(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式I，II，III又はIVのいずれかによるヒアルロン酸のオリゴマーの複合体又はその塩。
0006649892.tif 000010
（式中，Ｒ３はＣＯＯＲ６又はＣＨ２ＯＨであり，
Ｒ４はＯＨ又はＮＨＣＯＣＨ３であり，
Ｒ６はＨ＋であるか又はアルカリ金属イオン又はアルカリ土類金属イオンからなる群から選択され；
Ｒ５はＣ１−Ｃ３０アルキレン基，両端にカルボニル基を有するＣ１−Ｃ２８アルキレン基，又はフェニレンビスカルボニル基であり；
ＸはＯ又はＮＨ基であり；
Ｒ３がＣＯＯＲ６である場合，Ｒ４はＯＨであり，Ｒ１はＨであり，Ｒ２はヒアルロン酸オリゴマーの残基であり；
Ｒ３がＣＨ２ＯＨである場合，Ｒ４はＮＨＣＯＣＨ３であり，Ｒ２はＨであり，Ｒ１はヒアルロン酸オリゴマーの残基であり；
substrateはヒアルロン酸又はその薬理学的に許容されるその塩である。）
【請求項２】
ヒアルロン酸又はその薬理学的に許容されるその塩が１０４〜１０６g.mol-1の範囲内の分子量を有することを特徴とする請求項１記載の複合体。
【請求項３】
前記ヒアルロン酸オリゴマー残基が１〜１７の糖単位を含み，該糖単位がβ（１，３）−Ｄグルクロン酸及びβ−（１，４）−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンから成る群から選択される請求項１記載の複合体。
【請求項４】
請求項１記載の一般式I及びIIによるヒアルロン酸オリゴマー複合体の調製方法であって，一般式V及びVI：
0006649892.tif 000011
（式中，Ｒ３はＣＯＯＲ６又はＣＨ２ＯＨであり，
Ｒ４はＯＨ又はＮＨＣＯＣＨ３であり，
Ｒ６はＨ又は薬理学的に許容される塩であり；
Ｒ５はＣ１−Ｃ３０アルキレン基，両端にカルボニル基を有するＣ１−Ｃ２８アルキレン基，又はフェニレンビスカルボニル基であり；
ＸはＯ又はＮＨ基であり；
Ｒ３がＣＯＯＲ６である場合，Ｒ４はＯＨであり，Ｒ１はＨであり，Ｒ２はヒアルロン酸オリゴマーの残基であり；
Ｒ３がＣＨ２ＯＨである場合，Ｒ４はＮＨＣＯＣＨ３であり，Ｒ２はＨであり，Ｒ１はヒアルロン酸オリゴマーの残基である）のヒアルロン酸オリゴマー−ジアミノリンカー複合体を，水又は水と水混和性有機溶媒の混合物中で，基質の少なくとも１つのアルデヒド基と反応させることを特徴とする方法。
【請求項５】
前記ヒアルロン酸オリゴマー残基が１〜１７の糖単位を含み，該糖単位がβ（１，３）−Ｄグルクロン酸及びβ−（１，４）−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンからなる群から選択されることを特徴とする請求項４記載の調製方法。
【請求項６】
前記substrateが，１０４〜１０６g.mol-1の範囲内の分子量を有するヒアルロン酸又はその薬理学的に許容される塩であることを特徴とする請求項４記載の方法。
【請求項７】
１０〜４０℃の温度で，２４〜１５０時間行われることを特徴とする請求項４〜６いずれか１項記載の調製方法。
【請求項８】
前記水混和性溶媒がエタノール，イソプロパノール，メタノール又はジメチルスルホキシドからなる群より選択されることを特徴とする請求項４〜７いずれか１項記載の調製方法。
【請求項９】
一般式III及びIVによるヒアルロン酸オリゴマーの複合体の調製方法であって，請求項４〜８いずれか１項記載の方法により，かつ一般式V及びVIのヒアルロン酸オリゴマー−ジアミノリンカー複合体を基質の少なくとも１つのアルデヒド基と還元剤の存在下で反応させて行うことを特徴とする方法。
【請求項１０】
前記還元剤がシアノホウ化水素又はピコリン-ボランからなる群から選択されることを特徴とする請求項９記載の調製方法。
【請求項１１】
前記還元剤の量がヒアルロン酸の二糖体のモル量に対して０．１〜５当量の範囲内であることを特徴とする請求項９又は１０記載の調製方法。
【請求項１２】
