(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Nitratireductor属の微生物であって、
前記微生物がNitratireductor sp. OM-1株（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０２０４３）であり、
炭素数が６以下の有機酸から脂質を生成する微生物。
【請求項２】
炭素数が６以下の有機酸の資化性を有するNitratireductor属の微生物としてNitratireductor sp. OM-1株（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０２０４３）を用いて該有機酸から脂質を生産する方法。
【請求項３】
請求項２に記載の方法において、
前記炭素数が６以下の有機酸がプロピオン酸及び酢酸の少なくとも一方であることを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項２又は３に記載の方法において、
前記Nitratireductor sp. OM-1株は、前記炭素数が６以下の有機酸を含み、且つ窒素源の濃度が２０ｍＭ未満の液中で培養されることを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法において、
前記Nitratireductor sp. OM-1株は、前記炭素数が６以下の有機酸から2-ブテン酸1-メチルエチルエステルをさらに生産することを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項２〜５のうちいずれか１つに記載の方法において、
前記Nitratireductor sp. OM-1株を炭素源としてＮａＨＣＯ３のみを含む液中で培養した後、前記炭素数が６以下の有機酸を含む液中で継代培養して脂質を生成させることを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項２〜６のうちいずれか１つに記載の方法において、
前記Nitratireductor sp. OM-1株によって炭化水素がさらに生成されることを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項２〜７のうちいずれか１つに記載の方法において、
前記Nitratireductor sp. OM-1株を少なくとも炭素数が６以下の有機酸と、該有機酸以外の炭素源とを含む廃水中で培養する工程を備えていることを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項２〜８のうちいずれか１つに記載の方法において、
前記Nitratireductor sp. OM-1株により生成される前記脂質は、リノール酸、パルミチン酸及びステアリン酸のうち少なくとも１種を含むことを特徴とする方法。
【請求項１０】
炭素数が６以下の有機酸の資化性を有するNitratireductor属の微生物としてNitratireductor sp. OM-1株（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０２０４３）を、炭素源が制限され、且つＣＯ２を含む液中で培養することにより、ＣＯ２を固定しながら脂質を生産する方法。
【請求項１１】
炭素数が６以下の有機酸の資化性を有するNitratireductor属の微生物としてNitratireductor sp. OM-1株（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０２０４３）を用いて、該有機酸と、該有機酸以外の炭素源とを含む廃水の処理を行う方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書に開示された技術は、微生物を用いた脂質の生成方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
有機性の産業排水は、微生物を含む活性汚泥により処理されているが、その際に発生する余剰汚泥は法律上施設内で処理しなければならないとされている。活性汚泥が嫌気発酵するとプロピオン酸等の有機酸が生成され、これにより他の菌が死滅する。このような有機酸を含有する汚泥は脱水焼却されなければならず、その処理には大きなコストがかかる。このため、焼却される汚泥の量の低減や、汚泥の再利用が望まれている。
