(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
血管新生療法を実施した重症虚血肢患者の治療効果の評価方法であって、
前記評価方法が、
重症虚血肢患者の血液中のＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度を測定する測定工程、
測定したＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度の経時変化を指標として治療効果を評価する評価工程、
を含み、
前記評価工程が、血管新生療法を実施した後にＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度が血管新生療法を実施する前より一度上昇し、その後血管新生療法を実施する前より減少した場合に治療効果ありと評価する、
評価方法。
【請求項２】
血管新生療法を実施した重症虚血肢患者の治療効果の評価方法であって、
前記評価方法が、
重症虚血肢患者の血液中のＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度を測定する測定工程、
測定したＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度の経時変化を指標として治療効果を評価する評価工程、
を含み、
前記評価工程が、血管新生療法を実施する前のＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度と比較して、血管新生療法を実施し所定期間経過後のＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度の減少率が大きいほど、治療効果が高いと評価する、
評価方法。
【請求項３】
前記評価工程が、血管新生療法を実施した後にＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度が血管新生療法を実施する前より一度上昇し、その後血管新生療法を実施する前より減少した場合に治療効果ありと評価する、
請求項２に記載の評価方法。
【請求項４】
血管新生療法を実施した重症虚血肢患者の治療効果の評価方法であって、
前記評価方法が、
重症虚血肢患者の血液中のＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度を測定する測定工程、
測定したＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度の経時変化を指標として治療効果を評価する評価工程、
を含み、
前記測定工程が、重症虚血肢患者の血液中のＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度及び全ＶＥＧＦ−Ａ濃度を測定し、
前記評価工程が、
測定したＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度／全ＶＥＧＦ−Ａ濃度の比の経時変化を指標とし、
血管新生療法を実施する前のＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度／全ＶＥＧＦ−Ａ濃度の比と比較して、血管新生療法を実施し所定期間経過後のＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度／全ＶＥＧＦ−Ａ濃度の比の減少率が大きいほど、治療効果が高いと評価する、
評価方法。
【請求項５】
前記評価工程が、前記減少率が所定の基準値よりも大きい場合に治療効果ありと評価する、
請求項２〜４の何れか一項に記載の評価方法。
【請求項６】
血管新生療法を実施した重症虚血肢患者の治療効果のモニタリング方法であって、
前記血管新生療法を実施前の前記患者の血液中のＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度を測定する第１測定工程、
前記血管新生療法を実施後の前記患者の血液中のＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度を測定する第２測定工程、および
前記第１測定工程および前記第２測定工程の結果に基づいて、前記患者における血管新生療法の治療効果を評価する工程、
を含み、
前記評価工程において、前記第１測定工程で測定されたＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度よりも前記第２測定工程で測定されたＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度が低い場合、前記患者における血管新生療法が治療効果ありと評価する、
モニタリング方法。
【請求項７】
前記第１測定工程において、ＶＥＧＦ−Ａ165ａをさらに測定し、
前記第２測定工程において、ＶＥＧＦ−Ａ165ａをさらに測定し、
前記評価工程の前に、第１の比＝（第１測定工程で測定されたＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度）／（第１測定工程で測定されたＶＥＧＦ−Ａ165ａ濃度とＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度との合計値）を算出し、
前記評価工程の前に、第２の比＝（第２測定工程で測定されたＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度）／（第２測定工程で測定されたＶＥＧＦ−Ａ165ａ濃度とＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度との合計値）を算出し、
前記評価工程において、前記第１の比の値より前記第２の比の値が低い場合、前記患者における血管新生療法が治療効果ありと評価する、
請求項６に記載のモニタリング方法。
【請求項８】
前記第１測定工程において、全ＶＥＧＦ−Ａ濃度をさらに測定し、
前記第２測定工程において、全ＶＥＧＦ−Ａ濃度をさらに測定し、
前記評価工程の前に、第１の比＝（第１測定工程で測定されたＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度）／（第１測定工程で測定された全ＶＥＧＦ−Ａ濃度）を算出し、
前記評価工程の前に、第２の比＝（第２測定工程で測定されたＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度）／（第２測定工程で測定された全ＶＥＧＦ−Ａ濃度）を算出し、
前記評価工程において、前記第１の比の値より前記第２の比の値が低い場合、前記患者における血管新生療法が治療効果ありと評価する、
請求項６に記載のモニタリング方法。
【請求項９】
前記第２測定工程が、前記血管新生療法を実施後約１ヶ月後に実施される、
請求項６〜８の何れか一項に記載のモニタリング方法。
【請求項１０】
ＶＥＧＦ−Ａ165ｂの少なくともＥｘｏｎ８ｂ部分の立体構造を壊す変性剤、及び、
抗ＶＥＧＦ−Ａ165ｂ抗体、
を少なくとも含む、重症虚血肢患者の治療効果の評価試薬。
【請求項１１】
前記変性剤が、ジチオトレイトール、尿素、並びに、酸及びアルカリから選択され少なくとも１種である、
請求項１０に記載の重症虚血肢患者の治療効果の評価試薬。
【請求項１２】
プロセッサ及び前記プロセッサの制御下にあるメモリを含むコンピュータを備え、
前記メモリには、
（１）重症虚血肢患者の血液中のＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度の測定値、及び／又は、ＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度／全ＶＥＧＦ−Ａ濃度の比を取得する工程、
（２）血管新生療法を実施する前のＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度に対する、血管新生療法を実施し所定期間経過後のＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度の減少率、及び／又は、血管新生療法を実施する前のＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度／全ＶＥＧＦ−Ａ濃度の比に対する、血管新生療法を実施し所定期間経過後のＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度／全ＶＥＧＦ−Ａ濃度の比の減少率、
を計算し、計算した減少率を所定の基準値と比較する工程、及び
（３）前記減少率が、所定の基準値よりも大きい場合、血管新生療法を実施した重症虚血肢患者の治療効果があると評価する工程、
を前記コンピュータに実行させるためのコンピュータプログラムが記録されている、血管新生療法を実施した重症虚血肢患者の治療効果の評価装置。
【請求項１３】
プロセッサ及び前記プロセッサの制御下にあるメモリを含むコンピュータに、
（１）重症虚血肢患者の血液中のＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度の測定値、及び／又は、ＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度／全ＶＥＧＦ−Ａ濃度の比を取得する工程、