前記一般式をV及びVIのヒアルロン酸オリゴマー−ジアミノリンカー複合体を，ヒアルロン酸オリゴマー末端の１位のアノマー中心で一般式Ｈ２Ｎ−Ｘ−Ｒ５−Ｘ−ＮＨ２（式中，Ｒ５はＣ１−Ｃ３０アルキレン基，両端にカルボニル基を有するＣ１−Ｃ２８アルキレン基，又はフェニレンビスカルボニル基であり；
ＸはＯ又はＮＨ基である）のジアミノリンカーの過剰量と３〜６．９９の範囲内のpHで反応させ，その後，前記一般式V及びVIのヒアルロン酸オリゴマー−ジアミノリンカー複合体を単離する方法で調製することを特徴とする請求項４〜１１いずれか１項記載の調製方法。
【請求項１３】
前記反応が３〜６の範囲内のpHで行われることを特徴とする請求項１２記載の調製方法。
【請求項１４】
前記反応が，酢酸，プロパン酸又は乳酸からなる群から選択されるカルボン酸の存在下で行われることを特徴とする請求項１２又は１３記載の調製方法。
【請求項１５】
前記カルボン酸の量が，基質としてのヒアルロン酸の二糖体のモル量に対して５〜３０当量の範囲内であることを特徴とする請求項１４記載の調製方法。
【請求項１６】
前記リンカーの過剰量が，基質としてのヒアルロン酸の二糖体のモル量に対して５〜３０当量の範囲内であることを特徴とする請求項１２〜１５いずれか１項記載の調製方法。
【請求項１７】
前記反応が１０〜４０℃の温度で，２４〜１５０時間行われることを特徴とする請求項１２〜１６いずれか１項記載の調製方法。
【請求項１８】
抗癌作用を有する物質の調製のための請求項１〜３いずれか１項記載の複合体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は，ヒアルロン酸複合体又はその塩，その調製法及びその使用に関する。
【０００２】
そのような複合体によって，それらの元の天然型に遊離する可能性を有するヒアルロン酸オリゴマーを固定化することが可能である。
【背景技術】
【０００３】
ヒアルロン酸はβ−（１，３）−Ｄ−グルクロン酸及びβ−（１，４）−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの繰り返す二つの糖単位からなるグリコサミノグリカンである。
0006649892.tif 000002
スキーム１：ヒアルロン酸
【０００４】
それは，その単離方法及び最初の材料に依存して５．１０４〜５．１０６g.mol-1の高分子量であることを特徴とする。この非常に親水性の高い多糖は，全pH領域において塩の形態で水溶性である。それは，結合組織，皮膚，関節の滑液の一部を形成し，水和，プロテオグリカンの形成，細胞分化，増殖及び血管形成のような多くの生物学的プロセスで重要な役割を果たす。
【０００５】
ＨＡオリゴマーの結合
上記のように，天然のヒアルロン酸は生物内で非常に速く分解する直鎖多糖類である。枝分かれ構造を有するヒアルロナンの調製について最初の有力な試みは，Toemmeraase K.によって２００８年に記載されている(WO 2008/014787)。これは，高分子量を有する脱アセチル化ヒアルロナンのアミノ基とヒアルロナンオリゴマーの末端のアノマー中心との還元的アミノ化による結合に関するものである。別の特許文献Hacker M., Saraf A., Mikos A.G., WO 2008/115799の著者は，ポリエチレンイミンにＨＡオリゴマーの末端のアノマー中心を結合することを同様の方法で行った。強い結合を確保するためには，アミノ配糖体を加水分解的に非常に安定した第二級アミンに変換する還元的アミノ化が使用される。この反応はわずかに塩基性の環境下で，かつ高温で起こり，シアノ水素化ホウ素ナトリウムを還元剤として使用する。結果として生じる複合体は，ＤＮＡ又は間葉系幹細胞のカプセル化に使用され，ここではヒアルロナンオリゴマーとして六量体のみが言及されている。別の可能性はEur. J. Org. Chem. 2011, 5617-25の記事に開示された。ここでは，アミノ基はＨＡオリゴマーのグルコサミン部分の６位に生じ，その後，このアミノ基はカーボンナノチューブに結合したカルボン酸のＮＨＳエステルと穏やかな条件で反応する。還元的アミノ化を用いてジアミノ又はポリアミノのリンカーにより低分子量のヒアルロナンの末端のアノマー中心を結合することが，Xuにより開示されている (WO 2007/101243)。