(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）式（Ｉ）：ＶＨ−ＣＨ１−Ｘ−Ｖ１のポリペプチド鎖；および
ｂ）式（ＩＩ）：ＶＬ−ＣＬ−Ｙ−Ｖ２のポリペプチド鎖
を含む、またはからなる多重特異性抗体分子であって、
ここで、ＶＨは、重鎖可変ドメインを表し；
ＣＨ１は、重鎖定常領域のドメイン、例えば、そのドメイン１を表し；
Ｘは、結合またはリンカーを表し；
Ｙは、結合またはリンカーを表し；
Ｖ１は、ｄｓｓｃＦｖを表し；
ＶＬは、軽鎖可変ドメインを表し；
ＣＬは、Ｃκなどの軽鎖定常領域からのドメインを表し；
Ｖ２は、ｄｓｓｃＦｖを表す、
多重特異性抗体分子。
【請求項２】
Ｘがリンカーである、請求項１に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項３】
Ｙはリンカーである、請求項１または２のいずれか一項に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項４】
ＶＨ／ＶＬ、Ｖ１及びＶ２の何れかが、抗原結合部位を形成し、ＶＨ／ＶＬ、Ｖ１及びＶ２の何れか１つのみが、血清担体タンパク質に特異性を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項５】
前記血清担体タンパク質が、アルブミン、チロキシン結合タンパク質、トランスサイレチン、α１酸糖タンパク質、トランスフェリン、フィブリノゲンおよびそれらの何れかの断片からなる群から選択される、請求項４に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項６】
前記血清担体タンパク質が、ヒト血清アルブミンであり、前記血清担体タンパク質に特異性を有するＶＨ／ＶＬ、Ｖ１又はＶ２は、アルブミン結合部位を形成する、請求項４又は５に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項７】
前記アルブミン結合部位は、ＣＤＲＨ１のための配列番号７１、ＣＤＲＨ２のための配列番号７２、ＣＤＲＨ３のための配列番号７３、ＣＤＲＬ１のための配列番号７４、ＣＤＲＬ２のための配列番号７５およびＣＤＲＬ３のための配列番号７６を含むか、或いは配列番号７７および配列番号７８から選択される重鎖可変ドメインおよび配列番号７９および配列番号８０から選択される軽鎖可変ドメインを含む、請求項６に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項８】
前記配列番号７１〜７６の６つのＣＤＲ、又は前記配列番号７７〜８０の可変ドメインは、ＶＨ／ＶＬ、Ｖ１、又はＶ２の位置にある、請求項７に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項９】
前記配列番号７８の重鎖可変ドメインおよび前記配列番号８０の軽鎖可変ドメインは、Ｖ２の位置にあり、前記Ｖ２の軽鎖可変ドメイン又は重鎖可変ドメインは、例えばペプチド結合を通じてＹに結合している、請求項７又は８に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項１０】
目的の２つ以上の異なる抗原に選択的に結合することができる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項１１】
Ｖ１の軽鎖可変ドメインまたは重鎖可変ドメインは、例えば、ペプチド結合を介して、Ｘに結合される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項１２】
Ｖ２の軽鎖可変ドメインまたは重鎖可変ドメインは、例えば、ペプチド結合を介して、Ｙに結合される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項１３】
Ｖ１の軽鎖および重鎖可変ドメインおよび／またはＶ２の軽鎖および重鎖可変ドメインは、２つの改変されたシステイン残基の間のジスルフィド結合によって連結される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項１４】
Ｖ１および／またはＶ２の重鎖および軽鎖可変ドメインは、２つのシステイン残基間のジスルフィド結合によって結合され、ここで、システイン残基の対の位置は、ＶＨ３７およびＶＬ９５、ＶＨ４４およびＶＬ１００、ＶＨ４４およびＶＬ１０５、ＶＨ４５およびＶＬ８７、ＶＨ１００およびＶＬ５０、ＶＨ１００ｂおよびＶＬ４９、ＶＨ９８およびＶＬ４６、ＶＨ１０１およびＶＬ４６、ＶＨ１０５およびＶＬ４３、およびＶＨ１０６およびＶＬ５７（Ｋａｂａｔによる番号付け）を含む、またはからなる群から選択され、ここで、ＶＨおよびＶＬ値は、所定のＶ１またはＶ２内で独立して選択される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項１５】
改変されたシステイン残基の対の位置は、ＶＨ４４およびＶＬ１００である、請求項１４に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項１６】
Ｘは、ペプチドリンカー、例えば、配列番号１、２、６９および７０である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項１７】
Ｙは、ペプチドリンカー、例えば、配列番号１、２、６９および７０である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項１８】
三重特異性である請求項１〜１７のいずれか一項に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項１９】
３つの結合ドメインは、異なる抗原に結合する、請求項１８に記載の三重特異性抗体分子。
【請求項２０】
請求項１〜１９のいずれか一項に記載の多重特異性抗体分子をコードするポリヌクレオチド。
【請求項２１】
請求項２０に記載のポリヌクレオチド（単数）またはポリヌクレオチド（複数）を含むベクター。
【請求項２２】
それぞれ請求項２０または２１の１つ以上のベクターまたはポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
【請求項２３】
請求項１〜１９のいずれか一項に記載の多重特異性抗体分子の異なるポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチドを各々含む２つまたは３つのベクターを含む宿主細胞。
【請求項２４】
請求項２２または２３に記載の宿主細胞からの多重特異性抗体分子を発現することを含む、抗体分子の製造方法。
【請求項２５】
請求項１〜１９のいずれか一項に記載の多重特異性抗体分子および少なくとも１つの賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項２６】
治療に使用するための請求項２５に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
医薬組成物を調製するための、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の多重特異性抗体分子の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、特定の多重特異性抗体コンストラクト、そのコンストラクトを含む医薬製剤、コンストラクトをコードするＤＮＡおよびそれを含むベクターに関する。本開示はまた、例えば、宿主細胞において、コンストラクトを発現する方法および医薬組成物としてそれを処方する方法に及ぶ。本開示はまた、多重特異性抗体コンストラクトおよび治療での製剤の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
二重特異性抗体を作成するための多くのアプローチがあり、その多くは、Ｍｏｒｒｉｓｏｎらによって最初に記載されたフォーマットに基づいており（ＣｏｌｏｍａおよびＭｏｒｒｉｓｏｎ １９９７年、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ. １５、１５９−１６３）、全抗体、例えば、ＩｇＧ、または抗体Ｆａｂ断片に対する一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）の融合を含む、Ｓｃｈｏｏｎｊａｎｓら, ２０００、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１６５、７０５０−７０５７。
【０００３】
Ｆａｂ−ｓｃＦｖの場合、そのような二重特異性および三重特異性分子で使用されるｓｃＦｖのＶＨおよびＶＬドメインは、通常、ペプチドリンカーによって一緒に保持される。しかしながら、ＶＨおよびＶＬ可変ドメインの特定の組み合わせについて、ペプチドリンカーは、ｓｃＦｖに十分な安定性を付与することができず、可変ドメインの「ゆらぎ（breathing）」および可変ドメインとの無差別な分子間対合をもたらし、したがって、その一本鎖Ｆｖ部分を介して多重体を形成する傾向がある。これは、二重特異性分子に関して、図１に示される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明者らは、関連する多重特異性抗体分子を再改変して同等の機能性を有する抗体分子を提供する一方で、発現および／または精製後の多量体化を最小限に抑えるようにした。これは、得られる「モノマー」材料の収率を高めることを容易にし、精製、濃縮よび製剤化後の治療での使用に適した安定性の分子を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
したがって、１つの側面において、
ａ）式（Ｉ）：ＶＨ−ＣＨ１−Ｘ−Ｖ１のポリペプチド鎖；および
ｂ）式（ＩＩ）：ＶＬ−ＣＬ−Ｙ−Ｖ２のポリペプチド鎖
を含む、またはからなる多重特異性抗体分子が提供される。
ここで、ＶＨは、重鎖可変ドメインを表し；
ＣＨ１は、重鎖定常領域のドメイン、例えば、そのドメイン１を表し；
Ｘは、結合またはリンカーを表し；
Ｙは、結合またはリンカーを表し；
Ｖ１は、ｄｓＦｖ、ｓｄＡｂ、ｓｃＦｖまたはｄｓｓｃＦｖを表し；
ＶＬは、軽鎖可変ドメインを表し；
ＣＬは、Ｃκなどの軽鎖定常領域からのドメインを表し；
Ｖ２は、ｄｓＦｖ、ｓｄＡｂ、ｓｃＦｖまたはｄｓｓｃＦｖを表し；
ここで、Ｖ１またはＶ２の少なくとも１つは、ｄｓＦｖまたはｄｓｓｃＦｖである。
【０００６】
有利なことに、本開示の多重特異性抗体分子は、精製後に見られる凝集の量を最小にし、医薬濃度でコンストラクトの製剤中のモノマーの量を最大にし、保存の際に、経時的に高いモノマーレベルを維持することを含み、例えば、モノマーは、総タンパク質の５０％、６０％、７０％または７５％以上、例えば、８０％または９０％以上、例えば、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％以上として存在し得る。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
本発明の詳細な説明
本明細書中で使用される場合、「多重特異性抗体」は、２以上の結合ドメイン、例えば、２または３の結合ドメインを有する本明細書中で記載されるような抗体分子を指す。
１つの態様において、抗体コンストラクトは、三重特異性抗体である。
本明細書中で使用される場合、「三重特異性抗体」は、３つの抗原結合部位を有する抗体分子を指し、これは、独立して、同じまたは異なる抗原を結合し得る。１つの例において、三重特異性抗体分子は、２つの異なる抗原を結合し、すなわち、２つの結合部位は、同じ抗原を結合し、第３の結合部位は、第２の、異なる抗原を結合する。好ましくは、本発明の三重特異性抗体分子の３つの結合部位は、独立して、３つの異なる抗原を結合する。
【０００８】
１つの態様において、コンストラクトは、二重特異性抗体である。
本明細書中で使用される場合、「二重特異性抗体」は、２つの抗原結合部位を有する分子を指し、これは、同一または異なる抗原を結合し得る。
１つの態様において、ドメインは全て、同一の抗原に結合し、抗原上で同じエピトープを結合すること、または抗原上で異なるエピトープを結合することを含む。
１つの態様において、３つの結合ドメインがあり、３つの結合ドメインのそれぞれは、異なる（区別できる）抗原を結合する。
【０００９】
１つの態様において、３つの結合ドメインがあり、２つの結合ドメインは、同じ抗原を結合し、同じ抗原上で同じエピトープまたは異なるエピトープを結合することを含み、第３の結合ドメインは、異なる（区別できる）抗原を結合する。
本明細書中で使用される場合、「抗原結合部位」は、分子の部分を指し、これは、可変領域の１対、特に、標的抗原と特異的に相互作用する同族対を含む。
【００１０】
本明細書中で使用される場合、結合ドメインは、単一ドメイン抗体、すなわち、可変領域および抗原結合部位を含む。
本明細書中で使用される場合、「特異的に」は、特異的である抗原のみを認識する結合部位または結合ドメイン、または非特異的である抗原と比較して、有意に高い、例えば、５、６、７、８、９、１０倍より高い、結合親和性を有する結合部位または結合ドメインを指すことを意図する。
結合親和性は、標準的なアッセイ、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅなどの表面プラズモン共鳴によって測定され得る。
【００１１】
１つの態様において、本開示の多重特異性抗体分子は、それぞれ、式（Ｉ）および（ＩＩ）の重および軽鎖の二量体として提供され、ここで、ＶＬ−ＣＬ部位を一緒に有するＶＨ−ＣＨ１部位は、機能的ＦａｂまたはＦａｂ’断片を形成する。
ＶＨは、可変ドメイン、例えば、重鎖可変ドメインを表す。１つの態様において、ＶＨは、重鎖可変ドメインを表す。１つの態様において、ＶＨは、キメラ可変ドメインであり、すなわち、それは、少なくとも２つの種、例えば、ヒトフレームワークおよび非ヒトＣＤＲに由来する成分を含む。１つの態様において、ＶＨは、ヒト化される。１つの態様において、ＶＨは、ヒトである。
【００１２】
ＶＬは、可変ドメイン、例えば、軽鎖可変ドメインを表す。１つの態様において、ＶＬは、軽鎖可変ドメインを表す。１つの態様において、ＶＬは、キメラ可変ドメインであり、すなわち、少なくとも２つの種、例えば、ヒトフレームワークおよび非ヒトＣＤＲに由来する成分を含む。１つの態様において、ＶＬは、ヒト化される。１つの態様において、ＶＨは、ヒト化される。１つの態様において、ＶＨは、ヒトである。
通常、ＶＨおよびＶＬは、一緒に抗原結合ドメインを形成する。１つの態様において、ＶＨおよびＶＬは、同族対（cognate pair）を形成する。
【００１３】
本明細書中で使用される場合、「同族対」は、インビボで発生された単一抗体からの可変ドメインの対、すなわち宿主から単離される可変ドメインの自然に生じる対合を指す。したがって、同族対は、ＶＨおよびＶＬ対である。１つの例において、同族対は、共同的に、抗原を結合する。
本明細書中で使用される場合、「可変領域」は、ＣＤＲおよびフレームワーク、特に適切なフレームワークを含む抗体鎖での領域を指す。
【００１４】
本開示で使用される可変領域は、通常、抗体に由来し、これは当該分野で公知の任意の方法によって発生され得る。
本明細書中で使用される場合、「に由来する」は、使用される配列または使用される配列に非常に類似する配列は、抗体の軽または重鎖などの元の遺伝物質から得られたという事実を指す。
【００１５】
本明細書中で使用される場合、「高度に類似」は、その全長に渡って、９５％以上類似する、例えば、９６、９７、９８または９９％類似するアミノ酸配列を指すことを意図する。
本発明での使用のための可変領域は、本明細書中で上記に記載される場合、ＶＨおよびＶＬに関して、任意の適切な供給源からであり得、例えば、完全ヒトまたはヒト化であり得る。
１つの態様において、ＶＨおよびＶＬによって形成される結合ドメインは、第１の抗原に特異的である。
１つの態様において、Ｖ１によって形成される結合ドメインは、第２の抗原に特異的である。
１つの態様において、Ｖ２によって形成される結合ドメインは、第２または第３の抗原に特異的である。
１つの態様において、ＣＨ１ドメインは、抗体重鎖またはその誘導体から自然に発生するドメインである。
１つの態様において、ＣＬ断片は、軽鎖において、定常κ配列または定常λ配列またはその誘導体である。
【００１６】
本明細書中で使用される場合、自然に発生するドメインの誘導体は、自然に発生する配列中の１、２、３、４または５つのアミノ酸が、置換または欠失されているところを指し、例えば、望ましくない特性を排除するなどしてドメインの特性を最適化することを意図するが、ここで、ドメインを特徴付ける特徴（複数可）は保持される。
１つの態様において、１つ以上の天然のまたは改変された鎖間（すなわち、軽および重鎖間）ジスルフィド結合は、機能的ＦａｂまたはＦａｂ’断片に存在する。
１つの態様において、「天然の」ジスルフィド結合は、式（Ｉ）および（ＩＩ）のポリペプチド鎖中のＣＨ１およびＣＬの間に存在する。
ＣＬドメインが、κまたはλのいずれかに由来する場合、システインを形成する結合のための天然の位置は、ヒトｃκおよびｃλにおいて２１４である（Ｋａｂａｔ番号第４版１９８７年）。
【００１７】
ＣＨ１でシステインを形成するジスルフィド結合の正確な位置は、実際に使用される特定のドメインに依存する。したがって、例えば、ヒトγ−１において、ジスルフィド結合の天然の位置は、位置２３３に位置する（Ｋａｂａｔ番号第４版１９８７年）。γ２、３、４、ＩｇＭおよびＩｇＤなどの他のヒトアイソタイプに対するシステインを形成する結合の位置は公知であり、例えば、ヒトＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３について位置１２７およびヒトＩｇＤおよびＩｇＡ２Ｂの重鎖の位置１２８である。
任意に、式ＩおよびＩＩのポリペプチドのＶＨおよびＶＬの間のジスルフィド結合があってもよい。
１つの態様において、本開示に係る多重特異性抗体は、ＣＨ１およびＣＬの間に自然に生じる同等または対応する位置におけるジスルフィド結合を有する。
【００１８】
１つの態様において、ＣＨ１を含む定常領域およびＣＬなどの定常領域は、非天然に発生する位置にあるジスルフィド結合を有する。これは、必要な位置（単数）または位置（複数）で、システイン（複数可）をアミノ酸鎖中に導入することによってその分子に改変され得る。この非天然ジスルフィド結合は、ＣＨ１とＣＬの間に存在する天然のジスルフィド結合に加わる、または代わるものである。天然の位置のシステイン（複数可）は、ジスルフィド架橋を形成することができないセリンなどのアミノ酸によって置換されることができる。
【００１９】