（２）血管新生療法を実施する前のＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度に対する、血管新生療法を実施し所定期間経過後のＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度の減少率、及び／又は、血管新生療法を実施する前のＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度／全ＶＥＧＦ−Ａ濃度の比に対する、血管新生療法を実施し所定期間経過後のＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度／全ＶＥＧＦ−Ａ濃度の比の減少率、
を計算し、計算した減少率を所定の基準値と比較する工程、及び
（３）前記減少率が、所定の基準値よりも大きい場合、血管新生療法を実施した重症虚血肢患者の治療効果があると評価する工程、
を実行させるコンピュータプログラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血管新生療法を実施した重症虚血肢患者の治療効果の評価方法及びモニタリング方法、治療効果の評価試薬、並びに、治療効果の評価装置及びコンピュータプログラムであって、特に、重症虚血肢患者の血液中で発現している血管内皮細胞増殖因子ＶＥＧＦ−Ａ（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−Ａ）アイソフォームのひとつであるＶＥＧＦ−Ａ１６５ｂ濃度を測定し、測定したＶＥＧＦ−Ａ１６５ｂ濃度の経時変化を指標とする、評価方法及びモニタリング方法、治療効果の評価試薬、並びに、治療効果の評価装置及びコンピュータプログラムに関する。
【背景技術】
【０００２】
虚血肢とは、足や腕に行く動脈がつまったり細くなったりして、血のめぐりが悪くなる病気である。脚が冷たい、歩いているとふくらはぎが痛くなる等の比較的軽症の場合は、飲み薬や注射等で治療することが一般的である。一方、じっとしていても手足に痛みを感じたり、手足先にただれ（潰瘍）ができるまで症状が進んだ場合は重症虚血肢（ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｌｉｍｂ  ｉｓｃｈｅｍｉａ：ＣＬＩ）と呼ばれ、できる限り血行を増やす治療を施さないと、手足を切断しなければならない場合もある。【０００３】
重症虚血肢を発症する主な原因としては、末梢動脈閉塞性疾患（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  Ａｒｔｅｒｙ  Ｄｉｓｅａｓｅ；ＰＡＤ）あるいは閉塞性動脈硬化症（Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  ｏｂｌｉｔｅｒａｎｓ；ＡＳＯ）、バージャー病（Ｂｕｅｒｇｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）あるいは閉塞性血栓血管炎（Ｔｈｒｏｍｂｏａｎｇｉｉｔｉｓ  ｏｂｌｉｔｅｒａｎｓ；ＴＡＯ）、膠原病関連血管炎（強皮症、全身性エリテマトーデスなど）等が挙げられる。【０００４】
ＰＡＤは、動脈硬化が起こり足や手の動脈（末梢動脈）が狭くなる又は詰まることで血液の流れが悪くなり、様々な症状を引き起こす病気である。近年、我が国においては、食生活の欧米化や社会の高齢化に伴い、動脈硬化を基礎とするＰＡＤ患者数は増加傾向を示している。現在のところ、ＰＡＤ患者の正確な人数は把握されていないが、国内各地の疫学調査および人口動態より約６００万人以上が罹患していると推測されている。ＰＡＤの症状としては、しびれや痛みがあり、ひどくなると皮膚潰瘍ができ、手足の一部が壊死することもある。そして、症状がひどい場合は患肢（手足）切断する必要があり、生命予後も悪い。【０００５】
重症虚血肢の治療法としては、理学療法や薬物療法、もしくは血行再建術が知られている。特に、１９９０年代からは、様々な成長因子、ＶＥＧＦ−Ａ（血管内皮細胞増殖因子）などの遺伝子や、ヒト型組替え蛋白を用いて、虚血周辺部の健常組織からの血管新生や側副血行を促進させる試みがなされている。前記の血管新生や側副血行の促進する治療法は、「治療的血管新生」または「血管新生療法（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）」と呼ばれている。【０００６】
血管新生療法の具体例としては、従来の治療法では患肢切断が免れない重症虚血肢に対して、骨髄から採取した骨髄単核球細胞を患部に移植する血管新生療法が知られている（非特許文献１参照。）また、脂肪由来間葉系前駆細胞（Ａｄｉｐｏｓｅ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  ｃｅｌｌｓ：ＡＤＲＣｓ）を患部に移植すると、虚血組織での血管新生を増強することも知られている（非特許文献２参照）。【０００７】
ところで、血管新生療法を実施した重症虚血肢（ＰＡＤ等）患者の治療効果の判定指標としては、以下の７点が知られている。
１．視診：視診可能な虚血性潰瘍を写真に撮影記録する。
２．質問票（Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  Ｒａｔｉｎｇ  Ｓｃａｌｅ：ＮＲＳ）：痛み評価を、スケール０〜１０の１１段階で評価する。
３．足関節上腕血圧比（ＡＢＩ：ａｎｋｌｅ−ｂｒａｃｈｉａｌ  ｉｎｄｅｘ）を測定する。
４．レーザードップラーによる皮下血流または皮膚組織灌流圧（ＳＰＰ）や経皮的組織酸素分圧（ＴｃＯ2）を測定する。
５．画像診断により、血管新生を評価する。
６．末梢血中のＣＤ３４の陽性細胞数を測定する。
７．６分間歩行距離を測定する（下肢病変で歩行可能の場合のみの追加項目）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｅｒｉｋｏ  Ｔａｔｅｉｓｈｉ−Ｙｕｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｆｏｒ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｌｉｍｂ  Ｉｓｃｈｅｍｉａ  ｂｙ  Ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｃｅｌｌｓ  ：  Ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｔｒｉａｌ”，  Ｔｈｅ  ＬＡＮＣＥＴ，Ｖｏｌ．３６０，Ａｕｇｕｓｔ１０，２００２，ｐ４２７−４３５
【非特許文献２】Ｋａｚｕｈｉｓａ  Ｋａｎｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｄｉｐｏｓｅ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  Ｃｅｌｌｓ  Ｅｎｈａｎｃｅｓ  Ｉｓｃｈｅｍｉａ−Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．”，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｃ  Ｖａｓｃ  Ｂｉｏｌ，Ｊａｎｕａｒｙ  ２００９，ｐ６１−６６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
血管新生療法は、重症虚血肢患者の治療方法として、今後更なる臨床適用が期待される。しかしながら、従来の血管新生療法を実施した後の重症虚血肢患者の治療効果の判定指標は上記１〜７に記載の方法しか知られていない。痛み等は重症虚血肢患者の主観が入り、また、レーザードップラーや画像診断等の機器を用いた評価は、重症虚血肢患者が機器のある場所に行く必要があり、患者負担が大きいという問題がある。また、末梢血中のＣＤ３４の陽性細胞数を測定する方法は、重症虚血肢患者の主観が入らず且つ患者負担が少ないものの、主に移植した細胞がどのくらい血中へ出てきているかのみを反映しており、実際の治療効果を評価できないという問題がある。そのため、患者負担が少なく且つ客観的に治療効果を評価できる方法の開発が望まれる。【００１０】
本発明は、上記従来の問題を解決するためになされた発明であり、鋭意研究を行ったところ、血管新生療法を実施した後の重症虚血肢患者の血中のＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度を測定し、測定したＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度の経時変化を指標とすることで、血管新生療法による治療効果を評価できることを新たに見出し、本発明を完成した。【００１１】
すなわち、本発明の目的は、血管新生療法を実施した重症虚血肢患者の治療効果を、患者負担が少なく且つ客観的に評価できる評価方法及びモニタリング方法、治療効果の評価試薬、並びに、治療効果の評価装置及びコンピュータプログラムを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、以下に示す、血管新生療法を実施した重症虚血肢患者の治療効果の評価方法及びモニタリング方法、治療効果の評価試薬、並びに、治療効果の評価装置及びコンピュータプログラムに関する。【００１３】
［１］血管新生療法を実施した重症虚血肢患者の治療効果の評価方法であって、
前記評価方法が、
