(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
野生型トランスアミナーゼと比べて増加したトランスアミナーゼ活性を有する変異体トランスアミナーゼであって、変異体トランスアミナーゼが、SEQ ID NO:1、3、または5〜11のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも90％同一であるアミノ酸配列を含み、かつ野生型トランスアミナーゼと比べて少なくとも2個のアミノ酸置換を有し、SEQ ID NO:1の59位に対応する位置におけるアミノ酸がTrpまたはPhe（それぞれ、Trp59またはPhe59）に置換されており、SEQ ID NO:1の231位に対応する位置におけるアミノ酸がAlaまたはGly（それぞれ、Ala231またはGly231）に置換されている、変異体トランスアミナーゼ。
【請求項２】
−SEQ ID NO:1の87位に対応する位置におけるアミノ酸が、疎水性アミノ酸（HYaa87）に置換されており、特に、疎水性アミノ酸が、Leu（Leu87）もしくはVal（Val87）もしくはPhe（Phe87）であり；かつ/または
−SEQ ID NO:1の152位に対応する位置におけるアミノ酸が、Phe（Phe152）に置換されており、かつ/または
−SEQ ID NO:1の234位に対応する位置におけるアミノ酸が、Phe（Phe234）もしくはMet（Met234）に置換されており、かつ/または
−SEQ ID NO:1の423位に対応する位置におけるアミノ酸が、His（His423）に置換されている、
請求項1記載の変異体トランスアミナーゼ。
【請求項３】
SEQ ID NO:1における変異
−Trp59およびAla231、または
−Trp59、Phe87、およびAla231；または
−Trp59、Leu87、およびAla231；または
−Trp59、Val87、およびAla231；または
−Trp59、Phe87、Ala231、およびHis423；または
−Trp59、Phe87、Phe152、およびAla231；または
−Trp59、Leu87、Phe152、およびAla231；または
−Trp59、Val87、Phe152、およびAla231；または
−Trp59、Phe87、Phe152、Ala231、およびHis423、または
−Trp59およびGly231；または
−Trp59、Phe87、およびGly231；または
−Trp59、Leu87、およびGly231；または
−Trp59、Val87、およびGly231；または
−Trp59、Phe87、Phe152、およびGly231；または
−Trp59、Phe87、Phe152、Gly231、およびHis423；または
−Phe59およびAla231；または
−Phe59、Phe87、およびGly231；または
−Trp59、Ala231、およびPhe234；または
−Trp59、Ala231、およびMet234；または
−Trp59、Phe87、Ala231、およびPhe234；または
−Trp59、Leu87、Ala231、およびPhe234；または
−Trp59、Val87、Ala231、およびPhe234；または
−Trp59、Phe87、Phe152、Ala231、およびPhe234；または
−Trp59、Phe87、Phe152、Ala231、Phe234、およびHis423、または
−Trp59、Gly231、およびPhe234；または
−Trp59、Phe87、Gly231、およびPhe234；または
−Trp59、Leu87、Gly231、およびPhe234；または
−Trp59、Val87、Gly231、およびPhe234；または
−Trp59、Phe87、Phe152、Gly231、およびPhe234；または
−Trp59、Phe87、Phe152、Gly231、Phe234、およびHis423；または
−Phe59、Phe87、Gly231、およびPhe234、または
−Trp59、Ala231、およびMet234；または
−Trp59、Phe87、Ala231、およびMet234；または
−Trp59、Leu87、Ala231、およびMet234；または
−Trp59、Val87、Ala231、およびMet234；または
−Trp59、Phe87、Phe152、Ala231、およびMet234；または
−Trp59、Phe87、Phe152、Ala231、Met234、およびHis423、または
−Trp59、Gly231、およびMet234；または
−Trp59、Phe87、Gly231、およびMet234；または
−Trp59、Leu87、Gly231、およびMet234；または
−Trp59、Val87、Gly231、およびMet234；または
−Trp59、Phe87、Phe152、Gly231、およびMet234；または
−Trp59、Phe87、Phe152、Gly231、Met234、およびHis423；または
−Phe59、Phe87、Gly231、およびMet234
に対応する変異を少なくとも有する、請求項1または2記載の変異体トランスアミナーゼ。
【請求項４】
SEQ ID NO:1における変異
−Trp59、Phe87、Phe152、およびAla231、または
−Trp59、Phe87、Phe152、Ala231、およびMet234、または
−Trp59、Phe87、Phe152、Ala231、およびH423、または
−Phe59、Phe87、およびGly231
に対応する変異を少なくとも有する、請求項1〜3のいずれか一項記載の変異体トランスアミナーゼ。
【請求項５】
SEQ ID NO:30〜38、43〜51、53、55、および57〜64からなる群より選択される配列を含むかまたは該配列からなる、請求項1〜4のいずれか一項記載の変異体トランスアミナーゼ。
【請求項６】
SEQ ID NO:1、3、または5〜11のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも95％、96％、97％、98％、または99％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項1〜5のいずれか一項記載の変異体トランスアミナーゼ。
【請求項７】
1-(4-クロロフェニル)-1-フェニル-1-アミノメタン（1a）、2,2-ジメチル-1-フェニル-1-アミノプロパン（2a）、1,3-ジフェニル-1-アミノプロパン（3a）、1,2-ジヒドロアセナフチレン-1-アミン（4a）、および3-アミノ-8-ベンゾイル-8-アザビシクロ[3.2.1]オクタン（5a）、3(4-クロロフェニル)-フェニル-メタノン（1b）、2,2-ジメチル-1-フェニル-プロパン-1-オン（2b）、1,3-ジフェニルプロパン-1-オン（3b）、2H-アセナフチレン-1-オン（4b）、8-ベンゾイル-8-アザビシクロ[3.2.1]オクタン-3-オン（5b）、およびイソプロピルアミンからなる群より選択される少なくとも1種の化合物のアミノ基転移のための増加したトランスアミナーゼ活性を有する、請求項1〜6のいずれか一項記載の変異体トランスアミナーゼ。
【請求項８】
特に、1-(4-クロロフェニル)-1-フェニル-1-アミノメタン（1a）、2,2-ジメチル-1-フェニル-1-アミノプロパン（2a）、1,3-ジフェニル-1-アミノプロパン（3a）、1,2-ジヒドロアセナフチレン-1-アミン（4a）、および3-アミノ-8-ベンゾイル-8-アザビシクロ[3.2.1]オクタン（5a）、(4-クロロフェニル)-フェニル-メタノン（1b）、2,2-ジメチル-1-フェニル-プロパン-1-オン（2b）、1,3-ジフェニルプロパン-1-オン（3b）、2H-アセナフチレン-1-オン（4b）、8-ベンゾイル-8-アザビシクロ[3.2.1]オクタン-3-オン（5b）、およびイソプロピルアミンからなる群より選択される少なくとも1種の化合物のための、対応する野生型酵素と比べて、少なくとも2倍増加したトランスアミナーゼ活性、好ましくは、少なくとも2.5倍増加したトランスアミナーゼ活性、好ましくは、少なくとも3倍増加したトランスアミナーゼ活性、より好ましくは、少なくとも3.5倍増加したトランスアミナーゼ活性、および最も好ましくは、少なくとも4倍増加したトランスアミナーゼ活性を有する、請求項1〜7のいずれか一項記載の変異体トランスアミナーゼ。
【請求項９】
請求項1〜8のいずれか一項記載のトランスアミナーゼを含む融合タンパク質。
【請求項１０】
請求項1〜8のいずれか一項記載のトランスアミナーゼまたは請求項9記載の融合タンパク質をコードする核酸。
【請求項１１】
請求項1〜8のいずれか一項記載のトランスアミナーゼ、請求項9記載の融合タンパク質、または請求項10記載のポリヌクレオチドを含む、宿主細胞。
【請求項１２】
アミンドナーの存在下で、アミンアクセプターを、請求項1〜8のいずれか一項記載の変異体トランスアミナーゼまたは請求項9記載の融合タンパク質と反応させる工程を含む、アミンを作製する方法。
【請求項１３】
方法が、
（a）アミンアクセプターと変異体トランスアミナーゼもしくは融合タンパク質の存在下でのラセミアミンの速度論的分割；または
（b）アミンドナーと変異体トランスアミナーゼもしくは融合タンパク質の存在下でのプロキラルケトンの非対称アミノ基転移
のいずれかであり、変異体トランスアミナーゼまたは融合タンパク質が立体選択的であり、かつ鏡像異性的に濃縮されたキラルアミンが作製される、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
方法（a）において、ラセミアミンが、式
0006782708.tif 000039
を有し、
式中、R1もしくはR2は、相互に独立に、置換されていてもよいアルキル、アリール、カルボシクリル、もしくはヘテロシクリルを表すか；または
R1およびR2は、それらが結合している炭素原子と一緒に、置換されていてもよい単環式もしくは多環式の炭素環もしくは複素環を形成する、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
方法（a）において、アミンアクセプターがケトンおよびケトカルボン酸より選択される、請求項13〜14のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６】
方法（b）において、プロキラルケトンが、式
0006782708.tif 000040
を有し、
式中、R3もしくはR4は、相互に独立に、置換されていてもよいアルキル、アリール、カルボシクリル、もしくはヘテロシクリルを表すか；または
R3およびR4は、それらが結合している炭素原子と一緒に、置換されていてもよい単環式もしくは多環式の炭素環もしくは複素環を形成する、請求項13記載の方法。
【請求項１７】
方法（b）において、アミンドナーが、アキラルまたはキラルなアミンまたはアミノ酸である、請求項13または16記載の方法。
【請求項１８】
アミンの作製のための、特に、速度論的分割または非対称アミノ基転移による鏡像異性的に濃縮されたキラルアミンの作製のための、請求項1〜8のいずれか一項記載の変異体トランスアミナーゼまたは請求項9記載の融合タンパク質の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、野生型トランスアミナーゼと比べて増加したトランスアミナーゼ活性を有する変異体トランスアミナーゼ、トランスアミナーゼを含む融合タンパク質、トランスアミナーゼをコードするポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド、変異体トランスアミナーゼ、および/または融合タンパク質を含む宿主細胞、変異体トランスアミナーゼまたは融合タンパク質によってアミンを作製する方法、ならびにアミンの作製のための変異体トランスアミナーゼまたは融合タンパク質の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
（アミノトランスフェラーゼとも呼ばれる）トランスアミナーゼは、アミノ基転移反応、即ち、アミンドナーからアミンアクセプターへのアミノ基の転移、具体的には、一方の分子またはドメインのNH2基が、他方の分子またはドメインの=O基と交換される、アミンの脱アミノを伴うケトンのアミノ化を触媒する（スキーム1を参照すること）。
【０００３】
キラルアミンのようなアミン化合物は、製薬、農芸化学、または化学の産業のための重大なビルディングブロックである。これらの適用の多くにおいて、1種の光学的に純粋な型のみが使用されることが極めて重要である。そのような化合物の作製のための化学合成（例えば、遷移金属を使用した非対称水素化）が確立されているが、これらの化学プロセスは、収率、純度、および廃棄物生成に関して決して完璧でない。トランスアミナーゼによって触媒されるアミンの作製は、古典的な方法のしばしば有利な代替法であり、従って、代替的なまたは改善されたトランスアミナーゼは、当領域において興味深い。
【０００４】
改変された(R)選択的トランスアミナーゼを使用することによる薬物シタグリプチンの作製において良好に提示されたように（Savile et al.,2010；US 2015/0037869）、酵素によって媒介されるアミノ基転移を介したキラルアミンの作製は、確立されている化学不斉合成と比較して有益である。このケースにおいては、所望の基質に対して最初は不活性であったアミントランスアミナーゼ（ATA）が、定向進化法を介して拡張的に改変された。トランスアミナーゼのさらなる変異体は、当技術分野において記載されている（Steffen-Munsberg et al.,2013；Nobili et al.,2015 Deszcz et al.,2015）。モノアミンオキシターゼ、イミンレダクターゼ、アミノ酸デヒドロゲナーゼ、アンモニアリアーゼ、またはアミノムターゼのようなその他の酵素も、光学的に純粋なキラルなアミンおよびアミノ酸の作製のために使用され得る。ラセミアミンの速度論的分割のため、トランスアミナーゼを使用することもできるが、速度論的分割モードにおける50％のみの理論上の収率と比較して、ケト酸、ケトン、またはアルデヒドからの不斉合成は、理論上100％の変換をもたらす可能性があるため、最も重要である（合成および速度論的分割を例示するスキーム1を参照すること）。
【０００５】
スキーム1：
0006782708.tif 000002
【０００６】
残基Ra、Rb、Rc、およびRdは、例示的な目的のために適用されているに過ぎず、一般的な有機残基を表すものとする。
【０００７】
しかしながら、定向進化アプローチは、例えば、よりかさの大きい基質の受容に関して、分子的理由のための洞察を提供しない。トランスアミナーゼの高いエナンチオ選択性は、大きい結合ポケットおよび小さい結合ポケットの理論を支持したが、文献に見出される成功例の圧倒的大部分が、メチルケトンを変換するトランスアミナーゼであるという事実によって例示されるように、小さい結合ポケットを、かさの大きい基質に適合するよう拡大することは、容易には達成されない目標である。
【０００８】
本発明の目標は、野生型トランスアミナーゼと比べて増加したトランスアミナーゼ活性を有する変異体トランスアミナーゼを設計することであった。好ましくは、それらは、特に、立体選択性を維持しながら、広範囲の基質、特に、かさの大きい基質を受容することができなければならず、アミンドナーとしてイソプロピルアミンを使用することができなければならない。従って、増加した活性は、かさの大きい基質（例示される選択はスキーム2および3に示され、下記を参照すること）ならびにアミンドナーイソプロピルアミンに特に関連している。これらの立体選択的トランスアミナーゼは、それぞれのケトンからのキラルアミンの不斉合成のために使用されてもよいし、速度論的分割のために使用されてもよい。
【発明の概要】
【０００９】
驚くべきことに、SEQ ID NO:1（ルエゲリア（Ruegeria）sp.TM1040トランスアミナーゼ；3FCRと呼ばれる）のアミノ酸配列と少なくとも65％同一であるアミノ酸配列を含み、かつ野生型トランスアミナーゼと比べて少なくとも2個のアミノ酸置換を有する変異体トランスアミナーゼが、野生型トランスアミナーゼと比べて増加したトランスアミナーゼ活性を示すことが見出された。該変異体トランスアミナーゼにおいては、SEQ ID NO:1の59位に対応する位置におけるアミノ酸がTrpまたはPhe（それぞれ、Trp59またはPhe59）に置換されており、SEQ ID NO:1の231位に対応する位置におけるアミノ酸がAlaまたはGly（それぞれ、Ala231またはGly231）に置換されている。
[本発明1001]
野生型トランスアミナーゼと比べて増加したトランスアミナーゼ活性を有する変異体トランスアミナーゼであって、変異体トランスアミナーゼが、SEQ ID NO:1（ルエゲリア（Ruegeria）sp.TM1040トランスアミナーゼ；3FCRと呼ばれる）のアミノ酸配列と少なくとも65％同一であるアミノ酸配列を含み、かつ野生型トランスアミナーゼと比べて少なくとも2個のアミノ酸置換を有し、SEQ ID NO:1の59位に対応する位置におけるアミノ酸がTrpまたはPhe（それぞれ、Trp59またはPhe59）に置換されており、SEQ ID NO:1の231位に対応する位置におけるアミノ酸がAlaまたはGly（それぞれ、Ala231またはGly231）に置換されている、変異体トランスアミナーゼ。
