(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞内に形成されたストレス顆粒を構成するタンパク質を標識する第１の試薬と、
ヒト抗体を標識する第２の試薬と、
を備える、自己免疫疾患の診断用キット。
【請求項２】
前記第１の試薬は、
前記タンパク質に結合する一次抗体と、
前記一次抗体に結合する、蛍光色素で標識された二次抗体と、
を含む、請求項１に記載の自己免疫疾患の診断用キット。
【請求項３】
細胞内のストレス顆粒の形成を誘導する誘導剤をさらに備える、
請求項１または２に記載の自己免疫疾患の診断用キット。
【請求項４】
前記タンパク質は、
ｅＩＦ３エータである、
請求項１から３のいずれか一項に記載の自己免疫疾患の診断用キット。
【請求項５】
細胞内に形成されたストレス顆粒を構成するタンパク質に対する抗体を、被検者から採取された試料から検出する検出ステップを含み、
前記検出ステップの結果が、前記被検者が自己免疫疾患に罹患しているか否かを判定するために用いられる、
自己免疫疾患の診断を補助する判定方法。
【請求項６】
前記自己免疫疾患は、
関節リウマチである、
請求項５に記載の自己免疫疾患の診断を補助する判定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、自己免疫疾患の診断用キットおよび自己免疫疾患の診断を補助する判定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
自己免疫疾患では、免疫システムの異常により自己反応性の細胞および自己抗体が出現する。自己免疫疾患における自己抗体の診断的価値は大きく、自己抗体の検出に関して精力的に研究が行われている。全身性エリテマトーデスにおける抗二重鎖ＤＮＡ抗体および関節リウマチにおける抗環状シトルリン化ペプチド抗体などのように、自己抗体の検出は、自己免疫疾患の診断または疾患活動性の評価などにおいて不可欠な検査となっている（非特許文献１参照）。
【０００３】
基本的な自己抗体の検出法として抗核抗体検査が非特許文献２に開示されている。現在頻用されている抗核抗体（Ａｎｔｉ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ：ＡＮＡ）の検出法は、ＨＥｐ−２細胞を基質とした間接蛍光抗体法である。該間接蛍光抗体法では、スライド上のＨＥｐ−２細胞を患者血清に暴露し、抗原抗体反応を起こした患者血清をフルオレセインイソチオシアネート（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ、ＦＩＴＣ）標識抗ヒトイムノグロブリンにより検出する。抗核抗体は、その染色パターンによって、均等型、辺縁型、斑紋型、核小体型、細胞質型、ＰＣＮＡ型、およびセントロメア型（散在斑紋型）に分類される。各々の染色パターンに対応した抗原が知られており、ＡＮＡの検出は、診断またはその後の検査の選択に大きな意義を有する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】竹内  健、外２名、「全身性エリテマトーデス」、医学検査、日本臨床衛生検査技師会、２００２年、５１（９）、１２５６〜１２６４
【非特許文献２】三森  経世、「抗核抗体研究の進歩−自己抗体が認識する核および細胞質蛋白の構造と機能−」、リウマチ、１９９２年、３２（４）、３６６〜３７８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、抗核抗体検査は、健常人であっても陽性率が高い。また、染色パターンの判定に客観性を欠く場合がある。このため、抗核抗体検査による自己免疫疾患の診断精度は十分高いとは言い難い。抗核抗体検査と同等の検査により、さらに診断に有用な情報が得られることが大変望ましい。
【０００６】
本発明は、上記実情に鑑みてなされたものであり、自己免疫疾患の診断精度を向上させることができる自己免疫疾患の診断用キット、および自己免疫疾患の罹患をより正確に判定することができる自己免疫疾患の診断を補助する判定方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の第１の観点に係る自己免疫疾患の診断用キットは、
細胞内に形成されたストレス顆粒を構成するタンパク質を標識する第１の試薬と、
ヒト抗体を標識する第２の試薬と、
を備える。
