(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
顕微鏡を試験片上に自動的に合焦するための方法であって、
試験片を含む基体を顕微鏡の光軸に実質的に垂直に配置することと、
反射光ビームを生成するべく光源からの光ビームを前記試験片に反射するように誘導することと、
前記基体と前記顕微鏡の対物レンズとの間の距離を変化させることと、
前記反射光ビームの１つ又は複数の特徴の複数の測定値を検出器で収集することと、この場合、前記複数の測定値のそれぞれは、前記基体が前記対物レンズに対して前記顕微鏡の光軸に沿った異なる位置にあるときに収集され、
前記反射光ビームの１つ又は複数の特徴をもとに、前記複数の測定値のいずれが最適なＦ値を有するかを判定することと、
前記基体及び／又は前記対物レンズを、前記反射光ビームに関する測定値が最適なＦ値を有する前記基体と前記対物レンズとの間の距離に対応する最初の焦点位置に移動させることと、
前記最初の焦点位置の不確定性区間をイメージングに用いられる前記対物レンズの被写界深度で割ることによって、最良の焦点位置を見つけるために収集するデジタルイメージの数を決定すること、
前記基体及び／又は前記対物レンズを光軸に沿って前記最初の焦点位置よりも上及び／又は下に複数のステップで移動させることによって前記基体の前記決定した数のデジタルイメージを収集することと、この場合、各ステップは前記顕微鏡の被写界深度に等しく、
各イメージに関するフォーカスメトリックを判定するために少なくとも各イメージ内の関心領域を分析することと、
どのデジタルイメージが最良のフォーカスメトリックを有するかを判定することと、
前記顕微鏡を前記試験片上に自動的に合焦するために最良のフォーカスメトリックを有するイメージの位置に対応する最終焦点位置に前記基体及び／又は前記対物レンズを移動させることと、
を含む方法。
【請求項２】
前記光源がレーザを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記光源が発光ダイオード（ＬＥＤ）を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
平行光ビームをもたらすべく前記光源からの光ビームを整形することを含む、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記顕微鏡が、自動合焦に用いられる第１の光源とイメージングに用いられる第２の光源との２つの別個の光源を備える、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記第１の光源からの光ビームを前記第２の光源からの光ビームに対してスペクトルシフトすることを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記第１の光源が、３６０ｎｍ〜１，０００ｎｍのスペクトル範囲内の放射波長を有するレーザ又はＬＥＤであり、前記第２の光源が、３９０ｎｍ〜７００ｎｍのスペクトル範囲内の放射波長を有する白色光源である、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記顕微鏡が少なくとも２つの別個の検出チャネルを備え、第１の検出チャネルは自動合焦に用いられ、第２の検出チャネルはイメージングに用いられ、前記方法が、自動合焦に用いられる反射光ビームを前記イメージングに用いられる第２の検出チャネルから分離することを含む、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記顕微鏡が、自動合焦に用いられる第１の検出チャネルと、前記試験片から来る光ビームの少なくとも一部を収集するのに用いられる８つまでの異なるイメージング検出チャネルを備える、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記反射光ビームを生成するべく第１の光源からの光ビームを前記試験片に反射するように誘導することが、前記光ビームを前記試験片上に合焦するべく前記対物レンズの後ろの射出瞳を通して導入し、前記射出瞳の後ろで同じ対物レンズを通過する反射光ビームを収集することを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
前記反射光ビームを生成するべく光源からの光ビームを前記試験片に反射するように誘導することが、前記光ビームを前記対物レンズに面する前記試験片の前面から反射させることを含む、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記反射光ビームを生成するべく光源からの光ビームを前記試験片に反射するように誘導することが、前記光ビームを前記対物レンズとは反対方向に面する前記試験片の底面から反射させることを含む、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記自動合焦に用いられる検出チャネルがフォトダイオードを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
前記イメージングに用いられる検出チャネルがイメージセンサ装置又はＣＣＤカメラを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１５】
前記イメージセンサ装置が、カラーイメージセンサ装置又はカラーＣＣＤカメラである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記試験片のデジタルイメージが、前記カラーイメージセンサ装置又はＲＧＢ  ＣＣＤカメラによって収集される赤色、緑色、及び青色（ＲＧＢ）光から形成される合成イメージである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記反射光ビームを前記検出器上に合焦するために前記対物レンズの後ろ側に集束レンズを配置することを含む、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
前記方法が、前記試験片の焦点面よりも上又は下に存在する１つ又は複数の境界面から反射される焦点が合っていない光ビームを遮断するべく集束レンズの焦点面の空間開口を検出器の前に配置することを含む、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
前記空間開口が可変の直径を有し、前記方法が前記空間開口の直径を変化させることを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
どの測定値が最適なＦ値を有するかを判定することが、前記反射光ビームの強度を測定することを含む、請求項１〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
どのデジタルイメージが最良のフォーカスメトリックを有するかを判定することが、赤色、緑色、又は青色のデジタルイメージの強度をピクセル毎に測定することを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】
どのデジタルイメージが最良のフォーカスメトリックを有するかを判定することが、グレースケールイメージの強度をピクセル毎に測定することを含む、請求項１〜２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
どのイメージが最良のフォーカスメトリックを有するかを判定することが、前記デジタルイメージの強度の第１の微分をピクセル毎に計算することを含む、請求項１〜２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
どのイメージが最良のフォーカスメトリックを有するかを判定することが、前記デジタルイメージの強度の第２の微分をピクセル毎に計算することを含む、請求項１〜２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
どのイメージが最良のフォーカスメトリックを有するかを判定することが、デジタル化された強度イメージのフーリエ変換を計算することを含む、請求項１〜２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
前記基体がガラススライドを含む、請求項１〜２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
前記試験片が生体サンプルを含む、請求項１〜２６のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
前記試験片の少なくとも一部が可変の厚さを有する、請求項１〜２７のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