[本発明1002]
−SEQ ID NO:1の87位に対応する位置におけるアミノ酸が、疎水性アミノ酸（HYaa87）に置換されており、特に、疎水性アミノ酸が、Leu（Leu87）もしくはVal（Val87）もしくはPhe（Phe87）であり；かつ/または
−SEQ ID NO:1の152位に対応する位置におけるアミノ酸が、Phe（Phe152）に置換されており、かつ/または
−SEQ ID NO:1の234位に対応する位置におけるアミノ酸が、Phe（Phe234）もしくはMet（Met234）に置換されており、かつ/または
−SEQ ID NO:1の423位に対応する位置におけるアミノ酸が、His（His423）に置換されている、
本発明1001の変異体トランスアミナーゼ。
[本発明1003]
変異
−Trp59およびAla231、または
−Trp59、Phe87、およびAla231；または
−Trp59、Leu87、およびAla231；または
−Trp59、Val87、およびAla231；または
−Trp59、Phe87、Ala231、およびHis423；または
−Trp59、Phe87、Phe152、およびAla231；または
−Trp59、Leu87、Phe152、およびAla231；または
−Trp59、Val87、Phe152、およびAla231；または
−Trp59、Phe87、Phe152、Ala231、およびHis423、または
−Trp59およびGly231；または
−Trp59、Phe87、およびGly231；または
−Trp59、Leu87、およびGly231；または
−Trp59、Val87、およびGly231；または
−Trp59、Phe87、Phe152、およびGly231；または
−Trp59、Phe87、Phe152、Gly231、およびHis423；または
−Phe59およびAla231；または
−Phe59、Phe87、およびGly231；または
−Trp59、Ala231、およびPhe234；または
−Trp59、Ala231、およびMet234；または
−Trp59、Phe87、Ala231、およびPhe234；または
−Trp59、Leu87、Ala231、およびPhe234；または
−Trp59、Val87、Ala231、およびPhe234；または
−Trp59、Phe87、Phe152、Ala231、およびPhe234；または
−Trp59、Phe87、Phe152、Ala231、Phe234、およびHis423、または
−Trp59、Gly231、およびPhe234；または
−Trp59、Phe87、Gly231、およびPhe234；または
−Trp59、Leu87、Gly231、およびPhe234；または
−Trp59、Val87、Gly231、およびPhe234；または
−Trp59、Phe87、Phe152、Gly231、およびPhe234；または
−Trp59、Phe87、Phe152、Gly231、Phe234、およびHis423；または
−Phe59、Phe87、Gly231、およびPhe234、または
−Trp59、Ala231、およびMet234；または
−Trp59、Phe87、Ala231、およびMet234；または
−Trp59、Leu87、Ala231、およびMet234；または
−Trp59、Val87、Ala231、およびMet234；または
−Trp59、Phe87、Phe152、Ala231、およびMet234；または
−Trp59、Phe87、Phe152、Ala231、Met234、およびHis423、または
−Trp59、Gly231、およびMet234；または
−Trp59、Phe87、Gly231、およびMet234；または
−Trp59、Leu87、Gly231、およびMet234；または
−Trp59、Val87、Gly231、およびMet234；または
−Trp59、Phe87、Phe152、Gly231、およびMet234；または
−Trp59、Phe87、Phe152、Gly231、Met234、およびHis423；または
−Phe59、Phe87、Gly231、およびMet234
を少なくとも有する、本発明1001または1002の変異体トランスアミナーゼ。
[本発明1004]
変異
−Trp59、Phe87、Phe152、およびAla231、または
−Trp59、Phe87、Phe152、Ala231、およびMet234、または
−Trp59、Phe87、Phe152、Ala231、およびH423、または
−Phe59、Phe87、およびGly231
を少なくとも有する、本発明1001〜1003のいずれかの変異体トランスアミナーゼ。
[本発明1005]
SEQ ID NO:30〜38、43〜51、53、55、および57〜64からなる群より選択される配列を含むかまたは該配列からなる、本発明1001〜1004のいずれかの変異体トランスアミナーゼ。
[本発明1006]
SEQ ID NO:1のアミノ酸配列と少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、または99％同一であるアミノ酸配列、SEQ ID NO:1、3、または5〜11のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも90％、95％、96％、97％、98％、または99％同一であるアミノ酸配列を含む、本発明1001〜1005のいずれかの変異体トランスアミナーゼ。
[本発明1007]
1-(4-クロロフェニル)-1-フェニル-1-アミノメタン（1a）、2,2-ジメチル-1-フェニル-1-アミノプロパン（2a）、1,3-ジフェニル-1-アミノプロパン（3a）、1,2-ジヒドロアセナフチレン-1-アミン（4a）、および3-アミノ-8-ベンゾイル-8-アザビシクロ[3.2.1]オクタン（5a）、3(4-クロロフェニル)-フェニル-メタノン（1b）、2,2-ジメチル-1-フェニル-プロパン-1-オン（2b）、1,3-ジフェニルプロパン-1-オン（3b）、2H-アセナフチレン-1-オン（4b）、8-ベンゾイル-8-アザビシクロ[3.2.1]オクタン-3-オン（5b）、およびイソプロピルアミンからなる群より選択される少なくとも1種の化合物のアミノ基転移のための増加したトランスアミナーゼ活性を有する、本発明1001〜1006のいずれかの変異体トランスアミナーゼ。
[本発明1008]
特に、1-(4-クロロフェニル)-1-フェニル-1-アミノメタン（1a）、2,2-ジメチル-1-フェニル-1-アミノプロパン（2a）、1,3-ジフェニル-1-アミノプロパン（3a）、1,2-ジヒドロアセナフチレン-1-アミン（4a）、および3-アミノ-8-ベンゾイル-8-アザビシクロ[3.2.1]オクタン（5a）、(4-クロロフェニル)-フェニル-メタノン（1b）、2,2-ジメチル-1-フェニル-プロパン-1-オン（2b）、1,3-ジフェニルプロパン-1-オン（3b）、2H-アセナフチレン-1-オン（4b）、8-ベンゾイル-8-アザビシクロ[3.2.1]オクタン-3-オン（5b）、およびイソプロピルアミンからなる群より選択される少なくとも1種の化合物のための、対応する野生型酵素と比べて、少なくとも2倍増加したトランスアミナーゼ活性、好ましくは、少なくとも2.5倍増加したトランスアミナーゼ活性、好ましくは、少なくとも3倍増加したトランスアミナーゼ活性、より好ましくは、少なくとも3.5倍増加したトランスアミナーゼ活性、および最も好ましくは、少なくとも4倍増加したトランスアミナーゼ活性を有する、本発明1001〜1007のいずれかの変異体トランスアミナーゼ。
[本発明1009]
本発明1001〜1008のいずれかのトランスアミナーゼを含む融合タンパク質。
[本発明1010]
本発明1001〜1008のいずれかのトランスアミナーゼまたは本発明1009の融合タンパク質をコードする核酸。
[本発明1011]
本発明1001〜1008のいずれかのトランスアミナーゼ、本発明1009の融合タンパク質、または本発明1010のポリヌクレオチドを含む、宿主細胞。
[本発明1012]
アミンドナーの存在下で、アミンアクセプターを、本発明1001〜1008のいずれかの変異体トランスアミナーゼまたは本発明1009の融合タンパク質と反応させる工程を含む、アミンを作製する方法。
[本発明1013]
方法が、
（a）アミンアクセプターと変異体トランスアミナーゼもしくは融合タンパク質の存在下でのラセミアミンの速度論的分割；または
（b）アミンドナーと変異体トランスアミナーゼもしくは融合タンパク質の存在下でのプロキラルケトンの非対称アミノ基転移
のいずれかであり、変異体トランスアミナーゼまたは融合タンパク質が立体選択的であり、かつ鏡像異性的に濃縮されたキラルアミンが作製される、本発明1012の方法。
[本発明1014]
方法（a）において、ラセミアミンが、式
0006782708.tif 000003
を有し、
式中、R1もしくはR2は、相互に独立に、置換されていてもよいアルキル、アリール、カルボシクリル、もしくはヘテロシクリルを表すか；または
R1およびR2は、それらが結合している炭素原子と一緒に、置換されていてもよい単環式もしくは多環式の炭素環もしくは複素環を形成する、本発明1013の方法。
[本発明1015]
方法（a）において、アミンアクセプターがケトンおよびケトカルボン酸より選択される、本発明1013〜1014のいずれかの方法。
[本発明1016]
方法（b）において、プロキラルケトンが、式
0006782708.tif 000004
を有し、
式中、R3もしくはR4は、相互に独立に、置換されていてもよいアルキル、アリール、カルボシクリル、もしくはヘテロシクリルを表すか；または
R3およびR4は、それらが結合している炭素原子と一緒に、置換されていてもよい単環式もしくは多環式の炭素環もしくは複素環を形成する、本発明1013の方法。
[本発明1017]
方法（b）において、アミンドナーが、アキラルまたはキラルなアミンまたはアミノ酸である、本発明1013または1016の方法。
[本発明1018]
アミンの作製のための、特に、速度論的分割または非対称アミノ基転移による鏡像異性的に濃縮されたキラルアミンの作製のための、本発明1001〜1008のいずれかの変異体トランスアミナーゼまたは本発明1009の融合タンパク質の使用。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
実施例において示されるように、その置換が、それぞれの野生型トランスアミナーゼと比べて変異体トランスアミナーゼのトランスアミナーゼ活性を増加させる、トランスアミナーゼにおける数個のアミノ酸残基が同定された。特に、（Y59W/T231Aと呼ばれる）3FCRの二重変異体、即ち、SEQ ID NO:1の59位のTyrのTrpへの置換（Y59W）および231位のThrのAlaへの置換（T231A）を有する3FCRは、野生型によって受容される基質（スキーム2に示されるようなアミン3aおよび4a）に対して増加した活性を有していたが、アミン1aに対しては低い活性（およそ5mU/mg）が測定されたことが示され得る（表3および4を参照すること）。トランスアミナーゼ3FCRの変異体によって入手された結果は、（3GJUと呼ばれる）メソリゾビウム・ロティ（Mesorhizobium loti）maff303099のトランスアミナーゼの変異体によって確認され得る（表3を参照すること）。さらに、（Y87FおよびY152Fと呼ばれる）SEQ ID NO:1の87位のTyrのPheへの付加的な置換および/または152位のTyrのPheへの付加的な置換を有する3FCR変異体は、2個の芳香環を有する基質（即ち、アミン1a、3a、および4a）に対して増加した活性を有していた（表4中のY59W/Y87F/T231AおよびY59W/Y87F/Y152F/T231Aを参照すること）。同時に、変異Y152Fは、変異体の安定性を有意に増加させた（図1）。3FCRのトランスアミナーゼにおける（P423Hと呼ばれる）SEQ ID NO:1の423位のProのHisへのさらなる置換によって、さらに高い活性の増加および受容される基質の範囲が入手され得る（表3および4を参照すること）。置換Y59W、Y87F、Y152F、T231A、およびP423Hを有する変異体は、（アミン1a、3a、および4aのような）かさの大きい基質に対して特に活性であることが示され得る。再び、トランスアミナーゼ3FCRの変異体によって入手された結果は、3GJUの変異体によって確認され得る（表3を参照すること）。さらに、変異Y59W/Y87F/Y152F/T231Aを有するATA-3、ATA-5、ATA-6、ATA-7、ATA-8、およびATA-9の変異体トランスアミナーゼは、アミン1a、3a、4a、および6aに対して活性であることが示された（表5を参照すること）。野生型配列ATA-3〜ATA-9は、65〜70％からおよそ90％までの範囲の野生型3FCRとの配列同一性を有することに注意されたい。従って、65％以上の3FCR（SEQ ID NO:1）の配列との配列同一性を有する全てのトランスアミナーゼに、本発明の概念を移すことが可能であると結論付けることができる。さらに、LeuまたはVal（それぞれ、Y87LまたはY87V）のような脂肪族疎水性アミノ酸を87位に有する3FCRおよび3GJUの変異体は、増加した活性を有することが見出され、アミン2aのような三級炭素置換基の受容のために特に有効であった（表6を参照すること）。59位にフェニルアラニン（Y59F）を有しかつ/または231位にグリシン（T231G）を有する変異体は、アミン5aのような二環式化合物に対して増加した活性を示す（表7を参照すること）。さらに、（それぞれ、I234FおよびI234Mと呼ばれる）234位のIleのPheまたはMetへの置換を有する3FCR変異体は、アミン5a（表7を参照すること）およびアミンドナーイソプロピルアミン（表8を参照すること）に対して増加した活性を有していた。不斉合成および速度論的分割における変異体の維持された立体選択性および適応性は、実施例5〜11において立証された（表9〜10を参照すること）。
【００１１】
従って、第1の局面において、本発明は、SEQ ID NO:1（ルエゲリアsp.TM1040トランスアミナーゼ；3FCRと呼ばれる）のアミノ酸配列と少なくとも65％同一であるアミノ酸配列を含み、かつ野生型トランスアミナーゼと比べて少なくとも2個のアミノ酸置換を有する、野生型トランスアミナーゼと比べて増加したトランスアミナーゼ活性を有する変異体トランスアミナーゼを提供する。該変異体トランスアミナーゼにおいては、SEQ ID NO:1の59位に対応する位置におけるアミノ酸がTrpまたはPhe（それぞれ、Trp59またはPhe59）に置換されており、SEQ ID NO:1の231位に対応する位置におけるアミノ酸がAlaまたはGly（それぞれ、Ala231またはGly231）に置換されている。
【００１２】
（Enzyme Commission of the International Union of BiochemistryによってEC 2.6.1.XXとして分類されており；アミノトランスフェラーゼとしても公知である）「トランスアミナーゼ」という用語は、一般に、アミンドナーからアミンアクセプターのカルボニル基へのアミン基の転移（アミノ基転移）を触媒する酵素を意味する。トランスアミナーゼは、ピリドキサール-5'-リン酸依存性（PLP依存性）の酵素である。スキーム1に見られるように、アミンドナーが、アミンアクセプターへアミノ基を提供し、その結果、所望のアミンが合成され、対応するケトンが形成される。トランスアミナーゼはしばしば高い立体選択性を保有するため、アミノ基転移反応は、鏡像異性的に濃縮されたアミンとして、不斉還元による所望のアミンおよび/または酸化的脱アミノを介した分割による残存アミンドナーを提供する。ωトランスアミナーゼ（ωTA）は、αケト酸からのαアミノ酸の合成について公知のアミノ酸トランスアミナーゼとは対照的に、隣接したカルボキシ官能基を有しないケトンをキラルアミンに変換することができるため、本発明において特に興味深い。これらの酵素は、例えば、対応するεアルデヒドからL-リジンを合成する能力のために命名されたため、ωTAよりアミントランスアミナーゼ（ATA）という用語が好ましいことに注意すべきである。(S)選択的なATAは、10年以上前から既知である（Coffen et al,1994）。本発明のトランスアミナーゼは、非選択的であってもよいし、または選択的、例えば、(S)選択的もしくは(R)選択的、特に、(S)選択的なトランスアミナーゼであってもよい。これらのトランスアミナーゼの適当な例は、表1にも与えられる。  
【００１３】
