(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
OX40L阻害物質を含む、対象において自己免疫疾患、炎症、および／または自己免疫疾患に関連する炎症を治療または予防するための薬学的組成物であって、前記OX40L阻害物質が、以下を含む抗OX40L抗体またはその抗原結合性断片である、前記薬学的組成物：
SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、およびSEQ ID NO：7の相補性決定領域（CDR）アミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインならびにSEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、およびSEQ ID NO：14の相補性決定領域（CDR）アミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；
SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、およびSEQ ID NO：21の相補性決定領域（CDR）アミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインならびにSEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、およびSEQ ID NO：28の相補性決定領域（CDR）アミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；または
SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、およびSEQ ID NO：35の相補性決定領域（CDR）アミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインならびにSEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、およびSEQ ID NO：42の相補性決定領域（CDR）アミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン。
【請求項２】
OX40L阻害物質を含む、対象において炎症性Th2細胞応答および／または病原性Tfh細胞応答を低下させるための薬学的組成物であって、前記OX40L阻害物質が、以下を含む抗OX40L抗体またはその抗原結合性断片である、前記薬学的組成物：
SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、およびSEQ ID NO：7の相補性決定領域（CDR）アミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインならびにSEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、およびSEQ ID NO：14の相補性決定領域（CDR）アミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；
SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、およびSEQ ID NO：21の相補性決定領域（CDR）アミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインならびにSEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、およびSEQ ID NO：28の相補性決定領域（CDR）アミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；または
SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、およびSEQ ID NO：35の相補性決定領域（CDR）アミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインならびにSEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、およびSEQ ID NO：42の相補性決定領域（CDR）アミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン。
【請求項３】
前記対象が、アレルギー性疾患喘息、アトピー性皮膚炎、実験的自己免疫性脳脊髄炎、炎症性腸疾患、接触過敏症、喘息性気道反応亢進、自己免疫性糖尿病、アテローム性動脈硬化症、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、多発性硬化症、潰瘍性大腸炎、移植片対宿主病、移植片拒絶反応、および多発性筋炎の群より選択される自己免疫疾患を有する、請求項1または2に記載の薬学的組成物。
【請求項４】
前記自己免疫疾患が全身性エリテマトーデスである、請求項3に記載の薬学的組成物。
【請求項５】
前記対象がヒトである、請求項1〜4のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項６】
