(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクトースが別の炭素源と組み合わされた環境で生育するときにラクトース死滅現象に耐性である微生物を生産する方法であって、
ａ．変異により微生物内でのラクトーストランスポーターの発現レベルを変化させること、
ｂ．前記ラクトーストランスポーターの発現レベルを決定すること、
ｃ．前記変異した微生物を、ラクトースでない炭素源を含んでなる培地で生育させること、
ｄ．前記変異した微生物の生育の間にラクトースを前記培地に添加すること、及び
ｅ．ラクトースとラクトースでない炭素源とを含んでなる前記培地で生育し、前記ラクトーストランスポーターの野生型発現カセットで得られるラクトース流入の少なくとも50％を保持する微生物を、前記ラクトーストランスポーターの発現レベルに基づいて選択すること
を含んでなる方法。
【請求項２】
工程ａ)が、内因性若しくは外因性ラクトーストランスポーター遺伝子の前に異種プロモーターを導入すること、及び/又はコーディング配列の前の、リボソーム結合配列若しくはコザック配列を含む非翻訳領域を変異させること、及び/又は内因性ラクトーストランスポーター遺伝子のコドン使用頻度を改変することにより行われる請求項１に記載の方法。
【請求項３】
内因性又は外因性ラクトーストランスポーター遺伝子の前への異種プロモーターの前記導入が、ａ)ゲノムから内因性ラクトーストランスポーターを欠失させ、前記微生物のゲノム内の別の場所で該内因性ラクトーストランスポーターを再導入すること、又はｂ)内因性ラクトーストランスポーターの前に異種プロモーターを導入すること、又はｃ)内因性ラクトースプロモーターをノックアウトし、前記微生物のゲノム中の同じ位置に異種プロモーターを導入することにより行われる請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ラクトーストランスポーターの発現レベルを、リポーター遺伝子との翻訳共役及び/又はアプタマー連結を介して決定する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記ラクトーストランスポーターの発現レベルを、配列番号２、３、４及び/又は５に示される遺伝子構築物を介して決定する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記ラクトーストランスポーターの発現レベルを、前記変異した微生物の増殖速度を測定することにより決定する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記ラクトーストランスポーターの発現レベルを、唯一の炭素源としてラクトースを含んでなる培地での前記変異した微生物の増殖速度を測定することにより決定する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記ラクトーストランスポーターがラクトースパーミアーゼである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記微生物が細菌、酵母又は真菌細胞である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
ラクトーストランスポーターの発現を導き、ラクトース死滅表現型をもたらさないラクトーストランスポーター発現カセットであって、配列番号１、７、８、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56又は57で示される配列を含む発現カセット。
【請求項１１】
ラクトースが他の炭素源と組み合わされた環境で生育するときにラクトース死滅現象に耐性であり、配列番号１、７、８、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56又は57で示される配列を含むラクトーストランスポーター発現カセットを含む微生物。
【請求項１２】
ラクトース及び/又はガラクトース分解経路の酵素をコードする遺伝子が機能低下しているか又は非機能化している請求項１１に記載の微生物。
【請求項１３】
2-フコシルラクトース若しくは2'-フコシルラクトース若しくは3-フコシルラクトース若しくは2',3-ジフコシルラクトース若しくはラクトNトリオース若しくはラクト-N-テトラオース若しくはラクト-nN-テトラオース若しくは3'シアリルラクトース若しくは6'シアリルラクトース、糖脂質又はガラクトシル化化合物の製造のための、請求項１１若しくは１２に記載の微生物又は請求項１０に記載のラクトーストランスポーター発現カセットの使用。
【請求項１４】
ラクトーストランスポーター発現カセットの変異体を創製すること；
前記変異体発現カセットから、その発現カセットで形質転換した微生物においてラクトーストランスポーターが確実に発現する発現カセットをスクリーニングすること；
前記ラクトーストランスポーターが確実に発現する変異体発現カセットから、その発現カセットで形質転換した微生物においてラクトース死滅をもたらさない発現カセットを、中期対数増殖期にラクトースを加えた培地中で、前記発現カセットで形質転換した微生物を増殖させることによりスクリーニングすること；及び
ラクトース死滅現象に耐性である形質転換微生物から発現カセットを単離すること
を含む、ラクトース死滅をもたらさないラクトーストランスポーター発現カセットを製造する方法。
【請求項１５】
発現カセットからのラクトーストランスポーターの発現を、リポーター遺伝子との翻訳共役及び/又はアプタマー連結を介して検出する、請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の技術分野
本発明は、ラクトース死滅現象に耐性である変異した微生物を生産する方法、及び該方法により取得し得る微生物に関する。この遺伝子操作された微生物は、特別の生成物(例えば、特別の炭水化物、糖脂質及びガラクトシル化化合物であるがこれらに限定されない)の製造に適用することができる。
【背景技術】
【０００２】
背景技術
ラクトース死滅(lactose killing)は、別の炭素源とのラクトースの存在下で多くの生物の生育を害する周知であり十分に研究されている原理である。この現象の正確な機序は知られていないが、この現象を誘導するに必要となる特徴は明白である。ラクトース死滅は、別の炭素源(限定されないが、例えば、グリセロール又はスクロース)で生育している微生物培養物にラクトースを加えると生じる。更に、ラクトース死滅は、ラクトーストランスポート遺伝子が誘導性であるとき又は構成的に発現されるときに生じる(33，39，75)。ラクトース死滅は、ラクトースパーミアーゼの発現がケモスタット条件下でIPTG及びラクトースでモジュレートされた大腸菌(E. coli)について最初に観察された(28)。ラクトース死滅は、後に、Rhizobium meliloti、Kluyveromyces lactis及びZymomonas mobilisについても観察された(55，70，77)。この現象の可能性のある理由の１つは、当該細胞のラクトーストランスポーター活性のいわゆる「コスト」に帰せられた。この「コスト」は生育の低下又は阻害をもたらし、また、工業的プロセスにおいて十分に高い製品価及び収率を達成するために大抵は高く維持される細胞外ラクトース濃度にも関連する(34)。しかし、先行技術では、これら条件下でラクトース輸送が存在する限り、ラクトース死滅は生じるはずであると述べられている。ラクトース死滅の問題を解決するために、ラクトースパーミアーゼの欠失又はラクトース取込みの重度障害が提案されている(34)。例えば、Lodiら(55)は、K. lactisにおいてラクトースパーミアーゼを欠失させ(ノックアウト)、ラクトース死滅がもはや生じないことを見出した。更に、実験の間の自然発生変異により、選択したラクトース死滅ネガティブ系統はラクトース取込みが重度に損なわれていることが示された。しかし、ラクトース取込みは、特別の生成物又はバイオ生成物の効率的合成に必須である。よって、ラクトースパーミアーゼの欠失又はラクトースパーミアーゼ活性の重度障害は、明らかに、解決法ではない。なぜならば、バイオ生成物の製造は、１)効率的なラクトース取込み、及び２)「ラクトース死滅表現型」を導かない発現カセットを必要とするからである。ラクトース-ベースのバイオ生成物の製造用ラクトースパーミアーゼは、以前は、「ラクトース死滅表現型」を解決することなく用いられていた。過去においては、この問題は、ラクトースの取込みを大きく低減させることにより(よって、ラクトースに基づく特別の生成物はほとんど又は全く生成されない)、又は先ず十分なバイオマスを得るために、生育期と生成期とを切り離すことにより解決された。この生育期の後に、特別の生成物を製造するために、生成期にラクトースを加える。この第２の期では、強力な生育低下は生じない(59)。
【０００３】
よって、通常のラクトース取込みは常にラクトース死滅に至るので、ラクトース死滅を回避するためには、ラクトース取込みを排除するか又は重度に損傷させなければならないというのが現在大勢を占める意見である。これに対して、本発明は、ラクトース死滅を受けることなく効率的なラクトース取込みを可能にするラクトースパーミアーゼの発現カセットを見出すためのスクリーニング法を開示する。
ラクトースは、多くのバイオ生成物、より具体的には特別の炭水化物(14)、糖脂質及びガラクトシル化化合物(例えば、ガラクトシル脂質、ガラクトシルセラミド及びガラクトシル化アグリコン)の構築成分である。多くの場合で、ガラクトース部分は、医薬品の器官標的化に用いられる(28)。しかし、他の基質との組合せでのラクトースの基質としての使用は、上記「ラクトース死滅」現象に起因して自明なことではない。大抵の場合、ラクトース死滅を回避するための多相製造系、非増殖共役細胞系を必要とする(32，48)。
【０００４】
多くの特別の炭水化物の基本的構造骨格はラクトース又はガラクトース単位からなる。より具体的には、ヒト乳オリゴ糖、ひいては母乳オリゴ糖(糖及びオリゴ糖の広範な群)はガラクトース及びラクトース単位から構築される(15)。更に、これら炭水化物は、例えばN-アセチルグルコサミン、N-アセチルガラクトサミン、シアル酸(例えば、N-アセチルノイラミネート、N-グリコイルノイラミネート、2-ケト-3-デオキシ-D-グリセロ-ガラクト-ノヌロソン酸など)(21)、L-フコースなどのような糖部分で修飾される。これら化合物の合成には、活性化された炭水化物(例えば、UDP-N-アセチルグルコサミン、UDP-N-アセチルガラクトサミン、CMP-シアル酸、GDP-フコースなど)が必要である。これらは、生合成に必要なエネルギーに起因して、非常に高価で、分子合成が難しく、生育細胞によって至適に製造される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ヒト/母乳のオリゴ糖成分は、抗炎症効果及びプレバイオティック効果を有し、並びに/又は栄養補助製品、抗炎症剤、プレバイオティック若しくは医薬品のような処置剤で応用される(15，24，68)。しかし、このような高付加価値化合物の効率的製造方法は、依然として必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、高ラクトース濃度でさえもラクトース死滅を生じないラクトーストランスポーターの合成発現系を記載する。よって、前記発現系により取得可能である変異生物は、上記バイオ生成物の製造に有用である。
【０００７】
発明の要旨
本発明は、ラクトースが別の炭素源と組み合わされた環境で生育するときにラクトース死滅現象に耐性である微生物を生産する方法であって、
ａ．微生物内でのラクトーストランスポーターの発現を変異させること、ここで、前記変異は発現したラクトーストランスポーターを生じ、
ｂ．前記変異した微生物を、ラクトースでない炭素源を含んでなる培地で生育させること、
ｃ．前記変異した微生物の生育の間にラクトースを前記培地に添加すること、及び
ｄ．ラクトースを含んでなる前記培地で生育し、ラクトース死滅現象に耐性である微生物を選択すること
を含んでなる方法に関する。
【０００８】
より具体的には、本発明は、ラクトースが別の炭素源と組み合わされた環境で生育するときにラクトース死滅現象に耐性である微生物を生産する方法であって、
ａ．微生物内でのラクトーストランスポーターの発現を変異させること、ここで、前記変異は前記ラクトーストランスポーターの発現をもたらし、
ｂ．前記変異した微生物を、ラクトースでない炭素源を含んでなる培地で生育させること、