「野生型トランスアミナーゼ」という用語は、自然界に典型的に存在するトランスアミナーゼに関する。天然に存在する野生型トランスアミナーゼの例は、以下の表1に、SEQ ID NO:1、3、および5〜11（アミノ酸配列）として与えられる。1個または複数個の変異が導入される場合、変異体トランスアミナーゼが入手される。従って、「変異体トランスアミナーゼ」という用語は、そのアミノ酸配列が野生型配列とは異なるトランスアミナーゼに関する。本発明の変異体トランスアミナーゼに関して、変異体は機能的に活性であることに注意されたい。これは、変異体が、トランスアミナーゼの生物学的機能、即ち、酵素活性を維持していることを意味する。本発明によると、変異体のトランスアミナーゼ活性は、野生型のトランスアミナーゼ活性と比べて増加している。変異体に対応する野生型トランスアミナーゼは、最小数の変異によって変異体と異なる野生型トランスアミナーゼである。本発明によって変異させられ得る例示的な野生型トランスアミナーゼは、以下にリストされる：
−アミノトランスフェラーゼ（ルエゲリアsp.TM1040）(GI:499859271；3FCRと呼ばれる；SEQ ID NO:1)
−トランスアミナーゼ（メソリゾビウム・ロティmaff303099）（GI：499217058；3GJUと呼ばれる；SEQ ID NO:3）
−トランスアミナーゼ（オセアニコラ・グラニュロサス（Oceanicola granulosus））（GI：494465841；ATA-3と呼ばれる；SEQ ID NO:5）
−トランスアミナーゼ（ジャナスキア（Jannaschia）Sp CCS1）（GI：499773242；ATA-4；SEQ ID NO:6）
−トランスアミナーゼ（キサントバクター科（Xanthobacteraceae））（GI：517199618；ATA-5と呼ばれる；SEQ ID NO:7）
−ロドバクター科（Rhodobacteraceae）細菌RB2150_13166）（GI：126705951；ATA-6と呼ばれる；SEQ ID NO:8）
−トランスアミナーゼ（マルテレラ・メディテラネア（Martelella mediterranea）DSM 17316）（GI:516720233；ATA-7と呼ばれる；SEQ ID NO:9）
−トランスアミナーゼ（ルゲリア・ポメロイ（Rugeria pomeroyi）DSS-3）（GI:56677770；ATA-8と呼ばれる；SEQ ID NO:10）
−トランスアミナーゼ（サギッツラ・ステラタ（Sagittula stellata）E-37）（GI:126711082；ATA-9と呼ばれる；SEQ ID NO:11）。
【００１４】
本発明によって本明細書に記載された変異を導入することができる特に好ましい野生型トランスアミナーゼは、SEQ ID NO:1、3、および5〜11、特に、SEQ ID NO:1および3、特に、SEQ ID NO:1に明示されたものである。
【００１５】
本発明によると、変異体トランスアミナーゼは、変異を有しないそれぞれの野生型トランスアミナーゼと比べて増加したトランスアミナーゼ活性を有する。酵素活性は、酵素の活性の尺度である。酵素活性のための国際単位は、カタール（1カタール＝1mol秒-1）である。より実用的で一般的に使用されている値は、酵素単位（U）＝1μmol分-1である。1Uは16.67ナノカタールに相当する。1Uは、1分間に1マイクロモルの基質の変換を触媒する酵素の量として定義される。活性を測定する時の条件は、一般的に標準化されており：一般的には、（実施例のように）25℃または30℃の温度、ならびに最大の基質変換速度を与えるpH値および基質濃度が利用される。酵素の比活性は、（μmol分-1mg-1で表される）全タンパク質1ミリグラム当たりの酵素の活性である。それは、全タンパク質1ミリグラム当たりの、所定の条件の下で所定の量の時間において酵素によって形成される生成物の量である。比活性は、反応速度に反応体積を掛け、それを全タンパク質の質量で割ったものに等しい。国際単位はカタールkg-1であるが、より実用的な単位はμmol分-1mg-1である。比活性は、特定の（一般的には飽和）基質濃度における酵素処理能力の尺度であり、純粋な酵素については一般的に一定である。酵素の分子量が既知である場合には、代謝回転数またはμmol生成物秒-1μmol-1活性酵素を、比活性から計算することができる。代謝回転数は、各酵素分子が1秒間に触媒サイクルを実施する回数として視覚化され得る。
【００１６】
活性は、基質の消費または生成物の生成のいずれかを経時的に測定する酵素アッセイにおいて決定され得る。基質および生成物の濃度を測定する多数の異なる方法が存在し、多くの酵素は当業者に公知の数種の異なる方式でアッセイされ得る。本発明において、当該トランスアミナーゼは、アミノ基転移を助ける条件および時間で、適当なアミンドナーおよび適当なアミンアクセプターと共にインキュベートされる。
【００１７】
酵素アッセイは、試料採取方法によって2つの群：活性の連続的な読み取りを与える連続アッセイ、および試料が採取され、反応が中止され、次いで、基質/生成物の濃度が決定される不連続アッセイへ分類され得る。
【００１８】
好ましい態様において、本発明のトランスアミナーゼは、立体選択的、例えば、(S)選択的または(R)選択的、特に、(S)選択的である。「立体選択性」とは、化学反応または酵素反応において、一方の立体異性体が他方より優先的に形成されることをさす。立体選択性は、一方の立体異性体の形成が他方より有利である部分的なものであってもよいし、または一方の立体異性体のみが形成される完全なものであってもよい。立体異性体が鏡像異性体である時、立体選択性はエナンチオ選択性と呼ばれる。それは、当技術分野において、式[多い方の鏡像異性体-少ない方の鏡像異性体]/[多い方の鏡像異性体+少ない方の鏡像異性体]に従って計算される鏡像体過剰率（e.e.）として（典型的には、百分率として）一般的に報告される。あるいは、鏡像異性体比またはer(S:R)が、立体選択性を特徴決定するために使用されてもよい。鏡像異性体比とは、鏡像異性体の混合物の中の、一方の鏡像異性体（例えば、(S)-鏡像異性体）のパーセントと、他方の鏡像異性体（例えば、(R)-鏡像異性体）との比である。立体異性体がジアステレオ異性体である場合、立体選択性はジアステレオ選択性と呼ばれ、一般的には、2種のジアステレオマーの混合物の中の一方のジアステレオマーの割合（典型的には、百分率）として報告され、代替的に、ジアステレオマー過剰率（d.e.）として報告される。鏡像体過剰率およびジアステレオマー過剰率は、立体異性体過剰率の1種である。
【００１９】
この文脈において、鏡像異性的に濃縮されたとは、50:50を超える、好ましくは、少なくとも70:30、さらに好ましくは、少なくとも95:5、最も好ましくは、少なくとも99.5:0.5の望まれないキラルアミンに対する所望のキラルアミンの鏡像異性体比、または、同様に、0％を越える、好ましくは、少なくとも40％、さらに好ましくは、少なくとも90％、最も好ましくは、少なくとも99％の鏡像体過剰率を表す。
【００２０】
驚くべきことに、野生型トランスアミナーゼに導入される、本発明の文脈において本明細書において定義される変異は、野生型酵素と比べて酵素のトランスアミナーゼ活性を増加させることが見出された。本明細書に詳述されるように、これは、アミンの作製のため、特に、
方法（a）アミンアクセプターと変異体トランスアミナーゼもしくは融合タンパク質の存在下でのラセミアミンの速度論的分割、または
方法（b）アミンドナーと変異体トランスアミナーゼもしくは融合タンパク質の存在下でのプロキラルケトンの非対称アミノ基転移
のいずれかによる鏡像異性的に濃縮されたキラルアミンの作製のため、特に興味深い。ここで、変異体トランスアミナーゼもしくは融合タンパク質は立体選択的である。
【００２１】
特に、選択された化合物、例えば、かさの大きい基質に対する活性が増加し、それによって、トランスアミナーゼによって受容される基質のスペクトルが増加し、かつ/またはアミンドナーイソプロピルアミンに対する活性が増加している。これは、より広い産業的適用可能性、特に、キラルアミンのようなアミンのトランスアミナーゼによって媒介される作製における適用可能性を可能にするため、本発明において重要である。
【００２２】
トランスアミナーゼは、特に、かさの大きい基質に対して、増加した活性を示すことが見出された。方法（a）による、かさの大きい（ラセミ）アミンの例示的な例は、以下のスキーム2に示される。
【００２３】
スキーム2：
0006782708.tif 000005
【００２４】
化学名は、1-(4-クロロフェニル)-1-フェニル-1-アミノメタン（1a）、2,2-ジメチル-1-フェニル-1-アミノプロパン（2a）、1,3-ジフェニル-1-アミノプロパン（3a）、1,2-ジヒドロアセナフチレン-1-アミン（4a）、3-アミノ-8-ベンゾイル-8-アザビシクロ[3.2.1]オクタン（5a）、および1-フェニルエチルアミン（6a）である。
【００２５】
方法（b）による、かさの大きいプロキラルケトンの例示的な例は、以下のスキーム3に示される。
【００２６】
スキーム3:
0006782708.tif 000006
【００２７】
化学名は、(4-クロロフェニル)-フェニル-メタノン（1b）、2,2-ジメチル-1-フェニル-プロパン-1-オン（2b）、1,3-ジフェニルプロパン-1-オン（3b）、2H-アセナフチレン-1-オン（4b）、8-ベンゾイル-8-アザビシクロ[3.2.1]オクタン-3-オン（5b）、および1-フェニルエタノン（6b）である。
【００２８】
酵素活性を決定する様々な方法が当技術分野において周知である。これらには、非限定的に、分光測定アッセイ、蛍光測定アッセイ、熱量測定アッセイ、化学発光アッセイ、光散乱を含むアッセイ、放射測定アッセイ、およびクロマトグラフィアッセイが含まれる。アッセイは、一般的には、例えば、pH値、温度、塩、緩衝液、および基質濃度を含む十分に調節された条件の下で実施される。酵素のトランスアミナーゼ活性を研究するための適当な試験は、当業者に周知である。適当な試験は、Schatzle et al.,in Analytical Chemistry(2009)によって記載されている。この直接測光アッセイは、アミンおよびその対応するケトンの吸収スペクトルの有意な違いに基づく。一般に、共役芳香族ケトンの吸収スペクトルは、対応するアミンには存在しないベンゾイルモエティの電子非局在化のため、異なる。この違いは、吸収スペクトルの違いに反映され、訓練された当業者によって容易に決定され得る、ケトンとアミンとの間の吸収の違いが最も高い波長で、ケトンの生成をモニタリングすることができる。このアッセイは、特に、基質1、2、3、4、および6［即ち、アミン1a、2a、3a、4a、および6a（スキーム2を参照すること）、ケトン1b、2b、3b、4b、および6b（スキーム3を参照すること）］のために適当である。基質5a/bまたはイソプロピルアミンのような、前記のアッセイが適当でない基質のため、アミンドナーをスクリーニングするための適当な試験が開発された；その原理は、Weiβ et al.in Analytical Chemistry(2014)によって記載された。この試験においては、グリオキシル酸塩がアミンアクセプターとして使用される。トランスアミナーゼは、所望のアミンドナーを使用して、グリオキシル酸塩のアミノ化によってグリシンを生成し、グリシンは、その後、グリシンオキシダーゼによって酸化され、過酸化水素も生成する。過酸化水素は、西洋ワサビペルオキシダーゼによって使用され、フェノールを1,4-ベンゾキノンへ酸化し、それが、縮合反応によって4-アミノアンチピリンと自然に反応して、可視波長（498nm）で検出可能であるキノンイミン色素を形成する。フェノールをバニリン酸に置換してもよく、それは、酸化的脱炭酸反応および西洋ワサビペルオキシダーゼによって媒介される2-メトキシ-1,4-ベンゾキノンへの酸化を受ける。これらの2種の試験とは別に、高速液体クロマトグラフィ（HPLC）、ガスクロマトグラフィ（GC）、超臨界流体クロマトグラフィ（SFC）、およびキャピラリー電気泳動のような訓練された当業者に公知の標準的なクロマトグラフィ法も使用された。
【００２９】
さらに、例示的な試験が実施例にも記載され（セクションB2を参照すること）、特に適当な基質は、［アミン1a〜5a（スキーム2を参照すること）もしくはケトン1b〜5b（スキーム3を参照すること）としての］基質1〜5またはアミンドナーイソプロピルアミン（2-プロピルアミン）である。
【００３０】
さらに、当業者は、スチューデントt検定またはカイ二乗検定のような、ある値がもう一つの値と比べて増加しているか否かを査定するための統計的手法を承知している。データを分析する時にはバックグラウンドシグナルを差し引かなければならないことが、当業者には明白である。具体的な態様において、酵素活性の増加は、少なくとも約10％である。他の態様において、増加は、少なくとも20％、30％、40％、50％、または100％、特に、150％、200％、250％、または300％である。活性の増加率は、[活性(変異体)/活性(野生型)-1]*100として決定され得る。
【００３１】
本発明によると、変異体トランスアミナーゼは、SEQ ID NO:1のアミノ酸配列と少なくとも65％同一であるアミノ酸配列を含む。
【００３２】
「SEQ ID NO:1」という用語は、本明細書において言及されるように、SEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列を意味し、（3FCRと呼ばれる）ルエゲリアsp.TM1040由来の野生型アミノトランスフェラーゼのアミノ酸配列を表す。特に、「SEQ ID NO:1」という用語は、以下に示されるアミノ酸配列をさす：（本発明による好ましい置換部位は、太字/下線によって示され、位置番号によって明示されることに注意されたい）：
0006782708.tif 000007
。
【００３３】
「少なくとも65％同一」または「少なくとも65％の配列同一性」という用語は、本明細書において使用されるように、本発明による変異体トランスアミナーゼの配列が、100アミノ酸のストレッチにおいて少なくとも65個のアミノ酸残基が対応する野生型配列の配列と同一であることを特徴とするアミノ酸配列を有することを意味する。本発明による配列同一性は、例えば、配列比較の形態で、配列アライメントの方法によって決定され得る。配列アライメントの方法は、当技術分野において周知であり、例えば、Pearson and Lipman(1988)に記載された様々なプログラムおよびアライメントアルゴリズムを含む。さらに、配列分析プログラムblastp、blastn、blastx、tblastn、およびtblastxと共に使用するためのNCBI Basic Local Alignment Search Tool（BLAST）が、National Center for Biotechnology Information（NCBI,Bethesda,MD）を含むいくつかの供給元から、そしてインターネット上で入手可能である。SEQ ID NO:1のアミノ酸配列と比べた本発明による変異体の同一率は、典型的には、標準的な設定でNCBI Blast blastpを使用して特徴決定される。あるいは、配列同一性は、標準的な設定でソフトウェアGENEiousを使用して決定され得る。本発明において、提示されるアライメント結果は、アライメント型としてフリーエンドギャップ（free end gaps）、コストマトリックス（cost matrix）としてBlosum62を用いて、グローバルアライメントプロトコルを使用してSoftware Geneious（バージョンR8）から導出される。タグを含めない、SEQ ID NO:1（3FCR）との野生型タンパク質の同一性は、3GJUについては71.3％、ATA-3については72.2％、ATA-4については70.7％、ATA-5については69.6％、ATA-6については71.8％、ATA-7については77.9％、ATA-8については90.8％、ATA-9については80.3％と決定された。
【００３４】
本発明によると、変異体トランスアミナーゼは、野生型トランスアミナーゼと比べて少なくとも2個のアミノ酸置換を有し、SEQ ID NO:1の59位に対応する位置におけるアミノ酸がTrpまたはPhe（それぞれ、Trp59またはPhe59）に置換されており、SEQ ID NO:1の231位に対応する位置におけるアミノ酸がAlaまたはGly（それぞれ、Ala231またはGly231）に置換されている。
【００３５】
好ましい態様において、本発明の変異体トランスアミナーゼは、1個または複数個のさらなる変異を有し、即ち：
−SEQ ID NO:1の87位に対応する位置におけるアミノ酸が、疎水性アミノ酸（HYaa87）に置換されており、特に、疎水性アミノ酸が、Leu（Leu87）もしくはVal（Val87）もしくはPhe（Phe87）であり；かつ/または
−SEQ ID NO:1の152位に対応する位置におけるアミノ酸が、Phe（Phe152）に置換されており、かつ/または
