(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ロドコッカス・エリスロポリスＰＲ４株と、炭素数１３以上のアルカンと、培地とを混合し、前記ロドコッカス・エリスロポリスＰＲ４株が成育可能な条件で超音波処理を行い、前記ロドコッカス・エリスロポリスＰＲ４株が転移された前記アルカンの油滴が前記培地中に分散した有機溶媒処理用微生物製剤を得る工程を備える、有機溶媒処理用微生物製剤の製造方法。
【請求項２】
前記アルカンの炭素数が１３以上１９以下である、請求項１に記載の有機溶媒処理用微生物製剤の製造方法。
【請求項３】
前記油滴の平均粒径が１μｍ以上１００μｍ以下である、請求項１又は２に記載の有機溶媒処理用微生物製剤の製造方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の有機溶媒処理用微生物製剤の製造方法で得られた有機溶媒処理用微生物製剤を用いる、有機溶媒の処理方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有機溶媒処理用微生物製剤、有機溶媒処理用微生物製剤の製造方法及び有機溶媒の処理方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
有機溶媒分解菌であるロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌は、土壌や海洋などにありふれて存在するグラム陽性細菌、高Ｇ＋Ｃ含量のコリネ型細菌の一種である。ロドコッカス属細菌には、石油系炭化水素やポリ塩化ビフェニール類（ＰＣＢ）などをはじめとした数多くの難分解性化合物に対して分解及び資化能力をもつことに加え、アクリルアミドや有用酵素群、又は細胞外多糖をはじめとした機能性バイオポリマーなどの生産菌が多く存在することが知られている。
そのため、産業的に重要な菌群として位置づけられており、低エネルギー化や環境負荷を削減できるバイオプロセスによる環境浄化又は物質生産への応用などが期待されている。
【０００３】
特に、バイオプロセスを考える場合、応用が期待される微生物には、有機溶媒を含む特殊な環境下での良好な成育や活発な代謝活動などの性質が求められる。また、石油流出事故などによる石油汚染環境の浄化に必要な微生物にも、高濃度難揮発性化合物存在下でこれらの分解を行いながら良好な成育を示すために、これらに対する分解能だけでなく、共存する難揮発性化合物の毒性に対する耐性能が高いことが求められる。
これらの性質を解析するためには、まず、その切り口として微生物の有機溶媒耐性が必要であり、特にバイオプロセスにおいては、高濃度有機溶媒存在下での成育が求められる。
【０００４】
本発明者らは、ロドコッカス・ロドクラウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）Ｓ−２株が高濃度石油耐性石油分解菌であることを見出し（例えば、非特許文献１参照。）、その石油耐性に検討を加えた結果、同菌の生産する細胞外多糖（以下、「ＥＰＳ」という）が長鎖アルカンなどの難揮発性有機溶媒の耐性に深く関与していることを明らかにした。
さらに、ロドコッカス属細菌のコロニー形態と溶媒耐性について検討したところ、ＥＰＳ生産量の少ないラフ型菌は溶媒に親和性が高く結果的に溶媒感受性であり、一方で、ＥＰＳ生産量の多いムコイド型菌は耐性を示したことから、同属細菌においては、コロニー形態と有機溶媒耐性に高い相関があることを明らかにした。
また、ＥＰＳは溶媒に感受性のラフ型菌にも溶媒耐性を与えることが示されており、これらのことから、ムコイド型コロニーの形成が同属細菌の溶媒耐性を考える上での一つの指標であることが見出された。
【０００５】
ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）ＰＲ４株（以下、「ＰＲ４株」と称することがある。）は、分岐鎖状のアルカンの一種であるプリスタン（２，６，１０，１４−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ−ｐｅｎｔａｄｅｃａｎｅ）分解菌として単離された株であり（例えば、非特許文献２参照。）、培養の経過と共にＥＰＳの生産に基づいた自身のコロニー形態をラフ型→ムコイド型→ラフ型へと変化させる株である。また、同株は難揮発性有機溶媒に耐性を示すことが知られている。
【０００６】
一般に、有機溶媒を細菌で処理する場合、有機溶媒と培地成分を含む水性溶媒との二層培養系で行う。しかしながら、水性溶媒中に添加された細菌は、有機溶媒−水性溶媒界面でしか反応できないため、バイオプロセスによる環境浄化又は物質生産への応用には、菌体の親油性を改善し、菌体がアルカンに転移するようにしての処理効率を向上させる必要がある。
【０００７】
ＰＲ４株は培地／アルカンの二層培養系において、添加するアルカンの炭素数によって、アルカン粒子表面へ吸着する「吸着型」とアルカン粒子内へ転移する「転移型」の二つの異なる局在性を示す株であり（例えば、非特許文献３参照。）、バイオリメディエーションやバイオプロセスの宿主として期待されている。
【０００８】
本発明者らは、ＰＲ４株が前記炭素数１４以上のテトラデカン、ペンタデカン、ヘキサデカン、プリスタン、スクワラン等に転移して、これらのアルカンを代謝及び分解できることを明らかにした。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Iwabuchi, N. et al., “Relationships between Colony Morphotypes and Oil Tolerance in Rhodococcus rhodochrous”, Applied Environmental Microbiology, Vol. 66, No.11, p5073-5077, 2000.
【非特許文献２】Komukai-Nakamura, S. et al., “Construction of bacterial consortia which degrade Arabian light crude oil”, J. Ferment. Bioeng., Vol. 82, p 570-574, 1996.
【非特許文献３】Iwabuchi, N. et al., “Role of Interfacial Tensions in the Translocation of Rhodococcus erythropolis during Growth in a Two Phase Culture”, System Environmental Science & Technology, vol. 43, p8290-8294, 2009.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
ロドコッカス属細菌を利用して微生物製剤を開発するにあたり、１）前培養を伴わない分解酵素を誘導するための対策、２）分解酵素の発現を維持したままの細菌の保存、維持管理、移動の手軽さ等のための対策、３）製剤投与後の培地／アルカンの二層培養系全体への親和性を高めるための対策等、いくつかの課題が存在する。
【００１１】
通常、水／油混合系における乳化技術としては、界面活性剤や乳化安定剤を利用する化学的手法と、機械的エネルギーを利用する物理的手法との２つに分類することができる。前者の化学的手法では、界面活性剤等は難分解性の物質であり、河川や海に流出してしまうと残留し、環境汚染の原因となる虞がある。
【００１２】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、常温で保存可能であり、環境負荷が少ない乳化技術で作製された、高い有機溶媒分解能を有する新規有機溶媒処理用微生物製剤を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、有機溶媒分解菌を含む培地／アルカンの二層培養系を超音波処理によりミセル化することを見出し、本発明を完成させた。
【００１４】
すなわち、本発明は、以下の態様を含む。
