(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｘ１ＰＸ３Ｘ４ＰＸ６Ｘ７ＰＧＸ１０Ｘ１１ＡＸ１３Ｘ１４Ｘ１５ＤＬＸ１８Ｘ１９ＹＸ２１Ｘ２２ＲＬＸ２５Ｘ２６ＹＬＸ２９Ｘ３０ＶＡ（配列番号１）
の配列を含むペプチドであって、式中、
Ｘ１は、Ｇｌｙ、またはＧｌｙ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ａｒｇであり、
Ｘ３およびＸ４は、Ａｒｇであり、
Ｘ６は、ＡｒｇまたはＬｙｓであり、
Ｘ７は、ＴｙｒまたはＣｙｓであり、
Ｘ１０は、Ａｓｐであり、
Ｘ１１は、Ａｓｐであり、
Ｘ１３は、Ｐｒｏ、ＳｅｒまたはＣｙｓであり、
Ｘ１４は、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、ＴｈｒまたはＧｌｕであり、
Ｘ１５は、Ｇｌｕであり、
Ｘ１８は、Ｈｉｓであり、
Ｘ１９は、Ａｌａ、ＧｌｕまたはＴｒｐであり、
Ｘ２１は、Ｔｒｐであり、
Ｘ２２は、Ａｌａであり、
Ｘ２５は、Ｔｒｐであり、
Ｘ２６は、Ａｓｎであり、
Ｘ２９は、Ｔｙｒであり、および
Ｘ３０は、Ａｌａ、Ｐｒｏ、ＶａｌまたはＡｒｇである、
前記ペプチド。
【請求項２】
Ｘ−６Ｘ−５Ｘ−４Ｘ−３Ｘ−２Ｘ−１Ｘ１ＰＸ３Ｘ４ＰＸ６Ｘ７ＰＧＸ１０Ｘ１１ＡＸ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６ＬＸ１８Ｘ１９Ｘ２０Ｘ２１Ｘ２２Ｘ２３ＬＸ２５Ｘ２６ＹＬＸ２９Ｘ３０Ｘ３１Ｘ３２（配列番号１３）
の配列を含むペプチドであって、式中、
Ｘ−６、Ｘ−５、Ｘ−４、Ｘ−３、Ｘ−２およびＸ−１が存在しない場合、Ｘ１は、Ｇｌｙであり、
Ｘ−６、Ｘ−５、およびＸ−４が存在しない場合、Ｘ−３、Ｘ−２、Ｘ−１、およびＸ１は、Ｇｌｙ、Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、ＧｌｙまたはＧｌｙ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ａｒｇであり、
Ｘ−６、Ｘ−５、Ｘ−４、Ｘ−３、Ｘ−２およびＸ−１が存在する場合、Ｘ−６、Ｘ−５、Ｘ−４、Ｘ−３、Ｘ−２、Ｘ−１およびＸ１は、Ｇｌｙ、Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ａｒｇ；であり；
Ｘ３およびＸ４はＡｒｇであり、
Ｘ６は、ＡｒｇまたはＬｙｓであり、
Ｘ７は、ＴｙｒまたはＣｙｓであり、
Ｘ１０は、Ａｓｐであり、
Ｘ１１は、Ａｓｐであり、
Ｘ１３は、Ｐｒｏ、ＳｅｒまたはＣｙｓであり、
Ｘ１４は、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、ＴｈｒまたはＧｌｕであり、
Ｘ１５は、ＧｌｕまたはＧｌｙであり、
Ｘ１６は、Ａｓｐであり、
Ｘ１８は、Ｈｉｓであり、
Ｘ１９は、Ａｌａ、ＧｌｕまたはＴｒｐであり、
Ｘ２０は、ＴｙｒまたはＰｈｅであり、
Ｘ２１は、Ｔｒｐであり、
Ｘ２２は、Ａｌａあり、
Ｘ２３は、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、ＡｌａまたはＧｌｎであり、
Ｘ２５は、Ｔｒｐであり
Ｘ２６は、Ａｓｎであり、
Ｘ２９は、Ｔｙｒであり、
Ｘ３０は、Ａｌａ、Ｐｒｏ、ＶａｌまたはＡｒｇであり、
Ｘ３１は、Ｖａｌであり、および
Ｘ３２は、Ａｌａである、
前記ペプチド。
【請求項３】
第２のペプチドと会合した第１のペプチドを含むペプチド二量体であって、前記第１および第２のペプチドは各々、独立して、請求項１または２に記載のペプチドを含む、前記ペプチド二量体。
【請求項４】
二量体はホモ二量体である、請求項３に記載のペプチド二量体。
【請求項５】
二量体はヘテロ二量体である、請求項３に記載のペプチド二量体。
【請求項６】
ペプチド二量体は、標的タンパク質に結合し、前記標的タンパク質は、Ｒａｓである、請求項３〜５のいずれか一項に記載のペプチド二量体。
【請求項７】
Ｒａｓに関連した疾患または状態の処置を必要とする対象におけるその処置のための、請求項１または２に記載のペプチドまたは請求項３〜６のいずれか一項に記載のペプチド二量体を含む、医薬組成物。
【請求項８】
Ｒａｓに関連した疾患は、増殖性疾患である、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
増殖性疾患はがんである、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
Ｒａｓに関連した疾患は、ＣＦＣ症候群、毛細血管奇形−動静脈奇形症候群、Ｃｏｓｔｅｌｌｏ症候群、Ｌｅｇｉｕｓ症候群、神経線維腫症１型、Ｎｏｏｎａｎ症候群、または多発性黒子を伴うＮｏｏｎａｎ症候群（以前はＬＥＯＰＡＲＤ症候群）である、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
請求項１または２に記載のペプチドまたは請求項３〜６のいずれか一項に記載のペプチド二量体をコードする核酸。
【請求項１２】
請求項１１に記載の核酸を含む宿主細胞。
【請求項１３】
請求項１または２に記載のペプチドまたは請求項３〜６のいずれか一項に記載のペプチド二量体を含む宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下で、米国仮特許出願である２０１４年５月２１日出願の米国特許出願第６２／００１，５８７号の優先権を主張するものであり、その出願は参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
政府支援
本発明は、米国立衛生研究所（ＮＩＨ）により支給された助成金Ｔ３２  ＧＭ００７５９８の下で政府支援と共に行われた。米国政府は、本発明におけるある特定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
従来型の治療薬は、広くは２種類：小分子および生物製剤に分類することができる。小分子は典型的には１０００Ｄａ未満の質量を有し、タンパク質内の疎水性ポケットに高い親和性で結合し、多くは細胞を透過することができる。生物製剤は、他の生体分子の表面に高い親和性および特異性で結合することができるが、細胞に効率的に進入することはできない生体分子、通常はタンパク質（例えば抗体またはホルモンなど）である。ヒトタンパク質の約１２％しか小分子に高い親和性で結合することができる疎水性ポケットを含有せず、ヒトタンパク質の１０％未満は分泌される（すなわち、細胞の外側に輸送される）と推定されている。これら２つの群は相互排他的ではないため、ヒトタンパク質の７８％超は、細胞内に存在するが疎水性結合ポケットを欠く。これらのタンパク質は、細胞内にあり御しにくい疎水性ポケットを含有する他のものと共に、しばしば「創薬が困難である（ｕｎｄｒｕｇｇａｂｌｅ）」と称される。したがって、タンパク質標的の相互作用を抑制する分子の開発および特性化の必要性が依然として存在する。
【発明の概要】
【０００４】
ヒト疾患の分子的病因の理解においては進展がなされているが、治療的利益のためにこれらの発見を利用する能力は、原因となるプロセスを標的とする薬物を作製する能力の欠如により限定されることが多い。多くの疾患は、タンパク質の異常な活性に関連付けることができ、酵素および細胞外標的の抑制剤の開発は実行可能なことが多いが、これらのタンパク質は、細胞内の全てのタンパク質の小部分しか占めない。残りのタンパク質は、ほとんどの場合、治療上御しにくいと見なされ、時に「創薬が困難である」と称される。本発明は、タンパク質標的の相互作用を抑制するため、かつタンパク質標的の相互作用を抑制するためのペプチドライブラリをスクリーニングするための方法およびシステムにおける用途のための、本明細書に記載されるペプチドを提供することによって、この問題を解決する。
【０００５】
多くのタンパク質、特に高等生物におけるものは、部分的には他のタンパク質および生体分子との相互作用によってその活動を行う。こうした相互作用を特異的に妨害する能力は、さもなければ御しにくいプロセスを標的とする手段を提供し得るため、優れた治療的利益を有し得る。したがって、例えば、幅広いヒト癌の惹起および進行の両方に関連付けられるＲａｓなどのタンパク質標的の相互作用を抑制する分子の開発および特性化が必要とされている。他のタンパク質標的としては、Ｍｙｃ／Ｍａｘヘテロ二量体、ＲａｌＡタンパク質、βカテニン、ＹＡＰ／ＴＥＡＤ、およびＮＥＭＯ／ＩκＢキナーゼが挙げられるが、これらに限定されない。定向進化、および結晶構造を使用した合理的ペプチド設計と連関した高スループットスクリーニングによって、Ｒａｓ、Ｍｙｃ／Ｍａｘ、ＲａｌＡ、βカテニン、ＹＡＰ／ＴＥＡＤ、およびＮＥＭＯ／ＩκＢキナーゼといった様々なタンパク質標的に結合し、かつその発癌活性に必要なエフェクタータンパク質を働かせるその能力を遮断する、小タンパク質（時にミニタンパク質と称される）が同定された。本明細書に記載されるペプチドは、癌などの増殖性疾患、およびＲａｓ／ＭＡＰＫ症候群（ｒａｓｏｐａｔｈｙ）などの他の疾患の処置に有用である。
【０００６】
本明細書において提供されるペプチドは、膵臓ポリペプチドファミリーの変異体に基づく。一態様では、配列：Ｘ１ＰＸ３Ｘ４ＰＸ６Ｘ７ＰＧＤＸ１１ＡＸ１３Ｘ１４Ｘ１５ＤＬＸ１８Ｘ１９ＹＸ２１Ｘ２２ＲＬＸ２５Ｘ２６ＹＬＸ２９Ｘ３０ＶＡ（配列番号１）を含むペプチドが本明細書において提供され、式中、アミノ酸Ｘ１、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ１１、Ｘ１３、Ｘ１４、Ｘ１５、Ｘ１８、Ｘ１９、Ｘ２１、Ｘ２２、Ｘ２５、Ｘ２６、Ｘ２９、およびＸ３０は、本明細書に定義される通りであり、ペプチドは配列番号１と少なくとも９３％同一である。
【０００７】
別の態様では、第２のペプチドと会合した第１のペプチドを含むペプチド二量体が本明細書において提供され、第１および第２のペプチドは各々、独立して、配列番号１のペプチドを含む。本ペプチド二量体は、頭−尾配置で二量体化するペプチド単量体を含む。本ペプチド二量体は、ホモ二量体でもヘテロ二量体でもよい。
【０００８】
一態様では、配列：Ｘ１ＰＸ３Ｘ４ＰＸ６Ｘ７ＰＧＸ１０Ｘ１１ＡＸ１３Ｘ１４Ｘ１５ＤＬＸ１８Ｘ１９Ｘ２０Ｘ２１Ｘ２２Ｘ２３ＬＸ２５Ｘ２６ＹＬＸ２９Ｘ３０ＶＡ（配列番号１２）を含むペプチドが本明細書において提供され、式中、アミノ酸Ｘ１、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ１０、Ｘ１１、Ｘ１３、Ｘ１４、Ｘ１５、Ｘ１８、Ｘ１９、Ｘ２０、Ｘ２１、Ｘ２２、Ｘ２３、Ｘ２５、Ｘ２６、Ｘ２９、およびＸ３０は、本明細書に定義される通りであり、ペプチドは配列番号１２と少なくとも９３％同一である。
【０００９】
別の態様では、第２のペプチドと会合した第１のペプチドを含むペプチド二量体が本明細書において提供され、第１および第２のペプチドは各々、独立して、配列番号１２のペプチドを含む。本ペプチド二量体は、頭−尾配置で二量体化するペプチド単量体を含む。本ペプチド二量体は、ホモ二量体でもヘテロ二量体でもよい。
【００１０】
一態様では、配列：Ｘ−６Ｘ−５Ｘ−４Ｘ−３Ｘ−２Ｘ−１Ｘ１ＰＸ３Ｘ４ＰＸ６Ｘ７  ＰＧＸ１０  Ｘ１１Ａ  Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６ＬＸ１８Ｘ１９Ｘ２０Ｘ２１Ｘ２２Ｘ２３ＬＸ２５Ｘ２６ＹＬＸ２９Ｘ３０Ｘ３１Ｘ３２（配列番号１３）を含むペプチドが本明細書において提供され、式中、アミノ酸Ｘ−６、Ｘ−５、Ｘ−４、Ｘ−３、Ｘ−２、Ｘ−１、Ｘ１、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ１０、Ｘ１１、Ｘ１３、Ｘ１４、Ｘ１５、Ｘ１６、Ｘ１８、Ｘ１９、Ｘ２０、Ｘ２１、Ｘ２２、Ｘ２５、Ｘ２６、Ｘ２９、Ｘ３０、Ｘ３１、およびＸ３２は、本明細書に定義される通りであり、ペプチドは配列番号１３と少なくとも９３％同一である。
【００１１】
別の態様では、第２のペプチドと会合した第１のペプチドを含むペプチド二量体が本明細書において提供され、第１および第２のペプチドは各々、独立して、配列番号１３のペプチドを含む。本ペプチド二量体は、頭−尾配置で二量体化するペプチド単量体を含む。本ペプチド二量体は、ホモ二量体でもヘテロ二量体でもよい。
【００１２】
一態様では、配列：Ｘ１ＰＸ３Ｘ４ＰＸ６Ｘ７  ＰＧＸ１０ＡＡＸ１３Ｘ１４ＡＡＬＨＡＹＸ２１ＡＸ２３ＬＸ２５ＮＹＬＸ２９Ｘ３０ＶＸ３２（配列番号４８）を含むペプチドが本明細書において提供され、式中、アミノ酸Ｘ１、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ１０、Ｘ１３、Ｘ１４、Ｘ２１、Ｘ２３、Ｘ２５、Ｘ２９、Ｘ３０、およびＸ３２は、本明細書に定義される通りであり、ペプチドは配列番号４８と少なくとも９３％同一である。
【００１３】
別の態様では、第２のペプチドと会合した第１のペプチドを含むペプチド二量体が本明細書において提供され、第１および第２のペプチドは各々、独立して、配列番号４８のペプチドを含む。本ペプチド二量体は、頭−尾配置で二量体化するペプチド単量体を含む。本ペプチド二量体は、ホモ二量体でもヘテロ二量体でもよい。
【００１４】
別の態様では、配列：ＰＸａＸｂＰＸｃＸｄＰ（配列番号２）を含むオリゴマー化ドメインを含むペプチドが本明細書において提供され、式中、Ｘａ、Ｘｂ、およびＸｃの各々は独立して、任意の非プロリンアミノ酸であり、Ｘｄは、ペプチドを別のペプチドと架橋させることができるアミノ酸（例えば、システイン、セレノシステイン）である。オリゴマー化ドメインは、ペプチドが別のペプチドと会合して二量体を形成することを可能にする。
【００１５】
ある特定の実施形態では、配列：ＰＸａＸｂＰＸｃＸｄＰ（配列番号２）を含むオリゴマー化ドメインを含むペプチドであって、式中、ＸａおよびＸｂの各々は独立して、任意の非プロリンアミノ酸であり、ＸｃおよびＸｄの各々は独立して、非プロリンアミノ酸、またはペプチドを別のペプチドと架橋させることができるアミノ酸（例えば、システイン、セレノシステイン、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＤａｐ結合およびＤａｂ結合アクリルアミド残基などのアクリルアミド部分を含むアミノ酸）である、ペプチド。
【００１６】
本ペプチドは、配列：Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５ＤＬＸ１８Ｘ１９ＹＸ２１Ｘ２２ＲＬＸ２５Ｘ２６ＹＬＸ２９Ｘ３０ＶＡ（配列番号３）を含むαヘリックスドメインをさらに含み、式中、Ｘ１３、Ｘ１４、Ｘ１５、Ｘ１８、Ｘ１９、Ｘ２１、Ｘ２２、Ｘ２５、Ｘ２６、Ｘ２９、およびＸ３０は、本明細書に定義される通りである。αヘリックスドメインは、タンパク質−タンパク質相互作用に関与し、標的タンパク質（例えば、Ｒａｓ、Ｍｙｃ／Ｍａｘ、ＲａｌＡ、βカテニン、ＹＡＰ／ＴＥＡＤ、およびＮＥＭＯ／ＩκＢキナーゼ）と会合する。
【００１７】
別の態様では、配列：Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５ＤＬＸ１８Ｘ１９ＹＸ２１Ｘ２２ＲＬＸ２５Ｘ２６ＹＬＸ２９Ｘ３０ＶＡ（配列番号３）を含むαヘリックスドメインを含むペプチドが本明細書において提供され、式中、Ｘ１３、Ｘ１４、Ｘ１５、Ｘ１８、Ｘ１９、Ｘ２１、Ｘ２２、Ｘ２５、Ｘ２６、Ｘ２９、およびＸ３０は、本明細書に定義される通りである。
【００１８】
配列番号１、１２、および１３の例示的なペプチドには、
ＧＰＲＲＰＲＣＰＧＤＤＡＳＩＥＤＬＨＥＹＷＡＲＬＷＮＹＬＹＡＶＡ（配列番号４）、ＧＰＲＲＰＲＣＰＧＤＤＡＳＩＥＤＬＨＥＹＷＡＲＬＷＮＹＬＹＲＶＡ（配列番号５）、ＧＲＲＰＲＲＰＲＣＰＧＤＤＡＳＩＥＤＬＨＥＹＷＡＲＬＷＮＹＬＹＡＶＡ（配列番号６）、ＧＰＲＲＰＲＹＰＧＤＤＡＰＶＥＤＬＩＲＦＹＮＤＬＱＱＹＬＮＶＶＡ（配列番号７）、ＧＣＧＧＰＲＲＰＲＹＰＧＤＤＡＳＩＥＤＬＨＥＹＷＡＲＬＷＮＹＬＹＡＶＡ（配列番号８）、ＧＣＧＧＰＲＲＰＲＹＰＧＤＤＡＣＥＥＤＬＨＥＹＷＡＲＬＷＮＹＬＹＡＶＡ（配列番号９）、ＧＣＧＧＰＲＲＰＲＹＰＧＤＤＡＳＩＥＤＬＨＥＹＷＡＲＬＷＮＹＬＹＲＶＡ（配列番号１０）、またはＧＣＧＧＰＲＲＰＲＲＰＲＹＰＧＤＤＡＳＩＥＤＬＨＥＹＷＡＲＬＷＮＹＬＹＡＶＡ（配列番号１１）が含まれるが、これらに限定されない。本ペプチドは、配列番号１または配列番号４〜１１のアミノ酸配列に対して約８０％〜約９９％相同である配列を含んでもよい。本ペプチドは、配列番号１または配列番号４〜１１のアミノ酸配列と約８０％〜約９９％同一である配列を含んでもよい。本ペプチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸変化（例えば、アミノ酸欠失および／または付加）を伴う、配列番号１または配列番号４〜１１のアミノ酸配列を含む配列を含んでもよい。例示的なペプチド、および例示的なペプチドと少なくとも８０％相同または同一であるペプチドのいずれも、互いとヘテロ二量体またはホモ二量体を形成することができる。
【００１９】
配列番号１２、１３、および４８の例示的なペプチドには、
ＰＲＲＰＲＣＰＧＤＤＡＳＩＥＤＬＨＥＹＷＡＲＬＷＮＹＬＹＡＶＡ（配列番号１４）、
ＰＲＲＰＲＣＰＧＤＤＡＳＩＥＤＬＨＥＹＷＡＲＬＷＮＹＬＹＲＶＡ（配列番号１５）、
ＲＲＰＲＲＰＲＣＰＧＤＤＡＳＩＥＤＬＨＥＹＷＡＲＬＷＮＹＬＹＡＶＡ（配列番号１６）、
ＰＲＲＰＲＹＰＧＤＤＡＰＶＥＤＬＩＲＦＹＮＤＬＱＱＹＬＮＶＶＡ（配列番号１７）、
ＰＲＲＰＲＹＰＧＤＤＡＳＩＥＤＬＨＥＹＷＡＲＬＷＮＹＬＹＡＶＡ（配列番号１８）、
ＣＧＧＰＲＲＰＲＹＰＧＤＤＡＣＥＥＤＬＨＥＹＷＡＲＬＷＮＹＬＹＡＶＡ（配列番号１９）、
ＰＲＲＰＲＹＰＧＤＤＡＳＩＥＤＬＨＥＹＷＡＲＬＷＮＹＬＹＲＶＡ（配列番号２０）、
ＰＲＲＰＲＲＰＲＹＰＧＤＤＡＳＩＥＤＬＨＥＹＷＡＲＬＷＮＹＬＹＡＶＡ（配列番号２１）、
ＰＲＲＰＲＣＰＧＤＤＡＳＬＥＤＬＨＥＹＷＡＲＬＷＮＹＬＹＲＶＡ（配列番号２２）、
ＰＲＲＰＲＣＰＧＤＱＡＳＬＥＥＬＨＥＹＷＡＲＬＷＮＹＬＹＲＶＡ（配列番号２３）、
ＰＲＲＰＲＣＰＧＤＮＡＳＩＫＱＬＨＡＹＷＮＲＬＹＡＹＬＡＡＶＡ（配列番号２４）、
ＰＲＲＰＲＣＰＧＤＤＡＳＩＥＤＬＨＥＹＷＱＲＬＹＡＹＬＡＡＶＡ（配列番号２５）、
ＰＲＲＰＲＣＰＧＤＮＡＳＩＫＱＬＨＡＹＷＱＲＬＹＡＹＬＡＡＶＡ（配列番号２６）、
ＰＲＲＰＲＣＰＧＤＮＡＳＩＲＱＬＨＡＹＷＱＲＬＹＡＹＬＡＡＶＡ（配列番号２７）、
ＧＣＧＧＰＲＲＰＲＹＰＧＤＡＡＳＩＡＡＬＨＡＹＷＡＲＬＷＮＹＬＹＲＶＡ（配列番号２８）、
ＰＲＲＰＲＹＰＧＤＡＡＳＩＡＡＬＨＡＹＷＡＲＬＷＮＹＬＹＲＶＡ（配列番号２９）、
２２５−Ｈ：ＰＲＲＰＫＹＰＧＤＡＡＳＣＡＡＬＨＡＹＷＡＲＬＷＮＹＬＹＲＶＡ（配列番号３０）、
２２５−Ｉ：ＰＲＲＰＲＹＰＧＤＡＡＳＩＡＡＬＨＡＹＷＡＲＬＷＮＹＬＹＲＸＡ（配列番号３１）、
２２５−Ｊ：ＰＲＲＰＲＹＰＧＤＡＡＳＩＡＡＬＨＡＹＷＡＲＬＷＮＹＬＹＲＺＡ（配列番号３２）、
２２５−Ｋ：ＰＲＲＰＣＹＰＧＤＡＡＳＩＡＡＬＨＡＹＷＡＲＬＷＮＹＬＹＲＶＡ（配列番号３３）、
２２５−Ｌ：ＰＲＲＰＫＣＰＧＤＡＡＳＩＡＡＬＨＡＹＷＡＲＬＷＮＹＬＹＲＶＡ（配列番号３４）、
２２５−Ｍ：ＰＲＲＰＲＹＰＧＸＡＡＳＩＡＡＬＨＡＹＷＡＲＬＷＮＹＬＹＲＶＡ（配列番号３５）、
２２５−Ｎ：ＰＲＲＰＲＹＰＧＺＡＡＳＩＡＡＬＨＡＹＷＡＲＬＷＮＹＬＹＲＶＡ（配列番号３６）、
２２５−４ｓ１：ＰＲＲＰＫＹＰＧＤＡＡＳＩＡＡＬＨＡＹＷＡＲＬＷＮＹＬＹＲＶＲ（配列番号３７）、
２９１−Ａ：ＰＲＲＰＫＨＰＧＨＡＡＳＩＡＡＬＨＡＹＷＡＲＬＷＮＹＬＹＲＶＲ（配列番号３８）、
２９１−１：ＰＲＲＰＲＨＰＧＰＮＡＴＩＳＱＬＨＨＹＷＡＲＬＷＮＹＬＹＲＶＲ（配列番号３９）、
２９１−Ｈ：ＰＲＲＰＨＨＰＧＨＡＡＳＩＡＡＬＨＡＹＷＡＲＬＷＮＹＬＹＲＶＲ（配列番号４０）、
２９１−Ｉ：ＰＲＲＰＨＹＰＧＨＡＡＳＩＡＡＬＨＡＹＷＡＲＬＷＮＹＬＹＲＶＲ（配列番号４１）、
２９１−Ｑ３：ＰＲＲＰＲＣＰＧＨＡＡＳＩＡＡＬＨＡＹＷＡＲＬＷＮＹＬＹＲＶＲ（配列番号４２）、
ＭＹ０１：ＧＰＲＲＰＲＣＰＧＤＤＡＳＩＲＤＬＬＫＹＷＷＲＬＲＬＹＬＬＡＶＡ（配列番号４３）、
ＲＬ０１：ＧＰＲＲＰＲＣＰＧＤＤＡＳＩＳＤＬＬＬＹＷＬＲＬＤＲＹＬＷＡＶＡ（配列番号４４）、
ＲＲ０１：ＧＰＲＲＰＲＣＰＧＤＤＡＳＩＲＤＬＶＭＹＷＹＲＬＹＦＹＬＥＡＶＡ（配列番号４５）、
２２５−１ｃ：ＰＲＲＰＫＹＰＧＤＡＡＳＩＡＡＬＨＡＹＷＡＲＬＷＮＹＬＹＲＶＳ（配列番号４６）、
２２５−４ｄ：ＲＰＲＲＰＫＹＰＧＤＡＡＳＩＡＡＬＨＡＹＷＡＲＬＷＮＹＬＹＲＶＳ（配列番号４７）、
２９１−Ｔ：ＰＲＲＰＲＹＰＧＤＡＡＳＩＡＡＬＨＡＹＷＡＲＬＷＮＹＬＹＲＶＳ（配列番号４９）、
Ｑ：ＰＲＲＰＲＣＰＧＤＮＡＳＩＲＱＬＨＡＹＷＱＲＬＹＡＹＬＡＡＶＡ（配列番号５０）、および
Ｒ：ＰＲＲＰＲＣＰＧＤＡＡＳＩＡＡＬＨＡＹＷＱＲＬＹＡＹＬＡＡＶＡ（配列番号５１）が含まれるが、これらに限定されない。
【００２０】
本ペプチドは、配列番号１２〜５１のアミノ酸配列に対して約８０％〜約９９％相同である配列を含んでもよい。本ペプチドは、配列番号１２〜５１のアミノ酸配列と約８０％〜約９９％同一である配列を含んでもよい。本ペプチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸変化（例えば、アミノ酸欠失および／または付加）を伴う、配列番号１２〜５１のアミノ酸配列を含む配列を含んでもよい。例示的なペプチド、および例示的なペプチドと少なくとも８０％相同または同一であるペプチドのいずれも、互いとヘテロ二量体またはホモ二量体を形成することができる。
【００２１】
ある特定の実施形態では、ヘテロ二量体化したペプチドは、配列番号２２、２３、および４９から選択される一次的なペプチドを含む。ある特定の実施形態では、ヘテロ二量体化したペプチドは、配列番号２４〜２７、５０、および５１から選択される二次的なペプチドを含む。ある特定の実施形態では、ヘテロ二量体化したペプチドは、配列番号２２、２３、および４９から選択される一次的なペプチドと、配列番号２４〜２７、５０、および５１から選択される二次的なペプチドとを含む。
【００２２】
一態様では、細胞を透過することができるペプチドが提供される。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、低減した数の負電荷を含む。ある特定の実施形態では、ペプチドの負電荷の数は、出発ペプチドと比較して１、２、３、４、５、または６個の負電荷だけ低減される。例えば、ＡｌａまたはＳｅｒなどの中性アミノ酸または非負荷電アミノ酸をアニオン性残基の代わりに導入すると、細胞透過の向上に役立ち得る。細胞透過を向上させるのに有用となる他の残基は、タンパク質凝集を減少させることで知られるもの（概して大きくなく、高い電荷を有せず、かつ／または過剰に疎水性でない残基）である。ある特定の実施形態では、本開示のペプチドは、Ｘ１１位、Ｘ１５位、および／またはＸ１６位に、少なくとも１個、２個、もしくは３個の中性アミノ酸または非負荷電アミノ酸を含む。ある特定の実施形態では、本開示のペプチドは、Ｘ１１位、Ｘ１５位、Ｘ１６位、および／またはＸ１９位に、少なくとも１個、２個、３個、もしくは４個の中性アミノ酸または非負荷電アミノ酸を含む。ある特定の実施形態では、中性アミノ酸または非負荷電アミノ酸は、ＡｌａまたはＳｅｒである。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、アニオン性残基の代わりにＡｌａを含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、アニオン性残基の代わりにＳｅｒを含む。ある特定の実施形態では、本開示のペプチドは、本明細書において開示されるペプチドのうちいずれか１つのＸ１１位、Ｘ１５位、Ｘ１６位、および／またはＸ１９位に、少なくとも１個、２個、３個、もしくは４個のＡｌａまたはＳｅｒを含む。
【００２３】
一態様では、細胞透過前の二量体化を防止するかまたは最小限に抑えるように設計されたペプチドが、本明細書において提供される。本明細書において開示されるペプチドは、架橋を防止するために有機チオール小部分でマスクされたＣｙｓまたはＳｅｃを含んでもよい。ある特定の実施形態では、有機チオール小部分は−ＳＲＳであり、ここでＲＳは、置換または非置換のＣ１−５アルキルである。ある特定の実施形態では、有機チオール小部分は、ｔ−ブチルチオールまたはエタンチオールである。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号３０、３３、および３４からなる群から選択される配列を含み、Ｃｙｓは、有機チオール小部分にジスルフィド結合している。Ｃｙｓを含む前述の実施形態または本明細書における実施形態のいずれにおいても、Ｃｙｓの代わりにＳｅｃも企図される。
【００２４】
別の態様では、ペプチドが細胞を透過した後に別のペプチドに架橋するように設計された求電子性側鎖を含むペプチドが、本明細書において提供される。ある特定の実施形態では、本明細書において開示されるペプチドは、ＣｙｓまたはＳｅｃに架橋することができる部分で修飾された残基を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、アクリルアミド部分を含むアミノ酸を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、Ｌ−２，４−ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）残基またはＬ−２，３−ジアミノプロピオン酸（Ｄａｐ）残基を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、Ｌ−２，４−ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）残基またはＬ−２，３−ジアミノプロピオン酸（Ｄａｐ）残基を含み、ＤａｂおよびＤａｐは、アクリルアミドを含む側鎖を形成するようにアクリル酸で修飾されている。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号３１、３２、３５、および３６からなる群から選択される配列を含み、Ｘは、アクリルアミドに結合したＬ−２，４−ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）残基であり、Ｚは、アクリルアミドに結合したＬ−２，３−ジアミノプロピオン酸（Ｄａｐ）残基である。アクリルアミドに結合したＤａｐ残基およびＤａｂ残基は、本明細書にさらに記載される。ペプチド二量体は、配列番号３０、３３、および３４と、配列番号３１、３２、３５、および３６との任意の組み合わせから形成され得る。本明細書に記載される実施形態のいずれにおいても、ＣｙｓがＳｅｃで置換されていてもよいことは理解される。ある特定の実施形態では、本開示のペプチドは、本明細書において開示されるペプチドのうちいずれか１つのＸ６位、Ｘ７位、および／またはＸ１４位に、ＣｙｓまたはＳｅｃを含む。ある特定の実施形態では、本開示のペプチドは、本明細書において開示されるペプチドのうちいずれか１つのＸ１０位、Ｘ３１位、および／またはＸ３２位に、アクリルアミド部分を含むアミノ酸を含む。ある特定の実施形態では、本開示のペプチドは、本明細書において開示されるペプチドのいずれか１つのＸ１０位、Ｘ３１位、および／またはＸ３２位に、ＤａｐまたはＤａｂを含み、ＤａｐまたはＤａｂは、アクリルアミドを含む側鎖を形成するようにアクリル酸で修飾されている。ある特定の実施形態では、第１のペプチド単量体のＸ６位、Ｘ７位、またはＸ１４位にＣｙｓまたはＳｅｃを含む第１のペプチド単量体であって、ＣｙｓまたはＳｅｃは、本明細書において提供される有機チオール小部分でマスクされている、第１のペプチド単量体と、第２のペプチドのＸ１０位、Ｘ３１位、またはＸ３２位にＤａｐまたはＤａｂを含む第２のペプチド単量体であって、ＤａｐまたはＤａｂは、アクリルアミドを含む側鎖を形成するようにアクリル酸で修飾されている、第２のペプチド単量体と、が提供される。
【００２５】
さらに別の態様では、二量体のエンドソーム逃避および細胞質ゾルの接近を向上させるための選択的二量体不安定化手法が、本明細書において提供される。本明細書において提供される手法には、ｐＨ誘発性不安定化または嵩高残基（ｂｕｌｋｙ  ｒｅｓｉｄｕｅ）不安定化が含まれる。ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるペプチドは、反対側の単量体ペプチド上の１つ以上のカチオン性残基または１つ以上のＨｉｓに空間的に近接するようにアミノ酸位置に配置された１つ以上のＨｉｓを含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、Ｘ６位、Ｘ７位、および／またはＸ１０位に配置されたＨｉｓを含む。これらの位置のうちの１つ、２つ、または３つに配置されたＨｉｓは、本明細書に記載されるペプチドのいずれにも適用可能である。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号３８〜４１からなる群から選択される配列を含む。
【００２６】
ある特定の実施形態では、二量体不安定化は、二量体化を防止するために二量体界面付近の嵩高部分を含む残基を使用して実現される。そのような嵩高部分は細胞透過後に除去され、対応する残基が自由に二量体化できる。ＣｙｓまたはＳｅｃをマスクするのに有用な嵩高部分の例としては、有機チオール分子が挙げられる。ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるペプチドは、有機チオール分子との反応によって保護されたＣｙｓまたはＳｅｃを含む。ある特定の実施形態では、有機チオール分子は、アリールチオール、ヘテロアリールチオール、および脂肪族チオールから選択される。ある特定の実施形態では、有機チオール分子はヘテロアリールチオールである。ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるペプチドは、２，２’−ジピリジルジスルフィド、４，４’−ジピリジルジスルフィド、または２，２’−ジチオビス（５−ニトロピリジン）との反応によって保護されたＣｙｓまたはＳｅｃを含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号３０、３３、３４、および４２から選択される配列を含み、Ｃｙｓは、前述の有機チオール分子のいずれかによって保護されている。本明細書に記載される実施形態のいずれにおいても、ＣｙｓがＳｅｃで置換されていてもよいことは理解される。
【００２７】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるペプチドのいずれも、Ｘ７にＣｙｓまたはＳｅｃを、そしてＸ１１、Ｘ１５、Ｘ１６、および／またはＸ１９のうちの１つ以上にＡｌａまたはＳｅｒを含む。ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるペプチドのいずれも、Ｘ７にＴｙｒを、そしてＸ１１、Ｘ１５、Ｘ１６、および／またはＸ１９のうちの１つ以上にＡｌａまたはＳｅｒを含む。
【００２８】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるペプチドのいずれも、Ｘ６にＨｉｓを、そしてＸ７にＣｙｓまたはＳｅｃを含む。ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるペプチドのいずれも、Ｘ７にＣｙｓまたはＳｅｃを、そしてＸ１０にＨｉｓを含む。
【００２９】
本明細書に記載されるペプチドが、アセチル化Ｎ末端および／またはアミド化Ｃ末端を含んでもよいことは理解される。
【００３０】
さらに別の態様では、Ｒａｓ、Ｍｙｃ／Ｍａｘ、ＲａｌＡ、βカテニン、ＹＡＰ／ＴＥＡＤ、またはＮＥＭＯ／ＩκＢキナーゼに関連した疾患または状態の処置を必要とする対象においてそれを処置する方法であって、本明細書に記載のペプチドを対象に投与することを含む方法が、本明細書において提供される。ある特定の実施形態では、疾患または状態は、Ｒａｓに関連する。増殖性疾患の処置を必要とする対象においてそれを処置する方法であって、本明細書に記載のペプチドを対象に投与することを含む方法も、本明細書において提供される。例示的な疾患または状態には、様々な癌およびＲａｓ／ＭＡＰＫ症候群が含まれる。
【００３１】
本明細書に記載されるペプチドは、ペプチドのライブラリをスクリーニングするための方法およびシステムにおいても有用である。一態様では、ペプチド二量体のライブラリをスクリーニングする方法およびシステムであって、第１のペプチドおよび第２のペプチドをコードするベクターでディスプレイ細胞を形質転換させるステップであって、第１および第２のペプチドが会合して、細胞壁タンパク質に融合したペプチド二量体を形成する、形質転換させるステップと、ディスプレイ細胞を第１の標識と接触させるステップであって、第１の標識は、標的タンパク質を含み、標的に対する向上した結合性を有するペプチド二量体を発現する細胞と会合し、標的に対する向上した結合性を有するペプチド二量体を発現しない細胞とは会合しない、接触させるステップと、第１の標識が会合しているディスプレイ細胞を単離させるステップと、標的に対して向上した結合性を示す第１および第２のペプチドを同定するステップと、を含む、方法およびシステムが、本明細書において提供される。代替的に、本方法は、第１のペプチドをコードする第１のベクターおよび第２のペプチドをコードする第２のベクターでディスプレイ細胞を形質転換させることを含んでもよい。
【００３２】
さらなる態様では、本明細書に記載されるペプチドおよび二量体を含むキットが、本明細書において提供される。本明細書に記載されるペプチドおよび二量体をコードする核酸も提供される。それに加えて、本核酸、ペプチド、および二量体を含む宿主細胞もまた企図される。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
添付の図面は縮尺通りの描写を意図しない。図面においては、明確化を目的として、全ての構成要素が全ての図面で表示されているとは限らない。
【００３４】
【図１】エフェクターに結合したＲａｓの結晶構造を示す。ＨＲａｓ・ＧｐｐＮＨｐは右側に示され、ヌクレオチドが棒状に示されており、ＲａｌＧＤＳのＲａｓ結合ドメイン（ＲＢＤ）は左側に示される。ＰＤＢ：１ＬＦＤ。
【図２】酵母ディスプレイ系を示す。ペプチドライブラリをコードするＤＮＡライブラリが、Ａｇａ２ｐ−ペプチド融合物を発現し、それを細胞表面に分泌する、酵母株ＥＢＹ１００に形質転換される。酵母細胞は、次いで（提示される融合タンパク質の存在量を測定するため）蛍光標識された標的タンパク質（この場合はＲａｓ）、およびエピトープタグのうちの１つに対する蛍光標識された抗体と共にインキュベートされ、次いで、蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）を使用してスクリーニングされる。Ｃｈａｏ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．Ｉｓｏｌａｔｉｎｇ  ａｎｄ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｙｅａｓｔ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｄｉｓｐｌａｙ．Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ  １，７５５−６８（２００６）から改変された図である。
【図３】ａＰＰ−Ｍが野生型ａＰＰよりも高い熱安定性を有することを示す。図３Ａは、ａＰＰおよびａＰＰ−ＭのＣＤスペクトルを示す。図３Ｂは、２２２ｎｍにおける熱融解プロファイルを示す。
【図４】ランダム化のために選択されたライブラリ足場および残基を示す。ａＰＰの構造が図４Ａに見出され、ランダム化された残基が矢印で示されている。図４Ｂは、ライブラリのアミノ酸配列（配列番号ＸＸ−ＸＸ）を示す。下線が引かれたＸは、任意のアミノ酸を指定する。
【図５】ライブラリ断片を調製するためのＰＣＲ手法を示す。十分な重複を有する一式のプライマーが、アニーリングおよび伸展され、互いの鋳型として働く。各プライマー内の複数の縮重コドンの使用によって変異が導入され（部位飽和変異誘発）、結果として生じるライブラリにおいて高い組み合わせの多様性がもたらされる。
【図６】Ｓｆｐホスホパンテテイニルトランスフェラーゼを用いたタンパク質の部位特異的標識を示す。ＣｏＡのスルフヒドリル部分を最適なマレイミド官能化標識（例えば、ビオチン）と反応させ、次いで、結果として生じる結合体を、Ｓｆｐによって標的タンパク質上のｙＢＢｒタグに移す。
【図７】Ｒａｓタンパク質の精製を示す。図７Ａは、コバルト樹脂からの溶離後の、Ｈｉｓ６タグ付き（配列番号ＸＸ）ＫＲａｓ  Ｇ１２Ｖのゲル濾過トレースを示す。図７Ｂは、ＧＤＰ負荷タンパク質およびＧＴＰ負荷タンパク質に対するＲａｓ結合ヌクレオチドの逆相ＨＰＬＣ分析を示す。ＧＤＰおよびＧＴＰ標準は、それぞれ１２分および１５分で溶離する。図７Ｃは、Ｓｆｐによる酵素的なビオチン化の前後の、ＲａｓのＭＡＬＤＩ−ＭＳスペクトルを示す。
【図８】精製ステップ（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ染料）からのＲａｓタンパク質試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。
【図９】ａＰＰ足場ライブラリからの最初のヒットのフローサイトメトリー分析を示す。酵母細胞は、Ｒａｓの非存在、５００ｎＭのＫＲａｓ、５００ｎＭのＫＲａｓおよび４μＭのＢ−Ｒａｆ  ＲＢＤ、または１０％（ｖ／ｖ）のヒト血清を含む５００ｎＭのＫＲａｓの存在下でインキュベートした。５００ｎＭのＫＲａｓ試料が、比較のためにＲａｆプロットおよび血清プロット内で重ね合わされている。
【図１０】ａＰＰ足場ペプチドの定向進化を示す。各ラウンドのヒットをエラープローンＰＣＲによって多様化させ、次いで、結果として生じた酵母ライブラリを、漸増的にストリンジェントな条件（より低い［ＫＲａｓ］および増加した遮断剤）下でＫＲａｓに結合する能力に関して、磁気活性化細胞分取（ＭＡＣＳ）および蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）によって選択した。変異は、それらが現れる第１のラウンドでは下線が引かれており、後続のラウンドでは斜体で示されている。
【図１１】インビトロ研究に使用したペプチドを示す。一貫性を保つために、残基番号は、野生型ａＰＰペプチド内の位置を使用して報告される。アラニン点変異には下線が引かれている。
【図１２】２２５ペプチドの精製を示す。発現した融合コンストラクトのコバルト親和性クロマトグラフィーおよび一晩のＴＥＶ開裂後、この反応物を逆相ＨＰＬＣによって精製した（図１２Ａ）。２２５ペプチドを含む示されたピークを収集し、ＬＣ／ＭＳによって分析した（図１２Ｂおよび１２Ｃ）。ＨＰＬＣおよびＬＣ／ＭＳ計器に対する異なるカラムサイズが、ＡとＢとの保持時間の相違の主な原因である。データは、２２５−１ペプチド  （ＧＣＧＧＰＲＲＰＲＹＰＧＤＤＡＳＩＥＤＬＨＥＹＷＡＲＬＷＮＹＬＹＡＶＡ）について示されている。
【図１３】ａＰＰ−Ｍおよび２２５ペプチドの円二色性スペクトルを示す。図１３Ａは、ＵＶ  ＣＤスペクトルを示し、図１３Ｂは、２２２ｎｍにおける融解プロファイルを示す。ａＰＰ−Ｍおよび２２５−１は、ｐＨ８．０で測定し、２２５−３は、ｐＨ５〜１０範囲内での低い可溶性のため、ｐＨ１２およびｐＨ４．５で測定した。
【図１４】Ｒａｓ−ペプチド相互作用の蛍光偏光測定値を示す。ＦＩＴＣ標識２２５−３ペプチドを、漸増する濃度のＲａｓまたはＲａｓファミリータンパク質と混合し、次いで蛍光偏光を読み取り、プロットした。エラーバーは、平均値の標準誤差（ＳＥＭ）である。
【図１５】Ｒａｓ−ペプチド相互作用の表面プラズモン共鳴測定値を示す。ビオチン化ＫＲａｓ（ＧｐｐＮＨｐ（図１５Ａ）またはＧＤＰ（図１５Ｂ）のいずれかに結合している）を、ストレプトアビジン捕捉チップ上に固定化し、次いで、遊離２２５−１ペプチドを漸増する濃度で注入した。相互作用の高い親和性により、注入間の再生ステップを欠き、階段のような結合曲線を生成する「単一サイクル」試験が可能となった。データは、２ステップ結合モデルを使用して当てはめた。
【図１６】アラニン変異誘発のために選択された位置を示す。２２５ペプチドの残基をａＰＰの結晶構造上にモデリングした（ＰＤＢ：１ＰＰＴ）。アラニンへの変異のために選択された位置は、矢印で示されている。結晶構造は、Ｂｌｕｎｄｅｌｌ，Ｔ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．Ｘ−ｒａｙ  ａｎａｌｙｓｉｓ（１．４−Ａ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）ｏｆ  ａｖｉａｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ：Ｓｍａｌｌ  ｇｌｏｂｕｌａｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｈｏｒｍｏｎｅ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ７８，４１７５−９（１９８１）からのものである。
【図１７】２２５−３ペプチドの単一アラニン変異体の特性を示す。図１７Ａは、示される２２５−３アラニン変異体ペプチドおよびＫＲａｓ（Ｇ１２Ｖ）・ＧｐｐＮＨｐを用いて上記のように実施された蛍光偏光実験を示す。図１７Ｂは、２５℃における変異体のＣＤスペクトルを示し、図１７Ｃは、２２２ｎｍにおける融解プロファイルを示す。全てのＣＤ実験は、ｐＨ１２で行った。エラーバーはＳＥＭである。
【図１８】２２５−３ペプチドが癌細胞ライセート中で内在性Ｒａｓに結合し、Ｒａｆとのその相互作用を遮断することを示す。Ｃａｐａｎ−１腺癌細胞を溶解させ、２２５−３ペプチドおよび／またはＧＳＴタグ付きＲａｆ  ＲＢＤと共にインキュベートし、次いで、ペプチドまたはＲａｆのいずれかを、示されたビーズでプルダウンした。結合した試料をＳＤＳで沸騰させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で泳動させ、ニトロセルロース膜に移し、ｐａｎ−Ｒａｓ抗体を用いてウェスタンブロッティングした。
【図１９】２２５ペプチドがＲａｓからのヌクレオチド解離に干渉することを示す。ペプチドを、ｍａｎｔ−ＧｐｐＮＨｐを負荷したＫＲａｓ（Ｇ１２Ｖ）と混合し、次いでＧｐｐＮＨｐを６２５μＭまで添加し、ｍａｎｔ標識ヌクレオチドの解離を、蛍光の減少として追跡した（励起：３７０ｎｍ、発光：４５０ｎｍ）。ＲＦＵ∞＝０．３７として、このデータを一相指数関数的減衰に当てはめることによって、解離定数を計算した。
【図２０】２２５−１の存在および非存在下でのＲａｓの１Ｈ−１５Ｎ  ＨＳＱＣ（ＴＲＯＳＹ）ＮＭＲスペクトルを示す。図２０Ａは、１５Ｎ標識ＫＲａｓ（野生型）ＧＤＰのＴＲＯＳＹを示し、図２０Ｂは、非標識２２５−１を含む１５Ｎ標識ＫＲａｓのＴＲＯＳＹを示し、図２０Ｃは、スペクトルのオーバーレイを示す。
【図２１】２２５ペプチド結合部位がＲａｓエフェクタードメインと重複することを示す。エフェクタードメイン内の残基は、エフェクターを有するＨＲａｓの共結晶構造によって定義され、ペプチド結合部位は、図２０の２２５−１を用いたＴＲＯＳＹ実験によって定義された。残基は、ＫＲａｓ（野生型）・ＧｐｐＮＨｐの結晶構造上に空の輪郭で示されている（ＰＤＢ：３ＧＦＴ）。
【図２２】Ｒａｓの存在および非存在下での２２５−１の１Ｈ−１５Ｎ  ＨＳＱＣ（ＴＲＯＳＹ）ＮＭＲスペクトルを示す。図２２Ａは、１５Ｎ標識２２５−１のＴＲＯＳＹを示し、図２２Ｂは、非標識ＫＲａｓ（Ｇ１２Ｖ）ＧＤＰを含む１５Ｎ標識２２５−１のＴＲＯＳＹを示し、図２２Ｃは、スペクトルのオーバーレイを示す。
【図２３】ａＰＰペプチドの頭−尾二量体化を示す。ａＰＰの結晶構造（ＰＤＢ：１ＰＰＴ）が、漫画的表現で示され（図２３Ａ）、棒（図２３Ｂ）、そしてＹ７対が示されている（図２３Ｃ）。
【図２４】Ｎ２６Ａ変異体が、２２５−１とのヘテロ二量体としてＲａｓに結合することができることを示す。２２５−１または２２５−１  Ｎ２６Ａのいずれかを提示する酵母を、２５μＭの（遊離）２２５−１または２２５−１  Ｎ２６Ａペプチドと共にプレインキュベートし、次いでペレット化し、５００ｎＭのＫＲａｓと共にインキュベートした。
【図２５】２２５−１に基づく走査変異誘発ライブラリの設計を示す。ライブラリは、各サブライブラリについて個別のプライマーを使用して、本来のナイーブライブラリに関する重複延長によって調製された。Ｘは、ＮＮＫコドンによってコードされた。
【図２６】向上した親和性でＲａｓに結合する２２５−１を含むヘテロ二量体を形成する２２５−１  Ｓ１３Ｃ／Ｉ１４Ｅ変異を示す。図２６Ａは、２２５−１または２２５−１  Ｓ１３Ｃ／Ｉ１４Ｅのいずれかを提示する酵母を、１０μＭの（遊離）２２５−１、２２５−１  ａｌｋ（アルキル化２２５−１）、または２２５−１  Ｎ２６Ａのいずれかと共にプレインキュベートし、次いでペレット化し、ＦＡＣＳの前に５ｎＭのＫＲａｓと共にインキュベートしたことを示す。図２６Ｂは、ヨードアセトアミドによるシステイン側鎖のアルキル化を示す。
【図２７】Ｓ１３およびＮ末端システインの位置を例示するモデルを示す。左側のペプチドは、Ｎ末端に未反応のシステインハンドルを有する２２５−１を表し、右側のペプチドは、Ｓ１３とのパートナーを表す（これは、Ｓ１３Ｃ／Ｉ１４Ｅ二重変異体ではシステインである）。
【図２８】２２５−１  Ａ３０Ｒ変異体が、２２５−１よりもＫＲａｓ（ＧＴＰ）に対して選択的であることを示す。２２５−１または２２５−１  Ａ３０Ｒのいずれかを提示する酵母を、５００ｎＭのビオチン化ＫＲａｓ（ＧＴＰ）および５００ｎＭのＡｌｅｘａ６４７標識ＫＲａｓ（ＧＤＰ）と共にインキュベートし、次いで洗浄し、分取前にストレプトアビジン−フィコエリトリン（ＳＡ−ＰＥ）と共にインキュベートした。
【図２９】単量体２２５誘導体を同定するためのライブラリの設計を示す。２２５ペプチドからのαヘリックスは、新たなライブラリ内の対応するヘリックスの上に示されており、Ｘ４〜６はランダム化ループであり、ＸはＮＮＫである。下線が引かれたＡは、ＰＰＩＩヘリックスを以前充填した疎水性アミノ酸を置換する。
【図３０】解離定数を測定するための標準的アッセイである蛍光偏光による結合親和性を示す。ＲＤＡ１：Ｋｄ＝１７ｎＭ、ＲＤＡ２：Ｋｄ＝８ｎＭ、ＲＤＡ３：Ｋｄ＝６ｎＭ。
【図３１】酸化（ジスルフィド架橋）ペプチド二量体を還元（非架橋）ペプチド単量体と区別することができるＨＰＬＣアッセイを示す。細胞環境よりも大幅に強力な還元剤であるＤＴＴを５ｍＭまたは５０ｍＭ添加することによって、セレノシステイン含有ペプチド二量体は、それらのシステイン含有類似体とは異なり還元され得ないことを示すことができる。方法：ペプチドを緩衝液中に溶解させ、逆相ＨＰＬＣによって分析する前に、０ｍＭ、５ｍＭ、または５０ｍＭのＤＴＴと共にインキュベートした。還元したペプチドは、試料のＬＣ／ＭＳ分析によって判定した場合に、酸化したペプチドよりも早く溶離する。
【図３２】Ｒａｓ  ＲＤＡ１（配列番号４）の構造を示す。最初の図は、２．２オングストロームの解像度における全体構造を示す。次の２つは、同定された主要な結合残基と共に一次ヘリックスの近接図を示す。
【図３３】Ｒａｓ−ペプチド相互作用の表面プラズモン共鳴測定値を示す。ビオチン化ＫＲａｓ（ＧｐｐＮＨｐまたはＧＤＰのいずれかに結合している）を、ストレプトアビジン捕捉チップ上に固定化し、次いで、遊離二量体ペプチドを漸増する濃度で注入した。相互作用の高い親和性により、注入間の再生ステップを欠き、階段のような結合曲線を生成する「単一サイクル」試験が可能となった。データは、２ステップ結合モデルを使用して当てはめた。図３３Ａは、配列番号２３および２６を含むヘテロ二量体ペプチドを使用したＳＰＲ測定値を示す。図３３Ｂは、配列番号４を含むホモ二量体ペプチドを使用したＳＰＲ測定値を示す。
【図３４】Ｈ３５８肺腺癌細胞内で、ペプチド５μＭの濃度で、１０％のウシ胎仔血清を補充したＤＭＥＭ培地内で実施された、標識ペプチドを用いた生細胞顕微鏡法を示す。図３４Ａは、配列番号１０を含むペプチドホモ二量体で処理された細胞を示す。図３４Ｂは、配列番号２８を含む４残基変異体ペプチドホモ二量体で処理された細胞を示す。両方のペプチドをフルオレセインで標識した。配列番号２８を含む４残基変異体ペプチドは、配列番号１０を含むペプチドよりも良好に細胞に進入した。図３４Ａの凝集物は図３４Ｂには存在せず、これは、配列番号１０と比較して配列番号２８に見出される変異によって与えられる可溶性の増加の結果である。
【図３５】１ｍＭまたは１０ｍＭのグルタチオンのいずれかを用いた、配列番号３１のペプチドと混合した配列番号３０のペプチドのＬＣ−ＭＳ分析からのマスクロマトグラムを示す。
【図３６】標識ペプチド二量体を使用し、Ｈ３５８肺腺癌細胞内で、フルオレセイン標識ペプチド５μＭの濃度で、１０％のウシ胎仔血清を補充したＤＭＥＭ培地内で実施された、生細胞共焦点顕微鏡法を示す。図３６Ａは、ヒスチジンを欠く配列番号３７のペプチドを示す。図３６Ｂは、１つの単量体当たり２つのヒスチジン（１つの二量体当たり４つのヒスチジン；「Ｈｉｓ四分子」）を含有する配列番号３８のペプチドを示す。
【図３７】配列番号４２の２９１−Ｑ３ペプチドを示し、ここでは、Ｃｙｓを２，２’−ジピリジルジスルフィドと反応させて、ジスルフィド保護システインを生成した。このシステインは、低レベルのグルタチオンの存在下でケージから出されて、より良好なＲａｓ結合剤であるジスルフィド結合種を形成する。図のデータは、質量分析によって検証された場合に、５ｍＭの還元グルタチオンの添加（これは共有結合的なジスルフィド結合二量体の形成をもたらす）に際し、Ｒａｓ結合性の上昇を示す。
【図３８】配列番号４３〜４５のペプチドに関する、対応するタンパク質標的との酵母表面ディスプレイ結合性データを示す。図３８Ａは、ＫＲａｓおよびＲａｌＡに対する、配列番号４４のＲＬ０１ペプチドの結合性データを示す。図３８Ｂは、ＫＲａｓおよびＲａｌＡに対する、配列番号４５のＲＲ０１ペプチドの結合性データを示す。図３８Ｃは、Ｍｙｃ／Ｍａｘに対する、配列番号４３のＭＹ０１ペプチドの結合性データを示す。
【００３５】
定義
「ペプチド」は、ペプチド（アミド）結合によって一緒に連結されたアミノ酸残基のポリマーを含む。ペプチドという用語は、本明細書において、ペプチド単量体およびペプチド二量体の両方を概して指すように使用される。これらの用語は、本明細書において使用される場合、任意の大きさ、構造、または機能のタンパク質、ミニタンパク質、ポリペプチド、およびペプチドを指す。これらの用語は、ペプチドの二量体またはオリゴマーを指す場合もある。これらの用語は、本明細書において使用される場合、ステープルド、非ステープルド、ステッチド（ｓｔｉｔｃｈｅｄ）、および非ステッチド（ｕｎｓｔｉｔｃｈｅｄ）のポリペプチドを含み得る。典型的には、ペプチドは、少なくとも３アミノ酸長である。ペプチドは、個別のペプチドまたはペプチドの一群を指してもよい。発明的ペプチドは、好ましくは天然アミノ酸のみを含み得るが、あるいは、当該分野で公知のように、非天然アミノ酸（すなわち、自然には発生しないがペプチド鎖に組み込まれ得る化合物）および／またはアミノ酸類似体を代替的に用いてもよい。ペプチド内のアミノ酸のうちの１つ以上は、例えば、炭水化物基、ヒドロキシル基、リン酸基、ファルネシル基、イソファルネシル基、パルミトイル、ゲラニルゲラニル、ラウリル、脂肪酸基、結合、官能化、または他の修飾のためのリンカーなどの化学物質の添加によって修飾されてもよい。ペプチドは、自然発生のタンパク質またはペプチドのほんの断片であってもよい。ペプチドまたはポリペプチドは、自然発生、組換え、もしくは合成、またはそれらの任意の組み合わせであってもよい。
【００３６】
「アミノ酸」という用語は、アミノ基およびカルボキシル基の両方を含有する分子を指す。ある特定の実施形態では、アミノ酸はαアミノ酸である。ある特定の実施形態では、アミノ酸は天然アミノ酸である。ある特定の実施形態では、アミノ酸は非アミノ酸である。公知の非天然アミノ酸は多く存在し、そのいずれも本発明のペプチド内に含まれ得る。例えば、Ｓ．Ｈｕｎｔ，Ｔｈｅ  Ｎｏｎ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ：Ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ（Ｇ．Ｃ．Ｂａｒｒｅｔｔ，ＣｈａｐｍａｎおよびＨａｌｌにより編集、１９８５年）を参照されたい。
