(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象のポリペプチドの組換え発現に適している単離された脊椎動物細胞であって、前記脊椎動物細胞は、マトリプターゼの効果を障害するように変更されており、遺伝子ノックアウト、遺伝子変異、遺伝子欠失、遺伝子サイレンシングまたは前述のいずれかの組合せによって前記細胞において前記マトリプターゼ遺伝子の機能的発現が低減または排除されるので、前記マトリプターゼの効果が障害され、前記脊椎動物細胞は、対象のポリペプチドをコードする少なくとも１種の異種ポリヌクレオチドを含み、前記脊椎動物細胞は、前記対象のポリペプチドを分泌する、単離された脊椎動物細胞。
【請求項２】
前記脊椎動物細胞のゲノムが、内因性プロテアーゼマトリプターゼの機能を障害するように変更される、および／または前記マトリプターゼ遺伝子の少なくとも１つまたはすべてのコピーが、欠失するか、または機能的に不活性化される、請求項１に記載の単離された脊椎動物細胞。
【請求項３】
以下の特徴
ａ）前記脊椎動物細胞が、非機能的なもしくはあまり機能的でない発現産物を提供するように、前記マトリプターゼ遺伝子の少なくとも１つのコピーもしくはすべてのコピー中に１つもしくは複数の変異を含む、および／または
ｂ）前記脊椎動物細胞が、前記マトリプターゼ遺伝子のプロモーター中、５'ＵＴＲ、３'ＵＴＲおよび／もしくはその他の調節エレメント中に１つまたは複数の変異を含む
のうち１つまたは複数を有する、請求項２に記載の単離された脊椎動物細胞。
【請求項４】
前記１つまたは複数の変異が、前記マトリプターゼ遺伝子のコーディング領域中に含まれ、非機能的なまたはあまり機能的でない発現産物をもたらし、任意選択で、前記１つまたは複数の変異が、マトリプターゼのエキソン２をコードするマトリプターゼ遺伝子のポリヌクレオチド配列中に含まれるか、または前記１つまたは複数の変異が、マトリプターゼの触媒ドメインの少なくとも一部をコードする、前記マトリプターゼ遺伝子のポリヌクレオチド配列中に含まれ、それによって非機能的なまたはあまり機能的でない発現産物が得られる、請求項３に記載の単離された脊椎動物細胞。
【請求項５】
変更されていない内因性マトリプターゼが、マトリプターゼ参照タンパク質として配列番号１〜５に示されるアミノ酸配列のうち１種または複数に対して、少なくとも９０％の同一性を共有し、前記マトリプターゼ参照タンパク質と同一のタンパク質分解性活性を有する、請求項１から４のいずれか１項に記載の単離された脊椎動物細胞。
【請求項６】
前記脊椎動物細胞が、以下の特徴：
ａ）前記脊椎動物細胞が哺乳動物細胞である、
ｂ）前記脊椎動物細胞がヒト細胞である、
ｃ）前記脊椎動物細胞がげっ歯類細胞である、
ｄ）前記脊椎動物細胞がハムスター細胞である、
ｅ）前記脊椎動物細胞がＣＨＯ細胞である、および／または
ｆ）前記脊椎動物細胞が細胞クローンまたは細胞株として提供される哺乳動物細胞である
のうち１つまたは複数を有する、請求項１から５のいずれか１項に記載の単離された脊椎動物細胞。
【請求項７】
前記脊椎動物細胞が、前記マトリプターゼ遺伝子の一方、または両方の対立遺伝子のエキソン２中に１つまたは複数のフレームシフト変異を含むＣＨＯ細胞である、請求項１に記載の単離された脊椎動物細胞。
【請求項８】
前記対象のポリペプチドが、以下の特徴：
ａ）それが治療上活性のあるまたは診断用のポリペプチドである、
ｂ）それがプロテアーゼによるクリッピングに対して感受性である、
ｃ）それがマトリプターゼの少なくとも１つのクリッピング部位を含む、
ｄ）それがグリコポリペプチドである、および／または
ｅ）それが糖タンパク質、抗体、非ＩｇＧタンパク質、Ｆｃ融合タンパク質、Ｆａｂ断片、タンパク質複合体、ペプチダーゼ、シグナルペプチド、ナノボディ、増殖因子、ホルモン、サイトカイン、血液因子および酵素からなる群から選択される
のうち１つまたは複数を有する、請求項１から７のいずれか１項に記載の単離された脊椎動物細胞。
【請求項９】
前記対象のポリペプチドをコードする前記少なくとも１種の異種ポリヌクレオチドが、前記細胞の前記ゲノム中に組み込まれており、任意選択で、選択マーカーまたはレポーターポリペプチドをコードする少なくとも１種の異種ポリヌクレオチドが、前記細胞の前記ゲノム中にさらに組み込まれている、請求項１から８のいずれか１項に記載の単離された脊椎動物細胞。
【請求項１０】
前記対象のポリペプチドをコードする前記少なくとも１種の異種ポリヌクレオチドが、発現カセット中に含まれる、請求項１から９のいずれか１項に記載された単離された脊椎動物細胞。
【請求項１１】
請求項１から１０のいずれか１項に記載の脊椎動物細胞を製造するための方法であって、遺伝子ノックアウト、遺伝子変異、遺伝子欠失、遺伝子サイレンシングまたは前述のいずれかの組合せによって前記細胞において前記マトリプターゼ遺伝子の機能的発現が低減または排除されることによって脊椎動物細胞をマトリプターゼの効果を障害するように変更する段階と、対象のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを導入する段階とを含み、前記対象のポリペプチドが、前記脊椎動物細胞によって分泌される、方法。
【請求項１２】
対象のポリペプチドを組換えによって製造するための方法であって、
（ａ）前記対象のポリペプチドの発現および細胞培養培地への分泌を可能にする条件下で、請求項１から１０のいずれか１項に記載の脊椎動物宿主細胞を培養する段階と、
（ｂ）前記細胞培養培地から前記対象のポリペプチドを単離する段階と、
（ｃ）任意選択で、前記単離された対象のポリペプチドをプロセシングする段階と
を含む、方法。
【請求項１３】
対象のポリペプチドを組換え発現する宿主細胞を選択するための方法であって、
（ａ）宿主細胞として請求項１から１０のいずれか１項に記載の脊椎動物細胞を提供する段階と、
（ｂ）前記対象のポリペプチドを発現する１種または複数の宿主細胞を選択する段階と
を含み、
任意選択で、段階（ａ）が、対象のポリペプチドをコードする少なくとも１種のポリヌクレオチドを用いて、内因性プロテアーゼマトリプターゼの機能が障害されている脊椎動物細胞をトランスフェクトして、請求項１から１０のいずれか１項に記載の脊椎動物宿主細胞を提供する段階を含む、方法。
【請求項１４】
以下の特徴
ａ）前記脊椎動物細胞が哺乳動物細胞である、
ｂ）段階（ａ）において提供される前記宿主細胞が、選択マーカーをコードする少なくとも１種の異種ポリヌクレオチドをさらに含み、段階（ｂ）が、前記選択マーカーに対して選択的な条件下で前記複数の宿主細胞を培養することを含む、
ｃ）ポリヌクレオチドが、１種もしくは複数の発現ベクターをトランスフェクトすることによって前記脊椎動物細胞中に導入される、
ｄ）段階（ｂ）が、１つもしくは複数の選択ステップを含む、および／または
ｅ）段階（ｂ）が、フローサイトメトリーベースの選択を実施することを含む
のうち１つまたは複数を有する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
対象のポリペプチドの組換え製造のための脊椎動物細胞を選択するための方法であって、内因性プロテアーゼマトリプターゼが、前記脊椎動物細胞において機能的に発現されるか否かを分析する段階と、前記対象のポリペプチドの組換え製造のために、遺伝子ノックアウト、遺伝子変異、遺伝子欠失、遺伝子サイレンシングまたは前述のいずれかの組合せによって前記マトリプターゼ遺伝子の機能的発現が低減または排除されることによってこのような内因性マトリプターゼの効果が障害されている脊椎動物細胞を選択する段階を含む、方法。
【請求項１６】
前記対象のポリペプチドが分泌される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記脊椎動物細胞が、請求項２から１０のいずれか１項に記載の１つまたは複数の特徴を有する、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
脊椎動物細胞から分泌される対象のポリペプチドの組換え製造のための前記脊椎動物細
胞の使用であって、前記使用される細胞が、内因性プロテアーゼマトリプターゼの効果を
障害するように変更され、遺伝子ノックアウト、遺伝子変異、遺伝子欠失、遺伝子サイレンシングまたは前述のいずれかの組合せによって前記細胞において前記マトリプターゼ遺伝子の機能的発現が低減または排除されるので、前記マトリプターゼの効果が障害され、
任意選択で、前記脊椎動物細胞が、請求項２から１０のいずれか１項に記載の１つまたは複数の特徴を有する、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示の分野
本開示は、組換え発現技術の分野に関する。とりわけ、組換え発現法における変更された（altered）脊椎動物細胞およびその使用に関連する。前記変更された細胞において対象のポリペプチドを組換え発現させ、次いで、それが、細胞培養培地中に分泌される場合には、細胞培養培地において組換え発現された対象のポリペプチドのクリッピング（clipping）が大幅に低減されるか、さらに完全に阻止される。
【背景技術】
【０００２】
本開示の背景
生物製剤は今日の医学においてますます重要になっているので、生物製剤の市場は、急速に成長し続けている。現在、ますます多くの数の生物製剤が、特定の哺乳動物細胞などの脊椎動物細胞において製造されている。生物製剤として、それだけには限らないが、抗体、抗体断片、ＡＤＣ（抗体薬物コンジュゲート）、ナノボディ、Ｆｃ融合タンパク質、増殖因子、ホルモン、サイトカイン、酵素およびその他の治療用ポリペプチドが挙げられる。特に、組換え非抗体治療用タンパク質の発現は、ますます重要である。さらに、哺乳動物細胞におけるポリペプチドの組換え発現はまた、その他の分野においても役立ち、とても興味深いものである。組換え発現されたポリペプチドの製造費用を考慮すると、高発現哺乳動物細胞系を有することが重要である。対象のポリペプチドは、哺乳動物細胞によって発現され、細胞培養培地中に分泌され、次いで、そこから回収される。
【０００３】
組換え発現のための宿主細胞として哺乳動物細胞などの脊椎動物細胞を使用する場合に直面される１つの大きな問題は、「クリッピング」とも呼ばれる細胞培養培地において発現され分泌された対象のポリペプチドのタンパク質分解性分解である。製造のために使用される脊椎動物細胞に起因するプロテアーゼは、細胞培養培地において活性であり、そのタンパク質分解性活性が、組換え発現され分泌された対象のポリペプチドを分解し、それによって、変更された、例えば、非機能性またはあまり機能性ではない対象のポリペプチドをもたらし得る。この宿主細胞関連タンパク質分解性分解は、ポリペプチドの組換え発現における大きな障害のうちの１つである。例えば、ＩｇＧ抗体は、可変領域においてクリッピングされ得るのでＩｇＧ抗体も影響を受け得るが、タンパク質分解性分解、すなわち、クリッピングは、非ＩｇＧポリペプチドを用いた場合にかなり高い頻度で起こる。このような非ＩｇＧポリペプチド、特に、グリコポリペプチドは、その比較的露出された三次元構造のために、タンパク質分解性分解に対して極めて感受性である場合がある。組換え発現された非ＩｇＧポリペプチドのクリッピングは、最大１００％に達することもある。クリッピングは、意図される目的に有用ではない不活性および／または免疫原性ポリペプチドにつながり得る。さらに、タンパク質分解性分解が特定のパーセンテージにだけ起こる場合であっても、クリッピングされたポリペプチドは、意図される目的のために使用され得ず、したがって、対象の有用な組換えポリペプチドの収率は低減する。さらに、多数の適用のために、クリッピングされたポリペプチドは、精製の際に除去されなければならない。精製は、労働および費用集約的であり得、時には、上手くいかず、その結果、クリッピングされたタンパク質が不純物として残存することもある、無傷（インタクト（intact））のポリペプチドからクリッピングされたものを分離することを可能にする精製法の特別な開発を必要とし得る。したがって、脊椎動物細胞において対象のポリペプチドを組換えによって製造する場合には、細胞培養培地における発現された対象のポリペプチドのタンパク質分解性分解は、大きな問題である。
【０００４】
いくつかの研究によって、この問題の解決法を提供するためにクリッピングの現象が調査された。クリッピングは、時間および温度依存性であると見出され、熱処理によって不活性化され得る。しかし、今までのところ、組換え発現に使用される脊椎動物宿主細胞によって発現されるプロテアーゼについて、およびクリッピングに関与しているプロテアーゼについてはほとんど見出されていない。大きな課題の１つは、脊椎動物宿主細胞によって発現されるプロテアーゼの数である。例えば、げっ歯類細胞ゲノム中には７００種を超えるプロテアーゼが存在すると見出されており、その多くがクリッピングに関与している可能性がある。
【０００５】
クリッピングの問題を克服するために先行技術においていくつかのアプローチが示唆された。クリッピングを避けるための１つのアプローチは、クリッピングを起こしやすいアミノ酸モチーフを排除するための、影響を受けるタンパク質のリエンジニアリングである。しかし、このアプローチは、選択されたアプローチが成功するか否かに関わらず時間がかかり、膨大な試験を必要とし、再設計されたタンパク質が依然として機能的であり、その他の部位でのクリッピングを示さず、免疫原性ではないことを保証するものではない。細胞培養においてプロテアーゼ活性を制御するための異なる方法は、培養培地中に阻害剤または代替基質を添加することである。しかし、大規模製造プロセスでは、このような添加は、費用がかかり、精製の際に除去されなければならず、これは、添加物が残存していないことをモニタリングするための精製法および高感度アッセイの特別な開発を必要とし得る。細胞培養培地における発現された対象のポリペプチドのタンパク質分解性分解を低減するためのその他の方法として、細胞培養培地におけるプロテアーゼに対する対象のポリペプチドの曝露を制限するための回収のタイミング（早期回収）、培養の温度を低下させること、ｐＨ条件を最適化することまたは細胞内プロテアーゼの細胞培養培地中への放出を低減するために細胞生存力を改善することが挙げられる。さらに、製造宿主細胞として使用される脊椎動物細胞株の選択は、それぞれの細胞株によって発現されるプロテアーゼおよび発現されるべき個々の対象のポリペプチドに応じて、クリッピングに影響を有し得ることが見出された。したがって、１つの選択肢は、対象のポリペプチドのクリッピングが起こらないまたはより少ない程度に起こる細胞株を同定するために種々の細胞株をスクリーニングすることであるが、これには時間がかかり、選択された細胞株への製造プロセスの適応を必要とする場合がある。これらの種々の選択肢はクリッピングを低減し得るが、稀に、タンパク質分解性分解を完全に排除する。さらに、多くの場合には、発現されるべき個々の対象のポリペプチドへの発現および製造プロセスの適応は、クリッピングの問題を避ける、または少なくとも低減し、無傷の対象のポリペプチドを十分な収率および純度で提供する製造法を開発するために必要である。しかし、このような適応は、時間がかかり、費用がかかる。したがって、クリッピングの問題に対処するための改善された方法が必要である。
【０００６】
したがって、本発明の目的は、細胞培養培地において発現され分泌された対象のポリペプチドのクリッピングが低減または排除される、脊椎動物細胞における対象のポリペプチドの組換え製造のための改善された方法を提供することである。特に、本発明の目的は、前記細胞によって発現され分泌された対象のポリペプチドのクリッピングが低減または排除される新規脊椎動物細胞を提供することである。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本開示の要旨
本開示は、とりわけ、例えば、マトリプターゼ遺伝子の機能的発現を低減または排除することによって、内因性プロテアーゼマトリプターゼの効果を障害する（impair）よう脊椎動物細胞を変更することは、前記細胞によって細胞培養培地中に発現され分泌された対象の組換えポリペプチドのタンパク質分解性分解（「クリッピング」）を大幅に減少させるという予期しない知見に基づいている。したがって、前記細胞におけるマトリプターゼの効果を障害することは、マトリプターゼの効果が障害されていない対応する脊椎動物細胞と比較して、分泌された対象の組換えポリペプチドのクリッピングを低減させる。マトリプターゼを用いて、組換え発現され分泌されたポリペプチドのクリッピングに関与している重要なプロテアーゼが同定された。マトリプターゼの効果を障害するよう脊椎動物細胞を変更することによって、細胞培養培地における組換え発現され分泌された対象のポリペプチドのクリッピングを低減または排除することによって、対象のポリペプチドの組換え製造を大幅に改善することが可能となる。それによって、無傷の対象のポリペプチドの収率は増大される。実施例によって実証されるように、その他のプロテアーゼの機能を障害する場合にはこれらの有利な効果は見られず、これによって、マトリプターゼが、クリッピングに関与している主要なプロテアーゼであることが確認される。本開示によって提供される新規脊椎動物細胞は、タンパク質分解部位を排除するよう、発現されるべき対象のポリペプチドを再設計する必要性、またはクリッピングを低減もしくは防止するために製造プロセスを苦労して適応させる必要性、またはクリッピングされたタンパク質を除去するための特別な精製プロセスを設計する必要性をないものにする。本明細書に記載されるこれらの変更された脊椎動物細胞は、特にクリッピングの傾向がある対象のポリペプチドを含めた種々の対象のポリペプチドを発現させるための汎用性宿主細胞として使用できることが有利である。発現されるべきポリペプチドまたは発現系の特別な適応は、使われなくなり、これによって、時間および費用が節約される。さらに、実施例によって実証されるように、本開示によって提供された変更された脊椎動物細胞は、良好な成長および発現特徴を示す。したがって、マトリプターゼの効果を障害することは、依然として、対象のポリペプチドの組換え発現に重要である好都合な発現特徴を有する宿主細胞を提供する。したがって、本発明は、先行技術に重要な寄与を行う。
【０００８】
第１の態様によれば、本開示は、対象のポリペプチドの組換え発現に適している単離された脊椎動物細胞であって、マトリプターゼの効果を障害し、対象のポリペプチドをコードする少なくとも１種の異種ポリヌクレオチドを含むように変更されており、対象のポリペプチドを分泌する、単離された脊椎動物細胞を提供する。脊椎動物細胞は、例えば、前記脊椎動物細胞におけるマトリプターゼ遺伝子の機能的発現を低減または排除することによって、例えば、遺伝子サイレンシング、遺伝子欠失によって、または非機能的なもしくはあまり機能的でないタンパク質が発現されるようにマトリプターゼ遺伝子を変異させることによって、マトリプターゼの効果を障害するように変更されている。脊椎動物細胞においてマトリプターゼの効果を障害することは、分泌された対象の組換えポリペプチドのクリッピングを、マトリプターゼの効果が障害されていない対応する脊椎動物細胞と比較して低減する。とりわけ、スパイクイン実験に基づく実施例によって示されるように、マトリプターゼの効果が障害されている、それぞれ変更された脊椎動物細胞を培養した場合に得られる細胞培養培地の上清では、上清中でその他のプロテアーゼは依然として活性であるのに、対象の組換えポリペプチドのクリッピングが驚くほど高度に低減される。これらの結果は、マトリプターゼの効果が障害されているそれぞれ変更された細胞において、対象のいくつかのポリペプチドを発現させることによって確認された。これらの結果によって、マトリプターゼが、組換え発現され分泌された対象のポリペプチドのクリッピングに関与している重要なプロテアーゼであることが確認される。したがって、第１の態様の脊椎動物細胞は、組換え製造技術のための宿主細胞として特に適しており、脊椎動物細胞によって細胞培養培地中に分泌される対象のポリペプチドの組換え製造のために使用され得、細胞培養培地から対象のポリペプチドが回収され得る。
【０００９】
第２の態様によれば、本開示は、第１の態様の脊椎動物細胞を製造するための方法であって、脊椎動物細胞をマトリプターゼの効果を障害するように変更する段階と、発現されるべき対象のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを導入する段階とを含み、前記対象のポリペプチドは、脊椎動物細胞によって分泌される、方法を提供する。効果を障害することは、例えば、前記細胞におけるマトリプターゼ遺伝子の機能的発現を低減または排除することによって、例えば、遺伝子サイレンシング、遺伝子欠失によって、または非機能的なもしくはあまり機能的でないタンパク質が発現されるようにマトリプターゼ遺伝子を変異させることによって達成され得る。
【００１０】
第３の態様によれば、対象のポリペプチドを組換えによって製造するための方法であって、対象のポリペプチドの組換え発現のための宿主細胞として第１の態様の脊椎動物細胞を利用する段階を含む方法が提供される。上記のように、細胞培養培地におけるポリペプチドクリッピングレベルの低減の達成によって、これらの変更された脊椎動物細胞は、対象のポリペプチド、特に、グリコポリペプチドなどのクリッピングの傾向があるポリペプチドの組換え製造のための宿主細胞として特に適している。好ましい実施形態として、対象のポリペプチドを組換えによって製造するための方法であって、
（ａ）対象のポリペプチドの発現および細胞培養培地への分泌を可能にする条件下で、第１の態様の脊椎動物宿主細胞を培養する段階と、
（ｂ）細胞培養培地から対象のポリペプチドを単離する段階と、
（ｃ）任意選択で、単離された対象のポリペプチドをプロセシングする段階と
を含む方法が提供される。
【００１１】
第４の態様によれば、対象のポリペプチドを組換えによって製造するための方法であって、
（ａ）対象のポリペプチドの発現および細胞培養培地への分泌を可能にする条件下で、対象のポリペプチドをコードする少なくとも１種の異種ポリヌクレオチドを含む脊椎動物宿主細胞を培養する段階であって、細胞培養培地がマトリプターゼに対して選択的であるプロテアーゼ阻害剤を含む段階と、
（ｂ）細胞培養培地から対象のポリペプチドを単離する段階と、
（ｃ）任意選択で、単離された対象のポリペプチドをプロセシングする段階と
を含む方法が提供される。
【００１２】
第５の態様によれば、対象のポリペプチドを組換えによって発現する宿主細胞を選択するための方法であって、
（ａ）宿主細胞として第１の態様の脊椎動物細胞を提供する段階と、
（ｂ）対象のポリペプチドを発現する１種または複数の宿主細胞を選択する段階と
を含む方法が提供される。
【００１３】
第６の態様によれば、本開示は、脊椎動物細胞から分泌される対象のポリペプチドの組換え製造のための脊椎動物細胞の使用であって、使用される細胞は、内因性プロテアーゼマトリプターゼの効果を障害するように変更される、使用に関連する。それぞれ変更された細胞は、例えば、前記細胞によって発現および分泌されるよう推定される対象のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを用いてトランスフェクトされ得る。内因性プロテアーゼマトリプターゼの効果が障害されているそれぞれの脊椎動物細胞を使用する場合には、細胞培養培地において低減された量の機能的マトリプターゼが活性であるか、または機能的マトリプターゼがない。これが、細胞によって細胞培養培地中に分泌される対象の組換えポリペプチドのタンパク質分解性分解を大幅に低減するか、さらには排除する。したがって、組換えタンパク質発現にこのように変更された脊椎動物細胞を使用することは有利である。
【００１４】
第７の態様によれば、本開示は、対象のポリペプチドの組換え製造のための脊椎動物細胞を選択するための方法であって、内因性プロテアーゼマトリプターゼは、脊椎動物細胞において機能的に発現されるか否かを分析する段階と、対象のポリペプチドの組換え製造のために、このような内因性マトリプターゼの効果が障害されている脊椎動物細胞を選択する段階を含む、方法に関連する。この選択プロセスによって、細胞培養培地における対象のポリペプチドのクリッピングが低減されている、対象の組換えポリペプチドを製造可能である脊椎動物細胞を同定することが可能になる。それぞれの脊椎動物細胞は、組換えタンパク質製造に特に適している。
【００１５】
本願のその他の目的、特徴、利点および態様は、以下の説明および添付の特許請求の範囲から当業者に明らかとなる。しかし、以下の説明、添付の特許請求の範囲および具体例は、本願の好ましい実施形態を示すものの、単に例示として与えられるということは理解されるべきである。開示される本発明の趣旨および範囲内の種々の変更および改変は、以下を読むと当業者には容易に明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、種々のプロテアーゼ標的遺伝子に対して向けられたｓｉＲＮＡを用いてトランスフェクトされたＣＨＯ細胞を培養することによって得られた馴化培地中で数日間インキュベートされた２種の治療用タンパク質（上のパネル：ＩｇＧ（ｍＡｂ）、下のパネル：Ｆｃ融合タンパク質）のウエスタンブロットを示す図である（ｍＡｂについて７日のインキュベーション、Ｆｃ融合タンパク質について３日のインキュベーション）。第１の対照「（＋）」は、細胞と接触していない組成既知の培養培地中で同一時間インキュベートされた対象のポリペプチドのサンプルを表す。対照として使用される組成既知の培養培地は、馴化培地を得るために細胞が培養された培養培地と同一培養培地であった。第２の対照「（−）」は、ｓｉＲＮＡ陰性対照として働いた非効果的ｓｉＲＮＡ（１２５ｐｍｏｌ）を用いてトランスフェクトされたＣＨＯ細胞から得られた馴化培地においてインキュベートされた対象のポリペプチドのサンプルを表す。標的トリプシン様セリンプロテアーゼおよびその発現がｓｉＲＮＡトランスフェクションによってサイレンシングされる相同体の名称は、上記の上のパネルで与えられている（ＭＴ−ＳＰ１（マトリプターゼ、本明細書においてＳｔ１４とも呼ばれる）、Ｃ１ｒ（Ｃ１ｒａとも呼ばれる）、Ｃ１ｓ（Ｇｍ５０７７とも呼ばれる）、ＰｌａｔおよびＰｒｓｓ３５）。「対象のポリペプチド／プロテアーゼ発現がサイレンシングされた細胞の馴化培地」の組合せの各々について、異なるｓｉＲＮＡ濃度を用いる２種の実験設定の結果が示されている。また、１００％として設定されたｓｉＲＮＡ陰性対照細胞におけるプロテアーゼ遺伝子発現に対する、残存プロテアーゼ遺伝子発現のパーセンテージが、図１下部括弧内に決定され、示されている。これは、例えば、ＭＴ−ＳＰ１（１８．６％）に関しては、サイレンシングの際に１８．６％の残存遺伝子発現があったことを意味する。ＭＴ−ＳＰ１：１２５ｐｍｏｌ（１８．６％）および１５０ｐｍｏｌ（１８．２％）、Ｃ１ｒ（Ｃ１ｒａ）：１２５ｐｍｏｌ（６．３％）および１５０ｐｍｏｌ（６．７％）、Ｃ１ｓ（Ｇｍ５０７７）：１００ｐｍｏｌ（１１．９％）および１２５ｐｍｏｌ（１４．４％）、Ｐｌａｔ：１２５ｐｍｏｌ（８．３％）および１５０ｐｍｏｌ（５．１％）ならびにＰｒｓｓ３５：１００ｐｍｏｌ（１８．４％）および１２５ｐｍｏｌ（１４．８％）。結果は、ＭＴ−ＳＰ１  ｍＲＮＡレベルが、ＲＮＡ干渉によって下方制御される場合には、馴化培地において大幅に少ないクリッピングが生じた（ｍＡｂおよびＦｃ融合タンパク質について検出される）ことを実証する。その他の発現されるトリプシン様セリンプロテアーゼが下方制御される場合には、クリッピングは同一のままである。したがって、結果は、マトリプターゼは、クリッピングに関与している重要なプロテアーゼであることを実証する。
