(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗炎症物質により抑制される細胞質内へのＣａ２＋流入経路の判定方法であって、
自然免疫を担う白血球又は白血球様の培養細胞を、細胞外液をＣａ２＋フリーにした状態で、筋小胞体／小胞体Ｃａ２＋ＡＴＰアーゼ阻害剤で刺激する工程と、
抗炎症物質の存在下及び非存在下で、細胞外液のＣａ２＋濃度を上昇させる工程と、
自然免疫を担う白血球又は白血球様の培養細胞の細胞質内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量を測定する工程と、をこの順序で備え、かつ
抗炎症物質の非存在下と比較して抗炎症物質の存在下での細胞質内Ｃａ２＋濃度が減少し、かつ、スーパーオキシド産生量が減少した場合、抗炎症物質により抑制される細胞質内へのＣａ２＋流入経路が、ストア作動性カルシウム流入（ＳＯＣＥ）経路であると判定する工程と、
を備える方法。
【請求項２】
抗炎症物質により抑制される細胞質内へのＣａ２＋流入経路を判定する方法であって、
抗炎症物質の存在下及び非存在下で、かつ細胞外液をＣａ２＋フリーにした状態で、自然免疫を担う白血球又は白血球様の培養細胞を、ホスホリパーゼＣの活性化による細胞質内Ｃａ２＋濃度上昇を伴うスーパーオキシド産生を惹起する刺激物質で刺激する工程と、
自然免疫を担う白血球又は白血球様の培養細胞の細胞質内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量を測定する工程と、をこの順序で備え、かつ
抗炎症物質の非存在下と比較して抗炎症物質の存在下での細胞質内Ｃａ２＋濃度が減少し、かつ、スーパーオキシド産生量が減少した場合、抗炎症物質により抑制される細胞質内へのＣａ２＋流入経路が、小胞体から細胞質へのＣａ２＋流入（ＩＩＣＲ）経路であると判定する工程と、
を備える方法。
【請求項３】
抗炎症物質により抑制される細胞質内へのＣａ２＋流入経路を判定する方法であって、
自然免疫を担う白血球又は白血球様の培養細胞を、細胞外液をＣａ２＋フリーにした状態で、筋小胞体／小胞体Ｃａ２＋ＡＴＰアーゼ阻害剤で刺激する工程と、
抗炎症物質の存在下及び非存在下で、細胞外液のＣａ２＋濃度を上昇させる工程と、
自然免疫を担う白血球又は白血球様の培養細胞の第１の細胞質内Ｃａ２＋濃度及び第１のスーパーオキシド産生量を測定する工程と、をこの順序で備え、
抗炎症物質の存在下及び非存在下で、かつ細胞外液をＣａ２＋フリーにした状態で、自然免疫を担う白血球又は白血球様の培養細胞を、ホスホリパーゼＣの活性化による細胞質内Ｃａ２＋濃度上昇を伴うスーパーオキシド産生を惹起する刺激物質で刺激する工程と、
自然免疫を担う白血球又は白血球様の培養細胞の第２の細胞質内Ｃａ２＋濃度及び第２のスーパーオキシド産生量を測定する工程と、をこの順序で備え、かつ
抗炎症物質の非存在下と比較して抗炎症物質の存在下での第１及び第２の細胞質内Ｃａ２＋濃度が変化せず、かつ第１及び第２のスーパーオキシド産生量が変化しない場合、抗炎症物質により抑制される細胞質内へのＣａ２＋流入経路が、受容体作動性カルシウム流入（ＲＯＣＥ）経路であると判定する工程と、
を備える方法。
【請求項４】
被験物質の機能性を同定する方法であって、
自然免疫を担う白血球又は白血球様の培養細胞を、細胞外液をＣａ２＋フリーにした状態で、筋小胞体／小胞体Ｃａ２＋ＡＴＰアーゼ阻害剤で刺激する工程と、
被験物質の存在下及び非存在下で、細胞外液のＣａ２＋濃度を上昇させる工程と、
自然免疫を担う白血球又は白血球様の培養細胞の第１の細胞質内Ｃａ２＋濃度及び第１のスーパーオキシド産生量を測定する工程と、をこの順序で備え、
被験物質の存在下及び非存在下で、かつ細胞外液をＣａ２＋フリーにした状態で、自然免疫を担う白血球又は白血球様の培養細胞を、ホスホリパーゼＣの活性化による細胞質内Ｃａ２＋濃度上昇を伴うスーパーオキシド産生を惹起する刺激物質で刺激する工程と、
自然免疫を担う白血球又は白血球様の培養細胞の第２の細胞質内Ｃａ２＋濃度及び第２のスーパーオキシド産生量を測定する工程と、をこの順序で備え、かつ
被験物質の非存在下と比較して被験物質の存在下での第１の細胞質内Ｃａ２＋濃度が減少し、かつ第１のスーパーオキシド産生量が減少するか、又は第２の細胞質内Ｃａ２＋濃度が減少し、かつ第２のスーパーオキシド産生量が減少する被験物質を抗炎症物質と同定し、
被験物質の非存在下と比較して被験物質の存在下での第１及び第２の細胞質内Ｃａ２＋濃度が変化せず、かつ第１及び第２のスーパーオキシド産生量が増加する被験物質、並びに被験物質の非存在下と比較して被験物質の存在下での第１の細胞質内Ｃａ２＋濃度が増加し、かつ第１のスーパーオキシド産生量が増加するか、又は第２の細胞質内Ｃａ２＋濃度が増加し、かつ第２のスーパーオキシド産生量が増加する被験物質を自然免疫賦活物質と同定する工程と、
を備える方法。
【請求項５】
被験物質の非存在下と比較して被験物質の存在下での第１及び第２の細胞質内Ｃａ２＋濃度が変化せず、かつ第１及び第２のスーパーオキシド産生量が減少する被験物質に対して、
被検物質の存在下及び非存在下で、ヒポキサンチン−キサンチンオキシダーゼ系によりスーパーオキシドを生成させ、スーパーオキシド生成量を測定するステップ、及び
被検物質の非存在下と比較して被検物質存在下でのヒポキサンチン−キサンチンオキシダーゼ系におけるスーパーオキシド生成量が変化しない被験物質を抗炎症物質と同定し、
被検物質の非存在下と比較して被検物質存在下でのヒポキサンチン−キサンチンオキシダーゼ系におけるスーパーオキシド生成量が減少する被験物質を抗酸化物質と同定するステップ
を実施する工程を更に備える、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
細胞質内Ｃａ２＋濃度の上昇を伴う自然免疫賦活物質により促進される細胞質内へのＣａ２＋流入経路の判定方法であって、
自然免疫を担う白血球又は白血球様の培養細胞を、細胞外液をＣａ２＋フリーにした状態で、筋小胞体／小胞体Ｃａ２＋ＡＴＰアーゼ阻害剤で刺激する工程と、
自然免疫賦活物質の存在下及び非存在下で、細胞外液のＣａ２＋濃度を上昇させる工程と、
自然免疫を担う白血球又は白血球様の培養細胞の細胞質内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量を測定する工程と、をこの順序で備え、かつ
自然免疫賦活物質の非存在下と比較して自然免疫賦活物質の存在下での細胞質内Ｃａ２＋濃度が増加し、かつ、スーパーオキシド産生量が増加した場合、自然免疫賦活物質により促進される細胞質内へのＣａ２＋流入経路が、ＳＯＣＥ経路であると判定する工程と、
を備える方法。
【請求項７】
細胞質内Ｃａ２＋濃度の上昇を伴う自然免疫賦活物質により促進される細胞質内へのＣａ２＋流入経路の判定方法であって、
自然免疫賦活物質の存在下及び非存在下で、かつ細胞外液をＣａ２＋フリーにした状態で、自然免疫を担う白血球又は白血球様の培養細胞を、ホスホリパーゼＣの活性化による細胞質内Ｃａ２＋濃度上昇を伴うスーパーオキシド産生を惹起する刺激物質で刺激する工程と、
自然免疫を担う白血球又は白血球様の培養細胞の細胞質内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量を測定する工程と、をこの順序で備え、かつ
自然免疫賦活物質の非存在下と比較して自然免疫賦活物質の存在下での細胞質内Ｃａ２＋濃度が増加し、かつ、スーパーオキシド産生量が増加した場合、自然免疫賦活物質により促進される細胞質内へのＣａ２＋流入経路が、ＩＩＣＲ経路であると判定する工程と、
を備える方法。
【請求項８】
細胞質内Ｃａ２＋濃度の上昇を伴う自然免疫賦活物質により促進される細胞質内へのＣａ２＋流入経路の判定方法であって、
自然免疫を担う白血球又は白血球様の培養細胞を、細胞外液をＣａ２＋フリーにした状態で、筋小胞体／小胞体Ｃａ２＋ＡＴＰアーゼ阻害剤で刺激する工程と、
自然免疫賦活物質の存在下及び非存在下で、細胞外液のＣａ２＋濃度を上昇させる工程と、自然免疫を担う白血球又は白血球様の培養細胞の第１の細胞質内Ｃａ２＋濃度及び第１のスーパーオキシド産生量を測定する工程と、をこの順序で備え、
自然免疫賦活物質の存在下及び非存在下で、かつ細胞外液をＣａ２＋フリーにした状態で、自然免疫を担う白血球又は白血球様の培養細胞を、ホスホリパーゼＣの活性化による細胞質内Ｃａ２＋濃度上昇を伴うスーパーオキシド産生を惹起する刺激物質で刺激する工程と、
自然免疫を担う白血球又は白血球様の培養細胞の第２の細胞質内Ｃａ２＋濃度及び第２のスーパーオキシド産生量を測定する工程と、をこの順序で備え、かつ
自然免疫賦活物質の非存在下と比較して自然免疫賦活物質の存在下での第１及び第２の細胞質内Ｃａ２＋濃度が変化せず、かつ第１及び第２のスーパーオキシド産生量が変化しなかった場合、自然免疫賦活物質により促進される細胞質内へのＣａ２＋流入経路が、受容体作動性カルシウム流入（ＲＯＣＥ）経路であると判定する工程と、
を備える方法。
【請求項９】
ホスホリパーゼＣの活性化による細胞質内Ｃａ２＋濃度上昇を伴うスーパーオキシド産生を惹起する刺激物質が、ホルミルメチオニルロイシルフェニルアラニン、ロイコトリエンＢ４、血小板活性化因子及びＣ５ａからなる群から選択される１以上の刺激物質である、請求項２〜５及び７〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ホスホリパーゼＣの活性化による細胞質内Ｃａ２＋濃度上昇を伴うスーパーオキシド産生を惹起する刺激物質が、ホルミルメチオニルロイシルフェニルアラニンである、請求項２〜５及び７〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
自然免疫を担う白血球又は白血球様の培養細胞が、好中球若しくは好中球様の培養細胞又はマクロファージ若しくはマクロファージ様の培養細胞である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
