(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
かゆみの抑制又は治療に使用するための、ポリペプチドを含む医薬であって、該ポリペプチドは次のものを含み:
(i)非細胞毒性プロテアーゼ、ここで、該プロテアーゼは、かゆみ特異的DRGニューロン又は掻痒受容体においてSNAREタンパク質を切断することができる;
(ii)該かゆみ特異的DRGニューロン又は掻痒受容体上のMas関連Gタンパク質共役受容体(Mrgpr)に結合することのできる標的化部分(TM)、ここで、該Mas関連Gタンパク質共役受容体(Mrgpr)は、かゆみ特異的DRGニューロン又は掻痒受容体内にあるエンドソームに組み込まれるようにエンドサイトーシスを受けることができ、該かゆみ特異的DRGニューロン又は掻痒受容体は、該SNAREタンパク質を発現し;及び
(iii)エンドソーム内からエンドソーム膜を横切って該かゆみ特異的DRGニューロン又は掻痒受容体の細胞質ゾルにプロテアーゼを転位することのできる転位ドメイン;
ただし、該ポリペプチドは、クロストリジウム神経毒(ホロトキシン)分子ではないものとする。
【請求項２】
前記TMがMrgprX、MrgprA、及びMrgprCからなる群から選択される受容体に結合する、請求項1に記載の医薬。
【請求項３】
前記TMが、ウシ副腎髄質(BAM)ペプチド、メラニン細胞刺激ホルモンペプチド(MSH)、Y-G又はY-アミドで終端する神経ペプチド、クロロキン(CQ)、SLIGRL-NH2を含むペプチド、ヒスタミン、セロトニン、カプサイシン、コルチスタチン、及びその短縮型からなる群から選択される、請求項1又は2に記載の医薬。
【請求項４】
前記TMが、BAM8-22、γ2-MSH、SLIGRL、NPAF、NPFF、クロロキン(CQ)、ヒスタミン、セロトニン、カプサイシン、コルチスタチン、及びそれらの短縮型からなる群から選択される、請求項1〜3のいずれかに記載の医薬。
【請求項５】
前記TMがMrgprX1受容体に結合する、請求項1〜4のいずれかに記載の医薬。
【請求項６】
前記TMは、BAM8-22ペプチド又はその短縮型である、請求項1〜5のいずれかに記載の医薬。
【請求項７】
前記かゆみが、ヒスタミン非依存性のかゆみである、請求項1〜6のいずれかに記載の医薬。
【請求項８】
前記かゆみが、鎮痛剤の使用により引き起こされ又は悪化するかゆみである、請求項1〜7のいずれかに記載の医薬。
【請求項９】
前記鎮痛剤がオピオイド鎮痛剤である、請求項8に記載の医薬。
【請求項１０】
前記かゆみが、慢性のかゆみ、又は、腎疾患、肝疾患、癌、若しくは皮膚疾患に起因する慢性のかゆみである、請求項1〜9のいずれかに記載の医薬。
【請求項１１】
前記非細胞毒性プロテアーゼがクロストリジウム神経毒素L鎖又はIgAプロテアーゼを含む、請求項1〜10のいずれかに記載の医薬。
【請求項１２】
前記転位ドメインがクロストリジウム神経毒転位ドメインを含む、請求項1〜11のいずれかに記載の医薬。
【請求項１３】
かゆみの抑制又は治療に使用するための、請求項1〜12のいずれかにおいて定義されるポリペプチドをコードする核酸を含む医薬。
【請求項１４】
次のものを含むポリペプチド:
(i)非細胞毒性プロテアーゼ、ここで、該プロテアーゼは、かゆみ特異的DRGニューロン又は掻痒受容体においてSNAREタンパク質を切断することができる;
(ii)該かゆみ特異的DRGニューロン又は掻痒受容体上のMas関連Gタンパク質共役受容体(Mrgpr)に結合することのできる標的化部分(TM)、ここで、該Mas関連Gタンパク質共役受容体(Mrgpr)は、該かゆみ特異的DRGニューロン又は掻痒受容体内にあるエンドソームに組み込まれるようにエンドサイトーシスを受けることができ、該かゆみ特異的DRGニューロン又は掻痒受容体は、該SNAREタンパク質を発現し;及び
(iii)エンドソーム内からエンドソーム膜を横切って該かゆみ特異的DRGニューロン又は掻痒受容体の細胞質ゾルにプロテアーゼを転位することのできる転位ドメイン;
ただし、該ポリペプチドは、クロストリジウム神経毒(ホロトキシン)分子ではないものとし、該TMは、NPFF、NPAF、クロロキン(CQ)、SLIGRL-NH2を含むペプチド、ヒスタミン、セロトニン、及びその短縮型からなる群から選択される。
【請求項１５】
請求項14に記載のポリペプチドをコードする核酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、かゆみを抑制し又は治療するための方法及び組成物を提供する。
【背景技術】
【０００２】
医学的には掻痒症として知られているかゆみは、「引掻きに対する欲求又は反射を誘発する不快な皮膚感覚」であると定義されている。重度のかゆみを有する患者は、それに伴う不快感及び心理的障害、例えばうつ病や睡眠不足などのため、普通の生活を過ごすのが困難な場合が多いことが分かっている。また、かゆみは、多数の皮膚、全身及び神経系障害を伴う衰弱状態の場合もある。
【０００３】
かゆみは、痛みの知覚に関連する逃避反応によっては効果的に除去されないであろう昆虫及び植物の棘といった小さな取り付きの脅威から動物を保護するために進化したと仮定されている。かゆみニューロンと痛みニューロンと間における重複には近い進化的関係が明白である：両方とも、無髄Ｃ型神経線維（侵害受容体）の自由神経終末を介して仲介される。生体アミン、アルカロイド、プロテアーゼ及びペプチドといった、これらの神経を刺激することができる無数のメディエーターが存在する。侵害受容体は、それらの周辺軸索を介してメディエーターを検出し、脊髄にシグナルを送って、例えば、脳内にかゆみの知覚を生じさせる。臨床医にとって、かゆみと痛みとの重複は、神経因性疼痛を引き起こす可能性のある同じ神経疾患が神経障害性のかゆみも引き起こす可能性があることを意味する。しかしながら相違がある。痛みに効果的なほとんどの治療は、かゆみには有効ではない。注目すべきことに、オピオイド鎮痛剤（例えば、モルヒネ）などのいくつかの鎮痛剤はかゆみを引き起こし又は悪化させる。
【０００４】
最近の研究は、痛みとは別のかゆみ回路の特性を示し始めている。かゆみは、真皮表皮接合部及び表皮内に位置する「掻痒受容体（ｐｒｕｒｉｃｅｐｔｏｒ）」又はかゆみ特異的神経線維と呼ばれる侵害受容体のサブセットによって中継されることを特徴とすることが示唆されている。後根神経節（ＤＲＧ）又は三叉神経内における感覚ニューロンで特異的に発現する所定のＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）は、かゆみに固有の感覚に重要な役割を果たしていると考えられる。近年、この受容体群は、かゆみに固有なものとして同定され（すなわち、これらは痛み回路には関与していない）、かゆみを抑えることへの潜在的な治療標的となっている。
【０００５】
２０００年に実施された世界疾病負担（ＧＢＤ）研究によれば、人口の４％（約２．８億人）がかゆみに関連する症状に苦しめられている。現在、抗ヒスタミン剤及びコルチコステロイド剤が急性のかゆみのいくつかのタイプ及び慢性のかゆみのタイプの小さな割合を緩和することができる。しかし、これらのものは、腎疾患及び肝疾患、癌並びにアトピー性皮膚炎などの皮膚疾患に起因する慢性のかゆみのほとんどを治療しない。さらに、抗ヒスタミン剤は、ヒスタミン依存性のかゆみ（通常はアレルギー性刺激により誘発される）のみを打ち消す。しかし、ヒスタミン非依存性のかゆみがかゆみの大部分を占めている。
【発明の概要】
【０００６】
重度の引掻き行動は、皮膚を傷つけ、感染しやすくなり、免疫不全患者に深刻な合併症をもたらす場合がある（その際に、かゆみは、状態又は薬物反応に対して副次的なものである場合がある）。さらに、かゆみのため損傷しかつ感染した皮膚は、「かゆみ−引掻き−かゆみサイクル」（かゆみが引掻きを要求し、その引掻きがかゆみをさらに深めるサイクル）を強める場合が多い。医師が推奨するかゆみを緩和させる他の技術としては次のものが挙げられる：光線療法、緩い綿の服を身に着けること；温水の風呂に短時間に頻繁に入浴すること及び３０％〜４０％の湿度レベルの冷涼な環境を維持すること。しかし、これらの予防措置を常に維持することが可能であるとは限らない。したがって、当該技術分野には、かゆみを抑制又は治療するための新たな薬剤に対する要望が依然として存在する。
【０００７】
この要望は、上記の課題の一つ以上を解決する本発明によって対処される。
【０００８】
発明の概要
本発明は、被験体（例えば、患者）においてかゆみを抑制し又は治療するのに使用するための融合タンパク質を提供することによって上記の課題の一つ以上に対処し、該融合タンパク質は次のものを含み：
（ｉ）非細胞毒性プロテアーゼ、該プロテアーゼは、かゆみ特異的ＤＲＧニューロン又は掻痒受容体においてＳＮＡＲＥ（可溶性Ｎ−エチルマレイミド感受性因子付着タンパク質受容体）タンパク質を切断することができる；
（ii）かゆみ特異的ＤＲＧニューロン又は掻痒受容体上の結合部位に結合することのできる標的化部分（ＴＭ）、該結合部位は、かゆみ特異的ＤＲＧニューロン又は掻痒受容体内にあるエンドソームに組み込まれるようにエンドサイトーシスを受けることができ、該かゆみ特異的ＤＲＧニューロン又は掻痒受容体は、該ＳＮＡＲＥタンパク質を発現し；及び
（iii）エンドソーム内からエンドソーム膜を横切ってかゆみ特異的ＤＲＧニューロン又は掻痒受容体の細胞質ゾルにプロテアーゼを転位することのできる転位ドメイン；
ただし、該ポリペプチドは、クロストリジウム神経毒（ホロトキシン）分子ではないものとする。
【０００９】
また、第１の態様は、かゆみを抑制又は治療するための対応する方法を包含し、該方法は、患者に本発明のポリペプチドの治療上有効量を投与することを含む。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
発明の詳細な説明
本発明のポリペプチドは、天然に存在するクロストリジウム神経毒分子（クロストリジウムホロトキシンとしても知られている）ではない。クロストリジウムホロトキシンは、当業者に知られている最も致死性のある神経毒の一つであり、それ自体、治療用分子としてかなりの制限がある。また、かゆみを抑制する文脈において、クロストリジウムホロトキシンは、望ましくないオフサイト標的化、すなわち、かゆみ経路の神経細胞以外の細胞の標的化に関連する。
【００１１】
使用時に、本発明のポリペプチドは、かゆみ特異的ＤＲＧニューロン又は掻痒受容体上の受容体に結合する。転位成分は、かゆみ特異的ＤＲＧニューロン又は掻痒受容体の細胞質ゾルへのプロテアーゼ成分の輸送をもたらす。最終的に、内部に入ったら、プロテアーゼは、かゆみ特異的ＤＲＧニューロン又は掻痒受容体の細胞質ゾルに存在するＳＮＡＲＥタンパク質を切断することによって、かゆみ特異的ＤＲＧニューロン又は掻痒受容体の細胞外融合プロセスを阻害する。したがって、かゆみ特異的ＤＲＧニューロン又は掻痒受容体の細胞外融合器官を不活性化することにより、本発明のポリペプチドは、そこからの神経伝達物質の分泌を阻害する。したがって、本発明のポリペプチドは、かゆみ特異的ＤＲＧニューロン又は掻痒受容体から脊髄に送られる神経伝達物質のレベルを減少させ、それによってかゆみを抑制又は治療することができる。一実施形態では、神経伝達物質はアセチルコリンである。好ましい実施形態では、神経伝達物質はグルタメートである。別の好ましい実施形態では、神経伝達物質はガストリン放出タンパク質（ＧＲＰ）である。
【００１２】
本発明のポリペプチドは、それらが特定の標的細胞、かゆみ特異的ＤＲＧニューロン又は掻痒受容体からの分泌を阻害する能力を有する点で、他の治療を超える明確な利点を提供する。これに対し、他の提案された治療剤は、その効果を仲介する受容体に対する拮抗薬を使用することを試みることによってかゆみを軽減しようとするものである。しかしながら、本発明は、生成部位からの神経伝達物質の分泌を特異的に阻害する手段を提供する。
【００１３】
本発明の主要な標的細胞は、かゆみ特異的ＤＲＧニューロン又は掻痒受容体である。ＤＲＧ細胞は、脊柱付近の脊椎に沿って位置し、かゆみ特異的受容体として同定されているＭｒｇｐｒＸ１、ＭｒｇｐｒＡ３又はＭｒｇｐｒＣ１１などのＧＰＣＲの発現部位である。
【００１４】
本発明の融合タンパク質は、一般に、対応する「遊離」ＴＭ（すなわち、単離されたＴＭ自体）と比較したときに、標的細胞に対する結合親和性の低下（最大１０〜１００倍の範囲で）を示す。しかしながら、この観察結果にもかかわらず、本発明の融合タンパク質は、驚くべきことに、良好な有効性を示す。これは、２つの主要な特徴に起因し得る。第１に、非細胞毒性プロテアーゼ成分は触媒的である、すなわち、このような分子のいくつかの治療効果が標的細胞内で迅速に増幅される。第２に、標的細胞上に存在する受容体は、治療剤が入るためのゲートウェイとしてのみ作用する必要があり、かつ、必ずしもリガンド−受容体仲介薬理学的応答を達成するために必要なレベルまで刺激される必要はない。したがって、本発明の融合タンパク質は、典型的には高マイクログラムからミリグラム（さらには数百ミリグラムまで）量で投与される他の種類の治療用分子のために使用されるよりも低い用量で投与できる。対照的に、本発明の融合タンパク質は、非常に低い用量、典型的には少なくとも１０倍低い、より典型的には１００倍低い用量で投与できる。
