(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）中に妨害突然変異を含む、遺伝子組み換えカルボキシド栄養性酢酸生成細菌であって、前記細菌は、親細菌と比較して増加した量の生成物を生成し、前記生成物は、エタノール、２，３−ブタンジオール、ギ酸塩、ピルビン酸塩、コハク酸塩、バリン、ロイシン、イソロイシン、リンゴ酸塩、フマル酸塩、２−オキソグルタレート（ｏｘｏｇｌｕｔｅｒａｔｅ）、クエン酸塩、及びシトラマレートのうちの１つ以上であり、前記親細菌は、クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・リュングダリイ、及びクロストリジウム・ラグスダレイからなる群より選択される、前記細菌。
【請求項２】
前記突然変異は、前記酵素の発現または活性を低減または排除する、請求項１に記載の前記細菌。
【請求項３】
前記細菌は、親細菌と比較して減少した量の乳酸塩を生成する、請求項１に記載の前記細菌。
【請求項４】
前記細菌は、乳酸塩を実質的に生成しない、請求項１に記載の前記細菌。
【請求項５】
前記酵素は、ピルビン酸塩を乳酸塩に自然に変換する、請求項１に記載の前記細菌。
【請求項６】
前記親細菌は、ＤＳＭＺ受託番号ＤＳＭ２３６９３下で寄託されるクロストリジウム・オートエタノゲナムである、請求項１に記載の前記細菌。
【請求項７】
ＣＯを含む基質の存在下で請求項１に記載の前記細菌を培養することを含む、生成物を生成する方法であって、前記生成物は、エタノール、２，３−ブタンジオール、ギ酸塩、ピルビン酸塩、コハク酸塩、バリン、ロイシン、イソロイシン、リンゴ酸塩、フマル酸塩、２−オキソグルタレート（ｏｘｏｇｌｕｔｅｒａｔｅ）、クエン酸塩、及びシトラマレートのうちの１つ以上を含む、前記方法。
【請求項８】
前記突然変異は、前記酵素の発現または活性を低減または排除する、請求項７に記載の前記方法。
【請求項９】
前記細菌は、親細菌と比較して減少した量の乳酸塩を生成する、請求項７に記載の前記方法。
【請求項１０】
前記細菌は、乳酸塩を実質的に生成しない、請求項７に記載の前記方法。
【請求項１１】
前記細菌は、親細菌と比較して増加した量の前記生成物を生成する、請求項７に記載の前記方法。
【請求項１２】
前記酵素は、ピルビン酸塩を乳酸塩に自然に変換する、請求項７に記載の前記方法。
【請求項１３】
前記親細菌は、ＤＳＭＺ受託番号ＤＳＭ２３６９３下で寄託されるクロストリジウム・オートエタノゲナムである、請求項７に記載の前記方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本願は、２０１４年１月３０日出願の米国仮特許出願第６１／９３３，８１５号及び２０１４年２月２５日出願の米国仮特許出願第６１／９４４，５４１号の利益を主張し、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
配列表
【０００２】
本願は、本明細書と同時に提出され、以下、２０１５年１月２９日に作成された「ＬＴ１０２ＷＯ１＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」と題する２３，３２２バイトＡＳＣＩＩ（テキスト）ファイルとして識別される、ヌクレオチド／アミノ酸配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
アセトゲンは、嫌気呼吸の生成物として酢酸塩を生成する、または生成することが可能である微生物である。典型的には、アセトゲンは、エネルギー節約のため、かつアセチル−ＣｏＡならびに酢酸塩及びエタノールなどアセチル−ＣｏＡ由来生成物の合成のためのそれらの主要機構として、ウッド・ユングダール経路を使用する、偏性嫌気性細菌である（Ｒａｇｓｄａｌｅ，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ，１７８４：１８７３−１８９８，２００８）。
【０００４】
多くのアセトゲンは、少なくとも２つ以上の生成物を自然に生成する。しかしながら、これは、複数の生成物の生成が各個々の生成物の効率及び収率に有害であるため、商業的規模で必ずしも望ましくはない。具体的には、副生成物は、標的生成物の生合成経路から炭素を転用し、毒性の問題をもたらし、標的生成物の回収及び分離を妨げ、標的生成物に有利な発酵条件の制御を複雑化させ、汚染微生物の基質として働く可能性がある。
【０００５】
例えば、クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・リュングダリイ、クロストリジウム・ラグスダレイ（Ｋoｐｋｅ，Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，７７：５４６７−５４７５，２０１１）、及びブチリバクテリウム・メチロトロフィカム（Ｈｅｉｓｋａｎｅｎ，Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂ  Ｔｅｃｈｎｏｌ，４１  ３６２−３６７，２００７）などのアセトゲンは、副生成物として乳酸塩を生成し得る。この乳酸塩の生成は、エタノール、ブタノール、または２，３−ブタンジオールなどの標的生成物の効率及び収率を低減する。加えて、乳酸塩は、低濃度でさえクロストリジウム・オートエタノゲナムなどのアセトゲンに毒性である可能性があり（Ｋoｐｋｅ，Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，７７：５４６７−５４７５，２０１１）、他の細菌のための基質として働く可能性があり、乳酸塩が生成されるときの細菌汚染の可能性はますます。さらに、乳酸塩をエタノールなどの他の生成物から分離することは、煩雑な処理ステップを必要とする可能性がある。
【０００６】
したがって、乳酸塩などの副生成物の生成を低減または排除する微生物及び方法の強い必要性がある。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、乳酸塩生合成経路の酵素中に妨害突然変異を含む、カルボキシド栄養性（ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｒｏｐｈｉｃ）酢酸生成細菌を提供する。一実施形態では、妨害突然変異は、乳酸塩生合成経路の酵素の発現または活性を低減または排除する。
【０００８】
妨害突然変異は、乳酸塩を生成する細菌の能力に影響を及ぼす。一実施形態では、本発明の細菌は、親細菌と比較して減少した量の乳酸塩を生成する。一実施形態では、本発明の細菌は、乳酸塩を実質的に生成しない。
【０００９】
本発明の細菌は、エタノール、２，３−ブタンジオール、ギ酸塩、ピルビン酸塩、コハク酸塩、バリン、ロイシン、イソロイシン、リンゴ酸塩、フマル酸塩、２−オキソグルタレート（ｏｘｏｇｌｕｔｅｒａｔｅ）、クエン酸塩、及びシトラマレートのうちの１つ以上などの生成物を生成し得る。一実施形態では、本発明の細菌は、親細菌と比較して増加した量のエタノール、２，３−ブタンジオール、ギ酸塩、ピルビン酸塩、コハク酸塩、バリン、ロイシン、イソロイシン、リンゴ酸塩、フマル酸塩、２−オキソグルタレート（ｏｘｏｇｌｕｔｅｒａｔｅ）、クエン酸塩、及びシトラマレートのうちの１つ以上を生成する。
【００１０】
一実施形態では、乳酸塩生合成経路の酵素は、ピルビン酸塩を乳酸塩に自然に変換する酵素である。好ましい実施形態では、乳酸塩生合成経路の酵素は、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）である。
【００１１】
本発明の細菌は、クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・リュングダリイ、及びクロストリジウム・ラグスダレイなどの親細菌に由来してもよい。好ましい実施形態では、親細菌は、ＤＳＭＺ受託番号ＤＳＭ２３６９３下で寄託されるクロストリジウム・オートエタノゲナムである。
【００１２】
本発明は、ＣＯを含む基質の存在下で本発明の細菌を培養することを含み、それにより細菌が生成物を生成する、生成物を生成する方法をさらに提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ＬＤＨノックアウト戦略、及びスクリーニングのために使用されるプライマーを示す図である。
【図２】１組のゲル画像である。第１のゲル画像は、野生型（ｗ）及び接合完了体クローン６（６）における５’クロスオーバーのためのプライマーＯｇ２４ｒ／Ｏｇ３５ｆ及び３’クロスオーバーのためのプライマーＯｇ２１ｆ／Ｏｇ３６ｒを使用した、ノックアウトプラスミドの単一クロスオーバー統合に対するスクリーニングを示す。第２のゲル画像は、外側フランキングプライマーＯｇ３５ｆ／Ｏｇ３６ｒ及びＯｇ２１ｆ／Ｏｇ２４ｒを使用した、二重クロスオーバーに対するスクリーニングを示す。
【図３】プライマーＬｄｈＡＦ／Ｒを使用した、遺伝子ＩＤ：１２６８０３  Ｔａｒｇｅｔ  １２９Ｓに対するコロニーＰＣＲを示すゲル画像である。１００ｂｐのＰＣＲ産物が野生型の遺伝子型を示した一方で、約１．９ｋｂの産物サイズは、標的部位におけるグループＩＩイントロンの挿入を確認した。
【図４】プライマーＣａｔＰＲ／ＲｅｐＨＦを用いたプラスミド損失を示すゲル画像である。プラスミド損失を、耐性マーカー（ｃａｔＰ）の増幅及びグラム陽性複製起点（ｐＣＢ１０２）によって検査した。