ｃ．前記変異した微生物の生育の間にラクトースを前記培地に添加すること、及び
ｄ．ラクトースを含んでなる前記培地で生育し、ラクトース死滅現象に耐性である微生物であって、前記ラクトーストランスポーターの野生型発現カセットで得られるラクトース流入の少なくとも50％を保持する微生物を選択すること
を含んでなる方法に関する。
【０００９】
本発明は更に、工程ａ)が、内因性若しくは外因性ラクトーストランスポーター遺伝子の前に異種プロモーターを導入すること、及び/又はコーディング配列の前の、リボソーム結合配列若しくはコザック配列を含む非翻訳領域を変異させること、及び/又は内因性ラクトーストランスポーター遺伝子のコドン使用頻度を改変することにより行われる上記方法に関する。
本発明はまた、内因性又は外因性ラクトーストランスポーター遺伝子の前への異種プロモーターの前記導入が、ａ)ゲノムから内因性ラクトーストランスポーターを欠失させ、前記微生物のゲノム内の別の場所で該内因性ラクトーストランスポーターを再導入すること、又はｂ)内因性ラクトーストランスポーターの前に異種プロモーターを導入すること、又はｃ)内因性ラクトースプロモーターをノックアウトし、前記微生物のゲノム中の同じ位置に異種プロモーターを導入することにより行われる上記方法に関する。
【００１０】
本発明は更に、工程ｂ)におけるラクトースパーミアーゼの発現がリポーター遺伝子との翻訳共役及び/又はアプタマー連結により検出される上記方法に関する。
本発明は、前記発現したラクトーストランスポーターが配列番号２、３、４及び/又は５に示される遺伝子構築物により検出される上記方法に関する。
本発明は更に、前記ラクトーストランスポーターがラクトースパーミアーゼである上記方法に関する。
本発明は更に、前記微生物が細菌、酵母又は真菌である上記方法に関する。
本発明は、上記方法により取得し得るプロモーター配列、コーディング配列の前の(リボソーム結合配列又はコザック配列を含む)非翻訳領域配列、及び/又はラクトースパーミアーゼ配列であって、ラクトーストランスポーターの発現を導き、前記配列を含む微生物が、ラクトースが他の炭素源と組み合わされた環境で生育するときにラクトース死滅表現型をもたらさないプロモーター配列、非翻訳領域配列及び/又はラクトースパーミアーゼ配列にも関する。
【００１１】
本発明はまた、ラクトースが別の炭素源と組み合わされた環境で生育するときにラクトース死滅現象に耐性であり、上記方法により取得し得る微生物に関する。
より具体的には、本発明は、
配列番号１、７、８、９、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56又は57で示されるラクトーストランスポーター遺伝子の前に異種配列を有する上記微生物に関する。
本発明は、ラクトース及び/又はガラクトース分解経路の酵素をコードする遺伝子が機能低下しているか又は非機能化している、ラクトース死滅現象に耐性である微生物にも関する。
本発明は更に、ラクトースベースの特別の生成物(例えば、特別の炭水化物、糖脂質及びガラクトシル化化合物)の製造のための上記微生物の使用に関する。
本発明はまた、前記特別の炭水化物が2-フコシルラクトース又は2'-フコシルラクトース又は3-フコシルラクトース又は2',3-ジフコシルラクトース又はラクトNトリオース又はラクト-N-テトラオース又はラクト-nN-テトラオース又は3'シアリルラクトース又は6'シアリルラクトースである上記微生物の使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】大腸菌(E. coli)野生型系統に対するラクトースの影響。矢印の時点で、一方の培養物にラクトースを加えると、その培養物の増殖は直ぐに停止したが、他方の培養物は増殖を続けた。
【図２】ラクトーストランスポーター発現が合成の構成性プロモーターにより改変されている大腸菌(E. coli)ラクトーストランスポーター変異体系統に対するラクトースの影響。矢印は、一方の培養物においてラクトースを培地に加えた時点を示す。この場合、増殖に対する影響は観察されなかった。よって、これら変異体系統は、この様式で選択することができる。
【図３】大腸菌(E. coli)変異体系統に導入したときにラクトース死滅を生じないプロモーターとRBSとラクトーストランスポーター配列との組合せの例(配列番号１)。
【図４】lacZ遺伝子に翻訳共役したラクトースパーミアーゼ遺伝子の配列の例(配列番号２)。
【図５】cat遺伝子に翻訳共役したラクトースパーミアーゼ遺伝子lacYの配列の例(配列番号３)。
【図６】aph 1遺伝子に翻訳共役したK. maxianusラクトースパーミアーゼ遺伝子の配列の例(配列番号４)。
【図７】(Z)-4-(3,5-ジフルオロ-4-ヒドロキシベンジリデン)-1,2-ジメチル-1H-イミダゾール-5(4H)-オンに結合しラクトースパーミアーゼ発現の検出を可能にするアプタマーと連結されたラクトースパーミアーゼ遺伝子lacyの配列の例(配列番号５)。
【図８】クロラムフェニコール耐性遺伝子に翻訳共役したラクトースパーミアーゼを有しない参照プラスミドpSC101を含む参照系統及びクロラムフェニコール耐性遺伝子に翻訳共役したラクトースパーミアーゼを有する変異体系統のクロラムフェニコール耐性。Ｘ軸は、試験した種々のクロラムフェニコール濃度を示し、Ｙ軸は、48時間のインキュベーション後の培養物の光学密度を示す。参照系統は、変異体系統より低いクロラムフェニコール濃度で生育遅滞を示す。このことから、ラクトースパーミアーゼの発現は抗生物質耐性遺伝子との翻訳共役によりスクリーニング可能であることが証明される。よって、ラクトースパーミアーゼを発現する生物を、この様式で、非発現生物と発現生物との混合物から選択することができる。
【図９】クロラムフェニコール耐性遺伝子に翻訳共役したラクトースパーミアーゼを有しない参照プラスミドpSC101を含む参照系統及びクロラムフェニコール耐性遺伝子に翻訳共役したラクトースパーミアーゼを有する変異体系統のクロラムフェニコール耐性。Ｘ軸は、試験した種々のクロラムフェニコール濃度を示し、Ｙ軸は、92時間のインキュベーション後の培養物の光学密度を示す。参照系統は、変異体系統より低いクロラムフェニコール濃度で生育遅滞を示す。このことから、ラクトースパーミアーゼの発現は抗生物質耐性遺伝子との翻訳共役によりスクリーニング可能であることが証明される。よって、ラクトースパーミアーゼを発現する生物を、この様式で、非発現生物と発現生物との混合物から選択することができる。
【図１０】pCXP14-FT_H. pylori(配列番号６)。
【図１１】酵母野生型系統(Kluyveromyces marxianus lactis)に対するラクトースの影響。矢印の時点で、一方の培養物にラクトースを加えると、その培養物の増殖は直ぐに停止したが、他方の培養物は増殖を続けた。
【図１２】ラクトーストランスポーター発現が合成の構成性プロモーターにより改変されている酵母ラクトーストランスポーター変異体系統(Saccharomyces cerevisiae)に対するラクトースの影響。矢印は、一方の培養物においてラクトースを培地に加えた時点を示す。この場合、増殖に対する影響は観察されなかった。よって、これら変異体系統は、この様式で選択することができる。
【図１３】酵母変異体系統に導入したときにラクトース死滅を生じないプロモーター(p1)とコザックとK. marxianusラクトースパーミアーゼコーディング配列とターミネーターとの組合せの例(配列番号７)。
【図１４】酵母変異体系統に導入したときにラクトース死滅を生じないプロモーター(p2)とコザックとK. marxianusラクトースパーミアーゼコーディング配列とターミネーターとの組合せの例(配列番号８)。
【図１５】プロモーターとコザックとK. marxianus β-ガラクトシダーゼコーディング配列とターミネーターとの組合せの例(配列番号９)。
【図１６】HR1 rDNA(配列番号10)。
【図１７】HR2 rDNA(配列番号11)。
【図１８】実施例に記載したラクトース死滅スクリーニング法から得られる、選択した配列の例(配列番号12〜57)。
【図１９】野生型に対する、ラクトースパーミアーゼ発現カセットの相対的増殖速度。エラーバーは、少なくとも３回の繰返し測定の標準偏差である。Ｘ軸に示した配列に相当する配列を図18に示す。
【図２０】実施例16においてラクトース死滅について試験したlacIQ_lacY発現カセットの配列(配列番号58)。
【図２１】大腸菌(E. coli)野生型系統及びplacIQ_lacY変異体系統に対するラクトースの影響。両系統を、中期対数増殖期でのラクトースの添加あり/なしで増殖させた。矢印はラクトース添加時点を示す。両系統の増殖ともラクトース添加により重度に妨げられた。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
発明の説明
本発明は、遺伝子操作により生物中でのラクトーストランスポーターの発現を変化させ、変異ラクトーストランスポーターを発現する生物を生じさせることによってラクトース死滅を回避する新規方法を記載する。この目的のため、外因性及び/又は内因性ラクトーストランスポーター遺伝子を、ラクトース死滅表現型をもたらさない異種プロモーターにより発現させ、及び/又は、ラクトース死滅表現型をもたらさない変更されたラクトーストランスポーター発現が生じるようにラクトーストランスポーターのコドン使用を改変する。この目的のため、ラクトーストランスポーター発現の天然の制御を、ラクトース死滅が生じないように除去及び/又は置換しなければならない。例えば、天然に存在するラクトーストランスポーター発現カセットをゲノムから欠失させ、別の場所に再導入し、並びに/又は、本来の位置に存在するラクトーストランスポーターの前に異種プロモーターを導入し、並びに/又は、先ずラクトーストランスポーター遺伝子をノックアウトし、ゲノム中の同じ場所及び/若しくは別の位置で該ラクトーストランスポーター遺伝子を異種プロモーターと共に再導入し、並びに/又は、ラクトーストランスポーター遺伝子を、異種プロモーターにより発現するオペロン中に導入する。
【００１４】
よって、本発明は、ラクトースが別の炭素源と組み合わされた環境で生育するときにラクトース死滅現象に耐性である微生物を生産する方法であって、１)微生物内でのラクトーストランスポーターの発現を変異させること、ここで、前記変異は前記ラクトーストランスポーターの発現をもたらし、２)前記変異した微生物を、ラクトースでない炭素源を含んでなる培地で生育させること、３)前記変異した微生物の生育の間にラクトースを前記培地に添加すること、及び、４)ラクトースを含んでなる前記培地で生育し、ラクトース死滅現象に耐性である微生物であって、前記ラクトーストランスポーターの野生型発現カセットで得られるラクトース流入の少なくとも50％を保持する微生物を選択すること  を含んでなる方法に関する。
用語「ラクトース死滅」とは、ラクトース又はガラクトシドが別/他の炭素源と組み合わされた環境で生育する生物の増殖遅滞又は増殖停止の現象をいう。これら炭素源は、グリセロール、マルトース、グルコース、フルクトース、スクロース、フコース、マンノース、シアル酸、スターチ、セルロース、ポリオール(例えば、マンニトール、キシリトール、ソルビトール)、有機酸(ラクテート、スクシネート、アセテートなど)、及び/又はペントース(キシロース、アラビノースなど)であるが、これらに制限されない。
【００１５】
本発明は、ラクトース死滅を生じないラクトースパーミアーゼ発現系を同定する方法を記載する。本方法は、中期対数増殖期にラクトースを添加する変異体系統の増殖分析を含む。本方法は、高スループット様式でマイクロタイタープレートにおいて又はセルソーターを用いて実施することができ、変異体微生物におけるラクトースパーミアーゼ発現に影響し得る複数のプロモーター、リボソーム結合部位、コドン使用その他の因子のスクリーニングを可能にする。本発明は、翻訳共役及び/又はアプタマー連結によりラクトースパーミアーゼ発現を検出し、リポーター遺伝子により発現を導く配列を選択する方法を記載する。リポーター遺伝子は、例えば、抗生物質耐性遺伝子(例えば、クロラムフェニコール、ゲンチシンG418であるがこれらに限定されない)、蛍光タンパク質、ヒドロラーゼ(例えば、ガラクトシダーゼ、キシラナーゼであるがこれらに限定されない)及び又はアプタマー配列であるがこれらに限定されない。ラクトースパーミアーゼの発現をもたらす配列は、リポーター遺伝子に基いて、抗生物質を含む培地での生育により、比色アッセイ(例えばX-gal)及び/又は蛍光細胞を選別する蛍光活性化細胞ソーターにより、及び/又は(限定されないが例えば(Z)-4-(3,5-ジフルオロ-4-ヒドロキシベンジリデン)-1,2-ジメチル-1H-イミダゾール-5(4H)-オン(37，64)に基づく)アプタマーアッセイにより更に選択される。本発明は更に、ラクトース死滅を受けないラクトーストランスポーター発現変異体生物についてのスクリーニング法を記載する。加えて、本発明は、プロモーターライブラリ、RBS又はコザック配列ライブラリ、転写ターミネーターライブラリ及び/又はラクトースパーミアーゼ遺伝子のコドン使用バリアントを介してラクトースパーミアーゼ発現カセットのライブラリを作製し得る方法を記載する。更に、これらライブラリは、限定されないが、Gibsonアセンブリ、Golden Gateアセンブリ、Clivaアセンブリ、LCR又は制限ライゲーション(25，36，50，79)のような方法により作製される。