自然免疫を担う白血球又は白血球様の培養細胞が、好中球又は好中球様の培養細胞である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞質内Ｃａ２＋濃度の測定が蛍光の検出に基づくものであり、かつ前記スーパーオキシド産生量の測定が化学発光の検出に基づくものである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗炎症物質により抑制される細胞質内へのＣａ２＋流入経路の判定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗炎症物質は、免疫担当細胞の活性酸素及び炎症メディエーター等の産生を抑制する抗炎症作用を有する。抗酸化物質は、体内で産生された活性酸素を除去する作用（すなわち、スカベンジャーとしての作用）を有する。
【０００３】
抗炎症物質と抗酸化物質とを識別する方法として、例えば、特許文献１には、抗炎症物質と抗酸化物質とを識別する方法であって、被検物質の存在下及び非存在下で、自然免疫を担う白血球又は自然免疫を担う白血球様の培養細胞を、ホスホリパーゼＣの活性化による細胞内Ｃａ２＋濃度上昇を伴うスーパーオキシド産生を惹起する刺激物質で刺激する工程と、自然免疫を担う白血球又は自然免疫を担う白血球様の培養細胞の細胞内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量を測定する工程と、被検物質の非存在下と比較して被検物質の存在下での細胞内Ｃａ２＋濃度が減少し、かつ、スーパーオキシド産生量が減少する物質を抗炎症物質と同定し、被検物質の非存在下と比較して被検物質の存在下での細胞内Ｃａ２＋濃度が変化せず、かつ、スーパーオキシド産生量が減少する物質を抗酸化物質と同定する工程と、を備える方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００６−２８８３４６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
抗炎症物質による抗炎症作用は、細胞質内へのＣａ２＋動員を抑制し、それによりスーパーオキシド産生量を抑制することに基づくと考えられる。一方、特許文献１に開示されている方法では、抗炎症作用の作用機序を判定することまでは困難である。
【０００６】
本発明は、抗炎症物質による抗炎症作用の作用機序を簡便に判定するための方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
細胞質内へＣａ２＋が流入する経路としては、主に以下の３つが挙げられる。
（１）ストア作動性カルシウム流入（ＳＯＣＥ：ｓｔｏｒｅ−ｏｐｅｒａｔｅｄ  Ｃａ  Ｅｎｔｒｙ）
（２）小胞体Ｃａ２＋ストアから細胞質への流入（ＩＩＣＲ：ｉｎｏｓｉｔｏｌ  １，４，５−ｔｒｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＩＰ３）−ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｃａ  ｒｅｌｅａｓｅ）
（３）受容体作動性カルシウム流入（ＲＯＣＥ：ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｏｐｅｒａｔｅｄ  Ｃａ  Ｅｎｔｒｙ）
【０００８】
本発明は、抗炎症物質により抑制される細胞質内へのＣａ２＋流入経路の判定方法であって、自然免疫を担う白血球又は白血球様の培養細胞を、細胞外液をＣａ２＋フリーにした状態で、筋小胞体／小胞体Ｃａ２＋ＡＴＰアーゼ阻害剤で刺激する工程と、抗炎症物質の存在下及び非存在下で、細胞外液のＣａ２＋濃度を上昇させる工程と、自然免疫を担う白血球又は白血球様の培養細胞の細胞質内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量を測定する工程と、抗炎症物質の非存在下と比較して抗炎症物質の存在下での細胞質内Ｃａ２＋濃度が減少し、かつ、スーパーオキシド産生量が減少した場合、抗炎症物質により抑制される細胞質内へのＣａ２＋流入経路が、ストア作動性カルシウム流入（ＳＯＣＥ）経路であると判定する工程と、を備える方法（「第１の方法」ともいう。）を提供する。
【０００９】
第１の方法は、細胞質内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量を測定する前に、小胞体Ｃａ２＋ストアを枯渇させているため、小胞体内のＣａ２＋ストアが枯渇した際に形成される細胞膜カルシウムチャネルを介した細胞質内へのＣａ２＋流入（すなわち、ＳＯＣＥ）経路に対する抗炎症物質の影響を判定することができる。第１の方法では、前処理した培養細胞の細胞質内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量を測定することで、簡便に抗炎症作用の作用機序（ＳＯＣＥの抑制）を判定することができる。
【００１０】
本発明はまた、抗炎症物質により抑制される細胞質内へのＣａ２＋流入経路を判定する方法であって、抗炎症物質の存在下及び非存在下で、かつ細胞外液をＣａ２＋フリーにした状態で、自然免疫を担う白血球又は白血球様の培養細胞を、ホスホリパーゼＣの活性化による細胞質内Ｃａ２＋濃度上昇を伴うスーパーオキシド産生を惹起する刺激物質で刺激する工程と、自然免疫を担う白血球又は白血球様の培養細胞の細胞質内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量を測定する工程と、抗炎症物質の非存在下と比較して抗炎症物質の存在下での細胞質内Ｃａ２＋濃度が減少し、かつ、スーパーオキシド産生量が減少した場合、抗炎症物質により抑制される細胞質内へのＣａ２＋流入経路が、小胞体から細胞質へのＣａ２＋流入（ＩＩＣＲ）経路であると判定する工程と、を備える方法（「第２の方法」ともいう。）を提供する。
【００１１】
第２の方法は、細胞外液からのＣａ２＋流入を阻止しているため、小胞体Ｃａ２＋ストアから細胞質へのＣａ２＋流入に対する抗炎症物質の影響を判定することができる。第２の方法では、前処理した培養細胞の細胞質内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量を測定することで、簡便に抗炎症作用の作用機序（ＩＩＣＲの抑制）を判定することができる。
【００１２】
本発明は更に、抗炎症物質により抑制される細胞質内へのＣａ２＋流入経路を判定する方法であって、自然免疫を担う白血球又は白血球様の培養細胞を、細胞外液をＣａ２＋フリーにした状態で、筋小胞体／小胞体Ｃａ２＋ＡＴＰアーゼ阻害剤で刺激する工程と、抗炎症物質の存在下及び非存在下で、細胞外液のＣａ２＋濃度を上昇させる工程と、自然免疫を担う白血球又は白血球様の培養細胞の第１の細胞質内Ｃａ２＋濃度及び第１のスーパーオキシド産生量を測定する工程と、抗炎症物質の存在下及び非存在下で、かつ細胞外液をＣａ２＋フリーにした状態で、自然免疫を担う白血球又は白血球様の培養細胞を、ホスホリパーゼＣの活性化による細胞質内Ｃａ２＋濃度上昇を伴うスーパーオキシド産生を惹起する刺激物質で刺激する工程と、自然免疫を担う白血球又は白血球様の培養細胞の第２の細胞質内Ｃａ２＋濃度及び第２のスーパーオキシド産生量を測定する工程と、抗炎症物質の非存在下と比較して抗炎症物質の存在下での第１及び第２の細胞質内Ｃａ２＋濃度が変化せず、かつ第１及び第２のスーパーオキシド産生量が変化しない場合、抗炎症物質により抑制される細胞質内へのＣａ２＋流入経路が、受容体作動性カルシウム流入（ＲＯＣＥ）経路であると判定する工程と、を備える方法（「第３の方法」ともいう。）を提供する。
【００１３】
第３の方法は、第１及び第２の方法に準じて、細胞質内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量を測定し、上述の（１）及び（２）の流入経路ではない場合に（３）の流入経路（すなわち、ＲＯＣＥ）と判定するものである。第３の方法では、前処理した培養細胞の細胞質内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量を測定することで、簡便に抗炎症作用の作用機序（ＲＯＣＥの抑制）を判定することができる。
【００１４】
抗炎症作用は、細胞質内へのＣａ２＋動員を抑制し、それによりスーパーオキシド産生量を抑制することに基づくと考えられる。他方、抗酸化作用は、細胞質内へのＣａ２＋動員とスーパーオキシド産生には影響せず、産生されたスーパーオキシドを消去することに基づくと考えられ、自然免疫賦活作用は、細胞質内へのＣａ２＋動員には影響しないか、又は細胞質内へのＣａ２＋動員を促進し、スーパーオキシド産生を促進することに基づくと考えられる。すなわち、ある物質（被験物質）の機能性（特に、抗炎症作用、自然免疫賦活作用）は、上述した細胞質内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量に基づいて同定することができる。
【００１５】
したがって、本発明は、被験物質の機能性を同定する方法と捉えることもできる。すなわち、本発明の被験物質の機能性を同定する方法は、自然免疫を担う白血球又は白血球様の培養細胞を、細胞外液をＣａ２＋フリーにした状態で、筋小胞体／小胞体Ｃａ２＋ＡＴＰアーゼ阻害剤で刺激する工程と、被験物質の存在下及び非存在下で、細胞外液のＣａ２＋濃度を上昇させる工程と、自然免疫を担う白血球又は白血球様の培養細胞の第１の細胞質内Ｃａ２＋濃度及び第１のスーパーオキシド産生量を測定する工程と、被験物質の存在下及び非存在下で、かつ細胞外液をＣａ２＋フリーにした状態で、自然免疫を担う白血球又は白血球様の培養細胞を、ホスホリパーゼＣの活性化による細胞質内Ｃａ２＋濃度上昇を伴うスーパーオキシド産生を惹起する刺激物質で刺激する工程と、自然免疫を担う白血球又は白血球様の培養細胞の第２の細胞質内Ｃａ２＋濃度及び第２のスーパーオキシド産生量を測定する工程と、被験物質の非存在下と比較して被験物質の存在下での第１の細胞質内Ｃａ２＋濃度が減少し、かつ第１のスーパーオキシド産生量が減少するか、又は第２の細胞質内Ｃａ２＋濃度が減少し、かつ第２のスーパーオキシド産生量が減少する被験物質を抗炎症物質と同定し、被験物質の非存在下と比較して被験物質の存在下での第１及び第２の細胞質内Ｃａ２＋濃度が変化せず、かつ第１及び第２のスーパーオキシド産生量が増加する被験物質、並びに被験物質の非存在下と比較して被験物質の存在下での第１の細胞質内Ｃａ２＋濃度が増加し、かつ第１のスーパーオキシド産生量が増加するか、又は第２の細胞質内Ｃａ２＋濃度が増加し、かつ第２のスーパーオキシド産生量が増加する被験物質を自然免疫賦活物質と同定する工程と、を備える方法（「第４の方法」ともいう。）である。
