(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ａ−Ｘ：Ｙ−Ｂを有する二重特異性タンパク質複合体であって、
Ａ−Ｘは第１の融合タンパク質であり、
Ｙ−Ｂは第２の融合タンパク質であり、
Ｘ：Ｙはヘテロ二量体繋であり、
：はＸとＹの間の結合相互作用であり、
Ａは、Ｆａｂ又はＦａｂ’断片から選択される、二重特異性タンパク質複合体の第１のタンパク質成分であり、
Ｂは、Ｆａｂ又はＦａｂ’断片から選択される、二重特異性タンパク質複合体の第２のタンパク質成分であり、
Ｘは、抗原若しくは抗体又はその結合断片から独立して選択される、結合対の第１の結合パートナーであり、
Ｙは、抗原若しくは抗体又はその結合断片から独立して選択される、結合対の第２の結合パートナーであり、
ただし、Ｘが抗原である場合、Ｙは、Ｘにより表される抗原に特異的である抗体又はその結合断片であり、Ｙが抗原である場合、Ｘは、Ｙにより表される抗原に特異的である抗体又はその結合断片であり、
Ｘ又はＹは、配列番号１又は配列番号１のアミノ酸１から３８を有するペプチドＧＣＮ４に特異的であるｓｃＦｖであり、前記ｓｃＦｖは配列番号３又は配列番号３のアミノ酸１〜２４３を有する５２ＳＲ４であり、
Ｘ又はＹは、配列番号１又は配列番号１のアミノ酸１から３８を有するペプチドＧＣＮ４である、二重特異性タンパク質複合体。
【請求項２】
ＡがＦａｂ断片である、請求項１に記載の二重特異性タンパク質複合体。
【請求項３】
ＢがＦａｂ断片である、請求項１又は２に記載の二重特異性タンパク質複合体。
【請求項４】
ＸがＦａｂ又はＦａｂ’断片中の重鎖のＣ末端に、場合によってリンカーを介して、融合している、請求項１から３までのいずれか一項に記載の二重特異性タンパク質複合体。
【請求項５】
ＹがＦａｂ又はＦａｂ’断片中の重鎖のＣ末端に、場合によってリンカーを介して、融合している、請求項１から４までのいずれか一項に記載の二重特異性タンパク質複合体。
【請求項６】
Ａ及び／又はＢが、細胞表面受容体、共刺激分子、チェックポイント阻害因子、ナチュラルキラー細胞受容体、免疫グロブリン受容体、ＴＮＦＲファミリー受容体、Ｂ７ファミリー受容体、接着分子、インテグリン、サイトカイン／ケモカイン受容体、ＧＰＣＲ、増殖因子受容体、キナーゼ受容体、組織特異的抗原、がん抗原、病原体認識受容体、補体受容体、ホルモン受容体、可溶性分子、サイトカイン、ケモカイン、ロイコトリエン、増殖因子、ホルモン、酵素及びイオンチャネルを含む群から選択される抗原に対して特異的である、請求項１から５までのいずれか一項に記載の二重特異性タンパク質複合体。
【請求項７】
バイパラトピックである、請求項１から６までのいずれか一項に記載の二重特異性タンパク質複合体。
【請求項８】
２つの異なる抗原に結合する、請求項１から６までのいずれか一項に記載の二重特異性タンパク質複合体。
【請求項９】
請求項１から８までのいずれか一項に定義される１つ又は複数の二重特異性タンパク質複合体を含む組成物。
【請求項１０】
治療において使用するための請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
請求項１から８までのいずれか一項に記載の二重特異性タンパク質複合体における相乗的生物学的機能を検出する方法であって、１つ又は複数の機能アッセイにおいて二重特異性タンパク質複合体を試験することを含む、上記方法。
【請求項１２】
式Ａ−Ｘ：Ｙ−Ｂのヘテロ二量体的に繋ぎ合わされた二重特異性タンパク質複合体における相乗的生物学的機能を検出するための方法であって、
Ｘ：Ｙはヘテロ二量体繋であり、
：はＸとＹの間の結合相互作用であり、
Ａ及びＢはそれぞれＸ及びＹとの融合タンパク質の形態の二重特異性タンパク質複合体のタンパク質成分であり、前記方法は、
（ｉ）少なくとも１つのヘテロ二量体的に繋ぎ合わされた二重特異性タンパク質複合体を含むマルチプレックスの一部又はすべてについて機能アッセイにおいて活性を試験するステップと、
（ｉｉ）機能アッセイからの読み出し情報（単数又は複数）を解析して、ヘテロ二量体的に繋ぎ合わされた二重特異性タンパク質複合体における相乗的生物学的機能を検出するステップと
を含み、
Ｙは抗原でありＸはＹに特異的である抗体若しくはその結合断片である、又はＸは抗原でありＹはＸに特異的である抗体若しくはその結合断片である、上記方法。
【請求項１３】
マルチプレックスが格子の形態である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
マルチプレックスが少なくとも２つのヘテロ二量体的に繋ぎ合わされた二重特異性タンパク質複合体を含む、請求項１２又は請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ヘテロ二量体的に繋ぎ合わされた二重特異性タンパク質複合体（単数又は複数）がＦｃ領域を含有しない、請求項１２から１４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
Ａが、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、ＶＨＨ、ＶＨ、ＶＬ及びｓｃＦｖから独立して選択される、請求項１２から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
Ａが、Ｆａｂ又はＦａｂ’断片である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
Ｂが、抗体、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、ＶＨＨ、ＶＨ、ＶＬ及びｓｃＦｖから独立して選択される、請求項１２から１７までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
Ｂが、Ｆａｂ又はＦａｂ’断片である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
Ｘが抗体、Ｆａｂ又はＦａｂ’断片中の重鎖のＣ末端に、場合によってリンカーを介して、融合している、請求項１２から１９までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
Ｙが、抗体、Ｆａｂ又はＦａｂ’断片中の重鎖のＣ末端に、場合によってリンカーを介して、融合している、請求項１２から２０までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
Ｘが、ｓｃＦｖ、ＶＨＨ及びペプチドから独立して選択され、ただし、Ｘがペプチドである場合、Ｙは抗体又はその結合断片であり、ＸがｓｃＦｖ又はＶＨＨである場合、Ｙは抗原である、請求項１２から２１までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
Ｙが、ｓｃＦｖ、ＶＨＨ及びペプチドから独立して選択され、ただし、Ｙがペプチドである場合、Ｘは抗体又はその結合断片であり、ＹがｓｃＦｖ又はＶＨＨである場合、Ｘは抗原である、請求項１２から２２までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記ペプチドが５から２５アミノ酸長の範囲である、請求項２２又は２３に記載の方法。
【請求項２５】
ＸとＹの間の結合親和性が５ｎＭ又はそれよりも強い、請求項１２から２４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
ＸとＹの間の結合親和性が９００ｐＭ又はそれよりも強い、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
Ｘ又はＹが、配列番号１又は配列番号１のアミノ酸１から３８を有するペプチドＧＣＮ４に特異的であるｓｃＦｖ又はＶＨＨである、請求項１２から２６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記ｓｃＦｖが、配列番号３又は配列番号３のアミノ酸１〜２４３を有する５２ＳＲ４である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
Ｘ又はＹが、配列番号１又は配列番号１のアミノ酸１から３８を有するペプチドＧＣＮ４である、請求項１２から２８までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
Ａ及び／又はＢが、細胞表面受容体、共刺激分子、チェックポイント阻害因子、ナチュラルキラー細胞受容体、免疫グロブリン受容体、ＴＮＦＲファミリー受容体、Ｂ７ファミリー受容体、接着分子、インテグリン、サイトカイン／ケモカイン受容体、ＧＰＣＲ、増殖因子受容体、キナーゼ受容体、組織特異的抗原、がん抗原、病原体認識受容体、補体受容体、ホルモン受容体、可溶性分子、サイトカイン、ケモカイン、ロイコトリエン、増殖因子、ホルモン、酵素及びイオンチャネルを含む群から選択される抗原に対して特異的である、請求項１２から２９までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記ヘテロ二量体的に繋ぎ合わされた二重特異性タンパク質複合体が、試験に先立って精製されない、請求項１２から３０までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
Ａ−Ｘ及びＹ−Ｂ融合タンパク質が一過性に発現され、１対１モル比で混合されてヘテロ二量体的に繋ぎ合わされた二重特異性タンパク質複合体をそれぞれ生成する前に精製されない、請求項３１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示はヘテロ二量体的に繋ぎ合わされた二重特異的タンパク質複合体における相乗的な生物学的機能を検出する方法、特に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ／ｅｘ  ｖｉｖｏ方法、前記二重特異的タンパク質複合体のライブラリー／マルチプレックス、並びにそのキット及び組成物に関する。本開示は、前記新規二重特異性タンパク質複合体、並びに治療、研究及び実験目的における（特に、相乗的生物学的機能を探すアッセイにおける）前記新規二重特異性タンパク質複合体の使用にさらに関する。本開示は、前記二重特異性複合体を調製する方法にも及ぶ。
【背景技術】
【０００２】
ｉｎ  ｖｉｖｏでの生物学的機構はシグナルの極端に複雑なカスケードであり、この絡まりを解いて理解するのは困難である。そのようなシグナル伝達の例はＴ細胞を活性化するのに必要なシグナル伝達である。ｗｗｗ．ｃｅｌｌｓｉｇｎａｌ．ｃｏｍ出典の図１を参照されたい。Ｔ細胞の活性化には少なくとも２つのシグナルが必要である。
【０００３】
Ｔ細胞受容体による抗原の認識は、第１のシグナルと見なされ、第２のシグナルは、Ｔ細胞上のさらなる表面分子と抗原提示細胞上のさらなる分子のライゲーションから生じる共刺激から発生する。
【０００４】
したがって、Ｔ細胞活性化を用いて、生物学的機能の調節が複数のシグナルを必要とすることがあることを説明することができる。他の生物学的過程は等しく複雑である又はもっと複雑である。細胞に基づくｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニングはｉｎ  ｖｉｖｏ機構についての洞察を有しており前記洞察を得るのに役立ち得るが、それでも生物学的機能を調節する適切なリガンド対をどのようにして同定するかという問題が生じる。
【０００５】
二重特異性抗体は次世代のバイオ薬物治療において大きな役割を果たすと広く予想されている（D. Holmes, Nature Rev Drug Disc Nov 2011:10; 798）。二重特異性抗体は、さらに大きな割合の患者において優れた長期にわたる広い効力をもたらす潜在力がある。これは、一般疾患経路内で異なる抗原に同時に共結合し、それによって多重度を減少させることにより、又は独立した経路由来の抗原を標的として相加的な若しくは相乗的な効果を提供することにより達成することが可能である。
【０００６】
二重特異性抗体は、
１）細胞上の受容体を架橋結合する、
２）細胞媒介効果を誘導する、
３）サイトカインを細胞に局在化してシグナル伝達を調節する又はサイトカイン機能を局所的に遮断する、
４）複数のエピトープに同時に結合して、単一のモノクローナル抗体も、実際、連結していない抗体の混合物（「ポリ−モノクローナル」）も示すことができない「新しい活性」を生み出し、機能又は特異性を増加させる、
などの新規の生物学の利用を促進する。
【０００７】
二重の標的に結合する現在の戦略は主に、既知の機構の合理的設計に基づいており、阻害性受容体を架橋結合すること、受容体の共結合／クラスター形成、複数の刺激性経路を遮断すること、阻害性受容体の選択的結合並びに共刺激及びサイトカインシグナル伝達などの個別の経路を遮断することが含まれる。しかし、既知の機構及び標的に関する技術の現状はこの分野の進歩にとって制限要因となっている。
【０００８】
二重特異性抗体は、生物学的治療法として極めて大きな潜在力を有するが、モノクローナル抗体と比べると発見と開発にはより多くの一連の難問がある。困難な、２つの鍵となる分野は、１）成功裏な二重特異性抗体フォーマットの開発、及び２）二重特異性抗体が架橋する又は共結合することになる対になった標的を選択することである。
【０００９】
ＤＶＤ−Ｉｇ（Ａｂｂｖｉｅ）、ＤｕｏＢｏｄｉｅｓ、（Ｇｅｎｍａｂ）、Ｋｎｏｂｓ−ｉｎ−Ｈｏｌｅｓ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、Ｃｏｍｍｏｎ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ（Ｍｅｒｕｓ）を含む成功している治療薬として潜在的に機能することができると考えられる多くの有望な二重特異性抗体フォーマットが現在開発されている。しかし、こうした場合のそれぞれにおいて、これらのフォーマットは、二重特異性抗体と架橋結合するための新規の抗原対の発見を可能にするハイスループットな標的二重抗原発見スクリーニングに理想的には適していない。
【００１０】
典型的には、単一二重特異性抗体構築物では、少なくとも２つの可変領域を発見ベクターの元の供給源（例えば、ファージディスプレイ、ハイブリドーマ又は単一Ｂ細胞クローニング）から適切な二重特異性発現ベクターにサブクローニングする必要があり、二重特異性体のそれぞれのアームが発現され、こうして得られた二重特異性抗体は精製されなければならない。発見された可変領域のもっとも効果的な組合せを求めてスクリーニングする又は新規の抗原対を発見する試みにおいて多数の対になった可変領域を組み合わせるつもりであれば、このクローニング及びそれに続く発現努力はすぐに重大な実際上の障害になる。
【００１１】
例えば、５０の独特の抗体が５０の細胞表面標的のパネルに対して発見されたら、総数で２５００の二重特異性抗体が潜在的に産生されると考えられる（Ｘ−Ｙ格子として想定される）。上記の二重特異性抗体フォーマットを使えば、これは少なくとも１００の個々のクローニング反応（５０−Ｘと５０−Ｙ）と続いて２５００の抗体発現実験が必要になると考えられる。開始のモノクローナル抗体の数を１００まで増やせば、クローニング反応の最小数は２００（１００−Ｘと１００−Ｙ）まで、発現数は１０，０００まで増えることになる。
【００１２】
一般的に、この「発現障害」の根本原因は、上記のフォーマットは、最終二重特異性構築物の両方のタンパク質鎖「半分」が同じ細胞において単一発現実験内で同時に発現される必要があることである。したがって、多くのフォーマットでは、２５００の二重特異性抗体を産生するためには、２５００の発現実験が必要になる。
【００１３】
二重特異性抗体フォーマットがモノシストロン性（すなわち、単鎖タンパク質としてクローニングされ発現される）、例えば、単鎖ダイアボディである場合、クローニング実験の数が上に与えられた数についてそれぞれ２５００及び１０，０００になると考えられるので、「発現障害」はさらに悪化する。
【００１４】
さらに、発現後、所望の構築物を単離するためには大規模な精製が必要になる可能性がある。
【００１５】
一部の二重特異性アプローチはクローニングの量を減らすために二重特異性構築物に共通の軽鎖を用いるが、これでは発現実験の数は減らない。さらに、共通の軽鎖などの共通鎖を使用すれば、抗体は重鎖などの１つの鎖のみを通じて十分高い親和性でその抗原に結合する必要があるので開始抗体可変ドメインを見つけるのがより困難になるために、抗体発見という難問はさらに難しくなる。
【００１６】
したがって、現在の大規模な二重特異性フォーマット及び新規の抗原対を同定するハイスループットなスクリーニングの使用は非現実的であり、仮説駆動型アプローチのみを二重特異的抗原ターゲティングに使用し続けることになっていた。
【００１７】
２つの既知の標的上の所与のエピトープに結合する、限られた数の二重特異性抗体を設計し試験するよりむしろ、二重特異性抗体を用いた新規の生物学へのアクセスを利用する真の潜在力は、二重特異性抗体又はタンパク質リガンドの大きく多様なコンビナトリアルパネルを用いた広い機能スクリーニング努力を通じてのみ達成することが可能であることを提案する。このスクリーニングを促進するためには、容易に構築され種々の機能スクリーンにおいて機能的効果を求めてスクリーニングすることが可能な多数の多様な二重特異性タンパク質を産生することを可能にするフォーマット及び方法が必要である。このアプローチにより、相乗的対についての新発見をもたらす能力のある同定が可能になる。
【００１８】
したがって、種々の抗原特異性の組合せとして存在する多数の二重特異性タンパク質複合体を産生しスクリーニングするのは有用だと考えられる。特に、多数の異なる二重特異性抗体複合体を迅速に効率的に産生しスクリーニングすることができるのは有用だと考えられる。すでに上に記載されている二重特異性抗体を製造するための様々な既存の方法が存在する。しかし、これらの方法はそれぞれが不利な点があり、下でもっと詳細にさらに説明される別の方法も同じである。
【００１９】
二重特異性及び多特異性構築物の標的を効率よく同定する方法という問題は当技術分野では十分に取り組まれていない。例えば、ＷＯ２０１４／００１３２６は、タンパク質のＤＮＡ断片への化学的コンジュゲーションを用いており、ＤＮＡ断片は、２つのそのようなタンパク質を互いに連結している相補的ＤＮＡ配列にハイブリダイズして、少なくとも２つのターゲティング実体を含む個別化患者特異的多特異性分子を生ずる。このアプローチは、仮に新しい二重特異性組合せを同定することに用いられた場合、いくつかの困難が付随する。例えば、タンパク質をＤＮＡにコンジュゲートすると、タンパク質の活性及び／又は構造に損傷を与えることがある。特に、タンパク質−ＤＮＡハイブリッドは天然には存在しておらず、したがって干渉が起こる可能性がある。さらに、タンパク質とＤＮＡを結合させるのに必要な化学的コンジュゲーションは、複雑さも時間も経費もその工程に加えることになる。
【００２０】
カップリング及びコンジュゲーション技法は、抗体薬物コンジュゲートを作製すること及びｉｎ  ｖｉｖｏターゲティング技術のために存在している。従来の化学的架橋結合は、関連する化学種をホモ二量体及び他の望ましくない副産物から精製する必要がある場合があるために多くの労力を要する。さらに、化学修飾ステップはタンパク質の整合性を変化させ、したがって、安定性が不十分になる又は生物学的機能が変わってしまうことがある。その結果、化学的架橋結合による二重特異性抗体の産生は多くの場合非効率的であり、抗体活性も消失してしまうことがある。
【００２１】
二重特異性抗体を製造する別の方法は、工学的に操作された細胞が無作為に会合する２つの重抗体鎖及び２つの軽抗体鎖を発現する、細胞融合（例えば、ハイブリッドハイブリドーマ）によるものである。選択するのに４つの可能な変異体が存在するので、これにより１０の可能な二重特異性抗体組合せが作製され、そのうちのいくつか（多くの場合に、１つのみ）の組合せのみが望ましいと考えられる。したがって、細胞融合による二重特異性抗体の産生は、生産収率が低く、産生されたその他の二重特異性抗体から所望の二重特異性抗体を単離するためには追加の精製ステップも必要になる。これらの不利な点により製造時間及び経費が増加する。
【００２２】
組換えＤＮＡ技法も二重特異性抗体を産生するために用いられてきた。例えば、組換えＤＮＡ技法を使用して「ノブインツーホール（knob into hole）」二重特異性抗体も産生された。「ノブインツーホール」技法は、ＣＨ３ドメインインターフェイスで多量体化ドメインに立体的に相補的な突然変異を工学的に作製する（例えば、Ridgway et al., Protein Eng. 9:617-621 (1996); Merchant et al., Nat. Biotechnol. 16(7): 677-81 (1998)参照; 米国特許第５，７３１，１６８号及び米国特許第７，１８３，０７６号も参照）。この戦略の１つの制約は、同じ細胞で発現される場合、誤対合並びに望ましくない及び／又は不活性な分子の形成を防ぐためには２つの親抗体の軽鎖は同一でなければならない点である。それぞれの二重特異性体（その重及び軽鎖）は単一細胞で発現されなければならず、タンパク質産物は一般に約２０％のホモ二量体を含有しており、これはその後に精製により取り除かれる。
【００２３】
他のアプローチは、完全長ＩｇＧ４分子における鎖の自然な交換に基づいている（Ｇｅｎｍａｂ  Ｄｕｂｏｄｙ）。しかし、このアプローチもＦｃ領域なしでは構築物を調製することができないので困難を抱えている。Ｆｃ領域は生物活性に寄与する可能性があるので、観察される活性がＦｃを含む二重特異性分子において可変領域、Ｆｃ又は両方の組合せに基づいているのかどうかを確証するのは困難な場合がある。さらに、交換は動力学的過程であり、このせいで試験されている実体が実際に何であるのかに関して困難が生じることがある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２４】
したがって、二重特異性抗体のもっと効率的でもっとハイスループットなスクリーニングを可能にする二重特異性タンパク質複合体を作製する新たな方法の必要性が存在する。特に、利用可能な抗体又は抗体断片のプールからの任意の２つの抗体又は抗体断片の選択を容易に組み合わせて、例えば、ホモ二量体の形成を回避する又は最小化しつつ、異なる二重特異性抗体のマルチプレックスを効率的に産生することが可能になるフォーマット及び方法の必要性が存在する。抗原特異性の新たな組合せを求めて相乗的生物学的機能についてスクリーニングするときには、特に、ヘテロ二量体がその機能の発見に欠かせない場合には、異なる二重特異性抗体を効率よく会合させることは特に重要である。
【課題を解決するための手段】
【００２５】
一態様では、成分のすべてが基本的に凝集なしで個々のユニットとして細胞から発現されることが可能であり、コンジュゲーションもカップリング化学反応も用いず、ホモ二量体化は最小限であり、混合するだけでユニットを会合させることが可能であることにより、スクリーニングにおいて使用するのに特に適した新たな二重特異性フォーマットが提供される。
【００２６】
したがって、式Ａ−Ｘ：Ｙ−Ｂを有する二重特異性タンパク質複合体であって、
Ａ−Ｘは第１の融合タンパク質であり、
Ｙ−Ｂは第２の融合タンパク質であり、
Ｘ：Ｙはヘテロ二量体繋（heterodimeric-tether）であり、
：はＸとＹの間の結合相互作用であり、
Ａは、Ｆａｂ又はＦａｂ’断片から選択される、二重特異性タンパク質複合体の第１のタンパク質成分であり、
Ｂは、Ｆａｂ又はＦａｂ’断片から選択される、二重特異性タンパク質複合体の第２のタンパク質成分であり、
Ｘは、抗原若しくは抗体又はその結合断片から独立して選択される、結合対の第１の結合パートナーであり、
Ｙは、抗原若しくは抗体又はその結合断片から独立して選択される、結合対の第２の結合パートナーであり、
ただし、Ｘが抗原である場合、Ｙは、Ｘにより表される抗原に特異的である抗体又はその結合断片であり、Ｙが抗原である場合、Ｘは、Ｙにより表される抗原に特異的である抗体又はその結合断片である、上記二重特異性タンパク質複合体が提供される。
【００２７】
一実施形態では、可変因子Ｘ又はＹは、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ＶＨ、ＶＬ又はＶＨＨなどの抗体結合断片であり、一方の可変因子はペプチドである。
【００２８】
一実施形態では、可変因子Ｘ又はＹはｓｃＦｖ又はＶＨＨであり、一方の可変因子はペプチドである。したがって、二重特異性フォーマットは、例えば、そのＣ末端を経て、抗体結合断片（例えば、ｓｃＦｖ又はＶＨＨ）及びペプチド結合相互作用により連結された異なる特異性を有する２つのＦａｂアームを含む。この種の配置は、ユニットＡ−Ｘ又はユニットＢ−Ｙを発現するのに何の問題もないので、スクリーニングに使用するのに理想的である。Ｆａｂ／Ｆａｂ’断片は非常に安定しており不適切な二量体化に感受性ではない。したがって、それぞれのユニット（Ａ−Ｘ又はＢ−Ｙ）の発現後に必要とされる精製の量は最小限である又は事実上不必要である。二重特異性複合体は、関連するユニットを混合するだけで、すなわち、コンジュゲーション及びカップリング化学反応に頼らずとも１対１のモル比で形成することが可能である。Ｆａｂ／Ｆａｂ’断片中の定常領域はＦａｂ／Ｆａｂ’成分の二量体化を推進し、結合パートナーのＸとＹは必要なヘテロ二量体二重特異性複合体を形成するのに有利になるようさらに平衡を推進する。さらに、ヘテロ二量体化後の複合体の形成の後には精製はほとんど必要としないか全く必要としない。したがって、多数のＡ−Ｘ及びＢ−Ｙを容易に調製し組み合わせることが可能である。
【００２９】
複合体中のＦａｂ／Ｆａｂ’実体は、結合ドメインが古典的な抗体幾何学を模倣する生物学的に関連のある配向で保持されていることを意味し、これが本明細書で下に記載されているスクリーニング法により同定される可変領域の対を、活性を保持している他の二重特異性治療フォーマットに首尾よく変換するのに寄与する可能性がある。Ｆｃ断片ＣＨ２−ＣＨ３を欠く二重特異性複合体を調製しスクリーニングする能力は、観察される生物活性が実際に複合体中の可変領域対のみに起因することも保証する。本発明の二重特異性複合体の単純さ及びそれを調製する方法は、新たな標的抗原組合せを見つけるために、及び所与の組合せでの可変領域配列の最適化のために可変ドメイン対のハイスループットなスクリーニングを促進するという文脈では極めて有利である。
【００３０】
一実施形態では、ＡはＦａｂ断片である。一実施形態では、ＢはＦａｂ断片である。一実施形態では、ＡとＢは両方ともＦａｂ断片（本明細書ではＦａｂ−Ｋｄ−Ｆａｂとも呼ばれる）である。
【００３１】
一実施形態では、ＸはＦａｂ又はＦａｂ’断片中の重鎖又は軽鎖のＣ末端、特に重鎖のＣ末端に融合している。
【００３２】
一実施形態では、ＹはＦａｂ又はＦａｂ’断片中の重鎖又は軽鎖のＣ末端、特に重鎖のＣ末端に融合している。
【００３３】
一実施形態では、Ｘは、ｓｃＦｖ、ＶＨＨ及びペプチドから独立して選択され、ただし、Ｘがペプチドである場合、Ｙは抗体又はｓｃＦｖ若しくはＶＨＨなどのその結合断片であり、ＸがｓｃＦｖ又はＶＨＨである場合、Ｙはペプチドなどの抗原である。
【００３４】
一実施形態では、Ｙは、ｓｃＦｖ、ＶＨＨ及びペプチドから独立して選択され、ただし、Ｙがペプチドである場合、Ｘは抗体又はｓｃＦｖ若しくはＶＨＨなどの結合断片であり、ＹがｓｃＦｖ又はＶＨＨである場合、Ｘはペプチドなどの抗原である。
【００３５】
一実施形態では、ペプチド（結合パートナーのうちの１つである）は５から２５アミノ酸長の範囲である。
【００３６】
一実施形態では、ＸとＹの間の結合親和性は５ｎＭ又はそれよりも強く、例えば、ヘテロ二量体繋の結合親和性は９００ｐＭ又はそれよりも強い、例えば８００、７００、６００、５００、４００又は３００ｐＭなどである。
【００３７】
一実施形態では、Ｘ又はＹは、ペプチドＧＣＮ４に特異的であるｓｃＦｖ又はＶＨＨであり、例えば、ｓｃＦｖは５２ＳＲ４（配列番号３、又は配列番号３のアミノ酸１〜２４３）である。
【００３８】
一実施形態では、Ｘ又はＹは、ペプチドＧＣＮ４（配列番号１、又は配列番号１のアミノ酸１〜３８）である。
【００３９】
一実施形態では、Ａ及び／又はＢは、その翻訳後修飾バージョン、少なくとも１つのエピトープを含むその断片を含む、Ｔ細胞又はＢ細胞シグナル伝達受容体などの細胞表面受容体、共刺激分子、チェックポイント阻害因子、ナチュラルキラー細胞受容体、免疫グロブリン受容体、免疫グロブリン様受容体、メタロプロテアーゼのマトリックスメタロプロテアーゼ及び膜型マトリックスメタロプロテアーゼ組織阻害因子、ＴＮＦＲファミリー受容体、Ｂ７ファミリー受容体、接着分子、インテグリン、サイトカイン／ケモカイン受容体、ＧＰＣＲ、増殖因子受容体、キナーゼ受容体、組織特異的抗原、がん抗原（腫瘍関連抗原及びペプチド）、病原体認識受容体、補体受容体、ホルモン受容体、スカベンジャー受容体又はサイトカイン、ケモカイン、ロイコトリエン、増殖因子、ホルモン若しくは酵素などの可溶性分子、若しくはイオンチャネルを含む群から選択される抗原に特異的である。
【００４０】
一実施形態では、組成物、例えば、本開示に従った１つ又は複数の二重特異性複合体を含む医薬組成物が提供される。
【００４１】
さらに、本発明者らは、式Ａ−Ｘ：Ｙ−Ｂのヘテロ二量体的に繋ぎ合わされた二重特異性タンパク質複合体における相乗的機能を検出する方法であって、
Ｘ：Ｙはヘテロ二量体繋であり、例えば、Ｘ及びＹがホモ二量体を形成するには不適切であり、
Ａ及びＢはそれぞれＸ及びＹとの融合タンパク質の形態である二重特異性体の成分であり、
（ｉ）少なくとも１つのヘテロ二量体的に繋がれた二重特異性タンパク質を含むマルチプレックスの一部又はすべてについての機能アッセイにおいて活性を試験するステップと、
（ｉｉ）機能アッセイからの読み出し情報を解析して、二重特異性タンパク質複合体における相乗的生物学的機能を同定するステップと
を含む上記方法を考案した。
【００４２】
本方法は、式Ａ−Ｘ：Ｙ−Ｂを有する新規の二重特異性タンパク質複合体フォーマットであって、
Ａ−Ｘは第１の融合タンパク質であり、
Ｙ−Ｂは第２の融合タンパク質であり、
Ｘ：Ｙはヘテロ二量体繋であり、
Ａは二重特異性体の第１のタンパク質成分であり、
Ｂは二重特異性体の第２のタンパク質成分であり、
Ｘは結合対の第１の結合パートナーであり、
Ｙは結合対の第２の結合パートナーであり、
：はＸとＹの間の相互作用（例えば、結合相互作用）であり、特に、相互作用が複合体を形成し融合タンパク質を複合体化した形態で保持するのに十分である、上記二重特異性タンパク質複合体フォーマットを用いる。
【００４３】
特に、ヘテロ二量体的に繋がれた二重特異性タンパク質複合体は、Ａ−ＸとＢ−Ｙをｉｎ  ｖｉｔｒｏで混合することにより調製される。したがって、一実施形態では、方法はＡ−ＸとＢ−Ｙを接触させるｉｎ  ｖｉｔｒｏ混合ステップを含む。
【００４４】
したがって、一般的に、融合タンパク質Ａ−Ｘ及びＢ−Ｙは同じ細胞で同時発現されることはない。これは、そのおかげで、例えば、１００の融合タンパク質を発現し、場合によっては精製することが可能になり、１００の融合タンパク質を種々の並べ替えで続いて混合すれば１０，０００のヘテロ二量体的に繋がれた二重特異性タンパク質複合体を提供することが可能になり、そのうちの５，０００が類のない対であるので、有利である。
【００４５】
これとは対照的に、ある種の先行技術の方法では二重特異性の同時発現が必要であり、したがって、１０，０００の複合体では、１０，０００のトランスフェクション、発現及び精製が必要になる。
【００４６】
しかし、必要に応じて、Ａ−Ｘ及びＢ−Ｙは同じ細胞で発現することができる。
【００４７】
結合パートナーＸ及びＹは互いに対して親和性を有し、ベルクロ（登録商標）の生物学的等価物又はバーと磁石として機能し、複合体を１つに保持する。有利なことに、これは、融合タンパク質Ａ−Ｘ及びＹ−ＹＢは、その融合タンパク質を互いに混ぜ合わせるだけで容易に会合して二重特異性タンパク質複合体になることが可能であることを意味する。したがって、本開示の二重特異性タンパク質複合体はモジュラー構造体を有し、これのおかげで２つの異なるタンパク質を、例えば、格子状の様式で抗原特異性の異なる組合せを用いた二重特異性タンパク質複合体の並べ替えの大きなパネルを作製するために容易に会合させることが可能になる。これのおかげで、相加的、相乗的又は新規の生物学的機能を検出するための多数の二重特異性タンパク質複合体の効率的で系統的なスクリーニングが可能になる。
【００４８】
ＸとＹが互いに対して特異的であることを考慮すると、このせいで、ホモ二量体を形成する能力が著しく減少する。本明細書ではＸとＹは合わせて結合対又は結合パートナーと呼ばれる。一実施形態では、Ｘは他のＸに対して高い親和性を持たない。一実施形態では、Ｙは他のＹに対して高い親和性を持たない。有利なことに、ＸとＹがホモ二量体を形成しないとき、このことが望ましくない単一特異性タンパク質複合体の形成を妨げ、所望の二重特異性タンパク質複合体の収量を増やし、単一特異性タンパク質複合体を除去するための面倒な精製ステップの必要性をなくす。
【００４９】
これにより、大半の先行技術の方法では効率的に得ることができない収量及び／又は精度を持つ二重特異性タンパク質複合体の迅速な会合が可能になり、特に、先行技術の方法では一般に大規模な精製ステップが必要になる。本発明では二重特異性複合体の収量は典型的には７５％又はそれよりも高い。
【００５０】
さらに有利なことに、二重特異性タンパク質複合体は、その成分タンパク質（成分タンパク質が結合している抗原を含む）が既知の関係を持たない、又は異なる潜在的には無関係な経路に存在する複合体のスクリーニングを可能にする。例えば、２つの別々の経路で機能し、例えば、当業者が通常であれば互いに接触するとは予想しない２つのタンパク質を相加的、相乗的及び／又は新規の機能を同定するために二重特異性タンパク質複合体において試験することが可能である。
【００５１】
