(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｔｉ３Ｃ２  ＭＸｅｎｅｓナノシート、リンカー分子及び生体認識分子１を含み、前記Ｔｉ３Ｃ２  ＭＸｅｎｅｓナノシートとリンカー分子は静電吸着により結合し、前記リンカー分子と生体認識分子１はアミド基を介して結合し、前記リンカー分子は第一級アミン基又は第二級アミン基を含み、且つ前記リンカー分子は水に溶解した後に正電荷を有し、前記生体認識分子１は５’末端にカルボキシル基を有する一本鎖ＤＮＡ配列１であり、前記一本鎖ＤＮＡ配列１はエキソソーム上のＣＤ６３タンパク質を認識することができ、
前記リンカー分子はポリエチレンイミンである、ことを特徴とするＴｉ３Ｃ２二次元金属炭化物触媒ルミノール電気化学発光プローブ。
【請求項２】
前記一本鎖ＤＮＡ配列１の５’から３’までの配列はＴＴＴＴＴＴ  ＣＡＣ  ＣＣＣ  ＣＡＣ  ＣＴＣ  ＧＣＴ  ＣＣＣ  ＧＴＧ  ＡＣＡ  ＣＴＡ  ＡＴＧ  ＣＴＡである、ことを特徴とする請求項１に記載のプローブ。
【請求項３】
リンカー分子とＴｉ３Ｃ２  ＭＸｅｎｅｓナノシートを水中で均一に混合した後、撹拌し、遠心分離して沈殿物を得、得られた沈殿物と生体認識分子１をアミド反応させるステップを含み、
前記撹拌の時間は１〜１．５時間で、遠心分離速度は１００００ｒｐｍ以上であり、
前記アミド反応の反応系は、１−（３−（ジメチルアミノ）プロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩及びＮ−ヒドロキシスクシンイミドである、ことを特徴とする請求項１又は２に記載のプローブの製造方法。
【請求項４】
請求項１又は２に記載のプローブと組み合わせて使用するバイオセンサー電極であって、
グラッシーカーボン電極の表面は、金ナノ粒子により修飾され、
金ナノ粒子は、アミド基を介して少なくとも２つのアミノ基を含む分子のうち１つのアミノ基に結合し、
少なくとも２つのアミノ基を含む分子の他のアミノ基とカルボキシル基末端のポリＮ−イソプロピルアクリルアミド（ＰＮＩＰＡＭ）の１方のカルボキシル基は、アミド基を介して結合し、
カルボキシル基末端のポリＮ−イソプロピルアクリルアミドの他方のカルボキシル基と生体識認識分子２は、アミド基を介して結合し、
生体認識分子２は５’末端にアミノ基を有する一本鎖ＤＮＡ配列２であり、前記一本鎖ＤＮＡ配列２はエキソソーム上のＥｐＣＡＭ蛋白質を認識することができ、
前記少なくとも２つのアミノ基を有する分子はエチレンジアミンであり、
前記カルボキシル基末端のポリＮ−イソプロピルアクリルアミドは、１０００〜５０００の数平均分子量を有する、ことを特徴とするバイオセンサー電極。
【請求項５】
前記一本鎖ＤＮＡ配列２の５’から３’までの配列はＴＴＴＴＴＴ  ＣＡＣ  ＴＡＣ  ＡＧＡ  ＧＧＴ  ＴＧＣ  ＧＴＣ  ＴＧＴ  ＣＣＣ  ＡＣＧ  ＴＴＧ  ＴＣＡ  ＴＧＧ  ＧＧＧ  ＧＴＴ  ＧＧＣ  ＣＴＧである、ことを特徴とする請求項４に記載のバイオセンサー電極。
【請求項６】
金ナノ粒子分散液をグラッシーカーボン電極の表面に滴下して、金ナノ粒子をグラッシーカーボン電極の表面に付着させ、アミド反応により少なくとも２つのアミノ基を含む分子を金ナノ粒子に結合させるステップと、
アミド反応によりカルボキシル基末端のポリＮ−イソプロピルアクリルアミドを少なくとも２つのアミノ基を含む分子に結合させるステップと、
アミド反応により生体認識分子２をカルボキシル基末端のポリＮ−イソプロピルアクリルアミドと結合させるステップと、を含み、
各ステップにおけるにおける反応温度及び処理温度は室温又は３７±０．５℃である、ことを特徴とする請求項４又は５に記載のバイオセンサー電極の製造方法。
【請求項７】
請求項１又は２に記載のプローブ及び請求項４又は５に記載のバイオセンサー電極を含む、ことを特徴とする電気化学発光を用いたバイオセンサー。
【請求項８】
請求項１又は２に記載のプローブ、請求項４又は５に記載のバイオセンサー電極、及びルミノールを含む、ことを特徴とする電気化学発光キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、材料及び分析化学の分野に関し、特に二次元ナノ材料−Ｔｉ３Ｃ２  ＭＸｅｎｅｓ触媒ルミノール電気化学発光、及び適切な温度下で、カルボキシ末端のポリＮ−イソプロピルアクリルアミド（ＰＮＩＰＡＭ）ポリマー分子を利用してより多くの活性部位を露出させ、それにより電気化学発光バイオセンサーでエキソソームを検出する方法の構築に関する。