−SEQ ID NO:1の234位に対応する位置におけるアミノ酸が、Phe（Phe234）もしくはMet（Met234）に置換されており、かつ/または
−SEQ ID NO:1の423位に対応する位置におけるアミノ酸が、His（His423）に置換されている。
【００３６】
本発明において、変異の位置は、SEQ ID NO:1、即ち、（3FCRと呼ばれる）ルエゲリアsp.TM1040トランスアミナーゼのアミノ酸配列に関して同定される。3FCR以外のトランスアミナーゼの対応する変異部位は、既に詳述されたようなアミノ酸アライメントを実施することによって（例えば、http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthomeにおいて入手可能なBLAST（Basic Local Alignment Search Tool）を標準的な設定で使用することによって）、または、入手可能である場合には、構造を比較し、対応するアミノ酸を同定することによって同定され得る。対応する位置の例は、図2〜4および以下の表に示される。
0006782708.tif 000008
【００３７】
本発明の一つの態様において、本発明による変異体トランスアミナーゼは、1個または複数個のアミノ酸欠失、特に、小さい（例えば、10アミノ酸までの）N末端および/またはC末端の欠失を含んでいてよい。
【００３８】
一つの態様において、本発明による変異体トランスアミナーゼの配列は、本明細書に明示された置換に加えて、1個または複数個の付加的なアミノ酸置換、特に、1個または複数個の保存的なアミノ酸置換を含んでいてよい。「保存的アミノ酸置換」とは、ある残基の、類似した側鎖を有する異なる残基との置換をさし、従って、典型的には、ポリペプチド内のアミノ酸の、同一のまたは類似した定義されたアミノ酸クラス内のアミノ酸との置換を含む。例えば、非限定的に、脂肪族側鎖を有するアミノ酸は、もう一つの脂肪族アミノ酸、例えば、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンと置換され得；ヒドロキシ側鎖を有するアミノ酸は、ヒドロキシ側鎖を有するもう一つのアミノ酸、例えば、セリンおよびトレオニンと置換され；芳香族側鎖を有するアミノ酸は、芳香族側鎖を有するもう一つのアミノ酸、例えば、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、およびヒスチジンと置換され；塩基性側鎖を有するアミノ酸は、塩基性側鎖を有するもう一つのアミノ酸、例えば、リジンおよびアルギニンと置換され；酸性側鎖を有するアミノ酸は、酸性側鎖を有するもう一つのアミノ酸、例えば、アスパラギン酸およびグルタミン酸と置換され；疎水性または親水性のアミノ酸は、それぞれ、疎水性または親水性のもう一つのアミノ酸と交換される。保存的アミノ酸置換の例には、以下にリストされるものが含まれる：
0006782708.tif 000009
。
【００３９】
本発明の一つの態様において、本発明による変異体トランスアミナーゼは、1個または複数個のアミノ酸付加、特に、小さい（例えば、10アミノ酸までの）内部アミノ酸付加を含んでいてよい。
【００４０】
もう一つの態様において、本発明による変異体トランスアミナーゼの配列は、本明細書に明示された置換に加えて、前記定義の1個または複数個の欠失、置換、または付加の組み合わせを含んでいてよい。
【００４１】
さらに、もう一つの好ましい態様において、本発明の変異体トランスアミナーゼは、以下の変異を少なくとも有する。
−Trp59およびAla231、または
−Trp59、Phe87、およびAla231；または
−Trp59、Leu87、およびAla231；または
−Trp59、Val87、およびAla231；または
−Trp59、Phe87、Ala231、およびHis423；または
−Trp59、Phe87、Phe152、およびAla231；または
−Trp59、Leu87、Phe152、およびAla231；または
−Trp59、Val87、Phe152、およびAla231；または
−Trp59、Phe87、Phe152、Ala231、およびHis423、または
−Trp59およびGly231；または
−Trp59、Phe87、およびGly231；または
−Trp59、Leu87、およびGly231；または
−Trp59、Val87、およびGly231；または
−Trp59、Phe87、Phe152、およびGly231；または
−Trp59、Phe87、Phe152、Gly231、およびHis423；または
−Phe59およびAla231；または
−Phe59、Phe87、およびGly231；または
−Trp59、Ala231、およびPhe234；または
−Trp59、Ala231、およびMet234；または
−Trp59、Phe87、Ala231、およびPhe234；または
−Trp59、Leu87、Ala231、およびPhe234；または
−Trp59、Val87、Ala231、およびPhe234；または
−Trp59、Phe87、Phe152、Ala231、およびPhe234；または
−Trp59、Phe87、Phe152、Ala231、Phe234、およびHis423、または
−Trp59、Gly231、およびPhe234；または
−Trp59、Phe87、Gly231、およびPhe234；または
−Trp59、Leu87、Gly231、およびPhe234；または
−Trp59、Val87、Gly231、およびPhe234；または
−Trp59、Phe87、Phe152、Gly231、およびPhe234；または
−Trp59、Phe87、Phe152、Gly231、Phe234、およびHis423；または
−Phe59、Phe87、Gly231、およびPhe234、または
−Trp59、Ala231、およびMet234；または
−Trp59、Phe87、Ala231、およびMet234；または
−Trp59、Leu87、Ala231、およびMet234；または
−Trp59、Val87、Ala231、およびMet234；または
−Trp59、Phe87、Phe152、Ala231、およびMet234；または
−Trp59、Phe87、Phe152、Ala231、Met234、およびHis423、または
−Trp59、Gly231、およびMet234；または
−Trp59、Phe87、Gly231、およびMet234；または
−Trp59、Leu87、Gly231、およびMet234；または
−Trp59、Val87、Gly231、およびMet234；または
−Trp59、Phe87、Phe152、Gly231、およびMet234；または
−Trp59、Phe87、Phe152、Gly231、Met234、およびHis423；または
−Phe59、Phe87、Gly231、およびMet234
【００４２】
より好ましくは、本発明の変異体トランスアミナーゼは、以下の変異によってのみ対応する野生型トランスアミナーゼと異なる。
−Trp59およびAla231、または
−Trp59、Phe87、およびAla231；または
−Trp59、Leu87、およびAla231；または
−Trp59、Val87、およびAla231；または
−Trp59、Phe87、Ala231、およびHis423；または
−Trp59、Phe87、Phe152、およびAla231；または
−Trp59、Leu87、Phe152、およびAla231；または
−Trp59、Val87、Phe152、およびAla231；または
−Trp59、Phe87、Phe152、Ala231、およびHis423、または
−Trp59およびGly231；または
−Trp59、Phe87、およびGly231；または
−Trp59、Leu87、およびGly231；または
−Trp59、Val87、およびGly231；または
−Trp59、Phe87、Phe152、およびGly231；または
−Trp59、Phe87、Phe152、Gly231、およびHis423；または
−Phe59およびAla231；または
−Phe59、Phe87、およびGly231；または
−Trp59、Ala231、およびPhe234；または
−Trp59、Ala231、およびMet234；または
−Trp59、Phe87、Ala231、およびPhe234；または
−Trp59、Leu87、Ala231、およびPhe234；または
−Trp59、Val87、Ala231、およびPhe234；または
−Trp59、Phe87、Phe152、Ala231、およびPhe234；または
−Trp59、Phe87、Phe152、Ala231、Phe234、およびHis423、または
−Trp59、Gly231、およびPhe234；または
−Trp59、Phe87、Gly231、およびPhe234；または
−Trp59、Leu87、Gly231、およびPhe234；または
−Trp59、Val87、Gly231、およびPhe234；または
−Trp59、Phe87、Phe152、Gly231、およびPhe234；または
−Trp59、Phe87、Phe152、Gly231、Phe234、およびHis423；または
−Phe59、Phe87、Gly231、およびPhe234、または
−Trp59、Ala231、およびMet234；または
−Trp59、Phe87、Ala231、およびMet234；または
−Trp59、Leu87、Ala231、およびMet234；または
−Trp59、Val87、Ala231、およびMet234；または
−Trp59、Phe87、Phe152、Ala231、およびMet234；または
−Trp59、Phe87、Phe152、Ala231、Met234、およびHis423、または
−Trp59、Gly231、およびMet234；または
−Trp59、Phe87、Gly231、およびMet234；または
−Trp59、Leu87、Gly231、およびMet234；または
−Trp59、Val87、Gly231、およびMet234；または
−Trp59、Phe87、Phe152、Gly231、およびMet234；または
−Trp59、Phe87、Phe152、Gly231、Met234、およびHis423；または
−Phe59、Phe87、Gly231、およびMet234
【００４３】
さらに好ましい態様において、本発明の変異体トランスアミナーゼは、以下の変異を少なくとも有する。
−Trp59、Phe87、Phe152、およびAla231、または
−Trp59、Phe87、Phe152、Ala231、およびMet234、または
−Trp59、Phe87、Phe152、Ala231、およびH423、または
−Phe59、Phe87、およびGly231
【００４４】
より好ましくは、本発明の変異体トランスアミナーゼは、以下の変異によってのみ対応する野生型トランスアミナーゼと異なる。
−Trp59、Phe87、Phe152、およびAla231、または
−Trp59、Phe87、Phe152、Ala231、およびMet234、または
−Trp59、Phe87、Phe152、Ala231、およびH423、または
−Phe59、Phe87、およびGly231
【００４５】
変異体トランスアミナーゼの好ましい具体的なアミノ酸配列は、SEQ ID NO:30〜38、43〜51、53、55、および58〜64（図3、4、および5を参照すること）、ならびに57（以下のセクション「配列」を参照すること）のいずれかにおいて定義される配列を含むかまたは該配列からなるものである。
【００４６】
既に詳述されたように、本発明の変異体トランスアミナーゼは、SEQ ID NO:1のアミノ酸配列と少なくとも65％同一であるアミノ酸配列を含む。好ましい態様において、変異体トランスアミナーゼは、SEQ ID NO:1のアミノ酸配列と少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、または99％同一であるアミノ酸配列を含む。配列同一性は前記のように決定され得る。本発明の好ましい態様において、変異体トランスアミナーゼは、SEQ ID NO:1、3、および5〜11からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも90％、95％、96％、97％、98％、または99％同一であるアミノ酸配列を含む。
【００４７】
本発明によると、変異体トランスアミナーゼは、対応する野生型酵素と比べて増加したトランスアミナーゼ活性を有する。既に詳述されたように、これは、かさの大きい基質およびアミンドナーイソプロピルアミンに関して特に興味深い。従って、かさの大きい基質/イソプロピルアミンに対する増加した活性は、本発明に関して好ましい。これらに対する活性が増加しているか否かを決定するために適当なかさの大きい試験基質は、基質1〜5であり、スキーム2に示されたもの、即ち、1-(4-クロロフェニル)-1-フェニル-1-アミノメタン（1a）、2,2-ジメチル-1-フェニル-1-アミノプロパン（2a）、1,3-ジフェニル-1-アミノプロパン（3a）、1,2-ジヒドロアセナフチレン-1-アミン（4a）、および3-アミノ-8-ベンゾイル-8-アザビシクロ[3.2.1]オクタン（5a）、ならびにスキーム3に示されたもの、(4-クロロフェニル)-フェニル-メタノン（1b）、2,2-ジメチル-1-フェニル-プロパン-1-オン（2b）、1,3-ジフェニルプロパン-1-オン（3b）、2H-アセナフチレン-1-オン（4b）、および8-ベンゾイル-8-アザビシクロ[3.2.1]オクタン-3-オン（5b）を含む。当業者は、基質またはイソプロピルアミンのうちの少なくとも1種、特に、基質1〜5またはイソプロピルアミンのうちの少なくとも1種に関する活性が増加している場合、活性の増加が既に存在することを理解するであろう。
【００４８】
従って、本発明の好ましい態様において、変異体トランスアミナーゼは、1-(4-クロロフェニル)-1-フェニル-1-アミノメタン（1a）、2,2-ジメチル-1-フェニル-1-アミノプロパン（2a）、1,3-ジフェニル-1-アミノプロパン（3a）、1,2-ジヒドロアセナフチレン-1-アミン（4a）、および3-アミノ-8-ベンゾイル-8-アザビシクロ[3.2.1]オクタン（5a）、3(4-クロロフェニル)-フェニル-メタノン（1b）、2,2-ジメチル-1-フェニル-プロパン-1-オン（2b）、1,3-ジフェニルプロパン-1-オン（3b）、2H-アセナフチレン-1-オン（4b）、8-ベンゾイル-8-アザビシクロ[3.2.1]オクタン-3-オン（5b）、およびイソプロピルアミンからなる群より選択される少なくとも1種の化合物のアミノ基転移のための増加したトランスアミナーゼ活性を有する。
【００４９】
好ましい態様において、変異体トランスアミナーゼは、特に、1-(4-クロロフェニル)-1-フェニル-1-アミノメタン（1a）、2,2-ジメチル-1-フェニル-1-アミノプロパン（2a）、1,3-ジフェニル-1-アミノプロパン（3a）、1,2-ジヒドロアセナフチレン-1-アミン（4a）、および3-アミノ-8-ベンゾイル-8-アザビシクロ[3.2.1]オクタン（5a）、3(4-クロロフェニル)-フェニル-メタノン（1b）、2,2-ジメチル-1-フェニル-プロパン-1-オン（2b）、1,3-ジフェニルプロパン-1-オン（3b）、2H-アセナフチレン-1-オン（4b）、8-ベンゾイル-8-アザビシクロ[3.2.1]オクタン-3-オン（5b）、およびイソプロピルアミンからなる群より選択される少なくとも1種の化合物に対する、対応する野生型酵素と比べて、少なくとも2倍増加したトランスアミナーゼ活性、好ましくは、少なくとも2.5倍増加したトランスアミナーゼ活性、好ましくは、少なくとも3倍増加したトランスアミナーゼ活性、より好ましくは、少なくとも3.5倍増加したトランスアミナーゼ活性、最も好ましくは、少なくとも4倍増加したトランスアミナーゼ活性を有する。
【００５０】
さらなる局面において、本発明は、本発明のトランスアミナーゼを含む融合タンパク質に関する。
【００５１】
融合タンパク質とは、2種以上の最初は別々のタンパク質またはペプチドの接合によって作出されたタンパク質である。この手法は、最初のタンパク質の各々に由来する機能的特性を有するポリペプチドをもたらす。従って、トランスアミナーゼの意図された使用に依って、それは、さらなるペプチドまたはタンパク質と融合タンパク質へと組み合わせられ得る。タンパク質は、タンパク質が独立に折り畳まれ、予想通りの挙動を示す確率を増加させるリンカーまたはスペーサーを介して融合され得る。特に、リンカーがタンパク質精製を可能にするケースにおいて、タンパク質またはペプチドの融合物の中のリンカーは、時に、2種の別々のタンパク質の遊離を可能にするプロテアーゼまたは化学的薬剤のための切断部位を含むよう改変される。二量体または多量体の融合タンパク質は、人工的なタンパク質の二量体化または多量体化を誘導するペプチドドメイン（例えば、ストレプトアビジンまたはロイシンジッパー）の、最初のタンパク質との融合によって、遺伝子改変を通して製造され得る。融合タンパク質は、付着した毒素または抗体を含むよう製造されてもよい。他の融合には、脂質化（lipidation）シグナル配列、分泌シグナル配列、グリコシル化シグナル配列、転座シグナルペプチド等のようなシグナル配列の付加が含まれる。
