(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１の志賀毒素２サブユニットＢ（Ｓｔｘ２Ｂ）のモノマーに対して少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するペプチドからなり、前記のペプチドが２〜２０アミノ酸の長さであるペプチドリンカーを介してBrucellaルマジンシンターゼのモノマーのＮ末端に融合されているキメラ蛋白質であって、
前記Brucellaルマジンシンターゼのモノマーが、配列番号９に対して少なくとも９５％の配列同一性を有し；
ここで、前記キメラ蛋白質が、スフィンゴ糖脂質グロボトリアオシルセラミド（Gb3）への結合部位を構成するStx2Bの立体的エピトープの天然立体配置を保存する5つの同一モノマーのオリゴマー複合体を形成する、前記キメラ蛋白質。
【請求項２】
ペプチドリンカーが５〜１５アミノ酸の長さのＧ／Ｓフレキシブルペプチドである、請求項１に記載のキメラ蛋白質。
【請求項３】
Brucellaルマジンシンターゼのモノマーが、欠失と挿入との組み合わせが配列番号９に関して５アミノ酸よりも多くの伸長をもたらさないように、１つまたは２つ以上の置換、欠失、および／または挿入を最初の８つのＮ末端アミノ酸位置に有する、請求項１または２に記載のキメラ蛋白質。
【請求項４】
配列番号３、配列番号５、および配列番号７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項３に記載のキメラ蛋白質。
【請求項５】
配列番号５のアミノ酸配列を含む、請求項４に記載のキメラ蛋白質。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のキメラ蛋白質の五量体の二量体を含む、蛋白質オリゴマー複合体。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のキメラ蛋白質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項８】
配列番号４、配列番号６、および配列番号８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９】
配列番号６のヌクレオチド配列を含む、請求項８に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０】
請求項７または８に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１１】
配列番号６のヌクレオチド配列を含む、請求項１０に記載のベクター。
【請求項１２】
請求項７〜９のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含むトランスジェニック細胞。
【請求項１３】
細胞が大腸菌細胞、哺乳動物細胞、またはPichia pastoris細胞である、請求項１２に記載のトランスジェニック細胞。
【請求項１４】
細胞が大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞である、請求項１３に記載のトランスジェニック細胞。
【請求項１５】
細胞が哺乳動物の２９３Ｔ細胞である、請求項１３に記載のトランスジェニック細胞。
【請求項１６】
細胞がPichia pastoris細胞である、請求項１３に記載のトランスジェニック細胞。
【請求項１７】
請求項６に記載の蛋白質オリゴマー複合体および／または請求項１０または１１に記載のベクターと医薬的に好適なビヒクルとを含む、医薬組成物。
【請求項１８】
医薬組成物がワクチンである、請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
オリゴマー複合体が配列番号３、配列番号５、および配列番号７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
オリゴマー複合体が配列番号５のアミノ酸配列を含む、請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
ａ）キメラ蛋白質の発現にとって好適な条件下で請求項１２〜１６のいずれか一項に記載のトランスジェニック細胞を培養すること、およびｂ）前記キメラ蛋白質を回収することを含む、
請求項１〜５のいずれか一項に記載のキメラ蛋白質または請求項６に記載の蛋白質オリゴマー複合体を産生する方法。
【請求項２２】
ａ）オリゴマー複合体に対する中和抗体を惹起するのに好適な免疫スキームのもとで、請求項６に記載の蛋白質オリゴマー複合体を非ヒトである哺乳動物に投与するステップ、
ｂ）前記非ヒトである哺乳動物から、前記中和抗体および／または前記中和抗体を産生する能力がある細胞を含む生物試料を得るステップ、および
ｃ）前記生物試料を前記の抗体の供給源として用いるステップ、
を含む、
志賀毒素２のサブユニットＢに特異的に結合する抗体を産生するための方法。
【請求項２３】
ステップｂ）において得られる生物試料がＢ細胞を含み、それらがステップｃ）においてハイブリドーマを産生するために用いられる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
非ヒトである哺乳動物がマウスである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
非ヒトである哺乳動物がラクダ科動物である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
細菌量の低下が望まれる非ヒトである哺乳動物に請求項６に記載のオリゴマー複合体を投与するステップを含む、志賀毒素産生大腸菌（ＳＴＥＣ）血清型の一次リザーバーである非ヒトである哺乳動物内の腸管出血性大腸菌の細菌量を低下させる方法。
【請求項２７】
非ヒトである哺乳動物がウシである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
哺乳動物対象の溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）に対する抵抗力を誘導するための薬剤の製造における、請求項１０または１１に記載のベクターの使用。
【請求項２９】
哺乳動物対象の溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）に対する抵抗力を誘導する方法に用いるための、請求項１７〜２０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
哺乳動物対象の溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）に対する抵抗力を誘導するための医薬の製造への、請求項１〜５のいずれか一項に記載のキメラ蛋白質または請求項６に記載のオリゴマー複合体の使用。
【請求項３１】
請求項２２に記載の方法により産生される、請求項１〜５のいずれか一項に記載のキメラ蛋白質に結合するポリクローナル抗体またはその抗原結合断片。
【請求項３２】
請求項３１に記載の抗体と医薬的に許容される担体とを含む医薬組成物。
【請求項３３】
哺乳動物対象の溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）を予防または治療するための医薬の製造への、請求項３１に記載の抗体の使用。
【請求項３４】
対象がヒトである、請求項２８、３０または３３のいずれか一項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳動物において志賀毒素（Ｓｔｘ）に対する防御免疫応答および中和抗体を誘導するための免疫原として有用なキメラポリペプチドに関する。より具体的には、本発明は、BrucellaルマジンシンターゼのモノマーのＮ末端に融合された志賀２毒素のホモ五量体Ｂサブユニットのモノマーを含むキメラポリペプチド、および該キメラポリペプチドから形成されるオリゴマー蛋白質複合体に関する。本発明は、前記キメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよびベクター、該ポリヌクレオチドおよびベクターを含むトランスジェニック細胞、ならびに前記キメラポリペプチドおよびキメラポリヌクレオチドを含むワクチンなどの医薬組成物にさらに関する。本発明のキメラポリペプチドに結合する抗体、志賀２毒素のサブユニットＢに特異的に結合する抗体を得るための方法、およびとりわけ溶血性尿毒症症候群（hemolytic-ureic syndrome）（ＨＵＳ）の予防のために用いられ得る、哺乳動物内の腸管出血性大腸菌の細菌量を低下させる方法もまた本発明の範囲内である。
【背景技術】
【０００２】
腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）株は重要なヒトの食物媒介性病原体である（Kaper et al., 2004. Nat Rev Microbiol 2:123-140）。ＥＨＥＣ感染の臨床像は水様性下痢または出血性大腸炎（ＨＣ）から最も重度の結果である生命にかかわる溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）までに亘る（Karmali 1989. Clin Microbiol Rev 2:15-38）。感染は汚染された肉または野菜の摂取と相関するが、水またはさらには人から人への接触によってもまた伝染する（Caprioli et al., 2005. Vet Res 36:289-311、Griffin and Tauxe, 1991. Epidemiol Rev 13:60-98）。散発的または大規模なアウトブレイクが数カ国の先進国において報告されている。他の国においては（例えばアルゼンチンにおいては）、ＨＵＳは地域流行性の挙動を示し、高い罹病率および死亡率の値を有する深刻な公衆衛生の問題を表す（Lopez et al., 2000. Infect Dis Clin North Am 14:41-65, viii、Rivas et al., 2006. Medicina (B Aires) 66 Suppl 3:27-32）。
【０００３】
ＥＨＥＣ感染の顕著な特徴は強力な志賀毒素の産生であり、ＨＵＳ発症の原因となる（Noel and Boedeker, 1997. Dig Dis 15: 67-91、O'brien et al., Curr Top Microbiol Immunol 180: 65-94）。志賀毒素ファミリーは構造的および機能的に関係深いＡＢ５外毒素の一群であり、Shigella dysenteriae血清型１によって産生される志賀毒素（Ｓｔｘ）および腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）株によって産生される志賀毒素を含む。ＥＨＥＣはＳｔｘの２つの型、志賀毒素１型（Ｓｔｘ１）および２型（Ｓｔｘ２）、ならびにそれらのアレルバリアントを産生し得る。志賀毒素の遺伝子は溶原性λ様バクテリオファージによってコードされており（Schmidt, 2001. Res Microbiol 152(8): 687-95）、所与の細菌は１つのＳｔｘよりも多くを発現し得る。なぜなら、それらは１つのＳｔｘをコードするバクテリオファージよりも多くを含み得るからである。
【０００４】
全ての志賀毒素ファミリーメンバーはＡＢ５分子立体配置を有し（Stein et al., 1992. Nature 355 (6362): 748-50、Fraser et al., 1994. Nat Struct Biol 1 (1): 59-64）、酵素活性な単量体ＡサブユニットのＳｔｘＡ（３２ｋＤａの分子質量を有する）がＢサブユニットのＳｔｘＢ（細胞表面受容体への結合の原因である）と非共有結合的に会合している。ＳｔｘＢはホモ五量体蛋白質（同一の単量体同士の五量体。それぞれは７．７ｋＤａの分子質量を有する）である。ＳｔｘＢは、ＳｔｘＡのカルボキシル末端が挿入される中央の穴を有する環様構造を形成する（Fraser et al., 1994. Nat Struct Biol 1 (1): 59-64）。ＳｔｘＡおよびＳｔｘＢサブユニットは細菌のペリプラズムに分泌され、そこで非共有結合的に集合体形成して、大腸菌由来の熱不安定性エンテロトキシンとして最初に記載された、ホロ毒素になる（Hirst et al., 1984. Proc Natl Acad Sci USA 81 (24): 7752-6）。
【０００５】
ＳｔｘＡは高度に特異的なＲＮＡ−Ｎ−グリコシダーゼ活性を有し、真核生物リボソームの２８ＳリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）のドメインＶＩ上に位置するαサルシンループ上の位置４３２４のアデニン塩基を切断し、それによって伸長因子依存的なアミノアシルｔＲＮＡ結合およびそれに続く鎖伸長を阻害する（Endo et al., 1988. Eur J Biochem 171(1-2): 45-50）。細菌のリボソームもまたＳｔｘＡの基質であり、志賀毒素１型（Ｓｔｘ１）への曝露は感受性細菌の低下した増殖をもたらす（Suh et al., 1998. Biochemistry 37 (26): 9394-8）。
【０００６】
ＳｔｘＡサブユニットはジスルフィド架橋によって連結された２つの断片からなり、細胞質基質および小胞体中で酵素によって蛋白分解的に切断されて、酵素活性を担う２７ｋＤａのＡ１サブユニットを発生、およびより小さいＡ２断片を放出する（Garred et al., 1995. J Biol Chem 270(18): 10817-21）。Austinおよび共同研究者は、ＳｔｘＡおよびＳｔｘＢがホロ毒素を自然にインビトロで形成し得る一方で、組み換えＡ１断片はＳｔｘＢに結合し得ないということを示し、このことは、断片Ａ２がホロ毒素の集合体形成に必須であるということを示している（Austin et al., 1994. Infect Immun 62(5): 1768-75）。
【０００７】
ＳｔｘＡが毒性を担っているのに対して、ＳｔｘＢ五量体は真核細胞の特異的な受容体への結合を担っている。ＳｔｘＢは細胞の表面に存在する中性スフィンゴ糖脂質のグロボトリアオシルセラミド（Ｇｂ３。Ｃｄ７７またはＰｋ血液型抗原としても知られている）に結合し（Jacewicz et al., 1986. J Exp Med 163(6): 1391-404、Lindberg et al., 1987. J Biol Chem 262(4): 1779-85、Waddell et al., 1990. Proc Natl Acad Sci USA 87(20): 7898-901）、それに続く毒素の内在化に至る。ＳｔｘＡの非存在下においても、ＳｔｘＢは、前記受容体に結合するその能力においてホロ毒素と機能的に同等である五量体構造を依然としてとる（Donohue-Rolfe et al., 1989. Mol Microbiol 3(9): 1231-6）。各Ｂサブユニットモノマーは２つの３本鎖逆平行βシートおよび１つのαヘリックスを含む。五量体は環様構造を形成し、約１１Åの直径の中央の穴は５つのαヘリックスによって区切られ、隣接するモノマー同士の対のβシート（６本鎖逆平行βシートを形成する）によって取り囲まれている（Stein et al., 1992. Nature 355(6362): 748-50）。
【０００８】
受容体Ｇｂ３三糖アナログと複合体化した志賀毒素１のサブユニットＢ（Ｓｔｘ１Ｂ）の結晶構造の解像は、Ｂサブユニットの各モノマー中の３つの可能性のある結合部位（部位１、２、および３と呼ばれる）を明らかにした（Ling et al., 1998. Biochemistry 37(7): 1777-88）。それゆえに、ＳｔｘＢ五量体には１５個のＧｂ３結合部位がある。１５個のＧｂ３結合部位の全ては同じ方向に向いており、Ａサブユニットに対して末梢側にあり、それによって五量体の膜相互作用表面を定めている。Ｇｂ３結合部位は、直接的にも立体配座の変化を介しても互いに相互作用しない。
【０００９】
