(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞表面抗原に特異的に結合する結合性ポリペプチドを同定する方法であって、
（ａ）結合性ポリペプチドの多様な改変体の（variegated）核酸ディスプレイライブラリを第一の細胞タイプの外表面に天然に発現されたある細胞表面抗原と接触させ、ここで、前記の多様な改変体の核酸ディスプレイライブラリがＤＮＡディスプレイライブラリであり、該ＤＮＡディスプレイライブラリの各メンバーが、結合性ポリペプチドをコード化するＤＮＡコーディング配列に、介在するＤＮＡリンカーを介して結合している結合性ポリペプチドを含み、ここで、該ＤＮＡリンカーは制限エンドヌクレアーゼ部位を含み、制限エンドヌクレアーゼ部位は、ＤＮＡディスプレイライブラリのメンバーのコーディング配列中に存在せず、
（ｂ）前記第一の細胞タイプから、未結合のライブラリメンバーを洗浄により除去し、
（ｃ）前記第一の細胞タイプに結合しているライブラリメンバーから、ＤＮＡコーディング配列を、適当な制限エンドヌクレアーゼによる前記制限エンドヌクレアーゼ部位の切断によって酵素的に分離し、そして、
（ｄ）ＤＮＡコーディング配列が分離された少なくとも１つのライブラリメンバーの結合性ポリペプチドを、前記細胞表面抗原に特異的に結合する結合性ポリペプチドとして同定する
工程を含む方法。
【請求項２】
工程（ａ）の前に、結合性ポリペプチドの多様な改変体の核酸ディスプレイライブラリの未選別前駆ライブラリを、前記外表面上に提示された抗原を発現しない第二の細胞タイプと接触させ、該第二の細胞タイプに結合するライブラリメンバーを該未選別前駆ライブラリから単離および除去して、工程（ａ）で使用する多様な改変体の核酸ディスプレイライブラリを得る、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（ｅ）前記の結合性ポリペプチドの多様な改変体の核酸ディスプレイライブラリを、前記細胞表面抗原を発現しない第二の細胞タイプと接触させ、該ライブラリから該第二の細胞タイプに特異的に結合する少なくとも１つのライブラリメンバーを単離し、そして、
（ｆ）前記第一の細胞タイプに特異的に結合するが、前記第二の細胞タイプに結合しないライブラリメンバーを選択して、前記細胞表面抗原に特異的に結合する結合性ポリペプチドを同定する
工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
該方法がさらに、少なくとも一部の単離されたライブラリメンバーのＤＮＡコーディング配列を決定することを含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
ＤＮＡコーディング配列が、ピロシーケンスにより決定される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
抗原が天然に存在するタンパク質、グリカンまたは脂質である、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
抗原が、グリコホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカー型タンパク質である、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
第一の細胞タイプが、疾患特異的エピトープを発現する、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
第一の細胞タイプが腫瘍細胞である、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
結合性ポリペプチドが抗体またはその結合性フラグメントである、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
結合性ポリペプチドが抗体ＶＨまたはＶＬドメインである、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
第一の細胞タイプが生細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
第一および第二の細胞タイプが生細胞である、請求項３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１３年６月２８日に出願された、米国仮特許出願第６１／８４０，５８３号、発明の名称“標的抗原探索および表現型スクリーニング”に基づく優先権を主張し、その内容全体は引用により本明細書中に包含させる。
【背景技術】
【０００２】
背景
