(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
耐熱性の凍結乾燥ロタウイルスワクチン製剤であって、前記ワクチン製剤が、
−少なくとも１つのロタウイルス血清型と
−凍結保護物質、第１のクラスの緩衝剤、増量剤、イオン及び活性化剤、ならびに、任意で、塩、及び分散剤から選択される成分を含む賦形剤とを含んで成る、前記耐熱性の凍結乾燥ロタウイルスワクチン製剤であって、
−前記凍結保護物質がスクロース、トレハロース、ソルビトールまたはラクトースから選択され、
−前記第１のクラスの緩衝剤がＨＥＰＥＳ、トリス、リン酸塩、クエン酸塩及びヒスチジンから選択され、
−前記塩が塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化カリウムから選択され、
−前記イオンがＺｎ（ＩＩ）及びＣａ（ＩＩ）から選択される二価のカチオンであり、
−前記増量剤がポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、デキストランまたはマンニトールから選択され、
−前記分散剤がツイーン２０及びツイーン８０から選択され、
−前記活性化剤がＬ−アルギニン、グリシンから選択され、
−前記凍結保護物質が１．２％ｗ／ｖ〜６．０％ｗ／ｖの範囲内であり、
−前記第１のクラスの緩衝剤が１０ｍＭ〜５０ｍＭの範囲内であり、
−前記塩が０ｍＭ〜５０ｍＭの範囲内であり、
−前記二価のカチオンが０ｍＭ〜２ｍＭの範囲内であり、
−前記増量剤が２％〜６％ｗ／ｖの範囲内であり、
−前記分散剤が０〜０．０２％ｗ／ｖの範囲内であり、
−前記活性化剤が１０〜１００ｍＭの範囲内であり、
前記凍結乾燥ロタウイルスワクチン製剤が、５℃±３℃で２年間まで保存した場合及び４５℃までで少なくとも１８週間保存した場合、ｌｏｇ１０＝［０．５］を超える効力ロスを超えないことを特徴とする、前記耐熱性の凍結乾燥ロタウイルスワクチン製剤。
【請求項２】
−前記凍結保護物質がスクロース、トレハロース、またはそれらの組み合わせであり、
−前記第１のクラスの緩衝剤がＨＥＰＥＳであり、
−前記塩が塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）であり、
−前記二価のカチオンがＣａ２＋であり、
−前記第１のクラスの増量剤がＰＶＰであり、
−前記分散剤がツイーン２０であり、
−前記活性化剤がＬ−アルギニン及び／またはグリシンである
請求項１に記載の耐熱性の凍結乾燥ロタウイルスワクチン製剤。
【請求項３】
前記ロタウイルス血清型が、ウシ、アカゲザル、ヒト、ヒツジ、アカゲザル／ヒトリアソータント、ウシ／ヒトリアソータント及び他の一価または多価のロタウイルスから選択される少なくとも１つのロタウイルス株から選択される請求項１に記載の耐熱性の凍結乾燥ロタウイルスワクチン製剤。
【請求項４】
前記ロタウイルス血清型が、Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４及びＰ１ヒト／ウシリアソータントから単独でまたは組み合わせで選択される請求項１に記載の耐熱性の凍結乾燥ロタウイルスワクチン製剤。
【請求項５】
前記ロタウイルスワクチン製剤が、用量当たりＧ１：６．８１，Ｇ２：６．９２，Ｇ３：６．９１，Ｇ４：６．７８及びＰ１：６．８３としてのＬｏｇ１０濃度を有する請求項４に記載の耐熱性の凍結乾燥ロタウイルスワクチン製剤。
【請求項６】
請求項１に記載の耐熱性の凍結乾燥ロタウイルスワクチン製剤を調製する改善された凍結乾燥方法であって、前記方法が、
（ａ）少なくとも１つのロタウイルス血清型を選択するステップと
（ｂ）ステップ（ａ）の前記選択されたロタウイルス血清型を前記賦形剤に添加し、最適な効力保持を伴う液体フィードを調製するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）の前記水性液体フィードを凍結乾燥して低下した残留水分含量を伴う凍結乾燥製剤を得るステップと、
（ｄ）０℃から２５℃に及ぶ温度にて好適な製粉方法を用いてステップ（ｃ）から得られた前記凍結乾燥製剤を粉砕し、粉砕された乾燥製剤を得るステップと、
（ｅ）ステップ（ｄ）から得られた前記粉砕された乾燥製剤を、ブレンド剤と個々にまたは酸中和能を有する第２のクラス緩衝剤と組み合わせて混合し、単回用量または複数回用量の適宜包装のための前記耐熱性の凍結乾燥ロタウイルスワクチン製剤を得るステップとを含み、その際、前記方法はｌｏｇ１０＝［０．２］を超えない工程ロスを生じる、前記請求項１に記載の耐熱性の凍結乾燥ロタウイルスワクチン製剤を調製する改善された凍結乾燥方法。
【請求項７】
前記液体フィードが１０ｇ／１００ｍＬ〜２５ｇ／１００ｍＬ、さらに好ましくは１３ｇ／１００ｍＬ（１３％）の範囲で固形分を有している請求項６に記載の耐熱性の凍結乾燥ロタウイルスワクチン製剤を調製する改善された凍結乾燥方法。
【請求項８】
前記凍結乾燥方法が臨床上関連のある仕様（１×）または高い（５×）ロタウイルス濃度で実施される請求項６に記載の耐熱性の凍結乾燥ロタウイルスワクチン製剤を調製する改善された凍結乾燥方法。
【請求項９】
前記液体フィードが５．０Ｅ＋０６ＩＵ／ｍＬ〜６．０Ｅ＋０７ＩＵ／各血清型のｍＬ、好ましくは５．０Ｅ＋０６ＩＵ／ｍＬ〜４．０Ｅ＋０７ＩＵ／各血清型のｍＬの範囲で力価値を有している請求項６に記載の耐熱性の凍結乾燥ロタウイルスワクチン製剤を調製する改善された凍結乾燥方法。
【請求項１０】
前記凍結乾燥方法が、３７ｏＣ±２ｏＣの範囲の温度で少なくとも３０、６０、９０、１８０日間Ｌｏｇ１０＝［０．５］を超えない、及び４５ｏＣ±２ｏＣの範囲の温度で少なくとも３０、６０、９０、１２０日間Ｌｏｇ１０＝［０．５］を超えない累積効力ロスを生じる請求項６に記載の耐熱性の凍結乾燥ロタウイルスワクチン製剤を調製する改善された凍結乾燥方法。
【請求項１１】
前記粉砕された凍結乾燥粉末が、篩製粉、ハンマー製粉、ボール製粉、円錐篩製粉、及びローラー製粉等を含む製粉法によって得られ、その際、
−前記粉砕された凍結乾燥粉末の粒度はＤ９０値を有し、２５０μｍ以上であり；
−好ましい温度範囲は２０℃〜２２℃であり；
−前記製粉は窒素、アルゴン、ＣＯ２、空気またはそれらの組み合わせを含む乾燥気体の存在下で行われる請求項６に記載の耐熱性の凍結乾燥ロタウイルスワクチン製剤を調製する改善された凍結乾燥方法。
【請求項１２】
前記ワクチン製剤が、たとえば、凍結乾燥ケーキ、凍結乾燥粉末、粉砕された凍結乾燥粉末、粉砕され、混合された凍結乾燥粉末のような乾燥形態である請求項６に記載の耐熱性の凍結乾燥ロタウイルスワクチン製剤を調製する改善された凍結乾燥方法。
【請求項１３】
前記粉砕された凍結乾燥粉末が４８．０±１．０℃の範囲でのガラス転移温度（Ｔｇ）を示す請求項１１に記載の耐熱性の凍結乾燥ロタウイルスワクチン製剤を調製する改善された凍結乾燥方法。
【請求項１４】
前記凍結乾燥ロタウイルスワクチン製剤の前記残留水分含量が３．０％を下回る請求項６に記載の耐熱性の凍結乾燥ロタウイルスワクチン製剤を調製する改善された凍結乾燥方法。
【請求項１５】
前記ブレンド剤が、ＰＶＰＫ２５、ＰＶＰＫ４０、スクロース、マンニトール、４〜２０の範囲のＤＥを持つマルトデキストリン、フルクトース、グルコース、ラクトースから単独で、または粉砕され、混合された凍結乾燥粉末にＤ９０＞２５０μｍを提供する組み合わせで選択される請求項６に記載の耐熱性の凍結乾燥ロタウイルスワクチン製剤を調製する改善された凍結乾燥方法。
【請求項１６】
前記第２のクラスの緩衝剤がＨＥＰＥＳ、クエン酸三ナトリウム二水和物、ヒスチジン、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸ナトリウム、重炭酸カルシウム、重炭酸カリウム、水酸化アルミニウム、リン酸二水素ナトリウム一水和物または水酸化マグネシウムまたはそれらの組み合わせから選択される請求項６に記載の耐熱性の凍結乾燥ロタウイルスワクチン製剤を調製する改善された凍結乾燥方法。
【請求項１７】
前記第２のクラスの緩衝剤がブレンド剤と併せて使用されると、０．３ｍＥｑ／粉末の用量〜１．０ｍＥｑ／粉末の用量の範囲でのワクチンの前記酸中和能を生じる請求項６に記載の耐熱性の凍結乾燥ロタウイルスワクチン製剤を調製する改善された凍結乾燥方法。
【請求項１８】
前記ワクチンが再構成緩衝液と共にもしくはそれを伴わずに、または注射用水と共にもしくはそれを伴わずに経口で投与される請求項６に記載の耐熱性の凍結乾燥ロタウイルスワクチン製剤を調製する改善された凍結乾燥方法。
【請求項１９】
前記再構成緩衝液が、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸ナトリウム、重炭酸カルシウム、重炭酸カリウム、水酸化アルミニウムまたは水酸化マグネシウム、リン酸二水素ナトリウム一水和物、クエン酸三ナトリウム二水和物、またはそれらの組み合わせ、さらに好ましくはリン酸塩／クエン酸塩から選択される請求項１８に記載の耐熱性の凍結乾燥ロタウイルスワクチン製剤を調製する改善された凍結乾燥方法。
【請求項２０】
