(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
パロアッスル（学名：Cyclolepis genistoides D. Don）の溶媒抽出物又はパロアッスル（学名：Cyclolepis genistoides D. Don）の乾燥粉末を有効成分とし、老化の抑止のために用いられることを特徴とするＡＭＰＫ活性化用組成物。
【請求項２】
パロアッスル（学名：Cyclolepis genistoides D. Don）の含水率２０〜６０（ｖ／ｖ）％の含水エタノール抽出物を有効成分とするものである、請求項１に記載のＡＭＰＫ活性化用組成物。
【請求項３】
機能性食品、サプリメント、又は医薬品の形態である、請求項１又は２記載のＡＭＰＫ活性化用組成物。
【請求項４】
老化の抑止のために用いられるＡＭＰＫ活性化用組成物の調製のためのパロアッスル（学名：Cyclolepis genistoides D. Don）の溶媒抽出物又はパロアッスル（学名：Cyclolepis genistoides D. Don）の乾燥粉末の使用。
【請求項５】
パロアッスル（学名：Cyclolepis genistoides D. Don）の含水率２０〜６０（ｖ／ｖ）％の含水エタノール抽出物を使用するものである、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
前記ＡＭＰＫ活性化用組成物は、機能性食品、サプリメント、又は医薬品の形態である、請求項４又は５記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＡＭＰＫを活性化するための組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
アデノシン一リン酸活性化プロテインキナーゼ（Adenosine monophosphate-activated protein kinase、以下「ＡＭＰＫ」とする。）は生体内のエネルギーセンサーとして様々な生理機能に関与している。例えば、虚血、低グルコース、低酸素、カロリー制限、運動等によって筋細胞内のＡＴＰが消費されると、ＡＭＰやＡＭＰ／ＡＴＰ比が上昇し、ＡＭＰＫが活性化される（非特許文献１〜３）。このような生理機能から、ＡＭＰＫを適度に活性化する化合物は、糖尿病、肥満、高血圧、脂質異常症、癌、心血管疾患等の予防・治療、及び老化防止、あるいはそれに付随する症状の改善に有用であると考えられている。
【０００３】
また、老化によりＡＭＰＫの機能が衰えると、効率的な細胞恒常性の維持能力を弱めて、老化をさらに促進させることが報告されている。すなわち、ＡＭＰＫは、健康寿命や生命寿命の調節に関与しているＦｏｘＯ、ｍＴＯＲ/ＵＬＫ１、ＣＲＣＴ−１/ＣＲＥＢ、ＳＩＲＴ１等のシグナル経路を統合的に制御する機能を有する。このことから、ＡＭＰＫを活性化する化合物は、老化を抑止するのに有用であろうと考えられている（非特許文献２、４）。
【０００４】
また、ＡＭＰＫは、骨格筋刺激時における代謝変化を媒介すると考えられている。すなわち、ラットから単離した骨格筋に対してテタヌス刺激又はＡＭＰＫ活性化剤による刺激を行い、刺激したサンプルをメタボローム解析した結果、解糖系やＴＣＡ回路など糖代謝に関わる分子群、ＮＡＤ代謝や核酸代謝に関わる分子群などで、電気刺激とＡＭＰＫ活性化剤による刺激との間で高い相関がみられた。このことから、ＡＭＰＫを活性化する化合物は、運動療法代替薬として有用であろうと考えられている（非特許文献１）。
【０００５】
一方、南米のパラグアイ共和国のチャコ地方に自生している植物として、パロアッスル（Palo azul：学名Cyclolepis genistoides D. Don）が知られている。パロアッスルはキク科多年草の植物であり、現地では古くからその植物体の地上部を乾燥させて煮出したものが飲用され、伝承薬として糖尿病や腎臓病などに効果があるとされている。また、例えば、下記特許文献１には、パロアッスルの粉末及び／又は抽出エキスを有効成分として含有してなることを特徴とするα−グルコシダーゼ阻害剤が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００５−２６３６２９号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】宮本理人、多角的アプローチによる新規生活習慣病治療戦略の開発研究、YAKUGAKU ZASSHI. Vol.136(2016) No.5:751-759
【非特許文献２】Teet Seene, Priit Kaasik.,  Role of Exercise Therapy in Prevention of Decline in Aging Muscle Function: Glucocorticoid Myopathy and Unloading.,  Journal of Aging Research Volume 2012, Article ID 172492, 9 pages.