【００５２】
好ましくは、本発明の融合タンパク質はタグを含む。タグは、様々な目的のため、例えば、精製を容易にするか、タンパク質の適切な折り畳みを支援するか、タンパク質の沈殿を防止するか、クロマトグラフィ特性を改変するか、タンパク質を修飾するか、またはタンパク質をマークもしくは標識するため、タンパク質に付着させられる。
【００５３】
多数の（アフィニティ）タグまたは（アフィニティ）マーカーが現在公知である。これらは、一般的に、サイズによって3つのクラスへ分類される：小さいタグは最大12個のアミノ酸を有し、中サイズのものは最大60個を有し、大きいものは60個超を有する。小さいタグには、Argタグ、Hisタグ、Strepタグ、Flagタグ、T7タグ、V5ペプチドタグ、およびc-Mycタグが含まれ、中サイズのものには、Sタグ、HATタグ、カルモジュリン結合ペプチド、キチン結合ペプチド、およびいくつかのセルロース結合ドメインが含まれる。後者は、189個ものアミノ酸を含有している場合があり、その場合、GSTタグおよびMBPタグと同様に、大きいアフィニティタグと見なされる。特に純粋なタンパク質を作製するため、いわゆる二重タグまたはタンデムタグが開発された。このケースにおいては、タンパク質は、各ケースにおいて、第1のタグ、次いで、第2のタグの親和性を利用して、2種の別々のクロマトグラフィ工程において精製される。そのような二重タグまたはタンデムタグの例は、GST-Hisタグ（ポリヒスチジンタグに融合したグルタチオン-S-トランスフェラーゼ）、6×His-Strepタグ（Strepタグに融合した6個のヒスチジン残基（以下を参照すること））、6×His-tag100タグ（哺乳動物MAPキナーゼ2の12アミノ酸タンパク質に融合した6個のヒスチジン残基）、8×His-HAタグ（赤血球凝集素エピトープタグに融合した8個のヒスチジン残基）、His-MBP（マルトース結合タンパク質に融合したHisタグ）、FLAG-HAタグ（赤血球凝集素エピトープタグに融合したFLAGタグ）、およびFLAG-Strepタグである。これらのタグの大部分は、原核細胞によって産生されたタンパク質の精製のために特に開発されている。適当なタグは、説明に与えられ、1個のSEQ ID NO:56（SHHHHHH）を含む。
【００５４】
さらなる局面において、本発明は、本発明のトランスアミナーゼをコードする核酸に関する。
【００５５】
「核酸」という用語は、本明細書において使用されるように、一般に、本発明の変異体トランスアミナーゼをコードし、可変長であってよい任意のヌクレオチド分子に関する。本発明の核酸の例には、プラスミド、ベクター、または、例えば、イオン交換クロマトグラフィを含む標準的な分子生物学の手法によって単離され得る、任意の種類のDNA断片および/もしくはRNA断片が含まれるが、これらに限定されるわけではない。本発明の核酸は、特定の細胞または生物のトランスフェクションまたは形質導入のために使用され得る。
【００５６】
本発明の核酸分子は、例えば、クローニングによって入手されるか、または化学合成技術によって、もしくはその組み合わせによって作製される、mRNAもしくはcRNAのようなRNAの形態、または、例えば、cDNAおよびゲノムDNAを含むDNAの形態であり得る。DNAは、三本鎖、二本鎖、または一本鎖であり得る。一本鎖DNAは、センス鎖としても公知のコード鎖であってもよいし、またはアンチセンス鎖とも呼ばれる非コード鎖であってもよい。核酸分子とは、本明細書において使用されるように、とりわけ、一本鎖DNAおよび二本鎖DNA、一本鎖RNAと二本鎖RNAとの混合物であるDNA、および一本鎖領域と二本鎖領域との混合物であるRNA、一本鎖、または典型的に二本鎖、または三本鎖、または一本鎖領域と二本鎖領域との混合物であり得る、DNAとRNAとを含むハイブリッド分子もさす。さらに、核酸分子とは、本明細書において使用されるように、RNAもしくはDNAまたはRNAおよびDNAの両方を含む三本鎖領域をさす。
【００５７】
さらに、核酸は、1個または複数個の修飾型塩基を含有していてもよい。そのような核酸は、例えば、生理学的環境におけるそのような分子の安定性および半減期を増加させるための修飾をリボースリン酸骨格に含有していてもよい。従って、安定性のためまたはその他の理由のために修飾された骨格を有するDNAまたはRNAは、その特色が本明細書において意図されるため「核酸分子」である。さらに、わずか二つの例を挙げると、イノシンのような稀な塩基またはトリチル化塩基のような修飾型塩基を含むDNAまたはRNAは、本発明の文脈において、核酸分子である。当業者に公知の、多くの有用な目的に役立つ多様な修飾が、DNAおよびRNAに施され得ることが認識されるであろう。核酸分子という用語には、本明細書において利用されるように、核酸分子のそのような化学的、酵素的、または代謝的に修飾された型が包含され、とりわけ、単純型細胞および複雑型細胞を含む、ウイルスおよび細胞に特徴的なDNAおよびRNAの化学的な型も包含される。
【００５８】
さらに、本発明の変異体トランスアミナーゼをコードする核酸分子は、標準的なクローニング技術のような標準的な技術を使用して、制御配列、リーダー配列、異種マーカー配列、または融合タンパク質を作出するための異種コード配列のような任意の所望の配列に機能的に連結され得る。
【００５９】
本発明の核酸は、一般に、エンドヌクレアーゼおよび/もしくはエキソヌクレアーゼおよび/もしくはポリメラーゼおよび/もしくはリガーゼおよび/もしくはリコンビナーゼによる核酸の操作、または核酸を作製するための当業者に公知のその他の方法によって、インビトロでまたは培養物中の細胞において最初に形成され得る。
【００６０】
本発明の核酸は、宿主細胞における核酸の発現を促進することができるプロモーター配列に機能的に連結されて、発現ベクターに含まれていてもよい。
【００６１】
本明細書において使用されるように、「発現ベクター」という用語は、一般に、細胞において関心対象のタンパク質を発現させるために使用され得る任意の種類の核酸分子をさす（本発明の核酸に関する前記の詳細も参照すること）。特に、本発明の発現ベクターは、哺乳動物細胞、細菌細胞、および酵母細胞を含むが、これらに限定されるわけではない、特定の宿主細胞において、タンパク質を発現させるために適当である、当業者に公知の任意のプラスミドまたはベクターであり得る。本発明の発現構築物は、本発明のトランスアミナーゼをコードし、発現を確実にするためのそれぞれのベクターへの後のクローニングのために使用される核酸であってもよい。タンパク質発現のためのプラスミドおよびベクターは、当技術分野において周知であり、例えば、Promega（Madison,WI,USA）、Qiagen（Hilden,Germany）、Invitrogen（Carlsbad,CA,USA）、またはMoBiTec（Germany）を含む多様な供給元から市販されている。タンパク質発現の方法は、当業者に周知であり、例えば、Sambrook et al.,2000(Molecular Cloning:A laboratory manual,Third Edition)に記載されている。
【００６２】
ベクターは、複製開始点のような、宿主細胞における複製を可能にする核酸配列、1種もしくは複数種の治療用遺伝子、ならびに/または選択可能マーカー遺伝子、ならびにコードされたタンパク質の転写、翻訳、および/もしくは分泌を指図する制御要素のような当技術分野において公知のその他の遺伝要素をさらに含んでいてもよい。ベクターは、細胞を形質導入するか、形質転換するか、または感染させ、それによって、細胞にネイティブのもの以外の核酸および/またはタンパク質を細胞に発現させるために使用されてもよい。ベクターは、任意で、ウイルス粒子、リポソーム、タンパク質コーティング等のような、細胞への核酸の進入の達成を助けるための材料を含む。標準的な分子生物学技術によるタンパク質発現のための多数の型の適切な発現ベクターが、当技術分野において公知である。そのようなベクターは、昆虫、例えば、バキュロウイルス発現、または酵母、真菌、細菌、もしくはウイルスの発現系を含む従来のベクター型の中から選択される。その他の適切な発現ベクターも、この目的のために使用され得、それらの多数の型が当技術分野において公知である。そのような発現ベクターを入手する方法は周知である（例えば、Sambrook et al（前記）を参照すること）。
【００６３】
既に詳述されたように、本発明の変異体トランスアミナーゼをコードする核酸は、タンパク質の発現を確実にするため、宿主細胞におけるタンパク質の発現を駆動するために適当な配列に機能的に連結される。しかしながら、特許請求の範囲に記載された発現構築物は、タンパク質の発現を確実にするため、後に適当な発現ベクターへクローニングされる中間生成物を表していてもよいことが、本発明に包含される。本発明の発現ベクターは、ポリアデニル化シグナル、スプライスドナーシグナル、スプライスアクセプターシグナル、介在配列、転写エンハンサー配列、翻訳エンハンサー配列、薬剤耐性遺伝子等を含むが、これらに限定されるわけではない、あらゆる種類の核酸配列をさらに含んでいてもよい。任意で、薬剤耐性遺伝子は、細胞周期特異的であってもよいしまたは細胞周期非依存性であってもよい細胞内リボソーム進入部位（IRES）に機能的に連結されてもよい。
【００６４】
「機能的に連結された」という用語は、本明細書において使用されるように、遺伝子要素が、意図された目的のため、例えば、転写がプロモーターによって開始され、本発明のタンパク質をコードするDNA配列を通して進むよう、協調的に機能するよう配置されていることを一般に意味する。即ち、RNAポリメラーゼが、融合タンパク質をコードする配列をmRNAへ転写し、次いで、それがスプライシングを受け、タンパク質へ翻訳される。
【００６５】
「プロモーター配列」という用語は、本発明の文脈において使用されるように、下流コード配列に機能的に連結された任意の種類の制御性DNA配列を一般にさし、プロモーターは、細胞においてRNAポリメラーゼに結合し、コードされたオープンリーディングフレームの転写を開始し、それによって、下流コード配列の発現を駆動することができる。本発明のプロモーター配列は、構成性プロモーター、誘導可能プロモーター、細胞周期特異的プロモーター、および細胞型特異的プロモーターを含むが、これらに限定されるわけではない、当業者に公知の任意の種類のプロモーター配列であり得る。
【００６６】
本発明のもう一つの局面は、本発明のトランスアミナーゼ、本発明の融合タンパク質、または本発明のポリヌクレオチドもしくは発現ベクターを含む宿主細胞に関する。本発明の一つの態様において、トランスアミナーゼ活性を有する宿主細胞が、本発明の文脈において使用される。特に、任意で、溶解されたかまたは他の方法で透過性化された細胞が、例えば、本発明の方法および使用において、アミノ基転移のために使用される。本発明の「宿主細胞」は、組換えDNAテクノロジーへの適用のために適当な任意の種類の生物であり得、1種または複数種の組換えタンパク質を発現するために適当なあらゆる種類の細菌株および酵母株を含むが、これらに限定されるわけではない。宿主細胞の例には、例えば、様々な枯草菌（Bacillus subtilis）株または大腸菌（E.coli）株が含まれる。多様な大腸菌宿主細胞が当業者に公知であり、例えば、Stratagene（CA,USA）、Promega（WI,USA）、またはQiagen（Hilden,Germany）を含む多様な供給元から市販されているDH5α、HB101、MV1190、JM109、JM101、またはXL-1 blueのような株を含むが、これらに限定されるわけではない。特に適当な宿主細胞、即ち、大腸菌BL21（DE3）細胞も、実施例に記載される。宿主細胞として使用され得る枯草菌株には、例えば、MoBiTec（Germany）から市販されている、例えば、1012野生型：leuA8 metB5 trpC2 hsdRM1、および168 Marburg：trpC2（Trp-）が含まれる。
【００６７】
本発明による宿主細胞の培養は、当業者に公知のルーチンの手法である。即ち、本発明の変異体トランスアミナーゼをコードする核酸は、組換え手段によって、それぞれのタンパク質を作製するため、適当な宿主細胞へ導入され得る。これらの宿主細胞は、培養物中で培養され得る、任意の種類の適当な細胞、好ましくは、大腸菌のような細菌細胞であり得る。第一工程において、このアプローチは、それぞれの遺伝子の適当なプラスミドベクターへのクローニングを含んでいてよい。プラスミドベクターは、遺伝子クローニングのために広く使用されており、DNAに対して一時的に透過性にされた細菌細胞へ、容易に導入、即ち、トランスフェクトされ得る。タンパク質がそれぞれの宿主細胞において発現された後、細胞を採集し、関心対象のタンパク質を含有している細胞抽出物の調製のための出発材料として役立てることができる。関心対象のタンパク質を含有している細胞抽出物は、細胞の溶解によって入手される。化学的または機械的な細胞溶解のいずれかによって細胞抽出物を調製する方法は、当業者に周知であり、例えば、低浸透圧塩処置、均質化、または超音波処理を含むが、これらに限定されるわけではない。
【００６８】
さらなる局面において、本発明は、アミンドナーの存在下で、アミンアクセプターを、本発明の変異体トランスアミナーゼまたは本発明の融合タンパク質と反応させる工程を含む、アミンを作製する方法を提供する。
【００６９】
本発明の反応は、スキーム1（前記参照）に提示されたスキームに原理的に従う。スキームは、アミノ基がアミンドナーからアミンアクセプターへ転移されることを図示している。アミンドナーは、本発明の変異体トランスアミナーゼまたは融合タンパク質によって受容される転移可能なアミノ基を含む任意の分子であり得る。アミンアクセプターは、本発明の変異体トランスアミナーゼまたは融合タンパク質によってアミノ基が転移され得る任意の分子であり得る。一般に、アミノ基（NH2）は、トランスアミナーゼによって、一級アミン（アミンドナー）からカルボニル基（C=O）（アミンアクセプター）へ転移されるであろう。一方の「アミンアクセプター」および「アミノアクセプター」という用語も、他方の「アミンドナー」および「アミノドナー」という用語も、交換可能に使用される。
【００７０】
好ましい態様において、鏡像異性的に濃縮されたキラルアミンが作製され、かつ方法は、
（a）アミンアクセプターと変異体トランスアミナーゼもしくは融合タンパク質の存在下でのラセミアミンの速度論的分割；または
（b）アミンドナーと変異体トランスアミナーゼもしくは融合タンパク質の存在下でのプロキラルケトンの非対称アミノ基転移
のいずれかであり、変異体トランスアミナーゼもしくは融合タンパク質は立体選択的である。
【００７１】
これによって、変異体トランスアミナーゼまたは融合タンパク質は、溶液、凍結乾燥物、固定化されたまたは完全な細胞触媒として適用され得ることが理解される。
【００７２】
方法（a）
速度論的分割と呼ばれるこの方法においては、ラセミアミンの鏡像異性体が（任意で、宿主細胞中の）立体選択的なトランスアミナーゼまたは融合タンパク質と異なる反応速度で反応し、反応性がより低い鏡像異性体の鏡像異性的に濃縮された組成物をもたらす。従って、アミンのラセミ混合物が、所望の鏡像異性体について鏡像異性的に濃縮される。
【００７３】
ラセミアミンは、式
0006782708.tif 000010
を有し得、
式中、R1もしくはR2は、相互に独立に、置換されていてもよいアルキル、アリール、カルボシクリル、もしくはヘテロシクリルを表すか；または
R1およびR2は、それらが結合している炭素原子と一緒に、置換されていてもよい単環式もしくは多環式の炭素環もしくは複素環を形成する。
【００７４】
好ましい態様において、
R1が、置換されていてもよいC1-12アルキルもしくはアリールであり；
R2が、置換されていてもよいアリールもしくはヘテロシクリルであるか；または
R1およびR2は、それらが結合している炭素原子と一緒に、置換されていてもよい単環式もしくは多環式の炭素環もしくは複素環を形成し、任意の置換基は、C1-12アルキル、C1-12アルコキシ、アリール、アリールオキシ、ハロゲン、ヒドロキシ、もしくはシアノより選択される。
【００７５】
さらに好ましい態様において、
R1が、置換されていてもよいC1-7アルキルもしくはフェニルであり；
R2が、置換されていてもよいフェニルであるか；または
R1およびR2は、それらが結合している炭素原子と一緒に、置換されていてもよい単環式もしくは多環式の炭素環もしくは複素環を形成し、任意の置換基は、C1-7アルキル、C1-7アルコキシ、フェニル、フェニルオキシ、塩素、ヒドロキシ、もしくはシアノより選択される。
【００７６】
アミンの例示的な例は、スキーム2（前記）に示される。
【００７７】
