(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生きている真核細胞において環状ｍＲＮＡを製造するためのベクターであって、相互に動作可能に結合され且つ以下の順序で配置された次の要素を含むベクター：
ａ）ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、
ｂ）自己環化イントロンの５’スプライス接合、
ｃ）ＩＲＥＳ、
ｄ）任意の５’ＵＴＲ、
ｅ）ＯＲＦを前記ベクターに挿入するためのマルチクローニング挿入部位、
ｆ）３’ＵＴＲ、
ｇ）ポリＡトラクト、
ｈ）自己環化イントロンの３’スプライス接合、及び
ｉ）ＲＮＡポリメラーゼターミネーター。
【請求項２】
請求項１に記載のベクターであって、前記ＲＮＡポリメラーゼプロモーター及びターミネーターが、Ｔ７ウイルス、Ｔ６ウイルス、ＳＰ６ウイルス、Ｔ３ウイルス、またはＴ４ウイルス由来であるベクター。
【請求項３】
請求項１に記載のベクターであって、前記３’ＵＴＲは、ヒトβグロビン、ヒトαグロビン、アフリカツメガエルβグロビン、アフリカツメガエルαグロビン、ヒトプロラクチン、ヒトＧＡＰ−４３、ヒトｅＥＦｌａｌ、ヒトτ（タウ）、ヒトＴＮＦα、デングウイルス、ハンタウイルス小ｍＲＮＡ、ブンヤナウイルス小ｍＲＮＡ、カブ黄斑モザイクウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、風疹ウイルス、タバコモザイクウイルス、ヒトＩＬ−８、ヒトアクチン、ヒトＧＡＰＤＨ、ヒトチューブリン、ハイビスカス萎黄病輪点ウイルス、ウッドチャック肝炎ウイルス翻訳後調節要素、シンドビスウイルス、カブクリンクルウイルス、タバコエッチウイルス、またはベネズエラウマ脳炎ウイルスに由来するベクター。
【請求項４】
請求項１に記載のベクターであって、前記５’ＵＴＲが、ヒトβグロビン、アフリカツメガエルβグロビン、ヒトαグロビン、アフリカツメガエルαグロビン、風疹ウイルス、タバコモザイクウイルス、マウスＧｔｘ、デングウイルス、熱ショックタンパク質７０ｋＤａタンパク質１Ａ、タバコアルコールデヒドロゲナーゼ、タバコエッチウイルス、カブクリンクルウイルス、またはアデノウイルストリパータイトリーダーに由来するベクター。
【請求項５】
請求項１に記載のベクターであって、前記ポリＡトラクトは、前記３’ＵＴＲの後、且つ、前記３’スプライス接合の前に位置し、前記ポリＡトラクトは、少なくとも３０ヌクレオチド長であるベクター。
【請求項６】
請求項１に記載のベクターであって、前記ポリＡトラクトは、前記３’ＵＴＲの後、且つ、前記３’スプライス接合の前に位置し、前記ポリＡトラクトは、少なくとも６０ヌクレオチド長であるベクター。
【請求項７】
請求項１に記載のベクターであって、前記ＩＲＥＳは、タウラ症候群ウイルス、サシガメ属ウイルス、タイラー脳脊髄炎ウイルス、シミアンウイルス４０、フシアリ類インビクタウイルス１、ムギクビレアブラムシ（Ｒｈｏｐａｌｏｓｉｐｈｕｍ  ｐａｄｉ）ウイルス、細網内皮症ウイルス、ヒトポリオウイルス１、プラウチア・スタリ（Ｐｌａｕｔｉａ  ｓｔａｌｉ）腸ウイルス、カシミール蜂ウイルス、ヒトライノウイルス２、Ｈｏｍａｌｏｄｉｓｃａ  ｃｏａｇｕｌａｔａウイルス−１、ヒト免疫不全ウイルス１型、Ｈｏｍａｌｏｄｉｓｃａ  ｃｏａｇｕｌａｔａウイルス−１、ヒメトビ（Ｈｉｍｅｔｏｂｉ）Ｐウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、肝炎ＧＢウイルス、口蹄疫ウイルス、ヒトエンテロウイルス７１、馬鼻炎ウイルス、ウスジロエダシャク（Ｅｃｔｒｏｐｉｓ  ｏｂｌｉｑｕａ）ピコルナ様ウイルス、脳心筋炎ウイルス、ショウジョウバエＣウイルス、ヒトコクサッキーウイルスＢ３、アブラナ科トバモウイルス、コオロギ麻痺病ウイルス、ウシウイルス性下痢ウイルス１、ブラッククイーンセルウイルス、アブラムシ致死麻痺ウイルス、トリ脳脊髄炎ウイルス、急性ミツバチ麻痺ウイルス、ハイビスカス萎黄病輪点ウイルス、ブタコレラウイルス、ヒトＦＧＦ２、ヒトＳＦＴＰＡ１、ヒトＡＭＬ１／ＲＵＮＸ１、ショウジョウバエ・アンテナペディア、ヒトＡＱＰ４、ヒトＡＴ１Ｒ、ヒトＢＡＧ−１、ヒトＢＣＬ２、ヒトＢｉＰ、ヒトｃ−ＩＡＰｌ、ヒトｃ−ｍｙｃ、ヒトｅＩＦ４Ｇ、マウスＮＤＳＴ４Ｌ、ヒトＬＥＦ１、マウスＨＩＦ１α、ヒトｎ．ｍｙｃ、マウスＧｔｘ、ヒトｐ２７ｋｉｐｌ、ヒトＰＤＧＦ２／ｃ−ｓｉｓ、ヒトｐ５３、ヒトＰｉｍ−１、マウスＲｂｍ３、ショウジョウバエリーパー（ｒｅａｐｅｒ）、犬Ｓｃａｍｐｅｒ（Canine  Scamper）、ショウジョウバエＵｂｘ、ヒトＵＮＲ、マウスＵｔｒＡ、ヒトＶＥＧＦ−Ａ、ヒトＸＩＡＰ、ショウジョウバエ無毛、出芽酵母（Ｓ．  Ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＴＦＩＩＤ、出芽酵母（Ｓ．  Ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＹＡＰ１、ヒトｃ−ｓｒｃ、ヒト−ＦＧＦ−１、シミアンピコルナウイルス、カブクリンクルウイルス、またはｅＩＦ４Ｇに対するアプタマーに由来する、ベクター。
【請求項８】
請求項１に記載のベクターであって、更に、前記環状ｍＲＮＡに転写する際にｅＩＦ４Ｅに結合するＲＮＡ配列を含むベクター。
【請求項９】
請求項８に記載のベクターであって、ｅＩＦ４Ｅに結合する前記ＲＮＡ配列は、マウスヒストンＨ４、ヒトサイクリンＤ１、エンドウ隆起生長モザイクウイルスＲＮＡ２、キビモザイクウイルス、またはｅＩＦ４Ｅに対するＲＮＡアプタマーに由来する、ベクター。
【請求項１０】
請求項１に記載のベクターであって、前記ＩＲＥＳは、追加の開始因子の動員、リボソームサブユニット結合、リボソームシャント、リボソーム塩基対形成、またはリボソーム転位を容易にする第二のＩＲＥＳと組み合わせされるベクター。
【請求項１１】
請求項１に記載のベクターであって、自己環化触媒イントロンは、グループＩイントロンまたはグループＩＩイントロンであるベクター。
【請求項１２】
請求項１に記載のベクターであって、更に、メイソンファイザーモンキーウイルス構成的輸送要素（ＣＴＥ）、４Ｅ−ＳＥ要素、ウッドチャック肝炎ウイルス後調節要素、Ｂ型肝炎ウイルス後調節要素、またはＨＩＶのｒｅｖ応答要素から選択される核輸送要素を含むベクター。
【請求項１３】
請求項１に記載のベクターであって、前記ＩＲＥＳが配列番号３を含んでいるベクター。
【請求項１４】
エクスビボの生きている真核細胞において環状ｍＲＮＡを製造する方法であって、リボヌクレオチド三リン酸、無機ピロホスファターゼ、ＲＮａｓｅインヒビター、及びＲＮＡポリメラーゼを、適切な反応バッファー中において、請求項１に記載のベクターに加えるステップと、前記ベクターからＲＮＡを転写するステップと、前記転写されたＲＮＡを自己環化させて環状ｍＲＮＡを製造するステップとを含んでなる方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法であって、前記リボヌクレオチドは、修飾リボヌクレオチドｍ５Ｃ、ｍ５Ｕ、ｍ６Ａ、ｓ２Ｕ、Ψ、または２’−Ｏ−メチル−Ｕを含む方法。
【請求項１６】
エクスビボの生きている真核細胞において環状ＲＮＡを製造する方法であって、請求項１に記載のベクター、及びファージポリメラーゼまたはファージポリメラーゼをコードする核酸を真核細胞の中にトランスフェクトするステップと、前記細胞内で前記ベクターの転写を可能にして、転写されたＲＮＡを製造するステップと、前記転写されたＲＮＡの自己環化を可能にして環状ｍＲＮＡを製造するステップとを含んでなる方法。
【請求項１７】
環状ｍＲＮＡを製造する方法であって、請求項１に記載のベクターをエクスビボの真核細胞の中にトランスフェクトするステップであって、前記ベクターはホスト細胞ＲＮＡポリメラーゼによって転写されるステップを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
先行関連出願
本願は、２０１３年５月１５日に出願されたＵＳ仮出願６１／８２３，７０９による優先権を主張するものであり、これを全ての目的で、明示的に本明細書の一部として援用する。
連邦に講演された研究の陳述
【０００２】
適用なし。
【０００３】
この開示は一般に、真核細胞の内部で翻訳できる環状ＲＮＡを含んだ生物学的産物に関する。本発明は、コードされたポリペプチドの向上した翻訳及び発現を容易にするＲＮＡ要素の新規な組み合わせを記載するものであり、また環状ｍＲＮＡを作製するためのベクター、並びに該環状ｍＲＮＡ及び／またはベクターを使用する種々の応用を提供する。
【背景技術】
【０００４】
「遺伝子治療」とは、疾患を治療するための薬剤としてのＤＮＡの使用である。その名称は、ＤＮＡが疾患を治療するための療法として、患者の細胞内遺伝子を補充または変更できるという思想に由来する。遺伝子治療の最も一般的な形態は、突然変異した非機能的遺伝子を置換するために、機能的な治療用遺伝子をコードするＤＮＡを使用することを含んでいる。
【０００５】