結果として生じる基質は，活性物質のカプセル化に使用された。リン脂質をＨＡオリゴマーの末端のアノマー中心に結合するという別の可能性がCarterにより開示された (米国2012/0277416)。第一段階として１位にアミンを有するオリゴマーの誘導体を還元的アミノ化によって調製し，そしてそれをリン脂質の活性カルボキシル基と結合させた。結果として生じる複合体は広範囲の生物活性を示した。還元したアノマー末端にアミノ基を有するＨＡオリゴマーへの同様の結合方法は，２０１３年にSiiskonenによって発表され，ここでは指標となる２−アミノアクリドンが結合された。この複合体はサイトゾルにおけるヒアルロナン断片の生体内分布の研究のために使用された。
【０００６】
上記方法の問題点は，それらがさらに天然型に遊離されないＨＡオリゴマー又はポリマーの複合体を形成させるという事実である。その原因は，今までに知られているアノマー中心へのアミンの結合方法の全てが還元に関する，すなわち永遠に開いたままとなるという末端単位の不可逆的変化に関するものであり，天然型のオリゴマーへの逆の遊離を起こさせないという事実である。この状況は下記のスキーム1によって説明される:
0006649892.tif 000003
【０００７】
発明の概要
上記の問題点は，天然型のＨＡオリゴマーのそのような逆の遊離を可能にする本発明の一般式I，II，III又はIVのＨＡオリゴマーの複合体によって解決される。
【０００８】
本発明の内容は，一般式I，II，III又はIVのいずれかによるヒアルロン酸のオリゴマーの複合体又はその塩であり，
0006649892.tif 000004
式中，Ｒ３はＣＯＯＲ６又はＣＨ２ＯＨであり，
Ｒ４はＯＨ又はＮＨＣＯＣＨ３であり，
Ｒ６はＨ＋であるか又はアルカリ金属イオン又はアルカリ土類金属イオンからなる群から選択され，好ましくはＮａ＋，Ｋ＋，Ｍｇ２＋又はＬｉ＋であり；
Ｒ５はＣ１−Ｃ３０アルキレン基，両端にカルボニル基を有するＣ１−Ｃ２８アルキレン基，又はフェニレンビスカルボニル基であり；
ＸはＯ又はＮＨ基であり；
Ｒ３がＣＯＯＲ６である場合，Ｒ４はＯＨであり，Ｒ１はＨであり，Ｒ２はヒアルロン酸オリゴマーの残基であり；
Ｒ３がＣＨ２ＯＨである場合，Ｒ４はＮＨＣＯＣＨ３であり，Ｒ２はＨであり，Ｒ１はヒアルロン酸オリゴマーの残基であり；
substrateはヒアルロン酸又はその薬理学的に許容されるその塩である。）
【０００９】
結果として生じる複合体の構造は，置換基Ｘの特性にかなり依存する。Ｘが酸素橋−Ｏ−である場合はイミノ型がかなり存在する。Ｘが窒素橋−ＮＨ−である場合はβ配位を有するアミノ型が優勢である。
【００１０】
本発明による複合体におけるヒアルロン酸オリゴマーの残基は１〜１７個の糖単位を有し，この糖単位はβ−（１，３）−Ｄ−グルクロン酸及びβ−（１，４）−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンからなる群から選択される。
【００１１】
別の実施態様によると，上記一般式I及びIIのヒアルロン酸オリゴマー複合体は，本発明の方法により調製することができ，その概要は，第一工程において，ヒアルロン酸のオリゴマーをその１位の末端のアノマー中心で，過剰量の一般式：Ｈ２Ｎ−Ｘ−Ｒ５−Ｘ−ＮＨ２（式中，Ｒ５はＣ１−Ｃ３０アルキレン基，両端にカルボニル基を有するＣ１−Ｃ２８アルキレン基，又はフェニレンビスカルボニル基であり；
ＸはＯ又はＮＨ基である）のジアミノリンカーとpHが３〜６．９９，好ましくは３〜６，さらに好ましくは５〜６の範囲内の弱酸性環境で反応させ，その後，一般式のヒアルロン酸オリゴマー−ジアミノリンカー複合体V及びVI：
0006649892.tif 000005
（式中，置換基Ｒ１〜Ｒ６は上記で定義したとおりである）を単離することである。
【００１２】
反応の第一工程の進行は，スキーム２によって以下に説明される。
スキーム２：
0006649892.tif 000006
【００１３】
この反応は，リンカーの両端部での修飾を統計的方法で実質的になくす過剰量のジアミノリンカーで行われる。