改変されたシステインの導入は、当該分野で公知の任意の方法を使用して実施されることができる。これらの方法は、ＰＣＲ伸長重複突然変異誘発、部位特異的突然変異誘発法またはカセット式変異誘発が挙げられるが、これらに限定されない（一般的に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（分子クローニング）、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（研究室マニュアル）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ, Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ, ＮＹ, １９８９年；Ａｕｓｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（分子生物学における現在のプロトコル）、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ＆ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ, ＮＹ, １９９３年参照）。部位特異的突然変異誘発法キットは、市販されており、例えば、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ, Ｌａ Ｊｏｌｌａ, ＣＡ）である。カセット式変異誘発は、Ｗｅｌｌｓら, １９８５年, Ｇｅｎｅ, ３４：３１５−３２３に基づいて実施されることができる。あるいは、突然変異体は、アニーリング、ライゲーションおよびＰＣＲ増幅および重複オリゴヌクレオチドのクローニングによる全遺伝子合成によって作成されることができる。
【００２０】
１つの態様において、ＣＨ１およびＣＬの間のジスルフィド結合は、完全に存在せず、例えば、鎖間システインは、セリンなどの別のアミノ酸によって置換され得る。したがって、１つの態様において、分子の機能的Ｆａｂ断片における鎖間ジスルフィド結合は存在しない。参照により本明細書中に組み込まれるＷＯ２００５／００３１７０などの開示は、鎖間ジスルフィド結合なしのＦａｂ断片を提供する方法を記載する。
【００２１】
Ｖ１は、ｄｓＦｖ、ｓｄＡｂ、ｓｃＦｖ、またはｄｓｓｃＦｖ、例えば、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖまたはｄｓｓｃＦｖを表す。
Ｖ２は、ｄｓＦｖ、ｓｄＡｂ、ｓｃＦｖ、またはｄｓｓｃＦｖ、例えば、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖまたはｄｓｓｃＦｖを表す。
１つの態様において、Ｖ１およびＶ２は、両方ともｄｓｓｃＦｖである。
１つの態様において、Ｖ１およびＶ２は、両方ともｄｓＦｖである。Ｖ１およびＶ２の両方が、ｄｓＦｖの場合、ＶＨまたはＶＬ可変ドメインのいずれか一方は、Ｖ１およびＶ２と同一である。１つの態様において、Ｖ１およびＶ２は、同じＶＨ可変ドメインを有する。別の態様において、Ｖ１およびＶ２は、同じＶＬ可変ドメインを有する。１つの態様において、ＶＨおよびＶＬ可変ドメインは、Ｖ１およびＶ２について同一である。後者は、いくつかの標的にとって望ましい架橋結合を可能にする。
【００２２】
１つの態様において、Ｖ１はｄｓＦｖであり、Ｖ２はｓｃＦｖである。１つの態様において、Ｖ１はｓｃＦｖであり、Ｖ２はｄｓＦｖである。１つの態様において、Ｖ１はｄｓｓｃＦｖであり、Ｖ２はｄｓＦｖである。１つの態様において、Ｖ１はｄｓＦｖであり、Ｖ２はｄｓｓｃＦｖである。１つの態様において、Ｖ１はｄｓｓｃＦｖであり、Ｖ２はｓｃＦｖである。１つの態様において、Ｖ１はｓｄＦｖであり、Ｖ２はｄｓｓｃＦｖである。１つの態様において、Ｖ１はｓｃＦｖではない。１つの態様において、Ｖ２はｓｃＦｖではない。１つの態様において、Ｖ１およびＶ２の両方はｓｃＦｖではない。
【００２３】
したがって、１つの側面において、
ａ）式（Ｉ）：ＶＨ−ＣＨ１−Ｘ−Ｖ１のポリペプチド鎖；および
ｂ）式（ＩＩ）：ＶＬ−ＣＬ−Ｙ−Ｖ２のポリペプチド鎖
を含む、またはからなる多重特異性抗体分子が提供され、
ここで、ＶＨは、重鎖可変ドメインを表し；
ＣＨ１は、重鎖定常領域のドメイン、例えば、そのドメイン１を表し；
Ｘは、結合またはリンカーを表し；
Ｙは、結合またはリンカーを表し；
Ｖ１は、ｄｓＦｖまたはｄｓｓｃＦｖを表し；
ＶＬは、軽鎖可変ドメインを表し；
ＣＬは、定常領域からのドメイン、例えば、Ｃκなどの軽鎖定常領域ドメインを表し；
Ｖ２は、ｄｓＦｖまたはｄｓｓｃＦｖを表し；
本明細書中で使用される場合、「一本鎖可変断片」または「ｓｃＦｖ」は、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む、またはからなる一本鎖可変断片を指し、これは、ＶＨおよびＶＬ可変ドメインの間のペプチドリンカーによって安定化される。ＶＨおよびＶＬ可変ドメインは、任意の適切な配向性であり得、例えば、ＶＨのＣ末端は、ＶＬのＮ末端に結合され得る、またはＶＬのＣ末端は、ＶＨのＮ末端に結合され得る。
【００２４】
本明細書中で使用される場合、「ジスルフィド安定化一本鎖可変断片」または「ｄｓｓｃＦｖ」は、ＶＨおよびＶＬ可変ドメインの間のペプチドリンカーによって安定化される一本鎖可変断片を指し、またＶＨおよびＶＬのドメイン間ジスルフィド結合を含む。
本明細書中で使用される場合、「ジスルフィド安定化可変断片」または「ｄｓＦｖ」は、ＶＨおよびＶＬの可変ドメインの間のペプチドリンカーを含まず、代わりに、ＶＨおよびＶＬの間のドメイン間ジスルフィド結合によって安定化される一本鎖可変断片を指す。
本明細書中で使用される場合、「単一ドメイン抗体」または「ｓｄＡｂ」は、ＶＨまたはＶＬまたはＶＨＨなどの単一の単量体可変抗体ドメインからなる抗体断片を指す。
【００２５】
１つの態様において、Ｖ１および／またはＶ２が、ｄｓＦｖまたはｄｓｓｃＦｖの場合、Ｖ１および／またはＶ２の可変ドメインＶＨおよびＶＬ間のジスルフィド結合は、以下に列挙される残基の２つの間である（文脈が他を示さない限り、Ｋａｂａｔ番号付けは、以下の一覧で用いられる）。Ｋａｂａｔ番号付けに言及するときは常に、その関連文献は、Ｋａｂａｔら、１９８７年、米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）、米国のＳｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（免疫学的目的のタンパク質の配列）である。
【００２６】
１つの態様において、ジスルフィド結合は、以下を含む群から選択される位置にある：
・ＶＨ３７＋ＶＬ９５Ｃ 例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ６, ７８１−７８８ Ｚｈｕら（１９９７年）参照；
・ＶＨ４４＋ＶＬ１００ 例えば、；Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３ ５４５１−５４５９ Ｒｅｉｔｅｒら（１９９４年）；またはＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｖｏｌ. ２６９ Ｎｏ. ２８ ｐｐ.１８３２７−１８３３１ Ｒｅｉｔｅｒら（１９９４年）；またはＰｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ, ｖｏｌ.１０ ｎｏ.１２ ｐｐ.１４５３−１４５９ Ｒａｊａｇｏｐａｌら（１９９７年）参照；
・ＶＨ４４＋ＶＬ１０５ 例えば、Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ. １１８, ８２５−８３１ Ｌｕｏら （１９９５年）参照；
・ＶＨ４５＋ＶＬ８７ 例えばＰｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ６, ７８１−７８８ Ｚｈｕら（１９９７年）参照；
・ＶＨ５５＋ＶＬ１０１ 例えばＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３７７ １３５−１３９ Ｙｏｕｎｇら（１９９５年）参照； 
・ＶＨ１００＋ＶＬ５０ 例えばＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２９ １３６２−１３６７ Ｇｌｏｃｋｓｈｕｂｅｒら（１９９０年）参照；
・ＶＨ１００ｂ＋ＶＬ４９;
・ＶＨ９８＋ＶＬ４６ 例えばＰｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ６, ７８１−７８８ Ｚｈｕ ら（１９９７年）参照； 
・ＶＨ１０１＋ＶＬ４６；
・ＶＨ１０５＋ＶＬ４３ 例えば； Ｐｒｏｃ. Ｎａｔｌ. Ａｃａｄ. Ｓｃｉ. ＵＳＡ Ｖｏｌ. ９０ ｐｐ.７５３８−７５４２ Ｂｒｉｎｋｍａｎｎら（１９９３年）；またはＰｒｏｔｅｉｎｓ １９, ３５−４７ Ｊｕｎｇら（１９９４年）参照、
・ＶＨ１０６＋ＶＬ５７ 例えばＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３７７ １３５−１３９ Ｙｏｕｎｇら（１９９５年）参照
および分子中に位置する可変領域対におけるそれらに対応する位置。
【００２７】
１つの態様において、ジスルフィド結合は、位置ＶＨ４４およびＶＬ１００の間に形成される。
上記に列記したアミノ酸対は、システインによる置換に寄与する位置にあるので、ジスルフィド結合が形成されることができる。システインは、既知の技術によってこれらの所望の位置に改変されることができる。したがって、１つの態様において、本開示に係る改変されたシステインは、所定のアミノ酸位置での天然の残基が、システイン残基で置換されているところを指す。
【００２８】
改変されたシステインの導入は、当該技術で公知の任意の方法を使用して実施されることができる。これらの方法は、ＰＣＲ伸長重複突然変異誘発、部位特異的突然変異誘発法またはカセット式変異誘発が挙げられるが、これらに限定されない（一般的に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（分子クローニング）、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（研究室マニュアル）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ, Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ, ＮＹ, １９８９年；Ａｕｓｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（分子生物学における現在のプロトコル）、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ＆ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ, ＮＹ, １９９３年参照）。部位特異的突然変異誘発法キットは、市販されており、例えば、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ, Ｌａ Ｊｏｌｌａ, ＣＡ）である。カセット式変異誘発は、Ｗｅｌｌｓら, １９８５年, Ｇｅｎｅ, ３４：３１５−３２３に基づいて実施されることができる。あるいは、突然変異体は、アニーリング、ライゲーションおよびＰＣＲ増幅および重複オリゴヌクレオチドのクローニングによる全遺伝子合成によって作成されることができる。
【００２９】
したがって、１つの態様において、Ｖ１および／またはＶ２がｄｓＦｖまたはｄｓｓｃＦｖである場合、Ｖ１の可変ドメインＶＨおよびＶＬおよび／またはＶ２の可変ドメインＶＨおよびＶＬは、２つのシステイン残基（１つはＶＨに、１つはＶＬにある）の間のジスルフィド結合によって結合され得、ここで、システイン残基の対の位置は、ＶＨ３７およびＶＬ９５、ＶＨ４４およびＶＬ１００、ＶＨ４４およびＶＬ１０５、ＶＨ４５およびＶＬ８７、ＶＨ１００およびＶＬ５０、ＶＨ１００ｂおよびＶＬ４９、ＶＨ９８およびＶＬ４６、ＶＨ１０１およびＶＬ４６、ＶＨ１０５およびＶＬ４３、およびＶＨ１０６およびＶＬ５７からなる群から選択される。
【００３０】
１つの態様において、Ｖ１および／またはＶ２がｄｓＦｖまたはｄｓｓｃＦｖである場合、Ｖ１の可変ドメインＶＨおよびＶＬおよび／またはＶ２の可変ドメインＶＨおよびＶＬは、２つのシステイン残基（１つはＶＨに、１つはＶＬにある）の間のジスルフィド結合によって結合され得、これは、ＣＤＲの外側であり、ここで、システイン残基の対の位置は、ＶＨ３７およびＶＬ９５、ＶＨ４４およびＶＬ１００、ＶＨ４４およびＶＬ１０５、ＶＨ４５およびＶＬ８７、ＶＨ１００およびＶＬ５０、ＶＨ９８およびＶＬ４６、ＶＨ１０５およびＶＬ４３、およびＶＨ１０６およびＶＬ５７からなる群から選択される。
【００３１】
１つの態様において、Ｖ１がｄｓＦｖまたはｄｓｓｃＦｖである場合、Ｖ１の可変ドメインＶＨおよびＶＬは、２つの改変されたシステイン残基の間のジスルフィド結合によって結合され、１つは位置ＶＨ４４、もう１つはＶＬ１００である。
１つの態様において、Ｖ２がｄｓＦｖまたはｄｓｓｃＦｖの場合、Ｖ２の可変ドメインＶＨおよびＶＬは、２つの改変されたシステイン残基の間のジスルフィド結合によって結合され、１つは位置ＶＨ４４、もう１つはＶＬ１００である。
【００３２】
１つの態様において、Ｖ１がｄｓＦｖ、ｄｓｓｃＦｖ、またはｓｃＦｖである場合、Ｖ１のＶＨドメインは、Ｘに結合する。
１つの態様において、Ｖ１がｄｓＦｖ、ｄｓｓｃＦｖ、またはｓｃＦｖである場合、Ｖ１のＶＬドメインは、Ｘに結合する。
１つの態様において、Ｖ２がｄｓＦｖ、ｄｓｓｃＦｖ、またはｓｃＦｖである場合、Ｖ２のＶＨドメインは、Ｙに結合する。
１つの態様において、Ｖ２がｄｓＦｖ、ｄｓｓｃＦｖ、またはｓｃＦｖである場合、Ｖ２のＶＬドメインは、Ｙに結合する。
【００３３】
当業者は、Ｖ１および／またはＶ２がｄｓＦｖを表す場合、多重特異性抗体は、ＸまたはＹに結合しない対応する遊離ＶＨまたはＶＬドメインをコードする第３のポリペプチドを含むだろうことを理解するだろう。Ｖ１およびＶ２は、両方ともｄｓＦｖである場合、次に「遊離可変ドメイン」（すなわち、ポリペプチドの残部へのジスルフィド結合を介して結合されるドメイン）は、両方の鎖に共通だろう。したがって、ＸまたはＹを介してポリペプチドに融合されるまたは結合される実際の可変ドメインは、各ポリペプチド鎖で異なってもよいが、それと対にされる遊離可変ドメインは、一般的に互いに同一だろう。
【００３４】
１つの態様において、Ｘは、結合である。
１つの態様において、Ｙは、結合である。
１つの態様において、ＸおよびＹの両方は、結合である。
１つの態様において、Ｘはリンカー、好ましくは、ペプチドリンカー、例えば、タンパク質ＣＨ１およびＶ１を結合するのに適したペプチドである。
１つの態様において、Ｙはリンカー、好ましくは、ペプチドリンカー、例えば、タンパク質ＣＬおよびＶ２を結合するのに適したペプチドである。
１つの態様において、ＸおよびＹの両方は、リンカーである。１つの態様において、ＸおよびＹの両方は、ペプチドリンカーである。
【００３５】
本明細書で使用される場合、用語「ペプチドリンカー」は、アミノ酸からなるペプチドを指す。適切なペプチドリンカーの範囲は、当業者に知られているであろう。
１つの態様において、ペプチドリンカーは、長さで５０アミノ酸以下、例えば、２０アミノ酸以下、例えば、約１５アミノ酸以下、例えば、長さで９、１０、１１、１２、１３または１４アミノ酸である。
１つの態様において、リンカーは、配列１〜６７で示される配列から選択される。
【００３６】
１つの態様において、リンカーは、配列番号１または配列番号２で示される配列から選択される。
１つの態様において、Ｘは、配列ＳＧＧＧＧＴＧＧＧＧＳ（配列番号１）を有する。
１つの態様において、Ｙは、配列ＳＧＧＧＧＴＧＧＧＧＳ（配列番号１）を有する。
１つの態様において、Ｘは、配列ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２）を有する。１つの態様において、Ｙは、配列ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２）を有する。
１つの態様において、Ｘは、配列番号１で与えられる配列を有し、Ｙは、配列番号２で与えられる配列を有する。
１つの態様において、Ｘは、配列番号６９または７０で与えられる配列を有する。１つの態様において、Ｙは、配列番号６９または７０で与えられる配列を有する。１つの態様において、Ｘは、配列番号６９で与えられる配列を有し、およびＹは、配列番号７０で与えられる配列を有する。
【００３７】
【表１】
0006765974.tif 000002
【００３８】
【表２−１】
0006765974.tif 000003
【表２−２】
0006765974.tif 000004
【００３９】
（Ｓ）は、配列１４〜１８において任意である。
剛性リンカーの例としては、ペプチド配列ＧＡＰＡＰＡＡＰＡＰＡ（配列番号５２）、ＰＰＰＰ（配列番号５３）およびＰＰＰが挙げられる。
１つの態様において、ペプチドリンカーは、アルブミン結合ペプチドである・
【００４０】
アルブミン結合ペプチドの例は、ＷＯ２００７／１０６１２０で提供され、以下のものが挙げられる：
【表３】
0006765974.tif 000005
【００４１】
有利には、リンカーとしてアルブミン結合ペプチドの使用は、多重特異性抗体分子の半減期を増加させ得る。
１つの態様において、Ｖ１がｓｃＦｖまたはｄｓｓｃＦｖである場合、例えば、Ｖ１の可変ドメインＶＨおよびＶＬを結合するための適切なペプチドがある。
１つの態様において、Ｖ２がｓｃＦｖまたはｄｓｓｃＦｖである場合、例えば、Ｖ２の可変ドメインＶＨおよびＶＬを結合するための適切なペプチドがある。
１つの態様において、ｓｃＦｖまたはｄｓｓｃＦｖにおいて、ペプチドリカーは、長さで約１２〜２５のアミノ酸、例えば１５〜２０のアミノ酸の範囲である。
【００４２】
１つの態様において、Ｖ１がｓｃＦｖまたはｄｓｓｃＦｖである場合、Ｖ１の可変ドメインＶＨおよびＶＬを結合するリンカーは、配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号６８）を有する。
１つの態様において、Ｖ２がｓｃＦｖまたはｄｓｓｃＦｖである場合、Ｖ２の可変ドメインＶＨおよびＶＬを結合するリンカーは、配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号６８）を有する。
１つの態様において、Ｖ１がｓｃＦｖまたはｄｓｓｃＦｖである場合、Ｖ１の可変ドメインＶＨおよびＶＬを結合するリンカーは、配列ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号６９）を有する。
１つの態様において、Ｖ２がｓｃＦｖまたはｄｓｓｃＦｖである場合、Ｖ２の可変ドメインＶＨおよびＶＬを結合するリンカーは、配列ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号６９）を有する。