【背景技術】
【０００２】
エキソソームは、リソソームにおけるエキソサイトーシスによって多小胞体から放出されるナノスケールの細胞外小胞（３０〜１００ｎｍ）である。エキソソームは、膜貫通及び細胞質タンパク質、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、及びマイクロＲＮＡを含む豊富な細胞遺伝物質を運び、細胞間の情報伝達における重要な役割を果たす。実験の結果、それらが疾患、特に癌の病因に関連して重要な役割を果たすことが明らかになっている。そのため、エキソソームは癌を早期に診断するバイオマーカーとして、癌の検出における重要な意義を有すると見なされている。これまで、エキソソームの検出のために種々の方法が開発されており、それらの中にはウエスタンブロット法、フローサイトメトリー法又は酵素免疫測定法が含まれる。しかし、これら従来法では、高価な器具、複雑な技術、及び時間のかかる操作を必要とするなどの欠点がある。そのため、簡単、高感度で、信頼性に優れたエキソソームの検出方法の開発は非常に重要である。近年、電気化学発光（ＥＣＬ）は、高感度、高速、低いバックグラウンドノイズ、操作性及び低コストなどの利点を有する高度な分析技術として、タンパク質、ＤＮＡ、酵素などの物質の検出に広く使用されてきた。これらの多くの利点を考慮すると、エキソソームの検出への電気化学発光の応用が期待される。
【０００３】
ＭＸｅｎｅｓ（ＭＸｅｎｅ）は、近年発見された新しい二次元（２Ｄ）前周期遷移金属族炭化物である。ＭＸｅｎｅｓは、金属導電性のＭＡＸ相からＡｌ元素を選択的にエッチングすることにより製造されるものである。ＭＡＸ相としてはＴｉ２ＡｌＣ、Ｔｉ３ＡｌＣ２及びＴｉ４ＡｌＣ３などの様々な種類が挙げられる。Ｔｉ３Ｃ２  ＭＸｅｎｅｓは、ＭＸｅｎｅｓの１種であり、遷移金属炭化物の金属導電性及び水酸基又は酸素末端表面の親水性を組み合わせたものである。本質的には“導電性粘土”とも表現され、それ自体は導電性、触媒作用及び大きな比表面積などでグラフェンと類似したいくつかの特性を有する。これらの優れた特性に基づいて、Ｔｉ３Ｃ２  ＭＸｅｎｅｓは、触媒、バイオセンサー、汚染物質処理、スーパーキャパシタ、リチウムイオン電池などの様々な応用が非常に期待される。これまでに、バイオセンサー及び癌治療、細胞取り込みや抗菌活性などの生物医学の領域におけるＴｉ３Ｃ２  ＭＸｅｎｅｓの応用に関する報告はほとんどない。しかしながら、Ｔｉ３Ｃ２  ＭＸｅｎｅｓの優れた触媒特性や導電性などの特性により、高感度ＥＣＬバイオセンサーの製造における応用の可能性を有すると考えられる。
【発明の概要】
【０００４】
本発明における第一の目的は、従来技術の課題を解決することができるＴｉ３Ｃ２二次元金属炭化物触媒に基づくルミノールの電気化学発光を用いたバイオセンサーのプローブを提供することである。これによりルミノールの電気化学発光を改善することができる。
上記目的を達成するために、本発明では、以下の技術的解決手段を用いる。
【０００５】
すなわち、Ｔｉ３Ｃ２二次元金属炭化物触媒に基づくルミノールの電気化学発光によるプローブであって、Ｔｉ３Ｃ２  ＭＸｅｎｅナノシート、リンカー分子及び生体認識分子１を含み、前記Ｔｉ３Ｃ２  ＭＸｅｎｅｓナノシートとリンカー分子は静電吸着により結合し、前記リンカー分子と生体認識分子１はアミド基を介して結合し、前記リンカー分子は第一級アミン基又は第二級アミン基を含み、且つ前記リンカー分子は水に溶解した後に正電荷を有することができ、前記生体認識分子１は５’末端にカルボキシル基を有する一本鎖ＤＮＡ配列１であり、前記一本鎖ＤＮＡ配列１はエキソソーム上のＣＤ６３タンパク質を認識することができる。
【０００６】
本発明者らは、Ｔｉ３Ｃ２  ＭＸｅｎｅｓがルミノールの電気化学発光を改善できることを初めて発見し、Ｔｉ３Ｃ２  ＭＸｅｎｅｓを用いて、ルミノール電気化学発光によるバイオセンサーのプローブを製造することを検討したが、Ｔｉ３Ｃ２  ＭＸｅｎｅｓの修飾が困難であることが分かった。更に研究した結果、Ｔｉ３Ｃ２  ＭＸｅｎｅｓナノシートを水中に分散させると、その表面が負電荷を有するため、水に溶解した正電荷及びアミノ基を有する物質を用いてＴｉ３Ｃ２  ＭＸｅｎｅｓナノシートと結合させることにより、Ｔｉ３Ｃ２  ＭＸｅｎｅｓと一本鎖ＤＮＡ配列１を結合させやすくなり、その結果、Ｔｉ３Ｃ２二次元金属炭化物触媒に基づくルミノールの電気化学発光を用いたプローブが得られることを見出した。
