(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
クレアチンアミジノヒドロラーゼ活性を有する変異ポリペプチドであって、
配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、１７５位のアミノ酸残基システインがアラニンで置換され、２９９位のアミノ酸残基システインがアラニンで置換されている、ポリペプチドである変異ポリペプチド。
【請求項２】
配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列であって、配列番号２の１７５位のシステインに対応するアミノ酸残基がアラニンであり、配列番号２の２９９位のシステインに対応するアミノ酸残基がアラニンであり、配列番号２の２６８位のシステインに対応するアミノ酸残基が、ロイシン、バリン、イソロイシン、若しくはアラニンから選択される、アミノ酸配列を含む、請求項１に記載のクレアチンアミジノヒドロラーゼ活性を有する変異ポリペプチド。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の変異ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、単離ポリヌクレオチド。
【請求項４】
発現宿主における変異ポリペプチドの生成を指示する１つ以上の制御配列に動作可能に連結された、請求項３に記載のポリヌクレオチドを含む、核酸構築物。
【請求項５】
請求項１又は２に記載の変異ポリペプチドをコードする核酸構築物を含む遺伝子改変宿主細胞であって、好ましくは細菌細胞、酵母細胞、及び真菌細胞の中から選択される前記宿主細胞。
【請求項６】
請求項１又は２に記載の変異ポリペプチドを生成するための方法であって、
ａ．組換え宿主細胞を用意するステップであり、前記細胞がＤＮＡ分子を含み、前記ＤＮＡ分子が、請求項１又は２に記載の変異ポリペプチドをコードする核酸配列を含むステップと、
ｂ．前記宿主細胞を、前記変異ポリペプチドを発現させるのに適切な条件下でインキュベートするステップと、
ｃ  ステップｂ）で前記宿主細胞によって発現させた前記変異ポリペプチドを回収するステップとを含む、方法。
【請求項７】
乾燥粉末、錠剤として、又は液体として製剤化されている、請求項１又は２に記載の変異ポリペプチドを含む組成物。
【請求項８】
ａ．サルコシンオキシダーゼ（ＥＣ  １．５．３．１）、又は
ｂ．クレアチニナーゼ（ＥＣ  ３．５．２．１０）及びサルコシンオキシダーゼ（ＥＣ  １．５．３．１）を更に含む、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
チオール失活剤を含む濯ぎ溶液と組み合わせてクレアチニン及び／又はクレアチンを決定するためのセンサーにおける、請求項１若しくは２に記載の変異ポリペプチド又は請求項７若しくは８に記載の組成物の使用。
【請求項１０】
表面を有する少なくとも１つの電極と、前記少なくとも１つの電極の表面に固定化された複数の酵素とを含む、サンプル流体中のクレアチニン及び／又はクレアチンを決定するためのセンサーであって、前記酵素のうちの少なくとも１種が請求項１又は２に記載の変異ポリペプチドである、センサー。
【請求項１１】
ａ．クレアチナーゼ（ＥＣ  ３．５．３．３）及びサルコシンオキシダーゼ（ＥＣ  １．５．３．１）を含むクレアチンセンサー、
ｂ．クレアチナーゼ（ＥＣ  ３．５．３．３）、クレアチニナーゼ（ＥＣ  ３．５．２．１０）、及びサルコシンオキシダーゼ（ＥＣ  １．５．３．１）を含むクレアチニンセンサー、並びに
ｃ．前記クレアチンセンサー（ａ）及び前記クレアチニンセンサー（ｂ）の両方を備えるデュアルセンサーから選択される、請求項１０に記載のクレアチニン及び／又はクレアチンを決定するためのセンサー。
【請求項１２】
サンプル流体中のクレアチニン及び／又はクレアチンを決定するためのセンサーを生成するための方法であって、電極の表面に、複数の酵素を含有する水性混合物を堆積するステップを含み、前記酵素のうちの少なくとも１種が、請求項１又は２に記載の変異ポリペプチドである方法。
【請求項１３】
対象由来の生理液のサンプル中のクレアチニン及び／又はクレアチンを決定するための方法であって、
ａ．センサー又はデュアルセンサーを前記サンプルと接触させるステップ、
ｂ．前記サンプル中のクレアチン及び／又はクレアチニンを検出するステップ、
及び
ｃ．前記センサーを、チオール相互作用剤を含む濯ぎ溶液と接触させるステップ、を含む濯ぎステップを含み、前記濯ぎステップ（ｃ）が、ステップ（ａ）の前、ステップ（ｂ）の後、又はステップ（ａ）の前及びステップ（ｂ）の後の両方の、いずれかにあり、前記方法が、２５℃よりも高い温度で行われ、
前記センサーが、表面を有する電極、前記電極の表面に固定化された複数の酵素を含み、前記酵素のうちの少なくとも１種が、請求項１又は２に記載の変異ポリペプチドである方法。
【請求項１４】
前記センサーが、
ａ．クレアチナーゼ（ＥＣ  ３．５．３．３）及びサルコシンオキシダーゼ（ＥＣ  １．５．３．１）を含むクレアチンセンサー、
ｂ．クレアチナーゼ（ＥＣ  ３．５．３．３）、クレアチニナーゼ（ＥＣ  ３．５．２．１０）、及びサルコシンオキシダーゼ（ＥＣ  １．５．３．１）を含むクレアチニンセンサー、並びに
ｃ．前記クレアチンセンサー（ａ）及び前記クレアチニンセンサー（ｂ）の両方を備えるデュアルセンサーから選択される、請求項１３に記載のクレアチニン及び／又はクレアチンを決定するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、クレアチンアミジノヒドロラーゼ活性を有する変異ポリペプチドであって、チオール基を修飾する試薬の存在下で活性を保持すると共に高い熱安定性を有する変異ポリペプチドに関する。本発明は、更に、変異ポリペプチドを生成するための方法、及び生理液のサンプル中のクレアチニンの測定に使用される変異ポリペプチドを含むセンサーに関する。追加として、本発明は、クレアチニンセンサーの寿命を延ばすために変異ポリペプチドをどのように使用するか、及びセンサーを生成するための方法を教示する。
【背景技術】
【０００２】
全血、血清、血漿、又は尿などの生理液のサンプル中のクレアチニンのレベルは、腎機能の重要な指標である。クレアチンリン酸は、脊椎動物の筋肉に貯蔵され、エネルギー保存をもたらす。クレアチンリン酸は、クレアチニン（分解生成物）とエネルギーに富むリン酸基とに不可逆的に変換される。正常な筋機能中、クレアチンリン酸の総量の、１日当たり約１〜２％がクレアチニンに変換される。クレアチニンは、血液中に放出され、腎臓によって除去される。このように、健康な個体では、クレアチニンのレベルが約３５〜約７５μＭで比較的一定である。血中クレアチニンのレベルが増加した場合、腎臓の何らかの機能不全の徴候である可能性がある。そのような場合、クレアチニンのレベルは、２，０００μＭ程度に高いレベルまで増加する可能性がある。
【０００３】
対象由来の生理液のサンプル中のクレアチニンのレベルは、酵素作用によって、例えばクレアチニンイミノヒドロラーゼ（ＮＨ３の検出による）又はクレアチニンアミドヒドロラーゼを使用して、測定することができる。クレアチニンアミドヒドロラーゼは、「クレアチニナーゼ」とも呼ばれる。クレアチニナーゼの場合、生理液中のクレアチニンのレベルは、下記の反応によって表されるように、酵素クレアチニナーゼ（ＥＣ  ３．５．２．１０）、クレアチニンアミジノヒドロラーゼ（ＥＣ  ３．５．３．３−「クレアチナーゼ」）、及びサルコシンオキシダーゼ（ＥＣ  １．５．３．１）が関与する酵素反応のカスケードによって決定することができる。
【化１】
0006636533.tif 000002
この反応カスケードは、Ｈ２Ｏ２の形成をもたらし、電流測定又は光度測定によって検出され得る。いくつかのシステムでは、更なる酵素（例えば、ペルオキシダーゼ）又は指標を使用してもよい（例えば、発光団）。
【０００４】
生理液のサンプル中のクレアチニンのレベルは、クレアチニンの測定に適合させたセンサー、例えば、酵素クレアチナーゼ及びサルコシンオキシダーゼと組み合わせてクレアチニナーゼを含むセンサーを使用して測定することができる。そのようなセンサーは、バイオセンサーとしばしば呼ばれ、電気化学的及び／又は測光的な原理の両方を用いてもよい。
【０００５】
中間体生成物クレアチンも、それ自体が血液、血清、血漿、又は尿のサンプル中に存在する。したがって、クレアチニンが上記酵素反応のカスケードによって決定される場合には、デュアルセンサーシステムが好ましく用いられる。デュアルセンサーシステムを使用して、クレアチニンを、２種の物質の合計と中間体生成物のみとの差として決定してもよい。このように、サンプル中のクレアチニン及びクレアチンの合計濃度を決定するための第１のセンサーでは、クレアチニナーゼ、クレアチナーゼ、及びサルコシンオキシダーゼが共に、クレアチニン及びクレアチンをＨ２Ｏ２に変換するために存在する。サンプル中のクレアチンの濃度を決定するための第２のセンサーでは、クレアチナーゼ及びサルコシンオキシダーゼが、クレアチンをＨ２Ｏ２に変換するために存在する。このようにサンプル中のクレアチニンの濃度は、サンプル中のクレアチニン及びクレアチンの合計濃度とサンプル中のクレアチンの濃度との差から決定される。
【０００６】
生理液の連続サンプルを分析するために設計されたバイオセンサーは、一般に、サンプルをセンサーにかつセンサーから送達するための流路を用い、各サンプルの送達の後、典型的に濯ぎステップがあり、その後、後続のサンプルの分析が行われる。濯ぎステップは、１つのサンプルが次のサンプルによって汚染されるのを防止するのに役立つが、追加として、センサー及びサンプル流路での細菌増殖及びバイオフィルム形成を防止するのに使用されてもよい。メチルイソチアゾリノン又はＭＩＴとしても公知の活性剤２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン又はその他のイソチアゾリノン由来の殺生剤を含む、濯ぎ（又は保存料）溶液を、水含有溶液中の微生物増殖を制御するのに利用してもよい。
【０００７】
保存料溶液中に存在するイソチアゾリノン又はＭＩＴは、細菌及び真菌中の様々なタンパク質／酵素と相互に作用するチオール相互作用剤であり、細胞増殖の阻害、不可逆的な細胞損傷、及び細胞死をもたらす。イソチアゾリノン又はＭＩＴ剤の使用による欠点は、バイオセンサー内で１種以上のチオール基を含有する酵素を反応させ失活させることによって、バイオセンサーの使用寿命を制限する可能性があることである。クレアチナーゼはチオール含有ヒドロラーゼであり、その活性は、ＭＩＴを含めたイソチアゾリノン由来の薬剤などのチオール相互作用剤によって阻害される可能性があり、生理液のサンプル中のクレアチニンを測定するのに使用されるセンサーでの、これらの保存料の使用が制限される。
【０００８】