１つの態様において、Ｖ１がｓｃＦｖまたはｄｓｓｃＦｖである場合、Ｖ１の可変ドメインＶＨおよびＶＬを結合するリンカーは、配列ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＴＧＧＧＧＳ（配列番号７０）を有する。
１つの態様において、Ｖ２がｓｃＦｖまたはｄｓｓｃＦｖである場合、Ｖ２の可変ドメインＶＨおよびＶＬを結合するリンカーは、配列ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＴＧＧＧＧＳ（配列番号７０）を有する。
【００４３】
したがって、１つの側面において、
ａ）式（Ｉ）：ＶＨ−ＣＨ１−Ｘ−Ｖ１のポリペプチド鎖；および
ｂ）式（ＩＩ）：ＶＬ−ＣＬ−Ｙ−Ｖ２のポリペプチド鎖
を含む、またはからなる多重特異性抗体分子が提供され、
ここで、ＶＨは、重鎖可変ドメインを表し；
ＣＨ１は、重鎖定常領域のドメイン、例えば、そのドメイン１を表し；
Ｘは、結合またはリンカーを表し；
Ｙは、結合またはリンカーを表し；
Ｖ１は、ｄｓＦｖ、ｓｄＡｂ、ｓｃＦｖまたはｄｓｓｃＦｖを表し；
ＶＬは、軽鎖可変ドメインを表し；
ＣＬは、Ｃκなどの軽鎖定常領域からのドメインを表し；
Ｖ２は、ｄｓＦｖ、ｓｄＡｂ、ｓｃＦｖまたはｄｓｓｃＦｖを表し；
ここで、Ｖ１またはＶ２の少なくとも１つは、ｄｓＦｖまたはｄｓｓｃＦｖである。
【００４４】
本開示はまた、本明細書中に開示される配列に８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％類似する配列を提供する。
本明細書中で使用される場合、「同一性」は、アラインされた配列における任意の特定の位置で、アミノ酸残基は、配列間で同一であることを示す。
【００４５】
本明細書中で使用される場合、「類似性」は、アラインされた配列における任意の特定の位置で、アミノ酸残基は、配列の間の類似するタイプのものであることを示す。例えば、ロイシンは、イソロイシンまたはバリンに対して置換され得る。しばしば相互に置換されることができる他のアミノ酸は、次のものが挙げられるが、それらに限定されない：
フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファン（芳香族側鎖を有するアミノ酸）；
リシン、アルギニンおよびヒスチジン（塩基側鎖を有するアミノ酸）；
アスパラギン酸およびグルタミン酸（酸性側鎖を有するアミノ酸）；
アスパラギンおよびグルタミン（アミド側鎖を有するアミノ酸）；および
システインおよびメチオニン（硫黄含有側鎖を有するアミノ酸）。
【００４６】
同一性および類似性の程度は、容易に計算されることができる（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（計算分子生物学）, Ｌｅｓｋ, Ａ.Ｍ., ｅｄ., Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、１９８８年；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ。Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ（情報学およびゲノムプロジェクト）, Ｓｍｉｔｈ, Ｄ.Ｗ., ｅｄ., Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ, ニューヨーク、１９９３年；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ（配列データのコンピュータ分析）, Ｐａｒｔ １, Ｇｒｉｆｆｉｎ, Ａ.Ｍ.およびＧｒｉｆｆｉｎ, Ｈ.Ｇ., ｅｄｓ., Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ, ニュージャージー, １９９４年；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（分子生物学における配列分析）, ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ, Ｇ., Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ, １９８７年, Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ（配列分析プライマー）, Ｇｒｉｂｓｋｏｖ, Ｍ.およびＤｅｖｅｒｅｕｘ, Ｊ., ｅｄｓ., Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ, ニューヨーク、１９９１年、ＢＮＣＩから入手可能なＢＬＡＳＴ（登録商標）ソフトウェア（Ａｌｔｓｃｈｕｌ, Ｓ.Ｆら、１９９０年, Ｊ. Ｍｏｌ. Ｂｉｏｌ. ２１５：４０３−４１０； Ｇｉｓｈ, Ｗ. ＆ Ｓｔａｔｅｓ, Ｄ.Ｊ. １９９３年、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ. ３：２６６−２７２. Ｍａｄｄｅｎ, Ｔ.Ｌ.ら、１９９６年、Ｍｅｔｈ. Ｅｎｚｙｍｏｌ. ２６６：１３１−１４１； Ａｌｔｓｃｈｕｌ, Ｓ.Ｆ.ら、１９９７年, Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ. ２５：３３８９−３４０２； Ｚｈａｎｇ, Ｊ. ＆ Ｍａｄｄｅｎ, Ｔ.Ｌ. １９９７年、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ. ７：６４９−６５６,）。
【００４７】
本発明の多重特異性コンストラクトで使用するための抗体は、当該分野で公知の任意の適切な方法によって作製され得る。
抗原ポリペプチドに対して生じる抗体は、動物の免疫化が必要な場合に、動物、好ましくは、非ヒト動物にポリペプチドを投与することによって、周知で慣習的なプロトコル（例えば、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ, Ｄ. Ｍ. Ｗｅｉｒ （ｅｄ.）, Ｖｏｌ ４, Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ, Ｏｘｆｏｒｄ, Ｅｎｇｌａｎｄ、１９８６年参照）を使用して、得られうる。ウサギ、マウス、ラット、ヒツジ、ウシ、ラクダまたはブタなどの多くの温血動物が免疫され得る。しかしながら、マウス、ウサギ、ブタおよびラットが、通常最も適している。
モノクロナール抗体は、ハイブリドーマ技術（Ｋｏｈｌｅｒ ＆ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ, １９７５年, Ｎａｔｕｒｅ, ２５６：４９５−４９７）、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら １９８３年, Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ, ４：７２）およびＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ（モノクロナール抗体および癌療法）, ｐｐ７７−９６, Ａｌａｎ Ｒ Ｌｉｓｓ, Ｉｎｃ., １９８５年）など、当該分野で公知の任意の方法によって調製され得る。
【００４８】
抗体はまた、単一リンパ球抗体法を使用して、例えば、Ｂａｂｃｏｏｋ, Ｊ.ら、１９９６年, Ｐｒｏｃ. Ｎａｔｌ. Ａｃａｄ. Ｓｃｉ. ＵＳＡ ９３（１５）：７８４３−７８４８１； ＷＯ９２／０２５５１； ＷＯ２００４／０５１２６８およびＷＯ２００４／１０６３７７によって記載される方法によって特定の抗体の生産について選択される単一リンパ球から生じる免疫グロブリン可変領域ｃＤＮＡをクローニングおよび発現することによって作製され得る。
【００４９】
本開示で使用のための抗体は、当該分野で公知の様々なファージディスプレイ方法を使用して作製されることができ、Ｂｒｉｎｋｍａｎら（Ｊ. Ｉｍｍｕｎｏｌ. Ｍｅｔｈｏｄｓ, １９９５年, １８２： ４１−５０）、Ａｍｅｓら（Ｊ. Ｉｍｍｕｎｏｌ. Ｍｅｔｈｏｄｓ, １９９５年, １８４：１７７−１８６）、Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈら（Ｅｕｒ. Ｊ. Ｉｍｍｕｎｏｌ. １９９４年, ２４：９５２−９５８）、Ｐｅｒｓｉｃら（Ｇｅｎｅ, １９９７年 １８７ ９−１８） Ｂｕｒｔｏｎら（Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ, １９９４年, ５７：１９１−２８０）およびＷＯ９０／０２８０９； ＷＯ９１／１０７３７； ＷＯ９２／０１０４７；ＷＯ９２／１８６１９；ＷＯ９３/１１２３６；ＷＯ９５／１５９８２；ＷＯ９５／２０４０１；およびＵＳ ５，６９８，４２６； ５，２２３，４０９； ５，４０３，４８４； ５，５８０，７１７；５,４２７，９０８；５，７５０，７５３；５，８２１，０４７；５，５７１，６９８；５，４２７，９０８；５，５１６，６３７；５，７８０，２２５；５，６５８，７２７；５，７３３，７４３；５，９６９,１０８、およびＷＯ２００１１／３０３０５によって開示されるものが挙げられる。
【００５０】
１つの態様において、本開示に係る多重特異性分子は、ヒト化される。
本明細書中で開示されるヒト化抗体（ＣＤＲ移植抗体を含む）は、非ヒト種からの領域（ＣＤＲ）およびヒト免疫グロブリン分子からのフレームワーク領域を決定する１つ以上の相補性を有する分子を指す（例えば、ＵＳ ５，５８５，０８９；ＷＯ９１／０９９６７参照）。全体のＣＤＲよりむしろＣＤＲの残基を決定する特異性を移すことが必要であるにすぎないことが理解されるだろう（例えば、Ｋａｓｈｍｉｒｉら、２００５年、Ｍｅｔｈｏｄｓ, ３６, ２５−３４参照）。ヒト化抗体は、任意に、ＣＤＲが由来した非ヒト種由来の１つ以上のフレームワーク残基をさらに含む。
【００５１】
本明細書中で使用される場合、用語「ヒト化抗体分子」は、重および／または軽鎖が、アクセプター抗体（例えば、ヒト抗体）の重および／または軽鎖可変領域フレームワーク中に移植されるドナー抗体（例えば、マウスモノクロナール抗体）からの１つ以上のＣＤＲ（必要な場合、１つ以上の修飾ＣＤＲを含む）を含む抗体分子を指す。総説として、Ｖａｕｇｈａｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ, １６, ５３５−５３９, １９９８年参照。１つの態様において、全体のＣＤＲが転写されるよりも、本明細書中で上記に記載されるＣＤＲの任意の１つからの残基を決定する特異性の１つ以上のみが、ヒト抗体フレームワークに転写される（例えば、Ｋａｓｈｍｉｒｉら、２００５年, Ｍｅｔｈｏｄｓ, ３６, ２５−３４参照）。１つの態様において、本明細書中で上記に記載される１つ以上のＣＤＲからの残基を決定する特異性のみが、ヒト抗体フレームワークに転移される。別の態様において、本明細書中で上記に記載されるＣＤＲのそれぞれからの残基を決定する特異性のみが、ヒト抗体フレームワークに転移される。
【００５２】
ＣＤＲまたは特異性決定残基が移植される場合、任意の適切なアクセプターの可変領域フレームワーク配列は、マウス、霊長類およびヒトフレームワーク領域を含む、ＣＤＲが由来するドナー抗体のクラス／タイプに関して使用され得る。適切には、本発明に係るヒト化抗体は、ヒトアクセプターフレーム領域並びに本明細書中で提供されるＣＤＲの１つ以上を含む可変ドメインを有する。
【００５３】
本開示で使用されることができるヒトフレームワークの例は、ＫＯＬ、ＮＥＷＭ、ＲＥＩ、ＥＵ、ＴＵＲ、ＴＥＩ、ＬＡＹおよびＰＯＭである（前記Ｋａｂａｔら）。例えば、ＫＯＬおよびＮＥＷＭは、重鎖のために使用されることができ、ＲＥＩは、軽鎖のために使用されることができ、ＥＵ、ＬＡＹおよびＰＯＭは、重鎖および軽鎖の両方のために使用されることができる。あるいは、ヒト生殖系列配列が使用され得、これらは、http://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/vbase/list2.phpで利用できる。
【００５４】
本開示のヒト化抗体分子において、アクセプターの重および軽鎖は、同じ抗体に由来することが必ずしも必要ではなく、所望であれば、異なる鎖に由来するフレームワーク領域を有する複合鎖を含み得る。
【００５５】
フレームワーク領域は、アクセプター抗体の配列と全く同じ配列を有する必要はない。例えば、異常な残基は、そのアクセプター鎖のクラスまたはタイプのより頻繁に生じる残基に変化され得る。あるいは、アクセプターフレームワーク領域で選択された残基は、それらがドナー抗体中の同じ位置で検出される残基に相当するように変更され得る（Ｒｅｉｃｈｍａｎｎら、１９９８年、Ｎａｔｕｒｅ, ３３２, ３２３−３２４参照）。そのような変化は、ドナー抗体の親和性を回復するのに必要な最小限に保たれるべきである。変更される必要のあるアクセプターフレームワーク領域中の残基を選択するためのプロトコルは、ＷＯ９１／０９９６７に記載される。
【００５６】
フレームワークの誘導体は、代替アミノ酸、例えば、ドナー残基で置換される１，２、３または４つのアミノ酸を有し得る。
ドナー残基は、ドナー抗体からの残基、すなわち、ＣＤＲがもともと由来する抗体である。ドナー残基は、ヒト受容体フレームワーク（アクセプター残基）に由来する適切な残基で置換され得る。
１つの態様において、本開示の多重特異性抗体は、完全にヒトであり、特に、可変ドメインの１つ以上は、完全にヒトである。
【００５７】
完全なヒト分子は、重および軽鎖の両方の可変領域および定常領域（存在する場合）が、全てヒト起源であるか、または必ずしも同じ抗体からではない、ヒト起源の配列に実質的に同一のものである。完全ヒト抗体の例としては、例えば、上記のファージディスプレイ方法によって生産される抗体、およびマウス免疫グロブリン可変および任意に定常領域遺伝子がそれらのヒト対応物、例えば、ＥＰ０５４６０７３、ＵＳ５，５４５，８０６、ＵＳ５，５６９，８２５、ＵＳ５，６２５，１２６、ＵＳ５，６３３，４２５、ＵＳ５，６６１，０１６、ＵＳ５，７７０，４２９、ＥＰ ０４３８４７４およびＥＰ０４６３１５１において、一般的用語で記載されるようなものによって置換されているマウス産生抗体が挙げられる。
【００５８】
１つの態様において、本開示の多重特異性抗体分子は、目的の２つ、３つ以上の異なる抗原を選択的に結合することができる。
１つの態様において、ＶＨ／ＶＬ、またはＶ１またはＶ２によって形成される抗原結合ドメインによって結合される目的の抗原は、独立して、細胞関連タンパク質、例えば、細菌細胞、酵母細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、内皮細胞または腫瘍細胞、および可溶性タンパク質などの細胞上の細胞表面タンパク質から選択される。
【００５９】
目的の抗原はまた、疾患または感染中に上方調節されるそれらのタンパク質、例えば、受容体および／またはそれらの対応するリガンドなどの任意の医学的に関連するタンパク質であり得る。抗原の特定の例としては、Ｔ細胞またはＢ細胞シグナル伝達受容体、共刺激分子、チェックポイント阻害剤、ナチュラルキラー細胞受容体、免疫グロブリン受容体、ＴＮＦＲファミリー受容体、Ｂ７ファミリー受容体、接着分子、インテグリン、サイトカイン／ケモカイン受容体、ＧＰＣＲ、成長因子受容体、キナーゼ受容体、組織特異性抗原、癌抗原、病原体認識受容体、補体受容体、ホルモン受容体または可溶性分子、例えば、サイトカイン、ケモカイン、ロイコトリエン、成長因子、ホルモンまたは酵素またはイオンチャネル、エピトープ、それらの断片および翻訳後修飾フォームなどの細胞表面受容体が挙げられる。
【００６０】
１つの態様において、本開示の多重特異性抗体分子は、目的の抗原（複数可）の活性を機能的に変化させるために使用され得る。例えば、抗体融合タンパク質は、前記抗原の活性を直接的または間接的に中和、拮抗または作動させ得る。
１つの態様において、Ｖ１およびＶ２は、同じ抗原に特異的であり、例えば、その中の同じまたは異なるエピトープを結合する。１つの態様において、Ｖ１は、ヒト血清アルブミンに特異的である。１つの態様において、Ｖ２は、ヒト血清アルブミンに特異的である。１つの態様において、Ｖ１およびＶ２は、２つの異なる抗原に特異的である。
１つの態様において、Ｖ１およびＶ２は、同じ抗原、例えば、同じ抗原上の同じまたは異なるエピトープに特異的である。
１つの態様において、ＶＨ／ＶＬまたはＶ１またはＶ２によって結合される目的の抗原は、補体経路活性化および／またはエフェクター細胞補充などの、エフェクター機能を補充する能力を提供する。
【００６１】
エフェクター機能の補充は、エフェクター機能が細胞に関連し、前記細胞がその表面に補充分子を有するという点で、直接的であり得る。間接的補充は、補充ポリペプチドに対する本開示に係る分子における抗原結合ドメイン（Ｖ１またはＶ２など）への抗原の結合は、例えば、次に、直接的または間接的にエフェクター機能を補充しうる、またはシグナル伝達経路の活性化によるものであってもよい因子の放出を引き起こす場合に、起こりうる。例としては、ＩＬ２、ＩＬ６、ＩＬ８、ＩＦＮγ、ヒスタミン、Ｃ１ｑ、オプソニンおよびＣ２、Ｃ４、Ｃ３コンバターゼ、Ｃ５〜Ｃ９などの古典的および代替補体活性化カスケードの他のメンバーが挙げられる。
【００６２】
本明細書中で使用される場合、「補充ポリペプチド」は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩなどのＦｃγＲ、Ｃ１ｑおよびＣ３、ＣＤマーカータンパク質（分化マーカーのクラスター）または直接的または間接的に細胞媒介エフェクター機能を補充する能力を保持するその断片などの補体経路たんぱく質が挙げられるが、それらに限定されない。補充ポリペプチドはまた、エフェクター機能を有するＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＥおよびＩｇＡなどの免疫グロブリン分子が挙げられる。
【００６３】
１つの態様において、本開示に係る多重特異性抗体分子中の抗原結合ドメイン（Ｖ１またはＶ２またはＶＨ／ＶＬなど）は、補体経路タンパク質に特異性を有し、Ｃ１ｑが特に好ましい。
さらに、本開示の多重特異性抗体分子は、核種キレート化剤タンパク質に結合する単一ドメイン抗体により放射性核種をキレート化するために使用され得る。そのような融合タンパク質は、イメージングまたは治療への放射性核種ターゲティグアプローチでの使用である。
【００６４】
１つの態様において、本開示に係る分子内での抗原結合ドメイン（Ｖ１またはＶ２またはＶＨ／ＶＬなど）は、血清担体タンパク質、循環免疫グロブリン分子、またはＣＤ３５／ＣＲ１に特異性を有し、例えば、前記血清担体タンパク質、循環免疫グロブリン分子またはＣＤ３５／ＣＲ１に結合することによって、目的の前記抗原に対する特異性を有する抗体断片に延長した半減期を提供する。
