(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼ及びジアホラーゼからなる群より選ばれる少なくとも１種を含有する、洗浄剤組成物であって、該ジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼが下記（ａ）〜（ｄ）からなる群より選ばれる少なくとも１種のタンパク質であり、該ジアホラーゼが下記（ｅ）〜（ｈ）からなる群より選ばれる少なくとも１種のタンパク質である、洗浄剤組成物。
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列において１〜４５個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、還元力を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１のアミノ酸配列との同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、還元力を有するタンパク質
（ｄ）配列番号１のアミノ酸配列との同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、かつ配列番号１における１７３位〜２５２位及び３４０位〜４４７位のアミノ酸配列の少なくともいずれか一方を有し、還元力を有するタンパク質
（ｅ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｆ）配列番号２のアミノ酸配列において１〜２２個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、還元力を有するタンパク質
（ｇ）配列番号２のアミノ酸配列との同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、還元力を有するタンパク質
（ｈ）配列番号２のアミノ酸配列との同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、かつ配列番号２における７位〜１４９位のアミノ酸配列を有し、還元力を有するタンパク質
【請求項２】
泥汚れの洗浄のための、請求項１に記載の洗浄剤組成物。
【請求項３】
プロトン源を含有する、請求項１又は２に記載の洗浄剤組成物。
【請求項４】
前記プロトン源がＮＡＤＨ、又はＮＡＤＰＨである、請求項３に記載の洗浄剤組成物。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の洗浄剤組成物を用いた、繊維製品の泥汚れの洗浄方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、洗浄剤組成物、及びこれを用いた繊維製品の泥汚れの洗浄方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
衣料などの繊維製品に付着する汚れは、一般に有機質汚れと無機質汚れとに大別される。このうち、無機質汚れの代表的なものとしては、泥汚れが挙げられる。繊維製品に付着する泥汚れ、特に靴下等の衣類に付着する泥汚れは発生頻度が高い。そして、繊維製品に付着する泥汚れは泥粒子が繊維に強固に付着したものであるため、落としにくい汚れの１つとされている。
繊維製品用洗浄剤の主成分である界面活性剤やビルダーの、泥汚れに対する洗浄効果は、有機質汚れに対する洗浄効果と比較して小さい。そこで、この泥汚れに対する洗浄剤の洗浄効果を向上させるため、これまでに様々な技術が開発されてきた。
【０００３】
これまでに、衣類など繊維製品に付着する泥汚れに対して一定の効果を発揮する基材として、特定の酵素を含有する洗浄剤組成物について提案されている。
例えば、特許文献１には、プロトペクチナーゼを含有する洗浄剤組成物が記載されている。ここで、プロトペクチナーゼは不溶性のペクチンを可溶性のペクチンにする反応を触媒する酵素である。特許文献１に記載の発明では、泥汚れが付着する繊維のペクチン質ごと剥ぎ取り、泥汚れを洗浄している。
また、特許文献２〜５には、セルラーゼを含有する洗浄剤組成物が記載されている。特許文献２〜５に記載の発明では、セルラーゼの作用により繊維の一部を分解又は繊維を構成するセルロースの構造を変化させて繊維に付着している泥を遊離し、泥汚れの除去を行っている。
さらに、特許文献６には、泥に対する親和性を有する特定の酵素（リパーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、アミラーゼなど）を含有する洗浄剤組成物が記載されている。特許文献６に記載の発明は、脂肪やタンパク質などが泥と結合した泥複合汚れに対する洗浄剤組成物である。特許文献６に記載の発明では、前記酵素が泥に対して選択的に作用し、泥汚れ複合体を形成する脂質やタンパク質などを分解又は除去し、洗浄剤組成物に含まれる界面活性剤や金属捕捉剤により酵素近傍に存在する泥汚れの除去を行っている。
また、特許文献７及び８では、ペクチン分解酵素と酸化還元酵素を含有する洗浄組成物が記載されている。ここでは、ペクチン分解酵素又は酸化還元酵素類の単独では充分な洗浄効果が得られないため、２種類の酵素を同時に使用することで泥汚れの除去を行っている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開平１１−１４０４８９号公報
【特許文献２】特開昭６１−４７８００号公報
【特許文献３】特開昭６１−２３１０９４号公報
【特許文献４】特開２０００−３１９６８８号公報
【特許文献５】特表２００６−５１７９８９号公報
【特許文献６】特開２００４−２１０８１２号公報
【特許文献７】特開２００３−９８５６号公報
【特許文献８】特開２００６−１６０８９１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、繊維製品の泥汚れに対して優れた洗浄性を有する、洗浄剤組成物の提供を課題とする。
また本発明は、該洗浄剤組成物を用いた繊維製品の泥汚れの洗浄方法の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは上記課題に鑑み、鋭意検討を行った。その結果、ジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼ及びジアホラーゼが単独で、繊維製品の泥汚れに対して優れた洗浄性を有することを見い出した。本発明は、この知見に基づいて完成させるに至った。
【０００７】
すなわち本発明は、ジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼ及びジアホラーゼからなる群より選ばれる少なくとも１種を含有する、洗浄剤組成物に関する。
また本発明は、前記洗浄剤組成物を用いた、繊維製品の泥汚れの洗浄方法に関する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の洗浄剤組成物は、繊維製品の泥汚れに対して優れた洗浄性を有する。