【００１６】
第４の方法は、被験物質の非存在下と比較して被験物質の存在下での第１及び第２の細胞質内Ｃａ２＋濃度が変化せず、かつ第１及び第２のスーパーオキシド産生量が減少する被験物質に対して、被検物質の存在下及び非存在下で、ヒポキサンチン−キサンチンオキシダーゼ系によりスーパーオキシドを生成させ、スーパーオキシド生成量を測定するステップ、及び被検物質の非存在下と比較して被検物質存在下でのヒポキサンチン−キサンチンオキシダーゼ系におけるスーパーオキシド生成量が変化しない被験物質を抗炎症物質と同定し、被検物質の非存在下と比較して被検物質存在下でのヒポキサンチン−キサンチンオキシダーゼ系におけるスーパーオキシド生成量が減少する被験物質を抗酸化物質と同定するステップを実施する工程を更に備えるものであってもよい。
【００１７】
第１の方法乃至第３の方法は、細胞質内Ｃａ２＋濃度の上昇を伴う自然免疫賦活物質に対して、当該自然免疫賦活物質により促進される細胞質内へのＣａ２＋流入経路の判定にも応用可能である。したがって、本発明は更に、細胞質内Ｃａ２＋濃度の上昇を伴う自然免疫賦活物質により促進される細胞質内へのＣａ２＋流入経路の判定方法（第５の方法乃至第７の方法）とも捉えることができる。
【００１８】
すなわち、第５の方法は、細胞質内Ｃａ２＋濃度の上昇を伴う自然免疫賦活物質により促進される細胞質内へのＣａ２＋流入経路の判定方法であって、自然免疫を担う白血球又は白血球様の培養細胞を、細胞外液をＣａ２＋フリーにした状態で、筋小胞体／小胞体Ｃａ２＋ＡＴＰアーゼ阻害剤で刺激する工程と、自然免疫賦活物質の存在下及び非存在下で、細胞外液のＣａ２＋濃度を上昇させる工程と、自然免疫を担う白血球又は白血球様の培養細胞の細胞質内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量を測定する工程と、自然免疫賦活物質の非存在下と比較して自然免疫賦活物質の存在下での細胞質内Ｃａ２＋濃度が増加し、かつ、スーパーオキシド産生量が増加した場合、自然免疫賦活物質により促進される細胞質内へのＣａ２＋流入経路が、ＳＯＣＥ経路であると判定する工程と、を備える方法である。
【００１９】
第６の方法は、細胞質内Ｃａ２＋濃度の上昇を伴う自然免疫賦活物質により促進される細胞質内へのＣａ２＋流入経路の判定方法であって、自然免疫賦活物質の存在下及び非存在下で、かつ細胞外液をＣａ２＋フリーにした状態で、自然免疫を担う白血球又は白血球様の培養細胞を、ホスホリパーゼＣの活性化による細胞質内Ｃａ２＋濃度上昇を伴うスーパーオキシド産生を惹起する刺激物質で刺激する工程と、自然免疫を担う白血球又は白血球様の培養細胞の細胞質内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量を測定する工程と、自然免疫賦活物質の非存在下と比較して自然免疫賦活物質の存在下での細胞質内Ｃａ２＋濃度が増加し、かつ、スーパーオキシド産生量が増加した場合、自然免疫賦活物質により促進される細胞質内へのＣａ２＋流入経路が、ＩＩＣＲ経路であると判定する工程と、を備える方法である。
【００２０】
第７の方法は、細胞質内Ｃａ２＋濃度の上昇を伴う自然免疫賦活物質により促進される細胞質内へのＣａ２＋流入経路の判定方法であって、自然免疫を担う白血球又は白血球様の培養細胞を、細胞外液をＣａ２＋フリーにした状態で、筋小胞体／小胞体Ｃａ２＋ＡＴＰアーゼ阻害剤で刺激する工程と、自然免疫賦活物質の存在下及び非存在下で、細胞外液のＣａ２＋濃度を上昇させる工程と、自然免疫を担う白血球又は白血球様の培養細胞の第１の細胞質内Ｃａ２＋濃度及び第１のスーパーオキシド産生量を測定する工程と、自然免疫賦活物質の存在下及び非存在下で、かつ細胞外液をＣａ２＋フリーにした状態で、自然免疫を担う白血球又は白血球様の培養細胞を、ホスホリパーゼＣの活性化による細胞質内Ｃａ２＋濃度上昇を伴うスーパーオキシド産生を惹起する刺激物質で刺激する工程と、自然免疫を担う白血球又は白血球様の培養細胞の第２の細胞質内Ｃａ２＋濃度及び第２のスーパーオキシド産生量を測定する工程と、自然免疫賦活物質の非存在下と比較して自然免疫賦活物質の存在下での第１及び第２の細胞質内Ｃａ２＋濃度が変化せず、かつ第１及び第２のスーパーオキシド産生量が変化しなかった場合、自然免疫賦活物質により促進される細胞質内へのＣａ２＋流入経路が、受容体作動性カルシウム流入（ＲＯＣＥ）経路であると判定する工程と、を備える方法である。
【００２１】
上記の各方法において、自然免疫を担う白血球又は白血球様の培養細胞は、スーパーオキシドの産生力が強いことから、好中球若しくは好中球様の培養細胞又はマクロファージ若しくはマクロファージ様の培養細胞であることが好ましく、好中球又は好中球様の培養細胞であることがより好ましい。
【００２２】
上記の各方法において、ホスホリパーゼＣの活性化による細胞質内Ｃａ２＋濃度上昇を伴うスーパーオキシド産生を惹起する刺激物質は、スーパーオキシドの産生を促すのに充分な程度に強く自然免疫を担う白血球又は白血球様の培養細胞を刺激できることから、ホルミルメチオニルロイシルフェニルアラニン、ロイコトリエンＢ４、血小板活性化因子及びＣ５ａからなる群から選択される１以上の刺激物質であることが好ましく、ホルミルメチオニルロイシルフェニルアラニンであることがより好ましい。
【００２３】
上記の各方法において、上記細胞質内Ｃａ２＋濃度の測定が蛍光の検出に基づくものであり、かつ上記スーパーオキシド産生量の測定が化学発光の検出に基づくものであることが好ましい。これにより、細胞質内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量の検出を簡便に行うことができ、また検出感度を向上させることができる。
【発明の効果】
【００２４】
本発明によれば、抗炎症物質による抗炎症作用の作用機序を簡便に判定するための方法が提供される。また、本発明によれば、機能性が不明な物質（被験物質）の機能性（抗炎症作用、抗酸化作用、自然免疫賦活作用）を簡便に同定するための方法が提供される。さらに、本発明によれば、細胞質内Ｃａ２＋濃度の上昇を伴う自然免疫賦活物質による自然免疫賦活作用の作用機序を簡便に判定するための方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】参考例１における細胞質内Ｃａ２＋濃度とスーパーオキシド産生のサンプル／コントロール面積比とシコニン濃度との関係を示すグラフである。
【図２】実施例１における細胞質内Ｃａ２＋濃度とスーパーオキシド産生のサンプル／コントロール面積比とシコニン濃度との関係を示すグラフである。
【図３】実施例２における細胞質内Ｃａ２＋濃度とスーパーオキシド産生のサンプル／コントロール面積比とシコニン濃度との関係を示すグラフである。
【図４】参考例２における細胞質内Ｃａ２＋濃度とスーパーオキシド産生のサンプル／コントロール面積比とリポ多糖（ＬＰＳ）濃度との関係を示すグラフである。
【図５】実施例３における細胞質内Ｃａ２＋濃度とスーパーオキシド産生のサンプル／コントロール面積比とリポ多糖（ＬＰＳ）濃度との関係を示すグラフである。
【図６】実施例４における細胞質内Ｃａ２＋濃度とスーパーオキシド産生のサンプル／コントロール面積比とリポ多糖（ＬＰＳ）濃度との関係を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
【００２７】
〔Ｉ．抗炎症物質により抑制される細胞質内へのＣａ２＋流入経路の判定方法〕
（１．ストア作動性カルシウム流入（ＳＯＣＥ）経路）
抗炎症物質により抑制される細胞質内へのＣａ２＋流入経路の判定方法の一実施形態（第１の方法）では、ＳＯＣＥ経路への抗炎症物質の影響を判定することができる。
【００２８】
第１の方法は、自然免疫を担う白血球又は白血球様の培養細胞を、細胞外液をＣａ２＋フリーにした状態で、筋小胞体／小胞体Ｃａ２＋ＡＴＰアーゼ阻害剤で刺激する工程（第１−１工程）と、抗炎症物質の存在下及び非存在下で、細胞外液のＣａ２＋濃度を上昇させる工程（第１−２工程）と、自然免疫を担う白血球又は白血球様の培養細胞の細胞質内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量を測定する工程（第１−３工程）と、抗炎症物質の非存在下と比較して抗炎症物質の存在下での細胞質内Ｃａ２＋濃度が減少し、かつ、スーパーオキシド産生量が減少した場合、抗炎症物質により抑制される細胞質内へのＣａ２＋流入経路が、ストア作動性カルシウム流入（ＳＯＣＥ）経路であると判定する工程（第１−４工程）と、を備える。
【００２９】
第１−１工程では、自然免疫を担う白血球又は白血球様の培養細胞（以下、説明を簡略化するために、まとめて白血球細胞と表現する場合がある。）を、細胞外液をＣａ２＋フリーにした状態で、筋小胞体／小胞体Ｃａ２＋ＡＴＰアーゼ阻害剤で刺激する。
【００３０】
自然免疫を担う白血球又は白血球様の培養細胞としては、例えば、好中球若しくは好中球様の培養細胞（以下、説明を簡略化するために、好中球様の培養細胞も含めて好中球と表現する場合がある。）、マクロファージ若しくはマクロファージ様の培養細胞（以下、説明を簡略化するために、マクロファージ様の培養細胞も含めてマクロファージと表現する場合がある。）が挙げられる。好中球及びマクロファージはスーパーオキシドの産生力が強いため、自然免疫を担う白血球又は白血球様の培養細胞として好ましく用いられる。中でも、好中球がより好ましい。
【００３１】
好中球様の培養細胞とは、好中球様に分化した細胞をいい、マクロファージ様の培養細胞とは、マクロファージ様に分化した細胞をいい、それぞれ、当該技術分野において周知の方法を用いて調製することが可能である。好中球様の培養細胞として、例えば、ＨＬ−６０細胞（ヒト前骨髄芽球系株化細胞）をＤＭＳＯ等の分化誘導剤で分化させた細胞、ＴＨＰ−１細胞（ヒト単球系株化細胞）をＢｔ２ｃＡＭＰ（ジブチリルｃＡＭＰ）等の分化誘導剤で分化させた細胞等が挙げられる。
【００３２】