【図５Ａ】基質として３０ｐｓｉの製鋼オフガス（４４％  ＣＯ、２２％  ＣＯ２、２％  Ｈ２、３２％  Ｎ２）を有する血清ボトル内の６日間の増殖後の、Ｃ．オートエタノゲナムのＨＰＬＣ分析を示すグラフである。
【図５Ｂ】基質として３０ｐｓｉの製鋼オフガス（４４％  ＣＯ、２２％  ＣＯ２、２％  Ｈ２、３２％  Ｎ２）を有する血清ボトル内の６日間の増殖後の、不活性化乳酸脱水素酵素を有するＣ．オートエタノゲナムのＨＰＬＣ分析を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明者らは、酢酸生成細菌中の乳酸塩生合成経路の妨害が、親微生物と比較してエタノール、２，３−ブタンジオール、ギ酸塩、コハク酸塩、２−オキソグルタレート（ｏｘｏｇｌｕｔｅｒａｔｅ）、バリン、ロイシン、及びイソロイシンなどの生成物の増加した、またはより効率的な生成をもたらし、かつコハク酸塩、２−オキソグルタレート（ｏｘｏｇｌｕｔｅｒａｔｅ）、バリン、ロイシン、及びイソロイシンの前駆体であるピルビン酸塩、リンゴ酸塩、フマル酸塩、及びクエン酸塩の増加した、またはより効率的な生成ももたらし得ることを発見した。バリン、ロイシン、ギ酸塩、及びピルビン酸塩の生成はまた、培地をこれらの化合物で補充する必要性を取り除き、さらなる費用節約をもたらし得る。さらに、細菌の乳酸塩生成の低減または排除は、細菌に対する乳酸塩の毒作用を低減または排除する。
【００１５】
本発明は、乳酸塩生合成経路の酵素中に妨害突然変異を含む、カルボキシド栄養性酢酸生成細菌を提供する。
【００１６】
「突然変異」は、本発明の細菌が由来する野生型または親微生物と比較した、本発明の細菌中の核酸またはタンパク質の修飾を指す。用語「遺伝子修飾」は、用語「突然変異」を包含する。一実施形態では、突然変異は、酵素をコードする遺伝子中の１つ以上のヌクレオチドの欠失、挿入、または置換であってもよい。別の実施形態では、突然変異は、酵素中の１つ以上のアミノ酸の欠失、挿入、または置換であってもよい。
【００１７】
典型的には、突然変異は、乳酸塩生合成経路の酵素の発現または活性を低減または排除（すなわち、妨害）する「妨害突然変異」である。妨害突然変異は、乳酸塩生合成経路の酵素または酵素をコードする遺伝子を部分的に不活性化、完全に不活性化、または欠失してもよい。妨害突然変異は、ノックアウト（ＫＯ）突然変異であってもよい。妨害突然変異は、乳酸塩の生合成を低減、阻止、または遮断するいずれの突然変異であってもよい。妨害突然変異は、例えば、乳酸塩生合成経路の酵素をコードする遺伝子中の突然変異、乳酸塩生合成経路の酵素をコードする遺伝子の発現に関与する遺伝子調節要素中の突然変異、乳酸塩生合成経路の酵素の活性を低減または阻害するタンパク質を生成する核酸の導入、または乳酸塩生合成経路の酵素の発現を阻害する核酸（例えば、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ）またはタンパク質の導入を含んでもよい。
【００１８】
妨害突然変異は、乳酸塩を生成しないか、もしくは実質的に生成しない、または細菌が由来する親細菌と比較して減少した量の乳酸塩を生成する、本発明の細菌をもたらす。例えば、本発明の細菌は、乳酸塩を生成しない可能性があるか、または親細菌よりも少なくとも約１％、３％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、もしくは９５％少ない乳酸塩を生成し得る。例えば、本発明の細菌は、約０．００１、０．０１、０．１０、０．３０、０．５０、または１．０ｇ／Ｌ未満の乳酸塩を生成し得る。対照的に、発酵条件に応じて、未修飾Ｃ．オートエタノゲナムＬＺ１５６１は、最大で約２ｇ／Ｌの乳酸塩を生成し得る。他の未修飾細菌の菌株は、さらに多くの乳酸塩を生成し得る。
【００１９】
妨害突然変異は、当該技術分野において既知の任意の方法を使用して導入されてもよい。例示的な方法は、異種遺伝子発現、遺伝子またはプロモータ挿入または欠失、改変遺伝子発現または不活性化、酵素工学、指向性進化、知識型設計、ランダム突然変異導入法、遺伝子シャフリング、及びコドン最適化を含む。そのような方法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，２００１、Ｐｌｅｉｓｓ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２２：６１１−６１７，２０１１、及びＰａｒｋ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｅｓｉｇｎ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，２０１０に記載される。妨害突然変異は、適宜、一本鎖もしくは二本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、またはこれらの組み合わせなどの核酸を使用して導入されてもよい。核酸は、構築物またはベクターと称されてもよく、１つ以上の調節要素、複製起点、マルチクローニング部位、及び／または選択可能マーカーを含んでもよい。一実施形態では、核酸は、親細菌中の乳酸塩生合成経路の酵素をコードする遺伝子を妨害するように適合されてもよい。一実施形態では、核酸は、核酸によってコードされる１つ以上の遺伝子の発現を可能にするように適合されてもよい。構築物またはベクターは、プラスミド（例えば、ｐＭＴＬ、ｐＩＭＰ、ｐＪＩＲ）、ウイルス（バクテリオファージを含む）、コスミド、及び人工染色体を含んでもよい。構築物は、親細菌の形質転換後に染色体外に留まってもよく、または細菌のゲノムへの統合のために適合されてもよい。したがって、構築物は、統合（例えば、相同組換え及び宿主のゲノムへの標的統合を可能にする領域）、または染色体外構築物の発現及び複製（例えば、複製起点、プロモータ、及び他の調節配列）を補助するように適合される核酸配列を含んでもよい。
【００２０】
核酸は、相同組換えを使用して導入されてもよい。そのような核酸は、妨害される遺伝子内の領域または該遺伝子に隣接した領域に相同のアームを含んでもよい（「相同アーム）」。これらの相同アームは、妨害される遺伝子内の相同組換え、及び１つ以上のヌクレオチドの導入、欠失、または置換を可能にする。相同アームがゲノム中の標的領域に対して１００％の相補性を有することが好ましいが、１００％の相補性は、配列がゲノム中の標的領域との標的組換えを可能にするために十分に相補的である限り必要ではない。典型的には、相同アームは、厳しい条件下で標的領域への交雑を可能にし得る相同性のレベルを有する（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９）。親細菌中の標的核酸配列（すなわち、親細菌中の標的遺伝子または標的領域の配列）の知識は概して、適切な相同アームを設計するのに十分である。例えば、ＬＤＨを妨害するために、本明細書に記載されるフランキング相同アームが使用されてもよい（例えば、配列番号１〜２）。Ｃ．リュングダリイにおいて、相同アームは、ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＰ００１６６６．１に基づき設計されてもよい。他の菌株に対して、相同アームは、他の公的に入手可能である核酸配列情報に基づき設計されてもよい。
【００２１】
「乳酸塩生合成経路」は、乳酸塩の生成をもたらす反応の経路である。一実施形態では、乳酸塩生合成経路は、ピルビン酸塩を乳酸塩に変換する１つ以上の酵素を含む。一実施形態では、乳酸塩生合成経路は、乳酸脱水素酵素の酵素を含む。細菌に応じて、いくつかの異なる酵素が乳酸塩生合成経路に関与してもよい。細菌が乳酸塩生合成経路中に２つ以上の酵素、例えば、ピルビン酸塩を乳酸塩に変換することが可能な２つ以上の酵素を含むとき、２つ以上のそのような酵素を妨害することは、単一の酵素を妨害することによって達成され得るレベルを超えて、生成物の生成を増加する効果を有し得る。一実施形態では、細菌は、ピルビン酸塩を乳酸塩に変換することが可能な２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれよりも多くの酵素中の妨害突然変異を含む。全てのそのような酵素の発現及び／または活性を妨害することが、生成物生成において何らかの利点を有し得る一方で、概して、本発明の利点、すなわち、１つ以上の主要または標的生成物の増加した生成を得るために、全てのそのような酵素の発現及び／または活性を妨害する必要はない。
【００２２】
一実施形態では、乳酸塩生合成経路の酵素は、酵素が乳酸脱水素酵素活性を有するように、ピルビン酸塩を乳酸塩に自然に（すなわち、内因性でまたは天然に）変換する。酵素は、それがまたピルビン酸塩を乳酸塩に変換する限り、追加の触媒作用を有してもよい。例えば、酵素は、乳酸脱水素酵素活性を有する任意の脱水素酵素であってもよい。ピルビン酸塩を乳酸塩に変換する酵素への妨害突然変異の導入は、その酵素の発現または活性を低減または排除（すなわち、「妨害」）する。
【００２３】
好ましい実施形態では、乳酸塩生合成経路の酵素は、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）である。妨害突然変異のＬＤＨへの導入は、ＬＤＨの発現または活性を低減または排除（すなわち、「妨害」）する。