【０００７】
本発明における第二の目的は、上記プローブの製造方法を提供することである。上記プローブは、リンカー分子とＴｉ３Ｃ２  ＭＸｅｎｅｓナノシートを水中で均一に混合した後、特定の時間撹拌し、遠心分離して沈殿物を得、得られた沈殿物と生体認識分子１をアミド反応させることにより得られる。
【０００８】
本発明における第３の目的は、上記プローブと組み合わせて使用するバイオセンサー電極を提供することである。すなわち、グラッシーカーボン電極の表面は、金ナノ粒子により修飾され、金ナノ粒子は、アミド基を介して少なくとも２つのアミノ基を含む分子のうち１つのアミノ基に結合し、少なくとも２つのアミノ基を含む分子のうちもう１つのアミノ基とカルボキシル基末端のポリＮ−イソプロピルアクリルアミド（ＰＮＩＰＡＭ）のうち１つのカルボキシル基は、アミド基を介してカルボキシル基末端のポリＮ−イソプロピルアクリルアミドを少なくとも２つのアミノ基を含む分子と結合し、カルボキシル基末端のポリＮ−イソプロピルアクリルアミドのうちもう１つのカルボキシル基と生体識認識分子２は、アミド基を介してカルボキシル基末端ポリＮ−イソプロピルアクリルアミドを生体認識分子２と結合する。ここで、生体認識分子２は５’末端にアミノ基を有する一本鎖ＤＮＡ配列２であり、前記一本鎖ＤＮＡ配列２はエキソソーム上のＥｐＣＡＭ蛋白質を認識することができる。
【０００９】
金ナノ粒子の表面はカルボキシル基を有し、少なくとも２つのアミノ基を含む分子を介してカルボキシル末端のポリＮ−イソプロピルアクリルアミドに結合し、室温下でカルボキシル末端のポリ‐Ｎ‐イソプロピルアクリルアミドによるポリマー鎖延長により、複数のアプタマーの活性部位を露出する。その結果、電極がより多くのエキソソームを捕捉することが可能となる。
【００１０】
本発明における第４の目的は、上記バイオセンサー電極の製造方法を提供することである。金ナノ粒子がグラッシーカーボン電極の表面に付着するように、金ナノ粒子分散液をグラッシーカーボン電極の表面に滴下し、アミド反応によって少なくとも２つのアミノ基を含む分子を金ナノ粒子に結合させ、次にアミド反応によってカルボキシ末端のポリＮ−イソプロピルアクリルアミドを少なくとも２つのアミノ基を含む分子に結合させた後、アミド反応によって生体認識分子２をカルボキシル末端のポリＮ‐イソプロピルアクリルアミドに結合させる。
本発明における第５の目的は、上記プローブとバイオセンサー電極を含む電気化学発光バイオセンサーを提供することである。
本発明における第６の目的は、上記プローブ、バイオセンサー電極及びルミノールを含む電気化学発光キットを提供することである。
【００１１】
本発明における第７の目的は、電気化学発光によるエキソソームの検出における上記プローブ、バイオセンサー電極、バイオセンサー又はキットの使用を提供することである。
【００１２】
本発明における第８の目的は電気化学発光によるエキソソームの検出方法を提供することである。すなわち、上記バイオセンサー電極を試験対象のエキソソーム溶液に浸漬して、エキソソームをバイオセンサー電極に付着させた後、エキソソームが付着したバイオセンサー電極をプローブ含有溶液に浸漬して、プローブをバイオセンサー電極のエキソソームに付着させることによりプローブとバイオセンサー電極との間にエキソソームが挟まれたバイオセンサーを構成し、プローブとバイオセンサー電極との間にエキソソームが挟まれたバイオセンサーに対して電気化学発光による検出を行う。
本発明の有益な効果は以下のとおりである：
【００１３】
本発明では、Ｔｉ３Ｃ２  ＭＸｅｎｅｓがルミノールの電気化学発光を改善できることを初めて見出し、且つ該性質を利用してＴｉ３Ｃ２  ＭＸｅｎｅを用いてプローブを製造した後、該プローブと組み合わせて使用するバイオセンサー電極を製造して、バイオセンサーを得た。本発明では、該バイオセンサーを用いたエキソソームの検出に成功し、且つエキソソームの濃度は５×１０５〜５×１０９個／ｍＬの範囲内であり、該バイオセンサーの電気化学発光信号の大きさは、エキソソームの濃度の対数に対して線形関係にあり、相関係数Ｒ＝０．９７４０、検出限界は２．５×１０５個／ｍＬであった。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
