(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
エンメイソウ（Ｉｓｏｄｏｎ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ  Ｈａｒａ）の植物体又はその含水有機溶媒抽出物、１´−ピペリジン−プロピオン酸又はその塩、及びアスコルビン酸及び／又はその誘導体；あるいは、
エンメイソウ（Ｉｓｏｄｏｎ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ  Ｈａｒａ）の植物体又はその含水有機溶媒抽出物、イザヨイバラ抽出物、及びアスコルビン酸及び／又はその誘導体の組み合わせからなることを特徴とするＳｉｒｔｕｉｎ−１活性化剤、
ここで、前記アスコルビン酸及び／又はその誘導体は、2-O-メチルアスコルビン酸、2-O-エチルアスコルビン酸、2-O-n-プロピルアスコルビン酸、2-O-n-ブチルアスコルビン酸等の2-O-アルキルアスコルビン酸；3-O-メチルアスコルビン酸、3-O-エチルアスコルビン酸、3-O-n-プロピルアスコルビン酸、3-O-イソプロピルアスコルビン酸、3-O-n-ブチルアスコルビン酸、3-O-イソブチルアスコルビン酸等の3-O-アルキルアスコルビン酸；アスコルビン酸モノアルキルエステル類；アスコルビン酸ジアルキルエステル類；アスコルビン酸トリアルキルエステル類；アスコルビン酸トリエステル類；アスコルビン酸グルコシド類又はその塩から選択される１種又は複数種である。
【請求項２】
前記含水有機溶媒抽出物が１，３−ブチレングリコール溶液抽出物であることを特徴とする請求項１に記載のＳｉｒｔｕｉｎ−１活性化剤。
【請求項３】
前記アスコルビン酸及び／又はその誘導体が、2-O-エチルアスコルビン酸であることを特徴とする請求項１又は２に記載のＳｉｒｔｕｉｎ−１活性化剤。
【請求項４】
エンメイソウの植物体が、その葉、茎、又は全草であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載のＳｉｒｔｕｉｎ−１活性化剤。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のＳｉｒｔｕｉｎ−１活性化剤を含む、Ｓｉｒｔｕｉｎ−１活性化のための組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はSirtuin-1活性化剤を提供する。
【背景技術】
【０００２】
近年、長寿遺伝子として、NAD+依存性脱アセチル化酵素であるサーチュイン（Sirtuin）遺伝子が注目されている。最初に酵母においてSir2遺伝子が同定されており、酵母や線虫などの下等生物を使った実験系によりSir2を欠損させると寿命が短縮し、過剰発現させると寿命が延長することが報告されている（非特許文献１及び２）。Sir2遺伝子は、哺乳類においても保存されており、Sirtuin-1からSirtuin-7まで同定されている。中でも、酵母Sir2と構造や機能が最も類似していることから、Sirtuin-1に注目が集まっている。【０００３】
Sirtuin-1が標的とするタンパク質は同定されており、その研究から細胞内代謝、エネルギー消費、炎症及びストレス応答経路等に関与していると考えられている。また、Sirtuin-1遺伝子の活性化は、動脈硬化、糖尿病、心疾患、癌、糖尿病性合併症、神経障害痛、微小血管機能障害、ミトコンドリア性疾患、ミトコンドリア性筋障害、神経変性病（例えば、アルツハイマー病、筋委縮性硬化症、パーキンソン病）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、及び乾癬の治療、並びに寿命延長に有用であると考えられている（非特許文献３及び４）。【０００４】
これまでに、サーチュイン活性化物質としては、ブドウの果皮などにも含まれるレスベラトロール、イチゴ等やリンゴに含まれるフィセチンと言ったポリフェノール化合物や、ＳＲＴ１７２０等の非ポリフェノール化合物が知られている。英国の大手製薬会社であるグラクソ・スミソクライン社は、Sirtuin-1活性化物質の開発を精力的に行なっており、例えばＳＲＴ２１０４は、２型糖尿病、骨粗しょう症・サルコペニア、さらには骨格筋萎縮の予防に効果があると報告されており（非特許文献５）、現在臨床試験が進められている。更に、近年ではボタンボウフウを含むSirtuin-1活性化剤も知られている（特許文献１）。【０００５】