さらに、所与の抗原又はエピトープに対する複数の結合領域（可変領域などの）を生物学的機能における微妙な差異を同定するために平行に調べることが可能である。これにより、所与の抗原対に対する可変領域配列の組合せを調査し最適化することが可能になる。
【００５２】
本方法によればその科学はその結果を示すことができ、本方法は生物学的機能についての先入観及び技術的偏見に頼ってはいない。このアプローチは潜在的に極めて強力である。
【００５３】
有利なことに、Ｘ及びＹ成分のせいで、融合タンパク質の異なる並び替えから構成される二重特異性タンパク質複合体を含むマルチプレックスを迅速に容易に会合させることができる。
【００５４】
一実施形態では、タンパク質Ａ及びＢは抗体又は抗体断片である。抗体又は抗体断はＸとＹを介して複合体として１つに保持されているとき、これは二重特異性抗体複合体を形成する。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】Ｔ細胞の活性化に関与している主要な細胞シグナル伝達経路を示す模式図である。
【図２】本開示の二重特異性タンパク質複合体の構造と会合を示す模式図である。
【図３】本発明の二重特異性抗体を使用する機能スクリーニングのための例となる４×４格子を示す表である。この格子を使用すれば、１６の異なる二重特異性タンパク質複合体を会合させ相乗的機能について効率的にスクリーニングすることが可能である。
【図４】本開示の代表的二重特異性抗体複合体を示す模式図である。図は２つの異なるＦａｂ断片がどのようにして一体となって、Ｆａｂ断片に付加されている結合パートナー間の高親和性相互作用を介して二重特異性抗体複合体を形成するのかを描いている。
【図５】２つのＦａｂ断片が組み合わされて本開示の二重特異性抗体複合体を形成すると、２つの異なる標的抗原に特異的である２つのＦａｂ断片がその特異性を保持しその対応する標的抗原に同時に共結合することができることを実証するフローサイトメトリー実験の結果を示すグラフである。その結果は、Ｆａｂ断片に結合している結合パートナーの結合を逆にしても、それぞれの標的抗原に特異的に結合するＦａｂ断片の能力に影響を与えないことをさらに実証している。両方の特異性がペプチドに融合しているとき（Ｙ：Ｙ）に検出される結合がないことを示す複合体形成対照はない。塗潰し領域＝［抗抗原５Ｆａｂ−ペプチド‘ＧＣＮ４’］：［抗抗原６Ｆａｂ−ペプチド‘ＧＣＮ４’］：［ビオチン化抗原６］：［ＦＩＴＣ−ＳＴＲＥＰ］。複合体形成対照なし。薄い線＝［抗抗原５Ｆａｂ−ｓｃＦＶ‘５２ＳＲ４’］：［抗抗原６Ｆａｂ−ペプチド‘ＧＣＮ４’］：［ビオチン化抗原６］：［ＦＩＴＣ−ＳＴＲＥＰ］濃い線＝［抗抗原５Ｆａｂ−ペプチド‘ＧＣＮ４’］：［抗抗原６Ｆａｂ−ｓｃＦｖ‘５２ＳＲ４’］：［ビオチン化抗原６］：［ＦＩＴＣ−ＳＴＲＥＰ］
【図６】ＢＩＡコアトレースを示すグラフ及び表である。これは互いに対する結合パートナーの高親和性を実証している。チップ上でペプチド‘ＧＣＮ４’へのＦａｂＡ−ｓｃＦＶ‘５２ＳＲ４’結合が検出される。
【図７】抗原３、抗原１、抗原４及び抗原２に対する特異性を有する抗体の二重特異性及び二価組合せについてのリン酸化Ａｋｔの阻害の相対的効力の棒グラフである。
【図８】抗原３、抗原１、抗原４及び抗原２に対する特異性を有する抗体の二重特異性及び二価組合せについてのリン酸化ＰＬＣｇ２の阻害の相対的効力の棒グラフである。
【図９】抗原３、抗原１、抗原４及び抗原２に対する特異性を有する抗体の二重特異性及び二価組合せについてのＣＤ８６発現の阻害の相対的効力の棒グラフである。
【図１０】抗原１及び抗原２並びに単一Ｆａｂ’対照に対する特異性を有する抗体の二重特異性、二価又は混合物についてのリン酸化Ａｋｔの阻害の相対的効力の棒グラフである。
【図１１】抗原３及び抗原２に対する特異性を有する抗体の二重特異性、二価又は混合物についてのリン酸化Ａｋｔの阻害の相対的効力の棒グラフである。
【図１２】抗原３及び抗原２に対する特異性を有する抗体の二重特異性、二価又は混合物についてのリン酸化ＰＬＣｇ２の阻害の相対的効力の棒グラフである。
【図１３】抗ＩｇＭ刺激Ｂ細胞における全ＩｋＢレベルに対する抗抗原３と抗抗原２の二重特異性組合せの効果の滴定を示すグラフである。
【図１４】抗ＩｇＭ刺激Ｂ細胞上でのＣＤ８６発現に対する抗原３と抗原２の二重特異性組合せの効果の滴定を示すグラフである。
【図１５】抗原４及び抗原２に対する特異性を有する抗体の二重特異性、二価又は混合物についてのリン酸化Ａｋｔの阻害の相対的効力の棒グラフである。
【図１６】抗原４及び抗原２に対する特異性を有する抗体の二重特異性、二価又は混合物についてのリン酸化ＰＬＣｇ２の阻害の相対的効力の棒グラフである。
【図１７】抗ＩｇＭ刺激Ｂ細胞上でのＣＤ８６発現に対する抗原４と抗原２の二重特異性組合せの効果の滴定を示すグラフである。
【図１８】例１１の実験１からの重ね合わせたサイズ排除Ａ２８０シグナルトレースを示すグラフである。示されるトレースは、Ｆａｂ−Ｘ（ＶＲ４２４７）対照、Ｆａｂ−Ｙ（ＶＲ４２４８）対照及び５００μｇ／ｍｌのＦａｂ−Ｘ（ＶＲ４２４７）とＦａｂ−Ｙ（ＶＲ４２４８）複合体での１対１モル比混合物である。ピークは吸光度２８０ｎｍで検出した。
【図１９】例１１の実験２からの重ね合わせたサイズ排除Ａ２１４シグナルトレースを示すグラフである。示されるトレースは、Ｆａｂ−Ｘ（ＶＲ４１３０）対照、Ｆａｂ−Ｙ（ＶＲ４１３１）対照及び５００μｇ／ｍｌのＦａｂ−Ｘ（ＶＲ４１３０）とＦａｂ−Ｙ（ＶＲ４１３１）複合体での１対１モル比混合物である。ピークは吸光度２１４ｎｍで検出した。
【図２０】例１１の実験２からの重ね合わせたサイズ排除Ａ２１４シグナルトレースを示すグラフである。示されるトレースはすべて、指示されている５００μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ及び５μｇ／ｍｌでのＦａｂ−Ｘ（ＶＲ４１３０）／Ｆａｂ−Ｙ（ＶＲ４１３１）１対１モル比混合物である。ピークは吸光度２１４ｎｍで検出した。
【図２１】抗原格子にわたる特異性についてのデータを示す表である。値はＳｙｋのリン酸化のパーセンテージ阻害（活性化では負の値）であり、評価された複数のＶ領域組合せの平均を表す。
【図２２】抗原格子にわたる特異性についてのデータを示す表である。値はＰＬＣｇ２のリン酸化のパーセンテージ阻害（活性化では負の値）であり、評価された複数のＶ領域組合せの平均を表す。
【図２３】抗原格子にわたる特異性についてのデータを示す表である。値はＡＫＴのリン酸化のパーセンテージ阻害（活性化では負の値）であり、評価された複数のＶ領域組合せの平均を表す。
【図２４】Ｆａｂ−Ｙ中の抗原３と組み合わせたＦａｂ−Ｘ中の抗原２についてのＶ領域組合せごとのＳｙｋ、ＰＬＣｇ２及びＡＫＴのリン酸化のパーセンテージ阻害を示すグラフである。
【図２５】Ｆａｂ−Ｙ中の抗原２と組み合わせたＦａｂ−Ｘ中の抗原３についてのＶ領域組合せごとのＳｙｋ、ＰＬＣｇ２及びＡＫＴのリン酸化のパーセンテージ阻害を示すグラフである。
【図２６】Ｆａｂ−Ｙ中の抗原４と組み合わせたＦａｂ−Ｘ中の抗原２についてのＶ領域組合せごとのＳｙｋ、ＰＬＣｇ２及びＡＫＴのリン酸化のパーセンテージ阻害を示すグラフである。
【図２７】Ｆａｂ−Ｙ中の抗原２と組み合わせたＦａｂ−Ｘ中の抗原４についてのＶ領域組合せごとのＳｙｋ、ＰＬＣｇ２及びＡＫＴのリン酸化のパーセンテージ阻害を示すグラフである。
【図２８】精製Ｆａｂ’として又は一過性上澄み由来の組合せのときの抗原３Ｆａｂ’−Ｘ及び抗原２Ｆａｂ’−ＹによるＢ細胞上での抗ＩｇＭ誘導ＣＤ７１発現のパーセンテージ阻害についてのデータを示すグラフである。円−精製抗原２Ｆａｂ−Ｙ＋抗原３Ｆａｂ−Ｘ  ＩＣ５０  ０．３２２４ｎＭ四角−一過性上澄み抗原２−Ｙ＋抗原３−Ｘ    ＩＣ５０  ０．２６４０ｎＭ三角−モックトランスフェクトされた上澄み対照
【図２９】精製Ｆａｂ’として又は一過性上澄み由来の組合せのときの抗原３Ｆａｂ’−Ｘ及び抗原２Ｆａｂ’−ＹによるＢ細胞におけるｐ３８の抗ＩｇＭ誘導リン酸化のパーセンテージ阻害についてのデータを示すグラフである。円−精製抗原２Ｆａｂ−Ｙ＋抗原３Ｆａｂ−Ｘ  ＩＣ５０  ０．１４１３ｎＭ四角−一過性上澄み抗原２−Ｙ＋抗原３−Ｘ    ＩＣ５０  ０．１８６１ｎＭ三角−モックトランスフェクトされた上澄み対照
【００５６】
図３０から３３についての記号表
１．抗原２Ｆａｂ−Ｙ（ＶＲ４４４７）＋抗原３Ｆａｂ−Ｘ（ＶＲ６０６６）；
２．抗原２Ｆａｂ−Ｙ（ＶＲ４４４７）＋抗原３Ｆａｂ−Ｘ（ＶＲ６０７８）；
３．抗原２Ｆａｂ−Ｙ（ＶＲ４４４７）＋抗原３Ｆａｂ−Ｘ（ＶＲ６０７９）；
４．抗原２Ｆａｂ−Ｙ（ＶＲ４４４７）＋抗原３Ｆａｂ−Ｘ（ＶＲ６０８０）；
５．抗原２Ｆａｂ−Ｙ（ＶＲ４４４７）＋抗原３Ｆａｂ−Ｘ（ＶＲ６０８２）；
６．抗原２Ｆａｂ−Ｙ（ＶＲ４４４７）＋抗原３Ｆａｂ−Ｘ（ＶＲ６０６７）；
７．抗原２Ｆａｂ−Ｙ（ＶＲ４４４７）＋抗原３Ｆａｂ−Ｘ（ＶＲ６０６８）；
８．抗原２Ｆａｂ−Ｙ（ＶＲ４４４７）＋抗原３Ｆａｂ−Ｘ（ＶＲ６０７０）；
９．抗原２Ｆａｂ−Ｙ（ＶＲ４４４７）＋抗原３Ｆａｂ−Ｘ（ＶＲ６０７１）；
１０．抗原２Ｆａｂ−Ｙ（ＶＲ４４４７）＋抗原３Ｆａｂ−Ｘ（ＶＲ６０７３）；
１１．抗原２Ｆａｂ−Ｙ（ＶＲ４４４７）＋抗原３Ｆａｂ−Ｘ（ＶＲ６０７５）；
１２．抗原２Ｆａｂ−Ｙ（ＶＲ４４４７）＋抗原３Ｆａｂ−Ｘ（ＶＲ６０７６）；
１３．抗原２Ｆａｂ−Ｙ（ＶＲ４４４７）＋抗原３Ｆａｂ−Ｘ（ＶＲ６０７７）；
１４．抗原２Ｆａｂ−Ｙ（ＶＲ４４４７）＋抗原３Ｆａｂ−Ｘ（ＶＲ６０６９）；
１５．抗原２Ｆａｂ−Ｙ（ＶＲ４４４７）＋抗原３Ｆａｂ−Ｘ（ＶＲ６０７２）；
１６．抗原２Ｆａｂ−Ｙ（ＶＲ４４４７）＋抗原３Ｆａｂ−Ｘ（ＶＲ６０７４）；
１７．抗原２Ｆａｂ−Ｙ（ＶＲ４４４７）＋抗原３Ｆａｂ−Ｘ（ＶＲ６０８１）；
１８．抗原２Ｆａｂ−Ｙ（ＶＲ４４４７）＋抗原３Ｆａｂ−Ｘ（ＴＳＵＰ−２４１１７）；
１９．抗原２Ｆａｂ−Ｙ（ＶＲ４４４７）＋抗原３Ｆａｂ−Ｘ（ＴＳＵＰ−２４４３２）；
２０．モックの上澄み１；
２１．モックの上澄み２；
２２．抗原２Ｆａｂ−Ｙ（ＶＲ４４４７）＋抗原３Ｆａｂ−Ｘ（４１２６）精製。
【００５７】
【図３０】ＵＣＢ＿Ｃｏｎｅ＿１７２由来のＩｇＭ刺激Ｂ細胞上での抗原３特異的Ｆａｂ−Ｘトランジエントと組み合わせた精製抗原２特異的Ｆａｂ−Ｙ（ＶＲ４４４７）によるリン酸読み出しの阻害を示すグラフである。
【図３１】ＵＣＢ＿Ｃｏｎｅ＿１７３由来のＩｇＭ刺激Ｂ細胞上での抗原３特異的Ｆａｂ−Ｘトランジエントと組み合わせた精製抗原２特異的Ｆａｂ−Ｙ（ＶＲ４４４７）によるリン酸読み出しの阻害を示すグラフである。
【図３２】ＵＣＢ＿Ｃｏｎｅ＿１７２由来のＩｇＭ刺激Ｂ細胞上での抗原３特異的Ｆａｂ−Ｘトランジエントと組み合わせた精製抗原２特異的Ｆａｂ−Ｙ（ＶＲ４４５０）によるリン酸読み出しの阻害を示すグラフである。
【図３３】ＵＣＢ＿Ｃｏｎｅ＿１７３由来のＩｇＭ刺激Ｂ細胞上での抗原３特異的Ｆａｂ−Ｘトランジエントと組み合わせた精製抗原２特異的Ｆａｂ−Ｙ（ＶＲ４４５０）によるリン酸読み出しの阻害を示すグラフである。
【図３４】抗原３及び抗原２特異的Ｆａｂ−Ｋｄ−Ｆａｂ又はＢＹｂｅによるＢ細胞における抗ＩｇＭ誘導リン酸化ＰＬＣγ２のパーセンテージ阻害についてのデータを示す図である。
【図３５】抗原３及び抗原２特異的Ｆａｂ−Ｋｄ−Ｆａｂ又はＢＹｂｅによるＢ細胞における抗ＩｇＭ誘導リン酸化Ｐ３８のパーセンテージ阻害についてのデータを示す図である。
【図３６】抗原３及び抗原２特異的Ｆａｂ−Ｋｄ−Ｆａｂ又はＢＹｂｅによるＢ細胞における抗ＩｇＭ誘導リン酸化Ａｋｔのパーセンテージ阻害についてのデータを示す図である。
【図３７】抗原３及び抗原２特異的Ｆａｂ−Ｋｄ−Ｆａｂ又はＢＹｂｅによるＢ細胞上の抗ＩｇＭ誘導ＣＤ７１発現のパーセンテージ阻害についてのデータを示す図である。
【図３８】抗原３及び抗原２特異的Ｆａｂ−Ｋｄ−Ｆａｂ又はＢＹｂｅによるＢ細胞上の抗ＩｇＭ誘導ＣＤ４０発現のパーセンテージ阻害についてのデータを示す図である。
【図３９】抗原３及び抗原２特異的Ｆａｂ−Ｋｄ−Ｆａｂ又はＢＹｂｅによるＢ細胞上の抗ＩｇＭ誘導ＣＤ８６発現のパーセンテージ阻害についてのデータを示す図である。
【図４０】ＶＲ４４４７／ＶＲ４１２６  ＢＹｂｅ及びＶＲ４４４７／ＶＲ４１２６／ＶＲ６４５  ＢＹｂｅ／アルブミンによるＢ細胞上でのＣＤ２７発現の阻害を示す図である。
【図４１】ＶＲ４４４７／ＶＲ４１２６  ＢＹｂｅ及びＶＲ４４４７／ＶＲ４１２６／ＶＲ６４５  ＢＹｂｅ／アルブミンによるＢ細胞上でのＣＤ７１発現の阻害を示す図である。
【図４２】ＶＲ４４４７／ＶＲ４１２６  ＢＹｂｅ及びＶＲ４４４７／ＶＲ４１２６／ＶＲ６４５  ＢＹｂｅ／アルブミンによるＢ細胞上でのＣＤ８６発現の阻害を示す図である。
【図４３】ＶＲ４４４７／ＶＲ４１３０  ＢＹｂｅ及びＶＲ４４４７／ＶＲ４１３０／ＶＲ６４５  ＢＹｂｅ／アルブミンによるＢ細胞上でのＣＤ２７発現の阻害を示す図である。
【図４４】ＶＲ４４４７／ＶＲ４１３０  ＢＹｂｅ及びＶＲ４４４７／ＶＲ４１３０／ＶＲ６４５  ＢＹｂｅ／アルブミンによるＢ細胞上でのＣＤ７１発現の阻害を示す図である。
【図４５】ＶＲ４４４７／ＶＲ４１３０  ＢＹｂｅ及びＶＲ４４４７／ＶＲ４１３０／ＶＲ６４５  ＢＹｂｅ／アルブミンによるＢ細胞上でのＣＤ８６発現の阻害を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００５８】
本明細書で使用される「二重特異性タンパク質複合体」とは、ヘテロ二量体繋により一緒に保持される２つのタンパク質を含む分子（本明細書で二重特異性成分と呼ばれるＡ及びＢは本明細書では二重特異性のそれぞれ第１のタンパク質成分及び第２のタンパク質成分とも呼ばれる）のことである。一実施形態では、タンパク質のうちの１つ又は両方は結合ドメインを有しており、例えば、タンパク質のうちの１つ又は両方は抗体又はその断片である（特に、Ｆａｂ又はＦａｂ’断片、そのような複合体はＦａｂ−Ｋｄ−Ｆａｂとも呼ばれる）。
【００５９】
本明細書で用いられる「融合タンパク質」は、結合パートナーＸ又はＹに融合しているタンパク質成分Ａ又はＢを含む（必要に応じて）。一実施形態では、融合タンパク質は、遺伝子構築物から組換え技法により発現される、例えば、ＤＮＡ構築物から宿主において発現される翻訳タンパク質である。本開示の文脈では、融合タンパク質の鍵となる特徴の１つは、このタンパク質が細胞から「単一タンパク質／ユニット」として発現することが可能であることである（当然のことながら、Ｆａｂ／Ｆａｂ’断片を含む融合タンパク質の場合では、２つの鎖が存在することになるが、これは本明細書の目的のために、１つの鎖、場合によって本明細書で下に記載されるリンカーを介して、典型的には必要に応じてそのＣ末端でＸ又はＹに融合されている重鎖を有する単一タンパク質と見なすことになる）。
【００６０】
ヘテロ二量体繋（tether）Ｘ：Ｙの機能は、ＡとＢの相乗的機能をもたらす、又は例えば、本明細書に記載される方法を用いて、同定することができるように、タンパク質ＡとＢを互いの近傍に保持することである。
【００６１】
本明細書で使用される「ヘテロ二量体繋（tether）」とは、２つの結合パートナーを一緒に保持するのに十分である全体的親和性を有する互いの間の相互作用：（結合などの）を形成する２つの異なる結合パートナーＸとＹを含む繋のことである。一実施形態では、Ｘ及び／又はＹはホモ二量体を形成するには不適切である。
【００６２】
ヘテロ二量体的に繋がれたヘテロ二量体繋は本明細書では互換的に使用される。
【００６３】
一実施形態では、本明細書で用いられる「ホモ二量体を形成するには不適切な」とは、ホモ二量体よりもＸ−Ｙのヘテロ二量体の形成のほうが好ましい、例えば、形成された後は、熱力学的に安定ななどのより安定している形態のことである。一実施形態では、ＸとＹの間の結合相互作用は一価である。
【００６４】
一実施形態では、Ｘ−Ｙ相互作用はＸ−Ｘ又はＹ−Ｙ相互作用よりも都合がよい。このせいで、融合タンパク質Ａ−ＸとＢ−Ｙが混合されると、ホモ二量体Ｘ−Ｘ又はＹ−Ｙの形成は減少する。典型的には、１対１モル比の混合に続いて７５％を超えるヘテロ二量体が形成される。
【００６５】
必要に応じて、例えば、本開示に従った融合タンパク質ユニット及び／又は二重特異性タンパク質複合体を精製するために、カラムクロマトグラフィーなどの精製ステップ（特に、１ステップ精製）を用いることができる。
【００６６】
一実施形態では、精製ステップはそれぞれの融合タンパク質の発現後に提供されるが、典型的には凝集体レベルは低い。したがって、一実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ混合に先立って、融合タンパク質（単数又は複数）は実質的に純粋な形態で提供される。本明細書で用いられる実質的に純粋な形態とは、融合タンパク質が９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％単量体である場合のことである。
【００６７】
一実施形態では、融合タンパク質（単数又は複数）の精製は実施されない。
【００６８】
一実施形態では、それぞれの融合タンパク質ユニットは異なる発現実験／実行で発現される。
【００６９】
一実施形態では、二重特異性タンパク質複合体を産生するために混合前には、融合タンパク質（単数又は複数）の精製は実施されない。一実施形態では、混合前及び／又は後には、融合タンパク質（単数又は複数）の精製は実施されない。
【００７０】
一実施形態では、二重特異性タンパク質複合体形成後には精製は必要ではない。一実施形態では、混合後及び一般には追加の精製なしで、組成物の少なくとも５０％は所望の二重特異性タンパク質複合体であり、例えば、組成物の少なくとも６０、６５、７０、７５、８０％は必要とされる二重特異性タンパク質複合体である。
【００７１】
一実施形態では、本方法のｉｎ  ｖｉｔｒｏ混合ステップにおいて用いられる融合タンパク質の比は、１．５対１又は２対１などのＡ−Ｘ対Ｂ−Ｙで０．８対１から３対１である。
【００７２】
一実施形態では、本方法のｉｎ  ｖｉｔｒｏ混合ステップにおいて用いられる融合タンパク質の比は、特にモル比で、１．５対１又は２対１などのＢ−Ｙ対Ａ−Ｘで０．８対１から３対１である。
【００７３】
一実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ混合ステップにおいて用いられるＡ−Ｘ対Ｂ−Ｙの比は、１対１、特に１対１モル比である。
【００７４】
本開示は、融合タンパク質Ａ−ＸとＢ−Ｙを、例えば、１対１モル比で混合することを含む、本開示に従った二重特異性複合体を調製する方法までにも及ぶ。
【００７５】
一実施形態では、混合はｉｎ  ｖｉｔｒｏで起こる。
【００７６】
一実施形態では、混合は細胞、例えば、宿主細胞において起こる。
【００７７】
一実施形態では、混合はｉｎ  ｖｉｖｏで起こり、すなわち、融合タンパク質Ａ−ＸとＢ−Ｙは対象の身体内で互いに相互作用してヘテロ二量体繋を、その結果、二重特異性タンパク質複合体を形成する。
【００７８】
一実施形態では、ＸとＹは互いに完全に特異的であり、細胞内又は対象の身体内では他のいかなるペプチド／タンパク質とも結合しない。これは、例えば、ＸとＹが標的細胞中にも標的対象身体中にも天然に存在しないことを保証することによって達成することが可能である。これは、例えば、対象にとっては異なっている種又は実体（例えば、酵母タンパク質）由来であるＸ又はＹを選択し、それに対しもう１つの可変因子が特異的であることを保証することによって達成することが可能である。有利なことに、これにより融合タンパク質Ａ−Ｘ及び／又はＢ−Ｙが望ましくない標的へ結合して、それによって望まれない非特異的な効果を生じるのが妨げられる。
【００７９】
一実施形態では、結合パートナーのうちの１つ（又は少なくとも１つ）はホモ二量体を形成することができず、例えば、結合パートナーのアミノ酸配列が突然変異してホモ二量体の形成を排除する又は最小化する。
【００８０】
一実施形態では、結合パートナーの両方がホモ二量体を形成することができず、例えば、ペプチド結合パートナーのアミノ酸配列が突然変異してホモ二量体の形成を排除する又は最小化し、それに特異的なＶＨＨが用いられる。
【００８１】
本明細書で用いられるホモ二量体も凝集体も形成することができないとは、ホモ二量体又は凝集体を形成する傾向が低い又はないことである。本明細書で用いられる低いとは、例えば、混合又は発現又は精製後、４、３、２、１、０．５％若しくはそれ未満の凝集体などの、５％又はそれ未満のことである。
【００８２】
融合タンパク質中の少量の凝集体又はヘテロ二量体的に繋ぎ合わされた二重特異性タンパク質複合体中に残存するものは一般に本開示のスクリーニング法に最小限の効果を及ぼす。したがって、一実施形態では、融合タンパク質（単数又は複数）及び／又は二重特異性タンパク質複合体（単数又は複数）の精製は方法においては、特に混合ステップ後には用いない。
【００８３】
一実施形態では、：は、水素結合及び静電気相互作用などの、引力、例えば、ファンデルワールス力に基づく、特に、抗原（ペプチドなどの）に対する抗体特異性に基づく結合相互作用である。
【００８４】
一実施形態では、：は、クリックケミストリーなどの特定の化学的相互作用から形成される共有結合である。一実施形態では、：は共有結合ではない。一実施形態では、コンジュゲーション／カップリング化学反応は本開示の二重特異性タンパク質複合体を調製するのに用いられない。
【００８５】
本明細書で用いられる「複合体を形成する」とは、結合相互作用又は化学反応を含む相互作用のことであり、この相互作用は複合体が会合し融合タンパク質が一緒に保持される適切な条件下で融合タンパク質成分Ａ−Ｘ及びＢ−Ｙが接触するときには十分に特異的で強力である。
【００８６】
本明細書で用いられる「一緒に保持される」とは、Ｘ：Ｙ結合後、複合体を１つの分子であるかのように取り扱うことができ、多くの場合に単一分子のように振る舞い機能するようにその成分（融合タンパク質）を互いに近傍に保持することである。一実施形態では、保持によって複合体は本明細書で開示される方法において使用するのに適したものになる、すなわち、少なくとも１つの機能スクリーニングにおいて使用するのに適したものになる。
【００８７】
本明細書で用いられる特異性とは、例えば、相互作用におけるパートナー、例えば、Ｘ：Ｙ若しくはＡと抗原若しくはＢと抗原が互いのみを認識する又は非パートナーと比べて互いに対して有意に高い親和性、例えば、無関係の非パートナータンパク質への結合のバックグランドレベルと比べて、例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０倍の親和性を有する場合のことである。
【００８８】
本明細書で用いられるＸとＹに関する特異性とは、相互作用にある結合パートナーＸとＹが互いのみを認識する又は非パートナーと比べて互いに対して有意に高い親和性、例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０倍の親和性を有する場合のことである。
【００８９】
一実施形態では、結合相互作用は可逆的である。一実施形態では、結合相互作用は基本的に非可逆的である。
【００９０】
本明細書で用いられる基本的に非可逆的であるとは、抗体又は結合断片の遅いオフレート（解離定数）のことである。
【００９１】
一実施形態では、ＸとＹの間の結合相互作用は低い解離定数を有する。低い解離定数の例には、１〜９×１０−２ｓ−１又はそれよりも少ない、例えば、１〜９×１０−３ｓ−１、１〜９×１０−４ｓ−１、１〜９×１０−５ｓ−１、１〜９×１０−６ｓ−１、１〜９×１０−７ｓ−１が含まれる。特に適した解離定数には、２×１０−４ｓ−１又はそれよりも少ない、例えば、１×１０−５ｓ−１、１×１０−６ｓ−１又は１×１０−７ｓ−１が含まれる。
【００９２】
理論に縛られたくはないが、低い解離定数（オフレートとも呼ばれる）であれば分子は、二重特異性タンパク質複合体が特に機能スクリーニングアッセイにおいて有用になるほど安定していることができると考えられる。
【００９３】
一実施形態では、互いに対するＸとＹの親和性は５ｎＭ又はそれよりも強く、例えば、４ｎＭ、３ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭ又はそれよりも強い。
【００９４】
一実施形態では、互いに対するＸとＹの親和性は９００ｐＭ又はそれよりも強く、例えば、８００、７００、６００、５００、４００、３００、２００、１００若しくは５０ｐＭ又はそれよりも強い。
【００９５】
別の実施形態では、互いに対するＸとＹの親和性は１０ｐＭ又はそれよりも強く、例えば、９、８、７、６、又は５ｐＭである。
【００９６】
親和性は実体のオンレートとオフレートから計算される値である。本明細書で使用される用語「親和性」とは、分子（例えば、抗体）の単一の結合部位とその結合パートナー（例えば、ペプチド）の間の非共有結合的相互作用の総計の強さのことである。その結合パートナーに対する分子の親和性は一般に解離定数（ＫＤ）により表すことが可能である。親和性は、表面プラズモン共鳴法、特にＢＩＡコアなどの本明細書に記載される方法を含む、当技術分野で公知の一般的方法により測定することが可能である。
【００９７】
しかし、複合体を１つにまとめておく能力は親和性のことだけではない。理論に縛られたくはないが、実際に、３つの重大な成分：オンレート、オフレート及び親和性があると本発明者らは仮定している。親和性の計算はオンレートとオフレートに基づいている。したがって、オンレートが低くオフレートが速い場合には、親和性は低くなり、それでは二重特異性タンパク質複合体を１つにまとめておくのに十分ではなくなる。しかし、遅いオンレートは遅いオフレートにより埋め合わせされて、全体的に適切な親和性をもたらすことができると考えられる。
【００９８】
いくつかの実施形態では、高いオンレートは複合体を１つにまとめておくのに十分である場合がある。
【００９９】
複合体で用いられる結合パートナー（Ｘ及びＹ）が遅いオンレートを有する場合、成分を混合して複合体を形成させた後に追加の時間が必要になる可能性がある。
【０１００】
結合パートナー間の親和性が十分に高い場合、二重特異性タンパク質複合体のタンパク質（Ａ及びＢ）の親和性がその標的に弱い結合しかしなくても、二重特異性タンパク質複合体は、その所望の生物学的機能を実施することが可能である場合がある。逆に、タンパク質（Ａ及びＢ）がその標的に強く結合することができる場合、結合パートナー（Ｘ及びＹ）の互いに対する親和性がさらに低くても同じ生物学的機能を達成することが可能である場合がある。言い換えると、結合パートナー間のさらに高い親和性が標的に対するもっと低い親和性の埋め合わせができる及び逆も同じであるように「三位一体」の関係が存在する。
【０１０１】
一実施形態では、タンパク質Ａのそのリガンド又は抗原に対する親和性は約１００ｎＭ又はそれよりも強い、例えば、約５０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、５００ｐＭ、２５０ｐＭ、２００ｐＭ、１００ｐＭ又はそれよりも強い、特に５０ｐＭ又はそれよりも強い結合親和性である。
【０１０２】
一実施形態では、タンパク質Ｂのそのリガンド又は抗原に対する親和性は約１００ｎＭ又はそれよりも強い、例えば、約５０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、５００ｐＭ、２５０ｐＭ、２００ｐＭ、１００ｐＭ又はそれよりも強い、特に５０ｐＭ又はそれよりも強い結合親和性である。
【０１０３】
一実施形態では、ＣＨ１などの重鎖中の定常ドメインとＣＫａｐｐａなどの軽鎖中の定常ドメインの間の相互作用は、本開示に従った二重特異性複合体の形成及び／又は安定性に寄与する。したがって、本開示の二重特異性複合体においてＦａｂ又はＦａｂ’断片を用いることは有益である。
【０１０４】
一実施形態では、本開示の二重特異性複合体はエフェクター機能のある成分を含まない、例えば、複合体はＣＨ１及びＣＫａｐｐａ又はＣＬａｍｂｄａ以外の定常ドメインを含まない、特にＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ４及びその組合せを含む群から独立して選択される定常ドメインを含まない。一実施形態では、本開示の二重特異性複合体はＦｃ領域を欠く。
【０１０５】
一実施形態では、本明細書の方法は、ライブラリーから本開示の融合タンパク質を調製することによりナイーブファージライブラリーをスクリーニングするために用いられる。
【０１０６】
本発明の二重特異性タンパク質複合体は、機能スクリーニングを含むいかなる適切な用途においても使用することができる。この新規のフォーマットは、機能に基づいてタンパク質標的及びその標的タンパク質上の最適エピトープを同定するための多重機能スクリーニングに特に有用であり、この標的タンパク質は二重特異性療法が標的とすることができると考えられる。さらに、タンパク質Ａ及びＢが抗体又はその結合断片である場合、二重特異性タンパク質複合体は、二重特異性抗体療法において使用するための最適の可変領域対を同定する多重機能スクリーニングのためにも使用することができる。
【０１０７】
本明細書で用いる「マルチプレックス」は、
少なくとも１つのヘテロ二量体的に繋ぎ合わされた二重特異性タンパク質複合体及び少なくとも１つの関連する生物学的コンパレーターを同じ若しくは異なるフォーマットで作製するよう組み合わされた少なくとも２つの成分融合タンパク質（Ａ−Ｘ及びＹ−Ｂ）、又は
場合によって少なくとも１つの関連する生物学的コンパレーターを同じ若しくは異なるフォーマットで有する少なくとも２つのヘテロ二量体的に繋ぎ合わされた二重特異性タンパク質複合体
を含む試験のための実体の集団である。
【０１０８】
明らかに有用であるためには、コンパレーターとして用いられる異なるフォーマットは、本開示で用いられる機能ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいて試験するのに適していなければならない。一例では、マルチプレックス中のコンパレーターは、Ａ−ＸとＢ−Ｘの一価混合物又はＡ−Ｘ−Ｙ−Ａの二価単一特異性複合体である。
【０１０９】
一実施形態では、マルチプレックスは、特に、格子２から１００の第１及び第２の融合タンパク質（Ａ−Ｘ及びＢ−Ｙ）において混合することから作製される、１から数十万のヘテロ二量体的に繋ぎ合わされた二重特異性タンパク質複合体、例えば、２から１００，０００又は２から１０，０００などの２から５００，０００の前記複合体を含む。一実施形態では、マルチプレックスは、例えば、２から９００、２から８００、２から７００、２から６００、２から５００、２から４００、２から３００、２から２００、２から１００、２から９０、３から８０、４から７０、５から６０、６から５０、７から４０、８から３０、９から２５、１０から２０又は１５などの２から１０００の二重特異性タンパク質複合体を含む。そのような格子の例は図３を参照されたい。
【０１１０】
一実施形態では、このマルチプレックス中のヘテロ二量体的に繋ぎ合わされた二重特異性タンパク質の数はｎ２であり、ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５又はそれよりも多い。
【０１１１】
マルチプレックスはアレイ、例えば、マイクロタイタープレートの形態でもよく、マイクロプレートのそれぞれのウェルが異なった二重特異性タンパク質複合体を含有することができる。二重特異性タンパク質複合体は固体基材表面、例えば、ビーズに繋ぎ留めることができる、又は二重特異性タンパク質複合体は、例えば、ウェル内で若しくは液滴内で液体（例えば、溶液又は培養液）の形態で懸濁されることもできる。
【０１１２】
一実施形態では、マルチプレックス中のすべての「Ａ」は異なるタンパク質であり、好ましくは標的抗原に結合する抗体若しくはその結合断片であり、すべての「Ｂ」は異なるタンパク質であり、好ましくは標的抗原に結合する抗体若しくはその結合断片である。
【０１１３】
一実施形態では、マルチプレックスは下で考察される格子、例えば、８×８、１６×１６又は１６×２０で提供され、これはそれぞれ６４、２５６又は３２０試料に等しい。
【０１１４】
本明細書で用いられる「格子」とは、タンパク質Ａ（Ａ−Ｘで）などの１つの可変因子はＸ軸（水平軸）などの１つの軸に沿って変え、タンパク質Ｂ（Ｂ−Ｙで）などの別の可変因子はＹ軸（垂直軸）などのもう１つの軸に沿って変える２次元プロット又はアレイのことである。この配置は可変因子の種々の組合せ（並べ替え）を系統的に評価することを支援する。
【０１１５】
一実施形態では、マルチプレックスは９６ウェルプレート上で提供され、分析される試料はその倍数、すなわち、９６、１９２、３８４、等でもよい。
【０１１６】
有利なことに、格子配置は、本開示に従った二重特異性タンパク質複合体の生物学的機能を効率的にスクリーニングするのに特に有利である。図３はそのような格子の例を示しており、４つの第１の融合タンパク質は４つの第２の融合タンパク質と容易に組み合わせて１６の二重特異性タンパク質複合体を産生することが可能である。
【０１１７】
スクリーニング格子の他の変動は当業者には明らかであり、例えば、第１の融合タンパク質（Ａ−Ｘ）中の第１のタンパク質（Ａ）は一定に保ち、第２の融合タンパク質（Ｂ−Ｘ）中の第２のタンパク質（Ｂ）は変化させる。これは、予め選択された第１のタンパク質との相乗的機能について多数の異なる第２のタンパク質を迅速にスクリーニングするために有用であり得る。
【０１１８】
別の実施形態では、タンパク質Ａは、それぞれの抗体変異体が同じ抗原に特異的であるが可変領域の異なる組合せを有するように、タンパク質Ａの抗体可変領域を変えることにより１つの軸に沿って変化する。タンパク質Ｂは一定に保つことができる又は同じ様式で変化する若しくは抗原特異性がＢタンパク質について変化する（格子を横切る又は下る）ように変化することもできる。
【０１１９】
有利なことに、そのようなスクリーニング格子であれば、二重特異性タンパク質複合体が同じ抗原に特異的であるが可変領域の異なる組合せを有するときは、相乗的機能のわずかな違いの検出が潜在的に可能になる場合がある。
【０１２０】
