(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
化学物質（３）の存在下、培養培地（２）での生物学的粒子（１）の培養によって構成される少なくとも１つの第１の阻止域（Ｚ１）の有無を検出するための方法（１００）であって、前記検出方法が、培養培地（２）に生物学的粒子（１）を播種する第１のステップ（１０１）、培養培地（２）に化学物質（３）を含浸させた支持体（５、５’、５’’、５’’’、５’’’’）を与える第２のステップ（１０２）、及び培養培地をインキュベーションする第３のステップ（１０３）を含み、検出方法（１００）が、
オンブロスコピーにより培養培地の画像（７）を撮像して、第１の阻止域（Ｚ１）が生物学的粒子の増殖域よりも暗い培養培地の２次元強度画像を生成する第１フェーズ（Ｘ１）、及び
上記２次元強度画像を分析して、第１の阻止域（Ｚ１）の有無を検出すること
を含む、測定する第４のステップ（１０４）を含む、方法。
【請求項２】
測定する第４のステップ（１０４）が、含浸支持体（５，５’、５’’、５’’’、５’’’’）と第１の阻止域（Ｚ１）の辺縁（Ｂ）との間の距離（Ｆ）を測定することを含むことを特徴とする、請求項１に記載の検出方法（１００）。
【請求項３】
測定する第４のステップ（１０４）が、第１の阻止域（Ｚ１）の直径（Ｄ）を測定することを含むことを特徴とする、請求項１に記載の検出方法（１００）。
【請求項４】
検出方法（１００）が、培養培地（２）の対照写真（７’）を撮像する第２フェーズ（Ｘ２）を含む第５の処理ステップ（１０５）を含むことを特徴とする、請求項２又は３に記載の検出方法（１００）。
【請求項５】
対照写真（７’）が、培養培地（２）上に配置された定規（１５）の写真であることを特徴とする、請求項４に記載の検出方法（１００）。
【請求項６】
検出方法（１００）が、画像（７）と対照写真（７’）とを重ね合わせてノルムの表現（７’’）を形成する第３フェーズ（Ｘ３）を含むことを特徴とする、請求項４又は５に記載の検出方法（１００）。
【請求項７】
第５の処理ステップ（１０５）が、定規（１５）の基準点（１６）を局所化する第４フェーズ（Ｘ４）を含むことを特徴とする、請求項４から６のいずれか一項に記載の検出方法（１００）。
【請求項８】
第５の処理ステップ（１０５）がノルムの表現（７’’）を処理する第５フェーズ（Ｘ５）を含むことを特徴とする、請求項４から７のいずれか一項に記載の検出方法（１００）。
【請求項９】
第５フェーズ（Ｘ５）が、ノルムの表現（７’’）を均質化するための少なくとも１つの平滑化操作を含むことを特徴とする、請求項８に記載の検出方法（１００）。
【請求項１０】
第５フェーズ（Ｘ５）が、ノルムの表現（７’’）のストレッチを行い、ノルムの表現（７’’）のコントラストのヒストグラム（１７）を形成することを含む、ノルムの表現（７’’）のダイナミクスのストレッチを行う少なくとも１つの操作を含むことを特徴とする、請求項８又は９に記載の検出方法（１００）。
【請求項１１】
第５フェーズ（Ｘ５）が、閾値（１９）の検出及びノルムの表現（７’’）の輪郭（２０）の決定を含む、ノルムの表現（７’’）の少なくとも１つの閾値処理を含むことを特徴とする、請求項８から１０のいずれか一項に記載の検出方法（１００）。
【請求項１２】
最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を推定して化学物質（３）に対する生物学的粒子（１）の感受性を決定する少なくとも１つの操作を含むことを特徴とする、請求項３又は８から１１のいずれか一項に記載の検出方法（１００）。
【請求項１３】
画像（７）を撮像する第１フェーズ（Ｘ１）及び対照写真（７’）を撮像する第２フェーズ（Ｘ２）が、連続的に実施されるフェーズであることを特徴とする、請求項４から１２のいずれか一項に記載の検出方法（１００）。
【請求項１４】
画像（７）を撮像する第１フェーズ（Ｘ１）及び対照写真（７’）を撮像する第２フェーズ（Ｘ２）が、規定されたタイムラプスで実施されるフェーズであることを特徴とする、請求項４から１２のいずれか一項に記載の検出方法（１００）。
【請求項１５】
請求項１から１４のいずれか一項に記載の検出方法（１００）を実行するように構成されているプロセッサ。
【請求項１６】
請求項１５に記載のプロセッサを備えていることを特徴とする、第１の阻止域（Ｚ１）を検出するためのデバイス（１２）。
【請求項１７】
検知手段（６）、コリメートされた光線（９）を生成可能な光源（８）、及び光学フォーカス（８’）を備えていることを特徴とする、請求項１６に記載の検出デバイス（１２）。
【請求項１８】
検知手段（６）が、その上に培養培地（２）が拡がる第１の面（Ｐ１）に対して直角に配された検知軸（Ａ）を備えていることを特徴とする、請求項１７に記載の検出デバイス（１２）。
【請求項１９】
光源（８）が検知軸（Ａ）上に位置づけされ、培養培地（２）が検知手段（６）と光源（８）の間に置かれることを特徴とする、請求項１７に記載の検出デバイス（１２）。
【請求項２０】
光線（９）を培養培地（２）に方向転換するための少なくとも１つの半反射鏡（１０）を備えていることを特徴とする、請求項１７に記載の検出デバイス（１２）。
【請求項２１】
検知手段（６）が、テレセントリック対物レンズ（１１）を備えていることを特徴とする、請求項１６又は１７に記載の検出デバイス（１２）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化学物質の存在下、培養培地上での生物学的粒子の培養によって構成される少なくとも１つの第１の阻止域の有無を検出する方法に関し、該検出方法は、培養培地に生物学的粒子を播種する第１のステップ、培養培地に化学物質を与える第２のステップ、及び培養培地をインキュベーションする第３のステップを含む。
【背景技術】
【０００２】
文献国際公開第２０１１／１２５０３３号には、表面上の生物学的粒子のクラスターを検出する方法が記載されている。生物学的粒子は、細菌、酵母又は菌類などの微生物から、あるいは植物又は動物細胞から選択される。生物学的粒子は、典型的には１００μｍ以下の直径又は主要寸法を有する。表面は、培養培地と空気などの周囲媒体との界面、官能化支持体の表面、又は微多孔膜の表面から選択される。
【０００３】
この方法は、表面のトポグラフィー表現を決定することからなる第１のステップ、及び生物学的粒子のクラスター、とりわけ細菌コロニーに相当する可能性の高い領域を定める輪郭を、トポグラフィー表現上で検出することからなる第２のステップを含む複数のステップを有し、これらのステップは電子データ処理手段を使用して行われる。
【０００４】
第１のステップは、接触せず、かつ試料調製をせずに実施される光学的方法に基づいて行われる。第１の変形によれば、第１のステップは色共焦点マイクロトポグラフィーによって行われる。第２の変形によれば、第１のステップはストリオスコピー（strioscopy）又はオンブロスコピーによって行われる。より具体的には、第１のステップは、３次元表示を必要とする表面が光源によって照明されるフェーズ、この表面から反射された又は送信された光に対応する信号が光センサによって検出されるフェーズ、及び検出した信号から表面の３次元トポグラフィー表現を決定するフェーズを含む。
【０００５】
