(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
活性化した白血球の増加したレベルを特徴とする、肺の炎症の抑制を必要とする患者における肺の炎症を抑制する方法において使用される医薬組成物であって、
前記方法は、
前記患者からの生体サンプルにおいて、ＩＬ−５、ＩＬ−９、ＩＬ１７ＦおよびＩＬ−２３αからなる群から選択される少なくとも一つのサイトカインの発現が増加していることにより、前記患者が肺の炎症の抑制を必要としていることを決定すること；および
前記肺の炎症を抑制するのに有効な前記医薬組成物の量を前記患者に投与することを含み、
前記医薬組成物がロイコトキシンおよび薬学的に許容される担体を含み、
前記生体サンプルが肺組織、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびＢＡＬサンプルの少なくとも一つを含み、
前記患者に投与される量が気管支肺胞洗浄液または肺組織における局所の前記少なくとも一つのサイトカインのレベルを下げるのに有効である、医薬組成物。
【請求項２】
前記活性化した白血球が正常で健常な患者からの白血球と比較して、より多いレベルのＬＦＡ−１を発現する、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記活性化した白血球がＣＤ１１ａｈｉ細胞である、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記ロイコトキシンがアグリゲイティバクター・アクチノミセテムコミタンス（Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ  ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ）から調製される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記ロイコトキシンが配列番号１に記載のペプチドと少なくとも９０％の同一性を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記医薬組成物が経口的に、非経口的に、静脈内に、腹腔内に、または吸入により投与される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記炎症が疾病または慢性疾患により生じる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記疾病または慢性疾患が喘息、嚢胞性線維症、慢性閉塞性肺疾患、アレルゲン、または感染症である、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記感染症が細菌性、真菌性、またはウイルス性の感染症である、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記投与される量が前記少なくとも１つのサイトカインのレベルを少なくとも約５倍低下させるのに有効である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記医薬組成物がネブライザー、定量吸入器、および乾燥粉末吸入器からなる群から選択される吸入器を用いるために処方され、ならびに前記吸入器を用いて投与される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
肺の炎症を特徴とする疾病を治療する方法において使用される医薬組成物であって、
前記方法は、
患者からの生体サンプルにおいて、ＩＬ−５、ＩＬ−９、ＩＬ１７ＦおよびＩＬ−２３αからなる群から選択される少なくとも一つのサイトカインの発現が増加していることにより、前記患者が前記疾病の治療を必要としていることを決定すること；および
前記炎症を抑制するのに有効な量で前記治療を必要とする患者に前記医薬組成物を投与することを含み、
前記医薬組成物がロイコトキシンおよび薬学的に許容される担体を含み、
前記生体サンプルが肺組織、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびＢＡＬサンプルの少なくとも一つを含み、
前記疾病が喘息、嚢胞性線維症、慢性閉塞性肺疾患、アレルギー、および感染症からなる群から選択される、医薬組成物。
【請求項１３】
前記ロイコトキシンが配列番号１に記載のペプチドと少なくとも９０％の同一性を有する、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記医薬組成物がネブライザー、定量吸入器、および乾燥粉末吸入器からなる群から選択される吸入器を用いるために処方され、および前記吸入器を用いて投与される、請求項１２または１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
患者に投与される前記量が気管支肺胞洗浄液または肺組織における局所の前記少なくとも一つのサイトカインのレベルを下げるのに有効である、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
前記投与される量が前記少なくとも１つのサイトカインのレベルを少なくとも約５倍低下させるのに有効である、請求項１２〜１５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願のクロスリファレンス］
本出願は、２０１４年６月２０日に出願された米国特許仮出願第６２／０１４，９６７号の優先権を主張する。この出願の内容は、参照により全体に組み込まれる。
【０００２】
政府の権利
本明細書に開示された発明は、少なくとも一部分において、国立衛生研究所からの助成金番号Ｒ２１ＣＡ１６７２３８を受けて政府の支援によりなされた。したがって、米国政府は、本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
［技術分野］
本発明は、医薬組成物、および肺の炎症を治療するための方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
肺の疾患は、多くの免疫関連要因に続く肺および気道における活性化した白血球（ＷＢＣ）の広範な浸潤を特徴とする。いくつかの治療は、基礎疾患を治療することができるが、これらの疾患の多くは、治癒しておらず、慢性疾患であるか、または疾患の治療がすぐに有効ではなく、結果として生じる肺の炎症は、患者にとって健康上の懸念のままである。ステロイドが肺の炎症を治療するための補助療法として使用されているが、ステロイドの慢性的な使用は、近位筋ミオパシー、クッシングハビタス（ｃｈｕｓｉｎｇｇｏｉｄ  ｈａｂｉｔｕｓ）、高血糖、糖尿病、感染症および骨粗しょう症などの複数の副作用をもたらすことが多い。他の薬剤は、免疫系を下方制御することが知られているが、これらの薬剤の多くは、休止免疫細胞と活性化した免疫細胞とを区別できず、一般的に強力な免疫抑制効果を有する。したがって、最小限の免疫抑制および付随する副作用で、多くの疾病および免疫関連疾患により引き起こされる肺の炎症を抑制するための新たな治療法が必要である。