抗体およびそのフラグメントのような結合性ポリペプチドは、療法剤および診断剤として商業的に重要である。結合性ポリペプチドをスクリーニングするための従来の方法は、一般的に、可溶性抗原を用いる。しかしながら、任意の細胞表面抗原に関して、これらの抗原上の立体構造的エピトープ（conformational epitope）は、該抗原が細胞膜から可溶化されたときに変化するため、天然の抗原を認識することのできる結合性ポリペプチドを作製できなかった。従って、当技術分野において、それらの天然の立体構造の細胞表面抗原に特異的に結合できる結合性ポリペプチドをスクリーニングするための新規方法が必要とされていた。
【発明の概要】
【０００３】
概要
本発明は、細胞表面抗原に特異的に結合する結合性ポリペプチド（例えば、抗体またはその抗原結合フラグメント）を同定するための方法および組成物を提供する。本発明の方法は、一般的に、結合性ポリペプチドの多様な改変体の（variegated）核酸ディスプレイライブラリと細胞の外表面上に提示される細胞表面抗原を接触させ、そして該ライブラリから、該細胞の外表面上の細胞表面抗原に特異的に結合する少なくとも１個のライブラリメンバーを単離する工程を含む。本発明の方法および組成物は、標的細胞表面抗原の天然の形態に結合する結合性ポリペプチドの迅速な同定を可能にするという点で、特に有用である。これらの方法および組成物はまた、新規の治療的に有用な細胞タイプ特異的抗原またはエピトープの同定を可能にする。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
【図１】図１は、本発明のＤＮＡディスプレイ組成物およびスクリーニング法の概念図である。
【図２】図２は、本発明のＤＮＡディスプレイ組成物およびスクリーニング法の概念図である。
【図３】図３は、本発明の方法で用いる標的細胞スクリーニング戦略の概念図である。
【図４】図４は、本発明の方法で用いる並列スクリーニングおよびディープシークエンシング戦略の概念図である。
【図５】図５は、本発明の方法で用いる並列スクリーニングおよびディープシークエンシング戦略の概念図である。
【図６】図６は、本発明の方法で用いる並列スクリーニングおよびディープシークエンシング戦略の概念図である。
【図７】図７は、本発明の方法で用いる並列スクリーニング戦略の例の結果を示す図である。
【図８】図８は、本発明の方法を用いて選択された高親和性ＶＨ分子のＦＡＣＳベースの結合アッセイの結果を示す図である。
【図９】図９は、本発明の方法を用いて選択されたＶＨ分子の結合の差を示すグラフである。
【図１０】図１０は、本発明の方法を用いて選択されたＶＨ分子の結合の差を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００５】
詳細な説明
Ｉ．定義
本明細書で用いる用語“核酸ディスプレイライブラリ”とは、例えば、米国特許第７，１９５，８８０号；同第６，９５１，７２５号；同第７，０７８，１９７号；同第７，０２２，４７９号；同第６，５１８，０１８号；同第７，１２５，６６９号；同第６，８４６，６５５号；同第６，２８１，３４４号；同第６，２０７，４４６号；同第６，２１４，５５３号；同第６，２５８，５５８号；同第６，２６１，８０４号；同第６，４２９，３００号；同第６，４８９，１１６号；同第６，４３６，６６５号；同第６，５３７，７４９号；同第６，６０２，６８５号；同第６，６２３，９２６号；同第６，４１６，９５０号；同第６，６６０，４７３号；同第６，３１２，９２７号；同第５，９２２，５４５号；および、同第６，３４８，３１５号、ならびにＷＯ２０１０／０１１９４４（それらは全て、引用によりその全体を本明細書中に包含させる。）に記載されたものを、それらに限定されることなく含む、全ての当技術分野で認識されるインビトロ無細胞表現型−遺伝子型関連ディスプレイを意味する。
【０００６】
本明細書で用いる用語“抗原”は、結合性ポリペプチドにより認識される分子を意味する。
【０００７】
本明細書で用いる用語“に特異的に結合する”は、少なくとも約１×１０−６Ｍ、１×１０−７Ｍ、１×１０−８Ｍ、１×１０−９Ｍ、１×１０−１０Ｍ、１×１０−１１Ｍ、１×１０−１２Ｍ、またはそれ以上の親和性を有して抗原と結合し、および／または非特異的抗原に対するその親和性よりも少なくとも２倍大きい親和性を有して標的と結合する、結合分子（例えば、ＶＨまたはＶＬドメイン）の能力を意味する。
【０００８】