一実施形態では、本開示に従った「共通の」第１の融合タンパク質（Ａ−Ｘ）がそれぞれのウェル内に存在することができる。次に、本開示に従った一定範囲の異なる第２の融合タンパク質（Ｂ−Ｙ）をそれぞれのウェル内に分注することができる。それに続いて、２つの結合パートナー（Ｘ及びＹ）の特異的な結合相互作用は２つの融合タンパク質を物理的に近づけて二重特異性タンパク質複合体を形成させる。このために、すべて共通の第１の標的抗原（Ａが結合している）に結合するが、二重特異性タンパク質複合体ごとに異なる可能性がある第２の標的抗原（Ｂが結合している）にも結合することができる二重特異性タンパク質複合体を含むマルチプレックスが生じる。
【０１２１】
一実施形態では、Ｂ−Ｙ融合タンパク質は、Ａ−Ｘ中の可変領域と組み合わされた場合、可変領域及び／又はＢが結合している所与の標的抗原のエピトープの最適化を可能にするために、同じ標的抗原に対して異なる可変領域を含む。
【０１２２】
本明細書で用いられる「共通の」第１融合タンパク質とは、そのＡ又はＢ成分が同じタンパク質又はエピトープに結合する、特にＡ又はＢ成分が共通の融合タンパク質において完全な同一性を有する融合タンパク質のことであり、すなわち、共通の第１融合タンパク質は常に同じ可変領域配列を含む。
【０１２３】
当業者であれば、マルチプレックス中のそれぞれの位置の二重特異性タンパク質複合体の所望の特異性を容易に制御することが可能であるように、上記の異なる変動も認識している。これにより、そのようなマルチプレックスを機能アッセイにおいて使用すると二重特異的タンパク質複合体の異なる組合せの効率的スクリーニングが可能になる。一実施形態では、要因計画を用いて格子で用いられる可変因子を定義する。
【０１２４】
一実施形態では、本開示の方法はハイスループット分析に貢献する。
【０１２５】
一実施形態では、複数の二重特異性タンパク質複合体は平行して又は基本的の同時に試験される。
【０１２６】
本明細書で用いられる同時にとは、試料／分子／複合体が同じ分析で、例えば、同じ「ラン」で分析されることである。一般に所与の試料ランに用いられる試薬は同じバッチ、濃度、細胞源、等になり、したがって、同じ特性を有するので、これは有利になれる。さらに、温度及び湿度などの分析を実施する環境条件は類似する可能性がある。
【０１２７】
一実施形態では、同時にとは、シグナル出力が基本的に同時刻に機器により分析される共存分析のことである。このシグナルは得られた結果を解釈するのにデコンボリューションが必要になる場合がある。
【０１２８】
有利なことに、複数の二重特異性タンパク質複合体を試験すれば、多数の二重特異性タンパク質複合体のより効率的なスクリーニング及び新たな興味深い関係の同定が可能になる。
【０１２９】
一実施形態では、複数の二重特異性タンパク質複合体は、上記のマルチプレックスを使用し同じものを１つ又は複数の機能アッセイに供することにより試験する。したがって、本発明は、式Ａ−Ｘ：Ｙ−Ｂのヘテロ二量体的に繋ぎ合わされた二重特異性タンパク質複合体における相乗的生物学的機能を検出するための方法であって、
Ｘ：Ｙはヘテロ二量体繋であり、
：はＸとＹの間の結合相互作用であり、
Ａ及びＢはそれぞれＸ及びＹとの融合タンパク質の形態の二重特異性のタンパク質成分であり、
前記方法は、
（ｉ）少なくとも１つのヘテロ二量体的に繋ぎ合わされた二重特異性タンパク質複合体を含むマルチプレックスの一部又はすべてについて機能アッセイにおいて活性を試験するステップと、
（ｉｉ）機能アッセイからの読み出し情報（単数又は複数）を解析して、ヘテロ二量体的に繋ぎ合わされた二重特異性タンパク質複合体における相乗的生物学的機能を同定する又は検出するステップと
を含み、
Ｙは抗原でありＸはＹに特異的である抗体若しくはその結合断片である、又はＸは抗原でありＹはＸに特異的である抗体若しくはその結合断片である、
上記方法を提供する。
【０１３０】
本明細書で使用される用語「生物学的機能」とは、試験されている生物学的実体にとっては天然の又は目的とする活性、例えば、細胞、タンパク質若しくは類似のものの天然の活性のことである。理想的には、生物学的機能の存在は、Ｂ細胞若しくはＴ細胞などの生細胞などの哺乳動物細胞、又は組織をｅｘ  ｖｉｖｏで用いるアッセイを含む、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ機能アッセイを使用して試験することが可能である。本明細書で用いられる天然の機能には、がんなどの疾患に関連する機能などの異常な機能も含まれる。
【０１３１】
本明細書で用いられる関連する「生物学的コンパレーター」とは、ある変化又は新規の活性若しくは機能が存在するかどうかを確証するために二重特異性タンパク質複合体について用いられるのと同じアッセイにおいて活性を評価するのに適した実体のことである。Ａ−Ｘ：Ｙ−Ｂに適したコンパレーターには、天然の形態の又は二重特異性体と同じフォーマットで示される精製されたタンパク質（組換えタンパク質を含む）、例えば、ＡとＢがＡ−Ｘ：Ｙ−Ａ若しくはＢ−Ｘ：Ｙ−Ｂなどの同じ実体、すなわち二価単一特異性複合体である場合が含まれることがある。代わりに、複合体化されていない形態の融合タンパク質Ａ−Ｘ又はＢ−Ｙは、コンパレーターとして単独で又はＡ−ＸとＢ−Ｘを一緒に若しくはＡ−ＹとＢ−Ｙを一緒になどの複合体化されていない混合物として用いることができる。代わりに、異なるフォーマットの複数のコンパレーター（特に本明細書に記載される）を用いることができる。当業者であれば、共通の一般的知識又は文献に見出される情報に基づいて適切な対照／コンパレーターを同定し含むことができる。
【０１３２】
本明細書で使用される用語「相乗的機能」又は「相乗的生物学的機能」とは、
・二重特異性体が用いられるまでは個々の融合タンパク質成分を用いても観測されない（二重特異性フォーマット中には存在しない前記抗原に対する抗体の組合せを用いて観察される活性を含むことがあるが、特に、２つの結合ドメインが二重特異性フォーマットにおいて連結されているときにのみ観察される活性のことである）
生物活性若しくは生物活性のレベル又は生物学的機能若しくは生物活性に対する効果、又は
・本開示の二重特異性タンパク質複合体の第１と第２のタンパク質が個別に用いられるときに観察される活性と比べて高い若しくは低い活性、例えば、二重特異性形態でしか観察されない活性
のことである。
【０１３３】
したがって、「相乗的」は新規の生物学的機能又は新規の活性を含む。本明細書で用いられる相乗的機能は一般には、単純なターゲティングは含まない、すなわち、結合のみに基づくが、一般に結合後の一部の阻害、活性化、シグナル伝達又は類似のものを含む。
【０１３４】
本明細書で用いられる新規の生物学的機能又は新規の活性とは、２つ若しくはそれよりも多い相乗的実体（タンパク質Ａ及びタンパク質Ｂ）が１つにまとめられる（二重特異性体として又は他の方法で）まで明らかではない若しくは存在しない生物学的機能若しくは活性又はこれまで同定されていない機能のことである。
【０１３５】
本明細書で用いられるより高いとは、ゼロからの増加を含む活性の増加、例えば、個々の複合体化されていない二重特異性成分（単数又は複数）が関連する機能アッセイにおいて活性がない二重特異性体におけるある活性のことであり、本明細書では、新たな活性又は新規の生物学的機能とも呼ばれる。本明細書で用いられるより高いには、個々の複合体化されていない二重特異性成分（単独で試験される又は連結されていることと組み合わせて）と比べて関連する機能アッセイにおいて二重特異性体の相加的機能よりも大きい、例えば、関連する活性において１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００％又はそれよりも多いことも含む。
【０１３６】
一実施形態では、一つに複合体化されていないタンパク質は二重特異性体と同じ活性を有し、この活性又は機能はこれまで未知であった。これも本明細書の文脈においては新規の相乗的機能である。
【０１３７】
一実施形態では、相乗的機能はより高い機能である。
【０１３８】
一実施形態では、相乗的機能はより低い機能である。
【０１３９】
本明細書で用いられるより低い機能とは、関連する機能アッセイにおける二重特異性体が、関連する機能アッセイにおいて活性を有する個々の複合体化されていない二重特異性成分（単数又は複数）と比べてほとんど活性がないかまったくないことを言い、本明細書では、個々のタンパク質として分析される又は同じ条件下でタンパク質の混合物として分析される新たな活性又は新規の生物学的機能とも呼ばれ（天然のタンパク質、すなわち、融合タンパク質には存在しないし、前記タンパク質の活性ドメイン若しくは断片を含むｉｎ  ｖｉｖｏで存在する複合体以外の他のいかなる複合体の一部でもない組換え単離タンパク質などの）、例えば、関連する活性の１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００％又はそれよりも多い減少のことである。活性の１００％よりも多い減少とは、異なる方向でのプラスの活性の増加のことであり、例えば、実体がアゴニストである場合、１００％を超える活性の減少は実体をアンタゴニストにすることができ逆もまた同じである。
【０１４０】
一実施形態では、二重特異性複合体の活性はタンパク質Ａとタンパク質Ｂの既知の機能の合計よりも低い。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、本開示の二重特異性タンパク質複合体は単に相加的生物学的機能を有する。本明細書で用いられる相加的生物学的機能とは、同じ条件下で試験された場合、成分Ａ及びＢ個別のそれぞれの合計と同じである機能のことである。相加的機能は、活性又は機能がこれまで未知であった又は同定されていなかった場合には新規の機能になることができる。
【０１４２】
スクリーニングは、同定される所望の機能に応じて、当技術分野では公知のいかなる適切なアッセイでも使用して実施される。
【０１４３】
一実施形態では、本開示の方法において用いられる機能アッセイはｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏアッセイである。
【０１４４】
本明細書で使用される「機能アッセイ」は、アッセイ条件に曝される二重特異性タンパク質複合体、抗体複合体又は抗体の混合物の１つ又は複数の所望の特性又は活性を決定するために使用することが可能なアッセイである。適切な機能アッセイは、結合アッセイ、アポトーシスアッセイ、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）アッセイ、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）アッセイ、細胞成長又は増殖の阻害（細胞静止効果）アッセイ、細胞殺傷（細胞傷害効果）アッセイ、細胞シグナル伝達アッセイ、サイトカイン産生アッセイ、抗体産生及びアイソタイプスイッチ、細胞分化アッセイ、コロニー形成アッセイ、走化性アッセイ、細胞接着アッセイ、細胞遊走アッセイ、細胞周期アッセイ、代謝アッセイ（全細胞及びオルガネラ機能）、標的細胞への病原体の結合の阻害を測定するためのアッセイ、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の分泌又は他の分泌された分子を測定するアッセイ、静菌、殺菌力、ウイルスの中和についてのアッセイ、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法、標識化法などを含む、抗体が結合している部位への免疫系の成分の引力を測定するアッセイでもよい。
【０１４５】
一実施形態では、マウス腫瘍モデル、自己免疫疾患のモデル、ウイルス感染若しくは細菌感染の齧歯類又は霊長類モデル、及び同類のものを含む動物モデルなどのｉｎ  ｖｉｖｏアッセイを用いることができる。
【０１４６】
当業者であれば調査している標的／タンパク質に基づいて適切な機能アッセイを選択することが十分にできる。しかし、複合体は、新たな機能性を同定する試みに関連していると考えられるアッセイを前選択せずに「標準」アッセイのパネルを受けさせることができる。
【０１４７】
二重特異性抗体複合体の文脈では、本開示に従った二重特異性抗体複合体の効力は、当業者に一般的に知られている方法によってそのようなモデルにおいて個々の抗体又は抗体（又は断片）の混合物と比較することが可能である。
【０１４８】
例えば、二重特異性抗体複合体は、抗原に結合する以外の特性を含む生物学的機能である、増殖を阻害する、細胞の生存能若しくは代謝活性に影響を及ぼす（例えば、アラマーブルーなどの染色を用いて、又は細胞により発現されるルシフェラーゼに起因する発光をモニターすることにより）、又はがん細胞のアポトーシスを引き起こす能力について試験することができる。
【０１４９】
対象の特定の疾患に密接な関係のある機能アッセイを選択することによって、本開示の方法により既知の又は未知の標的分子に結合する潜在的な治療抗体を同定することが可能になる。したがって、本開示の方法を使用して新たな標的分子を同定する及び／又は潜在的な治療抗体を直接同定することが可能になる。有利なことに、本方法はいかなる特定のアッセイ（単数又は複数）にも限定されず、要件に応じてもっとも適切な機能アッセイを選択する完全な柔軟性を使用者に提供する。
【０１５０】
所望の生物学的機能を求めて二重特異性抗体複合体をスクリーニングする場合、種々の戦略を用いることができる。例えば、抗体を含有する培地を生物活性について直接スクリーニングすることが可能である。代わりに、生物活性についてのスクリーニングに先立って抗体を被覆されたビーズに又はマイクロタイタープレートに結合させることが可能である。代わりに、融合タンパク質をニッケル捕捉精製ステップにおいてＨｉｓタグを介して精製することができる。そのような戦略により抗体の局所的濃度を増加させ、機能アッセイからさらに明確な結果を得ることができる。
【０１５１】
機能アッセイは、結果の信頼性を高めるために特定の二重特異性抗体複合体の異なる試料を用いて又は用いずに必要に応じて何回か繰り返すことができる。当業者には公知の種々の統計検定を用いて統計的に有意な結果を同定し、このようにして、生物学的機能を有する二重特異性抗体複合体を同定することが可能である。
【０１５２】
スクリーニングのための機能アッセイを確立すると、当業者であれば、それを超えると同定された活性が「ヒット」だと見なされる適切な閾値を設定することが可能である。１つよりも多い機能アッセイが使用されるところでは、管理しやすいヒット率を確立するためにアッセイごとの閾値を適切なレベルで設定することができる。一例では、ヒット率は３〜５％でもよい。一例では、Ｂ細胞機能を阻害する抗原の対を探索する際に設定される基準は、Ｂ細胞活性化アッセイにおいて少なくとも２つのリン酸読み出しの少なくとも３０％阻害であってよい。
【０１５３】
本発明の二重特異性タンパク質複合体では、以下のタンパク質及びペプチド成分を使用することができる。
【０１５４】
一実施形態では、結合対の第１の結合パートナーＸと第２の結合パートナーＹのうちの少なくとも１つは、独立してペプチド及びタンパク質から選択され、例えば、第１の結合パートナー又は第２の結合パートナーはペプチドである。
【０１５５】
適切なペプチドには、ＧＣＮ４、Ｆｏｓ／Ｊｕｎ（ヒト及びマウスＦｏｓはそれぞれＵｎｉｐｒｏｔ番号Ｐ０１１００及びＰ０１１０１を有し、ヒト及びマウスＪｕｎはそれぞれＵｎｉｐｒｏｔ番号０５４１２及び０５６２７を有する）、ヒトインフルエンザ赤血球凝集素のアミノ酸９８から１０６に対応するＨＡタグ、ポリヒスチジン（Ｈｉｓ）、ｃ−ｍｙｃ及びＦＬＡＧを含む群を含む。他のペプチドも本開示において使用するのに適切と予想されており、特に適切なペプチドはタンパク質精製のためのアフィニティータグである。なぜならば、そのようなペプチドはそのそれぞれの結合パートナーに高親和性で結合する傾向があるからである。
【０１５６】
一実施形態では、ペプチドはＥ５Ｂ９ではない。
【０１５７】
本明細書で使用される用語「ペプチド」とは、ペプチド結合により連結されたアミノ酸の短いポリマーのことであり、ペプチドは２〜１００の範囲で、例えば、６から９８、７から９７、８から９６又は５から２５などの５から９９のアミノ酸を含有する。一実施形態では、本開示で用いられるペプチドは５０アミノ酸残基又はそれよりも少ない、例えば、４０、３０、２０、１０又はそれよりも少ないアミノ酸配列である。本開示で使用されるペプチドは目的に適合するのに十分な長さであり、例えば、ペプチドがリンカーである場合、ペプチドはそれが連結する断片がその生物学的機能を果たすことを可能にするのに適した長さである必要があり、代わりに、ペプチドが結合パートナーである場合、ペプチドは抗体などの別の実体に特異的に結合することができなければならない。
【０１５８】
一実施形態では、結合対のもう一方の結合パートナー（別の第１又は第２の結合パートナー）はタンパク質である。
【０１５９】
本明細書で用いられるタンパク質とは、１００アミノ酸又はそれよりも多いアミノ酸配列のことである。一実施形態では、本明細書で用いられる「タンパク質」とは、二次又は三次構造を持つアミノ酸配列のことである。
【０１６０】
ポリペプチドとタンパク質は本明細書では互換的に用いられる。しかし、ポリペプチドは通常、単純な構造を有し、例えば、二次及び／又は三次構造はほとんどないタンパク質である。
【０１６１】
一実施形態では、ペプチドとタンパク質の間の違いは二次構造及び／又は三次構造の存在又は非存在に基づいており、ペプチドは二次構造がなく、二次構造及び／又は三次構造を持つアミノ酸はタンパク質と見なされる。
【０１６２】
一実施形態では、タンパク質は抗体又は抗体断片である。
【０１６３】
本明細書で使用される用語「抗体」とは、免疫グロブリン分子の可変領域に位置する少なくとも１つの抗原認識部位（本明細書では結合部位とも呼ばれる）を介して、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチド、ペプチド、等などの標的抗原への特異的結合ができる免疫グロブリン分子のことである。
【０１６４】
本明細書で使用されるように、「抗体分子」には抗体及びその結合断片が含まれる。
【０１６５】
本明細書で用いられる「抗体断片」とは、Ｆａｂ、改変Ｆａｂ、Ｆａｂ’、改変Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、単一ドメイン抗体、ｓｃＦｖ、二価、三価又は四価抗体、Ｂｉｓ−ｓｃＦｖ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ及び上記のいずれかのエピトープ結合断片を含むがこれらに限定されない抗体結合断片のことである（例えば、Holliger and Hudson, 2005, Nature Biotech. 23(9):1126-1136; Adair and Lawson, 2005, Drug Design Reviews - Online 2(3), 209-217参照）。これらの抗体断片を作製し製造するための方法は当技術分野では周知である（例えば、Verma et al., 1998, Journal of Immunological Methods, 216:165-181参照）。本開示で使用するための他の抗体断片には、国際特許出願ＷＯ０５／００３１６９、国際特許出願ＷＯ０５／００３１７０及び国際特許出願ＷＯ０５／００３１７１に記載されるＦａｂ及びＦａｂ’断片が含まれる。多価抗体は複数の特異性体、例えば、二重特異性体を含んでいてもよく又は単一特異性であってもよい（例えば、ＷＯ９２／２２８５３、ＷＯ０５／１１３６０５、ＷＯ２００９／０４０５６２、及びＷＯ２０１０／０３５０１２参照）。
【０１６６】
本明細書で用いられる「結合断片」とは、断片をペプチド又は抗原に対して特異的であると特徴付けることができるほどの十分な親和性で標的ペプチド又は抗原に結合することができる断片のことである。
【０１６７】
本明細書で使用される用語「Ｆａｂ断片」とは、軽鎖（ＣＬ）のＶＬ（可変軽）ドメイン及び定常ドメインを含む軽鎖断片並びに重鎖のＶＨ（可変重）ドメイン及び第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含む抗体断片のことである。一例では、Ｆａｂ断片の重鎖配列はＣＨ１の鎖間システインで「終わる」。一実施形態では、Ａ−Ｘ及び／又はＢ−Ｙなどの本開示の融合タンパク質で用いられるＦａｂ断片は一価である。
【０１６８】
本明細書で用いられるＦａｂ’断片とは、ヒンジ領域の全て又は一部をさらに含むＦａｂ断片のことである。一実施形態では、Ａ−Ｘ及び／又はＢ−Ｙなどの本開示の融合タンパク質で用いられるＦａｂ’断片は一価である。
【０１６９】
本明細書で使用される用語「単鎖Ｆｖ」又は略記して「ｓｃＦｖ」とは、（例えば、ペプチドリンカーにより）連結されたＶＨとＶＬ抗体ドメインを含んだかたちで単一ポリペプチド鎖を形成する抗体断片のことである。重及び軽鎖の定常領域はこのフォーマットでは取り除かれている。本明細書で用いられる単鎖Ｆｖには、そのジスルフィド安定化バージョンが含まれ、これはペプチドリンカーに加えてジスルフィド結合が可変領域間に存在する。
【０１７０】
ジスルフィド安定化ｓｃＦｖは、可変領域が分離し再び一体となることに関係する動力学的に呼吸する一部の可変領域の傾向を取り除くことができる。本明細書で使用される用語「単一ドメイン抗体」とは、単一の単量体可変抗体ドメインからなる抗体断片のことである。単一ドメイン抗体の例には、ＶＨ又はＶＬ又はＶＨＨが含まれる。
【０１７１】
一実施形態では、抗体結合断片及び／又は二重特異性抗体複合体はＦｃ領域を含まない。本明細書で用いられる「Ｆｃ領域を含まない」とは、非存在であるＣＨ２、ＣＨ３及びＣＨ４などのもっと低い定常ドメインのことである。しかし、ＣＨ１、ＣＫａｐｐａ／ＣＬａｍｂｄａなどの定常ドメインは存在する場合がある。
【０１７２】
一実施形態では、抗体重鎖はＣＨ１ドメインを含み、抗体軽鎖はＣＬドメイン、カッパ又はラムダのいずれかを含む。
【０１７３】
一実施形態では、抗体重鎖はＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含み、抗体軽鎖はＣＬドメイン、カッパ又はラムダのいずれかを含む。
【０１７４】
一実施形態では、二重特異性タンパク質複合体の第１のタンパク質Ａ及び／又は第２のタンパク質Ｂは抗体又は抗体断片である。そのような二重特異性タンパク質複合体は二重特異性抗体複合体と呼ぶこともできる。
【０１７５】
本明細書で用いられる「二重特異性抗体複合体」とは、少なくとも２つの抗体結合部位を含み、成分抗体、断片又は両方がヘテロ二量体繋により一つに複合体化されている二重特異性タンパク質複合体のことである。
【０１７６】
二重特異性抗体複合体とは、通常、少なくとも２つの抗原結合部位を含み、結合部位が非同一特異性を有する分子のことである。
【０１７７】
一実施形態では、２つのタンパク質（例えば、抗体、断片又は抗体と断片の組合せ）は同じ抗原を標的とし、例えば、本明細書では同じ標的抗原上の２つの異なるエピトープに結合し、バイパラトピック二重特異性体とも呼ばれる。
【０１７８】
別の実施形態では、２つのタンパク質（例えば、抗体、断片又は抗体と断片の組合せ）は異なる抗原特異性を有することができ、例えば、２つの異なる標的抗原に結合する。
【０１７９】
さらに別の実施形態では、２つのタンパク質は同一であり、すなわち、同じ標的抗原上の同じエピトープに結合し、したがって、複合体は単一特異性である。
【０１８０】
一実施形態では、本開示の二重特異性抗体複合体で用いられるそれぞれの抗体又は断片は１つの結合部位を含む、すなわち、それぞれの結合部位は標的抗原ごとに一価である。
【０１８１】
融合タンパク質（Ａ−Ｘ又はＢ−Ｙ）で用いられる完全長抗体又は抗体断片は、単一特異性、一価、多価又は二重特異性でもよい。
【０１８２】
有利なことに、２つの二重特異性抗体又は抗体断片を使用することにより、本開示の二重特異性抗体複合体は潜在的に最大４つの異なる抗原に特異的であることができる（すなわち、複合体は四重特異性であることができる）。これにより結合活性タイプ効果を調べることができる。
【０１８３】
一実施形態では、第１の融合タンパク質（Ａ−Ｘ）で用いられる抗体又は抗体断片は、単一特異性抗体又は抗体断片、特に、一価Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ＶＨＨ又は類似のものである。
【０１８４】
一実施形態では、第２の融合タンパク質（Ｂ−Ｙ）で用いられる抗体又は抗体断片は、単一特異性抗体又は抗体断片、特に、一価Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ又は類似のものである。
【０１８５】
本明細書で用いられる「単一特異性」とは、１つの標的抗原のみに結合する能力のことである。
【０１８６】
本明細書で用いられる「一価」とは、単一の結合部位を有し、したがって、標的抗原に１回のみ結合するだけである抗体又は抗体断片のことである。
【０１８７】
一実施形態では、第１の融合タンパク質（Ａ−Ｘ）で用いられる抗体又は抗体断片は多価である、すなわち、２つ又はそれよりも多い結合ドメインを有する。
【０１８８】
一実施形態では、第２の融合タンパク質（Ｂ−Ｙ）で用いられる抗体又は抗体断片は多価である、すなわち、２つ又はそれよりも多い結合ドメインを有する。
【０１８９】
一実施形態では、第１の融合タンパク質（Ａ−Ｘ）で用いられる抗体又は抗体断片は一価であり、第２の融合タンパク質（Ｂ−Ｘ）で用いられる抗体又は抗体断片は一価である。
【０１９０】
一実施形態では、第１の融合タンパク質（Ａ−Ｘ）で用いられる抗体又は抗体断片は一価であり、第２の融合タンパク質（Ｂ−Ｙ）で用いられる抗体又は抗体断片は多価である。
【０１９１】
一実施形態では、第１の融合タンパク質（Ａ−Ｘ）で用いられる抗体又は抗体断片は多価であり、第２の融合タンパク質（Ｂ−Ｙ）で用いられる抗体又は抗体断片は一価である。
【０１９２】
一実施形態では、第１の融合タンパク質（Ａ−Ｘ）で用いられる抗体又は抗体断片は多価であり、第２の融合タンパク質（Ｂ−Ｙ）で用いられる抗体又は抗体断片は多価である。
【０１９３】
一実施形態では、Ａ−Ｘ又はＢ−Ｙは、１つは抗原ＣＤ３３に特異的であり１つは抗原ＣＤ３に特異的である２つのｓｃＦｖ又は代わりにこれら２つの抗原に特異的な二重特異性複合体フォーマットを含む融合タンパク質ではない。
【０１９４】
一実施形態では、Ａ−Ｘ又はＢ−Ｙは、ペプチドＥ５Ｂ９に連結されたＣＤ３に特異的なｓｃＦｖ（又は代わりに別の抗体フォーマット）を含む融合タンパク質ではない。
【０１９５】
本明細書で用いられる「結合ドメイン又は部位」は、抗体のうち抗原／エピトープに接触しそれとの結合相互作用に関与する部分である。一実施形態では、結合ドメインは少なくとも１つの可変ドメイン又はその誘導体、例えば、可変ドメイン又はその誘導体の同族対などの可変ドメイン又はその誘導体の対を含有する。
【０１９６】
一実施形態では、結合ドメインは、特に、結合ドメインがＶＨ、ＶＬ又はＶＨＨなどのドメイン抗体である場合には、３つのＣＤＲを含む。一実施形態では、結合ドメインは２つの可変ドメイン及び６つのＣＤＲ及びフレームワークを含み、合わせてこれらのエレメントは、抗原／エピトープとの抗体又は結合断片の結合相互作用の特異性に寄与する。
【０１９７】
本明細書で用いられる「同族対」とは、前もって形成されたカップルとして宿主から単離される重軽鎖対のことである。この定義は、宿主由来の初めの対合が保持されていないライブラリーから単離される可変ドメインを含まない。同族対は有利である可能性がある。なぜならば、同族対は宿主において成熟された親和性である場合が多く、したがって、その対が特異的である抗原に対して高い親和性を有する可能性があるからである。
【０１９８】
本明細書で用いられる「天然に存在するドメインの誘導体」は、例えば、望ましくない特性を取り除くことによりなどのドメインの特性を最適化するために、天然に存在する配列中の１つ、２つ、３つ、４つ又は５つのアミノ酸が置き換えられている又は欠失しているが、ドメインの特徴的な特色（単数又は複数）は保持されていることを指すことを意図している。改変の例は、グリコシル化部位、ＧＰＩアンカー、又は溶媒曝露リシンを取り除く改変である。これらの改変は、関連するアミノ酸残基を保存的アミノ酸置換で置き換えることにより達成することが可能である。
【０１９９】
一実施形態では、本開示の二重特異性抗体複合体又はその抗体／断片成分は処理されて、標的抗原（単数又は複数）に対する改善された親和性を提供する。そのような変異体は、ＣＤＲを突然変異する（Yang et al., J. Mol. Biol., 254, 392-403, 1995）、鎖シャフリング（Marks et al., Bio/Technology, 10, 779-783, 1992）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の変異誘発菌種の使用（Low et al., J. Mol. Biol., 250, 359-368, 1996）、ＤＮＡシャフリング（Patten et al., Curr. Opin. Biotechnol., 8, 724-733, 1997）、ファージディスプレイ（Thompson et al., J. Mol. Biol., 256, 77-88, 1996）及び性的ＰＣＲ（Crameri et al., Nature, 391, 288-291, 1998）を含むいくつかの親和性成熟プロトコールにより得ることが可能である。Vaughanら（上記）は親和性成熟のこれらの方法を考察している。
【０２００】
一実施形態では、第１の抗体又は抗体断片（Ａ）は第１の抗原に特異的であり、第２の抗体又は抗体断片（Ｂ）は第２の抗原に特異的であり、第１と第２の抗原は異なっている。有利なことに、二重特異性抗体複合体は２つの異なる抗原に対して特異的であることができる。これは、それぞれ異なる実体上に位置している２つの異なる抗原へ抗体複合体が結合し、それによって２つの実体を物理的に互いにすぐ近傍に近づける可能性を表す。
【０２０１】
代わりに、第１の抗体又は抗体断片（Ａ）は第１のエピトープに対して特異的であることができ、第２の抗体又は抗体断片（Ｂ）は第２のエピトープに対して特異的であることができ、第１と第２のエピトープは両方とも同じ抗原上にある。これは、抗原と二重特異性抗体複合体の間の複数の相互作用のせいで抗原に対する二重特異性抗体複合体の結合活性を大いに増強することが可能である。
【０２０２】
一実施形態では、本開示の二重特異性抗体複合体の第１の抗体（Ａ）又は第２の抗体（Ｂ）又は第１と第２の抗体の両方は、場合によって、不活性又は活性Ｆｃ領域を有するＩｇＧであってもよい。
【０２０３】
一実施形態では、第１（Ａ）又は第２（Ｂ）抗体断片は、断片抗原結合（Ｆａｂ）、Ｆａｂ’、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）及びＶＨＨなどの単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）からなる群から選択される。
【０２０４】
一実施形態では、本開示の二重特異性抗体複合体の第１の抗体／断片（Ａ）、第２の抗体／断片（Ｂ）又は第１と第２の抗体／断片の両方はＦａｂであってよい。
【０２０５】
一実施形態では、本開示の二重特異性抗体複合体の第１の抗体／断片（Ａ）、第２の抗体／断片（Ｂ）又は第１と第２の抗体／断片の両方はＦａｂ’であってよい。
【０２０６】
一実施形態では、本開示の二重特異性抗体複合体の第１の抗体／断片（Ａ）、第２の抗体／断片（Ｂ）又は第１と第２の抗体／断片の両方はｓｃＦｖであってよい。
【０２０７】
一実施形態では、本開示の二重特異性抗体複合体の第１（Ａ）若しくは第２（Ｂ）の抗体／断片又は第１と第２の抗体／断片の両方はＶＨＨである。
【０２０８】
便宜上、本開示の二重特異性タンパク質複合体は本明細書ではＡ−Ｘ：Ｙ−Ｂと呼ばれる。しかし、この命名法は、融合タンパク質Ａ−Ｘ及びＢ−Ｙがどのように設計されるのかを限定することを意図してはいない。なぜならば、本発明者らの実験は結合パートナーＸとＹをその方法に不利な影響を与えることなく逆にすることが可能であること、すなわち、Ａ−Ｙ及びＢ−Ｘを示しているからである。したがって、Ａ及びＢ並びにＸ及びＹは本技術の説明を支援するために言及される名目ラベルである。
【０２０９】
本明細書で用いられる「付加されている（attached）」とは、その例が下で考察されるペプチドリンカーなどのリンカーを介して直接的に又は間接的に連結している又は結合していることである。直接的に連結しているには、一つに融合している（例えば、ペプチド結合）又は化学的にコンジュゲートしているが含まれる。
【０２１０】
本明細書で用いられる「結合パートナー」とは、結合対の１つの成分部分のことである。
【０２１１】
一実施形態では、結合パートナーの親和性は高く、９００、８００、７００、６００、５００、４００、３００ｐＭ又はそれよりも強いなどの５ｎＭ又はそれよりも強い。
【０２１２】
本明細書で用いられる「結合対」とは、互いに特異的に結合する二つの結合パートナーのことである。結合対の例には、ペプチドとそれに特異的な抗体若しくは結合断片、又は酵素とリガンド、又は酵素とその酵素の阻害剤が含まれる。
【０２１３】
一実施形態では、第１の結合パートナー（Ｘ）は、完全長抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ及びｓｄＡｂを含む群から選択され、ｓｄＡｂの例にはＶＨ又はＶＬ又はＶＨＨが含まれる。
【０２１４】
Ｘが抗体又はその結合断片である場合、Ｙはタンパク質又はペプチド、特に、ペプチドである。
【０２１５】
一実施形態では、第２のパートナー（Ｙ）は、完全長抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ及びｓｄＡｂを含む群から選択され、ｓｄＡｂの例にはＶＨ又はＶＬ又はＶＨＨが含まれる。
【０２１６】
Ｙが抗体又はその結合断片である場合、Ｘはタンパク質又はペプチド、特に、ペプチドである。
【０２１７】
