(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
好ましくはヒトである個体における血管新生の阻害において使用するための、ＣＬＥＣ１４ＡポリペプチドのＣ型レクチンドメイン（残基３２〜１７３）に、アミノ酸残基９７〜１０８にわたる領域において選択的に結合する、ＣＬＥＣ１４ＡとＭＭＲＮ２との間の相互作用を阻害する抗体を含む薬剤。
【請求項２】
前記抗体が、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、もしくは単鎖抗体である、請求項１に記載の薬剤。
【請求項３】
前記抗体は、
（ａ）アミノ酸配列ＳＳＹＷＩＥ（配列番号１）もしくはＧＹＴＦＳＳＹＷ（配列番号４０）を含む重鎖ＣＤＲ１、
（ｂ）アミノ酸配列ＷＩＧＥＩＬＰＧＳＧＳＴ（配列番号２）もしくはＷＩＧＥＩＬＰＧＳＧＳＴＮ（配列番号７８）もしくはＩＬＰＧＳＧＳＴ（配列番号４１）を含む重鎖ＣＤＲ２、及び／または
（ｃ）アミノ酸配列ＡＲＧＧＤＹＤＥＥＹＹＬＭＤ（配列番号３）もしくはＡＲＧＧＤＹＤＥＥＹＹＬＭＤＹ（配列番号４２）を含む重鎖ＣＤＲ３、
あるいは、１個、２個、または３個のアミノ酸置換を含むこれらの配列のいずれかの変異体、を含む、請求項１または２に記載の薬剤。
【請求項４】
前記抗体は、
（ａ）アミノ酸配列ＳＹＭＹＷＹ（配列番号４）もしくはＳＳＶＳＹ（配列番号４３）を含む軽鎖ＣＤＲ１、
（ｂ）アミノ酸配列ＬＬＩＹＤＴＳＮＬＡ（配列番号５）もしくはＤＴＳを含む軽鎖ＣＤＲ２、及び／または
（ｃ）アミノ酸配列ＱＱＷＳＳＹＰＬ（配列番号６）もしくはＱＱＷＳＳＹＰＬＴ（配列番号４４）を含む軽鎖ＣＤＲ３、あるいは、１個、２個、または３個のアミノ酸置換を含むこれらの配列のいずれかの変異体、を含む、請求項１〜３のいずれかに記載の薬剤。
【請求項５】
前記抗体は、アミノ酸配列ＭＡＱＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＭＫＰＧＡＳＶＫＩＳＣＫＡＴＧＹＴＦＳＳＹＷＩＥＷＶＮＲＲＰＧＨＧＬＥＷＩＧＥＩＬＰＧＳＧＳＴＮＹＮＥＫＦＫＧＫＡＴＦＴＡＤＴＳＳＮＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＧＧＤＹＤＥＥＹＹＬＭＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳ（配列番号７）、もしくは
ＭＡＱＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＭＫＰＧＡＳＶＫＩＳＣＫＡＴＧＹＴＦＳＳＹＷＩＥＷＶＮＲＲＰＧＨＧＬＥＷＩＧＥＩＬＰＧＳＧＳＴＮＹＮＥＫＦＫＧＫＡＴＦＴＡＤＴＳＳＮＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＧＧＤＹＤＥＥＹＹＬＭＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶ（配列番号４９）、または、
１個、２個、３個、４個、もしくは５個のアミノ酸置換を含むこの配列の変異体、を含む重鎖可変領域を含む、請求項１〜４のいずれかに記載の薬剤。
【請求項６】
前記抗体は、アミノ酸配列ＱＩＶＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＳＡＳＳＳＶＳＹＭＹＷＹＱＱＫＰＧＳＳＰＲＬＬＩＹＤＴＳＮＬＡＳＧＶＰＶＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＲＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＹＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＩＫＲＡＡ（配列番号８）、もしくは
ＱＩＶＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＳＡＳＳＳＶＳＹＭＹＷＹＱＱＫＰＧＳＳＰＲＬＬＩＹＤＴＳＮＬＡＳＧＶＰＶＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＲＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＹＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＩＫＲＡＡＡ（配列番号５０）、または、
１個、２個、３個、４個、もしくは５個のアミノ酸置換を含むこの配列の変異体、を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１〜５のいずれかに記載の薬剤。
【請求項７】
前記抗体は、アミノ酸配列ＭＡＱＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＭＫＰＧＡＳＶＫＩＳＣＫＡＴＧＹＴＦＳＳＹＷＩＥＷＶＮＲＲＰＧＨＧＬＥＷＩＧＥＩＬＰＧＳＧＳＴＮＹＮＥＫＦＫＧＫＡＴＦＴＡＤＴＳＳＮＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＧＧＤＹＤＥＥＹＹＬＭＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳ（配列番号７）、または
ＭＡＱＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＭＫＰＧＡＳＶＫＩＳＣＫＡＴＧＹＴＦＳＳＹＷＩＥＷＶＮＲＲＰＧＨＧＬＥＷＩＧＥＩＬＰＧＳＧＳＴＮＹＮＥＫＦＫＧＫＡＴＦＴＡＤＴＳＳＮＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＧＧＤＹＤＥＥＹＹＬＭＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶ（配列番号４９）を含む重鎖可変領域、及び
アミノ酸配列ＱＩＶＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＳＡＳＳＳＶＳＹＭＹＷＹＱＱＫＰＧＳＳＰＲＬＬＩＹＤＴＳＮＬＡＳＧＶＰＶＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＲＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＹＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＩＫＲＡＡ（配列番号８）、または
ＱＩＶＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＳＡＳＳＳＶＳＹＭＹＷＹＱＱＫＰＧＳＳＰＲＬＬＩＹＤＴＳＮＬＡＳＧＶＰＶＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＲＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＹＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＩＫＲＡＡＡ（配列番号５０）を含む軽鎖可変領域、
を含む、請求項１〜６のいずれかに記載の薬剤。
【請求項８】
前記抗体は、ポリペプチド配列、
ＭＡＱＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＭＫＰＧＡＳＶＫＩＳＣＫＡＴＧＹＴＦＳＳＹＷＩＥＷＶＮＲＲＰＧＨＧＬＥＷＩＧＥＩＬＰＧＳＧＳＴＮＹＮＥＫＦＫＧＫＡＴＦＴＡＤＴＳＳＮＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＶＶＹＹＣＡＲＧＧＤＹＤＥＥＹＹＬＭＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＩＶＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＳＡＳＳＳＶＳＹＭＹＷＹＱＱＫＰＧＳＳＰＲＬＬＩＹＤＴＳＮＬＡＳＧＶＰＶＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＲＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＹＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＩＫＲＡＡＡ（配列番号５５）を含む、請求項１〜７のいずれかに記載の薬剤。
【請求項９】
前記抗体は、
（ａ）アミノ酸配列ＳＳＹＷＩＥ（配列番号１）もしくはＧＹＴＦＳＳＹＷ（配列番号４０）を含む重鎖ＣＤＲ１、
（ｂ）アミノ酸配列ＷＩＧＥＩＬＰＧＳＧＳＴＮ（配列番号７８）もしくはＩＬＰＧＳＧＳＴ（配列番号４１）を含む重鎖ＣＤＲ２、及び／または
（ｃ）アミノ酸配列ＡＲＧＧＤＹＤＥＥＹＹＶＭＤ（配列番号７７）もしくはＡＲＧＧＤＹＤＥＥＹＹＶＭＤＹ（配列番号４５）を含む重鎖ＣＤＲ３、
あるいは、１個、２個、または３個のアミノ酸置換を含むこれらの配列のいずれかの変異体、を含む、請求項１または２に記載の薬剤。
【請求項１０】
前記抗体は、
（ａ）アミノ酸配列ＳＹＭＹＷＹ（配列番号４）もしくはＳＳＶＳＹ（配列番号４３）を含む軽鎖ＣＤＲ１、
（ｂ）アミノ酸配列ＬＬＩＹＤＴＳＮＬＡ（配列番号５）もしくはＤＴＳを含む軽鎖ＣＤＲ２、及び／または
（ｃ）アミノ酸配列ＱＱＷＳＳＹＰＬ（配列番号６）もしくはＱＱＷＳＳＹＰＬＴ（配列番号４４）を含む軽鎖ＣＤＲ３、
あるいは、１個、２個、または３個のアミノ酸置換を含むこれらの配列のいずれかの変異体、を含む、請求項１、２または９に記載の薬剤。
【請求項１１】
前記抗体は、
アミノ酸配列ＭＡＥＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＭＫＰＧＡＳＶＫＩＳＣＫＡＴＧＹＴＦＳＳＹＷＩＥＷＶＫＱＲＰＧＨＧＬＥＷＩＧＥＩＬＰＧＳＧＳＴＮＹＮＥＫＦＫＧＫＡＴＦＴＡＤＴＳＳＮＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＧＧＤＹＤＥＥＹＹＶＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶ（配列番号５１）、または、
１個、２個、３個、４個、もしくは５個のアミノ酸置換を含むこの配列の変異体、
を含む重鎖可変領域、及び／あるいは
アミノ酸配列ＱＩＶＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＳＡＳＳＳＶＳＹＭＹＷＹＱＱＫＰＧＳＳＰＲＬＬＩＹＤＴＳＮＬＡＳＧＶＰＶＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＲＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＹＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫＲ（配列番号５２）または、
１個、２個、３個、４個、もしくは５個のアミノ酸置換を含むこの配列の変異体、
を含む軽鎖可変領域、を含む、請求項１、２、９及び１０のいずれかに記載の薬剤。
【請求項１２】
前記抗体は、ポリペプチド配列ＭＡＥＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＭＫＰＧＡＳＶＫＩＳＣＫＡＴＧＹＴＦＳＳＹＷＩＥＷＶＫＱＲＰＧＨＧＬＥＷＩＧＥＩＬＰＧＳＧＳＴＮＹＮＥＫＦＫＧＫＡＴＦＴＡＤＴＳＳＮＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＧＧＤＹＤＥＥＹＹＶＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＩＶＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＳＡＳＳＳＶＳＹＭＹＷＹＱＱＫＰＧＳＳＰＲＬＬＩＹＤＴＳＮＬＡＳＧＶＰＶＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＲＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＹＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫＲ（配列番号５６）を含む、請求項１、２及び９〜１１のいずれかに記載の薬剤。
【請求項１３】
前記抗体は、
（ａ）アミノ酸配列ＳＳＹＷＩＥ（配列番号１）もしくはＧＹＴＦＳＳＹＷ（配列番号４０）を含む重鎖ＣＤＲ１、
（ｂ）アミノ酸配列ＷＩＧＥＩＬＰＧＳＧＳＴＮ（配列番号７８）もしくはＩＬＰＧＳＧＳＴ（配列番号４１）を含む重鎖ＣＤＲ２、及び／または
（ｃ）アミノ酸配列ＡＲＧＧＤＹＤＥＥＹＹＡＭＤ（配列番号４６）もしくはＡＲＧＧＤＹＤＥＥＹＹＡＭＤＹ（配列番号４７）を含む重鎖ＣＤＲ３、
あるいは、１個、２個、または３個のアミノ酸置換を含むこれらの配列のいずれかの変異体、を含む、請求項１または２に記載の薬剤。
【請求項１４】
前記抗体は、
（ａ）アミノ酸配列ＳＹＭＹＷＹ（配列番号４）もしくはＳＳＶＳＹ（配列番号４３）を含む軽鎖ＣＤＲ１、
（ｂ）アミノ酸配列ＬＬＩＹＤＴＳＮＬＡ（配列番号５）もしくはＤＴＳを含む軽鎖ＣＤＲ２、及び／または
（ｃ）アミノ酸配列ＱＱＷＳＳＹＰＬ（配列番号６）もしくはＱＱＷＳＳＹＰＬＴＦ（配列番号４８）を含む軽鎖ＣＤＲ３、
あるいは、１個、２個、または３個のアミノ酸置換を含むこれらの配列のいずれかの変異体、を含む、請求項１、２または１３に記載の薬剤。
【請求項１５】
前記抗体は、
アミノ酸配列
ＭＡＥＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＭＫＰＧＡＳＶＫＩＳＣＫＡＴＧＹＴＦＳＳＹＷＩＥＷＶＮＱＲＰＧＨＧＬＥＷＩＧＥＩＬＰＧＳＧＳＴＮＹＮＥＫＦＫＧＫＡＴＦＴＡＤＴＳＳＮＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＧＧＤＹＤＥＥＹＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＬ（配列番号５３）、
または、１個、２個、３個、４個、もしくは５個のアミノ酸置換を含むこの配列の変異体、を含む重鎖可変領域、
及び／あるいは
アミノ酸配列ＱＩＶＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＳＡＳＳＳＶＳＹＭＹＷＹＱＱＫＰＧＳＳＰＲＬＬＩＹＤＴＳＮＬＡＳＧＶＰ  ＶＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＲＭＥＡＥＤＧＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＹＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫＲ（配列番号５４）、
または、１個、２個、３個、４個、もしくは５個のアミノ酸置換を含むこの配列の変異体、を含む軽鎖可変領域、を含む、請求項１、２、１３及び１４のいずれかに記載の薬剤。
【請求項１６】
前記抗体は、ポリペプチド配列、
ＭＡＥＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＭＫＰＧＡＳＶＫＩＳＣＫＡＴＧＹＴＦＳＳＹＷＩＥＷＶＮＱＲＰＧＨＧＬＥＷＩＧＥＩＬＰＧＳＧＳＴＮＹＮＥＫＦＫＧＫＡＴＦＴＡＤＴＳＳＮＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＧＧＤＹＤＥＥＹＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＬＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＩＶＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＳＡＳＳＳＶＳＹＭＹＷＹＱＱＫＰＧＳＳＰＲＬＬＩＹＤＴＳＮＬＡＳＧＶＰＶＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＲＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＹＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫＲ（配列番号５７）を含む、請求項１、２及び１３〜１５のいずれかに記載の薬剤。
【請求項１７】
前記抗体は、前記ＣＬＥＣ１４Ａポリペプチドへの特異的結合について請求項３〜１６のいずれかに記載の抗体と競合する、請求項１または２に記載の薬剤。
【請求項１８】
前記ＣＬＥＣ１４Ａポリペプチドへの特異的結合についてＭＭＲＮ２と競合する、請求項１〜１７のいずれかに規定する、抗体。
【請求項１９】
任意選択的に抗体及び細胞毒性部分が融合されたポリペプチドであり、または任意選択的に抗体及び検出可能部分が融合されたポリペプチドである、請求項１８に記載の抗体及び細胞毒性部分または検出可能部分を含む、化合物。
【請求項２０】
請求項１８に記載の抗体または請求項１９に記載の化合物をコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項２１】
以下のヌクレオチド配列、
（ｉ）ＡＧＴＡＧＣＴＡＣＴＧＧＡＴＡＧＡＧ（配列番号９）、
（ｉｉ）ＴＧＧＡＴＴＧＧＡＧＡＧＡＴＴＴＴＡＣＣＴＧＧＡＡＧＴＧＧＴＡＧＴＡＣＴＡＡＴ（配列番号１０）、
（ｉｉｉ）ＧＣＧＡＧＡＧＧＧＧＧＧＧＡＴＴＡＣＧＡＣＧＡＡＧＡＡＴＡＣＴＡＴＣＴＣＡＴＧＧＡＣ（配列番号１１）、
（ｉｖ）ＡＧＴＴＡＣＡＴＧＴＡＣＴＧＧＴＡＣ（配列番号１２）、
（ｖ）ＣＴＣＣＴＧＡＴＴＴＡＴＧＡＣＡＣＡＴＣＣＡＡＣＣＴＧＧＣＴ（配列番号１３）、及び
（ｖｉ）ＣＡＧＣＡＧＴＧＧＡＧＴＡＧＴＴＡＣＣＣＧＣＴＣ（配列番号１４）、
（ｖｉｉ）ＧＧＣＴＡＣＡＣＡＴＴＣＡＧＴＡＧＣＴＡＣＴＧＧ（配列番号６０）
（ｖｉｉｉ）ＡＴＴＴＴＡＣＣＴＧＧＡＧＴＧＧＴＡＧＴＡＣＴ（配列番号６１）
（ｉｘ）ＧＣＧＡＧＡＧＧＧＧＧＧＧＡＴＴＡＣＧＡＣＧＡＡＧＡＡＴＡＣＴＡＴＣＴＣＡＴＧＧＡＣＴＡＣ（配列番号６２）
（ｘ）ＴＣＡＡＧＴＧＴＡＡＧＴＴＡＣ（配列番号６３）
（ｘｉ）ＧＡＣＡＣＡＴＣＣ
（ｘｉｉ）ＣＡＧＣＡＧＴＧＧＡＧＴＡＧＴＴＡＣＣＣＧＣＴＣＡＣＧ（配列番号６４）
（ｘｉｉｉ）ＧＣＡＡＧＡＧＧＧＧＧＧＧＡＴＴＡＣＧＡＣＧＡＡＧＡＡＴＡＣＴＡＴＧＴＣＡＴＧＧＡＣ（配列番号５８）
（ｘｉｖ）ＡＴＴＴＴＡＣＣＴＧＧＡＡＧＴＧＧＴＡＧＴＡＣＴ（配列番号６６）
（ｘｖ）ＧＣＡＡＧＡＧＧＧＧＧＧＧＡＴＴＡＣＧＡＣＧＡＡＧＡＡＴＡＣＴＡＴＧＣＴＡＴＧＧＡＣＴＡＣ（配列番号６５）
（ｘｖｉ）ＧＣＡＡＧＡＧＧＧＧＧＧＧＡＴＴＡＣＧＡＣＧＡＡＧＡＡＴＡＣＴＡＴＧＣＴＡＴＧＧＡＣ（配列番号５９）
（ｘｖｉｉ）ＡＴＴＴＴＡＣＣＴＧＧＡＡＧＴＧＧＴＡＧＴＡＣＴ（配列番号６６）
（ｘｖｉｉｉ）ＧＣＡＡＧＡＧＧＧＧＧＧＧＡＴＴＡＣＧＡＣＧＡＡＧＡＡＴＡＣＴＡＴＧＴＣＡＴＧＧＡＣＴＡＣ（配列番号６７）
（ｘｉｘ）ＣＡＧＣＡＧＴＧＧＡＧＴＡＧＴＴＡＣＣＣＧＣＴＣＡＣＧ（配列番号４６）
（ｘｘ）ＴＧＧＡＴＴＧＧＡＧＡＧＡＴＴＴＴＡＣＣＴＧＧＡＡＧＴＧＧＴＡＧＴＡＣＴ（配列番号７９）のうちの１つ以上を任意選択的に含む、請求項２０に記載の、抗体をコードするポリヌクレオチド。
【請求項２２】
ヌクレオチド配列ＡＴＧＧＣＣＣＡＧＧＴＴＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＡＧＴＣＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＣＴＧＡＴＧＡＡＧＣＣＴＧＧＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＡＧＡＴＡＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＡＣＴＧＧＣＴＡＣＡＣＡＴＴＣＡＧＴＡＧＣＴＡＣＴＧＧＡＴＡＧＡＧＴＧＧＧＴＡＡＡＣＣＧＧＡＧＧＣＣＴＧＧＡＣＡＴＧＧＣＣＴＴＧＡＧＴＧＧＡＴＴＧＧＡＧＡＧＡＴＴＴＴＡＣＣＴＧＧＡＡＧＴＧＧＴＡＧＴＡＣＴＡＡＴＴＡＣＡＡＴＧＡＧＡＡＧＴＴＣＡＡＧＧＧＣＡＡＧＧＣＣＡＣＡＴＴＣＡＣＴＧＣＡＧＡＴＡＣＡＴＣＣＴＣＣＡＡＴＡＣＡＧＣＣＴＡＣＡＴＧＣＡＡＣＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＣＡＣＡＴＣＴＧＡＧＧＡＣＴＣＴＧＣＣＧＴＣＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＧＡＧＧＧＧＧＧＧＡＴＴＡＣＧＡＣＧＡＡＧＡＡＴＡＣＴＡＴＣＴＣＡＴＧＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＡＧＧＣＡＣＣＡＣＴＣＴＣＡＣＡＧＴＣＴＣＣＴＣＡ（配列番号１５）または
ＡＴＧＧＣＣＣＡＧＧＴＴＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＡＧＴＣＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＣＴＧＡＴＧＡＡＧＣＣＴＧＧＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＡＧＡＴＡＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＡＣＴＧＧＣＴＡＣＡＣＡＴＴＣＡＧＴＡＧＣＴＡＣＴＧＧＡＴＡＧＡＧＴＧＧＧＴＡＡＡＣＣＧＧＡＧＧＣＣＴＧＧＡＣＡＴＧＧＣＣＴＴＧＡＧＴＧＧＡＴＴＧＧＡＧＡＧＡＴＴＴＴＡＣＣＴＧＧＡＡＧＴＧＧＴＡＧＴＡＣＴＡＡＴＴＡＣＡＡＴＧＡＧＡＡＧＴＴＣＡＡＧＧＧＣＡＡＧＧＣＣＡＣＡＴＴＣＡＣＴＧＣＡＧＡＴＡＣＡＴＣＣＴＣＣＡＡＴＡＣＡＧＣＣＴＡＣＡＴＧＣＡＡＣＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＣＡＣＡＴＣＴＧＡＧＧＡＣＴＣＴＧＴＣＧＴＣＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＧＡＧＧＧＧＧＧＧＡＴＴＡＣＧＡＣＧＡＡＧＡＡＴＡＣＴＡＴＣＴＣＡＴＧＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＡＧＧＣＡＣＣＡＣＴＣＴＣＡＣＡＧＴＣ（配列番号６８）を含む、請求項２０または２１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２３】
ヌクレオチド配列ＣＡＡＡＴＴＧＴＴＣＴＣＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＧＣＡＡＴＣＡＴＧＴＣＴＧＣＡＴＣＴＣＣＡＧＧＧＧＡＧＡＡＧＧＴＣＡＣＣＡＴＧＡＣＣＴＧＣＡＧＴＧＣＣＡＧＣＴＣＡＡＧＴＧＴＡＡＧＴＴＡＣＡＴＧＴＡＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＡＧＧＡＴＣＣＴＣＣＣＣＣＡＧＡＣＴＣＣＴＧＡＴＴＴＡＴＧＡＣＡＣＡＴＣＣＡＡＣＣＴＧＧＣＴＴＣＴＧＧＡＧＴＣＣＣＴＧＴＴＣＧＣＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＧＴＣＴＧＧＧＡＣＣＴＣＴＴＡＣＴＣＴＣＴＣＡＣＡＡＴＣＡＧＣＣＧＡＡＴＧＧＡＧＧＣＴＧＡＡＧＡＴＧＣＴＧＣＣＡＣＴＴＡＴＴＡＣＴＧＣＣＡＧＣＡＧＴＧＧＡＧＴＡＧＴＴＡＣＣＣＧＣＴＣＡＣＧＴＴＣＧＧＴＧＣＴＧＧＧＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＡＡＴＣＡＡＡＣＧＴＧＣＧＧＣＣＧＣ（配列番号１６）または
ＣＡＡＡＴＴＧＴＴＣＴＣＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＧＣＡＡＴＣＡＴＧＴＣＴＧＣＡＴＣＴＣＣＡＧＧＧＧＡＧＡＡＧＧＴＣＡＣＣＡＴＧＡＣＣＴＧＣＡＧＴＧＣＣＡＧＣＴＣＡＡＧＴＧＴＡＡＧＴＴＡＣＡＴＧＴＡＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＡＧＧＡＴＣＣＴＣＣＣＣＣＡＧＡＣＴＣＣＴＧＡＴＴＴＡＴＧＡＣＡＣＡＴＣＣＡＡＣＣＴＧＧＣＴＴＣＴＧＧＡＧＴＣＣＣＴＧＴＴＣＧＣＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＧＴＣＴＧＧＧＡＣＣＴＣＴＴＡＣＴＣＴＣＴＣＡＣＡＡＴＣＡＧＣＣＧＡＡＴＧＧＡＧＧＣＴＧＡＡＧＡＴＧＣＴＧＣＣＡＣＴＴＡＴＴＡＣＴＧＣＣＡＧＣＡＧＴＧＧＡＧＴＡＧＴＴＡＣＣＣＧＣＴＣＡＣＧＴＴＣＧＧＴＧＣＴＧＧＧＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＡＡＴＣＡＡＡＣＧＴ（配列番号６９）を含む、請求項２０〜２２のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
【請求項２４】
ヌクレオチド配列ＡＴＧＧＣＣＣＡＧＧＴＴＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＡＧＴＣＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＣＴＧＡＴＧＡＡＧＣＣＴＧＧＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＡＧＡＴＡＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＡＣＴＧＧＣＴＡＣＡＣＡＴＴＣＡＧＴＡＧＣＴＡＣＴＧＧＡＴＡＧＡＧＴＧＧＧＴＡＡＡＣＣＧＧＡＧＧＣＣＴＧＧＡＣＡＴＧＧＣＣＴＴＧＡＧＴＧＧＡＴＴＧＧＡＧＡＧＡＴＴＴＴＡＣＣＴＧＧＡＡＧＴＧＧＴＡＧＴＡＣＴＡＡＴＴＡＣＡＡＴＧＡＧＡＡＧＴＴＣＡＡＧＧＧＣＡＡＧＧＣＣＡＣＡＴＴＣＡＣＴＧＣＡＧＡＴＡＣＡＴＣＣＴＣＣＡＡＴＡＣＡＧＣＣＴＡＣＡＴＧＣＡＡＣＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＣＡＣＡＴＣＴＧＡＧＧＡＣＴＣＴＧＣＣＧＴＣＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＧＡＧＧＧＧＧＧＧＡＴＴＡＣＧＡＣＧＡＡＧＡＡＴＡＣＴＡＴＣＴＣＡＴＧＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＡＧＧＣＡＣＣＡＣＴＣＴＣＡＣＡＧＴＣＴＣＣＴＣＡ（配列番号１５）もしくは
ＡＴＧＧＣＣＣＡＧＧＴＴＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＡＧＴＣＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＣＴＧＡＴＧＡＡＧＣＣＴＧＧＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＡＧＡＴＡＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＡＣＴＧＧＣＴＡＣＡＣＡＴＴＣＡＧＴＡＧＣＴＡＣＴＧＧＡＴＡＧＡＧＴＧＧＧＴＡＡＡＣＣＧＧＡＧＧＣＣＴＧＧＡＣＡＴＧＧＣＣＴＴＧＡＧＴＧＧＡＴＴＧＧＡＧＡＧＡＴＴＴＴＡＣＣＴＧＧＡＡＧＴＧＧＴＡＧＴＡＣＴＡＡＴＴＡＣＡＡＴＧＡＧＡＡＧＴＴＣＡＡＧＧＧＣＡＡＧＧＣＣＡＣＡＴＴＣＡＣＴＧＣＡＧＡＴＡＣＡＴＣＣＴＣＣＡＡＴＡＣＡＧＣＣＴＡＣＡＴＧＣＡＡＣＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＣＡＣＡＴＣＴＧＡＧＧＡＣＴＣＴＧＴＣＧＴＣＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＧＡＧＧＧＧＧＧＧＡＴＴＡＣＧＡＣＧＡＡＧＡＡＴＡＣＴＡＴＣＴＣＡＴＧＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＡＧＧＣＡＣＣＡＣＴＣＴＣＡＣＡＧＴＣ（配列番号６８）、
及び／または
ＣＡＡＡＴＴＧＴＴＣＴＣＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＧＣＡＡＴＣＡＴＧＴＣＴＧＣＡＴＣＴＣＣＡＧＧＧＧＡＧＡＡＧＧＴＣＡＣＣＡＴＧＡＣＣＴＧＣＡＧＴＧＣＣＡＧＣＴＣＡＡＧＴＧＴＡＡＧＴＴＡＣＡＴＧＴＡＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＡＧＧＡＴＣＣＴＣＣＣＣＣＡＧＡＣＴＣＣＴＧＡＴＴＴＡＴＧＡＣＡＣＡＴＣＣＡＡＣＣＴＧＧＣＴＴＣＴＧＧＡＧＴＣＣＣＴＧＴＴＣＧＣＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＧＴＣＴＧＧＧＡＣＣＴＣＴＴＡＣＴＣＴＣＴＣＡＣＡＡＴＣＡＧＣＣＧＡＡＴＧＧＡＧＧＣＴＧＡＡＧＡＴＧＣＴＧＣＣＡＣＴＴＡＴＴＡＣＴＧＣＣＡＧＣＡＧＴＧＧＡＧＴＡＧＴＴＡＣＣＣＧＣＴＣＡＣＧＴＴＣＧＧＴＧＣＴＧＧＧＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＡＡＴＣＡＡＡＣＧＴＧＣＧＧＣＣＧＣ（配列番号１６）もしくは
ＣＡＡＡＴＴＧＴＴＣＴＣＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＧＣＡＡＴＣＡＴＧＴＣＴＧＣＡＴＣＴＣＣＡＧＧＧＧＡＧＡＡＧＧＴＣＡＣＣＡＴＧＡＣＣＴＧＣＡＧＴＧＣＣＡＧＣＴＣＡＡＧＴＧＴＡＡＧＴＴＡＣＡＴＧＴＡＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＡＧＧＡＴＣＣＴＣＣＣＣＣＡＧＡＣＴＣＣＴＧＡＴＴＴＡＴＧＡＣＡＣＡＴＣＣＡＡＣＣＴＧＧＣＴＴＣＴＧＧＡＧＴＣＣＣＴＧＴＴＣＧＣＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＧＴＣＴＧＧＧＡＣＣＴＣＴＴＡＣＴＣＴＣＴＣＡＣＡＡＴＣＡＧＣＣＧＡＡＴＧＧＡＧＧＣＴＧＡＡＧＡＴＧＣＴＧＣＣＡＣＴＴＡＴＴＡＣＴＧＣＣＡＧＣＡＧＴＧＧＡＧＴＡＧＴＴＡＣＣＣＧＣＴＣＡＣＧＴＴＣＧＧＴＧＣＴＧＧＧＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＡＡＴＣＡＡＡＣＧＴ（配列番号６９）を含む、請求項２０〜２３のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
【請求項２５】
ヌクレオチド配列
ＡＴＧＧＣＣＧＡＧＧＴＴＣＡＧＣＴＴＣＡＧＣＡＧＴＣＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＣＴＧＡＴＧＡＡＧＣＣＴＧＧＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＡＧＡＴＡＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＡＣＴＧＧＣＴＡＣＡＣＡＴＴＣＡＧＴＡＧＣＴＡＣＴＧＧＡＴＡＧＡＧＴＧＧＧＴＡＡＡＧＣＡＧＡＧＧＣＣＴＧＧＡＣＡＴＧＧＣＣＴＴＧＡＧＴＧＧＡＴＴＧＧＡＧＡＧＡＴＴＴＴＡＣＣＴＧＧＡＡＧＴＧＧＴＡＧＴＡＣＴＡＡＴＴＡＣＡＡＴＧＡＧＡＡＧＴＴＣＡＡＧＧＧＣＡＡＧＧＣＣＡＣＡＴＴＣＡＣＴＧＣＡＧＡＴＡＣＡＴＣＣＴＣＣＡＡＣＡＣＡＧＣＣＴＡＣＡＴＧＣＡＡＣＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＣＡＴＣＴＧＡＧＧＡＣＴＣＴＧＣＣＧＴＣＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＡＡＧＡＧＧＧＧＧＧＧＡＴＴＡＣＧＡＣＧＡＡＧＡＡＴＡＣＴＡＴＧＴＣＡＴＧＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＡＧＧＡＡＣＣＴＣＡＧＴＣＡＣＴＧＴＣ（配列番号７０）、及び／または
ＣＡＡＡＴＴＧＴＴＣＴＣＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＧＣＡＡＴＣＡＴＧＴＣＴＧＣＡＴＣＴＣＣＡＧＧＧＧＡＧＡＡＧＧＴＣＡＣＣＡＴＧＡＣＣＴＧＣＡＧＴＧＣＣＡＧＣＴＣＡＡＧＴＧＴＡＡＧＴＴＡＣＡＴＧＴＡＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＡＧＧＡＴＣＣＴＣＣＣＣＣＡＧＡＣＴＣＣＴＧＡＴＴＴＡＴＧＡＣＡＣＡＴＣＣＡＡＣＣＴＧＧＣＴＴＣＴＧＧＡＧＴＣＣＣＴＧＴＴＣＧＣＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＧＴＣＴＧＧＧＡＣＣＴＣＴＴＡＣＴＣＴＣＴＣＡＣＡＡＴＣＡＧＣＣＧＡＡＴＧＧＡＧＧＣＴＧＡＡＧＡＴＧＣＴＧＣＣＡＣＴＴＡＴＴＡＣＴＧＣＣＡＧＣＡＧＴＧＧＡＧＴＡＧＴＴＡＣＣＣＧＣＴＣＡＣＧＴＴＣＧＧＴＧＣＴＧＧＧＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＡＡＡＣＧＴ（配列番号７１）を含む、請求項２０または２１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２６】
ヌクレオチド配列
ＡＴＧＧＣＣＧＡＧＧＴＴＣＡＧＣＴＴＣＡＧＣＡＧＴＣＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＣＴＧＡＴＧＡＡＧＣＣＴＧＧＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＡＧＡＴＡＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＡＣＴＧＧＣＴＡＣＡＣＡＴＴＣＡＧＴＡＧＣＴＡＣＴＧＧＡＴＡＧＡＧＴＧＧＧＴＡＡＡＴＣＡＧＡＧＧＣＣＴＧＧＡＣＡＴＧＧＣＣＴＴＧＡＧＴＧＧＡＴＴＧＧＡＧＡＧＡＴＴＴＴＡＣＣＴＧＧＡＡＧＴＧＧＴＡＧＴＡＣＴＡＡＴＴＡＣＡＡＴＧＡＧＡＡＧＴＴＣＡＡＧＧＧＣＡＡＧＧＣＣＡＣＡＴＴＣＡＣＴＧＣＡＧＡＴＡＣＡＴＣＣＴＣＣＡＡＣＡＣＡＧＣＣＴＡＣＡＴＧＣＡＡＣＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＣＡＴＣＴＧＡＧＧＡＣＴＣＴＧＣＣＧＴＣＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＡＡＧＡＧＧＧＧＧＧＧＡＴＴＡＣＧＡＣＧＡＡＧＡＡＴＡＣＴＡＴＧＣＴＡＴＧＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＡＧＧＡＡＣＣＴＣＡＧＴＣＡＣＣＣＴＣ（配列番号７２）、及び／または
ＣＡＡＡＴＴＧＴＴＣＴＣＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＧＣＡＡＴＣＡＴＧＴＣＴＧＣＡＴＣＴＣＣＡＧＧＧＧＡＧＡＡＧＧＴＣＡＣＣＡＴＧＡＣＣＴＧＣＡＧＴＧＣＣＡＧＣＴＣＡＡＧＴＧＴＡＡＧＴＴＡＣＡＴＧＴＡＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＡＧＧＡＴＣＣＴＣＣＣＣＣＡＧＡＣＴＣＣＴＧＡＴＴＴＡＴＧＡＣＡＣＡＴＣＣＡＡＣＣＴＧＧＣＴＴＣＴＧＧＡＧＴＣＣＣＴＧＴＴＣＧＣＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＧＴＣＴＧＧＧＡＣＣＴＣＴＴＡＣＴＣＴＣＴＣＡＣＡＡＴＣＡＧＣＣＧＡＡＴＧＧＡＧＧＣＴＧＡＡＧＡＴＧＣＴＧＣＣＡＣＴＴＡＴＴＡＣＴＧＣＣＡＧＣＡＧＴＧＧＡＧＴＡＧＴＴＡＣＣＣＧＣＴＣＡＣＧＴＴＣＧＧＴＧＣＴＧＧＧＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＡＡＡＣＧＴ（配列番号７３）を含む、請求項２０または２１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２７】
ヌクレオチド配列：ＡＴＧＧＣＣＣＡＧＧＴＴＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＡＧＴＣＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＣＴＧＡＴＧＡＡＧＣＣＴＧＧＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＡＧＡＴＡＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＡＣＴＧＧＣＴＡＣＡＣＡＴＴＣＡＧＴＡＧＣＴＡＣＴＧＧＡＴＡＧＡＧＴＧＧＧＴＡＡＡＣＣＧＧＡＧＧＣＣＴＧＧＡＣＡＴＧＧＣＣＴＴＧＡＧＴＧＧＡＴＴＧＧＡＧＡＧＡＴＴＴＴＡＣＣＴＧＧＡＡＧＴＧＧＴＡＧＴＡＣＴＡＡＴＴＡＣＡＡＴＧＡＧＡＡＧＴＴＣＡＡＧＧＧＣＡＡＧＧＣＣＡＣＡＴＴＣＡＣＴＧＣＡＧＡＴＡＣＡＴＣＣＴＣＣＡＡＴＡＣＡＧＣＣＴＡＣＡＴＧＣＡＡＣＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＣＡＣＡＴＣＴＧＡＧＧＡＣＴＣＴＧＴＣＧＴＣＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＧＡＧＧＧＧＧＧＧＡＴＴＡＣＧＡＣＧＡＡＧＡＡＴＡＣＴＡＴＣＴＣＡＴＧＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＡＧＧＣＡＣＣＡＣＴＣＴＣＡＣＡＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＧＴＧＧＡＧＧＣＧＧＴＴＣＡＧＧＣＧＧＡＧＧＴＧＧＣＴＣＴＧＧＣＧＧＴＧＧＣＧＧＡＴＣＧＣＡＡＡＴＴＧＴＴＣＴＣＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＧＣＡＡＴＣＡＴＧＴＣＴＧＣＡＴＣＴＣＣＡＧＧＧＧＡＧＡＡＧＧＴＣＡＣＣＡＴＧＡＣＣＴＧＣＡＧＴＧＣＣＡＧＣＴＣＡＡＧＴＧＴＡＡＧＴＴＡＣＡＴＧＴＡＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＡＧＧＡＴＣＣＴＣＣＣＣＣＡＧＡＣＴＣＣＴＧＡＴＴＴＡＴＧＡＣＡＣＡＴＣＣＡＡＣＣＴＧＧＣＴＴＣＴＧＧＡＧＴＣＣＣＴＧＴＴＣＧＣＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＧＴＣＴＧＧＧＡＣＣＴＣＴＴＡＣＴＣＴＣＴＣＡＣＡＡＴＣＡＧＣＣＧＡＡＴＧＧＡＧＧＣＴＧＡＡＧＡＴＧＣＴＧＣＣＡＣＴＴＡＴＴＡＣＴＧＣＣＡＧＣＡＧＴＧＧＡＧＴＡＧＴＴＡＣＣＣＧＣＴＣＡＣＧＴＴＣＧＧＴＧＣＴＧＧＧＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＡＡＴＣＡＡＡＣＧＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡ（配列番号７４）を含む、請求項２０または２１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２８】
ヌクレオチド配列：ＡＴＧＧＣＣＧＡＧＧＴＴＣＡＧＣＴＴＣＡＧＣＡＧＴＣＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＣＴＧＡＴＧＡＡＧＣＣＴＧＧＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＡＧＡＴＡＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＡＣＴＧＧＣＴＡＣＡＣＡＴＴＣＡＧＴＡＧＣＴＡＣＴＧＧＡＴＡＧＡＧＴＧＧＧＴＡＡＡＧＣＡＧＡＧＧＣＣＴＧＧＡＣＡＴＧＧＣＣＴＴＧＡＧＴＧＧＡＴＴＧＧＡＧＡＧＡＴＴＴＴＡＣＣＴＧＧＡＡＧＴＧＧＴＡＧＴＡＣＴＡＡＴＴＡＣＡＡＴＧＡＧＡＡＧＴＴＣＡＡＧＧＧＣＡＡＧＧＣＣＡＣＡＴＴＣＡＣＴＧＣＡＧＡＴＡＣＡＴＣＣＴＣＣＡＡＣＡＣＡＧＣＣＴＡＣＡＴＧＣＡＡＣＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＣＡＴＣＴＧＡＧＧＡＣＴＣＴＧＣＣＧＴＣＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＡＡＧＡＧＧＧＧＧＧＧＡＴＴＡＣＧＡＣＧＡＡＧＡＡＴＡＣＴＡＴＧＴＣＡＴＧＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＡＧＧＡＡＣＣＴＣＡＧＴＣＡＣＴＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＧＴＧＧＡＧＧＣＧＧＴＴＣＡＧＧＣＧＧＡＧＧＴＧＧＣＴＣＴＧＧＣＧＧＴＧＧＣＧＧＡＴＣＧＣＡＡＡＴＴＧＴＴＣＴＣＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＧＣＡＡＴＣＡＴＧＴＣＴＧＣＡＴＣＴＣＣＡＧＧＧＧＡＧＡＡＧＧＴＣＡＣＣＡＴＧＡＣＣＴＧＣＡＧＴＧＣＣＡＧＣＴＣＡＡＧＴＧＴＡＡＧＴＴＡＣＡＴＧＴＡＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＡＧＧＡＴＣＣＴＣＣＣＣＣＡＧＡＣＴＣＣＴＧＡＴＴＴＡＴＧＡＣＡＣＡＴＣＣＡＡＣＣＴＧＧＣＴＴＣＴＧＧＡＧＴＣＣＣＴＧＴＴＣＧＣＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＧＴＣＴＧＧＧＡＣＣＴＣＴＴＡＣＴＣＴＣＴＣＡＣＡＡＴＣＡＧＣＣＧＡＡＴＧＧＡＧＧＣＴＧＡＡＧＡＴＧＣＴＧＣＣＡＣＴＴＡＴＴＡＣＴＧＣＣＡＧＣＡＧＴＧＧＡＧＴＡＧＴＴＡＣＣＣＧＣＴＣＡＣＧＴＴＣＧＧＴＧＣＴＧＧＧＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＡＡＡＣＧＴ（配列番号７５）を含む、請求項２０または２１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２９】
ヌクレオチド配列：ＡＴＧＧＣＣＧＡＧＧＴＴＣＡＧＣＴＴＣＡＧＣＡＧＴＣＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＣＴＧＡＴＧＡＡＧＣＣＴＧＧＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＡＧＡＴＡＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＡＣＴＧＧＣＴＡＣＡＣＡＴＴＣＡＧＴＡＧＣＴＡＣＴＧＧＡＴＡＧＡＧＴＧＧＧＴＡＡＡＴＣＡＧＡＧＧＣＣＴＧＧＡＣＡＴＧＧＣＣＴＴＧＡＧＴＧＧＡＴＴＧＧＡＧＡＧＡＴＴＴＴＡＣＣＴＧＧＡＡＧＴＧＧＴＡＧＴＡＣＴＡＡＴＴＡＣＡＡＴＧＡＧＡＡＧＴＴＣＡＡＧＧＧＣＡＡＧＧＣＣＡＣＡＴＴＣＡＣＴＧＣＡＧＡＴＡＣＡＴＣＣＴＣＣＡＡＣＡＣＡＧＣＣＴＡＣＡＴＧＣＡＡＣＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＣＡＴＣＴＧＡＧＧＡＣＴＣＴＧＣＣＧＴＣＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＡＡＧＡＧＧＧＧＧＧＧＡＴＴＡＣＧＡＣＧＡＡＧＡＡＴＡＣＴＡＴＧＣＴＡＴＧＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＡＧＧＡＡＣＣＴＣＡＧＴＣＡＣＣＣＴＣＴＣＣＴＣＡＧＧＴＧＧＡＧＧＣＧＧＴＴＣＡＧＧＣＧＧＡＧＧＴＧＧＣＴＣＴＧＧＣＧＧＴＧＧＣＧＧＡＴＣＧＣＡＡＡＴＴＧＴＴＣＴＣＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＧＣＡＡＴＣＡＴＧＴＣＴＧＣＡＴＣＴＣＣＡＧＧＧＧＡＧＡＡＧＧＴＣＡＣＣＡＴＧＡＣＣＴＧＣＡＧＴＧＣＣＡＧＣＴＣＡＡＧＴＧＴＡＡＧＴＴＡＣＡＴＧＴＡＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＡＧＧＡＴＣＣＴＣＣＣＣＣＡＧＡＣＴＣＣＴＧＡＴＴＴＡＴＧＡＣＡＣＡＴＣＣＡＡＣＣＴＧＧＣＴＴＣＴＧＧＡＧＴＣＣＣＴＧＴＴＣＧＣＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＧＴＣＴＧＧＧＡＣＣＴＣＴＴＡＣＴＣＴＣＴＣＡＣＡＡＴＣＡＧＣＣＧＡＡＴＧＧＡＧＧＣＴＧＡＡＧＡＴＧＣＴＧＣＣＡＣＴＴＡＴＴＡＣＴＧＣＣＡＧＣＡＧＴＧＧＡＧＴＡＧＴＴＡＣＣＣＧＣＴＣＡＣＧＴＴＣＧＧＴＧＣＴＧＧＧＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＡＡＡＣＧＴ（配列番号７６）を含む、請求項２０または２１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３０】
請求項２０〜２９のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項３１】
請求項２０〜２９のいずれかに記載のポリヌクレオチド、または請求項３０に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項３２】
請求項１８に記載の抗体、または請求項２０〜２９のいずれかに記載のポリヌクレオチド、または請求項１９に記載の化合物、または請求項３０に記載のベクター、または請求項３１に記載の宿主細胞、ならびに薬学的に許容される担体、賦形剤、または希釈剤、を含む、薬学的組成物。
【請求項３３】
医薬品に使用するための、請求項３２に記載の薬学的組成物。
【請求項３４】
個体において血管新生の阻害に使用するための、請求項３２に記載の薬学的組成物。
【請求項３５】
請求項１８に記載の抗体、または請求項１９に記載の化合物を生成するための方法であって、請求項２０〜２９のいずれかに記載のポリヌクレオチドを発現させること含む、方法。
【請求項３６】
細胞毒性剤を個体の体内の血管系に標的化する際に使用するための、（ｉ）請求項１８に記載のＣＬＥＣ１４Ａポリペプチドに選択的に結合する抗体、及び（ｉｉ）細胞毒性部分を含む、薬学的組成物。
【請求項３７】
細胞毒性剤を個体の体内の血管系に標的化するための薬物の調製における、（ｉ）請求項１８に記載のＣＬＥＣ１４Ａポリペプチドに選択的に結合する抗体、及び（ｉｉ）細胞毒性部分、を含む化合物の使用。
【請求項３８】
個体における血管新生の阻害に使用するための、（ｉ）請求項１８に記載のＣＬＥＣ１４Ａポリペプチドに選択的に結合する抗体、及び（ｉｉ）細胞毒性部分を含む、薬学的組成物。
【請求項３９】
個体における血管新生を阻害するための薬物の調製における、（ｉ）請求項１８に記載のＣＬＥＣ１４Ａポリペプチドに選択的に結合する抗体、及び（ｉｉ）細胞毒性部分、を含む化合物の使用。
【請求項４０】
前記細胞毒性部分は、直接的細胞毒性化学療法剤、直接的細胞毒性ポリペプチド、プロドラッグを細胞毒性剤に変換することができる部分、放射線増感剤、直接的細胞毒性核酸、直接的もしくは間接的に細胞毒性ポリペプチドをコードする核酸分子、または放射性原子から選択される、請求項１９に記載の化合物、請求項３２〜３４、３６及び３８のいずれかに記載の薬学的組成物、請求項２０〜２９のいずれかに記載のポリヌクレオチド、請求項３０に記載のベクター、請求項３１に記載の宿主細胞。
【請求項４１】
前記細胞毒性部分は、直接的細胞毒性化学療法剤、直接的細胞毒性ポリペプチド、プロドラッグを細胞毒性剤に変換することができる部分、放射線増感剤、直接的細胞毒性核酸、直接的もしくは間接的に細胞毒性ポリペプチドをコードする核酸分子、または放射性原子から選択される、請求項３５に記載の方法、または請求項３７または３９に記載の使用。
【請求項４２】
前記放射性原子は、リン３２、ヨウ素１２５、ヨウ素１３１、インジウム１１１、レニウム１８６、レニウム１８８、またはイットリウム９０である、請求項４０に記載の化合物、または薬学的組成物、またはポリヌクレオチド、またはベクター、または宿主細胞。
【請求項４３】
前記放射性原子は、リン３２、ヨウ素１２５、ヨウ素１３１、インジウム１１１、レニウム１８６、レニウム１８８、またはイットリウム９０である、請求項４１に記載の方法または使用。
【請求項４４】
前記抗体がＣＬＥＣ１４ＡポリペプチドのＣ型レクチンドメイン（残基３２〜１７３）に、アミノ酸残基９７〜１０８にわたる領域において選択的に結合し、
少なくとも１つのさらなる抗癌剤が個体に投与される、
好ましくはヒトである個体における血管新生の阻害において使用するための、
請求項１〜１７のいずれかに記載の薬剤、請求項３６、３８、４０及び４２のいずれかに記載の薬学的組成物、または請求項４０もしくは４２に記載の化合物、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞。
【請求項４５】
前記抗体がＣＬＥＣ１４ＡポリペプチドのＣ型レクチンドメイン（残基３２〜１７３）に、アミノ酸残基９７〜１０８にわたる領域において選択的に結合し、
少なくとも１つのさらなる抗癌剤が個体に投与される、好ましくはヒトである個体における血管新生の阻害において使用するための、請求項４１または４３に記載の方法。
【請求項４６】
少なくとも１つのさらなる抗癌剤が前記個体に投与される、請求項３７及び３９、４１および４３のいずれかに記載の使用。
【請求項４７】
前記抗体がＣＬＥＣ１４ＡポリペプチドのＣ型レクチンドメイン（残基３２〜１７３）に、アミノ酸残基９７〜１０８にわたる領域において選択的に結合する抗体であって、
好ましくはヒトである、少なくとも１つのさらなる抗癌剤及び／または少なくとも１つのさらなる抗血管新生剤を投与される個体における血管新生の阻害において使用するための、
請求項１〜１７及び４４のいずれかに記載の薬剤、請求項３６、３８、４０、４２及び４４のいずれかに記載の薬学的組成物、または請求項４０、４２及び４４のいずれかに記載の化合物、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞。
【請求項４８】
前記抗体がＣＬＥＣ１４ＡポリペプチドのＣ型レクチンドメイン（残基３２〜１７３）に、アミノ酸残基９７〜１０８にわたる領域において選択的に結合する抗体であって、
好ましくはヒトである、少なくとも１つのさらなる抗癌剤及び／または少なくとも１つのさらなる抗血管新生剤を投与される個体における血管新生の阻害において使用するための、請求項４１、４３および４５のいずれかに記載の方法。
【請求項４９】
前記個体が、少なくとも１つのさらなる抗癌剤及び／または少なくとも１つのさらなる抗血管新生剤を投与される個体である、請求項３７、３９、４１、４３及び４６のいずれかに記載の使用。
【請求項５０】
前記少なくとも１つのさらなる抗癌剤は、シスプラチン、カルボプラチン、５−フルロウラシル（ｆｌｕｒｏｕｒａｃｉｌ）；パクリタキセル；マイトマイシンＣ；ドキソルビシン；ゲムシタビン；トムデックス；ペメトレキセド；メトトレキサート；イリノテカン、フルオロウラシル、及びロイコボリン；オキサリプラチン、５−フルオロウラシル、及びロイコボリン；ならびにパクリタキセル及びカルボプラチンから選択され、かつ／または前記少なくとも１つのさらなる抗血管新生剤は、ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標））である、請求項４４または４７に記載の薬剤、薬学的組成物、化合物、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞。
【請求項５１】
前記少なくとも１つのさらなる抗癌剤は、シスプラチン、カルボプラチン、５−フルロウラシル（ｆｌｕｒｏｕｒａｃｉｌ）；パクリタキセル；マイトマイシンＣ；ドキソルビシン；ゲムシタビン；トムデックス；ペメトレキセド；メトトレキサート；イリノテカン、フルオロウラシル、及びロイコボリン；オキサリプラチン、５−フルオロウラシル、及びロイコボリン；ならびにパクリタキセル及びカルボプラチンから選択され、かつ／または前記少なくとも１つのさらなる抗血管新生剤は、ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標））である、請求項４５または４８に記載の方法。
