(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
エテルカルセチドの調製方法であって、
（ｉ）Ｄ−アルギニンの代わりにＤ−オルニチンを含むエテルカルセチドの保護されたテトラペプチドフラグメントのＮ−末端を、エテルカルセチドの保護されたトリペプチドフラグメントのＣ−末端と、液相にてカップリングさせ、末端Ｄ−システインを含むエテルカルセチドの保護されたヘプタペプチド先駆体を形成させることを含む、方法。
【請求項２】
エテルカルセチドの保護されたテトラペプチドフラグメントが、構造式：
【化１】
0006783787.tif 000005
で示される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
エテルカルセチドの保護されたテトラペプチドフラグメントが室温で固体である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
トリペプチドフラグメントが構造式：
【化２】
0006783787.tif 000006
で示され、エテルカルセチドのその保護されたヘプタペプチド先駆体が構造式：
【化３】
0006783787.tif 000007
で示される、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
トリペプチドフラグメントが室温で固体である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
カップリングが有機溶媒中で実施されて反応混合物を提供する方法であって、該反応混合物に水を添加し、エテルカルセチドの保護されたヘプタペプチド先駆体を沈殿させることをさらに含む、請求項１−５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
（ｉｉ）エテルカルセチドの保護されたヘプタペプチド先駆体からオルニチンδ−アミノ保護基を取り除くこと、および
（ｉｉｉ）エテルカルセチドの脱保護されたヘプタペプチド先駆体をグアニル化（guanylating）に供し、それによりオルニチン残基をアルギニンと置き換え、構造式：
【化４】
0006783787.tif 000008
で示される中間体を形成すること
をさらに含む、請求項１−６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）にて形成された中間体の末端Ｄ−システインをＬ−システインとジスルフィド結合の形成を介してカップリングさせ、エテルカルセチドを形成することをさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
工程（ｉ）のカップリングを行う前に、
（ａ）エテルカルセチドの保護されたテトラペプチドフラグメントを液相にて調製することを、
さらに含む、請求項１−８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
エテルカルセチドの保護されたテトラペプチドが連続的液相プロセスを介して調製される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
調製工程（ａ）が、
（ａ−ｉ）オルニチンのウレタン保護されたＮ−カルボキシ無水物（ＵＮＣＡ）を、構造式：
【化５】
0006783787.tif 000009
で示されるジペプチドと、カップリングさせて保護されたトリペプチドを形成すること；
（ａ−ｉｉ）そのトリペプチドを脱保護に供し、脱保護されたトリペプチドを形成すること；および
（ａ−ｉｉｉ）その脱保護されたトリペプチドを、オルニチンのウレタン保護されたＮ−カルボキシ無水物にカップリングさせてエテルカルセチドの保護されたテトラペプチドフラグメントを形成すること
を含む、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
調製工程が副生成物の気体の形成をもたらす、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
オルニチンのウレタン保護されたＮ−カルボキシ無水物が、保護されたＤ−オルニチンのベンジルオキシカルボニル保護のＮ−カルボキシ無水物である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
カップリング工程（ａ−ｉ）および（ａ−ｉｉｉ）が、各々、テトラヒドロフラン中で実施される、請求項１１−１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
液相がエーテル、エステル、芳香族炭化水素および塩素化炭化水素からなる群より選択される有機溶媒を含む、請求項９−１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
カップリング工程（ｉ）の前に、エテルカルセチドの保護されたテトラペプチドフラグメントを沈降または再結晶操作により精製することをさらに含む、請求項１−１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
化合物１９のＤ−システインがアセトアミド保護基を含む方法であって、（ｖ）アセトアミド保護基を切断することをさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１８】
反応工程（ｉｖ）および切断工程（ｖ）が単一の反応容器中で実施される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
エテルカルセチドの調製方法であって、
（ｉ）エテルカルセチドのアセチル化されたＮ−末端保護のトリペプチドフラグメントを、液相中にてエテルカルセチドの完全に脱保護されたＣ−末端テトラペプチドフラグメントとカップリングさせ、末端Ｄ−システインを含む、エテルカルセチドの保護されたヘプタペプチドフラグメントを形成することを含む、方法。
【請求項２０】
エテルカルセチドのアセチル化されたＮ−末端保護のトリペプチドフラグメントが、構造式：
【化６】
0006783787.tif 000010
で示され、ここでＰＧが保護基である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
エテルカルセチドの完全に脱保護されたＣ−末端テトラペプチドフラグメントが、構造式：
【化７】
0006783787.tif 000011
で示される、請求項１９または請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
エテルカルセチドの保護されたヘプタペプチドフラグメントが、構造式：
【化８】
0006783787.tif 000012
で示される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
カップリングがカップリング試薬の存在下にある有機溶媒中で実施されて反応混合物を提供する、請求項１９−２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
（ｉｉ）エテルカルセチドの保護されたヘプタペプチドフラグメントを反応混合物より回収することをさらに含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
回収工程（ｉｉ）がアセトニトリルを反応混合物に添加し、エテルカルセチドの保護されたヘプタペプチドフラグメントを沈殿させることを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
（ｉｉｉ）エテルカルセチドの保護されたヘプタペプチドフラグメントの末端Ｄ−システインを溶液中にてＬ−システインとジスルフィド結合の形成を介してカップリングさせ、エテルカルセチドを形成させることをさらに含む、請求項１９−２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
エテルカルセチドの保護されたヘプタペプチドフラグメントのＤ−システインがトリチル保護基を含む方法であって、（ｉｉ−ａ）Ｌ−システインとカップリングさせる前に、トリチル保護基を切断することをさらに含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
（ｉｖ）エテルカルセチドを精製することをさらに含む、請求項２６または請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
精製工程（ｉｖ）がエテルカルセチドをイオン交換クロマトグラフィーによって精製することを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
精製工程（ｉｖ）がエテルカルセチドをナノ濾過により精製し、ナノ濾過されたエテルカルセチドを得ることを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
（ｖ）そのナノ濾過されたエテルカルセチドを凍結乾燥することをさらに含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
カップリング工程（ｉ）に付す前に、（ａ）エテルカルセチドのＣ−末端テトラペプチドフラグメントを液相にて調製することをさらに含む、請求項１９−３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
調製工程（ａ）が
（ａ−ｉ）Ｎ−保護のＤ−アラニンをＨ−（Ｄ）−アルギニン・塩酸塩とカップリング試薬の存在下にて溶液中でカップリングさせてＮ−保護のＤ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｒｇ−ＮＨ２・塩酸塩を形成する工程；
（ａ−ｉｉ）そのＮ−保護のＤ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｒｇ−ＮＨ２・塩酸塩をテトラフェニルホウ酸ナトリウムで処理し、テトラフェニルホウ酸塩を形成する工程；
（ａ−ｉｉｉ）（ａ−ｉｉ）から由来のテトラフェニルホウ酸塩を有機溶媒に抽出する工程；
（ａ−ｉｖ）そのテトラフェニルホウ酸塩を塩酸塩に変換する工程；
（ａ−ｖ）（ａ−ｉｖ）から由来の塩酸塩を脱保護に供し、ジペプチド  Ｈ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｒｇ−ＮＨ２・塩酸塩を形成する工程；
（ａ−ｖｉ）Ｎ−保護のＤ−アルギニン・塩酸塩とカップリングさせることにより、ジペプチド  Ｈ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｒｇ−ＮＨ２・塩酸塩でのカップリング工程、処理工程、抽出工程、および脱保護工程を連続して繰り返し、トリペプチド  Ｈ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｒｇ−ＮＨ２・塩酸塩を形成する工程；および
（ａ−ｖｉｉ）Ｎ−保護のＤ−アルギニン・塩酸塩とカップリングさせることにより、工程（ａ−ｖｉ）から由来のトリペプチド  Ｈ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｒｇ−ＮＨ２・塩酸塩でのカップリング工程、処理工程、抽出工程、および脱保護工程を連続して繰り返し、構造式：
【化９】
0006783787.tif 000013
で示されるテトラペプチドを形成する工程
を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
（ａ−ｖｉｉｉ）化合物２９のＮ−保護のテトラペプチドフラグメントを脱保護することをさらに含む、請求項３３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本願は、２０１５年３月２６日付け出願の米国仮特許出願第６２／１３８,９０３号の優先権の利益を主張するものであり、その内容をその出典を明示することにより本明細書に組み込まれるものとする。
【０００２】
（技術分野）
本発明の開示は、一般に、ポリペプチド合成の分野に、より詳細にはエテルカルセチド（etelcalcetide）（これまで、ＡＭＧ４１６またはベルカルセチド（velcalcetide）として知られている）またはその医薬的に許容される塩の液相合成に関する。
【背景技術】
【０００３】
エテルカルセチドは、カルシウム感知受容体の、８個のアミノ酸の合成選択的ペプチド作動薬である。エテルカルセチドは、インビボにおける副甲状腺ホルモンレベルを低下させるのに効果的であり、例えば、高カルシウム血症または副甲状腺機能亢進症の治療に有用である。例えば、Walter, S.ら，J. Pharmacol Exp Ther, 2013, Aug：346 (2)：229-40を参照のこと。エテルカルセチドは、今も、慢性腎疾患−ミネラルおよび骨障害の血液透析患者での二次的副甲状腺機能亢進症（ＳＨＰＴ）の治療において静脈内にて使用するのに開発中であり；その製品はパルサビブ（Parsabiv）（登録商標）の商品名にて言及される。
【０００４】
エテルカルセチドの塩酸塩は、化学構造式：
【化１】
0006783787.tif 000002
化合物２０（配列番号：１）
で示される。
【０００５】
本明細書においてエテルカルセチドの骨格とも称される、エテルカルセチドの主鎖は、すべてがＤ−配置の７個のアミノ酸を有し、一方で側鎖のシステイン残基（Ｈ−Ｌ−Ｃｙｓ−Ｈ）はＬ−配置である。エテルカルセチド（遊離塩基）の分子式はＣ３８Ｈ７３Ｎ２１Ｏ１０Ｓ２であり；その平均分子量は計算によると１０４８.３Ｄａである。
【０００６】
エテルカルセチドおよびその調製方法は、国際特許公開番号ＷＯ２０１１／０１４７０７（その内容を出典明示により本明細書の一部とする）に記載されている。エテルカルセチドは、伝統的には、その対応するＦｍｏｃ−保護Ｄ−アミノ酸から固相合成により組み立てられる。適切な樹脂支持体とのカップリングおよび切断を連続して行うこと（すなわち、固相ペプチド合成）によって主鎖を組み立てた後に、その主鎖をジピリジルジスルフィドの存在下にてトリフルオロ酢酸溶液で処理し、対応する活性化骨格を形成し、次にそれをＬ−Ｃｙｓ−ＯＨ／水で処理し、エテルカルセチドを得る。ついで得られた生成物を、典型的には、逆相高圧液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）に付して精製し、凍結乾燥によりＴＦＡ塩として単離する。次にそのＴＦＡ塩を、塩交換方法を実施することにより、例えばイオン交換クロマトグラフィーに付し、所望によりつづいて、例えば逆相液体クロマトグラフィーまたは逆浸透により精製することにより、塩酸塩などの医薬的に許容される塩に変換する。
【０００７】
上記にて概説される慣用的な固相合成とは異なり、本発明の開示は、エテルカルセチドを調製するための液相方法を提供する。本明細書において提供される方法は、限定されるものではないが、とりわけ、低原材料コスト、中間体の精製工程の容易さ、フラグメントのアセンブリーの容易さ、高キラル純度、および商業的スケールアップへの適応性を含め、下記にさらに詳細に記載されるように、伝統的固相合成と比べていくつかの利点を有する。
【発明の概要】
【０００８】
エテルカルセチドの中間体を調製するための、ならびにエテルカルセチドおよびその医薬的に許容される塩を調製するための液相方法が、本明細書にて提供される。一般に、該方法は、液相フラグメントをカップリングさせてエテルカルセチドの主鎖となるヘプタペプチドを形成し、つづいてジスルフィド架橋形成を通してＬ−システイン側鎖を導入することを含む。
【０００９】
より具体的には、第１の態様では、本明細書にて、（ｉ）Ｄ−アルギニンの代わりにＤ−オルニチンを含むエテルカルセチドの保護されたＮ−末端テトラペプチドフラグメントを、エテルカルセチドの保護されたトリペプチドフラグメントと、液相にてカップリングさせ、末端Ｄ−システインを含むエテルカルセチドの保護されたヘプタペプチド先駆体を形成することを含む、エテルカルセチドまたはその先駆体の調製方法が本明細書にて提供される。
【００１０】
第１の態様に関する１の実施態様において、エテルカルセチドの保護されたＮ−末端テトラペプチドフラグメントは、配列番号：２、Ｈ−Ｄ−Ｏｒｎ（Ｂｏｃ）−Ｄ−Ｏｒｎ（Ｂｏｃ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｏｒｎ（Ｂｏｃ）−ＯＭｅ  （化合物１４）で示される配列を有する。１または複数の関連する実施態様において、エテルカルセチドの保護されたＮ−末端テトラペプチドフラグメントは固体である。もう１つまたは複数のさらなる実施態様において、エテルカルセチドの保護されたＮ−末端テトラペプチドフラグメントは結晶化可能な固体である。エテルカルセチドのＮ−末端テトラペプチドフラグメントまたはエテルカルセチドの他のいずれかのフラグメントなどの固体、所望により結晶化可能な／結晶性の中間体の調製は、従来の時間および溶媒を必要とするクロマトグラフィー方法を利用するよりもむしろ、例えば沈降化または結晶化により固体を単離することにより精製の機会を付与するため、該調製は特に有益である。
【００１１】
第１の態様に関するさらに１または複数のさらなる実施態様において、トリペプチドフラグメントは、配列番号：３、Ａｃ−Ｄ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｏｒｎ（Ｂｏｃ）−ＯＨ）（化合物１３）で示される配列を有し、エテルカルセチドのその保護されたヘプタペプチド先駆体は、配列番号：４、Ａｃ−Ｄ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｏｒｎ（Ｂｏｃ）−Ｄ−Ｏｒｎ（Ｂｏｃ）−Ｄ−Ｏｒｎ（Ｂｏｃ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｏｒｎ（Ｂｏｃ）−ＯＭｅ（化合物１５）の配列を有する。