部位１は隣接するＢサブユニット間の溝内に位置し、Ｐｈｅ３０のフェニル環と受容体のＧａｌβとの間の疎水性相互作用により、およびＡｓｐ１７、Ｔｈｒ２１、Ｇｌｕ２８、およびＧｌｙ６０が関与する水素結合により特徴づけられる。部位２は、Ｐｈｅ３０のフェニル環の反対側のＧｌｙ６３、Ａｓｎ３２、Ａｒｇ３３、およびＡｌａ５６によって定義される凹部中に位置する。第３の結合部位には、Ｔｒｐ３４（Ｓｔｘ１Ｂの中央の穴を取り囲むαヘリックス中に位置する）のインドール環に対するＧａｌβの疎水性スタッキング相互作用と、Ｇａｌαと隣接するモノマーのＴｒｐ３４との間の疎水性相互作用とが関与する。加えて、Ｇａｌαの水素はＴｒｐ３４およびＡｓｎ３５、さらには隣接するモノマーのＡｓｐ１８に結合する。これらの結果から、少なくとも部位１および３が機能的であるためには、五量体の正しい集合体形成を必要とすると結論づけることができる。Ｓｔｘ１Ｂの変異研究は、部位１および２が高親和性の相互作用を媒介するということと、Ｓｔｘ１の細胞毒性活性が部位１および２へのＧｂ３結合によって主として媒介されるということとを実証した。しかしながら部位３は低親和性の相互作用を媒介する（Bast et al., 1999. Mol Microbiol 32(5): 953-60）。部位３の親和性は細胞結合の強度に大きく寄与するには低すぎであり得るが、Ling および共同研究者は部位３が他の目的に働き得るということを提案した。この考えの１つの理由は、溶媒に完全に曝露されているにもかかわらず位置３４のトリプトファン残基が保存されているという事実である。この著者らは、毒素の下の膜に多数のＧｂ３分子を隔離することを助ける役割を部位３が果たし得るということを提案している（Ling et al., 2000. Structure 8(3): 253-64）。よって、全ての３つのオリゴ糖結合部位は完全な生物学的活性に必要である。
【００１０】
Ｓｔｘ２Ｂの研究は、大量の生物学的活性形態を発現することの困難さによって阻まれて来た（Acheson et al., 1995. Infect Immun 63(1): 301-8）。しかしながら、Ｓｔｘ２の結晶学的構造の分析はそのＢサブユニット上の対応する三糖結合部位の存在を予測したが、部位２の立体配座がShigellaの志賀毒素およびＳｔｘ１Ｂサブユニットのものとは特徴的に異なるということもまた実証した（Fraser et al., 2004. J Biol Chem 279(26): 27511-7）。しかしながら、糖との結合に関与する残基は志賀毒素ファミリーにおいては保存されているかまたは保存的に置換されているかのいずれかである（Ling et al., 2000. Structure 8(3): 253-64）。１つの例外はＳｔｘ２Ｂの部位２におけるＧｌｕ１６の、Ｓｔｘ１Ｂにおけるアスパラギン酸への置換であり、Ｇｌｕ１６で見られる水によって媒介される水素結合がＡｓｐ１６では直接的相互作用によって置換される。この置換は部分的に志賀毒素２およびそのバリアントの減少したＧｂ３親和性を担い得る。
【００１１】
部位特異的変異導入は、保存された残基Ｇｌｙ６０がＳｔｘ１およびＳｔｘ２の細胞毒性に必須であるということを示している。この残基の置換は、部位１のみならず部位２にもまた関与するβ５−β６ループの立体配座を変えてしまう（Perera et al., 1991. J Bacteriol 173(3): 1151-60）。部位特異的変異導入は、Ａｒｇ３３がＳｔｘ１およびＳｔｘ２の細胞毒性に重要な役割を果たしていることもまた示している。結果は、部位２におけるＧｂ３三糖の末端ガラクトースとの水素結合におけるその側鎖の大規模な関与によって説明され得る（Ling et al., 2000. Structure 8(3): 253-64）。
【００１２】
志賀毒素ファミリーの原型はShigella dysenteriaeによって産生されるＳｔｘであり、これは大腸菌によって産生されるＳｔｘ１とほとんど同一であり、触媒サブユニットの１アミノ酸が異なる（O'Loughlin and Robins-Browne, 2001. Microbes Infect 3(6): 493-507）。Ｓｔｘ１およびＳｔｘ２は両方とも異なるバリアントを有しており、Ｓｔｘ２が最も多様である。Ｓｔｘ１ファミリーはＳｔｘ１およびＳｔｘ１ｃからなり、一方でＳｔｘ２はバリアントＳｔｘ２ｃ、Ｓｔｘ２ｃ２、Ｓｔｘ２ｄ、Ｓｔｘ２ｄａｃｔｉｖａｂｌｅ、Ｓｔｘ２ｅ、およびＳｔｘ２ｆを含む。Ｓｔｘ１およびＳｔｘ２はアミノ酸配列レベルでは５６％の同一性を有するのみである（Jackson et al., 1987. Microb Pathog 2(2): 147-53）。Ｓｔｘ２バリアントはＳｔｘ２と８４〜９９％相同である。
【００１３】
Ｓｔｘ１とＳｔｘ２との間にはそれらの基本構造、受容体認識、および生化学的作用機序に重大な類似性がある一方で、Ｓｔｘ１、Ｓｔｘ２、または両方を産生するＥＨＥＣ株に感染した患者の臨床的影響には相当の違いがある。原則的に、Ｓｔｘ１およびＳｔｘ２が両方ともＨＵＳを発症する危険に患者を晒すと予測されるであろう。しかしながら、数々の疫学研究は、Ｓｔｘ２産生株がＳｔｘ１産生株または両方の毒素を産生する株よりも高頻度にＨＵＳ発症と関連しているということを示して来た（Scotland et al., 1987. Epidemiol Infect 99(3): 613-24、Ostroff et al., 1989. J Infect Dis 160(6): 994-8、Donohue-Rolfe et al., 2000. J Infect Dis 181(5): 1825-9）。
【００１４】
Ｓｔｘ１とＳｔｘ２との間の違いに関して、それらの最も重大なものはＧｂ３受容体に対する親和性および毒性を誘導する能力の違いである。Ｓｔｘ１およびＳｔｘ２は同じ機能的な受容体を有するが、Ｓｔｘ１はＳｔｘ２と比較してＧｂ３に対する１０倍高い親和性を有する（Head et al., 1991. Biol Chem 266(6): 3617-21）。BIAcoreシステムを用いた研究は、Ｇｂ３とのＳｔｘ１の会合速度はＳｔｘ２よりも大きいが、受容体からのＳｔｘ２の解離はＳｔｘ１よりも低速であるということを示しており、これは、Ｓｔｘ２がより低速で受容体に結合する一方で、より低速で解離するということもまた示している（Nakajima et al., 2001. J Biol Chem 276(46): 42915-22）。
【００１５】
Ｇｂ３に対するＳｔｘ１のより高い親和性にもかかわらず、疫学研究と矛盾せず、Ｓｔｘ２はＳｔｘ１よりも４００倍低いマウスの５０％致死量（ＬＤ５０）を有する（Tesh et al., 1993. Infect Immun 61(8): 3392-402）。同様の結果はヒト腎微小血管内皮細胞がＳｔｘ１またはＳｔｘ２によって処理されたときにもまた得られ、Ｓｔｘ２は約１０００倍毒性であることが見いだされた（Louise and Obrig, 1995. J Infect Dis 172(5): 1397-401）。異なる研究は、ＢサブユニットがインビボでのＳｔｘ１およびＳｔｘ２の差別的な毒性の重要な決定因子であるということを明らかにしている。セルフリーのインビトロ翻訳阻害アッセイにおいてＳｔｘ１およびＳｔｘ２のＡサブユニットの毒性は区別できず、それらのサブユニットの酵素活性は２つの毒素間の大きいインビボでの違いを担ってはいないということを示唆している。対照的に、野生型およびキメラＳｔｘの毒性を比較した動物モデルは、Ｓｔｘ２Ｂサブユニットの存在がインビトロおよびインビボの致死性の重要な決定因子であるということを実証している（Weinstein et al., 1989. Infect Immun 57(12): 3743-50、Head et al., 1991. Biol Chem 266(6): 3617-21、Lingwood, 1996. Trends Microbiol 4(4): 147-53、Marcato et al., 2003. Infect Immun 71(10): 6075-8）。
【００１６】
質量分析技術を用いて、Kitovaらは、Ｓｔｘ１Ｂがイオン強度とは無関係に５〜８５μΜに亘るサブユニット濃度において主として五量体であったということを報告している（Kitova et al., 2005. J Am Soc Mass Spectrom 16(12): 1957-68、Kitova et al., 2009. Biochemistry 48(23): 5365-74）。これらのデータは、高度に熱安定な五量体を示すＳｔｘ１Ｂの円偏光二色性（ＣＤ）および動的走査熱量測定（ＤＳＣ）研究によって支持された（Pina et al., 2003. Biochemistry 42(31): 9498-506）。対照的に、Ｓｔｘ２Ｂサブユニットの集合体形成の程度は温度、サブユニット濃度、およびイオン強度に強力に依存する。５０μΜ超のサブユニット濃度においては、より小さいマルチマー（二量体、三量体、および四量体）もまた明らかにあるが、Ｓｔｘ２Ｂサブユニットは主に五量体として存在する。より低い濃度においては、Ｓｔｘ２Ｂサブユニットは主にモノマーおよび二量体として存在する。Conradyおよび共同研究者は、Kitovaら（2005）によって観察された違いを、直接的な溶液状態の技術によって確認および定量した。これらの著者は、Ｓｔｘ２Ｂ五量体はｐＨ７．４の溶液中においてＳｔｘ１Ｂ五量体よりもおよそ５０倍安定でないということを報告している（Conrady et al., 2010. PLoS One 5(12): e15153）。
【００１７】
Ｓｔｘ１とＳｔｘ２との間の別の重要な違いは免疫レベルで観察される。Ｓｔｘのそれらの２つの型は、１つのバリアントに対する抗体がもう一方と交差反応しなかったために最初に同定されたが、これらの２つの毒素間の交差反応性（および交差中和）の研究は長年の論争の対象であった。インビトロの研究は、これらの２つの毒素が血清学的に別であるということと、１つの毒素に対する抗体は他方を中和する能力がないということとを示している（Scotland et al., 1985. Lancet 2(8460): 885-6、Karmali et al., 1986. Lancet 1(8473): 164-5、Strockbine et al., 1986. Infect Immun 53(1): 135-40）。同様に、Wenらは、遺伝学的に不活性化されたＳｔｘ１またはＳｔｘ２トキソイドによるマウスの免疫で、同種の毒素に対しては抗毒素血清ＩｇＧを生ずることができるが、異種の毒素に対してはできなかったということと、それらの抗体が同種の毒素によるチャレンジに対してのみ特異的な防御免疫を提供したということとを示した（Wen et al., 2006. Vaccine 24(8): 1142-8）。しかしながら、Ｓｔｘ１またはＳｔｘ２のトキソイド調製物によって免疫された動物による他の研究では、Ａサブユニットに対する抗体の産生によって、いずれの毒素のチャレンジに対しても動物が交差防御を示した。Bielaszweskaらは、化学的に不活性化されたＳｔｘ１もしくはＳｔｘ２トキソイドまたは各毒素のＡサブユニットによるウサギの免疫が、毒素によって媒介される全身的病態を発症中の標的組織への異種の毒素の局在を妨げたということを見いだした。この研究では、Ｓｔｘ１またはＳｔｘ２のＢサブユニットは異種防御を提供しなかった（Bielaszewska et al., 1997. Infect Immun 65(7): 2509-16）。インビボの交差防御のさらなる証拠がLudwigらによって報告されており、Ｓｔｘ１によるチャンレンジに対するウサギの防御が、化学的に不活性化されたＳｔｘ２トキソイドによる免疫によって得られている（Ludwig et al., 2002. Can J Microbiol 48(1): 99-103）。
【００１８】
ＳｔｘのＢサブユニット間の交差反応もまた論争がある。いくつかの研究は、Ｓｔｘ１またはＳｔｘ２のＢサブユニットに対する抗体が交差防御を提供しないということを示している（Wadolkowski et al., 1990. Infect Immun 58(12): 3959-65、Bielaszewska et al., 1997. Infect Immun 65(7): 2509-16）。この理由から、数人の著者は、両方の毒素に対する防御を提供するためにＳｔｘ２ＢとＳｔｘ１Ｂとの間の融合蛋白質の使用を提案している（Gao et al., 2009. Vaccine 27(14): 2070-6、Zhang et al., 2011. Vaccine 29(22): 3923-9）。しかしながら、Tsujiらは、Ｓｔｘ２Ｂ−ＨＩＳ構築物（ヒスチジンタグを有するＳｔｘ２Ｂ）によるマウスの鼻腔内免疫がＳｔｘ１に対する交差防御を授与できたが、逆はあてはまらないということを報告している（Tsuji et al., 2008. Vaccine 26(17): 2092-9）。
【００１９】
Ｓｔｘ２バリアントは生物学的活性、免疫反応性、または受容体特異性の違いによって区別できる。Ｓｔｘ２およびそのバリアントはＧｂ３スフィンゴ糖脂質に選択的に結合するが、Ｓｔｘ２ｅは例外であり、グロボテトラアオシルセラミド（Ｇｂ４）に選択的に結合する（Lingwood, 1996. Trends Microbiol 4(4): 147-53）。Ｓｔｘ２およびＳｔｘ２ｃが最も病原性のＳｔｘ２バリアントであり、ＨＵＳの症例の大多数と関連している一方で（Boerlin et al., 1999.J ClinMicrobiol 37(3): 497-503）、Ｓｔｘ２ｅはヒトの出血性大腸炎およびＨＵＳと関連していない唯一のものであり、その代わりにブタの浮腫病の原因である（MacLeod et al., 1991. Vet Pathol 28(1): 66-73）。さらに、Ｓｔｘ２ｄａｃｔｉｖａｂｌｅは、エラスターゼ（Ａサブユニットの最後の２つの残基を切断して断片Ａ２を放出する腸粘液の成分）によって活性化され得るという点でＳｔｘの全ての他の型とは異なる（Scheiring et al., 2008. Pediatr Nephrol 23(10): 1749-60）。
【００２０】
ＥＨＥＣ感染によって引き起こされる社会的および経済的問題の大きさにもかかわらず、いかなる認可されたワクチンまたは有効な治療法も現在のところヒトへの使用に利用できない。最大の挑戦の１つは、、血清中での良好な中和能力を保証する長期持続的な高親和性の抗体を誘導するための、非毒性でありながら宿主免疫システムへの強力な入力もまた保証する、有効で安全な免疫原を開発することである。なぜなら、ＳｔｘファミリーのうちＳｔｘ２は最も病原性の毒素であり、Ｓｔｘ２Ｂベースの免疫原はＨＵＳ発症に最も関係深いＳｔｘに対して防御するであろうため、Ｓｔｘ２のＢサブユニット（Ｓｔｘ２Ｂ）は最も魅力的な候補である（Smith et al., 2006. Vaccine 24: 4122-4129、Wen et al., 2006. Vaccine 24(8): 1142-8、Tsuji et al., 2008. Vaccine 26(17): 2092-9）。加えて、Ｂサブユニットは毒素の結合ユニットを表し、哺乳動物細胞にとって非毒性である（Donohue-Rolfe et al., 1991. Rev Infect Dis 13 Suppl 4: S293-297、Lingwood, 1996. Trends Microbiol 4(4): 147-53）。哺乳動物細胞の特異的受容体（Ｇｂ３）への結合プロセスを遮断できる抗体は、毒性カスケードの最初のステップを予防するはずである（Ling et al., 1998. Biochemistry 37(7): 1777-88）。加えて、ＨＵＳに対するＳｔｘベースのワクチンは公知のＥＨＥＣ株（典型的にはＯ１５７および非Ｏ１５７血清型）に対して防御するであろうのみならず、Ｏ１０４：Ｈ４株によって引き起こされたＨＵＳの近年の大きなアウトブレイクのケースのような、志賀毒素産生大腸菌の新たなまたは稀少な病原性株に対してもまた有用であろう（Beutin et al., 2012. J Virol 86:10444-10455、Scheutz et al., 2011. Euro Surveill 16）。
【００２１】