【０００３】
特許文献１には、プロピオン酸等を炭素源として利用できる微生物が開示されている。また、特許文献２には、プロピオン酸等の低級有機酸を炭素源として利用し、炭化水素を生産できる微生物が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００３−２４５０６６号公報
【特許文献２】特開２００３−２２９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
汚泥に含まれる有機酸を分解することは望まれているが、有機酸を分解することで生成される物質が有用なものでなければ生成物を最終的に廃棄することになり、汚泥の低減を図ることができない。
【０００６】
特許文献１に記載された微生物はグルコースからグルコン酸を生成する。しかしながら、プロピオン酸を炭素源とする場合に有用な物質を生成することは特許文献１に何ら開示されていない。
【０００７】
特許文献２に記載された微生物は炭化水素を生成できるが、微生物はその種類によって基質や適した成育条件が異なるため、燃料等に利用可能な物質を生産できる他の微生物の発見は未だに望まれている。特に、低級有機酸を基質として有用な物質をより高い効率で生成できる微生物の探索は引き続き活発に行われている。
【０００８】
上記課題に鑑み、本発明は、低級有機酸等の炭素源を消費して利用可能な物質を効率良く生成する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本明細書には、低級有機酸から脂質を生成するNitratireductor属の微生物が開示されている。この微生物は例えばNitratireductor sp. OM-1株であってもよい。
【００１０】
また、本明細書に開示された方法は、低級有機酸資化性を有するNitratireductor属のNitratireductor sp. OM-1株を用いて低級有機酸から脂質を生産する方法である。
【発明の効果】
【００１１】
低級有機酸資化性を有するNitratireductor属の微生物（例えばNitratireductor sp. OM-1株）を用いた方法によれば、低級有機酸からバイオディーゼル等の脂質を効率良く生成させることが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、有機酸資化能を持つ細菌のスクリーニング手順を示すフローチャートである。
【図２】図２は、各株の細胞密度当たりの蛍光強度を測定した結果を示す図である。
【図３Ａ】図３Ａは、ＧＣにおいて、パルミチン酸、ステアリン酸及びスクアレンのピークが検出された時間を示す図である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、試料Ｎｏ．１の菌について、菌体に含まれる脂質のＧＣによる分析結果を示す図である。
【図３Ｃ】図３Ｃは、試料Ｎｏ．２の菌について、菌体に含まれる脂質のＧＣによる分析結果を示す図である。
【図３Ｄ】図３Ｄは、試料Ｎｏ．３の菌について、菌体に含まれる脂質のＧＣによる分析結果を示す図である。
【図３Ｅ】図３Ｅは、試料Ｎｏ．４の菌について、菌体に含まれる脂質のＧＣによる分析結果を示す図である。
【図３Ｆ】図３Ｆは、試料Ｎｏ．５の菌について、菌体に含まれる脂質のＧＣによる分析結果を示す図である。
【図４】図４は、炭素源を制限した培地から培地を変更して継代した場合と培地を変更せずに継代した場合における細菌の増殖曲線を示す図である。
【図５】図５は、培地中の窒素源濃度を変更した場合の乾燥菌体重量当たりの全脂質量（ｍｇ／ｇ）の変化を示す図である。
【図６】図６は、炭素源をグリセリンのみとした場合のNitratireductor sp. OM-1の増殖曲線を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
（実施形態）
−有機酸資化能を持つ細菌のスクリーニング−
本願発明者らは、低級有機酸への耐性を有し、且つ低級有機酸を分解できる菌の探索を行った。本願明細書で「低級有機酸」とは、炭素数が６以下の有機酸を指すものとする。本願発明者らは、低級有機酸への耐性を持つ菌のうち、脂質を生成できる菌を探索した。なお、本明細書において脂質とは、特にことわらない限りアルコールと脂肪酸のエステル（単純脂質）だけでなく、リン脂質等の複合脂質や脂肪酸等の誘導脂質も含むものとする。
【００１４】