［１］ロドコッカス・エリスロポリスＰＲ４株と、炭素数１３以上のアルカンと、培地とを混合し、前記ロドコッカス・エリスロポリスＰＲ４株が成育可能な条件で超音波処理を行い、前記ロドコッカス・エリスロポリスＰＲ４株が転移された前記アルカンの油滴が前記培地中に分散した有機溶媒処理用微生物製剤を得る工程を備える、有機溶媒処理用微生物製剤の製造方法。
［２］前記アルカンの炭素数が１３以上１９以下である、［１］に記載の有機溶媒処理用微生物製剤の製造方法。
［３］前記油滴の平均粒径が１μｍ以上１００μｍ以下である、［１］又は［２］に記載の有機溶媒処理用微生物製剤。
［４］［１］〜［３］のいずれか一つに記載の有機溶媒処理用微生物製剤の製造方法で得られた有機溶媒処理用微生物製剤を用いる、有機溶媒の処理方法。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、常温で保存可能であり、環境負荷が少ない乳化技術で作製された、高い有機溶媒分解能を有する有機溶媒処理用微生物製剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】実施例１における各種有機溶媒（Ｃ１２、Ｃ１５、Ｃ１６、Ｃ１９）を用いて製造した有機溶媒処理微生物用製剤を位相差顕微鏡により撮影した画像である。
【図２】実施例１における有機溶媒としてＣ１６又はＣ１９を用いて製造した有機溶媒処理微生物用製剤をＤＡＰＩ試薬及びＣＴＣ試薬を用いて二重染色して、位相差顕微鏡により撮影した画像である。
【図３】実施例１における有機溶媒としてＣ１６又はＣ１９を用いて製造した有機溶媒処理微生物用製剤での超音波処理直後の平均粒径及び平均転移数を、位相差顕微鏡を用いて目視により測定した結果を示すグラフである。
【図４】実施例１における有機溶媒としてＣ１６又はＣ１９を用いて製造した有機溶媒処理微生物用製剤での超音波処理後から１日目〜７日目の平均粒径及び平均転移数を、位相差顕微鏡を用いて目視により測定した結果を示すグラフである。
【図５】実施例２における有機溶媒としてＣ１９を、水性溶媒としてＭＭ培地を用いて製造した有機溶媒処理微生物用製剤を位相差顕微鏡により撮影した画像である。
【図６】実施例３における有機溶媒としてＣ１９を、水性溶媒としてＮＰ培地を用いて製造した有機溶媒処理微生物用製剤を位相差顕微鏡により撮影した画像である。
【図７】（Ａ）実施例４における有機溶媒としてＣ１６を、水性溶媒としてＭＭ培地を用いて製造した有機溶媒処理微生物用製剤と、有機溶媒としてＣ１６を、水性溶媒としてＭＭ培地を用いて製造したコントロールミセルとを位相差顕微鏡により撮影した画像である。（Ｂ）実施例４における有機溶媒としてＣ１６を、水性溶媒としてＭＭ培地を用いて製造した有機溶媒処理微生物用製剤と、有機溶媒としてＣ１６を、水性溶媒としてＭＭ培地を用いて製造したコントロールミセルとについて、レーザー回折式粒度分布測定装置により計測した粒径を示すグラフである。
【図８】試験例１における各分解条件（パターン１〜３）での処理後のｗｅａｔｈｅｒｅｄ−ｃｒｕｄｅ  ｏｉｌ（ｗ−ｏｉｌ）のＣ１６以外の各種残存成分を、パターン４をコントロールとしてＧＣ−ＭＳ解析（ＳＩＭ条件）した結果を示すグラフである。
【図９】試験例１における各分解条件（パターン１〜３）での処理後のｗｅａｔｈｅｒｅｄ−ｃｒｕｄｅ  ｏｉｌ（ｗ−ｏｉｌ）の残存成分（Ｃ１６）を、パターン４をコントロールとしてＧＣ−ＭＳ解析（ＳＩＭ条件）した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
＜＜有機溶媒処理用微生物製剤＞＞
一実施形態において、本発明は、有機溶媒によりミセル封入化された有機溶媒分解菌を含有する有機溶媒処理用微生物製剤を提供する。
【００１８】
本実施形態の有機溶媒処理用微生物製剤は、常温で保存可能であり、環境負荷が少ないものである。さらに、本実施形態の有機溶媒処理用微生物製剤は、高い有機溶媒分解能を有し、環境浄化又は物質生産へ利用することができる。
【００１９】
＜有機溶媒＞
本実施形態において、ミセル封入化に用いられる有機溶媒は、特別な限定はなく、例えば、常温及び常圧下で固体であるものであってもよく、常温及び常圧下で液体であるものであってもよい。常温及び常圧下で固体であるものを用いる場合、常温及び常圧下で液体である有機溶媒の存在により、前記常温及び常圧下で固体である有機溶媒を溶解し、液体とすることができればよい。中でも、ミセルの保存安定性の観点から、本実施形態においてミセル封入化に用いられる有機溶媒は、常温及び常圧下で液体であるものが好ましい。
【００２０】
本明細書において、「常温」とは、特に冷やしたり、熱したりしない温度、すなわち平常の温度を意味し、例えば、１５〜２５℃の温度等が挙げられる。
また、本明細書において、「常圧」とは、特別に減圧も加圧もしないときの圧力、すなわち大気圧に等しい圧力を意味し、例えば、１気圧（１ａｔｍ、１０１，３２５Ｐａ）程度等が挙げられる。
【００２１】
また、本実施形態において、ミセル封入化に用いられる有機溶媒は、炭素数１３以上のアルカンを含むことが好ましい。炭素数１２以下のアルカンでは、通常有機溶媒分解菌を有機溶媒中へ転移させることが難しい。よって、前記ミセル封入化に用いられる有機溶媒としては、炭素数１３以上のアルカン以外に炭素数１２以下の炭化水素又はその他の疎水性物質が含まれていてもよく、炭素数１３以上のアルカンで１００％占められていてもよい。炭素数１２以下のアルカンを含む場合は、有機溶媒の全量を基準として、炭素数１３以上のアルカンが２０％（ｖ／ｖ）以上含まれることが好ましく、４０％（ｖ／ｖ）以上含まれることがより好ましく、６０％（ｖ／ｖ）以上含まれることがさらに好ましい。
中でも、ミセル封入化に用いられる有機溶媒としては、炭素数１３以上のアルカンで１００％占められていることが好ましい。
【００２２】
よって、常温及び常圧下で液体であり、有機溶媒分解菌が有機溶媒中に転移可能である有機溶媒としては、例えば、炭素数１３以上１６以下の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルカン等が挙げられる。
【００２３】
前記炭素数１３以上１６以下の直鎖状のアルカンとしては、例えば、ｎ−トリデカン（Ｃ１３）、ｎ−テトラデカン（Ｃ１４）、ｎ−ペンタデカン（Ｃ１５）、ｎ−ヘキサデカン（Ｃ１６）等が挙げられる。
【００２４】
前記炭素数１３以上１６以下の分岐鎖状のアルカンとしては、例えば、２，２，７−トリメチルデカン（Ｃ１３）、２，６，８−トリメチルデカン（Ｃ１３）、２，４，６−トリメチルデカン（Ｃ１３）、３，５−ジメチルウンデカン（Ｃ１３）、４，７−ジメチルウンデカン（Ｃ１３）、２，５，５−トリメチルデカン（Ｃ１３）、５，７−ジメチルウンデカン（Ｃ１３）、２，８−ジメチルウンデカン（Ｃ１３）、４，８−ジメチルウンデカン（Ｃ１３）、２，３−ジメチルウンデカン（Ｃ１３）、２，２，９−トリメチルデカン（Ｃ１３）、５−メチル−５−プロピルノナン（Ｃ１３）、２，５，６−トリメチルデカン（Ｃ１３）、［Ｒ，（−）］  −３−メチルドデカン（Ｃ１３）、３，３，５−トリメチルデカン（Ｃ１３）、３，３−ジエチル−４，５，５−トリメチルオクタン（Ｃ１３）、４，４−ジプロピルヘプタン（Ｃ１３）、２，２，３，３−テトラメチルノナン（Ｃ１３）、２，４−ジメチル−３，３−ジイソプロピルペンタン（Ｃ１３）、２−メチルトリデカン（Ｃ１４）、７−メチルトリデカン（Ｃ１４）、３，８−ジエチルデカン（Ｃ１４）、（６Ｒ，７Ｓ）−６，７−ジメチルドデカン（Ｃ１４）、３，３，４，４−テトラエチルヘキサン（Ｃ１４）、２，２，３，３，４，４，５，５−オクタメチルヘキサン（Ｃ１４）、５−ブチルデカン（Ｃ１４）、２，５−ジメチル−３，４−ジイソプロピルヘキサン（Ｃ１４）、２，２，３，３，５，６，６−ヘプタメチルヘプタン（Ｃ１４）、３−ｔｅｒｔ−ブチル−２，２，５，５−テトラメチルヘキサン（Ｃ１４）、４−メチルテトラデカン（Ｃ１５）、２，７，１０−トリメチルドデカン（Ｃ１５）、７−メチルテトラデカン（Ｃ１５）、６−プロピルドデカン（Ｃ１５）、ファルネサン（Ｃ１５）、［Ｒ，（−）］−３−メチルテトラデカン（Ｃ１５）、２，６−ジメチル−３，５−ジイソプロピルヘプタン（Ｃ１５）、５−ブチルウンデカン（Ｃ１５）、５−ペンチルデカン（Ｃ１５）、（Ｒ）−５−エチル−５−プロピルウンデカン（Ｃ１６）、２，２，４，４，５，５，７，７−オクタメチルオクタン（Ｃ１６）、３，５，９−トリメチルトリデカン（Ｃ１６）、７−プロピルトリデカン（Ｃ１６）、５，８−ジエチルドデカン（Ｃ１６）、４−メチルペンタデカン（Ｃ１６）、３，３，６，６−テトラエチルオクタン（Ｃ１６）、２，４，６−トリメチルトリデカン（Ｃ１６）、３−メチルペンタデカン（Ｃ１６）、６−ペンチルウンデカン（Ｃ１６）、４，６−ジエチルドデカン（Ｃ１６）、２，２，４，４，６，６，７−ヘプタメチルノナン（Ｃ１６）、２，２，４，４，６，８，８−ヘプタメチルノナン（Ｃ１６）等が挙げられ、これらに限定されない。