【請求項５２】
前記少なくとも１つのさらなる抗癌剤は、シスプラチン、カルボプラチン、５−フルロウラシル（ｆｌｕｒｏｕｒａｃｉｌ）；パクリタキセル；マイトマイシンＣ；ドキソルビシン；ゲムシタビン；トムデックス；ペメトレキセド；メトトレキサート；イリノテカン、フルオロウラシル、及びロイコボリン；オキサリプラチン、５−フルオロウラシル、及びロイコボリン；ならびにパクリタキセル及びカルボプラチンから選択され、かつ／または前記少なくとも１つのさらなる抗血管新生剤は、ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標））である、請求項４６または４９に記載の使用。
【請求項５３】
個体の体内の新生血管系の画像化において使用するための、
（ｉ）請求項１８に記載のＣＬＥＣ１４Ａポリペプチドに選択的に結合する抗体、及び（ｉｉ）前記体内で画像化される検出可能な部分、を含む化合物を含む、薬学的組成物。
【請求項５４】
前記個体における前記化合物の位置が検出される、請求項５３に記載の薬学的組成物。
【請求項５５】
前記検出可能な部分は、ヨウ素１２３、ヨウ素１３１、インジウム１１１、フッ素１９、炭素１３、窒素１５、酸素１７、テクネチウム９９ｍ、ガドリニウム、マンガン、または鉄を含む、請求項５３または５４に記載の薬学的組成物。
【請求項５６】
好ましくはヒトである個体において、癌、乾癬、月経過多、子宮内膜症、関節炎（炎症性及びリウマチ性の両方）、黄斑変性症、パジェット病、網膜症及びその血管合併症（増殖性網膜症及び未熟児網膜症、ならびに糖尿病性網膜症を含む）、良性血管増殖、線維症、肥満症、及び炎症からなる群から選択される疾患または状態と闘うために使用するための、ＣＬＥＣ１４ＡポリペプチドのＣ型レクチンドメイン（残基３２〜１７３）に、アミノ酸残基９７〜１０８にわたる領域において選択的に結合し、ＣＬＥＣ１４ＡとＭＭＲＮ２との間の相互作用を阻害する抗体を含む、薬剤。
【請求項５７】
抗体が、請求項２〜１７に規定されたものである、請求項５６に記載の薬剤。
【請求項５８】
前記抗体がＣＬＥＣ１４ＡポリペプチドのＣ型レクチンドメイン（残基３２〜１７３）に、アミノ酸残基９７〜１０８にわたる領域において選択的に結合する抗体であって、
好ましくはヒトであり、固形腫瘍を有する個体において血管新生の阻害に使用するための、請求項１〜１７、４４、４７及び５０のいずれかに記載の薬剤、請求項３４、３６、３８、４０、４２、４４、４７、５０及び５３〜５５のいずれかに記載の薬学的組成物、請求項４０、４２、４４、４７及び５０のいずれかに記載の化合物、または請求項４０、４２、４４、４７及び５０のいずれかに記載のポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞。
【請求項５９】
前記抗体がＣＬＥＣ１４ＡポリペプチドのＣ型レクチンドメイン（残基３２〜１７３）に、アミノ酸残基９７〜１０８にわたる領域において選択的に結合する抗体であって、
好ましくはヒトであり、固形腫瘍を有する個体において血管新生の阻害に使用するための、請求項４１、４３、４５、４８及び５１のいずれかに記載の方法。
【請求項６０】
前記個体は、固形腫瘍を有する、請求項５６又は５７に記載の薬剤。
【請求項６１】
前記個体は、固形腫瘍を有する、請求項３７、３９、４６、４９及び５２のいずれかに記載の使用。
【請求項６２】
前記固形腫瘍は、結腸、直腸、卵巣、肝臓、膀胱、前立腺、乳房、腎臓、膵臓、胃、食道、肺、または甲状腺の腫瘍である、請求項５８に記載の薬剤、薬学的組成物、化合物、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞。
【請求項６３】
前記固形腫瘍は、結腸、直腸、卵巣、肝臓、膀胱、前立腺、乳房、腎臓、膵臓、胃、食道、肺、または甲状腺の腫瘍である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６４】
前記固形腫瘍は、結腸、直腸、卵巣、肝臓、膀胱、前立腺、乳房、腎臓、膵臓、胃、食道、肺、または甲状腺の腫瘍である、請求項６０に記載の薬剤。
【請求項６５】
前記固形腫瘍は、結腸、直腸、卵巣、肝臓、膀胱、前立腺、乳房、腎臓、膵臓、胃、食道、肺、または甲状腺の腫瘍である、請求項６１に記載の使用。
【請求項６６】
前記固形腫瘍は、肺腫瘍ではない、請求項５８または６２に記載の薬剤、薬学的組成物、化合物、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞。
【請求項６７】
前記固形腫瘍は、肺腫瘍ではない、請求項５９または６３に記載の方法。
【請求項６８】
前記固形腫瘍は、肺腫瘍ではない、請求項６０または６４に記載の薬剤。
【請求項６９】
前記固形腫瘍は、肺腫瘍ではない、請求項６１または６５に記載の使用。
【請求項７０】
前記固形腫瘍は、直腸腫瘍ではない、請求項５８、６２及び６６のいずれかに記載の薬剤、薬学的組成物、化合物、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞。
【請求項７１】
前記固形腫瘍は、直腸腫瘍ではない、請求項５９、６３及び６７のいずれかに記載の方法。
【請求項７２】
前記固形腫瘍は、直腸腫瘍ではない、請求項６０、６４及び６８のいずれかに記載の薬剤。
【請求項７３】
前記固形腫瘍は、直腸腫瘍ではない、請求項６１、６５及び６９のいずれかに記載の使用。
【請求項７４】
血管新生を阻害するエクスビボ法であって、ＣＬＥＣ１４ＡとＭＭＲＮ２との間の相互作用を阻害する抗体を、内皮細胞にまたは血管新生モデルにエクスビボで投与することを含み、前記抗体がＣＬＥＣ１４ＡポリペプチドのＣ型レクチンドメイン（残基３２〜１７３）に、アミノ酸残基９７〜１０８にわたる領域において選択的に結合する、方法。
【請求項７５】
前記ＣＬＥＣ１４ＡとＭＭＲＮ２との間の相互作用を阻害する抗体は、請求項２〜１７のいずれかに定義される、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記ＣＬＥＣ１４ＡとＭＭＲＮ２との間の相互作用を阻害する抗体は、請求項２〜１７のいずれかに定義される、請求項５６に記載の薬剤。
【請求項７７】
血管新生を調節する際もしくは癌と闘う際に有用であり得る抗体、または血管新生を調節する際もしくは癌と闘う際に有用であり得る抗体のリード化合物を同定する方法であって、
ＣＬＥＣ１４Ａのアミノ酸残基９７〜１０８を含む、ＣＬＥＣ１４Ａの一部分を提供することと、
候補抗体を提供することと、
前記候補抗体が、ＣＬＥＣ１４Ａの一部分の、ＭＭＲＮ２への結合を調節するかどうかを決定すること、を含む、方法。
【請求項７８】
血管新生アッセイにおいて前記候補抗体を試験するステップをさらに含む、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記血管新生アッセイは、冠動脈リングアッセイ、スポンジ血管新生アッセイ、内皮細胞増殖のアッセイ、内皮細胞遊走のアッセイ、及び／または内皮細胞浸潤のアッセイである、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記同定された抗体は修飾され、前記修飾された抗体は、ＣＬＥＣ１４Ａの一部分の、ＭＭＲＮ２またはＣＬＥＣ１４Ａに結合することができるＭＭＲＮ２の一部分への結合を調節する能力について試験される、請求項７７〜７９のいずれかに記載の方法。
【請求項８１】
前記同定された抗体または前記修飾された抗体は、固形腫瘍の動物モデルにおいて有効性について試験される、請求項７７〜８０のいずれかに記載の方法。
【請求項８２】
前記同定された抗体もしくは前記修飾された抗体を、合成、精製、及び／または製剤化するステップをさらに含む、請求項７７〜８１のいずれかに記載の方法。
【請求項８３】
固形腫瘍の治療において有用であり得る抗癌化合物を調製するための方法であって、請求項７７〜８２のいずれかに記載の方法を用いて抗体を同定すること、ならびに前記同定された抗体を合成、精製、及び／または製剤化することを含む、方法。
【請求項８４】
請求項７７〜８３のいずれかに記載の方法を用いて同定された前記抗体を、薬学的に許容される担体、賦形剤、または希釈剤と混合することを含む、薬学的組成物を作製する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して、内皮特異的遺伝子及びポリペプチド、血管新生を阻害するため及び他の疾患と戦うためのこれらの内皮特異的遺伝子／ポリペプチドの阻害剤、ならびに新生血管系を画像化及び標的化するためのこれらのポリペプチドに結合する抗体の使用に関する。特に、本発明は、ＣＬＥＣ１４Ａ、ＣＬＥＣ１４Ａに対する抗体、及び抗体を含む、ＣＬＥＣ１４ＡとＭＭＲＮ２との間の相互作用を阻害する薬剤の使用に関する。
【０００２】
内皮は、多くの生理的及び病理学的プロセスにおいて中心的役割を果たし、非常に活性の高い転写部位であることが知られている。約１，０００種類の異なる遺伝子が内皮細胞で発現されるが、それらの多くは内皮細胞に特異的ではない。対照的に、赤血球細胞は８種類、血小板は２２種類、また平滑筋は１２７種類の異なる遺伝子を発現することが明らかになっている（Ａｄａｍｓ  ｅｔ  ａｌ（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ  ３７７（６５４７  Ｓｕｐｐｌ）：３−１７４）。既知の内皮特異的遺伝子は、基礎研究及び臨床コミュニティの両方から大きな注目を集めている。例えば、内皮特異的なチロシンキナーゼＴｉｅ、ＴＩＥ２／ＴＥＫ、ＫＤＲ、及びｆｌｔ１は、血管の完全性、内皮によって媒介される炎症性プロセス、及び血管新生の制御において重要な役割を果たす。
【０００３】
内皮細胞は、全ての血管の内側を覆う単一の細胞層を形成し、血流と周辺組織との間の交換を制御する。新しい血管は、血管新生と称されるプロセスにおける内皮細胞の伸長によって既存の小血管の壁から発生する。内皮細胞は、培養液中で単離されたときに中空の毛細管を形成する能力さえ有する。いったん、血管系が完全に発達すると、血管の内皮細胞は、通常、静止状態に留まり、自然な創傷治癒における新しい血管の形成を除いて新しい血管は形成されない。しかしながら、一部の腫瘍は、新しい毛細血管新芽を構築するように近傍の内皮細胞を刺激する因子を分泌することによって新しい血液供給を誘導する。血管新生は、固形腫瘍の進行において主要な役割を果たし、固形腫瘍の増殖における律速過程として広く認識されている。血液供給を誘導できない腫瘍は、それらの増殖が大幅に制限される。したがって、不適切なまたは望ましくない血管新生を阻害する能力は、固形腫瘍の治療において有用であり得る。
【０００４】
新しい血管の発生は、局所的な腫瘍進行及び遠隔転移の発生の両方に不可欠である。実際に、腫瘍の増殖及び生存は、それらが血液供給を得る能力に依存し、腫瘍内皮に加えられる損傷は、腫瘍を効果的に絶滅させることが示されている（Ｂｕｒｒｏｗｓ  ｅｔ  ａｌ（１９９３）「Ｅｒａｄｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌａｒｇｅ  ｓｏｌｉｄ  ｔｕｍｏｒｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｗｉｔｈ  ａｎ  ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ａｇａｉｎｓｔ  ｔｕｍｏｒ  ｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ．」Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９０（１９）：８９９６−９０００）。腫瘍血管新生は、活性化組織または循環内皮前駆体による基底膜の分解、内皮細胞の増殖及び移動、細胞外マトリックスとの相互作用、形態学的分化、細胞接着、及び脈管形成を含む。したがって、腫瘍血管新生の阻害は、抗腫瘍療法の標的であり、血管新生阻害剤が単独でまたは標準的な癌治療と組み合わせて用いられる。しかしながら、抗腫瘍剤を血管新生の部位に標的化することは、腫瘍血管新生の特異的マーカーの同定に依存する。今では、固形腫瘍の増殖は、それらが血液供給を確保する能力に依存することが認められており、このプロセスを妨害する抗血管新生剤の開発に多大な努力が向けられている。また、確立された腫瘍血管系の標的破壊が治療機会を促すための別の手段であり、広範に発現される腫瘍内皮マーカーの発見が多大な臨床的利益を約束することも明らかになっている（Ｎｅｒｉ＆Ｂｉｃｋｎｅｌｌ（２００５）「Ｔｕｍｏｕｒ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ」Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ５（６）：４３６−４４６）。
【０００５】
本発明者は、ＣＬＥＣ１４Ａを腫瘍内皮マーカー（ＷＯ２０１１／０２７１３２）として以前に同定している。ＣＬＥＣ１４Ａは、血管に限定されるＣ型レクチンファミリー１４に属する１回膜貫通型糖タンパク質であり、他のメンバーとして、ＣＤ２４８／ＴＥＭ１／エンドシアリン、トロンボモジュリン、及びＣＤ９３が挙げられる。ＣＬＥＣ１４Ａに関する入手可能なデータは、ＣＬＥＣ１４Ａのレベルまたは抗体をブロックする機能を操作することにより、内皮移動を制御することを示唆している（９〜１２及びＷＯ２０１１／０２７１３２）。
【０００６】
本発明者は、今回、ＣＬＥＣ１４Ａとマルチメリン２（ＭＭＲＮ２）との間の相互作用が血管新生において重要な役割を果たすことを発見した。ＭＭＲＮ２は、エミリンファミリーの内皮特異的マーカーであり、細胞外マトリックスの構成要素である（１４、１５）。ＭＭＲＮ２は、ＣＬＥＣ１４Ａの細胞外相互作用タンパク質として最近特定され、腫瘍血管系においてＣＬＥＣ１４Ａと共発現することが分かっている（１１）。しかしながら、本発明者らの知る限り、この相互作用の機能、特に血管新生におけるその役割は、以前は未知であった。
【０００７】
ＷＯ２０１３／１８７７２４は、ＣＬＥＣ１４Ａ抗体、具体的にはＣ型レクチンドメインに結合する抗体を開示している。しかしながら、該特許は、ＣＬＥＣ１４ＡとＭＭＲＮ２との間の相互作用を阻害する抗体については言及も提案もしておらず、また本発明者によって示されるように、Ｃ型レクチンドメインを標的とする全ての抗体がこの相互作用をブロックするわけではなく、また血管新生に対する阻害効果を有するわけではない。
【０００８】
したがって、現在の観察を考慮して、本発明者は、ＣＬＥＣ１４ＡとＭＭＲＮ２との間の相互作用を阻害する薬剤が、血管新生を阻害する上で及び癌等の疾患と闘う上で治療的に有用であると考える。
【０００９】
したがって、本発明の第一の態様は、個体における血管新生を阻害する方法であって、ＣＬＥＣ１４ＡとＭＭＮＲ２との間の相互作用を阻害する薬剤を個体に投与することを含む方法を提供する。
【００１０】
この態様はまた、個体における血管新生の阻害に使用するためのＣＬＥＣ１４ＡとＭＭＮＲ２との間の相互作用を阻害する薬剤も含む。本態様は、個体における血管新生を阻害するための薬物の調製における、ＣＬＥＣ１４ＡとＭＭＮＲ２との間の相互作用を阻害する薬剤の使用をさらに含む。
【００１１】
疑義を避けるために、本発明は、ＣＬＥＣ１４ＡとＭＭＲＮ２との間の相互作用を阻害する薬剤をインビトロまたはエクスビボで組織または細胞に投与することを含む、血管新生（例えば、腫瘍血管新生）を阻害するインビトロ法またはエクスビボ法も含むことも理解されたい。細胞は、確立された細胞株、または個体から単離された細胞であり得る。組織または細胞は、好ましくは哺乳動物の組織または細胞（例えば、内皮組織または細胞）であり、最も好ましくは、ヒト組織または細胞である。方法がエクスビボ法である場合、薬剤は、エクスビボで血管新生モデルに投与されてもよい。好適な血管新生アッセイとして、内皮細胞の増殖、遊走、及び浸潤に関するアッセイ、スポンジアッセイ、ならびに冠動脈リングアッセイが挙げられる。さらなる血管新生アッセイについては、以下及び実施例に記載する。
【００１２】
「血管新生を阻害する」には、血管新生の速度またはレベルを低下させるという意味が含まれる。低下は、血管新生の速度またはレベルの約１０％、または約２０％、または約３０％、または約４０％という低レベルの低下であってもよい。好ましくは、低下は、血管新生の速度またはレベルの約５０％、または約６０％、または約７０％、または約８０％の低下という中間レベルの低下である。より好ましくは、低下は、血管新生の速度またはレベルの約９０％、または約９５％、または約９９％、または約９９．９％という高レベルの低下である。最も好ましくは、阻害は、血管新生の排除または検出不能なレベルまでのその低下も含むことができる。血管新生の速度またはレベルを測定するための、ひいては抗体が血管新生を阻害するかどうか、及びどの程度まで阻害するかを決定するための方法及びアッセイは、当該技術分野で既知であり、実施例を含む本明細書にさらに詳細に記載される。
【００１３】
典型的には、阻害される血管新生は、腫瘍血管新生である。したがって、個体は、腫瘍血管新生を阻害することによって治療することができる固形腫瘍を有し得る、すなわち、固形腫瘍は新しい血管の生成と関連している。「腫瘍」という用語は、乳房、卵巣、肝臓、膀胱、前立腺、腎臓、膵臓、胃、食道、肺、及び甲状腺の腫瘍を含む全ての形態の腫瘍性細胞増殖を指すものとして理解されたい。特に、膵腫瘍の血管新生が阻害され得る。
【００１４】
典型的には、腫瘍は、望ましくない新生血管系形成に関連しており、ＣＬＥＣ１４ＡとＭＭＲＮ２との間の相互作用の阻害剤が、有用な範囲までこれを低減する。望ましくない新生血管系形成を低減することにより、腫瘍の進行を食い止めることができ、腫瘍サイズ及び増殖の臨床的に有用な減少、例えば、腫瘍サイズの減少または少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、または９０％の増殖率の低下をもたらし得る。したがって、腫瘍血管新生の阻害は、腫瘍を治療するために、例えば、腫瘍の（さらなる）増殖を防止するため、腫瘍の広がり（転移）を防止するため、または腫瘍のサイズを減少させるために使用することができる。腫瘍のサイズは、例えば、標的とされる腫瘍に特異的な適切な抗体を使用して、腫瘍を画像化することによって測定することができる。腫瘍画像化の方法は、当該技術分野で周知である。腫瘍の増殖率は、一定期間にわたって（例えば、治療が増殖率の低下を引き起こしたかどうかを決定するために、治療の前後に）腫瘍サイズを測定することによって決定することができる。
【００１５】
好ましくは、本発明の方法及び薬物は、ヒトを治療するために使用され、その場合、薬剤は、ヒトＣＬＥＣ１４ＡとヒトＭＭＲＮ２との間の相互作用の阻害剤である。しかしながら、本発明の方法及び薬物が非ヒト哺乳動物の治療用である場合、薬剤が他の種に由来するＣＬＥＣ１４ＡとＭＭＲＮ２との間の相互作用を阻害する薬剤であることが好ましいことを理解されたい。
【００１６】
ＣＬＥＣ１４Ａ
ＣＬＥＣ１４Ａ遺伝子（Ｃ型レクチンドメインファミリー１４、メンバーＡ）は、１４ｑ２１．１に位置し、以前はＣ１４ｏｒｆ２７、ＣＥＧ１、及びＥＧＦＲ５として知られていた。ＣＬＥＣ１４Ａは、５１ｋＤａの予測分子量を有する４９０アミノ酸残基ポリペプチドをコードする。ＣＬＥＣ１４Ａポリペプチドには、その天然に存在する変異体を含む、ヒトＣＬＥＣ１４Ａの遺伝子産物の意味が含まれる。ヒトＣＬＥＣ１４Ａポリペプチドは、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＰ＿７７８２３０に見られるアミノ酸配列、及びその天然に存在する変異体を含む。ＮＰ＿７７８２３０からのＣＬＥＣ１４Ａポリペプチド配列は、図９に示される（配列番号１７）。また、ウマ、イヌ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ラット、マウス、モルモット、または霊長類等の他の種に見られるＣＬＥＣ１４Ａオルソロガスも含まれる。
【００１７】
ヒトＣＬＥＣ１４Ａ  ｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡ配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ＿１７５０６０に見られ、図９に示される（配列番号１８）。ＮＭ＿１７５０６０からのこのｃＤＮＡのコード領域は、ヌクレオチド３４８〜ヌクレオチド１８２０であり、これも同様に図９に示される（配列番号１９）。
【００１８】
ＣＬＥＣ１４Ａは、残基１〜２１にシグナルペプチドを有するＩ型膜貫通タンパク質である。成熟ヒトポリペプチドは、４６９アミノ酸長（アミノ酸残基２２〜４９０）であり、３７５残基の細胞外領域（残基２２〜３９６）、膜貫通領域（残基３９７〜４２５）、及び細胞質領域（残基４２６〜４９０）を含有する。細胞外領域は、Ｃ型レクチン様ドメイン（残基３２〜１７３）及びＥＧＦ様領域（残基２４５〜２８７）を含有する。
【００１９】
ＭＭＲＮ２
ＭＭＲＮ２遺伝子は、１０ｑ２３．２に位置し、８８８アミノ酸残基ポリペプチドをコードする。ＭＭＲＮ２ポリペプチドには、その天然に存在する変異体を含む、ヒトＭＭＲＮ２の遺伝子産物の意味が含まれる。ヒトＭＭＲＮ２ポリペプチドは、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＸＰ＿００６７１８０３３に見られるアミノ酸配列、及びその天然に存在する変異体を含む。ＸＰ＿００６７１８０３３からのＭＭＲＮ２ポリペプチド配列は、図１０に示される（配列番号２０）。また、ウマ、イヌ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ラット、マウス、モルモット、または霊長類等の他の種に見られるＭＭＲＮ２オルソロガスも含まれる。
【００２０】
ヒトＭＭＲＮ２  ｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡ配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ＿０２４７５６．２に見られ、そのコード領域も同様に図１０に示される（配列番号２１）。
【００２１】
ＣＬＥＣ１４ＡとＭＭＲＮ２との間の相互作用を阻害する薬剤
ＣＬＥＣ１４ＡとＭＭＲＮ２との間の相互作用を阻害する薬剤には、薬剤の非存在下でのＣＬＥＣ１４ＡとＭＭＲＮ２との間の結合レベルと比較してＣＬＥＣ１４ＡとＭＭＲＮ２との間の結合レベルを低下させる薬剤の意味が含まれる。好ましくは、薬剤は、ＣＬＥＣ１４ＡとＭＭＲＮ２との間の結合レベルを少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％低下させる薬剤であり、より好ましくは、薬剤は、ＣＬＥＣ１４ＡとＭＭＲＮ２との間の結合レベルを少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％低下させる薬剤である。最も好ましくは、薬剤は、ＣＬＥＣ１４ＡとＭＭＲＮ２との間の結合レベルを検出不能なレベルまで低下させるか、またはＣＬＥＣ１４ＡとＭＭＲＮ２との間の結合を排除する薬剤である。
【００２２】
ＭＭＲＮ２に対するＣＬＥＣ１４Ａの結合を検出及び／または測定する（定量化する）ための好適な方法は、当業者には周知である。適切な方法の例として、プルダウン分析、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、表面プラズモン共鳴アッセイ、チップベースのアッセイ、免疫細胞蛍光染色、酵母２ハイブリッド法、及びファージディスプレイが挙げられ、これらは、当該技術分野で慣例的な方法であり、例えば、Ｐｌａｎｔ  ｅｔ  ａｌ（１９９５）Ａｎａｌｙｔ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，２２６（２），３４２−３４８．ａｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに記載されている。ＣＬＥＣ１４ＡとＭＭＲＮ２との間の結合を検出するための他の方法として、限外濾過とイオンスプレー質量分析／ＨＰＬＣ法との併用、または他の物理的及び分析的方法が挙げられる。例えば、当業者に周知の蛍光エネルギー共鳴移動（ＦＲＥＴ）法が使用されてもよく、その場合、２つの蛍光標識された実体（すなわち、ＣＬＥＣ１４Ａ及びＭＭＲＮ２またはその一部分または変異体）が互いに接近したときに蛍光標識の相互作用を測定することによって、それらの結合が測定され得る。
【００２３】
薬剤は、抗体、ポリペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド、ペプチド模倣体、天然物、炭水化物、アプタマー、または小分子のいずれであってもよい。薬剤が何であり得るかの具体的な例を以下に記載し、また好適な薬剤を同定するための方法については、本発明の後続の態様で取り上げる。
【００２４】
薬剤自体が、ＣＬＥＣ１４とＭＭＲＮ２との間の相互作用を直接的に（例えば、ＣＬＥＣ１４ＡまたはＭＭＲＮ２に結合することによって）阻害し得ることを理解されたい。
【００２５】
ＣＬＥＣ１４ＡとＭＭＲＮ２との間の相互作用を阻害するポリペプチド薬剤は、直接的に投与されてもよいか、または薬剤をコードするポリヌクレオチドの形態で投与されてもよいことを理解されたい。したがって、本明細書で使用される場合、文脈上別途要求されない限り、ＣＬＥＣ１４ＡとＭＭＲＮ２との間の相互作用を阻害する薬剤（薬剤はポリペプチドである）を個体に投与することには、阻害剤を直接的に投与するという意味、または阻害剤をコードするポリヌクレオチドを典型的にはベクターの形態で投与するという意味が含まれる。同様に、本明細書で使用される場合、文脈上別途要求されない限り、ポリペプチドであるＣＬＥＣ１４ＡとＭＭＲＮ２との間の相互作用を阻害する薬剤を含む薬物または組成物には、薬物または組成物が、薬剤自体を含むという意味、または薬剤をコードするポリヌクレオチドを含むという意味が含まれる。
【００２６】
疑義を避けるために、ＣＬＥＣ１４ＡとＭＭＲＮ２との間の相互作用を阻害する薬剤には、そのプロドラッグの意味も含まれる。例えば、薬剤は、いったん対象の体内に入ると、代謝されるかまたは別様にその活性形態に変換されるプロドラッグとして投与されてもよい。本出願において使用される「プロドラッグ」という用語は、親薬物と比較して活性が低く、酵素的に活性化されるか、またはより活性の高い親形態に変換されることが可能な前駆体型または誘導体型の薬学的に活性な物質を指す（例えば、Ｄ．Ｅ．Ｖ．Ｗｉｌｍａｎ  「Ｐｒｏｄｒｕｇｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ」  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  １４，３７５−３８２（６１５ｔｈ  Ｍｅｅｔｉｎｇ，Ｂｅｌｆａｓｔ  １９８６）及びＶ．Ｊ．Ｓｔｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．「Ｐｒｏｄｒｕｇｓ：Ａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒ．Ｂｏｒｃｈａｒｄｔ  ｅｔ  ａｌ（ｅｄ．）ｐａｇｅｓ  ２４７−２６７（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  １９８５）を参照されたい）。
【００２７】
抗体
好ましい実施形態において、薬剤は、ＣＬＥＣ１４ＡとＭＭＲＮ２との間の相互作用を阻害する抗体である。
【００２８】
抗体は、ＣＬＥＣ１４とＭＭＲＮ２との間の相互作用に直接的または間接的に関与するＣＬＥＣ１４Ａ及び／またはＭＭＲＮ２の領域に特異的に結合する抗体であってもよい。例えば、抗体は、ＣＬＥＣ１４ＡのＭＭＲＮ２結合部位に結合することができ、そのためＭＭＲＮ２の結合を直接的にブロックするか、または抗体は、それにもかかわらず安定な相互作用に必要とされるＭＭＲＮ２結合部位以外のＣＬＥＣ１４Ａの領域に結合してもよく、そのためＭＭＲＮ２への結合に間接的に影響を及ぼす。同様に、抗体は、ＭＭＲＮ２のＣＬＥＣ１４Ａ結合部位に結合することができ、ＣＬＥＣ１４Ａの結合を直接的にブロックするか、または抗体は、それにもかかわらず安定な相互作用に必要とされるＣＬＥＣ１４Ａ結合部位以外のＭＭＲＮ２の領域に結合することができ、そのためＣＬＥＣ１４Ａへの結合に間接的に影響を及ぼす。
【００２９】
腫瘍血管新生の阻害において特に活性な抗体が、抗癌治療薬として好ましく、それらは、当該技術分野で周知の後述の方法を用いてこの活性について選択され得る。
【００３０】
ＣＬＥＣ１４ＡもしくはＭＭＲＮ２、またはその特定の部分に結合する好適な抗体は、当該技術分野で長期にわたって確立された技術を用いて当業者によって作製され得る。モノクローナル抗体及び抗体断片の調製方法は、当該技術分野で周知であり、ハイブリドーマ技術（Ｋｏｈｌｅｒ＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）「Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｆｕｓｅｄ  ｃｅｌｌｓ  ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｏｆ  ｐｒｅｄｅｆｉｎｅｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ．Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７）；抗体ファージディスプレイ（Ｗｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ（１９９４）「Ｍａｋｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｂｙ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．」Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：４３３−４５５）；リボソームディスプレイ（Ｓｃｈａｆｆｉｔｚｅｌ  ｅｔ  ａｌ（１９９９）「Ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｄｉｓｐｌａｙ：ａｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｒｏｍ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ．」Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３１：１１９−１３５）；及び反復コロニーフィルタスクリーニング（Ｇｉｏｖａｎｎｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ（２００１）「Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉ−ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｒｏｍ  ａ  ｌａｒｇｅ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ  ｂｙ  ｃｏｌｏｎｙ  ｆｉｌｔｅｒ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ．」Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２９：Ｅ２７）を含む。さらに、本発明において使用するのに好適な抗体及び抗体断片は、例えば、以下の刊行物に記載される：「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ」，Ｈｕｒｒｅｌｌ（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９８２）；「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」，Ｈ．Ｚｏｌａ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９８７，ＩＳＢＮ：０−８４９３６−４７６−０；「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」１ｓｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｈａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ，Ｅｄｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８８．ＩＳＢＮ０−８７９６９−３１４−２；「Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｈａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ，Ｅｄｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９９．ＩＳＢＮ０−８７９６９−５４３−９；及び「Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」Ｓｔｅｆａｎ  Ｄｕｂｅｌ，Ｅｄ．，１ｓｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，−Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，２００７．ＩＳＢＮ：３−５２７−３１４５３−９。
【００３１】
ＣＬＥＣ１４ＡまたはＭＭＲＮ２に選択的に結合する抗体には、抗体分子が、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）等の無関係なポリペプチドに対するよりも高い親和性でＣＬＥＣ１４ＡまたはＭＭＲＮ２に結合するという意味が含まれる。好ましくは、抗体は、無関係なポリペプチドに対するよりも少なくとも５倍、または少なくとも１０倍、または少なくとも５０倍高い親和性でＣＬＥＣ１４ＡまたはＭＭＲＮ２に結合する。より好ましくは、抗体分子は、無関係なポリペプチドに対するよりも少なくとも１００倍、または少なくとも１，０００倍、または少なくとも１０，０００倍高い親和性でＣＬＥＣ１４ＡまたはＭＭＲＮ２に結合する。そのような結合は、当該技術分野で周知の方法、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムの１つによって決定され得る。
【００３２】
ＣＬＥＣ１４ＡまたはＭＭＲＮ２に選択的に結合する抗体は、関連ポリペプチド、例えば、ＣＬＥＣ１４Ａの場合はトロンボモジュリンもしくはＭＭＲＮ２の場合はマルチメリン１に結合しないこと、あるいは抗体分子は、関連ポリペプチド、例えば、ＣＬＥＣ１４Ａの場合はトロンボモジュリンもしくはＭＭＲＮ２の場合はマルチメリン１に対するよりも高い親和性でＣＬＥＣ１４ＡまたはＭＭＲＮ２に結合することが好ましい。好ましくは、抗体は、関連ポリペプチドに対するよりも少なくとも５倍、または少なくとも１０倍、または少なくとも５０倍高い親和性でＣＬＥＣ１４ＡまたはＭＭＲＮ２に結合する。より好ましくは、抗体分子は、関連ポリペプチドに対するよりも少なくとも１００倍、または少なくとも１，０００倍、または少なくとも１０，０００倍高い親和性でＣＬＥＣ１４ＡまたはＭＭＲＮ２に結合する。そのような結合は、当該技術分野で周知の方法、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムの１つによって決定され得る。
【００３３】
抗体が、ＣＬＥＣ１４ＡまたはＭＭＲＮ２に対して少なくとも１０−５Ｍ、１０−６Ｍ、もしくは１０−７Ｍ、またより好ましくは１０−８Ｍの親和性を有することが好ましいが、例えば１０−９Ｍまたはそれ以上のより高い親和性を有する抗体がさらにより好ましい場合がある。
【００３４】
特に好ましい実施形態において、抗体は、ＣＬＥＣ１４Ａポリペプチドに選択的に結合する抗体である。
【００３５】
典型的には、ＣＬＥＣ１４Ａに選択的に結合する抗体は、成熟ペプチド（残基２２〜４９０）に結合し、シグナルペプチド（残基１〜２１）には結合しない。好ましくは、ＣＬＥＣ１４Ａに選択的に結合する抗体は、ＣＬＥＣ１４Ａの細胞外領域（残基２２〜３９６）に結合する。抗体は、ＥＧＦ様領域（残基２４５〜２８７）に結合することができるが、抗体がＣ型レクチンドメイン（残基３２〜１７３）に結合することが好ましい。より好ましくは、抗体は、Ｃ型レクチンドメイン内のＣＬＥＣ１４Ａのアミノ酸残基９７〜１０８にわたる領域、すなわち、ＥＲＲＲＳＣＨＴＬＥＮＥ（配列番号３９）に結合する。
【００３６】
ＣＬＥＣ１４Ａポリペプチドに選択的に結合する抗体は、Ｃ型レクチンドメイン内のＣＬＥＣ１４ＡポリペプチドのＭＭＲＮ２結合領域に選択的に結合することが特に好ましい。したがって、抗体は、ＣＬＥＣ１４Ａポリペプチドへの特異的結合についてＭＭＮＲ２と競合する抗体であってもよい。所与の抗体が、ＭＭＲＮ２結合領域に選択的に結合するか、またはＣＬＥＣ１４Ａポリペプチドへの特異的結合についてＭＭＲＮ２と競合するかどうかは、エピトープマッピング、競合結合試験、及び実施例１に記載される他の方法等の当該技術分野で日常的な方法を用いて決定することができる。例えば、所与の抗体に対するＣＬＥＣ１４Ａの結合は、様々な濃度のＭＭＲＮ２を用いたプレインキュベーション後に評価することができる。
【００３７】
ある実施形態において、ＣＬＥＣ１４Ａポリペプチドに選択的に結合する抗体は、ＣＬＥＣ１４Ａのアミノ酸残基３１〜７２にわたる領域、及び／またはＣＬＥＣ１４Ａのアミノ酸残基３１〜９２にわたる領域、及び／またはＣＬＥＣＡのアミノ酸残基９２〜１７２にわたる領域、及び／またはＣＬＥＣ１４Ａのアミノ酸残基１１２〜１７２にわたる領域、及び／またはＣＬＥＣ１４Ａのアミノ酸残基１５２〜１７２にわたる領域には結合しない。抗体がこれらの領域のいずれかに結合するかどうかは、本明細書に記載される結合アッセイ、例えば、ＥＬＩＳＡを含む、当該技術分野で標準的な技術を用いて評価することができる。
【００３８】
別の実施形態において、抗体は、ＭＭＲＮ２ポリペプチドに選択的に結合する抗体である。したがって、抗体は、ＭＭＲＮ２ポリペプチドへの特異的結合についてＣＬＥＣ１４Ａと競合する抗体であってもよい。この実施形態において、抗体は、ＭＭＲＮ２ポリペプチドのＣＬＥＣ１４Ａ結合領域に選択的に結合することが好ましい。この場合も同様に、所与の抗体が、ＭＭＲＮ２ポリペプチドのＣＬＥＣ１４Ａ結合領域に結合するかどうか、またはＭＭＲＮ２ポリペプチドへの特異的結合についてＣＬＥＣ１４Ａと競合するかどうかは、エピトープマッピング、競合結合試験、及び実施例１に記載される他の方法等の当該技術分野で日常的な方法を用いて決定することができる。
【００３９】
ＣＬＥＣ１４ＡまたはＭＭＲＮ２の特異的部分に選択的に結合する抗体には、抗体が前述のような標的に選択的に結合するだけではなく、抗体分子はまた、その任意の他の部分に対するよりも高い親和性でＣＬＥＣ１４ＡまたはＭＭＲＮ２の特定の部分にも結合するという意味が含まれる。好ましくは、抗体は、ＣＬＥＣ１４ＡまたはＭＭＲＮ２上の任意の他のエピトープに対するよりも少なくとも２倍、または少なくとも５倍、または少なくとも１０倍、または少なくとも５０倍高い親和性で特定の部分に結合する。より好ましくは、抗体分子は、ＣＬＥＣ１４ＡまたはＭＭＲＮ２上の任意の他のエピトープに対するよりも少なくとも１００倍、または少なくとも１，０００倍、または少なくとも１０，０００倍高い親和性で特定の部分に結合する。そのような結合は、当該技術分野で周知の方法、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムの１つによって決定され得る。抗体は、ＣＬＥＣ１４ＡまたはＭＭＲＮ２上のそれらの標的エピトープに対して、少なくとも１０−７Ｍ、またはより好ましくは１０−８Ｍの親和性を有することが好ましいが、例えば、１０−９Ｍまたはそれ以上のより高い親和性を有する抗体がさらにより好ましい場合がある。好ましくは、抗体は、ＣＬＥＣ１４ＡまたはＭＭＲＮ２内の特定のエピトープに選択的に結合し、その中の任意の他のエピトープには結合しない。
【００４０】
好ましくは、抗体が個体に投与される場合、抗体は、個体内の任意の他の分子に対するよりも高い親和性で標的ＣＬＥＣ１４ＡもしくはＭＭＲＮ２またはその特定の部分に結合する。好ましくは、抗体は、個体の他の分子に対するよりも少なくとも２倍、または少なくとも５倍、または少なくとも１０倍、または少なくとも５０倍高い親和性でＣＬＥＣ１４ＡまたはＭＭＲＮ２（の特定の部分）に結合する。より好ましくは、薬剤は、個体の任意の他の分子に対するよりも少なくとも１００倍、または少なくとも１，０００倍、または少なくとも１０，０００倍高い親和性でＣＬＥＣ１４ＡまたはＭＭＲＮ２（特異的ドメインに）結合する。好ましくは、抗体分子は、体内の他のポリペプチドに著しく結合せずにＣＬＥＣ１４ＡまたはＭＭＲＮ２に選択的に結合する。
【００４１】
実施例１に記載されるように、本発明者は、ＣＬＥＣ１４Ａに特異的に結合し、かつＭＭＲＮ２に対するＣＬＥＣ１４Ａの結合を阻害する抗体を同定した。この抗体の可変重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列、ならびにそれらをコードするヌクレオチド配列が図１１に提供され、ＣＤＲの配列は太字で強調表示されている。ＣＤＲ領域は、任意の好適なアルゴリズムを用いて予測され得る。本明細書に開示されるＣＤＲ領域は、Ａｂｙｓｉｓアルゴリズム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｙｓｉｓ／ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿ｉｎｐｕｔ／ｋｅｙ＿ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ／ｋｅｙ＿ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ．ｃｇｉ）またはｗｗｗ．ＩＭＧＴ．ｏｒｇに見出すことができるＩＭＧＴアルゴリズム（ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ）を用いて予測された：例えば、Ｌｅｆｒａｎｃ  ｅｔ  ａｌ  ２００９  ＮＡＲ  ３７：Ｄ１００６−Ｄ１０１２及びＬｅｆｒａｎｃ  ２００３  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  １７：２６０−２６６を参照されたい。いずれかのアルゴリズムによって同定されたいずれのＣＤＲ領域も、本発明に使用するのに等しく好適であると考えられる。
【００４２】
したがって、本発明の第１の態様の一実施形態において、薬剤は、
（ａ）アミノ酸配列ＳＳＹＷＩＥ（配列番号１）もしくはＧＹＴＦＳＳＹＷ（配列番号４０）を含む重鎖ＣＤＲ１、
（ｂ）アミノ酸配列ＷＩＧＥＩＬＰＧＳＧＳＴ（配列番号２）もしくはＷＩＧＥＩＬＰＧＳＧＳＴＮ（配列番号７８）もしくはＩＬＰＧＳＧＳＴ（配列番号４１）を含む重鎖ＣＤＲ２、及び／または
（ｃ）アミノ酸配列ＡＲＧＧＤＹＤＥＥＹＹＬＭＤ（配列番号３）もしくはＡＲＧＧＤＹＤＥＥＹＹＬＭＤＹ（配列番号４２）を含む重鎖ＣＤＲ３、
あるいは、１個、２個、または３個のアミノ酸置換を含むこれらの配列のいずれかの変異体、を含む抗体である。
【００４３】
本発明の第１の態様のさらなる実施形態において、薬剤は、
（ａ）アミノ酸ＳＹＭＹＷＹ（配列番号４）もしくはＳＳＶＳＹ（配列番号４３）を含む軽鎖ＣＤＲ１、
（ｂ）アミノ酸配列ＬＬＩＹＤＴＳＮＬＡ（配列番号５）もしくはＤＴＳを含む軽鎖ＣＤＲ２、及び／または
（ｃ）アミノ酸ＱＱＷＳＳＹＰＬ（配列番号６）もしくはＱＱＷＳＳＹＰＬＴ（配列番号４４）を含む軽鎖ＣＤＲ３、
あるいは、１個、２個、または３個のアミノ酸置換を含むこれらの配列のいずれかの変異体、を含む抗体である。
【００４４】
本発明の第１の態様のなおもさらなる実施形態において、薬剤は、前述のような軽鎖及び重鎖ＣＤＲの両方を含む抗体であってもよい。例えば、抗体は、アミノ酸配列ＳＳＹＷＩＥ（配列番号１）を含む重鎖ＣＤＲ１；アミノ酸配列ＷＩＧＥＩＬＰＧＳＧＳＴ（配列番号２）を含む重鎖ＣＤＲ２、もしくはアミノ酸配列ＷＩＧＥＩＬＰＧＳＧＳＴＮ（配列番号７８）を含む重鎖ＣＤＲ２；アミノ酸配列ＡＲＧＧＤＹＤＥＥＹＹＬＭＤ（配列番号３）を含む重鎖ＣＤＲ３；アミノ酸配列ＳＹＭＹＷＹ（配列番号４）を含む軽鎖ＣＤＲ１；アミノ酸配列ＬＬＩＹＤＴＳＮＬＡ（配列番号５）を含む軽鎖ＣＤＲ２；及びアミノ酸配列ＱＱＷＳＳＹＰＬ（配列番号６）を含む軽鎖ＣＤＲ３、または１個、２個、もしくは３個のアミノ酸置換を含む該配列のいずれかの変異体を含んでもよいか；あるいは抗体は、アミノ酸配列ＧＹＴＦＳＳＹＷ（配列番号４０）を含む重鎖ＣＤＲ１；アミノ酸配列ＩＬＰＧＳＧＳＴ（配列番号４１）を含む重鎖ＣＤＲ２；アミノ酸配列ＡＲＧＧＤＹＤＥＥＹＹＬＭＤＹ（配列番号４２）を含む重鎖ＣＤＲ３；アミノ酸配列ＳＳＶＳＹ（配列番号４３）を含む軽鎖ＣＤＲ１；アミノ酸配列ＤＴＳを含む軽鎖ＣＤＲ２；及びアミノ酸配列ＱＱＷＳＳＹＰＬＴ（配列番号４４）を含む軽鎖ＣＤＲ３、または１個、２個、もしくは３個のアミノ酸置換を含む該配列のいずれかの変異体を含んでもよい。
【００４５】
本発明の第１の態様のさらなる実施形態において、薬剤は、
（ａ）アミノ酸配列ＳＳＹＷＩＥ（配列番号１）もしくはＧＹＴＦＳＳＹＷ（配列番号４０）を含む重鎖ＣＤＲ１、
（ｂ）アミノ酸配列ＷＩＧＥＩＬＰＧＳＧＳＴＮ（配列番号７８）もしくはＩＬＰＧＳＧＳＴ（配列番号４１）を含む重鎖ＣＤＲ２、及び／または
（ｃ）アミノ酸配列ＡＲＧＧＤＹＤＥＥＹＹＶＭＤ（配列番号７７）もしくはＡＲＧＧＤＹＤＥＥＹＹＶＭＤＹ（配列番号４５）を含む重鎖ＣＤＲ３、
あるいは、１個、２個、または３個のアミノ酸置換を含むこれらの配列のいずれかの変異体、を含む抗体である。
【００４６】
本発明の第１の態様のなおもさらなる実施形態において、薬剤は、前述のような軽鎖及び重鎖ＣＤＲの両方を含む抗体であってもよい。例えば、抗体は、アミノ酸配列（配列番号１）を含む重鎖ＣＤＲ１；アミノ酸配列（配列番号７８）を含む重鎖ＣＤＲ２；アミノ酸配列（配列番号７７）を含む重鎖ＣＤＲ３；アミノ酸配列（配列番号４）を含む軽鎖ＣＤＲ１；アミノ酸配列（配列番号５）を含む軽鎖ＣＤＲ２；及びアミノ酸配列（配列番号６）を含む軽鎖ＣＤＲ３、または１個、２個、もしくは３個のアミノ酸置換を含む該配列のいずれかの変異体を含んでもよいか；あるいは抗体は、アミノ酸配列（配列番号４０）を含む重鎖ＣＤＲ１；アミノ酸配列（配列番号４１）を含む重鎖ＣＤＲ２；アミノ酸配列（配列番号４５）を含む重鎖ＣＤＲ３；アミノ酸配列（配列番号４３）を含む軽鎖ＣＤＲ１；アミノ酸配列ＤＴＳを含む軽鎖ＣＤＲ２；及びアミノ酸配列（配列番号４４）を含む軽鎖ＣＤＲ３、または１個、２個、もしくは３個のアミノ酸置換を含む該配列のいずれかの変異体を含んでもよい。
【００４７】
本発明の第１の態様のなおもさらなる実施形態において、薬剤は、
（ａ）アミノ酸配列ＳＳＹＷＩＥ（配列番号１）もしくはＧＹＴＦＳＳＹＷ（配列番号４０）を含む重鎖ＣＤＲ１、
（ｂ）アミノ酸配列ＷＩＧＥＩＬＰＧＳＧＳＴＮ（配列番号７８）もしくはＩＬＰＧＳＧＳＴ（配列番号４１）を含む重鎖ＣＤＲ２、及び／または
（ｃ）アミノ酸配列ＡＲＧＧＤＹＤＥＥＹＹＡＭＤ（配列番号４６）もしくはＡＲＧＧＤＹＤＥＥＹＹＡＭＤＹ（配列番号４７）を含む重鎖ＣＤＲ３、
あるいは、１個、２個、または３個のアミノ酸置換を含むこれらの配列のいずれかの変異体、を含む抗体である。
【００４８】
本発明の第１の態様のさらなる実施形態において、薬剤は、
（ａ）アミノ酸ＳＹＭＹＷＹ（配列番号４）もしくはＳＳＶＳＹ（配列番号４３）を含む軽鎖ＣＤＲ１、
（ｂ）アミノ酸配列ＬＬＩＹＤＴＳＮＬＡ（配列番号５）もしくはＤＴＳを含む軽鎖ＣＤＲ２、及び／または
（ｃ）アミノ酸配列ＱＱＷＳＳＹＰＬ（配列番号６）もしくはＱＱＷＳＳＹＰＬＴＦ（配列番号４８）を含む軽鎖ＣＤＲ３、
あるいは、１個、２個、または３個のアミノ酸置換を含むこれらの配列のいずれかの変異体、を含む抗体である。
【００４９】
本発明の第１の態様のなおもさらなる実施形態において、薬剤は、前述のような軽鎖及び重鎖ＣＤＲの両方を含む抗体であってもよい。例えば、抗体は、アミノ酸配列（配列番号１）を含む重鎖ＣＤＲ１；アミノ酸配列（配列番号７８）を含む重鎖ＣＤＲ２；アミノ酸配列（配列番号４６）を含む重鎖ＣＤＲ３；アミノ酸配列（配列番号４）を含む軽鎖ＣＤＲ１；アミノ酸配列（配列番号５）を含む軽鎖ＣＤＲ２；及びアミノ酸配列（配列番号６）を含む軽鎖ＣＤＲ３、または１個、２個、もしくは３個のアミノ酸置換を含む該配列のいずれかの変異体を含んでもよいか；あるいは抗体は、アミノ酸配列（配列番号４０）を含む重鎖ＣＤＲ１；アミノ酸配列（配列番号４１）を含む重鎖ＣＤＲ２；アミノ酸配列（配列番号４７）を含む重鎖ＣＤＲ３；アミノ酸配列（配列番号４３）を含む軽鎖ＣＤＲ１；アミノ酸配列ＤＴＳを含む軽鎖ＣＤＲ２；アミノ酸配列（配列番号４８）を含む軽鎖ＣＤＲ３、または１個、２個、もしくは３個のアミノ酸置換を含む該配列のいずれかの変異体を含んでもよい。
【００５０】
疑義を避けるために、抗体の特定のＣＤＲ配列の変異体が言及される場合、定義される抗体のＣＤＲのうちの１つ以上が変異され得ることを理解されたい。したがって、抗体が軽鎖または重鎖ＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ１〜３）を含むと定義される場合、各々が特定の配列を有し、それらの特定の配列のうちの最大１つ、２つ、または３つが変異され得る等である。同様に、抗体が軽鎖及び重鎖ＣＤＲ（例えば、６個のＣＤＲ）を含むと定義される場合、各々が特定の配列を有し、それらの特定の配列のうちの最大１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つ全てが変異され得る。
【００５１】
本明細書に記載される特定の配列の変異体のいずれも、抗体の所望の活性、すなわち、ＣＬＥＣ１４Ａに対するその選択的な結合及び／またはＣＬＥＣ１４ＡとＭＭＮＲ２との間の相互作用を阻害するその能力に影響を及ぼすべきではないことを理解されたい。
【００５２】
ＣＬＥＣ１４Ａに対する選択的な結合に影響を及ぼさないとは、変異体は、本明細書に記載される特定の配列を有する抗体の結合親和性と実質的に同じかまたはより高い結合親和性をＣＬＥＣ１４Ａに対して有するべきであるという意味を含む。例えば、変異体は、本明細書に記載される特定のアミノ酸配列を有する抗体の結合親和性の少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、１０５％、１１０％、１１５％、１２０％、またはそれ以上を有してもよい。
【００５３】
ＣＬＥＣ１４ＡとＭＭＮＲ２との間の相互作用を阻害する能力に影響を及ぼさないとは、変異体は、本明細書に記載される特定の配列を有する抗体のＣＬＥＣ１４ＡとＭＭＮＲ２との間の相互作用を阻害する能力と実質的に同じかまたはより高いＣＬＥＣ１４ＡとＭＭＲＮ２との間の相互作用を阻害する能力を有するべきであるという意味を含む。例えば、変異体は、本明細書に記載される特定のアミノ酸配列を有する抗体のＣＬＥＣ１４ＡとＭＭＲＮ２との間の相互作用を阻害する能力の少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、１０５％、１１０％、１１５％、１２０％、またはそれ以上を有してもよい。