前記抗OX40L抗体またはその抗原結合性断片が、
SEQ ID NO：4の重鎖可変領域およびSEQ ID NO：11の軽鎖可変領域；
SEQ ID NO：18の重鎖可変領域およびSEQ ID NO：25の軽鎖可変領域；または
SEQ ID NO：32の重鎖可変領域およびSEQ ID NO：39の軽鎖可変領域；
を含む、請求項1または2に記載の薬学的組成物。
【請求項７】
前記抗OX40L抗体またはその抗原結合性断片がヒトOX40Lまたはその等価物と結合する、請求項1〜6のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項８】
前記抗OX40L抗体が中和性である、請求項1〜7のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項９】
前記抗体が、ヒト抗体、ヒト化抗体、組換え抗体、キメラ抗体、抗体誘導体、ベニア抗体（veneered antibody）、ダイアボディ、モノクローナル抗体、またはポリクローナル抗体である、請求項1〜8のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項１０】
前記抗体がヒト化抗体である、請求項9に記載の薬学的組成物。
【請求項１１】
前記抗体またはその抗原結合性断片が改変を含む、請求項1〜10のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項１２】
SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、およびSEQ ID NO：7の相補性決定領域（CDR）アミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインならびにSEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、およびSEQ ID NO：14の相補性決定領域（CDR）アミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；
SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、およびSEQ ID NO：21の相補性決定領域（CDR）アミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインならびにSEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、およびSEQ ID NO：28の相補性決定領域（CDR）アミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；または
SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、およびSEQ ID NO：35の相補性決定領域（CDR）アミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインならびにSEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、およびSEQ ID NO：42の相補性決定領域（CDR）アミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン
を含む、抗OX40L抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項１３】
ヒト化抗体またはヒト化抗体に由来する抗原結合性断片である、請求項12に記載の抗OX40L抗体または抗原結合性断片。
【請求項１４】
SEQ ID NO：4の重鎖可変領域およびSEQ ID NO：11の軽鎖可変領域；
SEQ ID NO：18の重鎖可変領域およびSEQ ID NO：25の軽鎖可変領域；または
SEQ ID NO：32の重鎖可変領域およびSEQ ID NO：39の軽鎖可変領域；
を含む、請求項12に記載の抗OX40L抗体または抗原結合性断片。
【請求項１５】
請求項12〜14に記載の抗OX40L抗体または抗原結合性断片の重鎖可変ドメイン、請求項12〜14に記載の抗OX40L抗体または抗原結合性断片の軽鎖可変ドメイン、および請求項12〜14に記載の抗原結合性断片の1つまたは複数をコードする核酸配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１６】
請求項15に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項１７】
調節配列に機能的に連結された請求項15に記載のポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
【請求項１８】
1つまたは複数の請求項12〜14に記載の抗OX40L抗体または抗原結合性断片を含む組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、2014年8月4日に提出された米国仮特許出願第62／032,959号に対する優先権の恩典を主張し、これはその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