【００２４】
本発明の細菌は、乳酸塩生合成経路の酵素中の妨害突然変異に加えて、乳酸塩生合成経路と関連しない１つ以上の遺伝子またはタンパク質の遺伝子修飾を含む、１つ以上の他の遺伝子修飾を含んでもよい。
【００２５】
１つの特定の実施形態では、本発明の細菌は、乳酸塩生合成経路の酵素中の妨害突然変異に加えて、またはその代わりに乳酸塩生合成経路の酵素の阻害因子を発現させてもよい。
【００２６】
「酵素活性」は広く、反応を触媒するための酵素の活性、酵素の量、または酵素の利用可能性を含むがこれらに限定されない、酵素的活性を指す。したがって、酵素活性を「減少させること」または「低減すること」は、反応を触媒するための酵素の活性、酵素の量、または酵素の利用可能性を減少させること、または低減することを含む。酵素は、それが第１の化合物の少なくとも一部分が第２の化合物に変換される反応を触媒することができる場合、第１の化合物または基質を第２の化合物または生成物に「変換することが可能」である。
【００２７】
用語「変異体」は、核酸及びタンパク質の配列が、従来技術において開示されるかまたは本明細書に例示される参照核酸及びタンパク質の配列などの、参照核酸及びタンパク質の配列から変化する、核酸及びタンパク質を含む。本発明は、参照核酸またはタンパク質と実質的に同じ機能を果たす変異体核酸またはタンパク質を使用して実施されてもよい。例えば、変異体タンパク質は、参照タンパク質と実質的に同じ機能を果たすか、または実質的に同じ反応を触媒してもよい。変異遺伝子は、参照遺伝子と同じ、または実質的に同じタンパク質をコードしてもよい。変異体プロモータは、参照プロモータと実質的に同じ、１つ以上の遺伝子の発現を促進するための能力を有してもよい。
【００２８】
参照核酸またはタンパク質と実質的に同じ活性レベルを有する変異体核酸またはタンパク質は、本明細書において「機能的に同等の変異体」と称されてもよい。一例として、機能的に同等の核酸変異体は、対立遺伝子変異型、遺伝子のフラグメント、突然変異遺伝子、多型などを含んでもよい。他の微生物からの相同遺伝子もまた、機能的に同等の変異体の例である。これらは、クロストリジウム・アセトブチリクム、クロストリジウム・ベイジェリンキ、またはクロストリジウム・リュングダリイなどの種の相同遺伝子を含み、それらの詳細は、ＧｅｎｂａｎｋまたはＮＣＢＩなどのウェブサイト上で公的に入手可能である。機能的に同等の変異体はまた、配列が特定の生物に対するコドン最適化の結果として変化する核酸を含む。核酸の機能的に同等の変異体は、好ましくは、参照核酸と少なくとも約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９８％、またはそれを超える核酸配列同一性（相同性パーセント）を有する。タンパク質の機能的に同等の変異体は、好ましくは、参照タンパク質と少なくとも約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９８％、またはそれを超えるアミノ酸同一性（相同性パーセント）を有する。変異体核酸またはタンパク質の機能同等性は、当該技術分野において既知の任意の方法を使用して評価され得る。
【００２９】
しかしながら、変異体核酸またはタンパク質はまた、参照核酸またはタンパク質と比較して減少した活性レベルを有する可能性がある。例えば、変異体核酸は、減少した発現レベルを有する可能性があるか、または変異酵素は、参照核酸または酵素のそれぞれと比較して、特定の反応を触媒する能力が減少する可能性がある。乳酸塩生合成経路中の酵素の活性を評価するための酵素アッセイ及びキットは、当該技術分野において既知である（Ｗａｎｇ，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１９５：４３７３−４３８６，２０１３、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（ＭＡＫ０６６），Ｔｈｅｒｍｏ（８８９５３）、Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ＬＳ００２７５５））。
【００３０】
核酸は、当該技術分野において既知の任意の方法を使用して、本発明の細菌に送達されてもよい。例えば、核酸は、ネイキッド核酸として送達されてもよく、または１つ以上の薬剤（例えば、リポソーム）で配合されてもよい。制限阻害因子は、ある特定の実施形態で使用され得る（Ｍｕｒｒａｙ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｍｏｌｅｃ  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｖ，６４：４１２−４３４，２０００）。一例として、形質転換（形質導入またはトランスフェクションを含む）は、エレクトロポレーション、超音波処理、ポリエチレングリコール媒介形質転換、化学的なもしくは自然の能力、プロトプラスト形質転換、プロファージ誘発、または共役によって達成されてもよい（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９を参照されたい）。エレクトロポレーションの使用は、クロストリジウム・リュングダリイ（Ｋｏｅｐｋｅ，ＰＮＡＳ，１０７：１３０８７−１３０９２，２０１０、国際公開第ＷＯ／２０１２／０５３９０５号）、クロストリジウム・オートエタノゲナム（国際公開第ＷＯ／２０１２／０５３９０５号）、クロストリジウム・アセチカム（Ｓｃｈｉｅｌ−Ｂｅｎｇｅｌｓｄｏｒｆ，Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｂｉｏｌ，１５：２１９１−２１９８，２０１２）、及びアセトバクテリウム  ウッディイ（Ｓｔｒaｔｚ，Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，６０：１０３３−１０３７，１９９４）を含む、いくつかのカルボキシド栄養性アセトゲンに対して報告されている。エレクトロポレーションの使用はまた、クロストリジウム・アセトブチリクム（Ｍｅｒｍｅｌｓｔｅｉｎ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１０：１９０−１９５，１９９２）、及びクロストリジウム・セルロリティカム（Ｊｅｎｎｅｒｔ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１４６：３０７１−３０８０，２０００）を含むクロストリジウムにおいても報告されている。プロファージ誘発は、クロストリジウム・スカトロゲネス（Ｐａｒｔｈａｓａｒａｔｈｙ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｃａｔｏｌｏｇｅｎｅｓ  ＡＴＣＣ  ２５７７５  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｕｔａｎｔｓ，Ｍａｓｔｅｒｓ  Ｐｒｏｊｅｃｔ，Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｋｅｎｔｕｃｋｙ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，２０１０）を含むカルボキシド栄養性アセトゲンに対して実証されており、共役は、クロストリジウム  ディフィシル（Ｈｅｒｂｅｒｔ，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ，２２９：１０３−１１０，２００３）及びクロストリジウム／アセトブイリカム（ａｃｅｔｏｂｕｙｌｉｃｕｍ）（Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｊ  Ｇｅｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１３６：８１９−８２６，１９９０）を含む多くのクロストリジウムに対して記載されている。ある特定の実施形態では、活性制限酵素系を有することによって、本発明の細菌への核酸の導入前に核酸をメチル化する必要がある場合がある（国際公開第ＷＯ２０１２／１０５８５３号）。
【００３１】
用語「組換え体」は、核酸、タンパク質、または微生物が遺伝子修飾、突然変異、または組換えの産物であることを示す。概して、用語「組換え体」は、微生物の２つ以上の異なる菌株または種など、複数の源に由来する遺伝物質を含有する、またはそれによってコードされる核酸、タンパク質、または微生物を指す。本明細書で使用される場合、用語「組換え体」はまた、内因性核酸またはタンパク質の突然変異型を含む、突然変異した核酸またはタンパク質を含む微生物を記載するために使用されてもよい。
【００３２】
「親細菌」は、本発明の細菌を生成するために使用される細菌である。親細菌は、自然発生する細菌（すなわち、野生型細菌）またはすでに修飾された細菌（すなわち、突然変異もしくは組換え細菌）であってもよい。本発明の細菌は、親細菌と比較して少量の酵素を発現するように修飾されてもよく、または本発明の細菌は、親細菌によって発現する酵素を発現しないように修飾されてもよい。一実施形態では、親細菌は、クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・リュングダリイ、またはクロストリジウム・ラグスダレイである。好ましい実施形態では、親細菌は、ＤＳＭＺ受託番号ＤＳＭ２３６９３下で寄託されるクロストリジウム・オートエタノゲナム（すなわち、クロストリジウム・オートエタノゲナムＬＺ１５６１）である。