【００５４】
典型的には、本明細書に開示される変異体のアミノ酸置換が保存的アミノ酸置換であること、例えば、アミノ酸残基が、同様の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されていることが好ましい。保存的アミノ酸置換は、当該技術分野で周知であり、（元の残基←→置換）Ａｌａ（Ａ）←→Ｖａｌ，ＧｌｙまたはＰｒｏ；Ａｒｇ（Ｒ）←→ＬｙｓまたはＨｉｓ；Ａｓｎ（Ｎ）←→Ｇｌｎ；Ａｓｐ（Ｄ）←→Ｇｌｕ；Ｃｙｓ（Ｃ）←→Ｓｅｒ；Ｇｌｎ（Ｑ）←→Ａｓｎ；Ｇｌｕ（Ｇ）←→Ａｓｐ；Ｇｌｙ（Ｇ）←→Ａｌａ；Ｈｉｓ（Ｈ）←→Ａｒｇ；Ｉｌｅ（Ｉ）←→Ｌｅｕ；Ｌｅｕ（Ｌ）←→Ｉｌｅ，ＶａｌまたはＭｅｔ；Ｌｙｓ（Ｋ）←→Ａｒｇ；Ｍｅｔ（Ｍ）←→Ｌｅｕ；Ｐｈｅ（Ｆ）←→Ｔｙｒ；Ｐｒｏ（Ｐ）←→Ａｌａ；Ｓｅｒ（Ｓ）←→ＴｈｒまたはＣｙｓ；Ｔｈｒ（Ｔ）←→Ｓｅｒ；Ｔｒｐ（Ｗ）←→Ｔｙｒ；Ｔｙｒ（Ｙ）←→ＰｈｅまたはＴｒｐ；及びＶａｌ（Ｖ）←→ＬｅｕまたはＡｌａを含む。
【００５５】
３つ以下のＣＤＲ領域（場合によっては、単一のＣＤＲまたはその一部のみということさえある）を含有する分子は、そのＣＤＲ（複数可）が由来する抗体の抗原結合活性を保持できることを理解されたい。例えば、Ｇａｏら（１９９４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９：３２３８９−９３）が、その基質に対して高い親和性を有する完全長ＶＬ鎖（３つ全てのＣＤＲを含む）について記載している。
【００５６】
２つのＣＤＲ領域を含有する分子は、例えば、Ｖａｕｇｈａｎ＆Ｓｏｌｌａｚｚｏ（２００１，Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，４：４１７−４３０）によって記載されている。４１８ページ（右側の欄−３  Ｏｕｒ  Ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｆｏｒ  Ｄｅｓｉｇｎ）に、フレームワーク領域内に散在するＨ１及びＨ２  ＣＤＲ超可変領域のみを含むミニボディについて記載されている。ミニボディは、標的に結合することができると説明されている。Ｐｅｓｓｉら（１９９３，Ｎａｔｕｒｅ，３６２：３６７−９）及びＢｉａｎｃｈｉら（１９９４，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２３６：６４９−５９）は、Ｖａｕｇｈａｎ＆Ｓｏｌｌａｚｚｏによって参照されており、Ｈ１及びＨ２ミニボディとその特性についてより詳細に記載している。Ｑｉｕら（２００７，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２５：９２１−９）は、２つの連結したＣＤＲからなる分子が抗原に結合することができることを論証している（要約、及び９２６ページ右側の欄）。Ｑｕｉｏｃｈｏ（１９９３，Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２９３−４）は、Ｐｅｓｓｉらの「ミニボディ」技術の概要を提供している。Ｌａｄｎｅｒ（２００７，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２５：８７５−７）は、Ｑｉｕらの記事を考察しており、２つのＣＤＲを含有する分子が抗原結合活性を保持することができると述べている（８７５ページ右側の欄）。
【００５７】
単一のＣＤＲ領域を含有する分子は、例えば、Ｌａｕｎｅら（１９９７，ＪＢＣ，２７２：３０９３７−４４）に記載されており、彼らは、抗原結合活性を示すＣＤＲに由来する様々なヘキサペプチドについて論証し（要約）、強力な結合活性を示す完全な単一ＣＤＲの合成ペプチドに言及している（３０９４２ページ右側の欄）。Ｍｏｎｎｅｔら（１９９９，ＪＢＣ，２７４：３７８９−９６）は、様々な１２量体のペプチド及び関連するフレームワーク領域が抗原結合活性を有することを示しており（要約）、ＣＤＲ３様ペプチド単独で抗原に結合することができると述べている（３７８５ページ左側の欄）。Ｈｅａｐら（２００５，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，８６：１７９１−１８００）は、「マイクロ抗体」（単一のＣＤＲを含有する分子）が抗原に結合することができると報告しており（要約、及び１７９１ページ左側の欄）、抗ＨＩＶ抗体からの環状ペプチドが抗原結合活性及び機能を有することを示している。Ｎｉｃａｉｓｅら（２００４，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１３：１８８２−９１）は、単一のＣＤＲが、そのリゾチーム抗原に対して抗原結合活性及び親和性を付与することができることを示している。
【００５８】
本発明の第１の態様のより具体的な実施形態において、抗体は、アミノ酸配列
ＭＡＱＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＭＫＰＧＡＳＶＫＩＳＣＫＡＴＧＹＴＦＳＳＹＷＩＥＷＶＮＲＲＰＧＨＧＬＥＷＩＧＥＩＬＰＧＳＧＳＴＮＹＮＥＫＦＫＧＫＡＴＦＴＡＤＴＳＳＮＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＧＧＤＹＤＥＥＹＹＬＭＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳ（配列番号７）、
またはＭＡＱＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＭＫＰＧＡＳＶＫＩＳＣＫＡＴＧＹＴＦＳＳＹＷＩＥＷＶＮＲＲＰＧＨＧＬＥＷＩＧＥＩＬＰＧＳＧＳＴＮＹＮＥＫＦＫＧＫＡＴＦＴＡＤＴＳＳＮＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＧＧＤＹＤＥＥＹＹＬＭＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶ（配列番号４９）、
または１個、２個、３個、４個、もしくは５個のアミノ酸置換を含むこの配列の変異体、を含む重鎖可変領域を含む。
【００５９】
付加的にまたは代替的に（すなわち、任意選択的に前述の重鎖アミノ酸配列と組み合わせて）、抗体は、アミノ酸配列
ＱＩＶＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＳＡＳＳＳＶＳＹＭＹＷＹＱＱＫＰＧＳＳＰＲＬＬＩＹＤＴＳＮＬＡＳＧＶＰＶＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＲＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＹＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＩＫＲＡＡ（配列番号８）、
またはＱＩＶＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＳＡＳＳＳＶＳＹＭＹＷＹＱＱＫＰＧＳＳＰＲＬＬＩＹＤＴＳＮＬＡＳＧＶＰＶＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＲＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＹＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＩＫＲＡＡＡ（配列番号５０）、
または１個、２個、３個、４個、もしくは５個のアミノ酸置換を含むこの配列の変異体、を含む軽鎖可変領域を含んでもよい。
【００６０】
したがって、特に好ましい実施形態において、薬剤は、アミノ酸配列
ＭＡＱＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＭＫＰＧＡＳＶＫＩＳＣＫＡＴＧＹＴＦＳＳＹＷＩＥＷＶＮＲＲＰＧＨＧＬＥＷＩＧＥＩＬＰＧＳＧＳＴＮＹＮＥＫＦＫＧＫＡＴＦＴＡＤＴＳＳＮＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＧＧＤＹＤＥＥＹＹＬＭＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳ（配列番号７）
またはＭＡＱＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＭＫＰＧＡＳＶＫＩＳＣＫＡＴＧＹＴＦＳＳＹＷＩＥＷＶＮＲＲＰＧＨＧＬＥＷＩＧＥＩＬＰＧＳＧＳＴＮＹＮＥＫＦＫＧＫＡＴＦＴＡＤＴＳＳＮＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＧＧＤＹＤＥＥＹＹＬＭＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶ（配列番号４９）または１個、２個、３個、４個、もしくは５個のアミノ酸置換を含むこれらの配列のいずれかの変異体、を含む重鎖可変領域、
及びアミノ酸配列ＱＩＶＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＳＡＳＳＳＶＳＹＭＹＷＹＱＱＫＰＧＳＳＰＲＬＬＩＹＤＴＳＮＬＡＳＧＶＰＶＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＲＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＹＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＩＫＲＡＡ（配列番号８）
またはＱＩＶＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＳＡＳＳＳＶＳＹＭＹＷＹＱＱＫＰＧＳＳＰＲＬＬＩＹＤＴＳＮＬＡＳＧＶＰＶＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＲＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＹＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＩＫＲＡＡＡ（配列番号５０）または１個、２個、３個、４個、もしくは５個のアミノ酸置換を含むこれらの配列のいずれかの変異体、を含む軽鎖可変領域、を含む抗体である。
【００６１】
本発明の第１の態様のさらにより具体的な実施形態において、抗体はアミノ酸配列
ＭＡＥＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＭＫＰＧＡＳＶＫＩＳＣＫＡＴＧＹＴＦＳＳＹＷＩＥＷＶＫＱＲＰＧＨＧＬＥＷＩＧＥＩＬＰＧＳＧＳＴＮＹＮＥＫＦＫＧＫＡＴＦＴＡＤＴＳＳＮＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＧＧＤＹＤＥＥＹＹＶＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶ（配列番号５１）、または１個、２個、３個、４個、もしくは５個のアミノ酸置換を含むこの配列の変異体、を含む重鎖可変領域を含む。
【００６２】
付加的にまたは代替的に（すなわち、任意選択的に前述の重鎖アミノ酸配列と組み合わせて）、抗体は、アミノ酸配列ＱＩＶＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＳＡＳＳＳＶＳＹＭＹＷＹＱＱＫＰＧＳＳＰＲＬＬＩＹＤＴＳＮＬＡＳＧＶＰＶＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＲＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＹＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫＲ（配列番号５２）、
または１個、２個、３個、４個、もしくは５個のアミノ酸置換を含むこの配列の変異体、を含む軽鎖可変領域を含んでもよい。
【００６３】
したがって、特に好ましい実施形態において、薬剤は、アミノ酸配列（配列番号５１）または１個、２個、３個、４個、もしくは５個のアミノ酸置換を含むこの配列の変異体を含む重鎖可変領域と、アミノ酸配列（配列番号５２）または１個、２個、３個、４個、もしくは５個のアミノ酸置換を含むこの配列の変異体を含む軽鎖可変領域とを含む抗体である。
【００６４】
本発明の第１の態様のさらにより具体的な実施形態において、抗体は、アミノ酸配列
ＭＡＥＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＭＫＰＧＡＳＶＫＩＳＣＫＡＴＧＹＴＦＳＳＹＷＩＥＷＶＮＱＲＰＧＨＧＬＥＷＩＧＥＩＬＰＧＳＧＳＴＮＹＮＥＫＦＫＧＫＡＴＦＴＡＤＴＳＳＮＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＧＧＤＹＤＥＥＹＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＬ（配列番号５３）、
または１個、２個、３個、４個、もしくは５個のアミノ酸置換を含むこの配列の変異体、を含む重鎖可変領域を含む。
【００６５】
付加的にまたは代替的に（すなわち、任意選択的に前述の重鎖アミノ酸配列と組み合わせて）、抗体は、アミノ酸配列ＱＩＶＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＳＡＳＳＳＶＳＹＭＹＷＹＱＱＫＰＧＳＳＰＲＬＬＩＹＤＴＳＮＬＡＳＧＶＰ  ＶＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＲＭＥＡＥＤＧＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＹＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫＲ（配列番号５４）、
または１個、２個、３個、４個、もしくは５個のアミノ酸置換を含むこの配列の変異体、を含む軽鎖可変領域を含んでもよい。
【００６６】
したがって、特に好ましい実施形態において、薬剤は、アミノ酸配列（配列番号５３）または１個、２個、３個、４個、もしくは５個のアミノ酸置換を含むこの配列の変異体を含む重鎖可変領域と、アミノ酸配列（配列番号５４）または１個、２個、３個、４個、もしくは５個のアミノ酸置換を含むこの配列の変異体を含む軽鎖可変領域とを含む抗体である。
【００６７】
抗体が、特定のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、及び特定のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を有すると定義される場合、これらの配列のうち最大１つまたは２つが、本明細書に定義されるように変異され得ることを理解されたい。変異は、配列の非ＣＤＲ領域内に存在してもよいか、または変異はＣＤＲ領域内に存在してもよい。典型的には、所与の重鎖可変領域または所与の軽鎖可変領域内の単一のＣＤＲ領域が、１個、２個、または３個のアミノ酸置換を有してもよい。したがって、所与の重鎖可変領域または所与の軽鎖可変領域内の３つのＣＤＲ領域の各々は、最大３個のアミノ酸置換を有してもよいことを理解されたい。各所与の重鎖可変領域または所与の軽鎖領域は、非ＣＤＲ領域内に多数のアミノ酸置換、例えば、１個、２個、３個、４個、または５個のアミノ酸置換を付加的に含んでもよい。
【００６８】
アミノ酸置換の種類についての選好は、本発明の第１の態様に関連して上で詳述している。好ましくは、置換は、保存的アミノ酸置換である。
【００６９】
本発明の第１の態様のさらなる具体的な実施形態において、抗体は、配列ＭＡＱＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＭＫＰＧＡＳＶＫＩＳＣＫＡＴＧＹＴＦＳＳＹＷＩＥＷＶＮＲＲＰＧＨＧＬＥＷＩＧＥＩＬＰＧＳＧＳＴＮＹＮＥＫＦＫＧＫＡＴＦＴＡＤＴＳＳＮＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＶＶＹＹＣＡＲＧＧＤＹＤＥＥＹＹＬＭＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＩＶＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＳＡＳＳＳＶＳＹＭＹＷＹＱＱＫＰＧＳＳＰＲＬＬＩＹＤＴＳＮＬＡＳＧＶＰＶＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＲＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＹＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＩＫＲＡＡＡ（配列番号５５）または１個、２個、３個、４個、もしくは５個のアミノ酸置換を含むこの配列の変異体を含む。
【００７０】
本発明の第１の態様の別の具体的な実施形態において、抗体は、配列ＭＡＥＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＭＫＰＧＡＳＶＫＩＳＣＫＡＴＧＹＴＦＳＳＹＷＩＥＷＶＫＱＲＰＧＨＧＬＥＷＩＧＥＩＬＰＧＳＧＳＴＮＹＮＥＫＦＫＧＫＡＴＦＴＡＤＴＳＳＮＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＧＧＤＹＤＥＥＹＹＶＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＩＶＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＳＡＳＳＳＶＳＹＭＹＷＹＱＱＫＰＧＳＳＰＲＬＬＩＹＤＴＳＮＬＡＳＧＶＰＶＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＲＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＹＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫＲ（配列番号５６）または１個、２個、３個、４個、もしくは５個のアミノ酸置換を含むこの配列の変異体を含む。
【００７１】
本発明の第１の態様の別の具体的な実施形態において、抗体は、配列ＭＡＥＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＭＫＰＧＡＳＶＫＩＳＣＫＡＴＧＹＴＦＳＳＹＷＩＥＷＶＮＱＲＰＧＨＧＬＥＷＩＧＥＩＬＰＧＳＧＳＴＮＹＮＥＫＦＫＧＫＡＴＦＴＡＤＴＳＳＮＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＧＧＤＹＤＥＥＹＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＬＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＩＶＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＳＡＳＳＳＶＳＹＭＹＷＹＱＱＫＰＧＳＳＰＲＬＬＩＹＤＴＳＮＬＡＳＧＶＰＶＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＲＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＹＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫＲ（配列番号５７）または１個、２個、３個、４個、もしくは５個のアミノ酸置換を含むこの配列の変異体を含む。
【００７２】
また、薬剤は、その配列がＣＬＥＣ１４Ａへの特異的結合、例えば、ＭＭＲＮ２結合領域への特異的結合について本明細書に定義される抗体のいずれかと競合する抗体であってもよいことを理解されたい。
【００７３】
上で述べたように、ＣＬＥＣ１４ＡとＭＭＲＮ２との間の相互作用を阻害する薬剤は、その薬剤をコードするポリヌクレオチドであってもよい。
【００７４】
したがって、薬剤は、特定の配列への参照によって定義される本明細書に記載される抗体のいずれかをコードするポリヌクレオチドであってもよい。これらの抗体の可変軽鎖及び重鎖のポリヌクレオチド配列は、図１１に提供される。
【００７５】
したがって、薬剤は、以下のヌクレオチド配列のうちの１つ以上を含むポリヌクレオチドであってもよい：
（ｉ）ＡＧＴＡＧＣＴＡＣＴＧＧＡＴＡＧＡＧ（配列番号９）、
（ｉｉ）ＴＧＧＡＴＴＧＧＡＧＡＧＡＴＴＴＴＡＣＣＴＧＧＡＡＧＴＧＧＴＡＧＴＡＣＴＡＡＴ（配列番号１０）、
（ｉｉｉ）ＧＣＧＡＧＡＧＧＧＧＧＧＧＡＴＴＡＣＧＡＣＧＡＡＧＡＡＴＡＣＴＡＴＣＴＣＡＴＧＧＡＣ（配列番号１１）、
（ｉｖ）ＡＧＴＴＡＣＡＴＧＴＡＣＴＧＧＴＡＣ（配列番号１２）、
（ｖ）
ＣＴＣＣＴＧＡＴＴＴＡＴＧＡＣＡＣＡＴＣＣＡＡＣＣＴＧＧＣＴ（配列番号１３）、及び
（ｖｉ）ＣＡＧＣＡＧＴＧＧＡＧＴＡＧＴＴＡＣＣＣＧＣＴＣ（配列番号１４）、
（ｖｉｉ）ＧＧＣＴＡＣＡＣＡＴＴＣＡＧＴＡＧＣＴＡＣＴＧＧ（配列番号６０）
（ｖｉｉｉ）ＡＴＴＴＴＡＣＣＴＧＧＡＧＴＧＧＴＡＧＴＡＣＴ（配列番号６１）
（ｉｘ）ＧＣＧＡＧＡＧＧＧＧＧＧＧＡＴＴＡＣＧＡＣＧＡＡＧＡＡＴＡＣＴＡＴＣＴＣＡＴＧＧＡＣＴＡＣ（配列番号６２）
（ｘ）ＴＣＡＡＧＴＧＴＡＡＧＴＴＡＣ（配列番号６３）
（ｘｉ）ＧＡＣＡＣＡＴＣＣ
（ｘｉｉ）ＣＡＧＣＡＧＴＧＧＡＧＴＡＧＴＴＡＣＣＣＧＣＴＣＡＣＧ（配列番号６４）
（ｘｉｉｉ）ＧＣＡＡＧＡＧＧＧＧＧＧＧＡＴＴＡＣＧＡＣＧＡＡＧＡＡＴＡＣＴＡＴＧＴＣＡＴＧＧＡＣ（配列番号５８）
（ｘｉｖ）ＡＴＴＴＴＡＣＣＴＧＧＡＡＧＴＧＧＴＡＧＴＡＣＴ（配列番号６６）
（ｘｖ）ＧＣＡＡＧＡＧＧＧＧＧＧＧＡＴＴＡＣＧＡＣＧＡＡＧＡＡＴＡＣＴＡＴＧＣＴＡＴＧＧＡＣＴＡＣ（配列番号６５）
（ｘｖｉ）ＧＣＡＡＧＡＧＧＧＧＧＧＧＡＴＴＡＣＧＡＣＧＡＡＧＡＡＴＡＣＴＡＴＧＣＴＡＴＧＧＡＣ（配列番号５９）
（ｘｖｉｉ）ＡＴＴＴＴＡＣＣＴＧＧＡＡＧＴＧＧＴＡＧＴＡＣＴ（配列番号６６）
（ｘｖｉｉｉ）ＧＣＡＡＧＡＧＧＧＧＧＧＧＡＴＴＡＣＧＡＣＧＡＡＧＡＡＴＡＣＴＡＴＧＴＣＡＴＧＧＡＣＴＡＣ（配列番号６７）
（ｘｉｘ）ＣＡＧＣＡＧＴＧＧＡＧＴＡＧＴＴＡＣＣＣＧＣＴＣＡＣＧ（配列番号４６）
（ｘｘ）ＴＧＧＡＴＴＧＧＡＧＡＧＡＴＴＴＴＡＣＣＴＧＧＡＡＧＴＧＧＴＡＧＴＡＣＴ（配列番号７９）。
ポリヌクレオチド配列（ｉ）（配列番号９）は、重鎖ＣＤＲ  ＳＳＹＷＩＥ（配列番号１）をコードし、ポリヌクレオチド配列（ｉｉ）（配列番号１０）は、重鎖ＣＤＲ  ＷＩＧＥＩＬＰＧＳＧＳＴＮ（配列番号７８）をコードし、ポリヌクレオチド配列（ｘｘ）（配列番号７９）は、重鎖ＣＤＲ  ＷＩＧＥＩＬＰＧＳＧＳＴ（配列番号２）をコードし、ポリヌクレオチド配列（ｉｉｉ）（配列番号１１）は、重鎖ＣＤＲ  ＡＲＧＧＤＹＤＥＥＹＹＬＭＤ（配列番号３）をコードし、ポリヌクレオチド配列（ｉｖ）（配列番号１２）は、軽鎖ＣＤＲ  ＳＹＭＹＷＹ（配列番号４）をコードし、ポリヌクレオチド配列（ｖ）（配列番号１３）は、軽鎖ＣＤＲ  ＬＬＩＹＤＴＳＮＬＡ（配列番号５）をコードし、ポリヌクレオチド配列（ｖｉ）（配列番号１４）は、軽鎖ＣＤＲ  ＱＱＷＳＳＹＰＬ（配列番号６）をコードする。したがって、抗体をコードするポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド配列（ｉ）、（ｉｉ）もしくは（ｘｘ）、及び（ｉｉｉ）のうちの任意の１つ、２つ、または３つ、ならびに／またはポリヌクレオチド配列（ｉｖ）〜（ｖｉ）のうちの任意の１つ、２つ、または３つを含んでもよい。好ましくは、ポリヌクレオチドは、６つ全てのポリヌクレオチド配列（ｉ）、（ｉｉ）または（ｘｘ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）、及び（ｖｉ）を含む。
【００７６】
ポリヌクレオチド配列（ｖｉｉ）（配列番号６０）は、重鎖ＣＤＲ  ＧＹＴＦＳＳＹＷ（配列番号４０）をコードし、ポリヌクレオチド配列（ｖｉｉｉ）（配列番号６１）は、重鎖ＣＤＲ  ＩＬＰＧＳＧＳＴ（配列番号４１）をコードし、ポリヌクレオチド配列（ｉｘ）（配列番号６２）は、重鎖ＣＤＲ  ＡＲＧＧＤＹＤＥＥＹＹＬＭＤＹ（配列番号４２）をコードし、ポリヌクレオチド配列（ｘ）（配列番号６３）は、軽鎖ＣＤＲ  ＳＳＶＳＹ（配列番号４３）をコードし、ポリヌクレオチド配列（ｘｉ）は、軽鎖ＣＤＲ  ＤＴＳをコードし、ポリヌクレオチド配列（ｘｉｉ）（配列番号６４）は、軽鎖ＣＤＲ  ＱＱＷＳＳＹＰＬＴ（配列番号４４）をコードする。したがって、抗体をコードするポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド配列（ｖｉｉ）〜（ｉｘ）のうちの任意の１つ、２つ、または３つ、ならびに／またはポリヌクレオチド配列（ｘ）〜（ｘｉｉ）のうちの任意の１つ、２つ、または３つを含んでもよい。好ましくは、ポリヌクレオチドは、６つ全てのポリヌクレオチド配列（ｖｉｉ）〜（ｘｉｉ）を含む。
【００７７】
重鎖ＣＤＲ配列（ｉ）、（ｉｉ）または（ｘｘ）、及び（ｉｉｉ）をコードするポリヌクレオチド配列のいずれかが、対応する重鎖ＣＤＲ配列（ｖｉｉ）〜（ｉｘ）のいずれかと置換されてもよく、またその逆も同様であり、軽鎖ＣＤＲ配列（ｉｖ）〜（ｖｉ）をコードするポリヌクレオチド配列のいずれかが、対応する軽鎖ＣＤＲ配列（ｘ）〜（ｘｉｉ）のいずれかと置換されてもよく、またその逆も同様であることを理解されたい。
【００７８】
ポリヌクレオチド配列（ｉ）（配列番号９）は、重鎖ＣＤＲ  ＳＳＹＷＩＥ（配列番号１）をコードし、ポリヌクレオチド配列（ｉｉ）（配列番号１０）は、重鎖ＣＤＲ  ＷＩＧＥＩＬＰＧＳＧＳＴＮ（配列番号７８）をコードし、ポリヌクレオチド配列（ｘｉｉｉ）（配列番号５８）は、重鎖ＣＤＲ  ＡＲＧＧＤＹＤＥＥＹＹＶＭＤ（配列番号７７）をコードし、ポリヌクレオチド配列（ｉｖ）（配列番号１２）は、軽鎖ＣＤＲ  ＳＹＭＹＷＹ（配列番号４）をコードし、ポリヌクレオチド配列（ｖ）（配列番号１３）は、軽鎖ＣＤＲ  ＬＬＩＹＤＴＳＮＬＡ（配列番号５）をコードし、ポリヌクレオチド配列（ｖｉ）（配列番号１４）は、軽鎖ＣＤＲ  ＱＱＷＳＳＹＰＬ（配列番号６）をコードする。したがって、抗体をコードするポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド配列（ｉ）、（ｉｉ）、及び（ｘｉｉｉ）のうちの任意の１つ、２つ、または３つ、ならびに／またはポリヌクレオチド配列（ｉｖ）、（ｖ）、及び（ｖｉ）のうちの任意の１つ、２つ、または３つを含んでもよい。好ましくは、ポリヌクレオチドは、６つ全てのポリヌクレオチド配列（ｉ）、（ｉｉ）、（ｘｉｉｉ）（ｉｖ）、（ｖ）、及び（ｖｉ）を含む。
【００７９】
ポリヌクレオチド配列（ｖｉｉ）（配列番号６０）は、重鎖ＣＤＲ  ＧＹＴＦＳＳＹＷ（配列番号４０）をコードし、ポリヌクレオチド配列（ｘｖｉｉ）（配列番号６６）は、重鎖ＣＤＲ  ＩＬＰＧＳＧＳＴ（配列番号４１）をコードし、ポリヌクレオチド配列（ｘｖ）（配列番号６５）は、重鎖ＣＤＲ  ＡＲＧＧＤＹＤＥＥＹＹＶＭＤＹ（配列番号４５）をコードし、ポリヌクレオチド配列（ｘ）（配列番号６３）は、軽鎖ＣＤＲ  ＳＳＶＳＹ（配列番号４３）をコードし、ポリヌクレオチド配列（ｘｉ）は、軽鎖ＣＤＲ  ＤＴＳをコードし、ポリヌクレオチド配列（ｘｉｉ）（配列番号６４）は、軽鎖ＣＤＲ  ＱＱＷＳＳＹＰＬＴ（配列番号４４）をコードする。したがって、抗体をコードするポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド配列（ｖｉｉ）、（ｘｖｉｉ）、及び（ｘｖ）のうちの任意の１つ、２つ、または３つ、ならびに／またはポリヌクレオチド配列（ｘ）、（ｘｉ）、及び（ｘｉｉ）のうちの任意の１つ、２つ、または３つを含んでもよい。好ましくは、ポリヌクレオチドは、６つ全てのポリヌクレオチド配列（ｖｉｉ）、（ｘｖｉｉ）、（ｘｖ）、（ｘ）、（ｘｉ）、及び（ｘｉｉ）を含む。
【００８０】
重鎖ＣＤＲ配列（ｉ）、（ｉｉ）、及び（ｘｉｉｉ）をコードするポリヌクレオチド配列のいずれかが、対応する重鎖ＣＤＲ配列（ｖｉｉ）、（ｘｖｉｉ）、及び（ｘｖ）のいずれかと置換されてもよく、またその逆も同様であり、軽鎖ＣＤＲ配列（ｉｖ）、（ｖ）、及び（ｖｉ）をコードするポリペプチド配列のいずれかが、対応する軽鎖ＣＤＲ配列（ｘ）、（ｘｉ）、及び（ｘｉｉ）のいずれかと置換されてもよく、またその逆も同様であることを理解されたい。
【００８１】
ポリヌクレオチド配列（ｉ）（配列番号９）は、重鎖ＣＤＲ  ＳＳＹＷＩＥ（配列番号１）をコードし、ポリヌクレオチド配列（ｉｉ）（配列番号１０）は、重鎖ＣＤＲ  ＷＩＧＥＩＬＰＧＳＧＳＴＮ（配列番号７８）をコードし、ポリヌクレオチド配列（ｘｖｉ）（配列番号５９）は、重鎖ＣＤＲ  ＡＲＧＧＤＹＤＥＥＹＹＡＭＤ（配列番号４６）をコードし、ポリヌクレオチド配列（ｉｖ）（配列番号１２）は、軽鎖ＣＤＲ  ＳＹＭＹＷＹ（配列番号４）をコードし、ポリヌクレオチド配列（ｖ）（配列番号１３）は、軽鎖ＣＤＲ  ＬＬＩＹＤＴＳＮＬＡ（配列番号５）をコードし、ポリヌクレオチド配列（ｖｉ）（配列番号１４）は、軽鎖ＣＤＲ  ＱＱＷＳＳＹＰＬ（配列番号６）をコードする。したがって、抗体をコードするポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド配列（ｉ）、（ｉｉ）、及び（ｘｖｉ）のうちの任意の１つ、２つ、または３つ、ならびに／またはポリヌクレオチド配列（ｉｖ）、（ｖ）、及び（ｖｉ）のうちの任意の１つ、２つ、または３つを含んでもよい。好ましくは、ポリヌクレオチドは、６つ全てのポリヌクレオチド配列（ｉ）、（ｉｉ）、（ｘｖｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）、及び（ｖｉ）を含む。
【００８２】
ポリヌクレオチド配列（ｖｉｉ）（配列番号６０）は、重鎖ＣＤＲ  ＧＹＴＦＳＳＹＷ（配列番号４０）をコードし、ポリヌクレオチド配列（ｘｉｖ）（配列番号６６）は、重鎖ＣＤＲ  ＩＬＰＧＳＧＳＴ（配列番号４１）をコードし、ポリヌクレオチド配列（ｘｖｉｉｉ）（配列番号６７）は、重鎖ＣＤＲ  ＡＲＧＧＤＹＤＥＥＹＹＡＭＤＹ（配列番号４７）をコードし、ポリヌクレオチド配列（ｘ）（配列番号６３）は、軽鎖ＣＤＲ  ＳＳＶＳＹ（配列番号４３）をコードし、ポリヌクレオチド配列（ｘｉ）は、軽鎖ＣＤＲ  ＤＴＳをコードし、ポリヌクレオチド配列（ｘｉｘ）（配列番号４６）は、軽鎖ＣＤＲ  ＱＱＷＳＳＹＰＬＴＦ（配列番号４８）をコードする。したがって、抗体をコードするポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド配列（ｖｉｉ）、（ｘｉｖ）、及び（ｘｖｉｉｉ）のうちの任意の１つ、２つ、または３つ、ならびに／またはポリヌクレオチド配列（ｘ）、（ｘｉ）、（ｘｉｘ）のうちの任意の１つ、２つ、または３つを含んでもよい。好ましくは、ポリヌクレオチドは、６つ全てのポリヌクレオチド配列（ｖｉｉ）、（ｘｉｖ）及び（ｘｖｉｉｉ）、（ｘ）、（ｘｉ）、（ｘｉｘ）を含む。
【００８３】
重鎖ＣＤＲ配列（ｉ）、（ｉｉ）、及び（ｘｖｉ）をコードするポリヌクレオチド配列のいずれかが、対応する重鎖ＣＤＲ配列（ｖｉｉ）、（ｘｉｖ）、及び（ｘｖｉｉｉ）のいずれかと置換されてもよく、またその逆も同様であり、軽鎖ＣＤＲ配列（ｉｖ）、（ｖ）、及び（ｖｉ）をコードするポリペプチド配列のいずれかが、対応する軽鎖ＣＤＲ配列（ｘ）、（ｘｉ）、（ｘｉｘ）と置換されてもよく、またその逆も同様であることを理解されたい。
【００８４】
より具体的な実施形態において、薬剤は、配列番号７の可変重鎖をコードする、ヌクレオチド配列ＡＴＧＧＣＣＣＡＧＧＴＴＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＡＧＴＣＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＣＴＧＡＴＧＡＡＧＣＣＴＧＧＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＡＧＡＴＡＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＡＣＴＧＧＣＴＡＣＡＣＡＴＴＣＡＧＴＡＧＣＴＡＣＴＧＧＡＴＡＧＡＧＴＧＧＧＴＡＡＡＣＣＧＧＡＧＧＣＣＴＧＧＡＣＡＴＧＧＣＣＴＴＧＡＧＴＧＧＡＴＴＧＧＡＧＡＧＡＴＴＴＴＡＣＣＴＧＧＡＡＧＴＧＧＴＡＧＴＡＣＴＡＡＴＴＡＣＡＡＴＧＡＧＡＡＧＴＴＣＡＡＧＧＧＣＡＡＧＧＣＣＡＣＡＴＴＣＡＣＴＧＣＡＧＡＴＡＣＡＴＣＣＴＣＣＡＡＴＡＣＡＧＣＣＴＡＣＡＴＧＣＡＡＣＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＣＡＣＡＴＣＴＧＡＧＧＡＣＴＣＴＧＣＣＧＴＣＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＧＡＧＧＧＧＧＧＧＡＴＴＡＣＧＡＣＧＡＡＧＡＡＴＡＣＴＡＴＣＴＣＡＴＧＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＡＧＧＣＡＣＣＡＣＴＣＴＣＡＣＡＧＴＣＴＣＣＴＣＡ（配列番号１５）を含むポリヌクレオチドである。
【００８５】
さらにより具体的な実施形態において、薬剤は、配列番号８の可変軽鎖をコードする、ヌクレオチド配列ＣＡＡＡＴＴＧＴＴＣＴＣＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＧＣＡＡＴＣＡＴＧＴＣＴＧＣＡＴＣＴＣＣＡＧＧＧＧＡＧＡＡＧＧＴＣＡＣＣＡＴＧＡＣＣＴＧＣＡＧＴＧＣＣＡＧＣＴＣＡＡＧＴＧＴＡＡＧＴＴＡＣＡＴＧＴＡＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＡＧＧＡＴＣＣＴＣＣＣＣＣＡＧＡＣＴＣＣＴＧＡＴＴＴＡＴＧＡＣＡＣＡＴＣＣＡＡＣＣＴＧＧＣＴＴＣＴＧＧＡＧＴＣＣＣＴＧＴＴＣＧＣＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＧＴＣＴＧＧＧＡＣＣＴＣＴＴＡＣＴＣＴＣＴＣＡＣＡＡＴＣＡＧＣＣＧＡＡＴＧＧＡＧＧＣＴＧＡＡＧＡＴＧＣＴＧＣＣＡＣＴＴＡＴＴＡＣＴＧＣＣＡＧＣＡＧＴＧＧＡＧＴＡＧＴＴＡＣＣＣＧＣＴＣＡＣＧＴＴＣＧＧＴＧＣＴＧＧＧＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＡＡＴＣＡＡＡＣＧＴＧＣＧＧＣＣＧＣ（配列番号１６）を含むポリヌクレオチドである。
【００８６】
好ましくは、薬剤は、配列番号１５のヌクレオチド配列及び配列番号１６のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドである。
【００８７】
別の具体的な実施形態において、薬剤は、配列番号４９の可変重鎖をコードする、ヌクレオチド配列ＡＴＧＧＣＣＣＡＧＧＴＴＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＡＧＴＣＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＣＴＧＡＴＧＡＡＧＣＣＴＧＧＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＡＧＡＴＡＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＡＣＴＧＧＣＴＡＣＡＣＡＴＴＣＡＧＴＡＧＣＴＡＣＴＧＧＡＴＡＧＡＧＴＧＧＧＴＡＡＡＣＣＧＧＡＧＧＣＣＴＧＧＡＣＡＴＧＧＣＣＴＴＧＡＧＴＧＧＡＴＴＧＧＡＧＡＧＡＴＴＴＴＡＣＣＴＧＧＡＡＧＴＧＧＴＡＧＴＡＣＴＡＡＴＴＡＣＡＡＴＧＡＧＡＡＧＴＴＣＡＡＧＧＧＣＡＡＧＧＣＣＡＣＡＴＴＣＡＣＴＧＣＡＧＡＴＡＣＡＴＣＣＴＣＣＡＡＴＡＣＡＧＣＣＴＡＣＡＴＧＣＡＡＣＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＣＡＣＡＴＣＴＧＡＧＧＡＣＴＣＴＧＴＣＧＴＣＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＧＡＧＧＧＧＧＧＧＡＴＴＡＣＧＡＣＧＡＡＧＡＡＴＡＣＴＡＴＣＴＣＡＴＧＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＡＧＧＣＡＣＣＡＣＴＣＴＣＡＣＡＧＴＣ（配列番号６８）を含むポリヌクレオチドである。
【００８８】
さらにより具体的な実施形態において、薬剤は、配列番号５０の可変軽鎖をコードする、ヌクレオチド配列ＣＡＡＡＴＴＧＴＴＣＴＣＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＧＣＡＡＴＣＡＴＧＴＣＴＧＣＡＴＣＴＣＣＡＧＧＧＧＡＧＡＡＧＧＴＣＡＣＣＡＴＧＡＣＣＴＧＣＡＧＴＧＣＣＡＧＣＴＣＡＡＧＴＧＴＡＡＧＴＴＡＣＡＴＧＴＡＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＡＧＧＡＴＣＣＴＣＣＣＣＣＡＧＡＣＴＣＣＴＧＡＴＴＴＡＴＧＡＣＡＣＡＴＣＣＡＡＣＣＴＧＧＣＴＴＣＴＧＧＡＧＴＣＣＣＴＧＴＴＣＧＣＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＧＴＣＴＧＧＧＡＣＣＴＣＴＴＡＣＴＣＴＣＴＣＡＣＡＡＴＣＡＧＣＣＧＡＡＴＧＧＡＧＧＣＴＧＡＡＧＡＴＧＣＴＧＣＣＡＣＴＴＡＴＴＡＣＴＧＣＣＡＧＣＡＧＴＧＧＡＧＴＡＧＴＴＡＣＣＣＧＣＴＣＡＣＧＴＴＣＧＧＴＧＣＴＧＧＧＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＡＡＴＣＡＡＡＣＧＴ（配列番号６９）を含むポリヌクレオチドである。
【００８９】
好ましくは、薬剤は、配列番号６８のヌクレオチド配列及び配列番号６９のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドである。
【００９０】
さらに具体的な実施形態において、薬剤は、配列番号５１の可変重鎖をコードする、ヌクレオチド配列ＡＴＧＧＣＣＧＡＧＧＴＴＣＡＧＣＴＴＣＡＧＣＡＧＴＣＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＣＴＧＡＴＧＡＡＧＣＣＴＧＧＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＡＧＡＴＡＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＡＣＴＧＧＣＴＡＣＡＣＡＴＴＣＡＧＴＡＧＣＴＡＣＴＧＧＡＴＡＧＡＧＴＧＧＧＴＡＡＡＧＣＡＧＡＧＧＣＣＴＧＧＡＣＡＴＧＧＣＣＴＴＧＡＧＴＧＧＡＴＴＧＧＡＧＡＧＡＴＴＴＴＡＣＣＴＧＧＡＡＧＴＧＧＴＡＧＴＡＣＴＡＡＴＴＡＣＡＡＴＧＡＧＡＡＧＴＴＣＡＡＧＧＧＣＡＡＧＧＣＣＡＣＡＴＴＣＡＣＴＧＣＡＧＡＴＡＣＡＴＣＣＴＣＣＡＡＣＡＣＡＧＣＣＴＡＣＡＴＧＣＡＡＣＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＣＡＴＣＴＧＡＧＧＡＣＴＣＴＧＣＣＧＴＣＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＡＡＧＡＧＧＧＧＧＧＧＡＴＴＡＣＧＡＣＧＡＡＧＡＡＴＡＣＴＡＴＧＴＣＡＴＧＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＡＧＧＡＡＣＣＴＣＡＧＴＣＡＣＴＧＴＣ（配列番号７０）を含むポリヌクレオチドである。
【００９１】
さらにより具体的な実施形態において、薬剤は、配列番号５２の可変軽鎖をコードする、ヌクレオチド配列ＣＡＡＡＴＴＧＴＴＣＴＣＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＧＣＡＡＴＣＡＴＧＴＣＴＧＣＡＴＣＴＣＣＡＧＧＧＧＡＧＡＡＧＧＴＣＡＣＣＡＴＧＡＣＣＴＧＣＡＧＴＧＣＣＡＧＣＴＣＡＡＧＴＧＴＡＡＧＴＴＡＣＡＴＧＴＡＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＡＧＧＡＴＣＣＴＣＣＣＣＣＡＧＡＣＴＣＣＴＧＡＴＴＴＡＴＧＡＣＡＣＡＴＣＣＡＡＣＣＴＧＧＣＴＴＣＴＧＧＡＧＴＣＣＣＴＧＴＴＣＧＣＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＧＴＣＴＧＧＧＡＣＣＴＣＴＴＡＣＴＣＴＣＴＣＡＣＡＡＴＣＡＧＣＣＧＡＡＴＧＧＡＧＧＣＴＧＡＡＧＡＴＧＣＴＧＣＣＡＣＴＴＡＴＴＡＣＴＧＣＣＡＧＣＡＧＴＧＧＡＧＴＡＧＴＴＡＣＣＣＧＣＴＣＡＣＧＴＴＣＧＧＴＧＣＴＧＧＧＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＡＡＡＣＧＴ（配列番号７１）を含むポリヌクレオチドである。
【００９２】
好ましくは、薬剤は、配列番号７０のヌクレオチド配列及び配列番号７１のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドである。
【００９３】
さらにより具体的な実施形態において、薬剤は、配列番号５３の可変重鎖をコードする、ヌクレオチド配列ＡＴＧＧＣＣＧＡＧＧＴＴＣＡＧＣＴＴＣＡＧＣＡＧＴＣＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＣＴＧＡＴＧＡＡＧＣＣＴＧＧＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＡＧＡＴＡＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＡＣＴＧＧＣＴＡＣＡＣＡＴＴＣＡＧＴＡＧＣＴＡＣＴＧＧＡＴＡＧＡＧＴＧＧＧＴＡＡＡＴＣＡＧＡＧＧＣＣＴＧＧＡＣＡＴＧＧＣＣＴＴＧＡＧＴＧＧＡＴＴＧＧＡＧＡＧＡＴＴＴＴＡＣＣＴＧＧＡＡＧＴＧＧＴＡＧＴＡＣＴＡＡＴＴＡＣＡＡＴＧＡＧＡＡＧＴＴＣＡＡＧＧＧＣＡＡＧＧＣＣＡＣＡＴＴＣＡＣＴＧＣＡＧＡＴＡＣＡＴＣＣＴＣＣＡＡＣＡＣＡＧＣＣＴＡＣＡＴＧＣＡＡＣＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＣＡＴＣＴＧＡＧＧＡＣＴＣＴＧＣＣＧＴＣＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＡＡＧＡＧＧＧＧＧＧＧＡＴＴＡＣＧＡＣＧＡＡＧＡＡＴＡＣＴＡＴＧＣＴＡＴＧＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＡＧＧＡＡＣＣＴＣＡＧＴＣＡＣＣＣＴＣ（配列番号７２）を含むポリヌクレオチドである。
【００９４】
さらにより具体的な実施形態において、薬剤は、配列番号５４の可変軽鎖をコードする、ヌクレオチド配列ＣＡＡＡＴＴＧＴＴＣＴＣＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＧＣＡＡＴＣＡＴＧＴＣＴＧＣＡＴＣＴＣＣＡＧＧＧＧＡＧＡＡＧＧＴＣＡＣＣＡＴＧＡＣＣＴＧＣＡＧＴＧＣＣＡＧＣＴＣＡＡＧＴＧＴＡＡＧＴＴＡＣＡＴＧＴＡＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＡＧＧＡＴＣＣＴＣＣＣＣＣＡＧＡＣＴＣＣＴＧＡＴＴＴＡＴＧＡＣＡＣＡＴＣＣＡＡＣＣＴＧＧＣＴＴＣＴＧＧＡＧＴＣＣＣＴＧＴＴＣＧＣＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＧＴＣＴＧＧＧＡＣＣＴＣＴＴＡＣＴＣＴＣＴＣＡＣＡＡＴＣＡＧＣＣＧＡＡＴＧＧＡＧＧＣＴＧＡＡＧＡＴＧＣＴＧＣＣＡＣＴＴＡＴＴＡＣＴＧＣＣＡＧＣＡＧＴＧＧＡＧＴＡＧＴＴＡＣＣＣＧＣＴＣＡＣＧＴＴＣＧＧＴＧＣＴＧＧＧＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＡＡＡＣＧＴ（配列番号７３）を含むポリヌクレオチドである。
【００９５】
好ましくは、薬剤は、配列番号７２のヌクレオチド配列及び配列番号７３のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドである。
【００９６】
薬剤はさらに、本明細書に定義されるようなポリヌクレオチド配列の変異体、例えば、本明細書に定義されるようなポリヌクレオチド配列に対して少なくとも８５、９０、９５、９６、９７、９８、または９９％の配列相同性を有する変異体であってもよい。配列相同性は、当該技術分野で周知のプログラム（例えば、Ａｌｉｇｎ  ＱｕｅｒｙまたはＢｌａｓｔ  ２）を使用して決定することができる。任意のそのような変異体は、特定の配列への参照によって上に定義される抗体の変異体、例えば、抗体（例えば、機能的抗体）の所望の活性に影響を及ぼさない抗体の変異体をコードすることを理解されたい。当業者は、同じ生成物をコードするＲＮＡ配列と同様に、前述の配列に対して縮重しているポリヌクレオチド配列が本発明に包含されることを理解するであろう。
【００９７】
ＣＬＥＣ１４Ａ及びＭＭＲＮ２は、糖タンパク質であってもよいことを理解されたい。したがって、ＣＬＥＣ１４ＡまたはＭＭＲＮ２に結合する抗体は、ＣＬＥＣ１４ＡまたはＭＭＲＮ２のタンパク質または炭水化物成分の任意の組み合わせに結合できる。
【００９８】
本明細書で使用される「抗体」または「抗体分子」という用語は、限定されないが、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、一本鎖、Ｆａｂ断片、及びＦａｂ発現ライブラリによって産生される断片を含む。そのような断片は、標的物質、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）及びＦ（ａｂ’）２断片、ならびに一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、融合タンパク質、ならびに抗体の抗原結合部位を含む他の合成タンパク質に対するそれらの結合活性を保持する全抗体の断片を含む。この用語はまた、ファージディスプレイ技術、または特定のポリペプチドもしくはその特定領域に結合する分子に関する他の無作為選択技術を用いて産生され得る抗体様分子も含む。したがって、抗体という用語は、天然抗体の認識部位の一部（すなわち、エピトープまたは抗原に結合または複合する抗体の一部）である構造、好ましくは、ペプチド構造を含有する全ての分子を含む。さらに、抗体及びその断片は、現在当該技術分野で周知のヒト化抗体であってもよい。
【００９９】
「ＳｃＦｖ分子」とは、ＶＨ及びＶＬパートナードメインが柔軟なオリゴペプチドを介して連結された分子を意味する。ＳｃＦｖ抗体等の改変抗体は、当該技術分野で長い間既知である技術及び手法を用いて作製することができる。全抗体ではなく抗体断片を用いることにより、何倍もの利点が得られる。より小さいサイズの断片は、標的部位へのより良好な浸透等の薬理学的特性の改善をもたらし得る。相補的結合等の全抗体のエフェクタ機能が除去される。Ｆａｂ、Ｆｖ、ＳｃＦｖ、及びｄＡｂ抗体断片は全て、大腸菌中で発現させてそこから分泌することができ、したがって、大量の断片を容易に産生することができる。全抗体、及びＦ（ａｂ’）２断片は、「二価」である。「二価」とは、抗体及びＦ（ａｂ’）２断片が２つの抗原結合部位を有することを意味する。対照的に、Ｆａｂ、Ｆｖ、ＳｃＦｖ、及びｄＡｂ断片は、通常、一価であり、１つの抗原結合部位のみを有する。
【０１００】
しかしながら、ＳｃＦｖは、一価、二価、三価、または四価であり得ることが可能である。ＳｃＦｖは、ダイアボディ、トリアボディ、またはテトラボディであってもよい。二価、三価、もしくは四価の２つ以上のＶＨ及びＶＬパートナードメイン、またはダイアボディ、トリアボディ、もしくはテトラボディは、異なってもよい。例えば、一実施形態において、ＳｃＦｖ薬剤は、本明細書に開示される１つの抗体からのＶＨ及びＶＬを含み、また、本明細書に開示される異なる抗体からのＶＨ及びＶＬドメインも含む。そのような状況において、ＳｃＦｖ薬剤は、２つより多くまたは３つより多く、例えば４つの異なるＶＨ及びＶＬドメインを含んでもよい。付加的な実施形態において、本明細書に開示されるＳｃＦｖ薬剤は、本明細書に開示されるものに対する付加的な抗体、例えば、血管新生の阻害、または癌の治療において有用であると考えられる他の抗体からのＶＨ及びＶＬドメインを含んでもよい。
【０１０１】
さらに、特定のＳｃＦｖ薬剤を構成する本明細書に開示されるＶＨ及び／またはＶＬドメインは、本明細書に開示される配列よりも短くてもよい。例えば、ＶＨ及び／またはＶＬドメインは、本明細書に開示される配列よりも１残基短くてもよいか、または２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０残基以上短くてもよい。
【０１０２】
したがって、さらなる実施形態において、薬剤は、配列番号５５のＳｃＦｖ領域をコードする、ヌクレオチド配列ＡＴＧＧＣＣＣＡＧＧＴＴＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＡＧＴＣＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＣＴＧＡＴＧＡＡＧＣＣＴＧＧＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＡＧＡＴＡＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＡＣＴＧＧＣＴＡＣＡＣＡＴＴＣＡＧＴＡＧＣＴＡＣＴＧＧＡＴＡＧＡＧＴＧＧＧＴＡＡＡＣＣＧＧＡＧＧＣＣＴＧＧＡＣＡＴＧＧＣＣＴＴＧＡＧＴＧＧＡＴＴＧＧＡＧＡＧＡＴＴＴＴＡＣＣＴＧＧＡＡＧＴＧＧＴＡＧＴＡＣＴＡＡＴＴＡＣＡＡＴＧＡＧＡＡＧＴＴＣＡＡＧＧＧＣＡＡＧＧＣＣＡＣＡＴＴＣＡＣＴＧＣＡＧＡＴＡＣＡＴＣＣＴＣＣＡＡＴＡＣＡＧＣＣＴＡＣＡＴＧＣＡＡＣＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＣＡＣＡＴＣＴＧＡＧＧＡＣＴＣＴＧＴＣＧＴＣＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＧＡＧＧＧＧＧＧＧＡＴＴＡＣＧＡＣＧＡＡＧＡＡＴＡＣＴＡＴＣＴＣＡＴＧＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＡＧＧＣＡＣＣＡＣＴＣＴＣＡＣＡＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＧＴＧＧＡＧＧＣＧＧＴＴＣＡＧＧＣＧＧＡＧＧＴＧＧＣＴＣＴＧＧＣＧＧＴＧＧＣＧＧＡＴＣＧＣＡＡＡＴＴＧＴＴＣＴＣＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＧＣＡＡＴＣＡＴＧＴＣＴＧＣＡＴＣＴＣＣＡＧＧＧＧＡＧＡＡＧＧＴＣＡＣＣＡＴＧＡＣＣＴＧＣＡＧＴＧＣＣＡＧＣＴＣＡＡＧＴＧＴＡＡＧＴＴＡＣＡＴＧＴＡＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＡＧＧＡＴＣＣＴＣＣＣＣＣＡＧＡＣＴＣＣＴＧＡＴＴＴＡＴＧＡＣＡＣＡＴＣＣＡＡＣＣＴＧＧＣＴＴＣＴＧＧＡＧＴＣＣＣＴＧＴＴＣＧＣＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＧＴＣＴＧＧＧＡＣＣＴＣＴＴＡＣＴＣＴＣＴＣＡＣＡＡＴＣＡＧＣＣＧＡＡＴＧＧＡＧＧＣＴＧＡＡＧＡＴＧＣＴＧＣＣＡＣＴＴＡＴＴＡＣＴＧＣＣＡＧＣＡＧＴＧＧＡＧＴＡＧＴＴＡＣＣＣＧＣＴＣＡＣＧＴＴＣＧＧＴＧＣＴＧＧＧＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＡＡＴＣＡＡＡＣＧＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡ（配列番号７４）を含むポリヌクレオチドである。