初期の臨床的失敗が、遺伝子治療を過剰宣伝であるとして捨て去るように多くの人を導いたが、臨床的成功は、今や遺伝子治療の将来性における新たな楽観主義を勇気付けている。これには、網膜疾患のレーバー先天性黒内障、Ｘ連鎖重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）、アデノシンデアミナーゼＳＣＩＤ（ＡＤＡ−ＳＣＩＤ）、副腎白質ジストロフィー、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、多発性骨髄腫及びパーキンソン病を有する患者の治療成功が含まれる。これら最近の臨床的成功は、遺伝子治療における新たな関心を導いており、科学出版物及び大衆出版物の幾つかの記事は、この分野での継続的な投資を呼びかけている。
【０００６】
ＲＮＡはアンチセンス及びｓｉＲＮＡに基づく療法において使用されてはきたが、ＤＮＡに対するｍＲＮＡの使用は、遺伝子療法において潜在的な利点を提供するにもかかわらず、これまでｍＲＮＡ自身が遺伝子療法に用いられることはなかった。例えば、ｍＲＮＡにコードされるタンパク質は全ての細胞で発現されるので、プロモーターの選択は問題にはならない。挿入突然変異は生じ得ないので、当該方法の安全性を増大させ、また発現の一過的性質は多くの適用において有利である。ＤＮＡの制限とは対照的に、興味対象の遺伝子は、分裂中または非分裂中の細胞で容易に発現させることができる。
【０００７】
しかしながら、ｍＲＮＡには、それが種々の治療方法において成功裏に使用される前に、克服すべきかなりの技術的困難が存在する。
【０００８】
例えば、脂質、電気穿孔、及び他の方法を用いてｍＲＮＡをトランスフェクトすることは、加えられたＲＮＡを異物として認識するトール様受容体に媒介された、炎症性免疫反応をもたらす。この認識は分泌されるインターフェロンを導き、またｍＲＮＡの反復トランスフェクションが試みられるときは、最終的にはアポトーシスにより細胞死が起きる。
【０００９】
最近のブレークスルーは、生来の免疫応答を回避することを可能にし、この最初のハードルを克服する方法を提供する。この戦略は、トール様受容体に結合することができない修飾ヌクレオチドをＲＮＡに組み込んで、炎症性免疫応答を防止するものである（例えば、ＵＳ８２７８０３６、ＵＳ２０１０００４７２６１、ＵＳ２０１２０３２２８６４）。従って、少なくとも１つの課題は、ＲＮＡに基づく治療技術を実現するための挑戦において克服された。
【００１０】
もう一つの困難は、インビトロでの転写を介して完全かつ活性なｍＲＮＡを産生することであった。更に、得られるｍＲＮＡは、開始及び翻訳のために必要なすべての特徴を有していなければならず、また内因性ｍＲＮＡに対して効果的に競合できなければならない。従って、現在の技術における完全なｍＲＮＡは、真核細胞によって産生される標準的なｍＲＮＡ分子を模倣するために、５’ｃａｐまたはｃａｐアナログ、５’ＵＴＲ、ＯＲＦ、３’ＵＴＲ、及びポリアデニル化テールを必要とする。幾つかの例では、５’ｃａｐは省略されてＩＲＥＳ配列が利用されるが、これは遥かに非効率的であり、ＲＮＡの５末端が保護されていない直鎖ＲＮＡ分子の半減期を減少させる。同様に、ポリアデニル化テールを省略できるが、直鎖ｍＲＮＡ分子の低下した翻訳効率及び半減期を伴う。
【００１１】
しかしながら、おそらく最大の障害は、ｍＲＮＡの取り扱いが困難なことである。ＲＮＡは、末端ヌクレオチドの五炭糖環に二つの隣接ペンダント水酸基を有しており、これによって、塩基または水中及び殆どの表面に常に存在するＲＮＡｓｅによる求核攻撃を非常に受け易くなっている。ｍＲＮＡの産生及びその結果物の保存のためにはＲＮＡｓｅフリーの試薬が使用されるが、そのような技術をもってしても、分解に対する極端な感受性は、ＲＮＡに基づく技術を実行する際にかなりの困難を提示する。更にもう一つの障害は、細胞の内部ではｍＲＮＡの半減期が短いことである。メッセンジャーＲＮＡは、細胞内部では、一般に６〜１２時間程度の一過性発現しか与えない。
【００１２】
環状ＲＮＡ分子は、任意のエキソヌクレアーゼ活性または求核攻撃に対して本来的に耐性があるので、それらの直鎖状の対応物よりもはるかに長い半減期を有することが、文献において広く認識されている。従って、環状ＲＮＡの使用は、これら分解の問題を両方とも解決することができる。実際に、生体内における環状ＲＮＡの半減期は、アフリカツメガエル胚において４０時間よりも長いと推定された。これと同じ系において、直鎖ｍＲＮＡは６〜８時間の半減期を有していた。大腸菌においてさえ、活発に翻訳されている環状ＲＮＡは、ＲＮａｓｅＥ活性に対する耐性に起因して、その直鎖状対応物よりも４〜６倍以上安定していた。
【００１３】
また、シャイン・ダルガノ配列がリボソームを動員するために原核生物には必要であり、直鎖状かまたは環状かに拘わらず、何れかのＲＮＡ分子へのリボソームの動員を媒介できることが知られている。しかし、環状ＲＮＡは、もともと真核生物のリボソームには結合できないと考えられていた。幸運なことに、チェン（Ｃｈｅｎ；１９９５）は、環状ｍＲＮＡが、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）の存在下において真核生物リボソームに結合できることを実証した。
【００１４】
チェンは、この目的のためにピコルナウイルスＩＲＥＳ配列を利用して、インビトロでのウサギ網状赤血球系における翻訳を立証した。その戦略の主な目的は、環状ＲＮＡ分子の周囲での連続翻訳を介して、ポリマータンパク質の開発応用に焦点を当てることであった。これを生じさせるために、彼らは、リボソームがＲＮＡ分子の脱落信号を発しないように、終止コドンを除去した。このような構築物では、ＩＲＥＳ部位及びコード配列のみがｍＲＮＡ分子中に存在し、ＵＴＲ、ポリＡトラクト、終止部位等の他の信号は欠落していた。
【００１５】
要約すると、真核生物については、環状ｍＲＮＡ発現系は、ウサギ網状赤血球においてのみインビトロで立証されており、この系は、そうでなけれｃａｐ配列またはＩＲＥＳ配列を伴わない直鎖状鋳型上でさえも、何らかのレベルのバックグラウンド翻訳をバイアスしている。真核細胞内において、インビボで翻訳する環状ｍＲＮＡの能力についてのデータは提示されておらず、また原核生物における結果は失望させるものであった。細胞内のインビボ翻訳系に適用するためには、翻訳開始因子について天然の細胞ｍＲＮＡとの競合に成功することを可能にするために、多くの改変が環状ｍＲＮＡに必要とされる。
【００１６】
サルノウ（Ｓａｒｎｏｗ）及びチェンの特許（ＵＳ５７６６９０３）は、目的の遺伝子と共に、ＩＲＥＳを環状ＲＮＡの中に挿入することを権利主張している。しかしながら、この特許は、インビボでの翻訳のために、環状ＲＮＡ分子中に他の調節要素が必要であることを記載していない。実際、特許または刊行文献には、正常な細胞内における環状ｍＲＮＡの翻訳を実証するデータはない。ＩＲＥＳ要素との相乗効果で機能するポリアデニル化配列、または３’ＵＴＲ挿入についての議論は存在しない。更に、環状ｍＲＮＡにおいて、改善された翻訳を有する新規なＩＲＥＳ要素は提案されなかった。
【００１７】
更に、インビトロまたはインビボにおいて、環状ｍＲＮＡの有用性を実証した追跡報告は、文献には殆どなかった。最近の一つの研究では、インビトロのウサギ網状赤血球系において、ＳＰ−Ａ１・ＩＲＥＳを備えた環状ｍＲＮＡ鋳型が、翻訳を指示できることが示された（Ｗａｎｇ；２００９）。しかし、インビトロでの環状ＲＮＡの翻訳効率は、ＩＲＥＳを備えたキャップされていない直鎖ＲＮＡの１５％であった。同じ実験において、キャップされた直鎖ＲＮＡは、キャップされていない直鎖ＲＮＡの活性の１３１％の活性を有していた。これは、ウサギ網状赤血球系が、如何にして、キャップされていない転写物を超生理学的な翻訳レベルへとバイアスするかを強調していた。
【００１８】
更なる種々の特許が、環状ｍＲＮＡに関係している。しかしながら、これらの特許は、環状ｍＲＮＡ分子の実際のインビボ翻訳の証拠を提供できていない。先行技術の例には、ＵＳ５７６６９０３、ＵＳ６２１０９３１、ＵＳ５７７３２４４  ＵＳ５５８０８５９、ＵＳ２０１００１３７４０７、ＵＳ５６２５０４７、ＵＳ５７１２１２８  ＵＳ２０１１０１１９７８２が含まれる。従って、おそらく、真核生物におけるインビボ発現のために環状ｍＲＮＡを使用する可能性を認識してはいても、そのような適用は実際には実施可能ではなかった。
【００１９】
このように、当該技術において必要とされるのは、完全に実施可能になっており、且つインビボまたはエクスビボの真核系で動作することが示されている環状ｍＲＮＡを、製造及び使用する方法である。
【開示の概要】
【００２０】
本開示は、真核細胞内で効果的に翻訳できる環状ｍＲＮＡ分子、並びにこれを製造及び使用する方法に関し、また環状ｍＲＮＡを製造するために使用されるベクターに関する。
【００２１】
好ましい使用には、例えば治療または有用なタンパク質のバイオ生産のための、哺乳類細胞または動物への環状ｍＲＮＡ分子の投与が含まれる。この方法は、リボヌクレアーゼ及び塩基に対する耐性に起因して、直鎖ＲＮＡよりも長い半減期で、真核細胞内での望ましいポリペプチドの製造を提供することにおいて有利である。