【００２５】
前記炭素数１３以上１６以下の環状のアルカンとしては、例えば、シクロトリデカン（Ｃ１３）、シクロテトラデカン（Ｃ１４）、１，１，３，５−テトラメチルシクロヘキサン（Ｃ１４）、３−シクロヘキシル−４−メチルヘプタン（Ｃ１４）、シクロペンタデカン（Ｃ１５）、シクロヘキサデカン（Ｃ１６）等が挙げられ、これらに限定されない。
【００２６】
これらの前記直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルカンは１種又は２種以上を混合して用いてもよい。さらに、これら直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルカンの１個以上の水素原子が、ハロゲン原子又は水酸基で置換されていてもよい。ここで、水素原子を置換するハロゲン原子としては、例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等が挙げられる。
ミセル封入化に用いられる有機溶媒が炭素数１３以上１６以下の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルカンであることにより、有機溶媒分解菌は、前記有機溶媒中に転移することができる。さらに、有機溶媒分解菌は、ミセル封入化に用いられた有機溶媒自体についても分解及び代謝することができるため、ミセル封入化に用いられた有機溶媒が残らず、環境負荷を低減することができる。
【００２７】
＜有機溶媒分解菌＞
本明細書において、「有機溶媒分解菌」とは、有機溶媒を分解することができ、有機溶媒中で成育可能であって、有機溶媒の表面に吸着するのではなく、転移した状態、すなわち有機溶媒中に潜り込んだ状態で存在する菌を意味する。有機溶媒分解菌としては、特別な限定はなく、例えば、ロドコッカス属に属する細菌等が挙げられる。
ロドコッカス属に属する細菌として、より具体的には、例えば、ロドコッカス・アウストラリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｓｔｒａｌｉｓ）ＡＴＣＣ３５２１５株、ロドコッカス・コプロフィラス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｏｐｒｏｐｈｉｌｕｓ）ＡＴＣＣ２９０８０株、ロドコッカス・コプロフィラスＪＣＭ３２００株、ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）ＡＴＣＣ２７８５４株、ロドコッカス・エリスロポリスＡＴＣＣ４７０７２株、ロドコッカス・エリスロポリスＤＳＭ１０６９株、ロドコッカス・エリスロポリスＪＣＭ３２０１株、ロドコッカス・エリスロポリスＰＲ４株（以下、「ＰＲ４株」と称することがある。）、ロドコッカス・グロベルラス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｌｏｂｅｒｕｌｕｓ）ＡＴＣＣ１４３４６株、ロドコッカス・グロベルラスＡＴＣＣ１５０７６株、ロドコッカス・グロベルラスＡＴＣＣ２１２９２株、ロドコッカス・グロベルラスＡＴＣＣ２５６６９株、ロドコッカス・グロベルラスＡＴＣＣ２５６８８株、ロドコッカス・グロベルラスＡＴＣＣ３１１０株、ロドコッカス・グロベルラスＡＴＣＣ１４８９８株、ロドコッカス・ジョスティ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｊｏｓｔｉｉ）ＲＨＡ１株、ロドコッカス・オパカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｐａｃｕｓ）ＡＴＣＣ１７０３９１株、ロドコッカス・オパカスＡＴＣＣ５１８８１株、ロドコッカス・オパカスＡＴＣＣ５１８８２株、ロドコッカス・オパカスＪＣＭ９７０３株、ロドコッカス・ペルコラタス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｅｒｃｏｌａｔｕｓ）ＪＣＭ１００８７株、ロドコッカス・ロドニ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｎｉｉ）ＡＴＣＣ３５０７１株、ロドコッカス・ロドクラウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）ＡＴＣＣ２７１株、ロドコッカス・ロドクラウスＡＴＣＣ９９９株、ロドコッカス・ロドクラウスＡＴＣＣ４００１株、ロドコッカス・ロドクラウスＡＴＣＣ１３８０８株、ロドコッカス・ロドクラウスＡＴＣＣ１４３４８株、ロドコッカス・ロドクラウスＡＴＣＣ１４３４９株、ロドコッカス・ロドクラウスＡＴＣＣ１５９０５株、ロドコッカス・ロドクラウスＡＴＣＣ１５９０６株、ロドコッカス・ロドクラウスＡＴＣＣ１８４株、ロドコッカス・ロドクラウスＡＴＣＣ１７０４１株、ロドコッカス・ロドクラウスＡＴＣＣ１９１５０株、ロドコッカス・ロドクラウスＡＴＣＣ１２６７４株、ロドコッカス・ロドクラウスＪＣＭ２１５６株、ロドコッカス・ロドクラウスＪＣＭ２１５７株、ロドコッカス・ロドクラウスＲ−１株、ロドコッカス・ロドクラウスＲ−２株、ロドコッカス・ロドクラウスＳ−１株、ロドコッカス・ロドクラウスＳ−２株、ロドコッカス・ルーバー（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｕｂｅｒ）ＩＦＯ１５５９１株、ロドコッカス  スピーシーズＰＧ７−２株、ロドコッカス  スピーシーズＪＣＭ３３７６株、ロドコッカス  スピーシーズＪＣＭ３３９１株、ロドコッカス・ゾフィ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｚｏｐｆｉｉ）ＡＴＣＣ５１３４９株、ロドコッカス・ゾフィＪＣＭ９９１９株等が挙げられ、これらに限定されない。
中でも、本実施形態において用いられる有機溶媒分解菌としては、ロドコッカス・エリスロポリス属に属する細菌であることが好ましく、ＰＲ４株であることがより好ましい。
本実施形態における有機溶媒分解菌は、天然に由来する菌株であってもよく、有機溶媒を分解及び代謝する性質を維持又は向上させた形質転換体であってもよい。
【００２８】
＜ミセル＞
本実施形態の有機溶媒処理用微生物製剤において、有機溶媒がミセルとして分散しており、前記ミセル内に有機溶媒分解菌が封入されている。
前記ミセルの平均粒径としては、１μｍ以上１００μｍ以下であることが好ましく、１μｍ以上５０μｍ以下であることがより好ましく、５μｍ以上３０μｍ以下であることがさらに好ましい。ミセルの平均粒径は上記範囲であることにより、少なくとも１つの有機溶媒分解菌を内包することができ、ミセルとして安定して分散させることができる。
【００２９】
また、ミセル内に封入される有機溶媒分解菌の菌体数としては、少なくとも１以上であることが好ましく、１以上１０以下であることがより好ましく、２以上８以下であることがさらに好ましく、３以上６以下であることが特に好ましく、４以上５以下であることが最も好ましい。ミセル内に封入される有機溶媒分解菌の菌体数が上記範囲であることのより、有機溶媒分解菌を封入した状態でミセルを安定して分散させることができ、さらに効率的に有機溶媒を分解することができる。
【００３０】
＜水性溶媒＞
本実施形態の有機溶媒処理用微生物製剤に用いられる水性溶媒としては、特別な限定なく、有機溶媒分解菌を培養することができる培地であればよい。前記培地としては、一般的に細菌を培養するために用いられる培地であればよく、例えば、ＩＢ２液体培地、ＹＧ液体培地、ＬＢ培地、マリンブロス、ニュートリエントブロス、トリプトソイブロス、ＭＭ培地、ＮＰ培地等が挙げられる。中でも、培地としては、ＩＢ２液体培地、ＭＭ培地又はＮＰ培地を用いることが好ましい。