【０１０３】
したがって、さらなる実施形態において、薬剤は、配列番号５６のＳｃＦｖ領域をコードする、ヌクレオチド配列ＡＴＧＧＣＣＧＡＧＧＴＴＣＡＧＣＴＴＣＡＧＣＡＧＴＣＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＣＴＧＡＴＧＡＡＧＣＣＴＧＧＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＡＧＡＴＡＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＡＣＴＧＧＣＴＡＣＡＣＡＴＴＣＡＧＴＡＧＣＴＡＣＴＧＧＡＴＡＧＡＧＴＧＧＧＴＡＡＡＧＣＡＧＡＧＧＣＣＴＧＧＡＣＡＴＧＧＣＣＴＴＧＡＧＴＧＧＡＴＴＧＧＡＧＡＧＡＴＴＴＴＡＣＣＴＧＧＡＡＧＴＧＧＴＡＧＴＡＣＴＡＡＴＴＡＣＡＡＴＧＡＧＡＡＧＴＴＣＡＡＧＧＧＣＡＡＧＧＣＣＡＣＡＴＴＣＡＣＴＧＣＡＧＡＴＡＣＡＴＣＣＴＣＣＡＡＣＡＣＡＧＣＣＴＡＣＡＴＧＣＡＡＣＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＣＡＴＣＴＧＡＧＧＡＣＴＣＴＧＣＣＧＴＣＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＡＡＧＡＧＧＧＧＧＧＧＡＴＴＡＣＧＡＣＧＡＡＧＡＡＴＡＣＴＡＴＧＴＣＡＴＧＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＡＧＧＡＡＣＣＴＣＡＧＴＣＡＣＴＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＧＴＧＧＡＧＧＣＧＧＴＴＣＡＧＧＣＧＧＡＧＧＴＧＧＣＴＣＴＧＧＣＧＧＴＧＧＣＧＧＡＴＣＧＣＡＡＡＴＴＧＴＴＣＴＣＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＧＣＡＡＴＣＡＴＧＴＣＴＧＣＡＴＣＴＣＣＡＧＧＧＧＡＧＡＡＧＧＴＣＡＣＣＡＴＧＡＣＣＴＧＣＡＧＴＧＣＣＡＧＣＴＣＡＡＧＴＧＴＡＡＧＴＴＡＣＡＴＧＴＡＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＡＧＧＡＴＣＣＴＣＣＣＣＣＡＧＡＣＴＣＣＴＧＡＴＴＴＡＴＧＡＣＡＣＡＴＣＣＡＡＣＣＴＧＧＣＴＴＣＴＧＧＡＧＴＣＣＣＴＧＴＴＣＧＣＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＧＴＣＴＧＧＧＡＣＣＴＣＴＴＡＣＴＣＴＣＴＣＡＣＡＡＴＣＡＧＣＣＧＡＡＴＧＧＡＧＧＣＴＧＡＡＧＡＴＧＣＴＧＣＣＡＣＴＴＡＴＴＡＣＴＧＣＣＡＧＣＡＧＴＧＧＡＧＴＡＧＴＴＡＣＣＣＧＣＴＣＡＣＧＴＴＣＧＧＴＧＣＴＧＧＧＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＡＡＡＣＧＴ
（配列番号７５）を含むポリヌクレオチドである。
【０１０４】
さらに具体的な実施形態において、薬剤は、配列番号５７のＳｃＦｖ領域をコードする、ヌクレオチド配列ＡＴＧＧＣＣＧＡＧＧＴＴＣＡＧＣＴＴＣＡＧＣＡＧＴＣＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＣＴＧＡＴＧＡＡＧＣＣＴＧＧＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＡＧＡＴＡＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＡＣＴＧＧＣＴＡＣＡＣＡＴＴＣＡＧＴＡＧＣＴＡＣＴＧＧＡＴＡＧＡＧＴＧＧＧＴＡＡＡＴＣＡＧＡＧＧＣＣＴＧＧＡＣＡＴＧＧＣＣＴＴＧＡＧＴＧＧＡＴＴＧＧＡＧＡＧＡＴＴＴＴＡＣＣＴＧＧＡＡＧＴＧＧＴＡＧＴＡＣＴＡＡＴＴＡＣＡＡＴＧＡＧＡＡＧＴＴＣＡＡＧＧＧＣＡＡＧＧＣＣＡＣＡＴＴＣＡＣＴＧＣＡＧＡＴＡＣＡＴＣＣＴＣＣＡＡＣＡＣＡＧＣＣＴＡＣＡＴＧＣＡＡＣＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＣＡＴＣＴＧＡＧＧＡＣＴＣＴＧＣＣＧＴＣＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＡＡＧＡＧＧＧＧＧＧＧＡＴＴＡＣＧＡＣＧＡＡＧＡＡＴＡＣＴＡＴＧＣＴＡＴＧＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＡＧＧＡＡＣＣＴＣＡＧＴＣＡＣＣＣＴＣＴＣＣＴＣＡＧＧＴＧＧＡＧＧＣＧＧＴＴＣＡＧＧＣＧＧＡＧＧＴＧＧＣＴＣＴＧＧＣＧＧＴＧＧＣＧＧＡＴＣＧＣＡＡＡＴＴＧＴＴＣＴＣＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＧＣＡＡＴＣＡＴＧＴＣＴＧＣＡＴＣＴＣＣＡＧＧＧＧＡＧＡＡＧＧＴＣＡＣＣＡＴＧＡＣＣＴＧＣＡＧＴＧＣＣＡＧＣＴＣＡＡＧＴＧＴＡＡＧＴＴＡＣＡＴＧＴＡＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＡＧＧＡＴＣＣＴＣＣＣＣＣＡＧＡＣＴＣＣＴＧＡＴＴＴＡＴＧＡＣＡＣＡＴＣＣＡＡＣＣＴＧＧＣＴＴＣＴＧＧＡＧＴＣＣＣＴＧＴＴＣＧＣＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＧＴＣＴＧＧＧＡＣＣＴＣＴＴＡＣＴＣＴＣＴＣＡＣＡＡＴＣＡＧＣＣＧＡＡＴＧＧＡＧＧＣＴＧＡＡＧＡＴＧＣＴＧＣＣＡＣＴＴＡＴＴＡＣＴＧＣＣＡＧＣＡＧＴＧＧＡＧＴＡＧＴＴＡＣＣＣＧＣＴＣＡＣＧＴＴＣＧＧＴＧＣＴＧＧＧＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＡＡＡＣＧＴ
（配列番号７６）を含むポリヌクレオチドである。
【０１０５】
抗体は、標準的な技術によって、例えば、適切な（糖）ポリペプチドもしくはその一部分（複数可）を用いた免疫化によって、またはファージディスプレイライブラリを使用することによって、産生させることができる。
【０１０６】
ポリクローナル抗体が所望される場合、選択された哺乳動物（例えば、マウス、ラビット、ヤギ、ウマ等）が、任意選択的に別のポリペプチドにハプテン化された所望のエピトープ（複数可）を担持する免疫原性ポリペプチドで免疫される。宿主種に依存して、免疫学的応答を増大させるために種々のアジュバントが使用され得る。そのようなアジュバントは、限定されないが、フロイント、ミネラルゲル、例えば、水酸化アルミニウム、表面活性物質、例えば、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、及びジニトロフェノールを含む。免疫した動物から血清を回収し、既知の手順に従って処理する。所望のエピトープに対するポリクローナル抗体を含有する血清が他の抗原に対する抗体を含有する場合、ポリクローナル抗体は、免疫親和性クロマトグラフィーによって精製することができる。ポリクローナル抗血清を作製及び処理するための技術は、当該技術分野で周知である。
【０１０７】
ポリペプチド全体またはその特定のエピトープを標的としたモノクローナル抗体も、当業者によって容易に産生され得る。モノクローナル抗体を作製するための一般的な方法は周知である。不死抗体産生細胞株は、細胞融合によって、また他の技術、例えば、腫瘍ＤＮＡを用いたＢリンパ球の直接形質転換、またはエプスタイン・バーウイルスを用いたトランスフェクションによって作ることができる。上に列挙したポリペプチドに対して産生されるモノクローナル抗体のパネルを、種々の特性に対して、すなわち、アイソタイプ及びエピトープ親和性についてスクリーニングすることができる。モノクローナル抗体は、培養液中の連続継代細胞株による抗体分子の産生を提供する周知の技術のいずれかを用いて調製され得る。
【０１０８】
抗体は、モノクローナル抗体であることが好ましい。ある状況において、特に、抗体がヒト患者に繰り返し投与される場合、ヒトへの投与に好適なモノクローナル抗体は、投与される免疫グロブリンに対してヒトが免疫応答を生じないヒトモノクローナル抗体またはヒト化モノクローナル抗体であることが好ましい。好適に調製される非ヒト抗体は、既知の様式で、例えば、マウス抗体のＣＤＲ領域をヒト抗体のフレームワークに挿入することによって、「ヒト化」することができる。ヒト化抗体は、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９，１５３４−１５３６、及びＫｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ，（１９９１）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｌ４（７），７７３−７８３に記載される技術及び手法を用いて作製することができる。場合によって、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基が、対応する非ヒト残基によって置換される。一般に、ヒト化抗体は、ＣＤＲ領域の全てまたはほとんどが非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応し、フレームワーク領域が、実質的にまたは完全にヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のフレームワーク領域である、可変ドメインを含有する。
【０１０９】
完全ヒト抗体は、組換え技術を用いて産生してもよい。典型的には、何十億もの異なる抗体を含む大規模なライブラリが使用される。例えば、マウス抗体のキメラ化またはヒト化を用いる以前の技術とは対照的に、この技術は、特異的抗体を作製するために動物の免疫化に依存しない。代わりに、組換えライブラリは、膨大な数の予め作製された抗体変異体を含み、この場合、ライブラリは、任意の抗原に特異的な少なくとも１つの抗体を有する。したがって、そのようなライブラリを使用して、所望の結合特性を有する既存の抗体を同定することができる。ライブラリ中で良好な結合剤を効率的な様式で見つけるために、表現型、すなわち、抗体または抗体断片が、その遺伝子型、すなわち、コードする遺伝子に結合された種々の系が考案されてきた。最も一般的に使用されているそのような系は、いわゆるファージディスプレイ系であり、抗体断片が、繊維状ファージ粒子の表面上でファージコートタンパク質との融合体として発現され、提示される一方で、それと同時に、提示された分子をコードする遺伝子情報を担う（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ，１９９０，Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５４）。特定の抗原に特異的な抗体断片を提示するファージは、当該抗原への結合によって選択され得る。次いで、単離されたファージが増幅され得、選択された抗体可変ドメインをコードする遺伝子が、任意選択的に他の抗体フォーマット、例えば、完全長免疫グロブリンに移され、当該技術分野で周知の適切なベクター及び宿主細胞を用いて大量に発現され得る。代替的に、「ヒト」抗体は、本質的にヒト免疫グロブリン遺伝子を含有するトランスジェニックマウスを免疫することによって作製することができる（Ｖａｕｇｈａｎ  ｅｔ  ａｌ（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６，５３５−５３９）。
【０１１０】
非ヒト個体への投与用である場合、抗体は、対象とするレシピエント種に特異的に設計／産生され得ることを理解されたい。
【０１１１】
ファージ粒子状に提示される抗体特異性の形態は異なり得る。最も一般的に使用される形態は、Ｆａｂ（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  ｅｔ  ａｌ，１９９４．ＥＭＢＯ  Ｊ．１３：３２４５−３２６０）及び一本鎖（ｓｃＦｖ）（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ，１９９２，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２２７：３８１−３８８）であり、どちらも抗体の可変抗原結合ドメインを含む。一本鎖形態は、柔軟なリンカーを介して可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）に連結された可変重鎖ドメイン（ＶＨ）から構成される（ＵＳ４，９４６，７７８）。治療薬として使用される前に、抗体を、可溶性形態、例えば、ＦａｂまたはｓｃＦｖに移してそのまま分析することができる。後のステップにおいて、望ましい特徴を有すると同定された抗体断片が、完全長抗体等のさらに他の形態に移されてもよい。
【０１１２】
ＷＯ  ９８／３２８４５及びＳｏｄｅｒｌｉｎｄ  ｅｔ  ａｌ（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌ．１８：８５２−８５６は、抗体ライブラリに可変性をもたらすための技術について記載している。このライブラリに由来する抗体断片は全て、同じフレームワーク領域を有し、それらのＣＤＲにおいてのみ異なる。フレームワーク領域は生殖系列配列であるため、このライブラリ、または同じ技術を用いて生成された同様のライブラリに由来する抗体の免疫原性は、特に低いことが予想される（Ｓｏｄｅｒｌｉｎｄ  ｅｔ  ａｌ，２０００）。この特性は、治療抗体にとって非常に価値があり、患者が投与された抗体に対する抗体を形成するリスクを低減し、それによってアレルギー反応、ブロッキング抗体の発生のリスクを低減し、抗体の長い血漿半減期を可能にする。したがって、ヒトにおいて使用される治療抗体を開発する場合、現在は、初期のハイブリドーマ技術に優先して、現行の組換えライブラリ技術（Ｓｏｄｅｒｌｉｎｄ  ｅｔ  ａｌ，２００１，Ｃｏｍｂ．Ｃｈｅｍ．＆Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎ．４：４０９−４１６）が用いられる。
【０１１３】
抗体には、構造的にラクダ科の抗体に由来する重鎖抗体、例えば、Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）（Ａｂｌｙｎｘ）も含まれる。これらは、天然に存在する重鎖抗体の構造的及び機能的特性を有する抗体に由来する治療タンパク質である。Ｎａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）技術は、ラクダ科（ラクダ及びラマ）が軽鎖を欠いた完全に機能的な抗体を保有するという発見後に開発された。これらの重鎖抗体は、単一の可変ドメイン（ＶＨＨ）及び２つの定常ドメイン（ＣＨ２及びＣＨ３）を含有する。クローン化され、単離されたＶＨＨドメインは、元の重鎖抗体の完全な抗原結合能を有する完全に安定なポリペプチドである。これらのＶＨＨドメインは、特有の構造的及び機能的特性によってＮａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）の基礎を成す。それらは、従来の抗体の利点（高い標的特異性、高い標的親和性、及び低い固有毒性）と、小分子薬物の重要な特徴（酵素を阻害し、受容体の間隙に到達する能力）とを併せ持っている。さらに、それらは安定であり、注射以外の手段によって投与される可能性を有し、より製造し易く、またヒト化することができる。（例えば、ＵＳ５，８４０，５２６、ＵＳ５，８７４，５４１、ＵＳ６，００５，０７９、ＵＳ６．７６５，０８７、ＥＰ１  ５８９  １０７、ＷＯ９７／３４１０３、ＷＯ９７／４９８０５、ＵＳ５，８００，９８８、ＵＳ５，８７４，５４１、及びＵＳ６，０１５，６９５）。
【０１１４】
本発明の第２の態様は、ＣＬＥＣ１４Ａポリペプチドへの特異的結合についてＭＭＲＮ２と競合する抗体を提供する。
【０１１５】
疑義を避けるために、本発明のこの態様の抗体は、本発明の第１の態様に関連して前述したもののいずれかを含み、本発明のこの態様に記載される任意の抗体が、本発明の第１の態様の方法及び使用において使用され得ることを理解されたい。
【０１１６】
特異的結合についてＭＭＲＮ２と競合する抗体は、ＣＬＥＣ１４ＡとＭＭＲＮ２との間の結合レベルを、抗体の非存在下でのＣＬＥＣ１４ＡとＭＭＲＮ２との間の結合レベルと比較して少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％低下させることが好ましく、より好ましくは、結合レベルを少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％低下させることが好ましい。最も好ましくは、特異的結合についてＭＭＲＮ２と競合する抗体は、ＣＬＥＣ１４ＡとＭＭＲＮ２との間の結合レベルを検出不能なレベルまで低下させるか、またはＣＬＥＣ１４ＡとＭＭＲＮ２との間の結合を排除する抗体である。
【０１１７】
抗体がＣＬＥＣ１４Ａポリペプチドへの特異的結合についてＭＭＲＮ２と競合するかどうかを評価するための方法は、当該技術分野で周知であり、例えば、本発明の第１の態様及び実施例１に関連して記載される。一般的に、この方法は、様々な濃度の所与の抗体の存在下でＣＬＥＣ１４ＡとＭＭＲＮ２との間の結合レベルを評価すること、または様々な濃度のＭＭＲＮ２の存在下でＣＬＥＣ１４Ａと所与の抗体との間の結合レベルを評価することを含む。所与の抗体とＭＭＲＮ２とがＣＬＥＣ１４Ａポリペプチドへの特異的結合について競合する場合、所与の抗体またはＭＭＲＮ２のいずれかの濃度を変更したときに、測定される結合レベルが変化すると予想される。例えば、所与の抗体とＭＭＲＮ２とが特異的結合について競合する場合、ＭＭＲＮ２の存在下でのＣＬＥＣ１４Ａと所与の抗体との間の結合レベルは、ＭＭＲＮ２の非存在下でのＣＬＥＣ１４Ａと所与の抗体との間の結合レベルよりも低いと予想される。所与の抗体とＭＭＲＮ２とが特異的結合について競合しない場合（例えば、それらがＣＬＥＣ１４Ａポリペプチドの別々の領域に結合している場合）、結合レベルの変化は予想されないであろう。結合を測定するための好適な技術は、本明細書の他の箇所に、例えば、本発明の第１の態様に関連して記載され、免疫沈降技術、ＥＬＩＳＡ、及びウェスタンブロットを含む。
【０１１８】
好ましくは、抗体は、ＣＬＥＣ１４とＭＭＲＮ２との間の相互作用に直接的に関与するＣＬＥＣ１４Ａの領域に特異的に結合する抗体である。例えば、抗体は、ＣＬＥＣ１４ＡのＭＭＲＮ２結合部位に結合することができ、そのためＭＭＲＮ２の結合を直接的にブロックする。ＭＭＲＮ２結合部位は、ＣＬＥＣ１４ＡのＣ型レクチンドメイン内に存在するため、抗体は、典型的には、ＣＬＥＣ１４ＡポリペプチドのＣ型レクチンドメイン内のＭＭＲＮ２結合部位（残基３２〜１７３）に特異的に結合する抗体であることを理解されたい。
【０１１９】
ある実施形態において、ＣＬＥＣ１４Ａポリペプチドに選択的に結合する抗体は、ＣＬＥＣ１４Ａのアミノ酸残基３１〜７２にわたる領域、及び／またはＣＬＥＣ１４Ａのアミノ酸残基３１〜９２にわたる領域、及び／またはＣＬＥＣＡのアミノ酸残基９２〜１７２にわたる領域、及び／またはＣＬＥＣ１４Ａのアミノ酸残基１１２〜１７２にわたる領域、及び／またはＣＬＥＣ１４Ａのアミノ酸残基１５２〜１７２にわたる領域には結合しない。抗体がこれらの領域のいずれかに結合するかどうかは、本明細書に記載される結合アッセイ、例えば、ＥＬＩＳＡを含む、当該技術分野で標準的な技術を用いて評価することができる。
【０１２０】
実施例１に記載されるように、本発明者は、ＣＬＥＣ１４ＡとＭＭＲＮ２との間の相互作用を阻害する抗体が抗血管新生特性及び抗癌特性を有することを示した。具体的には、ＣＬＥＣ１４Ａ−ＭＭＲＮ２ブロッキング抗体は、管形成及び発芽型血管新生をインビトロ及びインビボで阻害するためのものであり、ルイス肺癌を有するマウスにおいて腫瘍の増殖を阻害した。したがって、本発明のこの態様の一実施形態において、抗体は、例えば、血管新生アッセイに示されるように、血管新生を阻害する抗体、及び／または、例えば、癌の動物モデル（例えば、ルイス肺癌を有するマウス）に示されるように、腫瘍増殖を阻害する抗体である。好適な血管新生アッセイは、当該技術分野で周知であり、冠動脈リングアッセイ、スポンジ血管新生アッセイ、内皮細胞増殖のアッセイ、内皮細胞遊走のアッセイ、及び／または内皮細胞浸潤のアッセイを含む。同様に、好適な癌の動物モデルも、当該技術分野で周知である。
【０１２１】
よって、特に好ましい実施形態において、本発明の第２の態様の抗体は、ＣＬＥＣ１４Ａポリペプチドへの特異的結合についてＭＭＲＮ２と競合する抗体であり、抗体は、例えば、血管新生アッセイ（例えば、冠動脈リングアッセイまたはスポンジ血管新生アッセイ）に示されるように、血管新生を阻害する抗体、及び／または、癌の動物モデル（例えば、ルイス肺癌を有するマウス）に示されるように、腫瘍増殖を阻害する抗体である。
【０１２２】
実施例１で例示される抗体のアミノ酸及びポリヌクレオチド配列は、図１１に提供される。
【０１２３】
ある実施形態において、抗体は、
（ａ）アミノ酸配列ＳＳＹＷＩＥ（配列番号１）もしくはＧＹＴＦＳＳＹＷ（配列番号４０）を含む重鎖ＣＤＲ１、
（ｂ）アミノ酸配列ＷＩＧＥＩＬＰＧＳＧＳＴ（配列番号２）、もしくはＷＩＧＥＩＬＰＧＳＧＳＴＮ（配列番号７８）、もしくはＩＬＰＧＳＧＳＴ（配列番号４１）を含む重鎖ＣＤＲ２、及び／または
（ｃ）アミノ酸配列ＡＲＧＧＤＹＤＥＥＹＹＬＭＤ（配列番号３）もしくはＡＲＧＧＤＹＤＥＥＹＹＬＭＤＹ（配列番号４２）を含む重鎖ＣＤＲ３、
あるいは、１個、２個、または３個のアミノ酸置換を含むこれらの配列のいずれかの変異体、を含む。
【０１２４】
別の実施形態において、抗体は、
（ａ）アミノ酸ＳＹＭＹＷＹ（配列番号４）もしくはＳＳＶＳＹ（配列番号４３）を含む軽鎖ＣＤＲ１、
（ｂ）アミノ酸配列ＬＬＩＹＤＴＳＮＬＡ（配列番号５）もしくはＤＴＳを含む軽鎖ＣＤＲ２、及び／または
（ｃ）アミノ酸ＱＱＷＳＳＹＰＬ（配列番号６）もしくはＱＱＷＳＳＹＰＬＴ（配列番号４４）を含む軽鎖ＣＤＲ３、
あるいは、１個、２個、または３個のアミノ酸置換を含むこれらの配列のいずれかの変異体、を含む。
【０１２５】
さらなる実施形態において、抗体は、
（ａ）アミノ酸配列ＳＳＹＷＩＥ（配列番号１）を含む重鎖ＣＤＲ１；（ｂ）アミノ酸配列ＷＩＧＥＩＬＰＧＳＧＳＴ（配列番号２）もしくはＷＩＧＥＩＬＰＧＳＧＳＴＮ（配列番号７８）を含む重鎖ＣＤＲ２；（ｃ）アミノ酸配列ＡＲＧＧＤＹＤＥＥＹＹＬＭＤ（配列番号３）を含む重鎖ＣＤＲ３；（ｄ）アミノ酸配列ＳＹＭＹＷＹ（配列番号４）を含む軽鎖ＣＤＲ４；（ｅ）アミノ酸配列ＬＬＩＹＤＴＳＮＬＡ（配列番号５）を含む軽鎖ＣＤＲ５、及び／または（ｅ）アミノ酸配列ＱＱＷＳＳＹＰＬ（配列番号６）を含む軽鎖ＣＤＲ６；あるいは、１個、２個、または３個のアミノ酸置換を含むこれらの配列のいずれかの変異体、の１つ以上または全部を含むか、
ないしは、抗体は、
アミノ酸配列ＧＹＴＦＳＳＹＷ（配列番号４０）を含む重鎖ＣＤＲ１；アミノ酸配列ＩＬＰＧＳＧＳＴ（配列番号４１）を含む重鎖ＣＤＲ２；アミノ酸配列ＡＲＧＧＤＹＤＥＥＹＹＬＭＤＹ（配列番号４２）を含む重鎖ＣＤＲ３；アミノ酸配列ＳＳＶＳＹ（配列番号４３）を含む軽鎖ＣＤＲ１；アミノ酸配列ＤＴＳを含む軽鎖ＣＤＲ２；及びアミノ酸配列ＱＱＷＳＳＹＰＬＴ（配列番号４４）を含む軽鎖ＣＤＲ３；あるいは１個、２個、もしくは３個のアミノ酸置換を含む該配列のいずれかの変異体、の１つ以上または全部を含んでもよい。
【０１２６】
本発明の第２の態様のさらなる実施形態において、抗体は、
（ａ）アミノ酸配列ＳＳＹＷＩＥ（配列番号１）もしくはＧＹＴＦＳＳＹＷ（配列番号４０）を含む重鎖ＣＤＲ１、
（ｂ）アミノ酸配列ＷＩＧＥＩＬＰＧＳＧＳＴＮ（配列番号７８）もしくはＩＬＰＧＳＧＳＴ（配列番号４１）を含む重鎖ＣＤＲ２、及び／または
（ｃ）アミノ酸配列ＡＲＧＧＤＹＤＥＥＹＹＶＭＤ（配列番号７７）もしくはＡＲＧＧＤＹＤＥＥＹＹＶＭＤＹ（配列番号４５）を含む重鎖ＣＤＲ３、
あるいは、１個、２個、または３個のアミノ酸置換を含むこれらの配列のいずれかの変異体、を含む。
【０１２７】
本発明の第２の態様のなおもさらなる実施形態において、抗体は、前述のような軽鎖及び重鎖ＣＤＲの両方を含んでもよい。例えば、抗体は、アミノ酸配列（配列番号１）を含む重鎖ＣＤＲ１；アミノ酸配列（配列番号７８）を含む重鎖ＣＤＲ２；アミノ酸配列（配列番号７７）を含む重鎖ＣＤＲ３；アミノ酸配列（配列番号４）を含む軽鎖ＣＤＲ１；アミノ酸配列（配列番号５）を含む軽鎖ＣＤＲ２；及びアミノ酸配列（配列番号６）を含む軽鎖ＣＤＲ３、または１個、２個、もしくは３個のアミノ酸置換を含む該配列のいずれかの変異体、を含んでもよいか；あるいは、抗体は、アミノ酸配列（配列番号４０）を含む重鎖ＣＤＲ１；アミノ酸配列（配列番号４１）を含む重鎖ＣＤＲ２；アミノ酸配列（配列番号４５）を含む重鎖ＣＤＲ３；アミノ酸配列（配列番号４３）を含む軽鎖ＣＤＲ１；アミノ酸配列ＤＴＳを含む軽鎖ＣＤＲ２；及びアミノ酸配列（配列番号４４）を含む軽鎖ＣＤＲ３、または１個、２個、もしくは３個のアミノ酸置換を含む該配列のいずれかの変異体、を含んでもよい。
【０１２８】
本発明の第２の態様のなおもさらなる実施形態において、抗体は、
（ａ）アミノ酸配列ＳＳＹＷＩＥ（配列番号１）もしくはＧＹＴＦＳＳＹＷ（配列番号４０）を含む重鎖ＣＤＲ１、（ｂ）アミノ酸配列ＷＩＧＥＩＬＰＧＳＧＳＴＮ（配列番号７８）もしくはＩＬＰＧＳＧＳＴ（配列番号４１）を含む重鎖ＣＤＲ２、及び／または（ｃ）アミノ酸配列ＡＲＧＧＤＹＤＥＥＹＹＡＭＤ（配列番号４６）もしくはＡＲＧＧＤＹＤＥＥＹＹＡＭＤＹ（配列番号４７）を含む重鎖ＣＤＲ３、
あるいは、１個、２個、または３個のアミノ酸置換を含むこれらの配列のいずれかの変異体、を含む。
【０１２９】
本発明の第２の態様のさらなる実施形態において、抗体は、
（ａ）アミノ酸ＳＹＭＹＷＹ（配列番号４）もしくはＳＳＶＳＹ（配列番号４３）を含む軽鎖ＣＤＲ１、
（ｂ）アミノ酸配列ＬＬＩＹＤＴＳＮＬＡ（配列番号５）もしくはＤＴＳを含む軽鎖ＣＤＲ２、及び／または
（ｃ）アミノ酸配列ＱＱＷＳＳＹＰＬ（配列番号６）もしくはＱＱＷＳＳＹＰＬＴＦ（配列番号４８）を含む軽鎖ＣＤＲ３、あるいは、１個、２個、または３個のアミノ酸置換を含むこれらの配列のいずれかの変異体、を含む。
【０１３０】
本発明の第２の態様のなおもさらなる実施形態において、前述のような軽鎖及び重鎖ＣＤＲの両方を含んでもよい。
【０１３１】
例えば、抗体は、アミノ酸配列（配列番号１）を含む重鎖ＣＤＲ１；アミノ酸配列（配列番号７８）を含む重鎖ＣＤＲ２；アミノ酸配列（配列番号４６）を含む重鎖ＣＤＲ３；アミノ酸配列（配列番号４）を含む軽鎖ＣＤＲ１；アミノ酸配列（配列番号５）を含む軽鎖ＣＤＲ２；及びアミノ酸配列（配列番号６）を含む軽鎖ＣＤＲ３、または１個、２個、もしくは３個のアミノ酸置換を含む該配列のいずれかの変異体を含んでもよいか；あるいは、抗体は、アミノ酸配列（配列番号４０）を含む重鎖ＣＤＲ１；アミノ酸配列（配列番号４１）を含む重鎖ＣＤＲ２；アミノ酸配列（配列番号４７）を含む重鎖ＣＤＲ３；アミノ酸配列（配列番号４３）を含む軽鎖ＣＤＲ１；アミノ酸配列ＤＴＳを含む軽鎖ＣＤＲ２；及びアミノ酸配列（配列番号４８）を含む軽鎖ＣＤＲ３、または１個、２個、もしくは３個のアミノ酸置換を含む該配列のいずれかの変異体を含んでもよい。
【０１３２】
本発明の第２の態様のより具体的な実施形態において、抗体は、アミノ酸配列
ＭＡＱＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＭＫＰＧＡＳＶＫＩＳＣＫＡＴＧＹＴＦＳＳＹＷＩＥＷＶＮＲＲＰＧＨＧＬＥＷＩＧＥＩＬＰＧＳＧＳＴＮＹＮＥＫＦＫＧＫＡＴＦＴＡＤＴＳＳＮＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＧＧＤＹＤＥＥＹＹＬＭＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳ（配列番号７）、
またはＭＡＱＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＭＫＰＧＡＳＶＫＩＳＣＫＡＴＧＹＴＦＳＳＹＷＩＥＷＶＮＲＲＰＧＨＧＬＥＷＩＧＥＩＬＰＧＳＧＳＴＮＹＮＥＫＦＫＧＫＡＴＦＴＡＤＴＳＳＮＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＧＧＤＹＤＥＥＹＹＬＭＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶ（配列番号４９）、
または１個、２個、３個、４個、もしくは５個のアミノ酸置換を含むこの配列の変異体、を含む重鎖可変領域を含む。
【０１３３】
付加的にまたは代替的に（すなわち、任意選択的に前述の重鎖アミノ酸配列と組み合わせて）、抗体は、アミノ酸配列
ＱＩＶＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＳＡＳＳＳＶＳＹＭＹＷＹＱＱＫＰＧＳＳＰＲＬＬＩＹＤＴＳＮＬＡＳＧＶＰＶＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＲＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＹＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＩＫＲＡＡ（配列番号８）、
またはＱＩＶＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＳＡＳＳＳＶＳＹＭＹＷＹＱＱＫＰＧＳＳＰＲＬＬＩＹＤＴＳＮＬＡＳＧＶＰＶＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＲＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＹＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＩＫＲＡＡＡ（配列番号５０）、
または１個、２個、３個、４個、もしくは５個のアミノ酸置換を含むこの配列の変異体、を含む軽鎖可変領域を含んでもよい。
【０１３４】
したがって、特に好ましい実施形態において、抗体は、アミノ酸配列
ＭＡＱＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＭＫＰＧＡＳＶＫＩＳＣＫＡＴＧＹＴＦＳＳＹＷＩＥＷＶＮＲＲＰＧＨＧＬＥＷＩＧＥＩＬＰＧＳＧＳＴＮＹＮＥＫＦＫＧＫＡＴＦＴＡＤＴＳＳＮＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＧＧＤＹＤＥＥＹＹＬＭＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳ（配列番号７）
またはＭＡＱＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＭＫＰＧＡＳＶＫＩＳＣＫＡＴＧＹＴＦＳＳＹＷＩＥＷＶＮＲＲＰＧＨＧＬＥＷＩＧＥＩＬＰＧＳＧＳＴＮＹＮＥＫＦＫＧＫＡＴＦＴＡＤＴＳＳＮＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＧＧＤＹＤＥＥＹＹＬＭＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶ（配列番号４９）、または１個、２個、３個、４個、もしくは５個のアミノ酸置換を含むこの配列の変異体、を含む重鎖可変領域、
及びアミノ酸配列ＱＩＶＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＳＡＳＳＳＶＳＹＭＹＷＹＱＱＫＰＧＳＳＰＲＬＬＩＹＤＴＳＮＬＡＳＧＶＰＶＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＲＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＹＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＩＫＲＡＡ（配列番号８）
またはＱＩＶＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＳＡＳＳＳＶＳＹＭＹＷＹＱＱＫＰＧＳＳＰＲＬＬＩＹＤＴＳＮＬＡＳＧＶＰＶＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＲＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＹＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＩＫＲＡＡＡ（配列番号５０）、または１個、２個、３個、４個もしくは５個のアミノ酸置換を含むこの配列の変異体、を含む軽鎖可変領域を含んでもよい。
【０１３５】
本発明の第２の態様のさらにより具体的な実施形態において、抗体は、アミノ酸配列
ＭＡＥＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＭＫＰＧＡＳＶＫＩＳＣＫＡＴＧＹＴＦＳＳＹＷＩＥＷＶＫＱＲＰＧＨＧＬＥＷＩＧＥＩＬＰＧＳＧＳＴＮＹＮＥＫＦＫＧＫＡＴＦＴＡＤＴＳＳＮＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＧＧＤＹＤＥＥＹＹＶＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶ（配列番号５１）、または１個、２個、３個、４個、もしくは５個のアミノ酸置換を含むこの配列の変異体、を含む重鎖可変領域を含む。
【０１３６】
付加的にまたは代替的に（すなわち、任意選択的に前述の重鎖アミノ酸配列と組み合わせて）、抗体は、アミノ酸配列ＱＩＶＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＳＡＳＳＳＶＳＹＭＹＷＹＱＱＫＰＧＳＳＰＲＬＬＩＹＤＴＳＮＬＡＳＧＶＰＶＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＲＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＹＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫＲ（配列番号５２）、
または１個、２個、３個、４個、もしくは５個のアミノ酸置換を含むこの配列の変異体、を含む軽鎖可変領域を含んでもよい。
【０１３７】
したがって、特に好ましい実施形態において、抗体は、アミノ酸配列（配列番号５１）を含む重鎖可変領域、及びアミノ酸配列（配列番号５２）を含む軽鎖可変領域、または１個、２個、３個、４個、もしくは５個のアミノ酸置換を含むこれらの配列の変異体を含んでもよい。
【０１３８】
本発明の第２の態様のさらにより具体的な実施形態において、抗体は、アミノ酸配列
ＭＡＥＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＭＫＰＧＡＳＶＫＩＳＣＫＡＴＧＹＴＦＳＳＹＷＩＥＷＶＮＱＲＰＧＨＧＬＥＷＩＧＥＩＬＰＧＳＧＳＴＮＹＮＥＫＦＫＧＫＡＴＦＴＡＤＴＳＳＮＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＧＧＤＹＤＥＥＹＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶ（配列番号５３）、
または１個、２個、３個、４個、もしくは５個のアミノ酸置換を含むこの配列の変異体、を含む重鎖可変領域を含む。
【０１３９】
付加的にまたは代替的に（すなわち、任意選択的に前述の重鎖アミノ酸配列と組み合わせて）、抗体は、アミノ酸配列ＱＩＶＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＳＡＳＳＳＶＳＹＭＹＷＹＱＱＫＰＧＳＳＰＲＬＬＩＹＤＴＳＮＬＡＳＧＶＰＶＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＲＭＥＡＥＤＧＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＹＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫＲ（配列番号５４）、
または１個、２個、３個、４個、もしくは５個のアミノ酸置換を含むこの配列の変異体、を含む軽鎖可変領域を含んでもよい。
【０１４０】
したがって、特に好ましい実施形態において、抗体は、アミノ酸配列（配列番号５３）を含む重鎖可変領域、及びアミノ酸配列（配列番号５４）を含む軽鎖可変領域、または１個、２個、３個、４個、もしくは５個のアミノ酸置換を含むこの配列の変異体、を含んでもよい。
【０１４１】
上で説明したように、抗体が、特定のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、及び特定のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を有すると定義される場合、これらの配列のうち最大１つまたは２つが定義されるように変異され得ることを理解されたい。変異は、配列の非ＣＤＲ領域内に存在してもよい。そのような変異体についての選好は、本発明の第１の態様に関連して前述したものを含む。
【０１４２】
本発明の第２の態様のさらに具体的な実施形態において、抗体は、配列ＭＡＱＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＭＫＰＧＡＳＶＫＩＳＣＫＡＴＧＹＴＦＳＳＹＷＩＥＷＶＮＲＲＰＧＨＧＬＥＷＩＧＥＩＬＰＧＳＧＳＴＮＹＮＥＫＦＫＧＫＡＴＦＴＡＤＴＳＳＮＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＶＶＹＹＣＡＲＧＧＤＹＤＥＥＹＹＬＭＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＩＶＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＳＡＳＳＳＶＳＹＭＹＷＹＱＱＫＰＧＳＳＰＲＬＬＩＹＤＴＳＮＬＡＳＧＶＰＶＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＲＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＹＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＩＫＲＡＡＡ（配列番号５５）または１個、２個、３個、４個、もしくは５個のアミノ酸置換を含むこの配列の変異体を含む。
【０１４３】
本発明の第２の態様の別の具体的な実施形態において、抗体は、配列ＭＡＥＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＭＫＰＧＡＳＶＫＩＳＣＫＡＴＧＹＴＦＳＳＹＷＩＥＷＶＫＱＲＰＧＨＧＬＥＷＩＧＥＩＬＰＧＳＧＳＴＮＹＮＥＫＦＫＧＫＡＴＦＴＡＤＴＳＳＮＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＧＧＤＹＤＥＥＹＹＶＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＩＶＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＳＡＳＳＳＶＳＹＭＹＷＹＱＱＫＰＧＳＳＰＲＬＬＩＹＤＴＳＮＬＡＳＧＶＰＶＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＲＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＹＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫＲ
（配列番号５６）または１個、２個、３個、４個、もしくは５個のアミノ酸置換を含むこの配列の変異体を含む。
【０１４４】
本発明の第２の態様の別の具体的な実施形態において、抗体は、配列ＭＡＥＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＭＫＰＧＡＳＶＫＩＳＣＫＡＴＧＹＴＦＳＳＹＷＩＥＷＶＮＱＲＰＧＨＧＬＥＷＩＧＥＩＬＰＧＳＧＳＴＮＹＮＥＫＦＫＧＫＡＴＦＴＡＤＴＳＳＮＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＧＧＤＹＤＥＥＹＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＬＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＩＶＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＳＡＳＳＳＶＳＹＭＹＷＹＱＱＫＰＧＳＳＰＲＬＬＩＹＤＴＳＮＬＡＳＧＶＰＶＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＲＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＹＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫＲ（配列番号５７）または１個、２個、３個、４個、もしくは５個のアミノ酸置換を含むこの配列の変異体を含む。
【０１４５】
本発明のこの態様はまた、例えば、ＣＬＥＣ１４Ａポリペプチドへの特異的結合について特定のアミノ酸配列を参照することにより、本明細書に記載される抗体のいずれかと競合する抗体も含む。したがって、本発明は、本明細書に記載される抗体のいずれかによって選択的に結合されるＣＬＥＣ１４Ａ内のエピトープに選択的に結合する抗体を提供する。特に好ましい実施形態において、本発明は、配列番号７を有する重鎖可変領域及び配列番号８を有する軽鎖可変領域；または配列番号４９を有する重鎖可変領域及び配列番号５０を有する軽鎖可変領域；または配列番号５１を有する重鎖可変領域及び配列番号５２を有する軽鎖可変領域；または配列番号５３を有する重鎖可変領域及び配列番号５４を有する軽鎖可変領域を含む抗体によって選択的に結合されるＣＬＥＣＡ１４Ａ内のエピトープに結合する抗体を提供する。
【０１４６】
本発明の第３の態様は、本発明の第２の態様の抗体をコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明の第３の態様は、本発明の第２の態様の抗体をコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子を提供することを理解されたい。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子であってもよい。
【０１４７】
ある実施形態において、ポリヌクレオチドは、以下のヌクレオチド配列のうちの１つ以上を含む：
（ｉ）ＡＧＴＡＧＣＴＡＣＴＧＧＡＴＡＧＡＧ（配列番号９）、
（ｉｉ）ＴＧＧＡＴＴＧＧＡＧＡＧＡＴＴＴＴＡＣＣＴＧＧＡＡＧＴＧＧＴＡＧＴＡＣＴＡＡＴ（配列番号１０）、
（ｉｉｉ）ＧＣＧＡＧＡＧＧＧＧＧＧＧＡＴＴＡＣＧＡＣＧＡＡＧＡＡＴＡＣＴＡＴＣＴＣＡＴＧＧＡＣ（配列番号１１）、
（ｉｖ）ＡＧＴＴＡＣＡＴＧＴＡＣＴＧＧＴＡＣ（配列番号１２）、
（ｖ）ＣＴＣＣＴＧＡＴＴＴＡＴＧＡＣＡＣＡＴＣＣＡＡＣＣＴＧＧＣＴ（配列番号１３）、及び
（ｖｉ）ＣＡＧＣＡＧＴＧＧＡＧＴＡＧＴＴＡＣＣＣＧＣＴＣ（配列番号１４）、
（ｖｉｉ）ＧＧＣＴＡＣＡＣＡＴＴＣＡＧＴＡＧＣＴＡＣＴＧＧ（配列番号６０）
（ｖｉｉｉ）ＡＴＴＴＴＡＣＣＴＧＧＡＧＴＧＧＴＡＧＴＡＣＴ（配列番号６１）
（ｉｘ）ＧＣＧＡＧＡＧＧＧＧＧＧＧＡＴＴＡＣＧＡＣＧＡＡＧＡＡＴＡＣＴＡＴＣＴＣＡＴＧＧＡＣＴＡＣ（配列番号６２）
（ｘ）ＴＣＡＡＧＴＧＴＡＡＧＴＴＡＣ（配列番号６３）
（ｘｉ）ＧＡＣＡＣＡＴＣＣ
（ｘｉｉ）ＣＡＧＣＡＧＴＧＧＡＧＴＡＧＴＴＡＣＣＣＧＣＴＣＡＣＧ（配列番号６４）
（ｘｉｉｉ）ＧＣＡＡＧＡＧＧＧＧＧＧＧＡＴＴＡＣＧＡＣＧＡＡＧＡＡＴＡＣＴＡＴＧＴＣＡＴＧＧＡＣ（配列番号５８）
（ｘｉｖ）ＡＴＴＴＴＡＣＣＴＧＧＡＡＧＴＧＧＴＡＧＴＡＣＴ（配列番号６６）
（ｘｖ）ＧＣＡＡＧＡＧＧＧＧＧＧＧＡＴＴＡＣＧＡＣＧＡＡＧＡＡＴＡＣＴＡＴＧＣＴＡＴＧＧＡＣＴＡＣ（配列番号６５）
（ｘｖｉ）ＧＣＡＡＧＡＧＧＧＧＧＧＧＡＴＴＡＣＧＡＣＧＡＡＧＡＡＴＡＣＴＡＴＧＣＴＡＴＧＧＡＣ（配列番号５９）
（ｘｖｉｉ）ＡＴＴＴＴＡＣＣＴＧＧＡＡＧＴＧＧＴＡＧＴＡＣＴ（配列番号６６）
（ｘｖｉｉｉ）ＧＣＡＡＧＡＧＧＧＧＧＧＧＡＴＴＡＣＧＡＣＧＡＡＧＡＡＴＡＣＴＡＴＧＴＣＡＴＧＧＡＣＴＡＣ（配列番号６７）
（ｘｉｘ）ＣＡＧＣＡＧＴＧＧＡＧＴＡＧＴＴＡＣＣＣＧＣＴＣＡＣＧ（配列番号４６）
（ｘｘ）ＴＧＧＡＴＴＧＧＡＧＡＧＡＴＴＴＴＡＣＣＴＧＧＡＡＧＴＧＧＴＡＧＴＡＣＴ（配列番号７９）。
ポリヌクレオチド配列（ｉ）（配列番号９）は、重鎖ＣＤＲ  ＳＳＹＷＩＥ（配列番号１）をコードし、ポリヌクレオチド配列（ｉｉ）（配列番号１０）は、重鎖ＣＤＲ  ＷＩＧＥＩＬＰＧＳＧＳＴＮ（配列番号７８）をコードし、ポリヌクレオチド配列（ｘｘ）（配列番号７９）は、重鎖ＣＤＲ  ＷＩＧＥＩＬＰＧＳＧＳＴ（配列番号２）をコードし、ポリヌクレオチド配列（ｉｉｉ）（配列番号１１）は、重鎖ＣＤＲ  ＡＲＧＧＤＹＤＥＥＹＹＬＭＤ（配列番号３）をコードし、ポリヌクレオチド配列（ｉｖ）（配列番号１２）は、軽鎖ＣＤＲ  ＳＹＭＹＷＹ（配列番号４）をコードし、ポリヌクレオチド配列（ｖ）（配列番号１３）は、軽鎖ＣＤＲ  ＬＬＩＹＤＴＳＮＬＡ（配列番号５）をコードし、ポリヌクレオチド配列（ｖｉ）（配列番号１４）は、軽鎖ＣＤＲ  ＱＱＷＳＳＹＰＬ（配列番号６）をコードする。したがって、抗体をコードするポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド配列（ｉ）、（ｉｉ）もしくは（ｘｘ）、及び（ｉｉｉ）のうちの任意の１つ、２つ、または３つ、ならびに／またはポリヌクレオチド配列（ｉｖ）〜（ｖｉ）のうちの任意の１つ、２つ、または３つを含んでもよい。好ましくは、ポリヌクレオチドは、６つ全てのポリヌクレオチド配列（ｉ）、（ｉｉ）または（ｘｘ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）、及び（ｖｉ）を含む。
【０１４８】
ポリヌクレオチド配列（ｖｉｉ）（配列番号６０）は、重鎖ＣＤＲ  ＧＹＴＦＳＳＹＷ（配列番号４０）をコードし、ポリヌクレオチド配列（ｖｉｉｉ）（配列番号６１）は、重鎖ＣＤＲ  ＩＬＰＧＳＧＳＴ（配列番号４１）をコードし、ポリヌクレオチド配列（ｉｘ）（配列番号６２）は、重鎖ＣＤＲ  ＡＲＧＧＤＹＤＥＥＹＹＬＭＤＹ（配列番号４２）をコードし、ポリヌクレオチド配列（ｘ）（配列番号６３）は、軽鎖ＣＤＲ  ＳＳＶＳＹ（配列番号４３）をコードし、ポリヌクレオチド配列（ｘｉ）は、軽鎖ＣＤＲ  ＤＴＳをコードし、ポリヌクレオチド配列（ｘｉｉ）（配列番号６４）は、軽鎖ＣＤＲ  ＱＱＷＳＳＹＰＬＴ（配列番号４４）をコードする。したがって、抗体をコードするポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド配列（ｖｉｉ）〜（ｉｘ）のうちの任意の１つ、２つ、または３つ、ならびに／またはポリヌクレオチド配列（ｘ）〜（ｘｉｉ）のうちの任意の１つ、２つ、または３つを含んでもよい。好ましくは、ポリヌクレオチドは、６つ全てのポリヌクレオチド配列（ｖｉｉ）〜（ｘｉｉ）を含む。
【０１４９】
重鎖ＣＤＲ配列（ｉ）〜（ｉｉｉ）をコードするポリヌクレオチド配列のいずれかが、対応する重鎖ＣＤＲ配列（ｖｉｉ）〜（ｉｘ）のいずれかと置換されてもよく、またその逆も同様であり、軽鎖ＣＤＲ配列（ｉｖ）〜（ｖｉ）をコードするポリヌクレオチド配列のいずれかが、対応する軽鎖ＣＤＲ配列（ｘ）〜（ｘｉｉ）のいずれかと置換されてもよく、またその逆も同様であることを理解されたい。
【０１５０】
ポリヌクレオチド配列（ｉ）（配列番号９）は、重鎖ＣＤＲ  ＳＳＹＷＩＥ（配列番号１）をコードし、ポリヌクレオチド配列（ｉｉ）（配列番号１０）は、重鎖ＣＤＲ  ＷＩＧＥＩＬＰＧＳＧＳＴ（配列番号７８）をコードし、ポリヌクレオチド配列（ｘｉｉｉ）（配列番号５８）は、重鎖ＣＤＲ  ＡＲＧＧＤＹＤＥＥＹＹＶＭＤＮ（配列番号７７）をコードし、ポリヌクレオチド配列（ｉｖ）（配列番号１２）は、軽鎖ＣＤＲ  ＳＹＭＹＷＹ（配列番号４）をコードし、ポリヌクレオチド配列（ｖ）（配列番号１３）は、軽鎖ＣＤＲ  ＬＬＩＹＤＴＳＮＬＡ（配列番号５）をコードし、ポリヌクレオチド配列（ｖｉ）（配列番号１４）は、軽鎖ＣＤＲ  ＱＱＷＳＳＹＰＬ（配列番号６）をコードする。したがって、抗体をコードするポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド配列（ｉ）、（ｉｉ）、及び（ｘｉｉｉ）のうちの任意の１つ、２つ、または３つ、ならびに／またはポリヌクレオチド配列（ｉｖ）、（ｖ）、及び（ｖｉ）のうちの任意の１つ、２つ、または３つを含んでもよい。好ましくは、ポリヌクレオチドは、６つ全てのポリヌクレオチド配列（ｉ）、（ｉｉ）、（ｘｉｉｉ）（ｉｖ）、（ｖ）、及び（ｖｉ）を含む。
【０１５１】
ポリヌクレオチド配列（ｖｉｉ）（配列番号６０）は、重鎖ＣＤＲ  ＧＹＴＦＳＳＹＷ（配列番号４０）をコードし、ポリヌクレオチド配列（ｘｖｉｉ）（配列番号６６）は、重鎖ＣＤＲ  ＩＬＰＧＳＧＳＴ（配列番号４１）をコードし、ポリヌクレオチド配列（ｘｖ）（配列番号６５）は、重鎖ＣＤＲ  ＡＲＧＧＤＹＤＥＥＹＹＶＭＤＹ（配列番号４５）をコードし、ポリヌクレオチド配列（ｘ）（配列番号６３）は、軽鎖ＣＤＲ  ＳＳＶＳＹ（配列番号４３）をコードし、ポリヌクレオチド配列（ｘｉ）は、軽鎖ＣＤＲ  ＤＴＳをコードし、ポリヌクレオチド配列（ｘｉｉ）（配列番号６４）は、軽鎖ＣＤＲ  ＱＱＷＳＳＹＰＬＴ（配列番号４４）をコードする。したがって、抗体をコードするポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド配列（ｖｉｉ）、（ｘｖｉｉ）、及び（ｘｖ）のうちの任意の１つ、２つ、または３つ、ならびに／またはポリヌクレオチド配列（ｘ）、（ｘｉ）、及び（ｘｉｉ）のうちの任意の１つ、２つ、または３つを含んでもよい。好ましくは、ポリヌクレオチドは、６つ全てのポリヌクレオチド配列（ｖｉｉ）、（ｘｖｉｉ）、（ｘｖ）、（ｘ）、（ｘｉ）、及び（ｘｉｉ）を含む。
【０１５２】
重鎖ＣＤＲ配列（ｉ）、（ｉｉ）、及び（ｘｉｉｉ）をコードするポリヌクレオチド配列のいずれかが、対応する重鎖ＣＤＲ配列（ｖｉｉ）、（ｘｖｉｉ）、及び（ｘｖ）のいずれかと置換されてもよく、またその逆も同様であり、軽鎖ＣＤＲ配列（ｉｖ）、（ｖ）、及び（ｖｉ）をコードするポリペプチド配列のいずれかが、対応する軽鎖ＣＤＲ配列（ｘ）、（ｘｉ）、及び（ｘｉｉ）のいずれかと置換されてもよく、またその逆も同様であることを理解されたい。
【０１５３】
ポリヌクレオチド配列（ｉ）（配列番号９）は、重鎖ＣＤＲ  ＳＳＹＷＩＥ（配列番号１）をコードし、ポリヌクレオチド配列（ｉｉ）（配列番号１０）は、重鎖ＣＤＲ  ＷＩＧＥＩＬＰＧＳＧＳＴＮ（配列番号７８）をコードし、ポリヌクレオチド配列（ｘｖｉ）（配列番号５９）は、重鎖ＣＤＲ  ＡＲＧＧＤＹＤＥＥＹＹＡＭＤ（配列番号４６）をコードし、ポリヌクレオチド配列（ｉｖ）（配列番号１２）は、軽鎖ＣＤＲ  ＳＹＭＹＷＹ（配列番号４）をコードし、ポリヌクレオチド配列（ｖ）（配列番号１３）は、軽鎖ＣＤＲ  ＬＬＩＹＤＴＳＮＬＡ（配列番号５）をコードし、ポリヌクレオチド配列（ｖｉ）（配列番号１４）は、軽鎖ＣＤＲ  ＱＱＷＳＳＹＰＬ（配列番号６）をコードする。したがって、抗体をコードするポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド配列（ｉ）、（ｉｉ）、及び（ｘｖｉ）のうちの任意の１つ、２つ、または３つ、ならびに／またはポリヌクレオチド配列（ｉｖ）、（ｖ）、及び（ｖｉ）のうちの任意の１つ、２つ、または３つを含んでもよい。好ましくは、ポリヌクレオチドは、６つ全てのポリヌクレオチド配列（ｉ）、（ｉｉ）、（ｘｖｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）、及び（ｖｉ）を含む。
