生物から単離した抗原または分子が挙げられる。
【０１３５】
該抗原は、アジュバントとともに、またはアジュバントなしで、任意の便利な方法でトランスジェニック動物に投与することができ、所定のスケジュールに従って投与することができる。
【０１３６】
モノクローナル結合タンパク質を作製するために、免疫したトランスジェニック動物から脾細胞を単離し、ハイブリドーマ精製のために軽質転換細胞株との細胞融合に用いるか、あるいは、標準的な分子生物学的技術により、抗体をコードするｃＤＮＡをクローニングし、トランスフェクト細胞に発現させる。モノクローナル抗体の作製手順は当該分野で確立されている。例えば、欧州特許出願第０  ５８３  ９８０  Ａ１号（「Ｍｅｔｈｏｄ  Ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｒｏｍ  Ｒａｂｂｉｔｓ」）、米国特許第４，９７７，０８１号（「Ｓｔａｂｌｅ  Ｒａｂｂｉｔ−Ｍｏｕｓｅ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  Ａｎｄ  Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｔｈｅｒｅｏｆ」）、ＷＯ９７／１６５３７（「Ｓｔａｂｌｅ  Ｃｈｉｃｋｅｎ  Ｂ−ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ  Ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  Ｕｓｅ  Ｔｈｅｒｅｏｆ」）、及びＥＰ０  ４９１  ０５７  Ｂ１（「Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｗｈｉｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｅｓ  Ａｖｉａｎ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｒｉｎ  Ｇ」）を参照されたく、その開示は参照により本明細書に援用されている。クローニングしたｃＤＮＡ分子からのモノクローナル抗体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ作製方法については、Ａｎｄｒｉｓ−Ｗｉｄｈｏｐｆらの“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈｉｃｋｅｎ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ    ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｂｙ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ”，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４２：１５９（２０００）、及びＢｕｒｔｏｎ，Ｄ．Ｒ．“Ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ”，Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １：８７（１９９５）に記載がある。
【０１３７】
一旦、モノクローナル単一ドメイン抗原結合タンパク質が生成されると、所望であれば、標準的な分子生物学的技術を用いて係る結合タンパク質を完全ヒト結合タンパク質に容易に転換することができる。完全ヒトモノクローナル結合タンパク質は、ヒトでは免疫原性ではなく、ヒト対象の治療的処置用に適している。