【０００８】
この場合、前記第１の試薬は、
前記タンパク質に結合する一次抗体と、
前記一次抗体に結合する、蛍光色素で標識された二次抗体と、
を含む、
こととしてもよい。
【０００９】
また、細胞内のストレス顆粒の形成を誘導する誘導剤をさらに備える、
こととしてもよい。
【００１０】
また、前記タンパク質は、
ｅＩＦ３エータである、
こととしてもよい。
【００１４】
本発明の第２の観点に係る自己免疫疾患の診断を補助する判定方法は、
細胞内に形成されたストレス顆粒を構成するタンパク質に対する抗体を、被検者から採取された試料から検出する検出ステップを含み、
前記検出ステップの結果が、前記被検者が自己免疫疾患に罹患しているか否かを判定するために用いられる。
【００１５】
この場合、前記自己免疫疾患は、
関節リウマチである、
こととしてもよい。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、自己免疫疾患の診断精度を向上させることができる。また、本発明によれば、自己免疫疾患の罹患をより正確に判定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】実施例における抗ストレス顆粒抗体陽性症例の染色例を示す図である。ａは細胞質に形成されたストレス顆粒のマーカーであるＣｙ２の蛍光を示す図である。ｂはヒト抗体のマーカーであるＣｙ３の蛍光を示す図である。ｃはａとｂとを重ね合わせた図である。
【図２】実施例における抗ストレス顆粒抗体陽性かつ抗核抗体陽性の症例の染色例を示す図である。ａは細胞質に形成されたストレス顆粒のマーカーであるＣｙ２の蛍光を示す図である。ｂはヒト抗体のマーカーであるＣｙ３の蛍光を示す図である。ｃはａとｂとを重ね合わせた図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明に係る実施の形態について説明する。なお、本発明は下記の実施の形態および図面によって限定されるものではない。
【００１９】
（実施の形態１）
まず、実施の形態１について説明する。実施の形態１に係る自己免疫疾患の診断用キットは、細胞内に形成されたストレス顆粒を構成するタンパク質を標識する第１の試薬と、ヒト抗体を標識する第２の試薬と、を備える。
【００２０】
ストレス顆粒（Ｓｔｒｅｓｓ  Ｇｒａｎｕｌｅ、以下単に「ＳＧ」ともいう）は、ストレスに反応し細胞質内に形成されるタンパク質とＲＮＡとの凝集塊である。ストレスとは、環境条件の急激な変化であって、例えば、熱ショック、酸化ストレス、虚血、ウイルス感染ならびに変性タンパク質および二本鎖ＲＮＡの形成などである。ストレス顆粒の形成は、ストレスにより翻訳が停止されたｍＲＮＡおよび翻訳の機構を一時的に保存し、ストレスの解除後に速やかに翻訳を開始するためであると考えられている。ストレス顆粒を構成する分子として、ｍＲＮＡ、６０Ｓを除くリボゾームＲＮＡ、ＲＮＡ結合タンパク質などが知られている。
【００２１】
ストレス顆粒を構成するタンパク質は、例えば、表１に挙げられる。第１の試薬は、表１に挙げられたタンパク質の少なくとも１種を標識するものであれば特に限定されない。好適には、第１の試薬は、ストレス顆粒を構成するタンパク質として、ｅＩＦ３エータを標識する。
【００２２】
【表１】
0006628303.tif 000002
【００２３】
より詳細には、第１の試薬は、例えば、ストレス顆粒を構成するタンパク質に結合する標識された抗体である。標識された抗体は、好ましくは、放射性同位体、発色反応で用いる酵素および蛍光色素などを担持する。標識された抗体は、免疫反応によってタンパク質を標識することができる。放射性同位体を担持させた抗体を用いる場合、免疫反応後に放射性同位体の放射線を検出すればよい。発色反応で用いる酵素を担持させた抗体を用いる場合、免疫反応後に当該酵素に対する発色基質を反応させ、生じた色によってタンパク質を検出することができる。蛍光色素を担持させた抗体を用いる場合、免疫反応の後に蛍光色素に対する励起波長の光を当て、その蛍光を検出すればよい。
【００２４】
放射性同位体としては、例えば、重水素（２Ｈ）、三重水素（３Ｈ）、１０Ｂ、１１Ｂ、１３Ｃ、１５Ｎ、１８Ｏなどが挙げられる。発色反応で用いる酵素は、公知の酵素、例えばアルカリホスファターゼおよびペルオキシダーゼなどである。蛍光色素は、公知の任意のものが使用できるが、例えば、ＦＩＴＣ、Ｃｙ２、Ｃｙ３、フルオレセイン、ローダミン、ダンシル、カルボシアニン誘導体など、あるいは蛍光タンパク質としての緑色蛍光タンパク質およびその変異体などである。