【０１５４】
ポリヌクレオチド配列（ｖｉｉ）（配列番号６０）は、重鎖ＣＤＲ  ＧＹＴＦＳＳＹＷ（配列番号４０）をコードし、ポリヌクレオチド配列（ｘｉｖ）（配列番号６６）は、重鎖ＣＤＲ  ＩＬＰＧＳＧＳＴ（配列番号４１）をコードし、ポリヌクレオチド配列（ｘｖｉｉｉ）（配列番号６７）は、重鎖ＣＤＲ  ＡＲＧＧＤＹＤＥＥＹＹＡＭＤＹ（配列番号４７）をコードし、ポリヌクレオチド配列（ｘ）（配列番号６３）は、軽鎖ＣＤＲ  ＳＳＶＳＹ（配列番号４３）をコードし、ポリヌクレオチド配列（ｘｉ）は、軽鎖ＣＤＲ  ＤＴＳをコードし、ポリヌクレオチド配列（ｘｉｘ）（配列番号４６）は、軽鎖ＣＤＲ  ＱＱＷＳＳＹＰＬＴＦ（配列番号４８）をコードする。したがって、抗体をコードするポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド配列（ｖｉｉ）、（ｘｉｖ）、及び（ｘｖｉｉｉ）のうちの任意の１つ、２つ、または３つ、ならびに／またはポリヌクレオチド配列（ｘ）、（ｘｉ）、（ｘｉｘ）のうちの任意の１つ、２つ、または３つを含んでもよい。好ましくは、ポリヌクレオチドは、６つ全てのポリヌクレオチド配列（ｖｉｉ）、（ｘｉｖ）及び（ｘｖｉｉｉ）、（ｘ）、（ｘｉ）、（ｘｉｘ）を含む。
【０１５５】
重鎖ＣＤＲ配列（ｉ）、（ｉｉ）、及び（ｘｖｉ）をコードするポリヌクレオチド配列のいずれかが、対応する重鎖ＣＤＲ配列（ｖｉｉ）、（ｘｖ）、及び（ｘｖｉｉｉ）のいずれかと置換されてもよく、またその逆も同様であり、軽鎖ＣＤＲ配列（ｉｖ）、（ｖ）、及び（ｖｉ）をコードするポリペプチド配列のいずれかが、対応する軽鎖ＣＤＲ配列（ｘ）、（ｘｉ）、（ｘｉｘ）と置換されてもよく、またその逆も同様であることを理解されたい。
【０１５６】
具体的な実施形態において、ポリヌクレオチドは、ヌクレオチド配列ＡＴＧＧＣＣＣＡＧＧＴＴＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＡＧＴＣＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＣＴＧＡＴＧＡＡＧＣＣＴＧＧＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＡＧＡＴＡＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＡＣＴＧＧＣＴＡＣＡＣＡＴＴＣＡＧＴＡＧＣＴＡＣＴＧＧＡＴＡＧＡＧＴＧＧＧＴＡＡＡＣＣＧＧＡＧＧＣＣＴＧＧＡＣＡＴＧＧＣＣＴＴＧＡＧＴＧＧＡＴＴＧＧＡＧＡＧＡＴＴＴＴＡＣＣＴＧＧＡＡＧＴＧＧＴＡＧＴＡＣＴＡＡＴＴＡＣＡＡＴＧＡＧＡＡＧＴＴＣＡＡＧＧＧＣＡＡＧＧＣＣＡＣＡＴＴＣＡＣＴＧＣＡＧＡＴＡＣＡＴＣＣＴＣＣＡＡＴＡＣＡＧＣＣＴＡＣＡＴＧＣＡＡＣＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＣＡＣＡＴＣＴＧＡＧＧＡＣＴＣＴＧＣＣＧＴＣＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＧＡＧＧＧＧＧＧＧＡＴＴＡＣＧＡＣＧＡＡＧＡＡＴＡＣＴＡＴＣＴＣＡＴＧＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＡＧＧＣＡＣＣＡＣＴＣＴＣＡＣＡＧＴＣＴＣＣＴＣＡ（配列番号１５）及び／またはヌクレオチド配列ＣＡＡＡＴＴＧＴＴＣＴＣＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＧＣＡＡＴＣＡＴＧＴＣＴＧＣＡＴＣＴＣＣＡＧＧＧＧＡＧＡＡＧＧＴＣＡＣＣＡＴＧＡＣＣＴＧＣＡＧＴＧＣＣＡＧＣＴＣＡＡＧＴＧＴＡＡＧＴＴＡＣＡＴＧＴＡＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＡＧＧＡＴＣＣＴＣＣＣＣＣＡＧＡＣＴＣＣＴＧＡＴＴＴＡＴＧＡＣＡＣＡＴＣＣＡＡＣＣＴＧＧＣＴＴＣＴＧＧＡＧＴＣＣＣＴＧＴＴＣＧＣＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＧＴＣＴＧＧＧＡＣＣＴＣＴＴＡＣＴＣＴＣＴＣＡＣＡＡＴＣＡＧＣＣＧＡＡＴＧＧＡＧＧＣＴＧＡＡＧＡＴＧＣＴＧＣＣＡＣＴＴＡＴＴＡＣＴＧＣＣＡＧＣＡＧＴＧＧＡＧＴＡＧＴＴＡＣＣＣＧＣＴＣＡＣＧＴＴＣＧＧＴＧＣＴＧＧＧＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＡＡＴＣＡＡＡＣＧＴＧＣＧＧＣＣＧＣ
（配列番号１６）を含む。好ましくは、ポリヌクレオチドは、配列番号１５のヌクレオチド配列及び配列番号１６のヌクレオチド配列を含む。この場合、２つのコード領域が同じポリヌクレオチド上に、例えば、ＳｃＦｖ抗体等の一本鎖抗体の発現のためのポリヌクレオチド上に存在してもよいことを理解されたい。
【０１５７】
別の具体的な実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号４９の可変重鎖をコードする、ヌクレオチド配列
ＡＴＧＧＣＣＣＡＧＧＴＴＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＡＧＴＣＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＣＴＧＡＴＧＡＡＧＣＣＴＧＧＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＡＧＡＴＡＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＡＣＴＧＧＣＴＡＣＡＣＡＴＴＣＡＧＴＡＧＣＴＡＣＴＧＧＡＴＡＧＡＧＴＧＧＧＴＡＡＡＣＣＧＧＡＧＧＣＣＴＧＧＡＣＡＴＧＧＣＣＴＴＧＡＧＴＧＧＡＴＴＧＧＡＧＡＧＡＴＴＴＴＡＣＣＴＧＧＡＡＧＴＧＧＴＡＧＴＡＣＴＡＡＴＴＡＣＡＡＴＧＡＧＡＡＧＴＴＣＡＡＧＧＧＣＡＡＧＧＣＣＡＣＡＴＴＣＡＣＴＧＣＡＧＡＴＡＣＡＴＣＣＴＣＣＡＡＴＡＣＡＧＣＣＴＡＣＡＴＧＣＡＡＣＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＣＡＣＡＴＣＴＧＡＧＧＡＣＴＣＴＧＴＣＧＴＣＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＧＡＧＧＧＧＧＧＧＡＴＴＡＣＧＡＣＧＡＡＧＡＡＴＡＣＴＡＴＣＴＣＡＴＧＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＡＧＧＣＡＣＣＡＣＴＣＴＣＡＣＡＧＴＣ（配列番号６８）を含む。
【０１５８】
さらにより具体的な実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号５０の可変軽鎖をコードする、ヌクレオチド配列ＣＡＡＡＴＴＧＴＴＣＴＣＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＧＣＡＡＴＣＡＴＧＴＣＴＧＣＡＴＣＴＣＣＡＧＧＧＧＡＧＡＡＧＧＴＣＡＣＣＡＴＧＡＣＣＴＧＣＡＧＴＧＣＣＡＧＣＴＣＡＡＧＴＧＴＡＡＧＴＴＡＣＡＴＧＴＡＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＡＧＧＡＴＣＣＴＣＣＣＣＣＡＧＡＣＴＣＣＴＧＡＴＴＴＡＴＧＡＣＡＣＡＴＣＣＡＡＣＣＴＧＧＣＴＴＣＴＧＧＡＧＴＣＣＣＴＧＴＴＣＧＣＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＧＴＣＴＧＧＧＡＣＣＴＣＴＴＡＣＴＣＴＣＴＣＡＣＡＡＴＣＡＧＣＣＧＡＡＴＧＧＡＧＧＣＴＧＡＡＧＡＴＧＣＴＧＣＣＡＣＴＴＡＴＴＡＣＴＧＣＣＡＧＣＡＧＴＧＧＡＧＴＡＧＴＴＡＣＣＣＧＣＴＣＡＣＧＴＴＣＧＧＴＧＣＴＧＧＧＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＡＡＴＣＡＡＡＣＧＴ（配列番号６９）を含む。
【０１５９】
好ましくは、ポリヌクレオチドは、配列番号６８のヌクレオチド配列及び配列番号６９のヌクレオチド配列を含む。そのようなポリヌクレオチドは、ＳｃＦｖ抗体等の一本鎖抗体を発現させることができる。
【０１６０】
さらに具体的な実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号５１の可変重鎖をコードする、ヌクレオチド配列ＡＴＧＧＣＣＧＡＧＧＴＴＣＡＧＣＴＴＣＡＧＣＡＧＴＣＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＣＴＧＡＴＧＡＡＧＣＣＴＧＧＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＡＧＡＴＡＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＡＣＴＧＧＣＴＡＣＡＣＡＴＴＣＡＧＴＡＧＣＴＡＣＴＧＧＡＴＡＧＡＧＴＧＧＧＴＡＡＡＧＣＡＧＡＧＧＣＣＴＧＧＡＣＡＴＧＧＣＣＴＴＧＡＧＴＧＧＡＴＴＧＧＡＧＡＧＡＴＴＴＴＡＣＣＴＧＧＡＡＧＴＧＧＴＡＧＴＡＣＴＡＡＴＴＡＣＡＡＴＧＡＧＡＡＧＴＴＣＡＡＧＧＧＣＡＡＧＧＣＣＡＣＡＴＴＣＡＣＴＧＣＡＧＡＴＡＣＡＴＣＣＴＣＣＡＡＣＡＣＡＧＣＣＴＡＣＡＴＧＣＡＡＣＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＣＡＴＣＴＧＡＧＧＡＣＴＣＴＧＣＣＧＴＣＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＡＡＧＡＧＧＧＧＧＧＧＡＴＴＡＣＧＡＣＧＡＡＧＡＡＴＡＣＴＡＴＧＴＣＡＴＧＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＡＧＧＡＡＣＣＴＣＡＧＴＣＡＣＴＧＴＣ（配列番号７０）を含む。
【０１６１】
さらにより具体的な実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号５２の可変軽鎖をコードする、ヌクレオチド配列ＣＡＡＡＴＴＧＴＴＣＴＣＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＧＣＡＡＴＣＡＴＧＴＣＴＧＣＡＴＣＴＣＣＡＧＧＧＧＡＧＡＡＧＧＴＣＡＣＣＡＴＧＡＣＣＴＧＣＡＧＴＧＣＣＡＧＣＴＣＡＡＧＴＧＴＡＡＧＴＴＡＣＡＴＧＴＡＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＡＧＧＡＴＣＣＴＣＣＣＣＣＡＧＡＣＴＣＣＴＧＡＴＴＴＡＴＧＡＣＡＣＡＴＣＣＡＡＣＣＴＧＧＣＴＴＣＴＧＧＡＧＴＣＣＣＴＧＴＴＣＧＣＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＧＴＣＴＧＧＧＡＣＣＴＣＴＴＡＣＴＣＴＣＴＣＡＣＡＡＴＣＡＧＣＣＧＡＡＴＧＧＡＧＧＣＴＧＡＡＧＡＴＧＣＴＧＣＣＡＣＴＴＡＴＴＡＣＴＧＣＣＡＧＣＡＧＴＧＧＡＧＴＡＧＴＴＡＣＣＣＧＣＴＣＡＣＧＴＴＣＧＧＴＧＣＴＧＧＧＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＡＡＡＣＧＴ（配列番号７１）を含む。
【０１６２】
好ましくは、ポリヌクレオチドは、配列番号７０のヌクレオチド配列及び配列番号７１のヌクレオチド配列を含む。そのようなポリヌクレオチドは、ＳｃＦｖ抗体等の一本鎖抗体を発現させることができる。
【０１６３】
さらにより具体的な実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号５３の可変重鎖をコードする、ヌクレオチド配列ＡＴＧＧＣＣＧＡＧＧＴＴＣＡＧＣＴＴＣＡＧＣＡＧＴＣＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＣＴＧＡＴＧＡＡＧＣＣＴＧＧＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＡＧＡＴＡＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＡＣＴＧＧＣＴＡＣＡＣＡＴＴＣＡＧＴＡＧＣＴＡＣＴＧＧＡＴＡＧＡＧＴＧＧＧＴＡＡＡＴＣＡＧＡＧＧＣＣＴＧＧＡＣＡＴＧＧＣＣＴＴＧＡＧＴＧＧＡＴＴＧＧＡＧＡＧＡＴＴＴＴＡＣＣＴＧＧＡＡＧＴＧＧＴＡＧＴＡＣＴＡＡＴＴＡＣＡＡＴＧＡＧＡＡＧＴＴＣＡＡＧＧＧＣＡＡＧＧＣＣＡＣＡＴＴＣＡＣＴＧＣＡＧＡＴＡＣＡＴＣＣＴＣＣＡＡＣＡＣＡＧＣＣＴＡＣＡＴＧＣＡＡＣＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＣＡＴＣＴＧＡＧＧＡＣＴＣＴＧＣＣＧＴＣＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＡＡＧＡＧＧＧＧＧＧＧＡＴＴＡＣＧＡＣＧＡＡＧＡＡＴＡＣＴＡＴＧＣＴＡＴＧＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＡＧＧＡＡＣＣＴＣＡＧＴＣＡＣＣＣＴＣ（配列番号７２）を含む。
【０１６４】
さらにより具体的な実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号５４の可変軽鎖をコードする、ヌクレオチド配列ＣＡＡＡＴＴＧＴＴＣＴＣＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＧＣＡＡＴＣＡＴＧＴＣＴＧＣＡＴＣＴＣＣＡＧＧＧＧＡＧＡＡＧＧＴＣＡＣＣＡＴＧＡＣＣＴＧＣＡＧＴＧＣＣＡＧＣＴＣＡＡＧＴＧＴＡＡＧＴＴＡＣＡＴＧＴＡＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＡＧＧＡＴＣＣＴＣＣＣＣＣＡＧＡＣＴＣＣＴＧＡＴＴＴＡＴＧＡＣＡＣＡＴＣＣＡＡＣＣＴＧＧＣＴＴＣＴＧＧＡＧＴＣＣＣＴＧＴＴＣＧＣＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＧＴＣＴＧＧＧＡＣＣＴＣＴＴＡＣＴＣＴＣＴＣＡＣＡＡＴＣＡＧＣＣＧＡＡＴＧＧＡＧＧＣＴＧＡＡＧＡＴＧＣＴＧＣＣＡＣＴＴＡＴＴＡＣＴＧＣＣＡＧＣＡＧＴＧＧＡＧＴＡＧＴＴＡＣＣＣＧＣＴＣＡＣＧＴＴＣＧＧＴＧＣＴＧＧＧＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＡＡＡＣＧＴ（配列番号７３）を含む。
【０１６５】
好ましくは、ポリヌクレオチドは、配列番号７２のヌクレオチド配列及び配列番号７３のヌクレオチド配列を含む。そのようなポリヌクレオチドは、ＳｃＦｖ抗体等の一本鎖抗体を発現させることができる。
【０１６６】
以前に論じたように、本発明は、上記で提供されたＤＮＡ配列に対応するかまたは相補的なＲＮＡ配列をさらに包含する。特に、本発明の抗体をコードする（例えば、本発明のｓｃＦｖをコードする）ＲＮＡ配列が包含される。
【０１６７】
併用療法
２００５年４月１４日付、２００５年６月１６日更新のＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｐｒｅｓｓ  Ｒｅｌｅａｓｅ（「Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ  Ｃｏｍｂｉｎｅｄ  Ｗｉｔｈ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  Ｉｍｐｒｏｖｅｓ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  −Ｆｒｅｅ  Ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｆｏｒ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  Ｗｉｔｈ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ」）によれば、血管新生阻害剤である抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体ベバシズマブは、標準的な化学療法と併用して投与された場合にいくつかの固形腫瘍の臨床結果を改善する。使用されている組み合わせは、ベバシズマブとイリノテカン、フルオロウラシル、及びロイコボリンとの併用；ベバシズマブとＦＯＬＦＯＸ４との併用（オキサリプラチン、５−フルオロウラシル及びロイコボリンの投与計画）；ベバシズマブとパクリタキセルとの併用；ならびにベバシズマブとパクリタキセル及びカルボプラチンとの併用を含む。
【０１６８】
したがって、前述のＣＬＥＣ１４ＡとＭＭＲＮ２との間の相互作用を阻害する薬剤は、任意の他の治療薬（例えば、抗癌化合物及び／または抗血管新生化合物）の非存在下で臨床的に有効であり得るが、これらの阻害剤をさらなる治療薬（例えば、抗癌剤及び／または抗血管新生化合物）と併せて投与することが有利であり得ることを理解されたい。
【０１６９】
したがって、ある実施形態において、方法はまた、少なくとも１つのさらなる治療薬（例えば、抗癌剤及び／または抗血管新生化合物）を個体に投与することを含んでもよい。方法は、ＣＬＥＣ１４ＡとＭＭＲＮ２との間の相互作用を阻害する薬剤（例えば、抗体）と、さらなる治療薬（例えば、抗癌剤及び／または抗血管新生化合物）とを含有する薬学的組成物を個体に投与することを含んでもよい。しかしながら、ＣＬＥＣ１４ＡとＭＭＲＮ２との間の相互作用を阻害する薬剤（例えば、抗体、ポリヌクレオチド、または細胞）とさらなる治療薬（例えば、抗癌剤及び／または抗血管新生化合物）とは、例えば、別の投与経路によって、別々に投与されてもよいことを理解されたい。したがって、ＣＬＥＣ１４ＡとＭＭＲＮ２との間の相互作用を阻害する薬剤（例えば、抗体）と、少なくとも１つのさらなる治療薬（例えば、抗癌剤及び／または抗血管新生化合物）とは、連続的にまたは（実質的に）同時に投与することができることを理解されたい。それらは、同じ薬学的製剤もしくは薬物中で投与されてもよいか、またはそれらは別々に製剤化され、投与されてもよい。
【０１７０】
本発明の医学的用途のある実施形態において、ＣＬＥＣ１４ＡとＭＭＲＮ２との間の相互作用を阻害する薬剤を含有する薬物はまた、少なくとも１つのさらなる治療薬（例えば、抗癌剤及び／または抗血管新生化合物）も含んでもよい。
【０１７１】
医学的用途の別の実施形態において、治療される個体は、少なくとも１つのさらなる治療薬（例えば、抗癌剤及び／または抗血管新生化合物）を投与される個体であってもよい。個体は、ＣＬＥＣ１４ＡとＭＭＲＮ２との間の相互作用を阻害する薬剤（例えば、抗体）を含有する薬物と同時にさらなる治療薬（例えば、抗癌剤及び／または抗血管新生化合物）を投与されてもよいが、個体は、ＣＬＥＣ１４ＡとＭＭＲＮ２との間の相互作用を阻害する薬剤を含有する薬物を投与される前に（または後に）さらなる治療薬（例えば、抗癌剤及び／または抗血管新生化合物）を投与されていても（または投与されても）よいことを理解されたい。
【０１７２】
また、本発明は、治療の方法も提供し、さらなる治療薬（例えば、抗癌剤及び／または抗血管新生化合物）がそれを必要とする個体に投与され、個体は、ＣＬＥＣ１４ＡとＭＭＲＮ２との間の相互作用を阻害する薬剤（例えば、抗体）を投与される個体であるが、さらなる治療薬（例えば、抗癌剤及び／または抗血管新生化合物）を含有する薬物を投与される前に（または後に）ＣＬＥＣ１４ＡとＭＭＲＮ２との間の相互作用を阻害する薬剤（例えば、抗体）を投与されていても（または投与されても）よいことを理解されたい。
【０１７３】
好ましくは、さらなる治療薬は抗癌剤である。さらなる抗癌剤は、ナイトロジェンマスタードを含むアルキル化剤、例えば、メクロレタミン（ＨＮ２）、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン（Ｌ−サルコリシン）、及びクロラムブシル；エチレンイミン及びメチルメラミン、例えば、ヘキサメチルメラミン、チオテパ；スルホン酸アルキル、例えば、ブスルファン；ニトロソ尿素、例えば、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、セムスチン（メチル−ＣＣＮＵ）、及びストレプトゾシン（ストレプトゾトシン）；ならびにトリアゼン、例えば、デカルバジン（ｄｅｃａｒｂａｚｉｎｅ）（ＤＴＩＣ：ジメチルトリアゼノイミダゾール−カルボキサミド）；葉酸類似体を含む代謝拮抗薬、例えば、メトトレキサート（アメトプテリン）；ピリミジン類似体、例えば、フルオロウラシル（５−フルオロウラシル：５−ＦＵ）、フロクスウリジン（フルオロデオキシウリジン：ＦＵｄＲ）、及びシタラビン（シトシンアラビノシド）；ならびにプリン類似体及び関連する阻害剤、例えば、メルカプトプリン（６−メルカプトプリン：６−ＭＰ）、チオグアニン（６−チオグアニン：ＴＧ）、及びペントスタチン（２′−デオキシコホルマイシン）；ビンカアルカロイドを含む天然物、例えば、ビンブラスチン（ＶＬＢ）、及びビンクリスチン；エピポドフィロトキシン、例えば、エトポシド及びテニポシド；抗生物質、例えば、ダクチノマイシン（アクチノマイシンＤ）、ダウノルビシン（ダウノマイシン；ルビドマイシン）、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン（ミトラマイシン）、及びマイトマイシン（マイトマイシンＣ）；酵素、例えば、Ｌ−アスパラギナーゼ；ならびに生物学的応答調節物質、例えば、インターフェロンアルフェノーム（ａｌｐｈｅｎｏｍｅ）；白金配位複合体を含む種々の薬剤、例えば、シスプラチン（ｃｉｓ−ＤＤＰ）及びカルボプラチン；アントラセネジオン、例えば、ミトキサントロン及びアントラサイクリン；置換尿素、例えば、ヒドロキシ尿素；メチルヒドラジン誘導体、例えば、プロカルバジン（Ｎ−メチルヒドラジン、ＭＩＨ）；及び腎皮質抑制剤、例えば、ミトタン（ｏ，ｐ′−ＤＤＤ）及びアミノグルテチミド；タキソール及び類似体／誘導体；細胞周期阻害剤；プロテオソーム阻害剤、及びボルテゾミブ（Ｖｅｌｃａｄｅ（登録商標））；シグナル伝達物質（例えば、チロシンキナーゼ）阻害剤、例えば、イマチニブ（Ｇｌｉｖｅｃ（登録商標））、ＣＯＸ−２阻害剤、及びホルモン作用物質／拮抗物質、例えば、フルタミド及びタモキシフェンから選択されてもよい。特に、チラパザミンが利用されてもよい。
【０１７４】
臨床的に使用される抗癌剤は、典型的には作用機序によって分類される：アルキル化剤、トポイソメラーゼＩ阻害剤、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤、ＲＮＡ／ＤＮＡ代謝拮抗薬、ＤＮＡ代謝拮抗薬、及び有糸分裂阻害薬。ＵＳ  ＮＩＨ／Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅのウェブサイトは、１２２種の化合物を列挙しており（ｈｔｔｐ：／／ｄｔｐ．ｎｃｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｄｏｃｓ／ｃａｎｃｅｒ／  ｓｅａｒｃｈｅｓ／ｓｔａｎｄａｒｄ＿ｍｅｃｈａｎｉｓｍ．ｈｔｍｌ）、それらは全て、ＣＬＥＣ１４Ａの阻害剤と併せて使用されてもよい。それらは、アルキル化剤、例えば、アサレイ、ＡＺＱ、ＢＣＮＵ、ブスルファン、カルボキシフタラート白金、ＣＢＤＣＡ、ＣＣＮＵ、ＣＨＩＰ、クロラムブシル、クロロゾトシン、シス−白金、クロメソン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、シクロジソン、ジアンヒドロガラクチトール、フルオロドパン、へプスルファム、ヒカントン、メルファラン、メチルＣＣＮＵ、マイトマイシンＣ、マイトゾルアミド、ナイトロジェンマスタード、ＰＣＮＵ、ピぺラジン、ピぺラジンジオン、ピポブロマン、ポルフィロマイシン、スピロヒダントインマスタード、テロキシロン、テトラプラチン、ピコプラチン（ＳＰ−４−３）（シス−アミンジクロロ（２−メチルピリジン）Ｐｔ（ＩＩ））、チオテパ、トリエチレンメラミン、ウラシルナイトロジェンマスタード、ヨシ−８６４；有糸分裂阻害薬、例えば、アロコルヒチン、ハリコンドリンＢ、コルヒチン、コルヒチン誘導体、ドラスタチン１０、マイタンシン、リゾキシン、タキソール、タキソール誘導体、チオコルヒチン、トリチルシステイン、ビンブラスチン硫酸塩、ビンクリスチン硫酸塩；トポイソメラーゼＩ阻害剤、例えば、カンプトテシン、カンプトテシン、ナトリウム塩、アミノカンプトテシン、２０カンプトテシン誘導体、モルホリノドキソルビシン；トポイソメラーゼＩＩ阻害剤、例えば、ドキソルビシン、アモナフィド、ｍ−ＡＭＳＡ、アントラピラゾール誘導体、ピラゾロアクリジン、ビサントレンＨＣＬ、ダウノルビシン、デオキシドキソルビシン、ミトキサントロン、メノガリル、Ｎ，Ｎ−ジベンジルダウノマイシン、オキサントラゾール、ルビダゾン、ＶＭ−２６、ＶＰ−１６；ＲＮＡ／ＤＮＡ代謝拮抗薬、例えば、Ｌ−アラノシン、５−アザシチジン、５−フルオロウラシル、アシビシン、３アミノプテリン誘導体、葉酸代謝拮抗薬、Ｂａｋｅｒの可溶性葉酸代謝拮抗薬、ジクロルアリル（ｄｉｃｈｌｏｒａｌｌｙｌ）ローソン、ブレキナル、フトラフル（プロドラッグ）、５，６−ジヒドロ−５−アザシチジン、メトトレキサート、メトトレキサート誘導体、Ｎ−（ホスホノアセチル）−Ｌ−アスパルテート（ＰＡＬＡ）、ピラゾフリン、トリメトレキサート；ＤＮＡ代謝拮抗薬、例えば、３−ＨＰ、２’−デオキシ−５−フルオロウリジン、５−ＨＰ、α−ＴＧＤＲ、アフィジコリングリシナート、アラ−Ｃ、５−アザ−２’−デオキシシチジン、β−ＴＧＤＲ、シクロシチジン、グアナゾール、ヒドロキシ尿素、イノシングリコジアルデヒド、マクベシンＩＩ、ピラゾロイミダゾール、チオグアニン、及びチオプリンを含む。
【０１７５】
しかしながら、少なくとも１つのさらなる抗癌剤が、シスプラチン；カルボプラチン；ピコプラチン；５−フルロウラシル（ｆｌｕｒｏｕｒａｃｉｌ）；パクリタキセル；マイトマイシンＣ；ドキソルビシン；ゲムシタビン；トムデックス；ペメトレキセド；メトトレキサート；イリノテカン、フルオロウラシル及びロイコボリン；オキサリプラチン、５−フルオロウラシル及びロイコボリン；ならびにパクリタキセル及びカルボプラチンから選択されることが好ましい。
【０１７６】
さらなる抗癌剤が特定の腫瘍型に対して特に有効であることが示された場合、その特定の腫瘍型を治療するために、ＣＬＥＣ１４ＡとＭＭＲＮ２との間の相互作用を阻害する薬剤をそのさらなる抗癌剤と併用することが好ましいかもしれない。
【０１７７】
好ましい抗血管新生化合物は、ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標））；イトラコナゾール；カルボキシアミドトリアゾール；ＴＮＰ−４７０（フマギリンの類似体）；ＣＭ１０１；ＩＦＮ−α；ＩＬ−１２；血小板第４因子；スラミン；ＳＵ５４１６；トロンボスポンジン；ＶＥＧＦＲ拮抗薬；血管新生抑制ステロイド＋ヘパリン；軟骨由来の血管新生阻害因子；マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤；アンジオスタチン；エンドスタチン；２−メトキシエストラジオール；テコガラン；テトラチオモリブデン酸塩；サリドマイド；プロラクチン；αＶβ３阻害剤；リノミド；タスキニモド；ラニビズマブ；ソラフェ二ブ；（Ｎｅｘａｖａｒ（登録商標））；スニチニブ（Ｓｕｔｅｎｔ（登録商標））；パゾパニブ（Ｖｏｔｒｉｅｎｔ（登録商標））；及びエベロリムス（Ａｆｉｎｉｔｏｒ（登録商標））を含む。
【０１７８】
細胞毒性部分を含む化合物
本発明の第４の態様は、本発明の第２の態様による抗体と、細胞毒性部分とを含む化合物を提供する。
【０１７９】
細胞毒性部分は、新生血管系の細胞、または新生血管系に近接した関連する細胞に対して直接的または間接的に毒性を示し得る。「直接的に細胞毒性を示す」には、その部分自体が細胞毒性を示す部分であるという意味が含まれる。「間接的な細胞毒性を示す」には、その部分が、それ自体は細胞毒性を示さないが、例えば、さらなる分子に対するその作用によって、またはそれに対するさらなる作用によって、細胞毒性を誘導し得る部分であるという意味が含まれる。例えば、間接的な細胞毒性部分は、免疫細胞（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞等の細胞傷害性免疫細胞）を補充するように作用し、それによって間接的に細胞毒性効果を誘導することができる。
【０１８０】
典型的には、細胞毒性部分は、直接的細胞毒性化学療法剤、直接的毒性ポリペプチド、プロドラッグを細胞毒性薬物に変換することができる部分、放射線増感剤、直接的毒性核酸、直接的もしくは間接的細胞毒性ポリペプチドをコードする核酸分子、または放射性原子から選択される。そのような細胞毒性部分、ならびに抗体及び細胞毒性部分を含むコンジュゲートを作製する方法の例は、参照により本明細書に組み込まれる本発明者らの初期の刊行物ＷＯ０２／３６７７１、ＷＯ２００４／０４６１９１、及びＷＯ２０１１／０２７１３２に提供される。
【０１８１】
一実施形態において、細胞毒性部分は、細胞毒性化学療法剤である。細胞毒性化学療法剤、例えば、抗癌剤は、当該技術分野で周知であり、前述したものを含む。
【０１８２】
癌治療用等の抗体薬物コンジュゲートは、Ｃａｒｔｅｒ＆Ｓｅｎｔｅｒ（２００８），Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ．１４（３）：１５４−６９及びＣｈａｒｉ  ｅｔ  ａｌ（２０１４）Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  ５３：３７５１（参照により本明細書に組み込まれる）によって考察されており、本発明のこの態様の化合物は、そのような抗体薬物コンジュゲートであると見なされてもよいことを理解されたい（ＵＳ５，７７３，００１；ＵＳ５，７６７，２８５；ＵＳ５，７３９，１１６；ＵＳ５，６９３，７６２；ＵＳ５，５８５，０８９；ＵＳ２００６／００８８５２２；ＵＳ２０１１／０００８８４０；ＵＳ７，６５９，２４１；Ｈｕｇｈｅｓ（２０１０）Ｎａｔ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  ９：６６５，Ｌａｓｈ（２０１０）；Ｉｎ  ｖｉｖｏ：Ｔｈｅ  Ｂｕｓｉｎｅｓｓ＆Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｒｅｐｏｒｔ  ３２−３８；Ｍａｈａｔｏ  ｅｔ  ａｌ（２０１１）Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ逆方向６３：６５９；Ｊｅｆｆｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ（２００６）ＢＭＣＬ  １６：３５８；Ｄｒｕｇｓ  Ｒ  Ｄ  １１（１）：８５−９５も参照されたい）。ＡＤＣは、一般的に、腫瘍細胞、細胞毒性薬物、及び抗体を薬物に付着させるリンカー上に存在する標的に対するモノクローナル抗体を含む。
【０１８３】
上で述べた種々の細胞毒性部分、例えば、細胞毒性化学療法剤は、以前に抗体及び他の標的化剤に付着されており、そのため、これらの薬剤を含む本発明の化合物は、当業者によって容易に作製され得る。例えば、カルボジイミド結合（Ｂａｕｍｉｎｇｅｒ＆Ｗｉｌｃｈｅｋ（１９８０）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．７０，１５１−１５９）が、ドキソルビシンを含む様々な薬剤を抗体にコンジュゲートさせるために用いられてもよい。細胞毒性部分を抗体にコンジュゲートさせるための他の方法を用いることもできる。例えば、過ヨウ素酸ナトリウムによる酸化後に適切な反応物の還元的アルキル化が用いられてもよく、またグルタルアルデヒド架橋が用いられてもよい。ポリペプチドを架橋する方法は当該技術分野で既知であり、ＷＯ２００４／０４６１９１に記載されている。しかしながら、本発明の化合物を生成するどの方法が選択されるかにかかわらず、抗体がその標的化能力を維持し、付着した部分がその関連する機能を維持するように決定がなされなければならないことを認識されたい。
【０１８４】
本発明のさらなる実施形態において、細胞毒性部分は、細胞毒性ペプチドまたはポリペプチド部分であってもよく、それには細胞死をもたらす任意の部分が含まれる。細胞毒性ペプチド及びポリペプチド部分は、当該技術分野で周知であり、例えば、リシン、アブリン、緑膿菌外毒素、組織因子等を含む。それらを抗体等の標的化部分に連結するための方法もまた、当該技術分野で既知であり、例えば、ポリペプチドを架橋する従来の様式、及び組換えＤＮＡ技術を用いた融合ポリペプチドとしての化合物の生成を含む。細胞毒性剤としてのリシンの使用は、Ｂｕｒｒｏｗｓ＆Ｔｈｏｒｐｅ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０，８９９６−９０００に記載され、局所的な血液凝固及び腫瘍の梗塞を引き起こす組織因子の使用は、Ｒａｎ  ｅｔ  ａｌ（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８，４６４６−４６５３及びＨｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７５，５４７−５５０に記載されている。Ｔｓａｉ  ｅｔ  ａｌ（１９９５）Ｄｉｓ．Ｃｏｌｏｎ  Ｒｅｃｔｕｍ  ３８，１０６７−１０７４は、モノクローナル抗体にコンジュゲートされたアブリンＡ鎖について記載している。他のリボソーム不活性化タンパク質は、細胞毒性剤としてＷＯ９６／０６６４１に記載されている。緑膿菌外毒素はまた、細胞毒性ポリペプチド部分として用いられてもよい（Ａｉｅｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２，１０４５７−１０４６１）。
【０１８５】
特定のサイトカイン、例えば、ＴＮＦα、ＩＮＦγ、及びＩＬ−２もまた、細胞毒性剤として有用である。
【０１８６】
特定の放射性原子もまた、十分な線量で送達された場合に細胞毒性を示し得る。したが
って、細胞毒性部分は、使用する際に、細胞毒性を示すのに十分な量の放射活性を標的部位に送達する放射性原子を含んでもよい。好適な放射性原子は、リン−３２、ヨウ素１２５、ヨウ素１３１、インジウム１１１、レニウム１８６、レニウム１８８、もしくはイットリウム９０、または隣接する細胞、細胞小器官、もしくは核酸を破壊するのに十分なエネルギーを放出する任意の他の同位体を含む。好ましくは、本発明の化合物中の放射性原子の同位体及び密度は、４０００ｃＧｙより高い（好ましくは、少なくとも６０００、８０００、または１００００ｃＧｙ）線量が、標的部位に、好ましくは、標的部位の細胞及びそれらの細胞小器官、特に核に送達されるよう名密度である。
【０１８７】
放射性原子は、既知の様式で抗体に付着させてもよい。例えば、ＥＤＴＡまたは別のキレート化剤を抗体に付着させて、１１１Ｉｎまたは９０Ｙに付着させるために用いることができる。チロシン残基は、１２５Ｉまたは１３１Ｉで標識することができる。
【０１８８】
細胞毒性部分は、放射線増感剤であってもよい。放射線増感剤は、フルオロピリミジン、チミジン類似体、ヒドロキシ尿素、ゲムシタビン、フルダラビン、ニコチンアミド、ハロゲン化ピリミジン、３−アミノベンズアミド、３−アミノベンゾジアミド、エタニキサゾール（ｅｔａｎｉｘａｄｏｌｅ）、ピモニダゾール及びミソニダゾールを含む（例えば、ＭｃＧｉｎｎ  ｅｔ  ａｌ（１９９６）Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８８，１１９３−１１２０３；Ｓｈｅｗａｃｈ＆Ｌａｗｒｅｎｃｅ（１９９６）Ｉｎｖｅｓｔ．Ｎｅｗ  Ｄｒｕｇｓ  １４，２５７−２６３；Ｈｏｒｓｍａｎ（１９９５）Ａｃｔａ  Ｏｎｃｏｌ．３４，５７１−５８７；Ｓｈｅｎｏｙ＆Ｓｉｎｇｈ（１９９２）Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０，５３３−５５１；Ｍｉｔｃｈｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ（１９８９）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｒａｄｉａｔ．Ｂｉｏｌ．５６，８２７−８３６；Ｉｌｉａｋｉｓ＆Ｋｕｒｔｚｍａｎ（１９８９）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｒａｄｉａｔ．Ｏｎｃｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｐｈｙｓ．１６，１２３５−１２４１；Ｂｒｏｗｎ（１９８９）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｒａｄｉａｔ．Ｏｎｃｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｐｈｙｓ．１６，９８７−９９３；Ｂｒｏｗｎ（１９８５）Ｃａｎｃｅｒ  ５５，２２２２−２２２８を参照されたい）。
【０１８９】
細胞毒性部分は、凝血促進因子、例えば組織因子の細胞外ドメインであってもよい（Ｒｉｐｐｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ（２０００）「Ｆｕｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｉｓｓｕｅ  ｆａｃｔｏｒ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ドメイン  ｔｏ  ａ  ｔｕｍｏｕｒ  ｓｔｒｏｍａ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｉｎ  ａｎ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ−ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ．」Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．３４９：８０５−１２；Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ（１９９７）「Ｔｕｍｏｒ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｂｙ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ｔｉｓｓｕｅ  ｆａｃｔｏｒ  ｔｏ  ｔｕｍｏｒ  ｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ．」Ｓｃｉｅｎｃｅ．２７５（５２９９）：５４７−５５０。
【０１９０】
細胞毒性部分は、間接的に細胞毒性を示すポリペプチドであってもよい。特に好ましい実施形態において、間接的に細胞毒性を示すポリペプチドは、酵素活性を有し、比較的非毒性のプロドラッグを細胞毒性薬物に変換することができる、ポリペプチドである。標的化部分が抗体である場合、この種類の系は、しばしばＡＤＥＰＴ（抗体指向性酵素プロドラッグ療法）と称される。この系は、標的化部分が酵素部分を患者の体内の所望の部位（例えば、腫瘍に関連した新しい血管組織の部位）に位置づけ、酵素がその部位で局在化する時間が経過した後、酵素の基質であるプロドラッグを投与することを必要とし、触媒作用の最終産物は細胞毒性化合物である。この手法の目的は、所望の部位における薬物の濃度を最大化し、正常組織における薬物の濃度を最小化することである（Ｓｅｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ（１９８８）「Ａｎｔｉ−ｔｕｍｏｒ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｉｎ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５，４８４２−４８４６；Ｂａｇｓｈａｗｅ（１９８７）Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ５６，５３１−２；ａｎｄ  Ｂａｇｓｈａｗｅ，ｅｔ  ａｌ（１９８８）．「Ａ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ａｇｅｎｔ  ｃａｎ  ｂｅ  ｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ  ａｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｓｉｔｅｓ」Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．５８，７００−７０３）；Ｂａｇｓｈａｗｅ（１９９５）Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．Ｒｅｓ．３４，２２０−２３０及びＷＯ２００４／０４６１９１は、本発明との関連で好適であり得る種々の酵素／プロドラッグの組み合わせについて記載している。
【０１９１】
典型的には、プロドラッグは、細胞毒性剤と比較して比較的非毒性である。典型的には、プロドラッグは、好適なインビトロ細胞毒性試験において測定されるように、１０％未満の毒性、好ましくは１％未満の毒性を有する。
【０１９２】
プロドラッグを細胞毒性剤に変換できる部分は、化合物の残りの部分から単離される際に活性を有する可能性が高いが、それは、（ａ）化合物の残りの部分と組み合わされるとき、及び（ｂ）化合物が標的細胞に付着されるか、隣接するか、または内在化されるときにのみ、活性である必要がある。
【０１９３】
細胞毒性部分は、放射されたときに細胞毒性を示すか、または細胞毒性部分を放出する部分であってもよい。例えば、ボロン−１０同位体は、適切に放射されると、細胞毒性を示すα粒子を放出する（ＵＳ４，３４８，３７６；Ｐｒｉｍｕｓ  ｅｔ  ａｌ（１９９６）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．７：５３２−５３５）。
【０１９４】
同様に、細胞毒性部分は、フォトフリン等の、光線力学的治療において有用なものであってもよい（例えば、Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ（１９９８）Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．９０，８８９−９０５を参照されたい）。
【０１９５】
特定の実施形態において、細胞毒性部分は、例えば、細胞傷害性免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）等の免疫細胞に特異的に結合するような抗体である。したがって、この場合、本発明の化合物は、非対称ＩｇＧ様抗体（例えば、Ｔｒｉｏｍａｂ／クアドローマ、Ｔｒｉｏｎ  Ｐｈａｒｍａ／Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ；ノブ・イントゥ・ホール、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ；Ｃｒｏｓｓ  ＭＡｂｓ、Ｒｏｃｈｅ；静電気的に適合した抗体、ＡＭＧＥＮ；ＬＵＺ−Ｙ、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ；鎖交換操作ドメイン（ＳＥＥＤ）ボディ、ＥＭＤ  Ｓｅｒｏｎｏ；ｂｉｏｌｏｎｉｃ、ｅｒｕｓ；及びＦａｂ交換抗体、Ｇｅｎｍａｂ）、対称ＩｇＧ様抗体（例えば、二重標的化（ＤＴ）−ｌｇ、ＧＳＫ／Ｄｏｍａｎｔｉｓ；ツー・イン・ワン抗体、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ；架橋Ｍａｂ、Ｋａｒｍａｎｏｓ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｎｔｅｒ；ｍＡｂ＜２＞、Ｆ−ｓｔａｒ；及びＣｏｖ  Ｘ−ｂｏｄｙ、Ｃｏｖ  Ｘ／Ｐｆｉｚｅｒ）、ＩｇＧ融合体（例えば、二重可変ドメイン（ＤＶＤ）−ｌｇ、Ａｂｂｏｔｔ；ＩｇＧ様二重特異性抗体、Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ；Ｔｓ２Ａｂ、Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ／ＡＺ；ＢｓＡｂ、ＺｙｍｏＧｅｎｅｔｉｃｓ；ＨＥＲＣＵＬＥＳ、Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｅ；ＴｖＡｂ、Ｒｏｃｈｅ）Ｆｃ融合体（例えば、ＳｃＦｖ／Ｆｃ融合体、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ；ＳＣＯＲＰＩＯＮ、Ｅｍｅｒｇｅｎｔ  ＢｉｏＳｏｌｕｔｉｏｎｓ／Ｔｒｕｂｉｏｎ、ＺｙｍｏＧｅｎｅｔｉｃｓ／ＢＭＳ；二重親和性再標的化技術（Ｆｃ−ＤＡＲＴ）、ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓ；二重（ＳｃＦｖ）２−Ｆａｂ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）Ｆａｂ融合体（例えば、Ｆ（ａｂ）２、Ｍｅｄａｒｅｘ／ＡＭＧＥＮ；二重作用またはＢｉｓ−Ｆａｂ、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ；ドック・アンド・ロック（ＤＮＬ）、ＩｍｍｕｎｏＭｅｄｉｃｓ；二価二重特異性、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ；及びＦａｂ−Ｆｖ、ＵＣＢ−Ｃｅｌｌｔｅｃｈ）、ＳｃＦｖ及びダイアボディに基づく抗体（例えば、二重特異性Ｔ細胞誘導抗体（ＢｉＴＥ）、Ｍｉｃｒｏｍｅｔ；タンデムダイアボディ（Ｔａｎｄａｂ）、Ａｆｆｉｍｅｄ；ＤＡＲＴ、ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓ；一本鎖ダイアボディ、Ａｃａｄｅｍｉｃ；ＴＣＲ様抗体、ＡＩＴ、Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｌｏｇｉｃｓ；ヒト血清アルブミンＳｃＦｖ融合体、Ｍｅｒｒｉｍａｃｋ；及びＣＯＭＢＯＤＩＥＳ、Ｅｐｉｇｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ＩｇＧ／ｎｏｎ−ｌｇＧ融合体（例えば、免疫細胞毒素、ＥＭＤＳｅｒｏｎｏ、Ｐｈｉｌｏｇｅｎ、ＩｍｍｕｎＧｅｎｅ、ＩｍｍｕｎｏＭｅｄｉｃｓ；スーパー抗原融合タンパク質、Ａｃｔｉｖｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ；及び免疫動員性抗癌ｍＴＣＲ、ＩｍｍＴＡＣ）、ならびにオリゴクローナル抗体（例えば、Ｓｙｍｐｈｏｇｅｎ及びＭｅｒｕｓ）であってもよい。
【０１９６】
別の実施形態において、細胞毒性部分は、ピロロベンゾジアゼピン二量体（ＰＢＤ）である。ＰＢＤは、インビボで広範な抗腫瘍活性を有することが示されている強力な抗癌剤である。これらの薬物は、ＤＮＡの小さな溝に結合し、その細胞が認識及び修復することが困難であるように２つのＤＮＡ鎖を連結することによってそれらの活性を発揮する。したがって、本発明の化合物は、ＰＢＤを含むＡＤＣであってもよい。ＰＢＤに関するさらなる情報は、Ｈａｒｔｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ，２０１２（Ｉｎｖｅｓｔ  Ｎｅｗ  Ｄｒｕｇｓ  ３０：９５０−９５８）に見出すことができる。
【０１９７】
本発明の第５の態様は、本発明の第４の態様において上で定義されたような化合物をコードするポリヌクレオチドを提供し、抗体及び細胞毒性部分は、融合されたポリペプチドである。
【０１９８】
検出可能な部分を含む化合物
本発明の第６の態様は、本発明の第２の態様による抗体と、検出可能な部分とを含む化合物を提供する。そのような化合物は、適切な検出方法と組み合わせて、個体における化合物の位置を検出するため、ひいては、個体における血管新生（例えば、腫瘍血管新生）の部位及び程度を同定するだけではなく、個体における血管新生（例えば、腫瘍血管新生）の阻害のためにも使用することができる。
【０１９９】
「検出可能な部分」には、本発明の化合物を患者に投与した後にその部分が標的部位に位置する場合に、典型的には、体外から及び標的が位置する部位の外から非侵襲的に検出され得る部分であるという意味が含まれる。したがって、本発明のこの態様の化合物は、後に詳述するように、画像化及び診断、特に、固形腫瘍の新生血管系の固形腫瘍及び診断において有用である。
【０２００】
典型的には、検出可能な部分は、磁気ナノ粒子、放射性核種、またはフルオロフォアであるか、またはそれを含む。
【０２０１】
したがって、ある実施形態において、検出可能な部分は、画像化において有用な放射性原子であってもよい。好適な放射性原子は、シンチグラフィー試験のためのテクネチウム９９ｍまたはヨウ素１２３を含む。他は、ヨウ素１２４；ヨウ素１２５；ヨウ素１２６；ヨウ素１３１；ヨウ素１３３；インジウム１１１；インジウム１１３ｍ、フッ素１８；フッ素１９；炭素１１；炭素１３；銅−６４；窒素１３；窒素１５；酸素１５；酸素１７；ヒ素−７２；ガドリニウム；マンガン；鉄；重水素；トリチウム；イットリウム８６；ジルコニウム−８９；臭素−７７、ガリウム−６７；ガリウム−６８、ルテニウム−９５、ルテニウム−９７、ルテニウム−１０３、ルテニウム−１０５、水銀−１０７、レニウム９９ｍ、レニウム１０１、レニウム１０５、スカンジウム−４７からなる群から選択されてもよい。直接的に、またはＥＤＴＡもしくはＤＴＰＡ等のキレート化剤を介して、そのような放射性同位体を抗体にカップリングするための好適な方法が、当該技術分野で機知であるように用いられてもよい。
【０２０２】
他の容易に検出可能な部分は、例えば、磁気共鳴画像（ＭＲＩ）のためのスピン標識、例えば、この場合もヨウ素１２３、ヨウ素１３１、インジウム１１１、フッ素１９、炭素１３、窒素１５、酸素１７、ガドリニウム、マンガン、または鉄を含む。明らかに、本発明の化合物は、分子が検出可能であるために、適切な原子同位体を十分に有しなければならない。
【０２０３】
放射標識または他の標識は、既知の様式で化合物に取り込まれてもよい。例えば、抗体が、例えば、水素の代わりにフッ素１９を含む好適なアミノ酸前駆体を用いた化学的アミノ酸合成によって生合成または合成され得る場合である。９９ｍＴｃ、１２３Ｉ、１８６Ｒｈ、１８８Ｒｈ、及び１１１Ｉｎ等の標識は、例えば、抗体のシステイン残基を介して付着させることができる。イットリウム９０は、リジン残基を介して付着させることができる。ＩＯＤＯＧＥＮ法（Ｆｒａｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ（１９７８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．８０，４９−５７）が、ヨウ素１２３を取り込むために使用されてもよい。参考文献（「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｓｃｉｎｔｉｇｒａｐｈｙ」，Ｊ．Ｆ．Ｃｈａｔａｌ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）は、他の方法について詳細に記載している。
【０２０４】
