(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）抗体Ａ由来の１本の重鎖と軽鎖を含む第１の半抗体断片Ａ’、ここで、該１本の重鎖はヒンジ領域内に１個以上の反応性チオール基を有するものである；
（ｂ）抗体Ｂ由来の１本の重鎖と軽鎖を含む第２の半抗体断片Ｂ’、ここで、該１本の重鎖はヒンジ領域内に１個以上の反応性チオール基を有するものである、
を含む二重特異性抗体であり；
前記第１の半抗体断片と第２の半抗体断片は、リンカーを介して前記第１の半抗体断片のヒンジ領域内の反応性チオールに結合しているアジドと、リンカーを介して前記第２の半抗体断片のヒンジ領域内の反応性チオールに結合しているアルキンとの付加環化反応により形成された１，２，３−トリアゾールによって共有結合されており、
抗体Ａおよび抗体Ｂは完全長の抗体であり、
アルキンと反応して１，２，３−トリアゾールを形成するアジドが、
【化１】
0006687247.tif 000037
から選択され、ここで、ＭはＮまたはＣであり、Ｍ’はＮまたはＣであり、および、ＺはＢｒ、ＩまたはＳＰｈであり、および
アジドと反応して１，２，３−トリアゾールを形成するアルキンが、
【化２】
0006687247.tif 000038
から選択され、ここで、ＭはＮまたはＣであり、Ｍ’はＮまたはＣであり、および、ＺはＢｒ、ＩまたはＳＰｈである、二重特異性抗体。
【請求項２】
前記断片Ａ’およびＢ’がＩｇＧ１またはＩｇＧ４免疫グロブリンに由来するものである、請求項１に記載の二重特異性抗体。
【請求項３】
以下の構造：
【化３】
0006687247.tif 000039
を有する、化学的に固定された二重特異性抗体ＡＢ。
【請求項４】
ＡおよびＢがＩｇＧクラスの抗体である、請求項３に記載の化学的に固定された二重特異性抗体。
【請求項５】
ＡおよびＢがＩｇＧ１またはＩｇＧ４免疫グロブリンである、請求項３または４に記載の化学的に固定された二重特異性抗体。
【請求項６】
Ａがヒンジ内変異（ＣＰＳＣ）を有するＩｇＧ１であり、Ｂが野生型ＩｇＧ４である、請求項１から３のいずれか一項に記載の化学的に固定された二重特異性抗体。
【請求項７】
Ａが抗−ｃＭｅｔ抗体であり、Ｂが抗−ＰＤ−Ｌ１抗体である、請求項１または３に記載の化学的に固定された二重特異性抗体。
【請求項８】
ヒトへの使用に適した水溶液中に請求項１から７のいずれか一項に記載の二重特異性抗体の有効量を含む医薬製剤。
【請求項９】
第１の完全長抗体「Ａ」と第２の完全長抗体「Ｂ」から二重特異性抗体「ＡＢ」または「ＢＡ」を作製するための方法であって：
（ａ）配列ＣＰＰＣ、ＣＰＳＣ、ＳＰＰＣまたはＳＰＳＣを有するヒンジ領域を有する前記第１の抗体Ａを、ヒンジ領域内の重鎖間の実質的にすべてのジスルフィド結合が切断されるのに充分な条件下で、還元剤と接触させ、各々が１本の重鎖に結合している１本の軽鎖を含むものである１対の第１の半抗体Ａ’を得ること、ここで、該重鎖は、前記ジスルフィド結合の還元により形成された１個または２個の反応性チオール基をヒンジ領域内に有するものである；
（ｂ）第１のヘテロ二官能性リンカーを前記第１の半抗体Ａ’に結合させ（前記第１のヘテロ二官能性リンカーは（ｉ）前記第１の半抗体の前記重鎖のヒンジ領域内の反応性チオール基との共有結合のための第１のチオール反応性官能基および（ｉｉ）アジドを含むものである。）、これにより、アジド官能基化された第１の半抗体を形成すること；
（ｃ）配列ＣＰＰＣ、ＣＰＳＣ、ＳＰＰＣまたはＳＰＳＣを有するヒンジ領域を有する前記第２の抗体Ｂを、ヒンジ領域内の重鎖間の実質的にすべてのジスルフィド結合が切断されるのに充分な条件下で、還元剤と接触させ、各々が１本の重鎖に結合している１本の軽鎖を含むものである１対の第２の半抗体Ｂ’を得ること、ここで、該重鎖は、前記ジスルフィド結合の該還元により形成された１個または２個の反応性チオール基をヒンジ領域内に有するものである；
（ｄ）第２のヘテロ二官能性リンカーを前記第２の半抗体Ｂ’に結合させ（前記第２のヘテロ二官能性リンカーは：（ｉ）前記第２の半抗体の前記重鎖のヒンジ領域内の反応性チオール基との共有結合のための第２のチオール反応性官能基および（ｉｉ）アルキンを含むものである。）；これにより、アルキン官能基化された第２の半抗体を形成すること；ならびに
（ｅ）前記アジド官能基化された第１の半抗体を前記アルキン官能基化された第２の半抗体と反応させて、前記アジドと前記アルキンとの付加環化によって前記第１の半抗体を前記第２の半抗体に共有結合させ、化学的に固定された二重特異性抗体「ＡＢ」または「ＢＡ」を形成することを含み、
ここで、半抗体Ａ’は、
【化４】
0006687247.tif 000040
からなる群より選択される構造に連結されており、ここで、Ｎ３は−Ｎ＝Ｎ＝Ｎであり、および、
半抗体Ｂ’は、
【化５】
0006687247.tif 000041
からなる群より選択される構造に連結されている、方法。
【請求項１０】
抗体Ａまたは抗体ＢがＩｇＧ１免疫グロブリンである、第１の抗体「Ａ」と第２の抗体「Ｂ」から二重特異性抗体「ＡＢ」または「ＢＡ」を作製するための請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
抗体Ａまたは抗体ＢがＩｇＧ４免疫グロブリンである、第１の抗体「Ａ」と第２の抗体「Ｂ」から二重特異性抗体「ＡＢ」または「ＢＡ」を作製するための請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
【化６】
0006687247.tif 000042
（Ｎ３は−Ｎ＝Ｎ＝Ｎである。）
に連結された連結部含有半抗体Ａを含むものであり、該半抗体Ａが；
【化７】
0006687247.tif 000043
に連結された連結部含有抗体Ｂに連接されている、
化学的に固定された二重特異性抗体ＡＢ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示により、高特異性であり、高い均質性を有する化学的に固定された（ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ−ｌｏｃｋｅｄ）二重特異性またはヘテロ二量体の抗体、好ましくはＩｇＧクラスの抗体を形成するための方法を提供する。より詳しくは、本開示により、バイオオルソゴナルなクリックケミストリーにより連接された連結領域を有する化学的に固定された二重特異性ＩｇＧクラスの抗体を提供する。
【０００２】
関連出願の相互参照
本特許出願は、２０１４年５月１０日に出願された米国特許仮出願第６１／９９１，５０８号の優先権を主張する。
【背景技術】
【０００３】
ヒト免疫グロブリンＧまたはＩｇＧ抗体には４つのサブクラスが存在し、各々は相違する構造的および機能的特性を有する。ＩｇＧは２つの重鎖−軽鎖ペア（半抗体）で構成されており、これらはヒンジ領域内のＣｙｓ残基（ＥＵ−インデックスの番号付け：システイン残基２２６および２２９；カバットの番号付け：システイン残基２３９および２４２）を直接連結する重鎖間ジスルフィド結合によって連結されている。ヒトＩｇＧ４分子は、重鎖間ジスルフィド結合が無いかあるかで異なる種々の分子形態で存在している。
【０００４】
多種多様な組換え抗体形式、例えば、ＩｇＧ抗体形式と一本鎖ドメインの融合による四価の二重特異性抗体が開発されている（Ｃｏｌｏｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  １５（１９９７）１５９−１６３；ＷＯ２００１／０７７３４２；およびＭｏｒｒｉｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ２５（２００７）１２３３−１２３４）。別の形式は、抗体のコア構造（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧまたはＩｇＭ）がもはや保持されていないもの、例えば、ダイアボディ、トリアボディまたはテトラボディ、ミニボディ、幾つかの一本鎖形式（ｓｃＦｖ、Ｂｉｓ−ｓｃＦｖ）である。しかしながら、かかる形式は２種類以上の抗原に結合し得るものである（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ２３（２００５）１１２６−１１３６；Ｆｉｓｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｌｅｇｅｒ，Ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ  ７４（２００７）３−１４；Ｓｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３１８（２００７）６５−７４；およびＷｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２５（２００７）１２９０−１２９７）。
【０００５】
少なくとも１つの鎖間ジスルフィド結合によって連結された二量体を優先的に合成するための方法、または該二量体を、少なくとも１つの鎖間ジスルフィド結合によって連結されたものでない二量体から（これらの２つの型のポリペプチド二量体を含む混合物から）分離するための方法がＵＳ２００５／０１６３７８２に報告されている。
【０００６】
二重特異性抗体材料を、従来のハイブリッドハイブリドーマ法および化学的コンジュゲーション法を用いて充分な量と質で得ることは困難である。さらに、ＷＯ２００５／０６２９１６および米国特許出願第２０１０／０１０５８７４号には、抗体「ＡＡ」と抗体「ＢＢ」を還元してジスルフィド結合を分離させ、１つの結合領域を有する１つの重鎖−軽鎖単位（ＡまたはＢ）（ここで、ＡとＢはどちらも異なる標的に結合する。）にすることにより、どのようにして二重特異性抗体を形成するかが記載されている。このとき、該抗体ではジスルフィド結合の異性化が起こることが許容されており、そのため、抗体ＡＢ、ＢＡ、ＡＡおよびＢＢが各々、約２５％の確率で再形成される。しかしながら、ＡＢとＢＡはどちらも同じ二重特異性抗体であり、従って、最大でも約５０％の収率である。従って、これには、再構成された元の抗体から、形成された所望の二重特異性抗体を分離するためのさらなる工程が必要とされる。しかしながら、米国特許出願第２０１０／０１０５８７４号では、ＩｇＧ４内のＣＰＳＣ（配列番号１）の配列を有するヒンジ領域について言及され：「ＣＰＳＣ（配列番号１）配列により、より柔軟性のあるコアヒンジ、および鎖内ジスルフィド結合が形成される可能性がもたらされる…ＩｇＧ４様コアヒンジ配列を有する抗体はジスルフィド結合の再構成に対して固有の活性を有しているかもしれないと考えられ、これを、本発明の方法で使用する条件によってシミュレーションする」と記載されている（段落００１３）。また、抗体ＡとＢの重鎖の配列を改変することにより作製された「ノブと穴（ｋｎｏｂ  ａｎｄ  ｈｏｌｅ）」構造を有する他の形態の二重特異性抗体も作製されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第２００１／０７７３４２号
【特許文献２】米国特許出願公開第２００５／０１６３７８２号明細書
【特許文献３】国際公開第２００５／０６２９１６号
【特許文献４】米国特許出願第２０１０／０１０５８７４号明細書
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｃｏｌｏｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  １５（１９９７）１５９−１６３
【非特許文献２】Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ２５（２００７）１２３３−１２３４
【非特許文献３】Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ２３（２００５）１１２６−１１３６