本発明は、米国国立衛生研究所（National Institutes of Health）によって授与された助成金AI057234、AI082715およびAI089987の下で、政府の援助を受けて行われた。米国政府は本発明においてある特定の権利を有する。
【０００３】
1．発明の分野
本発明は全体として、医学の分野に関する。より詳細には、本発明は、自己免疫障害および炎症性障害を治療するため、ならびに免疫応答を改変するための薬学的組成物に関する。
【背景技術】
【０００４】
2．関連技術の説明
自己免疫疾患およびいくつかの炎症性障害は、体内に通常存在する物質および組織に対する身体の異常免疫応答（自己免疫または自己炎症）が原因で起こる。これはある特定の臓器に限局していることも（例えば、自己免疫性甲状腺炎の場合）、または種々の場所にある特定の組織が罹病することもある（例えば、肺および腎臓の両方で基底膜を冒すことがあるグッドパスチャー病）。自己免疫疾患には米国だけでも5000万人にも及ぶ人々が罹患しているが、自己免疫病の原因は未だに不明である。その上、自己免疫病とは関連しておらず、かつ特発性であるかまたは慢性もしくは急性障害と関連している可能性がある、炎症性疾患も数多くある。
【０００５】
自己免疫疾患および炎症性疾患の治療は、典型的には、免疫抑制または抗炎症剤（anti-inflammatant）-免疫応答および／または炎症反応を低下させる薬剤を用いて行われる。シクロスポリン、タクロリムス、メトトレキサート、または抗TNFa／IL-6などの免疫抑制剤を用いる従来の免疫療法は、宿主において非病原性T細胞を含むT細胞の機能を非特異的に抑制する。このため、これらの免疫抑制剤（immunesuppressant）を用いる治療が、重症感染症の発症という結果になる場合が多く、時には致死的な転帰につながる場合もある。当技術分野において、全般的な免疫抑制を伴わずに自己免疫応答および／または炎症反応を治療する治療薬が必要である。
【発明の概要】
【０００６】
本明細書には、宿主免疫系の非特異的抑制を伴わずに自己免疫状態および炎症状態を治療するための方法および組成物が記載されている。特に、本明細書に記載の抗OX40L抗体は、それらが炎症性T細胞の分化を阻害するだけでなく、IL-10を誘導してTNF-αを阻害することによっておよび異常なTh2細胞応答を低下させることによって調節T細胞の生成および機能も促進するという点で独特である。その上、本明細書に記載の方法および組成物は、自己免疫疾患の病原性の一因となりうる異常な濾胞性ヘルパーT細胞（Tfh）応答を消失または低下させる。
【０００７】
3つの相補性決定領域（CDR）アミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む単離された抗OX40L抗体またはその抗原結合性断片を含み、CDRの1つまたは複数が、SEQ ID NO：5〜7、19〜21、33〜35より選択されるアミノ酸配列またはそれらの等価物を含む、薬学的組成物が開示される。いくつかの態様において、抗原結合性断片の抗体は、可変ドメイン由来の3つのCDRを含む。いくつかの態様において、3つの重鎖可変ドメインCDRは、SEQ ID NO：5〜7のアミノ酸配列のそれぞれまたはそれらの等価物を含む。他の態様において、3つの重鎖可変ドメインCDRはそれぞれ、SEQ ID NO：19〜21のアミノ酸配列またはそれらの等価物を含む。他の態様において、3つの重鎖可変ドメインCDRはそれぞれ、SEQ ID NO：33〜35のアミノ酸配列またはそれらの等価物を含む。さらなる態様において、抗OX40L抗体またはその抗原結合性断片は、3つの相補性決定領域（CDR）アミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインをさらに含み、ここでCDRの1つまたは複数は、SEQ ID NO：12〜14、26〜28、40〜42より選択されるアミノ酸配列またはそれらの等価物を含む。いくつかの態様においては、それぞれがSEQ ID NO：12〜14のアミノ酸配列またはそれらの等価物を含む、3つの軽鎖可変ドメインCDRがある。他の態様においては、それぞれがSEQ ID NO：26〜28のアミノ酸配列またはそれらの等価物を含む、3つの軽鎖可変ドメインCDRがある。さらなる態様においては、それぞれがSEQ ID NO：40〜42のアミノ酸配列またはそれらの等価物を含む、3つの軽鎖可変ドメインCDRがある。
【０００８】
本明細書に記載のある特定の態様において、抗OX40L抗体またはその抗原結合性断片は、ヒトOX40Lまたはその等価物と結合する。1つの具体的な態様において、OX40L抗体は、OX40Lタンパク質の機能または相互作用（例えば、OX40-OX40L相互作用）を撹乱するか、妨げるか、または妨害する中和抗体である。特定の態様において、抗OX40L抗体は、5C6、19A3または44F3モノクローナル抗体を含む。
【０００９】
他の態様において、抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、組換え抗体、キメラ抗体、抗体誘導体、ベニア抗体（veneered antibody）、ダイアボディ、操作された抗体（engineered antibody）、多重特異性抗体、DARPin（設計アンキリンリピートタンパク質）、モノクローナル抗体、またはポリクローナル抗体である。いくつかの態様において、抗体はヒト化抗体である。