【０００５】
肺に関連した疾患において、ＷＢＣの様々なサブタイプがリンパ球機能関連抗原１（「ＬＦＡ−１」）の上方制御および活性化を示す。その後、活性化したＬＦＡ−１は、気道へのＷＢＣの遊走を仲介する。遊走した時点で、炎症性ＷＢＣは、炎症が制御されない場合、患者に悪影響をもたらし得る気道の炎症および気道リモデリングを引き起こす。
【０００６】
肺の炎症は、肺のあらゆる部分、または周囲の組織および体液、ならびに特定のサイトカインの上方制御に影響を与える炎症の一般的な用語である。肺の炎症の臨床的特徴には、息切れ、肺の液体および／または粘液の増加、咳の増加、呼吸時の関連痛（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐａｉｎ  ｗｈｅｎ  ｂｒｅａｔｈｉｎｇ）および呼吸不能が含まれ得る。肺の炎症の治療は、炎症および無制御の肺の炎症により引き起こされる関連臨床症状を抑制することを目的とする。
【０００７】
ＬＦＡ−１をターゲットとする剤は、喘息、肺の炎症を引き起こす慢性疾患を治療するために使用されており、例えば、シンバスタチン、ＬＦＡ−１をターゲットとする小分子薬剤、およびＬＦＡ−１に対するモノクローナル抗体であるエファリズマブを含む。喘息患者のランダム化比較試験において、シンバスタチンは、気道および喀痰中の好酸球増加を抑制させることが示されたが、気道過敏性に影響を与えない、またはプラシーボと比較して炎症性サイトカイン（ＩＬ−４、５）の発現を抑制しなかった。エファリズマブでの喘息患者の治療は、薬剤がレセプターに結合している間にＬＦＡ−１をブロックすることによって、プラシーボと比較して遅い気道応答の減少と同時に、炎症細胞の数の減少を引き起こしたが、初期の喘息反応に何ら影響を及ぼさなかった。
【発明の概要】
【０００８】
一実施形態において、本発明は、活性化した白血球の増加したレベルを特徴とする、肺の炎症の抑制を必要とする患者における肺の炎症を抑制する方法であって、前記肺の炎症を抑制するのに有効な医薬組成物の量を前記患者に投与することを含み、前記医薬組成物がロイコトキシンおよび薬学的に許容される担体を含む、方法を提供する。前記活性化した白血球は、正常で健常な患者からの白血球と比較して、より多いレベルのＬＦＡ−１を発現する、およびＣＤ１１ａｈｉとしてさらに特徴づけることができる。ロイコトキシンは、アグリゲイティバクター・アクチノミセテムコミタンス（Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ  ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ）から、および組み換えにより調製できる。好ましい実施形態において、ロイコトキシンは、配列番号１に記載のペプチドと少なくとも９０％の相同性を有する。ロイコトキシンは、経口的に、非経口的に、静脈内に、腹腔内に、または吸入により投与できる。
【０００９】
特定の実施形態では、前記炎症は、疾病または慢性疾患により生じる。前記疾病または慢性疾患は、喘息、嚢胞性線維症、慢性閉塞性肺疾患、アレルゲン、または感染症でありうる。前記患者はまた、前記炎症を引き起こす細菌性、真菌性、またはウイルス性の感染症に感染しているであろう。前記患者に投与される量が気管支肺胞洗浄液または肺組織における局所のサイトカインレベルを下げるのに有効であり、前記サイトカインは、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−９、ＩＬ１７ＦおよびＩＬ−２３αでありうる。好ましい実施形態において、投与されるロイコトキシンの量は、少なくとも１つのサイトカインのレベルを少なくとも約５倍低下させるのに有効である。さらなる実施形態において、ロイコトキシンを含む医薬組成物は、ネブライザー、定量吸入器、および乾燥粉末吸入器からなる群から選択される吸入器を用いるために処方され、および前記吸入器を用いて投与される。
【００１０】
他の実施形態において、本発明は、肺の炎症を特徴とする疾病を治療する方法であって、前記炎症を抑制するのに有効な量で前記治療を必要とする患者に医薬組成物を投与することを含み、前記医薬組成物がロイコトキシンおよび薬学的に許容される担体を含み、ならびに前記疾病が喘息、嚢胞性線維症、慢性閉塞性肺疾患、アレルギー、および感染症からなる群から選択される、方法を提供する。
【００１１】
他の実施形態において、本発明は、ロイコトキシンおよび薬学的に許容される担体を含み、吸入に適した形態である医薬組成物を提供する。さらなる実施形態において、前記薬学的に許容される担体がエアロゾルまたは乾燥粉末の形態である。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１Ａ】図１Ａ−Ｂは、賦形剤（生理食塩水、ＨＤＭ／Ｄｅｘ賦形剤；またはＨＤＭ／ＬｔｘＡ賦形剤）、デキサメタゾン（ＨＤＭ／Ｄｅｘ）またはロイコトキシン（ＨＤＭ／ＬｔｘＡ）のいずれかを用いたイエダニ（ＨＤＭ）曝露マウスの治療後の気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）における白血球の試験を示す一連の図である。
【図１Ｂ】図１Ａ−Ｂは、賦形剤（生理食塩水、ＨＤＭ／Ｄｅｘ賦形剤；またはＨＤＭ／ＬｔｘＡ賦形剤）、デキサメタゾン（ＨＤＭ／Ｄｅｘ）またはロイコトキシン（ＨＤＭ／ＬｔｘＡ）のいずれかを用いたイエダニ（ＨＤＭ）曝露マウスの治療後の気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）における白血球の試験を示す一連の図である。
【図２】図２は、賦形剤（生理食塩水、ＨＤＭ／Ｄｅｘ賦形剤；またはＨＤＭ／ＬｔｘＡ賦形剤）；デキサメタゾン（ＨＤＭ／Ｄｅｘ）；またはロイコトキシン（ＨＤＭ／ＬｔｘＡ）のいずれかを用いたイエダニ（ＨＤＭ）曝露マウスの治療後の肺組織におけるサイトカインの試験を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、ＬｔｘＡを用いて肺の炎症を治療する方法に関し、ＬＦＡ−１を発現する活性化した炎症細胞を特徴とする肺の炎症を患う患者にＬｔｘＡを投与することが活性化した炎症細胞の急速な枯渇をもたらすという発見が組み込まれている。ＬＦＡ−１は、ＣＤ１１ａおよびＣＤ１８から構成される、白血球の表面に発現するβ２インテグリンであり、その活性立体配座において、免疫細胞の遊走およびシグナル伝達に関与する。
【００１４】
ＬｔｘＡ