【００１５】
非細胞毒性プロテアーゼ
本発明のＴＳＩポリペプチドの生物学的に活性な成分は、非細胞毒性プロテアーゼである。したがって、標的細胞の細胞質ゾルに供給されると、非細胞毒性プロテアーゼ成分は、所望の標的細胞内でＳＮＡＲＥ切断をもたらす。ＳＮＡＲＥタンパク質は、哺乳動物細胞内の分泌プロセスの必須成分であり、そのタンパク質分解不活性化は、該細胞からの分泌を抑制／阻害する。
【００１６】
非細胞毒性プロテアーゼは、細胞を死滅させない分子の個別的な部類である；その代わりに、これらのものは、タンパク質合成以外の細胞プロセスを阻害することによって作用する。非細胞毒性タンパク質は、様々な高等生物（例えば、植物及び動物）により産生される。このような高等生物の例は、ブラジルサソリである。さらに、非細胞毒性プロテアーゼは、様々な微生物、特にクロストリジウム属及びナイセリア属などの細菌により産生される。
【００１７】
クロストリジウム神経毒は、非細胞毒性毒素分子の主要な群を代表し、ジスルフィド結合によって互いに結合した２個のポリペプチド鎖を有する。これら２つの鎖は、約１００ｋＤａの分子量を有する重鎖（Ｈ鎖）及び約５０ｋＤａの分子量を有する軽鎖（Ｌ鎖）と呼ばれている。プロテアーゼ機能を有し、かつ、細胞外プロセスに関与する小胞又は形質膜会合ＳＮＡＲＥタンパク質（例えば、シンタキシン、ＳＮＡＰ及びシナプトブレビン（又はＶＡＭＰ））に対する高い基質特異性を示すのはＬ鎖である。これらの基質は、細胞の分泌機構の必須成分である。
【００１８】
ナイセリア属、最も顕著にはＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅは、機能的に類似する非細胞毒性毒素分子を生成する。このような非細胞毒性プロテアーゼの例は、ＩｇＡプロテアーゼである（ＷＯ９９／５８５７１を参照）。類似のＩｇＡプロテアーゼは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅなどの連鎖球菌により産生される。
【００１９】
したがって、一実施形態では、本発明の非細胞毒性プロテアーゼは、クロストリジウム神経毒素プロテアーゼ又はＩｇＡプロテアーゼとすることができる（例えばＷＯ９９／０３２２７２参照）。非細胞毒性プロテアーゼの他の例は、サソリ毒プロテアーゼ、例えばブラジルサソリＴｉｔｙｕｓ  ｓｅｒｒｕｌａｔｕｓの毒液、又はプロテアーゼのアンタレアーゼ（例えばＷＯ２０１１／０２２３５７号を参照）からのものである。
【００２０】
標的化部分（ＴＭ）
本発明の標的化部分（ＴＭ）成分を参照すると、この成分は、本発明のポリペプチドをかゆみ特異的ＤＲＧニューロン又は掻痒受容体に結合させるものである。このＴＭは、好ましくはペプチドである。
【００２１】
使用時には、本発明のポリペプチドは、かゆみ特異的ＤＲＧニューロン又は掻痒受容体に結合する。その後、ポリペプチドの転位成分は、かゆみ特異的ＤＲＧニューロン又は掻痒受容体の細胞質ゾルへのプロテアーゼ成分の輸送をもたらす。最終的には、一度内部に入ると、プロテアーゼは、かゆみ特異的ＤＲＧニューロン又は掻痒受容体の細胞質ゾルに存在するＳＮＡＲＥタンパク質を切断することによってかゆみ特異的ＤＲＧニューロン又は掻痒受容体の細胞外融合プロセスを阻害する。したがって、かゆみ特異的ＤＲＧニューロン又は掻痒受容体の細胞外融合器官を不活性化することにより、本発明のポリペプチドは、そこからの神経伝達物質の分泌を阻害する。したがって、本発明のポリペプチドは、脊髄を介したかゆみ知覚シグナルの脳への伝達を減少させ、それによってかゆみを抑制又は治療することができる。
【００２２】
このＴＭは、かゆみ特異的ＤＲＧニューロン又は掻痒受容体上の結合部位に結合し、これにより、他の細胞を超えるこの種の標的細胞に対するポリペプチドの選択性を与える。この点に関し、本発明の好ましいＴＭの実施形態としては、抗体（例えば、モノクローナル抗体、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）’2、Ｆｖ、ＳｃＦｖなどの抗体断片及び抗体ドメインペプチド）並びに以下に示す受容体に結合する結合骨格が挙げられる。したがって、本発明のポリペプチドは、問題の標的細胞又は受容体への特異的な結合を達成するように設計された市販の抗体又は結合骨格を含むことができる。あるいは、好ましいＴＭとしては、生体アミン、アルカロイド、プロテアーゼ、ペプチドリガンド及び神経ペプチドが挙げられる。
【００２３】
本発明のＴＭは、かゆみ特異的ＤＲＧニューロン又は掻痒受容体に結合する。一例として、本発明のポリペプチドのＴＭは、Ｍａｓ関連Ｇタンパク質受容体（例えばＭｒｇｐｒＸ１、ＭｒｇｐｒＡ３又はＭｒｇｐｒＣ１１）よりなる群から選択される、かゆみ特異的ＤＲＧニューロン又は掻痒受容体上のＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）に結合する。
【００２４】
一実施形態では、ＴＭは、ウシ副腎髄質ペプチド（例えばＢＡＭ8-22）、メラノサイト刺激ホルモンペプチド（例えば、γ２−ＭＳＨ）、ＲＦ／Ｙ−Ｇ又はＲＦ／Ｙ−アミドで終端する神経ペプチド（例えば、ＮＰＦＦ又はＮＰＡＦ）、ＳＬＩＧＲＬ−ＮＨ2を含むペプチド、アルカロイド（例えばクロロキン）、生体アミン（カプサイシン、ヒスタミン、セロトニン、コルチスタチン）並びにそれらの短縮物及びペプチドアナログから選択される。
【００２５】
一実施形態では、本発明のポリペプチドのＴＭは、ＭｒｇｐｒＸ１、ＭｒｇｐｒＡ３、又はＭｒｇｐｒＣ１１から選択されるかゆみ特異的ＤＲＧニューロン又は掻痒受容体上の受容体に結合する。これらの受容体の全ては、かゆみ特異的ＤＲＧニューロン又は掻痒受容体上で発現する。
【００２６】
一実施形態では、ＴＭは、ＢＡＭ8-22、γ２−ＭＳＨ、ＮＰＦＦ、ＮＰＡＦ、ＳＬＩＧＲＬ−ＮＨ2、クロロキン、カプサイシン、ヒスタミン、セロトニン、コルチスタチン並びにそれらの短縮型及びペプチドアナログから選択される。
【００２７】
一実施形態では、本発明のポリペプチドのＴＭは、Ｍｒｇｐｒ受容体、好ましくはＭｒｇｐｒＸ、ＭｒｇｐｒＡ又はＭｒｇｐｒＣに結合する。一実施形態では、本発明のポリペプチドは、ＭｒｇｐｒＸ１又はＭｒｇｐｒＡ３又はＭｒｇｐｒＣ１１に結合する。一例として、好適なＴＭとしては、ＢＡＭ8-22、クロロキン、γ２−ＭＳＨ、ＲＦ／Ｙ−Ｇ又はＲＦ／Ｙ−アミドで終端する神経ペプチド（例えばＮＰＦＦ又はＮＰＡＦ）、カプサイシン、ヒスタミン、セロトニン又はコルチスタチンが挙げられる。これらのＴＭは、Ｍｒｇｐｒへの結合のために好ましい。
【００２８】
好ましい実施形態では、ＴＭは、ＭｒｇｐｒＸ受容体、好ましくＭｒｇｐｒＸ１に結合する；また、ＴＭは、ＢＡＭ8-22又はその短縮型若しくはペプチドアナログであることが好ましい。
【００２９】
転位ドメイン
本発明の転位成分は、標的細胞への非細胞毒性プロテアーゼ（又はその断片）の転位を可能にし、それにより、プロテアーゼ活性の機能的発現が標的細胞の細胞質内で生じる。転位成分は、好ましくは、低ｐＨ条件下で脂質膜（例えば、エンドソーム膜）内にイオン透過孔を形成できる。転位成分は、微生物タンパク質源、例えば、細菌又はウイルスタンパク源から得ることができる。したがって、一実施形態では、転位成分は、細菌毒素などの酵素の転位ドメインを含む又はそれからなる。別の実施形態では、転位ドメインは、ウイルスタンパク質の転位ドメインを含む又はそれからなる。一実施形態では、本発明の転位成分は、クロストリジウム神経毒のＨNドメイン（又はその転位性断片）などのクロストリジウム神経毒素Ｈ鎖又はその断片を含む又はそれからなる。
【００３０】
ポリペプチド製剤
本発明のポリペプチドは、次の３つの主成分を含む：「生理活性」（すなわち非細胞毒性プロテアーゼ）；ＴＭ；及び転位ドメイン。このような融合タンパク質の調製に関連した一般的な技術は、再標的化毒素技術と呼ばれる場合が多い。例えば、ＷＯ９４／２１３００号；ＷＯ９６／３３２７３号；ＷＯ９８／０７８６４号；ＷＯ００／１０５９８号；ＷＯ０１／２１２１３号；ＷＯ０６／０５９０９３号；ＷＯ００／６２８１４号；ＷＯ００／０４９２６号；ＷＯ９３／１５７６６号；ＷＯ００／６１１９２号；及びＷＯ９９／５８５７１号を参照されたい。これらの刊行物の全ては、本明細書中において引用により援用される。
【００３１】
より詳細には、本発明のＴＭ成分は、本発明のプロテアーゼ成分又は転位成分のいずれかに融合できる。該融合は、好ましくは、共有結合、例えば直接共有結合による又はスペーサー／リンカー分子を介する。プロテアーゼ成分及び転位成分は、好ましくは、共有結合、例えば、直接共有結合を介して又はスペーサー／リンカー分子を介して互いに結合する。好適なスペーサー／リンカー分子は、当該技術分野において周知であり、典型的には５〜４０のアミノ酸ベース配列、好ましくは１０〜３０アミノ酸残基長を有する。
【００３２】
使用中に、ポリペプチドは、プロテアーゼ成分と転位成分とが好ましくはジスルフィド結合を介して互いに結合した二本鎖コンフォメーションを有する。
【００３３】
本発明のポリペプチドは、当業者に周知の従来の化学的コンジュゲーション技術によって調製できる。一例として、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．（１９９６），Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、及びＷｏｎｇ，Ｓ．Ｓ．（１９９１），Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎａｇｙ外，ＰＮＡＳ  ９５  ｐ１７９４−９９（１９９８）を参照されたい。本発明のポリペプチドに合成ＴＭを結合させるためのさらに詳細な方法は、例えばＥＰ０２５７７４２号に提供されている。上記コンジュゲーションの刊行物は、本明細書において参照により援用される。
【００３４】
あるいは、ポリペプチドは、単一ポリペプチド融合タンパク質の組換え調製によって調製できる（例えばＷＯ９８／０７８６４号参照）。この技術は、天然クロストリジウム神経毒（すなわちホロトキシン）を準備し、そして次の「単純化された」構造配置を有する融合タンパク質を得る生体内細菌メカニズムに基づく：
ＮＨ2−［プロテアーゼ成分］−［転位成分］−［ＴＭ］−ＣＯＯＨ。
【００３５】
ＷＯ９８／０７８６４号によれば、ＴＭは、融合タンパク質のＣ末端の方に位置する。その後、この融合タンパク質は、プロテアーゼ成分と転位成分との間の部位で切断するプロテアーゼによる処理によって活性化される。このようにして、単一のポリペプチド鎖としてのプロテアーゼ成分が転位成分＋ＴＭを含有する別の単一のポリペプチド鎖に共有結合（ジスルフィド架橋を介して）してなる二本鎖タンパク質が生成される。
【００３６】
あるいは、ＷＯ０６／０５９０９３によれば、融合タンパク質のＴＭ成分は、プロテアーゼ切断部位と転位成分との間において、直鎖融合タンパク質配列の中央の方に位置する。これは、ＴＭが転位ドメインに結合することを確実にする（すなわち天然クロストリジウムホロトキシンで生じるように）が、この場合には、これら２つの成分は、天然ホロトキシンに対して順番に反転する。プロテアーゼ切断部位でのその後の切断により、ＴＭのＮ末端部分が露出し、二本鎖ポリペプチド融合タンパク質が得られる。
【００３７】
さらなる変形例は、融合タンパク質のＴＭ成分の「スプリットリガンド」提示である。ここで、リガンドとして作用するＴＭ成分は、遊離Ｎ末端ドメイン及び遊離Ｃ末端ドメインの両方を有する。したがって、ＴＭは、標的化部分のＮ末端部分と結合部位のドメインとの相互作用により標的細胞上の結合部位（例えば、受容体又はアクセプター）と相互作用することができる。あるいは、ＴＭは、標的化部分のＣ末端部分と結合部位のドメインとの相互作用が可能である。又は、ＴＭは、標的化部分のＮ末端部分が結合部位のドメインと相互作用し、標的化部分のＣ末端部分が結合部位のドメインと相互作用する二重相互作用が可能である。この後者の実施形態では、ＴＭのＮ末端及びＣ末端部分は、結合部位の同一又は異なるドメインに結合でき、及び／又は異なる結合部位のドメインに結合できる。この構成に関するさらなる情報は、ＷＯ２０１２１５６７４３号に見出すことができる。この文献は、本明細書において引用により援用される。
【００３８】
上記のプロテアーゼ切断配列は、従来の手段、例えば部位特異的変異誘発によってＤＮＡレベルで導入できる（及び／又は任意の固有切断配列を除去）。切断配列の存在を確認するためのスクリーニングは、手作業で又はコンピュータソフトウェア（例えばＤＮＡＳＴＡＲ社のＭａｐＤｒａｗプログラム）の助けを借りて実行できる。任意のプロテアーゼ切断部位を使用することができる（すなわち、クロストリジウム又は非クロストリジウム）が、次のものが好ましい：