筋小胞体／小胞体Ｃａ２＋ＡＴＰアーゼ阻害剤は、ＳＥＲＣＡ阻害剤とも呼ばれ、細胞質から筋小胞体又は小胞体へのＣａ２＋移送を阻害する。筋小胞体／小胞体Ｃａ２＋ＡＴＰアーゼ阻害剤の具体例としては、例えば、サプシガルジン（ｔｈａｐｓｉｇａｒｇｉｎ）、シクロピアゾン酸、ジ−ｔｅｒｔ−ブチルヒドロキノン等が挙げられる。
【００３３】
細胞外液をＣａ２＋フリーにした状態で、白血球細胞を筋小胞体／小胞体Ｃａ２＋ＡＴＰアーゼ阻害剤（例えば、サプシガルジン）で刺激することにより、小胞体へのＣａ２＋の取り込みが阻害されると同時に、Ｃａ２＋の小胞体から細胞質への漏出が惹起され、小胞体内のＣａ２＋ストアが枯渇した状態となる。また、Ｃａ２＋ストアの枯渇は、ＳＯＣＥ経路を担う細胞膜カルシウムチャネルを活性化することになるため、ＳＯＣＥ経路への抗炎症物質の影響を判定することが可能になる。
【００３４】
筋小胞体／小胞体Ｃａ２＋ＡＴＰアーゼ阻害剤は、市販されているものを用いてもよく、また植物（例えば、サプシガルジンの場合、Ｔｈａｐｓｉａ  ｇａｒｇａｎｉｃａ）等から常法に従って抽出したものを用いてもよい。
【００３５】
第１−１工程は、細胞外液をＣａ２＋フリーにした状態で実施する。細胞外液をＣａ２＋フリーにした状態とは、細胞外液から細胞質内へのＣａ２＋の流入が生じない状態であればよく、細胞外液中にＣａ２＋が存在しない状態の他、細胞外液中のＣａ２＋がＣａ２＋キレート化剤でキレートされた状態を含む。
【００３６】
細胞外液をＣａ２＋フリーにした状態とする方法としては、例えば、培養培地等の細胞外液をＣａ２＋を含まない成分のみで調製する方法、細胞外液中のＣａ２＋をキレートするのに必要十分な量のＣａ２＋キレート化剤を添加する方法が挙げられる。
【００３７】
細胞外液に添加するＣａ２＋キレート化剤の具体例としては、例えば、グリコールエーテルジアミン四酢酸（ＥＧＴＡ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）及び１，２−ビス（ｏ−アミノフェノキシド）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸（ＢＡＰＴＡ）が挙げられる。Ｃａ２＋キレート化剤は、１種を単独で用いてもよく、また２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００３８】
細胞外液に添加するＣａ２＋キレート化剤の量は、細胞外液のＣａ２＋をキレートすることで、細胞質内へのＣａ２＋の流入を抑制することができ、かつ第１−２工程で細胞外液のＣａ２＋濃度を上昇させる際にキレートされていないＣａ２＋濃度が充分に上昇するのに必要十分な量として、細胞外液のＣａ２＋濃度に応じて適宜設定される。細胞外液は、例えば、培養培地、緩衝液等であり、これらは通常０ｍＭ〜２ｍＭのＣａ２＋を含有する。したがって、細胞外液に添加するＣａ２＋キレート化剤の量は、例えば、終濃度０．１ｍＭ〜２．１ｍＭの範囲で調整すればよい。
【００３９】
白血球細胞のＳＥＲＣＡ阻害剤による刺激は、培養培地中又は緩衝液中で行うことが可能である。白血球細胞の培養に用いられている培地（例えば、ＲＰＭＩ１６４０培地等）及び一般的な緩衝液（例えば、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液等）を使用できる。培養培地又は緩衝液の好適なｐＨ及び温度は、それぞれ６〜８及び３７℃である。
【００４０】
第１−２工程では、抗炎症物質の存在下及び非存在下で、細胞外液のＣａ２＋濃度を上昇させる。これにより、ＳＯＣＥ経路を介した細胞質内へのＣａ２＋流入が生じるため、抗炎症物質によるＳＯＣＥ経路への影響を観察することができる。
【００４１】
細胞外液のＣａ２＋濃度の上昇は、抗炎症物質の存在下（複数の濃度であってもよい）及び非存在下の双方で行う。
【００４２】
抗炎症物質は、例えば、免疫担当細胞の活性酸素及び炎症メディエーター等の産生を抑制する抗炎症作用を有する物質を特に制限なく使用することができる。抗炎症物質は、例えば、特許文献１に記載の方法により抗炎症物質と同定された物質であってもよい。抗炎症物質の具体例としては、これらに限られるものではないが、例えば、シコニン、アントシアン類、アスタキサンチン等が挙げられる。
【００４３】
細胞外液のＣａ２＋濃度の上昇は、遊離のＣａ２＋（すなわち、キレートされていないＣａ２＋）濃度が上昇するように、例えば、ＣａＣｌ２等のカルシウム塩等を添加することにより実施することができる。細胞外液のＣａ２＋濃度の上昇は、例えば、遊離のＣａ２＋濃度換算で０．５〜５ｍＭ、好ましくは０．８〜３ｍＭ、より好ましくは０．８〜１．２ｍＭ上昇するように実施することができる。
【００４４】
第１−３工程では、自然免疫を担う白血球又は白血球様の培養細胞の細胞質内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量を測定する。
【００４５】
細胞質内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量は、常法に従って、また、市販の試薬及び測定キットを用いて、測定することが可能である。細胞質内Ｃａ２＋濃度の測定は、例えば、カルシウム蛍光指示薬（例えば、Ｆｕｒａ−２及びＦｌｕｏ−３、膜透過性を高めたそれらのエステル誘導体等、数多くのカルシウム蛍光指示薬が市販されている）を、白血球細胞に導入し、励起光を照射して発生した蛍光を測定することにより可能である。スーパーオキシド産生量の測定は、例えば、ＣＬＡ（２−メチル−６−フェニル−３，７−ジヒドロイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３−オン）等のスーパーオキシドと反応して化学発光を生じる試薬を測定系に添加し、白血球細胞がスーパーオキシドを産生するに伴い発生する化学発光を測定することにより可能である。
【００４６】
本出願人が開発した化学発光及び蛍光の同時測定装置（特開２００４−６１４３８号公報、特開２０００−３３８０４５号公報及び特開２０００−１３１２３４号公報等に記載）は、化学発光及び蛍光を同時に測定できるため、白血球細胞の細胞質内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量の測定に特に適している。
【００４７】
第１−４工程では、抗炎症物質の非存在下と比較して抗炎症物質の存在下での細胞質内Ｃａ２＋濃度が減少し、かつ、スーパーオキシド産生量が減少した場合、抗炎症物質により抑制される細胞質内へのＣａ２＋流入経路が、ストア作動性カルシウム流入（ＳＯＣＥ）経路であると判定する。
【００４８】
抗炎症物質の非存在下（コントロール）と、抗炎症物質の存在下（サンプル）との比較は、例えば、測定された蛍光強度（細胞質内Ｃａ２＋濃度に比例する）の面積を算出し、サンプルの面積をコントロールの面積で除することで得た値（サンプル／コントロール面積比）に基づいて行うことができる。サンプル／コントロール面積比の場合は、当該面積比が１より小さいとき、抗炎症物質の非存在下と比較して抗炎症物質の存在下で細胞質内Ｃａ２＋濃度が減少したと判断することができる。統計的に有意差があるか否かを検定することを更に含んでいてもよい。スーパーオキシド産生量についても同様に判断することができる。
【００４９】
抗炎症物質の非存在下と比較して抗炎症物質の存在下での細胞質内Ｃａ２＋濃度が減少し、かつ、スーパーオキシド産生量が減少した場合は、抗炎症物質によりＳＯＣＥ経路を介した細胞質内へのＣａ２＋流入が阻害され、それによりスーパーオキシド産生量が減少したと考えられる。したがって、抗炎症物質により抑制される細胞質内へのＣａ２＋流入経路が、ＳＯＣＥ経路であると判定することができる。
【００５０】
第１の方法では、細胞内外のＣａ２＋濃度勾配に依存したＣａ２＋流入の影響（バックグラウンドレベル）を補正することが好ましい。この補正を行うことによって、被験物質（抗炎症物質）がＣａ２＋をキレートする物質である場合など、バックグラウンドレベルの影響が大きい場合であっても、ＳＯＣＥ経路への抗炎症物質の影響をより正確に評価することが可能になる。バックグラウンドレベルは、第１−１工程において筋小胞体／小胞体Ｃａ２＋ＡＴＰアーゼ阻害剤による刺激を省略する他は、第１−１工程、第１−２工程及び第１−３工程を実施することで測定することができる。すなわち、バックグラウンドレベルは、自然免疫を担う白血球又は白血球様の培養細胞の細胞外液をＣａ２＋フリーにした状態にする工程と、抗炎症物質の存在下及び非存在下で、細胞外液のＣａ２＋濃度を上昇させる工程と、自然免疫を担う白血球又は白血球様の培養細胞の細胞質内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量を測定する工程により測定することができる。バックグラウンドレベルは、例えば、細胞質内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量の測定値から、バックグラウンドレベルの測定値を差し引くことにより補正することができる。
【００５１】
第１の方法は、蛍光及び化学発光の測定という簡便な操作により、抗炎症物質によるＳＯＣＥ経路への影響を判定することができる。
【００５２】
（２．小胞体Ｃａ２＋ストアから細胞質への流入（ＩＩＣＲ）経路）
抗炎症物質により抑制される細胞質内へのＣａ２＋流入経路の判定方法の一実施形態（第２の方法）では、ＩＩＣＲ経路に対する抗炎症物質の影響を判定することができる。
【００５３】
第２の方法は、抗炎症物質の存在下及び非存在下で、かつ細胞外液をＣａ２＋フリーにした状態で、自然免疫を担う白血球又は白血球様の培養細胞を、ホスホリパーゼＣの活性化による細胞質内Ｃａ２＋濃度上昇を伴うスーパーオキシド産生を惹起する刺激物質で刺激する工程（第２−１工程）と、自然免疫を担う白血球又は白血球様の培養細胞の細胞質内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量を測定する工程（第２−２工程）と、抗炎症物質の非存在下と比較して抗炎症物質の存在下での細胞質内Ｃａ２＋濃度が減少し、かつ、スーパーオキシド産生量が減少した場合、抗炎症物質により抑制される細胞質内へのＣａ２＋流入経路が、小胞体から細胞質へのＣａ２＋流入経路であると判定する工程（第２−３工程）と、を備える。第２の方法において、第１の方法と重複する説明は適宜省略する。
【００５４】