一方、エンメイソウ（Isodon japonicus Hara)の植物体又はその抽出物には、Ｌ−アスコルビン酸等と混合した皮膚外用剤の形態で美白効果を有すること（特許文献２）、ビタミンＣ等と混合した皮膚外用剤の形態で抗老化効果を有すること（特許文献３）、などが知られている。また、エンメイソウ等のシソ科ヤマハッカ属植物の抽出物を配合した皮膚外用剤は、肌のほてり、肌荒れ、カミソリ負けなどを防止する効果があることも知られている（特許文献４）。【０００６】
エンメイソウ（延命草）は、シソ科ヤマハッカ属に属する植物である。北海道南部から九州及び朝鮮半島に分布しやや乾燥した山地に生える多年草である。日本の民間薬で古来から苦味健胃薬として広く用いられている。茎、葉を薬用として用い、消化不良、食欲不振、腹痛などに効果があるといわれている。苦味主成分のエンメインのほか、エンメイン−トリアセテート、インドカルビン、ノドシン、イソドトリシン、トリコドニン、ポニシジン等を含む。和名をヒキオコシという（非特許文献６及び７）。【０００７】
エンメイソウに上記のような薬用効果があることは古来より知られている。そして、サーチュイン（Sirtuin）遺伝子が長寿遺伝子として知られてから１７年程経っている。しかしながら、エンメイソウの植物体又はその抽出物がSirtuin-1活性化作用を有することはこれまでに一切報告されていない。更に、エンメイソウの植物体又はその抽出物は、1'-ピペリジン-プロピオン酸及び／又はその塩、イザヨイバラ抽出物、並びアスコルビン酸及び／又はその誘導体から選択される１種又は複数種の成分（特許文献５〜１０等）と組み合わせると、そのSirtuin-1活性化作用が更に亢進されることも報告されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特許第５６６６０５３号公報
【特許文献２】特開平１１−１８０８５３号公報
【特許文献３】特開２０１１−６３５１３号公報
【特許文献４】特開平５−１７８８６号公報
【特許文献５】特許第４８６５２５１号公報
【特許文献６】国際公開第２０１２／１５７５８７号
【特許文献７】特開２００９−２４２３４５号公報
【特許文献８】特開平１１−４９６５５号公報
【特許文献９】特開２０１２−１９３１３６号公報
【特許文献１０】特開２００４−１８２６２４号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Genes Dev., 13(19): 2570-80 (1999)
【非特許文献２】Nature, 410(6825): 227-30 (2001）
【非特許文献３】Nat. Rev. Drug Discov., 7(10): 841-853 (2008)
【非特許文献４】J. Invest. Dermatol., 129(1): 41-49 (2009)
【非特許文献５】Evi M. Mercken et.al., Aging Cell (2014)
【非特許文献６】原色牧野和漢薬草大図鑑、p447、北隆館出版(1988)
【非特許文献７】原色牧野植物大図鑑、p482、北隆館出版(1982)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の課題は、Sirtuin-1活性化剤の提供にある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、鋭意研究の結果、エンメイソウ（Isodon japonicus Hara）（別名「延命草」「ヒキオコシ」）の植物体又はその抽出物が、Sirtuin-1活性化剤として機能することを見出した。さらに、本発明者らは、エンメイソウのSirtuin-1活性化の効果は、1'-ピペリジン-プロピオン酸及び／又はその塩、イザヨイバラ抽出物、並びアスコルビン酸及び／又はその誘導体から選択される１種又は複数種の成分と組み合わせると更に亢進されることも見出した。以上の発見により、以下の発明を完成するに至った：
（１）エンメイソウ（Isodon japonicus Hara）の植物体又はその溶媒抽出物からなることを特徴とするSirtuin-1活性化剤。
（２）1'-ピペリジン-プロピオン酸及び／又はその塩、イザヨイバラ抽出物、並びアスコルビン酸及び／又はその誘導体から選択される１種又は複数種の成分を更に含有することを特徴とする（１）に記載のSirtuin-1活性化剤。
（３）前記溶媒抽出物が1,3-ブチレングリコール溶液抽出物であることを特徴とする（１）又は（２）に記載のSirtuin-1活性化剤。
