(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式IのGalNAcホスホロアミダイト誘導体であって、
0006649482.tif 000041
式中、R1はアシル基であり、nは0〜10の整数であり、mは0〜20の整数である、
前記GalNAcホスホロアミダイト誘導体、対応するエナンチオマー、および/またはそれらの光学異性体。
【請求項２】
R1が、C1〜6-アルキルまたはフェニルで置換されていてもよいC1〜6-アルキルカルボニル基である、請求項1に記載のGalNAcホスホロアミダイト誘導体。
【請求項３】
nが0〜5の整数であり、mが0〜10の整数である、請求項1または2に記載のGalNAcホスホロアミダイト誘導体。
【請求項４】
式IaのGalNAcホスホロアミダイト誘導体であり、
0006649482.tif 000042
式中、R1、m、およびnは前述のとおりである、
請求項1〜3のいずれか一項に記載のGalNAcホスホロアミダイト誘導体。
【請求項５】
R1がアセチルであり、nが2であり、mが5である、請求項1〜4のいずれか一項に記載のGalNAcホスホロアミダイト誘導体。
【請求項６】
式Ib
0006649482.tif 000043
の、請求項1〜5のいずれか一項に記載のGalNAcホスホロアミダイト誘導体。
【請求項７】
（a）式中、R1およびnが前記請求項1に記載された定義のとおりである、式IIIのGalNAc酸誘導体
0006649482.tif 000044
を、式中、R3がヒドロキシ保護基であり、mが前記請求項1に記載された定義のとおりである、式IVのアミン
0006649482.tif 000045
と反応させて、式中、R1、R3、nおよびmが前述のとおりである、式Vのアミド
0006649482.tif 000046
を形成する工程、
（b）ヒドロキシ保護基R3を除去して、式中、R1、nおよびmが前述のとおりである、式VIのGalNAc酸アミド
0006649482.tif 000047
を形成する工程、
ならびに
（c）式VIのGalNAc酸アミドをホスホロアミド化剤と反応させて、式IのGalNAcホスホロアミダイト誘導体を形成する工程
を含む、式IのGalNAcホスホロアミダイト誘導体の調製方法。
【請求項８】
工程（a）におけるアミド形成が、ペプチドカップリング剤、アミン塩基および有機溶媒の存在下で行われる、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
ペプチドカップリング剤がn-プロピルホスホン酸無水物であり、アミン塩基が第三級アミンであり、有機溶媒が極性非プロトン性溶媒であり、かつ反応温度が20℃〜70℃より選択される、請求項7または8に記載の方法。
【請求項１０】
工程（b）における除去が、水素化分解であり、水素化触媒の存在下で水素との接触水素化によって行われる、請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
ヒドロキシ保護基R3がベンジルである、請求項7〜10のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
工程（c）におけるホスホロアミド化剤が、2-シアノエチル-N,N-ジ-(2-プロピル)クロロホスホロアミダイトまたは2-シアノエチル-N,N,N’,N’-テトラ(2-プロピル)ホスホロジアミダイトより選択される、請求項7に記載の方法。
【請求項１３】
工程（c）における反応が、第三級アミンおよび極性非プロトン性溶媒の存在下、-20℃〜50℃の反応温度で、2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルクロロホスホロアミダイトを用いて行われる、請求項7または12に記載の方法。
【請求項１４】
GalNAcクラスターオリゴヌクレオチド結合体の調製のための式IのGalNAcホスホロアミダイト誘導体、対応するエナンチオマー、および/またはそれらの光学異性体の使用：
0006649482.tif 000048
（式中、R1はアシル基であり、nは0〜10の整数であり、mは0〜20の整数である）。
【請求項１５】
GalNAcクラスターオリゴヌクレオチド結合体の調製が、
（a2）請求項7〜13に記載の式IのGalNAcホスホロアミダイト誘導体の調製、
（b2）固体支持体に結合した所望のGalNAcクラスターオリゴヌクレオチド結合体を形成するための、所望の配列の所望のヌクレオシド構築ブロックと共に、オリゴヌクレオチド固相合成における式IのGalNAcホスホロアミダイト誘導体の使用、および最終的に
（c2）固相支持体からのGalNAcクラスターオリゴヌクレオチド結合体の切断および完全な脱保護
を含む、請求項14に記載の使用。
【請求項１６】
式IaのGalNAcホスホロアミダイト誘導体
0006649482.tif 000049
（式中、R1、m、およびnは前述のとおりである）
が用いられる、請求項14または15に記載の使用。
【請求項１７】
式IbのGalNAcホスホロアミダイト誘導体
0006649482.tif 000050
が用いられる、請求項14または15に記載の使用。
【請求項１８】
GalNAcクラスターオリゴヌクレオチド結合体が、以下より選択され、
0006649482.tif 000051
式中、AM-C6は、6-アミノヘキシル-1-ホスフェートまたは1-チオホスフェート結合を意味し、大文字はβ-D-オキシ-LNA単位を意味し、小文字はDNA単位を意味し、下付き文字「s」はホスホロチオアート結合を意味し、上付き文字mは、5-メチルシトシン塩基を含むDNAまたはβ-D-オキシ-LNA単位を意味し、上付き文字5-Brは、5-ブロモシトシン塩基を含むDNA単位を意味する、
請求項14〜17のいずれか一項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の概要】
【０００１】
本発明は、式IのGalNAcホスホロアミダイト誘導体、対応するエナンチオマー、および／またはそれらの光学異性体に関する。
0006649482.tif 000002
式中、R1はヒドロキシ保護基であり、nは0〜10の整数であり、mは0〜20の整数である。
【０００２】
式IのGalNAcホスホロアミダイトは、GalNAc部分を含む結合体の標的指向部分であるGalNAc部分を有する。GalNAc部分は、肝細胞上に位置するアシアロ糖タンパク質受容体へのその親和性により、オリゴヌクレオチド結合体の肝細胞への機能的送達を可能にする。そのようなGalNAcクラスター結合体は、薬物動態調節剤として作用する可能性を有するため、例えば、PCT公報WO 2012/083046または米国特許出願公開US 2011/0207799号に記載されているとおり、治療的に有用な化合物である。
【０００３】
GalNAc部分とホスホロアミダイトとの独特な組み合わせのために、式IのGalNAcホスホロアミダイトは、固相オリゴヌクレオチド合成において、ヌクレオシド構築ブロックと一緒に構築ブロックとして直接導入することができる。したがって、GalNAc部分を導入する別個の結合工程を回避することができる。
【０００４】
したがって、本発明の目的は、このような構築ブロックを提供することであった。また本発明のさらなる目的は、GalNAcクラスターオリゴヌクレオチド結合体の調製のための式IのGalNAcホスホロアミダイト誘導体の使用であった。
【０００５】
本目的は、上記の式Iの新規GalNAcホスホロアミダイト誘導体で達成することができた。
[本発明1001]
式IのGalNAcホスホロアミダイト誘導体であって、
0006649482.tif 000003
式中、R1はヒドロキシ保護基であり、nは0〜10の整数であり、mは0〜20の整数である、
前記GalNAcホスホロアミダイト誘導体、対応するエナンチオマー、および/またはそれらの光学異性体。
[本発明1002]
R1がアシル基である、本発明1001のGalNAcホスホロアミダイト誘導体。
[本発明1003]
R1が、C1〜6-アルキルまたはフェニルで置換されていてもよいC1〜6-アルキルカルボニル基である、本発明1001または1002のGalNAcホスホロアミダイト誘導体。
[本発明1004]
nが0〜5の整数であり、mが0〜10の整数である、本発明1001〜1003のいずれかのGalNAcホスホロアミダイト誘導体。
[本発明1005]
式IaのGalNAcホスホロアミダイト誘導体であり、
0006649482.tif 000004
式中、R1、m、およびnは前述のとおりである、
本発明1001〜1004のいずれかのGalNAcホスホロアミダイト誘導体。
[本発明1006]
R1がアセチルであり、nが2であり、mが5である、本発明1001〜1005のいずれかのGalNAcホスホロアミダイト誘導体。
[本発明1007]
式Ib
0006649482.tif 000005
の、本発明1001〜1006のいずれかのGalNAcホスホロアミダイト誘導体。
[本発明1008]