【図２】図２は、ＣＨＯ−Ｋ１由来細胞中のマトリプターゼ遺伝子のエキソン２およびそれぞれの両端に位置するイントロン領域の配列を示す図である。配列決定プライマー（草書体、太字および下線が引かれた）を、それぞれの両端に位置するイントロンを標的とし、ＣＨＯ−Ｋ１由来ＭＴ−ＳＰ１エキソン２配列（灰色で影を付けられた）を確認するよう設計した。マトリプターゼノックアウト細胞を得るために使用されるＴＡＬＥＮのＤＮＡ結合ドメイン結合部位は、太字で、下線が引かれて表されており、ノックアウト変異の標的領域は、太字で示され、二重下線が引かれている。
【図３】図３は、ＣＨＯ−Ｋ１由来マトリプターゼノックアウト細胞クローンＫＯ−１〜ＫＯ−９およびクローンΔ７／Δ１５ならびにＣＨＯ−Ｋ１由来野生型細胞株（ＷＴ）において測定された、相対マトリプターゼｍＲＮＡ発現を表す柱状図を示す。野生型ＣＨＯ−Ｋ１由来細胞株におけるマトリプターゼｍＲＮＡ発現は、１００％として定義された。見られるように、マトリプターゼｍＲＮＡ発現は、すべてのノックアウトクローンおよびクローンΔ７／Δ１５において低減された。
【図４】図４は、野生型ＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＷＴ）および異なる変異によってマトリプターゼがノックアウトされた種々の異なるＣＨＯ−Ｋ１由来細胞クローン（実施例２、特に、表５を参照のこと）の細胞培養培地上清中でインキュベートされたクリッピングの傾向がある対象の３種の異なるポリペプチドのウエスタンブロットを示す図である。対象のポリペプチド（濃度各０．７μＭ）を、野生型ＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＷＴ）、表５に示されるノックアウトクローンＫＯ−１〜ＫＯ−９（数字１〜９によって図４においてそれぞれ示される）から得られた馴化培地または細胞と接触していない組成既知の培地（＋）中でインキュベートした。図４Ａ中の対象のポリペプチドは、ＩｇＧ（ｍＡｂ）であり、インキュベーション時間は、４８時間とした。図４Ｂ中の対象のポリペプチドは、Ｆｃ融合タンパク質であり、インキュベーション時間は２４時間とした。図４Ｃ中の対象のポリペプチドは、２種の糖変異体を有するさらなる組換えタンパク質であり、インキュベーション時間は１時間とした。両糖変異体は、野生型ＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＷＴ）から得られた馴化培地においてクリッピングされた。無傷のおよびクリッピングされたタンパク質は矢印によって示されている。図４Ｄは、３ヶ月間培養されたそれぞれの細胞から得られた馴化培地を使用するｍＡｂを用いる実験の反復の結果を示す図である。インキュベーション条件は、図４Ａにおいてと同一とした。結果は、マトリプターゼノックアウト細胞クローンＫＯ−１〜ＫＯ−９から得られた馴化培地においてクリッピングが効果的に防止されることおよびこれらの有利な結果が長期培養の間維持されることを実証する。
【図５】図５ＡおよびＢは、クリッピングの傾向がある２種の異なるウイルス糖タンパク質（対象のポリペプチド）のウエスタンブロットを示す。対象のポリペプチドを、マトリプターゼを発現するＣＨＯ−Ｋ１由来細胞株（ＷＴ）およびマトリプターゼがノックアウトされた種々の細胞クローン（ＫＯ−１〜ＫＯ−３）から得られた馴化培地中でインキュベートした。対象のポリペプチドを、野生型細胞（ＷＴ）から得られた馴化培地、表５に示されるノックアウトクローンＫＯ−１〜ＫＯ−３から得られた馴化培地（それぞれ、数字１〜３によって示される）または細胞と接触されなかった組成既知の培養培地（＋）中、０．７μＭの濃度でインキュベートした。Ｄ１は、２４時間のインキュベーション時間を示し、Ｄ２は、４８時間のインキュベーション時間を示す。無傷のおよびクリッピングされたタンパク質は矢印によって示されている（白色および黒色矢印）。図５Ｂにおけるウエスタンブロットの左側の数字は、決定されたｋＤａでの分子量を表す。結果は、やはり、マトリプターゼＫＯクローンから得られた馴化培地において、クリッピングが大幅に低減されることを実証する。
【図６】図６は、野生型マトリプターゼを発現するＣＨＯ細胞（「ＷＴ１」および「ＷＴ２」）およびマトリプターゼが変異され、その結果、マトリプターゼの機能的発現が低減されたＣＨＯクローン（「Δ７／Δ１５」）から得られた細胞培養培地上清中でインキュベートされたＦｃ融合タンパク質（図６Ａ）およびＩｇＧ（ｍＡｂ）（図６Ｂ）のウエスタンブロットを示す図である。細胞と接触されなかった対応する組成既知の培養培地（「（＋）」）は、陽性対照として働いた。Ｆｃ融合タンパク質およびｍＡｂ（各０．７μＭの濃度）を、それぞれ２時間および２４時間インキュベートした。ウエスタンブロットの脇の数字は、ゲルで決定されたｋＤａでのおよその分子量を表す。結果は、活性マトリプターゼの機能的発現が低減されている変異体細胞クローンΔ７／Δ１５から得られた馴化培地においてクリッピングが低減されることを実証する。
【図７】図７は、種々の対象のポリペプチドの、２種の異なるトリプシン様プロテアーゼ、すなわち、マウス（ＭＴ−ＳＰ１）およびヒトＨｔｒａ１由来のマトリプターゼとの同時インキュベーションの結果を示す図である。図７Ａは、ｍＡｂのウエスタンブロット解析（インキュベーション時間２４時間）を示し、図７Ｂは、Ｆｃ融合タンパク質のキャピラリーゲル電気泳動分析（Ｃａｌｉｐｅｒ  ＬａｂＣｈｉｐ（登録商標））（インキュベーション時間２時間）を示し、図７Ｃは、さらなる組換えタンパク質のウエスタンブロット解析（インキュベーション時間１時間）を示す。対象のポリペプチドの濃度は、すべての実験設定において０．７μＭとした。各対象のポリペプチドを、ＭＴ−ＳＰ１およびＨｔｒａ１の漸減量を用いて試験した：プロテアーゼ対対象のポリペプチドのモル比は、ＭＴ−ＳＰ１について、左から右に１／１０、１／１００および１／１０００であり、Ｈｔｒａ１について１／３、１／１０および１／１００である。対象のポリペプチドはまた、組成既知の培養培地「（＋）」において、およびＣＨＯ−Ｋ１由来野生型細胞「（−）」から得られた馴化培地（上清）においてと同一時間インキュベートした。無傷のタンパク質（大きい）およびクリッピングされたタンパク質（小さい）は、図７Ａおよび７Ｃにおいて矢印によって示されている。図７Ｂでは、無傷のポリペプチドに加えて２種のクリッピングされたポリペプチドがある（すべて矢印を用いて記されており、横に示されている）。図７Ａ〜図７Ｃは、クリッピングがマトリプターゼの存在下で起こり、それによって、マトリプターゼが、クリッピングに関与している重要なプロテアーゼであることが確認されることを実証する。
【図８】図８は、２種の対象のポリペプチド、モノクローナルＩｇＧ抗体（上のパネル、インキュベーション時間２４時間）および組換えタンパク質（下のパネル、インキュベーション時間１時間）のウエスタンブロット解析を示す。対象のポリペプチド（濃度各０．７μＭ）を、組成既知の培養培地「（＋）」において、ＣＨＯ−Ｋ１由来の野生型細胞「（−）」から得られた馴化培地において、またはマウス（Mus Musculus）由来の組換えマトリプターゼを添加した組成既知の培養培地において（（＋）＋ＭＴ−ＳＰ１）のいずれかでインキュベートした。いくつかのサンプルに、示されるように抗ＭＴ−ＳＰ１阻害性Ｆａｂ断片を添加した（「＋Ｆａｂ」）。サンプル中のＦａｂの濃度は、レーンの上に示されている（１μＭ、１０μＭまたは５０μＭ）。矢印は、無傷のまたはクリッピングされたタンパク質を表すタンパク質バンドを示す。Ｆａｂ断片が添加されたレーンにおけるおよそ２５ｋＤのタンパク質バンドは、Ｆａｂ断片に相当する。結果は、マトリプターゼが活性である細胞培養培地への、抗ＭＴ−ＳＰ１  Ｆａｂ断片（選択的マトリプターゼ阻害剤である）の添加が、クリッピングを活発に低減するか、さらには完全に防止することを実証する。結果は、マトリプターゼが、クリッピングに関与している重要なプロテアーゼであることをさらに確認する。
【図９】図９は、マイクロチップキャピラリー電気泳動（Ｃａｌｉｐｅｒ  ＬａｂＣｈｉｐ（登録商標））の結果を示す図である。組換えｍＡｂを、ＣＨＯ−Ｋ１由来野生型細胞（ＷＴ）において、またはマトリプターゼノックアウト細胞（ＫＯ−４、表５も参照のこと）において発現させ、アフィニティークロマトグラフィー（プロテインＡ）を使用して精製した。レーンの上の数字は、並行トランスフェクションおよび選択プロセスから得られた異なるｍＡｂ製造細胞プールを示す。各レーンにおいて、矢印によって示されるように、３つのタンパク質バンドが見える。上のタンパク質バンドは、無傷のｍＡｂ重鎖に相当し、第２のバンド（第１のすぐ下）は、クリッピングされた抗体重鎖に相当し、下のバンドは、ｍＡｂの軽鎖に相当する。結果は、マトリプターゼノックアウト細胞において対象のポリペプチドを発現させる場合に、クリッピングが大幅に低減されることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
詳細な説明
本開示は、とりわけ、例えば、マトリプターゼ遺伝子の機能的発現を低減または排除することによって、内因性プロテアーゼマトリプターゼの効果が障害されている変更された脊椎動物細胞は、対象の組換えポリペプチドを発現し、細胞培養培地中に分泌することが可能であり、しかし、これでは、細胞培養培地における対象の組換えポリペプチドのクリッピングが大幅に低減されるという予期しない知見に基づいている。したがって、何百もの種々のプロテアーゼの中で、組換え発現され分泌されたポリペプチドのクリッピングに関与している主要なプロテアーゼが同定された。細胞培養培地においてクリッピングを有意に低減し、またはさらには排除するのに、単一のプロテアーゼの活性を標的とし、障害することが十分であるということも非常に驚くべきことであった。例えば、本発明のそれぞれ変更された脊椎動物細胞を使用することによって、細胞培養培地から発現および分泌後に得ることができる無傷の対象のポリペプチドの収率を増大することによって、対象のポリペプチドの組換え製造を大幅に改善することが可能となる。したがって、対象のポリペプチドを組換えによって製造するために本発明の変更された脊椎動物細胞を使用する場合には、タンパク質分解性分解を低減する、ひいては、対象のポリペプチドのクリッピングを防止するためのさらなる手段を実施することは必要ではない。したがって、本発明は、先行技術に重要な寄与を行う。
【００１８】
本開示の個々の態様ならびに適したおよび好ましい実施形態を、ここで、詳細に説明する。
【００１９】
Ａ．  変更された脊椎動物細胞
第１の態様によれば、本開示は、対象のポリペプチドの組換え発現に適している単離された脊椎動物細胞であって、マトリプターゼの効果を障害し、対象のポリペプチドをコードする少なくとも１種の異種ポリヌクレオチドを含むように変更されており、対象のポリペプチドを分泌する、単離された脊椎動物細胞を提供する。脊椎動物細胞においてマトリプターゼの効果を障害することは、マトリプターゼの効果が障害されていない対応する脊椎動物細胞と比較して、分泌された対象の組換えポリペプチドのクリッピングを低減する。
【００２０】
マトリプターゼは、培養乳癌細胞において新規ゼラチン分解活性として１９９３年に最初に記載された。マトリプターゼは、ＩＩ型膜貫通型セリンプロテアーゼ（ＴＴＳＰ）のファミリーに属する。マトリプターゼのオルソログは、哺乳動物種を含めた種々の脊椎動物種中に存在し、例えば、ヒト、チンパンジー、イヌ、マウス、ラット、ニワトリ、ゼブラフィッシュ、ミドリフグ（spotted green putterfish）およびトラフグ（tiger putterfish）において同定され、これは、進化上保存された機能を示唆する。マトリプターゼは、ＩＵＢＭＢ酵素命名法においてＥＣ３．４．２１．１０９として列挙されている。マトリプターゼは、膜型セリンプロテアーゼ１（ＭＴ−ＳＰ１）、腫瘍形成能のサプレッサー１４（ＳＴ１４）としても知られている（Chen et al, The Transmembrane Serine Protease Matriptase: Implications for Cellular Biology and Human Diseases J Med Sci 2012; 32 (3): 097-108を参照のこと）。細胞質Ｎ末端近くに１回膜貫通型ドメインを有する膜内在性タンパク質である。細胞外部分は、基部領域（単一ＳＥＡ、２つのＣＵＢおよび４つのＬＤＬＲＡドメインを含む）およびその他のＴＴＳＰと高度に構造的に同様であるＣ末端セリンプロテアーゼドメインからなり、触媒活性に必須である保存されたヒスチジン／アスパラギン酸／セリン（ＨＤＳ）触媒三残基を含む（例えば、List et al, Matriptase: Potent Proteolysis on the cell Surface; MOL MED 12 (1-3) 1-7, JANUARY-MARCH 2006およびChen et al, The Transmembrane Serine Protease Matriptase: Implications for Cellular Biology and Human Diseases J Med Sci 2012; 32 (3): 097-108を参照のこと）。マトリプターゼは、皮膚、乳房、肺、表皮、角膜、唾液腺、口腔および鼻腔、甲状腺、胸腺、食道、気管、細気管支、肺胞、胃、膵臓、胆嚢、十二指腸、小腸、結腸、直腸、腎臓、副腎、膀胱、尿管、精嚢、精巣上体、前立腺、卵巣、子宮および膣などの多数の臓器系において上皮において発現されていると記載されている（List et al、2006およびChen et al、2012を参照のこと）。マトリプターゼは、不活性チモーゲンとして合成され、複雑なプロセスによってその活性形態に変換される。細胞内タンパク質分解による切断に絡む活性化プロセスに関する詳細は、List et al 2006およびChen et al 2012においてヒトマトリプターゼについて記載されている。マトリプターゼは、触媒ドメインが細胞外間隙中に配向されたＩＩ型膜貫通型タンパク質として膜と結合している。さらに、マトリプターゼ、それぞれ、その細胞外部分の大幅な切断が、ｉｎ  ｖｉｖｏで起こることが文献に記載されている（List et al, 2006およびChen et al 2012を参照）。マトリプターゼは、例えば、クニッツ型セリンプロテアーゼ阻害剤ＨＡＩ−１と複合体を形成している複合体の形態で切断されることが、文献に記載されている。種々の研究によって、ヒト細胞では、ＨＡＩ−１の除去またはさらには単一点変異が、ゴルジ体領域におけるマトリプターゼの蓄積につながることが示されたので、特異的阻害剤ＨＡＩ−１が、細胞膜へのマトリプターゼの輸送を促進することが示唆される。文献では、ＨＡＩ−１に加えて、ＨＡＩ−２、抗トロンビン、α−１アンチトリプシンおよびα−２−抗プラスミンなどのマトリプターゼのいくつかの異なる内因性阻害剤が記載されている。さらにまた、マトリプターゼのその他の阻害剤��記載された（例えば、Chen et al, 2012を参照のこと）。文献には、マトリプターゼは、皮膚バリア機能、上皮完全性、毛包発達および胸腺ホメオスタシスなど、正常な生理において、また変形性関節症、アテローム性動脈硬化（atheroscleorisis）ならびに腫瘍進行、浸潤および転移など、ヒト病理において多数の役割を果たし得ることが記載されている。
【００２１】
対象のポリペプチドの組換え製造と無関係であるこの科学的背景に対して、マトリプターゼは、宿主細胞によって細胞培養培地中に分泌される組換え製造された対象のポリペプチドのクリッピングに関与している重要なプロテアーゼであるという本知見は、非常に驚くべきことであった。特に、哺乳動物細胞などの脊椎動物細胞において発現されるプロテアーゼの数の多さおよび多様性を考慮すると、この単一のプロテアーゼ−マトリプターゼの機能を障害することで、細胞培養培地中に分泌された対象のポリペプチドのクリッピングを大幅に低減する、またはさらには排除するのに十分であることはさらにより驚くべきことであった。これらの有利な効果は、その他のもの、密接に関連するプロテアーゼを用いた場合でさえ見られず、これが、マトリプターゼが、細胞培養培地中に分泌された組換えポリペプチドのクリッピングに関与している重要な酵素であるという知見の重要性を支持する理由である。実施例によって示されるように、内因性プロテアーゼマトリプターゼの効果が障害されている変更された脊椎動物細胞を使用する場合には、細胞によって細胞培養培地中に分泌される対象の組換えポリペプチドのクリッピングは、大幅に低減される。例えば、遺伝子サイレンシング（例えば、実施例１に示されるようなＲＮＡｉ）または内因性マトリプターゼ遺伝子の変異（例えば、実施例２および５に示されるような、２種のマトリプターゼ対立遺伝子の一方または両方のノックアウト）のいずれかによって、マトリプターゼの機能を障害することは、組換え発現され、細胞培養培地中に分泌された対象のポリペプチドのクリッピングの大幅な低減またはさらには完全排除につながる。クリッピングの大幅な低減は、ＩｇＧ抗体、Ｆｃ融合タンパク質、グリコシル化ウイルスタンパク質およびその他の治療上活性のあるタンパク質などの、クリッピングの傾向がある試験されたポリペプチドのすべてについて見られた。したがって、組換え発現によって対象のポリペプチドを製造するためにマトリプターゼ欠損細胞株を使用することは有利である。マトリプターゼが、細胞培養培地中に分泌される対象のポリペプチドを直接切断するという例からさらに明らかである。したがって、任意の、マトリプターゼの効果を障害することが、細胞培養培地中に分泌される組換え発現されたポリペプチドのクリッピングを低減する。さらに、実施例によって実証されるように、細胞培養培地に選択的マトリプターゼ阻害剤を添加することもまた、クリッピングを低減し得る。
【００２２】
本開示の第１の態様の脊椎動物細胞において、内因性プロテアーゼマトリプターゼの効果が障害されるので、例えば、細胞表面上にこのような細胞が、機能的マトリプターゼを示さないか、もしくは低減された量の機能的マトリプターゼを示す、および／または（例えば、シェディングによって）細胞培養培地中に機能的マトリプターゼを放出しないか、もしくは低減された量の機能的マトリプターゼを放出するので、前記細胞が培養される細胞培養培地中に、機能的に活性なマトリプターゼが存在しないか、またはより少ない機能的に活性なマトリプターゼしか存在しない。それによって、細胞培養培地中に分泌される対象の組換えポリペプチドのタンパク質分解性分解は、大幅に低減されるか、またはさらには排除され、これが、対象のポリペプチドを組換え製造する場合の重要な利点である。クリッピングが大幅に低減されるので、無傷の対象のポリペプチドの収率が増大される。より少ない、非機能的で、免疫原性の可能性があるクリッピングされた副生成物が製造されるか、またはさらには製造されない。さらに、これらの新規脊椎動物宿主細胞は、一般に、良好な発現収率を示し、良好な成長特徴を有し、これが製造細胞株としてそれらを特に適したものにすることが見出された。さらなる利点が以下に記載されており、また、実施例から明らかである。したがって、これらの有利な脊椎動物細胞は、対象のポリペプチドを改善された製品品質および収率で組換えによって製造することを可能にする。さらに、好ましくは、哺乳動物細胞である本発明の脊椎動物細胞を使用することは、対象のポリペプチドの組換え製造のために製造細胞株を開発するのに必要な時間を低減する。クリッピングを避けるか、または低減するために、例えば、アミノ酸配列を変更することによる、より少ない、対象のポリペプチドの最適化しか必要でないか、またはさらには必要ではない。特に、クリッピング部位の除去は使われなくなる。さらに、製造細胞株としてこれらの細胞を使用する場合には、クリッピングされたタンパク質を除去するための時間のかかる精製プロセスを避けることができる。したがって、これらの脊椎動物細胞は、組換え製造技術のための宿主細胞株として使用されている場合には重要な利点を有する。
【００２３】
配列表は、ハムスター（配列番号１−ＮＣＢＩ参照配列：ＸＰ＿００３４９５８９０）、ヒト（配列番号２−ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿０６８８１３）、マウス（配列番号３−ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿０３５３０６）、ラット（配列番号４−ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿４４６０８７）およびチンパンジー（配列番号５−ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００１１８９４３４）などの種々の脊椎動物種のマトリプターゼの例示的アミノ酸配列を示す。表１から明らかであるように、マトリプターゼは、現在、「腫瘍形成能のサプレッサー１４タンパク質」（例えば、ヒトについて）および「腫瘍形成能のサプレッサー１４タンパク質相同体」（例えば、マウスおよびチャイニーズハムスターにおいて）とも呼ばれる。用語「マトリプターゼ」は、本明細書において使用されるように、マトリプターゼ参照タンパク質として配列番号１〜５に示される１種または複数のタンパク質に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を共有し、前記マトリプターゼ参照タンパク質と同一のタンパク質分解性活性を有する任意のタンパク質を特に包含する。同一性は、本明細書において使用されるように、参照タンパク質の全長にわたって算出される。マトリプターゼは、その他のプロテアーゼとは区別される。文献では、マトリプターゼには、種々の名称が割り当てられており、その選択は、表１に提供されている。酵素マトリプターゼをコードする対応する遺伝子にもまた、種々の名称が割り当てられており、その選択は、表１に提供されている。本発明との関連では、プロテアーゼは、簡潔な容易さのために、「マトリプターゼ」、「ＭＴ−ＳＰ１」、「腫瘍形成能のサプレッサー１４タンパク質」または「腫瘍形成能のサプレッサー１４タンパク質相同体」と呼ばれる。しかし、用語「マトリプターゼ」はまた、前記タンパク質の任意の代替名称または例えば、異なる種における対応するタンパク質もしくは遺伝子を特徴付けるために使用される対応する遺伝子を指し、包含する。同一機能を有するマトリプターゼの相同体およびオルソログも、用語「マトリプターゼ」中に含まれる。これに関連して、マトリプターゼ−２およびマトリプターゼ−３は、マトリプターゼとは別個である（構造的には関連しているが）プロテアーゼに関し、したがって、本明細書において使用されるように、用語「マトリプターゼ」によって対象とされないことが記載される。
【００２４】
【表１】
0006636453.tif 000002
【００２５】
マトリプターゼタンパク質をコードする遺伝子は、また、本明細書において「マトリプターゼ遺伝子」とも呼ばれる。種々の哺乳動物種のゲノム遺伝子配列が知られており、例えば、チャイニーズハムスター（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：１００７５５２２５）；ヒト（Homo sapiens）（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：６７６８）；マウス（Mus musculus）（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：１９１４３）；ラット（Rattus norvegicus）（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：１１４０９３）；チンパンジー（Pan Troglodytes）（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：１００１８８９５０）およびその他において記載されている。マトリプターゼ遺伝子の同義語は、表１に列挙されており、よく使用されるものは、「ＳＴ１４」または「Ｓｔ１４」である。用語「マトリプターゼ遺伝子」は、本明細書において使用されるように、配列番号１〜５に示されるようなマトリプターゼタンパク質をコードする、またはマトリプターゼ参照タンパク質として配列番号１〜５に示されるマトリプターゼタンパク質のうち１種もしくは複数に対して、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を共有し、前記マトリプターゼ参照タンパク質と同一のタンパク質分解性活性を有する、マトリプターゼタンパク質をコードする脊椎動物細胞の任意の内因性遺伝子を特に包含する。同一性は、本明細書において使用されるように、参照タンパク質の全長にわたって算出される。
【００２６】
本開示は、とりわけ、好ましくは、哺乳動物細胞などの修飾された脊椎動物細胞であって、前記細胞において、普通、対応する非修飾脊椎動物細胞によって内因性に発現される内因性マトリプターゼの効果が、障害されている、脊椎動物細胞に関連する。内因性プロテアーゼマトリプターゼの効果を障害するこの変更のために、本明細書に記載される変更された脊椎動物細胞は、機能的マトリプターゼを細胞培養培地中に示さない、もしくは放出しない、または低減された量の機能的マトリプターゼを細胞培養培地中に示す、もしくは放出し、それによって、細胞培養培地における分泌された対象のポリペプチドのクリッピングは、低減されるか、またはさらには完全に防止される。実施例によって実証されるように、一時的なものであれ、永久的なものであれ、この変更は、前記変更された細胞によって細胞培養培地中に分泌される対象の組換えポリペプチドのタンパク質分解性分解を大幅に低減する。
【００２７】
脊椎動物細胞を変更、ひいては、修飾して、前記細胞において内因性マトリプターゼの効果を障害するためのいくつかの可能性がある。マトリプターゼの効果は、例えば、遺伝子レベルで、またはタンパク質レベルで障害され得る。マトリプターゼの効果は、例えば、マトリプターゼの構造／配列、マトリプターゼの転写、翻訳および／または細胞輸送の修飾によって障害され得る。限定されない選択肢は、以下に記載されている。
【００２８】
一実施形態によれば、前記細胞においてマトリプターゼ遺伝子の機能的発現は、低減または排除されるので、マトリプターゼの効果が障害される。実施例によって示されるように、マトリプターゼ遺伝子の機能的発現を低減または排除することによって、例えば、遺伝子サイレンシングによって、または遺伝子ノックアウトによってマトリプターゼ遺伝子の発現を変更することは、対象の組換えポリペプチドを発現するのに適しているが、細胞培養培地中に分泌された対象のポリペプチドのクリッピングが、低減またはさらには完全に避けられる、脊椎動物細胞を提供するための極めて効率的な手段である。脊椎動物細胞においてマトリプターゼ遺伝子の機能的発現が低減または排除される場合に、細胞培養培地中に分泌された対象の組換えポリペプチドのクリッピングが同様に減少されることが見出された。この相関は、予期しない知見である。
【００２９】
マトリプターゼの機能的発現の低減または排除は、種々の手段によって達成され得る。機能的発現は、例えば、マトリプターゼの発現レベルを低減することによって、またはマトリプターゼの触媒活性を低減することによって、または両方の組合せによって低減され得る。一実施形態によれば、細胞は、マトリプターゼ遺伝子の機能的発現が、遺伝子ノックアウト、遺伝子変異、遺伝子欠失、遺伝子サイレンシングまたは前述のいずれかの組合せによって、低減または排除されるよう変更される。一実施形態によれば、脊椎動物細胞のゲノムは、マトリプターゼの効果を障害するように変更される。
【００３０】