多くの好適なフルオロフォア及び検出方法が、当該技術分野で周知であり、例えば、Ｓｔｅｆａｎ  Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ−Ｅｎｇｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ（１９９７）「Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｆｏｒ  ｔｉｓｓｕｅ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ．Ｐｈｙｓ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．４２：８１５−８２４；Ａｌｔｉｎｏｇｌｕ  ｅｔ  ａｌ（２００８）「Ｎｅａｒ−Ｉｎｆｒａｒｅｄ  Ｅｍｉｔｔｉｎｇ  Ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ−Ｄｏｐｅｄ  Ｃａｌｃｉｕｍ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ」ＡＣＳ  Ｎａｎｏ  ２（１０）：２０７５−８４；及びＣｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ（２００９）「Ｉｎ−ｖｉｖｏ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ  ｕｓｉｎｇ  ｃｈｌｏｒｉｎ  ｅ６−ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｍａｇｉｎｇ  ａｎｄ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ」ＢＭＣ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ９：１（ｄｏｉ：１０．１１８６／１４７１−２３４２−９−１）に記載されている。例として、フルオレセイン及びその誘導体、蛍光色素、ローダミン及びその誘導体、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ダンシル、ウンベリフェロン等が挙げられる。そのようなコンジュゲートにおいて、本発明の抗体またはそれらの機能的断片は、当業者に機知の方法によって調製することができる。
【０２０５】
検出可能な部分は、検出可能な酵素、例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコースアミラーゼ、炭酸脱水酵素、アセチルコリンエステラーゼ、リゾチーム、リンゴ酸脱水素酵素、またはグルコース６−ホスフェートデヒドロゲナーゼを含んでもよい。
【０２０６】
検出可能な部分は、ビオチン、ジゴキシゲニン、または５−ブロモデオキシウリジン度の分子を含んでもよい。
【０２０７】
検出可能な部分は、ルミノール及びジオキセタン等の化学発光標識、またはルシフェラーゼ及びルシフェリン等の生物発光標識を含んでもよい。
【０２０８】
本発明の第７の態様は、本発明の第６の態様において上で定義されたような化合物をコードするポリヌクレオチドを提供し、抗体及び検出可能な部分は、融合されたポリペプチドである。本発明の第７の態様はまた、本発明の第６の態様において上で定義されたような化合物をコードするポリヌクレオチドを含む核酸も提供し、抗体及び検出可能な部分は、融合されたポリペプチドであることを理解されたい。
【０２０９】
ポリヌクレオチド、ベクター、及び発現
本発明の第３、第５、及び第７の態様のいずれの核酸分子も、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得、特定の状況では好ましくはＤＮＡである。他の状況において、例えば、細胞治療を用いる場合等には、本発明の抗体をコードするＲＮＡが好ましい場合がある。それは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチドもしくは塩基、及び／またはそれらの類似体、あるいはＤＮＡもしくはＲＮＡポリメラーゼによって、または合成反応によってポリマーに取り込むことができる任意の基質を含んでもよい。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチド及びそれらの類似体等の修飾ヌクレオチドを含んでもよい。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリマー構築の前または後に付与されてもよい。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド構成要素によって中断され得る。本発明の抗体をコードする核酸分子のいくつかの特定の例が、本明細書に記載される。他の好適な配列は、抗体の構造及び遺伝コードの知識に基づいて容易に決定することができる。
【０２１０】
本発明の第８の態様は、本発明の第３、第５、及び第７の態様のいずれかのポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
【０２１１】
本発明の第９の態様は、本発明の第３、第５、もしくは第７の態様のいずれかによるポリヌクレオチド、及び／または本発明の第２の態様による抗体、もしくは本発明の第８の態様によるベクターを含む宿主細胞を提供する。
【０２１２】
ベクターは、任意の種類であってもよく、例えば、発現ベクター等の組換えベクターであってもよい。発現ベクターは、宿主細胞における抗体の発現及び／または分泌を可能にする要素（例えば、プロモーター、翻訳の開始及び終了のシグナル、ならびに適切な転写の制御の領域）を含有する。具体的には、ベクターは、ウイルスベクター、例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、またはアデノウイルスであってもよい。最も具体的には、ベクターは、ガンマレトロウイルスであってもよい。様々な宿主細胞のいずれが使用されてもよく、原核細胞、例えば、大腸菌等、または真核細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞等の哺乳動物細胞、または酵母、昆虫、もしくは植物細胞が使用されてもよい。多くの好適なベクター及び宿主細胞が当該技術分野で周知である。好ましくは、宿主細胞は、安定な細胞株である。代替的に、宿主細胞は、患者から得た細胞、例えば、後に詳述するようなＴ細胞または他の免疫細胞であってもよい。
【０２１３】
特定の実施形態において、核酸分子及び発現ベクターは、後述の当該技術分野で既知の製剤及び方法を用いた遺伝子治療のアプローチを介して、本発明の治療態様に使用され得ることを理解されたい。
【０２１４】
本発明はまた、本発明の抗体を作製するための方法も含む。例えば、本発明は、好適な宿主細胞中に抗体（例えば、抗体断片）をコードする組換えベクターをさせ、その抗体を回収することを含む。抗体を発現させるため及び精製するための方法は、当該技術分野で周知である。
【０２１５】
本発明はまた、本発明の第３、第５、第７の態様によるポリヌクレオチド分子、または本発明の第８の態様によるベクターを導入することを含む、細胞を生成する方法を提供する。ポリヌクレオチド分子及び／またはベクターを導入する好適な方法は、前述したものを含み、当該技術分野で一般的に既知である。特に、電気穿孔法が用いられてもよい。
【０２１６】
様々な宿主細胞のいずれが使用されてもよく、原核細胞、例えば、大腸菌等、または真核細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞等の哺乳動物細胞、または酵母、昆虫、もしくは植物細胞が使用されてもよい。
【０２１７】
本発明の抗体を生成するための方法に宿主細胞が使用されることに加えて、宿主細胞自体が、治療に、例えば、細胞性治療に、直接使用されてもよい。したがって、本発明は、例えば、医薬品に使用するため、または癌の治療のため及び／もしくは血管新生の阻害のために、本発明による宿主細胞を対象に投与することを含む治療の方法を提供する。したがって、本発明はまた、医薬品に使用するため、例えば、癌の治療に使用するための、本発明の第３、第５、または第７の態様によるポリヌクレオチド分子、例えば、ＲＮＡ分子、または本発明の第８の態様によるベクター、例えば、ガンマレトロウイルスを含む宿主細胞を提供する。本発明はまた、例えば、癌の治療に使用するための医薬品に使用するための薬物の製造における該宿主細胞の使用も提供する。それを発現する宿主細胞及びポリヌクレオチドによって生成される抗体の選好は、上記に概説した通りである。
【０２１８】
好ましい実施形態において、宿主細胞は、哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞）である。
【０２１９】
さらに好ましい実施形態において、宿主細胞は、免疫細胞であり、好ましくは、ヒト免疫細胞等の哺乳動物免疫細胞である。免疫細胞は、Ｔ細胞及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む。
Ｔ細胞は、αβＴ細胞、γδＴ細胞、メモリーＴ細胞（例えば、幹細胞様特性を有するメモリーＴ細胞）のいずれであってもよい。ＮＫ細胞は、インバリアントＮＫ細胞であってもよい。
【０２２０】
特に好ましい実施形態において、免疫細胞は、幹細胞様特性を有するメモリーＴ細胞である。
【０２２１】
細胞は、後に詳述するように「自家性」または「同種」であってもよい。
【０２２２】
Ｔ細胞等の免疫細胞は、末梢血単核球、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位からの組織、腹水、胸水、脾臓組織、及び腫瘍といった多数の源から得ることができる。当該技術分野で入手可能な任意の数の細胞株（例えば、Ｔ細胞株等の免疫細胞株）も使用され得る。
【０２２３】
ある実施形態において、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）は、Ｆｉｃｏｌｌ（商標）分離等の当該技術分野で既知の任意の好適な技術を用いて対象から採取される血液の単位から得られる。別の実施形態において、対象の循環血液からの細胞は、アフェレシスによって得られる。アフェレシス産物は、典型的には、Ｔ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核白血球を含むリンパ球、赤血球、及び血小板を含有する。アフェレシスによって採取された細胞を洗浄し、血漿分画を除去して、後続の処理ステップのために細胞を適切な緩衝液または培地に入れることができることを理解されたい。例えば、細胞は、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄されてもよい。代替的に、洗浄液は、カルシウムを欠いており、マグネシウムを欠いてもよいか、または全てではないにしても多くの二価カチオンを欠いてもよい。カルシウムの非存在下での初期活性化ステップが、大規模な活性化を引き起こし得る。洗浄ステップは、当業者に機知の方法によって、例えば、半自動化「フロースルー」遠心分離（例えば、Ｃｏｂｅ  ２９９１細胞プロセッサ、Ｂａｘｔｅｒ  ＣｙｔｏＭａｔｅ、またはＨａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ  Ｃｅｌｌ  Ｓａｖｅｒ  ５）を製造業者の指示に従って使用することによって達成されてもよい。洗浄後、様々な生体適合性緩衝液、例えば、カルシウムを含まない、Ｍｇを含まないＰＢＳ、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ  Ａ、または緩衝液を含むかもしくは含まない他の生理食塩水中に、細胞を再懸濁することができる。代替的に、アフェレシス試料の望ましくない構成要素を除去して、培養培地に細胞を直接再懸濁することもできる。
【０２２４】
ある実施形態において、赤血球を溶解し、例えば、ＰＥＲＣＯＬＬＴＭ（商標）勾配による遠心分離によって、または向流遠心水簸により単球を枯渇させることによって、Ｔ細胞が末梢血リンパ球から単離される。Ｔ細胞の特定の亜集団、例えば、ＣＤ３＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４５ＲＡ＋、及びＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞は、当該技術分野で機知の陽性または陰性選択技術によってさらに単離されてもよい。例えば、Ｔ細胞は、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８（例えば、３×２８）コンジュゲートビーズ、例えば、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｍ−４５０  ＣＤ３／ＣＤ２８  Ｔとともに所望のＴ細胞の陽性選択に十分な期間インキュベーションすることによって単離されてもよい。付加的にまたは代替的に、Ｔ細胞の集団は、陰性選択によって、例えば、陰性選択された細胞に特有の表面マーカーを標的とする抗体の組み合わせによって、富化されてもよい。陰性磁気免疫接着法またはフローサイトメトリーによる細胞選別及び／または選択が用いられてもよい。
【０２２５】
本発明の抗体を発現するように修飾される対象由来の細胞は、それらを使用するまで一定期間保存されてもよい（例えば、後述の治療方法を参照されたい）。例えば、細胞は、任意選択的に洗浄された後に、冷凍されてもよいか、または、必要とされるときまで細胞が生存した状態を維持するのに好適な条件下で（例えば、２〜１０℃または室温で、回転子上で）インキュベートされてもよい。このように、細胞は、必要とされ得るときまで保存することができる。細胞は、未修飾の状態（すなわち、それらが本発明の抗体を発現しない場合）または修飾された状態（すなわち、それらが本発明の抗体を発現するように修飾されている場合）で保存され得る。
【０２２６】
以下に詳述する治療用途に使用する前に、当該技術分野で機知の方法を用いて一般的に細胞を活性化し、増殖させることができる。例えば、Ｔ細胞の表面上の共刺激分子を刺激する、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体関連シグナル及びリガンドを刺激する薬剤を結合させた表面と接触させることによって、Ｔ細胞を増殖させてもよい。具体的には、Ｔ細胞集団は、本明細書に記載されるように、例えば、表面上に固定化された抗ＣＤ３抗体、もしくはその抗原結合断片、または抗ＣＤ２抗体と接触させることによって、あるいは、カルシウムイオノフォアとともにタンパク質キナーゼＣアクチベーター（例えば、ブリオスタチン）と接触させることによって、刺激してもよい。Ｔ細胞の表面上のアクセサリー分子の共刺激には、アクセサリー分子に結合するリガンドが使用される。例えば、Ｔ細胞の集団を、Ｔ細胞の刺激性増殖に適した条件下で、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体と接触させることができる。抗ＣＤ２８抗体の例として、９．３、Ｂ−Ｔ３、ＸＲ−ＣＤ２８（Ｄｉａｃｌｏｎｅ、Ｂｅｓａｎｃｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）が挙げられ、当該技術分野で一般的に知られている他の方法と同様に使用することができる（Ｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  Ｐｒｏｃ．３０（８）：３９７５−３９７７，１９９８；Ｈａａｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９０（９）：１３１９１３２８，１９９９；Ｇａｒｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈ．２２７（１−２）：５３−６３，１９９９）。
【０２２７】
様々な刺激時間に曝露されたＴ細胞は、異なる特徴を示し得る。例えば、典型的な血液、またはアフェレシスを行った末梢血単核球産物は、細胞毒性またはサプレッサーＴ細胞集団（ＴＣ、ＣＤ８＋）よりも大きなヘルパーＴ細胞集団（ＴＨ、ＣＤ４＋）を有する。ＣＤ３及びＣＤ２８受容体を刺激することによるＴ細胞のエクスビボ増殖は、約８〜９日目の前までは主としてＴＨ細胞からなるＴ細胞の集団を生じるが、約８〜９日目の後、Ｔ細胞の集団は、次第に大きくなるＴＣ細胞の集団を含む。したがって、治療の目的に応じて、主としてＴＨ細胞を含むＴ細胞集団を対象に注入することが有利であり得る。同様に、ＴＣ細胞の抗原特異的サブセットが単離された場合、このサブセットをより大きな程度まで拡張することが有益であるかもしれない。
【０２２８】
特に、Ｔ細胞は、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターを用いた形質導入の前に増殖させてもよい。
【０２２９】
ある実施形態において、本発明の抗体を発現する細胞は、その抗体発現細胞（例えば、Ｔ細胞）の活性を増強する１つ以上の他の薬剤を含むかまたは発現するようにさらに修飾される。
【０２３０】
例えば、他の薬剤は、抗体発現細胞が効果的な免疫応答を開始する能力を低下させることが分かっている、抑制分子を阻害する薬剤であってもよい。抑制分子の例として、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、及びＴＧＦＲβが挙げられる。抑制分子を阻害する薬剤は、細胞に陽性シグナルを提供する第２のポリペプチド、例えば、本明細書に記載される細胞内シグナル伝達ドメインと関連する、第１のポリペプチド、例えば、抑制分子を含んでもよい。
【０２３１】
付加的にまたは代替的に、他の薬剤は、炎症促進性または増殖促進性のサイトカインであってもよい。そのようなサイトカインの目的は、抗体発現細胞の機能、増殖、及び／もしくは持続性を増強するために自己分泌支持を提供すること、ならびに／または腫瘍微小環境を有利に変更し、内在性の先天性かつ同族の免疫効果を補充することであり得る。
【０２３２】
製剤及び投与経路
本発明の第１０の態様は、本発明の第２の態様による抗体、または本発明の第３、第５、もしくは第７の態様のいずれかによるポリヌクレオチド、本発明の第８の態様によるベクター、本発明の第９の態様による細胞、または本発明の第４もしくは第６の態様のいずれかによる化合物、ならびに薬学的に許容される希釈剤、担体または賦形剤を含む薬学的組成物を提供する。
【０２３３】
ＣＬＥＣ１４Ａの薬剤、抗体、または化合物阻害剤は、典型的には、薬学的組成物として、すなわち、薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤とともに、個体への投与のために製剤化されることを理解されたい。
【０２３４】
「薬学的に許容される」とは、製剤が滅菌され、パイロジェンフリーであることを含む。好適な薬学的担体、希釈剤、及び賦形剤は、薬学の技術分野で周知である。担体（複数可）は、阻害剤と適合可能であり、そのレシピエントに有害ではないという意味で「許容され」なければならない。典型的には、担体は、滅菌されたパイロジェンフリーな水または生理食塩水であるが、他の許容される担体が使用されてもよい。
【０２３５】
ある実施形態において、本発明の薬学的組成物または製剤は、非経口投与、より具体的には静脈内投与用である。好ましい実施形態において、薬学的組成物は、例えば、注射による、患者への静脈内投与に好適である。
【０２３６】
非経口投与に好適な製剤は、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、及び製剤を対象とするレシピエントの血液と等張にする溶質を含有し得る水性及び非水性の滅菌注射溶液；ならびに、懸濁化剤及び増粘剤を含有し得る水性及び非水性の滅菌懸濁液を含む。
【０２３７】
代替の好ましい実施形態において、薬学的組成物は、患者への局所投与に好適である。
【０２３８】
好ましくは、製剤は、活性成分の１日用量もしくは単位、１日下位用量もしくはその適切な分割量を含有する単位投与量である。
【０２３９】
薬剤、抗体、または化合物は、薬学的に許容される剤形の、任意選択的に非毒性の有機または無機の酸、または塩基、付加塩の形態である、活性成分を含む薬学的製剤の形態で、経口的に、または任意の非経口経路によって投与されてもよい。治療される障害及び患者、ならびに投与経路に応じて、組成物は、さまざまな用量で投与され得る。
【０２４０】
ヒトの治療において、薬剤、抗体、または化合物は、一般的に、対象とする投与経路及び標準的な製薬規範を考慮して選択される好適な薬学的賦形剤、希釈剤、または担体と混合して投与される。
【０２４１】
例えば、薬剤、抗体、または化合物は、即時、遅延、または制御放出用途のために、香味剤または着色剤を含有し得る錠剤、カプセル剤、腔坐剤、エリキシル剤、液剤、または懸濁剤の形態で、経口、口腔、または舌下投与されてもよい。薬剤、抗体、または化合物はまた、陰茎海綿体内注射によって投与されてもよい。
【０２４２】
好適な錠剤は、賦形剤、例えば、微結晶セルロース、ラクトース、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、第二リン酸カルシウム、及びグリシン；崩壊剤、例えば、デンプン（好ましくは、トウモロコシ、ジャガイモ、またはタピオカデンプン）、デンプングリコール酸ナトリウム、クロスカルメロースナトリウム、及び特定の複雑珪酸塩、ならびに顆粒結合剤、例えば、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、スクロース、ゼラチン及びアカシアを含有してもよい。付加的に、滑沢剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、グリセリルベヘナート、及びタルクが含まれてもよい。
【０２４３】
同様の種類の固体組成物はまた、ゼラチンカプセル中の充填剤として用いられてもよい。これに関連して好ましい賦形剤は、ラクトース、デンプン、セルロース、乳糖、または高分子量ポリエチレングリコールを含む。水性懸濁液及び／またはエリキシルの場合、本発明の化合物は、種々の甘味剤または香味剤、着色物質または染料、乳化剤及び／または懸濁剤、ならびに希釈剤、例えば、水、エタノール、プロピレングリコール、及びグリセリン、ならびにこれらの組み合わせと組み合わされてもよい。
【０２４４】
薬剤、抗体、または化合物はまた、非経口的に、例えば、静脈内、動脈内、腹腔内、くも膜下内、脳室内、胸骨内、頭蓋内、筋肉内、もしくは皮下に投与することができるか、または、それらは輸液技術によって投与されてもよい。それらは、他の物質、例えば、溶液を血液と等張にするのに十分な塩またはグルコースを含有し得る、無菌水溶液の形態で使用されるのが最適である。水溶液は、必要であれば好適に（好ましくはｐＨ３〜９に）緩衝されるべきである。無菌条件下での好適な非経口製剤の調製は、当業者に既知の標準的な製薬技術によって容器に達成される。
【０２４５】
製剤は、単回投与または複数回投与用の容器、例えば、密封されたアンプル及びバイアル中に提示されてもよく、また、使用する直前に、無菌液体担体、例えば、注射用水の添加のみを必要とするフリーズドライ（凍結乾燥）条件下で保存されてもよい。即時注射溶液及び懸濁液は、以前に記載した種類の無菌の粉末、顆粒、及び錠剤から調製され得る。
【０２４６】
ヒト患者への経口及び非経口投与の場合、薬剤、抗体、または化合物の１日投与量レベルは、通常、成人１人当たり１〜１，０００ｍｇ（すなわち、約０．０１５〜１５ｍｇ／ｋｇ）であり、単回または分割用量で投与される。
【０２４７】
したがって、例えば、薬剤、抗体、または化合物の錠剤またはカプセルは、必要に応じて、１回でまたは２回以上の投与に１ｍｇ〜１，０００ｍｇの活性薬剤を含有してもよい。医師は、いかなる場合においても、任意の個々の患者に最も好適となる実際の投与量を決定し、またそれは特定の患者の年齢、体重、及び応答に応じて異なる。上記投与量は、平均的な症例の例である。当然のことながら、より多くのまたはより少ない投与量範囲の恩恵を受ける個々の例が存在してもよく、それらは本発明の範囲内である。
【０２４８】
薬剤、抗体、または化合物はまた、鼻腔内にまたは吸入によって投与することもでき、好適な推進剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、ヒドロフルオロアルケン、例えば、１，１，１，２−テトラフルオロエタン（ＨＦＡ  １３４Ａ３または１，１，１，２，３，３，３−ヘプタフルオロプロパン（ＨＦＡ  ２２７ＥＡ３）、二酸化炭素、または他の好適なガスを使用して、加圧容器、ポンプ、スプレー、または噴霧器から乾燥粉末吸入剤またはエアロゾルスプレーの形態で都合よく送達される。加圧エアロゾルの場合、投与量単位は、計量された量を送達するための弁を提供することによって決定され得る。加圧容器、ポンプ、スプレー、または噴霧器は、例えば、エタノールと推進剤の混合物を溶媒として使用して、活性化合物の溶液または懸濁液を含有してもよく、またそれは、滑沢剤、例えば、ソルビタントリオレエートを付加的に含有してもよい。吸入剤または吸入器において使用するためのカプセル及びカートリッジ（例えば、ゼラチンでできている）は、抗体と、ラクトースまたはデンプン等の好適な粉末基剤との粉末混合物を含有するように製剤化されてもよい。そのような製剤は、肺の固形腫瘍、例えば、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胸膜肺芽腫またはカルシノイド腫瘍等を治療するのに特に有用であり得る。
【０２４９】
エアロゾルまたは乾燥粉末製剤は、好ましくは、それぞれの計量された用量または「パフ」が、患者への送達用に少なくとも１ｍｇの阻害剤を含有するように構成される。エアロゾルを用いた全体的な１日用量は、患者ごとに異なり、単回用量で投与されるか、またはより一般的には１日を通して分割用量で投与されることを理解されたい。
【０２５０】
代替的に、薬剤、抗体、または化合物は、特に、結腸、直腸、または前立腺腫瘍を治療するかまたは標的化するための坐剤またはペッサリーの形態で投与することができる。
【０２５１】
薬剤、抗体、または化合物はまた、眼内経路によって投与されてもよい。点眼用途の場合、阻害剤は、等張性の、Ｐｈ調製済みの滅菌生理食塩水中に微粒子化した懸濁液として、または好ましくは、等張性の、Ｐｈ調製済みの滅菌生理食塩水中に溶液として、任意選択的に塩化ベンジルアルコニウム等の保存剤と組み合わせて製剤化することができる。代替的に、それらは、ワセリン等の軟膏に製剤化されてもよい。そのような製剤は、目の固形腫瘍、例えば、網膜芽腫、髄様上皮腫、ブドウ膜メラノーマ、横紋筋肉腫、眼内悪性リンパ腫、または眼窩リンパ腫を治療するのに特に有用であり得る。
【０２５２】
薬剤、抗体、または化合物は、ローション、溶液、クリーム、軟膏、または散布剤の形態で局所に適用されてもよいか、または、例えば、皮膚パッチの使用によって、経皮的に投与されてもよい。皮膚への局所的な塗布の場合、薬剤、抗体、または化合物は、例えば、以下のうちの１つ以上との混合物中に懸濁または溶解された活性化合物を含有する好適な軟膏として、製剤化することができる：鉱油、液体ワセリン、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン化合物、乳化ワックス、及び水。代替的に、それらは、例えば、以下のうちの１つ以上との混合物中に懸濁または溶解された好適なローションまたはクリームとして製剤化することができる：鉱油、モノステアリン酸ソルビタン、ポリエチレングリコール、液体パラフィン、ポリソルベート６０、セチルエステルワックス、セテアリルアルコール、２−オクチルドデカノール、ベンジルアルコール、及び水。そのような製剤は、例えば、基底細胞癌、扁平上皮細胞癌、またはメラノーマ等の皮膚の固形腫瘍を治療するのに特に有用であり得る。
【０２５３】
皮膚癌の場合、薬剤、抗体、または化合物は、エレクトロインコーポレーション（ＥＩ）によって送達することもできる。ＥＩは、皮膚表面上の直径最大３０ミクロンまでの小粒子が、電気穿孔法で用いられるのと同じかまたは同様の電気パルスを受けたときに起こる。ＥＩにおいて、これらの粒子は、角質層を通って皮膚のさらに深い層内に送られる。粒子に阻害剤を負荷もしくは被覆することができるか、または粒子は、単に皮膚に孔を形成する「弾丸」として作用することができ、そこを通って薬剤、抗体、または化合物が進入することができる。
【０２５４】
口腔内での局所投与に好適な製剤は、通常はスクロース及びアカシアまたはトラガカントである香味基剤中に活性成分を含むロゼンジ剤、ゼラチン及びグリセリン、またはスクロース及びアカシア等の不活性基剤中に活性成分を含む香錠、ならびに好適な液体担体中に活性成分を含む口腔洗浄液を含む。そのような製剤は、口腔及び咽頭の固形腫瘍を治療するのに特に有用であり得る。
【０２５５】
ある実施形態において、薬剤、抗体、または化合物が、抗ＣＬＥＣ１４Ａ抗体等のポリペプチドである場合、それは、注射可能な徐放性薬剤送達システムを使用して送達されてもよい。これらは、注射の頻度を減少させるために特化して設計される。そのようなシステムの例として、生分解性微粒子に遺伝子組換えヒト成長ホルモン（ｒｈＧＨ）を封入するＮｕｔｒｏｐｉｎ  Ｄｅｐｏｔが挙げられ、いったん注射されると長時間にわたってｒｈＧＨを徐放する。
【０２５６】
薬剤、抗体、または化合物は、必要とされる部位、例えば、眼内に薬物を直接放出して眼腫瘍を治療するために、外科的に埋め込まれたデバイスによって投与することができる。そのような疾患部位への直接的な適用は、著しい全身副作用を伴わずに効果的な治療を達成する。
【０２５７】
ポリペプチド薬剤、抗体、または化合物（複数の抗体等）の送達の代替的な方法は、感熱性のＲｅＧｅｌ注射用システムである。ＲｅＧｅｌは、体温より低い温度では注射可能な液体であるが、体温では、徐々に浸食及び溶解して既知の安全な生分解性ポリマーになるゲルリザーバーを直ちに形成する。活性な薬物は、バイオポリマーが溶解するにつれて経時的に送達される。
【０２５８】
抗体等のポリペプチド医薬品はまた、経口的に送達することもできる。このプロセスは、タンパク質及びペプチドを共送達するために、体内にビタミンＢ１２を経口摂取するための天然プロセスを用いる。ビタミンＢ１２摂取系に乗ることにより、タンパク質またはペプチドは、腸壁を通って移動することができる。ビタミンＢ１２類似体と薬物との間に複合体が合成され、これは、複合体のビタミンＢ１２部分における内因子（ＩＦ）に対する著しい親和性、及び複合体の薬物部分の著しい生物活性の両方を保持する。
【０２５９】
ポリヌクレオチドは、後述するような好適な遺伝子構築物として投与し、患者に送達して、そこで発現させてもよい。典型的には、遺伝子構築物中のポリヌクレオチドは、細胞内で化合物を発現させることができるプロモーターに作動可能に連結している。本発明の遺伝子構築物は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ（２００１）に記載される、当該技術分野で周知の方法を用いて調製することができる。
【０２６０】
ポリヌクレオチドを送達する遺伝子構築物は、ＤＮＡまたはＲＮＡであってもよいが、それらはＤＮＡであることが好ましい。
【０２６１】
好ましくは、遺伝子構築物は、ヒト細胞への送達に適合される。遺伝子構築物を細胞内に導入する手段及び方法は、当該技術分野において既知であり、イムノリポソーム、リポソーム、ウイルスベクター（ワクシニア、修飾ワクシニア、レンチウイルス、パルボウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、及びアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含む）の使用、ならびに例えば、遺伝子銃及び電気穿孔法を使用したＤＮＡの直接送達によるものを含む。さらに、治療のために患者の標的部位にポリヌクレオチドを送達する方法もまた、当該技術分野で周知である。代替の方法において、ＤＮＡ巨大分子を細胞内へ運び込むために受容体媒介性エンドサイトーシスを利用する、高効率核酸送達システムが用いられる。これは、鉄輸送タンパク質トランスフェリンを、核酸に結合するポリカチオンにコンジュゲートさせることによって達成される。Ｃｏｔｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９，６０９４−６０９８の方法によって生成される欠損があるかまたは化学的に不活化されたアデノウイルス粒子のエンドソーム破壊活性を利用した、本発明のＤＮＡ構築物または他の遺伝子構築物の高効率の受容体媒介性送達もまた用いられ得る。「裸のＤＮＡ」、ならびにカチオン性及び中性脂質と複合体を形成したＤＮＡも、治療される個体の細胞に本発明のＤＮＡを導入する際に有用であり得ることを理解されたい。遺伝子治療に対する非ウイルス的なアプローチは、Ｌｅｄｌｅｙ（１９９５，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ６，１１２９−１１４４）に記載されている。
【０２６２】
特定の組織の癌／腫瘍の場合、ポリヌクレオチド阻害剤をコードするベクター中に組織特異的プロモーターを使用することが有用であり得るが、これは絶対不可欠というわけではなく、なぜなら、体内の癌／腫瘍以外の位置における薬剤または抗体の発現のリスクは、癌／腫瘍に罹患する患者に対する治療効果と比較すると容認できることが予想されるためである。細胞におけるポリヌクレオチド阻害剤の発現を一時的に制御できることが望ましい場合があるが、これもまた絶対不可欠というわけではない。
【０２６３】
本発明の抗体、薬剤、及び化合物は、保存のために凍結乾燥し、使用する前に好適な担体中で再構成することができる。任意の好適な凍結乾燥方法（例えば、スプレー乾燥、ケーキ乾燥）及び／または再構成技術が用いられ得る。当業者は、凍結乾燥及び再構成が、様々な程度の抗体活性喪失を引き起こす可能性があり（例えば、従来の免疫グロブリンでは、ＩｇＭ抗体はＩｇＧ抗体よりも活性喪失が大きくなる傾向にある）、それを補うために使用レベルが上方調節されなければならない場合があることを理解するであろう。一実施形態において、凍結乾燥された（フリーズドライ）抗体は、再水和されると、（凍結乾燥前の）活性の約２０％以下、または約２５％以下、または約３０％以下、または約３５％以下、または約４０％以下、または約４５％以下、または約５０％以下を喪失する。
【０２６４】
本発明の第１１の態様は、医薬品に使用するための、本発明の第２の態様による抗体、または本発明の第３、第５、もしくは第７の態様のいずれかによるポリヌクレオチド、本発明の第８の態様によるベクター、本発明の第９の態様による細胞、または本発明の第４もしくは第６の態様のいずれかによる化合物を提供する。本発明の抗体は全て、癌の治療における有用性を示している。したがって、一実施形態において、本発明の第２の態様による抗体、または本発明の第３、第５、もしくは第７の態様のいずれかによるポリヌクレオチド、本発明の第８の態様によるベクター、本発明の第９の態様による細胞、または本発明の第４もしくは第６の態様のいずれかによる化合物は、癌の治療に使用される。
【０２６５】
さらなる実施形態において、第２の態様による抗体、または本発明の第３、第５、もしくは第７の態様のいずれかによるポリヌクレオチド、本発明の第８の態様によるベクター、本発明の第９の態様による細胞、または本発明の第４もしくは第６の態様のいずれかによる化合物は、血管新生の阻害に使用される。抗体等の活性薬剤、核酸分子／発現ベクター、または本発明の化合物を使用して薬物を製造する方法は、医薬及び薬学の分野の当業者には周知である。
【０２６６】
細胞毒性剤の標的化送達
本発明の第１２の態様は、細胞毒性剤を個体の体内の新生血管系に標的化する方法を提供し、該方法は、
本発明の第４の態様による化合物（例えば、第２の態様による抗体、及び細胞毒性剤を含む化合物）を個体に投与することを含む。好ましくは、新生血管系は腫瘍新生血管系である。
【０２６７】
本発明のこの態様は、細胞毒性剤を個体の体内の血管系に標的化する際に使用するための本発明の第４の態様による化合物を含む。本発明のこの態様は、細胞毒性剤を個体の体内の血管系に標的化する際に使用するための薬物の調製における、本発明の第４の態様による化合物の使用をさらに含む。
【０２６８】
細胞毒性剤を新生血管系に標的化することは、血管新生を阻害する作用があることを理解されたい。よって、本発明の第１３の態様は、個体における血管新生を阻害する方法を提供し、該方法は、
本発明の第４の態様による化合物を個体に投与することを含む。好ましくは、新生血管系は腫瘍新生血管系であり、血管新生は腫瘍血管新生である。
【０２６９】
本発明のこの態様は、個体における血管新生の阻害に使用するための、本発明の第４の態様による化合物を含む。本発明のこの態様は、個体における血管新生を阻害するための薬物の調製における本発明の第４の態様による化合物の使用をさらに含む。
【０２７０】
典型的には、本発明の第１２及び第１３の態様における個体は、固形腫瘍、好ましくは、本発明の第１の態様に関連して前述したもの等を有する。
【０２７１】
本発明の第１２及び第１３の態様に記載されるように、腫瘍の新規血管新生を阻害するために細胞毒性部分を腫瘍新生血管系に標的化することは、いずれか他の抗癌化合物の非存在下で臨床的に有効であり得るが、それにもかかわらず、化合物をさらなる抗癌剤と併せて投与することが有利であり得ることを理解されたい。したがって、本発明の第１２及び第１３の態様のある実施形態において、方法は、さらなる抗癌剤を個体に投与することを含んでもよい
【０２７２】
投与されるさらなる抗癌剤の選好は、前述の細胞毒性剤のうちのいずれかを含む。例えば、抗癌剤は、シスプラチン；カルボプラチン；５−フルロウラシル（ｆｌｕｒｏｕｒａｃｉｌ）；パクリタキセル；マイトマイシンＣ；ドキソルビシン；ゲムシタビン；トムデックス；ペメトレキセド；メトトレキサート；イリノテカン、フルオロウラシル、及びロイコボリン；オキサリプラチン、５−フルオロウラシル、及びロイコボリン；ならびにパクリタキセル及びカルボプラチンのうちのいずれか１つ以上であってもよい。
【０２７３】
本発明の第４の態様による化合物、及びさらなる抗癌剤は、これらの構成要素を両方含有する薬学的組成物の形態で投与されてもよい。しかしながら、化合物及びさらなる抗癌剤は、例えば、別々の投与経路によって、別々に投与されてもよいことを理解されたい。したがって、化合物及び少なくとも１つのさらなる抗癌剤は、連続的にまたは（実質的に）同時に投与することができることを理解されたい。それらは、同じ薬学的製剤もしくは薬物中で投与されてもよいか、またはそれらは別々に製剤化され、投与されてもよい。
【０２７４】
したがって、方法は、本発明の第４の態様による化合物を個体に投与することを含んでもよく、その場合、個体は、さらなる抗癌剤を投与される個体である。同様に、方法は、さらなる抗癌剤を個体に投与することを含んでもよく、その場合、個体は、本発明の第４の態様による化合物を投与される個体である。
【０２７５】
画像化、検出、及び診断
本発明の第１４の態様は、個体の体内の新生血管系を画像化する方法を提供し、該方法は、
本発明の第６の態様による化合物を個体に投与することと、
体内の検出可能な部分を画像化することと、を含む。好ましくは、新生血管系は腫瘍新生血管系である。
【０２７６】
典型的には、個体は、固形腫瘍、好ましくは、本発明の第１の態様に関連して前述したもの等を有し、腫瘍の新生血管系が画像化される。したがって、体内の特定の器官における抗体の局在化は、個体がその器官に固形腫瘍を有し得るか、または発症している場合があることを示唆する。この方法は、例えば、以前に診断された固形腫瘍のサイズを判定する際、固形腫瘍に対する治療の有効性を判定する際、または腫瘍の転移の程度を判定する際に有用であり得る。体内の検出可能な部分を画像化するための方法は、当該技術分野で周知であり、ＰＥＴ（陽電子放射断層撮影）を含む。
【０２７７】
したがって、本発明のこの態様は、個体における固形腫瘍を検出、診断、及び予後する方法を提供し、該方法は、本発明の第６の態様による化合物を個体に投与することと、体内の検出可能な部分の存在及び／または位置を検出することと、を含む。
【０２７８】
さらなる医学的用途
血管新生の阻害は、不要な、望ましくない、または不適切な血管新生を伴う任意の疾患または状態と闘う際に有用であり得る。そのような状態は、腫瘍／癌、乾癬、月経過多、子宮内膜症、関節炎（炎症性及びリウマチ性の両方）、黄斑変性症、パジェット病、網膜症及びその血管合併症（増殖性網膜症及び未熟児網膜症、ならびに糖尿病性網膜症を含む）、良性血管増殖、線維症、肥満症、及び炎症を含む。
【０２７９】
したがって、本発明の第１５の態様は、癌、乾癬、月経過多、子宮内膜症、関節炎（炎症性及びリウマチ性の両方）、黄斑変性症、パジェット病、網膜症及びその血管合併症（増殖性網膜症及び未熟児網膜症、ならびに糖尿病性網膜症を含む）、良性血管増殖、線維症、肥満症、及び炎症からなる群から選択される疾患または状態と闘う方法を提供し、該方法は、ＣＬＥＣ１４ＡとＭＭＮＲ２との間の相互作用を阻害する薬剤を、それを必要とする個体に投与することを含む。
【０２８０】
本発明のこの態様は、癌、乾癬、月経過多、子宮内膜症、関節炎（炎症性及びリウマチ性の両方）、黄斑変性症、パジェット病、網膜症及びその血管合併症（増殖性網膜症及び未熟児網膜症、ならびに糖尿病性網膜症を含む）、良性血管増殖、線維症、肥満症、及び炎症からなる群から選択される疾患または状態と闘う際に使用するための、ＣＬＥＣ１４ＡとＭＭＮＲ２との間の相互作用を阻害する薬剤を含む。本発明のこの態様は、癌、乾癬、月経過多、子宮内膜症、関節炎（炎症性及びリウマチ性の両方）、黄斑変性症、パジェット病、網膜症及びその血管合併症（増殖性網膜症及び未熟児網膜症、ならびに糖尿病性網膜症を含む）、良性血管増殖、線維症、肥満症、及び炎症からなる群から選択される疾患または状態と闘うための薬物の調製における、ＣＬＥＣ１４ＡとＭＭＲＮ２との間の相互作用を阻害する薬剤の使用をさらに含む。
【０２８１】
ＣＬＥＣ１４ＡとＭＭＲＮ２との間の相互作用を阻害する薬剤についての選好は、本発明の第１の態様に関連して前述したものを含む。薬剤は、抗体、例えば、第２の態様による抗体、最も好ましくはＣＬＥＣ１４Ａ抗体、例えば、本明細書において言及されるアミノ酸配列の参照によって定義される抗体であることが特に好ましい。
【０２８２】
「闘う」には、障害の症状を軽減するため（すなわち、方法が緩和的に用いられる）、または障害を治療するため、または障害を予防するために（すなわち、方法が予防的に用いられる）、方法が使用され得るという意味が含まれる。
【０２８３】
したがって、本発明は、血管新生が病状に寄与する疾患を有する個体を治療する方法を提供し、該方法は、個体にＣＬＥＣ１４ＡとＭＭＲＮ２との間の相互作用を阻害する薬剤（例えば、第２の態様による抗体）を投与するステップを含む。
【０２８４】
本明細書に記載される本発明の方法または使用のいずれにおいても、個体は、好ましくはヒトである。しかしながら、個体は、任意の非ヒト哺乳動物等の非ヒトであってもよく、例えば、ウマ、イヌ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ラット、マウス、モルモット、または霊長類であってもよいことも理解されたい。
【０２８５】
典型的には、本明細書に記載される本発明の方法または使用のいずれかにおいて、個体は、結腸、直腸、卵巣、肝臓、膀胱、前立腺、乳房、腎臓、膵臓、胃、食道、肺、または甲状腺の腫瘍等の固形腫瘍を有する。
【０２８６】
スクリーニング
本発明者は、血管新生を調節する際及び／または癌と闘う際に有用であり得る薬剤のスクリーニングの新しい可能性を開く、ＣＬＥＣ１４Ａ及びＭＭＲＮ２に関与する血管新生及び腫瘍増殖の新しい制御経路を発見した。よって、本発明の第１６の態様は、血管新生を調節する際もしくは癌と闘う際に有用であり得る薬剤、または血管新生を調節する際もしくは癌と闘う際に有用であり得るリード化合物を同定する方法であって、
ＣＬＥＣ１４Ａまたはその一部分もしくは変異体を提供することであって、該一部分もしくは変異体はＭＭＲＮ２に結合することができる、提供することと、
候補薬剤を提供することと、
候補薬剤が、ＣＬＥＣ１４Ａまたはその一部分もしくは変異体のＭＭＲＮ２またはＭＭＲＮ２の一部分もしくは変異体への結合を調節するかどうかを決定することであって、該一部分もしくは変異体はＣＬＥＣ１４Ａに結合することができる、決定することと、を含む、方法を提供する。
【０２８７】
「血管新生を調節する」には、血管新生を阻害するまたは増強するという意味が含まれる。
【０２８８】
ＣＬＥＣ１４Ａポリペプチドには、図９に列挙される配列（配列番号１７）、及びその天然に存在する変異体を有するポリペプチドが含まれる。
【０２８９】
ＭＭＲＮ２に結合することができるＣＬＥＣ１４Ａの一部分または変異体には、ＭＭＲＮ２に結合することができるＣＬＥＣ１４Ａの任意の一部分または変異体が含まれる。タンパク質間相互作用を評価することは、当該技術分野における標準的習慣であり、後により詳細に記載される。
【０２９０】
典型的には、ＭＭＲＮ２に結合することができるＣＬＥＣ１４Ａの一部分は、少なくとも２０アミノ酸残基長であり、２０〜５０残基長もしくは５０〜１００残基長もしくは１００〜１５０残基長もしくは１５０〜２００残基長、またはそれ以上であってもよい。特定の実施形態において、ＭＭＲＮ２に結合することができるＣＬＥＣ１４Ａの一部は、４００、３５０、３００、２５０、１５０、１４０、１３０、１１０、１００、９５、９０、または８５アミノ酸残基長未満である。ＭＭＲＮ２に結合することができるＣＬＥＣ１４Ａの一部が、ＣＬＥＣ１４Ａの細胞外領域（残基２２〜３９６）の一部であるかもしくは該一部が細胞外領域を含有すること、または該一部がＣ型レクチン様ドメイン（残基３２〜１７３）の一部であるかもしくは該一部がドメインを含有すること、または該一部がＣ型レクチン様ドメインの残基９７〜１０８を含有することが好ましい。
【０２９１】
ＭＭＲＮ２に結合することができるＣＬＥＣ１４Ａの変異体には、ヒトＣＬＥＣ１４Ａ（その配列は図９に提供される（配列番号１７））に対して少なくとも６０％の配列相同性を有するＣＬＥＣ１４Ａの変異体、例えば、ヒトＣＬＥＣ１４Ａに対して少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列相同性を有する変異体が含まれる。変異体ポリペプチドが、図９に列挙されるＣＬＥＣ１４Ａポリペプチドの配列のうち、少なくとも２０アミノ酸残基、より好ましくは少なくとも５０残基の連続領域を有することが好ましい。そのような変異体は、例えば、当該技術分野で周知の、組換えＤＮＡ技術、タンパク質工学、及び部位特異的変異原性の方法を用いて作製されてもよい。
【０２９２】
前述のＣＬＥＣ１４Ａの一部分は、ＣＬＥＣ１４Ａ変異体の一部分でもあり得ることを理解されたい。一般的に、ＣＬＥＣ１４Ａの一部分は、ヒトＣＬＥＣ１４Ａ（その配列は図９に提供される（配列番号１７））に対して少なくとも６０％の配列相同性を有し、例えば、一部分の長さにわたって少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列相同性を有する。
【０２９３】
２つのポリペプチド間のパーセント配列相同性は、好適なコンピュータプログラム、例えば、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  ＧｒｏｕｐのＧＡＰプログラムを使用して決定されてもよく、また、パーセント相同性は、配列が最適に整列されたポリペプチドに関連して算出されることを理解されたい。アラインメントは、代替的にＣｌｕｓｔａｌ  Ｗ  ｐｒｏｇｒａｍを使用して実行されてもよい（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２２，４６７３−８０）。使用されるパラメータは次の通りであり得る：ファストペアワイズアラインメントパラメータ：Ｋ−ｔｕｐｌｅ（ｗｏｒｄ）サイズ＝１、ウィンドウサイズ＝５、ギャップペナルティ＝３、トップダイアゴナル数＝５。スコアリング法：ｘパーセント。多重アラインメントパラメータ：ギャップ開始ペナルティ＝１０、ギャップ伸張ペナルティ＝０．０５。スコアリングマトリックス：ＢＬＯＳＵＭ。
【０２９４】
ＭＭＲＮ２ポリペプチドには、図１０に列挙される配列（配列番号２０）、及びその天然に存在する変異体を有するポリペプチドが含まれる。
【０２９５】
ＣＬＥＣ１４Ａに結合することができるＭＭＲＮ２の一部分または変異体には、ＣＬＥＣ１４Ａに結合することができるＭＭＲＮ２の任意の一部分または変異体が含まれる。タンパク質間相互作用を評価することは、当該技術分野における標準的習慣であり、後により詳細に記載される。
【０２９６】
典型的には、ＣＬＥＣ１４Ａに結合することができるＭＭＲＮ２の一部分は、少なくとも２０アミノ酸残基長であり、２０〜５０残基長もしくは５０〜１００残基長もしくは１００〜１５０残基長もしくは１５０〜２００残基長、またはそれ以上であってもよい。特定の実施形態において、ＣＬＥＣ１４Ａに結合することができるＭＭＲＮ２の一部分は、８００、７００、６００、５００、４００、３５０、３００、２５０、１５０、１４０、１３０、１１０、１００、９５、９０、または８５アミノ酸残基長未満である。
【０２９７】
ＣＬＥＣ１４Ａに結合することができるＭＭＲＮ２の変異体には、ヒトＭＭＲＮ２（その配列は図１０に提供される（配列番号２０））に対して少なくとも６０％の配列相同性を有するＭＭＲＮ２の変異体、例えば、ヒトＭＭＲＮ２に対して少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列相同性を有する変異体が含まれる。変異体ポリペプチドが、図１０に列挙されるＭＭＲＮ２ポリペプチドのうち、少なくとも２０アミノ酸残基、より好ましくは少なくとも５０残基の連続領域を有することが好ましい。そのような変異体は、例えば、当該技術分野で周知の、組換えＤＮＡ技術、タンパク質工学、及び部位特異的変異原性の方法を用いて作製されてもよい。
【０２９８】
前述のＭＭＲＮ２の一部分は、ＭＭＲＮ２変異体の一部分でもあり得ることを理解されたい。一般的に、ＭＭＲＮ２の一部分は、ヒトＭＭＲＮ２（その配列は図１０に提供される（配列番号２０））に対して少なくとも６０％の配列相同性を有し、例えば、一部分の長さにわたって少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列相同性を有する。
【０２９９】
候補薬剤は、抗体、ペプチド、ペプチド模倣体、天然物、炭水化物、アプタマー、または小分子であってもよい。
【０３００】
ある実施形態において、候補薬剤は、ＣＬＥＣ１４Ａポリペプチドに選択的に結合する抗体もしくはその断片、またはＭＭＲＮ２ポリペプチドに選択的に結合する抗体もしくはその断片である。好適な抗体は、上に記載される。
【０３０１】