（a）式中、R1およびnが前述のとおりである、式IIIのGalNAc酸誘導体
0006649482.tif 000006
を、式中、R3がヒドロキシ保護基であり、mが前述のとおりである、式IVのアミン
0006649482.tif 000007
と反応させて、式中、R1、R3、nおよびmが前述のとおりである、式Vのアミド
0006649482.tif 000008
を形成する工程、
（b）ヒドロキシ保護基R3を除去して、式中、R1、nおよびmが前述のとおりである、式VIのGalNAc酸アミド
0006649482.tif 000009
を形成する工程、
ならびに
（c）式VIのGalNAc酸アミドをホスホロアミド化剤と反応させて、式IのGalNAcホスホロアミダイト誘導体を形成する工程
を含む、式IのGalNAcホスホロアミダイト誘導体の調製方法。
[本発明1009]
工程（a）におけるアミド形成が、ペプチドカップリング剤、アミン塩基および有機溶媒の存在下で行われる、本発明1008の方法。
[本発明1010]
ペプチドカップリング剤がn-プロピルホスホン酸無水物であり、アミン塩基が第三級アミンであり、有機溶媒が極性非プロトン性溶媒であり、かつ反応温度が20℃〜70℃より選択される、本発明1008または1009の方法。
[本発明1011]
工程（b）における除去が、水素化分解であり、水素化触媒の存在下で水素との接触水素化によって行われる、本発明1008の方法。
[本発明1012]
ヒドロキシ保護基R3がベンジルである、本発明1008〜1011のいずれかの方法。
[本発明1013]
工程（c）におけるホスホロアミド化剤が、2-シアノエチル-N,N-ジ-(2-プロピル)クロロホスホロアミダイトまたは2-シアノエチル-N,N,N’,N’-テトラ(2-プロピル)ホスホロジアミダイトより選択される、本発明1008の方法。
[本発明1014]
工程（c）における反応が、第三級アミンおよび極性非プロトン性溶媒の存在下、-20℃〜50℃の反応温度で、2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルクロロホスホロアミダイトを用いて行われる、本発明1008または1013の方法。
[本発明1015]
GalNAcクラスターオリゴヌクレオチド結合体の調製のための式IのGalNAcホスホロアミダイト誘導体の使用。
[本発明1016]
GalNAcクラスターオリゴヌクレオチド結合体の調製が、
（a2）本発明1008〜1014の式IのGalNAcホスホロアミダイト誘導体の調製、
（b2）固体支持体に結合した所望のGalNAcクラスターオリゴヌクレオチド結合体を形成するための、所望の配列の所望のヌクレオシド構築ブロックと共に、オリゴヌクレオチド固相合成における式IのGalNAcホスホロアミダイト誘導体の使用、および最終的に
（c2）固相支持体からのGalNAcクラスターオリゴヌクレオチド結合体の切断および完全な脱保護
を含む、本発明1015の使用。
[本発明1017]
式Ia、好ましくは式IbのGalNAcホスホロアミダイト誘導体が用いられる、本発明1015または1016の使用。
[本発明1018]
GalNAcクラスターオリゴヌクレオチド結合体が、以下より選択され、
0006649482.tif 000010
式中、AM-C6は、6-アミノヘキシル-1-ホスフェートまたは1-チオホスフェート結合を意味し、大文字はβ-D-オキシ-LNA単位を意味し、小文字はDNA単位を意味し、下付き文字「s」はホスホロチオアート結合を意味し、上付き文字mは、5-メチルシトシン塩基を含むDNAまたはβ-D-オキシ-LNA単位を意味し、上付き文字5-Brは、5-ブロモシトシン塩基を含むDNA単位を意味する、
本発明1015〜1017のいずれかの使用。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
以下の定義は、本明細書において本発明を記載するために用いられる様々な用語の意味および範囲を例示し、定義するために示す。
【０００７】
化学構造中にキラル炭素が存在する場合はいつも、そのキラル炭素に関連するすべての立体異性体は、純粋な立体異性体ならびにその混合物として構造に包含されることが意図される。
【０００８】
「C1〜12-アルキル」なる用語は、1〜12個の炭素原子、特定の態様においては1〜6個の炭素原子の一価の直鎖または分枝飽和炭化水素基を意味する。アルキルの例には、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、n-ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、ならびにペンチルおよびヘキシルと、その異性体が含まれる。
【０００９】
「アシル」なる用語は、アルキル基に結合しているカルボニル基を意味する。本用語は特にC1〜12-アルキルカルボニル基、より詳細にはC1〜6-アルキルで置換されていてもよいか、またはフェニルで置換されていてもよいC1〜6-アルキルカルボニル基を表す。アシル基の例は、アセチル、ピバロイルまたはベンゾイルである。フェニルの任意の置換基は、塩素、臭素もしくはヨウ素などのハロゲンまたは上記に定義されるC1〜6-アルキル基である。
【００１０】
「ヒドロキシ保護基」なる用語は、ヒドロキシ基を保護することが意図される基を意味し、エステルおよびエーテル形成基、特にテトラヒドロピラニル、アシル（例えば、ベンゾイル、アセチル、カルバモイル）、ベンジルおよびシリルエーテル（例えば、TBS、TBDPS）基が含まれる。これらの基のさらなる例は、T. W. Greene and P. G. M. Wuts, ''Protective Groups in Organic Synthesis'', 2nd ed., John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, 1991, chapters 2-3；E. Haslam, ''Protective Groups in Organic Chemistry'', J. G. W. McOmie, Ed., Plenum Press, New York, NY, 1973, Chapter 5、およびT.W. Greene, ''Protective Groups in Organic Synthesis'', John Wiley and Sons, New York, NY, 1981において見出される。
【００１１】
「ハロゲン」なる用語は、フッ素、塩素、臭素、またはヨウ素を表す。
【００１２】
好ましい態様において、GalNAcホスホロアミダイト誘導体は、ヒドロキシ保護基R1がアシル基、特にC1〜12-アルキルカルボニル基、より詳細にはC1〜6-アルキルまたはフェニルによって置換されていてもよいC1〜6-アルキルカルボニル基である、式Iを有する。好ましいヒドロキシ保護基R1は、アセチル、ピバロイルまたはベンゾイルから選択することができ、アセチルが最も好ましい。
【００１３】
nは、好ましくは0〜5の整数であり、より好ましくは1〜3の整数であるが、最も好ましくは2である。
【００１４】
mは好ましくは0〜10の整数であり、より好ましくは3〜7の整数であるが、最も好ましくは5である。
【００１５】
好ましい態様において、GalNAcホスホロアミダイト誘導体は、R1、nおよびmが前述のとおりである、式Iaを有する。
0006649482.tif 000011
【００１６】
好ましくは、R1はアシルであり; nは0、1、2、3、4または5であり、かつmは0、1、2、3、4、5、6、7、8、8または10であり、より好ましくは、R1はアセチル、ピバロイルまたはベンゾイルであり; nは1、2または3であり、かつmは3、4、5、6または7である。
【００１７】
さらにより好ましい態様において、GalNAcホスホロアミダイト誘導体は、式Ibを有し、これはR1=アセチル、n=2およびm=5を伴う式Iaに対応する。
0006649482.tif 000012
【００１８】
式IのGalNAcホスホロアミダイト誘導体の調製方法は、以下を含む。
a）式Vのアミドを形成するための、式IIIのGalNAc酸誘導体と
0006649482.tif 000013
（式中、R1およびnは前述のとおりである）
式IVのアミンとの反応
0006649482.tif 000014
（式中、R3はヒドロキシ保護基であり、mは前述のとおりである）
0006649482.tif 000015
（式中、R1、R3、nおよびmは前述のとおりである）
b）式VIのGalNAc酸アミドを形成するためのヒドロキシ保護基R3の除去
0006649482.tif 000016
（式中、R1、nおよびmは前述のとおりである）
c）式IのGalNAcホスホロアミダイト誘導体を形成するための、式VIのGalNAc酸アミドとホスホロアミド化剤との反応。
【００１９】
工程a）
工程a）は、式IIIのGalNAc酸誘導体と式Vのアミンとの反応を含む。
【００２０】