本明細書中で使用される場合、「血清担体タンパク質」としては、チロキシン結合タンパク質、トランスサイレチン、α１酸糖タンパク質、トランスフェリン、フィブリノゲンおよびアルブミン、またはその任意の断片が挙げられる。
本明細書中で使用される場合、「循環免疫グロブリン分子」としては、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ｓＩｇＡ、ＩｇＭおよびＩｇＤ、またはその任意の断片が挙げられる。
【００６５】
ＣＤ３５／ＣＲ１は、３６日の半減期を有する赤血球上に存在するタンパク質である（２８〜４７日の通常の範囲：Ｌａｎａｒｏら、１９７１年、Ｃａｎｃｅｒ, ２８（３）：６５８−６６１）。
１つの態様において、ＶＨ／ＶＬが特異性を有する目的の抗原は、ヒト血清アルブミンなどのヒト血清担体のような血清担体タンパク質である。
１つの態様において、Ｖ１が特異性を有する目的の抗原は、ヒト血清アルブミンなどのヒト血清担体のような血清担体タンパク質である。
１つの態様において、Ｖ２が特異性を有する目的の抗原は、ヒト血清アルブミンなどのヒト血清担体のような血清担体タンパク質である。
１つの態様において、ＶＨ／ＶＬ、Ｖ１またはＶ２の１つのみが、ヒト血清アルブミンなどのヒト血清担体のような血清担体タンパク質に特異性を有する。
【００６６】
１つの態様において、本開示のコンストラクト中の結合部位は、６つのＣＤＲ、例えば、ＣＤＲＨ１のための配列番号７１、ＣＤＲＨ２のための配列番号７２、ＣＤＲＨ３のための配列番号７３、ＣＤＲＬ１のための配列番号７４、ＣＤＲＬ２のための配列番号７５およびＣＤＲＬ３のための配列番号７６を含む。
【００６７】
１つの態様において、前記６つのＣＤＲ配列番号７１〜７６は、本開示のコンストラクト中の位置ＶＨ／ＶＬにある。１つの態様において、前記６つのＣＤＲ配列番号７１〜７６は、本開示のコンストラクト中の位置Ｖ１にある。１つの態様において、前記６つのＣＤＲ配列番号７１〜７６は、本開示のコンストラクト中の位置Ｖ２にある。１つの態様において、前記６つのＣＤＲ配列番号７１〜７６は、本開示のコンストラクト中の位置Ｖ１およびＶ２にある。１つの態様において、前記６つのＣＤＲ配列番号７１〜７６は、本開示のコンストラクト中の位置ＶＨ／ＶＬおよびＶ１にある。１つの態様において、前記６つのＣＤＲ配列番号７１〜７６は、本開示のコンストラクト中の位置ＶＨ／ＶＬおよびＶ２にある。
【００６８】
１つの態様において、本開示のコンストラクト中のアルブミン結合部位は、配列番号７７および配列番号７８から選択される重鎖可変ドメインおよび配列番号７９および配列番号８０から選択される軽鎖可変ドメイン、特に、それぞれ、重および軽鎖について配列番号７７および７９または配列番号７８および８０を含む。１つの態様において、これらのドメインは、本開示のコントラクトにおいて、位置ＶＨ／ＶＬにある。１つの態様において、これらの可変ドメインは、位置Ｖ１にある。１つの態様において、これらの可変ドメインは、位置Ｖ２にある。１つの態様において、これらの可変ドメインは、位置Ｖ１およびＶ２にある。１つの態様において、これらの可変ドメインは、本開示のコンストラクトにおいて、位置ＶＨ／ＶＬおよびＶ２にある。可変ドメインが、本開示のコンストラクト中の２つの位置にある場合、可変ドメインの同じ対は、各位置にあり得る、または可変ドメインの２つの異なる対が使用され得る。
【００６９】
１つの態様において、本開示の多重特異性抗体分子は、標的抗原または抗原（複数）に対する改善された親和性を提供するように処理される。そのような変異体は、ＣＤＲを変異すること（Ｙａｎｇら Ｊ. Ｍｏｌ. Ｂｉｏｌ., ２５４, ３９２−４０３, １９９５年）、鎖シャッフリング（Ｍａｒｋｓら Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ, １０, ７７９−７８３, １９９２年）、大腸菌（Ｅ. ｃｏｌｉ）の突然変異誘発株の使用（Ｌｏｗら, Ｊ. Ｍｏｌ. Ｂｉｏｌ., ２５０, ３５９−３６８, １９９６年）、ＤＮＡシャッフリング（Ｐａｔｔｅｎら, Ｃｕｒｒ. Ｏｐｉｎ. Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ., ８, ７２４−７３３, １９９７年）、ファージディスプレイ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら, Ｊ. Ｍｏｌ. Ｂｉｏｌ., ２５６, ７７−８８, １９９６年）および性的ＰＣＲ（Ｃｒａｍｅｒｉら Ｎａｔｕｒｅ, ３９１, ２８８−２９１, １９９８年）を含むいくつかの親和性成熟プロトコルによって得られることができる。Ｖａｕｇｈａｎらは、親和性成熟のこれらの方法を議論している。
この文脈において、本明細書中で使用される場合、改善された親和性は、出発分子を超える改善を指す。
【００７０】
所望の場合、本開示で使用のための多重特異性抗体コンストラクトは、１つ以上のエフェクター分子（複数可）に結合され得る。エフェクター分子は、本発明の抗体に結合されることができる単一の部分を形成するように結合された単一エフェクター分子または２つ以上そのような分子を含み得ることが理解されるだろう。エフェクター分子に結合される抗体断片を得ることが望ましい場合、これは、抗体断片が、直接またはエフェクター分子へのカップリング剤を介して結合される標準化学的または組換えＤＮＡ手順によって調製され得る。そのようなエフェクター分子を抗体に結合させるための技術は、当該技術分野において周知である（ＨｅｌｌｓｔｒｏｍらＣｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ, 第２版, Ｒｏｂｉｎｓｏｎら, １９８７年, ｐｐ. ６２３−５３； Ｔｈｏｒｐｅら １９８２年, Ｉｍｍｕｎｏｌ. Ｒｅｖ., ６２：１１９−５８およびＤｕｂｏｗｃｈｉｋら １９９９年、ＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙおよびＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ, ８３, ６７−１２３参照）。特定の化学的手順は、例えば、ＷＯ９３／０６２３１、ＷＯ９２／２２５８３、ＷＯ８９／００１９５、ＷＯ８９/０１４７６およびＷＯ０３０３１５８１で記載されるものが挙げられる。あるいは、エフェクター分子は、タンパク質またはポリペプチドである場合、例えば、ＷＯ８６／０１５３３およびＥＰ０３９２７４５で記載されるように、リンケージは、組換えＤＮＡ手順を使用して達成され得る。
【００７１】
本明細書中で使用される場合、用語「エフェクター分子」としては、例えば、生物学的に活性なタンパク質、例えば、酵素、他の抗体または抗体断片、合成または天然発生ポリマー、核酸およびその断片、例えば、ＤＮＡ，ＲＮＡおよびその断片、放射性核種、特に、放射性ヨウ素、放射性同位元素、キレート化金属、ナノ粒子および蛍光化合物またはＮＭＲまたはＥＳＲ分光法によって検出され得る化合物などのレポーター基が挙げられる。
【００７２】
他のエフェクター分子としては、１１１Ｉｎおよび９０Ｙ、Ｌｕ１７７、ビスマス２１３、カリホルニウム２５２、イリジウム１９２およびタングステン１８８／レニウム１８８などのキレート化放射性核種；またはアルキルホスホコリン、トポイソメラーゼＩ阻害剤、タキソイドおよびスラミンなどの薬物が挙げられるが、それらに限定されない。
他のエフェクター分子は、タンパク質、ペプチドおよび酵素を含む。目的の酵素としては、タンパク質分解酵素、加水分解酵素、リアーゼ、イソメラーゼ、トラスフェラーゼが挙げられるが、それらに限定されない。目的のタンパク質、ポリペプチドおよびペプチドとしては、免疫グロブリン、アブリン、リシンＡ、シュードモーナス外毒素、またはジフテリア毒素などの毒、インスリン、α−インターフェロン、β−インターフェロン、神経成長因子、血小板由来成長因子又は組織プラスミノーゲンアクチベーターなどのタンパク質、血栓剤または抗血管新生剤、例えば、アンギオテンシンまたはエンドスタチン、またはリンホカイン、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）または他の成長因子および免疫グロブリンなどの生物学的応答修飾物質が挙げられるが、それらに限定されない。
【００７３】
他のエフェクター分子は、例えば診断において有用な検出可能な物質を含みうる。検出可能な物質の例としては、様々な酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射性核種、陽電子放出金属（陽電子放出断層撮影に使用するため）、および非放射性常磁性金属イオンが挙げられる。診断薬として使用するために抗体に結合されることができる金属イオンについては、一般的に、ＵＳ４，７４１，９００を参照されたい。適切な酵素としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータガラクシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられ；適切な補欠分子族としては、ストレプトアビジンおよびビオチンが挙げられ；適切な蛍光物質としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルレセイン、ダンシルクロリドおよびフィコエリトリンが挙げられ；適切な発光物質としては、ルミノールが挙げられ；適切な生物発光物質としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンが挙げられ；および適切な放射性核種としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎおよび９９Ｔｃが挙げられる。
【００７４】
別の態様において、エフェクター分子は、インビボで抗体の半減期を増加させ、および／または抗体の免疫原性を低下させ、および／または免疫系に対する上皮バリアを通る抗体の送達を増強しうる。このタイプの適切なエフェクター分子の例としては、ポリマー、アルブミン、ＷＯ０５／１１７９８４に記載されているようなアルブミン結合タンパク質またはアルブミン結合化合物が挙げられる。
エフェクター分子がポリマーである場合、それは、一般的に、合成または自然に発生するポリマー、例えば、任意に置換された直鎖または分枝鎖ポリアルキレン、ポリアルケニレンまたはポリオキシアルキレンポリマーまたは分枝または非分枝多糖類、例えば、ホモ−またはヘテロ−ポリサッカライドであり得る。
【００７５】
上記合成ポリマーに存在し得る特定の任意の置換基は、１つ以上の水酸基、メチル基またはメトキシ基を含む。
合成ポリマーの特定の例としては、任意に置換された直鎖または分枝鎖ポリ（エチレングリコール）、ポリ（プロピレングリコール）ポリ（ビニルアルコール）またはその誘導体、特に、メトキシポリ（エチレングリコール）またはその誘導体など任意に置換されたポリ（エチレングリコール）が挙げられる。
特定の自然に生じるポリマーとしては、ラクトース、アミロース、デキストラン、グリコーゲンまたはそれらの誘導体が挙げられる。
【００７６】
本明細書中で使用される場合、「誘導体」は、反応性誘導体、例えば、マレイミドなどのようなチオール選択的反応性基を含むことが意図される。反応性基は、ポリマーに直接またリンカーセグメントを介して結合され得る。そのような基の残基は、場合によっては、抗体断片およびポリマーの間の結合基として生成物の一部を形成するだろうことが理解されるだろう。
【００７７】
ポリマーのサイズは、所望の場合、変えることができ、一般的に、５００Ｄａ〜５００００Ｄａ、例えば、２００００Ｄａ〜４００００Ｄａなど５０００Ｄａ〜４００００Ｄａの平均分子量範囲であるだろう。ポリマーサイズは、特に、生成物の意図される使用、例えば、腫瘍などの特定の組織に局在するか、または循環半減期を延長する能力に基づいて選択され得る（レビューのために、Ｃｈａｐｍａｎ, ２００２, Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ, ５４, ５３１−５４５参照）。したがって、例えば、生成物が循環を離れて、組織に浸透することが意図される場合、例えば、腫瘍の治療での使用のために、例えば、約５０００Ｄａの分子量を有する低分子量ポリマーを使用することが有利であり得る。生成物が、循環中に留まる用途では、例えば、２００００Ｄａ〜４００００Ｄａの範囲の分子量を有する、より高い分子量を使用することが有利であり得る。
適切なポリマーとしては、ポリ（エチレングリコール）または、特に、メトキシポリ（エチレングリコール）またはその誘導体、および特に、約１５０００Ｄａ〜約４００００Ｄａの範囲の分子量を有するなどのポリアルキレンポリマーが挙げられる。
【００７８】
１つの態様において、本開示で使用のための抗体は、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）部分に結合される。１つの特定の例において、抗体は、抗体断片であり、ＰＥＧ分子は、抗体断片に位置する任意の利用可能なアミノ酸側鎖または末端アミノ酸官能基、例えば、任意の遊離アミノ、イミノ、チオール、水酸基またはカルボキシル基であり得る。そのようなアミノ酸は、抗体断片中で自然に生じ得る、または組換えＤＮＡ法を使用して断片中に改変され得る（例えば、ＵＳ５，２１９，９９６；ＵＳ ５，６６７，４２５； ＷＯ９８／２５９７１、ＷＯ２００８／０３８０２４参照）。１つの態様において、本発明の抗体分子は、修飾Ｆａｂ断片であり、ここで、その修飾は、エフェクター分子の結合を可能にするためのその重鎖のＣ末端への１つ以上のアミノ酸の追加である。適切には、追加のアミノ酸は、エフェクター分子が結合し得る１つ以上のシステイン残基を含む修飾されたヒンジ領域を形成する。複数の部位は、２つ以上のＰＥＧ分子を結合するために使用されることができる。
【００７９】
適切には、ＰＥＧ分子は、抗体断片に位置する少なくとも１つのシステイン残基のチオール基を介して共有結合される。修飾抗体断片に結合した各ポリマー分子は、断片に位置するシステイン残基の硫黄原子に共有結合され得る。共有結合は、一般的に、ジスルフィド結合、または特に、硫黄−炭素結合であるだろう。チオール基が結合点として適切に使用される場合、活性化されるエフェクター分子、例えば、マレイミドおよびシステイン誘導体などのチオール選択的誘導体が使用され得る。活性化されたポリマーは、上記のようなポリマー修飾抗体断片の調製で、出発物質として使用され得る。活性化されたポリマーは、α−ハロカルボン酸またはエステル、例えば、ヨードアセトアミド、イミド、例えば、マレイミド、ビニルスルホンまたはジスルフィドなどのチオール反応性基を含む任意のポリマーであってもよい。そのような出発物質は、商業的に得られうる（例えば、Ｎｅｋｔａｒ、以前は、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ Ｉｎｃ., Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ, ＡＬ, ＵＳＡから）、または従来の化学的手順を使用して市販の出発物質から調製され得る。特定のＰＥＧ分子は、２０Ｋメトキシ−ＰＥＧ−アミン（Ｎｅｋｔａｒ、以前は、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ； Ｒａｐｐ Ｐｏｌｙｍｅｒｅ；およびＳｕｎＢｉｏから入手可能）およびＭ−ＰＥＧ−ＳＰＡ（Ｎｅｋｔａｒ、以前は、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒから入手可能）を含む。
【００８０】
１つの態様において、分子中のＦ（ａｂ’）２、ＦａｂまたはＦａｂ’は、ＰＥＧ化され、すなわち、ＰＥＧ（ポリ（エチレングリコール））を共有結合させており、例えば、ＥＰ０９４８５４４またはＥＰ１０９００３７で開示される方法に従う［また「Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ） Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ, Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（ポリ（エチレングリコール）化学、バイオ技術的および生物医学的適用）」、１９９２年, Ｊ. Ｍｉｌｔｏｎ Ｈａｒｒｉｓ （ｅｄ）、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ, Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ,、「Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ） Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（ポリ（エチレングリコール）化学、および生物学的適用）」、１９９７年, Ｊ. Ｍｉｌｔｏｎ ＨａｒｒｉｓおよびＳ. Ｚａｌｉｐｓｋｙ （ｅｄｓ）, Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ, Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ＤＣおよび「Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｕｐｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（生物医科学のためのバイオコンジュゲーションタンパク質のカップリング技術）」、１９９８年, Ｍ. ＡｓｌａｍおよびＡ. Ｄｅｎｔ, Ｇｒｏｖｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ, Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ； Ｃｈａｐｍａｎ, Ａ. ２００２, Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２００２, ５４：５３１−５４５参照］。１つの態様において、ＰＥＧは、ヒンジ領域のシステインに結合される。１つの例において、ＰＥＧ修飾Ｆａｂ断片は、修飾ヒンジ領域において単一のチオール基に共有結合するマレイミド基を有する。リジン残基は、マレイミド基に共有結合されてもよく、リジン残基上のアミノ基のそれぞれは、約２０，０００Ｄａの分子量を有するメトキシポリ（エチレングリコール）ポリマーに結合され得る。したがって、Ｆａｂ断片に結合したＰＥＧの総分子量は、約４０，０００Ｄａであり得る。
【００８１】