【非特許文献３】Hardman SE, Hall DE, Cabrera AJ, Hancock CR, Thomson DM., The effects of age and muscle contraction on AMPK activity and heterotrimer.,  Exp Gerontol. 2014 Jul;55:120-8. doi: 10.1016/j.exger.2014.04.007. Epub 2014 Apr 18. composition.
【非特許文献４】Salminen A, Kaarniranta K, Kauppinen A.,  Age-related changes in AMPK activation: Role for AMPK phosphatases and inhibitory phosphorylation by upstream signaling pathways.,  Ageing Res Rev. 2016 Apr 6;28:15-26.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従来、パロアッスルに、ＡＭＰＫを活性化する作用効果があることは知られていなかった。
【０００９】
そこで本発明の目的は、パロアッスルを利用して、ＡＭＰＫを活性化するための組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本願発明者らは、上記目的を達成するため鋭意研究した結果、パロアッスルに、ＡＭＰＫを活性化する作用効果があることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明の第１は、パロアッスル又はその加工物を有効成分とすることを特徴とするＡＭＰＫ活性化用組成物を提供するものである。
【００１２】
本発明のＡＭＰＫ活性化用組成物においては、筋細胞内及び／又は脂肪細胞内へグルコースの取り込みを促進するために用いられることが好ましい。
【００１３】
また、細胞膜中のＧＬＵＴ４の発現を促進するために用いられることが好ましい。
【００１４】
また、インスリン摂取者に用いられることが好ましい。
【００１５】
また、機能性食品、サプリメント、又は医薬品の形態であることが好ましい。
【００１６】
一方、本発明の第２は、ＡＭＰＫ活性化用組成物の調製のためのパロアッスル又はその加工物の使用を提供するものである。
【００１７】
本発明の使用においては、前記ＡＭＰＫ活性化用組成物は、筋細胞内及び／又は脂肪細胞内へグルコースの取り込みを促進するために用いられるものであることが好ましい。
【００１８】
また、前記ＡＭＰＫ活性化用組成物は、細胞膜中のＧＬＵＴ４の発現を促進するために用いられるものであることが好ましい。
【００１９】
また、前記ＡＭＰＫ活性化用組成物は、インスリン摂取者に用いられるものであることが好ましい。
【００２０】
また、前記ＡＭＰＫ活性化用組成物は、機能性食品、サプリメント、又は医薬品の形態であることが好ましい。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によれば、パロアッスル又はその加工物を有効成分とするので、ヒトや動物の生命活動のマスター分子であるＡＭＰＫの機能を高める作用効果を奏する、ＡＭＰＫ活性化用組成物を提供することができる。本発明による組成物は、特に、ＧＬＵＴ４による細胞内へのグルコースの取り込みを誘導する効果に優れている。また、インスリンと併用することで、ＧＬＵＴ４による細胞内へのグルコースの取り込みをより強く誘導することができる。さらに、長期に有効量を摂取しても副作用などを伴うことがなく、安全に使用できる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】試験例１において、パロアッスルによってモデルマウスの空腹時血糖値がどのような影響を受けるか調べた結果を示す図表である。
【図２】試験例２において、３Ｔ３−Ｌ１細胞におけるグルコースの取り込みがパロアッスルによってどのように影響を受けるかを調べた結果を示す図表である。
【図３】試験例３において、３Ｔ３−Ｌ１細胞におけるＧＬＵＴ４の膜移行がパロアッスルによってどのように影響を受けるかを調べた結果を示す図表である。
【図４】試験例４において、Ｃ２Ｃ１２細胞におけるＩＲがパロアッスルによってどのように影響を受けるかを調べた結果を示す図表である。
【図５】試験例４において、Ｃ２Ｃ１２細胞におけるＡｋｔがパロアッスルによってどのように影響を受けるかを調べた結果を示す図表である。
【図６】試験例４において、Ｃ２Ｃ１２細胞におけるＥＲＫがパロアッスルによってどのように影響を受けるかを調べた結果を示す図表である。