式IIIのGalNAc誘導体のベンジルエステル前駆体は、以下のスキーム1に従って調製することができる。例えばパラジウム炭素などの水素化触媒の存在下での、水素との接触水素化による、後続のベンジルエステルの水素化分解が、式IIIのGalNAc誘導体をもたらす。
【００２１】
スキーム1：
0006649482.tif 000017
【００２２】
式Vのアミンは、以下のスキーム2の6-ベンジルオキシヘキサン-1-アミンについて例示されるとおりに調製することができる。この反応は、例えば、Saneyoshi, Hisao et al, Organic Letters, 16(1), 30-33; 2014またはAlvarez, M. et al, Anales de Quimica, Serie C: Quimica Organica y Bioquimica, 83(2), 155-61; 1987またはAlvarez, M. et al, Journal of Medicinal Chemistry, 30(7), 1186-93; 1987に記載されている。市販のハロゲンヘキサノキシメチルベンゼンから出発して、各イソインドリン-1,3-ジオンを1,3-ジオキソイソインドリン塩を用いて形成する。適切な1,3-ジオキソイソインドリン塩は、ナトリウム塩またはカリウム塩のようなアルカリ塩またはテトラブチルアンモニウム塩などのテトラアルキルアンモニウム塩である。後続の工程において、イソインドリン-1,3-ジオン基を、ヒドラジンまたは第1級アミン、好ましくはメチルアミンを用いて切断して遊離アミンを形成することができる。
【００２３】
スキーム2：
0006649482.tif 000018
【００２４】
工程a）のアミド形成は、ペプチドカップリング剤、アミン塩基および有機溶媒の存在下で行われる。
【００２５】
カップリングは、DCC（N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド）のようなカルボジイミドカップリング剤ならびにHOBt（1-ヒドロキシベンズトリアゾール）、HOSu（N-ヒドロキシスクシンイミド）、TBTU（N,N,N',N'-テトラメチル-O-(ベンゾトリアゾール-1-イル)ウロニウムテトラフルオロボラート、HBTU（2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート）またはHOAt（1-ヒドロキシ-7-アザベンゾトリアゾールおよびTBTU/HOBtまたはHBTU/HOAtなどのその一般的な組み合わせなどの添加剤を用いて、当業者に公知の古典的方法に従うことができる。
【００２６】
好ましい態様において、n-プロピルホスホン酸無水物（T3P）を、トリエチルアミンまたはN-エチルジイソプロピルアミンのような第三級アミン塩基と共に、好ましくはN-エチルジイソプロピルアミンと共に、カップリング剤として選択する。
【００２７】
カップリング反応は、通常、アセトニトリルもしくはテトラヒドロフランまたはその混合物のような極性非プロトン性溶媒中、20℃〜70℃の範囲、好ましくは20℃〜40℃の範囲の反応温度で行われる。
【００２８】
式V生成物の粗製アミドは、溶媒の蒸発によって単離することができる。生成物のさらなる精製は、無極性固定相およびアセトニトリル/水などの極性移動相を用いる分取逆相クロマトグラフィーまたはCO2/メタノール/エタノール/2-プロパノールを用いるSFC（超臨界流体クロマトグラフィー）によって達成することができる。
【００２９】
工程b)
工程b）は、ヒドロキシ保護基R3を除去して、式VIのGalNAc酸アミドを形成することを必要とする。
【００３０】
ヒドロキシ保護基R1が影響を受けずに残存しつつ、ヒドロキシ保護基R3が切断される方法で除去条件を選択できるように、ヒドロキシ保護基R3がヒドロキシ保護基R1と化学的に異なることが重要である。
【００３１】
適切なヒドロキシ保護基R3は、ハロゲンまたはC1〜6-アルキルで置換されていてもよいベンジルであるか、またはベンズヒドリルもしくはトリチル、すなわち水素化分解によって切断され得る基である。あるいは、R3はtert-ブチルジメチルシリルのようなシリルである。シリル基は、フッ化物イオンの存在下で切断することができる。
【００３２】
好ましい態様において、R3はベンジルであり、水素化分解は、適切な水素化触媒の存在下での水素との接触水素化である。
【００３３】
ベンジル基の除去に適した水素化触媒は、パラジウム炭素（Pd/C）である。
【００３４】
反応は、通常、アセトニトリルもしくはテトラヒドロフランまたはそれらの混合物のような極性非プロトン性溶媒の存在下、0℃〜40℃、好ましくは10℃〜30℃の反応温度、1バール〜5バールの水素圧力で行われる。
【００３５】
式VIのGalNAc酸アミドは、触媒をろ過除去し、蒸発により溶媒を除去することによって分離することができる。
【００３６】
工程c)
工程c）は、式IのGalNAcホスホロアミダイト誘導体を形成するために、式VIのGalNAc酸アミドとホスホロアミド化剤との反応を必要とする。
【００３７】
ホスホロアミド化剤は、2-シアノエチル-N,N-ジ-(2-プロピル)クロロホスホロアミダイトまたは2-シアノメチル-N,N,N’,N’-テトラ(2-プロピル)ホスホロジアミダイトより選択することができる。
【００３８】
2-シアノメチル-N,N,N’,N’-テトラ(2-プロピル)ホスホロジアミダイトが用いられる場合には、テトラゾール、5-(エチルチオ)-1H-テトラゾール、5-(ベンジルチオ)-1H-テトラゾール、または4,5-ジシアノイミダゾールのような活性化化合物の存在下で反応が行われる。
【００３９】
好ましい態様において、2-シアノエチル-N,N-ジ-(2-プロピル)クロロホスホロアミダイトが選択される。次いで、トリエチルアミンなどの第三級アミン、およびアセトニトリルもしくはテトラヒドロフランまたはそれらの混合物などの極性非プロトン性溶媒の存在下、-20℃〜50℃の反応温度で、好ましくはアセトニトリル中、0℃〜20℃の反応温度で反応が行われる。
【００４０】
式IのGalNAcホスホロアミダイト誘導体は、概して、ろ過によってトリエチルアミン塩酸塩から分離することができる。粗生成物を伴うろ液は、さらに精製することなく固相ヌクレオチド合成に直接用いることができる。
【００４１】
GalNAcクラスターオリゴヌクレオチド結合体の調製のための式IのGalNAcホスホロアミダイト誘導体の使用
本発明のさらなる態様において、式IのGalNAcホスホロアミダイト誘導体は、治療的に有用なGalNAcクラスターオリゴヌクレオチド結合体の調製に用いることができる。
【００４２】
GalNAcクラスターオリゴヌクレオチド結合体の調製は、
a2）上記の式IのGalNAcホスホロアミダイト誘導体の調製、
b2）固体支持体に結合した所望のGalNAcクラスターオリゴヌクレオチド結合体を形成するための、所望の配列の所望のヌクレオシド構築ブロックと共に、オリゴヌクレオチド固相合成におけるその使用、および最終的に
c2）固相支持体からのGalNAcクラスターオリゴヌクレオチド結合体の切断および完全な脱保護
を含む。
【００４３】
好ましい態様において、式Ia、好ましくは式IbのGalNAcホスホロアミダイト誘導体が用いられる。
【００４４】
本明細書において用いられるオリゴヌクレオチドなる用語は、複数の共有結合されたヌクレオシドを含む分子として、それが当業者によって一般的に理解されるとおりに定義される。治療的に有用なオリゴヌクレオチドとしての使用のためには、オリゴヌクレオチドは典型的には7〜30ヌクレオチドの長さで合成される。オリゴヌクレオチドは、一般に、固相化学合成とそれに続く精製によって実験室で作られる。オリゴヌクレオチドの配列に言及する場合、共有結合したヌクレオチドまたはヌクレオシドの核酸塩基部分、またはその修飾物の配列または順序が参照される。本発明のオリゴヌクレオチドは人工的に造られるものであり、化学的に合成され、典型的には精製または単離される。本発明のオリゴヌクレオチドは、1つまたは複数の修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドを含み得る。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドはアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【００４５】
オリゴヌクレオチドは、DNA、RNA、修飾RNAもしくはLNAヌクレオシドモノマー、またはその組み合わせからなってもよい。LNAヌクレオシドモノマーは、ヌクレオチドのリボース糖環のC2'とC4'との間に（ビラジカル（biradicle）または架橋といわれる）リンカー基を含む、修飾ヌクレオシドである。これらのヌクレオシドは、文献中で架橋核酸または二環式核酸（BNA）とも呼ばれる。
【００４６】
非限定的な態様において、オリゴヌクレオチドは、以下からなる群より選択することができる：
0006649482.tif 000019