様々な取り組みにもかかわらず上首尾なＳｔｘ２Ｂベースの免疫原は得られておらず、これは主にＳｔｘ２Ｂが非常に不良な免疫原であるからである（Marcato et al., 2001. J Infect Dis 183: 435-443、Imai et al., 2004. Infect Immun 72(2): 889-895）。３つの結合部位のうち２つは隣り合うモノマー同士から提供される残基によって形成されている。よって、結合部位が活性であるためには五量体の正確な集合体形成を必要とする（Ling et al., 1998. Biochemistry 37(7): 1777-88）。上で論じられた通り、Ｓｔｘ２Ｂ五量体はＡサブユニットの非存在下においてはわずかにのみ安定であり、免疫原として用いられたときには、五量体のモノマー間のほぼ境界面に位置する立体的エピトープに対する特異的な抗体を作ることができない。
【発明の概要】
【００２２】
本発明者は驚くべきことに、Ｓｔｘに対する免疫および／または抗体の産生に十分な免疫応答を惹起する能力がある非病原性の安定なＳｔｘ抗原が、Brucellaルマジンシンターゼ（ＢＬＳ）のモノマーに融合された志賀毒素２型のＢサブユニット（Ｓｔｘ２Ｂ）のモノマーを含むキメラペプチドを生み出すことによって産生され得るということを発見した。意外にも、かかるキメラペプチドが５つの同一のモノマーのオリゴマー複合体を形成するときにはＳｔｘ２サブユニットＢの立体的エピトープが安定化され、高度に安定なＢＬＳ−Ｓｔｘ２Ｂ融合蛋白質を、ＨＵＳに対する戦いにおいて有益な免疫原とする。
【００２３】
それゆえに、最初の側面によれば、本発明は、志賀毒素２型のＢサブユニットのモノマーに対して少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するペプチドを含むキメラ蛋白質を含み、そのペプチドは直接的にまたはペプチドリンカーを介してBrucellaルマジンシンターゼのモノマーに融合される。
【００２４】
志賀毒素２型のＢサブユニットは直接的にまたはペプチドリンカーを介してBrucellaルマジンシンターゼのモノマーのＮ末端に融合され得る。「BrucellaルマジンシンターゼのモノマーのＮ末端」によって、最もアミノ末端の１０アミノ酸のいずれか、例えばアミノ末端から最初の、第２の、第３の、第４の、第５の、第６の、第７の、第８の、第９の、または第１０のアミノ酸が意味される。
【００２５】
Brucellaルマジンシンターゼのモノマーは配列番号９に対して少なくとも９５％の配列同一性、例えば少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、またはそれ以上の配列同一性を有し得る。
【００２６】
Brucellaルマジンシンターゼのモノマーは、欠失と挿入との組み合わせが配列番号９に関して５アミノ酸よりも多くの伸長をもたらさないように、１つまたは２つ以上の置換、欠失、および／または挿入を最初の８つのＮ末端アミノ酸位置に有し得る。例えば、Brucellaルマジンシンターゼのモノマーは、欠失と挿入との組み合わせが配列番号９に関して５アミノ酸よりも多くの伸長をもたらさないように、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、または８つの置換、欠失、および／または挿入を最初の８つのＮ末端アミノ酸位置に有し得る。
【００２７】
本発明の好ましい態様において、アミノ酸配列番号３、配列番号５、または配列番号７、好ましくは配列番号５を含むキメラペプチドなどのように、志賀毒素のサブユニットＢのモノマー（配列番号１）は、BrucellaルマジンシンターゼのモノマーのＮ末端にＧ／Ｓフレキシブルペプチドなどのペプチドリンカーによって連結され、これは２〜２０アミノ酸の長さまたは５〜１５アミノ酸の長さであるＧ／Ｓフレキシブルペプチドであり得る。
【００２８】
別の側面によれば、本発明は、本発明のキメラ蛋白質の五量体の二量体を含むということを特徴とする蛋白質オリゴマー複合体を含む。
【００２９】
さらなる側面によれば、本発明は、本発明のキメラ蛋白質をコードするポリヌクレオチド、例えば配列番号４, 配列番号６、または配列番号８、好ましくは配列番号６を含むＤＮＡ分子を含む。
【００３０】
尚別の側面によれば、本発明は、本発明のキメラ蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含むベクター、例えば配列番号４、配列番号６、または配列番号８、好ましくは配列番号６を含むベクターを含む。
【００３１】
本発明は、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターを含むトランスジェニック細胞もまた含む。具体的な態様において、トランスジェニック細胞は大腸菌細胞、好ましくは大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞である。別の態様において、トランスジェニック細胞は哺乳動物細胞、好ましくは２９３Ｔ細胞である。尚別の態様において、トランスジェニック細胞はPichia pastoris細胞である。
【００３２】
本発明の別の側面は、本発明の蛋白質オリゴマー複合体および／またはベクターと医薬的に好適なビヒクルとを含む医薬組成物を含む。本発明の医薬組成物は好ましくはワクチンである。好ましい態様において、本発明のワクチンにおいて、オリゴマー複合体は配列番号３、配列番号５、および配列番号７からなる群から選択されるアミノ酸配列、好ましくは配列番号５を含む。
【００３３】
本発明のさらなる側面は本発明のキメラ蛋白質を産生する方法に関し、その方法は、ａ）そのキメラ蛋白質の発現にとって好適な条件下で、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターを含む本発明のトランスジェニック細胞を培養するステップと、ｂ）そのキメラ蛋白質を回収するステップとを含む。
【００３４】
尚別の側面において、本発明は、志賀毒素２のサブユニットＢに特異的に結合する抗体を得るための方法を含み、その方法は、
ａ）そのオリゴマー複合体に対する中和抗体を惹起するのに好適な免疫スキームのもとで、本発明の蛋白質オリゴマー複合体を哺乳動物に投与するステップ、
ｂ）その哺乳動物から、その中和抗体および／またはその中和抗体を産生する能力がある細胞を含む生物試料を得るステップ、および
ｃ）その生物試料をその抗体の供給源として用いるステップ、
を含むということを特徴とする。
【００３５】
抗体を得るための本発明の方法の好ましい態様において、ステップｂ）において得られる生物試料はＢ細胞を含み、それらはステップｃ）において用いられてハイブリドーマを産生し得る。好ましい態様において、蛋白質オリゴマー複合体が投与される哺乳動物はマウスである。別の好ましい態様において、蛋白質オリゴマー複合体が投与される哺乳動物はラクダ科動物である。本発明のこの側面の方法によって得られる抗体もまた本発明の範囲内であると考えられる。
【００３６】
別の側面において、本発明は、細菌量の低下が望まれる動物に本発明のオリゴマー複合体を投与することによって、ウシなどの動物内の腸管出血性大腸菌の細菌量を低下させる方法を含む。
【００３７】
別の側面において、本発明は、細菌量の低下が望まれる動物に本発明の抗体を投与することによって、ウシなどの動物内の腸管出血性大腸菌の細菌量を低下させる方法を含む。
【００３８】
尚さらなる側面によれば、本発明は、哺乳動物対象の溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）に対する抵抗力を誘導する方法を含み、該方法は、その哺乳動物対象に、例えば配列番号３、配列番号５、配列番号７からなる群から選択されるアミノ酸配列、好ましくは配列番号５を含む本発明のオリゴマー複合体を含むワクチンなどの本発明のワクチンを投与することを含む。
【００３９】
尚さらなる側面によれば、本発明は、哺乳動物対象の溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）に対する抵抗力を誘導する方法に用いるための本発明のワクチンを含む。
【００４０】
尚さらなる側面によれば、本発明は、哺乳動物対象の溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）に対する抵抗力を誘導するための医薬の製造への本発明のキメラ蛋白質の使用を含む。
【００４１】
本発明のさらなる側面は、本発明のキメラ蛋白質に結合する抗体に関する。かかる抗体は好ましく本発明のキメラ蛋白質に特異的である。この場合に、用語「特異的」は抗体が本発明のキメラ蛋白質に優先的に結合するということを意味するが、他の蛋白質とのより少ない程度の結合を排除しない。ヒトなどの哺乳動物の溶血性尿毒症症候群を予防または治療するための医薬組成物の製造への本発明の抗体の使用もまた本発明の一部である。
【００４２】
本発明のさらなる側面は本発明の抗体と医薬的に好適な担体とを含む医薬組成物に関する。本発明の抗体および医薬組成物は、例えばそれを必要とする対象の溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）を治療または予防するための方法に有用であり、これは本発明の尚別の側面である。かかる方法は、好ましくはヒト対象の溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）を治療または予防するために用いられる。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】ＢＬＳ−Ｓｔｘ２Ｂ−Ｌ５（パネルＡ）およびＢＬＳ−Ｓｔｘ２Ｂ−Ｌ１０キメラ（パネルＢ）、およびＢＬＳ−Ｓｔｘ２Ｂ−Ｌ１５（パネルＣ）の理論上の構造。これらの蛋白質の構造は実施例１に記載された通りにモデリングされた。ＢＬＳモノマーは黒色に着色されており、一方でＢＬＳの構造に融合されたＳｔｘ２Ｂは明灰色に着色されている。Ｓｔｘ２ＢとＢＬＳとの間のリンカー（ＧＳＧＳＧ）は暗灰色に着色されている。図はPymol Molecular Graphics Systemsプログラムによって構築された。
【図２】組み換え体Ｓｔｘ２Ｂ−ＢＬＳのＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析。発現および精製されたＳｔｘ２−ＢＬＳ（Ｌ１０）は１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離され、クーマシーブルーによって染色されるか（ＡおよびＢ）、または特異的な抗体によって明らかにされた（Ｃ）。同じプロトコールが全ての３つのキメラに対して実施された。Ａ）レーン１：未誘導のｐＥＴ−Ｓｔｘ２Ｂ−ＢＬＳ形質転換大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）の全蛋白質、レーン２：誘導後のｐＥＴ−Ｓｔｘ２Ｂ−ＢＬＳ形質転換大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）の不溶性ペレット、レーン３：誘導後のｐＥＴ−Ｓｔｘ２Ｂ−ＢＬＳ形質転換大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）の可溶性画分。Ｂ）レーン１：精製Ｓｔｘ２Ｂ、レーン２：精製ＢＬＳ、レーン３：精製Ｓｔｘ２Ｂ−ＢＬＳ。Ｃ）精製Ｓｔｘ２Ｂ−ＢＬＳのウェスタンブロット分析。ＳＤＳ−ＰＡＧＥはポリクローナル抗Ｓｔｘ２マウスＩｇＧ（レーン１および２）またはポリクローナル抗ＢＬＳマウスＩｇＧ（レーン３および４）によってプローブ処理され、ペルオキシダーゼ標識ウサギ抗マウスＩｇＧによって明らかにされた。レーン１：精製Ｓｔｘ２Ｂ、レーン２：精製Ｓｔｘ２Ｂ−ＢＬＳ、レーン３：精製ＢＬＳ、レーン４：精製Ｓｔｘ２Ｂ−ＢＬＳ。Ｄ）精製蛋白質のＳＤＳ−Ｐａｇｅ。レーン１：精製Ｓｔｘ２Ｂ、レーン２：精製ＢＬＳ、レーン３：精製Ｓｔｘ２Ｂ−ＢＬＳ−Ｌ５、レーン４：精製Ｓｔｘ２Ｂ−ＢＬＳ−Ｌ１０、レーン５：精製Ｓｔｘ２Ｂ−ＢＬＳ−Ｌ１５。
【図３】プラスミドｐＣｉｎｅｏ−ＢＬＳ−Ｓｔｘ２Ｂ−Ｌ５、ｐＣｉｎｅｏ−ＢＬＳ−Ｓｔｘ２Ｂ−Ｌ１０、およびｐＣｉｎｅｏ−ＢＬＳ−Ｓｔｘ２Ｂ−Ｌ１５によるトランスフェクション２９３Ｔ細胞のウェスタンブロット分析。レーン１：精製ＢＬＳ、レーン２：空のｐＣＩｎｅｏプラスミドによるトランスフェクション細胞、レーン３：トランスフェクションアッセイの陰性対照、レーン４：ＢＬＳ−Ｓｔｘ２Ｂ−Ｌ５によるトランスフェクション細胞、レーン５：ＢＬＳ−Ｓｔｘ２Ｂ−Ｌ１０によるトランスフェクション細胞、レーン６：ＢＬＳ−Ｓｔｘ２Ｂ−Ｌ１５によるトランスフェクション細胞。
【図４】ＢＬＳｗｔ（黒色点線）、Ｓｔｘ２Ｂ（黒色実線）、およびＢＬＳ−Ｓｔｘ２Ｂ（灰色実線）の３つの遠ＵＶ−ＣＤスペクトルの比較。各ＢＬＳ−Ｓｔｘ２Ｂキメラの理論上のスペクトルがＳｔｘ２ＢおよびＢＬＳのスペクトルの組み合わせから計算され、灰色点線によって表されている。
【図５】３つのＢＬＳ−Ｓｔｘ２ＢキメラのＳＬＳ分析と組み合わされたサイズ排除クロマトグラフィー（分析用S200カラム）。全ての分離は０．５ｍＬ／分の流速で実施された。溶出は屈折率（実線）およびＵＶ２８０ｎｍ（点線）のシグナルによって監視された。各試料の分子量は、その９０°およびＲＩのシグナルを関係づけ、ＢＳＡについて得られたものを標準としてこの値と比較して計算された。最初のピークは高ＭＷ凝集体に対応しており、大部分の１つはキメラＢＬＳ−Ｓｔｘ２Ｂに対応する。
【図６】温度の関数として蛋白質の２２２ｎｍのＣＤシグナルによって追跡されたＢＬＳの熱変性。野生型（黒色点線）、Ｓｔｘ２Ｂ（黒色実線）、ＢＬＳ−Ｓｔｘ２Ｂ−Ｌ５（暗灰色実線）、ＢＬＳ−Ｓｔｘ２Ｂ−Ｌ１０（灰色実線）、およびＢＬＳ−Ｓｔｘ２Ｂ−Ｌ１５（明灰色実線）。
【図７】ＢＬＳ−Ｓｔｘ２Ｂ集合体形成の評価とＧｂ３結合ＥＬＩＳＡアッセイ。段階希釈したＢＬＳ−Ｓｔｘ２Ｂ−Ｌ５、ＢＬＳ−Ｓｔｘ２Ｂ−Ｌ１０、ＢＬＳ−Ｓｔｘ２Ｂ−Ｌ１５、ＢＬＳ、ｒＳｔｘ２、または大腸菌ＢＬ２１溶解物（非特異的な結合の陰性対照として用いられた）がＧｂ３コーティングプレートに追加された。結合は実施例１３に詳述された通り決定された。
【図８】Ｓｔｘ２Ｂに対する特異的なＩｇＧ力価の経時変化。Ａ）ＢＬＳ−Ｓｔｘ２Ｂ−Ｌ１０またはＳｔｘ２Ｂ（両方ともＦＡで製剤化された）によって免疫されたマウスの血清中のＳｔｘ２Ｂ特異的なＩｇＧ力価が、ＥＬＩＳＡによって決定された。各時点は４〜６匹のマウス／群の平均±ＳＥＭを表す。＊＊Ｓｔｘ２Ｂ群の同じ時点に対してＰ＜０．００５。Ｂ）異なる製剤またはレジメンのＳｔｘ２−ＢＬＳ−Ｌ１０によって免疫されたマウスの血清中のＳｔｘ２Ｂ特異的なＩｇＧ力価。各時点は４〜６匹のマウス／群の平均±ＳＥＭを表す。＊アジュバントなし（Ｎ／Ａ）のＢＬＳ−Ｓｔｘ２Ｂ−Ｌ１０群の同じ時点に対してＰ＜０．０５。＊＊全ての他の群の同じ時点に対してＰ＜０．００５。黒色矢頭は蛋白質免疫を示し、灰色矢頭はＤＮＡ免疫を示す。
【図９】Ｓｔｘ２Ｂ特異的な（secific）ＩｇＧのサブタイプ。ＢＬＳ−Ｓｔｘ２Ｂ−Ｌ１０の異なる製剤によって免疫されたマウスの血清が、材料と方法に詳述された通りＥＬＩＳＡによってアッセイされた。各バーは群あたり４〜６の平均±ＳＥＭを表す。＊＊＊各群のＩｇＧ２ａに対してＰ＜０．００１。
【図１０】死亡率曲線。Ａ）免疫マウスの血清によるｒＳｔｘ２毒性（１ＬＤ１００）のエクスビボの中和。各免疫群（４〜６匹のマウス／プール）（最終回の免疫の４５日後）または非免疫マウスからの血清のプールを、図のリファレンスに示されたように、インビトロの中和力価に従って希釈した。Ｂ）精製ｒＳｔｘ２の致死量のチャレンジに対する免疫マウスの防御。Ｓｔｘ２Ｂ＋ＦＡまたはＢＬＳ−Ｓｔｘ２Ｂの異なる製剤またはＢＬＳ＋ＦＡによって免疫された成体雄ＢＡＬＢ／ｃマウス（４〜６匹のマウス／群）が、最終回の免疫の４５日後に１ＬＤ１００のｒＳｔｘ２によってｉ．ｖ．チャレンジされた。＊Ｓｔｘ２Ｂ＋ＦＡ免疫マウスに対してＰ＜０．０５、非免疫またはＢＬＳ＋ＦＡ免疫マウスに対してｐ＜０．００５。＊＊全ての他の群に対してｐ＜０．００５。
【図１１】長期の特異的なＩｇＧ抗体応答および防御免疫応答。Ａ）Ｓｔｘ２Ｂに対する特異的なＩｇＧ力価。最終回の免疫投与の９ヶ月後までＥＬＩＳＡによってアッセイされた。Ｂ）最初のｒＳｔｘチャレンジから生き残ったマウスは、パートＡに示された時間に２ＬＤ１００のｒＳｔｘ２による２回目のチャレンジを受けた（２ｎｄチャレンジ）。＊＊アジュバントなし（Ｎ／Ａ）またはＡＨのＢＬＳ−Ｓｔｘ２Ｂ−Ｌ１０免疫マウスと比較してＰ＜０．００５。Ｃ）最初の２回のｒＳｔｘ２チャレンジから生き残ったマウスは、パートＡに示された時間に３ＬＤ１００のｒＳｔｘ２による３回目のチャレンジを受けた（３ｎｄチャレンジ）。＊＊非免疫マウスと比較してＰ＜０．００５。