【非特許文献４】Ｆｉｓｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｌｅｇｅｒ，Ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ  ７４（２００７）３−１４
【非特許文献５】Ｓｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３１８（２００７）６５−７４
【非特許文献６】Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２５（２００７）１２９０−１２９７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
従って、本開示により、抗体内の固定領域のアミノ酸配列を改変するノブホール（ｋｎｏｂ  ａｎｄ  ｈｏｌｅ）法よりもずっと高い二重特異性抗体の収率という当該技術分野における必要性に対処され、より良好な安定性を有する化学的に固定された二重特異性ＩｇＧ抗体を作製するための方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本開示により、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２もしくはＩｇＧ４クラスの抗体またはそのＦａｂ２断片「Ａ」とＩｇＧ１、ＩｇＧ２もしくはＩｇＧ４クラスの抗体またはそのＦａｂ２断片「Ｂ」から化学的に固定された二重特異性抗体「ＡＢ」または「ＢＡ」を創出するための方法を提供する。該方法は：
（ａ）第１の抗体「Ａ」を、ヒンジ領域内の重鎖間の実質的にすべてのジスルフィド結合が切断されるのに充分な条件下で、還元剤と接触させ、各々が１本の重鎖に結合している１本の軽鎖を含むものである１対の第１の抗体断片Ａ’を得ること、該重鎖は、前記ジスルフィド結合の該還元により形成された１個以上の反応性チオール基を有するものである；
（ｂ）第１のヘテロ二官能性リンカーを第１の抗体断片Ａ’に結合させ（ここで、第１のヘテロ二官能性リンカーは（ｉ）第１の抗体断片Ａ’の重鎖の反応性チオール基との共有結合のための第１のチオール反応性官能基および（ｉｉ）アジドを含むものである。）、アジド官能基化された第１の抗体断片を形成すること；
（ｃ）第２の抗体「Ｂ」を、ヒンジ領域内の重鎖間の実質的にすべてのジスルフィド結合が切断されるのに充分な条件下で、還元剤と接触させ、各々が１本の重鎖に結合している１本の軽鎖を含むものである１対の第２の抗体断片Ｂ’を得ること、該重鎖は、前記ジスルフィド結合の該還元により形成された１個以上の反応性チオール基を有するものである；
（ｄ）第２のヘテロ二官能性リンカーを前記第２の抗体断片Ｂ’に結合させ（前記第２のヘテロ二官能性リンカーは：（ｉ）前記第２の抗体断片の前記重鎖の反応性チオール基との共有結合のための第２のチオール反応性官能基；および（ｉｉ）アルキンを含むものである。）；アルキン官能基化された第２の抗体断片を形成すること；
（ｅ）前記アジド官能基化された第１の抗体断片を前記アルキン官能基化された第２の抗体断片と反応させて、前記アジドと前記アルキンとの１，３−双極子付加環化によって前記第１の抗体断片を前記第２の抗体断片に共有結合させ、化学的に固定された二重特異性抗体「ＡＢ」または「ＢＡ」を形成すること
を含むものである。
【００１１】
ヒンジ領域内のジスルフィド結合を還元する工程は好ましくは、重鎖と軽鎖間のジスルフィド結合が実質的に還元されることなく行われ、これにより、一部の実施形態では、ヒンジ領域内のジスルフィド結合の切断後、かかる重鎖と軽鎖間のジスルフィド結合の少なくとも約９０％または少なくとも約９５％または少なくとも約９９％がそのままで維持されていることを意図する。
【００１２】
好ましくは、第１のヘテロ二官能性リンカーは形態Ｑ−Ｌ−Ｎ３を有するものであり、ここで、Ｑはチオール反応性官能基であり、Ｌは炭化水素リンカーであり、Ｎ３はアジドである。好ましくは、チオール反応性官能基Ｑはアルキルハライド（例えば、アルキルクロライド、ブロミドもしくはアイオダイド）、ベンジルハライド、マレイミド、ハロ−マレアミド（ブロモマレイミド）またはジハロ−マレイミド（ジブロモマレイミド）である。好ましくは、Ｌは、ＱとＮ３間に直結した鎖の３から６０個（例えば、より典型的には６から５０個）の原子を有する炭化水素リンカーである。より好ましくは、Ｌはポリアルキレンオキシド（ＰＥＦ）基であるか、またはＬは、各単量体単位が−（ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ）ｎ−もしくは−（Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２）ｎ−（ここで、「ｎ」は独立して１から２０、より典型的には１から８の整数である。）であるポリマーである。
【００１３】
好ましくは、第１のヘテロ二官能性リンカー（第１の抗体断片に結合）は：
【００１４】
【化１】
0006687247.tif 000002
であり、ここで、Ｑは、リンカーを抗体断片にライゲーションするのに適した任意の基であり得るが、好ましくは、重鎖のヒンジ領域内のシステイン残基のチオールと共有結合し得るものである。例示的なＱ基は：
【００１５】
【化２】
0006687247.tif 000003
であり、ここで、Ｚは独立して、Ｈ、Ｂｒ、ＩおよびＳＰｈからなる群より選択される。好ましくは、少なくとも１つのＺの存在はＨではないが、マレイミドの場合、Ｚは各存在において水素であり得る。Ｍは独立してＣＲ＊またはＮである。
【００１６】
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ２、Ｘ４およびＸ５は独立して、結合（即ち、存在しない。）、−Ｏ−、−ＮＲＮ−、−Ｎ＝Ｃ−、−Ｃ＝Ｎ−、−Ｎ＝Ｎ−、−ＣＲ＊＝ＣＲ＊−（シスまたはトランス）、−Ｃ≡Ｃ−、−（Ｃ＝Ｏ）−、−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−、−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＲＮ−、−（Ｃ＝Ｏ）−（ＣＨ２）ｎ−、−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−、−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＲＮ−（ＣＨ２）ｎ−および−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＲＮ−（ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ）ｎ−（ここで、「ｎ」はゼロまたは１から１０の整数のいずれかである。）からなる群より選択され；
Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄは独立して、−Ｏ−、−ＮＲＮ−、−ＣＨ２−、−（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＲ＊２）ｎ−、−（ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ）ｎ−、−（ＣＲ＊２ＣＲ＊２−Ｏ）ｎ−、−（Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２）ｎ−、−（Ｏ−ＣＲ＊２ＣＲ＊２）ｎ−、−ＣＲ＊＝ＣＲ＊−（シスまたはトランス）、−Ｎ＝Ｃ−、−Ｃ＝Ｎ−、−Ｎ＝Ｎ−、−Ｃ≡Ｃ−、−（Ｃ＝Ｏ）−、−（ＣＨ２）ｎ−（Ｃ＝Ｏ）−、−（Ｃ＝Ｏ）−（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎ−（Ｃ＝Ｏ）−（ＣＨ２）ｎ−、−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−、−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−、−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−、−（ＣＨ２）ｎ−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−、−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−（ＣＨ２）ｎ、−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎ−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−、−（ＣＨ２）ｎ−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎ−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−（ＣＨ２）ｎ−、−ＮＲＮ−（Ｃ＝Ｏ）−、−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＲＮ−、−ＮＲＮ−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−、−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＲＮ−、−ＮＲＮ−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＲＮ−、−（ＣＨ２）ｎ−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＲＮ−、−ＮＲＮ−（Ｃ＝Ｏ）−（ＣＨ２）ｎ、−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＲＮ−（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎ−ＮＲＮ−（Ｃ＝Ｏ）−、−（ＣＨ２）ｎ−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＲＮ−−（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎ−ＮＲＮ−（Ｃ＝Ｏ）−（ＣＨ２）ｎ−、−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＲＮ−（ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ）ｎ−、−（ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ）ｎ−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＲＮ−、−（ＣＨ２）ｎ−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＲＮ−（ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ）ｎ−、−（ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ）ｎ−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＲＮ−（ＣＨ２）ｎ−、および２から８員の環式炭化水素、複素環、アリール、またはヘテロアリール環；（ここで、「ｎ」は独立してゼロまたは１から１０の整数である。）からなる群より選択され；「ｌ」、「ｐ」、「ｑ」および「ｒ」は独立してゼロまたは１から１０の整数であり；
Ωは結合（即ち、存在しない。）であるかまたは、Ｃ３−２６の炭化水素環もしくは、場合により４個までの縮合環を含む縮合環系であるかのいずれかであり、各環は３から８個の構成員を有し、場合により各環内にＯ、ＳおよびＮから選択される１から４個のヘテロ原子を含むものである。好ましくは、Ωは、シクロオクタン環に縮合しているか、または８員の複素環式の環もしくは環系に縮合している１，２，３−トリアゾール環であり；