【００１４】
驚くべきことに，一定量の弱酸及び水の存在下でのみこの反応が進行することが見いだされた。条件が中性又は塩基性の場合，反応の成功は観察されなかった。ＨＣｌ又はＨ２ＳＯ４のような強酸が存在した場合，ＨＡオリゴマーの分解が生じた。
【００１５】
３〜６．９９の範囲内のpHを有する僅かに酸性の環境は，反応媒体にカルボン酸，好ましくは酢酸，プロパン酸又は乳酸，より好ましくは酢酸を添加することにより達成される。
【００１６】
これらの酸の量は，基質としてのヒアルロン酸の二糖体のモル量に対して５〜３０当量，好ましくは１０〜１５当量の範囲である。
【００１７】
さらに，ジアミノリンカーの量は，基質としてのヒアルロン酸の二糖体のモル量に対して５〜３０当量の範囲内，好ましくは１０当量である。
【００１８】
さらに，第一工程は，１０〜４０℃，好ましくは２０℃の温度で，２４〜１５０時間，好ましくは６０〜８０時間行われる。
【００１９】
その後，反応の第二工程が行われ，ここでは上記一般式V及びVIのヒアルロン酸オリゴマー−ジアミノリンカーの複合体を，水又は水とエタノール，イソプロパノール，メタノールもしくはジメチルスルホキシドからなる群から選択される水混和性有機溶媒との混合物中で，基質の少なくとも１つのアルデヒド基と反応させる。
【００２０】
さらに，第二工程も同様に１０〜４０℃，好ましくは２０℃の温度で，２４〜１５０時間，好ましくは６０〜８０時間行われる。
【００２１】
本発明の方法の別の好ましい実施態様によると，上記一般式V及びVIのヒアルロン酸オリゴマー−ジアミノリンカー複合体を，好ましくはシアノホウ化水素(NaBH3CN)又はピコリンボランからなる群から選択される還元剤の存在下で，基質の少なくとも１つのアルデヒド基と上記の方法及び条件により反応させ，基質が加水分解的に非常に強い結合によって結合されている一般式III及びIVの複合体を生成させる。
【００２２】
還元剤の量は，ヒアルロン酸の二糖体のモル量に対して０．１〜５当量，好ましくは３当量である。
【００２３】
基質のアミノ化又は還元アミノ化による結合の上記の両方の可能性をスキーム３に示す。
0006649892.tif 000007
【００２４】
驚くべきことに，一般式III及びIV(上記のスキームを参照)の複合体が形成される還元的アミノ化の間，還元は，実質的に基質−リンカー結合上でのみ進行する。これは，反応温度，時間， 還元剤の量のような妥協条件による（compromise conditions）ものであり，基本的にイミンを還元する特性をも有するオリゴマー−リンカー結合の還元は見られなかった。
【００２５】
ＨＡオリゴマーの末端のアノマー中心を基質−リンカー複合体と結合する試みは，ＨＡオリゴマーの剥離開裂（peeling cleavage）が起こる高温でも成功しない。
0006649892.tif 000008
したがって，最終的な複合体を調製する場合，最初に二機能性のリンカーをオリゴマーに結合する必要がある。
【００２６】
上記の事実から，本発明による複合体を調製する場合，最終的に見いだされた比較的狭い範囲の反応条件(弱酸領域のpH，注意深い還元)を見つけることが必要であったということになる。一般式I，II，III，IVの最終複合体は，今まで知られている解決法と比較して，それらの元の天然型のヒアルロナンオリゴマーを遊離することを可能にするものであり，それはそれらの生物活性の点から重要である。必要条件は，基質がアルデヒド基を含むということであり，これはＯＨ基を含んでいる多糖類の場合には酸化のような化学的修飾によって非常に容易に達成されるであろう。
【００２７】
本発明で示された解決法の実現は技術的に複雑ではなく，高価な化学製品，溶媒又は単離方法の使用を要求しない。
【００２８】
既に記載したように，本発明による複合体は：
0006649892.tif 000009
の遊離を可能にする。
【００２９】
可逆的な固定化の可能性は，それらの生物活性又は生体適合性のためにオリゴマーのオリジナルの構造を維持することが必要な場合に大変重要である。いくつかのタイプのＨＡオリゴマーは例えば癌細胞に対して生物活性を示すことが知られている。調製されたシステム（prepared systems）は，癌細胞の選抜系統に対して増強された生物活性を示した。