別の実施形態において、候補薬剤はペプチドであってもよい。ＣＬＥＣ１４ＡポリペプチドもしくはＭＭＲＮ２ポリペプチド、またはその断片に結合する好適なペプチドは、ペプチドライブラリのファージディスプレイ（Ｓｃｏｔｔ＆Ｓｍｉｔｈ（１９９０）「Ｓｅａｒｃｈｉｎｇ  ｆｏｒ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｗｉｔｈ  ａｎ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｌｉｂｒａｒｙ」Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３８６−３９０；Ｆｅｌｉｃｉ  ｅｔ  ａｌ（１９９５）「Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｏｆ  ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ」Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．１：１４９−１８３）；及びＣｏｌｌｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ（２００１）「Ｃｏｓｍｉｘ−ｐｌｅｘｉｎｇ：ａ  ｎｏｖｅｌ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｆｏｒ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ」Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７４：３１７−３３８）；例えば、インビボパニング（Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ（１９９７）「αｖ  ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ  ａｓ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｔｕｍｏｒ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｂｙ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｌｉｇａｎｄｓ」Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：５４２−５４６）、及び並行固相合成（Ｆｒａｎｋ（２００２）「Ｔｈｅ  ＳＰＯＴ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ．Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｒｒａｙｓ  ｏｎ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｓｕｐｐｏｒｔｓ  −ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２６７：１３−２６；ならびにＰｉｎｉｌｌａ  ｅｔ  ａｌ（２００３）「Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：ｍｉｘｔｕｒｅ−ｂａｓｅｄ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ」Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．９：１１８−１２２）等の方法によって同定され得る。ペプチドの解離定数は、典型的にはマイクロモルの範囲内にあるが、親和性は、多量体化によって改善され得る（Ｔｅｒｓｋｉｋｈ  ｅｔ  ａｌ（１９９７）「Ｐｅｐｔａｂｏｄｙ」：ａ  ｎｅｗ  ｔｙｐｅ  ｏｆ  ｈｉｇｈ  ａｖｉｄｉｔｙ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４，１６６３−１６６８；及びＷｒｉｇｈｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ（１９９７）「Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｐｏｔｅｎｃｙ  ｏｆ  ａｎ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｍｉｍｅｔｉｃ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｃｏｖａｌｅｎｔ  ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ」Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５，１２６１−１２６５）。
【０３０２】
たとえ、他のタンパク質、脂質、または無機化合物の結合が示されていたとしても、Ｃ型レクチンの主要なリガンドは炭水化物である。したがって、別の実施形態において、候補薬剤は、炭水化物であってもよいか、または糖タンパク質もしくは糖脂質（ｇｙｃｏｌｉｐｉｄ）等の炭水化物部分を含有する分子であってもよい。Ｃ型レクチンによる炭水化物の認識及び結合は、カルシウム依存性であることを理解されたい。したがって、この実施形態において、方法は、カルシウムイオンの存在下で実行される。
【０３０３】
さらに別の実施形態において、候補薬剤は、アプタマー、すなわち、特定のリガンド結合構造に折り畳まれる一本鎖ＤＮＡ分子であってもよい。ＣＬＥＣ１４Ａポリペプチド、ＭＭＲＮ２ポリペプチド、またはその断片に結合する好適なアプタマーは、インビトロ選択及び増幅（Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ＆Ｓｚｏｓｔａｋ（１９９２）「Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ  ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＤＮＡ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｔｈａｔ  ｆｏｌｄ  ｉｎｔｏ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｌｉｇａｎｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ」Ｎａｔｕｒｅ  ３５５：８５０−８５２；及びＤａｎｉｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ（２００３）「Ａ  ｔｅｎａｓｃｉｎ−Ｃ  ａｐｔａｍｅｒ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ  ｂｙ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌ  ＳＥＬＥＸ：ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １００，１５４１６−１５４２１）等の方法によって同定され得る。アプタマーは、ヌクレアーゼ安定性の「シュピーゲルマー」であってもよい（Ｈｅｌｍｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ（２００４）「Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｈｒｅｌｉｎ  ａｃｔｉｏｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｂｙ  ａｎ  ＲＮＡ−Ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒ」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１：１３１７４−１３１７９）。アプタマーは、典型的には、マイクロモルからサブナノモルの範囲の解離定数を有する。
【０３０４】
さらに別の実施形態において、候補薬剤は、小有機分子であってもよい。ＣＬＥＣ１４ＡポリペプチドもしくはＭＭＲＮ２ポリペプチド、またはその断片に結合する好適な小分子は、化合物の大規模ライブラリのスクリーニング（Ｂｅｃｋ−Ｓｉｃｋｉｎｇｅｒ＆Ｗｅｂｅｒ（２００１）Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ，Ｓｕｓｓｅｘ）；核磁気共鳴による構造活性相関によって（Ｓｈｕｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ（１９９６）「Ｄｉｓｃｏｖｅｒｉｎｇ  ｈｉｇｈ−ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ＳＡＲ  ｂｙ  ＮＭＲ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７４：１５３１−１５３４）；コード化された自己組織化化合物ライブラリ（Ｍｅｌｋｋｏ  ｅｔ  ａｌ（２００４）「Ｅｎｃｏｄｅｄ  ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｉｎｇ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｉｎｇ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ」Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：５６８−５７４）；ＤＮＡ鋳型化学（Ｇａｒｔｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ（２００４）「ＤＮＡ−ｔｅｍｐｌａｔｅｄ  ｏｒｇａｎｉｃ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  ｍａｃｒｏｃｙｃｌｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０５：１６０１−１６０５）；動的コンビナトリアルケミストリー（Ｒａｍｓｔｒｏｍ＆Ｌｅｈｎ（２００２）「Ｄｒｕｇ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｂｙ  ｄｙｎａｍｉｃ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．１：２６−３６）；係留（Ａｒｋｉｎ＆Ｗｅｌｌｓ（２００４）「Ｓｍａｌｌ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ：ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｎｇ  ｔｏｗａｒｄｓ  ｔｈｅ  ｄｒｅａｍ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．３：３０１−３１７）；及びＳｐｅｅｄＳｃｒｅｅｎ（Ｍｕｃｋｅｎｓｃｈｎａｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ（２００４）「ＳｐｅｅｄＳｃｒｅｅｎ：ｌａｂｅｌ−ｆｒｅｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ−ｂａｓｅｄ  ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ｏｒｐｈａｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｌｉｇａｎｄｓ」Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２４：２４１−２４９）等の方法によって同定され得る。典型的には、小有機分子は、特に空洞を有する抗原の場合、ポリペプチドに対してナノモル範囲の解離定数を有する。大抵の小有機分子結合剤の利点は、それらの製造しやすさ、免疫原性の欠如、組織分布特性、化学修飾戦略、及び経口バイオアベイラビリティを含む。分子量５０００ダルトン未満の小分子が好ましく、例えば、４００、３０００、２０００、もしくは１０００ダルトン未満、または５００ダルトン未満が好ましい。
【０３０５】
候補薬剤が、ＭＭＲＮ２またはその一部分もしくは変異体に対するＣＬＥＣ１４Ａまたはその一部分もしくは変異体の結合を調節する能力は、後により詳細に記載されるタンパク質／タンパク質相互作用または他の化合物／タンパク質相互作用を検出／測定する任意の方法によって評価され得る。好適な方法は、例えば、酵母ツーハイブリッド相互作用、共精製、ＥＬＩＳＡ、共免疫沈降、及び表面プラズモン共鳴法等の方法を含む。したがって、候補薬剤の非存在下で測定されるＣＬＥＣ１４ＡとＭＭＲＮ２との間の相互作用と比較して、ＥＬＩＳＡ、共免疫沈降、もしくは表面プラズモン共鳴法によって、または酵母ツーハイブリッド相互作用もしくは共精製法によって決定されるＣＬＥＣ１４ＡとＭＭＲＮ２との間（またはその一部分もしくは変異体）の相互作用が変化する（例えば、増加または減少する）場合、候補薬剤は、ＣＬＥＣ１４ＡとＭＭＲＮ２との間（またはその一部分もしくは断片）の結合を調節することができると見なされてもよい。相互作用が表面プラズモン共鳴法を用いて検出できることが好ましい。表面プラズモン共鳴法は、当業者に周知である。その技術は、例えば、Ｏ’Ｓｈａｎｎｅｓｓｙ  ＤＪ（１９９４）「Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｋｉｎｅｔｉｃ  ｒａｔｅ  ａｎｄ  ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｃｏｎｓｔａｎｔｓ  ｆｏｒ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ：ａ  ｃｒｉｔｉｑｕｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｌａｓｍｏｎ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ」Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５（１）：６５−７１；Ｆｉｖａｓｈ  ｅｔ  ａｌ（１９９８）「ＢＩＡｃｏｒｅ  ｆｏｒ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ」Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９（１）：９７−１０１；Ｍａｌｍｑｖｉｓｔ（１９９９）「ＢＩＡＣＯＲＥ：ａｎ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ」Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  Ｔｒａｎｓ．２７（２）：３３５−４０に記載されている。
【０３０６】
ハイスループット操作が可能なスクリーニングアッセイが特に好ましいことを理解されたい。例として、細胞ベースアッセイ及びタンパク質間結合アッセイが挙げられる。ＳＰＡベース（シンチレーション近接アッセイ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）のシステムが使用されてもよい。
【０３０７】
ポリペプチド／ポリペプチド相互作用を検出する他の方法として、限外濾過とイオンスプレー質量分析／ＨＰＬＣ法との併用、または他の物理的及び分析的方法が挙げられる。例えば、当業者に周知の蛍光エネルギー共鳴移動（ＦＲＥＴ）法が使用されてもよく、その場合、２つの蛍光標識された実体が互いに接近したときに蛍光標識の相互作用を測定することによって、それらの結合が測定され得る。
【０３０８】
候補薬剤は、ＭＭＲＮ２ポリペプチドへの添加前にＣＬＥＣ１４Ａポリペプチド（またはその一部分もしくは変異体）に添加されてもよいか、またはＣＬＥＣ１４Ａポリペプチド（またはその一部分もしくは変異体）への添加前にＭＭＲＮ２ポリペプチド（またはその一部分もしくは変異体）に添加されてもよく、結合に与えるその影響が評価されることを理解されたい。
【０３０９】
便宜上、ＣＬＥＣ１４Ａ及びＭＭＲＮ２（またはその一部分もしくは変異体）のうちの少なくともどちらか一方は、それらの結合、及びその結果として候補薬剤の影響の決定を容易にするために、検出可能に標識される。好適な標識の例として、ペプチド標識、核酸標識（Ｋｅｒｒ  ｅｔ  ａｌ（１９９３）ＪＡＣＳ  ｖｏｌ．１１５，ｐ．２５２９−２５３１；及びＢｒｅｎｎｅｒ＆Ｌｅｒｎｅｒ（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ｖｏｌ．８９，ｐ．５３８１−５３８３）、化学標識（Ｏｈｌｍｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ｖｏｌ．９０，ｐ．１０９２２２−１０９２６；及びＭａｃｌｅａｎ  ｅｔ  ａｌ（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ｖｏｌ．９４，ｐ．２８０５−２８１０）；蛍光標識（Ｙａｍａｓｈｉｔａ＆Ｗｅｉｎｓｔｏｃｋ（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ＷＯ９５／３２４２５（１９９５）；及びＳｅｂｅｓｔｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ（１９９３）Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｃ．Ｅｕｒ．Ｐｅｐｔ．Ｓｙｍｐ．２２ｎｄ  １９９２，ｐ．６３−６４）、または高周波タグ（Ｎｉｃｏｌａｏｕ  ｅｔ  ａｌ（１９９５）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．ｖｏｌ．３４，ｐ．２２８９−２２９１；及びＭｏｒａｎ  ｅｔ  ａｌ（１９９５）ＪＡＣＳ  ｖｏｌ．１１７，ｐ．１０７８７−１０７８８）が挙げられる。
【０３１０】
一実施形態において、候補薬剤は、ＣＬＥＣ１４Ａ、またはその一部分もしくは変異体とＭＭＲＮ２、またはその一部分もしくは変異体との間の結合レベルを低下させる薬剤であり、その場合、薬剤は、不要な、望ましくない、もしくは不適切な血管新生を伴う任意の疾患もしくは状態と闘う際に有用な薬剤であるか、または非常に有用な薬剤の同定のためのリード化合物であり得る。好ましくは、候補薬剤は、候補薬剤の非存在下での結合レベルと比較して、ＣＬＥＣ１４ＡとＭＭＲＮ２（またはその一部分（複数可）もしくは変異体（複数可））との間の結合レベルを少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％低下させ、より好ましくは、候補薬剤は、ＣＬＥＣ１４ＡとＭＭＲＮ２（またはその一部分（複数可）もしくは変異体（複数可））との間の結合レベルを少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％低下させる薬剤である。最も好ましくは、薬剤は、ＣＬＥＣ１４ＡとＭＭＲＮ２（またはその一部分（複数可）もしくは変異体（複数可））との間の結合レベルを検出不能なレベルまで低下させるか、またはＣＬＥＣ１４ＡとＭＭＲＮ２（またはその一部分（複数可）もしくは変異体（複数可））との間の結合を排除する薬剤である。
【０３１１】
ＣＬＥＣ１４Ａ、またはその一部分もしくは変異体のＭＭＲＮ２、またはその一部分もしくは変異体への結合を調節する候補薬剤の同定は、薬物スクリーニング経路における初期ステップであり得、同定された薬剤は、例えば、血管新生を阻害する能力及び／または腫瘍増殖を阻害する能力についてさらに選択されてもよいことを理解されたい。したがって、方法は、血管新生アッセイにおいて候補薬剤を試験するステップ及び／または固形腫瘍の動物モデルにおいて候補薬剤の有効性について試験するステップをさらに含んでもよい。
【０３１２】
血管新生の速度またはレベルを測定するための、ひいては候補薬剤が血管新生を阻害するかどうか、及びどの程度まで阻害するかを決定するための方法及びアッセイは、当該技術分野で既知である。例えば、参照により本明細書に組み込まれるＵＳ６，２２５，１１８は、血管新生の複合的な段階、すなわち、細胞発生の増幅、遊走、及び分化段階をモデル化するための多細胞のエクスビボアッセイについて記載している。ＴＣＳ  ＣｅｌｌＷｏｒｋｓ  Ｌｔｄ（Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍ  ＭＫ１８  ２ＬＲ，ＵＫ）によるＡｎｇｉｏＫｉｔ、カタログ番号ＺＨＡ−１０００は、化合物の抗血管新生特性を分析するためのヒト血管新生の好適なモデルである。また、血管新生の速度またはレベルは、当該技術分野で周知であり、かつ実施例１に記載される、冠動脈リングアッセイ及びスポンジ血管新生アッセイを用いて決定することもできる。
【０３１３】
内皮細胞の増殖、遊走、及び浸潤に関するアッセイも、血管新生アッセイとして有用である。内皮細胞増殖及び遊走に関する好適なアッセイは、当業者に既知である。内皮細胞浸潤に関する好適なアッセイもまた、当業者に既知であり、カタログ番号３５４１４１及び３５４１４２としてＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ，ＵＳＡ）から入手可能なＢＤ  ＢｉｏＣｏａｔ（商標）Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｉｎｖａｓｉｏｎ、ならびにＱＣＭ（商標）Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｉｎｖａｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を含む。
【０３１４】
これらの方法は、当業者に周知の用語である薬物スクリーニング法であってもよく、候補薬剤は、薬物様化合物、または薬物様化合物の開発のためのリード化合物であってもよいことを理解されたい。
【０３１５】
「薬物様化合物」という用語は、当業者に周知であり、例えば、薬物中の活性成分として医薬品に使用されるのに好適となり得る特徴を有する化合物という意味を含んでもよい。したがって、例えば、薬物様化合物は、有機化学の技術によって、あまり好ましくはないが分子生物学または生化学の技術によって合成され得る分子であってもよく、好ましくは、５０００ダルトン未満であってもよく、かつ水溶性であってもよい小分子である。薬物様化合物は、付加的に、特定のタンパク質（単数または複数）との選択的相互作用、ならびに生物学的に利用可能であり、かつ／または標的細胞膜もしくは血液脳関門に貫通することができるという特性を示し得るが、これらの特性は絶対不可欠というわけではないことを理解されたい。
【０３１６】
「リード化合物」という用語も、同様に当業者に周知であり、化合物が、それ自体は薬物としての使用に好適ではないものの（例えば、その対象とする標的に対して弱い効力しか示さない、その作用において非選択的である、不安定である、難溶性である、合成が困難である、または生物学的利用能が低いため）、より望ましい特徴を有し得る他の化合物の設計の出発点を提供し得るという意味を含んでもよい。
【０３１７】
ある実施形態において、同定された薬剤が修飾され、修飾された薬剤は、ＣＬＥＣ１４ＡとＭＭＲＮ２（またはその一部分（複数可）もしくは変異体（複数可））との間の結合を調節する能力について試験される。
【０３１８】
スクリーニング法は、固形腫瘍等の不要な、望ましくない、または不適切な血管新生を伴う任意の疾患または状態と闘う際に有用であり得る薬剤を同定するために使用することができることを理解されたい。したがって、スクリーニング法はまた、好ましくは、同定された薬剤または修飾された薬剤を、癌、特に固形腫瘍の動物モデルにおいて有効性について試験するさらなるステップも含む。好適なモデルは、当該技術分野で既知であり、マウスにおけるルイス肺癌皮下移植（Ｂｌａｃｋ  ５７マウスの同種移植片）またはヌードマウスにおけるＨＴ２９異種移植片皮下移植を含む。
【０３１９】
本発明は、同定された薬剤または修飾された薬剤を合成及び／または精製するさらなるステップを含んでもよい。本発明は、薬学的に許容される組成物中に薬剤を製剤化するステップをさらに含んでもよい。
【０３２０】
薬剤はまた、当業者に周知であるように、他の試験、例えば、毒性学試験または代謝試験に供されてもよい。
【０３２１】
本発明は、不要な、望ましくない、または不適切な血管新生を伴う任意の疾患または状態の治療に有用であり得る抗血管新生化合物を調製するための方法を含み、該方法は、前述のスクリーニング法を用いて薬剤を同定することと、同定された薬剤を合成、精製、及び／または製剤化することとを含む。
【０３２２】
本発明は、固形腫瘍の治療に有用であり得る抗癌化合物を調製するための方法を含み、該方法は、前述のスクリーニング法を用いて薬剤を同定することと、同定された薬剤を合成、精製、及び／または製剤化することとを含む。
【０３２３】
本発明はまた、薬学的に許容される担体を用いる前述の方法を用いて同定された薬剤を混合するステップを含む、薬学的組成物を作製する方法も含む。
【０３２４】
本明細書で言及される全ての文書は、参照により、それらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０３２５】
本明細書中の明らかに以前に公開された文書の列挙または考察は、必ずしも、その文書が最先端技術の一部であること、または共通の一般知識であることを認めるものであると解釈されるべきではない。
【０３２６】
次に、以下の実施例及び図を参照して本発明をさらに詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【０３２７】
【図１】ＣＬＥＣ１４ＡのＳｉＲＮＡノックダウンにより内皮細胞の発芽におけるＣＬＥＣ１４Ａの役割が明らかになる。［Ａ］ｑＰＣＲによって決定されるように、ＣＬＥＣ１４Ａを標的とするＳｉＲＮＡ二本鎖は、ＨＵＶＥＣにおけるＣＬＥＣ１４Ａ  ｍＲＮＡの発現を効率的にノックダウンすることができる。相対的発現は、発現をフロチリン２に正規化することによって決定した。［Ｂ］タンパク質レベルでのＣＬＥＣ１４Ａのノックダウンは、ウェスタンブロット分析により決定した。チューブリンを負荷対照として用いた。［Ｃ］対照、またはｓｉＲＮＡ処理ＨＵＶＥＣを標的とするｃｌｅｃ１４ａの、１６時間後の新芽の伸長の代表的な画像。［Ｄ］対照及びＣＬＥＣ１４ＡノックダウンＨＵＶＥＣの２７個のスフェロイド（３つの臍帯から９個のスフェロイド）に関する新芽の定量化；マン・ホイットニー統計検定ｐ＜０．００１。［Ｅ］混合対照（緑色）及びｓｉＲＮＡ処理ＨＵＶＥＣを標的とするｃｌｅｃ１４ａ（赤色）の、２４時間後の新芽の伸長の代表的な画像。［Ｆ］対照（ＣＯＮ）及びＣＬＥＣ１４Ａノックダウン（ＫＤ）ＨＵＶＥＣに由来するｔｉｐ細胞及びｓｔａｌｋ細胞の割合の定量化；ボンフェローニ事後検定を伴う二方向ＡＮＯＶＡ統計検定＊＊＊＝ｐ＜０．００１、ｎｓ＝有意ではない。
【図２】ＣＬＥＣ１４Ａの喪失はインビトロ及びインビボでの発芽を阻害する。［Ａ］Ｃ５７ＢＬ／６（ｃｌｅｃ１４ａ  ＋／＋）またはＣ５７ＢＬ／６（Ｃｌｅｃ１４ａｔｍ１（ＫＯＭＰ）Ｖｌｃｇ）（ｃｌｅｃ１４ａ  −／−）マウスにおけるｃｌｅｃ１４ａ遺伝子の略図。［Ｂ］ｃｌｅｃ１４ａの５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、コード配列（ＣＤＳ）、及び３’ＵＴＲについて、３匹のｃｌｅｃ１４ａ  ＋／＋マウス（白のバー）及び３匹のｃｌｅｃ１４ａ  −／−マウス（黒のバー）から作製したｃＤＮＡの定量的ＰＣＲ分析。相対的発現は、発現をフロチリン２に正規化することによって決定した。［Ｃ］マウスＣＬＥＣ１４Ａに対するポリクローナル抗血清を用いた、ｃｌｅｃ１４ａ  ＋／＋及びｃｌｅｃ１４ａ  −／−マウスからの肺溶解物中のＣＬＥＣ１４Ａタンパク質発現のウェスタンブロット分析。チューブリンを負荷対照として用いた。［Ｄ］ｃｌｅｃ１４ａ  ＋／＋及びｃｌｅｃ１４ａ  −／−マウスからの冠動脈リング発芽アッセイの代表的な画像。リング当たりに形成された管の定量化［Ｅ］、及び冠動脈リングからの内皮管による最大遊走距離の定量化［Ｆ］、遺伝子型当たり４８個のリングからのデータ（各遺伝子型につき６匹のマウス）；マン・ホイットニー統計検定ｐ＜０．００１。［Ｇ］ｃｌｅｃ１４ａ  ＋／＋及びｃｌｅｃ１４ａ  −／−マウスからのヘマトキシリン及びエオシンで染色したスポンジインプラント切片の代表的な画像、スポンジの中心部の切片を分析した。［Ｈ］Ｇに示されるスポンジインプラントへの細胞浸潤の定量化；マン・ホイットニー統計検定ｐ＜０．０５。［Ｉ］血管密度の定量化；マン・ホイットニー統計検定ｐ＜０．００１。［Ｊ］ｃｌｅｃ１４ａ  −／−マウスからのｘ−ｇａｌで染色し、ヘマトキシリン及びエオシンで対比染色した肝臓及びスポンジ組織の切片。
【図３】ＣＬＥＣ１４Ａの喪失は腫瘍増殖を阻害する。［Ａ］ｃｌｅｃ１４ａ  ＋／＋（丸を伴う黒い線）及びｃｌｅｃ１４ａ  −／−（四角を伴う黒い線）マウスにおけるルイス肺癌（ＬＬＣ）腫瘍の増殖；二方向ＡＮＯＶＡ統計分析、＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１。［Ｂ］ＬＬＣ腫瘍の代表的な画像。［Ｃ］７匹のｃｌｅｃ１４ａ  ＋／＋（丸）及び７匹のｃｌｅｃ１４ａ  −／−（四角）マウスのエンドポイント腫瘍重量；マン・ホイットニー統計検定ｐ＜０．００１。［Ｄ］マウスＣＤ３１について染色されたＬＬＣ腫瘍切片の免疫蛍光染色の代表的な画像。ｃｌｅｃ１４ａ  ＋／＋及びｃｌｅｃ１４ａ  −／−マウスからの血管密度の定量化［Ｅ］及び内皮化率［Ｆ］；マン・ホイットニー統計検定ｐ＜０．０００１。［Ｇ］ｘ−ｇａｌで染色し、ヘマトキシリン及びエオシンで対比染色したｃｌｅｃ１４ａ  −／−マウスからの肝臓及びＬＬＣ腫瘍組織の切片。
【図４】ＭＭＲＮ２はＣＬＥＣ１４Ａに結合する。［Ａ］２０μｇのＣＬＥＣ１４Ａ−ＥＣＤ−ＦｃまたはＦｃを用いて相互作用パートナーを沈殿させた。沈殿物及びＨＵＶＥＣ溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧで分離し、ＭＭＲＮ２（上パネル）またはＣＬＥＣ１４Ａ−ＥＣＤ−Ｆｃ（下パネル）についてブロットした。［Ｂ］ＣＬＥＣ１４Ａに対するポリクローナル抗血清を用いて、ＣＬＥＣ１４ＡをＨＵＶＥＣ溶解物から免疫沈降した。免疫沈降物をＭＭＲＮ２（上パネル）及びＣＬＥＣ１４Ａ（下パネル）についてのウェスタンブロットにより分析した。
【図５】ＣＬＥＣ１４Ａモノクローナル抗体は、ＭＭＲＮ２−ＣＬＥＣ１４Ａの相互作用をブロックする。［Ａ］ＨＡ−ＣＬＥＣ１４Ａを発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞または空のベクター（ＣＯＮ）を、ＣＬＥＣ１４Ａ  Ｃ２（カラム２）またはＣ４（カラム３）に対するＨＡタグ抗体（カラム１）またはモノクローナル抗体で染色した。細胞をフローサイトメトリーにより分析し、徐々に増加する蛍光（Ｘ軸）対カウント（Ｙ軸）のヒストグラムとして示した。［Ｂ］陰性対照ＳｉＲＮＡ二本鎖またはＣＬＥＣ１４Ａを標的とするＳｉＲＮＡ二本鎖でトランスフェクトしたＨＵＶＥＣをＣ２またはＣ４抗体でプローブし、Ａにおけるように分析した。［Ｃ］Ｃ２−ＦＩＴＣで染色する前に、ＨＵＶＥＣをブロッキング緩衝液（−）、１００μｇのＣ２抗体または１００μｇのＣ４抗体で前処理した。細胞をフローサイトメトリーにより分析した。幾何平均を、ブロッキング緩衝液で前処理した細胞の染色に対して正規化した。［Ｄ］Ｃ４−ＦＩＴＣで染色したこと以外はＣと同様である。［Ｅ］ＨＥＫ２９３Ｔ溶解物からのＭＭＲＮ２プルダウン前に、ＣＬＥＣ１４Ａ−Ｆｃ（５μｇ）プロテインＧアガロースビーズ複合体を、７．５、１５、３０μｇのｍＩｇＧまたはＣ２でブロックした。沈殿物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ＭＭＲＮ２（上パネル）及びＣＬＥＣ１４Ａ−Ｆｃ（下パネル）についてブロットした。［Ｆ］Ｃ２の代わりにＣ４を用いてブロックしたこと以外はＥと同様である。
【図６】ＭＭＲＮ２−ＣＬＥＣ１４Ａの相互作用ブロッキング抗体は、内皮管形成ならびにインビトロ及びインビボでの発芽を阻害する。ＨＵＶＥＣをマトリゲル上に播種し、２０μｇ／ｍｌのｍＩｇＧ１（ＣＯＮ）、Ｃ２、またはＣ４抗体の存在下で１６時間増殖させた。［Ａ］代表的な画像。管形成を、管の長さ［Ｂ］、視野当たりの分岐点の数［Ｃ］、網目の数［Ｄ］、分岐部の数［Ｅ］、及び分岐部の長さ［Ｆ］について分析した。３つの独立した実験のうちの１つからの代表的なデータ；クラスカル・ウォリス統計検定、＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、ｎｓ＝有意ではない。コラーゲンゲルに包埋したＨＵＶＥＣスフェロイドを、２０μｇ／ｍｌのｍＩｇＧ１（ＣＯＮ）、Ｃ２、またはＣ４を追加したＶＥＧＦを用いて発芽するように刺激した。［Ｇ］代表的な画像。［Ｈ］３つの独立した実験からの２７個のスフェロイドについてスフェロイド当たりの新芽の定量化；クラスカル・ウォリス統計検定＊＊＊＝ｐ＜０．００１、ｎｓ＝有意ではない。Ｃ５７ＢＬ／６マウスからの冠動脈リングを２０μｇ／ｍｌのｍＩｇＧ１（ＣＯＮ）、Ｃ２、またはＣ４の存在下で培養した。［Ｉ］代表的な画像。［Ｊ］リング当たりに形成された管の定量化（各条件につき少なくとも６匹のマウスを用いた、３０個のリングからのデータ）；クラスカル・ウォリス統計検定＊＊＊＝ｐ＜０．００１、ｎｓ＝有意ではない。［Ｋ］ｂＦＧＦ及びｍＩｇＧ１（ＣＯＮ）またはＣ４抗体を注入したスポンジインプラントの代表的な画像。［Ｌ］ヘマトキシリン及びエオシン染色切片の分析によるこれらのスポンジインプラントへの細胞浸潤の定量化；マン・ホイットニー統計検定ｐ＜０．０１。［Ｍ］Ｋからの血管密度の定量化；マン・ホイットニー統計検定ｐ＜０．００１。
【図７】ＭＭＲＮ２−ＣＬＥＣ１４Ａ相互作用ブロッキング抗体は腫瘍増殖を阻害する。［Ａ］ＬＬＣを注射したマウスをｍＩｇＧ１（丸を伴う黒い線；ｎ＝７）またはＣ４抗体（四角を伴う黒い線；ｎ＝７）の１００μｇ注射で処理した；二方向ＡＮＯＶＡ統計分析、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１。［Ｂ］ＬＬＣ腫瘍の代表的な画像。［Ｃ］７匹のｍＩｇＧ１処理マウス（丸）及び７匹のＣ４抗体処理マウス（四角）のエンドポイント腫瘍重量；マン・ホイットニー統計検定ｐ＜０．００１。［Ｄ］マウスＣＤ３１について染色されたＬＬＣ腫瘍切片の免疫蛍光染色の代表的な画像。ｍＩｇＧ１またはＣ４抗体で処理したマウスからの血管密度の定量化［Ｅ］及び内皮化率［Ｆ］；マン・ホイットニー統計検定ｐ＜０．００１。
【図８】ＣＬＥＣ１４Ａ−ＭＭＲＮ２結合は、内皮細胞新芽形成の重要な構成要素であり、腫瘍増殖の制御因子である。ＥＣＭ＝細胞外マトリックス、ＰＭ＝細胞膜。
【図９】Ａ：Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＰ＿７７８２３０からのヒトＣＬＥＣ１４Ａのポリペプチド配列（配列番号１７）。Ｂ：Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ＿１７５０６０からのヒトＣＬＥＣ１４ＡのｃＤＮＡ（配列番号１８）。Ｃ：ＮＭ＿１７５０６０の位置３４８〜１８２０からのヒトＣＬＥＣ１４Ａ  ｃＤＮＡのコード領域（配列番号１９）。
【図１０】ヒトＭＭＲＮ２（配列番号２０）のポリペプチド配列及びヒトＭＭＲＮ２（配列番号２１）のコーディングポリヌクレオチド配列。
【図１１】ＣＬＥＣ１４Ａ抗体、Ｃ４の可変軽鎖及び可変重鎖のポリペプチド及びポリヌクレオチド配列。
【図１２】ＣＬＥＣ１４Ａモノクローナル抗体Ｃ１、Ｃ４、及びＣ５は、ＣＬＥＣ１４Ａ−ＭＭＲＮ２の相互作用をブロックする。ヒトＣＬＥＣ１４Ａ−ＥＣＤ−Ｆｃを、プロテインＡビーズに結合させ、２０％ＦＣＳでブロックし、次いで、各ブロッキング条件でインキュベートした。次いで、これを、Ｈｉｓタグを有する完全長ヒトＭＭＲＮ２を過剰発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞の溶解物に加えた。ＣＲＴ１、ＣＲＴ４、ＣＲＴ５とのプレインキュベーションにより、ＣＬＥＣ１４Ａ−ＥＣＤ−ＦｃによってプルダウンされたＭＭＲＮ２のレベルが減少した。
【図１３】ＭＭＲＮ２は、非還元条件下でＣＬＥＣ１４ＡのＣ型レクチンドメインまたはｓｕｓｈｉドメインのいずれかに直接結合する。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ＣＬＥＣ１４Ａ野生型（ＷＴ）を含有するｐＣＳ２ベクターまたは各主要ドメインをＮ末端ＨＡタグで欠失させた（Δ）構築物で、モックトランスフェクトまたはトランスフェクトした。ＭＭＲＮ２タンパク質溶解物を用いたファーウェスタンブロットでは、Ｃ型レクチンドメイン（ＣＴＬＤ）またはｓｕｓｈｉドメインが欠落したものを除く全ての突然変異に結合を見ることができる。全ての変異タンパク質が発現されたことを示すために抗ＨＡブロットを含めた。
【図１４】ＣＤ１４１  ＣＴＬＤ（配列番号８３）、キメラタンパク質キメラ５（配列番号８４）、及びキメラ６（配列番号８５）のタンパク質配列。
【図１５】フローサイトメトリーを用いてＣＲＴ抗体の結合を分析した。全ての構築物はＣ末端ＧＦＰタグを有するため、緑色の細胞にゲートをかけ、赤色に染色した。全てのＣＲＴ抗体は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞で発現されるＣ末端ＧＦＰタグを有するＣＬＥＣ１４Ａ野生型に結合する。いずれのＣＲＴ抗体も、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞で発現されるＧＦＰタグを有する野生型トロンボモジュリンに結合しない。
【図１６】ＣＤ１４１のＣＬＥＣ１４Ａ領域１〜４２；ＣＤ１４１のＣＬＥＣ１４Ａ領域９７−１０８；及びＣＤ１４１のＣＬＥＣ１４Ａ領域１２２−１４２のアラインメント。ＣＬＥＣ１４Ａ  ＣＴＬＤ配列番号８６；ＣＤ１４１  ＣＴＬＤ配列番号８３。
【図１７】キメラ５（トロンボモジュリンのＣＴＬＤ、残りはＣＬＥＣ１４Ａ）は、ＣＲＴ２による若干の蛍光の変化を除いて、いずれのＣＲＴ抗体によっても認識されない。キメラ６（ＣＬＥＣ１４ＡのＣＴＬＤの正しい折り畳みを確実にするためのトロンボモジュリンのＳｕｓｈｉ）は、ＣＲＴ２を除く全てのＣＲＴ抗体の結合を引き起こす。
【図１８】残基９７〜１０８を、トロンボモジュリンの対応する領域と交換した。これにより、ＣＲＴ２及びＣＲＴ３がなおも結合できるため、正しい折り畳みが得られた。しかしながら、ＣＲＴ１、ＣＲＴ４、及びＣＲＴ５は、この突然変異を認識できないことから、これが結合領域であることが示唆される。
【図１９】１００万個のルイス肺癌細胞をマウスの右側腹部に皮下注射し、目に見えるサイズまで増殖させた。２週間目の抗体薬物コンジュゲート処理のエンドポイント腫瘍重量。Ｂ１２−ＡＤＣ処理群と比較した場合、ＣＲＴ４−ＡＤＣ処理群の湿重量間に有意な差があった。マン・ホイットニー検定ｐ＝０．０３１７。エラーバーＳＥＭ、ｎ＝５。データは、同じ方法の２つの別個の実験からプールした。
【０３２８】
本明細書に開示されるペプチド及びヌクレオチド配列を、下の表に要約する。ＣＤＲ領域は、Ａｂｙｓｉｓアルゴリズム（ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｙｓｉｓ／ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿ｉｎｐｕｔ／ｋｅｙ＿ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ／ｋｅｙ＿ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ．ｃｇｉ）またはｗｗｗ．ＩＭＧＴ．ｏｒｇに位置するＩＭＧＴアルゴリズム（ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ）で予測した（例えば、Ｌｅｆｒａｎｃ  ｅｔ  ａｌ  ２００９  ＮＡＲ  ３７：Ｄ１００６−Ｄ１０１２  ａｎｄ  Ｌｅｆｒａｎｃ  ２００３  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  １７：２６０−２６６を参照されたい）。
【０３２９】
下の表中のＶ１は、Ａｂｙｓｉｓアルゴリズムによって予測されるＣＤＲを指し、Ｖ２は、ＩＭＧＴアルゴリズムによって予測されるＣＤＲを指す。
【表１】
0006628290.tif 000002
0006628290.tif 000003
0006628290.tif 000004
0006628290.tif 000005
0006628290.tif 000006
0006628290.tif 000007
0006628290.tif 000008
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0006628290.tif 000010
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0006628290.tif 000026
0006628290.tif 000027
【実施例】
【０３３０】
実施例１：ＣＬＥＣ１４Ａ−ＭＭＲＮ２結合のブロッキングは発芽型血管新生及び腫瘍増殖を阻害する
概要
ＣＬＥＣ１４Ａは、腫瘍内皮マーカーである。本発明者らは、本明細書において、ＣＬＥＣ１４Ａがインビトロ及びインビボにおける発芽型血管新生の制御因子であることを示す。ＨＵＶＥＣスフェロイド発芽アッセイを用いて、本発明者らは、ＣＬＥＣ１４Ａが発芽開始の制御因子であることを発見した。冠動脈リングにおける内皮細胞の発芽の分析、ならびにｃｌｅｃ１４ａ  ＋／＋及びｃｌｅｃ１４ａ  −／−マウスからのインビボ皮下スポンジアッセイにより、ＣＬＥＣ１４Ａ欠損動物の発芽型血管新生における欠陥が明らかになった。ｃｌｅｃ１４ａ  −／−マウスマウスにおいて、腫瘍増殖が遅延し、血管分布が減少した。プルダウン実験及び共免疫沈降実験により、ＭＭＲＮ２がＣＬＥＣ１４Ａの細胞外領域に結合することが確認された。マウスモノクローナル抗体を用いてＣＬＥＣ１４Ａ−ＭＭＲＮ２相互作用を調べた。モノクローナル抗体を、この相互作用をブロックする能力についてスクリーニングした。クローンＣ４は、ＣＬＥＣ１４Ａ−ＭＭＲＮ２結合をブロックしたが、Ｃ２はブロックしなかった。Ｃ４抗体は、ＣＬＥＣ１４Ａの喪失と類似の表現型を有し、管形成及び内皮細胞の発芽をインビトロ及びインビボで撹乱させた。有意に、Ｃ４処理動物において腫瘍増殖が妨げられ、Ｃ４処理群では血管密度も減少した。本発明者らは、ＣＬＥＣ１４Ａ−ＭＭＲＮ２結合が、腫瘍増殖中に発芽型血管新生を誘発する役割を果たし、将来的な抗血管新生治療の設計において操作される可能性を有すると結論付けた。
【０３３１】
序論
固形腫瘍の成長が内皮細胞の補充、及び最終的には周囲の健康な組織の血管に依存するということは十分に確立されている。これらの補充された血管は、血流を通して腫瘍に酸素及び栄養素を送達する。この補充の主な機序は、腫瘍由来のＶＥＧＦの放出に起因する腫瘍に隣接する血管の発芽型血管新生によるものである。発芽型血管新生は、厳重に制御されたプロセスであり、主な制御構成要素は、ＶＥＧＦＲ２、Ｎｏｔｃｈ、及びアンジオポエチン（ａｎｇｐｏｉｅｔｉｎ）／Ｔｉｅ２シグナル伝達経路であり、これらの系のクロストークが、方向、増殖、及び細胞特異化に不可欠である１，２。しかしながら、最近の研究により、解糖３、ＰＫＡシグナル伝達４、及び細胞外マトリックス組成物の新しい制御因子５，６に関与する因子を含む複数の他の経路の、このプロセスの制御因子としての役割が明らかになっている。これらの因子の操作もまた、血管新生発芽をインビトロ及びインビボで抑制することが示されている。
【０３３２】
癌において血管新生を標的とすることは、標的組織型への効率的な送達、安定な遺伝子プロファイル、及び従来の化学療法よりも低い副作用の可能性を含む多くの治療上の利点を有する。現在の臨床における抗血管新生治療は、主としてＶＥＧＦシグナル伝達経路を標的としているが、あまり成果は上がっていない７。有効な抗血管新生治療を開発しようとする最近の努力は、発芽型血管新生の間に内皮ｔｉｐ細胞及びｓｔａｌｋ細胞を理解し、標的とすることに焦点を当ててきた２。これが有効であるためには、ｔｉｐ細胞の形成及び挙動に関与する経路を理解するためのより深い知識が必要である。
【０３３３】
ＣＬＥＣ１４Ａは、血管に限定されるＣ型レクチンファミリー１４に属する１回膜貫通型糖タンパク質であり、他のメンバーとして、ＣＤ２４８／ＴＥＭ１／エンドシアリン、トロンボモジュリン、及びＣＤ９３が挙げられる８。ＣＬＥＣ１４Ａは、複数の固形腫瘍に関連する血管上で高度に上方制御される内皮特異的遺伝子として最初に同定された９。より最近の研究は、１２１件の頭頸部扁平上皮癌、９５９件の乳癌、及び１７０件の腎明細胞癌のメタ分析において、「共通する血管新生の特性」の一部としてＣＬＥＣ１４Ａを示している１３。エミリンファミリーの内皮特異的ファミリーであり、細胞外マトリックスの構成要素である１４、１５ＭＭＲＮ２は、ＣＬＥＣ１４Ａの細胞外相互作用タンパク質であり、ＭＭＲＮ２とＣＬＥＣ１４Ａとの共発現が腫瘍血管系に認められている１１。この試験において、本発明者らは、発芽型血管新生におけるＣＬＥＣ１４Ａを調査し、初めて、そのインビボでの役割について調べた。
【０３３４】
結果
ＣＬＥＣ１４Ａはインビトロでの発芽型血管新生を制御する
本発明者らは、以前に、インビトロでの内皮移動及び管形成におけるＣＬＥＣ１４Ａの役割について説明した９。インビトロでの発芽型血管新生におけるＣＬＥＣ１４Ａの役割を調査するために、ｃｌｅｃ１４ａを標的とするｓｉＲＮＡまたは非相補的ＳｉＲＮＡ二本鎖で処理したＨＵＶＥＣからＨＵＶＥＣ  スフェロイドを作製した。ｑＰＣＲにより、これらの実験全体にわたって７４％の平均減少率で、ｍＲＮＡレベルでのｃｌｅｃ１４ａ発現のノックダウンが確認され（図１Ａ）、また抗ＣＬＥＣ１４Ａポリクローナル抗血清でプローブしたタンパク質抽出物のウェスタンブロット分析によりタンパク質レベルでの（図１Ｂ）ｃｌｅｃ１４ａ発現のノックダウンが確認された。ＶＥＧＦで誘導したＣＬＥＣ１４Ａノックダウンスフェロイドからの発芽が妨げられ、ノックダウンスフェロイドは、対照細胞の１３．２個と比較して、スフェロイド当たり平均６．９個の新芽を生じた（図１Ｃ及び１Ｄ）。ｔｉｐ／ｓｔａｌｋ細胞形成におけるＣＬＥＣ１４Ａの役割を特定するために、対照ＨＵＶＥＣ及びノックダウンＨＵＶＥＣを、スフェロイド形成前に赤色または緑色のいずれかで染色して混合し、発芽を誘導した（図１Ｅ）。ＣＬＥＣ１４Ａのノックダウンは、対照細胞（６７％）と比較してｔｉｐ細胞の位置（３３％）で細胞の割合を減少させたが、ＣＬＥＣ１４ＡノックダウンＨＵＶＥＣに由来するｓｔａｌｋ細胞の割合には影響は認められなかった（図１Ｆ）。これらのデータは、ＣＬＥＣ１４Ａが発芽の開始及び遊走において役割を果たすことを示唆している。
【０３３５】
ＣＬＥＣ１４Ａはインビボでの発芽型血管新生を制御する
以前に公開されたＣＬＥＣ１４Ａに関するデータは、インビトロでの内皮生物学におけるその役割を実証したが、そのインビボでの役割は報告されていない。インビボ及びエクスビボにおけるＣＬＥＣ１４Ａの役割を調査するために、ｃｌｅｃ１４ａコード配列をｌａｃＺレポーターと交換するためのマウスを作製した（図２Ａ）。均等な割合で作製したオス及びメスマウス（それぞれ、４９．５％／５０．５％）のヘテロ接合体（ｃｌｅｃ１４ａ−／＋）と、メンデル比の野生型：ヘテロ接合体：ホモ接合体マウス（それぞれ、２６．４％：４７．２％：２６．４％）の交雑。ｃｌｅｃ１４ａは、内皮に限定された遺伝子であるため、ｃｌｅｃ１４ａ  ＋／＋及びｃｌｅｃ１４ａ  −／−マウスから大動脈を単離した。抽出したｃＤＮＡをｑＰＣＲにより分析し、ｃｌｅｃ１４ａコード領域は喪失したが、５’及び３’非翻訳領域の発現は保持されたことが確認された（図２Ｂ）。タンパク質レベルでのＣＬＥＣ１４Ａの喪失も、肺組織溶解物のウェスタンブロット分析によって確認された（図１Ｃ）。
【０３３６】
多細胞三次元共培養中で発芽型血管新生におけるＣＬＥＣ１４Ａの役割を確認するために、大動脈を単離し、環状に切断してコラーゲンに包埋した。ＶＥＧＦにより細胞伸長を刺激し、内皮細胞の発芽のエンドポイント定量化の前に７日間にわたって監視した。この場合も同様に、ＣＬＥＣ１４Ａの喪失が内皮細胞の新芽の伸長及び遊走を妨げた（図２Ｄ）。野生型マウスからの冠動脈リングは、ＣＬＥＣ１４Ａノックアウトマウスで観察されたものと比較して倍以上の数の管を生じた（それぞれ、１３．４個の管と比較して３０．６個の管）（図２Ｅ）。さらに、各冠動脈リングから離れて遊走する最も遠い距離によって定義される最大遊走も、ノックアウト培養において減少した（図２Ｆ）。ＣＬＥＣ１４Ａがインビボでも同様の機能を有するかどうかを評価するために、ＣＬＥＣ１４Ａノックアウトマウスにスポンジバレルを皮下移植した。２日おきに２週間、スポンジ内へのｂＦＧＦ注射を用いて細胞浸潤及び新規血管新生を刺激した。ヘマトキシリン及びエオシンで染色したスポンジ切片の巨視的分析により、ｃｌｅｃ１４ａ  −／−動物においてスポンジへの細胞の浸潤が妨げられたことが明らかになった（図２Ｇ及び２Ｈ）。さらに、ｃｌｅｃ１４ａ  −／−動物の血管分布が優位に減少した（ｐ＜０．０１）（図２Ｉ）。新規血管新生性血管の内側を覆う内皮細胞が、このモデルにおいてｃｌｅｃ１４ａを発現することを確認するために、ＣＬＥＣ１４Ａ  ＫＯマウスからのスポンジ及び肝臓をｘ−ｇａｌで染色した。スポンジ内の血管に、対応する肝臓切片と比較して強いｘ−ｇａｌ染色が観察された（図２Ｊ）。これらのデータから、マウスＣＬＥＣ１４Ａの発現が、内皮移動及び血管新生発芽をインビボだけではなくインビトロでも制御し、ＣＬＥＣ１４Ａが発芽する内皮上で上方制御されると結論付けることができる。
【０３３７】
ＣＬＥＣ１４Ａは腫瘍増殖を促進する
ＣＬＥＣ１４Ａの発現は、健康な組織からの血管と比較してヒト腫瘍血管上で高度に上方制御されることが分かっており、癌治療はＣＬＥＣ１４Ａを標的とすることができることが示唆される９。したがって、ＣＬＥＣ１４Ａの喪失が腫瘍増殖に影響するかどうかを調査するために、本発明者らはシンジェニックなルイス肺癌（ＬＬＣ）モデルを使用した。このために、１×１０６のＬＬＣ細胞をｃｌｅｃ１４ａ  ＋／＋マウスまたはｃｌｅｃ１４ａ  −／−マウスのいずれかの右側腹部に皮下注射した。ｃｌｅｃ１４ａ  ＋／＋  同腹仔と比較してｃｌｅｃ１４ａ  −／−マウスにおいて腫瘍増殖が妨げられた（図３Ａ）。これは、３つの独立した実験によって確認された。ｃｌｅｃ１４ａ  −／−マウスから採取した切除腫瘍はｃｌｅｃ１４ａ  ＋／＋同腹仔よりもサイズが小さく（図３Ｂ）、また重量が低かった（図３Ｃ）。これらの腫瘍内の血管密度も影響を受けたかどうかを判定するために、抗ＣＤ３１抗体で組織片を染色した。分析は、異なる血管の密度低下（図３Ｄ及び３Ｅ）及び内皮化率の低下（図３Ｆ）を示す。さらに、ｃｌｅｃ１４ａ  −／−マウスから採取した腫瘍及び肝臓切片のｘ−ｇａｌ染色により、内腔が赤血球で満たされた成熟血管（図３Ｇ、黒の矢印）、及び腫瘍内の未熟な微小血管（図３Ｇ、赤の矢印）の両方でｃｌｅｃ１４ａの高い発現が明らかになり、ｃｌｅｃ１４ａが腫瘍血管上で上方制御されることが確認された。
【０３３８】
ＣＬＥＣ１４Ａ−ＭＭＲＮ２相互作用の同定及び確認
ＣＬＥＣ１４Ａの細胞外ドメインへの潜在的な結合パートナーを同定するために、本発明者らは、最初に、ヒトＦｃでタグ付けしたＣＬＥＣ１４Ａ細胞外ドメインタンパク質を精製した。このタンパク質またはＦｃのみをＨＵＶＥＣ全細胞溶解物とともにインキュベートし、プロテインＡアガロースビーズを使用して沈殿させた。次いで、沈殿したタンパク質を洗浄し、ＳＤＳ−ＰＡＧ上で分離した。７つのゲル領域を切除し、消化して、質量分析により分析した。同定された最も豊富なタンパク質は、１２個のペプチド（１１個が固有）を有するＭＭＲＮ２であり、対応する対照プルダウン画分にはペプチドは認められなかった。沈殿物のウェスタンブロット分析により、ＣＬＥＣ１４Ａ−ＥＣＤ−Ｆｃプルダウン中のＭＭＲＮ２の存在が確認され、Ｆｃのみのプルダウン中には検出されなかった（図４Ａ）。この相互作用をさらに裏付けるために、内在性ＣＬＥＣ１４ＡをＨＵＶＥＣ全細胞溶解物から免疫沈降した。ウェスタンブロット分析により、ＣＬＥＣ１４Ａ沈殿物中のＭＭＲＮ２共沈が確認されたが、ＩｇＧ対照中には検出されなかった（図４Ｂ）。