特定のＰＥＧ分子として、ＰＥＧ２ＭＡＬ４０Ｋ（Ｎｅｋｔａｒ、以前は、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒから入手可能）としても知られる、Ｎ，Ｎ’−ビス（メトキシポリ（エチレングリコール）分子量２０，０００修飾リジンの２−［３−（Ｎ−マレイミド）プロピオンアミド］エチルアミド）が挙げられる。
ＰＥＧリンカーの代替供給源は、ＧＬ２−４００ＭＡ２（ここで、以下の構造中のｍは、５である）およびＧＬ２−４００ＭＡ（ここで、ｍは２である）を供給するＮＯＦを含み、ｎは、約４５０である：
【化１】
0006765974.tif 000006
すなわち、各ＰＥＧは、約２０，０００Ｄａである。
【００８２】
さらに、以下のタイプの代替ＰＥＧエフェクター分子は、Ｄｒ Ｒｅｄｄｙ、ＮＯＦおよびＪｅｎｋｅｍから入手可能である：
【化２】
0006765974.tif 000007
【００８３】
１つの態様において、ＰＥＧ化され（例えば、本明細書中に記載されるＰＥＧと一緒に）、（連続した番号付けによる）鎖中のアミノ酸２２６またはその周囲で、例えば重鎖のアミノ酸２２６で、システインアミノ酸残基を介して結合される抗体分子を供給する。
１つの態様において、本開示の分子をコードするポリヌクレオチド配列、例えば、ＤＮＡ配列を提供する。
【００８４】
１つの態様において、例えば、以下の本開示の分子の２以上、または３以上のポリペプチド成分など、１つ以上をコードするポリヌクレオチド配列を提供する：
ａ）式（Ｉ）：ＶＨ−ＣＨ１−Ｘ−Ｖ１のポリペプチド鎖；および
ｂ）式（ＩＩ）：ＶＬ−ＣＬ−Ｙ−Ｖ２のポリペプチド鎖
ここで、ＶＨは、重鎖可変ドメインを表し；
ＣＨ１は、重鎖定常領域のドメイン、例えば、そのドメイン１を表し；
Ｘは、結合またはリンカーを表し；
Ｙは、結合またはリンカーを表し；
Ｖ１は、ｄｓＦｖ、ｓｄＡｂ、ｓｃＦｖまたはｄｓｓｃＦｖを表し；
ＶＬは、軽鎖可変ドメインを表し；
ＣＬは、Ｃκなどの軽鎖定常領域からのドメインを表し；
Ｖ２は、ｄｓＦｖ、ｓｄＡｂ、ｓｃＦｖまたはｄｓｓｃＦｖを表し；
ここで、Ｖ１またはＶ２の少なくとも１つは、ｄｓＦｖまたはｄｓｓｃＦｖである。
【００８５】
１つの態様において、ＤＮＡなどのポリヌクレオチドは、ベクター中に含まれる。
当業者は、Ｖ１および／またはＶ２がｄｓＦｖを表す場合、多重特異性抗体は、ＸまたはＹに結合しない相当する遊離ＶＨまたはＶＬをコードする第３のポリペプチドを含むことを理解するだろう。したがって、本発明の多重特性タンパク質は、１以上、２以上または３以上のポリヌクレオチドによってコードされ得、これらは、１以上のベクター中に組み込まれ得る。
【００８６】
ベクターが構築され得る一般的な方法、トランスフェクション方法および培養方法は、当業者に周知である。これに関しては、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（分子生物学における最新のプロトコル）」、１９９９年, Ｆ. Ｍ. Ａｕｓｕｂｅｌ （ｅｄ）, Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ, Ｎｅｗ ＹｏｒｋおよびＣｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇによって製造されたＭａｎｉａｔｉｓ Ｍａｎｕａｌ（マニアティスマニュアル）を参照されたい。
また、本発明の多重特異性タンパク質をコードする１以上のＤＮＡ配列を含む１以上のクローニングまたは発現ベクターを含む宿主細胞も提供する。任意の適切な宿主細胞／ベクター系は、本発明の抗体分子をコードするＤＮＡ配列の発現のために使用され得る。細菌、例えば、大腸菌および他の微生物系が使用されてもよく、または真核生物、例えば、哺乳動物、宿主細胞発現系を使用してもよい。適切な哺乳動物宿主細胞は、ＣＨＯ、骨髄腫、ＮＳＯ骨髄腫細胞およびＳＰ２細胞、ＣＯＳ細胞またはハイブリドーマ細胞を含む。
【００８７】
本開示はまた、本発明の多重特異性タンパク質をコードするＤＮＡからのタンパク質の発現を導き、多重特異性タンパク質を単離するのに適した条件下で、本発明のベクターを含む宿主細胞を培養することを含む本開示による多重特異性タンパク質の生産のためのプロセスを提供する。
重および軽鎖の両方を含む生成物の生産のために、細胞株は、軽鎖ポリペプチドをコードする第１のベクターおよび重鎖ポリペプチドをコードする第２のベクターの２つのベクターでトランスフェクトされ得る。あるいは、単一ベクターを使用してもよく、ベクターは、軽鎖および重鎖ポリペプチドをコードする配列を含む。１つの例において、細胞株は、２つのベクターでトランスフェクトされ得、それぞれが、本発明の抗体分子のポリペプチド鎖をコードする。Ｖ１および／またはＶ２はがｄｓＦｖである場合、細胞株は、３つのベクターでトランスフェクトされ得、それぞれが、本発明の多重特異性タンパク質のポリペプチド鎖をコードする。
【００８８】
１つの態様において、細胞株は、
ａ）式（Ｉ）：ＶＨ−ＣＨ１−Ｘ−Ｖ１のポリペプチド鎖；および
ｂ）式（ＩＩ）：ＶＬ−ＣＬ−Ｙ−Ｖ２のポリペプチド鎖
から選択される異なるポリペプチドを各々がコードする２つのベクターでトランスフェクトされ、
ここで、ＶＨは、重鎖可変ドメインを表し；
ＣＨ１は、重鎖定常領域のドメイン、例えば、そのドメイン１を表し；
Ｘは、結合またはリンカーを表し；
Ｙは、結合またはリンカーを表し；
Ｖ１は、ｄｓＦｖ、ｓｄＡｂ、ｓｃＦｖまたはｄｓｓｃＦｖを表し；
ＶＬは、軽鎖可変ドメインを表し；
ＣＬは、Ｃκなどの軽鎖定常領域からのドメインを表し；
Ｖ２は、ｄｓＦｖ、ｓｄＡｂ、ｓｃＦｖまたはｄｓｓｃＦｖを表し；
ここで、Ｖ１またはＶ２の少なくとも１つは、ｄｓＦｖまたはｄｓｓｃＦｖである。
【００８９】
１つの態様において、Ｖ１がｄｓＦｖであり、Ｖ１のＶＨドメインがＸに結合される場合、細胞株は、Ｖ１のＶＬドメインをコードする第３のベクターでトランスフェクトされ得る。
１つの態様において、Ｖ１がｄｓＦｖであり、Ｖ１のＶＬドメインがＸに結合される場合、細胞株は、Ｖ１のＶＨドメインをコードする第３のベクターでトランスフェクトされ得る。
１つの態様において、Ｖ２がｄｓＦｖであり、Ｖ２のＶＨドメインがＹに結合される場合、細胞株は、Ｖ２のＶＬドメインをコードする第３のベクターでトランスフェクトされ得る。
１つの態様において、Ｖ２がｄｓＦｖであり、Ｖ２のＶＬドメインがＹに結合される場合、細胞株は、Ｖ２のＶＨドメインをコードする第３のベクターでトランスフェクトされ得る。
１つの態様において、Ｖ１およびＶ２の両方がｄｓＦｖであり、Ｖ２のＶＬドメインがＹに結合され、Ｖ１のＶＬドメインがＸに結合される場合、細胞株はＶ１およびＶ２の両方の共通のＶＨドメインをコードする第３のベクターでトランスフェクトされ得る。
１つの態様において、Ｖ１およびＶ２の両方がｄｓＦｖであり、Ｖ２のＶＨドメインがＹに結合され、Ｖ１のＶＨドメインがＸに結合される場合、細胞株はＶ１およびＶ２の両方の共通のＶＬドメインをコードする第３のベクターでトランスフェクトされ得る。
【００９０】
宿主細胞中にトランスフェクトされる各ベクターの比率は、多重特異性抗体生成物の発現を最適化するために変えることができることが理解されるだろう。１つの態様において、２つのベクターが使用される場合、ベクターの比は１：１であってもよい。１つの態様において、３つのベクターが使用される場合、ベクターの比は１：１：１であってもよい。当業者は、トランスフェクション後のタンパク質発現レベルの日常的な試験に最適な比を見つけることができることが理解されるだろう。代わりにまたは加えて、各ベクターからの多重特異性コンストラクトの各ポリペプチド鎖の発現のレベルは、同じまたは異なるプロモーターを使用することによって制御され得る。
【００９１】
ポリペプチド成分の２つ以上または、存在する場合３つは、単一ベクターでポリヌクレオチドによってコードされ得ることが理解されるだろう。また、ポリペプチド成分の２つ以上、特に３つ以上が、単一ベクターでポリヌクレオチドによってコードされる場合、各ポリペプチド成分の相対的発現は、本開示のポリペプチド成分をコードする各ポリヌクレオチドに対して異なるプロモーターを利用することによって変えることができることが理解されるだろう。
１つの態様において、ベクターは、単一プロモーターの制御下で、本発明の多重特異性抗体分子の２つ、または存在する場合３つのポリペプチド鎖をコードする単一ポリヌクレオチド配列を含む。
【００９２】
１つの態様において、ベクターは、本開示の多重特異性抗体分子の２つ、または、存在する場合３つのポリペプチド鎖をコードする単一のポリヌクレオチド配列を含み、ここで、各ポリペプチド鎖をコードする各ポリヌクレオチド配列は、異なるプロモーターの制御下にある。
本開示に係る多重特異性タンパク質は、宿主細胞からの良好なレベルで発現される。したがって、抗体および／または断片の特性は、最適化され、商業的処理につながるようである。
【００９３】
有利には、本開示の多重特異性抗体分子は、精製後に見られる凝集の量を最小化し、医薬濃度でコンストラクトの製剤中のモノマーの量を最大化し、例えば、モノマーは、総タンパク質の５０％、６０％、７０％または７５％以上、８０または９０％以上など、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％以上などとして存在し得る。１つの例において、本開示の多重特異性抗体分子の精製されたサンプルは、４℃で２８日の保存後、９８％または９９％より大きい単量体のままである。１つの例において、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中５ｍｇ／ｍｌで本開示の多重特異性抗体分子の精製されたサンプルは、４℃で２８日の保存後、９８％より大きい単量体のままである。
【００９４】
本開示の抗体分子およびそれを含む組成物は、治療、例えば、病理学的状態の治療および／または予防で有用である。
本開示はまた、薬学的に許容可能な賦形剤、希釈剤または担体の１つ以上と組み合わせて本開示の抗体分子を含む医薬組成物または診断用組成物を提供する。したがって、特に本明細書中に開示される適用のために、治療での使用および医薬の製造のための本開示の抗体の使用を提供する。
組成物は、通常、薬学的に許容可能な担体を含む滅菌した医薬組成物の一部として供給されるだろう。本開示の医薬組成物は、薬学的に許容可能なアジュバントをさらに含み得る。
【００９５】
本開示はまた、１つ以上の薬学的に許容可能な賦形剤、希釈剤または担体と一緒に本開示の抗体分子を添加および混合することを含む医薬組成物または診断用組成物の調製のための方法を提供する。
抗体分子は、医薬組成物または診断用組成物中の唯一の活性成分であってもよく、または他の抗体成分、例えば、抗ＩＬ−１β、抗Ｔ細胞、抗ＩＦＮγまたは抗ＬＰＳ抗体、またはキサンチンなどの非抗体成分を含む他の活性成分を伴ってもよい。他の適切な活性成分として、耐性を誘導することができる抗体、例えば、抗ＣＤ３または抗ＣＤ４抗体が挙げられる。
さらなる態様において、本開示に係る抗体、断片または組成物は、さらなる薬学的に活性な薬剤と組み合わせて使用される。
【００９６】
医薬組成物は、本発明の抗体分子の治療有効量を適切に含む。本明細書中で使用される場合、用語「治療有効量」は、標的の疾患または状態を治療、改善または予防するため、または検出可能な治療または予防効果を示すために必要な治療剤の量を指す。任意の抗体について、治療有効量は、細胞培養アッセイまたは動物モデルのいずれかで、通常げっ歯類、ウサギ、イヌ、ブタまたは霊長類で最初に推定されることができる。動物モデルはまた、適切な濃度範囲および投与経路を決定するために使用され得る。次に、そのような情報は、ヒトにおける投与のために有用な用量および投与経路を決定するために使用されることができる。
【００９７】
ヒト対象に対する正確な治療有効量は、疾患状態の重篤度、対象の一般的な健康状態、対象の年齢、体重および性別、食事、投与の時間および頻度、薬物の組み合わせ（複数可）、反応感受性および治療に対する耐性／応答に依存するだろう。この量は、日常的な実験によって決定されることができ、臨床医の判断の範囲内である。一般的には、治療有効量は、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、例えば、０．１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇであるだろう。あるいは、用量は、１日当たり１〜５００ｍｇ、例えば、１日当たり１０〜１００、２００、３００または４００ｍｇであり得る。医薬組成物は、本発明の活性剤の所定量を含む単位用量フォームで従来通り提供されうる。
【００９８】
組成物は、患者に個々に投与されてもよく、または他の薬剤、薬物またはホルモンと組み合わせて（例えば、同時に、連続してまたは別々に）投与されてもよい。
本開示の抗体分子が投与される用量は、治療される状態の性質、存在する炎症の程度および抗体分子が予防的にまたは既存の状態を治療するために使用されているか否かに依存する。
投与の頻度は、抗体分子の半減期およびその効果の持続時間に依存するだろう。抗体分子が短い半減期（例えば、２〜１０時間）を有する場合、１日に１回以上の投与を与えることが必要であり得る。あるいは、抗体分子が長い半減期（例えば、２〜１５日）を有する場合、１日１回、１週間に１回、または１、２ヶ月ごとに１回の投与のみで足り得る。
【００９９】
薬学的に許容可能な担体は、組成物を受ける個体に有害な抗体の生産を誘導すべきではなく、有害であってはならない。適切な担体は、タンパク質、ポリペプチド、リポソーム、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマー性アミノ酸、アミノ酸コポリマーおよび不活性ウイルス粒子などの大きく、ゆっくり代謝される巨大分子であってもよい。
薬学的に許容可能な塩は、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩および硫酸塩などの鉱酸塩、または酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩および安息香酸塩などの有機酸の塩を使用することができる。
【０１００】
治療組成物中の薬学的に許容可能な担体は、水、生理食塩水、グリセロールおよびエタノールなどの液体をさらに含み得る。さらに、湿潤剤または乳化剤またはｐＨ緩衝物質などの補助物質は、そのような組成物中に存在し得る。そのような担体は、患者による摂取のために、錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリーおよび懸濁液として処方される医薬組成物を可能にする。
投与のための適切なフォームは、例えば、注射または注入によって、例えば、ボーラス注入法または連続注入による適切な非経口投与のフォームを含む。生成物が注射または注入用である場合、油性または水性賦形剤中の懸濁液、溶液または乳濁液のフォームをとってもよく、懸濁剤、保存剤、安定化剤および／または分散剤などの処方剤を含み得る。あるいは、抗体分子は、適切な滅菌液体との使用前の再構成のために、乾燥フォームであり得る。
【０１０１】
処方されると、本発明の組成物は、対象に直接投与されることができる。治療される対象は、動物であることができる。しかしながら、１つ以上の態様において、組成物は、ヒト対象への投与のために適合される。
１つの態様において、本開示に係る製剤において、最終製剤のｐＨは、抗体または断片の等電点の値に類似せず、製剤のｐＨが７である場合、８〜９またはそれ以上のｐＩが適切であり得る。理論に縛られることを望まないが、これは、最終的に、改善された安定性を有する最終製剤を提供し得ることが考えられ、例えば、抗体または断片が溶液中に残ったままである。
【０１０２】
本開示の医薬組成物は、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、髄腔内、脳室内、経皮、経皮的（例えば、ＷＯ９８／２０７３４参照）、皮下、腹腔内、鼻腔内、経腸、局所、舌下、膣内または直腸経路を含む任意の多くの経路によって投与され得るが、それらに限定されない。皮下噴霧器はまた、本発明の医薬組成物を投与するために使用され得る。典型的には、治療用組成物は、液体溶液または懸濁液のいずれかとして、注射剤として調製され得る。注射前の液体賦形剤中の溶液、または懸濁液に適した固体フォームはまた、調製され得る。好ましくは、本発明の抗体分子は、皮下、吸入または局所投与される。
【０１０３】
組成物の直接送達は、一般的に、注射、皮下、腹腔内、静脈内または筋肉内によって達成され、または組織の間質腔に送達される。組成物はまた、目的の特定の組織中に投与されることができる。投薬治療は、単回投与スケジュールまたは複数回投与スケジュールであってもよい。
組成物中の活性成分は、抗体分子であることが理解されるだろう。このように、消化管における分解を受けやすいだろう。したがって、組成物が、消化管を使用する経路によって投与される場合、組成物は、分解から抗体を保護するが、消化管から吸収された後に抗体を放出する薬剤を含む必要があるだろう。
【０１０４】
薬学的に許容可能な担体の徹底的な議論は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ‘ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎの薬学）（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ, Ｎ.Ｊ. １９９１年）で利用可能である。
１つの態様において、製剤は、吸入を含む局所投与のための製剤として提供される。
適切な吸入可能な製剤は、吸入可能な粉末、噴射剤ガスを含む計量エアロゾルまたは噴射剤ガスを含まない吸入可能な溶液（噴霧可能な溶液または懸濁液など）を含む。活性物質を含む本開示に係る吸入可能な粉末は、上記活性物質単独または生理学的に許容可能な賦形剤との上記活性物質の混合物からなり得る。
【０１０５】
これらの吸入可能な粉末は、単糖類（例えば、グルコースまたはアラビノース）、二糖類（例えば、ラクトース、サッカロース、マルトース）、オリゴ糖および多糖類（例えば、デキストラン）、ポリアルコール（例えば、ソルビトール、マンニトール、キシリトール）、塩類（例えば、塩化ナトリウム、炭酸カルシウム）または互いにこれらの混合物を含み得る。単糖類または二糖類は、好適に使用され、ラクトースまたはグルコースの使用は、特に限定されないが、それらの水和物のフォームで使用される。
肺での沈着のための粒子は、１０ミクロン未満、１〜９ミクロン、例えば０．１〜５μｍ、特に１〜５μｍなどを必要とする。活性剤（抗体または抗体断片など）の粒径は、最も重要である。
【０１０６】
吸入可能なエアロゾルを調製するために使用されることができる噴霧ガスは、当該技術分野において公知である。適切な噴霧ガスは、ｎ−プロパン、ｎ−ブタンまたはイソブタンなどの炭化水素またはメタン、エタン、プロパン、ブタン、シクロプロパンまたはシクロブタンの塩化および／またはフッ素化誘導体などのハロ炭化水素の間から選択される。上記の噴霧ガスは、それら自体またはその混合物で使用され得る。