本明細書で用いる用語“抗体”は、ジスルフィド結合で相互に結合された４つのポリペプチド鎖、２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む免疫グロブリン分子、ならびにその多量体（例えば、ＩｇＭ）を意味する。各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨと略す）および重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬと略す）および軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、１つのドメイン（ＣＬ１）を含む。ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と称されるより保存された領域が挿入された相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変領域にさらに細分化され得る。
【０００９】
本明細書で用いる用語、抗体の“抗原結合部位”は、抗原に特異的に結合して複合体を形成する、任意の天然に存在する、酵素化学的に得られる、合成の、または遺伝子操作されたポリペプチドまたは糖タンパク質を含む。抗体の抗原結合フラグメントは、例えば、抗体の可変ドメインおよび任意の定常ドメインをコード化するＤＮＡの操作および発現を含む、タンパク質分解または組み換え遺伝子操作技術のような好適な標準技術を用いて完全長抗体分子から誘導され得る。抗原結合部位の非限定的な例には、（ｉ）Ｆａｂフラグメント；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント；（ｉｉｉ）Ｆｄフラグメント；（ｉｖ）Ｆｖフラグメント；（ｖ）単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子；（ｖｉ）ｄＡｂフラグメント；および、（ｖｉｉ）抗体の超可変領域（例えば、単離された相補性決定領域（ＣＤＲ））を模倣するアミノ酸残基からなる最小認識単位が含まれる。二重特異性抗体（diabody）、三重特異性抗体（triabody）、四重特異性抗体（tetrabody）およびミニボディのような、他の操作された分子もまた、“抗原結合部位”の表現に包含される。
【００１０】
本明細書で用いる用語“ＶＨドメイン”および“ＶＬドメイン”は、ＦＲ（フレームワーク領域）１、２、３および４ならびにＣＤＲ（相補性決定領域）１、２および３をそれぞれ含む、単鎖抗体可変重鎖および軽鎖ドメインを意味する（Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest. (NIH Publication No. 91-3242, Bethesda)参照）。
【００１１】
ＩＩ．細胞表面抗原
ある局面において、本発明は、細胞表面抗原に特異的に結合する結合性ポリペプチドを同定する方法を提供する。
【００１２】
本発明の方法で使用することができる細胞の表面上に提示され得る任意の抗原には、タンパク質、グリカン、および／または脂質抗原が含まれるが、これらに限定されない。ある態様において、抗原は天然に存在する分子である。天然に存在する抗原の好適な非限定的な例には、膜貫通タンパク質（例えば、Ｇタンパク質共役受容体）およびＧＰＩ−アンカー型タンパク質が含まれるが、これに限定されない。ある態様において、抗原は、天然に存在しない組み換えまたは合成の抗原である。天然に存在しない抗原の好適な非限定的な例には、異なる抗原分子由来の部分を含むキメラ抗原が含まれる。ある態様において、抗原の同一性(identity)は、本発明の方法を実行する前に知られている。ある態様において、抗原の同一性は、本発明の方法を実行する前に知られていない。
【００１３】
本発明の方法で用いる細胞表面抗原は、任意の細胞または細胞様粒子（例えば、脂質ビークル）上に提示され得る。ある態様において、該細胞は、細胞表面抗原を天然に発現する細胞タイプである。ある態様において、該細胞は、細胞表面抗原を異種発現するように作製されている組み換え細胞である。ある態様において、該細胞は、正常細胞の疾患関連変異体（例えば、腫瘍細胞）である。
【００１４】
ＩＩＩ. 結合性ポリペプチド
ある局面において、本発明は、細胞表面抗原に特異的に結合する結合性ポリペプチドを同定する方法を提供する。
【００１５】