前記ワクチン製剤が再構成緩衝液で再構成されると、０．３ｍＥｑ／用量〜１．０ｍＥｑ／用量の範囲での酸中和能を生じる請求項１９に記載の耐熱性の凍結乾燥ロタウイルスワクチン製剤を調製する改善された凍結乾燥方法。
【請求項２１】
０〜６０％の、たとえば、ラクトース、グルコース、スクロース、フルクトースまたはそれらの組み合わせのような糖類を加えることによって前記再構成緩衝液の美味しさが維持される請求項２０に記載の耐熱性の凍結乾燥ロタウイルスワクチン製剤を調製する改善された凍結乾燥方法。
【請求項２２】
工程が、
（ａ）少なくとも１つのロタウイルス血清型を選択するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）の前記選択されたロタウイルス血清型を前記少なくとも１つの賦形剤に加えて最適な効力保持を伴った液体フィードを調製するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）の前記液体フィードを凍結乾燥して残留水分含量が低下した凍結乾燥製剤を得るステップと、
（ｄ）０℃〜２５℃の範囲の温度にて好適な製粉法を用いて、ステップ（ｃ）から得られた前記凍結乾燥製剤を粉砕し、粉砕された乾燥製剤を得るステップと、
（ｅ）ステップ（ｄ）から得られた前記粉砕された乾燥製剤をブレンド剤と個々に、または酸中和能を有する第２のクラスの緩衝剤と組み合わせてブレンド剤と混合して、単回用量または複数回用量の適宜包装のための前記耐熱性の凍結乾燥ロタウイルスワクチン製剤を得るステップと
（ｆ）経口投与に先立つ再構成のために別の容器にて前記酸中和能を有する前記緩衝剤を含む前記再構成緩衝液と共に容器にて前記耐熱性の凍結乾燥ロタウイルスワクチン製剤を包装するステップとを含む、改善された凍結乾燥方法によって調製される請求項６に記載の耐熱性の凍結乾燥ロタウイルスワクチン製剤を調製する改善された凍結乾燥方法。
【請求項２３】
前記ワクチンが前記再構成緩衝液で再構成されると、２℃〜８℃で４８時間及び２５℃で８時間の保存条件でｌｏｇ１０＝［０．５］を超えないウイルスの効力ロスを維持する請求項１９に記載の耐熱性の凍結乾燥ロタウイルスワクチン製剤を調製する改善された凍結乾燥方法。
【請求項２４】
前記ワクチン製剤が、２３℃±１℃で維持された前記再構成緩衝液に６０±５．０秒以内に溶解する請求項６に記載の耐熱性の凍結乾燥ロタウイルスワクチン製剤を調製する改善された凍結乾燥方法。
【請求項２５】
工程が、
（ａ）少なくとも１つのロタウイルス血清型を選択するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）の前記選択されたロタウイルス血清型を少なくとも１つの賦形剤に加えて最適な効力保持を伴う液体フィードを調製するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）の前記水性液体フィードを凍結乾燥して残留水分含量が低下した凍結乾燥製剤を得るステップとを含み、
その際、ステップ（ｃ）はバイアルにて実施される請求項１に記載の耐熱性の凍結乾燥ロタウイルスワクチン製剤を調製する改善された凍結乾燥方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は耐熱性の凍結乾燥ロタウイルスワクチン製剤及びその製造方法に関する。さらに具体的には、本発明は乾燥ケーキまたは乾燥粉末の形態での改善された熱安定性のロタウイルスワクチン製剤を開示する。本発明はまた改善された熱安定性及び使い易さや輸送し易さを有するロタウイルスワクチンにも関する。前記ワクチンは開発途上や低所得の国のワクチン接種プログラムの要件を満たす。
【背景技術】
【０００２】
ロタウイルスが乳児及び小児の間での重篤な下痢の主な原因であることは揺るぎないことである。世界中で年間５０〜６０万人の５歳未満の小児がロタウイルス下痢のために死亡し、さらに２００万人が病院に収容されている。これらの死亡の約９０〜９５％が主として開発途上国で起きている。
【０００３】
ロタウイルスは高度に伝染性で、耐性であり、水質及び利用できる公衆衛生にかかわらず、世界中のほぼあらゆる小児には感染のリスクがある。ワクチン接種はロタウイルス感染の予防の最も有効な手段であることが判明している。国際的な研究データは、現在のロタウイルスワクチンが重篤なロタウイルス胃腸炎（ＲＶＧＥ）に対して８５〜９５％の有効性を有することを示唆している。これを踏まえて、２００９年６月５日、世界保健機関（ＷＨＯ）はロタウイルスワクチンをあらゆる国家予防接種プログラムに含めなければならないことを推奨した。
【０００４】
しかしながら、９０〜９５％の死亡がロタウイルスにより生じ、治療へのアクセスも限定される開発途上国で同じものを使用する間で懸念がある。開発途上国が直面する２つの主な懸念は、（１）開発途上国及び低資源国におけるロタウイルスワクチンの低い有効性及び（２）現在利用可能なワクチンのコストと同様、プログラム上の好適性である。
【０００５】
ロタウイルスワクチンへのアクセスを加速することによって２０３０年までに２４０万人を超える小児の死亡を防ぐことができることが報告されている。これらのワクチンが世界ワクチン予防接種同盟（ＧＡＶＩ）の国々で使用されれば、それは毎年、推定１８０，０００人の死亡を防ぎ、６００万人の外来診療を回避することがあり得、それによって治療コストで年間６８００万米ドルを節約し得る。
【０００６】
しかしながら、これらの領域におけるロタウイルスワクチンの到達を増やすために、新しいプログラム上好適なワクチンが開発され、世界中の使用について資格を得なければならない。プログラム上の好適性は、低温流通体系能力における追加の投資、人材、廃棄物処分施設等を必要とすることなく、開発途上国のニーズに対処し、万人の予防接種を円滑にする目的でワクチンの事前審査に関連するＷＨＯによって開発された新しい工程である。この工程は、ワクチンがＷＨＯの事前審査のために持たねばならない強制的な、決定的な独特の、革新的な及び好ましいプログラム上の好適性の特徴の輪郭を描く。
【０００７】
ワクチンが２℃〜８℃の範囲で維持される冷蔵庫内温度で保存され、輸送されなければならないことは当該技術で周知である。さらに、ワクチンは冷蔵庫から取り出された後直ちに投与されなければならないことも周知である。普通、ＷＨＯで事前資格審査されたワクチンは２℃〜８℃で２４〜３６カ月まで安定である。
【０００８】
現在ＷＨＯによって事前資格審査されたロタウイルスワクチンは上述のように特定の温度で限られた持続時間のみ安定である。研究は、現在利用可能なワクチン、たとえば、ロタテック［Ｒｏｔａｔｅｑ］（登録商標）が不注意で８℃を超える温度に曝露される、またはそれにて保存されると、効力は、９℃〜２５℃にて４８時間の最大曝露について維持され、または２６℃〜３０℃で最低限１２時間維持される。しかしながら、ロタテック（登録商標）ワクチンが３０℃を超える温度に曝露されると、または上述の時間が経過すると、ワクチンはその効力を失うので廃棄されなければならない。ワクチンが不注意で０℃未満の温度に曝露されると、ワクチンの効力は維持されることを示唆する限られたデータがある。別の現在利用可能な凍結乾燥ワクチン、すなわち、ロタリックス[Ｒｏｔａｒｉｘ]ワクチンは２℃〜８℃にて３６カ月の保存可能期間で安定性を示す。
【０００９】
しかしながら、安定性のプロファイルにもかかわらず、双方のワクチンは輸送の間、低温流通体系を維持することが求められる。特に開発途上国及び低所得国にてワクチンの効力を保存するのに必要とされる低温流通体系を維持するのは非常に困難であり、廃棄される大量のワクチンを生じ、潜在的レシピエントの命を危険にさらす最悪のシナリオを生じる。ＷＨＯは、凍結乾燥ワクチンのほぼ半分及び液状ワクチンの４分の１が毎年廃棄されると推定している。この廃棄の最大の寄与因子の１つが低温流通体系の流通である。ワクチン接種の試みで開発途上国を援助するＧＡＶＩ同盟は、これらの国々における医療施設の半分が低温流通体系の操作に必須の要件である電力供給を全く有さず、たった１０％が信頼できる電力供給を有するにすぎないと推定している。たとえば、ロタウイルス疾患の最大の重荷を有する国であるインドでは、インド政府、州政府及びＷＨＯとの共同でのＵＮＩＣＥＦによる２００８年の国家低温流通体系評価の報告は、低温流通体系全体のインフラ及び物流の管理は、設備、インフラ及び訓練を受けたマンパワーの深刻な不足に苦しんでいると結論付けた。
【００１０】
従って、耐熱性のワクチンに対する大きな需要がある。多数の既存のワクチンはある程度の耐熱性を示す。しかしながら、既存のワクチンは課題に対処することができない短期間の耐熱性を持つ（たとえば、ＶＶＭ７またはＶＶＭ１４）ので、開発途上世界に達するのは難しい。たとえば、インドでは、ほとんどの開発途上世界と同様に、大量のワクチンを受け取り、保存し、供給する多層構成ワクチン保存ネットワークを使用し、ワクチンはすべて＋２℃〜＋８℃の温度範囲での保存を必要とする。この工程では、ワクチンは製造元からレシピエントに少なくとも１年を費やし、低温流通体系への大きな負担となり、不適当である。低温流通体系はワクチンの品質を保証する最も重要な構成成分なので、低温流通体系の外で長い期間輸送され、保存されてもよい耐熱性のワクチンを開発することは医療部門について高い優先度がある。凍結乾燥ワクチンは高い廃棄負担を担うので、これは凍結乾燥ワクチンにとって特にさらに重要である。
