(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
メカブフコイダンを有効成分として含有することを特徴とするカンジダ菌に由来するバイオフィルムの形成抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物によるバイオフィルムの形成を抑制するために用いるバイオフィルム抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオフィルムとは、細菌やカビ等の微生物が固体や液体の表面に付着することによって形成される微生物集合体であり、様々な環境に存在する。このバイオフィルムと呼ばれる微生物集合体は、日常生活の分野、食品産業の分野及び医療の分野等、各分野において深く関与して多くの問題を引き起こしている。例えば、日常生活の分野においては、台所、浴室、トイレ等の排水口に存在するヌメリもバイオフィルムであり、悪臭の要因となることが指摘されている。食品産業の分野においては、各種配管や各種製造設備等に微生物が付着してバイオフィルムを形成し、微生物汚染の要因になることが指摘されている。医療の分野に関しては、カテーテル内部やコンタクトレンズ、義歯等にバイオフィルムが形成され、感染症を引き起こす要因となることが指摘されている。
【０００３】
特に、義歯の汚れは義歯性口内炎だけでなく口角炎等を引き起こすことも指摘され、更に、バイオフィルムの形成（デンチャープラークの堆積）が助長され、ますます口腔内環境が悪化することも指摘されている。そして、このバイオフィルムには高頻度でカンジダ菌が検出されることが報告されている。
【０００４】
一般にバイオフィルムは、一度形成されると薬剤の浸透率低下や熱耐性を有するようになり、薬剤処理や加熱処理による除去が難しいとされる。最も効果的な手法としては、ブラッシング等による物理的除去とされているが、細部への物理的除去は困難とされ、問題視されているのが現状である。他のバイオフィルムの除去方法として、一般的な殺菌剤を用いる方法、バイオフィルム溶解物質を用いる方法、或いはこれらを併用する方法が提案されている。しかし、殺菌剤を多用した場合、或いは、高濃度の殺菌剤を使用した場合、薬剤耐性菌の出現や、殺菌効果による口腔内の菌環境の変化による菌交代症の発症、副作用の発現等、人体に対して様々な影響を与える可能性がある。従って、バイオフィルムを形成する微生物を殺菌するのではなく、バイオフィルムの形成そのものを抑制することが効果的であるといえる。
【０００５】
バイオフィルムの形成そのものを抑制する従来技術としては、モノグリセリンモノカプリル酸エステルを含む炭素数７〜１４の飽和脂肪酸残基を有するモノグリセリンモノ脂肪酸エステル、ジグリセリンモノラウリン酸エステルを有効成分とする、カンジダ菌によるバイオフィルムの形成を抑制するためのバイオフィルム抑制剤（特許文献１）、納豆、納豆分離菌、及び納豆分離菌培養濾液からなる群から選ばれるいずれかひとつ以上を有効成分として含むバイオフィルム形成抑制剤（特許文献２）、クランベリー抽出物を有効成分とするバイオフィルムの形成阻害剤（特許文献３）等が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１３‐２３１００２号公報
【特許文献２】特開２０１４−２２７３５５号公報
【特許文献３】特開２００７−９１７０３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、微生物を殺菌することなく、バイオフィルムの形成を抑制することができるバイオフィルム形成抑制剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、上記課題を解決する為に鋭意研究を重ねた結果、メカブフコイダンが上記課題を解決することを見出した。本発明者は、これらの知見に基づき更に研究を重ね、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は下記の構成からなっている。