前記試験片の少なくとも一部が不規則な表面を有する、請求項１〜２８のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
前記試験片の少なくとも一部が可変の反射率値を有する、請求項１〜２９のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
前記試験片が、前記基体の１つ又は複数の寸法にわたる可変のイメージコンテンツを有する、請求項１〜３０のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
前記基体と前記対物レンズとの間の距離を変化させることが、前記基体及び／又は前記対物レンズを可変の速度で移動させることを含む、請求項１〜３１のいずれかに記載の方法。
【請求項３３】
前記基体と前記対物レンズとの間の距離を変化させることが、前記基体及び／又は前記対物レンズを一定の速度で移動させることを含む、請求項１〜３１のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
前記顕微鏡の被写界深度が、０．１５μｍ〜１０μｍの範囲である、請求項１に記載の方法。
【請求項３５】
前記最良の焦点位置を見つけるために収集される前記試験片のイメージの数が、３〜１０の範囲である、請求項１に記載の方法。
【請求項３６】
前記顕微鏡を前記基体上の場所に自動的に合焦するのに必要とされる時間の量が２秒以下である、請求項１〜３５のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる２０１５年２月１８日に出願された米国特許仮出願第６２／１１７，８５８号の利益を主張するものである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００２】
顕微鏡を用いる試験片の自動イメージングは、複数の異なる基体のいずれかに関する最適な焦点位置を迅速且つ正確に判定することを必要とする。さらに、自動イメージングシステムは、そのイメージコンテンツが基体にわたって可変であり得る異なる試験片のタイプを確実に取り扱うことができなければならない。加えて、自動イメージング技術は、顕微鏡において基体が存在するかどうか、及び基体がイメージングのために適正に配向されるかどうかを判定することができる必要がある。対象となるシステム及び方法は、これらの及び他の必要性に対処するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００３】
顕微鏡を試験片上に自動的に合焦し、試験片の合焦されたイメージを収集するための方法、システム、及び装置が提供される。方法の態様は、顕微鏡における基体の存在を検出することと、基体がイメージングのための正しい配向にあるかどうかを判定することと、顕微鏡を基体上に設置される試験片上に合焦することと、試験片の１つ又は複数のイメージを収集することを含む。対象となる方法を実施するためのシステム及び装置も提供される。
【０００４】
一部の実施形態では、顕微鏡を試験片上に自動的に合焦するための方法は、試験片を含む基体を顕微鏡の光軸に実質的に垂直に配置することと、反射光ビームを生成するべく光源からの光ビームを試験片に反射するように誘導することと、基体と顕微鏡の対物レンズとの間の距離を変化させることと、反射光ビームの１つ又は複数の特徴の複数の測定値を検出器で収集することと、この場合、複数の測定値のそれぞれは、基体が対物レンズに対して顕微鏡の光軸に沿った異なる位置にあるときに収集され、どの測定値が最適なＦ値（ｆｏｃａｌ  ｖａｌｕｅ）を有するかを判定することと、基体及び／又は対物レンズを、反射光ビームに関する測定値が最適なＦ値を有する基体と対物レンズとの間の距離に対応する最初の焦点位置に移動させることと、基体及び／又は対物レンズを光軸に沿って最初の焦点位置よりも上及び／又は下に移動させることによって基体の複数のデジタルイメージを収集することと、各イメージに関するフォーカスメトリックを判定するために少なくとも各イメージ内の関心領域を分析することと、どのデジタルイメージが最良のフォーカスメトリックを有するかを判定することと、顕微鏡を試験片上に自動的に合焦するために最良のフォーカスメトリックを有するイメージの位置に対応する最終焦点位置に基体及び／又は対物レンズを移動させることと、を含む。
【０００５】
一部の実施形態では、光源はレーザを含む。一部の実施形態では、光源は発光ダイオード（ＬＥＤ）を含む。一部の実施形態では、方法は、平行光ビームをもたらすべく光源からの光ビームを整形することを含む。一部の実施形態では、顕微鏡は、自動合焦に用いられる第１の光源とイメージングに用いられる第２の光源との２つの別個の光源を含む。一部の実施形態では、方法は、第１の光源からの光ビームを第２の光源からの光ビームに対してスペクトルシフトすることを含む。一部の実施形態では、第１の光源は、３６０ｎｍ〜１，０００ｎｍのスペクトル範囲内の放射波長を有するレーザ又はＬＥＤであり、第２の光源は、３９０ｎｍ〜７００ｎｍのスペクトル範囲内の放射波長を有する白色光源である。
【０００６】
一部の実施形態では、顕微鏡は少なくとも２つの別個の検出チャネルを含み、第１の検出チャネルは自動合焦に用いられ、第２の別個の検出チャネルはイメージングに用いられ、方法は、自動合焦に用いられる反射光ビームをイメージングに用いられる第２の検出チャネルから分離することを含む。一部の実施形態では、顕微鏡は、自動合焦に用いられる第１の検出チャネルと、試験片から来る光ビームの少なくとも一部を収集するのに用いられる８つまでの異なるイメージング検出チャネルを含む。一部の実施形態では、反射光ビームを生成するべく第１の光源からの光ビームを試験片に反射するように誘導することは、光ビームを試験片上に合焦するべく対物レンズの後ろの射出瞳を通して導入し、射出瞳の後ろで同じ対物レンズを通過する反射光ビームを収集することを含む。一部の実施形態では、反射光ビームを生成するべく光源からの光ビームを試験片に反射するように誘導することは、光ビームを対物レンズに面する試験片の前面から反射させることを含む。一部の実施形態では、反射光ビームを生成するべく光源からの光ビームを試験片に反射するように誘導することは、光ビームを対物レンズとは反対方向に面する試験片の底面から反射させることを含む。
【０００７】
一部の実施形態では、自動合焦に用いられる検出チャネルは、フォトダイオードを含む。一部の実施形態では、イメージングに用いられる検出チャネルは、イメージセンサ装置又はＣＣＤカメラを含む。一部の実施形態では、イメージセンサ装置は、カラーイメージセンサ装置又はカラーＣＣＤカメラである。一部の実施形態では、試験片のデジタルイメージは、カラーイメージセンサ装置又はＲＧＢ  ＣＣＤカメラによって収集される赤色、緑色、及び青色（ＲＧＢ）光から形成される合成イメージである。
【０００８】
一部の実施形態では、方法は、反射光ビームを検出器上に合焦するべく対物レンズの後ろ側に集束レンズを配置することを含む。一部の実施形態では、方法は、試験片の焦点面よりも上又は下に存在する１つ又は複数の境界面から反射される焦点が合っていない光ビームを遮断するべく集束レンズの焦点面の空間開口を検出器の前に配置することを含む。一部の実施形態では、空間開口は可変の直径を有し、方法は、空間開口の直径を変化させることを含む。
【０００９】
一部の実施形態では、どの測定値が最適なＦ値を有するかを判定することは、反射光ビームの強度を測定することを含む。一部の実施形態では、どのデジタルイメージが最適なフォーカスメトリックを有するかを判定することは、赤色、緑色、又は青色のデジタルイメージの強度をピクセル毎に（ｏｎ  ａ  ｐｉｘｅｌ  ｂｙ  ｐｉｘｅｌ  ｂａｓｉｓ）測定することを含む。一部の実施形態では、どのデジタルイメージが最良のフォーカスメトリックを有するかを判定することは、グレースケールイメージの強度をピクセル毎に測定することを含む。一部の実施形態では、どのイメージが最良のフォーカスメトリックを有するかを判定することは、デジタルイメージの強度の第１の微分をピクセル毎に計算することを含む。一部の実施形態では、どのイメージが最良のフォーカスメトリックを有するかを判定することは、デジタルイメージの強度の第２の微分をピクセル毎に計算することを含む。一部の実施形態では、どのイメージが最良のフォーカスメトリックを有するかを判定することは、デジタル化された強度イメージのフーリエ変換を計算することを含む。
【００１０】
一部の実施形態では、基体は、ガラススライドを含む。一部の実施形態では、試験片は生体サンプルを含む。一部の実施形態では、試験片の少なくとも一部は可変の厚さを有する。一部の実施形態では、試験片の少なくとも一部は不規則な表面を有する。一部の実施形態では、試験片の少なくとも一部は可変の反射率値を有する。一部の実施形態では、試験片は基体の１つ又は複数の寸法にわたる可変のイメージコンテンツを有する。
【００１１】