【００１１】
耐熱特性は、温度の周囲極致が４０℃を超える及び低温流通体系が手近に利用できない世界の地域におけるワクチンの物流にも有益である。
【００１２】
現在利用できる凍結乾燥ワクチンは意味のある時間量で低温流通体系の外側での保存に好適なほど十分な耐熱特性は持たず、これらは冷蔵下で保存し、輸送しなければならない。従って、ワクチンには現在不足があるので、ワクチンに十分な耐熱性を付与する製剤化工程は、特に生弱毒化ワクチンについての世界中のワクチン接種の試みに対する重大な障壁である。対象とするワクチンについての不安定化の考えられるメカニズムを理解すること及びワクチンの製剤化を調整することと同様に工程パラメータを調節することはそれらのメカニズムを抑えるのに必須であり、上手く行く凍結乾燥方法を設計するのに必須である。
【００１３】
凍結乾燥はワクチン製剤に長期の安定性を付与するが、それは高い製造コストを招く。凍結乾燥のコストは、棚の表面積によって結果として定義される規模に直接相関する。このことは、コストという点でその熱不安定性の液状ワクチン製剤と比べて耐熱性凍結乾燥ワクチンを魅力のないものにしてしまい得る。従って、コスト効率が高い耐熱化工程を設計することに対するニーズも生じる。
【００１４】
さらに、ワクチンの既存の固形形態のほとんどは別々の容器／成分に包装され、再構成及び投与のために注射器及びバイアルと同様に他の複雑で費用のかかるメカニズムを必要とする。このことがワクチンの投与で困難さを引き起こし、低温流通体系に過度の負担をかけることによってワクチンの足跡も大きく高める。このことはまたひいては、輸送及び流通の難題、保存のための物流管理を増やし、緩衝液／ワクチンのミスマッチ、汚染、誤った容量の投与等のような潜在的に致命的な再構成ミスを生みやすい。従って、ワクチンの投与と同様に物流管理を改善する改善された容器／施栓における充填で柔軟性を提供するワクチンの革新的な形態に対するニーズがある。
【００１５】
米国特許第６，６１６，９３１号（ＷＯ２００２／０１１５４０）は、液状形態及び凍結乾燥形態の双方にて緩衝液、二価の金属イオン、糖及びポリアニオン、界面活性剤、アミノ酸が異なる製剤におけるロタウイルスワクチンの安定性を記載している。しかしながら、これらの製剤は２２℃を超えて３０℃までのどんな有意な時間量でも耐熱性を得ることはできなかった。ロタウイルスワクチンの凍結乾燥は、結果として低収率を生じるウイルス力価のロスを生じること、及び凍結乾燥ワクチン製剤による有効ではない予防接種を生じる必要とされるレベルを下回る効力を生じることも引用されている。胃酸の緩衝化に必要とされる追加の酸中和能を提供する再構成緩衝液も凍結乾燥製剤のために報告されている。この特許はまた、再構成された凍結乾燥製剤を３７℃で３０分間または３０℃で２時間インキュベートすることは室温で効力を失うことになることも開示している。
【００１６】
ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈｋｌｉｎｅのＵＳ７２８５２８０は生の弱毒化ロタウイルスワクチン製剤を開示している。ワクチン製剤は投与に先立って水溶液で再構成される制酸剤として存在する炭酸カルシウムと共に凍結乾燥される。或いは、この特許はまた、ロタウイルス抗原がある乳児／小児の舌の上に直接置かれる凍結乾燥形態での迅速溶解錠剤としてのワクチン製剤も請求している。別のＧＳＫの米国特許第８，１９２，７４７号は、カルシウムイオンと共に生の弱毒化ロタウイルス抗原、糖、カルボン酸塩及びカルボン酸、アジピン酸を含む液状経口ロタウイルス製剤を請求しており、その際、組成物は少なくとも１２分間の制酸能を有する。
【００１７】
米国特許出願ＵＳ２０１２／０１０７３５６は、安定剤なしで、高いウイルス力価、保存可能期間及び耐熱性と共に調製されるワクチン製剤を記載されている。安定剤の添加によって保存可能期間をさらに延長することができる。この顕著な耐熱性にもかかわらず、現在ライセンスされているワクチンは−２０℃での保存を必要とする液状形態である。さらに、成分にはタンパク質が含まれ、それは、高い収率を支える工程を用いて製造されるとしても製剤化についてのコストの意味合いを有する。低所得地域で広く導入されるワクチンについては、ワクチン及び安定剤のようなその成分のコストを低く保つことが極めて重要である。使用される賦形剤及び安定剤が動物起源の物質も、動物成分も含有すべきではないことは、規制及び安全性の観点からも極めて重要である。一部の国では実際、それは文化的及び宗教的な理由から同様に望ましくない。
【００１８】
国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０１１１６９は、液状ロタウイルス製剤にて、たとえば、Ｚｎ２＋及びＣａ２＋のような安定剤として二価のカチオンを用いることによるロタウイルスの保護のためのロタウイルス製剤の凍結乾燥を開示している。凍結乾燥はワクチンに対して不安定性は生じないという事実によって証拠付けられるように、これらの強化された製剤は優れた安定性を明らかにした。代表的な血清型として生のＧ１ロタウイルス株を用いて異なる製剤組成で凍結乾燥を実施した。凍結乾燥についての工程ロスは、３７℃での２ヵ月間の保存の後それぞれ、無視できるほどから０．２ｌｏｇｆｆｕ／ｍＬであり、当初の力価からの低下は無視できるほどから０．７ｌｏｇｆｆｕ／ｍＬだった。力価の低下は４℃及び２５℃での３ヵ月の保存の後、無視できるほどだった（＜０．１ｌｏｇｆｆｕ／ｍＬ）。
【００１９】
国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０１１１６９における顕著な所見の１つは、液状ロタウイルスワクチンにおけるＺｎ２＋の存在はウイルス生存率の安定性を高めるということだったが、米国特許６，６１６では、Ｚｎ２＋の存在はロタテックを構成するロタウイルス血清型の不活化を加速した。しかしながら、この所見は二価のカチオンの存在のみに起因するのではなく、スクロースの混入存在とｐＨに起因した。
【００２０】
凍結乾燥については、ここで引き出される唯一の結論は、Ｚｎ２＋の存在が凍結乾燥方法の間または高温でのその保存の間、ロタウイルスを不安定化しないということだった。従って、ロタウイルスワクチンの安定化についての二価のカチオンの役割は明瞭ではない。単一のロタウイルス血清型における実験に基づいた結論及びクレームが、ロタウイルス血清型のすべて特に多価のロタウイルスワクチンを構成するものに適用できることになることも明瞭ではない。従って、最適で且つ効果的な製剤に想到するための製剤の合理的な設計に対するニーズがある。
【００２１】
従って、上述の課題に応じるために、開発途上国及び低所得国のワクチン接種プログラムに対して大いに有利であろう単回用量で耐熱性のコスト効率の高いワクチンのニーズがある。
【００２２】
従って、本発明は、世界の辺鄙な所にワクチンを輸送することに関連するコスト及び複雑な要素を有意に軽減する冷蔵庫のないサプライチェーンで輸送されてもよい高い力価値を持つ耐熱性ワクチンを記載している。
【発明の概要】
【００２３】
本発明の目的
本発明の主な目的は改善された耐熱性の凍結乾燥ロタウイルスワクチン製剤を提供することである。
【００２４】
本発明の別の目的は、改善された耐熱性の凍結乾燥ロタウイルスワクチン製剤を得るための改善された凍結乾燥方法を提供することである。
【００２５】
本発明のさらに別の目的は、高温での長時間の効力ロスを未然に防ぐまたは有意に出来るだけ抑える改善された耐熱性の凍結乾燥ロタウイルスワクチン製剤を提供し、それによって冷蔵及び低温流通体系の維持への依存性を減らすことである。
【００２６】
本発明のさらに別の目的は、高い滴定値の有効な且つ経済的に実行可能な耐熱性の凍結乾燥ロタウイルスワクチン製剤を提供することである。
【００２７】
本発明のさらに別の目的は、ウシ、アカゲザル、ヒト、ヒツジ、アカゲザル／ヒトリアソータント（遺伝子再集合体）またはウシ／ヒトリアソータント（遺伝子再集合体）から選択される生ロタウイルスの株を含む耐熱性の凍結乾燥ロタウイルスワクチンを調製する工程を提供することである。
【００２８】
本発明のさらに別の目的は、一価の及び／または多価のロタウイルスの株を含む耐熱性の凍結乾燥ロタウイルスワクチンを調製する工程を提供することである。
【００２９】
本発明のさらに別の目的は、胃酸から生きたウイルスを保護するのに十分な酸中和能を提供する再構成緩衝液を個々にまたは組み合わせで伴うロタウイルスワクチン製剤を提供することである。
【００３０】
本発明のさらに別の目的は、薬剤送達装置、好ましくは経口送達装置による充填及び投与に理想的な特性を持つ改善された耐熱性の凍結乾燥ロタウイルスワクチン製剤を調製することである。
【００３１】