［１］フコイダンを有効成分として含有することを特徴とするバイオフィルム形成抑制剤。
［２］上記［１］に記載のバイオフィルム形成抑制剤を含有することを特徴とするバイオフィルム形成を抑制する口腔用組成物。
［３］フコイダンを用いることを特徴とするバイオフィルム形成を抑制する方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のバイオフィルム形成抑制剤は、カンジダ菌を殺菌することなく、カンジダ菌に由来するバイオフィルムの形成を抑制することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明で用いられるフコイダンとは、硫酸化多糖類の一種である。フコイダンとしては、例えば、褐藻類等に由来するフコイダンが挙げられる。
【００１１】
本発明で用いられるフコイダンの硫酸基含有量としては、例えば、約１０〜４０質量％が好ましく、約２０〜３５質量％がより好ましく、約２６〜３５質量％が更により好ましい。
【００１２】
上記褐藻類としては、例えば、コンブ目、ナガマツモ目、ヒバマタ目等に属する海藻類が挙げられ、具体的には、ガゴメコンブ、マコンブ、トロロコンブ、ワカメ、クロメ、アラメ、カジメ、ジャイアントケルプ、レッソニア・ニグレセンス、モズク、オキナワモズク、ヒバマタ、アスコフィラム・ノドサム等が挙げられ、中でもワカメ、ヒバマタが好ましく、ワカメの胞子葉であるメカブが十分量の原料確保が可能な点で特に好ましい。
【００１３】
褐藻類からフコイダンを抽出する場合、褐藻類からフコイダンを抽出する方法に特に制限はなく、例えば、藻体を酢酸又は希塩酸の水溶液に懸濁させ、室温から約１００℃の範囲で抽出を行う酸抽出法、藻体を水に懸濁させ、約１００℃で抽出を行う熱水抽出法等自体公知の方法で行えばよい。抽出後固液分離し、酸抽出法の場合は得られた抽出液を中和し、抽出液に塩化カルシウム又は酢酸バリウム等の水溶液を加えて沈殿するアルギン酸を除去してもよい。更に所望により限外ろ過、透析等を行って低分子量物質を除去してもよい。
【００１４】
本発明で用いられるフコイダンとしては、褐藻類由来のフコイダンを含む粗製品、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー等により精製した精製品、またこれらを含有する製剤等が挙げられ、いずれも好ましく用いることができる。本発明で用いられるフコイダンの好ましい形態としては、例えば、上記藻体抽出液の濃縮液又は該濃縮液を常法により真空凍結乾燥して得られる粉末等が挙げられる。
【００１５】
本発明で用いられるフコイダンは、低分子化し、又は分子量を分画して分子を比較的均一にしたフコイダンでもよい。低分子化する方法としては、例えば、硫酸、酵素、ガンマ線、超音波等によりフコイダンを分解する方法等自体公知の方法を用いればよい。分子量を分画する方法としては、例えば、塩酸で加水分解後、分子量を分画する方法〔ジャーナル  オブ  アンドロロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｎｄｒｏｌｏｇｙ)、第１３巻、第５１９〜５２５頁（１９９２）〕等がある。
また、本発明で用いられるフコイダンは天然物を原料とした場合に含まれる塩分、ヒ素、ヨウ素や夾雑たんぱく質等を低減したものでもよい。
【００１６】
本発明で用いられるフコイダンは、フコイダンに存在する硫酸基やカルボキシル基を公知の方法により塩に変換することで得られる薬理学的に許容されうる塩であってもよい。このような塩としては、例えば、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム等の金属の塩、ピリジン、ジメチルアミン、ジエチルアミン、エタノールアミン等の医薬的に許容される有機アミノ酸化合物の塩等が挙げられる。