また本発明の洗浄方法は、繊維製品の泥汚れを効率的に洗浄することができる。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明の洗浄剤組成物は、繊維製品の泥汚れに対する洗浄成分としてジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼ及びジアホラーゼからなる群より選ばれる少なくとも１種を含有する。
ジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼ及びジアホラーゼは、繊維製品の素材に関わらず、泥汚れに対して優れた洗浄性を有する。したがって、ジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼ及びジアホラーゼからなる群より選ばれる少なくとも１種を含有する本発明の洗浄剤組成物は、繊維製品用洗浄剤として好適に使用することができる。
【００１０】
ジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼもしくはジアホラーゼが泥汚れに対して洗浄性を有するメカニズムに関しては明らかでない点がある。しかし、後述の実施例でも示すように、本発明の洗浄剤組成物により繊維製品からの泥の遊離が確認されることより、漂白効果に基づく泥汚れ洗浄とは異なるメカニズムによるものと考えらえる。
【００１１】
ジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼ（以下、本明細書において、単に「ＤＬＤ」ともいう）は、フラボタンパク質の１種であり、ＮＡＤ＋、ＮＡＤＰ＋又はＦＡＤを補酵素として用いる酵素の１種であり、ＥＣ番号１．８．１．４に属する酵素である。ＤＬＤはジヒドロリポアミドをリポアミドに酸化する反応又はその逆反応を触媒する酵素として知られており、該反応によって測定される。ここで逆反応はジアホラーゼ活性としても測定される。
従って、ジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼ、ジヒドロリポイル脱水素酵素、ジアホラーセ、ジアフォラーゼ、ジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ、ジヒドロリポアミド脱水素酵素、リポアミドデヒドロゲナーゼ及びリポアミド脱水素酵素は同反応を触媒する酵素である。
【００１２】
本発明において、ジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼの由来は特に制限はなく、動物、植物、細菌等に広く分布しているものを用いることができる。例えば、ストレプトマイセス（Streptomyces）属、ストレプトコッカス（Streptococcus）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、バシラス（Bacillus）属、サーモビフィダ（Thermobifida）属等の細菌類が挙げられる。好ましくはサーモビフィダ・フスカ（Thermobifida fusca）由来のジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼが挙げられる。例えば、サーモビフィダ・フスカ株はＮＢＲＣ（ＮＩＴＥ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒ）においてＮＢＲＣ１４０７１株として保管、分譲されている。後述の参考例に記載の方法を用いて、サーモビフィダ・フスカ株由来のジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼを調製することができる。または、配列番号１に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを合成し、下記実施例に記載の方法に従い、宿主に該ＤＮＡを導入、発現させ、ジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼを調製することもできる。
【００１３】
ここで、サーモビフィダ・フスカ由来ジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列の１例を配列番号１に記載する。
本発明で用いるジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼは、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質、又は当該アミノ酸配列において１又は数個、具体的には１〜１３７個、好ましくは１〜９１個、より好ましくは１〜４５個、さらに好ましくは１〜２２個、特に好ましくは１〜４個、のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、還元力を有するタンパク質であることが好ましい。あるいは、配列番号１に示すアミノ酸配列との同一性が７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９９％以上、のアミノ酸配列からなり、還元力を有するタンパク質が好ましい。ここで、ジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼにおける「還元力」とは、具体的にはＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ又はＦＡＤＨ２等のプロトン源の存在下においてリポアミドをジヒドロリポアミドに還元する力をいう。
なお本明細書において、アミノ酸配列の同一性は、２つのアミノ酸配列をアラインメントしたときに両方の配列において同一のアミノ酸残基が存在する位置の数の全長アミノ酸残基数に対する割合（％）をいう。具体的には、リップマン−パーソン法（Lipman-Pearson法；Science，227，1435，(1985))によって計算され、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Win（Ver．11；ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Search  homology）プログラムを用いて、Unit  size  to  compare（ktup）を２として解析を行なうことにより算出できる。
また、ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴ検索において、配列番号１の１７３位〜２５２位及び３４０位〜４４７位のアミノ酸配列は、酸化還元に関わる配列であると推察される。よって、本発明で用いるジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼは、配列番号１の１７３位〜２５２位及び３４０位〜４４７位のアミノ酸配列の少なくともいずれか一方を有することが好ましい。
【００１４】