【０１３８】
したがって、単一ドメイン抗原結合タンパク質がヒトＶＨまたはヒトＶＬ領域、及び非ＩｇＭ  ＣＨ１ドメインにおいて欠失または不活性化変異を含んでいるマウス重鎖定常領域を含む一実施形態では、単一ドメイン抗原結合タンパク質のＶＨまたはＶＬドメインの配列は、場合によっては、適切な細胞（例えば、抗体発現に典型的な細胞、例えば、真核細胞、例えば、ＣＨＯ細胞）に発現させられることができる完全ヒト単一ドメイン抗原結合タンパク質をコードする発現コンストラクトが得られる適切な発現ベクターにＣＨ１ドメインを欠いているヒト定常領域の上流側にクローニングされ得る。
【０１３９】
したがって、本明細書では、本明細書に開示するように遺伝子改変された動物由来のモノクローナル結合タンパク質産生細胞、及び該細胞に由来する核酸も提供する。該細胞由来のハイブリドーマも提供する。完全ヒト単一ドメイン結合タンパク質、ならびにそれに由来するコード核酸も提供する。
【０１４０】
本明細書に記載した単一ドメイン抗原結合タンパク質を用いて、二重特異性抗体を作製してもよい。本明細書に記載の単一ドメイン抗原結合タンパク質の一利点は、単一の治療薬において、異なる２種のエピトープに対して特異性を有する重鎖をヘテロ二量体化することによって二重特異性抗体を作製することができることにある。
【実施例】
【０１４１】
以下の実施例は、本発明の方法及び組成物を作製、使用する方法を当業者に説明するために提供され、本発明者らが自身の発明とみなすものの範囲を限定しようとするものではない。使用する数（例えば、量、温度等）に関して正確性を保証するように努めたが、多少の実験誤差及びずれがあることを考慮されたい。以下の実施例には当業者には公知であろう従来の方法（分子クローニング法等）の詳細な説明は含まない。
【０１４２】
実施例１：ＶＨ単一ドメイン結合タンパク質をコードするマウス：重鎖可変領域、及び機能的ＣＨ１ドメインを欠いている重鎖定常領域を有する免疫グロブリン鎖を含み、且つ単一の再構成された軽鎖（ＵＬＣ）を含むマウス
実施例１．１：動物の作製
参照により本明細書に援用されるＭａｃｄｏｎａｌｄらのＵＳ２０１１／０１４５９３７に記載の方法に従って、完全で機能的なＩｇＭ遺伝子配列、及び機能的ＣＨ１遺伝子配列を欠き、場合によっては機能的ヒンジ領域を欠いているＩｇＧ１遺伝子配列を含む重鎖遺伝子座を含むように遺伝子改変されたマウス（図１Ａ）を作製した。種々の組み合わせの重鎖定常遺伝子配列を欠き、ＣＨ１ドメイン（複数可）の欠失を含むが、完全で機能的なＩｇＭを含んだマウスのいくつかのバージョンを作製した（図３）。例えば、マウス重鎖可変遺伝子セグメント、及び完全で機能的なＩｇＭ遺伝子配列、及び、機能的ＣＨ１遺伝子配列及びヒンジ領域を欠いているＩｇＧ１遺伝子配列を含んだ重鎖遺伝子座についてホモ接合性のマウス（ｍＶＨＩｇＧ１ΔＣＨ１＆ヒンジ；１５７６ＨＯ、図３及び４Ｂの「ＩＩ」）を作製した。更に、ヒト重鎖可変遺伝子セグメント、及び完全で機能的なＩｇＭ遺伝子配列、機能的なＣＨ１遺伝子配列及びヒンジ領域を欠いているＩｇＧ１遺伝子配列を含み、且つＩｇＧ２ｂ及びＩｇＧ２ａ遺伝子配列を欠いている重鎖遺伝子座についてホモ接合性のマウス（ｈＶＨＩｇＧ１ΔＣＨ１＆ヒンジΔＩｇＧ２ｂ／２ａ；１８５９ＨＯ、例えば、図３の「ＩＶ」を参照）を作製した。更に、ヒト重鎖可変遺伝子セグメント及び完全で機能的なＩｇＭ遺伝子配列、機能的なＣＨ１遺伝子配列を欠いたＩｇＧ１遺伝子配列を含み、且つＩｇＧ２ｂ及びＩｇＧ２ａ遺伝子配列を欠いている重鎖遺伝子座についてホモ接合性のマウス（ｈＶＨＩｇＧ１ΔＣＨ１ΔＩｇＧ２ｂ／２ａ；１６７３ＨＯ、例えば、図３及び４Ａの「ＩＩＩ」を参照）を作製した。