【００１７】
本発明のバイオフィルム形成抑制剤は、上記フコイダンの他に、本発明の効果を阻害しない範囲で他の物質を配合することができる。他の物質としては、例えば、賦形剤（乳糖、デキストリン、コーンスターチ、結晶セルロース等）等が挙げられる。
【００１８】
本発明のバイオフィルム形成抑制剤は、特にカンジダ菌に由来するバイオフィルムの形成抑制に有効である。対象となるカンジダ菌は特に制限はなく、カンジダ属に属する真菌全般を指し、例えば、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・トロピカリス、カンジダ・パラシロシス、カンジダ・グラブラタ、カンジダ・ギリエルモンジイ、カンジダ・クルセイ等が挙げられる。
【００１９】
バイオフィルム形成抑制剤を含有するバイオフィルム形成を抑制する口腔用組成物も本発明の形態の１つである。
【００２０】
バイオフィルム形成を抑制する口腔用組成物としては、例えば、練歯磨、液状歯磨、泡状歯磨等の歯磨剤、入歯安定剤、歯肉マッサージクリーム、局所塗布剤、洗口剤、マウスウォッシュ、口中清涼剤、タブレット、口腔用ウエットティッシュ、口腔湿潤用ジェル剤等が挙げられる。食品としては、例えば、トローチ剤、チューインガム、フィルム状食品等が挙げられる。
【００２１】
バイオフィルム形成を抑制する口腔用組成物に含まれるバイオフィルム形成抑制剤の配合量としては、有効成分であるフコイダンが、０．０００１〜５．０質量％が好ましく、０．０００５〜１．０質量％がより好ましい。０．０００５質量％未満であるとバイオフィルム形成抑制効果が不十分である場合があり、１．０質量％を超えると風味に悪影響を与える場合がある。
【００２２】
以下に本発明を実施例で説明するが、これは本発明を単に説明するだけのものであって、本発明を限定するものではない。
【実施例】
【００２３】
＜本発明品及び参考例品＞
［本発明品］
本発明品として、下記に示す本発明品１、２を用いた。
本発明品１：メカブフコイダン（商品名：理研メカブフコイダン；理研ビタミン社製、硫酸基含有量２７．１質量％）
本発明品２：ヒバマタフコイダン（商品名：フコイダン Fucus vesiculosus（ヒバマタ）由来；シグマ社製、硫酸基含有量２５．９質量％）
［参考例品］
参考例品として、下記に示す参考例品１を用いた。
参考例品１：ケトコナゾール（商品名：Ｋｅｔｏｃｏｎａｚｏｌｅ；ＬＫＴ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）
【００２４】
本発明品１、２に含まれる硫酸基含有量の測定方法は、下記方法で行った。
［硫酸基含有量測定法］
１００ｍＬ容三角フラスコに試料（フコイダン）を１ｇ秤量し、２Ｎ塩酸２５ｍＬを加えた後、三角フラスコに冷却管を取付け、沸騰水浴中で１２０分間加温した。加温した溶液をＮｏ．５Ｃ濾紙（ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製）で吸引濾過し、更に三角フラスコ内部を純水で２〜３回共洗いして吸引濾過した。濾過液を２００ｍＬ容三角フラスコに移し、冷却管を取付け、沸騰水浴中で１０分間加温した後、三角フラスコを撹拌しながら、１０％（ｗ／ｖ）塩化バリウム溶液８ｍＬを１分間ほどかけてゆっくりと加え、三角フラスコに冷却管を取付けてから沸騰水浴中で１２０分間加温した。三角フラスコ内の溶液を室温まで放冷したのち、予め１０５℃で２時間乾燥して恒量にしたガラスフィルター（型式：３ＧＰ１６；ＳＩＢＡＴＡ社製）で吸引濾過し、更に三角フラスコ内部を純水で２〜３回共洗いして吸引濾過した。吸引濾過に使用したガラスフィルターを１０５℃で２時間乾燥して恒量にした吸引濾過に使用したガラスフィルターを得た。以下の計算式から硫酸基含有量（質量％）を算出した。
硫酸基含有量（質量％）＝ ［（Ｗ１−Ｗ０）×０．４１２］／ＷＳ×１００ 