本出願の一部をなす図面は、本出願の更なる理解を容易にするために用いられ、本出願の例示的な実施例及びその説明は本出願を説明するためのものであり、本出願を不当に限定するものではない。
【図１】電気化学発光バイオセンサーの製造メカニズムを示す模式図である。
【図２】実施例１で製造したＴｉ３Ｃ２  ＭＸｅｎｅｓの走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）写真である。
【図３】実施例１で製造した電気化学発光バイオセンサーの電気化学発光強度とエキソソーム濃度との関係を示す図である。ここで、ａは５．０×１０５個／ｍＬ、ｊは５．０×１０９個／ｍＬである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下の詳細な説明はいずれも例示的なものであり、本発明のさらなる説明を提供することを意図している。特記しない限り、本明細書で使用されるすべての技術的及び科学的用語は、当業者に一般に理解されるものと同じ意味を有する。
【００１６】
本明細書で使用される用語は、発明を実施するための形態を説明するためのものに過ぎず、本発明の例示的な実施形態を意図的に制限するものではない。ここで使用されているように、文脈に特記しない限り、単数形は複数形をも含むことが意図されており、更に、本明細書において“含有”及び／又は“含む”という用語が使用された場合、特徴、ステップ、操作、デバイス、アセンブリ及び／又はそれらの組み合わせの存在を示す。
【００１７】
本明細書に記載のルミノール（Ｌｕｍｉｎｏｌ）は、化学名は３−アミノフタルヒドラジドである。室温で青色結晶又はベージュ色の粉末であり、安定した合成有機化合物である。化学式はＣ８Ｈ７Ｎ３Ｏ２である。
本明細書に記載のアミド反応とは、カルボキシル基が第一級又は第二級アミン基と反応してアミド基を形成する過程を指す。
【００１８】
背景技術で説明されたように、従来技術においてバイオセンサー及び癌治療、細胞取り込みや抗菌活性などの生物医学の領域におけるＴｉ３Ｃ２  ＭＸｅｎｅの使用に関する報告はほとんどない。上記技術的課題を解決するために、本発明ではＴｉ３Ｃ２二次元金属炭化物触媒に基づくルミノールの電気化学発光プローブを用いたバイオセンサー及びその製造方法を提供する。
【００１９】
本発明の代表的な実施形態として、以下のＴｉ３Ｃ２二次元金属炭化物触媒に基づくルミノールの電気化学発光プローブを提供する。すなわち、Ｔｉ３Ｃ２  ＭＸｅｎｅｓナノシート、リンカー分子及び生体認識分子１を含み、上記Ｔｉ３Ｃ２  ＭＸｅｎｅｓナノシートとリンカー分子は静電吸着により結合し、上記リンカー分子と生体認識分子１はアミド基を介して結合し、上記リンカー分子は第一級アミン基又は第二級アミン基を含み、且つ上記リンカー分子は水に溶解した後に正電荷を有し（有することができ）、上記生体認識分子１は５’末端にカルボキシル基を有する一本鎖ＤＮＡ配列１であり、上記一本鎖ＤＮＡ配列１はエキソソーム上のＣＤ６３タンパク質を認識することができる。
【００２０】
本発明者らは、Ｔｉ３Ｃ２  ＭＸｅｎｅがルミノールの電気化学発光を改善可能なことを初めて発見したため、Ｔｉ３Ｃ２  ＭＸｅｎｅｓによりルミノール電気化学発光によるバイオセンサーのプローブを製造することを検討したが、Ｔｉ３Ｃ２  ＭＸｅｎｅの修飾は困難であることが分かった。更に研究した結果、Ｔｉ３Ｃ２  ＭＸｅｎｅｓナノシートを水中に分散させると、その表面が負電荷を有するため、水に溶解した正電荷を有するリンカー分子を用いてＴｉ３Ｃ２  ＭＸｅｎｅｓナノシートと一本鎖ＤＮＡ配列１を結合させることにより、Ｔｉ３Ｃ２二次元金属炭化物触媒に基づくルミノールの電気化学発光プローブが得られることを見出した。
【００２１】
上記リンカー分子はポリエチレンイミン（ＰＥＩ）であり、重量平均分子量は７００００であることが好ましい。ポリエチレンイミンは、水溶性の高分子化合物であり、水に溶解し、その水溶液中のポリエチレンイミンの表面に大量の正電荷が分布し、Ｔｉ３Ｃ２  ＭＸｅｎｅナノシートの表面の負電荷と静電吸着する。
【００２２】
上記一本鎖ＤＮＡ配列１の５’から３’までの配列はＴＴＴＴＴＴ  ＣＡＣ  ＣＣＣ  ＣＡＣ  ＣＴＣ  ＧＣＴ  ＣＣＣ  ＧＴＧ  ＡＣＡ  ＣＴＡ  ＡＴＧ  ＣＴＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１）であることが好ましい。
【００２３】