【００２５】
好ましくは、第１の試薬は、上記のタンパク質に結合する一次抗体と、一次抗体に結合する、蛍光色素で標識された二次抗体と、を含む。この場合、例えば、一次抗体として、ヒト以外の動物、例えばヤギで作製した上記タンパク質に対するヤギ抗体を使用し、二次抗体として、蛍光色素で標識されたロバ抗ヤギ抗体を使用すればよい。一次抗体および二次抗体は、間接蛍光抗体法により、上記のタンパク質の少なくとも１種を標識できる。
【００２６】
第２の試薬は、ヒト抗体を標識するものであれば特に限定されない。第２の試薬は、例えば、標識された、ヒト免疫グロブリン抗体などのヒト抗体である。ヒト免疫グロブリン抗体は、特に限定されず、抗ヒトＩｇＧ抗体、抗ヒトＩｇＭ抗体、抗ヒトＩｇＡ抗体、抗ヒトＩｇＤ抗体および抗ヒトＩｇＥ抗体であってもよい。
【００２７】
上記のタンパク質に対する抗体は、公知の方法で作製したものを用いてもよいし、市販の抗体を用いてもよい。抗体は、ロバ、ヤギ、マウス、ウサギ、ラット、ヒツジ、ブタ、トリなど任意の動物種で作製されたものを用いることができる。
【００２８】
なお、第１の試薬および第２の試薬としては、抗体に限らず、上述のタンパク質に結合する、標識されたアプタマー、化合物またはペプチドなどであってもよい。また、抗体の標識には、アビジン−ビオチンシステムを用いてもよい。
【００２９】
細胞は、特に限定されず、細胞内にストレス顆粒が形成されるものであれば任意の細胞を用いることができる。例えば、細胞は、初代培養細胞でも各種細胞株でもよく、好ましくは癌細胞株、特には骨肉腫細胞株であるＵ２ＯＳなどである。
【００３０】
次に、上記診断用キットの使用方法について説明する。例えば、第１の試薬および第２の試薬として抗体を用いる場合、当該診断用キットは、公知の免疫染色法で使用するのが好ましい。まず、ホルムアルデヒドなどで固定された、細胞質内にストレス顆粒が形成された細胞に対して、ブロッキング処理を施す。次に、第１の試薬および被検者の血清に、細胞を暴露する。続いて、洗浄処理によって未反応の第１の試薬を除去した後、第２の試薬に細胞を暴露する。洗浄処理後、スライドグラスに細胞を固定し、蛍光顕微鏡で観察する。
【００３１】
第１の試薬による標識は、ストレス顆粒の存在を示す。第２の試薬による標識は、ヒト抗体の存在を示す。したがって、第１の試薬の標識と第２の試薬の標識とが重なっていれば、細胞内に形成されたストレス顆粒を構成するタンパク質に対する自己抗体が被検者の血清中に含まれていることになる。
【００３２】
下記実施例に示すように、ストレス顆粒を構成するタンパク質に対する自己抗体は、自己免疫疾患と関連する。本診断用キットを使用することで、自己免疫疾患の患者を診断できる。特に、従来の抗核抗体検査および抗細胞質抗体検査が陰性の被検者に対して、本診断用キットを使用することで、該被検者の自己免疫疾患を診断あるいは自己免疫疾患への易罹患性を判定できる。
【００３３】
ここで、自己免疫疾患とは、免疫系を原因とする種々の疾患であり、より詳細には、自己免疫性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、尋常性天疱瘡、落葉状天疱瘡、水疱性類天疱瘡、パセドウ病、慢性甲状腺炎、Ａ型胃炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、セリアックスプルー、インスリン依存性糖尿病、アジソン病、グッドパスチャー症候群、半月体形成性糸球体腎炎、多発性硬化症、ギラン・バレー症候群、重症筋無力症、自己免疫性溶血性貧血、赤芽球癆、突発性血小板減少性紫斑病、拡張型心筋症、慢性心筋炎、全身性エリテマトーデスおよび自己免疫性不妊症などである。特には、自己免疫疾患は、関節リウマチ、シェーグレン症候群、膠原病、強皮症、関節炎、レイノー病、ＲＳ３ＰＥ（Ｒｅｍｉｔｔｉｎｇ  Ｓｅｒｏｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｓｙｍｍｅｔｒｉｃａｌ  Ｓｙｎｏｖｉｔｉｓ  Ｗｉｔｈ  Ｐｉｔｔｉｎｇ  Ｅｄｅｍａ）症候群、および変形性関節症などである。
【００３４】