ＷＳ：試料質量（ｇ）
Ｗ０：予め恒量にしたガラスフィルターの質量（ｇ）
Ｗ１：吸引濾過に使用したガラスフィルター質量（ｇ）
０．４１２＝９６（ＳＯ４２−の分子量）／２３３（ＢａＳＯ４の分子量）
【００２５】
＜バイオフィルム形成抑制効果の評価＞
本発明品１、２、参考例品１のそれぞれを用いて、供試菌（カンジダ・アルビカンス  ＮＢＲＣ  １５９４株）に由来するバイオフィルムの形成抑制効果の評価を行った。
（１）供試菌液の調整
１２１℃、１５分間オートクレーブ滅菌したポテトデキストロース寒天培地（ＤＩＦＣＯ社製）を滅菌済みシャーレにて加えて固化し、寒天平板を作製した。凍結保存品の供試菌をこの寒天平板に塗抹して、３０℃にて２日間培養した。２％グルコース含有酵母ニトロゲンベース（ＤＩＦＣＯ社製）を１０倍希釈し、１２１℃、１５分間オートクレーブ滅菌した培地２０ｍｌをバッフル付き三角フラスコに分注し、上記寒天培地で培養した供試菌を一白金耳取り植菌した。その後、３０℃、１５０ｒｐｍにて２４時間攪拌培養し、前培養液とした。次いで、遠心分離（４７００ｒｐｍ、１０分、２０℃）をおこない集菌した。集菌した菌を生理食塩水２０ｍｌを用いて洗浄し、再び遠心分離（４７００ｒｐｍ、１０分、２０℃）をおこない集菌した。集菌した菌をサブローブドウ糖培地（ペプトン１．０質量％、ブドウ糖４．０質量％を含み、１規定の塩酸を用いてｐＨ５．７に調整した液体培地。以下、「ＳＧ培地」という。）１０ｍｌを加え、再懸濁した。この再懸濁液をＳＧ培地で２０倍希釈したものを供試菌液として用いた。供試菌液中の菌数は、３．２×１０６個／ｍｌであった。
【００２６】
（２）バイオフィルム形成方法
本発明品１、２、参考例品１を被験試料とし、本発明品１、２を純水で溶解し、参考例品１をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で溶解して被験試料液とし、該被験試料液２μＬ、供試菌液１９８μＬを、９６穴マイクロプレート（商品名：ＴＣプレート９６ｗｅｌｌ（Ｃｅｌｌ＋）；ザルスタット社製）の各ウェル（穴）に加えた。なお、被験試料液中の被験試料濃度は、供試菌液と加えた際の濃度、即ち各ウェル中の被験試料の濃度がそれぞれ５ｐｐｍ、２５ｐｐｍ、５０ｐｐｍ、１００ｐｐｍとなるように調製した。その後、被験試料液及び供試菌液を加えた９６穴マイクロプレートを３０℃、２日間の静置培養を行って各ウェル中にバイオフィルムを形成した。
また、本発明品１、２のコントロール（被験試料無添加）として、被験試料液２μＬと供試菌液１９８μＬをウェルに加えるのに替えて、被験試料を用いずに純水２μＬと供試菌液１９８μＬをウェルに加える以外は同様の操作を行って各ウェル中にバイオフィルムを形成した。
更に、参考例品１のコントロール（被験試料無添加）として、被験試料液２μＬと供試菌液１９８μＬをウェルに加えるのに替えて、被験試料を用いずにジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）２μＬと供試菌液１９８μＬをウェルに加える以外は同様の操作を行って各ウェル中にバイオフィルムを形成した。
【００２７】
（３）形成させたバイオフィルムの定量方法
静置培養終了後、各ウェルの被験試料液及び培養液等の液部を除去し、各ウェルの付着物（菌体、分泌物及び沈着物等）をバイオフィルムとし、各ウェルに０．０１質量％のクリスタルバイオレット水溶液（商品名：Ｂｅｃｔｏｎ；Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ社製）５０μＬを添加し、バイオフィルムを染色した。次いで、各ウェルから添加したクリスタルバイオレット液を除き、２００μＬの蒸留水で２回洗浄後、エタノール２００μＬを加えて各ウェルからバイオフィルムを染色していたクリスタルバイオレットを溶出させることにより、マイクロプレートに固着したバイオフィルムを定量した。定量方法としては、マイクロプレートリーダー（型式：ＳＨ−９０００Ｌａｂ；ＣＯＲＯＮＡ ＥＬＥＣＴＲＩＣ社製）を用いて、各ウェルの６００ｎｍにおける吸光度（Ｏ．Ｄ．６００）を測定した。