更に、ヒト重鎖可変遺伝子セグメント及び完全で機能的なＩｇＭ遺伝子配列、機能的ＣＨ１を欠いたＩｇＧ１遺伝子配列を含み、且つＩｇＤ、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＥ、及びＩｇＡ遺伝子配列を欠いている重鎖遺伝子座についてホモ接合性のマウス（ｈＶＨＩｇＧ１ΔＣＨ１ΔＩｇＧ２ｂ／２ａΔＩｇＧ３ΔＩｇＤ／Ａ／Ｅ；６１８０ＨＯ、図３及び４Ｃ〜Ｄの「Ｖ」を参照）を作製した。重鎖定常領域の改変の追加の例示のバージョンを図３に示す。ＣＨ１欠失／不活性化及び／または免疫グロブリン定常遺伝子欠失／不活性化の組み合わせの他の変形例を作成する。例えば、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａの両方がＣＨ１ドメイン欠失を含んでいるマウスを作製し、該マウスはまた、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ２ｂの欠失も含む。図４に示すように、重鎖遺伝子座は、ヒト可変領域（ヒト重鎖可変領域またはヒト軽鎖可変領域でもよい）を含むように改変することもできる（図１６、以下の実施例２及び３を参照）。重鎖遺伝子座はＡｄａｍ６ａ遺伝子、Ａｄａｍ６ｂ遺伝子、またはその両方、あるいは該遺伝子の断片を含むように改変することもでき、ここで、該遺伝子またはその断片は雄マウスにおいて機能的である（例えば、参照により本明細書に援用されるＵ．Ｓ．２０１２／０３２２１０８を参照）。
【０１４３】
単一の再構成された可変遺伝子配列Ｖ：Ｊを含む共通軽鎖マウス（ユニバーサル軽鎖またはＵＬＣマウスとも呼ぶ）（例えば、Ｖκ１−３９Ｊκ５またはＶκ３−２０Ｊκ１共通軽鎖マウス）の作製及び同マウスにおける抗原特異的抗体の作製については、例えば、米国特許出願第１３／０２２，７５９号、第１３／０９３，１５６号、第１３／４１２，９３６号、第１３／４８８，６２８号、第１３／７９８，３１０号、及び第１３／９４８，８１８号（それぞれ米国特許公開番号２０１１／０１９５４５４、２０１２／００２１４０９、２０１２／０１９２３００、２０１３／００４５４９２、ＵＳ２０１３０１８５８２１、及びＵＳ２０１３０３０２８３６）に記載されており、その各々を参照により全体として本明細書に援用する。具体的には、遺伝子操作されたＶκ１−３９Ｊκ５カッパ軽鎖（１６３３ＨＯまたは１６３４ＨＯ）または遺伝子操作されたＶκ３−２０Ｊκ１カッパ軽鎖（１６３５ＨＯまたは１６３６ＨＯ）をその生殖系列に発現するマウスを作製した。
【０１４４】
単一の再構成されたヒト生殖系列軽鎖領域（ＵＬＣ  Ｖκ１−３９Ｊκ５；１６３３または１６３４）または（ＵＬＣ  Ｖκ３−２０Ｊκ１；１６３５または１６３６）を含むＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスを、改変されたＩｇＧ定常領域を担持するマウスと交配した。具体的には、係るＵＬＣマウスを、ＩｇＧ１  ＣＨ１及びＩｇＧ１ヒンジ領域が欠失または不活性化されたネズミ重鎖定常領域に作動可能に連結されるネズミ重鎖可変領域を有するマウス（ｍＶＨＩｇＧ１ΔＣＨ１＆ヒンジ１５７６）、ＩｇＧ１  ＣＨ１及びＩｇＧ１ヒンジ領域ならびにＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂ遺伝子が欠失または不活性化されたネズミ重鎖定常領域に作動可能に連結されるヒト重鎖可変領域を有するマウス（ｈＶＨ  ＩｇＧ１ΔＣＨ１＆ヒンジΔＩｇＧ２ｂ／２ａ；１８５９）、ＩｇＧ１  