方法（a）における速度論的分割のための適当なアミンアクセプターは、ケトンおよびケトカルボン酸より選択され得る。好ましくは、2-ケトグルタル酸、グリオキシル酸、ピルビン酸、オキサロ酢酸等のような2-ケトカルボン酸のようなケトカルボン酸、およびそれらの適当な塩が、使用される。最も使用されており、従って、最も好ましいのは、2-ケトグルタル酸塩、ピルビン酸塩、グリオキシル酸塩、またはオキサレート（oxaloate）のような2-ケトカルボン酸の共役塩基である。
【００７８】
変異体トランスアミナーゼまたは融合タンパク質によるラセミアミンの速度論的分割は、10〜50℃、好ましくは、20℃〜40℃の温度範囲で、5〜11、特に、7.5〜10の範囲のpHで、CHES緩衝液のような生理学的緩衝液を適当に含有している水性媒体において都合よく達成される。
【００７９】
2-ケトカルボン酸がアミンアクセプターとして使用される時、ラセミアミンのアミンアクセプターに対するモル比は、概して、1.1〜10、特に、1.1〜2.5のモル比において選択される。アミンアクセプターとしてケトンを使用する時、モル比は、有意に増加し得る。
【００８０】
方法（b）
方法bは、アミンドナーおよび（任意で、宿主細胞中の）立体選択的な変異体トランスアミナーゼまたは融合タンパク質の存在下でのプロキラルケトンの非対称アミノ基転移を必要とする。
【００８１】
プロキラルケトンは、式
0006782708.tif 000011
を有し得、
式中、R3もしくはR4は、相互に独立に、置換されていてもよいアルキル、アリール、カルボシクリル、もしくはヘテロシクリルを表すか；または
R3およびR4は、それらが結合している炭素原子と一緒に、置換されていてもよい単環式もしくは多環式の炭素環もしくは複素環を形成する。
【００８２】
好ましい態様において、
R3が、置換されていてもよいC1-12アルキルもしくはアリールであり；
R4が、置換されていてもよいアリールもしくはヘテロシクリルであるか；または
R3およびR4は、それらが結合している炭素原子と一緒に、置換されていてもよい単環式もしくは多環式の炭素環もしくは複素環を形成し、任意の置換基は、C1-12アルキル、C1-12アルコキシ、アリール、アリールオキシ、ハロゲン、ヒドロキシ、もしくはシアノより選択される。
【００８３】
さらに好ましい態様において、
R3が、置換されていてもよいC1-7アルキルもしくはフェニルであり；
R4が、置換されていてもよいフェニルであるか；または
R3およびR4は、それらが付着している炭素原子と共に、置換されていてもよい単環式もしくは多環式の炭素環もしくは複素環を形成し、任意の置換基は、C1-7アルキル、C1-7アルコキシ、フェニル、フェニルオキシ、塩素、ヒドロキシ、もしくはシアノより選択される。
【００８４】
プロキラルケトンの例示的な例は、スキーム3（前記）に示される。
【００８５】
適当なアミンドナーは、一般に、アキラルまたはキラルなアミンまたはアミノ酸より選択され得る。典型的なアミンは、イソプロピルアミン、1-フェニルエチルアミン、2-アミノ-4-フェニルブタン、o-キシリレンジアミンのような一級脂肪族アミン、またはαアミノ酸、グリシン、グルタミン酸、もしくはアラニンのようなアミノ酸である。好ましいアミンドナーはイソプロピルアミンおよびL-アラニンである。
【００８６】
本発明の好ましい態様において、アミンアクセプターおよびアミンドナーは、所望の鏡像異性的に濃縮されたキラルアミンに向かって平衡を有利にする系を使用して、変異体トランスアミナーゼまたは融合タンパク質と反応させられる。
【００８７】
形成された副生成物、例えば、ピルビン酸塩の除去によって、第2の酵素、例えば、乳酸脱水素酵素、ピルビン酸デカルボキシラーゼによって、またはアラニン脱水素酵素を介した再利用/除去によって、非対称アミノ基転移の平衡をシフトさせるため、様々な生体触媒戦略が利用される。
【００８８】
多酵素系が適用されるため、反応条件は全ての含まれる酵素の必要性を満たす必要がある。都合よく、反応は、10℃〜50℃、好ましくは、20℃〜40℃の温度範囲で、5〜11、特に、7.5〜10の範囲のpHで、CHES緩衝液のような生理学的緩衝液を適当に含有している水性媒体において行われる。
【００８９】
プロキラルケトンとアミンドナーとのモル比は、使用される第2の酵素および個々の反応条件に依存する。概して、プロキラルケトンとアミンドナーとのモル比は、1:100〜1:5、特に、1:50〜1:10の範囲で選択され得る。
【００９０】
好ましいアミンドナーとしてのイソプロピルアミンの大過剰の適用は、特に、その対応するケトンである形成されたアセトンのインサイチューの除去と組み合わせられて、非対称アミノ基転移における平衡を、目標アミンの形成へシフトさせる。水混和性および非水混和性の有機共溶媒またはその他の特別な添加剤の添加は、反応を改善し得る。
【００９１】
式Iのラセミアミンおよび式IIのプロキラルケトンについて本明細書において使用される用語は、以下の意味を有する。
【００９２】
「ハロゲン」という用語は、フルオロ、クロロ、ブロモ、またはヨード、特に、塩素を意味する。
【００９３】
「アルキル」という用語は、1〜12個の炭素原子の1価の直鎖状または分岐状の飽和炭化水素基を意味する。具体的な態様において、アルキルは、1〜7個の炭素原子、より具体的な態様において、1〜4個の炭素原子を有する。アルキルの例には、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、n-ブチル、イソブチル、sec-ブチル、またはtert-ブチルが含まれる。
【００９４】
「アルコキシ」という用語は、酸素ラジカルに付着した前記定義のアルキル基をさす。アルコキシの例には、メトキシ、エトキシ、イソプロポキシ、n-ブトキシ、イソブトキシ、sec-ブトキシ、またはtert-ブトキシが含まれる。
【００９５】
「アリール」という用語は、6〜10個の炭素環原子を含む1価の芳香族の炭素環式の単環系または二環系を意味する。アリールモエティの例には、フェニルおよびナフチルが含まれる。
【００９６】
「アリールオキシ」という用語は、酸素ラジカルに付着した前記定義のアリール基を意味する。適当な例は、フェノキシまたはナフチルオキシである。
【００９７】
「単環式または多環式の環」という用語は、原子、主として炭素の1個または複数個の閉鎖された環を特色とする化合物をさす。これらの環下部構造には、シクロアルカン、芳香族、およびその他の環型が含まれる。「多」は文字通り「多い」を意味するが、二環、三環、四環等も含まれる。
【００９８】
「炭素環式」という用語は、シクロヘキサン、デカリン、または1,2-ジヒドロナフタレンのような、環員の全てが炭素原子である、飽和、部分的不飽和、または不飽和の環式化合物をさす。化合物は、芳香族であってもよいしまたは非芳香族であってもよい。単純な芳香環は、共役した平面の環系からのみなる。典型的な単純な芳香族化合物は、ベンゼン、インドール、およびシクロテトラデカヘプタンである。多環式芳香族炭化水素は、炭素および水素のみを含有しており、複数の芳香環から構成されている。例には、ナフタレン、アントラセン、およびフェナントレンが含まれる。
【００９９】
「ヘテロシクリル」という用語は、窒素、酸素、および/または硫黄より選択される1個、2個、または3個のヘテロ原子を含んでいてもよい、飽和、部分的不飽和、または不飽和の5〜6員単環式環または8〜10員二環式環をさす。環系は、芳香族であってもよいしまたは非芳香族であってもよい。典型的なヘテロシクリル残基は、ピリジニル、ピペリジニル、ピロリジル、ピリミジニル、フラニル、ピラニル、ベンゾイミダゾリル、キノリニル、またはイソキノリニルである。
【０１００】
式Iのラセミアミンおよび式IIのプロキラルケトンのために本明細書において使用される任意の置換基は、アルキル、アルコキシル、アリール、アリールオキシ、ハロゲン、ヒドロキシ、またはシアノより選択され得る。既に概説されたような、好ましいものおよび例は、置換基にも同様に当てはまる。
【０１０１】
もう一つの局面において、本発明は、ケトンのアミノ基転移のための、特に、転移されたアミノ基に結合した不斉炭素原子を有するキラルアミンの合成のための、本発明の変異体トランスアミナーゼまたは本発明の融合タンパク質の使用に関する。
【０１０２】
本発明の使用に関しては、この局面にも適用可能である、本開示の他の局面の文脈において使用された用語、例、および具体的な態様を参照すること。特に、本発明による変異体トランスアミナーゼまたは融合タンパク質は、本発明の方法に関して詳述されたように使用され得る。
【０１０３】
他に定義されない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語ならびに頭字語が、本発明の領域の当業者によって一般的に理解されるのと同一の意味を有する。分子生物学における一般的な用語の定義は、Benjamin Lewin,Genes V,published by Oxford University Press,1994(ISBN 0-19-854287-9)；Kendrew et al.(eds.),The Encyclopedia of Molecular Biology,published by Blackwell Science Ltd.,1994(ISBN 0-632-02182-9)；およびRobert A. Meyers(ed.),Molecular Biology and Biotechnology:a Comprehensive Desk Reference,published by VCH Publishers,Inc.,1995(ISBN 1-56081-569-8)に見出され得る。
【０１０４】
本発明は、変動し得るため、本明細書に記載された具体的な方法論、プロトコル、および試薬に限定されない。本明細書に記載されたものに類似しているかまたは等価である任意の方法および材料を、本発明の実施において使用することができるが、好ましい方法および材料が本明細書に記載される。さらに、本明細書において使用される用語は、具体的な態様を記載するためのものに過ぎず、本発明の範囲を限定するためのものではない。
【０１０５】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用されるように、単数形「１つの」、「ある」、および「その」には、文脈が明白にそうでないことを示していない限り、複数の参照が含まれる。同様に、「含む」、「含有している」、および「包含する」という単語は、排他的ではなく包括的に解釈されるべきである。同様に、「または」という単語は、文脈が明白にそうでないことを示していない限り、「および」を含むものとする。「複数」という用語は、2以上をさす。
【０１０６】
以下の図面および実施例は、本発明の様々な態様を例示するためのものである。従って、記述された具体的な改変は、本発明の範囲に対する制限として解釈されるべきではない。本発明の範囲を逸脱することなく、様々な等価物、変更、および改変が施され得ることが、当業者には明白であり、従って、そのような等価な態様は、本明細書に含まれることが理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【０１０７】
【図１】HEPES緩衝液（50mM）（pH7.5）における25℃での3FCRバリアントの熱安定性；3FCR Y59W/T231A（白丸）、3FCR Y59W/Y87F/T231A（黒丸）、3FCR Y59W/Y87F/Y152F/T231A（三角）、3FCR Y59W/Y87F/Y152F/T231A/ P423H（四角）。アミンドナーとして6aを使用して、パラグラフB2に記載される速度論的分割モードで、活性を評価し、インキュベーション前の活性を100％と定義した。
【図２】好ましい野生型トランスアミナーゼ3FCR、3GJU、ATA-3、ATA-4、ATA5、ATA-6、ATA-7、ATA-8、およびATA-9の配列アライメント。各トランスアミナーゼにおける、本発明による変異Trp59、Phe87、Phe152、Ala231、Met234、およびHis423の部位が、下線によって示される。
【図３】（各々、示されるように置換された4個のアミノ酸を有する）好ましい具体的な変異体トランスアミナーゼ3FCR、3GJU、ATA-3、ATA-4、ATA5、ATA-6、ATA-7、ATA-8、およびATA-9の配列アライメント。各トランスアミナーゼにおける、本発明による変異Trp59（Y59W）、Phe87（Y87F）、Phe152（Y152F）、およびAla231（T231A）が、下線によって示される。
【図４】（各々、示されるように置換された5個のアミノ酸を有する）好ましい具体的な変異体トランスアミナーゼ3FCR、3GJU、ATA-3、ATA-4、ATA5、ATA-6、ATA-7、ATA-8、およびATA-9の配列アライメント。各トランスアミナーゼにおける、本発明による変異Trp59（Y59W）、Phe87（Y87F）、Phe152（Y152F）、Ala231（T231A）、およびHis423（P423H）が、下線によって示される。
【図５】（各々、示されるように置換された5個のアミノ酸を有する）好ましい具体的な変異体トランスアミナーゼ3FCR、3GJU、ATA-3、ATA-4、ATA5、ATA-6、ATA-7、ATA-8、およびATA-9の配列アライメント。各トランスアミナーゼにおける、本発明による変異Trp59（Y59W）、Phe87（Y87F）、Phe152（Y152F）、Ala231（T231A）、およびMet234（I234M）が、下線によって示される。
【実施例】
【０１０８】
一般的な手法
A  生体触媒作製
A1  トランスアミナーゼ遺伝子の取得および発現ベクターの構築
トランスアミナーゼの報告されたアミノ酸配列（表1に提供されるNCBI GIコード）およびGenScript（Piscataway,U.S.A.）のコドン最適化アルゴリズム、OptimumGene（商標）に基づき、大腸菌（Escherichia coli）における発現のため、トランスアミナーゼ（TA）オープンリーディングフレームを設計し合成した。全てのケースにおいて、金属アフィニティクロマトグラフィによる発現されたTAの精製を容易にするため、末端に終止コドンを含むC末端ヒスチジンタグを付加した（それぞれのパラグラフを参照すること）。関心対象のベクターpET22bへの後のクローニングのための制限部位；5'末端のNdeI制限配列および3'末端のBamHI制限配列を、ヌクレオチド配列に付加した。開始コドン（ATG）をNdeIの制限部位に組み込み、1個のメチオニンのみがコードされるようにした。ベクターはアンピシリン耐性のためのblaコード配列（βラクタマーゼ）を含有している。クローニング戦略によると、発現はlacプロモーターの調節下にある。得られたプラスミドを、標準的な方法を使用して、大腸菌BL21（DE3）へ形質転換した。コドン最適化された遺伝子およびコードされたポリペプチドの配列は、「配列」というセクションに提供される。
【０１０９】
本発明において使用される変異体は、QuikChange（登録商標）PCR法の変法によって調製された。プライマーは、所望の変異を提供するミスマッチを含むよう設計された。各反応について、本発明者らは、Pfu緩衝液、0.2mM dNTP、0.2ng/μL親プラスミド、0.2μMの各プライマー、2％(w/w)DMSO、および0.2μLのPfu Plus!ポリメラーゼを使用した。増幅は以下のように実施された：
（a）95℃、5分；
（b）20サイクル：95℃、45秒；60℃、45秒；72℃、7分；
（c）72℃、14分。
PCR産物を、37℃で2時間、DpnI（20μL/mL）によって消化し、次いで、20分間、80℃に加熱することによって、制限酵素を不活化した。消化されたPCR産物を、標準的な方法を使用して、大腸菌TOP-10細胞へ形質転換した。PCR産物によって形質転換されたクローンからのプラスミド単離を実施し、DNA配列決定によって正確な配列を確認した。正確な変異を有する単離されたプラスミドを、標準的な方法を使用して、大腸菌BL21（DE3）細胞へ形質転換した。
【０１１０】
（表１）本発明において使用されたトランスアミナーゼおよび野生型配列のNCBI遺伝子同定コード（GI）
0006782708.tif 000012
【０１１１】
A2  トランスアミナーゼの作製
大腸菌BL21（DE3）の単一微生物コロニーを、100μg/mLアンピシリンを含有している試験管において、3mLルリアベルターニ培地へ接種し、180rpmで振とうしながら30℃で一晩（約18時間）増殖させた。300mL振とうフラスコにおいて、100μg/mLアンピシリンを含有している30mLのテリフィックブロスに、1％(v/v)の一晩培養物（0.3mL）を接種し、600nmでの光学濃度（OD600）が0.5〜0.7になるまで、180rpmで振とうしながら37℃でインキュベートした。培養物を20℃に冷却し、TAの発現を誘導するため、イソプロピルβD-チオガラクトシド（IPTG）を、0.2mMの最終濃度で添加した。振とうしながら20℃で一晩、約16時間、インキュベーションを続けた。細胞を遠心分離（6000g、10分、4℃）を介して採集し、上清を廃棄した。細胞ペレットを、0.1mMピリドキサール-5-リン酸（PLP）を含有している予冷された（4℃）HEPES緩衝液（50mM、pH7.5）6mLに再懸濁させ、細胞を溶解するため、超音波処理（Bandelin Sonopuls HD2070；5分間隔で5分を2回、50％パルス、60％出力、常に氷上に維持）によって処理した。遠心分離（6000g、30分、4℃）によって細胞片を除去した。溶解物上清を、0.2μmフィルタ（Millipore）によって濾過し、+4℃で保管するかまたは30％グリセロールを添加して-20℃で保管した。その後の精製工程のケースにおいては、0.3M NaClが溶解緩衝液に含まれる。