本発明ではさらに上記プローブの製造方法を提供する。リンカー分子とＴｉ３Ｃ２  ＭＸｅｎｅｓナノシートを水中で均一に混合した後、特定の時間撹拌し、遠心分離して沈殿物を得、得られた沈殿物と生体認識分子１をアミド反応させることにより、プローブが得られる。
撹拌時間は１〜１．５時間で、遠心分離速度は１００００ｒｐｍ以上であることが好ましい。
【００２４】
上記アミド反応の反応系は、１−（３−（ジメチルアミノ）プロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）であることが好ましい。
【００２５】
本発明では、Ｔｉ３ＡｌＣ２のエッチング方法を最適化した。すなわち、Ｔｉ３ＡｌＣ２粉末を４８±２％（質量）のＨＦ水溶液に浸漬し、４５±２℃で２４±０．５時間撹拌し、粉末粒子を遠心分離し、さらに４５００〜５５００ｒｐｍで毎回５分間、５〜６回洗浄し、上澄み（上清）を捨て、室温で乾燥させることにより、多層Ｔｉ３Ｃ２Ｔｘ粒子が得られる。
【００２６】
本発明ではＴｉ３Ｃ２  ＭＸｅｎｅｓナノシートの製造方法を最適化した。すなわち、多層Ｔｉ３Ｃ２Ｔｘ粒子をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に浸漬して一定時間撹拌した。撹拌時間は２４±０．５時間であることが好ましい。その後、遠心分離により上澄みを取り除いてから、脱イオン水を添加し、細胞破砕装置で粉砕してから遠心分離して、Ｔｉ３Ｃ２  ＭＸｅｎｅｓのコロイド溶液が得られる。粉砕前の遠心速度は１００００ｒｐｍ以上が好ましく、１２０００ｒｐｍが更に好ましい。粉砕後の回転速度は３０００〜４０００ｒｐｍが好ましく、３５００ｒｐｍが更に好ましい。
【００２７】
本発明では、上記プローブと組み合わせて使用するバイオセンサー電極を提供する。すなわち、グラッシーカーボン電極の表面は、金ナノ粒子により修飾され、金ナノ粒子は、アミド基を介して少なくとも２つのアミノ基を含む分子のうち１つのアミノ基に結合し、少なくとも２つのアミノ基を含む分子の他のアミノ基とカルボキシル基末端のポリＮ−イソプロピルアクリルアミド（ＰＮＩＰＡＭ）の１方のカルボキシル基は、アミド基を介して結合し、カルボキシル基末端のポリＮ−イソプロピルアクリルアミドの他方のカルボキシル基と生体識認識分子２は、アミド基を介して結合する。ここで、生体認識分子２は５’末端にアミノ基を有する一本鎖ＤＮＡ配列２であり、上記一本鎖ＤＮＡ配列２はエキソソーム上のＥｐＣＡＭ蛋白質を認識することができる。
【００２８】
金ナノ粒子の表面はカルボキシル基を有し、少なくとも２つのアミノ基を含む分子を介してカルボキシル末端のポリＮ−イソプロピルアクリルアミドに結合し、適切な温度におけるカルボキシル末端のポリＮ‐イソプロピルアクリルアミドが複数のアプタマーの活性部位を露出するため、電極がより多くのエキソソームを捕捉することが可能となる。
【００２９】
上記少なくとも２つのアミノ基を含有する分子は、エチレンジアミン、プロピレンジアミン、ｐ−フェニレンジアミン、オクタンジアミン、プロピレントリアミン、ジエチレントリアミンであってもよく、本発明において、少なくとも２つのアミノ基を有する分子はエチレンジアミンであることが好ましい。
【００３０】
上記カルボキシル末端のポリＮ−イソプロピルアクリルアミドは、１０００〜５０００の数平均分子量を有することが好ましく、市販品としては、ＳＩＧＭＡ−ＡＬＯＲＩＣＨ製が挙げられる。
【００３１】
上記一本鎖ＤＮＡ配列２の５’から３’までの配列はＴＴＴＴＴＴ  ＣＡＣ  ＴＡＣ  ＡＧＡ  ＧＧＴ  ＴＧＣ  ＧＴＣ  ＴＧＴ  ＣＣＣ  ＡＣＧ  ＴＴＧ  ＴＣＡ  ＴＧＧ  ＧＧＧ  ＧＴＴ  ＧＧＣ  ＣＴＧである（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２）ことが好ましい。
【００３２】
本発明は、上記バイオセンサー電極の製造方法を提供する。すなわち、金ナノ粒子がグラッシーカーボン電極の表面に付着するように、金ナノ粒子分散液をグラッシーカーボン電極の表面に滴下し、アミド反応により少なくとも２つのアミノ基を含む分子を金ナノ粒子に結合させ、次にアミド反応によりカルボキシ末端のポリＮ−イソプロピルアクリルアミドを少なくとも２つのアミノ基を含む分子に結合させた後、アミド反応により生体認識分子２をカルボキシル末端のポリＮ‐イソプロピルアクリルアミドに結合させる。
【００３３】
上記製造工程における反応温度及び処理温度は３７±０．５℃であることが好ましい。この温度は、例えば、アミド反応の温度、金ナノ粒子をグラッシーカーボン電極の表面に付着させる処理温度などである。