一実施形態では、Ａが抗体又はその断片である場合、第１の結合パートナー（Ｘ）は第１の抗体又は抗体断片の重又は軽鎖のＣ末端に付加されており、例えば、第１の結合パートナー（Ｘ）は第１の抗体又は抗体断片（Ａ）の重鎖のＣ末端に付加されている。
【０２１８】
別の実施形態では、Ｂが抗体又はその断片である場合、第２の結合パートナー（Ｙ）は第２の抗体又は抗体断片の重又は軽鎖のＣ末端に付加されており、例えば、第２の結合パートナー（Ｙ）は第２の抗体又は抗体断片（Ｂ）の重鎖のＣ末端に付加されている。
【０２１９】
一実施形態では、Ｘは抗体又は断片（タンパク質Ａ）の重鎖のＣ末端に付加されており、Ｙは抗体又は断片（タンパク質Ｂ）の重鎖のＣ末端に付加されている。
【０２２０】
一実施形態では、Ｘはリンカー（ＡＳＧＧＧＧ配列番号７１又はＡＳＧＧＧＧＳＧ配列番号７２などの）又は当技術分野で公知の若しくは本明細書の下で考察されている任意の他の適切なリンカーを介して、抗体又は断片（タンパク質Ａ）の重鎖のＣ末端に付加されており、Ｙはリンカー（ＡＳＧＧＧＧ配列番号７１又はＡＳＧＧＧＧＳＧ配列番号７２などの）を介して、抗体又は断片（タンパク質Ｂ）の重鎖のＣ末端に付加されている。
【０２２１】
適切な結合対（Ｘ又はＹ）の例には、ＧＣＮ４（配列番号１又はＨＩＳタグを欠く、配列番号１のアミノ酸１〜３８）又はその変異体、及びＧＣＮ４に対して特異的なｓｃＦｖである５２ＳＲ４（配列番号３又はＨＩＳタグを欠く配列番号３のアミノ酸１から２４３）又はその変異体を含むことができる。
【０２２２】
一実施形態では、第１の結合パートナー（名目上Ｘ）はＧＣＮ４（例えば、配列番号１で示される）又はその断片若しくは変異体（例えば、Ｈｉｓタグなし）であり、第２の結合パートナー（名目上Ｙ）はＧＣＮ４に対して特異的なｓｃＦｖ若しくはＶＨＨ（例えば、配列番号３に示される）又はその変異体である。
【０２２３】
一実施形態では、第１の結合パートナー（名目上Ｘ）はＧＣＮ４に対して特異的なｓＦｖ若しくはＶＨＨ（例えば、配列番号３に示される）又はその変異体であり、第２の結合パートナー（名目上Ｙ）はＧＣＮ４（例えば、配列番号１で示される）又はその断片若しくは変異体である。
【０２２４】
ＧＣＮ４変異体には、配列番号１に少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％又は９８％、又は９９％同一性のアミノ酸配列が含まれる。ＧＣＮ４変異体には、ヌクレオチド配列配列番号２によりコードされる配列に、又は厳密な条件下で配列番号２にハイブリダイズするヌクレオチド配列によりコードされる配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％同一性を有するアミノ酸配列も含まれる。
【０２２５】
ＧＣＮ４に特異的な適切なｓｃＦｖは５２ＳＲ４（配列番号３）又はその変異体である。５２ＳＲ４の変異体には配列番号３に少なくとも８０％、又は８５％、又は９０％、又は９５％、又は９８％、又は９９％同一性を有するアミノ酸配列が含まれる。５２ＳＲ４の変異体には、ヌクレオチド配列配列番号４によりコードされる配列に、又は厳密な条件下で配列番号４にハイブリダイズするヌクレオチド配列によりコードされる配列に少なくとも８０％、又は８５％、又は９０％、又は９５％、又は９８％、又は９９％同一性を有するアミノ酸配列も含まれる。
【０２２６】
本発明者らは、単鎖抗体５２ＳＲ４及びペプチドＧＣＮ４は本開示の二重特異性タンパク質複合体において使用するのに適した結合対であることを見出していた。
【０２２７】
代わりに、いかなる適切な抗体／断片及び抗原（ペプチドなどの）でもＸ及びＹとして用いることができる。好ましくは、そのようなＸとＹの対からは、Ａ−ＸとＹ−Ｂが１対１のモル比で組み合わされると７５％よりも多くのヘテロ二量体が得られる。
【０２２８】
一実施形態では、第１の結合パートナー（Ｘ）及び第２の結合パートナー（Ｙ）はタンパク質である。
【０２２９】
一実施形態では、第１の結合パートナー（Ｘ）は酵素若しくはその活性断片であり第２の結合パートナー（Ｙ）はリガンドである又はその逆もまた同じである。
【０２３０】
一実施形態では、第１の結合パートナー（Ｘ）は酵素若しくはその活性断片であり第２の結合パートナー（Ｙ）はその酵素の阻害剤である又はその逆もまた同じである。
【０２３１】
本明細書で用いられる「活性断片」とは、アミノ酸断片のことであり、これは実体では全アミノ酸配列よりも少なく、基本的に同じ生物活性又は関連する生物活性、例えば、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％などの５０％を超える活性を保持している。
【０２３２】
別の実施形態では、第１の結合パートナーＸはグルタチオン（ＧＳＨ）であり第２の結合パートナーＹはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）である又はその逆もまた同じである。
【０２３３】
別の実施形態では、ＸはＦｏｓでありＹはＪｕｎである又はその逆もまた同じである。
【０２３４】
別の実施形態では、ＸはＨｉｓでありＹは抗Ｈｉｓである又はその逆もまた同じである。
【０２３５】
別の実施形態では、結合対はカルモジュリン結合ペプチドでありＹはカルモジュリンである又はその逆もまた同じである。
【０２３６】
別の実施形態では、Ｘはマルトース結合タンパク質でありＹは抗マルトース結合タンパク質若しくはその断片である又はその逆もまた同じである。
【０２３７】
他の酵素−リガンド組合せも結合パートナーにおいて使用するために想定している。タンパク質精製のための当技術分野で公知の親和性タグも適切である。なぜならば、これらのタグはそのそれぞれの結合パートナーに高親和性で結合する傾向があるからである。
【０２３８】
「同一性」は、本明細書で使用されるように、整列させた配列中のいかなる特定の位置においてもアミノ酸残基が配列間で同一であることを示している。「類似性」は、本明細書で使用されるように、整列させた配列中のいかなる特定の位置においてもアミノ酸残基が配列間で類似する種類であることを示している。例えば、ロイシンはイソロイシン又はバリンの代わりに用いることができる。多くの場合互いに代わりに用いることが可能な他のアミノ酸には、
−  フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファン（芳香族側鎖を有するアミノ酸）
−  リシン、アルギニン及びヒスチジン（塩基性側鎖を有するアミノ酸）
−  アスパラギン酸及びグルタミン酸（酸性側鎖を有するアミノ酸）
−  アスパラギン及びグルタミン（アミド側鎖を有するアミノ酸）；並びに
−  システイン及びメチオニン（硫黄含有側鎖を有するアミノ酸）
が含まれるがこれらに限定されない。
【０２３９】
同一性及び類似性の程度は容易に計算することが可能である（Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing. Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987, Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991, the BLASTTM software available from NCBI (Altschul, S.F. et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410; Gish, W. & States, D.J. 1993, Nature Genet. 3:266-272. Madden, T.L. et al., 1996, Meth. Enzymol. 266:131-141; Altschul, S.F. et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; Zhang, J. & Madden, T.L. 1997, Genome Res. 7:649-656）。
【０２４０】
一実施形態では、第１又は第２の結合パートナー（Ｘ又はＹ）はタンパク質又はペプチドである。
【０２４１】
一実施形態では、第１及び第２の融合タンパク質は１つ又は複数のペプチドリンカーを含む。リンカーは融合タンパク質中の種々の位置に取り込むことができる。例えば、リンカーは結合パートナーとそれに付加されているタンパク質の間に導入することができる。
【０２４２】
一実施形態では、リンカーはペプチドリンカーである。
【０２４３】
本明細書で使用される用語「ペプチドリンカー」とは、アミノ酸配列を有するペプチドのことである。一定範囲の適切なペプチドリンカーは当業者には公知であろう。
【０２４４】
一実施形態では、二重特異性タンパク質複合体の結合パートナーはペプチドリンカーを介してそのそれぞれのタンパク質に結合されている。
【０２４５】
一実施形態では、融合タンパク質は翻訳融合であり、すなわち、融合タンパク質が発現されるもとの遺伝子構築物を含む宿主細胞において発現される融合タンパク質である。
【０２４６】
一実施形態では、融合タンパク質は、場合によってはペプチドリンカーを介してＡの重鎖をＸに及び／又はＢの重鎖をＹに融合させることにより調製される。
【０２４７】
一実施形態では、ペプチドリンカーは５０アミノ酸長又はそれよりも少なく、例えば、２０アミノ酸又はそれよりも少ない。
【０２４８】
一般に、融合タンパク質を組換え的に発現させるほうが効率的であり、したがって、宿主細胞において発現させることが可能な直接ペプチド結合又はペプチドリンカーが有利である可能性がある。
【０２４９】
一実施形態では、リンカーは配列５から７２に示される配列又はＰＰＰから選択される。
【表１】
0006628741.tif 000002
【表２−１】
0006628741.tif 000003
【表２−２】
0006628741.tif 000004
【０２５０】
（Ｓ）は配列１７から２０では自由選択である。
【０２５１】
強固なリンカーの例には、ペプチド配列ＧＡＰＡＰＡＡＰＡＰＡ（配列番号６９）、ＰＰＰＰ（配列番号７０）及びＰＰＰが含まれる。
【０２５２】
他のリンカーは表３に示されている。
【表３】
0006628741.tif 000005
【０２５３】
一態様では、本開示の二重特異性タンパク質複合体を産生する方法であって、
（ａ）結合対の第１の結合パートナー（Ｘ）に付加されている第１のタンパク質（Ａ）を含む、第１の融合タンパク質（Ａ−Ｘ）を作製するステップと、
（ｂ）結合対の第２の結合パートナー（Ｙ）に付加されている第２のタンパク質（Ｂ）を含む、第２の融合タンパク質（Ｂ−Ｙ）を作製するステップと、
（ｃ）ステップａ）及びｂ）において調製された第１（Ａ−Ｘ）と第２（Ｂ−Ｙ）の融合タンパク質を一緒に混合するステップと
を含む上記方法が提供される。
【０２５４】
典型的にはステップ（ｃ）におけるＡ−ＸとＢ−Ｙの混合は１対１のモル比である。
【０２５５】
一実施形態では、本開示の複合体中で用いられるそれぞれの融合タンパク質は、発現実験において宿主細胞（単数又は複数）での発現により産生される。
【０２５６】
一態様では、本開示の二重特異性タンパク質複合体を調製する方法であって、
（ａ）結合対の第１の結合パートナー（Ｘ）に付加されている第１のタンパク質（Ａ）を含む、第１の融合タンパク質（Ａ−Ｘ）を発現させるステップと、
（ｂ）結合対の第２の結合パートナー（Ｙ）に付加されている第２のタンパク質（Ｂ）を含む、第２の融合タンパク質（Ｂ−Ｙ）を発現させるステップと、
を含み、
融合タンパク質Ａ−Ｘ及びＢ−Ｙが同じ宿主細胞又は異なる宿主細胞から発現される上記方法が提供される。
【０２５７】
本明細書で用いられる異なる宿主細胞とは、同じ種類（同じクローン種でさえ）の細胞を含む、個々の細胞のことである。
【０２５８】
一実施形態では、発現は一過性発現である。一過性発現の使用は、精製に頼らずに二重特異性複合体を生成する能力と組み合わされると極めて有利である。これにより、一過性トランスフェクションは安定なトランスフェクションよりもはるかに簡単であり資源多消費ではないので、二重特異性タンパク質複合体を産生する迅速な方法が得られる。
【０２５９】
一実施形態では、発現は安定な発現である、すなわち、そこでは問題になっている融合タンパク質をコードするＤＮＡは宿主細胞ゲノム内に安定的に組み込まれている。
【０２６０】
一実施形態では、同じ又は異なるポリヌクレオチド配列上のＡ−Ｘをコードするポリヌクレオチド及びＢ−Ｙをコードするポリヌクレオチドは機能アッセイの一部として細胞内にトランスフェクトされ、タンパク質が細胞内で発現される及び／又はそこから放出される。特に、ポリヌクレオチドは同じ又は異なるプラスミド上に一過性にトランスフェクトされる。
【０２６１】
Ａ−ＸとＢ−Ｙの混合は、一般的に、ＸとＹが相互作用できる条件で成し遂げられる。一実施形態では、融合タンパク質は、細胞培養条件下で細胞培養培地においてインキュベートされ、例えば、融合タンパク質は３７℃／５％ＣＯ２環境において９０分間インキュベートされる。
【０２６２】
一実施形態では、本開示の融合タンパク質は水性環境で混合され、例えば、１つの融合タンパク質はビーズ又はプレートなどの固体表面に結合させることができ、もう一方の融合タンパク質は水溶液／懸濁液中でそれに対して導入することが可能である。固相であれば過剰な成分及び試薬は容易に洗い流すことができる。一実施形態では、どちらの融合物も固相に付加されておらず、液体／溶液／培養液中で混合しているだけである。したがって、一実施形態では、Ａ−Ｘ及びＢ−Ｙは水性媒体中で遊離のタンパク質として混合している。
【０２６３】
有利なことに、本開示の方法を用いれば、異種対間（すなわち、第１の融合タンパク質［Ａ−Ｘ］と第２の融合タンパク質［Ｂ−Ｙ］の間）で形成され、同種対間（すなわち、２つの第１の融合タンパク質［Ａ−Ｘ］間又は２つの第２の融合タンパク質［Ｂ−Ｙ］間）の相互作用が最小化されている複合体を調製することが可能である。したがって、本方法により、ホモ二量体複合体の混入を最小限にして又はなしで、多数の二重特異性タンパク質複合体を調製することが可能になる。本開示の構築物及び方法の利点は、Ａ−ＸとＢ−Ｙの比がＡ−ＸとＢ−Ｙの特性により制御され、特に、モル比１対１を達成することが可能である点である。この制御の要素は、ある種に先行技術の方法よりも著しい改良点である。
【０２６４】
一実施形態では、本開示の方法は、相乗活性を有すると確認されている対の可変領域（特に、２つの対の可変領域）を別の二重特異性フォーマットに移動させ、場合により必要ならば予め前記可変領域をヒト化しておく追加のステップを含み、このフォーマットは別の治療フォーマット及び／又はさらに長い期間の（例えば、１週間又はそれよりも長く行われる）アッセイにおいて試験するのに適している延長された半減期を有するフォーマットである。
【０２６５】
多価フォーマットには、ＤＶＤ−Ｉｇ、例えば、ＷＯ２００９／０４０５６２及びＷＯ２０１０／０３５０１２に開示されているＦａｂＦｖ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディなどの当技術分野で公知のフォーマット及び本明細書に記載されるフォーマットが含まれる。
【０２６６】
二重及び多特異性フォーマット（治療フォーマットを含む）の他の例には、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、タンデムｓｃＦｖ、タンデムｓｃＦｖ−Ｆｃ、ＦａｂＦｖ、Ｆａｂ’Ｆｖ、ＦａｂｄｓＦｖ、Ｆａｂ−ｓｃＦｖ、Ｆａｂ’−ｓｃＦｖ、ｄｉＦａｂ、ｄｉＦａｂ’、ｓｃダイアボディ、ｓｃダイアボディ−Ｆｃ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ−ｓｃＦｖ、ｓｃダイアボディ−ＣＨ３、ＩｇＧ−ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ−ＩｇＧ、Ｖ−ＩｇＧ、ＩｇＧ−Ｖ、ＤＶＤ−Ｉｇ、及びＤｕｏＢｏｄｙが含まれる。
【０２６７】
本明細書で用いられるダイアボディとは、２つのＦｖ対、すなわち、第１のＦｖのＶＨが第２のＦｖのＶＬに連結され、第１のＦｖのＶＬが第２のＦｖのＶＨに連結されるように２つのＦｖ内リンカーを有するＶＨ／ＶＬと追加のＶＨ／ＶＬ対のことである。
【０２６８】
本明細書で用いられるトリアボディとは、３つのＦｖ対と３つのＦｖ内リンカーを含むダイアボディに類似するフォーマットのことである。
【０２６９】
本明細書で用いられるテトラボディとは、４つのＦｖ対と４つのＦｖ内リンカーを含むダイアボディに類似するフォーマットのことである。
【０２７０】
本明細書で用いられるタンデムｓｃＦｖとは、単一のＦｖ内リンカーが存在するように単一のリンカーを介して互いに連結されている２つのｓｃＦｖ（リンカーを含むそれぞれは通常の様式である）のことである。
【０２７１】
本明細書で用いられるタンデムｓｃＦｖ−Ｆｃとは、それぞれ１つが定常領域断片−ＣＨ２ＣＨ３のＣＨ２ドメインのＮ末端に、例えば、ヒンジを介して付加している２つのタンデムｓｃＦｖのことである。
【０２７２】
本明細書で用いられるＦａｂＦｖとは、可変領域が以下の重鎖のＣＨ１及び軽鎖のＣＬのそれぞれのＣ末端に付加されているＦａｂ断片のことである。フォーマットはそのペグ化バージョンとして提供することができる。
【０２７３】
本明細書で用いられるＦａｂ’ＦｖはＦａｂＦｖに類似しており、Ｆａｂ部分がＦａｂ’で置き換えられている。フォーマットはそのペグ化バージョンとして提供することができる。
【０２７４】
本明細書で用いられるＦａｂｄｓＦｖとは、Ｆｖ内ジスルフィド結合が付加されたＣ末端可変領域を安定化しているＦａｂＦｖのことである。フォーマットはそのペグ化バージョンとして提供することができる。
【０２７５】
本明細書で用いられるＦａｂ−ｓｃＦＶは、ｓｃＦｖが軽又は重鎖のＣ末端に付加されているＦａｂ分子のことである。
【０２７６】
本明細書で用いられるＦａｂ’−ｓｃＦＶは、ｓｃＦｖが軽又は重鎖のＣ末端に付加されているＦａｂ’分子のことである。
【０２７７】
本明細書で用いられるＤｉＦａｂとは、重鎖のＣ末端を介して連結されている２つのＦａｂ分子のことである。
【０２７８】
本明細書で用いられるＤｉＦａｂ’とは、そのヒンジ領域において１つ又は複数のジスルフィド結合を介して連結されている２つのＦａｂ’分子のことである。
【０２７９】
本明細書で用いられるように、ｓｃダイアボディは、分子が３つのリンカーを含みそのＶＨとＶＬ末端のそれぞれが追加のＦｖ対の可変領域の１つに連結されている正常なｓｃＦｖを形成するように、Ｆｖ内リンカーを含むダイアボディである。
【０２８０】
本明細書で用いられるｓｃダイアボディ−Ｆｃは、それぞれ１つが定常領域断片−ＣＨ２ＣＨ３のＣＨ２ドメインのＮ末端に、例えば、ヒンジを介して付加されている２つのｓｃダイアボディである。
【０２８１】
本明細書で用いられるＳｃＦｖ−Ｆｃ−ｓｃＦｖとは、それぞれのうちの１つが−ＣＨ２ＣＨ３断片の重鎖と軽鎖の両方のＮ末端とＣ末端に付加されている４つのｓｃＦｖのことである。
【０２８２】
本明細書で用いられるｓｃダイアボディ−ＣＨ３とは、例えば、ヒンジを介してＣＨ３ドメインにそれぞれが連結されている２つのｓｃダイアボディ分子のことである。
【０２８３】
本明細書で用いられるＩｇＧ−ｓｃＦｖは、ｓｃＦｖが重鎖のそれぞれ又は軽鎖のそれぞれのＣ末端にある完全長抗体である。
【０２８４】
本明細書で用いられるｓｃＦｖ−ＩｇＧは、ｓｃＦｖが重鎖のそれぞれ又は軽鎖のそれぞれのＮ末端にある完全長抗体である。
【０２８５】
本明細書で用いられるＶ−ＩｇＧは、可変ドメインが重鎖のそれぞれ又は軽鎖のそれぞれのＮ末端にある完全長抗体である。
【０２８６】
本明細書で用いられるＩｇＧ−Ｖは、可変ドメインが重鎖のそれぞれ又は軽鎖のそれぞれのＣ末端にある完全長抗体である。
【０２８７】
ＤＶＤ−Ｉｇ（デュアルＶドメインＩｇＧとしても知られる）は、それぞれの重鎖及びそれぞれの軽鎖のＮ末端に１つ、４つの付加的可変領域を有する完全長抗体である。
【０２８８】
本明細書で用いられるＤｕｏｂｏｄｙ又は「Ｆａｂ−ａｒｍ交換」は、２つの異なるモノクローナル抗体の定常領域（典型的にはＣＨ３）においてマッチドした相補的な工学的に操作されたアミノ酸変化が、混合するとヘテロ二量体の形成をもたらす二重特異性ＩｇＧ抗体フォーマットである。第１の抗体由来の重／軽鎖対は、残基の工学的操作の結果、第２の抗体の重：軽鎖対と会合するほうを好む。
【０２８９】
存在する場合、本開示の二重特異性抗体複合体又は抗体分子の定常領域ドメインは、存在する場合、複合体又は抗体分子の提唱されている機能、特に、必要になる可能性のあるエフェクター機能を考慮して、選択することができる。例えば、定常領域ドメインはヒトＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ又はＩｇＭドメインであってよい。特に、抗体分子が治療的使用を意図されており抗体エフェクター機能が必要とされるときは、特に、ＩｇＧ１及びＩｇＧ３アイソタイプのヒトＩｇＧ定常領域ドメインを使用することができる。代わりに、抗体分子が治療目的を意図されており抗体エフェクター機能が必要とされないときは、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４アイソタイプを使用することができる。これらの定常領域ドメインの配列変異体も使用できることは認識されるであろう。例えば、Angal et al., 1993, Molecular Immunology, 1993, 30:105-108に記載されている２４１位のセリンがプロリンに交換されているＩｇＧ４分子を使用することができる。したがって、抗体がＩｇＧ４抗体である実施形態では、抗体は変異Ｓ２４１Ｐを含むことができる。
【０２９０】
抗体は種々の翻訳後修飾を受けることができることも当業者であれば理解するであろう。これらの修飾の種類及び程度は多くの場合、抗体を発現するのに使用される宿主細胞系並びに培養条件に依拠する。そのような修飾には、グリコシル化、メチオニン酸化、ジケトピペラジン形成、アスパラギン酸異性化及びアスパラギン脱アミド化の変動が含まれる場合がある。頻繁な修飾は、カルボキシペプチダーゼの作用によるカルボキシ末端塩基残基（リシン又はアルギニンなどの）の喪失である（Harris, RJ. Journal of Chromatography 705:129-134, 1995に記載されている）。したがって、抗体重鎖のＣ末端リシンは非存在でもよい。
【０２９１】
本開示は、上記の１つ又は複数の二重特異性タンパク質複合体を含む組成物であって、例えば、ホモ二量体複合体の混入を最小限にする又はなしで本開示に従ったヘテロ二量体二重特異性複合体を主に含む上記組成物も提供する。
【０２９２】
一実施形態では、組成中の融合タンパク質の少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％は二重特異性タンパク質複合体形態である。
【０２９３】
一実施形態では、組成中の融合タンパク質の少なくとも６０％は二重特異性タンパク質複合体形態である。
【０２９４】
一実施形態では、形成された複合体はさらなる精製ステップを必要とせず、したがって、組成物は未精製二重特異性複合体を含む。
【０２９５】
一実施形態では、形成された複合体は１回の精製ステップ、例えば、カラムクロマトグラフィーを必要とする。
【０２９６】
一実施形態では、方法は、例えば、本開示に従った融合タンパク質の発現後及び融合タンパク質を混合する前に、少なくとも１回の精製ステップをさらに含む。
【０２９７】
一態様では、本開示は、本明細書で定義される融合タンパク質、ヘテロ二量体的に繋ぎ合わされた二重特異性タンパク質複合体、融合タンパク質又は前記二重特異性タンパク質複合体を含む組成物、マルチプレックス、アレイ、ライブラリーに関する。
【０２９８】
一実施形態では、二重特異性タンパク質複合体は溶液又は懸濁液中にある。
【０２９９】
一実施形態では、二重特異性タンパク質複合体は固体基材表面上に固定されている。
【０３００】
一実施形態では、マルチプレックスはアレイの形態、例えば、９６又は３８４ウェルプレートなどのマイクロプレート中にある。そのようなアレイは、所望の機能性を備えた二重特異性タンパク質複合体を同定するためのスクリーニングアッセイにおいて容易に実行することが可能である。
【０３０１】
別の実施形態では、二重特異性タンパク質複合体はビーズにコンジュゲートされている。
【０３０２】
上で定義される融合タンパク質は、本開示に従った二重特異性タンパク質複合体の成分である。一態様では、本開示は本明細書に記載される融合タンパク質に関する。
【０３０３】
追加の態様では、上で定義される２つ又はそれよりも多い融合タンパク質を含むライブラリーが提供される。
【０３０４】
本明細書で使用される用語「ライブラリー」とは、組み合わせれば本開示に従った少なくとも２つの異なる二重特異性抗体複合体を形成することが可能な、本開示の２つ若しくはそれよりも多い二重特異性抗体複合体又は本開示の複数の融合タンパク質のことである。本明細書全体を通じて記載されるように、用語「ライブラリー」はその最も広い意味で使用され、サブライブラリーも包含することができる。
【０３０５】
有利なことに、ライブラリーは、特定の結合対の第１の結合パートナー（Ｘ）又は第２の結合パートナー（Ｙ）のいずれかが付加されている一定範囲の異なる融合タンパク質を含むことができる。一実施形態では、ライブラリーの一部は、それぞれが結合パートナーＸに連結しているタンパク質／抗体／断片を含み、ライブラリーの残りはそれぞれが結合パートナーＹに連結している同じタンパク質／抗体／断片を含む。したがって、これにより、１つの融合タンパク質に結合対の第１の結合パートナーが付加されておりもう一方の融合タンパク質に結合対の第２の結合パートナーが付加されている限り、任意の２つの融合タンパク質を容易に組み合わせて本開示の二重特異性タンパク質複合体を形成することが可能になる。
【０３０６】
一実施形態では、本発明の二重特異性タンパク質複合体は治療応用に適しており、疾患の処置に新規の治療薬を提供することができる。したがって、追加の態様では、治療において使用するための上記の二重特異性タンパク質複合体が提供される。二重特異性タンパク質複合体は、自己免疫疾患及びがんなどの一定範囲の疾患を処置するのに適している。
【０３０７】
逆に、Ｔリンパ球に対して特異的な１つの抗体又は抗体断片及びがん特異的抗原に対して特異的な別の抗体又は抗体断片を備えた本開示の二重特異性タンパク質複合体を工学的に作製することが可能である。その結果、本開示の二重特異性抗体複合体は、通常のモノクローナル抗体と比べた場合、より高い細胞傷害性潜在力を有することができて有利である。
【０３０８】
本開示の二重特異性タンパク質複合体は、種々の自己免疫疾患において免疫及び自己免疫反応を制御するためにＢ細胞機能を阻害するのにも特に適している。
【０３０９】
したがって、本開示は、本開示の二重特異性タンパク質複合体の投与を含む、患者において疾患を処置する方法にまで及ぶ。
【０３１０】
一態様では、本開示の１つ又は複数の二重特異性タンパク質複合体を含む医薬組成物が提供される。
【０３１１】
一実施形態では、本開示の方法のために入手される又は入手可能な融合タンパク質が提供される。
【０３１２】
一実施形態では、本開示の方法から入手される又は入手可能な二重特異性抗体複合体が提供される。
【０３１３】
一実施形態では、本開示に従った方法により同定される可変領域組合せを含む二重特異性又は多特異性抗体分子が提供される。
【０３１４】
一実施形態では、本開示の方法から得られる融合タンパク質、二重特異性抗体複合体又は二重特異性／多特異性抗体分子を含む医薬組成物などの組成物が提供される。
【０３１５】
薬学的に許容される担体、賦形剤及び／又は希釈剤を含む、種々の異なる成分を組成物に含めることが可能である。組成物は、場合により、本発明の抗体の集団の特徴を変えることができる追加の分子を含み、それによって、例えば、抗体の機能を減少する、安定化する、遅らせる、調節する及び／又は活性化することができる。組成物は、固体又は液体形態でもよく、なかんずく、粉末、錠剤、溶液又はエアロゾルの形態でもよい。
【０３１６】
本開示は、本発明の二重特異性タンパク質複合体を、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤又は担体のうちの１つ又は複数と組み合わせて含む医薬又は診断組成物も提供する。したがって、処置において使用するための及び病態又は障害の処置用の薬物の製造のための本発明の二重特異性タンパク質複合体の使用が提供される。
【０３１７】
病態又は障害は、例えば、感染症（ウイルス性、細菌性、真菌性及び寄生性）、感染に関連するエンドトキシンショック、関節リウマチなどの関節炎、重症喘息などの喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、骨盤内炎症性疾患、アルツハイマー病、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、ペロニー病、セリアック病、胆嚢疾患、毛巣病（Pilonidal disease）、腹膜炎、乾癬、血管炎、外科的癒着（surgical adhesions）、脳卒中、Ｉ型糖尿病、ライム病、髄膜脳炎、自己免疫ブドウ膜炎；多発性硬化症、ループス（全身性エリトマトーデスなどの）及びギランバレー症候群などの中枢及び末梢神経系の免疫媒介炎症性疾患；アトピー性皮膚炎、自己免疫性肝炎、線維性肺胞炎、グレーブス病、ＩｇＡ腎炎、特発性血小板減少性紫斑病、メニエール病、天疱瘡、原発性胆汁性肝硬変、サルコイドーシス、強皮症、ウェゲナー肉芽腫症、他の自己免疫疾患、膵炎、外傷（手術）、移植片対宿主病、移植片拒絶、心筋梗塞並びに粥状動脈硬化などの虚血性疾患を含む心疾患、血管内凝固、骨吸収、骨粗鬆症、変形性関節炎、歯周炎、低酸症（hypochlorhydia）並びに乳がん、肺がん、胃がん、卵巣がん、肝細胞がん、結腸がん、膵がん、食道がん、頭頸部がん、腎がんなどのがん、特に、腎細胞癌、前立腺がん、肝がん、メラノーマ、肉腫、骨髄腫、神経芽細胞腫、胎盤性絨毛癌、子宮頸がん、及び甲状腺がん、並びにその転移型からなる群から選択することができる。
【０３１８】
本開示は、本発明の二重特異性タンパク質複合体を、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤又は担体のうちの１つ又は複数と組み合わせて含む医薬又は診断組成物も提供する。したがって、処置において及び薬物の製造において使用するための本発明の二重特異性タンパク質複合体の使用が提供される。
【０３１９】
組成物は、通常薬学的に許容される担体を含むことになる無菌の医薬組成物の一部として普通、供給されることになる。本発明の医薬組成物は薬学的に許容されるアジュバントをさらに含むことができる。
【０３２０】
本発明は、本発明の抗体分子又は二重特異性抗体複合体を薬学的に許容される賦形剤、希釈剤又は担体のうちの１つ又は複数と一緒に添加して混合することを含む、医薬又は診断組成物の調製のための工程も提供する。
【０３２１】
本明細書で使用される用語「薬学的に許容される賦形剤」とは、本発明の組成物の所望の特徴を増強する薬学的に許容される製剤担体、溶液又は添加物のことである。賦形剤は当技術分野では周知であり、緩衝剤（例えば、クエン酸緩衝剤、リン酸緩衝剤、酢酸緩衝剤及び炭酸水素緩衝剤）、アミノ酸、尿素、アルコール、アスコルビン酸、リン脂質、タンパク質（例えば、血清アルブミン）、ＥＤＴＡ、塩化ナトリウム、リポソーム、マンニトール、ソルビトール、及びグリセロールが含まれる。溶液又は懸濁液はリポソーム又は生分解性マイクロスフェアに被包することが可能である。製剤は、一般に、無菌の製造工程を用いて実質的に無菌の形態で提供されることになる。
【０３２２】
これには、製剤のために使用される緩衝溶媒溶液の濾過による生産及び無菌化、無菌緩衝溶媒溶液中での抗体の無菌懸濁、並びに当業者によく知られている方法による製剤の無菌容器中への分注が含まれることがある。
【０３２３】
薬学的に許容される担体はそれ自体が、組成物を受ける個体にとって有害な抗体の産生を誘導するべきではないし、毒性を持つべきではない。適切な担体は、タンパク質、ポリペプチド、リポソーム、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、重合アミノ酸、アミノ酸共重合体及び不活性ウイルス粒子などの大きなゆっくり代謝される巨大分子であってよい。
【０３２４】
薬学的に許容される塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩及び硫酸塩などの鉱酸塩、又は酢酸、プロピオン酸、マロン酸及び安息香酸などの有機酸の塩を使用することが可能である。
【０３２５】
治療組成物中の薬学的に許容される担体は、水、生理食塩水、グリセロール及びエタノールなどの液体をさらに含有することができる。そのような担体であれば、患者による摂取のために、医薬組成物を、錠剤、ピル、糖衣錠、カプセル、液剤、ジェル、シロップ、スラリー及び懸濁液として処方することができる。
【０３２６】
本発明の二重特異性タンパク質複合体は溶媒中に分散させて、例えば、溶液又は懸濁液の形態で送達することが可能である。本発明の二重特異性タンパク質複合体は、適切な生理溶液、例えば、生理食塩水、薬学的に許容される溶媒又は緩衝液に懸濁することが可能である。当技術分野で公知の緩衝液は、約４．０から５．０のｐＨを達成するために１ｍｌの水あたり０．０５ｍｇから０．１５ｍｇのエデト酸二ナトリウム、８．０ｍｇから９．０ｍｇのＮａＣｌ、０．１５ｍｇから０．２５ｍｇのポリソルベート、０．２５ｍｇから０．３０ｍｇの無水クエン酸、及び０．４５ｍｇから０．５５ｍｇのクエン酸ナトリウムを含有することができる。上記のように、懸濁液は、例えば、凍結乾燥した抗体から作ることが可能である。
【０３２７】
薬学的に許容される担体の徹底的な検討はRemington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, N.J. 1991)で入手可能である。
【０３２８】