【図１２】ＢＬＳ−Ｓｔｘ２Ｂ−Ｌ１０の１回の投与による特異的なＩｇＧ力価の経時変化。ＡＨで製剤化されたＢＬＳ−Ｓｔｘ２Ｂ−Ｌ１０の１回の投与によって免疫されたマウスの血清中のＳｔｘ２Ｂ特異的なＩｇＧ力価が、ＥＬＩＳＡによって決定された。各時点は６匹のマウスの平均±ＳＥＭを表す。灰色矢印はｒＳｔｘ２によるチャレンジを示す。
【図１３】死亡率曲線。精製ｒＳｔｘ２の致死量のチャレンジに対する免疫マウスの防御。非免疫またはＢＬＳ−Ｓｔｘ２Ｂ−Ｌ１０免疫（１回投与）成体ＢＡＬＢ／ｃマウス（４〜６匹のマウス／群）が、（Ａ）：１ＬＤ１００のｒＳｔｘ２（免疫の３０日後）、（Ｂ）：３ＬＤ１００のｒＳｔｘ２（免疫の６０日後）、および（Ｃ）：５ＬＤ１００のｒＳｔｘ２（免疫の１２０日後）によってｉ．ｖ．チャレンジされた。異なるチャレンジは図１２の灰色矢印で示されている。＊＊非免疫マウスに対してＰ＜０．００５。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
本発明は、上首尾なＳｔｘ２Ｂベースの免疫原の欠如を克服するための新規戦略、すなわちＢＬＳ蛋白質粒子上へのＳｔｘＢ２五量体の提示を提案する。ＢＬＳ（Brucellaルマジンシンターゼ）は抗原送達にとって非常に効率的な担体として記載されている（Laplagne et al., 2004. Proteins 57: 820-828、Cassataro et al., 2007. Vaccine 25: 4437-4446、Bellido et al., 2009. Vaccine 27: 136-145）。ＢＬＳは五量体の高度に免疫原性で安定な二量体であり、その構造上に外来抗原を提示するために用いられて来たスキャフォールドである（Velikovsky et al., 2003. Infect Immun 71: 5750-5755、Zylberman et al., 2004. J Biol Chem 279: 8093-8101、Bellido et al., 2009. Vaccine 27: 136-145、Cassataro et al., 2007. Vaccine 25: 4437-4446、Laplagne et al., 2004. Proteins 57: 820-828）。しかしながら、別の多量体蛋白質の提示のための蛋白質多量体スキャフォールドの使用に関しては大変な困難が想像され得る。すなわち、ａ）挿入された抗原の多量体化が異なる蛋白質粒子間において起こり得、クロスオーバーおよび大規模な凝集を生じ、ｂ）ＢサブユニットおよびＢＬＳの五量体のフォールディングおよび会合の動態は非常に異なり得、よって融合粒子のフォールディングは中間状態に拘束され得、ｃ）ＢＬＳの五量体との共有結合に関して課される構造上の制約（constrains）は、Ｂサブユニットの五量体構造を安定化するのに妥当ではないかもしれず、ｄ）オリゴマースキャフォールドのトポロジーはオリゴマー標的のものと適合しないかもしれず、ｅ）異なる蛋白質の中間立体配置間の相互作用が融合粒子の適切なフォールディングおよび集合体形成を妨げ得、ｆ）融合標的の低い安定性または低い可溶性が全粒子の安定性に悪影響を及ぼして、複合体の凝集を誘導し得る。
【００４５】
オリゴマースキャフォールド上の全蛋白質の提示は、外来蛋白質の不適当な構造とホモマー性の相互作用を起こすその傾向とによって制限され得る。候補挿入物のホモマー性の相互作用を起こす性質は非常に重要である。非モノマー蛋白質の提示は、オリゴマースキャフォールドの場合には、粒子間架橋および標的サブユニットのホモマー性の相互作用を通した凝集ゆえに難問であり得る。プロトマーが遊離のままであるときには、標的オリゴマーとＢＬＳとの間の釣り合わない化学量論ゆえにこの現象はさらに悪化し得る。
【００４６】
モノマー蛋白質の提示に関して正しく機能することが公知の蛋白質多量体スキャフォールドの使用が、別の多量体蛋白質を正しく提示することの失敗をもたらした例がある。たとえば、ＨＢｃＡｇによって形成されたＢ型肝炎ウィルス様粒子（ＶＬＰ）はモノマーｅＧＦＰの提示のために上首尾に用いられている（Kratz et al., 1999. Proc Natl Acad Sci USA 96(5): 1915-1920）。しかしながら、ＧＦＰの二量体化および四量体化カラーバリアントはＶＬＰを形成することに失敗した（Vogel et al., 2005. Proteins 58(2): 478-488）。この場合には、加工されたモノマーバリアントを代わりに用いたときの上首尾なＶＬＰ形成によって、挿入物の四次構造の大事な役割が実証された。別の例は、コレラ毒素Ｂサブユニット、細菌の正二十面体ルマジンシンターゼ（１２個の集合体形成した五量体によって形成される）、および酵母のルマジンシンターゼのようなホモ五量体蛋白質との組み換え融合によって、ニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）のホモ五量体の細胞外Ｎ末端ドメイン（ＥＣＤ）を可溶性に発現し、そのフォールディングおよび集合体形成を改善しようとする試みであるが、それらの全ては失敗した（Fischer et al., 2001. Proc Natl Acad Sci USA 98(6): 3567-3570）。この取り組みの失敗は融合蛋白質のフォールディング／会合挙動のせいであり得る。
【００４７】
予想に全く反して、ＢＬＳスキャフォールドへのＳｔｘ２Ｂサブユニットの取り付けは毒素の正しい五量体化を促進し、その構造（特にその熱力学的安定性）を劇的に安定化し（これは６０からほとんど９０℃への融解温度（Ｔｍ）の大きな増大によって実証された）、よって、Ａサブユニットと会合していないときのＳｔｘ２毒素のＢサブユニットの安定性の前述の欠如を克服する。その上、もたらされるキメラ（ＢＬＳ−Ｓｔｘ２Ｂ）は長期持続的な液性免疫応答を誘導する注目すべき能力を示し、Ｓｔｘ２およびそのバリアントの高い中和能力を有する抗体を誘導できる。これは、ＢＬＳ−Ｓｔｘ２Ｂによって免疫されたマウスが最終回の免疫投与の１０ヶ月後までｉ．ｐ．のＳｔｘチャレンジの高い致死量に対して完全に防御されるほどである。高度に特異的な抗体を誘導する能力は、ＢＬＳ−Ｓｔｘ２ＢキメラがＧｂ３への結合部位を構成するＳｔｘ２Ｂの立体的エピトープの天然立体配置を保持しているだけでなく、溶媒へのそれらの効率的な提示を可能にするということを示している。
【００４８】
ＢＬＳスキャフォールドがＳｔｘＡのカルボキシル末端（これはホロ毒素ではＳｔｘＢの環様構造の中央の穴を埋める）と同等な中央の突起部を欠くということを考慮すると、キメラにおける天然立体配置の維持は特に驚くべきことである。よって、ＢＬＳ−Ｓｔｘ２ＢではＳｔｘ２Ｂの中央の穴は空いている。当業者は、これがＳｔｘ２Ｂ五量体の形状および／または対称性の少なくとも若干の変化を引き起こし、翻ってその結合部位（特に、五量体の正しい集合体形成が機能的であることを必要とする部位１および３）に負の影響を及ぼすと予想するであろう。しかしながら、ＢＬＳスキャフォールドはそのＧｂ３結合部位を遮断することなしにＳｔｘ２Ｂ五量体を安定化できるように見える。
【００４９】
「技術分野」の項で論じられた通り、Ｓｔｘ２（配列番号１）は最も病原性の志賀毒素であり、Ｓｔｘ２Ｂベースの免疫原は、ＨＵＳ発症の大部分の場合に見いだされるＳｔｘバリアントに対して防御するであろう（Smith et al., 2006. Vaccine 24: 4122-4129、Wen et al., 2006. Vaccine 24(8): 1142-8、Shimizu et al., 2008. MicrobPathog 35(1):1-9）。より意義あることに、キメラによって誘導される抗体は野生型Ｓｔｘ２およびそのバリアントに対して同様の中和能力を示し、交差中和能力さえも示す（例えば、ＢＬＳ−Ｓｔｘ２Ｂキメラによって誘導される抗体はＳｔｘ１を中和できる）。毒素のこのファミリーの全てのＧｂ３結合部位は、Ａサブユニットとは逆のＢ五量体の同じ面に位置するということが以前に実証されている。よって、異なるＳｔｘファミリーメンバーを中和する血清の能力は、それらの結合部位（これらはＳｔｘファミリーの全てのメンバーにおいて保存されている）を認識する抗体を主に原因とするであろう。この事実はＨＵＳの予防法または治療法にとって非常に重要である。なぜなら、Ｇｂ３結合部位に対して幅広い反応性を示す抗体はＳｔｘファミリーの毒素の大部分によって引き起こされる被害を予防する点で高度に有効であるはずであり、本発明を、志賀毒素産生大腸菌の病原性株によって引き起こされる将来的なアウトブレイクの際のその使用について約束されたものにしている。いずれかの具体的な説明に与するものではないが、本発明者は、マウスがたとえばＢＬＳ−Ｓｔｘ２Ｂによって免疫されたときに惹起される強力なＢ細胞応答が、Ｓｔｘ２Ｂ五量体の熱力学的安定化とＢＬＳが樹状細胞を標的化し活性化する能力とによって説明され得ると考える（Bergueret al., 2006. J Immunol 176: 2366-2372）。Ｓｔｘ２Ｂによって惹起されるものと比較されたときに、ＢＬＳ−Ｓｔｘ２Ｂによって惹起される抗体の特異的なＥＬＩＳＡ力価および中和活性は大きく改善されている。
【００５０】
最初の側面によれば、本発明は、Brucellaルマジンシンターゼ（ＢＬＳ）のモノマーに融合された志賀毒素２のＢサブユニット（Ｓｔｘ２Ｂ）のモノマーを含むキメラ蛋白質を含む。
【００５１】
志賀毒素２型のＢサブユニットは、直接的にまたはペプチドリンカーを介してBrucellaルマジンシンターゼのモノマーのＮ末端に融合され得る。「BrucellaルマジンシンターゼのモノマーのＮ末端」によって、最もアミノ末端の１０アミノ酸のいずれか、例えばアミノ末端から最初の、第２の、第３の、第４の、第５の、第６の、第７の、第８の、第９の、または第１０のアミノ酸が意味される。
【００５２】
ルマジンシンターゼ酵素はリボフラビン生合成経路の最後から２番目のステップを触媒する（Goldbaum et al., 1999. J. Med. Microbiol., 48: 833-839参照）。その活性部位はモノマー間の境界面に位置しており、非常に安定な多量体秩序をこの蛋白質に付与する（Ritsert et al.,1995. J Mol. Biol., 253: 151-167参照）。
【００５３】
Brucella種のルマジンシンターゼ（ＢＬＳ）は高度に安定な蛋白質である。免疫化学的な酵素機能およびＸ線結晶学によって決定された３次元構造の分析は、天然蛋白質および組み換え発現された蛋白質について同様の結果を示している（Braden et al,. 2000. J. Mol. Biol., 297. 1031-1036、Goldbaum et al.,1999. J. Med. Microbiol., 48: 833-839、Goldbaum et al., 1998. J. Struct. Biol., 123: 175-178参照）。構造は、この１８ｋＤａ蛋白質が溶液中において１８０ｋＤａの十量体として振る舞い、ルマジンシンターゼの四次配列の新たな型となるということを示している（Zylberman et al., 2004. J. Biol. Chem., 279(9): 8093-8101参照）。構造分析は、ＢＬＳのモノマー同士のＮ末端が互いに４０オングストロームの距離で対称性の五量体の頂点に提示されるということと、アミノ末端の１０アミノ酸が全体的なフォールディングにもモノマー間の接触にも関与しないということとをまた示している（Bradenet al., 2000. J. Mol. Biol., 297. 1031-1036参照）。これは、抗原の担体としてのその有用性に大きく影響を及ぼすことなしに、ＢＬＳの少なくとも最後の８つのＮ末端アミノ酸残基のいくつかまたは全てが除去または変異導入され得るということを意味する。したがって、本発明のキメラペプチドにおいて、ＢＬＳ部分は完全なＢＬＳ野生型配列を含み得るか、またはそのＮ末端の最初の８つの位置のアミノ酸の１つ、数個、もしくは全てに置換、挿入、もしくは欠失を示し得る。それでもやはり、Ｎ末端の過度の伸長をもたらす多数の挿入物は負の影響（例えば、低下した可溶性および／または免疫応答を惹起する能力）を本発明のキメラ蛋白質に及ぼし得るので、ＢＬＳモノマーのＮ末端の欠失と挿入との組み合わせは好ましくは配列番号９に関して５アミノ酸よりも多くの伸長をもたらすべきではない。本発明の好ましい態様において、Brucella種のルマジンシンターゼのＮ末端の最初の８アミノ酸は欠失している。
【００５４】
元々のペプチドの生物学的特性および活性の全てまたは一部を維持しながら、ペプチドのアミノ酸配列中の若干の変化が可能であるということは周知である。元々の配列からの逸脱の程度とともに、生物学的活性を減少または喪失させる可能性が増大するということもまた公知である。したがって、ＢＬＳモノマーが野生型ＢＬＳ配列に関して若干の変化を示すキメラペプチド、特にＢＬＳモノマーが少なくとも９５％の（例えば、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の）配列同一性を配列番号９に対して有するもの（上で論じられた通り最初の８つのアミノ酸位置は考慮しない）もまた本発明の一部である。同様に、志賀毒素ＩＩ型のサブユニットＢが野生型志賀毒素ＩＩ型のサブユニットＢに対して配列の少なくとも９５％％の（例えば、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の）アミノ酸配列同一性であるキメラペプチドもまた本発明の範囲内である。
【００５５】
ＢＬＳモノマーへの志賀毒素２型のサブユニットＢモノマーの融合は、本発明においては直接的に（すなわち、サブユニットＢモノマーのＣ末端とＢＬＳモノマーのＮ末端との間にペプチド性の結合を確立することによって）、またはペプチドリンカーを介して達成され得る。ペプチドリンカーは好ましくはＧ／Ｓペプチドであり、２〜２０アミノ酸の長さまたは５〜１５アミノ酸の長さであり得、５、１０、または１５アミノ酸の長さ（例えば、アミノ酸の配列番号３、配列番号５、または配列番号７、好ましくは配列番号５を含むキメラペプチド）を含む。
【００５６】
組み換え発現されたときに、本発明のキメラ蛋白質はＢＬＳの典型的な立体配座（すなわち五量体の二量体）をとる傾向がある。このオリゴマー複合体において、各五量体の５つのＢＬＳ部分はもう一方の五量体の５つのＢＬＳモノマーに向いており、各五量体の５つのＳｔｘ部分は十量体の逆の末端において曝露される。よって、各五量体上の５つのＳｔｘモノマーは天然Ｓｔｘの分子立体配置を保持し、結果として天然Ｂサブユニットの三糖結合部位が保持される。その増大した安定性と相まって、ＢＬＳ−Ｓｔｘ十量体中のＳｔｘＢサブユニットの立体的エピトープの保持は、有効で安全な免疫応答のエリシターとしてそれらを特に有用にしている。よって、その側面の別のものによれば、本発明は、本発明のキメラ蛋白質の２つの五量体を含むかまたはそれらからなる蛋白質オリゴマー複合体を含む。かかる蛋白質オリゴマー複合体は、ＨＵＳに対してヒトなどの哺乳動物を免疫するための免疫原として、かつＨＵＳの治療に有用な抗Ｓｔｘ抗体およびその誘導体（derivate）を得るための免疫原として両方に有用である。
【００５７】
本発明のキメラ蛋白質を産生するために有用であり、動物に投与されたときには細胞性または液性応答を誘導することもまたできる本発明のキメラ蛋白質をコードする人工ポリヌクレオチドもまた本発明の一部である。かかるポリヌクレオチドは例えばＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはｃＤＮＡであるが、これに限定されない。好ましい態様において、本発明のキメラ蛋白質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号４、配列番号６、または配列番号８、より好ましくは配列番号６を含むＤＮＡ分子である。本発明のキメラ蛋白質をコードするポリヌクレオチドは、たとえば、細菌またはウィルスベクターなどであるが、これに限定されないベクターの構築に有用である。そのベクターは本発明のキメラ蛋白質を発現またはその発現を促進でき、本発明の別の側面を構成する。本発明のキメラ蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターは、当業者に周知の標準的な技術によって産生され得る。一例として、かかるベクターは、本発明のキメラ蛋白質をコードするポリヌクレオチドをｐＣｉ−ｎｅｏ（Promega, USA）に挿入することによって産生され得る。本発明の好ましい態様において、ベクターは、配列番号４、配列番号６、または配列番号８、より好ましくは配列番号６の本発明のキメラ蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含む。