このように、チオール相互作用剤に対してより耐性があるクレアチナーゼ酵素であって、クレアチニンを測定するためのセンサーにおける濯ぎ溶液でそのような薬剤の使用を可能にする、クレアチナーゼ酵素が求められている。更に、チオール相互作用剤に対して高い耐性を有すると同時に熱安定特性も有する、クレアチナーゼ酵素が求められている。この理由は、分析機に取り付けられたバイオセンサーが一般に３７℃で使用されかつ貯蔵され、したがってバイオセンサーの構成要素は周囲温度の範囲全体にわたって、例えば少なくとも３７℃まで、安定であることが重要だからである。
【０００９】
特開平１０１７４５８５（Ａ）によれば、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ属に属する細菌は、一般に、優れた熱安定性を示す。特開平１０１７４５８５（Ａ）は、４５℃などの温度で改善された長期安定性を有する、変異クレアチンアミジノヒドロラーゼをコードする変異Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ属遺伝子を生成するのに、タンパク質工学技法を使用することを更に開示する。変異酵素は、野生型クレアチニンアミジノヒドロラーゼと比較して、１５位のグルタミン酸と、１０４位及び１３５位のアルギニンの中から、１つ又は２つ以上の組み合わされた置換位置によって特徴付けられ、野生型配列は、ＡＢ０１６７８８に記述されている。
【００１０】
Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ株ＫＳ−８５遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋ：ＢＡＡ８８８３０．１で、熱安定性クレアチナーゼ（ＥＣ  ３．５．３．３）をコードすることが報告されている。
【００１１】
特開平０７２５５４８５（Ａ）は、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  Ｕ−１８８クレアチナーゼ遺伝子変異の変異によって得られた変異クレアチナーゼについて記載しており、１６６位、２７７位、及び３２８位のアミノ酸配列のうちの少なくとも１つは、イソロイシンなどの疎水性アミノ酸で置換される。変異クレアチナーゼは、５５℃で貯蔵された場合に１時間、活性を保持した。
【発明の概要】
【００１２】
本発明は、ＭＩＴなどのチオール剤又はその他のイソチアゾリノン由来の薬剤に対してより耐性のある、変異クレアチナーゼを提供する。変異クレアチナーゼを含むセンサーは、「標準」（及び有効）濃度のＮｅｏｌｏｎｅ  ９５０と組み合わせて使用した場合に、より長い寿命を有することによって、Ｎｅｏｌｏｎｅ  ９５０などの保存料の使用に対して適合性がある。
【００１３】
第１の実施形態によれば、本発明は、２５℃よりも高い温度で、ＭＩＴなどのチオール剤又はその他のイソチアゾリノン由来の薬剤の存在下、酵素活性を保持する、クレアチンアミジノヒドロラーゼ活性を有する単離された変異ポリペプチドであって、
ａ．配列番号２に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、１７５位のアミノ酸残基システインがアラニンで置換され、２９９位のアミノ酸残基システインがアラニンで置換されている、ポリペプチド、又は
ｂ．配列番号３（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｓｐ．クレアチンアミジノヒドロラーゼに対応−Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｑ９ＲＨＵ９に対する置換：Ｃ１７５Ａ＋Ｃ２９９Ａ）、配列番号７（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ａｎｔｈｒｏｐｉｃクレアチナーゼに対応−Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ａ０Ａ０７６ＷＧＢ５に対する置換：Ｃ１７１Ａ＋Ｃ２９５Ａ）、配列番号１１（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐ．ＬＮＨＣ２２１Ｂ００クレアチナーゼに対応−Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｘ６ＤＬＭ３に対する置換：Ｓ１７５Ａ＋Ｃ２９９Ａ）、配列番号１５（Ｒｏｓｅｏｖａｒｉｕｓ  ｓｐ  ＴＭ１０３５クレアチナーゼに対応−Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ａ６ＤＶＦ８に対する置換：Ｃ１７５Ａ＋Ｃ２９９Ａ）、配列番号１９（Ｒｏｓｅｏｖａｒｉｕｓ  ｓｐ  ２１７クレアチナーゼに対応−Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ａ３Ｗ１Ｅ４に対する置換：Ｃ１７５Ａ＋Ｃ２９９Ａ）、配列番号２３（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓクレアチナーゼに対応−Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ａ１Ｂ０Ｔ５に対する置換：Ｃ１７５Ａ＋Ｃ２９９Ａ）、配列番号２７（Ｒｕｂｅｌｌｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ  ｍｅｓｏｐｈｉｌｕｍクレアチナーゼに対応−Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ａ０Ａ０１７ＨＲＶ０に対する置換：Ｃ１７５Ａ＋Ｃ２９９Ａ）、配列番号３１（Ｌｏｋｔａｎｅｌｌａ  ｖｅｓｔｆｏｌｄｅｎｓｉｓ  ＳＫＡ５３クレアチナーゼに対応−Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ａ３Ｖ１２８に対する置換：Ｃ２９８Ａ）、配列番号３５（Ｌｕｔｉｂａｃｕｌｕｍ  ｂａｒａｔａｎｇｅｎｓｅ  ＡＭＶ１クレアチナーゼに対応−Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｖ４ＲＧＥ５に対する置換：Ｃ１８０Ａ＋Ｃ３０４Ａ）、配列番号３９（Ｒｏｓｅｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．ＡｚｗＫ−３ｂクレアチナーゼに対応−Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ａ６ＦＱＱ７に対する置換：Ｃ２９９Ａ）、配列番号４３（Ｄｉｎｏｒｏｓｅｏｂａｃｔｅｒ  ｓｈｉｂａｅクレアチナーゼに対応−Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ａ８ＬＱＪ５に対する置換：Ｃ３０４Ａ）、配列番号４７（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓクレアチナーゼに対応−Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ａ１Ｂ７Ｉ６に対する置換：Ｃ１５０Ａ＋Ｃ２７４Ａ）の中から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである、変異ポリペプチドを提供する。
【００１４】
更なる実施形態によれば、この単離された変異ポリペプチドは、
ａ．配列番号２に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列であって、配列番号２の１７５位のシステインに対応するアミノ酸残基がアラニンであり、配列番号２の２９９位のシステインに対応するアミノ酸残基がアラニンであり、配列番号２の２６８位のシステインに対応するアミノ酸残基が、ロイシン、バリン、イソロイシン、若しくはアラニンから選択される、アミノ酸配列、又は
ｂ．配列番号４（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｓｐ．クレアチンアミジノヒドロラーゼに対応−Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｑ９ＲＨＵ９に対する置換：Ｃ１７５Ａ＋Ｃ２９９Ａ＋Ｃ２６８Ｌ）、配列番号８（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ａｎｔｈｒｏｐｉｃクレアチナーゼに対応−Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ａ０Ａ０７６ＷＧＢ５に対する置換：Ｃ１７１Ａ＋Ｃ２９５Ａ＋Ｃ２６４Ｌ）、配列番号１２（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐ．ＬＮＨＣ２２１Ｂ００クレアチナーゼに対応−Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｘ６ＤＬＭ３に対する置換：Ｓ１７５Ａ＋Ｃ２９９Ａ＋Ｃ２６８Ｌ）、配列番号１６（Ｒｏｓｅｏｖａｒｉｕｓ  ｓｐ  ＴＭ１０３５クレアチナーゼに対応−Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ａ６ＤＶＦ８に対する置換：Ｃ１７５Ａ＋Ｃ２９９Ａ＋Ｃ２６８Ｌ）、配列番号２０（Ｒｏｓｅｏｖａｒｉｕｓ  ｓｐ  ２１７クレアチナーゼに対応−Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ａ３Ｗ１Ｅ４に対する置換：Ｃ１７５Ａ＋Ｃ２９９Ａ＋Ｃ２６８Ｌ）、配列番号２４（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓクレアチナーゼに対応−Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ａ１Ｂ０Ｔ５に対する置換：Ｃ１７５Ａ＋Ｃ２９９Ａ＋Ｃ２６８Ｌ）、配列番号２８（Ｒｕｂｅｌｌｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ  ｍｅｓｏｐｈｉｌｕｍクレアチナーゼに対応−Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ａ０Ａ０１７ＨＲＶ０に対する置換：Ｃ１７５Ａ＋Ｃ２９９Ａ＋Ｃ２６８Ｌ）、配列番号３２（Ｌｏｋｔａｎｅｌｌａ  ｖｅｓｔｆｏｌｄｅｎｓｉｓ  ＳＫＡ５３クレアチナーゼに対応−Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ａ３Ｖ１２８に対する置換：Ｃ２９８Ａ＋Ｃ２６７Ｌ）、配列番号３６（Ｌｕｔｉｂａｃｕｌｕｍ  ｂａｒａｔａｎｇｅｎｓｅ  ＡＭＶ１クレアチナーゼに対応−Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｖ４ＲＧＥ５に対する置換：Ｃ１８０Ａ＋Ｃ３０４Ａ＋Ｃ２７３Ｌ）、配列番号４０（Ｒｏｓｅｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．ＡｚｗＫ−３ｂクレアチナーゼに対応−Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ａ６ＦＱＱ７に対する置換：Ｃ２９９Ａ＋Ｃ２６８Ｌ）、配列番号４４（Ｄｉｎｏｒｏｓｅｏｂａｃｔｅｒ  ｓｈｉｂａｅクレアチナーゼに対応−Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ａ８ＬＱＪ５に対する置換：Ｃ３０４Ａ＋Ｃ２７３Ｌ）、配列番号４８（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓクレアチナーゼに対応−Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ａ１Ｂ７Ｉ６に対する置換：Ｃ１５０Ａ＋Ｃ２７４Ａ＋Ｃ２４３Ｌ）の中から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００１５】