重症虚血肢患者の血液中のＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度を測定する測定工程、
測定したＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度の経時変化を指標として治療効果を評価する評価工程、
を含む、評価方法。
［２］前記評価工程が、血管新生療法を実施した後にＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度が血管新生療法を実施する前より一度上昇し、その後血管新生療法を実施する前より減少した場合に治療効果ありと評価する、
上記［１］に記載の評価方法。
［３］前記測定工程が、重症虚血肢患者の血液中のＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度及び全ＶＥＧＦ−Ａ濃度を測定し、
前記評価工程が、測定したＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度／全ＶＥＧＦ−Ａ濃度の比の経時変化を指標とする、
上記［１］に記載の評価方法。
［４］前記評価工程が、血管新生療法を実施する前のＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度と比較して、血管新生療法を実施し所定期間経過後のＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度の減少率が大きいほど、治療効果が高いと評価する、
上記［１］または［２］に記載の評価方法。
［５］前記評価工程が、血管新生療法を実施する前のＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度／全ＶＥＧＦ−Ａ濃度の比と比較して、血管新生療法を実施し所定期間経過後のＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度／全ＶＥＧＦ−Ａ濃度の比の減少率が大きいほど、治療効果が高いと評価する、
上記［３］に記載の評価方法。
［６］前記評価工程が、前記減少率が所定の基準値よりも大きい場合に治療効果ありと評価する、
上記［４］または［５］に記載の評価方法。
［７］血管新生療法を実施した重症虚血肢患者の治療効果のモニタリング方法であって、
前記血管新生療法を実施前の前記患者の血液中のＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度を測定する第１測定工程、
前記血管新生療法を実施後の前記患者の血液中のＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度を測定する第２測定工程、および
前記第１測定工程および前記第２測定工程の結果に基づいて、前記患者における血管新生療法の治療効果を評価する工程、
を含む、モニタリング方法。
［８］前記評価工程において、前記第１測定工程で測定されたＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度よりも前記第２測定工程で測定されたＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度が低い場合、前記患者における血管新生療法が治療効果ありと評価する、
上記［７］に記載のモニタリング方法。
［９］前記第１測定工程において、ＶＥＧＦ−Ａ165ａをさらに測定し、
前記第２測定工程において、ＶＥＧＦ−Ａ165ａをさらに測定し、
前記評価工程の前に、第１の比＝（第１測定工程で測定されたＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度）／第１測定工程で測定されたＶＥＧＦ−Ａ165ａ濃度とＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度との合計値）を算出し、
前記評価工程の前に、第２の比＝（第２測定工程で測定されたＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度）／第２測定工程で測定されたＶＥＧＦ−Ａ165ａ濃度とＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度との合計値）を算出し、
前記評価工程において、前記第１の比の値より前記第２の比の値が低い場合、前記患者における血管新生療法が治療効果ありと評価する、
上記［７］に記載のモニタリング方法。
［１０］前記第１測定工程において、全ＶＥＧＦ−Ａ濃度をさらに測定し、
前記第２測定工程において、全ＶＥＧＦ−Ａ濃度をさらに測定し、
前記評価工程の前に、第１の比＝（第１測定工程で測定されたＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度）／第１測定工程で測定された全ＶＥＧＦ−Ａ濃度）を算出し、
前記評価工程の前に、第２の比＝（第２測定工程で測定されたＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度）／第２測定工程で測定された全ＶＥＧＦ−Ａ濃度）を算出し、
前記評価工程において、前記第１の比の値より前記第２の値が低い場合、前記患者における血管新生療法が治療効果ありと評価する、
請求項７に記載のモニタリング方法。
［１１］前記第２測定工程が、前記血管新生療法を実施後約１ヶ月後に実施される、
上記［７］〜［１０］の何れか一つに記載のモニタリング方法。
［１２］ＶＥＧＦ−Ａ165ｂの少なくともＥｘｏｎ８ｂ部分の立体構造を壊す変性剤、及び、
抗ＶＥＧＦ−Ａ165ｂ抗体、
を少なくとも含む、重症虚血肢患者の治療効果の評価試薬。
［１３］前記変性剤が、ジチオトレイトール、尿素、並びに、酸及びアルカリから選択され少なくとも１種である、
上記［１２］に記載の重症虚血肢患者の治療効果の評価試薬。
［１４］プロセッサ及び前記プロセッサの制御下にあるメモリを含むコンピュータを備え、
前記メモリには、
（１）重症虚血肢患者の血液中のＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度の測定値、及び／又は、ＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度／全ＶＥＧＦ−Ａ濃度の比を取得する工程、
（２）血管新生療法を実施する前のＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度に対する、血管新生療法を実施し所定期間経過後のＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度の減少率、及び／又は、血管新生療法を実施する前のＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度／全ＶＥＧＦ−Ａ濃度の比に対する、血管新生療法を実施し所定期間経過後のＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度／全ＶＥＧＦ−Ａ濃度の比の減少率、
を計算し、計算した減少率を所定の基準値と比較する工程、及び
（３）前記減少率が、所定の基準値よりも大きい場合、血管新生療法を実施した重症虚血肢患者の治療効果があると評価する工程、
を前記コンピュータに実行させるためのコンピュータプログラムが記録されている、血管新生療法を実施した重症虚血肢患者の治療効果の評価装置。
［１５］プロセッサ及び前記プロセッサの制御下にあるメモリを含むコンピュータに、
（１）重症虚血肢患者の血液中のＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度の測定値、及び／又は、ＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度／全ＶＥＧＦ−Ａ濃度の比を取得する工程、
（２）血管新生療法を実施する前のＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度に対する、血管新生療法を実施し所定期間経過後のＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度の減少率、及び／又は、血管新生療法を実施する前のＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度／全ＶＥＧＦ−Ａ濃度の比に対する、血管新生療法を実施し所定期間経過後のＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度／全ＶＥＧＦ−Ａ濃度の比の減少率、
を計算し、計算した減少率を所定の基準値と比較する工程、及び
（３）前記減少率が、所定の基準値よりも大きい場合、血管新生療法を実施した重症虚血肢患者の治療効果があると評価する工程、
を実行させるコンピュータプログラム。
【発明の効果】
【００１４】
血管新生療法を実施した後の重症虚血肢患者の血液中で発現しているＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度の経時変化を指標とすることで、血管新生療法による治療効果を、患者負担が少なく且つ客観的に評価できる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、非特許文献４に記載されているウェスタンブロッティングの解析結果を示している。