【００３１】
培地としてＩＢ２液体培地を用いる場合、有機溶媒分解菌が水性溶媒、又はミセル封入化に用いられた有機溶媒から、処理対象である有機溶媒に移行するために、ＩＢ２液体培地中に酵母エキスを含むことが好ましい。ＩＢ２液体培地中に酵母エキスを含むことで、有機溶媒分解菌が水性溶媒、又はミセル封入化に用いられた有機溶媒から、処理対象である有機溶媒へスムーズに移行することができる。
前記水性溶媒中の前記酵母エキスの添加量は、水性溶媒の全量を基準（１００％）としたときに、０．０５％（ｗ／ｗ）以上であることが好ましく、０．５％（ｗ／ｗ）以上５％（ｗ／ｗ）以下であることがより好ましく、１％（ｗ／ｗ）程度であることがさらに好ましい。
【００３２】
本明細書において、「有機溶媒中へ移行する」とは、水性溶媒中に存在していた有機溶媒分解菌が、水性溶媒、又はミセル封入化に用いられた有機溶媒から、処理対象である有機溶媒に吸着又は転移することを意味する。
【００３３】
本実施形態の有機溶媒処理用微生物製剤において、通常有機溶媒分解菌は炭素数１２以下のアルカンに転移することが難しいが、水性溶媒に添加される無機塩の濃度を制限することにより、有機溶媒分解菌を炭素数１２以下のアルカンに転移させることができる。
前記無機塩の水性溶媒中の濃度は８８．５ｎＭ以下であることが好ましく、８．９ｎＭ以下であることがより好ましく、０．９ｎＭ以下であることがさらに好ましい。前記無機塩としては、例えば、マグネシウム塩が挙げられ、より具体的には、例えば、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、硝酸マグネシウムが挙げられる。
【００３４】
本実施形態の有機溶媒処理用微生物製剤の製造方法については、後述の＜＜有機溶媒処理用微生物製剤の製造方法＞＞において、示す。
【００３５】
本実施形態の有機溶媒処理用微生物製剤の保存条件については、有機溶媒分解菌が死滅しない温度であって、ミセル封入化に使用する有機溶媒又は水性溶媒が固化する温度よりも高い温度で保存すればよく、例えば、常温で保存してもよく、例えば、常温より高い温度又は常温未満の温度で保存してもよく、例えば、冷蔵（４℃以下）又は冷凍（−２０℃以下）等で保存してもよい。中でも、ミセルの安定性の観点から、常温で保存することが好ましい。
【００３６】
＜＜有機溶媒の処理方法＞＞
一実施形態において、本発明は、上述の有機溶媒処理用微生物製剤を用いた有機溶媒の処理方法を提供する。
【００３７】
本実施形態の処理方法によれば、簡便且つ効率的に有機溶媒を処理することができる。
【００３８】
本明細書において、「有機溶媒の処理」とは、有機溶媒分解菌が分解及び代謝可能な有機溶媒を、上述の有機溶媒処理用微生物製剤中に添加することを意味する。
【００３９】
＜処理対象となる有機溶媒＞
本実施形態において、上述の有機溶媒処理用微生物製剤を用いて処理対象となる有機溶媒としては、特別な限定はなく、有機溶媒分解菌が分解及び代謝可能なものであればよい。前記処理対象となる有機溶媒としては、例えば、炭素数６以上の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルカン等が挙げられる。有機溶媒分解菌が形質転換されたものである場合、炭素数６以上１２以下の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルカンでも成育可能であり、且つ、これら低炭素数のアルカンに少なくとも吸着することができるため、前記低炭素数のアルカンを代謝及び分解することができる。
さらに、アルカンの炭素数の上限は制限されない、例えば、常温及び常圧下で固体であるものであっても、常温及び常圧下で液体であるアルカンの存在により、前記常温及び常圧下で固体であるアルカンを溶解し、液体とすることができればよい。
また、前記炭素数６以上の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルカンを１種又は２種以上含んでいてもよい。
【００４０】
前記炭素数６以上の直鎖状のアルカンとしては、例えば、ｎ−ヘキサン、ｎ−ヘプタン、ｎ−オクタン、ｎ−ノナン、ｎ−デカン、ｎ−ウンデカン、ｎ−ドデカン、ｎ−トリデカン、ｎ−テトラデカン（Ｃ１４）、ｎ−ペンタデカン（Ｃ１５）、ｎ−ヘキサデカン（Ｃ１６）、ｎ−ヘプタデカン（Ｃ１７）、ｎ−オクタデカン（Ｃ１８）、ｎ−ノナデカン（Ｃ１９）、ｎ−イコサン（Ｃ２０）、ｎ−ペンタコサン（Ｃ２５）、ｎ−トリアコンタン（Ｃ３０）等が挙げられ、これらに限定されない。
【００４１】
前記炭素数６以上の分岐鎖状のアルカンとしては、例えば、以下のようなもの等が挙げられ、これらに限定されない。
炭素数６：２−メチルペンタン、２，３−ジメチルブタン、３−メチルペンタン、３−メチルペンタン、ジメチルブタン、２，２‐ジメチルブタン
炭素数７：３−メチルヘキサン、３，３−ジメチルペンタン、２，２，３−トリメチルブタン、２，３−ジメチルペンタン、３−エチルペンタン、２−メチルヘキサン、２，２−ジメチルペンタン、２，４−ジメチルペンタン
炭素数８：（３Ｒ，４Ｓ）−３，４−ジメチルヘキサン、２，２，３，３−テトラメチルブタン、（Ｓ）−３−メチルヘプタン、３，４−ジメチルヘキサン、３−メチルヘプタン、３−エチルヘキサン、３−メチル−３−エチルペンタン、２−メチル−３−エチルペンタン、２，３，３−トリメチルペンタン、イソオクタン、２−メチルヘプタン、４−メチルヘプタン、２，３，４−トリメチルペンタン、２，２，３−トリメチルペンタン、２，４−ジメチルヘキサン、２，３−ジメチルヘキサン
炭素数９：２，２，４，４−テトラメチルペンタン、３−エチルヘプタン、３，３，４−トリメチルヘキサン、２，２−ジメチルヘプタン、２，４−ジメチルヘプタン、３−エチル−２，３−ジメチルペンタン、２，３，４−トリメチルヘキサン、２，２，３，４−テトラメチルペンタン、４−エチルヘプタン、３，５−ジメチルヘプタン
炭素数１０：２，４−ジメチル−３−イソプロピルペンタン、２，３，５−トリメチルヘプタン、２,２−ジメチルオクタン、２，２，４，５−テトラメチルヘキサン、５−エチル−２−メチルヘプタン、２−メチル−３，３−ジエチルペンタン、２，３，３，５−テトラメチルヘキサン、２，２，５−トリメチルヘプタン、４−メチルノナン、２，４，５−トリメチルヘプタン、２，４，６−トリメチルヘプタン、３，４−ジエチルヘキサン
炭素数１１：４−イソプロピルオクタン、３，６−ジメチルノナン、２，２，６，６−テトラメチルヘプタン、３，４−ジエチルヘプタン、２，６−ジメチルノナン、２，３，７−トリメチルオクタン、２，４，６−トリメチルオクタン、３，３，５，５−テトラメチルヘプタン、４−エチル−４−メチルオクタン、３，５−ジエチルヘプタン、２，３，６−トリメチルオクタン、２，２，６−トリメチルオクタン、２−メチルデカン、２，２，３，３，４，４−ヘキサメチルペンタン、３，３−ジエチルヘプタン、２，５，６−トリメチルオクタン
炭素数１２：３，７−ジメチルデカン、５，６−ジメチルデカン、５−メチルウンデカン、２，２，４，６，６−ペンタメチルヘプタン、４−エチルデカン、２，３，５−トリメチルノナン、２，９−ジメチルデカン、５−プロピルノナン、２−メチルウンデカン、３，４−ジメチルデカン、２，２，７，７−テトラメチルオクタン、２，４，５，７−テトラメチルオクタン、２，２−ジメチルデカン、２，２，４，４，６−ペンタメチルヘプタン、２，２−ジブチルブタン
炭素数１３：２，２，７−トリメチルデカン、２，６，８−トリメチルデカン、２，４，６−トリメチルデカン、３，５−ジメチルウンデカン、４，７−ジメチルウンデカン、２，５，５−トリメチルデカン、５，７−ジメチルウンデカン、２，８−ジメチルウンデカン、４，８−ジメチルウンデカン、２，３−ジメチルウンデカン、２，２，９−トリメチルデカン、５−メチル−５−プロピルノナン、２，５，６−トリメチルデカン、［Ｒ，（−）］  −３−メチルドデカン、３，３，５−トリメチルデカン、３，３−ジエチル−４，５，５−トリメチルオクタン、４，４−ジプロピルヘプタン、２，２，３，３−テトラメチルノナン、２，４−ジメチル−３，３−ジイソプロピルペンタン