【００５８】
本発明の一態様において、本発明のキメラ蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターは、本発明のキメラ蛋白質を発現するトランスジェニック細胞を産生するために用いられ得る。かかるトランスジェニック細胞は本発明の別の側面を構成する。本発明の場合に形質転換され得る細胞は昆虫細胞、細菌（大腸菌など）、酵母（Pichia pastorisなど）、および哺乳動物細胞（ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＢＨＫ、ナマルバ、およびＨｅＬａなど）を含むが、これに限定されない。本発明の好ましい態様において、トランスジェニック細胞は大腸菌細胞、好ましくは大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）である。トランスジェニック細胞は哺乳動物細胞（２９３Ｔ細胞など）またはPichia pastoris細胞でもまたあり得る。
【００５９】
本発明の別の側面によれば、本発明の蛋白質オリゴマー複合体および／または本発明のキメラ蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む医薬組成物が提供される。本発明の医薬化合物またはワクチンの活性物質は有効な生理的な量で存在する。
【００６０】
好ましい態様において本発明の医薬組成物はワクチンであり、オリゴマー複合体が配列番号３, 配列番号５、および配列番号７からなる群から選択されるアミノ酸配列、好ましくは配列番号５を含む。本発明のワクチンは、本発明の別の態様によれば、本発明のキメラ蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含むＤＮＡワクチンである。
【００６１】
本発明の医薬組成物は、好ましくは、哺乳動物対象の溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）に対する抵抗力を誘導することおよび／または抗Ｓｔｘ抗体の産生に有用なワクチンである。好ましくは、本発明の医薬組成物は医薬的に許容される担体をさらに含む。医薬的に許容される担体は当業者に周知であり、その細かい種別は製剤の種類およびその意図される送達経路に依存し、溶媒および希釈剤、例えば水、生理食塩水、ブドウ糖、エタノール、グリセロールなど、分散剤、コーティング、安定化剤、例えばアルブミンおよびＥＤＴＡアルカリ塩、保存料、抗細菌および抗真菌薬、等張化剤などを含む。その経口投与を意図されるもののような固体製剤の場合には、担体はマンニトール（manitol）、ラクトース、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウムなどを含む。
【００６２】
本発明のワクチン組成物は、初期感染後または疾病のアウトブレイク後に投与され、疾病を寛解または治癒させることを意図される治療用ワクチン、さらには感染前に投与され、予防することを意図される予防用ワクチンを両方含む。本発明のワクチン組成物は当業者に周知の標準的な方法によって調製され得る。好ましくは、本発明のワクチン組成物は上で記載された医薬的に許容される担体を含む。ワクチン組成物は好ましくはアジュバントを含む。アジュバントの例は油−水エマルション、例えばフロイントアジュバント、アルミニウム化合物、リポソーム、非イオン性ブロックポリマー、サポニン、およびジメチルジオクタデシルアンモニウム（amonium）ブロミド（ＤＤＡ）であるが、これに限定されない。本発明のワクチン組成物は通常の経路のいずれかによって投与され得、経口、鼻腔、および注射（筋肉内、静脈内、皮下、皮内など）経路を含むが、これに限定されない。
【００６３】
本発明のワクチンなどの医薬製剤は、液体状態または当分野において公知のいずれかの他の医薬形態、例えば注射用エマルションであり得る。本発明に記載される医薬化合物またはワクチンは、経口投与のための錠剤、溶液、懸濁液、もしくはエリキシル剤、または溶液もしくは懸濁液などの無菌の液体であり得る。好ましくは不活性媒質、例えば生理食塩水媒質、リン酸生理食塩水緩衝液、およびキメラ蛋白質、ヌクレオチド配列、またはそのセグメントが適切な可溶性を有する他の媒質が用いられる。
【００６４】
本発明の蛋白質オリゴマー複合体および／または本発明のキメラ蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む医薬組成物は、哺乳動物対象の溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）に対する抵抗力を誘導する方法に有用であり、これもまた本発明の一部である。その方法において、その組成物はその哺乳動物対象に投与される。投与量、免疫スケジュール、およびブースター投与の必要性は他の因子のうち対象の哺乳動物種、衛生条件、年齢、およびサイズに依存し、当業者によって容易に決定され得る。
【００６５】
Brucellaルマジンシンターゼ（ＢＬＳ）のモノマーのＮ末端に融合された志賀毒素２型のＢサブユニットのモノマーを含むキメラ蛋白質を産生するための方法もまた本発明の範囲内である。その方法は、ａ）そのキメラ蛋白質の発現にとって好適な条件下で、本発明のキメラ蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含むトランスジェニック細胞を培養するステップと、ｂ）そのキメラ蛋白質を回収するステップとを含む。上で説明された通り、組み換え発現されたときに、本発明のキメラ蛋白質はＢＬＳの典型的な立体配座（すなわち五量体の二量体）をとり、よって自己集合体形成して本発明のオリゴマー複合体になる。この方法に用いられるトランスジェニック細胞が本発明のトランスジェニック細胞のいずれかであり得、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）などの大腸菌細胞、Pichia pastoris細胞、および２９３Ｔ細胞などの哺乳動物細胞を含むが、これに限定されない。形質転換細胞によって発現された蛋白質は次に、クロマトグラフィー法によってなど、当業者に公知の方法によって回収および精製され得る。
【００６６】
Ｓｔｘ２のサブユニットＢの非キメラ形と比較してその増大した安定性のおかげで、本発明の蛋白質オリゴマー複合体は、志賀毒素のサブユニットＢに特異的に結合する抗体を得るための免疫原として特に有用であり、これは翻って当業者にとって直ちに自明の医療および診断用途を有する。よって、免疫応答を惹起するための本発明のオリゴマー複合体の能力は、志賀毒素のサブユニットＢに特異的に結合する抗体を産生するための方法へのその使用を可能にする。かかる方法もまた本発明の範囲内である。かかる方法は、ａ）そのキメラ蛋白質に対する中和抗体を惹起するのに好適な免疫スキームのもとで、本発明の蛋白質オリゴマー複合体を哺乳動物に投与するステップと、ｂ）その哺乳動物から、その中和抗体および／またはその中和抗体を産生する能力がある細胞を含む生物試料を得るステップと、ｃ）その生物試料をその抗体の供給源として用いるステップとを含む。生物試料は異なる種類であり得、その細かい種別は本発明の抗体がステップｃ）において得られる具体的な方法に依存するであろう。たとえば生物試料は血液であり得、そこからポリクローナル抗体を含む血清が得られる。本発明の好ましい態様によれば、ステップｂ）の生物試料はＢ細胞を含むかまたはＢ細胞からなり、それらは抗体産生ハイブリドーマを産生するためにステップｃ）において用いられる。ハイブリドーマテクノロジーは当業者に周知であり、抗体の分野において標準慣行となっている。たとえば、ＢＬＳ−Ｓｔｘ２Ｂに対して免疫されたマウスの脾臓細胞がミエローマ細胞と融合されて、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを得られる。本発明のより好ましい態様において、ステップａ）において免疫される動物はラマなどのラクダ科動物であり、生物試料はリンパ球を含む血液である。それらのリンパ球から、特異的なＶＨＨドメインをコードする遺伝子セグメントが得られ、志賀毒素のサブユニットＢに特異的に結合するＶＨＨ断片を組み換え産生するために用いられる。その小さいサイズならびに増大した可溶性および安定性によって、ＶＨＨ断片（他所ではシングルドメイン抗体およびナノボディともまた呼ばれる）は製剤および投与することが容易であり、従来の抗体によって通常は到達されないエピトープを標的化するために用いられ得る。
【００６７】
本発明の方法によって得られる抗体およびその抗原結合断片は、志賀毒素のサブユニットＢに特異的に結合し、本発明のキメラ蛋白質の立体的エピトープに対して作られ、インビボで志賀毒素を効率的に中和できる。それらの抗体は、本発明のキメラ蛋白質によって免疫される動物に応じて異なる供給源のものであり得る。抗体は好ましくはマウス、ヒト、もしくはラクダ科動物抗体またはその抗体結合断片である。抗体はポリクローナル抗体またはその抗体結合断片であり得る。しかしながら、本発明の方法によって得られる抗体は好ましくはモノクローナル抗体もしくは組み換え抗体またはその抗体結合断片、例えばマウスモノクローナル抗体もしくはラマ抗体またはその抗体結合断片、好ましくはシングルドメインラマ抗体またはその抗体結合断片、より好ましくはＶＨＨである。本発明の方法によって作られる抗体をコードする核酸のポリヌクレオチド配列は、当業者によって問題の抗体またはＶＨＨの配列から容易に引き出され得る。その核酸は形質転換ベクターを構築するために用いられ、次に当分野において周知の標準的な手順、例えばSambrookらに記載されているものを用いてホスト細胞内に導入され得る（Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989）。
【００６８】
ウシ内の腸管出血性大腸菌の細菌量を低下させるための方法もまた本発明の範囲内である。ウシおよび他の反芻動物は、ヒトＨＵＳと典型的に関連する志賀毒素産生大腸菌（ＳＴＥＣ）血清型（例えばＯ１５７：Ｈ７）の一次リザーバーである。子牛は水平または垂直伝染によって生まれて間もなくＳＴＥＣに感染し（Shaw, D. J., C. Jenkins, M. C. Pearce, T. Cheasty, G. J. Gunn, G. Dougan, H. R. Smith, M. E. Woolhouse, and G. Frankel. 2004. Shedding patterns of verocytotoxin-producing Escherichia coli strains in a cohort of calves and their dams on a Scottish beef farm. Appl. Environ. Microbiol. 70:7456-7465）、感染の臨床症状を現さないが、細菌を数ヶ月間大量に排出し得る（Widiasih, D. A., N. Ido, K. Omoe, S. Sugii, and K. Shinagawa. 2004. Duration and magnitude of faecal shedding of Shiga toxin-producing Escherichia coli from naturally infected cattle. Epidemiol. Infect. 132:67-75）。
【００６９】
ウシの持続的なＳＴＥＣ排出の減少は、ヒトのＳＴＥＣ感染を予防することに大きく寄与するであろう。ウシの予防接種は実用的な制御手段であり得るという証拠が研究から得られており、ＳＴＥＣのＯ１５７：Ｈ７抗原による免疫後にウシは大腸菌Ｏ１５７をより高頻度でなく排出する（Potter, A. A., S. Klashinsky, Y. Li, E. Frey, H. Townsend, D. Rogan, G. Erickson, S. Hinkley, T. Klopfenstein, R. A. Moxley, D. R. Smith, and B. B. Finlay. 2004. Decreased shedding of Escherichia O157:H7 by cattle following vaccination with type III secreted proteins. Vaccine 22:362-369）。蓄積しつつある証拠は、志賀毒素が感染中にＳＴＥＣ抗原に対する免疫応答を抑制するということを示している。Ｓｔｘは粘膜マクロファージ（Stamm, I., M. Mohr, P. S. Bridger, E. Schropfer, M. Konig, W. C. Stoffregen, E. A. Dean-Nystrom, G. Baljer, and C. Menge. 2008. Epithelial and mesenchymal cells in the bovine colonic mucosa differ in their responsiveness to Escherichia coli Shiga toxin 1. Infect. Immun. 76: 5381-5391）および腸管上皮内リンパ球（Menge, C., M. Blessenohl, T. Eisenberg, I. Stamm, and G. Baljer. 2004. Bovine ileal intraepithelial lymphocytes represent target cells for Shiga toxin 1 from Escherichia coli. Infect. Immun. 72:1896-1905）のサイトカイン発現パターンを変えてしまい、インビトロにおける粘膜および末梢リンパ球の活性化および増殖を抑制する（Moussay, E., I. Stamm, A. Taubert, G. Baljer, and C. Menge. 2006. Escherichia coli Shiga toxin 1 enhances IL-4 transcripts in bovine ileal intraepithelial lymphocytes. Vet. Immunol. Immunopathol. 113: 367-382）。Ｓｔｘ陰性大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７を接種された動物のものと比較して、Ｓｔｘ２産生ＳＴＥＣのＯ１５７：Ｈ７による子牛の実験感染後には細胞性適応免疫応答の発生もまた大きく遅れる（Hoffman, M. A., C. Menge, T. A. Casey, W. Laegreid, B. T. Bosworth, and E. A. Dean-Nystrom. 2006. Bovine immune response to Shiga-toxigenic Escherichia coli O157:H7. Clin. Vaccine Immunol. 13: 1322-1327）。
【００７０】
よって、Ｏ１５７：Ｈ７大腸菌特異的な細胞性免疫応答がどのようにして長期の断続的なＳＴＥＣ排出に影響を及ぼすのかは依然として不明であるが（Cray, W. C., Jr., and H. W. Moon. 1995. Experimental infection of calves and adult cattle with Escherichia coli O157:H7. Appl. Environ. Microbiol. 61: 1586-1590）、ウシワクチンのための抗ＳＴＥＣ製剤中の抗原としてのＳｔｘの包含が有利であろうということが示唆されている。なぜなら、Ｓｔｘは全てのＳＴＥＣ株に共通の唯一の病原性因子であるからであり、Ｓｔｘの中和は全体的な抗ＳＴＥＣ免疫応答を改善し得るからである（Frohlich J1 , Baljer G, Menge C. Maternally and naturally acquired antibodies to Shiga toxins in a cohort of calves shedding Shiga-toxigenic Escherichia coli. Appl Environ Microbiol. 2009 Jun;75(11): 3695-704）。