Ｒ＊およびＲＮは独立して、各存在においてＨであるか、またはＣ１−１２炭化水素のいずれかであり、ハロゲン、Ｏ、ＳおよびＮから選択される１から６個のヘテロ原子で場合により置換されており；ここで、任意の２つの基Ｒ＊および／またはＲＮは一体となって３から８員の環を形成していてもよい。
【００１７】
第２のヘテロ二官能性リンカーは形態Ｑ−Ｌ−Ｇを有するものであり、ここで、Ｑはチオール反応性官能基であり、Ｌは炭化水素リンカーであり、Ｇはアルキン含有基である。チオール反応性官能基Ｑは、アルキルハライド（例えば、アルキルクロライド、ブロミドもしくはアイオダイド）、ベンジルハライド、マレイミド、ハロ−マレアミド（ブロモマレイミドなど）およびジハロ−マレイミド（ジブロモマレイミドなど）からなる群より選択される。Ｌは、ＱとＧ間に直結した鎖の３から６０個（例えば、好ましくは６から５０個）の原子を有する炭化水素リンカーである。好ましくは、Ｌはポリアルキレンオキシド基（ＰＥＧ）であり、好ましくは、Ｌは、単位−（ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ）ｎ−または−（Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２）ｎ−（ここで、「ｎ」は独立して１から２０、より典型的には１から８の整数である。）のポリマーである。
【００１８】
Ｇは、アジドとの付加環化を行い得る任意のアルキン含有基である。一部の実施形態では、Ｇは、−Ｃ≡ＣＨなどの末端アルキンを含むものである。他の実施形態では、Ｇは、環内に−Ｃ≡Ｃ−結合を有する環または環系を含むものである。一実施形態では、Ｇは、−Ｃ≡Ｃ−結合を有するＣ８環を含むものである。一実施形態では、−Ｃ≡Ｃ−含有環はひずみを有するものである。
【００１９】
第２のヘテロ二官能性リンカーは、形態：
【００２０】
【化３】
0006687247.tif 000004
を有するものである。
【００２１】
Ｑは、第１のヘテロ二官能性リンカーのものと同じもの、または異なるものである。Ｑは典型的には、形態：
【００２２】
【化４】
0006687247.tif 000005
のチオール反応性基であり、
ここで、Ｚは独立して、各存在においてＨ、Ｂｒ、ＩおよびＳＰｈから選択される。一部の実施形態では、少なくとも１つのＺの存在はＨではないが、マレイミドの場合、Ｚは各存在において水素であり得る。Ｍは独立して、各存在において、ＣＲ＊またはＮのいずれかである。
【００２３】
Ｇは典型的には、アジドとの１，３双極子付加環化反応を行い得る−Ｃ≡Ｃ−結合を含むＣ８−２０炭化水素基である。一部の実施形態では、Ｇは、形態−Ｃ≡Ｃ−Ｈを有するものである。他の実施形態では、Ｇは、−Ｃ≡Ｃ−結合を有する環を含むものである。特に、Ｇは、三重結合を有する８員環（例えば、シクロオクチン）を含むものであり得る。該環は場合により、１つ、２つまたはそれ以上のさらなる環に縮合しているものであってもよく、該さらなる環は典型的にはＣ３−６の環式炭化水素環、例えば、アリール、ヘテロアリールおよび複素環である。三重結合を含有している該８員環は、該環内に１個以上（例えば、１から４個）のヘテロ原子（窒素および酸素など）を含むものであってもよい。一実施形態では、該８員環は、該環内に窒素原子を含むものであり、これにより、以下：
【００２４】
【化５】
0006687247.tif 000006
に示す例示的な構造の場合のようなＬとの結合点がもたらされる。
【００２５】
好ましくは、Ｇは、形態：
【００２６】
【化６】
0006687247.tif 000007
を有するものであり、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ２、Ｘ４およびＸ５は独立して、各存在において、結合（即ち、存在しない。）、−Ｏ−、−ＮＲＮ−、−Ｎ＝Ｃ−、−Ｃ＝Ｎ−、−Ｎ＝Ｎ−、−ＣＲ＊＝ＣＲ＊−（シスまたはトランス）、−Ｃ≡Ｃ−、−（Ｃ＝Ｏ）−、−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−、−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＲＮ−、−ＮＲＮ−（Ｃ＝Ｏ）−、−ＮＲＮ−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−、−（Ｃ＝Ｏ）−（ＣＨ２）ｎ−、−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−、−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＲＮ−（ＣＨ２）ｎ−および−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＲＮ−（ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ）ｎ−（「ｎ」はゼロまたは１から１０の整数のいずれかである。）からなる群より選択され；
Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄは独立して、各存在において、−Ｏ−、−ＮＲＮ−、−ＣＨ２−、−（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＲ＊２）ｎ−、−（ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ）ｎ−、−（ＣＲ＊２ＣＲ＊２−Ｏ）ｎ−、−（Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２）ｎ−、−（Ｏ−ＣＲ＊２ＣＲ＊２）ｎ−、−ＣＲ＊＝ＣＲ＊−（シスもしくはトランス）、−Ｎ＝Ｃ−、−Ｃ＝Ｎ−、−Ｎ＝Ｎ−、−Ｃ≡Ｃ−、−（Ｃ＝Ｏ）−、−（ＣＨ２）ｎ−（Ｃ＝Ｏ）−、−（Ｃ＝Ｏ）−（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎ−（Ｃ＝Ｏ）−（ＣＨ２）ｎ−、−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−、−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−、−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−、−（ＣＨ２）ｎ−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−、−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−（ＣＨ２）ｎ、−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎ−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−、−（ＣＨ２）ｎ−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎ−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−（ＣＨ２）ｎ−、−ＮＲＮ−（Ｃ＝Ｏ）−、−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＲＮ−、−ＮＲＮ−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−、−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＲＮ−、−ＮＲＮ−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＲＮ−、−（ＣＨ２）ｎ−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＲＮ−、−ＮＲＮ−（Ｃ＝Ｏ）−（ＣＨ２）ｎ、−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＲＮ−（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎ−ＮＲＮ−（Ｃ＝Ｏ）−、−（ＣＨ２）ｎ−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＲＮ−−（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎ−ＮＲＮ−（Ｃ＝Ｏ）−（ＣＨ２）ｎ−、−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＲＮ−（ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ）ｎ−、−（ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ）ｎ−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＲＮ−、−（ＣＨ２）ｎ−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＲＮ−（ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ）ｎ−、−（ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ）ｎ−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＲＮ−（ＣＨ２）ｎ−、または２から８員の環式炭化水素、複素環、アリール、もしくはヘテロアリール環；（「ｎ」は独立して、各存在において、ゼロまたは１から１０の整数のいずれかである。）から選択され；「ｌ」、「ｐ」、「ｑ」および「ｒ」は独立して、ゼロまたは１から１０の整数のいずれかであり；
Ωは結合（即ち、存在しない。）または、Ｃ３−２６の炭化水素環もしくは、場合により４個までの縮合環を含む縮合環系であるかのいずれかであり、各環は３から８個の構成員を有し、場合により各環内にＯ、ＳおよびＮから選択される１から４個のヘテロ原子を含むものである。一実施形態では、Ωは、シクロオクタン環に縮合しているか、または８員の複素環式の環もしくは環系に縮合している１，２，３−トリアゾール環を含むものである。
【００２７】
Ｒ＊およびＲＮは独立して、各存在においてＨ、または、ハロゲン、Ｏ、ＳおよびＮから選択される１から６個のヘテロ原子で場合により置換されているＣ１−１２炭化水素のいずれかであり；ここで、２つの基Ｒ＊および／またはＲＮは一体となって３から８員の環を形成していてもよい。
【００２８】
アジドとアルキン間の付加環化反応は１，３双極子付加環化反応によって進行し得る。該反応は銅イオンによって触媒され得る。一部の実施形態では、付加環化反応は中性ｐＨまたは生理学的ｐＨで行われる。
【００２９】
本開示により、さらに、ヒンジ残基配列（ＥＵ−インデックスの番号付け：残基２２６から２２９；カバットの番号付け：残基２３９から２４２）ＣＰＰＣ（配列番号２）またはＣＰＳＣ（配列番号１）またはＳＰＰＣ（配列番号３）またはＳＰＳＣ（配列番号４）を有する抗体「Ａ」とヒンジ残基配列（残基２２６から２２９）ＣＰＰＣ（配列番号２）またはＣＰＳＣ（配列番号１）またはＳＰＰＣ（配列番号３）またはＳＰＳＣ（配列番号４）を有する第２の抗体「Ｂ」を還元し、半抗体Ａと半抗体Ｂを形成するための方法であって：
（ａ）各抗体Ａと抗体Ｂを還元すること、ここで、還元条件は、ヒンジ残基配列（ＥＵ−インデックスの番号付け：残基２２６から２２９；カバットの番号付け：残基２３９から２４２）ＣＰＰＣ（配列番号２）またはＣＰＳＣ（配列番号１）またはＳＰＰＣ（配列番号３）またはＳＰＳＣ（配列番号４）を有する各抗体のヒンジ領域内の任意の鎖間ジスルフィド結合または鎖内ジスルフィド結合を破壊するものである；