炭素数１４：２−メチルトリデカン、７−メチルトリデカン、３，８−ジエチルデカン、（６Ｒ，７Ｓ）−６，７−ジメチルドデカン、３，３，４，４−テトラエチルヘキサン、２，２，３，３，４，４，５，５−オクタメチルヘキサン、５−ブチルデカン、２，５−ジメチル−３，４−ジイソプロピルヘキサン、２，２，３，３，５，６，６−ヘプタメチルヘプタン、３−ｔｅｒｔ−ブチル−２，２，５，５−テトラメチルヘキサン
炭素数１５：４−メチルテトラデカン、２，７，１０−トリメチルドデカン、７−メチルテトラデカン、６−プロピルドデカン、ファルネサン、［Ｒ，（−）］−３−メチルテトラデカン、２，６−ジメチル−３，５−ジイソプロピルヘプタン、５−ブチルウンデカン、５−ペンチルデカン
炭素数１６：（Ｒ）−５−エチル−５−プロピルウンデカン、２，２，４，４，５，５，７，７−オクタメチルオクタン、３，５，９−トリメチルトリデカン、７−プロピルトリデカン、５，８−ジエチルドデカン、４−メチルペンタデカン、３，３，６，６−テトラエチルオクタン、２，４，６−トリメチルトリデカン、３−メチルペンタデカン、６−ペンチルウンデカン、４，６−ジエチルドデカン、２，２，４，４，６，６，７−ヘプタメチルノナン、２，２，４，４，６，８，８−ヘプタメチルノナン
炭素数１７：４，６，８，１０−テトラメチルトリデカン、５，９−ジメチルペンタデカン、２，５−ジメチルペンタデカン、（Ｓ）−３−メチルヘキサデカン、５,５−ジブチルノナン、４，４−ジプロピルウンデカン、６−ペンチルドデカン、２，６，１０−トリメチルテトラデカン、２，２，４，４−テトラメチル−３，３−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルペンタン、２−メチルヘキサデカン
炭素数１８：２−メチルヘプタデカン、３−メチルヘプタデカン、２，３，４，５，６，７，８，９−オクタメチルデカン、７，９−ジメチルヘキサデカン、４，９−ジプロピルドデカン、２，２，５，５−テトラメチル−３，４−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルヘキサン、４−メチルヘプタデカン、８−メチルヘプタデカン、２，２，４，９，１１，１１−ヘキサメチルドデカン、７−メチルヘプタデカン、４，５，６，７−テトラエチルデカン、７−ブチルテトラデカン
炭素数１９：プリスタン、２，６−ジメチルヘプタデカン、３−メチルオクタデカン、３，３−ジメチルヘプタデカン、（７Ｒ，１１Ｓ）−７，１１−ジメチルヘプタデカン、５，９−ジメチルヘプタデカン、５−メチルオクタデカン、２，６，１０，１３−テトラメチルペンタデカン、７−ヘキシルトリデカン、５，５，７，７−テトラエチルウンデカン、２−メチルオクタデカン
炭素数２０：フィタン、２−メチルノナデカン、３−メチルノナデカン、８−ｔｅｒｔ−ブチルヘキサデカン、４−メチルノナデカン、７，１１−ジメチルオクタデカン、２，６−ジメチルオクタデカン、９−メチルノナデカン、４−プロピルヘプタデカン、３−メチル−３−エチルヘプタデカン、２，６，１１，１５−テトラメチルヘキサデカン、５−ブチルヘキサデカン
炭素数２５：９−オクチルヘプタデカン、１０−ヘキシルノナデカン、２，６，１０，１５，１９−ペンタメチルイコサン、２，６，１０，１４，１９−ペンタメチルイコサン、７，７−ジヘキシルトリデカン、９−（２−エチルヘキシル）ヘプタデカン、ハシアン、２−メチルテトラコサン、２，２，８，８−テトラメチル−５，５―ビス（３，３−ジメチルブチル）ノナン、２，６，１０，１４，１８−ペンタメチルイコサン
炭素数３０：スクワラン、２，１０−ジメチルオクタコサン、７−メチルノナコサン、１１−ノニルヘニコサン、（Ｒ）−３−メチルノナコサン、８，１２−ジメチルオクタコサン、３−メチルノナコサン、９−オクチルドコサン、７，１２−ジヘキシルオクタデカン、リザン、２，６−ジメチルオクタコサン
【００４２】
前記炭素数６以上の環状のアルカンとしては、例えば、シクロヘキサン（Ｃ６）、シクロヘプタン（Ｃ７）、シクロオクタン（Ｃ８）、シクロノナン（Ｃ９）、シクロデカン（Ｃ１０）、１，１，３，３−テトラメチルシクロヘキサン（Ｃ１０）、１−メチル−２，４−ジエチルシクロペンタン（Ｃ１０）、１，５−ジメチルシクロオクタン（Ｃ１０）、シクロウンデガン（Ｃ１１）、シクロドデカン（Ｃ１２）、１−エチル−２−ペンチルシクロペンタン（Ｃ１２）、１−メチルシクロウンデカン（Ｃ１２）、ブチルシクロオクタン（Ｃ１２）、シクロトリデカン（Ｃ１３）、シクロテトラデカン（Ｃ１４）、１，１，３，５−テトラメチルシクロヘキサン（Ｃ１４）、１，２，４，５−テトラエチルシクロヘキサン（Ｃ１４）、３−シクロヘキシル−４−メチルヘプタン（Ｃ１４）、１，１，２−トリメチルシクロウンデカン（Ｃ１４）、イソプロピルシクロウンデカン（Ｃ１４）、シクロペンタデカン（Ｃ１５）、シクロヘキサデカン（Ｃ１６）、（１−プロピルヘプチル）シクロヘキサン（Ｃ１６）、１−ブチルシクロドデカン（Ｃ１６）、メチルシクロペンタデカン（Ｃ１６）、シクロヘプタデカン（Ｃ１７）、シクロオクタデカン（Ｃ１８）、（１−ペンチルヘプチル）シクロヘキサン（Ｃ１８）、ドデカメチルシクロヘキサン（Ｃ１８）、シクロノナデカン（Ｃ１９）、セムブラン（Ｃ２０）、シクロイコサン（Ｃ２０）、テトラデシルシクロヘキサン（Ｃ２０）、シクロペンタコサン（Ｃ２５）、（１−ノニルデシル）シクロヘキサン（Ｃ２５）、９−（３−シクロペンチルプロピル）ヘプタデカン（Ｃ２５）、シクロトリアコンタン（Ｃ３０）、イコサメチルシクロデカン（Ｃ３０）、ペンタコシルシクロペンタン（Ｃ３０）等が挙げられ、これらに限定されない。
【００４３】
＜使用用途＞
本実施形態の処理方法は、有機溶媒を含む汚染環境処理のために使用することができる。汚染環境処理としては、例えば、生活排水の処理、又は工業用水の処理等が挙げられる。
また、本実施形態の処理方法は、物質の生産のために使用することができる。物質の生産としては、例えば、分子量の大きい直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルカンを基質として、分子量の小さい直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルカンを生産すること等が挙げられる。
【００４４】
本実施形態の処理方法において、使用される上述の有機溶媒処理用微生物製剤は、界面活性剤等の乳化剤を含まず、有機溶媒処理用微生物製剤自体に含まれる有機溶媒も有機溶媒分解菌によって分解及び代謝可能なものであるため、環境負荷を低減することができる。
【００４５】
本実施形態の処理方法において、使用される上述の有機溶媒処理用微生物製剤は、有機溶媒の分解速度の傾きが大きく、初速が急激に上昇するものである。すなわち、使用される上述の有機溶媒処理用微生物製剤は、有機溶媒の分解能が高く、分解速度が速い。よって、例えば、汚水の浄化に適用する場合、通常、浄化槽等に含まれる汚水は２〜３日程度で入れ替わるが、本実施形態の処理方法によれば、浄化開始時から、上述の有機溶媒処理用微生物製剤は有機溶媒に対して高い親和性を有し、分解速度が速いため、限られた期間の中で、効率よく対象となる有機溶媒を分解及び代謝し、汚水を浄化することができる。
【００４６】
＜＜有機溶媒処理用微生物製剤の製造方法＞＞
一実施形態において、本発明は、有機溶媒分解菌と、有機溶媒と、培地とを混合し、前記有機溶媒分解菌が成育可能な条件で超音波処理を行い、前記有機溶媒によりミセル封入化された前記有機溶媒分解菌を得るミセル封入化工程を備える有機溶媒処理用微生物製剤の製造方法を提供する。
【００４７】
本実施形態の製造方法によれば、常温で保存可能であり、環境負荷が少なく、高い有機溶媒分解能を有する有機溶媒処理用微生物製剤を簡便に得ることができる。
【００４８】
＜ミセル封入化工程＞
まず、有機溶媒分解菌と、有機溶媒と、培地とを混合し、前記有機溶媒分解菌が成育可能な条件で超音波処理を行う。
【００４９】
本実施形態において使用する有機溶媒分解菌としては、上述の＜＜有機溶媒処理用微生物製剤＞＞において例示されたものと同様のものが挙げられる。中でも、本実施形態において使用する有機溶媒分解菌としては、ロドコッカス・エリスロポリス属に属する細菌であることが好ましく、ＰＲ４株であることがより好ましい。