式中、大文字はβ-D-オキシ-LNA単位を意味し；小文字はDNA単位を意味し；下付き文字「s」はホスホロチオアート結合を意味し；上付き文字mは、5-メチルシトシン塩基を含むDNAまたはβ-D-オキシ-LNA単位を意味し、上付き文字5-Brは、5-ブロモシトシン塩基を含むDNA単位を意味する。
【００４７】
オリゴヌクレオチド固相合成における構築ブロックとしての式IのGalNAcホスホロアミダイト誘導体の使用は、オリゴヌクレオチドの5’末端に適切なアミノリンカーと共にGalNAc部分を導入し、所望のGalNAcクラスターオリゴヌクレオチド結合体を形成することを可能にする。非限定的な態様において、GalNAcクラスターオリゴヌクレオチド結合体は、以下からなる群より選択することができる：
0006649482.tif 000020
式中、AM-C6は、6-アミノヘキシル-1-ホスフェートまたは以下の式の1-チオホスフェート結合を意味する。
0006649482.tif 000021
【００４８】
固相合成後、GalNAcクラスターオリゴヌクレオチド結合体は、依然として固体支持体上に結合しており、ヒドロキシ保護基R1のような保護基を依然として有している。
【００４９】
支持体からの切断および脱保護は、当業者に公知であり、Wincott et al.; Nucl. Acids Res. (1995) 23 (14): 2677-2684などの文献に記載される方法を用いて行うことができる。通常、GalNAcクラスターオリゴヌクレオチド結合体は、アンモニウム塩、またはナトリウム塩もしくはカリウム塩のようなアルカリ金属塩などの適切な塩の形態で得られる。
【００５０】
本明細書中に開示される化合物は、配列番号1、2、3、4および5からなる群より選択される核酸塩基配列を有する。
0006649482.tif 000022
【実施例】
【００５１】
略語：
AcOH  酢酸
DMAP  4-(ジメチルアミノ)-ピリジン
DMF  N,N'-ジメチルホルムアミド
EtOH  エタノール
MeOH  メタノール
rt  室温(20〜25℃)
THF  テトラヒドロフラン
MTBE  メチルtert-ブチルエーテル
【００５２】
GalNAc酸前駆体の合成
構築ブロックA：
実施例1
(2S)-6-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)-2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)ヘキサン酸ベンジル
0006649482.tif 000023
234.0g（500.0mmol）の(2S)-6-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)-2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)ヘキサン酸を500mlのジクロロメタンに懸濁し、62.0ml（600mmol、1.2当量）のベンジルアルコールおよび3.05gのDMAP（25.0mmol、0.05当量）を加えた。溶液を40分間のうちに0〜5℃に冷却し、500mlのジクロロメタン中の108.0g（525.0mmol、1.05当量）のN,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミドの溶液を滴加した。白色懸濁液を0〜5℃で1時間と、次いで室温で15時間撹拌した。懸濁液をG3ガラスフィルターでろ過し、白色ろ過ケークを合計250mlのジクロロメタンで少しずつ洗浄した。ろ液を650〜10mbar/1時間で蒸発させて、黄色油状物を得、これを2.0Lの酢酸エチルに溶解し、2.0Lの0.5M塩酸、2.0Lの1M NaHCO3および1.0Lの食塩水で抽出し、有機層を40℃/150〜10mbar/5時間で蒸発乾固させて、291.1gの粗製(2S)-6-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)-2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)ヘキサン酸ベンジルを白色固体として、収率104％および純度96.4％（HPLC面積％；約5％のベンジルアルコールを含む）で得た。この物質をそれ以上精製せずに次の工程で用いた。MS: m/z = 459.22735 (M-boc+H)+
【００５３】
実施例2
(2S)-2-アミノ-6-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)ヘキサン酸ベンジルメタンスルホン酸塩
0006649482.tif 000024
291.1g（500.0mmol）の(2S)-6-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)-2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)ヘキサン酸ベンジル（HPLC純度；95.8％；約5％のベンジルアルコールを含む）を1.4LのTHFに室温で溶解した。10分以内に、1.04Lのジエチルアミン（10.0mol、20当量）を加え、淡黄色溶液を室温で2時間撹拌し、次いで40℃/200〜10mbarで蒸発させ、200mlのアセトニトリルを加え、ジエチルアミンを効率的に除去するために40℃/100〜10mbar/1時間で再度蒸発させた。最後に、268.1gの黄色油状物を得、これを2.5Lのアセトニトリルに溶解し、室温で10分間撹拌した。不溶性粒子をガラスファイバーフィルターでろ過し、500mlのアセトニトリルで洗浄した。ろ液を10分間のうちに20℃〜25℃で34.0mlのメタンスルホン酸を滴加して処理した。生成した白色懸濁液を室温で17時間撹拌し、G3ガラスフィルターでろ過した。ろ過ケークを500mlのアセトニトリルで少しずつ洗浄した。白色結晶を40℃/15mbar/4時間で乾燥し、195.8gの(2S)-2-アミノ-6-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)ヘキサン酸ベンジルメタンスルホン酸塩を白色結晶として、収率91％（2工程）および純度99.3％（HPLC面積％）で得た。MS: m/z = 337.2149 (M+H)+
【００５４】
実施例3
(2S)-2-[[(2S)-2,6-ビス(tert-ブトキシカルボニルアミノ)ヘキサノイル]アミノ]-6-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)ヘキサン酸ベンジル
0006649482.tif 000025
190.0g（439.0mmol）の(2S)-2-アミノ-6-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)ヘキサン酸ベンジルメタンスルホン酸塩を1.9LのTHFに室温で懸濁した。335ml（1.98mol、4.5当量）のN-エチルジイソプロピルアミンを加え、それにより温度は15℃までわずかに低下した。次に、213g（615mmol、1.4当量）の(S)-2,6-ビス((tert-ブトキシカルボニル)アミノ)ヘキサン酸を加え、白色懸濁液を室温で20分間撹拌した。390mlのn-プロピルホスホン酸無水物（環式三量体としてのT3P、酢酸エチル中50％、659mmol、1.5当量）を20分のうちに20〜25℃（冷水浴中で冷却）で滴加した。得られた淡黄色混濁溶液を室温で1.5時間撹拌し、分液漏斗に移し、1.9L MTBEで希釈し、1.9Lの水、1.9Lの0.5M塩酸、1.9Lの0.5M NaOH、1.9Lの水および1.9Lの食塩水で抽出した。分離した、依然混濁した有機層をガラスファイバーフィルターでろ過し、フィルターを100mlのMTBEで洗浄し、合わせたろ液を40℃/100mbar/1時間で蒸発させ、1.0LのMTBE（水を共沸除去するため）を再度加え、40℃/250〜10mbar/1時間で蒸発させて、粗生成物296.4gを白色固体残渣として得た。
【００５５】
粗製固体を500mlのアセトニトリルで処理し、混濁溶液を60〜65℃で10分間加熱した。混合物を20〜25℃に冷却し、10分間撹拌し、ガラスファイバーフィルターでろ過し、50mlのアセトニトリルで洗浄した。淡黄色溶液を40℃/100〜10mbar/4時間で蒸発させて、295gの(2S)-2-[[(2S)-2,6-ビス(tert-ブトキシカルボニルアミノ)ヘキサノイル]アミノ]-6-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)ヘキサン酸ベンジルをオフホワイト固体として、収率101％（HPLC純度：100％、ジアステレオマー純度（SS）98.6％）で得、これをそれ以上精製せずに次の工程で用いた。MS: m/z = 565.3741 (M-boc+H)+
【００５６】
実施例4
(2S)-6-アミノ-2-[[(2S)-2,6-ジアミノヘキサノイル]アミノ]ヘキサン酸ベンジル三メタンスルホン酸塩
0006649482.tif 000026