結合性ポリペプチドの任意のタイプは、本発明の方法で使用され得て、抗体、またはそのフラグメント、および免疫グロブリン様ドメインを含むが、これに限定されない。好適な免疫グロブリン様ドメインは、フィブロネクチンドメイン（例えば、Koide et al. (2007), Methods Mol. Biol. 352: 95−109参照、引用によりその内容全体を本明細書中に包含させる）、ＤＡＲＰｉｎ（例えば、Stumpp et al. (2008) Drug Discov. Today 13 (15−16): 695−701参照、引用によりその内容全体を本明細書中に包含させる）、タンパク質ＡのＺドメイン（Nygren et al. (2008) FEBS J. 275 (11): 2668−76参照、引用によりその内容全体を本明細書中に包含させる）、リポカリン（例えば、Skerra et al. (2008) FEBS J. 275 (11): 2677−83参照、引用によりその内容全体を本明細書中に包含させる）、アフィリン(affilin)（例えば、Ebersbach et al. (2007)  J. Mol. Biol. 372 (1): 172−85参照、引用によりその内容全体を本明細書中に包含させる）、アフィチン（Affitins）（例えば、Krehenbrink et al. (2008).  J. Mol. Biol. 383 (5): 1058−68参照、引用によりその内容全体を本明細書中に包含させる）、アビマー（例えば、Silverman et al. (2005) Nat. Biotechnol. 23 (12): 1556−61参照、引用によりその内容全体を本明細書中に包含させる）、フィノマー（Fynomer）（例えば、Grabulovski et al. (2007) J Biol Chem 282 (5): 3196−3204参照、引用によりその内容全体を本明細書中に包含させる）、およびクニッツドメインペプチド（例えば、Nixon et al. (2006) Curr Opin Drug Discov Devel 9 (2): 261−8参照、引用によりその内容全体を本明細書中に包含させる）を含むが、これらに限定されない。ある態様において、結合性ポリペプチドは、抗体ＶＨまたはＶＬドメインである。
【００１６】
ＩＶ．細胞表面ディスプレイ方法
ある局面において、本発明は、細胞表面抗原に特異的に結合する結合性ポリペプチドを同定する方法であって、（ａ）結合性ポリペプチドの多様な改変体の（variegated）核酸ディスプレイライブラリと第一の細胞タイプの外表面上に提示されたある細胞表面抗原を接触させ、そして（ｂ）該ライブラリから、第一の細胞タイプの外表面上の該細胞表面抗原に特異的に結合する少なくとも１つのライブラリメンバーを単離して、該細胞表面抗原に特異的に結合する結合性ポリペプチドを同定する工程を含む方法を提供する。ある態様において、工程（ａ）の前に、結合性ポリペプチドの多様な改変体の核酸ディスプレイライブラリを、抗原に特異的に結合しない結合性ポリペプチドのライブラリを事前に明らかにするために、外表面上に提示される抗原を提示しない第二の細胞タイプと接触させる。
【００１７】
ある局面において、本発明は、細胞表面抗原に特異的に結合する結合性ポリペプチドを同定する方法であって、（ａ）結合性ポリペプチドの多様な改変体の核酸ディスプレイライブラリとある細胞表面抗原を発現する第一の細胞タイプを接触させ、該ライブラリから第一の細胞タイプに特異的に結合する少なくとも１つのライブラリメンバーを単離し、（ｂ）結合性ポリペプチドの多様な改変体の核酸ディスプレイライブラリと該細胞表面抗原を発現しない第二の細胞タイプを接触させて、該ライブラリから第二の細胞タイプと特異的に結合する少なくとも１つのライブラリメンバーを単離し、そして（ｃ）第一の細胞タイプに特異的に結合するが、第二の細胞タイプに結合しないライブラリメンバーを選択して該細胞表面抗原に特異的に結合する結合性ポリペプチドを同定する工程を含む方法を提供する。
【００１８】
本発明の方法における使用に好適な核酸ディスプレイライブラリは、例えば、米国特許第７，１９５，８８０号；同第６，９５１，７２５号；同第７，０７８，１９７号；同第７，０２２，４７９号；同第６，５１８，０１８号；同第７，１２５，６６９号；同第６，８４６，６５５号；同第６，２８１，３４４号；同第６，２０７，４４６号；同第６，２１４，５５３号；同第６，２５８，５５８号；同第６，２６１，８０４号；同第６，４２９，３００号；同第６，４８９，１１６号；同第６，４３６，６６５号；同第６，５３７，７４９号；同第６，６０２，６８５号；同第６，６２３，９２６号；同第６，４１６，９５０号；同第６，６６０，４７３号；同第６，３１２，９２７号；同第５，９２２，５４５号；および、同第６，３４８，３１５号、ならびにＷＯ２０１０／０１１９４４に記載されており、それらは全て、その内容全体を引用により本明細書中に包含させる。ある態様において、多様な改変体の核酸ディスプレイライブラリは、ＤＮＡディスプレイライブラリである。１つの態様において、核酸ディスプレイライブラリは、本明細書中に記載の、またはＷＯ２０１０／０１１９４４（その内容全体を引用により本明細書中に包含させる）に記載のＤＮＡディスプレイライブラリである。