特に、適切な噴霧ガスは、ＴＧ １１、ＴＧ １２、ＴＧ １３４ａおよびＴＧ２２７の間から選択されるハロゲン化アルカン誘導体である。上記のハロゲン化炭化水素のうち、ＴＧ １３４ａ（１，１，１，２−テトラフルオロエタン）およびＴＧ２２７（１，１，１，２，３，３，３−ヘプタフルオロプロパン）およびそれらの混合物が特に適している。
【０１０７】
噴霧ガス含有吸入可能なエアロゾルはまた、共溶媒、安定剤、界面活性剤（ｓｕｒｆａｃｅ−ａｃｔｉｖｅ ａｇｅｎｔｓ、ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ）、抗酸化剤、潤滑剤およびｐＨ調整手段などの他の成分を含み得る。全てのこれらの成分は、当該分野で公知である。
本発明に係る噴霧ガス含有吸入可能なエアロゾルは、活性物質の重量で５％までを含み得る。本発明に係るエアロゾルは、例えば、活性の０.００２〜５重量％、０．０１〜３重量％、０．０１５〜２重量％、０．１〜２重量％、０．５〜２重量％または０．５〜１重量％を含む。
あるいは、肺への局所投与は、液体溶液または懸濁製剤の投与によってであり得、例えば、圧縮機に接続される噴霧器（例えば、Ｐａｒｉ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ, Ｉｎｃ., Ｒｉｃｈｍｏｎｄ, Ｖａによって製造されるＰａｒｉ Ｍａｓｔｅｒ（登録商標）圧縮機に接続されるＰａｒｉ ＬＣ−Ｊｅｔ Ｐｌｕｓ（登録商標）噴霧器）などのデバイスを使用する。
【０１０８】
１つの態様において、製剤は、噴霧による送達のための単位用量を含む別個のアンプルとして提供される。
１つの態様において、抗体は、凍結乾燥のフォームで、再構成のためにまたは懸濁液製剤として代わりに供給される。
本開示の抗体は、例えば、溶液または懸濁液のフォームで、溶媒中に分散されて送達されることができる。適切な生理学的溶液、例えば、生理食塩水、薬学的に許容可能な溶媒または緩衝用溶液に懸濁されることができる。当該分野で公知の緩衝溶液は、水１ｍｌ当たり０．０５ｍｇ〜０．１５ｍｇのエデト酸二ナトリウム、８．０ｍｇ〜９．０ｍｇのＮａＣｌ、０．１５ｍｍｇ〜０．２５ｇのポリソルベート、０．２５ｍｇ〜０．３０ｍｇの無水クエン酸、および０．４５ｍｇ〜０．５５ｍｇのクエン酸ナトリウムを含むので、約４．０〜５．０のｐＨを達成し得る。上記のように、懸濁液は、例えば、凍結乾燥された抗体から作製されることができる。
【０１０９】
治療用懸濁液または溶液製剤はまた、１つ以上の賦形剤を含むことができる。賦形剤は、当該分野で周知であり、緩衝剤（例えば、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液および重炭酸緩衝液）、アミノ酸、尿素、アルコール、アスコルビン酸、リン脂質、タンパク質（例えば、血清アルブミン）、ＥＤＴＡ、塩化ナトリウム、リポソーム、マンニトール、ソルビトール、およびグリセロールを含む。溶液または懸濁液は、リポソームまたは生物分解性ミクロオスフェアに封入されることができる。製剤は、一般的に、滅菌製造プロセスを用いて実質的に無菌のフォームで供給されるだろう。
これは、製剤に使用される緩衝化溶媒溶液のろ過、滅菌緩衝化溶媒溶液中の抗体の無菌懸濁液、および当業者によく知られている方法による無菌容器への製剤の調剤による生成物および殺菌を含み得る。
【０１１０】
本開示に係る噴霧可能な製剤は、例えば、ホイルエンベロープで包装された単回投与単位（例えば、密閉されたプラスチック容器またはバイアル）として提供され得る。各バイアルは、溶媒／溶液緩衝液の体積、例えば、２ｍｌの単位用量を含む。
本開示の抗体は、噴霧による送達に適していると考えられる。
また、本発明の抗体は、遺伝子治療の使用によって投与され得ると予測される。これを達成するために、適切なＤＮＡ成分の制御下で抗体分子の重および軽鎖をコードするＤＮＡ配列が、抗体鎖がＤＮＡ配列から発現され、その場で組み立てられるように、患者に導入される。
【０１１１】
病理学的状態または疾患は、例えば、感染症（ウイルス性、細菌性、真菌性および寄生虫性）、感染症に関連する内毒素ショック、リウマチ性関節炎などの関節炎、重度の喘息などの喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、骨盤内炎症性疾患、アルツハイマー病、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、ペーロニー病、セリアック病、胆嚢疾患、パイロン病、毛巣病、腹膜炎、乾癬、血管炎、外科的癒着、脳卒中、Ｉ型糖尿病、ライム病、髄膜脳炎、自己免疫性ブドウ膜炎、多発性硬化症、紅斑性狼瘡（全身性エリテマトーデスなど）およびギラン・バレー症候群などの中枢および末梢神経系の免疫媒介性炎症性疾患、アトピー性皮膚炎、自己免疫性肝炎、線維化性肺胞炎、グレーブス病、ＩｇＡ腎症、特発性血小板減少性紫斑病、メニエール病、天疱瘡、原発性胆汁性肝硬変、サルコイドーシス、強皮症、ウェゲナー肉芽腫症、他の自己免疫疾患、膵炎、心的外傷（手術）、移植片宿主病、移植による拒絶反応、心筋梗塞ならびにアテローム性動脈硬化症などの虚血性疾患を含む心疾患、血管内凝固、骨吸収、骨粗しょう症、変形性関節症、歯周炎および低塩酸症からなる群から選択され得る。
【０１１２】
本開示はまた、疼痛、特に炎症に関連する疼痛の治療または予防における使用のための本発明に係る多重特異性抗体分子を提供する。
したがって、治療で使用するための本発明に係る多重特異性抗体およびそれを使用する治療の方法を提供する。
１つの態様において、多重特異性抗体（特に、本発明に係る抗体または断片）を精製する方法を提供する。
１つの態様において、不純物がカラム上に保持され、抗体が非結合画分で維持されるような非結合モードで陰イオン交換クロマトグラフィーを実施するステップを含む多重特異性抗体（特に、本発明に係る抗体または断片）を精製する方法を提供する。そのステップは、例えば、ｐＨ約６〜８で実施され得る。
【０１１３】
本発明の方法は、例えば、約４〜５のｐＨで実施される陽イオン交換クロマトグラフィーを使用する初期補足ステップをさらに含み得る。
本発明の方法は、生成物を確実にする追加のクロマトグラフィーステップ（複数可）をさらに含んでもよく、不純物に関連する方法は、生成物ストリームから適切に分離される。
精製方法はまた、濃縮および透析ろ過ステップなどの、１以上の限外ろ過ステップを含み得る。
上記で使用されるような精製されたフォームは、少なくとも９０％の純度、例えば、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％ｗ／ｗ以上の純度を意味することが意図される。
エンドトキシンを実質的に含まないとは、一般的に、抗体生成物１ｍｇ当たり１ＥＵ以下、例えば、生成物１ｍｇ当たり０．５または０．１ＥＵのエンドトキシン含量を指すことが意図される。
宿主細胞タンパク質またはＤＮＡを実質的に含まないとは、一般的に、適宜、抗体生成物の１ｍｇ当たり４００μｇ以下、例えば、１ｍｇ当たり１００μｇ以下、特に１ｍｇ当たり２０μｇの宿主細胞タンパクおよび／またはＤＮＡ含量を指すことを意図される。
本発明の抗体分子はまた、診断、例えば、インビボ診断および病態の画像化で使用され得る。
【０１１４】
１つの態様において、以下のステップを含む本発明に係る多重特異性タンパク質コンストラクトを選択する方法を提供する：
ａ）Ｖ１またはＶ２のいずれかが、所定の可変領域対についてｄｓｓｃＦｖである場合に単量体多重特異性タンパク質の収率を決定するステップ
ｂ）（ａ）において試験されたＶ１またはＶ２のいずれかが、同じ可変領域対についてｄｓＦｖである場合、単量体多重特異性タンパク質の収率を決定するステップおよび
ｃ）（ａ）および（ｂ）で得られたモノマーの収率を比較し、最も高い単量体の収率を有する多重特異性タンパク質を選択するステップ。
【０１１５】
典型的には、本発明の方法のステップ（ａ）および（ｂ）における「可変領域対」は、ＶＨおよびＶＬ対である。一般的には、ＶＨおよびＶＬは抗原結合ドメイン、Ｖ１またはＶ２を一緒に形成する。したがって、本発明の方法は、本発明のコンストラクト中のｄｓｓｃＦｖおよびｄｓＦｖの両方として試験されるＶＨおよびＶＬ対を可能にし、ほとんどの単量体コンストラクトは、ステップ（ｃ）で選択される。
【０１１６】
典型的には、本発明の方法のステップ（ａ）および（ｂ）において、収率は、アフィニティークロマトグラフィー後など、精製後に決定される。モノマーの収率は、サイズ排除クロマトグラフィーなど、任意の適切な方法を使用して決定され得る。
【０１１７】
本明細書の文脈における「含む」は、包含することを意味することを意図する。技術的に適切な場合、本発明の態様が組み合わせられ得る。態様は、特定の特徴／要素を含むものとして本明細書中に記載される。本開示はまた、前記特徴／要素からなる、または本質的になる態様を分離することを示す。
特許および出願のような技術的参考文献は、参照により本明細書中に組み込まれる。
本明細書中に具体的かつ明確に記載される任意の態様は、単独または１以上のさらなる態様との組み合わせのいずれかでディスクレーマー（「一部除く」）の基礎を形成し得る。
【０１１８】
本開示は、添付図面に言及する以下の実施例においてのみ例示としてさらに記載される。
【図面の簡単な説明】
【０１１９】
【図１】図１は、本開示のＦａｂ−２ｘｄｓｓｃＦｖおよびＦａｂ−ｄｓｓｃＦｖ−ｄｓＦｖコンストラクトを示す。
【０１２０】
【図２】図２は、プロテインＧ精製、ＨＥＫ２９３発現Ｆａｂ−１ｘｄｓｓｃＦｖ、１ｘｓｃＦｖおよびＦａｂ−２ｘｄｓｓｃＦｖタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。
【０１２１】
【図３】図３は、プロテインＧ精製、ＨＥＫ２９３発現Ｆａｂ−１ｘｄｓｓｃＦｖ、１ｘｓｃＦｖおよびＦａｂ−２ｘｄｓｓｃＦｖタンパク質のＧ３０００ＳＥ ＨＰＬＣ分析を示す。
【０１２２】
【図４】図４  精製ＨＥＫ２９３発現Ｆａｂ−２ｘｄｓｓｃＦｖ＃３タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
【０１２３】
【図５】図５  精製ＨＥＫ２９３発現Ｆａｂ−２ｘｄｓｓｃＦｖ＃３タンパク質のＳ２００ＳＥ ＨＰＬＣ分析。
【０１２４】
【図６】図６は、本開示の様々なプロテインＧ精製Ｆａｂ−ｄｓｓｃＦｖ−ｄｓＦｖコンストラクトのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。  （Ａ）Ｆａｂ−ｄｓｓｃＦｖ−ｄｓｓｃＦｖサンプル。（Ｂ）Ｆａｂ−ｄｓｓｃＦｖ−ｄｓＦｖサンプル。
【０１２５】
【図７】図７は、本開示のプロテインＧ精製Ｆａｂ−ｄｓｓｃＦｖ−ｄｓＦｖコンストラクトのＧ３０００ＳＥ ＨＰＬＣ分析を示す。
【０１２６】
【図８】図８は、還元条件下で本開示に係る様々なコンストラクトのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。
【０１２７】
【図９】図９は、単量体のＦａｂ−１ｘｄｓｓｃＦｖ−１ｘｓｃＦｖおよびＦａｂ−２ｘｄｓｓｃＦｖフォーマットのＧ３０００ＳＥ−ＨＰＬＣ時間経過分析を示す。
【０１２８】
【図１０】図１０は、プロテインＧ精製ＥＸＰｉＨＥＫ発現Ｆａｂ−２ｘｓｃＦｖおよびＦａｂ−２ｘｄｓｓｃＦｖフォーマットのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。
【実施例】
【０１２９】
抗原１に対する抗体断片は、標識化＃１である。
抗原２に対する抗体断片は、標識化＃２である。
抗原３に対する抗体断片は、標識化＃３である。
抗原４に対する抗体断片は、標識化＃４である。
【０１３０】
実施例１：Ｆａｂ−２ｘｄｓｓｃＦｖ
哺乳動物細胞における発現のためのプラスミドの構築
Ｆａｂ＃２−（ＨＣ）ｄｓｓｃＦｖ＃３、（ＬＣ）ｄｓｓｃＦｖ＃４およびＦａｂ＃２−（ＬＣ）ｄｓｓｃＦｖ＃３、（ＨＣ）ｄｓｓｃＦｖ＃４の発現のためのプラスミド（図１参照）は、フレキシブルリンカーＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ［本明細書中でＳ、２ｘＧ４Ｓとも呼ばれる］（配列番号２）を使用する＃２軽鎖のＫｍ３アロタイプヒトκ定常領域のＣ末端にｓｃＦｖ＃３およびｓｃＦｖ＃４を融合させることによって、またはフレキシブルリンカーＳＧＧＧＧＴＧＧＧＧＳ［本明細書中Ｓ、Ｇ４Ｔ、Ｇ４Ｓとも呼ばれる］（配列番号１）を使用して＃２重鎖のγ１アイソタイプヒトγ−１ＣＨ１定常領域のＣ末端にｓｃＦｖ＃３およびＳｃＦｖ＃４を融合することによって構築された。また、点突然変異が、ｖＬ＃３／ｖＬ＃４およびｖＨ＃３／ｖＨ＃４の両方のフレームワーク領域において選択された残基のＤＮＡ配列中に導入された。突然変異（重鎖Ｇ４４Ｃおよび軽鎖Ｇ１００Ｃ）は、Ｆｖ＃３の重および軽鎖の間の鎖間ジスルフィド結合を作製するために導入された。突然変異（重鎖Ｇ４４Ｃおよび軽鎖Ｑ１００Ｃ）は、Ｆｖ＃４の重および軽鎖の間の鎖間ジスルフィド結合を作製するために導入された。
【０１３１】
ｓｃＦｖ＃４およびｄｓｓｃＦｖ＃４をコードする遺伝子断片（ｖＨｖＬおよびｖＬｖＨ配向）は、化学的に製造され、上記で詳細したように、Ｆａｂ＃２に融合して以下のものを生成した：
プラスミドｅ１：Ｌｉｇｈｔ＃２−（ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ［配列番号２］−ｖＬ＃４−（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ［配列暗号６８］）−ｖＨ＃４；
プラスミドｆ１：Ｌｉｇｈｔ＃２−（ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ［配列番号２］−ｄｓｖＬ＃４−（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ［配列暗号６８］）−ｄｓｖＨ＃４；
プラスミドｅ２：Ｌｉｇｈｔ＃２−（ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ［配列番号２］−ｖＨ＃４−（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ［配列暗号６８］）−ｖＬ＃４；
プラスミドｆ２：Ｌｉｇｈｔ＃２−（ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ［配列番号２］−ｄｓｖＨ＃４−（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ［配列暗号６８］）−ｄｓｖＬ＃４；
プラスミドｇ１：Ｈｅａｖｙ＃２−（ＳＧＧＧＧＴＧＧＧＧＳ［配列番号１］−ｖＬ＃４−（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ［配列暗号６８］）−ｖＨ＃４；
プラスミドｈ１：Ｈｅａｖｙ＃２−（ＳＧＧＧＧＴＧＧＧＧＳ［配列番号１］−ｄｓｖＬ＃４−（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ［配列暗号６８］）−ｄｓｖＨ＃４；
プラスミドｇ２：Ｈｅａｖｙ＃２−（ＳＧＧＧＧＴＧＧＧＧＳ［配列番号１］−ｖＨ＃４−（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ［配列暗号６８］）−ｖＬ＃４；
プラスミドｈ２：Ｈｅａｖｙ＃２−（ＳＧＧＧＧＴＧＧＧＧＳ［配列番号１］−ｄｓｖＨ＃４−（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ［配列暗号６８］）−ｄｓｖＬ＃４。
ｐＮＤ１プラスミド（Ｆａｂ＃２Ｈｅａｖｙ−（ＳＧＧＧＧＴＧＧＧＧＳ）［配列番号１］−ｄｓｖＨ＃３−（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）［配列番号６８］−ｄｓｖＬ＃３）［プラスミドｉ］は、すでに入手可能であった。ｄｓＨＬｓｃＦｖ＃３をコードする遺伝子断片は、ｐＮＤ１から切除され、上記で詳述したように軽鎖＃２に融合されて：Ｌｉｇｈｔ＃２−（ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）［配列番号２］−ｄｓｖＨ＃３−（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）［配列番号６８］−ｄｓｖＬ＃３［プラスミドｊ］。
【０１３２】
全てのＦａｂ融合フォーマットは、ＨＣＭＶ−ＭＩＥプロモーターおよびＳＶ４０ＥポリＡ配列の制御下で哺乳動物発現ベクター中にクローニングされた。
【０１３３】
Ｆａｂ−１ｘｄｓｓｃＦｖ−１ｘｓｃＦｖおよびＦａｂ−２ｘｄｓｓＦｖフォーマットのＨＥＫ２９３発現
ＨＥＫ２９３細胞は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎの２９３フェクチントランスフェクション試薬をメーカーの説明通り使用して関連するプラスミドでトランスフェクトされた。プラスミドは、表４で示されるように、混合されて異なるコンストラクトを発現した。
【０１３４】
【表４】
0006765974.tif 000008
【０１３５】
トランスフェクションに使用されたプラスミドの比率は、１：１であった。全部で５０μｇのプラスミドＤＮＡを、１２５μｌの２９３フェクチン＋４．２５ｍｌ Ｏｐｔｉｍｅｍ培地で、２０分間、室温でインキュベートした。次に、その混合物を、１×１０６細胞／ｍｌで懸濁液中で５０ｍｌのＨＥＫ２９３細胞に加え、３７℃で振盪しながらインキュベートした。上清を、１５００ｇで遠心分離によって１０日目に採取して細胞を除去し、その上清を、０．２２μｍフィルターに通した。発現レベルを、プロテイン−Ｇ ＨＰＬＣによって決定した。
【０１３６】
表５は、プロテイン−Ｇ ＨＰＬＣ分析の結果を示す。わかるように、全てのコンストラクトの発現のレベルは、互いに同等であり、１１〜２３μｇ／ｍｌの範囲をカバーする。アスタリスク（＊）で示されたものは、別々のトランスフェクションで発現されたので、ＬＣ−ｓｃＦｖ＃３、ＨＣ−ｓｃＦｖ＃４の絶対発現レベルは、ＨＣ−ｓｃＦｖ＃３、ＬＣ−ｓｃＦｖ＃４と比較されることはできない。
【０１３７】
【表５】
0006765974.tif 000009
【０１３８】
ＨＥＫ２９３発現Ｆａｂ−１ｘｄｓｓｃＦｖ−１ｘｓｃＦｖおよびＦａｂ−２ｘｄｓｓｃＦｖフォーマットのプロテイン−Ｇ精製