124.0g（187mmol）の(2S)-2-[[(2S)-2,6-ビス(tert-ブトキシカルボニルアミノ)ヘキサノイル]アミノ]-6-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)ヘキサン酸ベンジルを1.25Lのアセトニトリルに懸濁した。61.0ml（935.0mmol、5.0当量）のメタンスルホン酸を20〜25℃で、10分のうちに加えた（ガス放出）。得られた橙色懸濁液を40分で55〜60℃まで加熱し、55〜60℃でさらに1時間撹拌した。橙赤色乳濁液を室温まで冷却し（脱boc化を1H-NMRにより制御した）、それ以上精製せずにA+B構築工程、実施例8で用いた。MS: m/z = 365.2558 (M+H)+
【００５７】
構築ブロックB:
実施例5a
2-[2-[2-(2-ヒドロキシエトキシ)エトキシ]エトキシ]酢酸ベンジル
0006649482.tif 000027
30.0g（200.0mmol）の2-[2-(2-ヒドロキシエトキシ)エトキシ]エタノールを50mlのDMFに20〜25℃で溶解し、次いで、46.0mlのメタノール中25％ナトリウムメトキシド（200.0mmol、1.0当量）を加えた。生成した溶液を40℃/50mbar/0.5時間で蒸発させ（40mlの溶媒の除去）、50mlのDMFを再度加え、40℃/20mbar/0.5時間で蒸発させた（15mlの溶媒の除去）、わずかにゼリー様の懸濁液に、50ml DMF中の13.9gのブロモ酢酸（100mmol、0.5当量）の溶液を20〜25℃で加え、混合物を6時間撹拌した。11.9mlの臭化ベンジル（100mmol、0.5当量）を加え、混合物を20〜25℃でさらに16時間撹拌した。次いで、反応混合物を200mlの食塩水で処理し、200mlのMTBEで抽出した。分離したMTBE層を200mlの食塩水で抽出し、次いで、分離したMTBE層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、40℃/300〜10mbar/1時間で蒸発させて、23.9gの粗製2-[2-[2-(2-ヒドロキシエトキシ)エトキシ]エトキシ]酢酸ベンジルを得た。
【００５８】
クロマトグラフィ（600gのシリカ60（0.063〜0.2mm）、移動相：酢酸エチル）後、合計7.85gの2-[2-[2-(2-ヒドロキシエトキシ)エトキシ]エトキシ]酢酸ベンジルを無色油状物として、収率13％および純度99.0％（HPLC面積％）で単離した。MS: m/z = 299.1517 (M+H)+
【００５９】
実施例5b
2-[2-[2-(2-ヒドロキシエトキシ)エトキシ]エトキシ]酢酸ベンジル
0006649482.tif 000028
11.2gのtert-酪酸カリウム（100.0mmol、0.5当量）を70mlの2-メチル-2-ブタノールに懸濁し（軽度の発熱35℃）、次いで30.0g（200.0mmol）の2-[2-(2-ヒドロキシエトキシ)エトキシ]エタノールを5分のうちに滴加した。滴下漏斗を10mlの2-メチル-2-ブタノールで洗浄し（温度は45℃に上昇）、溶液を60〜65℃まで加熱し、11.6g（100mmol、0.5当量）のクロロ酢酸ナトリウムを加え、60〜65℃で16時間撹拌し、次いで11.9mlの臭化ベンジル（100mmol、0.5当量）を加え、混合物を60〜65℃でさらに16時間撹拌した。反応混合物を室温まで冷却し、次いで50mlの水で処理し、80mlのMTBEおよび40mlのMTBEで抽出した。合わせたTBME層を50mlの半飽和食塩水で洗浄し、有機層を40℃/300〜10mbar/1時間で蒸発させて、27.0gの粗製2-[2-[2-(2-ヒドロキシエトキシ)エトキシ]エトキシ]酢酸ベンジルを得た。
【００６０】
クロマトグラフィ（270gのシリカ60（0.063〜0.2mm）、移動相：酢酸エチル/n-ヘプタン1/1で開始し、純粋な生成物が見えれば、移動相を100％酢酸エチルに変更）後、合計11.4gの2-[2-[2-(2-ヒドロキシエトキシ)エトキシ]エトキシ]酢酸ベンジルを無色に近い油状物として、収率19％（クロロ酢酸ナトリウムから38％）および純度99.0％（HPLC面積％）で単離した。
【００６１】
実施例6
2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジアセトキシ-6-(アセトキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]酢酸ベンジル
0006649482.tif 000029
268.0gの2-(2-(2-(2-ヒドロキシエトキシ)エトキシ)エトキシ)酢酸ベンジル（900mol）を2.4Lのジクロロメタンに溶解した。385.0gの(2S,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-6-(アセトキシメチル)テトラヒドロ-2H-ピラン-2,4,5-トリイルトリアセテート（990mmol、1.1当量）および12.0mlのトリフルオロメタンスルホン酸（135mmol、0.15当量）を加えた。懸濁液をディーンスターク分離器（50ml、AcOHを除去するため）を用いて加熱還流した。1時間後、4.50mlのトリフルオロメタンスルホン酸（50.7mmol、0.05当量）および50mlのジクロロメタンを橙色懸濁液に加え、ディーンスターク分離器からの溶媒（50ml）を排出した。半時間ごとにこの手順を合計6回（3時間）繰り返した。合計4.5時間後、赤色溶液を10〜15℃まで冷却し、30分以内に20〜25℃で1.8Lの1M炭酸水素ナトリウム（1.8mol、2.0当量）の溶液に加えた（CO2放出、pH7〜8）。黄色有機層を分離し、40℃/600〜10mbar/3時間で蒸発させて、585.4gの粗製2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジアセトキシ-6-(アセトキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]酢酸ベンジルを黄色油状物として得た（HPLC純度：87％）。粗生成物を700mlのアセトンに溶解し、あらかじめ充填されたシリカカラム（3.0kgのシリカ60；0.063〜0.2mm）にチャージした。n-ヘプタン/アセトンを移動相（5：1〜1：2の勾配）として用いたクロマトグラフィを行った。合わせた回収分画を40℃/600〜10mbarで蒸発させ、20〜25℃/0.3mbar/3時間で乾燥して、465.0gの2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジアセトキシ-6-(アセトキシメチル)テトラヒドロ-ピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]酢酸ベンジルを黄色油状物として、収率83％および純度100％（HPLC面積％）で得た。MS: m/z = 628.2627 (M+H)+
【００６２】
実施例7
2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジアセトキシ-6-(アセトキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]酢酸
0006649482.tif 000030
アルゴン雰囲気下、456.0gの2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジアセトキシ-6-(アセトキシメチル)テトラヒドロ-ピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]酢酸ベンジル（727mmol）を1.4LのTHFに溶解した。4.56gのPd/C 10％を加え、アルゴン雰囲気を水素（1bar）で置換した。黒色懸濁液を20〜25℃で2時間水素化した。水素雰囲気をアルゴンで置換し、黒色懸濁液をろ過し、ろ過ケークを合計400mlのTHFで少しずつ洗浄した。無色ろ液（HPLC純度：71％および27％トルエン）をいかなる精製もせずにA+B構築工程、実施例8で用いた。MS: m/z = 538.2191 (M+H)+
【００６３】
構築ブロックAおよびBの構築
実施例8
(2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジアセトキシ-6-(アセトキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-2-[[(2S)-2,6-ビス[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジアセトキシ-6-(アセトキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサン酸ベンジル
0006649482.tif 000031