【００１９】
ある態様において、ＤＮＡディスプレイライブラリの各メンバーは、結合性ポリペプチドをコード化するＤＮＡコーディング配列に、介在するＤＮＡリンカーを介して結合している結合性ポリペプチドを含み、ここで、該ＤＮＡリンカーは制限エンドヌクレアーゼ部位を含む（例えば、図１参照）。任意の制限エンドヌクレアーゼ部位を用いることができる。ある特定の態様において、制限エンドヌクレアーゼ部位は、ＤＮＡディスプレイライブラリのメンバーのＤＮＡコーディング配列中に存在せず、従って、ライブラリメンバーの制限エンドヌクレアーゼ消化によるＤＮＡコーディング配列の切断は回避される。ある特定の態様において、制限エンドヌクレアーゼ部位は、Ｎｏｔ１部位である。
【００２０】
ある態様において、連結された結合性ポリペプチドから単離されたライブラリメンバーのＤＮＡコーディング配列を物理的に分離することが望ましい。物理的分離の何らかの方法を用いることができる。単離されたライブラリメンバーが制限エンドヌクレアーゼ部位を含むＤＮＡリンカーを含むとき（例えば、図１参照）、物理的分離は、単離されたライブラリメンバーの制限エンドヌクレアーゼ消化によって達成することができる。その結果、遊離したＤＮＡコーディング配列は、何れかの当技術分野で認識されている方法、例えば、遠心分離により、細胞／結合性ポリペプチド複合体からさらに分離され得る。
【００２１】
ある態様において、第一および／または第二の細胞タイプから、無傷の単離されたライブラリメンバーを物理的に分離することが望ましい。物理的分離のいずれかの方法を用いることができる。ある態様において、単離されたライブラリメンバーは、細胞表面抗原の酵素的切断によって第一または第二の細胞タイプから分離される。抗原の酵素的切断の何れかの方法、例えば、プロテアーゼ、脂質、および／またはグリコシダーゼ酵素的切断を用いることができる。ある態様において、細胞表面抗原が糖脂質アンカーにより細胞表面に結合しているとき、単離されたライブラリメンバーは、第一または第二の細胞タイプから糖脂質アンカー型ホスホリパーゼ切断によって分離される。その結果、遊離した単離されたライブラリメンバーは、何れかの当技術分野で認識されている方法、例えば、遠心分離により、第一または第二の細胞タイプからさらに分離され得る。
【００２２】
一旦、第一および／または第二の細胞タイプに特異的に結合するライブラリメンバーが単離されると、これらの分子のＤＮＡコーディング配列を決定することができる。従って、ある態様において、本発明の方法は、単離されたライブラリメンバーの少なくとも一部分のＤＮＡコーディング配列を決定する工程をさらに含む。ＤＮＡ配列決定のための任意の当技術分野で認識されている手段を用いることができる。ある特定の態様において、ＤＮＡコーディング配列は、単一分子のディープシークエンシング技術（例えば、ピロシーケンス）により決定される。単一分子のディープシークエンシング技術は、当技術分野で周知である（例えば、ＵＳ６，２１０，８９１に記載の技術、その内容全体は引用により本明細書中に包含させる）。ある態様において、結合性ポリペプチドが、抗体またはその抗原結合フラグメントであるとき、ＣＤＲ３領域のＤＮＡコーディング配列が決定される。ある態様において、第一および第二の細胞タイプに結合するライブラリメンバーのＤＮＡコーディング配列が決定される。第一の細胞タイプに特異的に結合するが、第二の細胞タイプに結合しないライブラリメンバーは、第一の細胞タイプに特異的な抗原に特異的に結合する結合性ポリペプチドを含むと考えられる。
【００２３】
一旦、細胞表面抗原に特異的に結合する結合性ポリペプチドが同定されると、それは、インビトロ（例えば、細胞または無細胞発現系）またはインビボ（例えば、トランスジェニック動物）で異種発現され得る。従って、ある態様において、本発明の方法は、インビトロ（例えば、細胞または無細胞発現系）またはインビボ（例えば、トランスジェニック動物）で同定された結合性ポリペプチドを異種発現させる工程をさらに含む。
【００２４】
ある態様において、抗原の同一性は、本発明の方法を、本願発明の方法は、本発明の方法を実行する前に知られている。しかしながら、必ずしも抗原の同一性を知る必要はない。実際、ある態様において、抗原の同一性は、本発明の方法を実行する前に知られていない。従って、後者の場合において、本発明の方法は、目的の細胞タイプ（例えば、腫瘍細胞）の表面上に存在する新規な抗原およびエピトープの同定を可能にする。
【００２５】