【００１０】
さらなる態様において、OX40L抗体は改変を含む。ある特定の態様において、改変は、VHおよび／またはVLのCDR1領域内、CDR2領域内、および／またはCDR3領域内の保存的アミノ酸突然変異；Fcヒンジ領域内の保存的アミノ酸突然変異；ペグ化；血清タンパク質とのコンジュゲーション；ヒト血清アルブミンとのコンジュゲーション；コンジュゲーションとの検出可能な標識；診断剤とのコンジュゲーション；酵素とのコンジュゲーション；蛍光物質、発光物質、もしくは生物発光物質とのコンジュゲーション；放射性物質とのコンジュゲーション；または治療剤とのコンジュゲーションである。
【００１１】
ある特定の態様は、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、およびSEQ ID NO：7の相補性決定領域（CDR）アミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインとSEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13およびSEQ ID NO：14の相補性決定領域（CDR）アミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインとを含む単離されたヒト化IgG抗OX40L抗体またはその抗原結合性断片を含む、薬学的組成物に関する。
【００１２】
他の態様は、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、およびSEQ ID NO：21の相補性決定領域（CDR）アミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインとSEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、およびSEQ ID NO：28の相補性決定領域（CDR）アミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインとを含む単離されたヒト化IgG抗OX40L抗体またはその抗原結合性断片を含む、薬学的組成物に関する。
【００１３】
さらなる態様は、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34およびSEQ ID NO：35の相補性決定領域（CDR）アミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインとSEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41およびSEQ ID NO：42の相補性決定領域（CDR）アミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインとを含む単離されたヒト化IgG抗OX40L抗体またはその抗原結合性断片を含む、薬学的組成物に関する。
【００１４】
本開示のさらなる局面は、3つの相補性決定領域（CDR）アミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む抗OX40L抗体またはその抗原結合性断片のポリペプチド鎖をコードする核酸配列を含みCDRの1つまたは複数が、SEQ ID NO：5〜7、19〜21、33〜35より選択されるアミノ酸配列またはそれらの等価物を含む、単離されたポリヌクレオチドに関する。1つのさらなる局面は、3つの相補性決定領域（CDR）アミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含む抗OX40L抗体またはその抗原結合性断片のポリペプチド鎖をコードする核酸配列を含みCDRの1つまたは複数が、SEQ ID NO：12〜14、26〜28、40〜42より選択されるアミノ酸配列またはそれらの等価物を含む、単離されたポリヌクレオチドに関する。また、本明細書に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター、および調節配列に機能的に連結された本明細書に記載のポリヌクレオチドを含む宿主細胞も開示される。
【００１５】
抗OX40L抗体またはその抗原結合性断片が、OX40Lと特異的に結合する抗体由来の1つまたは複数のCDRドメインを含む、態様が提供される。特定の態様において、抗OX40L抗体またはその抗原結合性断片は、19A3、5C6、および44F3モノクローナル抗体のVHドメインまたはVLドメインの中からの1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つまたはそれ以上のCDRドメインを含む。ある特定の局面において、抗OX40L抗体またはその抗原結合性断片は、19A3、5C6、および44F3モノクローナル抗体のVHドメインまたはVLドメインの中からの6つのCDRドメインを含む。いくつかの態様において、抗OX40L抗体またはその抗原結合性断片は、19A3、5C6、および44F3モノクローナル抗体のVHドメインまたはVLドメインに対して少なくともまたは最大で70％、75％、80％、85％、90％、95％、または99％（またはこの中から派生する任意の範囲）同一な配列を含む。抗OX40L抗体またはその抗原結合性断片が、19A3、5C6もしくは44F3モノクローナル抗体由来のVHドメインおよび／または19A3、5C6もしくは44F3モノクローナル抗体由来のVLドメインを含む、態様が提供される。