【００２２】
当該環状ｍＲＮＡは、そのままトランスフェクトすることができ、または所望によりＤＮＡベクターの形態でトランスフェクトして、細胞中で転写することができる。細胞の転写は、添加されたポリメラーゼまたはこれをコードする核酸を使用することができ、或いは、好ましくは内因性ポリメラーゼを使用することができる。我々は、Ｔ７ポリメラーゼを加えてここでの概念の立証を示したが、これは例示のみであり、より便利な細胞に基づくポリメラーゼが好ましいかもしれない。
【００２３】
真核細胞における環状ｍＲＮＡの好ましい半減期は、ハイブリダイゼーション実験または定量的ＲＴ−ＰＣＲにより測定されたときに、少なくとも２０時間、３０時間、更には少なくとも４０時間である。
【００２４】
本発明の好ましい実施形態は、ＩＲＥＳ、５’ＵＴＲ、目的のコード配列、３’ＵＴＲ及びポリアデニル化配列をこの順序で備えた環状ｍＲＮＡ分子からなっている。これらＲＮＡ要素と、翻訳増強特性及び相乗作用を備えたこれらのＲＮＡ要素の多くの異なる組み合わせを作出できることは良く理解されている。このような組み合わせには、ＩＲＥＳ−ＯＲＦ−３’ＵＴＲ−ポリＡ、ＩＲＥＳ−ＯＲＦ−３’ＵＴＲ、ＩＲＥＳ−５’ＵＴＲ−ＯＲＦ−３’ＵＴＲ等が含まれるが、がこれらに限定されない。
【００２５】
本発明の一つの実施形態は、修飾されたＲＮＡのヌクレオチドを有する環状ＲＮＡ分子からなっている。可能な修飾リボヌクレオチド塩基には、５−メチルシチジン及びシュードウリジンが含まれる。これらのヌクレオチドは、更なる安定性及び免疫活性化に対する耐性を提供する。
【００２６】
本発明のもう一つの実施形態は、目的の環状ｍＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ鋳型のインビトロ転写からなっている。ＲＮＡ分子の両末端における反転イントロン自己スプライシング配列は、如何なる追加の酵素も必要とせずに、当該環状ＲＮＡの形成を容易にする。
【００２７】
本発明の追加の実施形態は、細胞内での環状ｍＲＮＡの製造を含んでおり、これは細胞質内ではバクテリオファージＲＮＡポリメラーゼによって、または核内では宿主ＲＮＡポリメラーゼＩＩによってＤＮＡ鋳型を転写オフにすることができる。
【００２８】
本発明の一実施形態は、環状ｍＲＮＡ分子によりコードされるポリペプチドが生体内で発現されるように、環状ｍＲＮＡ分子のヒトまたは動物への注射からなっている。該ポリペプチドは、細胞内に存在させるか、または分泌させることができる。
【００２９】
本発明のもう一つの実施形態では、環状ｍＲＮＡは、目的の所望のポリペプチドを発現させるために、組織培養中の細胞内にトランスフェクトすることができる。特に、環状ｍＲＮＡは、目的の細胞における細胞内タンパク質及び膜タンパク質を発現することができる。
【００３０】
本発明は、以下の特徴の１以上を、そのすべての可能な組み合わせで含んでいる：
【００３１】
−環状ｍＲＮＡを製造するためのベクターであって、相互に動作可能に結合され且つ以下の順序で配置された次の要素を含むベクター：ａ）ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、ｂ）自己環化イントロンの５’スプライス接合、ｃ）ＩＲＥＳ、ｄ）任意の５’ＵＴＲ、ｅ）ＯＲＦを前記ベクターに挿入するためのマルチクローニング挿入部位、ｆ）３’ＵＴＲ、ｇ）任意のポリＡトラクト、ｈ）自己環化イントロンの３’スプライス接合、及びｉ）任意のＲＮＡポリメラーゼターミネーター。
【００３２】
−前記ＲＮＡポリメラーゼプロモーター及びターミネーターが、Ｔ７ウイルス、Ｔ６ウイルス、ＳＰ６ウイルス、Ｔ３ウイルス、またはＴ４ウイルス由来であるベクター。
【００３３】
−前記３’ＵＴＲは、ヒトβグロビン、ヒトαグロビン、アフリカツメガエルβグロビン、アフリカツメガエルαグロビン、ヒトプロラクチン、ヒトＧＡＰ４３、ヒトｅＥＦｌａｌ、ヒトτ（タウ）、ヒトＴＮＦα、デングウイルス、ハンタウイルス小ｍＲＮＡ、ブンヤナウイルス小ｍＲＮＡ、カブ黄斑モザイクウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、風疹ウイルス、タバコモザイクウイルス、ヒトＩＬ−８、ヒトアクチン、ヒトＧＡＰＤＨ、ヒトチューブリン、ハイビスカス萎黄病輪点ウイルス、ウッドチャック肝炎ウイルス翻訳後調節要素、シンドビスウイルス、カブクリンクルウイルス、タバコエッチウイルス、またはベネズエラウマ脳炎ウイルスに由来するベクター。
【００３４】
−前記５’ＵＴＲが、ヒトβグロビン、アフリカツメガエルβグロビン、ヒトαグロビン、アフリカツメガエルαグロビン、風疹ウイルス、タバコモザイクウイルス、マウスＧｔｘ、デングウイルス、熱ショックタンパク質７０ｋＤａタンパク質１Ａ、タバコアルコールデヒドロゲナーゼ、タバコエッチウイルス、カブクリンクルウイルス、またはアデノウイルストリパータイトリーダーに由来するベクター。
【００３５】
−前記ポリＡトラックは、少なくとも３０ヌクレオチド長または少なくとも６０ヌクレオチド長であるベクター。
【００３６】
−前記ＩＲＥＳは、タウラ症候群ウイルス、サシガメ属ウイルス、タイラー脳脊髄炎ウイルス、シミアンウイルス４０、フシアリ類インビクタウイルス１、ロパロシフムｐａｄｉウイルス（Ｒｈｏｐａｌｏｓｉｐｈｕｍ  ｐａｄｉ  ｖｉｒｕｓ）、細網内皮症ウイルス、ヒトポリオウイルス１、プラウチア・スタリ（Ｐｌａｕｔｉａ  ｓｔａｌｉ）腸ウイルス、カシミール蜂ウイルス、ヒトライノウイルス２、ホマロディスカ（Ｈｏｍａｌｏｄｉｓｃａ）凝固ウイルス−１、ヒト免疫不全ウイルス１型、ホマロディスカ凝固ウイルス−１、ヒメトビ（Ｈｉｍｅｔｏｂｉ）Ｐウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、肝炎ＧＢウイルス、口蹄疫ウイルス、ヒトエンテロウイルス７１、馬鼻炎ウイルス、エクトロピスオブリカ（Ｅｃｔｒｏｐｉｓ  ｏｂｌｉｑｕａ）ピコルナ様ウイルス、脳心筋炎ウイルス、ショウジョウバエＣウイルス、ヒトコクサッキーウイルスＢ３、アブラナ科トバモウイルス、クリケット麻痺ウイルス、ウシウイルス性下痢ウイルス１、ブラッククイーンセルウイルス、アブラムシ致死麻痺ウイルス、トリ脳脊髄炎ウイルス、急性ミツバチ麻痺ウイルス、ハイビスカスクロロ輪点ウイルス、ブタコレラウイルス、ヒトＦＧＦ２、ヒトＳＦＴＰＡ１、ヒトＡＭＬ１／ＲＵＮＸ１、ショウジョウバエ・アンテナペディア、ヒトＡＱＰ４、ヒトＡＴ１Ｒ、ヒトＢＡＧ−１、ヒトＢＣＬ２、ヒトＢｉＰ、ヒトｃ−ＩＡＰｌ、ヒトｃ−ｍｙｃ、ヒトｅＩＦ４Ｇ、マウスＮＤＳＴ４Ｌ、ヒトＬＥＦ１、マウスＨＩＦ１α、ヒトｎ．ｍｙｃ、マウスＧｔｘ、ヒトｐ２７ｋｉｐｌ、ヒトＰＤＧＦ２／ｃ−ｓｉｓ、ヒトｐ５３、ヒトＰｉｍ−１、マウスＲｂｍ３、ショウジョウバエ刈り取り（ｒｅａｐｅｒ）、犬疾走（Canine  Scamper）、ショウジョウバエＵｂｘ、ヒトＵＮＲ、マウスＵｔｒＡ、ヒトＶＥＧＦ−Ａ、ヒトＸＩＡＰ、ショウジョウバエ無毛、Ｓ．セレビシエＴＦＩＩＤ、Ｓ．セレビシエＹＡＰ１、ＷＯ０１５５３６９、タバコエッチウイルス、カブクリンクルウイルス、またはｅＩＦ４Ｇに対するアプタマーに由来するベクター。
【００３７】
−環状ｍＲＮＡに転写する際にｅＩＦ４Ｅに結合し、ＩＲＥＳ要素として機能するＲＮＡ配列を含むベクター。
【００３８】
−ｅＩＦ４Ｅに結合する前記ＲＮＡ配列は、マウスヒストンＨ４、ヒトサイクリンＤ１、エンドウ隆起生長モザイクウイルスＲＮＡ２、キビモザイクウイルス、またはＲＮＡアプタマー由来のｅＩＦ４Ｅであるベクター。
【００３９】
−前記ＩＲＥＳは、追加の開始因子の動員、リボソームサブユニット結合、リボソームシャント、リボソーム塩基対形成、またはリボソーム転移を容易にする第二のＩＲＥＳと組み合わせされるベクター。
【００４０】
−自己環化触媒イントロンは、グループＩイントロンまたはグループＩＩイントロンであるベクター。
【００４１】
−メイソンファイザーモンキーウイルス構成的輸送要素（ＣＴＥ）、４Ｅ−ＳＥ要素、ウッドチャック肝炎ウイルス後調節要素、ｂ型肝炎ウイルス後調節要素、またはＨＩＶのｒｅｖ応答要素から選択される核輸送要素を含むベクター。
【００４２】
−前記ＩＲＥＳが配列番号３を含んでいるベクター。
【００４３】
−環状ｍＲＮＡを製造する方法であって、リボヌクレオチド三リン酸、無機ピロホスファターゼ、ＲＮａｓｅインヒビター、及びＲＮＡポリメラーゼを、適切な反応バッファー中において、ここに記載したベクターに加えるステップと、前記ベクターからＲＮＡを転写するステップと、前記転写されたＲＮＡを自己環化させて環状ｍＲＮＡを製造するステップとを含んでなる方法。
【００４４】
−ここに記載した方法であって、前記リボヌクレオチドは、修飾リボヌクレオチドｍ５Ｃ、ｍ５Ｕ、ｍ６Ａ、ｓ２Ｕ、Ψ、または２’−Ｏ−メチル−Ｕを含む方法。
【００４５】