配列番号１に示すアミノ酸配列との同一性が７０％以上であるジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼとしては、例えば、サーモビフィダ・フスカ由来のDLD（配列番号３）、ノカルジオプシス・ルセンテンシス（Nocardiopsis lucentensis）由来のDLD（配列番号４）、ノカルジオプシス・ポテンス（Nocardiopsis potens）由来のDLD（配列番号５）、ノカルジオプシス・ハロトレランス（Nocardiopsis halotolerans）由来のDLD（配列番号６）、ノカルジオプシス・エスピー（Nocardiopsis  sp．）CNT312由来のDLD（配列番号７）、ノカルジオプシス・エスピー（Nocardiopsis  sp．）CNS639由来のDLD（配列番号８）、ノカルジオプシス・ダッソンビレイ（Nocardiopsis dassonvillei）由来のDLD（配列番号９）、ノカルジオプシス・エスピー（Nocardiopsis  sp．）RV163由来のDLD（配列番号１０）、ノカルジオプシス・シンネマタフォルマンス（Nocardiopsis synnemataformans）由来のDLD（配列番号１１）、ノカルジオプシス・アルカリフィラ（Nocardiopsis alkaliphila）由来のDLD（配列番号１２）、ノカルジオプシス・ガンジアフエンシス（Nocardiopsis ganjiahuensis）由来のDLD（配列番号１３）、ノカルジオプシス・バリフォーミス（Nocardiopsis valliformis）由来のDLD（配列番号１４）、ノカルジオプシス・プラシナ（Nocardiopsis prasina）由来のDLD（配列番号１５）、ノカルジオプシス・クンサネンシス（Nocardiopsis kunsanensis）由来のDLD（配列番号１６）、ノカルジオプシス・ハロフィア（Nocardiopsis haloplia）DSM  44494若しくはノカルジオプシス・バイチェンジェネシシス（Nocardiopsis baichengensis）YIM  90130由来のDLD（配列番号１７）、ノカルジオプシス・アルバ（Nocardiopsis alba）ATCC  BAA-2165、ノカルジオプシス・アルバ（Nocardiopsis alba）DSM  43377若しくはノカルジオプシス・エスピー（Nocardiopsis  sp．）TP-A0876由来のDLD（配列番号１８）、ノカルジオプシス・キシンジアンゲンシス（Nocardiopsis xinjiangensis）由来のDLD（配列番号１９）、ノカルジオプシス・ギルバ（Nocardiopsis gilva）由来のDLD（配列番号２０）、ノカルジオプシス・クロマトゲネス（Nocardiopsis chromatogenes）由来のDLD（配列番号２１）、アロサリナクチノスポラ・ロプノレンシス（Allosalinactinospora lopnorensis）由来のDLD（配列番号２２）、ストレプトモノスポラ・アルバ（Streptomonospora alba）由来のDLD（配列番号２３）、ストレプトスポランジウム・ロゼウム（Streptosporangium roseum）由来のDLD（配列番号２４）、サーモビスポラ・ビスポラ（Thermobispora bispora）由来のDLD（配列番号２５）、ストレプトスポランジウム・ロゼウム由来のDLD（配列番号２６）、ノノムラエア・コクセンシス（Nonomuraea coxensis）由来のDLD（配列番号２７）、ミクロビスポラ・エスピー（Microbispora  sp．）ATCC  PTA-5024由来のDLD（配列番号２８）、ノノムラエア・カンジダ（Nonomuraea candida）由来のDLD（配列番号２９）、ノカルジオプシス・サリナ（Nocardiopsis salina）由来のDLD（配列番号３０）、ミクロビスポラ・ロゼア（Microbispora rosea）由来のDLD（配列番号３１）、ハービドスポラ・クレタセア（Herbidospora cretacea）由来のDLD（配列番号３２）、ストレプトスポランジウム・アメチストゲネス（Streptosporangium amethystogenes）由来のDLD（配列番号３３）、アシドサーマス・セルロリチクス（Acidothermus cellulolyticus）由来のDLD（配列番号３４）、アクチノマデュラ・オリゴスポーラ（Actinomadura oligospora）由来のDLD（配列番号３５）、��ポリクシア・ポリモルファ（Sporichthya polymorpha）由来のDLD（配列番号３６）、スピリロスポラ・アルビダ（Spirillospora albida）由来のDLD（配列番号３７）、ストレプトマイセス・メガスポラス（Streptomyces megasporus）由来のDLD（配列番号３８）、サーモモノスポラ・クルバータ（Thermomonospora curvata）由来のDLD（配列番号３９）、ストレプトマイセス・スカブリスポルス（Streptomyces scabrisporus）由来のDLD（配列番号４０）、アクチノマデュラ・マデュレ（Actinomadura madurae）由来のDLD（配列番号４１）、ミクロビスポラ・エスピーATCC  PTA-5024由来のDLD（配列番号４２）、ストレプトマイセス・エスピー（Streptomyces  sp．）AA1529若しくはストレプトマイセス・エスピーCNT318由来のDLD（配列番号４３）、ストレプトマイセス・エスピーAA0539由来のDLD（配列番号４４）、ストレプトマイセス・エスピーTAA486由来のDLD（配列番号４５）、ストレプトマイセス・エスピーNRRL  F-2890若しくはストレプトマイセス・キシアメネンシス（Streptomyces xiamenensis）由来のDLD（配列番号４６）、ストレプトマイセス・キシアメネンシス由来のDLD（配列番号４７）、ストレプトアシジフィラス・ルゴサス（Streptacidiphilus rugosus）由来のDLD（配列番号４８）、ゲオデルマトフィラス・バクテリウム（Geodermatophilaceae bacterium）URHB0062由来のDLD（配列番号４９）、ブラストコッカス・エスピー（Blastococcus  sp．）URHD0036由来のDLD（配列番号５０）、ストレプトマイセス・エスピーCNS606由来のDLD（配列番号５１）が挙げられる。
【００１５】
ジアホラーゼは、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを補酵素として用いる酵素の１種であり、ＥＣ番号１．６．９９．−に属する酵素である。ジアホラーゼは、下記反応式（１）の反応又はその逆反応を触媒する酵素として知られている。
反応式（１）
ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ＋acceptor  →  ＮＡＤ（Ｐ）＋（reduced  acceptor）    
【００１６】
ジアホラーゼ活性は、特開２０１４−１４３９４２号公報に記載の方法で測定することができる。電子受容体としてＤＣＰＩＰを用い、酵素反応時の６００ｎｍの波長の吸光度変化を測定することで、酵素の活性を測定することができる。
【００１７】