【００３４】
金ナノ粒子を付着させる前に、前処理によりグラッシーカーボン電極の表面を洗浄する必要がある。金ナノ粒子をグラッシーカーボン電極に付着する前処理としてまず研磨し、次いで洗浄することが好ましい。
本発明は更にプローブとバイオセンサー電極を含む電気化学発光バイオセンサーを提供する。
本発明は更に上記プローブ、バイオセンサー電極及びルミノールを含む電気化学発光キットを提供する。
本発明は更に電気化学発光によるエキソソームの検出における上記プローブ、バイオセンサー電極及びルミノールの使用を提供する。
【００３５】
本発明は更に電気化学発光によるエキソソームの検出方法を提供する。すなわち、上記バイオセンサー電極を試験対象のエキソソーム溶液に浸漬し、エキソソームをバイオセンサー電極に付着させた後、エキソソームが付着したバイオセンサー電極を上記プローブを含有する溶液に浸漬して、プローブをバイオセンサー電極のエキソソームに付着させることによりプローブとバイオセンサー電極との間にエキソソームが挟まれたバイオセンサーを構成し、プローブとバイオセンサー電極との間にエキソソームが挟まれたバイオセンサーに対して電気化学発光による検出を行う。
当業者が本発明の技術的解決手段をよりよく理解するために、以下、具体的な実施例を参照しながら本発明の技術的解決手段を詳しく説明する。
【００３６】
原料は以下のとおりである。
ａｐｔａｍｅｒ１としては、上海生工生物工程技術服務有限公司製の５’−ＣＯＯＨ−ＴＴＴＴＴＴ  ＣＡＣ  ＣＣＣ  ＣＡＣ  ＣＴＣ  ＧＣＴ  ＣＣＣ  ＧＴＧ  ＡＣＡ  ＣＴＡ  ＡＴＧ  ＣＴＡ  ａｐｔａｍｅｒ２：５’−ＮＨ２  −ＴＴＴＴＴＴ  ＣＡＣ  ＴＡＣ  ＡＧＡ  ＧＧＴ  ＴＧＣ  ＧＴＣ  ＴＧＴ  ＣＣＣ  ＡＣＧ  ＴＴＧ  ＴＣＡ  ＴＧＧ  ＧＧＧ  ＧＴＴ  ＧＧＣ  ＣＴＧは、上海生工生物工程技術服務有限公司を用いた。
その他、福斯曼科技有限公司（中国北京）製のＴｉ３ＡｌＣ２（９８％）、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製のカルボキシ末端のポリＮ−イソプロピルアクリルアミド（ＰＮＩＰＡＭ、Ｍｎ＝２０００）とルミノール、Ｓｈａｎｇｈａｉ  Ｒｅａｇｅｎｔ（中国上海）のＨＡｕＣｌ４・３Ｈ２Ｏ（４８％、ｗ／ｗ）、北京化工有限公司（中国北京）製の１−（３−（ジメチルアミノ）プロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、エチレンジアミン（ＥＤＡ）及びジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を用いた。
（実施例１）
ＭＸｅｎｅ−ａｐｔａｍｅｒ１ナノプローブの合成
【００３７】
Ｔｉ３ＡｌＣ２（１．０ｇ）粉末を４８質量％のＨＦ水溶液１５ｍＬに浸漬し、４５℃で２４時間撹拌し、遠心分離によって粉末粒子を５０００ｒｐｍで数回洗浄した。洗浄は、毎回５分間行い、上澄みを捨て、室温で乾燥させ、得られた層状のＴｉ３Ｃ２Ｔｘを、４℃で貯蔵して使用した。
【００３８】
層状のＴｉ３Ｃ２（０．０５ｇ）粉末を１ｍＬのＤＭＳＯに浸漬し、室温で２４時間撹拌し、１２０００ｒｐｍで遠心分離した後、５回洗浄した。洗浄は、毎回５分間行い、次に、上澄みを捨て、脱イオン水を添加して細胞破砕装置で２時間粉砕した。最後に、溶液を３５００ｒｐｍで６０分間遠心分離し、上澄み（即ちＴｉ３Ｃ２  ＭＸｅｎｅｓナノシートの分散液）を保留し、４℃で貯蔵した。得られたＴｉ３Ｃ２  ＭＸｅｎｅｓナノシートのＳＥＭ観察写真を図２に示す。
【００３９】
２００μＬの（０．００５ｇ／ｍＬ）ＰＥＩと３ｍＬのＴｉ３Ｃ２  ＭＸｅｎｅｓナノシートを混合し、該溶液中に２ｍＬの脱イオン水を添加し、得られた溶液を室温で１時間ゆっくり撹拌した。その後、該溶液を１２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上澄みを捨て、脱イオン水を添加した。ＥＤＣ（４００ｍＭ）、ＮＨＳ（１００ｍＭ）及びａｐｔａｍｅｒ１（１μＭ、５’−ＣＯＯＨ−ＴＴＴＴＴＴ  ＣＡＣ  ＣＣＣ  ＣＡＣ  ＣＴＣ  ＣＴＣ  ＧＣＴ  ＣＣＣ  ＧＴＧ  ＡＣＡ  ＣＴＡ  ＡＴＧ  ＣＴＡ）の混合物を３７℃で１時間活性化した。その後、得られた２００μＬのＴｉ３Ｃ２  ＭＸｅｎｅｓ−ＰＥＩ溶液を３７℃でａｐｔａｍｅｒ１の混合液（１２０μＬ）に添加して１時間静置した。最後に、混合液を１２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上澄みを捨て、脱イオン水を添加してプローブ溶液を得た。