なお、本実施の形態に係る診断用キットは、細胞内のストレス顆粒の形成を誘導する誘導剤をさらに備えてもよい。誘導剤としては、亜ヒ酸ナトリウム、マレイン酸ジエチル（ＤＥＭ）、Ｈ２Ｏ２、ツニカマイシン、タプシガルギン、ジチオトレイトール、エトポシドおよびテノイルトリフルオロアセトンなどが挙げられる。
【００３５】
以上詳細に説明したように、本実施の形態に係る診断用キットによれば、自己免疫疾患を精度よく診断することができる。また、該診断用キットは、ヒト抗体を標識する第２の試薬を備えるので、試料中の抗核抗体の有無もわかる。
【００３６】
なお、第１の試薬は一次抗体と二次抗体とを含んでもよいこととした。一次抗体と二次抗体とを用いる間接蛍光抗体法は、一次抗体に複数の二次抗体が反応するため、蛍光強度など標識のシグナルを増強させることができ、診断が容易になる。また、ストレス顆粒を構成するタンパク質に特異的な一次抗体があれば、共通の二次抗体を使用できるので二次抗体の汎用性が高まる。
【００３７】
また、上記診断用キットは、誘導剤を備えてもよいこととした。誘導剤によって、継代細胞、細胞株などの各種の細胞で、ストレス顆粒の形成を誘導することができるので、本診断用キットの利便性がさらに高まる。
【００３８】
なお、第１の試薬および第２の試薬として抗体を用いる場合、ストレス顆粒を構成するタンパク質およびヒト抗体を、蛍光抗体補体法で標識してもよい。
【００３９】
（実施の形態２）
次に、実施の形態２について説明する。上述のように、ストレス顆粒はストレスに反応し細胞質内に形成される。このため、細胞に誘導剤などでストレスを負荷することで細胞内にストレス顆粒を形成させることができる。これに対し、実施の形態２に係る細胞は、細胞内のストレス顆粒の形成を誘導しなくても、ストレス顆粒が細胞内に形成される。本実施の形態に係る細胞は、人為的にストレス顆粒の形成を誘導せずに、例えば、Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ培地などの塩、非必須アミノ酸、グルタミンおよび重炭酸ナトリウムなどを必要最小限含む培地で培養してもストレス顆粒が細胞内に形成される。
【００４０】
本実施の形態に係る細胞は、ストレス顆粒の形成に関与する、あるいはストレス顆粒の形成機序を促進するタンパク質をコードする遺伝子を細胞に導入することで作製できる。当該タンパク質は、例えば、表１に示すストレス顆粒を構成するタンパク質である。この場合、１種または複数種のタンパク質をコードする各遺伝子を細胞に導入してもよい。
【００４１】
遺伝子は、公知の生物学的、化学的または物理的な手法で細胞に導入できる。例えば、ストレス顆粒を構成するタンパク質をコードする遺伝子を組み込んだベクターを、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法およびリポフェクション法などの公知の方法で細胞に導入すればよい。また、トランスポゼース遺伝子を有するトランスポゾンベクターを用いて、ストレス顆粒を構成するタンパク質をコードする遺伝子を細胞に導入してもよい。
【００４２】
遺伝子の導入では、プログラマブルエンドヌクレアーゼ（ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ）で細胞のゲノムを任意の部位で切断し、相同組換え修復を利用して、ストレス顆粒を構成するタンパク質をコードする遺伝子をゲノムに挿入してもよい。プログラマブルエンドヌクレアーゼは、特に限定されないが、例えば、ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ−ｌｉｋｅ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｎｕｃｌｅａｓｅ（ＴＡＬＥＮ）、ｚｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒ  ｎｕｃｌｅａｓｅ（ＺＦＮ）およびＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔ  ａｎｄ  Ｃｒｉｓｐｅｒ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）システムなどである。プログラマブルエンドヌクレアーゼは、ゲノムの切断部位近傍の塩基配列に応じて、公知の方法で設計される。好ましくは、転写活性が高い遺伝子の下流にストレス顆粒を構成するタンパク質をコードする遺伝子を挿入すればよい。
【００４３】