本発明において、ジアホラーゼの由来は特に制限はなく、動物、植物、細菌等に広く分布しているものを用いることができる。例えば、クロストリジウム・クルイベリ（Clostridium kluyveri）由来であることが好ましい。クロストリジウム・クルイベリ株由来のジアホラーゼは、例えばＮＢＲＣ１２０１６株を常法に従い培養し調製することができる。又は、市販のジアホラーゼ（オリエンタル酵母製）を購入して、使用することができる。さらに、配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを合成し、下記実施例に記載の方法に従い、宿主に該ＤＮＡを導入、発現させ、ジアホラーゼを調製することもできる。
ここで、クロストリジウム・クルイベリ由来のジアホラーゼのアミノ酸配列の１例を配列番号２に記載する。本発明で用いるジアホラーゼは、配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質、又は当該アミノ酸配列において１又は数個、具体的には１〜６８個、より好ましくは１〜４５個、さらに好ましくは１〜２２個、さらに好ましくは１〜１１個、特に好ましくは１又は２個、のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなる。あるいは、配列番号２に示すアミノ酸配列との同一性が７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９９％以上、のアミノ酸配列からなり、還元力を有するタンパク質が好ましい。ここで、ジアホラーゼにおいて「還元力」とは、具体的には前記反応式（１）の反応を触媒する力、すなわちジアホラーゼ活性をいう。
また、ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴ検索において、配列番号２の７〜１４９位のアミノ酸配列は酸化還元反応に関与すると推察される。よって、本発明で用いるジアホラーゼは、配列番号２の７〜１４９位のアミノ酸配列を有することが好ましい。
【００１８】
本発明で用いるジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼ及びジアホラーゼはそれぞれ、市販のジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼ及びジアホラーゼであってもよいし、動物や植物、微生物などから常法により分離したジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼ及びジアホラーゼであってもよい。また、配列番号１〜５０に示すアミノ酸配列情報をもとに人工的に化学合成することで、前記タンパク質を得ることができる。あるいは、遺伝子工学的手法により、組換えタンパク質として作製してもよい。なお、本明細書におけるジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼ及びジアホラーゼはそれぞれ、ジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼ又はジアホラーゼと、他のタンパク質又は分子とが融合又は抱合した、融合体又は抱合体も包含する。
【００１９】
本発明の洗浄剤組成物に含まれるジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼ及びジアホラーゼは、１種であってもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００２０】
本発明の洗浄剤組成物中における前記タンパク質の含有量は、当業者が適宜設定することができる。例えば、前記タンパク質の含有量は、洗浄剤組成物の総量中０．００１質量％以上が好ましく、０．０１質量％以上がより好ましい。またその上限値としては、０．１質量％以下が好ましく、０．０５質量％以下がより好ましい。前記タンパク質の含有量の数値範囲としては、０．００１〜０．１質量％が好ましく、０．０１〜０．０５質量％がより好ましい。
【００２１】
本発明の洗浄剤組成物は、プロトン源を含有することが好ましい。プロトン源（水素源）を含有させることで、前記による泥汚れの洗浄効果を一層向上させることができる。本発明で好ましく用いることができるプロトン源としては、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、ＦＡＤＨ２が挙げられる。このうち、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨがより好ましい。
プロトン源の含有量は当業者が適宜設定することができ、例えば、洗浄剤組成物中の総量中、１ｍＭ以上が好ましく、５ｍＭ以上がより好ましく、また上限値としては、１００ｍＭ以下が好ましく、２０ｍＭ以下がより好ましい。プロトン源の含有量の数値範囲としては１〜１００ｍＭが好ましく、５〜２０ｍＭがより好ましい。
【００２２】
本発明の洗浄剤組成物にはこの種の洗浄剤に通常用いられる任意の成分を配合することができる。このような成分としては、下記に示すものが挙げられる。
【００２３】
（１）界面活性剤
本発明の洗浄剤組成物には、界面活性剤を配合することができる。本発明において、陰イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、及び陽イオン性界面活性剤等の任意の界面活性剤を１種単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。本発明において用いることができる界面活性剤は、陰イオン性界面活性剤又は非イオン性界面活性剤であることが好ましい。
【００２４】
陰イオン性界面活性剤としては、炭素数１０〜１８のアルコールの硫酸エステル塩、炭素数８〜２０のアルコールのアルコキシル化物の硫酸エステル塩、アルキルベンゼンスルホン酸塩、アルキル硫酸エステル塩、パラフィンスルホン酸塩、α−オレフィンスルホン酸塩、α−スルホ脂肪酸塩、α−スルホ脂肪酸アルキルエステル塩又は脂肪酸塩が挙げられる。また、これらの塩の対イオンとしては、アルカリ金属塩、アミン類が挙げられ、具体的にはナトリウム、カリウム、モノエタノールアミン、又はジエタノールアミンが挙げられる。
【００２５】
非イオン性界面活性剤としては、ポリオキシアルキレンアルキル（炭素数８〜２０）エーテル、アルキルポリグリコシド、ポリオキシアルキレンアルキル（炭素数８〜２０）フェニルエーテル、ポリオキシアルキレンソルビタン脂肪酸（炭素数８〜２２）エステル、ポリオキシアルキレングリコール脂肪酸（炭素数８〜２２）エステル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックポリマーが挙げられる。
【００２６】