【０１１２】
A3  トランスアミナーゼの精製
訓練された当業者にとって標準的な手法によって、全ての発現されたTAにおいて、C末端Hisタグを活用した金属アフィニティクロマトグラフィを使用して、タンパク質精製を実施した。パラグラフA2に記載されるように調製された粗溶解物を、溶解緩衝液（HEPES緩衝液、50mM、0.3M NaCl、0.1mM PLP）による平衡化の後、Aktaタンパク質クロマトグラフィ系に備え付けられたHisTrap FastFlow 5mLカラムへロードする。カラムにTAをロードした後、2カラム体積の10mMイミダゾールの適用によって非特異的に結合したタンパク質を洗浄した。2カラム体積の0.3Mイミダゾールの適用によって、カラムからTAを溶出させた。訓練された当業者に公知の標準的な手法によって、精製されたTA画分をプールし、その後、0.1mM PLPを含有しているHEPES（50mM、pH7.5）緩衝液によって平衡化されたセファデックスG60カラムを使用して、Akta系を介して脱塩した。精製された酵素溶液を、+4℃で保管するかまたは30％グリセロールを添加して-20℃で保管する。
【０１１３】
B  生体触媒
B1  関心対象の化合物のストック溶液の調製
関心対象の基質（スキーム2および3を参照すること）の疎水性のため、2-プロパノールまたはジメチルスルホキシドのような水溶性有機溶媒においてストック溶液を調製した。速度論的分割実験のための標準的な手法において、関心対象のケトンおよびアミンの20〜40mMストック溶液を、2-プロパノールにおいて調製した。アミン1および4は、HCl塩として調製されたため、分散を容易にするため、溶液を室温で30秒間超音波処理した（Bandeling Sonorex RK 512H）。分散後、均質溶液は安定しており、アミンまたはアミン塩の沈殿は観察されなかった。
【０１１４】
B2  速度論的分割モードにおける活性測定
活性測定はマイクロタイタープレートリーダを使用して、TECAN Infinite（登録商標）200 PROリーダにおいて実施された。Schatzle et al.in Analytical Chemistry（2009；前記も参照すること）によって記載された直接測光アッセイのため、酵素反応を、200μLの全容量で30℃でCHES緩衝液（50mM、pH9.0）において行う。1mMの関心対象のラセミアミン（racアミン）および2mMのアミンアクセプター（好ましくは、ピルビン酸塩またはグリオキシル酸塩）を、関心対象のTAを含有している緩衝液へ添加する（最終濃度）。有機溶媒におけるアミンストック溶液の調製のため、有機溶媒（2-プロパノールまたはDMSO）の最終濃度は、5％(v/v)である。反応は、第2の基質（ピルビン酸塩）の添加によって開始される。酵素の濃度は、調査中の基質に対する比活性に依って、2〜800μg/mL最終濃度で変動した。訓練された当業者に公知の方法によって決定される各化合物の最適の波長において、ケトンの生成がモニタリングされる。正確な反応条件において決定された、各基質について使用された波長およびTAの比活性を決定するために使用された見かけの吸光係数は、表2に提示される。
【０１１５】
（表２）関心対象のケトンについての最適波長（nm）および見かけの吸光係数（M-1cm-1）。ケトン5aは、直接測光アッセイによってモニタリングされ得ないため、含まれていない。アミンのいくつかが、モニタリングされた波長において軽微であるが不利益な吸光度を有していたため、見かけの係数は、反応条件をシミュレートして計算された。
0006782708.tif 000013
【０１１６】
基質5a/bおよびイソプロピルアミンのような、直接測光アッセイを適用することができない化合物については、Weiβ et al.in Analytical Chemistry(2014)によって記載された試験を使用した。この試験を使用するため、2mMアミン5aまたは50mMイソプロピルアミン（アミンドナー）、2.4mMグリオキシル酸塩（アミンアクセプター）、ゲオバチルス・カウストフィルス（Geobacillus kaustophilus）由来の0.12mg/mLグリシンオキシダーゼ、5U/mL西洋ワサビペルオキシダーゼ、3.9mMバニリン酸、および1.2mM 4-アミノアンチピリンを含有しているマスターミックスを、CHES緩衝液（pH9.0、50mM）において調製した。反応は、130μLのマスターミックスに、1mg/mLの濃度に標準化された酵素溶液20μLを添加することによって開始され、37℃で1時間実施された。酵素活性は、キノンイミン色素の形成による498nmでの吸光度（ε＝4654M-1cm-1）の増加によって決定された。この試験は3種の酵素の活性に頼るため、比活性の計算は可能ではない。従って、TAの活性は、常に参照バリアントと比べて提示される［活性(変異体)/活性(参照)*100］。
【０１１７】
実施例1：変異の組み込みによるracアミン1a、3a、および4aの速度論的分割についてのTA比活性の改善
racアミン1a、3a、4a、および6aの速度論的分割についての、提示された変異体の比活性を、精製されたTAを用いて、一般的な手法のセクションB2に記載された試験に従って決定した。位置は、3FCR足場において同定され、次いで、関心対象のアミンの受容における重大性の確認のため、3GJU足場へ移された。SEQ ID NO:1およびSEQ ID NO:3の同一性は71.3％である。
【０１１８】
（表３）速度論的分割モードにおける3FCRおよび3GJUの変異体についての比活性（U/mg）。n.a.：非活性；n.d.：未決定。
0006782708.tif 000014
【０１１９】
3FCRにおいて、二重変異体Y59W/T231Aが、野生型および単一変異体と比較して優れているが、71.3％のみの配列同一性を有する酵素（3GJU）においても、そうであることが立証される。さらに、他の位置の累積的な有益な効果が、変異体Y59W/Y87F/Y152F/T231A/P423Hによって例示される。
【０１２０】
より具体的には、3FCRの足場で作出された最も興味深い中間変異体は、表4に提示される比活性を有していた。
【０１２１】
（表４）速度論的分割モードにおける3FCR変異体についての比活性（U/mg）。
0006782708.tif 000015
【０１２２】
この表において、基質1a、3a、および4aに対する活性が、各変異の付加によって徐々に増加することが例証される。これらのかさの大きい基質に対する活性の増加は、必ずしも、標準基質6aに対する活性と一致しない。
【０１２３】
最も興味深い変異体の操作安定性を25℃で評価した。精製された酵素を、振とうすることなく明示された温度で保管緩衝液（HEPES緩衝液、50mM、pH7.5、0.1mM PLPの添加を含む）においてインキュベートした。特定の時間間隔で、インキュベートされた酵素のアリコートを取り出し、残存している活性を、アミンドナーとしてracアミン6aを使用して、一般的な手法のパラグラフB2に記載された直接試験によってモニタリングした。各変異体についてインキュベーション前に測定された活性を、それぞれ、100％と定義した。結果は図1に提示される。
【０１２４】
変異Y59W、Y87F、Y152F、およびT231Aを、NCBIのBLAST探索によって同定された数種の推定トランスアミナーゼへ組み込んだ。3FCR Y59W/Y87F/Y152F/T231Aのアミノ酸配列を、非重複タンパク質配列データベースにおけるクエリーのために使用した。最初の100の結果の中に、これらの4個の変異のいずれかを有することが見出された配列は存在せず；全ての配列が、これらの位置において保存されており、即ち、Tyr59、Tyr87、Tyr152、およびThr231を有していた。69.6％という低い同一性を有する配列を選択し（SEQ ID NO:5〜11）、4個の変異をそれぞれの位置に有する合成遺伝子を注文した（アミノ酸配列について、それぞれ、SEQ ID NO:32および34〜38）。ATA-4を除き、全てのTAを、可溶性に発現させた。アミン1a、3a、4a、および6aの速度論的分割についてのトランスアミナーゼの比活性を、精製されたTAを用いて、一般的な手法のパラグラフB2に記載された試験に従って決定した。
【０１２５】
（表５）速度論的分割モードにおける、Y59W/Y87F/Y152F/T231A変異が組み込まれた、BLAST探索において同定された推定トランスアミナーゼの比活性（U/mg）。
0006782708.tif 000016
【０１２６】
3FCRにおいて見出され、3GJUにおいて試験されたモチーフは、少なくとも65％の配列同一性を有する酵素へ移され、基質1a、3a、および4aに対する興味深い活性を与えることができる。
【０１２７】
実施例2：変異の組み込みによるracアミン1a、2a、3a、4a、および6aの速度論的分割についてのTA比活性の改善
racアミン1a、2a、3a、4a、および6aの速度論的分割についての、提示された変異体の比活性を、精製されたTAを用いて、一般的な手法のパラグラフB2に記載された試験に従って決定した。位置は、3FCR足場において同定され、次いで、関心対象のアミンの受容における重大性の確認のため、3GJU足場へ移された。SEQ ID NO:1およびSEQ ID NO:3の同一性は71.3％である。
【０１２８】
（表６）速度論的分割モードにおける3FCRおよび3GJUの変異体についての比活性（U/mg）。n.a.：非活性；n.d.：未決定。
0006782708.tif 000017
【０１２９】
87位は、基質2a/bの受容のために重大である。受容を容易にするため、この位置においては、LeuまたはValのような脂肪族疎水性残基が必要である。効果は、（3GJU（配列同一性：71.3％）のような）相同タンパク質へ移され得る。
【０１３０】
実施例3：変異の組み込みによるracアミン5aの速度論的分割についてのTA比活性の改善
racアミン5aの速度論的分割についての、提示された変異体の比活性を、精製されたTAを用いて、一般的な手法のパラグラフB2に記載された試験に従って決定した。位置は3FCR足場において同定された。
【０１３１】
（表７）racアミン5aの速度論的分割における3FCR変異体の相対活性。3FCR Y59W/T231Aの活性を参照（100％）として使用した。比較のため、基質6aに対する比活性（U/mg）が提供される。
0006782708.tif 000018
【０１３２】
基質5aに対する活性のための3FCR足場におけるY59FおよびT231Gの置換の有益な効果が立証される。バリアントY59F/Y152F/T231Gにおける組み合わせは、基質6aと比べて、基質5aに対して、これまでに最適なバリアントを与えた。さらに、234位のPheまたはMetへの置換の有益な効果が示され得る。
【０１３３】
実施例4：アミンドナーとしてのイソプロピルアミンの使用のためのTA比活性の改善
アミンドナーとしてのイソプロピルアミンの使用のための、提示された変異体の比活性を、精製されたTAを用いて、一般的な手法のパラグラフB2に記載された試験に従って決定した。位置は3FCR足場において同定された。
【０１３４】
（表８）アミンドナーとしてイソプロピルアミンを使用した3FCR変異体の相対活性。3FCR Y59W/T231Aの活性を参照（100％）として使用した。比較のため、基質6aに対する比活性（U/mg）が提供される。
0006782708.tif 000019
【０１３５】
234位の置換はイソプロピルアミンに対する活性に対して有益な効果を有すると結論付けることができる。
【０１３６】
実施例5：アミンドナーとしてL-アラニンを使用したキラルアミン1a、3a、および4aの不斉合成
8mMケトン（1、3、または4）、200mM L-アラニン、20％ DMSO、25mMグルコース、5mM NADH、0.5mg/mLグルコースデヒドロゲナーゼGDH-105（Codexis）、ウシ心臓由来の5μL/mL L-乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）（L2625-50KU、Sigma）、1mM PLP、および関心対象のTAの反応混合物（HEPES緩衝液、50mM、pH8.0）0.5 mLを含有している2mLのガラスバイアルを、600rpmの振とうスピードで、thermoshaker（Eppendorf）において30℃でインキュベートした。20時間後、10分間の90℃での酵素の熱変性によって反応を終結させる。反応物を、室温に冷却し、0.1％ジエチルアミンを含有している等量のアセトニトリルを、反応混合物へ添加する。混合物を、沈殿したタンパク質を除去するため、1分間17000gで遠心分離し、上清を、HPLC分析（Chiralpak OD-RHカラム、150*4.6mm、5μm粒子、30℃；0.5mL/分の流速での50％アセトニトリルおよび50％ 0.1％ジエチルアミンを含有しているH2Oによる均一濃度法）のため、インレットへ濾過した。変換は[全アミン(mM)/(全アミン(mM)+ケトン(mM))*100]として定義される。
【０１３７】
（表９）アミンドナーとしてL-アラニンを使用したキラルアミンの不斉合成における変換（％）および鏡像異性体比（er、％）。酵素濃度は1.8mg/mLであった；n.d.未決定。
0006782708.tif 000020
【０１３８】
（キラルアミン1a、3a、および4aの生成のための）8mMケトンのスケールでの不斉合成は、1日未満（20時間）で、アミンドナーとしてL-アラニンを使用して、望ましい変換およびエナンチオ選択性で実施され得る。様々なバリアントが反応を効率的に触媒した。
【０１３９】
実施例6：アミンドナーとしてアラニンを使用したアミン5aの不斉合成
8mMケトン5、200mM L-アラニン、20％ DMSO、25mMグルコース、5mM NADH、0.5mg/mLグルコースデヒドロゲナーゼGDH-105（Codexis）、ウシ心臓由来の5μL/mL L-乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）（L2625-50KU、Sigma）、1mM PLP、および関心対象のTAの反応混合物（HEPES緩衝液、50mM、pH8.0）0.5mLを含有している2mLのガラスバイアルを、600rpmの振とうスピードで、thermoshaker（Eppendorf）において30℃でインキュベートした。20時間後、10分間の90℃での酵素の熱変性によって反応を終結させる。反応物を室温に冷却し、0.1％ジエチルアミンを含有している等量のアセトニトリルを反応混合物へ添加する。混合物を、沈殿したタンパク質を除去するため、1分間17000gで遠心分離し、上清を、HPLC分析（Chiralpak OD-RHカラム、150*4.6mm、5μm粒子、30℃；0.5mL/分の流速での30％アセトニトリルおよび70％ 0.1％ジエチルアミンを含有しているH2Oによる均一濃度法）のため、インレットへ濾過した。変換は[全アミン(mM)/(全アミン(mM)+ケトン(mM))*100]として定義される。
【０１４０】
（表１０）アミンドナーとしてL-アラニンを使用したアミン5aの不斉合成の変換（％）
0006782708.tif 000021
【０１４１】
基質5a/bについての8mMケトンのスケールでの不斉合成は、1日未満（20時間）で、アミンドナーとしてL-アラニンを使用して、望ましい変換およびエナンチオ選択性で実施され得る。様々なTA変異体が反応を効率的に触媒した。
【０１４２】
実施例7：アミンドナーとしてアラニンを使用したキラルアミン1a、(R)-(4-クロロフェニル)-フェニルメタンアミンの不斉合成