【図７】試験例４において、Ｃ２Ｃ１２細胞におけるＩＲＳ−１がパロアッスルによってどのように影響を受けるかを調べた図である。
【図８】試験例４において、Ｃ２Ｃ１２細胞におけるＰＩ３Ｋｐ８５がパロアッスルによってどのように影響を受けるかを調べた結果を示す図表である。
【図９】試験例４において、Ｃ２Ｃ１２細胞におけるＡＭＰＫがパロアッスルによってどのように影響を受けるかを調べた結果を示す図表である。
【図１０】ＧＬＵＴ４が細胞膜に輸送されるＡＭＰＫ経路及びインスリンシグナル経路の作用機序を示した概略説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明においては、パロアッスル（Palo azul：学名Cyclolepis genistoides D. Don）を、アデノシン一リン酸活性化プロテインキナーゼ（ＡＭＰＫ：Adenosine monophosphate-activated protein kinase）を活性化するための有効成分として用いる。ＡＭＰＫは、セリン／スレオニンキナーゼに属し、その１７２番目のスレオニンがリン酸化されることによって活性化されることが知られているが、本発明におけるＡＭＰＫの活性化はこれに限定されるものではない。
【００２４】
パロアッスルとしては、その植物体の成分を含有するものであればよく、何れの形態に加工したものであってもよいが、具体的には、パロアッスルの植物体に含まれる多種類の成分を複合的に含有する乾燥末や抽出物等を意味する。更により具体的には、植物体を乾燥して粉砕してなる乾燥末、植物体に適当な抽出溶媒を添加して抽出してなる抽出液、その抽出液の濃縮エキス、それら抽出液や濃縮エキスの乾燥物、その乾燥物を粉砕してなる乾燥粉末などが挙げられる。植物体の部位としては、茎、葉、枝などの地上部、根茎などの地下部等いずれの部位を利用してもよいが、特に茎、葉、枝などの地上部を用いることが好ましい。
【００２５】
植物体の乾燥末は、例えば、採取したパロアッスルを洗浄後、生のまま粉砕して乾燥して粉砕機で粉砕したり、あるいは採取したパロアッスルを洗浄後、乾燥してから粉砕機で粉砕したりすること等により、調製することができる。この場合、１０〜３．５メッシュ（ＪＩＳ規格）の篩をパスする程度の粒度の粉末として調製することができる。乾燥は焙煎であってもよい。
【００２６】
植物体の抽出物は、例えば、採取したパロアッスルを洗浄後、生のままあるいは乾燥してから粉砕して、これに適当な抽出溶媒を２〜１０倍量程度、好ましくは２〜５倍量程度添加し、４０〜１００℃程度の温度で１〜１０時間程度、振盪下又は非振盪下に加熱するか、１０〜３５℃程度の温度下で１〜１０日間程度、振盪下又は非振盪下に浸漬すること等により、調製することができる。パロアッスルの乾燥は焙煎であってもよい。加熱や浸漬等の処理後には、適当な濾過手段により、不溶物を除去してもよい。抽出溶媒としては、水、低級アルコール、含水低級アルコールなどが挙げられる。抽出溶媒を植物体に添加する際には、熱水などのように予め加熱した状態で添加してもよい。抽出溶媒は、含水率１０〜８０（ｖ／ｖ）％の含水エタノールを用いることが好ましく、含水率２０〜６０（ｖ／ｖ）％の含水エタノールを用いることがより好ましい。
【００２７】
上記のようにして得られた抽出物には、更に、溶媒を除去して濃縮したり、噴霧乾燥、真空乾燥、凍結乾燥などの手段で乾燥したり、また、乾燥後に粉砕して粉末化したり、その粉末化後に造粒したり、その粉末化後に焙煎したり、その粉末化後に更に微粒子化したり等の加工を施し、本発明に用いる抽出物としてもよい。このような加工の際には、賦形剤を抽出物の固形分中に１０〜２０質量％程度添加して、それらの加工を行ってもよい。賦形剤としてはデキストリン等が挙げられる。例えば一態様においては、本発明に用いる抽出物は、その固形分中にパロアッスル由来成分を７０〜９０質量％程度、デキストリンを３０〜１０質量％程度含有し、７０〜１００メッシュ（ＪＩＳ規格）の篩をパスする程度の粒度の粉末として調製することができる。
【００２８】
上記のようにして得られた抽出物には、更にまた、活性炭等で脱臭したり、クロマトグラフィーで成分を分画したり等の加工を施し、本発明に用いる抽出物としてもよい。
【００２９】