−環状ｍＲＮＡを製造する方法であって、ここに記載したベクター、及びファージポリメラーゼまたはファージポリメラーゼをコードする核酸を真核細胞の中にトランスフェクトするステップと、前記細胞内で前記ベクターの転写を可能にして、転写されたＲＮＡを製造するステップと、前記転写されたＲＮＡの自己環化を可能にして環状ｍＲＮＡを製造するステップとを含んでなる方法。
【００４６】
−環状ｍＲＮＡを製造する方法であって、ここに記載したベクターを真核細胞の中にトランスフェクトするステップを含み、前記ベクターはホスト細胞ＲＮＡポリメラーゼによって転写される方法。
【００４７】
−ここに記載の何れかの方法またはベクターによって製造された環状ｍＲＮＡ。
【００４８】
−真核細胞中で少なくとも２０時間の半減期、または真核細胞中で直鎖の同じｍＲＮＡの半減期の少なくとも２倍の半減期を有する環状ｍＲＮＡ。
【００４９】
−それを必要とする患者に環状ｍＲＮＡを導入することを含んでなる遺伝子治療の方法。
【００５０】
−それを必要とする患者に、本明細書中に記載のベクターを導入するステップを含んでなる遺伝子治療の方法。
【００５１】
−タンパク質をバイオ製造する方法であって、前記ＯＲＦによりコードされるタンパク質の製造のために、ここに記載したベクターを真核細胞または哺乳類の中に導入するステップを含んでなる方法。
【００５２】
−タンパク質をバイオ製造する方法であって、前記ＯＲＦによりコードされるタンパク質の製造のために、環状ｍＲＮＡを真核細胞または哺乳類の中に導入するステップを含んでなる方法。
【００５３】
ここで「遺伝子」が意味するものは、少なくともプロモーター、ＯＲＦ、及び終止配列、並びに何れか他の所望の発現制御配列を含むＤＮＡ分子である。
【００５４】
「ＯＲＦ」が意味するものは、典型的には目的のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームである。
【００５５】
「インビボ」が意味するものは、細胞内でのｍＲＮＡの翻訳であり、これに対して「インビトロ」翻訳は、真核生物翻訳開始因子、リボソーム、アミノ酸をチャージされたｔＲＮＡ、及びｍＲＮＡを含む生成された成分の混合物が、完全な細胞を伴わずに一緒に混合されるものである。「エクスビボ」は、多細胞生物に由来するが、現在は細胞培養物として増殖される生きた細胞の内部での翻訳を意味する。
【００５６】
「ベクター」または「クローニングベクター」が意味するものは、ウイルス、プラスミド、または高等生物の細胞から採取したＤＮＡの小片であり、安定して生体内に維持することができ、またその中にクローニング及び／または発現のためにその中にＤＮＡ断片を挿入することができるものである。ベクターは、典型的には、複製起点、及び抗生物質耐性またはＧＦＰのような選択マーカーまたはレポーター遺伝子を有し、また通常は複数のクローニング部位を含んでいる。この用語には、プラスミドベクター、ウイルスベクター、コスミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）などが含まれる。
【００５７】
幾つかの実施形態において、該ベクターは宿主ゲノムへの組み込みを可能にする組み込み配列を含むことができ、そのようなことは、増加した安定性の故に細胞ベースのバイオリアクターのために特に好ましい可能性がある。
【００５８】
「発現ベクター」は、ＯＲＦの転写及び翻訳に必要な配列の全てをも含むベクターである。これらには強力なプロモーター、リボソーム結合部位及び開始コドンのような適切な翻訳開始配列、強力な終止コドン、及び転写終止配列が含まれる。原核生物と真核生物の間にはタンパク質合成のための機構の違いがあり、従って、発現ベクターは選択された宿主に適した発現のための要素を持っている必要がある。例えば、真核生物発現ベクターはコザックコンセンサス配列を含むのに対して、原核生物の発現ベクターは、リボソームの結合のための翻訳開始部位にシャイン−ダルガノ配列を有するであろう。
【００５９】
「マルチクローニング部位」または「ＭＣＳ」は、「ポリリンカー」とも呼ばれ、多くの（〜２０以下）の制限部位を含んだ短いＤＮＡセグメントであり、これは加工されたプラスミド及び他のベクターの標準的特徴である。ＭＣＳ内の制限部位は典型的には一意であって、指定されたプラスミド内に一度だけ発生し、従ってベクターに目的のＯＲＦを挿入するために使用することができる。更に、発現ベクターは、正しい挿入部位を選択することによって、ＭＣＳが正確なリーディングフレームでＯＲＦを挿入できるように、及び／または、ユーザがベクターの選択によってリーディングフレームを選択できるように（しばしば、３つの全てのフレームで利用可能である）設計されることが多い。
【００６０】
「アプタマー」とは、特定の標的分子に結合するオリゴ核酸またはペプチド分子である。アプタマーは、通常は大きなランダム配列プールからそれらを選択することにより作製されるが、天然アプタマーもリボスイッチ中に存在する。アプタマーは、基礎研究、並びに高分子薬物のような臨床目的の両方のために使用することができる。アプタマーは、それらの標的分子の存在下で自己切断するように、リボザイムと組み合わせることができる。これらの化合物分子は、研究、工業及び臨床において追加の用途を有している。
【００６１】
より詳細に言えば、核酸アプタマーは、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＸＮＡアプタマーとして分類することができる。それらは、オリゴヌクレオチドの（通常は短い）鎖からなっている。ペプチドアプタマーは、その両端でタンパク質足場に取り付けられた、短い可変ペプチドドメインからなっている。
【００６２】
単語「ａ」または「ａｎ」は、特許請求の範囲または明細書において「含む」の用語と組み合わせて使用するときには、文脈が別途指示しない限り、１以上を意味する。
【００６３】
「約」の用語は、記載された値プラスまたはマイナス測定誤差マージンを意味し、または測定方法が指示されていないときは、プラスまたはマイナス１０％を意味する。
【００６４】
特許請求の範囲における用語「または」の使用は、唯一の選択肢を意味するように明示的に指示されない限り、或いは選択肢が相互に排他的であるならば、「及び／または」意味するように用いられる。
【００６５】
「包含する」、「有する」、「含む」及び「含有する」の用語（及びそれらの変化形）は、オープンエンドの連結動詞であり、特許請求の範囲において使用されるときは、他の要素の追加を許容するものである。
【００６６】
「からなる」の語句はクローズドエンドであり、全ての追加要素を排除するものである。
【００６７】
「本質的にからなる」の語句は、追加の重要な要素を排除するが、使用のための指示書、バッファー等のような発明の性質を本質的に変化させない非実質的な要素を含めることは許容する。
【表１】
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【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】図１は環状ｍＲＮＡ分子を生成するように設計されたベクターを示す。該ベクターはその中に挿入されたＯＲＦと共に示されているが、挿入前にはＭＣＳが代わりに示されるであろう。
【図２】図２は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼに駆動された発現後の、ＨＥＫ細胞における環状ｍＲＮＡの翻訳から生じるＧＦＰレポータータンパク質の画像を示している。
【図３】図３は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼに駆動された発現後の、ＨＥＫ細胞における環状ｍＲＮＡの翻訳から生じるＧＦＰ及びＤＡＰＩ（核染色）画像を示している。
【図４】図４は、配列番号１〜９を示している。配列番号１：Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター（２１塩基対）；配列番号２：５’グループＩイントロン配列（１６７塩基対）；配列番号３：ｅＩＦ４Ｅアプタマー１配列（８６塩基対）；配列番号４：ヒトβグロビン５’ＵＴＲ（５０塩基対）；配列番号５：ヒトβグロビン３’ＵＴＲ（１３３塩基対）；配列番号６：３’グループＩイントロン配列（１０７塩基対）；配列番号７：Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼターミネーター（４７塩基対）；配列番号８：ポリアデニル化配列（３３塩基対）；配列番号９：ＥＭＣＶのＩＲＥＳ（５９３塩基対）。
【図５】図５は、配列番号１０を示している：ｐＢＳＫ−ＣＲ配列＝図５に提供された概略に基づく合成ＤＮＡ配列。目的の遺伝子（ＧＯＩ）は、ＮｃｏＩとＳａｌＩの間にクローニングでき、ｅＩＦ４Ｅアプタマー−βグロビン５’ＵＴＲ−ＧＯＩ−βグロビン３’ＵＴＲ−ポリＡを有する環状ｍＲＮＡとして発現させることができる  。
【図６】図６は、配列番号１１を示している：遺伝子１ＬＧ−ＩＲＥＳ・ＧＦＰを含むキャップされていない直鎖ｍＲＮＡを発現する。
【図７】図７は、配列番号１２を示している：遺伝子２ＣＩ−ＩＲＥＳ・ＧＦＰを含む環状ｍＲＮＡを発現する。