ストレスに暴露された細胞におけるストレス顆粒の形成には、ａ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ２（ｅＩＦ２α）ｃｏｍｐｌｅｘのＳｅｒ５１のリン酸化が必要である。したがって、本実施の形態に係る細胞は、ｅＩＦ２α  ｃｏｍｐｌｅｘのＳｅｒ５１のリン酸化を促進するタンパク質などの因子を細胞内に導入することでも作製できる。
【００４４】
好適には、細胞内に形成されるストレス顆粒を構成する少なくとも１種のタンパク質が、標識されている。タンパク質の標識としては、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）が好ましい。ＧＦＰで標識する場合、ストレス顆粒を構成するタンパク質を、ＧＦＰとの融合タンパク質として発現させればよい。
【００４５】
人為的に誘導しなくてもストレス顆粒が細胞内に形成されたことは、例えば、ストレス顆粒を構成するタンパク質を標識する上記第１の試薬で確認することができる。当該細胞を培養し、ストレス顆粒を構成するタンパク質、例えば、ｅＩＦηが細胞質内で観察されれば、ストレス顆粒が細胞内に形成されたと判断できる。この場合、陽性対照として、誘導剤に暴露した上記Ｕ２ＯＳと比較することで、ストレス顆粒の形成が確認しやすい。また、ストレス顆粒の形成に特異的な遺伝子の発現を定量することでも、ストレス顆粒の形成を確認できる。
【００４６】
以上詳細に説明したように、本実施の形態に係る細胞によれば、誘導剤を使用しなくても、ストレス顆粒が細胞内に形成されるので、ストレス顆粒を構成するタンパク質に対するヒト抗体を被検者の血清などから検出する際に有用である。細胞に誘導剤を作用させる工程が不要になるので、試験時間を短縮でき、試験を簡便に行うことができる。当該ヒト抗体は、自己免疫疾患と関連するので、本実施の形態に係る細胞は、自己免疫疾患の診断用キットに好適である。
【００４７】
なお、本実施の形態では、細胞内に形成されるストレス顆粒を構成する少なくとも１種のタンパク質が、標識されていてもよいこととした。これにより、細胞内の該タンパク質の局在が把握できるので、ストレス顆粒の形成機序を観察または解析しやすくなる。また、当該細胞に作用させたヒト抗体の標識の位置と細胞内の該タンパク質の局在との対比で細胞内の該タンパク質に対するヒト抗体の有無を簡便に決定することができる。
【００４８】
別の実施の形態では、本実施の形態に係る細胞と、ヒト抗体を標識する試薬と、を備える自己免疫疾患の診断用キットが提供される。当該診断用キットによれば、細胞においてストレス顆粒の形成を誘導しなくても、被検者の血清などに含まれるストレス顆粒を形成するタンパク質に対するヒト抗体を検出できるので、迅速および簡便に自己免疫疾患を診断できる。
【００４９】
（実施の形態３）
続いて、実施の形態３について説明する。本実施の形態に係る自己免疫疾患への易罹患性の判定方法は、検出ステップと、判定ステップとを含む。
【００５０】
検出ステップでは、ストレス顆粒を構成するタンパク質に対する抗体を、被検者から採取された試料から検出する。当該タンパク質は、例えば表１に示されるタンパク質である。抗体はヒト抗体で検出できる。当該抗体は、標識された、ヒト免疫グロブリン抗体などのヒト抗体で上述のように検出できる。
【００５１】
試料は、被検者の血液、尿、関節液、胆汁、胃液、腸液、唾液、脳脊髄液などである。好適には、試料は血清である。
【００５２】
判定ステップでは、検出ステップの結果に基づいて、被検者の自己免疫疾患への易罹患性を判定する。例えば、試料から抗体が検出された場合、試料から抗体が検出されない場合よりも被検者が自己免疫疾患に罹り易いと判定する。一方、試料から抗体が検出されない場合、試料から抗体が検出された場合よりも被検者が自己免疫疾患に罹りにくいと判定してもよい。
【００５３】
自己免疫疾患は、上述の免疫系を原因とする種々の疾患であれば特に限定されないが、好ましくは関節リウマチ、シェーグレン症候群、膠原病、強皮症、関節炎、レイノー病、ＲＳ３ＰＥ症候群および変形性関節症などである。
【００５４】
以上詳細に説明したように、本実施の形態に係る自己免疫疾患への易罹患性の判定方法は、自己免疫疾患の発症または易罹患性と関連する、ストレス顆粒を構成するタンパク質に対する抗体を被検者由来の試料から検出するので、被検者の自己免疫疾患への易罹患性を精度よく判定することができる。
【００５５】