ＣＨ１領域ならびにＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂ遺伝子が欠失または不活性化されたネズミ重鎖定常領域に作動可能に連結されるヒト重鎖可変領域を有するマウス（ｈＶＨ  ＩｇＧ１ΔＣＨ１ΔＩｇＧ２ｂ／２ａ；１６７３）、またはＩｇＧ  ＣＨ１領域ならびにＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂ、ＩｇＤ、ＩｇＧ３、ＩｇＡ、及びＩｇＥ遺伝子が欠失または不活性化されたマウス重鎖定常領域に作動可能に連結されるヒト重鎖可変領域を有するマウス（ｈＶＨ  ＩｇＧ１ΔＣＨ１ΔＩｇＧ２ｂ／２ａΔＩｇＧ３ΔＩｇＤ／Ａ／Ｅ；６１８０）と交配して以下の後代マウスを得た。
【０１４５】
ｍＶＨＩｇＧ１ΔＣＨ１＆ヒンジ  ｘ  Ｖκ３−２０Ｊκ１  ＵＬＣまたはｍＶＨＩｇＧ１ΔＣＨ１＆ヒンジ  ｘ  Ｖκ１−３９Ｊκ５  ＵＬＣホモ接合マウス（１５７６ＨＯ  １６３５ＨＯまたは１５７６ＨＯ  １６３３ＨＯ）、
【０１４６】
ｈＶＨ  ＩｇＧ１ΔＣＨ１＆ヒンジΔＩｇＧ２ｂ／２ａ  ｘ  Ｖκ３−２０Ｊκ１  ＵＬＣまたはｈＶＨ  ＩｇＧ１ΔＣＨ１＆ヒンジΔＩｇＧ２ｂ／２ａ  ｘ  Ｖκ１−３９Ｊκ５  ＵＬＣホモ接合マウス（１８５９ＨＯ  １６３５ＨＯまたは１８５９ＨＯ  １６３３ＨＯ）、
【０１４７】
ｈＶＨ  ＩｇＧ１ΔＣＨ１ΔＩｇＧ２ｂ／２ａ  ｘ  Ｖκ３−２０Ｊκ１  ＵＬＣまたはｈＶＨ  ＩｇＧ１ΔＣＨ１ΔＩｇＧ２ｂ／２ａ  ｘ  Ｖκ１−３９Ｊκ５  ＵＬＣホモ接合マウス（１６７３ＨＯ  １６３５ＨＯまたは１６７３ＨＯ  １６３３ＨＯ）、及び
【０１４８】
ｈＶＨ  ＩｇＧ１ΔＣＨ１＆ヒンジΔＩｇＧ２ａ／２ｂΔＩｇＧ３ΔＩｇＤ／Ａ／Ｅ  ｘ  Ｖκ３−２０Ｊκ１  ＵＬＣまたはｈＶＨ  ＩｇＧ１ΔＣＨ１＆ヒンジΔＩｇＧ２ａ／２ｂΔＩｇＧ３ΔＩｇＤ／Ａ／Ｅ  ｘ  Ｖκ１−３９Ｊκ５  ＵＬＣホモ接合マウス（６１８０ＨＯ  １６３５ＨＯまたは６１８０ＨＯ  １６３４ＨＯ）。
【０１４９】
ＣＨ１ドメインにおける欠失または不活性化変異及び免疫グロブリン定常領域遺伝子における欠失または不活性化変異を含むマウスの他のバージョンを、上記の単一の再構成されたヒト生殖系列軽鎖領域を含むマウスと交配した。
【０１５０】
実施例１．２：抗原によるマウスの免疫及び単一ドメイン結合タンパク質の発現
異なる抗原を用いて改変についてホモ接合性のマウスに免疫し、種々のアジュバントを用い、様々な経路により追加免疫した。ＩｇＧ１特異的応答の力価をＥＬＩＳＡまたはウエスタンブロットにより評価した。
【０１５１】
図５Ａに示すように、ＩｇＧ１ΔＣＨ１／ヒンジ及びＵＬＣ改変の両方についてホモ接合性のマウスは、ＩｇＧ１ΔＣＨ１のみを有するマウスと比較して、免疫化の前後両方で、血清中のＩｇＧ１の総量の増加した発現を示す。ΔＣＨ１／ヒンジ  ｘ  ＵＬＣマウスでは力価が高いことから、ユニバーサル軽鎖が存在すると、抗原特異的単一ドメイン抗原結合タンパク質を産生する可能性が高くなることが示唆される。図５Ｂ。
【０１５２】
図７は、ΔＣＨ１及びＵＬＣ改変を含むように遺伝子操作された種々のバージョンのマウスを用いると、高い力価が得られる可能性があることを示す。
【０１５３】
更に、図６及び８は単一ドメイン抗原結合タンパク質が存在し、ＣＨ１領域において欠失を有するヒト重鎖可変領域及び単一の再構成された軽鎖（ユニバーサル軽鎖）の両方を含んだマウスから単離され得ることを示している。
【０１５４】
実施例１．３：単一ドメイン結合タンパク質及び単一の再構成された軽鎖（ＵＬＣ）を発現するマウスにおけるＢ細胞発生及び成熟