表面の照射は、周囲環境から表面の方向に向けられうる。照明がコリメートされない場合、測定区域に焦点を合わせることができる。光源は、空間的に及び／又は時間的にコヒーレントであっても、コヒーレントでなくてもよい。それは多色であっても単色であってもよい。検出は、リニアアレイのような１次元画像センサ、又はＣＭＯＳ型、ＣＣＤ、光電子増倍管、光ダイオード等のマトリクスのような２次元画像センサによって行われうる。このセンサは、検出された光スペクトルの分析を可能にする分光分析機能を有していてもよい。これはまた、共焦点検出のためのデバイスを構成するためにダイヤフラム又はピンホールに接続されていてもよい。
【０００６】
細菌コロニーは、オンブロスコピーの技法を使用して設定することによって観察できるようになる。平行光束は培養培地を含むペトリ皿を通過し、次いで第１のレンズによって検出器に結像する。細菌コロニーが培養培地の表面で成長する場合、高さのばらつきと、それによって表面に形成される局所勾配に起因して、光線が偏向する。観察表面における高さのばらつき及び／又は指標のばらつきによって偏向した放射線は、検出器によっては捉えられない。このデバイスは、分析される平面上の局所勾配の検出を可能にし、結果として、検出器によって形成される画像上の暗領域の出現をもたらす。よって、この方法によれば、細菌コロニーは、明るい背景上の暗い点として見え、この背景は培養培地の表面に相当する。培地の表面トポグラフィーの表現は、２次元表現、すなわち、２つの隣接するピクセル間の強度変化が被照射面の高さのばらつきを反映している画像である。
【０００７】
抗生物質などの化学物質に対する生物学的粒子の応答の診断の分野では、生物学的粒子の有無を検出する、迅速、有効、かつ確かな方法が必要とされている。化学物質の存在下、生物学的粒子の成長の阻止域の有無を検出するための多くの撮像技術が存在する。しかしながら、培養培地の表面及び寒天内における化学物質の拡散現象は、培地の表面における生物学的粒子、とりわけ微生物の成長と相まって、測定値が経時的に安定であって、使用する培地及び化学物質の種類に対して感受性ではない阻止域を検出することが困難であることを意味している。一方では、化学物質の濃度は、プラトー値に達するまで、拡散の最初の数時間で変化し；他方では、培養培地の存在内で、生物学的粒子は化学物質の濃度に依存する方式で成長する。異なる種類の化学物質、とりわけ抗生物質もまた異なる拡散挙動を有する場合があり、それら自体の屈折率を有する。よって、粒子が成長する成長域と、粒子にとって成長するには化学物質の濃度が高すぎる阻止域との間の安定した境界の決定は、特に複雑である。この欠点を克服するため、ＮＣＣＬＳ（米国臨床検査標準委員会（National Committee for Clinical Laboratory Standards））又はＥＵＣＡＳＴ（欧州抗菌薬感受性試験法検討委員会（European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing））などの規制当局の勧告は、化学物質の拡散現象が寒天内及び寒天上で安定しており、かつ、基準測定値と比較して、阻止域の測定値が確実かつ反復可能であることを確実にするために、１８時間、又は２０時間、任意選択的に２４時間の時点での単回測定（single reading）を行うことである。より具体的には、したがって、診断時間が、とりわけ８時間未満に改善された、確実性及び反復性が最適化された、このような方法を得ることが望まれている。
【発明の概要】
【０００８】
したがって、本発明の１つの目的は、使用される培養培地及び化学物質の種類にかかわらず、確実かつ、その反復性が最適化された、第１の阻止域の有無を検出する方法を提案することである。さらには、本発明の別の目的は、とりわけ培養培地内の化学物質の拡散を通じて、迅速かつ経時的に安定な、第１の阻止域を測定する方法を提案することである。本発明の別の目的は、短い、とりわけ８時間に等しい、より具体的には生物学的粒子の裸眼観察に基づいた先行技術から知られた方法よりも迅速な、化学物質の存在に対する応答時間を提示する、確実かつその反復性が最適化された生物学的粒子の有無を検出する方法を提案することである。本発明の別の目的は、該検出方法を行うための検出デバイスを提案することである。
【０００９】
本発明の１つの方法は、化学物質の存在下、培養培地上での生物学的粒子の培養によって構成される少なくとも１つの第１の阻止域の有無を検出する方法である。検出方法は、培養培地に生物学的粒子を播種する第１のステップ、培養培地に化学物質を含浸させた支持体を与える第２のステップ、及び培養培地をインキュベーションする第３のステップを含む。
【００１０】
本発明によれば、検出方法は、オンブロスコピーによって第１の阻止域の画像を撮像する第１フェーズを含む、培養培地の第１の阻止域を測定する第４のステップを含む。
【００１１】
本発明の第１の実施態様によれば、測定する第４のステップは、含浸支持体と第１の阻止域の辺縁との間の距離を測定することを含む。
【００１２】
本発明の第２の実施態様によれば、測定する第４のステップは、第１の阻止域の直径を測定することを含む。この実施態様では、この第４のステップの後に、有利には、化学物質に対する生物学的粒子の感受性を決定するために最小発育阻止濃度を推定する少なくとも１つの操作を行ってもよい。
【００１３】
検出方法は、有利には、培養培地の対照写真を撮像する第２フェーズを含む第５の処理ステップを含む。
【００１４】
対照写真は、例えば、培養培地上に配置された定規の写真である。
【００１５】
検出方法は、有利には、画像と対照写真とを重ね合わせてノルムの表現を形成する第３フェーズを含む。
【００１６】
第５の処理ステップは、有利には、定規の基準点を位置づけする第４フェーズを含む。
【００１７】
第５の処理ステップは、有利には、ノルムの表現を処理する第５フェーズを含む。
【００１８】
第５フェーズは、有利には、ノルムの表現を均質化するための少なくとも１つの平滑化操作を含む。
【００１９】
第５フェーズは、有利には、ノルムの表現のピクセル強度のダイナミクスのストレッチを行い、ノルムの表現のコントラストヒストグラムを形成する少なくとも１つの操作を含む。
【００２０】
第５フェーズは、有利には、閾値の検出及びノルムの表現の輪郭の決定を含む、ノルムの表現の少なくとも１つの閾値処理を含む。
【００２１】
検出方法は、有利には、化学物質に対する生物学的粒子の感受性を決定するために最小発育阻止濃度を推定する少なくとも１つの操作を含む。
【００２２】
画像を撮像する第１フェーズ及び対照写真を撮像する第２フェーズは、例えば、連続的に実施されるフェーズである。
【００２３】
画像を撮像する第１フェーズ及び対照写真を撮像する第２フェーズは、例えば、規定されたタイムラプスで実施されるフェーズである。
【００２４】
本発明の算出手段は、好ましくは測定ステップ１０４及び／又は処理ステップ１０５を行うために、該検出方法を行うように構成された算出手段である。
【００２５】
本発明のプロセッサは、有利には該算出手段を含む。
【００２６】
本発明の検出デバイスは、主に、検出デバイスがこの種のプロセッサを備えるという点で認識できる。
【００２７】
検出デバイスは、有利には、検知手段、コリメートされた光線を生成可能な光源、及び光学フォーカスを備える。
【００２８】
検知手段は、有利には、培養培地がその上に拡がる第１の面に対して直角に配された検知軸を備える。
【００２９】
光源は、有利には、検知軸上に位置づけされ、培養培地は検知手段と光源の間に置かれる。
【００３０】
検出デバイスは、有利には、光源から放出される光線を培養培地へと方向転換するための少なくとも１つの半反射鏡を備える。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