ある態様において、本明細書に記載の方法は、細胞表面抗原に結合することにより機能的に内在化され得る結合性ポリペプチドの選択を含む。そのような結合性ポリペプチドは、それらが標的細胞の内部への細胞毒性の薬物の送達を可能にするために、薬物複合体の製造において特に有用である。機能的内在化をスクリーニングするための任意の方法を用いることができる。例えば、結合性ポリペプチドの多様な改変体の核酸ディスプレイライブラリは、結合性ポリペプチドの内在化を可能にする条件下で（例えば、３７℃にて約１−２時間）、目的の細胞と接触させることができる。次いで、細胞を洗浄し、プロテアーゼ阻害剤の存在下で細胞溶解バッファーを用いて溶解し得る。その後、内在化されたライブラリメンバーをエタノール沈殿させ、ＤＮＡコーディング配列をＰＣＲ増幅により増幅させ得る。
【００２６】
本明細書に記載の方法は、任意の標的エピトープの発見プロセスに適用することができる。例えば、標的エピトープには、炎症に関するホーミングドメイン；処置に耐性を有するか、または有さない原発腫瘍、腫瘍細胞株、およびネオエピトープをもたらし得る任意の変異を有する腫瘍からの腫瘍特異的標的エピトープ；ならびに、疾患特異的機能不全を媒介し、生物学的療法のために標的化される他の疾患特異的エピトープ、が含まれ得る。
【００２７】
本明細書に記載の方法はまた、患者への薬物治療の過程で、特定の細胞表面エピトープの存在または不存在をモニターするためのバイオマーカーを発見するために適用され得る。バイオマーカーの発見に由来する抗体はまた、バイオマーカー検出のためのツールとして使用され得る。
【００２８】
さらに、またはあるいは、本明細書に記載の方法は、トランスジェニック動物および動物疾患モデルにおけるような他の種における標的またはエピトープの発見にも適用され得る。
本願発明の好ましい態様を次に示す：
［項１］
細胞表面抗原に特異的に結合する結合性ポリペプチドを同定する方法であって、
ａ．結合性ポリペプチドの多様な改変体の（variegated）核酸ディスプレイライブラリを第一の細胞タイプの外表面に提示されたある細胞表面抗原と接触させ、そして、
ｂ．該ライブラリから、第一の細胞タイプの外表面上の細胞表面抗原に特異的に結合する少なくとも１つのライブラリメンバーを単離して、該細胞表面抗原に特異的に結合する結合性ポリペプチドを同定する
工程を含む、方法。
［項２］
工程（ａ）の前に、結合性ポリペプチドの多様な改変体の核酸ディスプレイライブラリを、外表面上に提示された抗原を提示しない第二の細胞タイプと接触させる、上記項１に記載の方法。
［項３］
細胞表面抗原に特異的に結合する結合性ポリペプチドを同定する方法であって、
ａ．結合性ポリペプチドの多様な改変体の核酸ディスプレイライブラリを、ある細胞表面抗原を発現する第一の細胞タイプと接触させて、該ライブラリから第一の細胞タイプに特異的に結合する少なくとも１個のライブラリメンバーを単離し、
ｂ．結合性ポリペプチドの多様な改変体の核酸ディスプレイライブラリを、該細胞表面抗原を発現しない第二の細胞タイプと接触させ、該ライブラリから第二の細胞タイプに特異的に結合する少なくとも１個のライブラリメンバーを単離し、そして
ｃ．第一の細胞タイプに特異的に結合するが、第二の細胞タイプに結合しないライブラリメンバーを選択して該細胞表面抗原に特異的に結合する結合性ポリペプチドを同定する
工程を含む、方法。
［項４］
多様な改変体の核酸ディスプレイライブラリがＤＮＡディスプレイライブラリである、上記項１、２または３に記載の方法。
［項５］
ＤＮＡディスプレイライブラリの各メンバーが、結合性ポリペプチドをコード化するＤＮＡコーディング配列に、介在するＤＮＡリンカーを介して結合している結合性ポリペプチドを含み、ここで、該ＤＮＡリンカーは制限エンドヌクレアーゼ部位を含む、上記項４に記載の方法。
［項６］
制限エンドヌクレアーゼ部位が、ＤＮＡディスプレイライブラリのメンバーのコーディング配列中に存在しない、上記項５に記載の方法。
［項７］
該方法がさらに、ＤＮＡコーディング配列と、単離されたライブラリメンバーの連結された結合性ポリペプチドを物理的に分離することを含む、上記項５または６に記載の方法。
［項８］
該方法がさらに、第一または第二の細胞タイプから無傷の単離されたライブラリメンバーを分離することを含む、上記項１から７のいずれか一項に記載の方法。
［項９］
単離されたライブラリメンバーが、第一または第二の細胞タイプから細胞表面抗原の酵素的切断によって分離される、上記項８に記載の方法。
［項１０］
細胞表面抗原が糖脂質アンカーにより細胞表面に結合し、単離されたライブラリメンバーが、第一または第二の細胞タイプから、糖脂質アンカーのホスホリパーゼ切断により分離される、上記項９に記載の方法。
［項１１］
該方法がさらに、単離されたライブラリメンバーの少なくとも一部のＤＮＡコーディング配列を決定することを含む、上記項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