一部の実施形態では、基体と対物レンズとの間の距離を変化させることは、基体及び／又は対物レンズを可変の速度で移動させることを含む。一部の実施形態では、基体と対物レンズとの間の距離を変化させることは、基体及び／又は対物レンズを一定の速度で移動させることを含む。一部の実施形態では、対物レンズに対する光軸に沿った複数の位置から試験片の複数のイメージを収集することは、基体及び／又は対物レンズを複数のステップで移動させることを含み、各ステップは顕微鏡の被写界深度に等しい。一部の実施形態では、顕微鏡の被写界深度は、０．１５μｍ〜１０μｍの範囲である。
【００１２】
一部の実施形態では、方法は、最初の焦点位置の不確定性区間をイメージングに用いられる対物レンズの被写界深度で割ることによって、最良の焦点位置を見つけるために収集するイメージの数を決定することを含む。一部の実施形態では、収集される試験片のイメージの数は、３〜１０の範囲である。一部の実施形態では、顕微鏡を基体上の場所に自動的に合焦するのに必要とされる時間の量は２秒以下である。
【００１３】
一部の実施形態では、方法は、光源からの光ビームを、基体が存在する場合に基体が反射光ビームを生成することが見出されるべき場所へ誘導することと、反射光ビームの強度を検出器で測定することと、顕微鏡において基体が存在するかどうかを判定するために反射光ビームの強度が閾値を超過するかどうかを判定することと、を含む。
【００１４】
一部の実施形態では、方法は、平坦な表面を含む基体を顕微鏡の光軸に実質的に垂直に配置することと、２つの反射光ビームを生成するべく光源からの光ビームを平坦な表面上の第１の位置及び第２の異なる位置に順次に反射するように誘導すること、この場合、第１の位置は非反射性領域を含み、第２の位置は反射性領域を含み、基体と顕微鏡の対物レンズとの間の距離を変化させることと、２つの反射光ビームの１つ又は複数の特徴の複数の測定値を検出器で収集することと、この場合、複数の測定値のそれぞれは、基体が対物レンズに対して顕微鏡の光軸に沿った異なる位置にあるときに収集され、２つの反射光ビームの測定値が閾値を超過する量だけ互いに異なるかどうかを判定することと、２つの反射光ビームの測定値が閾値を超過する量だけ互いに異なる場合に、顕微鏡において基体が適正に配向されると判定することと、２つの反射光ビームの測定値が閾値を超過する量だけ互いに異ならない場合に、顕微鏡において基体が不適正に配向されると判定することと、を含む。
【００１５】
一部の実施形態では、２つの反射光ビームの１つ又は複数の特徴の複数の測定値を収集することは、２つの反射光ビームの強度を測定することを含む。一部の実施形態では、方法は、集束レンズ及び空間開口を検出器の前に配置することを含む。
【００１６】
一部の実施形態では、光源からの光ビームは、紫外（ＵＶ）光、可視光、又は赤外線（ＩＲ）光を含む。一部の実施形態では、基体はガラススライドを含む。一部の実施形態では、光源はレーザを含む。一部の実施形態では、光源は発光ダイオード（ＬＥＤ）を含む。
【００１７】
一部の実施形態では、方法は、平行光ビームをもたらすべく光源からの光ビームを整形することを含む。一部の実施形態では、基体と対物レンズとの間の距離を変化させることは、基体及び／又は対物レンズを可変の速度で移動させることを含む。一部の実施形態では、基体と対物レンズとの間の距離を変化させることは、基体及び／又は対物レンズを一定の速度で移動させることを含む。一部の実施形態では、顕微鏡における基体の配向を自動的に分析するのに必要とされる時間の量は１秒以下である。
【００１８】
一部の実施形態では、方法は、第１の反射光ビームを生成するべく光源からの第１の光ビームを第１の位置で基体に反射するように誘導することと、第１の反射光ビームの強度を検出器で測定することと、顕微鏡において基体が存在することを判定するために第１の反射光ビームの強度が閾値を超過することを判定することと、第２の反射光ビームを生成するべく光源からの第２の光ビームを第２の異なる位置で基体に反射するように誘導することと、この場合、第２の位置は非反射性領域を含み、基体と顕微鏡の対物レンズとの間の距離を変化させることと、第１及び第２の反射光ビームの１つ又は複数の特徴の複数の測定値を検出器で収集すること、この場合、複数の測定値のそれぞれは、基体が対物レンズに対して顕微鏡の光軸に沿った異なる位置にあるときに収集され、第１の反射光ビームの測定値が第２の反射光ビームの測定値とは閾値を超過する量だけ異なることを判定し、これにより、顕微鏡において基体が適正に配向されると判定することと、第１の反射光ビームの１つ又は複数の特徴の複数の測定値を検出器で収集すること、この場合、複数の測定値のそれぞれは、基体が対物レンズに対して顕微鏡の光軸に沿った異なる位置にあるときに収集され、どの測定値が最適なＦ値を有するかを判定することと、基体及び／又は対物レンズを、第１の反射光ビームに関する測定値が最適なＦ値を有する基体と対物レンズとの間の距離に対応する最初の焦点位置に移動させることと、基体及び／又は対物レンズを光軸に沿って最初の焦点位置よりも上及び／又は下に移動させることによって基体の複数のデジタルイメージを収集することと、各イメージに関するフォーカスメトリックを判定するために少なくとも各イメージ内の関心領域を分析することと、どのデジタルイメージが最良のフォーカスメトリックを有するかを判定することと、顕微鏡を試験片上に自動的に合焦するために最良のフォーカスメトリックを有するイメージの位置に対応する最終焦点位置に基体及び／又は対物レンズを移動させることと、を含む。一部の実施形態では、顕微鏡を試験片上に自動的に合焦するのに必要とされる時間の量は２秒以下である。
【００１９】
本発明は、添付図と併せて読むときに、以下の詳細な説明から最も良く理解され得る。添付図に含まれるのは以下の図面である。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】基体のｚ軸位置の関数としての、基体からの反射時に収集されたフォトダイオードカウントの単位の反射光信号を示すグラフであり、ｚ軸は顕微鏡の光軸と平行である。
【図２】ノイズに起因するフォトダイオード信号におけるピーク位置のｚ座標を判定する際の不確定性区間又はサーチ区間を示すグラフである。
【図３】本発明の実施形態に係る光学系の概略図である。
【図４】２つの非反射性マーキングを含む基体の例示である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
顕微鏡を試験片上に自動的に合焦し、試験片の合焦されたイメージを収集するための方法、システム、及び装置が提供される。方法の態様は、顕微鏡における基体の存在を検出することと、基体がイメージングのための正しい配向にあるかどうかを判定することと、顕微鏡を基体上に配置される試験片上に合焦することと、試験片の１つ又は複数のイメージを収集することを含む。対象となる方法を実施するためのシステム及び装置も提供される。
【００２２】
本発明がさらに詳細に説明される前に、この発明は、もちろん変化する可能性があるものとして、説明された特定の実施形態に限定されないことが理解される。本明細書で用いられる用語は、特定の実施形態を説明する目的のためだけのものであって、本発明の範囲が付属の請求項によってのみ制限されることになるため、限定するものとなることを意図されないことも理解される。
【００２３】
値の範囲が提供される場合、文脈上他の意味に明白に規定される場合を除き、下限の単位の１０分の１までの中間にある各値、該範囲の上限と下限との間、及び表記された該範囲内のあらゆる他の表記された値又は中間にある値は、本発明内に包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限及び下限は、より小さい範囲に独立して含まれてもよく、且つまた本発明内に包含され、表記された範囲内のあらゆる具体的に除外される限界（ｌｉｍｉｔ）の対象になる。表記された範囲が限界の一方又は両方を含む場合、これらの含まれた限界のいずれか又は両方を除外する範囲もまた本発明に含まれる。
【００２４】
ある範囲が、「約」という用語に先行されている数値とともに提示されている。「約」という用語は、それが先行する正確な数、ならびに、この用語が先行する数に近いか、または近似的である数の文字支援を提供するために本明細書で使用される。数が具体的に記載された数に近いか、または近似的であるかどうかを決定する際に、近い、または近似的な記載されていない数は、それが提示されている文脈において、具体的に記載された数の実質的均等物を提供する数であってもよい。
【００２５】
他に定めのない限り、本明細書で用いられるすべての技術用語及び科学用語は、この発明が属する技術分野の当業者によって通例理解されるものと同じ意味をもつ。本明細書に記載のものと類似した又は等価なあらゆる方法及び材料もまた本発明の実践又は試験に用いることができるが、代表的な例証となる方法及び材料がここで説明される。
【００２６】