【００１６】
用語「ラクトーストランスポーターの野生型発現カセットで得られるラクトース流入の少なくとも50％を保持する」は、本発明の変異微生物が、ラクトース死滅に耐性であるにもかかわらず、依然として、ラクトーストランスポーターの野生型発現カセットを用いたときに得られるラクトース流入の少なくとも50％(すなわち、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、99％)を保持することができなければならない事実に関する。
用語「発現カセット」は、プロモーター配列、非翻訳領域配列(リボソーム結合配列又はコザック配列を含む)、コーディング配列(例えば、ラクトースパーミアーゼ遺伝子配列)及び任意に転写ターミネーター(18)が存在する任意の配列に関する。
用語「ラクトーストランスポーター」とは、微生物において発現される、細胞膜を横切ってラクトースを転置(輸送)することができる任意のタンパク質をいう。このタンパク質は、例えば、ラクトースパーミアーゼ(MFS[Major Facilitator Superfamily]のトランスポーター)である。
【００１７】
用語「異種プロモーター」とは、コーディング配列の前に天然に存在しない任意のプロモーターをいう。「プロモーター」は、コーディング配列の直前に存在する転写開始部位及び非翻訳領域の前方に位置するRNAポリメラーゼ結合配列の全体である。よって、「異種プロモーター」配列は、１)天然に存在するプロモーター配列の、少なくとも１つの(すなわち１つ、２つ、３つ、４つの又はそれより多い)変異を含むバリアント、及び/又は２)前記トランスポーターのコーディング配列の前に天然に存在しない変異型ラクトーストランスポーター発現微生物に由来する天然型プロモーター、及び/又は３)ラクトーストランスポーター発現微生物に天然に存在しない配列、及び/又は４)インシリコで設計したプロモーターである人工プロモーターである。これらプロモーターは、限定されないがAlperら(2005)、Hammerら(2006)、De Meyら(2007)、Coussementら(2014)、Mutalikら(2013)(3，25，29，41，60)又はBlountら(2012)(13)により記載されるもののようなライブラリに由来することができ、或いは、限定されないがHXT7p、ADH1p、TEF1p、TEF2p、GPDp、PDC1p、FBA1p、PGK1p、PGI1p、TDH2p、PYK1p,ENO2p、GPM1p、TPI1pのようなプロモーターに由来することができ、或いは、例えばRhodiusら(2012)(66)に記載されるように設計することができる。また、用語「人工プロモーター」とは、天然型(自家)プロモーター配列と、異なる(自家又は異種)プロモーター配列の部分との組合せであるDNA配列を有するプロモーターをいう。このような「人工プロモーター」の配列は、例えばpartsregistry.org(19)のようなデータベースに見出すことができる。異種プロモーターは、転写因子を介した構成性発現又は調節された発現をもたらす。
【００１８】
用語「構成性(的)発現」は、或る特定の生育条件下でRNAポリメラーゼのサブユニット(例えば、細菌性シグマ因子)以外の転写因子によっては調節されない発現として定義する。このような転写因子の非限定的例は、大腸菌(E. coli)のCRP、LacI、ArcA、Cra、IclRなど、又はSaccharomyces cerevisiaeのAft2p、Crz1p、Skn7など、又はB. subtilisのDeoR、GntR、Furなどである。これら転写因子は、特異的配列に結合し、或る特定の生育条件で発現をブロック又は亢進し得る。RNAポリメラーゼは、特異的配列に結合して、原核生物宿主においては、例えばシグマ因子を介して、転写を開始する。
用語「調節された発現」は、或る特定の生育条件下でRNAポリメラーゼのサブユニット(例えば、細菌性シグマ因子)以外の転写因子により調節される発現として定義する。このような転写因子の例は上記のとおりである。
用語「(リボソーム結合部位又はコザック配列を含む、コーディング配列の直前の)非翻訳領域」は、RNAポリメラーゼ結合配列とコーディング配列との間の配列に関する。この非翻訳領域はまた、コーディング配列の直前に天然に存在する配列及び/又はラクトーストランスポーター発現微生物に天然に存在する配列及び/又は他の生物(原核生物又は真核生物)に由来する配列及び/又は人工的に設計された配列である。人工的に設計された配列は、既知の又は測定可能な翻訳速度を有する非天然の又はインシリコで設計されたリボソーム結合部位に関する。前記配列は、Mutalikら(2013)(60)により記載されるようなライブラリから得ることができるか、又は例えばSalisら(2009)(67)により記載されるようなアルゴリズムにより設計することができるか、又はpartsregistry.org(19)のようなデータベースに見出すことができる。
【００１９】
用語「改変されたコドン使用」は、DNAコーディング配列内で用いられているコドンの、当該生物がより頻繁に用いるか又は稀にしか用いないコドンへの変更に関する。コドン使用は、コドン使用データベース(61)のようなデータベースにおいて規定されており、コドン使用は、コドン使用設計アルゴリズム(73)により最適化される。
用語「翻訳共役」とは、興味対象の遺伝子と、緑色蛍光タンパク質、抗生物質耐性遺伝子、毒性遺伝子のようなリポーター遺伝子との共役発現に関する(49，53，58，63)。用語「翻訳センサー」とは、遺伝子の発現及び翻訳について指標となる任意の機構(例えば下記の参考文献(17，72)に記載のような蛍光タグ及び開裂タグ)をいう。
用語「アプタマー連結」とは、フルオロホア、限定されないが例えば(Z)-4-(3,5-ジフルオロ-4-ヒドロキシベンジリデン)-1,2-ジメチル-1H-イミダゾール-5(4H)-オン(37，64)により検出可能なアプタマー配列の、ラクトーストランスポーターメッセンジャーRNAへの導入をいう。
【００２０】
用語「増殖分析」とは生物の増殖曲線の分析をいう。生物は増殖培地において増殖環境で培養する。用語 増殖環境 は全ての環境パラメーター(例えば、pH、温度、溶存酸素)に関する。pHはpH緩衝液又はpHコントロールにより設定し、限定されないが例えば、pH４、4.5、５、5.5、６、6.5、７、7.5又は８である。温度は限定されないが例えば25、28、30、32、34、37、40、42、45℃に設定する。溶存酸素は、嫌気、微小好気(溶存酸素1.5mg/l未満)又は好気条件である。
用語「培地」又は「増殖培地」は、生物が増殖するに必要な基質を含有する任意の溶液に関する。これら基質は、限定されないが、窒素源、例えばアンモニウム塩、硝酸塩、酵母抽出物、ペプトン、カザミノ及び/又はアミノ酸、リン源、限定されないが例えばリン酸塩、イオウ源、限定されないが例えば硫酸塩、元素、限定されないが例えば銅、コバルト、鉄、セレン、ヨウ素、モリブデン、マグネシウム、カルシウム、カリウム、ナトリウム、亜鉛、ニッケル、マンガン、及び/又はホウ酸、及び/又はビタミン、限定されないが例えばチアミン、パントテン酸及び/又はナイアシン、及び/又は炭素源、限定されないが例えばグリセロール、マルトース、グルコース、フルクトース、スクロース、フコース、マンノース、シアル酸、スターチ、セルロース、ポリオール(例えば、マンニトール、キシリトール、ソルビトール)、有機酸(ラクテート、スクシネート、アセテートなど)、及び/又はペントース(キシロース、アラビノースなど)である。
【００２１】
上記の用語「生物」又は「細胞」とは、細菌、酵母又は真菌からなるリストより選択される微生物、又は植物若しくは動物の細胞をいう。細菌は、好ましくは、Proteobacteria門又はFirmicutes門又はCyanobactria門又はDeinococcus-Thermus門に属する。Proteobacteria門に属する細菌は、好ましくはEnterobacteriaceae科、好ましくはEscherichia coli種に属する。細菌は、好ましくは、Escherichia coli種に属する任意の系統、限定されないが例えばEscherichia coli B、Escherichia coli C、Escherichia coli W、Escherichia coli K12、Escherichia coli Nissleに関する。より具体的には、この用語は、実験室環境に十分に適合し、野生型系統とは異なり腸で繁殖する能力を喪失した培養Escherichia coli系統−例えば大腸菌(E. coli) K12系統と名付けられた系統−に関する。大腸菌(E. coli) K12系統の周知例は、K12野生型、W3110、MG1655、M182、MC1000、MC1060、MC1061、MC4100、JM101、NZN111及びAA200である。よって、本発明は、具体的には、大腸菌(E. coli)系統がK12系統である上記の変異した及び/又は形質転換したEscherichia coli系統に関する。より具体的には、本発明は、K12系統が大腸菌(E. coli) MG1655である上記の変異した及び/又は形質転換したEscherichia coli系統に関する。Firmicutes門に属する細菌は、好ましくは、Bacilliに属し、好ましくはBacillus種のものである。酵母は、好ましくは、Ascomycota門又はBasidiomycota門又はDeuteromycota門又はZygomycetes門に属する。酵母は、好ましくは、Saccharomyces属、Pichia属、Hansunella属、Kluyveromyces属、Yarrowia属又はStarmerella属に属する。真菌は、好ましくは、Rhizopus属、Dictyostelium属又はAspergillus属に属する。
【００２２】
本発明は、ラクトース死滅を受けることなくラクトースを取り込むことができ、ラクトース又はそのガラクトース部分を特別の生成物に変換することができる生物を記載する。より具体的には、前記特別の生成物又はバイオ生成物は、特別の炭水化物、糖脂質(限定されないが例えばガラクト脂質及び/又はラクト脂質)及び/又はガラクトシル化化合物(例えばガラクトシル脂質、ガラクトシルセラミド及び/又はガラクトシル化アグリコン)である。
本発明は、ラクトース死滅を受けることなくラクトースを取り込むことができ、ラクトースをヒト乳オリゴ糖、限定されないが例えば、3-フコシルラクトース、2'-フコシルラクトース、6-フコシルラクトース、2',3-ジフコシルラクトース、2',2-ジフコシルラクトース、3,4-ジフコシルラクトース、6'-シアリルラクトース、3'-シアリルラクトース、3,6-ジシアリルラクトース、6,6'-ジシアリルラクトース、3,6-ジシアリルラクト-N-テトラオース、ラクトジフコテトラオース、ラクト-N-テトラオース、ラクト-N-ネオテトラオース、ラクト-N-フコペンタオースII、ラクト-N-フコペンタオースＩ、ラクト-N-フコペンタオースIII、シアリルラクト-N-テトラオースｃ、シアリルラクト-N-テトラオースｂ、シアリルラクト-N-テトラオースａ、ラクト-N-ジフコヘキサオースＩ、ラクト-N-ジフコヘキサオースII、ラクト-N-ヘキサオース、ラクト-N-ネオヘキサオース、パラ-ラクト-N-ヘキサオース、モノフコシルモノシアリルラクト-N-テトラオースｃ、モノフコシルパラ-ラクト-N-ヘキサオース、モノフコシルラクト-N-ヘキサオースIII、異性体フコシル化ラクト-N-ヘキサオースIII、異性体フコシル化ラクト-N-ヘキサオースＩ、シアリルラクト-N-ヘキサオース、シアリルラクト-N-ネオヘキサオースII、ジフコシル-パラ-ラクト-N-ヘキサオース、ジフコシルラクト-N-ヘキサオース、ジフコシルラクト-N-ヘキサオースａ、ジフコシルラクト-N-ヘキサオースｃ、ガラクトシル化キトサン、フコシル化オリゴ糖及び/又はシアリル化オリゴ糖などに変換することができる生物を記載する。