本発明のさらに別の目的は、高い温度で安定である、使い易い、輸送し易い且つ世界中の低所得及び開発途上の国々の要件を満たす、足跡の低下したコスト効率の高い、ロタウイルスワクチンを提供することである。
【００３２】
発明の要約
従って本発明は、耐熱性の凍結乾燥ロタウイルスワクチン製剤及びその製造方法を提供する。前記方法は、凍結乾燥法を用いてワクチンの脱水形態を生成することによるロタウイルスワクチンの安定化に関する。脱水は、種々の安定剤を含む賦形剤の存在下で凍結乾燥法を用いて達成される。前記安定剤は、不安定な水との相互作用を製剤成分の安定な相互作用で変換し、それによって低温、室温及び高温にてワクチン成分に耐熱性を与える。
【００３３】
本発明の耐熱性の凍結乾燥ロタウイルスワクチンは、一価または多価のロタウイルスまたはそれらの組み合わせから選択される株を含んで成り、前記生弱毒化ウイルスはウシ、アカゲザル、ヒト、ヒツジ、アカゲザル／ヒトリアソータントまたはウシ／ヒトリアソータントから選択される。
【００３４】
本発明の耐熱性ロタウイルスワクチンは、ロタウイルス負荷の大半が存在し、ワクチンの低温流通体系への依存性を部分的にまたは完全に排除する可能性がある地域で直面することが多い高温での効力を保持する潜在力を有する。
【００３５】
本発明は、凍結乾燥が複数のウイルス濃度でまとめて達成され、それによって製造コストを下げる経済的な凍結乾燥方法を提供する。
【００３６】
本発明は、たとえば、再構成緩衝液を充填済みの注射器と共に供給されるバイアル、またはそれぞれワクチンと緩衝液を伴った２つのバイアルとアダプターと注射器、または再構成緩衝液のチャンバー上にて指で強くつまんだ際、壊れて固形ワクチンと再構成緩衝液が混合するのを可能にしてもよい破れ易いシールの付いた二重チャンバーポーチで構成される単一容器施栓のような多様な容器／施栓における包装の柔軟性を提供する耐熱性の凍結乾燥ロタウイルスワクチンを提供する。
【００３７】
従って、本発明は耐熱性の凍結乾燥ロタウイルスワクチン製剤及び前記ワクチンを調製する工程を開示する。前記ワクチンは、改善された熱安定性、低下した足跡、低コストの製造及び輸送、ならびに使い易さ及び輸送し易さを持つ。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】２℃〜８℃の保存条件でＮ＝１（○）、Ｎ＝２（△）及びＮ＝３（□）について５つのヒト／ウシ血清型（Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４及びＰ１）を含有するバイアルにおける凍結乾燥製剤１００４ｃの安定性データを示す図である。
【図２】３７℃の保存条件でＮ＝１（○）、Ｎ＝２（△）及びＮ＝３（□）について５つのヒト／ウシ血清型（Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４及びＰ１）を含有するバイアルにおける凍結乾燥製剤１００４ｃの安定性データを示す図である。
【図３】４５℃の保存条件でＮ＝１（○）、Ｎ＝２（△）及びＮ＝３（□）について５つのヒト／ウシ血清型（Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４及びＰ１）を含有するバイアルにおける凍結乾燥製剤１００４ｃの安定性データを示す図である。
【図４】２℃〜８℃の保存条件でＮ＝１（○）、Ｎ＝２（△）及びＮ＝３（□）について５つのヒト／ウシ血清型（Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４及びＰ１）を含有するバイアルにおける凍結乾燥し、粉砕し、混合した製剤１００４ｃの安定性データを示す図である。
【図５】３７℃の保存条件でＮ＝１（○）、Ｎ＝２（△）及びＮ＝３（□）について５つのヒト／ウシ血清型（Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４及びＰ１）を含有するバイアルにおける凍結乾燥し、粉砕し、混合した製剤１００４ｃの安定性データを示す図である。
【図６】４５℃の保存条件でＮ＝１（○）、Ｎ＝２（△）及びＮ＝３（□）について５つのヒト／ウシ血清型（Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４及びＰ１）を含有するバイアルにおける凍結乾燥し、粉砕し、混合した製剤１００４ｃの安定性データを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
既存の従来技術における前述の欠点を未然に防ぐために、本発明は耐熱性の凍結乾燥ロタウイルスワクチン製剤及びそれを調製する工程に関する。さらに具体的には、本発明は、改善された凍結乾燥方法を用いて調製されるロタウイルスワクチン製剤の改善された耐熱性の乾燥ケーキの形態または乾燥粉末の形態を開示する。本発明はまた、ワクチン製剤の乾燥ケーキの形態または乾燥粉末の形態の再構成を用いて調製される液状または固形のロタウイルスワクチン製剤にも関するので、前記ワクチン製剤は、改善された熱安定性、輸送し易さ及び使い易さを有し、値頃感がある。従って、前記ワクチンは、開発途上国及び低所得国のワクチン接種プログラムの要件を満たす。
【００４０】
本発明は水性ロタウイルスワクチンの不安定性の主な原因の１つである水部分を取り除くための凍結乾燥の工程を使用する。水部分は、個々のウイルスもしくは血清型のための、または複数のロタウイルス血清型の組み合わせでの液状ロタウイルスワクチン製剤から抽出されて脱水された耐熱性のワクチン製剤を形成する。凍結乾燥のこれらの方法はおよそ３．０パーセント未満の水分含量を達成し、それによって過剰の水の存在に関連するロタウイルス血清型の分解経路を妨害する。
【００４１】
本発明の好ましい実施形態が開示される前に、本発明は、記載されている特定の物質は変化してもよいので、これらに限定されないことが理解される。本明細書で使用される用語は特定の実施形態のみを記載する目的のものであって、本発明の範囲を限定するようには決して意図されないことも理解される。
【００４２】
本明細書で使用されるとき、文脈が明瞭に指示しない限り、単数形態「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は複数の参照を含み、特に定義されない限り、本明細書で使用される専門用語及び科学用語はすべて本発明が属する技術の当業者によって共通して理解されるものと同じ意味を有することが言及されなければならない。
【００４３】
従って、好ましい実施形態では、脱水は、安定剤を含む賦形剤の存在下で凍結乾燥方法を用い、不安定な水との相互作用を安定化成分の安定な相互作用で置き換えて達成される。
【００４４】
実施形態の１つでは、凍結乾燥方法及び他の製造ステップの間でのワクチン形成及び安定性ロスを決定するためのその後の保存におけるウイルスの効力ロスに有意な影響を有する可能性がある潜在的な賦形剤、その濃度及びそれらの組み合わせの特定に実験計画法（ＤｏＥ）の方法論を採用する。場合によっては、実験の数を最小化するために、連続的一部実施要因ＤｏＥも採用されている。
【００４５】
種々の生物物理学的方法、たとえば、示差熱分析（ＤＴＡ）、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）、凍結乾燥顕微鏡（ＦＤＭ）及びインピーダンス測定によって潜在的な賦形剤、その濃度及びそれらの組み合わせの好適性を決定する。さらに、種々の方法、たとえば、他の４つのリアソータントウイルスの存在下で各個々のリアソータントウイルスの特定の定量を可能にする多価ＱＰＣＲに基づく効力分析（Ｍ−ＱＰＡ）を用いて直接効力も測定される。生物物理学的な方法は、たとえば、必要とされる時間及びエネルギーの入力のような工程好適性の指示を与え、後者の効力測定法は、処理の間及びその後の保存の間、効力に対する安定剤を含む賦形剤の効果の指示を与える。場合によっては、ＤｏＥ組成物の存在下でウイルスの凍結融解を繰り返し、その後高い温度で、すなわち、２５℃で、長時間、少なくとも２４時間及び最大で１週間までインキュベートした後の効力の変化も使用されている。
【００４６】
種々の安定剤を含む賦形剤は、（ａ）たとえば、スクロース、トレハロース、ソルビトール及びラクトースのような凍結保護物質（lyoprotectant）、（ｂ）二価のカチオン、さらに詳しくは二価のイオン性構造安定剤、たとえば、Ｚｎ（ＩＩ）及びＣａ（ＩＩ）；（ｃ）たとえば、ＨＥＰＥＳ、トリス、リン酸塩、クエン酸塩またはヒスチジンのような緩衝剤；ならびに（ｄ）たとえば、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化マグネシウム、塩化カリウムのような塩；（ｅ）たとえば、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、デキストラン、マンニトールのような増量剤；（ｆ）Ｌ−アルギニン及び／またはグリシンを含む活性化剤ならびに（ｇ）たとえば、ツイーン（たとえば、ツイーン２０及びツイーン８０）のような分散剤から選択されるが、これらに限定されない。
【００４７】