エンテロキナーゼ              （ＤＤＤＤＫ↓）（配列番号１）
因子Ｘａ                      （ＩＥＧＲ↓／ＩＤＧＲ↓）（配列番号２及び３）
ＴＥＶ（タバコエッチウイルス）（ＥＮＬＹＦＱ↓Ｇ）（配列番号４）
トロンビン                    （ＬＶＰＲ↓ＧＳ）（配列番号５）
ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ        （ＬＥＶＬＦＱ↓ＧＰ）（配列番号６）
【００３９】
追加のプロテアーゼ切断部位としては、非細胞毒性プロテアーゼ、例えばクロストリジウム神経毒によって切断される認識配列が挙げられる。これらのものとしては、クロストリジウム神経毒のような非細胞毒性プロテアーゼによって切断されるＳＮＡＲＥ（例えば、ＳＮＡＰ−２５、シンタキシン、ＶＡＭＰ）タンパク質認識配列が挙げられる。特定の例がＵＳ２００７／０１６６３３２号に提供されている。この文献は、本明細書において引用によりその全体が援用される。
【００４０】
また、用語「プロテアーゼ切断部位」に包含されるのは、自己切断配列であるインテインである。自己スプライシング反応は、例えば、存在する還元剤の濃度を変化させることによって制御可能である。また、「破壊的」切断部位（以下で説明）を本発明のポリペプチドに組み込むべき場合には、上記「活性化」切断部位を使用することもできる。
【００４１】
好ましい実施形態では、本発明の融合タンパク質は、Ｎ末端及び／又はＣ末端に位置する１個以上の精製タグを含むことができる。任意の精製タグを使用することができるが、次のものが好ましい：
好ましくはＣ末端及び／又はＮ末端タグとしてＨｉｓタグ（例えば６×ヒスチジン）（配列番号７）
好ましくはＮ末端タグとしてＭＢＰタグ（マルトース結合タンパク質）
好ましくはＮ末端タグとしてＧＳＴタグ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）
好ましくはＮ末端タグとしてＨｉｓ−ＭＢＰタグ
好ましくはＮ末端タグとしてＧＳＴ−ＭＢＰタグ
好ましくはＮ末端タグとしてチオレドキシンタグ
好ましくはＮ末端タグとしてＣＢＤ−タグ（キチン結合ドメイン）。
【００４２】
１個以上のペプチドスペーサー／リンカー分子を融合タンパク質に含めることができる。例えば、精製タグと融合タンパク質分子の残部との間にペプチドスペーサーを使用することができる。
【００４３】
また、本発明は、上記融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列も提供する。本発明の好ましい態様では、ＤＮＡ配列は、ＤＮＡベクターの一部として調製され、該ベクターは、プロモーター及びターミネーターを含む。
【００４４】
好ましい実施形態では、ベクターは、次のものから選択されたプロモーターを有する：
プロモーター                誘導剤            典型的な誘導条件
Ｔａｃ（ハイブリッド）      ＩＰＴＧ          ０．２ｍＭ（０．０５−２．０ｍＭ）
ＡｒａＢＡＤ                Ｌ−アラビノース  ０．２％（０．００２−０．４％）
Ｔ７−ｌａｃオペレーター    ＩＰＴＧ          ０．２ｍＭ（０．０５−２．０ｍＭ）
【００４５】
本発明のＤＮＡ構築は、好ましくはｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで設計され、次いで、従来のＤＮＡ合成技術によって合成される。
【００４６】
上記ＤＮＡ配列情報は、使用されるべき最終的な宿主細胞（例えば、大腸菌）発現系に応じたコドンバイアスのために任意に修飾される。
【００４７】
ＤＮＡ骨格は、好ましくは、転写及び翻訳されると第２ペプチドコード配列によりコードされるプロテアーゼ切断部位に相当するアミノ酸配列を生成するであろう任意の固有の核酸配列に対してスクリーニングされる。このスクリーニングは、手作業で又はコンピュータソフトウェア（例えばＤＮＡＳＴＡＲ社によるＭａｐＤｒａｗプログラム）の助けを借りて実行できる。
【００４８】
ここで使用するときに「抑制」及び「治療」への言及は、被験体に治療上の利益を提供することを意味する。これは、例えば、本明細書において定義される融合タンパク質を投与してかゆみのつらさを防ぎ又は軽減することを含む。
【００４９】
本発明のさらなる態様は、かゆみを防ぐ又は抑制する方法を提供し、該方法は、被検体に次のものを含む融合タンパク質の治療上有効量を投与することを含み：
（ｉ）非細胞毒性プロテアーゼ、該プロテアーゼは、かゆみ特異的ＤＲＧニューロン又は掻痒受容体においてＳＮＡＲＥタンパク質を切断することができる；
（ii）かゆみ特異的ＤＲＧニューロン又は掻痒受容体上の結合部位に結合することのできる標的化部分（ＴＭ）、該結合部位は、かゆみ特異的ＤＲＧニューロン又は掻痒受容体内にあるエンドソームに組み込まれるようにエンドサイトーシスを受けることができ、該かゆみ特異的ＤＲＧニューロン又は掻痒受容体は、該ＳＮＡＲＥタンパク質を発現し；及び
（iii）エンドソーム内からエンドソーム膜を横切ってかゆみ特異的ＤＲＧニューロン又は掻痒受容体の細胞質ゾルにプロテアーゼを転位することのできる転位ドメイン；
ただし、該ポリペプチドは、クロストリジウム神経毒（ホロトキシン）分子ではないものとする。
【００５０】
本発明の融合タンパク質は、融合タンパク質がオフサイト位置に移行するかもしれない場合に切断に影響を受けやすい（局所的なプロテアーゼにより）破壊的プロテアーゼ切断部位を含むことができる。このアプローチは、オフサイト標的化の危険性を最小限に抑えることができる。したがって、本発明の融合タンパク質は、例えばＷＯ２０１０／０９４９０５号及びＷＯ２００２／４４１９９号に記載されるように、１個以上の破壊的切断部位を含むように設計できる。これらの文献のそれぞれは、本明細書において引用によりその全体が援用される。
【００５１】
ポリペプチド送達
使用の際に、本発明は、ポリペプチドを、薬学的に許容されるキャリア、賦形剤、補助剤、推進剤及び／又は塩から選択される少なくとも１種の成分と共に含む医薬組成物を使用する。
【００５２】
本発明のポリペプチドは、経口、非経口、連続注入、移植、吸入又は局所適用のために処方できる。注射に適した組成物は、溶液、懸濁液若しくはエマルジョン又は使用前に適切なビヒクル中に溶解若しくは懸濁される乾燥粉末の形態にあることができる。
【００５３】
局所送達手段としては、経口又は胃送達を挙げることができる。この点に関して、例えば、腸溶性カプセル又はミクロスフェアなどの他の微粒子系における製剤を使用することができる。また、腹腔鏡手術による十二指腸への局所投与も可能である。局所送達の他の例としては、経皮送達（接着パッチによる）を挙げることができる。
【００５４】
好ましい投与経路は、全身、経口、腹腔鏡及び／又は局所注射から選択される。
【００５５】
注射用製剤の場合には、投与部位での保持を補助する又は投与部位からのポリペプチドの除去を減少させるように薬学的に活性な物質を含むことは任意である。このような薬学的に活性な物質の一例は、アドレナリンなどの血管収縮剤である。このような製剤は、投与後のポリペプチドの残留時間を増加させ、それによってその効果を増大及び／又は向上させるという利点を与える。
【００５６】
本発明のポリペプチドの投与のための用量範囲は、所望の治療効果を生じさせるためのものである。必要な用量範囲は、ポリペプチド又は組成物の正確な性質、投与経路、製剤の性質、患者の年齢、患者の状態の性質、程度又は重症度、もしあれば禁忌及び主治医の判断に依存することが分かるであろう。これらの用量レベルの変化は、最適化のために標準的な経験的ルーチンを用いて調節できる。
【００５７】
好適な一日用量（患者の体重１ｋｇあたり）は、０．０００１〜１ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．０００１〜０．５ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは０．００２〜０．５ｍｇ／ｋｇ、特に好ましくは０．００４〜０．５ｍｇ／ｋｇの範囲にある。単位用量は、用量当たり１μｇ未満から３０ｍｇまで変更できるが、典型的には０．０１〜１ｍｇの範囲であり、これは、毎日又は好ましくはそれほど頻繁でなく、例えば１週間毎又は６ヶ月毎に投与できる。
【００５８】
特に好ましい投与計画は、１×用量として２．５ｎｇのポリペプチドに基づく。この点に関して、好ましい用量範囲は、１×〜１００×（すなわち、２．５〜２５０ｎｇ）の範囲である。
【００５９】
液体剤形は、典型的には、ポリペプチドと発熱物質を含まない滅菌ビヒクルとを利用して調製される。ポリペプチドは、使用されるビヒクル及び濃度に応じて、ビヒクルに溶解又は懸濁できる。溶液の調製の際に、ポリペプチドは、ビヒクルに溶解でき、ここで、この溶液を、必要に応じて塩化ナトリウムの添加によって等張にし、そして無菌技術を使用して滅菌フィルターを介して濾過により滅菌してから、好適な滅菌バイアル又はアンプルに充填し密閉する。或いは、溶液の安定性が十分な場合には、その密閉容器内の溶液をオートクレーブによって滅菌してもよい。有利には、緩衝剤、可溶化剤、安定化剤、防腐剤又は殺菌剤、懸濁剤又は乳化剤及び／又は局所麻酔剤などの添加剤をビヒクルに溶解できる。
【００６０】
使用前に好適なビヒクルに溶解又は懸濁される乾燥粉末は、滅菌領域内で無菌技術を使用して滅菌容器に予め滅菌された成分を充填することにより調製できる。或いは、これらの成分は、滅菌領域で無菌技術を使用して適切な容器内で溶解できる。次いで、生成物を凍結乾燥し、容器を無菌的に密閉する。
【００６１】
筋肉内、皮下又は皮内注射に適した非経口懸濁液も実質的に同じ方法で調製されるが、ただし、滅菌を濾過によって達成できない場合には無菌成分を滅菌ビヒクルに溶解させる代わりに懸濁させる。これらの成分は、滅菌状態で単離してよく、或いは単離後に例えばガンマ線照射により滅菌してもよい。
【００６２】
有利には、懸濁剤、例えばポリビニルピロリドンが成分の均一な分布を容易にするために組成物中に含まれる。
【００６３】
本発明による投与は、微粒子カプセル化、ウイルス送達系又は高圧エアロゾル衝突を含めた様々な送達技術の利益を得ることができる。
【００６４】
定義の節
標的化部分（ＴＭ）とは、結合部位と機能的に相互作用して、本発明のポリペプチドと標的細胞の表面との間に物理的会合を生じさせる任意の化学構造を意味する。本発明において、標的細胞は、かゆみ特異的ＤＲＧニューロン又は掻痒受容体である。用語ＴＭは、標的細胞上の結合部位に結合することができ、その結合部位が内部移行（例えば、エンドソーム形成）（受容体仲介エンドサイトーシスともいう）可能である任意の分子（すなわち、天然型分子又はその化学的／物理的に修飾された変異体）を包含する。ＴＭは、エンドソーム膜転位機能を有することができ、その場合には、別々のＴＭ及び転位ドメインの構成要素は、本発明の薬剤中に存在する必要はない。上記説明を通して、特定のＴＭが記載されている。該ＴＭに対する言及は単なる例示であり、本発明は、例示したＴＭの基本的な結合（すなわち標的化）能力を保持するその変異体及び誘導体の全てを包含する。
【００６５】
本発明に係るＴＭは、抗体（例えば、抗体断片）及び結合骨格；特に標的細胞への結合（例えば特異的に）のために設計された市販の抗体／断片及び骨格を含む。
【００６６】
タンパク質骨格は、それぞれ本発明のＴＭとして使用できるｓｃＦｖ、Ｆａｂ分子、ｄＡｂ（単一ドメイン抗体）、ラクダ抗体、二重特異性抗体及び低分子化抗体などの治療用モノクローナル抗体及び誘導体の拡大レパートリーを補完するために、一般的な結合フレームワークの新世代を代表する。骨格系は、新規の骨格の作製又は既知のタンパク質結合ドメインの修飾により、既知のタンパク質認識ドメインを生じさせる又は修飾する。このような骨格としては、次のものが挙げられるが、これらに限定されない：
（ｉ）プロテインＡ系の骨格−アフィボディ（Ｎｏｒｄ，Ｋ外，１９９７，「Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｓｅｌｅｃｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  ｏｆ  ａｎ  ａｌｐｈａ−ｈｅｌｉｃａｌ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｄｏｍａｉｎ」，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １５，７７２−７７７）。