（ｂ）
【００３０】
【化７】
0006687247.tif 000008
（Ｎ３は−Ｎ＝Ｎ＝Ｎである。）
からなる群より選択される化合物を；
半抗体Ａのヒンジコア配列の一方または両方のＣｙｓ残基（ＥＵ−インデックスの番号付け：残基２２６および２２９；カバットの番号付け：残基２３９および２４２）に連結させ、連結部含有半抗体Ａを形成すること；
（ｃ）
【００３１】
【化８】
0006687247.tif 000009
からなる群より選択される化合物を、抗体Ｂのヒンジコア配列のＣｙｓ残基２２６と２２９の一方または両方（ＥＵ−インデックスの番号付け：残基２２６および２２９；カバットの番号付け：残基２３９および２４２）に連結させ、連結部含有抗体Ｂを形成すること；ならびに
（ｄ）ほぼ等モル量の連結部含有抗体Ａと連結部含有抗体Ｂを中性条件下でインキュベートし、連結された二重特異性抗体ＡＢを形成すること
を含む方法を提供する。
【００３２】
好ましくは、半抗体Ａを形成するための抗体Ａおよび半抗体Ｂを形成するための抗体Ｂの還元は還元剤中で行われ、該還元剤は、Ｌ−システイン、ジチオトレイトール、β−メルカプトエタノール、システアミン、ＴＣＥＰ（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン）、２−ＭＥＡ（２−メルカプトエチルアミン）およびその組み合わせからなる群より選択される。好ましくは、１個または２個のＣｙｓ残基を有する抗体Ａのヒンジ領域は：
【００３３】
【化９】
0006687247.tif 000010
（Ｎ３は−Ｎ＝Ｎ＝Ｎである。）
からなる群より選択される構造を有するＡ部分と連結させる。好ましくは、１個または２個のＣｙｓ残基を有する抗体Ｂのヒンジ領域は：
【００３４】
【化１０】
0006687247.tif 000011
からなる群より選択される構造を有するＢ部分と連結させ、連結部含有半抗体Ｂを形成させる。
【００３５】
本開示により、さらに、連結部含有半抗体Ａ
【００３６】
【化１１】
0006687247.tif 000012
（Ｎ３は−Ｎ＝Ｎ＝Ｎである。）
が；
連結部含有抗体Ｂ
【００３７】
【化１２】
0006687247.tif 000013
に連接されて図１０に示す構造を有する二重特異性抗体ＡＢを形成している、化学的に固定された二重特異性抗体ＡＢを提供する。
【００３８】
本開示により：
【００３９】
【化１３】
0006687247.tif 000014
（Ｎ３は−Ｎ＝Ｎ＝Ｎであり、Ｚは脱離基である。）
からなる群より選択される構造を有する半抗体Ａ；
と：
【００４０】
【化１４】
0006687247.tif 000015
からなる群より選択される構造を有する半抗体Ｂ
を含むものである、ＩｇＧクラスの抗体「Ａ」またはその断片とＩｇＧクラスの抗体「Ｂ」に由来する化学的に固定された二重特異性抗体「ＡＢ」または「ＢＡ」を提供する。
【００４１】
本開示により、さらに：
（ａ）抗体Ａ由来の１本の重鎖と軽鎖を含む第１の抗体断片Ａ’、該重鎖は１個以上の反応性チオール基を有するものである；
（ｂ）１本の重鎖と軽鎖を含む第２の抗体断片Ｂ’、該重鎖は１個以上の反応性チオール基を有するものである、
を含むものであり；
前記第１の抗体断片と第２の抗体断片は、リンカーを介して前記第１の抗体断片の反応性チオールに結合しているアジドとリンカーを介して前記第２の抗体断片の反応性チオールに結合しているアルキンとの付加環化反応により形成された１，２，３−トリアゾールによって共有結合されている、二重特異性抗体を提供する。該リンカーは上記のものである。抗体断片Ａ’およびＢ’は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４免疫グロブリンまたはそのＦａｂ２断片に由来するものである。
【００４２】
本開示により、さらに、リンカーに共有結合された抗体断片であって、該リンカーが、アジドとの付加環化反応を行い得る−Ｃ≡Ｃ−結合を有するＣ８環を含むものである抗体断片を提供する。本開示により、さらに、リンカーに共有結合された抗体断片であって、該リンカーが、−Ｃ≡Ｃ−結合との付加環化反応を行い得るアジドを含むものである抗体断片を提供する。
【００４３】
好ましくは、半抗体Ａを形成するための抗体Ａおよび半抗体Ｂを形成するための抗体Ｂの還元は還元剤中で行われ、該還元剤は、Ｌ−システイン、ジチオトレイトール、β−メルカプトエタノール、システアミン、ＴＣＥＰ（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン）、２−ＭＥＡ（２−メルカプトエチルアミン）およびその組み合わせからなる群より選択される。好ましくは、１個または２個のＣｙｓ残基を有する抗体Ａのヒンジ領域は：
【００４４】
【化１５】
0006687247.tif 000016
（Ｎ３は−Ｎ＝Ｎ＝Ｎである。）
からなる群より選択される構造を有するＡ部分により；
半抗体Ａのヒンジコア配列の一方または両方のＣｙｓ残基（ＥＵ−インデックスの番号付け：残基２２６および２２９；カバットの番号付け：残基２３９および２４２）に連結させ、連結部含有半抗体Ａを形成する；
（ｃ）：
【００４５】
【化１６】
0006687247.tif 000017
からなる群より選択される化合物を、抗体Ｂのヒンジコア配列のＣｙｓ残基２２６と２２９の一方または両方（ＥＵ−インデックスの番号付け：残基２２６および２２９；カバットの番号付け：残基２３９および２４２）に連結させ、連結部含有抗体Ｂを形成すること；ならびに
（ｄ）ほぼ等モル量の連結部含有抗体Ａと連結部含有抗体Ｂを中性条件下でインキュベートし、連結された二重特異性抗体ＡＢを形成すること。
【００４６】
好ましくは、半抗体Ａを形成するための抗体Ａおよび半抗体Ｂを形成するための抗体Ｂの還元は還元剤中で行われ、該還元剤は、Ｌ−システイン、ジチオトレイトール、β−メルカプトエタノール、システアミン、ＴＣＥＰ（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン）、２−ＭＥＡ（２−メルカプトエチルアミン）およびその組み合わせからなる群より選択される。好ましくは、１個または２個のＣｙｓ残基を有する抗体Ａのヒンジ領域を：
【００４７】
【化１７】
0006687247.tif 000018
（Ｎ３は−Ｎ＝Ｎ＝Ｎである。）
からなる群より選択される構造を有するＡ部分と連結させる。好ましくは、１個または２個のＣｙｓ残基を有する抗体Ｂのヒンジ領域を：
【００４８】
【化１８】
0006687247.tif 000019
からなる群より選択される構造を有するＢ部分と連結させ、連結部含有半抗体Ｂを形成する。
【００４９】
本開示により、さらに、連結部含有半抗体Ａ
【００５０】
【化１９】
0006687247.tif 000020
（Ｎ３は−Ｎ＝Ｎ＝Ｎである。）
が；
連結部含有抗体Ｂ
【００５１】
【化２０】
0006687247.tif 000021
に連接されて図１０に示す構造を有する二重特異性抗体ＡＢを形成している、化学的に固定された二重特異性抗体ＡＢを提供する。
【００５２】
本開示により：
【００５３】
【化２１】
0006687247.tif 000022
（Ｎ３は−Ｎ＝Ｎ＝Ｎであり、Ｚは脱離基である。）
からなる群より選択される構造を有する半抗体Ａ、および該半抗体Ａと結合させる；
【００５４】
【化２２】
0006687247.tif 000023
からなる群より選択される構造を有する半抗体Ｂ
を含むものである、ＩｇＧクラスの抗体「Ａ」とＩｇＧクラスの抗体「Ｂ」に由来する化学的に固定された二重特異性抗体「ＡＢ」または「ＢＡ」を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】図１は、ＩｇＧクラスの抗体のヒンジ領域内の１個のＣｙｓ残基への化学的コンジュゲーションによる二重特異性ｍＡｂの創出のセットアップの概略図を示す。
【図２】図２は、本明細書における開示によるＩｇＧクラスの抗体のヒンジ領域内の１個のＣｙｓ残基への化学的コンジュゲーションによる鎖間架橋の概略表示を示す。
【図３】図３は、ＩｇＧクラスの抗体のヒンジ領域内の２個のＣｙｓ残基との鎖内架橋の概略表示を示す。
【図４】図４は、ＩｇＧクラスの抗体のヒンジ領域内の２個のＣｙｓ残基との鎖間架橋による二重特異性ｍＡｂの創出の概略表示（上および下）を示す。図４は、配列番号１として「ＣＰＳＣ」を開示する。
【図５】図５は、化学的に固定された半ｍＡｂ断片のＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析を示す。
【図６】図６は、未加工の（ｎａｋｅｄ）ｍＡｂのＨＣ  Ｆａｂ（上）、アジドコンジュゲートｍＡｂ断片（中央）およびアルキンコンジュゲートｍＡｂ断片（下）のＭＳ分析を示す。図６は、配列番号３として「ＳＰＰＣ」を開示する。
【図７】図７は、アジド結合半ｍＡｂとアルキン結合半ｍＡｂ断片による架橋生成物のＳＤＳ  ＰＡＧＥを示す。図７は、配列番号４として「ＳＰＳＣ」を開示する。
【図８】図８は、出発ｍＡｂの（Ｆａｂ）２（上）および架橋生成物（下）のＭＳ分析を示す。図８は、配列番号３として「ＳＰＰＣ」を開示する。
【図９】図９は、本明細書の実施例４で作製した化学修飾半抗体断片（レーン２および３）の非還元ＳＤＳ  ＰＡＧＥを示す。
【図１０】図１０は、２種類の半抗体断片間のクリックコンジュゲーションによる二重特異性抗体の創出を示す。
【図１１】図１１は、半抗体断片（ａ）およびクリック生成物（ｂ）の非還元ＳＤＳ  ＰＡＧＥを示す。半抗体−アジドはゲル（ａ）のレーン２であり、半抗体−ＤＢＣＯはゲル（ａ）のレーン３である。クリック生成物はゲル（ｂ）のレーン２である。
【図１２】図１２は、二重特異性抗体ＣＢＡ−０７１０の質量を示すＩｄｅＳ消化クリック生成物の質量スペクトルを示す。
【図１３】図１３は、二重特異性抗体ＣＢＡ−０７１０のＳＥＣサイズ排除クロマトグラフィーを示す。
【図１４】図１４は、ＢＩＡｃｏｒｅでの二重特異性抗体ＣＢＡ−０７１０の結合を示す。より詳しくは、図１４は、ＢＩＡｃｏｒｅでの二重特異性抗体ＣＢＡ−０７１０の２種類の抗原との同時結合を示す２。
【図１５】図１５は、トリプルネガティブ乳がん細胞ＭＤＡ−ＭＢ−２３１との二重特異性抗体ＣＢＡ−０７１０の結合を示す。この細胞は抗原−１と抗原−２の両方を発現する。ＳＴＩ−Ａ０６０７は抗−抗原−１モノクローナル抗体であり、ＳＴＩ−Ａ１０１０は抗−抗原−２モノクローナル抗体である。
【図１６】図１６は、トリプルネガティブ乳がん細胞における二重特異性抗体ＣＢＡ−０７１０の拮抗的活性を示す。ＳＴＩ−Ａ０６０７は抗−抗原−１モノクローナル抗体であり、ＳＴＩ−Ａ１０１０は抗−抗原２モノクローナル抗体である。ＨＧＦは抗原−１の天然リガンドである。
【図１７】図１７は、二重特異性抗体ＣＢＡ−０７１０に応答したＩＦＮ−γ放出の増大を示す。ＳＴＩ−Ａ１０１０は抗−抗原−２（免疫チェックポイント）モノクローナル抗体である。競合ｍＡｂはヒト化抗−抗原−２（免疫チェックポイント）モノクローナル抗体である。
【図１８】図１８は、二重特異性抗体ＣＢＡ−０７１０に応答したＩＬ−２放出の増大を示す。ＳＴＩ−Ａ１０１０は抗−抗原−２（免疫チェックポイント）モノクローナル抗体である。競合ｍＡｂはヒト化抗−抗原−２（免疫チェックポイント）モノクローナル抗体である。
【図１９】図１９は、通常の抗−ｃ−Ｍｅｔ  ＩｇＧ１抗体および抗−ＰＤ−Ｌ１  ＩｇＧ１抗体と比べてＡの抗−ｃ−Ｍｅｔ抗体とＢの抗−ＰＤ−Ｌ１抗体で構成された化学的に固定された二重特異性抗体での有効性の改善を示す。
【図２０】図２０は、化学的コンジュゲーションによる二重特異性Ｆ（ａｂ）’２の創出の概略図を示す。