【００３７】
例示的なアミノ酸としては、ペプチド内に見出される２０種の一般的な自然発生αアミノ酸のＤ−異性体およびＬ−異性体などの天然αアミノ酸、２０種の一般的な自然発生のアミノ酸ではない天然アミノ酸、および非天然αアミノ酸が挙げられるが、これらに限定されない。本発明のペプチドの構築に使用されるアミノ酸は、有機合成によって調製されても、例えば、天然源の分解または天然源からの単離などの他の経路によって得られてもよい。アミノ酸は、市販のものでも、合成されてもよい。疎水性側鎖を有するアミノ酸には、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、Ｔｒｐ、およびＴｙｒが含まれる。ある特定の実施形態では、疎水性側鎖を有するアミノ酸には、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、およびＶａｌが含まれる。極性中性側鎖を有するアミノ酸には、Ａｓｎ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｍｅｔ、Ｓｅｒ、およびＴｈｒが含まれる。芳香族側鎖を有するアミノ酸には、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、およびＨｉｓが含まれる。疎水性芳香族側鎖を有するアミノ酸には、Ｐｈｅ、Ｔｙｐ、およびＴｙｒが含まれる。荷電側鎖を有するアミノ酸には、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、およびＬｙｓが含まれる。負荷電側鎖には、ＡｓｐおよびＧｌｕが含まれる。正荷電側鎖には、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、およびＬｙｓが含まれる。非負荷電アミノ酸は、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、およびＧｌｎからなる群から選択される。
【００３８】
本明細書において使用される場合、「ペプチドを別のペプチドと架橋させることができるアミノ酸」には、共有結合および非共有結合で架橋させるアミノ酸が含まれる。例えば、共有結合架橋させることができる残基としては、Ｃｙｓ、Ｓｅｃ、アクリルアミドを含む側鎖を形成するようにアクリル酸で修飾されたＤａｐおよびＤａｂなどのアクリルアミド部分を含むアミノ酸が挙げられるが、これらに限定されない。そのようなＤａｂおよびＤａｐ結合アクリルアミド残基は、ＣｙｓまたはＳｅｃ残基に架橋することができる。ペプチドを非共有結合で架橋させることができるアミノ酸残基としては、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３９】
アミノ酸は、ジスルフィド結合、ジセレン結合、スルフィド−セレン結合、炭素−炭素結合、アミド結合、エステル結合、水素結合、塩橋、パイスタッキング相互作用、または非極性疎水性相互作用を介して架橋され得る。ある特定の実施形態では、２つのペプチドは、ジスルフィド結合を介して会合している。ある特定の実施形態では、２つのペプチドは、ジセレン結合を介して会合している。ある特定の実施形態では、２つのペプチドは、水素結合、塩橋、または非極性疎水性相互作用を介して会合している。ある特定の実施形態では、２つのペプチドは、パイスタッキング相互作用を介して会合している。例えば、１つのペプチド上のチロシンは、パイスタッキングを介して、別のペプチド上の別のチロシンと相互作用する。
【００４０】
「相同性」という用語は、本明細書において使用される場合、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列のレベルで高度に関連する核酸またはタンパク質に言及する、当該分野で理解されている用語である。互いに相同である核酸またはタンパク質は、相同体と称される。相同性は、２つの配列（すなわち、ヌクレオチド配列またはアミノ酸）間の配列類似性の度合いを指してもよい。本明細書において言及される相同性割合の値は、２つの配列間で可能な最大の相同性、すなわち、マッチする（相同性の）位置が最も多くなるように２つの配列が整列しているときの相同性パーセントを反映する。相同性は、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８８、Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９３、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８７、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  Ｉ，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４、およびＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．，Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１（これらの各々は参照により本明細書に組み込まれる）に記載される方法などの公知の方法によって容易に計算することができる。配列間の相同性を判定するために一般的に用いられる方法としては、参照により本明細書に組み込まれるＣａｒｉｌｌｏ，Ｈ．，ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．，ＳＩＡＭ  Ｊ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．，４８：１０７３（１９８８）に開示されている方法が挙げられるが、それらに限定されない。相同性を判定するための技法は、公的に利用可能なコンピュータプログラムに成文化されている。２つの配列間の相同性を判定するための例示的なコンピュータソフトウェアとしては、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１２（１），３８７（１９８４））、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、およびＰＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３（１９９０））が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４１】
「相同性」という用語は、本明細書において使用される場合、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列のレベルで高度に関連する核酸またはポリペプチドに言及する、当該分野で理解されている用語である。互いに相同である核酸またはポリペプチドは、「相同体」と称される。
【００４２】
「相同性」という用語は、２つの配列間の比較に言及する。２つのヌクレオチド配列は、それらがコードするポリペプチドが、少なくとも２０個のアミノ酸の少なくとも１つの区間（ｓｔｒｅｔｃｈ）にわたって少なくとも約５０〜６０％同一、好ましくは約７０％同一である場合に、相同であると見なされる。好ましくは、相同性のヌクレオチド配列は、少なくとも４〜５個の一意的に指定されたアミノ酸の一区間をコードする能力も特徴とする。ヌクレオチド配列を相同と見なすには、これらのアミノ酸の同一性、およびそれらの互いに対するおおよその間隔の両方を考慮しなくてはならない。６０ヌクレオチド長未満のヌクレオチド配列については、相同性は、少なくとも４〜５個の一意的に指定されたアミノ酸の一区間をコードする能力によって判定される。
【００４３】
本明細書において使用される場合、「同一性」という用語は、ポリマー分子間、例えば、核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子および／またはＲＮＡ分子）間、および／またはポリペプチド分子間の全体的な関連性を指す。２つの核酸配列の同一性パーセントの計算は、例えば、最適な比較の目的のために２つの配列を整列させることによって実施することができる（例えば、最適な配列比較のために、第１および第２の核酸配列の一方または両方にギャップを導入してもよく、非同一配列は、比較目的で無視してよい）。ある特定の実施形態では、比較目的で整列される配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％である。これで、対応するヌクレオチド位置におけるヌクレオチドが比較される。第１の配列内のある位置が、第２の配列内の対応する位置と同じヌクレオチドで占められているとき、それらの分子はその位置において同一である。２つの配列間の同一性パーセントは、２つの配列の最適な配列比較のために導入される必要があるギャップの数、および各ギャップの長さを考慮した、配列が共有する同一位置の数の関数である。配列の比較、および２つの配列間の同一性パーセントの判定は、数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。例えば、２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８８、Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９３、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８７、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  Ｉ，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４、およびＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．，Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１（これらの各々は参照により本明細書に組み込まれる）に記載される方法などの方法を使用して判定され得る。例えば、２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ＰＡＭ１２０重量残基表、１２のギャップ長さペナルティ、および４のギャップペナルティを用いて、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれているＭｅｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒのアルゴリズム（ＣＡＢＩＯＳ，１９８９，４：１１−１７）を使用して判定されてもよい。２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、代替的に、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックスを用いて、ＧＣＧソフトウェアパッケージ内のＧＡＰプログラムを使用して判定されてもよい。配列間の同一性パーセントを判定するために一般的に用いられる方法としては、参照により本明細書に組み込まれるＣａｒｉｌｌｏ，Ｈ．，ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．，ＳＩＡＭ  Ｊ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．，４８：１０７３（１９８８）に開示されている方法が挙げられるが、それらに限定されない。同一性を判定するための技法は、公的に利用可能なコンピュータプログラムに成文化されている。２つの配列間の相同性を判定するための例示的なコンピュータソフトウェアとしては、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１２（１），３８７（１９８４））、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、およびＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３（１９９０））が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４４】
本明細書において使用される場合、ペプチドを「架橋させること」は、ペプチドを共有結合で架橋させること、またはペプチドを非共有結合で架橋させることのいずれかを指す。ある特定の実施形態では、ペプチドは、共有結合で会合している。共有結合相互作用とは、２つのペプチドが天然または非天然のアミノ酸側鎖などのリンカー基を介して共有結合しているときである。他の実施形態では、ペプチドは、非共有結合で会合している。非共有結合相互作用としては、水素結合、ファンデルワールス相互作用、疎水性相互作用、磁性相互作用、および静電気的相互作用が挙げられる。本明細書におけるペプチドは、ペプチドを別のペプチドと架橋させることができるアミノ酸（例えば、システイン、セレノシステイン、アクリルアミド部分を含むアミノ酸、Ｄａｐ結合アクリルアミド、Ｄａｂ結合アクリルアミド）を含む。ペプチド二量体の場合、本ペプチド二量体は、第１のペプチドを第２のペプチドと架橋させるアミノ酸を含む。本ペプチドは、ペプチドを別のペプチドと架橋させることができる天然または非天然のアミノ酸を含んでもよい。本ペプチド二量体は、第１のペプチドを第２のペプチドと架橋させる天然または非天然のアミノ酸を含んでもよい。
【００４５】
「ペプチドステープリング」は、ペプチド内（イントラペプチド（ｉｎｔｒａｐｅｐｔｉｄｅ））または異なるペプチド間（インターペプチド（ｉｎｔｅｒｐｅｐｔｉｄｅ））で架橋させるための１つの方法である。ペプチドステープリングは、架橋を形成するために閉環メタセシス（ＲＣＭ）反応を使用して１つのペプチドまたは複数の異なるペプチド内に存在する２つのオレフィン含有側鎖が共有結合で連結される（「ステープルされる」）合成方法論を表す（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．（２００１）ｖｏｌ．６６，ｉｓｓｕｅ  １６の表紙絵（αヘリックスペプチドのメタセシスに基づく架橋を表している）、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．（１９９４）３７：３２８１、および米国第７，１９２，７１３号を参照されたい）。「ペプチドステッチング」は、複数回ステープルされた（「ステッチされた」としても知られる）ポリペプチドを提供するための、単一のポリペプチド鎖内の複数の「ステープリング」事象を伴う（例えば、Ｗａｌｅｎｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００４）３０５：１４６６−１４７０、米国特許第７，１９２，７１３号、米国特許第７，７８６，０７２号、米国特許第８，５９２，３７７号、米国特許第７，１９２，７１３号、米国特許出願公開第２００６／０００８８４８号、米国特許出願公開第２０１２／０２７０８００号、国際公開第ＷＯ  ２００８／１２１７６７号、および国際公開第ＷＯ  ２０１１／００８２６０号を参照されたい）。全炭化水素架橋を使用したペプチドのステープリングは、特に生理学的に関連性のある障害において、ペプチドの天然の高次構造および／または二次構造を維持するのに役立つことが示されている（Ｓｃｈａｆｍｉｅｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（２０００）１２２：５８９１−５８９２、Ｗａｌｅｎｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００４）３０５：１４６６−１４７０を参照されたい）。ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるペプチド内に見出される非天然アミノ酸は、閉環メタセシス（ＲＣＭ）反応などの架橋反応を使用し、オレフィン部分を用いて共有結合で連結される（すなわち、「一緒にステープルされる」）ことができる側鎖を含む。関連するペプチドステープリングまたはペプチドステッチングの追加の説明は、国際公開第２０１０／０１１３１３号、国際公開第２０１２／０４０４５９号、国際公開第２０１２／１７４４２３号、ならびにＰＣＴ／ＵＳ出願第２０１３／０６２００４号、米国特許出願第６１／４７８８４５号、同第６１／４７８８６２号、同第６１／７０５９５０号、同第６１／７８９１５７号、および同第６１／７０８３７１号に見出すことができ、これらは全て、参照により本明細書に組み込まれる。
【００４６】
「Ｒａｓ」という用語は、Ｒａｓタンパク質ファミリーまたはその変異体を指す。Ｒａｓタンパク質は、いくつかのシグナル伝達経路内で機能し、Ｒａｓエフェクタードメインを介した結合によっていくつかの下流タンパク質（エフェクター）を活性化させることができる、小型細胞質ＧＴＰアーゼである。Ｒａｓタンパク質は、上流因子によって、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ、「オン」）状態とグアノシン二リン酸（ＧＤＰ、「オフ」）状態との間で切り替えられる。ヒトには、３つのＲａｓアイソフォーム：ＫＲａｓ、ＨＲａｓ、およびＮＲａｓが存在し、ＫＲａｓには２つのスプライスバリアント、すなわちＫＲａｓ４ＡおよびＫＲａｓ４Ｂがある。活性Ｒａｓタンパク質は、脂質（典型的にはファルネシルまたはゲラニルゲラニル基）の翻訳後結合によって膜に局在化し、典型的には、エフェクタータンパク質のＲａｓ結合ドメイン（ＲＢＤ）に結合することによってそれらを活性化させ、それによってそれらを膜に動員し、ここでそれらは様々な機構を介して活性化される。
【００４７】
本明細書において使用される場合、「疾患」および「障害」という用語は、互換的に使用される。
【００４８】
投与が企図される「対象」としては、ヒト（すなわち、任意の年齢群の男性または女性、例えば、小児科の対象（例えば、乳児、小児、青年）または成人対象（例えば、若年成人、中年成人、または高齢成人））、ならびに／または他の非ヒト動物、例えば哺乳動物（例えば、霊長類（例えば、カニクイザル、アカゲザル）、商業的に関連のある哺乳動物、例えばウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、および／またはイヌなど）、トリ（例えば、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、および／またはシチメンチョウなどの商業的に関連のあるトリ）、爬虫類、両生類、および魚が挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、非ヒト動物は哺乳動物である。非ヒト動物は雄でも雌でもよく、いずれの発達段階にあってもよい。非ヒト動物はトランスジェニック動物であってもよい。
【００４９】
本明細書において使用される場合、かつ別段の記載がない限り、「処置する（ｔｒｅａｔ）」、「処置すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、および「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」という用語は、対象が障害を患っている間に行われる、障害の重症度を低減させる行為、または障害の進行を遅延もしくは減速させる行為（「治療的処置」）を企図し、また、対象が障害を患い始める前に行われ、かつ障害の重症度を抑制もしくは低減させる行為（「予防的処置」）も企図する。
【００５０】
概して、ペプチドの「有効量」は、所望の生物学的応答、すなわち、障害の処置を誘起するのに十分な量を指す。当業者には理解されるように、本発明のペプチドの有効量は、所望の生物学的エンドポイント、化合物の薬物動態、処置される障害、投与形態、および年齢、健康状態、および対象などの要因に応じて変動し得る。有効量は、治療的処置および予防的処置を包含する。
【００５１】
本明細書において使用される場合、かつ別段の記載がない限り、ペプチドの「治療有効量」は、障害の処置において治療的利益を提供するため、または障害に関連する１つ以上の症状を遅延させるかもしくは最低限に抑えるために十分な量である。ペプチドの治療有効量は、単独または他の療法との組み合わせで、障害の処置において治療的利益を提供する治療的薬剤の量を意味する。「治療有効量」という用語は、全体的な療法を改善するか、障害の症状もしくは病因を低減または回避するか、あるいは別の治療的薬剤の治療有効性を向上させる量を包含してもよい。
【００５２】
本明細書において使用される場合、かつ別段の記載がない限り、ペプチドの「予防的有効量」は、障害もしくは障害に関連する１つ以上の症状を防止するため、またはその再発を防止するために十分な量である。ペプチドの予防的有効量は、単独または他の薬剤との組み合わせで、障害の防止において予防的利益を提供する治療的薬剤の量を意味する。「予防的有効量」という用語は、全体的な予防法を改善するか、または別の予防的薬剤の予防的有効性を向上させる量を包含してもよい。
【００５３】
「Ｒａｓ／ＭＡＰＫ症候群」（単数または複数）という用語は、Ｒａｓ／マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）経路の構成要素または制御因子をコードする遺伝子内の生殖細胞系列変異によって引き起こされる医学的遺伝症候群の臨床的に定義された群である。これらの障害には、神経線維腫症１型、Ｎｏｏｎａｎ症候群、多発性黒子を伴うＮｏｏｎａｎ症候群、毛細血管奇形−動静脈奇形症候群、Ｃｏｓｔｅｌｌｏ症候群、心臓−顔−皮膚（ＣＦＣ）症候群、およびＬｅｇｉｕｓ症候群が含まれる。根底にある共通のＲａｓ／ＭＡＰＫ経路調節不全のため、Ｒａｓ／ＭＡＰＫ症候群は、多くの重複する表現型特徴を示す。Ｒａｓ／ＭＡＰＫ経路は、細胞周期ならびに細胞の成長、分化、および老化の制御において必須の役割を果たし、これらは全て、正常な発達に非常に重要である。したがって、Ｒａｓ／ＭＡＰＫ経路調節不全は、発達の胎生期および後期の両方に深刻な有害作用を及ぼす。Ｒａｓ／ＭＡＰＫ経路は癌において研究されており、様々な悪性腫瘍を処置するための小分子抑制の標的である。
【００５４】
「脂肪族」という用語は、アルキル、アルケニル、アルキニル、および炭素環基を指す。同様に、「ヘテロ脂肪族」という用語は、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル、および複素環基を指す。
【００５５】
「アルキル」という用語は、１〜１０個の炭素原子を有する直鎖または分岐状の飽和炭化水素基のラジカル（「Ｃ１−１０アルキル」）を指す。一部の実施形態では、アルキル基は、１〜９個の炭素原子を有する（「Ｃ１−９アルキル」）。一部の実施形態では、アルキル基は、１〜８個の炭素原子を有する（「Ｃ１−８アルキル」）。一部の実施形態では、アルキル基は、１〜７個の炭素原子を有する（「Ｃ１−７アルキル」）。一部の実施形態では、アルキル基は、１〜６個の炭素原子を有する（「Ｃ１−６アルキル」）。一部の実施形態では、アルキル基は、１〜５個の炭素原子を有する（「Ｃ１−５アルキル」）。一部の実施形態では、アルキル基は、１〜４個の炭素原子を有する（「Ｃ１−４アルキル」）。一部の実施形態では、アルキル基は、１〜３個の炭素原子を有する（「Ｃ１−３アルキル」）。一部の実施形態では、アルキル基は、１〜２個の炭素原子を有する（「Ｃ１−２アルキル」）。一部の実施形態では、アルキル基は、１個の炭素原子を有する（「Ｃ１アルキル」）。一部の実施形態では、アルキル基は、２〜６個の炭素原子を有する。（「Ｃ２−６アルキル」）。Ｃ１−６アルキル基の例としては、メチル（Ｃ１）、エチル（Ｃ２）、プロピル（Ｃ３）（例えば、ｎ−プロピル、イソプロピル）、ブチル（Ｃ４）（例えば、ｎ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル）、ペンチル（Ｃ５）（例えば、ｎ−ペンチル、３−ペンタニル、アミル、ネオペンチル、３−メチル−２−ブタニル、三級アミル）、およびヘキシル（Ｃ６）（例えば、ｎ−ヘキシル）が挙げられる。アルキル基の追加の例としては、ｎ−ヘプチル（Ｃ７）、ｎ−オクチル（Ｃ８）などが挙げられる。別段の記載がない限り、アルキル基の各事例は、独立して、非置換（「非置換アルキル」）であるか、または１つ以上の置換基（例えば、Ｆなどのハロゲン）で置換されている（「置換アルキル」）。ある特定の実施形態では、アルキル基は、非置換Ｃ１−１０アルキル（例えば、非置換Ｃ１−６アルキル、例えば、−ＣＨ３（Ｍｅ）、非置換エチル（Ｅｔ）、非置換プロピル（Ｐｒ、例えば、非置換ｎ−プロピル（ｎ−Ｐｒ）、非置換イソプロピル（ｉ−Ｐｒ））、非置換ブチル（Ｂｕ、例えば、非置換ｎ−ブチル（ｎ−Ｂｕ）、非置換ｔｅｒｔ−ブチル（ｔｅｒｔ−Ｂｕまたはｔ−Ｂｕ）、非置換ｓｅｃ−ブチル（ｓｅｃ−Ｂｕ）、非置換イソブチル（ｉ−Ｂｕ）など）である。ある特定の実施形態では、アルキル基は、置換Ｃ１−１０アルキル（例えば、置換Ｃ１−６アルキル、例えば、−ＣＦ３、Ｂｎなど）である。
【００５６】
「アリール」という用語は、６〜１４個の環炭素原子および０個のヘテロ原子が芳香環系内に提供されている、単環式または多環式（例えば、二環式または三環式）４ｎ＋２芳香環系の（例えば、環状アレイ内で共有される６個、１０個、または１４個のπ電子を有する）ラジカル（「Ｃ６−１４アリール」）を指す。一部の実施形態では、アリール基は、６個の環炭素原子を有する（「Ｃ６アリール」、例えばフェニル）。一部の実施形態では、アリール基は、１０個の環炭素原子を有する（「Ｃ１０アリール」、例えば、１−ナフチルおよび２−ナフチルなどのナフチル）。一部の実施形態では、アリール基は、１４個の環炭素原子を有する（「Ｃ１４アリール」、例えばアントラシル）。「アリール」には、上記に定義されたアリール環が１つ以上のカルボシクリル基またはヘテロシクリル基と縮合しており、ラジカルまたは結合点がアリール環上にある環系も含まれ、そのような事例では、炭素原子の数が、続いてアリール環系内の炭素原子の数を指定する。別段の記載がない限り、アリール基の各事例は、独立して、非置換（「非置換アリール」）であるか、または１つ以上の置換基で置換されている（「置換アリール」）。ある特定の実施形態では、アリール基は、非置換Ｃ６−１４アリールである。ある特定の実施形態では、アリール基は、置換Ｃ６−１４アリールである。
【００５７】
「ヘテロアリール」という用語は、環炭素原子および１〜４個の環ヘテロ原子が芳香環系内に提供されている（ここで各ヘテロ原子は、独立して、窒素、酸素、および硫黄から選択される）、５〜１４員の単環式または多環式（例えば、二環式、三環式）４ｎ＋２芳香環系の（例えば、環状アレイ内で共有される６個、１０個、または１４個のπ電子を有する）ラジカル（「５〜１４員ヘテロアリール」）を指す。１つ以上の窒素原子を含有するヘテロアリール基では、結合点は、結合価が許す限り、炭素または窒素原子であってもよい。ヘテロアリール多環式環系は、一方または両方の環内に１つ以上のヘテロ原子を含み得る。「ヘテロアリール」には、上記に定義されたヘテロアリール環が１つ以上のカルボシクリル基またはヘテロシクリル基と縮合しており、結合点がヘテロアリール環上にある環系が含まれ、そのような事例では、環員の数が、続いてヘテロアリール環系内の環員の数を指定する。「ヘテロアリール」には、上記に定義されたヘテロアリール環が１つ以上のアリール基と縮合しており、結合点がアリールまたはヘテロアリール環のいずれかの上にある環系も含まれ、そのような事例では、環員の数が、縮合多環式（アリール／ヘテロアリール）環系内の環員の数を指定する。１つの環がヘテロ原子を含有しない多環式ヘテロアリール基（例えば、インドリル、キノリル、カルバゾリルなど）結合点は、いずれの環、すなわち、ヘテロ原子を保有する環（例えば、２−インドリル）またはヘテロ原子を含有しない環（例えば、５−インドリル）のいずれの上にあってもよい。
【００５８】
一部の実施形態では、ヘテロアリール基は、環炭素原子および１〜４個の環ヘテロ原子が芳香環系内に提供されている（ここで各ヘテロ原子は、独立して、窒素、酸素、および硫黄から選択される）、５〜１０員芳香環系（「５〜１０員ヘテロアリール」）である。一部の実施形態では、ヘテロアリール基は、環炭素原子および１〜４個の環ヘテロ原子が芳香環系内に提供されている（ここで各ヘテロ原子は、独立して、窒素、酸素、および硫黄から選択される）、５〜８員芳香環系（「５〜８員ヘテロアリール」）である。一部の実施形態では、ヘテロアリール基は、環炭素原子および１〜４個の環ヘテロ原子が芳香環系内に提供されている（ここで各ヘテロ原子は、独立して、窒素、酸素、および硫黄から選択される）、５〜６員芳香環系（「５〜６員ヘテロアリール」）である。一部の実施形態では、５〜６員ヘテロアリールは、窒素、酸素、および硫黄から選択される１〜３個の環ヘテロ原子を有する。一部の実施形態では、５〜６員ヘテロアリールは、窒素、酸素、および硫黄から選択される１〜２個の環ヘテロ原子を有する。一部の実施形態では、５〜６員ヘテロアリールは、窒素、酸素、および硫黄から選択される１個の環ヘテロ原子を有する。別段の記載がない限り、ヘテロアリール基の各事例は、独立して、非置換（「非置換ヘテロアリール」）であるか、１つ以上の置換基で置換されている（「置換ヘテロアリール」）。ある特定の実施形態では、ヘテロアリール基は、非置換５〜１４員ヘテロアリールである。ある特定の実施形態では、ヘテロアリール基は、置換５〜１４員ヘテロアリールである。
【００５９】
１個のヘテロ原子を含有する例示的な５員ヘテロアリール基としては、ピロリル、フラニル、およびチオフェニルが挙げられるが、これらに限定されない。２個のヘテロ原子を含有する例示的な５員ヘテロアリール基としては、イミダゾリル、ピラゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、チアゾリル、およびイソチアゾリルが挙げられるが、これらに限定されない。３個のヘテロ原子を含有する例示的な５員ヘテロアリール基としては、トリアゾリル、オキサジアゾリル、およびチアジアゾリルが挙げられるが、これらに限定されない。４個のヘテロ原子を含有する例示的な５員ヘテロアリール基としては、テトラゾリルが挙げられるが、これに限定されない。１個のヘテロ原子を含有する例示的な６員ヘテロアリール基としては、ピリジニルが挙げられるが、これに限定されない。２個のヘテロ原子を含有する例示的な６員ヘテロアリール基としては、ピリダジニル、ピリミジニル、およびピラジニルが挙げられるが、これらに限定されない。３個または４個のヘテロ原子を含有する例示的な６員ヘテロアリール基としては、それぞれトリアジニルおよびテトラジニルが挙げられるが、これらに限定されない。１個のヘテロ原子を含有する例示的な７員ヘテロアリール基としては、アゼピニル、オキセピニル、およびチエピニルが挙げられるが、これらに限定されない。例示的な５，６−二環式ヘテロアリール基としては、インドリル、イソインドリル、インダゾリル、ベンゾトリアゾリル、ベンゾチオフェニル、イソベンゾチオフェニル、ベンゾフラニル、ベンゾイソフラニル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾイソオキサゾリル、ベンゾオキサジアゾリル、ベンズチアゾリル、ベンゾイソチアゾリル、ベンズチアジアゾリル、インドリジニル、およびプリニルが挙げられるが、これらに限定されない。例示的な６，６−二環式ヘテロアリール基としては、ナフチリジニル、プテリジニル、キノリニル、イソキノリニル、シンノリニル、キノキサリニル、フタラジニル、およびキナゾリニルが挙げられるが、これらに限定されない。例示的な三環式ヘテロアリール基としては、フェナントリジニル、ジベンゾフラニル、カルバゾリル、アクリジニル、フェノチアジニル、フェノキサジニル、およびフェナジニルが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６０】
「チオール」という用語は、−ＳＨ基（例えば、Ｃｙｓ側鎖に見出される）、−ＳＲＳ基、または−Ｓ−Ｓ−部分を含む分子を指す。例えば、「有機チオール分子」には、２，２’−ジピリジルジスルフィド、４，４’−ジピリジルジスルフィド、または２，２’−ジチオビス（５−ニトロピリジン）などの分子が含まれる。「有機チオール小部分」という表現は、硫黄を含む有機基、例えば−ＳＲＳなどを含み、ここでＲＳは、置換または非置換のＣ１−５アルキルである。そのような部分は、それぞれジスルフィド結合またはセレン−スルフィド結合を介して、他のチオールまたはセレン部分に結合することができる。例えば、ｔ−ブチルチオールに結合したＣｙｓ側鎖は、以下の構造を有する。
【化１】
0006759109.tif 000002
【００６１】
本明細書で使用される略語の一覧を以下に提供する。
【表１】
0006759109.tif 000003
【発明を実施するための形態】
【００６２】
ヒト疾患の分子機構の理解においては進展がなされているが、治療的利益のためにこれらの発見を利用する能力は、疾患の原因となるプロセスを標的とする薬物を作製する能力の欠如により限定されることが多い。多くの疾患は、タンパク質の異常な活性に関連付けることができ、酵素および細胞外標的の抑制剤の開発は実行可能なことが多いが、これらのタンパク質は、全てのタンパク質の小部分しか占めない。残りのタンパク質は、ほとんどの場合、治療上御しにくいと見なされ、時に「創薬が困難である」と称される。「創薬が困難な」タンパク質標的の一例はＲａｓであり、Ｒａｓは、癌などの幅広いヒト疾患の惹起および進行の両方に関連付けられるが、未だ現代の治療学の範疇外である。これは主に、このタンパク質を生物製剤に接近不能にするＲａｓの細胞内局在、および典型的には細胞に進入することができる小分子に対するそれらの抵抗性の結果である。Ｒａｓの１つの疎水性ポケット（ヌクレオチド結合部位）を標的とする試みは、グアニンヌクレオチドに対するＲａｓタンパク質の極端に高い（ピコモルの）親和性、および細胞内のこれらのヌクレオチドの比較的高い存在量を主因として、成功していない。多くのペプチド治療薬は、細胞に進入する能力が限定されている。しかしながら、ある特定の小タンパク質（ペプチド）は、適切な化学修飾により細胞に進入することができる。ペプチドは多くの場合、タンパク質表面に結合するのに十分に大きく、それらのタンパク質標的に対して高い親和性および特異性を有するように修飾された場合、インビボでタンパク質−タンパク質相互作用の有効な抑制剤として働くことが示されている。
【００６３】
従来型の療法では現在処置できないタンパク質標的のタンパク質−タンパク質相互作用を抑制するペプチドが、本明細書において提供される。本ペプチドは、αヘリックスドメインを含む足場に基づく。αヘリックスは、タンパク質における最も一般的な二次構造であり、αヘリックスは、非常に重要なタンパク質−タンパク質相互作用に関与することが多い。したがってαヘリックスは、特に、疾患の原因となるタンパク質−タンパク質相互作用を妨害するために使用され得るため、潜在的な治療薬として魅力的である。
【００６４】
ある特定の実施形態では、本明細書において提供されるペプチドは、ポリプロリンＩＩ型ヘリックスドメイン、リンカードメイン、およびαヘリックスドメインを含む。これらのタンパク質は、タンパク質標的に結合し、それによってタンパク質−タンパク質相互作用を妨害し得る。発明的タンパク質の標的の例としては、Ｒａｓ腫瘍性タンパク質が挙げられる。本ペプチドは、それらの標的の表面に結合し、標的の活性（例えば、Ｒａｓの発癌活性）に必要とされるパートナー分子との主要な相互作用を遮断する。他の標的としては、Ｍｙｃ／Ｍａｘヘテロ二量体およびＲａｌＡタンパク質が挙げられる。
【００６５】
本明細書において提供されるペプチドは、膵臓ポリペプチドファミリーに基づく。ある特定の実施形態では、本明細書において提供されるペプチドは、トリ、ヒト、ウシ、ヒツジ、ブタ、イヌの膵臓ポリペプチド、およびそれらの変異体に基づく。ある特定の実施形態では、本明細書において提供されるペプチドは、トリ膵臓ポリペプチド（ａＰＰ）、ならびにその誘導体および変異体に基づく。本明細書において提供されるペプチドは、ポリプロリンＩＩ型ヘリックスドメイン、リンカードメイン、およびＣ末端αヘリックスドメインを含み、本ペプチドは、ペプチドを別のペプチドに架橋させることができる部分を含む。一般的なペプチド二量体の一例は図２３に示される。ポリプロリンＩＩ型ヘリックスドメイン、リンカードメイン、およびＣ末端αヘリックスドメインを各々が含む２つのペプチドのペプチド二量体も本明細書において提供され、ここで各ペプチドは、別のペプチド単量体と共有結合または非共有結合で架橋することができる部分を含む。本ペプチド二量体は、ホモ二量体でもヘテロ二量体でもよい。
【００６６】
「ペプチド」という用語は、本明細書において、ペプチド単量体およびペプチド二量体の両方を指すように使用される。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、化学的に安定化され、かつ／または細胞浸透性である。化学的安定化の例としては、本明細書に記載される架橋、ペプチドステープリング、ペプチドステッチング、またはペプチド環化（例えば、Ｎ末端およびＣ末端がアミド結合で結合して連続的なアミド骨格を形成する、またはＮ末端上の側鎖がＣ末端上の側鎖に架橋する）が挙げられる。タンパク質分解への抵抗は、Ｄ−アミノ酸の組み込み、個別のペプチド単量体のエンドキャッピングまたは環化を含むがこれらに限定されない様々な方法を使用して達成することができる。ある特定の実施形態では、環化は、頭−尾環化によるものである。これは、本発明者らの結晶構造に見られるように、Ｎ末端およびＣ末端が空間的に近接しているという事実を利用する。これは、アミド結合を形成するようにＮ末端およびＣ末端をカップリングすることによって、または、Ｎ末端およびＣ末端であるか、もしくはそれらに近接している２個の残基の側鎖をカップリングすることによって達成することができる。ステープルドペプチドまたはステッチドペプチドは、例えば、Ｗａｌｅｎｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００４）３０５：１４６６−１４７０、米国特許第８，５９２，３７７号、米国特許第７，１９２，７１３号、米国特許出願公開第２００６／０００８８４８号、米国特許出願公開第２０１２／０２７０８００号、国際公開第ＷＯ  ２００８／１２１７６７号、および国際公開第ＷＯ  ２０１１／００８２６０号に記載されており、これらの各々は参照により本明細書に組み込まれる。
【００６７】
タンパク質標的、例えばＲａｓ、Ｍｙｃ／Ｍａｘ、ＲａｌＡ、または他の標的などに対する向上した結合性について、ディスプレイ技術（例えば、酵母細胞ディスプレイ、細菌細胞ディスプレイ、またはファージディスプレイ）を使用して、ペプチド二量体のライブラリをスクリーニングする方法が、本明細書においてさらに提供される。タンパク質−タンパク質相互作用の抑制剤として有用なペプチドを含む薬学的組成物、方法、使用、およびキットも本明細書において提供される。一部の場合では、ペプチドを含む本薬学的組成物、方法、使用、およびキットは、Ｒａｓ腫瘍性タンパク質などの従来型の療法およびエフェクター分子とのその相互作用では現在標的とすることができない、タンパク質−タンパク質相互作用の抑制剤として有用である。本明細書に記載されるペプチドで防止および／または処置され得る例示的な疾患としては、増殖性疾患（例えば、癌）および他の疾患、障害、または状態（例えば、Ｒａｓ／ＭＡＰＫ症候群）が挙げられる。
【００６８】
ペプチド
本ペプチドは、ａＰＰ足場であるＧＰＳＱＰＴＹＰＧＤＤＡＰＶＥＤＬＩＲＦＹＮＤＬＱＱＹＬＮＶＶＡ（配列番号４９）に基づき、タンパク質標的に結合する。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、Ｒａｓ、Ｍｙｃ／Ｍａｘ、および／またはＲａｌＡに結合する。ある特定の実施形態では、本ペプチドはＲａｓに結合する。ある特定の実施形態では、本ペプチドはＭｙｃ／Ｍａｘに結合する。ある特定の実施形態では、本ペプチドはＲａｌＡに結合する。ある特定の実施形態では、本ペプチドはＫＲａｓおよびＲａｌＡの両方に結合する。
【００６９】
ある特定の実施形態では、配列：Ｘ１ＰＸ３Ｘ４ＰＸ６Ｘ７ＰＧＸ１０Ｘ１１ＡＸ１３Ｘ１４Ｘ１５ＤＬＸ１８Ｘ１９ＹＸ２１Ｘ２２ＲＬＸ２５Ｘ２６ＹＬＸ２９Ｘ３０ＶＡ（配列番号１）を含むペプチドが本明細書において提供され、本ペプチドは、ペプチドを別のペプチドと架橋させることができる１〜２個のアミノ酸を含む。ある特定の実施形態では、ペプチドを別のペプチドと架橋させることができるアミノ酸は、共有結合架橋させることができる。第２のペプチドと会合した第１のペプチドを含むペプチド二量体であって、第１および第２のペプチドは各々、独立して、配列番号１のペプチドを含み、第１および第２のペプチドは各々、第１のペプチドを第２のペプチドと架橋させる１〜２個のアミノ酸を含む、ペプチド二量体も提供される。ある特定の実施形態では、本ペプチド二量体は、共有結合で架橋している。Ｘ１は、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、またはペプチドを別のペプチドと架橋させることができるアミノ酸である。ある特定の実施形態では、Ｘ１は、配列番号１に存在しない。Ｘ３、Ｘ４、およびＸ６は各々、独立して、荷電アミノ酸である。Ｘ１０は荷電アミノ酸である。Ｘ１１は、荷電アミノ酸、またはペプチドを別のペプチドと架橋させることができるアミノ酸である。Ｘ７は、Ｔｙｒ、またはペプチドを別のペプチドと架橋させることができるアミノ酸である。Ｘ１３は、Ｓｅｒ、またはペプチドを別のペプチドと架橋させることができるアミノ酸である。Ｘ１４は、ＩｌｅまたはＧｌｕである。Ｘ１５は、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、またはＧｌｙである。Ｘ１８は、芳香族アミノ酸または疎水性アミノ酸である。Ｘ１９は、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｌａ、またはＴｒｐである。Ｘ２１、Ｘ２５、およびＸ２９は各々、独立して、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓ、またはシクロヘキシル側鎖を有するアミノ酸であり、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、またはシクロヘキシル側鎖は、１つ以上のフッ素で置換されていてもよい。Ｘ２２は、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、またはＶａｌである。Ｘ２６は、Ａｓｎ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、またはＨｉｓである。Ｘ３０は、ＡｌａまたはＡｒｇである。
【００７０】
ある特定の実施形態では、配列：Ｘ１ＰＸ３Ｘ４ＰＸ６Ｘ７ＰＧＸ１０Ｘ１１ＡＸ１３Ｘ１４Ｘ１５ＤＬＸ１８Ｘ１９Ｘ２０Ｘ２１Ｘ２２Ｘ２３ＬＸ２５Ｘ２６ＹＬＸ２９Ｘ３０ＶＡ（配列番号１２）を含むペプチドが本明細書において提供され、本ペプチドは、ペプチドを別のペプチドと架橋させることができる１〜２個のアミノ酸を含む。ある特定の実施形態では、ペプチドを別のペプチドと架橋させることができるアミノ酸は、共有結合架橋させることができる。第２のペプチドと会合した第１のペプチドを含むペプチド二量体であって、第１および第２のペプチドは各々、独立して、配列番号１２のペプチドを含み、第１および第２のペプチドは各々、第１のペプチドを第２のペプチドと架橋させる１〜２個のアミノ酸を含む、ペプチド二量体も提供される。ある特定の実施形態では、本ペプチド二量体は、共有結合で架橋している。Ｘ１は、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、またはペプチドを別のペプチドと架橋させることができるアミノ酸である。ある特定の実施形態では、Ｘ１は、配列番号１２に存在しない。Ｘ３、Ｘ４、およびＸ６は各々、独立して、荷電アミノ酸である。Ｘ１０は荷電アミノ酸である。Ｘ１１は、荷電アミノ酸、またはペプチドを別のペプチドと架橋させることができるアミノ酸である。Ｘ７は、Ｔｙｒ、またはペプチドを別のペプチドと架橋させることができるアミノ酸である。Ｘ１３は、Ｓｅｒ、Ｐｒｏ、またはペプチドを別のペプチドと架橋させることができるアミノ酸である。Ｘ１４は、Ｉｌｅ、Ｇｌｕ、またはＶａｌである。Ｘ１５は、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、またはＧｌｙである。Ｘ１８は、芳香族アミノ酸または疎水性アミノ酸である。Ｘ１９は、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｌａ、Ｔｒｐ、またはＡｒｇである。Ｘ２０は、ＴｙｒまたはＰｈｅである。Ｘ２１は、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓ、またはシクロヘキシル側鎖を有するアミノ酸であり、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、シクロヘキシル側鎖は、１つ以上のフッ素で置換されていてもよい。Ｘ２２は、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、またはＡｓｎである。Ｘ２３は、ＡｒｇまたはＡｓｐである。Ｘ２５は、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ、またはシクロヘキシル側鎖を有するアミノ酸であり、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、シクロヘキシル側鎖は、１つ以上のフッ素で置換されていてもよい。Ｘ２６は、Ａｓｎ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｈｉｓ、またはＧｌｎである。Ｘ２９は、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓ、Ａｓｎ、またはシクロヘキシル側鎖を有するアミノ酸であり、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、シクロヘキシル側鎖は、１つ以上のフッ素で置換されていてもよい。Ｘ３０は、Ａｌａ、Ａｒｇ、またはＶａｌである。
【００７１】
ある特定の実施形態では、配列：
Ｘ−６Ｘ−５Ｘ−４Ｘ−３Ｘ−２Ｘ−１Ｘ１ＰＸ３Ｘ４ＰＸ６Ｘ７ＰＧＸ１０Ｘ１１ＡＸ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６ＬＸ１８Ｘ１９Ｘ２０Ｘ２１Ｘ２２Ｘ２３ＬＸ２５Ｘ２６ＹＬＸ２９Ｘ３０Ｘ３１Ｘ３２（配列番号１３）を含むペプチドが本明細書において提供され、本ペプチドは、ペプチドを別のペプチドと架橋させることができる１〜２個のアミノ酸を含む。ある特定の実施形態では、ペプチドを別のペプチドと架橋させることができるアミノ酸は、共有結合架橋させることができる。第２のペプチドと会合した第１のペプチドを含むペプチド二量体であって、第１および第２のペプチドは各々、独立して、配列番号１３のペプチドを含み、第１および第２のペプチドは各々、第１のペプチドを第２のペプチドと架橋させる１〜２個のアミノ酸を含む、ペプチド二量体も提供される。ある特定の実施形態では、本ペプチド二量体は、共有結合で架橋している。Ｘ３およびＸ４は各々、独立して、中性アミノ酸または荷電アミノ酸である。Ｘ６は、荷電アミノ酸、またはペプチドを別のペプチドと架橋させることができるアミノ酸である。Ｘ７は、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ、またはペプチドを別のペプチドと架橋させることができるアミノ酸である。Ｘ１０は、Ｐｒｏ、荷電アミノ酸、またはペプチドを別のペプチドと架橋させることができるアミノ酸である。Ｘ１１は、Ａｌａ、Ｓｅｒ、中性アミノ酸もしくは荷電アミノ酸、またはペプチドを別のペプチドと架橋させることができるアミノ酸である。Ｘ１３は、Ｓｅｒ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、またはペプチドを別のペプチドと架橋させることができるアミノ酸である。Ｘ１４は、Ｉｌｅ、Ｇｌｕ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、またはペプチドを別のペプチドと架橋させることができるアミノ酸である。Ｘ１５は、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、またはＧｌｙである。Ｘ１６は、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｌａ、またはＳｅｒである。Ｘ１８は、芳香族アミノ酸または疎水性アミノ酸である。Ｘ１９は、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｒｐ、またはＡｒｇである。Ｘ２０は、ＴｙｒまたはＰｈｅである。Ｘ２１は、Ｇｌｎ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓ、またはシクロヘキシル側鎖を有するアミノ酸であり、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、シクロヘキシル側鎖は、１つ以上のフッ素で置換されていてもよい。Ｘ２２は、Ａｌａ、Ｇｌｎ、Ｔｒｐ、Ｌｅｕ、Ｔｙｒ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、またはＡｓｎである。Ｘ２３は、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｌｅｕ、またはＡｌａである。Ｘ２５は、Ｇｌｎ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、またはシクロヘキシル側鎖を有するアミノ酸であり、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、シクロヘキシル側鎖は、１つ以上のフッ素で置換されていてもよい。Ｘ２６は、Ａｓｎ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ａｒｇ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ｈｉｓ、またはＧｌｎである。Ｘ２９は、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓ、またはシクロヘキシル側鎖を有するアミノ酸であり、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、シクロヘキシル側鎖は、１つ以上のフッ素で置換されていてもよい。Ｘ３０は、Ａｌａ、Ａｒｇ、またはＶａｌである。Ｘ３１は、Ｖ、またはペプチドを別のペプチドと架橋させることができるアミノ酸である。Ｘ３２は、Ｖ、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、またはペプチドを別のペプチドと架橋させることができるアミノ酸である。
【００７２】
配列番号１３の任意選択の残基は、Ｘ−６、Ｘ−５、Ｘ−４、Ｘ−３、Ｘ−２、Ｘ−１、およびＸ１である。Ｘ−６が存在する場合、Ｘ−６はＧｌｙであり、Ｘ−５〜Ｘ１は存在する。Ｘ−５が存在する場合、Ｘ−５はＣｙｓまたはＳｅｃであり、Ｘ−４〜Ｘ１は存在する。Ｘ−４が存在する場合、Ｘ−４はＧｌｙであり、Ｘ−３〜Ｘ１は存在する。Ｘ−３が存在する場合、Ｘ−３はＧｌｙであり、Ｘ−２〜Ｘ１は存在する。Ｘ−２が存在する場合、Ｘ−２はＰｒｏ、Ｃｙｓ、Ｓｅｃ、またはＧｌｙであり、Ｘ−１およびＸ１は存在する。Ｘ−１が存在する場合、Ｘ−１はＡｒｇまたはＧｌｙであり、Ｘ１は存在する。Ｘ１が存在するとき、Ｘ１はＧｌｙ、Ａｒｇ、またはペプチドを別のペプチドと架橋させることができるアミノ酸である。Ｘ１の追加の実施形態が本明細書に記載される。
【００７３】
配列番号１３のある特定の実施形態では、Ｘ−６〜Ｘ１は存在せず、Ｘ１１、Ｘ１５、Ｘ１６、Ｘ１９は各々、ＡｌａまたはＳｅｒであり、Ｘ１８はＨｉｓであり、Ｘ２０はＴｙｒであり、Ｘ２６はＡｓｎである。配列番号１３のある特定の実施形態では、Ｘ−６〜Ｘ１は存在せず、Ｘ１１、Ｘ１５、Ｘ１６、Ｘ１９は各々、Ａｌａであり、Ｘ１８はＨｉｓであり、Ｘ２０はＴｙｒであり、Ｘ２６はＡｓｎである。
【００７４】