本発明による組成物は、パロアッスル又はその加工物を有効成分とするものであり、これをヒトや動物に投与することにより生命活動のマスター分子であるＡＭＰＫを活性化してその機能を高めることができる。そして、ヒトや動物に有益な健康機能的影響を与えることができる。ここで「ヒトや動物に有益な健康機能的影響を与える」とは、種々の疾患の予防・治療、あるいはそれらに付随する症状を予防・改善することも含まれる。例えば、上述した老化の抑止の用途や運動療法代替薬などとしても利用され得る。特に、ＧＬＵＴ４による細胞内へのグルコースの取り込みを誘導する効果に優れている。すなわち、細胞膜中のＧＬＵＴ４の発現を促進してその機能を高めて、例えば筋肉や脂肪組織における細胞内へグルコースの取り込みを誘導することができる。また、その作用機序においてインスリン経路を介さないので、インスリン経路を亢進するインスリン等と併用することにより、細胞内へグルコースの取り込みをより強く誘導することができる。
【００３０】
なお、ＧＬＵＴ４は、体内のグルコースの代謝に関するグルコーストランスポーター４（Glucose transporter 4）を指す。グルコースの取り込み量はグルコーストランスポーターの量によって規定されており、筋肉や脂肪組織における主なグルコーストランスポーターがＧＬＵＴ４である。このＧＬＵＴ４は、通常は細胞内部に存在しており、インスリン刺激や虚血、低糖、及び低酸素等の刺激によって細胞膜上に移動し、グルコースがその輸送体を通して細胞内に取り込まれる。
【００３１】
細胞内へのグルコースの取り込みは、例えば、ラジオアイソトープで標識した２−デオキシグルコースを用いて細胞内のラジオアイソトープ量を測定するＲＩ法や、２−デオキシグルコースを細胞内に取込ませた後、細胞摘出液を２段階の酵素反応及び酵素サイクリングでグルコース取込み量を測定する比色法等の公知の方法で測定することができる。
【００３２】
本発明による組成物の投与形態に特に制限はないが、摂取の負担の軽減や投与のし易さの観点からは、経口投与の形態が好ましい。パロアッスルは、既に健康食品やサプリメント等として使用実績が豊富な物質であり、長期間摂取しても副作用などを伴うことがなく、安全に使用できる。
【００３３】
本発明による組成物においては、パロアッスル又はその加工物以外に、他の成分や素材を含有することに特に制限はなく、必要に応じて薬学的に許容される基材や担体、その他賦形剤、保存剤、着色剤、矯味剤等を添加して、公知の製剤方法によって、例えば、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、粉末剤、液剤、シロップ剤、トローチ剤、ゼリー状剤、飴状剤等の形態とすることができる。剤形によっても異なるが、パロアッスル又はその加工物を全体中に固形分換算で０．１〜９９質量％含有していることが好ましく、１．０〜８０質量％含有していることがより好ましく、１０〜６０質量％含有していることが最も好ましい。
【００３４】
本発明による組成物は、例えば、インスリン摂取者にも好適に用いられる。この場合、インスリン摂取者には、糖尿病患者に限らず、インスリンを必要としているヒトや動物が含まれる。インスリンの接種形態も特に限定されず、例えば、注射器、歩行型の注入ポンプ、又はその両方の組み合わせで投与され得る。そして、そのようなインスリン摂取者（あるいは動物であってもよい）に、上記に説明した、パロアッスル又はその加工物、あるいはそれを含む組成物を併用して投与することにより、インスリンシグナル経路とＡＭＰＫ経路との双方が互いに干渉されることなく相加的に作用して、ＧＬＵＴ４による細胞内へのグルコースの取り込みをより強く誘導することができる。なお、「併用して投与」とは、必ずしも同時的に投与される必要はなく、インスリンに生理的な影響を受けている対象者（あるいは動物であってもよい）において、上記に説明した、パロアッスル又はその加工物、あるいはそれを含む組成物が投与されることにより、その併用投与による作用効果が奏される。
【００３５】
本発明による組成物の使用形態としては、その作用効果を損なわない限り、特に制限はない。例えば、機能性食品、サプリメント、医薬品などの形態である。なお、これらの形態は、ヒト用だけに限られず、動物用であってもよい。より具体的には、医薬品、医薬部外品、健康食品、機能性食品、栄養補助食品、サプリメント、動物用医薬品、動物用医薬部外品、動物用健康食品、動物用機能性食品、動物用栄養補助食品、動物用サプリメントなど各種の製品形態で、あるいはそれら製品と組み合わせて使用されることが可能である。
【００３６】
本発明による組成物をヒトに経口投与する場合、その投与量としては、年齢や体重によっても異なるが、成人１日当たりパロアッスル又はその加工物の固形分換算で０．０１〜１０ｇ程度であることが好ましく、０．１〜５ｇ程度であることがより好ましく、０．３〜３ｇ程度であることが最も好ましい。また、投与形態としては、１０日以上の長期にわたって投与されるように用いられることが好ましく、１ヶ月以上の長期にわたって投与されるように用いられることがより好ましく、２ヶ月以上の長期にわたって投与されるように用いられることが最も好ましい。