実施例4からの(2S)-6-アミノ-2-[[(2S)-2,6-ジアミノヘキサノイル]アミノ]ヘキサン酸ベンジル三メタンスルホン酸塩（180.0mmol）の赤橙色溶液（約1.4L）を3.60Lのアセトニトリルで希釈した。20〜25℃で、365.0mlのN-エチルジイソプロピルアミン（2.16mol、12.0当量）を5分以内に加えた。生成した粘稠スラリーに、実施例7からの2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジアセトキシ-6-(アセトキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]酢酸（720mmol、4.0当量）の溶液（約2.25L）を20〜25℃で10分以内に加え、それにより温度が40℃までわずかに上昇した。45〜50℃で、425mlのn-プロピルホスホン酸無水物（T3P、三量体、酢酸エチル中50％、720mmol、4.0当量）の溶液を10分以内に加えた。反応溶液を45〜50℃で1時間撹拌した。淡黄色溶液を20〜25℃まで冷却し、40℃/10mbar/6時間で蒸発させて、1.06kgの粗製(2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジアセトキシ-6-(アセトキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-2-[[(2S)-2,6-ビス[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジアセトキシ-6-(アセトキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサン酸ベンジル（HPLC純度：24.1％）を得た。粗生成物を3回に分けて沈澱させ、メタンスルホン酸N-エチルジイソプロピルアミンおよび残存T3Pを除去した。353gの粗生成物を7.0Lの2-プロパノールに溶解し、1時間で-25℃まで冷却し、-25℃で1時間撹拌し、あらかじめ冷却した（-25℃）G3ガラスフィルターでろ過し（洗浄なし）、沈澱生成物からの一部が反応器からガラス壁上に沈着した。すべての沈澱をフィルターおよびガラス壁から合計1.0LのTHFで少しずつ溶解した。合わせた溶液を40℃/20mbar/6時間で蒸発させて、390.0gの(2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジアセトキシ-6-(アセトキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-2-[[(2S)-2,6-ビス[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジアセトキシ-6-(アセトキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサン酸ベンジル（HPLC純度：71.9％）を得、これをそれ以上精製せずに次の工程で用いた。MS: m/z = 1923.8438 (M+H)+
【００６４】
GalNAcホスホロアミダイトの合成
実施例9
(2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジアセトキシ-6-(アセトキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-2-[[(2S)-2,6-ビス[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジアセトキシ-6-(アセトキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサン酸
0006649482.tif 000032
5.0g（2.6mmol）の(2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジアセトキシ-6-(アセトキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-2-[[(2S)-2,6-ビス[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジアセトキシ-6-(アセトキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサン酸ベンジルを25.0mlのTHFに溶解し、100mgのPd/C 10％を加え、混合物をアルゴンで3回、次いで水素ガスで3回フラッシュした。黒色懸濁液を水素雰囲気下、20〜25℃で3.0時間水素化した。懸濁液をガラスファイバーフィルターでろ過し、ろ液を20℃/100〜10mbar/1時間で蒸発させて、4.5gの(2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジアセトキシ-6-(アセトキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-2-[[(2S)-2,6-ビス[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジアセトキシ-6-(アセトキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサン酸を淡黄色油状物として得た。LC-MS, (ESI) MH+1832.7941
【００６５】
実施例10a
2-(6-ベンジルオキシヘキシル)イソインドリン-1,3-ジオン
0006649482.tif 000033
10.8g（40mmol）の6-ブロモヘキソキシメチルベンゼンを55.0mlのTHFに溶解し、17.1g（44.0mmol、1.1当量）のテトラブチルアンモニウム 1,3-ジオキソイソインドリン-2-イド（フタルイミド/水酸化テトラブチルアンモニウム メタノール中25％ 1/1/トルエンと蒸発/共沸させ、40℃で乾燥）を無色溶液（光発熱）に加えた。反応混合物を20〜25℃で2時間撹拌し、生成した懸濁液をろ過し、ろ過ケーキを20.0mlのTHFで洗浄し、合わせたろ液を50mlのMTBEで希釈し、50mlの水で抽出し、有機層を分離し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、30mlのMTBEで洗浄し、40℃/400〜15mbar/3時間で蒸発させて、12.9gの粗製2-(6-ベンジルオキシヘキシル)イソインドリン-1,3-ジオンを明黄色固体として得、それをさらに精製することなく工程10cで用いた。MS: m/z = (M+H)+ 338.1752
【００６６】
実施例10b
2-(6-ベンジルオキシヘキシル)イソインドリン-1,3-ジオン
0006649482.tif 000034
12.7g（47mmol）の6-ブロモヘキソキシメチルベンゼンを64.0mlのTHFに溶解し、9.6g（51.7mmol、1.1当量）のカリウム-イソインドリン-2-イド-1,3-ジオン、および0.32g（0.94mmol、0.02当量）の硫酸水素テトラブチルアンモニウムを無色溶液に加えた。反応混合物を18時間還流し、64mlのMTBEで希釈し64mlの水で2回抽出し、有機層を分離し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、30mlのMTBEで洗浄し、40℃/400〜15mbar/3時間で蒸発させ、14.7gの粗製2-(6-ベンジルオキシヘキシル)イソインドリン-1,3-ジオンをオフホワイト固体として得た。10.6gの粗生成物を37mlのメタノールと5.5mlの水との混合物で処理し、加熱還流し、5分後に混濁溶液を20〜25℃に冷却し、20〜25℃で1時間撹拌し、白色懸濁液をろ過し、ろ過ケーキを7.0mlのメタノールと1.0mlの水の混合物で洗浄した。白色結晶を40℃/15mbar/1時間で乾燥して9.6gの2-(6-(ベンジルオキシ)ヘキシル)イソインドリン-1,3-ジオンを白色結晶として得た。MS: m/z = (M+H)+ 338.1752
【００６７】
実施例10c
6-ベンジルオキシヘキサン-1-アミン
0006649482.tif 000035
12.8g（37.9mmol）の2-(6-(ベンジルオキシ)ヘキシル)イソインドリン-1,3-ジオンを40.0mlのTHFに溶解し、室温で5.5mlのヒドラジン一水和物 水中64%（113mmol、3.0当量）を加えた。無色溶液を50〜55℃で2時間加熱し、形成した白色懸濁液を室温に冷却し、ろ過し、白色ろ過ケーキを合計30.0mlのTHFで洗浄した。ろ液を60.0mlのMTBEで希釈し、50mlの水で抽出した。有機層を分離し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、40℃/350〜15mbar/2時間で蒸発させて、6.44gの粗製6-ベンジルオキシヘキサン-1-アミンを無色油状物として得た。
【００６８】
塩酸塩の形成：6.44g（31.1mmol）を32.0mlのメタノールに溶解し、室温で7.80mlのメタノール中の4M HClを加え、淡黄色溶液を40℃/150〜15mbar/15分で蒸発させて、8.1gの粗生成物を黄色油状物として得た。この油状物に65.0mlの酢酸エチルを加え、白色懸濁液を形成し、これを室温で16時間撹拌した。白色懸濁液をろ過し、ろ過ケーキを合計40.0mlの酢酸エチルで洗浄し、40℃/15mbar/3時間で乾燥して、4.95gの6-ベンジルオキシヘキサン-1-アミン塩酸塩を白色結晶として得た。