【図２】図２はＶＥＧＦ−Ａ165ａ及びＶＥＧＦ−Ａ165ｂの構造の概略を示す図である。
【図３】図３は、重症虚血肢患者の治療効果の評価装置の一例を示す概略図である。
【図４】図４は、評価装置のハードウェア構成を示すブロック図である。
【図５】図５は、評価装置を用いた評価方法の実施形態の一例のフローチャートである。
【図６】図６は、図面代用写真で、症例１〜５の重症虚血肢患者の血管新生療法前の写真及び術後の写真である。
【図７】図７（Ａ）は健常人の血液中のＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度の経時変化を示すグラフで、図７（Ｂ）は症例１〜５の重症虚血肢患者の血管新生療法前後の血液中のＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度の経時変化を示すグラフである。
【図８】図８（Ａ）は健常人の血液中のＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度／全ＶＥＧＦ−Ａ濃度の比の経時変化を示すグラフで、図８（Ｂ）は症例１〜５の重症虚血肢患者の血管新生療法前後の血液中のＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度／全ＶＥＧＦ−Ａ濃度の比の経時変化を示すグラフである。
【図９】図９（Ａ）は健常人の血液中の全ＶＥＧＦ−Ａ濃度の経時変化を示すグラフで、図９（Ｂ）は症例１〜５の重症虚血肢患者の血管新生療法前後の血液中の全ＶＥＧＦ−Ａ濃度の経時変化を示すグラフである。
【図１０】図１０は、症例１〜５の重症虚血肢患者の血管新生療法前後の血液中のＣＤ３４陽性細胞数の経時変化を示すグラフである。
【図１１】図１１は、図面代用写真で、症例６の重症虚血肢患者の血管新生療法前の写真及び術後２８日の写真である。
【図１２】図１２は、重症虚血肢患者の血管新生療法の術前と術後２８日の経時変化を示すグラフで、図１２（Ａ）は全ＶＥＧＦ−Ａ濃度の経時変化、図１２（Ｂ）はＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度の経時変化、図１２（Ｃ）はＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度／全ＶＥＧＦ−Ａ濃度の比の経時変化を示している。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下に、血管新生療法を実施した重症虚血肢患者の治療効果の評価方法（以下、単に「評価方法」と記載することがある。）、モニタリング方法、治療効果の評価試薬、並びに、治療効果の評価装置及びコンピュータプログラムの実施形態について詳しく説明する。
【００１７】
実施形態に示す評価方法は、血管新生療法を実施した後（以下、「術後」と記載することがある。）の重症虚血肢患者の血液中で発現しているＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度の経時変化を指標としている。ＶＥＧＦ−Ａは１９８０年代に同定され、脈管形成及び血管新生に関与する一群の糖蛋白質として知られている。ＶＥＧＦ−Ａは、主に血管内皮細胞表面にある血管内皮細胞増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）にリガンドとして結合し、細胞分裂や遊走、分化を刺激したり、微小血管の血管透過性を亢進させたりする働きをもつが、その他単球・マクロファージの活性化にも関与することが知られている。また、正常な体の血管新生に関わる他、腫瘍の血管形成や転移など、悪性化の過程にも関与していることが知られている。
【００１８】
一方、ＶＥＧＦ−ＡファミリーであるＶＥＧＦ−Ａ165ｂは、ＶＥＧＦ−Ａ遺伝子の構成要素である８番目のエクソンの末端における特異的なスプライスによって生成された配列が一部異なるアイソフォームとして２００２年に同定されている（Ｄａｖｉｄ  Ｏ．Ｂ.  ｅｔ．ａｌ．，“ＶＥＧＦ１６５ｂ，  ａｎ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  Ｓｐｌｉｃｅ  Ｖａｒｉａｎｔ  ｏｆ  Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ，  Ｉｓ  Ｄｏｗｎ−Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｉｎ  Ｒｅｎａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ．”，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ２００２  Ｊｕｌ  １５；６２（１４）：４１２３−３１．参照）。そして、ＶＥＧＦ−Ａ165ｂは、ＶＥＧＦ−Ａによって誘発される血管内膜増殖、上皮移動、血管拡張、生体内血管新生、腫瘍成長を抑制する作用があることが知られている。
【００１９】
また、本発明者らは、ＰＡＤ患者では新しい血管を作らせるＶＥＧＦ−Ａの血中濃度が健常人と比較して優位に上昇しているにもかかわらず、下肢組織の虚血が改善されていない問題（Ｃｌａｒｅｎｃｅ  Ｍ.Ｆｉｎｄｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｐｌａｓｍａ  Ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  Ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｔｉｅ２  ａｎｄ  Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈ  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｌｉｍｂ  Ｉｓｃｈｅｍｉａ  Ｆｒｏｍ  Ｉｎｔｅｒｍｉｔｔｅｎｔ  Ｃｌａｕｄｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  Ｗｉｔｈ  Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  Ａｒｔｅｒｉａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ”，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ，２００８，Ｖｏｌ．５２，Ｉｓｓｕｅ５，ｐ３８７−３９３、以下「非特許文献３」と記載する。）について、血管新生促進型のＶＥＧＦ−Ａ165ａと抑制型のＶＥＧＦ−Ａ165ｂを区別して測定することで、ＰＡＤ患者においてＶＥＧＦ−Ａ165ｂが上昇しており、このことが血管形成不全を起こしている一因であることを明らかにしている（Ｒ．Ｋｉｋｕｃｈｉ  ｅｔ．  aｌ．，“Ａｎ  ａｎｔｉａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  ｉｓｏｆｏｒｍ  ｏｆ  ＶＥＧＦ−Ａ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ  ｔｏ  ｉｍｐａｉｒｅｄ  ｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ａｒｔｅｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅ”，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２０，Ｐ．１４６４−１４７１、（２０１４）、以下「非特許文献４」と記載する。）。
【００２０】
なお、上記非特許文献４は、上記非特許文献３に記載されているＰＡＤ患者における検査結果と病態の進行の矛盾を解明するために行われた研究である。そして、非特許文献４に記載されている実験手法は、図１に示すとおり、健常人とＰＡＤ患者の血液中の全ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ａ165ａ、及びＶＥＧＦ−Ａ165ｂをウェスタンブロッティングにより解析し、発現量の多少を確認することに留まっている。上記のとおり、上記非特許文献４は、ＰＡＤ患者における検査結果と病態の進行の矛盾を解明することに着目した発明であって、術後の重症虚血肢患者の血液中のＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度を精度よく測定し、測定した濃度の経時変化を指標とすることで、術後の重症虚血肢患者に対する治療効果を評価することについて記載及び示唆する記載もない。
【００２１】
本明細書において「血管新生療法」とは、血管の新生を促進させる治療方法を意味し、上記の骨髄単核球細胞や脂肪由来間葉系前駆細胞を患者に移植する方法の他、ＶＥＧＦ−Ａを産生する血管内皮細胞、マクロファージ、平滑筋、血管内皮前駆細胞、ｉＰＳ細胞等を患者に移植する方法が挙げられる。
【００２２】