【実施例】
【００３７】
次の実施例を示して本発明をさらに詳細を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００３８】
＜製造例１＞  
パロアッスルの地上部の粗粉砕品３０ｋｇ質量部に対し１２０Ｌ質量部の含水率５０（ｖ／ｖ）％の含水エタノールを添加し、６０℃で２時間浸漬して抽出物を得、その抽出物を濾過して液部を抽出液として回収した。この抽出液を、遠心薄膜型濃縮装置を用いて濃縮し、固形分５０％の濃縮エキスを得た。この濃縮エキスにデキストリンを固形分あたり１８質量％含有するように添加、混合し、プレート式殺菌装置に通して、１２０℃、１分の殺菌処理後、スプレードライにより乾燥粉末化した。粉末は８０メッシュ（ＪＩＳ規格）の篩で篩別して粒度をそろえた。以上のようにしてパロアッスル抽出エキス末を得た。
【００３９】
＜試験例１＞  
パロアッスルによってモデルマウスの空腹時血糖値がどのような影響を受けるかを以下の方法で調べた。
【００４０】
（１．使用動物）
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系統雄マウス（日本エスエルシー）を用いた。通常時の餌としては脂肪カロリー比８．２％の普通食（ＭＦ、オリエンタル酵母）を使用した。
【００４１】
（２．食餌とパロアッスルの投与）
５週齢マウスを普通食で１週間馴化させた後、脂肪カロリー比６０％の高脂肪食（ＨＦＤ−６０、オリエンタル酵母）に変更した。また、１週間当たり６回、パロアッスル抽出エキス末を２５０ｍｇ／ｋｇ（Ｐａｌｏ  ｌｏｗ群）、又は１０００ｍｇ／ｋｇ（Ｐａｌｏ  ｈｉｇｈ群）を経口投与した。
【００４２】
（３．空腹時血糖値測定）
餌を変更した日をＷｅｅｋ０とし、Ｗｅｅｋ１４に空腹時血糖値を測定した。採血前日の夜間（２１時）から採血直前まで餌を取り除いて絶食状態とし、おおよそ９時に尾静脈より採血をした。血糖値はメディセーフミニＧＲ−１０２（テルモ）を用いて測定した。
【００４３】
（４．データ解析/統計処理）
統計解析は、解析ソフトウエアStatLight（Yukms corp. 1997）を用い、２群の検定はＳｔｕｄｅｎｔ  ｔ−ｔｅｓｔ法、多群の検定はＤｕｎｎｅｔｔ法、又はＴｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ  ｔｅｓｔ法にて検定を行い、ｐ＜０．０５を有意とした。実験は独立して３回以上行い、データは平均値±標準偏差(mean ± S.D.)として表記した。
【００４４】
（５．結果）
結果を図１に示す。なお、図中、ＮＦＤは普通食・蒸留水、ＣＴＬは高脂肪食・蒸留水、Ｐａｌｏは高脂肪食・パロアッスル２５０ｍｇ／ｋｇを投与した群を表す。Ｐａｌｏ群では、ＣＴＬ群と比較して空腹時血糖値を減少させる傾向を示した。
【００４５】
＜試験例２＞  
３Ｔ３−Ｌ１細胞（マウス由来脂肪細胞）におけるグルコースの取り込みが、パロアッスルによってどのように影響を受けるかを、以下の方法で調べた。
【００４６】
（１．パロアッスル）  
製造例１で調製したパロアッスル抽出エキス末をＤＭＳＯ（dimethyl sulfoxide）に溶解し、更に培養培地で適宜希釈して、細胞培養時に所定の最終濃度となるように添加した。なお、ＤＭＳＯの最終濃度は０．１（ｖ／ｖ）％を超えないようにした。
【００４７】
（２．使用細胞）  
３Ｔ３−Ｌ１細胞（マウス由来脂肪細胞）は、国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所JCRB Cell Bankから入手し、用いた。
【００４８】
（３．培養培地）  
ＤＭＥＭ（Dulbecco’s modified eagle’s medium）に１０％ＦＢＳ（Fetal bovine serum）及び１％Penicillin-streptomycin試薬（GIBCO）（以下、「ｐ／ｓ」という。）を加えた培地を用いた。
【００４９】
（４．細胞培養）