【図２１】図２１は、Ｆ（ａｂ）’２とＦ（ａｂ）’のＳＤＳ＿ＰＡＧＥゲル分析を示す。１列目は、ＩｄｅＳで消化した抗体Ａである。２列目は、ＩｄｅＳで消化した抗体Ｂである。３列目は、消化し、ＦＣを除去した抗体Ａである。４列目は、消化し、ＦＣを除去した抗体Ｂである。５列目は、消化し、ＦＣを除去し、２ＭＥＡとＴＣＥＰで還元し、ＤＢＣＯ（ジベンゾシクロオクチル）−マレイミドとコンジュゲートさせた抗体Ａである。６列目は、消化し、ＦＣを除去し、２ＭＥＡとＴＣＥＰで還元し、アジド−マレイミドとコンジュゲートさせた抗体Ｂである。
【図２２】図２２は、２種類のＦ（ａｂ）’断片間のクリックコンジュゲーションによるＦ（ａｂ）’２化学的に固定された二重特異性抗体の創出の模式図を示す。
【図２３】図２３は、本明細書の実施例７によるクリックＦ（ａｂ）’２のＳＥＣを示す。
【図２４】図２４は、クリック二重特異性Ｆ（ａｂ）’２断片のＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析を示す。１列目は、消化し、ＦＣを除去し、２ＭＥＡとＴＣＥＰで還元し、ＤＢＣＯ（ジベンゾシクロオクチル）−マレイミドとコンジュゲートさせた抗体Ａである。２列目は、消化し、ＦＣを除去し、２ＭＥＡとＴＣＥＰで還元し、アジド−マレイミドとコンジュゲートさせた抗体Ｂである。３列目はクリック＿二重特異性Ｆ（ａｂ）’２である。
【図２５】図２５は、二重特異性Ｆ（ａｂ）’２の質量を示すクリック生成物の質量スペクトルを示す。
【図２６】図２６は、クリックＦ（ａｂ）’２のＳＥＣを示す。
【図２７】図２７は、Ｏｃｔｅｔ  Ｒｅｄでの二重特異性Ｆ（ａｂ）’２の２種類の抗原との同時結合を示す。
【図２８】図２８は、化学的コンジュゲーションによる二重特異性ＩｇＧ２の創出の概略図を示す。
【図２９】図２９は、ＩｇＧ２断片のＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析を示す。１列目は抗体Ａである。２列目は、ＴＣＥＰで還元し、アジド−マレイミドとコンジュゲートさせた抗体Ａである。３列目は抗体Ｂである。４列目は、ＴＣＥＰで還元し、アジド−マレイミドとコンジュゲートさせた抗体Ｂである。
【図３０Ａ】図３０Ａは、リンカーとコンジュゲートさせたＩｇＧ２＿Ａの質量を示す質量スペクトルを示す。
【図３０Ｂ】図３０Ｂは、リンカーとコンジュゲートさせたＩｇＧ２＿Ｂの質量を示す質量スペクトルを示す。
【図３０Ｃ】図３０Ｃは、ＩｇＧ２＿ＡとＢで形成した二重特異性のＩｇＧ２の質量を示す質量スペクトルを示す。
【図３１】図３１は、ＩｇＧ２＿Ａ、ＩｇＧ２＿Ｂおよびクリック生成物のＳＥＣを示す。
【発明を実施するための形態】
【００５６】
二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）は、ヒンジ領域で化学結合された２種類の半抗体断片で構成されている（図１）。出発抗体はＩｇＧ１またはＩｇＧ４アイソタイプのいずれかである。出発抗体は、Ｃｙｓ残基をまずＳｅｒに変異させ、ヒンジのジスルフィドを１つだけにした修飾ヒンジ領域を含むものであってもよい。二重特異性抗体の創出は３つの主要な工程を伴う。第１工程は、半抗体断片を形成するための抗体ＡとＢの両方の選択的還元である。第２工程は、それぞれ化学修飾された半抗体断片Ａ’とＢ’がもたらされる、システインベースでのコンジュゲーションによる各半抗体断片のヒンジ領域内への官能性部分ＸまたはＹの導入である。最後の工程では、この２種類の半抗体断片を、Ｘ部分とＹ部分間の化学ライゲーションによって一体に連結させ、二重特異性抗体を形成する。
【００５７】
本開示により、ＩｇＧクラスの抗体「Ａ」とＩｇＧクラスの抗体「Ｂ」に由来する化学的に固定された二重特異性抗体「ＡＢ」または「ＢＡ」を創出するための方法であって：
（ａ）ヒンジ残基配列（ＥＵ−インデックスの番号付け：残基２２６から２２９；カバットの番号付け：残基２３９から２４２）ＣＰＰＣ（配列番号２）またはＣＰＳＣ（配列番号１）またはＳＰＰＣ（配列番号３）またはＳＰＳＣ（配列番号４）を有する第１の抗体「Ａ」とヒンジ残基配列（ＥＵ−インデックスの番号付け：残基２２６から２２９；カバットの番号付け：残基２３９から２４２）ＣＰＰＣ（配列番号２）またはＣＰＳＣ（配列番号１）またはＳＰＰＣ（配列番号３）またはＳＰＳＣ（配列番号４）を有する第２の抗体「Ｂ」を還元し、半抗体Ａと半抗体Ｂを形成すること、ここで、抗体Ａは第１の標的に結合するものであり、抗体Ｂは第２の標的に結合するものであり、還元条件は、ヒンジ残基配列（残基２２６から２２９）ＣＰＰＣ（配列番号２）またはＣＰＳＣ（配列番号１）またはＳＰＰＣ（配列番号３）またはＳＰＳＣ（配列番号４）を有するクラスの抗体のヒンジ領域内の任意の鎖間ジスルフィド結合または鎖内ジスルフィド結合を破壊するものである；
（ｂ）式Ｉの化合物を、半抗体Ａのヒンジコア配列の１個または２個のＣｙｓ残基（ＥＵ−インデックスの番号付け：残基２２６および２２９；カバットの番号付け：残基２３９および２４２）に連結させ：
【００５８】
【化２３】
0006687247.tif 000024
（Ｎ３は−Ｎ＝Ｎ＝Ｎである。）
からなる群より選択される構造を有する連結部含有半抗体Ａを形成すること；
（ｃ）式ＩＩの化合物を、抗体Ｂのヒンジコア配列の１個または２個のＣｙｓ残基（ＥＵ−インデックスの番号付け：残基２２６および２２９；カバットの番号付け：残基２３９および２４２）に連結させ：
【００５９】
【化２４】
0006687247.tif 000025
からなる群より選択される構造を有する連結部含有抗体Ｂを形成すること；ならびに
（ｄ）ほぼ等モル量の連結部含有抗体Ａと連結部含有抗体Ｂを中性条件下でインキュベートし、連結された二重特異性抗体ＡＢを形成すること
を含む方法を提供する。
【００６０】
好ましくは、半抗体Ａを形成するための抗体Ａおよび半抗体Ｂを形成するための抗体Ｂの還元は還元剤中で、例えば、Ｌ−システイン、ジチオトレイトール、β−メルカプトエタノール、システアミン、ＴＣＥＰ（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン）、２−ＭＥＡ（２−メルカプトエチルアミン）およびその組み合わせ中で行われる。好ましくは、２個のＣｙｓ残基を有する抗体Ａのヒンジ領域は：
【００６１】
【化２５】
0006687247.tif 000026
（Ｎ３は−Ｎ＝Ｎ＝Ｎである。）
からなる群より選択される構造を有するＡ部分と連結させる。好ましくは、２個のＣｙｓ残基を有する抗体Ｂのヒンジ領域は：
【００６２】
【化２６】
0006687247.tif 000027
からなる群より選択される構造を有するＢ部分と連結させる。
【００６３】
本開示により、さらに、連結部含有半抗体Ａ
【００６４】
【化２７】
0006687247.tif 000028
（Ｎ３は−Ｎ＝Ｎ＝Ｎである。）
が；
連結部含有抗体Ｂ
【００６５】
【化２８】
0006687247.tif 000029
に連接されて図１０に示す構造を有する二重特異性抗体ＡＢを形成している、化学的に固定された二重特異性抗体ＡＢを提供する。
【００６６】
本開示により：
【００６７】
【化２９】
0006687247.tif 000030
（Ｎ３は−Ｎ＝Ｎ＝Ｎである。）
からなる群より選択される構造を有する半抗体Ａ；
と：
【００６８】
【化３０】
0006687247.tif 000031
からなる群より選択される構造を有する半抗体Ｂ
を含むものである、ＩｇＧクラスの抗体「Ａ」とＩｇＧクラスの抗体「Ｂ」に由来する化学的に固定された二重特異性抗体「ＡＢ」または「ＢＡ」を提供する。好ましくは、半抗体Ａを形成するための抗体Ａおよび半抗体Ｂを形成するための抗体Ｂの還元は還元剤中で、例えば、Ｌ−システイン、ジチオトレイトール、β−メルカプトエタノール、システアミン、ＴＣＥＰ（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン）、２−ＭＥＡ（２−メルカプトエチルアミン）およびその組み合わせ中で行われる。
【００６９】
好ましくは、抗体ＡおよびＢはモノクローナル抗体である。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法によって、または組換えＤＮＡ法とタンパク質発現法によって作製され得る。さらに、抗体ＡおよびＢは完全長の抗体であるか、または抗体断片である。
【００７０】
抗体ＡおよびＢは、ＣＰＰＣ（配列番号２）コアヒンジ領域配列またはＣＰＳＣ（配列番号１）コアヒンジ領域配列またはＳＰＰＣ（配列番号３）コアヒンジ領域配列またはＳＰＳＣ（配列番号４）コアヒンジ領域配列（ＥＵ−インデックスの番号付け：残基２２６から２２９；カバットの番号付け：残基２３９から２４２）を有するものである。さらに、インキュベートする工程（ｄ）は還元剤を添加する工程をさらに含むものであり、この場合、還元剤は、Ｌ−システイン、ジチオトレイトール、β−メルカプトエタノール、システアミン、ＴＣＥＰ（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン）、２−ＭＥＡ（２−メルカプトエチルアミン）およびその組み合わせからなる群より選択される。
【００７１】
得られた二重特異性抗体の品質と純度は、常套的な生化学的手法、例えば、吸光度の測定、ＨＰ−ＳＥＣ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、非変性ＰＡＧＥおよびＲＰ−ＨＰＬＣを用いて分析することができる。本開示の方法では一般的に、式Ｉのリンカーの式ＩＩのリンカーに対する親和性の特異性のため、任意の精製工程が回避されることに注意されたい。しかしながら、種々の精製工程がＵＳ２０１０／０１０５８７４に示されており、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。
【００７２】
本開示の方法はさらに、二重特異性抗体を治療的使用のために製剤化する工程を含むものである。この治療的使用は、ヒトへの使用に適した、特に非経口または静脈内投与に適した水溶液中に有効量の二重特異性抗体を含む製剤によってなされる。
【００７３】
図２は、化学的コンジュゲーションによる二重特異性のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を創出するためのスキームを示す。本明細書に記載の二重特異性ｍＡｂは、ヒンジ領域で化学結合された２種類の半抗体断片で構成されている。二重特異性ｍＡｂの創出方法は、３つの主要な工程を伴う（図２）。第１工程は、２種類の異なるｍＡｂ、それぞれＡとＢのヒンジ内のジスルフィドの選択的還元である。第２工程は、各ｍＡｂの同じ重鎖上の２つのシステイン間へのリンカーＸまたはＹによる鎖内結合の導入である。この鎖内結合過程により、２種類の化学的に固定されたｍＡｂ断片Ａ’およびＢ’がもたらされる。最後の工程では、この２種類のｍＡｂ断片を、ＸとＹ間の化学ライゲーションによって一体に連結させ、二重特異性抗体ＡＢを形成する。
【００７４】
ヒンジ内変異（ＣＰＳＣ（配列番号１））を有するＩｇＧ１、ｗｔ  ＩｇＧ４およびヒンジ内変異（ＳＰＳＣ（配列番号４））を有するＩｇＧ４を本試験において使用した。
【００７５】
第１工程は、抗体Ａおよび抗体Ｂの各々を還元するためのものである。一実施形態において、抗体（１０ｍｇ）を、１０モル当量の２−メルカプトエチル−アミン（２−ＭＥＡ）（０．１ＭのＰＢＳ（ｐＨ７．４）中）、１．０ｍＭのジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）で３７℃にて２時間処理した。過剰の２−ＭＥＡを部分還元ｍＡｂから、５０ｋＤａ遠心濾過チューブ（遠心分離は３，０００ＲＰＭで２０分間行った。）を用いて精製して除去した。０．１ＭのＰＢＳで合計３回の洗浄を行った。タンパク質濃度は、１．０ｍｇ／ｍＬの溶液で２８０ｎｍにおいて１．５８の吸光度値を用いて定量し、モル濃度は、１５０，０００ｇ／ｍｏｌの分子量を用いて測定した。
【００７６】