【００７１】
その上、マウスモデルで実施された研究は、抗Ｓｔｘ抗体がＥＨＥＣの定着を阻害できるということを実証した（Mohawk KL, Melton-Celsa AR, Robinson CM, O'Brien AD. Neutralizing antibodies to Shiga toxin type 2 (Stx2) reduce colonization of mice by Stx2-expressing Escherichia coli O157:H7. Vaccine 2010., 28: 4777-4785）。提案された異なる機序のうち、Ｓｔｘ２は、インチミンの真核生物の受容体として働くヌクレオリンの表面発現を増強することによってＥＨＥＣの付着に正に寄与し得るということが示されている（Sinclair JF, O'Brien AD. Cell surface-localized nucleolin is a eukaryotic receptor for the adhesin intimin-gamma of enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7. J Biol Chem 2002, 277: 2876-2885、Robinson CM, Sinclair JF, Smith MJ, O'Brien AD. Shiga toxin of enterohemorrhagic Escherichia coli type O157:1-17 promotes intestinal colonization. Proc Natl Acad Sci USA 2006, 103: 9667-9672）。
【００７２】
ウシなどの哺乳動物内の腸管出血性大腸菌の細菌量を低下させるための本発明の方法において、本発明のオリゴマー複合体は細菌量の低下が望まれる動物に投与され、よって志賀毒素２のＢサブユニットに対する有効な免疫応答を惹起する。翻って、これはＳＴＥＣ抗原に対する免疫応答の志賀毒素による抑制を予防し、ウシの持続的なＳＴＥＣ排出の減少をもたらす。
【００７３】
ウシなどの哺乳動物内の腸管出血性大腸菌の細菌量を低下させるための本発明の代替的な方法において、本発明の抗体は細菌量の低下が望まれる動物に投与される。
【００７４】
本発明のさらなる側面は、本発明のキメラ蛋白質に結合する抗体に関する。かかる抗体は好ましく本発明のキメラ蛋白質に特異的である。この場合に、用語「特異的」は抗体が本発明のキメラ蛋白質に優先的に結合するということを意味するが、他の蛋白質とのより少ない程度の結合を排除しない。
【００７５】
ヒトなどの哺乳動物の溶血性尿毒症症候群を予防または治療するための医薬組成物の製造への本発明の抗体の使用もまた本発明の一部である。その場合には、本発明の抗体は、ＨＵＳの予防または治療の必要がある哺乳動物へのその投与のために医薬的に許容される担体と組み合わせられ得る。医薬担体および医薬提示は既に上で論じられており、当業者に周知である。
【００７６】
本発明のさらなる側面は、本発明の抗体と医薬的に好適な担体とを含む医薬組成物に関する。本発明の抗体および医薬組成物は例えばその必要がある対象の溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）を治療または予防するための方法に有用であり、これは本発明の尚別の側面である。かかる方法は、ヒト対象（大腸菌の腸管出血性株に感染したヒト対象など）の溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）を治療または予防するために好ましくは用いられる。
【００７７】
例１
キメラ蛋白質ＢＬＳ−Ｓｔｘ２の分子モデリング
キメラの設計は、PyMOL 1 .5プログラム（www.pymol.org）によってその理論上の構造をモデリングし、Ｓｔｘ２Ｂの構造のＣ末端（PDBコードIR4P）をＢＬＳの結晶学的構造のＮ末端（PDBコードID10）と融合することによって行った。これは以前にLaplagneらによって記載されたものと同様の戦略である（Laplagne et al., 2004. Proteins 57:820-828）。ＢＬＳのＮ末端の最初の８残基のコード配列を、Ｓｔｘ２Ｂと両方の蛋白質を繋ぐフレキシブルＧ／Ｓ５ペプチド、１０ペプチド、または１５アミノ酸ペプチドリンカーとのコード配列によって置換した。Ｓｔｘ２ＢおよびＢＬＳは両方とも同じＣ５対称性の五量体構造を形成し、各プロトマーは他の２つと相互作用する。分子モデリングによって得られたキメラの理論上の構造（図１）は、用いられる全てのリンカーが十分に長く、立体障害なしにＢＬＳの五量体モジュール上へのＳｔｘ２Ｂ五量体の集合体形成を可能にするということを示している。十量体ＢＬＳ粒子において、２つのＳｔｘ２Ｂ五量体は構造の頂部および底部において逆方向に提示されるであろう。このモデルにおいては、Ｓｔｘ２ホロ毒素のＡサブユニットと相互作用するＳｔｘ２ＢのＣ末端表面はＢＬＳスキャフォールドに向いており、免疫システムとの相互作用から恐らく防御されるであろう一方で、グロボトリアオシルセラミド（Ｇｂ３）結合部位はまったく曝露されるであろうということは、注目に値する。
【００７８】
例２
配列番号４を有する遺伝子を含むｐＥＴ１１ａ−ＢＬＳ−Ｓｔｘ２Ｂ−Ｌ５（５アミノ酸リンカーを有する）プラスミドが、次のプロトコールによって構築された。
ａ）Brucella種のルマジンシンターゼ（ＢＬＳ）のコード遺伝子をクローニングするために、ＢＬＳ配列をB. abortusのゲノムＤＮＡから特異的プライマーによるＰＣＲ増幅によって得、ｐＥＴ１１ａベクターにクローニングした（Novagen, USA）。カセットを製作するために、Brucella種のルマジンシンターゼ（ＢＬＳ）のオープンリーディングフレームをコードする配列に対して部位特異的変異導入を実施した（Laplagne et. al., 2004）。２つの新たな制限部位をＢＬＳ遺伝子の５’領域に挿入した（５’末端の最初の２つのコドンにＮｓｉＩ部位、ＢＬＳの天然アミノ酸配列の８および９残基を含む２つのコドンに１つのＡｆｌＩＩ部位）。
ｂ）Ｓｔｘ２Ｂ蛋白質（配列番号１）をコードする配列を挿入するために、本発明者は、配列の５’のＮｓｉＩ酵素の部位（下線）および配列の３’のＡｆｌＩＩ酵素の部位（下線）＋５アミノ酸のリンカーをコードする配列（小文字）を有するＳｔｘ２Ｂ蛋白質を増幅するオリゴヌクレオチドを設計した。Ｓｔｘ２Ｂ遺伝子（配列番号２）は、鋳型としてｐＧＥＭ−Ｔベクター中の以前にクローニングされた配列からＰＣＲによって得た（Capozzo et al., 2003. Infect Immun 71: 3971-3978）。
そのため, 次のオリゴヌクレオチドを作り、プライマーとしてＰＣＲに用いた。
プライマーforward（配列番号１０）：
5' ATCAACATGCATGCGGATTGTGCTAAAGGT 3'
プライマーreverse 5（配列番号１１）：
5' TAAAATCTTAAGACCAGAACCAGAACCGTCATTATTAAACTGCAC 3'
ＰＣＲ反応は０．２ｍＭデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）（Promega Inc.）、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２（PBL（登録商標））、０．１５ユニットのＤＮＡＴａｑポリメラーゼ（PBL（登録商標））、および０．５μΜプライマーによって行った。サイクルのプロファイルは、９４℃２分間の１サイクル、９２℃１０秒間、６２℃１２秒間、および７２℃３０秒間の５サイクル、ならびに最後に７２℃２分間の１サイクルであった。
ＰＣＲ産物はアガロースゲルを用いてチェックし、次にQiagen抽出キット（Qiagen, UK）を用いて精製した。
ｃ）ｐＥＴ１１ａ−ＢＬＳプラスミドおよびＳｔｘ２Ｂ−Ｌ５の精製ＰＣＲ産物をＮｓｉＩおよびＡｆｌＩＩ制限酵素によって消化した。消化は３ユニットのＮｓｉＩ（Fermentas Inc.）および３ユニットのＡｆｌＩＩ（Fermentas Inc）によってTango（商標）緩衝液２×（最終濃度）中で、４時間３７℃で実施した。消化産物を５ユニットのＤＮＡＴ４リガーゼ酵素（Fermentas Inc.）によって一晩１６℃でライゲーションした。ライゲーションを大腸菌ＤＨ５αコンピテントセルに形質転換し、コロニーを特異的プライマー（forwardおよびreverse 5）によるＰＣＲによってスクリーニングした。挿入はシーケンシングによって確認した。シーケンシング分析によって、Brucella種のルマジンシンターゼの最初の８アミノ酸がＳｔｘ２Ｂ蛋白質の７０アミノ酸（配列番号１）によって置換されているということが示された。よって配列番号３を有するＢＬＳ−Ｓｔｘ２Ｂ（Ｌ５）と呼ばれるキメラ融合蛋白質をコードする遺伝子が得られた。
【００７９】
例３
ｐＣＩ−ｎｅｏ−ＢＬＳ−Ｓｔｘ２Ｂ−Ｌ５プラスミドを次のプロトコールによって構築した。
ｐＥＴ１１ａベクターにクローニングされた配列番号４のＢＬＳ−Ｓｔｘ２Ｂ（Ｌ５）の遺伝子の配列を、ベクターｐＣｉ−ｎｅｏ（Promega, USA）にサブクローニングした。そのため、次のオリゴヌクレオチドを作り、プライマーとしてＰＣＲに用いた。ACCATG
BLS-DNA-chimera all（配列番号１２）：5' GTTTAAgaattcGAAGGAGATACCACCATGCAT 3'
BLS-Back（配列番号１３）：3' CGTAGCGCGAACAGACTcgatcgTACTGACCACCTGT 5'
BLS-DNA-chimera allプライマーはＥｃｏＲＩ酵素の制限部位（小文字）およびＫｏｚａｋコンセンサス配列（下線）を追加し、BLS-BackプライマーはＮｈｅＩ酵素の制限部位（小文字）を追加する。
かかる配列は、鋳型としてｐＥＴ１１ａ−ＢＬＳ−Ｓｔｘ２Ｂ（Ｌ５）プラスミドを用いてＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ反応を実施例２Ｃに記載された通り行った。サイクルのプロファイルは、９４℃５分間の１サイクル、９４℃１分間、５５℃１分間、および７４℃１分間の４０サイクル、ならびに最後に７４℃８分間の１サイクルであった。ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩおよびＮｈｅＩ酵素によって消化し、ｐＣＩ−ｎｅｏベクターをＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩによって消化した。ＥｃｏＲＩ／Ｎｈｅｌ消化は次の通り行った。５ユニットのＮｈｅＩ（Fermentas Inc.）、Tango（商標）緩衝液１×（最終濃度）中、４時間３７℃。次に、５ユニットのＥｃｏＲＩ（Fermentas Inc.）およびTango（商標）緩衝液を式Ｖ＝Ａ／８に従って追加した。Ｖは追加されるべき緩衝液の体積であり、Ａは反応の最初の体積である。消化は３７℃でもう３時間インキュベーションした。ＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ消化は、４ユニットのＥｃｏＲＩおよび４ユニットのＸｂａＩ（Fermentas Inc.）でTango（商標）緩衝液２×（最終濃度）中で、４時間３７℃で行った。
次に、ライゲーション反応を（ＮｈｅＩおよびＸｂａＩ酵素は適合する末端を有する）実施例２Ｃに記載された通り実施した。ライゲーションを大腸菌ＤＨ５αコンピテントセルに形質転換し、コロニーを特異的プライマー（BLS-DNA-chimera all／BLS-Backおよびforward／reverse 5）によるＰＣＲによってスクリーニングした。得られた構築物はシーケンシングによってチェックした。ｐＣＩ−ｎｅｏ−ＢＬＳ−Ｓｔｘ２Ｂ（Ｌ５）プラスミドを大腸菌ＤＨ５α細胞によって増幅し、さらに"mini prep"カラム（Qiagen, UK）によって精製した。ＤＮＡの純度および濃度は２６０／２８０ｎｍの分光測色法によって評価した。
【００８０】
例４
配列番号６を有する遺伝子を含むｐＥＴ１１ａ−ＢＬＳ−Ｓｔｘ２Ｂ−Ｌ１０（１０アミノ酸リンカーを有する）プラスミドを次のプロトコールによって構築した。
ａ）Brucella種のルマジンシンターゼ（ＢＬＳ）のコード遺伝子をクローニングするために、ＢＬＳ配列をB. abortusのゲノムＤＮＡから特異的プライマーによるＰＣＲ増幅によって得、ｐＥＴ１１ａベクター（Novagen, USA）にクローニングした。カセットを製作するために、Brucella種のルマジンシンターゼ（ＢＬＳ）のオープンリーディングフレームをコードする配列に対して部位特異的変異導入を実施した（Laplagne et al., 2004. Proteins 57:820-828）。２つの新たな制限部位をＢＬＳ遺伝子の５’領域に挿入した（５’末端の最初の２つのコドンにＮｓｉＩ部位、ＢＬＳの天然アミノ酸配列の８および９残基を含む２つのコドンに１つのＡｆｌＩＩ部位）。
ｂ）Ｓｔｘ２Ｂ蛋白質（配列番号１）をコードする配列を挿入するために、本発明者は、配列の５’のＮｓｉＩ酵素の部位（下線）および配列の３’のＡｆｌＩＩ酵素の部位（下線）＋１０アミノ酸のリンカーをコードする配列（小文字）を有するこのＳｔｘ２Ｂ蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含む配列を設計した。
Ｓｔｘ２Ｂ遺伝子（配列番号２）は、鋳型としてｐＧＥＭ−Ｔベクター中の以前にクローニングされた配列からＰＣＲによって得た（Capozzo et al., 2003. Infect Immunol 71: 3971-3978）。
そのため、次のオリゴヌクレオチドを作り、プライマーとしてＰＣＲに用いた。
プライマーforward（配列番号１４）：
5' ATCAACATGCATGCGGATTGTGCTAAAGGT 3'
プライマーreverse 10（配列番号１５）：
5' TAAAATCTTAAGagaaccagaaccagaaccagaaccAGAACCGTCATTATTAAACTGCAC 3'
ＰＣＲ反応を実施例２Ｃに記載された通り行った。サイクルのプロファイルは、１サイクルの９４℃２分間、３５サイクルの９２℃１０秒間、６８℃１２秒間、および７２℃３０秒間、ならびに最後の１サイクルの７２℃２分間であった。
ＰＣＲ産物はアガロースゲルを用いてチェックし、次にQiagen抽出キット（Qiagen, UK）を用いて精製した。
ｃ）ｐＥＴ１１ａ−ＢＬＳプラスミドおよび精製遺伝子をＮｓｉＩおよびＡｆｌＩＩ制限酵素によって消化し、ＤＮＡＴ４リガーゼ酵素によって１６℃で実施例２（Ｃ）に記載された通りライゲーションした。ライゲーションを大腸菌ＤＨ５αコンピテントセルに形質転換し、コロニーを特異的プライマー（forwardおよびreverse 10）によるＰＣＲによってスクリーニングした。挿入はシーケンシングによって確認した。シーケンシング分析によって、Brucella種のルマジンシンターゼの最初の８アミノ酸がＳｔｘ２Ｂ蛋白質の７０アミノ酸（配列番号１）によって置換されているということが示された。よって遺伝子が得られ、これは配列番号５を有するＢＬＳ−Ｓｔｘ２Ｂ（Ｌ１０）と呼ばれるキメラ融合蛋白質をコードする。
【００８１】
例５
ｐＣＩ−ｎｅｏ−ＢＬＳ−Ｓｔｘ２Ｂ−Ｌ１０プラスミドを次のプロトコールによって構築した。
ｐＥＴ１１ａベクターにクローニングされた配列番号６のＢＬＳ−Ｓｔｘ２Ｂ（Ｌ１０）の遺伝子の配列をｐＣｉ−ｎｅｏベクター（Promega, USA）にサブクローニングした。そのため, 次のオリゴヌクレオチドを作り、プライマーとしてＰＣＲに用いた。
BLS-DNA-chimera all（配列番号１６）：5' GTTTAAgaattcGAAGGAGATACCACCATGCAT 3'