本実施形態における有機溶媒分解菌は、天然に由来する菌株であってもよく、有機溶媒を分解及び代謝する性質を維持又は向上させた形質転換体であってもよい。
【００５０】
本実施形態において有機溶媒としては、常温及び常圧下で液体であり、有機溶媒分解菌が有機溶媒中に転移可能である有機溶媒であることが好ましく、例えば、炭素数１３以上１６以下の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルカン等が挙げられる。炭素数１３以上１６以下の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルカンとしては、上述の＜＜有機溶媒処理用微生物製剤＞＞において例示されたものと同様のものが挙げられる。
【００５１】
本実施形態において使用する培地としては、上述の＜＜有機溶媒処理用微生物製剤＞＞において例示されたものと同様のものが挙げられる。中でも、本実施形態において使用する培地としては、ＩＢ２液体培地、ＭＭ培地又はＮＰ培地であることが好ましい。
【００５２】
本実施形態において有機溶媒と培地との混合割合としては、例えば１：１〜１：２０程度であればよい。有機溶媒が培地よりも少ない量混合することにより、容易に有機溶媒分解菌をミセル封入化することができる。
また、有機溶媒分解菌の混合溶液中の濃度は、有機溶媒分解菌の種類、作製するミセル１個当たりに封入させたい菌体数、超音波処理の条件等に応じて、適宜調整することができる。例えば、有機溶媒１ｍＬ及び培地１０ｍＬに対し、有機溶媒分解菌が１．０×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように混合すればよい。
【００５３】
本明細書において、「成育可能な条件」とは、超音波処理によって、前記有機溶媒分解菌が死滅しない、又は菌体が損傷せず、成育が妨げられない条件であることを意味する。「成育可能な条件」での超音波処理としては、例えば、４Ｌの水を含む超音波洗浄機（アズワンＵＳＤ−４Ｒ）を用いて、有機溶媒分解菌１．０×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬと、有機溶媒１ｍＬと、培地１０ｍＬとの混合溶液１１ｍＬを含む試験管等の容器に対し、常温及び常圧下において、４０ｋＨｚで１５分間処理する条件等が挙げられる。このとき、容器中の混合溶液の液面が、超音波洗浄機の水面よりも１．５ｃｍ〜２．０ｃｍ程度下であることが好ましい。
超音波処理は、有機溶媒分解菌と、有機溶媒と、培地との混合溶液に直接的に行ってもよく、有機溶媒分解菌と、有機溶媒と、培地との混合溶液を含む容器を介して間接的に行ってもよい。中でも、有機溶媒分解菌が死滅しない、又は菌体が損傷せず、成育が妨げられない条件であることから、有機溶媒分解菌と、有機溶媒と、培地との混合溶液を含む容器を介して間接的に行うことが好ましい。
使用する超音波発生装置としては、特別な限定なく、例えば、振動子が平板（振動板）に装着されている定在波型（洗浄器型）超音波発生装置、振動子の先端に円筒状のホーンが装着されているホーン型（ホモジナイザー型）超音波発生装置等が挙げられる。中でも、有機溶媒分解菌が死滅しない、又は菌体が損傷せず、成育が妨げられない条件であることから、定在波型（洗浄器型）超音波発生装置を用いることが好ましい。
【００５４】
作製された有機溶媒処理用微生物製剤について、ミセル内に封入された有機溶媒分解菌の菌体数は、例えば、位相差顕微鏡等を用いる方法により確認することができる。また、ミセルの平均粒径は、例えば、位相差顕微鏡等を用いて目視で計測する方法、又はレーザー回折式粒度分布測定装置等を用いて計測する方法等で確認することができる。
【００５５】
作製された有機溶媒処理用微生物製剤の保存条件については、有機溶媒分解菌が死滅しない温度であって、ミセル封入化に使用する有機溶媒又は水性溶媒が固化する温度よりも高い温度で保存すればよく、例えば、常温で保存してもよく、例えば、常温より高い温度又は常温未満の温度で保存してもよく、例えば、冷蔵（４℃以下）又は冷凍（−２０℃以下）等で保存してもよい。また、冷蔵（４℃以下）又は冷凍（−２０℃以下）等で保存した場合に、有機溶媒が固化することによりミセルが壊れて、有機溶媒相及び培地相に分離しても、再度上述の＜ミセル封入化工程＞を行うことにより、有機溶媒分解菌をミセル封入化することができる。
中でも、再度の超音波処理を必要とせず、ミセルを安定して保存できることから、常温で保存することが好ましい。
【実施例】
【００５６】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００５７】
［材料］
１．使用菌株
以下の実施例において、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ  ＰＲ４株（以下、「ＰＲ４株」と称することがある。）を用いた。
【００５８】
２．使用培地
以下の実施例において、使用した培地の作製方法は以下のとおりである。
２−１．ＩＢ２寒天培地
ミリＱ水８００ｍＬに８ｇのグルコース（和光純薬工業社製）、８ｇのｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ（Ｂｅｃｔｏｎ，  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  ｃｏｍｐａｎｙ社製)、０．１６ｇのＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ（和光純薬工業社製）、０．０８ｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ（和光純薬工業社製）、０．０８ｇのＮａＣｌ（和光純薬工業社製）、０．０１６ｇのＦｅＣｌ２・６Ｈ２Ｏ（和光純薬工業社製）、０．４ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４（和光純薬工業社製）を加えた。続いて、ｐＨ７．２に調整後、さらに１２ｇのアガー（和光純薬工業社製）を加えた。続いて、１２１℃で１５分間オートクレーブし、冷却した。
【００５９】
２−２．ＩＢ２液体培地
ミリＱ水５００ｍＬに５ｇのグルコース（和光純薬工業社製）、５ｇのｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ（Ｂｅｃｔｏｎ，  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  ｃｏｍｐａｎｙ社製)、０．０９ｇのＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ（和光純薬工業社製）、０．０５ｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ（和光純薬工業社製）、０．０５ｇのＮａＣｌ（和光純薬工業社製）、０．０１ｇのＦｅＣｌ２・６Ｈ２Ｏ（和光純薬工業社製）、０．２５ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４（和光純薬工業社製）を加えた。続いて、ｐＨ７．２に調整後、１２１℃で１５分間オートクレーブし、冷却した。
【００６０】
２−３．ＭＭ培地
ミリＱ水５００ｍＬに０．０９ｇのＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ（和光純薬工業社製）、０．０５ｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ（和光純薬工業社製）、０．０５ｇのＮａＣｌ（和光純薬工業社製）、０．０１ｇのＦｅＣｌ２・４Ｈ２Ｏ（和光純薬工業社製）、０．２５ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４（和光純薬工業社製）、０．２５ｇのＫ２ＨＰＯ４（和光純薬工業社製）を加えた。続いて、１２１℃で１５分間オートクレーブし、冷却した。
【００６１】
２−４．ＮＰ培地
ミリＱ水５００ｍＬに０．２５ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４（和光純薬工業社製）、０．２５ｇのＫ２ＨＰＯ４（和光純薬工業社製）を加えた。続いて、１２１℃で１５分間オートクレーブし、冷却した。