【図８】図８は、配列番号を１３示している：遺伝子３ＣＩＡ−ＩＲＥＳ・ＧＦＰ、βグロビン３’ＵＴＲ及びポリアデニル化配列を含む環状ｍＲＮＡを発現する。
【図９】図９は、配列番号１４を示している：遺伝子４ＥＡ−ｅＩＦ４Ｅアプタマー、βグロビン５’ＵＴＲ、ＧＦＰ、βグロビン３’ＵＴＲ、及びポリアデニル化配列を含む環状ｍＲＮＡを発現する。
【図１０】図１０は、配列番号１５としての一つの例示的ベクター配列を示している：環状ＲＮＡ・ＩＲＥＳ−ＭＣＳ−ＵＴＲ−ポリＡ−ベクターは、ＥＭＣＶ・ＩＲＥＳの後、及びβグロビン３’ＵＴＲ及びポリＡ配列の前にβマルチクローニング部位を含み、マルチリーディングフレーム内での遺伝子挿入を可能にする。発現は環状ｍＲＮＡを生じる。
【発明を実施するための形態】
【００６９】
本開示は、哺乳類細胞の内部で成功裏に翻訳できる環状ｍＲＮＡ、並びにその製造方法、それを製造するためのベクター、及び該ベクターもしくは環状ｍＲＮＡの何れかを使用する方法を記載する。
【００７０】
当該環状ｍＲＮＡは、リボソームを環状ｍＲＮＡに動員するのを補助するために、ＩＲＥＳ及びＯＲＦを超えた追加の領域を特徴とする。前記環状ｍＲＮＡは、ＩＲＥＳ部位、目的のタンパク質のためのＯＲＦ、３’ＵＴＲ、及び任意のポリＡトラックを有している。本発明の幾つかの実施形態では、ＩＲＥＳが如何にして機能するかに応じて、ＩＲＥＳ及び５’ＵＴＲの両方が存在し得る。なお、本質的にＩＲＥＳ配列の広い多様性を考えると、提案ベクトルにおいてこれらＩＲＥＳ配列が置換されるときには、広範囲の翻訳効率が存在するであろうことに留意すべきである。しかし一般には、本発明は、ポリＡテール及び３’ＵＴＲ要素（これらは両者とも翻訳のためのリボソームの動員を補助する）を使用するため、問題のＩＲＥＳの性質にかかわらず、環状ｍＲＮＡ産物の効率を増大させるであろう。
【００７１】
環状ｍＲＮＡが細胞内で効率的に翻訳されるためには、それらは、これもまた翻訳機構を動員する細胞性ｍＲＮＡに対してインビボで競合しなければならない。ＩＲＥＳ配列は、より少ない翻訳開始の要件を有しているが、ｅＩＦ４Ｅ介しての標準的な動員プロセスは、直接の比較ではやはり遥かに効率的にリボソームを動員する。本発明は、ウイルスＩＲＥＳ配列に加えて、ｅＩＦ４Ｅ自体を動員できる環状ｍＲＮＡのためのＩＲＥＳ配列を記載する。
【００７２】
本発明の一つの実施形態において、前記ＩＲＥＳは、グアノシンｃａｐに結合するタンパク質の面についての特異性を備えた、ｅＩＦ４Ｅ（配列番号３）に対するアプタマーである。このアプタマーはＩＲＥＳとして使用されたことはなく、本開示の新規な態様を表す。該アプタマーはｅＩＦ４Ｅに結合し、それによって、細胞性ｍＲＮＡ分子に類似した翻訳開始複合体の残りに結合することができる。翻訳開始を補助することは、３’ＵＴＲ及びポリＡテールの存在であり、本発明のこの実施形態における環状ｍＲＮＡが、細胞性ＲＮＡと全く同じ方法でリボソームを動員できることを意味している。細胞性ＲＮＡは、ＰＡＢＰのｅＩＦ４Ｇタンパク質への物理的結合によって環化されるのに対して、本発明の環状ＲＮＡは、物理的連結によって一緒に保持される。
【００７３】
ｃａｐ非依存性翻訳のためのｅＩＦ４Ｅの動員は、ｅＩＦ４Ｅを、ペプチドタグを介して該タグに特異的に結合するＲＮＡ構造に繋ぐことにより達成できる。これは、ＲＮＡ構造またはアプタマーもしくはステムループが直接ｅＩＦ４Ｅと結合できれば、ｃａｐ非依存性翻訳を達成できるであろうことを示唆している。実際、これは植物ウイルス、エンドウ隆起生長モザイクウイルス（ＰＥＭＶ）について既に観察されている。そのＲＮＡ２分子は、植物のｅＩＦ４Ｅタンパク質に直接結合するＲＮＡシュードノット構造を含んでいる。
【００７４】
ある種の真核生物転写物はまた、その３’ＵＴＲまたはコード配列中の、前記ｃａｐ結合機構とは独立に動作するＲＮＡモチーフを介してｅＩＦ４Ｅタンパク質を動員することができる。このモチーフは４Ｅ感受性要素、または４Ｅ−ＳＥと呼ばれている。４Ｅ−ＳＥの例は、マウスヒストンＨ４・ｍＲＮＡ及びヒトサイクリンＤ１・ｍＲＮＡに見られる。これらのｍＲＮＡにおけるそれらの役割は、核局在化とエクスポートを規制すること、並びに翻訳を修飾することである。環状ｍＲＮＡの目的について、４Ｅ−ＳＥは、ｃａｐとは独立にｅＩＦ４ＥをｍＲＮＡへと同様に動員し、翻訳を刺激するために使用できることが想像できる。
【００７５】
本発明の別の実施形態においては、ＩＲＥＳは細胞ｍＲＮＡ中の配列から取られた４Ｅ−ＳＥ要素であり、これはｅＩＦ４Ｅ要素への直接結合を媒介する。この実施形態では、４Ｅ−ＳＥの下流に５’ＵＴＲまたはＩＲＥＳが加えられてよく、これは非標準翻訳を刺激する方法として分流リボソームを促進する。一例は、マウスＧｔｘ５’ＵＴＲ、または任意のウイルス性もしくは細胞性のＩＲＥＳ配列であろう。
【００７６】
ｅＩＦ４Ｅと結合する４Ｅ−ＳＥ配列を使用する代わりとして、ｅＩＦ４Ｅのｃａｐ結合ポケットに対して向けられたアプタマーが、翻訳を促進する上で、通常のグアノシンｃａｐの効果を複製できるとして提案されている。一例として、ｅＩＦ４Ｅアプタマー配列が配列番号３に与えられている。当技術分野で知られているように、多くの縮重配列のアプタマーが所与のタンパク質に対して生成されることができ、従って、これは一つの例示的配列であるに過ぎない。
【００７７】
同様に、ｅＩＦ４Ｅを介した必要な動員を省略してｅＩＦ４Ｇに直接結合する、新規なＩＲＥＳが開発され得るであろう。この戦略の一例は、翻訳を阻害するがｅＩＦ４Ｇへの強い結合を媒介する、ｅＩＦ４Ｇに対するアプタマーを開発することであろう
【００７８】
新たなＩＲＥＳ配列を利用する以外に、環状ｍＲＮＡ分子に他のＲＮＡ要素を追加することも、細胞内での翻訳を可能にする。例えば、ｃａｐは真核生物の直鎖ｍＲＮＡの翻訳のための重要な構造ではあるが、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ及びポリＡテールもまた、翻訳に重要な役割を果たすことが容易に理解される。
【００７９】
本発明の好ましい実施形態は、アデノシンの約３０リボヌクレオチドの、環状ＲＮＡにおけるポリアデニル化配列を含んでいる。これはヒトポリ（Ａ）結合性タンパク質の単一の複合体に結合することができる。該ポリアデニル化配列は、ＯＲＦ及び３’ＵＴＲの後、並びにスプライス部位及び終止信号の前に配置されるであろう。
【００８０】
ｍＲＮＡのポリアデニル化は、ウイルス性ＩＲＥＳに駆動された発現を増大させることが示されている。環状ｍＲＮＡに追加されたポリＡ配列はまた、ポリＡの５’ＲＮＡリーダーが、翻訳の媒介において開始因子のバイパスを許容できるとの報告に示唆されるように、追加のＩＲＥＳ部位タイプとして機能する可能性がある。
【００８１】
ウイルス性ＩＲＥＳに加えて、細胞のｍＲＮＡもまた、ポリアデニル化テールと共に増加した、それらのＩＲＥＳ配列の翻訳効率を有することができる。ｃ−ｍｙｃ及びＢｉＰのｍＲＮＡのＩＲＥＳ活性は、通常はこのような相互作用を媒介する完全なｅＩＦ４ＧまたはＰＡＢＰがなくとも、ポリＡテールの追加を介して増大することができるであろう。
【００８２】
本発明の一実施形態では、翻訳を媒介するために、本来的に互いに交信する一対のウイルス性５’及び３’ＵＴＲが利用され得るであろう。多くのウイルスの５’及び３’ＵＴＲは、増加した翻訳または翻訳の調節を容易にするために、ＲＮＡ−ＲＮＡまたはＲＮＡ−タンパク質相互作用を介して交信する。これは、前記ＵＴＲの使用を最適化すること、または環化を介して両端を永久に一緒にすることによって、向上した翻訳を導き得る可能性があることを示唆している。本発明の環状ＲＮＡの発明において有用な相乗効果的のＵＴＲの一例は、一緒にＩＲＥＳ活性を有するデングウイルス由来の前記５’及び３’ＵＴＲの対である。
【００８３】
本発明においては、ｍＲＮＡの標準的な構成要素の幾つかを増強するか、または置換する一定のウイルスの３’ＵＴＲの能力もまた提案される。一例として、アンデスハンタウイルスの小ｍＲＮＡの３’ＵＴＲは、機能的にはポリＡテールを置換することができ、またｃａｐ依存性翻訳との相乗効果で作用することができる。
【００８４】
本発明の別の実施形態では、翻訳されるべきポリペプチドの最初のコドンへの、リボソームの送達を容易にする５’ＵＴＲが利用される。下流のＡＵＧコドンへのリボソームテザリング及び送達のメカニズムもまた、環状ｍＲＮＡ分子において有用であろう。このプロセスは、「リボソームシャント」とも称される。シャンティング媒介する配列の例は、ＧｔｘホモドメインｍＲＮＡの５’ＵＴＲ由来のｍＲＮＡ要素（これは１８Ｓ・ｒＲＮＡに対して塩基対形成する）、及びアデノウイルストリパータイトリーダーである。
【００８５】