（ｉｉ）リポカリン系の骨格−アンチカリン（Ｓｋｅｒｒａ  ２００８「Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ａｎｔｉｃａｌｉｎｓ  −  ｈａｒｎｅｓｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌｉｐｏｃａｌｉｎ  ｌｉｇａｎｄ  ｐｏｃｋｅｔ  ｔｏ  ｅｎｇｉｎｅｅｒ  ｎｏｖｅｌ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ」，ＦＥＢＳ  Ｊ．２７５：２６７７−８３）；
（ｉｉｉ）フィブロネクチン系の骨格−アドネクチン（Ｄｉｎｅｅｎ外，２００８，「Ｔｈｅ  Ａｄｎｅｃｔｉｎ  ＣＴ−３２２  ｉｓ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ＶＥＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ２  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｔｈａｔ  ｄｅｃｒｅａｓｅｓ  ｔｕｍｏｕｒ  ｂｕｒｄｅｎ  ｉｎ  ａｎ  ｏｒｔｈｏｔｒｏｐｉｃ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ」，ＢＭＣ  Ｃａｎｃｅｒ  ８：３５２）；
（ｉｖ）アビマー（Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ外，２００５，「Ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ  ａｖｉｍｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｅｖｏｌｖｅｄ  ｂｙ  ｅｘｏｎ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｄｏｍａｉｎｓ」，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２３：１５５６−６１）；
（ｖ）アンキリン系の骨格−ダルピン（Ｚａｈｎｄ外，２００６，「Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｅｒ２  ｂｉｎｄｉｎｇ−ｄｅｓｉｇｎｅｄ  ａｎｋｙｒｉｎ  ｒｅｐｅａｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ」，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２８１：３５１６７−７５）；及び
（ｖｉ）センチリン骨格−ＣＤＲに類似するループを有するＩｇドメインとの有意な構造的相同性を有するタンパク質の折り畳みに基づく。Ｉｇドメインは、ヒトタンパク質における共通の基本単位であり、代わりの骨格タンパク質として広く応用されている。上記「骨格」の刊行物のそれぞれは、引用により（その全体が）援用される。
【００６７】
結合性骨格を使用して、特定の細胞表面タンパク質、受容体又は糖基などの他の細胞表面エピトープとの相互作用により特定の細胞型を標的化することができる。このような修飾された骨格は、本発明の組換え非細胞毒性プロテアーゼ系ポリペプチドに設計できる。
【００６８】
本発明のＴＭは、問題のかゆみ特異的ＤＲＧニューロン又は掻痒受容体標的細胞に結合する（好ましくは特異的に結合する）。用語「特異的に結合する」とは、好ましくは、所定のＴＭが、１０6Ｍ-1以上、好ましくは１０7Ｍ-1以上、より好ましくは１０8Ｍ-1以上、最も好ましくは１０9Ｍ-1以上の結合親和性（Ｋａ）で標的細胞に結合することを意味する。また、用語「特異的に結合する」とは、所定のＴＭが１０6Ｍ-1以上、好ましくは１０7Ｍ-1以上、より好ましくは１０8Ｍ-1以上、最も好ましくは１０9Ｍ-1以上の結合親和性（Ｋａ）で所定の受容体、Ｍａｓ関連Ｇタンパク質共役受容体（例えばＭｒｇｐｒＸ１又はＭｒｇｐｒＡ1-3又はＭｒｇｐｒＣ１１）に結合することも意味することができる。
【００６９】
本願明細書におけるＴＭへの言及は、問題の標的細胞に結合する能力を保持するその断片及び変異体を包含する。例えば、変異体は、基準ＴＭ（リファレンスＴＭ）（例えば、ＴＭを定義する、本明細書に与えた任意の配列番号）と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９７％又は少なくとも９９％のアミノ酸配列相同性を有することができる。したがって、変異体は、アミノ酸（例えば非天然アミノ酸）の１種以上のアナログ又は置換結合を含むことができる。また、例として、ＴＭに関連して使用される用語「断片」とは、基準ＴＭの少なくとも１０、好ましくは少なくとも２０、より好ましくは少なくとも３０、最も好ましくは少なくとも４０個のアミノ酸残基を有するペプチドを意味する。また、用語「断片」は、上記の変異体にも関する。したがって、例として、本発明の断片は、少なくとも１０、２０、３０又は４０個のアミノ酸を有するペプチド配列を含むことができ、該ペプチド配列は、基準ペプチドのアミノ酸の対応するペプチド配列（連続した）に対して少なくとも８０％の配列相同性を有する。
【００７０】
ＴＭが選択された標的細胞に結合することを確認することはルーチンである。例えば、単純な放射性置換実験を使用することができ、その際に、問題の標的細胞を代表する組織又は細胞を過剰の非標識ＴＭの存在下で標識（例えばトリチウム化）ＴＭに曝露する。このような実験では、非特異的及び特異的結合の相対的割合を評価し、それによってＴＭが標的細胞に結合することを確認することを可能にすることができる。任意に、このアッセイは、１種以上の結合アンタゴニストを含むことができ、このアッセイは、ＴＭ結合の欠失を観察することをさらに含むことができる。この種の実験の例は、Ｈｕｌｍｅ，Ｅ．Ｃ．（１９９０），Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｔｕｄｉｅｓ，ａ  ｂｒｉｅｆ  ｏｕｔｌｉｎｅ，ｐｐ．３０３−３１１，Ｉｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｅ．Ｃ．Ｈｕｌｍｅ著，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓに記載されている。
【００７１】
本発明において、ペプチドＴＭに対する言及には、そのペプチドアナログが含まれるが、ただし、該アナログが対応する「基準」ＴＭと同じ受容体に結合する場合に限る。
【００７２】
本発明の融合タンパク質（ポリペプチドともいう）は、クロストリジウム神経毒の機能性ＨC又はＨCCドメインを欠失していてよい。一実施形態では、ポリペプチドは、クロストリジウム神経毒ホロトキシンの最後の５０個のＣ末端アミノ酸を欠失する。別の実施形態では、ポリペプチドは、クロストリジウム神経毒ホロトキシンの最後の１００、１５０、２００、２５０又は３００個のＣ末端アミノ酸残基を欠失する。あるいは、ＨC結合活性は、突然変異誘発により打ち消す／低減することができる。例として、便宜上ＢｏＮＴ／Ａを参照すると、ガングリオシド結合ポケット内における１又は２個のアミノ酸残基変異の修飾（Ｗ１２６６をＬに及びＹ１２６７をＦに）により、ＨC領域がその受容体結合機能を失う。同様の変異を、非血清型Ａクロストリジウムペプチド成分、例えば変異（Ｗ１２６２からＬ及びＹ１２６３からＦ）を有するボツリヌスＢ又はボツリヌスＥ（Ｗ１２２４からＬ及びＹ１２２５からＦ）に基づく構築物に対して行うことができる。活性部位への他の変異は、ＨC受容体結合活性の同じアブレーション、例えばＡ型ボツリヌス毒素におけるＹ１２６７Ｓ及び他のクロストリジウム神経毒における対応する高度保存残基を達成する。この及び他の変異の詳細は、Ｒｕｍｍｅｌ外（２００４）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５１：６３１−６３４）に記載されている。この文献を本明細書において引用により援用する。
【００７３】
天然クロストリジウム神経毒のＨCペプチドは、約４００〜４４０個のアミノ酸残基を含み、かつ、それぞれ約２５ｋＤａの２つの機能的に異なるドメイン、すなわち、Ｎ末端領域（一般にＨCNペプチド又はドメインと呼ばれる）及びＣ末端領域（一般にＨCCペプチド又はドメインと呼ばれる）からなる。さらに、Ｃ末端の１６０〜２００個のアミノ酸残基を構成するＣ末端領域（ＨCC）がクロストリジウム菌神経毒素のその天然細胞受容体、すなわち神経筋接合部における神経終末への結合の原因であることがよく実証されている。このように、本明細書を通じて、重鎖が、天然クロストリジウム神経毒が結合する細胞表面受容体に結合することができないように機能性重鎖ＨCペプチド（又はドメイン）を欠失するクロストリジウム重鎖に対する言及は、クロストリジウム重鎖が単に機能性ＨCCペプチドを欠失していることを意味する。言い換えれば、ＨCCペプチド領域は、神経筋接合部での神経終末のためのその天然の結合能力を不活性化させるために、部分的又は完全に欠失し、又はそうでなければ修飾される（例えば、従来の化学的又はタンパク質分解処理によって）。
【００７４】
したがって、一実施形態では、本発明のクロストリジウムＨNペプチドは、クロストリジウム神経毒のＣ末端ペプチド部分（ＨCC）の一部を欠失しているため、天然クロストリジウム神経毒のＨC結合機能を喪失している。例として、一実施形態では、Ｃ末端延長クロストリジウムＨNペプチドは、クロストリジウム神経毒重鎖のＣ末端の４０個のアミノ酸残基、又はＣ末端の６０個のアミノ酸残基、又はＣ末端の８０個のアミノ酸残基、又はＣ末端の１００個のアミノ酸残基、又はＣ末端の１２０個のアミノ酸残基、又はＣ末端の１４０個のアミノ酸残基、又はＣ末端の１５０個のアミノ酸残基、又はＣ末端の１６０個のアミノ酸残基を欠失している。別の実施形態では、本発明のクロストリジウムＨNペプチドは、クロストリジウム神経毒の全Ｃ末端ペプチド部分（ＨCC）を欠失しているため、天然クロストリジウム神経毒のＨC結合機能を喪失している。例として、一実施形態では、クロストリジウムＨNペプチドは、クロストリジウム菌神経毒素重鎖のＣ末端の１６５個アミノ酸残基、又はＣ末端の１７０個のアミノ酸残基、又はＣ末端の１７５個のアミノ酸残基、又はＣ末端の１８０個のアミノ酸残基、又はＣ末端の１８５個のアミノ酸残基、又はＣ末端の１９０個のアミノ酸残基、又はＣ末端の１９５個のアミノ酸残基を欠失する。さらなる例として、本発明のクロストリジウムＨNペプチドは、次のものよりなる群から選択されるクロストリジウムＨCC基準配列を欠失する：
Ａ型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基（Ｙ１１１１−Ｌ１２９６）
Ｂ型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基（Ｙ１０９８−Ｅ１２９１）
Ｃ型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基（Ｙ１１１２−Ｅ１２９１）
Ｄ型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基（Ｙ１０９９−Ｅ１２７６）
Ｅ型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基（Ｙ１０８６−Ｋ１２５２）
Ｆ型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基（Ｙ１１０６−Ｅ１２７４）
Ｇ型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基（Ｙ１１０６−Ｅ１２９７）
破傷風神経毒−アミノ酸残基（Ｙ１１２８−Ｄ１３１５）。
【００７５】
上記特定の基準配列は、ガイドと見なすべきである。亜血清型に応じてわずかな変化が生じることがあるからである。
【００７６】
本発明のプロテアーゼは、真核細胞における細胞外融合器官の１種以上のタンパク質を切断することのできる全ての非細胞毒性プロテアーゼを包含する。
【００７７】
本発明のプロテアーゼは、好ましくは、細菌プロテアーゼ（又はその断片）である。より好ましくは、細菌プロテアーゼは、クロストリジウム属又はナイセリア／ストレプトコッカス属（例えば、クロストリジウムＬ鎖又は好ましくはＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ又はＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅからのナイセリアＩｇＡプロテアーゼ）から選択される。非細胞毒性プロテアーゼの他の例としては、サソリ毒プロテアーゼ、例えば、ブラジルサソリＴｉｔｙｕｓ  ｓｅｒｒｕｌａｔｕｓの毒からのもの又はプロテアーゼアンタレアーゼが挙げられる。
【００７８】