細胞ストックを解凍し、培養培地で懸濁して１００ｍｍディッシュに播種した。培養は、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターで、２−３日ごとに培地交換を行いながら、セミコンフルエントまで行った。その後、培養培地を吸引してＰＢＳ（−）（Dulbecco’s PBS(-)）でディッシュを洗い、0.25% Trypsin-EDTA solution（SIGMA）（以下、「Ｔ／Ｅ」という。）で３７℃、３分間処理して細胞を剥がし、培養培地を混合してＴ／Ｅを失活させチューブに回収した。これを８００ｒｐｍで３分間遠心し、上清を除去して回収した細胞を培養培地に再懸濁し、２．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度で１００ｍｍディッシュ、又は６ウェルプレートに継代した。１−２日後、コンフルエントになったことを確認し、培養培地を交換してさらに２日間培養した。その後、０．２５μＭ  ＤＥＸ（Dexamethasone-water soluble、SIGMA)、０．５ｍＭ  ＩＢＭＸ（3-Isobutyl-1-methylxanthine、SIGMA）、及び1０μｇ／ｍＬインスリン（Insulin solution human、SIGMA）からなる誘導溶液を培地に添加して脂肪細胞に分化誘導した。誘導溶液を添加した時点をｄａｙ０とした。また、ｄａｙ２に、５μｇ／ｍＬインスリンからなる成熟溶液を培地に添加した。ｄａｙ４以降は４８時間ごとに新しい培地に交換した。
【００５０】
（５．２−ＤＧアッセイ）
上記で培養したｄａｙ１４の細胞を用いて２−ＤＧアッセイを行った。２−ＤＧアッセイには、2-DG Uptake Measurement Kit（コスモバイオ）を用いた。細胞への糖取り込み(２−ＤＧ取り込み)、細胞試料の調製、及び２−ＤＧ取り込み量の測定はキットの説明に従って行った。
【００５１】
（６．データ解析/統計処理）
試験例１と同様に解析、及び統計処理をした。パロアッスルとインスリンのいずれも投与していない群（ＣＴＬ）の値を１として、２−ＤＧの取り込みの各相対値を求めた。
【００５２】
（７．結果）
結果を図２に示す。パロアッスルはインスリン非依存下で、２−ＤＧの取り込みを上昇させる傾向を示し、その効果はインスリン単独よりも顕著であった。また、インスリン存在下ではさらに有意に取り込みを上昇させた。
【００５３】
＜試験例３＞  
３Ｔ３−Ｌ１細胞（マウス由来脂肪細胞）におけるＧＬＵＴ４の膜移行が、パロアッスルによってどのように影響を受けるかを、以下の方法で調べた。
【００５４】
（１．パロアッスル）  
試験例２と同様にパロアッスルを調製した。
【００５５】
（２．使用細胞）  
試験例２と同様に３Ｔ３−Ｌ１細胞を用いた。
【００５６】
（３．培養培地）  
試験例２と同様の培地を用いた。
【００５７】
（４．細胞培養）
試験例２と同様に３Ｔ３−Ｌ１細胞を培養した。
【００５８】
（５．細胞膜分画タンパク質調製）
上記で培養したｄａｙ１４の細胞を用いて細胞膜分画のタンパク質調製を行った。
【００５９】
１００ｎＭインスリンの添加から３０分後に、冷却ＰＢＳ（−）でディッシュを洗い、ＰＢＳを完全に吸引した。その後、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００／Ｂｕｆｆｅｒ  Ａを１００μＬ添加し、細胞をチューブに回収した。ハンドマイクロチューブホモジナイザーでホモジナイズした細胞をシリンジに移しピペッティングした後、エッペンに細胞を移して１０００ｇ、４℃で１０分間遠心した。その後、上清を新しいエッペン（エッペンＡ）に回収し、氷上で保存した。ペレットが残ったエッペンにＢｕｆｆｅｒ  Ａを１００μＬ添加、懸濁し、氷上で１０分静置した後、１，０００ｇ、４℃で１０分間再度遠心した。上清を上記エッペンＡに回収し、氷上で保存した。ペレットが残ったエッペンに、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００／Ｂｕｆｆｅｒ  Ａを１００μＬ添加、懸濁し、氷上で1時間静置した後、１６，０００ｇ、４℃で２０分間度遠心した。上清をエッペンに回収し、細胞膜分画として−８０℃で保存した。上記エッペンＡの上清（２００μＬ）を１６，０００ｇ、４℃で２０分間度遠心した。この上清を回収し、非細胞膜分画として−８０℃で保存した。
【００６０】
（６．タンパク質濃度測定）
９６ウェルプレートに細胞回収用試薬（ＲＩＰＡ  ｂｕｆｆｅｒ：50 mM Tris（pH 8.0）、150 mM NaCl、1% Triton X-100、0.1% SDS、2 mM EDTA、0.2 mM PMSF、1% Protease inhibitor cocktail）で５倍希釈した上記タンパク質サンプル２０μＬを添加した。すぐにＤＣ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（Bio-Rad）にてキットの説明に従いタンパク質定量サンプルを準備し、１５分後に吸光マイクロプレートリーダ（「Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ  ＪＸ」、Labsystems）で６５０ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００６１】