【００１６】
ある特定の態様において、抗体またはその抗原結合性断片は組換え性である。ある特定の局面において、組換えポリペプチドは、19A3、5C6、および44F3モノクローナル抗体のVHドメイン由来またはVLドメイン由来の1つまたは複数のCDRドメインの少なくとも90％、95％、または99％を含む。いくつかの態様において、組換えポリペプチドは、19A3、5C6および44F3モノクローナル抗体のVHドメイン由来またはVLドメイン由来の2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、またはそれ以上のCDRドメインを含む。
【００１７】
いくつかの態様において、組換えポリペプチドは、（i）19A3の可変軽鎖由来のCDR1、CDR2、および／もしくはCDR3（SEQ ID NO：12〜14）；ならびに／または（ii）19A3の可変重鎖由来のCDR1、CDR2および／もしくはCDR3（SEQ ID NO：5〜7）を含む。いくつかの態様において、組換えポリペプチドは、（i）5C6の可変軽鎖由来のCDR1、CDR2および／もしくはCDR3（SEQ ID NO：26〜28）；ならびに／または（ii）5C6の可変重鎖由来のCDR1、CDR2、および／もしくはCDR3（SEQ ID NO：19〜21）を含む。いくつかの態様において、組換えポリペプチドは、（i）44F3の可変軽鎖由来のCDR1、CDR2、および／もしくはCDR3（SEQ ID NO：40〜42）；ならびに／または（ii）44F3の可変重鎖由来のCDR1、CDR2および／もしくはCDR3（SEQ ID NO：33〜35）を含む。これらのCDRの配列は、本開示において以下に見ることができる。
【００１８】
いくつかの態様においては、1つまたは複数の抗OX40L抗体CDRドメインを含む精製ポリペプチドが存在する。上に指摘したように、ポリペプチドは、抗OX40L抗体の軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域由来の1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、または6つのCDRを含みうる。ある特定の態様において、ポリペプチドは、特定の抗体の軽鎖可変領域由来のCDR1、CDR2、および／またはCDR3を含有する。いくつかの態様においてポリペプチドは軽鎖の可変領域および／または重鎖の可変領域由来のCDR1、CDR2、およびCDR3を有するものの、そのCDR1、CDR2、およびCDR3は同じ抗体由来である必要はないことを想定している。いくつかのポリペプチドは同じ抗体由来であるかまたは同じ抗体を基にしたCDR1、CDR2、およびCDR3を有するものの、1つの抗体由来のCDR1が、別の抗体由来であるかそれを基にしたCDRによって置換されてもよいことを想定している。例えば、ポリペプチドが、19A3の軽鎖可変領域由来であるかまたはそれを基にしたCDR1、19A3の軽鎖可変領域由来であるかまたはそれを基にしたCDR2を含み、しかしその上で5C6の可変軽鎖領域由来であるかまたはそれを基にしたCDR3を有してもよい。しかし、CDR1、CDR2およびCDR3の単一のセットを併せて使用する場合には、それらはすべて軽鎖可変領域由来であるかまたは重鎖可変領域由来であり、両者由来の混在物ではないことを一般に想定している。
【００１９】
または、ポリペプチドが、抗OX40L抗体の軽鎖可変領域由来のCDR1配列であるSEQ ID NO：12、26および40に示された配列全体に対して、最大でまたは少なくとも70、75、80、85、90、95、96、97、98、99、100％（またはこの中から派生する任意の範囲）同一であるCDR1配列を含んでもよい。代替的または追加的に、ポリペプチドが、抗OX40L抗体の軽鎖可変領域由来のCDR2配列であるSEQ ID NO：13、27および41に示された配列全体に対して、最大でまたは少なくとも70、75、80、85、90、95、96、97、98、99、100％（またはこの中から派生する任意の範囲）同一であるCDR2配列を含んでもよい。代替的または追加的に、ポリペプチドが、抗OX40L抗体の軽鎖可変領域由来のCDR3配列であるSEQ ID NO：14、28および42に示された配列全体に対して、最大でまたは少なくとも70、75、80、85、90、95、96、97、98、99、100％（またはこの中から派生する任意の範囲）同一であるCDR3配列を含んでもよい。代替的または追加的に、ポリペプチドが、抗OX40L抗体の重鎖可変領域由来のCDR1配列であるSEQ ID NO：5、19および33に示された配列全体に対して、最大でまたは少なくとも70、75、80、85、90、95、96、97、98、99、100％（またはこの中から派生する任意の範囲）同一であるCDR1配列を含んでもよい。代替的または追加的に、ポリペプチドが、抗OX40L抗体の重鎖可変領域由来のCDR2配列であるSEQ ID NO：6、20および34に示された配列全体に対して、最大でまたは少なくとも70、75、80、85、90、95、96、97、98、99、100％（またはこの中から派生する任意の範囲）同一であるCDR2配列を含んでもよい。代替的または追加的に、ポリペプチドが、抗OX40L抗体の重鎖可変領域からのCDR3配列である、SEQ ID NO：7、21および35に示された配列全体に対して、最大でまたは少なくとも70、75、80、85、90、95、96、97、98、99、100％（またはこの中から派生する任意の範囲）同一であるCDR3配列を含んでもよい。