BLS-Back（配列番号１７）：3 'CGTAGCGCGAACAGACTcgatcgTACTGACCACCTGT 5'
BLS-DNA-chimera allプライマーはＥｃｏＲＩ酵素の制限部位（小文字）およびＫｏｚａｋコンセンサス配列（下線）を追加し、BLS-BackプライマーはＮｈｅＩ酵素の制限部位（小文字）を追加する。
かかる配列を、鋳型としてｐＥＴ１１ａ−ＢＬＳ−Ｓｔｘ２Ｂ（Ｌ１０）プラスミドを用いてＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲは実施例３に記載された通り実施した。ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩおよびＮｈｅＩ酵素によって消化し、ｐＣＩ−ｎｅｏベクターをＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩによって実施例３に記載された通り消化した。次にライゲーション反応を（ＮｈｅＩおよびＸｂａＩ酵素は適合する末端を有する）実施例２（Ｃ）に記載された通り実施した。ライゲーションを大腸菌ＤＨ５αコンピテントセルに形質転換し、コロニーを特異的プライマー（BLS-DNA-chimera all／BLS-Backおよびforward／reverse 10）によるＰＣＲによってスクリーニングした。得られた構築物をシーケンシングによってチェックした。ｐＣＩ−ｎｅｏ−ＢＬＳ−Ｓｔｘ２Ｂ（Ｌ１０）プラスミドを大腸菌ＤＨ５α細胞によって増幅し、さらに"mini prep"カラム（Qiagen, UK）によって精製した。ＤＮＡの純度および濃度は２６０／２８０ｎｍの分光測色法によって評価した。
【００８２】
例６
配列番号８を有する遺伝子を含むｐＥＴ１１ａ−ＢＬＳ−Ｓｔｘ２Ｂ（１５アミノ酸リンカーを有する）プラスミドを次のプロトコールによって構築した。
ａ）Brucella種のルマジンシンターゼ（ＢＬＳ）のコード遺伝子をクローニングするために、ＢＬＳ配列をB. abortusのゲノムＤＮＡから特異的プライマーによるＰＣＲ増幅によって得、ｐＥＴ１１ａベクター（Novagen, USA）にクローニングした。カセットを製作するために、Brucella種のルマジンシンターゼ（ＢＬＳ）のオープンリーディングフレームをコードする配列に対して部位特異的変異導入を実施した（Laplagne et al., 2004. Proteins 57:820-828）。２つの新たな制限部位をＢＬＳ遺伝子の５’領域に挿入した（５’末端の最初の２つのコドンにＮｓｉＩ部位、ＢＬＳの天然アミノ酸配列の８および９残基を含む２つのコドンに１つのＡｆｌＩＩ部位）。
ｂ）Ｓｔｘ２Ｂ蛋白質（配列番号１）をコードする配列を挿入するために、本発明者は、配列の５’のＮｓｉＩ酵素の部位（下線）および配列の３’のＡｆｌＩＩ酵素の部位（下線）＋１５アミノ酸のリンカーをコードする配列（小文字）を有するこのＳｔｘ２Ｂ蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含む配列を設計した。
Ｓｔｘ２Ｂ遺伝子（配列番号２）は、鋳型としてｐＧＥＭ−Ｔベクター中の以前にクローニングされた配列からＰＣＲによって得た（Capozzo et al., 2003. Infect Immunol 71: 3971-3978）。
そのため、次のオリゴヌクレオチドを作り、プライマーとしてＰＣＲに用いた。
プライマーforward（配列番号１８）：
5' ATCAACATGCATGCGGATTGTGCTAAAGGT 3'
プライマーreverse 15（配列番号１９）：
5' TAAAATCTTAAGaccagaaccagaaccagaaccagaaccagaaccagaaccagaaccGTCATTATTAAACTGCAC 3'
ＰＣＲ反応は実施例２Ｃに記載された通り実施した。サイクルのプロファイルは、１サイクルの９４℃２分間、３５サイクルの９２℃１０秒間、６８℃１２秒間、および７２℃３０秒間、ならびに最後の１サイクルの７２℃２分間であった。
ＰＣＲ産物をアガロースゲルを用いてチェックし、次にQiagen抽出キット（Qiagen, UK）を用いて精製した。
ｃ）ｐＥＴ１１ａ−ＢＬＳプラスミドおよび精製遺伝子をＮｓｉＩおよびＡｆｌＩＩ制限酵素によって消化し、ＤＮＡＴ４リガーゼ酵素によって１６℃で実施例２（Ｃ）に記載された通りライゲーションした。ライゲーションを大腸菌ＤＨ５αコンピテントセルに形質転換し、コロニーを特異的プライマー（forwardおよびreverse 15）によるＰＣＲによってスクリーニングした。挿入はシーケンシングによって確認した。シーケンシング分析によって、Brucella種のルマジンシンターゼの最初の８アミノ酸がネコＳｔｘ２Ｂ蛋白質の７０アミノ酸（配列番号１）によって置換されていることが示された。よって遺伝子が得られ、これは配列番号７を有するＢＬＳ−Ｓｔｘ２Ｂ（Ｌ１５）と呼ばれるキメラ融合蛋白質をコードする。
【００８３】
例７
ｐＣＩ−ｎｅｏ−ＢＬＳ−Ｓｔｘ２Ｂ−Ｌ１５プラスミドを次のプロトコールによって構築した。
ｐＥＴ１１ａベクターにクローニングされた配列番号８のＢＬＳ−Ｓｔｘ２Ｂ（Ｌ１５）の遺伝子の配列を、ｐＣｉ−ｎｅｏ（Promega, USA）ベクターにサブクローニングした。そのため, 次のオリゴヌクレオチドを作り、プライマーとしてＰＣＲに用いた。
BLS-DNA-chimera all（配列番号２０）：
5' GTTTAAgaattcGAAGGAGATACCACCATGCAT 3'
BLS-Back（配列番号２1）：
3 'CGTAGCGCGAACAGACTcgatcgTACTGACCACCTGT 5'
BLS-DNA-chimera allプライマーはＥｃｏＲＩ酵素の制限部位（小文字）およびＫｏｚａｋコンセンサス配列（下線）を追加し、BLS-BackプライマーはＮｈｅＩ酵素の制限部位（小文字）を追加する。
かかる配列は、鋳型としてｐＥＴ１１ａ−ＢＬＳ−Ｓｔｘ２Ｂ（Ｌ１５）プラスミドを用いてＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲは実施例３に記載された通り行った。ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩおよびＮｈｅＩ酵素によって消化し、ｐＣＩ−ｎｅｏベクターを実施例３に記載された通りＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩによって消化した。次にライゲーション反応を（ＮｈｅＩおよびＸｂａＩ酵素は適合する末端を有する）実施例２（Ｃ）に記載された通り実施した。ライゲーションを大腸菌ＤＨ５αコンピテントセルに形質転換し、コロニーを特異的プライマー（BLS-DNA-chimera all／BLS-Backおよびforward／reverse 15）によるＰＣＲによってスクリーニングした。得られた構築物はシーケンシングによってチェックした。ｐＣＩ−ｎｅｏ−ＢＬＳ−Ｓｔｘ２Ｂ（Ｌ１５）プラスミドを大腸菌ＤＨ５α細胞によって増幅し、さらに"mini prep"カラム（Qiagen, UK）によって精製した。ＤＮＡの純度および濃度は２６０／２８０ｎｍの分光測色法によって評価した。
【００８４】
例８
ＢＬＳ−Ｓｔｘ２Ｂ（５、１０、および１５アミノ酸リンカーを有する）キメラの精製
３つのｐｅｔ１１ａ−ＢＬＳ−Ｓｔｘ２Ｂプラスミドを組み換え蛋白質の発現のための大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテントセルに形質転換した。細胞をアンピシリンを補ったＬＢブロス中で、３７℃で撹拌しながら（２５０ｒｐｍ）生育した。一晩培養物を新鮮なＬＢ−アンピシリン培地によって１：１００希釈し、ＯＤ６００ｎｍ＝１に達するまで生育した。この時点で、１ｍＭイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）（Sigma）を追加することによって培養物を誘導し、撹拌しながら（２５０ｒｐｍ）２８℃で３時間インキュベーションした。細菌を４℃で２０分、１５０００ｇで遠心した。採取した細胞を５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝液中に再懸濁し、音波処理によって溶解した。
全てのＳｔｘ２Ｂ−ＢＬＳキメラは封入体として発現された（図２Ａ）。封入体を、一晩のインキュベーションによって、８Ｍ尿素、５０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８）の緩衝液中で、室温で撹拌しながら可溶化した。蛋白質は１Ｍ尿素、５０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．５）緩衝液に対して１２−１４，０００  ＭＷＣＯ膜（Spectrum Laboratories, Inc., Rancho Dominguez, CA, USA）によって透析した。可溶化した蛋白質は、ＵＶ／ｖｉｓ検出器（Gilson, model 152）に繋がったＨＰＬＣ装置（Gilson model 320）を用い、Q-Sepharose（Pharmacia, GE Healthcare Life Sciences）カラムの陰イオン交換クロマトグラフィーによって精製した。溶出は１Ｍ尿素、５０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ、１ｍＭのＰＭＳＦ（ｐＨ８．５）の緩衝液中の０〜１ＭのＮａＣｌの直線勾配を用いて実施した。蛋白質を10,000 MWCO Centriprep（登録商標）濃縮システム（Millipore, Carrigtwohill, Co. Cork, Ireland）によって濃縮した。調製物の純度はドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１５％、ｗ／ｖ）によって決定し（図２ＢおよびＤ）、標準的な方法によって定量した。蛋白質は各免疫以前にリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に対して透析した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定すると、蛋白質は予想される分子量を有しており（図２Ｄ）、抗ＢＬＳおよび抗Ｓｔｘ２抗体によってウェスタンブロットアッセイによって認識された（図２Ｃ）。
【００８５】
例９
ｐＣＩｎｅｏ−ＢＬＳ−Ｓｔｘ２ＢＬ５、Ｌ１０、およびＬ１５による２９３Ｔ細胞のトランスフェクション
真核細胞内におけるＢＬＳ−Ｓｔｘ２Ｂの正しい発現を裏付けるために、PolyFect（登録商標）試薬（Qiagen Inc.）を用いてｐＣＩ−ＢＬＳ−Ｓｔｘ２Ｂによって２９３Ｔ細胞をトランスフェクションした。簡略には、６×１０５細胞／ウェルを、５％ＣＯ２中の３７℃の６ウェル培養プレートで、抗生物質−抗真菌薬（ＡＡ）および５％胎児ウシ血清（FBS, Natocor）を有するＲＰＭＩ１６４０培地中で生育した。２μｇのｐＣＩｎｅｏ−ＢＬＳ−Ｓｔｘ２ＢをＲＰＭＩ培地によって１００μｌまで希釈し、２０μｌのPolyFect（登録商標）試薬を追加した。複合体形成を可能にするために、混合物を室温で１０分インキュベーションした。トランスフェクション混合物をＲＭＰＩ培地によって１ｍｌまで希釈して細胞に追加し、５％ＣＯ２中３７℃で、ＡＡおよび２％ＦＢＳを有するＲＰＭＩ１６４０培地中で４８時間インキュベーションした。４８時間後に細胞をＰＢＳによって採取し、１５００ｒｐｍで５分間遠心した。細胞ペレットをＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液中に再懸濁し（細胞溶解のため）、ウェスタンブロット分析にかけた。細胞溶解蛋白質の結果を１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、ニトロセルロース膜に電気転写した。膜は、ＰＢＳ−０．１％Ｔｗｅｅｎで希釈した５％ミルクによって室温で２時間ブロッキングし、３％ミルクのＰＢＳ−０．１％Ｔｗｅｅｎで希釈したＢＬＳ特異的な抗体（１：２０００）と一緒に４℃で一晩インキュベーションした。膜を洗浄し、ペルオキシダーゼ標識ウサギ抗マウスＩｇＧ（１：３０００）（Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA）と一緒に室温で２時間インキュベーションした。反応はＥＣＬ溶液によって現像した（図３）。
図３は、全ての３つのｐＣＩｎｅｏ−ＢＬＳ−Ｓｔｘ２Ｂ構築物が対応する蛋白質を真核細胞株２９３Ｔ中で発現できるということを示している。これはウェスタンブロットアッセイによって、予想された分子量（およそ２５ｋＤａ）の特異的なバンドとして明らかにされた。
【００８６】
例１０
円偏光二色性による構造分析
精製キメラの二次構造を評価するために、遠ＵＶ（２００〜２５０ｎｍの波長範囲）の円偏光二色性（ＣＤ）シグナルが測定された。
【００８７】
遠ＵＶ領域（２５０〜２００ｎｍ）におけるＢＬＳ−Ｓｔｘ２Ｂ、ＢＬＳ、およびＳｔｘ２ＢのＣＤスペクトルをJASCO J-810分光偏光計によってＰＢＳ（ｐＨ７．０）緩衝液中２５℃で測定した。１または２ｍｍのいずれかの経路長の石英キュベットを用いた。ProtParamExPASyツール（http://web.expasy.org/protparam/）を用いて各蛋白質について得られた理論上の分子量値を用いて、データをモル楕円率［θ］（°ｃｍ２μｍｏｌｐｒｏｔ−１の単位）に変換した。
ＢＬＳ−Ｓｔｘ２Ｂの遠ＵＶ−ＣＤスペクトルは、単離されたＢＬＳおよびＳｔｘ２ＢのＣＤシグナルの組み合わせからこの蛋白質について理論上計算されたものと実質的に同一であるということが示された。これらの結果は、３つのキメラの構造において、ＢＬＳおよびＳｔｘ２Ｂ両方の二次構造の保持を示している（図４）。
【００８８】
例１１
静的光散乱による構造分析
ＢＬＳ−Ｓｔｘ２Ｂの平均分子量（Ｍｗ）を、高速液体クロマトグラフィーシステム（Waters 486 UV検出器およびLKB 2142示差屈折率計を含む）にタンデムに繋がれたPrecision Detectors PD2010光散乱器によって決定した。一般的に、２００〜４００μｌの各ＢＬＳ−Ｓｔｘ２Ｂ−Ｌ５、Ｌ１０、およびＬ１５（０．５〜１ｍｇ／ｍｌ）をSuperdex 200 HR-10/30カラムにローディングし、１Ｍ尿素の５０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ、０．１５ＭのＮａＣｌ（ｐＨ８）の緩衝液によって溶出した。溶出材料の９０°の光散乱および屈折率シグナルをＰＣコンピュータ上に記録し、Precision Detectorsによって供給されたDiscovery32ソフトウェアによって分析した。９０°光散乱検出器はウシ血清アルブミン（Ｍｗ：６６．５ｋＤａ）を標準として用いて校正した。もたらされたＭＷと理論上のＭＷとの間の類似性によって、天然ＢＬＳの四次構造と一致する各キメラの構造の適切なフォールディングされたものが示された（図５）。
【００８９】
例１２
熱変性分析
ＰＢＳ（ｐＨ７．０）緩衝液中のＢＬＳ−Ｓｔｘ２Ｂ−Ｌ５、Ｌ１０、およびＬ１５、ＢＬＳ野生型、ならびにＳｔｘ２Ｂ試料の熱によって誘導される変性を、温度の関数としてJASCO J-810分光偏光計によってそれらの蛋白質の２２２ｎｍのＣＤシグナルを測定することによって追跡した。ペルチェシステム（Jasco）によって温度を増大させることによって試料を低速で加熱した。温度走査の範囲は４℃／分の速度で２５〜１００℃であった。２２２ｎｍのモル楕円率を０．５℃毎に測定した。よって熱転移の中点温度を見かけ上の融解温度（Ｔｍ）として考慮した。キメラの適切なフォールディング構造は、単離されたＳＴＸ２ＢおよびＢＬＳモジュールと比較した熱安定性の分析によってもまた支持された。これらの蛋白質の熱変性をＣＤ分光によって分析した（図６）。ＢＬＳの構造は８５℃まで安定である。この温度を超えると、蛋白質は８９℃の見かけ上のＴｍで不可逆的プロセスによって協同的にアンフォールディングする。一方で、Ｓｔｘ２Ｂは５０℃までは安定なままであり、次に６０℃の見かけ上のＴｍで協同的で不可逆的にアンフォールディングする。
【００９０】