好ましい実施形態では、耐熱性の凍結乾燥ワクチン製剤は、１．２％ｗ／ｖ〜６．０％ｗ／ｖの範囲での凍結保護物質、０ｍＭ〜２ｍＭの範囲でのＺｎ（ＩＩ）及びＣａ（ＩＩ）のような二価のカチオン、０ｍＭ〜５０ｍＭの範囲での塩、１０ｍＭ〜５０ｍＭの範囲での緩衝剤、２％〜６％ｗ／ｖの範囲での増量剤、１０ｍＭ〜１００ｍＭの範囲での活性化剤、０％ｗ／ｖ〜０．０２％ｗ／ｖの範囲での分散剤を含有する。
【００４８】
さらに別の好ましい実施形態では、安定剤、特に緩衝系を含む賦形剤は、そのように選択されてＺｎ（ＩＩ）及びＣａ（ＩＩ）のような二価のイオンに最大の溶解性を与え、それは原則として最大の工程安定性に必要とされ、高い温度での長時間のロタウイルスの保存安定性にても役割を担う。
【００４９】
さらに別の実施形態では、本発明に記載されているロタウイルスワクチン製剤は、ヒト／ウシリアソータント、すなわち、Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４及びＰ１の生弱毒化ロタウイルスと同様にウシ、アカゲザル、ヒト、ウシ、アカゲザル／ヒトリアソータントまたはウシ／ヒトリアソータントに由来する他の生弱毒化ロタウイルスを含むことができる。本発明で使用されるウイルスの他の試料には、限定しないで、麻疹ウイルス、ノロウイルス、ポリオウイルス及び他の一価または多価のロタウイルスを含む他の生弱毒化ウイルスも挙げられてもよい。
【００５０】
さらに別の実施形態では、それぞれバイアル及びトレイにて５４時間の凍結乾燥サイクルまたは７０時間の凍結乾燥サイクルを用いて特に好ましい凍結乾燥ワクチンが調製される。場合によっては、上述の種々の生物物理学的方法に由来する入力（ガラス転移温度Ｔｇ’及び共晶融点融解温度Ｔｅｕ）及びＭ−ＱＰＡに由来する効力ロスを用いて凍結乾燥サイクルを適宜改変することができる。本発明の態様すべてにおいて、上記の最適化されたパラメータ及び前記組成物を用いた凍結乾燥は、３．０％未満の残留水分含量を伴った乾燥ケーキまたは乾燥固形粉末を生じる。残留水分の３％を下回る含量への前記低下は水の存在に関連する熱分解経路の阻止を生じる。前記ロタウイルスワクチン製剤は適当な凍結乾燥法を用いて得ることができる。
【００５１】
好ましい実施形態では、組成物における凍結乾燥製剤の成分及び濃度は効力及び生物物理学的測定に基づいて選択され、前記ウイルス血清型についてＬｏｇ１０＝［０．２］以下の工程ロスを伴う最適な凍結乾燥のパラメータ及び時間をもたらす製剤に想到する。
【００５２】
さらに別の実施形態では、前記ロタウイルスワクチン製剤は単回用量及び／または複数回用量の製剤でバイアルにて凍結乾燥することができ、前記ワクチンは投与に先立って提供される再構成緩衝液によって再構成される。
【００５３】
さらに別の実施形態では、前記ロタウイルスワクチン製剤は、ゴアー［ＧＯＲＥ］（登録商標）リオガード［ＬＹＯＧＵＡＲＤ］（登録商標）凍結乾燥トレイまたはステンレススチールトレイのような市販の凍結乾燥トレイを用いてまとめて凍結乾燥される。
【００５４】
さらに別の好ましい実施形態では、前記ロタウイルスワクチン製剤はまとめて凍結乾燥され、たとえば、臨床的に関連する仕様よりも５〜１０倍高い力価のロタウイルスワクチンが凍結乾燥されるので、バッチのサイズ及び数の双方を減らし、それによって製造の全体的なコストを削減する。
【００５５】
容器施栓、特に単回用量容器を満たすのに好適な粉末を得るために、大量の凍結乾燥された物質を粉砕し、２５０μｍ以上のＤ９０値の粒度を持つ粉砕された凍結乾燥粉末を生じる。製粉単位工程は、篩製粉、ハンマー製粉、円錐篩製粉、ボール製粉及びローラー製粉を含むが、これらに限定されない適当な製粉法を用いて０℃〜２５℃の範囲の温度にて達成することができる。
【００５６】
さらに別の実施形態では、粉砕された凍結乾燥粉末は、ＰＶＰ  Ｋ２５、ＰＶＰ  Ｋ４０、スクロース、マンニトール、一般に４〜２０の範囲のＤＥを持つマルトデキストリン、フルクトース、グルコース、ラクトースまたは同一組成のプラセボ製剤またはそれらの組み合わせから選択されるが、これらに限定されない好適なブレンド剤と混合することができる。前記組み合わせはそのように調製されるので、臨床上関連のある最低濃度または所望の放出仕様と同等のロタウイルス力価を有する粉末化剤形を得るとともに所定の包装容器を満たす正確で精密な粉末にふさわしい粉末特性を操作する。
【００５７】
さらに別の実施形態では、凍結乾燥は、臨床上関連のある仕様または高い力価のロタウイルス規模（ガラス製バイアルにて５×で、またはＬｏｇ１０＝［０．２］以下の工程ロスを伴うステンレススチールのトレイを用いてまとめて）で実施され、任意の組み合わせにおける凍結乾燥ロタウイルスワクチン血清型の累積効力（工程及び安定性）ロスは、出発充填量、血清型、工程規模及びそれらの組み合わせのような因子に関わらず、３７℃±２℃（ＲＨ７５％±５．０％）で少なくとも３０、９０または１８０日間Ｌｏｇ１０＝０．５を超えず、任意の組み合わせにおける凍結乾燥ロタウイルスワクチン血清型の累積効力（工程及び安定性）ロスは、出発充填量、血清型、工程規模及びそれらの組み合わせのような因子に関わらず、４５℃±２℃（ＲＨ７５％±５．０％）で少なくとも３０、９０または１２０日間Ｌｏｇ１０＝０．５を超えない。
【００５８】
ロタウイルスは酸不安定性であり、ｐＨ２．０では１２分未満の半減期で急速に不活化する。ロタウイルスワクチンは経口で投与されるように意図され、胃に存在する胃酸によって不活化され得るロタウイルスを保護することは極めて重要である。そのようなワクチンを投与するための効果的な方法は経口ワクチンの投与前にまたはそれと組み合わせて制酸剤または中和緩衝液を使用することである。
【００５９】
本発明のさらに別の実施形態では、特殊な準備を採用して経口投与の後、胃酸からワクチンを保護し、胃酸の中和は、さらに良好な酸中和能（ＡＮＣ）を持つ緩衝剤と共にワクチンを投与することによって達成される。緩衝化／制酸の成分は、ＨＥＰＥＳ、クエン酸三ナトリウム二水和物、ヒスチジン、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸ナトリウム、重炭酸カルシウム、重炭酸カリウム、水酸化アルミニウム、リン酸二水素ナトリウム一水和物または水酸化マグネシウムまたはそれらの組み合わせから選択されるが、これらに限定されない。
【００６０】
本発明のさらに別の実施形態では、前記ワクチン製剤は粉砕され、０．３ｍＥｑ／ワクチン粉末の用量〜１．０ｍＥｑ／用量の範囲である所望のＡＮＣを付与するブレンド剤及び／または緩衝剤と混合され、水分含量は３％を下回る。
【００６１】
本発明のさらに別の実施形態では、前記ワクチン製剤は、投与の直前に、０．３ｍＥｑ／ワクチンの用量〜１．０ｍＥｑ／用量の範囲である所望のＡＮＣを付与する再構成緩衝液で再構成される。
【００６２】
別の実施形態では、製剤に美味しさを提供するために、再構成緩衝液に０％ｗ／ｖ〜６０％ｗ／ｖの範囲での濃度の糖を加える。糖は、ラクトース、グルコース、スクロース、フルクトースまたはそれらの組み合わせから選択されるが、これらに限定されない。
【００６３】
本発明の態様すべてにおいて、ワクチン製剤は乾燥形態、すなわち、凍結乾燥ケーキ／粉末、粉砕された乾燥粉末及び粉砕され、混合された凍結乾燥粉末である。そのように得られた前記上記製剤は、５℃±３℃で（統計的に２年まで推定されてもよい）少なくとも９ヵ月、及び３７℃または４５℃で少なくとも１８週間保存された場合、Ｌｏｇ１０＝０．５を超える効力ロスを超えない。
【００６４】
本発明の態様すべてにおいて、前記粉末化ワクチン製剤は、ブレンド剤のみと混合した場合の再構成緩衝液、またはブレンド剤及び所望のＡＮＣを有する緩衝剤と混合した場合の注射用水のいずれかで再構成することによって経口で投与される。
【００６５】
本発明のさらに別の態様は、適当な水性の再構成緩衝液で再構成され、２℃〜８℃で４８時間保存した場合、Ｌｏｇ１０＝［０．５］を超える全体的な（工程＋安定性）ウイルス効力のロスを生じない無菌的に再構成されたウイルス製剤を提供する。
【００６６】
本発明のさらに別の実施形態では、粉砕されたワクチンのガラス転移温度（Ｔｇ）は４７℃を超え、高温の保存条件で耐熱性を提供する。
【００６７】
さらに別の実施形態では、粉末化ワクチン製剤は、再構成のための別々の再構成緩衝液と共に供給される小袋またはバイアルを含む最終包装の容器／施栓にて分配される。
【００６８】
従って、前記ワクチン製剤は、改善された熱安定性、輸送し易さ及び使い易さを有し、値頃感があるので、前記ワクチンは開発途上国及び低所得国のワクチン接種プログラムの要件を満たす。
【実施例】
【００６９】
以下の実施例は本発明を説明するのであって、本発明の範囲を限定するものではない。
【００７０】
実施例１：凍結乾燥方法を用いたロタウイルス血清型の耐熱化
試験１：安定剤を含む賦形剤の選択