図１は、有機酸資化能を持つ細菌のスクリーニング手順を示すフローチャートである。
【００１５】
広島県の大崎上島付近の海域において海水及び礫を試料として採取し、この試料に含まれる菌をプロピオン酸が添加されたＡＴＣＣ＃１４０９培地を用いて集積培養した（ステップＳ１）。ここで、ＡＴＣＣ＃１４０９培地は、３０ｇ／ＬのＮａＣｌ、１ｍＬ／ＬのＳＬＡ  ｔｒａｃｅ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ、１ｍＬ／ＬのＶＡ  ｖｉｔａｍｉｎｓ、１．０ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、０．５ｇ／ＬのＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．１ｇ／ＬのＣａＣｌ２・Ｈ２Ｏ、１．０ｇ／ＬのＮＨ４Ｃｌ、３．０ｇ／ＬのＮａＨＣＯ３、０．７ｇ／ＬのＮａ２ＳＯ４、１．０ｇ／Ｌの酢酸ナトリウム（酢酸として１０ｍＭ相当の量）、０．５ｇ／Ｌのアスコルビン酸ナトリウム、０．１ｇ／ＬのＹｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ、０．１５６ｇ／Ｌの硫酸ナトリウムを含み、そのｐＨは６．９〜７．０である。
【００１６】
ＳＬＡ  ｔｒａｃｅ  ｅｌｅｍｅｎｔｓは、２５０ｍｇのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、１０ｍｇのＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、１０ｍｇのＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、７０ｍｇのＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、１００ｍｇのＺｎＣｌ２、５００ｍｇのＨ３ＢＯ３、３０ｍｇのＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、１０ｍｇのＮａ２ＳｅＯ３・５Ｈ２Ｏ、１．８ｇのＦｅＣｌ２・４Ｈ２Ｏを１Ｌの蒸留水に溶解させることで作成された。
【００１７】
ＶＡ  ｖｉｔａｍｉｎｓは、１００ｍｇのビオチン、３５０ｍｇのニコチンアミド、３００ｍｇのチアミン−ＨＣＬ、２００ｍｇのパラアミノ安息香酸、１００ｍｇのピリドキシン−ＨＣＬ、１００ｍｇのＤ−パントテン酸カルシウム、５０ｍｇのシアノコバラミン（Ｂ１２）を蒸留水１Ｌに溶解させることで作成された。
【００１８】
本ステップでは、上述のＡＴＣＣ＃１４０９培地に濃度が１０ｍＭとなるようにプロピオン酸が添加された培地を用い、２８℃、暗所、好気条件で１６８時間培養した。
【００１９】
次に、それぞれ１０ｍＭの酢酸及びプロピオン酸を含有するＡＴＣＣ＃１４０９培地の寒天培地（アガロース濃度１．５％）に先の培養で得られた菌液を塗布し、２０℃〜２６℃、暗所、好気条件で２１６時間培養を行った（ステップＳ２）。
【００２０】
次いで、寒天培地に生じたコロニーを取り、それらの菌を９６穴プレートに植菌し、１０ｍＭのプロピオン酸を含有するＡＴＣＣ＃１４０９培地により培養した（ステップＳ３）。ＡＴＣＣ＃１４０９培地の量はウェルごとに６００μＬとした。培養は２５℃、２５０ｒｐｍ、暗所、好気条件で行った。
【００２１】
次に、プレートリーダー（Spectra MAX M5、Molecular Devices社製）を用いて各ウェルでの吸光度を測定した。ここでは、培養された菌液の一部を９６穴プレートに移し、６６０ｎｍでの吸光度を測定した。本ステップにおいて、吸光度が大きいことは、菌が増殖していることを意味する。
【００２２】
次に、各培養液を遠心分離して集菌し、菌体をPhosphate Buffered Saline（ＰＢＳ）で洗浄後、５０μＬのＰＢＳと２μＬのナイルレッド（和光純薬製、濃度１ｍｇ／ｍＬ）とを加えて菌体を染色した。試料を９６穴プレートに移し、蛍光／発光マイクロプレートリーダー（Fluoroskan Ascent FL、Thermo社製）を用いて励起波長５４０ｎｍ、蛍光波長５９０ｎｍの蛍光強度を測定した。各株の細胞密度当たりの蛍光強度を算出し、その値が比較的高かった株を、有機酸耐性菌の候補株として選択した（ステップＳ４）。
【００２３】
図２は、各株の細胞密度当たりの蛍光強度を測定した結果を示す図である。同図において、棒グラフのそれぞれが試料の測定結果を示している。この測定により、Ｎｏ．１〜５の計５株が有機酸耐性菌の候補株として選定された。