【００１２】
第１の態様に関するさらに１または複数のさらなる実施態様において、トリペプチドフラグメントは固体である。さらに１または複数の関連する実施態様において、トリペプチドフラグメントは結晶化可能な固体である。
【００１３】
さらに１または複数の実施態様において、反応混合物を提供するのにカップリングは有機溶媒にて実施され、その方法は、さらには、水を反応混合物に添加してエテルカルセチドの保護されたヘプタペプチド先駆体を沈殿させることを含む。
【００１４】
上記態様に関するさらに１または複数のさらなる実施態様において、該方法は、（ｉｉ）エテルカルセチドの保護されたヘプタペプチド先駆体からオルニチンδ−アミノ保護基を取り除くこと、および（ｉｉｉ）エテルカルセチドの脱保護されたヘプタペプチド先駆体をグアニチニル化（guanitinylating）し、それによりオルニチン残基をアルギニンと置き換え、配列番号：５の配列を有する中間体（化合物１９）を形成することをさらに含む。
【００１５】
１または複数のさらなる実施態様において、該方法は、（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）にて形成された中間体の末端Ｄ−システインをジスルフィド結合の形成を介してＬ−システインとカップリングさせて、エテルカルセチド（配列番号：１、化合物２０）を形成することをさらに含む。
【００１６】
第１の態様に係る方法のさらに１または複数の実施態様において、該方法は、工程（ｉ）のカップリングに付す前に、（ａ）エテルカルセチドの保護されたＮ−末端テトラペプチドフラグメントを液相にて調製することをさらに含む。上記される事項に関する１または複数の実施態様において、エテルカルセチドの保護されたＮ−末端テトラペプチドは、連続的液相プロセスを介して調製される。より詳細には、１または複数のさらなる実施態様において、調製工程（ａ）は、
（ａ−ｉ）オルニチンのウレタン保護されたＮ−カルボキシ無水物（ＵＮＣＡ）を、配列番号：６のジペプチド（化合物６）とカップリングさせて保護されたトリペプチドを形成すること；
（ａ−ｉｉ）トリペプチドを脱保護に供し、脱保護されたトリペプチドを形成すること；および
（ａ−ｉｉｉ）脱保護されたトリペプチドを、オルニチンのウレタン保護されたＮ−カルボキシ無水物にカップリングさせてエテルカルセチドの保護されたＮ−末端テトラペプチドフラグメントを形成すること
を含む。上記した態様に対応する例示的フラグメントは、配列番号：７の工程（ａ−ｉ）の完全に保護されたトリペプチド（化合物７）および配列番号：８の一部脱保護されたトリペプチド（化合物８）を包含する。
【００１７】
上記態様に関する１または複数の実施態様において、調製工程は気体の副生成物の形成をもたらす。
【００１８】
さらに１または複数のさらなる実施態様において、オルニチンのウレタン保護されたＮ−カルボキシ無水物は、保護されたＤ−オルニチンのベンジルオキシカルボニル保護されたＮ−カルボキシ無水物である。
【００１９】
その上１または複数のさらなる実施態様において、カップリング工程（ａ−ｉ）および（ａ−ｉｉｉ）の各々は、テトラヒドロフラン中で実施される。
【００２０】
工程（ａ）またはその下位工程に関するさらにもう一つ別の１または複数の実施態様において、液相は、エーテル、エステル、芳香族炭化水素および塩素化炭化水素からなる群より選択される有機溶媒を含む。
【００２１】
その上１または複数のさらなる実施態様において、該方法は、カップリング工程（ｉ）に付す前に、再結晶化によりエテルカルセチドのＮ−末端テトラペプチドフラグメントを精製することをさらに含む。
【００２２】
第２の態様において、エテルカルセチドまたはその医薬的に許容される塩を調製するための液相方法であって、（ｉ）配列番号：５の中間体（化合物１９）をＬ−システインと液相にて反応させることを含む、該方法が本明細書にて提供される。
【００２３】
第２の態様に関する１または複数の実施態様において、化合物１９のＤ−システインはアセトアミド保護基を含み、該方法は、（ｉｉ）アセトアミド保護基を切断することをさらに含む。上記の態様に関する実施態様において、反応工程（ｉ）および切断工程（ｉｉ）は単一の反応容器で実施され、エテルカルセチドを提供する。
【００２４】
本発明の第３の態様は、エテルカルセチドまたはその先駆体を調製する方法であって、（ｉ）エテルカルセチドのＮ−末端がアセチル化で保護されたトリペプチドフラグメントを、遊離アミノ基を有するエテルカルセチドのＣ−末端が完全に脱保護されたテトラペプチドフラグメントと、液相中でカップリングさせ、末端Ｄ−システインを含むエテルカルセチドの保護されたヘプタペプチドフラグメントを形成する、ことを含む、方法に関する。以下の実施態様および／または特徴は、エテルカルセチドまたはその先駆体を調製する方法の第３の態様に関する。
【００２５】
第３の態様に関する１または複数の実施態様において、遊離Ｃ−末端を有するＮ−末端がアセチル化で保護されたトリペプチドフラグメントは、配列番号：９の配列  （Ａｃ−（Ｄ）Ｃｙｓ（ＰＧ）−（Ｄ）Ａｌａ−（Ｄ）Ａｒｇ−ＯＨ）（化合物３６）を有する。
【００２６】
その上１または複数のさらなる実施態様において、エテルカルセチドのＮ−末端が完全に脱保護されたテトラペプチドフラグメントは配列番号：５の配列（Ｈ−（Ｄ）Ａｒｇ−（Ｄ）Ａｒｇ−（Ｄ）−Ａｌａ−（Ｄ）Ａｒｇ−ＮＨ２）（化合物３０）を有する。
【００２７】
１または複数のさらなる実施態様において、エテルカルセチドの保護されたヘプタペプチドフラグメントは配列番号：１１の配列（Ａｃ−（Ｄ）Ｃｙｓ（ＰＧ）−（Ｄ）Ａｌａ−（Ｄ）Ａｒｇ−（Ｄ）Ａｒｇ−（Ｄ）Ａｒｇ−（Ｄ）−Ａｌａ−（Ｄ）Ａｒｇ−ＮＨ２）（化合物３７）を有する。
【００２８】
その上１または複数のさらなる実施態様において、カップリングは反応混合物を得るのにカップリング試薬を含む有機溶媒中で実施される。
【００２９】
１または複数のさらなる実施態様において、第３の態様の方法は、（ｉｉ）エテルカルセチドの保護されたヘプタペプチドフラグメントを反応混合物から回収することをさらに含む。
【００３０】
上記の態様に関する１または複数の個々の実施態様において、回収工程（ｉｉ）は、アセトニトリルを反応混合物に添加し、エテルカルセチドの保護されたヘプタペプチドフラグメントを沈殿させることを含む。
【００３１】
その上１または複数の実施態様において、該方法は、（ｉｉｉ）エテルカルセチドの保護されたヘプタペプチドフラグメントの末端Ｄ−システインを保護されたＬ−システインとジスルフィド結合の形成を介して溶液中でカップリングさせ、エテルカルセチドを形成することをさらに含む。
【００３２】
その上１または複数の実施態様において、エテルカルセチドの保護されたヘプタペプチドフラグメントのＤ−システインはトリチル保護基を含み、該方法は（ｉｉ−ａ）Ｌ−システインとのカップリングの前にトリチル保護基を切断することをさらに含む。
【００３３】
その上１または複数のさらなる実施態様において、該方法は（ｉｖ）エテルカルセチドを精製することをさらに含む。上記態様の特定の実施態様において、エテルカルセチドはイオン交換クロマトグラフィーにより精製される。その上さらなる実施態様において、イオン交換クロマトグラフィー工程に続いて、ナノ濾過、すなわち塩を除去する操作に供される。もう一つ別の実施態様において、精製工程（ｉｖ）はエテルカルセチドをイオン交換／ナノ濾過に付して精製することを含み、ここで該方法は（ｖ）ナノ濾過に付したエテルカルセチドを凍結乾燥させることを含む。
【００３４】
第３の態様に関する１または複数の実施態様において、該方法は、カップリング工程（ｉ）に付す前に、（ａ）エテルカルセチドのＣ−末端テトラペプチドフラグメントを液相中で調製することをさらに含む。
【００３５】
上記の態様に関する１または複数の実施態様において、調製工程（ａ）は、
（ａ−ｉ）Ｎ−保護のＤ−アラニンを塩酸Ｈ−（Ｄ）−アルギンアミドと、カップリング剤を配合した溶液中でカップリングさせ、Ｎ−保護のＤ−Ａｌａ−Ａｒｇ−ＮＨ２・塩酸塩を形成する工程；
（ａ−ｉｉ）Ｎ−保護のＤ−Ａｌａ−Ａｒｇ−ＯＨをテトラフェニルホウ酸ナトリウムで処理し、テトラフェニルホウ酸塩を形成する工程；
（ａ−ｉｉｉ）（ａ−ｉｉ）から由来のテトラフェニルホウ酸塩を有機溶媒に抽出する工程；
（ａ−ｉｖ）そのテトラフェニルホウ酸塩を塩酸塩に変換する工程；
（ａ−ｖ）脱保護、例えば（ａ−ｉｖ）から由来の塩酸塩からＮ−保護Ｃｂｚ（Ｚ）基を除去し、ジペプチド  Ｈ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｒｇ−ＮＨ２・塩酸塩を形成する工程；
（ａ−ｖｉ）Ｎ−保護されたＤ−アルギニン・塩酸塩とカップリングさせることにより、ジペプチド  Ｈ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｒｇ−ＮＨ２・塩酸塩でのカップリング工程、処理工程、抽出工程、および脱保護工程を連続して繰り返し、トリペプチド  Ｈ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｒｇ−ＮＨ２・塩酸塩を形成する工程；および
（ａ−ｖｉｉ）Ｎ−保護されたＤ−アルギニン・塩酸塩とカップリングさせることにより、工程（ａ−ｖｉ）からのトリペプチド  Ｈ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｒｇ−ＮＨ２・塩酸塩でのカップリング工程、処理工程、抽出工程、および脱保護工程を連続して繰り返し、配列番号：１２のテトラペプチド（化合物２９）  Ｚ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｒｇ−ＮＨ２・２ＨＣｌを形成する工程
を含む。
【００３６】
その上１または複数の実施態様において、該方法は、
（ａ−ｖｉｉｉ）配列番号：１２のＮ−保護テトラペプチドフラグメントを脱保護する工程
をさらに含む。
【００３７】
本明細書に記載の方法のさらなる実施態様は、後記する説明、実施例および請求の範囲から明らかであろう。上記および後記の説明から理解され得るように、本明細書に記載のどの特徴も、２つ以上のかかる特徴のどの組み合わせも、かかる組み合わせにおいて含まれる特徴が相互に矛盾しないという条件の下で、本発明の開示の範囲内に含まれる。さらには、いずれの特徴または特徴の組み合わせであっても、本発明のどの実施態様からも特別に除外されてもよい。特に後記される実施例および添付の図面と合わせて考慮されると、本発明のさらなる態様および利点が以下の説明において記載される。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】エテルカルセチド（Ａｃ−Ｄ−Ｃｙｓ（Ｈ−Ｌ−Ｃｙｓ−ＯＨ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｒｇ−ＮＨ２、配列番号：１）の化学構造式を示す。
【００３９】
【図２】配列番号：１３の配列を有するエテルカルセチドのＮ−末端が完全に保護されたテトラペプチドフラグメント（化合物９、Ｚ−Ｄ−Ｏｒｎ（Ｂｏｃ）−Ｄ−Ｏｒｎ（Ｂｏｃ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｏｒｎ（Ｂｏｃ）−ＯＭｅ）を調製するための代表的な液相反応スキームを示す。実施例１−７を参照のこと。
【００４０】
【図３】配列番号：３の配列を有する、エテルカルセチドの保護されたトリペプチドフラグメント（化合物１３、Ａｃ−Ｄ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｏｒｎ（Ｂｏｃ）−ＯＨ）を調製するための代表的な液相反応スキームを示す。また、エテルカルセチドのＮ−末端が保護されたテトラペプチドフラグメント（１のＮ−末端が遊離塩基の保護されていない形態である、１４）を、エテルカルセチドの保護されたトリペプチドフラグメント１３（そのＣ末端が保護されていない）とカップリングさせ、最終的に完全に保護されるエテルカルセチドのヘプタペプチド先駆体１６を提供する、代表的な反応スキームを示す。エテルカルセチドのヘプタペプチド先駆体１６は完全に保護されており、エテルカルセチドの主鎖においてＤ−アルギニンがＤ−オルニチンで置換されているものに相当する。エテルカルセチドの完全に保護されたヘプタペプチドフラグメント１８は１７をペルグアニジニル化することにより生成され、ここで１７はオルニチンδ−アミノ基のすべてがすべて保護されていない（すなわち、遊離アミノの）形態である。実施例８−１６を参照のこと。
【００４１】
【図４】エテルカルセチドのヘプタペプチド中間体に含まれるＢｏｃ−保護のアルギニンをグローバルな脱保護に、つづいてＤ−システインを脱保護に供し、Ｌ−システインとカップリングさせ、所望の生成物のエテルカルセチドを形成することを示す。実施例１５および１６を参照のこと。
【００４２】
【図５】エテルカルセチドの保護されたヘプタペプチドフラグメントの液相調製に有用な、エテルカルセチドのＣ−末端が完全にアミノ脱保護されたテトラペプチドフラグメント、化合物３０（配列番号：１０）の代表的な液相合成を示す。その合成の詳細は実施例１７−２０に提供される。
【００４３】
【図６】エテルカルセチドの保護されたヘプタペプチドフラグメントの液相調製に有用な、エテルカルセチドのＮ−末端がアセチル化により保護されたトリペプチドフラグメント、化合物３６（配列番号：９）を調製するための代表的な液相合成方法を示す。その合成の詳細は実施例２１−２４に提供される。
【００４４】
【図７】エテルカルセチドのヘプタペプチドを形成するための代表的な液相合成方法を示す。該方法では、Ｎ−末端がアセチル化により保護されたトリペプチドを、Ｃ−末端が完全にアミノ脱保護されたテトラペプチドとカップリングさせ、ヘプタペプチドのエテルカルセチド中間体を形成する。その合成の詳細は実施例２５および２６にて提供される。
【００４５】
【図８】図８Ａ−８Ｌは本明細書に記載の種々の化合物の合成を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
本発明の開示は、この度、下記にてより詳細に記載されるであろう。しかしながら、この開示は、多種多様な形態で具現化されてもよく、本明細書に記載の実施態様に限定されるものと解釈されるべきではなく；むしろ、これらの実施態様は本発明の開示が完璧かつ完全であって、その範囲を当業者に完全に伝えるように提供される。
【００４７】
本明細書中にて引用されるすべての刊行物、特許および特許出願（上記または下記を問わない）は、特記されない限り、出典明示によりその全体が本明細書に組み込まれる。同じ用語が、出典明示により本明細書に組み込まれた刊行物、特許または特許出願と、本発明の開示との両方で定義される場合には、本発明の開示における定義が支配的定義を表す。特定の型の化合物、ペプチド、化学等の記載のために参照される刊行物、特許および特許出願では、かかる化合物、化学等に関与する部分は、出典明示により本明細書に組み込まれるそれらの文書の部分である。
【００４８】
本明細書で使用されるセクションの見出しは、組織化を目的として記載されるに過ぎず、記載される題目を限定するものとして何ら解釈されるべきではない。
【００４９】
定義
本明細書中で使用される単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が単数であることを明示しない限り、複数形を包含することを留意すべきである。
【００５０】
他に特に言及しない限り、本明細書で提供される用語の定義は、例えば、有機合成、ペプチド合成および薬学の分野で使用される標準的な定義である。例えば、L. Otvos（編）、ペプチドをベースとする薬物設計：方法およびプロトコル（Peptide-Based Drug Design：Methods and Protocols）, Human Press（2010）；Benoiton, L.、ペプチド合成の化学（Chemistry of Peptide Synthesis）, CＲC Press（2005）； Ausubel F. M.ら（編）、分子生物学における最新のプロトコル（Current Protocols in Molecular Biology）, John Wiley & Sons（2004）を参照のこと。精製技法は、典型的には、当該分野にて一般的に行われるような、製造業者の仕様に従って、あるいは本明細書に記載されるように実施される。例えば、本明細書に記載の分析化学、合成有機化学、および薬学的および製薬的化学の実験室での操作および技法は、当該分野にて周知かつ一般的に使用される操作および技法である。
【００５１】
本発明を記載および特許請求するにおいて、以下の用語は、下記の定義に従って使用されるであろう。
【００５２】
これまで、ＡＭＧ４１６、ベルカルセチドおよびＫＡＩ−４１６９として知られる、「エテルカルセチド」なる語は、以下の構造式：
【化２】
0006783787.tif 000003
を有する、化学名がＬ−システインとのＮ−アセチル−Ｄ−システイニル−Ｄ−アラニル−Ｄ−アルギニル−Ｄ−アルギニル−Ｄ−アルギニル−Ｄ−アラニル−Ｄ−アルギンアミド・ジスルフィドである、化合物をいう。
【００５３】
エテルカルセチドへの、あるいは本明細書にて記載されるようなエテルカルセチドのフラグメント、中間体または先駆体のいずれかの化合物への言及は、その中性の非荷電性形態、ならびにその医薬的に許容される塩、水和物および溶媒和物を包含するものとする。
【００５４】