第２−１工程では、抗炎症物質の存在下及び非存在下で、かつ細胞外液をＣａ２＋フリーにした状態で、自然免疫を担う白血球又は白血球様の培養細胞を、ホスホリパーゼＣの活性化による細胞質内Ｃａ２＋濃度上昇を伴うスーパーオキシド産生を惹起する刺激物質で刺激する。
【００５５】
ホスホリパーゼＣの活性化による細胞質内Ｃａ２＋濃度上昇を伴うスーパーオキシド産生を惹起する刺激物質としては、例えば、ホルミルメチオニルロイシルフェニルアラニン（以下、ｆＭＬＰと略す）、ロイコトリエンＢ４、血小板活性化因子及びＣ５ａが挙げられる。これらの刺激物質は、スーパーオキシドの産生を促すのに充分な程度に強く白血球細胞を刺激できるため、好ましく用いられる。中でも、ｆＭＬＰがより好ましい。
【００５６】
ホスホリパーゼＣの活性化による細胞質内Ｃａ２＋濃度上昇を伴うスーパーオキシド産生を惹起する刺激物質の濃度は、白血球細胞を刺激しスーパーオキシドの産生を促すのに充分な濃度であればよく、至適濃度は刺激物質の種類に依存する。例えば、ｆＭＬＰの場合、その至適濃度は典型的には０．１μＭ〜１０μＭである。
【００５７】
白血球細胞の刺激物質による刺激は、培養培地中又は緩衝液中で行うことが可能である。白血球細胞の培養に用いられている培地（例えば、ＲＰＭＩ１６４０培地等）及び一般的な緩衝液（例えば、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液等）を使用できる。培養培地又は緩衝液の好適なｐＨ及び温度は、それぞれ６〜８及び３７℃である。
【００５８】
細胞外液をＣａ２＋フリーにした状態とは、第１の方法と同様、細胞外液から細胞質内へのＣａ２＋の流入が生じない状態であればよく、細胞外液中にＣａ２＋が存在しない状態の他、細胞外液中のＣａ２＋がＣａ２＋キレート化剤でキレートされた状態を含む。
【００５９】
細胞外液をＣａ２＋フリーにするのは、細胞質内へのＣａ２＋の流入を抑制するためである。この目的をより効果的に達成するため、第２の方法では、細胞外液をＣａ２＋フリーにした状態が、細胞外液にＣａ２＋キレート化剤を存在させた状態であることが好ましい。細胞外液にＣａ２＋キレート化剤を存在させるのは、細胞外液のＣａ２＋をキレートすることで、細胞質内へのＣａ２＋の流入を抑制するためである。Ｃａ２＋キレート化剤の種類は、第１の方法で説明したとおりである。Ｃａ２＋キレート化剤の添加量は、細胞外液中のＣａ２＋を充分にキレートできればよい。細胞外液は、例えば、培養培地、緩衝液等であり、これらは通常０ｍＭ〜２ｍＭのＣａ２＋を含有する。したがって、Ｃａ２＋キレート化剤の添加量は、例えば、終濃度２ｍＭ以上であってよく、３ｍＭ以上であることが好ましく、５ｍＭ以上であることがより好ましい。添加量の上限に特に制限はないが、例えば、１０ｍＭ以下であってもよい。
【００６０】
第２−１工程では、細胞外液から細胞質内へのＣａ２＋の流入が抑制されているため、刺激物質による刺激により、小胞体膜上のカルシウムチャネルを介した小胞体から細胞質内へのＣａ２＋流入経路だけが働くこととなる。
【００６１】
第２−２工程では、自然免疫を担う白血球又は白血球様の培養細胞の細胞質内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量を測定する。
【００６２】
第２−３工程では、抗炎症物質の非存在下と比較して抗炎症物質の存在下での細胞質内Ｃａ２＋濃度が減少し、かつ、スーパーオキシド産生量が減少した場合、抗炎症物質により抑制される細胞質内へのＣａ２＋流入経路が、小胞体から細胞質へのＣａ２＋流入（ＩＩＣＲ）経路であると判定する。
【００６３】
抗炎症物質の非存在下と比較して抗炎症物質の存在下での細胞質内Ｃａ２＋濃度が減少し、かつ、スーパーオキシド産生量が減少した場合は、抗炎症物質によりＩＩＣＲ経路を介した細胞質内へのＣａ２＋流入が阻害され、それによりスーパーオキシド産生量が減少したと考えられる。したがって、抗炎症物質により抑制される細胞質内へのＣａ２＋流入経路が、ＩＩＣＲ経路であると判定することができる。
【００６４】
第２の方法は、蛍光及び化学発光の測定という簡便な操作により、抗炎症物質によるＩＩＣＲ経路への影響を判定することができる。
【００６５】
（３．受容体作動性カルシウム流入（ＲＯＣＥ）経路）
抗炎症物質により抑制される細胞質内へのＣａ２＋流入経路の判定方法の一実施形態（第３の方法）では、ＲＯＣＥ経路に対する抗炎症物質の影響を判定することができる。
【００６６】
第３の方法は、自然免疫を担う白血球又は白血球様の培養細胞を、細胞外液をＣａ２＋フリーにした状態で、筋小胞体／小胞体Ｃａ２＋ＡＴＰアーゼ阻害剤で刺激する工程（第３−１工程）と、抗炎症物質の存在下及び非存在下で、細胞外液のＣａ２＋濃度を上昇させる工程（第３−２工程）と、自然免疫を担う白血球又は白血球様の培養細胞の第１の細胞質内Ｃａ２＋濃度及び第１のスーパーオキシド産生量を測定する工程（第３−３工程）と、抗炎症物質の存在下及び非存在下で、かつ細胞外液をＣａ２＋フリーにした状態で、自然免疫を担う白血球又は白血球様の培養細胞を、ホスホリパーゼＣの活性化による細胞質内Ｃａ２＋濃度上昇を伴うスーパーオキシド産生を惹起する刺激物質で刺激する工程（第３−４工程）と、自然免疫を担う白血球又は白血球様の培養細胞の第２の細胞質内Ｃａ２＋濃度及び第２のスーパーオキシド産生量を測定する工程（第３−５工程）と、抗炎症物質の非存在下と比較して抗炎症物質の存在下での第１及び第２の細胞質内Ｃａ２＋濃度が変化せず、かつ第１及び第２のスーパーオキシド産生量が変化しない場合、抗炎症物質により抑制される細胞質内へのＣａ２＋流入経路が、受容体作動性カルシウム流入（ＲＯＣＥ）経路であると判定する工程（第３−６工程）と、を備える。第３の方法において、第１の方法及び第２の方法と重複する説明は適宜省略する。
【００６７】
第３の方法は、第１の方法及び第２の方法における判定する工程（第１−４工程及び第２−３工程）以外を実施し、第３−６工程で抗炎症物質により抑制される細胞質内へのＣａ２＋流入経路が、ＲＯＣＥ経路であるか否かを判定するものである。
【００６８】
第３−６工程では、抗炎症物質の非存在下と比較して抗炎症物質の存在下での第１及び第２の細胞質内Ｃａ２＋濃度が変化せず、かつ第１及び第２のスーパーオキシド産生量が変化しない場合、抗炎症物質により抑制される細胞質内へのＣａ２＋流入経路が、受容体作動性カルシウム流入（ＲＯＣＥ）経路であると判定する。
【００６９】
抗炎症物質の非存在下及び存在下とに関わらず、第１の細胞質内Ｃａ２＋濃度及び第１のスーパーオキシド産生量が変化しないことは、抗炎症物質により抑制される細胞質内へのＣａ２＋流入経路が、ストア作動性カルシウム流入（ＳＯＣＥ）経路ではないことを意味する。同様に、第２の細胞質内Ｃａ２＋濃度及び第２のスーパーオキシド産生量が変化しないことは、抗炎症物質により抑制される細胞質内へのＣａ２＋流入経路が、小胞体から細胞質へのＣａ２＋流入（ＩＩＣＲ）経路ではないことを意味する。よって、抗炎症物質により抑制される細胞質内へのＣａ２＋流入経路が、受容体作動性カルシウム流入（ＲＯＣＥ）経路であると判定することができる。なお、細胞質内へのＣａ２＋流入経路には、上述した３つの経路に加えて、細胞内外のＣａ２＋濃度勾配によるＣａ２＋流入がある。しかし、本実施形態に係る方法においては、コントロール（抗炎症物質の非存在下）に対するサンプル（抗炎症物質の存在下）の細胞質内Ｃａ２＋濃度に基づいて判定を行うものであるため、細胞内外のＣａ２＋濃度勾配によるＣａ２＋流入は相殺される。
【００７０】
第３−６工程では、抗炎症物質により抑制される細胞質内へのＣａ２＋流入経路が、（１）ＳＯＣＥ経路、（２）ＩＩＣＲ経路、（３）ＲＯＣＥ経路のいずれであるかを判定することもできる。すなわち、第３−６工程において、抗炎症物質の非存在下と比較して抗炎症物質の存在下での第１の細胞質内Ｃａ２＋濃度が減少し、かつ、第１のスーパーオキシド産生量が減少した場合は、抗炎症物質により抑制される細胞質内へのＣａ２＋流入経路がＳＯＣＥ経路であると判定することができる。また、抗炎症物質の非存在下と比較して抗炎症物質の存在下での第２の細胞質内Ｃａ２＋濃度が減少し、かつ、第２のスーパーオキシド産生量が減少した場合は、抗炎症物質により抑制される細胞質内へのＣａ２＋流入経路がＩＩＣＲ経路であると判定することができる。さらに、抗炎症物質の非存在下と比較して抗炎症物質の存在下での第１及び第２の細胞質内Ｃａ２＋濃度が変化せず、かつ第１及び第２のスーパーオキシド産生量が変化しない場合、抗炎症物質により抑制される細胞質内へのＣａ２＋流入経路が、ＲＯＣＥ経路であると判定することができる。
【００７１】
〔ＩＩ．被験物質の機能性を同定する方法〕
本実施形態に係る被験物質の機能性を同定する方法（第４の方法）は、自然免疫を担う白血球又は白血球様の培養細胞を、細胞外液をＣａ２＋フリーにした状態で、筋小胞体／小胞体Ｃａ２＋ＡＴＰアーゼ阻害剤で刺激する工程（第４−１工程）と、被験物質の存在下及び非存在下で、細胞外液のＣａ２＋濃度を上昇させる工程（第４−２工程）と、自然免疫を担う白血球又は白血球様の培養細胞の第１の細胞質内Ｃａ２＋濃度及び第１のスーパーオキシド産生量を測定する工程（第４−３工程）と、被験物質の存在下及び非存在下で、かつ細胞外液をＣａ２＋フリーにした状態で、自然免疫を担う白血球又は白血球様の培養細胞を、ホスホリパーゼＣの活性化による細胞質内Ｃａ２＋濃度上昇を伴うスーパーオキシド産生を惹起する刺激物質で刺激する工程（第４−４工程）と、自然免疫を担う白血球又は白血球様の培養細胞の第２の細胞質内Ｃａ２＋濃度及び第２のスーパーオキシド産生量を測定する工程（第４−５工程）と、被験物質の機能性を同定する工程（第４−６工程）とを備える。第４の方法において、第１の方法乃至第３の方法と重複する説明は適宜省略する。
【００７２】
第４−６工程では、被験物質の非存在下と比較して被験物質の存在下での第１の細胞質内Ｃａ２＋濃度が減少し、かつ第１のスーパーオキシド産生量が減少するか、又は第２の細胞質内Ｃａ２＋濃度が減少し、かつ第２のスーパーオキシド産生量が減少する被験物質を抗炎症物質と同定する。なお、抗炎症物質と同定する条件には、第１及び第２の細胞質内Ｃａ２＋濃度が減少し、かつ第１及び第２のスーパーオキシド産生量が減少する場合も含まれる。
【００７３】