二重特異性抗体複合体（又は本開示の二重特異性／多特異性抗体分子）は医薬又は診断組成物中で唯一の活性成分であってもよく、或いは他の抗体成分、例えば、抗ＴＮＦ、抗ＩＬ−１β、抗Ｔ細胞、抗ＩＦＮγ若しくは抗ＬＰＳ抗体、又はキサンチンなどの非抗体成分を含む他の活性成分を伴うことができる。他の適切な活性成分には、トレランスを誘導することができる抗体、例えば、抗ＣＤ３又は抗ＣＤ４抗体が含まれる。
【０３２９】
追加の実施形態では、本開示に従った抗体、断片又は組成物は、追加の医薬活性剤、例えば、コルチコステロイド（フルチカゾンプロピオン酸エステルなどの）及び／若しくはベータ２アゴニスト（サルブタモール、サルメテロール又はホルモテロールなどの）又は細胞成長及び増殖阻害剤（ラパマイシン、シクロホスファミド（cyclophosphmide）、メトトレキサートなどの）又は代わりにＣＤ２８及び／若しくはＣＤ４０阻害剤と組み合わせて用いられる。一実施形態では、阻害剤は小分子である。別の実施形態では、阻害剤は標的に特異的な抗体である。
【０３３０】
医薬組成物は治療的有効量の本発明の二重特異性抗体複合体（又は本開示の二重特異性／多特異性抗体分子）を適切に含む。
【０３３１】
本明細書で使用される用語「治療的有効量」とは、標的とされた疾患若しくは状態を処置する、寛解する若しくは予防する、又は検出可能な治療若しくは予防効果を示すのに必要な治療剤の量のことである。任意の抗体では、治療的有効量は、最初は細胞培養アッセイにおいて、又は動物モデルにおいて、通常、齧歯類、ウサギ、イヌ、ブタ若しくは霊長類においてのどちらかで推定することが可能である。動物モデルを使用して適切な濃度範囲及び投与経路を決定することもできる。次に、そのような情報を使用すればヒトにおける有用な用量及び投与のための経路を決定することが可能である。
【０３３２】
ヒト対象についての正確な治療的有効量は、疾病状態の重症度、対象の全般的健康、対象の年齢、体重及び性別、食事、投与時間及び回数、薬物組合せ（単数又は複数）、反応感受性及び治療に対するトレランス／応答に依拠することになる。この量はルーチンな実験方法により決定することが可能であり、臨床医の判断の範囲内である。一般に、治療的有効量は０．０１ｍｇ／ｋｇから５０ｍｇ／ｋｇ、例えば、０．１ｍｇ／ｋｇから２０ｍｇ／ｋｇになる。代わりに、用量は１日あたり１０から１００、２００、３００又は４００ｍｇなどの１日あたり１から５００ｍｇであってよい。医薬組成物は、所定量の本発明の活性剤を含有する単位用量形態で都合よく提示することができる。
【０３３３】
組成物は患者に独立して投与してもよいし、又は他の薬剤、薬物若しくはホルモンと組み合わせて（例えば、同時に、逐次又は別々に）投与してもよい。
【０３３４】
本発明の抗体分子が投与される用量は、処置される状態の性質、存在する炎症の程度及び抗体分子が予防的に使用されているのか又は既存の状態を処置するために使用されているのかどうかに依拠する。投与回数は抗体分子の半減期及びその効果の持続時間に依拠することになる。抗体分子の半減期が短い（例えば、２から１０時間）場合、１日あたり１又は複数用量を与える必要がある場合もある。代わりに、抗体分子の半減期が長い（例えば、２から１５日）場合、１日あたり１回、１週間あたり１回又は１若しくは２か月ごとに１回でも用量を与えるだけでよい場合もある。
【０３３５】
本開示では、最終製剤のｐＨは抗体又は断片の等電点の値に類似してはいない。なぜならば、製剤のｐＨが７である場合、８〜９又はそれよりも上のｐｌが適切である場合があるからである。理論に縛られたくはないが、これは最終的に最終製剤に改善された安定性をもたらすことができる、例えば、抗体又は断片は溶液のままであると考えられる。
【０３３６】
本発明の医薬組成物は、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、くも膜下腔内、脳室内、経皮（transdermal）、経皮（transcutaneous）（例えば、ＷＯ９８／２０７３４参照）、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、局所的、舌下、膣内又は直腸経路を含むがこれらに限定されないいかなる数の経路によっても投与することができる。皮下噴射器を使用して本発明の医薬組成物を投与することもできる。
【０３３７】
組成物の直接送達は、一般的には、皮下に、腹腔内に、静脈内に若しくは筋肉内に注射により実現される、又は組織の間質腔に送達されることになる。組成物は対象の特定の組織にも投与することが可能である。投薬処置は単回服用予定でも複数回服用予定でもよい。
【０３３８】
生成物が注射又は注入目的である場合、油性又は水性溶媒中の懸濁液、水溶液又は乳化液の形態を帯びることができ、生成物は懸濁剤、保存剤、安定化剤及び／又は分散剤などの調合剤を含有することができる。代わりに、二重特異性タンパク質複合体（又は本開示の二重特異性／多特異性抗体分子）は、適切な無菌液体と一緒に使用する前の復元のために乾燥形態でもよい。消化管を使用する経路により組成物を投与するつもりであれば、組成物は抗体を分解から保護ししかし消化管から吸収された後は二重特異性タンパク質複合体を放出する薬剤を含有する必要があることになる。
【０３３９】
本開示に従った噴霧可能な製剤は、例えば、ホイル包みに充填された単回用量単位（例えば、密封されたプラスチック容器又はバイアル）として提供することができる。それぞれのバイアルは、容積が、例えば、２ｍｌの溶媒／溶液緩衝液中に単位用量を含有する。
【０３４０】
本明細書で使用される用語「変異体」とは、対応する野生型ペプチド又はタンパク質のアミノ酸又はヌクレオチド配列と比べた場合、少なくとも１つのアミノ酸配列又はヌクレオチド配列変化を含有するペプチド又はタンパク質のことである。変異体は対応する野生型ペプチド又はタンパク質に少なくとも８０％、又は８５％、又は９０％、又は９５％、又は９８％、又は９９％配列同一性を含むことができる。しかし、変異体は、対応する野生型ペプチド又はタンパク質に実質的に類似する機能を示すのであれば、８０％未満の配列同一性を含むことが可能である。
【０３４１】
抗原には、Ｔ細胞若しくはＢ細胞シグナル伝達受容体などの細胞表面受容体、共刺激分子、チェックポイント阻害剤、ナチュラルキラー細胞受容体、免疫グロブリン受容体、ＴＮＦＲファミリー受容体、Ｂ７ファミリー受容体、接着分子、インテグリン、サイトカイン／ケモカイン受容体、ＧＰＣＲ、成長因子受容体、キナーゼ受容体、組織特異的抗原、がん抗原、病原体認識受容体、補体受容体、ホルモン受容体又はサイトカイン、ケモカイン、ロイコトリエン、成長因子、ホルモン若しくは酵素などの可溶性分子又はイオンチャネル、そのエピトープ、断片及び翻訳後修飾形態が含まれる。
【０３４２】
一実施形態では、二重特異性タンパク質複合体は１つ又は２つの細胞表面受容体特異性を含む。
【０３４３】
一実施形態では、二重特異性タンパク質複合体は１つ又は２つのサイトカイン又はケモカイン特異性を含む。
【０３４４】
本開示に従った方法により同定される対になった標的に対する抗体又は断片は、実験用試薬、アッセイ用試薬又は治療薬として使用するのに適したいかなるフォーマットにも組み込むことができる。
【０３４５】
したがって、一態様では、本開示は、任意のフォーマットの対としての抗体断片又はその組合せの使用に及び、その例は上に与えられている。
【０３４６】
本開示は、特定の抗原特異性を備えた前記新規のフォーマットを含む医薬組成物などの組成物までも及ぶ。
【０３４７】
追加の態様では、本開示は処置におけるフォーマット及び組成物の使用を含む。
【０３４８】
一実施形態では、本開示の二重特異性タンパク質複合体を使用すれば、対象の抗原（単数又は複数）の活性を機能的に変えることができる。例えば、二重特異性タンパク質複合体は前記抗原（単数又は複数）の活性を直接的に又は間接的に中和する、拮抗する又は刺激することができる。
【０３４９】
本開示は、例えば、
ａ）結合対の第１の結合パートナー（Ｘ）に付加されている第１の抗体又は抗体断片（Ａ）を含む１つ又は複数の融合タンパク質（Ａ−Ｘ）、及び
ｂ）結合対の第２の結合パートナー（Ｙ）に付加されている第２の抗体又は抗体断片（Ｂ）を含む１つ又は複数の融合タンパク質（Ｂ−Ｙ）を含むキットであって、後者が第１の結合パートナーに対して特異的であり、
例えば、第１の結合パートナー（Ｘ）がペプチド又はポリペプチドであり第２の結合パートナー（Ｙ）がそれに特異的な抗体又は抗体断片であり、
Ｙである第２の結合パートナーが第１の結合パートナーＸに特異的であり、第２の結合パートナーが、例えば、それに特異的な抗体又は抗体断片であり、２つの結合パートナーの特異的相互作用（結合相互作用などの）が、ａ）とｂ）由来の２つの融合タンパク質を物理的に一つにまとめて二重特異性タンパク質複合体を形成するヘテロ二量体繋を形成し、
融合タンパク質（単数又は複数）が複合体化された又は非複合体形態である
上記キットにまでも及ぶ。
【０３５０】
有利なことに、キットは本開示の二重特異性タンパク質複合体を含んでいてもよいし、又は複合体化された若しくは非複合体形態である融合タンパク質を含んでいてもよい。前者の場合では、二重特異性タンパク質複合体は便利さと使用のしやすさを提供する「枠を超える」使用の準備が整っており、後者の場合では、二重特異性タンパク質複合体は異なる融合タンパク質を組み合わせることにより使用者の要件に従って会合させることが可能である。
【０３５１】
別の実施形態では、キットは使用のための説明書をさらに含む。
【０３５２】
さらに別の実施形態では、キットは１つ又は複数の機能アッセイを実施するための１つ又は複数の試薬をさらに含む。
【０３５３】
一実施形態では、本明細書に記載される融合タンパク質、二重特異性タンパク質複合体、マルチプレックス、格子、ライブラリー、組成物、等は実験用試薬としての使用を目的とする。
【０３５４】
追加の態様では、ヌクレオチド配列、例えば、上で定義される融合タンパク質及び／又は二重特異性タンパク質複合体をコードするＤＮＡ配列が提供される。
【０３５５】
一実施形態では、ヌクレオチド配列、例えば、本開示に従った二重特異性タンパク質複合体をコードするＤＮＡ配列が提供される。
【０３５６】
一実施形態では、ヌクレオチド配列、例えば、本開示に従った二重特異性又は多特異性抗体分子をコードするＤＮＡ配列が提供される。
【０３５７】
本明細書の開示は上で定義されるヌクレオチド配列を含むベクターにも及ぶ。
【０３５８】
本明細書で使用される用語「ベクター」とは、それがすでに連結されている別の核酸を輸送することができる核酸分子のことである。ベクターの例は「プラスミド」であり、これは追加のＤＮＡセグメントをそこにライゲートすることができる環状二本鎖ＤＮＡループである。別の種類のベクターはウイルスベクターであり、追加のＤＮＡセグメントをウイルスゲノムにライゲートすることができる。ある種のベクターは、それが導入されている宿主細胞内で自律複製することができる（例えば、細菌性の複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は宿主細胞のゲノムに組み込むことが可能であり、そこではベクターはそれに続いて宿主ゲノムと一緒に複製される。プラスミドはもっとも一般的に使用されている形態のベクターであるので、本明細書では、用語「プラスミド」と「ベクター」は互換的に使用することができる。
【０３５９】
ベクターを構築することができる一般的な方法、すなわち、トランスフェクション法及び培養法は当業者には周知である。これに関しては、"Current Protocols in Molecular Biology", 1999, F. M. Ausubel (ed), Wiley Interscience, New York and the Maniatis Manual produced by Cold Spring Harbor Publishingを参照する。
【０３６０】
本明細書で使用される用語「選択可能なマーカー」とは、その発現によってマーカー遺伝子を含有するベクターを形質転換されている又はトランスフェクトされている細胞を同定することができるようになるタンパク質のことである。広範囲の選択マーカーが当技術分野では公知である。例えば、典型的には選択可能マーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞にＧ４１８、ハイグロマイシン又はメトトレキサートなどの薬物に対する耐性を与える。選択可能マーカーは、例えば、蛍光マーカーなどの視覚的に同定可能なマーカーでも可能である。蛍光マーカーの例には、ローダミン、ＦＩＴＣ、ＴＲＩＴＣ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒｓ及びその種々のコンジュゲートが含まれる。
【０３６１】
本開示の抗体をコードする１つ又は複数のＤＮＡ配列を含む１つ又は複数のクローニング又は発現ベクターを含む宿主細胞も提供される。本開示の抗体分子をコードするＤＮＡ配列の発現のためにはいかなる適切な宿主細胞／ベクター系でも使用することができる。細菌、例えば、大腸菌及び他の微生物系を使用してもよいし、又は真核生物、例えば、哺乳動物宿主細胞発現系を使用してもよい。適切な哺乳動物宿主細胞にはＣＨＯ、骨髄腫又はハイブリドーマ細胞が含まれる。
【０３６２】
本開示は、本開示に従った融合タンパク質の産生のための工程であって、本開示のベクターを含有する宿主細胞を、本開示の分子をコードするＤＮＡからタンパク質を発現するのに適した条件下で培養し、分子を単離することを含む上記工程も提供する。
【０３６３】
本開示の二重特異性タンパク質複合体は診断／検出キット中で使用することができ、抗原特異性の特定の組合せを備えた二重特異性タンパク質複合体が使用される。例えば、キットは、両方が同じ細胞型上に存在している２つの抗原に対して特異的である二重特異性抗体複合体を含み、両方の抗原が首尾よく検出される場合にのみ確定診断を下すことができる。非複合体形態の２つの別々の抗体又は抗体断片よりもむしろ本開示の二重特異性抗体複合体を使用することにより、検出の特異性を大いに増強することが可能になる。
【０３６４】
一実施形態では、二重特異性抗体複合体は固体表面に固定される。固体表面は例えば、チップ又はＥＬＩＳＡプレートであってもよい。
【０３６５】
試料中で第１と第２のペプチドの存在を検出するための本開示の二重特異性タンパク質複合体の使用がさらに提供され、二重特異性複合体は検出剤として使用される。
【０３６６】
本開示の二重特異性抗体複合体は、例えば、結合した抗体−抗原複合体の検出を促進する蛍光マーカーにコンジュゲートすることができる。そのような二重特異性抗体複合体は免疫蛍光顕微鏡のために使用することが可能である。代わりに、二重特異性抗体複合体はウェスタンブロッティング又はＥＬＩＳＡのためにも使用することができる。
【０３６７】
一実施形態では、抗体（特に、本発明に従った抗体又は断片）を精製するための工程が提供される。
【０３６８】
一実施形態では、本開示に従った融合タンパク質又は二重特異性タンパク質複合体を精製するための工程であって、不純物がカラム上に保持され抗体は非結合画分に維持されるように、アニオン交換クロマトグラフィーを非結合モードで実施するステップを含む、上記工程が提供される。ステップは、例えば、ｐＨ約６〜８で実施することができる。
【０３６９】
工程は、例えば、ｐＨ約４〜５で実施される、カチオン交換クロマトグラフィーを用いる最初の捕捉ステップをさらに含むことができる。
【０３７０】
工程は、生成物及び工程関連不純物が生成物ストリームから適切に分離されることを確実にする追加のクロマトグラフィーステップ（単数又は複数）をさらに含むことができる。
【０３７１】
精製工程は、濃縮及びダイアフィルトレーションステップなどの１つ又は複数の限外濾過ステップも含むことができる。
【０３７２】
上で使用される「精製された形態」は、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％ｗ／ｗ又はそれよりも多い純度などの少なくとも９０％純度を指すことを意図されている。
【０３７３】
本明細書の文脈では、「含む（comprising）」は「含む（including）」と解釈するべきである。
【０３７４】
ある種の要素を含む開示の態様は、関連する要素「からなる」又は「基本的にからなる」別の実施形態に及ぶことも意図されている。
【０３７５】
本明細書で用いられるプラスの実施形態は本開示の排除的なある種の態様の土台の役を果たすことができる。
【０３７６】
二重特異性複合体に関係する方法の文脈における開示は、複合体それ自体に等しく当てはまり、逆もまた同じである。
【０３７７】
項：
１．式Ａ−Ｘ：Ｙ−Ｂのヘテロ二量体的に繋ぎ合わされた二重特異性タンパク質複合体における相乗的機能を検出する方法であって、
Ｘ：Ｙはヘテロ二量体繋であり、
Ａ及びＢはそれぞれＸ及びＹとの融合タンパク質の形態である二重特異性体の成分であり、
（ｉ）少なくとも１つのヘテロ二量体的に繋ぎ合わされた二重特異性タンパク質を含むマルチプレックスの一部又は全てについての機能アッセイにおいて活性を試験するステップと、
（ｉｉ）機能アッセイからの読み出し情報を解析して、二重特異性タンパク質複合体における相乗的生物学的機能を同定するステップと
を含む上記方法。
２．項１に従ったヘテロ二量体的に繋ぎ合わされた二重特異性タンパク質複合体における相乗的機能を検出するための方法であって、ヘテロ二量体的に繋ぎ合わされた二重特異性タンパク質複合体のマルチプレックスを形成する第１のステップをさらに含む上記方法。
３．項１又は２に従ったヘテロ二量体的に繋ぎ合わされた二重特異性タンパク質複合体における相乗的機能を検出するための方法であって、Ｘがペプチド又はタンパク質であり、ＹがＸに特異的なペプチド又はタンパク質結合パートナーである、上記方法。
４．項３に従ったヘテロ二量体的に繋ぎ合わされた二重特異性タンパク質複合体における相乗的機能を検出するための方法であって、ヘテロ二量体繋の結合親和性が５ｎＭ又はそれよりも強い、上記方法。
５．項４に従ったヘテロ二量体的に繋ぎ合わされた二重特異性タンパク質複合体における相乗的機能を検出するための方法であって、ヘテロ二量体繋の結合親和性が９００ｐＭ又はそれよりも強い、例えば８００、７００、６００、５００、４００又は３００ｐＭなどである、上記方法。
６．項３に従ったヘテロ二量体的に繋ぎ合わされた二重特異性タンパク質複合体における相乗的機能を検出するための方法であって、Ｘが抗体又はその結合断片である、上記方法。
７．項６に従ったヘテロ二量体的に繋ぎ合わされた二重特異性タンパク質複合体における相乗的機能を検出するための方法であって、ＸがＦａｂ、Ｆａｂ’、単鎖Ｆｖ、及びＶＨＨなどの単一ドメイン抗体を含む群から選択される抗体断片である、上記方法。
８．項７に従ったヘテロ二量体的に繋ぎ合わされた二重特異性タンパク質複合体における相乗的機能を検出するための方法であって、Ｘが単鎖Ｆｖである、上記方法。
９．項８に従ったヘテロ二量体的に繋ぎ合わされた二重特異性タンパク質複合体における相乗的機能を検出するための方法であって、単鎖ＦｖがペプチドＧＣＮ４に特異的である、上記方法。
１０．項９に従ったヘテロ二量体的に繋ぎ合わされた二重特異性タンパク質複合体における相乗的機能を検出するための方法であって、単鎖Ｆｖが５２ＳＲ４である、上記方法。
１１．項３から１０のいずれか一項に従ったヘテロ二量体的に繋ぎ合わされた二重特異性タンパク質複合体における相乗的機能を検出するための方法であって、Ｙがペプチドである、上記方法。
１２．項１１に従ったヘテロ二量体的に繋ぎ合わされた二重特異性タンパク質複合体における相乗的機能を検出するための方法であって、ペプチドが５から２５アミノ酸長である、上記方法。
１３．項１から１２のいずれか一項に従ったヘテロ二量体的に繋ぎ合わされた二重特異性タンパク質複合体における相乗的機能を検出するための方法であって、Ａが抗体又はその結合断片である、上記方法。
１４．項１から１３のいずれか一項に従ったヘテロ二量体的に繋ぎ合わされた二重特異性タンパク質複合体における相乗的機能を検出するための方法であって、Ｂが抗体又はその結合断片である、上記方法。
１５．マルチプレックスが、少なくとも１つのヘテロ二量体的に繋ぎ合わされた二重特異性タンパク質に対する少なくとも１つの生物学的コンパレーターを含む、先行する項のいずれか一項に従った方法。
１６．複数の二重特異性タンパク質複合体が同時に試験される、項１から１５のいずれか一項に従った方法。
１７．式Ａ−Ｘ：Ｙ−Ｂのヘテロ二量体的に繋ぎ合わされた二重特異性タンパク質複合体における相乗的機能を検出する方法であって、
Ａ−Ｘは第１の融合タンパク質であり、
Ｙ−Ｂは第２の融合タンパク質であり、
Ｘ：Ｙはヘテロ二量体繋であり、
Ａは二重特異性体の第１のタンパク質成分であり、
Ｂは二重特異性体の第２のタンパク質成分であり、
Ｘは結合対の第１の結合パートナーであり、
Ｙは結合対の第２の結合パートナーであり、
：はＸとＹの間の相互作用（結合相互作用などの）である、上記二重特異性タンパク質複合体。
１８．ＸとＹの間の結合相互作用が低い解離定数を有する、項１７に従った二重特異性タンパク質複合体。
１９．解離定数が１〜９×１０−３ｓ−１又はそれよりも少ない、例えば１〜９×１０−３ｓ−１、１〜９×１０−４ｓ−１、１〜９×１０−５ｓ−１、１〜９×１０−６ｓ−１又は１〜９×１０−７ｓ−１の範囲である、項１８に従った二重特異性タンパク質複合体。
２０．解離定数が１×１０−４ｓ−１又はそれよりも少ない、例えば１×１０−５ｓ−１、１×１０−６ｓ−１又は１×１０−７ｓ−１である、項１９に従った二重特異性タンパク質複合体。
２１．互いに対するＸとＹの親和性が５ｎＭ又はそれよりも強く、９００ｐＭ又はそれよりも強い、例えば８００、７００、６００、５００、４００又は３００ｐＭなどである、項１７から２０のいずれか一項に従った二重特異性タンパク質複合体。
２２．Ｙがペプチド又はタンパク質である、項１７から２１のいずれか一項に従った二重特異性タンパク質複合体。
２３．ペプチドがＧＣＮ４である、項２２に従った二重特異性タンパク質複合体。
２４．Ｘが抗体又は抗体断片である、項１６から２３のいずれか一項に従った二重特異性タンパク質複合体。
２５．抗体断片がＦａｂ、Ｆａｂ’、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）及びＶＨＨなどの単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）からなる群から選択される、項２４に従った二重特異性タンパク質複合体。
２６．抗体断片がｓｃＦｖである、項２５に従った二重特異性タンパク質複合体。
２７．ｓｃＦｖが５２ＳＲ４である、項２６に従った二重特異性タンパク質複合体。
２８．Ｘ又はＹがペプチドであり、ペプチドがＥ５Ｂ９と呼ばれるペプチドエピトープ以外である、項１７から２７のいずれか一項に従った二重特異性複合体。
２９．結合パートナー対が、
（ｉ）Ｘはグルタチオン（ＧＳＨ）でありＹはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）である、
（ｉｉ）ＸはＦｏｓでありＹはＪｕｎである、
（ｉｉｉ）ＸはＦＬＡＧでありＹは抗ＦＬＡＧ抗体又はその断片である、
（ｉｖ）ＸはＨｉｓでありＹは抗Ｈｉｓである、
（ｖ）Ｘはマルトース結合タンパク質でありＹは抗マルトース結合タンパク質又はその断片である
から選択される、項１７に従った二重特異性タンパク質複合体。
３０．Ａが、抗体又は抗体断片などの、抗体、抗体断片、リガンド、受容体、阻害剤及び酵素からなる群から選択される、項１７から２９のいずれか一項に従った二重特異性タンパク質複合体。
３１．Ｂが、抗体又は抗体断片などの、抗体、抗体断片、リガンド、受容体、阻害剤及び酵素からなる群から選択される、項１７から３０のいずれか一項に従った二重特異性タンパク質複合体。
３２．Ａ及び／又はＢが細胞表面受容体に対して特異的である抗体又は抗体断片である、項３０又は３１のいずれか一項に従った二重特異性タンパク質複合体。
３３．Ａ及び／又はＢがサイトカイン又はケモカインに対して特異的である抗体又は抗体断片である、項２９から３０のいずれか一項に従った二重特異性タンパク質複合体。
３４．Ｘが第１の抗体又は抗体断片の重又は軽鎖のＣ末端に付加されており、例えば、Ｘが第１の抗体又は抗体結合断片の重鎖のＣ末端に付加されている、項３０から３４のいずれか一項に従った二重特異性タンパク質複合体。
３５．Ｙが第２の抗体又は抗体結合断片の重又は軽鎖のＣ末端に付加されており、例えば、Ｙが第２の抗体又は抗体断片の重鎖のＣ末端に付加されている、項３１から３５のいずれか一項に従った二重特異性タンパク質複合体。
３６．Ａが第１の抗原に特異的な抗体又は抗体結合断片であり、Ｂが第２の抗原に特異的な抗体又は抗体断片であり、第１と第２の抗原が異なっている、項１７から３６のいずれか一項に従った二重特異性タンパク質複合体。
３７．項１７から３７のいずれか一項に従った１つ又は複数の二重特異性タンパク質複合体を含む組成物。
３８．融合タンパク質の少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％が二重特異性タンパク質複合体形態である、項３８に従った組成物。
３９．融合タンパク質の少なくとも６０％が二重特異性タンパク質複合体形態である、項３９に従った組成物。
４０．項１９から３７のいずれか一項に従った少なくとも２つの二重特異性タンパク質複合体を含み、二重特異性タンパク質複合体が異なる特異性を有する、二重特異性タンパク質複合体のマルチプレックス。
４１．二重特異性タンパク質複合体が溶液中にある又は固体基材表面に固定されている、項４１に従ったマルチプレックス。
４２．マルチプレックスがアレイ又は格子の形態であり、例えば、９６ウェルプレート又は３８４ウェルプレートなどのマイクロプレート中にある、項４２に従ったマルチプレックス。
４３．二重特異性タンパク質複合体がビーズにコンジュゲートされている、項４１から４３のいずれか一項に従ったマルチプレックス。
４４．項１から３７のいずれか一項に定義されている融合タンパク質Ａ−Ｘ又はＢ−Ｙ。
４５．項１から３７のいずれか一項に定義されている２つ又はそれよりも多い融合タンパク質を含むライブラリー。
４６．項１から３７のいずれか一項に定義されている融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列。
４７．項４７に従ったヌクレオチド配列を含むベクター。
４８．治療において使用するための、項１７から３７のいずれか一項に従った二重特異性タンパク質複合体又は項３８から４０のいずれか一項に従った組成物。
４９．項７から３６のいずれか一項に従った二重特異性タンパク質複合体又は項３７から３９のいずれか一項に従った組成物の投与を含む、患者を処置する方法。
５０．ａ）１つ又は複数の融合タンパク質Ａ−Ｘ、及び
ｂ）１つ又は複数の融合タンパク質Ｂ−Ｙ
を含むキットであって、
Ｘ：Ｙはヘテロ二量体繋であり、
Ａは二重特異性体の第１のタンパク質成分であり、
Ｂは二重特異性体の第２のタンパク質であり、
Ｘは、ペプチド又はタンパク質などの結合対の第１の結合パートナーであり、
Ｙは、結合対の第２の結合パートナー、例えば、Ｘに特異的なペプチド又はタンパク質であり、
ＸとＹの間の特異的結合相互作用がヘテロ二量体繋を形成し、２つの融合物を物理的に持ちより二重特異性タンパク質複合体を形成するように、Ｘ及びＹはホモ二量体を形成することができず、
キット中の融合タンパク質（単数又は複数）は複合体化された又は非複合体形態である、上記キット。
５１．使用するための説明書をさらに含む、項５１に従ったキット。
５２．１つ又は複数の機能アッセイを実施するための１つ又は複数の試薬をさらに含む、項５０又は５１に従ったキット。
【０３７８】
本明細書で参照される全ての参考文献は、参照により具体的に組み込まれる。
【０３７９】
参考文献
1.Ribosome display efficiently selects and evolves high-affinity antibodies in vitro from immune libraries. Hanes J, Jermutus L, Weber-Bornhauser S, Bosshard HR, Pluckthun A. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 14130-14135
2.Directed in Vitro Evolution and Crystallographic Analysis of a Peptide-binding Single Chain Antibody Fragment (scFv) with Low Picomolar Affinity. Zhand C, Spinelli S, Luginbuhl B, Amstutz P, Cambillau C, Pluckthun A. (2004) J. Biol. Chem. 279, 18870-18877
3.Antigen recognition by conformational selection. Berger C,  Weber-Bornhauser S,  Eggenberger Y, Hanes J,  Pluckthun A, Bosshard H. R. (1999) F.E.B.S. Letters 450, 149-153
【実施例】
【０３８０】
いくつかの例において用いられる一般方法
一般方法１：血小板アフェレーシス円錐体由来のヒトＰＢＭＣを凍結アリコートとして預けた。アッセイを実施するのに先立って、細胞は解凍し、ＤＭＥＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で洗浄し、３７℃、５％ＣＯ２環境に順応させた。
【０３８１】
一般方法２：Ｆａｂ’Ａ−Ｘ及びＦａｂ’Ｂ−Ｙは９０分間一緒にインキュベートし（３７℃／５％ＣＯ２環境で）、その後Ｖ字型底９６ウェルプレートにおいて２．５×１０５ＰＢＭＣと混合した。次に、ＰＢＭＣプラス二重特異性（Ｆａｂ’Ａ−Ｘ及びＦａｂ’Ｂ−Ｙ）又は二価（例えば、Ｆａｂ’Ａ−Ｘ  Ｆａｂ’Ａ−Ｙ）組合せをさらに９０分間一緒にインキュベートした。この時間の後、Ｂ細胞は、３７℃で８分間、２００ｎＭのヤギＦ（ａｂ’）２抗ヒトＩｇＭ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）の添加により活性化した。次に、シグナル伝達反応は等容積のＣｙｔｏｆｉｘ緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を添加することにより停止させた。次に、プレートは１５分間室温で放置し、その後５００ｇで５分間遠心分離した。過剰な上澄みは細胞ペレットから捨て、このペレットはフロー緩衝液に再懸濁しもう１度洗浄した。次に、細胞は３０分間、氷冷Ｐｅｒｍ  Ｂｕｆｆｅｒ  ＩＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に再懸濁し、その後フロー緩衝液で２度洗浄した。
【０３８２】
一般方法３：細胞は一般方法２に記載される通りに活性化し、蛍光的に標識された抗ＣＤ２０抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、４７３位の改変セリン残基を認識する抗リン酸Ａｋｔ抗体、７５９位の改変されたチロシン残基を認識する抗リン酸ＰＬＣｇ２抗体及び全ＩｋＢを認識した抗ＩｋＢ抗体で染色した。次にプレートは再懸濁し、暗所において室温で１時間インキュベートした。この時間の後、プレートはさらに２回洗浄し、２５μｌのフロー緩衝液に再懸濁した。ＣＤ２０、Ａｋｔ及びＰＬＣｇ２の細胞発現は、Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ  ＨＴＦＣ（商標）フローサイトメトリーを使用して測定した。
【０３８３】
（例１）
本開示の二重特異性抗体複合体ＦａｂＢ−ＧＣＮ４（７Ｐ１４Ｐ）：５２ＳＲ４−ＦａｂＡの構築
図２及び４は本開示の代表的な二重特異性抗体複合体を示している。二重特異性抗体複合体は第１と第２の融合タンパク質で構成されている。
【０３８４】
第１の融合タンパク質（Ａ−Ｘ）は抗原６に対する特異性を備えたＦａｂ断片（ＦａｂＡ（Ｆａｂ＃１とも呼ばれる））を含み、この断片はペプチドリンカーＡＳＧＧＧＧ配列番号７１を介してＸ  ｓｃＦｖ（クローン５２ＳＲ４配列番号３）に付加されており、このリンカーはＦａｂ断片のＣＨ１ドメインのＣ末端とｓｃＦｖのＶＬドメインに連結されている。ｓｃＦｖそれ自体もそのＶＬとＶＨドメインの間に位置するペプチドリンカーを含有している。
【０３８５】
第２の融合タンパク質（Ｂ−Ｙ）はＦａｂ断片（抗原５に対する特異性を備えたＦａｂＢ［Ｆａｂ＃２とも呼ばれる］）を含む。しかし、第１のタンパク質と比べて、Ｆａｂ断片はペプチドリンカーＡＳＧＧＧＧ配列番号７１を介してＹ  ペプチドＧＣＮ４（クローン７Ｐ１４Ｐ配列番号１）に付加されており、このリンカーはＦａｂ断片のＣＨ１ドメインに連結されている。
【０３８６】
ｓｃＦｖ、Ｘは結合パートナーＹ、ＧＣＮ４に対して特異的であり相補的である。その結果、２つの融合タンパク質が互いに接触すると、ｓｃＦｖとＧＣＮ４ペプチドの間の非共有結合相互作用が起こり、それによって２つの融合タンパク質が二重特異性抗体複合体の形態で物理的に保持される。
【０３８７】
単鎖抗体（ｓｃＦｖ）５２ＳＲ４は、ＧＣＮ４（７Ｐ１４Ｐ）で免疫されたマウスの脾臓からリボソームディスプレイＶＬ−リンカー−ＶＨ  ｓｃＦｖライブラリーを構築しパニングすることにより得られた（参考文献１）。追加の２００４年度出版物は、ランダム化されたライブラリーのリボソームディスプレイを再び使用して報告されている５ｐＭへの５２ＳＲ４の親和性成熟を報告している（参考文献２）。
【０３８８】
ＧＣＮ４ペプチドは７位及び１４位にプロリン残基を含むことにより酵母転写因子ＧＣＮ４に由来しており、したがってBerger et alによる１９９９年度出版物に記載されている通りに、ｓｃＦｖ結合するとＧＣＮ４（７Ｐ１４Ｐ）は単量体状態のままである（参考文献３）。