「エテルカルセチド塩酸塩」と「エテルカルセチド・ＨＣｌ」なる語は相互に変換でき、以下の構造式：
【化３】
0006783787.tif 000004
を有する、エテルカルセチドの塩酸塩の形態をいう。典型的には、ｘは約４ないし５の数値である。正確な値は所定の試料を塩素含量分析に付すことで測定され得る。
【００５５】
「医薬的に許容される塩」とは、患者に対して有意で有害な毒性作用を惹起しない塩形成に適する少なくとも１つの基を有する化合物の塩形態をいう。「医薬的に許容される塩」なる語は、ある点において、本明細書にて提供されるような化合物の、例えば、エテルカルセチド、ならびに１または複数のイオン化可能なアミン基を有する、エテルカルセチドのフラグメント、中間体、先駆体等の相対的に毒性の小さな無機または有機酸付加塩を言ってもよい。代表的な塩として、臭化水素酸塩、塩酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、酢酸塩、吉草塩、オレイン酸塩、パルミチン酸塩、ステアリン酸塩、ラウリン酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、ホスファート、トシル酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、ナフトエ酸塩（napthylate）、メシル酸塩、グルコヘプトン酸塩、ラクトビオン酸塩、およびラウリル硫酸塩（laurylsulphonate）等が挙げられる。（例えば、Bergeら（1977）「医薬としての塩（Pharmaceutical Salts）」、J. Pharm. Sci. 66：1-19を参照のこと）
【００５６】
ある場合には、化合物は１または複数の酸性官能基を含有してもよい。そのような場合には、該化合物は医薬的に許容される塩基との医薬的に許容される塩を形成するであろう。「医薬的に許容される塩」なる語は、そのような場合には、かかる化合物の相対的に毒性の小さな無機または有機塩基付加塩を言ってもよい。代表的なアルカリまたはアルカリ土類塩として、リチウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムおよびアルミニウム塩等が挙げられる。塩基付加塩の形成に有用な代表的な有機アミンとして、エチルアミン、ジエチルアミン、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ピペラジン等が挙げられる。適切に医薬的に許容される塩の形態は、例えば、Handbook of Pharmaceutical Salts：Properties, Selection and Use, Weinheim／Zurich：Wiley−VCH／VHCA, 2002； P. H. StahlおよびC. G. Wermuth編に見受けられる。
【００５７】
本明細書中に使用されるような「保護基」または「ＰＧ」なる語は、潜在的に反応性の官能基を望ましくない化学変換から保護する、一時的な置換基をいう。かかる保護基の例として、カルボン酸のエステル、アルコールのシリルエーテル、ならびにアルデヒドおよびケトンの各々でアセタールおよびケタールが挙げられる。例えば、Greene, T.W.； Wuts, P.G.M. 有機合成における保護基（Protective Groups in Organic Synthesis）、第４版； Wiley：New York, 2００7； Isidro-Llobet, A.ら、アミノ酸保護基（アミノ Acid-Protecting Groups）、Chem. Rev 2009, 109, 2455-2504を参照のこと。本明細書に記載の反応性アミノ酸またはペプチドフラグメントは、対象となる化学変換の標的ではない官能基に、１または複数の保護基を適宜含有することが多い。代表的な保護基として、例えば、ベンジルオキシカルボニル（「Ｃｂｚ」または「Ｚ」）とも称されるカルボキシベンジル、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、tert-ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、トリチル（Ｔｒｔ）、メチルエステル（ＯＭｅ）、アミド等が挙げられる。本明細書において示される略式構造にて、Ｃ−末端の−ＮＨ２はアミド保護基（〜Ｃ（Ｏ）ＮＨ２）を意味し、Ｎ−末端の「Ｈ」は遊離アミノ基を意味し、括弧中の保護基の表示は保護基がオルニチンのδ位の窒素上にあることを意味する。
【００５８】
「遊離アミノ酸」または「遊離アミノ基」は、−ＮＨ２の形態にて、すなわち、保護されていないアミノ基を有する、アミノ酸、ペプチドフラグメントまたはペプチドをいう。
【００５９】
本明細書にて使用されるような「カップリング剤」、「縮合剤」、「縮合活性化剤」なる語は、本明細書において互換的に使用され、１のアミノ酸からのアミノ基と、もう一つ別のアミノ酸からのカルボキシル基との反応を容易にし、ペプチド結合を形成する化学試剤をいう。典型的なカップリング剤は、当該分野にて周知であり、限定されるものではないが、Ｎ,Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、１−［ビス（ジメチルアミノ）メチレン]−１Ｈ−１,２,３−トリアゾロ［４,５−ｂ］ピリジニウム  ３−オキシド  ヘキサフルオロホスファート（ＨＡＴＵ）、［ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ（ジメチルアミノ）メチリデン］−ジメチルアザニウム・テトラフルオロボラート（ＴＢＴＵ）、Ｎ,Ｎ,Ｎ’,Ｎ’−テトラメチル−Ｏ−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）ウロニウム・ヘキサフルオロホスファート、Ｏ−（ベンゾチリアゾール−１−イル）−Ｎ,Ｎ,Ｎ’,Ｎ’−テトラメチルウロニウム・ヘキサフルオロホスファート（ＨＢＴＵ）およびＮ,Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＩＰＥＡ）などのカルボジイミドを包含する。かかる化合物は商業的供給業者より容易に入手可能である。
【００６０】
本明細書中で使用される「カップリング」なる語は、２つのアミノ酸、または２つのペプチドフラグメントを反応させるか、あるいはアミノ酸とペプチドフラグメントとを反応させ、それによりその反応物の鎖長よりも伸長された鎖長を有するペプチドを形成することをいう。一般に、カップリング反応は２つのアミノ酸の間で、またはアミノ酸とペプチドフラグメントとの間で、あるいは２つのペプチドフラグメントの間で新しいペプチドまたはアミド結合の形成をもたらすが、本明細書で使用されるような「カップリング」なる語はまた、ジスルフィド結合の形成をもたらしてもよく、例えば、システインのチオール基を反応させた場合に、（Ｌ−システインをエテルカルセチドの主鎖に導入する場合のように）ジスルフィド架橋を形成してもよい。
【００６１】
「治療する」なる語は、傷害、病理または症状の治療または改善における、軽減；寛解；徴候または症状の減少などの客観的または主観的パラメータを含む、成功の何らかの兆しを、あるいは傷害、病理または症状を患者に対してより許容しやすくすること；退化または衰退速度を遅らせること；患者の肉体的または精神的健全性を改善することをいう。徴候または症状の治療または改善は、身体検査の結果を含め、客観的または主観的パラメータに基づくことができる。例えば、エテルカルセチドの投与は、血清中無傷の副甲状腺ホルモン（ｉＰＴＨ）を減少させることにより、ＣＫＤ−ＭＢＤを有する血液透析患者におけるＳＨＰＴを治療するのに用いることができる。
【００６２】
「効果的な量」は、一般に、症状の重篤度および／または頻度を減少させ、症状および／または根底にある原因を排除し、症状および／またはその根底にある原因の出現を防止し、および／または病態（例えば、高ＰＨＴレベル）からもたらされる、または病態に付随する損傷を改善または修正するのに十分な量である。「治療的に効果的な量」は、病態または症候、特に該病態に付随する症状または症候を改善するのに十分な量であるか、あるいはそうでないとすれば、どのような方法であれ、その病態、または疾患に付随する任意の他の望ましくない症候の進行を防止、妨害、遅延または反転させる量である。完全な治療効果が、１用量の投与によって必ずしも生じるものではなく、一連の用量を投与した後でだけ生じるかもしれない。かくして、治療的に効果的な量は、単回用量として投与されてもよく、または複数回用量にて投与されてもよい。
【００６３】
本明細書中で使用されるような、「治療的に効果的な用量」および「治療的に効果的な量」なる語は、組織系、動物または人類において、治療すべき疾患または症状の徴候または症候の緩和または改善を誘発する、生物学的または医学的応答を惹起する量、すなわち１または複数の望ましい生物学的または医学的応答の観察可能なレベル、例えばＰＴＨの低下を支持するエテルカルセチドの量を意味する。
【００６４】
「ペプチド」なる語は、１のアミノ酸のカルボキシル基がもう一つ別のアミノ酸のアミノ基と連結する、２またはそれ以上のアミノ酸を含有する化合物をいう。かくして、エテルカルセチド、ならびに２またはそれ以上のアミノ酸を含有するそのフラグメント、中間体および先駆体（ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド等）は、本明細書では、一般にペプチドと称される。ペプチドなる語は、１または複数のアミノ酸残基が、対応する天然に存するアミノ酸のアナログまたは模倣体であるペプチドに、ならびに天然に存するアミノ酸だけを含むペプチドにも適用する。本明細書にて提供されるようなペプチドはまた、例えば、炭水化物残基を付加することにより糖タンパク質を形成するように修飾されてもよく、あるいはリン酸化されてもよい。
【００６５】
ペプチドの「変種」は、１または複数のアミノ酸残基が、別のポリペプチド配列と比べて、アミノ酸配列に挿入、欠失および／または置換されているアミノ酸配列を含む。変種は融合タンパク質を包含する。
【００６６】
ペプチドの「誘導体」は、例えば、別の化学的部分との接合を介して、挿入、欠失または置換された変種とは異なるある方法で化学的に修飾されているペプチドである。そのような修飾として、例えば、ある基のペプチドまたはポリペプチドのアミノおよび／またはカルボキシ末端との共有付加、例えば、アミノ末端のアセチル化、および／またはペプチドまたはポリペプチドのカルボキシ末端のアミド化を挙げることができる。化学的修飾が１または複数の保護基の導入である場合には、かかるペプチドは、一般には、本明細書において保護された形態であると称される。
【００６７】
「アミノ酸」なる語は当該分野におけるその通常の意味を含む。２０種の天然に存するアミノ酸およびその略語は慣用的な使い方に従う。免疫学−合成（Immunology-A Synthesis）, 2nd Edition,（E.S.GolubおよびD.R.Green編）, Sinauer Associates： Sunderland, Mass.（1991）を参照のこと。１９種の従来型アミノ酸（グリシンを除く）の立体異性体（例えば、Ｄ−アミノ酸）、［アルファ］−,［アルファ］−ジ置換アミノ酸などの非天然型アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、および他の非従来型アミノ酸もまた、本明細書において提供されるようなペプチドのための適切な構成要素であってもよく、「アミノ酸」なる語に含まれる。非従来型アミノ酸の例として、ホモシステイン、オルニチン、４−ヒドロキシプロリン、［ガンマ］−カルボキシグルタマート、［エプシロン]−Ｎ,Ｎ,Ｎ−トリメチルリジン、［エプシロン]−Ｎ−アセチルリジン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリジン、［ガンマ]−Ｎ−メチルアルギニン、および他の類似するアミノ酸およびイミノ酸（例えば、４−ヒドロキシプロリン）が挙げられる。本明細書で使用されるペプチド表記法において、標準的な使用および慣例に従って、左手方向がアミノ末端方向であり、右手方向がカルボキシ末端方向である。
【００６８】
キラル純度は、ペプチドフラグメントまたはペプチドのジアステレオマー純度をいう。例えば、キラル純度が９８％のペプチドフラグメントは、ペプチドフラグメントの９８％が単一のジアステレオマーの形態であることを意味する。本明細書に記載の方法により提供されるペプチドおよびペプチドフラグメントは、一般に、９５％より大きな、しばしば９８％より大きな、好ましくは少なくとも９９％のキラル純度を示す。
【００６９】
「ＵＮＣＡ」なる略語は、ウレタン保護されたアミノ酸Ｎ−カルボキシ無水物をいう。本明細書で提供されるような代表的なＵＮＣＡ化合物には、化合物１および４が含まれる。
【００７０】
本明細書中で使用されるような「室温」なる語は、１６℃と２６℃の範囲内にある温度をいう。
【００７１】
「液相」において行われる反応または工程は、従来の固相ペプチド合成において用いられるような固体支持体の使用というよりはむしろ、溶液中で行われる。固相ペプチド合成（「ＳＰＰＳ」）では、成長するペプチド鎖が固体支持体に連結される。
【００７２】
連続的液相工程は、該工程にて形成される中間体が単離または精製されずに、その後の変換工程に引き継がれる、上記されるような液相工程である。一般に、連続的液相工程は、副生成物および過剰量の試薬が濾過または抽出により除去され得るか、または気体形態であり、それによって時間のかかる中間体の単離または精製の排除を可能にする、工程である。
【００７３】
本明細書中で使用されるような「対象」または「患者」はいずれの哺乳動物をもいい、典型的な実施態様において、対象または患者はヒトである。
【００７４】
「任意の」または「所望により」は、その後に記載される状況が生じて、生じなくてもよいことを意味し、その説明はその状況が起こる場合、および起こらない場合を含む。
【００７５】
特定の特徴または実体に関して「実質的に」なる語は、その特徴または実体に関して有意な程度まで、またはほとんどすべて（すなわち、８５％以上の程度まで）を意味する。
【００７６】
「約」なる語は、特に所定の数に関して、±５％の偏差を含むものとする。
【００７７】
さらなる定義はまた下記のセクションでも見出すことができる。
【００７８】
概説
本発明の開示は、フラグメントをカップリングさせる技法を用いる、エテルカルセチド、またはその中間体および先駆体を調製するための液相方法を提供する。
【００７９】
第１の液相方法では、エテルカルセチドの主鎖は、２つのペプチドフラグメント（ここで該フラグメントはウレタン保護のアミノ酸Ｎ−カルボキシ無水物（ＵＮＣＡ）出発材料／反応体を用いて調製される）を液相フラグメントカップリングに供することにより組み立てられる。好ましくは、エテルカルセチドフラグメントは連続的プロセス、すなわち、中間体の単離または精製工程を必要としないプロセスを用いて調製される。第１の方法にて利用されるエテルカルセチドフラグメントは、Ｄ−アルギニンの代わりに、Ｄ−オルニチンを含有する。それらのＤ−アルギニンカウンターパートよりもむしろ、Ｄ−オルニチン含有のフラグメントの使用は、グアニジンの存在と関連付けられる望ましくない副反応の回避を可能とする。エテルカルセチドの先駆体、すなわち、Ｄ−アルギニンの代わりにＤ−オルニチン残基を有する先駆体を組み立てるためのカップリング方法にて使用される両方のフラグメントは、意外かつ有利にも、結晶化可能であり、該フラグメントが結晶化操作により精製され得ることを意味する。結晶性中間体の形成能は、時間および費用のかかる溶媒集約的クロマトグラフィー方法に依存することなく、容易で費用対効果に優れた、そのプロセスにおいて純度の高い中間体を提供するための方法を提供する。その第１の方法にてさらに有利な特徴は、エテルカルセチドヘプタペプチド先駆体に対してグローバルなグアニル化（すなわち、単一の反応）を実施し、それによりＤ−オルニチンをＤ−アルギニンと置き換える能力である。エテルカルセチドの主鎖の組み立ておよびグローバルなグアニル化に付された後、Ｌ−システインがジスルフィド結合の形成を介して導入される。
【００８０】
収束合成方法を利用する第２の液相フラグメントカップリング法にて、アセチル化されたＮ−末端の保護されたトリペプチドを、完全に脱保護されたＣ−末端テトラペプチドとカップリングさせ、ヘプタペプチドエテルカルセチド中間体を形成する。この液相方法にて、鎖伸長（すなわち、カップリング反応）は、保護されていないアルギニン残基を有するアミノ酸／ペプチドフラグメントを用いて実施される。この方法を用いると、Ｃ−末端エテルカルセチドなどのアルギニン含有のペプチドフラグメント、およびその関連する先駆体であるエテルカルセチドのジ−およびトリ−ペプチドが調製され、そのテトラフェニルボラート塩に変換され、後処理の間にアルギニン側鎖を保護する必要がなく、副生成物および不純物の除去が簡単となる。反応副生成物および不純物を除去した後、アルギニン含有のフラグメントのテトラフェニルボラート塩の形態は、典型的には、無機塩、例えば、塩酸塩に変換される。次にヘプタペプチドの背景からエテルカルセチドの形成は、例えば、Ｌ−システインとのジスルフィド架橋を形成することにより実施為れる。
【００８１】
上記の方法の特徴は、この度、後記するセクションにおいて詳細に記載される。
【００８２】
液相方法１