なお、当該判定方法は、特に関節リウマチの易罹患性の判定に有効である。抗核抗体検査は、偽陽性が比較的多く、染色パターンの判定に客観性を欠くことがあるため、関節リウマチの易罹患性の判定精度を向上させる点で、本判定方法の臨床的意義は極めて高い。本判定方法は、関節リウマチの易罹患性の判定において単独で用いられてもよいし、抗核抗体検査と併用されてもよい。また、当該判定方法は、リウマチ因子または抗環状シトルリン化ペプチド抗体（Ａｎｔｉ−ｃｙｃｌｉｃ  ｃｉｔｒｕｌｌｉｎａｔｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ：ＡＣＰＡ）による検査の代用としてもよいし、リウマチ因子またはＡＣＰＡによる検査を補助するために用いられてもよい。
【００５６】
別の実施の形態では、自己免疫疾患の診断方法が提供される。当該診断方法は、上記検出ステップと、検出ステップの結果に基づいて、被検者が自己免疫疾患に罹患しているか否かを診断する診断ステップとを含む。例えば、診断ステップでは、ストレス顆粒を構成するタンパク質に対する抗体が被検者から採取された試料から検出された場合、被検者が自己免疫疾患に罹患していると診断する。
【００５７】
他の実施の形態では、自己免疫疾患の予後予測方法が提供される。当該予後予測方法は、上記検出ステップと、検出ステップの結果に基づいて、被検者の自己免疫疾患の予後を予測する予測ステップとを含む。例えば、予測ステップでは、ストレス顆粒を構成するタンパク質に対する抗体が被検者から採取された試料から検出された場合、該抗体が試料から検出されない場合よりも、被検者の自己免疫疾患の予後が不良であると予測する。
【実施例】
【００５８】
以下の実施例により、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【００５９】
（対象症例）
診断を知らされていない担当者が、広島大学病院リウマチ・膠原病科受診症例のうち、抗核抗体検査が行われた９０症例を無作為に選択し、以下の検討の対象とした。
【００６０】
（ストレス顆粒の誘導と細胞の固定）
２４ウェルの組織培養プレートにカバースリップを設置した。各ウェルに２．０×１０５個の骨肉腫細胞株Ｕ２ＯＳを播種した。播種した細胞を、１０％の胎児牛血清を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）で、３７℃の５％の二酸化炭素存在下で一晩培養した。培養することで細胞をプレートに接着させた。
【００６１】
ストレス顆粒を誘導するため、各ウェルに、０．５ｍＭの亜ヒ酸ナトリウムを１００μＭになるように添加し、３７℃の５％の二酸化炭素存在下で細胞を４０分培養した。Ｐｈｏｓｐａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ  ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）で各ウェルを洗浄後、ＰＢＳに希釈した４％ホルムアルデヒドで細胞を固定した。次に、１００％メタノールで−２０℃にて１５分間、細胞を固定し、さらに７０％エタノールに細胞を浸して、４℃で４時間以上脱水を行った。その後、細胞をＰＢＳに浸し、染色まで４℃で保存した。
【００６２】
（抗ストレス顆粒抗体の検出）
ストレス顆粒誘導後の固定した細胞を、５％の正常馬血清を含むＰＢＳを用いてブロッキングした。続いて、ストレス顆粒のマーカーとしてのヤギ抗ｅＩＦ３η抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社製）と患者血清とを、抗体が１μｇ／ｍｌに、患者血清が４０倍希釈となるようにブロッキング溶液と混合し、各ウェルに添加した。次に、プレートを４℃で１時間インキュベートした。各ウェルをＰＢＳで３回洗浄後、Ｃｙ２ラベルしたロバ抗ヤギ抗体とＣｙ３ラベルしたロバ抗ヒト抗体と、核染色用のＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８（１ｎｇ／ｍｌ）とをＰＢＳに希釈し、各ウェルに添加した。プレートを室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄後、スライドグラスに細胞を固定し、蛍光顕微鏡（オリンパスシステム生物顕微鏡ＢＸ５３）で観察した。
【００６３】
（結果）