可能性のある成分の間で、さらなる処理ステップ（工程ロス）及び保存（安定性ロス）を含む凍結乾燥方法の間でロタウイルスの安定性に有意な影響を有する可能性があると共に最適で経済的な凍結乾燥方法を支える可能性のあるその濃度及びそれらの組み合わせを特定するために、実験計画法（ＤｏＥ）の方法論を適用する。ロタウイルスのＧ１株を代表的な株として用いてウイルスの効力変化を報告する。実験の数を出来るだけ抑えるために、連続的一部実施要因設計を使用する。一部実施要因設計は表１及び表２に示すように８つの因子に限定される。
【００７１】
【表１】
0006674945.tif 000002
【００７２】
【表２】
0006674945.tif 000003
【００７３】
スクリーニング設計をさらに簡略化するために、段階的なアプローチにて緩衝液１つと糖及び増量剤の組み合わせ１つとを一度に選択する。この一部実施要因設計によって組み合わせ当たり合計１９の実験が得られ、その際、緩衝剤、塩の濃度、糖：増量剤の比、アミノ酸、活性化剤及び分散剤は変化する。最適な凍結乾燥方法の設計ための及び凍結乾燥の間ウイルスの安定性を支えるための安定剤の組み合わせの能力を調べるために、以下のスクリーニング実験を実施する：
（ａ）プラセボ組成物にて示差熱分析、凍結乾燥顕微鏡及びインピーダンス測定を実施して凍結乾燥方法に影響を与える決定的な温度を決定する。マンニトールを含有するＤｏＥセットは、これらの製剤がさらに長い凍結乾燥サイクルを要したので最初のスクリーニングでは省略する。
（ｂ）凍結融解（ＦＴ）試験を実施し、その際、２．０Ｅ＋０７ＩＵ／ｍＬの濃度でのＧ１血清型を５サイクルの凍結融解、その後の２５℃での１週間のインキュベートに供する。これらの実験からスクロース：ＰＶＰを含有する組み合わせはＧ１株についてスクロース：デキストランを含有する組み合わせに比べてはるかに良好な効力を保持したことが観察される。
（ｃ）効力という点で選択された最良の性能の製剤を、表３で示すような水性フィードの７．３ｌｏｇ／ｍＬの濃度でのＧ１と共に実際の凍結乾燥実験にてさらに評価する。これらの選択された製剤に由来する１ｍＬの液状フィードを５ｍＬ収容能力のガラス製バイアルに分配し、
（ｉ）予備凍結乾燥する液体を１０℃〜１２℃に予備冷却し、凍結乾燥機に負荷することと、
（ｉｉ）予備凍結乾燥する液体を−４０℃で３時間〜４時間凍結し（０．５〜２．０時間以内に４℃から−４０℃の下降で）、その後−２０℃でさらに２時間アニーリングすること（０．５時間〜１．５時間の範囲で−４０℃から−２０℃の傾斜、−５０℃で３〜４時間の最終凍結）と、
（ｉｉｉ）−４２℃で最大１５時間の氷の昇華、その後の５０ミリトールの真空条件下での−４０℃でさらに１５〜９０時間、または−３８℃〜−３５℃の温度範囲で５５時間のさらなる昇華と、
（ｉｖ）５０ミリトールの真空における２０℃〜２５℃範囲での１０〜１５時間の二次乾燥と
を特徴とする８２時間から１１０時間までのサイクルを用いて凍結乾燥する。
【００７４】
得られた凍結乾燥試料を凍結乾燥していない水性液状「フィード」試料と比べて当初の効力（ｔ＝０）について評価する。凍結乾燥試料の一部は、７５％±５％の相対湿度（ＲＨ）の保存条件下で３７℃±２℃にて様々な時点でインキュベートし、表４にて示すように２℃〜８℃の保存条件で保存した試料と比べる。評価した製剤すべての間で、Ｇ１の効力を保持した１０００、１００４、１００５、１０１１及び１０１３を３７℃±２℃（ＲＨ７５％±５％）で保存される場合、４週間まで測定する。増量剤としてデキストランを伴う製剤の間で、１０３０は３７℃±２℃（ＲＨ７５％±５％）にて４週間までＧ１の効力を保持した。しかしながら、この製剤は、ＤＴＡ及びインピーダンスの分析データに基づいて最適な凍結乾燥には適さないことが認められる。
（ｄ）製剤はすべてカールフィッシャー法を用いて水分含量についても評価される。製剤１００５、１０１１及び１０１３は表５に示す反復試験にて非常に高い水分含量を示した。製剤１０００及び１００４は他の３つの製剤に比べて低い水分含量と同様に見事なケーキの外観を示した。これらの製剤はまた３７℃±２℃（ＲＨ７５％±５％）でロタウイルスの効力を保持するという点でさらに良好であると認められる。製剤１００２は低い水分含量を示したが、２週間目の保存の間に３７℃±２℃（ＲＨ７５％±５％）で効力を失った。
【００７５】
低水分含量で見事なケーキが得られた凍結乾燥製剤１０００及び１００４。Ｇ１血清型の工程ロス及び安定性ロスは、３７℃±２℃（ＲＨ７５％±５％）での保存の間にｌｏｇ１０＝［０．５］を超えなかったことが観察され、その後の試験で例となる製剤として使用される。
【００７６】
さらに、ＤｏＥ製剤の効力データ及びＤＴＡデータの統計処理から、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、スクロース：１．６：６．４（ｇ％：ｇ％）のＰＶＰ比、２５ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＬ−アルギニン、１００ｍＭのグリシン及び２ｍＭのＣａＣｌ２.２Ｈ２Ｏを含む安定剤の最適な組み合わせが出現した。
【００７７】
【表３】
0006674945.tif 000004
【００７８】
【表４】
0006674945.tif 000005
【００７９】
【表５】
0006674945.tif 000006
【００８０】
試験２：最適な緩衝液と増量剤の組み合わせの選択
最適化された組み合わせ（実施例１、試験１におけるＤｏＥ製剤の効力データとＤＴＡデータの統計処理によって得られた安定剤の表６で示すような１０５７）は、効力の変化について評価することによって緩衝液と増量剤を最適化するためにさらに調べられる。３種の増量剤と緩衝液の組み合わせ用いて表６で示すような種々の製剤を生じる最良の成績の組み合わせを特定する。組成物はＧ１株及びＧ３株で製剤化する。各株の標的濃度は７．０ｌｏｇ／ｍＬである。製剤１０６５Ｈは凍結乾燥サイクルで加えられるアニーリングステップを伴った１０６５と同じである。凍結乾燥サイクルは、
（ｉ）バイアルの負荷に先立って−４５℃まで凍結乾燥機の棚を予備冷却することと
（ｉｉ）１．５時間の凍結ステップに続いて同じ温度で３０分間保持することと、
（ｉｉｉ）温度を−２．０℃に上昇させることに続いて２時間以内で−３０℃に下降させることによるによる一次乾燥。さらに３時間以内に温度を−３６℃に下降させ、最終的に５時間で−３８℃に下降させ、この温度で生成物を２３時間保持し、その後さらに４時間で−１０℃まで上昇させること。一次乾燥工程の間中維持される真空は０．０８０ミリバールであることと、
（ｉｖ）３０分以内で温度を２５℃まで上昇させ、ゼロ真空下で同じ温度にて生成物を８時間保持することによる二次乾燥とを
特徴とする５０時間の持続時間である。
【００８１】
【表６】
0006674945.tif 000007
【００８２】
一部の組成物；１０６５Ｈでは、追加のアニーリングステップが加えられ、
（ｉ）バイアルの負荷に先立って−４５℃まで凍結乾燥機の棚を予備冷却することと
（ｉｉ）１．５時間の凍結ステップに続いて同じ温度で３０分間保持することと、
（ｉｉｉ）５分以内に温度を−４５℃から−１５℃まで上昇させ、次いで同じ温度で２時間保持し、続いて生成物を−４５℃に１時間再凍結することによるアニーリングステップと、
（ｉｖ）１５分以内で温度を−７．０℃まで上昇させ、それに続いてさらに２時間以内で−２７℃まで下降させることによる一次乾燥。温度を３時間以内でさらに−３３℃まで低下させ、最終的に５時間で−３５℃に低下させる。生成物をこの温度で３０時間保持する。一次乾燥工程の間中維持される真空は０．０８０ミリバールである。このステップにゼロ真空下で−１０℃まで４時間上昇させることが続いたことと、
（ｖ）３０分以内に温度を２５℃まで上昇させ、ゼロ真空下にて同じ温度で生成物を８時間保持することによる二次乾燥とを
特徴とする５８時間のサイクルを生じた。
【００８３】
凍結乾燥した製剤は３７℃±２℃（ＲＨ７５％±５％）及び２℃〜８℃で４週間保存される。対数ロス値は表７で示されるようなＭ−ＱＰＡによって解析される。緩衝剤としてのＨＥＰＥＳと組み合わせて増量剤としてのＰＶＰを伴う組成は代表的なロタウイルス血清型Ｇ１及びＧ３について効力の最良の保持を生じた。
【００８４】
効力の保持という点で最良の成績をあげる製剤、１０５７及び１０６３を、２℃〜８℃及び３７℃±２℃（ＲＨ７５％±５％）の保存条件下で５つの（Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４及びＰ１）のヒト／ウシロタウイルス血清型の効力を支えるその能力についてさらに評価する。表８にて示されるように、ＨＥＰＥＳを含有する製剤１０５７は、リン酸塩を含有する１０６３に比べて高温で５つの血清型すべての効力を最良に支えたことが見いだされる。リン酸緩衝液を含む組成も製剤にてＣａ２＋イオンの析出を生じ、長期の保存におけるＣａ２＋の必須の役割を示した。
【００８５】
【表７】
0006674945.tif 000008
【００８６】
【表８】
0006674945.tif 000009
【００８７】
試験３：ワクチンに酸中和能（ＡＮＣ）を提供するための再構成緩衝液の製剤