【０３３９】
ＣＬＥＣ１４Ａモノクローナル抗体の開発及び検証
ＣＬＥＣ１４Ａに関する理解を深めるために、次に本発明者らは、種交差反応性抗体を生成した。これを可能にするために、ヒトＦｃタグを有するマウスＣＬＥＣ１４Ａタンパク質をＨＥＫ２９３Ｔ細胞中に発現させ、プロテインＡカラムで精製した。次いで、完全フロイントアジュバントを用いて５０μｇのｍＣＬＥＣ１４Ａでマウスを免疫して耐容性を破壊した。ヒトＣＬＥＣ１４ＡまたはヒトＦｃに対する活性についてクローンをスクリーニングした。クローンが細胞に結合したＣＬＥＣ１４Ａを認識できることを確認するために、ＨＡ−ＣＬＥＣ１４Ａを過剰発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞をクローンＣ２もしくはＣ４またはモノクローナルＨＡタグ抗体で染色した。ＦＡＣＳ解析により、ＨＡ−ＣＬＥＣ１４Ａ過剰発現細胞における各抗体の蛍光の増加を、対照でトランスフェクトした細胞と比較して示す（図５Ａ）。抗体がＣＬＥＣ１４Ａの内在性形態を認識することを確認するために、これらのクローンを用いて、対照でまたはｓｉＲＮＡを標的とするｃｌｅｃ１４ａで処理したＨＵＶＥＣを染色した。対照ＨＵＶＥＣは、クローンＣ２及びＣ４によって強く染色され、この染色は、ＣＬＥＣ１４Ａのノックダウンによってアイソタイプの対照レベルまで減少された（図５Ｂ）。これらの結果は、ＣＬＥＣ１４Ａモノクローナル抗体の特性を裏付けるものであった。
【０３４０】
Ｃ２及びＣ４クローンがＣＬＥＣ１４Ａの同じ領域に結合するかどうかを判定するために、Ｃ２−ＦＩＴＣで染色する前に、ＨＵＶＥＣをＢＳＡ、Ｃ２、またはＣ４抗体で前処理した。Ｃ２とのインキュベーションはＣ２−ＦＩＴＣ染色を効果的にブロックしたが、Ｃ４はほとんど効果を示さなかった（図５Ｃ）。Ｃ４−ＦＩＴＣ染色の前に同じ前処理を繰り返した。Ｃ２抗体は、Ｃ４−ＦＩＴＣ染色に影響を与えなかったが、Ｃ４で前処理したＨＵＶＥＣは、Ｃ４−ＦＩＴＣの結合低下を示した（図５Ｄ）。これらの結果から、Ｃ２及びＣ４がＣＬＥＣ１４Ａの異なる領域に結合すると結論付けることができる。
【０３４１】
ＣＬＥＣ１４Ａモノクローナル抗体はＣＬＥＣ１４Ａ−ＭＭＲＮ２結合をブロックする
これらのＣＬＥＣ１４Ａモノクローナル抗体のいずれかが、ＭＭＲＮ２のＣＬＥＣ１４Ａへの結合を阻害することができるかどうかを決定するために、ＭＭＲＮ２を過剰発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞の溶解物とのインキュベーション前に、徐々に濃度を増加させたｍＩｇＧ１、Ｃ２、Ｃ４でＣＬＥＣ１４Ａ−ＥＣＤ−Ｆｃをプレインキュベートした。次いで、沈殿物を分離し、ＭＭＲＮ２またはＣＬＥＣ１４Ａ−ＥＣＤ−Ｆｃについてプローブした。ｍＩｇＧ１またはＣ２でブロックしたＣＬＥＣ１４Ａ−ＥＣＤ−Ｆｃ沈殿物にはＭＭＲＮ２の結合が観察されたが（図５Ｅ）、Ｃ４でブロックした沈殿物中にはＭＭＲＮ２の結合は観察されなかった（図５Ｆ）。これは、Ｃ４モノクローナル抗体は、ＣＬＥＣ１４ＡへのＭＭＲＮ２の結合をブロックするが、Ｃ２はブロックしないことを裏付けるものである。
【０３４２】
ＣＬＥＣ１４Ａ−ＭＭＲＮ２ブロッキング抗体は管形成及び発芽型血管新生をインビトロ及びインビボで阻害する
本発明者らは、以前に、ＣＬＥＣ１４Ａの発現が内皮細胞の遊走及び管形成を制御することを示した９。Ｃ２またはＣ４が内皮細胞の遊走の調節において役割を果たすかどうかを評価するために、ＨＵＶＥＣ単層に創傷を形成し、２０μｇ／ｍｌのｍＩｇＧ１、Ｃ２、またはＣ４で処理した。１６〜２４時間に創傷の閉鎖を評価した。しかしながら、いずれの処理間にも違いは観察されなかった（データは示さず）。ＣＬＥＣ１４Ａモノクローナル抗体がインビトロでの管形成において制御特性を有するかどうかを決定するために、ＨＵＶＥＣをＭａｔｒｉｇｅｌ上に播種し、ｍＩｇＧ１、Ｃ２、またはＣ４のいずれかで１６時間処理した。Ｃ２処理は、ｍＩｇＧ１対照と比較すると管形成に影響を及ぼさなかったが、Ｃ４による処理は、枝分及び網目に影響を与えた（図６Ａ）。各々の処理は、全体的な管の長さ（図６Ｂ）または分岐点の数（図６Ｃ）に影響を与えなかった。対照的に、Ｃ４処理群において網目の数（図６Ｄ）が減少し、これに対応して、この処理群の分岐部の数が対照群及びＣ２群と比較して増加した（図６Ｅ）。さらに、Ｃ４で処理したＨＵＶＥＣの分岐部の長さが減少した（図６Ｆ）。これらのデータは、Ｃ４が発芽またはセンシングを阻害し、管の相互接続性を遅延させるが、第２のＣＬＥＣ１４Ａを標的とする抗体（Ｃ２）は管形成に対して作用しないことを示唆している。
【０３４３】
ＭＭＲＮ２−ＣＬＥＣ１４Ａ相互作用の破壊がインビトロでの発芽にどのように影響するのかを調査するために、２０μｇ／ｍｌのＣ４またはＣ２またはｍＩｇＧ１対照抗体でＨＵＶＥＣスフェロイドを処理した。対照であるｍＩｇＧ１で処理したスフェロイドは、予想通り、１６時間後に新芽を形成した（図６Ｇ）。Ｃ２による処理は発芽に影響を与えなかったが、Ｃ４による処理は新芽形成を５０％阻害した（図６Ｇ及び６Ｈ）。さらに調査するために、冠動脈リング培養物にも２０μｇ／ｍｌのＣ４またはＣ２またはｍＩｇＧ１抗体を追加した。内皮細胞の伸長及び管形成は、ｍＩｇＧ１の存在下で７日間培養した後に十分に確立された（図６Ｉ）。Ｃ４抗体は、管の伸長を効率的に阻害したが、Ｃ２抗体は、冠動脈リングからの管形成／新芽形成の制御においては機能しなかった（図６Ｉ及び６Ｊ）。
【０３４４】
インビボでのＭＭＲＮ２−ＣＬＥＣ１４Ａ相互作用における役割を評価するために、皮下スポンジインプラントを使用した。１０μｇのｍＩｇＧ１またはＣ４抗体のいずれかを添加することにより、スポンジ浸潤を前述のように刺激した。全体的な細胞のスポンジ浸潤は、Ｃ４処理群においてｍＩｇＧ１対照と比較して有意に減少した（ｐ＜０．０１）（図６Ｋ及び６Ｌ）。Ｃ４抗体群では、浸潤されたスポンジの血管密度も減少した（図６Ｍ）。これらのデータは、ＭＭＲＮ２−ＣＬＥＣ１４Ａ相互作用がインビボ血管新生を促進することを証明している。
【０３４５】
ＣＬＥＣ１４Ａ−ＭＭＲＮ２ブロッキング抗体は腫瘍増殖を阻害する
ＬＬＣ腫瘍を有するマウスに、試験期間中、１０μｇのＣ４またはｍＩｇＧ１（対照）を週に２回腹腔内注射した。Ｃ４抗体で処理したマウスの場合、対照であるｍＩｇＧ１処理群と比較して腫瘍増殖が遅延された（図７Ａ）。Ｃ４処理マウスの腫瘍は、対照動物よりサイズが小さく（図７Ｂ）、重量が少なかった（図７Ｃ）。この場合も同様に、これらの腫瘍内の血管密度を調べた。組織片を抗ＣＤ３１抗体で染色し、蛍光分析により、異なる血管の密度（図７Ｄ及び７Ｅ）及び内皮化率の低下が明らかとなり（図７Ｆ）、ＭＭＲＮ２へのＣＬＥＣ１４Ａ結合が、腫瘍によって誘導される血管新生の重要な機能的構成要素であることが示唆された。
【０３４６】
考察
ＣＬＥＣ１４Ａは、複数の腫瘍型において腫瘍血管新生に寄与する内皮遺伝子の小さなグループの１つである９，１３。ここでは、ＣＬＥＣ１４Ａの喪失によって、腫瘍増殖がインビボで阻害されることを実証する（図３）。ＴＥＭ８，１６、エンドグリン１７、ガレクチン１８、ＥＬＴＤ１１３、及びエンドシアリン１９等の他の腫瘍内皮マーカーについても同様の表現型が観察されており、これらの腫瘍内皮で発現される遺伝子の血管新生反応及び腫瘍増殖における重要性が示される。多くのグループが生理的な発芽型血管新生に関与する因子に焦点を当ててきているが、これらの腫瘍内皮で発現される遺伝子は、腫瘍に抗血管新生の治療可能性を送達することができる２０。
【０３４７】
ＣＬＥＣ１４Ａの上方制御は、膵臓癌及び子宮頸癌のヒト腫瘍９，１３，２１及びマウスモデルにおいて観察されており１１、これは、ＬＬＣモデルにおいてｃｌｅｃ１４ａの発現が腫瘍血管上で上方制御されるという本発明者らの所見を支持するものである（図３）。ＣＬＥＣ１４Ａは、接着１０，１２、遊走９，１０，１２、管形成，９−１１を含む内皮生物学の多くの態様を制御することが示されているが、次に本発明者らは、これがインビトロ及びインビボでの発芽型血管新生にとっても重要であることを実証する（図１及び２）。インビトロでのＨＵＶＥＣ発芽は、ＣＬＥＣ１４Ａノックダウンによって撹乱されるため、他の細胞型の存在は不要であることが示唆されることから、本発明者らは、このＣＬＥＣ１４Ａの役割は、内皮−内皮相互作用または内皮−細胞外マトリックス相互作用によるものであると推察する。本発明者らはまた、皮下スポンジアッセイにおいて、新規血管新生性血管上のｃｌｅｃ１４ａ発現の上方制御を初めて観察した（図２）。新しく形成された内皮新芽は、４．２μｍの分岐点から新芽の先端まで極めて低い剪断応力（０．２Ｐａ）を経験するようにモデル化されており２３、ｃｌｅｃ１４ａ発現は、低い剪断応力によって上方制御されることが分かっている９ため、このことは予想される。
【０３４８】
Ｚａｎｉｖａｎらは、ＭＭＲＮ２と相互作用する細胞外マトリックスの構成要素としてＣＬＥＣ１４Ａを同定した１１。本発明者らは、ＣＬＥＣ１４Ａの細胞外ドメインを用いたＨＵＶＥＣ溶解物からのタンパク質のプルダウン、及び内在性タンパク質の共免疫沈降により、この相互作用を独立して検証した（図４）。ＣＬＥＣ１４Ａモノクローナル抗体の作製及び検証を通して、ＣＬＥＣ１４Ａの異なる領域に結合する２つの抗体を同定し（図５Ｃ及び５Ｄ）、Ｃ２クローンではなく、Ｃ４クローンが、ＣＬＥＣ１４ＡとＭＭＲＮ２との相互作用をブロックすることを示した（図５Ｅ）。ＣＬＥＣ１４Ａ−ＭＭＲＮ２相互作用の機能を証明するために、本発明者らは、マトリゲル管形成アッセイにＣ４抗体を使用し、分岐の増加及び発生した網目の減少を見出した（図６）。ｓｉＲＮＡによるノックダウン、またはポリクローナルＣＬＥＣ１４Ａ抗血清による標的化は、このインビトロマトリゲルアッセイにおいて分岐に同様の影響を与える９。しかしながら、ＣＬＥＣ１４Ａに結合するが、ＭＭＲＮ２の結合はブロックしない別のモノクローナル抗体は、影響を与えなかった（図６）。ＣＬＥＣ１４Ａのｃ型レクチンドメイン（ＣＴＬＤ）を標的とするＩｇＧを開発するためのファージディスプレイを使用した研究において、試験した全てのクローンではないが、作製したＩｇＧのいくつかはＨＵＶＥＣ細胞遊走及び管形成を減少させた１２。本発明者らのモノクローナル抗体は同様の機能を有するため、ＭＭＲＮ２結合部位がＣＬＥＣ１４ＡのＣＴＬＤ領域内に存在する可能性があるが、これを裏付けるためにはさらなる研究が必要である。Ｃ４抗体で処理したインビトロ及びインビボの発芽アッセイもまた、内皮細胞の発芽に対するＣＬＥＣ１４Ａ−ＭＭＲＮ２相互作用の役割を実証した（図６）。最後に、本発明者らは、ＣＬＥＣ１４Ａ−ＭＭＲＮ２相互作用が腫瘍増殖にとって重要であり（図７）、ｃｌｅｃ１４ａ  −／−マウスに見られるように、Ｃ４による処理が、腫瘍増殖を再現し、腫瘍血管分布を減少させたことを見出した（図３）。腫瘍内皮マーカー機能の抗体による阻害は、ＴＥＭ８２４に対する抗血管新生治療の様式として提案されており、本発明者らの研究はこのアプローチを裏付けるものである。この実施例ではリガンドまたは作用様式は特定されていないが、ＣＬＥＣ１４Ａ及び特定の細胞外相互作用が腫瘍増殖にとって重要であることが示されたのはこれが初めてであり、従来の手段に新しい抗血管新生治療を提唱する。
【０３４９】
材料及び方法
試薬
ウェスタンブロット及び免疫沈降用    一次抗体：ヒツジポリクローナル抗ヒトＣＬＥＣ１４Ａ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）、マウスモノクローナル抗ヒトチューブリン（Ｓｉｇｍａ）、マウスポリクローナル抗ヒトＭＭＲＮ２（Ａｂｎｏｖａ）；二次抗体：西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）にコンジュゲートさせたヤギポリクローナル抗マウスＩｇＧ（Ｄａｋｏ）、ＨＲＰにコンジュゲートさせたロバポリクローナル抗ヒツジＩｇＧ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）。免疫蛍光法用    一次抗体：ウサギポリクローナル抗マウスＰＥＣＡＭ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）；二次抗体：Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８にコンジュゲートさせたロバポリクローナル抗ウサギ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。フローサイトメトリー用    一次抗体：マウスモノクローナル抗ＨＡタグ（ＣＲＵＫ）、マウスモノクローナル抗ＣＬＥＣ１４Ａ（後述のＣ２、Ｃ４）；二次抗体：Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８にコンジュゲートさせたヤギポリクローナル抗マウスＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。
【０３５０】
プラスミド
タンパク質生成用；レンチウイルスプラスミドｐｓＰＡＸ２（レンチウイルスパッケージング；Ａｄｄｇｅｎｅ）、ｐＭＤ２Ｇ（エンベローププラスミド；Ａｄｄｇｅｎｅ）、及びｐＷＰＩ  ｈＣＬＥＣ１４Ａ−ＥＣＤ−Ｆｃ（ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰを含有するレンチウイルスの哺乳動物発現プラスミド；Ａｄｄｇｅｎｅ）を使用した。ｐＷＰＩ  ｈＣＬＥＣ１４Ａ−Ｆｃ及びｍＣＬＥＣ１４Ａ−Ｆｃをｃｌｅｃ１４ａ  ＩＭＡＧＥクローン（Ｏｒｉｇｅｎｅ）からｐｃＤＮＡ３−Ｆｃプラスミドへの初期ＰＣＲサブクローニングにより作製した。使用したプライマーは次の通りであった：ヒトＣＬＥＣ１４Ａ順方向５’ＴＡＧＴＡＧＧＡＡＴＴＣＧＡＧＡＧＡＡＴＧＡＧＧＣＣＧＧＣＧＴＴＣＧＣＣＣＴＧ３’（配列番号２２）；ヒトＣＬＥＣ１４Ａ逆方向−５’ＡＧＡＡＣＣＧＣＧＧＣＣＧＣＴＧＧＡＧＧＡＧＴＣＧＡＡＡＧＣＣＴＧＡＧＧＡＧＴ３’（配列番号２３）；マウスＣＬＥＣ１４Ａ順方向−５’ＴＡＧＴＡＧＧＡＡＴＴＣＧＡＧＡＧＡＡＴＧＡＧＧＣＣＡＧＣＧＣＴＴＧＣＣＣＴＧ３’（配列番号２４；マウスＣＬＥＣ１４Ａ逆方向−５’ＣＴＡＣＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＧＴＧＧＡＡＧＡＧＧＴＧＴＣＧＡＡＡＧＴ３’（配列番号２５）。ＥｃｏＲ１及びＮｏｔ１制限部位を用いてＣＬＥＣ１４Ａを挿入した。さらなるラウンドのＰＣＲサブクローニングを行ってＣＬＥＣ１４Ａ−Ｆｃ融合物をｐＷＰＩに転写した。使用したプライマーは次の通りであった：ヒトＣＬＥＣ１４Ａ順方向−５’ＴＡＧＴＡＧＴＴＡＡＴＴＡＡＧＡＧＡＧＡＡＴＧＡＧＧＣＣＧＧＣＧＴＴＣ３’（配列番号２６）；マウスＣＬＥＣ１４Ａ順方向−５’ＴＡＧＴＡＧＴＴＡＡＴＴＡＡＧＡＧＡＧＡＡＴＧＡＧＧＣＣＡＧＣＧＣＴＴ３’（配列番号２７）；ヒトＦｃ逆方向−５’ＣＴＡＣＴＡＧＴＴＴＡＡＡＣＴＣＡＴＴＴＡＣＣＣＧＧＡＧＡＣＡＧＧＧＡ３’（配列番号２８）。このステップのために、Ｐａｃ１及びＰｍｅ１制限部位を用いた。
【０３５１】
以下のプライマーを用いて、ＭＭＲＮ２哺乳動物発現プラスミドを、ｍｍｒｎ２  ＩＭＡＧＥクローン（Ｔｈｅｒｍｏ）からｐＨＬ−Ａｖｉｔａｇ３にＰＣＲクローニングすることにより構築した２５：順方向−ＣＣＧＧＡＣＣＧＧＴＣＡＧＧＣＴＴＣＣＡＧＴＡＣＴＡＧＣＣ（配列番号２９）；逆方向−ＣＧＧＧＧＴＡＣＣＧＧＴＣＴＴＡＡＡＣＡＴＣＡＧＧＡＡＧＣ（配列番号３０）。Ａｇｅ１及びＫｐｎ１制限酵素を使用した。
【０３５２】
細胞培養
ヒト臍帯静脈内皮細胞は、以前に記載されたように単離した９。臍帯は、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ  Ｗｏｍｅｎ’ｓ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｃａｒｅ  ＮＨＳ  Ｔｒｕｓｔからインフォームドコンセントにより得た。１〜６継代のＨＵＶＥＣを用いて、１０％ウシ胎仔血清（ＰＡＡ）、１％ウシ脳抽出物２６、９０μｇ／ｍｌヘパリン、ならびに４ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有するＭ１９９完全培地（ｃＭ１９９）中で培養し、ブタ皮膚からの０．１％タイプ１ゼラチンで被覆したプレートに播種した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＰＡＡ）、４ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有するＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ）完全培地（ｃＤＭＥＭ）中で培養した。
【０３５３】
ＨＵＶＥＣにおけるＳｉＲＮＡトランスフェクションを、以前に記載されたように行った９。前述のレンチウイルスパッケージング、エンベロープ、及び発現プラスミドを用いた一過性トランスフェクションにより、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中にレンチウイルを生成した。プラスミドを、１：４の比でポリエチレンイミン（３６μｇ／ｍｌ）を含むＯｐｔｉＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中、室温で１０分間インキュベートした後、ｃＤＭＥＭ中のＨＥＫ２９３Ｔ細胞に添加した。培地上清を用いて新しいＨＥＫ２９３Ｔ細胞に形質導入した。ＧＦＰ陽性ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をソートし、タンパク質生成に用いた。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＭＭＲＮ２の発現は、ｐＨＬ−Ａｖｉｔａｇ３  ｈＭＭＲＮ２を用いた前述のようなポリエチレンイミンによる一過性トランスフェクションによって達成した。
【０３５４】
定量的ＰＣＲ
Ｈｉｇｈ−Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ａｒｃｈｉｖｅキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、１μｇの抽出した全ＲＮＡからｃＤＮＡを調製した。ｑＰＣＲ反応は、ＲＧ−３０００（Ｃｏｒｂｅｔｔ／Ｑｉａｇｅｎ、Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ，ＵＫ）サーモサイクラー上でＥｘｐｒｅｓｓ  ｑＰＣＲ  ＳｕｐｅｒＭｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて行った。ヒトＣＬＥＣ１４ａ及びフロチリン−２用のプライマーについては、以前に記載した通りである９。マウスｃｌｅｃ１４ａの５’ＵＴＲ、ＣＤＳ、及び３’ＵＴＲ、ならびにマウスβアクチン用のプライマーは、次の通りである：５’ＵＴＲ順方向−ＴＴＣＣＴＴＴＴＣＣＡＧＧＧＴＴＴＧＴＧ（配列番号３１）；５’ＵＴＲ逆方向−ＧＣＣＴＡＣＡＡＧＧＴＧＧＣＴＴＧＡＡＴ（配列番号３２）；ＣＤＳ順方向−ＡＡＧＣＴＧＴＧＣＴＣＣＴＧＣＴＣＴＴＧ（配列番号３３；ＣＤＳ逆方向−ＴＣＣＴＧＡＧＴＧＣＡＣＴＧＴＧＡＧＡＴＧ（配列番号３４）；３’ＵＴＲ順方向−ＣＴＧＴＡＧＡＧＧＧＣＧＧＴＧＡＣＴＴＴ（配列番号３５）；３’ＵＴＲ逆方向−ＡＧＣＴＧＣＴＣＣＣＡＡＧＴＣＣＴＣＴ（配列番号３６）；ｍＡＣＴＢ順方向−ＣＴＡＡＧＧＣＣＡＡＣＣＧＴＧＡＡＡＡＧ（配列番号３７）；ｍＡＣＴＢ逆方向−ＡＣＣＡＧＡＧＧＣＡＴＡＣＡＧＧＧＡＣＡ（配列番号３８）。相対的発現比は、効率を調節した数学モデルに従って算出した２７。
【０３５５】
ウェスタンブロット及び免疫沈降
全細胞タンパク質溶解物を作製し、２×１０７ＨＵＶＥＣからタンパク質を抽出したことを除いて、以前に記載されたように共免疫沈降実験を行った２８。ＣＬＥＣ１４Ａ相互作用タンパク質の初期単離には、５μｇのＣＬＥＣ１４Ａ−Ｆｃまたは等モル量のｈＦｃを用いた。内在性免疫沈降実験には、０．４μｇの抗ＣＬＥＣ１４Ａ抗体またはヒツジＩｇＧを用いた。ブロッキング実験のために、５μｇのＣＬＥＣ１４Ａ−ＦｃまたはｈＦｃを、ＰＢＳ中で一晩、プロテインＧビーズに結合させた。２０％ＦＣＳ（ＰＡＡ）を含有するＰＢＳ中でビーズを５〜６時間ブロックした。結合したＣＬＥＣ１４Ａ−ＦｃまたはｈＦｃタンパク質を、結合緩衝液中の徐々に濃度を増加させたｍＩｇＧ、Ｃ２、またはＣ４で一晩ブロックした。ＭＭＲＮ２でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞からの溶解物を、次いで、ビーズ複合体で一晩インキュベートした後、洗浄してウェスタンブロットにより分析した。ウェスタンブロット及びＳＤＳ−ＰＡＧＥの標準プロトコルを使用した。一次抗体は、対応するＨＲＰにコンジュゲートさせた二次抗体とともに、本文に示されるように使用した。
【０３５６】
フローサイトメトリー
細胞を、細胞解離緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で解離し、ＰＢＳ中ですすいだ後、ブロッキング緩衝液（ＰＢＳ、３％ＢＳＡ、１％ＮａＮ３）中で１５分間インキュベーションした。その後の染色では、１０μｇ／ｍｌの抗ＨＡタグ（ＣＲＵＫ）、１０μｇ／ｍｌの抗ＣＬＥＣ１４Ａ（後述のＣ２、Ｃ４））を、一次抗体としてブロッキング緩衝液中で３０分間使用した。細胞をＰＢＳ中ですすぎ、ブロッキング緩衝液中でＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８にコンジュゲートさせたヤギポリクローナル抗マウスＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色した。ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ装置（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ）を使用してデータ（１５，０００事象／試料）を収集し、結果をＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｃｅｌｌ  Ｑｕｅｓｔ  ソフトウェアを用いて分析した。
【０３５７】
ＨＵＶＥＣスフェロイド発芽アッセイ及びインビトロマトリゲル管形成アッセイ
ＨＵＶＥＣスフェロイドの作製及びコラーゲンゲル中での内皮細胞の発芽の誘導は、スフェロイド当たり１０００個のＨＵＶＥＣを使用して、以前に記載されたお通りに行った２９。定量化は、包埋の１６時間後に行った。新芽の成長を定量化するために、新芽の数を数え、新芽の累積長さ及び新芽の最大長さを評価した。２色発芽実験のために、ＨＵＶＥＣをオレンジ色及び緑色のＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で前標識した。２４時間後、スフェロイドを４％ホルムアルデヒド中で固定し、Ｖｅｃｔｏｒｓｈｉｅｌｄ（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｓ）でマウントした。Ａｘｉｏｓｋｏｐ２顕微鏡及びＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎ  ＳＥ６４  Ｒｅｌ４．８ソフトウェア（Ｚｅｉｓｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）を用いて画像化した。
【０３５８】
マトリゲル管形成アッセイのために、１．４×１０５ＨＵＶＥＣを、１２ウェルプレート内の７０μｌの基底膜抽出物（Ｍａｔｒｉｇｅｌ，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ）上に播種した。１６時間後、１０ｘ倍率のＵＳＢ  ２．０  ２Ｍ  Ｘｌｉデジタルカメラ（ＸＬ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ＬＬＣ、Ｃａｒｒｏｌｌｔｏｎ，ＴＸ，ＵＳＡ）を装備したＬｅｉｃａ  ＤＭ  ＩＬ顕微鏡（Ｌｅｉｃａ，Ｍｉｌｔｏｎ  Ｋｅｙｎｅｓ，ＵＫ）を使用して、ウェル当たり５つの視野の画像を撮影した。画像は、Ｉｍａｇｅ  Ｊ用のＡｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  Ａｎａｌｙｚｅｒプラグインを用いて分析し（Ｃａｒｐｅｎｔｉｅｒ  Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ｆｏｒ  ＩｍａｇｅＪ．４ｔｈ  ＩｍａｇｅＪ  Ｕｓｅｒ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ）ａｎｄ  ａｖａｉｌａｂｌｅ  ａｔ  ｔｈｅ  ＮＩＨウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｉｍａｇｅｊ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／ｍａｃｒｏｓ／ｔｏｏｌｓｅｔｓ／Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ％２０Ａｎａｌｙｚｅｒ．ｔｘｔ）で入手可能である。
【０３５９】
タンパク質の生成
ＣＬＥＣ１４Ａ−Ｆｃを発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞から培養液（ＣＭ）を回収した。ＣＭをＨｉＴｒａｐプロテインＡ  ＨＰカラム（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ａｍｅｒｓｈａｍ，ＵＫ）上に流し、１００ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ３）の０〜１００％勾配を用いてタンパク質を溶出させた後、１Ｍトリス塩基で中和した。画分をＳＤＳ−ＰＡＧにかけ、クーマシー染色及びウェスタンブロットによりタンパク質の純度及び特異性について評価した。同様の濃度を含有する画分を併せ、機能アッセイの前にＰＢＳで透析した。
【０３６０】
モノクローナル抗体産生
マウスモノクローナル抗体は、本発明者らによって提供された耐容性を破壊するために、以下のプロトコルを使用してＳｅｒｏｔｅｃ  Ｌｔｄ（Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ）によって商業的に調製された。精製マウスＣＬＥＣ１４Ａ−Ｆｃ融合タンパク質を、フロイント完全アジュバント中５０μｇで皮下投与した。２週間後、マウスに別の５０μｇを皮下投与したが、今回はフロイントアジュバント中であった。マウスを選別して屠殺し、２週間後に融合させるために脾臓を採取した。
【０３６１】
ｃｌｅｃ１４ａ  −／−マウスの作製
マウスは、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｕｎｉｔ（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＵＫ）で飼育された。ＣＬＥＣ１４Ａ欠失カセット（Ｃｌｅｃ１４ａｔｍ１（ＫＯＭＰ）Ｖｌｃｇ；ｐｒｏｊｅｃｔ  ＩＤ  ＶＧ１０５５４）を含有するＣ５７ＢＬ／６Ｎ  ＶＧＢ６フィーダー依存性胚性幹細胞を、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  Ｍｏｕｓｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、Ｄａｖｉｓ，ＵＳＡ）から調達した。Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ＢｉｒｍｉｎｇｈａｍのＴｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｍｏｕｓｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙは、アルビノＣ５７ＢＬ／６マウスへの胚性幹細胞の注射によりキメラマウスを作製し、Ｃ５７ＢＬ／６メスと交雑させて、カセットにヘテロ接合させたマウスを作製した。動物の飼育は適切であった。
【０３６２】
Ｈｏｍｅ  Ｏｆｆｉｃｅの承認及び認可
冠動脈リング及びマウス皮下スポンジ血管新生アッセイ
大動脈を単離し、以前に記載されたようにコラーゲン中で冠動脈リングアッセイのために処理した３０。管／新芽の伸長、最大内皮移動、及び全体的な内皮細胞の伸長を定量化した。マウス皮下スポンジ血管新生アッセイを、若干の変更を伴って、以前に記載されたように行った３１。０日目に、オスＣ５７ブラックマウスの各側腹部の背面皮膚下に皮下用滅菌ポリエーテルスポンジディスク（１０×５×５ｍｍ）を移植した。１４日間、１日おきに、皮膚を介して直接スポンジ内に１００μｌのｂＦＧＦ（４０ｎｇ／ｍｌ；Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を注射した。１４日目にスポンジを切除し、１０％ホルマリンに固定し、包埋した。切片をヘマトキシリン及びエオシンで染色し、細胞浸潤分析のために、×１倍率のＵＳＢ  ２．０  ２Ｍ  Ｘｌｉデジタルカメラ（ＸＬ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ＬＬＣ，Ｃａｒｒｏｌｌｔｏｎ，ＴＸ，ＵＳＡ）を装備したＬｅｉｃａ  ＭＺ  １６顕微鏡（Ｌｅｉｃａ，Ｍｉｌｔｏｎ  Ｋｅｙｎｅｓ，ＵＫ）を用いてスポンジ断面を撮影した。４０ｘ倍率のＬｅｉｃａ  ＤＭ  Ｅ顕微鏡（Ｌｅｉｃａ，Ｍｉｌｔｏｎ  Ｋｅｙｎｅｓ，ＵＫ）で捉えた画像を血管密度について分析した。スポンジ当たり断面ごとに５つの視野で血管数を評価した。全ての動物実験は、ＲＢによって保持されるＨｏｍｅ  Ｏｆｆｉｃｅ  Ｌｉｃｅｎｓｅ  番号ＰＰＬ  ４０／３３３９に準拠して実行された。
【０３６３】
腫瘍移植アッセイ
１０６のルイス肺癌細胞を、８〜１０週齢のオスマウスの側腹部に皮下注射した。毎日のノギス測定により腫瘍増殖監視し、２〜４週間増殖させた後、重量により腫瘍体積を決定し、４％ＰＦＡにて固定し、パラフィン包埋し、連続的に６μｍの切片を切り出した。
【０３６４】
免疫蛍光法及びＸ−ｇａｌ染色
免疫蛍光染色を以前に記載されたように行った９。
Ｘ−Ｇａｌ染色を以前に記載されたように行った３２。
実施例２  ＣＬＥＣ１４Ａモノクローナル抗体Ｃ１、Ｃ４、及びＣ５はＣＬＥＣ１４Ａ−ＭＭＲＮ２相互作用をブロックする
どのＣＬＥＣ１４Ａモノクローナル抗体がＭＭＲＮ２のＣＬＥＣ１４Ａへの結合を阻害することができるかを判定するために、ＭＭＲＮ２を過剰発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞の溶解物とのインキュベーション前に、徐々に濃度を増加させたｍＩｇＧ１、またはＣＲ１〜５でＣＬＥＣ１４Ａ−ＥＣＤ−Ｆｃをプレインキュベートした。次いで、沈殿物を分離し、ＭＭＲＮ２またはＣＬＥＣ１４Ａ−ＥＣＤ−Ｆｃについてプローブした。ｍＩｇＧ１またはＣ２及びＣ３でブロックしたＣＬＥＣ１４Ａ−ＥＣＤ−Ｆｃ沈殿物にはＭＭＲＮ２の結合が観察されたが、Ｃ１、４、及び５でブロックした沈殿物中にはＭＭＲＮ２の結合は観察されなかった（図１２）。これは、抗体Ｃ１、４、及び５が、Ｃ２及び３モノクローナル抗体が結合するものとは異なるエピトープ上のＣＬＥＣ１４ａに結合し、ＣＬＥＣ１４ＡとのＭＭＲＮ２相互作用を特異的にブロックすることを裏付けるものである。
【０３６５】
実施例３  ＭＭＲＮ２結合ドメイン及びＣＲＴ抗体のマッピング
１）ＭＭＲＮ２は、ＣＬＥＣ１４ａのＣＴＬＤまたはＳＵＳＨＩドメインのいずれかに結合する。
ＭＭＲＮ２のＣＬＥＣ１４Ａへの結合を、ＣＬＥＣ１４ＡのＣＴＬＤまたはＳＵＳＨＩドメインに絞り込んだ。ドメイン欠失においてＣＴＬＤまたはＳＵＳＨＩドメインが存在しない場合、ＣＬＥＣ１４Ａが適切に折り畳まれず、もはやＭＭＲＮ２（またはＣＲＴ抗体）に結合しなくなる可能性が高い。これは、図１３に示すようにＭＭＲＮ２を用いてファーウェスタンブロットしたＣＬＥＣ１４Ａの欠失構築物を使用して発見された。
【０３６６】
２）ＣＲＴ抗体はＣＬＥＣのＣＴＬＤドメインに結合するが、ＳＵＳＨＩドメインには結合しない
ＣＴＬＤまたはＳＵＳＨＩが結合ドメインであるかどうかをさらに決定し、正しい折り畳みを保証するために、ＭＭＲＮ２に結合しない１４型ＣＴＬＤファミリーメンバーであるトロンボモジュリン（ＣＤ１４１としても知られる）と交換したＣＴＬＤまたはＳＵＳＨＩドメインを有するＣＬＥＣ１４Ａのキメラ構築物を作製した。
【０３６７】
キメラ５（ＣＤ１４１のＣＴＬＤを有するＣＬＥＣ１４Ａ）及びキメラ６（ＣＤ１４１のＳＵＳＨＩを有するＣＬＥＣ１４Ａ）の配列を図１４に示す。
【０３６８】
ＣＲＴ抗体の結合を、フローサイトメトリーを用いて分析した。全ての構築物がＣ末端ＧＦＰタグを有するため、緑色の細胞にゲートをかけ、赤色に染色した。全てのＣＲＴ抗体が、予想された通りにＷＴ  ＣＬＥＣ１４Ａに結合し、ＷＴ  ＣＤ１４１には全く結合しない（図１５）。さらに、いずれの抗体もキメラ５に結合せず（ＣＲＴ２による若干の結合を除く）、全ての抗体がキメラ６（ＣＲＴ２を除く）に結合する（図１５）。これは、抗体ＣＲＴ１、３、４、及び５、ならびにＭＭＲＮ２の結合部位がＣ型レクチンドメイン内に存在することを裏付けるものである。ＣＲＴ２は、ＣＴＬＤとｓｕｓｈｉドメインとの間の領域上に結合することが可能である。
【０３６９】
３）ＭＭＲＮの相互作用をブロックするＣＲＴ抗体は、ＷＯ２０１３／１８７７２４において特定される領域には結合しないが、ＣＬＥＣ１４ａ  ＣＴＬＤのａａ  ９７−１０８を含む領域には結合する
抗体及びＭＭＲＮ２の結合領域をさらに決定するために、キメラループ構築物を作製した。これは、ＣＬＥＣ１４Ａ  ＣＴＬＤ、及びＷＯ２０１３／１８７７２４において同定された抗体が結合する領域の構造予測に基づいていた。
【０３７０】
ＣＤ１４１の領域１〜４２を有するＣＬＥＣ１４Ａ
ＣＤ１４１配列−ＭＬＧＶＬＶＬＧＡＬＡＬＡＧＬＧＦＰＡＰＡＥＰＱＰＧＧＳＱＣＶＥＨＤＣＦＡＬＹ（配列番号８０）
ＣＤ１４１の領域９７〜１０８を有するＣＬＥＣ１４Ａ
ＣＤ１４１配列−ＱＬＰＰＧＣＧＤＰＫＲＬ（配列番号８１）
ＣＤ１４１の領域１２２〜１４２を有するＣＬＥＣ１４Ａ
ＣＤ１４１配列−ＴＳＹＳＲＷＡＲＬＤＬＮＧＡＰＬＣＧＰＬ（配列番号８２）
アラインメントを図１６に示す。残念ながら、１〜４２及び１２２〜１４２のキメラは、正しく折り畳まれなかった。このことは、それらがＣＬＥＣ１４Ａポリクローナル抗体に陽性に染色された細胞表面上に存在するという事実に起因すると考えられるが、Ｃ抗体のいずれにも（Ｃ２にさえも）染色しない。
【０３７１】
しかしながら、９７〜１０８のキメラはＣ２及びＣ３に結合し、この突然変異が正しく折り畳まれることを示している。この突然変異は、ＭＭＲＮ２またはＣ１、４、もしくは５（ＣＬＥＣ１４Ａ−ＭＭＲＮ２相互作用をブロックすると考えられる抗体）に結合しない（図１７）。したがって、本発明者らは、結合ドメインは、次の残基を含有するループに依存すると結論付ける：ＥＲＲＲＳＣＨＴＬＥＮＥ（配列番号３９）。
【０３７２】
残基９７〜１０８を、トロンボモジュリンの対応する領域と交換した。これにより、Ｃ２及びＣ３がなおも結合できるため、正しい折り畳みが得られた（図１８）。しかしながら、Ｃ１、Ｃ４、及びＣ５は、この突然変異を認識できないことから、これが結合領域であることが示唆される。
【０３７３】
この実験を３回繰り返したところ、同じ結果が得られた。
【０３７４】
実施例４−抗体薬物コンジュゲート腫瘍データ
６〜８週齢の野生型オスＣ５７ＢＬ６マウスの右側腹部に１×１０＾６のルイス肺癌（ＬＬＣ）細胞を皮下注射した。腫瘍が触知可能なサイズに達してから、マウスをＢ１２−ＡＤＣまたはＣ４−ＡＤＣの各処理群に無作為に割り当てた。マウスの尾静脈に１ｍｇ／ｋｇを１週間空けて２回静脈内注射した。最後の注射から１週間後、マウスを選別して屠殺し、腫瘍を切除し、湿重量を測定した。そのデータを図１９に示す。
【０３７５】
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１１．Ｚａｎｉｖａｎ  Ｓ，Ｍａｉｏｎｅ  Ｆ，Ｈｅｉｎ  ＭＹ，Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｆｅｒｎａｕｄ  ＪＲ，Ｏｓｔａｓｉｅｗｉｃｚ  Ｐ，Ｇｉｒａｕｄｏ  Ｅ  ｅｔ  ａｌ．ＳＩＬＡＣ−ｂａｓｅｄ  ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｕｎｖｅｉｌｓ  ｔｕｍｏｒ  ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  ｍａｒｋｅｒｓ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ２０１３；１２：３５９９−３６１１．
１２．Ｋｉ  ＭＫ，Ｊｅｏｕｎｇ  ＭＨ，Ｃｈｏｉ  ＪＲ，Ｒｈｏ  Ｓ−Ｓ，Ｋｗｏｎ  Ｙ−Ｇ，Ｓｈｉｍ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｃ−ｔｙｐｅ  ｌｅｃｔｉｎ−ｌｉｋｅ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｕｍｏｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｍａｒｋｅｒ  ｃｌｅｃ１４ａ  ｒｅｇｕｌａｔｅ  ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２０１３；３２：５４４９−５４５７．
１３．Ｍａｓｉｅｒｏ  Ｍ，Ｓｉｍｏｅｓ  ＦＣ，Ｈａｎ  ＨＤ，Ｓｎｅｌｌ  Ｃ，Ｐｅｔｅｒｋｉｎ  Ｔ，Ｂｒｉｄｇｅｓ  Ｅ  ｅｔ  ａｌ．Ａ  Ｃｏｒｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｉｍａｒｙ  Ｔｕｍｏｒ  Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  ｔｈｅ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｏｒｐｈａｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＥＬＴＤ１  ａｓ  ａ  Ｋｅｙ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｏｆ  Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ２０１３；２４：２２９−２４１．
１４．Ｓａｎｚ−Ｍｏｎｃａｓｉ  ＭＰ，Ｇａｒｉｎ−Ｃｈｅｓａ  Ｐ，Ｓｔｏｃｋｅｒｔ  Ｅ，Ｊａｆｆｅ  ＥＡ，Ｏｌｄ  ＬＪ，Ｒｅｔｔｉｇ  ＷＪ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｈｉｇｈ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ，ｅｎｄｏＧｌｙｘ−１，ｉｎ  ｎｏｒｍａｌ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ  ｂｌｏｏｄ  ｖｅｓｓｅｌｓ．Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ  １９９４；７１：３６６−３７３．
１５．Ｃｏｌｏｍｂａｔｔｉ  Ａ，Ｓｐｅｓｓｏｔｔｏ  Ｐ，Ｄｏｌｉａｎａ  Ｒ，Ｍｏｎｇｉａｔ  Ｍ，Ｂｒｅｓｓａｎ  ＧＭ，Ｅｓｐｏｓｉｔｏ  Ｇ．Ｔｈｅ  ＥＭＩＬＩＮ／Ｍｕｌｔｉｍｅｒｉｎ  Ｆａｍｉｌｙ．Ｆｒｏｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０１１；２：９３．
１６．Ｃｕｌｌｅｎ  Ｍ，Ｓｅａｍａｎ  Ｓ，Ｃｈａｕｄｈａｒｙ  Ａ，Ｙａｎｇ  ＭＹ，Ｈｉｌｔｏｎ  ＭＢ，Ｌｏｇｓｄｏｎ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｈｏｓｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｔｕｍｏｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｍａｒｋｅｒ  ８  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｔｈｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｏｆ  ｍｅｌａｎｏｍａ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００９；６９：６０２１−６０２６．
１７．Ｄｕｗｅｌ  Ａ，Ｅｌｅｎｏ  Ｎ，Ｊｅｒｋｉｃ  Ｍ，Ａｒｅｖａｌｏ  Ｍ，Ｂｏｌａｎｏｓ  ＪＰ，Ｂｅｒｎａｂｅｕ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．Ｒｅｄｕｃｅｄ  ｔｕｍｏｒ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ｅｎｄｏｇｌｉｎ  ｈａｐｌｏｉｎｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｉｃｅ．Ｔｕｍｏｕｒ  Ｂｉｏｌ  ２００７；２８：１−８．
１８．Ｔｈｉｊｓｓｅｎ  ＶＬＪＬ，Ｐｏｓｔｅｌ  Ｒ，Ｂｒａｎｄｗｉｊｋ  ＲＪＭＧＥ，Ｄｉｎｇｓ  ＲＰＭ，Ｎｅｓｍｅｌｏｖａ  Ｉ，Ｓａｔｉｊｎ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｇａｌｅｃｔｉｎ−１  ｉｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｉｎ  ｔｕｍｏｒ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｉｓ  ａ  ｔａｒｇｅｔ  ｆｏｒ  ａｎｔｉａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２００６；１０３：
１５９７５−１５９８０．
１９．Ｎａｎｄａ  Ａ，Ｋａｒｉｍ  Ｂ，Ｐｅｎｇ  Ｚ，Ｌｉｕ  Ｇ，Ｑｉｕ  Ｗ，Ｇａｎ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｕｍｏｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｍａｒｋｅｒ  １（Ｔｅｍ１）  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａｂｄｏｍｉｎａｌ  ｔｕｍｏｒｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２００６；１０３：３３５１−３３５６．
２０．Ｎａｎｄａ  Ａ，Ｓｔ  Ｃｒｏｉｘ  Ｂ．Ｔｕｍｏｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｍａｒｋｅｒｓ：ｎｅｗ  ｔａｒｇｅｔｓ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２００４；１６：４４−４９．
２１．Ｐｉｒｃｈｅｒ  Ａ，Ｆｉｅｇｌ  Ｍ，Ｕｎｔｅｒｇａｓｓｅｒ  Ｇ，Ｈｅｉｄｅｇｇｅｒ  Ｉ，Ｍｅｄｉｎｇｅｒ  Ｍ，Ｋｅｒｎ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．Ｆａｖｏｒａｂｌｅ  ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ｏｐｅｒａｂｌｅ  ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ  ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ（ＮＳＣＬＣ）  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｈａｒｂｏｒｉｎｇ  ａｎ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｍａｒｋｅｒｓ（ＴＥＭｓ）．Ｌｕｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ  ２０１３；８１：２５２−２５８．
２２．Ｚｈｕａｎｇ  Ｘ，Ｃｒｏｓｓ  Ｄ，Ｈｅａｔｈ  ＶＬ，Ｂｉｃｋｎｅｌｌ  Ｒ．Ｓｈｅａｒ  ｓｔｒｅｓｓ，ｔｉｐ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ  ｏｆ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  Ｔｒａｎｓ  ２０１１；３９：１５７１−
１５７５．
２３．Ｓｔａｐｏｒ  ＰＣ，Ｗａｎｇ  Ｗ，Ｍｕｒｆｅｅ  ＷＬ，Ｋｈｉｓｍａｔｕｌｌｉｎ  ＤＢ．Ｔｈｅ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｌｕｉｄ  ｓｈｅａｒ  ｓｔｒｅｓｓｅｓ  ｉｎ  ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｓｐｒｏｕｔｓ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｅｎｇ  Ｔｅｃｈ  ２０１１；
２：１２４−１３６．
２４．Ｃｈａｕｄｈａｒｙ  Ａ，Ｈｉｌｔｏｎ  ＭＢ，Ｓｅａｍａｎ  Ｓ，Ｈａｉｎｅｓ  ＤＣ，Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ  Ｓ，Ｌｅｍｏｔｔｅ  ＰＫ  ｅｔ  ａｌ．ＴＥＭ８／ＡＮＴＸＲ１  ｂｌｏｃｋａｄｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｐｏｔｅｎｔｉａｔｅｓ  ｔｕｍｏｒｉｃｉｄａｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｙｐｅｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ２０１２；２１：２１２−２２６．
２５．Ａｒｉｃｅｓｃｕ  ＡＲ，Ｌｕ  Ｗ，Ｊｏｎｅｓ  ＥＹ．Ａ  ｔｉｍｅ−  ａｎｄ  ｃｏｓｔ−ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ．Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  Ｄ  Ｂｉｏｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  ２００６；６２：１２４３−１２５０．
２６．Ｍａｃｉａｇ  Ｔ，Ｃｅｒｕｎｄｏｌｏ  Ｊ，Ｉｌｓｌｅｙ  Ｓ，Ｋｅｌｌｅｙ  ＰＲ，Ｆｏｒａｎｄ  Ｒ．Ａｎ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｆｒｏｍ  ｂｏｖｉｎｅ  ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｕｓ：ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐａｒｔｉａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９７９；７６：５６７４−５６７８．
２７．Ｐｆａｆｆｌ  ＭＷ．Ａ  ｎｅｗ  ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２００１；２９：２００２−２００７．
２８．Ｄｅｓｊｏｂｅｒｔ  Ｃ，Ｎｏｙ  Ｐ，Ｓｗｉｎｇｌｅｒ  ＴＥ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  Ｈ，Ｇａｓｔｏｎ  Ｋ，Ｊａｙａｒａｍａｎ  Ｐ−Ｓ．Ｔｈｅ  ＰＲＨ／Ｈｅｘ  ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃａｕｓｅｓ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ  ｏｆＧｒｏｕｃｈｏ／ＴＬＥ  ｃｏ−ｒｅｐｒｅｓｓｏｒｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ２００９；４１７：１２１−１３２．
２９．Ｋｏｒｆｆ  Ｔ，Ｋｒａｕｓｓ  Ｔ，Ａｕｇｕｓｔｉｎ  ＨＧ．Ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｓｐｈｅｒｏｉｄａｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  ｃｙｔｏｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔ  ｃｅｌｌｓ  ｍｉｍｉｃｓ  ｔｈｅ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ａｎｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｙｔｏｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔｓ  ｆｒｏｍ  ｎｏｒｍａｌ  ａｎｄ  ｐｒｅｅｃｌａｍｐｔｉｃ  ｐｒｅｇｎａｎｃｉｅｓ．Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ  ２００４；２９７：４１５−４２３．
３０．Ｂａｋｅｒ  Ｍ，Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ＳＤ，Ｌｅｃｈｅｒｔｉｅｒ  Ｔ，Ｂａｒｂｅｒ  ＰＲ，Ｔａｖｏｒａ  Ｂ，Ｄ’Ａｍｉｃｏ  Ｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｕｓｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ａｏｒｔｉｃ  ｒｉｎｇ  ａｓｓａｙ  ｔｏ  ｓｔｕｄｙ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ  ２０１１；７：８９−１０４．
３１．Ｓｕｃｈｔｉｎｇ  Ｓ，Ｈｅａｌ  Ｐ，Ｔａｈｔｉｓ  Ｋ，Ｓｔｅｗａｒｔ  ＬＭ，Ｂｉｃｋｎｅｌｌ  Ｒ．Ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｒｏｂｏ４  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ．ＦＡＳＥＢ  Ｊ  ２００５；１９：１２１−１２３．
３２．Ｓａｕｎｄｅｒｓ  ＴＬ．Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｉｎ  ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｍｉｃｅ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２００３；２０９：１２５−１４３．
【図１】
0006628290.tif 000028
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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