（４）前記アスコルビン酸及び／又はその誘導体が、2-O-エチルアスコルビン酸であることを特徴とする（２）又は（３）に記載のSirtuin-1活性化剤。
（５）エンメイソウの植物体が、その葉、茎、又は全草であることを特徴とする（１）〜（４）のいずれか１項に記載のSirtuin-1活性化剤。
（６）（１）〜（５）のいずれか１項に記載のSirtuin-1活性化剤を含む、組成物。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のSirtuin-1活性化剤の投与により、Sirtuin-1を活性化することができる。本発明によれば、Sirtuin-1活性化剤を含有する組成物や皮膚外用剤を提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明のSirtuin-1活性化剤の投与により、Sirtuin-1を活性化することができる。Sirtuin-1遺伝子の活性化は、動脈硬化、糖尿病、心疾患、癌、糖尿病性合併症、神経障害痛、微小血管機能障害、ミトコンドリア性疾患、ミトコンドリア性筋障害、神経変性病（例えば、アルツハイマー病、筋委縮性硬化症、パーキンソン病）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、及び乾癬の治療、並びに寿命延長に有用である。
【００１４】
本発明におけるSirtuin-1遺伝子の活性化とは、例えばSirtuin-1遺伝子の発現を亢進させること、例えば何も付与していない状態（コントロール）に比べて、Sirtuin-1活性化剤を付与した場合にSirtuin-1遺伝子の発現が亢進していることを意味し得る。例えば、有意水準を5％とした統計学的有意差をもって亢進していることを意味することもある。あるいは、本発明におけるSirtuin-1遺伝子の活性化とは、例えば何も付与していない状態（コントロール）に比べて、Sirtuin-1活性化剤を付与した場合に、Sirtuin-1遺伝子の発現が、例えば10％以上、20％以上、30％以上、40％以上、50％以上、60％以、70％以上、80％以上、90％以上、100％以上、200％以上、300％以上、400％以上、又は500％以上亢進していることを意味し得る。
【００１５】
本発明のSirtuin-1活性化剤は、皮膚に外用すること及び／又は経口的に摂取することが可能なエンメイソウ（Isodon japonicus Hara)抽出物を有効成分として含有する。
【００１６】
本発明で用いられるエンメイソウ（Isodon japonicus Hara）（別名「延命草」）はシソ科ヤマハッカ属に属する植物である。北海道南部から九州及び朝鮮半島に分布しやや乾燥した山地に生える多年草である（非特許文献６及び７）。
【００１７】
エンメイソウは生のままでも乾燥したものでも使用することができるが、使用性、製剤化等の観点から抽出物あるいは乾燥粉末として用いることが好ましい。
【００１８】
本発明で用いる抽出物の抽出方法は溶媒抽出により行うことができる。溶媒抽出の場合には、植物の全草あるいは各種部位（葉、花、根等）を必要に応じて乾燥させ、更に必要に応じて細断又は粉砕した後、水性抽出剤、例えば冷水、温水、又は沸点若しくはそれより低温の熱水、あるいは含水有機溶媒、有機溶媒、例えば1,3-ブチレングリコール、メタノール、エタノール、エーテル等を常温で又は加熱して用いることにより抽出される。しかしながら、抽出方法は溶媒抽出に限定されず、当業界で知られている常用の手法によってもよく、本発明で用いる抽出物の抽出方法や抽出物の形態は、本発明の効果を損なわない限り任意である。上記抽出物の形態は、抽出液自体だけでなく、常用の手法により適宜希釈又は濃縮したものであってもよく、更に、抽出液を乾燥することによって得られる粉状あるいは塊状の固体であってもよい。
【００１９】
本発明に用いられる抽出溶媒は、含水有機溶媒が好ましく、特に含水1,3-ブチレングリコール、含水メタノール、含水エタノール又は等の含水低級アルコールを選ぶことが好ましく、含水1,3-ブチレングリコールが最も好ましい。その場合の含水率は、例えば20〜80v/v％である。含水率は、30〜70v/v％、40〜60v/v％等であってもよい。
【００２０】
乾燥粉末を得る方法としては、植物の全草あるいは各種部位（葉、花、根等）を細断又は粉砕し、その後に乾燥する方法や植物を乾燥した後に細断又は粉砕して乾燥粉末を得る方法がある。また、植物を細断又は粉砕し、発酵や酵素処理を施した後、乾燥し、更に必要に応じて所定の粒径にすべく粉砕する方法等を適宜採ることができる。