上記の試験に由来する例となる主要製剤はそれ自体でその適正なＡＮＣを示さなかった。従って、再構成緩衝液を調製し、生ウイルスを胃酸から保護するのに十分な所望のＡＮＣを提供する。２.０ｍＬまでの適量の水にて４００ｍｇのスクロースと２９．８ｍｇのリン酸二水素ナトリウム一水和物と１２７ｍｇのクエン酸三ナトリウム二水和物によって各２．０ｍＬの再構成緩衝液を製剤化する。
【００８８】
米国薬局方３４ＮＦ２９によって記載された方法を用いてＡＮＣ値を決定する。実験は３つ組で実施する。結果は用量当たりのｍＥｑを単位として表現する。上記の主要製剤はすべて再構成緩衝液に溶解すると０．８ｍＥｑ／２．０ｍＬの用量のＡＮＣ値を生じることが観察される。
【００８９】
試験４：バイアルにおける例となる主要製剤１０００及び１００４についての長期試験及び再現性
表９にて示されるように５つ（Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４及びＰ１）のヒト／ウシロタウイルス株すべてを組み込んで、３７℃及び２℃〜８℃での保存条件で長期の安定性について、試験１に由来する２つの例となる製剤１０００及び１００４を調べる。製剤の組成、保存条件及び効力分析は試験１で記載されたものに類似する。各血清型についての当初の効力は７．０ｌｏｇ／ｍＬである。以下で記載されるようにこれらの製剤を凍結乾燥するために９９時間のサイクルを使用する：
（ｉ）予備凍結乾燥する液体を１０℃〜１２℃に予備冷却し、凍結乾燥機に負荷し、その後に凍結乾燥サイクルが続く。
（ｉｉ）温度を６０分で４℃から−４０℃に低下させる。凍結ステップは−４０℃で３時間実施し、その後に−２０℃でのアニーリングがさらに２時間続く。アニーリング温度は２０分以内に得られる。温度を６０分以内にさらに−５０℃に低下させ、その後、同じ温度でバイアルを４時間保持する。
（ｉｉｉ）一次乾燥は−４２℃で１０時間行い、その後、５０ミリトールの真空条件下で−４５℃にて１５時間、次いで−３７℃の温度にて４５時間の昇華が続く。温度を−４２℃から−４０℃にゆっくり上昇させ、及び１５分で−４０℃から−３７℃に上昇させる。
（ｉｖ）二次乾燥は５０ミリトールの真空にて２０℃で１５時間行った。
【００９０】
水性液体フィードの固形分は、最適な乾燥、収率及び／またはケーキの外観について１０．００ｇ／１００ｍＬ〜２５．００ｇ／１００ｍＬの範囲内である。
工程ロスは凍結乾燥の前と後に得られる試料間での効力の差異として算出される。ＲＨ７５％±５％を伴った３７℃±２℃での３０日間当たりの安定性対数ロスは、７日間の試料採取間隔を伴った少なくとも３０日間の３７℃±２℃及びＲＨ７５％±５％でインキュベートされた試料の効力データの線形回帰によって算出される。
【００９１】
【表９】
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【００９２】
試験５：バイアルにおける製剤１００４の長期の耐熱性及び再現性
３７℃±２℃（ＲＨ７５％±５％）、４５℃±２℃（ＲＨ７５％±５％）及び２℃〜８℃の保存条件下で長期の安定性及び工程再現性について例となる製剤１００４を調べた。製剤は、Ｇ１：６．８１；Ｇ２：６．９２；Ｇ３：６．９１；Ｇ４：６．７８及びＰ１：６．８３（１×濃度）として用量／ｍＬ当たりの対数濃度で５つの株すべてと共に組み込まれる。６３時間の凍結乾燥サイクルが展開され、この製剤に調製について最適化され、凍結乾燥機の全負荷（バッチ当たり＞６８０のバイアル）の凍結乾燥を支えることが見いだされる。凍結乾燥サイクルの詳細は以下で述べられる：
（ａ）予備凍結乾燥する液体が１０℃〜１２℃に予備冷却され、凍結乾燥機に負荷され、その後、凍結乾燥サイクルが続く。
（ｂ）６０分以内に温度を４℃から−４０℃に下降させ、凍結ステップを−４０℃で２時間実施し、その後、−２０℃でさらに２時間のアニーリングが続く。アニーリング温度は６０分以内にもたらされる。さらなる下降は６０分以内に−４０℃まで実施される。最終的な凍結は−４０℃で１５時間行われる。
（ｃ）温度を４時間以内に−３３℃まで上げ、一次乾燥を−３３℃で３３時間行い、その後、６時間以内の−１０℃までの温度上昇が続き、次いでそれぞれ３時間以内に０℃及び２５℃に上昇させる。一次乾燥ステップの間、５０ミリトールの真空が維持される。
（ｄ）二次乾燥は０ミリトールにて２５℃で５時間行われる。
【００９３】
３つの独立した製造バッチすべての最終的な残留水分含量は２．０％を下回る。製剤は３７℃±２℃（ＲＨ７５％±５％）、４５℃±２℃（ＲＨ７５％±５％）及び２℃〜８℃で少なくとも１２週間その効力を保持した。工程ロスは凍結乾燥の前と後の試料間での効力の差異として算出される。安定性ロス（対数ロス）は、異なる保存条件下でインキュベートされた試料の効力データの線形回帰によって算出される。角括弧にて言及される値は、表１０で示されるような４５℃±２℃（ＲＨ７５％±５％）での１２週間の効力対数ロスの値を表す。
【００９４】
【表１０】
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【００９５】
実施例２：ロタウイルスワクチンの耐熱化のための拡大縮小可能な且つ再現性のある凍結乾燥方法を設計すること
試験１：製剤の最適化
この製剤１００４は高い力価（＞２０００用量）を持つパイロット規模で準最適なケーキ特性を示したが、製剤の固形分を高めて表１１にて示されるような１００４の３つの変異体を生成するように増量剤の濃度及び糖：増量剤の比を変化させることによってさらに最適化する。これらの改変された製剤は、以下のステップを含む５４時間の持続時間の凍結乾燥サイクルを支えた。
（ｉ）予備凍結乾燥する液体を１０℃〜１２℃に予備冷却し、凍結乾燥機に負荷すること。
（ｉｉ）予備凍結乾燥する液体−３５℃（４℃から−３５℃までの温度下降：２時間）で１時間及び−４５℃で１．５時間（−３５℃から−４５℃までの温度下降：０．５時間）凍結し、その後、−２０℃でのさらに２時間のアニーリングが続く（−４５℃から−２０℃への温度上昇：１時間）。−４０℃での１．５時間の最終的な凍結（−２０℃から−４０℃までの温度下降：０．５時間）
（ｉｉｉ）５０ミリトールの真空下での−３２℃で１時間及び−２８℃で２４時間（−４０℃から−３２℃までの温度上昇及び−３２℃から−２８℃までの温度上昇：各１時間）での一次乾燥。−２８℃から０℃までの（１０時間）温度上昇、その後、０ミリトールの真空下での２５℃で５時間の二次乾燥が続く（０℃から２５℃までの温度上昇：２時間）。
【００９６】
上記３つの製剤すべての最終的な残留水分含量は見事なケーキを伴って１．０％を下回る（＜１．０％）が、１００４ｂ及び１００４ｃは保存可能期間全体にわたるケーキの外見という点でさらに良好だった。各製剤を、５つの（Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４及びＰ１）ヒト／ウシロタウイルス血清型すべてを伴ったバイアルにて上記のサイクルを用いて凍結乾燥し、３７℃±２℃（ＲＨ７５％±５％）及び２℃〜８℃で保存された場合の効力変化について評価する。工程ロスは凍結乾燥の前と後の試料間での効力の差異として算出される。２℃〜８℃及び３７℃±２℃（ＲＨ７５％±５％）での３０日間当たりの安定性ロス（対数ロス）はこの条件下でインキュベートされた試料の効力データの線形回帰によって算出される。液体フィードのｍＬ当たりの当初の対数効力値は、Ｇ１：６．８１；Ｇ２：６．９２；Ｇ３：６．９１；Ｇ４：６．７８及びＰ１：６．８３である。改変された製剤はすべて見事なケーキを示し、示された効力は、表１２にて示されるように３０日間でｌｏｇ１０＝０．５を超えない工程ロス、安定性ロス及び累積工程ロスを示した。
【００９７】
【表１１】
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【００９８】
【表１２】
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【００９９】
試験２：バイアルにおける製剤１００４ｃの長期の耐熱性及び再現性
３７℃±２℃（ＲＨ７５％±５％）及び２℃〜８℃での８週間の保存条件下にてロタウイルスの臨床的に関連する濃度での長期の耐熱性及び工程再現性について例となる製剤１００４ｃを調べる。製剤は、Ｇ１：６．８１；Ｇ２：６．９２；Ｇ３：６．９１；Ｇ４：６．７８及びＰ１：６．８３（１×濃度）としてｍＬ当たり用量当たりの対数濃度で５つの株すべてと共に組み込まれる。実施例２の試験１で言及されたような５４時間の凍結乾燥サイクルをこの製剤の調製に用い、それは凍結乾燥機の全負荷（バッチ当たり＞６８０バイアル）の凍結乾燥を支えることが見いだされる。総固形分は水性液体フィードにて１３ｇ／１００ｍＬである。
【０１００】
工程ロスは、凍結乾燥の前と後の試料間での効力の差異として３つの独立した製造バッチ（Ｎ＝１、２、３）について算出される。
【０１０１】
ＲＨ７５％±５％を伴った３７℃±２℃での安定性ロス（対数ロス）は、表１３で示されるように３７℃±２℃及びＲＨ７５％±５％でインキュベートされた試料の効力データの線形回帰によって算出される。３つの製造バッチすべての水分含量は２．０％を下回る（＜２．０％）。
【０１０２】
【表１３】