第２の実施形態によれば、本発明は、変異クレアチンアミジノヒドロラーゼポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、単離ポリヌクレオチドを提供する。
【００１６】
更なる実施形態によれば、本発明は、変異クレアチンアミジノヒドロラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸構築物であって、ポリヌクレオチドが、発現宿主における変異ポリペプチドの生成を指示する１つ以上の制御配列に動作可能に連結されている、核酸構築物を提供する。
【００１７】
更なる実施形態によれば、本発明は、変異クレアチンアミジノヒドロラーゼポリペプチドをコードする核酸構築物を含む遺伝子改変宿主細胞であって、好ましくは細菌細胞、酵母細胞、及び真菌細胞の中から選択される宿主細胞を提供する。
【００１８】
第３の実施形態によれば、本発明は、変異クレアチンアミジノヒドロラーゼポリペプチドを生成するための方法であって、
ａ．組換え宿主細胞を用意するステップであり、この細胞がＤＮＡ分子を含み、ＤＮＡ分子が、変異クレアチンアミジノヒドロラーゼポリペプチドをコードする核酸配列を含むステップと、
ｂ．宿主細胞を、変異クレアチンアミジノヒドロラーゼポリペプチドを発現させるのに適切な条件下でインキュベートするステップと、宿主細胞によって発現させた変異ポリペプチドを回収するステップとを含む、方法を提供する。
【００１９】
第４の実施形態によれば、本発明は、変異クレアチンアミジノヒドロラーゼポリペプチドを含む組成物であって、乾燥粉末、錠剤、又は液体として製剤化されており、サルコシンオキシダーゼ（ＥＣ  １．５．３．１）、又はクレアチニナーゼ（ＥＣ  ３．５．２．１０）及びサルコシンオキシダーゼ（ＥＣ  １．５．３．１）の両方を任意選択で更に含む、組成物を提供する。
【００２０】
第５の実施形態によれば、本発明は、チオール失活剤を含む濯ぎ溶液と組み合わせてクレアチニン及び／又はクレアチンを決定するためのセンサーにおける、変異クレアチンアミジノヒドロラーゼポリペプチド又は変異クレアチンアミジノヒドロラーゼポリペプチドを含む組成物の使用を開示する。
【００２１】
第６の実施形態によれば、本発明は、表面を有する少なくとも１つの電極と、少なくとも１つの電極表面に固定化された複数の酵素とを含む、サンプル流体中のクレアチニン及び／又はクレアチンを決定するためのセンサーであって、酵素のうちの少なくとも１種が、２５℃よりも高い温度、例えば３０、３２、３４、３５、３７、又は４０℃よりも高い温度で、ＭＩＴなどのチオール剤又はその他のイソチアゾリノン由来の薬剤の存在下で酵素活性を保持するクレアチンアミジノヒドロラーゼポリペプチドである、センサーを提供する。
【００２２】
更なる実施形態によれば、本発明は、サンプル流体中のクレアチニン又はクレアチンを決定するためのセンサーを生成するための方法であって、電極の表面に、複数の酵素を含有する水性混合物を堆積するステップを含み、酵素のうちの少なくとも１種が変異クレアチンアミジノヒドロラーゼポリペプチドである方法を提供する。
【００２３】
第７の実施形態によれば、本発明は、対象由来の生理液のサンプル中のクレアチニン及び／又はクレアチンを決定するための方法であって、
ａ）センサー又はデュアルセンサーをサンプルと接触させるステップ、
ｂ）サンプル中のクレアチン及び／又はクレアチニンを検出するステップ、
及び
ｃ）センサーを、チオール相互作用剤を含む濯ぎ溶液と接触させるステップ、を含む濯ぎステップを含み、濯ぎステップ（ｃ）が、ステップ（ａ）の前、ステップ（ｂ）の後、又はステップ（ａ）の前及びステップ（ｂ）の後の両方の、いずれかにあり、方法が、２５℃よりも高い温度で行われ、
センサーが、２５℃よりも高い温度、例えば３０、３２、３４、３５、又は３７℃よりも高い温度で、ＭＩＴなどのチオール剤又はその他のイソチアゾリノン由来の薬剤の存在下、酵素活性を保持するクレアチンアミジノヒドロラーゼポリペプチドを含む方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】電極及び膜を備える従来の酵素センサーを示す。
【図２】図１のセンサーの膜を示す。
【図３】例示的な、平面状の厚膜センサー構築物を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
（定義）
単離ポリペプチド：本明細書で使用される「単離ポリペプチド」という用語は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定した場合、少なくとも２０％純粋な、好ましくは少なくとも４０％純粋な、より好ましくは少なくとも６０％純粋な、更により好ましくは少なくとも８０％純粋な、最も好ましくは少なくとも９０％純粋な、更に最も好ましくは少なくとも９５％純粋な、ポリペプチドを指す。
【００２６】
クレアチンアミジノヒドロラーゼ活性：クレアチンアミジノヒドロラーゼ活性（又は「クレアチナーゼ」活性）という用語は、ＥＣ番号：ＥＣ  ３．５．３．３を有する、サルコシン及び尿素を生成するようにクレアチンの加水分解を触媒するヒドロラーゼ活性と定義される。クレアチナーゼ活性は、クレアチン及びサルコシンオキシダーゼと共にリン酸緩衝液中でクレアチナーゼをインキュベートすることによって測定され、Ｈ２Ｏ２の形成は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、４−ヒドロキシベンゼンスルホネート、及び４−アミノアンチピリンによって連続的に検出される。４−ヒドロキシベンゼンスルホネートの酸化及びその後の４−アミノアンチピリンとの反応によって形成された着色生成物の形成は、４９０ｎｍで、吸光度の上昇を伴う。
【００２７】
感度の低下：本発明のセンサーに関し、これはセンサーが、最長数週間のある特定の期間を過ぎた後、３７℃で０．１１ｇ  ＭＩＴ／Ｌを含む濯ぎ溶液に曝された場合、クレアチニン又はクレアチンを検出するための感度の損失である。
【００２８】
熱安定性：２５℃よりも高い温度、例えば３０、３２、３４、３５、又は３７℃よりも高い温度、好ましくは３５又は３７℃又はそれ以上で酵素活性を保持するクレアチナーゼ酵素は、本発明の文脈において熱安定性を示すと言える。
【００２９】
クレアチニンを測定するための、酵素クレアチニナーゼ（ＥＣ  ３．５．２．１０）、クレアチンアミジノヒドロラーゼ（ＥＣ  ３．５．３．３−「クレアチナーゼ」）、及びサルコシンオキシダーゼ（ＥＣ  １．５．３．１）を含むセンサーの寿命は、保存料ＭＩＴ（例えば、９％のＭＩＴを含む、保存料Ｎｅｏｌｏｎｅ  ９５０）を含む濯ぎ溶液を用いたとき、ある特定の期間の後に又はある特定の回数の測定の後に、大幅に低減したことが観察された。センサーシステムの寿命の低減を引き起こす、ＭＩＴによるクレアチナーゼの失活は、高温で、例えば３７℃で特に観察された。
【００３０】
センサーの流路での細菌増殖及びバイオフィルム形成を防止するための、Ｎｅｏｌｏｎｅ  ９５０の推奨濃度は、約１．２５ｇ  Ｎｅｏｌｏｎｅ  ９５０／Ｌ（０．１１ｇ  ＭＩＴ／Ｌに該当）の濯ぎ溶液である。Ｎｅｏｌｏｎｅ  ９５０によるクレアチナーゼの失活は、センサーの寿命を短くすることが見出され、Ｎｅｏｌｏｎｅ  ９５０中のチオール剤ＭＩＴとクレアチナーゼ中のチオール基との相互作用に起因すると考えられた。
【化２】
0006636533.tif 000003
【００３１】
センサーの寿命は、Ｎｅｏｌｏｎｅ  ９５０の量を０．３ｇ／Ｌの濯ぎ溶液まで低減させることによって、２週間に延ばすことができるが、この保存料の濃度は、センサー内の細菌増殖及びバイオフィルム形成を防止するのに十分ではない。
【００３２】
Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｓｐ．ＫＳ−８５から単離された天然クレアチナーゼ（ＥＣ  ３．５．３．３）は熱安定性であることが報告されているが（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｑ９ＲＨＵ９）、この酵素は、実施例１からわかるように、０．１１ｇ  ＭＩＴ／Ｌを含む濯ぎ溶液中に貯蔵された場合、高温で不安定になる。
【００３３】
Ｉ．イソチアゾリノン由来の薬剤の存在下、熱安定性の変異クレアチナーゼ（ＥＣ  ３．５．３．３）
野生型クレアチナーゼ（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｑ９ＲＨＵ９）又はその相同体由来の広範な変異クレアチナーゼをコードする合成遺伝子は、その野生型親酵素に比べて高温で貯蔵された場合、イソチアゾリノン由来の薬剤の存在下でより安定な変異体を同定するために、構築しかつ組換えにより発現させた。これらの研究は、この性質の組合せ（即ち、高温でのかつイソチアゾリノン由来の薬剤における安定性）を有する変異クレアチナーゼ酵素が、Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｑ９ＲＨＵ９のアミノ酸残基１７５及び２９９に対応する位置に特定のアミノ酸が存在することによって特徴付けられることを明らかにした（実施例１）。この性質の所望の組合せを有する変異クレアチナーゼ酵素は、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｓｐ．ＫＳ−８５クレアチナーゼに構造的に関係する天然クレアチナーゼ酵素を最初に選択し、次いで発現したポリペプチドがＵｎｉｐｒｏｔ  Ｑ９ＲＨＵ９のアミノ酸残基１７５及び２９９に対応する位置に必要な特定のアミノ酸を有するように１つ以上のアミノ酸残基を置換することによって、天然酵素から誘導できることが更に示される。
【００３４】