本発明の洗浄剤組成物中の界面活性剤の含有量は、当業者であれば適宜設定することができる。洗浄力及び溶解性の点からは、界面活性剤の含有量は、洗浄剤組成物の総量中１０質量％以上が好ましく、１５質量％以上がより好ましく、２０質量％以上がさらに好ましく、またその上限値としては、６０質量％以下が好ましく、５０質量％以下がより好ましく、４５質量％以下がさらに好ましい。界面活性剤の含有量の数値範囲としては、１０〜６０質量％が好ましく、１５〜５０質量％がより好ましく、２０〜４５質量％がさらに好ましい。そのうち陰イオン性界面活性剤の含有量は洗浄剤組成物の総量中１質量％以上が好ましく、２質量％以上がより好ましく、３質量％以上がさらに好ましく、また上限値としては、６０質量％以下が好ましく、５０質量％以下がより好ましく、４０質量％以下がさらに好ましい。陰イオン性界面活性剤の含有量の数値範囲としては、１〜６０質量％が好ましく、２〜５０質量％がより好ましく、３〜４０質量％がさらに好ましい。また非イオン性界面活性剤の含有量は洗浄剤組成物の総量中１質量％以上が好ましく、２質量％以上がより好ましく、４質量％以上がさらに好ましく、またその上限値としては、４５質量％以下が好ましく、３５質量％以下がより好ましく、２５質量％以下がさらに好ましい。非イオン性界面活性剤の含有量の数値範囲としては、１〜４５質量％が好ましく、２〜３５質量％がより好ましく、４〜２５質量％がさらに好ましい。
陰イオン性界面活性剤と非イオン性界面活性剤はそれぞれ単独で用いることもできるが、混合して用いるのが好ましい。また、両性界面活性剤や陽イオン性界面活性剤を目的に合わせ併用してもよい。
【００２７】
（２）ビルダー
本発明の洗浄剤組成物には、ビルダーを配合することができる。
ここで、「ビルダー」とは、それ自身に洗浄力は無いか又はごく弱い洗浄力しか有しないにもかかわらず、界面活性剤と共に配合されるとその洗剤能力を著しく向上させることができる成分を意味する。ビルダーの作用としては、例えば、多価金属陽イオン捕捉作用、汚れ分散作用、若しくはアルカリ緩衝作用、又はそれらの２種以上の組み合わせなどが挙げられる。
ビルダーとしては、水溶性無機化合物、水不溶性無機化合物、有機化合物等が挙げられる。
本発明で用いることができる水溶性無機化合物のビルダーとしては、リン酸塩（トリポリリン酸塩、ピロリン酸塩、メタリン酸塩、リン酸三ナトリウム等）、ケイ酸塩、炭酸塩、硫酸塩、亜硫酸塩等が挙げられる。
本発明で用いることができる水不溶性無機化合物のビルダーとしては、アルミノケイ酸塩（Ａ型ゼオライト、Ｐ型ゼオライト、Ｘ型ゼオライト、非晶質アルミノ珪酸塩等）、結晶性珪酸塩等が挙げられる。
本発明で用いることができる有機化合物のビルダーとしては、カルボン酸塩（アミノカルボン酸塩、ヒドロキシアミノカルボン酸塩、ヒドロキシカルボン酸塩、シクロカルボン酸塩、マレイン酸誘導体、シュウ酸塩等）、有機カルボン酸（塩）ポリマー（アクリル酸ポリマー及びコポリマー、多価カルボン酸（例えばマレイン酸等）ポリマー及びコポリマー、グリオキシル酸ポリマー、多糖類及びこれらの塩等）等が挙げられる。
ビルダーの塩において、対イオンとしては、アルカリ金属塩、アミン類が挙げられ、具体的にはナトリウム、カリウム、モノエタノールアミン、又はジエタノールアミンが挙げられる。
本発明に用いることができるビルダーとしては、水溶性無機化合物、水溶性無機化合物及び有機化合物の組み合わせ、又は、水溶性無機化合物、有機化合物及び水不溶性無機化合物の組み合わせが挙げられる。
【００２８】
本発明の洗浄剤組成物中のビルダーの含有量は、当業者であれば適宜設定することができる。例えば、ビルダーの含有量は、洗浄剤組成物の総量中２０質量％以上が好ましく、３０質量％以上がより好ましく、３５質量％以上がさらに好ましく、また上限値としては、８０質量％以下が好ましく、７０質量％がより好ましく、６０質量％以下がさらに好ましい。ビルダーの含有量の数値範囲としては、２０〜８０質量％が好ましく、３０〜７０質量％がより好ましく、３５〜６０質量％がさらに好ましい。そのうち水溶性無機化合物ビルダーは、洗浄剤組成物の総量中１０質量％以上が好ましく、１５質量％以上がより好ましく、２０質量％以上がさらに好ましく、またその上限値としては、５０質量％以下が好ましく、４５質量％がより好ましく、４０質量％以下がさらに好ましい。水溶性無機化合物ビルダーの含有量の数値範囲としては、１０〜５０質量％が好ましく、１５〜４５質量％がより好ましく、２０〜４０質量％がさらに好ましい。また、水不溶性無機化合物ビルダーは洗浄剤組成物の総量中５質量％以上が好ましく、１０質量％以上がより好ましく、１５質量％以上がさらに好ましく、またその上限値としては、５０質量％以下が好ましく、４５質量％がより好ましく、４０質量％以下がさらに好ましい。水不要性無機化合物ビルダーの含有量の数値範囲としては、５〜５０質量％が好ましく、１０〜４５質量％がより好ましく、１５〜４０質量％がさらに好ましい。また、有機化合物ビルダーは洗浄剤組成物の総量中０．１質量％以上が好ましく、０．３質量％以上がより好ましく、０．５質量％以上がさらに好ましく、またその上限値としては、２０質量％以下が好ましく、１５質量％がより好ましく、１０質量％以下がさらに好ましい。有機化合物ビルダーの含有量の数値範囲としては、０．１〜２０質量％が好ましく、０．３〜１５質量％がより好ましく、０．５〜１０質量％がさらに好ましい。
【００２９】
（３）緩衝剤
本発明の洗浄剤組成物には、緩衝剤を配合することができる。
本発明で用いることができる緩衝剤のｐＨは５．０以上が好ましく、８．０以上がより好ましく、１１．０以下が好ましい。あるいは、ｐＨ５．０〜１１．０が好ましく、ｐＨ８．０〜１１．０がより好ましい。また、緩衝剤の硬度は０度であることが好ましい。
本発明で用いることができる緩衝剤としては、クエン酸Ｎａ緩衝液、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、グリシンＮａ緩衝液などが挙げられる。
【００３０】
（４）その他の成分
本発明の洗浄剤組成物には、繊維製品用洗剤の分野で通常用いられるアルカリ剤、漂白剤、蛍光剤、柔軟化剤、還元剤、抑泡剤、再汚染防止剤、香料、各種酵素、などその他の成分を配合することができる。
【００３１】
本発明の洗浄剤組成物は、前記タンパク質と、必要により洗浄剤に通常用いられる任意の成分とを、常法に従い処方することで製造することができる。
本発明の洗浄剤組成物の形態は用途に応じて適宜選択することができる。例えば、液体、粉体、顆粒、ペースト、固形などにすることができる。これらのうち、本発明の洗浄剤組成物の形態は液体であることが好ましい。なお、本明細書において「液体」とは、２５℃で流動性を有することを意味する。流動性は常法に従い測定することができる。
【００３２】
本発明の洗浄剤組成物を用いて繊維製品の洗浄を行う場合、添加する前記タンパク質の終濃度を好ましくは０．００１質量％以上、より好ましくは０．０１質量％以上、好ましくは０．１質量％以下、より好ましくは０．０５質量％以下となるよう適宜設定することができる。
【００３３】
常法に従い本発明の洗浄剤組成物を繊維製品に適用することで、繊維製品に付着する泥汚れの洗浄や、泥汚れによる繊維製品の再汚染を防止することができる。
洗浄方法や再汚染の防止方法としては適宜選択することができる。具体的には、付け置き洗い、手洗い洗浄、洗濯機や攪拌機を用いた洗浄等により行うことができる。
【００３４】
本発明の洗浄剤組成物を適用する繊維製品の素材としては特に制限はなく、ウール、シルク、木綿等の天然素材、ポリエステル、ポリアミド等の化学繊維、及びこれらの組合せのいずれであってもよい。このうち、木綿、ポリエステル、及びこれらの組み合わせが好ましい。