ある特定の実施形態では、配列：Ｘ１ＰＸ３Ｘ４ＰＸ６Ｘ７  ＰＧＸ１０ＡＡＸ１３Ｘ１４ＡＡＬＨＡＹＸ２１ＡＸ２３ＬＸ２５ＮＹＬＸ２９Ｘ３０ＶＸ３２（配列番号４８）を含むペプチドが本明細書において提供され、本ペプチドは、ペプチドを別のペプチドと架橋させることができる１〜２個のアミノ酸を含む。ある特定の実施形態では、ペプチドを別のペプチドと架橋させることができるアミノ酸は、共有結合架橋させることができる。Ｘ１は任意選択により存在する。存在するとき、Ｘ１は、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、またはペプチドを別のペプチドと架橋させることができるアミノ酸である。Ｘ３、Ｘ４、およびＸ６は各々、独立して、中性アミノ酸または正荷電アミノ酸である。Ｘ７は、Ｔｙｒ、またはペプチドを別のペプチドと架橋させることができるアミノ酸である。Ｘ１０は、Ａｓｐまたは中性アミノ酸である。Ｘ１３は、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、またはペプチドを別のペプチドと架橋させることができるアミノ酸である。Ｘ１４は、ＩｌｅまたはＬｅｕである。Ｘ２１、Ｘ２５、Ｘ２９は各々、独立して、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓ、またはシクロヘキシル側鎖を有するアミノ酸であり、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、シクロヘキシル側鎖は、１つ以上のフッ素で置換されていてもよい。Ｘ２３は、Ａｒｇ、Ｌｅｕ、またはＡｌａである。Ｘ３０は、ＡｌａまたはＡｒｇである。Ｘ３２は、Ａｌａ、Ｓｅｒ、またはＡｒｇである。
【００７５】
ある特定の実施形態では、１１位、１５位、１６位、および１９位における１つ以上のＡｌａがＳｅｒで置換されていることを除いて配列番号４８の配列を含むペプチドが提供される。
【００７６】
ある特定の実施形態では、本ペプチド二量体はホモ二量体である。ある特定の実施形態では、本ペプチド二量体はヘテロ二量体である。ある特定の実施形態では、本ペプチド二量体は、共有結合架橋による二量体である。例えば、アクリル酸で修飾されたＣｙｓ、Ｓｅｃ、Ｄａｐ、またはアクリル酸で修飾されたＤａｂが、共有結合架橋剤として使用される。アクリルアミド、ビニルスルホンアミド、ヨードアセトアミド部分を含む他のアミノ酸、または他の公知のＭｉｃｈａｅｌ受容体が、架橋に有用である。ある特定の実施形態では、本ペプチド二量体は、非共有結合架橋による二量体である。例えば、Ｈｉｓ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、またはＴｒｐが、非共有結合架橋剤として使用される。
【００７７】
ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号７の配列を含まない。ある特定の実施形態では、本ペプチド単量体は、同じペプチド単量体とホモ二量体化することはできないが、異なるペプチド単量体とヘテロ二量体化することができる。これは、例えば、１つのペプチド内の残基が（例えば、立体的または別様に好ましくない相互作用に起因して）同じペプチドを有する二量体内には収容され得ないが、第２のペプチドを有する二量体内には収容され得る、「バンプ−ホール（ｂｕｍｐ−ｈｏｌｅ）」システムの使用により達成され得る。同じことが第２のペプチドにも当てはまり、このようにして、いずれのペプチドもホモ二量体を形成することができないが、ヘテロ二量体化することはできる。
【００７８】
例示的なペプチド単量体には、
ＲＤＡ１：ＧＰＲＲＰＲＣＰＧＤＤＡＳＩＥＤＬＨＥＹＷＡＲＬＷＮＹＬＹＡＶＡ（配列番号４）、
ＲＤＡ２：ＧＰＲＲＰＲＣＰＧＤＤＡＳＩＥＤＬＨＥＹＷＡＲＬＷＮＹＬＹＲＶＡ（配列番号５）、
ＲＤＡ３：ＧＲＲＰＲＲＰＲＣＰＧＤＤＡＳＩＥＤＬＨＥＹＷＡＲＬＷＮＹＬＹＡＶＡ（配列番号６）、
ａＰＰ−Ｍ：ＧＰＲＲＰＲＹＰＧＤＤＡＰＶＥＤＬＩＲＦＹＮＤＬＱＱＹＬＮＶＶＡ（配列番号７）、
２２５−１：ＧＣＧＧＰＲＲＰＲＹＰＧＤＤＡＳＩＥＤＬＨＥＹＷＡＲＬＷＮＹＬＹＡＶＡ（配列番号８）、
２２５−１  Ｓ１３Ｃ／Ｉ１４Ｅ：ＧＣＧＧＰＲＲＰＲＹＰＧＤＤＡＣＥＥＤＬＨＥＹＷＡＲＬＷＮＹＬＹＡＶＡ（配列番号９）、
２２５−１  Ａ３０Ｒ：ＧＣＧＧＰＲＲＰＲＹＰＧＤＤＡＳＩＥＤＬＨＥＹＷＡＲＬＷＮＹＬＹＲＶＡ（配列番号１０）、
２２５−３：ＧＣＧＧＰＲＲＰＲＲＰＲＹＰＧＤＤＡＳＩＥＤＬＨＥＹＷＡＲＬＷＮＹＬＹＡＶＡ（配列番号１１）、
ＰＲＲＰＲＣＰＧＤＤＡＳＩＥＤＬＨＥＹＷＡＲＬＷＮＹＬＹＡＶＡ（配列番号１４）、
ＰＲＲＰＲＣＰＧＤＤＡＳＩＥＤＬＨＥＹＷＡＲＬＷＮＹＬＹＲＶＡ（配列番号１５）、
ＲＲＰＲＲＰＲＣＰＧＤＤＡＳＩＥＤＬＨＥＹＷＡＲＬＷＮＹＬＹＡＶＡ（配列番号１６）、
ＰＲＲＰＲＹＰＧＤＤＡＰＶＥＤＬＩＲＦＹＮＤＬＱＱＹＬＮＶＶＡ（配列番号１７）、
ＰＲＲＰＲＹＰＧＤＤＡＳＩＥＤＬＨＥＹＷＡＲＬＷＮＹＬＹＡＶＡ（配列番号１８）
ＣＧＧＰＲＲＰＲＹＰＧＤＤＡＣＥＥＤＬＨＥＹＷＡＲＬＷＮＹＬＹＡＶＡ（配列番号１９）
ＰＲＲＰＲＹＰＧＤＤＡＳＩＥＤＬＨＥＹＷＡＲＬＷＮＹＬＹＲＶＡ（配列番号２０）
ＰＲＲＰＲＲＰＲＹＰＧＤＤＡＳＩＥＤＬＨＥＹＷＡＲＬＷＮＹＬＹＡＶＡ（配列番号２１）
ＰＲＲＰＲＣＰＧＤＤＡＳＬＥＤＬＨＥＹＷＡＲＬＷＮＹＬＹＲＶＡ（配列番号２２）、
ＰＲＲＰＲＣＰＧＤＱＡＳＬＥＥＬＨＥＹＷＡＲＬＷＮＹＬＹＲＶＡ（配列番号２３）、
ＰＲＲＰＲＣＰＧＤＮＡＳＩＫＱＬＨＡＹＷＮＲＬＹＡＹＬＡＡＶＡ（配列番号２４）、
ＰＲＲＰＲＣＰＧＤＤＡＳＩＥＤＬＨＥＹＷＱＲＬＹＡＹＬＡＡＶＡ（配列番号２５）、
ＰＲＲＰＲＣＰＧＤＮＡＳＩＫＱＬＨＡＹＷＱＲＬＹＡＹＬＡＡＶＡ（配列番号２６）、
ＰＲＲＰＲＣＰＧＤＮＡＳＩＲＱＬＨＡＹＷＱＲＬＹＡＹＬＡＡＶＡ（配列番号２７）、
ＧＣＧＧＰＲＲＰＲＹＰＧＤＡＡＳＩＡＡＬＨＡＹＷＡＲＬＷＮＹＬＹＲＶＡ（配列番号２８）、
ＰＲＲＰＲＹＰＧＤＡＡＳＩＡＡＬＨＡＹＷＡＲＬＷＮＹＬＹＲＶＡ（配列番号２９）、
２２５−Ｈ：ＰＲＲＰＫＹＰＧＤＡＡＳＣＡＡＬＨＡＹＷＡＲＬＷＮＹＬＹＲＶＡ（配列番号３０）、
２２５−Ｉ：ＰＲＲＰＲＹＰＧＤＡＡＳＩＡＡＬＨＡＹＷＡＲＬＷＮＹＬＹＲＸＡ（配列番号３１）、
２２５−Ｊ：ＰＲＲＰＲＹＰＧＤＡＡＳＩＡＡＬＨＡＹＷＡＲＬＷＮＹＬＹＲＺＡ（配列番号３２）、
２２５−Ｋ：ＰＲＲＰＣＹＰＧＤＡＡＳＩＡＡＬＨＡＹＷＡＲＬＷＮＹＬＹＲＶＡ（配列番号３３）、
２２５−Ｌ：ＰＲＲＰＫＣＰＧＤＡＡＳＩＡＡＬＨＡＹＷＡＲＬＷＮＹＬＹＲＶＡ（配列番号３４）、
２２５−Ｍ：ＰＲＲＰＲＹＰＧＸＡＡＳＩＡＡＬＨＡＹＷＡＲＬＷＮＹＬＹＲＶＡ（配列番号３５）、
２２５−Ｎ：ＰＲＲＰＲＹＰＧＺＡＡＳＩＡＡＬＨＡＹＷＡＲＬＷＮＹＬＹＲＶＡ（配列番号３６）、
２２５−４ｓ１：ＰＲＲＰＫＹＰＧＤＡＡＳＩＡＡＬＨＡＹＷＡＲＬＷＮＹＬＹＲＶＲ（配列番号３７）、
２９１−Ａ：ＰＲＲＰＫＨＰＧＨＡＡＳＩＡＡＬＨＡＹＷＡＲＬＷＮＹＬＹＲＶＲ（配列番号３８）、
２９１−１：ＰＲＲＰＲＨＰＧＰＮＡＴＩＳＱＬＨＨＹＷＡＲＬＷＮＹＬＹＲＶＲ（配列番号３９）、
２９１−Ｈ：ＰＲＲＰＨＨＰＧＨＡＡＳＩＡＡＬＨＡＹＷＡＲＬＷＮＹＬＹＲＶＲ（配列番号４０）、
２９１−Ｉ：ＰＲＲＰＨＹＰＧＨＡＡＳＩＡＡＬＨＡＹＷＡＲＬＷＮＹＬＹＲＶＲ（配列番号４１）、
２９１−Ｑ３：ＰＲＲＰＲＣＰＧＨＡＡＳＩＡＡＬＨＡＹＷＡＲＬＷＮＹＬＹＲＶＲ（配列番号４２）、
ＭＹ０１：ＧＰＲＲＰＲＣＰＧＤＤＡＳＩＲＤＬＬＫＹＷＷＲＬＲＬＹＬＬＡＶＡ（配列番号４３）、
ＲＬ０１：ＧＰＲＲＰＲＣＰＧＤＤＡＳＩＳＤＬＬＬＹＷＬＲＬＤＲＹＬＷＡＶＡ（配列番号４４）、
ＲＲ０１：ＧＰＲＲＰＲＣＰＧＤＤＡＳＩＲＤＬＶＭＹＷＹＲＬＹＦＹＬＥＡＶＡ（配列番号４５）、
２２５−１ｃ：ＰＲＲＰＫＹＰＧＤＡＡＳＩＡＡＬＨＡＹＷＡＲＬＷＮＹＬＹＲＶＳ（配列番号４６）、
２２５−４ｄ：ＲＰＲＲＰＫＹＰＧＤＡＡＳＩＡＡＬＨＡＹＷＡＲＬＷＮＹＬＹＲＶＳ（配列番号４７）、
２９１−Ｔ：ＰＲＲＰＲＹＰＧＤＡＡＳＩＡＡＬＨＡＹＷＡＲＬＷＮＹＬＹＲＶＳ（配列番号４９）、
Ｑ：ＰＲＲＰＲＣＰＧＤＮＡＳＩＲＱＬＨＡＹＷＱＲＬＹＡＹＬＡＡＶＡ（配列番号５０）、および
Ｒ：ＰＲＲＰＲＣＰＧＤＡＡＳＩＡＡＬＨＡＹＷＱＲＬＹＡＹＬＡＡＶＡ（配列番号５１）が含まれるが、これらに限定されない。
【００７９】
ある特定の実施形態では、本ペプチドは、二量体を安定化させる目的のために単量体間に架橋するアミノ酸を含む。単量体間に架橋するアミノ酸は、配列番号１、１２、１３、または４８のいずれの位置にあってもよい。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号１、１２、１３、または４８の１位に、単量体間に架橋するアミノ酸を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号１、１２、１３、または４８の６位に、単量体間に架橋するアミノ酸を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号１、１２、１３、または４８の７位に、単量体間に架橋するアミノ酸を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号１、１２、１３、または４８の１０位に、単量体間に架橋するアミノ酸を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号１、１２、１３、または４８の１１位に、単量体間に架橋するアミノ酸を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号１、１２、１３、または４８の１３位に、単量体間に架橋するアミノ酸を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号１、１２、１３、または４８の３１位に、単量体間に架橋するアミノ酸を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号１、１２、１３、または４８の３２位に、単量体間に架橋するアミノ酸を含む。
【００８０】
ある特定の実施形態では、第１のペプチド内の配列番号１、１２、１３、または４８の特定の位置における架橋アミノ酸は、第２のペプチドの同じ位置における架橋アミノ酸に架橋する。ある特定の実施形態では、第１のペプチド内の配列番号１、１２、１３、または４８の特定の位置における架橋アミノ酸は、第２のペプチドの異なる位置における架橋アミノ酸に架橋する。ある特定の実施形態では、第１のペプチド内の配列番号１、１２、１３、または４８の７位における架橋アミノ酸は、第２のペプチドの７位における架橋アミノ酸に架橋する。ある特定の実施形態では、第１のペプチド内の配列番号１、１２、１３、または４８の１位における架橋アミノ酸は、第２のペプチドの１１位または１３位における架橋アミノ酸に架橋する。
【００８１】
ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号１、１２、１３、または４８の−２位に、単量体間に架橋するアミノ酸を含む。ある特定の実施形態では、第１のペプチド内の配列番号１、１２、１３、または４８の−２位における架橋アミノ酸は、第２のペプチドの１１位または１３位における架橋アミノ酸に架橋する。
【００８２】
ある特定の実施形態では、単量体間に架橋するアミノ酸は、システインである。ある特定の実施形態では、単量体間に架橋するアミノ酸は、セレノシステインである。ある特定の実施形態では、単量体間に架橋するアミノ酸は、ジスルフィド結合を形成することができるアミノ酸である。ある特定の実施形態では、単量体間に架橋するアミノ酸は、ジセレニド結合を形成することができるアミノ酸である。ある特定の実施形態では、単量体間に架橋するアミノ酸は、ＣｙｓまたはＳｅｃと結合を形成することができるアミノ酸である。例えば、求電子性部分、例えばアクリルアミド、ビニルスルホンアミド、ヨードアセトアミド部分を有するもの、または他の公知のＭｉｃｈａｅｌ受容体。
【００８３】
向上させるべきペプチド特性は、結合親和性、安定性、および細胞浸透性を含み、例えば、１つ以上のペプチドドメイン内の１つ以上のアミノ酸残基を変異させることによって達成され得る。本ペプチドは、細胞透過性ペプチド（例えばＴＡＴ、アンテナペディア、トランスポータン、およびポリアルギニンなど）またはステープルドペプチドとの結合によって細胞浸透性にすることができる。ペプチド特性を改善させる他の方法、例えば、組織特異性標的の目的もしくは効力増大に有用である薬物−抗体結合体などの他の薬物とペプチドを連結させること、または、半減期を向上させ腎クリアランスを減速させるように、ポリエチレングリコールまたは同様の分子とペプチドを連結させることなどは、当業者に公知である。ある特定の実施形態では、ポリプロリンＩＩ型ヘリックスドメインは、改善した特性を有するように操作されている。ある特定の実施形態では、ループ／リンカードメインは、改善した特性を有するように操作されている。ある特定の実施形態では、ループ／リンカードメインはＩ型βターンである。ある特定の実施形態では、Ｃ末端αヘリックスドメインは、改善した特性を有するように操作されている。ある特定の実施形態では、ペプチド上の電荷は、細胞浸透性を改善するように操作されている。例えば、負荷電（Ａｓｐ、Ｇｌｕ）残基の数が減少され、正荷電（Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ）残基の数が減少され、かつ／または疎水性（Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ）残基の数が減少される。本明細書においてさらに開示されるように、ある特定の実施形態では、本ペプチドのある特定の残基は、Ａｌａおよび／またはＳｅｒに変異させられる。例えば、Ｘ１１、Ｘ１５、Ｘ１６、およびＸ１９から選択される少なくとも１個、２個、３個、または４個の残基が、Ａｌａおよび／またはＳｅｒに変異させられてもよい。ある特定の実施形態では、負荷電残基がＡｌａおよび／またはＳｅｒに変異させられる。ある特定の実施形態では、Ｘ１１位、Ｘ１５位、Ｘ１６位、およびＸ１９位における少なくとも１個、２個、３個、または４個の負荷電残基残基が、Ａｌａおよび／またはＳｅｒに変異させられる。ある特定の実施形態では、血清タンパク質に結合する本ペプチドの能力は、薬物動態を改善するように操作されている。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、ナノ粒子を使用して送達される。
【００８４】
ある特定の実施形態では、第２の標的に結合する本ペプチドの能力は、第２の標的をＲａｓに動員するように操作されている。ペプチドまたはペプチドライブラリは、ＰＰＩＩヘリックス、ループ、および／または第１の標的への結合に関与しないαヘリックスの部分上に、変異またはランダム化した残基を有する。変異またはランダム化した残基は、ヘテロ二量体の第１または第２の単量体の両方に使用され得る。ある特定の実施形態では、ループ／リンカードメインはＩ型βターンである。ある特定の実施形態では、本明細書において使用されるペプチドは、選択的組織標的に有用である。第２の標的の例としては、血清アルブミンおよび血清レチノイド結合タンパク質などの血清タンパク質、ＣＤ−２０などのＡＤＣ結合の標的であるリサイクリング受容体、組織標的のためのトランスフェリン受容体およびインスリン受容体、肝臓送達のための肝臓ＧａｌＮＡｃ受容体、ならびに新生児Ｆｃ受容体が挙げられる。
【００８５】
第１のペプチドおよび第２のペプチドは、共有結合で会合していてもよい。第１のペプチドおよび第２のペプチドはまた、非共有結合で会合していてもよい。いかなる共有結合または非共有結合相互作用も、本二量体の形成に使用され得る。ある特定の実施形態では、第１のペプチドおよび第２のペプチドは、ジスルフィド結合、ジセレニド結合、炭素−炭素結合、アミド結合、エステル結合、水素結合、塩橋、パイスタッキング相互作用、または非極性疎水性相互作用を介して会合している。ある特定の実施形態では、第１のペプチドおよび第２のペプチドは、ジスルフィド結合を介して会合している。ある特定の実施形態では、第１のペプチドおよび第２のペプチドは、ジセレニド結合を介して会合している。ある特定の実施形態では、第１のペプチドおよび第２のペプチドは、炭素−炭素結合、アミド結合、エステル結合、水素結合、塩橋、パイスタッキング相互作用、または非極性疎水性相互作用を介して会合している。
【００８６】
本ペプチドは、各々、ペプチドを別のペプチドと架橋させることができる１個のアミノ酸を含み得る。本ペプチドは、各々、ペプチドを別のペプチドと架橋させることができる２個のアミノ酸を含んでもよい。本ペプチド二量体は、第１のペプチドを第２のペプチドと架橋させる１個のアミノ酸を各々含む、第１および第２のペプチドを含んでもよい。本ペプチド二量体は、第１のペプチドを第２のペプチドと架橋させる２個のアミノ酸を各々含む、第１および第２のペプチドを含んでもよい。ある特定の実施形態では、架橋は共有結合性である。ある特定の実施形態では、架橋は非共有結合性である。
【００８７】
ある特定の実施形態では、Ｘ１は、第１のペプチドを第２のペプチドと架橋させることができるアミノ酸である。ある特定の実施形態では、Ｘ１は、第１のペプチドを第２のペプチドと架橋させるアミノ酸である。ある特定の実施形態では、Ｘ１は、ペプチドを別のペプチドと架橋させることができる天然または非天然のアミノ酸である。ある特定の実施形態では、Ｘ１は、第１のペプチドを第２のペプチドと架橋させる天然または非天然のアミノ酸である。ある特定の実施形態では、Ｘ１は、Ｃｙｓ、Ｓｅｃ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、またはＴｙｒである。ある特定の実施形態では、Ｘ１は、Ｃｙｓ、Ｓｅｃである。ある特定の実施形態では、Ｘ１はＣｙｓである。ある特定の実施形態では、Ｘ１はＳｅｃである。ある特定の実施形態では、Ｘ１は、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、またはＴｙｒである。
【００８８】
ある特定の実施形態では、Ｘ３、Ｘ４、およびＸ６の各々は独立して、荷電アミノ酸である。ある特定の実施形態では、Ｘ３、Ｘ４、およびＸ６の各々は独立して、荷電側鎖を有する塩基性アミノ酸である。ある特定の実施形態では、Ｘ３、Ｘ４、およびＸ６の各々は独立して、正荷電アミノ酸である。ある特定の実施形態では、Ｘ３、Ｘ４、およびＸ６の各々は独立して、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、またはＨｉｓである。ある特定の実施形態では、Ｘ３、Ｘ４、およびＸ６の各々は独立して、Ａｒｇである。ある特定の実施形態では、Ｘ３、Ｘ４、およびＸ６の各々は独立して、Ｌｙｓである。ある特定の実施形態では、Ｘ３、Ｘ４、およびＸ６の各々は独立して、Ｈｉｓである。ある特定の実施形態では、Ｘ３、Ｘ４、およびＸ６の各々は、同じアミノ酸でも異なるアミノ酸でもよい。ある特定の実施形態では、Ｘ３、Ｘ４、およびＸ６の各々は、同じアミノ酸である。ある特定の実施形態では、Ｘ３、Ｘ４、およびＸ６の各々は、異なるアミノ酸である。ある特定の実施形態では、Ｘ３、Ｘ４、およびＸ６の各々は、そのペプチド内の他のアミノ酸または別のペプチド内のアミノ酸との静電気作用などを介して安定性を提供するアミノ酸である。ある特定の実施形態では、Ｘ３、Ｘ４、およびＸ６は各々、独立して、負荷電アミノ酸である。ある特定の実施形態では、Ｘ３、Ｘ４、およびＸ６の各々は独立して、ＡｓｐまたはＧｌｕである。
【００８９】
ある特定の実施形態では、Ｘ６は、ペプチドを別のペプチドと架橋させることができるアミノ酸である。ある特定の実施形態では、Ｘ６は、ペプチドを別のペプチドと架橋させることができる天然または非天然のアミノ酸である。ある特定の実施形態では、Ｘ６は、第１のペプチドを第２のペプチドと架橋させる天然または非天然のアミノ酸である。ある特定の実施形態では、Ｘ６は、Ｃｙｓ、Ｓｅｃ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、またはＴｙｒである。ある特定の実施形態では、Ｘ６はＣｙｓまたはＳｅｃである。ある特定の実施形態では、Ｘ６はＣｙｓである。ある特定の実施形態では、Ｘ６はＳｅｃである。ある特定の実施形態では、Ｘ６は、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、またはＴｙｒである。
【００９０】
ある特定の実施形態では、Ｘ６はＣｙｓまたはＳｅｃであり、Ｘ７はＴｙｒである。
【００９１】
ある特定の実施形態では、Ｘ７は、Ｔｙｒ、または第１のペプチドを第２のペプチドと架橋させることができるアミノ酸である。ある特定の実施形態では、Ｘ７は、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ、または第１のペプチドを第２のペプチドと架橋させることができるアミノ酸である。ある特定の実施形態では、Ｘ７はＴｙｒである。ある特定の実施形態では、Ｘ７はＨｉｓである。ある特定の実施形態では、Ｘ７は、第１のペプチドを第２のペプチドと架橋させるアミノ酸である。ある特定の実施形態では、Ｘ７は、ペプチドを別のペプチドと架橋させることができる天然または非天然のアミノ酸である。ある特定の実施形態では、Ｘ７は、第１のペプチドを第２のペプチドと架橋させる天然または非天然のアミノ酸である。ある特定の実施形態では、Ｘ７は、正荷電アミノ酸または負荷電アミノ酸である。ある特定の実施形態では、Ｘ７は、Ｃｙｓ、Ｓｅｃ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、またはＴｙｒである。ある特定の実施形態では、Ｘ７は、Ｃｙｓ、Ｓｅｃ、Ｔｙｒ、またはＨｉｓである。ある特定の実施形態では、Ｘ７はＣｙｓである。ある特定の実施形態では、Ｘ７はＳｅｃである。ある特定の実施形態では、Ｘ７は、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、またはＴｙｒである。ある特定の実施形態では、Ｘ７はＹであり、Ｘ６はＣｙｓまたはＳｅｃである。
【００９２】
ある特定の実施形態では、Ｘ１０は、荷電側鎖を有するアミノ酸である。ある特定の実施形態では、Ｘ１０は負荷電アミノ酸である。ある特定の実施形態では、Ｘ１０はＧｌｕまたはＡｓｐである。ある特定の実施形態では、Ｘ１０は、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、またはＡｌａである。ある特定の実施形態では、Ｘ１０はＧｌｕである。ある特定の実施形態では、Ｘ１０はＡｓｐである。ある特定の実施形態では、Ｘ１０はＡｌａである。ある特定の実施形態では、Ｘ１０は正荷電アミノ酸である。ある特定の実施形態では、Ｘ１０は、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、またはＬｙｓである。ある特定の実施形態では、Ｘ１０は、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、またはＰｒｏである。ある特定の実施形態では、Ｘ１０は、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ、またはアクリルアミド部分を含むアミノ酸である。ある特定の実施形態では、Ｘ１０はＡｒｇである。ある特定の実施形態では、Ｘ１０はＨｉｓである。ある特定の実施形態では、Ｘ１０はＬｙｓである。ある特定の実施形態では、Ｘ１０はＰｒｏである。ある特定の実施形態では、Ｘ１０は、アクリルアミド部分を含むアミノ酸である。ある特定の実施形態では、アクリルアミド部分を含むアミノ酸は、ＤａｂおよびＤａｐ結合アクリルアミド残基である。
【００９３】
ある特定の実施形態では、Ｘ１０は、ペプチドを別のペプチドと架橋させることができるアミノ酸である。ある特定の実施形態では、Ｘ１０は、ペプチドを別のペプチドと架橋させることができる天然または非天然のアミノ酸である。ある特定の実施形態では、Ｘ１０は、第１のペプチドを第２のペプチドと架橋させる天然または非天然のアミノ酸である。ある特定の実施形態では、Ｘ１０は、Ｃｙｓ、Ｓｅｃ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、またはＴｙｒである。ある特定の実施形態では、Ｘ１０はＣｙｓである。ある特定の実施形態では、Ｘ１０はＳｅｃである。ある特定の実施形態では、Ｘ１０は、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、またはＴｙｒである。ある特定の実施形態では、Ｘ１０は、本明細書にさらに記載されるように、アクリルアミドに結合したＬ−２，４−ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）、またはアクリルアミドに結合したＬ−２，３−ジアミノプロピオン酸（Ｄａｐ）である。
【００９４】
ある特定の実施形態では、Ｘ１１は、荷電側鎖を有するアミノ酸である。ある特定の実施形態では、Ｘ１１は負荷電アミノ酸である。ある特定の実施形態では、Ｘ１１はＧｌｕまたはＡｓｐである。ある特定の実施形態では、Ｘ１１はＧｌｕである。ある特定の実施形態では、Ｘ１１はＡｓｐである。ある特定の実施形態では、Ｘ１１は正荷電アミノ酸である。ある特定の実施形態では、Ｘ１１はＡｒｇ、Ｈｉｓ、またはＬｙｓである。ある特定の実施形態では、Ｘ１１はＡｒｇである。ある特定の実施形態では、Ｘ１１はＨｉｓである。ある特定の実施形態では、Ｘ１１はＬｙｓである。ある特定の実施形態では、Ｘ１１は中性アミノ酸である。ある特定の実施形態では、Ｘ１１は、疎水性側鎖を有するアミノ酸である。ある特定の実施形態では、Ｘ１１は、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｌａ、またはＳｅｒである。ある特定の実施形態では、Ｘ１１は、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌである。ある特定の実施形態では、Ｘ１１はＡｌａである。ある特定の実施形態では、Ｘ１１はＳｅｒである。ある特定の実施形態では、Ｘ１１はＡｓｐまたはＡｌａである。ある特定の実施形態では、Ｘ１１は、Ａｓｐ、または第１のペプチドを第２のペプチドと架橋させることができるアミノ酸である。ある特定の実施形態では、Ｘ１１はＡｓｐである。ある特定の実施形態では、Ｘ１１は、第１のペプチドを第２のペプチドと架橋させるアミノ酸である。ある特定の実施形態では、Ｘ１１は、ペプチドを別のペプチドと架橋させることができる天然または非天然のアミノ酸である。ある特定の実施形態では、Ｘ１１は、第１のペプチドを第２のペプチドと架橋させる天然または非天然のアミノ酸である。ある特定の実施形態では、Ｘ１１は、Ｃｙｓ、Ｓｅｃ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、またはＴｙｒである。ある特定の実施形態では、Ｘ１１はＣｙｓである。ある特定の実施形態では、Ｘ１１はＳｅｃである。ある特定の実施形態では、Ｘ１１は、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、またはＴｙｒである。
【００９５】
ある特定の実施形態では、Ｘ１３は、Ｓｅｒ、Ｐｒｏ、またはＴｈｒである。ある特定の実施形態では、Ｘ１３はＳｅｒである。ある特定の実施形態では、Ｘ１３はＰｒｏである。ある特定の実施形態では、Ｘ１３はＴｈｒまたはＡｌａである。ある特定の実施形態では、Ｘ１３は、第１のペプチドを第２のペプチドと架橋させることができるアミノ酸である。ある特定の実施形態では、Ｘ１３は、第１のペプチドを第２のペプチドと架橋させるアミノ酸である。ある特定の実施形態では、Ｘ１３は、ペプチドを別のペプチドと架橋させることができる天然または非天然のアミノ酸である。ある特定の実施形態では、Ｘ１３は、第１のペプチドを第２のペプチドと架橋させる天然または非天然のアミノ酸である。ある特定の実施形態では、Ｘ１３は、Ｃｙｓ、Ｓｅｃ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、またはＴｙｒである。ある特定の実施形態では、Ｘ１３はＣｙｓである。ある特定の実施形態では、Ｘ１３はＳｅｃである。ある特定の実施形態では、Ｘ１３は、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、またはＴｙｒである。
【００９６】
ある特定の実施形態では、Ｘ１４はＩｌｅまたはＧｌｕである。ある特定の実施形態では、Ｘ１４はＩｌｅである。ある特定の実施形態では、Ｘ１４はＧｌｕである。ある特定の実施形態では、Ｘ１４はＬｅｕまたはＡｓｐである。ある特定の実施形態、Ｘ１４は、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、Ｌｅｕ、または第１のペプチドを第２のペプチドと架橋させるアミノ酸である。ある特定の実施形態では、Ｘ１４はＣｙｓである。ある特定の実施形態では、Ｘ１４はＳｅｃである。
【００９７】
ある特定の実施形態では、Ｘ１５は、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、またはＧｌｙである。ある特定の実施形態では、Ｘ１５は、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、またはＡｌａである。ある特定の実施形態では、Ｘ１５はＧｌｕである。ある特定の実施形態では、Ｘ１５はＡｓｐである。ある特定の実施形態では、Ｘ１５はＧｌｎである。ある特定の実施形態では、Ｘ１５はＧｌｙである。ある特定の実施形態では、Ｘ１５はＡｌａである。
【００９８】
ある特定の実施形態では、Ｘ１６は、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｌａ、またはＳｅｒである。ある特定の実施形態では、Ｘ１６はＡｓｐである。ある特定の実施形態では、Ｘ１６はＧｌｕである。ある特定の実施形態では、Ｘ１６はＧｌｎである。ある特定の実施形態では、Ｘ１６はＡｌａである。ある特定の実施形態では、Ｘ１６はＳｅｒである。
【００９９】
ある特定の実施形態では、Ｘ１８は芳香族アミノ酸である。ある特定の実施形態では、Ｘ１８は疎水性アミノ酸である。ある特定の実施形態では、Ｘ１８は、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、またはＭｅｔである。ある特定の実施形態では、Ｘ１８はＨｉｓである。ある特定の実施形態では、Ｘ１８は、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、またはＴｒｐである。ある特定の実施形態では、Ｘ１８は、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、またはＭｅｔである。ある特定の実施形態では、Ｘ１８は、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、またはＩｌｅである。ある特定の実施形態では、Ｘ１８はＭｅｔである。ある特定の実施形態では、Ｘ１８はＡｌａである。ある特定の実施形態では、Ｘ１８はＶａｌである。ある特定の実施形態では、Ｘ１８はＬｅｕである。ある特定の実施形態では、Ｘ１８はＩｌｅである。
【０１００】
ある特定の実施形態では、Ｘ１９は、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｌａ、またはＴｒｐである。ある特定の実施形態では、Ｘ１９は、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｒｐ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、またはＨｉｓである。ある特定の実施形態では、Ｘ１９は、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｌａ、Ｔｒｐ、Ａｒｇ、またはＨｉｓである。ある特定の実施形態では、Ｘ１９はＧｌｕである。ある特定の実施形態では、Ｘ１９はＡｓｐである。ある特定の実施形態では、Ｘ１９はＧｌｎである。ある特定の実施形態では、Ｘ１９はＡｌａである。ある特定の実施形態では、Ｘ１９はＳｅｒである。ある特定の実施形態では、Ｘ１９はＴｒｐである。ある特定の実施形態では、Ｘ１９はＡｒｇである。ある特定の実施形態では、Ｘ１９はＬｙｓである。ある特定の実施形態では、Ｘ１９はＬｅｕである。ある特定の実施形態では、Ｘ１９はＭｅｔである。ある特定の実施形態では、Ｘ１９はＨｉｓである。
【０１０１】
ある特定の実施形態では、Ｘ２０はＴｙｒまたはＰｈｅである。ある特定の実施形態では、Ｘ２０はＴｙｒである。ある特定の実施形態では、Ｘ２０はＰｈｅである。
【０１０２】
ある特定の実施形態では、Ｘ２１、Ｘ２５、およびＸ２９は各々、疎水性かつ／または大型のアミノ酸である。ある特定の実施形態では、Ｘ２１はＴｒｐである。ある特定の実施形態では、Ｘ２１はＴｙｒである。ある特定の実施形態では、Ｘ２１はＰｈｅである。ある特定の実施形態では、Ｘ２１はＨｉｓである。ある特定の実施形態では、Ｘ２１はＧｌｎである。ある特定の実施形態では、Ｘ２５はＴｒｐである。ある特定の実施形態では、Ｘ２５はＴｙｒである。ある特定の実施形態では、Ｘ２５はＨｉｓである。ある特定の実施形態では、Ｘ２５はＰｈｅである。ある特定の実施形態では、Ｘ２５はＨｉｓである。ある特定の実施形態では、Ｘ２９はＴｙｒである。ある特定の実施形態では、Ｘ２９はＴｒｐである。ある特定の実施形態では、Ｘ２９はＰｈｅである。ある特定の実施形態では、Ｘ２９はＨｉｓである。ある特定の実施形態では、Ｘ２１、Ｘ２５、Ｘ２９の各々は、独立して、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、またはシクロヘキシル側鎖を有するアミノ酸であってもよく、ここでＴｙｒ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、またはシクロヘキシル側鎖は、任意選択によりフッ素化されている。ある特定の実施形態では、Ｘ２５は、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、またはＡｓｐである。ある特定の実施形態では、Ｘ２９は、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、またはＧｌｕである。
【０１０３】
ある特定の実施形態では、Ｘ２２は小型アミノ酸である。ある特定の実施形態では、Ｘ２２はＡｌａである。ある特定の実施形態では、Ｘ２２は、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、またはＶａｌである。ある特定の実施形態では、Ｘ２２は、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、またはＡｓｎである。ある特定の実施形態では、Ｘ２２はＧｌｙである。ある特定の実施形態では、Ｘ２２はＳｅｒである。ある特定の実施形態では、Ｘ２２はＶａｌである。ある特定の実施形態では、Ｘ２２は、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｔｒｐ、Ｌｅｕ、またはＴｙｒである。
【０１０４】
ある特定の実施形態では、Ｘ２３はＡｒｇまたはＡｓｐである。ある特定の実施形態では、Ｘ２６は、Ａｓｎ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、またはＨｉｓである。ある特定の実施形態では、Ｘ２６は、Ａｓｎ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｐｈｅ、またはＡｌａである。ある特定の実施形態では、Ｘ２６はＡｓｎである。ある特定の実施形態では、Ｘ２６はＬｅｕである。ある特定の実施形態では、Ｘ２６はＩｌｅである。ある特定の実施形態では、Ｘ２６はＨｉｓである。
【０１０５】
ある特定の実施形態では、Ｘ３０はＡｌａまたはＡｒｇである。ある特定の実施形態では、Ｘ３０は、Ａｌａ、Ａｒｇ、またはＶａｌである。ある特定の実施形態では、Ｘ３０はＡｒｇである。ある特定の実施形態では、Ｘ３０はＡｌａである。ある特定の実施形態では、Ｘ３０はＶａｌである。
【０１０６】
ある特定の実施形態では、Ｘ３１は、ペプチドを別のペプチドと架橋させることができるアミノ酸である。ある特定の実施形態では、Ｘ３１は、ペプチドを別のペプチドと架橋させることができる天然または非天然のアミノ酸である。ある特定の実施形態では、Ｘ３１は、第１のペプチドを第２のペプチドと架橋させる天然または非天然のアミノ酸である。ある特定の実施形態では、Ｘ３１は、Ｖａｌ、またはペプチドを別のペプチドと架橋させることができるアミノ酸である。ある特定の実施形態では、Ｘ３１は、Ｃｙｓ、Ｓｅｃ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、またはＴｙｒである。ある特定の実施形態では、Ｘ３１はＣｙｓである。ある特定の実施形態では、Ｘ３１はＳｅｃである。ある特定の実施形態では、Ｘ３１は、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、またはＴｙｒである。ある特定の実施形態では、Ｘ３１は、Ｄａｐ結合アクリルアミドである。ある特定の実施形態では、Ｘ３１は、Ｄａｂ結合アクリルアミドである。
【０１０７】
ある特定の実施形態では、Ｘ３２は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ｓｅｒである。ある特定の実施形態では、Ｘ３２はＡｌａである。ある特定の実施形態では、Ｘ３２はＡｒｇである。ある特定の実施形態では、Ｘ３２はＳｅｒである。ある特定の実施形態では、Ｘ３２は、ペプチドを別のペプチドと架橋させることができるアミノ酸である。ある特定の実施形態では、Ｘ３２は、ペプチドを別のペプチドと架橋させることができる天然または非天然のアミノ酸である。ある特定の実施形態では、Ｘ３２は、第１のペプチドを第２のペプチドと架橋させる天然または非天然のアミノ酸である。ある特定の実施形態では、Ｘ３２は、Ｃｙｓ、Ｓｅｃ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、またはＴｙｒである。ある特定の実施形態では、Ｘ３２はＣｙｓである。ある特定の実施形態では、Ｘ３２はＳｅｃである。ある特定の実施形態では、Ｘ３２は、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、またはＴｙｒである。ある特定の実施形態では、Ｘ３２はＡｒｇまたはＡｌａである。ある特定の実施形態では、Ｘ３２は、ＤａｂまたはＤａｐ結合アクリルアミドである。
【０１０８】
ある特定の実施形態では、本ペプチドは、本明細書において提供されるアミノ酸配列に対して約８０％〜約９９％相同である配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、本明細書において提供されるアミノ酸配列に対して約８４％〜約９９％相同である配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、本明細書において提供されるアミノ酸配列に対して約８７％〜約９９％相同である配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、本明細書において提供されるアミノ酸配列に対して約９０％〜約９９％相同である配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、本明細書において提供されるアミノ酸配列に対して約９３％〜約９９％相同である配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、本明細書において提供されるアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％相同である配列を含む。
【０１０９】
ある特定の実施形態では、本ペプチドは、本明細書において提供されるアミノ酸配列と約８０％〜約９９％同一である配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、本明細書において提供されるアミノ酸配列と約８４％〜約９９％同一である配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、本明細書において提供されるアミノ酸配列と約８７％〜約９９％同一である配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、本明細書において提供されるアミノ酸配列と約９０％〜約９９％同一である配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、本明細書において提供されるアミノ酸配列と約９３％〜約９９％同一である配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、本明細書において提供されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％同一である配列を含む。
【０１１０】
ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列に対して約８０％〜約９９％相同である配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列に対して約８５％〜約９９％相同である配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列に対して約９０％〜約９９％相同である配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列に対して約９５％〜約９９％相同である配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列に対して約９７％〜約９９％相同である配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列に対して約９８％〜約９９％相同である配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号１のアミノ配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％相同である配列を含む。前述の値は、配列番号１２、１３、および４８に適用可能である。
【０１１１】
ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列と約８０％〜約９９％同一である配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列と約８４％〜約９９％同一である配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列と約８７％〜約９９％同一である配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列と約９０％〜約９９％同一である配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列と約９３％〜約９９％同一である配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列と約９６％〜約９９％同一である配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号１のアミノ配列と少なくとも約８０％、８４％、８７％、９０％、９３％、または９６％同一である配列を含む。前述の値は、配列番号１２、１３、および４８に適用可能である。
【０１１２】
ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列とは１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０アミノ酸異なる配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列とは１アミノ酸異なる配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列とは２アミノ酸異なる配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列とは３アミノ酸異なる配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列とは４アミノ酸異なる配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列とは５アミノ酸異なる配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列とは６アミノ酸異なる配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列とは７アミノ酸異なる配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列とは８アミノ酸異なる配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列とは９アミノ酸異なる配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列とは１０アミノ酸異なる配列を含む。前述の差異は、配列番号１２、１３、および４８にも適用可能である。
【０１１３】
ある特定の実施形態では、本ペプチドは、ＧＰＲＲＰＲＣＰＧＤＤＡＳＩＥＤＬＨＥＹＷＡＲＬＷＮＹＬＹＡＶＡ（配列番号４）の配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、ＧＰＲＲＰＲＣＰＧＤＤＡＳＩＥＤＬＨＥＹＷＡＲＬＷＮＹＬＹＲＶＡ（配列番号５）の配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、ＧＲＲＰＲＲＰＲＣＰＧＤＤＡＳＩＥＤＬＨＥＹＷＡＲＬＷＮＹＬＹＡＶＡ（配列番号６）の配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、ＧＰＲＲＰＲＹＰＧＤＤＡＰＶＥＤＬＩＲＦＹＮＤＬＱＱＹＬＮＶＶＡ（配列番号７）の配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、ＧＣＧＧＰＲＲＰＲＹＰＧＤＤＡＳＩＥＤＬＨＥＹＷＡＲＬＷＮＹＬＹＡＶＡ（配列番号８）の配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、ＧＣＧＧＰＲＲＰＲＹＰＧＤＤＡＣＥＥＤＬＨＥＹＷＡＲＬＷＮＹＬＹＡＶＡ（配列番号９）の配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、ＧＣＧＧＰＲＲＰＲＹＰＧＤＤＡＳＩＥＤＬＨＥＹＷＡＲＬＷＮＹＬＹＲＶＡ（配列番号１０）の配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、ＧＣＧＧＰＲＲＰＲＲＰＲＹＰＧＤＤＡＳＩＥＤＬＨＥＹＷＡＲＬＷＮＹＬＹＡＶＡ（配列番号１１）の配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号１４〜５１の配列を含む。
【０１１４】
ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列に対して約８０％〜約９９％相同である配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列に対して約８５％〜約９９％相同である配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列に対して約９０％〜約９９％相同である配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列に対して約９５％〜約９９％相同である配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列に対して約９７％〜約９９％相同である配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列に対して約９８％〜約９９％相同である配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号４のアミノ配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％相同である配列を含む。前述の値は、配列番号１４〜５１に適用可能である。
【０１１５】
ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列と約８０％〜約９９％同一である配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列と約８４％〜約９９％同一である配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列と約８７％〜約９９％同一である配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列と約９０％〜約９９％同一である配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列と約９３％〜約９９％同一である配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列と約９６％〜約９９％同一である配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号４のアミノ配列と少なくとも約８０％、８４％、８７％、９０％、９３％、または９６％同一である配列を含む。前述の値は、配列番号１４〜５１に適用可能である。
【０１１６】
ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列とは１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０アミノ酸異なる配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列とは１アミノ酸異なる配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列とは２アミノ酸異なる配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列とは３アミノ酸異なる配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列とは４アミノ酸異なる配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列とは５アミノ酸異なる配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列とは６アミノ酸異なる配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列とは７アミノ酸異なる配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列とは８アミノ酸異なる配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列とは９アミノ酸異なる配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列とは１０アミノ酸異なる配列を含む。前述の値は、配列番号１４〜５１に適用可能である。
【０１１７】
ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号５のアミノ酸配列に対して約８０％〜約９９％相同である配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号５のアミノ酸配列に対して約８５％〜約９９％相同である配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号５のアミノ酸配列に対して約９０％〜約９９％相同である配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号５のアミノ酸配列に対して約９５％〜約９９％相同である配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号５のアミノ酸配列に対して約９７％〜約９９％相同である配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号５のアミノ酸配列に対して約９８％〜約９９％相同である配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号５のアミノ配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％相同である配列を含む。
【０１１８】
ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号５のアミノ酸配列と約８０％〜約９９％同一である配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号５のアミノ酸配列と約８４％〜約９９％同一である配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号５のアミノ酸配列と約８７％〜約９９％同一である配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号５のアミノ酸配列と約９０％〜約９９％同一である配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号５のアミノ酸配列と約９３％〜約９９％同一である配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号５のアミノ酸配列と約９６％〜約９９％同一である配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号５のアミノ配列と少なくとも約８０％、８４％、８７％、９０％、９３％、または９６％同一である配列を含む。
【０１１９】
ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号５のアミノ酸配列とは１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０アミノ酸異なる配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号５のアミノ酸配列とは１アミノ酸異なる配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号５のアミノ酸配列とは２アミノ酸異なる配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号５のアミノ酸配列とは３アミノ酸異なる配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号５のアミノ酸配列とは４アミノ酸異なる配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号５のアミノ酸配列とは５アミノ酸異なる配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号５のアミノ酸配列とは６アミノ酸異なる配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号５のアミノ酸配列とは７アミノ酸異なる配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号５のアミノ酸配列とは８アミノ酸異なる配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号５のアミノ酸配列とは９アミノ酸異なる配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号５のアミノ酸配列とは１０アミノ酸異なる配列を含む。
【０１２０】
ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号６のアミノ酸配列に対して約８０％〜約９９％相同である配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号６のアミノ酸配列に対して約８５％〜約９９％相同である配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号６のアミノ酸配列に対して約９０％〜約９９％相同である配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号６のアミノ酸配列に対して約９５％〜約９９％相同である配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号６のアミノ酸配列に対して約９７％〜約９９％相同である配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号６のアミノ酸配列に対して約９８％〜約９９％相同である配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号６のアミノ配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％相同である配列を含む。
【０１２１】
ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号６のアミノ酸配列と約８０％〜約９９％同一である配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号６のアミノ酸配列と約８４％〜約９９％同一である配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号６のアミノ酸配列と約８７％〜約９９％同一である配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号６のアミノ酸配列と約９０％〜約９９％同一である配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号６のアミノ酸配列と約９３％〜約９９％同一である配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号６のアミノ酸配列と約９６％〜約９９％同一である配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号６のアミノ配列と少なくとも約８０％、８４％、８７％、９０％、９３％、または９６％同一である配列を含む。
【０１２２】
ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号６のアミノ酸配列とは１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０アミノ酸異なる配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号６のアミノ酸配列とは１アミノ酸異なる配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号６のアミノ酸配列とは２アミノ酸異なる配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号６のアミノ酸配列とは３アミノ酸異なる配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号６のアミノ酸配列とは４アミノ酸異なる配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号６のアミノ酸配列とは５アミノ酸異なる配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号６のアミノ酸配列とは６アミノ酸異なる配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号６のアミノ酸配列とは７アミノ酸異なる配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号６のアミノ酸配列とは８アミノ酸異なる配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号６のアミノ酸配列とは９アミノ酸異なる配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号６のアミノ酸配列とは１０アミノ酸異なる配列を含む。
【０１２３】
ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号７に対して少なくとも約８０％〜９９％相同である配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号７のアミノ酸配列に対して約８５％〜約９９％相同である配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号７のアミノ酸配列に対して約９０％〜約９９％相同である配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号７のアミノ酸配列に対して約９５％〜約９９％相同である配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号７のアミノ酸配列に対して約９７％〜約９９％相同である配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号７のアミノ酸配列に対して約９８％〜約９９％相同である配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号７のアミノ配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％相同である配列を含む。
【０１２４】
ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号７に対して少なくとも約８０％〜９９％相同である配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号７のアミノ酸配列と約８５％〜約９９％同一である配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号７のアミノ酸配列と約９０％〜約９９％同一である配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号７のアミノ酸配列と約９５％〜約９９％同一である配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号７のアミノ酸配列と約９７％〜約９９％同一である配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号７のアミノ酸配列と約９８％〜約９９％同一である配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号７のアミノ配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％同一である配列を含む。
【０１２５】
ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号７のアミノ酸配列とは１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０アミノ酸異なる配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号７のアミノ酸配列とは１アミノ酸異なる配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号７のアミノ酸配列とは２アミノ酸．異なる配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号７のアミノ酸配列とは３アミノ酸異なる配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号７のアミノ酸配列とは４アミノ酸異なる配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号７のアミノ酸配列とは５アミノ酸異なる配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号７のアミノ酸配列とは６アミノ酸異なる配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号７のアミノ酸配列とは７アミノ酸異なる配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号７のアミノ酸配列とは８アミノ酸異なる配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号７のアミノ酸配列とは９アミノ酸異なる配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号７のアミノ酸配列とは１０アミノ酸異なる配列を含む。
【０１２６】
ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号８に対して少なくとも約８０％〜９９％相同である配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号８に対して少なくとも約９０％〜９９％相同である配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号８に対して少なくとも約９４％〜９９％相同である配列を含む。
【０１２７】
ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号８と少なくとも約８０％〜９９％同一である配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号８と少なくとも約９０％〜９９％同一である配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号８と少なくとも約９４％〜９９％同一である配列を含む。
【０１２８】
ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号８のアミノ酸配列とは１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０アミノ酸異なる配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号８のアミノ酸配列とは１アミノ酸異なる配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号８のアミノ酸配列とは２アミノ酸異なる配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号８のアミノ酸配列とは３アミノ酸異なる配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号８のアミノ酸配列とは４アミノ酸異なる配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号８のアミノ酸配列とは５アミノ酸異なる配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号８のアミノ酸配列とは６アミノ酸異なる配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号８のアミノ酸配列とは７アミノ酸異なる配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号８のアミノ酸配列とは８アミノ酸異なる配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号８のアミノ酸配列とは９アミノ酸異なる配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号８のアミノ酸配列とは１０アミノ酸異なる配列を含む。
【０１２９】
ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号９に対して少なくとも約８０％〜９９％相同である配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号９に対して少なくとも約９０％〜９９％相同である配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号９に対して少なくとも約９４％〜９９％相同である配列を含む。
【０１３０】
ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号９と少なくとも約８０％〜９９％同一である配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号９と少なくとも約９０％〜９９％同一である配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号９と少なくとも約９４％〜９９％同一である配列を含む。
【０１３１】
ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号９のアミノ酸配列とは１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０アミノ酸異なる配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号９のアミノ酸配列とは１アミノ酸異なる配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号９のアミノ酸配列とは２アミノ酸異なる配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号９のアミノ酸配列とは３アミノ酸異なる配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号９のアミノ酸配列とは４アミノ酸異なる配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号９のアミノ酸配列とは５アミノ酸異なる配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号９のアミノ酸配列とは６アミノ酸異なる配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号９のアミノ酸配列とは７アミノ酸異なる配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号９のアミノ酸配列とは８アミノ酸異なる配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号９のアミノ酸配列とは９アミノ酸異なる配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号９のアミノ酸配列とは１０アミノ酸異なる配列を含む。
【０１３２】
ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号１０に対して少なくとも約８０％〜９９％相同である配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号１０に対して少なくとも約９０％〜９９％相同である配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号１０に対して少なくとも約９４％〜９９％相同である配列を含む。
【０１３３】
ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号１０と少なくとも約８０％〜９９％同一である配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号１０と少なくとも約９０％〜９９％同一である配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号１０と少なくとも約９４％〜９９％同一である配列を含む。
【０１３４】
ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号９のアミノ酸配列とは１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０アミノ酸異なる配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号１０のアミノ酸配列とは１アミノ酸異なる配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号１０のアミノ酸配列とは２アミノ酸異なる配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号１０のアミノ酸配列とは３アミノ酸異なる配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号１０のアミノ酸配列とは４アミノ酸異なる配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号１０のアミノ酸配列とは５アミノ酸異なる配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号１０のアミノ酸配列とは６アミノ酸異なる配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号１０のアミノ酸配列とは７アミノ酸異なる配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号１０のアミノ酸配列とは８アミノ酸異なる配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号１０のアミノ酸配列とは９アミノ酸異なる配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号１０のアミノ酸配列とは１０アミノ酸異なる配列を含む。
【０１３５】
ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号１１に対して少なくとも約８０％〜９９％相同である配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号１１に対して少なくとも約９０％〜９９％相同である配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号１１に対して少なくとも約９４％〜９９％相同である配列を含む。
【０１３６】
ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号１１と少なくとも約８０％〜９９％同一である配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号１１と少なくとも約９０％〜９９％同一である配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号１１と少なくとも約９４％〜９９％同一である配列を含む。
【０１３７】
ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号１１のアミノ酸配列とは１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０アミノ酸異なる配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号１１のアミノ酸配列とは１アミノ酸異なる配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号１１のアミノ酸配列とは２アミノ酸異なる配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号１１のアミノ酸配列とは３アミノ酸異なる配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号１１のアミノ酸配列とは４アミノ酸異なる配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号１１のアミノ酸配列とは５アミノ酸異なる配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号１１のアミノ酸配列とは６アミノ酸異なる配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号１１のアミノ酸配列とは７アミノ酸異なる配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号１１のアミノ酸配列とは８アミノ酸異なる配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号１１のアミノ酸配列とは９アミノ酸異なる配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号１１のアミノ酸配列とは１０アミノ酸異なる配列を含む。
【０１３８】
ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号１の９位、１０位、１２位、１６位、１７位、２０位、２３位、２４位、２７位、２８位、３１位、または３２位におけるアミノ酸のうちのいずれか１つが任意の天然または非天然のアミノ酸である配列を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号１の配列を含み、ここで、９位、１０位、１２位、１６位、１７位、２０位、２３位、２４位、２７位、２８位、３１位、または３２位における、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、または１２個のアミノ酸は変更されてもよい。
【０１３９】
ある特定の実施形態では、本ペプチドは、第２のペプチドと会合して、標的タンパク質に結合するペプチド二量体を形成する第１のペプチドである。ある特定の実施形態では、本ペプチド二量体は、標的タンパク質に結合する。ある特定の実施形態では、標的タンパク質はＲａｓである。Ｒａｓの例としては、ＮＲａｓ、ＨＲａｓ、ならびにＫＲａｓ４ＡおよびＫＲａｓ４Ｂを含むＫＲａｓが挙げられる。ある特定の実施形態では、標的タンパク質はＲａｓ変異体である。ある特定の実施形態では、Ｒａｓ変異体は、以下の変異：Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１３Ｒ、Ｇ１３Ｖ、Ｇ１３Ｓ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ａ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｒ、Ｑ６１Ｋ、もしくはＱ６１Ｈのうちの１つ以上を有する、ＮＲａｓ、ＨＲａｓ、またはＫＲａｓである。ある特定の実施形態では、標的タンパク質はＭａｘ／Ｍｙｃである。ある特定の実施形態では、標的タンパク質はＲａｌＡである。ある特定の実施形態では、標的タンパク質はＲａｓおよびＲａｌＡである。
【０１４０】
ある特定の実施形態では、第２のペプチドは、第１のペプチドの配列と同じ配列を含む。ある特定の実施形態では、第２のペプチドは、第１のペプチドの配列とは異なる配列を含む。ある特定の実施形態では、第２のペプチドは、配列番号１の配列を含む。ある特定の実施形態では、第２のペプチドは、配列番号１、１２、１３、または４８の配列を含む。ある特定の実施形態では、第２のペプチドのＸ２１またはＸ２５は、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓ、またはシクロヘキシル側鎖を有するアミノ酸であり、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、またはシクロヘキシル側鎖は、任意選択によりフッ素化されている。ある特定の実施形態では、第２のペプチドのＸ２１はＴｒｐである。ある特定の実施形態では、第２のペプチドのＸ２５はＴｙｒである。ある特定の実施形態では、第１のペプチドのＸ２５はＴｒｐである。ある特定の実施形態では、第２のペプチドのＸ２５はＴｙｒであり、第１のペプチドのＸ２５はＴｒｐである。ある特定の実施形態では、第２のペプチドのＸ１８はＨｉｓであり、Ｘ２１およびＸ２５の各々はＴｒｐである。ある特定の実施形態では、第１のペプチドおよび第２のペプチドは、ジスルフィド結合、ジセレニド結合、炭素−炭素結合、アミド結合、エステル結合、水素結合、塩橋、パイスタッキング相互作用、または非極性疎水性相互作用を介して会合している。ある特定の実施形態では、第１のペプチドおよび第２のペプチドは、ジスルフィド結合またはジセレン結合を介して会合している。ある特定の実施形態では、２つのペプチドは、パイスタッキング相互作用を介して会合している。例えば、１つのペプチド上のチロシンは、パイスタッキングを介して、別のペプチド上の別のチロシンと相互作用する。
【０１４１】
ある特定の実施形態では、本ペプチドは、それらの標的（例えば、Ｒａｓタンパク質）に、中度から低度のナノモル結合親和性で結合する。この理論に束縛されることを望むものではないが、本ペプチドは、Ｒａｓエフェクタードメインに直接結合し、Ｒａｓがその発癌活性に必要なエフェクタータンパク質に結合することを遮断する。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、頭−尾二量体としてＲａｓに結合する。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、頭−尾ホモ二量体としてＲａｓに結合する。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、頭−尾ヘテロ二量体としてＲａｓに結合する。
【０１４２】
標的（例えば、Ｒａｓタンパク質）に対する本明細書に記載されるペプチドの結合親和性は、当該分野で公知の方法（例えば、蛍光偏光測定）を使用して、本明細書に記載されるペプチドおよび標的の解離定数（Ｋｄ）によって測定され得る。ある特定の実施形態では、本ペプチド二量体は、およそ５００ｎＭ、２００ｎＭ、１５０ｎＭ、１４０ｎＭ、１３０ｎＭ、１２０ｎＭ、１１０ｎＭ、１００ｎＭ、９０ｎＭ、８０ｎＭ、７０ｎＭ、６０ｎＭ、５０ｎＭ、４０ｎＭ、３０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ、９ｎＭ、８ｎＭ、７ｎＭ、６ｎＭ、５ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭ、または０．５ｎＭ未満の解離定数（Ｋｄ）でＲａｓに結合する。ある特定の実施形態では、本ペプチド二量体は、およそ４００ｐＭ、２００ｐＭ、１５０ｐＭ、１４０ｐＭ、１３０ｐＭ、１２０ｐＭ、１１０ｐＭ、１００ｐＭ、９０ｐＭ、８０ｐＭ、７０ｐＭ、６０ｐＭ、５０ｐＭ、４０ｐＭ、３０ｐＭ、２０ｐＭ、１０ｐＭ、９ｐＭ、８ｐＭ、７ｎＭ、６ｎＭ、または５ｎＭ未満の解離定数（Ｋｄ）でＲａｓに結合する。前述のＫｄ値は、ペプチドホモ二量体とヘテロ二量体との両方に適用可能である。
【０１４３】
ある特定の実施形態では、本ペプチド二量体は、およそ５００ｎＭ未満の解離定数（Ｋｄ）でＲａｓに結合する。ある特定の実施形態では、本ペプチド二量体は、およそ１５０ｎＭ未満の解離定数（Ｋｄ）でＲａｓに結合する。ある特定の実施形態では、本ペプチド二量体は、およそ１５０ｎＭ未満の解離定数（Ｋｄ）でＲａｓに結合する。ある特定の実施形態では、本ペプチド二量体は、およそ６０ｎＭ未満の解離定数（Ｋｄ）でＲａｓに結合する。ある特定の実施形態では、本ペプチド二量体は、およそ４０ｎＭ未満の解離定数（Ｋｄ）でＲａｓに結合する。ある特定の実施形態では、本ペプチド二量体は、およそ２０ｎＭ未満の解離定数（Ｋｄ）でＲａｓに結合する。ある特定の実施形態では、本ペプチド二量体は、およそ１０ｎＭ未満の解離定数（Ｋｄ）でＲａｓに結合する。ある特定の実施形態では、本ペプチド二量体は、およそ５ｎＭ未満の解離定数（Ｋｄ）でＲａｓに結合する。ある特定の実施形態では、本ペプチド二量体は、およそ１０ｎＭ未満の解離定数（Ｋｄ）でＲａｓに結合する。ある特定の実施形態では、本ペプチド二量体は、およそ５ｎＭ未満の解離定数（Ｋｄ）でＲａｓに結合する。ある特定の実施形態では、本ペプチド二量体は、およそ１ｎＭ未満の解離定数（Ｋｄ）でＲａｓに結合する。ある特定の実施形態では、本ペプチド二量体は、およそ１ｎＭ未満の解離定数（Ｋｄ）でＲａｓに結合する。
【０１４４】
ある特定の実施形態では、本ペプチド二量体は、およそ４００ｐＭ未満の解離定数（Ｋｄ）でＲａｓに結合する。ある特定の実施形態では、本ペプチド二量体は、およそ２００ｐＭ未満の解離定数（Ｋｄ）でＲａｓに結合する。ある特定の実施形態では、本ペプチド二量体は、およそ１５０ｐＭ未満の解離定数（Ｋｄ）でＲａｓに結合する。ある特定の実施形態では、本ペプチド二量体は、およそ１００ｐＭ未満の解離定数（Ｋｄ）でＲａｓに結合する。ある特定の実施形態では、本ペプチド二量体は、およそ８０ｐＭ未満の解離定数（Ｋｄ）でＲａｓに結合する。ある特定の実施形態では、本ペプチド二量体は、およそ６０ｐＭ未満の解離定数（Ｋｄ）でＲａｓに結合する。ある特定の実施形態では、本ペプチド二量体は、およそ４０ｐＭ未満の解離定数（Ｋｄ）でＲａｓに結合する。ある特定の実施形態では、本ペプチド二量体は、およそ２０ｐＭ未満の解離定数（Ｋｄ）でＲａｓに結合する。ある特定の実施形態では、本ペプチド二量体は、およそ１０ｐＭ未満の解離定数（Ｋｄ）でＲａｓに結合する。ある特定の実施形態では、本ペプチド二量体は、およそ５ｐＭ未満の解離定数（Ｋｄ）でＲａｓに結合する。ある特定の実施形態では、本ペプチド二量体は、およそ１ｐＭ未満の解離定数（Ｋｄ）でＲａｓに結合する。ある特定の実施形態では、本ペプチド二量体は、およそ１ｐＭ未満の解離定数（Ｋｄ）でＲａｓに結合する。
【０１４５】
ある特定の実施形態では、本ペプチド二量体は、非発癌型よりも発癌型の標的タンパク質に対して高い結合親和性を有する。ある特定の実施形態では、本ペプチド二量体は、Ｒａｓ・ＧＤＰよりもＲａｓ・ＧＴＰに対して高い結合親和性を有する。ある特定の実施形態では、本ペプチド二量体は、Ｒａｓ・ＧＤＰに対する結合親和性よりもおよそ１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、または１０倍、高い、Ｒａｓ・ＧＴＰに対する結合親和性を有する。
【０１４６】
Ｒａｓ抑制は、細胞生存率アッセイ（例えば、ＭＴＴまたはＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏ）、カスパーゼ開裂アッセイ（例えば、定量的ウェスタンブロッティングまたはカスパーゼ３／７  Ｇｌｏによる）、例えば、全タンパク質と比べてリン酸化タンパク質を測定することによるＲａｓ経路活性化（例えば、ＭＡＰＫ経路、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路、Ｒａｌ経路の活性化）の定量的ウェスタンブロッティングなどの方法を使用して測定され得る。
【０１４７】
ある特定の実施形態では、ペプチド単量体は、最少３，０００Ｄａ、最大９，０００Ｄａである。ある特定の実施形態では、ペプチド単量体は、最少３，０００Ｄａ、最大６，０００Ｄａである。ある特定の実施形態では、ペプチド単量体は、最少６，０００Ｄａ、最大９，０００Ｄａである。ある特定の実施形態では、ペプチド二量体は、最少６，０００Ｄａ、最大１８，０００Ｄａである。ある特定の実施形態では、ペプチド二量体は、最少６，０００Ｄａ、最大１２，０００Ｄａである。ある特定の実施形態では、ペプチド二量体は、最少１２，０００Ｄａ、最大１８，０００Ｄａである。
【０１４８】
ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号１〜１１のＮ末端に追加のアミノ酸を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号１〜１１のＣ末端に追加のアミノ酸を含む。ある特定の実施形態では、追加のアミノ酸は、配列番号１〜５および７のＮ末端におけるＸ−２ＧまたはＧＲを含む。ある特定の実施形態では、追加のアミノ酸は、配列番号１〜５および７のＮ末端におけるＧＣＧを含む。本明細書において使用される場合、下付き文字として負数を有するＸは、配列番号１のＸ１に対してＮ末端側に位置するアミノ酸残基の位置を表す。
【０１４９】
ある特定の実施形態では、Ｘ−２は、第１のペプチドを第２のペプチドと架橋させることができるアミノ酸である。ある特定の実施形態では、Ｘ−２は、第１のペプチドを第２のペプチドと架橋させるアミノ酸である。ある特定の実施形態では、Ｘ−２は、ペプチドを別のペプチドと架橋させることができる天然または非天然のアミノ酸である。ある特定の実施形態では、Ｘ−２は、第１のペプチドを第２のペプチドと架橋させる天然または非天然のアミノ酸である。ある特定の実施形態では、Ｘ−２は、Ｃｙｓ、Ｓｅｃ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、またはＴｙｒである。ある特定の実施形態では、Ｘ−２はＣｙｓである。ある特定の実施形態では、Ｘ−２はＳｅｃである。ある特定の実施形態では、Ｘ−２は、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、またはＴｙｒである。
【０１５０】
ある特定の実施形態では、Ｘ１３はＣｙｓまたはＳｅｃであり、Ｘ１４はＧｌｕである。ある特定の実施形態では、Ｘ１８はＨｉｓであり、Ｘ２５およびＸ２１の各々はＴｒｐである。
【０１５１】
ある特定の実施形態では、Ｘ１はＧｌｙであり、Ｘ３、Ｘ４、およびＸ６の各々はＡｒｇであり、Ｘ７はＣｙｓである。ある特定の実施形態では、Ｘ１はＧｌｙであり、Ｘ３、Ｘ４、およびＸ６の各々はＡｒｇであり、Ｘ７はＣｙであり、Ｘ３０はＡｌａである。ある特定の実施形態では、Ｘ１はＧｌｙであり、Ｘ３、Ｘ４、およびＸ６の各々はＡｒｇであり、Ｘ７はＣｙｓであり、Ｘ３０はＡｒｇである。ある特定の実施形態では、Ｘ−２はＧｌｙであり、Ｘ−１はＡｒｇであり、Ｘ１はＡｒｇであり、Ｘ３、Ｘ４、およびＸ６の各々はＡｒｇであり、Ｘ７はＣｙｓであり、Ｘ３０はＡｌａである。前述の実施形態の各々において、ＳｅｃがＣｙｓの代わりに使用されることも企図される。
【０１５２】
ある特定の実施形態では、ヘテロ二量体化ペプチドは、一次的なペプチドおよび二次的なペプチドを含む。一次的なペプチドは、Ｒａｓとの接点の大部分を形成する。
【０１５３】
ある特定の実施形態では、ヘテロ二量体化したペプチドは、配列番号２２、２３、および４９から選択される一次的なペプチドを含む。ある特定の実施形態では、ヘテロ二量体化したペプチドは、配列番号２４〜２７、５０、および５１から選択される二次的なペプチドを含む。ある特定の実施形態では、ヘテロ二量体化ペプチドは、配列番号２２の一次的なペプチド、および配列番号２４の二次的なペプチドを含む。ある特定の実施形態では、ヘテロ二量体化ペプチドは、配列番号２２から選択される一次的なペプチド、および配列番号２５の二次的なペプチドを含む。ある特定の実施形態では、ヘテロ二量体化ペプチドは、配列番号２２の一次的なペプチド、および配列番号２６の二次的なペプチドを含む。ある特定の実施形態では、ヘテロ二量体化ペプチドは、配列番号２２の一次的なペプチド、および配列番号２７の二次的なペプチドを含む。ある特定の実施形態では、ヘテロ二量体化ペプチドは、配列番号２２の一次的なペプチド、および配列番号５０の二次的なペプチドを含む。ある特定の実施形態では、ヘテロ二量体化ペプチドは、配列番号２２の一次的なペプチド、および配列番号５１の二次的なペプチドを含む。
【０１５４】
ある特定の実施形態では、ヘテロ二量体化ペプチドは、配列番号２３の一次的なペプチド、および配列番号２４の二次的なペプチドを含む。ある特定の実施形態では、ヘテロ二量体化ペプチドは、配列番号２３の一次的なペプチド、および配列番号２５の二次的なペプチドを含む。ある特定の実施形態では、ヘテロ二量体化ペプチドは、配列番号２３の一次的なペプチド、および配列番号２６の二次的なペプチドを含む。ある特定の実施形態では、ヘテロ二量体化ペプチドは、配列番号２３の一次的なペプチド、および配列番号２７の二次的なペプチドを含む。ある特定の実施形態では、ヘテロ二量体化ペプチドは、配列番号２３の一次的なペプチド、および配列番号５０の二次的なペプチドを含む。ある特定の実施形態では、ヘテロ二量体化ペプチドは、配列番号２３の一次的なペプチド、および配列番号５１の二次的なペプチドを含む。
【０１５５】
ある特定の実施形態では、ヘテロ二量体化ペプチドは、配列番号４９の一次的なペプチド、および配列番号２４の二次的なペプチドを含む。ある特定の実施形態では、ヘテロ二量体化ペプチドは、配列番号４９の一次的なペプチド、および配列番号２５の二次的なペプチドを含む。ある特定の実施形態では、ヘテロ二量体化ペプチドは、配列番号４９の一次的なペプチド、および配列番号２６の二次的なペプチドを含む。ある特定の実施形態では、ヘテロ二量体化ペプチドは、配列番号４９の一次的なペプチド、および配列番号２７の二次的なペプチドを含む。ある特定の実施形態では、ヘテロ二量体化ペプチドは、配列番号４９の一次的なペプチド、および配列番号５０の二次的なペプチドを含む。ある特定の実施形態では、ヘテロ二量体化ペプチドは、配列番号４９の一次的なペプチド、および配列番号５１の二次的なペプチドを含む。
【０１５６】
一態様では、細胞透過前の二量体化を防止するかまたは最小限に抑えるように設計されたペプチドが、本明細書において提供される。本明細書において開示されるペプチドは、マスクされたＣｙｓまたはＳｅｃを含んでもよい。ジスルフィド形態またはセレン−スルフィド形態の硫黄は求核性ではないため、細胞透過前に、ペプチド単量体内のシステインまたはセレノシステイン残基は、架橋を防止するように、有機チオール小部分にジスルフィド結合またはセレン−スルフィド結合していてもよい。ある特定の実施形態では、ペプチド単量体は、有機チオール小部分にジスルフィド結合しているシステインを含む。ある特定の実施形態では、ペプチド単量体は、有機チオール小部分にセレン−スルフィド結合しているセレノシステインを含む。ある特定の実施形態では、有機チオール小部分は、脂肪族チオール部分である。ある特定の実施形態では、脂肪族チオールは、アルキルチオール部分である。ある特定の実施形態では、アルキルチオールは、Ｃ１−５アルキルチオールである。ある特定の実施形態では、有機チオール小部分はＳＲＳであり、ここでＲＳは、置換または非置換のＣ１−５アルキルである。ある特定の実施形態では、ＲＳは、置換Ｃ１−５アルキルである。ある特定の実施形態では、ＲＳは、非置換Ｃ１−５アルキルである。ある特定の実施形態では、有機チオール小部分は、ｔ−ブチルチオールである。ある特定の実施形態では、有機チオール小部分は、エタンチオールである。本明細書に記載される、単量体である発明的ペプチドは、ジスルフィド結合していないＣｙｓまたはジスルフィド結合しているＣｙｓのいずれを含んでもよい。ある特定の実施形態では、発明的ペプチドは、ジスルフィド結合していないＣｙｓを含む単量体である。ある特定の実施形態では、発明的ペプチドは、ジスルフィド結合しているＣｙｓを含む単量体である。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号３０、３３、および３４からなる群から選択される配列を含み、Ｃｙｓは、ジスルフィド結合していない。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号３０、３３、および３４からなる群から選択される配列を含み、Ｃｙｓは、有機チオール小部分にジスルフィド結合している。前述の実施形態のいずれにおいても、Ｃｙｓの代わりにＳｅｃも企図される。
【０１５７】
細胞透過後、ペプチド単量体のジスルフィド結合システインは、細胞質環境で還元され、システイン残基の遊離チオールが、チオール求核剤と反応することができる求電子性側鎖を含む第２のペプチド単量体に架橋することが可能となる。この手法は、架橋のための求核剤として機能し得るセレノシステインを含むペプチドにも適用可能である。例えば、求電子性側鎖には、アクリルアミド、ビニルスルホンアミド、ヨードアセトアミド部分を有するものが含まれる。ＣｙｓまたはＳｅｃと反応することができる他のＭｉｃｈａｅｌ受容体もまた、ペプチドの架橋に適用可能であり、当該分野で公知である。例えば、本ペプチドは、ＣｙｓまたはＳｅｃに架橋することができる部分で修飾された残基を含んでもよい。例えば、アクリルアミド部分を含むアミノ酸側鎖。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、アクリルアミド部分を含むアミノ酸側鎖を含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、Ｌ−２，４−ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）残基またはＬ−２，３−ジアミノプロピオン酸（Ｄａｐ）残基を含む。本明細書において使用される場合、残基ＸはＬ−２，４−ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）残基であり、残基ＺはＬ−２，３−ジアミノプロピオン酸（Ｄａｐ）残基である。
【化２】
0006759109.tif 000004
【０１５８】
ある特定の実施形態では、ＤａｂまたはＤａｐ残基は、ペプチド骨格α炭素からアクリルアミドを分離させる１個または２個のいずれかの炭素を有するアクリルアミド側鎖を形成するように、側鎖窒素に連結したアクリル酸を有する。アクリルアミドを含む側鎖を形成するようにアクリル酸に連結したＤａｐおよびＤａｂ残基の側鎖は、以下に示される。そのようなＤａｐまたはＤａｂ修飾残基は、ＤａｂおよびＤａｐ結合アクリルアミド残基と称される。
【化３】
0006759109.tif 000005
【０１５９】
ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号３１、３２、３５、および３６からなる群から選択される配列を含み、Ｘは、Ｌ−２，４−ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）残基であるか、または、Ｚは、アクリルアミドに結合したＬ−２，３−ジアミノプロピオン酸（Ｄａｐ）残基である。
【０１６０】
ある特定の実施形態では、Ｌ−２，４−ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）残基またはＬ−２，３−ジアミノプロピオン酸（Ｄａｐ）残基を含むペプチドは、アクリル酸と共にＤａｐまたはＤａｂの側鎖窒素に連結されて、アクリルアミドを含む側鎖を形成する。
【０１６１】
ペプチド二量体は、配列番号３０、３３、および３４と、配列番号３１、３２、３５、および３６との任意の組み合わせから形成され得る。
【０１６２】
選択的二量体不安定化手法も本明細書において提供される。エンドソーム内で二量体を不安定化させると、二量体のエンドソーム逃避、ひいては細胞質ゾルの接近を向上させることができる。単量体は、エンドソームの逃避において、二量体と比較してより効率的であると考えられている。二量体不安定化は、ｐＨ誘発性であっても、嵩高残基で誘発されてもよい。ｐＨ誘発性二量体不安定化は、ヒスチジン残基が反対側の単量体上のカチオン性残基または他のヒスチジンに空間的に近接するように、ヒスチジン残基を１つのペプチド単量体に配置することを伴う。通常の細胞質ゾルのｐＨ（約７．４）において、これらのヒスチジンはエンドソーム内（ｐＨ約５〜６）よりも正電荷が低く、したがって二量体はエンドソーム内で選択的に不安定化され、より効率的な逃避につながる。６．０〜６．５のヒスチジンのｐＫａにより、ヒスチジンは細胞質ゾルのｐＨ値（ｐＨ７．２〜７．４）において大部分は中性になるが、エンドソーム内のプロトン化がもたらされ、これは、典型的には約ｐＨ６．０で開始し、エンドソームがリソソームに遷移するにつれてｐＨ５．０以下まで進行する。反対側の単量体上の正電荷付近のヒスチジン残基の配置は、エンドソーム内への進入に当たり２つのペプチド単量体間の静電反発を生じさせ、これは、単量体状態を好む二量体を不安定化させる。
【０１６３】
配列番号３８〜４１は、このヒスチジンｐＨ誘発性不安定化手法を例示する。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、ＨｉｓがＸ６位、Ｘ７位、および／またはＸ１０位に配置されている配列を含む。これらの位置のうちの１つ、２つ、または３つに配置されたＨｉｓは、本明細書に記載されるペプチドのいずれにも適用可能である。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、配列番号３８〜４１からなる群から選択される配列を含む。図３６Ａおよび３６Ｂは、生細胞顕微鏡法を使用して、同濃度の配列番号３７（これはヒスチジンを含まない）を含む細胞と、配列番号３８（これはヒスチジンを含む）を含む細胞を比較する。
【０１６４】
二量体不安定化は、二量体化を防止するために二量体界面付近の嵩高部分を含む残基を使用して実現することもできる。細胞内に進入すると、残基の嵩高部分が除去され、二量体化、およびＲａｓ、Ｍｙｃ／Ｍａｘ、またはＲａｌＡなどのタンパク質標的への結合が可能になる。この手法は、本明細書に記載されるＣｙｓまたはＳｅｃを含むいずれのペプチドにも適用可能である。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、チオール分子により保護されたＣｙｓまたはＳｅｃを含む。例えば、本明細書に記載される発明的ペプチドは、ある特定の位置（例えば、Ｘ７）における、かつ、例えば、還元チオールを２，２’−ジピリジルジスルフィド、４，４’−ジピリジルジスルフィド、２，２’−ジチオビス（５−ニトロピリジン）、または同様の試薬と反応させることによる、有機チオールへのジスルフィド結合によって保護されている、ＣｙｓまたはＳｅｃを含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、有機チオール分子への結合によって保護されたＣｙｓまたはＳｅｃを含む。ある特定の実施形態では、有機チオール分子は、アリールチオール、ヘテロアイル（ｈｅｔｅｒｏａｙｌ）チオール、または脂肪族チオールである。ある特定の実施形態では、有機チオール分子はヘテロアリールチオールである。ある特定の実施形態では、有機チオール分子は、２，２’−ジピリジルジスルフィド、４，４’−ジピリジルジスルフィド、および２，２’−ジチオビス（５−ニトロピリジン）から選択される。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、試薬２，２’−ジチオビス（５−ニトロピリジン）で保護されたＳｅｃを含む。エンドソームから細胞質ゾルへの逃避に当たり、このジスルフィド結合は細胞環境により還元され、二量体化が可能になる。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、２，２’−ジピリジルジスルフィドへのジスルフィド結合によって保護されたＣｙｓを含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、４，４’−ジピリジルジスルフィドへのジスルフィド結合によって保護されたＣｙｓを含む。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、２，２’−ジチオビス（５−ニトロピリジン）へのジスルフィド結合によって保護されたＣｙｓを含む。この手法を示す配列には、配列番号３０、３３、３４、および４２が含まれる。本明細書に記載される実施形態のいずれにおいても、ＣｙｓがＳｅｃで置換されていてもよいことは理解される。
【０１６５】