ＬｔｘＡは、グラム陰性バクテリア、アグリゲイティバクター・アクチノミセテムコミタンス（Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ  ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ）により産生された、〜１１５ｋＤａタンパク質である。ＬｔｘＡは、ＬＦＡ−１に特異的に結合するので、ＬＦＡ−１を欠く細胞は、その毒性に耐性がある。例えば、ＬｔｘＡは、ヒト赤血球細胞、ヒト上皮細胞、ラット細胞、またはマウス細胞に対して活性を有さない。ＬｔｘＡはまた、ヒト末梢血の存在下で活性を維持する。
【００１５】
多くのＬｔｘＡ調製物を利用することができるが、好ましくは高純度のＬｔｘＡである。例として、アグリゲイティバクター・アクチノミセテムコミタンス（Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ  ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ）から精製されたＬｔｘＡポリペプチド（配列番号１）および配列番号１の配列が有するものと実質的に同じ生物学的活性を有する、その他の変異体が挙げられる。アグリゲイティバクター・アクチノミセテムコミタンス（Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ  ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ）が培養上清中に活性ＬｔｘＡを分泌したことが明らかにされ、その精製のための効果的な方法がＫａｃｈｌａｎｙ，Ｓ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．２００２．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ  Ｐｕｒｉｆ  ２５：４６５−７１に記載された。したがって、この方法は、単離されたまたは精製されたＬｔｘＡポリペプチドを調製するために用いることができる。一例において、毒素の精製手順は、
ａ．シングルコロニーのアグリゲイティバクター・アクチノミセテムコミタンス（Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ  ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ）を植菌し、培養物を増殖させる；
ｂ．増殖した培養物を新鮮な培養液へ添加し、ガラスビーズを添加し、インキュベートする；
ｃ．インキュベートした培養物を遠心分離し、ペレットおよび上清を生成する；
ｄ．膜を通して上清をろ過し、ろ過した上清を得る；
ｅ．（ＮＨ４）２ＳＯ４およびろ過した上清を共に混合し、混合物を生成する；
ｆ．混合物を遠心分離し、混合物のペレットを生成する；
ｇ．混合物のペレットをバッファーに再懸濁し、タンパク質の再懸濁液を生成する；
ｈ．タンパク質の再懸濁液をカラムに通す；ならびに、
ｉ．カラムから流出したタンパク質を収集する。
【００１６】
ＰＣＴ／ＵＳ２００６／４５２５８（国際公開第２００７／０６２１５０号）；米国特許出願公開第２００９００７５８８３号明細書（米国出願番号１２／１５４，８４３）およびＰＣＴ／ＵＳ１０／５２４５３（国際公開第２０１１／０４７０１１号）もまた参照。これらの文献の内容は参照することにより引用される。
【００１７】
「単離されたポリペプチド（ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）は、天然では結合している他のタンパク質、脂質、および核酸から分離しているポリペプチドを意味する。ポリペプチドは、精製された調製物の乾燥重量で少なくとも１０％（すなわち、１０％から１００％の間の任意の割合、例えば、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、および９９％）を構成する。純度は、任意の適切な標準的方法、例えば、カラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、またはＨＰＬＣ分析により測定することができる。本発明の単離されたポリペプチドは、天然源から精製する、組み換えＤＮＡ技術または化学的方法により製造することができる。ＬｔｘＡの機能的な等価物は、ＬｔｘＡポリペプチドのポリペプチド誘導体、例えば１以上の点突然変異、挿入、欠失、切断、融合タンパク質、またはその組み合わせを有するタンパク質を意味する。それは、ＬｔｘＡポリペプチドの活性、すなわち体内の他の細胞または器官にほとんどまたはまったく影響を及ぼさない一方、表面で活性化した形態のＬＦＡ−１を発現する白血球をターゲットとし、死滅させる能力を実質的に維持する。単離されたポリペプチドは、配列番号１または配列番号１の機能的フラグメントを含むことができる。一般的に、機能的な等価物は、配列番号１に対して少なくとも７５％（例えば、７５％以上１００％以下の任意の値、例えば、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、および９９％）の同一性がある。
【００１８】
天然起源のＬｔｘＡ、遺伝子操作されたＬｔｘＡ、および化学的に合成されたＬｔｘＡのすべては、本明細書に開示した発明を実施するために用いることができる。組み換えＤＮＡ技術により得られたＬｔｘＡは、天然起源のＬｔｘＡ（配列番号１）またはその機能的等価物と同じアミノ酸配列を有するであろう。用語「ＬｔｘＡ」はまた、化学的に修飾されたＬｔｘＡにまで及ぶ。化学的に修飾されたＬｔｘＡの例は、糖鎖が構造的に変化、付加または欠失を受けたＬｔｘＡ、およびポリエチレングリコールのような化合物が結合したＬｔｘＡを含む。一般的な手法によりまたは下記実施例に記載の方法によって精製および分析された時点で、ＬｔｘＡは医薬組成物、例えば局所用組成物に加えることができる。
【００１９】
本明細書に記載されたＬｔｘＡポリペプチドのアミノ酸組成は、白血球をターゲットとし、死滅させるポリペプチドの能力を破壊することなく変化するであろう。例えば、１以上の保存的アミノ酸置換を含むことができる。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられたものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、技術的に定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β−分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を含む。したがって、配列番号１における予測された非本質的なアミノ酸残基は、好ましくは同じ側鎖ファミリーからの他のアミノ酸残基で置きかれられる。また、飽和突然変異誘発のように、配列番号１のすべてまたは部分で変異をランダムに導入することができ、結果として得られた変異は、炎症を抑制するおよび／または下記実施例で記載されるような活性を維持する変異を同定する能力に関するスクリーニングを行うことができる。