【００３５】
上述した実施形態に関し、本発明はさらに以下の洗浄剤組成物、方法、及び使用を開示する。
【００３６】
＜１＞ジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼ及びジアホラーゼからなる群より選ばれる少なくとも１種を含有する、洗浄剤組成物。
【００３７】
＜２＞前記ジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼが下記（ａ）〜（ｄ）からなる群より選ばれる少なくとも１種のタンパク質であり、前記ジアホラーゼが下記（ｅ）〜（ｈ）からなる群より選ばれる少なくとも１種のタンパク質である、前記＜１＞項に記載の洗浄剤組成物。
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列において１個又は数個、好ましくは１〜１３７個、より好ましくは１〜９１個、さらに好ましくは１〜４５個、さらに好ましくは１〜２２個、特に好ましくは１〜４個、のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、還元力を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１のアミノ酸配列との同一性が７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９９％以上、のアミノ酸配列からなり、還元力を有するタンパク質
（ｄ）配列番号１のアミノ酸配列との同一性が７０％以上のアミノ酸配列からなり、かつ配列番号１における１７３位〜２５２位及び３４０位〜４４７位のアミノ酸配列の少なくともいずれか一方を有し、還元力を有するタンパク質
（ｅ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｆ）配列番号２のアミノ酸配列において１個又は数個、好ましくは１〜６８個、より好ましくは１〜４５個、さらに好ましくは１〜２２個、さらに好ましくは１〜１１個、特に好ましくは１又は２個、のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、還元力を有するタンパク質
（ｇ）配列番号２のアミノ酸配列との同一性が７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９９％以上、のアミノ酸配列からなり、還元力を有するタンパク質
（ｈ）配列番号２のアミノ酸配列との同一性が７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９９％以上、のアミノ酸配列からなり、かつ配列番号２における７位〜１４９位のアミノ酸配列を有し、還元力を有するタンパク質
【００３８】
＜３＞前記タンパク質（ｂ）又は（ｃ）が、配列番号３〜５１のいずれか１つに示すアミノ酸配列からなるタンパク質である、前記＜２＞項に記載の洗浄剤組成物。
＜４＞前記ジヒドリポイルデヒドロゲナーゼがサーモビフィダ・フスカ由来のジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼである、前記＜１＞〜＜３＞のいずれか１項に記載の洗浄剤組成物。
＜５＞前記ジアホラーゼがクロストリジウム・クルイベリ由来のジアホラーゼである、前記＜１＞〜＜３＞のいずれか１項に記載の洗浄剤組成物。
＜６＞前記洗浄剤組成物の形態が液体である、前記＜１＞〜＜５＞のいずれか１項に記載の洗浄剤組成物。
＜７＞前記タンパク質の含有量が、前記洗浄剤組成物の総量中０．００１質量％以上、好ましくは０．０１質量％以上、であり、０．１質量％以下、好ましくは０．０５質量％以下、である、前記＜１＞〜＜６＞のいずれか１項に記載の洗浄剤組成物。
＜８＞プロトン源を含有する、前記＜１＞〜＜７＞のいずれか１項に記載の洗浄剤組成物。
＜９＞前記プロトン源がＮＡＤＨである、前記＜８＞項に記載の洗浄剤組成物。
＜１０＞前記プロトン源の含有量が、前記洗浄剤組成物の総量中１ｍＭ以上、好ましくは５ｍＭ以上、より好ましくは１０ｍＭ以上、であり、１００ｍＭ以下、好ましくは５０ｍＭ以下、より好ましくは２０ｍＭ以下、である、前記＜８＞又は＜９＞項に記載の洗浄剤組成物。
＜１１＞界面活性剤を含有する、前記＜１＞〜＜１０＞のいずれか１項に記載の洗浄剤組成物。
＜１２＞前記界面活性剤の含有量が、前記洗浄剤組成物の総量中１０質量％以上、好ましくは１５質量％以上、より好ましくは２０質量％以上、であり、６０質量％以下、好ましくは５０質量％以下、より好ましくは４５質量％以下、である、前記＜１１＞項に記載の洗浄剤組成物。
＜１３＞前記界面活性剤が陰イオン性界面活性剤及び非イオン性界面活性剤からなる群より選ばれる少なくとも１種の界面活性剤である、前記＜１１＞又は＜１２＞項に記載の洗浄剤組成物。
＜１４＞前記陰イオン性界面活性剤が、炭素数１０〜１８のアルコールの硫酸エステル塩、炭素数８〜２０のアルコールのアルコキシル化物の硫酸エステル塩、アルキルベンゼンスルホン酸塩、アルキル硫酸エステル塩、パラフィンスルホン酸塩、α−オレフィンスルホン酸塩、α−スルホ脂肪酸塩、及びα−スルホ脂肪酸アルキルエステル塩又は脂肪酸塩からなる群より選ばれる少なくとも１種の陰イオン性界面活性剤、好ましくはアルキル鎖の炭素数が１０〜１４（より好ましくは炭素数が１２〜１４）の直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩及びアルキル硫酸塩からなる群より選ばれる少なくとも１種の陰イオン性界面活性剤、である、前記＜１３＞項に記載の洗浄剤組成物。
＜１５＞前記陰イオン性界面活性剤の含有量が、前記洗浄剤組成物の総量中１質量％以上、好ましくは２質量％以上、より好ましくは３質量％以上、であり、６０質量％以下、好ましくは５０質量％以下、より好ましくは４０質量％以下、である、前記＜１３＞又は＜１４＞項に記載の洗浄剤組成物。
＜１６＞前記非イオン性界面活性剤が、ポリオキシアルキレンアルキル（炭素数８〜２０）エーテル、アルキルポリグリコシド、ポリオキシアルキレンアルキル（炭素数８〜２０）フェニルエーテル、ポリオキシアルキレンソルビタン脂肪酸（炭素数８〜２２）エステル、ポリオキシアルキレングリコール脂肪酸（炭素数８〜２２）エステル、及びポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックポリマーからなる群より選ばれる少なくとも１種の非イオン性界面活性剤、好ましくはポリオキシエチレン（ＥＯ平均付加モル数６）アルキル（炭素数１２〜１４）エーテル、である、前記＜１３＞項に記載の洗浄剤組成物。
＜１７＞前記非イオン性界面活性剤の含有量が、前記洗浄剤組成物の総量中１質量％以上、好ましくは２質量％以上、より好ましくは４質量％以上、であり、４５質量％以下、好ましくは３５質量％、より好ましくは２５質量％以下、である、前記＜１３＞又は＜１６＞項に記載の洗浄剤組成物。
【００３９】
＜１８＞前記＜１＞〜＜１７＞のいずれか１項に記載の洗浄剤組成物の繊維製品用洗浄剤としての使用。
＜１９＞繊維製品用洗浄剤の製造のための前記＜１＞〜＜１７＞のいずれか１項に記載の洗浄剤組成物の使用。