【００３３】
用語「〜由来の」は、核酸、タンパク質、または微生物が異なる（例えば、親または野生型）核酸、タンパク質、または微生物から修飾または適合されて、新しい核酸、タンパク質、または微生物を生成することを示す。そのような修飾または適合は、典型的には、核酸または遺伝子の挿入、欠失、突然変異、または置換を含む。概して、本発明の細菌は、親細菌由来である。一実施形態では、本発明の細菌は、クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・リュングダリイ、またはクロストリジウム・ラグスダレイ由来である。好ましい実施形態では、本発明の細菌は、ＤＳＭＺ受託番号ＤＳＭ２３６９３下で寄託されるクロストリジウム・オートエタノゲナムＬＺ１５６１由来である。
【００３４】
一実施形態では、親細菌は、クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・リュングダリイ、クロストリジウム・ラグスダレイ、クロストリジウム・コスカッティ、クロストリジウム・カルボキシディボランス、クロストリジウム・ドラケイ、クロストリジウム・スカトロゲネス、クロストリジウム・アセチカム、クロストリジウム・フォルミコアセチカム、クロストリジウム・マグナム、アセトバクテリウム  ウッディイ、アルカリバクラム・バッチィ、ムーレラ・サーモアセチカ、スポロミュサ・オヴァタ、ブチリバクテリウム・メチロトロフィカム、ブラウティア・プロダクタ、ユーバクテリウム・リモスム、及びサーモアナエロバクター・キウヴィの種を含むカルボキシド栄養性酢酸生成細菌の群から選択される。これらのカルボキシド栄養性酢酸生成細菌は、一酸化炭素（ＣＯ）及び二酸化炭素（ＣＯ２）などの気体の１炭素原子源上で化学独立栄養的に増殖し、嫌気性条件下でエネルギー源として一酸化炭素（ＣＯ）及び／または水素（Ｈ２）を使用し、アセチル−ＣｏＡ、酢酸塩、及び他の生成物を生成するそれらの能力によって定義される。それらは、同じ発酵モード、すなわちウッド・ユングダールまたは還元的アセチル−ＣｏＡ経路を共有し、一酸化炭素脱水素酵素（ＣＯＤＨ）、ヒドロゲナーゼ、ギ酸脱水素酵素、ホルミルテトラヒドロ葉酸シンテターゼ、メチレンテトラヒドロ葉酸脱水素酵素、ホルミルテトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼ、メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ、及び一酸化炭素脱水素酵素／アセチル−ＣｏＡシンターゼ（ＣＯＤＨ／ＡＣＳ）からなる酵素セットの存在によって定義され、その組み合わせは、この種の細菌に特徴的かつ特有である（Ｄｒａｋｅ，Ｔｈｅ  Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ，３５４−４２０，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２００６）。基質を、生成物が直接またはアセチル−ＣｏＡを介して形成されるバイオマス、二次代謝産物、及びピルビン酸塩に変換する糖発酵細菌の化学合成従属栄養増殖とは対照的に、アセトゲンは、基質を、生成物、バイオマス、及び二次代謝産物が形成されるアセチル−ＣｏＡに直接誘導する。
【００３５】
好ましい実施形態では、本発明の細菌は、乳酸脱水素酵素を含む親微生物由来であり、本発明の細菌は、乳酸脱水素酵素中の妨害突然変異を含む。例えば、親微生物は、ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＥＩ９０７３６．１を含む核酸配列、またはＧｅｎＢａｎｋ  ＣＰ００６７６３．１、ＫＥＧＧ  ＣＡＥＴＨＧ＿１１４７、もしくはＧｅｎＢａｎｋ  ＨＱ８７６０２５．１を含むアミノ酸配列を含む、Ｃ．オートエタノゲナムであってもよい。親微生物は、ＧｅｎＢａｎｋ  ＹＰ＿００３７８１３６８．１を含む核酸配列、またはＧｅｎＢａｎｋ  ＣＰ００１６６６．１もしくはＫＥＧＧ  ＣＬＪＵ＿ｃ３２１９０を含むアミノ酸配列を含む、Ｃ．リュングダリイであってもよい。親微生物は、ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＥＩ９０７３７．１を含む核酸配列、またはＧｅｎＢａｎｋ  ＨＱ８７６０２６．１を含むアミノ酸配列を含む、Ｃ．ラグスダレイであってもよい。他の親細菌は、他の核酸及びアミノ酸配列を有してもよい。
【００３６】
「カルボキシド栄養細菌（ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｒｏｐｈ）」は、高濃度の一酸化炭素（ＣＯ）に耐えることが可能である微生物である。典型的には、本発明の細菌は、カルボキシド栄養細菌である。
【００３７】
本発明の細菌は、クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・リュングダリイ、クロストリジウム・ラグスダレイの種を含むカルボキシド栄養性クロストリジウム、及びクロストリジウム・オートエタノゲナムＪＡＩ−１Ｔ（ＤＳＭ１００６１）（Ａｂｒｉｎｉ，Ａｒｃｈ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１６１：３４５−３５１，１９９４）、クロストリジウム・オートエタノゲナムＬＢＳ１５６０（ＤＳＭ１９６３０）（国際公開第ＷＯ２００９／０６４２００号）、クロストリジウム・オートエタノゲナムＬＺ１５６１（ＤＳＭ２３６９３）、クロストリジウム・リュングダリイＰＥＴＣＴ（ＤＳＭ１３５２８＝ＡＴＣＣ  ５５３８３）（Ｔａｎｎｅｒ，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｓｙｓｔ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，４３：２３２−２３６，１９９３）、クロストリジウム・リュングダリイＥＲＩ−２（ＡＴＣＣ  ５５３８０）（米国特許第５，５９３，８８６号）、クロストリジウム・リュングダリイＣ−０１（ＡＴＣＣ  ５５９８８）（米国特許第６，３６８，８１９号）、クロストリジウム・リュングダリイＯ−５２（ＡＴＣＣ  ５５９８９）（米国特許第６，３６８，８１９号）、クロストリジウム・ラグスダレイＰ１１Ｔ（ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−６２２）（国際公開第ＷＯ２００８／０２８０５５号）の菌株を含むがこれらに限定されない関連分離株、「クロストリジウム・コスカッティ」（米国公開第２０１１／０２２９９４７号）などの関連分離株、またはクロストリジウム・リュングダリイＯＴＡ−１（Ｔｉｒａｄｏ−Ａｃｅｖｅｄｏ，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｅｔｈａｎｏｌ  ｆｒｏｍ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｇａｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ，ＰｈＤ  ｔｈｅｓｉｓ，Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，２０１０）などの突然変異した菌株のクラスターに由来してもよい。
【００３８】
これらの菌株は、クロストリジウムｒＲＮＡクラスターＩ内のサブクラスターを形成し、それらの１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子は、約３０％の同様の低いＧＣ含有量を有して９９％を超えて同一である。しかしながら、ＤＮＡ−ＤＮＡ再会合及びＤＮＡフィンガープリント実験は、これらの菌株が異なる種に属することを示した（国際公開第ＷＯ２００８／０２８０５５号）。このクラスターの菌株は、同様の遺伝子型及び表現型の両方を有する共通の特徴によって定義され、それらは全て、同じエネルギー節約及び発酵代謝のモードを共有する。さらに、このクラスターの菌株は、シトクロムを欠いており、Ｒｎｆ複合体を介してエネルギーを節約する。このクラスターの全ての種は、同様の形態及びサイズを有し（対数増殖細胞は、０．５〜０．７×３〜５μｍである）、中温性であり（最適増殖温度は３０〜３７℃の間）、偏性嫌気性である（Ａｂｒｉｎｉ，Ａｒｃｈ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１６１：３４５−３５１，１９９４、Ｔａｎｎｅｒ，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｓｙｓｔ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，４３：２３２−２３６，１９９３、及び国際公開第ＷＯ２００８／０２８０５５号）。さらに、それらは全て、同じｐＨ範囲（ｐＨ４〜７．５、最適初期ｐＨは５．５〜６）、同様の増殖率を有するＣＯ含有ガス上の強力な独立栄養増殖、ならびに主な発酵最終生成物としてのエタノール及び酢酸、及びある特定の条件下で形成される少量の２，３‐ブタンジオール及び乳酸と同様の代謝プロファイルなど、同じ主要な系統発生的形質を共有する（Ａｂｒｉｎｉ，Ａｒｃｈ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１６１：３４５−３５１，１９９４、Ｋoｐｋｅ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２２：３２０−３２５，２０１１、Ｔａｎｎｅｒ，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｓｙｓｔ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，４３：２３２−２３６，１９９３、及び国際公開第ＷＯ２００８／０２８０５５号）。インドール生成を３つ全ての種で同様に観察した。