【００２３】
本発明は更に、ラクトース死滅を受けず、ヌクレオチド糖、限定されないが例えば、GDP-L-フコース、GDP-マンノース、GDP-グルコース、CMP-シアル酸、UDP-グルコース、UDP-ガラクトース、UDP-N-アセチルグルコサミン、UDP-N-アセチルマンノサミン、UDP-N-アセチルガラクトサミン、UDP-グルクロン酸、UDP-ガラクツロン酸、UDP-キシロース、UDP-アラビノース及び/又はdTDP-ラムノースを合成する生物を記載する。用語「シアル酸」は、Varki(1992)(71)により定義されるようなノイラミン酸、N-アセチルノイラミン酸又はN-グリコイルノイラミン酸(これらに限定されない)のような化合物群の名称である。細胞内GDP-フコース濃度又はプールは、デノボ経路及び/又はサルベージ経路によるアップレギュレーションにより亢進する。デノボ経路は、GDP-4-ケト-6-デオキシマンノース-3,5-エピメラーゼ-4-レダクターゼ又はGDP-フコースシンターゼ、GDP-マンノース4,6-デヒドラターゼ、GDP-D-マンノースピロホスホリラーゼ、ホスホマンノースイソメラーゼ及び/又はホスホマンノムターゼからなる。これらの発現は、遺伝要素、限定されないが例えばプロモーター及び/又はリボソーム結合部位及び/又はモノシストロン又はポリシストロン(オペロン構造)中の変更したコドン使用により；及び/又はEnterobacteriaceaeにおける調節因子arcA iclRにより、及び/或いはEnterobacteriaceaeにおける転写調節因子RcsA又は細菌における相同遺伝子、Saccharomyces cerevisiaeにおけるXbp1、Spt20、Sfp1、Rpd3、Rap1、Gcr1、Gcn5、Cst6、Abf1、Hsf1、Reb1、Cad1、Sin4、Ash1、Ixr1、Met32、Pho2、Rgr1、Spt7、Swi4又は酵母若しくは真菌における相同遺伝子により、個別に増強される。サルベージ経路は、L-フコースキナーゼ及び/又はGDP-L-フコースピロホスホリラーゼからなる。GDP-マンノースプールは、GDP-D-マンノースピロホスホリラーゼ、ホスホマンノースイソメラーゼ及び/又はホスホマンノムターゼをコードする遺伝子；及び/又はマンノキナーゼ及びGDP-D-マンノースピロホスホリラーゼをコードする遺伝子をアップレギュレートすることにより亢進する。UDP-ガラクトースプールは、ガラクトキナーゼ及び/又はガラクトース-1-ホスフェートウリジルトランスフェラーゼ、及び/又は、UDP-ガラクトース-4-エピメラーゼ、及び/又は、UDP-ガラクトース/グルコースピロホスホリラーゼ、及び/又はラクトースシンターゼ、及び/又はラクトースホスホリラーゼ及び/又はスクロースホスホリラーゼをコードする遺伝子をアップレギュレートすることにより亢進する。UDP-グルコースプールは、グルコキナーゼ、及び/又は、UDP-グルコースピロホスホリラーゼ、及び/又はスクロースホスホリラーゼ及び/又はホスホグルコムターゼ、及び/又はスクロースシンターゼをコードする遺伝子をアップレギュレートすることにより亢進する。CMP-シアル酸プールは、L-グルタミン:D-フルクトース-6-ホスフェートアミノトランスフェラーゼ、及び/又は、ホスホグルコサミンムターゼ、及び/又は、グルコサミン-1-ホスフェートアセチルトランスフェラーゼ及び/又はN-アセチルグルコサミン-1-ホスフェートウリジルトランスフェラーゼ、及び/又はUDP-N-アセチルグルコサミン2-エピメラーゼ及び/又はN-アセチルノイラミネートシンターゼ及び/又はシチジン5'-モノホスフェートN-アセチルノイラミネートシンセターゼをコードする遺伝子をアップレギュレートする��とにより亢進する。UDP-N-アセチルグルコサミンプールは、L-グルタミン:D-フルクトース-6-ホスフェートアミノトランスフェラーゼ、及び/又は、ホスホグルコサミンムターゼ、及び/又は、グルコサミン-1-ホスフェートアセチルトランスフェラーゼ及び/又はN-アセチルグルコサミン-1-ホスフェートウリジルトランスフェラーゼ及び/又はグルコサミン-6-ホスフェートN-アセチルトランスフェラーゼ及び/又は、ホスホアセチルグルコサミンムターゼ、及び/又は、UDP-N-アセチルグルコサミンピロホスホリラーゼをコードする遺伝子をアップレギュレートすることにより亢進する。UDP-N-アセチルマンノサミンプールは、UDP-N-アセチルグルコサミンプール増加及び/又はUDP-N-アセチルグルコサミン2-エピメラーゼをコードする遺伝子をアップレギュレートすることにより亢進する。UDP-N-アセチルガラクトサミンプールは、UDP-N-アセチルグルコサミンプール増加及び/又はUDP-N-アセチルグルコサミンC4-エピメラーゼをコードする遺伝子をアップレギュレートすることにより亢進する。UDP-グルクロン酸プールは、UDP-グルコースプール増加及び/又はUDP-グルコースデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子をアップレギュレートすることにより亢進する。UDP-キシロースプールは、UDP-グルクロン酸プール増加及び/又はUDP-D-キシロースシンターゼをコードする遺伝子をアップレギュレートすることにより亢進する。UDP-ガラクツロン酸プールは、UDP-グルクロン酸プール増加及び/又はUDP-D-グルクロン酸4-エピメラーゼをコードする遺伝子をアップレギュレートすることにより亢進する。UDP-アラビノースプールは、UDP-グルクロン酸プール増加及び/又はUDP-D-キシロース 4-エピメラーゼ及び/又はアラビノースキナーゼ及び/又はUDP-L-アラビノースピロホスホリラーゼをコードする遺伝子をアップレギュレートすることにより亢進する。dTDP-ラムノースプールは、dTDP-グルコースピロホスホリラーゼ及び/又はdTDP-グルコース4,6-デヒドラターゼ、及び/又はdTDP-4-デヒドロラムノース3,5-エピメラーゼ及び/又はdTDP-4-デヒドロラムノースレダクターゼ及び又はグルコース-1-ホスフェートチミジリルトランスフェラーゼ及び/又はヌクレオチドラムノースシンターゼをコードする遺伝子をアップレギュレートすることにより亢進する。
【００２４】
更に、用語「プール」は、野生型生物に天然に存在する代謝物の濃度、例えばヌクレオチド糖プールの濃度に関する。用語「増加したプール」は、野生型生物中の代謝物プールより高い、顕著に増加した濃度の代謝物プールに関する。
用語「遺伝子をアップレギュレートする」は、増強した遺伝子発現及び/又は遺伝子産物の増強した活性をもたらす遺伝子改変に関する。遺伝子改変は、増大した発現及び/又は活性を導く、プロモーター、非翻訳領域、リボソーム結合部位、コーディング配列、遺伝子位置、イントロン/エキソン構造及び/又は転写ターミネーターの改変である。
加えて、本発明は、グリコシルトランスフェラーゼ酵素により、ヌクレオチド糖を単糖、二糖又はオリゴ糖、限定されないが例えばガラクトース、ラクトース、ラクトNビオース、ラクトNトリオース、ラクトNテトラオース、ラクト-N-ネオテトラオース、グロボトリオース、2'フコシルラクトース、3-フコシルラクトース、3-シアリルラクトース、6-シアリルラクトース、ヒト乳オリゴ糖、ヘパロサン、キトサン、nod-因子、糖脂質、及び/又はアグリコンなどに転移することができる遺伝子改変生物を記載する。
本発明はまた、ラクトース死滅を受けず、限定されないが炭水化物ヒドロラーゼ、炭水化物トランスフェラーゼ、炭水化物シンターゼ、アセチラーゼ、アシルトランスフェラーゼ、炭水化物ホスファターゼ、多糖リアーゼ、キナーゼ、ピルビラーゼ及び/又はスルホトランスフェラーゼのような酵素でラクトースを更に改変することができる生物を記載する。
【００２５】
本発明は更に、ラクトース死滅を受けず、ラクトースヒドロラーゼ遺伝子の機能低下又は非機能化によりラクトースをもはや分解しない生物を記載する。
用語「機能低下又は非機能化している遺伝子」とは、機能的な最終生成物を生産する能力が低下している(すなわち、機能的野生型遺伝子と比較して能力が統計学的に有意に「低下している」)か又は全くない(例えば、遺伝子ノックアウト)ように遺伝子を変更するために用いる当業者に周知の技術、例えば、siRNA、RNAi、miRNA、asRNA、遺伝子変異、遺伝子ノックアウト、トランスポゾン変異誘発、CrispR/CASなどの利用をいう。よって、用語「(遺伝子)ノックアウト」とは、非機能化された遺伝子をいう。用語「欠失した遺伝子」又は「遺伝子欠失」も、非機能化された遺伝子をいう(2，4-9，22，27，30，43，45，46，51，65，74)。
本発明は、上記のバイオ生成物を生産するように遺伝子が導入/ノックイン/アップレギュレートされている生物を記載する。これら遺伝子は、限定されないがgenbankのような遺伝子データベース又は限定されないがuniprotのようなタンパク質データベース又は限定されないがBrenda酵素データベースのような酵素データベースに見出され(16，23，38)、バイオ生成物への経路は、限定されないがKEGG、Biocyc、Metacycのようなデータベースに見出される(20，44，47)。上記の或る特定のバイオ生成物への経路は、当該分野で記載される幾つかの数学的ツールにより決定することができる(35，54，57，76)。
【実施例】
【００２６】
実施例
１．材料及び方法  大腸菌(Escherichia coli)
系統及びプラスミド
大腸菌MG1655[λ-，F-，rph-1]及びJM109は、Netherlands Culture Collection of Bacteria(NCCB)から入手した。全ての変異体系統はDatsenko及びWanner(27)の方法を用いて創製した。
【００２７】
培地
Luriaブロス(LB)培地は、１％トリプトンペプトン(Difco，Erembodegem，Belgium)、0.5％酵母抽出物(Difco)及び0.5％塩化ナトリウム(VWR，Leuven，Belgium)からなるものであった。振盪フラスコ培地は、２g/l NH4Cl、５g/l (NH4)2SO4、2.993g/l KH2PO4、7.315g/l K2HPO4、8.372g/l MOPS、0.5g/l NaCl、0.5g/l MgSO4・7H2O、15g/lグリセロール(特に記載しなければ)、１ml/lビタミン溶液、100μl/lモリブデート溶液及び１ml/lセレン溶液を含んでいた。培地は１Ｍ KOHでpH７に設定した。
ビタミン溶液は、3.6g/l FeCl2・4H2O、５g/l CaCl2・2H2O、1.3g/l MnCl2・2H2O、0.38g/l CuCl2・2H2O、0.5g/l CoCl2・6H2O、0.94g/l ZnCl2、0.0311g/l H3BO4、0.4g/l Na2EDTA・2H2O及び1.01g/lチアミン・HClからなるものであった。モリブデート溶液は0.967g/l Na2MoO4・2H2Oを含んでいた。セレン溶液は42g/l SeO2を含んでいた。
発酵用最小培地は、上記と同じ組成で、6.75g/l NH4Cl、1.25g/l (NH4)2SO4、1.15g/l KH2PO4、0.5g/l NaCl、0.5g/l MgSO4・7H2O、30g/lラクトース及び20g/lスクロース(又は別の記載があれば異なる濃度)、１ml/lビタミン溶液、100μl/lモリブデート溶液及び１ml/lセレン溶液を含んでいた。
【００２８】
培養条件
５ml LB培地中の(LBプレートでの単一コロニーからの)予備培養物を、オービタル振盪機上200rpmで８時間37℃にてインキュベートした。この培養物から２mlを500ml振盪フラスコ中100mlの最小培地に移し、オービタル振盪機上200rpmで16時間37℃にてインキュベートした。４％種菌を、1.5Ｌ又は４Ｌの実働容積を有する２又は５ＬのBiostat B Plus培養容器(Sartorius Stedim Biotech，Melsungen，Germany)中で用いた。培養条件は次のとおりであった：37℃、800rpmで撹拌及び1.5L/分の気体流速。曝気により好気条件を維持した。pHは0.5Ｍ H2SO4及び35％ Ｍアンモニア溶液で７に維持した。ガスをクーラー(Frigomix 1000，Sartorius Stedim Biotech，Melsungen，Germany)で４℃に冷却した。発酵の間に泡が生じたらシリコーン消泡剤(BDH 331512K，VWR Int Ltd.，Poole，England)の10％溶液を加えた(約10μl)。オフガスをEL3020オフガスアナライザー(ABB Automation GmbH，60488 Frankfurt am Main，Germany)で測定した。