（７．ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ウエスタンブロッティング）
常法に従い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ウエスタンブロッティングを行った。１次抗体、２次抗体は表1に示したとおりに使用した。メンブレンをＴＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、ＥＣＬ反応（ImmobilonTM Western、MILLIPORE）を行いＬＡＳ−４０００(FUJIFILM)で化学発光を検出してバンドを確認した。
【００６２】
【表１】
0006636396.tif 000002
【００６３】
なお、上記ＧＬＵＴ４にはAnti-GLUT4 (C-terminal) (rabbit) (SIGMA-ALDRICH)、Ｃａｖｅｏｌｉｎ−１にはAnti-caveolin-1(Mouse)(BD biosciences)、β―ａｃｔｉｎにはMonoclonal anti-βactin,clone AC-74 mouse ascites fluid (SIGMA)、ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔにはDonkey anti-rabbit IgG-HRP (Beckman Coulter)、ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅにはHorse anti-mouse IgG, HRPlinked antibody (Cell Signaling)を用いた。
【００６４】
（８．データ解析/統計処理）
ウエスタンブロッティングで検出したデータの画像はＴＩＦＦ方式で保存し定量した。その他は、試験例１と同様に解析、及び統計処理をした。
【００６５】
（９．結果）
結果を図３に示す。なお、図３左図において、ＰＭは細胞膜分画、Ｐｏｓｔ−ＰＭは非細胞膜画分を表す。また、図３右図は、左図のバンドを定量し、ＧＬＵＴ４膜移行率を求めたものである。
【００６６】
ＧＬＵＴ４膜移行率は下記のように求めた。
【００６７】
Ａ＝（細胞膜画分ＧＬＵＴ４／caveolin-1）／（非細胞膜画分／βactin）
パロアッスルとインスリンのいずれも投与していない群（ＣＴＬ）のＡ値を１としたときの、各相対値をＧＬＵＴ４膜移行率とした。
【００６８】
非細胞膜分画ＧＬＵＴ４発現はインスリン単独添加群で減少傾向がみられたものの大きな変化は示さなかった。パロアッスルはインスリン添加の有無に関わらず、細胞膜分画ＧＬＵＴ４発現を上昇させる傾向を示した。特にインスリン非依存下の効果はインスリン単独よりも顕著であった。ＧＬＵＴ４膜移行率は、インスリンとパロアッスルの共添加群においてさらに有意に値が上昇した。
【００６９】
＜試験例４＞
Ｃ２Ｃ１２細胞（マウス由来筋芽細胞）におけるＩＲ、Ａｋｔ、ＥＲＫ、ＩＲＳ−１、ＰＩ３Ｋｐ８５、ＡＭＰＫが、パロアッスルによってどのように影響を受けるかを、以下の方法で調べた。
【００７０】
なお、ＩＲはインスリン受容体（Insulin Receptor）、ＡｋｔはRAC-alpha serine/threonine-protein kinas、ＥＲＫは細胞外シグナル調節キナーゼ（Extracellular Signal-regulated Kinase）、ＩＲＳ−１はインスリン受容体基質（Insulin receptor substrate 1）、ＰＩ３ＫはPhosphatidylinositide 3-kinasesのことをいう。
【００７１】
（１．パロアッスル）
試験例２と同様にパロアッスルを調製した。
【００７２】
（２．使用細胞）
Ｃ２Ｃ１２細胞（マウス由来筋芽細胞）は、理化学研究所バイオリソースセンターから入手し、用いた。
【００７３】
（３．培養培地）
ＤＭＥＭに１０％ＦＢＳ及び１％ｐ／ｓを加えたものを、培養培地として用いた。
【００７４】
（４．細胞培養）
細胞ストックを解凍し、培養培地で懸濁して１００ｍｍディッシュに播種した。培養は、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターで、２日ごとに培地交換を行いながら、セミコンフルエントまで行った。セミコンフルエントまで培養した後、培養培地を吸引してＰＢＳ（−）でディッシュを洗い、ＰＢＳを完全に吸引した。Ｔ／Ｅで３７℃、３分間処理して細胞を剥がし、培養培地を混合してＴ／Ｅを失活させチューブに回収した。これを１０００ｒｐｍで３分間遠心し、上清を除去して回収した細胞を培養培地に再懸濁し、５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度で６ウェルプレートに継代した。その後、８０％コンフルエントになった時点をｄａｙ０とした。ｄａｙ０、２、４に培養培地を交換し、さらに上記パロアッスルをＤＭＳＯに溶解したものを所定の最終濃度となるように培養培地で希釈して培地に添加した。また、インスリン添加群では、ｄａｙ４に、インスリンを培養培地で希釈したものを、最終濃度１００ｎＭとなるように添加した。