本発明の他の特徴及び利点は、添付の図面内の図を参照しつつ、実施態様の例が与えられる記述を読解することにより明らかとなるであろう。
【図１】本発明の検出方法を行うために使用されるペトリ皿の断面図
【図２】本発明の検出方法の概略図
【図３】本発明の検出方法のシーケンスの概略図
【図４】本発明の第１の実施態様に従った、３つに分けたそれぞれの時点での図１に示されるペトリ皿の概略的な上面図
【図４ａ】本発明の第２の実施態様に従った、３つに分けたそれぞれの時点での図１に示されるペトリ皿の概略的な上面図
【図４ｂ】本発明の第３の実施態様に従った、３つに分けたそれぞれの時点での図１に示されるペトリ皿の概略的な上面図
【図５】本発明の第１の実施態様に従った、３つに分けたそれぞれの時点での図１に示されるペトリ皿の概略的な上面図
【図５ａ】本発明の第２の実施態様に従った、３つに分けたそれぞれの時点での図１に示されるペトリ皿の概略的な上面図
【図５ｂ】本発明の第３の実施態様に従った、３つに分けたそれぞれの時点での図１に示されるペトリ皿の概略的な上面
【図６】本発明の第１の実施態様に従った、３つに分けたそれぞれの時点での図１に示されるペトリ皿の概略的な上面図
【図６ａ】本発明の第２の実施態様に従った、３つに分けたそれぞれの時点での図１に示されるペトリ皿の概略的な上面図
【図６ｂ】本発明の第３の実施態様に従った、３つに分けたそれぞれの時点での図１に示されるペトリ皿の概略的な上面図
【図７】図２に示される検出方法を行うための検出デバイスの第１の変形の第１の実施態様の概略図
【図８】図７に示される検出デバイスから得られる画像の例示
【図９】図２に示される検出方法を行うための検出デバイスの第１の変形の第２の実施態様の概略図
【図１０】図２に示される検出方法を行うための検出デバイスの第２の変形の概略図
【図１１】２時間の測定時間Ｔ１における、それぞれ、アンピシリン、アンピシリン−スルバクタム及びピペラシリン−タゾバクタムの存在下での大腸菌（ＡＴＣＣ３５２１８）の培養の図１０に示される検出デバイスによって撮像された画像
【図１２】４時間の測定時間Ｔ１における、それぞれ、アンピシリン、アンピシリン−スルバクタム及びピペラシリン−タゾバクタムの存在下での大腸菌（ＡＴＣＣ３５２１８）の培養の図１０に示される検出デバイスによって撮像された画像
【図１３】それぞれ２時間及び４時間の測定時間Ｔ１における、アンピシリンの存在下での大腸菌（ＡＴＣＣ２５９２２）の培養の図１０に示される検出デバイスによって撮像された画像
【図１４】それぞれ、０時間、２時間、４時間、６時間、８時間及び２４時間の測定時間Ｔ１における、  アンピシリンの存在下での大腸菌（ＡＴＣＣ３５２１８）の培養の図９に示される検出デバイスによって撮像された画像
【図１５】それぞれ、０時間、２時間、４時間、６時間、８時間及び２４時間の測定時間Ｔ１における、アンピシリン−スルバクタムの存在下での大腸菌（ＡＴＣＣ３５２１８）の培養の図９に示される検出デバイスによって撮像された画像
【図１６】それぞれ、０時間、２時間、４時間、６時間、８時間及び２４時間の測定時間Ｔ１における、ピペラシリン−タゾバクタムの存在下での大腸菌（ＡＴＣＣ３５２１８）の培養の図９に示される検出デバイスによって撮像された画像
【図１７】本発明の検出方法を行うことによって観察された、アンピシリンの存在下での大腸菌（ＡＴＣＣ２５９２２）、黄色ブドウ球菌（ＡＴＣＣ２５９２３）及び大腸菌（ＡＴＣＣ３５２１８）の阻止域の直径の時間依存性の発達の概略図
【図１８】本発明の検出方法を行うことによって観察された、アンピシリン−スルバクタムの存在下での大腸菌（ＡＴＣＣ３５２１８）の阻止域の直径の時間依存性の発達の概略図
【図１９】図２に示される検出方法のそれぞれのステップの概略図
【図２０】図２に示される検出方法のそれぞれのステップの概略図
【図２１】図２に示される検出方法の第５フェーズの連続操作の概略図
【図２２】図２に示される検出方法の第５フェーズの連続操作の概略図
【図２３】図２に示される検出方法の第５フェーズの連続操作の概略図
【図２４】図２に示される検出方法の第５フェーズの連続操作の概略図
【図２５】図２に示される検出方法の第５フェーズの連続操作の概略図
【図２６】図２に示される検出方法を行うことによって得られたノルムの表現の概略図
【図２７】図２に示される検出方法を行うことによって得られたノルムの表現の概略図
【図２８】図２に示される検出方法を行うことによって得られたノルムの表現の概略図
【図２９】図２に示される検出方法を行うことによって得られたノルムの表現の概略図。
【図３０】図２に示される検出方法を行うことによって得られたノルムの表現の概略図。
【図３１】４時間、５時間及び２０時間のそれぞれの測定時間Ｔ１における、セフォキシチンの存在下、不透明な発色培養培地ＣｈｒｏｍｏＩＤＴＭＭＲＳＡ  Ｓｍａｒｔ（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ社、参照番号４１３０５０）上での黄色ブドウ球菌の懸濁液の図９に示される検出デバイスによって撮像された画像
【図３２】４時間、５時間及び２０時間のそれぞれの測定時間Ｔ１における、セフォキシチンの存在下、透明な発色培養培地ＣｈｒｏｍｏＩＤＴＭＭＲＳＡ（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ社、参照番号４３４５１）上での黄色ブドウ球菌の懸濁液の図９に示される検出デバイスによって撮像された画像
【図３３】４時間、５時間、６時間のそれぞれの測定時間Ｔ１における、ゲンタマイシンの存在下、発色培養培地ＣＰＳ（登録商標）ＩＤ  ３（ＣＰＳ３）（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ社、参照番号４３５４１）上での表皮ブドウ球菌の懸濁液の図９に示される検出デバイスによって撮像された画像
【図３４】４時間、５時間、６時間のそれぞれの測定時間Ｔ１における、ゲンタマイシンの存在下、発色培養培地ＣＰＳ（登録商標）ＩＤ  ３（ＣＰＳ３）（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ社、参照番号４３５４１）上での黄色ブドウ球菌の懸濁液の図９に示される検出デバイスによって撮像された画像
【図３５】６時間の測定時間Ｔ１における、ゲンタマイシンの存在下、ミューラー・ヒントンＥ培養培地（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ  ＭＨＥ、参照番号４１３８２２）上での大腸菌の培養を、異なる検出デバイス、すなわちそれぞれ「ＳＩＵ」、「ＡＤＶＥＮＣＩＳ」及び図９に示されるデバイスによって撮像した画像
【図３６】３つの検出デバイスで撮像した、図３５ａ、３５ｂ及び３５ｃの画像で観察される３つのグレイレベルプロファイルの概略図
【図３７】それぞれ、４時間、６時間及び２４時間の測定時間Ｔ１でインキュベーション後、ゲンタマイシンの存在下、ミューラー・ヒントンＥ培養培地（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ  ＭＨＥ、参照番号４１３８２２）上での大腸菌（ＡＴＣＣ「アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（American Type Culture Collection）」２５９２２）の懸濁液を、検出デバイス「ＳＩＵ」で撮像した画像