また、本発明は、変異型非細胞毒性タンパク質（すなわち、天然型プロテアーゼ分子の変異体）を包含するが、ただし、該変異型プロテアーゼが依然として必要なプロテアーゼ活性を示す場合に限る。例えば、変異体は、基準プロテアーゼ配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％又は少なくとも９８％のアミノ酸配列相同性を有することができる。したがって、用語「変異体」には、エンドペプチダーゼ活性が強化された（又は減少した）非細胞毒性プロテアーゼが含まれる。ここで、特に、ＢｏＮＴ／Ａ変異体Ｑ１６１Ａ、Ｅ５４Ａ及びＫ１６５ＬのＫcat／Ｋmの増加に言及しておく。Ａｈｍｅｄ，Ｓ．Ａ．（２００８）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｊ．ＤＯＩ １０．１００７／ｓ１０９３０−００７−９１１８−８を参照されたい。この文献は、引用により援用される。プロテアーゼに関連して使用されるときに、用語「断片」とは、典型的には、基準プロテアーゼの少なくとも１５０個、好ましくは少なくとも２００個、より好ましくは少なくとも２５０個、最も好ましくは少なくとも３００個のアミノ酸残基を有するペプチドを意味する。ＴＭ「断片」成分（上で議論した）と同様に、本発明のプロテアーゼ「断片」は、基準配列に基づく変異型プロテアーゼの断片を包含する。
【００７９】
本発明のプロテアーゼは、好ましくはセリン又はメタロプロテアーゼ活性（例えば、エンドペプチダーゼ活性）を示す。プロテアーゼは、好ましくはＳＮＡＲＥタンパク質（例えば、ＳＮＡＰ−２５、シナプトブレビン／ＶＡＭＰ、又はシンタキシン）に特異的である。
【００８０】
特に、神経毒のプロテアーゼドメイン、例えば細菌神経毒のプロテアーゼドメインが挙げられる。したがって、本発明は、自然界に存在する神経毒ドメイン並びに天然型神経毒の組換えにより調製されたバージョンの使用を包含する。
【００８１】
代表的な神経毒はクロストリジウムによって産生され、用語「クロストリジウム神経毒」には、Ｃ．ｔｅｔａｎｉ（ＴｅＮＴ）及びＣ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ（ＢｏＮＴ）血清型Ａ〜Ｇによって産生される神経毒並びにＣ．ｂａｒａｔｉｉ及びＣ．ｂｕｔｙｒｉｃｕｍによって産生される密接に関連するＢｏＮＴ様神経毒が包含される。上記略語を、本明細書を通して使用する。例えば、ＢｏＮＴ／Ａの命名は、ＢｏＮＴ（血清型Ａ）としての神経毒源を示す。対応する命名法が他のＢｏＮＴ血清型にも当てはまる。
【００８２】
ＢｏＮＴは、知られている最も強力な毒素であり、マウスについての５０％致死量（ＬＤ５０）値は、血清型に応じて０．５〜５ｎｇ／ｋｇの範囲である。ＢｏＮＴは、胃腸管に吸着され、そして体循環に入った後に、コリン作動性神経末端のシナプス前膜に結合し、それらの神経伝達物質アセチルコリンの放出を阻害する。ＢｏＮＴ／Ｂ、ＢｏＮＴ／Ｄ、ＢｏＮＴ／Ｆ及びＢｏＮＴ／Ｇはシナプトブレビン／小胞関連膜タンパク質（ＶＡＭＰ）を切断し；ＢｏＮＴ／Ｃ、ＢｏＮＴ／Ａ及びＢｏＮＴ／Ｅは、２５ｋＤａのシナプトソーム関連タンパク質（ＳＮＡＰ−２５）を切断し；ＢｏＮＴ／Ｃはシンタキシン切断する。
【００８３】
ＢｏＮＴ類は、共通の構造を共有し、〜１５０ｋＤａの二本鎖タンパク質であり、〜５０ｋＤａの軽鎖（Ｌ鎖）への単一のジスルフィド結合によって共有結合された〜１００ｋＤａの重鎖（Ｈ鎖）からなる。Ｈ鎖は、それぞれ〜５０ｋＤａの２個のドメインからなる。Ｃ末端ドメイン（ＨC）は、高親和性結合ニューロン結合のために必要とされるのに対し、Ｎ末端ドメイン（ＨN）は、膜転位に関与することが提案されている。Ｌ鎖は、基質ＳＮＡＲＥタンパク質の切断に関与する亜鉛依存性メタロプロテアーゼである。
【００８４】
用語「Ｌ鎖断片」とは、その断片がメタロプロテアーゼ活性を示し、かつ、細胞エキソサイトーシスに関与する小胞及び／又は細胞膜関連タンパク質をタンパク質分解により切断することのできる神経毒のＬ鎖の構成要素を意味する。
【００８５】
好適なプロテアーゼ（基準）配列としては、次のものが挙げられる：
Ａ型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基（１−４４８）
Ｂ型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基（１−４４０）
Ｃ型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基（１−４４１）
Ｄ型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基（１−４４５）
Ｅ型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基（１−４２２）
Ｆ型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基（１−４３９）
Ｇ型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基（１−４４１）
破傷風神経毒−アミノ酸残基（１−４５７）
ＩｇＡプロテアーゼ−アミノ酸残基（１−９５９）*
*Ｐｏｈｌｎｅｒ，Ｊ．外（１９８７）．Ｎａｔｕｒｅ  ３２５，ｐｐ．４５８−４６２。この文献をその参照により援用する。
【００８６】
上記基準配列は、わずかな変化が亜血清型に応じて生じることがあるためガイドと見なすべきである。例として、ＵＳ２００７／０１６６３３２号（ここに参照により援用される）は、わずかに異なるクロストリジウム配列を引用する：
Ａ型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基（Ｍ１−Ｋ４４８）
Ｂ型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基（Ｍ１−Ｋ４４１）
Ｃ型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基（Ｍ１−Ｋ４４９）
Ｄ型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基（Ｍ１−Ｒ４４５）
Ｅ型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基（Ｍ１−Ｒ４２２）
Ｆ型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基（Ｍ１−Ｋ４３９）
Ｇ型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基（Ｍ１−Ｋ４４６）
破傷風神経毒−アミノ酸残基（Ｍ１−Ａ４５７）。
【００８７】
軽鎖を含む様々なクロストリジウム毒断片が本発明の態様において有用であり得るが、ただし、これらの軽鎖断片は、神経伝達物質放出体のコア成分を特異的に標的とするため、全体的な細胞メカニズムを実行することに関与し、それによりクロストリジウム毒素が基質をタンパク質分解により切断することを条件とする。クロストリジウム毒素の軽鎖は、約４２０〜４６０アミノ酸長であり、かつ、酵素ドメインを含む。研究から、クロストリジウム毒素軽鎖の全長は、酵素ドメインの酵素活性に必要でないことが示されている。非限定的な例として、ＢｏＮＴ／Ａ軽鎖の最初の８個のアミノ酸は、酵素活性に必要ではない。別の非限定的な例として、ＴｅＮＴ軽鎖の最初の８個のアミノ酸は、酵素活性に必要ではない。同様に、軽鎖のカルボキシル末端は活性に必要ではない。非限定的な例として、ＢｏＮＴ／Ａの軽鎖の最後の３２個のアミノ酸（残基４１７−４４８）は、酵素活性に必要ではない。別の非限定的な例として、ＴｅＮＴ軽鎖の最後の３１個のアミノ酸（残基４２７−４５７）は、酵素活性に必要ではない。したがって、この実施形態の態様は、例えば少なくとも３５０個のアミノ酸、少なくとも３７５個のアミノ酸、少なくとも４００個のアミノ酸、少なくとも４２５個のアミノ酸及び少なくとも４５０個のアミノ酸長を有する酵素ドメインを含むクロストリジウム毒素軽鎖を含むことができる。この実施形態の他の態様は、例えば多くとも３５０個のアミノ酸、多くとも３７５アミノ酸、多くとも４００個のアミノ酸、多くとも４２５個のアミノ酸及び多くとも４５０個のアミノ酸長さを有する酵素ドメインを有するクロストリジウム毒素軽鎖を含むことができる。
【００８８】
好適な非細胞毒性プロテアーゼのさらなる例は、ＷＯ２００７／１０６１１５号に詳細に記載されており、この文献は、本明細書において引用によりその全体が援用される。
【００８９】
一実施形態では、非細胞毒性プロテアーゼは、ＳＮＡＰ−２３タンパク質などの非神経ＳＮＡＲＥタンパク質を切断する。一実施形態では、非細胞毒性プロテアーゼは、ＳＮＡＰ−２３を切断することができる修飾ボツリヌス毒素Ｌ鎖である。このような修飾Ｌ鎖の例は、Ｃｈｅｎ及びＢａｒｂｉｅｒｉ，ＰＮＡＳ，ｖｏｌ．１０６，ｎｏ．２３，ｐ９１８０−９１８４，２００９に記載されている。
【００９０】
一実施形態では、非細胞毒性プロテアーゼは、ＢｏＮＴ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｃ又はＢｏＮＴ／Ｅプロテアーゼであり、好ましいＳＮＡＲＥモチーフは、ＳＮＡＰ（例えばＳＮＡＰ２５）モチーフである。
【００９１】
別の実施形態では、非細胞毒性プロテアーゼは、ＢｏＮＴ／Ｂ、ＢｏＮＴ／Ｄ、ＢｏＮＴ／Ｆ若しくはＢｏＮＴ／Ｇ又は破傷風神経毒素（ＴｅＮＴ）プロテアーゼであり、好ましいＳＮＡＲＥモチーフはＶＡＭＰモチーフである。
【００９２】
別の実施形態では、非細胞毒性プロテアーゼはＢｏＮＴ／Ｃ1プロテアーゼであり、好ましいＳＮＡＲＥモチーフはシンタキシンモチーフである。
【００９３】
本発明の非細胞毒性タンパク質は、異なる切断部位配列を認識するため、わずかに異なる切断特異性を有する。
【００９４】
【表１】
0006675306.tif 000002
【００９５】
さらなる例として、次の認識配列及び切断部位が挙げられる：
【表２−１】
0006675306.tif 000003
【表２−２】
0006675306.tif 000004
【表２−３】
0006675306.tif 000005
【００９６】
本発明のポリペプチド、特にそのプロテアーゼ成分は、ＰＥＧ化されていてよい。これは、安定性、例えばプロテアーゼ成分の作用の持続時間を増大させるのに役立つ場合がある。ＰＥＧ化は、プロテアーゼがＢｏＮＴ／Ａ、Ｂ又はＣ1プロテアーゼを含む場合に特に好ましい。ＰＥＧ化は、好ましくは、プロテアーゼ成分のＮ末端にＰＥＧを付加することを含む。一例として、プロテアーゼのＮ末端は、同一でも異なってもよい１個以上のアミノ酸（例えば、システイン）残基で伸長できる。該アミノ酸残基の１個以上は、その自身のＰＥＧ分子がそれに結合（例えば共有結合）していてもよい。この技術の例は、ＷＯ２００７／１０４５６７号に記載されており、この文献は、引用によりその全体が援用される。
【００９７】
転位ドメインは、プロテアーゼ活性の機能的発現が標的細胞の細胞質内で生じるようにプロテアーゼの標的細胞への転位を可能にする分子である。任意の分子（例えば、タンパク質又はペプチド）が本発明の必要な転位機能を有するかどうかは、従来の多数のアッセイのいずれかで確認できる。
【００９８】
例えば、Ｓｈｏｎｅ  Ｃ．（１９８７）には、試験分子で刺激されるリポソームを使用したインビトロアッセイが記載されている。必要な転位機能の存在は、リポソームからのＫ+及び／又は標識ＮＡＤの放出によって確認され、これは容易に監視できる［Ｓｈｏｎｅ  Ｃ．（１９８７）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ；ｖｏｌ．１６７（１）：ｐｐ．１７５−１８０を参照］。
【００９９】
さらなる例がＢｌａｕｓｔｅｉｎ  Ｒ．（１９８７）に提供されており、これには、平面リン脂質二重膜を用いた単純な試験管内アッセイが記載されている。これらの膜を試験分子でチャレンジし、そして必要な転位機能を、膜を横切るコンダクタンスの増大により確認する［Ｂｌａｕｓｔｅｉｎ（１９８７）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｓ；ｖｏｌ．２２６，ｎｏ．１：ｐｐ．１１５−１２０参照］。
【０１００】
膜融合の評価を可能にする追加の方法、すなわち本発明での使用に適した転位ドメインの同定がＭｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ２２０及び２２１，Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｐａｒｔｓ  Ａ及びＢ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９３に提供されている。
【０１０１】