【００２０】
本明細書で使用される「実質的に同一」とは、核酸またはアミノ酸配列が８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０以上のヌクレオチドまたはアミノ酸の領域にわたり少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％同一であること、または核酸に関して、第１の配列が第２の配列の相補体と実質的に相補的である場合、を意味する。好ましくは、このような変異している核酸およびポリペプチド配列は、本願に記載の配列と７５％以上（すなわち、８０、８５、９０、９５、９７、９８、９９％以上）の配列同一性を共有するであろう。好ましくは、このような配列同一性は、参照配列（すなわち、本願に記載の配列）の全体に関して算出される。好ましい実施形態において、ロイコトキシンは、配列番号１のペプチドと少なくとも９０％以上の相同性を有する。
【００２１】
本発明に記載のＬｔｘＡポリペプチドは、天然起源のポリペプチドまたは組み換えポリペプチドとして得ることができる。組み換えポリペプチドを調製するために、それ（例えば、配列番号２）をコードする核酸は、融合パートナー、例えばグルタチオン−ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、６ｘ−Ｈｉｓエピトープタグ、またはＭ１３  Ｇｅｎｅ３タンパク質をコードする他の核酸と結合することができる。結果として得られた融合核酸は、適切な宿主細胞において、公知の方法により単離することができる融合タンパク質を発現する。単離された融合タンパク質は、融合パートナーを除去し、本発明の組み換えポリペプチドを得るために、例えば酵素消化により、さらに処理することができる。
【００２２】
医薬組成物
本発明はまた、肺への投与に適したＬｔｘＡおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。薬学的に許容される担体の例は、制限されないが、微粒子、乾燥分散可能（ｄｒｙ  ｄｉｓｐｅｒｓｉｂｌｅ）な粉末、無水エタノール、噴霧乾燥によって形成された粒子など、ならびに肺内投与に適したものであると当技術分野で公知なその他の調製物を含む。したがって、ＬｔｘＡを含む本発明の医薬組成物は、肺の細気管支の領域へ粉末または液体エアロゾル粒子の形態において医薬組成物のデリバリのために構成された一般的に公知なデバイスを用いて投与することができる。このようなデバイスは、特に制限されないが、吸入器、噴霧器、鼻スプレー、乾燥粉末吸入システム；超音波吸入システム；定量吸入器；溶液計量装置を含む。本発明の医薬組成物の薬学的に許容される担体は、製剤の目的に有用であり、物質的にＬｔｘＡの新規で有用な性質に影響を与えない様々な不活性成分を含むことができる。
【００２３】
用語「薬学的に許容される（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ  ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ）」は、生物学的であるなしにかかわらず望ましい成分を意味し、すなわち、前記成分は、本発明の医薬組成物と組み合わせることができ、いかなる望ましくない生物学的効果を生じることなく、または有害な方法で相互作用することなく、含有される任意の他の成分の製剤組成物とともに、患者の肺に投与することができる。用語「薬学的に許容される（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ  ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ）」が薬理活性物質以外の成分を言及するのに使用される場合、成分が毒物試験および製造試験の要求基準を満たすことが示唆され、または米国食品医薬品局により作成された非アクティブ成分ガイドに含まれる。
【００２４】
吸入製品は、一般的に公知の噴霧器および他の吸入システムのために、複数投与形態でパッケージングされる。防腐剤は、使用中の微生物による汚染を防止するために使用できる。適切な防腐剤は、ビグアナイド、過酸化水素、過酸化水素プロデューサー、塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、ベンゾドデシニウムブロミド、メチルパラベン、プロピルパラベン、フェニルエチルアルコール、エデト酸二ナトリウム、ソルビン酸、ポリクオタニウム−１、または当業者に公知なその他の剤を含む。このような防腐剤は、典型的には、０．００１から１％（ｗ／ｗ）のレベルで用いられる。本発明の単位用量製剤は、無菌であるが、通常は保存できないであろう。したがって、このような製剤は、一般的に防腐剤を含まない。
【００２５】
医薬組成物は、さらに抗生物質、抗ウイルス剤、コルチコステロイド、β−アゴニスト（長時間または短時間作用）、ロイコトリエン受容体拮抗薬（ｌｅｕｋｏｔｒｉｅｎｅ  ｍｏｄｉｆｉｅｒｓ）、抗ヒスタミン薬、ホスホジエストラーゼ阻害剤、クロモグリク酸ナトリウム、ネドクロミル、サイトカイン、およびテオフィリンを含むことができる。
【００２６】
抗生物質の例は、制限されず、セファゾリン、セフラジン、セファクロル、セファピリン、セフチゾキシム、セフォペラゾン、セフォテタン、セフロキシム、セフォタキシム、セファドロキシル、セフタジジム、セファレキシン、セファロチン、セファマンドール、セフォキシチン、セフォシニド、セフォラニド、セフトリアキソン、セファドロキシル、セフラジン、セフロキシム、アンピシリン、アモキシシリン、シクラシリン、アンピシリン、ペニシリンＧ、ペニシリンＶカリウム、ピペラシリン、オキサシリン、バカンピシリン、クロキサシリン、チカルシリン、アズロシリン、カルベニシリン、メチシリン、ナフシリン、エリスロマイシン、テトラサイクリン、ドキシサイクリン、ミノサイクリン、アズトレオナム、クロラムフェニコール、塩酸シプロフロキサシン、クリンダマイシン、メトロニダゾール、ゲンタマイシン、リンコマイシン、トブラマイシン、バンコマイシン、硫酸ポリミキシンＢ、コリスティメタート、コリスチン、アジスロマイシン、オーグメンチン、スルファメトキサゾール、トリメトプリム、その誘導体など、およびその混合物を含む。
【００２７】
コルチコステロイドの例は、コルチゾン、プレドニゾロン、トリアムシノロン、フルオロメトロン、デキサメタゾン、メドリゾン、ロテプレドノール、フルアザコート、ヒドロコルチゾン、プレドニゾン、トリアムシノロン、ベタメタゾン、プレドニゾン、メチルプレドニゾロン、トリアムシノロンアセトニド、トリアムシノロンヘキサセトニド、酢酸パラメタゾン、ジフロラゾン、フルオシノロンおよびフルオシノニド、その誘導体、ならびにその混合物を含む。抗ウイルス剤の例は、インターフェロンガンマ、ジドブジン、塩酸アマンタジン、リバビリン、アシクロビル、バラシクロビル、ジデオキシシチジン、およびその誘導体を含む。抗ヒスタミン薬の例は、ロラタジン、ヒドロキシジン、ジフェンヒドラミン、クロルフェニラミン、ブロムフェニラミン、シプロヘプタジン、テルフェナジン、クレマスチン、トリプロリジン、カルビノキサミン、ジフェニルピラリン、フェニンダミン、アザタジン、トリペレナミン、デクスクロルフェニラミン、デキスブロムフェニルアミン、メトジラジン、およびトリメプラジンドキシラミン、フェニラミン、ピリラミン、クロルシクリジン、トンジラミン、ならびにその誘導体を含むが、制限されない。