対照的に、ＢＬＳ−Ｓｔｘ２Ｂキメラは全て８５℃まで安定なままであり、この温度を超えると蛋白質は複雑なプロセスによってアンフォールディングする。キメラのＣＤシグナルは、おそらくキメラの十量体構造中の変性したＳＴＸ２Ｂドメインの凝集現象（これはＢＬＳモジュールの構造を混乱させて、それらのアンフォールディングを促進する）によって低下する。しかしながら、全ての３つのキメラで示された６０℃におけるＳＴＸＢの熱転移の喪失は、ＢＬＳの分子が志賀様Ｂ毒素のサブユニットを安定化し、五量体の変性を８３℃まで遅らせるということを示している。
【００９１】
例１３
ＧＢ３結合試験
Ｓｔｘ２Ｂの五量体立体配座はＧＢ３結合に必要であるので、Ｇｂ３結合ＥＬＩＳＡアッセイを用いて、５、１０、または１５アミノ酸の長さのペプチドリンカーを有するキメラ蛋白質の形（それぞれＢＬＳ−Ｓｔｘ２Ｂ−Ｌ５、ＢＬＳ−Ｓｔｘ２Ｂ−Ｌ１０、およびＢＬＳ−Ｓｔｘ２Ｂ−Ｌ１５）が集合体形成して天然ホロ毒素Ｂサブユニットの立体配置になったということを機能的に確認した。アッセイは以前に記載された通り実施した（Akenazi et al., 1989. J. ClinMicrobiol 27:1145-1150）。クロロホルム：メタノール（２：１）中に溶解されたＧｂ３（Matreya, State College, PA）を用いて、９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany）をウェルあたり１μgでコーティングした。ＢＬＳ−Ｓｔｘ２Ｂ免疫マウスの血清のプールを一次抗体として用い（１：１０００希釈）、ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（Zymed, Invitrogen, Carisbad, CA, USA）を二次抗体として用いた（１：３０００希釈）。反応をＯ−フェニレンジアミン（Sigma, St Louis, MO, USA）によって現像し、吸光度を４９２ｎｍで読み取った。ＢＬＳおよび大腸菌ＢＬ２１抽出物を非特異的結合の陰性対照として用いた。
投与量依存的な様式の陽性反応がキメラおよび組み換えＳｔｘ２ホロ毒素では観察されたが、ＢＬＳでは観察されなかった（図７）。これらの発見から、ＢＬＳ十量体の頂部のＢサブユニットは正しく集合体形成されており、キメラ蛋白質の３つの形においてそれらのＧｂ３結合能力を維持しているということが結論づけられる。
【００９２】
例１４
免疫中の抗体−力価の経時変化
単離された精製組み換えＳｔｘ２Ｂサブユニット（Ｓｔｘ２Ｂ）と比較して液性免疫応答を改善するＢＬＳ−Ｓｔｘ２Ｂの能力を評価するために、マウスの群に、１０アミノ酸の長さのＧ／Ｓリンカーペプチドを有するキメラ（ＢＬＳ−Ｓｔｘ２Ｂ−Ｌ１０）またはＳｔｘ２Ｂをフロイントアジュバント（ＦＡ）の存在下でｉ．ｐ．注射した。水酸化アルミニウムゲル（ＡＨ）懸濁液（１ｍｇ／ｍｌ）をＳｔｘ２Ｂ−ＢＬＳと混合し、撹拌しながら室温で３０分インキュベーションした。ＡＨ吸着抗原を１００００ｇで１０分遠心し、ペレットをＰＢＳ中に再懸濁した。
【００９３】
予防接種マウスの血清中の特異的なＩｇＧ抗体を２ヶ月間超分析した。Ｓｔｘ２Ｂに特異的なＩｇＧ力価は両方の予防接種群において惹起された（図８Ａ）。ＢＬＳ−Ｓｔｘ２Ｂ−Ｌ１０群のＥＬＩＳＡ力価は最初の３回のワクチン接種中に上昇し、３回目のワクチン接種の１４日後にピークに達した。一方では、Ｓｔｘ２Ｂ免疫マウスは３回目の予防接種投与の４５日後まで特異的な抗体応答を示さず、個体間には大きい力価のばらつきがあった。全ての分析された時間において、ＢＬＳ−Ｓｔｘ２Ｂ−Ｌ１０によって生じた抗体力価はＳｔｘ２Ｂ群のものよりも有意に高かった（Ｐ＜０．００５）（図８Ａ）。
免疫システムを活性化し、異なる製剤またはワクチンレジメンによって抗体を生ずるＢＬＳ−Ｓｔｘ２Ｂの能力もまた評価するために、本発明者は、フロイントアジュバント（ＦＡ）もしくは水酸化アルミニウム（ＡＨ）と一緒に、アジュバントなしに、またはＤＮＡ−蛋白質プライム・ブーストスケジュールに従って、ＢＬＳ−Ｓｔｘ２Ｂ−Ｌ１０蛋白質によってマウスの群を免疫した。血清試料を予防接種後の異なる時間に採集し、特異的なＩｇＧ力価をＥＬＩＳＡによって決定した。結果は、ＢＬＳ−Ｓｔｘ２Ｂキメラが試験された全てのプロトコールにおいて外因性アジュバントなしでさえも免疫応答を活性化するということを示している（図８Ｂ）。一方で、ＤＮＡ−蛋白質プライム・ブーストレジメンはＳｔｘ２Ｂ特異的な抗体を遅く（lately）誘導したが（蛋白質ブーストの３５日後）、この時点においてＡＨのＢＬＳ−Ｓｔｘ２Ｂ−Ｌ１０と同じ力価に達した。アジュバント非存在下の蛋白質は、最大力価およびそれらに達する時間に関して最低の液性応答を誘導した。
【００９４】
成体ＢＡＬＢ／ｃマウスを、０、１５、および３０日目に、フロイントアジュバント（ＦＡ）（腹腔、ｉ．ｐ．）、ＡＨ（皮下、ｓ．ｃ．）、またはアジュバントなし（ＮＡ）（ｉ．ｐ．）によるＢＬＳ−Ｓｔｘ２Ｂ−Ｌ１０の３回投与によって免疫した。ＦＡの場合には、最初の投与を完全ＦＡによって、２回目の投与を不完全ＦＡによって、最終回の投与をアジュバントなしで投与した。ＡＨでは、１ｍｇ／ｍｌの懸濁液をＢＬＳ−Ｓｔｘ２Ｂ−Ｌ１０と混合し、撹拌しながら室温で３０分インキュベーションした。ＡＨ吸着抗原を１００００ｇで１０分遠心し、ペレットをＰＢＳ中に再懸濁してマウスに接種した。マウスの群はＦＡ中のＢＬＳおよびＳｔｘ２Ｂによってもまたｉ．ｐ．免疫した。ＢＬＳおよびＢＬＳ−Ｓｔｘ２Ｂ−Ｌ１０の投与量はそれらの分子量によって補正し、Ｓｔｘ２Ｂと比較して各蛋白質の等モル量を接種した（投与量は２０μｇのＳｔｘ２Ｂと同等であった）。
プライム・ブースト免疫のためには、マウスに１００μｇのｐＣＩ−ＢＬＳ−Ｓｔｘ２Ｂ−Ｌ１０を０、１４、および２８日目に筋肉内（ｉ．ｍ．）経路によって後ろ足に注射し、次に最終回のｉ．ｐ．ブースターを４０日目に不完全ＦＡ中のＢＬＳ−Ｓｔｘ２Ｂ−Ｌ１０によって実施した。
マウスを各免疫以前および１５または３０日毎に麻酔し、眼窩静脈叢の穿刺によって採血し、血清試料を得た。
予防接種マウスの血清試料中のＳｔｘ２Ｂ特異的なＩｇＧをＥＬＩＳＡアッセイによって分析した。簡略には、９６ウェルのMaxiSorpプレート（Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany）を０．５ｇの精製Ｓｔｘ２Ｂによってコーティングし、０．４％ＢＳＡのＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎによって２時間、３７℃でブロッキングした。次に、プレートを段階希釈したマウス血清と一緒に２時間、３７℃でインキュベーションした。洗浄後に、プレートは、ＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎで希釈した（１：３０００）ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（Zymed, Invitrogen, Carisbad, CA, USA）と一緒に３７℃で１．５時間インキュベーションした。プレートを洗浄し、クエン酸／リン酸緩衝液中の２ｍｇ／ｍｌのＯ−フェニレンジアミン（Sigma）および０．３％Ｈ２Ｏ２によって反応を現像した。反応を２ＭのＨ２ＳＯ４によって止め、４９２ｎｍの吸光度をマイクロタイタープレートリーダーASYS UVM340（Biochrom Ltd., Cambridge, England）によって測定した。結果はエンドポイント力価として表し、免疫前血清試料の媒質±２×標準偏差（ＳＤ）よりも高い光学密度を有する最終希釈の逆数値として計算した。
【００９５】
例１５
抗体のサブタイピングおよび抗体の親和性
ＢＬＳ−Ｓｔｘ２Ｂ−Ｌ１０抗原は、分析された全てのプロトコールでＩｇＧ２ａよりも高い（Ｐ＜０．００１）抗Ｓｔｘ２Ｂの特異的なＩｇＧ１力価を誘導した。ただしプライム・ブーストスケジュールでは、両方のＩｇＧサブクラス間に重大な違いはなかった（図９）。ＩｇＧのサブタイピングのために、ＥＬＩＳＡを上で記載された通りペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ（１：１０００）（BD-Pharmigen, New Jersey, USA）を二次抗体として用いて行った。
ＦＡまたはＡＨと一緒に製剤されたＢＬＳ−Ｓｔｘ２Ｂ−Ｌ１０によって実施例１４の通り免疫されたマウスの血清は、ＦＡ中の精製Ｓｔｘ２Ｂによって免疫されたマウスの血清よりもＳｔｘ２Ｂに対する高い親和性を有する抗体を提示した。同様の親和性の結果が、表１Ａのプライム・ブーストレジメンのアジュバントなしのＢＬＳ−Ｓｔｘ２Ｂ−Ｌ１０によって免疫されたマウスから採集された血清で観察された。免疫マウスによって作られた抗体のＳｔｘ２Ｂ親和性をチオシアン酸溶出ベースのＥＬＩＳＡによって決定した。手順はＳｔｘ２ＢのＥＬＩＳＡについて記載したものと同様であったが、追加のステップを含んだ。正規化した濃度の血清と一緒のインキュベーションの後に、プレートを洗浄し、チオシアン酸アンモニウム（Anedra, San Fernando, Bs. As., Argentina）をＰＢＳで希釈して、０〜４Ｍに亘る濃度でウェルに追加した。プレートを室温で１５分静置した後に洗浄し、アッセイを続けた。結合した抗体の５０％を解離させるのに必要なチオシアン酸アンモニウムの濃度を決定した。結合のパーセンテージを次の通り計算した。チオシアン酸アンモニウム存在下のＯＤ４９２ｎｍ×１００／チオシアン酸アンモニウム非存在下のＯＤ４９２ｎｍ。
【００９６】
例１６
組み換えＳｔｘ２（ｒＳｔｘ２）に対する中和力価
Ｓｔｘ２中和抗体力価を決定するために、１ＣＤ５０のｒＳｔｘ２（６７０ｐｇのＳｔｘ２、Ｖｅｒｏ細胞の５０％を殺す細胞毒性量）と実施例１４の通り免疫されたマウスの実験血清試料の段階希釈物とを、３７℃で１時間、次に４℃で１時間プレインキュベーションした。１０４個のＶｅｒｏ細胞を含む各ウェルに混合物を重層し、５％ＣＯ２中３７℃で４８時間インキュベーションした。細胞をＰＢＳによって洗浄し、クリスタルバイオレット色素によって染色し、マイクロタイタープレートリーダー（Biochrom Ltd.）上で５７０ｎｍフィルターによって読み取った。中和活性は、Ｖｅｒｏ細胞に対するＳｔｘ２毒性の５０％を遮断した最高希釈の逆数値として表した。
ＦＡと一緒に製剤されたＢＬＳ−Ｓｔｘ２Ｂ−Ｌ１０によって免疫されたマウスの全ての血清は、最高の中和力価を示した（Ｐ＜０．００１）。対照的に、単離されたＳｔｘ２Ｂによって免疫されたマウスの血清は、ＦＡ中に製剤されたときであっても最低の中和活性を示した（表１）。
【表１】
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抗体親和性は、（ＥＬＩＳＡ試験において）結合した抗体の５０％を解離させるのに必要なチオシアン酸アンモニウムのモル濃度として表した。結果は４〜６匹のマウス／群の平均±ＳＥＭとして表している。免疫マウス（最終回の免疫の４５日後）の血清をｒＳｔｘ２と一緒にインビトロでプレインキュベーションし、その毒性を材料と方法に詳述された通りＶｅｒｏ細胞に対してアッセイした。各値は４〜６匹のマウス／群の平均±ＳＥＭを表す。＊Ｓｔｘ２Ｂ＋ＦＡ群に対してＰ＜０．０５。＊＊＊全ての他の予防接種プロトコールに対してＰ＜０．００１。
【００９７】
例１７
マウス血清の交差反応
この目的のために、Ｓｔｘ２またはＳｔｘ２ｃもしくはＳｔｘ２ｄバリアントを産生するＥＨＥＣのヒト分離株の上清を、実施例１４の通りＢＬＳ−Ｓｔｘ２Ｂ−Ｌ１０＋ＦＡまたはＳｔｘ２Ｂ＋ＦＡによって免疫されたマウスの血清と一緒にインキュベーションし、Ｖｅｒｏ細胞に対する毒性を評価した。本発明者は組み換えＳｔｘ１（ｒＳｔｘ１）に対する中和能力もまた評価した。ＢＬＳ−Ｓｔｘ２Ｂ−Ｌ１０によって免疫されたマウスの血清は、野生型Ｓｔｘ２およびそのバリアント、ならびにｒＳｔｘ１もまた強力に中和した。はっきりと対照的に、精製Ｓｔｘ２Ｂによって免疫した６匹のマウスのうち１匹から採取した血清試料のみが野生型Ｓｔｘ２を弱く中和でき、それらのいずれもＳｔｘ２バリアントまたはｒＳｔｘ１を中和しなかった（表２）。
【表２】
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【００９８】
例１８
ｒＳｔｘ２のチャレンジに対する免疫マウスの防御：エクスビボのｒＳｔｘ２中和活性
エクスビボアッセイのために、２．２ｎｇ／マウスのｒＳｔｘ２（１００％致死量。１ＬＤ１００）を、実施例１４の通り免疫されたマウスの血清と一緒に３７℃で１時間および４℃で１時間プレインキュベーションした。混合物を未処理の成体ＢＡＬＢ／ｃマウスに静脈内（ｉ．ｖ．）接種し、生存率を観察した。この投与量のｒＳｔｘ２は、注射後９６時間以内に１００％の死亡率に至る。図１０Ａに示されている通り、異なるプロトコールのもとでＢＬＳ−Ｓｔｘ２Ｂ−Ｌ１０によって免疫されたマウスから採取された血清と一緒のｒＳｔｘ２のインキュベーションによって、ｒＳｔｘ２の毒性は完全に無効化された。一方で、Ｓｔｘ２Ｂ予防接種マウスの血清によってｒＳｔｘ２の毒性は予防されなかった。
【００９９】
例１９
ｒＳｔｘ２による静脈内チャレンジと長期の応答
実施例１４の通り免疫されたマウスを、最終回の免疫の５０日後に１ＬＤ１００のｒＳｔｘ２によるｉ．ｖ．接種によってチャレンジした。図１０Ｂは、ＢＬＳ−Ｓｔｘ２Ｂ−Ｌ１０予防接種マウスの１００％およびＳｔｘ２Ｂ予防接種マウスの３３％がｒＳｔｘ２の致死量のチャレンジから生き残ったということを示している。用いたｒＳｔｘ２投与量によれば、ＢＬＳによって免疫された動物または非免疫マウスの０％がチャレンジから生き残った（図１０Ｂ）。
生き残ったＢＬＳ−Ｓｔｘ２Ｂ免疫マウスの血清を長期採取して、特異的な抗体応答の持続期間を研究した（図１１Ａ）。全てのＢＬＳ−Ｓｔｘ２Ｂレジメンは長期持続的な免疫応答を誘導した（これはＥＬＩＳＡの抗Ｓｔｘ２抗体として評価した）。マウスを、２ＬＤ１００（４．４ｎｇ／マウス）のｒＳｔｘ２によって最終回の投与の８ヶ月後に、３ＬＤ１００（６．６ｎｇ／マウス）によって最終回の投与の１０ヶ月後に再チャレンジした（図１１Ｂ）。全てのＢＬＳ−Ｓｔｘ２Ｂ−Ｌ１０予防接種マウスは、最終回の免疫投与の８ヶ月後に２ＬＤ１００によってチャレンジされたものおよび最終回の免疫投与の１１ヶ月後の３ＬＤ１００によるチャレンジから生き残った。
【０１００】
例２０
ｂｌｓ−ｓｔｘ２ｂ−ｌ１０の１回投与による免疫によって作られた抗体の防御能力
ＢＬＳ−Ｓｔｘ２Ｂ−Ｌ１０蛋白質による免疫によって作られた抗体の防御能力をさらに分析するために、水酸化アルミニウム中に製剤されたＢＬＳ−Ｓｔｘ２Ｂ−Ｌ１０の１回投与によって成体ＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫した（投与量は２０μｇのＳｔｘ２Ｂと同等であった）。水酸化アルミニウムゲル（ＡＨ）懸濁液（１ｍｇ／ｍｌ）をＢＬＳ−Ｓｔｘ２Ｂ−Ｌ１０と混合し、撹拌しながら室温で３０分インキュベーションした。ＡＨ吸着抗原を１００００ｇで１０分遠心し、ペレットをＰＢＳ中に再懸濁した。血清試料を予防接種後の異なる時間に採集し、特異的なＩｇＧ力価をＥＬＩＳＡによって決定した。予防接種マウスの血清試料中のＳｔｘ２Ｂ特異的なＩｇＧを実施例１４に記載された通りＥＬＩＳＡアッセイによって分析した。
図１２は、ＢＬＳ−Ｓｔｘ２Ｂ−Ｌ１０の１回の投与が特異的なＩｇＧ液性応答を発生させるのに十分であるということを示している。
免疫応答の防御能力を試験するために、マウスを免疫の１ヶ月後に１ＬＤ１００のｒＳｔｘ２によってチャレンジした。図１３Ａは、ＢＬＳ−Ｓｔｘ２Ｂ−Ｌ１０予防接種マウスの１００％がｒＳｔｘ２の致死量のチャレンジから生き残った一方で、非免疫マウスの０％がチャレンジから生き残ったということを示している。
生き残ったマウスは、それぞれ免疫の２ヶ月後および免疫の４ヶ月後に３ＬＤ１００および５ＬＤ１００によって再チャレンジした。図１３ＢおよびＣは、全てのマウスが高い投与量のｒＳｔｘ２による両方のチャレンジから生き残ることができたということを示している。これは、ＢＬＳ−Ｓｔｘ２Ｂ−Ｌ１０による免疫によって作られた抗体の高い防御能力を示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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