一実施形態によれば、細胞においてマトリプターゼ遺伝子の機能的発現は、遺伝子ノックアウトによって低減または排除される。遺伝子ノックアウトは、遺伝子が、その機能を破壊することによって無効にされる遺伝子技術である。例えば、核酸が、コード配列中に挿入され、それによって遺伝子機能が破壊され得る。さらに、完全マトリプターゼ遺伝子またはその一部が欠失し、それによって、個々に変更された細胞によって、タンパク質が発現されない、または機能的タンパク質が発現されないこともある。別の選択肢は、コード配列中に、非機能的なまたはあまり機能的でない発現産物を提供する１つまたは複数のノックアウト変異を導入することである。例えば、非機能的なまたはあまり機能的でないタンパク質をもたらす、１つまたは複数のフレームシフト変異が導入され得る。あるいは、またはさらに、末端切断型の、非機能的なまたはあまり機能的でないタンパク質が得られるようコード配列中に１つまたは複数の停止コドンが導入され得る。したがって、一実施形態によれば、マトリプターゼ遺伝子は、非機能的なまたはあまり機能的でない発現産物を提供する１つまたは複数の変異を含む。一実施形態によれば、前記１つまたは複数の変異は、フレームシフトまたは停止コドン変異である。一実施形態によれば、マトリプターゼのＣ末端に位置するプロテアーゼドメインのすべてまたは一部が、導入された１つまたは複数の変異のために存在しない。その他の選択肢として、それだけには限らないが、プロモーター中、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲおよび／またはその他の調節エレメント中に１つまたは複数の変異を導入することが挙げられる。一実施形態によれば、マトリプターゼ遺伝子のプロモーター機能は、例えば、プロモーター欠失を導入することによって、またはプロモーターと転写開始部の間に構築物を導入することによって破壊される。標的遺伝子の機能的発現を抑制または排除する遺伝子ノックアウトを達成するための方法もまた、当業者に周知であり、したがって、本明細書において何らかの詳細な説明を必要としない。それにもかかわらず、いくつかの限定されない例が以下に記載されている。
【００３１】
一実施形態によれば、マトリプターゼ遺伝子は、遺伝子工学によって機能的にノックアウトされる。例として、それだけには限らないが、エンジニアリングされたヌクレアーゼを用いるゲノム編集（ＧＥＥＮ）などのゲノム編集が挙げられる。これは、人工的にエンジニアリングされたヌクレアーゼまたは「分子ハサミ」を使用して、ＤＮＡが挿入され、置換されるか、またはゲノムから除去される遺伝子工学の１種である。ヌクレアーゼは、ゲノム中の所望の位置で特定の二本鎖切断（ＤＳＢ）を創出し、相同組換え（ＨＲ）および非相同末端結合（ＮＨＥＪ）の天然プロセスによって誘導された切断を修復するための細胞の内因性機序を利用する。この目的のために使用することができるエンジニアリングされたヌクレアーゼの少なくとも４種のファミリーがある：ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）を認識するヌクレアーゼおよびエンジニアリングされたメガヌクレアーゼによってリエンジニアリングされたホーミングエンドヌクレアーゼ。マトリプターゼ遺伝子が完全にまたは部分的にノックアウトされ、それによって、前記細胞においてマトリプターゼの効果が障害された、変更された哺乳動物細胞を提供するために、実施例においてＴＡＬＥＮ技術も使用された。
【００３２】
一実施形態によれば、脊椎動物細胞においてマトリプターゼの効果を低減または排除し、ひいては、障害するように、脊椎動物細胞のゲノム中に存在するマトリプターゼ遺伝子の１つまたは複数のコピーが変更されている、例えば、ノックアウトされているか、欠失する。したがって、一実施形態によれば、脊椎動物細胞のゲノムにおいて、マトリプターゼ遺伝子の少なくとも１つのコピーが欠失するか、または機能的に不活性化されている。一実施形態によれば、脊椎動物細胞は、非機能的なまたはあまり機能的でない発現産物を提供するように、マトリプターゼ遺伝子の少なくとも１つのコピー中に１つまたは複数の変異を含む。一般に、脊椎動物細胞は、マトリプターゼ遺伝子の２種の対立遺伝子コピーを含む。１つまたは複数の変異が、マトリプターゼ遺伝子の一方または両方のコピー中に挿入され得る。非機能的なまたはあまり機能的でない発現産物を提供し、ひいては、脊椎動物細胞においてマトリプターゼの効果を障害するように、マトリプターゼ遺伝子の両方にそれぞれ、すべてのコピーに１つまたは複数の変異が挿入されていることが好ましい。それによって、マトリプターゼ遺伝子のすべてのコピーが、ゲノム中で基本的に障害されるか、または不活性化されている。実施例において示されるように、障害することを達成するためにマトリプターゼ遺伝子の異なる対立遺伝子中に異なる変異を導入することができる。
【００３３】
一実施形態によれば、前記１つまたは複数の変異は、マトリプターゼ遺伝子のコーディング領域中に含まれ、非機能的なまたはあまり機能的でない発現産物をもたらす。例えば、変更された脊椎動物細胞は、マトリプターゼの２種以上の触媒的に活性な、したがって、機能的なスプライシング変異体中に存在するアミノ酸配列をコードするマトリプターゼ遺伝子の領域中に１つまたは複数の変異を含むので、マトリプターゼの機能が障害され得る。種々の種において、マトリプターゼのいくつかのスプライシング変異体が同定されている。マトリプターゼエキソンのうちいくつかは、大部分が、またはさらにはすべてが同定された機能的スプライシング変異体において見出される。１つまたは複数の変異を、それぞれの脊椎動物細胞の機能的マトリプターゼスプライシング変異体のうち２種以上に、好ましくは、大部分に、さらにはすべてに存在するエキソンをコードするマトリプターゼ遺伝子の領域中に導入することが有利である。
【００３４】
一実施形態によれば、１つまたは複数の変異は、マトリプターゼのエキソン２をコードするポリヌクレオチド配列中に含まれる。変更される脊椎動物細胞において、内因性プロテアーゼマトリプターゼの機能を障害するための変更のための標的としてエキソン２を選択することは、このアプローチが、いくつかの異なる機能的スプライシング変異体を対象とするという利点を有する。エキソン１、エキソン２およびエキソン３などのマトリプターゼのＮ末端に近いエキソンは、１つまたは複数の変異、特に、１つまたは複数のフレームシフト変異を導入するための有利な標的である。これらのエキソンのうち１種におけるフレームシフト変異は、配列中、早期に停止コドンにつながる可能性が最も高い。変異された遺伝子によってコードされる末端切断型タンパク質は、短く、細胞内に位置し、および／または不活性であると推測される可能性が最も高い。不活性の末端切断型タンパク質は、その発現が細胞に対して非毒性であると推測され得るので有利である。しかし、１つまたは複数の変異はまた、例えば、エキソン４〜１９から選択される、その後のエキソンのうち１種中に導入されてもよい。
【００３５】
実施例では、エキソン２中に種々のフレームシフト変異を含むＣＨＯ細胞を作製した。実施例は、それぞれ変更された細胞が、細胞成長を持続したことを示す。したがって、実施例において試験されるマトリプターゼのコードされる末端切断型バージョン（単数または複数）は、細胞に対して明らかに毒性ではなかった。さらに、それぞれ変異されたマトリプターゼ遺伝子の全体的なｍＲＮＡ発現は低く、その結果、より低いレベルの末端切断型バージョンが得られると見出された（図３を参照のこと）。したがって、実施例は、それぞれの変更が、好ましくは、哺乳動物細胞などの脊椎動物細胞において、対象のポリペプチドの組換え製造に重要であるその他の特徴を維持しながらマトリプターゼの機能を障害するのに有効であると実証する。したがって、一実施形態によれば、単離された脊椎動物細胞は、マトリプターゼ遺伝子のエキソン２中に少なくとも１つのフレームシフト変異を含み、これが、非機能的なまたはあまり機能的でない末端切断型ポリペプチドが発現されることをもたらす。好ましい実施形態によれば、脊椎動物細胞は、マトリプターゼ遺伝子の一方または、好ましくは、両方の対立遺伝子のエキソン２中に１つまたは複数のフレームシフト変異を含むＣＨＯ細胞であり、それによって、前記ＣＨＯ細胞においてマトリプターゼの効果が障害される。
【００３６】
一実施形態によれば、脊椎動物細胞は、マトリプターゼの触媒ドメインの少なくとも一部をコードする、マトリプターゼ遺伝子のポリヌクレオチド配列中に１つまたは複数の変異を含み、それによって、非機能的なまたはあまり機能的でない発現産物が得られる。触媒ドメインは、その基質と相互作用して、酵素反応を引き起こす酵素の領域である。１つまたは複数の変異が、タンパク質の触媒活性が低減または排除されるように、このドメイン中に導入され得る。触媒ドメインは、エキソン１６、１７、１８および１９中のアミノ酸によってコードされる。したがって、一実施形態によれば、脊椎動物細胞は、エキソン１６、エキソン１７、エキソン１８およびエキソン１９から選択される１つまたは複数のエキソン中に１つまたは複数の変異を含む。一実施形態によれば、触媒ドメイン中の１つまたは複数の変異は、マトリプターゼの触媒活性の低減または排除につながる。これは、例えば、フレームシフト変異によって、触媒ドメイン中の特異的点変異、停止コドン変異および／または欠失または挿入によって達成され得る。一実施形態によれば、マトリプターゼの触媒三残基が変更され、それによって、非機能的なまたはあまり機能的でないタンパク質を提供するように１つまたは複数の変異が導入される。例えば、Ｇ８２７Ｒ−マトリプターゼまたはＳ８０５Ａ−マトリプターゼなどのマトリプターゼの触媒不活性変異体も、文献に記載されている（Desilets et al, The Journal of Biological Chemistry Vol. 283, No. 16, pp. 10535-10542, 2008を参照のこと）。さらに、組換えマトリプターゼの触媒ドメインの結晶構造が知られている。この構造および配列データから、当業者ならば、マトリプターゼの触媒機能を障害するための変異のさらなる特異的標的を導くことができる。
【００３７】
マトリプターゼの機能的発現が障害されている変更された細胞はまた、ランダム変異誘発またはスクリーニングアプローチを使用して得ることができる。それぞれの方法は、先行技術において公知であり、詳細に記載される必要はない。次いで、マトリプターゼの機能的発現が障害されている変更された細胞は、例えば、第７の態様の方法を使用して同定され得る。
【００３８】
マトリプターゼの機能的発現はまた、少ない転写物が産生されるか、転写物が産生されないようにマトリプターゼ遺伝子のプロモーターおよび／もしくはエンハンサーを変更することによって、または転写もしくは転写後遺伝子サイレンシングなどの遺伝子サイレンシング技術によって影響を受け得る。一実施形態によれば、単離された脊椎動物細胞は、マトリプターゼ遺伝子のプロモーター領域中に１つまたは複数の変異を含む。例えば、プロモーター領域は、あまり機能的でない、または非機能的なプロモーターを提供するように変更され得、プロモーターはまた、完全に排除され得る。あるいはまたはそれに加えて、マトリプターゼ遺伝子のプロモーターと開始コドンの間に停止コドンを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を付加することが可能であり、これはマトリプターゼの代わりのその他のポリペプチドの発現につながる。プロモーターと開始コドンの間に挿入されるポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドは、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などのレポーターポリペプチドであり得る。レポーターのシグナルは、レポーターをコードする異種ポリヌクレオチドが、マトリプターゼの代わりに発現されることを示し、それによって、マトリプターゼの機能的発現が障害されている細胞をより容易に同定することが可能となる。
【００３９】
機能的遺伝子発現の低減は、機能的発現がさらに排除されるレベルを達成し得る。
【００４０】
転写後遺伝子サイレンシングは、アンチセンス分子またはＲＮＡ干渉を媒介する分子を使用することによって達成され得る。限定されない例を、以下に手短に記載する。
【００４１】
アンチセンスポリヌクレオチドは、ＲＮＡと特異的に結合し、ＲＮＡ−ＤＮＡまたはＲＮＡ−ＲＮＡハイブリッドの形成をもたらし、逆転写またはメッセンジャーＲＮＡ翻訳を停止するよう設計され得る。アンチセンスの多数の形態が開発されており、酵素依存性アンチセンスまたは立体遮断性アンチセンスに広く分類され得る。酵素依存性アンチセンスは、標的ｍＲＮＡを分解するＲＮａｓｅＨ活性に応じて、一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡおよびホスホロチオエートアンチセンスを含めた形態を含む。アンチセンスポリヌクレオチドは、転写鎖としてアンチセンス鎖を含有するアンチセンス構築物からの発現によって細胞内で通常作製される。トランス切断触媒ＲＮＡ（リボザイム）は、エンドリボヌクレアーゼ活性を有するＲＮＡ分子である。リボザイムは、特定の標的に対して特異的に設計され得、細胞性ＲＮＡのバックグラウンドにおいて任意のＲＮＡ種部位特異的に切断するようにエンジニアリングされ得る。切断事象は、ｍＲＮＡを不安定にし、タンパク質発現を防ぐ。脊椎動物細胞のゲノムは、それぞれのアンチセンス分子が例えば永久に発現されるように変更され得る。
【００４２】
転写後レベルでマトリプターゼ遺伝子の機能的発現を低減するための別の適した選択肢は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）に基づいている。スパイクイン実験に基づく実施例によって示されるように、ＲＮＡｉによってマトリプターゼの発現を低減することは、それぞれ変更された脊椎動物細胞によって発現され、細胞培養培地中に分泌される対象の組換えポリペプチドのクリッピングの程度を減少させるのに有効である。ＲＮＡｉによるマトリプターゼ遺伝子のサイレンシングの際には、大幅により多くの組換えポリペプチドが、上清／細胞培養培地中で無傷のままであり、したがって、それから回収され得る。対照的に、その他のプロテアーゼの発現レベルの低減は、密接に関連するセリンプロテアーゼでさえ、クリッピングに対して全く効果がないか、またはほとんど効果がなかった。これは、好ましくは、哺乳動物細胞においてなど、脊椎動物細胞において対象の組換えポリペプチドを発現させる場合に、マトリプターゼ、クリッピングに関与する主要なプロテアーゼを用いた場合に同定された重要性を強調する。ＲＮＡｉによって標的遺伝子をサイレンシングするための方法は、当業者に周知であり、したがって、ここで何らかの詳細な説明を必要としない。マトリプターゼ遺伝子の発現をサイレンシングし、それによって、マトリプターゼの効果が障害されている変更された細胞を提供するために使用され得るＲＮＡｉ誘導性化合物の例として、それだけには限らないが、低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）ならびに実際のＲＮＡｉ誘導性化合物に細胞においてプロセシングされるそれらの前駆体が挙げられる。一実施形態によれば、ｓｉＲＮＡは、サイレンシングのために使用される。ｓｉＲＮＡは、各々の鎖に３’オーバーハングを有する二本鎖分子として提供され得る。平滑末端分子も使用され得る。前記ｓｉＲＮＡは、デスオキシ−ならびにリボヌクレオチドを含み得、さらに、修飾されたヌクレオチドを含み得る。ｓｉＲＮＡ化合物のいくつかの実施形態および変形例は、先行技術において公知であり、マトリプターゼの発現を低減するために使用され得る。ＲＮＡレベルで標的遺伝子の選択された／同定された標的配列を標的とする、適したｓｉＲＮＡは、適切な計算方法を使用して、特定の設計アルゴリズムを適用することによって同定され得る。標的転写物に対するｓｉＲＮＡを得るために、二本鎖分子が、細胞中に直接トランスフェクトされてもよい。実施例によって示されるように、マトリプターゼの発現を低減するこのような一時的な方法でさえ、このような脊椎動物細胞から得られた馴化培地における対象のポリペプチドのクリッピングを防止するのに有効である。あるいは、ｓｉＲＮＡは、ダイサー、長ｄｓＲＮＡまたは短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）のいずれかをｓｉＲＮＡに変換する酵素によるプロセシングに起因し得る。これらの前駆体または最終ｓｉＲＮＡ分子は、外因的に（人工的に）製造され得、次いで、種々のトランスフェクション法によって脊椎動物細胞中に導入され得る。さらなる実施形態によれば、ＲＮＡｉ誘導性化合物は、脊椎動物細胞中にトランスフェクトされるベクターによって発現される。ｓｉＲＮＡについて、これは、例えば、２つの鎖の間にループを導入し、したがって、単一転写物を製造すること、次いで、これが脊椎動物細胞中で機能的ｓｉＲＮＡにプロセシングされ得ることによって行われ得る。このような転写カセットは、通常、普通、小さい核ＲＮＡ（例えば、ｓｈＲＮＡを発現するための）の転写に向けるＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター（例えば、Ｕ６またはＨ１）を使用する。ベクターから得られたｓｈＲＮＡ転写物は、次いで、ダイサーによってプロセシングされ、それによって、好ましくは、特徴的な３’オーバーハングを有する二本鎖ｓｉＲＮＡ分子を製造すると推測される。一実施形態によれば、このようなｓｈＲＮＡを提供するベクターは、脊椎動物細胞のゲノム中に安定に組み込まれる。この実施形態は、マトリプターゼ遺伝子の下方制御が、かなり安定であり、一時的ではない一定に製造されるｓｉＲＮＡによるので有利である。例えば、それぞれのｓｈＲＮＡを提供するベクターを含む細胞は、次いで、脊椎動物細胞によって発現され分泌されるべき対象のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを用いてトランスフェクトされ得る。さらに、ｓｈＲＮＡを生成するベクターが、対象のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターとともに同時トランスフェクトされる同時トランスフェクション戦略が使用されてもよい。
【００４３】
転写遺伝子サイレンシングは、例えば、エピジェネティック修飾を含み得る。さらに、マトリプターゼ遺伝子の配列は、ｍＲＮＡの半減期を低減するように変更され得る。これもまた、マトリプターゼの機能的発現の低減を達成し得る。
【００４４】
一実施形態によれば、マトリプターゼ発現は、マトリプターゼ遺伝子の発現の調節に関与している調節エレメントを標的とすることによって低減または排除される。例えば、転写因子、プロモーター（上記も参照のこと）、エンハンサー、ＵＴＲまたはその他の調節エレメントは、例えば、ノックアウト、欠失、変異、下方制御または前記調節エレメントの活性を不活性化もしくは低減する任意のその他の変更によって標的とされ得、それによって、マトリプターゼ遺伝子の機能的発現を防止または低減し、また、それによって、前記細胞においてマトリプターゼの効果を障害する。
【００４５】
一実施形態によれば、脊椎動物細胞は、非機能性であるか、または内因性マトリプターゼよりも機能性ではない変異体マトリプターゼの異種発現によって、マトリプターゼの機能を障害するように変更される。この実施形態では、単離された脊椎動物細胞は、対象のポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドに加えて、変異体マトリプターゼをコードするさらなる異種ポリヌクレオチドを含む。変異体マトリプターゼは、内因性マトリプターゼと比較して減少した触媒活性を有するか、またはさらには触媒活性を有さない。それぞれの変異体マトリプターゼを過剰発現させることによって、ドミナントネガティブ表現型を創出するために、変異不活性形態が内因性マトリプターゼの代わりに細胞膜中に挿入される可能性が増大される。細胞によって通常発現されるマトリプターゼの効果を障害する、したがって、低減するさらなる選択肢は、マトリプターゼを中和および／または阻害する、したがって、マトリプターゼの効果を障害する、抗体またはマトリプターゼ阻害剤などのタンパク質の異種発現である。
【００４６】
一実施形態によれば、マトリプターゼの効果は、細胞においてマトリプターゼと機能的に相互作用する分子の機能的発現を変更することによって細胞において障害される。
【００４７】
一実施形態によれば、マトリプターゼの機能は、マトリプターゼの細胞内輸送を障害することによって細胞において障害される。
【００４８】
別の実施形態によれば、マトリプターゼの機能は、マトリプターゼチモーゲンの活性化を障害することによって障害される。一実施形態によれば、マトリプターゼの機能は、１種もしくは複数の内因性細胞性マトリプターゼ阻害剤の上方制御によって、および／またはマトリプターゼ阻害剤の同時発現によって障害される。ＨＡＩ−１、ＨＡＩ−２、α１−抗トリプシン、α２−抗プラスミン、抗トロンビンなどのマトリプターゼのいくつかの内因阻害剤が、種々の脊椎動物細胞において現在までに記載されている（Chen et al, 2012による総説を参照のこと）。変更されるべき脊椎動物細胞によって発現される場合には、これらの阻害剤の発現の上方制御および／またはこれらの阻害剤の同時発現もまた、内因性プロテアーゼマトリプターゼの機能を障害し得、それによって細胞培養培地中に分泌された対象のポリペプチドのクリッピングを低減する。
【００４９】
一実施形態によれば、マトリプターゼの機能的発現は、抗体またはその結合ドメインなどのアンタゴニストの組換え発現によって障害される。例えば、それぞれのアンタゴニストは、脊椎動物細胞によって過剰発現され得る。
【００５０】
一実施形態によれば、マトリプターゼのコード配列は、タンパク質がＥＲ中に残存するように変更される。例えば、マトリプターゼタンパク質は、マトリプターゼがＥＲ中に残存するという効果を有するＫＤＥＬモチーフ（motiv）を含むように変更され得る。同様のアプローチも使用され得る。
【００５１】
内因性プロテアーゼマトリプターゼの効果を障害することは、前記変更された細胞によって発現および分泌される対象の組換えポリペプチドのクリッピングが、内因性プロテアーゼマトリプターゼの機能が障害されていない対応する脊椎動物細胞と比較して低減される、またはさらには存在しない、変更された細胞をもたらす。本明細書に記載されるように、組換え発現のための宿主細胞として、マトリプターゼの効果が障害されるそれぞれ変更された細胞を使用する場合には、前記宿主細胞を含有し、対象のポリペプチドが分泌される細胞培養培地において、非機能的なまたはあまり機能的でないマトリプターゼが活性である。
【００５２】
一実施形態によれば、マトリプターゼ遺伝子の発現は、マトリプターゼの効果が障害されていない（１００％と設定される）、変更されていない対応する参照脊椎動物細胞において、マトリプターゼ遺伝子の発現と比較して、４０％以下、３５％以下、３０％以下、２５％以下、２０％以下、１５％以下、１２．５％以下、１０％以下、５％以下、２．５％以下、１．５％以下、１％以下または０．０５％以下である。一実施形態によれば、第１の態様の変更された細胞において、マトリプターゼ遺伝子の発現は、前記細胞において１８Ｓ  ＲＮＡの発現（１００％と設定される）と比較して、０．１％以下またはそれ未満、０．０７５％以下、０．０５％以下、０．０４５％以下、０．０４％以下、０．０３５％以下、０．０３％以下、０．０２５％以下、０．０２％以下、０．０１５％以下、０．０１％以下、０．００７５％以下、０．００５％以下、０．００４５％以下、０．００４％以下、０．００３５％以下、０．００３％以下、０．００２５％以下、０．００２％以下、０．００１５％以下または０．００１％以下である。一実施形態によれば、マトリプターゼ遺伝子の発現は、前記細胞において１８Ｓ  ＲＮＡの発現（１００％と設定される）と比較して、０．０００７５％以下、０．０００５％以下または０．０００４％以下である。マトリプターゼ遺伝子の機能的発現は、前記細胞によって細胞培養培地中に分泌される対象の組換えポリペプチドのクリッピングが、マトリプターゼ遺伝子の機能的発現が低減または排除されていない対応する参照脊椎動物細胞（変更された細胞が導かれる）と比較して低減されるように、低減または排除される。例えば、前記特徴を分析するために、マトリプターゼの機能的発現が低減される変更されたＣＨＯ細胞は、参照脊椎動物細胞としてのＣＨＯ野生型細胞に対して比較される。試験ポリペプチドとして、参照脊椎動物細胞によって発現された場合にクリッピングの傾向があるポリペプチドが使用される。一実施形態によれば、クリッピングは、マトリプターゼ遺伝子の機能的発現が低減または排除されていない対応する参照脊椎動物細胞と比較して、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも５倍、少なくとも７．５倍、少なくとも８倍または少なくとも１０倍低減される。これは、例えば、実施例において記載されるアッセイを使用して試験され得る。
【００５３】
変更される脊椎動物細胞は、マトリプターゼを内因性に発現する種および細胞種に由来する。脊椎動物細胞は、好ましくは、哺乳動物細胞である。したがって、脊椎動物細胞について本明細書に記載されるすべての実施形態は、一般に、哺乳動物細胞が使用される好ましい実施形態に当てはまり、それを具体的に指す。用語「単離された」は、動物またはヒトなどの生物中に脊椎動物細胞が含有されていないことを明確にするために単に使用される。本明細書に記載されるように、脊椎動物細胞は、細胞培養物、細胞株、細胞クローンなどの形態で提供され得る。例を同様に以下に記載する。上記で記載されるように、前記脊椎動物細胞は、マトリプターゼを内因性に発現する対応する変更されていない脊椎動物細胞と比較して、マトリプターゼの効果を障害するように変更される。障害することは、好ましくは、マトリプターゼ遺伝子の機能的発現を低減または排除することによって達成される。実施形態は上記に記載されている。安定な、均一な、したがって、予測可能な特徴を有する製造細胞株を提供するために、脊椎動物細胞のゲノムを変更して、マトリプターゼ障害を達成することが好ましい。適した実施形態は上記に記載されている。それぞれ変更された脊椎動物細胞は、対象のポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含み、対象のポリペプチドを細胞培養培地中に分泌する、本開示の宿主細胞を提供するように、対象のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを用いてトランスフェクトされ得る。脊椎動物細胞は、好ましくは、哺乳動物細胞であり、例えば、げっ歯類細胞、ヒト細胞およびサル細胞からなる群から選択され得る。好ましい脊椎動物細胞は、例えば、ハムスターまたはマウスに由来する細胞などのげっ歯類細胞である。げっ歯類細胞は、チャイニーズハムスター細胞株（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株など）、ＢＨＫ細胞株、ＮＳ０細胞株、Ｃ１２７細胞株、マウス３Ｔ３線維芽細胞細胞株およびＳＰ２／０細胞株からなる群から選択される細胞株であり得る。ＣＨＯ−Ｋ１由来ＣＨＯ細胞などのＣＨＯ細胞が特に好ましい。実施例において示されるように、ＣＨＯ細胞においてマトリプターゼの機能的発現を低減または排除することは、分泌された対象のポリペプチドのクリッピングが大幅に減少されるか、さらには排除される馴化細胞培養培地を提供する。マトリプターゼはまた、ヒト細胞において発現される。したがって、一実施形態によれば、脊椎動物細胞は、例えば、ＨＥＫ２９３細胞、ＭＣＦ−７細胞、ＰｅｒＣ６細胞、ＣＡＰ細胞、造血細胞およびＨｅＬａ細胞からなる群から選択され得るヒト細胞に由来する。別の代替物として、例えば、ＣＯＳ細胞、ＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７細胞およびＶｅｒｏ細胞からなる群から選択され得るサル細胞がある。一実施形態によれば、脊椎動物細胞は、細胞クローン、細胞株または細胞培養物として提供される。
【００５４】