【００３０】
本発明の別の実施態様によると，上記で定義された一般式I〜IVの複合体は，好ましくは薬学及び生物医学において生物学的に活性なオリゴマーのキャリアとして使用され，又は，それらを抗癌作用を有する物質の調製に使用することが可能である。
【００３１】
ここに使用された「薬学的に許容される塩」の用語は，生体内における使用に安全で，有効であり，所望の生物活性を有するＨＡ複合体の塩を意味する。薬学的に許容される塩は，好ましくはアルカリ金属又はアルカリ土類金属のイオン，より好ましくはＮａ＋，Ｋ＋，Ｍｇ＋又はＬｉ＋を含む。
【００３２】
「多糖」の用語は，ヒアルロン酸のような多糖類，その医薬用の塩，デンプン，グリコーゲン，セルロース等であり，ＯＨ基を酸化した後に少なくとも一つのアルデヒド基を有するものを意味する。
【００３３】
「複合体」の用語は共有結合による２つ以上の化合物の結合により形成される化合物を意味する。本発明による複合体は，ＨＡオリゴマー及びリンカーが結合してＨＡオリゴマー−リンカー複合体を生じさせ，その後それを基質，すなわち多糖，好ましくはヒアルロン酸に結合して，ＨＡオリゴマー−リンカー−基質複合体を生じさせることにより形成される。
【００３４】
「ヒアルロン酸のオリゴマー」の用語はβ−（１，３）−Ｄグルクロン酸及びβ−（１，４）−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの交互に繰り返す糖単位を含むヒアルロン酸のオリゴマーを意味する。好ましくは，糖単位の数は２〜１８である。
【００３５】
「ヒアルロン酸オリゴマーの残基」の用語はヒアルロン酸オリゴマーの少なくとも１つの糖単位を意味し，これはβ−（１，４）−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン又はβ−（１，３）−Ｄグルクロン酸である。
【００３６】
そのアノマー中心によってリンカーに結合している末端の糖単位が，β−（１，３）−Ｄグルクロン酸である場合，前記糖単位はβ−（１，４）−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンである。
【００３７】
そのアノマー中心によってリンカーに結合している末端の糖単位がβ−（１，４）−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンである場合，前記糖単位はβ−（１，３）−Ｄグルクロン酸である。
【００３８】
ヒアルロン酸オリゴマーの残基が１つより多い糖単位を含む場合，β−（１，３）−Ｄグルクロン酸及びβ−（１，４）−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの糖単位が交互に繰り返される。
【００３９】
「過剰」の用語はジアミノリンカーの量が，基質としてのヒアルロン酸の二糖単位のモル量に対して１当量より多いことを意味する。
【００４０】
「単離された」の用語は，反応を終了した後反応液が中和され，沈殿した反応生成物が，濾過され，乾燥されたことを意味する。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】影響を受けていない（non-affected）不死化された癌細胞の増殖の抑制率（％）の推移を示す。
【００４２】
実施例
ここで使用される「当量」の用語は，そうでないことが示されていない限り，ヒアルロン酸の二糖体に対するものである。パーセントは，そうでないことが示されていない限り，重量パーセントである。
【００４３】
最初のヒアルロン酸の分子量(出所:CPN spol.s r.o.,ドルニ  ドブロウク, チェコ)は，１０４〜１０６g.mol-1の範囲内の重量平均分子量であり，SEC-MALLSによって測定された。
【００４４】
２〜１８の糖単位を含むヒアルロン酸オリゴマーは，より高い分子量を有するポリマーの酵素分解により調製された。