【００６９】
遊離塩基の形成：2.0gの6-ベンジルオキシヘキサン-1-アミン塩酸塩を15.0mlの1M NaOH/13％NaClで処理し、15.0mlのMTBEで抽出し、有機層を分離し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、5mlのMTBEで洗浄し、40℃/350〜15mbar/2時間で蒸発させて、1.67gの6-ベンジルオキシヘキサン-1-アミンを無色油状物として得た。
MS: m/z = (M+H)+ 208.17006
【００７０】
実施例10d
[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-アセトアミド-6-[2-[2-[2-[2-[[(5S)-5-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジアセトキシ-6-(アセトキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-6-[[(1S)-5-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジアセトキシ-6-(アセトキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-1-(6-ベンジルオキシヘキシルカルバモイル)ペンチル]アミノ]-6-オキソ-ヘキシル]アミノ]-2-オキソ-エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]-3,4-ジアセトキシ-テトラヒドロピラン-2-イル]メチルアセテート
0006649482.tif 000036
4.4gの(2S)-6-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジアセトキシ-6-(アセトキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-2-[[(2S)-2,6-ビス[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジアセトキシ-6-(アセトキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサン酸を45.0mlのTHFに溶解し、20〜25℃で0.55g（2.64mmol、1.1当量）の6-ベンジルオキシヘキサン-1-アミンおよび1.22ml（7.2mmol、3.0当量）のN-エチルジイソプロピルアミンを加え、溶液を35〜40℃に加温し、1.84mlのn-プロピルホスホン酸無水物（環式三量体としてのT3P、酢酸エチル中50％、3.12mmol、1.3当量）を淡黄色溶液に加えた。混合物を35〜40℃で4.0時間撹拌し、20〜25℃に冷却し、20〜25℃/100〜10mbar/2時間で蒸発させて、6.5gの粗生成物を得た。生成物をSFC/RP-C18/2-プロパノールで精製して、2.91gの[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-アセトアミド-6-[2-[2-[2-[2-[[(5S)-5-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジアセトキシ-6-(アセトキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-6-[[(1S)-5-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジアセトキシ-6-(アセトキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-1-(6-ベンジルオキシヘキシルカルバモイル)ペンチル]アミノ]-6-オキソ-ヘキシル]アミノ]-2-オキソ-エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]-3,4-ジアセトキシ-テトラヒドロピラン-2-イル]メチルアセテートを白色泡状物として得た。LC-MS、(ESI) MH+2021.945
【００７１】
実施例11
[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-アセトアミド-6-[2-[2-[2-[2-[[(5S)-5-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジアセトキシ-6-(アセトキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-6-[[(1S)-5-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジアセトキシ-6-(アセトキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-1-(6-ヒドロキシヘキシルカルバモイル)ペンチル]アミノ]-6-オキソ-ヘキシル]アミノ]-2-オキソ-エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]-3,4-ジアセトキシ-テトラヒドロピラン-2-イル]メチルアセテート
0006649482.tif 000037
1.62g（0.80mmol）の[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-アセトアミド-6-[2-[2-[2-[2-[[(5S)-5-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジアセトキシ-6-(アセトキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-6-[[(1S)-5-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジアセトキシ-6-(アセトキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-1-(6-ベンジルオキシヘキシルカルバモイル)ペンチル]アミノ]-6-オキソ-ヘキシル]アミノ]-2-オキソ-エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]-3,4-ジアセトキシ-テトラヒドロピラン-2-イル]メチルアセテートを8.0mlのメタノールに溶解し、162mgのPd/C 10％を加え、混合物を最初にアルゴンで3回、次いで水素ガスで3回フラッシュした。黒色懸濁液を20〜25℃で1.5時間水素化した。黒色懸濁液をガラスファイバーフィルターでろ過し、無色ろ液を20℃/100〜10mbar/1時間で蒸発させた。無色の油状物を10mlのアセトニトリルに溶解し、100〜10mbar/1時間で蒸発させ、10mlのアセトニトリルで再度処理し、100〜10mbar/1時間で蒸発させた後、無色油状物を20〜25℃、1mbarで2時間乾燥して、1.50gの[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-アセトアミド-6-[2-[2-[2-[2-[[(5S)-5-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジアセトキシ-6-(アセトキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-6-[[(1S)-5-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジアセトキシ-6-(アセトキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-1-(6-ヒドロキシヘキシルカルバモイル)ペンチル]アミノ]-6-オキソ-ヘキシル]アミノ]-2-オキソ-エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]-3,4-ジアセトキシ-テトラヒドロピラン-2-イル]メチルアセテートを無色油状物として得た。LC-MS MH+1931.90142
【００７２】
実施例12
[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-アセトアミド-6-[2-[2-[2-[2-[[(5S)-5-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジアセトキシ-6-(アセトキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-6-[[(1S)-5-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジアセトキシ-6-(アセトキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-1-[6-[2-シアノエトキシ-(ジイソプロピルアミノ)ホスファニル]オキシヘキシルカルバモイル]ペンチル]アミノ]-6-オキソ-ヘキシル]アミノ]-2-オキソ-エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]-3,4-ジアセトキシ-テトラヒドロピラン-2-イル]メチルアセテート