【００２１】
本発明のSirtuin-1活性化剤は、エンメイソウの植物体又はその溶媒抽出物を含む。
【００２２】
本発明のSirtuin-1活性化剤は、1'-ピペリジン-プロピオン酸及び／又はその塩、イザヨイバラ抽出物、並びにアスコルビン酸及び／又はその誘導体から選択される１種又は複数種の成分を更に含有してもよい。
【００２３】
1'-ピペリジン-プロピオン酸は、以下の一般式（Ｉ）の化合物である。
【００２４】
【化１】
0006783858.tif 000002
【００２５】
1'-ピペリジン-プロピオン酸は、公知の物質であり、公知の方法により容易に合成できる（特許文献５〜７）。また市販品を容易に入手できる。
【００２６】
また、本発明に係る上記一般式（Ｉ）で示される1'-ピペリジン-プロピオン酸は公知の方法により無機塩又は有機塩とすることができる。本発明において用いられる塩としては、特に限定されないが、例えば、無機塩としては、塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩、臭化水素酸塩、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、アンモニウム塩等が挙げられる。有機塩としては、酢酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、メタンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、トリエタノールアミン塩、ジエタノールアミン塩、アミノ酸塩等が挙げられる。
【００２７】
イザヨイバラ抽出物は、常法により得ることができる（特許文献８および９）。例えば、イザヨイバラ植物体の一部又は全部を抽出溶媒と共に常温で又は加熱還流した後、濾過、濃縮して得ることができる。溶媒抽出の前に、抽出部位を乾燥させてもよい。抽出部位は任意であるが、果実抽出物であることが特に好ましい。抽出溶媒としては、通常抽出に用いられる溶媒を任意に用いることができる。例えば、水、含水有機溶媒、有機溶媒、例えば、1,3-ブチレングリコール、メタノール、エタノール、エーテル等が使用できる。
【００２８】
アスコルビン酸及び／又はその誘導体は、一般にビタミンＣといわれ、強い還元作用を有する（特許文献１０）。アスコルビン酸誘導体としては、2-O-メチルアスコルビン酸、2-O-エチルアスコルビン酸、2-O-n-プロピルアスコルビン酸、2-O-n-ブチルアスコルビン酸等の2-O-アルキルアスコルビン酸；3-O-メチルアスコルビン酸、3-O-エチルアスコルビン酸、3-O-n-プロピルアスコルビン酸、3-O-イソプロピルアスコルビン酸、3-O-n-ブチルアスコルビン酸、3-O-イソブチルアスコルビン酸等の3-O-アルキルアスコルビン酸；アスコルビン酸モノアルキルエステル類；アスコルビン酸ジアルキルエステル類；アスコルビン酸トリアルキルエステル類；アスコルビン酸トリエステル類；アスコルビン酸グルコシド類などが挙げられる。アスコルビン酸及びその誘導体は、塩の形態であってもよい。このような塩としては、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩、アルカノールアミン塩、アミノ酸塩等が挙げられる。本発明では、2-O-エチルアスコルビン酸（ビタミンＣエチル）を使用することが好ましい。2-O-エチルアスコルビン酸はアスコルビン酸の２位の水酸基をエトキシ化して合成することができる。
【００２９】
本発明のSirtuin-1活性化剤は、皮膚外用又は経口摂取等により投与することができる。本発明のSirtuin-1活性化剤を投与する場合、本発明の有効成分をSirtuin-1活性化の効果が十分発揮されるような量で適用することが好ましい。エンメイソウの植物体又はその溶媒抽出物の配合量は、それらの種類、目的、形態、利用方法などに応じて、適宜決めることができる。
【００３０】
本発明のSirtuin-1活性化剤を皮膚外用剤又は経口摂取剤として利用する場合には、外用剤又は経口剤全量に対して、植物体又はその溶媒抽出物の乾燥重量が、0.001〜10重量％程度になるように調製することが好ましく、0.01〜10重量％程度がより好ましく、0.1〜10重量％程度だと更に好ましい。
【００３１】