【００２４】
次に、先のステップで選択された菌に含まれる全脂質量の測定を行った（ステップＳ５）。この測定は、GC-17A、CBM-102（島津製作所製）を用いたガスクロマトグラフィー（ＧＣ）により行った。解析ソフトとしてGCSolutionバージョン２．４（島津製作所製）を用いた。カラムとしては内径０．２５ｍｍ、長さ３０ｍ、膜厚０．１μｍのDB-5HTキャピラリーGCカラム（Agilent Technologies社製）を用いた。分析条件は、カラムオーブンを１００℃から３８０℃まで１０℃／ｍｉｎで昇温させ、キャリアガスとしてＮ２を用い、試料気化室を３００℃とし、検出器を３８０℃とし、圧力を１０７ｋＰａとし、全流量を１６ｍＬ／ｍｉｎとし、カラム流量を１．１９ｍＬ／ｍｉｎとし、スプリット比を１：１０とした。
【００２５】
本ステップでは、各試料を遠心分離して集菌した湿菌体を−８０℃にて凍結保存した。次いで、フリーズドライヤーを用いて菌体を凍結乾燥させた。乾燥菌体にクロロホルム／メタノール混合液（体積比で２：１の混合物）を５００μＬ加えて懸濁した。この操作を繰り返して２ｍＬの細胞抽出液を得た。さらに抽出液にミリＱ水を５００μＬ加えて懸濁した後遠心分離し、クロロホルム層を試験管に移して乾固した。乾固後の抽出物に２５０μＬのクロロホルムを加えてガラスバイアルに移し、窒素気流下にて乾固した。次に、乾固後の抽出物に２５μＬのクロロホルムを加えて抽出サンプルとした。この抽出サンプルを１μＬ用いてＧＣ測定を行った。
【００２６】
また、ガスクロマトグラフィー質量分析計（ＧＣ／ＭＳ）により生成物の同定を行った。カラムとしては内径０．２５ｍｍ、長さ３０ｍ、膜厚０．２５μｍのZB-1HT（Zebron製）を用い、ＧＣ／ＭＳとしてはJMS-T100GCV"AccuTOF GCv 4G"（日本電子製）を用いた。分析条件は、カラムオーブンを１００℃から３８０℃まで１０℃／ｍｉｎで昇温させ、キャリアガスとしてＨｅを用い、試料気化室を３００℃とし、検出器を２７０℃とし、注入量を１．０μＬとし、カラム流量を１．２ｍＬ／ｍｉｎとし、スプリット比を１：１０とした。
【００２７】
図３Ａは、ＧＣにおいて、パルミチン酸、ステアリン酸及びスクアレンのピークが検出された時間を示す図であり、図３Ｂ〜図３Ｆは、試料Ｎｏ．１〜５の５つについて、菌体に含まれる脂質のＧＣによる分析結果を示す図である。表１に、この分析結果をまとめて示す。
【００２８】
【表１】
0006685137.tif 000002
【００２９】
図３Ｂ〜図３Ｆ及び表１に示す結果から、乾燥菌体あたりの脂質の収量は、５株のうち試料Ｎｏ．１、４、５の３株が多いことが分かった。また、各菌により、パルミチン酸、ステアリン酸等の脂質や、スクアレン等の炭化水素が生成されていることが確認できた。なお、表１に示す「全脂質」には、便宜的にスクアレン等の炭化水素も含まれている。
【００３０】
次に、炭素源としてＮａＨＣＯ３のみを含む培地を用いた培養により、低級有機酸資化性を有する菌の分離を行った（ステップＳ６）。具体的には、選択された各菌を炭素源としてＮａＨＣＯ３のみを含む培地に移して室温で７日間培養した。低級有機酸を利用できる菌が低級有機酸を消費することで、低級有機酸を利用できない菌の生存が可能になっていたと考えられるところ、菌を飢餓状態に置くことにより、菌の分離が可能になると予想された。なお、本ステップで使用された「炭素源としてＮａＨＣＯ３のみを含む培地」は、上述のＡＴＣＣ＃１４０９培地からＮａＨＣＯ３以外の炭素源を除いたものであり、Yeast extractを含む。
【００３１】
炭素源としてＮａＨＣＯ３のみを含む培地では、菌数は２日間程度で飽和状態に達し、１０ｍＭのプロピオン酸が添加された通常のＡＴＣＣ＃１４０９培地を用いた培養に比べて菌数は少なかった。この培養の結果、図３Ｄに示す試料Ｎｏ．３から低級有機酸資化性を有する単菌化された菌株（後述するNitratireductor sp. OM-1株）を得ることに成功した。次いで、炭素源としてＮａＨＣＯ３のみを含む培地からＡＴＣＣ＃１４０９培地へと単菌化された細菌を植え継いで２８℃で７日間培養を続けた。次いで、上述の方法で菌体を処理してＧＣ分析により脂質及び炭化水素の生成量を測定した。一方で、炭素源としてＮａＨＣＯ３のみを含む培地での培養（すなわち、炭酸固定条件での培養）を７日間継続した。
【００３２】