図２はＶＥＧＦ−Ａ165ａ及びＶＥＧＦ−Ａ165ｂの構造の概略を示す図である（非特許文献４参照）。血液中のＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度は、血液から定法により血清を分離し、Ｅｘｏｎ８ｂを特異的に認識する市販の抗ＶＥＧＦ−Ａ165ｂ抗体を用いた酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）により測定（測定工程）すればよい。なお、測定工程は、血管新生療法を実施前の患者の血液中のＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度を測定する工程を第１測定工程、血管新生療法を実施後の血液中のＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度を測定する工程を第２測定工程と定義してもよい。血液中の全ＶＥＧＦ−Ａ濃度を測定する場合には、血液から定法により血清を分離し、図２に示すＮ−ｔｅｒｍｉｎａｌを特異的に認識する市販の抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体を用いたＥＬＩＳＡ法により測定すればよい。また、血液中のＶＥＧＦ−Ａ165ａ濃度を測定する場合は、血液から定法により血清を分離し、Ｅｘｏｎ８ａを特異的に認識する抗ＶＥＧＦ−Ａ165ａ抗体を用いたＥＬＩＳＡ法により測定すればよい。抗ＶＥＧＦ−Ａ165ａ抗体は、公知の方法で作成すればよい。ＥＬＩＳＡ法を用いることで、血液中のＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ａ165ａ、及びＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度を精度よく測定することができる。
【００２３】
なお、市販の抗ＶＥＧＦ−Ａ165ｂ抗体を用いてＥＬＩＳＡ法により血液（血清）中のＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度を測定しようとしても、ＶＥＧＦ−Ａ165ｂ自体を検出することができない。これは、抗ＶＥＧＦ−Ａ165ｂ抗体が結合するＥｘｏｎ８ｂの立体構造が、サンプル（血清、プラズマ、尿、細胞培養上澄み液等）によって違うためと考えられる。そのため、本発明者らは、血液から分離した血清を前処理してから測定することで、抗ＶＥＧＦ−Ａ165ｂ抗体を用いたＥＬＩＳＡ法により血清中のＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度を測定できることを、今回新たに見出している。前処理は、ＶＥＧＦ−Ａ165ｂの少なくともＥｘｏｎ８ｂ部分の立体構造を壊すことができればよく、例えば、血清をジチオトレイトール（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ，ＤＴＴ）又は尿素で処理、或いは、血清を塩酸等の酸で処理して水酸化ナトリウム等のアルカリで中和する、等が挙げられる。したがって、（１）ジチオトレイトール、尿素、並びに、酸及びアルカリ等から選択される、ＶＥＧＦ−Ａ165ｂの少なくともＥｘｏｎ８ｂ部分の立体構造を壊す変性剤、及び、（２）抗ＶＥＧＦ−Ａ165ｂ抗体、を組み合わすことで、重症虚血肢患者の治療効果の評価試薬を作製することができる。
【００２４】
評価工程では、経時変化は症状により異なるものの、所定期間、例えば、術後、２週間、３週間、４週間、２カ月、３か月、６か月等の間、定期的に血液（血清）中のＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度を測定する。そして、血管新生療法を実施する前（以下、「術前」と記載することがある。）と比較して、所定期間経過後の血液（血清）中のＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度が有意に減少している場合は、治療効果ありと評価することができる。なお、後述する実施例に示すとおり、術後の重症虚血肢患者の血液中で、一時的にＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度の上昇が見られた。したがって、術後にＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度が一度上昇し、その後術前よりＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度が減少した場合に治療効果ありと評価してもよい。また、後述する実施例に示すとおり、ＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度の減少率が大きいほど、治療効果が高いと評価することもできる。
【００２５】
評価工程では、血液（血清）中のＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度の経時変化を指標としてもよいが、術後の重症虚血肢患者の血液中のＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度及び全ＶＥＧＦ−Ａ濃度を測定し、測定したＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度／全ＶＥＧＦ−Ａ濃度の比の経時変化を指標としてもよい。ＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度／全ＶＥＧＦ−Ａ濃度の比を指標とすることで、全ＶＥＧＦ−Ａに占めるＶＥＧＦ−Ａ165ｂの割合が分かり、重症虚血肢患者が血管を新生しやすい状況にあるのか、又は血管の新生を抑制する状況にあるのかも分かる。なお、前記比に関しては、血管新生療法を実施前の患者の血液中のＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度／全ＶＥＧＦ−Ａ濃度の比を第１の比、血管新生療法を実施後の血液中のＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度／全ＶＥＧＦ−Ａ濃度の比を第２の比と定義してもよい。また、後述する実施例に示すとおり、比を指標とすると、治療効果をより精度よく予測できる。術後の重症虚血肢患者の治療効果は、ＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度又はＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度／全ＶＥＧＦ−Ａ濃度の比を指標として評価してもよいし、ＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度及びＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度／全ＶＥＧＦ−Ａ濃度の比の両方を指標として評価してもよい。なお、血管新生療法を実施した重症虚血肢患者の治療効果の評価方法は上記のとおりであるが、上記測定工程及び評価工程を用いることで、治療効果を評価しながら患者の治療効果を観察するモニタリング方法とすることもできる。
【００２６】
上記のとおり、ＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度、又は、ＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度／全ＶＥＧＦ−Ａ濃度の比を指標として術後の重症虚血肢患者の治療効果を評価している。ところで、ＶＥＧＦ−Ａは、主にＶＥＧＦ−Ａ165ａ及びＶＥＧＦ−Ａ165ｂで構成されている。したがって、ＶＥＧＦ−Ａ165ａ、又は、ＶＥＧＦ−Ａ165ａ濃度／全ＶＥＧＦ−Ａ濃度の比を指標としても、術後の重症虚血肢患者の治療効果を評価できる。ＶＥＧＦ−Ａ165ａ濃度は、ＶＥＧＦ−Ａ165ａのみを特異的に認識する（例えば、図２のＥｘｏｎ８ａのみを認識）抗体を公知の方法で作製し、ＥＬＩＳＡによりＶＥＧＦ−Ａ165ａ濃度を測定すればよい。又は、全ＶＥＧＦ−Ａ濃度からＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度を引けばよい。また、ＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度／全ＶＥＧＦ−Ａ濃度の比に代え、ＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度／ＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度とＶＥＧＦ−Ａ165ａ濃度の合計値の比を用いてもよい。
【００２７】
以下に、上記の本実施形態の評価方法を実施するための評価装置及び評価プログラムの一実施形態を、添付図面を参照して説明する。図３は、評価装置１の概略図である。評価装置１は、測定装置２と、測定装置２に接続されたコンピュータシステム３と、を含む。
【００２８】
測定装置２は、重症虚血肢患者の血液中のＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度、更に、必要に応じてＶＥＧＦ−Ａ165ａ濃度、全ＶＥＧＦ−Ａ濃度を測定する。測定装置２は、特に限定されるものではなく、ＶＥＧＦ−Ａ165ｂ、ＶＥＧＦ−Ａ165ａ、ＶＥＧＦ−Ａの測定方法に応じて適宜選択できる。本実施形態の測定装置２は、例えば、ＶＥＧＦ−Ａ165ｂのみを特異的に認識する抗体、ＶＥＧＦ−Ａ165ａのみを特異的に認識する抗体、ＶＥＧＦ−Ａを特異的に認識する抗体を用いるＥＬＩＳＡ法により生じるシグナルを検出可能な測定装置である。なお、抗ＶＥＧＦ−Ａ165ｂ抗体、抗ＶＥＧＦ−Ａ165ａ抗体、抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体は標識されたものを用いてもよい。あるいは、抗ＶＥＧＦ−Ａ165ｂ抗体、抗ＶＥＧＦ−Ａ165ａ抗体、または、抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体と結合する標識された２次抗体と共に用いてもよい。この種の測定装置は、用いた標識物質に基づくシグナルの検出が可能であれば特に限定されず、標識物質の種類に応じて適宜選択できる。