全てのデータをSartorius MFCS/win v3.0システム(Sartorius Stedim Biotech，Melsungen，Germany)で記録した。
【００２９】
サンプリング法
バイオリアクターは、その内部に、リアクターポートに接続した収集パイプ(BD Spinal Needle，1.2×152mm；BDMedical Systems，Franklin Lakes，NJ - USA)を備え、該ポートは外部でMasterflex-14チューブ(Cole-Parmer，Antwerpen，Belgium)に、続いて、サンプリング用の隔膜を備えた収集ポートに繋がる。この収集ポートの反対側は、Masterflex-16チューブでリアクター容器に戻るように接続する。この系を迅速サンプリングループと呼ぶ。サンプリングの間、リアクターブロスは、サンプリングループ内を周回するように送出される。流速150ml/分で、リアクターブロスが収集ポートに達するには0.04秒を要し、再びリアクターに戻ってくるまでには3.2秒を要すると見積もられる。50％のpO2レベルで、37℃の液体には約３mg/lの酸素が存在する。pO2レベルは、微小好気条件を回避するために、20％未満に低下させるべきではない。よって、収集ループを通過する間に1.8mg/lの酸素が消費されてもよい。酸素取込み速度を0.4ｇ酸素/ｇバイオマス/時(μmaxで観察された最大酸素取込み速度)と仮定すると、５g/lのバイオマスについて、酸素取込み速度は２g/l/h又は0.56mg/l/sとなり、これは3.2秒間(ループ内での滞留時間)で1.8mg/lの酸素消費となる。
サンプリングの間に細胞代謝を停止させるため、リアクターブロスを、収集ポートを通じて、−20℃に予め冷却した62ｇのステンレス鋼ビーズを充填したシリンジ内に吸引し、５mlのブロスを直ぐに４℃に冷却した。サンプリングの直後に冷却遠心分離(15000ｇ，５分間，４℃)を行った。バッチ実験の間、迅速サンプリングループ及び冷却ステンレスビーズサンプリング法を用いて、OD600nm測定用のサンプルを採取した。
【００３０】
分析法
600nmの光学密度を測定することにより培養物の細胞密度を頻繁にモニターした(Uvikom 922 spectrophotometer，BRS，Brussel，Belgium)。細胞乾燥重量は次のとおりにして得た。予め乾燥させ秤量したファルコン中で20ｇのリアクターブロスを遠心分離し(15分間，5000ｇ，GSA rotor，Sorvall RC-5B，Goffin Meyvis，Kapellen，Belgium)、その後、ペレットを20mlの生理学的溶液(９g/l NaCl)で１回洗浄し、一定重量となるまで70℃で乾燥させた。OD600nm測定値のバイオマス濃度への変換を可能にするため、OD600nm測定値とバイオマス濃度との相関曲線を作成した。グルコース及び有機酸の濃度は、１cmプレカラムを備え、65℃に加温したAminex HPX-87Hカラム(Bio-Rad，Eke，Belgium)を用いるVarian Prostar HPLCシステム(Varian，Sint-Katelijne-Waver，Belgium)で、移動相として５mM H2SO4(0.6ml/分)を用いて測定した。ピークの検出には、二波長UV-VIS(210nm及び265nm)検出器(Varian Prostar 325)及び差分反射率検出器(Merck LaChrom L-7490，Merck，Leuven，Belgium)を用いた。265nm及び210nmの両吸収ピークの除算により、ピークを同定できた。この除算は、或る特定の化合物に代表的な一定値をもたらす(Beer-Lambertの式)。
グルコース、フルクトース、スクロース、オリゴ糖及びグルコース-1-ホスフェートは、Hypercarbカラムを備えるHPLCで測定し、MSMS検出器で検出した(Antonioら，2007；Nielsenら，2006)。
【００３１】
遺伝子法
変異体構築に用いた方法を以下に記載する。
プラスミドは、宿主大腸菌(E. coli)DH5α(F-，φ80dlacZΔM15，Δ(lacZYA-argF)U169，deoR，recA1，endA1，hsdR17(rk-，mk+)，phoA，supE44，λ-，thi-1，gyrA96，relA1)中で維持した。
プラスミド．pKD46プラスミド(Redヘルパープラスミド、アンピシリン耐性)、pKD3プラスミド(FRTが隣接したクロラムフェニコール耐性(cat)遺伝子を含む)、pKD4プラスミド(FRTが隣接したカナマイシン耐性(kan)遺伝子を含む)及びpCP20プラスミド(FLPリコンビナーゼ活性を発現する)を変異体構築に用いた。プラスミドpBluescript(Fermentas，St. Leon-Rot，Germany)を用いて、プロモーターライブラリを含むか又は点変異を有する対立遺伝子を含むpKD3及びpKD4の誘導体を構築した。
【００３２】
変異．変異は本質的に遺伝子破壊(ノックアウト，KO)からなった。変異はDatsenko及びWanner(27)の概念を用いて導入した。
Redヘルパープラスミドを有する形質転換体を、アンピシリン(100mg/l)及びL-アラビノース(10mM)を含む10mlのLB培地で、30℃にて、0.6のOD600nmまで増殖させた。細胞を、最初は50mlの氷冷水で洗浄し、２回目は１mlの氷冷水で洗浄することにより、エレクトロコンピテントにした。次いで、細胞を50μlの氷冷水に再懸濁した。50μlの細胞及び10〜100ngの線状二本鎖DNA産物でのエレクトロポレーションを、Gene PulserTM(BioRad)(600Ω，25μFD及び250ボルト)を用いて行った。
エレクトロポレーション後、細胞を１mlのLB培地に加え37℃にて１時間インキュベートし、最後に、25mg/lのクロラムフェニコール又は50mg/lのカナマイシンを含むLB-寒天に塗布して抗生物質耐性形質転換体を選択した。選択した変異体を、改変領域の上流及び下流プライマーを用いるPCRにより検証し、ヘルパープラスミドを喪失させるためにLB-寒天で42℃にて増殖させた。変異体をアンピシリン感受性について試験した。
【００３３】
線状二本鎖DNA．pKD3、pKD4及びそれらの誘導体をテンプレートとして用いるPCRにより線状ds-DNAアンプリコンを得た。用いたプライマーは、テンプレートに相補的な配列の一部と、組換えが生じるべき染色体DNA上の部位と相補的な別の一部を有するものであった。KOのために、興味対象の遺伝子の開始及び停止コドンの50nt上流及び50nt下流に相同性領域を設計した。KIのためには、転写開始点(+1)を尊重しなければならなかった。PCR産物をPCR精製し、DpnIで消化し、アガロースゲルから再精製し、溶出緩衝液(５mM Tris，pH8.0)に懸濁した。
抗生物質耐性遺伝子の除去．選択した変異体(クロラムフェニコール又はカナマイシン耐性)をpCP20プラスミドで形質転換した。このプラスミドは、アンピシリン及びクロラムフェニコール耐性プラスミドであり、温度感受性複製及びFLP合成の熱誘導を示す。アンピシリン耐性形質転換体を30℃で選択した後、42℃のLB中で数個をコロニー精製し、次いで全ての抗生物質耐性及びFLPヘルパープラスミドの喪失について試験した。遺伝子ノックアウト及びノックインは、コントロールプライマー(Fw/Rv-gene-out)を用いて検査した。
形質転換．Hanahan(42)の手順を単純化した手法又は上記のエレクトロポレーションによりプラスミドをCaCl2コンピテント細胞に形質転換した。
【００３４】
２．材料及び方法  酵母
2.1．系統
Saccharomyces cerevisiae BY4742は、Euroscarf culture collectionから入手した。全ての変異体系統は、相同組換え又はGietz(40)の方法を用いるプラスミド形質転換により創製した。Kluyveromyces marxianus lactisは、Laboratory of Industrial Biotechnology and Biocatalysisのカルチャーコレクションから入手した。
2.2．培地
これら系統を、6.7g/Lのアミノ酸不含酵母窒素ベース(YNB w/o AA，Difco)、20g/Lの寒天(Difco)(固相培養)、22g/Lのグルコース一水和物又は20g/Lのラクトースを含むComplete Supplement Mixture又はCSM drop-outを加えた合成規定(SD)酵母培地(それぞれ、SD CSM又はSD CSM-Ura)、及び0.79g/LのCSM又は0.77g/LのCSM-Ura(MP Biomedicals)で増殖させる。
【００３５】
2.3．培養条件
先ず、酵母培養物を５mlの適切な培地に接種し、30℃にて200rpmで一晩インキュベートする。より高容量の培養物を得るため、２％(又はより高い)の予備培養物を50〜200mlの培地に接種する。これら培養物を再び30℃にて200rpmでインキュベートする。
増殖実験は、96ウェルプレート又はエルレンマイヤースケールで行う。増殖及び生産実験用の出発材料として単一コロニーを得るため、前記系統を選択SD CSMプレートに塗布し、２〜３日間30℃にてインキュベートする。次いで、１つのコロニーを採取し、エルレンマイヤー試験用の５ml培地又はマイクロタイタープレート実験用の１ml培地に移す。
エルレンマイヤー実験については、予備培養物を30℃にて200rpmで一晩インキュベートし、予備培養物の２％を100ml培地に加えて増殖実験を開始する。
MTP増殖実験については、コロニーを150μL培地に加えて、30℃にて24時間インキュベートする。インキュベーション後、２μLのMTP予備培養物を、150μLの新鮮培地を含むMTPに加える。Infinite(登録商標) 200 Pro Tecanで15分間毎に48時間ODを測定する。
【００３６】
2.4．サンプリング法
培養物のサンプルを、OD用(0.2ml)並びに細胞画分及び上清画分用(１ml)に、静止期までは２時間毎に、静止期の間は２、３時間毎に採取する。１mlサンプルは先ず遠心分離し(11)、その後細胞ペレットと上清とを分離して、別々に−20℃で保存する。上清は細胞外産物の分析用に保存し、ペレットは細胞内代謝物の分析に用いる。
2.5．分析法
600nmの光学密度を測定するか(Uvikom 922 spectrophotometer，BRS，Brussel，Belgium)又はBiochrom Anthos Zenyth 340マイクロタイタープレートリーダーを用いて、培養物の細胞密度を頻繁にモニターした。細胞乾燥重量は次のとおりにして得た。予め乾燥させ秤量したファルコン中で20ｇのリアクターブロスを遠心分離し(15分間，5000ｇ，GSA rotor，Sorvall RC-5B，Goffin Meyvis，Kapellen，Belgium)、その後、ペレットを20mlの生理学的溶液(９g/l NaCl)で１回洗浄し、一定重量となるまで70℃で乾燥させた。OD600nm測定値のバイオマス濃度への変換を可能にするため、OD600nm測定値とバイオマス濃度との相関曲線を作成した。グルコース及び有機酸の濃度は、１cmプレカラムを備え、65℃に加温したAminex HPX-87Hカラム(Bio-Rad，Eke，Belgium)を用いるVarian Prostar HPLCシステム(Varian，Sint-Katelijne-Waver，Belgium)で、移動相として５mM H2SO4(0.6ml/分)を用いて測定した。ピークの検出には、二波長UV-VIS(210nm及び265nm)検出器(Varian Prostar 325)及び差分反射率検出器(Merck LaChrom L-7490，Merck，Leuven，Belgium)を用いた。265nm及び210nmの両吸収ピークの除算により、ピークを同定できた。この除算は、或る特定の化合物に代表的な一定値をもたらす(Beer-Lambertの式)。