＜２０＞前記＜１＞〜＜１７＞のいずれか１項に記載の洗浄剤組成物を繊維製品用洗浄剤として使用する方法。
＜２１＞前記＜１＞〜＜１７＞のいずれか１項に記載の洗浄剤組成物を用いた、繊維製品の泥汚れの洗浄方法。
＜２２＞前記＜１＞〜＜１７＞のいずれか１項に記載の洗浄剤組成物の、繊維製品の泥汚れの洗浄のための使用。
＜２３＞前記繊維製品の素材が木綿、ポリエステル、又はこれらの組み合わせである、前記＜１８＞〜＜２２＞のいずれか１項に記載の使用又は方法。
【実施例】
【００４０】
以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。ここで、本実施例で用いるプライマーの塩基配列を表１に示す。
【００４１】
【表１】
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【００４２】
実施例１
下記参考例に記載のサーモビフィダ・フスカＯＧ１３１２株の遺伝子を鋳型として、ジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（塩基配列：配列番号５２）を、表１に示すプライマー番号５３及びプライマー番号５４を用いて、ＰＣＲにより増幅した。
また、プラスミドベクターpET21a(+)（Novagen製）をプライマー番号５５及びプライマー番号５６を用いて、ＰＣＲにより増幅した。
その後、得られたＰＣＲ産物をIn-fusion法にて融合し、ジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼ遺伝子発現用プラスミドを作製した。
【００４３】
前記ジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼ遺伝子発現用プラスミドを大腸菌BL21(DE3)（ニッポンジーン社製）へと導入して形質転換を行い、得られた菌株をジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼ生産菌として用いた。
50mLのＬＢ培地を入れた500mL容ヒダ付き三角フラスコに、終濃度が100μg/mLとなるようにカナマイシン一硫酸塩（和光純薬工業社製）を添加し、小試験管（φ16×125mm）で一晩培養した菌体500μLを植菌した。37℃、210rpmで3時間培養を行い、終濃度が0.4mMとなるようにＩＰＴＧ（イソプロピル-β-チオガラクトピラノシド：和光純薬工業社製）を加えた。この条件で再び20時間培養した後、集菌した。上清を回収し、限外ろ過膜を用いて20mM  Tris-HCl（pH8.0）に置換し、ジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼを適宜濃縮して用いた。
【００４４】
直径6mmに裁断した、２種類の標準人工汚染布（商品名：CS40（原料：木綿）；及び商品名：PS40（原料：ポリエステル）、いずれも日本資材社より入手）をそれぞれ９６穴ディープウェルプレート（サーモ製）の各ウェルに１枚ずつ入れ、市販の衣料用粉末洗剤溶液（0.067％(w/v)）を540μL添加した。ここで用いた洗剤溶液は、市販の衣料用粉末洗剤（アタック；花王、２００９年製造）から、配合されている酵素造粒物を除き、所定の使用濃度になるように調整した。
さらに、上記で調製したサーモビフィダ・フスカ由来ジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼを脱イオン水（０°ｄＨ）で適宜希釈したものを60μLを加え、ジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼの終濃度が0.03g/Lとなるように適宜調整した。また、ＮＡＤＨを終濃度10mMとなるように添加した。コントロールとして、前記タンパク質溶液に代えて、脱イオン水を60μL加えた。
その後、バイオシェーカーＭ・ＢＲ−０２４（タイテック製）を用いて、370rpm、40℃の条件下で、72時間ディープウェルプレートを振盪させた。振盪後、高速振盪機CUTE  MIXER  CM-1000（EYELA製）でさらに10分間振盪し、上記の市販の衣料用粉末洗剤溶液250μLを９６穴プレート（IWAKI製）に分注した。
【００４５】
洗液の濁度（ＯＤ600）をプレートリーダーInfinite  M200（Tecan製）を用いて測定した。洗液の濁度が高いほど、より多くの泥が汚染布から遊離しており、泥汚れに対する洗浄剤組成物の洗浄力が高いことを表す。
その結果を表２に示す。
【００４６】
【表２】
0006765191.tif 000003
【００４７】
表２の結果から明らかなように、ジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼを含有する洗浄剤組成物は、繊維製品に付着した泥汚れに対して、その素材に関わらず優れた洗浄効果を示した。
【００４８】
実施例２
直径6mmに裁断した、標準人工汚染布（商品名：CS40（原料：木綿）、日本資材社より入手）を９６穴ディープウェルプレート（サーモ製）の各ウェルに１枚ずつ入れ、市販の衣料用粉末洗剤溶液を540μL添加した。ここで用いた洗剤溶液は、市販の衣料用粉末洗剤（アタック；花王、２００９年製造）から、配合されている酵素造粒物を除き、所定の使用濃度になるように調整した。
さらに、クロストリジウム・クルイベリ由来ジアホラーゼ（オリエンタル酵母製；溶媒：脱イオン水、０°ＤＨ）60μLを加え、ジアホラーゼの終濃度が0.1g/Lとなるように適宜調整した。また、ＮＡＤＨを終濃度10mMとなるように添加した。コントロールとして、前記タンパク質溶液に代えて、脱イオン水を60μL加えた。
その後、バイオシェーカーＭ・ＢＲ−０２４（タイテック製）を用いて、370rpm、40℃の条件下で、30時間ディープウェルプレートを振盪させた。振盪後、高速振盪機CUTE  MIXER  CM-1000（EYELA製）でさらに10分間振盪し、洗液250μLを９６穴プレート（IWAKI製）に分注した。
【００４９】
洗液の濁度（ＯＤ600）をプレートリーダーInfinite  M200（Tecan製）を用いて、実施例１と同様に測定した。その結果を表３に示す。
【００５０】
【表３】
0006765191.tif 000004
【００５１】
表３の結果から明らかなように、ジアホラーゼを含有する洗浄剤組成物は、繊維製品に付着した泥汚れに対して優れた洗浄効果を示した。
【００５２】
比較例
直径6mmに裁断した、２種類の標準人工汚染布（商品名：CS40（原料：木綿）；及び商品名：PS40（原料ポリエステル）、いずれも日本資材社より入手）をそれぞれ９６穴ディープウェルプレート（サーモ製）の各ウェルに１枚ずつ入れ、市販の衣料用粉末洗剤溶液を540μL添加した。ここで用いた洗剤溶液は、市販の衣料用粉末洗剤（アタック；花王、２００９年製造）から、配合されている酵素造粒物を除き、所定の使用濃度になるように調整した。