【図３８】それぞれ、３時間３０分、６時間及び２４時間の測定時間Ｔ１でインキュベーション後、ゲンタマイシンの存在下、ミューラー・ヒントンＥ培養培地（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ  ＭＨＥ、参照番号４１３８２２）上での大腸菌（ＡＴＣＣ２５９２２）の懸濁液の、図９に従ったオンブロスコピーによる検出デバイスで撮像した画像
【図３９】図３７ａ、３７ｂ及び３７ｃ及び３８ａ、３８ｂ、３８ｃを得るために使用した２つのデバイスの各測定時間において観察された３つのグレイレベルプロファイルの概略図
【００３２】
図１又は２を参照すると、医療及び／又は製薬の分野では、化学物質３と接触した培養培地２上で生物学的粒子１の有無を検出する方法１００を使用することがしばしば必要とされる。培養培地２には、生物学的粒子１、次いで、ある特定の生物学的粒子１の成長を阻害可能な化学物質３が、連続して与えられる。生物学的粒子１は、細菌、酵母又は菌類などの微生物から、又は植物又は動物細胞から、無差別に選択される。培養培地２は、好ましくは寒天、寒天の層などである。化学物質３は、とりわけ、抗生物質、抗真菌剤、抗微生物又は同様の化合物である。
【００３３】
より具体的には、化学物質３の存在に対する生物学的粒子１の確実かつ迅速な応答を特徴づけることができることが望ましく、該応答は、一般に、次の３つの項目：感受性、中間又は耐性の１つに分類される。「感受性」とは、化学物質３のある特定の濃度を発端として、化学物質３の存在下での生物学的粒子１の成長又は生存が不可能であることを意味する。「中間」とは、化学物質３のある特定の濃度を発端として、化学物質３の存在下での生物学的粒子１の成長に支障をきたすことを意味する。「耐性」とは、化学物質３の存在下での生物学的粒子１の成長が可能であることを意味する。
【００３４】
この種の検出方法１００は、とりわけ、患者の病理を検出するために用いられる医療的及び／又は製薬的診断の分野において頻繁に適用される。結果として、該検出方法１００は、化学物質３に対する生物学的粒子１の前述の応答の性質が、確信的に、疑いもなくかつ明白に望ましいという意味で信頼できることが所望される。したがって、その連続シーケンスが図３に示されるこのような検出方法１００は迅速であることが望ましく、生物学的粒子１が化学物質３と接触に至る初期時間Ｔ０と該信頼できる応答が得られる検出時間ＴＸとの間に経過する応答時間は可能な限り短いこと、とりわけ８時間未満であることが望ましいと言える。このような検出方法１００は適切な反復性を有することも望ましいといえる。このような目的は、有利には、本発明の検出方法１００を行うことによって達成される。
【００３５】
一般論として、図２を参照すると、本発明の検出方法１００は、培養培地２に生物学的粒子１の抽出物を播種する第１のステップ１０１を含む。生物学的粒子１の抽出物は、例えば、患者から直接採取した生物学的粒子１の生試料である。この場合、生試料は、試料が多様な生物学的粒子１を含む場合には、存在する生物学的粒子１の株を単離し、選択及び単離された生物学的粒子１を増加させるための前培養フェーズに供される。生物学的粒子１の抽出物は、例えば、同様の方式で調製され、とりわけ濾過され、遠心分離され、及び／又は精製された試料である。生物学的粒子１の試料は、０．５マクファーランドの濃度の標準液など、有効に分析するのに十分な生物学的粒子１のバイオマスを含む。生物学的粒子１の抽出物は、例えば、尿、血液、脳脊髄液又は同様の体液に由来する。
【００３６】
培養培地２は、例えば、生物学的粒子１の抽出物で満たされるか、又は塗付することによって生物学的粒子１を播種されるか、又はレーキを使用して生物学的粒子を拡げることによって生物学的粒子を与えられる。次に、ペトリ皿４は横方向にかき混ぜられて、生物学的粒子１の抽出物をできるだけ一様に培養培地２上に分布され、次いで上清がペトリ皿４から除去される。播種する第１のステップ１０１は、本発明の規則を逸脱することなく、上述のものとは異なる特徴を有しうる。
【００３７】
次に、検出方法１００は、例えば、培養培地２上の含浸支持体５の受け入れ区域Ｒに、化学物質３を与えた少なくとも１つの含浸支持体５を置くことから開始する、初期時点Ｔ０において少なくとも単回用量の化学物質３を与えられる第２のステップ１０２を含む。
【００３８】
含浸支持体５は、例えば、円柱体を薄く切った全体的な形態を有する、化学物質３を含浸させたディスクである。ディスクは、その容積全体に均質な、ある量の化学物質３を含む。
【００３９】
含浸支持体５はまた、例えば、全体的に矩形の形態をした細長いストリップである。ストリップは、例えば、ストリップの一方の短縁から対向する短縁まで上昇する濃度勾配をたどる、ある濃度の化学物質３を含む。
【００４０】
含浸支持体５は、例えば、化学物質３を含む水滴へと縮小される。
【００４１】
図４、５及び６に示される一実施態様によれば、培養培地２は単一の含浸支持体５を与えられる。受け入れ区域Ｒは、好ましくはペトリ皿４の中心点によって形成される。
【００４２】
図４ａ、５ａ及び６ａに示される別の実施態様によれば、培養培地２は、複数の含浸支持体５’、５’’、５’’’、５’’’’を与えられ、各含浸支持体５’、５’’、５’’’、５’’’’は、例えば、他の含浸支持体５’、５’’、５’’’、５’’’’とは異なるそれ自体の化学物質３の濃度を有する。例えば、第１の含浸支持体５’は、第２の含浸支持体５’’に含まれる化学物質３の第２の濃度よりも低い、第１の濃度の化学物質３を含み、第２の濃度は第３の含浸支持体５’’’に含まれる化学物質３の第３の濃度より低く、第３の濃度は第４の含浸支持体５’’’に含まれる化学物質３の第４の濃度より低い。複数の受け入れ区域Ｒが存在し、これらは例えば、培養培地２から等距離にある地点によって形成される。別の実施態様によれば、各含浸支持体５’、５’’、５’’’、５’’’’は、他の含浸支持体５’、５’’、５’’’、５’’’’とは異なる化学物質３を含む。
【００４３】
図４ｂ、５ｂ及び６ｂに示されるさらに別の実施態様によれば、培養培地２は、それぞれストリップの形態をした、それぞれ化学物質３を含浸させた複数の含浸支持体５’、５’’、５’’’、５’’’’を与えられる。複数の受け入れ区域Ｒが存在し、それらは例えば、ペトリ皿４のそれぞれの半径に適合される。
【００４４】
これらの変形は、場合によって、最適化された分析の変化量（rate）で、さまざまな化学物質３に対する、かつ、さまざまな化学物質３のさまざまな濃度に対する生物学的粒子１の応答の分析の効率及び速度を最適化することを目的とする。これらのさまざまな変形によれば、第２の与えられるステップ１０２は、培養培地２の内部への化学物質３の即座の送達を生じ、これは含浸支持体５、５’、５’’、５’’’、５’’’’から培養培地２の内部へと伝播される。
【００４５】
次に、検出方法１００はインキュベーションする第３のステップ１０３を含み、この間に、生物学的粒子１は、インキュベーション時間に対応する規定されたタイムラプスの間に化学物質３と相互作用する。好ましくは、該インキュベーションステップ１０３は、制御環境下、例えば３７℃の一定の温度で行われる。インキュベーション時間は、好ましくはほぼ数時間、とりわけ２時間、又は４時間、又は６時間、又は８時間、又は１８時間、又は２０時間、又は２４時間である。典型的には、インキュベーション時間は下記の観測時間Ｔ１、Ｔ２に等しい。
【００４６】