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【０１０３】
試験３：バイアルにおける１００４ｃ製剤の力価拡大、長期試験及び再現性
当初のヒト／ウシロタウイルス血清型の濃度がバイアルにてＧ１：７．５１；Ｇ２：７．６２；Ｇ３：７．６１；Ｇ４：７．４７；Ｐ１：７．５２として５用量当たりｍＬ当たりの対数値によって５倍（５×）に増加することを除いて、製剤の組成は実施例２の試験１で使用されたものと同じである。３つの独立した製造バッチＮ＝１、２及び３すべてについての水性液体フィードにて総固形分は１３ｇ／１００ｍＬである。溶液のｐＨは６．１０±０．１に調整する。５４時間の凍結乾燥サイクル（実施例２の試験１に類似する）を３ｍＬ最大容量のＩ型ガラス製バイアルにおけるこの製剤の調製に使用する。
【０１０４】
予備凍結乾燥する液体対照に比べて無視できるほどの工程ロスが観察される。長期試験は２℃〜８℃、３７℃±２℃（ＲＨ７５％±５％）及び４５℃±２℃（ＲＨ７５％±５％）の保存条件下で実施する。データはそれぞれ図１、図２及び図３にて示す。このデータの線形回帰に基づいて、凍結乾燥したロタウイルス製剤はこれらすべての保存条件でほぼ２５２日間（０９カ月）安定であることが観察される。２℃〜８℃で保存した試料についての傾きの値はロスがないことを示した。データのアレニウス反応速度シミュレーションは、この製剤の中での５つの血清型についてのＬｏｇ１０＝０．５の効力ロスによって示されるように、３７℃±２℃（ＲＨ７５％±５％）における安定性について予想される時間は２３ヵ月であり得ることを示した。データの類似の処理は、４５℃±２℃（ＲＨ７５％±５％）の保存条件での効力におけるＬｏｇ１０＝０．５のロスは０９ヵ月以内に観察され、リアルタイムで確認されることを示した。
【０１０５】
試験４：トレイにおける例となる製剤１００４ｃの大量凍結乾燥
ロタウイルスの５×濃度でステンレススチール（ＳＳ）製のトレイにて製剤１００４ｃを凍結乾燥する。３８０ｍＬの予備凍結乾燥用の液体をＳＳトレイに加え、実施例２の試験２及び３におけるバイアルで得られるのと同じ液体の高さを得る。３つの独立した製造バッチＮ＝１、２及び３を調製した。
【０１０６】
しかしながら、最適なケーキ特性及び水分含量については、トレイにおける大量凍結乾燥は７０時間の持続時間の凍結乾燥サイクルを要した。この凍結乾燥サイクルには以下のステップが関与する：
（ｉ）予備凍結乾燥する液体を１０℃〜１２℃に予備冷却し、凍結乾燥機に負荷すること。
（ｉｉ）予備凍結乾燥する液体−３５℃（４℃から−３５℃までの温度下降：２時間）で１時間及び−４５℃で１．５時間（−３５℃から−４５℃までの温度下降：０．５時間）凍結し、その後、−２０℃でのさらに２時間のアニーリングが続く（−４５℃から−２０℃への温度上昇：１時間）。−４０℃での１．５時間の最終的な凍結（−２０℃から−４０℃までの温度下降：０．５時間）
（ｉｉｉ）一次乾燥は、５０ミリトールの真空下にて−３２℃で１時間及び−２８℃で３４時間（−４０℃から−３２℃までの温度上昇及び−３２℃から−２８℃までの温度上昇：各１時間）実施される。
（ｉｖ）０ミリトールの真空下での２５℃で５時間のケーキの二次乾燥（−２８℃から０℃までの温度上昇：１５．５時間、及び０℃から２５℃までの温度上昇：２時間）。
【０１０７】
上記で言及された３つの独立した製造バッチすべての最終的な残留水分含量は３％を下回り（＜３％）、それによって過剰な水の存在と関連するロタウイルス血清型における分解経路を妨害する。視覚で確認される崩壊のない見事なケーキがトレイにて観察される。
【０１０８】
試験５：自由流動の粉末を得るための大量凍結乾燥ケーキの処理
最終的な包装容器／施栓に充填するのに好適な粉末を得るために、Ｔｕｒｂｕｌａミキサー（Ｗｉｌｌｙ  Ａ．Ｂａｃｈｏｆｅｎ  ＡＧ，スイス．Ｔ２Ｆ型Ｎｏ．１３１２６６）における２５０ｍＬまたは２．０Ｌのステンレススチールの気密性容器にてボール製粉を用いて大量凍結乾燥した５価のロタウイルスワクチンケーキを粉砕する。ワクチンケーキとスチールボールを加え１：１０の重量比を得る。Ｔｕｒｂｕｌａミキサーを７２ｒｐｍの速度で１０５秒間操作する。粉砕されたケーキを完全性について視覚的にチェックし、必要に応じて３０秒間のさらなる粉砕を行う。容器に入れる前の試料調製ステップはすべて窒素パージしたグローブボックスにて低いＲＨ（＜５％）条件下で行う。
【０１０９】
Ｔｕｒｂｕｌａミキサー（Ｗｉｌｌｙ  Ａ．Ｂａｃｈｏｆｅｎ  ＡＧ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ．Ｔ２Ｆ型Ｎｏ．１３１２６６）における２５０ｍＬまたは２．０Ｌのステンレススチールの気密性容器を用いて、微粉化５価ロタウイルス凍結乾燥ワクチンをブレンド剤としてのマルトデキストリンＤＥ６−８（Ｇｌｕｃｉｄｅｘ６Ｄ）と混合する。混合は２３ｒｐｍで１５分間行い、その後さらに３２ｒｐｍで２〜３分間行う。粉砕され、混合された製剤を、粒度分布、溶解時間、再構成後のｐＨ、残留水分含量及びガラス転移温度（Ｔｇ）について特徴付ける。Ｔｇは特定の上昇速度での温度上昇とその後に等温期間が続く一連のマイクロステップによるステップ／走査ＤＳＣにて得られる。
【０１１０】
混合された粉末で以下の所見が得られる
（ｉ）平均容積直径として報告される、粉砕された粉末のＤ５０及びＤ９０を特徴とする粒度は、それぞれ８５μｍ及び２９１μｍであることが認められるのに対して、ブレンド剤はそれぞれ９１μｍ及び２７０μｍの粒度を示した。
（ｉｉ）粉砕された凍結乾燥粉末及びブレンド剤の双方は顕微鏡で観察すると不規則な形状の粒子を示した。
（ｉｉｉ）粉砕された試料は２．０％〜２．５％の間での残留水分を示すのに対して最終的に混合された粉末は１．０％〜１．５％の低い水分含量を示した。
（ｉｖ）予備凍結乾燥する液体のｐＨは６．１０±０．１である。粉砕され、混合された凍結乾燥の５価ロタウイルスワクチン粉末は再構成緩衝液で再構成され、再構成されたワクチンは０．８０ｍＥｑ／２ｍＬの用量の酸中和能（ＡＮＣ）を示した。再構成の後のワクチンのｐＨは６．１０±０．１であることが認められた。
（ｖ）調節された示差走査熱量測定（ＭＤＳＣ）は、３つの独立したトレイで乾燥させた製造バッチについての粉砕された乾燥粉末について４８℃±１℃での反転事象としての開始を伴う鋭い転移としてＴｇを示した。
（ｖｉ）２３．０℃±１．０℃で維持された２．０ｍＬの再構成緩衝液における単回用量の５価ロタウイルスワクチン混合粉末（１３０ｍｇ）の溶解時間はバイアルの手動での穏やかな振盪を伴って６０±５．０秒であることが観察される。２℃〜８℃で維持された緩衝液温度では、穏やかな手動での振盪で５価ロタウイルスワクチンを完全に溶解するのにほぼ２分かかった。
【０１１１】
試験６：粉砕され、混合された凍結乾燥の主要製剤のための長期安定性試験及び再現性試験
粉砕され、混合された凍結乾燥の例となる製剤１００４ｃをＩ型ガラス製バイアルにて等分し、３７℃±２℃（ＲＨ７５％±５％）及び４５℃±２℃（ＲＨ７５％±５％）で保存した。試料採取の時点で凍結乾燥ワクチンを再構成緩衝液で再構成し、その後効力を分析した。工程ロスは３つの独立した製造バッチにて凍結乾燥の前と後の試料間での効力の差異として算出される。安定性ロスはこの保存条件下で少なくとも２６週間インキュベートした試料の効力データの線形回帰によって算出される。
（ｉ）例となる製剤１００４ｃは、図４にて示されるように２℃〜８℃の保存条件で２６週間後でさえ０．０に再現性よく統計的に等しい累積効力ロスを示した。
（ｉｉ）例となる製剤１００４ｃは、図５にて示されるように３７℃±２℃（ＲＨ７５％±５％）の保存条件で２６週間後でさえ有意に再現性よく０．５ｌｏｇ未満である累積効力ロスを示した。
（ｉｉｉ）４５℃±２℃（ＲＨ７５％±５％）の保存条件の場合、効力値は、図６にて示されるように１８週以内に３つの独立した製造バッチについて０．５ｌｏｇのロスに等しいものに再現性よく達した。
【０１１２】
試験７：主要製剤１００４ｃについての再構成後の安定性試験
凍結乾燥した５価のロタウイルスワクチンを再構成緩衝液で再構成する。各２００μＬのアリコートを１．５ｍＬ容量のエッペンドルフチューブに分注し、インキュベータにて２℃〜８℃、２５℃、３７℃及び−７０℃の保存条件でインキュベートする。試料を０時間、８時間、１１時間、３５時間及び４８時間の時間間隔で採取し、効力について評価する。上述の条件下でインキュベートした凍結乾燥ワクチンのＩＵ／用量を−７０℃でインキュベートした試料と比べることによって上記条件で残っているロタウイルスの効力を決定する。
【０１１３】
これらの試験から得られたデータは、表１４にて示されるように５つの株すべてについて２５℃で８〜１１時間効力が保持されることを示している。２℃〜８℃及び−７０℃の保存条件では効力の低下は無視できる。
【０１１４】
【表１４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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