したがって本発明は、クレアチンアミジノヒドロラーゼ活性を有する変異ポリペプチドであって、その野生型親酵素に比べ、ＭＩＴなどのチオール剤又はその他のイソチアゾリノン由来の薬剤に対してより耐性のある性質を有し、それと共に熱安定性を示す、変異ポリペプチドを提供する。熱安定性は、３日以上の期間にわたり、例えば１０、１４、２１、３０、３６日にわたり若しくはそれよりも長い期間、又は５０日よりも長く、好ましくは３６日間又はそれよりも長い期間にわたり、最高約４０℃、より典型的には最高約３７℃の温度でインキュベーションした後の液体環境で変異ポリペプチドが少なくとも５０％（より好ましくは少なくとも５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、又は９０％）の酵素活性を保持する能力であると理解されたい。本発明の変異クレアチナーゼ酵素は、野生型親酵素と比較した場合よりも、２５℃よりも高い温度、例えば３０、３２、３４、３５、又は３７℃で又はそれよりも高い温度で、好ましくは３５又は３７℃で又はそれよりも高い温度で、多くの酵素活性を保持することが観察される。
【００３５】
一実施形態によれば、変異ポリペプチドは、配列番号２を有する、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｓｐ  （Ｑ９ＲＨＵ９＿Ｕｎｉｐｒｏｔ）からの天然クレアチナーゼ酵素から誘導可能であり、又はＱ９ＲＨＵ９（受託番号：ＡＢ０１６７８８．１）をコードする天然遺伝子の相同体（即ち、オルソログ又はパラログ）である遺伝子によってコードされた天然クレアチナーゼ酵素から誘導されてもよい。Ｑ９ＲＨＵ９（受託番号：ＡＢ０１６７８８．１；配列番号１）をコードする天然遺伝子の相同体（即ち、オルソログ又はパラログ）である遺伝子によってそれぞれコードされた天然クレアチナーゼ酵素（ＥＣ  ３．５．３．３）は、高度なアミノ酸同一性を共有し、したがってそれらの配列は、適切なプログラム（例えば、ＣＬＵＳＴＡＬ  ０（１−２−１））を使用して互いにアラインメントすることによりそれらの配列同一性を明らかにすることができ、かつ対応する残基をそれらのそれぞれのアミノ酸配列中に位置付けることができる。本発明の変異ポリペプチドは、配列番号３に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号２の１７５位のシステインに対応するアミノ酸残基はアラニンであり、配列番号２の２９９位のシステインに対応するアミノ酸残基はアラニンである（表１参照）。配列番号３に対する変異ポリペプチドのアミノ酸配列同一性の好ましいパーセンテージは、少なくとも８０％、例えば少なくとも８２％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、及び少なくとも９９．５％である。好ましくは、ポリペプチド中の１つ以上のアミノ酸残基の置換、挿入、付加、又は欠失の数は限られており、即ち、配列番号３を有する対応する変異体ポリペプチドに比べて、１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０以下の置換、及び／又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０以下の挿入、及び／又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０以下の付加、及び／又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０以下の欠失がある。本明細書で使用される「配列同一性」という用語は、実質的に等しい長さの２つのアミノ酸配列同士、又は実質的に等しい長さの２つの核酸配列同士の同一性の程度の定量的尺度を示す。比較する２つの配列は、タンパク質配列又は核酸配列の、ギャップの挿入あるいは末端の切断に、最良の可能性ある状態でアラインメントしなければならない。配列同一性は、（（Ｎｒｅｆ−Ｎｄｉｆ）１００）／（Ｎｒｅｆ）として計算することができ、式中、Ｎｄｉｆは、アラインメントしたときの２つの配列における非同一残基の総数であり、Ｎｒｅｆは、配列の１つにおける残基の数である。したがってＤＮＡ配列ＡＧＴＣＡＧＴＣは、配列ＡＡＴＣＡＡＴＣに対して７５％の配列同一性を有することになる（Ｎｄｉｆ＝２及びＮｒｅｆ＝８）。ギャップは、特定の残基の非同一性としてカウントされ、即ち、核酸配列ＡＧＴＧＴＣは、核酸配列ＡＧＴＣＡＧＴＣに対して７５％の配列同一性を有することになる（Ｎｄｉｆ＝２及びＮｒ���ｆ＝８）。同様に、ポリペプチド配列ＡｌａＧｌｙＴｈｒＣｙｓＡｌａＧｌｙＴｈｒＣｙｓは、配列ＡｌａＡｌａＴｈｒＣｙｓＡｌａＡｌａＴｈｒＣｙｓに対して７５％の配列同一性を有することになる（Ｎｄｉｆ＝２及びＮｒｅｆ＝８）。ギャップは、特定の残基の非同一性としてカウントされ、即ち、ポリペプチド配列ＡｌａＧｌｙＴｈｒＧｌｙＴｈｒＣｙｓは、ポリペプチド配列ＡｌａＧｌｙＴｈｒＣｙｓＡｌａＧｌｙＴｈｒＣｙｓに対して７５％の配列同一性を有することになる（Ｎｄｉｆ＝２及びＮｒｅｆ＝８）。配列同一性は、代替として、ＢＬＡＳＴプログラムによって、例えばＢＬＡＳＴプログラム（Ｐｅａｒｓｏｎ  Ｗ．Ｒ  ａｎｄ  Ｄ．Ｊ．Ｌｉｐｍａｎ（１９８８））（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＢＬＡＳＴ））によって計算することができる。本発明の一実施形態では、アラインメントは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ２．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｃｌｕｓｔａｌｗ／で入手可能な、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  Ｊ．，ｅｔ  ａｌ  １９９４によって記述されるように、デフォルトパラメータを用いた配列アラインメント法ＣｌｕｓｔａｌＷによって行われる。
【００３６】
更なる実施形態によれば、変異ポリペプチドは、配列番号３に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号２の１７５位のシステインに対応するアミノ酸残基がアラニンであり、配列番号２の２９９位のシステインに対応するアミノ酸残基がアラニンであり（表１参照）、ポリペプチドは、配列番号３（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｓｐ．クレアチンアミジノヒドロラーゼに対応−Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｑ９ＲＨＵ９に対する置換：Ｃ１７５Ａ＋Ｃ２９９Ａ）、配列番号７（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ａｎｔｈｒｏｐｉクレアチナーゼに対応−Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ａ０Ａ０７６ＷＧＢ５（配列番号６）に対する置換：Ｃ１７１Ａ＋Ｃ２９５Ａ）、配列番号１１（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐ．ＬＮＨＣ２２１Ｂ００クレアチナーゼに対応−Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｘ６ＤＬＭ３（配列番号１０）に対する置換：Ｓ１７５Ａ＋Ｃ２９９Ａ）、配列番号１５（Ｒｏｓｅｏｖａｒｉｕｓ  ｓｐ  ＴＭ１０３５クレアチナーゼに対応−Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ａ６ＤＶＦ８（配列番号１４）に対する置換：Ｃ１７５Ａ＋Ｃ２９９Ａ）、配列番号１９（Ｒｏｓｅｏｖａｒｉｕｓ  ｓｐ  ２１７クレアチナーゼに対応−Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ａ３Ｗ１Ｅ４（配列番号１８）に対する置換：Ｃ１７５Ａ＋Ｃ２９９Ａ）、配列番号２３（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓクレアチナーゼに対応−Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ａ１Ｂ０Ｔ５（配列番号２２）に対する置換：Ｃ１７５Ａ＋Ｃ２９９Ａ）、配列番号２７（Ｒｕｂｅｌｌｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ  ｍｅｓｏｐｈｉｌｕｍクレアチナーゼに対応−Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ａ０Ａ０１７ＨＲＶ０（配列番号２６）に対する置換：Ｃ１７５Ａ＋Ｃ２９９Ａ）、配列番号３１（Ｌｏｋｔａｎｅｌｌａ  ｖｅｓｔｆｏｌｄｅｎｓｉｓ  ＳＫＡ５３クレアチナーゼに対応−Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ａ３Ｖ１２８（配列番号３０）に対する置換：Ｃ２９８Ａ）、配列番号３５（Ｌｕｔｉｂａｃｕｌｕｍ  ｂａｒａｔａｎｇｅｎｓｅ  ＡＭＶ１クレアチナーゼに対応−Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｖ４ＲＧＥ５（配列番号３４）に対する置換：Ｃ１８０Ａ＋Ｃ３０４Ａ）、配列番号３９（Ｒｏｓｅｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．ＡｚｗＫ−３ｂクレアチナーゼに対応−Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ａ６ＦＱＱ７（配列番号３８）に対する置換：Ｃ２９９Ａ）、配列番号４３（Ｄｉｎｏｒｏｓｅｏｂａｃｔｅｒ  ｓｈｉｂａｅクレアチナーゼに対応−Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ａ８ＬＱＪ５（配列番号４２）に対する置換：Ｃ３０４Ａ）、配列番号４７（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓクレアチナーゼに対応−Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ａ１Ｂ７Ｉ６（配列番号４６）に対する置換：Ｃ１５０Ａ＋Ｃ２７４Ａ）の中から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００３７】
更なる実施形態によれば、変異ポリペプチドは、配列番号３に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号２の１７５位のシステインに対応するアミノ酸残基はアラニンであり、配列番号２の２９９位のシステインに対応するアミノ酸残基はアラニンであり、配列番号２の２６８位のシステインに対応するアミノ酸残基は、ロイシン、バリン、イソロイシン、又はアラニンから選択され、好ましくはロイシンである（表１参照）。