一方では図５、５ａ、５ｂ、他方では図６、６ａ、６ｂをそれぞれ参照すると、これらの配置の結果として、第１の観測時間Ｔ１での観測、続いて第２の観測時間Ｔ２での観測の間に、生物学的粒子１が化学物質３に対して感受性である好ましい事例では、その内側で生物学的粒子１が阻害されている、生物学的粒子１の少なくとも１つの第１の阻止域Ｚ１が形成される。この事例では、生物学的粒子１が破壊されるか、又はそれらの成長が停止される。そうでなければ、培養培地２は均質なままであり、生物学的粒子１の濃度は培養培地２内全てにおいて全体的に均質である。この場合、阻止域Ｚ１が存在しないことが観察される、言い換えれば、化学物質３の存在下での生物学的粒子１の成長が観察される。
【００４７】
図５、５ａ及び図６、６ａでは、阻止域Ｚ１は全体的に円形であり、受け入れ区域Ｒを中心とする。生物学的粒子１の各阻止域Ｚ１は、図５、５ａに示される第１の観測時間Ｔ１と図６、６ａに示される第２の観測時間Ｔ２との間で、受け入れ区域Ｒから放射状に拡大する傾向にある。
【００４８】
図５ｂ及び図６ｂでは、阻止域Ｚ１は全体的に楕円形であり、受け入れ区域Ｒの両側に対称的に拡がる。生物学的粒子１の各阻止域Ｚ１は、図５ｂに示される第１の観測時間Ｔ１と図６ｂに示される第２の観測時間Ｔ２との間で、受け入れ区域Ｒから外側に向かって拡大する傾向にある。
【００４９】
検出方法１００は、次に、オンブロスコピーによって第１の阻止域Ｚ１を測定する第４のステップ１０４を含む。第４の測定ステップ１０４は、阻止域Ｚ１の受け入れ区域Ｒと端縁Ｂとの間に延びる距離Ｆを測定するフェーズを含む。
【００５０】
図６及び６ａでは、距離Ｆは、阻止域Ｚ１の直径Ｄに等しい。
【００５１】
図６ｂでは、距離Ｆは、含浸支持体５に沿った阻止域Ｚ１の長さに等しい。
【００５２】
図７、９及び１０を参照すると、第４の測定ステップ１０４は、画像７の検知手段６及び光源８を使用する。一般論として、光源８は、ペトリ皿４を照射し、その画像７は、検知手段６によって規則的な時間間隔で、又は規定されたタイムラプスの後に、各ペトリ皿４について、又は連続的にまったく同一のペトリ皿４上で撮像される。検知手段６は、好ましくは、培養培地２が拡がる第１の面Ｐ１に対して直角に配された検知軸Ａを備える。検知手段６は、有利には、培養培地２の上面図を撮像するように、ペトリ皿４の上に位置づけられる。検知手段６は、例えばＣＣＤカメラ、とりわけＢａｓｌｅｒ  ｐｉＡ２４００−１７  ｇｍ型であり、これはテレセントリック対物レンズ（telecentric objective）１１を備えている。光源８は、好ましくは、培養培地２に直角に到達する平行な光線９を生成することができる、コリメートされた照明器である。光源８は、無差別に赤色、緑色、青色及び白色の発光範囲を含む複数のダイオードを備えている。
【００５３】
図７に示される第１の変形の第１の実施態様によれば、光源８は、ペトリ皿４の上方に横方向に配置される。図９に示される第１の変形の第２の実施態様によれば、光源８はペトリ皿４の下方に横方向に配置される。光源８は、ペトリ皿４の直接照射を可能にする光学フォーカス８’と関連付けられている。第１の実施態様によれば、光源８は、光源８によってペトリ皿４に放射される光線９を方向転換するために４５°傾斜した半反射鏡１０と関連付けられている。光源８は、例えば、Ｏｐｔｏ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ−ＬＴＣＬ  ０４８−Ｗ型である。光学フォーカス８’は、例えば、Ｏｐｔｏ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ−ＬＴＣＬ  ２４型である。両方の事例において、テレセントリック対物レンズ１１は、とりわけ、４６×３８．５ｍｍの焦点野及び１３４．６ｍｍの作動距離を有するＯｐｔｏ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ−ＴＣ２３ ０４８型である。
【００５４】
図１０に示される第２の実施態様によれば、光源８により放射される光線９を直接ペトリ皿４に向けるために、光源８はペトリ皿４の下方に中心に置かれる。より具体的には、光源８は、背面照明がペトリ皿４に届くように、検知軸Ａに対して軸方向に配置される。この場合、光源８は、例えば、発光波長が５２０ ｎｍのＯｐｔｏ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ−ＬＴＣＬ  ０２４−Ｇ型であり、テレセントリック対物レンズ１１は、例えば、８．４４×７．０７ｍｍの焦点野及び６５ｍｍの作動距離を含むＥｄｍｕｎｄ  Ｏｐｔｉｃｓ−６３７３３型である。
【００５５】
検知手段６、光源８並びに任意選択的に半反射鏡１０及び光学フォーカス８’は、本発明の検出方法１００を行うことが可能な検出デバイス１２を形成する。
【００５６】
図５、６、５ａ、６ａ、５ｂ、６ｂ及び８を参照すると、光線９が生物学的粒子１を含まない培養培地２の第１の阻止域Ｚ１を通過するとき、光線９は、検知手段６によって撮像された画像７が、光、とりわけ白色光であり、かつ、第１の阻止域Ｚ１と同一の形態をした画像７の第１の部分を表すように、偏向せずに培養培地２を通過する。光線９が生物学的粒子１を含む第２の増殖域Ｚ２を通過するとき、生物学的粒子１は、検知手段６によって撮像された画像７が、暗い、とりわけ黒い、第２の増殖域Ｚ２と同一の形態をした画像２の第２の部分を表すように、光線９を偏向させる。このことにより、結果として、所与の観察時間において、第１の阻止域Ｚ１と第２の増殖域Ｚ２との間のコントラストは、通常の先行技術の方法を用いて観察された同一のコントラストよりも大きくなる。図８に示される画像７が図７に示される検出デバイス１２を使用して得られるこの段階の説明において、生物学的粒子は黄色ブドウ球菌（ＡＴＣＣ２５９２３）であり、化学物質３はシプロフロキサシンであり、検出時間ＴＸは１８時間であることに留意されたい。
【００５７】
２時間の測定時間Ｔ１における、それぞれ、アンピシリン、アンピシリン−スルバクタム及びピペラシリン−タゾバクタムの存在下での大腸菌（ＡＴＣＣ３５２１８）の培養の画像７である図１１ａ、１１ｂ及び１１ｃ、及び、４時間の測定時間Ｔ１における、それぞれ、アンピシリン、アンピシリン−スルバクタム及びピペラシリン−タゾバクタムの存在下での大腸菌（ＡＴＣＣ３５２１８）の培養の画像７である図１２ａ、１２ｂ及び１２ｃ、ならびに、それぞれ２時間及び４時間の測定時間Ｔ１における、アンピシリンの存在下での大腸菌（ＡＴＣＣ２５９２２）の培養の画像７である図１３ａ及び１３ｂを参照すると、該画像７は、ストリップ１３から放射状をなしている、ストリップ１３で構成されるペトリ皿４の部分画像であり、ストリップ１３はペトリ皿４の受け入れ区域Ｒと周辺端Ｅとの間に延びる。このような事例では、検出方法１００は、より良好な解像度及び第１の阻止域Ｚ１のより迅速な検出を与えるという利点を提示する、マイクロオンブロスコピーによる検出方法である。よって、図１２ｂ、１２ｃ及び１３ｂでは、第１の阻止域Ｚ１は、４時間の検出時間ＴＸで確認でき、又は図１１ｂ、１１ｃ及び１３ａでは２時間の検出時間ＴＸで確認できる。結果は、４時間の検出時間ＴＸでのアンピシリン−スルバクタム混合物に対する及びピペラシリン−タゾバクタム混合物に対する大腸菌（ＡＴＣＣ３５２１８）の感受性に関する、また、アンピシリンに対する大腸菌（ＡＴＣＣ３５２１８）の耐性に関する確実かつ明確な応答である。結果は、２時間の検出時間ＴＸでのアンピシリンに対する大腸菌（ＡＴＣＣ２５９２２）の感受性に関する確実かつ明確な応答であり、この応答は、裸眼観察法などの先行技術の参照方法に匹敵するが、検出時間がはるかに短い。
【００５８】