以前に考察したように、Ｒａｓ以外の他の標的が企図される。配列番号４３は、Ｍｙｃ／Ｍａｘヘテロ二量体に結合する。配列番号４４は、ＲａｌＡタンパク質に結合する。配列番号４５は、ＲａｌＡおよびＫＲａｓの両方に結合する。配列番号４３〜４５は、ジスルフィド結合を使用して二量体化する、７位にＣｙｓを含むペプチドである。
【０１６６】
ペプチドが別のペプチドと会合して二量体を形成することを可能にするオリゴマー化ドメインを含むペプチドが本明細書においてさらに提供され、ここでオリゴマー化ドメインは、配列：ＰＸａＸｂＰＸｃＸｄＰ（配列番号２）を含み、Ｘａ、Ｘｂ、およびＸｃの各々は、任意の非プロリンアミノ酸であり、Ｘｄは、ペプチドを別のペプチドに架橋させることができるアミノ酸である。ある特定の実施形態では、ＸａおよびＸｂの各々は独立して、任意の非プロリンアミノ酸であり、ＸｃおよびＸｄの各々は独立して、任意の非プロリンアミノ酸、またはペプチドを別のペプチドと架橋させることができるアミノ酸（例えば、システイン、セレノシステイン）である。ある特定の実施形態では、ＸｃおよびＸｄの各々は独立して、任意の非プロリンアミノ酸であるが、各々は、ペプチドを別のペプチドに架橋させることができるアミノ酸ではない。オリゴマー化ドメインを含むペプチドは、タンパク質−タンパク質相互作用の抑制剤として有用である。オリゴマー化ドメインを含むペプチドは、ＲａｓまたはＲａｓ変異体などの標的タンパク質の結合および抑制に有用である。
【０１６７】
ある特定の実施形態では、本二量体の第１のペプチド内の架橋アミノ酸は、第２のペプチドのＰＸａＸｂＰＸｃＸｄＰモチーフ内の付随する架橋アミノ酸への架橋を形成する。ある特定の実施形態では、第１および第２のペプチド内のＰＸａＸｂＰＸｃＸｄＰモチーフは、逆平行構成にある。ある特定の実施形態では、ＰＸａＸｂＰＸｃＸｄＰモチーフは、ＰＰＩＩヘリックス構成をとる。ある特定の実施形態では、ＰＸａＸｂＰＸｃＸｄＰモチーフは、各々、それらのＮ末端またはＣ末端のいずれかにおいてαヘリックスに結合し、αヘリックスを逆平行構成で安定化させる。
【０１６８】
ある特定の実施形態では、Ｘｃは、Ｃｙｓ、Ｓｅｃ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、またはＴｙｒである。ある特定の実施形態では、Ｘｃは、ペプチドを別のペプチドと架橋させることができるアミノ酸である。ある特定の実施形態では、ＸｃはＣｙｓまたはＳｅｃである。ある特定の実施形態では、ＸｃはＣｙｓである。ある特定の実施形態では、ＸｃはＳｅｃである。
【０１６９】
ある特定の実施形態では、Ｘｄは、Ｃｙｓ、Ｓｅｃ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、またはＴｙｒである。ある特定の実施形態では、Ｘｄは、ペプチドを別のペプチドと架橋させることができるアミノ酸である。ある特定の実施形態では、ＸｄはＣｙｓまたはＳｅｃである。ある特定の実施形態では、ＸｄはＣｙｓである。ある特定の実施形態では、ＸｄはＳｅｃである。
【０１７０】
ある特定の実施形態では、Ｘｃがペプチドを別のペプチドと架橋させることができるアミノ酸であるとき、Ｘｄはペプチドを別のペプチドと架橋させることができるアミノ酸ではない。ある特定の実施形態では、Ｘｄがペプチドを別のペプチドと架橋させることができるアミノ酸であるとき、Ｘｃはペプチドを別のペプチドと架橋させることができるアミノ酸ではない。
【０１７１】
ある特定の実施形態では、本ペプチドは配列番号２を含み、ＸａおよびＸｂは各々Ａｒｇである。ある特定の実施形態では、本ペプチドは配列番号２を含み、ＸｃはＡｒｇであり、ＸｄはＣｙｓである。ある特定の実施形態では、本ペプチドは配列番号２を含み、ＸｃはＡｒｇであり、ＸｄはＴｙｒである。ある特定の実施形態では、本ペプチドは配列番号２を含み、ＸｃはＬｙｓであり、ＸｄはＴｙｒである。ある特定の実施形態では、本ペプチドは配列番号２を含み、ＸｃはＣｙｓであり、ＸｄはＴｙｒである。ある特定の実施形態では、本ペプチドは配列番号２を含み、ＸｃはＬｙｓであり、ＸｄはＣｙｓである。ある特定の実施形態では、本ペプチドは配列番号２を含み、ＸｃはＬｙｓであり、ＸｄはＨｉｓである。ある特定の実施形態では、本ペプチドは配列番号２を含み、ＸｃはＡｒｇであり、ＸｄはＨｉｓである。ある特定の実施形態では、本ペプチドは配列番号２を含み、ＸｃはＨｉｓであり、ＸｄはＨｉｓである。ある特定の実施形態では、本ペプチドは配列番号２を含み、ＸｃはＨｉｓであり、ＸｄはＴｙｒである。ある特定の実施形態では、本ペプチドは配列番号２を含み、ＸａおよびＸｂは各々Ａｒｇであり、ＸｃおよびＸｄの各々は、前述の一般的な実施形態および特定の実施形態のうちのいずれかを有する。
【０１７２】
配列番号２の実施形態のいずれにおいても、Ｘａ、Ｘｂ、Ｘｃ、およびＸｄは、それぞれ、本明細書に記載されるＸ３、Ｘ４、Ｘ６、およびＸ７に対応する。
【０１７３】
本ペプチドは、配列：Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５ＤＬＸ１８Ｘ１９ＹＸ２１Ｘ２２ＲＬＸ２５Ｘ２６ＹＬＸ２９Ｘ３０ＶＡ（配列番号３）を含むαヘリックスドメインをさらに含み、式中、Ｘ１３、Ｘ１４、Ｘ１５、Ｘ１８、Ｘ１９、Ｘ２１、Ｘ２２、Ｘ２５、Ｘ２６、Ｘ２９、およびＸ３０は、本明細書に定義される通りである。
【０１７４】
配列：Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５ＤＬＸ１８Ｘ１９ＹＸ２１Ｘ２２ＲＬＸ２５Ｘ２６ＹＬＸ２９Ｘ３０ＶＡ（配列番号３）を含むαヘリックスドメインを含むペプチドが本明細書においてさらに提供され、式中、Ｘ１３、Ｘ１４、Ｘ１５、Ｘ１８、Ｘ１９、Ｘ２１、Ｘ２２、Ｘ２５、Ｘ２６、Ｘ２９、およびＸ３０は、本明細書に定義される通りである。
【０１７５】
ある特定の実施形態では、発明的ペプチドは、水性培地内で可溶性である。ある特定の実施形態では、発明的ペプチドは、細胞を透過することができる。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、低減した数の負電荷を含む。ある特定の実施形態では、ペプチドの負電荷の数は、出発ペプチドと比較して１、２、３、４、５、または６個の負電荷だけ低減される。例えば、ＡｌａまたはＳｅｒをアニオン性残基の代わりに導入すると、細胞透過の向上に役立ち得る。ある特定の実施形態では、本開示のペプチドは、Ｘ１１位、Ｘ１５位、および／またはＸ１６位に、少なくとも１個、２個、または３個の非負荷電アミノ酸を含む。ある特定の実施形態では、本開示のペプチドは、Ｘ１１位、Ｘ１５位、Ｘ１６位、および／またはＸ１９位に、少なくとも１個、２個、３個、または４個の非負荷電アミノ酸を含む。ある特定の実施形態では、本開示のペプチドは、Ｘ１１位、Ｘ１５位、Ｘ１６位、およびＸ１９位に、４個の非負荷電アミノ酸を含む。ある特定の実施形態では、非負荷電アミノ酸は中性アミノ酸である。ある特定の実施形態では、非負荷電アミノ酸は、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、およびＧｌｎからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、非負荷電アミノ酸は正荷電アミノ酸である。ある特定の実施形態では、正荷電アミノ酸は、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、およびＨｉｓからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、アミノ酸位置Ｘ１１、Ｘ１５、Ｘ１６、およびＸ１９にＡｌａを含む。
【０１７６】
ある特定の実施形態では、本開示のペプチドは、Ｘ１１位、Ｘ１５位、Ｘ１６位、および／またはＸ１９位に、少なくとも１個、２個、３個、もしくは４個のＡｌａおよび／またはＳｅｒを含む。ある特定の実施形態では、本開示のペプチドは、Ｘ１１位、Ｘ１５位、および／またはＸ１６位に、少なくとも１個、２個、または３個のＡｌａを含む。ある特定の実施形態では、本開示のペプチドは、Ｘ１１位、Ｘ１５位、Ｘ１６位、および／またはＸ１９位に、少なくとも１個、２個、３個、または４個のＡｌａを含む。ある特定の実施形態では、本開示のペプチドは、Ｘ１１位、Ｘ１５位、Ｘ１６位、およびＸ１９位にＡｌａを含む。Ｘ１１位、Ｘ１５位、および／またはＸ１６位のＡｌａに関する前述の実施形態は、Ｘ１１位、Ｘ１５位、および／またはＸ１６位のＳｅｒにも適用可能である。
【０１７７】
発明的ペプチドの調製方法
発明的ペプチドの合成は、第１に、所望の配列、および非天然アミノ酸を含むいくつかのアミノ酸の選択を伴う。一旦アミノ酸が選択されたら、発明的ペプチドの合成は、標準的な脱保護およびカップリング反応を使用して実現することができる。ペプチド結合の形成およびポリペプチド合成は、当業者に周知の技法であり、固相法および溶液相法の両方を包含する（概して、各々の全内容が参照により本明細書に組み込まれる、Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ  ａｎｄ  Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，Ｔｈｅ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ，１９８４、Ａｔｈｅｒｔｏｎ  ａｎｄ  Ｓｈｅｐｐａｒｄ，Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ，１９８９、およびＳｔｅｗａｒｔ  ａｎｄ  Ｙｏｕｎｇ，Ｓｏｌｉｄ  ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，１９８４を参照されたい）。溶液相技法および固相技法の両方において、保護基の選択、ならびに用いられる特定のカップリング技法を考慮しなければならない。溶液相反応および固相反応でのペプチド合成技法の詳細な考察については、全内容が参照により本明細書に組み込まれる、Ｈｅｃｈｔ，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：１９９８を参照されたい。
【０１７８】
ある特定の実施形態では、本方法は、米国公開第ＵＳ  ２０１２／０２７０８００号および国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／００１９５２号（これらは同様に参照により本明細書に組み込まれる）に記載される手法に従って、発明的ステープルドペプチドを別のポリペプチドまたはタンパク質に連結することによって発明的ステープルドペプチドを会合させることを含む。ある特定の実施形態では、連結される他方のポリペプチドは、ステープルされているか、またはステッチされている。
【０１７９】
ある特定の実施形態では、本方法は、発明的ペプチドの溶液相合成を含む。上述の溶液相合成は、ポリペプチドの構築のための周知の技法である。例示的な溶液相合成は、（１）Ｎ末端においてアミノ保護基で保護されているアミノ酸を提供するステップ、（２）Ｃ末端において酸素保護基で保護されているアミノ酸を提供するステップ、（３）Ｎ保護アミノ酸をＣ保護アミノ酸にカップリングするステップ、（４）カップリング反応の生成物をＮ末端またはＣ末端のいずれかにおいて脱保護するステップ、および（５）所望のポリペプチドが得られるまでステップ（３）〜（４）を繰り返すステップを含み、上記のステップのいずれかにおいてカップリングされるアミノ酸のうち少なくとも２つは、各々、少なくとも１つの末端不飽和アミノ酸側鎖、および、任意選択により、２つの末端不飽和アミノ酸側鎖を含むアミノ酸を含む。上記の合成の過程中、アミノ酸の立体化学、および用いられるアミノ酸残基を含むがこれらに限定されない、様々なパラメータは多様であってよい。
【０１８０】
ある特定の実施形態では、本方法は、発明的ペプチドの固相合成を含む。上述の固相合成は、ポリペプチドの構築のための周知の技法である。例示的な固相合成は、（１）樹脂結合アミノ酸を提供するステップ、（２）樹脂結合アミノ酸を脱保護するステップ、（３）脱保護された樹脂結合アミノ酸にアミノ酸をカップリングするステップ、（４）所望のペプチドが得られるまでステップ（３）を繰り返すステップを含む。
【０１８１】
上記の合成の過程中、側鎖を有するアミノ酸の配置、アミノ酸の立体化学、側鎖長および機能性、ならびに用いられるアミノ酸残基を含むがこれらに限定されない、様々なパラメータは多様であってよい。
【０１８２】
ある特定の実施形態では、合成ペプチドは、ペプチドを別のペプチドと架橋させることができるアミノ酸を含有する。例えば、このアミノ酸は、ステープリング（または複数回ステープリング）を促進する特定の触媒と接触するとペプチドがステープルされて、ペプチドのステープルドバージョンを提供して、高次構造的に安定化されたペプチドの提供を可能にすることができる。そのようなアミノ酸には、末端不飽和アミノ酸側鎖を有するものが含まれる。
【０１８３】
他の修飾としては、ペプチド足場上のどこか（例えば、ペプチドのＮ末端、ペプチドのＣ末端、ペプチドのアミノ酸側鎖上など）の、細胞浸透剤、治療活性剤、標識、または診断薬とのペプチドの結合を挙げることができる。そのような修飾は、細胞、組織、または器官へのペプチドまたは治療活性剤の送達において有用であり得る。そのような修飾は、ある特定の実施形態では、特定の型の細胞または組織を標的とすることを可能にし得る。
【０１８４】
ある特定の実施形態では、ペプチド内のアミノ酸のうちの１つ以上は、例えば、炭水化物基、ヒドロキシル基、リン酸基、ファルネシル基、イソファルネシル基、パルミトイル、ゲラニルゲラニル、ラウリル、脂肪酸基、結合、官能化、または他の修飾のためのリンカーなどの化学物質の添加によって修飾されてもよい。脂質の使用は、Ｒａｓが局在化する細胞膜にペプチドが局在化することを助け得る。
【０１８５】
ある特定の実施形態では、発明的ペプチドはＤ−アミノ酸を含む。ある特定の実施形態では、発明的ペプチドは、最大１０％のＤ−アミノ酸を含む。ある特定の実施形態では、発明的ペプチドは、最大２０％のＤ−アミノ酸を含む。ある特定の実施形態では、発明的ペプチドは、最大３０％のＤ−アミノ酸を含む。ある特定の実施形態では、発明的ペプチドは、最大４０％のＤ−アミノ酸を含む。ある特定の実施形態では、発明的ペプチドは、最大５０％のＤ−アミノ酸を含む。ある特定の実施形態では、発明的ペプチドは、最大６０％のＤ−アミノ酸を含む。ある特定の実施形態では、発明的ペプチドは、最大７０％のＤ−アミノ酸を含む。ある特定の実施形態では、発明的ペプチドは、最大８０％のＤ−アミノ酸を含む。ある特定の実施形態では、発明的ペプチドは、最大９０％のＤ−アミノ酸を含む。
【０１８６】
ある特定の実施形態では、発明的ペプチドは、全体的にＤ−アミノ酸である。そのような「鏡像」タンパク質は、対応する鏡像高次構造へと折り重なることができ、Ｌ−アミノ酸を含む発明的ペプチドと同じＰＰＩＩ−ループ−αヘリックス高次構造、ならびに二量体化する（かつ前述の位置におけるジスルフィドまたはジセレニドを介して架橋する）能力を有すると予想される。ある特定の実施形態では、標的に対する結合剤を発見するためにコンピュータによる方法が使用される。ある特定の実施形態では、酵母、ファージなどが提示される「鏡像ディスプレイ」技術が、Ｄ−アミノ酸標的タンパク質と共に使用される。ある特定の実施形態では、本明細書において開示されるＲａｓ結合ペプチドは、Ｄ−アミノ酸を含まない。
【０１８７】
他のペプチド、またはステープルドもしくはステッチドペプチドへのペプチドの結合
本明細書に記載されるペプチドは、ステープルもしくはステッチされている別のペプチド、または細胞透過性ペプチドである別のペプチド（例えば、ＴＡＴ）に結合していてもよい。ステープルドもしくはステッチドペプチド、または細胞透過性ペプチドは、本明細書において提供されるペプチドが細胞に浸透することを可能にする。ステープルドペプチドまたはステッチドペプチドは、例えば、Ｗａｌｅｎｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００４）３０５：１４６６−１４７０、米国特許第８，５９２，３７７号、米国特許第７，１９２，７１３号、米国特許出願公開第２００６／０００８８４８号、米国特許出願公開第２０１２／０２７０８００号、国際公開第ＷＯ  ２００８／１２１７６７号、および国際公開第ＷＯ  ２０１１／００８２６０号に記載されており、これらの各々は参照により本明細書に組み込まれる。細胞透過性ペプチドは、例えば、Ｍａｒｇｕｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ−ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｓ  ｖｅｒｓａｔｉｌｅ  ｖｅｈｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙＭｏｌ  Ｔｈｅｒ．（２０１２）；２０（３）：５２５−３３に記載されている。
【０１８８】
二量体ディスプレイ技術
本明細書において提供されるスクリーニング方法は、様々なインビトロディスプレイ方法と共に使用され得る。高スループットスクリーニング方法は、標的タンパク質に結合するペプチドを同定するのに有用である。多数のタンパク質（またはペプチド）を調製し、結合活性についてそれらを評価するためにはいくつかの方法が存在し、それらは集合的に「ディスプレイ」技術と称される。これらの技術のほとんどは、タンパク質の配列をコードするＤＮＡ鋳型に基づいてタンパク質を合成する生合成の仕組み（すなわち、細胞内またはインビトロのいずれかのリボソーム）、および発現されたタンパク質をそれをコードするＤＮＡに物理的に連結させる何らかの手段に依存する。この後者の特徴は、ＰＣＲおよび十分に確立されたＤＮＡ配列決定技術を使用して、活性について選択されたタンパク質の同一性を判定する容易な手段を提供し、これにより、ＤＮＡの単一の分子の増幅および分析ですら可能になる。一旦タンパク質が発現され、それらのコーディングＤＮＡに連結されると、所望の特性を有するものは様々な技法を使用して残りから単離され得、その技法は、概して「スクリーン」（この技法では各個別種が１つずつ評価される）または「セレクション」（この技法では分子がまとめて評価される）のいずれかである。ディスプレイ技術は、ナイーブライブラリから結合剤を同定するため、および所望の活性を既に有するタンパク質の特性を改善するための両方に使用され得る。この後者の方法は、典型的には、本来のタンパク質の変異体ライブラリを調製すること、最良のバリアントを単離すること、およびこれらのステップを繰り返すことを伴い、「定向進化」と称される。定向進化は、例えば、Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ  ａｎｄ  Ａｒｎｏｌｄ，Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ：ｎｅｗ  ｐａｒｔｓ  ａｎｄ  ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００９）；２０（４）：４８６−９１において査読されている。
【０１８９】
例示的なディスプレイ技法の１つはファージディスプレイであり、これは、Ｍ１３ファージからコートタンパク質への融合物として目的のタンパク質を発現させることを伴う。大きなファージライブラリは、適切なライブラリＤＮＡを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に形質転換することによって調製され得、一旦生成されると、ライブラリの活性なメンバーが、典型的には「パンニング」セレクションによって単離され得る（パンニングセレクションでは、標的結合タンパク質を固定化し、ファージを表面上で洗い、活性バリアントに結合させる）。ファージディスプレイは最も一般的に使用されているディスプレイ技術であり、多様な生物学的標的ならびに非生物学的標的に結合するタンパク質およびペプチドを同定するために使用されている（Ｌｅｖｉｎ，Ａ．Ｍ．ａｎｄ  Ｗｅｉｓｓ，Ｇ．Ａ．Ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ  ｔｈｅ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ａｎｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｗｉｔｈ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｉｓｐｌａｙ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｓｙｓｔ  ２，４９−５７（２００６））。
【０１９０】
酵母表面ディスプレイは、Ｂｏｄｅｒ  ａｎｄ  Ｗｉｔｔｒｕｐ，Ｙｅａｓｔ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｆｏｒ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １５，５５３−７（１９９７）および米国特許第６，３００，０６５号にさらに記載されている。概して、酵母表面ディスプレイ方法は、ＤＮＡライブラリを細胞（出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）など）に形質転換することを伴い、提示されたタンパク質は、酵母表面タンパク質であるＡｇａ２ｐに融合される（図２）。酵母細胞は、１時間当たり１０７個超の細胞を評価することができ、かつ複数の蛍光シグナルに基づいて細胞を分取することができる、蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）によるスクリーニングを可能にするのに十分に大きい。これは多パラメータ分取を可能にし、細胞の（例えば、蛍光標識された標的タンパク質に対する）絶対結合性のみに基づいてではなく、異なるフルオロフォアの比に基づいて、細胞が選択されることが可能となる。これは、ファージなどの一部の他のディスプレイ細胞では可能となり得ない細胞の選択を可能にする；例えば、融合タンパク質上のエピトープに対する標識抗体が使用される場合、標的結合シグナルは発現レベルに正規化され得る、あるいは、細胞は、別様に標識された標的と比べた１つの標識標的タンパク質に対する嗜好性に基づいて選択され得る。発現に対する正規化は、提示されるタンパク質に対して強い発現傾向を有することが多いファージでは可能でないため、特に有用である。
【０１９１】
酵母ディスプレイの追加の特徴は、提示されるタンパク質が酵母分泌系を通過し、これがジスルフィド結合（および大腸菌に関する一般的な折り畳み構造）の形成を促進することである。この特徴は、活性のために適切に形成されたジスルフィド結合を必要とするタンパク質にとって有利である（一部のジスルフィド含有タンパク質およびペプチドはファージ上で成功裏に提示されているが、多くは適切に形成されることができない）。
【０１９２】
酵母表面ディスプレイに加えて、細胞表面タンパク質への融合体としてタンパク質を提示する類似した細菌系が開発されている。この方法は酵母表面ディスプレイの利点の一部を有し、原理上は（ファージよりは小さいが）酵母よりも大きなライブラリサイズを実現することができるが、酵母系の折り畳み能力およびジスルフィド形成能力を有しない。最後に、ＤＮＡ鋳型を作製し、無細胞翻訳抽出物内でタンパク質を生成することを伴う、いくつかのインビトロディスプレイ方法がある。これらの方法は、形質転換が必要とされないため最大の理論的ライブラリサイズに適応することができ、単離されたヒットを増幅させるためにＰＣＲが典型的に使用されるため、単一の配列の活性を検出できることが多い。ある特定の実施形態では、ｍＲＮＡディスプレイまたはリボソームディスプレイが、ペプチドライブラリを提示するために使用されてもよい。
【０１９３】
ペプチド二量体のライブラリをスクリーニングする方法が、本明細書において提供される。本方法は、第１のペプチドおよび第２のペプチドをコードするベクターでディスプレイ細胞を形質転換させることであって、第１および第２のペプチドが会合して、細胞壁タンパク質に融合したペプチド二量体を形成する、形質転換させることと、ディスプレイ細胞を第１の標識と接触させることであって、第１の標識は、標的タンパク質を含み、標的に対する向上した結合性を有するペプチド二量体を発現する細胞と会合し、標的に対する向上した結合性を有するペプチド二量体を発現しない細胞とは会合しない、接触させることと、第１の標識が会合しているディスプレイ細胞を単離させることと、標的に対して向上した結合性を示す第１および第２のペプチドを同定することと、を含む。代替的に、本方法は、第１のペプチドをコードする第１のベクターおよび第２のペプチドをコードする第２のベクターでディスプレイ細胞を形質転換させることを含んでもよい。
【０１９４】
ペプチドライブラリは、ＰＣＲなどの方法を使用して作製され得る（図５参照）。例えば、鋳型配列のランダム変異誘発（エラープローンＰＣＲ）が使用され得る。十分な重複を有する一式のプライマーが、鋳型にアニーリングされ、伸展され、それによって互いの鋳型として働く。各プライマー内の複数の縮重コドンの使用によって変異が導入され（部位飽和変異誘発）、結果として生じるライブラリにおいて高い組み合わせの多様性がもたらされる。ライブラリを作製する別の方法は、プライマー合成中に三量体ホスホロアミダイトの混合物と共にプライマー内に組み込まれる、いくつかのコドン（各アミノ酸につき１つ）の規定された混合物で出発することである。
【０１９５】
ペプチドライブラリは、膵臓ポリペプチドファミリーに基づく任意のペプチドから設計されることができる。ある特定の実施形態では、ライブラリを設計するために使用されるペプチドは、トリ、ヒト、ウシ、ヒツジ、ブタ、イヌの膵臓ポリペプチド、またはそれらの変異体に基づく。ある特定の実施形態では、ライブラリを設計するために使用されるペプチドは、トリ膵臓ポリペプチド（ａＰＰ）またはその変異体に基づく。ペプチドライブラリは、膵臓ポリペプチドファミリーの足場を含む任意のペプチドから設計されてもよい。ペプチドライブラリは、ＰＰＩＩヘリックスドメインおよびαヘリックスドメインを含む任意のペプチドから設計されてもよい。ペプチドライブラリは、ＰＰＩＩヘリックスドメイン、ループドメイン、およびαヘリックスドメインを含む任意のペプチドから設計されてもよい。ある特定の実施形態では、ループドメインはＩ型βターンである。ある特定の実施形態では、ライブラリを設計するために使用されるペプチドは、配列番号１または４〜１１に基づく。ある特定の実施形態では、ライブラリを設計するために使用されるペプチドは、配列番号１に基づく。ある特定の実施形態では、ペプチドライブラリは、配列番号１または４〜１１に対して８０％〜９９％の相同性を有する任意のペプチドから設計されてもよい。ある特定の実施形態では、ペプチドライブラリは、配列番号１または４〜１１に対して８０％〜９９％同定するを有する任意のペプチドから設計されてもよい。ある特定の実施形態では、ペプチドライブラリは、配列番号２を含む任意のペプチドから設計されてもよい。ある特定の実施形態では、ペプチドライブラリは、配列番号３を含む任意のペプチドから設計されてもよい。
【０１９６】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される発明的ペプチド／二量体は、αヘリックス構造を各々が備える２つのペプチドのペプチドホモ二量体である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される発明的ペプチド／二量体は、ポリプロリンＩＩ型高次構造を各々が備える２つのペプチドのペプチドホモ二量体である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される発明的ペプチド／二量体は、ループドメインによってポリプロリンＩＩ型高次構造に接続されたαヘリックス構造を各々が備える２つのペプチドのペプチドホモ二量体である。ある特定の実施形態では、ループ／リンカードメインはＩ型βターンである。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される発明的ペプチド／二量体は、αヘリックス構造を各々が備える２つのペプチドのペプチドヘテロ二量体である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される発明的ペプチド／二量体は、ポリプロリンＩＩ型高次構造を各々が備える２つのペプチドのペプチドヘテロ二量体である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される発明的ペプチド／二量体は、ループによってポリプロリンＩＩ型高次構造に接続されたαヘリックス構造を各々が備える２つのペプチドのペプチドヘテロ二量体である。
【０１９７】
ある特定の実施形態では、２つのペプチドは、共有結合している。ある特定の実施形態では、２つのペプチドは、非共有結合している。ある特定の実施形態では、２つのペプチドは、ジスルフィド結合、ジセレン結合、炭素−炭素結合、アミド結合、エステル結合、水素結合、塩橋、パイスタッキング相互作用、または非極性疎水性相互作用を介して会合している。ある特定の実施形態では、２つのペプチドは、ジスルフィド結合を介して会合している。ある特定の実施形態では、２つのペプチドは、ジセレン結合を介して会合している。ある特定の実施形態では、２つのペプチドは、水素結合、塩橋、または非極性疎水性相互作用を介して会合している。ある特定の実施形態では、２つのペプチドは、パイスタッキング相互作用を介して会合している。例えば、１つのペプチド上のチロシンは、パイスタッキングを介して、別のペプチド上の別のチロシンと相互作用する。
【０１９８】
ある特定の実施形態では、２つのペプチドの各々は独立して、配列番号１〜配列番号１１の配列、または、少なくともおよそ８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％相同もしくは同一であるそれらの配列を含む。ある特定の実施形態では、２つのペプチドの各々は、ペプチドを別のペプチドと架橋させることができるアミノ酸である部分を含む。ある特定の実施形態では、２つのペプチドの各々は、２つのペプチドを互いに架橋させる部分を含む。ある特定の実施形態では、架橋させることができるアミノ酸は、ＣｙｓまたはＳｅｃである。
【０１９９】
ある特定の実施形態では、架橋させることができる部分は、第１のペプチドを第２のペプチドと架橋させることができる非天然アミノ酸である。ある特定の実施形態では、ディスプレイ細胞は、哺乳動物細胞、細菌細胞、またはファージである。ある特定の実施形態では、ディスプレイ細胞は酵母細胞である。ある特定の実施形態では、ディスプレイ細胞は出芽酵母である。ある特定の実施形態では、本ペプチド二量体は、酵母表面タンパク質に融合している。ある特定の実施形態では、酵母表面タンパク質はＡｇａ２ｐである。
【０２００】
ある特定の実施形態では、標的タンパク質は非対称である。ある特定の実施形態では、標的タンパク質は、ＲａｓまたはＲａｓ変異体である。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、Ｒａｓ・ＧＤＰよりもＲａｓ・ＧＴＰに対して高い選択性を有する。ある特定の実施形態では、本ペプチドは、Ｒａｓ・ＧＤＰよりもＲａｓ・ＧＴＰに対して少なくともおよそ１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、または１０倍選択的である。
【０２０１】
第１の標識は、標的タンパク質を標識するために使用され、次いでディスプレイ細胞と共にインキュベートされる。ある特定の実施形態では、第１の標識は、標的タンパク質に結合した蛍光標識である。ある特定の実施形態では、第１の標識は、Ｒａｓに結合したビオチンである。フィコエリトリン、アロフィコシアニン、Ａｌｅｘａ６４７、Ａｌｅｘａ４８８、およびＦＩＴＣなどの他のフルオロフォアを、標的タンパク質を標識するために使用してもよい。
【０２０２】
任意選択の第２の標識を使用して、ディスプレイ細胞上に提示される融合タンパク質の存在量を測定してもよい。第２の標識は、蛍光標識されている抗体、または第１の標識に結合することができるマイクロビーズであってもよい。結合した標的タンパク質を含有するディスプレイ細胞を分取するのに有用な例示的な方法としては、蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）および磁気活性化細胞分取（ＭＡＣＳ）が挙げられる。
【０２０３】
使用および処置の方法
Ｒａｓに関連した疾患または状態の処置を必要とする対象においてそれを処置する方法であって、有効量の本明細書に記載されるペプチドを対象に投与することを含む方法が、本明細書において提供される。Ｒａｓに関連した疾患または状態の処置を必要とする対象においてそれを処置する方法であって、有効量の本明細書に記載されるペプチドを対象に取り込むように対象に指示することを含む方法が、本明細書において提供される。Ｒａｓに関連した疾患または状態の処置を必要とする対象においてそれを処置する際に使用するためのペプチドも、本明細書において提供される。
【０２０４】
ある特定の実施形態では、Ｒａｓに関連した疾患は、増殖性疾患である。本明細書において使用される場合、増殖性の疾患、状態、または障害には、癌、造血性腫瘍障害、良性腫瘍（すなわち、腫瘍）、糖尿病性網膜症、リウマチ性関節炎、黄斑変性症、肥満、およびアテローム性動脈硬化症が含まれるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、増殖性疾患は癌である。例示的な癌としては、細胞腫、肉腫、または転移性障害、乳癌、卵巣癌、結腸癌、肺癌、線維肉腫、筋肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓａｒｃｏｍａ）、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫（ｌｙｍｐｈａｎｇｉｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓａｒｃｏｍａ）、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）、食道癌、直腸癌、膵臓癌、卵巣癌、前立腺癌、子宮癌、頭頸部癌、皮膚癌、脳癌、胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）、扁平上皮細胞癌、皮脂腺癌（ｓｅｂａｃｅｏｕｓ  ｇｌａｎｄ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、乳頭癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性肺癌、腎細胞癌、肝細胞腫、胆管癌、絨毛癌、セミノーマ、胚性癌腫、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫瘍、乏突起神経膠腫、髄膜腫、メラノーマ、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、白血病、リンパ腫、およびカポジ肉腫が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２０５】
例示的な造血性腫瘍障害としては、造血性起源の（例えば、骨髄、リンパ系、または赤血球系統から生じる）増生細胞／腫瘍性細胞、またはそれらの前駆体細胞が関わる障害が挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、障害は、低分化の急性白血病、例えば、赤芽球性白血病および急性巨核芽球性白血病から生じる。追加の例示的な骨髄疾患としては、限定されないが、急性前骨髄白血病（ＡＰＭＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、および慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）が挙げられ、リンパ系腫瘍としては、限定されないが、Ｂ系統ＡＬＬおよびＴ系統ＡＬＬを含む急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、前リンパ球性白血病（ＰＬＬ）、有毛細胞性白血病（ＨＬＬ）、ならびにヴァルデンストレームマクログロブリン血症（ＷＭ）が挙げられる。悪性リンパ腫の追加の形態としては、非ホジキンリンパ腫およびその変種、末梢Ｔ細胞リンパ腫、成人Ｔ細胞性白血病／リンパ腫（ＡＴＬ）、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）、大顆粒リンパ球性白血病（ＬＧＦ）、ホジキン病、ならびにＲｅｅｄ−Ｓｔｅｍｂｅｒｇ病が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２０６】
ある特定の実施形態では、Ｒａｓに関連した疾患は、非増殖性疾患である。ある特定の実施形態では、Ｒａｓに関連した疾患は、Ｒａｓ／ＭＡＰＫ症候群である。ある特定の実施形態では、Ｒａｓに関連した疾患は、ＣＦＣ症候群、毛細血管奇形−動静脈奇形症候群、Ｃｏｓｔｅｌｌｏ症候群、Ｌｅｇｉｕｓ症候群、神経線維腫症１型、Ｎｏｏｎａｎ症候群、または多発性黒子を伴うＮｏｏｎａｎ症候群（以前はＬＥＯＰＡＲＤ症候群）である。
【０２０７】
薬学的組成物
本明細書に記載されるペプチドおよび薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的組成物が、本明細書において提供される。薬学的組成物は、治療的使用のための組成物を含む。そのような組成物は、任意選択により、１つ以上の追加の治療活性剤を含んでもよい。一部の実施形態によると、発明的組成物を含む薬学的組成物を、それを必要とする対象に投与する方法が提供される。一部の実施形態では、発明的組成物は、ヒトに投与される。本発明では、「活性成分」は概して、本明細書に記載されるペプチドを指す。
【０２０８】
本明細書において提供される薬学的組成物の説明はヒトへの投与のための薬学的組成物を主に対象とするが、そのような組成物があらゆる種類の動物への投与に概して好適であることは、当業者には理解されるであろう。様々な動物への投与のための薬学的組成物の改変は十分に理解されており、獣医学的薬理学の当業者であれば、あったとしても単なる通常の実験を用いて、そのような改変を設計および／または実施することができる。
【０２０９】
本明細書に記載される薬学的組成物は、薬理学の分野で公知であるかまたは今後開発される、任意の方法によって調製され得る。概して、そのような調製方法は、活性成分を賦形剤および／または１つ以上の他の補助成分と会合させるステップ、そして、必要かつ／または望ましい場合は、その生成物を付形および／または梱包して所望の単一用量または複数用量単位にするステップを含む。
【０２１０】
本発明の薬学的組成物は、まとめて、単一単位用量として、かつ／または複数の単一単位用量として、調製、梱包、および／または販売されてもよい。本明細書において使用される場合、「単位用量」は、所定量の活性成分を含む薬学的組成物の個別の量である。活性成分の量は概して、対象に投与される活性成分の薬用量、および／または、そのような薬用量の簡便な一部分、例えば、そのような薬用量の１／２もしくは１／３などと等しい。
【０２１１】
本発明の薬学的組成物内の活性成分、薬学的に許容される賦形剤、および／または任意の追加の成分の相対量は、処置される対象の同一性、サイズ、および／または障害に応じて、またさらに、本組成物が投与される経路に応じて変動する。例として、本組成物は、０．１％〜１００％（ｗ／ｗ）の活性成分を含んでもよい。
【０２１２】
本明細書において使用される場合、薬学的に許容される賦形剤には、所望される特定の薬用量形態に適した、ありとあらゆる溶媒、分散媒体、希釈剤、または他の液体ビヒクル、分散もしくは懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘剤もしくは乳化剤、防腐剤、固形結合剤、滑沢剤などが含まれる。ＲｅｍｉｎｇｔｏｎのＴｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ，２００６）は、薬学的組成物の製剤化に使用される様々な賦形剤、およびその調製のための公知の技法を開示している。いかなる従来型の担体媒体も、望まれない生物学的作用をもたらすこと、ないしは薬学的組成物の他の構成成分（複数可）のいずれかと有害な様式で相互作用することなどにより、物質またはその誘導体と不適合である場合を除いて、その使用は本発明の範囲内であることが企図される。
【０２１３】
一部の実施形態では、薬学的に許容される賦形剤は、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％純粋である。一部の実施形態では、賦形剤は、ヒトにおける使用および獣医学的使用に認可されている。一部の実施形態では、賦形剤は、米国食品医薬品局（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）によって認可されている。一部の実施形態では、賦形剤は、薬学的グレードである。一部の実施形態では、賦形剤は、米国薬局方（ＵＳＰ）、ヨーロッパ薬局方（ＥＰ）、英国薬局方、および／または国際薬局方の基準を満たす。
【０２１４】
薬学的組成物の製造に使用される薬学的に許容される賦形剤としては、不活性希釈剤、分散剤および／もしくは造粒剤、界面活性剤および／もしくは乳化剤、崩壊剤、結合剤、防腐剤、緩衝剤、滑沢剤、ならびに／または油類が挙げられるが、これらに限定されない。そのような賦形剤は、任意選択により、発明的製剤に含まれてもよい。調合者の判断により、カカオバターおよび坐薬型ワックスなどの賦形剤、着色剤、コーティング剤、甘味剤、風味剤、ならびに香料が組成物中に存在してもよい。
【０２１５】
例示的な希釈剤としては、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、リン酸カルシウム、リン酸二カルシウム、硫酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、リン酸ナトリウムラクトース、スクロース、セルロース、微結晶セルロース、カオリン、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、塩化ナトリウム、乾燥デンプン、トウモロコシデンプン、粉糖、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２１６】
例示的な造粒剤および／または分散剤としては、ジャガイモデンプン、トウモロコシデンプン、タピオカデンプン、デンプングリコール酸ナトリウム、粘土、アルギン酸、グアーガム、柑橘類の果肉、寒天、ベントナイト、セルロースおよび木製品、海綿、カチオン交換樹脂、炭酸カルシウム、ケイ酸塩、炭酸ナトリウム、架橋ポリ（ビニル−ピロリドン）（クロスポビドン）、カルボキシメチルデンプンナトリウム（デンプングリコール酸ナトリウム）、カルボキシメチルセルロース、架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム（クロスカルメロース）、メチルセルロース、アルファ化デンプン（デンプン１５００）、微結晶デンプン、非水溶性デンプン、カルボキシメチルセルロースカルシウム、ケイ酸アルミニウムマグネシウム（Ｖｅｅｇｕｍ）、ラウリル硫酸ナトリウム、四級アンモニウム化合物、ならびにそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２１７】
例示的な界面活性剤および／または乳化剤としては、天然乳化剤（例えば、アカシア、寒天、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、トラガント、コンドラックス（ｃｈｏｎｄｒｕｘ）、コレステロール、キサンタン、ペクチン、ゼラチン、卵黄、カゼイン、羊毛脂、コレステロール、ワックス、およびレシチン）、コロイド粘土（例えば、ベントナイト［ケイ酸アルミニウム］およびＶｅｅｇｕｍ［ケイ酸アルミニウムマグネシウム］）、長鎖アミノ酸誘導体、高分子量アルコール（例えば、ステアリルアルコール、セチルアルコール、オレイルアルコール、トリアセチンモノステアレート、エチレングリコールジステアレート、モノステアリン酸グリセリル、およびプロピレングリコールモノステアレート、ポリビニルアルコール）、カルボマー（例えば、カルボキシポリメチレン、ポリアクリル酸、アクリル酸ポリマー、およびカルボキシビニルポリマー）、カラゲナン、セルロース誘導体（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、粉末セルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース）、ソルビタン脂肪酸エステル（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート［Ｔｗｅｅｎ  ２０］、ポリオキシエチレンソルビタン［Ｔｗｅｅｎ  ６０］、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート［Ｔｗｅｅｎ  ８０］、ソルビタンモノパルミテート［Ｓｐａｎ  ４０］、ソルビタンモノステアレート［Ｓｐａｎ  ６０］、ソルビタントリステアレート［Ｓｐａｎ  ６５］、モノオレイン酸グリセリル、ソルビタンモノオレエート［Ｓｐａｎ  ８０］）、ポリオキシエチレンエステル（例えば、ポリオキシエチレンモノステアレート［Ｍｙｒｊ  ４５］、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリエトキシル化ヒマシ油、ポリオキシメチレンステアレート、およびＳｏｌｕｔｏｌ）、スクロース脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル（例えば、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ）、ポリオキシエチレンエーテル、（例えば、ポリオキシエチレンラウリルエーテル［Ｂｒｉｊ  ３０］）、ポリ（ビニル−ピロリドン）、モノラウリン酸ジエチレングリコール、オレイン酸トリエタノールアミン、オレイン酸ナトリウム、オレイン酸カリウム、オレイン酸エチル、オレイン酸、ラウリン酸エチル、ラウリル硫酸ナトリウム、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ  ６８、ポロクサマー１８８、臭化セトリモニウム、塩化セチルピリジニウム、塩化ベンザルコニウム、ドクサートナトリウム、ならびに／またはそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２１８】
例示的な結合剤としては、デンプン（例えば、トウモロコシデンプンおよびデンプンペースト）、ゼラチン、糖類（例えば、スクロース、グルコース、デキストロース、デキストリン、糖蜜、ラクトース、ラクチトール、マンニトール）、天然ガムおよび合成ガム（例えば、アカシア、アルギン酸ナトリウム、アイリッシュモスエキス、パンワールガム（ｐａｎｗａｒ  ｇｕｍ）、ガティガム（ｇｈａｔｔｉ  ｇｕｍ）、イサポール（ｉｓａｐｏｌ）皮粘液、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、微結晶セルロース、酢酸セルロース、ポリ（ビニル−ピロリドン）、ケイ酸アルミニウムマグネシウム（Ｖｅｅｇｕｍ）、およびカラマツアラボガラクタン（ｌａｒｃｈ  ａｒａｂｏｇａｌａｃｔａｎ））、アルギン酸塩、ポリエチレンオキシド、ポリエチレングリコール、無機カルシウム塩、ケイ酸、ポリメタクリレート、ワックス、水、アルコール、ならびにそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２１９】
例示的な防腐剤としては、抗酸化剤、キレート剤、抗菌性防腐剤、抗真菌性防腐剤、アルコール防腐剤、酸性防腐剤、および他の防腐剤を挙げることができる。例示的な抗酸化剤としては、αトコフェロール、アスコルビン酸、アコルビルパルミテート（ａｃｏｒｂｙｌ  ｐａｌｍｉｔａｔｅ）、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、モノチオグリセロール、メタ重亜硫酸カリウム、プロピオン酸、没食子酸プロピル、アスコルビン酸ナトリウム、重亜硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、および亜硫酸ナトリウムが挙げられるが、これらに限定されない。例示的なキレート剤としては、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、クエン酸一水和物、エデト酸二ナトリウム、エデト酸二カリウム、エデト酸、フマル酸、リンゴ酸、リン酸、エデト酸ナトリウム、酒石酸、およびエデト酸三ナトリウムが挙げられる。例示的な抗菌性防腐剤としては、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、ベンジルアルコール、ブロノポール、セトリミド、塩化セチルピリジニウム、クロルヘキシジン、クロロブタノール、クロロクレゾール、クロロキシレノール、クレゾール、エチルアルコール、グリセリン、ヘキセチジン、イミド尿素、フェノール、フェノキシエタノール、フェニルエチルアルコール、硝酸フェニル水銀、プロピレングリコール、およびチメロサールが挙げられるが、これらに限定されない。例示的な抗真菌性防腐剤としては、ブチルパラベン、メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、安息香酸、ヒドロキシ安息香酸、安息香酸カリウム、ソルビン酸カリウム、安息香酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、およびソルビン酸が挙げられるが、これらに限定されない。例示的なアルコール防腐剤としては、エタノール、ポリエチレングリコール、フェノール、フェノール化合物、ビスフェノール、クロロブタノール、ヒドロキシベンゾエート、およびフェニルエチルアルコールが挙げられるが、これらに限定されない。例示的な酸性防腐剤としては、ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＥ、βカロテン、クエン酸、酢酸、デヒドロ酢酸、アスコルビン酸、ソルビン酸、およびフィチン酸が挙げられるが、これらに限定されない。他の防腐剤としては、トコフェロール、酢酸トコフェロール、デテロキシムメシレート（ｄｅｔｅｒｏｘｉｍｅ  ｍｅｓｙｌａｔｅ）、セトリミド、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエンｄ（ＢＨＴ）、エチレンジアミン、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ）、ラウリルエーテル硫酸ナトリウム（ＳＬＥＳ）、重亜硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸カリウム、メタ重亜硫酸カリウム、Ｇｌｙｄａｎｔ  Ｐｌｕｓ、Ｐｈｅｎｏｎｉｐ、メチルパラベン、Ｇｅｒｍａｌｌ  １１５、Ｇｅｒｍａｂｅｎ  ＩＩ、Ｎｅｏｌｏｎｅ、Ｋａｔｈｏｎ、およびＥｕｘｙｌが挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、防腐剤は抗酸化剤である。他の実施形態では、防腐剤はキレート剤である。
【０２２０】
例示的な緩衝剤としては、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、塩化アンモニウム、炭酸カルシウム、塩化カルシウム、クエン酸カルシウム、グルビオン酸カルシウム、グルセプト酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、Ｄ−グルコン酸、グリセロリン酸カルシウム、乳酸カルシウム、プロパン酸、レブリン酸カルシウム、ペンタン酸、二塩基性リン酸カルシウム、リン酸、三塩基性リン酸カルシウム、水酸化リン酸カルシウム（ｃａｌｃｉｕｍ  ｈｙｄｒｏｘｉｄｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、酢酸カリウム、塩化カリウム、グルコン酸カリウム、カリウム混合物、二塩基性リン酸カリウム、一塩基性リン酸カリウム、リン酸カリウム混合物、酢酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、二塩基性リン酸ナトリウム、一塩基性リン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム混合物、トロメタミン、水酸化マグネシウム、水酸化アルミニウム、アルギン酸、パイロジェンフリー水、等張生理食塩水、リンゲル液、エチルアルコール、ならびにそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２２１】