上記されるように、エテルカルセチドを製造するための第１の方法は、一般に、（ａ）Ｄ−アルギニンがＤ−オルニチンと置換されている、エテルカルセチドの保護されたテトラペプチドフラグメントを、（ｂ）エテルカルセチドの保護されたトリペプチドと、液相にてカップリングさせ、エテルカルセチドの保護されたヘプタペプチド先駆体を得ることからなる。エテルカルセチドのヘプタペプチド先駆体は、Ｄ−アルギニンがＤ−オルニチンと置換されている、エテルカルセチドの主鎖または骨格部に相当する。次にエテルカルセチドの保護されたヘプタペプチド先駆体をペルグアニレーション（perguanylate）に付し、Ｄ−オルニチンをＤ−アルギニンと置き換え、エテルカルセチドの保護されたヘプタペプチドのフラグメントを得、つづいてジスルフィド結合の形成を介してシステイン側鎖を導入する。
【００８３】
エテルカルセチドの完全に保護されたテトラペプチドフラグメント（化合物（９））を調製するための典型的な液相反応スキームが図２に示される。「完全に保護された」ペプチドフラグメントは、そのフラグメントにある感受性に富む反応性官能基のすべてが保護されているフラグメントである。例えば、化合物（９）を参照のこと。「保護された」ペプチドフラグメントまたはアミノ酸は、変換／カップリング反応において標的とすることを意図とする官能基を除いて、ペプチドフラグメントまたはアミノ酸の範囲内にある感受性に富む反応性部位のすべてが適切な保護基で保護されているペプチドまたはアミノ酸をいう。
【００８４】
図２に関連して、保護されたＤ−オルニチンのＮ−保護のＮ−カルボキシ無水物を用いて（Ｄ−アルギニンの代わりに）Ｄ−オルニチンを成長するペプチド鎖に導入し、テトラペプチド中間体を形成する。出発材料である、ベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）保護のＮ−カルボキシ無水物１は、Biopolymers, １９９６, ４０, １８３-2０５に、および国際特許公開番号ＷＯ２０１２／０６８１８７に記載されるように、Ｂｏｃ保護のＤ−オルニチンより調製され得る。特定の保護基は、本明細書にて、末端（α）アミノ、側鎖アミノ、末端カルボキシル、システインおよび他のアミノ酸またはペプチド官能基を保護／マスキングするために記載されるが、かかる保護基は例示を目的として提供されるに過ぎず、本明細書にて提供される液相合成方法の１または複数の実施態様と関連付けられる；別の適切な保護基および対応する脱保護方法を利用してもよく、本発明の開示の範囲内にある考えられる。例えば、ＵＮＣＡはＢｏｃ、Ｆｍｏｃ、Ｃｂｚまたは他の適切な保護基を含有してもよい。
【００８５】
次に、無水物の環を、例えば、外界条件下、例えば室温でアルコール性溶媒中、穏やかな反応条件下で開環させて対応するメチルエステル（２）を形成し、つづいて適切な反応条件下でＣｂｚ保護基を除去し、カップリングのために利用できる保護されていないα−アミノ基を有するが、オルニチンのＣ−末端およびδ−アミノ基で保護基を有する、保護されたＤ−オルニチン化合物（３、Ｈ−Ｄ−Ｏｒｎ（Ｂｏｃ）−ＯＭｅ）を得る。Ｃｂｚ保護基は、例えば、接触水素化分解により除去され得る。接触水素化分解は、典型的には、鎖長伸長工程の間に利用されＣｂｚ基を除去するが、一方でＨＢｒ／酢酸、高温でのトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、ＴＦＡ−チオアニソール、液体フッ化水素酸または三臭化ホウ素がペプチドの最終脱保護においてＣｂｚ基を除去するのに利用されてもよい。代表的な反応条件を図２に示す。
【００８６】
エテルカルセチドのテトラペプチドフラグメントの調製を続ける場合、次に化合物３、Ｈ−Ｄ−Ｏｒｎ（Ｂｏｃ）−ＯＭｅを、保護されたＤ−アラニン  ＵＮＣＡ、例えば、Ｃｂｚ−保護のＤ−アラニン  ＵＮＣＡ（４）と、典型的には極性の非プロトン性溶媒中で反応させ、完全に保護されたＤ−オルニチン−Ｄ−アルギニンジペプチド、Ｚ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｏｒｎ（Ｂｏｃ）−ＯＭｅ（５）を得る。ＵＮＣＡ−付加反応を実施するのに適切な極性の非プロトン性有機溶媒は、例えば、エーテル、エステル、極性芳香族炭化水素および塩素化炭化水素を包含する。代表的な溶媒は、例えば、ジメチルスルホキシド、Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ,Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチル−２−ピロリジン、ホルムアミド、テトラヒドロフラン、アセトニトリル等を包含する。ＵＮＣＡ−付加反応は、典型的には、約−１５℃から約６０℃の、または約−１０℃から約３０℃の、あるいはより好ましくは約−１０℃から約２５℃の範囲にある温度で実施される。
【００８７】
所望により、過剰量のＵＮＣＡは、例えば、シリサイクル（Silicycle）（登録商標）−ＮＨ２などのスカベンジャーと、あるいはその後で濾過により除去することができるいずれか他の適切な固体支持のアミンと反応させることにより、反応混合物より除去され得る。中間体の保護されたジ−、トリ−およびテトラ−ペプチドは、所望により、例えば、再結晶により、あるいはクロマトグラフィー技法を用いることにより、さらに精製されてもよい。例えば、（保護されているか、または完全に保護されている）ジ−、トリ−および／またはテトラ−ペプチドは、例えば、ジクロロメタンまたはクロロホルム中５％メタノールなどのアルコール−塩素化炭化水素の混合した溶媒系などの溶出液を用いるシリカゲルでのカラムクロマトグラフィーにより精製されてもよい。完全に保護されたテトラペプチド中間体、ＰＧ−ＮＨ−Ｄ−Ｏｒｎ（ＮＨ−ＰＧ）−Ｄ−Ｏｒｎ（ＮＨ−ＰＧ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｏｒｎ（ＮＨ−ＰＧ）−ＣＯ２−ＰＧ（ここで、「ＰＧ」は保護基を意味する；例えば、Ｚ−Ｄ−Ｏｒｎ（Ｂｏｃ）−Ｄ−Ｏｒｎ（Ｂｏｃ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｏｒｎ（Ｂｏｃ）−ＯＭｅ（９）を調製するために、例えば、化合物５などの完全に保護されたＤ−オルニチン−Ｄ−アラニンのジペプチドを用いる脱保護−カップリング操作を反復して繰り返し、完全に保護されたテトラペプチドの中間体を得る。例えば、化合物５の脱保護を、例えば接触水素化分解（例えば、パラジウム−炭素触媒の存在下で水素気体を用いる操作）に供してＤ−アラニンのＮ−末端でカルボキベンジル保護基を除去して６を得、つづいてＺ−Ｄ−Ｏｒｎ（Ｂｏｃ）ＵＮＣＡなどの保護されたＤ−オルニチンＵＮＣＡとの反応により鎖長伸長操作に付し、完全に保護されたトリペプチド（７）を得る。化合物（７）は結晶化可能であり、すなわち、再結晶により精製され得る。適切な再結晶溶媒または溶媒系として、例えば、アセトニトリルが挙げられる。次に、脱保護を、この時点で鎖長伸長した完全に保護されたトリペプチド化合物（７）、Ｚ−Ｄ−Ｏｒｎ（Ｂｏｃ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｏｒｎ（Ｂｏｃ）−ＯＭｅに対してもう一度実施し、例えば、接触水素化分解によりカルボキシベンジル保護基を除去して保護されたトリペプチド化合物（８）、Ｈ−Ｄ−Ｏｒｎ（Ｂｏｃ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｏｒｎ（Ｂｏｃ）−ＯＭｅを形成する。ついで化合物（８）の遊離アミノ基を保護された−Ｄ−オルニチンＵＮＣＡ、例えば、Ｚ−Ｄ−Ｏｒｎ（Ｂｏｃ）ＵＮＣＡと反応させて完全に保護されたテトラペプチド（９）を得る。
【００８８】
実施例７において見ることができるように、上記のＵＮＣＡをベースとする反復鎖伸長方法は、９０％を超える収率で化合物９を得るのに効果的であった。次に、完全に保護されたテトラペプチド（９）の末端アミノ基を除去し、保護されたテトラペプチド中間体１４（ここでそのＮ−末端は保護されたトリペプチドフラグメントの化合物（１３）の保護されていないＣ−末端とカップリングするのに利用可能である）を形成する。化合物（２−９）の合成が例示として実施例１−７に提供される。
【００８９】
こうして調製された保護および／または完全に保護されたジ−、トリ−、およびテトラ−ペプチドは、面倒なクロマトグラフィー精製を要することなく、その後の変換において用いるのに適している。ペプチドフラグメントは他のペプチドフラグメントまたはアミノ酸と液相にてカップリングさせる前に単離されてもよいが、かかる物質はその後のカップリング／変換反応に付す前にさらなる精製を必要とせず、粗材料として単離されてもよい。粗材料は、例えば、固体の副生成物および未反応の出発材料を濾過により除去し、つづいてその濾液を減圧下で濃縮して溶媒を除去することにより単離されてもよい。例えば、化合物（６）および８の回収を参照のこと。中間体のフラグメントは、別途、適切な溶媒に抽出させ、つづいて減圧下で濃縮することにより、回収されてもよい。
【００９０】
実施例において示されるように、α−アミノ保護基を除去した後、化合物６および８を次のＵＮＣＡ−アミノ酸鎖長伸長反応にその粗生成物の精製をさらに行うことなく供した。しかしながら、必要ならば、そのフラグメントを、例えば、カラムクロマトグラフィーにより、または再結晶により、上記されるようにさらに精製してもよい。例えば、化合物９、Ｚ−Ｄ−Ｏｒｎ（Ｂｏｃ）−Ｄ−Ｏｒｎ（Ｂｏｃ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｏｒｎ（Ｂｏｃ）−ＯＭｅ（９）、アセトニトリルからの再結晶により、エテルカルセチドの完全に保護されたテトラペプチド先駆体の精製を記載する、実施例７を参照のこと。テトラペプチドフラグメントのキラル純度は非常に高いのが典型である。キラル純度は、９０％より、または９２％より、または好ましくは９５％より、またはさらにより好ましくは９８％より大きいのが一般的である。実施例７から分かるように、上記の方法を用いて、完全に保護されたテトラペプチド化合物（９）は９９％のキラル純度で調製された。
【００９１】
完全に保護または保護されたテトラペプチド先駆体の化合物（９）または１４を形成するためにＵＮＣＡを基礎とする方法を用いることは、気体の反応生成物、二酸化炭素を形成させ、そのことは多数の固体処理工程および／または取り出し工程の必要性を軽減するために、特に利点がある。
【００９２】
エテルカルセチドのヘプタペプチド先駆体を形成するために、テトラペプチドフラグメント（９）を、Ｎ−末端からＣｂｚ基を除去してテトラペプチドフラグメント（１４）を得た後、保護されたトリペプチドフラグメント（末端Ｄ−システインを含む）とカップリングさせる。例えば、図３（遊離Ｎ−末端アミノ基を有するエテルカルセチドの保護されたＮ−末端テトラペプチドフラグメント（１４）を、エテルカルセチドの、そのＣ−末端が保護されていない、保護されたトリペプチドフラグメント（１３）とカップリングとさせ、最終的にエテルカルセチドの完全に保護されたヘプタペプチド先駆体（１６）を得るための代表的な反応スキームを提供する）を参照のこと。エテルカルセチドのヘプタペプチド先駆体（１６）は完全に保護されており、エテルカルセチドの主鎖に対応するが、Ｄ−アルギニンの代わりにＤ−オルニチンをその中に含む。エテルカルセチドの完全に保護されたヘプタペプチドフラグメント（１８）は、（１７）のペルグアニル化により生成され、化合物（１７）はそのオルニチンにあるδ−アミノ基がすべて保護されていない（すなわち、遊離アミノの）形態である。
【００９３】
さらに図３を参照すると、末端Ｄ−システインを有する、エテルカルセチドの保護されたトリペプチドフラグメント（１３）は、保護されたＤ−Ｃｙｓ−ＯＨ（１０）、すなわち、−ＮＨ−Ｄ−Ｃｙｓ（Ｓ−ＰＧ）ＯＨを、中間体の保護されたジペプチドフラグメント、Ｈ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｏｒｎ（ＮＨ−ＰＧ）−ＣＯ−ＰＧ（６）とカップリングさせ、完全に保護されたエテルカルセチドのトリペプチドフラグメントを得ることにより形成される。適切ないずれかの保護基を用いてＤ−システインチオールを保護してもよい；適切な保護基として、アセトアミドメチル（Ａｃｍ）、トリチル（Ｔｒｔ）、ベンジル（Ｂｎ）およびメチルベンジル（Ｍｅｂ）、第３ブチル（ｔ−Ｂｕ）、ｐ−メトキシベンジル（Ｍｏｂ）、モノメトキシトリチル（Ｍｍｔ）、２−ピリジン−スルフェニル（Ｓ−Ｐｒｙ）およびtert−ブチルメルカプト（Ｓ−ｔＢｕ）が挙げられる。Ａｃｍ基が好ましい。具体的には、該方法の１の実施態様において、ジペプチド中間体（６）は、標準的カップリング条件下で商業的に入手可能なアミノ酸（１０）、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）ＯＨとカップリングさせ、完全に保護されたトリペプチド中間体（１１）、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｏｒｎ（Ｂｏｃ）−ＯＭｅを得るか、より一般的にはＰＧ−ＮＨ−Ｄ−Ｃｙｓ（Ｓ−ＰＧ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｏｒｎ（ＮＨ−ＰＧ）−ＣＯＰＧを得る。このカップリング反応および他の従来のカップリング反応に利用され得るこれまでの液相カップリング試薬として、例えば、６−クロロ−１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、Ｎ,Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、１−［ビス（ジメチルアミノ）メチレン]−１Ｈ−１,２,３−トリアゾロ［４,５−ｂ］ピリジニウム  ３−オキシド・ヘキサフルオロホスファート（ＨＡＴＵ）、［ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ（ジメチルアミノ）メチリデン］−ジメチルアザニウム；テトラフルオロボラート（ＴＢＴＵ）、Ｎ,Ｎ,Ｎ’,Ｎ’−テトラメチル−Ｏ−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）ウロニウム・ヘキサフルオロホスファート、Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ,Ｎ,Ｎ’,Ｎ’−テトラメチルウロニウム・ヘキサフルオロホスファート（ＨＢＴＵ）およびＮ,Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＩＰＥＡ）が挙げられる；ヒドロキシスクシンイミジルまたはｐ−ニトロフェノールエステルなどの活性化エステルも使用されてもよい。
【００９４】
次に、完全に保護されたトリペプチド（１１）を脱保護に付し、例えば、適切な脱保護条件下でＦｍｏｃ保護基を除去する。Ｆｍｏｃ保護基は、例えば、塩基、典型的には、ピペリジンなどの第２アミンで処理することにより適宜除去され得る。液相除去は、例えば、有機溶媒中、液体アンモニア、モルホリン、ピペリジン、ジエチルアミン、ジメチルアセトアミドまたはピペラジンなどの塩基で処理することにより実施され得る。次に得られた遊離アミノ基を異なる保護基、例えば、アセチル基で保護し、完全に保護された化合物（１２、Ａｃ−Ｄ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｏｒｎ（Ｂｏｃ）−ＯＭｅ）を得る。ここで、新たに導入されたアセチル基は下記の反応条件に対して安定している。ついでＮ−保護のメチルエステル化合物（１２）を塩基性条件下で加水分解に付し、保護された、遊離酸含有のトリペプチド中間体（１３、Ａｃ−Ｄ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｏｒｎ（Ｂｏｃ）−ＯＨ）を得、それを上記されるように、（９）より誘導される遊離アミノテトラペプチドフラグメントの化合物（１４、Ｈ−Ｄ−Ｏｒｎ（Ｂｏｃ）−Ｄ−Ｏｒｎ（Ｂｏｃ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｏｒｎ（Ｂｏｃ）−ＯＭｅ）とカップリングさせ、完全に保護されたヘプタペプチド中間体（１５、Ａｃ−Ｄ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｏｒｎ（Ｂｏｃ）−Ｄ−Ｏｒｎ（Ｂｏｃ）−Ｄ−Ｏｒｎ（Ｂｏｃ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｏｒｎ（Ｂｏｃ）−ＯＭｅ）を得る。（１５）のカルボン酸メチルエステル官能基をアンモニアで処理することにより、アミド基、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２に変換し、完全に保護されたヘプタペプチド化合物（１６、Ａｃ−Ｄ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｏｒｎ（Ｂｏｃ）−Ｄ−Ｏｒｎ（Ｂｏｃ）−Ｄ−Ｏｒｎ（Ｂｏｃ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｏｒｎ（Ｂｏｃ）−ＮＨ２）を得る。次に化合物（１６）をグローバルな脱保護工程に適用し、すべての保護基、例えば、Ｂｏｃまたは他の適切な保護基をオルニチンδ−アミノ基から除去し、それにより４個の各オルニチンが遊離δ−アミノ基を含む化合物（１７、Ａｃ−Ｄ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｏｒｎ−Ｄ−Ｏｒｎ−Ｄ−Ｏｒｎ−Ｄ−Ａｌａ−Ｏｒｎ−ＮＨ２）などを得る。得られたヘプタペプチドのエテルカルセチド先駆体（１７など）を次にペルグアニル化（perguanylate）に付し、４個の脱保護されたオルニチンを保護されたＤ−アルギニンと置き換える。該反応は、例えば、適切な反応条件下にてピラゾールカルボキシアミジン試薬を用いて実施され、完全に保護されたエテルカルセチド骨格の化合物（１８、Ａｃ−Ｄ−Ｃｙｓt（Ａｃｍ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｒｇ（Ｂｏｃ）２−Ｄ−Ａｒｇ（Ｂｏｃ）２−Ｄ−Ａｒｇ（Ｂｏｃ）２−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｒｇ（Ｂｏｃ）２−ＮＨ２）を得る。典型的なグアニル化試薬として、例えば、１Ｈ−１,２,４−トリアゾール−１−カルボキシアミジン・塩酸塩、１−Ｈ−ピラゾール−１−カルボキシアミジン・塩酸塩、および３,５−ジメチル−１−Ｈ−ピラゾール−１−カルボキシアミジン・塩酸塩が挙げられる。チオ尿素またはイソチオ尿素をベースとする試薬も使用され得る。