【０３８９】
ＧＣＮ４ペプチド及び５２ＳＲ４  ｓｃＦｖをコードするヌクレオチド配列は、２つの別々のベクターの、ＣＨ１を含有し抗体ＶＨ領域を受け入れるようにすでに設計されている社内重鎖Ｆａｂ発現ベクターの下流にクローニングした。
【０３９０】
次に、抗抗原６抗体及び抗抗原５抗体由来のＶＨ領域はこれら２つの重鎖ベクターに別々にクローニングした。
【０３９１】
ＧＣＮ４ペプチド及び５２ＳＲ４  ｓｃＦｖをコードするヌクレオチド配列は、それぞれ第１及び第２のベクターの、ＣＫを含有し抗体ＶＬ領域を受け入れるように設計されている社内軽鎖Ｆａｂ発現ベクターの下流に別々にクローニングした。
【０３９２】
抗抗原６抗体及び抗抗原５抗体由来のＶＬ領域は、適切な重鎖ベクターと同時発現してＦａｂ−ｓｃＦｖ及びＦａｂ−ペプチドタンパク質を発現するために社内軽鎖発現ベクターのＣＫを備えたフレームに別々にクローニングした。
【０３９３】
次に、ベクターを配列決定して、クローニングが成功しており、それに続いて細胞が、それぞれ抗抗原６抗体及び抗抗原５抗体由来のＶ領域を備えたＦａｂ−ｓｃＦｖとＦａｂ−ペプチドタンパク質を別々に発現したことを確認した。例１の抗原５及び６は、大きな格子フォーマットを備えた後の例において抗原５及び抗原６とラベルされた抗原ではない。
【０３９４】
（例２）
２つの標的抗原に同時に共結合することが可能な非共有結合二重特異性抗体を形成するｓｃＦｖ：ペプチド相互作用のフローサイトメトリー実証
図５は、ｓｃＦｖ：ペプチド結合相互作用を使用して形成される２つの異なる二重特異性抗体複合体の抗原特異性を実証するフローサイトメトリー実験の結果を示している。
【０３９５】
第１の二重特異的抗体複合体は、以下の２つの融合タンパク質：
１．抗抗原５Ｆａｂ−ｓｃＦｖ（５２ＳＲ４）；及び
２．抗抗原６Ｆａｂ−ペプチド（ＧＣＮ４）
を使用して構築した。
【０３９６】
第２の二重特異的抗体複合体は、以下の２つの融合タンパク質：
１．抗抗原５Ｆａｂ−ペプチド（ＧＣＮ４）；及び
２．抗抗原６Ｆａｂ−ｓｃＦｖ（５２ＳＲ４）
を使用して構築した。
【０３９７】
したがって、２つの二重特異性抗体複合体は同じＦａｂ断片及び同じ結合パートナー（すなわち、５２ＳＲ４及びＧＣＮ４）を有していた。２つの二重特異性抗体複合体間の違いは、どのＦａｂ断片がどの結合パートナーに付加されているかにあった。
【０３９８】
複合体を形成しない対照混合物は以下の融合タンパク質：
１．抗抗原５Ｆａｂ：ＧＣＮ４；及び
２．抗抗原６Ｆａｂ：ＧＣＮ４
から作製した。
【０３９９】
抗原５に結合する二重特異性抗体複合体の能力を実証するため、複合体を抗原５を発現するジャーカット細胞と一緒にインキュベートした。抗原６に結合する二重特異性抗体複合体の能力を実証するため、ジャーカット細胞上で一度抗原５に結合した複合体をそれに続いてビオチン化抗原６に接触させた。次に、ビオチン化抗原６は蛍光的に標識されたストレプトアビジンを使用して検出した。
【０４００】
次に、ジャーカット細胞をＦａｃｓｃａｌｉｂｕｒフローサイトメトリー装置にかけた。ジャーカット細胞は、自身は抗原６に結合している二重特異性抗体複合体に結合しているときだけ標識され得、これによって、二重特異性抗体複合体が抗原５と抗原６の両方に結合できることを示されるのであるが、このフローサイトメトリーでは、蛍光的に標識されたジャーカット細胞は、いずれも合体を形成することができないペプチドに融合されている２つの融合タンパク質と一緒にインキュベートされたジャーカット細胞から分離することが可能である。
【０４０１】
図５のＦＡＣＳプロットは、両方の二重特異性抗体複合体についての著しい移動（黒い背景の上の細い線及び太い線）を示しており、こうして二重特異性抗体複合体が両方の標的抗原に首尾よく結合できること、両方の標的抗原に結合する能力は、所与のＦａｂ断片がｓｃＦｖ又はペプチドに連結しているかどうかとは無関係に保持されることが実証されている。
【０４０２】
抗抗体６ＦａｂにＣ末端で融合しているそれぞれペプチド又はｓｃＦｖのそれに続く捕捉は、最終層において蛍光的に標識されたストレプトアビジンで検出されるビオチン化抗原６のさらなる捕捉を可能にする。したがって、ＦＡＣＳプロットに示されている結果は、本開示の二重特異性抗体複合体が２つの異なる標的抗原に同時に首尾よく結合できることを示している。
【０４０３】
例２の抗原５及び抗原６は、下で大きな格子フォーマットを備えた後の例において抗原５及び抗原６とラベルされた抗原ではない。
【０４０４】
（例３）
ｓｃＦｖ：ペプチド相互作用のビアコア実証
図６は、ｓｃＦｖ：ペプチド（すなわち、５２ＳＲ４：ＧＣＮ４）相互作用の親和性を実証する表面プラズモン共鳴トレースを示している。表面プラズモン共鳴はビアコア３０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して実施した。実験はすべて２５℃で実施した。ストレプトアビジン（社内で作製）はアミンカップリング化学反応を介してＣＭ５  Ｓｅｎｓｏｒ  Ｃｈｉｐ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に固定し、最終レベルはおおよそ１７５０応答単位であった。ＨＢＳ−Ｎ緩衝液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）は、固定化及びペプチド捕捉のためのランニング緩衝液として使用した。ＨＢＳ−Ｎ中のビオチン−ＧＣＮ４ペプチドの５μｌ注射液（１０ｎＭ、Ｍ．Ｗ．４３６０）を使用して、固定化されたストレプトアビジン上でのおおよそ６ＲＵの捕捉を達成した。ランニング緩衝液は、抗ＧＣＮ４（５２ＳＲ４）ｓｃＦｖ結合動態学の測定のためにＨＢＳ−ＥＰ＋緩衝液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％（ｖ／ｖ）界面活性剤Ｐ２０；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に切り替えた。３０ｎＭからのＦａｂ−ｓｃＦｖ（社内で作製）の３倍連続希釈、又はＨＢＳ−ＥＰ＋緩衝液対照は、流速３０μｌ／分で固定化ＧＣＮ４ペプチド上に注入した（３分会合、１５分解離）。表面は、２Ｍのグアニジン−ＨＣｌの２回の連続６０秒注入により流速１０μｌ／分でそれぞれの注入後に再生した。標準手順に続いて、ダブル参照バックグランド減算結合曲線（Double referenced background subtracted binding curves）を３０００  ＢＩＡＥｖａｌソフトウェア（バージョン４．１）を使用して解析した。動態学パラメータは、１対１結合モデルアルゴリズムをフィットさせることから決定した。データは、ｓｃＦｖがペプチドに対して５１６ｐＭの親和性を有することを示している。
【０４０５】
（例４）
機能アッセイのためのＦａｂ−Ａ（Ｆａｂ−ｓｃＦｖ「Ａ−Ｘ」）及びＦａｂ−Ｂ（Ｆａｂ−ペプチド［Ｂ−Ｙ］）の作製
クローニング戦略：抗体可変領域ＤＮＡはＰＣＲ又は遺伝子合成隣接制限酵素部位ＤＮＡ配列により作製した。これらの部位は可変重鎖ではＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｈｏｌであり、可変軽鎖ではＨｉｎｄＩＩＩ及びＢｓｉＷＩであった。これにより重可変領域は２つの重鎖ベクター（ＦａｂＢ−Ｙを備えたｐＮＡＦＨ及びＦａｂＡ−Ｘを備えたｐＮＡＦＨ）へのライゲーションを受け入れやすくなる。なぜならば、ベクターが相補的制限部位を有するからである。これにより、可変領域はマウス定常領域及びペプチドＹ（ＧＣＮ４）又はｓｃＦｖ  Ｘ（５２ＳＲ４）の上流（又は５’）にライゲートされ、全リーディングフレームが作製される。軽鎖は、再び同じ相補的制限部位を使用する標準社内マウス定常カッパベクター（ｐＭｍＣＫ又はｐＭｍＣＫ  Ｓ１７１Ｃ）にクローニングした。ｐＭｍＣＫ  Ｓ１７１Ｃベクターは可変領域がウサギから単離された場合に使用する。クローニング事象は、全オープンリーディングフレームに隣接するプライマーを使用する配列決定により確認した。
【０４０６】
ＣＨＯＳＸＥを培養する：浮遊ＣＨＯＳＸＥ細胞を、２ｍＭ（１００×）ｇｌｕｔａｍｘを補充したＣＤＣＨＯ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に前順応させた。細胞は、振盪インキュベーター器（Ｋｕｎｅｒ  ＡＧ、Ｂｉｒｓｆｅｌｄｅｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）上、１４０ｒｐｍで撹拌して対数増殖期に維持し、８％ＣＯ２を補充して３７℃で培養した。
【０４０７】
電気穿孔トランスフェクション：トランスフェクションに先立って、細胞数及び生存率をＣＥＤＥＸ細胞計数器（Ｉｎｎｏｖａｔｉｓ  ＡＧ．Ｂｉｅｌｅｆｅｌｄ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して決定し、必要量の細胞（２×１０８細胞／ｍｌ）を遠心コニカルチューブに移して１４００ｒｐｍで１０分間回転させた。ペレット状細胞は無菌Ｅａｒｌｓ平衡塩類溶液に再懸濁させ、１４００ｒｐｍでさらに１０分間回転させた。上澄みは捨てペレットは所望の細胞密度まで再懸濁した。
【０４０８】
最終濃度２×１０８細胞／ｍｌ混合で４００μｇ及び８００μｌのベクターＤＮＡはキュベット（Ｂｉｏｒａｄ）にピペットを使って入れ、社内電気穿孔システムを使用して電気穿孔した。
【０４０９】
Ｆａｂ−Ａ（Ｆａｂ−ｓｃＦｖ「Ａ−Ｘ」）及びＦａｂ−Ｂ（Ｆａｂ−ペプチド［Ｂ−Ｙ］）は別々にトランスフェクトした
トランスフェクトされた細胞は、２ｍＭ  ｇｌｕｔａｍｘ及び抗生物質有糸分裂阻害剤（１００×）溶液（５００中１）で強化したＰｒｏＣＨＯ５培養液を含有する１×３Ｌエルレンマイヤーフラスコに直接移し、細胞は３７℃、５％ＣＯ２及び１４０ｒｐｍに設定したＫｕｈｎｅｒ振盪インキュベーター器で振盪しながら培養した。栄養補助剤２ｇ／ＬのＡＳＦ（味の素）をトランスフェクションの２４時間後に添加し、さらに１３日間の培養のために温度を３２℃まで下げた。４日目、３ｍＭの酪酸ナトリウム（ｎ−酪酸ナトリウム塩、Ｓｉｇｍａ  Ｂ−５８８７）を培養物に添加した。
【０４１０】
１４日目、培養物はチューブに移し、４０００ｒｐｍでの３０分間の遠心分離後上澄みを細胞から分離した。保持した上澄みは０．２２μｍのＳＡＲＴＯＢＲＡＮ（登録商標）Ｐ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、続いて０．２２μｍのガンマゴールド濾過器を通してさらに濾過した。最終発現レベルはプロテインＧ−ＨＰＬＣにより決定した。
【０４１１】
大規模（１．０Ｌ）精製：Ｆａｂ−Ａ及びＦａｂ−Ｂは、ＡＫＴＡ  Ｘｐｒｅｓｓシステム及びＨｉｓＴｒａｐ  Ｅｘｃｅｌ前充填ニッケルカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して親和性捕捉により精製した。培養上澄みは０．２２μｍの無菌濾過を行い、ｐＨは必要な場合にはカラムに充填する前に弱酸又は弱塩基で中性に調整した。１５〜２５ｍＭイミダゾールを含有する二次洗浄ステップを使用して、弱い結合の宿主細胞タンパク質／非特異的Ｈｉｓ結合物をいずれもニッケル樹脂から移動させた。溶出は、１０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４＋１Ｍ  ＮａＣｌ＋２５０ｍＭイミダゾールを用いて実施し、２ｍｌの画分を収集した。１カラム容積を溶出に入れ、系は１０分間休止させて、溶出ピークを締め、したがって、全溶出量は減少する。一番きれいな画分をプールし、ＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ）、ｐＨ７．４に緩衝液交換し０．２２μｍの濾過を行った。最終プールはＡ２８０  Ｓｃａｎ、ＳＥ−ＨＰＬＣ（Ｇ３０００法）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元された及び非還元の）により、内毒素についてはＰＴＳ  Ｅｎｄｏｓａｆｅシステムを使用してアッセイした。
【０４１２】
（例５）
Ａｋｔシグナル伝達の阻害に基づく（Ｂ細胞活性化の尺度として）機能的二価及び二重特異性抗原標的組合せを選択するためのヘテロ二量体的に繋ぎ合わされた二重特異性タンパク質複合体フォーマットにおけるＦａｂ−Ａ（Ｆａｂ−ｓｃＦｖ「Ａ−Ｘ」）及びＦａｂ−Ｂ（Ｆａｂ−ペプチド［Ｂ−Ｙ］）の使用
ヒトＰＢＭＣを一般方法１に従って調製した。この期間中、二重特異性又は二価抗体の格子は、１０％仔牛血清及び２ｍＭグルタミンを含有するＤＭＥＭで細胞表面タンパク質抗原３、抗原１、抗原４及び抗原２に対する種々の抗原特異性を有する等モル（２００ｎＭ）量のＦａｂ’−Ａ（Ｆａｂ−ｓｃＦｖ）及びＦａｂ’−Ｂ（Ｆａｂ−ペプチド）を希釈することにより作製した。この格子は表４に示されている。
【表４】
0006628741.tif 000006
XはscFv(52SR4)でありYはペプチド(GCN4)である。
【０４１３】
Ｆａｂ’Ａ−Ｘ及びＦａｂ’Ｂ−Ｙは、例４に記載される精製に続いて一般方法２に従ってＰＭＢＣと一緒にインキュベートした。
【０４１４】
次に、細胞は、蛍光的に標識された抗ＣＤ２０抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及びタンパク質上の４７３位の改変されたセリン残基を認識する蛍光的に標識された抗リン酸Ａｋｔ抗体で染色した。次にプレートは再懸濁し、暗室において室温で１時間インキュベートした。この時間の後、プレートはさらに２回洗浄し２５μｌのフロー緩衝液に再懸濁した。ＣＤ２０及びＡｋｔの細胞発現はＩｎｔｅｌｌｉｃｙｔ  ＨＴＦＣ（商標）フローサイトメトリーを使用して測定した。
【０４１５】
データ解析ソフトウェアパッケージＦｏｒｅｃｙｔ（商標）（Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ）を使用して、Ｂ細胞は他の細胞集団とは異なると同定され、Ａｋｔレベルの幾何平均はウェルごとに計算した。次に、データはすべて最大限応答（抗ＩｇＭのみ）マイナスバックグランド（細胞のみ）のパーセンテージ阻害として表した。抗体と抗原３（ＶＲ０９８２）、抗体と抗原１（ＶＲ４２４７）、抗体と抗原４（ＶＲ４２４８）及び抗体と抗原２（ＶＲ４２４６）の組合せの相対的効果は表５に示されている（↓＝阻害、↑＝刺激及び⇔＝総合効果なし）。矢の数は活性の強度を示している。
【表５】
0006628741.tif 000007
XはscFv(52SR4)でありYはペプチド(GCN4)である。
【０４１６】
このデータは、平均値としてヒストグラムの形態でも示しており（図７）、エラーバーは９５％信頼区間を示している。データは、抗原３（ＶＲ０９８２）に対するＦａｂと抗原２（ＶＲ４２４６）に対するＦａｂ、抗原１（ＶＲ４２４７）に対するＦａｂと抗原２（ＶＲ４２４６）に対するＦａｂ、及び抗原４（ＶＲ４２４８）に対するＦａｂと抗原２（ＶＲ４２４６）に対するＦａｂの組合せすべてが、抗ＩｇＭで刺激されたＢ細胞においてリン酸−Ａｋｔ発現を阻害することが可能であることを示している。これとは対照的に、抗原３（ＶＲ０９８２）に対するＦａｂと抗原３（ＶＲ０９８２）に対するＦａｂ、及び抗原３（ＶＲ０９８２）に対するＦａｂと抗原４（ＶＲ４２４８）に対するＦａｂの組合せは上昇したレベルのリン酸−Ａｋｔ発現を示した。試験した他のすべての組合せは効果を示さなかった。
【０４１７】
（例６）
ＰＬＣｇ２シグナル伝達の阻害に基づく（Ｂ細胞活性化の尺度として）機能的二価及び二重特異性抗原標的組合せを選択するためのヘテロ二量体的に繋ぎ合わされた二重特異性タンパク質複合体フォーマットの使用
ヒトＰＢＭＣを一般方法１に従って調製した。この期間中、二重特異性又は二価抗体の格子は、１０％仔牛血清及び２ｍＭグルタミンを含有するＤＭＥＭで細胞表面タンパク質抗原３、抗原１、抗原４及び抗原２に対する抗原特異性を有する等モル（２００ｎＭ）量のＦａｂ’−Ａ（Ｆａｂ−ｓｃＦｖ［Ａ−Ｘ］）及びＦａｂ’−Ｂ（Ｆａｂ−ペプチド［Ｂ−Ｙ］）を希釈することにより作製した。この格子は表６に示している。
【０４１８】
Ｆａｂ’Ａ−Ｘ及びＦａｂ’Ｂ−Ｙは一般方法２に従ってインキュベートした。
【０４１９】
次に、細胞は、蛍光的に標識された抗ＣＤ２０抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及びタンパク質上の７５９位の改変されたチロシン残基を認識する蛍光的に標識された抗リン酸ＰＬＣｇ２抗体で染色した。次にプレートは再懸濁し、暗室において室温で１時間インキュベートした。この時間の後、プレートは２回洗浄し２５μｌのフロー緩衝液に再懸濁した。ＣＤ２０及びＰＬＣｇ２の細胞発現はＩｎｔｅｌｌｉｃｙｔ  ＨＴＦＣ（商標）フローサイトメトリーを使用して測定した。
【０４２０】
データ解析ソフトウェアパッケージＦｏｒｅｃｙｔ（商標）（Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ）を使用して、Ｂ細胞は他の細胞集団とは異なると同定され、ＰＬＣｇ２レベルの幾何平均はウェルごとに計算した。次に、データはすべて最大限応答（抗ＩｇＭのみ）マイナスバックグランド（細胞のみ）のパーセンテージ阻害として表した。抗原３、抗原１、抗原４及び抗原２の「抗体」組合せの相対的効果は表６に示されている（↓＝阻害、↑＝刺激及び⇔＝総合効果なし）。矢の数は活性の強度を示している。
【表６】
0006628741.tif 000008
XはscFvでありYはペプチドである。
【０４２１】
このデータはヒストグラムとしても表され（図８）、平均値を示しておりエラーバーは９５％信頼区間である。データは、抗原３（ＶＲ０９８２）に対するＦａｂと抗原２（ＶＲ４２４６）に対するＦａｂ、抗原１（ＶＲ４２４７）に対するＦａｂと抗原２（ＶＲ４２４６）に対するＦａｂ、及び抗原４（ＶＲ４２４８）に対するＦａｂと抗原２（ＶＲ４２４６）に対するＦａｂの組合せすべてが、抗ＩｇＭで刺激されたＢ細胞においてリン酸−ＰＬＣｇ２発現を阻害することが可能であることを示している。これとは対照的に、抗原３（ＶＲ０９８２）に対するＦａｂと抗原３（ＶＲ０９８２）に対するＦａｂ、及び抗原３（ＶＲ０９８２）に対するＦａｂと抗原４（ＶＲ４２４８）に対するＦａｂの組合せは上昇したレベルのリン酸−ＰＬＣｇ２発現を示した。抗原１に対するＦａｂと抗原１に対するＦａｂの組合せは効果を示さなかった。
【０４２２】
（例７）
ＣＤ８６発現の阻害に基づく（Ｂ細胞活性化の尺度として）機能的二価及び二重特異性抗原標的組合せを選択するためのヘテロ二量体的に繋ぎ合わされた二重特異性タンパク質複合体フォーマットの使用
ヒトＰＢＭＣを一般方法１に従って調製した。この期間中、二重特異性又は二価抗体の格子は、１０％仔牛血清及び２ｍＭグルタミンを含有するＤＭＥＭで細胞表面タンパク質抗原３、抗原１、抗原４及び抗原２に対する抗原特異性を有する等モル（２００ｎＭ）量のＦａｂ’−Ｘ（Ｆａｂ−ｓｃＦｖ）及びＦａｂ’−Ｙ（Ｆａｂ−ペプチド）を希釈することにより作製した。この格子は表７に示している。
【０４２３】
Ｆａｂ’Ａ−Ｘ及びＦａｂ’Ｂ−Ｙは９０分間一緒にインキュベートし（３７℃及び５％ＣＯ２環境で）、その後Ｖ字型底９６ウェルプレートにおいて２．５×１０５ＰＢＭＣと混合した。次に、ＰＢＭＣプラス二重特異性又は二価組合せをさらに９０分間一緒にインキュベートした。この時間の後、Ｂ細胞は３７℃で２４時間２００ｎＭのヤギＦ（ａｂ’）２抗ヒトＩｇＭ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）の添加により活性化された。この時間の後、プレートは氷上に置き、氷冷フロー緩衝液（ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ＋０．０１％ＮａＮ３）で１度洗浄した。次に、細胞は蛍光的に標識された抗ＣＤ１９抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及び蛍光的に標識された抗ＣＤ８６抗体で染色し、暗室において氷上で１時間インキュベートした。この時間の後、プレートはさらに２度洗浄し２５μｌのフロー緩衝液に再懸濁した。ＣＤ１９及びＣＤ８６の細胞発現はＩｎｔｅｌｌｉｃｙｔ  ＨＴＦＣ（商標）フローサイトメトリーを使用して測定した。
【０４２４】
データ解析ソフトウェアパッケージＦｏｒｅｃｙｔ（商標）（Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ）を使用して、Ｂ細胞は他の細胞集団とは異なると同定され、ＣＤ８６レベルの幾何平均はウェルごとに計算した。次に、データはすべて最大限応答（抗ＩｇＭのみ）マイナスバックグランド（細胞のみ）のパーセンテージ阻害として表した。抗原３（ＶＲ０９８２）に対するＦａｂ、抗原１（ＶＲ４２４７）に対するＦａｂ、抗原４（ＶＲ４２４８）に対するＦａｂ、及び抗原２（ＶＲ４２４６）に対するＦａｂの組合せの相対的効果は表７に示されている（↓＝阻害、↑＝刺激及び⇔＝総合効果なし）。矢の数は活性の強度を示している。
【表７】
0006628741.tif 000009
XはscFv(52SR4)でありYはペプチド(GCN4)である。
【０４２５】
このデータは、平均値としてヒストグラムとしても示され（図９）、エラーバーは９５％信頼区間である。データは、抗原３（ＶＲ０９８２）に対するＦａｂと抗原２（ＶＲ４２４６）に対するＦａｂ、抗原１（ＶＲ４２４７）に対するＦａｂと抗原２（ＶＲ４２４６）に対するＦａｂ、抗原４（ＶＲ４２４８）に対するＦａｂと抗原２（ＶＲ４２４６）に対するＦａｂ、及び抗原２（ＶＲ４２４６）に対するＦａｂと抗原２（ＶＲ４２４６）に対するＦａｂの組合せすべてが、抗ＩｇＭで刺激されたＢ細胞上でＣＤ８６発現を阻害することが可能であることを示している。これとは対照的に、抗原３（ＶＲ０９８２）に対するＦａｂと抗原３（ＶＲ０９８２）に対するＦａｂ、及び抗原１（ＶＲ４２４７）に対するＦａｂと抗原４（ＶＲ４２４８）に対するＦａｂの組合せは上昇したレベルのＣＤ８６発現を示した。試験したその他の組合せはすべて効果を示さなかった。
【０４２６】
（例８）
抗原１（ＶＲ４２４７）に対するＦａｂと抗原２（ＶＲ４２４６）に対するＦａｂの阻害効果は抗体が二重特異性配向に配置された場合のみ再現することができる
ヒトＰＢＭＣを一般方法１に従って調製した。この期間中、抗体の二重特異性、二価又は混合物の組合せは、１０％仔牛血清及び２ｍＭグルタミンを含有するＤＭＥＭで細胞表面タンパク質抗原１及び抗原２に対する抗原特異性を有する等モル（２００ｎＭ）量のＦａｂ’Ａ−Ｘ（Ｆａｂ−ｓｃＦｖ）及び／又はＦａｂ’Ｂ−Ｙ（Ｆａｂ−ペプチド）を希釈することにより作製した。さらに、単一Ｆａｂ対照（Ｆａｂ’−Ｘ及びＦａｂ’−Ｙ）も加えた。これらの組合せは表８に示している。
【表８】
0006628741.tif 000010
XはscFv(52SR4)でありYはペプチド(GCN4)である。
【０４２７】
Ｆａｂ’Ａ−Ｘ及び／又はＦａｂ’Ｂ−Ｙは一般方法２に従ってインキュベートした。
【０４２８】
次に、細胞は、蛍光的に標識された抗ＣＤ２０抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及びタンパク質上の４７３位の改変されたセリン残基を認識する蛍光的に標識された抗リン酸Ａｋｔ抗体で染色した。次にプレートは再懸濁し、暗室において室温で１時間インキュベートした。この時間の後、プレートはさらに２回洗浄し２５μｌのフロー緩衝液に再懸濁した。ＣＤ２０及びＡｋｔの細胞発現はＩｎｔｅｌｌｉｃｙｔ  ＨＴＦＣ（商標）フローサイトメトリーを使用して測定した。
【０４２９】
データ解析ソフトウェアパッケージＦｏｒｅｃｙｔ（商標）（Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ）を使用して、Ｂ細胞は他の細胞集団とは異なると同定され、Ａｋｔレベルの幾何平均はウェルごとに計算した。次に、データはすべて最大限応答（抗ＩｇＭのみ）マイナスバックグランド（細胞のみ）のパーセンテージ阻害として表した。図１０は、抗原１（ＶＲ４２４７）に対するＦａｂと抗原２（ＶＲ４２４６）に対するＦａｂの二重特異性組合せのみがＢ細胞リン酸−Ａｋｔレベルを調節でき、他のどの組合せもできないことを示している（データは平均値を表しており、エラーバーは９５％信頼区間である）。
【０４３０】
（例９）
抗抗原３（ＶＲ０９８２）及び抗抗原２（ＶＲ４２４６）の阻害効果は抗体が二重特異性配向に配置された場合のみ再現することができる
ヒトＰＢＭＣを一般方法１に従って調製した。この期間中、抗体の二重特異性、二価又は混合物の組合せは、１０％仔牛血清及び２ｍＭグルタミンを含有するＤＭＥＭで細胞表面タンパク質抗原１及び抗原２に対する抗原特異性を有する等モル（２００ｎＭ）量のＦａｂ’−Ｘ（Ｆａｂ−ｓｃＦｖ）及び／又はＦａｂ’−Ｙ（Ｆａｂ−ペプチド）を希釈することにより作製した。これらの組合せは表９に示している。
【表９】
0006628741.tif 000011
XはscFv(52SR4)でありYはペプチド(GCN4)である。
【０４３１】
Ｆａｂ’Ａ−Ｘ及び／又はＦａｂ’Ｂ−Ｙは一般方法２に従ってインキュベートした。
【０４３２】
次に、細胞は一般方法３に従って染色した。
【０４３３】
データ解析ソフトウェアパッケージＦｏｒｅｃｙｔ（商標）（Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ）を使用して、Ｂ細胞は他の細胞集団とは異なると同定され、Ａｋｔ及びＰＬＣｇ２レベルの幾何平均はウェルごとに計算した。次に、データはすべて最大限応答（抗ＩｇＭのみ）マイナスバックグランド（細胞のみ）のパーセンテージ阻害として表した。図１１及び１２は、抗原３と抗原２の二重特異性組合せのみがリン酸化されたＡｋｔ及びＰＬＣｇ２発現を阻害し、抗抗原３（ＶＲ０９８２）と抗抗原２（ＶＲ４２４６）抗体の混合物では阻害しなかったことを示している（データは平均値を表しており、エラーバーは９５％信頼区間である）。
【０４３４】
抗原３と抗原２に対する二重特異性組合せを用いて見られる阻害を確証するため、この組合せを抗抗原３（ＶＲ０９８２）と抗抗原２（ＶＲ４２４６）抗体の混合物と一緒に滴定し、全細胞内ＩｋＢ（シグナル伝達読み取り）及びＣＤ８６（２４時間後の活性化マーカー）の阻害をＢ細胞において測定した。
【０４３５】
図１３で見ることができるように、全ＩｋＢタンパク質のレベルにより測定した場合、抗原−３−Ｘ／抗原−２−Ｙの組合せは抗ＩｇＭ刺激後ＮＦ−ｋＢシグナル活性化を阻害することができたが、抗原−３−Ｘ／抗原−２−Ｘの組合せ（すなわち、単純な非連結混合物として）は阻害できなかった。Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６を使用する４パラメータロジスティック曲線フィットを使用して外挿したＩＣ５０は、７．５ｎＭであった（データは平均値を表し、エラーバーは標準偏差である）。さらに、抗原−３−Ｘ／抗原−２−Ｙの組合せの滴定は、２４時間後のＢ細胞上での抗ＩｇＭ誘導ＣＤ８６発現を阻害することができたが、抗原−３−Ｘ／抗原−２−Ｘの組合せは阻害できなかった（図１４参照）。Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６を使用する４パラメータロジスティック曲線フィットを使用して外挿したＩＣ５０は、１０．３ｎＭであった（データは平均値を表し、エラーバーは標準偏差である）。
【０４３６】
（例１０）
抗抗原４及び抗抗原２の阻害効果は抗体が二重特異性配向に配置された場合のみ再現することができる
ヒトＰＢＭＣを一般方法１に従って調製した。この期間中、抗体の二重特異性、二価又は混合物の組合せは、１０％仔牛血清及び２ｍＭグルタミンを含有するＤＭＥＭで細胞表面タンパク質抗原４及び抗原２に対する抗原特異性を有する等モル（２００ｎＭ）量のＦａｂ’Ａ−Ｘ（Ｆａｂ−ｓｃＦｖ）及び／又はＦａｂ’Ｂ−Ｙ（Ｆａｂ−ペプチド）を希釈することにより作製した。これらの組合せは表１０に示している。
【表１０】
0006628741.tif 000012
XはscFv(52SR4)でありYはペプチド(GCN4)である。
【０４３７】
Ｆａｂ’Ａ−Ｘ及び／又はＦａｂ’Ｂ−Ｙは一般方法２に従ってインキュベートした。次に、細胞は一般方法３に従って染色した。
【０４３８】
データ解析ソフトウェアパッケージＦｏｒｅｃｙｔ（商標）（Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ）を使用して、Ｂ細胞は他の細胞集団とは異なると同定され、Ａｋｔ及びＰＬＣｇ２レベルの幾何平均はウェルごとに計算した。次に、データはすべて最大限応答（抗ＩｇＭのみ）マイナスバックグランド（細胞のみ）のパーセンテージ阻害として表した。
【０４３９】
図１５及び１６は、抗抗原４（ＶＲ４２４８）と抗抗原２（ＶＲ４２４６）の二重特異性組合せのみがリン酸化されたＡｋｔ及びＰＬＣｇ２発現を阻害し、抗抗原４（ＶＲ４２４８）と抗抗原２（ＶＲ４２４６）抗体の混合物では阻害しなかったことを示している（データは平均値を表しており、エラーバーは９５％信頼区間である）。
【０４４０】
抗抗原４（ＶＲ４２４８）と抗抗原２（ＶＲ４２４６）の二重特異性組合せを用いて見られる阻害を確証するため、この組合せをＢ細胞上で抗ＩｇＭ誘導ＣＤ８６発現を測定するアッセイシステムにおいて滴定した。
【０４４１】
図１７で見ることができるように、抗原４−Ｘ／抗原２−Ｙの組合せの滴定は、２４時間後のＢ細胞上での抗ＩｇＭ誘導ＣＤ８６発現を阻害することができた。Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６を使用する４パラメータロジスティック曲線フィットを使用して外挿したＩＣ５０は、４．７ｎＭであった（データは平均値を表し、エラーバーは標準偏差である）。
【０４４２】
（例１１）
二重特異性複合体特徴付け
機能的スクリーニング試薬の精製：機能的スクリーニングフォーマットＦａｂ−Ｘ（Ｆａｂ−ｓｃＦｖ−Ｈｉｓ）及びＦａｂ−Ｙ（Ｆａｂ−ペプチド−Ｈｉｓ）を標準ＣＨＯ発現後以下の通りに精製した。浄化した細胞培養上澄みは１Ｌのステリカップを使用して０．２２μｍ無菌濾過した。ｐＨを測定し必要な場合にはｐＨ７．４に調整した。調製された上澄みは、１０ｍＭのリン酸ナトリウム、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４に平衡化された５ｍｌ  ＨｉｓＴｒａｐニッケルエクセル（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）カラム上に５ｍｌ／分で充填した。カラムは１５ｍＭイミダゾール、１０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４で洗浄し、その後、２５０ｍＭイミダゾール、１０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４で溶出した。溶出に続いて２８０ｎｍでの吸光度及び溶出ピークを収集した。ピーク溶出液はＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷＸＬ上サイズ排除クロマトグラフィーにより分析され；５μｍ、７．８×３００ｍｍカラムは１ｍｌ／分で均一濃度勾配の０．２Ｍリン酸、ｐＨ７．０を用いて展開させ、２８０ｎｍの吸光度により検出した。十分な純度の試料は、１０ｋＤａ分子量カットオフ膜付きのＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５濃縮器を使用して＞１ｍ／ｍｌまで濃縮し、ＰＢＳ  ｐＨ７．４（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）中に透析濾過し、スイングアウトローターにおいて４０００×ｇで遠心分離した。生成物品質が十分でない場合は、ニッケルカラム溶出液を濃縮し、ＰＢＳ、ｐＨ７．４（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）で平衡化されたＸＫ１６／６０又はＸＫ１６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）カラムのいずれかに適用した。カラムは、それぞれ１ｍｌ／分又は２．６ｍｌ／分で均一濃度勾配のＰＢＳ  ｐＨ７．４（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を用いて展開させた。画分を収集し、ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷＸＬ上サイズ排除クロマトグラフィーにより分析され；５μｍ、７．８×３００ｍｍカラムは１ｍｌ／分で均一濃度勾配の０．２Ｍリン酸、ｐＨ７．０を用いて展開させ、２８０ｎｍの吸光度により検出した。選択した画分はプールし、１０ｋＤａ分子量カットオフ膜付きのＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５濃縮器を使用して＞１ｍｇ／ｍｌまで濃縮し、スイングアウトローターにおいて４０００×ｇで遠心分離した。
【０４４３】
溶液中の二重特異性製剤の分析
実験１
精製したＦａｂ−Ｘ（ＶＲ４２４７）及び精製したＦａｂ−Ｙ（ＶＲ４２４８）を１対１モル比で混合し、全タンパク質濃度は５００μｇ／ｍｌにして、環境温度で一晩インキュベートした。対照は、混合している場合と同じ濃度の混合物の個々の部分からなっていた。１００μｌの試料及びそれぞれの対照をＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷＸＬ上に注入し；５μｍ、７．８×３００ｍｍカラムは１ｍｌ／分で均一濃度勾配の０．２Ｍリン酸、ｐＨ７．０を用いて展開させた。検出は２８０ｎｍの吸光度によった（図１８参照）。
【０４４４】