さらに、カンジタ・エスピー由来ウリカーゼ（和光純薬工業社製；溶媒：脱イオン水、０°ＤＨ）、アスペルギルス・ニガー由来グルコースオキシダーゼ（和光純薬工業社製；溶媒：脱イオン水、０°ＤＨ）、ヒト由来チロシナーゼ（和光純薬工業社製；溶媒：脱イオン水、０°ＤＨ）、バシラス・エスピーKSM-P15由来ペクチナーゼ（特開２０００−２５３８８８号公報参照；溶媒：脱イオン水、０°ＤＨ）60μLを加え、それぞれの酵素の終濃度が0.04g/Lとなるように適宜調整した。コントロールとして、前記タンパク質溶液に代えて、脱イオン水を60μL加えた。
その後、バイオシェーカーＭ・ＢＲ−０２４（タイテック製）を用いて、370rpm、40℃の条件下で、77時間ディープウェルプレートを振盪させた。振盪後、高速振盪機でCUTE  MIXER  CM-1000（EYELA製）でさらに10分間振盪し、洗液250μLを９６穴プレート（IWAKI製）に分注した。
【００５３】
洗液の濁度（ＯＤ600）をプレートリーダーInfinite  M200（Tecan製）を用いて、実施例１と同様に測定したその結果を表４に示す。
【００５４】
【表４】
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【００５５】
表４から明らかなように、ジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼ及びジアホラーゼ以外の酸化還元酵素を用いた場合、繊維製品に付着した泥汚れを洗浄することはできなかった。これは、酸化還元酵素であっても繊維製品の泥汚れに対して洗浄効果を示すとは限らないことを示している。
【００５６】
上記実施例から、酸化還元酵素のうち、ジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼ及びジアホラーゼが繊維製品に付着した泥汚れに対して優れた洗浄効果を示すことが判明した。
また、本実施例の条件においては、本実施例とは異なる条件において繊維製品の泥汚れに対して洗浄効果を示すことが既知であるペクチナーゼにおいても、洗浄効果が見られない。これは、ジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼ及びジアホラーゼは、該ペクチナーゼとは異なる作用機序により、繊維製品に付着した泥汚れを洗浄することを示唆するものである。
【００５７】
実施例１で用いたジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼと、実施例２で用いたジアホラーゼとでは、これらのアミノ酸配列において相同性がない。しかし、これらはともに酵素学上同義であり、且つ共に泥汚れの洗浄において有効である。すなわち、上記実施例で示したこれらのタンパク質の効果はアミノ酸配列と相関性は無く、ジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼ活性又はその逆反応であるジアホラーゼ活性に基づくものである可能性が示唆された。
【００５８】
参考例
＜サーモビフィダ・フスカの土壌からの分離＞
土壌懸濁液をCMC寒天培地（ＬＢ培地「ダイゴ」０．６３％、CMCナトリウム（試薬）１％、トリパンブルー（試薬）０．０１％、寒天（試薬）１．５％）に塗沫し、５０℃１日培養後に生育した菌株を候補株とした。
候補株をセルラーゼ誘導液体培地（非結晶セルロース（ＫＣフロック）０．５％、ＬＢ培地「ダイゴ」２．５％）にて、５０℃、３〜４日間培養し、セルラーゼ活性陽性を示した菌株を候補株とした。候補株ＯＧ１３１２株を得た。
【００５９】
＜セルラーゼ活性確認試験＞
培養液を遠心分離（１３０００ｒｐｍ、１０分、室温）し、得られた上清を評価サンプルとした。基質溶液（セルロースアズレ（試薬）０．５％、１００ｍＭ緩衝液）７５μＬに評価サンプル７５μＬを添加し、５０℃１晩反応させた。反応後、３０００ｒｐｍ、１０分間、室温にて遠心分離を行い、得られた上清の色（青色）を５７５ｎｍの吸光度にて測定した。
【００６０】
＜１６ＳｒＲＮＡ解析＞
寒天培地上の菌体を滅菌水に懸濁後、遠心分離（１２０００ｒｐｍ、１０分、４℃）を行い、菌体を回収した。得られた菌体からＵｌｔｒａＣｌｅａｎＴＭＭｉｃｒｏｖｉａｌ  ＤＮＡ  ＩｓｏｌａｔｉｏｎＫｉｔ（ＭＯ  ＢＩＯ社製）を用いて、手順書に従い染色体を抽出した。調製した染色体を鋳型にし、表５に示すプライマー27ｆ及び1525ｒを用いてＰＣＲを行った。ポリメラーゼはＬＡ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用い、９４℃で１分、鋳型ＤＮＡを変性させた後、９４℃で１分、５５℃で３０秒、７２℃で２分、を１サイクルとして３０サイクルを行い、さらに７２℃で２分保温した。増幅した１６ＳｒＲＮＡ領域の約１．５ｋｂＤＮＡ断片のシーケンスには、表５に示すプライマーｆ1Ｌ、ｆ2Ｌ、926ｆを用い、Ｂｉｇ  Ｄｙｅ（アプライドバイオシステム社製）処理した。シーケンサーＡ377（アプライドバイオシステム社製）を用いて１方向のみシーケンスし、塩基配列を決定した。得られた塩基配列の解析はＧｅｎｅｔｙｘ（Ｖｅｒ．１１、ソフトウエア開発社製）を用いて行った。
【００６１】
【表５】
0006765191.tif 000006
【００６２】
＜１６ＳｒＲＮＡを用いた菌株の同定＞
得られた１６ＳｒＲＮＡ配列をＮＣＢＩ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）のＢＬＡＳＴ検索を行い、相同性検索を行った。候補株ＯＧ１３１２株の１６ＳｒＲＮＡ配列はサーモビフィダ・フスカの１６ＳｒＲＮＡ配列と９９.９％の同一性を示し、ＯＧ１３１２株はサーモビフィダ・フスカであると推定された。
【００６３】
＜ＯＧ１３１２株由来のジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列の解析＞
調製した染色体を鋳型にし、表６に示すプライマー番号６２及びプライマー番号６３を用いてＰＣＲを行った。ポリメラーゼはＬＡ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用い、９４℃で１分、鋳型ＤＮＡを変性させた後、９４℃で１分、５５℃で３０秒、７２℃で２分、を１サイクルとして３０サイクルを行い、さらに７２℃で２分保温した。増幅した遺伝子産物約１．５ｋｂＤＮＡ断片のシーケンスには、表６に示すプライマー番号６２及びプライマー番号６３を用い、Ｂｉｇ  Ｄｙｅ（アプライドバイオシステム社製）処理した。シーケンサーＡ377（アプライドバイオシステム社製）を用いて１方向のみシーケンスし、塩基配列を決定した。得られた塩基配列の解析はＧｅｎｅｔｙｘ（Ｖｅｒ．１１、ソフトウエア開発社製）を用いて行った。
結果、ＯＧ１３１２株由来のジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列はサーモビフィダ・フスカのジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列と１００％の同一性が認められたため、ＯＧ１３１２株はサーモビフィダ・フスカであり、得られた酵素はジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼであると推定された。
【００６４】
【表６】
0006765191.tif 000007
【配列表】
0006765191000001.app