0006649482.tif 000038
1.50g（0.77mmol）の[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-アセトアミド-6-[2-[2-[2-[2-[[(5S)-5-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジアセトキシ-6-(アセトキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-6-[[(1S)-5-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジアセトキシ-6-(アセトキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-1-(6-ヒドロキシヘキシルカルバモイル)ペンチル]アミノ]-6-オキソ-ヘキシル]アミノ]-2-オキソ-エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]-3,4-ジアセトキシ-テトラヒドロピラン-2-イル]メチルアセテートを5.0mlのアセトニトリルに溶解し、淡黄色溶液を0〜5℃に冷却し、0.184mlのトリエチルアミンおよび2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルクロロホスホロアミダイトを0〜5℃で加えた。15分後、1.50gのモレキュラーシーブ3Aビーズ4〜8メッシュを加え、0〜5℃で10分間撹拌し、懸濁液をガラスファイバーフィルターでろ過し、淡黄色溶液を20〜25℃/100〜10mbar/0.5時間で蒸発させて、1.50gの[(2R,3R,4R,5R,6R)-5-アセトアミド-6-[2-[2-[2-[2-[[(5S)-5-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジアセトキシ-6-(アセトキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-6-[[(1S)-5-[[2-[2-[2-[2-[(2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジアセトキシ-6-(アセトキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-1-[6-[2-シアノエトキシ-(ジイソプロピルアミノ)ホスファニル]オキシヘキシルカルバモイル]ペンチル]アミノ]-6-オキソ-ヘキシル]アミノ]-2-オキソ-エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]-3,4-ジアセトキシ-テトラヒドロピラン-2-イル]メチルアセテートを黄色油状物として得、これをさらに精製することなく次の工程で使用した。
31P-NMR DMSO-d6 146.33ppm (s 1P). LC-MS, M(NH4)+ 2149.0
【００７３】
実施例13
ヘキサデカアンモニウム;[(3S)-2-[[6-[[6-[[2-[2-[2-[2-[(2R)-3-アセトアミド-4,5-ジヒドロキシ-6-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]-2-[2,6-ビス[[2-[2-[2-[2-[(2R)-3-アセトアミド-4,5-ジヒドロキシ-6-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロピラン-2-イル]オキシエトキシ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ヘキサノイルアミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキソキシ-オキシド-ホスホリル]オキシメチル]-5-(4-アミノ-2-オキソ-ピリミジン-1-イル)テトラヒドロフラン-3-イル] [(2R,3S,5R)-3-[[(1R,4R,6R,7S)-7-[[(1R,4R,6R,7S)-6-(4-アミノ-5-メチル-2-オキソ-ピリミジン-1-イル)-7-[[(1R,4R,6R,7S)-6-(2-アミノ-6-オキソ-1H-プリン-9-イル)-7-[[(2R,3S,5R)-3-[[(2R,3S,5R)-3-[[(2R,3S,5R)-3-[[(2R,3S,5R)-3-[[(2R,3S,5R)-5-(2-アミノ-6-オキソ-1H-プリン-9-イル)-3-[[(2R,3S,5R)-3-[[(2R,3S,5R)-5-(2-アミノ-6-オキソ-1H-プリン-9-イル)-3-[[(2R,3S,5R)-3-[[(4R)-6-(2-アミノ-6-オキソ-1H-プリン-9-イル)-7-[[6-(2-アミノ-6-オキソ-1H-プリン-9-イル)-7-[[7-ヒドロキシ-6-(5-メチル-2,4-ジオキソ-ピリミジン-1-イル)-2,5-ジオキサビシクロ[2.2.1]ヘプタン-4-イル]メトキシ-オキシド-ホスフィノチオイル]オキシ-2,5-ジオキサビシクロ[2.2.1]ヘプタン-4-イル]メトキシ-オキシド-ホスフィノチオイル]オキシ-2,5-ジオキサビシクロ[2.2.1]ヘプタン-4-イル]メトキシ-オキシド-ホスフィノチオイル]オキシ-5-(6-アミノプリン-9-イル)テトラヒドロフラン-2-イル]メトキシ-オキシド-ホスフィノチオイル]オキシ-テトラヒドロフラン-2-イル]メトキシ-オキシド-ホスフィノチオイル]オキシ-5-(6-アミノプリン-9-イル)テトラヒドロフラン-2-イル]メトキシ-オキシド-ホスフィノチオイル]オキシ-テトラヒドロフラン-2-イル]メトキシ-オキシド-ホスフィノチオイル]オキシ-5-(6-アミノプリン-9-イル)テトラヒドロフラン-2-イル]メトキシ-オキシド-ホスフィノチオイル]オキシ-5-(6-アミノプリン-9-イル)テトラヒドロフラン-2-イル]メトキシ-オキシド-ホスフィノチオイル]オキシ-5-(6-アミノプリン-9-イル)テトラヒドロフラン-2-イル]メトキシ-オキシド-ホスフィノチオイル]オキシ-5-(5-メチル-2,4-ジオキソ-ピリミジン-1-イル)テトラヒドロフラン-2-イル]メトキシ-オキシド-ホスフィノチオイル]オキシ-2,5-ジオキサビシクロ[2.2.1]ヘプタン-4-イル]メトキシ-オキシド-ホスフィノチオイル]オキシ-2,5-ジオキサビシクロ[2.2.1]ヘプタン-4-イル]メトキシ-オキシド-ホスフィノチオイル]オキシ-6-(2-アミノ-6-オキソ-1H-プリン-9-イル)-2,5-ジオキサビシクロ[2.2.1]ヘプタン-4-イル]メトキシ-オキシド-ホスホリル]オキシ-5-(6-アミノプリン-9-イル)テトラヒドロフラン-2-イル]メチルホスフェート
0006649482.tif 000039
AKTA Oligopilot 100（GE Healthcare、Freiburg、GermanyおよびPrimer Support 5G Unylinker 350（GE Healthcare、Freiburg、Germany）を使用して、GalNAcクラスター修飾LNA/DNAを、標準的なホスホロアミダイト化学によって固相上で0.200mmolのスケールで製造した。対応するホスホロアミダイトおよびGalNAcクラスターホスホロアミダイトを用いて、LNA含有、2’-OCH2-4’架橋ヌクレオチド（Sigma-Aldrich、SAFC、Hamburg、Germany）およびDNA（Sigma-Aldrich、SAFC、Hamburg、Germany）を生成した。本分野で公知の方法によって切断および脱保護を達成した（Wincott F. et al. Nucleic Acid Research, 1995, 23, 14, 2677-84）。アンモニウム塩（1.6g）としての脱保護および乾燥した粗製GalNAcクラスター修飾LNAを特徴付けし、イオン対HPLC-MSを用いて
0006649482.tif 000040
であることを確認した。
C231H316N78O118P16S13, LC-MS, M (ESI) 6981.3
（大文字はβ-D-オキシ-LNA単位を意味し；小文字はDNA単位を意味し；下付き文字「s」はホスホロチオアート結合を意味し；上付き文字mは、5-メチルシトシン塩基を含むDNAまたはβ-D-オキシ-LNA単位を意味し、AM-C6は、6-アミノヘキシル-1-ホスフェート結合を意味する。）
【配列表】
0006649482000001.app