図１８のサイズ排除クロマトグラムは、Ｆａｂ−Ｘ（ＶＲ４２４７）対照は全ピーク面積の９２％の主ピークを有し、保持時間は８．６１０計量分であることを示している。Ｆａｂ−Ｙ（ＶＲ４２４８）対照は全ピーク面積の９４％の主ピークを有し、保持時間は１０．７６７計量分である。Ｆａｂ−Ｘ及びＦａｂ−Ｙ対照について測定された保持時間は、同じ条件下で実行したＢｉｏＲａｄゲル濾過標準（１５１−１９０１）の保持時間から作成した標準曲線を使用することによりそれぞれ９５ｋＤａ及び３５ｋＤａの見かけ分子量に変換された。これらの見かけ分子量は、Ｆａｂ−ｓｃＦｖ及びＦａｂ−ペプチド分子について予想される見かけ分子量と一致している。Ｆａｂ−Ｘ（ＶＲ４２４７）／Ｆａｂ−Ｙ（ＶＲ４２４８）混合物の主ピークは９．２８９計量分の保持時間を有している。これは上記と同じく、１８７ｋＤａの見かけ分子量に変換される。この見かけ分子量は１つのＦａｂ−Ｘ（ＶＲ４２４７）と１つのＦａｂ−Ｙ（ＶＲ４２４８）の対合について予想される見かけの分子量と一致している。この主ピークは全ピーク面積の８４％でもあり、Ｆａｂ−Ｘ（ＶＲ４２４７）とＦａｂ−Ｙ（ＶＲ４２４８）の大半が１対１の二重特異性タンパク質複合体を形成していることが示唆される。主ピークの後で溶出している小さな追加の肩部及びピークは、Ｆａｂ−Ｘ（ＶＲ４２４７）及びＦａｂ−Ｙ（ＶＲ４２４８）開始物質と一致している。
【０４４５】
実験２
精製したＦａｂ−Ｘ（ＶＲ４１３０）とＦａｂ−Ｙ（ＶＲ４１３１）を１対１モル比で混合し、全タンパク質濃度は５００μｇ／ｍｌにした。次に、この混合物のアリコートは、濃度５０μｇ／ｍｌと５μｇ／ｍｌまでＰＢＳ  ｐＨ７．４で希釈した。５００μｇ／ｍｌの混合物に混合している場合と同じ濃度の混合物の個々の部分からなる対照も設定した。混合物及び対照はすべて環境温度で一晩インキュベートした。１００μｌのすべての試料及び対照をＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷＸＬ上に注入し；５μｍ、７．８×３００ｍｍカラムは１ｍｌ／分で均一濃度勾配の０．２Ｍリン酸、ｐＨ７．０を用いて展開させた。検出は２１４ｎｍの吸光度によった（図１９、図２０及び表１１参照）。
【０４４６】
図１９のサイズ排除クロマトグラムは、Ｆａｂ−Ｘ（ＶＲ４１３０）対照が全ピーク面積の９１％の主ピークを有し、保持時間は８．６３４計量分であることを示している。Ｆａｂ−Ｙ（ＶＲ４１３１）対照は全ピーク面積の９７％の主ピークを有し、保持時間は９．３６１計量分である。Ｆａｂ−Ｘ及びＦａｂ−Ｙ対照について測定された保持時間は、同じ条件下で実行したＢｉｏＲａｄゲル濾過標準（１５１−１９０１）の保持時間から作成した標準曲線を使用することによりそれぞれ１０９ｋＤａ及び５５ｋＤａの見かけ分子量に変換された。これらの見かけ分子量は、Ｆａｂ−ｓｃＦｖ及びＦａｂ−ペプチド分子について予想される見かけ分子量と一致している。Ｆａｂ−Ｘ（ＶＲ４１３０）／Ｆａｂ−Ｙ（ＶＲ４１３１）混合物の主ピークは８．０１６計量分の保持時間を有している。これは上記と同じく、１９８ｋＤａの見かけ分子量に変換された。この見かけ分子量は１つのＦａｂ−Ｘ（ＶＲ４１３０）と１つのＦａｂ−Ｙ（ＶＲ４１３１）の対合について予想される見かけの分子量と一致している。この主ピークは全ピーク面積の８２％でもあり、Ｆａｂ−Ｘ（ＶＲ４１３０）とＦａｂ−Ｙ（ＶＲ４１３１）の大半が１対１の複合体を形成していることが示唆される。主ピークの後で溶出している２つの小さなピークは、Ｆａｂ−Ｘ（ＶＲ４１３０）及びＦａｂ−Ｙ（ＶＲ４１３１）開始物質と一致している。
【０４４７】
図２０のサイズ排除クロマトグラムは、５００μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ及び５μｇ／ｍｌ濃度でのＦａｂ−Ｘ（ＶＲ４１３０）／Ｆａｂ−Ｙ（ＶＲ４１３１）１対１混合物についてである。トレースはすべて、類似する保持時間並びに類似する相対的ピーク高及び面積を有する試料間で対応するピークについて類似している。パーセントピーク面積を表１１に要約しており、それぞれのピークの％は混合物を希釈してもかなり一定のままである。これは、Ｆａｂ−Ｘ／Ｆａｂ−Ｙ１対１複合体が試験されたすべての濃度で複合体として残っていることを示している。Ｆａｂ−ＸとＦａｂ−Ｙの７５％は、複合体では４０ｎＭの濃度に相当する５μｇ／ｍｌまで混合物を希釈した場合でも１対１複合体として存在している。
【表１１】
0006628741.tif 000013
【０４４８】
したがって、これらの実験の結果は、高割合のＦａｂ−ＸとＦａｂ−Ｙの融合タンパク質が所望の二重特異性複合体を形成しており、残存する単量体は最小限の割合であり、ホモ二量体形成の証拠はないことを示している。
【０４４９】
（例１２）
新規の二重特異性抗体標的を同定するためのヘテロ二量体的に繋ぎ合わされたタンパク質複合体の大きなパネルの格子スクリーニング
序論：前の例における二重特異性フォーマット及びスクリーニング法が首尾よく確証されたことを受けて、スクリーニングを多数の抗原対にまで広げた。Ｂ細胞上で発現される２３の異なる抗原に対する抗体可変（Ｖ）領域対のパネルを作製した。Ｆａｂ−Ｋｄ−Ｆａｂ［すなわち、Ａ−Ｘ：Ｙ−Ｂ  Ａ及びＢはＦａｂ断片］フォーマットを使用して、３１５の異なる抗原対組合せのそれぞれの複数のＶ領域組合せを表すヘテロ二量体的に繋ぎ合わされたタンパク質複合体の格子を形成した。これらの組合せは、二重特異性抗体を用いた介入治療のための新規の標的対を選択するため、ハイスループットフローサイトメトリーアッセイにおいてＢＣＲ（Ｂ細胞受容体）シグナル伝達を調節するその能力についてスクリーニングした。
【０４５０】
免疫化：選択された抗原をコードするＤＮＡは、遺伝子合成又は商業的供給源により入手し、強力な構成的プロモーターを備えた発現ベクター中にクローニングした。次に、社内電気穿孔システムを使用して、プラスミドＤＮＡをＲａｂ−９ウサギ線維芽細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−１４１４（商標））にトランスフェクトした。２４時間後、細胞はフローサイトメトリーにより抗原発現について調べ、使用するまで液体窒素中にアリコートで凍結した。同じ細胞上での同時発現、又は単一若しくは複数をトランスフェクトされた細胞の混合物を作ることによりウサギあたり最大６抗原を免疫化した。ウサギは３用量の細胞で免疫化した。
【０４５１】
抗体発見：Ｂ細胞培養物はZublerら(1985)により記載された方法に類似する方法を使用して調製した。手短に言えば、免疫化ウサギからの脾臓又はＰＢＭＣ由来Ｂ細胞を、１０％ＦＣＳ（ＰＡＡ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ｌｔｄ）、２％ＨＥＰＥＳ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、１％Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン溶液（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）、０．１％βメルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）、３％活性化脾細胞培養上澄み及びガンマ線照射突然変異ＥＬ４マウス胸腺腫細胞（５×１０４／ウェル）を補充した２００μｌ／ウェル  ＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を備えたバーコード化９６ウェル組織培養プレートにおいてウェル当たりおおよそ２０００〜５０００細胞の密度で、５％ＣＯ２環境において３７℃で７日間培養した。
【０４５２】
Ｂ細胞培養上澄み中の抗原特異的抗体の存在は、ウサギを免疫化するのに用いた抗原を同時トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞を使用する均一蛍光ベースの結合アッセイを使用して判定した。スクリーニングは、バーコード化９６ウェル組織培養プレート由来の１０μｌの上澄みを、標的抗原をトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞を含有する（おおよそ３０００細胞／ウェル）バーコード化３８４ウェル黒壁アッセイプレートにＭａｔｒｉｘ  Ｐｌａｔｅｍａｔｅリキッドハンドラを使用して移すことを含んでいた。結合はヤギ抗ウサギＩｇＧ  Ｆｃγ特異的Ｃｙ−５コンジュゲート（Ｊａｃｋｓｏｎ）を用いて明らかにした。プレートはＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ８２００細胞検出システム上で読み取った。
【０４５３】
一次スクリーニングに続いて、陽性上澄みはＡｖｉｓｏ  Ｏｎｙｘ  ｈｉｔ−ｐｉｃｋｉｎｇ  ｒｏｂｏｔを使用して９６ウェルバーコード化マスタープレート上にまとめ、細胞培養プレート中のＢ細胞は−８０℃で凍結した。次に、マスタープレートは、抗原で別々にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞及び抗原供給源として組換えタンパク質で被覆したＳｕｐｅｒａｖｉｄｉｎ（商標）ビーズ（Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）上での均一蛍光ベースの結合アッセイにおいてスクリーニングした。これはウェルごとの抗原特異性を判定することが目的であった。
【０４５４】
対象のウェルの選択からの抗体可変領域遺伝子の回収を可能にするために、デコンボリューションを実施してＢ細胞の不均一集団を含有する所与のウェルにおいて抗原特異的Ｂ細胞の同定を可能にした。これは蛍光フォーカス法（Clargo et al., 2014.Mabs 2014 Jan 1: 6(1) 143-159; EP1570267B1）を使用して達成した。手短に言えば、陽性ウェル由来の免疫グロブリン分泌Ｂ細胞を、標的抗原をトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞又はビオチン化標的抗原及びヤギ抗ウサギＦｃγ断片特異的ＦＩＴＣコンジュゲート（Ｊａｃｋｓｏｎ）の１対１２００最終希釈で被覆したストレプトアビジンビーズ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）のいずれかと混合した。３７℃での１時間の静置インキュベーション後、抗原特異的Ｂ細胞はそのＢ細胞を取り囲んでいる蛍光ハローの存在のために同定することができた。いくつかのこれらの個々のＢ細胞クローンは、Ｏｌｙｍｐｕｓ顕微鏡を使用して同定されたが、次に、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆマイクロマニュピレーターを用いて選び取り、ＰＣＲチューブ内に蓄積した。蛍光フォーカス法を使用して、直接免疫化ウサギの骨髄由来のＢ細胞の不均一集団からも抗原特異的Ｂ細胞を同定した。
【０４５５】
抗体可変領域遺伝子は、重及び軽鎖可変領域特異的プライマーを使用して逆転写（ＲＴ）ＰＣＲにより単細胞から回収した。２ラウンドのＰＣＲを実施し、３’及び５’末端に制限部位を組み込んでいるネステッド二次ＰＣＲにより可変領域をマウスＦａｂ−Ｘ及びＦａｂ−Ｙ（ＶＨ）又はマウスカッパ（ＶＬ）哺乳動物発現ベクターにクローニングすることができた。Ｆａｂ−Ｘ及びＦａｂ−Ｙ発現ベクターのための重及び軽鎖構築物は、Ｆｅｃｔｉｎ２９３（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してＨＥＫ２９３細胞に又はＥｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してＥｘｐｉ２９３細胞に同時トランスフェクトし、組換え抗体が容積５ｍｌの６ウェル組織培養プレートで発現された。発現の５〜７日後、上澄みを収穫した。上澄みは、抗原をトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞及び組換えタンパク質で被覆したＳｕｐｅｒａｖｉｄｉｎ（商標）ビーズ（Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）又は抗原トランスフェクトＨＥＫ細胞上での均一蛍光ベースの結合アッセイにおいて試験した。これはクローン化された抗体の特異性を確認するために実行した。
【０４５６】
小規模ＦａｂＡ−Ｘ及びＦａｂＢ−Ｙの作製（小規模（５０ｍＬ）Ｅｘｐｉ２９３トランスフェクション）
Ｅｘｐｉ２９３細胞はＥｘｐｉ２９３（商標）発現培養液において、最終濃度０．５×１０６生細胞／ｍＬまでルーチン的に継代し、軌道振盪インキュベーター（Ｍｕｌｔｉｔｒｏｎ、Ｉｎｆｏｒｓ  ＨＴ）において１２０ｒｐｍで８％ＣＯ２及び３７℃でインキュベートした。
【０４５７】
トランスフェクションの日、自動細胞計測器（Ｖｉ−ＣＥＬＬ、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して細胞生存率及び濃度を測定した。最終細胞濃度２．５×１０６生細胞／ｍＬを達成するため、適切な容積の細胞懸濁系を無菌２５０ｍＬエルレンマイヤー振盪フラスコに添加し、５０ｍＬトランスフェクションごとに新鮮な予熱したＥｘｐｉ２９３（商標）発現培養液を添加することにより４２．５ｍＬの容積まで養育した。
【０４５８】
トランスフェクションごとに脂質ＤＮＡ複合体を調製するため、全体で５０μｇの重鎖及び軽鎖プラスミドＤＮＡを全容積２．５ｍＬまでＯｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）Ｉ培養液（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に希釈し、１３５μＬのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を全容積２．５ｍＬまでＯｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）Ｉ培養液に希釈した。全ての希釈物を穏やかに混合し室温で長くても５分間インキュベートし、その後それぞれのＤＮＡ溶液をそれぞれの希釈したＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３試薬に添加して、全容積５ｍＬを得た。ＤＮＡ−ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３試薬混合物は穏やかに混合し、室温で２０〜３０分間インキュベートしてＤＮＡ−ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３試薬複合体を形成させた。
【０４５９】
ＤＮＡ−ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３試薬複合体インキュベーションを終わらせた後、５ｍＬのＤＮＡ−ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３試薬複合体をそれぞれの振盪フラスコに添加した。振盪フラスコは軌道振盪インキュベーター（Ｍｕｌｔｉｔｒｏｎ、Ｉｎｆｏｒｓ  ＨＴ）において１２０ｒｐｍで８％ＣＯ２及び３７℃でインキュベートした。
【０４６０】
トランスフェクションのおおよそ１６〜１８時間後、２５０μＬのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３トランスフェクションエンハンサー１（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及び２．５ｍＬのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３トランスフェクションエンハンサー２（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）をそれぞれの振盪フラスコに添加した。
【０４６１】
細胞培養物はトランスフェクション７日後に収穫した。細胞は５０ｍＬ回転チューブ（Ｆａｌｃｏｎ）に移し、４０００ｒｐｍで３０分間回転させ、その後０．２２μｍ  Ｓｔｅｒｉｃｕｐ（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通して無菌濾過した。浄化し無菌濾過した上澄みは４℃で保存した。最終発現レベルはプロテインＧ−ＨＰＬＣにより判定した。
【０４６２】
小規模（５０ｍｌ）精製：Ｆａｂ−ＸとＦａｂ−Ｙの両方を、小規模真空ベースの精製システムを使用する親和性捕捉により別々に精製した。手短に言えば、５０ｍｌの培養上澄みを０．２２μｍ無菌濾過し、その後５００μＬのＮｉセファロースビーズ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を添加した。次に、上澄みビーズ混合物は約１時間転がし、その後上澄みは吸引を適用して取り除いた。次に、ビーズはＷａｓｈ１（５０ｍＭリン酸ナトリウム、１Ｍ  ＮａＣｌ  ｐＨ６．２）及びＷａｓｈ２（０．５Ｍ  ＮａＣｌ）で洗浄した。溶出は５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０＋１Ｍ  ＮａＣｌを用いて実施した。溶出画分はＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ）、ｐＨ７．４に緩衝液交換し０．２２μｍ濾過した。最終プールはＡ２８０スキャン、ＳＥ−ＵＰＬＣ（ＢＥＨ２００法）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元及び非還元）により、内毒素ではＰＴＳ  Ｅｎｄｏｓａｆｅシステムを使用してアッセイした。
【０４６３】
スクリーニングアッセイ
ドナーＰＢＭＣを３７℃に設定した水浴を使用して急速解凍し、５０ｍｌＦａｌｃｏｎチューブに慎重に移した。次に、ＰＢＭＣは、浸透圧ショックを最小化するためアッセイ培養液で５ｍｌまで液滴で希釈した。次に、細胞は２０ｍｌまで慎重に希釈し、その後最終培養液希釈液を添加して、容積を５０ｍｌにした。次に、細胞は５００ｇで５分間回転させ、その後上澄みを取り除いて細胞を１ｍｌ培養液に再懸濁した。次に、細胞は計数し１．６６×１０６細胞／ｍｌまで希釈し、その後ウェル当たり３０μｌをＶ字型底ＴＣプレートに分注し、最終アッセイ濃度５．０×１０４細胞／ウェルを与える。次に、細胞プレートは必要になるまで３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中にカバーして保存し、最小限１時間休ませる。
【０４６４】
Ｆａｂ−Ｘ及びＦａｂ−Ｙ試薬はアッセイ培養液において、等モル比、最終アッセイ濃度の５倍で混合し、３７℃、５％ＣＯ２で９０分間インキュベートした。試料は９６ウェルＵ字型底ポリプロピレンプレートにおいて調製し、インキュベーション中はカバーした。
【０４６５】
１０μｌの５×Ｆａｂ−ＫＤ−Ｆａｂ混合物を、細胞を含有する適切な試験ウェルに添加し、１０００ｒｐｍで３０秒間振盪することにより混合し、その後３７℃、５％ＣＯ２で９０分間インキュベートした。
【０４６６】
次に、細胞は１０μｌの抗ヒトＩｇＭで刺激した。刺激の最終アッセイ濃度は、アッセイパネル読み出し情報により変動し、３つの抗体カクテルＡ、Ｂ及びＣ（下で詳述）は、５０μｇ／ｍｌ（カクテルＡ及びＣ）又は２５μｇ／ｍｌ（カクテルＢ）のいずれかの最終アッセイ濃度で刺激した。次に、アッセイプレートは１０００ｒｐｍで３０秒間穏やかに混合し、その後３７℃、５％ＣＯ２で５分間（抗体カクテルＡ及びＣ）又は２分間（抗体カクテルＢ）インキュベートした。アッセイは、１５０μｌの氷冷ＢＤ  ＣｙｔｏＦｉｘをすべてのウェルの添加することにより停止し、室温で１５分間インキュベートした。次に、固定された細胞は５００ｇで５分間回転させて細胞をペレット状にし、ＢｉｏＴｅｋ  ＥＬｘ４０５プレート洗浄機を使用して上澄みを除去させた。ペレットはプレートを２４００ｒｐｍで３０秒間ボルテックスすることにより再懸濁した。次に、細胞は、１００μｌの氷冷ＢＤ細胞透過処理緩衝液ＩＩＩを３０分間添加することにより４℃で透過処理した。次に、細胞は１００μｌのＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し５００ｇで５分間回転させた。上澄みはＥＬｘ４０５により再び取り除き、その後それを使用して残っている透過処理緩衝剤はいずれも洗い流すために２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液を迅速に分注した。細胞は５００ｇで再び回転させ、上澄みは反転により取り除いた。先行する回転ステップ中、抗体カクテルはＦＡＣＳ緩衝液で調製し、光を遮断したままにした。次に、細胞はボルテックスする（２４００ｒｐｍ、３０秒間）ことにより再懸濁し、その後２０μｌの抗体カクテルをすべてのウェルの添加し、プレートは１０００ｒｐｍで３０秒間振盪させた。次に、細胞は暗所において室温で６０分間インキュベートした。
【０４６７】
次に、細胞は５００ｇの回転をかけて２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、それぞれのステップ後に上澄みを取り除いた。最後に、細胞は２４００ｒｐｍで３０秒間ボルテックスすることにより再懸濁し、その後最終２０μｌのＦＡＣＳ緩衝液を添加した。次に、プレート（単数又は複数）はＩｎｔｅｌｌｉｃｙｔ  ＨＴＦＣ／ｉＱｕｅ装置上で読み取った。
ＦＡＣＳ緩衝液＝ＰＢＳ＋１％  ＢＳＡ＋０．０５％  ＮａＮ３＋２ｍＭ  ＥＤＴＡ
抗体カクテルＡ＝１対２  ＣＤ２０  ＰｅｒＣｐ−Ｃｙ５．５（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）＋１対５  ＰＬＣｇａｎｍａ２  ＡＦ８８＋１対１０  Ａｋｔ  ＡＦ６４７＋１対５０  ＥＲＫ１／２  ＰＥ（ＦＡＣＳ緩衝液で希釈）。
抗体カクテルＢ＝１対２  ＣＤ２０  ＰｅｒＣｐ−Ｃｙ５．５（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）＋１対５  Ｓｙｋ  ＰＥ＋１対５  ＢＬＮＫ  ＡＦ６４７（ＦＡＣＳ緩衝液で希釈）
抗体カクテルＣ＝１対５  ＣＤ２０  ＰｅｒＣｐ−Ｃｙ５．５（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）＋１対５  ＰＬＣｇａｎｍａ２  ＡＦ４８８＋１対１０  Ａｋｔ  ＡＦ６４７＋１対５  Ｓｙｋ  ＰＥ（ＦＡＣＳ緩衝液で希釈）
【表１２】
0006628741.tif 000014
Fab-X+Fab-Y組合せは、抗体カクテルA及びB又はC単独のいずれかを用いてスクリーニングされた。スクリーニングはすべて2つの異なる血液ドナー由来の錐体細胞上で行った。データは市販のソフトウェアツールを使用して取得し評価した。総数で2500のFab-X+Fab-Y組合せは315の異なる抗原組合せまでスクリーニングした。
【０４６８】
結果
それぞれのＦａｂ−Ｋｄ−Ｆａｂ［すなわち、Ａ−Ｘ：Ｙ−ＢでＡ及びＢはＦａｂ断片］組合せによるＢＣＲシグナル伝達カスケードタンパク質のリン酸化の誘導のパーセンテージ阻害を計算し、この例では、Ｂ細胞機能を阻害する抗原の新たな組合せを探して、陽性組合せの基準を、Ｖ領域の少なくとも１つの組合せによる少なくとも２つのリン酸読み取りの少なくとも３０％阻害として設定した。この閾値に従えば、試験した３１５から１１の新たな抗原対組合せが必要とされる基準を満たした。これは３．５％のヒット率を表しており、所望の活性の組合せを見つけるためには多数の組合せをスクリーニングするのが重要であることを実証している。
【０４６９】
図２１〜２３は抗原格子クロス特異性についてのデータを示している。値はそれぞれＳｙｋ、ＰＬＣｇ２及びＡｋｔのリン酸化のパーセント阻害（活性化に対してマイナスの値）であり、評価された複数のＶ領域組合せの平均を表している。３１５の異なる抗原組合せを試験し、図に示すように、抗体の異なる組合せによるＢＣＲシグナル伝達に対する効果は強い阻害、例えば、Ｆａｂ−Ｙ上の抗原３及び４と組み合わせたＦａｂ−Ｘ上の抗原２（リン酸Ｓｙｋの６９．６６％及び７０．４％阻害、図２１）から活性化、例えば、Ｘ上の抗原６とＹ上の抗原１１（マイナス１１８．１０％リン酸Ｓｙｋ、図２１）まで著しく変化した。
【０４７０】
図２１〜２３に表される平均％値を表すそれぞれのデータポイントは、図２４ではＦａｂ−Ｘ上の抗原２とＦａｂ−Ｙ上の抗原３について示されている。この場合、異なる抗体Ｖ領域の２３の異なる組合せを評価した。同じ抗原組合せであるが配向が別である、すなわち、Ｆａｂ−Ｙ上の抗原２とＦａｂ−Ｘ上の抗原３は図２５に示されている。この場合、異なる抗体Ｖ領域の９つの異なる組合せを評価した。Ｖ領域すべてが阻害を示しているが、有利なことに、この方法は最適Ｖ領域組合せの選択においても使用することが可能である。
【０４７１】
同様に、図２１〜２３に表される平均％値を表すそれぞれのデータポイントは、図２６ではＦａｂ−Ｘ上の抗原組合せ２とＦａｂ−Ｙ上の抗原４について示されている。この場合、異なる抗体Ｖ領域の１０の異なる組合せを評価した。同じ抗原組合せであるが配向が別である、すなわち、Ｆａｂ−Ｙ上の抗原２とＦａｂ−Ｘ上の抗原４は図２７に示されている。この場合、異なる抗体Ｖ領域の６つの異なる組合せを評価した。再び、Ｖ領域すべてが阻害を示しているが、最適Ｖ領域組合せは本方法を使用して同定し選択することが可能である。
【０４７２】
（例１３）
ＦａｂＡ−Ｘ：Ｙ−ＦａｂＢ格子スクリーニングがタンパク質精製に頼らなくても新規の二重特異性抗体標的を同定できるかどうかを評価するための一過性に発現されたヘテロ二量体的に繋ぎ合わされたタンパク質複合体の評価
序論：Ｆａｂ−Ｋｄ−Ｆａｂ［ＦａｂＡ−Ｘ：Ｙ−ＦａｂＢ］フォーマット及びヘテロ二量体的に繋ぎ合わされたタンパク質複合体格子スクリーニングを使用して同定された二重特異性抗体としてのＢ細胞シグナル伝達を阻害する２つの異なる抗原、２及び３に対するＶ領域はＦａｂＡ−Ｘ及びＦａｂＢ−Ｙとして一過性に発現された。一過性に発現され（それに続く精製なしで）及び精製されたＦａｂＡ−ＸとＦａｂＢ−Ｙ組合せの活性を比較して、精製された成分の代わりに一過性発現の直接の生成物を用いて格子スクリーニングを行うことが可能かどうかを評価した。
【０４７３】
免疫化：抗原発現細胞の調製及びウサギの免疫化は、例１２と同じように実行した。
【０４７４】
抗体発見
Ｂ細胞培養物は例１２に記載されるのと同じように調製した。
【０４７５】
Ｂ細胞培養上澄み中の抗原特異的抗体のスクリーニング及び抗原特異的Ｂ細胞の同定のためのデコンボリューションステップは例１２に記載されるのと同じように決定した。
【０４７６】
抗体可変領域遺伝子は、重及び軽鎖可変領域特異的プライマーを使用する逆転写（ＲＴ）ＰＣＲにより単細胞から回収した。２ラウンドのＰＣＲを実施し、３’及び５’末端に制限部位を組み込んでいるネステッド二次ＰＣＲにより可変領域をマウスＦａｂ−Ｘ及びＦａｂ−Ｙ（ＶＨ）又はマウスカッパ（ＶＬ）哺乳動物発現ベクターにクローニングすることができた。次に、増幅された可変領域、ヒトＣＭＶプロモーター断片及びウサギガンマ１重定常又はウサギカッパ定常断片を組み合わせると別々の重及び軽転写的に活性なＰＣＲ（ＴＡＰ）断片を作製することができる三次ＰＣＲを実施した。これらのＤＮＡ断片は、２９３Ｆｅｃｔｉｎ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してＨＥＫ２９３細胞において又はＥｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してＥｘｐｉ２９３細胞においてウサギ完全長ＩｇＧ抗体の組換え発現のために直接使用した。次に、こうして得られた組換え抗体は、抗原をトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞及び組換えタンパク質で被覆したＳｕｐｅｒａｖｉｄｉｎ（商標）ビーズ（Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）上での均一蛍光ベースの結合アッセイを使用して抗原結合についてスクリーニングした。ＴＡＰトランジエントで特異性を確かめた後、抗体遺伝子はＦａｂ−Ｘ及びＦａｂ−Ｙ発現ベクター内にクローニングした。重及び軽鎖構築物は、Ｆｅｃｔｉｎ２９３（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してＨＥＫ２９３細胞に又はＥｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してＥｘｐｉ２９３細胞に同時トランスフェクトし、組換え抗体は５ｍｌの容積の６ウェル組織培養プレートにおいて発現させた。５〜７日発現後、上澄みを収穫した。上澄みは、抗原をトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞及び組換えタンパク質で被覆したＳｕｐｅｒａｖｉｄｉｎ（商標）ビーズ（Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）又は抗原トランスフェクトＨＥＫ細胞上での均一蛍光ベースの結合アッセイにおいて試験した。これはクローン化された抗体の特異性を確認するために実行した。
【０４７７】
Ｆａｂ−Ｘ及びＦａｂ−Ｙを含有する一過性上澄みの作製
例１２に記載されるのと同じＥｘｐｉ２９３トランスフェクション法を使用してＦａｂ−Ｘ及びＦａｂ−Ｙを含有する一過性上澄みを作製した。
【０４７８】
精製されたＦａｂ−Ｘ及びＦａｂ−Ｙの作製
浮遊ＣＨＯＳＸＥ細胞を、２ｍＭ（１００×）ｇｌｕｔａｍｘを補充したＣＤＣＨＯ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に前順応させた。細胞は、振盪インキュベーター器（Ｋｕｎｅｒ  ＡＧ、Ｂｉｒｓｆｅｌｄｅｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）上、１４０ｒｐｍで撹拌して対数増殖期に維持し、８％ＣＯ２を補充して３７℃で培養した。
【０４７９】
トランスフェクションに先立って、細胞数及び生存率をＣＥＤＥＸ細胞計数器（Ｉｎｎｏｖａｔｉｓ  ＡＧ．Ｂｉｅｌｅｆｅｌｄ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して決定し、必要量の細胞（２×１０８細胞／ｍｌ）を遠心コニカルチューブに移して１４００ｒｐｍで１０分間回転させた。ペレット状細胞は無菌Ｅａｒｌｓ平衡塩類溶液に再懸濁させ、１４００ｒｐｍでさらに１０分間回転させた。上澄みは捨てペレットは所望の細胞密度まで再懸濁した。
【０４８０】
最終濃度２×１０８細胞／ｍｌ混合で４００μｇ及び８００μｌのベクターＤＮＡはキュベット（Ｂｉｏｒａｄ）にピペットを使って入れ、社内電気穿孔システムを使用して電気穿孔した。
【０４８１】
トランスフェクトされた細胞は、２ｍＭ  ｇｌｕｔａｍｘ及び抗生物質有糸分裂阻害剤（１００×）溶液（５００中１）で強化したＰｒｏＣＨＯ５培養液を含有する１×３Ｌエルレンマイヤーフラスコに直接移し、細胞は３７℃、５％ＣＯ２及び１４０ｒｐｍに設定したＫｕｈｎｅｒ振盪インキュベーター器で振盪しながら培養した。栄養補助剤２ｇ／ＬのＡＳＦ（味の素）をトランスフェクションの２４時間後に添加し、さらに１３日間の培養のために温度を３７℃まで下げた。４日目、３ｍＭの酪酸ナトリウム（ｎ−酪酸ナトリウム塩、Ｓｉｇｍａ  Ｂ−５８８７）を培養物に添加した。
【０４８２】
１４日目、培養物はチューブに移し、４０００ｒｐｍでの３０分間の遠心分離後上澄みを細胞から分離した。保持した上澄みは０．２２μｍのＳＡＲＴＯＢＲＡＮ（登録商標）Ｐ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、続いて０．２２μｍのガンマゴールド濾過器を通してさらに濾過した。最終発現レベルはプロテインＧ−ＨＰＬＣにより決定した。
【０４８３】
Ｆａｂ−Ｘ及びＦａｂ−Ｙは、ＡＫＴＡ  Ｘｐｒｅｓｓシステム及びＨｉｓＴｒａｐ  Ｅｘｃｅｌ前充填ニッケルカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して親和性捕捉により精製した。培養上澄みは０．２２μｍの無菌濾過を行い、ｐＨは必要な場合にはカラムに充填する前に弱酸又は弱塩基で中性に調整した。１５〜２５ｍＭイミダゾールを含有する二次洗浄ステップを使用して、弱い結合の宿主細胞タンパク質／非特異的Ｈｉｓ結合物をいずれもニッケル樹脂から移動させた。溶出は、１０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４＋１Ｍ  ＮａＣｌ＋２５０ｍＭイミダゾールを用いて実施し、２ｍｌの画分を収集した。１カラム容積を溶出に入れ、系は１０分間休止させて、溶出ピークを締め、したがって、全溶出量は減少する。一番きれいな画分をプールし、ＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ）、ｐＨ７．４に緩衝液交換し０．２２μｍの濾過を行った。最終プールはＡ２８０  Ｓｃａｎ、ＳＥ−ＨＰＬＣ（Ｇ３０００法）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元された及び非還元の）により、内毒素についてはＰＴＳ  Ｅｎｄｏｓａｆｅシステムを使用してアッセイした。
【０４８４】
機能アッセイ
活性化マーカーアッセイ：抗原２特異的Ｆａｂ’−Ｙ及び抗原３特異的Ｆａｂ’−Ｘは、精製されたものでも一過性上澄み中でも、等モル濃度で６０分間（３７℃及び５％ＣＯ２環境で）一緒にインキュベートした。組合せは、１対４連続希釈で開始モル濃度１８５ｎＭから滴定した。モックの上澄みもインキュベートし、原液から滴定した。Ｖ字型底９６ウェルプレートにおいて、１．５×１０５ＰＢＭＣをウェルに添加し、それに滴定されたＦａｂ’−Ｘ及びＦａｂ’−Ｙ組合せ又はモックの上澄みを添加した。次に、組合せ及び細胞はさらに９０分間一緒にインキュベートした。この時間の後、Ｂ細胞は、３７℃及び５％ＣＯ２で２４時間、１２．５μｇ／ｍＬのヤギＦ（ａｂ’）２抗ヒトＩｇＭ（Ｓｏｕｔｈｅｒｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を添加することにより活性化した。