グルコース、フルクトース、スクロース、オリゴ糖及びグルコース-1-ホスフェートは、Hypercarbカラムを備えるHPLCで測定し、MSMS検出器で検出した(Antonioら，2007；Nielsenら，2006)。
【００３７】
2.6．遺伝子法
変異体構築に用いた方法を以下に記載する。
プラスミドは、宿主大腸菌(E. coli)DH5α(F-，φ80dlacZΔM15，Δ(lacZYA-argF)U169，deoR，recA1，endA1，hsdR17(rk-，mk+)，phoA，supE44，λ-，thi-1，gyrA96，relA1)中で維持した。
プラスミド．唯一のＣ源としてラクトースでのSaccharomycesの増殖を可能とするため、Laboratory of Industrial Biotechnology and Biocatalysisから入手可能である酵母発現プラスミドp2a_2μ_Lac4を用いた。このプラスミドは、大腸菌(E. coli)における選択及び維持を可能とするアンピシリン耐性遺伝子及び細菌性複製起点を含む。このプラスミドは更に、酵母における選択及び維持のための2μ酵母ori及びUra3選択マーカーを含む。最後に、このプラスミドはβ-ガラクトシダーゼ発現カセットを含む(配列番号９、図15)。
変異．変異は、p2a_2μ_Lac4(上記)を用いるプラスミド導入及び線状二本鎖DNA(上記)を用いる遺伝子ノックイン(KI)(rDNA遺伝子座でのKI)から本質的になった。形質転換体を、プラスミドDNAで形質転換後はSD CSM-Uraに播種し、線状二本鎖DNAで形質転換後は唯一のＣ源としてラクトースを含むSD CSM-Uraに播種した。選択したプラスミド含有変異体を、p2a_2μ_Lac4に適合するプライマーを用いるPCRにより検証した。選択したゲノムノックイン変異体を、改変領域の上流及び下流プライマーを用いるPCRにより検証し、配列決定により確証した(LGC Genomics(LGC group，Germany)にて実施)。
【００３８】
線状二本鎖DNA．プラスミドpJet_KI_p1_Lac12_t@rDNA又はpJet_KI_p2_Lac12_t@rDNAを用いるPCRにより線状ds-DNAアンプリコンを得た。これらプラスミドは、pJETクローニングベクター(Thermoscientific)のマルチクローニング部位に、それぞれ配列番号７及び配列番号８に隣接する2 500bp相同性領域(HR1(配列番号10，図16)及びHR2(配列番号11，図17))を含有する。用いたプライマーは、HR1の5'末端(フォワードプライマー)及びHR2の3'末端(リバースプライマー)に相同である。PCR産物は、形質転換の前にPCR精製した。
形質転換．Gietz(40)の方法を用いてプラスミド及び線状二本鎖DNAを形質転換した。
【００３９】
３．結果
実施例１：agp遺伝子座での大腸菌(E. coli)ラクトースパーミアーゼlacYノックインの構築
先ず、系統MG1655ΔlacYを、上記のとおりDatsenko及びWannerの方法に従って構築した。この目的のため、MG1655をpKD46で形質転換し、線状DNAを、基本プラスミドpKD3及びpKD4から、lacY遺伝子に隣接相同領域を有するように構築した。次いで、成功した組換え体を適切な抗生物質を用いてスクリーニングした。ラクトースが取り込まれないことを確実にするため、この系統を炭素源としてラクトースのみを含む最小培地で増殖させた。この実験の間、増殖は観察されなかった。よって、この細胞は、もはや膜を超えてラクトースを輸送することができなかった。
更に、合成発現系を構築するため、合成プロモーター及びRBSをlacY遺伝子との組合せで合成した(IDT及びGeneartに依頼)。この配列を図３に示す。この配列もゲノムにagp遺伝子座で、Datsenko及びWannerの方法の変法により導入した。簡潔には、ラクトースパーミアーゼ構築物を、先ず、pKD3プラスミドのスクリーニングカセットを用いて組み立てた(新規プラスミドpCX_lacY-kan)。このプラスミドから、agpゲノム領域に相同性を有する線状DNAをPCR増幅させることができた。得られたこの線状DNAは、その後、pKD46プラスミドが存在するE coli MG1655ΔlacYに形質転換することができる。このことにより、ラクトーストランスポーター発現カセットのゲノムへの組換えがもたらされ、ラクトースパーミアーゼ発現生物MG1655ΔlacYΔagp::lacYsyntheticを生じる。ラクトースでの増殖が確実に保存されるために、この系統を上記のラクトース最小培地で増殖させた。これにより、ラクトースでの増殖の完全な保存がもたらされ、増殖速度は野生型と類似した。
【００４０】
実施例２：野生型大腸菌(E. coli)系統及びラクトース死滅を受けない変異体大腸菌(E. coli)系統に対するラクトースの影響
材料及び方法に記載した振盪フラスコ実験を、野生型MG1655及びMG1655ΔlacYΔagp::lacYsyntheticを用いて企画した。これら系統をグリセロール振盪フラスコ培地(材料及び方法に記載したように15g/lのグリセロール)で増殖させ、中期対数増殖期(ODがほぼ0.8)にラクトースを添加した(最終濃度10g/lとなるように200g/lのストック溶液を添加した)。図１及び図２から理解されるように、変異体系統はラクトース死滅を受けない。
【００４１】
実施例３：ラクトーストランスポーター発現を確実にするための翻訳共役又は翻訳センサーの使用
完全ラクトースパーミアーゼノックアウト系統もまたラクトース死滅を受けないであろうし、ゴールは、機能的で活性なラクトースパーミアーゼの発現を得ることであるので、ラクトースパーミアーゼ発現を確実にするスクリーニングが必要である。この目的のためには、プロモーター、リボソーム結合部位、コザック配列、コドン使用及び転写ターミネーターの配列バリアントを創製することが可能である。しかし、これら配列バリアントは、無発現構築物をもたらし、よってラクトーストランスポーター陰性変異体系統をもたらす可能性がある。したがって、ラクトーストランスポーターの発現を検出する系、好ましくはリポーター遺伝子(例えば、lacZ、蛍光タンパク質又は抗生物質耐性遺伝子)のスクリーニングにより容易に検出する系を設計する必要がある。
ラクトーストランスポーター発現を検出するための、リポーター遺伝子の翻訳を再開する翻訳共役系の構築
２つの遺伝子は、翻訳再開領域を興味対象の遺伝子の3'側でリポーター遺伝子の5'側に導入することにより翻訳共役させることができる。翻訳は、幾つかのコドン、例えばAUG、UUG、GUG又はAUAにより再開させることができる(63)。ラクトースパーミアーゼ遺伝子とlacZ遺伝子とを翻訳共役させた構築物の配列を図４に示す。この配列の創製のために、lacY及びlacZ配列を、大腸菌(E. coli)ゲノムから、ゴールデンゲート制限部位(BsaI、NEBから入手)を有するプライマーを用いて増幅させる。翻訳共役を可能にする遺伝子間領域は、任意の遺伝子合成会社(例えば、IDT又はGeneart)から入手可能である。次いで、全てのパーツを、Englerら(2013)(36)により記載されるゴールデンゲート法により、図３(大腸菌(E. coli)について)に示されるようなプロモーター及びRBS配列と共にpUC54プラスミドに組み立てるか、又はBacillusプロモーター及びリボソーム結合部位を用いてBacillus sp.中で複製するpGK12に組み立てる。
【００４２】
リボソーム結合部位のループの開裂によりラクトーストランスポーター発現を検出するための、リポーター遺伝子の翻訳を開始する翻訳共役系の構築
翻訳共役により発現をスクリーニングする第２の方法は、Mendez-Perezら(2012)(58)により記載されている。この方法を、クロラムフェニコールリポーター遺伝子を用いる、ラクトースパーミアーゼ発現のスクリーニングに適合させた。この場合、ラクトーストランスポーターlacYを、HISタグ及びリボソーム結合部位を介してクロラムフェニコール耐性遺伝子に連結する。この構築物の配列パーツもまた、IDT又はGeneartから入手可能であり、ゴールデンゲートアセンブリにより組み立てる。得られる配列を図５に示す。
酵母ラクトーストランスポーターをリポーター遺伝子と連結する翻訳共役系の構築
酵母はシストロンを利用しないが、ウイルス性内部リボソーム進入部位(いわゆるIRES配列)を介する翻訳共役により発現をスクリーニングすることが依然として可能である(56)。完全に独立した(融合タンパク質としての翻訳ではないことを意味する)、シストロン中の２つのタンパク質の共役翻訳を可能とする配列(シストロンの最後のタンパク質が発現すれば、最初のタンパク質も発現していることを意味する)の例はT2A配列である(10)。
酵母では、細胞内でラクトースを輸送するために、例えばKluyveromyces marxianusのラクトースパーミアーゼ遺伝子を用いることができる。この遺伝子は、T2A配列を用いて、ゲンチシン耐性をコードするaph 1遺伝子に連結することができる。この配列も同様に上記のように構築する。最終配列を図６に示す。
ラクトースパーミアーゼのメッセンジャーRNAにアプタマーを導入するアプタマー連結系の構築
ラクトースパーミアーゼ発現は、メッセンジャーRNAレベルで検出することもできる。この目的のため、(Z)-4-(3,5-ジフルオロ-4-ヒドロキシベンジリデン)-1,2-ジメチル-1H-イミダゾール-5(4H)-オン結合性アプタマーを、図７に示すように、ラクトースパーミアーゼコーディング配列の後にクローニングする。この構築物の発現は、実施例６で更に記載するように、モジュレートされる。細胞の増殖後、(Z)-4-(3,5-ジフルオロ-4-ヒドロキシベンジリデン)-1,2-ジメチル-1H-イミダゾール-5(4H)-オンを、Pothoulakisら(2013)(64)により記載される培地に加え、ラクトースパーミアーゼ発現変異体系統を蛍光活性化細胞ソーター(FACS)により選択する。
【００４３】
実施例４：クロラムフェニコール耐性遺伝子と翻訳共役したラクトーストランスポーターの発現の検出
ラクトースパーミアーゼをゲノムからノックアウトした２つの系統を構築した。両系統に、カナマイシン耐性遺伝子を含有するpSC101プラスミド(一方のプラスミドが実施例１及び２に記載したような構成的に発現するラクトースパーミアーゼを含有する点で異なる)を形質転換し、図４及び図５に記載の参照系統MG1655ΔlacY pSC101_kan及びlacY_cat翻訳共役系統MG1655ΔlacY pSC101_kan_lacYsynthetic_catを得た。両系統を、上記の最小培地において、異なるクロラムフェニコール濃度(０〜30mg/l)で増殖させた。図８及び９は、48時間及び92時間の増殖後に、参照系統の増殖が変異体lacY_cat翻訳共役系統より低いクロラムフェニコール濃度で阻害されることを示す。このことから、この系は、ラクトースパーミアーゼ発現遺伝子構築物についての優れたスクリーニング法となる。
【００４４】
実施例５：ラクトース死滅を受けないラクトースパーミアーゼ発現変異体のスクリーニング手順
実施例２と同様に、クロラムフェニコールに耐性の２つの系統の混合物を増殖させた。一方はラクトース死滅を受けず、クロラムフェニコールに翻訳共役した系統であり、他方はクロラムフェニコールカセットを有するが、ラクトースパーミアーゼの天然の発現系を有する系統である。両系統を実施例２に記載の培地で増殖させ、実施例２に示すように、中期対数増殖期にラクトースを加えた。ラクトース死滅を受けない変異体系統は増殖し続けた一方で、ラクトース死滅感受性である他方の系統は増殖を停止した。対数増殖期の終時に、培養物0.1mlを、上記と同様な培地を含む第２の振盪フラスコに接種した。再び、OD 0.8で、ラクトースを加えて、ラクトース死滅感受性系統の増殖を停止させ、ラクトース死滅を受けない変異体系統を更に富化した。この手順を５回繰り返した後、ラクトース死滅を受けない変異体系統の99％濃縮を達成した。その後、ラクトース死滅を受けない変異体系統を培養物から容易に単離する。
【００４５】
実施例６：ラクトースパーミアーゼ発現カセットの変異体の創製