本明細書に示す種々の細胞表面マーカーのフローサイトメトリーを用いて、Ｂ細胞発生及びＢ細胞成熟の進行について、改変されたＣＨ１ドメイン及び単一の再構成された軽鎖（ＵＬＣ）（図２を参照）についてホモ接合性のマウスからの脾臓、血液及び骨髄コンパートメントのＢ細胞含有物を分析した。
【０１５５】
要約すると、ＵＬＣマウス及び改変されたＣＨ１ドメイン及び再構成された軽鎖についてホモ接合性のマウスを殺処分し、血液、脾臓、及び骨髄を採取した。ＥＤＴＡが入っているマイクロテイナーチューブ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に血液を採取した。完全ＲＰＭＩ培地（ウシ胎仔血清、ピルビン酸ナトリウム、ＨＥＰＥＳと２−メルカプトエタノール、非必須アミノ酸、及びゲンタマイシンを補充したＲＰＭＩ培地）フラッシュすることにより大腿骨から骨髄を採取した。脾臓及び骨髄調製物からの赤血球（ＲＢＣ）をＡＣＫ溶解緩衝液（Ｌｏｎｚａ  Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ）で溶解し、その後、完全ＲＰＭＩ培地で洗浄した。
【０１５６】
細胞（１ｘ１０６個）を抗マウスＣＤ１６／ＣＤ３２（２．４Ｇ２、ＢＤ）と氷上で１０分間培養し、次に、次の抗体を用いて氷上で３０分間標識した：ＡＰＣ−Ｈ７コンジュゲート抗マウスＣＤ１９（クローン１Ｄ３、ＢＤ）、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅコンジュゲート抗マウスＣＤ３（クローン１７Ａ２、ＢＩＯＬＥＧＥＮＤ（登録商標））、ＰｅＣｙ７−ＩｇＭ（ＩＩ／４１、ＥＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ（登録商標））、ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５−ＩｇＤ（１１−２６ｃ．２ａ、ＢＩＯＬＥＧＥＮＤ（登録商標））、ＡＰＣ−ｅＦｌｕｏｒ  ７８０−Ｂ２２０（ＲＡ３−６Ｂ２、ＥＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ（登録商標））、ＡＰＣ−ＣＤ１９（ＭＢ１９−１、ＥＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ（登録商標））、ＰＥ−ＣＤ９３（ＡＡ４．１、ＢＩＯＬＥＧＥＮＤ（登録商標））、ＦＩＴＣ−ＣＤ２３（Ｂ３Ｂ４、ＢＤ）、ＡＰＣ−ＣＤ２１／ＣＤ３５（７Ｇ６、ＢＤ）。骨髄：未成熟Ｂ細胞（Ｂ２２０ｉｎｔＩｇＭ＋）、成熟Ｂ細胞（Ｂ２２０ｈｉＩｇＭ＋）。血液及び脾臓：Ｂ細胞（ＣＤ１９＋）、成熟Ｂ細胞（ＣＤ１９＋ＩｇＭｉｎｔＩｇＤｈｉ）、移行／未成熟Ｂ細胞（ＣＤ１９＋ＩｇＭｈｉＩｇＤｉｎｔ）。
【０１５７】
染色後、細胞を洗浄し、２％ホルムアルデヒド中に固定した。データ収集は、ＬＳＲＩＩフローサイトメータ上で実施し、ＦＬＯＷＪＯ（商標）ソフトウェア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ，Ｉｎｃ．）で分析した。図９はそれらのマウスが正常な血清定常状態のＩｇＭレベル及びＩｇＧレベルを有していることを示している。図１０及び１１は脾臓コンパートメントの結果を示しており、脾臓にはほぼ正常なＢ細胞数及びほぼ正常なＢ細胞成熟化があることが分かる。図１２及び１３は、骨髄コンパートメントの結果を示しており、骨髄には正常なＢ細胞数及びほぼ正常なＢ細胞発達があることが分かる。
【０１５８】
実施例２：ＶＬ単一ドメイン結合タンパク質をコードするマウス：軽鎖可変領域、及び機能的ＣＨ１ドメインを欠いている重鎖定常領域を有する免疫グロブリン鎖を含むマウス
実施例２．１：動物の生成