【００６２】
３．使用試薬
ＰＲ４株の生死を確認するために、ＤＡＰＩ（４’，６−Ｄｉａｍｉｄｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｏｄｏｌｅ，ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）試薬（和光純薬工業社製）及びＣＴＣ（５−Ｃｙａｎｏ−２，３−ｄｉｔｏｌｙｌ−２Ｈ−ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）試薬（同仁堂社製）を用いた。
【００６３】
また、以下の実施例において使用した有機溶媒は、下記の通りである。
ｎ−ドデカン（以下、「Ｃ１２」と称することがある。）（和光純薬工業社製）
ｎ−テトラデカン（以下、「Ｃ１４」と称することがある。）（和光純薬工業社製）
ｎ−ペンタデカン（以下、「Ｃ１５」と称することがある。）（和光純薬工業社製）
ｎ−ヘキサデカン（以下、「Ｃ１６」と称することがある。）（和光純薬工業社製）
プリスタン（以下、「Ｃ１９」と称することがある。）（ＡＣＲＯＳＳ社製）
【００６４】
また、培地に添加した各種無機塩類は、以下のように調製した。
３−１．ＭｇＣｌ２溶液
ミリＱ水に１８．４ｇのＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ（和光純薬工業社製）を加え、１００ｍＬまでメスアップした。続いて、１２１℃で１５分間オートクレーブし、冷却した。
【００６５】
３−２．ＣａＣｌ２溶液
ミリＱ水に１０ｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ（和光純薬工業社製）を加え、１００ｍＬまでメスアップした。続いて、１２１℃で１５分間オートクレーブし、冷却した。
【００６６】
３−３．ＮａＣｌ溶液
ミリＱ水に１０ｇのＮａＣｌ（和光純薬工業社製）を加え、１００ｍＬまでメスアップした。続いて、１２１℃で１５分間オートクレーブし、冷却した。
【００６７】
３−４．ＦｅＣｌ２溶液
ミリＱ水に１．７ｇのＦｅＣｌ２・４Ｈ２Ｏ（和光純薬工業社製）を加え、１００ｍＬまでメスアップした。続いて、１２１℃で１５分間オートクレーブし、冷却した。
【００６８】
３−５．（ＮＨ４）２ＳＯ４溶液
ミリＱ水に５０ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４（和光純薬工業社製）を加え、１００ｍＬまでメスアップした。続いて、１２１℃で１５分間オートクレーブし、冷却した。
【００６９】
［実施例１］各種有機溶媒（Ｃ１２、Ｃ１５、Ｃ１６、Ｃ１９）を用いた有機溶媒処理微生物用製剤の製造
（１）ＰＲ４株の前培養液の作製
予め乾熱滅菌を１８０℃、３０分間行った試験管を用意し、これにオートピペッター及び１０ｍＬメスピペットを用いて、５ｍＬのＩＢ２液体培地を加えた。続いて、ＰＲ４株をディスポスティックでＩＢ２寒天培地から適当量掻き取り、植菌した。続いて、これらのＰＲ４株が植菌された試験管を２８℃、１１０ｒｐｍで２〜３日間振盪培養したものを前培養液として用いた。
【００７０】
（２）ＰＲ４株のミセル封入化
続いて、予め乾熱滅菌を１８０℃、３０分間行った試験管を用意し、これにオートピペッター及び１０ｍＬメスピペットを用いて、ＩＢ２液体培地を１０ｍＬ加えた。続いて、ピペットマンＰ−１０００を用いて、Ｃ１２、Ｃ１５、Ｃ１６、Ｃ１９をそれぞれ１ｍＬずつ加えた。続いて、ピペットマンＰ−２００を用いて、（１）で作製したＰＲ４株の前培養液を１００μＬ加え、これを２８℃、１１０ｒｐｍで１日振盪培養した。培養後の菌体濃度は、１．０×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬであった。続いて、４Ｌの水量を含む超音波洗浄機（ＵＳＤ−４Ｒ、アズワン社製）を用いて、常温及び常圧下において、４０ｋＨｚで１５分間超音波処理した。超音波処理において、試験管中の溶液の液面が、超音波洗浄機の水面よりも１．５ｃｍ〜２．０ｃｍ程度下になるようにして行った。続いて、超音波処理後の溶液を１００μＬサンプリングした。サンプリングした溶液は、位相差顕微鏡を用いて観察を行った。観察は、溶液を、ピペットマンＰ−２０を用いて、各８μＬずつプレパラートに滴下し、カバーガラスをのせ、イマ―ジョンオイルを１滴垂らしたものを、位相差顕微鏡（オリンパス社製）のステージ上に乗せ、対物レンズの倍率を１００倍にして行った。結果を図１に示す。
【００７１】
図１から、有機溶媒としてＣ１２を、水性溶媒としてＩＢ２液体培地を用いた場合では、局在性が吸着型となり、ＰＲ４株が有機溶媒の表面に吸着しており、ＰＲ４株をミセル封入化することができなかった。
一方、有機溶媒としてＣ１５、Ｃ１６又はＣ１９を、水性溶媒としてＩＢ２液体培地を用いた場合では、局在性が転移型となり、ＰＲ４株をミセル封入化することができた。また、各ミセル内には、ＰＲ４株が１〜５細胞程度転移している状態が確認された。
【００７２】
（３）超音波処理によるＰＲ４株への影響の確認
また、有機溶媒としてＣ１６又はＣ１９を用いて製造した有機溶媒処理微生物用製剤について、ＤＡＰＩ、ＣＴＣによる二重染色を行った。
二重染色は次のように行った。有機溶媒としてＣ１６又はＣ１９を用いて製造した有機溶媒処理微生物用製剤各１００μＬに、ピペットマンＰ−２を用いて、Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  ｒｅａｇｅｎｔ  Ｂ液（同仁堂社製）を０．５μＬずつ、ＣＴＣ試薬を１．５μＬずつ加え、ボルテックスで十分に撹拌した。続いて、３７℃に設定したＴＨＥＲＭＯ  ＭＩＮＤＥＲ  ５０  ｍｉｎｉ（ＴＡＩＴＥＣ社製）で１５分間培養した。続いて、ピペットマンＰ−２を用いてＤＡＰＩ試薬を１μＬずつ加え、ボルテックスで十分に撹拌した後、室温で１５分間放置した。続いて、位相差顕微鏡を用いてサンプルを観察した。ＤＡＰＩ試薬は対比染色として用いた核染色試薬であり、ＣＴＣ試薬は生菌選択的蛍光染色試薬である。結果を図２に示す。
【００７３】
図２から、有機溶媒としてＣ１６又はＣ１９を用いて製造した有機溶媒処理微生物用製剤について、ＣＴＣ染色による赤い蛍光が検出された。また、詳細なデータは示さないが、超音波処理の有無でのＰＲ４株のコロニー数を比較したところ、超音波処理（上述の条件）を行ったＰＲ４株は、超音波処理を行っていないＰＲ４株と同程度のコロニーを形成していることが確かめられた。このことから、コロニー形成能に対する超音波処理の影響はないことが確かめられた。
以上のことから、超音波処理を行っても、ＰＲ４株は呼吸活性を有することが確認できた。すなわち、上述の条件の超音波処理では、ＰＲ４株は死滅しないことが確かめられた。
【００７４】
（４）ミセルの平均粒径及びＰＲ４株の平均転移数の測定
また、有機溶媒としてＣ１６又はＣ１９を用いて製造した有機溶媒処理微生物用製剤（各４サンプルずつ）について、位相差顕微鏡を用いて目視にて、独立して３回ずつ測定を行い、ミセルの平均粒径および平均転移数を算出した。結果を図３に示す。
【００７５】
図３から、有機溶媒としてＣ１６を用いて製造した有機溶媒処理微生物用製剤について、４つのサンプル間で平均粒径及び平均転移数に大きな差は見られなかった。また、４つのサンプルを用いて平均粒径及び平均転移数の平均値を求めたところ、平均粒径１２．２７μｍ、平均転移数３．２７であった。
また、有機溶媒としてＣ１９を用いて製造した有機溶媒処理微生物用製剤について、Ｃ１６のときと同様に、４つのサンプル間で平均粒径及び平均転移数に大きな差は見られなかった。また、４つのサンプルを用いて平均粒径及び平均転移数の平均値を求めたところ、平均粒径１３．２６μｍ、平均転移数４．２３であった。
以上のことから、局在性が転移型である有機溶媒分解菌を用いることで、有機溶媒の種類を選ばず、１〜５細胞程度の菌体をミセル封入化できることが確かめられた。
【００７６】
（５）ミセルの安定性の検討