【００２０】
本開示の方法の局面は、それを必要とする対象において炎症を治療または予防するための方法であって、対象にOX40L阻害物質の治療的有効量を投与する段階を含む、方法に関する。
【００２１】
さらなる局面は、それを必要とする対象において自己免疫疾患を治療または予防するための方法であって、対象にOX40L阻害物質の治療的有効量を投与する段階を含む、方法に関する。
【００２２】
ある特定の局面において、本方法は、それを必要とする対象において自己免疫疾患に関連する炎症を予防するためであり、対象にOX40L阻害物質の治療的有効量を投与する段階を含む。
【００２３】
他の局面は、それを必要とする対象において炎症性Th2細胞応答を低下させるため、IL-10産生を増大させるため、および／またはTNF-a産生を減少させるための方法であって、対象にOX40L阻害物質の治療的有効量を投与する段階を含む、方法に関する。いくつかの態様において、炎症性Th2細胞応答には、IL-10低産生性／TNF-α高産生性の炎症性Th2細胞が含まれる。
【００２４】
他の局面は、それを必要とする対象において病原性Tfh細胞応答を低下させるための方法であって、OX40L阻害物質の治療的有効量を投与する段階を含む、方法に関する。
【００２５】
いくつかの態様において、治療される対象は、自己免疫疾患を有する対象である。ある特定の局面において、対象における自己免疫障害は、対象における病原性Tfh細胞応答を低下させる、OX40L阻害物質の投与によって治療される。
【００２６】
さらなる態様において、対象は炎症を有する。対象における炎症は、対象におけるIL-10産生を増大させかつTNF-a産生を減少させる、OX40L阻害物質を投与することによって治療される。また、OX40L阻害物質が、対象における炎症性Th2細胞応答を低下させることによって炎症を軽減してもよい。
【００２７】
いくつかの態様において、治療される対象は、自己免疫障害を有するか、または自己免疫障害の結果としての炎症を有する。いくつかの態様において、自己免疫疾患は、アレルギー性疾患喘息、アトピー性皮膚炎、実験的自己免疫性脳脊髄炎、炎症性腸疾患、接触過敏症、喘息性気道反応亢進、自己免疫性糖尿病、アテローム性動脈硬化症、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、1型糖尿病、関節リウマチ、多発性硬化症、潰瘍性大腸炎、多発性筋炎、混在性結合組織病、全身性硬化症、重症筋無力症、甲状腺炎、自己免疫性溶血性貧血、免疫性血小板減少性紫斑病、皮膚筋炎、抗好中球細胞質自己抗体媒介性疾患、IgA媒介性血管炎、およびIg4関連障害の群より選択される。いくつかの態様において、自己免疫疾患は全身性エリテマトーデスである。
【００２８】
さらなる態様において、炎症は特発性であってよい。さらに別の態様において、炎症が、自己免疫とは関連性のない、損傷などの疾患または状態の結果であってもよい。
【００２９】
さらなる局面は、それを必要とする対象において移植片対宿主病または移植片拒絶を治療または予防するための方法であって、対象にOX40L阻害物質の治療的有効量を投与する段階を含む、方法に関する。
【００３０】
移植片対宿主病（GVHD）は、同種異系組織移植後によく起こる合併症である。これは幹細胞移植または骨髄移植に伴ってみられることが一般的であるが、この用語は他の形態の組織移植片にも適用する。組織（移植片）中の免疫細胞（白血球）はレシピエント（宿主）を「異質」であると認識する。移植された免疫細胞はそこで、宿主の体細胞を攻撃する。用いられる血液製剤が放射線照射を受けていない場合には、輸血の後にGVHDが起こることもある。
【００３１】
移植片拒絶は、移植組織がレシピエントの免疫系によって拒絶され、それが移植組織を破壊する場合に起こる。移植片拒絶は、移植片拒絶反応または宿主対移植片病と呼ばれることもある。
【００３２】
以上に開示された方法のいずれかのうちいくつかの態様において、対象は、移植組織を受け入れる予定であるかまたは受け入れている対象である。1つの関連した態様において、移植組織は同種移植片である。同種移植片（同種移植、同種異系移植またはホモグラフトとしても知られる）とは、遺伝的に同一でない同じ種のドナーからレシピエントへの細胞、組織または臓器の移植のことである。1つの関連した態様において、対象は移植組織による合併症を有する対象であり、ここで合併症は移植片拒絶またはGVHDである。
【００３３】
「対象」、「個体」、または「患者」という用語は、本明細書において互換的に用いられ、脊椎動物、例えば霊長動物、哺乳動物、または好ましくはヒトのことを指す。哺乳動物には、ウマ科動物、イヌ科動物、ウシ科動物、ヒツジ、マウス、ラット、サル、ヒト、家畜、競技用動物および愛玩動物が非限定的に含まれる。本明細書に記載の方法の1つの態様において、対象はヒト対象である。
【００３４】