「対象のポリペプチド」は、脊椎動物細胞によって、多量に発現および分泌されると仮定される組換えポリペプチドである。対象のポリペプチドは、前記細胞中に含まれる異種ポリヌクレオチドによってコードされる。前記宿主細胞は、対象のポリペプチドをコードする２種以上の異種ポリヌクレオチドを含み得る。対象のポリペプチドは、脊椎動物細胞によって細胞培養培地中に分泌され、それから回収、例えば、単離および精製され得る。
【００５５】
「異種ポリヌクレオチド」または「異種核酸」および本明細書において使用される同様の表現は、特に、例えば、トランスフェクションなどの組換え技術の使用によって脊椎動物細胞中に導入されたポリヌクレオチド配列を指す。「ポリヌクレオチド」は、通常、１つのデオキシリボースまたはリボースから別のものに連結されるヌクレオチドのポリマーを特に指し、文脈によってＤＮＡならびにＲＮＡを指す。用語「ポリヌクレオチド」は、何らかのサイズ制限を含まない。
【００５６】
脊椎動物細胞は、対象のポリペプチドをコードする少なくとも１種の異種ポリヌクレオチドに加えて、選択マーカー（selectable marker）をコードする異種ポリヌクレオチドおよび／またはレポーターポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含み得る。これは、成功裏にトランスフェクトされ、したがって、対象のポリペプチドを発現する宿主細胞の選択を単純化する。さらに、脊椎動物細胞は、種々の選択マーカーおよび／またはレポーターポリペプチドをコードするいくつかのポリヌクレオチドを含み得る。
【００５７】
「選択マーカー」は、適当な選択培養条件下で、前記選択マーカーを発現する宿主細胞の選択を可能にする。選択マーカーは、生存および／または成長利点とともに選択条件下で前記マーカーのキャリアを提供する。通常、選択マーカー遺伝子は、宿主細胞において、薬物、例えば、抗生物質またはその他の毒性薬剤などの選択剤に対する耐性を付与するか、または代謝もしくは異化欠陥を補償する。それは陽性または陰性選択マーカーであり得る。一実施形態によれば、選択マーカーは、前記薬物が関与する選択条件に対する耐性を付与するタンパク質をコードする薬物耐性マーカーである。種々の選択マーカー遺伝子が記載されている（例えば、国際公開第９２／０８７９６号パンフレット、国際公開第９４／２８１４３号パンフレット、国際公開第２００４／０８１１６７号パンフレット、国際公開第２００９／０８０７５９号パンフレット、国際公開第２０１０／０９７２４０号パンフレットを参照のこと）。例えば、１種または複数の抗生物質薬剤に対する耐性を付与する少なくとも１種の選択マーカーが使用され得る。選択マーカーは、一実施形態によれば、増幅可能な選択マーカーであり得る。増幅可能な選択マーカーは、宿主細胞を含有するベクターの選択を可能にし、宿主細胞における前記ベクターの遺伝子増幅を促進し得る。脊椎動物細胞とともによく使用される選択マーカー遺伝子として、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｈｙｇ）、ジヒドロホレートレダクターゼ（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ（ｔｋ）、グルタミンシンセターゼ、アスパラギンシンセターゼの遺伝子ならびにネオマイシン（Ｇ４１８）、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、ゼオシン、ウワバイン、ブラストサイジン、ヒスチジノールＤ、ブレオマイシン、フレオマイシンおよびミコフェノール酸に対する耐性をコードする遺伝子が挙げられる。一実施形態によれば、選択マーカーとして葉酸受容体が、好ましくは、哺乳動物細胞である本明細書に記載される新規脊椎動物細胞とともに使用される（例えば、国際公開第２００９／０８０７５９号パンフレットを参照のこと）。葉酸受容体はまた、国際公開第１０／０９７２４０号パンフレットに記載されるように、選択マーカーとしてＤＨＦＲと組み合わせて使用され得る。「レポーターポリペプチド」は、レポート特徴（例えば、蛍光）に基づいて、前記レポーターポリペプチドを発現する細胞の同定を可能にする。レポーター遺伝子は、通常、宿主細胞に生存利点を提供しない。しかし、レポーターポリペプチドの発現は、レポーターポリペプチドを発現する細胞と、発現しない細胞の間を区別するために使用され得る。したがって、また、レポーター遺伝子は、成功裏にトランスフェクトされた宿主細胞の選択を可能にする。適したレポーターポリペプチドとして、それだけには限らないが、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＹＦＰ、ＣＦＰおよびルシフェラーゼなどが挙げられる。一実施形態によれば、レポーターポリペプチドは、フローサイトメトリーによる選択を可能にする特徴を有する。
【００５８】
一実施形態によれば、対象のポリペプチドをコードする少なくとも１種の異種ポリヌクレオチドが、前記細胞のゲノム中に組み込まれており、任意選択で、選択マーカーまたはレポーターポリペプチドをコードする少なくとも１種の異種ポリヌクレオチドが、前記細胞のゲノム中にさらに組み込まれている。
【００５９】
宿主細胞中に異種ポリヌクレオチドを導入するために、発現ベクターが使用され得る。ポリヌクレオチドは、発現カセット中に含まれ得る。対象のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（単数または複数）および選択マーカーまたはレポーターポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（単数または複数）は、同一または異なる発現ベクターに位置付けられ得る。異なる発現ベクターに位置付けられる場合には、発現ベクターは、宿主細胞中に同時トランスフェクトされる。このような同時トランスフェクション戦略は、先行技術において周知であるように、同様に選択を可能にする。脊椎動物細胞中への導入は、例えば、対象のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、適した発現ベクターを宿主細胞中にトランスフェクトすることによって達成され得る。発現ベクターは、好ましくは、宿主細胞のゲノム中に組み込まれる（安定なトランスフェクション）。異種核酸がゲノム中に挿入されない場合には、異種核酸は、後の段階で、例えば、細胞が有糸分裂を起こすときに失われ得る（一時的トランスフェクション）。安定なトランスフェクションは、工業規模で対象のポリペプチドを製造するための高発現細胞クローンを作製するために好ましい。これは、治療上活性のある、または診断用の対象のポリペプチドに特に重要である。発現ベクターなどの異種核酸を、好ましくは、哺乳動物宿主細胞である脊椎動物宿主細胞中に導入するためのいくつかの適切な方法が先行技術において公知であり、本明細書において何らかの詳細な説明を必要としない。それぞれの方法として、それだけには限らないが、リン酸カルシウムトランスフェクション、エレクトロポレーション、リポフェクション、バイオリスティックおよびポリマー媒介性遺伝子移入などが挙げられる。伝統的なランダム組込みに基づく方法に加えて、組換え媒介性アプローチも、異種ポリヌクレオチドを宿主細胞ゲノム中に移入するために使用され得る。それぞれの方法が、先行技術において周知であるので、それらはここで何らかの詳細な説明を必要としない。適したベクター設計の限定されない実施形態はまた、後に記載され、それぞれの開示内容が参照される。
【００６０】
宿主細胞における対象のポリペプチドの発現を達成するために使用される発現ベクターは、通常、例えば、通常、発現カセットのエレメントとして、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、転写休止または終結シグナルなどの転写を駆動するのに適した転写制御エレメントを含有する。例えば、リボソームを動員するのに適した５’キャップ構造につながる５’非翻訳領域および翻訳プロセスを終結させるための停止コドンなどの適した翻訳制御エレメントがベクター中に含まれることが好ましい。得られた転写物は、タンパク質発現（すなわち、翻訳）および適切な翻訳終結を促進する機能的翻訳エレメントを有する。組み込まれたポリヌクレオチドの発現を適切に駆動可能な機能的発現単位はまた、「発現カセット」と呼ばれる。脊椎動物細胞において対象のポリペプチドの発現および分泌を可能にするために発現カセットが設計されるべき方法は当業者に周知である。
【００６１】
対象の組換えポリペプチドの細胞培養培地中への分泌を達成するために、対象のポリペプチド中に適当なリーダーペプチドが提供される。対象のポリペプチドの分泌を達成するためのリーダー配列および発現カセット設計は、先行技術において周知であり、したがって、本明細書において記載される必要はない。
【００６２】
本発明の脊椎動物細胞において、任意の対象のポリペプチドが発現され得る。用語「ポリペプチド」とは、ペプチド結合（単数または複数）によって一緒に連結されたアミノ酸のポリマーを含む分子を指す。ポリペプチドは、タンパク質（例えば、５０個を超えるアミノ酸を有する）およびペプチド（例えば、２〜４９個のアミノ酸）を含む、任意の長さのポリペプチドを含む。ポリペプチドは、任意の活性、機能またはサイズのタンパク質および／またはペプチドを含み、例えば、酵素（例えば、キナーゼ、ホスファターゼ）、受容体、輸送体、細菌および／または内毒素結合タンパク質、構造ポリペプチド、膜結合ポリペプチド、グリコポリペプチド、球状タンパク質、免疫ポリペプチド、毒素、抗生物質、ホルモン、増殖因子、血液因子、ワクチン、ウイルスグリコポリペプチドなどを含み得る。本明細書に記載される技術に従って発現される対象のポリペプチドはまた、ポリペプチドのサブユニットまたはドメイン、例えば、抗体の重鎖もしくは軽鎖またはその機能的断片または誘導体などであり得る。用語「対象のポリペプチド」は、文脈に応じて、このような個々のサブユニットまたはドメインまたはそれぞれのサブユニットまたはドメインから構成される最終タンパク質を指し得る。
【００６３】
一実施形態によれば、対象のポリペプチドは、治療用または診断用ポリペプチドから選択される。治療用、したがって、治療上活性のあるポリペプチドは、特に重要である。用語「治療用ポリペプチド」はまた、ワクチン接種のために使用される予防用ポリペプチドを包含する。ポリペプチドは、ペプチドホルモン、インターロイキン、組織プラスミノーゲン活性化因子、サイトカイン、増殖因子、免疫グロブリン、特に、抗体または機能的抗体断片またはその変異体または誘導体およびＦｃ融合タンパク質からなる群から選択され得る。一実施形態では、対象のポリペプチドは、抗体などの免疫グロブリン分子である。用語「抗体」とは、本明細書において使用されるように、特に、ジスルフィド結合によって接続される少なくとも２つの重鎖および２つの軽鎖を含むタンパク質を指す。用語「抗体」は、天然に存在する抗体ならびに抗体のすべての組換え形態、例えば、ヒト化抗体、完全ヒト抗体およびキメラ抗体を含む。各重鎖は、通常、重鎖可変領域（ＶＨ）および重鎖定常領域（ＣＨ）からなる。各軽鎖は、通常、軽鎖可変領域（ＶＬ）および軽鎖定常領域（ＣＬ）からなる。しかし、用語「抗体」はまた、単一ドメイン抗体、重鎖抗体、すなわち、１つまたは複数の、特に、２つの重鎖のみからなる抗体およびナノボディ、すなわち、単一の単量体可変ドメインのみからなる抗体などのその他の種類の抗体を含む。ナノボディはまた、多価構造を形成するよう連結され得る。上記で論じられるように、対象のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドはまた、対象のポリペプチドとして、抗体の１つまたは複数のサブユニットまたはドメイン、例えば、重鎖または軽鎖またはその機能的断片または誘導体をコードし得る。前記サブユニットまたはドメインは、同一または異なる発現カセットのいずれかから発現され得る。
【００６４】
抗体の「機能的断片または誘導体」は、特に、抗体に由来し、抗体と同一抗原と、特に、同一エピトープと結合可能であるポリペプチドを指す。抗体の抗原結合機能は、全長抗体の断片またはその誘導体によって実行され得ることが示されている。抗体の断片または誘導体の例として、（ｉ）Ｆａｂ断片、重鎖および軽鎖各々の可変領域および第１の定常ドメインからなる一価の断片；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ）２断片、ヒンジ領域でジスルフィド橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片；（ｉｉｉ）重鎖の可変領域および第１の定常ドメインＣＨ１からなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単一アームの重鎖および軽鎖可変領域からなるＦｖ断片；（ｖ）ｓｃＦｖ断片、単一ポリペプチド鎖からなるＦｖ断片；（ｖｉ）一緒に共有結合によって連結された２つのＦｖ断片からなる（Ｆｖ）２断片；（ｖｉｉ）重鎖可変ドメイン；ならびに（ｖｉｉｉ）重鎖および軽鎖可変領域の会合が、分子内ではなく分子間のみで起こり得るような方法で共有結合によって一緒に連結された、重鎖可変領域および軽鎖可変領域からなるマルチボディーが挙げられる。
【００６５】
一実施形態によれば、変更された脊椎動物細胞によって発現される対象のポリペプチドは、プロテアーゼによるクリッピングに対して感受性である。一実施形態によれば、対象のポリペプチドは、マトリプターゼによって認識される少なくとも１つのクリッピング部位を含む。クリッピングの傾向がある、糖タンパク質、抗体、非ＩｇＧタンパク質、Ｆａｂ断片、タンパク質複合体、ペプチダーゼ、シグナルペプチド、Ｆｃ融合タンパク質、ナノボディ、増殖因子、ホルモン、サイトカイン、ウイルスグリコポリペプチド、血液因子および酵素からなる群から選択されるいくつかのポリペプチドが同定されている。これらのポリペプチドのうち多数は、２つ以上のクリッピング部位を含有し、クリッピングに対して特に感受性である。実施例によって実証されるように、細胞培養培地中の分泌された対象のポリペプチドのクリッピングは、大幅に低減される、またはさらには排除されるので、本開示の変更された脊椎動物細胞において対象のポリペプチドとしてクリッピングの傾向があるポリペプチドを発現することは、有利である。
【００６６】
脊椎動物細胞は、対象のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対応する、それぞれに同一である内因性ポリヌクレオチドを含む場合も含まない場合もある。一実施形態によれば、脊椎動物細胞は、対象のポリペプチドに対応する内因性遺伝子を含まない。
【００６７】
一実施形態によれば、対象のポリペプチドは、マトリプターゼではないか、または含まない。一実施形態によれば、対象のポリペプチドは、ＨＡＩ−１ではないか、または含まない。
【００６８】
脊椎動物細胞中に含まれる発現ベクターまたは発現ベクターの組合せは、さらなるベクターエレメントをさらに含み得る。例えば、さらなる対象の産物をコードする少なくとも１種のさらなるポリヌクレオチドが含まれ得る。上記で説明されるように、また、本教示に従って発現され得るポリペプチドの上記の例から明らかになるように、宿主細胞によって産生および分泌されるべき最終ポリペプチドはまた、いくつかの個々のサブユニットまたはドメインからなるタンパク質であり得る。それぞれのタンパク質の一例として、免疫グロブリン分子、特に、例えば、重鎖および軽鎖を含む抗体がある。種々の個々のサブユニットまたはドメインから構成されるそれぞれのタンパク質を製造するためのいくつかの選択肢があり、適当なベクター設計は、当技術分野で公知である。一実施形態によれば、１つの発現カセットから前記タンパク質の２つ以上のサブユニットまたはドメインが発現される。この実施形態では、タンパク質の個々のサブユニットまたはドメインのコーディング領域を含むそれぞれの発現カセットから１種の長い転写物が得られる。一実施形態によれば、少なくとも１つのＩＲＥＳエレメント（配列内リボソーム進入部位）が、個々のサブユニットまたはドメインのコーディング領域の間に機能的に位置しており、各コーディング領域は、分泌リーダー配列が前についている。それによって、前記転写物から別個の翻訳産物が得られることおよび最終タンパク質が、正しく組み立てられ、分泌され得ることが確実にされる。それぞれの技術は、先行技術において公知であり、したがって、本明細書において何らかの詳細な説明を必要としない。抗体の発現などのいくつかの実施形態については、異なる発現カセットから個々のサブユニットまたはドメインを発現させることがさらに好ましい。一実施形態によれば、対象の産物を発現させるために使用される発現カセットは、モノシストロニック発現カセットである。発現ベクターまたは発現ベクターの組合せ中に含まれるすべての発現カセットは、モノシストロニックであり得る。一実施形態によれば、したがって、対照の産物を発現させるために設計される各発現カセットは、対象のポリペプチドとして発現されるべきタンパク質の１つのサブユニットまたはドメインをコードするポリヌクレオチドを含む。例えば、抗体の場合には、１つの発現カセットは、抗体の軽鎖をコードし得、別の発現カセットは、抗体の重鎖をコードし得る。個々の発現カセットからの個々のサブユニットまたはドメインの発現後、抗体などの最終タンパク質が前記サブユニットまたはドメインから組み立てられ、宿主細胞によって分泌される。この実施形態は、抗体などの免疫グロブリン分子を発現させるために特に適している。
【００６９】
上記のように、対象のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（単数または複数）および選択マーカー（単数または複数）および／またはレポーターポリペプチド（単数または複数）をコードするポリヌクレオチドが、発現カセット中に含まれることが好ましい。いくつかの実施形態が適している。例えば、前記ポリヌクレオチド（単数または複数）の各々は、別個の発現カセット中に含まれ得る。これはまた、モノシストロニック設定と呼ばれる。しかし、それぞれのポリヌクレオチドのうち少なくとも２つが、１つの発現カセット中に含まれることも、本発明の範囲内にある。一実施形態によれば、少なくとも１つの配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）エレメントは、同一発現カセットから発現されるポリヌクレオチド間に機能的に位置する。それぞれのＩＲＥＳベースの発現技術およびその他のジ−およびポリシストロニック系は周知であり、したがって、ここでさらなる説明を必要としない
【００７０】
Ｂ．  第１の態様の脊椎動物細胞を製造するための方法
第２の態様によれば、第１の態様の脊椎動物細胞を製造するための方法であって、マトリプターゼの効果を障害するよう脊椎動物細胞を変更する段階および対象のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを前記細胞中に導入する段階を含み、前記対象のポリペプチドは、次いで、脊椎動物細胞によって分泌される、方法が提供される。
【００７１】
内因性プロテアーゼマトリプターゼの機能を障害する、適した好ましい実施形態は、第１の態様の脊椎動物細胞とともに上記に記載されており、上記の開示内容が参照され、これはまた、ここでも当てはまる。したがって、方法は、第１の態様の変更された脊椎動物細胞とともに上記のようなマトリプターゼの効果を障害することを含み得る。限定されない実施形態を、以下に再度手短に記載する。
【００７２】
一実施形態によれば、方法は、マトリプターゼ遺伝子の機能的発現を低減または排除し、それによって、マトリプターゼの効果を障害する段階を含む。上記のように、この障害は、例えば、変更された細胞によって、細胞表面上に機能的マトリプターゼが示されないか、もしくは低減された量の機能的マトリプターゼが示される、および／または機能的マトリプターゼが放出されない、例えば、シェディングされないか、もしくは低減された量の機能的マトリプターゼが放出される、例えば、シェディングされるので、機能的マトリプターゼが、変更された細胞を含有する細胞培養培地中に活性形態で存在しないか、低減された量の機能的マトリプターゼが活性形態で存在するという効果を有する。それによって、対象の組換えポリペプチドが分泌される細胞培養培地中にタンパク質分解性に活性な形態で、マトリプターゼが存在しないか、より少ないマトリプターゼが存在する。本開示が、マトリプターゼが、分泌された対象のポリペプチドのクリッピングに関与する重要なプロテアーゼであることを示すので、細胞のこの変更は、対象のポリペプチドのクリッピングを有利に低減またはさらには排除する。マトリプターゼの機能的発現を低減または排除するための適した方法は、第１の態様の脊椎動物細胞とともに上記に記載されており、それが参照される。一実施形態によれば、脊椎動物細胞のゲノムは、マトリプターゼ遺伝子の機能的発現を低減または排除するように変更される。例えば、遺伝子ノックアウトが、マトリプターゼ遺伝子中に導入され得る。一実施形態によれば、このような遺伝子ノックアウトは、マトリプターゼ遺伝子のすべてのコピー中に導入される。一実施形態によれば、マトリプターゼ遺伝子は、例えば、フレームシフトおよび／または停止コドン変異などの１つまたは複数の変異を導入することによって欠失またはノックアウトされる。マトリプターゼ遺伝子のすべてのコピーは、ゲノム中でそれぞれ変更され得る。
【００７３】
一実施形態によれば、前記１つまたは複数の変異が、マトリプターゼ遺伝子のコーディング領域中に含まれ、機能的発現産物をもたらさないか、またはより少ない機能的発現産物をもたらす。詳細は、第１の態様の変更された脊椎動物細胞とともに上記に記載されており、それぞれの開示内容が参照され、これはまた、ここでも当てはまる。一実施形態によれば、１つまたは複数の変異が、１種または２種以上の、マトリプターゼの触媒的に活性なスプライシング変異体中に存在するアミノ酸配列をコードするマトリプターゼ遺伝子の領域中に導入される。大部分またはさらにはすべての同定された触媒的に活性なスプライシング変異体においてマトリプターゼエキソンのいくつかが見られる。上記で記載され、実施例において実証されるように、エキソン２は、マトリプターゼのスプライス変異体の大部分において発現され、それぞれの変異が非機能的なまたはあまり機能的でない発現産物をもたらすので、マトリプターゼのエキソン２をコードするマトリプターゼ遺伝子のポリヌクレオチド配列は、例えば、フレームシフト変異などの１つまたは複数の変異を導入するための適した標的である。さらに、エキソン２などのマトリプターゼのＮ末端に近いエキソンは、非機能的なまたはあまり機能的でない末端切断型タンパク質の発現につながる１つまたは複数のフレームシフト変異を導入するための有利な標的である。さらに、１つまたは複数の変異は、マトリプターゼの機能を破壊するために触媒ドメイン中に導入され得る。
【００７４】
一実施形態によれば、脊椎動物細胞は、哺乳動物細胞である。一実施形態によれば、脊椎動物細胞は、げっ歯類細胞である。好ましくは、げっ歯類細胞は、ＣＨＯ細胞などのハムスター細胞である。一実施形態によれば、ＣＨＯ細胞、好ましくは、細胞株Ｋ１に由来するが、好ましくは、マトリプターゼ遺伝子の機能的発現を低減または排除することによって、内因性プロテアーゼマトリプターゼの効果が障害されている変更された脊椎動物細胞株を提供するために使用される。
【００７５】
宿主細胞のゲノムが、障害を達成するように変更される場合には、脊椎動物細胞を、内因性プロテアーゼマトリプターゼの効果、したがって、機能を基本的に永久的に障害するよう最初に変更し、次いで、対象のポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを導入することが好ましい。マトリプターゼ遺伝子を、例えば、ＲＮＡｉによって一時的にサイレンシングする場合のように、変更が永久的ではない場合には、対象のポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを最初に導入し、次いで、内因性プロテアーゼマトリプターゼの機能を、例えば、転写後遺伝子サイレンシングによって障害するよう脊椎動物細胞を変更してもよい。適した方法は上記に記載されており、当業者に公知である。上記のように、好ましい実施形態によれば、脊椎動物細胞のゲノムが、障害を達成するように変更される。マトリプターゼの効果が障害されている宿主細胞を同定および選択するために、第７の態様の方法が使用され得る。
【００７６】
一実施形態によれば、第２の態様の方法は、マトリプターゼ遺伝子の機能的発現が低減または排除されるように変更されている脊椎動物細胞中に、対象のポリペプチドをコードする少なくとも１種のポリヌクレオチド、好ましくは、選択マーカーをコードする少なくとも１種のポリヌクレオチドを導入する段階をさらに含む。一実施形態によれば、対象のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび選択マーカーをコードするポリヌクレオチドは、同一または異なる発現ベクターに位置付けられる。適した好ましい実施形態は、上記に記載されており、それぞれの開示内容が参照され、これはまた、ここでも当てはまる。導入は、トランスフェクションによって達成され得、ここで、安定なトランスフェクションが好ましい。対象のポリペプチドを成功裏に発現する脊椎動物宿主細胞は、例えば、第５の態様の方法を使用して選択され得る。その後の開示内容が参照される。
【００７７】
Ｃ．  対象のポリペプチドを組換えによって製造するための方法
第３の態様によれば、対象のポリペプチドの組換え発現のための宿主細胞として第１の態様の脊椎動物細胞を利用する段階を含む、対象のポリペプチドを組換えによって製造するための方法が提供される。上記のように、組換え発現のためにこれらの新規脊椎動物細胞を使用する場合に達成される、細胞培養培地における対象のポリペプチドの減少されたレベルのタンパク質分解性分解によって、好ましくは、哺乳動物細胞であるこれらの新規脊椎動物細胞は、対象のポリペプチドを組換えによって製造するための宿主細胞として特に適している。好ましくは、マトリプターゼ遺伝子の機能的発現を低減または排除することによって、マトリプターゼの効果を障害するように変更されている、脊椎動物宿主細胞の適した好ましい例ならびに対象のポリペプチドの適した好ましい例は、上記で詳細に記載されており、上記の開示内容が参照され、これはまた、ここでも当てはまる。
【００７８】
一実施形態によれば、本方法は、内因性プロテアーゼマトリプターゼの効果が障害されるように変更されている脊椎動物宿主細胞中に、対象のポリペプチドをコードする少なくとも１種のポリヌクレオチドを導入する段階および対象のポリペプチドを組換え発現する脊椎動物宿主細胞を選択する段階を含む。導入は、周知であり、また本明細書において記載されるように、トランスフェクションによって達成され得る。選択は、本開示の第５の態様の方法を使用して起こり得る。好ましくは、対象のポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドが、宿主細胞のゲノム中に安定に組み込まれている宿主細胞が選択される。
【００７９】
一実施形態によれば、本方法は、
（ａ）対象のポリペプチドの発現および分泌を可能にする条件下で、第１の態様の脊椎動物宿主細胞を培養する段階と、
（ｂ）細胞培養培地から対象のポリペプチドを単離する段階と、
（ｃ）任意選択で、単離された対象のポリペプチドをプロセシングする段階と
を含む。
【００８０】
したがって、第３の態様の方法の好ましい実施形態として、
（ａ）対象のポリペプチドの発現および細胞培養培地への分泌を可能にする条件下で、第１の態様の脊椎動物宿主細胞を培養する段階と、
（ｂ）細胞培養培地から対象のポリペプチドを単離する段階と、
（ｃ）任意選択で、単離された対象のポリペプチドをプロセシングする段階と
を含む、対象のポリペプチドを組換えによって製造するための方法が提供される。