それぞれ、０時間、２時間、４時間、６時間、８時間及び２４時間の測定時間Ｔ１における、アンピシリンの存在下での大腸菌（ＡＴＣＣ３５２１８）の培養の画像７である図１４ａ、１４ｂ、１４ｃ、１４ｄ、１４ｅ及び１４ｆを参照すると、アンピシリンに対する大腸菌（ＡＴＣＣ３５２１８）の耐性の確実かつ明確な応答が４時間を発端として確認できることは、注目に値する。実際、４時間を発端として阻止域は検出されず、これは、経時により、確実かつ反復可能である。
【００５９】
それぞれ、０時間、２時間、４時間、６時間、８時間及び２４時間の測定時間Ｔ１における、アンピシリン−スルバクタムの存在下での大腸菌（ＡＴＣＣ３５２１８）の培養の画像７である図１５ａ、１５ｂ、１５ｃ、１５ｄ、１５ｅ及び１５ｆを参照すると、アンピシリン−スルバクタム混合物に対する大腸菌（ＡＴＣＣ３５２１８）の感受性の確実かつ明確な応答が４時間を発端として確認できることは、注目に値する。実際、４時間を発端として検出される阻止域は、経時により反復可能に測定できる安定な直径を有している。
【００６０】
それぞれ、０時間、２時間、４時間、６時間、８時間及び２４時間の測定時間Ｔ１で、ピペラシリン−タゾバクタムの存在下での大腸菌（ＡＴＣＣ３５２１８）の培養の画像７である図１６ａ、１６ｂ、１６ｃ、１６ｄ、１６ｅ及び１６ｆを参照すると、アンピシリン−スルバクタム混合物に対する大腸菌（ＡＴＣＣ３５２１８）の感受性の確実かつ明確な応答が４時間を発端として確認できることは、注目に値する。実際、４時間を発端として検出される阻止域は、経時により反復可能に測定できる安定な直径を有している。図１４から１６の例は、阻止域の検出にオンブロスコピーを使用することの利益を示しており、この方法におけるオンブロスコピーの使用、より具体的には、好ましくはコリメートされた照明器と結合させた、テレセントリック対物レンズの使用の利点を実証するものである。
【００６１】
再び図２を参照すると、化学物質３に対するさまざまな生物学的粒子１の前述の応答は、有利には、本発明の検出デバイス１２によって得られる画像７を処理する第５のステップ１０５を含む、本発明の検出方法１００から得られる。第５の処理ステップ１０５は、例えば画像解析及び処理手段を含む、このステップを実行するように構成された算出手段１４を用いることによって行われ、算出手段１４は、検出デバイス１２に含まれるプロセッサのパーツを形成する。
【００６２】
第５の処理ステップ１０５の第１のアプアローチによれば、後者は、例えば、画像７のガウシアンフィルタ、画像それぞれのプロファイルの取得、及び該プロファイルの微分を含む。
【００６３】
第５の処理ステップ１０５の第２のアプアローチによれば、後者は、例えば、受け入れ区域Ｒの局所化、画像の高いダイナミックレンジの設定、後者の中央値フィルタリング、画像を受け入れ区域Ｒを中心に回転させることによるプロファイルの獲得、該プロファイルの微分、及びプロファイルの平均値を算出して各々の画像７内における第１の阻止域Ｚ１の有無を決定することを含む。
【００６４】
前述のアプアローチのいずれかによれば、検出方法１００は、時間ｔの関数としての第１の阻止域Ｚ１の直径Ｄを表す、阻害応答の動力学を決定可能にし、ここで、該動力学は図１７及び１８に示されている。図１７では、曲線Ｃ’１、Ｃ’２、Ｃ’３は、それぞれ、図１４ａから１４ｆ、図１５ａから１５ｆ及び図１６ａから１６ｆにおける阻害応答の動力学を示している。図１８では、曲線Ｃ２は、この抗生物質に対する腸内細菌についての基準閾値ＢＰに対する、抗生物質アンピシリン−スルバクタムの存在下での大腸菌（ＡＴＣＣ３５２１８）の阻害応答の動力学を例証している。６時間後、測定した直径Ｄは、特定の基準閾値ＢＰよりも大きい。結果として、この株はこの抗生物質に対して感受性であるとみなされる。
【００６５】
第５の処理ステップ１０５の第３のアプアローチは図１９から３０に示される。
【００６６】
図１９では、第５の処理ステップ１０５は、ペトリ皿４に含まれる培養培地２上に配置された定規１５の対照写真７’を撮像する第２フェーズＸ２を含み、この第２フェーズＸ２も検出デバイス１２によって行われる。次に、第５の処理ステップ１０５は、画像７と対照写真７’とを、より具体的にはそれらのそれぞれの受け入れ区域Ｒを重ね合わせて培養培地２のノルムの表現７’’を形成する第３フェーズＸ３を含む。
【００６７】
図２０では、第５の処理ステップ１０５は、定規１５の基準点１６を局所化する第４フェーズＸ４を含む。示される例では、基準点１６は定規１５上の表示「２５６」であり、この基準点１６は他の何らかの、及び相対的ないずれかの表示で構成されてもよい。基準点１６は、カーテシアン座標Ｘ２５６及びＹ２５６を含む。
【００６８】
図２１から２５では、第５の処理ステップ１０５は、ノルムの表現７’’を処理する第５フェーズＸ５を含む。
【００６９】
図２１では、第５フェーズＸ５は、ノルムの表現７’’を均質化するための少なくとも１つの平滑化操作を含む。該平滑化操作は、例えば、ノルムの表現７’’のガウシアンフィルタリングを発端として行われる。好ましくは、平滑化操作は、数回、とりわけ７回行われる。
【００７０】
図２２では、第５フェーズＸ５は、ノルムの表現７’’のピクセル強度のダイナミクスのストレッチを行って、ノルムの表現７’’のコントラストのヒストグラム１７を形成する少なくとも１つの操作を含み、このコントラストはノルムの表現７’’の暗いピクセルと明るいピクセルとの間で考慮される。これは、結果として、ノルムの表現７’’の有用なダイナミクス１８の決定をもたらす。
【００７１】
図２３では、第５フェーズＸ５は、例えば、閾値１９の検出及びノルムの表現７’’のデジタル化に由来する輪郭２０の決定を含む、ノルムの表現７’’の少なくとも１つの閾値処理を含む。
【００７２】
図２４では、第５フェーズＸ５は、一般に頭字語ＭＩＣで知られる最小発育阻止濃度を、参照される最小発育阻止濃度ＸＭＩＣの横座標の決定に基づいて推定する、少なくとも１つの操作を含む。
【００７３】
図２５では、第５フェーズＸ５は、以下の関係［１］から最小発育阻止濃度ＭＩＣを算出する、少なくとも１つの操作を含む：
0006783150.tif 000002
ここで、定数「ｄｉｖ」は、倍数２で区切られた定規１５の２つの目盛りの間のピクセル数に相当する。定数「ｄｉｖ」は、例えば、１６９ピクセルに等しい。
【００７４】
これらの配置により、そこを発端として第１の阻止域Ｚ１が見られる、化学物質３の濃度である最小発育阻止濃度ＭＩＣが、正確に、確実に、反復可能に、かつ短い、とりわけ８時間以下の信頼できる応答時間で、決定される。
【００７５】
図２６及び２７は、アンピシリンの存在下での大腸菌（ＡＴＣＣ２５９２２）の培養のノルムの表現７’’を示しており、６時間を発端として、算出した最小濃度ＭＩＣが大腸菌（ＡＴＣＣ２５９２２）の応答をアンピシリンに対する感受性として特徴づけることを可能にすることは注目に値する。
【００７６】
図２８は、アンピシリンの存在下での黄色ブドウ球菌（ＡＴＣＣ２５９２３）の培養のノルムの表現７’’を示しており、６時間を発端として、算出した最小濃度ＭＩＣが黄色ブドウ球菌（ＡＴＣＣ２５９２３）の応答をアンピシリンに対する感受性として特徴づけることができることは注目に値する。
【００７７】
図２９は、アンピシリンの存在下での大腸菌（ＡＴＣＣ３５２１８）の培養のノルムの表現７’’を示しており、第１の阻止域Ｚ１が存在しないことに基づいて、大腸菌（ＡＴＣＣ３５２１８）がアンピシリンに対して耐性であることは注目に値する。
【００７８】