還元工程の別の実施形態では、抗体（１０ｍｇ）を、３．０モル当量のジチオトレイトール（ＤＴＴ）（０．１ＭのＰＢＳ（ｐＨ７．４）中）、１．０ｍＭのジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）で２４℃にて２時間処理した。過剰のＤＴＴを部分還元ｍＡｂから、５０ｋＤａ遠心濾過チューブ（遠心分離は３，０００ＲＰＭで２０分間行った。）を用いて精製して除去した。０．１ＭのＰＢＳで合計３回の洗浄を行った。
【００７７】
還元工程の別の実施形態では、ｍＡｂ（１０ｍｇ）を、２．０モル当量のトリス（２−カルボキシエチル）−ホスフィン（ＴＣＥＰ）（０．１ＭのＰＢＳ（ｐＨ８．０）中）、１．０ｍＭのジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）で２４℃にて２時間処理した。ｍＡｂ濃度は８．０ｍＭであった。精製せずに、部分還元ｍＡｂをコンジュゲーション工程に直接使用した。
【００７８】
第２工程はコンジュゲーション工程である。還元工程による部分還元ｍＡｂである「抗体Ａ」（０．１ＭのＰＢＳ中）を２．５モル当量の架橋剤Ｚ−Ｘ−Ｚに添加した（図２および図３）。架橋剤は、予備調製したストック溶液（ＤＭＳＯ中）（１ｍｇ／ｍＬ）で使用した。反応混合物中、部分還元抗体濃度は８．０ｍｇ／ｍＬであり、ＤＭＳＯ含有量は５％（ｖ／ｖ）であった。コンジュゲーションは２４℃で２時間行った。システイン（１ｍＭ終濃度）を使用し、任意の未反応の過剰の架橋剤をクエンチした。コンジュゲートｍＡｂを、リン酸緩衝生理食塩水で平衡化したＰＤ−１０カラムを用いて精製した。コンジュゲートｍＡｂの構造を図４に示す。同じ条件下で、第２のｍＡｂ（抗体Ｂ）を架橋剤Ｚ−Ｙ−Ｚとコンジュゲートさせ（図５および図６）、精製した。コンジュゲートｍＡｂの構造を図７および図８に示す。
【００７９】
第３工程は鎖間コンジュゲーション工程である。鎖間架橋のためのクリックコンジュゲーションを図９に示す。簡単には、アジド修飾抗体断片（３．０ｍｇ）（０．５ｍＬのＰＢＳ（０．１Ｍ、ｐＨ７．４）中）に、３．０ｍｇのアルキン修飾抗体断片（０．５ｍＬのＰＢＳ（０．１Ｍ、ｐＨ７．４）中）を添加する。この混合物に５０μＬのアセトニトリルを添加し、アセトニトリルの最終含有量を５％（ｖ／ｖ）にする。室温で３時間の反応後、混合物を、１００ｋＤａ遠心濾過チューブ（遠心分離は３，０００ＲＰＭで２０分間行う。）を用いて精製する。混合物をＰＢＳで３回洗浄し、得られた生成物をインビトロ特性評価に供する。
【実施例】
【００８０】
［実施例１］
この実施例は、本開示の方法による二重特異性抗体の合成を示す。図４は、ＩｇＧクラスの抗体のヒンジ領域内の２個のＣｙｓ残基への化学的コンジュゲーションによる二重特異性のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を創出するためのスキームを示す。本開示の二重特異性ｍＡｂは、そのそれぞれのヒンジ領域で化学結合されている２種類の半抗体断片で構成されている。二重特異性ｍＡｂを合成するための方法は、図５に示す３つの主要な工程を伴う。第１工程は、２種類の異なるｍＡｂ、それぞれＡとＢのヒンジ内のジスルフィドの選択的還元である。第２工程は、各ｍＡｂの同じ重鎖上の２つのシステイン間へのリンカーＸまたはＹによる鎖内結合の導入である。この鎖内結合過程により、２種類の化学的に固定されたｍＡｂ断片Ａ’およびＢ’がもたらされる。最後の工程では、この２種類のｍＡｂ断片を、ＸとＹ間の化学ライゲーションによって一体に連結させ、二重特異性抗体ＡＢを形成する。
【００８１】
より詳しくは、本発明者らは、ヒンジ内変異（ＣＰＳＣ（配列番号１））を有するＩｇＧ１である抗体「Ａ」と野生型ＩｇＧ４である抗体「Ｂ」を入手した。第１工程は抗体の還元であった。条件１：抗体（１０ｍｇ）を別々に、１０モル当量の２−メルカプトエチル−アミン（２−ＭＥＡ）（０．１ＭのＰＢＳ（ｐＨ７．４）中）、１．０ｍＭのジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）で３７℃にて２時間処理した。過剰の２−ＭＥＡを部分還元ｍＡｂから、５０ｋＤａ遠心濾過チューブ（遠心分離は３，０００ＲＰＭで２０分間行った。）を用いて精製して除去した。０．１ＭのＰＢＳで合計３回の洗浄を行った。タンパク質濃度は、１．０ｍｇ／ｍＬの溶液で２８０ｎｍにおいて１．５８の吸光度値を用いて定量し、モル濃度は、１５０，０００ｇ／ｍｏｌの分子量を用いて測定した。
【００８２】
条件２：抗体（１０ｍｇ）を、３．０モル当量のジチオトレイトール（ＤＴＴ）（０．１ＭのＰＢＳ（ｐＨ７．４）中）、１．０ｍＭのジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）で２４℃にて２時間処理した。過剰のＤＴＴを部分還元ｍＡｂから、５０ｋＤａ遠心濾過チューブ（遠心分離は３，０００ＲＰＭで２０分間行った。）を用いて精製して除去した。０．１ＭのＰＢＳで合計３回の洗浄を行った。
【００８３】
条件３：ｍＡｂ（１０ｍｇ）を、２．０モル当量のトリス（２−カルボキシエチル）−ホスフィン（ＴＣＥＰ）（０．１ＭのＰＢＳ（ｐＨ８．０）中）、１．０ｍＭのジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）で２４℃にて２時間処理した。ｍＡｂ濃度は８．０ｍＭであった。精製せずに、部分還元ｍＡｂをコンジュゲーションに直接使用した。
【００８４】
［実施例２］
この実施例は、実施例１で作製した二重特異性抗体が元の半Ｍａｂの両方の結合特性を保持していたことを示す。
【００８５】
【化３１】
0006687247.tif 000032
１−（２−（２−アジドエトキシ）エチル）−３，４−ジブロモ−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオンの合成：
２．５ｇの３，４−ジブロモ−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン（１０ｍｍｏｌ）と１ｇのＮＭＭ（６０ｍＬのＴＨＦ中）にＭｅＯＣＯＣｌ（１０ｍｍｏｌ、１０ｍｌのＤＣＭ中９４０ｍｇ）を滴下し、２０分間撹拌し、次いで、反応溶液を６ｏｍＬのＤＣＭで希釈し、水で３回洗浄し、有機相を無水硫酸ナトリウムによって撹拌し、濃縮し、２．６５ｇの３，４−ジブロモ−２，５−ジオキソ−２Ｈ−ピロール−１（５Ｈ）−カルボン酸メチルを得た。３１１ｍｇ（１ｍｍｏｌ）のこの化合物に、２−（２−アジドエトキシ）エタンアミン（１３０ｍｇ、１ｍｍｏｌ）と５ｍＬのＤＣＭを添加し、ＴＬＣにより反応が２０分で終了したことが示され、次いでＤＣＭとブラインによって抽出し、ＮＨ４Ｃｌ溶液によって洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、次いでカラム精製のために濃縮し、２：１のヘキサンとエチルエチラートによりフラッシングし、２３０ｍｇの１−（２−（２−アジドエトキシ）エチル）−３，４−ジブロモ−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオンを得た。１ＨＮＭＲ：３．３２ｐｐｍ（ｔ，Ｊ＝５．０Ｈｚ，１Ｈ）、３．４０ｐｐｍ（ｔ，Ｊ＝５．０Ｈｚ，１Ｈ）、３．５０ｐｐｍ（ｑ，Ｊ＝５．０Ｈｚ，１Ｈ）、３．６２ｐｐｍ（ｔ，Ｊ＝５．０Ｈｚ，１Ｈ）、３．６３−３．６９ｐｐｍ（ｍ，３Ｈ）、３．８４ｐｐｍ（ｔ，Ｊ＝５Ｈｚ，１Ｈ）．Ｆｗ：３６５．９、Ｃ８Ｈ８Ｂｒ２Ｎ４Ｏ３；質量ピーク（１：２：１）：３６６．９、３６８．９、３７０．９。
【００８６】
［実施例３］
この実施例は、ＩｇＧクラスの抗体のヒンジ領域内に存在する１個のＣｙｓ残基を用いた二重特異性抗体の化学的創出を示す。本明細書に記載の出発ｍＡｂは改変ヒンジ領域を含むものであり、この改変ヒンジ領域では、各鎖上の同じ位置の１個のＣｙｓがＳｅｒに変異され、従ってヒンジはジスルフィドが１つだけになっている。二重特異性ｍＡｂの創出方法は３つの主要な工程を伴う（図１）。第１工程は、２種類の異なるｍＡｂ、それぞれＡとＢのヒンジ内のジスルフィドの選択的還元である。第２工程は、システインベースでのコンジュゲーションによる官能性部分ＸまたはＹの導入である。このＣｙｓ連結工程により２種類の化学的に固定されたｍＡｂ断片Ａ’およびＢ’がもたらされる。最後の工程では、この２種類のｍＡｂ断片を、ＸとＹ間の化学ライゲーションによって一体に連結させ、二重特異性抗体ＡＢを形成する。この試験では、ヒンジ領域内変異（ＳＰＰＣ（配列番号３））を有するＩｇＧ１モノクローナル抗体を使用した。
【００８７】
条件１：抗体（１０ｍｇ）を、１０モル当量の２−メルカプトエチル−アミン（２−ＭＥＡ）（０．１ＭのＰＢＳ（ｐＨ７．４）中）、１．０ｍＭのジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）で３７℃にて２時間処理した。過剰の２−ＭＥＡを部分還元ｍＡｂから、５０ｋＤａ遠心濾過チューブ（遠心分離は３，０００ＲＰＭで２０分間行った。）を用いて精製して除去した。０．１ＭのＰＢＳで合計３回の洗浄を行った。タンパク質濃度は、１．０ｍｇ／ｍＬの溶液で２８０ｎｍにおいて１．５８の吸光度値を用いて定量し、モル濃度は、１５０，０００ｇ／ｍｏｌの分子量を用いて測定した。
【００８８】
条件２：抗体（１０ｍｇ）を、３．０モル当量のジチオトレイトール（ＤＴＴ）（０．１ＭのＰＢＳ（ｐＨ７．４）中）、１．０ｍＭのジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）で２４℃にて２時間処理した。過剰のＤＴＴを部分還元ｍＡｂから、５０ｋＤａ遠心濾過チューブ（遠心分離は３，０００ＲＰＭで２０分間行った。）を用いて精製して除去した。０．１ＭのＰＢＳで合計３回の洗浄を行った。
【００８９】
条件３：ｍＡｂ（１０ｍｇ）を、２．０モル当量のトリス（２−カルボキシエチル）−ホスフィン（ＴＣＥＰ）（０．１ＭのＰＢＳ（ｐＨ８．０）中）、１．０ｍＭのジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）で２４℃にて２時間処理した。ｍＡｂ濃度は８．０ｍＭであった。精製せずに、部分還元ｍＡｂをコンジュゲーションに直接使用した。
【００９０】
［実施例４］
この実施例は、本明細書に開示の方法による、本開示の化学連結構造体が各半抗体断片のヒンジ領域を互いに連結している二重特異性抗体の作製方法を示す。この抗体の骨格は：ヒンジ内変異（ＳＰＳＣ（配列番号４））を有するＩｇＧ４であった。
【００９１】
本発明者らは、まず各Ｉｇ抗体を、半抗体を創出するために化学修飾により修飾した。具体的には、バッファー交換反応で抗体（０．５から３ｍｇ）を１５ｍＬ容遠心濾過チューブ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＵＦＣ９０３０２４）に添加し、適切な容量のｐＨ８．０のＰＢＳ  １ｍＭのＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン五酢酸）バッファーをチューブの５０ｍＬの印まで添加した。このチューブを３，０００ＲＰＭで２０分間、５℃にて遠心分離した。抗体を１．５ｍＬ容プラスチックバイアル内に移し、濃度をＮａｎｏｄｒｏｐ（Ｆｉｓｈｅｒ，ＮＤ−２０００  ＵＶ−Ｖｉｓ分光光度計）を用いて確認した。最終抗体濃度は５から８ｍｇ／ｍＬの間であった。
【００９２】
１ｍｇ／ｍＬのＴＣＥＰ（（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン））、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｃ４７０６）のｐＨ８．０のＰＢＳ（１．０ｍＭのＤＴＰＡ）バッファー中のストック溶液を調製した。本発明者らは以下の表を使用し、バッファー交換後に回収された抗体の当量数および結果としての質量に応じて抗体に添加する必要があるＴＣＥＰ溶液の容量を計算した。
【００９３】
【表１】
0006687247.tif 000033
【００９４】
適切な容量のＴＣＥＰ溶液（上記の表によって計算）を抗体溶液に添加し、軽くボルテックスし、バイアルをカルーセル上に配置した。還元反応を室温で９０分間行った。