【００８１】
前記宿主細胞は、血清不含条件下で培養され得る。ポリペプチドが発現され、培養培地中に分泌され、それから得ることができる。分泌目的のために、対象のポリペプチドが分泌されるような適当なリーダーペプチドが提供される。分泌を達成するためのリーダー配列および発現カセット設計は、先行技術において周知であり、したがって、本明細書において記載される必要はない。
【００８２】
上記のように、製造宿主細胞のために第１の態様の変更された脊椎動物細胞を使用する場合には、前記細胞を含有する細胞培養培地において、機能的マトリプターゼは有効ではないか、または低減された量の機能的マトリプターゼが有効であり、それによって、細胞培養培地中に分泌される対象の組換えポリペプチドのタンパク質分解性分解が大幅に低減されるか、さらには完全に避けられる。これは、驚くべきことに、脊椎動物細胞によって発現される数百種の種々のプロテアーゼの中で、マトリプターゼが、細胞培養培地において組換え発現されたポリペプチドのクリッピングを引き起こす重要なプロテアーゼであるということが見出されたからである。したがって、製造宿主細胞として本開示の新規脊椎動物宿主細胞を使用する場合には、細胞培養培地における対象のポリペプチドのタンパク質分解性分解、したがって、クリッピングを低減または避けるためのさらなる手段を実施することは必ずしも必要ではない。したがって、一実施形態によれば、細胞培養培地にプロテアーゼ阻害剤は添加されない。一実施形態によれば、培養温度は、細胞培養培地におけるタンパク質分解性活性を低減するために低下されない。本開示は、対象のポリペプチドが、プロテアーゼによるクリッピングの傾向がある１つまたは複数のモチーフを除去するようリエンジニアリングされる方法を包含する。しかし、一実施形態によれば、対象のポリペプチドは、クリッピングを低減または防止するために、マトリプターゼによるクリッピングの傾向がある１つまたは複数のアミノ酸モチーフを除去するようリエンジニアリングされない。この実施形態によれば、マトリプターゼ以外のプロテアーゼによるクリッピングの傾向がある１つまたは複数のアミノ酸モチーフを除去するために望まれる場合には、それぞれのリエンジニアリングが実施されることもある。しかし、一実施形態によれば、対象のポリペプチドは、クリッピングを低減または防止するためにプロテアーゼによるクリッピングの傾向がある１つまたは複数のアミノ酸モチーフを除去するために全くリエンジニアリングされない。実施例によって示されるように、それぞれのリエンジニアリングアプローチ（approached）が、基本的に使われなくなるように、本明細書に記載される変更された細胞を使用する場合には、クリッピングは効率的に低減またはさらには完全に排除される。
【００８３】
変更された脊椎動物細胞を用いて製造され得る対象のポリペプチドの例は、本発明の第１の態様とともに上記に記載されており、それぞれの開示内容が参照され、これはまた、ここでも当てはまる。一実施形態によれば、以下の特徴：
ａ）治療用または診断用ポリペプチドである、
ｂ）プロテアーゼによるクリッピングに対して感受性である、
ｃ）マトリプターゼの少なくとも１つのクリッピング部位を含む、
ｄ）グリコポリペプチドである、
ｅ）糖タンパク質、抗体、非ＩｇＧタンパク質、Ｆａｂ断片、タンパク質複合体、ペプチダーゼ、シグナルペプチド、Ｆｃ融合タンパク質、ナノボディ、増殖因子、ホルモン、サイトカイン、血液因子および酵素からなる群から選択される、
ｆ）マトリプターゼではない、もしくは含まない；および／または
ｇ）ＨＡＩ−１ではない、または含まない
のうち１つまたは複数を有する対象のポリペプチドを製造するための製造法が使用される。
【００８４】
製造される対象のポリペプチドは、細胞培養培地から単離され、任意選択で、当技術分野で公知の方法によってさらにプロセシングされる。例えば、ポリペプチドは、それだけには限らないが、遠心分離、濾過、限外濾過、抽出または沈殿を含めた従来手順によって栄養培地から収集され得る。精製ステップなどのさらなる処理ステップが、それだけには限らないが、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性、疎水性、等電点電気泳動、プロテインＡまたはプロテインＧクロマトグラフィーおよびサイズ排除）、電気泳動手順（例えば、分取等電点電気泳動）、差次的溶解度（例えば、硫酸アンモニウム沈殿）または抽出を含めた、当技術分野で公知の種々の手順によって実施され得る。さらに、単離された、精製された対象のポリペプチドは、例えば、修飾される、および／または組成物、例えば、医薬組成物に製剤化されるなどさらに処理され得る。
【００８５】
第４の態様によれば、対象のポリペプチドを組換えによって製造するための方法であって、
（ａ）対象のポリペプチドの発現および細胞培養培地への分泌を可能にする条件下で、対象のポリペプチドをコードする少なくとも１種の異種ポリヌクレオチドを含む脊椎動物宿主細胞を培養する段階であって、細胞培養培地がマトリプターゼに対して選択的であるプロテアーゼ阻害剤を含む段階と、
（ｂ）細胞培養培地から対象のポリペプチドを単離する段階と、
（ｃ）任意選択で、単離された対象のポリペプチドをプロセシングする段階と
を含む方法が提供される。
【００８６】
第４の態様の方法はまた、マトリプターゼは、細胞培養培地における分泌された対象の組換えポリペプチドのタンパク質分解性分解に関与する重要なプロテアーゼであるという本明細書に記載される重要な知見に基づいている。第４の態様の方法では、「クリッピング」（上記参照のこと）とも呼ばれる、細胞培養培地における対象のポリペプチドのタンパク質分解性分解は、細胞培養培地に、マトリプターゼに対して選択的であるプロテアーゼ阻害剤を添加することによって避けられる。マトリプターゼに対して選択的であるプロテアーゼ阻害剤はまた、本明細書において、選択的マトリプターゼ阻害剤とも呼ばれる。もちろん、同様に、２種以上の選択的マトリプターゼ阻害剤が添加されてもよい。実施例４によって実証されるように、細胞培養培地に選択的マトリプターゼ阻害剤を添加することによって、通常、マトリプターゼを発現する脊椎動物細胞を使用する場合でさえ、対象のポリペプチドのクリッピングを大幅に低減またはさらには、消滅させることが可能となる。したがって、この実施形態は、細胞培養培地において障害が達成されるので、変更されていない、したがって、マトリプターゼの効果が障害されていない脊椎動物細胞を使用することを可能にする。
【００８７】
細胞培養培地中に存在する選択的マトリプターゼ阻害剤は、細胞培養培地におけるマトリプターゼのタンパク質分解性活性の減少または消滅につながる。マトリプターゼ阻害剤は、例えば、マトリプターゼの活性部位について基質と競合する競合阻害剤またはマトリプターゼの構造をその活性を低減するよう修飾するアロステリック阻害剤であり得る。マトリプターゼ阻害剤は、マトリプターゼに対するその阻害活性が、その他のセリンプロテアーゼ、特に、その他のＩＩ型膜貫通セリンプロテアーゼに対するその阻害活性よりも高い場合に選択的と考えられる。
【００８８】
選択的マトリプターゼ阻害剤は、対象の組換えポリペプチドを製造するために使用される宿主細胞に対して有害な効果を示さない限り、任意の種類のものであり得る。選択的マトリプターゼ阻害剤は、ｉ）それだけには限らないが、抗体ベースのまたは抗体由来の選択的マトリプターゼ阻害剤、ペプチドまたはタンパク質を含む、生物学的マトリプターゼ阻害剤およびｉｉ）小分子などの化学的マトリプターゼ阻害剤から選択され得る。
【００８９】
一実施形態によれば、選択的マトリプターゼ阻害剤は、その他のプロテアーゼよりもマトリプターゼに対して少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍または少なくとも２５０倍より選択的であり、したがって、特異的である。しかし、選択性はまた、例えば、少なくとも５００倍、少なくとも５０００倍、少なくとも１００００倍、少なくとも５００００倍、少なくとも５０００００倍および少なくとも５００００００倍など、実質的に高いものであり得る。範囲は、それだけには限らないが、５倍〜１０００００００倍、１０倍〜５００００００倍、２５倍〜１００００００倍、５０倍〜５００００００倍を含む。選択的生物学的マトリプターゼ阻害剤、例えば、マトリプターゼ特異的抗体またはＦａｂ断片などを用いると、例えば、少なくとも５０００倍または少なくとも１００００倍およびそれ以上のより高い選択性が達成され得る。
【００９０】
選択性は、例えば、その他の試験されたプロテアーゼよりも低い、選択的マトリプターゼ阻害剤のものであるｋｉ値に基づいて決定され得る。一実施形態によれば、マトリプターゼ阻害剤は、マトリプターゼを選択的に阻害し、２００ｎＭ以下、１５０ｎＭ以下、１００ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、２５ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、１５ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、７．５ｎＭ以下、５ｎＭ以下、２．５ｎｍ以下、１ｎＭ以下または０．７５ｎＭ以下のｋｉ値を有する。
【００９１】
上記で記載されるように、先行技術においていくつかの選択的マトリプターゼ阻害剤が記載されている。例えば、Ｆａｒａｄａｙらは、種々の抗体ベースの選択的マトリプターゼ阻害剤、すなわち、Ｆａｂ断片（Farady et al., 2008 J.Mol.Biol. (2008) 380, 351-360）および２種のｓｃＦｖ抗体阻害剤（J Mol Biol. 2007 June 15; 369 (4): 1041-1051）を記載している。Ｋｉ値が１２ｐＭおよび１６０ｐＭである単一鎖可変断片（ｓｃＦｖ）抗体阻害剤Ｅ２およびＳ４が、特に選択的であると記載された。抗体ベースの選択的マトリプターゼ阻害剤は、異なる種に由来するマトリプターゼに対して活性であり得る。実施例４によって実証されるように、例えば、ヒトマトリプターゼに対するＦａｂ断片はまた、マウスおよびハムスターに由来するマトリプターゼに対して有効であった。しかし、それぞれの抗体ベースの選択的マトリプターゼ阻害剤はまた、最大阻害効果を確実にし、細胞培養培地においてより低い濃度の選択的マトリプターゼ阻害剤を使用することを可能にするために、関係する宿主細胞によって発現された特定のマトリプターゼに対して作製されることもある。さらに、マトリプターゼの触媒部位に対して特異的な抗体が記載されている（米国特許出願公開第２００６／１７１８８４号明細書）。３−アミジノフェニルアラニン型分子ＣＪ−７３０およびＣＪ−６９７などの、ペプチドミメティック分子選択的マトリプターゼ阻害剤は、それぞれ、４６ｎＭおよび２６ｎＭのマトリプターゼに対するｋｉ値を有する。（Forbs et al. International Journal of Oncology 27: 1061-1070 2005に記載される）。Forbsにおいて記載されるように、腫瘍細胞株の細胞培養物へのこれらの化合物の添加は、細胞の増殖に影響を及ぼすことなくマトリプターゼ活性を大幅に低減する。マトリプターゼの選択的阻害剤はまた、Steinmetzer et al, J. Med. Chem. 2006, 49, 4116-4126およびGoswami et al, ACS Med. Chem. Lett., 2013 4 (12) pp 1152-1157に記載されている。さらに、エグリンｃ、セリンプロテアーゼ阻害剤である小さい単量体タンパク質の構造的変異体が、それぞれのマトリプターゼ阻害剤として同定されている（Desilets et al. FEBS Letters 580 (2006) 2227-2232）。ここで、スクリーニングアッセイにおいて、エグリンｃの種々の構造的変異体が創出され、そのマトリプターゼに対する特異性について試験された。反応性部位ループにおける単一アミノ酸交換（Ｌ４５Ｒ）は、エグリンｃマトリプターゼを特異的にする（ｋｉ＝１８ｎＭ）。したがって、細胞培養培地中でマトリプターゼを選択的に阻害し、それによって、脊椎動物宿主細胞によって組換え発現され、細胞培養培地中に分泌される対象のポリペプチドのクリッピングを低減または防止するために、本開示の目的のために使用され得る多数の選択的マトリプターゼ阻害剤が公知である
【００９２】
細胞培養培地中でのマトリプターゼの効果を障害するために、発現宿主細胞が培養される細胞培養培地に選択的マトリプターゼ阻害剤を添加してもよい。対象のポリペプチドのタンパク質分解性分解が低減されるような、細胞培養培地において十分なマトリプターゼ阻害を達成するために必要とされる個々の選択的マトリプターゼ阻害剤の濃度は、日常的な実験に基づいて決定できる。選択的マトリプターゼ阻害剤は、宿主細胞の添加の前または後に細胞培養培地に添加してもよい。一実施形態によれば、選択的マトリプターゼ阻害剤を、細胞培養の開始時に添加する。一実施形態によれば、選択的マトリプターゼ阻害剤を、宿主細胞が、対象のポリペプチドを分泌し始める時点で添加する。選択的マトリプターゼ阻害剤はまた、持続的に添加してもよい。例えば、流加培養法では、供給物中に選択的マトリプターゼ阻害剤を含めてもよい。
【００９３】
対象のポリペプチドに関する詳細、細胞培養培地からの対象のポリペプチドの単離ならびにその後のプロセシングは、例えば、第３の態様の方法とともに上記に記載されており、上記の開示内容が参照され、これはまた、ここでも当てはまる。
【００９４】
大規模製造に必要な細胞培養容量を考慮すると、細胞培養培地における対象のポリペプチドのクリッピングを効率的に低減または防止するために、高い選択性を有するマトリプターゼ阻害剤が使用される場合であっても、多量の（１種または複数の）選択的マトリプターゼ阻害剤が細胞培養培地に添加されなくてはならない。これは、費用がかかる可能性がある。さらに、生物製剤などの多数の対象のポリペプチドについては、最終対象のポリペプチドのマトリプターゼ阻害剤での汚染を避けるために、その後の、対象のポリペプチドの単離および精製の間に添加される選択的マトリプターゼ阻害剤が排除されなければならない。このような除去ステップは、イオン交換、親和性、サイズ排除または逆相クロマトグラフィーなどの任意の公知の精製ステップを含み得る。除去の好適な方法は、使用される選択的マトリプターゼ阻害剤の種類に応じて変わる。このようなステップは、骨の折れるものであり得、費用を増大し得るので、第１の態様の変更された脊椎動物細胞の使用を含む第３の態様の方法が好ましい。
【００９５】
Ｄ．  選択方法
第５の態様によれば、対象のポリペプチドを組換え発現する宿主細胞を選択するための方法であって、
（ａ）宿主細胞として本発明の第１の態様の脊椎動物細胞を提供する段階と、
（ｂ）対象のポリペプチドを発現する１種または複数の宿主細胞を選択する段階と
を含む方法が提供される。
【００９６】
適した好ましい実施形態ならびにその利点を含めて、第１の態様の脊椎動物宿主細胞は、上記で詳細に記載されており、それぞれの開示内容が参照され、これはまた、ここでも当てはまる。好ましくは、脊椎動物細胞は、哺乳動物細胞である。一実施形態によれば、第５の態様の選択方法の段階（ａ）は、対象のポリペプチドをコードする少なくとも１種のポリヌクレオチドを用いて、内因性プロテアーゼマトリプターゼの効果を障害するように変更される脊椎動物細胞をトランスフェクトして、第１の態様の脊椎動物宿主細胞を提供することを含む。一実施形態によれば、細胞は、宿主細胞によって発現され分泌されるべき対象のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのトランスフェクションに先立って、対象のポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含まない。記載されるように、脊椎動物宿主細胞として、哺乳動物細胞が好ましくは使用される。対象の産物をコードするポリヌクレオチドは、発現ベクター中に含まれ得、これが、次いで、脊椎動物細胞中にトランスフェクトされる。
【００９７】
一実施形態によれば、段階（ａ）において提供される前記宿主細胞は、選択マーカーをコードする少なくとも１種の異種ポリヌクレオチドをさらに含み、段階（ｂ）は、選択マーカーに対して選択的な条件下で前記複数の宿主細胞を培養することを含む。選択段階（ｂ）は、対象のポリペプチドを発現する宿主細胞を選択、したがって、同定するためにいくつかの選択ステップを含むマルチステップ選択プロセスであり得る。したがって、一実施形態によれば、選択段階（ｂ）は、いくつかの選択ステップを含み得る。例えば、段階（ｂ）は、成功裏にトランスフェクトされた細胞を選択するための１つまたは複数の選択ステップならびに成功裏にトランスフェクトされた細胞のプールから高発現細胞を選択するための１つまたは複数のその後の選択ステップを含み得る。適当な選択戦略は、対象のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを導入するために使用される発現ベクターの設計に応じて変わり、特に、使用される選択マーカー（単数または複数）および／またはレポーター（単数または複数）に応じて変わる。限定されない実施形態は、以下に記載する。
【００９８】
上記のように、脊椎動物宿主細胞は、選択マーカーをコードする少なくとも１種の異種ポリヌクレオチドを含み得る。選択マーカーをコードするポリヌクレオチドは、同一または異なる、のいずれかの同時トランスフェクトされる発現ベクターを使用して、対象のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと一緒に宿主細胞中に導入され得る。次いで、段階（ｂ）は、例えば、適当な選択培地を使用して、成功裏にトランスフェクトされた宿主細胞を選択するよう宿主細胞へ選択圧を提供する条件下で前記複数の宿主細胞を培養することを含む。本明細書において使用されるように、「選択培地」とは、特に、選択マーカーを発現する宿主細胞の選択に有用な細胞培養培地を指す。成功裏にトランスフェクトされた宿主細胞を選択することを可能にする毒性薬剤などの選択剤を含み得る。あるいは、選択培地において、必須化合物が存在しない場合があるか、またはその濃度が低減され得る。一実施形態によれば、成功裏にトランスフェクトされず、したがって、選択マーカー（単数または複数）を発現しない、または発現が低い宿主細胞は、選択的培養条件下では増殖できない、または死滅する。対照的に、発現ベクター（単数または複数）を用いて成功裏にトランスフェクトされ、選択マーカー（単数または複数）（およびしたがって同時導入された対象のポリペプチド）を十分な収量で発現する宿主細胞は、選択圧に対して耐性であるか、またはそれによってあまり影響を受けず、したがって、増殖でき、それによって、成功裏にトランスフェクトされなかった、または細胞のゲノムへの組込み部位が好ましくない宿主細胞よりも増殖する。選択マーカーは、抗生物質耐性マーカー、薬物耐性マーカーおよび代謝マーカーからなる群から選択され得る。選択マーカーおよび選択原理の適した例は、第１の態様とともに上記に記載されており、当業者には、個々の選択マーカーのための適当な選択条件も周知である。上記のように、あるいはまたはさらに、レポーターポリペプチドに基づく選択が実施され得る。
【００９９】
一実施形態によれば、段階（ａ）において提供される脊椎動物細胞は、哺乳動物細胞である。一実施形態によれば、哺乳動物細胞は、げっ歯類細胞、好ましくは、ＣＨＯ細胞などのハムスター細胞である。適した好ましい実施形態は、第１の態様とともに上記に記載されており、上記の開示内容が参照される。特に、第１の態様の脊椎動物宿主細胞に関するさらに好ましい実施形態、発現ベクターまたは発現ベクターの組合せは、上記に詳細に同様に記載されている。上記の開示内容が参照される。
【０１００】
第５の態様の選択方法の結果として得られた細胞は、個々の細胞として単離され、培養され得る。しかしまた、下流プロセスにおいて遺伝的に異なる宿主細胞の濃縮集団、すなわち、細胞プールを使用することも可能である。得られた宿主細胞はまた、さらなる定性的もしくは定量的分析に付され得るか、または例えば、タンパク質製造のためのクローン細胞株の開発において使用され得る。クローン細胞株は、対象のポリペプチドを高収量で安定に発現する選択された宿主細胞から確立され得る。
【０１０１】
一実施形態によれば、選択された細胞は、特に、クローン細胞培養物の形態で細胞クローンを提供するために培養される。クローン細胞培養物は、ある単一の祖先の細胞に由来する細胞培養物である。クローン細胞培養物では、すべての細胞は、互いにクローンである。好ましくは、細胞培養物中のすべての細胞が、同一または実質的に同一の遺伝情報を含有する。特定の実施形態では、生産性を評価するために、細胞培養物中の対象のポリペプチドの量または濃度が決定される。例えば、培養上清を分析することによって力価が測定され得る。さらに、得られた細胞クローンを用いて安定性研究が実施され得る。
【０１０２】
Ｅ．  組換え製造のための変更された脊椎動物細胞の使用
第６の態様によれば、脊椎動物細胞から分泌される対象のポリペプチドの組換え製造のための単離された脊椎動物細胞の使用であって、使用される細胞は、内因性プロテアーゼマトリプターゼの効果を障害するように変更される、使用が提供される。第６の態様の一実施形態によれば、好ましくは、上記にさらに詳細に記載されるような、マトリプターゼ遺伝子の機能的発現の低減または排除によって、第１の態様とともに上記に詳細に記載されるように、マトリプターゼの効果が障害される。脊椎動物細胞は、好ましくは、哺乳動物細胞である。したがって、一実施形態によれば、内因性プロテアーゼマトリプターゼの効果は、第１の態様の変更された脊椎動物細胞とともに上記のように障害される。一実施形態によれば、対象のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは前記細胞中に導入される。導入後、対象のポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含む脊椎動物細胞であって、対象のポリペプチドは、次いで、脊椎動物細胞から細胞培養培地中に分泌される、脊椎動物細胞が提供される。したがって、使用は、対象のポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを前記脊椎動物細胞に導入することを含み得、ここで、前記対象のポリペプチドは、脊椎動物細胞によって分泌される。対象のポリペプチドに関する詳細は、同様に上記に詳細に記載され、それぞれの開示内容が参照され、これもまたここで当てはまる。ポリヌクレオチドを脊椎動物細胞中に導入するための方法は、当業者に公知であり、同様に上記で手短に記載されている。
【０１０３】
一実施形態によれば、脊椎動物細胞は、発現されるべき対象のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの導入に先立って、対象のポリペプチドをコードする異種ポリペプチドを含まない。一実施形態によれば、前記細胞は、選択マーカーをコードする異種ポリヌクレオチドおよび／またはレポーターポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドをさらに含まない。一実施形態によれば、脊椎動物細胞は、対象のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの導入に先立って任意の異種ポリヌクレオチドを含まない。内因性プロテアーゼマトリプターゼの効果を障害するように変更されるそれぞれの「空の」脊椎動物細胞は、例えば、組換え製造技術のためのクローニング細胞株として使用され得る。それぞれの細胞株は、例えば、適当な発現ベクターを使用して、対象のポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを用いてトランスフェクトされ得る。組換え産物をまだ発現および分泌しないこのような「空の」脊椎動物細胞は、したがって、組換え製造されると仮定される所望の対象のポリペプチドに応じて異なる発現ベクターを用いてトランスフェクトされ得る。したがって、このような脊椎動物細胞株は、種々のプロジェクトのために、すなわち、種々の対象のポリペプチドの製造のために使用され得る。一実施形態によれば、脊椎動物細胞は、第１の態様の脊椎動物細胞である。詳細は、上記に記載されており、上記の開示内容が参照される。
【０１０４】
Ｆ．  マトリプターゼ機能が障害された脊椎動物宿主細胞を選択するための方法
第７の態様によれば、本開示は、対象のポリペプチドの組換え製造のための脊椎動物細胞を選択するための方法であって、内因性プロテアーゼマトリプターゼは、脊椎動物細胞において機能的に発現されるか否かを分析する段階と、対象のポリペプチドの組換え製造のために、このような内因性マトリプターゼの効果が障害されている脊椎動物細胞を選択する段階を含む、方法に関連する。この選択プロセスによって、対象の組換えポリペプチドを発現および分泌可能である宿主細胞を同定することが可能となり、ここで、細胞培養培地における分泌された対象のポリペプチドのクリッピングは低減される。それぞれの宿主細胞は、組換え製造に特に適している。
【０１０５】
この分析方法は、マトリプターゼ遺伝子の効果が障害された脊椎動物細胞が製造されるか否かを同定するために、例えば、本開示の第２の態様の方法と組み合わせて有利に使用され得る。好ましい実施形態によれば、本方法は、前記細胞においてマトリプターゼ遺伝子の機能的発現が低減または排除されるか否かを分析する段階を含む。限定されない実施形態が以下に記載される。どの分析方法が適しているかはまた、細胞が、マトリプターゼの機能的発現の低減または排除を達成するように変更される方法に応じて変わる。
【０１０６】
例えば、マトリプターゼの機能的発現を低減または排除するために遺伝子ノックアウトをマトリプターゼ遺伝子に導入する場合には、遺伝子ノックアウトがマトリプターゼ遺伝子中に導入されたことを確認するために対応するＤＮＡセクションを増幅し、増幅されたＤＮＡを配列決定できる。１つまたは複数の変異の導入は、例えば、配列決定することによって検出され得る。前記遺伝子を完全または部分的に欠失させることによってマトリプターゼの機能的発現が低減または排除される場合には、例えば、欠失を検出するための適した増幅ベースの検出方法を使用して（このような方法は当業者に公知である）、ＤＮＡレベルで欠失を検出できる。
【０１０７】
さらに、例えば、少なくとも１つの変異によって、全体的な発現が低減もしくは排除されるので、および／または発現されたマトリプターゼの活性が低減もしくは排除されるので、本方法は、マトリプターゼの天然に機能的な発現が低減または排除されている、適した細胞株を選択するために使用され得る。それぞれの細胞は、本明細書に記載されるように、第７の態様の方法を使用して同定され得る。例えば、マトリプターゼの発現は、ＲＴ−ＰＣＲなどのＰＣＲベースの技術および／または配列決定を使用して分析され得る。あるいは、またはさらに、マトリプターゼの活性は、分析されるべき細胞から得られた馴化培地を使用して分析され得る。
【０１０８】
一実施形態によれば、細胞表面上にマトリプターゼがないか、または低減された量のマトリプターゼを有する細胞は、フローサイトメトリーによって選択される。例えば、抗体またはマトリプターゼと結合するその他の検出剤は、マトリプターゼを発現する細胞を特徴付けるために使用され得る。次いで、抗体もしくはその他の検出剤と結合する標識された薬剤を添加することによってそれぞれの細胞が標識され得、または抗体もしくはその他の検出剤は直接的に標識され得る。一実施形態によれば、標識は、蛍光標識である。それによって、細胞は、マトリプターゼのその発現レベルに従って特徴づけられ、次いで、これによって、例えば、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）によって、マトリプターゼの低減された発現または発現がないことを示す細胞を同定および選別することが可能となる。