本明細書で挙げられたすべての刊行物及び特許は、個々の各刊行物又は特許が参照により組み入れられるように特異的に及び個々に示されたかのように参照により本明細書に組み入れられ、且つ挙げられた刊行物との関連において方法及び／又は材料を開示し及び説明するために参照により本明細書に組み入れられる。あらゆる刊行物の引用は、出願日よりも前のその開示のためであって、本発明が先願発明の理由に基づきこうした公開の日付を実際より早める権利をもたないことを認めるものと解釈されるべきではない。さらに、提供された公開日は、実際の公開日とは異なる場合があり、独立して確認される必要がある場合がある。
【００２７】
本明細書及び付属の請求項で用いられる、単数形の「ひとつの（ａ、ａｎ）」、及び「該、前記（ｔｈｅ）」は、文脈上他の意味に明白に規定される場合を除き、複数形の指示対象を含むことに留意されたい。請求項は、あらゆる随意的な要素を除外するように起草されてもよいことにさらに留意されたい。従って、この記述は、請求項の要素の列挙又は「消極的な」限定の使用との関連において「単独で」、「のみ」などのような排他的用語の使用のための先行詞基準として作用することを意図される。
【００２８】
本開示を読めば当業者には明らかとなるように、本明細書で説明され例証される個々の実施形態の各々は、本発明の範囲又は精神から逸脱することなく他の幾つかの実施形態のいずれかの機能部から容易に分離されてもよい又はいずれかの機能部と組み合わされてもよい個別の構成要素及び機能部を有する。あらゆる列挙される方法は、列挙される事象の順番で又は論理的に可能なあらゆる他の順番で実行することができる。
【００２９】
本発明の実施形態の種々の態様をさらに詳細に説明するにあたり、種々の実施形態のシステム及び装置の態様が最初にさらに詳細に説明され、次に、本発明の特定の実施形態に係る方法及びキットが概説される。
【００３０】
方法
本発明の実施形態に係る方法は、顕微鏡において基体（例えば、顕微鏡スライド）が存在するかどうかを自動的に検出し、顕微鏡において基体がイメージング分析のために適正に配向されるかどうかを判定し、顕微鏡を基体上に配置される試験片上に合焦し、試験片の１つ又は複数のイメージを収集するために用いられてよい。一部の実施形態では、対象となる方法は、自動機器を用いて実施することができ、機器は、方法ステップのそれぞれを自動的に実施するように構成される。一部の実施形態では、対象となる方法の１つ又は複数のステップは、手動で、例えば、オペレータによって実施することができる。例えば、一部の実施形態では、オペレータは、対象となる方法の一部を実施してよく、残りの方法ステップは、例えば、対象となる方法ステップの少なくとも一部を実施するように構成される自動機器を用いて実施されてよい。対象となる方法の態様が以下でさらに詳しく説明される。
【００３１】
一部の実施形態では、対象となる方法は、顕微鏡の光源からの光ビームを、顕微鏡において基体が存在する場合に基体が見つかるべき場所へ誘導することによって、顕微鏡において基体が存在するかどうかを判定することを含む。基体が存在する場合、光ビームが基体に反射して反射光ビームが生成される。次いで、検出器を用いて反射光ビームの強度が測定され、測定された強度が閾値と比較される。測定された反射光ビームの強度が閾値を超過する場合、顕微鏡において基体が存在すると判定される。測定された反射光ビームの強度が閾値を超過しない場合、顕微鏡において基体が存在しないと判定される。一部の実施形態では、顕微鏡において基体が存在するかどうかを判定するのに用いられる閾値強度値は、フォトダイオードによって測定される場合に４０〜５１０ｎＡの範囲である。
【００３２】
一部の実施形態では、対象となる方法は、イメージングのために顕微鏡の試験片ホルダ上で基体が適正に配向されるかどうかを判定するために基体を自動的に分析することを含む。「適正に配向される」とは、顕微鏡が合焦されることになる基体の表面が顕微鏡の対物レンズに対向するように基体が顕微鏡の試験片ホルダ上に配置されることを意味する。一部の実施形態では、顕微鏡ホルダ上で基体が適正に配向されるかどうかを判定するための方法は、光源からの光ビームを、基体表面の反射率が違う２つの異なる位置で順次に反射するように誘導することを含む。一部の実施形態では、２つの反射光ビームが生成され、その１つは基体の非反射性領域から、もう１つは基体の反射性領域から生成される。
【００３３】
基体の非反射性領域に反射している光ビームは、基体の反射性領域（例えば、ガラススライドの変化のない表面）に反射している光ビームの特徴とは異なる特徴（例えば、強度値）を有することになる。したがって、第１の反射光ビームと第２の反射光ビームの１つ又は複数の特徴を互いに比較することができ、特徴の差異を定量化することができる。例えば、対象となる方法の一部の実施形態では、基体の反射性領域と非反射性領域からの反射光ビームの強度を互いに比較することができ、その差異の値が、基体の配向が適正であるかどうかを判定するために閾値と比較される。
【００３４】
２つの反射光ビームからの測定値が閾値を超過する量で互いに異なる場合に、顕微鏡において基体が適正な配向にあると判定される。２つの反射光ビームからの測定値が閾値を超過する量で互いに異ならない場合、顕微鏡において基体が不適正な配向にあると判定される。一部の実施形態では、対象となる方法は、基体を顕微鏡の光軸に沿って複数の異なる位置を通って移動させるために、基体と顕微鏡の対物レンズとの間の距離を変化させることを含む。基体を顕微鏡の光軸に沿って複数の異なる位置を通って移動させることは、基体と対物レンズとの間の距離が変調される（例えば、増加又は減少する）ように、基体を移動させること、対物レンズを移動させること、又は基体と対物レンズとの両方を移動させることによって達成することができる。基体が顕微鏡の光軸に沿って複数の位置を通って移動されている間に、１つ又は複数の検出器を用いて１つ又は複数の反射光ビームの１つ又は複数の特徴の複数の測定値を収集することができる。
【００３５】
一部の実施形態では、２つの反射光ビームのそれぞれからの測定値が、測定値間の差異を定量化するために比較される。一部の実施形態では、対象となる方法は、基体と顕微鏡の対物レンズとの間の距離を一定の速度で変化させることを含み、或る実施形態では、速度は、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、又は４５０μｍ／ｓなどの１００〜５００μｍ／ｓの範囲である。一部の実施形態では、対象となる方法は、基体と顕微鏡の対物レンズとの間の距離を可変の速度で変化させることを含む。例えば、一部の実施形態では、対象となる方法は、基体と顕微鏡の対物レンズとの間の距離を第１の時間にわたって１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、又は４５０μｍ／ｓなどの１００〜５００μｍ／ｓの範囲の第１の速度で変化させることと、基体と顕微鏡の対物レンズとの間の距離を第２の時間にわたって１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、又は４５０μｍ／ｓなどの１００〜５００μｍ／ｓの範囲の第２の速度で変化させることを含む。一部の実施形態では、顕微鏡において基体が適正に配向されるかどうかを自動的に判定するための対象となる方法は、２秒以下又は１秒以下で実施される。
【００３６】
一部の実施形態では、対象となる方法は、光ビームが検出器に到達する前に集束レンズ及び空間開口（さらに後述する）を通過するように、集束レンズ及び空間開口を検出器の前に配置することを含む。一部の実施形態では、空間開口は、そのサイズ（例えば、直径）が１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、又は４５０μｍなどの５０μｍ〜５００μｍの範囲の開口を含む。一部の実施形態では、空間開口は、そのサイズ（例えば、直径）が可変の開口を含み、対象となる方法は、開口を通過できる光ビームの部分を変化させるべく空間開口の直径を変化させることを含む。或る実施形態では、対象となる方法は、空間開口の直径を、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、又は４５０μｍなどの５０μｍ〜５００μｍの範囲で変化させることを含む。
【００３７】
顕微鏡において基体が適正に配向されるかどうかを判定するための対象となる方法は、種々の適切な単色光源（さらに後述する）のいずれかからの光を用いて行うことができる。一部の実施形態では、光源からの光は、３６０〜４２０ｎｍの範囲の波長を有する紫外光を含んでよい。一部の実施形態では、光源からの光は、４２０〜７００ｎｍの範囲の波長を有する可視光（例えば、白色光）を含んでよい。一部の実施形態では、光源からの光は、７００ｎｍ〜１μｍの範囲の波長を有する近赤外光を含んでよい。
【００３８】