約５０ｍｌのＨＥＫ２９３上清を、１０ｋＤａの分子量カットオフ遠心分離濃縮器を使用して、約２ｍｌへと約２５倍に濃縮した。濃縮した上清を、２０ｍＭリン酸塩、４０ｍＭＮａｌ ｐＨ７．４中で平衡化された１ｍｌ ＨｉＴｒａｐプロテイン−Ｇ ＦＦカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用した。カラムを２０ｍＭ リン酸塩、４０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．４で洗浄し、結合物質を、０．１Ｍグリシン／ＨＣｌ ｐＨ２．７で溶出した。溶出ピークを集め、２ＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ８．５で約ｐＨ７．０に調整した。ｐＨ調整された溶出液を濃縮し、１０ｋＤａの分子量カットオフ遠心分離濃縮器を使用してＰＢＳ ｐＨ７．４にｂｕｆｆｅｒ置換した。
【０１３９】
プロテイン−Ｇ精製、ＨＥＫ２９３発現Ｆａｂ−１ｘｄｓｓｃＦｖおよびＦａｂ−２ｘｄｓｓｃＦｖフォーマットのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
サンプル（２μｇ）を、ＰＢＳを用いて、９．７５μｌの体積に希釈し、３．７５μｌ４×ＬＳＤサンプル緩衝液および１．５μｌ １００ｍＭのＮ−エチルマレイミド（非還元サンプル）または１．５μｌの１０×ＮｕＰＡＧＥ還元剤（還元サンプル）を添加した。サンプルをボルテックスし、７０℃で１０分間インキュベートし、冷却し、１２５００ｒｐｍで３０秒間、遠心分離した。調製したサンプルを４〜２０％アクリルアミドＴｒｉｓ／グリシンＳＤＳゲル上に充填し、約１００分間、１２５Ｖ、一定電圧で流した。ＳｅｅＢｌｕｅＰｌｕｓ２（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）分子量ラダーを使用した。ゲルをＩｎｓｔａｎｔ Ｂｌｕｅタンパク質染色（Ｅｘｐｅｄｅｏｎ）で染色し、蒸留水で脱染した。
還元および非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後の予想バンドサイズを表６に示す。
【０１４０】
【表６】
0006765974.tif 000010
【０１４１】
全てのタンパク質について、非還元ゲルは、約１００ｋＤａでバンドを示すと予想されたが、還元ゲルは、両方のバンドで、約５０ｋＤａで同等の染色を有するダブレットを示すと予想された。
全てのＦａｂ−１ｘｄｓｓｃＦｖ−１ｘｓｃＦｖおよびＦａｂ−２ｘｄｓｓｃＦｖタンパク質について、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルは、コンストラクトが、約５０ｋＤａでダブレットを有する移動位置および染色強度の両方に関して正しく発現されていたことを示したバンドパターンを示した（図２Ｂ，Ｄ）。さらなる最上部のマイナーバンドは、非還元性全長タンパク質と一致する。予想通り、ジスルフィド結合多量体は、非還元ゲル上で見られ（図２Ａ、Ｃ）、これは、還元条件下で消失する（図２Ｂ、Ｄ）。非還元ゲル上で、約５０ｋＤａのマイナーバンド（図２Ａ、Ｃ）は、Ｆａｂ領域での重および軽鎖の間での不完全なｄｓバンド形成と一致し得る。
【０１４２】
プロテイン−Ｇ精製、ＨＥＫ２９３発現Ｆａｂ−１ｘｄｓｓｃＦｖ−１ｘｓｃＦｖおよびＦａｂ−２ｘｄｓｓｃＦｖフォーマットのＧ３０００ ＳＥ−ＨＰＬＣ分析
１０μｇ精製タンパク質サンプル（ＰＢＳで希釈した０．１ｍｇ／ｍｌストックの１００μｌ）を、精製後３日目にＴＳＫ Ｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷＸＬ、７．８×３００ｍｍ、カラム（Ｔｏｓｏｈ）上に注入し、１ｍｌ／分で２００ｍＭリン酸塩ｐＨ７．０のアイソクラチック勾配を発現させた。シグナル検出は、２８０ｎｍの吸光度で行った。
【０１４３】
結果を図３に示す。図３からわかるように、プロテイン−Ｇ精製後、Ｆａｂ−１ｘｄｓｓｃＦｖ−１ｘｓｃＦｖおよびＦａｂ−２ｘｄｓｓｃＦｖフォーマットは、８３〜８９％のモノマーであった。
全てのサンプルは、アッセイで類似のモノマーレベルを有し、Ｆｖジスルフィドを欠くｓｃＦｖを含むそれらのサンプルは、動的平衡にある。これは、これらのサンプルに対するアッセイで測定されるモノマー％がサンプルの濃度に依存し、より濃縮されたサンプルは、より高いモノマー％を与え、より濃縮されていないサンプルは、より低いモノマー％を与えることを意味する。対照的に、両方のｓｃＦｖがジスルフィドを含むサンプルは、安定であり、動的平衡でない。したがって、アッセイで測定された％モノマーは、サンプル濃度の変化と一緒に変化しない。
【０１４４】
Ｆａｂ−２ｘｄｓｓｃＦｖフォーマットのモノマーおよび多量体は安定であり、動的平衡ではないので、サンプルは、容易にさらに精製されて％モノマーを増加させることができる。精製された単量体サンプルはまた、所定の製剤中のコンストラクトの濃度が増加しても単量体のままであり、それにより、医薬調製物における使用に非常に適したコンストラクトを作製する。対照的に、Ｆａｂ−２ｘｓｃＦｖは、モノマーとして精製後、ｓｃＦｖドメインのｖＬおよびｖＨの間の分子間動的ドメイン交換に供されることができる。したがって、非凝集フォームは、分析方法の間に使用される希釈ステップ後にモノマーに分解することができるので、二量体、三量体、高次構造および凝集体の形成のリスクが増加することに加えて、そのような分子は、観察が難しい。したがって、Ｆａｂ−２ｘｄｓｓｃＦｖは、医薬組成物の分析中にさらなる透明性を提供する。
【０１４５】
Ｆａｂ−１ｘｄｓｓｃＦｖ−１ｘｓｃＦｖおよびＦａｂ−２ｘｄｓｓｃＦｖフォーマットのＣＨＯＳ発現
ＣＨＯＳ細胞を、１Ｌスケールでエレクトロポレーション法によって関連するプラスミドでトランスフェクトした。プラスミドを、表７で示されるように混合してタンパク質を発現させた。培養物を、２ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸを添加したＣＤ−ＣＨＯ培地で増殖させ、２４時間、１４０ｒｐｍで８％ＣＯ２と一緒に、３７℃でインキュベートし、その後、３２℃でさらに１３日間インキュベートした。トランスフェクション後４日目に、３ｍＭの最終濃度の酪酸ナトリウムを培養物に添加した。トランスフェクション後１４日目に、培養物上清を、遠心分離および滅菌した０．２２μｍフィルターにより採取した。発現力価を、プロテインＧ ＨＰＬＣにより測定した（表８）。
【０１４６】
【表７】
0006765974.tif 000011
【０１４７】
【表８】
0006765974.tif 000012
【０１４８】
ＣＨＯ発現Ｆａｂ−１ｘｄｓｓｃＦｖ−１ｘｓｃＦｖおよびＦａｂ−２ｘｄｓｓｃＦｖフォーマットのプロテイン−Ｇ精製
１ＬのＣＨＯ上清を、１０ｋＤａ分子量カットオフＡｍｉｃｏｎ撹拌セルを使用して約４０ｍｌに約２５倍濃縮した。濃縮した上清を、ランニング緩衝液としてプロテインＧカラムおよびＰＢＳを有するＡＫＴＡ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎシステム上に充填した。結合物質を、０．１Ｍグリシン／ＨＣＬ ｐＨ２．７で溶出し、２Ｍ Ｔｒｉｓ/ＨＣｌ ｐＨ８．５で約ｐＨ７．０に調整した。次に、溶出した材料を、１０ｋＤａの分子量濃縮器を使用して濃縮し、得られた濃縮物を、ランニング緩衝液としてＰＢＳでゲルろ過のためにＳｕｐｅｒｄｅｘカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に充填した。個々の溶出ピークを収集し、サイズ排除ＨＰＬＣによって分析して、単量体画分を決定した。最終単量体タンパク質をＰＢＳ中５ｍｇ／ｍｌに濃縮し、４℃で保存した。
【０１４９】
Ｆａｂ−１ｘｄｓｓｃＦｖ−１ｘｓｃＦｖおよびＦａｂ−２ｘｄｓｓｃＦｖフォーマットのプロテイン−Ｇ精製、ＣＨＯＳ発現単量体画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
サンプル（２μｇ）を、９．７５μｌの体積にＰＢＳで希釈し、３．７５μｌ ４×ＬＤＳサンプル緩衝液および１．５μｌ １００ｍＭ Ｎ−エチルマレイミド（非還元サンプル）または１．５μｌ １０×ＮｕＰＡＧＥ還元剤（還元サンプル）を添加した。サンプルをボルテックスし、７０℃で１０分間インキュベートし、冷却し、１２５００ｒｐｍで３０秒間、遠心分離した。調製したサンプルを４〜２０％アクリルアミドＴｒｉｓ／グリシンＳＤＳゲル上に充填し、約１００分間、１２５Ｖ、一定電圧で流した。Ｍａｒｋ１２（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）分子量ラダーを使用した。ゲルをＩｎｓｔａｎｔ Ｂｌｕｅタンパク質染色（Ｅｘｐｅｄｅｏｎ）で染色し、蒸留水で脱染した。
還元および非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後の予想されるバンドサイズを、表９に示す。
【０１５０】
【表９】
0006765974.tif 000013
【０１５１】
全てのタンパク質について、非還元ゲルは、約１００ｋＤａでバンドを示すと予想されたが、還元ゲルは、両方のバンドで約５０ｋＤａで同等の染色でダブレットを示すと予想された。
全てのＦａｂ−１ｘｄｓｓｃＦｖ−１ｘｓｃＦｖおよびＦａｂ−２ｘｄｓｓｃＦｖタンパク質について、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルは、コンストラクトが単量体であり、移動位置および約５０ｋＤａでダブレットを有する染色強度の両方に関して正確に発現されたことを示すバンディングパターンを示した（図８Ｂ、Ｄ）。さらなる最上部のマイナーバンドは、非還元性全長タンパク質と一致する（図８Ｂ、Ｄ）。全てのタンパク質について、非還元ゲルは、約１００ｋＤａでバンドを示し、完全長タンパク質を示した（図８Ａ、ａ）。非還元ゲル上で約５０ｋＤａのマイナーバンド（図８Ａ、ｂ）は、Ｆａｂ領域で、重および軽鎖の間の不完全なジスルフィド結合形成と一致し得る。
【０１５２】
単量体Ｆａｂ−１ｘｄｓｓｃｃＦｖ−１ｘｓｃＦｖおよびＦａｂ−２ｘｄｓｓｃＦｖフォーマットのＧ３０００ ＳＥ−ＨＰＬＣ時間経過分析
抗体フォーマットの精製モノマーの５ｍｇ／ｍｌを、ＰＢＳ中４℃で保存し、精製後４日目、１４日目および２８日目に分析した。サンプルをＰＢＳで１０μｇに希釈し、ＴＳＫ Ｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷＸＬ, ７．８ｘ３００ｍｍ、カラム（Ｔｏｓｏｈ）上に注入し、１ｍｌ／分で２００ｍＭリン酸塩ｐＨ７．０のアイソクラチック勾配で展開させた。シグナル検出は、２８０ｎｍの吸光度で行った。結果を表９に示す。精製後４日目に、Ｆａｂ−２ｘｄｓｓｃＦｖの分析が示すところによれば、タンパク質の大部分が実験開始時に単量体であり（実線）、時間経過にわたって、単量体で安定なままで、多量体（二量体、三量体、高次数および大きな凝集体）として定義されたのは＜１％であった。一方、多量体化のより高い発生が、時間の経過とともに直線的に増加することが観察されたＦａｂ−１ｘｄｓｓｃＦｖ−１ｘｓｃＦｖについて検出された（破線）。実際に、多量体化の普及は、ＶＬ／ＶＨ配向性で非ジスルフィド安定化ｓｃＦｖを含むフォーマットでより顕著であるようであった。しかしながら、Ｆｖジスルフィドを欠くｓｃＦｖを含むフォーマットは、動的平衡であり、ジスルフィドで安定化されたｓｃＦｖより保存中の多量体化の傾向がより大きいことが明らかである。実際に、両方ともジスルフィドで安定化されたｓｃＦｖを含むフォーマットは、所定の製剤中のタンパク質の濃度が増加する場合でも、単量体のままであることが示されている。これは、両方のｓｃＦｖが、貯蔵期間中に多量体または大きな凝集体の高次を形成する危険性が非常に重要でない必要がある医薬調製物での使用に理想的に適したＦｖジスルフィドを含むコンストラクトを作製する。
【０１５３】
実施例２：Ｆａｂ−２ｘｄｓｓｃＦｖ（同じｄｓｓｃＦｖの２つを有する２価）
哺乳動物細胞における発現のためのプラスミドの構築
Ｆａｂ＃２−（ＨＣ）ｄｓｓｃＦｖ#３、（ＬＣ）ｄｓｓｃＦｖ＃３の発現のためのプラスミド（図４参照）が、フレキシブルリンカーＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ［本明細書中でＳ、２ｘＧ４Ｓとも呼ばれる］（配列番号２）を使用して軽鎖＃２のＫｍ３アロタイプヒトκ定常領域のＣ末端にｄｓｓｃＦｖ＃３を融合することによって、またはフレキシブルリンカーＳＧＧＧＧＴＧＧＧＧＳ［本明細書中でＳ、Ｇ４Ｔ、Ｇ４Ｓとも呼ばれる］（配列番号１）を使用して重鎖＃２のγ１アイソタイプヒトγ−１ＣＨ１定常領域のＣ末端にｄｓｓｃＦｖ＃３を融合することによって、構築された。点突然変異は、ｖＬ＃３／ｖＬ＃１およびｖＨ＃３／ｖＨ＃１の両方のフレームワーク領域で選択された残基でＤＮＡ配列中に導入された。突然変異（重鎖Ｇ４４Ｃおよび軽鎖Ｇ１００Ｃ）が導入され、Ｆｖ＃３の重および軽鎖の間の鎖間ジスルフィド結合を作製した。
【０１５４】
ｐＮＤ１プラスミド（Ｆａｂ＃２重鎖−（ＳＧＧＧＧＴＧＧＧＧＳ［配列番号１］）−ｄｓｖＨ＃３−（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ［配列番号６８］）−ｄｓｖＬ＃３）［プラスミドｉ］は、すでに利用可能であった。ｄｓＨＬｓｃＦｖ＃３をコードする遺伝子断片がｐＮＤ１から切り出され、上記に詳述したように軽鎖＃２に融合させて発生した：軽鎖＃２−（ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ［配列番号２］）−ｄｓｖＨ＃３−（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ［配列番号６８］）−ｄｓｖＬ＃３［プラスミドｊ］。
Ｆａｂ融合フォーマットは、ＨＣＭＶ−ＭＩＥプロモーターおよびＳＶ４０ＥポリＡ配列の制御下、哺乳動物発現ベクター中にクローニングした。
【０１５５】
Ｆａｂ−２ｘｄｓｓｃＦｖ＃３のＨＥＫ２９３発現
ＨＥＫ２９３細胞は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎの２９３フェクチントランスフェクション試薬をメーカーの説明通り使用して関連するプラスミドでトランフェクトされた。プラスミドを、表１０で示されるように混合してタンパク質を発現した。
【０１５６】
【表１０】
0006765974.tif 000014
【０１５７】
トランスフェクションに使用されたプラスミドの比率は１：１であった。全部で５０μｇのプラスミドＤＮＡは、室温で２０分間、１２５μｌ ２９３フェクチン＋４．２５ｍｌ Ｏｐｔｉｍｅｍ培地でインキュベートされた。次に、その混合物を１×１０６細胞／ｍｌで懸濁液中で５０ｍｌのＨＥＫ２９３細胞に加え、３７℃で振盪しながらインキュベートした。上清を１５００ｇでの遠心分離により１０日目に採取し、細胞を除去し、その上清を０．２２μｍフィルターに通した。発現レベルを、プロテイン−Ｇ ＨＰＬＣによって決定した。表１１は、プロテイン−Ｇ ＨＰＬＣアッセイの結果を示す。発現のレベルは、２０μｇ／ｍｌであった。
【０１５８】
【表１１】
0006765974.tif 000015
【０１５９】
ＨＥＫ２９３発現Ｆａｂ−２ｘｄｓｓｃＦｖ＃３の精製
約５０ｍｌ ＨＥＫ２９３の上清を、３０ｋＤａ分子量カットオフ遠心分離濃縮器を使用して、約２ｍｌへと約２５倍に濃縮した。濃縮した上清を精製し、さらに濃縮し、緩衝液を３０ｋＤａ分子量カットオフ遠心分離濃縮器を使用してＰＢＳ ｐＨ７．４中に交換した。
【０１６０】
プロテイン−Ｇ精製、ＨＥＫ２９３発現Ｆａｂ−２ｘｄｓｓｃＦｖ＃３のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
サンプル（２μｇ）を、９．７５μｌの体積にＰＢＳで希釈し、３．７５μｌ ４×ＬＤＳサンプル緩衝液および１．５μｌ １００ｍＭ Ｎ−エチルマレイミド（非還元サンプル）または１．５μｌ １０×ＮｕＰＡＧＥ還元剤（還元サンプル）を添加した。サンプルをボルテックスし、７０℃で１０分間インキュベートし、冷却し、１２５００ｒｐｍで３０秒間、遠心分離した。調製したサンプルを４〜２０％アクリルアミドＴｒｉｓ／グリシンＳＤＳゲル上に充填し、約１００分間、１２５Ｖ、一定電圧で流した。ＳｅｅＢｌｕｅＰｌｕｓ２（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）分子量ラダーを使用した。ゲルをＩｎｓｔａｎｔ Ｂｌｕｅタンパク質染色（Ｅｘｐｅｄｅｏｎ）で染色し、蒸留水で脱染した。還元および非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後の予想されるバンドサイズを、表１２に示す。
【０１６１】
【表１２】
0006765974.tif 000016
【０１６２】
非還元ゲルは、約１００ｋＤａでバンドを示すことが予想されたが、還元ゲルは、両方のバンドで同等の染色で約５０ｋＤａでダブレットを示すと予想された。
還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルは、コンストラクトが、移動位置および約５０ｋＤａでダブレットを有する染色強度の両方に関して正確に発現されていたことを示すバンディングパターンを示したが（図４Ｂ）、しかしながら、いくつかのさらなるマイナー種がまた、Ｆａｂの精製に典型的に使用される標準プロテインＧ媒介精製方法とは対照的に、おそらくは準最適な精製スキームのために可能に観察された。ジスルフィド結合多量体は、非還元ゲル上で見られ（図４Ａ）、これは、還元条件下で消失する（図４Ｂ）。
【０１６３】
精製されたＨＥＫ２９３発現Ｆａｂ−２ｘｄｓｓＦｖ＃３のＳ２００ ＳＥ−ＨＰＬＣ分析
１０μｇ精製タンパク質サンプル（ＰＢＳで希釈した０．１ｍｇ／ｍｌストックの１００μｌ）を、精製後３日にＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０/３００ ＧＬ Ｔｒｉｃｏｒｎ カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に注入し、１ｍｌ／分で、２８０ｎｍの吸光度によって連続検出で、ＰＢＳ ｐＨ７．４のアイソクラチック勾配で展開させた。その結果を図５に示す。図５からわかるように、精製後、Ｆａｂ−２ｘｄｓｓｃＦｖ＃３フォーマットは、８１％モノマーであった。
【０１６４】
実施例３：Ｆａｂ−（ＨＣ）ｄｓｓｃＦｖ−（ＬＣ）ｄｓＦｖ
哺乳動物細胞における発現のためのＦａｂ＃２−（ＨＣ）ｄｓｓｃＦｖ＃３−（ＬＣ）ｄｓｓｃＦｖ＃１およびＦａｂ＃２−（ＨＣ）ｄｓｓｃＦｖ＃３−（ＬＣ）ｄｓＦｖ＃１（ＬＣ−ｖＬ結合）プラスミドの構築
Ｆａｂ＃２−（ＨＣ）ｄｓｓｃＦｖ＃３−（ＬＣ）ｄｓｓｃＦｖ＃１およびＦａ＃２−（ＨＣ）ｄｓｓｃＦｖ＃３−（ＬＣ）ｄｓＦｖ＃１（ＬＣ−ｖＬ結合）の発現のためのＦａｂ＃２融合タンパク質（図６参照）は、フレキシブルリンカーＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号６９）を使用して軽鎖＃２のＫｍ３アロタイプヒトκ定常領域のＣ末端にｄｓｓｃＦｖ＃１（ｄｓｖＨ−４ｘＧ４Ｓ−ｄｓｖＬ）またはｄｓｖＬ＃１のいずれかを融合することによって構築され、