図３０は、カラムの左から右に順番に、それぞれ、アンピシリン、ピペラシリンとタゾバクタムの混合物、及びアンピシリンとスルバクタムの混合物の存在下での大腸菌（ＡＴＣＣ３５２１８）の培養のノルムの表現７’’を示しており、大腸菌（ＡＴＣＣ３５２１８）が、ＥＵＣＡＳＴ（欧州抗菌薬感受性試験法検討委員会（European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing））に従って、アンピシリンに対する耐性、ピペラシリン及びタゾバクタムの混合物に対して感受性、及びアンピシリンとスルバクタムの混合物に対して中間であることは注目に値する。
【００７９】
これらの配置は、本発明の検出方法１００を使用することにより、生物学的粒子１が化学物質３に対して感受性である場合に、第１の阻止域Ｚ１が、生物学的粒子１と化学物質３とを接触させて４時間後には確実に検出可能になるようになされる。
【００８０】
図３１ａ、３１ｂ、３１ｃは、不透明な発色培養培地ＣｈｒｏｍｏＩＤＴＭＭＲＳＡ  Ｓｍａｒｔ（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ社、参照番号４１３０５０）上で、黄色ブドウ球菌の懸濁液の図９に示される検出デバイスによって撮像された画像である。播種は、０．５マクファーランドで較正された溶液で満たすことによって実施され；次に、セフォキシチンの濃度勾配を含むＥｔｅｓｔ（登録商標）ストリップ（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ社）が培地の表面に配置される。培地は３７℃でインキュベートされ、画像は、それぞれ、４時間（図３１ａ）、５時間（図３１ｂ）及び最後に２０時間（図３１ｃ）の測定時間Ｔ１で撮像される。
【００８１】
図３２ａ、３２ｂ、３２ｃは、透明な発色培養培地ＣｈｒｏｍｏＩＤＴＭＭＲＳＡ（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ社、参照番号４３４５１）上で、黄色ブドウ球菌の懸濁液の図９に示される検出デバイスによって撮像された画像である。播種は、０．５マクファーランドで較正された溶液で満たすことによって実施され；次に、セフォキシチンの濃度勾配を含むＥｔｅｓｔ（登録商標）ストリップ（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ社）が培地の表面に配置される。培地は３７℃でインキュベートされ、画像は、それぞれ、４時間（図３２ａ）、５時間（図３２ｂ）、及び２０時間（図３２ｃ）の測定時間Ｔ１で撮像される。
【００８２】
図３３ａ、３３ｂ、３３ｃは、発色培養培地ＣＰＳ（登録商標）ＩＤ  ３（ＣＰＳ３）（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ社、参照番号４３５４１）上で、表皮ブドウ球菌の懸濁液の図９に示される検出デバイスによって撮像された画像である。播種は、０．５マクファーランドで較正された溶液で満たすことによって実施され；次に、ゲンタマイシンの濃度勾配を含むＥｔｅｓｔ（登録商標）ストリップ（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ社）が培地の表面に配置される。培地は３７℃でインキュベートされ、画像は、それぞれ、４時間（図３３ａ）、５時間（図３３ｂ）、及び６時間（図３３ｃ）の測定時間Ｔ１で撮像される。
【００８３】
図３４ａ、３４ｂ、３４ｃは、発色培養培地ＣＰＳ（登録商標）ＩＤ  ３（ＣＰＳ３）（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ社、参照番号４３５４１）上で、黄色ブドウ球菌の懸濁液の図９に示される検出デバイスによって撮像された画像である。播種は、０．５マクファーランドで較正された溶液で満たすことによって実施され；次に、ゲンタマイシンの濃度勾配を含むＥｔｅｓｔ（登録商標）ストリップ（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ社）が培地の表面に配置される。培地は３５℃でインキュベートされ、画像は、それぞれ、４時間（図３４ａ）、５時間（図３４ｂ）、及び６時間（図３４ｃ）の測定時間Ｔ１で撮像される。
【００８４】
４時間を発端とする図３１から３４で得られた最小発育阻止濃度の値は、２０時間のインキュベーション後の通常の読み取り（reading）では、対応する微生物についてのＥＵＣＡＳＴの勧告を満たす。図３１ａ、３２ａ、３３ａ及び３４ａにおいて４時間を発端とする読み取り可能な最小発育阻止濃度の値が、図３１ｂ、３２ｂ、３３ｂ及び３４ｂにおいて５時間を発端とする読み取り可能な値とも似通っていることは注目に値する。さらには、観測可能な阻止域は、十分に安定であり、かつ反復可能であり、したがって、６時間（図３３ｃ、３４ｃ）及び２０時間（図３１ｃ、３２ｃ）における値も同様である。したがって、オンブロスコピーの使用、より具体的には、好ましくはコリメートされた照明器と結合した、テレセントリック対物レンズの使用における利点は、全ての種類の培養培地、とりわけ発色培地について確実かつ反復可能な最小発育阻止濃度の値の、８時間未満、又は６時間未満、好ましくは４時間の時点における読み取りについて実証される。この技法の利点は、分析が困難なことが知られている不透明な培地上での撮像（図３１ａ、３１ｂ、３１ｃ）についても実証されている。例えば、培地の不透明性は、寒天を通して照明の拡散を増大し、よって撮像される画像のコントラストを低下させる。例えば、図３１から３４のすべての撮像画像が細菌増殖域と阻止域との間に十分に高いコントラストを有することが分かり、したがって、画像は、例えば画像解析及び処理手段を含む算出手段を使用する解析を容易にし、この算出手段は検出デバイス１２に含まれるプロセッサのパーツを形成する。
【００８５】
最後に、２つの異なる種類の抗生物質、すなわち殺菌剤（セフォキシチン）及び静菌剤（ゲンタマイシン）において実施されたこれらの解析は、迅速に、４時間を発端として、８時間未満で、さらには経時により反復可能に阻害の値を得る、本発明に従った方法の潜在的な能力をも示すことができる。撮像画像における化学物質の屈折率の影響は、オンブロスコピーの使用、より具体的には好ましくはコリメートされた照明器に結合された、テレセントリック対物レンズの使用によっても制限される。発色培地などの培地の特定に用いられるオンブロスコピーの別の利点はまた、生物学的粒子、典型的には存在する微生物の種類を同定するステップ、及び最小発育阻止濃度の値を、単一の培養培地及び単一の画像取得ステップに基づいて推定するステップの同時実行能力でもある。
【００８６】
図３５ａ、３５ｂ、３５ｃは異なる検出デバイスで撮像した画像である。図３５ａは、国際特許出願の国際公開第２０１２／１５２７６８号に記載されるシステムによって得られる（参照記号ＳＩＵ）。画像取得に用いられる照明は、培養培地に垂直に配置され、培養培地の表面の方に４５°の角度に配向された、１０ＲＧＢ  ＬＥＤの４つのリニアアレイからなる低照度の環状の照明である。４つのリニアアレイは、培地の周りに９０°に規則的に分配される。画像取得に用いられるセンサは、５メガピクセルのＣＭＯＳセンサであり、各ピクセルは３．４５μｍ×３．４５μｍの領域を表す。黒い背景は、画像取得用の培養培地の下に配される。撮像した画像のチャネルＲ（赤）のみが示される。図３５ｂは、反射による線形照明を有するスキャナ及びリニアカメラからなる、ＡＤＶＥＮＣＩＳ社から市販され、国際公開第２０１３／１１０７３４号（参照記号Ａｄｖｅｎｃｉｓ）に記載される「Ｂｉｏ−Ｓｙｓｔｅｍ  Ｉｎｃｕｂａｔｏｒ」装置を使用して得られる。図３５ｃは、図９に示されるデバイス（参照記号ＯＭＢＲＯ）を使用して得られる。