また、本発明は、変異転位ドメインも包含するが、ただし、該変異ドメインが依然として必要な転位活性を示す場合に限る。例えば、変異体は、基準転位ドメインと少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％又は少なくとも９８％のアミノ酸配列相同性を有することができる。転位ドメインに関連して使用されるときに、用語「断片」とは、基準転位ドメインの少なくとも２０個、好ましくは少なくとも４０個、より好ましくは少なくとも８０個、最も好ましくは少なくとも１００個のアミノ酸残基を有するペプチドを意味する。クロストリジウム転位ドメインの場合には、断片は、基準転位ドメイン（例えばＨNドメイン）の少なくとも１００個、好ましくは少なくとも１５０個、より好ましくは少なくとも２００個、最も好ましくは少なくとも２５０個のアミノ酸残基を有する。ＴＭ「断片」成分（上記）と同様に、本発明の転位「断片」は、基準配列に基づく変異型転位ドメインの断片を包含する。
【０１０２】
転位ドメインは、低ｐＨの条件下で脂質膜内にイオン透過性細孔を形成することができることが好ましい。好ましくは、エンドソーム膜内に細孔形成が可能なタンパク質分子の部分のみを使用することが見出されている。
【０１０３】
転位ドメインは、微生物のタンパク質源、特に細菌又はウイルスタンパク質源から得ることができる。したがって、一態様では、転位ドメインは、細菌毒素又はウイルスタンパク質などの酵素の転位性ドメインである。
【０１０４】
細菌毒素分子の所定ドメインがこのような孔を形成することができることが記載されている。また、ウイルス発現膜融合タンパク質の所定の転位ドメインがこのような孔を形成することができることも知られている。このようなドメインを本発明で使用することができる。
【０１０５】
転位ドメインは、ＨNドメイン（又はその機能性成分）などのクロストリジウム由来のものであることができる。ＨNとは、Ｈ鎖のアミノ末端の半分、又はそのままのＨ鎖におけるその断片に想到するドメインとほぼ同等のクロストリジウム神経毒のＨ鎖の一部又は断片を意味する。この点について、ＨC細胞結合機能を除去することが望ましいならば、これは、ＨC又はＨCCのアミノ酸配列の欠失によって行うことができる（ＤＮＡ合成のレベルで、又はヌクレアーゼ若しくはプロテアーゼ処理による合成後のレベルで）。あるいは、ＨC機能は、化学的又は生物学的処理によって不活性化できる。
【０１０６】
好適な（基準）転位ドメインの例としては、次のものが挙げられる：
Ａ型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基（４４９−８７１）
Ｂ型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基（４４１−８５８）
Ｃ型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基（４４２−８６６）
Ｄ型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基（４４６−８６２）
Ｅ型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基（４２３−８４５）
Ｆ型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基（４４０−８６４）
Ｇ型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基（４４２−８６３）
破傷風神経毒−アミノ酸残基（４５８−８７９）。
【０１０７】
上記基準配列は、わずかな変化が亜血清型に応じて発生することがあるためガイドと見なすべきである。一例として、ＵＳ２００７／０１６６３３２号（ここに引用により援用する）は、わずかに異なるクロストリジウム配列を引用している：
Ａ型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基（Ａ４４９−Ｋ８７１）
Ｂ型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基（Ａ４４２−Ｓ８５８）
Ｃ型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基（Ｔ４５０−Ｎ８６６）
Ｄ型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基（Ｄ４４６−Ｎ８６２）
Ｅ型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基（Ｋ４２３−Ｋ８４５）
Ｆ型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基（Ａ４４０−Ｋ８６４）
Ｇ型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基（Ｓ４４７−Ｓ８６３）
破傷風神経毒−アミノ酸残基（Ｓ４５８−Ｖ８７９）。
【０１０８】
好適な転位ドメインのさらなる例は、ＷＯ２００７／１０６１１５号に詳細に記載されており、この文献は、ここに引用によりその全体が援用される。
【０１０９】
本発明において、転位ドメインを含む様々なクロストリジウム毒素ＨN領域が本発明の態様において有用であり得るが、ただし、これらの活性断片が細胞内小胞から標的細胞の細胞質への非細胞毒性プロテアーゼ（例えばクロストリジウムＬ鎖）の放出を促進し、したがって全体的な細胞メカニズムの実行に関与することができ、それによってクロストリジウム毒素が基質をタンパク質分解により切断することを条件とする。クロストリジウム毒素の重鎖からのＨN領域は、約４１０〜４３０アミノ酸長であり、かつ、転位ドメインを含む。研究から、クロストリジウム毒素重鎖のＨN領域の全長が転位ドメインの転位活性に必要なわけではないことが示されている。したがって、この実施形態の態様は、例えば、少なくとも３５０個のアミノ酸、少なくとも３７５個のアミノ酸、少なくとも４００個のアミノ酸及び少なくとも４２５個アミノ酸長を有する転位ドメインを含むクロストリジウム毒素ＨN領域を含むことができる。この実施形態の他の態様は、例えば、多くとも３５０個、多くとも３７５アミノ酸、多くとも４００個のアミノ酸及び多くとも４２５個のアミノ酸長を有する転位ドメインを含むクロストリジウム毒素ＨN領域を含むことができる。
【０１１０】
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ及びＣ．ｔｅｔａｎｉにおける毒素産生の遺伝的基礎の詳細については、Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ外（１９９７），Ｔｈｅ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  ｐｒｅｓｓを参照されたい。
【０１１１】
用語ＨNは、天然型神経毒ＨN部分及び天然には存在しないアミノ酸配列及び／又は合成アミノ酸残基を有する修飾ＨN部分を包含するが、ただし、該修飾ＨN部分が依然として上記の転位機能を示す場合に限る。
【０１１２】
あるいは、転位ドメインは、非クロストリジウム由来のものであってよい。非クロストリジウム（基準）転位ドメイン由来の例としては、ジフテリア毒素の転位ドメイン［Ｏ＝Ｋｅｅｆｅ外，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９２）８９，６２０２−６２０６；Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ外，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９３）２６９，２２５２４−２２５３２；及びＬｏｎｄｏｎ，Ｅ．（１９９２）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，１１１２，ｐｐ．２５−５１］、Ａ型シュードモナス外毒素の転位ドメイン［Ｐｒｉｏｒ外，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９２）３１，３５５５−３５５９］、炭疽菌毒素の転位ドメイン［Ｂｌａｎｋｅ外，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９６）９３，８４３７−８４４２］、転位機能の様々な融合性又は疎水性ペプチド［Ｐｌａｎｋ外，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９４）２６９，１２９１８−１２９２４；及びＷａｇｎｅｒ外（１９９２）ＰＮＡＳ，８９，ｐｐ．７９３４−７９３８］、及び両親媒性ペプチド［Ｍｕｒａｔａ外（１９９２）Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３１，ｐｐ．１９８６−１９９２］が挙げられるが、これらに限定されない。転位ドメインは、天然タンパク質中に存在する転位ドメインの鏡像であることができ、又はアミノ酸変異を含むことができるが、ただし、これらの変異が転位ドメインの転位能力を破壊しないことを条件とする。
【０１１３】
本発明での使用に適したウイルス（基準）転位ドメインの特定の例としては、ウイルス発現膜融合タンパク質の所定の転位ドメインが挙げられる。例えば、Ｗａｇｎｅｒ外（１９９２）及びＭｕｒａｔａ外（１９９２）は、インフルエンザウイルス赤血球凝集素のＮ末端領域に由来する多数の融合性及び両親媒性ペプチドの転位（すなわち、膜融合及び小胞形成）機能を記載する。所望の転位活性を有することが知られている他のウイルス発現膜融合タンパク質は、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）融合ペプチドの転位ドメイン、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）糖タンパク質Ｇの転位ドメイン、ＳＥＲウイルスＦタンパク質の転位ドメイン及び泡沫状ウイルスエンベロープ糖タンパク質の転位ドメインである。ウイルスにコードされたＡｓｐｉｋｅタンパク質、例えば、ＳＦＶのＥ１タンパク質及びＶＳＶのＧタンパク質は、本発明において特定の用途を有する。
【０１１４】
表（以下）に列挙された（参照）転位ドメインの使用には、その配列変異体の使用が含まれる。変異体は、1個以上の保存的核酸置換及び/又は核酸の欠失若しくは挿入を含むことができるが、ただし、該変異体が必要な転位機能を保持することを条件とする。また、変異体は、１個以上のアミノ酸置換及び/又はアミノ酸の欠失若しくは挿入を含むこともできるが、ただし、該変異体が必要な転位機能を保持する場合に限る。
【０１１５】
【表３】
0006675306.tif 000006
【０１１６】
本発明のポリペプチドは、転位促進ドメインをさらに含むことができる。該ドメインは、非細胞毒性プロテアーゼの標的細胞の細胞質への送達を容易にし、例えばＷＯ０８／００８８０３号及びＷＯ０８／００８８０５号に記載されている。これらの文献のそれぞれは、本明細書中に引用により援用される。
【０１１７】
一例として、好適な転位促進ドメインとしては、エンベロープウイルス融合性ペプチドドメインが挙げられ、例えば、好適な融合性ペプチドドメインとしては、インフルエンザウイルス融合性ペプチドドメイン（例えば、２３個のアミノ酸のインフルエンザＡウイルス融合性ペプチドドメイン）、アルファウイルス融合性ペプチドドメイン（例えば、２６個のアミノ酸のセムリキ森林ウイルス融合性ペプチドドメイン）、ベシクロウイルス融合性ペプチドドメイン（例えば、２１個のアミノ酸の水疱性口内炎ウイルス融合性ペプチドドメイン）、レスピロウイルス融合性ペプチドドメイン（例えば、２５個のアミノ酸のセンダイウイルス融合性ペプチドドメイン）、モルビリウイルス融合性ペプチドドメイン（例えば、２５個のアミノ酸のイヌジステンパーウイルス融合性ペプチドドメイン）、アブラウイルス融合性ペプチドドメイン（例えば、２５個のアミノ酸のニューカッスル病ウイルス融合性ペプチドドメイン）、ヘニパウイルス融合性ペプチドドメイン（例えば、２５個のアミノ酸のヘンドラウイルス融合性ペプチドドメイン）、メタニューモウイルス融合性ペプチドドメイン（例えば、２５個のアミノ酸のヒトメタニューモウイルス融合性ペプチドドメイン）又はサル泡沫状ウイルス融合性ペプチドドメインなどのスプーマウイルス融合性ペプチドドメイン；或いはその断片又は変異体が挙げられる。
【０１１８】
別の例として、転位促進ドメインは、クロストリジウム毒素ＨCNドメイン又はその断片若しくは変異体を含むことができる。より詳細には、クロストリジウム毒素ＨCN転位促進ドメインは、少なくとも２００個のアミノ酸、少なくとも２２５個のアミノ酸、少なくとも２５０個のアミノ酸、少なくとも２７５個のアミノ酸長を有することができる。この点に関して、クロストリジウム毒素ＨCN転位促進ドメインは、好ましくは多くとも２００個のアミノ酸、多くとも２２５個のアミノ酸、多くとも２５０個のアミノ酸、又は多くとも２７５個のアミノ酸長を有する。特定の（参考）例としては、次のものが挙げられる：
Ａ型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基（８７２−１１１０）