【００９５】
次に、Ｄ−アルギニン保護基を完全に保護されたエテルカルセチド骨格から全体的に除去する。例えば、図４に示されるように、グローバルなＢｏｃ脱保護を中間体（１８）において、例えば、ＴＦＡ、あるいは他のいずれか適する脱保護手段を用いて実施し、中間体の化合物（１９）を得る。中間体の化合物（１９）は、Ｌ−システインとカップリングさせる前に除去される、保護されたシステインチオール基を有し、所望の生成物のエテルカルセチドを得る。図４に示されるように、１９にあるアセトアミド保護基は、例えば、ヨウ素などの酸化剤の存在下で酸化的切断により除去され、遊離チオールを形成し、つづいてジスルフィド結合の形成を介してＬ−Ｃｙｓとカップリングしうる。アセトアミド基を除去するのに使用されてもよいさらなる試薬として、例えば、トリフルオロ酢酸タリウムＴＩ（ＴＦＡ）３、および酢酸水銀（ＩＩ）などの水銀（ＩＩ）塩が挙げられる。保護基のＤ−システインからの除去およびＬ−システイン側鎖をエテルカルセチド骨格を含有する遊離チオールにカップリングさせる最終カップリング工程は両方共に同じ反応容器で実施され、所望のペプチド生成物である、エテルカルセチド（２０）を得ることができる。図４はヘプタペプチド中間体に含まれるＢｏｃ−保護のアルギニンにてグローバルな脱保護を、つづいてチオール脱保護およびＬ−システインへのカップリングを行い、所望の生成物を形成するための典型的な反応条件を提供する。
【００９６】
液相方法２
第２の態様では、図７にて模式的に示されるように、遊離カルボキシル基を有するアセチル化Ｎ−末端保護のトリペプチドを、遊離アミノ基を有する保護されていないアルギニン側鎖を含むテトラペプチドアミドとカップリングさせ、ヘプタペプチドのエテルカルセチド中間体を形成する、液相フラグメントカップリング法が本明細書にて提供される。この方法を用いて、鎖長伸長は、保護されていないアルギニン残基を有するアミノ酸／ペプチドフラグメントを用いて実施される。エテルカルセチドのＣ−末端テトラペプチドおよびエテルカルセチドのその関連する先駆体であるジ−およびトリ−ペプチドなどのアルギニン含有のペプチドフラグメントを調製し、そのテトラフェニルホウ酸塩に変換し、例えば得られた反応混合物の後処理の間にアルギニン側鎖の保護を必要とすることなく、カップリング反応に付した後の副生成物および不純物の簡易化された除去を可能とする。反応副生成物および不純物を、例えば、水相に抽出することにより除去した後、アルギニン含有のフラグメントの、例えば有機溶媒中のテトラフェニルホウ酸塩は、無機塩、例えば塩酸塩に変換される。次にエテルカルセチドのそのヘプタペプチド骨格からの形成が、例えば、Ｌ−システインでのジスルフィド架橋の形成により実施される。
【００９７】
第２液相合成方法に関連して、フラグメントカップリング法において用いられる反応体の一つ、すなわち、エテルカルセチドの完全にアミノ脱保護されたＣ−末端テトラペプチドフラグメントを調製するための方法が本明細書にて提供される。次に図５を参照すれば、この図は完全にアミノ脱保護されたテトラペプチドフラグメント（３０、配列番号：１０、Ｈ−（Ｄ）Ａｒｇ−（Ｄ）Ａｒｇ−（Ｄ）Ａｌａ−（Ｄ）Ａｒｇ−ＮＨ２・４ＨＣｌ）を形成する方法の実施態様を説明する。図５にて説明される実施態様は実施例１７−２０に記載される。
【００９８】
３０などのテトラペプチドの合成は以下のように実施されてもよい。例えば、その適宜活性化されたカルボキシ基を有する、例えば、活性化されたエステルの形態の、アミノ保護されたアラニン、例えば、Ｚ−Ｄ−Ａｌａ−ＯＳｕ（２２）を、その適宜保護されたカルボキシル基を有するアルギニン、例えば、Ｄ−アルギンアミド・塩酸塩（２３）と、カップリング条件下でカップリングさせ、保護されたジペプチドフラグメント（ＰＧ−ＮＨ−（Ｄ）−Ａｌａ−（Ｄ）−Ａｒｇ−ＣＯ−ＰＧ）を得る。カップリング反応は、例えば、ジメチルアセトアミド、Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）またはアセトニトリルなどの非プロトン性有機溶媒中、カップリング反応の間にプロトンスカベンジャーとして作用する、Ｎ,Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、ＨＡＴＵまたはＨＢＴＵ等などのカップリング剤の存在下で実施される。該カップリング反応は、典型的には、穏やかな条件下、例えば、約１０℃〜約６０℃、約１５℃〜約４５℃、または約２０℃〜３０℃の範囲にある温度で実施される。代表的なＤ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｒｇジペプチドは、末端カルボキシベンジル保護のアラニンのアミノ基と、対応するアミドとして保護されたＤ−アルギニンカルボキシル基とを含む、例えば、Ｚ−（Ｄ）Ａｌａ−（Ｄ）Ａｒｇ−ＮＨ２（２４）である。カップリングの後、例えば、該ジペプチドを溶かすのに、該反応混合物に水を添加してもよく、未反応の出発材料および副生成物は、所望により、例えば、酢酸エチルなどの適切な有機溶媒を用いる１または複数の洗浄工程で除去されてもよい。次に、そのジペプチドをテトラフェニルホウ酸（ＴＰＢ）ナトリウムで処理し、対応するＴＰＢ塩を形成させる。ＴＰＢ塩の形成により、そのフラグメントをジクロロメタン、クロロホルムまたは他のいずれか適切な溶媒などの有機溶媒に抽出させることが可能となる。例えば、米国特許公開番号ＵＳ２０１１００９８４４６を参照のこと。次にその得られた有機層を、好ましくは、水で１回または複数回洗浄し、カップリング反応の副生成物等を除去する。有機層を処理して不要な不純物を除去した後、イオン交換反応を、メタノールなどの適切な溶媒中、例えば、イオン交換カラムを用いて実施し、ジペプチドフラグメントを無機酸塩、例えば塩酸塩として得る。次にその末端Ｄ−アラニンアミノ保護基の除去を行う。例えば、Ｚ−（Ｄ）Ａｌａ−（Ｄ）Ａｒｇ−ＮＨ２（２４）のカルボキシベンジル基は、上記されるように、接触水素化分解により除去されてもよい。上記のカップリング反応および塩交換を実施するのに適する反応条件の詳細は実施例１８にて提供される。次にカップリング、テトラフェニルホウ酸塩の形成、塩交換および脱保護に付すこの工程は実施例５に示されるように反復して実施される。例えば、カップリング／水素添加の工程は、ＰＧ−ＮＨ−Ｄ−アルギニン・塩酸塩、例えば、Ｚ−Ｄ−Ａｒｇ−ＯＨ（２６）を用いて２５に対して反復して実施され、トリペプチド（２７）を得、その後で所望のテトラペプチド（３０）が高収率で得る。例えば、実施例１９および２０を参照のこと。適切なカップリング条件は、ペプチド合成、有機合成等の分野における当業者により���易に決定され得る。例えば、２６などのアミノ酸のカルボキシ基は適切ないずれかの活性化基を用いて活性化され、カップリング反応は当該分野における当業者に公知の多数のカップリング剤のいずれかを用いて実施される。図５に示され、その対応する実施例に記載の特定のカップリング条件は単に例示であることが意図されており、範囲を限定することを意図するものではない。上記の方法は、化合物（３０）などの完全にアミノ脱保護されたテトラペプチドを調製し、それを次に液相カップリング反応に使用し、エテルカルセチドの保護されたヘプタペプチドフラグメントを形成するのに有用である。ＨＣｌ塩などの酸付加塩に含有される酸分子の数は変化しうる。というのも、異なるイオン交換生成物は、酸、例えばＨＣｌの異なる保持能を有するからである。エテルカルセチドの調製において、ＨＣｌ塩を形成するのに利用可能なさらなる塩基性部位は、アルギニンが付加的に導入される場合に、伸長するペプチド鎖に導入される。
【００９９】
図６は、エテルカルセチドのアセチル化されたＮ−末端保護のトリペプチドフラグメントを調製するための典型的反応スキームおよび典型的反応条件を提供する。上記のテトラペプチドとカップリングするためのＤ−システインアミノ酸を含有するトリペプチドフラグメントは、テトラペプチドについて上述されるとの同様の方法にて、出発材料がＨ−Ｄ−Ａｒｇ−ＯＨ（３１）であることを除いて、組み立てることができる。保護されていないアラニン（３１、Ｈ−Ｄ−Ａｒｇ−ＯＨ）を、その適宜活性化されたカルボキシ基を有するアミン保護のアラニンと、例えば、活性化されたエステルの形態にて、例えば、Ｚ−Ｄ−Ａｌａ−ＯＳｕ（２２）と、保護されたジペプチドフラグメント（ＰＧ−ＮＨ−（Ｄ）−Ａｌａ−（Ｄ）−Ａｒｇ−ＯＨ）を提供するのに適するカップリング条件下でカップリングさせる。得られたジペプチドがカルボキシベンジル保護されている場合、そのジペプチドはＺ−Ｄ−Ａｌａ−（Ｄ）−Ａｒｇ−ＯＨ・ＨＣｌ（３２）に相当する。次に該ジペプチドの脱保護を、利用される特定の保護基に適する脱保護条件を用いて、実施する。例えば、ジペプチド（３２）は水素化分解に供され、それによりＺ保護基を除去してもよい。得られた完全に脱保護されたジペプチドはＨ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｒｇ−ＯＨ（３３）である。ついで、例えば、３３にある遊離アミノ基を、ＰＧ−ＮＨ−Ｄ−Ｃｙｓ（ＳＨ−ＰＧ）−ＯＨと、すなわち、Ｎ−末端保護のチオール保護されたシステイン（３４、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｃｙｓ（ｔｒｔ）−ＯＨなど）とカップリングさせ、保護されたトリペプチド（３５、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｃｙｓ（ｔｒｔ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｒｇ−ＯＨ）を形成することによりトリペプチドが形成される。カップリング反応は当該分野にて周知のカップリング条件下で実施される。記載されるように、カップリングは、例えば、カルボジイミドカップリング試薬を用いて実施され得る。特に、カップリング反応は、適切な溶媒系、例えば、ジメチルホルムアミド−イソプロピルアルコールの溶媒混合液中、活性化剤のヒドロキシノルボルネン／ＤＣＣを用いて所望のトリペプチドを提供するようになされてもよい。次に、得られたトリペプチドを脱保護に付し、すなわち、Ｎ−末端の保護基を適切な脱保護法法を用いて除去する。例えば、Ｆｍｏｃ基は、有機溶媒中、塩基で処理することで除去される。例えば、Ｆｍｏｃ保護基は、メタノール中、モル過剰量のピペリジンで処理することにより３５より除去され、次に得られたトリペプチドの遊離アミノ基をアセチル基で頭を覆い、エテルカルセチドのアセチル化されたＮ−末端の保護されたトリペプチドフラグメント（例えば、３６）を得る。
【０１００】
ついで、エテルカルセチドの、中間体化合物、すなわち、アセチル化されたＮ−末端保護のトリペプチドフラグメントと、完全にアミノ脱保護されたＣ−末端テトラペプチドフラグメントとをカップリングさせて、末端Ｄ−システインを含むエテルカルセチドの保護されたヘプタペプチドフラグメントを形成させる。例えば、実施例２５を参照のこと。本明細書に記載されるように、Ｈ−（Ｄ）Ａｒｇ−（Ｄ）Ａｒｇ−（Ｄ）Ａｌａ−（Ｄ）Ａｒｇ−ＮＨ２・４ＨＣｌ（３０）または適宜保護されたその均等物を、Ａｃ−Ｄ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｒｇ−ＯＨ（３６）または適宜保護されたその均等物と、溶液中でカップリングさせ、３７などのエテルカルセチドの保護されたヘプタペプチドフラグメントを得る。トリ−とテトラ−ペプチドフラグメントとのカップリングを、当該分野にて周知の１または複数のカップリング剤およびカップリング条件を用いて実施する。例えば、そのフラグメントをカルボジイミドカップリング剤、あるいはホスホニウムまたはアミニウム塩を用いてカップリングさせてもよい。例えば、カップリング反応は、カルボジイミドカップリング剤を用いて、所望によりＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＨＯＳｕ）、ＨＯＤｈＢｔ、ＨＯＢｔ、ＨＯＡｔまたは１−ヒドロキシ−１,２,３−トリアゾール誘導体などのヒドロキシルアミン誘導体の存在下で実施されてもよい。代表的なカップリング条件は、２−ヒドロキシピリジン−Ｎ−オキシドの存在下で、ＥＤＣなどのカルボジイミドカップリング試薬の使用を包含する。例えば、反応速度を促進するために、ジイソプロピルエチルアミンを反応混合物に添加することもできる。上記のカップリング反応において用いるのに適するさらなる試薬およびカップリング条件は、例えば、「ペプチドカップリング試薬における近年の開発（Recent development in peptide coupling reagents）」、Al-Warhi,T.I.ら、J. of Saudi Chemical Society（2012), 16, 97-116に開示されている。カップリング反応は、一般に、利用されるカップリング剤に応じて、約−２５℃〜約６０℃、または約０℃〜約４０℃、または約０℃〜約２５℃の範囲の温度で実施される。カップリング反応は、一般に、ジメチルアセトアミドなどの非プロトン溶媒にて実施される。カップリング反応における使用に適する非プロトン溶媒は本明細書にて上記されるとおりである。カップリング反応が終了すれば、その粗ヘプタペプチドは、例えば、アセトニトリルで沈降させることにより反応混合物から回収され得る。所望により、ヘプタペプチドフラグメントは当該分野にて公知の適切ないずれかのペプチド精製方法を用いてさらに精製され得る。１の実施態様において、ヘプタペプチドはクロマトグラフィーにより精製される。
【０１０１】
次に、システイン側鎖を、３７などの、すなわち、保護された形態にて、末端Ｄ−システインを有するエテルカルセチドの主鎖を含む、エテルカルセチドの保護されたヘプタペプチドフラグメントに、酸化条件下でシステインチオール基同士を反応させることにより導入し、ジスルフィド架橋を形成する。例えば、ジスルフィド結合の形成は、エテルカルセチドの保護されたヘプタペプチドフラグメントを過剰量のチオール保護のＬ−システイン、例えば、Ｈ−Ｌ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨと、ヨウ素の存在下で反応させることにより実施され得る。一般に、過剰量のヨウ素が用いられ、反応は、例えば、水中、または水含有溶媒中で実施されてもよい。その反応は、典型的には、約２〜約７.５のｐＨで実施される。１の実施態様において、チオールカップリング反応は、７未満、例えば約２〜約５のｐＨで実施される。反応溶液のｐＨを下げることは、例えば、保護されたシステイン反応体（Ｌ−Ｈ−Ｃｙｓ（ｔｒｔ）−ＯＨ）の溶解を助成しうる。この最終のＬ−システインカップリング反応は、例えば、液相方法１の下に記載されるのと同様の方法にて、所望の生成物のエテルカルセチドを提供する。ジスルフィド結合の形成を促進するヨウ素の使用は、都合よくは、アセトアミド基とトリチル基の両方を酸化的に切断し、所望の生成物を提供することを可能とする。液相中で得られる生成物のエテルカルセチドは、典型的には、さらに精製される。反応副生成物は、例えば、適切な溶媒で抽出することにより反応混合物より除去され、粗生成物は従来の分離および／または精製技法を用いて精製される。例えば、１の実施態様において、粗エテルカルセチドはイオン交換クロマトグラフィーにより精製される。イオン交換処理に付した後に集めたフラクションに存在する塩は、例えば、ナノ濾過により除去されてもよい。
【０１０２】
実施例
以下の実施例は純粋に例示を目的とするものであり、決して添付した特許請求の範囲を限定するものではない。反応条件、例えば、成分濃度、溶媒、混合溶媒、温度、保護基、および他の反応パラメーター、ならびに純度、収率等などの生成物の特性を最適化するために利用され得る条件において、多数の変形および組み合わせがある。そのようなことも同様に本発明の範囲内にあると考えられる。
【０１０３】
実施例１
（Ｒ）−メチル  ２−（ベンジルオキシカルボニルアミノ）−５−（tert−ブトキシカルボニルアミノ）ペンタノアート：化合物２
Ｚ−Ｄ−Ｏｒｎ（Ｂｏｃ）−ＯＭｅ（２）：Ｚ−Ｄ−Ｏｒｎ（Ｂｏｃ）ＵＮＣＡ（１）（６０ｇ、１５７.７ミリモル）の無水ＭｅＯＨ（１０００ｍＬ）中溶液を窒素雰囲気下の外界温度で０.５時間攪拌した。その時点でＴＬＣは反応の完了を示した。過剰量の溶媒を減圧下で除去し、２（５５.０ｇ、９５％）を粘性のガム状物として得た。その材料をさらに精製することなく次の工程に用いた。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  ７.７１（ｄ，Ｊ＝７.５Ｈｚ，１Ｈ）、７.３２（ｍ，５Ｈ）、６.７７（ｂｓ，１Ｈ）、５.０１（ｓ，２Ｈ）、３.９９（ｍ，１Ｈ）、３.６０（ｓ，３Ｈ）、２.８７（ｄｄ，Ｊ＝１２.１、６.１Ｈｚ，２Ｈ）、１.６３（ｍ，２Ｈ）、１.５４（ｍ，２Ｈ）、１.３９（ｓ，９Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  １７３.３、１５６.６、１５６.０、１３７.９、１２８.８、１２８.３、１２８.２、１２７.６、７７.８、６５.９、５４.１、５２.２、２８.７、２８.５、２６.４；ＭＳ  ＥＳＩ（ｍ／ｚ）  Ｃ１９Ｈ２９Ｎ２Ｏ６として、［Ｍ＋Ｈ−Ｂｏｃ］＋  計算値：２８１、測定値：２８１；ＨＰＬＣ純度：９９.５％；キラル純度：１００％