一部の実施形態では、対象となる方法は、顕微鏡を試験片上に自動的に合焦することを含み、方法は、基体及び／又は顕微鏡の対物レンズを、最良の焦点位置の近傍に存在する（例えば、いくつかの被写界深度の或る区間内に存在する）顕微鏡の光軸に沿って最初の焦点位置に移動させることと、或るサーチ区間内の光軸に沿った異なる座標でとられる基体の複数のデジタルイメージを収集することと、収集したイメージを分析することと、最良の焦点位置を見つけるためにどのイメージが最良のフォーカスメトリックを有するかを判定することを含む。一部の実施形態では、サーチ区間は、対物レンズに関する被写界深度の１０倍未満に等しい。「被写界深度」とは、対物レンズの開口数によって決定される、顕微鏡の光軸と平行な方向の顕微鏡の対物レンズの軸方向又は長手方向の解像力を意味する。最良のフォーカスメトリックを有するイメージは、所与の対物レンズに関する顕微鏡の最良の焦点位置に対応する。対象となる方法のこれらの態様のそれぞれが以下でさらに詳しく説明される。
【００３９】
一部の実施形態では、方法は、最初の焦点位置を見つけるために用いられる基体からの反射光ビームの１つ又は複数の特徴を生成及び測定することを含む。或る実施形態では、方法は、適切な光源からの光ビームを、試験片に反射して反射光ビームを生成するように基体へ誘導することを含む。基体と顕微鏡の対物レンズとの間の距離は、基体又は対物レンズのいずれか又は両方を光軸に沿って特定の区間内で移動させることによって変化され、反射光ビームの１つ又は複数の特徴の複数の測定値が収集される。収集された測定値は、どの測定値がピーク値を有するかを判定するべく分析される。「ピーク値」とは、対物レンズの位置に対する顕微鏡の光軸に沿った基体の位置の関数としての、最大強度値を有する反射光ビームからの測定値を意味する。ピーク位置（反射ビームの最大強度値の軸方向の座標に対応する）が突き止められると、基体及び／又は対物レンズをこの位置に（又はこの位置の上又は下のいずれかの近傍内に）移動させることができ、これは最良の焦点位置を識別するべくさらにサーチする際に用いられる最初の位置となる。
【００４０】
前述のように、一部の実施形態では、対象となる方法は、基体と顕微鏡の対物レンズとの間の距離を一定の速度で変化させることを含み、或る実施形態では、速度は、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、又は４５０μｍ／ｓなどの１００〜５００μｍ／ｓの範囲である。一部の実施形態では、対象となる方法は、基体と顕微鏡の対物レンズとの間の距離を可変の速度で変化させることを含む。例えば、一部の実施形態では、対象となる方法は、基体と顕微鏡の対物レンズとの間の距離を第１の時間にわたって１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、又は４５０μｍ／ｓなどの１００〜５００μｍ／ｓの範囲の第１の速度で変化させることと、基体と顕微鏡の対物レンズとの間の距離を第２の時間にわたって１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、又は４５０μｍ／ｓなどの１００〜５００μｍ／ｓの範囲の第２の速度で変化させることを含む。通常、より速い速度は、最初の焦点位置よりもさらに下又は上に存在する区間内の移動に対応し、一方、より遅い速度は、最初の焦点位置により近い区間内の移動に対応する。例えば、サーチ区間が４００μｍに等しい（最初の焦点位置よりも２００μｍ下で始まって２００μｍ上で終わる）場合、最初の焦点位置よりも２００μｍ〜５０μｍ下及び最初の焦点位置よりも５０μｍ〜２００μｍ上の区間内の移動に関して、速度は２００μｍ／ｓとすることができ、一方、最初の焦点位置よりも５０μｍ下及び５０μｍ上の区間内の移動に関して、速度は１００μｍ／ｓとすることができる。
【００４１】
一部の実施形態では、対象となる方法は、光ビームの一部を分析のための検出器に到達する前に制御及び／又は変調するために、光ビームを検出器に到達する前に整形することを含む。したがって、一部の実施形態では、方法の態様は、光ビームが検出器に到達する前に集束レンズ及び空間開口（さらに後述する）を通過するように、集束レンズ及び空間開口を検出器の前に配置することを含む。一部の実施形態では、空間開口は、そのサイズ（例えば、直径）が１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、又は４５０μｍなどの５０〜５００μｍの範囲の開口を含む。一部の実施形態では、空間開口は、そのサイズ（例えば、直径）が可変の開口を含み、対象となる方法は、開口を通過できる光ビームの部分を変化させるべく空間開口の直径を変化させることを含む。或る実施形態では、対象となる方法は、空間開口の直径を、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、又は４５０μｍなどの５０〜５００μｍの範囲で変化させることを含む。
【００４２】
顕微鏡を試験片上に自動的に合焦し、試験片の１つ又は複数のデジタルイメージを収集するための対象となる方法は、種々の適切な光源（さらに後述する）のいずれかからの単色光を用いて行うことができる。一部の実施形態では、光源からの光は、３６０ｎｍ〜４００ｎｍの範囲の波長を有する紫外光を含んでよい。一部の実施形態では、光源からの光は、４００〜７００ｎｍの範囲の波長を有する可視光（例えば、白色光）を含んでよい。一部の実施形態では、光源からの光は、７００ｎｍ〜１，０００ｎｍの範囲の波長を有する近赤外光を含んでよい。
【００４３】
一部の実施形態では、対象となる方法は、自動合焦及びイメージングに用いられる別個の光源を有する顕微鏡を用いて実施される。一部の実施形態では、自動合焦に用いられる光源とイメージングに用いられる光源は、同じタイプの光を含んでもよく、例えば、両方とも同じ波長のレーザ光又はＬＥＤ光を含んでよい。一部の実施形態では、自動合焦に用いられる光源は、その波長がイメージングに用いられる光源の波長とは異なる光を含む。例えば、或る実施形態では、対象となる方法は、近赤外（又は紫外）光ビームを自動合焦に用い、一方、ブロードスペクトルを有する可視光（白色光源）をイメージングに用いることを含む。
【００４４】
或る実施形態では、対象となる方法は、平行光ビームをもたらすべく光源からの光ビームを整形することを含む。「平行光ビーム」とは、その光線が互いに実質的に平行であり、したがって、スペースを通って移動する際に最小限に拡散する、光ビームを意味する。或る実施形態では、光源からの光ビームを平行光ビームに整形するために１つ又は複数の光学部品が用いられてよい。例えば、一部の実施形態では、コリメートレンズ又はいくつかのレンズの組合せが、光ビームの経路内に配置され、光源からの光ビームを平行光ビームに整形するのに用いられてよい。
【００４５】
一部の実施形態では、対象となる方法を行うのに用いられる顕微鏡は、少なくとも２つの別個の検出チャネルを含み、一方の検出チャネルは自動合焦用であり、他方の検出チャネルはイメージング用であり、これにより、自動合焦信号とイメージング信号を分離し、それらを異なる検出器へ誘導する。或る実施形態では、イメージング用の検出チャネルの数は、１つよりも多くすることができ、この場合、試験片を出てくる光ビームは、特定の異なる用途によって必要とされる場合にいくつかの検出チャネルに分割される。例えば、試験片のイメージングのために蛍光信号が収集される場合、顕微鏡は、自動合焦のための１つの検出チャネルと、イメージングのための８つもの異なる検出チャネルを含むことができる。
【００４６】
一部の実施形態では、対象となる方法は、反射光ビームを特定の経路に従うように誘導することを含む。例えば、一部の実施形態では、光ビームは、光ビームを対物レンズの後ろに存在する射出瞳に導入することによって試験片に反射するように誘導することができる。射出瞳を通って対物レンズに入った後で、光ビームは、試験片に反射して反射光ビームを生成する。或る実施形態では、反射光ビームは、次いで、同じ対物レンズへ戻るように誘導され、同じ対物レンズによって集光され、対物レンズの後方を通って分析のための検出チャネルに出る。
【００４７】
一部の実施形態では、対象となる方法は、光ビームを基体の前面（対物レンズに面する表面）に反射するように誘導することを含む。他の実施形態では、対象となる方法は、光ビームを基体の底面（前面よりも下又は上に存在し、対物レンズとは反対方向に面する表面）に反射するように誘導することを含む。
【００４８】
基体が最初の焦点位置に移動されると、方法の態様は、基体及び／又は対物レンズを光軸に沿って複数の異なる位置に移動させ、異なる位置のそれぞれからの試験片の複数のデジタルイメージを収集することを含む。一部の実施形態では、対象となる方法は、基体及び／又は顕微鏡の対物レンズを顕微鏡の光軸に沿って特定の距離増分で移動させることを含む。或る実施形態では、各ステップのサイズは顕微鏡の被写界深度に等しい。一部の実施形態では、対象となる方法を実施するのに用いられる顕微鏡の被写界深度は、０．１５〜１０μｍの範囲であり、したがって、一部の実施形態では、複数のデジタルイメージを収集するのに用いられる各ステップのサイズは、０．２５、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、又は９μｍなどの０．１５〜１０μｍの範囲である。