【０１０９】
一実施形態によれば、脊椎動物細胞の発現プロファイルは、マトリプターゼ遺伝子の機能的発現が低減または排除されるか否かを決定するために分析される。例えば、分析は、マトリプターゼｍＲＮＡの存在、不在、量または長さを検出するために定性的または定量的ＲＴ（逆転写）ＰＣＲを実施することを含み得る。細胞における機能的マトリプターゼ発現の分析に加えて、またはその代わりに、選択プロセスは、前記細胞から得られた馴化培地中にマトリプターゼ活性があるか否かを試験するステップを含み得る。例えば、実施例に記載されるようなスパイクイン実験が実施され得る。したがって、それぞれに得られた馴化培地中にマトリプターゼ活性があるか否かを分析するために、種々の可能性のある細胞株から細胞培養培地が集められ得る。例えば、馴化培地は、クリッピングの傾向があるポリペプチドに対するそのクリッピング活性について試験され得る。クリッピング活性を試験するための標準として、クリッピングされると知られている１種または複数のポリペプチドを使用することによって、互いに対して、または標準細胞株に対して、可能性のある細胞株のクリッピング活性を定性または定量することが可能である。
【０１１０】
一実施形態によれば、第７の態様の方法は、哺乳動物細胞、特に、ハムスター細胞などのげっ歯類細胞、好ましくは、ＣＨＯ細胞を選択するためである。
【０１１１】
一実施形態によれば、第７の態様の方法は、対象のポリペプチドの組換え発現のために、好ましくは、マトリプターゼ遺伝子の機能的発現の低減または排除によってマトリプターゼの機能が障害されている少なくとも１種の細胞を選択することを含む。それぞれの特徴を有する細胞は、実施例によって示されるような組換え発現に特に適している。それぞれの細胞のさらなる実施形態も、上記に詳細に記載されており、それぞれの開示内容が参照される。
【０１１２】
本明細書に記載される数的範囲は、範囲を規定する数字を含む。本明細書において提供される見出しは、本開示の種々の態様または実施形態の制限ではなく、これは、本明細書を全体として参照して読まれ得る。一実施形態によれば、特定の要素を含むとして本明細書に記載される主題はまた、それぞれの要素からなる主題を指す。特に、特定の配列を含むとして本明細書に記載されるポリヌクレオチドはまた、それぞれの配列からなり得る。本明細書に記載される好ましい実施形態を選択および組み合わせることが好ましく、好ましい実施形態のそれぞれの組合せに起因する具体的な主題もまた、本開示に属する。本明細書に引用されるすべての文書は、参照により組み込まれる。
【実施例】
【０１１３】
以下の実施例は、その範囲を決して制限することなく本発明を例示するよう働く。特に、実施例は、本発明の好ましい実施形態に関する。
【０１１４】
Ｉ．材料および方法
１．  細胞培養
本明細書において特に断りがない限り、細胞培養物として、ＣＨＯ−Ｋ１由来のＣＨＯ細胞を増殖する懸濁液を、例えば、国際公開第２０１１／１３４９２０号パンフレットに開示されるような標準培地および細胞培養プロセスにおいて振盪フラスコ中で培養した。細胞を新鮮な培地に１週間あたり２回継代し、研究を通じて対数増殖期で維持した。
【０１１５】
細胞を培養するために使用された同一培養培地を、実施例において陽性対照として使用した。
【０１１６】
２．  馴化培地を使用するスパイクイン実験
対象のポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含まない細胞を、２×１０５個の生存細胞／ｍｌの密度で標準培地（３０ｍｌ培養物）中に継代し、３７℃で増殖させた。生細胞密度のピークで（普通、継代の７または８日後；生存力は依然として９５％超）細胞を培地から除去した。これらの条件下で、細胞成長のこの段階で、細胞死による細胞内プロテアーゼを放出せずに細胞培養培地中で最大量の分泌されたプロテアーゼが活性であると予測される。また、細胞が対象の組換えポリペプチドを発現するようトランスフェクトされた場合に、これらの条件下で、最大量の分泌された対象のポリペプチドが予測される。馴化培地を得るために、細胞培養物を１５分間９０ｇ（遠心分離ストレスのために細胞が細胞内プロテアーゼ放出しないよう十分に穏やかに）で遠心分離した。遠心分離後、上清を移し、０．２２μｍのフィルターを通して、馴化培地から残存する細胞粒子を除去した。
【０１１７】
このように得られた馴化培地に対象のポリペプチドを添加し、０．７μＭの最終濃度とし、５００ｒｐｍで連続振盪しながら３７℃でインキュベートした。対象のポリペプチド各々のインキュベーション時間は、野生型サンプルにおいてアリコートを周期的に除去することならびにＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットを使用してそれらを分析することによって予め決定した。野生型馴化培地において少なくとも５０％分解が観察された時点を、各対象のポリペプチドについて選択した。インキュベーション後、対象のポリペプチドのすべてのサンプルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと、通常、それに続いて、ウエスタンブロット解析によって分析して、クリッピングの量を決定した。実施例では、クリッピングを分析するために、種々の治療用ポリペプチドを対象のポリペプチドとして使用した。
【０１１８】
３．  ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット
タンパク質サンプルを、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｌａｎｅマーカー還元サンプルバッファー（１０ｍＭ  ＤＴＴ、カタログ３９０００）で希釈し、９５℃で５分間沸騰させた。約０．１〜０．６μｇタンパク質／レーンをプレキャスト４〜１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログＮＰ０３２２ＢＯＸ）中にロードした。電気泳動後、ゲルを、Ｂｉｏ−Ｒａｄウェットエレクトロブロッティングシステムを使用してニトロセルロースメンブレン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＬＣ２００１）に移した。対象のポリペプチドを、ＨＲＰ結合型特異的抗体およびＥＣＬ（Ｐｉｅｒｃｅ、カタログ３２１０９）を使用して検出した。
【０１１９】
ＩＩ．実施例１：ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）によって種々のプロテアーゼの発現をサイレンシングする場合の、種々の対象のポリペプチドのクリッピング
第１に、ＣＥ−ＳＤＳ分析、質量分析およびコンピュータによる分析（データは示さず）を含めた種々の技術を使用して、クリッピングの傾向がある種々の組換えタンパク質のタンパク質分解による切断部位（単数または複数）を分析した。種々のプロテアーゼ阻害剤を使用するさらなる分析と組み合わせたこの分析は、クリッピングの傾向がある試験されたタンパク質の大部分が、セリンプロテアーゼのサブファミリーであるトリプシン様プロテアーゼによって切断されることを示した。実施例１のＲＮＡｉ実験は、マトリプターゼがクリッピングに関与する重要なプロテアーゼであることおよびマトリプターゼ遺伝子のサイレンシングが、クリッピングを大幅に低減するのに対し、種々のプロテアーゼをコードするその他の遺伝子のサイレンシングが、対象のポリペプチドのクリッピングを低減しないことを実証するよう設定した。ｓｉＲＮＡは、ＣＨＯ細胞において発現される以下の標的ｍＲＮＡに対して設計した：１．マトリプターゼ（ＭＴ−ＳＰ１；本明細書においてＳｔ１４とも呼ばれる）、２．Ｃ１ｒ（補体成分によって活性化されるＣ１ｒ；Ｃｔｒａとも呼ばれる）、３．Ｃ１ｓ（補体成分Ｃ１ｓＢ；Ｇｍ５０７７とも呼ばれる）、４．Ｐｌａｔ（ｔ−プラスミノゲンアクチベーター）および５．Ｐｒｓｓ３５（プロテアーゼ、セリン、３５）。これらの標的遺伝子は、分泌型または膜貫通タンパク質のいずれかであり、したがって、細胞培養培地中に分泌される組換え発現されたタンパク質のクリッピングに関与し得るトリプシン様プロテアーゼをコードする。これらのタンパク質は、ＣＨＯ細胞によって発現されるということは前もって確認された。表２は、それぞれの標的遺伝子にわたる概要を提供する。
【０１２０】
【表２】
0006636453.tif 000003
【０１２１】
マトリプターゼおよびその他の標的プロテアーゼに対するｓｉＲＮＡのセンスおよびアンチセンス配列が表３に列挙されている。
【０１２２】
【表３】
0006636453.tif 000004
【０１２３】
実験の詳細な設定を、以下に記載する。
【０１２４】
１．１．  ｓｉＲＮＡトランスフェクション
ＣＨＯ−Ｋ１由来細胞のＲＮＡｉトランスフェクションを、６ウェルプレートにスケールアップした、マニュアルＭＡＮ０００１１８２の「リバーストランスフェクションプロトコール」に従って、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）ＲＮＡｉＭＡＸ試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カタログ１３７７８）を使用して実施した。各ｍＲＮＡ標的のために、１００、１２５および１５０ｐｍｏｌの間でＲＮＡｉ二本鎖分子の２つの最も効果的な濃度：ＭＴ−ＳＰ１（Ｓｔ１４）に対して、１２５および１５０ｐｍｏｌ、Ｃ１ｒ（Ｃ１ｒａ）に対して１２５および１５０ｐｍｏｌ、Ｃ１ｓ（Ｇｍ５０７７）に対して１００および１２５ｐｍｏｌ、Ｐｌａｔに対して１２５および１５０ｐｍｏｌならびにＰｒｓｓ３５に対して１００および１２５ｐｍｏｌを使用した。２つの選択された濃度のＲＮＡｉ二本鎖分子を、１ｍｌ  Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）（Ｇｉｂｃｏ、カタログ３１９８５−０６２）で希釈した。ＲＮＡｉ陰性対照（ｓｉＲＮＡ陰性対照）として、Ｓｉｌｅｎｃｅｒ（登録商標）陰性対照番号１  ｓｉＲＮＡ（ＡＭ４６１１）を使用した（１２５ｐｍｏｌで）。各ウェルに５μｌ  Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）ＲＮＡｉＭＡＸ試薬を添加した。２ｍｌの、０．５×１０６個細胞／ｍｌの濃度を有する細胞懸濁液を添加し、プレートを３７℃および１０％  ＣＯ２でインキュベートした。トランスフェクションの３日後、細胞密度を測定し、ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌｕｓ  Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ７４１３４）を使用して３×１０６個の生存細胞の全ＲＮＡを抽出し、各ウェルから馴化培地を集めた。標的遺伝子に対するサイレンシング効果を制御するために、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによってｍＲＮＡ発現を決定した。
【０１２５】
【表４】
0006636453.tif 000005
【０１２６】
１００％として設定されたｓｉＲＮＡ陰性対照細胞におけるプロテアーゼ遺伝子発現に対する残存するプロテアーゼ遺伝子発現は、以下の通りであった：ＭＴ−ＳＰ１：１２５ｐｍｏｌ（１８．６％）および１５０ｐｍｏｌ（１８．２％）、Ｃ１ｒ（Ｃ１ｒａ）：１２５ｐｍｏｌ（６．３％）および１５０ｐｍｏｌ（６．７％）、Ｃ１ｓ（Ｇｍ５０７７）：１００ｐｍｏｌ（１１．９％）および１２５ｐｍｏｌ（１４．４％）、Ｐｌａｔ：１２５ｐｍｏｌ（８．３％）および１５０ｐｍｏｌ（５．１％）およびＰｒｓｓ３５：１００ｐｍｏｌ（１８．４％）および１２５ｐｍｏｌ（１４．８％）。
【０１２７】
１．２．  馴化培地におけるスパイクイン実験
馴化培地を集める、６ウェルプレートから２００μｌの細胞培養培地を遠心分離し（３００ｇで３分間）、得られた上清を、上記の材料および方法に記載されるようなスパイクイン実験のための馴化培地として使用した。対象のポリペプチドは、モノクローナルＩｇＧ抗体（ｍＡｂ）またはＦｃ融合タンパク質のいずれかであった。上記のように、野生型馴化培地において少なくとも５０％の分解が観察された時点を、各対象のポリペプチドについて選択した。結果はＦｃ融合タンパク質について３日のインキュベーション時間につながり（しかし、分解は既に５０％をはるかに上回っていた）、ｍＡｂについては７日のインキュベーション時間につながった。インキュベーション後、馴化培地中の対象のポリペプチドのサンプルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット解析によって分析して、材料および方法に記載されるようにクリッピングの量を決定した。
【０１２８】
１．３．  タンパク質クリッピング：スパイクイン実験の結果
図１は、上のパネル、ｍＡｂにおける、および下のパネルＦｃ融合タンパク質における、上記で定義されるインキュベーション後の種々の分析された対象のポリペプチドのウエスタンブロットを示す。
【０１２９】
上のパネルのウエスタンブロットの第１のレーンは、未処理（組成既知の）培地（細胞を培養するために使用されたものと同一培地）において７日間インキュベートした後のｍＡｂを示し、これでは、したがって、細胞培養培地が細胞と接触せず、したがって、前記培地中に細胞性プロテアーゼが存在しないので、クリッピングは起こらないはずである（陽性対照（＋））。ｍＡｂは、単一の強力なタンパク質バンド（矢印で印がつけられた）として示され、クリッピングは起こらなかった。
【０１３０】
第２のレーンは、ｓｉＲＮＡ陰性対照（遺伝子発現に対する効果なし）を用いてトランスフェクトされた陰性対照細胞（（−））の馴化培地において７日間インキュベートした後のｍＡｂサンプルを示す。ｓｉＲＮＡ陰性対照は、遺伝子発現に対して効果を有さないので、馴化培地は、変更されていない細胞、したがって、正常な標的遺伝子発現を示す、したがって、コードされるプロテアーゼが正常に発現される細胞のインキュベーション後得られる馴化培地に本質的に対応する。見られるように、無傷のｍＡｂのタンパク質バンドに加えて、クリッピングされたｍＡｂ（矢印で印がつけられている）に相当する第２の強力なタンパク質バンドが下に表れる。両タンパク質バンドは、同様の強度を有し、したがって、ｍＡｂの約５０％がクリッピングされたと推定され得る。Ｃ１ｒ（Ｃ１ｒａ）、Ｃ１ｓ（Ｇｍ５０７７）、ＰｌａｔおよびＰｒｓｓ３５が、ＲＮＡｉによってサイレンシングされた（レーン５〜１２を参照のこと）細胞の細胞上清中でインキュベートされたｍＡｂについて、同一結果−相当なクリッピング−が見られる。標的遺伝子が効率的にサイレンシングされたことが、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって確認された。Ｃ１ｒ（Ｃ１ｒａ）について、最強のｍＲＮＡ低減が見られ、９３．７％および９３．３％であった。Ｐｌａｔについて見られた低減は、９１．７％および９４．９％であり、Ｃ１ｓ（Ｇｍ５０７７）については、８８．１％および８５．６％であり、Ｐｒｓｓ３５については、８１．６％および８５．２％であった。したがって、すべてのこれらの標的遺伝子は、８０％超、成功裏にサイレンシングされた。それにもかかわらず、すべてのこれらの場合において、クリッピングされたｍＡｂのタンパク質バンドは、無傷のｍＡｂのタンパク質バンドと少なくともほぼ同一のシグナル強度を有していた。したがって、陰性対照（−）におけるように、少なくとも約５０％のｍＡｂがクリッピングされた。したがって、これらのプロテアーゼ遺伝子の下方制御は、馴化培地において対象のポリペプチドのクリッピングを低減しなかった。
【０１３１】
対照的に、ＲＮＡｉによって細胞においてマトリプターゼ（ＭＴ−ＳＰ１）発現を低減することは（レーン３および４を参照のこと）は、ｍＡｂのクリッピングを相当低減した。ＭＴ−ＳＰ１が陰性対照と比較して８１．４％および８１．８％抑制された（残存するＭＴ−ＳＰ１発現は、１８．６％および１８．２％）両設定において、クリッピングされたｍＡｂのタンパク質バンドは、無傷のｍＡｂのタンパク質バンドよりもかなり弱い。これは、大幅に少ないｍＡｂがクリッピングされたことを実証し、マトリプターゼ遺伝子の機能的発現を低減するよう、ここではＲＮＡｉによって脊椎動物細胞を変更することは、前記細胞から得られた馴化細胞培養培地において対象のポリペプチドのクリッピングの量を大幅に低減することを示す。
【０１３２】
対象のポリペプチドのさらなる例としてＦｃ融合タンパク質の結果が、図１の下のパネルに示されている。ｍＡｂと対照的に、Ｆｃ融合タンパク質の比較サンプル「（＋）」は、無傷のタンパク質のタンパク質バンドに加えて、Ｆｃ部分単独に対応する第２の強力なバンドを含有し、これはまた、主なクリッピング産物でもある（両バンドが矢印で印がつけられている）。出発材料（ＣＨＯ細胞において製造されたＦｃ融合タンパク質）が、精製後でさえ、高いパーセンテージのクリッピングされたＦｃ融合タンパク質を含有するので、クリッピングされたＦｃ部分はまた、陽性対照中に見られる。Ｆｃタンパク質の精製プロセスの間、クリッピングされた材料のすべてが除去され得ない。したがって、出発材料として陽性対照において使用されるＦｃ融合タンパク質は、不純物として相当な量のクリッピングされたＦｃ部分を既に含有する。Ｃ１ｒ（Ｃ１ｒａ）、Ｃ１ｓ（Ｇｍ５０７７）、ＰｌａｔまたはＰｒｓｓ３５の発現がサイレンシングされた細胞の馴化培地では、無傷のＦｃ融合タンパク質のシグナルは、弱い（Ｐｌａｔ）から極めて弱い（Ｐｒｓｓ３５）の範囲である。したがってＦｃ融合タンパク質のクリッピングは、これらの場合には極めて高く、これらのプロテアーゼの発現が抑制されたとしても最大ほぼ１００％の値に到達した。したがって、これらのプロテアーゼ遺伝子のサイレンシングは、クリッピングを低減するには効果がない。対照的に、マトリプターゼ（ＭＴ−ＳＰ１）の発現がサイレンシングされた細胞から得られた馴化培地では（１つのｓｉＲＮＡ濃度のみが使用された）、陽性対照（＋）とほぼ同一強度の無傷のタンパク質が見られる。したがって、クリッピングは、大幅に低減された。ｓｉＲＮＡ陰性対照（−）に相当するレーンはまた、無傷のタンパク質を含む。しかし、この結果は、ローディングの際にこぼれ出た陽性対照による、ｓｉＲＮＡ陰性対照レーンの混入である。
【０１３３】
要約すると、このＲＮＡｉ実験は、宿主細胞におけるマトリプターゼの発現をサイレンシングすることは、前記細胞から得られた馴化培地における種々の例示的な対象のポリペプチドのクリッピングの大幅な減少をもたらすことを実証する。対照的に、宿主細胞によって発現されたその他のトリプシン様プロテアーゼの発現をサイレンシングすることは、クリッピングに対して正の効果を全く有さない。したがって、実施例１は、マトリプターゼが、組換え発現され分泌された対象のポリペプチドのクリッピングに関与する主要なプロテアーゼであるという知見の重要性を支持する。さらに、マトリプターゼがＲＮＡｉによって下方制御された細胞は、ｓｉＲＮＡ陰性対照細胞と同一の成長特徴を有することが見出された。したがって、マトリプターゼ発現の下方制御は、細胞成長に影響を及ぼさなかった。
【０１３４】
ＩＩＩ．実施例２：ＣＨＯ細胞におけるマトリプターゼ遺伝子ノックアウト（ＫＯ）は、クリッピングの減少につながる
Ａ．  ＴＡＬＥＮ技術を用いて実施されたＫＯ
ＴＡＬＥＮ（転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ）技術を使用して、ＣＨＯ−Ｋ１由来細胞に基づいて９種のマトリプターゼ（ＭＴ−ＳＰ１）ノックアウト細胞クローンを作製した。ノックアウトのために、膜貫通ドメインのコーディング領域の前に位置する領域でマトリプターゼエキソン２を標的とした。種々の選択的スプライシング変異体に及ぶので、エキソン２を選択した。エキソン２においてフレームシフト変異を加えることは、末端切断型タンパク質が短く、細胞内に位置し、さらに、不安定で細胞に対して非毒性であるという利点を有する。
【０１３５】
２．Ａ．１．  マトリプターゼのエキソン２に特異的であるＴＡＬＥＮの設計／製造および使用
ＣＨＯ−Ｋ１由来親細胞株において、マトリプターゼのエキソン２およびそれぞれの両端に位置するイントロンを配列決定した（図２、配列番号３１を参照のこと）。
【０１３６】
マトリプターゼエキソン２を標的とする２つの末端切断型ＴＡＬ  ＦｏｋＩを設計した。各ＴＡＬＥＮは、それぞれ、５’（フォワード上）または３’（リバース上）ＤＮＡ鎖のいずれか上の１９のヌクレオチドを標的とし、それと結合する。２つの結合部位は、切断部位の１６のヌクレオチドによって分離している。各設計されたＴＡＬを合成し、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）エントリーベクターにクローニングし、ｐＥＸＰ３−ＤＥＳＴ＿Ａ３０２デスティネーションベクターにサブクローニングした。製品説明書きおよび方法は、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ／ＧｅｎｅＡｒｔから入手可能である。ＴＡＬＥＮ（バックボーンベクターｐＥＸＰ３−ＤＥＳＴ中にサブクローニングされた）を認識する５’（左）または３’（右）鎖をコードするプラスミドを製造した。ｐＥＸＰ３−ＤＥＳＴは、ＴＡＬＥＮコード配列の上流にＴ７プロモーターを含有し、これが、ＴＡＬ−ＦｏｋＩをコードするｍＲＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）を可能にする。
【０１３７】
２．Ａ．２．  ＴＡＬＥＮベクターのｉｎ−ｖｉｔｒｏ転写
ＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡを、ＴＡＬＥＮベクターのｉｎ−ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）によって製造した。ＴＡＬＥＮベクターは、ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素（Ｒｏｃｈｅ、カタログ１０６５６３２１００１）を用いて前もって直線化し、イソプロパノールとそれに続く７０％エタノール沈殿法を使用して精製した。ｍＲＮＡを、当業者に公知の手順を使用して作製した。キャッピングされたＩＶＴ産物を、ＮＨ４−Ａｃ沈殿を用いて精製し、生成したｍＲＮＡ（ポリＡテールおよび５’キャップを含有する）を、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｃｒｏキット（カタログ７４００４）を使用して．精製した。
【０１３８】
２．Ａ．３．  ＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡのトランスフェクション
９５％超の生存力を有する指数的増殖相にある親ＣＨＯ−Ｋ１細胞を、トランスフェクションに使用した。Ａｍａｘａ（商標）、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）技術を使用し、製造業者（Ｌｏｎｚａ）の使用説明書に従って、エレクトロポレーション（ヌクレオフェクション）を実施した。トランスフェクション後４日目に、トランスフェクトされた細胞を増殖させ、３０×９６ウェルプレートにおいて７日目に単細胞を分離した。単クローン性およびコンフルエンスを、ＣｌｏｎｅＳｅｌｅｃｔ（商標）Ｉｍａｇｅｒ（Ｇｅｎｅｔｉｘ）を用いて制御した。
【０１３９】
２．Ａ．４．  Ｃｅｌ−Ｉ−アッセイおよびスクリーニング戦略
Ｃｅｌ−Ｉ−アッセイを、ＳＡＦＣ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓのマニュアルに従って実施した。Ｃｅｌ−Ｉ−アッセイは、切断効率を決定するための標準アッセイである。手短には、トランスフェクションの３日後、細胞からゲノムＤＮＡを単離し、以下のプライマーを使用してＰＣＲを実施した：
Ｆｗｄ：ｔｔｔｔｔｔｇｃｃｃａｇｔｃｃｔｇｇｔｔ（配列番号３２）
Ｒｅｖ：ｃｃｃｔｔｔｇｇｔｃｔｇｔｃｃｔｃｔｇａ（配列番号３３）
【０１４０】
増幅産物を変性し、再生を可能にした。次いで、ヌクレアーゼＳおよびヌクレアーゼＳエンハンサーを添加し、インキュベートした。消化産物を分析した。２つの小さいバンドが存在し、これは、ゲノムの領域内のＴＡＬＥＮ活性を示し、したがって、変異によってマトリプターゼ遺伝子が変更された細胞が、分析された細胞プール中に存在することを支持した。最も陽性の細胞プール（２つの小さいバンドのより強い強度）から、９６ウェルプレートに単細胞を選別した。
【０１４１】
Ｅｘｔｒａｃｔ−Ｎ−Ａｍｐ（商標）血液ＰＣＲキット（カタログＸＮＡＢ２Ｒ、Ｓｉｇｍａ）を使用して、９６ウェルプレート中の各クローンからゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を抽出した。以下の配列：
切断プライマー：ＧＴＧＧＡＧＴＴＴＣＴＧＣＣＴＧＴＧＡＡ（配列番号３４）
を有する、切断部位で結合するプライマー（切断プライマーと呼ばれる）と組み合わせた、上記で示されたリバースプライマー（Ｒｅｖ）（配列番号３３）を使用する「ＣｕｔＳｉｔｅ  ＰＣＲ」アッセイにおいて、ｇＤＮＡ抽出物を使用して、変異されたクローンについてスクリーニングした。
【０１４２】
切断部位領域において、ＴＡＬＥＮの活性のために変異が生じた場合には、切断プライマーは結合せず、その結果、ＰＣＲ産物が得られないことになる。ＰＣＲ産物がないクローンを配列決定により分析して、誘導された変異を決定した。あるいは、またはさらに、上記で示されるフォワード（Ｆｗｄ）およびリバース（Ｒｅｖ）プライマーを使用するＳｕｒｖｅｙｏｒ変異検出アッセイ（Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃｓ、カタログ７０６０２５）を実施した。変異を有するクローンを、１２５ｍｌの振盪フラスコ中に移し、配列決定した。前記スクリーニングアッセイにおいて、クローンΔ７／Δ１５を同定した。さらに、第１ラウンドのトランスフェクションおよびＣｅｌ−Ｉアッセイを使用するスクリーニングの後、遺伝子型ｗｔ／Δ４を有する１つのクローンが生成し、これは、１つのマトリプターゼ対立遺伝子中にフレームシフト変異を有していた。
【０１４３】
両対立遺伝子中にフレームシフト変異を含むノックアウトクローンを得るために、２つのＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡトランスフェクションおよびクローニングラウンドを実施した。ＭＴ−ＳＰ１の両対立遺伝子中にフレームシフト変異を有するノックアウトクローンを得るために、遺伝子型ｗｔ／Δ４を有するクローンを上記のように第２のＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡトランスフェクション−クローニングラウンドにおいて使用して、第２の対立遺伝子中に同様にフレームシフト変異を作製した。両対立遺伝子中にフレームシフト変異を含有する、合計で９個のマトリプターゼノックアウトクローン（ＫＯ−１〜ＫＯ−９）を作製した。９個のクローンの遺伝子型は、表５に開示されている。野生型およびこれらの変異を指すＭＴ−ＳＰ１エキソン２配列は、表６に示されている。変異に起因するＭＴ−ＳＰ１産物の部分配列は、表７に示されている。エキソン２によってコードされるアミノ酸は、太字で強調されている。
【０１４４】
表５によれば、遺伝子型Δ４／Δ４を有する４個のクローン、ＫＯ−１、ＫＯ−４およびＫＯ−７およびＫＯ−９がある。これらのクローンのマトリプターゼ遺伝子型は同一である。ＫＯ−１、ＫＯ−４およびＫＯ−７は、同一のＴＡＬＥＮ再トランスフェクトされたプールに由来し、ＫＯ−９は、異なるものに由来する。クローンのＦＩＳＨ分析は、ＫＯ−１、ＫＯ−４およびＫＯ−７のカリオグラム中にいくつかの相違があることを示した。したがって、それらは同一母細胞に由来しないと想定される。