【００７５】
（５．タンパク質調製）
インスリンの添加から３０分後に、ＰＢＳ（−）でプレートを洗い、ＰＢＳを完全に吸引した。その後すぐに液体窒素に３秒、室温に３０秒静止する操作を３回繰り返した。水分を完全に除去した後、ＲＩＰＡ  ｂｕｆｆｅｒを１００μＬ／ウェルでプレートに加え、セルスクレイパーで細胞を回収しチューブに移した。作業は氷上で行った。これを１５，０００ｒｐｍ、４℃で２０分間遠心した。上清を別のチューブに移してタンパク質サンプルとし、−８０℃で保存した。
【００７６】
（６．タンパク質濃度測定）
試験例３と同様にタンパク質濃度の測定をした。
【００７７】
（７．ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ウエスタンブロッティング）
試験例３と同様に行った。１次抗体、２次抗体は表２に示したとおりに使用した。
【００７８】
【表２】
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【００７９】
なお、上記ＩＲにはInsulin Receptorβ(4B8) (Cell Signaling)、ＡｋｔにはAnti-Akt (rabbit) antibody (Cell Signaling)、ｐＡｋｔにはAnti-Phospho-Akt (rabbit) antibody (Cell Signaling)、ＥＲＫにはAnti-ERK1/2(rabbit) antibody (Cell Signaling)、ｐＥＲＫにはAnti-Phospho-ERK1/2 (rabbit) antibody (Cell Signaling)、ＩＲＳ−１にはIRS-1 antibody (rabbit) (SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY)、ｐＩＲＳ−１にはPhospho-IRS-1（Ser307）(rabbit) antibody(Cell Signaling)、ＰＩ３Ｋｐ８５にはPI3K  p85α(B-9) (mouse) antibody (Santa cruz)、ＡＭＰＫにはAnti-AMPKα(Rabbit) (Cell signaling)、ｐＡＭＰＫにはAnti-Phospho-AMPKα(Thr172) (Rabbit) (Cell signaling)を用いた。
【００８０】
（８．データ解析/統計処理）
試験例３と同様に行った。
【００８１】
（９．結果）
ウエスタンブロッティングの結果を図４〜図９に示す。また、検出されたバンドを定量し、それぞれの図中下段にグラフ化した。なお、図１０には、ＧＬＵＴ４が細胞膜に輸送されるＡＭＰＫ経路及びインスリンシグナル経路の作用機序の概略説明図を示す。
【００８２】
図４〜図８に示されるように、Ｃ２Ｃ１２細胞の分化誘導条件下で上記パロアッスルを４日間曝露した結果、インスリン非存在下では、パロアッスルはインスリンシグナル経路に属する各因子の発現や活性化をほとんど促進しなかった。また、インスリン単独ではこれらの因子の発現や活性化の傾向が認められたものの、さらなるパロアッスルの添加によりそれらの因子の発現や活性化が抑制される傾向を示した。
【００８３】
一方、図９に示されるように、パロアッスルの添加によりＡＭＰＫのリン酸化タンパク質の発現量が上昇し、パロアッスルによるＡＭＰＫ経路の活性化が認められた。
【００８４】
以上から、パロアッスルはＡＭＰＫ経路を活性化することにより、インスリンシグナル経路を介すことのなく、ＧＬＵＴ４による細胞内へのグルコースの取り込みを誘導することができるものと考えられた（図１０参照）。そして、例えばインスリンと併用することで、インスリンシグナル経路とＡＭＰＫ経路との双方が互いに干渉されることなく相加的に作用して、ＧＬＵＴ４による細胞内へのグルコースの取り込みをより強く誘導することができるものと考えられた（図１０参照）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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