また、本発明のSirtuin-1活性化剤を経口摂取剤として利用する場合には、成人１人当たりのエンメイソウの植物体又はその溶媒抽出物の摂取量は、0.16〜約16ｇ（乾燥重量換算）程度、より好ましくは0.8〜約8ｇ（乾燥重量換算）程度になるように調製するのが好ましい。
【００３２】
本発明のSirtuin-1活性化剤は、エンメイソウ抽出物、1'-ピペリジン-プロピオン酸、及びアスコルビン酸及び／又はその誘導体の組み合わせを含むことが好ましく、エンメイソウ抽出物、イザヨイバラ抽出物、及びアスコルビン酸及び／又はその誘導体の組み合わせを含むことも好ましい。上記組合せのなかでも特に、アスコルビン酸及び／又はその誘導体が2-O-エチルアスコルビン酸であることが好ましい。
【００３３】
本発明のSirtuin-1活性化剤における、エンメイソウの植物体又はその抽出物に対する1'-ピペリジン-プロピオン酸、イザヨイバラ抽出物、及びアスコルビン酸及び／又はその誘導体の比率は任意であるが、例えば、重量換算で、1：0〜10：0〜10：0〜10（＝エンメイソウ抽出物：1'-ピペリジン-プロピオン酸：イザヨイバラ抽出物：アスコルビン酸及び／又はその誘導体）等が挙げられる。また、1：0.001〜0.5：0.001〜0.5（＝エンメイソウ抽出物：1'-ピペリジン-プロピオン酸：アスコルビン酸及び／又はその誘導体）、1：0.001〜0.5：0.001〜0.5（＝エンメイソウ抽出物：イザヨイバラ抽出物：アスコルビン酸及び／又はその誘導体）等の様々な組み合わせ及び比率を採用することができる。
【００３４】
本発明のSirtuin-1活性化剤における、エンメイソウの植物体又はその抽出物に対する1'-ピペリジン-プロピオン酸、イザヨイバラ抽出物、及びアスコルビン酸及び／又はその誘導体の比率は任意である。例えば、重量換算で、1：0〜10：0〜10：0〜10（＝エンメイソウ抽出物：1'-ピペリジン-プロピオン酸：イザヨイバラ抽出物：2-O-エチルアスコルビン酸）等が挙げられる。
【００３５】
また、エンメイソウの植物体又はその抽出物に対する1'-ピペリジン-プロピオン酸の重量比は、通常1：0〜10、中でも1：0〜5、更には1：0.001〜0.5とすることができる。
【００３６】
また、エンメイソウの植物体又はその抽出物に対するイザヨイバラ抽出物の重量比は、通常1：0〜10、中でも1：0〜5、更には1：0.001〜0.5とすることができる。
【００３７】
また、エンメイソウの植物体又はその抽出物に対するアスコルビン酸及び／又はその誘導体の重量比は、通常1：0〜10、中でも1：0〜5、更には1：0.001〜0.5とすることができる。
【００３８】
なお、以上の比率はあくまでも例示であり、その他にも様々な組み合わせ及び比率を採用することができる。
【００３９】
配合する場合、本発明のSirtuin-1活性化剤における1'-ピペリジン-プロピオン酸、イザヨイバラ抽出物、及びＬ−アスコルビン酸の配合量も適宜決めることができる。本発明のSirtuin-1活性化剤を皮膚外用剤又は経口摂取剤として利用する場合には、皮膚外用剤又は経口剤全量に対して、各成分がそれぞれ0.0005〜10重量％程度になるように調製することが好ましく、0.005〜10重量％程度だとより好ましい。
【００４０】
本発明のSirtuin-1活性化剤を皮膚外用剤などの組成物に含有してもよい。皮膚外用剤等に配合する場合、その形態は、粉末状、液状、固形状、顆粒状、ペースト状、ゲル状、乳液状、クリーム状、シート状、スプレー状、泡状、パウダー状等の様々な形態であり得る。また、化粧水、乳液、クリーム、美容液、ローション、パック、クレンジング、洗顔料、石鹸、ボディソープ、シャンプー、ヘアスプレー等の各種化粧品の形態であってもよい。また、軟膏等の医薬品、医薬部外品等であってもよい。
【００４１】
本発明の皮膚外用剤は、上記の1'-ピペリジン-プロピオン酸、イザヨイバラ抽出物、及びＬ−アスコルビン酸以外に、本発明の効果を損なわない範囲で、医薬部外品、化粧品、医薬品等に用いられる他の成分、例えば、美白剤、保湿剤、酸化防止剤、紫外線吸収剤、皮膚栄養剤等油分、界面活性剤、粉末、色材、水、アルコール類、増粘剤、キレート剤、シリコーン類、香料、各種薬効成分、防腐剤、ｐＨ調整剤、中和剤等を必要に応じて適宜配合することができる。
【００４２】
また、本発明のSirtuin-1活性化剤は、経口摂取用の組成物に含有してもよい。経口摂取の形態としては、例えば、粉末状、液体状、錠剤等の固形、顆粒、粒状、ペースト状、ゲル状など任意に選択することができる。また、該組成物は、乾燥粉末、お茶や清涼飲料水などの飲料、サプリメントなどの錠剤及びカプセル剤、レトルト食品等の加工食品、デザート等の嗜好品、調味料、乳製品、油脂加工品等の食品であってもよい。