Ｂ型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基（８５９−１０９７）
Ｃ型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基（８６７−１１１１）
Ｄ型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基（８６３−１０９８）
Ｅ型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基（８４６−１０８５）
Ｆ型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基（８６５−１１０５）
Ｇ型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基（８６４−１１０５）
破傷風神経毒−アミノ酸残基（８８０−１１２７）。
【０１１９】
上記の配列位置は、血清型／亜型に応じて少し異なる場合があり、好適な（参考）クロストリジウム毒素ＨCNドメインのさらなる例としては次のものが挙げられる：
Ａ型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基（８７４−１１１０）
Ｂ型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基（８６１−１０９７）
Ｃ型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基（８６９−１１１１）
Ｄ型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基（８６５−１０９８）
Ｅ型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基（８４８−１０８５）
Ｆ型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基（８６７−１１０５）
Ｇ型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基（８６６−１１０５）
破傷風神経毒−アミノ酸残基（８８２−１１２７）。
【０１２０】
上記促進ドメインのいずれかを、本発明における使用に適した前記転位ドメインペプチドのいずれかと組み合わせることができる。したがって、一例として、非クロストリジウム促進ドメインを非クロストリジウム転位ドメインペプチド又はクロストリジウム転位ドメインペプチドと組み合わせることができる。或いは、クロストリジウム毒素ＨCN転位促進ドメインを、非クロストリジウム転位ドメインペプチドと組み合わせることができる。或いは、クロストリジウム毒素ＨCN促進ドメインをクロストリジウム転位ドメインペプチドと組み合わせることができ、その例としては次のものが挙げられる：
Ａ型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基（４４９−１１１０）
Ｂ型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基（４４２−１０９７）
Ｃ型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基（４５０−１１１１）
Ｄ型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基（４４６−１０９８）
Ｅ型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基（４２３−１０８５）
Ｆ型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基（４４０−１１０５）
Ｇ型ボツリヌス神経毒−アミノ酸残基（４４７−１１０５）
破傷風神経毒−アミノ酸残基（４５８−１１２７）。
【０１２１】
配列相同性
様々な配列アラインメントの方法のいずれかを使用して同一性％を決定することができ、例えば、限定されないが、グローバル方法、ローカル方法及びハイブリッド方法、例えばセグメントアプローチ方法が挙げられる。同一性％を決定するためのプロトコルは、当業者の範囲内にある日常的な手順である。グローバル方法は、分子の最初から最後まで配列を整列させ、個々の残基対のスコアを加算し、そしてギャップペナルティを課すことによって最良のアラインメントを決定する。非限定的な方法としては、例えば、ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗ，Ｊｕｌｉｅ  Ｄ．Ｔｈｏｍｐｓｏｎ外，ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗ：Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｔｈｒｏｕｇｈ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｗｅｉｇｈｔｉｎｇ，Ｐｏｓｉｔｉｏｎ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｇａｐ  Ｐｅｎａｌｔｉｅｓ  ａｎｄ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｍａｔｒｉｘ  Ｃｈｏｉｃｅ，２２（２２）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４６７３−４６８０（１９９４）；及び反復改良法、例えば、Ｏｓａｍｕ  Ｇｏｔｏｈ，Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ  Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ  ｉｎ  Ａｃｃｕｒａｃｙ  ｏｆ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ  ｂｙ  Ｉｔｅｒａｔｉｖｅ  Ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ  ａｓ  Ａｓｓｅｓｓｅｄ  ｂｙ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｔｏ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ，２６４（４）Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．８２３−８３８（１９９６）を参照されたい。ローカル方法は、入力配列の全てによって共有される１以上の保存モチーフを同定することにより、配列を整列させる。非限定的な方法としては、例えば次のものが挙げられる：マッチボックス、例えば、Ｅｒｉｃ  Ｄｅｐｉｅｒｅｕｘ及びＥｒｎｅｓｔ  Ｆｅｙｔｍａｎｓ，Ｍａｔｃｈ−Ｂｏｘ：Ａ  Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｌｙ  Ｎｅｗ  Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｓｅｖｅｒａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，８（５）ＣＡＢＩＯＳ  ５０１−５０９（１９９２）参照；ギブスサンプリング、例えば、Ｃ．Ｅ．Ｌａｗｒｅｎｃｅ外，Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  Ｓｕｂｔｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｓｉｇｎａｌｓ：Ａ  Ｇｉｂｂｓ  Ｓａｍｐｌｉｎｇ  Ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｆｏｒ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ，２６２（５１３１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０８−２１４（１９９３）参照；アライン−Ｍ、例えば、Ｉｖｏ  Ｖａｎ  Ｗａｌｌｅ外，Ａｌｉｇｎ−Ｍ  −Ａ  Ｎｅｗ  Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ  ｆｏｒ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｉｇｈｌｙ  Ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，２０（９）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：１４２８−１４３５（２００４）を参照。
【０１２２】
このように、配列同一性％は、従来の方法による決定される。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ外，Ｂｕｌｌ．Ｍａｔｈ．Ｂｉｏ．４８：６０３−１６，１９８６並びにＨｅｎｉｋｏｆｆ及びＨｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：１０９１５−１９，１９９２を参照されたい。簡単に説明すると、２つのアミノ酸配列を、１０のギャップオープニングペナルティー、１のギャップ伸長ペナルティ及び以下に示すように（アミノ酸は、標準的な１文字コードで示されている）Ｈｅｎｉｋｏｆｆ及びＨｅｎｉｋｏｆｆ（前掲）の「ｂｌｏｓｕｍ  ６２」スコアマトリックスを使用してアラインメントスコアを最適化させるように配列させる。
【０１２３】
配列同一性を決定するためのアラインメントスコア
【表４】
0006675306.tif 000007
【０１２４】
続いて、同一性％は次のように算出する：
完全一致の総数／［長い配列の長さ＋２つの配列を整列させるために該長い配列に導入されたギャップの数］×１００。
【０１２５】
実質的に相同的なポリペプチドは、１以上のアミノ酸置換、欠失又は付加を有することを特徴とする。これらの変化は、好ましくは、ポリペプチドの折り畳み又は活性に有意には影響を与えない保存的アミノ酸置換（以下参照）及び他の置換；典型的には１個〜約３０個のアミノ酸の小さな欠失；及び小さなアミノ末端又はカルボキシル末端伸長、例えばアミノ末端メチオニン残基、約２０〜２５個残基までの小さなリンカーペプチド、又は親和性タグであるマイナーな性質のものである。
【０１２６】
保存的アミノ酸置換
塩基性：              アルギニン
リジン
ヒスチジン
酸性：                グルタミン酸
アスパラギン酸
極性：                グルタミン
アスパラギン
疎水性：              ロイシン
イソロイシン
バリン
芳香族：              フェニルアラニン
トリプトファン
チロシン
小型：                グリシン
アラニン
セリン
トレオニン
メチオニン
【０１２７】
２０種の標準的なアミノ酸の他に、非標準的なアミノ酸（４−ヒドロキシプロリン、６−Ｎ−メチルリジン、２−アミノイソ酪酸、イソバリン及びα−メチルセリンなど）を本発明のポリペプチドのアミノ酸残基に対して置換することができる。制限された数の非保存的アミノ酸、遺伝子コードによりコードされないアミノ酸、及び非天然アミノ酸を、クロストリジウムポリペプチドのアミノ酸残基に対して置換することができる。また、本発明のポリペプチドは、非天然型アミノ酸残基を含むこともできる。
【０１２８】