また、第４−６工程では、被験物質の非存在下と比較して被験物質の存在下での第１及び第２の細胞質内Ｃａ２＋濃度が変化せず、かつ第１及び第２のスーパーオキシド産生量が増加する被験物質を自然免疫賦活物質と同定する。また、被験物質の非存在下と比較して被験物質の存在下での第１の細胞質内Ｃａ２＋濃度が増加し、かつ第１のスーパーオキシド産生量が増加するか、又は第２の細胞質内Ｃａ２＋濃度が増加し、かつ第２のスーパーオキシド産生量が増加する被験物質も自然免疫賦活物質と同定する。なお、自然免疫賦活物質と同定する条件には、第１及び第２の細胞質内Ｃａ２＋濃度が増加し、かつ第１及び第２のスーパーオキシド産生量が増加する場合も含まれる。
【００７４】
第４の方法では、被験物質の非存在下と比較して被験物質の存在下での第１及び第２の細胞質内Ｃａ２＋濃度が変化せず、かつ第１及び第２のスーパーオキシド産生量が減少する被験物質は、抗酸化物質又は抗炎症物質の両者の可能性がある。当該被験物質の機能性を同定するため、第４の方法は、更に以下のヒポキサンチン−キサンチンオキシダーゼ系評価工程を備えていてもよい。
【００７５】
ヒポキサンチン−キサンチンオキシダーゼ系評価工程は、被験物質の非存在下と比較して被験物質の存在下での第１及び第２の細胞質内Ｃａ２＋濃度が変化せず、かつ第１及び第２のスーパーオキシド産生量が減少する被験物質に対して、被検物質の存在下及び非存在下で、ヒポキサンチン−キサンチンオキシダーゼ系によりスーパーオキシドを生成させ、スーパーオキシド生成量を測定するステップ、及び被検物質の非存在下と比較して被検物質存在下でのヒポキサンチン−キサンチンオキシダーゼ系におけるスーパーオキシド生成量が変化しない被験物質を抗炎症物質と同定し、被検物質の非存在下と比較して被検物質存在下でのヒポキサンチン−キサンチンオキシダーゼ系におけるスーパーオキシド生成量が減少する被験物質を抗酸化物質と同定するステップを含む。
【００７６】
ヒポキサンチン−キサンチンオキシダーゼ系評価工程は、無細胞系であるヒポキサンチン−キサンチンオキシダーゼ系におけるスーパーオキシドの生成量の減少の観察を実施するものである。ヒポキサンチン−キサンチンオキシダーゼ系によりスーパーオキシドを生成させた場合、抗酸化物質はそのスカベンジャー作用によって生成したスーパーオキシドを捕捉し破壊するため、抗酸化物質の非存在下と比較してスーパーオキシドの生成量が減少する。一方、抗炎症物質は細胞に作用して細胞のスーパーオキシド産生を抑制することはできても、スーパーオキシドそのものに作用することはできない。つまり、抗炎症物質は、無細胞系のヒポキサンチン−キサンチンオキシダーゼ系により生成するスーパーオキシドに何ら影響を与えない。この性質の違いを利用することにより、抗炎症物質と抗酸化物質とをより確実に識別することが可能となる。
【００７７】
ヒポキサンチン−キサンチンオキシダーゼ系によりスーパーオキシドを生成させることは、当業者にとって既知であり、例えば、「活性酸素実験プロトコール  測定法・遺伝子解析・病態生理モデル」（秀潤社、１９９４年９月１０日発行）６３〜６５頁などに記載されている。簡潔に説明すると、キサンチンオキシダーゼによってヒポキサンチンがキサンチンに酸化されるのに伴って、また、さらにキサンチンが尿酸に酸化されるのに伴って、酸素が還元されてスーパーオキシドが生成する。ヒポキサンチン及びキサンチンオキシダーゼはともに市販されている。典型的には、１ｍＭのヒポキサンチン溶液に０．０１〜１００ｍＵ／ｍｌの濃度でキサンチンオキシダーゼを加えてスーパーオキシドを生成させるが、これに限定されず、また、ヒポキサンチンの濃度、ヒポキサンチン溶液のｐＨ及び温度、キサンチンオキシダーゼの濃度及び添加量などの条件は、当業者が適宜決定することが可能である。
【００７８】
生成したスーパーオキシドの測定は、上述のとおり、スーパーオキシドと反応して化学発光を生じる試薬を添加し、その化学発光量を測定することにより行うことができる。
【００７９】
第４の方法では、被験物質の非存在下と比較して被験物質の存在下での第１及び第２の細胞質内Ｃａ２＋濃度が変化せず、かつ第１及び第２のスーパーオキシド産生量が変化しない被験物質は、抗炎症物質、自然免疫賦活物質又は機能性（抗酸化、抗炎症又は自然免疫賦活）を有しない物質の可能性がある。当該被験物質は、少なくとも抗酸化物質ではないため、抗炎症又は自然免疫賦活の機能性を有するか否かを更に評価してもよい。抗炎症の機能性を有するか否か、自然免疫賦活の機能性を有するか否かは、常法に従って評価することができる。
【００８０】
第４の方法は、蛍光及び化学発光の測定という簡便な操作により、機能性が不明な物質（被験物質）の機能性（抗炎症作用、抗酸化作用、自然免疫賦活作用）を簡便に同定することができる。
【００８１】
〔ＩＩＩ．細胞質内Ｃａ２＋濃度の上昇を伴う自然免疫賦活物質により促進される細胞質内へのＣａ２＋流入経路の判定方法〕
（１．ＳＯＣＥ経路）
細胞質内Ｃａ２＋濃度の上昇を伴う自然免疫賦活物質により促進される細胞質内へのＣａ２＋流入経路の判定方法の一実施形態（第５の方法）では、ＳＯＣＥ経路への自然免疫賦活物質の影響を判定することができる。
【００８２】
第５の方法は、自然免疫を担う白血球又は白血球様の培養細胞を、細胞外液をＣａ２＋フリーにした状態で、筋小胞体／小胞体Ｃａ２＋ＡＴＰアーゼ阻害剤で刺激する工程（第５−１工程）と、自然免疫賦活物質の存在下及び非存在下で、細胞外液のＣａ２＋濃度を上昇させる工程（第５−２工程）と、自然免疫を担う白血球又は白血球様の培養細胞の細胞質内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量を測定する工程（第５−３工程）と、自然免疫賦活物質の非存在下と比較して自然免疫賦活物質の存在下での細胞質内Ｃａ２＋濃度が増加し、かつ、スーパーオキシド産生量が増加した場合、自然免疫賦活物質により促進される細胞質内へのＣａ２＋流入経路が、ＳＯＣＥ経路であると判定する工程（第５−４工程）と、を備える。第５の方法において、第１の方法乃至第４の方法と重複する説明は適宜省略する。
【００８３】
細胞質内Ｃａ２＋濃度の上昇を伴う自然免疫賦活物質は、自然免疫賦活物質のうち、細胞質内Ｃａ２＋濃度上昇作用を有する物質である。自然免疫賦活物質は、例えば、免疫担当細胞の活性酸素及び炎症メディエーター等の産生を促進する作用を有する物質である。細胞質内Ｃａ２＋濃度の上昇を伴う自然免疫賦活物質としては、例えば、第４の方法により、細胞質内Ｃａ２＋濃度の上昇を伴う自然免疫賦活物質として同定された物質を用いることができる。当該自然免疫賦活物質の具体例としては、これらに限られるものではないが、例えば、リポ多糖（ＬＰＳ）、ラクトフェリン等が挙げられる。
【００８４】
第５−４工程では、自然免疫賦活物質の非存在下と比較して自然免疫賦活物質の存在下での細胞質内Ｃａ２＋濃度が増加し、かつ、スーパーオキシド産生量が増加した場合、自然免疫賦活物質により促進される細胞質内へのＣａ２＋流入経路が、ＳＯＣＥ経路であると判定する。
【００８５】
自然免疫賦活物質の非存在下（コントロール）と、自然免疫賦活物質の存在下（サンプル）との比較は、例えば、測定された蛍光強度（細胞質内Ｃａ２＋濃度に比例する）の面積を算出し、サンプルの面積をコントロールの面積で除することで得た値（サンプル／コントロール面積比）に基づいて行うことができる。サンプル／コントロール面積比の場合は、当該面積比が１より大きいとき、自然免疫賦活物質の非存在下と比較して自然免疫賦活物質の存在下で細胞質内Ｃａ２＋濃度が増加したと判断することができる。統計的に有意差があるか否かを検定することを更に含んでいてもよい。スーパーオキシド産生量についても同様に判断することができる。
【００８６】
自然免疫賦活物質の非存在下と比較して自然免疫賦活物質の存在下での細胞質内Ｃａ２＋濃度が増加し、かつ、スーパーオキシド産生量が増加した場合は、自然免疫賦活物質によりＳＯＣＥ経路を介した細胞質内へのＣａ２＋流入が促進され、それによりスーパーオキシド産生量が増加したと考えられる。したがって、自然免疫賦活物質により促進される細胞質内へのＣａ２＋流入経路が、ＳＯＣＥ経路であると判定することができる。
【００８７】
第５の方法は、蛍光及び化学発光の測定という簡便な操作により、自然免疫賦活物質によるＳＯＣＥ経路への影響を判定することができる。
【００８８】
（２．ＩＩＣＲ経路）
細胞質内Ｃａ２＋濃度の上昇を伴う自然免疫賦活物質により促進される細胞質内へのＣａ２＋流入経路の判定方法の一実施形態（第６の方法）では、ＩＩＣＲ経路への自然免疫賦活物質の影響を判定することができる。
【００８９】
第６の方法は、自然免疫賦活物質の存在下及び非存在下で、かつ細胞外液をＣａ２＋フリーにした状態で、自然免疫を担う白血球又は白血球様の培養細胞を、ホスホリパーゼＣの活性化による細胞質内Ｃａ２＋濃度上昇を伴うスーパーオキシド産生を惹起する刺激物質で刺激する工程（第６−１工程）と、自然免疫を担う白血球又は白血球様の培養細胞の細胞質内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量を測定する工程（第６−２工程）と、自然免疫賦活物質の非存在下と比較して自然免疫賦活物質の存在下での細胞質内Ｃａ２＋濃度が増加し、かつ、スーパーオキシド産生量が増加した場合、自然免疫賦活物質により促進される細胞質内へのＣａ２＋流入経路が、ＩＩＣＲ経路であると判定する工程（第６−３工程）と、を備える。第６の方法において、第１の方法乃至第５の方法と重複する説明は適宜省略する。
【００９０】
第６−３工程では、自然免疫賦活物質の非存在下と比較して自然免疫賦活物質の存在下での細胞質内Ｃａ２＋濃度が増加し、かつ、スーパーオキシド産生量が増加した場合、自然免疫賦活物質により促進される細胞質内へのＣａ２＋流入経路が、ＩＩＣＲ経路であると判定する。
【００９１】
自然免疫賦活物質の非存在下と比較して自然免疫賦活物質の存在下での細胞質内Ｃａ２＋濃度が増加し、かつ、スーパーオキシド産生量が増加した場合は、自然免疫賦活物質によりＩＩＣＲ経路を介した細胞質内へのＣａ２＋流入が促進され、それによりスーパーオキシド産生量が増加したと考えられる。したがって、自然免疫賦活物質により促進される細胞質内へのＣａ２＋流入経路が、ＩＩＣＲ経路であると判定することができる。
【００９２】
第６の方法は、蛍光及び化学発光の測定という簡便な操作により、自然免疫賦活物質によるＩＩＣＲ経路への影響を判定することができる。