修飾されたＲＮＡのヌクレオチドは、他の適用の中でもｓｉＲＮＡの設定において、ヌクレアーゼに対する耐性のために多くの注目を集めているが、修飾ＲＮＡヌクレオチドは、翻訳効率及び転写物の半減期において温和な改善生じるに過ぎない。従って、環状ＲＮＡは、今日の他の全ての方法に比較して、最長の転写物半減期を達成する能力において改善を表す一方で、それと同時に、単一のＲＮＡポリメラーゼ酵素だけを必要とする、ｍＲＮＡ製造のための遥かに堅牢で安価な方法を提供する。これは、合計で３酵素反応以下（例えば、ＲＮＡポリメラーゼ、ポリアデニラーゼ、キャッピング酵素）を必要とする、従来技術の他のｍＲＮＡのインビトロ製造プロトコルと比較される。更に、ｃａｐアナログと混合された転写反応からのＲＮＡ収量は、この混合がない場合よりも一般に２〜６倍低く、環状ｍＲＮＡについてのもう一つの製造上の利点を表している。
【００８６】
ここに記載した環状ｍＲＮＡはまた、細胞内においてインビボで製造することができる。環状ｍＲＮＡのインビボ製造のための二つの異なる実施形態がある。第一の実施形態では、ＤＮＡが核に送達されるか、または核に組み込まれる。転写は、当該細胞に対して内因性のＲＮＡポリメラーゼＩＩを動員するプロモーターによって駆動されるであろう。自己スプライシングは核内で起こるであろう。５’ｃａｐは、ｍＲＮＡのエクスポートのために重要であることが示されていることを考えると、環状ｍＲＮＡのエクスポートを増加させるために別の手段を加える必要があるかもしれない。一例は、メイソンファイザーモンキーウイルスの構成的輸送エレメント（ＣＴＥ）、非標準的なｍＲＮＡエクスポートの媒介を補助できるＲＮＡ配列である。
【００８７】
インビボでの環状ｍＲＮＡ生成の他の手段は、細胞内に、例えばＴ７プロモーターを含む直鎖状または環状ＤＮＡをトランスフェクトすることと、例えばＴ７を追加することからなるであろう。Ｔ７ポリメラーゼタンパク質は、プラスミドＤＮＡと共にトランスフェクトすることができ、その後、細胞質中においてベクターＤＮＡ上のＴ７プロモーターに結合し、環状ｍＲＮＡの転写を開始するであろう。この方法の一つの実施形態では、転写カセットはＴ７ターミネーターを欠失していてＲＮＡの連続的なローリングサークル転写を導き、ここではＴ７がＤＮＡ鋳型から解離しない。
【００８８】
他の実施形態では、Ｔ７ＤＮＡまたはＴ７ｍＲＮＡをコードするＤＮＡを細胞に加えて、細胞内のＴ７を製造するための転写及び翻訳を可能にすることができる。もちろん、Ｔ７は単なる例示であり、Ｔ６、Ｔ４、Ｔ３、ＳＰ６、またはＲＮＡポリメラーゼＩ等のような、如何なる類似のＲＮＡポリメラーゼも使用することができる。
【００８９】
環状ＲＮＡを生成するために必要な技術は、以前に文献に記載されている。通常は、Ｔ４バクテリオファージ由来の順序を変えたイントロン−エキソン配列によるグループＩ自己スプライシングが使用される。それはＲＮＡ単独で触媒されるので、この反応は原核細胞、真核細胞において、またはインビトロで生じることができる。しかし、種々の異なる方法が、環状ＲＮＡを合成する方法に関する従来技術に存在する。当該提案の強化された環状ｍＲＮＡ分子は、その製造において、これらの方法（例えば、ＵＳ６２１０９３１、ＵＳ５７７３２４４）の何れかにおいて使用きるであろうことが理解される。
【００９０】
グループＩイントロン自己スプライシング配列の例には、Ｔ４バクテリオファージ遺伝子ｔｄ由来の自己スプライシング並べ替えイントロン−エキソン配列が含まれる。テトラヒメナの介在配列（ＩＶＳ）ｒＲＮＡもまた、グループＩイントロン自己スプライシング配列の例を含んでいる。グループＩ及びグループＩＩの触媒イントロンが自然の中に広範に存在することを考えれば、多くの可能な配列が、環状ＲＮＡを作製するために使用できるであろう
【００９１】
自己スプライシングは、リボザイムを形成する稀少イントロンについて発生し、ＲＮＡのみによってスプライソソームの機能を実行する。３種類の自己スプライシングイントロン、すなわち、グループＩ、グループＩＩ及びグループＩＩＩが存在する。グループＩ及びＩＩイントロンは、如何なるタンパク質も必要とせずに、スプライソソームに類似したスプライシングを実行する。この類似性は、グループＩ及びＩＩイントロンが、スプライソソームに進化的に関連している可能性があることを示唆している。自己スプライシングはまた、非常に古い可能性があり、タンパク質の前に存在するＲＮＡワールドにおいて存在していた可能性がある。
【００９２】
細胞質発現系は、核依存性転写の代替として、またはｍＲＮＡ自体のトランスフェクションとして以前に使用されていた。これらの系は、ファージＲＮＡポリメラーゼ（通常はＴ７ＤＮＡポリメラーゼ）のＤＮＡ鋳型との同時トランスフェクションに依存している。時々、Ｔ７は核プロモーター由来の遺伝子として発現され、またはＴ７ポリメラーゼをコードするｍＲＮＡが細胞内にトランスフェクトされる。これらは、Ｔ７ポリメラーゼのタンパク質トランスフェクションに対する代替えを提供する。更に、Ｔ７ポリメラーゼは、一定の系において、より多くのＴ７ポリメラーゼの合成を指令することができ、自立する自己遺伝子効果（ａｕｔｏｇｅｎｅ  ｅｆｆｅｃｔ）を創成したであろう。このような自己遺伝子系は比類のない発現レベルを達成し、他の要因の中で唯一、細胞質中の三リン酸−リボヌクレオチドの量によってのみ制限される。
【００９３】
本発明のもう一つの応用例において、環状ｍＲＮＡは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの高度の加工性に起因して環状鋳型から連続的に生成することができ、これは伸長段階の間、殆どＤＮＡ鋳型から脱落しない。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼは、適切な終止配列が提供されなければ、プラスミドの回りを何度も周回することができる。これは、ｓｈＲＮＡ系において、ＲＮＡ産物の大幅に増加した収率生じることが示されている。
【００９４】
ＲＮＡに基づく技術の臨床使用への翻訳を仲介するための努力において、生来の免疫系を活性化することができる二本鎖ＲＮＡ不純物を排除し、大規模にｍＲＮＡを精製することに進歩がなされている（例えば、ＥＰ２５１００９９、ＥＰ２０９２０６４）。
【００９５】
環状ｍＲＮＡ分子とは異なる関連の応用は、環状ＲＮＡ干渉エフェクター分子（例えば、ＷＯ２０１００８４３７１）を記載している。また、最近になって、ヒト細胞は、マイクロＲＮＡスポンジとして機能するように見える天然の環状ＲＮＡ分子を有することが文献で公表されている。しかし、これらの環状ＲＮＡ分子を試験したところ、タンパク質由来のエキソン配列を有するにもかかわらず、翻訳活性を示さなかった。僅かに異なる応用において、環状ＲＮＡ分子はダイサーのための基質として作用し、また更にｓｉＲＮＡを生成するための更なる処理として働く（例えば、ＥＰ２１４３７９２）。
【００９６】
以下の実験は例示のみであり、一般的に、本発明のための概念実験の証拠を提供するように働くものである。しかし、本発明及び特許請求の範囲は、提供される特定の実施例によって限定されるべきではない。
【００９７】
ベクター構成
図１に概説したスキームに適合する環状ｍＲＮＡを作製するために、一連のベクターが調製された。次に、この鋳型は、一連の異なるＧＦＰをコードする遺伝子を構築するために使用され、該遺伝子は異なるタイプのｍＲＮＡ分子を生じた。遺伝子１ＬＧ及び２ＣＩは、先行技術に存在した直鎖ｍＲＮＡ分子を生成したのに対して、遺伝子３ＣＩＡ及び４ＣＥＡは本発明の新規な環状ｍＲＮＡ分子を生成した。以下で概説するように、標準的なクローニング手順利用して、最終的なベクターＤＮＡ配列を製造した。
【００９８】
図５と一致する合成ＤＮＡ配列（配列番号１０）を用いて、プラスミドｐＢＳＫ−ＣＲを調製した。ＥＭＣＶ・ＩＲＥＳ及びこれに続くＧＦＰ配列を含有する、もう一つのプラスミドｐＩＲＥＳ−ＧＦＰもまた得られた。次のクローニング工程は、ここでの環状ｍＲＮＡを生成するために使用されるベクターを生成するために行われた。
【００９９】
ＩＲＥＳ・ＧＦＰ−βグロビン３’ＵＴＲ−ポリＡを備えた直鎖のキャップされていないＲＮＡ分子を製造するベクター１ＬＧが、ｐＩＲＥＳ−ＧＦＰ及びｐＢＳＫ−ＣＲの両者におけるＢａｍＨＩ及びＳａｌＩで消化し、続いてＩＲＥＳ−ＧＦＰ挿入物をｐＢＳＫ−ＣＲ配列の中にライゲートすることによって構築された。
【０１００】
ＩＲＥＳ−ＧＦＰ単独を備えた環状ＲＮＡ分子を産生するベクター２ＣＩが、ＸｈｏＩ及びＸｂａＩでのｐＩＲＥＳ−ＧＦＰ及びｐＢＳＫ−ＣＲの消化と、それに続くＩＲＥＳ−ＧＦＰ挿入物のｐＢＳＫ−ＣＲ配列中へのライゲーションによって構築された。
【０１０１】
ＩＲＥＳ−ＧＦＰ−βグロビン３’ＵＴＲ−ポリＡを備えた環状ＲＮＡ分子を産生するベクター３ＣＩＡが、ＸｈｏＩ及びＳａｌＩでのｐＩＲＥＳ−ＧＦＰ及びｐＢＳＫ−ＣＲの消化と、それに続くＩＲＥＳ−ＧＦＰ挿入物のｐＢＳＫ−ＣＲ配列中へのライゲーションによって構築された。
【０１０２】
ｅＩＦ４Ｅアプタマー−βグロビン５’ＵＴＲ−ＧＦＰ−βグロビン３’ＵＴＲ−ポリＡを備えた環状ＲＮＡ分子を産生するベクター４ＣＥＡが、ＮｃｏＩ及びＳａｌＩでのｐＢＳＫ−ＣＲ及びｐＩＲＥＳ−ＧＦＰの消化と、それに続くＩＲＥＳ−ＧＦＰ挿入物のｐＢＳＫ−ＣＲ配列中へのライゲーションによって構築された。
【０１０３】