非天然型アミノ酸としては、例えば、トランス−３−メチルプロリン、２，４−メタノプロリン、シス−４−ヒドロキシプロリン、トランス−４−ヒドロキシプロリン、Ｎ−メチルグリシン、アロトレオニン、メチルトレオニン、ヒドロキシエチルシステイン、ヒドロキシエチルホモシステイン、ニトログルタミン、ホモグルタミン、ピペコリン酸、ｔ−ロイシン、ノルバリン、２−アザフェニルアラニン、３−アザフェニルアラニン、４−アザフェニルアラニン及び４−フルオロフェニルアラニンが挙げられるが、これらに限定されない。タンパク質に非天然型アミノ酸残基を組み込むためのいくつかの方法が当該技術分野において知られている。例えば、ナンセンス変異が化学的にアミノアシル化されたサプレッサーｔＲＮＡを使用して抑制されるインビトロ系を使用することができる。アミノ酸及びアミノアシルｔＲＮＡを合成するための方法は、当該技術分野において知られている。ナンセンス突然変異を含むプラスミドの転写及び翻訳は、Ｅ．ｃｏｌｉＳ３０抽出物と市販の酵素と他の試薬とを含む無細胞系で実施される。タンパク質は、クロマトグラフィーによって精製される。例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ外，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１３：２７２２，１９９１；Ｅｌｌｍａｎ外，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０２：３０１，１９９１；Ｃｈｕｎｇ外，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９：８０６−９，１９９３；及びＣｈｕｎｇ外，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：１０１４５−９，１９９３）を参照されたい。第２の方法では、翻訳は、突然変異ｍＲＮＡのマイクロインジェクション及び化学的アミノアシル化サプレッサーｔＲＮＡによってアフリカツメガエル卵母細胞において実施される（Ｔｕｒｃａｔｔｉ外，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１９９９１−８，１９９６）。第３の方法では、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を、置換されるべき天然アミノ酸（例えば、フェニルアラニン）の不在下でかつ所望の非天然型アミノ酸（例えば、２−アザフェニルアラニン、３−アザフェニルアラニン、４−アザフェニルアラニン、又は４−フルオロフェニルアラニン）の存在下で培養する。非天然型アミノ酸は、その天然の対応物の代わりにポリペプチドに組み込まれる。Ｋｏｉｄｅ外，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３３：７４７０−６，１９９４を参照されたい。天然型アミノ酸残基は、インビトロ化学修飾によって天然に存在しない種に変換できる。化学的修飾を部位特異的突然変異誘発と組み合わせて置換の範囲をさらに拡大することもできる（Ｗｙｎｎ及びＲｉｃｈａｒｄｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．２：３９５−４０３，１９９３）。
【０１２９】
限られた数の非保存的アミノ酸、遺伝子コードによりコードされないアミノ酸、天然には生じないアミノ酸及び非天然アミノ酸を、本発明のポリペプチドのアミノ酸残基に対して置換することができる。
【０１３０】
本発明のポリペプチドにおける必須アミノ酸は、部位特異的突然変異誘発又はアラニンスキャニング突然変異誘発（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ及びＷｅｌｌｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１０８１−５，１９８９）などの当該技術分野において知られている手順に従って同定できる。また、生物学的相互作用の部位を、推定接触部位アミノ酸の変異と組み合わせて、核磁気共鳴、結晶学、電子回折又は光親和性ラベリングなどの技術により決定されるように、構造の物理的解析によっても決定できる。例えば、ｄｅ  Ｖｏｓ外，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５５：３０６−１２，１９９２；Ｓｍｉｔｈ外，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：８９９−９０４，１９９２；Ｗｌｏｄａｖｅｒ外，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３０９：５９−６４，１９９２を参照されたい。必須アミノ酸の同一性は、本発明のポリペプチドの関連する成分（例えば、転位又はプロテアーゼ成分）との相同性の分析から推測できる。
【０１３１】
複数のアミノ酸置換は、Ｒｅｉｄｈａａｒ−Ｏｌｓｏｎ及びＳａｕｅｒ（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：５３−７，１９８８）又はＢｏｗｉｅ及びＳａｕｅｒ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：２１５２−６，１９８９）に記載されるような既知の突然変異誘発及びスクリーニングの方法を使用して作製されかつ試験される。簡単に説明すると、これらの著者は、ポリペプチド中における２個以上の位置を同時にランダム化し、機能的ポリペプチドについて選択し、その後突然変異誘発ポリペプチドの配列を決定して各位置での許容可能な置換の範囲を決定するための方法を開示する。使用できる他の方法としては、ファージディスプレイ（例えば、Ｌｏｗｍａｎ外，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３０：１０８３２−７，１９９１；Ｌａｄｎｅｒ外、米国特許第５２２３４０９；Ｈｕｓｅ、ＷＯ９２／０６２０４号）及び領域指向性突然変異誘発（Ｄｅｒｂｙｓｈｉｒｅ外，Ｇｅｎｅ  ４６：１４５，１９８６；Ｎｅｒ外，ＤＮＡ ７：１２７，１９８８）が挙げられる。
【０１３２】
複数のアミノ酸置換は、Ｒｅｉｄｈａａｒ−Ｏｌｓｏｎ及びＳａｕｅｒ（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：５３−７，１９８８）又はＢｏｗｉｅ及びＳａｕｅｒ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：２１５２−６，１９８９）に記載されるような既知の突然変異誘発及びスクリーニングの方法を使用して作製されかつ試験される。簡単に説明すると、これらの著者は、ポリペプチド中における２個以上の位置を同時にランダム化し、機能的ポリペプチドについて選択し、その後突然変異誘発ポリペプチドの配列を決定して各位置での許容可能な置換の範囲を決定するための方法を開示する。使用できる他の方法としては、ファージディスプレイ（例えば、Ｌｏｗｍａｎ外，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３０：１０８３２−７，１９９１；Ｌａｄｎｅｒ外、米国特許第５２２３４０９；Ｆｕｓｅ、ＷＯ９２／０６２０４号）及び領域指向性突然変異誘発（Ｄｅｒｂｙｓｈｉｒｅ外，Ｇｅｎｅ  ４６：１４５，１９８６；Ｎｅｒ外，ＤＮＡ ７：１２７，１９８８）が挙げられる。
【実施例】
【０１３３】
かゆみに苦しむ患者に投与するためにポリペプチドを調製し、かゆみの抑制又は治療のための方法を提供する。本発明で定義されるように、調製されたポリペプチドの標的化部分（ＴＭ）成分は、かゆみ特異的ＤＲＧニューロン又は掻痒受容体に存在するＧタンパク質共役受容体に結合する。その後、転位成分は、ポリペプチドの非細胞毒性プロテアーゼ成分の輸送を達成し、このポリペプチドがかゆみ特異的ＤＲＧニューロン又は掻痒受容体の内部に入ると、そこからの神経伝達物質の分泌を阻害する。したがって、このポリペプチドは、神経伝達物質のレベルを減少させ、かゆみを抑制又は治療することができる。
【０１３４】
例１
３５歳の女性乳癌患者は、悪性腫瘍の治療のための薬物反応に起因する消耗性の慢性のかゆみに苦しんでいる。治療は、ＢＡＭ8-22リガンドを含む本発明のポリペプチドを０．０２５ｍｇ／ｋｇ皮下注射（６ヶ月の期間にわたって週１回の注射）することによるものであり、これにより、かゆみ感覚の減少及び顕著な健康の改善に至った。この患者は、効果的なかゆみの緩和を報告した。
【０１３５】
例２
６０歳の男性患者は、慢性のかゆみを報告し、腎疾患に起因する重症例を示す。ＳＬＩＧＲＬ−ＮＨ2ペプチドを含む本発明のポリペプチドの０．０７ｍｇ／ｋｇの経口懸濁液を、腹腔鏡下十二指腸注射（６ヶ月毎の注射管理）により投与した。かゆみの減少を含むポジティブな結果が治療の最初の月に報告された。
【０１３６】
例３
乾癬の家族歴を有する３７歳の男性患者は、身体的健康及び生活の質に大きな影響を及ぼしている慢性的なかゆみに悩まされている。γ２−メラニン細胞刺激ホルモン（γ２−ＭＳＨ）ペプチドを含む本発明のポリペプチドの０．０９ｍｇ／ｋｇの毎週用量を静脈内に投与する。乾癬の重症度が低下し、それ以上のかゆみ感覚のないことが治療期間を通して患者によって報告された。
【０１３７】
例４
重度の慢性的なかゆみに悩まされる４５歳のＨＩＶ患者は、最近、帯状疱疹、すなわち極度のかゆみを伴う場合の多い症状を有する疾患と診断された。絶えず続く引掻きで何日も眠れない夜の後、彼女に、クロロキン（ＣＱ）を含む本発明のポリペプチドの０．０５ｍｇ／ｋｇの毎月の静脈内注射を処方した。この患者は、治療の３ヶ月後に回復率の改善と、さらなるかゆみ感覚がないことを報告した。
【０１３８】
例５
アトピー性湿疹を有する６歳の女性患者に、ヒスタミンＨＴ１を含む本発明のポリペプチドのカプセル化製剤の０．１ｍｇ／ｋｇの経口用量を毎月処方した。この患者は、治療後に状態の改善と、膝の後ろの皮膚の赤い領域の消失を報告した。
【０１３９】
例６
シェーグレン症候群を有する１７歳の男性は、眼におけるそう痒症及び四肢における皮膚発疹の症状を報告した。臨床医は、セロトニンを含む本発明のポリペプチドの０．００１ｍｇ／ｋｇを処方した（８週間毎に局所腹腔鏡下注射）。２ヶ月以内に、この患者は、不快感の有意な減少を報告した。
【０１４０】
例７
１８歳の女性患者は、アフリカへの休暇後に丘疹蕁麻疹と診断された。彼女は、臨床医に、露出領域、特に下肢のみならず腕、頬及びウエストラインに多数の病変を提示した。丘疹及び炎症後瘢痕は明白であった。診断以来、この患者は、全体的な生活の質の低下を経験した。この患者は、ＮＰＦＦ／Ｙ−Ｇ又はＲＦ／Ｙ−アミドで終端する神経ペプチドを含む本発明のポリペプチドの０．０７ｍｇ／ｋｇの毎月の注射によりかゆみを治療した。６ヶ月の治療プログラム中に、この患者は、さらなるかゆみ感覚がないことを報告した。
【０１４１】
例８
皮膚細胞型Ｂ細胞リンパ腫を有する５９歳の男性患者は、後に、身体の約８０％をカバーする重度のかゆみを伴う赤い発疹及び乾燥肌を発症した。この患者の医師は、カプサイシンを含む本発明のポリペプチドの０．１ｍｇ／ｋｇを処方し、３ヶ月毎に腹腔鏡下十二指腸注射によって投与した。治療の１回用量後に、この患者は、さらなるかゆみがないことを報告した。
【０１４２】
例９
妊娠の多形性発疹（ＰＥＰ）を有する３４歳の女性患者は、下腹部及び手足の皮膚のみみず腫れ及び大きな炎症領域を伴う発疹の形で深刻なかゆみを示した。この患者を、皮膚の表面に、２週間にわたってパッチからゆっくりと拡散することにより、コルチスタチンを含む本発明のポリペプチドを与える接着パッチを投与することによって治療した。この経皮パッチを１２週間たってから交換し、その終了時にかゆみ感覚が消失したと報告された。
【０１４３】
動物モデルの例
本発明のポリペプチドを、本明細書に記載されたかゆみ誘発性アトピー性皮膚炎（ＡＤ）のマウスモデルを使用することにより、かゆみの治療として試験する。以下に例示するように、ＢＡＬＢ／ｃ及びＣ５７ＢＬ／６マウス株は同様に好適である。
【０１４４】
例１０
オボアルブミンによるテープ剥がし皮膚の反復経皮（ＥＣ）感作によって誘発されるかゆみのＢＡＬＢ／ｃマウスモデル。マウスの背中の皮膚を剃毛し、テープを３Ｍテープで６回剥がし、アトピー性皮膚炎（ＡＤ）患者での引掻きによって与えられる皮膚損傷を模倣する。通常の生理食塩水１００μｌ中のＯＶＡ１００μｇを、滅菌ガーゼの１×１ｃｍパッチ上に置き、このガーゼを透明な生体閉塞包帯で皮膚に固定する。これにより、抗原が舐められないことが確保される。それぞれのマウスは、２週間の間隔で互いに分離される同じ部位でパッチに対して合計３回の１週間露出を有する。ＥＣ感作されたマウスは、引掻き行動が増加し、それらの皮膚は、表皮及び真皮の肥厚によって特徴付けられる病変を発症する。
【０１４５】
本発明のポリペプチドを１ｍｇ／ｍｌの濃度で１時間間隔で首の後ろに皮内（ｉ．ｄ）投与する。ＰＢＳの注射をコントロール（対照）として使用した。
【０１４６】
「かゆみ」を、本発明のポリペプチドを用いた治療前に、治療後と比較した引掻きの「発作」の数を計数することによって測定する。引掻きの発作とは、注射部位（すなわち首の後）の周囲の領域に対する後足での３回以上の個々の迅速な引掻き運動であると定義される。結果は、本発明のポリペプチドによる処理後に引掻きの顕著な減少を示す。
【０１４７】
例１１
ＢＡＢＬ／ｃマウスは、組換えダニアレルゲンＤｅｒ  ｐ８のＥＣ適用を受け、表皮過形成及び海綿状変化を伴う皮膚炎の特徴を示す。本発明のポリペプチドを上記のように投与する。所見は、引掻きの有意な減少が本発明のポリペプチドでの処理後に認められる点で、ＯＶＡによるＥＣ感作モデルにおいて観察されたものと同様である。
【０１４８】
例１２
ＢＡＢＬ／ｃマウスを、ＡＤの症状を悪化させかつ皮膚病変を引き起こすことが知られているＳ．ａｕｒｅｕｓ感染症にさらす。本発明のポリペプチドを投与した結果は、対照マウスと比較して、本発明のポリペプチドで治療した被験体による引掻きのレベルが著しく減少したことを示す。これらの結果は、かゆみの治療における本発明のポリペプチドの使用を実証するものである。
【配列表】
0006675306000001.app