ｅＩＦ３ηに結合したヤギ抗ｅＩＦ３η抗体には、Ｃｙ２ラベルしたロバ抗ヤギ抗体が結合するので、Ｃｙ２の蛍光により細胞質内に凝集したＳＧを検出できる。患者血清に抗ＳＧ抗体が存在する場合、ストレス顆粒に結合した抗ＳＧ抗体にＣｙ３ラベルしたロバ抗ヒト抗体が結合するので、Ｃｙ２で検出されたストレス顆粒の位置に重なってＣｙ３の蛍光が観察される。
【００６４】
患者血清に抗ＳＧ抗体が検出された症例、すなわち抗ＳＧ抗体陽性症例の染色例を図１および図２に示す。図１ａの矢印は、Ｃｙ２の蛍光を示し、細胞質に形成されたＳＧの局在を示す。図１ｂの矢印は、Ｃｙ３の蛍光を示し、ヒト抗体（ＩｇＧ）の局在を示す。図１ｃは、図１ａと図１ｂとを重ね合わせた画像を示す。ＳＧの局在を示すＣｙ２の蛍光とヒト抗体の局在を示すＣｙ３の蛍光の位置が一致している。このため、当該症例の患者血清には、抗ＳＧ抗体が含まれていることが示された。
【００６５】
図２は、抗ＳＧ抗体陽性かつ抗核抗体陽性である症例の染色例を示す。図１と同様に、図２ａ、図２ｂおよび図２ｃから抗ＳＧ抗体陽性を確認できる。さらに、ヒト抗体の局在を示すＣｙ３の蛍光がＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８で染色された核内に確認できるので（図２ｂ）、当該症例の患者血清には、抗核抗体が含まれていることが示された。なお、抗核抗体のパターンは、ＦＬＵＯＲＯ  ＨＥＰＡＮＡ  ＴＥＳＴで検出されたパターンと同一であった。このことから、本方法によれば、抗核抗体の検出能を維持しながら抗ＳＧ抗体の検出が可能である。
【００６６】
本方法で抗ＳＧ抗体を検出したところ、９０症例のうち１５症例（１７％）が抗ＳＧ抗体陽性症例であった。表２は、陽性症例の特徴を示す。なお、図１及び図２は、表１の症例１３および症例１４の結果を示す。
【００６７】
【表２】
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【００６８】
陽性症例の診断は、診断未確定関節炎５例、関節リウマチ４例、ＲＳ３ＰＥ、クローン病、全身性強皮症、レイノー現象、シェーグレン症候群、変形性関節症が各々一例であった。一例のレイノー現象を除く症例が関節痛を主訴とする症例であった。
【００６９】
抗ＳＧ抗体陽性の１５症例の中で、抗核抗体陽性の症例は２例のみであった。抗核抗体陽性の２症例は、いずれも斑紋型であった。抗細胞質抗体は全例で陰性であった。抗ＳＧ抗体陽性の１５症例には、リウマチ因子（ＲＦ）陽性が４症例（症例１、１０、１３、１４）、ＡＣＰＡ陽性が２例（症例１１、１３）であった。なお、リウマチ因子の正常範囲は、１５．０ＩＵ／ｍｌ未満である。ＡＣＰＡの正常範囲は、４．５Ｕ／ｍｌ未満である。表２中の「Ｎ．Ｄ．」は未決定を意味する。
【００７０】
リウマチ因子陽性の４例およびＡＣＰＡ陽性の２例を除く９例は、関節リウマチ関連の自己抗体が陰性であったにも関わらず、抗ＳＧ抗体が検出された点は特筆に値する。関節リウマチの確定診断に至った症例は４例あったが（症例２、１１、１３、１５）、ＲＦおよびＡＣＰＡがともに明らかに陽性であった症例は症例１３のみで、他の３症例はＲＦおよびＡＣＰＡがともに陰性（症例２、１５）、あるいはＡＣＰＡのみが低タイターで陽性であった（症例１１）。
【００７１】
本実施例で示された結果により、関節リウマチに関連する自己抗体が陰性の症例であっても、抗ＳＧ抗体の検出によって関節リウマチなどの自己免疫疾患の症例または自己免疫疾患を発症する可能性のある症例を見出すことができる。したがって、抗ＳＧ抗体の検出は、これまで診断し得なかった自己免疫疾患の診断の一助になるうえ、自己免疫疾患への易罹患性を判定に有効である。
【００７２】
上述した実施の形態は、本発明を説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。すなわち、本発明の範囲は、実施の形態ではなく、特許請求の範囲によって示される。そして、特許請求の範囲内およびそれと同等の発明の意義の範囲内で施される様々な変形が、本発明の範囲内とみなされる。
【産業上の利用可能性】
【００７３】
本発明は、自己免疫疾患の診断および治療に好適である。
【図１】
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【図２】
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