例示的な滑沢剤としては、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸、シリカ、タルク、麦芽、グリセリルベハネート（ｇｌｙｃｅｒｙｌ  ｂｅｈａｎａｔｅ）、硬化植物油、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、ロイシン、ラウリル硫酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２２２】
例示的な油類としては、アーモンド油、キョウニン油、アボカド油、ババス油、ベルガモット油、黒潮種子油、ルリジサ油、ジュニパータール油、カモミール油、キャノーラ油、カラウェー油、カルナバ油、ヒマシ油、ケイヒ油、カカオバター、ヤシ油、タラ肝油、コーヒー油、トウモロコシ油、綿実油、エミュー油、ユーカリ油、月見草油、魚油、アマニ油、ゲラニオール、ウリ油、ブドウ種子油、ヘーゼルナッツ油、ヒソップ油、ミリスチン酸イソプロピル、ホホバ油、ククイの実油、ラバンジン油、ラベンダー油、レモン油、リツェアクベバ油、マカデミアナッツ油、ゼニアオイ油、マンゴー種子油、メドウフォーム種子油、ミンク油、ナツメグ油、オリーブ油、オレンジ油、オレンジラフィー油、パーム油、パーム核油、トウニン油、ピーナッツ油、ケシ種子油、カボチャ種子油、ナタネ油、米ぬか油、ローズマリー油、サフラワー油、ビャクダン油、サスクアナ油（ｓａｓｑｕａｎａ）、セイボリー油、シーバックソーン油、ゴマ油、シアバター、シリコーン、大豆油、ヒマワリ油、ティーツリー油、アザミ油、ツバキ油、ベチベル油、クルミ油、および小麦胚種油が挙げられるが、これらに限定されない。例示的な油類としては、ステアリン酸ブチル、カプリル酸トリグリセリド、カプリン酸トリグリセリド、シクロメチコン、セバシン酸ジエチル、ジメチコン３６０、ミリスチン酸イソプロピル、鉱物油、オクチルドデカノール、オレイルアルコール、シリコーン油、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２２３】
薬学的薬剤の製剤化および／または製造における概論は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  ２１ｓｔ  ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００５に見出すことができる。
【０２２４】
本明細書において提供される発明的ペプチドは、典型的に、投与の容易さおよび薬用量の均一性のために、薬用量単位形態で製剤化される。しかしながら、本発明の組成物の１日の合計使用量が、健全な医学的判断の範囲内で担当医により決定されることは理解されるであろう。いかなる特定の対象に対する特定の治療有効用量レベルも、疾患、障害、または処置される障害、および障害の重症度、用いられる特定の活性成分の活性、用いられる特定の組成物、対象の年齢、体重、全体的健康、性別、および食事、用いられる特定の活性成分の投与時間，投与経路，および排泄速度、処置の持続期間、用いられる特定の活性成分と組み合わせてまたは同時に使用される薬物、ならびに医学分野で周知の同様の要因といった、様々な要因に依存する。
【０２２５】
本明細書において提供されるペプチドまたはその薬学的組成物は、任意の経路によって投与されてよい。一部の実施形態では、本ペプチドまたはその薬学的組成物は、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、髄腔内、皮下、脳室内、経皮、皮内、直腸、腟内、腹腔内、局所（粉末、軟膏、クリーム、および／または点滴薬などによる）、粘膜、経鼻、頬側、腸内、舌下を含む様々な経路によって、気管内注入、気管支注入、および／もしくは吸入によって、ならびに／または口腔スプレー、鼻腔スプレー、および／もしくはエアロゾルとして、投与される。特に企図される経路は、全身静脈注入、血液および／もしくはリンパ供給を介する局所投与、ならびに／または患部への直接投与である。概して、最も適切な投与経路は、薬剤の性質（例えば、胃腸管の環境内でのその安定性）、および対象の障害（例えば、対象が経口投与に耐えることができるかどうか）を含む、様々な要因に依存する。現在のところ、肺および／または呼吸器系に治療的薬剤を直接送達するためには、口腔スプレーおよび／もしくは鼻腔スプレーならびに／またはエアロゾル経路が最も一般的に使用されている。しかしながら、本発明は、薬物送達の科学において起こり得る進展を考慮して、任意の適切な経路による発明的な薬学的組成物の送達を包含する。
【０２２６】
ある特定の実施形態では、本ペプチドまたはその薬学的組成物は、所望の治療効果を得るために、１日に１回以上、１日当たり約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、または約１ｍｇ／ｋｇ〜約２５ｍｇ／ｋｇ（対象の体重）の、送達に十分な薬用量レベルで投与され得る。所望の薬用量は、１日３回、１日２回、１日１回、２日毎、３日毎、１週間毎、２週間毎、３週間毎、または４週間毎に送達されてもよい。ある特定の実施形態では、所望の薬用量は、複数投与（例えば、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１１回、１２回、１３回、１４回、またはそれ以上の投与）を使用して送達されてもよい。
【０２２７】
本明細書に記載される用量範囲は、提供される薬学的組成物を成人に投与するための指針を提供することが理解されるであろう。例えば、小児または青年に投与される量は医師または当業者によって決定され得、成人に投与される量より低くても同じであってもよい。有効量を実現するために必要とされる発明的ペプチドの正確な量は、例えば、対象の種、年齢、および全体的な障害、副作用または障害の重症度、特定の化合物（複数可）の同一性、投与形態などに応じて、対象それぞれで異なる。
【０２２８】
一部の実施形態では、本発明は、発明的ペプチドを含む「治療薬カクテル」を包含する。一部の実施形態では、発明的ペプチドは、複数の標的に結合することができる単一種を含む。一部の実施形態では、異なる発明的ペプチドは異なる標的部分種を含み、異なる標的部分種の全てが、同じ標的に結合することができる。一部の実施形態では、異なる発明的ペプチドは異なる標的部分種を含み、異なる標的部分種の全てが、異なる標的に結合することができる。一部の実施形態では、そのような異なる標的は、同じ細胞型に関連し得る。一部の実施形態では、そのような異なる標的は、異なる細胞型に関連し得る。
【０２２９】
本発明の発明的ペプチドおよび薬学的組成物が併用療法で用いられ得ることは理解されるであろう。併用レジメンで用いるべき療法（治療薬または手技）の特定の組み合わせは、所望の治療薬および／または手技、ならびに実現されるべき所望の治療効果を考慮に入れるものである。用いられる療法が、同じ目的に関して所望の作用を実現してもよく（例えば、腫瘍を検出するのに有用な発明的結合体は、腫瘍を検出するのに有用な別の薬剤と同時に投与されてもよく）、または異なる作用（例えば、有害作用の制御）を実現してもよいことは理解されるであろう。
【０２３０】
本発明の薬学的組成物は、単独または１つ以上の治療活性剤との組み合わせのいずれで投与されてもよい。「との組み合わせで」とは、それらの薬剤が一緒に送達されるために同時に投与および／または製剤化されなければならないことを暗示するものではないが、これらの送達方法は本発明の範囲内である。本組成物は、１つ以上の他の所望の治療薬または医学的手技と同時に、その前に、またはその後に投与されてもよい。概して、各薬剤は、その薬剤に関して決定された用量および／またはタイムスケジュールで投与される。さらに、本発明は、発明的な薬学的組成物の生体利用能を向上させ、発明的な薬学的組成物の代謝を低減および／もしくは改変し、発明的な薬学的組成物の排泄を抑制し、かつ／または体内における発明的な薬学的組成物の分配を改変し得る薬剤と組み合わせた、発明的な薬学的組成物の送達を包含する。この組み合わせで用いられる治療活性剤および発明的ペプチドが、単一の組成物で一緒に投与されてもよく、または異なる組成物で別々に投与されてもよいことは、さらに理解されるであろう。
【０２３１】
併用レジメンで用いられる特定の組み合わせは、治療活性剤および／または手技と、発明的ペプチドおよび／または実現されるべき所望の治療効果との適合性を考慮に入れるものである。用いられる組み合わせが、同じ障害に関して所望の作用を実現してもよく（例えば、発明的ペプチドは、同じ障害を処置するために使用される別の治療活性剤と同時に投与されてもよく）、かつ／または異なる作用（例えば、有害作用の制御）を実現してもよいことは理解されるであろう。
【０２３２】
本明細書において使用される場合、「治療活性剤」は、障害の処置、防止、遅延、低減、または寛解のための医薬として使用される任意の物質を指し、かつ、予防的処置および治療的処置を含む療法に有用である物質を指す。治療活性剤はまた、例えば、発明的ペプチドの効力を増進させるか、またはその有害作用を低減させることにより、別の化合物の作用または有効性を向上させる化合物を含む。
【０２３３】
ある特定の実施形態では、治療活性剤は、抗癌剤、抗生物質、抗ウイルス剤、抗ＨＩＶ剤、抗寄生虫剤、抗原虫剤、麻酔薬、抗凝固薬、酵素抑制剤、ステロイド剤、ステロイド性もしくは非ステロイド性の抗炎症剤、抗ヒスタミン薬、免疫抑制剤、抗悪性腫瘍剤、抗原、ワクチン、抗体、うっ血除去薬、鎮静薬、オピオイド、鎮痛薬、解熱薬、受胎調節剤、ホルモン、プロスタグランジン、プロゲステロン作用薬、抗緑内障剤、点眼剤、抗コリン薬、鎮痛薬、抗うつ薬、抗精神病薬、神経毒、催眠薬、精神安定薬、抗痙攣薬、筋弛緩薬、抗パーキンソン病薬、鎮痙薬、筋収縮薬（ｍｕｓｃｌｅ  ｃｏｎｔｒａｃｔａｎｔ）、チャネル遮断薬、縮瞳剤、抗分泌剤、抗血栓剤、抗凝固薬、抗コリン薬、βアドレナリン遮断薬、利尿薬、心血管作用剤、血管作用剤、血管拡張剤、降圧剤、血管新生剤、細胞−細胞外マトリックス相互作用の調節薬（例えば、細胞成長抑制剤および抗接着分子）、またはＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質−タンパク質相互作用、タンパク質−受容体相互作用の抑制剤／干渉物質である。
【０２３４】
一部の実施形態では、発明的な薬学的組成物は、癌の１つ以上の症状または特徴を処置し、緩和し、寛解させ、軽減させ、その発症を遅延させ、その進行を抑制し、その重症度を低減させ、かつ／またはその発生率を低減させるために有用である、任意の治療活性剤または手技（例えば、手術、放射線療法）と組み合わせて投与されてもよい。
【０２３５】
キット
本発明のペプチドのうちの１つ以上を含む様々なキットが、本明細書において提供される。例えば、本発明は、発明的ペプチドおよび使用のための説明書を含むキットを提供する。キットは、複数の異なるペプチドを含んでもよい。キットは、いくつかの追加の構成要素または試薬のうちのいずれを、任意の組み合わせで含んでもよい。様々な組み合わせの全てを明示的に記載はしないが、各組み合わせが本発明の範囲内に含まれる。
【０２３６】
本発明のある特定の実施形態によると、キットは、例えば、（ｉ）１つ以上の発明的ペプチド、および、任意選択により、送達されるべき１つ以上の特定の治療活性剤、（ｉｉ）それを必要とする対象への投与に関する説明書を含んでもよい。
【０２３７】
キットは典型的に、例えば、発明的ペプチドの生成、それを必要とする対象への発明的ペプチドの投与、新規の発明的ペプチドの設計に関するプロトコルを含み、かつ／または障害を説明してもよい説明書を含む。キットは概して、個別の構成要素および試薬の一部または全部が別々に収容され得るように、１つ以上のベッセルすなわち容器を含む。キットはまた、商業的販売のために個別の容器を比較的狭く閉ざされた状態で封入するための手段、例えば、プラスチックの箱を含んでもよく、その中に説明書、スタイロフォームなどの梱包材料が封入されてもよい。識別子、例えば、バーコード、無線周波数識別（ＩＤ）タグが、キット内またはその上、あるいは、キット内に含まれるベッセルすなわち容器のうちの１つ以上の中またはに存在してもよい。識別子は、例えば、品質管理、在庫管理、追跡、ワークステーション間の移動の目的で、キットを一意的に識別するために使用され得る。
【０２３８】
本明細書に記載される本発明がより十分に理解され得るように、以下の実施例を記載する。これらの実施例は例示のみを目的とするものであり、本発明をいかようにも限定するものと解釈されるべきではないことを理解されたい。
【実施例】
【０２３９】
本明細書に記載される本発明がより十分に理解され得るように、以下の実施例を記載する。これらの実施例は例示のみを目的とするものであり、本発明をいかようにも限定するものと解釈されるべきではないことを理解されたい。
【０２４０】
実験方法
一般的方法。オリゴヌクレオチドプライマーは、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  ＭＷＧ  ＯｐｅｒｏｎまたはＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから発注した。三量体ホスホロアミダイト含有プライマーをＹａｌｅ  Ｋｅｃｋ  Ｏｌｉｇｏ施設から発注し、三量体ホスホロアミタイド（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏａｍｉｔｉｄｅ）構成要素（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）と合成した。ＬｏｎｇＡｍｐ  Ｔａｑポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いてＰＣＲを実施し、ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した。プラスミドを標準方法により大腸菌内で増殖させ、Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製した。吸光測定は、ＮａｎｏＤｒｏｐ  ２０００Ｃ分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて実施した。ＨＰＬＣは、Ｓｕｐｅｌｃｏの２５０×１０ｍｍ  Ｃ１８カラムを備えたＡｇｉｌｅｎｔ  １２００シリーズの計器を用いて実施した。ＬＣ／ＭＳは、Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００シリーズの四重極型ＭＳＤに接続されたＡｇｉｌｅｎｔの１５０×２．１ｍｍ  Ｃ１８カラムを備えたＡｇｉｌｅｎｔ  １２６０シリーズの計器を用いて実施した。ゲル濾過および脱塩は、Ａｋｔａ  ＦＰＬＣ（Ａｍｅｒｓｈａｍ／ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で実施した。
【０２４１】
ペプチド合成。ペプチドは、典型的には３０μｍｏｌスケールでＲｉｎｋアミド樹脂を使用して、標準的なフルオレニルメチルオキシカルボニルクロリド（Ｆｍｏｃ）法によって、固相で合成した。この樹脂結合ペプチドのＮ末端Ｆｍｏｃ保護基を、Ｎ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）中２５％のピペリジンでの１０分間の処理２回、続いてＮＭＰでの４回の洗浄によって除去した。Ｆｍｏｃ保護アミノ酸（０．１９Ｍの最終濃度で６当量）を、ＰｙＣｌｏｃｋ（５．７当量）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ、１２当量）と事前混合し、樹脂と共に窒素下で１時間バブリングした。カップリングが困難であると予想されたため（例えば、α，α−二置換アミノ酸、β分岐アミノ酸、およびプロリンの後）１時間のカップリング反応を２回連続的に行った。カップリング後、この樹脂をＮＭＰ中で４回洗浄し、前述同様に脱保護した。１，２−ジクロロエタン（ＤＣＥ）中１０ｍＭのグラブスＩ触媒での２時間の処理を２回用い、オレフィンメタセシスを行った。ＮＭＰ中１０％（ｖ／ｖ）のＤＩＥＡと共に３０ｍｇ／ｍｌのＦＩＴＣ中で一晩樹脂をバブリングすることによって、ＦＩＴＣをペプチドＮ末端に付加した。この合成後、ペプチドを、９５％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、２．５％のトリイソプロピルシラン（ＴＩＳ）、および２．５％のＨ２Ｏ中で脱保護し開裂させ、次いで、０．１％のＴＦＡを含むＨ２Ｏ中で１０％から１００％までのアセトニトリル勾配を使用した高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって精製した。収集した画分を、ＳｐｅｅｄＶａｃおよび凍結乾燥によって乾燥させた。
【０２４２】
円二色性分光法。ＣＤ測定は、ＰＴＣ−３４８Ｗ温度制御器を備えたＪａｓｃｏ  Ｊ−７１０分光光度計で行った。試料（約１９０μｌ）を、別段の記載がない限り５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ８）中２０〜８０μＭで、（パラフィルムで密閉した）１ｍｍの石英キュベットに入れた。スペクトルについては、ＣＤは、２５℃で０．１ｎｍの増分間隔で２０ｎｍ／分の走査速度で、２６０ｎｍから１９０ｎｍまで走査した。融解曲線については、２２２ｎｍでＣＤを記録しながら、温度を２℃／分の速度で１０℃から９０℃に上昇させた。生曲線（ｒａｗ  ｃｕｒｖｅ）は、Ｓａｖｉｔｚｋｙ−Ｇｏｌａｙフィルタを使用して平滑化した。
【０２４３】
マトリックス支援レーザー脱離／イオン化。ＭＡＬＤＩは、ＷａｔｅｒｓのＭＡＬＤＩ  Ｍｉｃｒｏ  ＭＸで実施した。２００ｐｍｏｌのタンパク質を、０．１％のＴＦＡを含有する水中で２０μｌに増やし、次いでＺｉｐＴｉｐのμＣ１８チップに結合させ、水＋０．１％ＴＦＡで洗浄し、次いで５０％ＭｅＣＮ＋０．１％ＴＦＡで溶離させた。シナピン酸の４０％ＭｅＣＮ＋０．１％ＴＦＡ飽和溶液で予めスポッティングされている金属製のＭＡＬＤＩプレートに試料を加え、次いで分析前に空気乾燥させた。
【０２４４】
酵母へのライブラリ形質転換。酵母ディスプレイプロトコルは概して、Ｗｉｔｔｒｕｐおよび共同研究者らによって説明されているように行った１、２。酵母密度を吸光度によって数量化し（１  ＡＵ６００＝１０７細胞／ｍｌ）、細胞を（１．５ｍｌのエッペンドルフ管内で）約４５秒１５，０００×ｇで、または（より大きな体積については）３分間２，５００×ｇでペレット化した。直線化したｐＣＴＣＯＮ２（１μｇ）をＰＣＲインサート（４μｇ）と混合し、水中で１００μｌに増やし、２μｌのＰｅｌｌｅｔＰａｉｎｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ）、続いて１０μｌの４Ｍ  ＮＨ４Ａｃを添加し、混合し、次いで２００μｌのエタノールを添加し、５分間インキュベートすることによって沈殿させた。このＤＮＡをペレット化し、２００μｌの７０％エタノールで洗浄し、次いで１００％エタノールで洗浄し、空気乾燥させた。このＤＮＡを２μｌの水に再懸濁させ、形質転換まで４℃で保管した。出芽酵母株ＥＢＹ１００（Ｋ．Ｄａｎｅ  Ｗｉｔｔｒｕｐ（Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）から入手）を、２２５ｒｐｍで振盪しながら３０℃のＹＰＤ培地で成長させた。細胞を形質転換前に２回継代培養して、健康な培養物を確保した。形質転換の日、細胞を１１０ｍｌのＹＰＤ培地内で０．１のＯＤ６００まで希釈し、ＯＤ６００＝１．４まで成長させ、その時点で１ｍｌのトリス−ＤＴＴ緩衝液（１Ｍトリス中２．５ＭのＤＴＴ、ｐＨ８）を添加した。さらに１５分間の振盪の後、これらの細胞をペレット化し、５０ｍｌの１０ｍＭトリス、２７０ｍＭスクロース、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２（ｐＨ７．５）中に再懸濁させ、再度ペレット化し、さらに２５ｍｌの同じ緩衝液で洗浄した。これらの細胞を、緩衝液で約６００μｌの最終体積まで再懸濁させ、次いで沈殿したライブラリＤＮＡ（５０μｌの細胞当たり１μｇのベクター／４μｇのインサート）と混合し、ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ  ＩＩ電気穿孔器（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）において０．５４ｋＶ、２５μＦで電気穿孔する前に１０分間インキュベートした。細胞を、３０℃に予熱した３０ｍｌのＹＰＤ中に直ちに取り出し、３０℃のシェーカーに６０分間移し、次いでペレット化し、アンピシリンおよびカナマイシンを補充したＳＤＣＡＡ培地内に再懸濁させた。一連の希釈物をＳＤＣＡＡプレート上に蒔いて、ライブラリ形質転換効率を判定した。エラープローンＰＣＲを使用したライブラリ鋳型の作製については、ｄＰＴＰおよび８−オキソ−ｄＧＴＰを用いるＺａｃｃｏｌｏらの方法３を、Ｃｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．１に記載されているように使用した。
【０２４５】
ＭＡＣＳによる酵母ライブラリのスクリーニング。酵母ライブラリをＳＤＣＡＡ培地内で成長させ、次いで分取の２０〜２４時間前にＳＧＣＡＡ培地に継代培養した。酵母（最大５＊１０９細胞）をペレット化し、ＭＡＣＳ緩衝液（１５ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、０．５％ｗ／ｖのＢＳＡ）で洗浄し、次いで、室温で１０９細胞／ｍｌの密度においてビオチン化Ｒａｓと共に４５〜６０分間インキュベートし、その後ペレット化し、緩衝液で洗浄し、１ｍｌの緩衝液中に再懸濁させた。抗ビオチンマイクロビーズ（５０μｌ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を添加し、これらの細胞を４℃で３０分間回転させ、次いでＰｏｓｓｅｌ＿ｓプログラムを使用してＡｕｔｏＭＡＣＳ計器（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）で分離させた。溶離した細胞をＳＤＣＡＡ中に再懸濁させ、１／１００希釈物をＳＤＣＡＡ上に蒔いて、保持された細胞の数を推定した。
【０２４６】
ＦＡＣＳによる酵母ライブラリのスクリーニング。酵母ライブラリをＳＤＣＡＡ培地内で成長させ、次いで分取の２０〜２４時間前にＳＧＣＡＡ培地に継代培養した。酵母細胞をペレット化し、ＦＡＣＳ緩衝液（１５ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、０．１％ｗ／ｖのＢＳＡ）で洗浄し、次いで、室温でビオチン化Ｒａｓと共に４５〜６０分間インキュベートし、その後ペレット化し、緩衝液で洗浄し、１０７個の細胞当たり１００μｌの緩衝液中に再懸濁させた。Ｒａｓインキュベーションは１０７細胞／ｍｌの密度で行ったが、ただし［Ｒａｓ］の濃度が１００ｎＭ未満に低下した場合は除き、この場合は、１個の酵母細胞当たり少なくとも５００，０００個のＲａｓ分子が存在するように結合量を選択した（Ｃｈａｏらの指針１による）。次いで二次的な試薬（１：２００の希釈度における抗ＨＡ  Ａｌｅｘａ４８８、および１：１００の希釈度におけるＳＡ−ＰＥ、ＳＡ−ＡＰＣ、またはＮＡ−ＰＥのいずれか）を添加し、ペレット化、洗浄、および再度ペレット化する前に、４℃で１０分間にわたり暗所でインキュベートした。分取の直前に、これらの細胞を、およそ２＊１０７細胞／ｍｌの密度まで、ＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁させた。
【０２４７】
Ｒａｓタンパク質の発現および精製。Ｒａｓタンパク質を、Ｃ末端Ｈｉｓ６タグおよびｙＢＢｒタグと共に大腸菌ＢＬ２１  Ｒｏｓｅｔｔａ  Ｉ  ｐＬｙｓＳ細胞内で組換え発現させた。このプラスミド骨格の同一性は未知である（親ＫＲａｓベクターは元々Ｊｏｈａｎｎｅｓ  Ｙｅｈから入手した）が、おそらくはｐＥＴ由来であり、アンピシリン抵抗性を伴う。これらの細胞を、３０℃で５時間にわたり０．３ｍＭのＩＰＴＧで誘発してＯＤ６００＝０．７まで成長させ、次いで採取し、液体窒素中で急速凍結させる前に、４℃の５０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２中に再懸濁させた。精製のために、このペレットを解凍し、同じ緩衝液中で４０ｍｌに増やし、ＲｏｃｈｅのＣｏｍｐｌｅｔｅ  ＥＤＴＡ非含有プロテアーゼ抑制剤タブレットと混合した。これらの細胞をチップソニケーター（ＶｉｒＳｏｎｉｃ、出力レベル６．５で１０秒オン、１５秒オフの６サイクル）で溶解させ、次いで３０分間３０，０００×ｇでペレット化し、１．２μＭのＳｕｐｏｒ膜（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を通して濾過した。この澄ましたライセートを、溶解緩衝液で平衡化されている２ｍｌのＨｉｓＰｕｒコバルト樹脂（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｐｉｅｒｃｅ）に添加し、重力によって排液した。このカラムを２０ｍｌの緩衝液で洗浄し、次いで、タンパク質を、１５０ｍＭのイミダゾールを含有する約５ｍｌの緩衝液で溶離させた。カラムからの溶出の直後、約１ｍＭの最終濃度になるようにＤＴＴを添加し、（溶解ステップから確保した）少量のプロテアーゼ抑制剤を添加した。このタンパク質をＣｅｎｔｒｉｐｒｅｐ  ＹＭ−１０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）において２ｍｌまで濃縮し、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  １０／３００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上でのゲル濾過によって、５０ｍＭのトリス（ｐＨ７．４）、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴ中に精製した。長期保管のために、タンパク質を１００μＭ超まで濃縮し、１０％までグリセロールと混合し、液体窒素中で急速凍結させ、−８０℃で保管した。
【０２４８】
同じプロトコルに従って、Ｒａｐ１ａ、ＲａｌＡ、およびＲａｂ２５を発現させ、精製した。Ｒａｐ１ａおよびＲａｌＡをＲａｓタンパク質に関して同一の（Ｈｉｓ６／ｙＢＢｒタグ付き）ベクター内にクローンし、Ｈｉｓ６タグ付きＲａｂ２５をｐＥＴベクターから発現させた。
【０２４９】
仔ウシ腸管アルカリホスファターゼとのヌクレオチド交換。酵素的なヌクレオチド交換のために、Ｒａｓタンパク質を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  １０／３００カラム上でのゲル濾過によって、３２ｍＭのトリス（ｐＨ８）、２００ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１ｍＭのＤＴＴ、０．５ｍＭのＮａＮ３、１μＭのＺｎＣｌ２中に緩衝液交換した。このタンパク質を１００μＭ超まで濃縮し、次いで０．５〜１．０ｍＭまでＧｐｐＮＨｐまたはＧｐｐＣｐと混合し、続いて１０〜２０ユニットの仔ウシ腸管アルカリホスファターゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）と混合した。このタンパク質を室温で３０分間インキュベートし、次いで５ｍＭまでＭｇＣｌ２を添加し、このタンパク質を、５０ｍＭのトリス（ｐＨ７．４）、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴ中に前述同様にゲル濾過した。その後のＧＴＰまたはＧＤＰへの交換のために、ＧｐｐＣｐを負荷したＲａｓタンパク質を、１０ｍＭ  ＥＤＴＡの存在下にて３０分間室温で、５０〜１００倍過剰量の所望のヌクレオチドと共にインキュベートし、その後、２０ｍＭまでＭｇＣｌ２を添加し、過剰のヌクレオチドを通常通りゲル濾過によって除去した。
【０２５０】
ＨＰＬＣによるヌクレオチド負荷の数量化。Ｒａｓタンパク質（約２ｎｍｏｌ）を超純水で１５０μｌまで増やし、次いで１５０μｌの１００ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ６．５）、１０ｍＭ臭化テトラブチルアンモニウムと混合した。試料を、１００ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ６．５）、１０ｍＭの臭化テトラブチルアンモニウム、７．５％のアセトニトリル中で２０分間の均一濃度の泳動を使用した逆相ＨＰＬＣ（Ｓｕｐｅｌｃｏのセミ分取Ｃ１８カラム）によって分析した。ＧＤＰ、ＧＴＰ、およびＧｐｐＮＨｐの溶出時間は、純粋なヌクレオチド（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｒｉｃｈ）を用いて判定した。
【０２５１】
Ｂ−Ｒａｆ  ＲＢＤの精製。Ｒａｆ  ＲＢＤを、Ｎ末端グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグと共に大腸菌ＢＬ２１  Ｒｏｓｅｔｔａ  Ｉ  ｐＬｙｓＳ細胞内で組換え発現させた。このＲＢＤの遺伝子を、Ｊｏｈａｎｎｅｓ  ＹｅｈによるｐＧＥＸ−５Ｘプラスミド（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）内にサブクローニングした。これらの細胞を、３０℃で５時間にわたり０．３ｍＭのＩＰＴＧで誘発してＯＤ６００＝０．７まで成長させ、次いで採取し、液体窒素中で急速凍結させる前に、溶解緩衝液（ＰＢＳ＋１ｍＭ  ＤＴＴおよび０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ）中に再懸濁させた。精製のために、このペレットを解凍し、同じ緩衝液中で４０ｍｌに増やし、ＲｏｃｈｅのＣｏｍｐｌｅｔｅ  ＥＤＴＡ非含有プロテアーゼ抑制剤タブレットと混合した。これらの細胞をチップソニケーター（ＶｉｒＳｏｎｉｃ、出力レベル６．５で１０秒オン、１５秒オフの６サイクル）で溶解させ、次いで３０分間３０，０００×ｇでペレット化し、１．２μＭのＳｕｐｏｒ膜（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を通して濾過した。この澄ましたライセートを、溶解緩衝液で平衡化されている２ｍｌの固定化グルタチオン樹脂（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｐｉｅｒｃｅ）に添加し、重力によって排液した。このカラムを２０ｍｌの緩衝液で洗浄し、次いで、タンパク質を、５０ｍＭのトリス（ｐＨ８．０）、１０ｍＭの還元グルタチオン、１ｍＭのＤＴＴ、０．５ｍＭのＥＤＴＡで溶離させた。この試料をＣｅｎｔｒｉｐｒｅｐ  ＹＭ−１０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）において２ｍｌまで濃縮し、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  １０／３００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上でのゲル濾過によって、５０ｍＭのトリス（ｐＨ７．４）、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴ中に精製した。長期保管のために、タンパク質を１００μＭ超まで濃縮し、１０％までグリセロールと混合し、液体窒素中で急速凍結させ、−８０℃で保管した。
【０２５２】
Ｓｆｐホスホパンテテイニルトランスフェラーゼの精製。Ｓｆｐを、大腸菌ＢＬ２１細胞内で、Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ  Ｗａｌｓｈ（Ｈａｒｖａｒｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌ）から入手したｐＥＴ２９−Ｓｆｐベクターから組換え発現させた。これらの細胞を、２５℃で６時間にわたり１ｍＭのＩＰＴＧで誘発してＯＤ６００＝０．７まで成長させ、採取し、液体窒素中で急速凍結させる前に、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）、３００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのイミダゾール中に再懸濁させた。このタンパク質を、Ｒａｓタンパク質に関して上に記載したようにコバルト親和性クロマトグラフィーによって精製した。この精製タンパク質を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  １０／３００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で、１０ｍＭのトリス（ｐＨ７．５）、１ｍＭのＥＤＴＡ、１０％のグリセロール中にゲル濾過した。約１５ｍｌにおけるピークで溶離する画分をプールし、アリコートに分割し、液体窒素中で急速凍結させ、−８０℃で保管した。
【０２５３】
ビオチン−ＣｏＡ（ＬＫ０４）の合成。補酵素Ａ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ダルベッコリン酸緩衝食塩水中１０ｍＭ）を、１当量のビオチン−Ｐｅｇ２−マレイミド（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｐｉｅｒｃｅ、５０ｍＭトリス中２０ｍＭ、ｐＨ７）、続いて０．２当量のＴＣＥＰ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、水中０．５Ｍ）と混合した。この反応物を室温で２時間インキュベートし、次いで、０．１％のＴＦＡを含む水中で０％から４０％まで２０分間のＭｅＣＮ勾配を使用したＨＰＬＣによって精製した。
【０２５４】
Ａｌｅｘａ６４７−ＣｏＡ（ＬＫ０６）の合成。補酵素Ａ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ダルベッコリン酸緩衝食塩水中１０ｍＭ）を、５０ｍＭのトリス（ｐＨ７）中で５ｍＭまで希釈し、次いでＴＣＥＰを７．５ｍＭまで添加した（３μｌの５００ｍＭストック）。５分後、１ｍｇのＡｌｅｘａ６４７−Ｃ２−マレイミド（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、３４μｌのＤＭＳＯ中に溶解させ、反応物に添加し、室温で４５分間にわたり暗所でインキュベートし、その後この反応物を５００μｌのＭｉｌｌｉＱで希釈し、０．１％のＴＦＡを含む水中で０％から６０％まで２０分間のＭｅＣＮ勾配を使用したＨＰＬＣによって精製した。
【０２５５】
Ｓｆｐホスホパンテテイニルトランスフェラーゼによるタンパク質標識。精製したＲａｓを、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  １０／３００カラム上で、６４ｍＭのトリス（ｐＨ７．５）、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴ中にゲル濾過した。Ｒａｓ（５０〜１５０μＭ）を、１．０〜１．３当量のＣｏＡリンカー（ＬＫ０４またはＬＫ０６）、続いてＳｆｐと３〜５μＭまで混合した。この反応物を室温で１時間インキュベートし、次いで５０ｍＭのトリス（ｐＨ７．４）、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴ中に前述同様にゲル濾過した。
【０２５６】
２２５ペプチドの組換え生成。ｐＥＴ３０ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）をＮｃｏＩ−ＨＦおよびＸｈｏＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で消化し、５’ＮｃｏＩ部位および３’ＸｈｏＩ部位を有するペプチド配列を含むＰＣＲ断片と連結した。このＯＲＦを（発現株適合性の理由のため）アンピシリン抵抗性プラスミドにシャトリングするため、このプラスミドをＸｂａＩおよびＸｈｏＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で消化し、インサートをｐＥＴ１９ｂベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）にサブクローニングした。結果として生じたプラスミドを、アラビノース誘導性プロモーターの制御下で、ｄｎａＫ、ｄｎａＪ、ｇｒｐＥ、ＧｒｏＥＬ、およびＧｒｏＥＳシャペロンを保有するｐＧ−ＫＪＥ８プラスミド（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を含有するＢＬ２１細胞に形質転換させた。細胞を、３７℃のＬＢ培地内で約０．７のＯＤ６００まで成長させ、次いで５００μＭのＩＰＴＧおよび２００ｍｇのアラビノースと共に３０℃で５時間インキュベートした。これらの細胞を、１５分間５，０００×ｇでペレット化し、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）、１０００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのイミダゾール中に再懸濁させ、急速凍結させた。後続のステップは全て４℃で実施した。このペレットを解凍し、ＥＤＴＡ非含有プロテアーゼ抑制剤（Ｒｏｃｈｅ）と混合し、チップソニケーター（ＶｉｒＳｏｎｉｃ、出力レベル６．５で１０秒オン、１５秒オフの６サイクル）で溶解させ、次いで３０分間３０，０００×ｇでペレット化し、１．２μＭのフィルタを通して濾過した。この澄ましたライセートを、２ｍｌのコバルト樹脂（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｐｉｅｒｃｅ）と共に３０分間揺動させ、次いでカラムに移し、重力によって排液した。この樹脂を約２０ｍｌの溶解緩衝液で洗浄し、次いでこの融合タンパク質を、３５０ｍＭのイミダゾールを含有する溶解緩衝液で溶離させた。ＤＴＴおよびＥＤＴＡを、それぞれ１ｍＭおよび０．５ｍＭの濃度まで、プロテアーゼ抑制剤（Ｒｏｃｈｅ）と共に添加した。この溶離したタンパク質を２ｍｌまで濃縮し、５ｍｌのＨｉＴｒａｐ脱塩カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を２本直列で使用して、５０ｍＭのトリス（ｐＨ８）、２５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＤＴＴ、０．５ｍＭのＥＤＴＡ中に緩衝液交換し、次いでＴＥＶプロテアーゼを用いて一晩室温で開裂させた。この開裂反応物を、２本直列のＳｅｐＰａｋ  Ｃｌａｓｓｉｃ  Ｃ１８カートリッジ（Ｗａｔｅｒｓ）に移してペプチドに結合させ、このカートリッジを水＋０．１％ＴＦＡで洗浄し、次いでこのペプチドを７５％ＭｅＣＮ＋０．１％ＴＦＡで溶離させた。ＳｐｅｅｄＶａｃによる濃縮の後、このペプチドを、０．１％のＴＦＡを含むＨ２Ｏ中で１０から１００％までのアセトニトリル勾配を使用したＨＰＬＣによって精製した。収集した画分を、ＳｐｅｅｄＶａｃおよび凍結乾燥によって乾燥させた。
【０２５７】
ＦＩＴＣを用いたペプチドの標識。ＨＰＬＣ精製したペプチドを、ＤＭＳＯ中で２５０〜５００μＭまで希釈し、次いで５０ｍＭのトリス（ｐＨ７）中５ｍＭのＴＣＥＰストックから２当量のＴＣＥＰを添加した。室温で５分間のインキュベーションの後、２当量のＮ−（５−フルオレセニル）マレイミドを、ＤＭＳＯ中２．５ｍＭのストックから添加し、この反応物を室温で３０分間にわたり暗所でインキュベートした。この試料を、５０％ＭｅＣＮ＋０．１％ＴＦＡを添加することによって反応停止させ、次いで非標識のペプチドに関してＨＰＬＣによって精製した。
【０２５８】
ビオチンを用いたペプチドの標識。ＨＰＬＣ精製したペプチドを、ＤＭＳＯ中で２５０〜５００μＭまで希釈し、次いで５０ｍＭのトリス（ｐＨ７）中５０ｍＭのＴＣＥＰストックから２当量のＴＣＥＰを添加した。室温で５分間のインキュベーションの後、２当量のビオチン−ＰＥＧ２−マレイミド（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｐｉｅｒｃｅ）を、５０ｍＭのトリス（ｐＨ７）中２０ｍＭのストックから添加し、この反応物を室温で３０分間にわたり暗所でインキュベートした。この試料を、５０％ＭｅＣＮ＋０．１％ＴＦＡを添加することによって反応停止させ、次いで非標識のペプチドに関してＨＰＬＣによって精製した。
【０２５９】
蛍光偏光。ＦＩＴＣ標識したペプチドを、５０ｍＭのトリス（ｐＨ７．４）、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴ中で３０ｎＭまで希釈し、次いで、３８４ウェルの黒色マイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に分注した４０μｌの２×タンパク質ストック（同じ緩衝液中）に添加した。このプレートを室温で４５分間静置し、次いで、励起４８５ｎｍ、発光５２５ｎｍ、カットオフ５１５ｎｍ、ＰＭＴ高、読み取り１００回、低いキャリッジ速度、および整定時間５００ミリ秒とし、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）で蛍光異方性を記録した。各濃度点は３連で作成し、各ウェルは２回読み取った（そして平均した）。データは、Ｐｒｉｓｍ（Ｇｒａｐｈｐａｄ）を使用してプロットし、ヒル係数を用いて一部位特異結合モデルに当てはめた。
【０２６０】
ｍａｎｔヌクレオチドの合成。ｍＧｐｐＮＨｐおよびｍＧＤＰの合成を、Ｈｉｒａｔｓｕｋａ４によって説明されているように実施した。２０μｍｏｌのグアノシン５’−［β，γ−イミド］三リン酸三ナトリウム塩水和物（ＧｐｐＮＨｐ）またはグアノジン二リン酸（Ｇｕａｎｏｄｉｎｅ  ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）（ＧＤＰ）（Ｓｉｇｍａ）を、丸底フラスコ内の１０００μｌの超純水中に溶解させ、１ＭのＮａＯＨでｐＨを約９．５に調整した。この溶液を水浴中で３８℃に加熱し、撹拌下で１ＭのＮａＯＨでｐＨを９〜１０に維持しながら、Ｎ−メチルイサト酸無水物（６５μｍｏｌ、３．２５当量、Ａｌｄｒｉｃｈ、微粉末状に粉砕）を４回に分けて１時間かけて添加した。３時間後、１ＭのＨＣｌを添加してｐＨを約７に低下させ、反応を終了させ、この管を氷上でインキュベートして過剰のＮ−メチルイサト酸無水物を沈殿させ、次いで最大速度で５分間にわたり遠心分離した。この上清を除去し、次いでこの粗生成物を、０．１％のＴＦＡを含むＨ２Ｏ中で０から６０％までのアセトニトリル勾配を使用したＨＰＬＣによって精製した。収集した画分を、ＳｐｅｅｄＶａｃおよび凍結乾燥によって乾燥させ、吸光度によって数量化した（ｐＨ７においてε２５２＝２１５００）。これらのヌクレオチドを、それらの非標識の対応物に関して上に記載したようにアルカリホスファターゼを使用して、Ｒａｓタンパク質上に負荷した。
【０２６１】
ｍａｎｔＧｐｐＮＨｐの合成のための一般的スキームを以下に提供する。ＧｐｐＮＨｐを３８℃の超純水中に溶解させ、ＮａＯＨでｐＨを約９．５に調整し、次いで、ＮａＯＨを定期的に添加してｐＨを９〜１０に維持しながら、Ｎ−メチルイサト酸無水物（３当量）を少量ずつ添加した。３時間後、この反応をＨＣｌで終了させ、この生成物をＨＰＬＣによって精製する前に氷上で沈殿させた。
【化４】
0006759109.tif 000006
【０２６２】
Ｍａｎｔヌクレオチド解離実験。黒色の９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）のウェルに、２μＭのＲａｆまたはペプチドを含有する１００μｌの緩衝液（５０ｍＭのトリス（ｐＨ７．４）、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴ）、続いて５０μｌの２μＭ  ｍａｎｔヌクレオチド負荷Ｒａｓタンパク質を添加した。室温の暗所で１０分間インキュベートした後、非標識ヌクレオチドの５０μｌの２．６ｍＭストックを、Ｒａｓ  ５００ｎＭ、Ｒａｆまたはペプチド１μＭ、および非標識ヌクレオチド０．６５ｍＭの最終濃度まで添加した。マルチチャネルピペットを使用してウェルを混合し、次いでＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて２時間にわたってｍａｎｔ蛍光を追跡し、３０秒毎に６回の読み取りを記録した（励起３７０ｎｍ、発光４５０ｎｍ、カットオフ４３５ｎｍ）。
【０２６３】
表面プラズモン共鳴法。ビオチン化ＫＲａｓ（ＧｐｐＮＨｐまたはＧＤＰ）を、Ｂｉａｃｏｒｅ泳動緩衝液（５０ｍＭのトリス（ｐＨ７．４）、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、２ｍＭのＤＴＴ＋０．０２％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、濾過および脱気済み、ＧｐｐＮＨｐ含有タンパク質試料については１μＭのＧｐｐＮＨｐを含む）中で５０ｎＭまで希釈し、緩衝液で３回プライミングされ、かつＣＡＰｔｕｒｅ再生溶液での３×６０秒の処理で馴化されているＢｉａｃｏｒｅ  Ｘ１００  ＳＰＲシステム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  ＣＡＰｔｕｒｅチップ上に固定化した。１８０秒の結合および９００秒の安定化を伴う単一サイクル試験を記録し、分析ステップに先行する各再生ステップの後に緩衝液洗浄を行った。カスタムパラメータは次の通りであった：捕捉１：２μｌ／分において３００秒、安定化１２０秒；捕捉２：５μｌ／分において４５秒、安定化１８０秒、試料：３０μｌ／分、再生：１０μｌ／分において１２０秒、安定化６０秒。１つの始動サイクルと、バックグラウンド除去のための２つのブランクサイクルとから開始し、次いで、５ｍＭのＮａＯＨ中に新鮮に溶解させ数量化した２２５−３の試料から調製した２２５−３ペプチドの、１．２３ｎＭ、３．７ｎＭ、１１ｎＭ、３３ｎＭ、および１００ｎＭにおける試料注入を行った。試料は全て、キャップなしのＢｉａｃｏｒｅ管（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）内で調製した。データは、２ステップ結合モデルを使用し、計器のソフトウェアによって処理および分析した。
【０２６４】
Ｃａｐａｎ−１細胞ライセートにおけるプルダウンアッセイ。Ｃａｐａｎ−１腺癌細胞をＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手し、７５ｃｍ２の培養フラスコ（Ｆａｌｃｏｎ）を使用して、２０％のウシ胎仔血清および１×抗生物質／抗真菌薬（Ａｎｔｉ−Ａｎｔｉ、Ｇｉｂｃｏ）を含むイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）内で３７℃（ＣＯ２５％の加湿雰囲気）で培養した。２つのフラスコの細胞を約９０％コンフルエンスまで成長させ、１５分間３７℃でトリプシン処理し、ペレット化し、冷ＰＢＳで洗浄し、次いで、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍＭのＤＴＴ、１％（ｖ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、および５×ＨＡＬＴプロテアーゼ抑制剤（Ｔｈｅｒｍｏ）中で１０分間インキュベートすることによって溶解させた。これらの細胞を、卓上遠心分離機内で１０分間１６，０００×ｇでペレット化し、次いでこの上清を急速凍結させ、−８０℃で保管した。プルダウンの日に、このライセートを解凍し、０．０１％（ｖ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００のみを含有する溶解緩衝液中で１０倍に希釈した（高い洗浄剤の濃度はＲａｓ−ペプチド相互作用に干渉する）。後続のステップは全て４℃で実施した。ペプチドプルダウンについては、このライセートをモックまたはＲａｆ  ＲＢＤ（３μＭ）と共に１０分間プレインキュベートし、その後、ビオチン化２２５−３（５μＭ）を添加し、４５分間インキュベートし、続いて、０．１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含有するダルベッコＰＢＳで１０分間室温でブロッキングされている５０μｌのＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  ＭｙＯｎｅ  Ｔ１  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加した。これらの試料を３０分間回転させ、次いでビーズを磁石で収集し、０．１％（ｖ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含有する３×４００μｌの溶解緩衝液で洗浄した。これらの試料を、ＳＤＳローディング緩衝液中で５分間沸騰させ、次いで卓上遠心分離機において１６，０００×ｇでペレット化することによって、ビーズから溶出させた。Ｒａｆ  ＲＢＤプルダウンについては、このライセートをモックまたはペプチド（１０μＭ）と共に１０分間プレインキュベートし、その後、ＧＳＴタグ付きＲａｆ  ＲＢＤ（５μＭ）および５０μｌのグルタチオンアガロースビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ）を添加し、６０分間回転させた。この上清を、フィルタカラム（Ｔｈｅｒｍｏ）を通して回転させることによって除去し、０．１％（ｖ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含有する３×４００μｌの溶解緩衝液でビーズを洗浄した。これらの試料を、ＳＤＳローディング緩衝液中に５分間浸漬させ、次いで卓上遠心分離機において１６，０００×ｇでペレット化し、５分間沸騰させることによって、ビーズから溶出させた。１５０Ｖで４５分間にわたり、１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で試料を泳動させ、次いで、５０Ｖで４５分間にわたり、ウェスタンブロッティングチャンバ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、１５ｍＭのトリス、１９２ｍＭのグリシン、２０％のメタノール中で０．４５μｍのニトロセルロース膜（Ｗｈａｔｍａｎ）に移した。この膜を、０．１％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ−２０（ＴＢＳ／Ｔ）を含むトリス緩衝生理食塩水中で５％の乾燥脱脂乳で１時間ブロッキングし、ＴＢＳ／Ｔで洗浄し、次いで、１：１０００希釈の抗ＲａｓウサギｍＡｂ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、＃３３３９）を含むＴＢＳ／Ｔ中で５％のＢＳＡにおいて４℃で一晩インキュベートした。翌日、この膜をＴＢＳ／Ｔで洗浄し、抗ウサギＨＲＰ結合体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）と共に室温で１時間インキュベートし、もう１回洗浄し、次いで、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ化学発光造影試薬（Ｔｈｅｒｍｏ）およびＢｉｏＭａｘ  Ｌｉｇｈｔフィルム（Ｋｏｄａｋ／Ｃａｒｅｓｔｒｅａｍ  Ｈｅａｌｔｈ）を用いて可視化した。
【０２６５】