【０１０４】
実施例２
（Ｒ）−メチル  ２−アミノ−５−（tert−ブトキシカルボニルアミノ）ペンタノアート：化合物３の合成
Ｈ−Ｄ−Ｏｒｎ（Ｂｏｃ）−ＯＭｅ（３）：２（１５.０ｇ、３９.４ミリモル）の無水ＥｔＯＡｃ（２５０ｍＬ）中溶液に、Ｐｄ−Ｃ（２ｇ、活性炭上１０％）を窒素雰囲気下で、そして触媒量の酢酸を添加し、得られた溶液を水素雰囲気下（３ｋｇ）の外界温度で１６時間攪拌した。ＴＬＣ（ニンヒドリン溶液に浸し、乾燥させ、加熱した）は反応の完了を示した。反応混合物をセライトのパッドに通し、フィルター上の固体をＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）で洗浄した。こうして得られた濾液を減圧下で濃縮し、粗残渣を得た。その粗製物の塊をトルエンと一緒に２回共蒸発させ、３（１１.２ｇ；粗製）を粘性のガム状物として得、それをさらに精製することなく用いた。
【０１０５】
実施例３
（５Ｒ,８Ｒ）−メチル ５,１５,１５−トリメチル−３,６,１３−トリオキソ−１−フェニル−２,１４−ジオキサ−４,７,１２−トリアザヘキサデカン−８−カルボキシラート：化合物５の合成
Ｚ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｏｒｎ（Ｂｏｃ）−ＯＭｅ（５）：３（１１.０ｇ、粗製）の無水ＴＨＦ（２５０ｍＬ）中の窒素雰囲気下でのよく攪拌した溶液に、（Ｒ）−ベンジル  ４−メチル−２,５−ジオキソオキサゾリジン−３−カルボキシラート：４（１１.２ｇ、４７.３ミリモル）を０℃で添加し、その中身を外界温度で２時間攪拌し、その後で反応はＴＬＣにより示されるように完了した。そのフラスコに、シリサイクルのアミン（５ｇ）を添加し、攪拌を外界温度でさらに１６時間続け、残りの無水物を除去した。シリサイクルのアミンを濾別し、濾液を減圧下で蒸発させ、粗残留物を得た。その粗製物の塊をシリカゲル（２３０−４００メッシュ）フラッシュカラムにより２％ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３で精製し、５（１２.０ｇ、６７％）を白色の固体として生成した。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  ８.１８（ｄ，Ｊ＝７.３Ｈｚ，１Ｈ）、７.３５（ｍ，６Ｈ）、６.７７（ｂｓ，１Ｈ）、４.９９（ｓ，２Ｈ）、４.１２（ｍ，２Ｈ）、３.５９（ｓ，３Ｈ）、２.８７（ｍ，２Ｈ）、１.６１（ｍ，２Ｈ）、１.３６（ｍ，２Ｈ）、１.３５（ｓ，９Ｈ）、１.１８（ｄ，Ｊ＝７.１Ｈｚ，３Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  １７３.２、１７２.９、１５６.０、１３７.５、１２８.８、１２８.２、１２８.１９、７７.９、６５.８、５２.２、５０.２、２８.７、２８.６、２６.４、１８.６；ＭＳ  ＥＳＩ（ｍ／ｚ）  Ｃ２２Ｈ３４Ｎ３Ｏ７として［Ｍ＋Ｈ−Ｂｏｃ］＋  計算値：３５２、測定値：３５２；ＨＰＬＣ純度：９９.９％
【０１０６】
実施例４
（Ｒ）−メチル  ２−（（Ｒ）−２−アミノプロパンアミド）−５−（tert−ブトキシカルボニルアミノ）ペンタノアート：化合物６（配列番号：６）の合成
Ｈ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｏｒｎ（Ｂｏｃ）−ＯＭｅ（６）：５（５６.０ｇ、１２４.１ミリモル）の無水ＴＨＦ（５００ｍＬ）中溶液に、Ｐｄ−Ｃ（６ｇ、活性炭上１０％；湿重量基準）を窒素雰囲気下で添加し、その得られた溶液を水素圧（４０ｐｓｉ）下の外界温度で２時間かき混ぜた。ＴＬＣ（ニンヒドリン溶液に浸し、乾燥させ、加熱した）は反応の完了を示した。反応混合物をセライトのパッドに通し、フィルター上の固体をＴＨＦ（２００ｍＬ）で洗浄し、こうして得られた濾液を減圧下で濃縮して６（３８.０ｇ；粗製）を黒色のタール物質として得、それをさらに精製することなく用いた。
【０１０７】
実施例５
（９Ｒ,１２Ｒ,１５Ｒ）−メチル１５−（ベンジルオキシカルボニルアミノ）−２,２,１２,２２,２２−ペンタメチル−４,１１,１４,２０−テトラオキソ−３,２１−ジオキサ−５,１０,１３,１９−テトラアザトリコサン−９−カルボキシラート：化合物７（配列番号：７）の合成
Ｚ−Ｄ−Ｏｒｎ（Ｂｏｃ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｏｒｎ（Ｂｏｃ）−ＯＭｅ（７）：６（３８.０ｇ；粗製）の無水ＴＨＦ（５００ｍＬ）中の十分に攪拌した溶液に、１（５１.７ｇ、１３１.８ミリモル）を窒素雰囲気下の０℃で添加し、その中身を外界温度で２時間攪拌し、その後で反応はＴＬＣにより示されるように完了した。そのフラスコに、シリサイクルのアミン（１５ｇ）を添加し、攪拌を外界温度でさらに１６時間続け、残りの無水物を除去した。シリサイクルのアミンを濾別し、濾液を減圧下で蒸発させ、粗残留物を得た。その粗製物の塊をアセトニトリル（６倍容量）からの再結晶に付し、７（４５.０ｇ、５５％）を白色の固体として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  ８.１９（ｄ，Ｊ＝７.２Ｈｚ，１Ｈ）、７.９２（ｄ，Ｊ＝７.６Ｈｚ，１Ｈ）、７.３６（ｍ，６Ｈ）、６.７６（ｍ，２Ｈ）、４.９９（ｓ，２Ｈ）、４.２９（ｍ，１Ｈ）、４.１８（ｍ，１Ｈ）、３.９４（ｍ，１Ｈ）、３.５８（ｓ，３Ｈ）、２.８７（ｍ，４Ｈ）、１.５８（ｍ，８Ｈ）、１.３５（ｍ，１８Ｈ）、１.１８（ｄ，Ｊ＝７Ｈｚ， ３Ｈ）；ＭＳ  ＥＳＩ（ｍ／ｚ）、Ｃ３２Ｈ５２Ｎ５Ｏ１０として、［Ｍ＋Ｈ］＋  計算値：６６６、測定値：６６６；ＨＰＬＣ純度：９８.８％；キラル純度：１００％
【０１０８】
実施例６
（９Ｒ,１２Ｒ,１５Ｒ）−メチル１５−アミノ−２,２,１２,２２,２２−ペンタメチル−４,１１,１４,２０−テトラオキソ−３,２１−ジオキサ−５,１０,１３,１９−テトラアザトリコサン−９−カルボキシラート：化合物８（配列番号：８）の合成
Ｈ−Ｄ−Ｏｒｎ（Ｂｏｃ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｏｒｎ（Ｂｏｃ）−ＯＭｅ（８）：７（２５.０ｇ、３７.６ミリモル）の無水ＴＨＦ（２００ｍＬ）中溶液に、Ｐｄ−Ｃ（２.５ｇ、活性炭上１０％；湿重量基準）を窒素雰囲気下で加え、その得られた溶液を水素圧（４０ｐｓｉ）下の外界温度で３時間かき混ぜた。ＴＬＣ（ニンヒドリン溶液に浸し、乾燥させ、加熱した）は反応の完了を示した。反応混合物をセライトのパッドに通し、フィルター上の固体をＴＨＦ（２００ｍＬ）で洗浄し、こうして得られた濾液を減圧下で濃縮して８（１８.２ｇ；粗製）を黒色の綿毛のようにフワッとした物質として得、それをさらに精製することなく用いた。
【０１０９】
実施例７
（９Ｒ,１２Ｒ,１５Ｒ,１８Ｒ）−メチル−１８−（ベンジルオキシカルボニルアミノ）−１５−（３−（tert−ブトキシカルボニルアミノ）プロピル）−２,２,１２,２５,２５−ペンタメチル−４,１１,１４,１７,２３−ペンタオキソ−３,２４−ジオキサ−５,１０,１３,１６,２２−ペンタアザヘキサコサン−９−カルボキシラート：化合物９（配列番号：１３）の合成
Ｚ−Ｄ−Ｏｒｎ（Ｂｏｃ）−Ｄ−Ｏｒｎ（Ｂｏｃ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｏｒｎ（Ｂｏｃ）−ＯＭｅ（９）：８（１８.２ｇ；粗製）の０℃での無水ＴＨＦ（５００ｍＬ）中の十分に攪拌した溶液に、１（１５.０ｇ、３８.３ミリモル）を窒素雰囲気下で添加し、その中身をその中身を外界温度で２時間攪拌し、その後で反応はＴＬＣにより示されるように完了した。そのフラスコに、シリサイクルのアミン（１０ｇ）を添加し、攪拌を外界温度でさらに１６時間続け、残りの無水物を除去した。シリサイクルのアミンを濾別し、濾液を減圧下で蒸発させ、粗残留物を得た。その粗生成物を熱アセトニトリルからの再結晶に付して精製し、９（２７.０ｇ, ８１％）をオフホワイトの固体として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  ８.２２（ｄ，Ｊ＝７.１Ｈｚ，１Ｈ）、７.９２（ｍ，２Ｈ）、７.３３（ｍ，６Ｈ）、６.７８（ｍ，３Ｈ）、５.０２（ｓ，２Ｈ）、４.２５（ｍ，３Ｈ）、４.０１（ｍ，１Ｈ）、３.６０（ｓ，３Ｈ）、２.８８（ｍ，６Ｈ）、１.５６（ｍ，６Ｈ）、１.５２（ｍ，６Ｈ）、１.３７（ｓ，２７Ｈ）、１.１（ｄ，Ｊ＝７Ｈｚ， ３Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  １７２.８、１７２.７、１７２.２、１７１.５、１５６.４、１５６.０、１３７.８、１２８.８、１２８.２、１２８.１、７７.８、６５.８、５４.９、５２.４、５２.２、４８.２、２９.９、２９.８、２８.７、２６.５、２６.４、１８.６；ＭＳ  ＥＳＩ（ｍ／ｚ）、Ｃ４２Ｈ７０Ｎ７Ｏ１３として、［Ｍ＋Ｈ］＋  計算値：８８１、測定値：８８１；ＨＰＬＣ純度：９９％；キラル純度：９９％
【０１１０】
実施例８
（７Ｓ,１０Ｒ,１３Ｒ）−メチル  ７−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニルアミノ）−１３−（３−（tert−ブトキシカルボニルアミノ）プロピル）−１０−メチル−２,８,１１−トリオキソ−５−チア−３,９,１２−トリアザテトラデカン−１４−オアート：化合物１１（配列番号：１４）の合成
Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｏｒｎ（Ｂｏｃ）−ＯＭｅ（１１）：Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−ＯＨ（１０；１２.１ｇ、２９.２ミリモル）および６（１２.０ｇ、３７.８ミリモル）の窒素雰囲気下の０℃での無水ＴＨＦ（２５０ｍＬ）中にて十分に攪拌された溶液に、ＥＤＣＩ・ＨＣｌ（６.１２ｇ、３１.９ミリモル）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（３.９５ｇ、２９.２ミリモル）およびＮ,Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（５.４ｍＬ、３１.９ミリモル）を加えた。その中身を外界温度で１６時間攪拌させた。反応が完了した後（ＴＬＣ）、反応の中身を氷冷水（２５０ｍＬ）中に攪拌しながら注ぎ、沈殿した固体を濾過し、濾紙上の固体ケーキを冷水で洗浄し、真空下で乾燥させて粗残留物を得、それを３％ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３を用いるシリカゲル（２３０−４００メッシュ）フラッシュカラムに付して精製し、１１（１２.５ｇ、６６％）を白色の固体として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  ８.６０（ｍ，１Ｈ）、８.２２（ｍ，１Ｈ）、７.９１（ｍ，３Ｈ）、７.７１（ｍ，２Ｈ）、７.５９（ｍ，１Ｈ）、７.４０（ｍ，２Ｈ）、７.３０（ｍ，２Ｈ）、６.７８（ｂｓ，１Ｈ）、４.３８−４.１８（ｍ，９Ｈ）、３.５８（ｓ，３Ｈ）、２.８７（ｍ，３Ｈ）、２.６６（ｍ，１Ｈ）、１.８９（ｓ，３Ｈ）、１.５５（ｍ，２Ｈ）、１.４４（ｍ，２Ｈ）、１.４１（ｓ，９Ｈ）、１.２３（ｄ，Ｊ＝７Ｈｚ，３Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  １７２.８、１７２.７、１７０.６、１７０.４、１５６.５、１５６.０、１４４.２、１４１.２、１２８.９、１２７.５、１２５.７、１２０.５、７７.８、６６.２、６５.４、５４.８、５２.２、４８.４、４７.０、３２.９、２８.７、２８.６、２６.３、２３.０１、１８.６、１５.６；ＭＳ  ＥＳＩ  Ｃ３５Ｈ４８Ｎ５Ｏ９Ｓとして、［Ｍ＋Ｈ］＋  計算値：７１４.８；測定値：４９５；ＨＰＬＣ純度：９３.６％
【０１１１】
実施例９
（７Ｓ,１０Ｒ,１３Ｒ）−メチル  ７−アセトアミド−１３−（３−（tert−ブトキシカルボニルアミノ）プロピル）−１０−メチル−２,８,１１−トリオキソ−５−チア−３,９,１２−トリアザテトラデカン−１４−オアート：化合物１２（配列番号：１５）の合成
Ａｃ−Ｄ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｏｒｎ（Ｂｏｃ）−ＯＭｅ（１２）：ピペリジン（２.５ｍＬ、２５.２ミリモル）を、１１（１２.０ｇ、１６.８ミリモル）の窒素雰囲気下の０℃での無水ＴＨＦ（２５０ｍＬ）中にて十分に攪拌した懸濁液に添加し、その得られた混合物を外界温度で攪拌させた。ＴＬＣにより示されるように、反応は１６時間後に完了した。過剰量の溶媒を減圧下で除去し、粗製物の塊を得た。こうして得られた粗製物の塊を３％ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３を用いる塩基性アルミナフラッシュカラムに付して精製し、遊離アミンの中間体（６.５ｇ）を得た。そのアミン（６.５ｇ）を無水ＴＨＦ（２５０ｍＬ）に溶かし、反応物を０℃に冷却し、そのフラスコに塩化アセチル（１.１ｍＬ、１５.８ミリモル）およびＮ,Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（３.７ｍＬ,１５.８ミリモル）を添加し、攪拌を１６時間続け、その後でＴＬＣにより示されるように反応が完了していることが判明した。該反応混合物を氷水（２５０ｍＬ）に注ぎ、粗生成物をＥｔＯＡｃ（２ｘ３００ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせ、ブラインで洗浄し、乾燥させ（無水Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し、濾液を減圧下で蒸発させて粗残留物を得、それを３％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２を用いるシリカゲル（６０−１２０メッシュ）カラムに付して精製し、１２（６.０ｇ、８５％）を白色の固体として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  ８.５１（ｍ，１Ｈ）、８.１３（ｔ，Ｊ＝９.６Ｈｚ，２Ｈ）、７.９４（ｄ，Ｊ＝７.５Ｈｚ，１Ｈ）、６.７８（ｂｓ，１Ｈ）、４.４７（ｍ，１Ｈ）、４.３５−４.０９（ｍ，４Ｈ）、３.５８（ｓ，３Ｈ）、２.８５（ｍ，３Ｈ）、２.５８（ｍ，１Ｈ）、１.８３（ｓ，６Ｈ）、１.６７−１.５２（ｍ，３Ｈ）、１.３６（ｍ，１Ｈ）、１.３５（ｓ，９Ｈ）、１.２０（ｄ，Ｊ＝６.８Ｈｚ， ３Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  １７２.８、１７２.７、１７０.５、１７０.３、１６９.９、１５６.０、７７.９、５２.７、５２.２、４８.４、３３.０、２８.７、２８.６、２６.３、２３.０、２２.９、１８.６；ＭＳ  ＥＳＩ（ｍ／ｚ）、Ｃ２２Ｈ４０Ｎ５ＯＯ８Ｓとして、［Ｍ＋Ｈ］＋  計算値：５３３.８、測定値：５３３.８；ＨＰＬＣ純度：９９.９％
【０１１２】
実施例１０
（７Ｓ,１０Ｒ,１３Ｒ）−７−アセトアミド−１３−（３−（tert−ブトキシカルボニルアミノ）プロピル）−１０−メチル−２,８,１１−トリオキソ−５−チア−３,９,１２−トリアザテトラデカン−１４−オイック酸：化合物１３（配列番号：３）の合成
Ａｃ−Ｄ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｏｒｎ（Ｂｏｃ）−ＯＨ（１３）：１２（６.０ｇ、１１.６４ミリモル）のＴＨＦ：水（１：１）の混合液（２０ｍＬ）中の十分に攪拌されている溶液に、１Ｎ  ＬｉＯＨ（１３.５ｍＬ、１３.５ミリモル）を０℃で添加し、得られた溶液をその同じ温度で４時間攪拌させた。ＴＬＣにより示されるように反応が完了した後、反応混合物のｐＨを約３にまで落とし、水相をＥｔＯＡｃで３回抽出した（３ｘ３００ｍＬ）。有機層を合わせ、ブラインで洗浄し、乾燥（無水Ｎａ２ＳＯ４）させ、濾過し、こうして得られた濾液を減圧下で蒸発させて粗残留物を得、それを５％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２を用いるシリカゲル（６０−１２０メッシュ）カラムに付して精製し、１３（３.５ｇ、６０％）をオフホワイトの固体として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  １２.５４（ｂｓ，１Ｈ）、８.５３（ｔ，Ｊ＝５.７Ｈｚ，１Ｈ）、８.１１（ｄ，Ｊ＝８.１Ｈｚ，１Ｈ）、８.０１（ｄｄ，Ｊ＝２１.５、７.５Ｈｚ，２Ｈ）、６.８０（ｂｓ，１Ｈ）、４.５１（ｍ，１Ｈ）、４.３５（ｍ，２Ｈ）、４.１５（ｍ，２Ｈ）、２.８９（ｍ，３Ｈ）、２.６０（ｍ，１Ｈ）、１.８６（ｓ，３Ｈ）、１.８５（ｓ，３Ｈ）、１.６８（ｍ，１Ｈ）、１.５４（ｍ，１Ｈ）、１.３８（ｍ，２Ｈ）、１.３７（ｓ，９Ｈ）、１.２３（ｄ，Ｊ＝７Ｈｚ， ３Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  １７３.８、１７２.５、１７０.５、１７０.３、１６９.９、１５６.０、７７.９、６０.２、５２.６、５２.２、４８.４、３３.０、３０.８、２８.８、２８.７、２６.５、２３.０、２２.９、２１.５、２１.２、１８.６；ＭＳ  ＥＳＩ（ｍ／ｚ）、Ｃ２１Ｈ３８Ｎ５Ｏ８Ｓとして、［Ｍ＋Ｈ］＋  計算値：５１９.８、測定値：５１９.８；ＨＰＬＣ純度：９９.９％