【００２８】
（４）バイオフィルム形成抑制効果の評価方法
コントロールのウェルに形成したバイオフィルムの６００ｎｍにおける吸光度を基準吸光度とし、その数値の時にバイオフィルム形成率１００％とした。それぞれの被験試料の吸光度と基準吸光度と対比してバイオフィルム形成率を計算し、各被験試料のバイオフィルム形成率を縦軸、被試験試料の濃度を横軸とした対数近似曲線グラフを作成した。
上記対数近似曲線のグラフを用い、各ウェルの吸光度が、基準吸光度の５０％に相当するバイオフィルム形成率、すなわちバイオフィルム形成率５０％となる各試被験試料の濃度（以下、「５０％阻害濃度」という。）を算出した。
被験試料のバイオフィルム形成抑制効果の判定は、各被検試料について算出された５０％阻害濃度が、２０ｐｐｍ以下の場合にバイオフィルム形成の抑制に非常に優れているとし、２０ｐｐｍを超えて３０ｐｐｍ以下の場合にバイオフィルム形成の抑制に優れているとし、３０ｐｐｍを超える場合にバイオフィルム形成の抑制に劣ると判定した。得られた結果を表１に示す。
【００２９】
【表１】
0006721947.tif 000002
【００３０】
＜バイオフィルム形成抑制に用いた被験試料の静菌効果の評価＞
１２１℃、１５分間オートクレーブ滅菌したＢｒａｉｎ  Ｈｅａｒｔ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ寒天培地（ＤＩＦＣＯ社製）１０ｍｌを５０℃まで冷却した。そこに、本発明品１、２を純水に溶解した被験試料液、参考例品１をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解した被験試料液のいずれか１００μＬを添加し、撹拌して均一になるように混合した後に滅菌済みシャーレに加えて平板培地を作製した。なお、該平板培地中の各被験試料の濃度は、１０ｐｐｍ、１００ｐｐｍ、３００ｐｐｍとなるようにした。次いで凍結保存品の供試菌（カンジダ・アルビカンス（ＮＢＲＣ １５９４株））を各平板培地に一白金耳塗抹して、３０℃にて１日間培養した。
培養終了後の各平板培地上の菌増殖状況を目視にて確認した。平板培地上に塗抹線に沿って発育が認められなかったものは、その被験試料の濃度で静菌性があると判断した。結果を表２に示す。
【００３１】
【表２】
0006721947.tif 000003
【００３２】
表１、２の結果より、本発明品１は、バイオフィルム形成抑制効果の評価が、５０％阻害濃度が２０ｐｐｍ以下でありバイオフィルム形成抑制効果に非常に優れていた。本発明品２は、バイオフィルム形成抑制効果の評価が、５０％阻害濃度が２０ｐｐｍを超えて３０ｐｐｍ以下でありバイオフィルム形成抑制効果に優れていた。また、本発明品１、２の静菌性の評価は、３００ｐｐｍ添加区でも菌の発育がみられ、静菌効果を有していなかった。即ち、本発明品１、２は、菌を殺菌することがなかった。
一方、参考例品１は、バイオフィルム形成抑制効果の評価が、５０％阻害濃度が２０ｐｐｍを超えて３０ｐｐｍ以下でありバイオフィルム形成抑制効果に優れていた。しかし、静菌性の評価は、参考例品１は、１００ｐｐｍ添加区で菌の生育が認められず、静菌性を有していた。
【００３３】
＜製造例１：タブレットの製造＞
下記表３の配合により、各成分を均一に混合し水を加えて混練りした後、乾燥させて単発式打錠機にて本発明品１を含有するタブレットを製造した。
【００３４】
【表３】
0006721947.tif 000004
【００３５】
＜製造例２：フィルム状食品の製造＞
下記表４の配合により、各成分を均一に混合し水を加えて混練りした後プラスチックフィルムに展延し乾燥させ、本発明品１を含有するフィルム状食品を製造した。
【００３６】
【表４】
0006721947.tif 000005