【００２９】
前記抗体を少なくとも含む試薬、重症虚血肢患者から採取した血液試料を測定装置２にセットすると、測定装置２は、各試薬を用いて抗原抗体反応を実行し、ＶＥＧＦ−Ａ165ｂ、ＶＥＧＦ−Ａ165ａ、ＶＥＧＦ−Ａと特異的に結合した抗体に基づく光学的情報としてシグナルを取得し、得られた光学的情報をコンピュータシステム３に送信する。なお、血液試料は、予めＶＥＧＦ−Ａ165ｂの少なくともＥｘｏｎ８ｂ部分の立体構造を壊す変性剤で変性した試料を用いてもよいし、測定装置２内で変性剤を用いて変性してもよい。
【００３０】
コンピュータシステム３は、コンピュータ４と、データなどを入力する入力部５と、重症虚血肢患者の情報や評価結果などを表示する表示部６と、を含んでもよい。コンピュータシステム３は、測定装置２から受信した光学的情報に基づき、重症虚血肢患者から採取された血液試料中のＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度の測定値、及び／又は、ＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度／全ＶＥＧＦ−Ａ濃度の比を取得する。次に、（ｉ）血管新生療法を実施する前のＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度（第１測定工程）に対する、血管新生療法を実施し所定期間経過後のＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度（第２測定工程）の減少率、及び／又は、（ｉｉ）血管新生療法を実施する前のＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度／全ＶＥＧＦ−Ａ濃度の比（第１の比）に対する、血管新生療法を実施し所定期間経過後のＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度／全ＶＥＧＦ−Ａ濃度の比（第２の比）の減少率、を計算する。次に、計算した減少率を所定の基準値と比較することで、血管新生療法を実施した重症虚血肢患者の治療効果の有無を評価する。なお、コンピュータシステム３は、図３に示すように、測定装置２とは別個の機器であってもよいし、測定装置２に組み込まれていてもよい。
【００３１】
コンピュータ４は、図４に示すように、プロセッサ（ＣＰＵ）４０、ＲＯＭ４１、ＲＡＭ４２、ハードディスク（ＨＤＤ）４３、入出力インターフェイス４４、読取装置４５、通信インターフェイス４６及び画像出力インターフェイス４７を備えており、これらはバス４８によってデータ通信可能に接続されている。また、測定装置２は、通信インターフェイス４６により、コンピュータ４と通信可能に接続されている。
【００３２】
ＣＰＵ４０は、入出力各部の動作を一連に制御するとともに、ＲＯＭ４１又はハードディスク４３に記憶されているコンピュータプログラムを実行する。つまり、ＣＰＵ４０は、コンピュータプログラムに従って、測定装置２から受信した光学的情報の処理を行い、血液試料中のＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度の測定値、及び／又は、ＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度／全ＶＥＧＦ−Ａ濃度の比を算出するとともに、ＲＯＭ４１又はハードディスク４３に記憶されている所定の基準値（カットオフ値）を読み出し、（ｉ）血管新生療法を実施する前のＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度に対する、血管新生療法を実施し所定期間経過後のＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度の減少率、及び／又は、（ｉｉ）血管新生療法を実施する前のＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度／全ＶＥＧＦ−Ａ濃度の比に対する、血管新生療法を実施し所定期間経過後のＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度／全ＶＥＧＦ−Ａ濃度の比の減少率が、基準値よりも大きい場合に、血管新生療法を実施した重症虚血肢患者の治療効果があると評価する。そして、ＣＰＵ４０は、決定結果を出力して表示部５に表示させる。
【００３３】
ＲＯＭ４１は、マスクＲＯＭ、ＰＲＯＭ、ＥＰＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭなどによって構成される。ＲＯＭ４１には、上述したように、ＣＰＵ４０によって実行される血管新生療法を実施した重症虚血肢患者の治療効果の評価のためのコンピュータプログラム（評価プログラム）及び当該治療効果評価プログラムの実行に用いるデータが記録される。また、ＲＯＭ４１には、所定の基準値の他、当該重症虚血肢患者のＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度の測定値、及び／又は、ＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度／全ＶＥＧＦ−Ａ濃度の比の経時変化などが記録されていてもよい。
【００３４】
ＲＡＭ４２は、ＳＲＡＭ、ＤＲＡＭなどによって構成される。ＲＡＭ４２は、ＲＯＭ４１及びハードディスク４３に記録されているコンピュータプログラムの読み出しに用いられる。ＲＡＭ４２は、また、ＣＰＵ４０がこれらのコンピュータプログラムを実行するときに、ＣＰＵ４０の作業領域として利用される。
【００３５】
ハードディスク４３は、ＣＰＵ４０に実行させるためのオペレーティングシステム、アプリケーションプログラム(治療効果評価プログラム)などのコンピュータプログラム及び当該コンピュータプログラムの実行に用いるデータが記録される。ハードディスク４３には、所定の基準値（カットオフ値）の他、当該重症虚血肢患者のＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度の測定値、及び／又は、ＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度／全ＶＥＧＦ−Ａ濃度の比の経時変化などが記録されていてもよい。
【００３６】
読取装置４５は、フレキシブルディスクドライブ、ＣＤ−ＲＯＭドライブ、ＤＶＤＲＯＭドライブなどによって構成される。読取装置４５は、可搬型記録媒体７に記録されたコンピュータプログラム又はデータを読み取ることができる。
【００３７】
入出力インターフェイス４４は、例えば、ＵＳＢ、ＩＥＥＥ１３９４、ＲＳ−２３２Ｃなどのシリアルインターフェイスと、ＳＣＳＩ、ＩＤＥ、ＩＥＥＥ１２８４などのパラレルインターフェイスと、Ｄ／Ａ変換器、Ａ／Ｄ変換器などからなるアナログインターフェイスとから構成される。入出力インターフェイス４４には、キーボード、マウスなどの入力部５が接続されている。操作者は、入力部５によりコンピュータ３に各種の指令を入力することができる。
【００３８】
通信インターフェイス４６は、例えば、Ｅｔｈｅｒｎｅｔ（登録商標）インターフェイスなどである。コンピュータ３は、通信インターフェイス４６により、プリンタなどへ印刷データの送信を行うことができる。
【００３９】
画像出力インターフェイス４７は、ＬＣＤ、ＣＲＴなどで構成される表示部６に接続されている。表示部６は、ＣＰＵ４０から与えられた画像データに応じた映像信号を出力できる。表示部６は、入力された映像信号にしたがって画像を表示する。
【００４０】