先行技術のプラスミドｐＩＲＥＳ−ＧＦＰは、ＣＭＶプロモーターによって駆動される細胞の核内部で生成されるポリＡテールを備えた標準的な直鎖のキャップされたｍＲＮＡを産生する。このプラスミドは、我々の新規な環状ｍＲＮＡを、直鎖のキャップされたｍＲＮＡの発現と比較することを可能にし、先行技術との直接的な比較を提供する。しかしながら、生じた相対的なｍＲＮＡレベルは、それらの異なるプロモーターを考慮すれば、与えられた２つのシステムの間で異なるであろう。
【０１０４】
細胞内Ｔ７駆動によるＭＲＮＡ発現
この実験の目的は、トランスフェクションの際のＲＮＡの毒性効果、または実験の取り扱いの際の環境中の豊富なＲＮａｓｅによるｍＲＮＡの可能な分解の変数を排除しながら、Ｔ７ポリメラーゼを用いて細胞内でｍＲＮＡを生成することであった。目標は、２４穴フォーマットにおいて条件あたり４つのウエルで、活性なＴ７  ＲＮＡポリメラーゼタンパク質と一緒に、プラスミドＤＮＡ（組み合わせは以下に示す）をＨＥＫ２９３細胞の中へ同時トランスフェクトすることであった。全ての量及び容積は、ウエル当たりのベースで与えられる。
【表２】
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【０１０５】
１．トランスフェクションの前日、ＨＥＫ細胞をトリプシン処理し、計数した。細胞を、完全増殖培地０．５ｍｌ中において、ウエル当たり１．０×１０５で細胞を播種した。
【０１０６】
２．２μｇのＤＮＡ、及び５０μｌの結成フリーＯＰＴＩＭＥＭ培地中の５０ＵのＴ７ＲＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ：登録商標）を組み合わせ、室温で１０分間インキュベートした。
【０１０７】
３．純粋なリポフェクタミン（５μｌ）を、プラスミド／Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ複合体に加え、該混合物を４５分間インキュベートし、次いでＯＰＴＩＭＥＭ培地で２００μｌに希釈した。
【０１０８】
４．更に３０分のインキュベーションの後、２００μｌのＤＮＡ−Ｔ７ポリメラーゼ−Ｌリポフェクタミン試薬複合体を、細胞を含む各ウエルに直接添加し、プレートを前後に揺動することにより穏やかに混合した。ＤＮＡ／タンパク質／リポフェクタミン複合体は、トランスフェクション後に除去する必要はない。
【０１０９】
５．細胞を、５％ＣＯ２において３７℃で２４時間インキュベートする。
【０１１０】
６．次いで、２４時間後に蛍光顕微鏡を用いてＨＥＫ細胞の画像を取り、ＧＦＰ発現を検出した。幾つかの実験においては、４％ＰＦＡを用いて細胞を４８時間固定し、次いで、細胞の核の輪郭を検出し、ＧＦＰの可視化を改善するためにＤＡＰＩで染色した。ＧＦＰの局在化は、その後の核の位置を基準に観察することができた。
【０１１１】
実験の結果は、幾つかの系で観察されたように、直鎖のキャップされていないＩＲＥＳ−ＧＦＰ−３’ＵＴＲ−ポリＡがＧＦＰ（１ＬＧ）を発現したことを示した。ＩＲＥＳ及びＯＲＦの要素のみを持つ環状ＲＮＡの従来技術に一致して、２ＣＩ環状ｍＲＮＡは、細胞が生きている最中（図２）または細胞固定後（図３）に、反復された実験においてＧＦＰ発現を示すことができなかった。従って、単にＲＮＡを環化することは、同じｍＲＮＡが直鎖状に転写可能なときでも、真核細胞中における真核生物発現のためには十分ではない（ここでは示さないが、先行技術において実証されている）。
【０１１２】
本発明の３ＣＩＡ及び４ＣＥＡの環状ｍＲＮＡは明確なＧＦＰ発現を示し、これはキャップされない直鎖１ＬＧ・ｍＲＮＡにＧＦＰ強度が類似していた。
【表３】
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【０１１３】
ＭＲＮＡ転写及びトランスフェクション
前の実験と同じベクトル１ＬＧ、２ＣＩ、３ＣＩＡ、及び４ＥＡを、インビトロのｍＲＮＡ転写のための鋳型として使用した。インビトロでのｍＲＮＡ転写のプロセスは、当該分野において周知であり、同一のセンス鎖上に短い長さのファージプロモーター及びこれに続く目的の遺伝子を有するＤＮＡ鋳型を得ることからなっている。このＤＮＡ鋳型は、しばしばＲＮＡポリメラーゼの高い処理能力により線形化されるが、ポリメラーゼターミネーター配列が遺伝子の後に続いている場合、環状のまま残ることができる。
【０１１４】
ここでの実験のために、インビトロでのｍＲＮＡ転写反応は、アンビオン社（Ａｍｂｉｏｎ：登録商標）からのＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔキットを使用して設定された。リボヌクレオチド、Ｔ７ポリメラーゼ及びＤＮＡ鋳型の混合物を、２０μＬの反応混合物に添加した。反応を３７℃で２時間進行させた。次いで、過剰のリボヌクレオチド、ＤＮＡ及びタンパク質を除去するために、標準的な塩化リチウムプロトコールを用いてｍＲＮＡ転写物を精製した。
【０１１５】
次に、リポフェクタミンを使用して、精製されたｍＲＮＡを次のようにしてＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした：
【０１１６】
１．トランスフェクションの前日、ＨＥＫ細胞をトリプシン処理して計数した。細胞を、０．５ｍｌの完全増殖培地中に、ウエル当たり１．０×１０５個で播種した。
【０１１７】
２．０．５〜１μｇのＲＮＡを、２．５μＬのリポフェクタミン２０００に加え、この混合物を４５分間インキュベートし、次いで、ＯＰＴＩＭＥＭ培地で２００μｌに希釈した。
【０１１８】
４．更に３０分のインキュベーションの後に、２００μｌのｍＲＮＡ−リポフェクタミン試薬複合体を、細胞を含んだ各ウエルに直接加え、プレートを前後に揺動することによって穏やかに混合した。該複合体は、トランスフェクション後に除去しなかった。
【０１１９】
５．細胞を更に２４時間、５％ＣＯ２の中において３７℃でインキュベートした。
【０１２０】
６．２４時間において、ＧＦＰ発現を検出するために、蛍光顕微鏡を用いてＨＥＫ細胞の画像を撮影した。幾つかの実験においては、４％ＰＦＡを用いて細胞を４８時間固定し、次いで、細胞の核の輪郭を検出するためにＤＡＰＩで染色した。ＧＦＰの局在化は、その後の核の位置を基準に観察することができた。
【０１２１】
予想通り、ｍＲＮＡのトランスフェクション実験の結果は、細胞内のＴ７駆動によるｍＲＮＡ発現の結果と一致した。幾つかの先行技術のシステムで観察されているように、キャップされていない直鎖ＩＲＥＳ−ＧＦＰ−３’ＵＴＲ−ポリＡ・ｍＲＮＡは、ＧＦＰ（１ＬＧ）を発現した。ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ及びＯＲＦ単独の従来技術に一致する２ＣＩ環状ｍＲＮＡは、細胞が生きている間または細胞固定後に画像化したとき、反復実験においてＧＦＰ発現を示すことができなかった。従って、上記の実験と一致して、単独のＩＲＥＳ及びＯＲＦは、環状ｍＲＮＡの細胞内転写のためには不十分である。更に、それは、生きた動物での（インビボ）発現のためにも十分ではないと予測される。
【０１２２】
３ＣＩＡ及び４ＣＥＡの環状ｍＲＮＡはＧＦＰ発現を示し、これはＧＦＰ強度において、キャップされていない直鎖型１ＬＧのｍＲＮＡに類似していた。
【表４】
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【０１２３】
結論
環状ｍＲＮＡ産生の二つの異なる方法を使用して、その環状ｍＲＮＡが宿主のｃａｐ化されたｍＲＮＡと直接競合して、真核細胞において細胞内翻訳され得ることが初めて観察された。これは、以前の研究者が達成できなかった重要な知見である。更に、真核細胞内で翻訳される環状ｍＲＮＡが自然界に存在することはこれまで発見されておらず、従って、これらの結果は予想外のものである。実際に、環状のエキソン及びイントロンは今、真核細胞内に存在することが認められてはいるが、進化は、リボソームによって翻訳できる環状ｍＲＮＡを選択しなかったように思える。実験結果の概要を以下の表に列記する。
【表５】
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【０１２４】
遺伝子２ＣＩは、同じＥＭＣＶ・ＩＲＥＳ及びＯＲＦ構築物（ＵＳ５７６６９０３参照）を含む従来技術に一致した環状ｍＲＮＡ分子を生成するために構築された。従って、２ＣＩ遺伝子は、複数のＲＮＡ翻訳増強要素を含んだ本発明に対する比較例となる。ＥＭＣＶ・ＩＲＥＳ−ＧＦＰ単独をコードする２ＣＩ環状ｍＲＮＡは、生細胞撮像及び細胞で固定後の両方において、如何なる識別可能なＧＦＰ発現も生じさせないことを観察する。これは、インビトロでのウサギ網状赤血球システムにおいて報告された陽性発現（Ｃｈｅｎ  ＆  Ｓａｒｎｏｗ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９５）とは対照的である。
【０１２５】
一方、環状ｍＲＮＡの３ＣＩＡ及び４ＣＥＡは、キャップされていない直鎖ｍＲＮＡである１ＬＧの発現に類似した発現パターンを生じる。ｃａｐなしのＥＭＣＶ・ＩＲＥＳ−ＧＦＰ−βグロビン３’ＵＴＲ−ポリＡを含む直鎖ｍＲＮＡの１ＬＧは、トランスフェクション後にＧＦＰを生成することが文献で知られているが、我々は同じｍＲＮＡの環状バージョンの発現の最初の確認された実証を示した。