【００３８】
更なる実施形態によれば、変異ポリペプチドは、配列番号３に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号２の１７５位のシステインに対応するアミノ酸残基はアラニンであり、配列番号２の２９９位のシステインに対応するアミノ酸残基はアラニンであり、配列番号２の２６８位のシステインに対応するアミノ酸残基はロイシンであり（表１参照）、ポリペプチドは、配列番号４（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｓｐ．クレアチンアミジノヒドロラーゼに対応−Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｑ９ＲＨＵ９（配列番号２）に対する置換：Ｃ１７５Ａ＋Ｃ２９９Ａ＋Ｃ２６８Ｌ）、配列番号８（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ａｎｔｈｒｏｐｉｃクレアチナーゼに対応−Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ａ０Ａ０７６ＷＧＢ５（配列番号６）に対する置換：Ｃ１７１Ａ＋Ｃ２９５Ａ＋Ｃ２６４Ｌ）、配列番号１２（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐ．ＬＮＨＣ２２１Ｂ００クレアチナーゼに対応−Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｘ６ＤＬＭ３（配列番号１０）に対する置換：Ｓ１７５Ａ＋Ｃ２９９Ａ＋Ｃ２６８Ｌ）、配列番号１６（Ｒｏｓｅｏｖａｒｉｕｓ  ｓｐ  ＴＭ１０３５クレアチナーゼに対応−Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ａ６ＤＶＦ８（配列番号１４）に対する置換：Ｃ１７５Ａ＋Ｃ２９９Ａ＋Ｃ２６８Ｌ）、配列番号２０（Ｒｏｓｅｏｖａｒｉｕｓ  ｓｐ  ２１７クレアチナーゼに対応−Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ａ３Ｗ１Ｅ４（配列番号１８）に対する置換：Ｃ１７５Ａ＋Ｃ２９９Ａ＋Ｃ２６８Ｌ）、配列番号２４（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓクレアチナーゼに対応−Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ａ１Ｂ０Ｔ５（配列番号２２）に対する置換：Ｃ１７５Ａ＋Ｃ２９９Ａ＋Ｃ２６８Ｌ）、配列番号２８（Ｒｕｂｅｌｌｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ  ｍｅｓｏｐｈｉｌｕｍクレアチナーゼに対応−Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ａ０Ａ０１７ＨＲＶ０（配列番号２６）に対する置換：Ｃ１７５Ａ＋Ｃ２９９Ａ＋Ｃ２６８Ｌ）、配列番号３２（Ｌｏｋｔａｎｅｌｌａ  ｖｅｓｔｆｏｌｄｅｎｓｉｓ  ＳＫＡ５３クレアチナーゼに対応−Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ａ３Ｖ１２８（配列番号３０）に対する置換：Ｃ２９８Ａ＋Ｃ２６７Ｌ）、配列番号３６（Ｌｕｔｉｂａｃｕｌｕｍ  ｂａｒａｔａｎｇｅｎｓｅ  ＡＭＶ１クレアチナーゼに対応−Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｖ４ＲＧＥ５（配列番号３４）に対する置換：Ｃ１８０Ａ＋Ｃ３０４Ａ＋Ｃ２７３Ｌ）、配列番号４０（Ｒｏｓｅｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．ＡｚｗＫ−３ｂクレアチナーゼに対応−Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ａ６ＦＱＱ７（配列番号３８）に対する置換：Ｃ２９９Ａ＋Ｃ２６８Ｌ）、配列番号４４（Ｄｉｎｏｒｏｓｅｏｂａｃｔｅｒ  ｓｈｉｂａｅクレアチナーゼに対応−Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ａ８ＬＱＪ５（配列番号４２）に対する置換：Ｃ３０４Ａ＋Ｃ２７３Ｌ）、配列番号４８（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓクレアチナーゼに対応−Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ａ１Ｂ７Ｉ６（配列番号４６）に対する置換：Ｃ１５０Ａ＋Ｃ２７４Ａ＋Ｃ２４３Ｌ）の中から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００３９】
更なる実施形態によれば、変異ポリペプチドは、配列番号２に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号２の１７５位のシステインに対応するアミノ酸残基はアラニンであり、配列番号２の２９９位のシステインに対応するアミノ酸残基はアラニンであり、配列番号２の２０２位に対応するアミノ酸残基はアラニンでありかつ配列番号２の３１２位に対応するアミノ酸残基はグルタミン酸であり、任意選択で配列番号２の２６８位のシステインに対応するアミノ酸残基は、ロイシン、バリン、イソロイシン、又はアラニンから選択される（表１参照）。
【表１−１】
0006636533.tif 000004
【表１−２】
0006636533.tif 000005
【表１−３】
0006636533.tif 000006
【００４０】
ＩＩ．本発明の変異クレアチナーゼ（ＥＣ  ３．５．３．３）を生成するための方法
本発明は更に、本発明の変異ポリペプチドをコードする遺伝子を含む遺伝子改変宿主細胞を提供する。変異ポリペプチドの発現に適切な宿主細胞として、細菌細胞、酵母細胞、及び真菌細胞が挙げられる。変異ポリペプチドをコードする核酸分子は、合成により作製することができ、次いで制限部位を、発現プラスミドのクローニング部位にクローニングすることができ、これを選択された宿主細胞に形質転換することができる。宿主細胞に形質転換された核酸分子は、宿主ゲノムに組み込まれてもよく、又は自己複製ベクター上に保持されてもよい。変異ポリペプチドをコードする核酸分子は、形質転換された宿主細胞での発現を容易にするプロモーターに融合させてもよい。核酸分子は更に、発現したポリペプチドの精製が容易になるように、Ｃ−末端又はＮ−末端に融合したアミノ酸配列タグに融合された変異ポリペプチドを、コードしてもよい。適切な融合アミノ酸配列タグは、例えば、細菌性線毛タンパク質、例えば線毛成分のピリン及びｐａｐＡとすることができ、タンパク質Ａ、ＺＺ−ペプチド（ＺＺ−融合物は、Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｓｗｅｄｅｎから販売されている）、マルトース、セルロース、又はデンプン結合タンパク質／ペプチド（ドメイン）、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、（−ガラクトシダーゼ、又はポリ−ヒスチジン）及び任意選択で、精製後にそのようなタグを除去するためのプロテアーゼ切断部位とすることができる。
【００４１】
本発明は更に、本発明の変異ポリペプチドを生成するための方法であって、ａ）組換え宿主細胞を用意するステップであり、この細胞がＤＮＡ分子を含み、ＤＮＡ分子が変異ポリペプチドをコードする核酸配列を含むステップと、ｂ）宿主細胞を、変異ポリペプチドを発現させるのに適切な培地中でインキュベートするステップと、ｃ）培地から、ステップｂ）で宿主細胞によって発現させた変異ポリペプチドを回収するステップとを含む方法を提供する。
【００４２】
ＩＩＩ  本発明の変異クレアチナーゼ（ＥＣ  ３．５．３．３）を含む組成物
更なる実施形態では、本発明は、クレアチナーゼ（ＥＣ  ３．５．３．３）及びサルコシンオキシダーゼ（ＥＣ  １．５．３．１）を含む、あるいはクレアチナーゼ（ＥＣ  ３．５．３．３）、クレアチニナーゼ（ＥＣ  ３．５．２．１０）、及びサルコシンオキシダーゼ（ＥＣ  １．５．３．１）を含む組成物であって、クレアチナーゼが、イソチアゾリノン由来の薬剤の存在下で熱安定性であり、クレアチナーゼのアミノ酸配列が上記セクションＩで定義された通りである組成物を提供する。組成物は、乾燥粉末、錠剤として、又は液体として製剤化されていてもよい。
【００４３】
ＩＶ  本発明の変異クレアチナーゼ（ＥＣ  ３．５．３．３）を含む生理液のサンプル中のクレアチニン及び／又はクレアチンを測定するのに適切なセンサー
本発明は更に、クレアチナーゼ（ＥＣ  ３．５．３．３）及びサルコシンオキシダーゼ（ＥＣ  １．５．３．１）含むクレアチンセンサー、又はクレアチナーゼ（ＥＣ  ３．５．３．３）、クレアチニナーゼ（ＥＣ  ３．５．２．１０）、及びサルコシンオキシダーゼ（ＥＣ  １．５．３．１）を含むクレアチニンセンサー、又はクレアチン及びクレアチニンセンサーの両方を備えるデュアルセンサーであって、クレアチナーゼ酵素が、イソチアゾリノン由来の薬剤の存在下で熱安定性であり、クレアチナーゼのアミノ酸配列が上記セクションＩで定義した通りである、センサーを提供する。
【００４４】
サンプル流体中のクレアチニン又はクレアチンを決定するためのセンサーは、表面を有する電極を含み、クレアチニン又はクレアチンを決定するための複数の酵素が電極表面に固定化されており、その酵素のうちの１種が上記セクションＩで定義された通りのクレアチンアミジノヒドロラーゼであることを特徴とする。
【００４５】
Ｖ  本発明の変異クレアチナーゼ（ＥＣ  ３．５．３．３）を含む従来のセンサー
一実施形態では、変異クレアチナーゼを含むセンサーは、生理液のサンプル中のクレアチニンを測定するのに適切な従来のセンサーである。従来のセンサーは、伝統的な電流測定センサーとして構築されたクレアチン及びクレアチニンセンサーから構成されるデュアルセンサーシステムを含む。図１は、そのようなセンサー１を示し、生体サンプル中の分析物の濃度を測定するための装置（例えば、ＡＢＬ（商標）８３７血液ガス分析機（Ｒａｄｉｏｍｅｔｅｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ＡｐＳ，Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ））に取り付けるのに適切なものである。
【００４６】