次に、図５を用いて、評価プログラムに基づき、評価装置１により実行される血管新生療法を実施した重症虚血肢患者の治療効果の評価方法の実施形態の一例について説明する。まず、ステップＳＴ１において、ＣＰＵ４０は、測定装置２から光学的情報（シグナル）の送信を受けると、取得した光学的情報から血液試料中のＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度の測定値、及び／又は、ＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度／全ＶＥＧＦ−Ａ濃度の比を算出し、ＲＯＭ４１又はハードディスク４３に記憶する。そして、ステップＳＴ２において、ＣＰＵ４０は、取得した（ｉ）血管新生療法を実施する前のＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度に対する、血管新生療法を実施し所定期間経過後のＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度の減少率、及び／又は、（ｉｉ）血管新生療法を実施する前のＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度／全ＶＥＧＦ−Ａ濃度の比に対する、血管新生療法を実施し所定期間経過後のＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度／全ＶＥＧＦ−Ａ濃度の比の減少率と、ＲＯＭ４１又はハードディスク４３に記憶された所定の基準値（カットオフ値）とを比較する。減少率が、所定の基準値（カットオフ値）より大きいと、ステップＳＴ３が「ＹＥＳ」となってＳＴ４に進み、ＣＰＵ４０は、血管新生療法を実施した重症虚血肢患者の治療効果があると評価し、ステップＳＴ６において、ＣＰＵ４０は、評価結果を出力して、表示部５に表示したり、プリンタにより印刷したりする。また、治療効果があるとの評価結果をＲＯＭ４１又はハードディスク４３に記憶してもよい。一方、減少率が、所定の基準値（カットオフ値）と同じ又はそれより低いと、ステップＳＴ３が「ＮＯ」となってステップＳＴ５に進み、ＣＰＵ４０は、血管新生療法を実施した重症虚血肢患者の治療効果がないと評価する。そして、ステップＳＴ６において、ＣＰＵ４０は、評価結果を出力して、表示部５に表示したり、プリンタにより印刷したりする。また、治療効果がないとの評価結果をＲＯＭ４１又はハードディスク４３に記憶してもよい。治療効果の評価装置及びコンピュータプログラムにおいて、ＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度／全ＶＥＧＦ−Ａ濃度の比は、ＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度／ＶＥＧＦ−Ａ165ａ濃度とＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度との合計値の比に置き換えてもよい。
【００４１】
以上、治療効果の評価装置及びコンピュータプログラムの一実施形態について説明したが、本発明は上記実施形態に限定されるものではなく、本発明の趣旨を逸脱しない限りにおいて種々の変更が可能である。
【００４２】
以下に実施例を掲げ、本発明を具体的に説明するが、この実施例は単に本発明の説明のため、その具体的な態様の参考のために提供されているものである。これらの例示は本発明の特定の具体的な態様を説明するためのものであるが、本願で開示する発明の範囲を限定したり、あるいは制限することを表すものではない。
【実施例】
【００４３】
実施例及び比較例で用いた臨床検体、血管新生療法の手順、血液中のＶＥＧＦ−Ａ165ｂ及び全ＶＥＧＦ−Ａ濃度の測定方法は以下のとおりである。
＜臨床検体＞
以下の症例の重症虚血肢患者に対し血管新生療法を実施した。
症例１：６４歳、女性、強皮症、難治性足趾潰瘍
症例２：６５歳、女性、強皮症＋閉塞性動脈硬化症（ＡＳＯ）、難治性足趾潰瘍
症例３：４９歳、男性、バージャー病、難治性足趾壊死・潰瘍
症例４：２８歳、女性、強皮症＋全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、難治性手指潰瘍
症例５：３７歳、女性、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、難治性足趾潰瘍
また、比較のため、５人の健常人を選択した。健常人の選択基準は、次の４点を満たしていない者である。
１．脂質異常症
２．耐糖能異常
３．喫煙歴
４．血圧異常【００４４】
＜血管新生療法＞
重症虚血肢患者に局所麻酔または全身麻酔を施し、脂肪吸引法により自己皮下脂肪から、約３００ｍｌの脂肪組織を採取した。次に、脂肪吸引懸濁液をセルーション遠心分離器（サイトリ・セラピューティックス社製）に接続した滅菌処理を施した専用のディスポーザブルキットに入れ、ＡＤＲＣｓを分離した。そして、分離したＡＤＲＣｓを筋注法により、患部（虚血肢）に移植した。図６は、症例１〜５の重症虚血肢患者の術前の写真及び術後（症例１〜３は２８日及び６か月、症例４及び５は２８日）の写真である。写真から明らかなように、程度の差はあるものの、何れの症例においても血管新生療法により症状は改善した。【００４５】
＜血液中のＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度の測定＞
先ず、定法により血液から血清を分離した。次に、分離した血清にＤＴＴの最終濃度が５ｍＭとなるように添加し、３７℃で６０分間前処理を行った。次に、Ｈｕｍａｎ  Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ−１６５ｂ  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ（ＭｙＢｉｏＳｏｕｒｃｅ社：ＭＢＳ７２０１３２）を用い、メーカー指示書にしたがって、前処理を行った血清中のＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度を測定した。【００４６】
＜血液中の全ＶＥＧＦ−Ａ濃度の測定＞
先ず、定法により血液から血清を分離した。次に、Ｈｕｍａｎ  ＶＥＧＦ  Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ，ＤＶＥ００（Ｒ＆Ｄ社）を用い、メーカー指示書にしたがって、血清中の全ＶＥＧＦ−Ａ濃度を測定した。【００４７】
＜血液中のＣＤ３４陽性細胞数の測定＞
血液中のＣＤ３４陽性細胞数は、ＢＥＣＫＭＡＮ  ＣＯＵＬＴＥＲ社製のＡ０７７７６を用い、添付マニュアルにしたがって測定した。【００４８】
＜実施例１及び比較例１＞
〔ＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度の経時変化〕
図７（Ａ）は健常人の血液中のＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度の経時変化を示すグラフで、図７（Ｂ）は症例１〜５の重症虚血肢患者の術前・術後の血液中のＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度の経時変化を示すグラフである。図７（Ａ）に示すように、健常人の１日目から２８日目の血液中のＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度の変化は、平均−２．９％±１２．２％（ｐ＝０．８１２５）で有意な傾向は見られなかった。一方、図７（Ｂ）に示すように、症例１〜５の重症虚血肢患者の場合、術後２８日の血液中のＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度は術前と比較して全ての症例で減少しており、濃度変化は平均−３５．０±１２．４％（ｐ＝０．０１１４）で、有意な傾向が見られた。また、図７（Ｂ）の症例１〜３に示すように、術後６か月の血液中のＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度は術後２８日と比較してほぼ同じ又は微増していたが、術前のＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度よりは十分低い値であった。なお、術後３日目、７日目で血液中のＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度が上昇したのは、血管新生療法により炎症細胞が移植箇所の周りに集まり、炎症細胞の分泌物としてＶＥＧＦ−Ａ165ｂが血液中に放出されたためと考えられる。また、図７（Ｂ）から明らかなように、症例１及び２については、術後１４日目で、血液中のＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度は術前より減少した。【００４９】
以上の結果より、術後の重症虚血肢患者の血液中のＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度の経時変化を指標とすることで、血管新生療法の治療効果を評価できることが明らかとなった。また、ＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度の経時変化は、症例により異なるものの、少なくとも術後１４日以上モニターし、血液中のＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度が術前より減少した場合に治療効果ありと評価できる。【００５０】
更に、図６の症例１〜３の写真に示すように、術後２８日と術後６か月では目視した治療効果に差はあるものの、血液中のＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度はあまり変わっていない。したがって、本発明の評価方法を用いることで、術後の比較的に早い段階で治療予測をすることができるので、重症虚血肢患者の治療意欲を高めることができることに加え、血管新生療法の追加実施等、早い段階で治療方針の再検討をすることができる。【００５１】
＜実施例２及び比較例２＞
〔ＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度／全ＶＥＧＦ−Ａ濃度の比の経時変化〕