【０１２６】
２ＣＩにおける環状ｍＲＮＡ（発現なし）と３ＣＩＡにおけるｍＲＮＡ（発現あり）間でのＧＦＰ発現における差は、唯一の追加の配列がβグロビン３’ＵＴＲ及びポリアデニル化配列であったことを考慮すると、顕著である。これは、追加されたこれらの配列が、ＥＭＣＶ・ＩＲＥＳによる細胞内での効果的なリボソーム動員を可能にし、同様に、ＩＲＥＳへの追加の開始因子動員を補助してその効率を増大させることを示している。例えば、ＰＡＢＰは、ポリアデニル化配列及びｅＩＦ４Ｇに結合するが、これはＥＭＣＶ・ＩＲＥＳが標的にしているタンパク質である。
【０１２７】
本発明はまた、環状ＲＮＡにリボソームを動員する際に、ＩＲＥＳ様の要素としてのｅＩＦ４Ｅに結合するＲＮＡ配列の使用を初めて記載したものである。これまでのところ、リボソーム動員の排他的メカニズムとしてｅＩＦ４Ｅ動員を利用する哺乳動物ウイルスまたは細胞遺伝子は記載されていない。従って、翻訳を促進するｅＩＦ４Ｅアプタマーの立証は、真核生物のｍＲＮＡの翻訳開始のための新たな知見を意味するものである。
【０１２８】
将来の実験は、ＩＲＥＳ、５’及び３’ＵＴＲ、並びにポリアデニル化配列長の異なる組み合わせを使用して、環状ｍＲＮＡ遺伝子の最適化を模索するであろう。ホタルルシフェラーゼ遺伝子は、ｍＲＮＡの翻訳の後に産生されるタンパク質量の定量的測定を可能にするための、トランスフェクトされたＯＲＦとして利用されるであろう。
【０１２９】
我々はまた、定量的ＲＴ−ＰＣＲ及び／またはＲＮＡ精製及びハイブリダイゼーション実験を使用して、真核細胞において、我々の環状ｍＲＮＡの半減期を測定するために、将来の実験を計画している。我々は先行技術の教示に基づいて、半減期は、１０時間の半減期を有するキャップされた対照ｍＲＮＡより少なくとも２倍、３倍、４倍または５倍であると考えている。従って、我々は、少なくとも２０時間、３０時間、または４０時間以上の半減期を期待する。
材料
【表６】
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【０１３０】
次の参照文献の各々を、全ての目的で、その全体を本明細書の一部として援用する。
【０１３１】
ＥＰ  １０８３２３２（Ｎｉｃｏｌｅｔｔｅ）；  ＵＳ２００８０２９９６６２（Ｆｅｒｒａｎｄｅｚ）；  ＵＳ２００８０２６７８７３  ＵＳ２０１０００４７２６１（Ｈｏｅｒｒ）；  ＵＳ２０１００１３７４０７（Ａｂｅ）；  ＵＳ２０１００１７３３５６（Ｌｅｈｍａｎｎ）；  ＵＳ２０１１０１０４１２７（Ｔｏｒｚｅｗｓｋｉ）；  ＵＳ２０１１０１１９７８２  ＵＳ２０１１０１４３３９７（Ｄａｌｅ）；  ＵＳ２０１２０３２２８６４（Ｒｏｓｓｉ）；  ＵＳ５５８０８５９  ＵＳ５６２５０４７（Ｆｅｌｇｎｅｒ）；  ＵＳ５７１２１２８（Ｂｅｅｎ）；  ＵＳ５７６６９０３（Ｓａｒｎｏｗ）；  ＵＳ５７７３２４４（Ａｒｅｓ）；  ＵＳ５８２４４９７（Ａｎｄｒｅｗｓ）；  ＵＳ６２１０９３１（Ｆｅｌｄｓｔｅｉｎ）；  ＵＳ８１９２９８４  ＵＳ８２５７９４５（Ａｔｅｂｅｋｏｖ）；  ＵＳ８２７８０３６（Ｋａｒｉｋｏ）；  ＵＳ８３８３３４０（Ｋｅｔｔｅｒｅｒ）；  ＷＯ２０１００８４３７１（Ｐｌａｎｅ）。
【０１３２】
Ｃｈｅｎ  Ｃ．Ｙ．  ＆  Ｓａｒｎｏｗ  Ｐ．，  環状ＲＮＡ上での真核生物翻訳装置によるタンパク質合成の開始.  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｎｅｗ  Ｓｅｒｉｅｓ，  ２６８（５２０９）：  ４１５−４１７（１９９５）.
【０１３３】
Ｃｕｌｊｋｏｖｉｃ  Ｂ．，  ｅｔ  ａｌ．，  ｅＩＦ４Ｅは、３’ＵＴＲにおける要素を介してサイクリンＤ１ｍＲＮＡの核搬出を促進する.,  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １６９（２）：  ２４５−２５６（２００５）.
【０１３４】
Ｄｅ  Ｇｒｅｇｏｒｉｏ  Ｅ．，  ｅｔ  ａｌ．，  係留された機能の解析は、ｅＩＦ４Ｅがそのｃａｐ構造への結合とは独立に、リボソームを動員できることを明らかにする.  ＲＮＡ  ７：１０６−１１３（２００１）．
【０１３５】
Ｆｏｒｄ  Ｅ．  ＆  Ａｒｅｓ，  Ｍ．，  ファージＴ４のグループＩイントロン由来のＲＮＡシクラーゼリボソームを用いた、バクテリア及び酵母における環状ＲＮＡの合成．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９１：３１１７−３１２１（１９９４）．  
【０１３６】
Ｈａｒｌａｎｄ  Ｒ．  ＆  Ｍｉｓｈｅｒ  Ｌ．，  発生中のアフリカツメガエル胚におけるＲＮＡの安定性及びＴＦＩＩＩＡメッセンジャーＲＮＡにおける不安定化配列の同定．  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １０２：８３７−８５２（１９８８）．
【０１３７】
Ｋｏｎａｒｓｋａ，  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．，  たばこモザイクウイルスＲＮＡの直鎖及び環状形態の５’-末端リーダー断片に対するリボソームの結合．  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １１４：２２１−２２７（１９８１）．
【０１３８】
Ｍａｃｋｉｅ，  Ｇ．Ａ．，  環状ｒｐｓＴ・ｍＲＮＡの安定化は、インビボでのＲＮａｓｅＥ動作の５−末端依存性を示す,  Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７５：３３（２０００）．
【０１３９】
Ｍｏｃｈｉｚｕｋｉ  Ｋ．，  ｅｔ  ａｌ．，  哺乳類開始因子４Ｅに対する高親和性ＲＮＡは、ｍＲＮＡ−ｃａｐ結合を妨害し、翻訳を阻害する，  ＲＮＡ  １１：７７−８９（２００５）．
【０１４０】
Ｐｅｒｒｉｍａｎ  ＆  Ａｒｅｓ，  環状ｍＲＮＡは極端に長い反復配列タンパク質のインビボでの翻訳を指令することができる．  ＲＮＡ（１９９８）４：１０４７−１０５４．
【０１４１】
Ｐｅｒｒｉｍａｎ，Ｒ．モノマー及びポリマー緑色蛍光タンパク質をコードする環状ｍＲＮＡ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １８３：６９−８５（２００２）．
【０１４２】
Ｐｕｔｔａｒａｊｕ  Ｍ．  ＆  Ｂｅｅｎ  Ｍ．Ｄ．，  グループＩ自己スプライシングで順序変更されたイントロン−エキソン配列を用いて大腸菌中で生成された環状リボザイム，  Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７１（４２）：２６０８１−２６０８７（１９９６）．
【０１４３】
Ｕｍｅｋａｇｅ，  Ｓ．  ＆  Ｋｉｋｕｃｈｉ  Ｙ．，  高レベル発現のための構成的プロモーターを使用したインビボの環状ＲＮＡ製造．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １０８（４）：３５４−３５６（２００９）．
【０１４４】
Ｕｍｅｋａｇｅ，  Ｓ．  ＆  Ｋｉｋｕｃｈｉ  Ｙ．，  環状ＲＮＡアプタマーのインビトロ及びインビボでの製造及び精製．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３９：  ２６５−２７２  （２００９）．
【０１４５】
Ｖａｎ  Ｌｉｅｓｈｏｕｔ，  Ｊ．Ｆ．Ｔ．，  ｅｔ  ａｌ．，  環状ｍＲＮＡ並びにその機能的インビボ及びインビトロ翻訳のリボザイムに媒介された加工（２００７）．
【０１４６】
Ｗａｎｇ  Ｚ．，  ｅｔ  ａｌ．，  ｃａｐ結合性翻訳開始因子のｅＩＦ４Ｅは、ウイルスｃａｐ非依存性翻訳開始要素における偽結節に結合する.  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  １９（６）：８６８−８０（２０１１）．
【０１４７】
Ｗａｎｇ，  Ｇ．，  ｅｔ  ａｌ．，  ヒトＳＰ−Ａ  ５’−ＵＴＲ変異体のＣａｐ非依存性翻訳：  二重ループ構造及びｃｉｓ−要素寄与，  Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｌｕｎｇ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２９６：Ｌ６３５−Ｌ６４７（２００９）．
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
0006625521.tif 000016
【図１０】
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【配列表】
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