プロモーター、リボソーム結合部位、コザック配列及び転写ターミネーターの配列バリアント並びにラクトースパーミアーゼ遺伝子バリアント(異なるコドン使用)の製造を、IDT、Geneart、Genscript、Gen9などのような遺伝子合成ベンダーに依頼した。細菌用プロモーターライブラリの設計は、転写開始位置の−10bp及び−35bpに２つの保存領域を有する、細菌性プロモーターのコンセンサス配列に基づく。これら保存領域の間、前及び後の塩基を、Ａ、Ｔ、Ｇ又はＣでランダムに変化させることで、異なる発現強度を有するプロモーターが導かれる。或いは、保存領域を変化させ、周囲の配列を固定したままとしても、異なる発現強度を有するプロモーターが導かれる。次いで、これら配列混合物を翻訳共役ラクトースパーミアーゼの前に(ギブソンアセンブリ、ゴールデンゲートアセンブリ、クリバアセンブリ、LCR又は制限ライゲーションにより)クローニング(25，36，50，79)することで、ラクトースパーミアーゼの発現カセットのライブラリが導かれ、これは実施例５に記載のスクリーニングプロトコルによりスクリーニング可能である。
真核生物プロモーターライブラリはコアプロモーター(13)に基いて創製する。Saccharomyces cerevisiaeについては、プロモーターは、UAS配列で増強されプロモーター強度が変化するように変異された異種TEFプロモーターpTEF1であってもよい(12)。このようなプロモーターは、商業的に入手可能であり、上記のように翻訳共役ラクトースパーミアーゼの前にクローニングし、最終構成物を、酵母(例えばSaccharomyces cerevisiae)にプラスミド上又は染色体への組込み用として形質転換する。
【００４６】
非翻訳領域は、原核生物については、リボソーム結合部位からなり、真核生物についてはコザック配列からなる。上記のように、両配列をランダム化し、コーディング配列の前にクローニングすることで、異なる翻訳効率を有する発現カセットのライブラリが導かれる。ランダム化は、配列翻訳効率相関を計算するRBS計算機のようなツールを用いて合理化し、ライブラリに含ませるべきバリアントの数を減少させることができる(67)。
コドン使用は、タンパク質のアミノ酸配列を変更させることなく、遺伝子のコーディング配列を変更することにより変化させる。これをコドン適合と呼ぶ。コドン配列全体のコドン使用を、或る特定の領域に、より稀な又はより稀でないコドンを導入するように変化させることで、発現効率及びフォールディング効率の変更を導く。配列中に稀なコドン(コドン使用頻度データベースにより生物ベースで決定(61))のみを有するパーミアーゼは、完全にコドン最適化した配列を有する(標的生物において高率で生じるコドンのみを有する)パーミアーゼより低い翻訳速度を示す。加えて、コーディング配列の最初のコドンもまた、コザック又はリボソーム結合部位の効率に影響する(62，69，78)。
転写ターミネーター領域は、データベースに見出される内因性又は外因性転写ターミネーター配列により変化させる(18，26)。これら転写ターミネーターもまた、上記の方法と同様にしてクローニングする。
【００４７】
実施例７：ラクトースパーミアーゼを発現しラクトース死滅をもたらさない発現カセットの富化
発現カセットは実施例３及び７に従って創製する。これにより、ラクトースパーミアーゼ発現カセットのライブラリがもたらされる。ラクトースパーミアーゼの発現を生じる発現カセットは、実施例３及び４の方法に従って選択する。ラクトースパーミアーゼを発現し、ラクトース死滅をもたらさない発現カセットは、実施例２及び５に記載の方法に従って選択する。選択した発現カセットは、配列決定及び実施例２に記載の方法により更に分析する。
【００４８】
実施例８：大腸菌(E. coli)を用いる、Helicobacter pyloriに由来するフコシルトランスフェラーゼによる2-フコシルラクトースの発酵生産
遺伝子lacZ、glgC、agp、pfkA、pfkB、pgi、arcA、iclR、wcaJをノックアウトし、全ての培養条件下での発現を確実にするために実施例１及び実施例２に記載したように構成性発現によりlacYを発現する変異体系統を、Helicobacter pyloriに由来するフコシルトランスフェラーゼ及びBifidobacterium adolescentisに由来するスクロースホスホリラーゼ(これらも構成的に発現する)で更に形質転換した。構成性プロモーターはDe Meyら(2007)により記載されたプロモーターライブラリに由来する。この系統を材料及び方法に記載した培地(ただし、30g/lのスクロース及び50g/lのラクトースを含む)で培養した。これは、1.5 g/lまでの2'-フコシルラクトースの生成をもたらした。
【００４９】
実施例９：大腸菌(E. coli)を用いる、2-フコシルラクトースの流加培養生産
ラクトースパーミアーゼ発現が実施例１及び実施例２に記載のように変化した変異体系統を、次の遺伝子型を用いて、上記の遺伝子操作法により構築した：ΔlacZYAΔglgCΔagpΔpgiΔpfkA-P22-baSPΔpfkBΔarcAΔiclR::slΔwcaJΔlonΔadhE-P14-frk ＋ pCXP14-FT_. pylori(配列番号６の配列を有するベクター、図10を参照)。プロモーターP22及びP14は、De Meyら(29)により構築されたプロモーターライブラリに由来し、Aertsら(1)により記載された方法と同様にクローニングした。「::sl」は、痕跡のない遺伝子欠失、よって、染色体中に残存するFRT部位がないことを表す。
この系統を、材料及び方法に記載したバイオリアクター中、30g/lのスクロース及び50g/lのラクトースを含む無機培地で培養した。バッチ期の後、バイオリアクターに500g/lのスクロース、50g/lのラクトース及び１g/lの硫酸マグネシウム７水和物を供給した。これにより、上清中に27.5g/lのフコシルラクトースの蓄積がもたらされた。
【００５０】
実施例10：大腸菌(E. coli)を用いるラクトNトリオースの生産
UDP-N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ、スクロースホスホリラーゼ及びL-グルタミン:D-フルクトース-6-ホスフェートアミノトランスフェラーゼ及びグルコサミンウリジルトランスフェラーゼを発現する変異体系統を、De Meyら(29)のプロモーターライブラリに由来する各構成性プロモーター及びβ-ラクタマーゼ選択マーカーを有するpBR322プラスミドに基いて、上記の方法を用いる遺伝子操作により構築した。このベクターを、上記のように、遺伝子型ΔlacZYAΔglgCΔagp::P14-frk-P22-BaSPΔpgiΔpfkAΔpfkBΔnagABCDEΔmanAΔnanATEKΔmanXYZを有し、ラクトースパーミアーゼを構成的に発現する大腸菌(E. coli)変異体系統に形質転換した。この系統を、上記の振盪フラスコ中、炭素源としてのラクトース及びスクロース並びに追加のグリセロール有り又は無しで培養した。この産生宿主はラクトース死滅を受けることはなく、添加したラクトースから、それぞれ62.5及び55.3mg/lのラクトNトリオースを産生した。
【００５１】
実施例11：rDNA遺伝子座での酵母K. marxianusラクトースパーミアーゼ(p1)のノックインの構築
先ず、プラスミドp2a_2μ_Lac4を用いてSaccharomyces cerevisiae BY4742野生型系統を形質転換させた。形質転換は、Gietzのプロトコル(40)を用い、合計４μgのプラスミドを用いて行った。形質転換した酵母細胞をSD-CSMドロップアウトプレート(ウラシルなし)に播種した。２日後、プレート上で増殖が観察され、酵母コロニーを所望のプラスミドの存在について試験した。コロニーPCRを33の全てのコロニーについて行った。全てのコロニーが、プラスミドp2a_2μ_Lac4の存在に関して陽性の試験結果を示した。コロニー５を更なる使用のために選択した。このコロニーを、pJet_KI_p1_Lac12_t@rDNAから得た２μgの線状二本鎖DNAで形質転換した。形質転換細胞を、唯一のＣ源としてラクトースを含むSD-CSM-Uraプレート上に播種した。形質転換の３日後、幾つかのコロニーは、Saccharomyces rDNAにおけるLac12発現カセットの存在について試験するに十分に増殖した。コロニーPCRを全てのコロニーについて行った。全てのコロニーがLac12発現カセットの存在に関して陽性の試験結果を示した。コロニー６を更なる使用のために選択した(Saccharomyces KI_p1_Lac12_t@rDNA)。
【００５２】
実施例12：rDNA遺伝子座での酵母K. marxianusラクトースパーミアーゼ(p2)のノックインの構築
先ず、プラスミドp2a_2μ_Lac4を用いてSaccharomyces cerevisiae BY4742野生型系統を形質転換させた。形質転換は、Gietzのプロトコル(40)を用い、合計４μgのプラスミドを用いて行った。形質転換した酵母細胞をSD-CSMドロップアウトプレート(ウラシルなし)に播種した。２日後、プレート上で増殖が観察され、酵母コロニーを所望のプラスミドの存在について試験した。コロニーPCRを33の全てのコロニーについて行った。全てのコロニーが、プラスミドp2a_2μ_Lac4の存在に関して陽性の試験結果を示した。コロニー５を更なる使用のために選択した。このコロニーを、pJet_KI_p2_Lac12_t@rDNAから得た２μgの線状二本鎖DNAで形質転換した。形質転換細胞を、唯一のＣ源としてラクトースを含むSD-CSM-Uraプレート上に播種した。形質転換の３日後、幾つかのコロニーは、Saccharomyces rDNAにおけるLac12発現カセットの存在について試験するに十分に増殖した。コロニーPCRを全てのコロニーについて行った。全てのコロニーがLac12発現カセットの存在に関して陽性の試験結果を示した。コロニー７を更なる使用のために選択した(Saccharomyces KI_p2_Lac12_t@rDNA)。
【００５３】
実施例13：野生型酵母系統及び２つの変異体酵母系統のラクトースでの増殖
材料及び方法に記載の振盪フラスコ実験を、野生型Kluyveromyces、Saccharomyces KI_p1_Lac12_t@rDNA及びSaccharomyces KI_p2_Lac12_t@rDNAを用いて企画した。これら系統を、唯一のＣ源としてラクトース(20g/L)を含む振盪フラスコ培地で増殖させた。表１から理解し得るように、変異体Saccharomyces系統は、ラクトースで迅速に増殖することが知られている野生型Kluyveromyces marcianus lactis(31)と同程度に迅速に増殖する。よって、構成的に発現したラクトースパーミアーゼは、酵母細胞における迅速で効率的なラクトース流入を確実にする。
【００５４】
【表１】
0006765372.tif 000002
【００５５】
実施例14：野生型酵母系統及びラクトース死滅を受けない変異体酵母系統に対するラクトースの影響
材料及び方法に記載の振盪フラスコ実験を、野生型Kluyveromyces、Saccharomyces KI_p1_Lac12_t@rDNA及びSaccharomyces KI_p2_Lac12_t@rDNAを用いて企画した。これら系統を、グルコース振盪フラスコ培地(材料及び方法に記載のとおり20g/Lのグルコース)で増殖させ、中期対数増殖期にラクトースを加えた(最終濃度が10g/Lとなるように200g/Lストック溶液を加えた)。図11及び図12から理解し得るように、変異体系統はラクトース死滅を受けない。にもかかわらず、これら酵母細胞における迅速で効率的なラクトース流入は実施例13において証明された。
【００５６】
実施例15：ラクトース死滅を受けないラクトースパーミアーゼ発現カセットの配列決定
上記のスクリーニングに由来する46のコロニーを配列決定し、配列番号12〜57を得た(図18)。これら配列は、大腸菌(E. coli)で発現するときにラクトース死滅をもたらさないプロモーター及びRBSのバリアントである。これが配列決定した膨大な量のコロニーから選択した一部にすぎず、スクリーニング法により、図18に示すより遥かに多くの配列が得られ、上記の代替ライブラリ創製法も図18に示したもの以外の配列を導くことに留意すべきである。
【００５７】
実施例16：ラクトースパーミアーゼ発現カセット変異体系統のμMAXの測定