表２は、炭酸固定条件と、炭酸固定条件からプロピオン酸が添加された通常のＡＴＣＣ＃１４０９培地へと培地を変更した場合とでそれぞれ得られた菌の乾燥菌体当たりの全脂質量、パルミチン酸、ステアリン酸及びスクアレンの収量を測定した結果を示す図である。また、表３は、炭酸固定条件と、炭酸固定条件からプロピオン酸が添加された通常のＡＴＣＣ＃１４０９培地へと培地を変更した場合とでそれぞれ得られた培地の体積当たりの全脂質、パルミチン酸、ステアリン酸及びスクアレンの収量を測定した結果を示す図である。図４は、炭素源を制限した培地から培地を変更して継代した場合と培地を変更せずに継代した場合における細菌の増殖曲線を示す図である。同図に示す吸光度の増加は菌体密度の増加を表す。なお、表２及び表３に示す「全脂質」には、スクアレン等の炭化水素も便宜的に含まれている。
【００３３】
【表２】
0006685137.tif 000003
【００３４】
【表３】
0006685137.tif 000004
【００３５】
図４に示す結果から、炭素源を制限したＡＴＣＣ＃１４０９培地に植え継いだ場合には菌体濃度が２日程度で飽和するのに対して、プロピオン酸を含むＡＴＣＣ＃１４０９培地に植え継いだ場合には菌体濃度が飽和するまで５〜７日要し、菌の大幅な増殖が認められた。また、表２、３に示すように、プロピオン酸を含むＡＴＣＣ＃１４０９培地に植え継いだ場合の方が、炭素源を制限したＡＴＣＣ＃１４０９培地に植え継いだ場合に比べて菌体重量当たりの全脂質量、培地体積当たりの全脂質量共に大幅に増加していた。
【００３６】
表２、３に示すように、パルミチン酸、ステアリン酸等の脂質や、スクアレン等の炭化水素が菌体内で生成されていた。また、表２と表１との比較から分かるように、炭酸固定条件からプロピオン酸を含むＡＴＣＣ＃１４０９培地へと植え継ぐことで、乾燥菌体重量当たりの全脂質及び各脂質の収量が大幅に増加することが確認できた。これは、菌を貧栄養条件に置くことで、菌体内で脂質を貯蔵する代謝が優先されるように切り替わったためではないかと推定される。
【００３７】
なお、プロピオン酸を含むＡＴＣＣ＃１４０９培地から同じ培地へと継代を重ねると菌体重量当たりの全脂質量は１７７．９６４ｍｇ／ｇから徐々に減少してからほぼ一定となり、培地の体積当たりの収量も同様の傾向となった。しかしながら、表１に示す単菌化前と比べると乾燥菌体重量当たりの全脂質は増加していた。
【００３８】
ここで、ＡＴＣＣ＃１４０９培地では炭素源が制限されていること、及び単独の菌株として分離する前の菌を培養した際に培地中のプロピオン酸濃度の減少が見られたことから、これらの脂質はプロピオン酸が転換されたものであると考えられた。
【００３９】
一方、図４、表２、３に示す結果から、この菌は、ＮａＨＣＯ３のみを含む培地でもある程度増殖が可能であり、培養後の菌体内にはスクアレン等の炭化水素や脂質が蓄えられることが分かった。ＮａＨＣＯ３が水に溶けるとＮａイオンとＨＣＯ３イオンとに分かれるが、ＣＯ２が水に溶けてもＨＣＯ３イオンが同様に生じることから、この菌には液中に溶けたＣＯ２を固定化する能力があると考えられる。従って、この菌を用いれば、有機酸を含む炭素源が含まれていない液中であってもＣＯ２から脂質や炭化水素を生産することが可能であると考えられる。
【００４０】
−菌種の同定−
次に、得られた菌株の種を同定するために公知のＰＣＲ法により１６ＳｒＤＮＡの部分配列（約０．５ｋｂｐ）を解析した。この結果、Nitratireductor aquimarinus strain CL-SC21の１６Ｓ ｒＤＮＡと９９％の相同性を示し、Nitratireductor属の菌であることが明らかになった。この細菌は好気性の短桿菌であってヘテロ栄養性を有し、プロピオン酸資化性も有する。この細菌はまた、炭酸固定能を有しており、低級有機酸からトリアシルグリセロールを生産する。これに対し、Nitratireductor属の既知の細菌が低級有機酸からトリアシルグリセロールを生産することは報告されていない。また、この細菌は低級有機酸だけでなく糖類やアルコール等、既知の細菌に比べて多様な物質から脂質及び炭化水素を合成することができる。
【００４１】
次に、本願発明者らは、得られた菌株について、プロピオン酸以外の低級有機酸の資化性についても調べた。具体的には、ＡＴＣＣ＃１４０９培地に炭素源として炭素数が５以下の種々の低級有機酸を添加して２８℃で７日間、暗所、好気条件下で培養した。培地中の各低級有機酸の濃度は１０ｍＭとした。酢酸資化性については、酢酸ナトリウムを抜いたＡＴＣＣ＃１４０９培地に１０ｍＭの濃度で酢酸を添加した培地を用いて調べた。