これらの画像の各々について、ミューラー・ヒントンＥ培養培地（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ  ＭＨＥ）は、０．５マクファーランドで較正された大腸菌の懸濁液で満たすことによって播種される。ゲンタマイシン勾配を有するＥｔｅｓｔ（登録商標）ストリップ（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ社）は、各培地の表面に置かれる。各画像は、３７℃、６時間のＴ１での測定及びインキュベーションの時点で得られる。コントラストの差異を定量化するため、区域Ａは図３５ｃに見られるように画定され、その幅は、Ｙ軸に沿った各ストリップの目盛り「１９２」及び「２５６」によって、及びＸ軸上の５０ｍｍの長さに区切られている。この区域は、ストリップに対して垂直であり、またＹ軸に対して平行に延びる。次に、Ｘに沿ったプロファイルは、Ｘにおける各位置について、区域ＡのＹに沿ったピクセルのグレイ値の平均値を見出すことによって得られる。よって、得られるプロファイルは、画像取得デバイスの各々について、それぞれの参照記号ＳＩＵ、ＡＤＶＥＮＣＩＳ及びＯＭＢＲＯとともに図３６に示される。
【００８７】
よって、図３６は、３つの検出デバイスで撮像した画像上で見られる３つのグレイレベルプロファイル（ＧＬ、８ビット符号化）の概略図である：図３５ａについては「ＳＩＵ」、図３５ｂについては「Ａｄｖｅｎｃｉｓ」、及び図３５ｃについては「ＯＭＢＲＯ」。菌叢、成長域、及び阻止域の間の移行、並びに阻止域とＥｔｅｓｔ（登録商標）ストリップ間の移行は、図３６の各プロファイルで見ることができる。各デバイスを用いて得られたコントラストを推定するため、ｌｍａｘは菌叢の区域で見られる最大グレイ値を表し、ｌｍｉｎは阻止域で見られる最小グレイ値を表す。よって、コントラストは次の等式から算出される：
コントラスト＝（ｌｍａｘ−ｌｍｉｎ）／（ｌｍａｘ＋ｌｍｉｎ）
【００８８】
下記表１は、３つのプロファイルのコントラストについての結果を与える：
0006783150.tif 000003
３つのプロファイルについてのコントラストの結果は、ＯＭＢＲＯオンブロスコピーデバイス、より具体的には好ましくはコリメートされた照明器に結合されたテレセントリック対物レンズの使用により、６時間のインキュベーションを発端として、他の技法より十分高い３８．１８％のコントラスト値を与えることを実証している。さらには、観察される最小発育阻止濃度の値は、この抗生物質／微生物対に対する規制当局の勧告を確かに満たす。
【００８９】
図３７ａ、３７ｂ、３７ｃは、それぞれ、４時間、６時間及び２４時間の測定時間Ｔ１でインキュベーション後、ゲンタマイシンの存在下、ミューラー・ヒントンＥ培養培地（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ  ＭＨＥ）上での大腸菌（ＡＴＣＣ「アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（American Type Culture Collection）」２５９２２）の懸濁液の、「ＳＩＵ」検出デバイスで撮像した画像である。撮像した画像のチャネルＲ（赤）のみが示される。
【００９０】
図３８ａ、３８ｂ、３８ｃは、それぞれ、３時間３０分、６時間及び２４時間の測定時間Ｔ１でインキュベーション後、ゲンタマイシンの存在下、ミューラー・ヒントンＥ培養培地（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ  ＭＨＥ）上での大腸菌（ＡＴＣＣ２５９２２）の懸濁液の、図９に従ったオンブロスコピーによる、検出デバイスで撮像した画像である。
【００９１】
図３９ａ及び３９ｂは、図３７ａ、３７ｂ及び３７ｃ及び３８ａ、３８ｂ、３８ｃを取得するために使用したデバイスの各々について、各測定時間で撮像した画像に見られる３つのグレイレベルプロファイル（ＧＬ、８ビット符号化）の概略図である。
【００９２】
下記表２は、各インキュベーション時間における３つのプロファイルのコントラストの結果を与えるものである：
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【００９３】
よって、オンブロスコピーは、ＳＩＵ撮像デバイスよりも大きいコントラストを生じることが分かる。実際、３時間３０分を発端として、観察したコントラストレベルは４０％を上回るのに対し、４時間のインキュベーション後であってもＳＩＵデバイスではいかなるコントラストも見られず、したがって、阻止域を確実かつ反復可能に決定することはできない。さらには、２４時間のインキュベーション後でさえも、コントラストレベルはわずかに１１．６８％であり、これは最小発育阻止濃度の偽の判定につながるかもしれず、患者の健康問題を包含する臨床判断プロセスには許容することができない。したがって、好ましくはコリメートされた照明器に結合された、テレセントリック対物レンズを特に使用するオンブロスコピーによって得られたグレイレベルプロファイルは、はるかに大きいコントラストを表示し、これはまた算出手段による解析、とりわけ、より確実かつ反復可能な、測定１０４及び処理１０５の自動化ステップを可能にする。
【００９４】
本発明に記載される方法及びデバイスは、単一のコンピュータ上に、又はコンピュータシステムにわたって分布した、活性又は不活性なさまざまな形態で存在しうる、１つ以上のコンピュータプログラムによって実行することができる。例えば、それらは、本発明の方法を実施することができる命令を含み、かつ、行われる本発明に従った方法のある特定のステップ、とりわけ測定ステップ１０４及び／又は処理ステップ１０５を可能にするソースコード、オブジェクトコード、実行コード又は任意のフォーマットの形態で記載されるソフトウェアによって実行されてもよい。これらすべてのコンピュータプログラムは、記憶媒体及び圧縮又は解凍形態の対応する信号を含めたコンピュータ可読記憶媒体に保存してもよい。
【００９５】
用語コンピュータとは、中央処理装置（ＣＰＵ）、専用プロセッサ又はマイクロコントローラなどのプロセッサを備えた任意の電子デバイスのことを指す。コンピュータは、データ（１つ以上の入力）を受信し、該データに一連の所定のステップを実施し、かつ、データ又は信号の形態の結果（１つ以上の出力）を生成することが可能である。文脈に応じて、用語コンピュータは、プロセッサ、特に又はより一般的には、単一のケーシング内に含まれる相互接続された要素のアセンブリに関連するプロセッサを表しうる。
【００９６】
用語記憶媒体又はコンピュータ可読記憶媒体とは、コンピュータに使用される又はコンピュータに関するコンピュータプログラムを含む、保存する、通信する、配信する、又は移植するための任意の手段、あるいは該プログラムを実行する任意の手段のことを指す。コンピュータ可読記憶媒体は、非包括的ではあるが、電子、磁気、光学的、電磁、赤外線又は半導体のシステム、並びに、該プログラムを実行するための装置、デバイス又は手段でありうる。記憶媒体のより具体的な非限定的な例としては、フロッピーディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、読み取り専用メモリ（ＲＯＭ）、消去可能なプログラム可能読み取り専用メモリ（ＥＰＲＯＭ又はフラッシュストレージ）、光ファイバ、又は１つ以上のケーブルを含む任意の電気接続が挙げられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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