【００４３】
前記組成物には、必要に応じて添加剤を任意に選択し併用することができる。添加剤としては賦形剤等を含ませることができる。賦形剤としては、所望の剤型としたときに通常用いられるものであれば何でも良く、例えば、コムギデンプン、コメデンプン、トウモロコシデンプン、バレイショデンプン、デキストリン、シクロデキストリンなどのでんぷん類、結晶セルロース類、乳糖、ブドウ糖、砂糖、還元麦芽糖、水飴、フラクトオリゴ糖、乳化オリゴ糖などの糖類、ソルビトール、エリスリトール、キシリトール、ラクチトール、マンニトールなどの糖アルコール類が挙げられる。これら賦形剤は、単独で又は二種以上組み合わせて使用できる。
【００４４】
その他の着色剤、保存剤、増粘剤、結合剤、崩壊剤、分散剤、安定化剤、ゲル化剤、酸化防止剤、界面活性剤、保存剤、ｐＨ調整剤等については、公知のものを適宜選択して使用できる。
【実施例】
【００４５】
次に実施例によって本発明をさらに詳細に説明する。なお、本発明はこれにより限定されるものではない。【００４６】
実験１：エンメイソウ抽出物の作製
エンメイソウの地上部を、50v/v％ 1,3-ブチレングリコール水溶液に室温で１週間浸漬した。この浸漬液を濾過し、濾過液を減圧濃縮して回収することにより、エンメイソウ抽出物を調製した。この抽出物の組成は以下の表１の通りである。【００４７】
【表１】
0006783858.tif 000003
【００４８】
実験２：エンメイソウ抽出物を含有する細胞実験用培地の調製
HuMedia−KB2（クラボウ）にHuMedia−KG増殖添加剤セットを添加した培地（KGM培地）に、実験１で作製したエンメイソウ抽出物を加えて、以下の表２に示す組成を有する細胞実験用培地を調製した。
【表２】
0006783858.tif 000004
【００４９】
実験３：Sirtuin-1発現に対するエンメイソウの効果
定量的ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）法による評価
ヒト正常ケラチノサイトを２４ウェルマルチプレートに播種し、サブコンフルエントになるまで培養した。その後、表２の組成を有する各培地にて24時間インキュベートし、ＰＢＳで洗浄後、ＭａｇＮＡ Ｐｕｒｅ ＬＣ（ロシュ・ダイアグノスティックス）を用いて細胞からｍＲＮＡを抽出した。次に逆転写酵素ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＶＩＬＯ（インビトロジェン）のキットを用いてｃＤＮＡを合成した。このｃＤＮＡを鋳型にＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（ロシュ・ダイアグノスティックス）で蛍光色素ＣｙｂｅｒＧｒｅｅｎを用いたリアルタイムＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は９５℃、１０分間の酵素活性化ののち、９５℃１５秒・６０℃１０秒・７２℃１０秒の増幅反応を３０回繰り返した。遺伝子発現量は、一定量のＰＣＲ産物が得られるまでのサイクル数から相対値を算出した。ＲＴ−ＰＣＲはSirtuin-1遺伝子の他に内部標準としてＧ３ＰＤＨ（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）遺伝子についても行い、Sirtuin-1の相対発現量をＧ３ＰＤＨの相対発現量で補正することによって薬剤の評価を行った。【００５０】
結果を表３に示す。表３に示すSirtuin-1発現量は、製剤を投与しない培地で培養した対照のSirtuin-1発現量を100とした場合の値である。【００５１】
【表３】
0006783858.tif 000005
【００５２】
表３に示すように、エンメイソウ抽出物を含有する製剤を投与すると、投与しない対照と比べてSirtuin-1の発現量が増加した。Sirtuin-1の発現量を増加する効果は、培地１が最も高く、対照と比べて約1.6倍高い値を示した。また、培地２や培地３でも対照と比べてそれぞれ約1.5倍及び約1.3倍という値を示した。このことから、エンメイソウ抽出物は、単独でも優れたSirtuin-1活性化効果があるが、1'-ピペリジン-プロピオン酸及び2-O-エチルアスコルビン酸の組み合わせや、イザヨイバラ抽出物及び2-O-エチルアスコルビン酸との組み合わせで更に高い効果を発揮することがわかる。