【０４８５】
ウェルに１００μＬの氷冷ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ＋０．１％ＮａＮ３＋２ｍＭ  ＥＤＴＡ）を添加し、プレートは密封しておおよそ１５分間湿った氷でカバーし、その後５００×ｇで、４℃、５分間遠心分離した。過剰な上澄みは細胞ペレットから破棄し、プレートは２０００ｒｐｍで３０秒間振盪させた。
【０４８６】
次に、細胞は蛍光的に標識された抗ＣＤ１９、抗ＣＤ２０及び抗ＣＤ７１抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）のカクテルで染色した。プレートは手短に振盪し、暗所において湿った氷上で１時間インキュベートした。この時間の後、プレートは２度洗浄し、２０μＬのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。ＣＤ１９、ＣＤ２０及びＣＤ７１の細胞発現はＩｎｔｅｌｌｉｃｙｔ  ｉＱＵＥ（登録商標）スクリーナーフローサイトメーターを使用して測定した。
【０４８７】
データ解析ソフトウェアパッケージＦｏｒｅｃｙｔ（商標）（Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ）を使用して、Ｂ細胞は他の細胞集団とは異なると同定され、ＣＤ７１レベルの幾何平均はウェルごとに計算した。次に、データはすべて最大限応答（抗ＩｇＭのみ）マイナスバックグランド（細胞のみ）のパーセンテージ阻害として表した。
【０４８８】
ＰｈｏｓＦｌｏｗアッセイ：抗原２特異的Ｆａｂ’−Ｙ及び抗原３特異的Ｆａｂ’−Ｘは、精製されたものでも一過性上澄み中でも、等モル濃度で６０分間（３７℃及び５％ＣＯ２環境で）一緒にインキュベートした。組合せは、１対４連続希釈で開始モル濃度１８５ｎＭから滴定した。モックの上澄みもインキュベートし、原液から滴定した。Ｖ字型底９６ウェルプレートにおいて、５．０×１０４ＰＢＭＣをウェルに添加し、それに滴定されたＦａｂ’−Ｘ及びＦａｂ’−Ｙ組合せ又はモックの上澄みを添加した。次に、組合せ及び細胞はさらに９０分間一緒にインキュベートした。この時間の後、Ｂ細胞は、３７℃及び５％ＣＯ２で１５分間、２５μｇ／ｍＬのヤギＦ（ａｂ’）２抗ヒトＩｇＭ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を添加することにより活性化した。次に、シグナル伝達反応は等容積のＣｙｔｏｆｉｘ緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を添加することにより停止した。次に、プレートは１５分間室温に放置し、その後５００×ｇで、５分間遠心分離した。過剰な上澄みは細胞ペレットから破棄し、ペレットはＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ＋０．０１％ＮａＮ３＋２ｍＭ  ＥＤＴＡ）に再懸濁して、もう１度洗浄した。次に、細胞は氷冷Ｐｅｒｍ緩衝液ＩＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に３０分間再懸濁し、その後フロー緩衝液で２度洗浄した。
【０４８９】
次に、細胞は蛍光的に標識された抗ＣＤ２０抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及び保存された二重リン酸化部位ｐＴ１８０／ｐＹ１８２を認識する抗リン酸化ｐ３８抗体で染色した。次に、プレートは再懸濁し、暗所において室温で１時間インキュベートした。この時間の後、プレートはさらに２度洗浄し、２０μＬのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。ＣＤ２０及びホスホ−ｐ３８の細胞発現はＩｎｔｅｌｌｉｃｙｔ  ｉＱＵＥ（登録商標）フローサイトメトリーを使用して測定した。
【０４９０】
データ解析ソフトウェアパッケージＦｏｒｅｃｙｔ（商標）（Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ）を使用して、Ｂ細胞は他の細胞集団とは異なると同定され、ｐ３８レベルの幾何平均はウェルごとに計算した。次に、データはすべて最大限応答（抗ＩｇＭのみ）マイナスバックグランド（細胞のみ）のパーセンテージ阻害として表した。
【０４９１】
結果
活性化マーカーアッセイ：図２８において見られるように、データは、抗原３と抗原２の組合せが、精製されたものでも一過性上澄み由来でも、抗ＩｇＭで刺激されたＢ細胞上でＣＤ７１発現を阻害できることを示している。
【０４９２】
ＰｈｏｓＦｌｏｗアッセイ：図２９のデータは、抗原３と抗原２の組合せが、精製されたものでも一過性上澄み由来でも、抗ＩｇＭで刺激されたＢ細胞においてリン酸化ｐ３８を阻害できることを示している。
【０４９３】
精製に頼らずに一過性に発現された培養物に直接由来する本発明の二重特異性複合体を構築することができる驚くべき能力のおかげで、精製された成分を使用した場合よりも二重特異性複合体のはるかにハイスループットなスクリーニングを達成することができる。
【０４９４】
（例１４）
最適抗原３抗体Ｖ領域を選択するためのヘテロ二量体的に繋ぎ合わされたタンパク質複合体中の精製された抗抗原２Ｆａｂ−Ｙと一緒のＦａｂ−Ｘとしての抗原３に対する一過性に発現されたＶ領域のスクリーニング
序論：抗原２特異的Ｖ領域と組み合わせた二重特異性抗体としてＢ細胞シグナル伝達を阻害する抗原３に対する新しいＶ領域は、ヘテロ二量体的に繋ぎ合わされたタンパク質複合体の格子スクリーニングを使用して同定した。抗原３  Ｖ領域は、Ｆａｂ−Ｘとして一過性に発現され、精製した抗抗原２  Ｆａｂ−Ｙと組み合わされた。Ｂ細胞シグナル伝達の活性化の阻害を測定してもっとも強力な抗原３及び抗原２  Ｖ領域を選択した。
【０４９５】
抗原発現細胞の調製及びウサギの免疫化は例１２に記載されるのと同じように実行した。
【０４９６】
抗体発見：Ｂ細胞培養物は例１２に記載されるのと同じように調製した。
【０４９７】
Ｂ細胞培養上澄み中の抗原特異的抗体のスクリーニング及び抗原特異的Ｂ細胞の同定のためのデコンボリューションステップは例１２と同じように決定した。
【０４９８】
追加の可変領域は免疫化マウスの脾臓及び骨髄由来Ｂ細胞から直に直接フォーカス法により発見した。手短に言えば、４×１０５から８×１０５細胞／ｍｌの最終密度の細胞を、ビオチン化抗原及び１対１２００最終希釈のヤギ抗マウスＦｃγ断片特異的ＦＩＴＣコンジュゲート（Ｊａｃｋｓｏｎ）で被覆したストレプトアビジンビーズ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）と混合した。３７℃での１時間の静置インキュベーション後、抗原特異的Ｂ細胞はそのＢ細胞を取り囲んでいる蛍光ハローの存在のために同定することができた。いくつかのこれらの個々のＢ細胞クローンは、Ｏｌｙｍｐｕｓ顕微鏡を使用して同定されたが、次に、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆマイクロマニュピレーターを用いて選び取り、ＰＣＲチューブ内に蓄積した。
【０４９９】
抗体可変領域遺伝子は、重及び軽鎖可変領域特異的プライマーを使用して逆転写（ＲＴ）ＰＣＲにより単細胞から回収した。２ラウンドのＰＣＲを実施し、３’及び５’末端に制限部位を組み込んでいるネステッド二次ＰＣＲにより可変領域をマウスＦａｂ−Ｘ及びマウスカッパ（ＶＬ）哺乳動物発現ベクターにクローニングすることができた。次に、これらのベクターは、２９３Ｆｅｃｔｉｎ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してＨＥＫ２９３細胞に又はＥｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してＥｘｐｉ２９３細胞に同時トランスフェクトし、６日間発現させておいた。上澄みは、抗原をトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞及び組換えタンパク質で被覆したＳｕｐｅｒａｖｉｄｉｎ（商標）ビーズ（Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）又は抗原トランスフェクトＨＥＫ細胞上での均一蛍光ベースの結合アッセイにおいて試験した。これはクローン化された抗体の特異性を確認するために実行した。
【０５００】
Ｆａｂ−Ｘ一過性上澄みに加えて、陰性対照であるモックの上澄みを無関係な対照ＤＮＡを使用して同じように調製した。
【０５０１】
Ｆａｂ−Ｘの発現レベルはプロテインＧ−ＨＰＬＣにより決定した。
【０５０２】
精製されたＦａｂ−Ｙの作製：精製されたＦａｂ−Ｙは例１３に記載されるのと同じ方法を使用して調製した。
【０５０３】
機能アッセイ
３つの異なる抗体カクテルの代わりに、例１２において抗体カクテルＡについて記載されたのと同じアッセイ濃度及びインキュベーション条件を用いて１カクテルのみを使用することを除いて、例１２に記載されるのと同じ機能アッセイを使用した。
抗体カクテル＝１対３  ＣＤ２０  ＰｅｒＣｐ−Ｃｙ５．５＋１対５  ＰＬＣｇａｎｍａ２  ＡＦ８８＋１対１０  Ａｋｔ  ＡＦ６４７＋１対５  ｐ３８  ＭＡＰＫ  ＰＥ（ＦＡＣＳ緩衝液に希釈した）
【０５０４】
結果
図３０〜３３に見られるように、データは、Ｆａｂ−Ｘ中の異なる一過性に発現された抗原３マウスＶ領域とＦａｂ−Ｙ中の２つの異なる精製された抗原２  Ｖ領域（ＶＲ４４７及びＶＲ４４５０）の組合せがＢ細胞活性化を異なるレベルにまで阻害することが可能であり、したがって、スクリーニングは最適Ｖ領域の選択を促進することを示している。一過性Ｆａｂ−Ｘとの組合せは、精製されたＦａｂ−Ｘ（ＶＲ４１２６）との基準組合せと比べた。
【０５０５】
（例１５）
分子的に連結された二重特異性ＢＹｂｅフォーマットとのＦａｂ−Ｋｄ−Ｆａｂスクリーニングフォーマットにおける抗原２プラス抗原３同時ターゲティングの活性の比較
序論：Ｆａｂ−Ｋｄ−Ｆａｂヘテロ二量体的に繋ぎ合わされたスクリーニング複合体において同定された標的対活性が、別の治療的分子的に連結されたフォーマットにおける類似する所望の活性に変換可能であることを調べるために、抗原２特異性（ＶＲ４４４７）及び抗原３特異性（ＶＲ４１３０）をＢＹｂｅフォーマットで生じさせた。このＢＹｂｅフォーマットは、抗抗原２Ｆａｂ（ＶＲ４４４７）の重鎖に融合されたジスルフィド安定化（ｄｓ）単鎖（ｓｃ）−Ｆｖとしての抗抗原３  Ｖ領域（ＶＲ４１３０）からなる。
【０５０６】
方法：
機能スクリーニングのためのＢＹｂｅの精製を以下の通りに実施することを除いて例１３に記載の通りである：
機能スクリーニングＢＹｂｅ（Ｆａｂ−ｄｓｓｃＦｖ［Ｆａｂ重鎖のＣ末端からのｓｃＦｖ］）フォーマットは以下の通りに精製した。標準ｅｘｐｉＨＥＫ又はＣＨＯ発現由来の澄んだ細胞培養上澄みを０．２２μｍ無菌濾過した。濾過した上澄みは、ＰＢＳ  ｐＨ７．４（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）で平衡化した５０ｍｌのＧａｍｍａｂｉｎｄＰｌｕｓ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＸＫ２６カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に２ｍｌ／分で充填した。充填後、カラムはＰＢＳ  ｐＨ７．４で洗浄し、次に０．１Ｍ  グリシン／ＨＣｌ  ｐＨ２．７で溶出させた。溶出に続いて２８０ｎｍで吸光度を測り、溶出ピークを収集し、次に１／２５容積の２Ｍ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ８．５で中和した。中和された試料はＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５濃縮器を使用して濃縮し、１０ｋＤａ（ＢＹｂｅ）分子量は膜から切り離し、スイングアウトルーターにおいて４０００×ｇで遠心分離した。濃縮した試料は、ＰＢＳ  ｐＨ７．４で平衡にしたＸＫ１６／６０又はＸＫ２６／６０Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のいずれかに適用した。カラムは、それぞれ１ｍｌ／分又は２．６ｍｌ／分のいずれかで均一濃度勾配のＰＢＳ、ｐＨ７．４を用いて展開させた。画分を収集し、ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷＸＬ上サイズ排除クロマトグラフィーにより分析し；５μｍ、７．８×３００ｍｍカラムは１ｍｌ／分で均一濃度勾配の０．２Ｍリン酸、ｐＨ７．０を用いて展開させ、２８０ｎｍの吸光度により検出した。選択された単量体画分はプールし、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５濃縮器を使用して＞１ｍｇ／ｍｌまで濃縮し、１０ｋＤａ（ＢＹｂｅ）分子量は膜から切り離し、スイングアウトルーターにおいて４０００×ｇで遠心分離した。最終試料は、Ａ２８０Ｓｃａｎｎｉｎｇ  ＵＶ−可視光分光光度計（Ｃａｒｙ  ５０Ｂｉｏ）により濃度について；ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷＸＬ上サイズ排除クロマトグラフィーにより％単量体について；５μｍ、７．８×３００ｍｍカラムは１ｍｌ／分で均一濃度勾配の０．２Ｍリン酸、ｐＨ７．０を用いて展開させ、２８０ｎｍの吸光度により検出；５０ｍＡ（ゲルあたり）で５３分間４〜２０％  Ｔｒｉｓ−グリシン１．５ｍｍゲル（Ｎｏｖｅｘ）上で実行される還元性及び非還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより；並びにカブトガニアメボサイトライセート（ＬＡＬ）試験カートリッジを用いるＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ’ｓ  ＥｎｄｏＳａｆｅ（登録商標）携帯型試験システムにより内毒素についてアッセイした。
【０５０７】
機能アッセイ
活性化マーカーアッセイ：抗原２特異的Ｆａｂ’−Ｙ及び抗原３特異的Ｆａｂ’−Ｘは、等モル濃度で６０分間（３７℃及び５％ＣＯ２環境で）一緒にインキュベートした。組合せは、１対４連続希釈で開始モル濃度１００ｎＭから滴定した。抗原２及び３特異的ＢＹｂｅも１対４連続希釈で開始モル濃度１００ｎＭから滴定した。Ｖ字型底９６ウェルプレートにおいて、１．５×１０５ＰＢＭＣをウェルに添加し、それに滴定されたＦａｂ’−Ｘ及びＦａｂ’−Ｙ組合せ又は滴定されたＢｙｂｅを添加した。Ｆａｂ’−Ｘ及びＦａｂ’−Ｙ組合せ又はＢｙｂｅはさらに９０分間細胞と一緒にインキュベートした。この時間の後、Ｂ細胞は、３７℃及び５％ＣＯ２で２４時間、２５μｇ／ｍＬのヤギＦ（ａｂ’）２抗ヒトＩｇＭ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を添加することにより活性化した。
【０５０８】
ウェルに１００μＬの氷冷ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ＋０．１％ＮａＮ３＋２ｍＭ  ＥＤＴＡ）を添加し、プレートは密封しておおよそ１５分間湿った氷でカバーし、その後５００×ｇで、４℃、５分間遠心分離した。過剰な上澄みは細胞ペレットから破棄し、プレートは２０００ｒｐｍで３０秒間振盪させた。
【０５０９】
次に、細胞は蛍光的に標識された抗ＣＤ１９、抗ＣＤ２０及び抗ＣＤ７１抗体、並びに抗ＣＤ４０及び抗ＣＤ８６抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）のカクテルで染色した。プレートは手短に振盪し、暗所において湿った氷上で１時間インキュベートした。この時間の後、プレートは２度洗浄し、２０μＬのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。ＣＤ１９、ＣＤ２０及びＣＤ７１、ＣＤ４０及びＣＤ８６の細胞発現はＩｎｔｅｌｌｉｃｙｔ  ｉＱＵＥ（登録商標）スクリーナーフローサイトメトリーを使用して測定した。
【０５１０】
データ解析ソフトウェアパッケージＦｏｒｅｃｙｔ（商標）（Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ）を使用して、Ｂ細胞は他の細胞集団とは異なると同定され、ＣＤ７１、ＣＤ４０及びＣＤ８６レベルの幾何平均はウェルごとに計算した。次に、データはすべて最大限応答（抗ＩｇＭのみ）マイナスバックグランド（細胞のみ）のパーセンテージ阻害として表した。
【０５１１】
ＰｈｏｓＦｌｏｗアッセイ：抗原２特異的Ｆａｂ’−Ｙ及び抗原３特異的Ｆａｂ’−Ｘは、等モル濃度で６０分間（３７℃及び５％ＣＯ２環境で）一緒にインキュベートした。組合せは、１対４連続希釈で開始モル濃度１００ｎＭから滴定した。抗原２及び抗原３特異的ＢＹｂｅも１対４連続希釈で開始モル濃度１００ｎＭから滴定した。Ｖ字型底９６ウェルプレートにおいて、５．０×１０４ＰＢＭＣをウェルに添加し、それに滴定されたＦａｂ’−Ｘ及びＦａｂ’−Ｙ組合せ又は滴定されたＢＹｂｅを添加した。Ｆａｂ’−Ｘ及びＦａｂ’−Ｙ組合せ又はＢｙｂｅはさらに９０分間細胞と一緒にインキュベートした。この時間の後、Ｂ細胞は、３７℃及び５％ＣＯ２で１５分間、２５μｇ／ｍＬのヤギＦ（ａｂ’）２抗ヒトＩｇＭ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を添加することにより活性化した。次に、シグナル伝達反応は等容積のＣｙｔｏｆｉｘ緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を添加することにより停止した。次に、プレートは１５分間室温に放置し、その後５００×ｇで、５分間遠心分離した。過剰な上澄みは細胞ペレットから破棄し、ペレットはＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ＋０．０１％ＮａＮ３＋２ｍＭ  ＥＤＴＡ）に再懸濁して、もう１度洗浄した。次に、細胞は氷冷Ｐｅｒｍ緩衝液ＩＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に３０分間再懸濁し、その後フロー緩衝液で２度洗浄した。
【０５１２】
次に、細胞は蛍光的に標識された抗ＣＤ２０抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）並びに抗リン酸化ＰＬＣγ２、抗リン酸化Ａｋｔ及び抗リン酸化ｐ３８抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で染色した。次に、プレートは再懸濁し、暗所において室温で１時間インキュベートした。この時間の後、プレートはさらに２度洗浄し、２０μＬのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。ＣＤ２０並びにホスホ−ＰＬＣγ２、ホスホ−Ａｋｔ及びホスホ−ｐ３８抗体の細胞発現はＩｎｔｅｌｌｉｃｙｔ  ｉＱＵＥ（登録商標）フローサイトメーターを使用して測定した。
【０５１３】
データ解析ソフトウェアパッケージＦｏｒｅｃｙｔ（商標）（Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ）を使用して、Ｂ細胞は他の細胞集団とは異なると同定され、ＰＬＣγ２、Ａｋｔ及びｐ３８レベルの幾何平均はウェルごとに計算した。次に、データはすべて最大限応答（抗ＩｇＭのみ）マイナスバックグランド（細胞のみ）のパーセンテージ阻害として表した。
【０５１４】
結果
ＰｈｏｓＦｌｏｗアッセイ：図３４のデータは、Ｆａｂ−Ｋｄ−Ｆａｂ又はＢｙｂｅフォーマットのいずれかで抗原３と抗原２をターゲティングすると、抗ＩｇＭで刺激されたＢ細胞においてリン酸化ＰＬＣγ２を阻害できることを示している。図３５のデータは、Ｆａｂ−Ｋｄ−Ｆａｂ又はＢｙｂｅフォーマットのいずれかで抗原３と抗原２をターゲティングすると、抗ＩｇＭで刺激されたＢ細胞においてリン酸化ｐ３８を阻害できることを示している。図３６のデータは、Ｆａｂ−Ｋｄ−Ｆａｂ又はＢｙｂｅフォーマットのいずれかで抗原３と抗原２をターゲティングすると、抗ＩｇＭで刺激されたＢ細胞においてリン酸化Ａｋｔを阻害できることを示している。
【０５１５】
活性化マーカーアッセイ：図３７で見ることができるように、データは、Ｆａｂ−Ｋｄ−Ｆａｂ又はＢｙｂｅフォーマットのいずれかで抗原３と抗原２をターゲティングすると、抗ＩｇＭで刺激されたＢ細胞上でＣＤ７１発現を阻害できることを示している。図３８のデータは、Ｆａｂ−Ｋｄ−Ｆａｂ又はＢｙｂｅフォーマットのいずれかで抗原３と抗原２をターゲティングすると、抗ＩｇＭで刺激されたＢ細胞上でＣＤ４０発現を阻害できることを示している。図３９のデータは、Ｆａｂ−Ｋｄ−Ｆａｂ又はＢｙｂｅフォーマットのいずれかで抗原３と抗原２をターゲティングすると、抗ＩｇＭで刺激されたＢ細胞上でＣＤ８６発現を阻害できることを示している。
【０５１６】
（例１６）
ｉｎ  ｖｉｖｏ半減期の延長のための分子的に連結された二重特異性Ｂｙｂｅフォーマットにおける抗原２プラス抗原３同時ターゲティングの活性の抗アルブミン結合ドメインのさらなる付加との比較
序論：Ｆａｂ−Ｋｄ−Ｆａｂヘテロ二量体的に繋ぎ合わされたスクリーニング複合体において同定された標的対活性が、抗アルブミン標的ｉｎ  ｖｉｖｏ半減期延長を有する潜在的な治療的分子的に連結されたフォーマットにおける類似する所望の活性に変換可能であることを調べるために、抗アルブミン抗体断片を例１５に記載されるＢｙｂｅフォーマットの抗原３Ｆａｂの軽鎖に融合させた。抗原２特異性（ＶＲ４４４７）及び抗原３特異性（ＶＲ４１３０及びＶＲ４１２６）を、抗アルブミン断片（ＶＲ０６４５）を付加して及び付加なしでＢＹｂｅフォーマットで生じさせた。
【表１３】
0006628741.tif 000015
【０５１７】
方法
機能スクリーニングのためのＢＹｂｅの精製
機能スクリーニングＢＹｂｅ（Ｆａｂ−ｄｓｓｃＦｖ［Ｆａｂ重鎖のＣ末端からのｓｃＦｖ］）フォーマットは以下の通りに精製した。標準ｅｘｐｉＨＥＫ又はＣＨＯ発現由来の澄んだ細胞培養上澄みを０．２２μｍ無菌濾過した。濾過した上澄みは、ＰＢＳ  ｐＨ７．４（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）で平衡化した５０ｍｌのＧａｍｍａｂｉｎｄＰｌｕｓ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＸＫ２６カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に２ｍｌ／分で充填した。充填後、カラムはＰＢＳ  ｐＨ７．４で洗浄し、次に０．１Ｍ  グリシン／ＨＣｌ  ｐＨ２．７で溶出させた。溶出に続いて２８０ｎｍで吸光度を測り、溶出ピークを収集し、次に１／２５容積の２Ｍ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ８．５で中和した。中和された試料はＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５濃縮器を使用して濃縮し、１０ｋＤａ又は３０ｋＤａいずれかの分子量は膜から切り離し、スイングアウトルーターにおいて４０００×ｇで遠心分離した。濃縮した試料は、ＰＢＳ  ｐＨ７．４で平衡にしたＸＫ１６／６０又はＸＫ２６／６０Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のいずれかに適用した。カラムは、それぞれ１ｍｌ／分又は２．６ｍｌ／分のいずれかで均一濃度勾配のＰＢＳ、ｐＨ７．４を用いて展開させた。画分を収集し、ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷＸＬ上サイズ排除クロマトグラフィーにより分析し；５μｍ、７．８×３００ｍｍカラムは１ｍｌ／分で均一濃度勾配の０．２Ｍリン酸、ｐＨ７．０を用いて展開させ、２８０ｎｍの吸光度により検出した。選択された単量体画分はプールし、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５濃縮器を使用して＞１ｍｇ／ｍｌまで濃縮し、１０ｋＤａ又は３０ｋＤａ分子量は膜から切り離し、スイングアウトルーターにおいて４０００×ｇで遠心分離した。最終試料は、Ａ２８０Ｓｃａｎｎｉｎｇ  ＵＶ−可視光分光光度計（Ｃａｒｙ  ５０Ｂｉｏ）により濃度について；ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷＸＬ上サイズ排除クロマトグラフィーにより％単量体について；５μｍ、７．８×３００ｍｍカラムは１ｍｌ／分で均一濃度勾配の０．２Ｍリン酸、ｐＨ７．０を用いて展開させ、２８０ｎｍの吸光度により検出；５０ｍＡ（ゲルあたり）で５３分間４〜２０％Ｔｒｉｓ−グリシン１．５ｍｍゲル（Ｎｏｖｅｘ）上で実行される還元性及び非還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより；並びにカブトガニアメボサイトライセート（ＬＡＬ）試験カートリッジを用いるＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ’ｓ  ＥｎｄｏＳａｆｅ（登録商標）携帯型試験システムにより内毒素についてアッセイした。
【０５１８】
１００ｎＭのそれぞれの構築物精製タンパク質を、ＲＭＰＩ  １６４０培地プラス１０％ウシ胎仔血清及び２ｍＭ  Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｒ１０培地）において３７℃／５％ＣＯ２で６０分間５つの別々のドナー由来のヒトＰＢＭＣと一緒に前インキュベートした。６０分後、細胞は、Ｂ細胞のみを刺激するように設計された２５μｇ／ｍｌのヤギ抗ＩｇＭ抗体で刺激した。２４時間後、プレートは氷上に置いてそれ以上のいかなる活性化も停止させ、その後氷冷フローサイトメトリー緩衝液（ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ＋０．０１％ＮａＮ３）で１度洗浄した。上澄みはすべて取り除き細胞ペレットは再懸濁した。細胞は氷上に置き、抗ＣＤ１９、抗ＣＤ２０、抗ＣＤ２７、抗ＣＤ７１及びＣＤ８６抗体のカクテルを添加した。細胞は６０分間インキュベートし、その後フローサイトメトリー緩衝液で２度洗浄した。抗ＣＤ２７、抗ＣＤ７１及びＣＤ８６のＣＤ１９／ＣＤ２０陽性Ｂ細胞への結合に関するデータは、ｉＱＵＥハイスループットフローサイトメトリーを使用して作成した。Ｆｏｒｅｃｙｔソフトウェアを使用してヒストグラムを作成し、抗ＣＤ２７、抗ＣＤ７１及びＣＤ８６抗体のＢ細胞への結合について幾何平均強度の記録値を得た。このデータをＥｘｃｅｌに取り込み、組合せごとにパーセンテージ阻害値を得た。次に、データはＧｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍに取り込み、平均を「＋」で示して組合せごとに箱ヒゲチャートを作成した。
【０５１９】
図４０は、ＶＲ４４４７／ＶＲ４１２６  ＢＹｂｅ及びＶＲ４４４７／ＶＲ４１２６／ＶＲ６４５  ＢＹｂｅ／アルブミンにより誘導されるＢ細胞上のＣＤ２７発現の阻害を示している。試験された５件のドナーにわたり、両方が抗ＩｇＭ誘導ＣＤ２７の一貫して類似するレベルの阻害を示した。図４１は、ＶＲ４４４７／ＶＲ４１２６  ＢＹｂｅ及びＶＲ４４４７／ＶＲ４１２６／ＶＲ６４５  ＢＹｂｅ／アルブミンにより誘導されるＢ細胞上のＣＤ７１発現の阻害を示している。５件のドナーにわたり、両方が抗ＩｇＭ誘導ＣＤ７１の一貫して類似するレベルの阻害を示した。図４２は、ＶＲ４４４７／ＶＲ４１２６  ＢＹｂｅ及びＶＲ４４４７／ＶＲ４１２６／ＶＲ６４５  ＢＹｂｅ／アルブミンにより誘導されるＢ細胞上のＣＤ８６発現の阻害を示している。５件のドナーにわたり、両方が抗ＩｇＭ誘導ＣＤ８６の一貫して類似するレベルの阻害を示した。
【０５２０】
GCN4(7P14P) 配列
0006628741.tif 000016
ボールド（全角）のアミノ酸は任意であり、下線部のアミノ酸は連結配列である。
GCTAGCGGAGGCGGAAGAATGAAACAACTTGAACCCAAGGTTGAAGAATTGCTTCCGAAAAATTATCACTTGGAAAATGAGGTTGCCAGATTAAAGAAATTAGTTGGCGAACGCCATCACCATCACCATCAC 配列番号２
【０５２１】
52SR4 ds scFv配列
DAVVTQESALTSSPGETVTLTCRSSTGAVTTSNYASWVQEKPDHLFTGLIGGTNNRAPGVPARFSGSLIGDKAALTITGAQTEDEAIYFCVLWYSDHWVFGCGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDVQLQQSGPGLVAPSQSLSITCTVSGFLLTDYGVNWVRQSPGKCLEWLGVIWGDGITDYNSALKSRLSVTKDNSKSQVFLKMNSLQSGDSARYYCVTGLFDYWGQGTTLTVSSAAAHHHHHHEQKLISEEDL−配列番号３
【０５２２】
GATGCGGTGGTGACCCAGGAAAGCGCGCTGACCAGCAGCCCGGGCGAAACCGTGACCCTGACCTGCCGCAGCAGCACCGGCGCGGTGACCACCAGCAACTATGCGAGCTGGGTGCAGGAAAAACCGGATCATCTGTTTACCGGCCTGATTGGCGGCACCAACAACCGCGCGCCGGGCGTGCCGGCGCGCTTTAGCGGCAGCCTGATTGGCGATAAAGCGGCGCTGACCATTACCGGCGCGCAGACCGAAGATGAAGCGATTTATTTTTGCGTGCTGTGGTATAGCGACCATTGGGTGTTTGGCTGCGGCACCAAACTGACCGTGCTGGGTGGAGGCGGTGGCTCAGGCGGAGGTGGCTCAGGCGGTGGCGGGTCTGGCGGCGGCGGCAGCGATGTGCAGCTGCAGCAGAGCGGCCCGGGCCTGGTGGCGCCGAGCCAGAGCCTGAGCATTACCTGCACCGTGAGCGGCTTTCTCCTGACCGATTATGGCGTGAACTGGGTGCGCCAGAGCCCGGGCAAATGCCTGGAATGGCTGGGCGTGATTTGGGGCGATGGCATTACCGATTATAACAGCGCGCTGAAAAGCCGCCTGAGCGTGACCAAAGATAACAGCAAAAGCCAGGTGTTTCTGAAAATGAACAGCCTGCAGAGCGGCGATAGCGCGCGCTATTATTGCGTGACCGGCCTGTTTGATTATTGGGGCCAGGGCACCACCCTGACCGTGAGCAGCGCGGCCGCCCATCACCATCACCATCACGAACAGAAACTGATTAGCGAAGAAGATCTGTAATAG
配列番号４
【図１】
0006628741.tif 000017
【図２】
0006628741.tif 000018
【図３】
0006628741.tif 000019
【図４】
0006628741.tif 000020
【図５】
0006628741.tif 000021
【図６】
0006628741.tif 000022
【図７】
0006628741.tif 000023
【図８】
0006628741.tif 000024
【図９】
0006628741.tif 000025
【図１０】
0006628741.tif 000026
【図１１】
0006628741.tif 000027
【図１２】
0006628741.tif 000028
【図１３】
0006628741.tif 000029
【図１４】
0006628741.tif 000030
【図１５】
0006628741.tif 000031
【図１６】
0006628741.tif 000032
【図１７】
0006628741.tif 000033
【図１８】
0006628741.tif 000034
【図１９】
0006628741.tif 000035
【図２０】
0006628741.tif 000036
【図２１】
0006628741.tif 000037
【図２２】
0006628741.tif 000038
【図２３】
0006628741.tif 000039
【図２４】
0006628741.tif 000040
【図２５】
0006628741.tif 000041
【図２６】
0006628741.tif 000042
【図２７】
0006628741.tif 000043
【図２８】
0006628741.tif 000044
【図２９】
0006628741.tif 000045
【図３０】
0006628741.tif 000046
【図３１】
0006628741.tif 000047
【図３２】
0006628741.tif 000048
【図３３】
0006628741.tif 000049
【図３４】
0006628741.tif 000050
【図３５】
0006628741.tif 000051
【図３６】
0006628741.tif 000052
【図３７】
0006628741.tif 000053
【図３８】
0006628741.tif 000054
【図３９】
0006628741.tif 000055
【図４０】
0006628741.tif 000056
【図４１】
0006628741.tif 000057
【図４２】
0006628741.tif 000058
【図４３】
0006628741.tif 000059
【図４４】
0006628741.tif 000060
【図４５】
0006628741.tif 000061
【配列表】
0006628741000001.app