基本的に、センサー１は電極２を備え、そこには膜リング３が取着されている。電極２は、白金ワイヤー５で接続された白金アノード４を備え、このワイヤーは、マイクロプラグ６を通って銀アノード接触本体７に接続されている。白金アノード４と白金ワイヤー５の下部とは、ガラス本体８内に封止されている。ガラス本体８とマイクロプラグ６との間では、白金ワイヤー５が、熱収縮管材で保護されている。管状銀参照電極１０が、ガラス本体８の上部を取り囲み、電極２の長さをアノード接触本体７まで延びており、固定本体１１及びエポキシ１２を用いて参照電極内に固定されている。ガラス本体８の下部は、電極基部１３によって取り囲まれ、そこに膜リング３が取着されている。
【００４７】
参照電極１０の上部は、分析装置（図示せず）の対応するプラグ内で電極２を取り付けるために、かつマントル１５を固定するために、プラグ部１４によって取り囲まれている。ガスケット１６及び１７が、電極２の測定表面に位置付けられた任意の電解質が蒸発しないことを確実にするために、電極２とマントル１５との間に配置されている。マントル１５の一端に取り付けられた膜リング３は、リング２０を備える。膜２１が、リング２０の下方開口を覆うように延伸されている。この膜２１を、図２に詳細に示す。
【００４８】
図２は、５層：電極２の白金アノード４に面するノイズ低減スペーサー層２２、干渉限定膜層２３、酵素層２５を取り囲むガスケット２４、及び８０％程度の含水量を有するポリウレタンの親水性保護層でコーティングされた拡散限定多孔質膜層２６を含む、膜２１を詳細に示す。コーティングされた膜層２６は、分析がなされるサンプルに面している。
【００４９】
ノイズ低減スペーサー層２２は、約２１±２μｍのポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴＰ）のトラックエッジ付き膜であってもよい。干渉限定膜層２３は、約６±２μｍの酢酸セルロース（ＣＡ）の多孔質膜であってもよい。
【００５０】
ガスケット２４は、直径が１５００μｍのセンター穴を有する、３０±５μｍの両面接着ディスクであってもよい。ガスケット２４の接着剤は、酵素が層の間から漏出しなくなる程度まで、干渉限定層２３及び拡散限定層２６に接着する。
【００５１】
クレアチンセンサーの酵素層２５は、典型的には、緩衝液などの適切な添加剤と混合させた、グルタルアルデヒド（キッコーマン（Kikkoman.co.jp）から供給）に架橋したクレアチナーゼ及びサルコシンオキシダーゼの約２０μｍの層である。クレアチニンセンサーの酵素層２５は、典型的には、緩衝液などの適切な添加剤と混合させた、グルタルアルデヒドに架橋したクレアチニナーゼ（キッコーマン（Kikkoman.co.jp）から供給）、クレアチナーゼ、及びサルコシンオキシダーゼの約２０μｍの層である。
【００５２】
拡散限定多孔質膜層２６は、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴＰ）の約１２μｍの層（細孔直径約０．１μｍ、細孔密度約３・１０７  ｐｏｒｅｓ／ｃｍ２）であってもよく、この層は、含水量が約８０％のポリウレタンでコーティングされたものである。
【００５３】
クレアチニンセンサーでは、クレアチン及びクレアチニンが共に、酵素により過酸化水素に変換される。クレアチンセンサーでは、クレアチンのみが、酵素により過酸化水素に変換される。
【００５４】
電流測定電極で、過酸化水素は、Ａｇ／ＡｇＣｌに対して＋６７５ｍＶで陽極酸化される。得られた電流は、サンプル中でクレアチニン／クレアチン濃度に比例する。クレアチニンの濃度は、クレアチニンセンサーシグナル（クレアチン＋クレアチニンを検出する）とクレアチンセンサーシグナル（クレアチンを検出する）との差から決定される。
【００５５】
ＶＩ  本発明の変異クレアチナーゼ（ＥＣ  ３．５．３．３）を含む厚膜センサー
一実施形態では、変異クレアチナーゼを含むセンサーは、生理液のサンプル中のクレアチニンの測定に適切な厚膜センサーである。厚膜センサーは、図３に示されるように構築されたクレアチン及びクレアチニンセンサーを備えるデュアルセンサーから構成される。
【００５６】
図３を参照すると、厚さ２００μｍのアルミナ基板１１０が用意され、その片面には、直径１０００μｍ及び厚さ１０μｍの円形白金作用電極１２０と、作用電極の外周の角度範囲３０〜３３００を覆う、外径３０００μｍ、内径２０００μｍ、及び厚さ１０μｍの、環状白金対電極１３０と、０℃で作用電極の外周に位置決めされた、直径５０μｍの円形銀／塩化銀参照電極１４０とが設けられている。これら３つの電極構造の全ては、基板を横断する白金で満たされたスルーホール（図示せず）を介して、アルミナ基板１１０の全体にわたってセンサー電子部品（図示せず）に接続される。動作後、作用電極１２０は、参照電極１４０に対して＋６７５ｍＶに分極する。
【００５７】
更に、アルミナ基板１１０上には、ガラス及びポリマー包封材の２層化構造がある。これらの２層化構造は、作用電極１２０を取り囲む、外径１８００μｍ、内径１２００μｍ、及び厚さ５０μｍの環状構造１６０、１６１と、完全電極システムを取り囲む、厚さ５０μｍの構造１５０、１５１とを備える。これら２層化構造は共に、厚さ２０μｍの英国、ＥＳＬ  Ｅｕｒｏｐｅ製のＥＳＬガラス４９０４のアルミナ基板１１０に面する内層１５０、１６０と、２８．１重量％のポリエチルメタクリレート（Ｅｌｖａｃｉｔｅ、部品番号２０４１、ＤｕＰｏｎｔ製）、３６．４重量％の酢酸カルビトール、３４．３重量％のシラン化カオリン（部品番号ＨＦ９００、Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ製）、０．２重量％のヒュームドシリカ、及び１．０重量％のトリメトキシシランを含むＣａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡのＳｅｎＤｘ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｃ．による国際特許出願ＷＯ９７／４３６３４号に開示されたＣａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡのＳｅｎＤｘ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｃ．製ポリマー包封材の外層１５１、１６１とからなる。
【００５８】
直径１２００μｍ及び厚さ１０μｍの酢酸セルロース及び酢酸酪酸セルロースの円形内膜１７０は、作用電極１２０を覆う。
【００５９】
クレアチニンセンサーの場合、直径１２００μｍ及び厚さ１２μｍの、クレアチニナーゼ、グルタルアルデヒドで処理されたクレアチナーゼ、及びサルコシンオキシダーゼの円形酵素層１８０が、内膜１７０を覆う。
【００６０】
クレアチンセンサーの場合、直径１２００μｍ及び厚さ１２μｍの、グルタルアルデヒドで処理されたクレアチナーゼ及びサルコシンオキシダーゼの円形酵素層１８０が、内膜１７０を覆う。
【００６１】
直径４０００μｍ及び厚さ約１０μｍの、アクリレートの円形外膜層１９０（拡散限定膜）は、作用電極１２０を中心にして完全電極システムを覆う。
【００６２】
外膜は、ポリアクリレート（Ｅｕｄｒａｇｉｔ）の希釈分散体から調製し、この分散体をセンサー領域上に吐出して、３つの電極全てを覆うようにかつポリマー包封材１５１と約０．５ｍｍの重なりを有するようにした。クレアチニンセンサーでは、クレアチン及びクレアチニンが共に、酵素によって過酸化水素に変換される。クレアチンセンサーでは、クレアチンのみが、酵素によって過酸化水素に変換される。クレアチニンの濃度は、クレアチニンセンサーシグナル（クレアチン＋クレアチニンを表す）とクレアチンセンサーシグナル（クレアチンを表す）との差から決定される。
【００６３】
ＶＩＩ  本発明の変異クレアチナーゼ（ＥＣ  ３．５．３．３）を使用して生理液のサンプル中のクレアチニン又はクレアチンを測定するための方法
本発明は更に、サンプル中のクレアチン及び／又はクレアチニンを測定するための方法であって、サンプルと、イソチアゾリノン由来の薬剤の存在下で熱安定性のクレアチナーゼ酵素（ＥＣ  ３．５．３．３）を含むセンサー又はデュアルセンサーとを接触させるステップと、サンプル中のクレアチン及び／又はクレアチニンを検出するステップとを含む方法を提供する。次いでセンサーによって検出されたクレアチン及び／又はクレアチニンを使用して、検出された、サンプル中のクレアチン及び／又はクレアチニンのレベルを決定する。一実施形態では、方法は、センサーと、イソチアゾリノン由来の薬剤（例えば、ＭＩＴ）などのチオール相互作用剤を含む濯ぎ溶液とを接触させるステップを含み、この濯ぎステップは、サンプルとセンサー又はデュアルセンサーとを接触させるステップの前、後、又は前及び後の、いずれに行ってもよい。サンプル中のクレアチン及び／又はクレアチニンを測定するための方法、及び濯ぎステップは、通常、３７℃の温度で行うが、２５℃よりも高い温度で（例えば、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、又は４５℃で、又はそれよりも高い温度で）行ってもよい。
【００６４】
方法の一実施形態では、センサーは、クレアチンを測定するために、クレアチナーゼ（ＥＣ  ３．５．３．３）及びサルコシンオキシダーゼ（ＥＣ  １．５．３．１）を含み、方法の第２の実施形態では、センサーは、クレチニンを測定するためにクレアチナーゼ（ＥＣ  ３．５．３．３）、クレアチニナーゼ（ＥＣ  ３．５．２．１０）、及びサルコシンオキシダーゼ（ＥＣ  １．５．３．１）を含み、又は方法の第３の実施形態では、センサーは、このクレアチン及びクレアチニンセンサーの両方を備えるデュアルセンサーである。方法の更なる実施形態では、クレアチナーゼ酵素が変異クレアチナーゼであり、クレアチナーゼのアミノ酸配列は、上記セクションＩで定義された通りである。
【００６５】
ＶＩＩ  ３７℃及びそれよりも高い温度でチオール相互作用剤の存在下、高い安定性を持つクレアチニン又はクレアチンセンサーでの本発明の変異クレアチナーゼ（ＥＣ  ３．５．３．３）の使用。
【００６６】
本発明は更に、チオール失活剤を含む濯ぎ溶液と組み合わせてクレアチニンを決定するのに適切なセンサーにおける、チオール相互作用剤（例えば、ＭＩＴなどのイソチアゾリノン由来の薬剤）の存在下で熱安定性のあるクレアチナーゼ酵素（ＥＣ  ３．５．３．３）の使用であって、約３７℃及びそれよりも高い温度でのセンサーの寿命が延びる使用を提供する。
【００６７】
クレアチナーゼ酵素は更に、ａ）クレアチナーゼ（ＥＣ  ３．５．３．３）及びサルコシンオキシダーゼ（ＥＣ  １．５．３．１）を含むクレアチンセンサー、ｂ）クレアチナーゼ（ＥＣ  ３．５．３．３）、クレアチニナーゼ（ＥＣ  ３．５．２．１０）、及びサルコシンオキシダーゼ（ＥＣ  １．５．３．１）を含むクレアチニンセンサー、又はｃ）クレアチン及びクレアチニンセンサーの両方を備えるデュアルセンサーのいずれかで使用され、クレアチナーゼ酵素は、イソチアゾリノン由来の薬剤の存在下で熱安定性であり、クレアチナーゼのアミノ酸配列は、上記セクションＩで定義された通りである。
【００６８】
実施例１：チオール基を修飾する試薬の存在下で活性を保持しかつ高い熱安定性を有する、クレアチンアミジノヒドロラーゼを生成するための方法
Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｓｐ（Ｑ９ＲＨＵ９＿Ｕｎｉｐｒｏｔ）からの天然クレアチナーゼ酵素は、本質的に熱安定性であることが公知であるので野生型親酵素として選択した。Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｓｐ（Ｑ９ＲＨＵ９＿Ｕｎｉｐｒｏｔ）クレアチナーゼから誘導された変異ポリペプチドは、所望の変異体（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔにより、注文に応じて供給される）をコードする合成導入遺伝子で形質転換させた組換え微生物細胞内で生成した。
【００６９】
天然クレアチナーゼ酵素（Ｑ９ＲＨＵ９＿Ｕｎｉｐｒｏｔ）中に存在するシステイン残基は、これらの残基が、クレアチナーゼ活性を損なう可能性のあるチオール基を攻撃するＳＨ試薬に関する潜在的標的であるという理由により、変異のために選択した。各システイン残基に関するいくつかの置換を試験し、アラニン、セリン、及びトレオニン残基などの保存的置換から開始した。このように、所与の変異ポリペプチドにおけるシステイン残基の１つ、２つ、３つ、又はそれ以上の置換を含む、一連の変異クレアチナーゼポリペプチドを生成した。次いで発現しかつ生成された変異ポリペプチドを、安定性に関して（保持されるクレアチナーゼ酵素活性に関して）試験し、保存料Ｎｅｏｌｏｎｅなしの１００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．４中で、並びに１．２５ｇ／ＬのＮｅｏｌｏｎｅを含有するＡＢＬ９０分析機（Ｒａｄｉｏｍｅｔｅｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ａｐｓ）の濯ぎ溶液中で、０．２ｍｇ／ｍＬ酵素のインキュベーションを行い、４℃、２２℃（ＲＴ）、又は４０℃で、８日間（又は指示通りに４日間）にわたりインキュベートした。ＡＢＬ９０分析機用の濯ぎ溶液は、１．２５ｇ／ＬのＮｅｏｌｏｎｅ（ＭＩＴを含む）と共に保存されたｐＨ７．４の緩衝生理食塩液であった。
【００７０】
インキュベーション後、サンプルの残留活性を、全てのサンプルを１００ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．５中で１０倍希釈した後に決定した。各希釈サンプル１００μＬを、マイクロウェルプレートに二連でピペット分取し、その後、５０ｍＭクレアチン、１０Ｕ／ｍＬサルコシンオキシダーゼ、５Ｕ／ｍＬホースラディッシュペルオキシダーゼ、０．０４％  ４−ヒドロキシベンゼンスルホネート、及び１．５ｍＭ  ４−アミノアンチピリンを含有する６０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．５を１００μＬ加えた。４−ヒドロキシベンゼンスルホネートを酸化し、その後、４−アミノアンチピリンと反応させることによって形成された着色生成物の形成を、４９０ｎｍでの吸光度を上昇させることによって（ΔＡｂｓ）、２５℃に自動温度調節したマイクロウェルリーダーで追跡した。進行曲線の線形部分で得られたΔＡｂｓ／分を、相対クレアチナーゼ活性の尺度として使用する。
【００７１】
変異ポリペプチドの安定性（４℃でインキュベートした後の活性に対する保持活性％）を、野生型親酵素及び市販の組換え熱安定性クレアチナーゼ、Ｃ２−ＡＴ（キッコーマン（Kikkoman.co.jp）により供給）と比較した。クレアチナーゼ、Ｃ２−ＡＴの決定されたアミノ酸配列は、２つのアミノ酸置換：Ａ２０２Ｔ及びＥ３１２Ｋを有すること以外、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ属のクレアチナーゼＱ９ＲＨＵ９の配列と同一であることがわかった。
【表２】
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【００７２】
Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ属のクレアチナーゼ中の全てのシステイン残基をセリンで置換することにより、酵素活性の完全損失がもたらされた（図示せず）。システイン残基のいくつかの保存置換は、２２℃の室温で、ＭＩＴに対して改善された安定性をもたらした。システイン残基の代替の保存置換の比較は、意外にも、アラニンによる置換で、ＭＩＴに対する最大限の安定性が与えられたことを明らかにした。例えば、Ｃ１７５並びにＣ２９９の、トレオニン、グリシン、又はセリンのいずれかによる置換は、ＭＩＴに対する安定性を高めることができなかった。しかし、単一システイン置換を持つ変異酵素は、室温でＭＩＴに対して高い安定性を示しながら、４０℃で酵素安定性の損失を示した。
【００７３】
２つのシステイン置換のいくつかの異なる組合せを含む、変異Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ属のクレアチナーゼポリペプチドを、試験し、その中で、Ｃ２９９Ａ、Ｃ１７５Ａ置換の特定の組合せは、イソチアゾリノンに対して最大限の安定性をもたらすと同時に４０℃で熱安定性を保持した。追加として、第３の保存システイン置換、Ｃ２６８Ｌは、二重置換（Ｃ２９９Ａ、Ｃ１７５Ａ）を有する変異体に挿入された場合、イソチアゾリノンに対して４０℃で安定性の更なる増大をもたらすことがわかった。しかし２つのアミノ酸置換Ａ２０２Ｔ及びＥ３１２Ｋは、単独で又はＣ２９９Ａ、Ｃ１７５Ａ置換と組み合わせて、イソチアゾリノンに対し、４０℃でいかなる追加の安定性の増大ももたらさなかった。
【００７４】
その他の微生物源から誘導されたクレアチナーゼ酵素は、天然クレアチナーゼ酵素Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｓｐ  （Ｑ９ＲＨＵ９＿Ｕｎｉｐｒｏｔ）に対して高度な構造的相同性及び同じ機能的性質を共有するものであり、その酵素は、８０％よりも高いアミノ酸配列同一性をそれらの酵素が共有することに基づいて同定され、ＥＣ  ３．５．３．３のクレアチナーゼ活性が割り当てられた。選択されたクレチナーゼ酵素のそれぞれのアミノ酸配列を、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｓｐ  （Ｑ９ＲＨＵ９＿Ｕｎｉｐｒｏｔ）からの天然クレアチナーゼ酵素のアミノ酸配列（配列番号２）とアラインメントし、配列番号２中のＣ２９９Ａ、Ｃ１７５Ａ、及び任意選択でＣ２６８Ｌに対応する置換を特定し（表１参照）たが、それらはそれぞれの酵素の各々でイソチアゾリノンに対して最高４０℃で高い安定性をもたらすのに十分である。
【００７５】
実施例２：クレアチニンセンサーの有効寿命は、チオール基を修飾しかつ高い熱安定性を有する試薬の存在下で活性を保持するクレアチンアミジノヒドロラーゼを用いることによって延びる
クレアチン及びクレアチニンセンサーを、クレアチナーゼ変異体＃４２（Ｃ１７５Ａ、Ａ２０２Ｔ、Ｃ２９９Ａ、Ｅ３１２Ｋ）並びにキッコーマン製の商用クレアチナーゼＣ２−ＡＴで生成した。センサーを、Ｒａｄｉｏｍｅｔｅｒ  ＡＢＬ９０分析機用センサーカセット内に配置し、９％のメチルイソチアゾリノン（ＭＩＴ）と共に０．７ｇ／ＬのＮｅｏｌｏｎｅ  ９５０を含む濯ぎ溶液を用い、３７℃に自動温度調節した分析機内に取り付けた。分析機を、標準分析機条件下で８日間運転して、機能性及び安定な応答を確実にした。９日目に、分析機を２つのグループ（Ａ及びＢ、それぞれは変異体＃４２  ＣＩ酵素を持つ３つの分析機と、商用ＣＩ、Ｃ２−ＡＴを持つ２つの分析機からなる）に分割した。グループＡには、１．２ｇ／Ｌ  Ｎｅｏｌｏｎｅ  ９５０を含む濯ぎ溶液を適用し、グループＢには、２ｇ／Ｌ  Ｎｅｏｌｏｎｅ  ９５０を含む濯ぎ溶液を適用した。次いで分析機を、標準の濯ぎ及び較正で、更に３６日間運転した。これらの３６日間におけるセンサーの感度の低下を、表にまとめる。
【表３】
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【００７６】
センサー寿命、の期間中に許容される感度損失は、約１０ｐＡ／μＭである。
【００７７】
保存料Ｎｅｏｌｏｎｅ  ９５０の両方のレベルで、３６日間にわたる感度の低減は、商用の酵素に比べ、ＣＩ変異体＃４２で著しく低下する。  本明細書は、以下の発明の開示を包含する：
［１]クレアチンアミジノヒドロラーゼ活性を有する変異ポリペプチドであって、
ａ．配列番号２に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、１７５位のアミノ酸残基システインがアラニンで置換され、２９９位のアミノ酸残基システインがアラニンで置換されている、ポリペプチド、並びに
ｂ．配列番号３（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｓｐ．クレアチンアミジノヒドロラーゼに対応−Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｑ９ＲＨＵ９に対する置換：Ｃ１７５Ａ＋Ｃ２９９Ａ）、配列番号７（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ａｎｔｈｒｏｐｉｃクレアチナーゼに対応−Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ａ０Ａ０７６ＷＧＢ５に対する置換：Ｃ１７１Ａ＋Ｃ２９５Ａ）、配列番号１１（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐ．ＬＮＨＣ２２１Ｂ００クレアチナーゼに対応−Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｘ６ＤＬＭ３に対する置換：Ｓ１７５Ａ＋Ｃ２９９Ａ）、配列番号１５（Ｒｏｓｅｏｖａｒｉｕｓ  ｓｐ  ＴＭ１０３５クレアチナーゼに対応−Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ａ６ＤＶＦ８に対する置換：Ｃ１７５Ａ＋Ｃ２９９Ａ）、配列番号１９（Ｒｏｓｅｏｖａｒｉｕｓ  ｓｐ  ２１７クレアチナーゼに対応−Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ａ３Ｗ１Ｅ４に対する置換：Ｃ１７５Ａ＋Ｃ２９９Ａ）、配列番号２３（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓクレアチナーゼに対応−Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ａ１Ｂ０Ｔ５に対する置換：Ｃ１７５Ａ＋Ｃ２９９Ａ）、配列番号２７（Ｒｕｂｅｌｌｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ  ｍｅｓｏｐｈｉｌｕｍクレアチナーゼに対応−Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ａ０Ａ０１７ＨＲＶ０に対する置換：Ｃ１７５Ａ＋Ｃ２９９Ａ）、配列番号３１（Ｌｏｋｔａｎｅｌｌａ  ｖｅｓｔｆｏｌｄｅｎｓｉｓ  ＳＫＡ５３クレアチナーゼに対応−Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ａ３Ｖ１２８に対する置換：Ｃ２９８Ａ）、配列番号３５（Ｌｕｔｉｂａｃｕｌｕｍ  ｂａｒａｔａｎｇｅｎｓｅ  ＡＭＶ１クレアチナーゼに対応−Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｖ４ＲＧＥ５に対する置換：Ｃ１８０Ａ＋Ｃ３０４Ａ）、配列番号３９（Ｒｏｓｅｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．