【００２８】
治療方法
本発明は、ロイコトキシンおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を肺の炎症を抑制するのに有効な量において患者に投与することで、活性化した白血球の増加したレベルを特徴とする、肺の炎症の抑制を必要とする患者における肺の炎症を抑制する方法を提供する。他の実施形態において、本発明は、疾患を特徴づける肺の炎症を抑制するのに有効な量でロイコトキシンおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を必要とする患者に投与することを含む、肺の炎症を特徴とする疾病を治療する方法を提供する。
【００２９】
他の実施形態において、本発明は、患者から生体サンプルを要求することで肺の炎症の患者をスクリーニングし、前記患者が１以上のバイオマーカーを発現しているかどうかを決定するために生体サンプルの分析を要求し、その後ＬｔｘＡを含む医薬組成物で患者を治療するための方法を提供する。ある実施形態では、患者は、現在ＬｔｘＡで治療を受けており、ＬｔｘＡの投与量が肺の炎症のバイオマーカーの存在によりさらに決定される。
【００３０】
肺の炎症は、肺の炎症を発症していない健康な患者の白血球と比較して、より高いレベルの活性化した形態のＬＦＡ−１を発現する活性化した白血球の増加を特徴とし得る。より高いレベルの活性化した形態のＬＦＡ−１を有するこれらの白血球はまた、ＣＤ１１ａｈｉ細胞と称される。ＣＤ１１ａｈｉ細胞は、肺組織、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）またはＢＡＬサンプルのような患者からの生体サンプルで同定でき、よって臨床医は、患者が肺の炎症の治療を必要とするかどうかを決定できる。他の実施形態では、患者からの生体サンプルはまた、患者が肺の炎症の治療を必要とするかどうかを決定するために、あるサイトカイン（バイオマーカー）の増加した発現をスクリーニングできる。これらのサイトカイン／バイオマーカーは、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−９、ＩＬ−１７ＦおよびＩＬ−２３αを含む。一般的なアッセイとして、生体サンプルのサイトカインを検出するものが公知であり、生体サンプルの例は、特に制限されず、肺組織、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）またはＢＡＬサンプルをふくむ。
【００３１】
肺の炎症は、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、過敏性肺炎、好酸球性肺炎、気腫、気管支炎、アレルギー性気管支炎気管支拡張症、嚢胞性線維症、結核、過敏性肺炎、職業喘息、サルコイド、反応性気道機能不全症候群、間質性肺疾患、好酸球増加症候群、鼻炎、副鼻腔炎、運動誘発性喘息、汚染誘発性喘息、咳喘息、寄生虫性肺疾患、細菌感染、呼吸系発疹ウイルス（ＲＳＶ）感染、パラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）感染、ライノウイルス（ＲＶ）感染およびアデノウイルス感染など、多くの疾患および慢性疾患により発症しうる。上記疾患および慢性疾患の多くは、活性化した形態のＬＦＡ−１を発現する白血球の増加を引き起こし、肺組織およびＢＡＬに遊走および集合するため、本発明の方法によって治療するのに適している。
【００３２】
嚢胞性線維症（ＣＦ）は、慢性的な炎症ならびに肺および気道への免疫介在性の損傷を特徴とする疾患であり、呼吸不全および死をもたらす。細菌感染に応答して活性化したＬＦＡ−１好中球は、主に得免疫介在性損傷の原因である。好中球は、一般的に細菌性の病原体の排除において役割をはたすが、ＣＦの場合、活性化したＬＦＡ−１好中球、ひいてはＬｔｘＡ治療のターゲットとしては、免疫学的に有効ではない。喘息は、肺の炎症によっても特徴づけられる慢性的な症状であり、そのため活性化した白血球は、気道に浸潤し、さらに気管支上皮の損傷を引き起こす炎症仲介物質を放出する。アレルギー性喘息は、ＩｇＥ依存性であり、吸入性アレルゲンへの初期曝露およびその後のＩＬ−４およびＩＬ−１３を分泌する、Ｔヘルパー２型白血球への抗原提示を伴う。アレルギー性喘息は、ＢＡＬおよび肺組織における気道炎症、サイトカイン産生の増加を伴う持続性Ｔｈ２応答、進行性気道リモデリングおよび気管支過活動によってさらに特徴づけることができる。ターゲットとなる白血球はまた、単球および約１０３〜１０５の平均蛍光強度（ＭＦＩ）でＬＦＡ−１を発現する非ヘルパーＴ細胞（ｎｏｎ−ｈｅｌｐｅｒ  Ｔ−ｃｅｌｌｓ）である、ＣＤ１１ａｈｉ細胞として特徴づけることができる。好ましい実施形態において、本発明の治療方法は、約１０４〜１０５のＬＦＡ−１  ＭＦＩを有するＣＤ１１ａｈｉ細胞を特徴とする喘息発作を患う患者を治療する。当業者は、当技術分野で公知の標準的な手法と試薬とを用いたＭＦＩによりＣＤ１１ａｈｉ細胞を同定できる。
【００３３】
ＣＯＰＤ、または慢性閉塞性肺疾患は、呼吸困難が生じる進行性疾患である。ＣＯＰＤは、多量の粘液（ぬるぬるの物質）、喘鳴、息切れ、胸部圧迫、およびその他の症状をもたらす咳を引き起こし得る。ＣＯＰＤにおいて、下記：気道および気嚢がその弾性的性質を失うこと；多くの空気嚢の間の壁が破壊されること；気道の壁が厚くなり、炎症を起こすこと、ならびに気道が通常よりも多くの粘液を作るので、気管支を詰まらせうること、の１つ以上のために、気道内外への空気の流入が少ない。
【００３４】
慢性気管支炎において、気道の内壁は、常に刺激され、炎症を起こす。これにより内壁が厚くなる。多くの粘液が気道において形成され、呼吸を困難にする。
【００３５】
「治療または処理（ｔｒｅａｔｉｎｇまたはｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、肺の炎症、肺の炎症の兆候、肺の炎症に続く疾患状態、または肺の炎症への素因を、治癒、軽減、緩和、治療、遅延、または改善するために、肺の炎症を有する、患者への化合物または医薬組成物の投与を意味する。
【００３６】