【０１４５】
フレームシフト変異は、すべてのクローンＫＯ−１〜ＫＯ−９においてマトリプターゼ遺伝子の両対立遺伝子中に挿入される。さらに、遺伝子型Δ７／Δ１５を有し、１つの対立遺伝子のみにフレームシフト変異を有する（Δ７）変異されたクローンΔ７／Δ１５を得た。第２の対立遺伝子では、変異Δ１５、１５塩基対の欠失は、マトリプターゼの短い細胞内ドメインにおける５個のアミノ酸の欠失をもたらす。しかし、Δ１５欠失のためにフレームシフトは起こらない。触媒プロテアーゼドメインを含む細胞外部分がシェディングしている場合も依然として膜と結合するので、影響を受けるドメインは、触媒機能に必要ではないようである。したがって、Δ１５対立遺伝子から発現されるマトリプターゼは、依然として触媒的に活性であると推測される。したがって、細胞クローンΔ７／Δ１５では、マトリプターゼの機能的発現が低減されるが、消滅しない。前記クローンによって発現されるおよそ半分の残存するｍＲＮＡは、フレームシフト変異を含有するとさらに推測される。
【０１４６】
【表５】
0006636453.tif 000006
【０１４７】
【表６】
0006636453.tif 000007
0006636453.tif 000008
【０１４８】
【表７】
0006636453.tif 000009
【０１４９】
２．Ａ．５．  マトリプターゼ（Matripase）ｍＲＮＡ発現
マトリプターゼ発現に対する導入された変異の効果を試験するために、定量的逆転写リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）を実施した。ｑＲＴ−ＰＣＲによって個々のクローンにおいて測定されるマトリプターゼｍＲＮＡ発現を、野生型ＣＨＯ−Ｋ１由来細胞におけるｍＲＮＡ発現と比較した。この実験の結果は、図３に示されている。図３によれば、マトリプターゼが変異した細胞クローンでは、ｍＲＮＡは、野生型と比較して５〜４０％の範囲においてのみ発現される。この結果は、変異されたマトリプターゼの発現が低減されることを示唆する。したがって、少ない（非機能的）マトリプターゼタンパク質が、細胞によって発現される。また、細胞クローンΔ７／Δ１５は、細胞において低いマトリプターゼｍＲＮＡ発現しか示さない。
【０１５０】
２．Ａ．６．  ９種のマトリプターゼ（ＭＴ−ＳＰ１）ノックアウトクローンから得られた細胞上清を用いるスパイクイン実験
マトリプターゼノックアウトの効果を評価するために、クリッピングの傾向がある５種の異なる対象のポリペプチドを用いてスパイクイン実験を実施した。材料および方法の下に記載されたプロトコールに従って、ＣＨＯノックアウトクローンに由来する細胞培養物の馴化培地を得た。スパイクイン実験のために、対象のポリペプチドを馴化培地に添加し、０．７μＭの最終濃度を有し、５００ｒｐｍで連続振盪しながら３７℃でインキュベートした。インキュベーション時間は、試験された対象のポリペプチドの種類に応じて変わる。インキュベーション後、馴化培地中の対象のポリペプチドのサンプルを、材料および方法の下に記載されるように、ＳＤＳ  ｐａｇｅおよびウエスタンブロットによって分析した。
【０１５１】
図４Ａは、対象のポリペプチドとしてモノクローナルＩｇＧ抗体（ｍＡｂ）を用いるスパイクイン実験のウエスタンブロット解析を示す。参照対照として、ウエスタンブロットの左から最初のレーン（「（＋）」によって示される）は、組成既知の培地においてインキュベートした後のｍＡｂを示す（同一培養培地はまた、馴化培地を得るために使用された）。産物のクリッピングは検出されない；無傷のタンパク質は矢印で印がつけられている。第２のレーン（ＷＴ）は、通常、マトリプターゼを発現するＣＨＯ−Ｋ１由来細胞から得られた馴化培地において４８時間インキュベートした後のモノクローナル抗体を示す。ここで、クリッピングされた抗体に相当する第２の強力なバンドが検出される（矢印によって印がつけられる）。クリッピング抗体のタンパク質バンドは、無傷のタンパク質のタンパク質バンドよりも強いので、５０％超のタンパク質がクリッピングされる。対照的に、それぞれ、９種のノックアウト細胞株ＫＯ−１〜ＫＯ−９（図４中、１〜９）から得られた馴化培地におけるモノクローナル抗体のインキュベーション後に、クリッピング産物は検出されない。したがって、脊椎動物宿主細胞におけるマトリプターゼ遺伝子のノックアウトは、細胞培養培地におけるｍＡｂのクリッピングが効率的に防止され得るので大幅な改善である。
【０１５２】
Ｆｃ融合タンパク質を用いる対応するスパイクイン実験の結果は、図４Ｂに示されている。インキュベーション時間は２４時間とした。モノクローナル抗体と対照的に、組成既知の培地において既に陽性の対照（＋）は、クリッピングされたタンパク質の大きな部分を含有していた（矢印で印がつけられている）。これは、対象のポリペプチドとして添加されるＦｃ融合タンパク質が、ＣＨＯ細胞において製造され、それが回収される培養培地では重度にクリッピングされるからである。すべてのクリッピングされたタンパク質が、精製プロセスの間に除去され得ず、その結果、出発材料は、幾分かのクリッピングされたタンパク質の混入を既に含有していた。マトリプターゼノックアウトクローン（１〜９）を用いる実験では、無傷のタンパク質およびクリッピングされたタンパク質の量は、陽性対照（＋）においてインキュベートされた出発材料と同等であるが、変更されていないＣＨＯ−Ｋ１由来野生型細胞（ＷＴ）の馴化培地におけるインキュベーションは、無傷のタンパク質を完全に消滅させ、したがって、分解した。したがって、マトリプターゼの機能を障害するように変更されなかった細胞から得られた馴化培地では、基本的に１００％のクリッピングが観察された。
【０１５３】
馴化培地中で１時間インキュベートされたさらなる組換え治療用タンパク質について、同等の結果が見られる（図４Ｃ）。タンパク質の２種の糖変異体が存在する。やはり、野生型ＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＷＴ）の馴化培地において、両タンパク質糖変異体の５０％超がクリッピングされたが（矢印によって印がつけられた）、内因性プロテアーゼマトリプターゼの機能が、遺伝子ノックアウトによって障害される、ＫＯ−１〜ＫＯ−９細胞（１〜９）の馴化培地におけるインキュベーションは、組成既知の培地（陽性対照（＋））におけるインキュベーション後に観察されるように、無傷のタンパク質の状態を保った。
【０１５４】
また、ＫＯクローンを、クリッピングの防止、それぞれの低減が、マトリプターゼ遺伝子がノックアウトされた変更された脊椎動物細胞の安定な特徴であるか否かを分析するために数ヶ月にわたって分析した。したがって、ｍＡｂを用いるスパイクイン実験を、３ヶ月間培養されたマトリプターゼノックアウト細胞クローンから得られた馴化培地を用いて反復した。陰性対照「（ＷＴ）」としてのＣＨＯ野生型細胞および陽性対照「（＋）」としての組成既知の培地から得られた馴化培地と再度比較された実験の結果が、図４Ｄに示されている。ウエスタンブロットは、図４Ａにおいて見られるものと正確に同一のタンパク質バンドパターンを示す。同一結果が、Ｆｃ融合タンパク質について３ヶ月後に見られた（データは示さず）。したがって、ＫＯクローンを用いた場合、数ヶ月後にクリッピングは現れないことが確認された。さらに、ＫＯ細胞株が良好に増殖し、細胞成長が３ヶ月の培養にわたって一層改善することが見出された。
【０１５５】
２４時間（Ｄ１）および４８時間のインキュベーション（Ｄ２）後の、マトリプターゼノックアウトクローンＫＯ−１〜ＫＯ−３（１〜３）の馴化培地を使用する、２種のグリコシル化ウイルスタンパク質を用いるスパイクイン実験の結果が、図５に示されている。組成既知の培地（＋）でのインキュベーション後のタンパク質を表すウエスタンブロット（図５Ａ）の第１のレーンでは、２本のタンパク質バンドが見える。上側のバンドは、無傷のタンパク質を表し、下側のバンドは、サンプル中の総タンパク質の約５％を構成するタンパク質のクリッピング版を表す。ＣＨＯ−Ｋ１野生型の馴化培地（ＷＴレーン）では、２４時間（Ｄ１）のインキュベーション後に強力に低減された量の無傷のタンパク質が存在する。４８時間（Ｄ２）後、タンパク質バンドは、ほとんど見えない、すなわち、ほとんどすべてのタンパク質がクリッピングされた。さらに、クリッピングされたタンパク質のタンパク質バンドは、完全に消失し、これは、タンパク質がさらに分解されたことを示唆する。対照的に、マトリプターゼノックアウトクローンＫＯ−１〜ＫＯ−３の馴化培地において２４時間または４８時間インキュベートされたタンパク質については、タンパク質バンドパターンの相違は見られない（１〜３を参照のこと）。したがって、マトリプターゼノックアウト細胞株から得られた馴化培地を用いると、治療用タンパク質のタンパク質分解性分解は検出されないか、または大幅に低減された。第２のウイルスタンパク質は、同等の結果を示す（図５Ｂ）。ここで、無傷のタンパク質は、レーン「（＋）」において単一タンパク質バンドによって表される。ＣＨＯ−Ｋ１由来野生型細胞の馴化培地における２４時間のインキュベーション後（ＷＴ、Ｄ１）には既に、無傷のタンパク質の痕跡は、ほとんど検出され得ない。代わりに、タンパク質のクリッピング版を表す２種のより低いタンパク質バンドが現れる。これらのタンパク質バンドはまた、マトリプターゼノックアウトクローンＫＯ−１〜ＫＯ−３から得られた培地を用いる実験においても見られる。しかし、ウイルスタンパク質の大部分は、すべての試験されたノックアウトクローンを用いて、４８時間のインキュベーション後でさえ保存される。
【０１５６】
上記の実験を確認して、上記のように、クリッピングの傾向がある５種のさらなるＦｃ融合タンパク質を用いるスパイクイン実験を実施した。１ｍＬのＨｉＴｒａｐ  ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  Ｓｕｒｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用するプロテインＡ親和性液体クロマトグラフィーによって、細胞不含回収上清が捕獲された。平衡化、ロードおよび洗浄のために、２分の滞留時間を適用した。溶出のために、４分の滞留時間を適用した。溶出液を１Ｍ  Ｔｒｉｓを用いてｐＨ５に滴定し、その後、Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＶシリンジフィルターユニット（０．２２μｍ、ＰＶＤＦ、１３分；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて滅菌濾過した。２８０ｎｍ波長でＮａｎｏＤｒｏｐ２０００分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してタンパク質濃度を決定した。すべてのステップを室温で実施した。表８は、質量分析による分析データを示す。見られるように、すべての試験されたＦｃ融合タンパク質は、親細胞において発現された場合には、完全にまたはほとんど完全にクリッピングされた。それとは対照的に、クリッピングは、ノックアウト細胞株において発現されている場合には、相当低減された。
【０１５７】
【表８】
0006636453.tif 000010
【０１５８】
これらの実施例は、内因性プロテアーゼマトリプターゼの機能が障害されている、本開示の変更された脊椎動物細胞は、機能的マトリプターゼを示さない、もしくは低減された量の機能的マトリプターゼを示す、または機能的マトリプターゼを細胞培養培地中に放出しない、もしくは低減された量の機能的マトリプターゼを細胞培養培地中に放出することを実証する。したがって、対象のポリペプチドを製造するためにこれらの変更された細胞を使用する場合には、細胞培養培地中に存在する（普通、分泌される）対象の組換えポリペプチドのタンパク質分解性分解は、大幅に低減される。
【０１５９】
２．Ａ．７．  マトリプターゼ変異体クローンΔ７／Δ１５から得た細胞上清を用いるスパイクイン実験
低減された機能的マトリプターゼ発現の効果を評価するために、Ｆｃ融合タンパク質およびモノクローナルＩｇＧ抗体（ｍＡｂ）を用いるスパイクイン実験を、Δ７／Δ１５クローンから得た馴化培地を用いて反復した。細胞培養物の馴化培地は、材料および方法の下に記載されたプロトコールに従って得た。スパイクイン実験のために、馴化培地に対象のポリペプチドを添加し、０．７μＭの最終濃度とし、５００ｒｐｍで連続振盪しながら３７℃でインキュベートした。Ｆｃ融合タンパク質は、２時間インキュベートし、ｍＡｂは、２４時間インキュベートした。インキュベーション後、馴化培地中の対象のポリペプチドのサンプルを、材料および方法の下に記載されたように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット解析によって分析した。
【０１６０】
Ｆｃ融合タンパク質を用いるスパイクイン実験の結果が、図６Ａに示されている。参照として、ウエスタンブロットの第１のレーンは、組成既知の培地におけるインキュベーション後のＦｃ融合タンパク質（「（＋）」によって示される）を示す。第２および第３のレーン（「ＷＴ１」および「ＷＴ２」）は、通常、修飾されていない機能的マトリプターゼを発現する、２種の異なるＣＨＯ−Ｋ１由来野生型細胞株から得た馴化培地においてインキュベートした後のＦｃ融合タンパク質を示す。上記で論じられたように、出発材料は、無傷のＦｃ融合タンパク質ならびに不純物としてクリッピングされたＦｃ融合タンパク質を含有していた。野生型マトリプターゼを有するＣＨＯ細胞から得た馴化培地を用いるインキュベーションに由来するタンパク質サンプル（「ＷＴ１」および「ＷＴ２」）では、基本的に、無傷のＦｃ融合タンパク質は観察されない。対照的に、マトリプターゼの機能的発現が大幅に低減されている（クローンの詳細に関しては、実施例２．４を参照のこと）Δ７／Δ１５細胞クローン（「Δ７／Δ１５」）から得られた馴化培地におけるインキュベーションでは、無傷のＦｃ融合タンパク質を表す強力なタンパク質バンドから結論付けられ得るようにクリッピングは大幅に低減される。
【０１６１】
図６Ｂは、対象のポリペプチドとしてＩｇＧ  ｍＡｂを用いるスパイクイン実験のウエスタンブロット解析を示す。参照として、ウエスタンブロットの第１のレーン（「（＋）」によって示される）は、組成既知の培地におけるインキュベーション後のｍＡｂを示す。無傷の抗体を表す１本の強力なタンパク質バンドが見える。第２および第３のレーン（「ＷＴ１」および「ＷＴ２」）は、修飾されていないマトリプターゼを発現する、２種の異なるＣＨＯ−Ｋ１由来野生型細胞株から得た馴化培地においてインキュベートした後のモノクローナル抗体を示す。この第２および第３のレーンでは、クリッピングされた抗体を表すより少ない分子量を有するさらなる強力なタンパク質バンドが現れる。シグナル強度によれば、５０％超の抗体が、クリッピングされるようである。細胞クローンΔ７／Δ１５から得た馴化培地においてインキュベートした後のｍＡｂを示す第４のレーン（「Δ７／Δ１５」）では、シグナルの強度が逆転している。したがって、クリッピングは完全に消滅してはいないが、マトリプターゼ野生型細胞クローンと比較して強力に低減される。この結果から、マトリプターゼの機能的発現を低減することは、細胞培養培地における対象のポリペプチドのクリッピングを大幅に低減することが確認される。
【０１６２】
これらの実験は、１種のマトリプターゼ対立遺伝子のみがノックアウトされており、機能的マトリプターゼ発現が低減されている細胞クローンを使用する場合にはまた、細胞培養培地における対象のポリペプチドのクリッピングの低減につながることを示す。したがって、クリッピング活性が機能的マトリプターゼ発現の程度に比例すると結論付けられ得る。
【０１６３】
Ｂ．  ＺＦＮ技術を用いて実施されるＫＯ
ＣＨＯ親細胞に基づいて１種のＺＦＮ（ＭＴ−ＳＰ１）ノックアウト細胞クローンを、ＺＦＮ（ジンクフィンガーヌクレアーゼ）技術を使用して作製した。ノックアウトのために、膜貫通ドメインのコーディング領域の前に位置する領域上のマトリプターゼエキソン２を標的とした（実施例２Ａに記載されるように）。
【０１６４】
２．Ｂ．１．  マトリプターゼのエキソン２に特異的であるＴＡＬＥＮの設計／製造および使用
マトリプターゼエキソン２を標的とする１対のＺＦＮを設計した。一方のＺＦＮは、１２のヌクレオチドを標的とし、これと結合し、もう一方のものは、１８のヌクレオチドを標的とする。２つの結合部位は、切断部位の５のヌクレオチドによって分離している。
【０１６５】
２．Ｂ．２．  ＴＡＬＥＮベクターのｉｎ−ｖｉｔｒｏ転写
ＺＦＮ  ｍＲＮＡを、ＺＦＮベクターのｉｎ−ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）によって製造した。ｍＲＮＡは、当業者に公知の手順を使用して作製した。キャッピングされたＩＶＴ産物を、ＮＨ４−Ａｃ沈殿を用いて精製し、生成したｍＲＮＡ（ポリＡテールおよび５’キャップを含有する）を、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｃｒｏキット（カタログ７４００４）を使用して精製した。
【０１６６】
２．Ｂ．３．  ＺＦＮ  ｍＲＮＡのトランスフェクション
９５％超の生存力を有する指数的増殖期にある親ＣＨＯ細胞を、トランスフェクションのために使用した。エレクトロポレーション（ヌクレオフェクション）を、Ａｍａｘａ（商標）、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙを、製造業者（Ｌｏｎｚａ）の使用説明書に従って使用して実施した。
【０１６７】
２．Ｂ．４．  Ｃｅｌ−Ｉ−アッセイおよびスクリーニング戦略
Ｃｅｌ−Ｉ−アッセイをＳＡＦＣ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓのマニュアルに従って実施し、実施例２Ａ．４に記載されるような同様のスクリーニングを実施した。
【０１６８】
両対立遺伝子中にフレームシフト変異を含むノックアウトクローンを得るために、２回のＺＦＮ  ｍＲＮＡトランスフェクションおよびクローニングラウンドを実施した。両対立遺伝子中にフレームシフト変異を含有する１種のマトリプターゼノックアウトクローン（ＫＯ−１０）を作製した（Δ１３／Δ１３）。
【０１６９】
２．Ｂ．５．  マトリプターゼ（ＭＴ−ＳＰ１）ノックアウトクローンから得た細胞上清を用いるスパイクイン実験
マトリプターゼノックアウトの効果を評価するために、スパイクイン実験を、両方ともクリッピングの傾向がある２種の異なる対象のポリペプチドを用いて実施した。ＣＨＯノックアウトクローンから細胞培養物の馴化培地を、材料および方法の下に記載されたプロトコールに従って得た。スパイクイン実験のために、馴化培地に対象のポリペプチド（１種のＦｃ融合タンパク質および１種組換え治療用タンパク質）を添加し、０．７μＭの最終濃度とし、５００ｒｐｍで連続振盪しながら３７℃でインキュベートした。インキュベーション時間は、試験される対象のポリペプチドの種類に応じて異なった。インキュベーション後、馴化培地中の対象のポリペプチドのサンプルを、材料および方法の下に記載されるように、ＳＤＳ  ｐａｇｅによって分析した。
【０１７０】
結果は、ＴＡＬＥＮ技術を用いて作製されたＫＯクローンを用いて実施したスパイクイン実験に対応している。実施例の節２．Ａ．６に記載されるようなＦｃ融合タンパク質および組換え治療用タンパク質を使用した。マトリプターゼノックアウトクローンを用いる実験では、無傷のタンパク質およびクリッピングされたタンパク質の量は、陽性対照（＋）においてインキュベートされた出発材料と同等であるが、変更されていないＣＨＯ−Ｋ１由来野生型細胞（ＷＴ）の馴化培地中でのインキュベーションは、無傷のタンパク質を完全に消滅させ、したがって、分解した。
【０１７１】
ＫＯクローンをまた、クリッピングの防止、それぞれの低減が、マトリプターゼ遺伝子がノックアウトされた変更された脊椎動物細胞の安定な特徴であるか否かを分析するために数ヶ月にわたって分析した。したがって、Ｆｃ融合タンパク質を用いるスパイクイン実験を、６ヶ月間培養されたマトリプターゼノックアウト細胞クローンから得られた馴化培地を用いて反復した。実験の結果から、ＫＯクローンを用いた場合、数ヶ月後でさえクリッピングが現れなかったことが確認された。さらに、ＫＯ細胞株が良好に増殖し、細胞成長が培養時間にわたって一層改善することが見出された。
【０１７２】
ＩＶ．実施例３：組換えタンパク質は、マトリプターゼによって直接切断される
マトリプターゼが、組換え発現され、分泌されたタンパク質（クリッピング標的）を直接的に切断することをさらに実証するために、市販のプロテアーゼ、すなわち、マウスＭＴ−ＳＰ１およびヒトＨｔｒａ１を使用した。モノクローナルＩｇＧ抗体ｍＡｂ（図７Ａ）、Ｆｃ融合タンパク質（図７Ｂ）およびさらなる組換えタンパク質（図７Ｃ）を、組成既知の培養培地に添加された２種のトリプシン様プロテアーゼ、マウスＭＴ−ＳＰ１およびヒトＨｔｒａ１とともに、それぞれ２４時間、２時間および１時間インキュベートした。５００ｒｐｍで連続振盪しながら、同時インキュベーションを３７℃で実施した。対象のポリペプチドを、各０．７μＭの濃度で使用した。各対象のポリペプチドを、漸減量のプロテアーゼＭＴ−ＳＰ１およびＨｔｒａ１を用いて試験した：左から右へのプロテアーゼ／対象のポリペプチドのモル比は、ＭＴ−ＳＰ１について１／１０、１／１００、１／１０００であり、Ｈｔｒａ１について１／３、１／１０および１／１００である。対照として、陰性対照としてＣＨＯ−Ｋ１野生型由来細胞から得た馴化培地（レーン「（−）」）および陽性対照として細胞と接触しなかった組成既知の培地（レーン「（＋）」）を用いて対象のポリペプチドのさらなるサンプルをインキュベートする。
【０１７３】
図７Ａ〜Ｃにおけるウエスタンブロットから、細胞培養培地に添加された組換えＨｔｒａ１が、試験された対象のポリペプチドを切断しないことが明らかである。より高いＨｔｒａ１濃度でさえ、タンパク質バンドは、陽性対照（「（＋）」）においてと正確に同様であるように見える。対照的に、最低濃度でＭＴ−ＳＰ１が添加されても、すべての対象の組換えポリペプチドは大幅にクリッピングされた。タンパク質バンドは、陰性対照（「−」）のものと似ているか、または一層悪かった。したがって、ＭＴ−ＳＰ１が添加された場合には、試験されたすべての条件下で大幅な程度のクリッピングが生じた。
【０１７４】
Ｆｃ融合タンパク質を用いる実験では、プロテアーゼＭＴ−ＳＰ１の濃度依存性効果が観察された（図７Ｂ）。最低濃度のマトリプターゼ／ＭＴ−ＳＰ１で、約８５ｋＤａの無傷のＦｃ融合タンパク質のタンパク質バンドは、陽性対照との比較でわずかにのみ低減されるが、より高い濃度のＭＴ−ＳＰ１では、およそ８５ｋＤａのタンパク質バンドは、完全に消失する。結果として、Ｆｃ融合タンパク質のクリッピングの程度は、細胞培養培地中のマトリプターゼ／ＭＴ−ＳＰ１の濃度と相関する。
【０１７５】
この実施例において使用される市販のマウスＭＴ−ＳＰ１によって誘導されるクリッピング部位を決定するために、ＭＴ−ＳＰ１濃度１／１００を用いた抗体サンプル（ｍＡｂ）を、質量分析に付した。同定されたクリッピング部位は、ｍＡｂが野生型ＣＨＯ細胞株によって製造された場合と同一であった。これは、ｍＡｂ上のマウスマトリプターゼのクリッピング部位が、ＣＨＯ細胞においてｍＡｂを製造する場合にクリッピングに関与するプロテアーゼのクリッピング部位と同一であること示す。これらの結果から、マトリプターゼがクリッピングプロテアーゼであることがさらに確認される。
【０１７６】
Ｖ．実施例４：選択的マトリプターゼ阻害剤によるマトリプターゼクリッピング作用の阻害
対象の組換えポリペプチドのクリッピングが、クリッピングに関与する重要なプロテアーゼとしてマトリプターゼによって引き起こされることをさらに確認するために、ヒトマトリプターゼ／ＭＴ−ＳＰ１を特異的に阻害する特異的抗ＭＴ−ＳＰ１  Ｆａｂ断片を用いて、スパイクイン実験を実施した。ヒトＭＴ−ＳＰ１での阻害性Ｆａｂ構造および結合詳細は、Farady et al., 2008 J. Mol. Biol. (2008) 380, 351-360)に公開されている。
【０１７７】
クリッピング標的として対象の治療用ポリペプチドは、この場合には、モノクローナルＩｇＧ抗体（ｍＡｂ）および２種の糖変異体を有する組換え非抗体糖タンパク質とした。対象のポリペプチドを各場合において０．７μＭの濃度で添加した。表９は、ｍＡｂ（図８、上のパネル）および組換えタンパク質（図８、下のパネル）の図８に示されるウエスタンブロット結果に対応する実験設定のさらなる詳細を記載する：
【０１７８】
【表９】
0006636453.tif 000011
【０１７９】
馴化培地を、材料および方法の下で記載されたように調製した。インキュベーション時間は、モノクローナルＩｇＧ抗体の場合には２４時間とし、組換え非抗体タンパク質については１時間とした。
【０１８０】
図８（上のパネルを参照のこと）は、無傷のｍＡｂの強力なタンパク質バンドが陽性対照（＋）において存在することを示す（レーン２を参照のこと）。クリッピングされたｍＡｂは、観察されない。陰性対照（−）では（レーン３および８を参照のこと）では、より高い強度の第２のタンパク質バンドは、無傷のタンパク質よりもわずかに低く現れ、これは、モノクローナル抗体が、ＣＨＯ−Ｋ１由来野生型細胞の馴化培地において大幅にクリッピングされることを示す。無傷のおよびクリッピングされたｍＡｂは、矢印で印がつけられている。マウスＭＴ−ＳＰ１が添加された組成既知の培地において、陰性対照（−）においてと同一パターンが見られる（レーン４を参照のこと）。組換え非抗体タンパク質に関しては（図８、下のパネルを参照のこと）、陽性対照（＋）において（レーン２を参照のこと）、約３７ｋＤａに２種の無傷のタンパク質糖変異体の強力なバンドが見られる。陽性対照において見られる無傷のタンパク質糖変異体のそれらのタンパク質バンドは、陰性対照（−）では消失し、クリッピングされたタンパク質糖変異体の新規タンパク質バンドが現れた（レーン３および８を参照のこと）。
【０１８１】
抗ＭＴ−ＳＰ１  Ｆａｂの存在下でインキュベートされたサンプルに関して、マウスＭＴ−ＳＰ１によるｍＡｂの分解を完全に消滅させるのに、既に１μＭのＦａｂで十分であった（図８、上のパネル、レーン５）。１μＭの抗ＭＴ−ＳＰ１  Ｆａｂはまた、馴化培地においてｍＡｂのクリッピングを低減したが、完全に防止できなかった（上のパネル、レーン９を参照のこと）。ｍＡｂのクリッピングは、１０μＭおよび５０μＭのＦａｂ濃度で馴化培地において消滅された（図８、上のパネル、レーン１０および１１）。組成既知の培地において組換えマウスＭＴ−ＳＰ１とともにインキュベートされた組換えタンパク質について、既に１μＭ  Ｆａｂの濃度でクリッピングが低減された（図８、下のパネル、レーン５を参照のこと）。クリッピングのさらなる低減は、組換えマウスＭＴ−ＳＰ１が添加された組成既知の培地において、ならびに馴化培地において、１０μＭ  Ｆａｂで見られ、５０μＭ  Ｆａｂを用いてクリッピングの完全な停止が見られた（図８、下のパネル、レーン６、７ならびに１０および１１を参照のこと）。したがって、ヒトマトリプターゼに対して作製されたＦａｂはまた、マウスならびにハムスターマトリプターゼを効率的に阻害した。しかし、マウスおよびハムスターマトリプターゼの完全な阻害を見るには、より高い濃度が必要であった。これは、エピトープ結合部位内のヒトと、マウスおよびハムスターマトリプターゼ間のアミノ酸の相違に起因すると推測され、その結果、ヒトマトリプターゼに対する阻害性Ｆａｂは、マウスおよびハムスターマトリプターゼに対してはあまり強力ではなく、その結果、それらを阻害するにはより高い濃度のＦａｂが必要である。
【０１８２】
ＶＩ．実施例５：マトリプターゼノックアウト細胞株におけるタンパク質製造