【００９３】
（３．ＲＯＣＥ経路）
細胞質内Ｃａ２＋濃度の上昇を伴う自然免疫賦活物質により促進される細胞質内へのＣａ２＋流入経路の判定方法の一実施形態（第７の方法）では、ＲＯＣＥ経路への自然免疫賦活物質の影響を判定することができる。
【００９４】
第７の方法は、自然免疫を担う白血球又は白血球様の培養細胞を、細胞外液をＣａ２＋フリーにした状態で、筋小胞体／小胞体Ｃａ２＋ＡＴＰアーゼ阻害剤で刺激する工程（第７−１工程）と、自然免疫賦活物質の存在下及び非存在下で、細胞外液のＣａ２＋濃度を上昇させる工程（第７−２工程）と、自然免疫を担う白血球又は白血球様の培養細胞の第１の細胞質内Ｃａ２＋濃度及び第１のスーパーオキシド産生量を測定する工程（第７−３工程）と、自然免疫賦活物質の存在下及び非存在下で、かつ細胞外液をＣａ２＋フリーにした状態で、自然免疫を担う白血球又は白血球様の培養細胞を、ホスホリパーゼＣの活性化による細胞質内Ｃａ２＋濃度上昇を伴うスーパーオキシド産生を惹起する刺激物質で刺激する工程（第７−４工程）と、自然免疫を担う白血球又は白血球様の培養細胞の第２の細胞質内Ｃａ２＋濃度及び第２のスーパーオキシド産生量を測定する工程（第７−５工程）と、自然免疫賦活物質の非存在下と比較して自然免疫賦活物質の存在下での第１及び第２の細胞質内Ｃａ２＋濃度が変化せず、かつ第１及び第２のスーパーオキシド産生量が変化しなかった場合、自然免疫賦活物質により促進される細胞質内へのＣａ２＋流入経路が、受容体作動性カルシウム流入（ＲＯＣＥ）経路であると判定する工程（第７−６工程）と、を備える。第７の方法において、第１の方法乃至第６の方法と重複する説明は適宜省略する。
【００９５】
第７の方法は、第５及び第６の方法に準じて、細胞質内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量を測定し、自然免疫賦活物質により促進される細胞質内へのＣａ２＋流入経路が、ＳＯＣＥ経路及びＩＩＣＲ経路でない場合に、ＲＯＣＥ経路と判定するものである。第７の方法は、蛍光及び化学発光の測定という簡便な操作により、自然免疫賦活物質によるＲＯＣＥ経路への影響を判定することができる。
【００９６】
なお、上述の各方法（第１の方法乃至第７の方法）において、抗炎症物質又は被検物質の非存在下と比較して抗炎症物質又は被検物質の存在下での細胞質内Ｃａ２＋濃度又はスーパーオキシド産生量が「変化しない」とは、抗炎症物質又は被検物質の存在下での測定値を抗炎症物質又は被検物質の非存在下での測定値で除した数値が０．８以上１．２以下であることが好ましい。また、抗炎症物質又は被検物質の非存在下と比較して抗炎症物質又は被検物質の存在下での細胞質内Ｃａ２＋濃度又はスーパーオキシド産生量が「増加する」とは、抗炎症物質又は被検物質の存在下での測定値を抗炎症物質又は被検物質の非存在下での測定値で除した数値が１．２よりも大きいことが好ましい。また、抗炎症物質又は被検物質の非存在下と比較して抗炎症物質又は被検物質の存在下での細胞質内Ｃａ２＋濃度又はスーパーオキシド産生量が「減少する」とは、抗炎症物質又は被検物質の存在下での測定値を抗炎症物質又は被検物質の非存在下での測定値で除した数値が０．８未満であることが好ましい。特に、細胞質内Ｃａ２＋濃度及びスーパーオキシド産生量の増減の評価にあたっては、複数用量（濃度）の抗炎症物質又は被検物質で測定を行い、用量（濃度）依存曲線を作成し、その最大変化量について評価を行うことが好ましい。
【実施例】
【００９７】
以下、本発明を実施例に基づいてより具体的に説明する。ただし、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００９８】
〔細胞の調製〕
好中球様の細胞に分化可能なＨＬ−６０細胞（急性前骨髄球性白血病の３６歳の女性末梢血より分離された前骨髄芽球系株細胞）を分化誘導剤（ジメチルスルホキシド：ＤＭＳＯ）で分化させた。分化誘導後、４日間培養した細胞を回収し、終濃度３μＭのｆｌｕｏ３−ＡＭ（カルシウム検出用蛍光性指示薬：１−［２−アミノ−５−（２，７−ジクロロ−６−ヒドロキシ−３−オキシ−９−ザンテニル）フェノキシ］−２−（２−アミノ−５−メチルフェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（１−［２−Ａｍｉｎｏ−５−（２，７−ｄｏｃｈｌｏｒｏ−６−ｈｙｄｒｏｘｙ−３−ｏｘｙ−９−ｘａｎｔｈｅｎｎｙｌ）ｐｈｅｎｏｘｙ］−２−（２―ａｍｉｎｏ―５−ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｏｘｙ）ｅｔｈａｎｅ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ））を加えて３７℃、５％ＣＯ２存在下で４５分間培養し、細胞内にｆｌｕｏ３−ＡＭを取り込ませた。ＲＨバッファー（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５４ｍＭ  ＮａＣｌ、５．６ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ７．４）で１回洗浄後、同バッファーに懸濁し、細胞懸濁液を得た。
【００９９】
〔参考例１：シコニンの機能性評価〕
生薬シコンの有効成分であるシコニンの機能性（抗炎症作用、抗酸化作用等）を特許文献１に記載の方法により評価した。
【０１００】
上述した細胞懸濁液（終濃度１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を測定用キュベットに入れ、ＣａＣｌ２及びＣＬＡ（スーパーオキシド検出用化学発光性指示薬：２−メチル−６−フェニル−３，７−ジヒドロイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３−オン（２−ｍｅｔｈｙｌ−６−ｐｈｅｎｙｌ−１−３，７−ｄｉｈｙｄｒｏｉｍｉｄａｚｏ［１，２−ａ］ｐｙｒａｚｉｎ−３−ｏｎｅ））をそれぞれ終濃度１ｍＭ及び１μＭとなるよう加えた。さらに、０、０．０３３、０．１、０．３３、１及び３．３ｍＭに調製したシコニン（和光純薬工業株式会社）のＤＭＳＯ溶液を１．５μＬ添加して、総液量を１．５ｍＬとした（シコニンの終濃度は、それぞれ０、０．０３３、０．１、０．３３、１及び３．３μＭ）。
【０１０１】
撹拌しながら、７分間３７℃でプレインキュベートした後、蛍光・化学発光同時計測装置にセットして測定を開始した。測定中は試料溶液に、６２．５ｍｓｅｃ間隔で点滅している５００ｎｍＬＥＤを照射し、３７℃でのインキュベートと撹拌を続けた。測定開始から１分後、１００μＭのｆＭＬＰ（ＲＨＢ：ＤＭＳＯ＝３：１溶液）を１５μＬ添加し、細胞を刺激した。この刺激により、細胞質内Ｃａ２＋濃度を示す蛍光シグナルと、スーパーオキシド産生を示す化学発光シグナルが上昇し、ピークを形成した。
【０１０２】
各シコニン濃度における蛍光ピーク及び化学発光ピークの面積を、コントロール（シコニン無添加のＤＭＳＯを等量添加）の蛍光ピーク及び化学発光ピークの面積で除し、サンプル／コントロール面積比を算出した。また、細胞質内Ｃａ２＋濃度上昇抑制とスーパーオキシド産生抑制のＩＣ５０値（半数阻害濃度（Ｈａｌｆ  ｍａｘｉｍａｌ  （５０％）  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ））も算出した。
【０１０３】
図１に、細胞質内Ｃａ２＋濃度とスーパーオキシド産生のサンプル／コントロール面積比とシコニン濃度との関係を示した。図１中、「＊」及び「＊＊」は、対応のある場合のｔ−検定により、サンプル−コントロール間で統計上有意差があったことを示す（それぞれ、Ｐ＜０．０５及びＰ＜０．０１）。細胞質内Ｃａ２＋濃度上昇とスーパーオキシド産生は、シコニン濃度依存的に、同調して低下した。この結果は、シコニンが細胞質内へのＣａ２＋の流入を抑えることによりスーパーオキシドの産生を抑制したと考えられる。したがって、シコニンは、抗炎症作用を有すると判定した。
【０１０４】
また、細胞質内Ｃａ２＋濃度上昇抑制及びスーパーオキシド産生抑制のＩＣ５０値は、それぞれ１．４５±０．０６μＭ及び１．１２±０．０３μＭであった。
【０１０５】
〔実施例１：シコニンによる抗炎症作用の作用機序評価（１）〕
実施例１では、シコニンにより抑制される細胞質内へのＣａ２＋の流入経路を特定するため、小胞体内のＣａ２＋ストアが枯渇した際に形成される細胞膜カルシウムチャネルを介した流入経路（ＳＯＣＥ）に及ぼす影響を評価した。具体的には、ＥＧＴＡを細胞外液に添加し、細胞外液をＣａ２＋フリーの状態にした。ここに、筋小胞体／小胞体Ｃａ２＋ＡＴＰアーゼ阻害剤であるサプシガルジンを添加した。これによって、小胞体へのＣａ２＋の取り込みが阻害されると同時に、Ｃａ２＋の小胞体から細胞質への漏出が惹起され、小胞体内のＣａ２＋ストアが枯渇した状態となる。この状態でＣａＣｌ２を細胞外液に添加することでＳＯＣＥが誘導される。したがって、シコニンが、ＳＯＣＥに及ぼす影響を評価することができる。
【０１０６】
ＣａＣｌ２を添加せず、ＥＧＴＡを終濃度０．１ｍＭになるように添加したこと、並びにサプシガルジン及びシコニン溶液分を減量したこと以外は、参考例１と同様に試料溶液を調製した。これにより、細胞外液をＣａ２＋フリーの状態にした。試料溶液を３７℃で４分間インキュベートした後、サプシガルジン（終濃度１μＭ）を添加した。３７℃で２分間インキュベートし、小胞体内のＣａ２＋を枯渇させた。続けて参考例１と同様にシコニン溶液を添加し、３７℃で５分インキュベーションした後、蛍光・化学発光同時計測装置にセットし、参考例１と同様に測定を開始した（但し、ｆＭＬＰは添加していない。）。開始から２分後、試験溶液にＣａＣｌ２を終濃度１ｍＭになるよう添加して、ＳＯＣＥを誘導した。なお、バックグラウンドレベルの補正のため、各サンプルについて、サプシガルジンの代わりに同量の溶媒（ＲＨＢ：ＤＭＳＯ＝３：１溶液）を添加したこと以外は同様の操作を行った補正用サンプルを用意した。
【０１０７】