本明細書において、用語「患者（ｓｕｂｊｅｃｔ）」は、制限されないが、ヒト、非ヒト霊長類、げっ歯類、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、家畜など、任意の動物（例えば、哺乳類）を意味し、特定の治療のレシピエントである。一般的には、用語「患者（ｓｕｇｊｅｃｔ）」および「病人（ｐａｔｉｅｎｔ）」は、本明細書において、ヒトの患者（ｈｕｍａｎ  ｓｕｂｊｅｃｔ）に関して交互に用いられる。
【００３７】
「治療的に有効な量（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｍｏｕｎｔ）」は、有益なまたは所望の結果を達成するのに十分な剤または医薬組成物の量を意味する。治療的に有効な量は、１つ以上の投与、適用または用量で投与することができ、特定の製剤または投与経路に限定することを意図するものではない。
【００３８】
剤または医薬組成物は、ｉｎ  ｖｉｖｏで、単独で投与することができ、または他の薬剤または治療と組み合わせて同時投与することができる。本明細書において、用語「同時投与（ｃｏ−ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）または同時投与された（ｃｏ−ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｅｄ）」は、患者への少なくとも２つの剤の投与または治療を意味する。いくつかの実施形態において、２つ以上の剤／治療の同時投与は、並行される。その他の実施形態において、第１の剤／治療は、第２の剤／治療に先立って投与される。当業者は、用いられる様々な剤／治療の投与の製剤および／または経路が異なる場合があることを理解する。
【００３９】
本発明の医薬組成物が局所的または全身的に投与されてもよいことは、当業者であれば理解できるであろう。投与経路には、鼻、肺、口、非経口（静脈内、皮下および筋肉内）、ならびに経口が含まれる。また、インプラントからの投与も可能である。適切な製剤形態は、例えば顆粒、粉末、錠剤、コーティング錠、（マイクロ）カプセル、マイクロ粒子、シロップ、エマルジョン、水、油および界面活性剤からなる光学的に等方性の熱力学的に安定な系として定義される、マイクロエマルジョン、長距離秩序（ｌｏｎｇ−ｒａｎｇｅ  ｏｒｄｅｒ）であるが短距離無秩序（ｓｈｏｒｔ−ｒａｎｇｅ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ）（例として、層状、六方晶および立方体の相、水または油の連続のいずれかを含む）によって特徴づけられる系として定義される、液晶相、またはそれらの分散したカウンターパート、ゲル、分散液、懸濁液、クリーム、エアロゾル、液滴もしくはアンプル形態の注射液、ならびに活性化合物の持続放出を伴う製剤、その製剤における、賦形剤、希釈剤、アジュバントもしくは担体は、上記のとおり習慣的に使用される。
【００４０】
必要とされる投与量は、投与経路の選択；処方の性質；患者の疾病の性質；患者のサイズ、体重、表面積、年齢および性別；投与される他の薬物；ならびに主治医の判断による。適切な投与量は、０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲である。必要な投与量の変動は、ＬｔｘＡと組み合わせることができる入手可能な化合物の多様性および様々な投与経路の異なる効率の観点から考慮されるべきである。これらの投与レベルの変動は、過度の実験をすることなく当業者により使用されうる当技術分野で公知のような最適化のための標準的で経験的な決められた方法を用いて調整できる。適切なデリバリ担体（例えば、ポリマー微粒子またはインプラント可能なデバイス）における化合物のカプセル化は、デリバリの効率を向上できる。
【００４１】
代わりの好ましい実施形態において、医薬組成物は、肺投与または経鼻投与に適している。
【００４２】
本発明の医薬組成物は、鼻腔内にまたは吸入により投与でき、一般的には、適切な噴射剤、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロ−エタン、１，１，１，２−テトラフルオロエタン（ＨＦＡ  １３４Ａ３または１，１，１，２，３，３，３−ヘプタフルオロプロパン（ＨＦＡ  ２２７ＥＡ３）などのヒドロフルオロアルカン、二酸化炭素またはその他の適切なガスの使用による加圧容器、ポンプ、スプレーまたは噴霧器からの液体または粉末粒子の乾燥吸入器もしくはエアロゾルスプレープレゼンテーション（ａｅｒｏｓｏｌ  ｓｐｒａｙ  ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）の形態で投与される。加圧エアロゾルの場合、投薬単位は、計量された量をデリバリするためのバルブを提供することによって決定できる。加圧容器、ポンプ、スプレーまたはネブライザーは、活性化合物、例えばトリオレイン酸ソルビタンなどの潤滑剤をさらに含みうる、溶媒としてエタノールと推進剤との混合液を用いて、溶液または懸濁液を含むことができる。吸入具（ｉｎｈａｌｅｒ）または吸入器（ｉｎｓｕｆｆｌａｔｏｒ）で使用されるカプセルおよびカートリッジ（例えばゼラチン製）は、本発明のポリペプチドとラクトースまたはデンプンのような適切な粉末基剤との粉末混合物を含むことで製剤できる。
【００４３】
エアロゾルまたは乾燥粉末製剤は、好ましくはアレンジされ、それぞれの計量された容量または「パフ（ｐｕｆｆ）」は、患者へデリバリするための少なくとも０．１ｍｇの本発明のＬｔｘＡポリペプチドを含む。エアロゾルを用いた一日用量の全量は、患者ごとに異なるであろうし、単回用量で、またはより通常は一日を通して分割した用量で投与できることが理解されるであろう。
【００４４】
ある実施形態において、本発明は、肺の炎症の治療のためのキットを提供する。前記キットは、ＬｔｘＡ医薬組成物を投与するための吸入デバイスと共に使用されるＬｔｘＡを含む医薬組成物の複数の用量、カプセルまたはカートリッジを含むことができる。前記キットは、前記治療方法を行うための一連の指示書をさらに含むことができる。前記キットは、肺の炎症を検出する、またはＬｔｘＡ治療の有効性を判定するための試薬をさらに含むことができる
以下の非限定的な実施例は、本発明をさらに説明する目的を果たす。
【実施例】
【００４５】
材料および方法
ＬｔｘＡ精製。ＬｔｘＡは、Ａ．アクチノミセテムコミタンス（ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ）株４５００（Ｄｉａｚ  ｅｔ  ａｌ．，（２００６）Ｍｉｃｒｏｂ  Ｐａｔｈｏｇ  ４０，４８−５５．）の培養上清から精製された。
【００４６】