軽鎖遺伝子セグメントを重鎖遺伝子座に導入したマウスは米国特許出願公開第２０１２／００９６５７２号に記載のように生成した。具体的には、ＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）遺伝子工学技術を用いてマウスゲノムのバクテリア人工染色体（ＢＡＣ）ライブラリーを改変して、種々のターゲティングコンストラクトを作製した（例えば、米国特許第６，５８６，２５１号及びＶａｌｅｎｚｕｅｌａ，Ｄ．Ｍ．，Ｍｕｒｐｈｙ，Ａ．Ｊ．，Ｆｒｅｎｄｅｗｅｙ，Ｄ．，Ｇａｌｅ，Ｎ．Ｗ．，Ｅｃｏｎｏｍｉｄｅｓ，Ａ．Ｎ．，Ａｕｅｒｂａｃｈ，Ｗ．，Ｐｏｕｅｙｍｉｒｏｕ，Ｗ．Ｔ．，Ａｄａｍｓ，Ｎ．Ｃ．，Ｒｏｊａｓ，Ｊ．，Ｙａｓｅｎｃｈａｋ，Ｊ．，Ｃｈｅｒｎｏｍｏｒｓｋｙ，Ｒ．，Ｂｏｕｃｈｅｒ，Ｍ．，Ｅｌｓａｓｓｅｒ，Ａ．Ｌ．，Ｅｓａｕ，Ｌ．，Ｚｈｅｎｇ，Ｊ．，Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ｊ．Ａ．，Ｗａｎｇ，Ｘ．，Ｓｕ，Ｈ．，Ｘｕｅ，Ｙ．，Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ，Ｍ．Ｇ．，Ｎｏｇｕｅｒａ，Ｉ．，Ｔｏｒｒｅｓ，Ｒ．，Ｍａｃｄｏｎａｌｄ，Ｌ．Ｅ．，Ｓｔｅｗａｒｔ，Ａ．Ｆ．，ＤｅＣｈｉａｒａ，Ｔ．Ｍ．，Ｙａｎｃｏｐｏｕｌｏｓ，Ｇ．Ｄ．（２００３）“Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ”，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２１，６５２−６５９を参照）。相同組換えによりマウスＢＡＣ  ＤＮＡを改変してＶＨ、ＤＨ及びＪＨ遺伝子セグメントのターゲティングされた欠失を通して内在性マウス重鎖遺伝子座を不活性化し、続いて再構成されていないヒト生殖系列κ軽鎖遺伝子配列を挿入した（図１５の上）。
【０１５９】
要約すると、リコンビナーゼ媒介組換えを用いた２つの連続したターゲティングイベントによりマウス重鎖遺伝子座を欠失させた。第１のターゲティングイベントには、５’から３’にかけて５’マウス相同性アーム、リコンビナーゼ認識部位、ネオマイシンカセット及び３’相同性アームを含んでいるターゲティングベクターを用いたマウス重鎖遺伝子座の５’末端のターゲティングを含めた。５’及び３’相同性アームにはマウス重鎖遺伝子座の配列５’を含めた。第２のターゲティングイベントには、５’から３’にかけて５’マウス相同性アーム、５’リコンビナーゼ認識部位、第２のリコンビナーゼ認識部位、ハイグロマイシンカセット、第３のリコンビナーゼ認識部位、及び３’マウス相同性アームを含んだ第２のターゲティングベクターを用いたＪＨ遺伝子セグメント領域のマウス重鎖遺伝子座の３’末端のターゲティングを含めた。５’及び３’相同性アームには、マウスＪＨ遺伝子セグメントに隣接する配列、ならびにイントロンエンハンサー及び定常領域の５’を含めた。（上記のような）両ターゲティングベクターによりターゲティングされた改変重鎖遺伝子座を含む陽性ＥＳ細胞を核型分析によって確認した。次いで、二重にターゲティングされたＥＳ細胞からＤＮＡを単離し、リコンビナーゼによる処理に供することにより、第１のターゲティングベクターの５’リコンビナーゼ認識部位と第２のターゲティングベクターの５’リコンビナーゼ認識部位との間のマウス重鎖遺伝子座のゲノムＤＮＡの欠失を媒介し、２つのリコンビナーゼ認識部位により隣接される単一のリコンビナーゼ認識部位及びハイグロマイシンカセットを残した（図１５の上を参照）。このようにしてインタクトなＣＨ遺伝子を含む改変されたマウス重鎖遺伝子座を作製し、図１５に概説するようなターゲティングベクターを用いて正確な様式でヒトκ生殖系列遺伝子セグメントを順に挿入した。