グラッシーカーボン電極の表面前処理
【００４０】
グラッシーカーボン電極（ＧＣＥ）を、０．３μｍのＡｌ２Ｏ３粉末を用いスエードの上で研磨し、次にエタノール、脱イオン水を用いてそれぞれ３分間超音波洗浄し、電極表面に純窒素を吹き付けて乾燥した。
【００４１】
吹き付け乾燥したグラッシーカーボン電極を作用電極とし、Ａｇ／ＡｇＣｌを参照電極とし、白金線を対電極として、フェリシアン化カリウム溶液中で、−０．２〜０．６Ｖ、１００ｍＶ／ｓで、ＣＶが安定するまでスキャンした。グラッシーカーボン電極の酸化還元電位差が８０ｍＶの活性化基準になるまでこれを繰り返し、グラッシーカーボン電極を水で洗浄し、窒素を吹き付けて乾燥させた。
電極の組み立て
【００４２】
ＡｕＮＰｓ修飾処理後のＧＣＥ
以下の方法で、ＡｕＮＰｓ（１８ｎｍ）の分散液を調製した。激しく撹拌しながら０．０１％（ｗ／ｖ）ＨＡｕＣｌ４溶液１００ｍＬを沸騰させた後、０．２ｍｏｌ／ｍＬのクエン酸三ナトリウム溶液０．５８８ｍＬを沸騰溶液中に急速添加した。該溶液が暗赤色となり、ＡｕＮＰｓの形成が認められた後、溶液を継続して撹拌しかつ冷却した。コロイドは４℃で保存した。
ＡｕＮＰｓ（１８ｎｍ）６μＬをグラッシーカーボン電極の表面に滴下し、３７℃で乾燥するまでインキュベートした。次に電極を４００μＭのＥＤＣ、１００μＭのＮＨＳ、及び２ｍｇ／ｍＬのＥＤＡ混合液１２０μＬに浸漬し、３７℃で２時間インキュベートした。同時に、１ｍｇ／ｍＬ−１のカルボキシル末端のＰＮＩＰＡＭ、４００μＭのＥＤＣ、１００μＭのＮＨＳ各４０μＬを混合し、室温で１時間活性化した。ＥＤＡ中でインキュベートしたグラッシーカーボン電極を、1時間活性化させたＰＮＩＰＡＭ溶液中に継続して浸漬し、１時間インキュベートした。その後、電極を１μＭ（４０μＬ）のａｐｔａｍｅｒ２中に浸漬し、３７℃で2時間インキュベートし、洗浄、吹き付け乾燥して、バイオセンサー電極を得た。このバイオセンサー電極は、ａｐｔａｍｅｒ２／ＰＮＩＰＡＭ／ＡｕＮＰｓ／ＧＣＥと表記する。
センサーの組み立て
【００４３】
ａｐｔａｍｅｒ２／ＰＮＩＰＡＭ／ＡｕＮＰｓ／ＧＣＥを５．０×１０５−５×１０９個／ｍＬのエキソソームに浸漬し、３７℃の環境で２時間静置し、洗浄、吹き付け乾燥するにより、エキソソームを捕捉した電極を得た。この電極は、ｅｘｏｓｏｍｅｓ／ａｐｔａｍｅｒ２／ＰＮＩＰＡＭ／ＡｕＮＰｓ／ＧＣＥと表記する。
【００４４】
エキソソームを捕捉した電極を蒸留水で洗浄し、吹き付け乾燥した後、プローブ溶液中で、３７℃で２時間インキュベートし、反応完了後、蒸留水で洗浄し、窒素を吹き付けて乾燥させることにより、電気化学発光バイオセンサーを得た。該センサーの製造過程は図１に示すとおりである。
【００４５】
電気化学発光バイオセンサーにより電気化学発光検出を行った結果を図３に示す。用いたエキソソームの濃度はそれぞれ５．０×１０５個／ｍＬ（ａ）、１×１０６個／ｍＬ（ｂ）、２．５×１０６個／ｍＬ（ｃ）、５×１０６個／ｍＬ（ｄ）、１０７個／ｍＬ（ｅ）、５×１０７個／ｍＬ（ｆ）、１０８個／ｍＬ（ｇ）、５×１０８個／ｍＬ（ｈ）、１０９個／ｍＬ（ｉ）、５×１０９個／ｍＬ（ｊ）であり、エキソソームの濃度の増加に伴って、電気化学発光信号は徐々に強くなった。エキソソームの濃度が５．０×１０５−５×１０９個／ｍＬの範囲内で、電気化学発光信号の大きさは、エキソソームの濃度の対数に対して線形関係にあり、相関係数Ｒ＝０．９７４０、検出限界は２．５×１０５個／ｍＬである。
【００４６】
同時に、ＥＣＬバイオセンサーは、更にＭＣＦ−７（乳癌細胞）、ＨｅｐＧ２（肝細胞癌細胞）及びＢ１６（黒色腫細胞）エキソソームなどの異なるエキソソームを検出することができる。検出濃度がいずれも１０７個／ｍＬの３つの異なるエキソソームは、生成されたＥＣＬ信号が異なる。そのうち、ＭＣＦ−７エキソソームから検出された信号が最も大きく、ＨｅｐＧ２エキソソームはそれに続き、Ｂ１６エキソソームは最も小さい。このことは、設計されたＥＣＬバイオセンサーが優れた選択性を持つことを示している。
（実施例２）
本実施例と実施例１の相違点は以下のとおりである。
電極の組み立て
【００４７】