血液からのＰＢＭＣの単離。全血は、８人のアレルギー性喘息患者およびいかなるアレルギーを示さなかった１１人の非アレルギーの健康な対照から採取された。すべてのアレルギー性喘息患者は、５〜５０歳である。患者は、肺活量測定における可逆的気道疾患および皮膚試験により決定されたダニのアレルギーの最近の兆候があった。患者は、短時間作用型気管支拡張剤、吸入コルチコステロイド、および長時間作用型気管支拡張剤のいずれの組み合わせでも問題なかった。患者は、妊娠、オマリズマブ（Ｘｏｌａｒ（登録商標））もしくはその他の免疫療法を受けている場合、全身性コルチコステロイド、３０日以内の抗生物質、またはＨＩＶ、心臓病、糖尿病、およびガンなどの重要な併存疾患を有する場合、除外された。対照群には、喘息またはアレルギー状態の病歴はなかった。収集プロトコルは、Ｒｕｔｇｅｒｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄにより承認され、書面のインフォームドコンセントは、すべての試験患者から得られた。ＰＢＭＣは、フィコール密度勾配分離（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｅｌｌｇｒｏ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）を用いて単離された。生存細胞は、Ｖｉ−Ｃｅｌｌ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔを用いてカウントされた。
【００４７】
ＰＢＭＣの分析。患者および対照からのＰＢＭＣ（１０６細胞／ｍｌ）は、以下のマーカー：ＣＤ４（Ｔヘルパー細胞）、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１４（単球）、およびＣＤ３（Ｔ−細胞）に対して抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）で染色された。喘息患者からのＰＢＭＣはまた、ＲＰＭＩ１６４０培地中のバッファーまたはＬｔｘＡ（５００ｎｇ／ｍｌ）のいずれかで一晩インキュベートされた。処理されたＰＢＭＣは、ＰＢＳで洗浄され、上記抗体と共にアネキシンＶで染色され、ＬｔｘＡ−媒介細胞死を測定するためにフローサイトメトリーで分析された。
【００４８】
動物実験。メスのＢＡＬＢ／ｃマウス（６〜８週、１５〜２０ｇ、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）を特定の病原体を含まない条件下、食料および水へのアクセスと１２時間の明暗サイクルで飼育した。イソフルラン麻酔下、ＨＤＭ抽出物（Ｄ．  ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｎｕｓ；Ｇｒｅｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｌｅｎｏｉｒ，ＮＣ）を鼻腔内に曝露した（鼻腔あたり生理食塩水１０μｌ中２５μｇ）。コントロール（非喘息性の）マウスは、同量の生理食塩水のみを投与された（生理食塩水／無処理、図１および２）。ＨＤＭ／生理食塩水への曝露の周期は、５日／週で、合計５週間であった。パイロット研究からの出力計算は、グループあたり４匹のマウスがコントロール群と実験群との間で有意な差を検出するのに十分であったことを示した。
【００４９】
２週間後、ＨＤＭ曝露マウスは、４マウス／群の４つの群に分けられ、（１）デキサメタゾン賦形剤、生理食塩水（ＨＤＭ／Ｄｅｘ賦形剤、図１および２）、皮下（ｓ．ｃ．）へ１日１回、週に５日、（２）デキサメタゾン、シグマ；１．２５ｍｇ／ｋｇ（ＨＤＭ／Ｄｅｘ、図１および２）、皮下へ１日１回、週に５日、（３）ＬｔｘＡ賦形剤、バッファー（ＨＤＭ／ＬｔｘＡ賦形剤、図１および２）、腹腔内（ｉ．ｐ．）、週に３日、および（４）ＬｔｘＡ、０．５ｍｇ／ｋｇ（ＨＤＭ／ＬｔｘＡ、図１および２）腹腔内、週に３日、で処理された。ＨＤＭ曝露は、３週間の治療期間を通じて継続された。
【００５０】
各マウスからのＢＡＬ液は、室温で１０分間、ＲＢＣ溶解を行い、その後、４００×ｇで５分間、２回洗浄され、ＰＢＳで細胞ペレットを再懸濁した。合計のＢＡＬ液細胞数は、血球計を用いてカウントされた。ＢＡＬ液細胞の免疫表現型解析は、抗体染色およびフローサイトメトリーにより行われた。各抗体染色のために、１０６細胞がまず１０分間室温で、Ｆｃブロッカー（ラット抗マウスＣＤ１６／ＣＤ３２，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を用いてブロックされ、その後３０分間４℃で、モノクローナル抗体とインキュベートされ、ＬＳＲ  ＩＩフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で分析された。以下のマーカーに対する抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）は、様々な細胞のサブタイプ同定するために用いられた：ＣＤ３ｅ  （Ｔ細胞）、ＣＤ４５Ｒ／Ｂ２２０（Ｂ細胞）、Ｌｙ６Ｇ、ＣＣＲ３（好中球）、ＣＣＲ３、Ｌｙ６Ｇ（好酸球）、ＭＨＣ  ＩＩ（マクロファージ）。関連するアイソタイプコントロールは、各実験に含まれた。
【００５１】
マウスからの血液は、ＢＡＬ液の分離のすぐ後で、回腸の静脈穿刺により収集された。血液は、抗凝固剤チューブに回収され、１０分間４００×ｇで遠心分離された。
【００５２】
肺組織の組織構造。ＢＡＬ液および血液の収集後、肺は切開により除去され、顕微鏡分析まで室温で１０％中性緩衝ホルマリンに保存された。固定化した肺組織を埋め込んだパラフィンの薄片は、合計の肺炎症を分析するためにＨ＆Ｅで染色された。薄片はまた、粘液細胞および杯細胞過形成ならびに好酸球へのシリウスレッドを識別するために過ヨウ素酸シッフ試薬で染色された。組織調製および試験は、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌ  Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙで行われた。サンプルは、認定病理医により検査された。
【００５３】
サイトカイン分析。定量ＲＴ−ＰＣＲは、マウスの肺において、炎症性サイトカイン（ＩＬ−４、５、９、１７Ｆおよび２３α）の発現レベルを決定するために用いられた。肺組織からの総ＲＮＡは、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）で抽出された。相対的なｍＲＮＡレベルは、ｑＲＴ−ＰＣＴにより決定された。総ＲＮＡの１マイクログラムは、Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）を用いて逆転写された。増幅は、ＴａｑＭａｎ  Ｆａｓｔ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）を用いて行われた。データは、ＧＡＰＤＨに対して正規化された。遺伝子発現は、ナイーブサンプルに対して、ΔΔＣＴ法を用いて算出された。
【００５４】
統計分析。ＢＡＬ液細胞数、分化細胞数、およびサイトカインレベルは、スチューデントのｔ検定により比較された。＜０．０５のｐ値を有意とみなす。
【００５５】
結果