【００３９】
しかしながら、種は、種々の糖（例えば、ラムノース、アラビノース）、酸（例えば、グルコン酸塩、クエン酸塩）、アミノ酸（例えば、アルギニン、ヒスチジン）、または他の基質（例えば、べタイン、ブタノール）の基質利用が異なった。さらに、特定のビタミン（例えば、チアミン、ビオチン）に栄養要求性である種と、そうではない種があることがわかった。ガス取り込みに関与するウッド・ユングダール経路遺伝子の組織及び数は、酢酸及びアミノ酸配列の差に関わらず、全ての種で同じであることが分かっている（Ｋoｐｋｅ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２２：３２０−３２５，２０１１）。また、カルボン酸のそれらの対応するアルコールへの還元が、これらの微生物の範囲内で示されている（Ｐｅｒｅｚ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ，１１０：１０６６−１０７７，２０１２）。したがって、これらの形質は、クロストリジウム・オートエタノゲナムまたはクロストリジウム・リュングダリイなどの１つの微生物に特有なのではなく、むしろカルボキシド栄養性、エタノール合成クロストリジウムに対して一般的な形質であり、性能の差がある可能性はあるが、機構がこれらの菌株にわたって同様に作用することが予想され得る。
【００４０】
「アセトゲン」は、嫌気呼吸の生成物として酢酸塩を生成する、または生成することが可能である微生物である。典型的には、アセトゲンは、エネルギー節約のため、かつアセチル−ＣｏＡならびに酢酸塩などのアセチル−ＣｏＡ由来生成物の合成のためのそれらの主要機構として、ウッド・ユングダール経路を使用する、偏性嫌気性細菌である（Ｒａｇｓｄａｌｅ，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ，１７８４：１８７３−１８９８，２００８）。好ましい実施形態では、本発明の細菌は、アセトゲンである。
【００４１】
本発明は、ＣＯを含む基質の存在下で本発明の細菌を培養することを含み、それにより細菌が生成物を生成する、生成物を生成する方法をさらに提供する。
【００４２】
用語「基質」は、本発明の細菌のための炭素及び／またはエネルギー源を指す。典型的には、基質は、一酸化炭素（ＣＯ）を含むガス状基質である。基質は、体積で約２０％〜１００％、２０％〜７０％、３０％〜６０％、または４０％〜５５％のＣＯなど、大きな割合のＣＯを含んでもよい。特定の実施形態では、基質は、体積で約２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、または６０％のＣＯを含む。本発明の細菌は概して、基質中のＣＯの少なくとも一部分を生成物に変換する。
【００４３】
基質が水素（Ｈ２）を含有する必要はないが、Ｈ２の存在は、生成物形成に有害であるはずはなく、改善した全体的効率をもたらし得る。例えば、特定の実施形態では、基質は、２：１、１：１、または１：２のＨ２：ＣＯのおよその比率を含んでもよい。一実施形態では、基質は、体積で約３０％、２０％、１５％、または１０％未満のＨ２を含む。他の実施形態では、基質は、低濃度のＨ２、例えば、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、または１％未満のＨ２を含む。さらなる実施形態では、基質は、Ｈ２を実質的に含有しない。
【００４４】
基質はまた、二酸化炭素（ＣＯ２）、例えば、体積で約１％〜８０％または１％〜３０％のＣＯ２を含有してもよい。一実施形態では、基質は、体積で約２０％未満のＣＯ２を含む。さらなる実施形態では、基質は、体積で約１５％、１０％、または５％未満のＣＯ２を含む。別の実施形態では、基質は、ＣＯ２を実質的に含有しない。
【００４５】
基質は典型的にはガス状であるが、基質はまた、代替の形態で提供されてもよい。例えば、基質は、マイクロバブル分散物発生装置（Ｈｅｎｓｉｒｉｓａｋ，Ａｐｐｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１０１：２１１−２２７，２００２）を使用して、ＣＯ含有ガスで飽和した液体中に溶解されてもよい。さらなる例として、基質は、固体支持体上に吸着されてもよい。
【００４６】
基質は、自動車の排出ガスまたはバイオマスガス化からなど、産業プロセスの副生成物として得られる、または何らかの他の源からの排ガスであってもよい。ある特定の実施形態では、産業プロセスは、鉄鋼製造などの鉄金属生成物製造、非鉄金属生成物製造、石油精製プロセス、石炭ガス化、電力生成、カーボンブラック生成、アンモニア生成、メタノール生成、及びコークス製造からなる群から選択される。これらの実施形態では、ＣＯ含有ガスは、任意の従来の方法を使用して、それが大気中に放出される前に産業プロセスから捕捉されてもよい。ＣＯは、合成ガス、すなわち、一酸化炭素及び水素を含むガスの一成分であってもよい。産業プロセスから生成されるＣＯは通常、燃焼処理されてＣＯ２を生成し、したがって、本発明は、ＣＯ２温室効果ガス排出を低減することにおいて特定の有用性を有する。基質の組成は、反応の効率及び／または費用に著しい影響を及ぼし得る。例えば、酸素（Ｏ２）の存在は、嫌気性発酵プロセスの効率を低減し得る。基質の組成に応じて、基質を処理、スクラブ、またはろ過して、毒素、望ましくない成分、またはちり粒子などの任意の望ましくない不純物を除去する、及び／または所望の成分の濃度を増加させることが望ましくあり得る。
【００４７】
本発明の細菌は、１つ以上の生成物を生成するために培養されてもよい。概して、本発明の細菌は、エタノール、２，３−ブタンジオール、ギ酸塩、ピルビン酸塩、コハク酸塩、バリン、ロイシン、イソロイシン、リンゴ酸塩、フマル酸塩、２−オキソグルタレート（ｏｘｏｇｌｕｔｅｒａｔｅ）、クエン酸塩、及びシトラマレートからなる群から選択される１つ以上などの生成物を生成する。本発明の細菌はまた、アセト乳酸塩またはリンゴ酸アセトインなどの他の生成物も生成し得る。
【００４８】
好ましい実施形態では、本発明の細菌は、親細菌と比較して増加した量のエタノール、２，３−ブタンジオール、ギ酸塩、ピルビン酸塩、コハク酸塩、バリン、ロイシン、イソロイシン、リンゴ酸塩、フマル酸塩、２−オキソグルタレート（ｏｘｏｇｌｕｔｅｒａｔｅ）、クエン酸塩、及びシトラマレートのうちの１つ以上を生成する。例えば、本発明の細菌は、本発明の細菌が由来する親細菌と比較して約１％、３％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％、または５００％多い１つ以上の生成物を生成し得る。生成物生成のこの増加は、少なくとも部分的に、乳酸塩生合成経路の酵素中の妨害突然変異によるものである可能性があり、それは、乳酸塩の生成から離れて、他の生成物の生成に向かって炭素及びエネルギーを転用する。
【００４９】
用語「主生成物」は、最高の濃度及び／または収率で生成される単一の生成物を指す。一実施形態では、主生成物は、エタノールまたは２，３−ブタンジオールである。
【００５０】
加えて、１つ以上の生成物の生成を１つ以上の他の生成物よりも選好するように、本発明の細菌を操作することが可能である。例えば、ピルビン酸塩の乳酸塩への変換を妨害することは、バリン、ロイシン、及びイソロイシンの生成よりも２，３−ブタンジオール、ギ酸塩、リンゴ酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩、及び２−オキソグルタレート（ｏｘｏｇｌｕｔｅｒａｔｅ）の生成を選好し得る。
【００５１】
本明細書において、生成物（例えば、クエン酸塩）の記述は、生成物の塩（例えば、クエン酸塩）及び酸（例えば、クエン酸）両方の形態を含む。多くの場合、生成物の塩及び酸形態の混合物は、ブロスのｐＨに応じて変化する比率で発酵ブロス中に存在する。さらなる例として、用語「酢酸塩」は、酢酸塩及び酢酸を包含し、用語「ギ酸塩」は、ギ酸塩及びギ酸を包含し、用語「リンゴ酸塩」は、リンゴ酸塩及びリンゴ酸を包含し、かつ用語「乳酸塩」は、乳酸塩及び乳酸を包含する。
【００５２】