【００４２】
この試験結果を表４に示す。表４では、１０ｍＭのプロピオン酸を添加したＡＴＣＣ＃１４０９培地を用いて７日間培養した場合の生育状態を基準として、当該基準を超える生育状態であれば判定Ａとし、当該基準と同等程度の生育状態であれば判定Ｂとし、生育可能であるが当該基準以下である場合を判定Ｃとした。
【００４３】
【表４】
0006685137.tif 000005
【００４４】
表４に示すように、単離された細菌は少なくとも炭素数が６以下の低級有機酸を資化できることが確認できた。この細菌は、低級有機酸のうち、酢酸、クエン酸、酪酸及び吉草酸を含む培地では、プロピオン酸を含む培地以上に増殖できることも確認できた。なお、近縁種と考えられるNitratireductor aquimarinus strain CL-SC21株ではリンゴ酸資化性がほぼ有していないのに対し、本願発明者らが単離した細菌は、リンゴ酸資化性を有している点でNitratireductor aquimarinus strain CL-SC21株と大きく異なっていた（International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology (2011), 61, 2676-2681を参照）。
【００４５】
なお、Nitratireductor属の代表種であるNitratireductor aquibiodomus NL21（International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology (2004), 54, 269-273参照）と今回単離された細菌とは１６ＳｒＤＮＡの相同性が９７％であるとともに、低級有機酸の資化性が異なっていた。
【００４６】
また、ここで単離された細菌は、硝酸塩だけでなくアンモニウム塩及びグルタミン酸を窒素源として用いることができることも確認できた。
【００４７】
以上の性質から、ここで得られた細菌はNitratireductor属の新種であることが分かり、上述のようにNitratireductor sp. OM-1と命名された。
【００４８】
なお、Nitratireductor sp. OM-1株は、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０２０４３として千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 122号室所在の独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センターに寄託されている。
【００４９】
−Nitratireductor sp. OM-1による生成物の分析−
１０ｍＭのプロピオン酸を含む上述のＡＴＣＣ＃１４０９培地を用いて２８℃で７日間Nitratireductor sp. OM-1の培養を行った。次いで、脂肪酸だけでなく、ジアシルグリセロール、トリアシルグリセロールを含む全ての脂質をメチルエステル化した後、ＧＣ分析及びＧＣ／ＭＳ分析を行って、乾燥菌体あたりの全脂肪酸量と各脂肪酸の量とを測定した。また、窒素源の存在が脂質の生産量に与える影響を調べるため、０ｍＭから２０ｍＭの間で窒素源の濃度を変えて培養を行った。窒素源の一例としてＮＨ４Ｃｌを用いた。
【００５０】
ここでは、炭素源を制限した上述のＡＴＣＣ＃１４０９培地から１０ｍＭの酢酸ナトリウム及び１０ｍＭのプロピオン酸を含むＡＴＣＣ＃１４０９培地に植え継ぎ、プロピオン酸を含むＡＴＣＣ＃１４０９培地を用いて数回継代培養した後、ＧＣ分析等を行った。この分析結果を表５に示す。また、ＧＣ分析によって得られた乾燥菌体重量当たりの全脂質量を図５に示す。なお、表５に示す「全脂肪酸量」には、スクアレン等の炭化水素の収量は含まれていない。これらの炭化水素の収量は、図５に示す乾燥菌体重量当たりの全脂質量には含まれている。
【００５１】
【表５】
0006685137.tif 000006
【００５２】
表５に示す結果では、Nitratireductor sp. OM-1の培養では、培地中のＮＨ４Ｃｌ濃度が低くなるにつれて乾燥菌体重量当たりの脂肪酸の生産量、特にトリアシルグリセロールが増えていた。培養後の菌体をナイルレッドを用いて染色すると、菌体内の油滴（オイルドロップ）が大きくなっていることが確認された。これは、窒素源を欠乏させることによって、菌体内で脂質を貯蔵するように代謝が切り替わったためと考えられた。また、図５に示すように、乾燥菌体重量当たりの全脂質量もＮＨ４Ｃｌ濃度が低くなるにつれて増加ししていた。