核磁気共鳴法。１５Ｎ標識ＫＲａｓまたはペプチドを調製するために、１ｇ／ｌの１５ＮＨ４Ｃｌを含有する最少培地内で細胞を成長させ、非標識タンパク質に関して発現させた。ＫＲａｓおよび２２５−１を上に記載したように精製し、次いでＮＭＲ緩衝液（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、５０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＭｇＣｌ２、２ｍＭのＴＣＥＰ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、０．０２％のＮａＮ３）中に緩衝液交換した。Ｒａｓおよびペプチドを、凝集を回避するために５０μＭ未満で混合し、次いで１００〜２００μＭまで濃縮し、１／１９体積のＤ２Ｏと混合し（５％の最終濃度）、０．４５μｍの膜を通して濾過し、次いでＳｈｉｇｅｍｉ  ＢＭＳ−３  ＮＭＲ試験管に加えた。ＮＭＲ実験は、（クライオプローブを備えた）７００ＭＨｚ  Ｂｒｕｋｅｒ上でＴＲＯＳＹを使用し、２９８Ｋで実施した。データは、ＮＭＲｐｉｐｅを用いて処理し、ＮＭＲｖｉｅｗを使用して可視化した。
【０２６６】
還元試験。ペプチドを緩衝液中に溶解させ、逆相ＨＰＬＣによって分析する前に、０ｍＭ、５ｍＭ、または５０ｍＭのＤＴＴと共にインキュベートした。還元したペプチドは、試料のＬＣ／ＭＳ分析によって判定した場合に、酸化したペプチドよりも早く溶離する。
【０２６７】
複合体形成、結晶化、およびデータ収集。Ｋ−Ｒａｓ／ＲＤＡ複合体を、２０ｍＭのトリス（ｐＨ８．０）、５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２中でＫ−Ｒａｓが２５μＭの濃度で、Ｋ−Ｒａｓを１．２倍過剰モルのＲＤＡペプチドと混合することによって形成した。１時間のインキュベーションの後、この複合体をサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。０．５μｌの複合体（２０ｍＭのトリス（ｐＨ８．０）、５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２中で９ｍｇ／ｍｌ）と、０．３Ｍの塩化カルシウムおよび２３％（ｗ／ｖ）のＰＥＧ  ３３５０を含有する０．５μｌのリザーバ液とを混合した後、ＲＤＡ１とＧＭＰ−ＰＮＰとの複合体中のＫ−Ｒａｓの結晶を成長させた。Ｋ−Ｒａｓ／ＲＤＡ２／ＧＭＰ−ＰＮＰ複合体を、０．１〜０．２Ｍの硫酸アンモニウム、２０〜２２％のＰＥＧ  ３３５０を含有する１μｌのリザーバ液と混合した０．５μｌの複合体（１１．５ｍｇ／ｍｌ）を使用して結晶化させた。結晶は全て、シッティングドロップ蒸気拡散法により２０℃で成長させた。凍結保護については、採取した結晶全てを、液体窒素中で急速冷凍する前に２０％のグリセロールを補充したリザーバ液中で手短にインキュベートした。回析データは全て、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｐｈｏｔｏｎ  Ｓｏｕｒｃｅにおいて２４−ＩＤビームラインで収集し、ＸＰＤおよびＨＫＬ２０００スイートで処理した。
【０２６８】
構造決定および精密化。Ｋ−Ｒａｓ／ＲＤＡ１／ＧＭＰ−ＰＮＰ複合体は、Ｐ２１の空間群において結晶化し、非対称ユニット内に４つの分子を有した。Ｋ−Ｒａｓ／ＲＤＡ２／ＧＭＰ−ＰＮＰ複合体もまた、Ｐ２１の空間群において結晶化したが、非対称ユニット内に単一の分子を有した。両方の構造は、検索モデルとして以前に決定されたＫ−Ｒａｓ構造（ＰＤＢアクセス３ＧＦＴ）を使用し、ＰＨＡＳＥＲを用いた分子置換によって決定した。ＣＯＯＴにおけるマニュアルモデル構築の反復サイクル、およびＲＥＦＭＡＣを使用した構造精密化によって、ＲＤＡペプチドモデルを構築した。最終モデルは、それぞれ２．１５Åおよび１．７ÅでＰＨＥＮＩＸを使用して細密化し、ＭｏｌＰｒｏｂｉｔｙによって検証した。
【０２６９】
生細胞共焦点顕微鏡法。ヒト腫瘍細胞株（例えば、Ｈ３５８またはＨＰＡＦ−ＩＩ）を、ＬａｂＴｅｋ  ＩＩ培養チャンバ内で１０％のウシ胎仔血清を補充したＤＭＥＭ培地内に播種し、標準的な細胞培養条件下で３７℃で一晩成長させた。翌日、培地を、５μＭのフルオレセイン標識ペプチドを含有する培地と交換し、３７℃で４時間インキュベートした。これらの細胞を洗浄し、ＮｕｃＢｌｕｅ  Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２およびＤｅｘｔｒａｎ  １０ｋ  Ａｌｅｘａ６４７で染色し、次いで共焦点顕微鏡で撮像した。蛍光ペプチドを４８８ｎｍのレーザーで可視化し、図３４Ａおよび３４Ｂに緑色で示す。
【０２７０】
実施例１：Ｒａｓ結合ペプチドの特性化およびＲａｓ−ペプチド結晶構造
結合親和性。Ｋ−Ｒａｓに対するペプチドの結合親和性を、蛍光偏光実験によって判定した。以下は、使用したペプチドの配列と、それらの測定された解離定数である。
【表２】
0006759109.tif 000007
【０２７１】
還元試験。これは、酸化（ジスルフィド架橋）ペプチド二量体を還元（非架橋）ペプチド単量体と区別することができるＨＰＬＣアッセイである。細胞環境よりも大幅に強力な還元剤であるＤＴＴを５ｍＭまたは５０ｍＭ添加することによって、セレノシステイン含有ペプチド二量体は、それらのシステイン含有類似体とは異なり還元され得ないことが観察された（図３１参照）。
【０２７２】
Ｒａｓ−ＲＤＡ構造。図３２は、２．２オングストロームの解像度における全体構造を示す。図３２はまた、同定された一次ヘリックスおよび主要な結合残基も示す。
【０２７３】
実施例２：Ｒａｓ結合ペプチドのための酵母ディスプレイスクリーン
Ｒａｓエフェクタードメインに結合するペプチドを同定するために２つの手法を探求し、その両方が、酵母表面ディスプレイによる大きなペプチドライブラリのスクリーニングを伴った。第１の方策は、Ｒａｓに結合する能力が未知である小さなペプチド足場に基づくナイーブライブラリをスクリーニングすることであった。これらのライブラリは、依然として安定した高次構造にありながら可能な限り高い構造多様性を含むように設計された。第２の方策は、Ｒａｓエフェクタードメインに結合することが知られるタンパク質のドメインに基づいてライブラリをスクリーニングすることであった。この場合、スクリーンの目標は、その親タンパク質により提供される足場の非存在下でＲａｓに結合することができるドメインの安定化した変異体を同定することであった。
【０２７４】
ライブラリ足場セレクション。ナイーブライブラリの足場候補を同定するために、Ｘ線または核磁気共鳴（ＮＭＲ）構造のいずれかが利用可能であった１０００〜５０００Ｄａの質量を有するポリペプチドに関して、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋを検索した。結果を手作業で精選して、非共有結合の相互作用または共有結合の相互作用（例えば、ジスルフィド結合）によって提供されるかを問わず、構造安定性の基準でペプチドを選択した。らせん形のトリ膵臓ポリペプチド（ａＰＰ、ＰＤＢ：１ＰＰＴ）を予備研究のために選択した。
【０２７５】
トリ膵臓ポリペプチド（ａＰＰ）は、元々はニワトリの膵臓から単離した３２−アミノ酸ミニタンパク質である。その構造は、Ｎ末端ポリプロリンＩＩ型（ＰＰＩＩ）ヘリックス、Ｉ型βターン、およびＣ末端αヘリックスからなる。ａＰＰは、ヘリックスおよびループの両方からの残基間の分子間接触によって安定化され、溶液中で頭−尾ホモ二量体を形成する。ＰＰＩＩとαヘリックスとの間の分子内の疎水性相互作用は、ａＰＰ単量体を比較的高い安定性（融解転移（Ｔｍ）≒６２℃）を有する明確に定義された折り畳み構造へと安定化させ、これは、高い熱安定性が一部のタンパク質の進化性を向上させることが示されているため、足場に関して魅力的な特性である。Ｓｃｈｅｐａｒｔｚおよび共同研究者らは、様々なタンパク質のαヘリックスからの残基をａＰＰ  αヘリックスの露出面にグラフトして、本来のタンパク質の標的に結合する能力を保持するキメラタンパク質を得ることができると実証した。例えば、Ｚｏｎｄｌｏらは、酵母転写因子ＧＣＮ４のＤＮＡ結合ドメインからの残基をａＰＰ足場にグラフトして、低いナノモル親和性でＧＣＮ４ハーフサイト（ｈａｌｆ−ｓｉｔｅ）に結合することができるミニタンパク質を作製した。別の事例では、Ｋｒｉｔｚｅｒらは、ｐ５３のｈＤＭ２結合ドメインからの残基をａＰＰにグラフトし、次いで変異誘発およびスクリーニングを適用して、結果として生じたペプチドの親和性を向上させた。
【０２７６】
Ｓｃｈｅｐａｒｔｚおよび共同研究者らはまた、一部の状況では細胞取り込みを増進させることで知られるアルギニンで複数の残基を置換することによって、ａＰＰに細胞透過特性を与えることができることも実証した。一事例では、Ｄａｎｉｅｌｓらは、ＰＰＩＩヘリックスおよびβターンからの残基をアルギニンで置換して、１μＭの濃度でＨｅＬａ細胞を透過し、エンドソーム内に捕捉されなかったペプチドを得た。別個の研究では、Ｓｍｉｔｈらが、αヘリックスからの残基をアルギニンで置換して、ペプチドの相当の部分がエンドソームに局在化したままであったにもかかわらず、同様に１μＭでＨｅＬａ細胞を透過したペプチドを生成した。こうした細胞透過の潜在性は、安定した二次構造および操作の確立された例と共に、ａＰＰをＲａｓ標的ライブラリのスクリーニングおよび進化に魅力的な足場にした。
【０２７７】
これらの細胞透過研究の重要な注意点は、ａＰＰ変異体は、円二色性（ＣＤ）分光法によって判定された場合にそれらのａＰＰ折り畳み構造を保持した一方で、アルギニンの導入によって不安定化したということである。足場の安定性が低いと、その折り畳み構造が失われる前に許容される変異がより少なくなると予測されるため、結果として生じるライブラリのうち明確な高次構造を有する部分はより小さくなるであろう。したがって、細胞浸透性を与えることが示されているが足場内の安定性を損なわなかったアルギニン置換の一部を組み込んだ、ａＰＰ変異体の同定を試みた。本発明者らの狙いはαヘリックス表面をランダム化に使用することであったため、６つのアルギニン変異を含んだ、ＰＰＩＩ提示アルギニン系列のうち最も細胞透過性のペプチドに焦点を当てた。ａＰＰ結晶構造の検査は、変異残基のうち３つが、ペプチド内で他のアミノ酸と潜在的に安定化作用のある接点を形成することを示唆した。これらの残基が不安定化の大部分に寄与したという仮説を試験するため、これらの位置を未変化（野生型）のまま残しつつ、残りの３つをアルギニンに変異させたａＰＰ変異体、すなわちａＰＰ−Ｍを合成した（図４の配列参照）。このペプチドの安定性を査定するため、ａＰＰのものと一緒にそのＣＤスペクトルおよび融解プロファイルを記録した（図３）。αヘリックスの末端である第３２のアミノ酸の後で両方のペプチドを切断した。２５℃におけるＣＤスペクトルは、２つのペプチドに関してほぼ同一であり、文献で発表されたものと一致しており、全体的な高次構造が未変化のままであったことを示した。予想外なことに、ａＰＰ−ＭのＴｍは、６４．５℃から７７℃超と、ａＰＰと比べて上昇した。このさらなる安定性の起源は完全には明らかでないが、アルギニンがＰＰＩＩヘリックスとの関連で安定化作用があり得ることは知られている。その向上した安定性およびアルギニン含量のため、ａＰＰ−Ｍ変異体を酵母ディスプレイライブラリの足場として使用した。
【０２７８】
細胞内のジスルフィド結合の不安定性に対処する最も実用的な方法は、ジスルフィドをより安定したリンカーで置換することである。１つの可能性はジセレニド結合を組み込むことであり、ジセレニド結合は、ジスルフィドと等電子性であるが、それをヒト細胞の還元性環境に対して安定させる酸化還元電位を有する。Ｃｒａｉｋおよび共同研究者らは、そのような置換が、コノトキシンの構造を撹乱させることなくその安定性を向上させることができると示している。第２の選択肢は、「ステープルドペプチド」に使用される全炭化水素架橋などの非天然リンカーでジスルフィドを置換することであろう。これは（還元され得ないため）潜在的にジスルフィドまたはジセレニドよりも安定であり得、細胞透過に寄与し得るが、さほど等電子性にはならない。さらに、β構造をそのようなリンカーで安定化させる前例は発表されておらず、そのため、合成、反応条件、リンカーの長さおよび組成などを最適化する方法の開発に対する必要性がおそらく存在するであろう。
【０２７９】
標的タンパク質の調製。標的タンパク質は、細胞表面上で検出され得るように、酵母ディスプレイ研究のために標識されなければならない。これは典型的には、標的タンパク質をビオチン化すること、および磁気活性化細胞分取（ＭＡＣＳ）のためのストレプトアビジンビーズ、またはＦＡＣＳのためのストレプトアビジン−フルオロフォア結合体を使用することによって達成される。この方策の１つの欠点は、ストレプトアビジンに結合することができるペプチドが偽陽性物質を生成し得、偽陽性物質は、その親和性が十分に高ければ真の標的結合剤に競り勝ち得ることである。これらの二次的結合配列のセレクションは、異なるビオチン結合剤を用いること、例えば、抗ビオチン抗体に接合されたビーズを用いてＭＡＣＳを実施し、続いてＦＡＣＳのためにニュートラアビジン−フィコエリトリン（ＮＡ−ＰＥ）とストレプトアビジン−アロフィコシアニン（ＳＡ−ＰＥ）とを交互に用いることによって、部分的に抑制され得る。本発明者らの最初のライブラリスクリーンおよび定向進化の取り組みでは、複数の機会で二次的結合剤からの汚染を経験したが、この方策を採用した。本発明者らのより最近の酵母ディスプレイ研究では、付随する二次的なステップを伴わずに小分子フルオロフォアに直接接合されたＲａｓタンパク質を用いてＦＡＣＳを実施することによって、この問題の回避を試みた。
【０２８０】
標的タンパク質を調製するために、ヒトＫＲａｓの残基１〜１７７の遺伝子（Ｇ１２Ｖ）を、未変性のＮ末端ならびにＣ末端Ｈｉｓ６タグおよびｙＢＢｒタグと共に、ｐＥＴ発現ベクター内にサブクローニングした。Ｈｉｓ６タグにより、ニッケル−ＮＴＡまたはコバルト樹脂を用いた標準的な固定化金属親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）法を使用して、細胞ライセートから融合タンパク質を精製することが可能になる。ｙＢＢｒペプチドは、補酵素Ａ（ＣｏＡ）からペプチド内の２位におけるセリン残基の側鎖ヒドロキシルへのホスホパンテテイニル基の共有結合的付加を触媒することができる、Ｓｆｐホスホパンテテイニルトランスフェラーゼの最適化された１１アミノ酸基質配列（ＤＳＬＥＦＩＡＳＫＬＡ）である。この反応は概して、ＣｏＡのスルフヒドリル末端における置換を許容するため、高い選択性でＣｏＡとビオチン、フルオロフォアなどとの結合体に融合タンパク質を結合させるために使用することができる（図６）。本発明者らは、この手法を、例えばアミンまたはチオール反応性プローブを使用した非特異的標識（これは、エフェクタードメイン内またはその近位に位置するリジンおよびシステイン残基を修飾することによってＲａｓの天然構造を撹乱させる潜在性があり得る）と比べて好ましいと見なした。ＫＲａｓのＧ１２Ｖ変異体は、ヒト癌に見出される最も一般的な発癌性変異のうちの１つであり、野生型よりも低いＧＴＰ加水分解のバックグラウンド率を有するため、これをこれらの研究に選択した。
【０２８１】
Ｔ７リゾチームおよびＲｏｓｅｔｔａ  Ｉプラスミド（これは、コドンがヒト遺伝子内で一般的に見出されるが大腸菌内には存在しない６つのｔＲＮＡを保有する）を含有する大腸菌（ＤＥ３）細胞内でＫＲａｓコンストラクトを発現させた。ｐＥＴ発現系は、（Ｔ７プロモーターを有する）組換えタンパク質およびＴ７  ＲＮＡポリメラーゼの両方を、ｌａｃリプレッサーによって恒常的に抑制されているｌａｃオペレーターの制御下に置くことによって機能する。イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ、アロラクトース類似体）の添加は、これらの２つのタンパク質の抑圧を軽減させ、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼの発現、ひいては組換えタンパク質の発現を可能にする。細胞がおよそ０．７の光学密度（ＯＤ）に達するまで、３７℃の溶原性ブロス（ＬＢ）培地内で細胞を成長させ、次いで３０℃のＩＰＴＧで融合タンパク質の発現を誘発した。これらの細胞を超音波処理によって溶解させ、遠心分離によって澄まし、コバルト樹脂を使用してＲａｓを精製した。この粗製タンパク質をゲル濾過によってさらに精製し（図７Ａ）、所望のグアニンヌクレオチドで酵素負荷をかけ（図７Ｂ）、次いで、Ｙｉｎ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．Ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｂｙ  Ｓｆｐ  ｐｈｏｓｐｈｏｐａｎｔｅｔｈｅｉｎｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ．Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ  １，２８０−５（２００６）に詳述されているようにＳｆｐを使用して、ビオチンまたはフルオロフォアで標識した（図６）。Ｓｆｐ反応の前後に、タンパク質のマトリックス支援レーザー脱離／イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）によって標識を検証した（図７Ｃ）。
【０２８２】
ＧＴＰアーゼは典型的には高い親和性でグアニンヌクレオチドに結合し、ＨＲａｓの場合、解離定数（Ｋｄ）は低ピコモル範囲内である。そのような高い親和性は、組換え発現されたＲａｓタンパク質が、精製プロセス全体にわたり、典型的にはＧＤＰ結合状態およびＧＴＰ結合状態の混合物中で、そのヌクレオチドを保持することを意味する。Ｒａｓの野生型形態は、ＧＡＰタンパク質の非存在下であってもＧＴＰをＧＤＰにゆっくりと加水分解するが、本発明者らの研究に使用されたＧ１２Ｖなどの変異体は、非常にゆっくりと加水分解する傾向がある。この不均一混合物は、Ｒａｓの高次構造および結合特性が２つのヌクレオチド状態間で著しく異なるため、酵母ディスプレイまたは生化学的アッセイには理想的でない。高いヌクレオチド結合親和性は、操作の観点からの課題を呈する：単に大過剰の所望のヌクレオチドを提供することによってタンパク質に負荷をかけることはできず、アルカリホスファターゼなどの酵素は、酵素のＫｍを大幅に下回る濃度の溶液中で遊離しているため、ヌクレオチドを効率的に分解することができない。
【０２８３】
均一に負荷されたＲａｓタンパク質を調製するために、２つの手法が開発されている。第１の手法は、Ｍｇ２＋イオンをキレートし、それらをヌクレオチド結合ポケットから除去するＥＤＴＡを精製タンパク質に添加することを伴う。これにより、Ｒａｓ−ヌクレオチド相互作用の親和性が低下し、また、大過剰（典型的には１００倍）の所望のヌクレオチドを添加し、室温でインキュベートすることによるヌクレオチドの交換が可能となる３４。本発明者らの経験上、この方法は、最大８５〜９０％のレベルまでタンパク質に負荷をかけることができ、本発明者らの早期の酵母ディスプレイおよび生化学的実験のためのタンパク質を調製するために使用された。第２の方策は、アルカリホスファターゼおよび非加水分解性ＧＴＰ類似体、例えばグアノシン５’−［β，γ−イミド］三リン酸（ＧｐｐＮＨｐ）またはβ，γ−メチレングアノシン５’−三リン酸（ＧｐｐＣｐ）なとを、Ｍｇ２＋非含有の緩衝液中に交換されているＲａｓタンパク質に添加することである。これらの条件下では、Ｒａｓ−ヌクレオチド親和性は、最初のヌクレオチドと非加水分解性の類似体との交換を可能にするのに十分に低く、Ｒａｓが十分に（１００μＭ超に）濃縮されていれば、加水分解性ヌクレオチドの濃度は、アルカリホスファターゼによって効率的に分解されるために十分に高くなる３３。ＧｐｐＣｐが使用される場合、ＧＤＰまたはＧＴＰはホスファターゼ除去後にタンパク質上に効率的に再度負荷され得、これは、ＧｐｐＣｐが１００倍低い親和性を有し、過剰の天然ヌクレオチドによって容易に打ち負かされるためである３５。この方法は、所望のヌクレオチドが負荷されたＲａｓタンパク質へのほぼ定量的な変換を実現するために使用され得、本発明者らのより最近の研究に使用された。７．５％のアセトニトリルおよび１００ｍＭの臭化テトラブチルアンモニウムを含有するリン酸緩衝液で平衡化した逆相（Ｃ１８）高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）カラムに精製タンパク質を注入することによって、Ｒａｓヌクレオチド状態を判定した。テトラブチルアンモニウムイオンは、リン酸基の数に比例した化学量論でグアニンヌクレオチドに結合し、それにより、ＧＴＰは、ＧＤＰよりも親油性のカチオンと複合体を形成し、したがってより疎水性の分子として挙動する。均一濃度条件下でカラムを展開することにより、ＧＤＰとＧＴＰとの明確な分離が得られ（図７Ｂ）、その保持時間は、精製ヌクレオチド標準を使用して判定され得る。
【０２８４】
酵母ディスプレイスクリーニング。Ｃｈａｏ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．Ｉｓｏｌａｔｉｎｇ  ａｎｄ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｙｅａｓｔ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｄｉｓｐｌａｙ．Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ  １，７５５−６８（２００６）に記載されているように、酵母ディスプレイプロトコルを行った。まず、ビオチン化ＫＲａｓ（Ｇ１２Ｖ）−ＧＴＰを標的として使用して、ａＰＰライブラリを用いた最初のパイロットスクリーンを実施した。ライブラリのサイズが、ＦＡＣＳによって簡便に評価され得る細胞の数よりも大きかったため、ＭＡＣＳステップからスクリーンを開始した。１μＭのＲａｓ濃度で２＊１０９個の細胞をスクリーニングし、およそ１９０，０００個の細胞を単離した。結果として生じたライブラリを、１ラウンド１．８μＭ、次いで３ラウンド５５０ｎＭのＦＡＣＳによって分取した。この５回の分取により、５５０ｎＭにおいてＲａｓに対する強力な結合を示した細胞集団が得られた（図９）。提示されたペプチドがＲａｓエフェクタードメインに結合するかどうかを試験するため、大過剰のＢＲａｆのＲＢＤと事前混合されているＫＲａｓと共に酵母をインキュベートした。見かけ上のＲａｓ結合は減少したが、一部は依然として結合しているようであった。単離した集団を配列決定し、３つの密接に関連したペプチド配列を見出した（図１０および以下の考察を参照されたい）。
【０２８５】
ａＰＰ足場ペプチドの定向進化。図１０は、進化の過程で同定されたペプチドの一覧を提供する。予備研究は、ａＰＰ変異体ライブラリから誘導された、２２１−１、２２１−２、および２２１−３と名付けられた３つのヒットに焦点を当てた。３つ全てが、共通のランダム化残基：Ｈ１８、Ｗ２１、Ｗ２５、Ｎ２６、およびＹ２９のうちいくつかを共有した（図１０）。残りの位置では、強いコンセンサスはなかった（残基１５においてＥ／Ｇ、残基１９においてＡ／Ｅ／Ｗ、そして残基２３においてＡ／Ｑ）。Ｒ６における２２１−３のリジンへの偶発変異も観察された。これらの配列において疎水性残基の保有率が比較的高かったことも注目され、観察された結合は特異性の弱い疎水性相互作用に起因することが示唆された。この可能性を査定するため、タンパク質の不均一混合物を含有し、相互作用が主に疎水性相互作用によって推進される場合にＲａｓ−ペプチド結合を低下させると予測されるヒト血清の存在および非存在下において、ａＰＰヒット集団に酵母表面結合アッセイを実施した。ＦＡＣＳプロットは、血清が１０％（ｖ／ｖ）まで添加されたときでさえ、結合性の変化を本質的に示さず（図９）、Ｒａｓ−ペプチド相互作用が非特異性競合相手に強いことが示された。
【０２８６】
ａＰＰヒットの親和性を向上させるために、定向進化を使用した。最初にＭＡＣＳラウンド、続いて低いＫＲａｓ濃度でＦＡＣＳを使用して、酵母ディスプレイを前述同様に行った。さらに、非特異的結合に対する選択圧を維持するために、５％（ｖ／ｖ）のヒト血清および１００μｇ／ｍｌの非特異性ＤＮＡ（一本鎖、サケ精子由来）の存在下での進化の実施を決定した。条件およびそれらの結果として生じた配列の概要が図１０に示され、色分けは、変異が最初に現れたラウンドを示す。
【０２８７】
（２２３ペプチドをもたらした）第２のラウンドについては、エラープローンＰＣＲによって第１のラウンドからの３つの２２１ヒットを多様化させ、次いで１００ｎＭのＫＲａｓ濃度でＭＡＣＳを実施した。結果として生じた集団を、ＫＲａｓ  ５０ｎＭにおけるＦＡＣＳによる５ラウンドのスクリーニングにわたって富化させ、各々追加の変異（２２３−１についてはＸ２３Ｒ、および２２３−２についてはＶＩ４Ｉ）と共に、共通の２つの変異（Ｐ１３ＳおよびＶ３０Ａ）を共有した、２つの一意的配列を得た。ヌクレオチド配列の検査により、２２３−１が２２１−２から誘導されたこと、および２２３−２が２２１−１から誘導されたことを見出した。これらの変異の全てが有益であると想定することはできないことに留意するのが重要である；好ましいものへの遺伝連鎖によって選択された中性または有害な変異が存在する可能性がある。これら２つの配列の場合では、Ｓ１３およびＡ３０は独立して異なる親配列から生じ、進化の後続のラウンドにおいて（１つを例外として）固定されたままであったことから、それらが好ましいと結論付けることが合理的と考えられる。
【０２８８】
（２２４ペプチドをもたらした）第３のラウンドでは、エラープローンＰＣＲによって第２のラウンドからの２つの２２３ヒットを多様化させ、次いで２５ｎＭのＫＲａｓ濃度でＭＡＣＳを実施した。結果として生じたライブラリを、ＫＲａｓ  ２５ｎＭにおけるＦＡＣＳによって２回スクリーニングし、３つの一意的配列を得た。ヌクレオチド分析は、２２４−１、２２４−２、および２２４−３が２２３−１から誘導されたこと、ならびに２２４−４が２２３−２から誘導されたことを示した。２２４−１、２２４−２、および２２４−３ペプチドは共通のＹ７Ｃ変異を共有し（以下参照）、２２４−１は追加のＦ２０Ｙ変異を保有し、２２４−２は、２２３−２で以前に観察されたＶＩ４Ｉ変異を保有する。２２４−４の配列は、ＰＰＩＩヘリックスの始めに挿入された追加のＰＲＲを例外として、２２３−２と同一である。この一見好ましい変異は、おそらくａＰＰペプチドの直前にある配列が反復している（Ｇ４ＳＧ４ＳＧ４）ため、ＰＣＲの間のプライマースライディングによってライブラリに導入された可能性が最も高い。
【０２８９】
本発明者らは初め、（ＰＰＩＩヘリックス内の）このシステインが、ＫＲａｓ内の表面露出システイン残基のうちの１つとジスルフィド結合を形成することによってペプチドの見かけ上の親和性を向上させていたと想定し、２２４−１、２２４−２、および２２４−３に見出されたＹ７Ｃ変異を人為的結果と見なした。この想定は不正確であったと後に判明したが（第２章を参照のこと）、２２５ペプチドをもたらした後続の（第４の）ラウンドでは、この変異とＰＲＲ延長との両方を親ライブラリ鋳型から削除することを決定した。このライブラリは、上記（図５）の重複延長法によって調製した合成鋳型のエラープローンＰＣＲによって調製された。この鋳型は、Ｙ７ＣおよびＰＲＲ延長を例外として、第３のラウンドで見出された変異の全てを、シャッフル（コンビナトリアル）形式で含んだ。また、Ｙ７Ｃ変異を含む稀なクローンを富化させ得る過度にストリンジェントな条件を回避するため、ＫＲａｓの濃度を１００ｎＭまで上昇させた。１００ｎＭにおける１ラウンドのＭＡＣＳおよび２ラウンドのＦＡＣＳの後、１１個中９個のクローンが２２５−１配列に対応し、単一クローンがＥ１９Ａ変異を含み（２２５−５）、単一クローンがＡ３０Ｐ変異を含んだ（２２５−６）。記録管理エラーのため、このラウンドでの番号付けは非経時的であることに留意されたい。Ｙ７Ｃ変異を含んだクローンは存在しなかった。
【０２９０】
（２２６ペプチドをもたらした）第５かつ最終のラウンドでは、ヒット鋳型のエラープローンＰＣＲによって前述同様にライブラリを調製した。ＫＲａｓ  １００ｎＭにおける１ラウンドのＭＡＣＳの後、１００ｎＭから開始し、次いで５０ｎＭに進み、最終的に２０ｎＭまで低下するＫＲａｓ濃度を用いて、３ラウンドのＦＡＣＳを実施した。この集合は７つの一意的配列を含み、そのうち５つは、２２４−１と同一なもの（２２６−４）を含め、Ｙ７Ｃ変異を含んだ。残りの２つのうち、一方は２２５−１と同一であり（２２６−１）、他方はＩ１４Ｖ復帰を除いて同一であった。これらの配列に基づいて、本発明者らのエラープローン変異誘発方策で利用可能なライブラリの多様性を少なくとも所与とすると、親和性の向上にはシステインの獲得が必要であると思われる点に到達したと結論付けられた。ここで進化を停止させ、本発明者らのペプチドをインビトロでより徹底的に特性化することを決定した。２２５−１配列が２２５ラウンドにおいて最も一般的なクローンであり、２２６ラウンドでシステインを含まずに再度現れたため、これをこれらの研究のための代表的なペプチドとして選択した。また、向上した親和性および潜在的に細胞透過を提供し得るという理由で、２２４−４に見出されたＰＲＲ延長を含んだバージョンの２２５−１を試験することを決定した。このペプチドを２２５−３と名付けた。
【０２９１】
実施例３：Ｒａｓ結合ペプチドのインビトロの特性化
定向進化の取り組みから、さらなる研究のために２つのａＰＰ由来ペプチド、すなわち２２５−１および２２５−３を選択した。これらのペプチドは、酵母ディスプレイ系においてナノモル濃度でＫＲａｓに結合し、Ｒａｆ結合に関してＲａｓと競合し、遮断剤（ＤＮＡおよび血清）の存在に対して顕著な耐性を示した。この実施例は、大腸菌内でのこれらのペプチドの組換え生成、それらのインビトロの結合特性の特性化、Ｒａｓ表面上のそれらの結合部位の定義に向けた初期の取り組みを説明する。
【０２９２】
２２５ペプチドの発現および精製。定向進化実験の過程中、Ｓｃｈｅｐａｒｔｚおよび共同研究者らによって彼らの研究のために行われたように、固相ペプチド合成を使用して少数のａＰＰペプチド（大部分は２２３および２２４系列に由来）を調製した（Ｄａｎｉｅｌｓ，Ｄ．Ｓ．ａｎｄ  Ｓｃｈｅｐａｒｔｚ，Ａ．Ｉｎｔｒｉｎｓｉｃａｌｌｙ  ｃｅｌｌ−ｐｅｒｍｅａｂｌｅ  ｍｉｎｉａｔｕｒｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ａ  ｍｉｎｉｍａｌ  ｃａｔｉｏｎｉｃ  ＰＰＩＩ  ｍｏｔｉｆ．Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  １２９，１４５７８−９（２００７）、Ｋｒｉｔｚｅｒ，Ｊ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．Ｍｉｎｉａｔｕｒｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐ５３−ｈＤＭ２  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ．Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ  ７，２９−３１（２００６）、Ｓｍｉｔｈ，Ｂ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．Ｍｉｎｉｍａｌｌｙ  ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｃｅｌｌ−ｐｅｒｍｅａｂｌｅ  ｍｉｎｉａｔｕｒｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｖｉａ  ａｌｐｈａ−ｈｅｌｉｃａｌ  ａｒｇｉｎｉｎｅ  ｄｉｓｐｌａｙ．Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  １３０，２９４８−９（２００８）を参照されたい）。しかしながら、これらの配列の長さ、およびカップリングの観点（例えば、ＲＰおよびＲＲ）から困難である残基対の保有率に起因して、これらの合成は多くの労力とコストを要し、複数ラウンドのＨＰＬＣ精製後であってもクリーンな試料を得るのが困難な場合があった。これらのペプチドが全体的に自然発生のアミノ酸からなることを所与として、本発明者らのａＰＰペプチドを大腸菌内で過剰産生させるための組換え発現系の開発を試みた。この方策は、収率が十分である限り、この長さの配列に関するいくつかの利点を有する：細菌内でのタンパク質発現は概して、固相合成よりも費用および時間がかからず、翻訳エラーの比較的低い比率４は、精製除去されなければならない無関係の細胞タンパク質が多く存在するが、密接に関連する副生成物の存在率が低いようなものである。２２５−１および２２５−３ペプチドをコードする大腸菌コドン最適化断片（配列は図１１を参照のこと）を、Ｎ末端Ｈｉｓ６タグおよびＳ−タグを含むｐＥＴ３０ａ発現ベクター内にサブクローニングし、タバコエッチプロテアーゼ（ＴＥＶ）開裂部位を、このペプチド配列の始まりの直前に配置した。このペプチドのＮ末端に、（効率的なタンパク質分解を促進するように）ＴＥＶ部位とＰＰＩＩヘリックスの始まりとの間で可動性リンカーとして働き、かつハンドル（システイン−ＳＨ基）を提供するＧＣＧトリペプチドを付加して、後続の実験のためにフルオロフォアおよびビオチンを用いたペプチドの標識を可能にした。
【０２９３】
これらのコンストラクトをＢＬ２１  Ｒｏｓｅｔｔａ  ｐＬｙｓＳ細胞に形質転換させ、これを抗生物質と共にＬＢ内で成長させてプラスミドを維持し、Ｒａｓタンパク質の精製に関して記載されているように、ＩＰＴＧを使用して３０℃で発現を誘発した。誘発後、遠心分離によって細胞を採取し、それらを超音波処理によって溶解させ、コバルト親和性クロマトグラフィーを使用して、Ｈｉｓタグ付きペプチド融合物を精製した。溶離したタンパク質をＴＥＶの添加によって開裂させ、結果として生じた反応物をＨＰＬＣによって精製した。
【０２９４】
２２５−１ペプチドの精製に関する代表的データは図１２に示される。２２５ペプチドは、２個のトリプトファンおよび４個のチロシン残基に起因して２８０ｎｍにおいて強力に吸光し、ＴＥＶ反応のＨＰＬＣトレースは、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ／ＭＳ）によって分析したとき（図１２Ｂおよび１２Ｃ）、１１分において明らかな汚染のない開裂ペプチドを含む強力なピークを示した（図１２Ａ）。精製後、このペプチドをジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に溶解させ、アミノ酸配列から予測された消衰係数と、この特定の溶媒の組み合わせについて実験的に決定した補正率（０．９１）とを使用して、５０％のＤＭＳＯと５０％のリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）との混合物中のＡ２８０を測定することによって、ペプチドの濃度を判定した。
【０２９５】
この発現系を用いて得られた２２５−１および２２５−３の収量は中程度、すなわち典型的には２リットルの調製物に対して約５０ｎｍｏｌ（約２２０μｇ）ほどであり、これは予備研究には十分な材料であった。しかしながら、アラニン走査のために点変異体を発現する本発明者らの後続の取り組み（ＩＩＩ．Ｅ節参照）は、大幅に乏しく発現し、時に６リットル超の培養物を必要とし、一部の変異体の場合では一切の発現をもたらさなかった。配列の比較的疎水性の本質のため、分子シャペロンとの同時発現がペプチド収率を向上させるかもしれないと仮定した。したがって、本発明者らのコンストラクトを、アラビノース誘導性プロモーターの制御下でｄｎａＫ、ｄｎａＪ、ｇｒｐＥ、ＧｒｏＥＬ、およびＧｒｏＥＳシャペロンを保有する改変形態のｐＧ−ＫＪＥ８プラスミド（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を保有するＢＬ２１細胞内で発現させた。２００ｍｇ／ｌのアラビノースと併せてＩＰＴＧを用いた誘発は、試験した変異体ペプチドのほとんどの収率を劇的に向上させ、生化学研究のために十分な量のアラニン点変異体全種を調製することを可能にした。シャペロンとの同時発現はまた、２２５−１ペプチドの収率も向上させ（より中程度ではあったが）、この方策は、後続のペプチド全ての生成のために採用された。
【０２９６】
機能化ペプチドを必要とした実験については、マレイミド結合体（例えば、ＦＩＴＣ−マレイミドまたはビオチン−ＰＥＧ２−マレイミド）を用いてＮ末端付近のシステインを標識した。まず、この精製２２５ペプチドを、チオールを欠き、マレイミドなどのスルフヒドリル反応性分子と反応する可能性が低い還元剤であるトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）で処理した。次いでこのペプチドを、適切なマレイミド結合体を用いて室温で標識し、続いてＨＰＬＣによる精製、そして非標識ペプチドについてはＬＣ／ＭＳによる特性化を行った。典型的には、反応物質の可溶性を補助し、ｐＨがシステインによるマレイミド基の選択的標識の助けになることを確実にするために、これらの反応はＤＭＳＯとｐＨ７緩衝液との混合物中で実施した。
【０２９７】
２２５−１および２２５−３ペプチドを緩衝液中に溶解させようと試みたところ、２２５−１は比較的良好な可溶性（中性ｐＨにおいて最大約１００〜２００μＭ）を有したが、２２５−３ペプチドは中性ｐＨにおいて可溶性でなく、低ｐＨ（５未満）または高ｐＨ（１１超）においてマイクロモル濃度でしか可溶化され得なかったことが見出された。しかしながら、予備試験は、２２５−３ペプチドが２２５−１よりも強い結合親和性を保有し、いくらか細胞浸透性でもあったことを示した。したがって、２２５−３を使用して以降の実験の大部分を実施し、中性ｐＨで高濃度が必要とされる事例（例えば、ＮＭＲ）では２２５−１のみを使用した。これら２つのペプチド配列間の差異は比較的わずかであるため、また、それらは同様の結合親和性、ＣＤスペクトル、およびＲａｓからのヌクレオチド解離の抑制を示すため、それらを概して２２５ペプチドと称する。
【０２９８】
円二色性によるペプチド二次構造の特性化。２２５ペプチドは、ａＰＰ−Ｍと比べて１２個、そしてａＰＰと比較して１５個のアミノ酸置換を含む。これらの変化のほとんどは（結晶構造の検査に基づいて）ａＰＰの折り畳みへの寄与が予測されない残基内で発生するが、アミノ酸の半分近くがａＰＰから２２５ペプチドに変異したため、それらの高次構造が同じになることは明らかではなかった。２２５ペプチドの二次構造に関する初期見識を得るため、２２５−１および２２５−３のＣＤスペクトルを記録した。２２５−１ペプチドは、ｐＨ８のリン酸緩衝液中では容易に溶解できなかったが、２２５−３ペプチドは、ｐＨ５未満およびｐＨ１１超のＣＤ研究のために十分に高い濃度でしか調製され得なかった（上記参照）。したがって、ｐＨ４．５およびｐＨ１２における２２５−３に関するＣＤを記録した。そのデータは図１３に示される。２２５ペプチドは、ａＰＰ−ＭのＣＤスペクトルと同様のＣＤスペクトルを有するが、（典型的にαヘリックスに対して２０８ｎｍおよび２２２ｎｍにおける）２つの最小値は、ａＰＰ−Ｍと比較して２２５ペプチドに対してわずかに赤方偏移しているようであった。それに加えて、最小値の相対強度は異なる：ａＰＰ−Ｍが２０８ｎｍおよび２２２ｎｍにおいてほぼ同一のＣＤを有する一方で、２２５ペプチドは２１０と比較して２２５においてより強いＣＤを有する。αヘリックスとの関連で、高い［θ２２２］／［θ２０８］比が、非コイル状ヘリックスからコイルドコイル構造への転移にしばしば関連する５。こうしたデータは、２２５ペプチドが溶液中で同様の種類の構造を形成し得ることを示唆する；１つの可能性は、２２５ペプチドが、（ａＰＰに関して報告されているように）それらのａＰＰ−Ｍ親よりも頭−尾ホモ二量体を形成しやすいということである。
【０２９９】
２２５ペプチドの安定性に関する見識を得るため、１０℃〜９０℃で２２２ｎｍにおけるＣＤを記録した。融解曲線は、試験した３つの２２５ペプチド試料に関するシグモイド転移を示す；２２５−３については、ｐＨ４．５（５７℃のＴｍ）と比較して、ｐＨ１２（４６．２℃のＴｍ）が折り畳み構造を不安定化させるようであり、中性ｐＨでは、２２５−１は６６．６℃のＴｍを有する。２２５−１に関するこのＴｍは、ａＰＰ−Ｍ親のもの（７７℃超のＴｍ）より低いが、野生型ａＰＰのもの（６４．５℃のＴｍ）よりは依然として高い。この比較的高い融解転移は、２２５ペプチドが熱的に安定していることを示唆する。ペプチド高次構造を詳細に理解するには、より直接的な（例えば、ＮＭＲまたはＸ線結晶構造解析からの）構造情報が必要だが、これらのＣＤデータは、ａＰＰの折り畳みに寄与することが知られる残基のほとんど全てが本発明者らによる進化の過程中に保存された事実と併せて、２２５ペプチドがそれらのａＰＰ親と同様の構造をおそらく共有することを示唆する。
【０３００】
蛍光偏光によるＲａｓ−ペプチド結合親和性の数量化。酵母ディスプレイ系により、２２５ペプチドが中度から低度のナノモル濃度でＲａｓタンパク質に結合することができることが示唆された。Ｒａｓ−ペプチド結合親和性のより定量的な測定値を得るために、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）で標識されている２２５ペプチドを用いて蛍光偏光（ＦＰ）アッセイを実施した。このアッセイは、溶液中で比較的遅く転回するＦＩＴＣ標識ペプチドが、早く転回するものよりも高い異方性を示すように、励起光に対して平行な面と、励起光に対して直角の面との両方で蛍光を測定することに依存する。２２５ペプチドはＲａｓタンパク質よりも著しく小さいため（２１ｋＤａと比較して４．５ｋＤａ）、溶液中で遊離しているペプチドからＲａｓ結合ペプチドへの転移は、蛍光偏光の増加を示すと予測される。２２５−３ペプチドのＦＰを様々なＫＲａｓ（Ｇ１２Ｖ）・ＧｐｐＮＨｐ濃度で測定し、２０ｎＭの解離定数（Ｋｄ）を判定した（図１４）。この親和性はＢ−Ｒａｆ  ＲＢＤに対するＨＲａｓの親和性と比較可能であり、Ｂ−Ｒａｆ  ＲＢＤに対するＫＲａｓの親和性の２倍強力である７。この結合曲線に関するヒル係数は１．０であり、結合が非協同性であることが示唆された。これらのＦＰ実験は決まって乱雑データを生成し、クリーンな曲線を得るために多くの複製が必要であったが、親和性は再現性よく本明細書に報告される範囲内であったことが注目された。これは、２２５−１系列からのペプチド（すなわち、Ｎ末端ＰＲＲ延長を欠いたもの、第Ｉ章参照）に特に当てはまった。したがって、継続して、２２５−３およびその誘導体を用いたＦＰ実験の残部を実施した。
【０３０１】
次に、２２５−３ペプチドおよびＧＤＰ形態のＫＲａｓ（Ｇ１２Ｖ）、ならびにＧｐｐＮＨｐおよびＧＤＰ形態のＫＲａｓ（野生型）に関する結合曲線を測定した。Ｒａｓの変異状態はペプチド結合親和性に強い影響を及ぼさないように見えたが、ＧｐｐＮＨｐヌクレオチド状態は、両方のタンパク質に関してＧＤＰ状態よりもわずかに好ましかった。これらのペプチドについて観察されたヌクレオチド選択性は、典型的にはＧＴＰ状態に対して１００倍超の選択性を示す、自然発生のＲａｓ結合タンパク質のものよりも著しく低い。しかしながら、本発明者らの初期の定向進化の取り組みの間に明示的な選択性要件が含まれなかったのに反して、これらのタンパク質は、この特性を保有するように進化した。より最近の酵母ディスプレイ実験では、ＫＲａｓ・ＧＤＰと比べてＫＲａｓ・ＧＴＰに対して高い結合比を有するペプチドをスクリーニングすることによって、ヌクレオチド選択性を向上させようと試みた（第３章参照）。
【０３０２】
３つのＲａｓタンパク質は全て、Ｒａｆ  ＲＢＤに対する親和性にほんのわずかな差異があるが、ほとんどのＲａｓエフェクターに結合することができる７。２２５−３ペプチドのアイソフォーム選択性を判定するために、ＫＲａｓ、ＨＲａｓ、およびＮＲａｓのＧｐｐＮＨｐ結合形態を用いてＦＰを実施した（図１４）。ＫＲａｓに対する２２５−３のＫｄ（２０ｎＭ）は、ＨＲａｓおよびＮＲａｓに対するもの（４５ｎＭ）よりわずかに高いだけで、３つのＲａｓアイソフォーム全てが同様の親和性で２２５−３ペプチドに結合することを示す。
【０３０３】
Ｒａｓタンパク質は、ＧＴＰアーゼの大きなファミリーに属し、その一部は、Ｒａｓに対して著しい構造および配列の類似性を共有する。これらのタンパク質のいくつかは、多くの細胞型にまたがるハウスキーピング機能に関与しているため、Ｒａｓ抑制剤の重要な特性の１つは、Ｒａｓタンパク質とそれらの密接なファミリーメンバーとを差別する能力である。２２５ペプチドの選択性を判定するために、全てがＲａｓタンパク質と同じＧＴＰアーゼ折り畳み構造を共有するＧｐｐＮＨｐ結合Ｒａｐ１ａ、ＲａｌＡ、およびＲａｂ２５を用いて、ＦＰアッセイを実施した。Ｒａｐ１ａおよびＲａｌＡは、一次配列においてＲａｓタンパク質に最も近い２つのタンパク質であり、一方でＲａｂ２５は、Ｒａｓに対して３０％未満の配列同一性を有する遠縁のＲａｂタンパク質ファミリーに属するため、Ｒａｐ１ａおよびＲａｌＡを選択した８。Ｒａｐ１ａは、Ｒａｆ  ＲＢＤを含む一部のＲａｓエフェクターに結合することができ、同様に一部のＲａｐエフェクタータンパク質はＲａｓに結合することができるため９、Ｒａｐ１ａは本発明者らにとって特別な関心の対象であった。ＲａｌＡおよびＲａｐ２５は、認識可能な程度には２２５−３に結合せず、Ｋｄは、Ｒａｂ２５に関しては約１０μＭ、そしてＲａｌＡに関しては１０μＭ超であった（図１４）。Ｒａｐ１ａは、わずかに高い親和性（３．５μＭ）で２２５−３に結合するようであったが、依然としてＲａｓよりも１００倍超弱かった。これらのデータは、２２５−３ペプチドが、進化実験中の特異性に関する明示的な選択の欠如にもかかわらず、密接に関連するファミリーメンバーよりもＲａｓタンパク質に対して顕著な特異性を有することを示唆する。
【０３０４】
ＳＰＲによるＲａｓ−ペプチド結合親和性の数量化。Ｒａｓ−ペプチド結合親和性の独立した測定値を得るために、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ、しばしばＢｉａｃｏｒｅと称される）を使用した結合アッセイを実施した。このアッセイは、目的の分子を金の薄板の表面上に固定化し、プリズムを通してこの薄板に偏光を導くことを伴う。これは、全内部反射の条件下で行われ、ここで、表面から反射される光の強度は、金表面のいずれかの側にある材料の屈折率に依存する。表面における比較的小さな変化、例えば固定化したリガンドへの生体分子の結合などは、屈折率を変化させ、反射光の強度の変化をもたらす。ＳＰＲシステムは、目的の分子を金の薄板上に固定化し、次いで、反射光を連続的に記録しながら第２の分子をチップ上に流すことによって機能する。固定化分子と「自由」分子との間の結合事象が共鳴単位（ＲＵ）の増加として検出され、これを使用して結合事象の動態学的パラメータおよび熱力学的パラメータの両方を測定することができる。この方法の利点の１つは、「自由」分子は純粋にその質量によって検出され、したがっていかなる標識も必要としないということである。固定化分子は、チップ上で共有結合的に（例えば、アミノまたはチオール基の非特異性カップリングによって）捕捉されても、非共有結合的に（例えば、ビオチン−ストレプトアビジン対を用いて）捕捉されてもよい。
【０３０５】
本発明者らの初期方策は、２２５ペプチドをチップ表面上に固定化し、遊離した非標識のＲａｓタンパク質をその上に流すことであった。この設定の利点は、ＳＰＲシステムによって検出されるＲＵシグナルは質量にほぼ比例することから、Ｒａｓタンパク質は、ペプチドよりも質量において約５倍大きいため、結合するとより強力なシグナルを生成すると予想されるということである。ストレプトアビジン官能化金チップを選択し、システインハンドル（上記参照）においてビオチン化されている２２５−３ペプチドを固定化した。このペプチドは、基線ＲＵシグナルの増加によって判定した場合に成功裏にチップ上に捕捉されたが、非標識Ｒａｓタンパク質を添加すると、結合シグナルの認識可能な増加は観察されなかった。この原因は直ちに明らかにはならなかった；本発明者らの最初の想定は、ビオチン化により何らかの理由でペプチドがＲａｓに結合できないようになったか、またはＲａｓ−ペプチド結合がビオチン−ストレプトアビジン結合と（例えば、立体的理由で）適合しなかったということであった。しかしながら、この説明は、ストレプトアビジンビーズを使用し、同じビオチン化２２５−３ペプチドを使用して、細胞ライセートからの精製ＫＲａｓおよびＲａｓの両方の結合に成功したプルダウンアッセイと一致しなかった（図１８参照）。
【０３０６】
現在の知識を所与として、ペプチド二量体モデルに関するこれらの観察を説明することができる：ビオチン化ペプチドをストレプトアビジンチップに導入すると、ビオチン−ストレプトアビジン相互作用の極端に高い親和性（約５０ｆＭ）１０が、ビオチン部分の全ての固定化を引き起こした。ストレプトアビジンは、４つのビオチン結合部位を有するホモ四量体タンパク質であり、結晶構造の検査により、２つのペプチドが、依然として頭−尾ａＰＰ様ホモ二量体構造にありながら、隣接するビオチン結合部位にうまく結合することができなかったのは明らかであった。ビオチン−ストレプトアビジン相互作用は、これらの実験の時間尺度では本質的に不可逆的であるため、ホモ二量体は、ストレプトアビジンチップに導入されると効果的に引き裂かれ、したがってＲａｓタンパク質に結合することができない状態で固定化された可能性がある。この説明により以下の予測が立つことが注目される：ビオチン化ペプチドの固定化、続いて非標識ペプチドとのインキュベーションは、チップ表面上でＲａｓに結合することができる二量体の形成をもたらすはずである。
【０３０７】
これらの実験の際、この現象の原因は未解決のままであり、Ｒａｓタンパク質を固定化し表面上に遊離ペプチドを流す代替のＳＰＲ手法を進めた。酵母ディスプレイに関して第Ｉ章に記載したＳｆｐビオチン化Ｒａｓタンパク質を使用し、ＧｐｐＮＨｐ結合状態およびＧＤＰ結合状態の両方を試験した。Ｒａｓタンパク質はチップ上に安定して捕捉され得、非標識２２５−３ペプチドに対して安定した結合を示した（図１５）。ＳＰＲ親和性実験は、典型的には、２つの方法、すなわち「複数サイクル」試験（この試験では、タンパク質が固定化され、単回注入のリガンドが表面上に流され、その後チップが再生され、その結果、タンパク質およびリガンドの新たなバッチが導入され得る）、および「単一サイクル」試験（この試験では、タンパク質が固定化され、複数回の注入が連続して実施される）のうち１つで実施した。単一サイクル試験は、複数サイクル試験よりも高速でコスト効果が高く、結合事象のオフ速度がオン速度と比べて遅い限り（すなわち、結合親和性が高いときに）正確なデータをもたらすものであり、本発明者らの研究に使用された方法であった。
【０３０８】
ＧｐｐＮＨｐ状態およびＧＤＰ状態の両方が高い親和性で２２５−３に結合し、それぞれ２．５ｎＭおよび０．４６ｎＭの解離定数をもたらした。曲線の目視検査および計算される動態学的パラメータの両方から、ＧＴＰよりもＧＤＰ状態のＲａｓに対して解離が遅いことは明らかであり、この観察は、酵母ディスプレイを使用して実施されたオフレートセレクション実験と一致する。両方の曲線が２ステップ結合モデルによって最もよく当てはめられたことが見出され、このことは本発明者らの予想に反し、これらの実験の結果は、蛍光偏光からの結果ともいくらか食い違った：計算された親和性は、ＦＰによって見出されたものよりも１桁高く、ヌクレオチド選択性は逆転していた。
【０３０９】
これらの相違の正確な原因は本発明者らにとって完全に明らかではないが、このペプチド二量体モデルは、システム内に複数の相互依存的な平衡が存在するはずであると予測するため、何らかの見識を提示し得る。ペプチドは様々な濃度（１〜１００ｎＭ）で調製され固定化チップ上に注入されるので、ペプチドの濃度がより高ければ、より高い割合のペプチドが二量体（Ｒａｓ結合）状態で存在することになるため、Ｒａｓに対するより強力な有効Ｋｄが認められるであろう。このことは、添加されるペプチドの濃度が、Ｒａｓに結合するために利用可能なペプチド二量体の有効濃度を正確に反映しない場合があるため、結合曲線およびデータ当てはめの歪曲をもたらし得る。ＦＰ実験では、ペプチドは一定濃度に保たれ、そのためこの作用の影響をより受けにくい場合があるが、単量体ペプチド、二量体ペプチド、およびＲａｓ−ペプチド二量体複合体についてはＦＰが異なると予想されるため、複数の状態がバルクＦＰシグナルに寄与している可能性もある。したがって、これらの結合アッセイの両方が、それらから導かれ得る結論を制限する注意点を保有し、単にペプチド−Ｒａｓ相互作用は中度から低度のナノモル範囲内にあると主張するのが、おそらく最も安全である。
【０３１０】