全ての系統は、LB-寒天プレートから開始したか、又はクライオバイアルから開始して5,0mL Luriaブロス培地(10ｇトリプトン；５ｇ酵母抽出物；10ｇ NaCL)に接種した。37℃での増殖後、１mLのこの予備培養物を、100ml最小ラクトース培地(2,0g/L NH4Cl；5,0g/L (NH4)2SO4；3,0g/L KH2PO4；7,3g/L K2HPO4；8,4g/L MOPS；0,5g/L MgSO4・7H2O；0,5g/L NaCL；10g/Lラクトース；0,4mg/L Na2EDTA・2H2O；0,03mg/L H3BO3；1,01mg/LチアミンHCL；0,94mg/L ZnCL2；0,5mg/L CoCL2・6H2O；0,38mg/L CuCl2・2H2O；1,59mg/L MnCl2・4H2O；3,6mg/L CaCL2及び0,096mg/L Na2MoO4・2H2O；pH7.0)を含有する500ml振盪フラスコに加えた。37℃での増殖後、両予備培養物を最小ラクトース培地で0,050のOD600に希釈した。次いで、この懸濁物を96 MTPプレートに移し(ｎ=32)、イージーシールカバーで覆った。OD測定を10分毎に24時間、Infinite M200 pro(TECAN)を用いて以下の条件下で行った：温度：37℃±0,5；振盪597秒；２mm振盪幅；280rpm；波長OD600；Flash#10；settle time 150ms)。
【００５８】
実施例17：ラクトースパーミアーゼ発現カセットの特徴決定
ラクトース死滅を低減させるか排除する１つの方法は、ラクトースパーミアーゼの活性を顕著に低減させ又は消去することである(実施例16を参照)。しかし、ラクトース又はガラクトースベースのバイオ生成物の生産の観点からは、細胞内への高いラクトース流入が必要である。ここで、本発明者らは、ラクトース死滅耐性変異体系統のラクトース流入は、依然として、ラクトース死滅を受ける野生型生物のラクトース流入に匹敵し、同等であるか又はより高くさえあることを証明する。この目的のため、新規なラクトースパーミアーゼ発現カセットを、β-ガラクトシダーゼを依然として発現するMG1655ΔlacY系統に導入した。これら新たな系統の増殖速度はラクトース流入の尺度である。なぜならば、ラクトースパーミアーゼ発現が顕著低減した系統は増殖速度が顕著に低下するからである。
この分析結果を図19に示す。この図に示すほぼ全ての系統は、野生型と等しいか又はより高い増殖速度を有する。このことから、これら発現カセットは、野生型発現系とは対照的にラクトース死滅を生じない一方で、野生型と等しいか又はより高いラクトースパーミアーゼの活性及び発現を示すことが示される。しかし、この方法は、増殖の速度制限段階となるβガラクトシダーゼ遺伝子の発現により制限される。したがって、ラクトースパーミアーゼ遺伝子の発現を上記翻訳共役系により測定した。クロラムフェニコールの最小阻害濃度(MIC)は、ラクトースパーミアーゼ遺伝子の発現の指標であり、これを各カセットについて決定した。野生型との比較で同じ増殖速度を依然としてもたらす最も低いMICを、野生型ラクトースパーミアーゼ発現についての指標として用いた。
野生型系統と同じ増殖速度を有する、MICが最も低いカセットは、約20mg/lクロラムフェニコールのMICを有する。僅かに低い増殖速度を示す変異体系統は、15〜20mg/lの範囲のMICを有し、等しいか又はより高い増殖速度の変異体系統は、20〜80mg/lのMICを有する。配列の85％は後者のカテゴリーに分類される。このことは、以前に文献に記載されたことに反して、ラクトース死滅陰性発現カセットとして同定されたほとんどの配列が、より高いラクトースパーミアーゼ発現を有することを意味している。
【００５９】
実施例18：lacIQプロモーター発現カセットの構築
上記の方法と同様に、placIQプロモーターを大腸菌(E. coli)のlacY遺伝子の前にクローニングした。この構築物の最終配列を図20に示す。
【００６０】
実施例19：ラクトース死滅を受ける当該分野で使用される他のプロモーター
プロモーターplacIQは、当該分野において、大腸菌(E. coli)でのラクトースパーミアーゼの発現に用いられてきたプロモーターである。このプロモーターの使用は、細胞へのラクトースの取込みを生じる。しかし、この取込みの影響は調べられていない。ラクトースでの野生型の増殖速度は、lacIQプロモーターと有意には異ならなかった(それぞれ、μmax 0,1及び0,11/時)ことから、類似するラクトース取込み速度が示される。このlacIQ発現カセットのラクトース死滅スクリーニングにより、このプロモーターもまたラクトース死滅をもたらすことが証明された(図21参照)。このことは、ラクトース死滅をもたらすプロモーター配列も存在すれば、ラクトース死滅をもたらさないプロモーター配列も存在することを証明する。配列の合理化は可能でなく、個々の配列の試行錯誤は膨大なコストを要する面倒な作業であり、よってラクトース死滅を受けない発現カセットを同定する上記方法は、時間がかかりコストを要するスクリーニング作業を回避する完璧な方法である。
【００６１】
実施例20：S. cerevisiaeを用いるラクトNテトラオースの生産
実施例11及び12で構築した変異体系統を、標準の酵母発現ベクター(例えば、Leeら(52)により記載されるもの)を用いて、Neisseria meningitidisに由来するβ-1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼ及びβ-1,3-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ(これらもまた構成的に発現する)で更に形質転換した。この系統を、材料及び方法に記載の培地(ただし、20g/lのスクロース及び20g/lのラクトースを含む)で培養した。これにより、30mg/lまでのラクトNテトラオースの生成を生じた。
【００６２】
実施例21：S. cerevisiaeを用いる2-フコシルラクトースの生産
実施例11及び12で構築した変異体系統を、標準の酵母発現ベクター(例えば、Leeら(52)により記載されるもの)を用いて、大腸菌(E. coli)のGDP-フコースシンターゼ及びGDP-マンノース4,6-デヒドラターゼ並びにHelicobacter pyloriに由来するフコシルトランスフェラーゼ(これらもまた構成的に発現する)で更に形質転換した。こｎ系統を、材料及び方法に記載の培地(ただし、20g/lのスクロース及び20g/lのラクトースを含む)で培養した。これにより、10mg/lまでの2-フコシルラクトースの生成を生じた。
【００６３】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１８−３】
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【図１８−４】
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【図１８−５】
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【図１８−６】
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【図１８−７】
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【図１８−８】
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【図１８−９】
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【図１８−１０】
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【図１８−１１】
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【図１８−１２】
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【図１８−１３】
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【図１８−１４】
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【図１８−１５】
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【図１８−１６】
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【図１８−１７】
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【図１８−１８】
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【図１８−１９】
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【図１８−２０】
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【図１８−２１】
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【図１８−２２】
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【図１８−２３】
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【図１８−２４】
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【図１８−２５】
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【図１８−２６】
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【図１８−２７】
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【図１８−２８】
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【図１８−２９】
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【図１８−３０】
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【図１８−３１】
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【図１８−３２】
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【図１８−３３】
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【図１８−３４】
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【図１８−３５】
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【図１８−３６】
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【図１８−３７】
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【図１８−３８】
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【図１８−３９】
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【図１８−４０】
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【図１８−４１】
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【図１８−４２】
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【図１８−４３】
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【図１８−４４】
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【図１８−４５】
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【図１８−４６】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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