【０１６０】
別個の４つのターゲティングベクターを操作して、４０個のヒトＶκ遺伝子セグメント及び５個のヒトＪκ遺伝子セグメントを（上記）不活性化されたマウス重鎖遺伝子座に順に挿入した（図１５）。上記４つのターゲティングコンストラクトの操作に用いたヒトκ遺伝子セグメントは、生殖系列ヒトκ軽鎖遺伝子座の近位コンティグに天然に見出される（図１４Ｂ）。
【０１６１】
係る改変された重鎖遺伝子座についてヘテロ接合性のマウスを交配して上記重鎖遺伝子座についてホモ接合性のマウスを得た。参照により本明細書に援用されるＭａｃｄｏｎａｌｄらの米国特許出願公開第ＵＳ２０１１／０１４５９３７号に記載の方法を用い、図１６に示したスキームに従って軽鎖可変領域遺伝子セグメントを有する係る改変された重鎖遺伝子座を含む胚性幹細胞をターゲティングして、軽鎖可変領域、及びＩｇＧ１遺伝子において機能的ＣＨ１ドメインを欠き、更にＩｇＧ２ｂ遺伝子及びＩｇＧ２ａ遺伝子を欠いている重鎖定常領域を含んでいる重鎖遺伝子座についてホモ接合性のマウスを作製した
【０１６２】
このように、図１６に記載のターゲティングベクターを用いて、例えばＵＳ２０１２／００９６５７２に記載の軽鎖可変領域遺伝子セグメントを含んでいる改変された重鎖遺伝子座マウスの生殖系列を更に改変して、重鎖遺伝子座を操作し、ＩｇＧ１遺伝子セグメントが機能的ＣＨ１ドメインを欠いているように、且つＩｇＧ２ａ遺伝子及びＩｇＧ２ｂ遺伝子を欠失させてヒトカッパ可変ドメイン及びネズミＩｇＧ１定常領域を含んでいる単一ドメイン抗原結合タンパク質についてホモ接合性のマウスが得られるようにし、ここで、該ＩｇＧ１定常ドメインは機能的ＣＨ１領域を欠いている（ｈＶκＩｇＧ１ΔＣＨ１ΔＩｇＧ２ａΔＩｇＧ２ｂ；６０８２ＨＯ）。ＣＨ１欠失及び／または免疫グロブリン定常遺伝子欠失の組み合わせの追加の変形例を作製する。例えば、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａの両方がＣＨ１ドメイン欠失を含むヒト軽鎖カッパ可変領域を含んでいる重鎖遺伝子座を含むマウスを作製し、該マウスはＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ２ｂの欠失も含む。
【０１６３】
ウエスタンブロットにより軽鎖のみの単一ドメイン結合タンパク質が存在しており、ヒトカッパ可変ドメイン及びネズミＩｇＧ１定常領域を含むように遺伝子改変されたマウスから単離され得ることを確認し、ここで該ＩｇＧ１定常ドメインは機能的ＣＨ１領域を欠いている（６０８２ＨＯ、データは示さず）。
【０１６４】
実施例２．２：ＶＬ単一ドメイン結合タンパク質をコードする遺伝子配列の生産的な再構成の確認
（ａ）軽鎖可変領域と、ＩｇＧ１遺伝子において機能的ＣＨ１ドメインを欠き、且つ更にＩｇＧ２ｂ遺伝子及びＩｇＧ２ａ遺伝子を欠いている重鎖定常遺伝子配列とを含んでいる重鎖遺伝子座についてホモ接合性のマウス、（ｂ）対照野生型、及び（ｃ）ヒト重鎖Ｖ、Ｄ及びＪセグメントを発現し、ＩｇＧ１遺伝子における機能的ＣＨ１ドメインを欠き、且つ機能的ＩｇＧ２ｂ及びＩｇＧ２ａ遺伝子も欠き、且つ共通またはユニバーサル軽鎖とも呼ばれる単一の再構成された軽鎖遺伝子座（例えば、米国特許出願公開第２０１１／０１９５４５４号参照）を含む改変されたマウス重鎖遺伝子座について双方ホモ接合性の対照ＣＨ１  ｄｅｌ  ｘ  ＵＬＣマウスの脾臓及び骨髄からＢ細胞のｍＲＮＡを単離した。ＴＡＱＭＡＮアッセイにおいて以下のプローブ及びプライマーを用いて、単離したｍＲＮＡの生産的な再構成を分析した：