２２５−３ペプチドのアラニン走査変異誘発。次に、Ｒａｓ−ペプチド相互作用のより詳細な理解を得ようと試みた。上で考察したように、本発明者らのＣＤおよび進化結果は、２２５ペプチドはａＰＰの全体的な折り畳み構造を保持したが、Ｒａｓ結合に関与するペプチド残基は容易に明らかではなかったことを示唆した。ａＰＰライブラリはαヘリックスの外向きの面で多様化されたため、また、進化中に現れた変異の本質的に全てがこの領域内に位置していたため、２２５ペプチドは、そのαヘリックス上の残基を主に介してＲａｓに結合すると推測したいところである。この仮説を試験するため、各々が単一のアラニン点変異を含んだ２２５−３のバリアントを試験することによってアラニン走査変異誘発を実施した。アラニンは、小さいにもかかわらず、ほとんどのアミノ酸の高次構造の嗜好性を模倣するため、この種類の実験で使用される最も一般的なアミノ酸である。アラニンは、２２５ペプチド二次構造の大部分を構成すると思われるＰＰＩＩおよびαヘリックスの両方で概して安定化作用があるため、特にこのペプチドに関してとりわけ好適である。
【０３１１】
変異誘発のために、１０個の残基：ＰＰＩＩヘリックス内で２個、ループ内で２個、そしてαヘリックス内で６個を選択した（図１６参照）。これらの変異体のプラスミドは、部位特異的変異誘発ＰＣＲを使用して構築し、上記のように発現させ精製した。これらのうち９つが発現および精製され得たが、これらの一部は、シャペロンとの同時発現に絶対的に依存した。１つの変異体、すなわちＥ１５Ａのみ、シャペロンの存在下でも発現され得なかった。この残基はαヘリックス上にあり、外向きであると予測され、このペプチド二量体モデルは、この残基と近隣のペプチド上の残基との間のいかなる相互作用も予測しないため、この乏しい発現の理由は現在明らかではない。
【０３１２】
一旦精製したら、アラニン変異体をＦＩＴＣで標識し、ＦＰによって試験した（図１７）。アラニン走査に典型的に期待されることは、研究される特性に影響する一部の変異体、およびほとんどまたは全く影響を及ぼさない他の変異体を見出すことである。予想外なことに、試験した全ての変異体が、結合を少なくとも４倍妨害し、ほとんどが、測定された親和性の少なくとも１０倍の低減を引き起こした。これらの変異のうちの３つ（Ｉ１４Ａ、Ｗ２１Ａ、およびＷ２５Ａ、全てαヘリックス上）が、ＣＤによって査定された場合に、ペプチド二次構造に対して著しい不安定化作用を及ぼすようであった。これらのデータに関する本発明者らの初期解釈は、他の７個の残基全てがＲａｓへの結合に関与していたというものであり、これは、ペプチドが、αヘリックスを介するだけでなく、ＰＰＩＩとα−ヘリックスとの両方からの接点を有するペプチドの１つの「側面」を提示することにもよってＲａｓに結合することを示唆した。このペプチド二量体モデルに照らすと、これらのデータは、試験した残基の一部はＲａｓに接触するが、その他は二量体の安定化に関与するという、代替的な説明を示唆する。実際に、ａＰＰ二量体構造（図２３）の検査は、試験した残基のうちのいくつかは、単量体間の接点の形成におそらく関与することを示す：（結合を安定化させるように見えた２つのアルギニンを含む）ＰＰＩＩヘリックスは、反対側のペプチド上の酸性残基のパッチに近接しており、Ｗ２１残基対（これらはａＰＰにおいてＴｙｒである）は、πスタッキングのために互いから適切な距離にあるようである。したがって、アラニン走査の解釈は、これらのデータを所与として、Ｒａｓに直接結合する残基と、ペプチド−ペプチド二量体化を安定化させる残基とを区別する能力の欠如によって、いくらか複雑化されている。さらに、ペプチドがホモ二量体内にあるため、アラニン走査変異体は、単一の残基ではなくむしろ一対の残基の役割を調べたということに留意されたい。
【０３１３】
生物活性分子を用いたアッセイを実施する際、活性化合物に可能な限り類似していながら標的活性の一部または全てが欠如した陰性対照分子を有することが有益である。本発明者らの研究に関しては、これは理想的には、ペプチド構造を破壊することなくＲａｓへの結合を抑止する単一変異を有する２２５ペプチドである。アラニン走査系列からは、３つのペプチド、すなわちＷ２１Ａ、Ｗ２５Ａ、およびＮ２６Ａが、５μＭを超えるＫｄ値を有した。上で考察したように、トリプトファン変異体の両方が、ＣＤによって判断した場合に、２２５−３親と比較して不安定化されたようであった。しかしながら、Ｎ２６Ａ変異体は、２２５−３と比較して未変化であったＣＤプロファイルを有し、したがって、このペプチドを、本発明者らの後続の研究において陰性対照として使用するために選択した。
【０３１４】
癌細胞ライセートにおけるプルダウンアッセイ。このように、これまでのデータは、２２５ペプチドがナノモル親和性および良好な特異性でＲａｓタンパク質に結合することを示す。しかしながら、これらの実験は全て、組換え発現されたＲａｓタンパク質を用いて実施されたものであり、これらのタンパク質が（翻訳後修飾、折り畳み構造の差異、パートナータンパク質の関与などに起因して）生細胞内のＲａｓの性質を正確に反映しなかったという可能性が残った。２２５ペプチドが癌細胞内の内在性Ｒａｓタンパク質に結合することができたかどうか、そして２２５ペプチドがこうした内在性タンパク質とエフェクターとの結合を妨害することができたかどうかを試験するために、変異型のＲａｓ（Ｇ１２Ｖ）を保有し、かつ生存のためにＲａｓ活性に依存することが示されているＣａｐａｎ−１膵臓腺癌細胞株のライセートにおいて、プルダウンアッセイを実施した。
【０３１５】
これらの細胞を標準的方法で成長させ、それらを非変性条件下（１％（ｖ／ｖ）の非イオン性洗浄剤Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含有する緩衝液、追加の詳細については「方法」を参照のこと）で溶解させた。このライセートを、ビオチン化２２５−３ペプチド、ビオチン化２２５−３  Ｎ２６Ａペプチド、またはＤＭＳＯ対照と共にインキュベートし、次いで、このペプチドを磁性ストレプトアビジンコーティングビーズで捕捉し、これらの試料を、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）ゲル上に泳動させ、続いてニトロセルロース膜に移し、Ｒａｓに関するウェスタンブロッティングを行った。これらのペプチドがＲａｓエフェクターと競合することができたかどうかを試験するため、過剰のＲａｆ  ＲＢＤと共にプレインキュベートされているライセートを用いて、同じ実験一式を並行して実施した。この処理は、ほぼ全てのＲａｓ分子が（高いＲａｓ−Ｒａｆ親和性に起因して）Ｒａｆに結合することにつながると予想され、Ｒａｆおよび２２５ペプチドが結合部位を共有する場合、ペプチドによってプルダウンされるＲａｓの量は減少すると予測される。
【０３１６】
この実験の結果は図１８Ａに示される。このライセートは、インプットレーンによって判断した場合に著しい量のＲａｓを含有したが、Ｒａｓは、ビーズ単独によっても、２２５−３のＮ２６Ａ変異体の存在下のビーズによってもプルダウンされなかった。２２５−３の活性型はＲａｓをプルダウンしたが、ライセートをＲａｆ  ＲＢＤと共にプレインキュベートしたときはプルダウンしなかった。これらのデータは、２２５ペプチドがヒト癌細胞株において内在性Ｒａｓに結合することができること、およびペプチドがＲａｆとの結合部位を共有するようであることを実証し、２２５ペプチドが、インビボのＲａｓエフェクター結合を抑制する能力を有し得ることを示唆する。
【０３１７】
この見かけ上の競合は、Ｒａｆおよび２２５−３が重複する結合部位を共有することの結果ではなく、むしろ、Ｒａｓを凝集させて捕捉したり、あるいはビーズ上のビオチン結合部位を遮断したりするＲａｆの能力に起因したという可能性がある。対照実験として、このプルダウン手法を逆転させ、代わりに、グルタチオンビーズを使用して、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）でタグ付けされているＲａｆ  ＲＢＤを捕捉した。ＧＴＰ結合形態のＲａｓしか認識可能な親和性でＲａｆに結合することができないため、このアッセイは、癌細胞内のＲａｓ活性状態を判定するためにしばしば使用される１４。Ｒａｓは、グルタチオンビーズ単独によってプルダウンされなかったが、ＧＳＴタグ付きＲａｆの存在下ではプルダウンされ、２２５−３のＮ２６Ａ変異体とのプレインキュベーションはこのプルダウンを妨害しなかったが、２２５−３はそれを完全に抑止した（図１８Ｂ）。これは、ＩＩ−９Ａの結果を裏付け、２２５ペプチドが内在性Ｒａｓへの結合のために基準のＲａｓエフェクターと競合することができることを示す。
【０３１８】
Ｒａｓ上の２２５結合部位の同定。上に示されるプルダウンデータは、２２５ペプチドはＲａｓ結合のためにＲａｆタンパク質と競合することができるため、２２５ペプチドはＲａｓエフェクタードメインまたはその付近で結合することを示唆する。しかしながら、この競合は、Ｒａｆおよび２２５ペプチドが非重複部位に結合するが、他のリガンドが同時に結合することを防止するのに十分に異なるＲａｓの明確に異なる高次構造に結合する、アロステリック機構の結果であるという可能性もある。したがって、Ｒａｓ表面上の正確な２２５ペプチド結合部位を定義しようと試みた。Ｒａｓエフェクタータンパク質の特徴の１つは、Ｒａｓ上のヌクレオチド結合ポケットからのグアニンヌクレオチドの解離に干渉するその能力である。２２５ペプチドがこの特性を共有するかどうかを査定するために、グアニンヌクレオチドの蛍光類似体に依存する、Ｊｏｈｎおよび共同研究者ら１５によって元々は報告されたＲａｓヌクレオチド解離アッセイを実施した。Ｒａｓに結合すると蛍光が増加することで知られる、ＧｐｐＮＨｐのＮ−メチルアントラニロイルエステル（ｍａｎｔＧｐｐＮＨｐ）を合成した。
【０３１９】
ヌクレオチド解離抑制アッセイを、「熱い」ヌクレオチドと結合したタンパク質に「冷たい」ヌクレオチドを加えることを伴う古典的な３２Ｐ標識ヌクレオチド実験と同様の様式で実施した。Ｒａｓ・ＧｐｐＮＨｐに関して記載されているようにアルカリホスファターゼを使用して、ＫＲａｓにｍａｎｔＧｐｐＮＨｐを負荷し、次いで、大過剰のＧｐｐＮＨｐを添加する前に、ペプチドもしくはＲａｆ  ＲＢＤと共に、または何も用いずにインキュベートした。この過剰の非標識ヌクレオチドは、ｍａｎｔＧｐｐＮＨｐの解離を効果的に不可逆的にし、したがって、曲線を指数関数的減衰に当てはめることによって、解離速度定数が測定され得る（図１９）。
【０３２０】
追加の「冷たい」ヌクレオチドの非存在下では、蛍光レベルは比較的安定しており、光退色、タンパク質アンフォールディングなどが、実験の時間経過を通してシグナルの著しい低減につながらなかったことが示された。過剰のＧｐｐＮＨｐを添加すると、蛍光は指数関数的な様式で減少し、これは、以前に報告されているように１５、Ｒａｆ  ＲＢＤの導入によって抑止された。２２５−１または２２５−３のいずれの添加も同様の作用を有し、ヌクレオチド解離の見かけ速度をＲａｆ  ＲＢＤのものと比較可能なレベルまで減速させたが、２２５−１  Ｎ２６Ａまたは２２５−３  Ｎ２６Ａの添加は、解離の速度を減少させず、この作用がＲａｓへの結合に依存したことが示された。このように、２２５ペプチドは、Ｒａｓからのヌクレオチドの解離を抑制するようであり、それらの結合部位がヌクレオチド結合ポケットと重複すること、または、ペプチド結合が、タンパク質がより低いヌクレオチド親和性を有する高次構造に接近することを制限するということのいずれかが示唆される。
【０３２１】
Ｒａｓ−ペプチド相互作用のより詳細な理解を発展させるため、溶液ＮＭＲ実験を実施して、各分子上の結合に関与した残基を同定した。本発明者らが使用した方法は、分子内の化学的に明確に異なるＮ−Ｈ結合（タンパク質の場合、主にアミドＮ−Ｈ結合）を検出し、Ｎ−Ｈ対におけるプロトンおよび窒素原子の個別のシフトに従って位置付けられるクロスピークの２Ｄプロットを生成するＮＭＲ技法である、１Ｈ−１５Ｎ異核量子スピン相関（ＨＳＱＣ）分光法であった（例えば、図２０参照）。タンパク質全体の化学環境における可変性のため、ほとんどのＮ−Ｈ結合は適切な条件下で互いと区別することができ、いくつかの追加の測定法（例えば１Ｈ−１３Ｃ  ＨＳＱＣ、ＨＣＣＨ  ＴＯＣＳＹなど）の助けを借りて、１Ｈ−１５Ｎ  ＨＳＱＣ  クロスピークをタンパク質内の特定の残基に割り当てることができる。こうした割当が既知であれば、リガンドの存在下および非存在下のＨＳＱＣスペクトルを比較し、シフトするクロスピークを同定することによって、リガンドに結合する際のタンパク質高次構造の変化を、タンパク質内の特定の部位にマッピングすることができる。
【０３２２】
ＫＲａｓ（野生型）ＧＤＰに関する割当は２０１２年に発表され、新規のＲａｓタンパク質の割当なしにＨＳＱＣ研究を実施することが可能となった。ＫＲａｓタンパク質を前述同様に大腸菌内で発現させたが、１５ＮＨ４Ｃｌを唯一の窒素源として含む最少合成培地を使用した。このタンパク質を精製し、ＮＭＲ割当に関して報告された緩衝液中に交換し、次いで、クライオプローブを備えたＢｒｕｋｅｒ  ７００ＭＨｚ  ＮＭＲ分光計で１Ｈ−１５Ｎ  ＨＳＱＣ測定を実施した。これらの研究については、比較的大きなタンパク質からのＨＳＱＣシグナルの質を向上させる標準的な１Ｈ−１５Ｎ  ＨＳＱＣ実験の変種である、横緩和最適化分光法（ＴＲＯＳＹ）を使用した。
【０３２３】
１５Ｎ標識ＫＲａｓの１Ｈ−１５Ｎ  ＨＳＱＣスペクトルは図２０Ａに示される。この測定は、以前に報告されたスペクトルと良好に対応する、明瞭で明確に異なるクロスピークをもたらした。ペプチド結合の際に化学環境の変化を経験したＫＲａｓ上の残基を同定するため、１５Ｎを欠くためにＨＳＱＣスペクトル内で可視的でない非標識２２５−１ペプチドの存在下で、同じ測定を記録した。上で考察したように、２２５−３は、これらのＮＭＲ試料の調製に必要とされる濃度（１００μＭ超）で可溶性でないため、これらの実験には２２５−１を使用した。２〜３当量のペプチドが（本発明者らの吸光度に基づく数量化によると）飽和の実現に必要であったことが見出され、この観察は、当時は意味をなさなかったが、現在は、１：２のＲａｓ：ペプチドの結合化学量論を予測するペプチド−二量体モデルによって説明することができる。Ｒａｓ−ペプチド複合体のＨＳＱＣスペクトルが図２０Ｂに示され、自由なＲａｓおよびＲａｓ−ペプチドのスペクトルが図２０Ｃに重ね合わされている。
【０３２４】
この重ね合わせは、「自由」スペクトルと結合スペクトルとの間でシフトする多数のクロスピークによって証明されるように、Ｒａｓに結合すると著しい数の残基が化学環境の変化を経験することを示す。（１３Ｃおよび場合により２Ｈ標識を必要とする）さらなる測定なしにＲａｓ−ペプチドスペクトル内のピークの同一性を知ることは不可能であるが、シフトする自由スペクトル内の（割り当てられた）ピークを同定することにより、ペプチド結合の際にどの残基が影響を受けるかに関する初期観念を発展させることができる。ペプチドへの結合に際してシフトした自由スペクトル内のクロスピークを手作業で表にし、次いで、発表された割当を使用して、それらをＲａｓの結晶構造にマッピングした（図２１）。これらの残基は、エフェクタータンパク質と複合したＲａｓの共結晶構造によって定義されるように、Ｒａｓエフェクタードメインと相当な重複を共有したＲａｓの１つの面上で、明確に定義されたクラスター内に位置していたことが見出された。Ｒａｓタンパク質上の他の箇所の残基は、ＨＳＱＣスペクトル内のそれらに対応するクロスピークが認識可能な程度にシフトしなかったことから、影響されなかったようであった。このように、これらのデータは、２２５ペプチドがＲａｓ表面上の特定の結合部位に結合すること、および、エフェクター結合を遮断する２２５ペプチドの能力と一致して、この部位がエフェクタードメインと重複することを示唆する。
【０３２５】
次に、非標識Ｒａｓの存在下または非存在下で１５Ｎ標識２２５のＨＳＱＣスペクトルを比較することにより、類似のＮＭＲ実験を２２５ペプチドに対して実施しようと試みた。このタンパク質に対するクロスピーク割当は当然確立されていないが、ペプチドの比較的小さなサイズ（２２５−１については３５アミノ酸）を所与として、これらの割当の実施は単純であることが見込まれた。まず、ＫＲａｓに関しては１５Ｎ含有最少培地内で２２５−１ペプチドを発現させ、Ｒａｓ実験に使用したものと同じ緩衝液中で遊離ペプチドのＨＳＱＣスペクトルを記録した。これにより、互いと重複するようであったクロスピークをいくつか含んだが、比較的クリーンなスペクトルが得られた（図２２Ａ）。次いで、ＫＲａｓの存在下で１５Ｎ標識２２５−１ペプチドのＨＳＱＣスペクトルを記録した。予想外なことに、このスペクトルは、ペプチド単独試料の２倍の数のピークを含んだ（図２２Ｂ）。
【０３２６】
この観察は、ＫＲａｓは非標識であり（１５Ｎの天然存在量は全窒素の０．５％未満である）、新たなクロスピークのほとんどは自由スペクトルまたはペプチド結合Ｒａｓスペクトルのいずれとも重なり合わなかったことから、タンパク質からの汚染シグナルによって説明され得ない。これらのデータはまた、ペプチド単独スペクトル内に存在するピークの多くがＲａｓ−ペプチドスペクトルには存在しなかったことから、部分飽和とも一致しない。別の説明は、ペプチドが２つの高次構造でＲａｓに結合することができるというものである。これは形式上可能だが、Ｒａｓ−ペプチドスペクトル内のクロスピークの全てに対して強度がかなり均一に見えることを所与とすると、可能性は低い。これは、２つの高次構造がおよそ等しい割合で高密度である場合にのみ観察されるであろうが、それにはそれらが同様のエネルギーをもつことが必要であり、これは、明確に異なるＨＳＱＣスペクトルを生じさせるのに十分に異なる２つの状態では見込みがない。
【０３２７】
代替的な説明は、Ｒａｓタンパク質が、２２５ペプチドに対して同時に占有され得る２つの明確に異なる結合部位を含むというものである。これは、各アミノ酸につき２つのクロスピークの存在と一致し、少なくとも２当量のペプチドがＲａｓを飽和させるのに必要とされるという観察とも適合する。Ｒａｓ  ＨＳＱＣ実験が単一の結合部位を示唆し、ＦＰアッセイが１．０のヒル係数を有する典型的なシグモイド結合曲線を示したことから、このモデルは見込みがないと最初は見なされた。しかしながら、ａＰＰおよびその類縁体の一部は溶液中で頭−尾二量体を形成することができることを思い起こし（図２３）６、２２５ペプチドが二量体としてＲａｓに結合したという可能性を考慮した。これは、１５Ｎ標識ペプチドＨＱＳＣスペクトルと一致する：頭−尾ホモ二量体は対称的であり、したがって２つの単量体は、同一の化学環境を経験し、ひいては同一の１Ｈ−１５Ｎクロスピークを保有すると予測される。しかしながら、Ｒａｓは対称的ではないため、Ｒａｓに結合すると、ペプチド二量体の対称性が破壊され、２つの単量体は異なる環境を経験し、スペクトルの分割が引き起こされる。
【０３２８】
二量体として結晶化するａＰＰの結晶構造が図２３に示される。このモデルに照らすと、本章の前節で考察された、これまでの混乱させるいくつかの観察が意味をなす。特に興味深いのは、定向進化の取り組み中のＹ７Ｃ変異の再発であった：ａＰＰ構造内の対応するチロシンの検査により（図２３Ｃ）、反対側の単量体上のＹ７残基が密接状態（ａＰＰの場合はπスタッキング）になることが明らかであり、この位置におけるシステインの存在が、ペプチド二量体を安定化させるジスルフィド結合の形成につながり、それによってＲａｓに対するその親和性が上昇するということがもっともらしい。
【０３２９】
タンパク質複合体の構造特性化のための代表的基準はＸ線結晶構造解析であり、これは、原子分解において詳細かつ完全な構造を提供することができる。Ｖｅｒｄｉｎｅ研究室の結晶学者（Ｓｅｕｎｇ−ｊｏｏ  ＬｅｅおよびＲｏｕ−Ｊｉａ  Ｓｕｎｇ）と協力して、ＮＭＲによって研究されたＫＲａｓ−２２５−１複合体に関して記載されているように調製した、ＫＲａｓ−２２５およびＨＲａｓ−２２５複合体の結晶化を試みた。今までのところ成功は収められていないが、この分野における本発明者らの取り組みは継続中である。
【０３３０】
このペプチド二量体モデルが意味することの１つは、２２５ペプチドが、Ｒａｓに対する結合のために十分に最適化されていないということである。これは、Ｒａｓタンパク質は非対称であるのに反して、各残基（ひいては進化中に試験された各変異）は、Ｒａｓ結合二量体内の２つの位置で現れなければならないという、ペプチドホモ二量体によって課される制約の結果である。したがって、好ましいアミノ酸変異が、ペプチド二量体を横断して対応する部位に関して適合性でないために禁止される位置が、Ｒａｓ−ペプチド結合界面内に複数存在する可能性がある。これは、ペプチドヘテロ二量体が、２２５ホモ二量体に対して親和性を得る能力を有し得ることを予測する。
【０３３１】
実施例４：２２５ペプチドの親和性および特異性の向上
第ＩＩ章で提唱したペプチド二量体の仮説は、Ｒａｓが非対称であり、したがってペプチドホモ二量体内の同じアミノ酸であるように制約される接触残基に対して明確に異なる嗜好性をおそらく有することから、２２５ペプチドがＲａｓに対する結合のために十分に最適化され得ないことを示唆する。本章では、酵母表面ディスプレイを使用して二量体の仮説を試験するため、また、２２５−１とヘテロ二量体化し、２２５−１ホモ二量体と比べて向上した親和性でＲａｓに結合することができるペプチド変異体を同定するための、本発明者らの予備的な取り組みを考察する。また、２２５ペプチドと比べて向上したＲａｓ・ＧＴＰ対Ｒａｓ・ＧＤＰに対する選択性を保有するペプチド変異体を同定するための本発明者らの取り組みも考察する。
【０３３２】
酵母表面上のＮ２６Ａ変異体の補完。ペプチド二量体の仮説が正しければ、１つ予測されることは、ホモ二量体では不可能である最適化された接触に起因して、Ｒａｓに対する向上した結合性を有するペプチドヘテロ二量体が存在するはずだということである。例えば、Ｒａｓ表面上の１つのペプチド結合ハーフサイトとの関連で非常に重要な接点を形成するいくつかの残基が２２５ペプチド内に存在する可能性がある。この接点に、この部位におけるいかなる変異も結合を抑止するほど十分な安定化作用がある場合、パートナーペプチド上の対応する残基は、異なるアミノ酸が好ましかったとしても、同じアミノ酸であるように制約されるであろう。この事実の結果が、最も強力なペプチドホモ二量体はおそらく、各ハーフサイトにおけるアミノ酸嗜好性間の最良の妥協点を表す配列であるというものである。これが事実である場合、２２５ペプチドは、ホモ二量体として結合することの制約に起因して、潜在的に好ましい相互作用を犠牲にしている場合がある。
【０３３３】
この概念を表す代替的な方法は、ペプチド内の有害変異はおそらく、１つのハーフサイトに関して他よりも強力な作用を有するというものである。例えば、Ｎ２６Ａ変異がＲａｓに対する結合を少なくとも１００倍抑止することを示したが、（Ｒａｓは非対称であるため）ホモ二量体内の２つのＮ２６残基が異なる環境を経験し、明確に異なる残基に結合しなければならないことを所与とすると、それらがこの作用に等しく寄与する可能性は低い。ただし、この変異が２２５ペプチドの実際の二量体化を妨害しないとすれば、Ｎ２６Ａ変異が１つのハーフサイトにおいて著しい不安定化作用を有し、その他においては弱性、中性、またはさらには陽性の作用を有するということが、よりもっともらしい。これが事実である場合、２２５−１および２２５−１  Ｎ２６Ａのヘテロ二量体は、Ｎ２６Ａホモ二量体と比べて著しく向上したＲａｓへの結合性を有するはずであると予測される。
【０３３４】
ペプチドヘテロ二量体のライブラリをスクリーニングするための方法は、より強力なＲａｓ結合剤を同定する能力を大幅に向上させるであろう。２２５ホモ二量体化の動態および熱力学は現在知られていないが、本発明者らは、単量体交換が十分に急速であれば、（酵母表面上で提示された）２２５変異体と（トランスで供給され、提示された変異体と共にヘテロ二量体に交換させられた）２２５−１ペプチドとの間のヘテロ二量体を用いた酵母表面ディスプレイを実施することが可能となるかもしれないと思い当たった。２２５−１および２２５−１  Ｎ２６Ａは２２５−１  Ｎ２６ホモ二量体よりも良好にＲａｓに結合することができるはずであるという予測に照らして、２２５−１または２２５−１  Ｎ２６Ａのいずれかを発現する酵母細胞を使用し、トランスで遊離２２５−１または２２５−１  Ｎ２６Ａペプチドを提供して、この考えの試験を試みた。いくらかの最適化の後、酵母細胞を中マイクロモル濃度の遊離ペプチドと共にプレインキュベートし、続いて（過剰のペプチドを除去するために）ペレット化し、その後Ｒａｓと共にインキュベートすることによって、ヘテロ二量体形成が可能なようであることを見出した（図２４）。
【０３３５】
ＫＲａｓ、およびこの結合は、遊離２２５−１または２２５−１  Ｎ２６Ａとのプレインキュベーションによる影響を比較的受けなかったようであった。２２５−１  Ｎ２６Ａを発現する酵母細胞は、インビトロデータ（第ＩＩ章）と一致して、検出可能なレベルでＲａｓと結合せず、遊離２２５−１  Ｎ２６Ａと共にプレインキュベートされたときにも結合しなかった。しかしながら、遊離２２５−１と共にプレインキュベートされたとき、これらの細胞は、２２５ペプチドが二量体としてＲａｓに結合するという仮説と一致して、Ｒａｓに対して強力な結合を示した。これらのデータは、Ｒａｓに結合する２２５−１  Ｎ２６Ａ変異体の能力の部分救済しか示さず、したがって、Ｎ２６Ａ変異体が両方のハーフサイトに対して等しく有害であるという可能性を正式に否定し得ないということに留意するのが重要である。しかしながら、本発明者らの二量体交換技法は不完全に起こる可能性がある：酵母によって提示されるペプチドは細胞表面に制約され、したがってこれらのペプチドの局所濃度は高く、これは、提示されたペプチドのホモ二量体化は、溶液中の遊離ペプチドとのヘテロ二量体化と比べて強く好まれるはずだということを意味する。表面提示ペプチドのどの部分がヘテロ二量体形態と対比してホモ二量体形態で存在するかを判定することはできないため、表面提示２２５−１  Ｎ２６Ａペプチドを遊離２２５−１と共にインキュベートすると観察される結合性の上昇を定量的に解釈するのは困難である。しかしながら、表面提示２２５−１ペプチドが２２５−１  Ｎ２６Ａと共にプレインキュベートされるときに結合性の著しい減少はなく、これは、ヘテロ二量体が２２５−１ホモ二量体よりも著しく弱い場合には予想されないであろう。ヘテロ二量体形成がこの特定の事例において特に非効率的であった可能性が残るが、ペプチドが逆実験で使用したものと同一であることを所与とすると、この可能性は低いと考えられる。このように、これらの実験は、２２５ペプチドは、ヘテロ二量体内で結合したとき、Ｎ２６Ａ変異の機能損失を少なくとも部分的に補完することができると主張する。
【０３３６】
上昇した親和性でＲａｓに結合するヘテロ二量体の同定。酵母表面ディスプレイを使用してヘテロ二量体を提示することができるという観察に励まされ、２２５−１ホモ二量体よりも高い親和性でＲａｓに結合する変異体／２２５−１ヘテロ二量体を同定するために、補完スクリーンを実施した。実験的方策は、Ｎ２６Ａ補完研究に関して記載されている通りであり、２２５−１と共に酵母細胞をプレインキュベートし、Ｒａｓを添加する前にペレット化した。２２５−１に対して非常に弱い結合をもたらす、５ｎＭのＲａｓ濃度を選択した（図２６）。この実験では、配列全体にわたって隣接する残基対を系統的に変動させた２２５−１ペプチドに基づく走査変異誘発ライブラリを使用した（図２５）。このライブラリの理論的ライブラリサイズは（アミノ酸多様性の観点から）およそ１２，４００メンバーであり、これは、酵母に形質転換され得るライブラリサイズと比べて小さい。しかしながら、エラープローンＰＣＲによって設計されたライブラリは、ある特定の置換に対して偏る傾向があり、あらゆる位置のあらゆるアミノ酸変異、ましてや隣接部位における可能性のあるあらゆるアミノ酸対を網羅する見込みがない１のに対して、この方策は、配列全体にわたる変異の系統的評価を可能にする。したがって、この手法は、この実験のための配列空間の試験に優れた方法であると見なした。
【０３３７】
走査変異誘発ライブラリを使用して、ＫＲａｓ・ＧＴＰ  ５ｎＭで補完スクリーンを実施し、３ラウンドの分取後、遊離２２５−１とのプレインキュベーションに依存する様式で、２２５−１よりも強力にＲａｓに結合するように見えた集団を単離した（図２６Ａ）。この集団の配列決定により、それが、Ｓ１３Ｃ／Ｉ１４Ｅ二重変異を有する単一クローンから主になっていることが明らかになった。２２５−１と比べて向上した特性を有するペプチド変異体が、以下に提供される。一貫性を保つために、残基番号は、ａＰＰペプチド内の位置を使用して報告される。変異には下線が引かれている。
【表３】
0006759109.tif 000008
【０３３８】
この変異が興味深いのは、システイン残基の出現がいま一度見られるからである。本発明者らの初期進化研究において見出された（単量体間のジスルフィド結合の形成に関与していると仮定される）Ｙ７Ｃ変異に関する本発明者らの先の仮説に照らして、この変異が二量体を安定化させることによってＲａｓ結合親和性も向上させている可能性があるかどうかに疑問を抱いた。この変異体は、２２５−１ペプチドと共にプレインキュベートされたとき５ｎＭでしかＲａｓに結合することができず、したがって、このシステインが、二量体を横断して対応するシステインとのジスルフィド形成に関与している可能性は低い。実際に、ａＰＰ二量体の構造の検査は、これらの残基が遠く離れており、形成される二量体という状況で相互作用するものとは期待されないことを実証する。しかしながら、これらの補完研究で使用された遊離２２５−１ペプチドがそのＮ末端に（標識目的で）遊離システインを含有したこと、また、ａＰＰ二量体モデルが、この残基には提示された変異体内のＣ１３残基と相互作用する能力があり得ると予測することを思い起こした（図２７）。したがって、向上した結合性に関する１つの説明は、Ｓ１３Ｃ／Ｉ１４Ｅ二重変異がジスルフィド安定化ヘテロ二量体を形成するというものである。
【０３３９】
この仮説が正しければ、遊離２２５−１ペプチド上のシステインを遮断すると、結合性の向上が解消されるはずである。これを試験するため、２２５−１ペプチド上のシステインをヨードアセトアミド（チオールに対して良好な選択性を有する有機小分子、図２６Ｂ参照）でアルキル化し、次いで補完実験を繰り返した。本発明者らの予測と一致して、Ｒａｓに対する結合性の向上は、非標識２２５−１と比較すると、このペプチドによってほぼ完全に解消された。これは、Ｓ１３Ｃ／Ｉ１４Ｅ二重変異体が実際に、２２５−１とジスルフィド安定化ヘテロ二量体を形成することによって、Ｒａｓに対する結合性の向上を示し得ることを示唆する。この作用は、ジスルフィド形成に起因するものではなく、むしろアルキル化によって２２５−１構造を撹乱させることの結果である可能性が残る。しかしながら、ヨードアセトアミドは比較的小さな分子であり、２２５−１上のＮ末端システインは以前、活性を消失させることなくビオチンおよびフルオロフォアで修飾されたため、この説明はふさわしくないと考えられる。
【０３４０】
２２５ペプチドのヌクレオチド特異性の向上。以前に考察されたように、Ｒａｓ・ＧＤＰと対比してＲａｓ・ＧＴＰに対する２２５ペプチドの選択性は比較的乏しかった（そして使用された結合アッセイに応じて異なった）ことが見出された。Ｒａｓ・ＧＴＰが生物学的関連性の標的であるため、Ｒａｓ・ＧＴＰに対して向上した選択性を示す２２５−１変異体が存在するかどうかに疑問を抱いた。酵母表面ディスプレイの利点の１つは、複数の蛍光チャネル、ひいては複数の結合剤を使用する能力であり、これにより多パラメータ分取が可能になる。したがって、酵母ディスプレイスクリーンを実施し、ここでは、Ｒａｓ・ＧＴＰおよびＲａｓ・ＧＤＰを添加し、異なるフルオロフォアで標識した（Ｒａｓ・ＧＴＰはビオチン化し、ＳＡ−ＰＥで検出し、Ｒａｓ・ＧＤＰはＡｌｅｘａ６４７で直接標識した）。２２５−１を提示する細胞を各々５００ｎＭのＲａｓ・ＧＴＰおよびＲａｓ・ＧＤＰで標識したとき、２２５−１が比較可能な親和性で両方のヌクレオチド状態に結合することができるという観察と一致して、２つの蛍光チャネル間の直線関係が観察された（図２８）。同様のプロファイルが、走査変異誘発ライブラリについて観察された。次いで、スクリーンを実施し、ＧＴＰ選択性領域（示されるゲートを参照のこと）内の２２５−１集団の限界を超えて存在した細胞を選択した。２ラウンドの分取後、２２５−１親よりも選択的にＲａｓ・ＧＴＰに結合するように見えた集団を単離した（図２８）。この集団の配列決定により、ペプチドのＣ末端付近の、単一の保存されたＡ３０Ｒの変異が明らかになった。この置換の理論的根拠は明白ではなく、その理解にはＲａｓ−ペプチド複合体のより詳細な構造データが必要であるが、Ｒａｓ・ＧＴＰとＲａｓ・ＧＤＰとの明らかな差異の１つがＲａｓ・ＧＴＰ内にある追加のリン酸塩の存在であることから、アルギニンがこのアニオン性基と静電気的相互作用を生じさせている可能性があると推測したいところである。
【０３４１】
２２５ペプチドを改善する手段。本プロジェクトの最終目標は、小ペプチドを用いてＲａｓエフェクタードメインを働かせる新たな方法を同定すること、そして理想的には、癌細胞内のＲａｓ活性を抑制することができる分子を開発することである。中度から低度のナノモル親和性でＲａｓ表面に結合し、エフェクタードメインを直接標的にしそうであるペプチドを同定するために、酵母ディスプレイおよび定向進化を使用してきた。現在、２２５（ホモ二量体）ペプチドは、癌細胞の処置のために使用されたとき、Ｒａｓ抑制活性を保有しないように思われ、これが事実であり得る理由にはいくつかの可能性が存在する。本ペプチドは弱細胞浸透性であるように思われるが、それらが実現し得る細胞内濃度は、それらの親和性および／またはＲａｓタンパク質の細胞内存在量を所与とすると低すぎる場合があり、そのため、本ペプチドの親和性の浸透性のいずれかの向上が活性のために必要とされ得る可能性がある。また、一旦細胞内に入ると、２２５ペプチドは、非Ｒａｓタンパク質によって捕捉されるか、または活性Ｒａｓが位置する細胞膜の内葉から離れるという可能性もある。実際に、ＦＩＴＣ標識２２５ペプチドを用いた予備的な結果は、おそらくペプチドの一部分が核局在化シグナル（ＮＬＳ）として認識されるために、ペプチドが主に核に局在化し得ることを示唆する。２２５ペプチドのＰＰＩＩヘリックスは、プロリンおよび塩基性アミノ酸に富んだ分裂酵母（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）内で同定されたＮＬＳとの類似性をいくらか有するが、本発明者らが知る限りでは、ヒト細胞内の等価のシグナルは未だ特性化されていない２。これが事実であると判明した場合、アルギニン残基を除去するＰＰＩＩヘリックスの変異体を試験することによって、例えば、それらをａＰＰ内に見出されるアミノ酸に復帰させることによって、そのような局在化を弱化させることが可能となり得る。最後に、２２５ペプチドは、ヒト細胞に進入すると急速に分解され、その結果、それらがＲａｓシグナル伝達に対する効果を発揮し得る前に清掃されるという可能性がある。
【０３４２】
現在、本発明者らは、仮想のジスルフィド安定化二量体（すなわち、Ｙ７Ｃホモ二量体およびＳ１３Ｃ／Ｉ１４Ｅ−２２５−１ヘテロ二量体）の活性を評価している。原理上、これらの分子は、２２５−１ホモ二量体と比べてより強力な親和性および向上した安定性を保有し得、インビトロで有望な結果が得られれば、生細胞内のそれらの活性が試験され得る。ジスルフィド結合は概してヒト細胞内で安定でないが、それでもなおペプチド−Ｒａｓ複合体の安定性に寄与し得るのは、それらが二量体化およびＲａｓ結合に厳密に必要とされないことが明らかであるためである。また、第Ｉ章で考察したように、得られる非還元性バリアントを期待して、対応するセレノシステインペプチドの調製も想像することができる。
【０３４３】
２２５ペプチドの生物活性を向上させるさらなる手法の１つは、それらに、活性Ｒａｓタンパク質が局在化する細胞内コンパートメント、すなわち細胞膜の内葉を標的とさせることである。これを実現するための明らかな方法の１つは、単にＲａｓタンパク質を模倣し、ペプチドをファルネシルまたはヘキサデシル部分などの親油性基に結合させることである。原理上は、これにより、２２５ペプチドの比較的高い局所濃度を経験するＲａｓタンパク質がもたらされるはずであり、このことは、概して膜に係留されないエフェクターと競合する２２５ペプチドの能力を向上させ得る。本発明者らは、２２５ペプチドが二量体として働くことを発見する前に、それらを用いてこの手法の初期試験を実施し、得られた陰性結果はおそらく、膜アンカリングの際の二量体破壊の結果である（ストレプトアビジンＳＰＲチップに固定化されたとき、ビオチン化ペプチドがＲａｓに結合できないことに類似する）。ジスルフィド安定化二量体が安定していると判明すれば、そのようなペプチドが細胞内のＲａｓ活性を抑制することができるかどうかを試験するために、（脂質付加反応中に準化学量論的当量の標識を使用した）単脂質付加（ｍｏｎｏ−ｌｉｐｉｄａｔｅｄ）二量体の調製を試みる。
【０３４４】
Ｒａｓプロジェクトの将来の方向性。このペプチド二量体の仮説が正しければ、Ｒａｓ結合２２５種のサイズはおよそ９ｋＤａである。これは、導入において考察された細胞透過活性ペプチドと比較するとやや大きく、その分子量は著しく低いことが好ましいであろう。ペプチド二量体上のどの残基がＲａｓ表面への結合に関与しているかは現在分かっていないが、αヘリックスがライブラリのためにランダム化されたペプチド面であったことを所与とすると、それらが主にαヘリックス上に局在化するのはふさわしいと考えられる（２２５ペプチドが、全てのライブラリメンバーに対して同じであったＰＰＩＩヘリックスを介してＲａｓに結合したならば、稀で特異的なαヘリックスコンセンサスが結合に必要されるとは予想されないであろう）。さらに、αヘリックスは、二量体安定化に関与していると仮定されるシステイン変異体を例外として、定向進化中に生じた変異のほぼ全ての部位であった。αヘリックスが２２５ペプチド二量体のＲａｓ相互作用領域を実際に含む場合、本発明者らが二量体を安定化させる代替的手段を同定することができれば、ＰＰＩＩヘリックスは不必要となり得る。二量体モデルの頭−尾配向は、これに対して可能性のある解決策を示唆する：各αヘリックスのＮ末端およびＣ末端は近接しているため、１つのαヘリックスに（未知の組成の）ループ、次いで第２のαヘリックスが続く単量体内に分子を凝縮させることが可能であり得る（図２９）。
【０３４５】
原理上は、この方策は、分子量が２２５二量体の分子量のほぼ半分であるペプチドをもたらし得る。しかしながら、主要な問題の１つは、ヘリックス間のループの長さおよび組成である。ａＰＰ二量体の検査は、４〜６個のアミノ酸のループ長が理想的であり得ると示唆するが、特に、本発明者らが２２５二量体の実際の構造を保有しないことを所与とすると、最適な長さは予測が困難である。ループ組成も同様に予測が困難である。幸運にも、この問題は酵母表面ディスプレイによく適している：Ｒａｓ−ペプチド相互作用の本発明者らのモデルの大部分が正しい限り、２つの２２５  αヘリックス間に４〜６アミノ酸のランダム化ループを有するライブラリを構築することにより、２つのヘリックスをＲａｓ結合性の高次構造に安定化させるループを同定することが可能となるはずである。本発明者らは、そのようなライブラリ（図２９）を、ヘリックスを横断するジスルフィド架橋の可能性を許すコンストラクトのＮ末端およびＣ末端におけるシステイン残基の特徴を加えて設計した。これら２つの残基間の最適距離もまた予測が困難であるため、このライブラリは、（グリシン残基を挿入することにより）合計４つの可能な組み合わせで各システインにつき２つの異なる位置が可能になるように合成した。さらに、２２５ペプチドの「内部」上のいくつかの疎水性αヘリックス残基がＰＰＩＩヘリックスの充填に関与するため、それらのアラニンでの置換またはそれらのランダム化のいずれかを行った。
【０３４６】
本発明者らはこのライブラリを準備し、間もなくそのスクリーニングを開始することを計画している。これがヒットをもたらした場合は、２２５ペプチドを特性化するために使用したインビトロアッセイの同じバッテリーを実施して、新たな配列が合理的な親和性および特異性でＲａｓエフェクタードメインに結合するかどうかを判定する。次いでペプチドの特性を向上させるために定向進化を使用する場合があり、最終的には細胞内でのそれらの活性を試験することを目指す。ジスルフィド結合はヒト細胞内で概して安定でないため、本発明者らの新たなペプチドが活性のためにジスルフィド結合に依存することが判明すれば、ペプチドを安定化させる代替的な手段を開発する必要が生じる。可能性の１つは、システイン残基をセレノシステインで置換することであろう。化学的合成またはインテイン手法３のいずれかによって、頭−尾骨格環化ペプチドを調製することも可能であり得る。最後に、新たなペプチドがαヘリックス結合性高次構造の大部分を保持すれば、それらは全炭化水素ステープリングのための好適な候補となり得る。本発明者らは、酵母ディスプレイスクリーンからヒットが出現すればこれらの手段を探求する予定である。
【０３４７】
実施例５：共有結合なペプチド二量体の形成
ｔ−ブチルで保護されたシステインを含むペプチド単量体（配列番号３０）と、アクリルアミドを含むペプチド単量体（配列番号３１）とを、５０ｍＭのトリス−Ｃｌ（ｐＨ８）中で、各ペプチドについて５μＭの最終濃度で一緒に混合した。これらの試料に、１ｍＭまたは１０ｍＭのいずれかの還元グルタチオンを添加し、これらの試料を室温で４５分間インキュベートし、その後、８０μｌの反応物を１０μｌの１％トリフルオロ酢酸に添加し、Ｃ１８カラム、および０．１％のトリフルオロ酢酸を含む水中で１０から１００％までのアセトニトリル勾配を使用したＬＣ−ＭＳによって分析した。
【０３４８】
図３５は、低レベルのグルタチオン（１ｍＭ）（これは、ｔ−ブチルチオール保護システインを効果的に還元することができない）、またはより高いレベルのグルタチオン（１０ｍＭ）（これは、示されるイオンの外観から分かるように、配列番号３０のペプチドと配列番号３１のペプチドとの間に共有結合架橋をもたらす）のいずれかを用いた、配列番号３１のペプチド単量体と混合した配列番号３０のペプチド単量体のＬＣ−ＭＳ分析からのマスクロマトグラムを示す。
【０３４９】
実施例６：選択的二量体不安定化
生細胞共焦点顕微鏡法を標識ペプチドを用いて実施し、Ｈ３５８肺腺癌細胞内で、フルオレセイン標識ペプチド５μＭの濃度で、１０％のウシ胎仔血清を補充したＤＭＥＭ培地内で実施した。図３６Ａは、ヒスチジンを欠く配列番号３７のペプチドを示す。図３６Ｂは、１つの単量体当たり２つのヒスチジン（１つの二量体当たり４つのヒスチジン；「Ｈｉｓ四分子」）を含有する配列番号３８のペプチドを示す。
【０３５０】
実施例７：嵩高部分を使用した二量体不安定化
図３７は配列番号４２のペプチドを示し、ここでは、Ｃｙｓを２，２’−ジピリジルジスルフィドと反応させて、ジスルフィド保護システインを生成した。このシステインは、低レベルのグルタチオンの存在下でケージから出されて、より良好なＲａｓ結合剤であるジスルフィド結合種を形成する。以下のデータは、質量分析によって検証された場合に、５ｍＭの還元グルタチオンの添加（これは共有結合的なジスルフィド結合二量体の形成をもたらす）に際し、Ｒａｓ結合性の上昇を示す。これらの実験は、図１９に関して記載されているものと同様である。
【０３５１】
実施例８：追加の標的に結合するペプチド
図３８Ａ〜Ｃは、配列番号４３〜４５のペプチドに関する、それらに対応するタンパク質標的との酵母表面ディスプレイ結合性データを示す。酵母ディスプレイアッセイの実験は、図９に関して使用されたものと同様である。配列番号４３のＭＹ０１ペプチドは、図３８Ｃに示される高結合性集団に対応する。ＲａｌＡタンパク質の精製は、以前に考察したＫＲａｓコンストラクトのために使用した方法と同様であった。
【０３５２】
Ｍｙｃ／Ｍａｘタンパク質の精製は次のように行った。Ｈｉｓ６−ｙＢＢｒ−ＴＥＶ−Ｍｙｃ（残基３５３〜４３４）およびタグなしＭａｘ（残基２２〜１０２）を含む２シストロン性ｐＥＴベクターを、化学的に適格性のあるＢＬ２１細胞に形質転換させた。これらの細胞を、３０℃で５時間にわたり０．２５ｍＭのＩＰＴＧで誘発してＯＤ６００＝０．７まで成長させ、次いで採取し、液体窒素中で急速凍結させる前に、溶解緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、５００ｍＭのＫＣｌ、５％のグリセロール）中に再懸濁させた。精製のために、このペレットを解凍し、同じ緩衝液中で４０ｍｌに増やし、ＲｏｃｈｅのＣｏｍｐｌｅｔｅ  ＥＤＴＡ非含有プロテアーゼ抑制剤タブレットと混合した。これらの細胞をチップソニケーター（ＶｉｒＳｏｎｉｃ、出力レベル６．５で１０秒オン、１５秒オフの６サイクル）で溶解させ、次いで３０分間３０，０００×ｇでペレット化し、０．４５μＭのＴｕｆｆｒｙｎ膜（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を通して濾過した。この澄ましたライセートを、同じ緩衝液で平衡化されている２ｍｌのＨｉｓＰｕｒ  Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｐｉｅｒｃｅ）に添加し、重力によって排液した。このカラムを２０ｍｌの緩衝液で洗浄し、次いで、タンパク質を、１５０ｍＭのイミダゾールおよび何らかのプロテアーゼ抑制剤を含有する緩衝液で溶離させた。カラムからの溶出の直後、ＥＤＴＡを０．５ｍＭまで添加した。このタンパク質を、Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ  ＹＭ−１０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）内で２ｍｌまで濃縮させ、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５カラムを使用して、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、５％のグリセロール中にゲル濾過した。このタンパク質を、Ｒａｓタンパク質に関して上に記載したようにＡｌｅｘａ６４７で標識した。
【０３５３】
等価物および範囲
特許請求の範囲において、「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」などの冠詞は、別段の記載があるか、または別様に文脈から明白である場合を除いて、１つまたは２つ以上を意味し得る。一群の１つ以上の要素間に「または」を含む請求項または説明は、別段の記載があるか、または別様に文脈から明白である場合を除いて、その群の要素の１つ、２つ以上、または全てが、所与の生成物もしくはプロセス内に存在するか、用いられているか、または別様にそれらに関連する場合に成立すると見なされる。本発明には、一群の要素の１つのみが、所与の生成物もしくはプロセス内に存在するか、用いられているか、または別様にそれらに関連する実施形態が含まれる。本発明には、一群の要素の２つ以上または全てが、所与の生成物もしくはプロセス内に存在するか、用いられているか、または別様にそれらに関連する実施形態が含まれる。
【０３５４】
さらに、本発明は、列挙される請求項のうちの１つ以上における１つ以上の制限、要素、条項、および説明的用語が別の請求項に導入される、全ての変形、組み合わせ、および並べ替えを包含する。例えば、別の請求項に従属するいかなる請求項が、同じ基本請求項に従属するいかなる他の請求項に見出される１つ以上の制限を含むように修正されてもよい。要素が一覧として（例えばマーカッシュ群形式で）提示される場合、要素の各小群も開示され、いかなる要素（複数可）がその群から削除されてもよい。本発明または本発明の態様が特定の要素および／または特徴を含むものと称される場合、本発明のある特定の実施形態または本発明の態様は、そのような要素および／または特徴からなるか、あるいはそれらから本質的になることを理解されたい。簡素化を目的として、そうした実施形態は、本明細書においてその通りの言葉で具体的に記載されていない。また、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」という用語は無制限であるよう意図され、追加の要素またはステップの包含を許すことにも留意されたい。範囲が与えられている場合、終点が含まれる。さらに、別段の記載があるか、または別様に文脈および当業者の理解から明白である場合を除いて、範囲として表される値は、本発明の異なる実施形態において、文脈による明確な別段の記載がない限り、その範囲の下限の単位の１／１０まで、記載される範囲内にあるいかなる特定の値または部分的範囲をとることができる。
【０３５５】
本出願は、様々な交付済み特許、公開特許出願、学術論文、および他の刊行物を参照し、それら全てが参照により本明細書に組み込まれる。組み込まれた参考文献のいずれかと本明細書との間に矛盾がある場合、本明細書が優先する。それに加えて、本発明のいかなる特定の実施形態が先行技術の範囲内にある場合、任意の１つ以上の請求項から明示的に除外され得る。そのような実施形態は当業者に公知であると見なされるため、それらは、除外が本明細書に明示的に記載されていなくとも除外され得る。本発明のいかなる特定の実施形態も、先行技術の存在に関連するか否かを問わず、任意の理由で、任意の請求項から除外されてよい。
【０３５６】
当業者であれば、日常と同程度の実験を使用して本明細書に記載される特定の実施形態に対する多くの等価物を認識するか、またはそれらを確認することができるであろう。本明細書に記載される本実施形態の範囲は、上記の発明を実施するための形態に限定されるよう意図されるものではなく、むしろ添付の特許請求の範囲に記載される通りである。次の特許請求の範囲に定義される本発明の主旨または範囲から逸脱することなく、本明細書に様々な変更および修正がなされ得ることは、当業者であれば理解するであろう。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【図１７Ａ−１】
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【図１７Ａ−２】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１８Ａ−Ｂ】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２１】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ−Ｃ】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２−１】
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【図３２−２】
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【図３３Ａ】
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【図３３Ｂ】
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【図３４Ａ】
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【図３４Ｂ】
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【図３５Ａ】
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【図３５Ｂ】
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【図３６Ａ】
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【図３６Ｂ】
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【図３７】
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【図３８Ａ】
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【図３８Ｂ】
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【図３８Ｃ】
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【配列表】
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