文脈上別段の解釈が要求される場合を除いて、１つ以上の異性体（例えば、Ｄ、Ｌ、メソ、Ｓ、Ｒ、シス、またはトランス形態）で存在する本明細書の任意の化合物への言及は、概して、化合物の任意の１つ以上のそのような異性体を包含すると解釈されるべきである。例えば、「乳酸塩」への言及は、概して、乳酸塩のＤ及びＬ異性体の両方を包含する。
【００５３】
典型的には、培養はバイオリアクタ内で実施される。用語「バイオリアクタ」は、連続撹拌槽反応器（ＣＳＴＲ）、固定化細胞反応器（ＩＣＲ）、トリクルベッド反応器（ＴＢＲ）、気泡塔、ガスリフト発酵槽、静的ミキサ、またはガス−液体接触に好適な他の容器もしくは他の装置などの１つ以上の容器、塔、または配管からなる培養／発酵装置を含む。いくつかの実施形態では、バイオリアクタは、第１の増殖反応器及び第２の培養／発酵反応器を含んでもよい。基質は、これらの反応器のうちの１つまたは両方に提供されてもよい。本明細書で使用される場合、用語「培養」及び「発酵」は、同じ意味で使用される。これらの用語は、培養／発酵プロセスの増殖期及び生成物生合成期の両方を包含する。
【００５４】
培養物は概して、細菌の増殖を可能にするのに十分な栄養素、ビタミン、及び／または無機物を含有する水性培地中で維持される。好ましくは、水性培地は、最小嫌気性微生物増殖培地である。好適な培地は、当該技術分野において既知であり、例えば、米国特許第５，１７３，４２９号、米国特許第５，５９３，８８６号、及び国際公開第ＷＯ２００２／００８４３８号に記載される。
【００５５】
培養／発酵は、望ましくは、標的生成物の生成のための適切な条件下で実施されるべきである。考慮すべき反応条件は、圧力（またはＣＯの分圧）、温度、ガス流速、液体流速、培地ｐＨ、培地酸化還元電位、撹拌速度（連続撹拌槽反応器を使用する場合）、接種レベル、液相中のＣＯが制限的にならないことを確実にするための最大ガス基質濃度、及び生成物阻害を回避するための最大生成物濃度を含む。具体的には、ＣＯ含有基質の導入速度は、生成物がＣＯ制限条件下での培養によって消費され得るため、液相中のＣＯの濃度が制限的にならないことを確実にするために制御されてもよい。
【００５６】
発酵プロセスと関連して使用される場合、用語「効率を増加させること」、「増加した効率」などは、発酵を触媒する微生物の増殖速度、増殖及び／または生成物生成速度、消費される基質の体積当たり生成される所望の生成物（アルコールなど）の体積、所望の生成物の生成速度または生成レベル、及び発酵の他の副生成物と比較した生成される所望の生成物の相対的比率のうちの１つ以上を増加させることを含むがこれらに限定されない。
【００５７】
上昇した圧力でバイオリアクタを動作させることは、気相から液相へのＣＯ物質移動の増加した速度を可能にする。したがって、概して、大気圧よりも高い圧力で培養／発酵を実施することが好ましい。また、所与のＣＯ変換速度が部分的に基質保持時間の関数であり、かつ保持時間がバイオリアクタの必要な体積を示すため、加圧システムの使用は、必要なバイオリアクタの体積、及びその結果として培養／発酵装置の資本コストを大幅に低減することができる。米国特許第５，５９３，８８６号における例によると、反応器体積は、反応器動作圧力の増加に線形比例して低減され得る。つまり、１０気圧の圧力で動作するバイオリアクタは、１気圧の圧力で動作するバイオリアクタの１０分の１の体積である必要しかない。加えて、国際公開第ＷＯ２００２／００８４３８号は、それぞれ１５０ｇ／Ｌ／日及び３６９ｇ／Ｌ／日のエタノール生産性をもたらす、３０ｐｓｉｇ及び７５ｐｓｉｇの圧力下で実施されるガス−エタノール発酵を記載する。対照的に、大気圧で同様の培地及び入力ガス組成を使用して実施される発酵は、１日、１リットル当たり１０〜２０倍少ないエタノールを生成することがわかった。
【００５８】
本発明の方法は、１つ以上の生成物を回収または精製することをさらに含んでもよい。例えば、エタノールまたはエタノール及び／もしくは他の生成物を含油する混合アルコール流は、部分蒸留、蒸発、パーベーパレーション、または抽出発酵（例えば、液液抽出）を含む、当該技術分野において既知の任意の方法によって発酵ブロスから回収されてもよい。酢酸塩または酸などの副生成物はまた、活性炭吸着システム電気透析、または連続ガスストリッピングを含む、当該技術分野において既知の任意の方法を使用して、発酵ブロスから回収されてもよい。一実施形態では、生成物は、連続的にバイオリアクタからブロスの一部分を除去し、（便利にろ過によって）ブロスから微生物細胞を分離し、ブロスから生成物を回収することによって、発酵ブロスから回収されてもよい。分離した微生物細胞は、バイオリアクタに戻されてもよい。加えて、無細胞透過物もまた、任意にビタミンＢなどの栄養素の補充を伴い、生成物が除去された後にバイオリアクタに戻されてもよい。
【００５９】
コハク酸塩は、例えば、酸性化、イオン交換クロマトグラフィと併せた電気透析（Ｓｏｎｇ，Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂ  Ｔｅｃｈｎｏｌ，３９：３５２−３６１，２００６）、ろ過及び硫酸の添加と併せたＣａ（ＯＨ）での沈殿（Ｌｅｅ，Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，７９：１１−２２，２００８）、またはトリ−ｎ−オクチルアミンなどのアミン系抽出剤を用いた反応抽出（Ｈｕｈｅｔ，Ｐｒｏｃ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ４１：１４６１−１４６５，２００６）を使用して、発酵ブロスから回収され得る。全ての方法に対して、塩ではなく遊離酸形態を有することが極めて重要である。しかしながら、コハク酸のためのほとんどのバイオテクノロジー生成プロセスは、６〜７の中性またはわずかに酸性のｐＨで動作する。コハク酸のｐＫａ（ｐＫａ＝４．１６及び５．６１）を所与として、コハク酸の大部分は、これらの条件下で遊離酸としてではなく塩として存在する。しかしながら、Ｃ．オートエタノゲナム及び他のカルボキシド栄養性アセトゲンは、望ましくは４〜６の低いｐＨで耐性を有し、かつ増殖することが既知である。
【００６０】
バリン、ロイシン、及びイソロイシンなどの分枝鎖アミノ酸は、バイオマスの濃縮（例えば、逆浸透を介した）、結晶化、もしくは除去（例えば、限外ろ過もしくは遠心分離）、またはイオン交換クロマトグラフィ（Ｉｋｅｄａ，Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌ−Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ，１−３５，２００３）を使用して、発酵ブロスから回収されてもよい。
【００６１】
２，３−ブタンジオール、ギ酸塩、２−オキソグルタレート（ｏｘｏｇｌｕｔｅｒａｔｅ）、及び他の生成物は、当該技術分野において既知の任意の方法を使用して、発酵ブロスから回収されてもよい。例えば、低濃度の２，３−ブタンジオールは、選択的イオン透過膜にわたる好適な電位の印加を伴う、電気透析などの膜技術を使用して回収されてもよい。他の好適な技術は、一価イオンが圧力下で膜を選択的に通過するナノろ過を含む。
実施例
【００６２】
以下の実施例は、本発明をさらに例示するが、当然のことながら、いかなる方法によってもその範囲を制限すると解釈されるべきではない。
【実施例１】
【００６３】
本実施例は、一般的な材料及び方法を記載する。
【００６４】
オートエタノゲナムＤＳＭ１００６１及びＤＳＭ２３６９３（ＤＳＭ１００６１の誘導体ならびにＣ．リュングダリイＤＳＭ１３５２８は、ＤＳＭＺ（Ｔｈｅ  Ｇｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ，Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒａsｅ  ７  Ｂ，３８１２４  Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から供給された。Ｃ．ラグスダレイＡＴＣＣ  ＢＡＡ−６２２は、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ  ２０１０８，ＵＳＡ）から供給された。大腸菌ＤＨ５αは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  （Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ  ９２００８，ＵＳＡ）から供給された。
【００６５】
大腸菌を、ＬＢ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）培地中で、３７℃で好気増殖させた。固体培地は、１．５％寒天を含有した。
【表１】
0006783658.tif 000002
【００６６】
クロストリジウム菌株を標準的な嫌気性技術（Ｈｕｎｇａｔｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，３Ｂ：１１７−１３２，１９６９、Ｗｏｌｆｅ，Ａｄｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ，６：１０７−１４６，１９７１）を使用して、ｐＨ５．６でＰＥＴＣ培地中で３７℃において増殖させた。フルクトース（従属栄養増殖）またはヘッドスペース（独立栄養増殖）内の３０ｐｓｉのＣＯ含有製鉄ガス（Ｎｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ  Ｓｔｅｅｌ  ｓｉｔｅ（Ｇｌｅｎｂｒｏｏｋ，ＮＺ）から回収。組成：４４％  ＣＯ、３２％  Ｎ２、２２％  ＣＯ２、２％  Ｈ２）を基質として使用した。固体培地に対して、１．２％バクトアガー（ＢＤ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ  ０７４１７，ＵＳＡ）を添加した。