ＡｚｗＫ−３ｂクレアチナーゼに対応−Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ａ６ＦＱＱ７に対する置換：Ｃ２９９Ａ）、配列番号４３（Ｄｉｎｏｒｏｓｅｏｂａｃｔｅｒ  ｓｈｉｂａｅクレアチナーゼに対応−Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ａ８ＬＱＪ５に対する置換：Ｃ３０４Ａ）、配列番号４７（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓクレアチナーゼに対応−Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ａ１Ｂ７Ｉ６に対する置換：Ｃ１５０Ａ＋Ｃ２７４Ａ）の中から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドから選択される、変異ポリペプチド。
[２]ａ．配列番号２に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列であって、配列番号２の１７５位のシステインに対応するアミノ酸残基がアラニンであり、配列番号２の２９９位のシステインに対応するアミノ酸残基がアラニンであり、配列番号２の２６８位のシステインに対応するアミノ酸残基が、ロイシン、バリン、イソロイシン、若しくはアラニンから選択される、アミノ酸配列、又は
ｂ．配列番号４（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｓｐ．クレアチンアミジノヒドロラーゼに対応−Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｑ９ＲＨＵ９に対する置換：Ｃ１７５Ａ＋Ｃ２９９Ａ＋Ｃ２６８Ｌ）、配列番号８（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ａｎｔｈｒｏｐｉｃクレアチナーゼに対応−Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ａ０Ａ０７６ＷＧＢ５に対する置換：Ｃ１７１Ａ＋Ｃ２９５Ａ＋Ｃ２６４Ｌ）、配列番号１２（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐ．ＬＮＨＣ２２１Ｂ００クレアチナーゼに対応−Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｘ６ＤＬＭ３に対する置換：Ｓ１７５Ａ＋Ｃ２９９Ａ＋Ｃ２６８Ｌ）、配列番号１６（Ｒｏｓｅｏｖａｒｉｕｓ  ｓｐ  ＴＭ１０３５クレアチナーゼに対応−Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ａ６ＤＶＦ８に対する置換：Ｃ１７５Ａ＋Ｃ２９９Ａ＋Ｃ２６８Ｌ）、配列番号２０（Ｒｏｓｅｏｖａｒｉｕｓ  ｓｐ  ２１７クレアチナーゼに対応−Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ａ３Ｗ１Ｅ４に対する置換：Ｃ１７５Ａ＋Ｃ２９９Ａ＋Ｃ２６８Ｌ）、配列番号２４（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓクレアチナーゼに対応−Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ａ１Ｂ０Ｔ５に対する置換：Ｃ１７５Ａ＋Ｃ２９９Ａ＋Ｃ２６８Ｌ）、配列番号２８（Ｒｕｂｅｌｌｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ  ｍｅｓｏｐｈｉｌｕｍクレアチナーゼに対応−Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ａ０Ａ０１７ＨＲＶ０に対する置換：Ｃ１７５Ａ＋Ｃ２９９Ａ＋Ｃ２６８Ｌ）、配列番号３２（Ｌｏｋｔａｎｅｌｌａ  ｖｅｓｔｆｏｌｄｅｎｓｉｓ  ＳＫＡ５３クレアチナーゼに対応−Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ａ３Ｖ１２８に対する置換：Ｃ２９８Ａ＋Ｃ２６７Ｌ）、配列番号３６（Ｌｕｔｉｂａｃｕｌｕｍ  ｂａｒａｔａｎｇｅｎｓｅ  ＡＭＶ１クレアチナーゼに対応−Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｖ４ＲＧＥ５に対する置換：Ｃ１８０Ａ＋Ｃ３０４Ａ＋Ｃ２７３Ｌ）、配列番号４０（Ｒｏｓｅｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．ＡｚｗＫ−３ｂクレアチナーゼに対応−Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ａ６ＦＱＱ７に対する置換：Ｃ２９９Ａ＋Ｃ２６８Ｌ）、配列番号４４（Ｄｉｎｏｒｏｓｅｏｂａｃｔｅｒ  ｓｈｉｂａｅクレアチナーゼに対応−Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ａ８ＬＱＪ５に対する置換：Ｃ３０４Ａ＋Ｃ２７３Ｌ）、配列番号４８（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓクレアチナーゼに対応−Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ａ１Ｂ７Ｉ６に対する置換：Ｃ１５０Ａ＋Ｃ２７４Ａ＋Ｃ２４３Ｌ）の中から選択されるアミノ酸配列を含む、［１］に記載のクレアチンアミジノヒドロラーゼ活性を有する変異ポリペプチド。
［３］［１］又は［２］に記載の変異ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、単離ポリヌクレオチド。
［４］発現宿主における変異ポリペプチドの生成を指示する１つ以上の制御配列に動作可能に連結された、［３］に記載のポリヌクレオチドを含む、核酸構築物。
［５］［１］又は［２］に記載の変異ポリペプチドをコードする核酸構築物を含む遺伝子改変宿主細胞であって、好ましくは細菌細胞、酵母細胞、及び真菌細胞の中から選択される前記宿主細胞。
［６］［１］又は［２］に記載の変異ポリペプチドを生成するための方法であって、
ａ．組換え宿主細胞を用意するステップであり、前記細胞がＤＮＡ分子を含み、前記ＤＮＡ分子が、［１］又は［２］に記載の変異ポリペプチドをコードする核酸配列を含むステップと、
ｂ．前記宿主細胞を、前記変異ポリペプチドを発現させるのに適切な条件下でインキュベートするステップと、
ｃ  ステップｂ）で前記宿主細胞によって発現させた前記変異ポリペプチドを回収するステップとを含む、方法。
［７］乾燥粉末、錠剤として、又は液体として製剤化されている、［１］又は［２］に記載の変異ポリペプチドを含む組成物。
［８］ａ．サルコシンオキシダーゼ（ＥＣ  １．５．３．１）、又は
ｂ．クレアチニナーゼ（ＥＣ  ３．５．２．１０）及びサルコシンオキシダーゼ（ＥＣ  １．５．３．１）を更に含む、［７］に記載の組成物。
［９］チオール失活剤を含む濯ぎ溶液と組み合わせてクレアチニン及び／又はクレアチンを決定するためのセンサーにおける、［１］若しくは［２］に記載の変異ポリペプチド又は［７］若しくは［８］に記載の組成物の使用。
［１０］表面を有する少なくとも１つの電極と、前記少なくとも１つの電極の表面に固定化された複数の酵素とを含む、サンプル流体中のクレアチニン及び／又はクレアチンを決定するためのセンサーであって、前記酵素のうちの少なくとも１種が［１］又は［２］に記載の変異ポリペプチドである、センサー。
［１１］ａ．クレアチナーゼ（ＥＣ  ３．５．３．３）及びサルコシンオキシダーゼ（ＥＣ  １．５．３．１）を含むクレアチンセンサー、
ｂ．クレアチナーゼ（ＥＣ  ３．５．３．３）、クレアチニナーゼ（ＥＣ  ３．５．２．１０）、及びサルコシンオキシダーゼ（ＥＣ  １．５．３．１）を含むクレアチニンセンサー、並びに
ｃ．前記クレアチンセンサー（ａ）及び前記クレアチニンセンサー（ｂ）の両方を備えるデュアルセンサーから選択される、［１０］に記載のクレアチニン及び／又はクレアチンを決定するためのセンサー。
［１２］サンプル流体中のクレアチニン及び／又はクレアチンを決定するためのセンサーを生成するための方法であって、電極の表面に、複数の酵素を含有する水性混合物を堆積するステップを含み、前記酵素のうちの少なくとも１種が、［１］又は［２］に記載の変異ポリペプチドである方法。
［１３］
対象由来の生理液のサンプル中のクレアチニン及び／又はクレアチンを決定するための方法であって、
ａ．センサー又はデュアルセンサーを前記サンプルと接触させるステップ、
ｂ．前記サンプル中のクレアチン及び／又はクレアチニンを検出するステップ、
及び
ｃ．前記センサーを、チオール相互作用剤を含む濯ぎ溶液と接触させるステップ、を含む濯ぎステップを含み、前記濯ぎステップ（ｃ）が、ステップ（ａ）の前、ステップ（ｂ）の後、又はステップ（ａ）の前及びステップ（ｂ）の後の両方の、いずれかにあり、前記方法が、２５℃よりも高い温度で行われ、
前記センサーが、表面を有する電極、前記電極の表面に固定化された複数の酵素を含み、前記酵素のうちの少なくとも１種が、［１］又は［２］に記載の変異ポリペプチドである方法。
［１４］前記センサーが、
ａ．クレアチナーゼ（ＥＣ  ３．５．３．３）及びサルコシンオキシダーゼ（ＥＣ  １．５．３．１）を含むクレアチンセンサー、
ｂ．クレアチナーゼ（ＥＣ  ３．５．３．３）、クレアチニナーゼ（ＥＣ  ３．５．２．１０）、及びサルコシンオキシダーゼ（ＥＣ  １．５．３．１）を含むクレアチニンセンサー、並びに
ｃ．前記クレアチンセンサー（ａ）及び前記クレアチニンセンサー（ｂ）の両方を備えるデュアルセンサーから選択される、［１３］に記載のクレアチニン及び／又はクレアチンを決定するための方法。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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