【００４９】
対象となる方法の態様は、顕微鏡の光軸に沿って収集する試験片のデジタルイメージの数を決定することを含む。或る実施形態では、収集するデジタルイメージの数を決定することは、最初の焦点位置の不確定性区間又はサーチ区間を、イメージングに用いられる対物レンズの被写界深度で割ることを含む。最初の焦点位置の「不確定性区間」又は「サーチ区間」とは、最初の焦点位置を判定するのに用いられる反射光ビームの測定された特徴の変化（例えば、反射光ビームの強度の変化）が信号ノイズを上回らない距離を意味する。例えば、図２参照。例えば、所与の基体に関して、基体に関する最初の焦点位置を判定するのに用いられる強度ピークが比較的狭く鋭い、すなわち、はっきりしている場合、不確定性区間は小さくなる。対照的に、所与の基体に関する強度ピークが比較的ブロードで平坦な場合、不確定性区間はより大きくなる。一部の実施形態では、収集される試験片のデジタルイメージの数は、４、５、６、７、８、又は９などの３〜１０の範囲である。例えば、開口数０．５の倍率２０の対物レンズに関する不確定性区間が１０μｍと判定され、被写界深度が２μｍである場合、収集されることになるイメージの総数は、１０÷２、すなわち５であり、この場合、１つのイメージが最初の焦点位置で収集され、最初の焦点位置の各側で２つのイメージ（最初の焦点位置よりも下で２つのイメージ及び上で２つのイメージ）が収集される。
【００５０】
一部の実施形態では、方法の態様は、対物レンズのフル視野に対応する全体のデジタルイメージを収集することを含む。或る実施形態では、方法の態様は、視野の或る区域だけを選択することによってイメージの所定の区域（例えば、関心領域、ＲＯＩ）だけを収集することを含む。ＲＯＩは、可変の寸法を有することができ、最小で２×２ピクセル領域から最大でフルサイズイメージまでの範囲にわたる。例えば、検出器のサイズが１９３６×１４５６ピクセルである場合、ＲＯＩは、それぞれ、一方の方向に２ピクセル〜１９３６ピクセル及び他方の方向に２ピクセル〜１４５６ピクセルの範囲内の可変の寸法を有することができる。
【００５１】
方法の態様は、どのイメージが最良のフォーカスメトリックを有するかを判定するべく収集したデジタルイメージを分析することを含む。「最良のフォーカスメトリック」とは、データセットにおけるすべての他の収集したデジタルイメージでの同じ測定値又は特徴を上回る又はより優れているデジタルイメージの測定値又は特徴を意味する。一部の実施形態では、方法の態様は、１つ又は複数の分析アルゴリズムを用いて収集したデジタルイメージのそれぞれに対してデジタルイメージ分析を行うことを含む。或る実施形態では、方法の態様は、試験片のデジタルイメージをピクセル毎に分析することを含み、この場合、デジタルイメージの各個々のピクセルが分析される。次いで、デジタルイメージの特徴を判定するべく各ピクセルの分析の結果が合計又は集計され、次いで、どのデジタルイメージが最良のフォーカスメトリックを有するかを判定するべくデジタルイメージの特徴を他の収集したデジタルイメージ（単数又は複数）に関して判定された同じ特徴と比較することができる。
【００５２】
一部の実施形態では、コンピュータプロセッサを用いて試験片のデジタルイメージを分析することは、イメージ全体の強度（例えば、グレースケール強度）をピクセル毎に測定することを含む。一部の実施形態では、方法の態様は、デジタルイメージの強度の第１の微分をピクセル毎に計算することを含む。一部の実施形態では、方法の態様は、デジタルイメージの強度の第２の微分をピクセル毎に計算することを含む。一部の実施形態では、方法の態様は、デジタル化された強度イメージのフーリエ変換を計算することを含む。一部の実施形態では、イメージセンサは、カラーイメージセンサによって収集される赤色光、緑色光、及び／又は青色光から形成される試験片のデジタルイメージを作成するように構成されるカラーイメージセンサを含む。このような実施形態では、方法の態様は、試験片の赤色、緑色、及び／又は青色のデジタルイメージの強度をピクセル毎に測定することを含む。
【００５３】
一部の実施形態では、コンピュータプロセッサを用いて試験片のデジタルイメージを分析することは、顕微鏡の視野内の選択された関心領域（ＲＯＩ）の強度（例えば、グレースケール強度）をピクセル毎に測定することを含む。一部の実施形態では、方法の態様は、ＲＯＩの強度の第１の微分をピクセル毎に計算することを含む。一部の実施形態では、方法の態様は、ＲＯＩの強度の第２の微分をピクセル毎に計算することを含む。一部の実施形態では、方法の態様は、ＲＯＩのフーリエ変換を計算することを含む。一部の実施形態では、さらなる分析のための１つ又は複数のＲＯＩを、異なる色のイメージ（例えば、赤色、緑色、又は青色のイメージ）から選択し、特定の用途のための適切なフォーカスメトリック計算アルゴリズムをもたらすべくイメージ処理によって適切な方法で組み合わせることができる。
【００５４】
一部の実施形態では、顕微鏡を試験片上に自動的に合焦し、最良のフォーカスメトリックを有する試験片のデジタルイメージを収集するための対象となる方法は、４秒以下、３秒以下、２秒以下、又は１秒以下などの５秒以下で実施される。
【００５５】
対象となる方法は、顕微鏡を用いて複数の試験片を自動的に分析する際の使用が見出される。例えば、対象となる方法は、顕微鏡内に基体（例えば、顕微鏡スライド）が存在するかどうか及び顕微鏡において基体が適正に配向されるかどうかを自動的に判定するのに用いられてよい。加えて、対象となる方法は、顕微鏡を基体上に設置される試験片上に自動的に合焦し、最適なフォーカスメトリックを有する試験片のデジタルイメージを収集する際の使用が見出される。最良のフォーカスメトリックを有する試験片のデジタルイメージは、最良の可能なシャープネス又は鮮明度（例えば、手動フォーカスによって達成することができるのと同じシャープネス又は鮮明度）を有し、さらなる分析のために適切である、例えば、試験片の１つ又は複数の部分のさらなる分析を行うのに用いることができる、又はオペレータ又は臨床医がレビューすることができるイメージである。したがって、対象となる方法は、イメージング分析手順を通じて複数の基体を自動的に処理するために用いることができ、この場合、各基体が顕微鏡の試験片ホルダ上に配置され、顕微鏡が基体上の試験片に合焦され、顕微鏡によって最良のフォーカスメトリックを有するデジタルイメージが収集されて、さらなる分析のための適切な試験片のデジタルイメージが生成される。
【００５６】
ここで図１を参照すると、基体のｚ軸位置（ｚ軸は顕微鏡の光軸と平行である）の関数としての、基体からの反射時に光検出器によって収集された（フォトダイオードカウントで測定された）反射信号のグラフが示される。光源からの光のビームは、所定の場所（例えば、ベアガラス又は試験片を含む場所）で基体に反射するように誘導されており、反射光ビームは、フォトダイオード検出器に含まれる検出チャネルに誘導されている。基体が顕微鏡の光軸に沿って期待焦点位置よりも上又は下にある最初のサーチ位置から或る区間だけ移動される際に、フォトダイオードカウントのグラフは、反射信号の最高強度を有する顕微鏡の光軸内の基体の位置に対応する極大値又はピーク値を示す。基体が対物レンズの焦点位置を通過し、表面上の光ビームが最小のスポットに合焦されるときに、反射ビームの最高強度が生じる。極大値のｚ位置が判定されると、ピーク、又は不確定性区間（図２に関連してさらに後述する）内のピーク位置よりも上／下のいずれかにに対応する位置に基体を配置するべく基体及び／又は対物レンズが移動される。
【００５７】
ここで図２を参照すると、基体のｚ軸位置の関数としての、基体からの反射時に光検出器によって収集された（フォトダイオードカウントで測定された）反射信号のグラフが示される。光源からの光のビームは、所定の場所（例えば、ベアガラス又は試験片を含む場所）で基体に反射するように誘導されており、反射光ビームは、フォトダイオード検出器に含まれる検出チャネルに誘導されている。基体が顕微鏡の光軸に沿って移動される際に、フォトダイオードカウントのグラフは、反射ビームの最高強度を有する顕微鏡の光軸内の基体の位置に対応する極大値又はピークを示す。ピーク位置に関する不確定性区間は、両方向矢印で示され、描画されたグラフでは１２μｍのｚ位置の差異（ΔＺ）を表す。
【００５８】
システム及び装置
本発明の態様は、対象となる方法を実施する、例えば、顕微鏡を試験片上に自動的に合焦し、試験片のデジタルイメージを収集するように構成されたシステム及びその装置を含む。対象となるシステム及び方法の種々のコンポーネントが以下で詳細に説明される。
【００５９】