アレルギー性喘息患者および健康な対照からのＷＢＣに対するＬＦＡ−１の発現。我々は、８人のアレルギー性喘息患者および１１人の健康な対照からの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を分析した。喘息と診断された患者は、イエダニに対するアレルギー反応が陽性であった。全体のＰＢＭＣの集団から、患者からのＣＤ１１ａ（ＬＦＡ−１）陽性細胞の割合は、健康な対照からのものよりも有意に高かった。患者は、９５．１±３．１４％のＣＤ１１ａ陽性細胞を有し、一方健康な対照は、９０．３±４．１１％であった。また、アレルギー性喘息患者からのＣＤ１１ａ＋  ＷＢＣの表面におけるＬＦＡ−１分子の数（８６０５±２５１９）は、平均蛍光強度が示すように、健康な対照のＷＢＣの表面における数（５０８９±２１０７）よりも有意に多かった。
【００５６】
抗ＣＤ４抗体および高ＣＤ１１ａ抗体で染色されたＷＢＣは、健康な対照のサンプルには存在しなかった、ＣＤ４−ＣＤ１１ａｈｉ（ＭＦＩ  １０４〜１０５）からなるアレルギー性喘息患者におけるユニークな細胞集団を明らかにした。免疫表現型分析は、喘息のサンプルにおけるこのＣＤ１１ａｈｉの集団が主にＣＤ１４＋単球およびＣＤ３＋非ヘルパーＴ細胞（ｎｏｎ−ｈｅｌｐｅｒ  Ｔ−ｃｅｌｌｓ）からなることを明らかにした。したがって、高いＬＦＡ−１の発現は、アレルギー性喘息を有する患者において存在するユニークな細胞集団を明確にする。
【００５７】
アレルギー性喘息患者からのＰＢＭＣへのＬｔｘＡの影響。患者からのいずれの細胞がＬｔｘＡによりターゲットにされるのかを決定するため、ＰＢＭＣサンプルは、２４時間ＬｔｘＡで処理され、その後アネキシンＶで染色され、フローサイトメトリーにより分析された（図３Ａ）。ＣＤ１１ａ＋  ＰＢＭＣのうち、ＬｔｘＡはＣＤ１１ａｈｉ細胞だけを死滅し、低発現のＬＦＡ−１を有する細胞に影響を与えなかった。細胞は、アポトーシス（アネキシンＶ陽性）および枯渇により死滅された。ＬｔｘＡにより枯渇された細胞は、活性状態においてＬＦＡ−１を特異的に認識する抗体（ｍＡｂ２４）で染色することで明らかなように活性状態のＬＦＡ−１を発現する。これらの細胞のほとんどは、ＣＤ１４陽性であり、これらが単球であることを示している。
【００５８】
アレルギー喘息のマウスモデルにおけるＬｔｘＡの評価。ＬＦＡ−１がアレルギー性喘息の病因において果たしている潜在的な役割およびアレルギー性喘息の患者に特有であるｅｘ  ｖｉｖｏでのＬＦＡ−１ｈｉ白血球を特異的にターゲットとするＬｔｘＡの能力を考えると、アレルギー喘息のマウスモデルにおける最初のＬｔｘＡの原理証明評価が行われた。マウスは、５週間、週に５日、イエダニ（ＨＤＭ）抽出物または生理食塩水を鼻腔内（ｉ．ｎ．）に投与された。投与の２週間後、ＨＤＭ曝露マウスは、１群あたり４匹の４つの群に再分割され、さらに３週間、下記の処理を受けた：デキサメタゾン賦形剤、皮下（ｓ．ｃ．）５日／週；デキサメタゾン（１．２５ｍｇ／ｋｇ）、皮下５日／週；ＬｔｘＡ賦形剤、腹腔内（ｉ．ｐ．）３日／週；ＬｔｘＡ（０．５ｍｇ／ｋｇ）、腹腔内３日／週。
【００５９】
本研究の終了時点で、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）液、肺組織、および血液は、さらなる評価のためにすべてのマウスから収集された。ＢＡＬ液における白血球の検査は、デキサメタゾン賦形剤またはＬｔｘＡ賦形剤で処理されたＨＤＭ曝露マウスが生理食塩水のみを投与されたマウスよりも、有意に高いレベルのすべての白血球サブセットを有したことを明らかにした（図１）。デキサメタゾンまたはＬｔｘＡでのＨＤＭ曝露マウスの治療は、ＢＡＬ液における多くの白血球の数の大幅な減少を引き起こした。
【００６０】
ＬＦＡ−１がこの動物モデルにおける白血球の肺組織への遊走に関与するかどうかを決定するために、ＬｔｘＡ賦形剤で処理された２つのＨＤＭ曝露マウスにおけるＰＢＭＣおよびＢＡＬ液白血球でのＬＦＡ−１のレベルを検査した。ＢＡＬ液において存在する遊走した白血球は、同じ動物の末梢血における白血球でよりも、有意に高いレベルのＬＦＡ−１を有していた。
【００６１】
肺組織は、薄片にされ、Ｈ＆Ｅ、ＰＡＳまたはシリウスレッドで染色された。Ｈ＆Ｅ染色は、デキサメタゾン賦形剤またはＬｔｘＡ賦形剤で処理されたＨＤＭ曝露マウスの肺組織において、白血球の大規模な浸潤を明らかにした。浸潤は、生理食塩水曝露マウスでは明らかではなかった。ＨＤＭ曝露マウスにおける白血球の浸潤は、血管および気管支の周辺で最も明白であった。他のサンプルにおいてではなく、賦形剤処理コントロールにおいて多くの気管支周囲での著しい杯細胞過形成が観察された。ＬｔｘＡ賦形剤処理マウスからの肺組織におけるＰＡＳでの多糖類の染色は、ムチン産生杯細胞およびコラーゲンの上皮下蓄積の存在を裏付けた。薄片のシリウスレッド染色は、ＬｔｘＡ処理マウスではなく、賦形剤処理マウスにおけるピンク染色の好酸球を明らかにした。デキサメタゾンで処理されたマウスは、ＬｔｘＡ処理マウスよりも依然として多いが、賦形剤のコントロールと比較して好酸球数の減少があった。
【００６２】
炎症性サイトカインは、アレルギー性喘息および他の炎症症状の病因に重要な役割を果たしている。アレルギー性喘息において、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−９、ＩＬ−１７Ｆ、およびＩＬ−２３αは、疾患に関与する主なシグナル分子である。すべてのマウスからの肺組織におけるＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−９、ＩＬ−１７Ｆ、およびＩＬ−２３αのｍＲＮＡのレベルを評価した（図２）。賦形剤処理マウスは、生理食塩水曝露マウスと比較して、炎症性サイトカインの有意に高い発現が認められた。加えて、デキサメタゾンは、ＩＬ−９、ＩＬ−１７Ｆ、およびＩＬ−２３αの減少を生じさせ、一方、ＬｔｘＡ処理は、検査されたすべてのサイトカインの著しい減少を生じさせた。
【００６３】
明細書において引用したすべての刊行物、特許文献および非特許文献の両方は、本発明が属する技術分野における合理的な当業者のレベルを示すものである。これらすべての刊行物は、個々の刊行物が具体的および個別に参照により組み込まれるものとして示されているのと同じ程度に、本明細書にすべて参照により組み込まれる。
【００６４】
本明細書中の発明は、特定の実施形態を参照して記載されているが、これらの実施形態は、本発明の原理および用途の単なる実例であることと理解すべきである。したがって、多くの改変が例示的な実施形態に対して行うことができ、その他の構成は、下記請求項により規定される本発明の主旨および範囲から逸脱することなく考案することができる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【配列表】
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