［項１２］
ＤＮＡコーディング配列が、ピロシーケンスにより決定される、上記項１１に記載の方法。
［項１３］
抗原が天然に存在するタンパク質、グリカンまたは脂質である、上記項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
［項１４］
抗原が、グリコホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカー型タンパク質である、上記項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
［項１５］
抗原が組み換え抗原である、上記項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
［項１６］
抗原がキメラ抗原である、上記項１から１５のいずれか一項に記載の方法。
［項１７］
第一の細胞タイプが、細胞表面抗原を天然で発現する細胞である、上記項１から１６のいずれか一項に記載の方法。
［項１８］
第一の細胞タイプが、細胞表面抗原を異種発現するように作製されている組み換え細胞である、上記項１から１７のいずれか一項に記載の方法。
［項１９］
第一の細胞タイプが、正常細胞の疾患に関連する変異体である、上記項１から１８のいずれか一項に記載の方法。
［項２０］
第一の細胞タイプが腫瘍細胞である、上記項１から１９のいずれか一項に記載の方法。
［項２１］
結合性ポリペプチドがそのフラグメントの抗体である、上記項１から２０のいずれか一項に記載の方法。
［項２２］
結合性ポリペプチドが抗体ＶＨまたはＶＬドメインである、上記項１から２１のいずれか一項に記載の方法。
【実施例】
【００２９】
Ｖ．実施例
Ａ．概要
ヒトドナーの骨髄、末梢血および脾臓細胞から得られた完全ヒト抗体ＶＨライブラリを構築し、複数の標的に対する多数の高親和性の、および特異的なＶＨ結合性ポリペプチドを、ｄｓＤＮＡディスプレイ技術を用いて同定した。標的細胞特異的エピトープを、ヒトＶＨライブラリおよびｄｓＤＮＡディスプレイ技術を用いて、生細胞の選択およびディープシークエンシング分析により同定した。並列の分別選択および標的細胞選択の戦略を、これらの方法に適用した（図４、５、６参照）。全ての段階の全ての集合体(pool)のディープシークエンシングからのＣＤＲ３頻度の集計により、ＶＨクローンの選択性が予測された。標的細胞および関連する細胞タイプに選択的に結合する高親和性ＶＨを同定した。
【００３０】
Ｂ．生細胞エピトープ探索のためのライブラリ作成および選択方法
２つの方法が、生細胞に結合したライブラリメンバーを効果的に回収するために開発された。
【００３１】
第一の方法は、結合抗体に融合されたＤＮＡの制限酵素消化により生細胞から結合性ポリペプチドを切り出す工程を伴う。この方法は、細胞上の全てのエピトープに結合しているＶＨの完全な回収を可能にする。ＶＨ  ＤＮＡライブラリのＣ末端は、ＮｏｔＩ制限部位を担持するように設計された（図１参照）。天然のＶＨフレームワークにはＮｏｔＩ部位がないため、完全長ＶＨ結合性ポリペプチドのみが、その後の増幅のために細胞から溶出される。ＮｏｔＩ制限酵素消化バッファーは、生細胞で試験され、３７℃にて２時間までのインキュベーションでは該細胞は生存していた。ＮｏｔＩの消化効率は高かった。４℃にて１時間、ライブラリを細胞に結合させた後、細胞を洗浄し、３７℃にて１時間、ＮｏｔＩバッファーで消化し、次いで、細胞を遠心分離し、上清（結合したＶＨ  ＤＮＡを含む）をＰＣＲ増幅のために集めた（図１参照）。
【００３２】
第二の方法は、ホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）の消化を用いて、生細胞からＶＨ結合性ポリペプチドを切り取るものである。この方法は、任意のＧＰＩアンカー型膜タンパク質のエピトープ（すなわち、エピトープのサブセット）に結合しているＶＨの溶出を可能にする。対照分子のＦＡＣＳ検証の結果、ＰＬＣクリッピング効率は高い。ライブラリと細胞を４℃にて１時間インキュベート後、細胞を洗浄し、ＰＬＣと共に３７℃にて１５分間インキュベートした。その後、細胞を遠心分離し、ＧＰＩアンカー型膜タンパク質の細胞外ドメインと複合体を形成した融合ＶＨを含む上清を、ＰＣＲ増幅させた（図２参照）。
【００３３】
Ｃ．標的および関連／望ましくない細胞タイプの並列選択、分別選択および標的細胞選択
マスター天然融合ライブラリを、ＷＯ２０１０／０１１９４４（引用によりその内容全体が本明細書中に包含させる）に記載のプロトコルにより製造した。選択の第一段階で、全ての選択肢について同じ多様性を担持するように、精製した融合ライブラリを複数のライブラリ中に均等に分配した（図５参照）。
【００３４】