Ｌｉｇｈｔ＃２−（ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ［配列番号６９］）−ｄｓｓｃＦｖ＃１［プラスミドｂ］および
Ｌｉｇｈｔ＃２−（ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ［配列番号６９］）−ｄｓｖＬ＃１［プラスミドｃ］を発生させ；および
フレキシブルリンカーＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＴＧＧＧＧＳ（配列番号７０）を使用してＨｅａｖｙ＃２のγ１アイソタイプヒトγ−ＣＨ１定常領域のＣ末端にＨＬｄｓｓｃＦｖ＃３（ｄｓｖＨ−４ｘＧ４Ｓ−ｄｓｖＬ）を融合することによって構築され、
Ｈｅａｖｙ＃２−（ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＴＧＧＧＧＳ［配列番号７０］）−ｄｓｓｃＦｖ＃３［プラスミドａ］を発生させた。
【０１６５】
点突然変異（重鎖Ｇ４４Ｃおよび軽鎖Ｇ１００Ｃ）が、ｖＬ＃３、ｖＨ＃３、ｖＬ＃１およびｖＨ＃１のフレームワーク領域で選択された残基でＤＮＡ配列中に導入され、Ｆｖ＃３およびＦｖ＃１の重および軽鎖の間の鎖間ジスルフィド結合を作製した。重および軽鎖Ｆａｂ融合遺伝子は、ＨＣＭＶ−ＭＩＥプロモーターおよびＳＶ４０ＥポリＡ配列の制御下で哺乳動物発現ベクター中にクローニングされた。Ｈｅａｖｙ＃２−（ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＴＧＧＧＧＳ［配列番号７０］）−ｄｓｓｃＦｖ＃３［プラスミドａ］およびｄｓｖＨ＃１フリードメイン［プラスミドｄ］をコードする遺伝子は、化学的に製造され、ＨＣＭＶ−ＭＩＥプロモーターおよびＳＶ４０ＥポリＡ配列の制御下で、哺乳動物発現ベクター中に個々にクローニングされた。
ｄｓｓｃＦｖ＃１およびｄｓｖＬ＃１をコードする遺伝子は、化学的に製造され、軽鎖＃２のＣ末端に融合され、Ｌｉｇｈｔ＃２−（ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ［配列番号６９］）−ｄｓｓｃＦｖ＃１［プラスミドｂ］およびＬｉｇｈｔ＃２−（ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ［配列番号６９］）−ｄｓｖＬ＃１＃１［プラスミドｃ］を作製し、全コンストラクトは、ＨＣＭＶ−ＭＩＥプロモーターおよびＳＶ４０ＥポリＡ配列の制御下で哺乳動物発現ベクター中にクローニングされた。
【０１６６】
Ｆａｂ＃２−（ＨＣ）ｄｓｓｃＦｖ＃３−（ＬＣ）ｄｓｓｃＦｖ＃１およびＦａｂ＃２−（ＨＣ）ｄｓｓｃＦｖ＃３−（ＬＣ）ｄｓＦｖ＃１（ＬＣ−ｖＬ結合）のＨＥＫ２９３発現
ＨＥＫ２９３細胞は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎの２９３フェクチントランスフェクション試薬をメーカーの説明通り使用して関連するプラスミドでトオラスフェクトされた。プラスミドは、混合されて以下の表１３で示されるように異なるコンストラクトを発現した。
【０１６７】
【表１３】
0006765974.tif 000017
【０１６８】
２つのプラスミドの組み合わせについて、トランスフェクションに使用されたプラスミドの比率は１：１であったが、３つのプラスミドの組み合わせについて、その比率は１：１：１であった。全部で５０μｇのプラスミドＤＮＡは、室温で２０分間、１２５μｌ ２９３フェクチン＋４．２５ｍｌ Ｏｐｔｉｍｅｍ培地でインキュベートされた。次に、その混合物を１×１０６細胞／ｍｌの懸濁液中で５０ｍｌのＨＥＫ２９３細胞に加え、３７℃で振盪しながらインキュベートした。上清を１５００ｇでの遠心分離により１０日目に採取し、細胞を除去し、その上清を０．２２μｍフィルターに通した。発現レベルを、プロテイン−Ｇ ＨＰＬＣによって決定した。
【０１６９】
結果を表１４に示す。見てわかるように、両方のコンストラクトの発現のレベルが、互いに匹敵した（１６〜１８μｇ／ｍｌ）。文献に、ｖＬおよびｖＨを一緒にもたらすためのｖＬおよびｖＨの間のリンカーまたは二量化モチーフのいずれかを欠くＦｖ領域の発現は、結合したＦｖよりも実質的に低い発現レベルを有することが報告されている。驚くべきことに、これは、コンストラクトの各タイプの発現レベルの間に有意差が観察されなかったこのデータでは観察されない。
【０１７０】
【表１４】
0006765974.tif 000018
【０１７１】
ＨＥＫ２９３発現Ｆａ２＃−（ＨＣ）−ｄｓｓｃＦｖ＃３−（ＬＣ）ｄｓｓｃＦｖ＃１およびＦａｂ＃２−（ＨＣ）ｄｓｓｃＦｖ＃３−（ＬＣ）ｄｓＦｖ＃１（ＬＣ−ｖＬ結合）のプロテイン−Ｇ精製
約５０ｍｌのＨＥＫ２９３上清を、１０ｋＤａの分子量カットオフ遠心分離濃縮器を使用して、約２ｍｌへと約２５倍に濃縮した。濃縮した上清を、２０ｍＭリン酸塩、４０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．４中で平衡化された１ｍｌのＨｉＴｒａｐプロテイン−Ｇ ＦＦカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用した。カラムを２０ｍＭリン酸塩、４０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．４で洗浄し、結合物質を、０．１Ｍグリシン／ＨＣｌ ｐＨ２．７で溶出した。溶出ピークを集め、ｐＨを、２ＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ８．５で約ｐＨ７．０に調整した。ｐＨ調整された溶出液を濃縮し、緩衝液は１０ｋＤａの分子量カットオフ遠心分離濃縮器を使用してＰＢＳ ｐＨ７．４中に交換した。
【０１７２】
プロテイン−Ｇ精製、ＨＥＫ２９３発現Ｆａｂ＃２−（ＨＣ）ｄｓｓｃＦｖ＃３−（ＬＣ）ｄｓｓｃＦｖ＃１およびＦａｂ＃２−（ＨＣ）ｄｓｓｃＦｖ＃３−（ＬＣ）ｄｓＦｖ＃１（ＬＣ−ｖＬ結合）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
サンプル（２μｇ）を、９．７５μｌの体積にＰＢＳで希釈し、３．７５μｌ ４×ＬＤＳサンプル緩衝液および１．５μｌ １００ｍＭ Ｎ−エチルマレイミド（非還元サンプル）または１．５μｌ １０×ＮｕＰＡＧＥ還元剤（還元サンプル）を添加した。サンプルをボルテックスし、７０℃で１０分間インキュベートし、冷却し、１２５００ｒｐｍで３０秒間、遠心分離した。調製したサンプルを４〜２０％アクリルアミドＴｒｉｓ／グリシンＳＤＳゲル上に充填し、約１００分間、１２５Ｖ、一定電圧で流した。ＳｅｅＢｌｕｅＰｌｕｓ２（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）分子量ラダーを使用した。ゲルをＩｎｓｔａｎｔ Ｂｌｕｅタンパク質染色（Ｅｘｐｅｄｅｏｎ）で染色し、蒸留水で脱染した。
結果を図６に示す。Ｆａｂ＃２−（ＨＣ）ｄｓｓｃＦｖ＃３−（ＬＣ）ｄｓｓｃＦｖ＃１について、非還元ゲルは、約１００ｋＤａでバンドを示すと予測されたが、還元ゲルは、両方のバンドでほぼ等しい染色を有する約５０ｋＤａでダブレットを示すことが予想された。Ｆａｂ＃２−（ＨＣ）ｄｓｓｃＦｖ＃３−（ＬＣ）ｄｓＦｖ＃１（ＬＣ−ｖＬ結合）について、非還元ゲルは、約１００ｋＤａでバンドを示すことが予想されるが、還元ゲルは、上方から下方バンドにおおよそ３：２：１の比率の染色で、約５０、約３６および約１３ｋＤａで３つのバンドを示すことが予想された。
【０１７３】
還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルは、コンストラクトが移動位置および染色強度の両方に関して正確に発現されていたことを示すバンドパターンを示した。非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルは、多量体化と一致したＦａｂ−２ｘｄｓｓｃＦｖについて顕著なバンドパターン＞２００ｋＤａを示したたが（図６Ａ、レーン２）、より少ない高分子量種が、Ｆａｂ−ｄｓｓｃＦｖ−ｄｓＦｖサンプル中で観察された（図６Ｂ、レーン２）。
【０１７４】
プロテイン−Ｇ精製、ＨＥＫ２９３発現、Ｆａｂ＃２−（ＨＣ）ｄｓｓｃＦｖ＃３−（ＬＣ）ｄｓｓｃＦｖ＃１およびＦａ＃２−（ＨＣ）ｄｓｓｃＦｖ＃３−（ＬＣ）ｄｓＦｖ＃１（ＬＣ−ｖＬ結合）のＧ３０００ ＳＥ−ＨＰＬＣ分析
１０μｇ精製タンパク質サンプル（ＰＢＳで希釈した０．１ｍｇ／ｍｌストックの１００μｌ）を、精製後３日目にＴＳＫ Ｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷＸＬ、７．８×３００ｍｍ、カラム（Ｔｏｓｏｈ）上に注入し、１ｍｌ／分で２００ｍＭリン酸塩ｐＨ７．０のアイソクラチック勾配で展開させた。シグナル検出を、２８０ｎｍの吸光度によって行った。
【０１７５】
結果を図７に示す。プロテイン−Ｇ精製後、Ｆａｂ＃２−（ＨＣ）ｄｓｓｃＦｖ＃３−（ＬＣ）ｄｓＦｖ＃１（ＬＣ−ｖＬ結合）は、９１％のモノマーであったが、Ｆａｂ＃２−（ＨＣ）ｄｓｓｃＦｖ＃３−（ＬＣ）ｄｓｓｃＦｖ＃１は、３０％モノマーであった。
ｄｓｓｃＦｖ＃１は、特に多量体化する傾向があることが知られている。多量体は、ｄｓｓｃＦｖリンカーによって（ｖＬ＃１またはｖＨ＃１は、異なるポリペプチド鎖からのｖＨ＃１またはｖＬ＃１と対にされる）、ｄｓｓｃＦｖ＃１をｄｓＦｖ＃１（ｓｃＦｖリンカーを含まない）で置き換えることによって、物理的に結合されると、得られたモノマーの割合が有意に増加した。
したがって、当業者は、多量体化するｄｓｓｃＦｖの傾向に依存して、場合によって、ｄｓｓＦｖの代わりにｄｓＦｖを使用する利益があることを理解するたろう。
【０１７６】
実施例４：Ｂｉａｃｏｒｅアフィニティーおよび抗原標的の同時結合の証明
Ｆａｂ＃２−（ＨＣ）ｄｓＨＬｓｃＦｖ＃３（ＬＣ）ｄｓＨＬｓｃＦｖ＃４の相互作用に対する結合親和性および動的パラメーターは、ＣＭ５センサーチップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＢ）およびＨＢＳ−ＥＰ（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％ ｖ／ｖ界面活性剤Ｐ２０）ランニング緩衝液を使用して、ＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ１００またはＢＩＡｃｏｒｅ ３０００上で実施された表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって決定された。全ての実験を２５℃で実施した。抗体サンプルを、ヒトＦ（ａｂ’）２特異的ヤギＦａｂ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）または社内で作製した抗ヒトＣＨ１モノクロナール抗体のいずれかを使用して、センサーチップ表面に捕捉した。補足抗体の共有結合的固定は、６０００〜７０００応答単位（ＲＵ）のレベルに標準的なアミンカップリング化学によって達成された。
抗原＃２、＃３または＃４は、捕捉抗体に対して別々に滴定された。各アッセイサイクルは、抗原の３分注入からなる会合相の前に、１分の注入を使用して、抗体サンプルを最初に捕捉することからなり、その後、解離が１０分間モニターされた。各サイクルの後、捕捉表面は、４０ｍＭ ＨＣｌの２×１分注入、続いて、５ｍＭ ＮａＯＨの３０ｓで再発生された。使用された流速は、捕捉に対して１０μｌ分−１、会合および解離相に対して３０μｌ分−１、および再発生に対して１０μｌ分−１であった。動力学的パラメーターは、ＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ１００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアｖ２．０．１またはＢＩＡｃｏｒｅ ３０００ ＢＩＡＥｖａｌｕａｔｉｏｎ ｖ３．２を使用して、標準１：１結合モデルに得られたセンサーグラムの同時のグローバルフィッテイングによって決定された。その結果を表１５に示す。抗体は、試験された抗原についてｐＭ−ｎＭ範囲内で予想される親和性を示した。
【０１７７】
【表１５】
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【０１７８】
全ての３つ抗原に同時に結合するＦａｂ＃２−（ＨＣ）ｄｓＨＬｓｃＦｖ＃３（ＬＣ）ｄｓＨＬｓｃＦｖ＃４の可能性は、固定化された抗ヒトＩｇＧ−Ｆ（ａｂ’）２を介してセンサーチップに三重特異的抗体を捕捉することによって評価された。抗原＃２、＃３および＃４の各抗原または混合溶液は、３分注入で捕捉された抗体上で滴定された。独立した注入および組み合わせられた反応について観察された結合反応を表１６に示す。組み合わせられた抗原＃２／#３／＃４溶液についての結合反応は、独立した注入の応答の和と同等であった。これは、Ｆａｂ＃２−（ＨＣ）ｄｓＨＬｓｃＦｖ＃３（ＬＣ）ｄｓＨＬｓｃＦｖ＃４が、試験された全ての３つの抗原に同時に結合することができることを確認するものである。
【０１７９】
【表１６】
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【０１８０】
実施例５  Ｆａｂ−２ｘｓｃＦｖおよびＦａｂ−２ｘｄｓｓｃＦｖフォーマットの間の単量体収率の比較
ＥＸｐｉＨＥＫ細胞は、５０ｍｌスケールのエレクトロポレーション法によって関連するプラスミドでトランスフェクトした。プラスミドは、表１７に示されるように混合されて、タンパク質を発現した。培養物を、ＥＸｐｉＨＥＫ発現培地中で増殖し、エンハンサー１および２の添加の前に、１６〜１８時間、１２０ｒｐｍで８％ＣＯ２で３７℃でインキュベートした。その後、培養物を３７℃で、さらに４日間、インキュベートした。培養物上清を、遠心分離および滅菌された０．２２μｍフィルターによって採取した。発現力価を、プロテインＧ ＨＰＬＣによって測定した（表１８）。
【０１８１】
【表１７】
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【０１８２】
【表１８】
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【０１８３】
ＥＸＰｉＨＥＫ発現Ｆａｂ−２ｘｓｃＦｖＦｖおよびＦａｂ−２ｘｄｓｓｃＦｖフォーマットのタンパク質−Ｇ精製
上清を、１０ｋＤａ分子量カットオフ濃縮器を使用して、約２ｍｌへと約２５倍に濃縮した。濃縮した上清を、リン酸塩緩衝液ｐＨ７．４を使用して、プロテインＧ ＨＰＬＣによって精製した。結合物質を０．１Ｍグリシン／ＨＣＬｐＨ２．７で溶出し、ｐＨを２Ｍ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ８．５で約７．０に調整した。溶出された物質を１０ｋＤａ分子量濃度計を使用して濃縮し、緩衝液をＰＢＳ中に交換した。精製したタンパク質を、ＰＢＳ中約４〜５ｍｇ／ｍｌに濃縮し、４℃で保存した。
【０１８４】
プロテイン−Ｇ精製、ＥＸＰｉＨＥＫ発現Ｆａｂ−２ｘｓｃＦｖおよびＦａｂ−２ｘｄｓｓｃＦｖフォーマットのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
サンプル（２μｇ）を、９．７５μｌの体積にＰＢＳで希釈し、これに３．７５μｌ ４×ＬＤＳサンプル緩衝液および１．５μｌ １００ｍＭ Ｎ−エチルマレイミド（非還元サンプル）または１．５μｌ １０×ＮｕＰＡＧＥ還元剤（還元サンプル）を添加した。サンプルをボルテックスし、７０℃で１０分間インキュベートし、冷却し、１２５００ｒｐｍで３０秒間、遠心分離した。調製したサンプルを４〜２０％アクリルアミドＴｒｉｓ／グリシンＳＤＳゲル上に充填し、約１００分間、１２５Ｖ、一定電圧で流した。ＳｅｅＢｌｕｅ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）分子量ラダーを使用した。ゲルをＩｎｓｔａｎｔ Ｂｌｕｅタンパク質染色（Ｅｘｐｅｄｅｏｎ）で染色し、蒸留水で脱染した。
還元および非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後の予想されるバンドサイズを、表１９に示す。
【０１８５】
【表１９】
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【０１８６】
全てのタンパク質について、非還元ゲルは、約１００ｋＤａでバンドを示すことが予想されたが、還元ゲルは、両方のバンドで同等の染色で約５０ｋＤａでダブレットを示すと予想された。
全てのＦａｂ−２ｘｓｃＦｖおよびＦａｂ−２ｘｄｓｓｃＦｖタンパク質について、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルは、コンストラクトが、移動位置および約５０ｋＤａでダブレットを有する染色強度の両方に関して正確に発現されたことを示すバンディングパターンを示した（図１０Ｂ、ａ）。さらなる最上部マイナーバンドは、非還元全長タンパク質と一致する（図１０Ｂ、ｂ）。全てのタンパク質について、非還元ゲルは、約１３０ｋＤａでバンドを示し、完全長タンパク質を示した（図１０Ａ、ａ）。非還元ゲル上で約５０ｋＤａのバンド（図１０Ａ、ｂ）は、Ｆａｂ領域の重および軽鎖の間の不完全なジスルフィド結合と一致し得る。
【０１８７】
Ｆａｂ−２ｘｓｃＦｖおよびＦａｂ−２ｘｄｓｓｃＦｖフォーマットのＧ３０００ ＳＥ−ＨＰＬＣ分析
約５ｍｇ／ｌの精製抗体タンパク質を、分析前に２４時間ＰＢＳ中４℃で保存した。２５μｇの濃度に相当するサンプルを、ＴＳＫ Ｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷＸＬ、７．８ｘ３００ｍｍカラム（Ｔｏｓｏｈ）上に注入し、１ｍｌ／分で２００ｍＭ リン酸塩 ｐＨ７．０のアイソクラチック勾配で展開した。シグナル検出は、２８０ｎｍの吸光度で行った。結果を表２０に示す。分析は、全てのＦａｂ−２ｘｄｓｓｃＦｖタンパク質が、＞９０％単量体であったことを示した。一方、多量体化のより高い発生が、全てのＦａｂ−２ｘｓＦｖについて検出された。Ｆｖジスルフィドを有するｓｃＦｖを含むフォーマットは、Ｆｖジスルフィドを欠くｓｃＦｖと比較してより単量体であることが明らかである。これは、安定した品質を有する治療用分子を選択することに関して、Ｆｖジスルフィドを含むｓｃＦｖを有するフォーマットを使用することが好ましいことを示し、また製造プロセスにおいて有利であると考えられる。
【０１８８】
【表２０】
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【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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