【００９５】
ＤＢＣＯ−マレイミド（Ｃｌｉｃｋ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｔｏｏｌｓ，Ａ１０８−１００）のＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，４７２３０１）中のストック溶液を、上記の表からの計算に基づいて調製した。このＤＢＣＯ−マレイミドのＤＭＳＯ溶液を抗体試料（ＴＣＥＰの精製なし）に添加した。抗体試料中のＤＭＳＯの最終容量は約５％（ｖ／ｖ）であった。コンジュゲーション反応を室温で１時間、カルーセルによる混合下で行った。各試料を別個の１５ｍＬ容遠心濾過チューブ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＵＦＣ９０３０２４）内に入れ、適切な容量の１×ＤＰＢＳ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，２１−０３１−ＣＭ，カルシウムまたはマグネシウムなし）バッファーをチューブの５０ｍＬの印まで添加した。試料を３，０００ＲＰＭで２０分間、５℃にて遠心分離した。洗浄工程をもう１回、繰り返した。洗浄後、試料を別々の１．５ｍＬ容プラスチックバイアル内に移し、冷蔵庫（５℃）に入れた。
【００９６】
ＩｇＧ４抗体では、４．０当量のＴＣＥＰで大量の半抗体が得られた。ＩｇＧ１抗体では、３．５当量のＴＣＥＰで大量の半抗体が得られた。どちらの型の抗体の場合も５．０当量のＤＢＣＯを使用した。
【００９７】
ＤＢＣＯ−マレイミド（１．０ｍｇ、１．０当量）のＤＭＳＯ（０．１２ｍＬ）溶液にアジド−ＰＥＧ４−アジド（２．５ｍｇ、５．０当量）（ＤＭＳＯ（０．６ｍＬ）中）を添加した。混合物を室温で２時間撹拌した。反応はＬＣ／ＭＳによって示されたときに終了した。得られたアジド−マレイミドの分子量は６２７．６５ｇ／ｍｏｌであった。アジド−マレイミドの合成（スキーム１）
【００９８】
【化３２】
0006687247.tif 000034
【００９９】
スキーム１．アジド−マレイミドの合成
アジド−マレイミド（５．０当量）（ＤＭＳＯ中）を抗体試料に添加した。抗体試料中のＤＭＳＯの最終容量は約５％（ｖ／ｖ）であった。コンジュゲーション反応を室温で１時間、カルーセルによる混合下で行った。試料を先に記載のとおりに洗浄した。
【０１００】
各半抗体断片を疎水性相互作用カラム（ＨＩＣ）によって精製した。ＨＩＣアッセイは、ＴＯＳＯＨブチル−ＮＰＲカラムを用いて４０℃のカラム温度および０．６ｍＬ／分の流速で行った。溶出は、５０ｍＭのリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）中、３０分間で塩濃度を低下させ（１．５から０Ｍまでの硫酸アンモニウム）、有機調整剤を増大させる（０％から２５％までのイソプロピルアルコール）勾配で行った。半抗体断片をＳＤＳ  ＰＡＧＥによって分析した。具体的には、分析対象の各試料について０．６ｍｇ／ｍＬの濃度の２０μＬが必要であった。本発明者らは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル泳動のための確立されたプロトコル（ＲＴＰ  ＡＤ００１−０１およびＡＤ００２−０１）に従った。図９は、化学修飾半抗体断片の非還元ＳＤＳ  ＰＡＧＥ（レーン２および３）を示す。
【０１０１】
［実施例５］
この実施例は、クリック反応による二重特異性抗体の創出を示す。図１０は、２種類の半抗体断片間のクリックコンジュゲーションによる二重特異性抗体の創出を示す。２種類の半抗体断片間のクリック反応を図１０に示す。半抗体−アジド断片（５００μｇ）（ＰＢＳ中（５．０ｍｇ／ｍＬ））に半抗体−ＤＢＣＯ断片（５００μｇ）（ＰＢＳ中（５．０ｍｇ／ｍＬ））を添加した。反応を室温で２時間、カルーセルによる混合下で行った。混合物をＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析（図１１）およびイオン交換クロマトグラフィーによる精製に供した。
【０１０２】
二重特異性抗体を、Ｔｈｅｒｍｏ  ＷＣＸ−１０カラムを使用したＡｇｉｌｅｎｔ  １２００  ＨＰＬＣにて０．６ｍＬ／分の流速で精製した。溶出は、１０ｍＭのＭＥＳバッファー（ｐＨ５．７）中、３０分間で塩濃度を増大させる（０から１００ｍＭまでのＮａＣｌ）勾配で行った。二重特異性抗体ＳＴＩ  ＣＢＡ−０７１０をＩｄｅＳプロテアーゼによって消化させ、Ｗａｔｅｒ  Ｘｅｖｏ  Ｇ−２  ＱＴＯＦ質量分析で分析し、確認した（図１２）。
【０１０３】
二重特異性抗体ＳＴＩ  ＣＢＡ−０７１０の生物理学的特性を、二重特異性抗体のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって調べた（図１３）。具体的には、二重特異性抗体を、ＴＳＫゲルＳｕｐｅｒＳＷ３０００カラム（４．６ｍｍ  ＩＤ×３０ｃｍ、４μｍ）を使用したＡｇｉｌｅｎｔ  １２００  ＨＰＬＣで分析した。バッファーは、０．２Ｍのリン酸カリウム、０．２５ＭのＫＣｌ（ｐＨ６．２）にした。
【０１０４】
【表２】
0006687247.tif 000035
【０１０５】
図１４は、ＢＩＡｃｏｒｅでの二重特異性抗体ＣＢＡ−０７１０の結合を示す。第１の抗原をＣＭ５センサーチップ上におよそ１５００ＲＵまで、標準的なＮＨＳ／ＥＤＣカップリング方法論を用いて固定化した。ベースラインのためにバッファーを流した。二重特異性抗体、続いてバッファーを負荷し、次いで第２の抗原に対する結合を行った。
【０１０６】
［実施例６］
この実施例は、本明細書において作製した二重特異性抗体についての種々のアッセイ結果を示す。二重特異性抗体の細胞ベースの結合と機能がみられる。二重特異性抗体ＣＢＡ−０７１０はＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ヒト乳がん）細胞に結合した（図１５）（フローサイトメトリーによってアッセイ）。抗体のＥＣ５０値を調べた。抗原−１と抗原−２の両方を発現しているＭＤＡ−ＭＢ−２３１トリプルネガティブ乳がん（ＴＮＢＣ）細胞を、無酵素細胞解離バッファー（ＧＩＢＣＯ）を用いて収集し、Ｖ字底９６ウェルプレート（５０，０００細胞／ウェル）に移した。細胞を氷上で４５分間、二重特異性抗体ＣＢＡ−０７１０、または親の単一特異性抗−抗原−１抗体もしくは抗−抗原−２抗体のいずれかの連続希釈物とともに、ＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ＋２％ＦＢＳ）＋ＮａＮ３中でインキュベートした。ＦＡＣＳバッファー中で２回の洗浄後、フィコエリトリンコンジュゲート抗−ヒトＩｇＧ（γ−鎖特異的）の１：１０００希釈物を添加し、３０分間インキュベートした。最後の洗浄後、蛍光強度をＩｎｔｅｌｌｉｃｙｔ  Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ＨＴＦＣ）で測定した。データを、Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアおよび非線形回帰フィットを用いて解析した。データ点を、陽性標識細胞の蛍光強度中央値（ＭＦＩ）＋／−標準誤差として示す。ＥＣ５０値は、細胞に対する最大結合の５０％が達成される抗体濃度として報告する。
【０１０７】
結果を表３および図１５に示す。結果は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に対する二重特異性抗体の結合が、親の型と比べて改善されたことを示し、抗−抗原−２抗体と同様のサブナノモルのＥＣ５０値および抗−抗原−１抗体と同程度に高い結合強度を示す。
【０１０８】
【表３】
0006687247.tif 000036
【０１０９】
二重特異性抗体ＣＢＡ−０７１０の拮抗的活性が示された。具体的には、二重特異性抗体ＣＢＡ−０７１０によるｃ−ＭＥＴリン酸化の阻害を、ＰａｔｈＳｃａｎ（Ｒ）Ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｍｅｔ（ｐａｎＴｙｒ）Ｓａｎｄｗｉｃｈ  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ  ＃７３３３プロトコルに従って行った。簡単には、細胞ライセートを添加し、検出抗体を再構成し、インキュベートした後、再構成したＨＲＰ結合二次抗体を添加した。洗浄後、ＴＭＢ基質を添加し、インキュベートした。停止溶液を添加した後、結果の読み取りを行った。図１６は、トリプルネガティブ乳がん細胞における二重特異性抗体ＣＢＡ−０７１０の拮抗的活性を示す。ＳＴＩ−Ａ０６０７は抗−抗原−１モノクローナル抗体であり、ＳＴＩ−Ａ１０１０は抗−抗原２モノクローナル抗体である。ＨＧＦは抗原−１の天然リガンドである。
【０１１０】
二重特異性抗体ＣＢＡ−０７１０の免役調節活性がみとめられた。二重特異性抗体ＣＢＡ−０７１０がＴ細胞応答性を調節する能力を測定するため、精製ＣＤ４＋細胞を同種異系樹状細胞（単球をＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４中で７日間培養することによって調製）とともに培養した。パラレルプレートを、３日目と５日目に上清みを収集して市販のＥＬＩＳＡキットを用いてＩＬ−２およびＩＦＮγのそれぞれを測定することが可能なようにセットアップした。競合ヒト化抗−抗原−２（免疫チェックポイント）ｍＡｂを自社で作製して陽性対照ＩｇＧ１として使用し、無関連のＳＴＩヒトｍＡｂを陰性対照ＩｇＧ抗体として使用した。図１７は、二重特異性抗体ＣＢＡ−０７１０に応答したＩＦＮ−γ放出の増大を示す。ＳＴＩ−Ａ１０１０は抗−抗原−２（免疫チェックポイント）モノクローナル抗体である。競合ｍＡｂはヒト化抗−抗原−２（免疫チェックポイント）モノクローナル抗体である。
【０１１１】
［実施例７］
この実施例は、Ｆ（ａｂ）’２抗体Ａ’とＢ’を用いて本開示の二重特異性抗体を合成するためのスキームを示す。本明細書に記載の二重特異性Ｆ（ａｂ）’２は、ヒンジ領域で化学結合された２種類のＦ（ａｂ）’断片で構成されている（図２０）。出発抗体はＩｇＧ１またはＩｇＧ４アイソタイプのいずれかである。出発抗体は修飾ヒンジ領域を含むものであり、この修飾ヒンジ領域ではＣｙｓ残基がＳｅｒ残基に変異され、ヒンジ領域のジスルフィドが１つだけになっている。二重特異性Ｆ（ａｂ）’２の化学的に固定された二重特異性抗体の創出は４つの主要な工程を伴う。第１工程はＦｃ断片の除去である。第２工程は、それぞれ抗体ＡとＢの選択的還元である。第３工程は、システインベースでのコンジュゲーションによるヒンジ領域内への官能性部分ＸまたはＹの導入により、それぞれ化学修飾された抗体断片Ａ’とＢ’をもたらすことである。最後の工程では、２種類の抗体断片を、ＸとＹ間の化学ライゲーションによって一体に連結させ、二重特異性Ｆ（ａｂ）’２を形成する。この合成のスキームを図２１に示す。
【０１１２】
具体的には、本発明者らは、Ｆ（ａｂ）’２の化学的に固定された二重特異性抗体の合成方法を、ヒンジ内変異（ＳＰＰＣ（配列番号３））を有するＩｇＧ１  Ａ抗体とヒンジ内変異（ＳＰＳＣ（配列番号４））を有するＩｇＧ４  Ｂ抗体を用いて行った。酵素ＩｄｅＳ（これは、ＩｇＧのみをヒンジ領域より下の特定の１つの部位で切断する消化酵素である。）を使用し、抗体（１．５ｍｇ）をＩｄｅＳ（Ａ０−ＦＲ１−００８）の各チューブに添加し、３７℃で一晩、ヘッド・トゥ・ヘッド型スピナー内でインキュベートした。次いで、Ｆｃ断片を、プロテインＡ精製を用いて除去した。
【０１１３】
抗体（１から１０ｍｇ）を１５ｍＬ容遠心濾過チューブ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＵＦＣ９０３０２４）に添加し、適切な容量の５０ｍＭのリン酸ナトリウム、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡのｐＨ７．７のバッファーをチューブの５０ｍＬの印まで添加した。チューブを３，０００ＲＰＭで２０分間、２２℃にて遠心分離した。抗体を１．５ｍＬ容プラスチックバイアル内に移し、濃度を、Ｎａｎｏｄｒｏｐ（Ｆｉｓｈｅｒ，ＮＤ−２０００  ＵＶ−Ｖｉｓ分光光度計）を用いて確認した。最終抗体濃度は１０ｍｇ／ｍＬまでであった。