ＡｕＮＰｓ修飾処理後のＧＣＥ：ＡｕＮＰｓ（１８ｎｍ）分散液６μＬをグラッシーカーボン電極の表面に滴下し、３７℃で乾燥するまでインキュベートした。次に電極を４００μＭのＥＤＣ、１００μＭのＮＨＳ、及び２ｍｇ／ｍＬのＥＤＡに浸漬し、３７℃で２ｈインキュベートした。同時に、１ｍｇ／ｍＬ−１のカルボキシル末端のＰＮＩＰＡＭ、４００μＭのＥＤＣ、１００μＭのＮＨＳ各４０μＬを混合し、室温で１時間活性化した。
【００４８】
ＥＤＡ中でインキュベートしたグラッシーカーボン電極を、１時間活性化させたＰＮＩＰＡＭ溶液中に継続して浸漬し、１時間インキュベートした。その後、電極を０．８μＭのａｐｔａｍｅｒ２に浸漬し、３７℃で２時間インキュベートし、洗浄、吹き付け乾燥して、バイオセンサー電極を得た。この電極は、ａｐｔａｍｅｒ２／ＰＮＩＰＡＭ／ＡｕＮＰｓ／ＧＣＥと表記する。
センサーの組み立て
【００４９】
ａｐｔａｍｅｒ２／ＰＮＩＰＡＭ／ＡｕＮＰｓ／ＧＣＥを異なる濃度のエキソソームに浸漬し、２５℃の環境で１時間静置し、洗浄、吹き付け乾燥して、エキソソームを捕捉した電極を得た。この電極は、ｅｘｏｓｏｍｅｓ／ａｐｔａｍｅｒ２／ＰＮＩＰＡＭ／ＡｕＮＰｓ／ＧＣＥと表記する。
【００５０】
エキソソームを捕捉した電極を蒸留水で洗浄し、吹き付け乾燥した後、プローブ溶液中で、３７℃で１時間インキュベートし、反応完了後、蒸留水で洗浄し、窒素を吹き付けて乾燥して、電気化学発光バイオセンサーを得た。
（実施例３）
本実施例と実施例１の相違点は以下のとおりである。
電極の組み立て
【００５１】
ＡｕＮＰｓ修飾処理後のＧＣＥ：ＡｕＮＰｓ（１８ｎｍ）分散液６μＬをグラッシーカーボン電極の表面に滴下し、３７℃で乾燥するまでインキュベートした。次に電極を４００μＭのＥＤＣ、１００μＭのＮＨＳ、及び２ｍｇ／ｍＬのＥＤＡに浸漬し、３７℃で２時間インキュベートした。同時に、１ｍｇ／ｍＬ−１のカルボキシル末端のＰＮＩＰＡＭ、４００μＭのＥＤＣ、１００μＭのＮＨＳ各４０μＬを混合し、室温で１時間活性化した。
【００５２】
ＥＤＡ中でインキュベートしたグラッシーカーボン電極を、１時間活性化させたＰＮＩＰＡＭ溶液中に継続して浸漬し、１時間インキュベートした。その後、電極を１．２μＭのａｐｔａｍｅｒ２に浸漬し、３７℃で１．５時間インキュベートし、洗浄、吹き付け乾燥して、バイオセンサー電極を得た。この電極は、ａｐｔａｍｅｒ２／ＰＮＩＰＡＭ／ＡｕＮＰｓ／ＧＣＥと表記する。
センサーの組み立て
【００５３】
ａｐｔａｍｅｒ２／ＰＮＩＰＡＭ／ＡｕＮＰｓ／ＧＣＥを異なる濃度のエキソソームに浸漬し、５０℃の環境で３０分間静置し、洗浄、吹き付け乾燥して、エキソソームを捕捉した電極を得た。この電極は、ｅｘｏｓｏｍｅｓ／ａｐｔａｍｅｒ２／ＰＮＩＰＡＭ／ＡｕＮＰｓ／ＧＣＥと表記する。
【００５４】
エキソソームを捕捉した電極を蒸留水で洗浄し、吹き付け乾燥した後、プローブ溶液中で、３７℃で３０分間インキュベートし、反応完了後、蒸留水で洗浄し、窒素を吹き付けて乾燥して、電気化学発光バイオセンサーを得た。
【００５５】
以上の説明は本発明の好ましい実施例に過ぎず、本発明を限定するものではない。当業者は、本発明の実施態様に様々な変更及び修正を加えることが可能である。しかしながら、本発明の技術的思想を逸脱しない限り、いかなる修正、等価置換、改善も、本発明の技術的範囲に属する。
【００５６】
ＳＥＱＵＥＮＣＥ  ＬＩＳＴＩＮＧ
＜１１０＞  青島大学
＜１２０＞  Ｔｉ３Ｃ２二次元金属炭化物触媒に基づくルミノールの電気化学発光プローブを用いたバイオセンサー及びその製造方法
＜１３０＞  ２０１８
＜１６０＞  ２
＜１７０＞  ＰａｔｅｎｔＩｎ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．３
＜２１０＞  １
＜２１１＞  ３９
＜２１２＞  ＤＮＡ
＜２１３＞  人工配列
＜４００＞  １
ｔｔｔｔｔｔｃａｃｃ  ｃｃｃａｃｃｔｃｇｃ  ｔｃｃｃｇｔｇａｃａ  ｃｔａａｔｇｃｔａ    ３９
＜２１０＞  ２
＜２１１＞  ５４
＜２１２＞  ＤＮＡ
＜２１３＞  人工配列
＜４００＞  ２
ｔｔｔｔｔｔｃａｃｔ  ａｃａｇａｇｇｔｔｇ  ｃｇｔｃｔｇｔｃｃｃ  ａｃｇｔｔｇｔｃａｔ  ｇｇｇｇｇｇｔｔｇｇ  ｃｃｔｇ  ５４
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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