【表２】
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【００６７】
唯一のエネルギー及び炭素源としてＣＯ含有製鉄ガスを使用して、３７℃において１．５Ｌバイオリアクタ内で、Ｃ．オートエタノゲナムＤＳＭ２３６９３を用いた発酵を実施した。ＭｇＣｌ、ＣａＣｌ２（０．５ｍＭ）、ＫＣｌ（２ｍＭ）、Ｈ３ＰＯ４（５ｍＭ）、Ｆｅ（１００μＭ）、Ｎｉ、Ｚｎ（５μＭ）、Ｍｎ、Ｂ、Ｗ、Ｍｏ、Ｓｅ（２μＭ）を含有する定義された培地を調製した。培地をバイオリアクタ内に移し、４５分間１２１℃で加熱滅菌した。加熱滅菌後、培地をチアミン、パントテン酸塩（０．０５ｍｇ／Ｌ）、及びビオチン（０．０２ｍｇ／Ｌ）で補充し、３ｍＭのシステイン−ＨＣｌで還元した。嫌気性条件を達成するために、反応を０．２μｍのフィルタを通して窒素を注入した。接種前、ガスをＣＯ含有製鉄ガスに切り替え、反応器に連続的に供給した。ガス流量を最初に８０ｍＬ／分で設定し、中間指数増殖期中に２００ｍＬ／分に増加させたと同時に、撹拌を２００ｒｐｍから３５０ｒｐｍに増加させた。Ｎａ２Ｓを０．２５ｍＬ／時でバイオリアクタ内に添加した。いったんＯＤ６００が０．５に達すると、バイオリアクタを１．０ｍＬ／分の速度の連続モードに切り替えた（希釈率０．９６ｄ−１）。試料を採取して、バイオマス及び代謝産物を測定した。加えて、流入及び流出ガスのヘッドスペース分析を定期的に実施した。
【００６８】
２つの取り付けられたチャネルを備えたＶａｒｉａｎ  ＣＰ−４９００マイクロＧＣ上で、ヘッドスペースのガス組成を測定した。チャネル１が、７０℃、２００ｋＰａのアルゴン、及び４．２秒のバックフラッシュ時間で動作する１０ｍ  Ｍｏｌ−ｓｉｅｖｅカラムであった一方で、チャネル２は、９０℃、１５０ｋＰａのヘリウムで、かつバックフラッシュなしで動作する１０ｍ  ＰＰＱカラムであった。両方のチャネルに対する注入器温度は、７０℃であった。実行時間を１２０秒に設定したが、全ての対照のピークは、通常１００秒前に溶出する。  
【００６９】
３５℃で動作するＲＩＤ（示差屈折率検出器）及び６０℃で保持されたＡｌｌｔｅｃｈ  ＩＯＡ−２０００有機酸カラム（１５０×６．５ｍｍ、粒径５μｍ）を備えた、Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００  Ｓｅｒｉｅｓ  ＨＰＬＣシステムを使用して、代謝最終産物のＨＰＬＣ分析を実施した。微酸性水を０．７ｍＬ／分の流速での移動相として使用した（０．００５Ｍ  Ｈ２ＳＯ４）。タンパク質及び他の細胞残渣を除去するために、４００μＬの試料を１００μＬの２％（ｗ／ｖ）５−スルホサリチル酸と混合し、３分間１４，０００×ｇで遠心分離して、沈殿残渣を分離した。次いで、１０μＬの上清を分析のためにＨＰＬＣ内に注入した。
【００７０】
Ｓｕｐｅｌｃｏ  ＰＤＭＳ  １００  １ｃｍファイバ、Ａｌｌｔｅｃｈ  ＥＣ−１０００（３０ｍ×０．２５ｍｍ×０．２５μｍ）カラム、及び水素炎イオン化検出器（ＦＩＤ）を備えた、Ａｇｉｌｅｎｔ  ６８９０ＮヘッドスペースＧＣを使用して、代謝最終産物のＧＣ分析を実施した。５ｍＬの試料をＨｕｎｇａｔｅ管に移し、水槽内で４０℃まで加熱し、正確に５分間ファイバに曝露した。注入器を２５０℃で保持し、１ｍＬ／分の一定流量をキャリヤガスとして使用した。オーブンプログラムは、５分間で４０℃、続いて最大で２００℃まで１０℃／分の増加であった。次いで、温度を５０℃／分の速度で４０℃まで低下させ、最後に１分間保持する前に、温度を５０℃／分の速度で２２０℃までさらに上げ、続いて、この温度で５分間保持した。４０ｍＬ／分の水素、４５０ｍＬ／分の空気、及び１５ｍＬ／分の窒素を補給ガスとして使用して、ＦＩＤを２５０℃で保持した。
【００７１】
完全な形質転換の実験中、標準的な嫌気性技術（Ｈｕｎｇａｔｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，３Ｂ：１１７−１３２，１９６９、Ｗｏｌｆｅ，Ａｄｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ，６：１０７−１４６，１９７１）を使用して、３７℃において、還元剤の存在下で、かつ３０ｐｓｉの製鉄排ガス（Ｎｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ  Ｓｔｅｅｌ  ｓｉｔｅ（Ｇｌｅｎｂｒｏｏｋ，ＮＺ）から回収。組成：４４％  ＣＯ、３２％  Ｎ２、２２％  ＣＯ２、２％  Ｈ２）を用いて、ＹＴＦ培地中でＣ．オートエタノゲナムＤＳＭ２３６９３を増殖させた。
【表３】
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【００７２】
コンピテント細胞を作るために、Ｃ．オートエタノゲナムＤＳＭ２３６９３の５０ｍＬの培養物を５日間連続、新鮮なＹＴＦ培地に継代培養した。これらの細胞を使用して、０．０５のＯＤ６００ｎｍで、４０ｍＭ  ＤＬ−トレオニンを含有する５０ｍＬのＹＴＦ培地に接種した。培養物が０．５のＯＤ６００ｎｍに達したとき、細胞を３０分間氷上でインキュベートし、次いで、嫌気性チャンバに移し、４，７００×ｇ及び４℃で採取した。培養物を氷のように冷たいエレクトロポレーション緩衝液（２７０ｍＭスクロース、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、７ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４）で２回洗浄し、最終的に６００μＬの新鮮なエレクトロポレーション緩衝液の体積中で懸濁させた。この混合物を、２μｇのメチル化プラスミド混合物及び１μＬのタイプＩの制限阻害剤（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含有する０．４ｃｍの電極ギャップを有する予め冷却したエレクトロポレーションキュベットに移し、すぐに以下の設定、２．５ｋＶ、６００Ω、及び２５μＦを有するＧｅｎｅ  ｐｕｌｓｅｒ  Ｘｃｅｌｌエレクトロポレーションシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用してパルス供給した。３．７〜４．０ｍｓの時定数を達成した。培養物を５ｍＬの新鮮なＹＴＦ培地に移した。管保持具を備えたＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｈｅｌｉｏｓ  Ｅｐｓｉｌｏｎ  Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ）を使用して、６００ｎｍの波長で細胞の再生を監視した。バイオマスの初期の低下後、細胞は再び増殖し始めた。いったんバイオマスがその点から二倍になると、約２００μＬの培養物を５ｇ／Ｌのフルクトースを含有するＹＴＦ寒天プレート及びＰＥＴＣ寒天プレート（両方とも１．２％バクトアガー及び１５μｇ／ｍＬのチアンフェニコールを含有する）上に広げた。３〜４日間の３７℃での３０ｐｓｉの製鉄ガスを用いたインキュベーションの後、１プレート当たり５００コロニーが明確に視認できた。
【００７３】
Ｃ．オートエタノゲナム：６つのクローン及びＤＮＡ転移の識別を検証するために、ＰＵＲＥＬＩＮＫ（商標）Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡミニキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造業者の使用説明書に従って使用して、ゲノムＤＮＡをＰＥＴＣ液体培地中で６つ全てのコロニー／クローンから単離した。野生型オートエタノゲナムＤＳＭ２３６９３のＤＮＡと一緒にこれらのゲノムＤＮＡを、ＰＣＲにおけるテンプレートとして使用した。ｉｐｒｏｏｆ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｒａｔｏｒｉｅｓ）、以下の実施例に記載される特異的プライマー、ならびに以下のプログラム、最終伸長ステップ（７分間７２℃）の前に２分間９８℃での初期変性、続いて、２５回の変性サイクル（１０秒間９８℃）、アニーリング（１５秒間６１℃）、及び伸長（９０秒間７２℃）を用いて、ＰＣＲを実施した。野生型Ｃ．オートエタノゲナムＤＳＭ２３６９３からのゲノムＤＮＡを、対照ＰＣＲにおけるテンプレートとして使用した。
【００７４】
クローンの識別を確認するために、プライマーｆＤ１（配列番号１０）及びｒＰ２（配列番号１１）を使用して、かつ上記のＰＣＲ条件を使用して、ＰＣＲを１６ｓ  ｒＲＮＡに対しても実施した。ＰＣＲ産物をＺｙｍｏ  ＣＬＥＡＮ  ＡＮＤ  ＣＯＮＣＥＮＴＲＡＴＯＲ（商標）キットを使用して精製し、プライマーｒＰ２を使用して配列した。  
実施例２
【００７５】