53.5ml反応緩衝液（HEPES 100mM pH8.0；4mM PLP；400mM D,L-アラニン）に、4.5gのピルビン酸還元酵素ミックス（5.4mg GDH-102［Codexis］；21.6mg LDH-101［Codexis］；126mg NAD［Roche］；4.32g D-グルコース）を溶解させた。その後、精製された変異体トランスアミナーゼ3FCR Y59W/Y87F/Y152F/T231Aを、溶液（22ml、タンパク質2.6mg/ml；A3を参照すること）として添加し、30℃で5分間撹拌した。反応は、20ml DMSOに溶解した100mg（4-クロロフェニル)(フェニル)メタノンの添加によって開始された。反応pHは、8.0に手動で調整され（2N NaOH）、0.1N NaOHの自動添加によって一定に維持された。開始時、黄色の反応溶液はわずかに濁っていた。24時間および98面積％の変換（IPC-HPLC）の後、酵素を沈殿させるため、反応物をpH2.0へ酸性化した。1.125g濾過助剤（Dicalite）を添加し、混合物を20分間撹拌した。その後、反応混合物を、20g濾過助剤（Dicalite）床を通して濾過し、濾過ケークを40ml 0.1N HClで洗浄した。2回の50ml TBMEを使用したアミン抽出のため、合わせたわずかに黄色の透明な水性溶液のpHを、pH10に調整したところ、溶液の色は橙色に変化した。合わせた有機相を、MgSO4で乾燥させ、濾過し、40℃で真空下で蒸発させ、タイトル化合物1aの粗生成物として、122mg（122％）の淡黄色の油を得た。
【０１４３】
HCl塩形成：粗生成物を5ml TBMEに溶解させ、撹拌しながら、350μl 2M HClを注射器を使用して添加した。形成された懸濁物を、室温で2時間撹拌した後、濾過（濾紙）した。単離されたHCl塩を、TBMEで洗浄し、室温で高真空下で3時間乾燥させ、95mg（82％）の白色粉末を得た。
【０１４４】
化学的純度  HPLC：99.7面積％［210nm；X-Bridge C8；50*4.6mm、2.5μm、流量2ml、45℃、A：H2O/ACN（95/5）、3分で50→10％、0.5分保持、B：ACN、3分で40→80％、0.5分保持、C：H2O中100mmol酢酸アンモニウム/ACN（95/5）、10％均一濃度］；キラルHPLC：97.1％(R)、2.9％(S)［235nm；Chrownpack CR-I(+)；150*3mm、5μm、流量0.4ml、40℃、A：55％ H2O中3.6g過塩素酸、B：45％ACN］；
0006782708.tif 000022
。
【０１４５】
実施例8：(S)-2,2-ジメチル-1フェニルプロパン-1-アミンの調製のためのアミンアクセプターとしてピルビン酸塩を使用したアミン2aの速度論的分割
89.75mlの反応緩衝液（TRIS 50mM pH8.5；1mM PLP）に、129mgピルビン酸ナトリウムおよび変異体トランスアミナーゼ3FCR Y59W/Y87L/T231Aの精製された溶液（18.5ml、タンパク質2.47mg/ml；A3を参照すること）を後に添加し、30℃で5分間撹拌した。反応は、1ml DMSOに溶解した100mg 2,2-ジメチル-1-フェニルプロパン-1-アミンの添加によって開始された。48時間およびおよそ55面積％の変換（IPC-HPLC）の後、酵素を沈殿させるため、反応物をpH2.0へ酸性化し、20分間撹拌した。その後、反応混合物を25g濾過助剤（Dicalite）床を通して濾過し、その後、濾過ケークを脱イオン水および50ml TBMEで洗浄した。相分離の後、2,2-ジメチル-1-フェニル-プロパン-1-オン（2b）を除去するため、水相を50ml TBMEによって抽出した。合わせた有機相を、MgSO4で乾燥させ、濾過し、40℃で真空下で蒸発させ、25mg（26.5％；キラルHPLC：99面積％）2,2-ジメチル-1-フェニル-プロパン-1-オン（2b）を黄色の粘性の油として得た。水相のpHを、2N NaOHを使用して12に調整し、その後、50ml TBMEで2回抽出した。合わせた有機相を、MgSO4で乾燥させ、濾過し、40℃で真空下で蒸発させ、38mg（40％）(S)-2,2-ジメチル-1-フェニル-プロパン-1-アミン（2a）を黄色の油として得た。
【０１４６】
キラルHPLC：98.1％(S)、1.9％(R)［220nm；Chiracel OD-3R；150*4.6mm、3μm、流量1.0ml、25℃、A：50％ ACN、B：50％ 950ml H2O：50ml ACN中6.3gギ酸アンモニウム］；
0006782708.tif 000023
。
【０１４７】
実施例9：アミンドナーとしてアラニンを使用したキラルアミン3a、(S)-1.3-ジフェニルプロピルアミンの不斉合成
68ml反応緩衝液（HEPES 100mM pH8.0；4mM PLP；400mM D,L-アラニン）に、4.5gピルビン酸還元酵素ミックス（5.4mg GDH-102［Codexis］；21.6mg LDH-101［Codexis］；126mg NAD［Roche］；4.32g D-グルコース）を溶解させた。精製された変異体トランスアミナーゼ3FCR Y59W/Y87F/Y152F/T231Aを、その後、溶液（6.8ml、タンパク質2.6mg/ml；A3を参照すること）として添加し、30℃で5分間撹拌した。反応は、20ml DMSOに溶解した100mg 1.3-ジフェニルプロパン-1-オンの添加によって開始された。反応pHは、0.1N NaOHの自動添加によって一定に維持された。開始時、黄色の反応溶液はわずかに濁っていた。24時間および98面積％の変換（IPC-HPLC）の後、酵素を沈殿させるため、反応物をpH2.0へ酸性化した。1.125gの濾過助剤（Dicalite）を添加し、混合物を20分間撹拌した。その後、反応混合物を20gの濾過助剤（Dicalite）床を通して濾過し、濾過ケークを40ml 0.1N HClで洗浄した。2回の50ml TBMEを使用したアミン抽出のため、合わせたわずかに黄色の透明な水溶液のpHを、pH10に調整したところ、色が橙色に変化した。合わせた有機相を、MgSO4で乾燥させ、濾過し、40℃で真空下で蒸発させ、タイトル化合物3aの粗生成物として、95mg（95％）淡黄色の油を得た。
【０１４８】
HCl塩形成：粗生成物を、5ml TBMEに溶解させ、撹拌しながら、360μl 2M HClを注射器を使用して添加した。形成された懸濁物を、室温で2時間撹拌した後、濾過（濾紙）した。単離されたHCl塩をTBMEで洗浄し、室温で高真空下で3時間乾燥させ、タイトル化合物3aのHCl塩として、84mg（71％）白色粉末を得た。
【０１４９】
化学的純度  HPLC：99.0面積％［210nm；X-Bridge C8；50*4.6mm、2.5μm、流量2ml、45℃、A：H2O/ACN（95/5）、3分で60→10％、0.5分保持、B：ACN、3分で30→80％、0.5分保持、C：H2O中100mmol酢酸アンモニウム/ACN（95/5）、10％均一濃度］；キラルHPLC：100％(S)［222nm；Chiralpak IF 3；150*4.6mm、流量1ml、40℃、A：90％ 0.1％ジエチルアミンを含むヘプタン、B：10％エタノール］；
0006782708.tif 000024
。
【０１５０】
実施例10：アミンドナーとしてアラニンを使用したキラルアミン4a、(S)-アセナフテン-1-イルアミンの不斉合成
60.5ml反応緩衝液（HEPES 100mM pH8.0；4mM PLP；400mM D,L-アラニン）に、4.5gピルビン酸還元酵素ミックス（5.4mg GDH-102［Codexis］；21.6mg LDH-101［Codexis］；126mg NAD［Roche］；4.32g D-グルコース）を溶解させた。精製されたアミノトランスアミナーゼ3FCR Y59W/Y87F/Y152F/T231Aを、溶液（15ml、タンパク質2.6mg/ml；A3を参照すること）としてその後に添加し、30℃で5分間撹拌した。反応は、20ml DMSOに溶解した100mg 2H-アセナフチレン-1-オンの添加によって開始された。反応物pHは、8.0に手動で調整され（2N NaOH）、0.1N NaOHの自動添加によって一定に維持された。開始時、黄色の反応溶液はわずかに濁っていた。可能性のある酸化的芳香族化を防止するため、N2雰囲気下で暗所で反応を実施した。46時間および98面積％の変換（IPC-HPLC）の後、酵素を沈殿させるため、反応物をpH2.0へ酸性化した。5g濾過助剤（Dicalite）を添加し、混合物を20分間撹拌した。その後、反応混合物を、20g濾過助剤（Dicalite）床を通して濾過し、濾過ケークを40ml 0.1N HClおよび50ml TBMEで洗浄した。合わせたわずかに黄色の透明な水性溶液のpHを、pH10に調整した後、50ml TBMEを使用してアミンを抽出した。合わせた有機相を、MgSO4で乾燥させ、濾過し、40℃で真空下で蒸発させ、タイトル化合物4aの粗生成物として、112mg（112％）橙〜褐色の油を得た。
【０１５１】
HCl塩形成：粗生成物を、5ml TBMEに溶解させ、撹拌しながら、445μl 2M HClを注射器を使用して添加した。形成された極めて微細な懸濁物を、室温で1時間撹拌した後、遠心分離した（5分；4000rpm）。TBMEのデカンテーションの後、残りの固体を10ml TBMEに再懸濁させ、激しく混合し、遠心分離し（5分；4000rpm）、再度デカントした。湿ったHCl塩を、40℃で真空下で蒸発させ、室温で高真空下で3時間乾燥させ、タイトル化合物4aのHCl塩として、84mg（69％）ベージュの粉末を得た。
【０１５２】
化学的純度およびキラル純度  HPLC：81.5％(S)：18.5％(R)［232nm；Chiracel OJ-3；150*4.6mm、3μm；流量2.5ml、30℃、A：96％ 0.1％ジエチルアミンを含むヘプタン、B：4％エタノール］；
0006782708.tif 000025
。
【０１５３】
実施例11：アミンドナーとして2-プロピルアミンを使用したアミン5a、エキソ-3-アミノ-8-アザ-ビシクロ[3.2.1]オクタ-8-イル-フェニル-メタノンの不斉合成
82ml反応緩衝液（HEPES 50mM；2mM PLP；0.2M 2-プロピルアミン塩酸塩；pH7.5）へ、20ml DMSOに溶解した、精製された変異体トランスアミナーゼ3FCR Y59W/Y87F/Y152F/T231A/I234M溶液（全部で78ml、タンパク質1.1mg/ml；A3を参照すること）および100mg 8-ベンゾイル-8-アザ-ビシクロ[3.2.1]オクタン-3-オン5bを30℃で撹拌しながら添加した。反応を、75面積％の変換（IPC-HPLC）を可能にするため、9日間進行させた。9日後、酵素を沈殿させるため、反応物をpH2.0へ酸性化し、15分間撹拌した。その後、反応混合物を、25g濾過助剤（Dicalite）床を通して濾過し、8-ベンゾイル-8-アザ-ビシクロ[3.2.1]オクタン-3-オン5bを除去するため、50mlジクロロメタンで2回抽出した。合わせた有機相を、MgSO4で乾燥させ、濾過し、40℃で真空下で蒸発させ、わずかに黄色の油として、37mg（HPLC：97面積％）8-ベンゾイル-8-アザ-ビシクロ[3.2.1]オクタン-3-オン5bを得た。水相のpHを、2N NaOHを使用して12に調整し、その後、50mlジクロロメタンで4回抽出した。合わせた有機相をMgSO4で乾燥させ、濾過し、40℃で真空下で蒸発させ、60℃で高真空下で36時間乾燥させ、タイトル化合物5aの黄色の油として60mg（60％）を得た。
【０１５４】
キラル純度HPLC：98.9面積％［210nm；X-Bridge C8；50*2.1mm、2.5μm、流量ml、40℃、A：90％ H2O中10mmol酢酸アンモニウム/ACN（95/5）、B：ACN、10％]；キラルSFC：100％エキソ［210nm；Chiralpak AD-3；150*4.6mm、5μm；流量3ml；左40℃；右42℃；A：82％ CO2、B：18％ 0.2％ 2-プロピルアミンを含むメタノール]；
0006782708.tif 000026
。
【０１５５】
配列
野生型配列（＋タグ）：
3FCR野生型（＋タグ）：アミノ酸（SEQ ID NO:1＋SEQ ID NO:56）
0006782708.tif 000027
【０１５６】
3FCR野生型＋タグ：核酸（SEQ ID NO:2）
0006782708.tif 000028
【０１５７】
3GJU野生型（＋タグ）：アミノ酸（SEQ ID NO:3＋SEQ ID NO:56）
0006782708.tif 000029
【０１５８】
3GJU野生型＋タグ：核酸（SEQ ID NO:4）
0006782708.tif 000030
【０１５９】
ATA-3：図2に例示されたアミノ酸（SEQ ID NO:5）
ATA-4：図2に例示されたアミノ酸（SEQ ID NO:6）
ATA-5：図2に例示されたアミノ酸（SEQ ID NO:7）
ATA-6：図2に例示されたアミノ酸（SEQ ID NO:8）
ATA-7：図2に例示されたアミノ酸（SEQ ID NO:9）
ATA-8：図2に例示されたアミノ酸（SEQ ID NO:10）
ATA-9：図2に例示されたアミノ酸（SEQ ID NO:11）
【０１６０】
二重変異体の配列：
0006782708.tif 000031
0006782708.tif 000032
【０１６１】
三重変異体の配列：
0006782708.tif 000033
0006782708.tif 000034
0006782708.tif 000035
【０１６２】
四重変異体の配列：
3FCR Y59W/Y87F/Y152F/T231A：図3のようなアミノ酸（SEQ ID NO:30）
3GJU Y59W/Y87F/Y152F/T231A：図3のようなアミノ酸（SEQ ID NO:31）
ATA-3 Y59W/Y87F/Y152F/T231A：図3のようなアミノ酸（SEQ ID NO:32）
ATA-4 Y59W/Y87F/Y152F/T231A：図3のようなアミノ酸（SEQ ID NO:33）
ATA-5 Y59W/Y87F/Y152F/T231A：図3のようなアミノ酸（SEQ ID NO:34）
ATA-6 Y59W/Y87F/Y152F/T231A：図3のようなアミノ酸（SEQ ID NO:35）
ATA-7 Y59W/Y87F/Y152F/T231A：図3のようなアミノ酸（SEQ ID NO:36）
ATA-8 Y59W/Y87F/Y152F/T231A：図3のようなアミノ酸（SEQ ID NO:37）
ATA-9 Y59W/Y87F/Y152F/T231A：図3のようなアミノ酸（SEQ ID NO:38）
【０１６３】
0006782708.tif 000036
【０１６４】
五重変異体の配列：
3FCR Y59W/Y87F/Y152F/T231A/P423H：図4のようなアミノ酸（SEQ ID NO:43）
3GJU Y59W/Y87F/Y152F/T231A/P423H：図4のようなアミノ酸（SEQ ID NO:44）
ATA-3 Y59W/Y87F/Y152F/T231A/P423H：図4のようなアミノ酸（SEQ ID NO:45）
ATA-4 Y59W/Y87F/Y152F/T231A/P423H：図4のようなアミノ酸（SEQ ID NO:46）
ATA-5 Y59W/Y87F/Y152F/T231A/P423H：図4のようなアミノ酸（SEQ ID NO:47）
ATA-6 Y59W/Y87F/Y152F/T231A/P423H：図4のようなアミノ酸（SEQ ID NO:48）
ATA-7 Y59W/Y87F/Y152F/T231A/P423H：図4のようなアミノ酸（SEQ ID NO:49）
ATA-8 Y59W/Y87F/Y152F/T231A/P423H：図4のようなアミノ酸（SEQ ID NO:50）
ATA-9 Y59W/Y87F/Y152F/T231A/P423H：図4のようなアミノ酸（SEQ ID NO:51）
3FCR Y59W/Y87F/Y152F/T231A/I234M：図5のようなアミノ酸（SEQ ID NO:53）
3GJU Y59W/Y87F/Y152F/T231A/I234M：図5のようなアミノ酸（SEQ ID NO:55）
ATA-3 Y59W/Y87F/Y152F/T231A/I234M：図5のようなアミノ酸（SEQ ID NO:58）
ATA-4 Y59W/Y87F/Y152F/T231A/I234M：図5のようなアミノ酸（SEQ ID NO:59）
ATA-5 Y59W/Y87F/Y152F/T231A/I234M：図5のようなアミノ酸（SEQ ID NO:60）
ATA-6 Y59W/Y87F/Y152F/T231A/I234M：図5のようなアミノ酸（SEQ ID NO:61）
ATA-7 Y59W/Y87F/Y152F/T231A/I234M：図5のようなアミノ酸（SEQ ID NO:62）
ATA-8 Y59W/Y87F/Y152F/T231A/I234M：図5のようなアミノ酸（SEQ ID NO:63）
ATA-9 Y59W/Y87F/Y152F/T231A/I234M：図5のようなアミノ酸（SEQ ID NO:64）
【０１６５】
0006782708.tif 000037
【０１６６】
参照
0006782708.tif 000038
【図１】
0006782708.tif 000041
【図２】
0006782708.tif 000042
【図３】
0006782708.tif 000043
【図４】
0006782708.tif 000044
【図５】
0006782708.tif 000045
【配列表】
0006782708000001.app