ｈＪｋ／ｍＩｇＧ１ヒンジ−セット７１（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓに注文）
（センス）５’−ＧＧＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＡＣ−３’（配列番号１）、
（アンチセンス）５’−ＣＴＴＣＴＧＧＧＡＣＴＧＴＡＣＡＴＡＴＧＣＡＡ−３’（配列番号２）、
（プローブ）５’−ＦＡＭ−ＣＣＣＡＧＧＧＡＴＴＧＴＧＧＴＴＧＴＡＡＧＣＣ−ＢＨＱ１−３’（配列番号３）；
ｈＪＨ／ｍＩｇＧ１ヒンジ−セット７２（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓに注文）
（センス）５’−ＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＴＧ−３’（配列番号４）、
（アンチセンス）５’−ＣＡＣＡＣＧＴＧＡＣＣＴＴＡＧＧＡＧＴＣＡＧＡＧ−３’（配列番号５）、
（プローブ）５’−ＦＡＭ−ＴＧＧＴＴＧＴＡＡＧＣＣＴＴＧＣ−ＭＧＢ−３’（配列番号６）；
ｍＨＰＲＴ１−セット５１（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓに注文）
（センス）５’−ＣＧＡＧＴＣＴＧＡＡＧＣＴＣＴＣＧＡＴＴＴＣＣＴ−３’（配列番号７）、
（アンチセンス）５’−ＣＡＧＣＣＡＡＣＡＣＴＧＣＴＧＡＡＡＣＡＴＧ−３’（配列番号８）、
（プローブ）５’−ＦＡＭ−ＣＡＧＣＡＴＣＴＡＡＧＡＧＧＴＴＴＴＧＣＴＣＡＧＴＧＧＡ−ＢＨＱ−３（配列番号９）’；
【０１６５】
図１７Ａ及び１７Ｂに示すように、内在性重鎖可変領域遺伝子セグメントを置き換える再構成されていない軽鎖可変領域遺伝子セグメントは、機能的ＣＨ１ドメインを欠いている内在性重鎖定常ＩｇＧ１遺伝子による生産的な再構成を受けることができる。
【０１６６】
実施例３：ＶＬ単一ドメイン結合タンパク質をコードするマウス：軽鎖可変領域、及び機能的ＣＨ１ドメインを欠いている重鎖定常領域を有する免疫グロブリン鎖を含み且つ単一の再構成された軽鎖（ＵＬＣ）を含むマウス
単一の再構成されたヒト生殖系列軽鎖領域を含んでいるＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）ヒト化マウス（ＵＬＣ  Ｖκ３−２０Ｊκ１；１６３５、あるいは、ＵＬＣ  Ｖκ１−３９Ｊκ５；１６３３も使用する）を、ＩｇＧ１  ＣＨ１ドメイン、ＩｇＧ２ａ遺伝子及びＩｇＧ２ｂ遺伝子が欠失または不活性化されたネズミ定常領域に作動可能に連結されるヒト軽鎖カッパ可変領域を含んでいる改変された重鎖遺伝子座を担持するマウス（ｈＶκＩｇＧ１ΔＣＨ１ΔＩｇＧ２ａ／２ｂ；６０８２）と交配して以下の後代マウスを得た：ｈＶκＩｇＧ１ΔＣＨ１ΔＩｇＧ２ａ／２ｂ  ｘ  Ｖκ３−２０Ｊκ１  ＵＬＣホモ接合マウス（６０８２ＨＯ  １６３５ＨＯ）。これらのマウスはＶＬ単一ドメイン結合タンパク質を発現した（図１８）。
【図１Ａ−Ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ−Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ−Ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８】
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【配列表】
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