本実施例は、乳酸脱水素酵素活性を排除するＣ．オートエタノゲナムの遺伝子修飾を実証する。
【００７６】
Ｃ．オートエタノゲナムの識別された（Ｋoｐｋｅ，Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，７７：５４６７−５４７５，２０１１）乳酸脱水素酵素（ＡＥＩ９０７３６．１）遺伝子ｌｄｈ（ＨＱ８７６０２５．１）の不活性化の実証は、２つの方法、相同組換え及びＣｌｏｓＴｒｏｎを使用することによって実証した。
【００７７】
相同組換え：乳酸塩をもはや生成することができないＣ．オートエタノゲナム菌株を作るために、ノックアウト構築物を二重相同組換えによってｌｄｈを妨害するように設計した。ｌｄｈ遺伝子に隣接した約１ｋｂの相同アーム（配列番号１〜２）をｐＭＴＬ８５１５１プラスミド（図１）及び得られるプラスミドｐＭＴＬ８５１５１−ｌｄｈ−ｋｏ（配列番号３）にクローン化した。標準的な組換えＤＮＡ及びクローン化技術は、当該技術分野において既知である（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，２００１、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｗｉｌｅｙ，１９８７）。ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのＰｕｒｅｌｉｎｋ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡミニキットを製造業者の使用説明書に従って使用して、Ｃ．オートエタノゲナムＤＳＭ２３６９３からのゲノムＤＮＡを単離した。
【００７８】
上記または国際公開第ＷＯ２０１２／０５３９０５号に記載されるように、ＤＮＡを導入するための形質転換を実施した。
【００７９】
選択後、コロニーを、単一クロスオーバー統合（図２Ａ）に対して、次いで二重クロスオーバー突然変異（図２Ｂ）に対してスクリーニングした。Ａ３’クロスオーバー事象がクローン６において見られ（図２Ａ）、ｌｄｈ遺伝子のノックアウトが外側フランキングプライマーを用いてスクリーニングしたときに観察された（図２Ｂ）。二重クロスオーバー乳酸脱水素酵素欠失の識別のために、オリゴヌクレオチドＯｇ２１ｆ（配列番号４）、Ｏｇ２４ｒ（配列番号５）、Ｏｇ３５ｆ（配列番号６、及びＯｇ３６ｒ（配列番号７）を使用した。
【００８０】
同じ戦略及びプラスミドが、Ｃ．リュングダリイまたはＣ．ラグスダレイにおいても使用され得る。形質転換プロトコルは、当該技術分野において記載されてきた（国際公開第ＷＯ２０１２／０５３９０５号  Ｌｅａｎｇ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，７９：１１０２−１１０９，２０１３）。
【００８１】
ＣｌｏｓＴｒｏｎ：ＣｌｏｓＴｒｏｎ（Ｈｅａｐ，Ｊ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，７０：４５２−４６４，２００７）、ＣｌｏｓＴｒｏｎウェブサイトをホストとしたイントロン設計ツールを使用して、３４４ｂｐ標的領域１２９ｓ（配列番号８）を設計し、標的部位（配列番号９）を識別した。ＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ）によるレトロトランスポジション活性化ｅｒｍＢマーカー（ＲＡＭ）を含有するベクターｐＭＴＬ００７Ｃ−Ｅ２において、標的領域を化学合成した（配列番号１２）。
【００８２】
国際公開第ＷＯ２０１２／０５３９０５号に記載されるように、ベクターをＣ．オートエタノゲナムに導入した。１５μｇ／ｍＬのチアンフェニコールを有するＰＥＴＣ  ＭＥＳ上で増殖した単一コロニーを、５μｇ／ｍＬのクラロスロマイシンを有するＰＥＴＣ  ＭＥＳ上でストリ−クした。各標的からのコロニーを無作為に選択し、フランキングプライマー１５５Ｆ（配列番号４）及び９３９Ｒ（配列番号５）を使用した挿入に対してスクリーニングした。ｉＮｔｒｏｎ  Ｍａｘｉｍｅ  ＰＣＲプレミックスを使用して、増幅を実施した。１００ｂｐのＰＣＲ産物が野生型遺伝子を示す一方で、約１．９ｋｂの産物サイズは、標的部位におけるグループＩＩイントロンの挿入を示唆する（図３）。プラスミドの損失を、耐性マーカー（ｃａｔＰ）の増幅及びグラム陽性複製起点（ｐＣＢ１０２）によって検査した（図４）。
【表４】
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【００８３】
同じ戦略及びプラスミドが、Ｃ．リュングダリイまたはＣ．ラグスダレイにおいても使用され得る。形質転換プロトコルは、当該技術分野において記載されてきた（国際公開第ＷＯ２０１２／０５３９０５号、Ｌｅａｎｇ，Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，７９：１１０２−１１０９，２０１３）。
実施例３
【００８４】
本実施例は、未修飾Ｃ．オートエタノゲナムと不活性化乳酸脱水素酵素を有するＣ．オートエタノゲナムの生成物プロファイルを比較する増殖実験を記載する。
【００８５】
Ｃ．オートエタノゲナム及び不活性化乳酸脱水素酵素を有するＣ．オートエタノゲナム及び菌株を、血清ボトル中の１０ｇ／ＬのＭＥＳ緩衝液を有するＰＥＴＣ培地中で増殖させた。接種材料は培地体積の１０％であり、培地の体積は１０ｍＬであった。培養物に製鋼オフガス（４４％  ＣＯ、２２％  ＣＯ２、２％  Ｈ２、３２％  Ｎ２）３０ｐｓｉを供給し、３７℃でインキュベートした。培地のｐＨは５．７であった。
【００８６】
増殖期中、試料をＯＤ６００の測定のために、かつＨＰＬＣによる分析のために採取した。瓶に３０ｐｓｉ製鉄ガスを毎日供給した。実験を３系列で実施した。  
【００８７】
未修飾Ｃ．オートエタノゲナ菌株が６日間の増殖後に０．２６３±０．０４１ｇ／Ｌの乳酸塩を生成した一方で（図５Ａ）、不活性化乳酸脱水素酵素を有するＣ．オートエタノゲナム菌株は、６日間の増殖後に乳酸塩を生成しなかった（図５Ｂ）。加えて、不活性化乳酸脱水素酵素を有するＣ．オートエタノゲナム菌株は、増加した量の酢酸塩、エタノール、及び２，３−ブタンジオールを生成した。その他の点では、２つの菌株は、同様の増殖プロファイルを有し、それぞれ２．６９及び２．３６５の同様のＯＤ６００ｎｍに達した。
【００８８】
本明細書に列挙される公表文献、特許出願、及び特許を含む全ての参考文献は、各参考文献があたかも参照により組み込まれることが個々にかつ具体的に示され、かつその全体が本明細書中に記載された場合と同じ程度まで、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書における任意の従来技術への言及は、その従来技術が任意の国における努力傾注分野の共通の一般的知識の一部をなすという承認ではなく、かつそのように解釈されるべきではない。
【００８９】
本発明の記載との関連で（特に、以下の特許請求の範囲との関連で）、用語「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」ならびに同様の指示語の使用は、本明細書中に他に指示がない限り、または文脈によって明らかに相反することがない限り、単数及び複数の両方を包含すると解釈されるものとする。用語「含むこと」、「有すること」、「含むこと」、及び「含有すること」は、特に断りのない限り、非限定的な用語（すなわち、「〜を含むがこれらに限定されないこと」を意味する）と解釈されるものとする。本明細書の値の範囲の記載は、本明細書に別段の指示がない限り、範囲内に入る各それぞれの値を個々に言及する省略法としての機能を果たすことを単に意図し、各それぞれの値は、あたかも本明細書に個々に記載されたかのように、本明細書中に組み込まれる。本明細書に記載される全ての方法は、本明細書に別段の指示がない限り、または文脈によって明らかに相反することがない限り、任意の好適な順序で実施され得る。本明細書に提供されるありとあらゆる実施例または例示的な用語（例えば、「など」）の使用は、本発明をよりよく理解することを単に意図し、別段特許請求の範囲に記載されない限り、本発明の範囲を制限しない。本明細書におけるいかなる用語も、本発明の実施に不可欠な任意の非請求要素を示すものと解釈するべきではない。
【００９０】
本発明を実施するための本発明者らに既知の最良の形態を含む、本発明の好ましい実施形態が本明細書に記載される。それらの好ましい実施形態の変化形は、上記の説明を読むことによって当業者に明らかとなり得る。本発明者らは、当業者が必要に応じてそのような変化形を採用することを予想し、本発明者らは、本発明が本明細書に具体的に記載されるものとは別の方法で実施されることを意図する。したがって、本発明は、適用法によって許可された通り、本明細書に添付される特許請求の範囲に記載される主題の全ての修正物及び均等物を含む。さらに、上記の要素のそれらの全ての考えられる変化形における任意の組み合わせは、本明細書中に他に指示がない限り、または文脈によって明らかに相反することがない限り、本発明によって包含される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【配列表】
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