【０１１４】
１ｍＬの５０ｍＭのリン酸ナトリウム、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡのｐＨ７．７のバッファーを、６ｍｇの２−メルカプトエチルアミン・ＨＣｌを入れた１つのバイアルに添加した（５０ｍＭ  ２−ＭＥＡになった。）。５０ｍＭ  ２−ＭＥＡをＦ（ａｂ）’２終濃度１５ｍＭまで添加し、充分に混合した。３７℃で１５分間インキュベートした。２−ＭＥＡを還元されたＦ（ａｂ）’２から、ＮＡＰ−５（ＧＥ１７−０８５３−０２）脱塩カラムを用いて分離した。
【０１１５】
１ｍｇ／ｍＬのＴＣＥＰ（（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン））、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｃ４７０６）のｐＨ８．０のＰＢＳ（１．０ｍＭのＤＴＰＡ）バッファー中のストック溶液を調製した。プロテインＡ精製後に回収されたＦ（ａｂ）’２の当量数および結果としての質量にもよるが、５当量のＴＣＥＰを脱塩Ｆ（ａｂ）’に添加して充分に振盪し、室温で５分間インキュベートした。
【０１１６】
ＤＢＣＯ（ジベンゾシクロオクチル）−マレイミドとアジド−マレイミドのコンジュゲーションのため、ＤＢＣＯ−マレイミド（Ｃｌｉｃｋ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｔｏｏｌｓ，Ａ１０８−１００）のＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，４７２３０１）中のストック溶液を調製し、２０当量のＤＢＣＯ−マレイミドのＤＭＳＯ溶液をＦ（ａｂ）’（Ａ）試料（ＴＣＥＰの精製なし）に添加した。抗体試料中のＤＭＳＯの最終容量は約５％（ｖ／ｖ）であった。コンジュゲーション反応を室温で２時間、カルーセルによる混合下で行った。アジド−マレイミド（２０当量）のＤＭＳＯ溶液をＦ（ａｂ）’（Ｂ）試料に添加した。抗体試料中のＤＭＳＯの最終容量は約５％（ｖ／ｖ）であった。コンジュゲーション反応を室温で２時間、カルーセルによる混合下で行った。
【０１１７】
洗浄工程のため、各試料を別個の１５ｍＬ容遠心濾過チューブ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＵＦＣ９０３０２４）内に入れ、適切な容量の１×ＤＰＢＳ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，２１−０３１−ＣＭ、カルシウムまたはマグネシウムなし）バッファーをチューブの５０ｍＬの印まで添加した。試料を３，０００ＲＰＭで２０分間、２２℃にて遠心分離した。洗浄工程をもう１回、繰り返した。洗浄後、試料を別々の１．５ｍＬ容プラスチックバイアル内に移し、冷蔵庫（５℃）に入れるか、またはクリック工程に使用した。Ｆ（ａｂ）’断片の分析のため、ＳＤＳ  ＰＡＧＥ手順を使用した。各試料を分析するためには、０．６ｍｇ／ｍＬの濃度の２０μＬが必要であった。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル泳動のための確立されたプロトコル（ＲＴＰ  ＡＤ００１−０１およびＡＤ００２−０１）に従った（図２１）。
【０１１８】
２種類のＦ（ａｂ）’断片間のクリック反応のスキームを図２３に示す。Ｆ（ａｂ）’−アジド断片（５００μｇ）（ＰＢＳ中（５．０ｍｇ／ｍＬ））にＦ（ａｂ）’−ＤＢＣＯ断片（５００μｇ）（ＰＢＳ中（５．０ｍｇ／ｍＬ））を添加した。反応を室温で一晩、カルーセルによる混合下で行った。混合物をＳＥＣ分析に供した（図２４）。
【０１１９】
この実施例で作製した二重特異性抗体の生物理学的特性をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を用いて調べた。ＴＳＫゲルＳｕｐｅｒＳＷ３０００カラム（４．６ｍｍ  ＩＤ×３０ｃｍ、４μｍ）を使用したサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）Ａｇｉｌｅｎｔ  １２００  ＨＰＬＣを使用し、Ｆ（ａｂ）’＿Ａ、Ｆ（ａｂ）’＿Ｂおよび二重特異性Ｃｌｉｃｋ＿Ｆ（ａｂ）’２を分析した（図２４）。バッファーは、０．２Ｍのリン酸カリウム、０．２５ＭのＫＣｌ、ｐＨ６．２。
【０１２０】
二重特異性Ｆ（ａｂ）’２を質量分析によって確認した。二重特異性Ｆ（ａｂ）’２をＷａｔｅｒ  Ｘｅｖｏ  Ｇ−２  ＱＴＯＦ９で分析した（図２５）。二重特異性Ｆ（ａｂ）’２をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を用いて精製した。ＴＳＫゲルＳｕｐｅｒＳＷ３０００カラム（４．６ｍｍ  ＩＤ×３０ｃｍ、４μｍ）を使用したサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）Ａｇｉｌｅｎｔ  １２００  ＨＰＬＣを使用し、二重特異性Ｃｌｉｃｋ＿Ｆ（ａｂ）’２を精製した（図２６）。バッファーは、０．２Ｍのリン酸カリウム、０．２５ＭのＫＣｌ、ｐＨ６．２。
【０１２１】
インビトロ親和性の測定はＯｃｔｅｔ  Ｒｅｄを使用するものにした（図２７）。センサーＡＲ２Ｇを使用し、二重特異性Ｆ（ａｂ）’２の抗原との相互作用をＯｃｔｅｔ  Ｒｅｄ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ，Ｉｎｃ．）で測定した。簡単には、測定スキームを以下のとおりにした：３００秒間のベースライン；３００秒間の１０μｇ／ｍｌの二重特異性Ｆ（ａｂ）’２の負荷、１２０秒間のベースライン；３００秒間の抗原Ａ；３００秒間の解離；３００秒間の抗原Ｂおよび３００秒間の解離（図２７）。センサーの湿潤ならびにベースラインおよび解離の測定はＰＢＳ中で実施した。
【０１２２】
［実施例８］
この実施例は、ＩｇＧ２抗体Ａ’とＢ’を用いて本開示の二重特異性抗体を合成するためのスキームを示す。本明細書に記載の二重特異性ＩｇＧ２は、ヒンジ領域で化学結合された２種類のＩｇＧ２断片で構成されている（図２９）。出発抗体はＩｇＧ２アイソタイプである。二重特異性ＩｇＧ２の創出は３つの主要な工程を伴う。第１工程は、まだホモ二量体構造を維持しているＩｇＧ２抗体のヒンジ領域内の（４つのうちの）１つまたは２つのジスルフィド結合の還元である。第２工程は、システインベースでのコンジュゲーションによるヒンジ内への官能性部分ＸまたはＹの導入により、それぞれ化学修飾された抗体断片Ａ’とＢ’をもたらすことである。最後の工程では、この２種類の抗体をＸとＹ間の化学ライゲーションによって一体に連結させ、二重特異性＿ＩｇＧ２を形成する。
【０１２３】
具体的には、本発明者らは、ＩｇＧ２化学的に固定された二重特異性抗体の合成方法を行った。抗体（１から１０ｍｇ）を１５ｍＬ容遠心濾過チューブ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＵＦＣ９０３０２４）に添加し、適切な容量の５０ｍＭのリン酸ナトリウム、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡのｐＨ７．７のバッファーをチューブの５０ｍＬの印まで添加した。チューブを３，０００ＲＰＭで２０分間、２２℃にて遠心分離した。抗体を１．５ｍＬ容プラスチックバイアル内に移し、濃度を、Ｎａｎｏｄｒｏｐ（Ｆｉｓｈｅｒ，ＮＤ−２０００  ＵＶ−Ｖｉｓ分光光度計）を用いて確認した。最終抗体濃度は１０ｍｇ／ｍＬまでであった。
【０１２４】
１ｍｇ／ｍＬのＴＣＥＰ（（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン））、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｃ４７０６）のｐＨ８．０のＰＢＳ（２．０ｍＭのＤＴＰＡ）バッファー中のストック溶液を調製した。ＩｇＧ２の当量数および結果としての質量にもよるが、２当量のＴＣＥＰをＩｇＧ２溶液に添加し、充分に振盪し、室温で９０分間インキュベートした。
【０１２５】
ＤＢＣＯ（ジベンゾシクロオクチル）−マレイミドおよびアジド−マレイミド
コンジュゲーションのため、ＤＢＣＯ−マレイミド（Ｃｌｉｃｋ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｔｏｏｌｓ，Ａ１０８−１００）のＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，４７２３０１）中のストック溶液を調製し、５当量のＤＢＣＯ−マレイミドのＤＭＳＯ溶液をＩｇＧ２＿Ａ試料（ＴＣＥＰの精製なし）に添加した。抗体試料中のＤＭＳＯの最終容量は約５％（ｖ／ｖ）であった。コンジュゲーション反応を室温で１時間、カルーセルによる混合下で行った。アジド−マレイミド（５当量）のＤＭＳＯ溶液をＩｇＧ２（Ｂ）試料に添加した。抗体試料中のＤＭＳＯの最終容量は約５％（ｖ／ｖ）であった。コンジュゲーション反応を室温で１時間、カルーセルによる混合下で行った。
【０１２６】
洗浄工程のため、各試料を別個の１５ｍＬ容遠心濾過チューブ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＵＦＣ９０３０２４）内に入れ、適切な容量の１×ＤＰＢＳ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，２１−０３１−ＣＭ、カルシウムまたはマグネシウムなし）バッファーをチューブの５０ｍＬの印まで添加した。試料を３，０００ＲＰＭで２０分間、２２℃にて遠心分離した。洗浄工程をもう１回、繰り返した。洗浄後、試料を別々の１．５ｍＬ容プラスチックバイアル内に移し、冷蔵庫（５℃）に入れるか、またはクリック工程に使用した。
【０１２７】
各試料を分析するためには、０．６ｍｇ／ｍＬの濃度の２０μＬが必要であった。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル泳動のための確立されたプロトコル（ＲＴＰ  ＡＤ００１−０１およびＡＤ００２−０１）に従った（図２９）。
【０１２８】
質量分析のため、ＴＣＥＰで還元し、ＤＢＣＯとコンジュゲートさせた抗体ＡをＷａｔｅｒ  Ｘｅｖｏ  Ｇ−２  ＱＴＯＦで分析した。このデータは、２つのＤＢＣＯ（ジスルフィド結合を１つだけ還元）または４つのＤＢＣＯ（２つのジスルフィド結合を還元）と本発明者らのＩｇＧ２とのコンジュゲーションを示す（図３０ＡからＣ）。
【０１２９】
この実施例で作製した二重特異性抗体の生物理学的特性をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を用いて調べた。二重特異性ＩｇＧ２を分析するための、ＴＳＫゲルＳｕｐｅｒＳＷ３０００カラム（４．６ｍｍ  ＩＤ×３０ｃｍ、４μｍ）を使用したサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）Ａｇｉｌｅｎｔ  １２００  ＨＰＬＣ（図３１）。バッファーは、０．２Ｍのリン酸カリウム、０．２５ＭのＫＣｌ、ｐＨ６．２。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【図３０Ｃ】
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【図３１】
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【配列表】
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