DS=置換度= 100% ×(結合した置換基又は修飾された二糖体のモル量) /(全二糖体のモル量)
【００４５】
実施例１：グルコサミン部分の６位が酸化されたＨＡアルデヒドの製造
ヒアルロン酸の酸化
ＮａＣｌＯ水溶液（０．５当量）を，窒素雰囲気下で，ＮａＣｌ１% ，ＴＥＭＰＯ（０．０１当量）及びＮａＨＣＯ３（５当量）を含むヒアルロナン（１g，２００kDa)の１パーセント水溶液に徐々に加えた。その混合物を０℃の温度で１２時間撹拌し，その後０．１ｇのエタノールを添加し加え，この混合物をさらに１時間撹拌した。その後，得られた溶液を，蒸留水で０．２％に希釈し，混合物（０．１%のNaCl，０．１%のNaHCO3に対して５リットル１日１回で３回，そして蒸留水に対して７リットル１日２回で７回透析した。その後，得られた溶液を蒸発させ分析した。
ＤＳ  １０％（ＮＭＲで決定）
１Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）：δ５．２６（ｓ，１Ｈ，polymer−ＣＨ（ＯＨ）２）
ＨＳＱＣ（Ｄ２Ｏ）： cross signal ５．２６ ppm（１Ｈ）−９０ppm（１３Ｃ）（polymer−ＣＨ（ＯＨ）２）
【００４６】
実施例２：アジピン酸ジヒドラジドとＨＡ八糖体（ＨＡ−８）との複合体の調製
ＨＡ八糖体を，水に５％の濃度で溶解した。その後，アジピン酸ジヒドラジド（６当量）及び酢酸（１５当量）を添加し，この混合物をpH 4で７２時間，２０℃の温度で撹拌した。得られた混合物をＮａＨＣＯ３で中和し，イソプロピルアルコールを用いて繰り返し沈殿させた。最終固体生成物を真空下で乾燥した。
１Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）：δ４．１１（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ，−Ｏ−ＣＨ−ＮＨ−beta），初期の末端のアノマー中心（−Ｏ−ＣＨ−ＯＨ alpha)のシグナルはない。
【００４７】
実施例３：アジピン酸ジヒドラジドとＨＡ三糖体（ＨＡ−３）の複合体の調製
ＨＡ三糖体（グルクロン酸で終わる）を７％の濃度で水に溶解した。その後，アジピン酸ジヒドラジド（２５当量）及び酢酸（２５当量）を添加し，この混合物をpH ６で１５０時間１０℃の温度で撹拌した。得られた混合物を，ＮａＨＣＯ３によって中和し，イソプロピルアルコールを用いて繰り返し沈殿させた。最終固体生成物を真空下で乾燥した。
１Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）：δ４．１１（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ，−Ｏ−ＣＨ−ＮＨ−beta），初期の末端のアノマー中心（−Ｏ−ＣＨ−ＯＨ  alpha)のシグナルはない。
【００４８】
実施例４：アジピン酸ジヒドラジドとＨＡ十八糖体（ＨＡ−１８）の複合体の調製
ＨＡ十八糖体（グルコサミンで終わる）を５％の濃度で水に溶解した。その後，アジピン酸ジヒドラジド（１５当量）及び酢酸（２０当量）を添加し，この混合物をpH５で２４時間，４０℃の温度で撹拌した。得られた混合物を，ＮａＨＣＯ３によって中和し，イソプロピルアルコールを用いて繰り返し沈殿させた。
最終固体生成物を真空下で乾燥した。
１Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）：δ４．１０（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ，−Ｏ−ＣＨ−ＮＨ−beta) 
【００４９】
実施例５：Ｏ，Ｏ’−１，３−プロパンジイルビスヒドロキシルアミンとＨＡ十糖体（ＨＡ−１０）の複合体の調製
ＨＡ十糖体を３％の濃度で水に溶解した。その後，Ｏ，Ｏ’−１，３−プロパンジイルビスヒドロキシルアミン（５当量）及び乳酸（５当量）を添加し，この混合物をpH６で１００時間２０℃の温度で撹拌した。得られた混合物を，ＮａＨＣＯ３によって中和し，イソプロピルアルコールを用いて繰り返し沈殿させた。最終固体生成物を真空下で乾燥した。
１Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）：δ７．５３（ｄ，Ｊ＝５．３Ｈｚ，１Ｈ，−Ｏ−ＣＨ＝Ｎ−Ｚ−isomer），δ６．８９（ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，１Ｈ，−Ｏ−ＣＨ＝Ｎ−Ｅ−isomer）
【００５０】
実施例６：テレフタル酸ジヒドラジドとＨＡ四糖体（ＨＡ−４）の複合体の調製
ＨＡ四糖体を３％の濃度で水に溶解した。その後，テレフタル酸ジヒドラジド（５当量）及び酪酸（６当量）を添加し，この混合物をpH６で１００時間２０℃の温度で撹拌した。得られた混合物を，ＮａＨＣＯ３によって中和し，イソプロピルアルコールを用いて繰り返し沈殿させた。最終固体生成物を真空下で乾燥した。
１Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）：δ４．１２（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ，−Ｏ−ＣＨ−ＮＨ−beta）
【００５１】
実施例７：６位がアルデヒドに酸化されたヒアルロナン（実施例１）へのＨＡ−８−アジピン酸ジヒドラジド複合体（実施例２）の還元アミノ化による結合
実施例２で調製された複合体０．０１ｇを２％の濃度で水に溶解した。その後，アルデヒド基を有するヒアルロン酸誘導体（分子量６×１０５g.mol-1）０．０１g及びピコリン−ボラン５当量を添加した。この混合物を２４時間２０℃の温度で撹拌した。得られた混合物を，イソプロピルアルコールを用いて沈殿させた。最終固体生成物を真空下で乾燥した。
１Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）：δ２．８５，３．１２（m,m diastereotoic pair,２Ｈ，−ＮＨ−ＣＨ２−polymer）
ＤＯＳＹ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）：δ４．２４（ｄ，Ｊ＝９．７Ｈｚ，１Ｈ，−Ｏ−ＣＨ−ＮＨ−beta）高分子量のヒアルロン酸と同じ移動度，及び2.85 a 3.12のジアステレオトピックな水素のシグナルを有する。
【００５２】
実施例８：６位がアルデヒドに酸化されたヒアルロナン（実施例１）へのＨＡ−３−アジピン酸ジヒドラジド複合体（実施例３）の還元アミノ化による結合
実施例３で調製された複合体０．０１gを２％の濃度で水に溶解した。その後，アルデヒド基を有するヒアルロン酸誘導体（分子量２×１０４g.mol-1）０．０１g及びシアノ水素化ホウ素ナトリウム０．３当量を添加した。この混合物を７２時間１０℃の温度で撹拌した。得られた混合物を，イソプロピルアルコールを用いて沈殿させた。最終固体生成物を真空下で乾燥した。
１Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）：δ２．８９，３．０４（m,m diastereotopic pair,２Ｈ，−ＮＨ−ＣＨ２−polymer）
ＤＯＳＹ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）：δ４．１１（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ，−Ｏ−ＣＨ−ＮＨ−beta）高分子量のヒアルロン酸と同じ移動度，及び2.89 a 3.04のジアステレオトピックな水素のシグナルを有する。
【００５３】
実施例９： ６位がアルデヒドに酸化されたヒアルロナン（実施例１）へのＨＡ−８−アジピン酸ジヒドラジド複合体（実施例２）の還元なしでの結合
実施例２で調製された複合体０．１gを２％の濃度で１／１の比率の水／ＤＭＳＯ混合物に溶解した。その後，アルデヒド基を有するヒアルロン酸誘導体（分子量２×１０４g.mol-1）０．１gを添加した。この混合物を７２時間２０℃の温度で撹拌した。得られた混合物を，イソプロピルアルコールを用いて沈殿させた。最終固体生成物を真空下で乾燥した。
１Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）：δ７．４８（ｍ，１Ｈ，−Ｎ＝ＣＨ−polymer）
ＤＯＳＹ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）：δ４．２４（ｄ，Ｊ＝９．７Ｈｚ，１Ｈ，−Ｏ−ＣＨ−ＮＨ−beta）高分子量のヒアルロン酸と同じ移動度，及びシグナル７．４８を有する。
【００５４】
実施例１０： ６位がアルデヒドに酸化されたヒアルロナン（実施例１）へのＨＡ−１８−アジピン酸ジヒドラジド（実施例４）の還元なしでの結合
実施例４で調製された複合体０．１gを２％の濃度で水に溶解した。その後，アルデヒド基を有するヒアルロン酸誘導体（分子量２×１０４g.mol-1）０．１gを添加した。この混合物を１００時間１０℃の温度で撹拌した。得られた混合物を，イソプロピルアルコールを用いて沈殿させた。最終固体生成物を真空下で乾燥した。
１Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）：δ７．４７（ｍ，１Ｈ，−Ｎ＝ＣＨ−polymer）
ＤＯＳＹ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）：δ４．２５（ｄ，Ｊ＝９．７Ｈｚ，１Ｈ，−Ｏ−ＣＨ−ＮＨ−beta）高分子量のヒアルロン酸と同じ移動度，及びシグナル７．４７を有する。
【００５５】
実施例１１：６位がアルデヒドに酸化されたヒアルロナン（実施例１）へのＨＡ−１０−Ｏ，Ｏ’−１，３−プロパンジイルビスヒドロキシルアミン複合体（実施例５）の還元なしでの結合
実施例５で調製された複合体０．０１gを２％の濃度で水に溶解した。その後，アルデヒド基を有するヒアルロン酸誘導体（分子量２×１０４g.mol-1）０．０１gを添加した。この混合物を４８時間２０℃の温度で撹拌した。得られた混合物を，イソプロピルアルコールを用いて沈殿させた。最終固体生成物を真空下で乾燥した。
ＤＯＳＹ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）：δ７．５３（ｄ，Ｊ＝５．３Ｈｚ，１Ｈ，−Ｏ−ＣＨ＝Ｎ−Ｚ−isomer），δ６．８９（ｄ，Ｊ＝６，０Ｈｚ，１Ｈ，−Ｏ−ＣＨ＝Ｎ−Ｅ−isomer）高分子量のヒアルロン酸と同じ移動度を有する。
【００５６】
実施例１２：実施例８により調製された複合体の生物学的試験 
実施例８により調製した複合体で処理した後のＡ２０５８株の生存率の測定
標準条件（１０％ＦＢＳを含む培地ＤＭＥＭ，３７℃，５％のＣＯ２）で培養した細胞株を１ウェル当たり５０００個の細胞密度で４枚の９６−ウェル培養パネルへ播種し，２００μlの培地中で２４時間インキュベートした。その後，該培養液を，１０００，１００及び１０μg/mlの濃度で複合体（実施例８）を含む新鮮培地に換えた。対照の細胞用の培地は該複合体を含まない新鮮な培地に換えた。処理直後に，細胞の生存率をＭＴＴ法により最初のパネルで測定した。要するに，２０μlのＭＴＴ溶液（５mg/ml）を細胞に加え，それらを３７℃，暗所で２．５時間一緒にインキュベートした。インキュベーション後，培地を吸い取り，細胞単層を１０％Toriton X-100を含むＤＭＳＯとイソプロパノール（１：１）の混合物で溶解した。前記パネルの個々のウェル中で生じた色を，プレート分光光度計（６９０nmの補正で５７０nmにおける吸光度）によって測定した。この測定を，２４時間ごとに他のパネルでも同様に繰り返した。最終生存率は，所定の時間と時間Ｔ０におけるサンプルの吸光度の比率として計算された。Ａ２０５８はヒト黒色腫に由来した，不死化した細胞株であり，非常に浸潤性であるため，腫瘍形成及び転移のモデルとしてしばしば使用される。
【００５７】
細胞増殖の抑制率（％）の結果を図１に示す。これにより，本発明による複合体の影響により細胞増殖の抑制が指数関数的に増加することが明らかである。
【図１】
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