正常ドナーまたは患者から得られた初代細胞を、標準的な細胞生物学のプロトコルにより、新らたに解凍するか、または細胞培養フラスコから単離した。次いで、該細胞を、３７℃にて１時間、完全培地中で回復させ、次いで、氷上で３０分間、選択バッファー中でブロッキングした。全ての選択を、抗体および標的の内在化を防止するために氷上で行った。
【００３５】
並列選択の場合、ライブラリを、２００μｌの予めブロックされたストレプトアビジンビーズおよび２００μｌの予めブロックされたｈＩｇＧ−エポキシビーズを用いて、室温にて３０分間プレクリアランスし、その後、ミスフォールドおよび非特異的（sticky）ライブラリメンバーを除去した。次いで、プレクリアランスされたライブラリを、氷上で冷却し、予めブロックされた細胞に加え、氷上で１時間インキュベートした。
【００３６】
標的細胞の選択のため、プレクリアランスは、任意の非選択的結合性ポリペプチドを除去するために、氷上で１時間、望ましくないおよび密接に関連する細胞タイプで実施し、次いで、標的細胞で行った。
【００３７】
選択段階４では、分別選択方法を標的細胞の各選択肢に適用した（細胞のプレクリアランスを行う、行わないの区別なく）。この段階では、ライブラリを複数のチューブに分割し、それぞれの細胞タイプおよび疾患の異なるステージ由来の患者の細胞に並行して結合させた。この戦略は、ディープシークエンシング分析による他の細胞タイプに対する標的細胞の直接の比較、および疾患の進行で生じた異なるエピトープを認識する結合性ポリペプチドの同定を可能にした（図６参照）。
【００３８】
全ての選択肢について、結合後、細胞を、上記の通り、１０ｍＬの結合バッファーで洗浄し、膜タンパク質に対する全ての結合性ポリペプチドを回収するためにＮｏｔＩ制限酵素消化を行うか、またはＧＰＩアンカー型膜タンパク質に対する結合性ポリペプチドを回収するためにＰＬＣクリッピングを行った。
【００３９】
Ｄ．標的細胞に対する選択的結合性ポリペプチドを予測するためのディープシークエンシング分析
選択の各段階後、結合プールをＰＣＲ増幅させた。各結合プールのＨＣＤＲ３を、ＶＨフラグメントのフレームワーク３のＣ末端およびフレームワーク４のＮ末端にプライミングするオリゴを用いてＰＣＲにより増幅させた。その後、個々の選択段階および選択肢からのこれらのＨＣＤＲ３フラグメントを、ＰＣＲによりイルミナシークエンサーに使用される特定のＤＮＡバーコードでタグ付けした。タグ付けされたＨＣＤＲ３を集め、Ｈｉ  Ｓｅｑ技術を用いるハイスループットシークエンシングのために送付した。標的細胞由来の段階４結合プールもまたＤＮＡバーコードでタグ付けし、完全長ＶＨ配列を得るために、４５４のシークエンシングのために提出した。
【００４０】
該配列を、配列決定後、ＤＮＡバーコードに基づいてデコンボリューションした。各選択段階からの数百万の配列を、異なる段階および選択肢に存在する特定のＣＤＲ３配列の頻度を比較することにより作表した。選択的結合性ポリペプチドの同定のために使用される基準は、１）最初の段階から最後の段階までの間、対照細胞または密接に関連している細胞タイプではなく、標的細胞上でのＣＤＲ３配列の富化、２）異なる選択段階で、標的特異的細胞タイプに高頻度および対照細胞または密接に関連している細胞タイプに低頻度（図７参照）；および、３）データベース内の他のプログラムから他の標的または細胞の選択には存在しない配列である。次いで、イルミナシークエンサーにより同定された選択クローンを、４５４の完全長配列情報に基づいて合成した。
【００４１】
Ｅ．製造、精製およびＦＡＣＳ結合アッセイ
その後、結合プールおよび合成ＶＨを、ｐＥＴ２２ｂ発現ベクター中にサブクローニングした。ＶＨは、ＢＬ−２１大腸菌細胞中で産生され、Ｃ末端Ｈｉｓタグにより標準的なプロトコルを用いて精製された。ＦＡＣＳアッセイを行い、異なる細胞タイプに対するＶＨの結合および選択性ならびに結合性ポリペプチドのＥＣ５０を評価した。高親和性および選択性ＶＨ結合性ポリペプチドを、生細胞選択過程により同定した（図８、９および１０参照）。
【図１】
0006636917.tif 000002
【図２】
0006636917.tif 000003
【図３】
0006636917.tif 000004
【図４】
0006636917.tif 000005
【図５】
0006636917.tif 000006
【図６】
0006636917.tif 000007
【図７】
0006636917.tif 000008
【図８】
0006636917.tif 000009
【図９】
0006636917.tif 000010
【図１０】
0006636917.tif 000011
【配列表】
0006636917000001.app