【００５３】
ただし、Nitratireductor sp. OM-1は、培地中のＮＨ４Ｃｌ濃度が少なくとも２０ｍＭ以下の範囲では低級有機酸から脂質を合成することができることも確認できた。ここでは、培地中の資化可能な炭素源を低級有機酸に絞っているため、脂質は低級有機酸から合成されたものであると考えられる。
【００５４】
また、ＧＣ分析の結果から、培地中の窒素源（ＮＨ４Ｃｌ）の濃度が低くなるにつれて2-ブテン酸1-メチルエチルエステル（2-Butenoic acid 1-metylethyl ester）が多量に生産されることも分かった。2-ブテン酸1-メチルエチルエステルの乾燥菌体重量当たりの生産量は、窒素源の濃度が０ｍＭの場合、全脂質量の約５０％に上っていた。2-ブテン酸1-メチルエチルエステルは可燃性であり、そのままでも燃料として利用可能である。さらに、2-ブテン酸1-メチルエチルエステルのエステル結合を切断することにより、派生体である2-ブテン酸を得ることができる。この2-ブテン酸を軽油として利用すれば、エタノールよりも高い燃焼エネルギーを得ることができる。
【００５５】
なお、代謝の切り替わりの傾向は窒素源の種類によって変わらないと考えられる。このため、ＮＨ４Ｃｌ以外のアンモニウム塩や硝酸塩、グルタミン酸が窒素源になる場合であっても窒素源としての濃度が少なくとも２０ｍＭ以下の範囲ではNitratireductor sp. OM-1は、低級有機酸から脂質を合成することができると考えられる。
【００５６】
また、表５に示す結果から、Nitratireductor sp. OM-1によって生成されるトリアシルグリセロールは、リノール酸を主成分とし、ペンタデセン酸、パルミトレイン酸等を分子中に含むことが分かった。
【００５７】
以上の結果から、Nitratireductor sp. OM-1の培養は、ＮＨ４Ｃｌ等の窒素源の濃度が低い環境で行われることが好ましく、少なくとも２０ｍＭ以下で行われることで、菌体重量当たりの全脂質量を増やすとともに、燃料としてより有用な2-ブテン酸1-メチルエチルエステルの生産量を増やすこともできるので、好ましいと言える。
【００５８】
Nitratireductor sp. OM-1は、酢酸やプロピオン酸等の低級有機酸から脂質を生成することができるので、例えば活性汚泥中の低級有機酸を除去できるだけでなく、生成した脂質をバイオディーゼルとして利用することが可能となる。また、活性汚泥の代わりにNitratireductor sp. OM-1の菌液を用いれば、低級有機酸を含む対象物の処理を行った後、集菌及び乾燥により得られたペレットをそのまま燃料として利用することもできる。
【００５９】
また、対象物の処理の際にはあらかじめ炭素源をＮａＨＣＯ３のみに制限した貧栄養培地で培養された菌液を処理に用いることで、脂質の収量を大幅に向上させることができる。
【００６０】
このように、Nitratireductor sp. OM-1を用いれば、廃棄される汚泥の量を効果的に減らすことができるとともに、燃料を得ることができる。
【００６１】
Nitratireductor sp. OM-1により産生された脂質の多くは菌体内に油滴として蓄えられ、培地中にはあまり放出されない。このため、上述のように低級有機酸を含む液体中で脂質を生成させた後、遠心分離等の公知の方法によって菌体を回収することで、生成された脂質を容易に効率良く得ることができる。
【００６２】
Nitratireductor sp. OM-1を用いる方法によれば、化学的な方法でプロピオン酸等の除去を図る場合に比べて有毒な薬剤を用いたり高温にしたりする必要がないので、低コストで安全に活性汚泥等の処理を行うことができる。また、低級有機酸を含む処理対象物は活性汚泥に限られない。
【００６３】
なお、本実施形態では２０℃〜２６℃程度でNitratireductor sp. OM-1を培養する例を説明したが、この範囲外であっても生育可能な温度であれば培養により低級有機酸から脂質を合成させることは可能である。振盪培養の際の回転速度は特に限定されず、処理対象物の容積によって攪拌方法や攪拌条件を適宜変更してもよい。培地のｐＨは特に限定されないが、例えば４以上８以下であってもよい。
【００６４】
以上の例では低級有機酸として酢酸及びプロピオン酸が基質として培地に含まれている例を示したが、酢酸及びプロピオン酸のいずれか一方のみが培地に含まれていてもよいし、酢酸及びプロピオン酸以外の低級有機酸が培地に含まれていても脂質を合成させることができる。