対象となるシステムの態様は、対象となる方法を実施するように構成される光学顕微鏡を含む。本発明の実施形態に係る顕微鏡は、少なくとも１つの対物レンズと、少なくとも１つの光源と、少なくとも１つの検出チャネルを含む。本発明の実施形態に係る対物レンズは、撮像される物体（例えば、基体上に設置された試験片）からの光を収集し、光を合焦して物体の像を作るように構成される。或る実施形態では、対物レンズは、単一のレンズ又はミラーを含んでよく、又は、撮像される物体からの光を収集し、光を合焦して物体の像を作るように構成される複数の光学部品を含んでよい。一部の実施形態では、顕微鏡は、対象となる方法に従って対物レンズと基体との間の距離を変調するように構成されるモータ駆動コンポーネントを含んでよい。
【００６０】
本発明の実施形態に係る対物レンズは、任意の適切な開口数（ＮＡ）を有してよい。対物レンズの開口数は、対物レンズによって放射光信号をどのくらい収集することができるか及び達成可能な回折限界分解能を表す。
【数１】
0006783778.tif 000002
のアッベ回折限界によって定義される関係性により、波長に依存する様態で、より高い開口数は、向上された分解能をもたらす。一部の実施形態では、対物レンズの開口数は、０．１５、０．２、０．２５、０．３、０．３５、０．４、０．４５、０．５、０．５５、０．６、０．６５、０．７、０．７５、０．８、０．８５、０．９、０．９５、１．０、１．０５、１．１、１．１５、１．２、１．２５、１．３、又は１．３５などの、０．１〜１．４の範囲である。
【００６１】
一部の実施形態では、光源は、レーザ又は発光ダイオード（ＬＥＤ）を含んでよい。本発明の実施形態に係る光源は、前述のようにＵＶ光から、可視光まで、赤外光までの範囲の任意の適切な波長を有する光を放出するように構成されてよい（例えば、任意の適切な放射スペクトルを有してよい）。或る実施形態では、対象となる方法は、平行光ビームをもたらすべく光源からの光ビームを整形することを含む。或る実施形態では、光ビームを平行光ビームに整形するために１つ又は複数の光学部品が用いられてよい。例えば、一部の実施形態では、光学コリメートレンズ又はレンズの群が、光ビームの経路内に配置され、光源からの光ビームを平行光ビームに整形するのに用いられてよい。
【００６２】
本発明の実施形態に係る検出チャネルは、光ビームを入力として受信し、入力光ビームを分析のための検出器に誘導するように構成される。一部の実施形態では、検出チャネルは、特定の波長の又は特定の波長範囲の光だけが検出チャネルに入ることができるように構成されてよい。例えば、一部の実施形態では、検出チャネルは、特定の波長範囲の光だけが検出チャネルに入ることができるように構成される光学フィルタを含んでよい。一部の実施形態では、顕微鏡は、それぞれ関連する別個の検出器を有する、複数の検出チャネルを含んでよい。
【００６３】
一部の実施形態では、自動合焦に用いられる検出チャネルは、フォトダイオードを備えた検出器を含んでよい。本発明の実施形態に係るフォトダイオードは、光のフォトンを吸収し、光を測定可能な電流に変換するように構成される。一部の実施形態では、フォトダイオードは、光学フィルタ、レンズ、又は光エネルギーを測定のための電流に変換するのに用いられ得る任意の他の適切なコンポーネントを含んでよい。
【００６４】
一部の実施形態では、イメージングに用いられる検出チャネルは、イメージセンサを備えた検出器を含んでよい。本発明の実施形態に係るイメージセンサは、光学イメージを電気信号に変換するように構成される。イメージセンサの例は、電荷結合素子（ＣＣＤ）及び相補型金属酸化物半導体（ＣＭＯＳ）又はｎ型金属酸化物半導体デバイスを含むがこれらに限定されない。一部の実施形態では、イメージセンサは、アクティブピクセルセンサ（ＡＰＳ）であってよい。或る実施形態では、イメージセンサは、カラーイメージセンサであってよい。一部の実施形態では、カラーイメージセンサは、試験片からの赤色光、緑色光、及び／又は青色光を収集し、収集した赤色光、緑色光、及び／又は青色光から試験片の合成イメージを生成するように構成されてよい。
【００６５】
一部の実施形態では、イメージングに用いられる検出チャネルは、カメラを含んでよい。一部の実施形態では、カメラは、極めて低いノイズ、速いフレームレート、広いダイナミックレンジ、高い量子効率（ＱＥ）、高い分解能、及び広い視野を提供するＣＣＤカメラ又は科学計測用ＣＭＯＳカメラ（ｓＣＭＯＳ）である。このようなカメラは、科学技術専門業者から市販されている。
【００６６】
対象となるシステムの態様はまた、システムにおける光ビームの少なくとも一部を制御及び／又は変調するのに用いることができるさらなるコンポーネントを含んでよい。さらなるコンポーネントの例は、ミラー、レンズ、ビームスプリッタ、プリズム、回折格子、光電子増倍管、光学フィルタ、ビーム整形光学系などを含むがこれらに限定されない。
【００６７】
一部の実施形態では、対象となるシステムの態様は、１つ又は複数の集束レンズを含む。本発明の実施形態に係る集束レンズは、光ビームの合焦に適切な方法で影響するように構成される任意のレンズを含む。例えば、一部の実施形態では、集束レンズは、光ビームを所望の焦点に合焦するように構成される。
【００６８】
一部の実施形態では、対象となるシステムの態様は、１つ又は複数の空間開口を含む。本発明の実施形態に係る空間開口（空間フィルタとしても知られている）は、システムの１つ又は複数の光学部品の不完全性又はバリエーションに起因する光ビームの収差を除去するように構成されるコンポーネントである。一部の実施形態では、空間開口は、光ビームの光路内に配置され、光ビームの望ましくない部分又は構造に対応する光を遮断しながら光ビームの所望の部分が開口を通過することを可能にする、開口又は開口部を含む。本発明の実施形態に係る空間開口は、光が通過することを可能にする小さい円形開口又は「ピンホール」開口を含んでよい。一部の実施形態では、空間開口は、その直径が１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、又は４５０μｍなどの５０μｍ〜５００μｍの範囲の開口を有する。或る実施形態では、空間開口は、そのサイズが可変の開口を含んでよく、対象となる方法は、空間開口のサイズを変化させること（例えば、直径を変化させること）を含んでよい。或る実施形態では、空間開口は、そのサイズを１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、又は４５０μｍなどの５０μｍ〜５００μの範囲で変化させることができる開口を含んでよい。
【００６９】
本発明の態様は、透明な材料で作製された硬質構造体又は半硬質構造体である基体を含む。このような材料は、プラスチック、ガラス、及び／又は石英を含むがこれらに限定されない。一部の実施形態では、基体は、任意の適切な材料で作製され、四角形、長方形、円形、楕円形、又は六角形の幾何学的形状などの任意の適切な幾何学的形状を有する、顕微鏡スライドである。
【００７０】
一部の実施形態では、基体の寸法（例えば、長さ）は、約２０ｍｍから約２５ｍｍまで、約３０ｍｍまで、約３５ｍｍまで、約４０ｍｍまで、約４５ｍｍまで、約５０ｍｍまで、約５５ｍｍまで、約６０ｍｍまで、約６５ｍｍまで、約７０ｍｍまで、約７５ｍｍまで、約８０ｍｍまでのサイズの範囲である。一部の実施形態では、基体の別の寸法（例えば、幅）は、約２０ｍｍから約２５ｍｍまで、約３０ｍｍまで、約３５ｍｍまで、約４０ｍｍまで、約４５ｍｍまで、約５０ｍｍまで、約５５ｍｍまで、約６０ｍｍまで、約６５ｍｍまで、約７０ｍｍまで、約７５ｍｍまで、約８０ｍｍまでのサイズの範囲である。一部の実施形態では、基体の厚さは、約０．５ｍｍから約０．８ｍｍまで、約１ｍｍまで、約１．２ｍｍまで、約１．５ｍｍまでの範囲である。一部の実施形態では、基体は、およそ７５ｍｍの長さ、２５ｍｍの幅、及び１ｍｍの厚さの標準的な顕微鏡スライドである。
【００７１】
一部の実施形態では、基体は、ポリマー（例えば、ポリ−Ｌ−リジン、シラン）又はタンパク質（例えば、アルブミン）を含有するものなどの１つ又は複数の表面コーティング又は表面処理を含んでよい。一部の実施形態では、基体は、フロスティング処理又はグレイジング処理などの基体の少なくとも一部を不透明又は半透明にする表面コーティング又は表面処理を含む。一部の実施形態では、基体は、例えば、適切なラベルをつけることができる端部領域又は角部領域などのラベリングに用いることができる領域を含む。一部の実施形態では、基体は、例えば、基体の表面にラベルを貼る器具、ラベルを作製するべく基体をエッチングする及び／又はマークをつける器具、又はラベルを作製するべく基体の表面にインク及び／又は任意の他の適切なマーキング材料をプリント又は塗布する器具などのラベリング器具を用いてラベル付けされる。一部の実施形態では、基体は、基体を識別するのに用いることができるバーコードラベルを含んでよい。
【００７２】