【０１１３】
実施例１１
（９Ｒ,１２Ｒ,１５Ｒ,１８Ｒ）−メチル  １８−アミノ−１５−（３−（tert−ブトキシカルボニルアミノ）プロピル）−２,２,１２,２５,２５−ペンタメチル−４,１１,１４,１７,２３−ペンタオキソ−３,２４−ジオキサ−５,１０,１３,１６,２２−ペンタアザヘキサコサン−９−カルボキシラート：化合物１４（配列番号：２）の合成
Ｈ−Ｄ−Ｏｒｎ（Ｂｏｃ）−Ｄ−Ｏｒｎ（Ｂｏｃ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｏｒｎ（Ｂｏｃ）−ＯＭｅ（１４）：Ｚ−Ｄ−Ｏｒｎ（Ｂｏｃ）−Ｄ−Ｏｒｎ（Ｂｏｃ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｏｒｎ（Ｂｏｃ）−ＯＭｅ（９；１.５ｇ）の無水ＴＨＦ（３５ｍＬ）中溶液に、Ｐｄ−Ｃ（２００ｍｇ、活性炭上１０％；湿重量基準）を窒素雰囲気下で添加し、その得られた溶液を水素圧（４０ｐｓｉ）下の外界温度で４時間かき混ぜた。ＴＬＣ（ニンヒドリン溶液に浸し、乾燥させ、加熱した）は反応の完了を示した。反応混合物をセライトのパッドに通し、フィルター上の固体をＴＨＦ（２０ｍＬ）で洗浄し、こうして得られた濾液を減圧下で濃縮し、１４（１.２ｇ；粗製物）を黒色の綿毛のようにフワッとした物質として得、それをさらに精製することなく直ちに用いた。
【０１１４】
実施例１２
（７Ｓ,１０Ｒ,１３Ｒ,１６Ｒ,１９Ｒ,２２Ｒ,２５Ｒ）−メチル  ７−アセトアミド−１３,１６,１９−トリス（３−（tert−ブトキシカルボニルアミノ）プロピル）−１０,２２,３２,３２−テトラメチル−２,８,１１,１４,１７,２０,２３,３０−オクタオキソ−３１−オキサ−５−チア−３,９,１２,１５,１８,２１,２４,２９−オクタアザトリトリアコンタン−２５−カルボキシラート：化合物１５（配列番号：４）の合成
Ａｃ−Ｄ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｏｒｎ（Ｂｏｃ）−Ｄ−Ｏｒｎ（Ｂｏｃ）−Ｄ−Ｏｒｎ（Ｂｏｃ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｏｒｎ（Ｂｏｃ）−ＯＭｅ（１５）：１４（６.５ｇ、７.４１ミリモル）の０℃でのＮ−メチルピロリドン（１００ｍＬ）中の十分に攪拌されている溶液に、ＥＤＣ・ＨＣｌ（１.５５ｇ、８.０８ミリモル）、Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２,３−ジカルボキシイミド・ＨＯＮｂ（１.２ｍｇ、６.７４ミリモル）およびＮ,Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１.４ｍＬ、８.０８ミリモル）を加え、その得られた溶液を外界温度で１６時間攪拌し、その時点で出発物質がすべて変換されたことがＴＬＣにより示された。反応物を攪拌しながら氷冷水（１５０ｍＬ）中に注ぎ、沈殿した固体を濾過し、フィルター上の固体ケーキを冷水で洗浄し、真空下で乾燥させ、粗残留物を得、それを６％ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３を用いるシリカゲル（２３０−４００メッシュ）フラッシュカラムに付して精製し、１５（５.２ｇ、６２％）をオフホワイトの固体として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  ８.５１（ｔ，Ｊ＝５.９Ｈｚ，１Ｈ）、８.１７（ｄｄ，Ｊ＝２１.４、７.４４Ｈｚ，２Ｈ）、８.０２（ｄ，Ｊ＝７.５Ｈｚ，１Ｈ）、７.８９（ｍ，３Ｈ）、７.８４（ｄ，Ｊ＝７.８Ｈｚ，１Ｈ）、６.７９（ｍ，１Ｈ）、６.７４（ｍ，３Ｈ）、４.４８（ｍ，１Ｈ）、４.２９（ｍ，４Ｈ）、４.１３（ｍ，４Ｈ）、３.６２（ｓ，３Ｈ）、２.８８（ｍ，６Ｈ）、２.７１−２.４９（ｍ，４Ｈ）、１.８６（ｓ，６Ｈ）、１.６１（ｍ，８Ｈ）、１.３８（ｍ，８Ｈ）、１.３７（ｓ，３６Ｈ）、１.２（ｍ，６Ｈ）；ＭＳ  ＥＳＩ（ｍ／ｚ）、Ｃ５５Ｈ９９Ｎ１２Ｏ１８Ｓとして、［Ｍ＋Ｈ−Ｂｏｃ］＋  計算値：１１４７.６、測定値：１１４７.６；ＨＰＬＣ純度：９９％；キラル純度：９７％
【０１１５】
実施例１３
（７Ｓ,１０Ｒ,１３Ｒ,１６Ｒ,１９Ｒ,２２Ｒ,２５Ｒ）−７−アセトアミド−１３,１６,１９−トリス（３−（tert−ブトキシカルボニルアミノ）プロピル）−１０,２２,３２,３２−テトラメチル−２,８,１１,１４,１７,２０,２３,３０−オクタオキソ−３１−オキサ−５−チア−３,９,１２,１５,１８,２１,２４,２９−オクタアザトリトリアコンタン−２５−カルボキシアミド：化合物１６（配列番号：１６）の合成
Ａｃ−Ｄ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｏｒｎ（Ｂｏｃ）−Ｄ−Ｏｒｎ（Ｂｏｃ）−Ｄ−Ｏｒｎ（Ｂｏｃ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｏｒｎ（Ｂｏｃ）−ＮＨ２（１６）：１５（５.０ｇ、４.０５ミリモル）の０℃での無水ＭｅＯＨ（２００ｍＬ）中の十分に攪拌されている溶液に、ＮＨ３（ｇ）をニードルアドプターを通して１時間にわたって吹き込み、アンモニアを１２時間毎の間隔で４８時間にわたって連続的にパージした。反応過程中の試料が出発物質が完全に消失したことを示すまで攪拌を続けた。過剰量の溶媒を減圧下で除去し、粗製物の塊を得、それをジエチルエーテル（１００ｍＬ）で洗浄して固体を得た。その粗固体を７％ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３を用いるシリカゲル（６０−１２０メッシュ）カラムに付してさらに精製し、１６（３.６ｇ、７３％）をオフホワイトの固体として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  ８.４９（ｔ，Ｊ＝６.５Ｈｚ，１Ｈ）、８.１３（ｄ，Ｊ＝７.８Ｈｚ，１Ｈ）、８.０１（ｍ，１Ｈ）、７.９２（ｍ，３Ｈ）、７.８１（ｄ，Ｊ＝７.６Ｈｚ，１Ｈ）、７.７０（ｄ，Ｊ＝７.４Ｈｚ，１Ｈ）、７.２４（ｂｓ，１Ｈ）、７.００（ｓ，１Ｈ）、６.７２（ｍ，４Ｈ）、４.４７（ｍ，１Ｈ）、４.３４−４.１０（ｍ，８Ｈ）、２.８７（ｍ，６Ｈ）、２.６０（ｍ，４Ｈ）、１.８６（ｓ，６Ｈ）、１.６５（ｍ，８Ｈ）、１.３６（ｍ，８Ｈ）、１.３４（ｓ，３６Ｈ）、１.２３（ｍ，６Ｈ）；ＭＳ  ＥＳＩ（ｍ／ｚ）、Ｃ５４Ｈ９８Ｎ１３Ｏ１７Ｓとして、［Ｍ＋Ｈ］＋  計算値：１２３３.６、測定値：１２３３.６；ＨＰＬＣ純度：９６.３％；キラル純度：９８％
【０１１６】
実施例１４
（Ｒ）−２−（（７Ｓ,１０Ｒ,１３Ｒ,１６Ｒ）−７−アセトアミド−１３,１６−ビス（３−アミノプロピル）−１０−メチル−２,８,１１,１４−テトラオキソ−５−チア−３,９,１２,１５−テトラアザヘプタデカンアミド）−５−アミノ−Ｎ−（（Ｒ）−１−（（Ｒ）−１,５−ジアミノ−１−オキソペンタン−２−イルアミノ）−１−オキソプロパン−２−イル）ペンタンアミド：化合物１７（配列番号：１７）の合成
Ａｃ−Ｄ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｏｒｎ−Ｄ−Ｏｒｎ−Ｄ−Ｏｒｎ−Ｄ−Ａｌａ−Ｏｒｎ−ＮＨ２（１７）：１６（１.５ｇ、１.２１ミリモル）の５Ｎ  ＨＣｌ／ＥｔＯＡｃ（１５ｍＬ）中の攪拌されている溶液に、トリイソプロピルシラン（１.２ｍＬ、６.０ミリモル）を窒素雰囲気下にて０℃ないし外界温度で添加した。反応過程中の試料をＬＣＭＳ分析に付すことで示されるように、Ｂｏｃの脱保護を１時間で完全に終えた。過剰量の溶媒をデカントし、固形残渣をジエチルエーテルで洗浄して粗アミンを得、それをさらに精製することなく、次の工程に適用した。ＭＳ  ＥＳＩ（ｍ／ｚ）  Ｃ３４Ｈ６６Ｎ１３Ｏ９Ｓとして、［Ｍ＋Ｈ］＋  計算値：８３２.８、測定値：８３２.８
【０１１７】
実施例１５
Ａｃ−Ｄ−Ｃｙｓt（Ａｃｍ）−Ｄ−Ａｌａ−［Ｄ−Ａｒｇ（ジ−tert−ブチルカルボキシグアニニル）３]−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｒｇ（ジ−tert−ブチルカルボキシグアニニル）−ＮＨ２：化合物１８（配列番号：１８）の合成
Ａｃ−Ｄ−Ｃｙｓt（Ａｃｍ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｒｇ（Ｂｏｃ）２−Ｄ−Ａｒｇ（Ｂｏｃ）２−Ｄ−Ａｒｇ（Ｂｏｃ）２−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｒｇ（Ｂｏｃ）２−ＮＨ２（１８）：粗製１７（９２０ｍｇ）のＭｅＯＨ（８ｍＬ）および水（２ｍＬ）の混合液中の十分に攪拌されている溶液に、（Ｚ）−tert−ブチル  （１Ｈ−ピラゾール−１−イル）メチレンジカルバマート（２.０６ｇ、６.６３ミリモル）およびＮ,Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（３.８ｍＬ、２２.１３ミリモル）を外界温度で添加し、その中身を外界温度で１２時間攪拌し、その後で反応過程中の試料をＬＣＭＳ分析に付すことで反応の終了したことが示された。過剰量の溶媒を減圧下で除去して粗材料を得、それをＥｔＯＡｃ（３００ｍＬ）に溶かし、その溶液を冷水およびブラインで洗浄し、乾燥（無水Ｎａ２ＳＯ４）させ、濾過し、このようにして得られた濾液を減圧下で濃縮して粗製物の塊を得、それを７０％ＥｔＯＡｃ／石油エーテルを用いるシリカゲル（２３０−４００メッシュ）フラッシュカラムに付して精製し、１８（６８０ｍｇ、３１％）をオフホワイトの固体として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  １１.５０（ｓ，４Ｈ）、８.５０（ｔ，Ｊ＝６.４Ｈｚ，１Ｈ）、８.２７（ｍ，４Ｈ）、８.１３（ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ，１Ｈ）、８.０６−７.９５（ｍ，５Ｈ）、７.７４（ｄ，Ｊ＝７.９Ｈｚ，１Ｈ）、７.２９（ｓ，１Ｈ）、７.０５（ｓ，１Ｈ）、４.４６（ｍ，１Ｈ）、４.３４−４.１２（ｍ，８Ｈ）、３.２６（ｍ，８Ｈ）、２.８５（ｍ，１Ｈ）、２.６５（ｍ，１Ｈ）、１.８６（ｓ，６Ｈ）、１.６５（ｍ，８Ｈ）、１.５０（ｍ，８Ｈ）、１.４６（ｓ，３６）、１.３９（ｓ，３６Ｈ）、１.２１（ｍ，６Ｈ）；ＭＳ  ＥＳＩ、Ｃ７８Ｈ１３８Ｎ２１Ｏ２５Ｓとして、［Ｍ＋Ｈ］＋  計算値：１８０１.１、測定値：１８０１.６；ＨＰＬＣ純度：９４.９％；キラル純度：９８％
【０１１８】
実施例１６
エテルカルセチド：化合物２０の合成
エテルカルセチド：２０℃のバイアル中の１８（０.１８０ｇ、０.１ミリモル）のＤＣＭ（２.０ｍＬ）懸濁液に、ＴＦＡ（２.０ｍＬ）を加え、その中身を一夜放置した（中身は均一な溶液となった）。反応の終了を示すＬＣＭＳ（ｍ／２＝５００.２）が質量分析法により観察された。反応混合物を減圧蒸留に供し、油性残留物を得、それを水に溶かし、凍結乾燥させて生成物１９（配列番号：５）のＴＦＡ塩を泡沫体（０.１６３ｇ）として得た。ＴＦＡ塩の理論的な量は０.１４７ｇであり、その余分な質量は、凍結乾燥されたケーキ中に尚も存在する、水（吸湿性）による可能性がある。この材料をさらに精製することなく次の工程に用いた。最後から２番目の１９のＴＦＡ塩（０.０６８g, ０.０６８ミリモル）のＭｅＯＨ（１ｍＬ）中懸濁液に、ＤＩ水（１ｍＬ）を添加し、その中身を放置して溶液を形成させた（長期にわたる超音波処理の後であっても、粒子のいくらかは不溶性のままであった）。この混合物に、システイン・塩酸塩・水和物（０.０１５ｇ、１.２５当量）およびヨウ素（０.０２２g、１.２５当量）を添加し、中身を超音波処理に付してヨウ素を溶かした。中身を室温で放置し、ＬＣ−ＭＳ（水／ＡＣＮ（１／１）を用いて５０μＬを１ｍＬに希釈した）でモニター観察した。１０分での試料は何ら生成物の形成を示さず、１時間、３時間および４時間での試料は、出発材料が存在しながらも、二重荷電イオンとしての生成物の形成を示した。中身を一夜放置し、試料のデータ分析は出発材料がいくらか混合物中になおも存在することを示した。その中身に、アンバーライトＩＲＮ（ＣＩ形態）樹脂を添加し、１時間放置した。褐色がかった色の大部分が樹脂に移行し、中身を細かなフリットを通して濾過して無色の溶液を得、それを凍結乾燥させて褐色の残留物を得た。エテルカルセチド（２０）の形成がＬＣ−ＭＳにより主生成物として確認された。その生成物はさらに精製されなかった。
【０１１９】
実施例１７
Ｚ−Ｄ−Ａｌａ−ＯＳｕ（２２）の調製
Ｚ−Ｄ−Ａｌａ−ＯＳｕ（２２）：Ｚ−（Ｄ）Ａｌａ−ＯＨ（５１.８ｇ）およびＳｕｃＯＨ（１.０５当量、３０.３ｇ）２１をアセトニトリル（５６０ｍｌ）に溶かし、その溶液を０℃に冷却した。ＤＣＣ（５４.６ｇ、１.１当量）をアセトニトリル（８０ｍｌ）に溶かし、ゆっくりと添加した。添加から３０分経過した後、その溶液を室温にした。一夜放置した後、ＨＰＬＣによれば変換は＞９９％であった。ＤＣＵ副生成物を濾過で除去し、そのケーキをアセトニトリルで洗浄した（２ｘ２５０ｍｌ）。濾液および洗浄液を合わせ、減圧下で濃縮し、溶液（質量：５７３ｇ）を得た。この溶液に、ｉＰｒＯＨ（１９２０ｍｌ）を加え、その混合物を４℃で一夜冷却した。得られた結晶を濾別し、ＩＰＡで洗浄した（２ｘ１６５ｍＬ）。一夜乾燥させた後、２２（６５ｇ）を単離した（ＨＰＬＣ純度：１００％ＲＳ（下記のクロマトグラム）、収率：８５％）
【０１２０】
実施例１８
Ｈ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｒｇ−ＮＨ２・２ＨＣｌ（２５）の調製
Ｈ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｒｇ−ＮＨ２・２ＨＣｌ（２５）：Ｈ−（Ｄ）Ａｒｇ−ＮＨ２（１９.４g、７５ミリモル）２３のジメチルアセトアミド（３５０ｍｌ）中懸濁液に、ＤＩＰＥＡ（９.７ｇ、１当量）を、つづいてＺ−（Ｄ）Ａｌａ−ＯＳｕ２２（２７.５ｇ、１.１当量、８２.５ミリモル）を室温で添加した。１.５時間経過した後、９５％が変換され、その混合物を水（１１２０ｍｌ）で希釈した。Ｚ−（Ｄ）Ａｌａ−ＯＳｕおよびＺ−（Ｄ）Ａｌａ−ＯＨ（活性化エステルの加水分解により形成）を除去するために、この溶液を酢酸エチル（６２５ｍｌ）で２回洗浄した。得られた水相のｐＨをＮａ２ＣＯ３（２８.１ｇ、３.５４当量）を用いて１０.８８に調整し、ナトリウムテトラフェニルボラート（ＮａＴＰＢ）（２９ｇ、１.１当量）を添加した。これによりガム状の沈殿物を得、それにジクロロメタン（１２５０ｍｌ）を添加して溶かした。この操作により、ＴＰＢ塩として形成されたジペプチドの有機相における選択的抽出が可能となる。得られた水相を、７.２および２.４ｇのＮａＴＰＢを添加した後、ジクロロメタン（５００ｍｌ）で２回再び抽出した。最終の水相にて、１.３％の生成物が失われた（ＨＰＬＣで評価した）。有機相を合わせ、容量を１５００ｍｌまで濃縮し、ついで水（１１００ｍｌ）で２回洗浄した。洗浄した有機層を濃縮し、溶媒をメタノールに交換し、溶液（３０８ｇ）を得た。濃縮の際に形成された固体（ＨＰＬＣ分析によれば、ペプチドを含有しない、ＴＰＢの塩）を濾過で除去した。次の工程で、テトラフェニルボラートをクロリドと交換するために、該溶液を強塩基性アニオン交換樹脂（アンバーライトＩＲＡ９５８  Ｃｌ形態）で処理した。この操作は、一部にて、バッチ反応において、ガラスカラムで行われた。テトラフェニルボラートを除去するのに合計で６７６ｇ（９当量）の樹脂が必要とされた（ＨＰＬＣでモニター観察された）。樹脂をメタノールで洗浄してペプチドを回収した。得られた溶液を濃縮して溶液（３６０ｇ、Ｚ−（Ｄ）Ａｌａ−（Ｄ）Ａｒｇ−ＮＨ２２４を含有する）（ＨＰＬＣによれば９３.８面積％）とした。
【０１２１】
この溶液に、Ｐｄ／Ｃペースト（５％；８ｇ）を加え、水素気体を室温で該溶液に通気した。４時間後、脱保護が完了していることが判明した。触媒を濾別し、４Ｎ  ＨＣｌ／ジオキサン（１９.７ｇ、１当量）を添加し、ついで該溶液を真空下で濃縮した。メタノールを除去した時点で、残りの水（アニオン交換樹脂に存在する残留水に由来する）をアセトニトリル（合計で約２Ｌを供給バッチに添加）との共沸蒸留を通して取り除く。乾燥の間に固体が形成され、最初はガム状で、さらに乾燥させると、それは結晶となった。その固体を濾過で単離し、真空下の４５℃で乾燥させた。２５（１９.７ｇ）が得られた（収率７１.９％）。
【０１２２】
実施例１９
Ｈ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｒｇ−ＮＨ２・２ＨＣｌ（２８）の合成