スパイクイン実験の結果を確認するために、流加培養法においてマトリプターゼノックアウト細胞クローン中でいくつかの対象のポリペプチドを発現させ、発現され、分泌された対象のポリペプチドのクリッピングを分析し、無傷のマトリプターゼを内因性に発現する対応するＣＨＯ野生型細胞株を用いて得られた結果と比較した。
【０１８３】
５．１．  ｍＡｂコーディングベクターのトランスフェクション
マトリプターゼを発現するＣＨＯ野生型細胞株（ＣＨＯ−Ｋ１に由来する）およびマトリプターゼノックアウトＣＨＯ細胞クローン４（ＫＯ−４、表５を参照のこと）を、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）および２種の選択マーカー遺伝子、すなわち、ｎｅｏおよびＤＨＦＲをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを用いてトランスフェクトした。トランスフェクションのために、細胞を指数増殖期に増殖させ、３μｇのベクターＤＮＡを用いて５×１０６個の細胞をトランスフェクトした。野生型細胞株を使用して５回のトランスフェクション反復を実施し、ＫＯ−４細胞株を使用して４回のトランスフェクション反復を実施した。対象のタンパク質をコードするベクターを用いて安定にトランスフェクトされた細胞の選択を、Ｇ４１８（Ｇ４１８濃度０．８ｍｇ／ｍｌ）と、それに続くＭＴＸ選択の２回の連続ステップ（５００ｎＭおよび１μＭ  ＭＴＸ）を用いて実施した。選択条件は、すべてのプールおよび両細胞株について同一とした。選択の最後に（細胞生存力＞９５％）細胞を凍結した。選択プロセスの間に、培地中の発現されたｍＡｂの力価を決定した。マトリプターゼノックアウト細胞の上清中の力価を、ＣＨＯ野生型細胞の力価と比較した。結果は、マトリプターゼノックアウトが、細胞の製造能力に対して陰性効果を有さず、力価を増大する傾向さえ有していることを実証した。
【０１８４】
５．２．  流加製造手順
流加製造のために、マトリプターゼノックアウトクローンＫＯ−４の４つのプールすべておよび最高抗体力価を有する３つのＣＨＯ野生型細胞株プールを選択した。７つのプールの凍結細胞を同時に解凍し、１回継代し、その後、個々の流加リアクター中に播種した。
【０１８５】
細胞を、アミノ酸、ビタミンおよび微量元素を濃縮した組成既知の培地（流加培地）を含有する流加シェーカー中で培養した。流加培養法を、３７℃の温度で、振盪して実施した。流加培養法の間に、グルコースおよびアミノ酸を含有する供給物（流加供給物）をプロセスに沿って定期的に添加した。流加培養法プロセスの間に、流加培養材料のサンプルを定期的に集めて、Ｖｉ−Ｃｅｌｌ細胞生存力分析器（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して生細胞密度（ｖｃｄ）を決定し、細胞培養培地におけるタンパク質力価を決定した。流加の最後に（１３または１４日）、培養プロセスを停止させた。振盪フラスコ（１００ｍｌ培養物）から馴化培地を回収し、０．２２μｍ  Ｓｔｅｒｉｆｌｉｐフィルターを使用して濾過した。濾過された馴化培地からプロテインＡ親和性液体クロマトグラフィー（プロテインＡ  Ｍｉｎｉ  Ｃｏｌｕｍｎｓ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、カタログＰＵＲ００８）を使用してモノクローナル抗体を精製した。精製は、ベンダーのプロトコールを使用して実施した。プロテインＡ精製後のサンプルのタンパク質濃度を、ＮａｎｏＤｒｏｐ（商標）システム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をベンダーのプロトコールに従って使用して決定した。流加培養物の分析は、１４日の培養期間にわたって、ＫＯ−４プールの培養培地中の発現されたｍＡｂの力価が、ＣＨＯ野生型細胞プールの培養培地物中と同様であるか、または高いことを示した。さらに、細胞生存力は、ＫＯ−４細胞プールについて同様またはより高かった。ＫＯ細胞はまた、同様またはさらに良好な細胞密度で増殖した。これらの結果は、マトリプターゼノックアウトは、タンパク質発現速度に負に影響を及ぼさず、それを増強する可能性があることを示す。さらに、細胞成長は、負に影響を及ぼされなかったが、さらに改善される可能性がある。
【０１８６】
５．３．  クリッピング分析
クリッピング分析のために、２つの並行するアプローチを使用した：マイクロチップ電気泳動（ＭＥ）−ＳＤＳおよび質量分析
【０１８７】
マイクロチップ電気泳動
サンプル調製のために、５μＬの精製タンパク質を使用する。サンプルの濃度に応じて、タンパク質の量が異なる。還元マイクロチップアッセイのサンプル調製のために、５μＬを、３５μＬの還元サンプルバッファーと混合する。次いで、混合溶液を、７０℃で、ヒートブロック中で１５分間インキュベートする。冷却した後、７０μＬのＭｉｌｌｉＱ水を添加し、最終容量を１１０μＬとした。ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ製のＬａｂＣｈｉｐ（登録商標）ＧＸ  ＩＩ機器をシステムとして使用した。使用されるプロトコールは、ベンダーのプロトコールを改定版である。主な相違は、サンプル／還元サンプルバッファーの割合であり、良好な変性のためには、ベンダーのプロトコールにおける１：３．５の代わりに、本プロトコールでは１：７である。
【０１８８】
図９は、マイクロチップ電気泳動の結果を示す。左から最初の３レーン（ＷＴ１、２および３と同定される）は、ＣＨＯ野生型細胞プールを用いる３回の製造から得られた、プロテインＡ精製された細胞培養物のタンパク質サンプル組成を表す。各サンプルにおいて、同一タンパク質バンドパターンが観察される。モノクローナル抗体の無傷の重鎖（ＨＣ）を表す広いタンパク質バンドが、観察された（Ｌａｂｃｈｉｐアッセイから得たサイズは、正確ではなく、通常、大きく推定される）。このタンパク質バンドのすぐ下に、クリッピングされた重鎖を表す第２のより薄いタンパク質バンドが観察される。クリッピングされたＨＣ種は、非グリコシル化ＨＣと同時に移動する。さらに、軽鎖を表す第３のタンパク質バンドが、約２９ｋＤａに観察される。マトリプターゼノックアウト細胞プール（ＫＯ−４  １、２、３および４と同定される）において製造されたモノクローナル抗体のタンパク質サンプルでは、無傷の重鎖の、および軽鎖のタンパク質バンドの両方が、ＣＨＯ野生型細胞株によって製造されたサンプルにおいて見られるタンパク質バンドと比べて強くなければ少なくとも同等である。しかし、図９の上から２番目の矢印によって同定されるクリッピングされた重鎖のバンドは、４種の抗体サンプルＫＯ４−１、ＫＯ４−２、ＫＯ４−３およびＫＯ４−４のすべてにおいて見るのが困難である。これは、ｍＡｂのクリッピングは、マトリプターゼノックアウト細胞株において製造されている場合にはほとんど消滅することを実証する。
【０１８９】
結果を定量化するために、クリッピングされた抗体重鎖および無傷の抗体重鎖のタンパク質バンドの強度を決定し、これから、クリッピングのパーセンテージを算出した。この分析の結果が、表１０にまとめられている。モノクローナル抗体のクリッピングの量は、製造細胞株としてマトリプターゼノックアウトクローンを使用する場合に著しく低減されることを示す。分析によれば、３つのＣＨＯ野生型細胞プールによって製造されたモノクローナル抗体重鎖のうち平均して１６．１％がクリッピングされた。対照的に、４つのマトリプターゼノックアウト流加培養法において製造されたｍＡｂ  ＨＣについては、平均して１％以下のみのクリッピングが起こった。非グリコシル化ＨＣの同時移動のために、ＬａｂＣｈｉｐ（登録商標）分析に基づいては、正確な値を決定することができない。
【０１９０】
【表１０】
0006636453.tif 000012
【０１９１】
したがって、マイクロチップ電気泳動を使用すると、マトリプターゼＫＯ細胞によって発現されたｍＡｂにおいてわずか１％以下のクリッピングが検出されるが、同一ｍＡｂを発現するＷＴ細胞では１２％〜２０％のクリッピングが検出される（ＨＣにおいて検出されるクリッピング）。
【０１９２】
質量分析による分析
質量分析による分析に先立って、サンプルを脱グリコシル化し、還元した。７種のプロテインＡ精製したタンパク質サンプルの各々から、５０μｇの総タンパク質を有するアリコートを、３７℃で、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ７．５中、０．３ｍｇ／ｍｌの濃度の１．２５μｌのＰＮＧａｓｅ  Ｆとともに一晩インキュベートした。サンプルの最終濃度は、約０．５ｍｇ／ｍｌとした。脱グリコシル化後、８８μｌのＰＮＧａｓｅ  Ｆ消化したサンプルを、１１２μｌの還元バッファー（８Ｍ  ＧｕＨＣｌ、１０μｌの１Ｍ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ７．５および２μｌの１Ｍ  ＤＴＴ）を添加し、３７℃で１時間インキュベートすることによって還元した。還元は、２μｌの１０％トリフルオロ酢酸を添加することによってクエンチした。
【０１９３】
２０２μｌの総容量および約０．２２ｍｇ／ｍｌのタンパク質の濃度を有するそのように得られたサンプルを、次いで、組み合わされた液体クロマトグラフィーおよび質量分析による分析に使用した。ＬＣ／ＭＳ機器は、ＵＰＬＣと一体となったＷａｔｅｒｓ  Ｓｙｎａｐｔ  Ｇ２システム（ソフトウェア：ＭａｓｓＬｙｎｘ  ４．１）とした。ＬＣ法は、０．２ｍＬ／分の流速およびバッファーＭＰＡ（水中、０．１％ＴＦＡ）およびＭＰＢ（アセトニトリル中、０．０９％ＴＦＡ）を使用した。ＵＶ検出は、２１４ｎｍおよび２８０ｎｍで実施した。サンプル温度は、約５℃とした。１４μｌの脱グリコシル化され、還元されたサンプル（タンパク質量３μｇ）をＢＥＨ  Ｃ４  １．７μｍ、２．１×１００ｍｍカラム（Ｗａｔｅｒｓ）にロードした。カラム温度は、８０℃とした。サンプルローディングに先立って、バッファーＭＰＡを用いてカラムを平衡化した。溶出はバッファーＭＰＢを用いて実施した。
【０１９４】
溶出したタンパク質を次いで、質量分析によってさらに分析した。ＬＣ／ＭＳデータを使用して、クリッピング部位を同定し、クリッピングされた種のパーセンテージを定量化した。表１１は、各タンパク質サンプルにおけるＬＣ／ＭＳアッセイに基づくクリッピングされた抗体重鎖のパーセンテージを示す。野生型サンプルでは、２０〜２９％のクリッピングが観察されたが、製造にマトリプターゼノックアウト細胞を使用した場合には抗体重鎖の２％以下しかクリッピングされなかった。ＵＶ２１４ｎｍデータに基づいて算出された結果は、還元ＬａｂＣｈｉｐアッセイから得られたもの（表１０を参照のこと）と比較してわずかに高かった。しかし、本開示の教示を適応した場合に達成されるクリッピングの強力な低減が再度確認される。ＬＣ／ＭＳ結果は、マトリプターゼノックアウト細胞株において製造されたｍＡｂのクリッピングの１５倍減少を実証する。クリッピング部位の分析は、マトリプターゼノックアウト細胞において製造されたｍＡｂ重鎖が、ＣＨＯ野生型細胞株において製造されたｍＡｂ  ＨＣと同一部位でクリッピングされることを示した。タンパク質モデリングは、クリッピング部位は、細胞培養培地に対して露出しているｍＡｂの極めてフレキシブルな領域中に位置することをさらに示した。したがって、このクリッピング部位に対して低い親和性を有するプロテアーゼでさえ、容易に到達し、それを切断できる。これらの知見は、マトリプターゼノックアウト株における残存するクリッピング事象を説明し得る。
【０１９５】
【表１１】
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【０１９６】
５．４．  ＷＴおよびＫＯ−４の、さらなる糖タンパク質を用いるトランスフェクション
導入されたマトリプターゼノックアウトが、組換え糖タンパク質の製造レベルおよび製品品質に負に影響を及ぼさないことを再度実証するために、さらなる実施例を実施した。抗体（ここでは、Ｆｃ融合タンパク質ならびに１種の組換え治療用タンパク質）とは異なる、２種の糖タンパク質を発現させた。マトリプターゼノックアウト細胞株ＫＯ−４およびクローンＫＯ−４が由来するＣＨＯ野生型細胞株を、適した発現ベクターを用いてトランスフェクトした。トランスフェクションおよび選択後、力価およびタンパク質分析（例えば、章５．３において上記に記載されるように）を実施した。
【０１９７】
マトリプターゼＫＯ細胞株ＫＯ−４によって達成されるタンパク質力価は、クローンＫＯ−４が由来する対応するＷＴ細胞株においてと同一範囲内にあるか、またはより高かった。（表１２も参照のこと）。クリッピングは、ＷＴ細胞から得られたＦｃ融合タンパク質などのタンパク質に対して、ＫＯ細胞から得られたＦｃ融合タンパク質などのタンパク質において、やはり大幅に低減された（表１３も参照のこと）。これは、マトリプターゼ遺伝子のＫＯが、種々のさらなるポリペプチドのタンパク質分解性分解を低減したことを明確に示す。
【０１９８】
【表１２】
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【０１９９】
【表１３】
0006636453.tif 000015
【０２００】
概して、マトリプターゼＫＯ細胞株は、糖タンパク質の製造について、同様の、または一層改善された特徴を示した。したがって、それぞれの細胞株は、タンパク質分解感受性ポリペプチドの製造に、ならびにタンパク質分解非感受性ポリペプチドの製造に適している。したがって、種々の対象のポリペプチドの製造を単純化する汎用性細胞株が提供される。
【０２０１】
ＶＩＩ．実施例６：上流プロセス適合性およびバイオリアクタースケールアップ
マトリプターゼノックアウト細胞株の、大規模治療用製造のためにスケールアップされる適合性を示すために、２種の異なるマトリプターゼＫＯアプローチ（ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮ技術）から導かれた１２種の親クローンを、３段階スクリーニングアプローチで評価した。比較のためにＣＨＯ野生型細胞株を使用した。
【０２０２】
６．１．  親クローン性能の評価
６．１．１．  細胞増殖の間の親クローン性能の比較
大規模製造のための増殖の間の、１２種のトランスフェクトされていないＫＯクローン（７種のＺＦＮサブクローン（実施例２ｂに記載されたＺＦＮ  ＫＯクローンの単細胞選別によって作製した）および５種のＴＡＬＥＮ由来）および比較物野生型細胞株の性能を評価するために、必須ビタミンの濃度が異なる２種の細胞培養増殖培地を使用して振盪フラスコ中で種系列を評価した。したがって、クローンを両方の増殖培地に、規定の生細胞密度で播種し、３６．５℃で４日間培養した。クローンを、表１４に記載されるように、最終生細胞密度、平均成長速度について分析した。製造段階培地（章６．１．２）を使用する親クローンの適合性評価から得られた結果とともに、製造能力に関するさらなる比較のために７種の最良の性能を発揮するクローンを選択した（章６．２を参照のこと）。
【０２０３】
【表１４】
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【０２０４】
６．１．２．  製造条件下での親クローン性能の比較
１２種の親クローンおよび参照野生型細胞株を、振盪フラスコ流加製造プロセスにおいてさらに比較した。章６．１．１．に記載された増殖研究から得た細胞を、２種の異なる培養条件（２種の異なる組成既知の製造培地、播種細胞密度および供給計画）を使用して、３６．５℃で１４日間培養した。予め規定したプロファイルでプロセスを通じて２種の独立した供給溶液を用いて供給を実施し、温度シフトを適用した。細胞密度、生存力および重要な代謝産物を毎日モニタリングし、製造に対する適合性に関して、ＷＴクローンに対してＫＯクローンを比較するために使用した。野生型細胞株と同様またはそれより優れた成長性能に達した７種のクローンを同定したが、代謝産物プロファイルは同等であった。
【０２０５】
６．２．  トランスフェクトされたプールの振盪フラスコスクリーニング
章６．１において同定されたような最良の７種の親クローンおよびＣＨＯ野生型を、野生型細胞株のバックグラウンドにおいてタンパク質分解性分解に対して感受性であると見出されている対象のポリペプチドとして、モノクローナルＩｇＧ抗体を用いて３連でトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を、振盪フラスコ培養および章６．１．２に記載されるような２種の異なる条件を使用して評価した。培養の間、細胞成長（生細胞密度、細胞生存力）および産物形成をモニタリングした。ＴＡＬＥＮノックアウトアプローチから導かれた細胞は、ＣＨＯ野生型細胞と比較して、同様の、または増大した細胞成長を示し、そのため、ＺＦＮ由来プールは、ＴＡＬＥＮ由来プールと比較して、指数的増殖相の間にわずかに低い細胞成長を示した。しかし、培養の最後での細胞生存力は、すべてのクローンについて同等であった。培養の最後での容積生産性は、ＣＨＯ野生型プールの生産性と比較して、ＴＡＬＥＮについては、平均で１９％高く、ジンクフィンガーヌクレアーゼプールについては９％高かった。
【０２０６】
培養の最後（１４日目）で、モノクローナルＩｇＧ抗体を完全性について分析した。したがって、遠心分離によって上清を回収し、滅菌濾過した。上清からモノクローナルＩｇＧ抗体を捕獲し、タンパク質分解性分解についてＣＥ−ＳＤＳ（キャピラリー電気泳動−ドデシル硫酸ナトリウム）によって分析し、ＣＥＣ（陽イオン交換クロマトグラフィー）によって分析して、電荷変異体分布を評価した。ノックアウトクローンに由来するすべてのプールは、約１％という同様に低いレベルのポリペプチドクリッピングの示したのに対し、ＣＨＯ野生型に由来する産物は、およそ２１％で切断された。
【０２０７】
６．３．  親サブクローンおよびトランスフェクトされたプールのバイオリアクタースクリーニング
章６．１．および６．２．において同定されるような４種の最良の性能を発揮する親クローンおよびトランスフェクトされたプールを、７Ｌのガラスバイオリアクターの制御された培養条件を使用する徹底的な特徴決定のために選択した。培養プロセスは、本質的に章６．１．２．に記載されるとおりであるが、章６．２において同定されるような唯一の好ましい培養条件を使用した。トランスフェクトされていない親クローンと比較して、トランスフェクトされたプールについてわずかに低い成長が見られ、これは、ポリペプチド発現によって引き起こされる代謝負荷によるとされる公知の現象である。しかし、ＷＴ細胞株と比較して細胞成長挙動に大きな相違はないと見出された。乳酸塩およびアンモニウムなどの代謝産物は、一般的な範囲内にあり、野生型細胞株と同様である。
【０２０８】
製品品質を、ＳＥＣ、ＣＥＣおよびＣＥ−ＳＤＳによって純度について、ならびに独占所有権のある方法によってＮ−グリコシル化について分析的に評価した。結果は、すべてのＫＯクローンは、凝集および分解生成物、電荷変異体分布およびグリコシル化パターンの点で同等の製品品質に達することを示した。ＣＥ−ＳＤＳ還元結果は、すべてのＫＯサブクローンについてクリッピングされた種が０．７％の低レベルで存在することを示した。すべてのＫＯクローンは、参照野生型細胞株と比較して、同様または好ましい成長特徴を示すだけでなく、一貫して良好な品質のポリペプチドを製造した。
本発明は、以下の態様を包含し得る。
［１］
対象のポリペプチドの組換え発現に適している単離された脊椎動物細胞であって、前記脊椎動物細胞は、マトリプターゼの効果を障害し、対象のポリペプチドをコードする少なくとも１種の異種ポリヌクレオチドを含むように変更されており、前記脊椎動物細胞は、前記対象のポリペプチドを分泌する、単離された脊椎動物細胞。
［２］
前記細胞において前記マトリプターゼ遺伝子の機能的発現が低減または排除されるので、前記マトリプターゼの効果が障害される、上記［１］に記載の単離された脊椎動物細胞。
［３］
前記マトリプターゼ遺伝子の機能的発現が、遺伝子ノックアウト、遺伝子変異、遺伝子欠失、遺伝子サイレンシングまたは前述のいずれかの組合せによって低減または排除される、上記［２］に記載の単離された脊椎動物細胞。
［４］
前記脊椎動物細胞のゲノムが、内因性プロテアーゼマトリプターゼの機能を障害するように変更される、上記［１］から［３］のうち１項または複数項に記載の単離された脊椎動物細胞。
［５］
前記マトリプターゼ遺伝子の少なくとも１つまたはすべてのコピーが、欠失するか、または機能的に不活性化される、上記［１］から［４］のうち１項または複数項に記載の単離された細胞。
［６］
以下の特徴
ａ）前記脊椎動物細胞が、非機能的なもしくはあまり機能的でない発現産物を提供するように、前記マトリプターゼ遺伝子の少なくとも１つのコピーもしくはすべてのコピー中に１つもしくは複数の変異を含む、および／または
ｂ）前記脊椎動物細胞が、前記マトリプターゼ遺伝子のプロモーター中、５'ＵＴＲ、３'ＵＴＲおよび／もしくはその他の調節エレメント中に１つまたは複数の変異を含む
のうち１つまたは複数を有する、上記［４］または［５］に記載の単離された脊椎動物細胞。
［７］
前記１つまたは複数の変異が、前記マトリプターゼ遺伝子のコーディング領域中に含まれ、非機能的なまたはあまり機能的でない発現産物をもたらす、上記［６］に記載の単離された脊椎動物細胞。
［８］
前記１つまたは複数の変異が、マトリプターゼのエキソン２をコードするマトリプターゼ遺伝子のポリヌクレオチド配列中に含まれるか、または前記１つまたは複数の変異が、マトリプターゼの触媒ドメインの少なくとも一部をコードする、前記マトリプターゼ遺伝子のポリヌクレオチド配列中に含まれ、それによって非機能的なまたはあまり機能的でない発現産物が得られる、上記［７］に記載の単離された脊椎動物細胞。
［９］
変更されていない内因性マトリプターゼが、マトリプターゼ参照タンパク質として配列番号１〜５に示されるアミノ酸配列のうち１種または複数に対して、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を共有し、前記マトリプターゼ参照タンパク質と同一のタンパク質分解性活性を有する、上記［１］から［８］のうち１項または複数項に記載の単離された脊椎動物細胞。
［１０］
前記脊椎動物細胞が、哺乳動物細胞である、上記［１］から［９］のうち１項または複数項に記載の単離された脊椎動物細胞。
［１１］
前記哺乳動物細胞が、以下の特徴：
ａ）前記哺乳動物細胞がヒト細胞である、
ｂ）前記哺乳動物細胞がげっ歯類細胞である、
ｃ）前記哺乳動物細胞がハムスター細胞、好ましくは、ＣＨＯ細胞である、および／または
ｄ）前記哺乳動物細胞が細胞クローンまたは細胞株として提供される
のうち１つまたは複数を有する、上記［１０］に記載の単離された脊椎動物細胞。
［１２］
前記脊椎動物細胞が、前記マトリプターゼ遺伝子の一方、または両方の対立遺伝子のエキソン２中に１つまたは複数のフレームシフト変異を含むＣＨＯ細胞である、上記［１］に記載の単離された脊椎動物細胞。
［１３］
前記対象のポリペプチドが、以下の特徴：
ａ）それが治療上活性のあるまたは診断用のポリペプチドである、
ｂ）それがプロテアーゼによるクリッピングに対して感受性である、
ｃ）それがマトリプターゼの少なくとも１つのクリッピング部位を含む、
ｄ）それがグリコポリペプチドである、および／または
ｅ）それが糖タンパク質、抗体、非ＩｇＧタンパク質、Ｆｃ融合タンパク質、Ｆａｂ断片、タンパク質複合体、ペプチダーゼ、シグナルペプチド、ナノボディ、増殖因子、ホルモン、サイトカイン、血液因子および酵素からなる群から選択される
のうち１つまたは複数を有する、上記［１］から［１２］のうち１項または複数項に記載の単離された脊椎動物細胞。
［１４］
前記対象のポリペプチドをコードする前記少なくとも１種の異種ポリヌクレオチドが、前記細胞の前記ゲノム中に組み込まれており、任意選択で、選択マーカーまたはレポーターポリペプチドをコードする少なくとも１種の異種ポリヌクレオチドが、前記細胞の前記ゲノム中にさらに組み込まれている、上記［１］から［１３］のうち１項または複数項に記載の単離された脊椎動物細胞。
［１５］
上記［１］から［１４］のうち１項または複数項に記載の脊椎動物細胞を製造するための方法であって、脊椎動物細胞をマトリプターゼの効果を障害するように変更する段階と、対象のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを導入する段階とを含み、前記対象のポリペプチドが、前記脊椎動物細胞によって分泌される、方法。
［１６］
対象のポリペプチドを組換えによって製造するための方法であって、
（ａ）前記対象のポリペプチドの発現および細胞培養培地への分泌を可能にする条件下で、上記［１］から［１４］のうち１項または複数項に記載の脊椎動物宿主細胞を培養する段階と、
（ｂ）前記細胞培養培地から前記対象のポリペプチドを単離する段階と、
（ｃ）任意選択で、前記単離された対象のポリペプチドをプロセシングする段階と
を含む、方法。
［１７］
対象のポリペプチドを組換えによって製造するための方法であって、
（ａ）対象のポリペプチドの発現および細胞培養培地への分泌を可能にする条件下で、対象のポリペプチドをコードする少なくとも１種の異種ポリヌクレオチドを含む脊椎動物宿主細胞を培養する段階であって、前記細胞培養培地がマトリプターゼに対して選択的であるプロテアーゼ阻害剤を含む、段階と、
（ｂ）前記細胞培養培地から前記対象のポリペプチドを単離する段階と、
（ｃ）任意選択で、前記単離された対象のポリペプチドをプロセシングする段階と
を含む、方法。
［１８］
対象のポリペプチドを組換え発現する宿主細胞を選択するための方法であって、
（ａ）宿主細胞として上記［１］から［１４］のうち１項または複数項に記載の脊椎動物細胞を提供する段階と、
（ｂ）前記対象のポリペプチドを発現する１種または複数の宿主細胞を選択する段階と
を含む、方法。
［１９］
段階（ａ）が、対象のポリペプチドをコードする少なくとも１種のポリヌクレオチドを用いて、内因性プロテアーゼマトリプターゼの機能が障害されている脊椎動物細胞をトランスフェクトして、上記［１］から［１４］のうち１項または複数項に記載の脊椎動物宿主細胞を提供する段階を含む、上記［１８］に記載の方法。
［２０］
以下の特徴
ａ）前記脊椎動物細胞が哺乳動物細胞である、
ｂ）段階（ａ）において提供される前記宿主細胞が、選択マーカーをコードする少なくとも１種の異種ポリヌクレオチドをさらに含み、段階（ｂ）が、前記選択マーカーに対して選択的な条件下で前記複数の宿主細胞を培養することを含む、
ｃ）ポリヌクレオチドが、１種もしくは複数の発現ベクターをトランスフェクトすることによって前記脊椎動物細胞中に導入される、
ｄ）段階（ｂ）が、１つもしくは複数の選択ステップを含む、および／または
ｅ）段階（ｂ）が、フローサイトメトリーベースの選択を実施することを含む
のうち１つまたは複数を有する、上記［１８］または［１９］に記載の方法。
［２１］
脊椎動物細胞から分泌される対象のポリペプチドの組換え製造のための前記脊椎動物細胞の使用であって、前記使用される細胞が、内因性プロテアーゼマトリプターゼの効果を障害するように変更される、使用。
［２２］
前記脊椎動物細胞が、上記［１］から［１４］のうち１項または複数項に記載の１つまたは複数の特徴を有する、上記［２１］に記載の使用。
［２３］
対象のポリペプチドの組換え製造のための脊椎動物細胞を選択するための方法であって、内因性プロテアーゼマトリプターゼが、前記脊椎動物細胞において機能的に発現されるか否かを分析する段階と、前記対象のポリペプチドの組換え製造のために、このような内因性マトリプターゼの効果が障害されている脊椎動物細胞を選択する段階を含む、方法。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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