さらに、（４）で用いた有機溶媒としてＣ１６又はＣ１９を用いて製造した有機溶媒処理微生物用製剤について、ミセルの安定性を検討した。方法としては、２８℃で振盪培養又は常温で静置培養した有機溶媒としてＣ１６又はＣ１９を用いて製造した有機溶媒処理微生物用製剤を用いて、超音波処理後１日目、３日目、５日目、７日目にサンプリングを行い、位相差顕微鏡を用いて目視にて、平均粒径及び平均転移数を経時的に測定することによって、安定性があるか否か検討した。結果を図４に示す。
【００７７】
図４から、有機溶媒としてＣ１６を用いて製造した有機溶媒処理微生物用製剤について、平均粒径及び平均転移数は、培養日数が経過しても大きく変化しなかった。振盪培養と静置培養の２つの培養法を用いて安定性の比較を行ったところ、静置培養の方が平均粒径、平均転移数ともに安定していた。このことから、振盪することによって近くにあるミセル同士が結合する等の影響があったと推察された。
また、有機溶媒としてＣ１９を用いて製造した有機溶媒処理微生物用製剤について、Ｃ１６のときと同様に、平均粒径及び平均転移数は、培養日数が経過しても大きく変化しなかった。Ｃ１９においても、Ｃ１６のときと同様に、振盪培養と静置培養の２つの培養法を用いて安定性の比較を行ったところ、静置培養の方が平均粒径、平均転移数ともに安定していた。このことから、振盪することによって近くにあるミセル同士が結合する等の影響があったと推察された。
以上のことから、有機溶媒としてＣ１６又はＣ１９を用いて製造した有機溶媒処理微生物用製剤について、１週間程度は常温で保存可能であることが確かめられた。
【００７８】
［実施例２］水性溶媒としてＭＭ培地を用いた有機溶媒処理用微生物製剤の製造
（１）菌体洗浄
実施例１の（１）で調製した前培養液を、２．０ｍＬエッペンチューブにピペットマンＰ−１０００を用いて、５００μＬ加えた。続いて、１００００ｇ、４℃で１０分間遠心分離を行い、上清を除去した。続いて、５００μＬの滅菌ミリＱ水を加え、十分に撹拌し、再び１００００ｇ、４℃で１０分間遠心分離を行った。この作業を計４回繰り返し、５００μＬの滅菌ミリＱ水に懸濁後、続く（２）で用いた。
【００７９】
（２）ＰＲ４株のミセル封入化
有機溶媒としてＣ１９を、ＩＢ２液体培地の代わりにＭＭ培地を用いた以外は、実施例１の（２）と同様の方法を用いて、超音波処理した。続いて、超音波処理後の溶液を１００μＬサンプリングした。サンプリングした溶液は、位相差顕微鏡を用いて観察を行った。結果を図５に示す。
【００８０】
図５から、ＰＲ４株がミセル内に封入化されていることが確かめられた。このことから、局在性が転移型である有機溶媒分解菌を用いることで、培地の種類を選ばず、１〜５細胞程度の菌体をミセル封入化できることが確かめられた。
【００８１】
［実施例３］水性溶媒としてＮＰ培地を用いた有機溶媒処理用微生物製剤の製造
（１）菌体洗浄
実施例２の（１）と同様の方法を用いて、前培養液中の菌体を洗浄し、５００μＬの滅菌ミリＱ水に懸濁後、続く（２）で用いた。
【００８２】
（２）ＰＲ４株のミセル封入化
有機溶媒としてＣ１９を、ＩＢ２液体培地の代わりにＭＭ培地を用いた以外は、実施例１の（２）と同様の方法を用いて、超音波処理した。続いて、超音波処理後の溶液を１００μＬサンプリングした。サンプリングした溶液は、位相差顕微鏡を用いて観察を行った。結果を図６に示す。
【００８３】
図６から、ＰＲ４株がミセル内に封入化されていることが確かめられた。このことから、局在性が転移型である有機溶媒分解菌を用いることで、培地の種類を選ばず、１〜５細胞程度の菌体をミセル封入化できることが確かめられた。
【００８４】
［実施例４］レーザー回折式粒度分布測定装置を用いた有機溶媒処理用微生物製剤の粒径の解析
（１）菌体洗浄
実施例２の（１）と同様の方法を用いて、前培養液中の菌体を洗浄し、５００μＬの滅菌ミリＱ水に懸濁後、続く（２）で用いた。
【００８５】
（２）ＰＲ４株のミセル封入化
有機溶媒としてＣ１６を、ＩＢ２液体培地の代わりにＭＭ培地を用いた以外は、実施例１の（２）と同様の方法を用いて、超音波処理した。また、ＰＲ４株を含有せずに超音波処理を行い、コントロールミセルを作製した。続いて、超音波処理後の溶液を１００μＬサンプリングした。サンプリングした溶液は、位相差顕微鏡を用いて観察を行った。結果を図７（Ａ）に示す。
【００８６】
図７（Ａ）から、有機溶媒処理用微生物製剤では、ＰＲ４株がミセル封入化されていることが確かめられた。
【００８７】
（３）粒径の解析
さらに、（２）で作製した有機溶媒処理用微生物製剤及びコントロールミセルについて、島津レーザー回折式粒度分布測定装置（ＳＡＬＤ−２３００、島津製作所製）を用いて、粒径を測定した。結果を図７（Ｂ）に示す。
【００８８】
図７（Ｂ）から、コントロールミセルでは、粒径が０．７〜３μｍに分布しており、平均粒径は１．５８±０．０７μｍであった。一方、有機溶媒処理用微生物製剤では、粒径が０．９〜４００μｍに分布しており、平均粒径は２３．４０±３．７６μｍであった。
【００８９】
［試験例１］有機溶媒処理用微生物製剤を用いたｗｅａｔｈｅｒｅｄ−ｃｒｕｄｅ  ｏｉｌ（ｗ−ｏｉｌ）の分解試験
（１）分解条件
有機溶媒として、Ｃ１６を、水性溶媒として、ＭＭ培地を用いた。また、分解対象として、１ｍｇ／ｍＬのｗｅａｔｈｅｒｅｄ−ｃｒｕｄｅ  ｏｉｌ（ｗ−ｏｉｌ）を用いた。ｗ−ｏｉｌとは、アラビアンライト原油の加熱処理産物であって、汚染環境下において残存する不揮発油と想定して使用した。初期菌体量は、１．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬであった。また、以下の４つの分解条件のサンプルを準備し、２８℃で４８時間振盪培養した。
パターン１：ＭＭ培地にＰＲ４株とＣ１６とを別々に投入し、超音波処理していないもの
パターン２：予め超音波処理したＰＲ４株及びＭＭ培地と、予め超音波処理したＣ１６及びＭＭ培地とを混合したもの（超音波の条件は、実施例１の（２）と同様である）
パターン３：有機溶媒としてＣ１６を、ＩＢ２液体培地の代わりにＭＭ培地を用いた以外は、実施例１の（２）と同様の方法を用いて、超音波処理したもの
パターン４：有機溶媒としてＣ１６を、ＩＢ２液体培地の代わりにＭＭ培地を用い、ＰＲ４株を含有せずに、実施例１の（２）と同様の方法を用いて、超音波処理したもの
【００９０】
（２）ＧＣ−ＭＳを用いた残存成分の解析
（１）での分解処理後の各サンプルの培養液から、クロロホルムを用いて残存成分を抽出し、ＧＣ−ＭＳ（島津製作所製）を用いて解析を行った。なお、各サンプルについて、Ｃ１６がｗ−ｏｉｌ中の他のアルカンと比較して非常に多く含有しているため、同じ強度では示せないため、Ｃ１６以外の成分と、Ｃ１６とを分けて測定し、ＳＩＭ解析した。いずれにおいても、パターン４をコントロールとして（各種残存成分の残存量を１００％として）、相対残存率として表した。結果を図８及び図９に示す。
【００９１】
図８から、ｗ−ｏｉｌ中のＣ１６以外の各種成分について、パターン１及びパターン２の分解条件と比較して、パターン３の分解条件では、いずれのアルカンも分解が進み相対残存率が低下したことが確かめられた。また、パターン２では、Ｃ１６を含まず超音波処理を行ったため、ＰＲ４株がダメージを受けてしまい、分解速度が低下したと推察された。
【００９２】
また、図９から、有機溶媒及びｗ−ｏｉｌ由来のＣ１６について、パターン１及びパターン２の分解条件と比較して、パターン３の分解条件では、分解が進み相対残存率が低下したことが確かめられた。よって、本発明の有機溶媒処理用微生物製剤は、製剤中に含まれる有機溶媒も分解することができ、残存しないため、環境負荷が少ないと推察された。
【００９３】
以上のことから、本発明の有機溶媒処理用微生物製剤は、常温で保存可能であり、環境負荷が少なく、高い有機溶媒分解能を有することが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００９４】
本発明によれば、常温で保存可能であり、環境負荷が少ない乳化技術で作製された、高い有機溶媒分解能を有する有機溶媒処理用微生物製剤を提供することができる。さらに、本発明の有機溶媒処理用微生物製剤を用いることで、環境浄化又は物質生産へ利用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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