Ｈ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｒｇ−ＮＨ２・２ＨＣｌ（２８）：Ｚ−Ｄ−Ａｒｇ−ＯＨ２６（１６.１５g、５２.７ミリモル）の室温でのＤＭＡｃ（１７０ｍｌ）中懸濁液に、４Ｎ  ＨＣｌ／ジオキサン（１３.７ｇ、１当量、５２.７ミリモル）を添加した。この清澄溶液をＮ２雰囲気下にて−１５℃に冷却し、冷却する間にＤＩＰＥＡ（６.８ｇ、１当量）およびピリジン（４.２ｇ、１当量）を加えた。塩化ピバロイル（６.３２ｇ、５２.７ミリモル、１当量）を添加することで活性化がなされた。活性化から５分経過後、２５（１９.１g、５２.７ミリモル、１当量）のＤＭＡｃ（１３２ｍｌ）中溶液をＤＩＰＥＡ（６.５ｇ、滴定による測定によれば０.９７当量）と一緒に０℃に冷却して添加した。反応混合物を室温までの加温に供し、３０分経過した後に反応は完了していると考えられた。混合物を炭酸ナトリウム（１４.７ｇ、３.５４ミリモル）を含有する脱塩水（７８０ｍｌ）で希釈し、ｐＨを１０.６とした。ナトリウムテトラフェニルボラート（ＮａＴＰＢ、４０.６３ｇ）（２.２当量）を添加した。この操作によりガム状の沈殿物を得、ジクロロメタン（８７０ｍｌ）を添加することでそれを溶かした。この操作により、ＴＰＢ塩として形成されたトリペプチドの有機相での選択的抽出が可能となった。得られた水相を、ＮａＴＰＢ（１２.６ｇ）を添加した後、ジクロロメタン（４００ｍｌ）で１回再抽出した。最終の水相において、２.５％の生成物が失われた（ＨＰＬＣにより評価した）。有機相を合わせ、１０００ｍｌの容量に濃縮し、ついで水（７５０ｍｌ）で洗浄した。洗浄した有機層を濃縮し、メタノールへの溶媒交換を実施し、溶液（１９８ｇ）を得た。濃縮の際に形成された固体（ＨＰＬＣ分析によれば、ペプチドを含有しない、ＴＰＢの塩）を濾過で除去した。ここで、イオン交換はベンジルトリエチルアンモニウムクロリド（１７ｇ、１.４当量）を０℃で添加することで行われた。形成されたベンジルトリエチルアンモニウムテトラフェニルボラートはメタノールに沈殿し、ペプチドのクロリド塩は溶液中に留まった。濾過した後、固体をメタノール（１３０ｍｌ）で洗浄した。母液を濃縮して溶液（４１９ｇ）を得た。四級アンモニウム塩として沈殿しなかったＴＰＢ（約１０％）を除去するために、該溶液をアンバーライトＩＲＡ９５８Ｃｌ（５２０ｇ、１０当量）で処理した。その樹脂をメタノールで洗浄し、ペプチドを回収した。得られた溶液を濃縮して４１９ｇ（２７を含有する）とした。この溶液に、Ｐｄ／Ｃペースト（２.８ｇ、５％）を添加し、水素気体を室温にて該溶液に通気した。１時間後、触媒を濾別し、母液を真空下で濃縮した。メタノールを除去した時点で、残りの水（アニオン交換樹脂に存在する残留水に由来する）をアセトニトリル（合計で約１Ｌを供給バッチに添加）との共沸蒸留を通して取り除く。乾燥の間に固体が形成され、最初はガム状で、さらに乾燥させると、それは結晶となった。その固体を濾過で単離し、真空下の４５℃で乾燥させた。粉末（１７.２２ｇ）が得られた（ＨＰＬＣ純度９５.５％ＲＳ、収率５３％）。
【０１２３】
実施例２０
Ｈ−（Ｄ）Ａｒｇ−（Ｄ）Ａｒｇ−（Ｄ）Ａｌａ−（Ｄ）Ａｒｇ−ＮＨ２・４ＨＣｌ（３０、配列番号：１０）の合成
Ｈ−（Ｄ）Ａｒｇ−（Ｄ）Ａｒｇ−（Ｄ）Ａｌａ−（Ｄ）Ａｒｇ−ＮＨ２・４ＨＣｌ（３０）：Ｈ−（Ｄ）Ａｒｇ−（Ｄ）Ａｌａ−（Ｄ）Ａｒｇ−ＮＨ２・２ＨＣｌ２８（１６.６g、２７ミリモル）およびＺ−Ａｒｇ−ＯＨ２６（９.６ｇ、３０.５ミリモル、１.１３当量）をＤＭＡ（２８５ｍｌ）に懸濁させ、４Ｎ  ＨＣｌ／ジオキサン（５.４ｇ、トリペプチドの滴定により決定されたとすると０.７７当量）をＨＯＢｔ（４.２ｇ）と一緒に添加した。懸濁液を４０℃に加熱して溶液を得、その後でそれを０℃に冷却した。エチルジイソプロピルカルボジイミド・塩酸塩（ＥＤＣ）（５.９６ｇ、１.１４当量）を２回に分けて３０分間にわたって添加した。そのＥＤＣが可溶化された時点で、該溶液を室温までの加温に供し、一夜放置した。変換は＞９０％に達し、その溶液を炭酸ナトリウム（１０.１ｇ、３.５４当量）を含有する脱塩水（４００ｍｌ）で希釈してｐＨを１０.８８とした。ナトリウムテトラフェニルボラート（ＮａＴＰＢ）（２９.６ｇ、３.１当量）を添加した。この操作はガム状物の沈殿を誘導し、その沈殿物はジクロロメタン（４５０ｍＬ）を添加することで溶解された。
この操作により、ＴＰＢ塩として形成されたテトラペプチドの有機相での選択的抽出が可能となった。得られた水相を、ＮａＴＰＢ（２.１ｇ）を添加した後、ジクロロメタン（２００ｍｌ）で１回再抽出した。最終の水相において、３％の生成物が失われた（ＨＰＬＣにより評価した）。有機相を合わせ、水（４００ｍｌ）で２回洗浄した。洗浄した有機層を濃縮し、メタノールへの溶媒交換を実施し、溶液（１９３ｇ）を得た。該溶液をアンバーライトＩＲＡ９５８Ｃｌ形成樹脂（７１５ｇ、２６当量）で処理した。その樹脂をメタノールで洗浄し、ペプチドを回収した。得られた溶液を濃縮して溶液（２４８ｇ、２９（Ｚ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｒｇ−ＯＨ・２ＨＣｌ、配列番号：１２）を含有する）とした。この溶液に、Ｐｄ／Ｃペースト（２.９ｇ、５％）を添加し、水素気体を室温にて該溶液に通気した。１時間後、脱保護は完了し、触媒を濾別し、濾液を真空下で濃縮し、つづいて４Ｎ  ＨＣｌ／ジオキサン（７ｇ、１当量）を添加した。メタノールを除去した時点で、残りの水（アニオン交換樹脂に存在する残留水に由来する）をアセトニトリル（合計で約１.１Ｌを供給バッチに添加）との共沸蒸留を通して取り除く。乾燥の間に固体が形成され、最初はガム状で、さらに乾燥させると、それは結晶となった。その固体を濾過で単離し、真空下の４５℃で乾燥させた。３０（１８.１ｇ）が得られた（ＨＰＬＣ純度９４.１％ＲＳ（下記のクロマトグラム）収率７４.５％、エナンチオマー純度の測定用の試料をＣＡＴに送った）。
【０１２４】
実施例２１
Ｚ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｒｇ−ＯＨ・ＨＣｌ（３２）の合成
Ｚ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｒｇ−ＯＨ・ＨＣｌ（３２）：Ｈ−（Ｄ）Ａｒｇ−ＯＨ３１（９.６ｇ、５５ミリモル）を脱塩水（１６０ｍｌ）に溶かし、そしてＺ−（Ｄ）Ａｌａ−ＯＳｕ２２（１９.９ｇ、１.１当量）をアセトニトリル（２９２ｍｌ）に別個に溶かした。後者の溶液を室温で前者に添加した。活性なエステルが消費（カップリングまたは加水分解）された時点で、反応混合物を脱塩水（１００ｍｌ）で希釈し、アセトニトリルを真空下で蒸留して除去し、溶液（３２０ｇ）を得た。該溶液を１.２Ｎ  ＨＣｌでｐＨ２.５の酸性にし、（Ｚ−Ｄ−Ａｌａ−ＯＨを取り除くために）ＥｔＯＡｃ（２７５ｍｌ）で２回洗浄した。その後で、水相から、ペプチドを、各々、２８５、２７５および２２０ｍｌの２−ＢｕＯＨで抽出した。有機層を合わせ、減圧下で濃縮し、共沸蒸留を通して乾燥させた。合計で２.５Ｌの２−ＢｕＯＨが供給バッチに加えられた。その濃縮された溶液（１２１ｇ）に、酢酸イソプロピル（４３７ｍｌ）を添加し、沈殿を生じさせた。解放されたＳｕｃＯＨを出来るだけ多く取り除くために、固体を濾過し、ｉＰｒＯＡｃ（２２０ｍｌ）で２回トリチュレートした。最後に、固体をｉＰｒＯＨ（１００ｍｌ）に再び溶かし、ジイソプロピルエーテル（５００ｍｌ）中に沈殿させて固体を得た。濾過し、ジイソプロピルエーテル（１００ｍｌ）で洗浄した後、固体を真空下で乾燥させ、３２（１８ｇ）を得た（ＨＰＬＣ純度：９８.３％（下記のクロマトグラム）、収率７３％）。
【０１２５】
実施例２２
Ｈ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｒｇ−ＯＨ・ＨＣｌ（３３）の合成
Ｈ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｒｇ−ＯＨ・ＨＣｌ（３３）：Ｚ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｒｇ−ＯＨ３２（１８g、３８ミリモル）をＭｅＯＨ（２３０ｍｌ）＋水（７５ｍｌ）に溶かした。Ｐｄ／Ｃペースト（２.５ｇ、５％）を添加し、水素気体を室温で該溶液を介して通気した。１.５時間後、脱保護反応は完了し、０.４５μフィルターを用いる濾過で触媒を除去し、ＭｅＯＨ（４６ｍｌ）で洗浄した。ペプチド溶液を真空下で濃縮し、アセトニトリルを供給バッチに添加することにより（４ｘ２５０ｍｌ）共沸蒸留に付して水を除去する。蒸留する間に、脱保護されたジペプチドが出てくる。最後に、得られた懸濁液を濃縮して１８９ｇとし、濾別してアセトニトリルで洗浄する。４５℃で一夜乾燥させた後、白色の粉末（１１.２ｇ）を得る（ＨＰＬＣ純度：９７.４％ＲＳ（下記のクロマトグラム）、収率：９１.３％）。
【０１２６】
実施例２３
Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｒｇ−ＯＨ・ＨＣｌ（３５、配列番号：１９）の合成
Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｒｇ−ＯＨ・ＨＣｌ（３５）（配列番号：１９）：Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ３４（９.６ｇ、１.０当量）およびＨＯＮｂ（Ｎ−ヒドロキシノルボルネン）（３.２ｇ、１.０５当量）をＤＭＦ（１４ｍｌ）に室温にて溶かした。この混合物をｉ−ＰｒＯＡｃ（５０ｍｌ）で希釈し、０℃に冷却した。ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ、３.７ｇ）をｉ−ＰｒＯＡｃ（４ｍｌ）に溶かし、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨを含有する溶液に添加した。ＤＣＣを添加する際に、反応混合物を室温にまで加温させ、２時間攪拌した。２時間後（変換率＞９６％）、ＤＣＵを濾過で取り除き、ｉ−ＰｒＯＡｃ（２０ｍｌ）で洗浄した。この溶液に、Ｈ−（Ｄ）Ａｌａ−（Ｄ）Ａｒｇ−ＯＨ３３（６.０ｇ、１.１当量）およびＤＩＰＥＡ（２.４ｍｌ、１.０９当量）のＤＭＦ（４０ｍｌ）および脱塩水（２４ｍｌ）中溶液に室温で添加した。一夜反応させた後、Ｆｍｏｃ−（Ｄ）Ｃｙｓ（ｔｒｔ）−ＯＮｂは完全に消費され、その混合物をｉ−ＰｒＯＡｃ（２００ｍｌ）、水（２００ｍｌ）およびジクロロメタン（２００ｍｌ）で希釈した。相分離の後、水相を捨て、有機相を脱塩水（３５０ｍｌ）で、つづいて２（ｗ／ｖ）％ＮａＣｌ溶液で洗浄した。有機層を真空下で濃縮し、ジクロロメタンを除去すると固体が出現した。この固体を濾過し、ＨＰＬＣは主たる不純物としてＦｍｏｃ−（Ｄ）Ｃｙｓ（ｔｒｔ）−ＯＨを示した。この沈殿操作を繰り返した場合（３ｘ）、その中身は約２％まで減少させることが可能であった。乾燥後、固体（１３.９ｇ）を得た（ＨＰＬＣ純度：９５％ＲＳ（下記のクロマトグラム）、収率９６％）。
【０１２７】
実施例２４
Ａｃ−Ｄ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｒｇ−ＯＨ（３６、配列番号：９）の合成
Ａｃ−Ｄ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｒｇ−ＯＨ（３６）（配列番号：９）：Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｃｙｓ（ｔｒｔ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｒｇ−ＯＨ・ＨＣｌ（３５）（８.６５ｇ、９.８ミリモル、１.０当量）をＭｅＯＨ（８０ｍｌ）に懸濁させ、ピペリジン（６.８ｇ、８当量）を室温で徐々に添加した。変換率が＞９７％であった場合に、該溶液をメチルtert-ブチルエーテル（ＭＴＢＥ、６００ｍｌ）に加えた。沈殿物を濾別し、ＭＴＢＥ（８０ｍｌ）で洗浄し、真空下、４５℃で一夜乾燥させた。Ｈ−Ｄ−Ｃｙｓ（ｔｒｔ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｒｇ−ＯＨ（化合物３８、６.２ｇ）を白色の粉末として得た（９４.５％ＲＳ（ＨＰＬＣ方法１、下記のクロマトグラム）、収率：９５.４％）。
【０１２８】
Ｈ−Ｄ−Ｃｙｓ（ｔｒｔ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｒｇ−ＯＨ３８（６.０ｇ、９.１ミリモル、１.０当量）をジクロロメタン（７５ｍｌ）に溶かした。４Ｎ  ＨＣｌ／ジオキサン（７９２μｌ、滴定により測定した場合に０.３４８当量）を、つづいてアセチル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＡｃＯＳｕ）（３.４ｇ、２.４当量）を室温で３回に分けて添加した。反応を促進させるために、ＤＩＰＥＡを添加することでそのｐＨを３.５から６に上げた。この操作はペプチドのゲル化をもたらした（ほとんどの両性イオン形態はジクロロメタンに可溶ではない）。ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ、１５ｍｌ）を添加し、ジクロロメタンを除去して溶液を得た。９８％の変換率が得られるまで（４８時間）反応を続け、次にｉ−ＰｒＯＡｃ（３５０ｍｌ）で沈殿させた。その固体を濾過し、ｉ−ＰｒＯＡｃ（８５ｍｌ）で洗浄した。固体をＭｅＯＨ（９０ｍｌ）に溶かし、ｉ−ＰｒＯＡｃ（２００ｍｌ）中に再び沈殿させた。濾過後、該固体を真空下４５℃で一夜乾燥させ、３６（５ｇ）を白色の粉末として得た（９８.２％ＲＳ（ＨＰＬＣ方法１）、収率：８７.３％）。ＨＰＬＣ方法１に相当するＨＰＬＣ条件：メルク・クロモリス（Merck Chromolith）ＲＰ  Ｃ１８−ｅ（１００ｍｍｘ４.６ｍｍ）移動相Ａ：水＋０.１％ＴＦＡ：移動相Ｂ：アセトニトリル＋０.１％ＴＦＡ；カラム温度：４０℃；流速：４ｍｌ／分；ＵＶ（２２０ｎｍ）；勾配：２％Ｂで開始、８分間で２から７３.３％Ｂとする。
【０１２９】
実施例２５
Ａｃ−Ｄ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｒｇ−ＮＨ２・４ＨＣｌ（３７、配列番号：１１）の合成
Ａｃ−Ｄ−Ｃｙｓ（ｔｒｔ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｒｇ−ＮＨ２・４ＨＣｌ（３７、配列番号：１１）：Ａｃ−（Ｄ）−Ｃｙｓ（ｔｒｔ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｒｇ−ＯＨ（３６、７.９g、１２.０ミリモル）、Ｈ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｒｇ−ＮＨ２・４ＨＣｌ（３０、１１.０ｇ、１.００５当量）およびＨＯＰＯ（２−ヒドロキシピリジン−Ｎ−オキシド、１.４０ｇ、１.０５当量）をＤＭＡ（１３０ｍｌ）に懸濁させ、溶けるまで攪拌させた（一夜）。溶解の際に、反応混合物を氷浴で冷却し、ＥＤＣ・ＨＣｌ（２.４ｇ、１.０３当量）を添加した。８時間反応させた後、ＤＩＰＥＡ（７８μｌ、０.１当量）を加え、反応を促進させた。反応の開始から２４時間経過した後、温度を２０℃に上げた。ＤＯＰＥＡ（３８２μｌ、０.２当量）を２回に分けて、ならびにＥＤＣ・ＨＣｌ（１１７ｍｇ、０.０５当量）を添加し、反応を終えた。９６％の変換率が得られた際に（４８時間）、ペプチドをアセトニトリル（１１００ｍｌ）に沈殿させ、濾別し、アセトニトリル（１２５０ｍｌ）で洗浄した。真空下、４５℃で一夜乾燥させた後、粗製３７（１７.３ｇ）を白色の粉末として得た（８６.７％ＲＳ（ＨＰＬＣ方法２））。ＨＰＬＣ方法２の条件：カラム：ゾルバックス（Zorbax）ＳＢ−Ｃ１８（１５０ｍｍｘ４.６ｍｍ、３.５μ）移動相Ａ：水＋２０ｍＭペンタフルオロプロピオン酸（ＰＥＰＡ）  移動相Ｂ：アセトニトリル＋２０ｍＭペンタフルオロプロピオン酸（ＰＥＰＡ）；カラム温度：４０℃；流速：１.５ｍｌ／分；２２０ｎｍのＵＶ；勾配：２％Ｂで開始し、２０分間で２から９１.１％Ｂとする。その粗ペプチドを分取規模の逆相ＨＰＬＣで精製し、ＨＰＬＣにより９９面積％以上で６４％の所望のペプチドを得た。ＨＰＬＣ条件：カラム：ダイソパック（Daisopak）ＳＰ−１２０−２５−ＯＤＳ−ＲＰＳ  ２０ｘ２５０ｍｍ、移動相Ａ：水中１％ＨＯＡｃ、移動相Ｂ：アセトニトリル中１％ＨＯＡｃ；流速：１９ｍｌ／分；勾配：５％Ｂで１分間、２０分間で５−２５％Ｂとし、１分間で２５−９０％Ｂとし、９０％Ｂで５分間洗浄する；試料：４２ｇ／Ｌ  Ａｃ−（Ｄ）Ｃｙｓ（ｔｒｔ）−（Ｄ）Ａｌａ−（Ｄ）Ａｒｇ−（Ｄ）Ａｒｇ−（Ｄ）Ａｒｇ−（Ｄ）Ａｌａ−（Ｄ）Ａｒｇ−ＮＨ２・４ＨＣｌ  ８８％ＲＳのＨＰＬＣ純度；注入容量：３ｍｌフラクション（０.７５分間）
【０１３０】
実施例２６
エテルカルセチド（化合物２０）の合成
エテルカルセチド：Ａｃ−（Ｄ）Ｃｙｓ（ｔｒｔ）−（Ｄ）Ａｌａ−（Ｄ）Ａｒｇ−（Ｄ）Ａｒｇ−（Ｄ）Ａｒｇ−（Ｄ）Ａｌａ−（Ｄ）Ａｒｇ−ＮＨ２・４ＨＣｌ（３７、配列番号：１１、１.０ｇ、０.６４ミリモル）を水（９５ｍｌ）に溶かし、Ｈ−Ｃｙｓ（ｔｒｔ）−ＯＨ（２.４ｇ、１０当量）を添加した。その溶液のｐＨを水性ＨＣｌを用いて２.８５に調整し、これによりＨ−Ｃｙｓ（ｔｒｔ）−ＯＨの溶解を助けた。ＭｅＯＨ中ヨウ素の２％溶液を合計で約１０当量が添加されるまで少しずつ（およそ１時間毎に）加えた。一夜反応させた後、出発材料は完全に消費され、メタノールおよびアセトニトリルを蒸発により除去した。沈殿したトリチル誘導体（分解生成物）をＭＴＢＥで抽出することで除去した。粗エテルカルセチド（５.９ｇ／Ｌ）を含有する得られた水溶液（約６０ｍｌ）をさらに精製した（６０％ＲＳ（ＨＰＬＣ方法２）、収率５３％（ＨＰＬＣアッセイによる評価））。分取クロマトグラフィーに付した後、フラクションを単離し、＞９５％ＲＳ（ＵＰＬＣ）を＞９０％の収率で得た。ＵＰＬＣ条件：カラム：ウォーターズ・アクワイティ（Waters ACQUITY）ＵＰＬＣ  ＨＳＳ  Ｔ３カラム（１００Å、１.８μ、２.１ｘ１５０ｍｍ）  移動相Ａ：３％アセトニトリル中０.１％ＴＦＡ：移動相Ｂ：３０％アセトニトリル中０.１％ＴＦＡ；カラム温度：４５℃；流速：０.２５ｍｌ／分；ＵＶ（２２０ｎｍ）；勾配：１分間０％Ｂとし、２３分間で０から３４％Ｂとし、９分間で３４から７０％Ｂとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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