一部の実施形態では、基体は、基体の平坦な表面上に１つ又は複数の非反射性領域を含み、対象となる方法は、光源からの光ビームを基体の非反射性領域に反射するように誘導することを含む。本発明の実施形態に係る非反射性領域は、任意の適切な形状及び寸法を有してよい。例えば、一部の実施形態では、非反射性領域は、円形、楕円形、四角形、長方形、又は六角形の形状であってよい。本発明の実施形態に係る非反射性領域は、２〜５ｍｍなどの１〜１０ｍｍの範囲の寸法（例えば、直径又は辺の長さ）を有してよい。本発明の実施形態に係る非反射性領域は、任意の適切な厚さを有してよい。一部の実施形態では、非反射性領域の厚さは、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、又は０．９ｍｍなどの０〜１ｍｍの範囲であってよい。基体の非反射性領域は、限定はされないが、基体の表面上に非反射性コーティングを堆積すること、例えばエッチング技術を用いて基体の表面を改質することなどを含む任意の適切な技術を用いて作製されてよい。
【００７３】
一部の実施形態では、対象となるシステムの態様は、基体上に配置されている１つ又は複数の試験片を含む。対象となる方法を用いる分析を適用できる試験片は、限定はされないが、固体組織又は半固体組織、生物学的流体、細胞（例えば、血球）、生体分子などを含む任意のタイプの生体組織を含む。一部の実施形態では、試験片の少なくとも一部は、可変の厚さを有してよく、試験片の一部の厚さは、基体の１つ又は複数の寸法にわたって変化する。一部の実施形態では、試験片の少なくとも一部は、不規則な表面を有してよく、この場合、試験片の一部の表面は、基体の１つ又は複数の寸法にわたって変化する。一部の実施形態では、試験片の少なくとも一部は、可変の反射率値を有してよく、この場合、試験片の一部の反射率は、基体の１つ又は複数の寸法にわたって変化する。或る実施形態では、試験片は、基体の１つ又は複数の寸法にわたる可変のイメージコンテンツを有してよい。例えば、一部の実施形態では、試験片の一部は、第１のイメージコンテンツ（例えば、高濃度の細胞又は分子を含む試験片の一部）を有してよく、試験片の別の一部は、第２のイメージコンテンツ（例えば、どのような細胞又は分子も含まない試験片の一部）を有してよい。
【００７４】
一部の実施形態では、試験片は、試験片の視覚分析を容易にするために試験片の１つ又は複数の部分を染色又は着色するように適合される１つ又は複数の染色手順を受けている。一部の実施形態では、試験片は、試験片の視覚分析を容易にするために試験片と安定して結合（ａｓｓｏｃｉａｔｅ）するように構成される１つ又は複数の結合剤と接触させられている。
【００７５】
本発明の態様は、対象となるシステムの１つ又は複数のコンポーネントを制御する又は動作させるように構成又は適合されるコントローラ、プロセッサ、及びコンピュータ可読媒体を含む。一部の実施形態では、システムは、例えば、本明細書に記載の１つ又は複数の方法を実施するためにシステムの態様を制御する及び／又は対象となるシステムの１つ又は複数の動作又は機能を実行するように構成される、本明細書に記載の対象となるシステムの１つ又は複数のコンポーネントと通信するコントローラを含む。一部の実施形態では、システムは、プロセッサと、メモリ媒体及び／又はストレージ媒体を含む場合があるコンピュータ可読媒体を含む。コンピュータ可読メモリ上のコンピュータ可読命令として具体化されるアプリケーション及び／又はオペレーティングシステムは、本明細書に記載のいくつかの又はすべての機能を提供するべくプロセッサによって実行することができる。
【００７６】
一部の実施形態では、システムは、ユーザから入力を受信し、本明細書に記載の方法のうちの１つ又は複数を実行するように適合又は構成されるグラフィカルユーザインターフェース（ＧＵＩ）などのユーザインターフェースを含む。一部の実施形態では、ＧＵＩは、ユーザにデータ又は情報を表示するように構成される。
【００７７】
ここで図３を参照すると、本発明の実施形態に係る顕微鏡システムの一部が描画される。描画されるシステムは、対象となる方法を実施するように構成された自動合焦ＬＥＤ、イメージングＬＥＤ、ＣＣＤカメラ、コリメータ、集束レンズ、空間開口（ピンホール）、対物レンズ、並びに種々の他の光学部品を含む。
【００７８】
ここで図４を参照すると、本発明の実施形態に係る基体が示される。描画される基体は２つの非反射性領域を含む。適切な寸法の例が描画されるが、本発明の実施形態に係るシステム及び方法で用いることができる基体の寸法を限定することはまったく意図していない。
【００７９】
実施例
実施例１：顕微鏡を試験片上に自動的に合焦し、試験片の合焦されたデジタルイメージを収集する
生物学的試験片が、図４に描画されるように２つの非反射性領域を含む基体の上側に配置される。試験片は、試験片内の複数の細胞をそれらの視覚識別を容易にするために染色する染色手順を受ける。次いで、基体が図３に描画される顕微鏡システムの試験片ホルダ上に配置され、システムを制御し自動フォーカス手順を実施するように構成されるコンピュータプロセッサ上で、自動フォーカス手順が開始される。
【００８０】
プロセッサは、光源からの第１の光ビームを基体の反射性部分（すなわち、基体の２つの非反射性領域のうちの１つ以外の位置）に反射するように誘導する。反射した光ビームが、フォトダイオード検出器を含む検出チャネルに誘導され、反射光ビームの強度がフォトダイオードカウントで測定される。測定した強度が閾値強度値を超過すると、プロセッサは、顕微鏡において基体が存在すると判定する。
【００８１】
プロセッサは、次いで、顕微鏡の光源からの第２の光ビームを基体の非反射性領域のうちの１つに反射するように誘導する。第１の反射光ビームと第２の反射光ビームとの両方が基体に反射している間、基体と対物レンズとの間の距離は、基体及び／又は対物レンズを移動させることによって変化する。反射光ビームのそれぞれは、フォトダイオードを含む検出チャネルに誘導され、２つの反射光ビームの強度がフォトダイオードによって測定される。２つの反射光ビームの強度測定値が互いに比較され、差が測定される。２つの反射光ビームの差が閾値を超過するかが判定され、これにより、基体がイメージング分析のために顕微鏡において適正に位置決めされることを確認する。
【００８２】
第１の反射光ビームの測定された強度プロファイルの極大又はピークが、図１及び図２に描画されるように顕微鏡の光軸内の基体の位置の関数として測定される。ピーク値を有する強度測定値が最適なＦ値を有する測定値と判定され、基体が不確定性区間の１／２に等しい距離にあるピーク位置よりも上又は下に存在する顕微鏡の光軸内の位置に移動される。
【００８３】
次に、最適なフォーカスメトリックを有するイメージを識別するためにとられるべき試験片のデジタルイメージの数が判定される。これは、最初の焦点位置の不確定性区間を、顕微鏡の対物レンズの被写界深度で割ることによって達成され、１〜１０の範囲の数が得られる。
【００８４】
基体は、顕微鏡の光軸に沿って対物レンズの被写界深度と同じサイズのステップで移動され、計算された数のイメージがイメージングセンサを用いて収集される。収集されたイメージのそれぞれが、イメージの強度値をピクセル毎に求めるべく分析される。各イメージの分析の結果が比較され、最適なフォーカスメトリックを有する（例えば、ピクセル毎の最高の測定された強度値を有する）イメージが最良のイメージとして選択される。次いで、基体が、最適なフォーカスメトリックを有するイメージの位置に対応する顕微鏡の光軸内の位置に移動され、これにより、顕微鏡が試験片上に自動的に合焦される。
【００８５】
顕微鏡における基体の存在を判定し、基体が分析のための適切な配向にあるかどうかを判定し、試験片の必要とされる数のデジタルイメージを収集し、顕微鏡を試験片上に合焦する全プロセスは、２秒未満で行われる。
【００８６】
上記の発明は理解を明確にする目的での例示及び例によってある程度詳細に説明されているが、付属の請求項の精神又は範囲から逸脱することなく特定の変化及び修正が本発明に加えられてよいことが、この発明の教示に照らせば当業者にはすぐに分かる。
【００８７】
したがって、上記は本発明の原理を単に例示するだけである。本明細書で明示的に説明又は図示されないが、本発明の原理を具体化する、本発明の精神及び範囲内に含まれる種々の構成を当業者は考案できることが理解されるであろう。さらに、本明細書に列挙されるすべての例及び条件付きの文言は、当該技術分野を進展させるために本発明者らによって提供される本発明の原理及び概念を読者が理解するのを助けることを主として意図され、このような具体的に列挙される例及び条件に限定されないと解釈されるべきである。さらに、本発明の原理、態様、及び実施形態、並びにその具体例を列挙する本明細書でのすべての文は、その構造の均等物と機能の均等物との両方を包含することを意図される。加えて、このような均等物は、現在公知の均等物と将来開発される均等物、すなわち、構造に関係なく同じ機能を果たす開発される任意の要素との両方を含むことが意図される。したがって、本発明の範囲は、本明細書で図示及び説明される例示的な実施形態に限定されることを意図されない。むしろ、本発明の範囲及び精神は、付属の請求項によって具体化される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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