【００６５】
図６は、炭素源をグリセリンのみとした場合のNitratireductor sp. OM-1の増殖曲線を示す図である。また、表６には、炭素源をグリセリンのみとした場合の乾燥菌体当たり又は培養液の体積当たりの全脂質量及び各種脂肪酸の量を示す。図６は、上記の培地を用いて２８℃、暗所、好気条件下でNitratireductor sp. OM-1を７日間培養した結果を示す。また、全脂質量及び各種脂肪酸の量の測定は、ＧＣ及びＧＣ／ＭＳにより行った。
【００６６】
【表６】
0006685137.tif 000007
【００６７】
図６及び表６に示すように、Nitratireductor sp. OM-1はグリセリンを炭素源として生育可能であり、グリセリンから脂質を生産できることが分かる。
【００６８】
Nitratireductor sp. OM-1により生成されたトリアシルグリセロールはメチルエステル化されることによりバイオディーゼルに変換されるが、この過程でグリセリンが生成する。上述のように、Nitratireductor sp. OM-1はグリセリンを基質として利用することもできるので、バイオディーゼルの生産過程で排出されるグリセリンも処理することが可能である。
【００６９】
このように、Nitratireductor sp. OM-1は低級有機酸だけでなく糖類やアルコール類等、広範囲の物質を資化できるので、複数種の炭素源を含む複合廃水を単独で処理することができる。このため、複数種の微生物を用いて廃水処理を行う場合に比べて条件等の管理が容易になる。本実施形態の微生物が生育可能な廃水であれば処理される廃水の種類は特に限定されない。処理される廃水は、例えば廃糖蜜を含む廃水等、食品系廃水であってもよい。
【００７０】
また、Nitratireductor sp. OM-1は廃水処理に利用できるだけでなく、液中の炭素源を制限することによって上述のように、大気中に含まれるＣＯ２を固定し、燃料等として有用な脂質や炭化水素を生産することができる。
【００７１】
また、酢酸及びプロピオン酸等の低級有機酸の濃度が１０ｍＭ以外の濃度であっても酢酸及びプロピオン酸から脂質を合成することができる。例えば低級有機酸の濃度は０ｍＭより大きく５０ｍＭ程度以下であってもよい。今回得られた菌株の低級有機酸に対する耐性は高いので、培地中の低級有機酸の濃度をかなり高くしても生育が可能であると考えられる。一方、低級有機酸の濃度が低くても炭素源があれば菌の生育は可能である。
【００７２】
Nitratireductor sp. OM-1が生産できる炭化水素としてスクアレンを挙げたが、Nitratireductor sp. OM-1は、スクアレン以外の炭化水素も生産可能である。
【００７３】
また、図１に示すステップＳ１〜Ｓ６を含む方法を用いれば、Nitratireductor sp. OM-1と同様に低級有機酸から脂質を生成できるNitratireductor属又は他属の新たな菌株を単離することは可能である。このようなNitratireductor属や他属の菌株もNitratireductor sp. OM-1と同様に低級有機酸を含む物質の処理、あるいは低級有機酸と、低級有機酸以外の炭素源とを含む複合廃水の処理等に用いることができる。また、Nitratireductor sp. OM-1株又はこれと同等の微生物学的性質を有する菌株を適宜公知の遺伝子工学の手法等によって改変することで得られた微生物を、低級有機酸が含まれた物質の処理に用いてもよい。
【産業上の利用可能性】
【００７４】
以上説明したように、本開示の一例に係る微生物及びこれを用いた脂質の生産方法は、活性汚泥や廃液等の処理に適用される。
【図１】
0006685137.tif 000008
【図２】
0006685137.tif 000009
【図３Ａ】
0006685137.tif 000010
【図３Ｂ】
0006685137.tif 000011
【図３Ｃ】
0006685137.tif 000012
【図３Ｄ】
0006685137.tif 000013
【図３Ｅ】
0006685137.tif 000014
【図３Ｆ】
0006685137.tif 000015
【図４】
0006685137.tif 000016
【図５】
0006685137.tif 000017
【図６】
0006685137.tif 000018