図８（Ａ）は健常人の血液中のＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度／全ＶＥＧＦ−Ａ濃度の比の経時変化を示すグラフで、図８（Ｂ）は症例１〜５の重症虚血肢患者の術前・術後の血液中のＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度／全ＶＥＧＦ−Ａ濃度の比の経時変化を示すグラフである。図８（Ａ）に示すように、健常人の１日目から２８日目の血液中のＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度／全ＶＥＧＦ−Ａ濃度の比の変化は、平均−９．９％±２．９％（ｐ＝０．０６３）で有意な傾向は見られなかった。一方、図８（Ｂ）に示すように、症例１〜５の重症虚血肢患者の場合、術後２８日の血液中のＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度／全ＶＥＧＦ−Ａ濃度の比は術前と比較して全ての症例で減少しており、比の変化は平均−４６．２±２３．７％（ｐ＝０．０１７２）で、有意な傾向が見られた。【００５２】
また、図６の症例１〜３の６か月の写真に示すとおり、症例１は治療効果が見られるものの潰瘍部分は依然として残っているが、症例２及び３は潰瘍部分がほとんど無くなり高い治療効果を示している。ところで、図７（Ｂ）の症例１〜３の術後２８日目と術後６か月のＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度の経時変化をみると、何れの症例も術後６か月の方がＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度が僅かであるが高くなっている。一方、図８（Ｂ）の症例１〜３の術後２８日目と術後６か月のＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度／全ＶＥＧＦ−Ａ濃度の比の経時変化をみると、症例１では術後６か月の方が比は高くなっているが、症例２及び３は術後６か月の方が比は低くなり、且つ、症例１と比較して症例２及び３の全ＶＥＧＦ−Ａ濃度に占めるＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度も低くなっている。【００５３】
以上の結果より、ＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度／全ＶＥＧＦ−Ａ濃度の比の経時変化を指標とすると、治療効果をより正確に評価（予測）できることが示唆された。【００５４】
＜比較例３及び４＞
〔全ＶＥＧＦ−Ａ濃度の経時変化〕
図９（Ａ）は健常人の血液中の全ＶＥＧＦ−Ａ濃度の経時変化を示すグラフで、図９（Ｂ）は症例１〜５の重症虚血肢患者の術前・術後の血液中の全ＶＥＧＦ−Ａ濃度の経時変化を示すグラフである。図９（Ａ）に示す健常人の１日目から２８日目の血液中の全ＶＥＧＦ−Ａ濃度の変化は、平均７．６％±１０．９％（ｐ＝０．４１２７）で有意な傾向は見られなかった。また、図９（Ｂ）に示す症例１〜５の重症虚血肢患者の１日目から２８日目の血液中の全ＶＥＧＦ−Ａ濃度の変化は、平均５６．８±１１５．６％（ｐ＝０．３５５８）の変動が認められ、有意な傾向は見られなかった。【００５５】
＜比較例５＞
図１０は症例１〜５の重症虚血肢患者の術前・術後の血液中のＣＤ３４陽性細胞数の経時変化を示すグラフである。症例１〜５の重症虚血肢患者の１日目から２８日目の血液中のＣＤ３４陽性細胞数の変化は、平均３８．４±４１．４％（ｐ＝０．２８５７）で有意な傾向は見られなかった。【００５６】
上記のとおり、症例１乃至５の検体において、ＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度の経時変化、ＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度／全ＶＥＧＦ−Ａ濃度の比の経時変化を指標とすることで、血管新生療法の治療効果を評価できることが明らかとなった。なお、図６の治療前後の写真、並びに、図７（Ｂ）及び図８（Ｂ）から、ＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度及びＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度／全ＶＥＧＦ−Ａ濃度の比が、術前と比較して術後２８日目の減少率が大きいほど、治療効果が比較的高い傾向が見られたことから、更に検討を行った。【００５７】
＜実施例３及び４、比較例６＞
以下の症例の重症虚血肢患者に対し、上記と同様の手順で、血管新生療法を実施し術前と術後２８日におけるＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度の経時変化（実施例３）、ＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度／全ＶＥＧＦ−Ａ濃度の比の経時変化（実施例４）、及び、全ＶＥＧＦ−Ａ濃度の経時変化（比較例６）を測定した。
症例６：４３歳、男性、バージャー病、難治性足趾壊死・潰瘍【００５８】
図１１は、症例６の重症虚血肢患者の術前及び術後２８日の写真である。なお、症例６は、足の指と脹脛に潰瘍があった。写真から明らかなように、脹脛の潰瘍は小さくなっており、血管新生療法により症状は改善しているが治療効果は軽度であった。【００５９】
図１２は、術前と術後２８日の経時変化を示すグラフで、図１２（Ａ）は全ＶＥＧＦ−Ａ濃度の経時変化、図１２（Ｂ）はＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度の経時変化、図１２（Ｃ）はＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度／全ＶＥＧＦ−Ａ濃度の比の経時変化を示している。全ＶＥＧＦ−Ａ濃度の経時変化に差は殆ど見られなかったが、ＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度とＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度／全ＶＥＧＦ−Ａ濃度の比に関しては、術前と比較して術後２８日では有意に減少した。【００６０】
次に、図７（Ｂ）、図８（Ｂ）、図９（Ｂ）、及び図１２（Ａ）乃至（Ｃ）の各グラフの術前と術後２８日の数値及び変化率を表にまとめた。また、図６及び図１１の写真に基づいた治療効果を、著明改善、中程度改善、軽度改善の３種類に分類した。【００６１】
【表１】
0006685563.tif 000002
【００６２】
【表２】
0006685563.tif 000003
【００６３】
【表３】
0006685563.tif 000004
【００６４】
表１から明らかなように、全ＶＥＧＦ−Ａ濃度の経時変化の変化率と治療効果には、相関関係が見られなかった。一方、表２及び表３から明らかなように、症例６のＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度の経時変化による変化率（減少率）及びＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度／全ＶＥＧＦ−Ａ濃度の比の経時変化による変化率（減少率）は、何れも症例１〜３、５より小さく、且つ、治療効果も軽度改善であった。なお、症例４は、表２及び表３に示す変化率（減少率）は小さいものの、治療効果は著明改善であった。これは、症例４のみ疾患箇所が上肢（手）で、他の症例の疾患箇所（足）と異なっているためと考えられる。【００６５】
以上の結果より、何れの症例も、所定期間（術後２８日）経過後のＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度、及び、ＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度／全ＶＥＧＦ−Ａ濃度の比が、術前と比較して減少した。したがって、例えば、減少率の基準値（カットオフ値）を０として、減少率が０より大きい場合は、治療効果ありと評価することができる。また、減少率が大きいほど、治療効果が高いという傾向が得られたことから、所定期間（例えば、術後約１ヶ月間等）経過後の減少率が３０％より大きい場合を治療効果ありと評価する等、基準値を予め設定することで、再治療の要否等の評価をぶれなく実施することができる。また、基準値は、上肢と下肢とで異なる値としてもよいことが明らかとなった。【００６６】
以上の結果より、術後の重症虚血肢患者の血液中のＶＥＧＦ−Ａ165ｂ濃度の経時変化を指標とすることで、血管新生療法を実施した重症虚血肢患者の治療効果を評価できることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００６７】
本発明により、血管新生療法を実施した重症虚血肢患者の治療効果を、患者負担が少なく且つ客観的に評価できる。したがって、医療産業にとって有用である。
【図１】
0006685563.tif 000005
【図２】
0006685563.tif 000006
【図３】
0006685563.tif 000007
【図４】
0006685563.tif 000008
【図５】
0006685563.tif 000009
【図６】
0006685563.tif 000010
【図７】
0006685563.tif 000011
【図８】
0006685563.tif 000012
【図９】
0006685563.tif 000013
【図１０】
0006685563.tif 000014
【図１１】
0006685563.tif 000015
【図１２】
0006685563.tif 000016