試験溶液にＣａＣｌ２を添加することにより、細胞質内Ｃａ２＋濃度上昇が強く惹起された。細胞質から小胞体へのＣａ２＋の取り込みがサプシガルジンによって阻害されているため、蛍光の信号低下はなく横ばいのピークとなった。シコニンの濃度依存的に、細胞質内Ｃａ２＋濃度上昇が抑えられる結果となった。ＣａＣｌ２添加前のベースとなる部分を最小二乗法で延長し、それを底辺としてＡＵＣ（Ａｒｅａ  ｕｎｄｅｒ  ｔｈｅ  ｃｕｒｖｅ曲線下面積）を算出した。算出したＡＵＣ値から、各サンプルの補正用サンプルのＡＵＣ値を減算し、補正ＡＵＣ値を得た。この補正ＡＵＣ値から、細胞質内Ｃａ２＋濃度上昇とスーパーオキシド産生のサンプル／コントロール面積比（ＡＵＣ比）とＩＣ５０値を算出した。スーパーオキシド産生を示す化学発光信号は、実施例２のｆＭＬＰ刺激時よりも小さいピークが観察され、同様にシコニン濃度依存的に減少していた。
【０１０８】
図２に、細胞質内Ｃａ２＋濃度上昇とスーパーオキシド産生のサンプル／コントロール面積比とシコニン濃度との関係を示した。図２中、「＊」及び「＊＊」は、対応のある場合のｔ−検定により、サンプル−コントロール間で統計上有意差があったことを示す（それぞれ、Ｐ＜０．０５及びＰ＜０．０１）。細胞質内Ｃａ２＋濃度上昇とスーパーオキシド産生は、シコニン濃度依存的に、同調して低下した。この結果は、シコニンがＳＯＣＥを抑制したことを示す。
【０１０９】
また、細胞質内Ｃａ２＋濃度上昇抑制及びスーパーオキシド産生抑制のＩＣ５０値は、それぞれ０．３８８±０．０９８μＭ及び０．２４７±０．０５９μＭであった。
【０１１０】
〔実施例２：シコニンによる抗炎症作用の作用機序評価（２）〕
実施例２では、シコニンにより抑制される細胞質内へのＣａ２＋の流入経路を特定するため、小胞体から細胞質内へのＣａ２＋流入（ＩＩＣＲ）経路に及ぼす影響を評価した。具体的には、参考例１と同様の測定を実施する際に、Ｃａ２＋のキレート剤であるＥＧＴＡ（グリコールエーテルジアミン四酢酸）を細胞外液に添加した。ＥＧＴＡを細胞外液に添加することで、細胞外液から細胞質内へのＣａ２＋流入は起こらず、細胞内のＣａ２＋貯蔵器官である小胞体から細胞質内へのＣａ２＋流入経路だけが働くこととなる。したがって、シコニンが、ＩＩＣＲ経路に及ぼす影響を評価することができる。
【０１１１】
ＥＧＴＡとシコニン溶液添加分を減量したこと以外は、参考例１と同様に試料溶液を調製した。試料溶液を３７℃で１分間インキュベートして充分に小胞体内にＣａ２＋を取り込ませた後、ＥＧＴＡを終濃度５ｍＭになるように添加し、続けて参考例１と同様にシコニン溶液を添加した。３７℃で６分間インキュベートを続けた後、参考例１と同様の測定を実施し、細胞質内Ｃａ２＋濃度上昇とスーパーオキシド産生のサンプル／コントロール面積比（ＡＵＣ比）とＩＣ５０値を算出した。
【０１１２】
図３に、細胞質内Ｃａ２＋濃度上昇とスーパーオキシド産生のサンプル／コントロール面積比とシコニン濃度との関係を示した。図３中、「＊」及び「＊＊」は、対応のある場合のｔ−検定により、サンプル−コントロール間で統計上有意差があったことを示す（それぞれ、Ｐ＜０．０５及びＰ＜０．０１）。細胞質内Ｃａ２＋濃度上昇とスーパーオキシド産生は、シコニン濃度依存的に、同調して低下した。この結果は、シコニンがＩＩＣＲを抑制したことを示す。
【０１１３】
また、細胞質内Ｃａ２＋濃度上昇抑制及びスーパーオキシド産生抑制のＩＣ５０値は、それぞれ０．２８１±０．０２５μＭ及び０．３０８±０．０１９μＭであった。
【０１１４】
参考例１及び実施例１〜２の結果より、シコニンは、ＩＩＣＲ及びＳＯＣＥの双方を抑制することにより、抗炎症作用を示すことが明らかとなった。また、実施例１〜２の結果より、シコニン（被験物質）は、第１の細胞質内Ｃａ２＋濃度が減少し、また第１のスーパーオキシド産生量が減少し（実施例１の結果参照）、かつ第２の細胞質内Ｃａ２＋濃度が減少し、また第２のスーパーオキシド産生量が減少する（実施例２の結果参照）ことから、本発明の第４の方法により、抗炎症物質と同定することができる。
【０１１５】
〔参考例２：リポ多糖（ＬＰＳ）の機能性評価〕
グラム陰性菌細胞壁外膜の構成成分であるリポ多糖（ＬＰＳ）の機能性を、参考例１と同様に、特許文献１に記載の方法により評価した。なお、ＬＰＳは、Ｔｏｌｌ様受容体を介して自然免疫賦活作用を有することが知られている。
【０１１６】
上述した細胞懸濁液（終濃度１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を測定用キュベットに入れ、ＣａＣｌ２及びＣＬＡをそれぞれ終濃度１ｍＭ及び１μＭとなるよう加えた。さらに、ＬＰＳ（自然免疫応用技研株式会社）を終濃度が０、０．００１、０．０１、０．１、１及び１０ｐｇ／ｍＬになるよう添加した（総液量１．５ｍＬ）。
【０１１７】
撹拌しながら、７分間３７℃でプレインキュベートした後、蛍光・化学発光同時計測装置にセットして測定を開始した。測定中は試料溶液に、６２．５ｍｓｅｃ間隔で点滅している５００ｎｍＬＥＤを照射し、３７℃でのインキュベートと撹拌を続けた。測定開始から１分後、１００μＭのｆＭＬＰ（ＲＨＢ：ＤＭＳＯ＝３：１溶液）を１５μＬ添加し、細胞を刺激した。この刺激により、細胞質内Ｃａ２＋濃度を示す蛍光シグナルと、スーパーオキシド産生を示す化学発光シグナルが上昇し、ピークを形成した。
【０１１８】
各ＬＰＳ濃度における蛍光ピーク及び化学発光ピークの面積を、コントロール（ＬＰＳ無添加の１％ＢＳＡ/ＰＢＳを等量添加）の蛍光ピーク及び化学発光ピークの面積で除し、サンプル／コントロール面積比を算出した。
【０１１９】
図４に、細胞質内Ｃａ２＋濃度とスーパーオキシド産生のサンプル／コントロール面積比とＬＰＳ濃度との関係を示した。図４中、「＊」及び「＊＊」は、対応のある場合のｔ−検定により、サンプル−コントロール間で統計上有意差があったことを示す（それぞれ、Ｐ＜０．０５及びＰ＜０．０１）。細胞質内Ｃａ２＋濃度上昇は、有意差有りの２割弱の増加だったのに対して、スーパーオキシド産生は２割以上増加した。この結果は、ＬＰＳが細胞質内へのＣａ２＋の流入亢進によるスーパーオキシド産生促進に加え、カルシウム流入に関与しない部分にも作用してスーパーオキシドの産生を促進したと考えられる。
【０１２０】
〔実施例３：ＬＰＳによる自然免疫賦活作用の作用機序評価（１）〕
実施例３では、ＬＰＳにより促進される細胞質内へのＣａ２＋の流入経路を特定するため、ＳＯＣＥ経路に及ぼす影響を評価した。
【０１２１】
ＣａＣｌ２を添加せず、ＥＧＴＡを終濃度０．１ｍＭになるように添加したこと、並びにサプシガルジン及びＬＰＳ添加分を減量したこと以外は、参考例２と同様に試料溶液を調製した。これにより、細胞外液をＣａ２＋フリーの状態にした。試料溶液を３７℃で４分間インキュベートした後、サプシガルジン（終濃度１μＭ）を添加した。３７℃で２分間インキュベートし、小胞体内のＣａ２＋を枯渇させた。続けて参考例２と同様にＬＰＳを添加し、３７℃で５分インキュベーションした後、蛍光・化学発光同時計測装置にセットし、参考例２と同様に測定を開始した（但し、ｆＭＬＰは添加していない。）。開始から２分後、試験溶液にＣａＣｌ２を終濃度１ｍＭになるよう添加して、ＳＯＣＥを誘導した。なお、バックグラウンドレベルの補正のため、各サンプルについて、サプシガルジンの代わりに同量の溶媒（ＲＨＢ：ＤＭＳＯ＝３：１溶液）を添加したこと以外は同様の操作を行った補正用サンプルを用意した。
【０１２２】
ＣａＣｌ２添加前のベースとなる部分を最小二乗法で延長し、それを底辺としてＡＵＣ（Ａｒｅａ  ｕｎｄｅｒ  ｔｈｅ  ｃｕｒｖｅ曲線下面積）を算出した。算出したＡＵＣ値から、各サンプルの補正用サンプルのＡＵＣ値を減算し、補正ＡＵＣ値を得た。この補正ＡＵＣ値から、細胞質内Ｃａ２＋濃度上昇とスーパーオキシド産生のサンプル／コントロール面積比（ＡＵＣ比）を算出した。
【０１２３】
図５に、細胞質内Ｃａ２＋濃度上昇とスーパーオキシド産生のサンプル／コントロール面積比とＬＰＳ濃度との関係を示した。図５中、「＊」及び「＊＊」は、対応のある場合のｔ−検定により、サンプル−コントロール間で統計上有意差があったことを示す（それぞれ、Ｐ＜０．０５及びＰ＜０．０１）。細胞質内Ｃａ２＋濃度上昇は変化せず、スーパーオキシド産生は、高濃度で増加傾向が見られた。この結果は、ＬＰＳにより促進される細胞質内へのＣａ２＋の流入経路がＳＯＣＥ経路ではないことを示す。
【０１２４】
〔実施例４：ＬＰＳによる自然免疫賦活作用の作用機序評価（２）〕
実施例４では、ＬＰＳにより促進される細胞質内へのＣａ２＋の流入経路を特定するため、ＩＩＣＲ経路に及ぼす影響を評価した。
【０１２５】
ＥＧＴＡとＬＰＳ添加分を減量したこと以外は、参考例２と同様に試料溶液を調製した。試料溶液を３７℃で１分間インキュベートして充分に小胞体内にＣａ２＋を取り込ませた後、ＥＧＴＡを終濃度５ｍＭになるように添加し、続けて参考例２と同様にＬＰＳを添加した。３７℃で６分間インキュベートを続けた後、参考例２と同様の測定を実施し、細胞質内Ｃａ２＋濃度上昇とスーパーオキシド産生のサンプル／コントロール面積比（ＡＵＣ比）を算出した。
【０１２６】
図６に、細胞質内Ｃａ２＋濃度上昇とスーパーオキシド産生のサンプル／コントロール面積比とＬＰＳ濃度との関係を示した。図６中、「＊」及び「＊＊」は、対応のある場合のｔ−検定により、サンプル−コントロール間で統計上有意差があったことを示す（それぞれ、Ｐ＜０．０５及びＰ＜０．０１）。細胞質内Ｃａ２＋濃度上昇は変化せず、スーパーオキシド産生は、有意差有りの１割程度の増加が見られた。この結果は、ＬＰＳにより促進される細胞質内へのＣａ２＋の流入経路がＩＩＣＲ経路ではないことを示す。
【０１２７】
参考例２及び実施例３〜４の結果より、ＬＰＳは、カルシウム流入に関与しない部分に作用してスーパーオキシド産生を促進させるのと同時に、ＲＯＣＥ経路を介して細胞質内へのＣａ２＋流入を促進させ、これによりスーパーオキシド産生を促進することにより、自然免疫賦活作用を示すことが明らかとなった。また、実施例３〜４の結果より、ＬＰＳ（被験物質）は、第１の細胞質内Ｃａ２＋濃度が変化せず、また第１のスーパーオキシド産生量が増加し（実施例３の結果参照）、かつ第２の細胞質内Ｃａ２＋濃度が変化せず、また第２のスーパーオキシド産生量が増加する（実施例４の結果参照）ことから、本発明の第４の方法により、自然免疫賦活物質と同定することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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