OX40L阻害物質は、siRNA、dsRNA、miRNA、リボザイム、分子阻害物質、小分子、抗体、または抗原結合性断片であってよい。いくつかの態様において、OX40L阻害物質はOX40L抗体またはその抗原結合性断片である。さらなる態様において、OX40L阻害物質は、本明細書に記載の通りの組成物を含む。さらに別の態様において、OX40L阻害物質は、本明細書に記載のポリペプチド、ポリヌクレオチド、抗体、宿主細胞または発現ベクターを含む。
【００３５】
本明細書において用いる場合、「1つ（a）」または「1つの（an）」は、1つまたは複数を意味しうる。特許請求の範囲において、「含む（comprising）」という語とともに用いる場合、「1つの（a）」または「1つの（an）」は、1つまたは複数を意味しうる。
【００３６】
特許請求の範囲における「または」という用語の使用は、その選択肢のみを指すように明示されているかまたはその選択肢が相互排他的である場合を除いて、「および／または」を意味するために使用される。本明細書において用いる場合、「別の」とは、少なくとも第2またはそれ以上のものを意味しうる。
【００３７】
本出願の全体を通じて、「約」という用語は、ある値が、装置の固有の誤差の変動、その値を決定するために使用される方法、または研究対象に存在する変動を含むことを指し示すために用いられる。
【００３８】
[本発明1001]
それを必要とする対象において移植片対宿主病または移植片拒絶を治療または予防するための方法であって、該対象にOX40L阻害物質の治療的有効量を投与する段階を含む、方法。
[本発明1002]
前記対象が、移植組織を受け入れる予定であるかまたは受け入れている対象である、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記対象が前記移植組織による合併症を有しており、該合併症が移植片拒絶またはGVHDである、本発明1002の方法。
[本発明1004]
それを必要とする対象において自己免疫疾患、炎症、および／または自己免疫疾患に関連する炎症を治療または予防するための方法であって、該対象にOX40L阻害物質の治療的有効量を投与する段階を含む、方法。
[本発明1005]
それを必要とする対象において炎症性Th2細胞応答および／または病原性Tfh細胞応答を低下させるための方法であって、該対象にOX40L阻害物質の治療的有効量を投与する段階を含む、方法。
[本発明1006]
前記対象が、アレルギー性疾患喘息、アトピー性皮膚炎、実験的自己免疫性脳脊髄炎、炎症性腸疾患、接触過敏症、喘息性気道反応亢進、自己免疫性糖尿病、アテローム性動脈硬化症、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、多発性硬化症、潰瘍性大腸炎、移植片対宿主病、移植片拒絶反応、および多発性筋炎の群より選択される自己免疫疾患を有する、本発明1004または1005の方法。
[本発明1007]
前記自己免疫疾患が全身性エリテマトーデスである、本発明1006の方法。
[本発明1008]
前記対象がヒトである、本発明1001〜1007のいずれかの方法。
[本発明1009]
前記OX40L阻害物質が、siRNA、dsRNA、miRNA、リボザイム、分子阻害物質、小分子、抗体、または抗原結合性断片より選択される、本発明1001〜1008のいずれかの方法。
[本発明1010]
前記OX40L阻害物質がOX40L抗体またはその抗原結合性断片である、本発明1009の方法。
[本発明1011]
前記OX40L抗体またはその抗原結合性断片が、3つの相補性決定領域（CDR）アミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含み、該CDRの1つまたは複数が、SEQ ID NO：5〜7、19〜21、33〜35より選択されるアミノ酸配列またはそれらの等価物を含む、本発明1010の方法。
[本発明1012]
前記重鎖可変ドメインCDRが、SEQ ID NO：5〜7のアミノ酸配列またはそれらの等価物を含む、本発明1011の方法。
[本発明1013]
前記重鎖可変ドメインCDRが、SEQ ID NO：19〜21のアミノ酸配列またはそれらの等価物を含む、本発明1011の方法。
[本発明1014]
前記重鎖可変ドメインCDRが、SEQ ID NO：33〜35のアミノ酸配列またはそれらの等価物を含む、本発明1011の方法。
[本発明1015]
前記抗OX40L抗体またはその抗原結合性断片が、3つの相補性決定領域（CDR）アミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインをさらに含み、該CDRの1つまたは複数が、SEQ ID NO：12〜14、26〜28、40〜42より選択されるアミノ酸配列またはそれらの等価物を含む、本発明1010〜1014のいずれかの方法。
[本発明1016]
前記軽鎖可変ドメインCDRが、SEQ ID NO：12〜14のアミノ酸配列またはそれらの等価物を含む、本発明1015の方法。
[本発明1017]
前記軽鎖可変ドメインCDRが、SEQ ID NO：26〜28のアミノ酸配列またはそれらの等価物を含む、本発明1015の方法。
[本発明1018]
前記軽鎖可変ドメインCDRが、SEQ ID NO：40〜42のアミノ酸配列またはそれらの等価物を含む、本発明1015の方法。
[本発明1019]
前記抗OX40L抗体またはその抗原結合性断片がヒトOX40Lまたはその等価物と結合する、本発明1010〜1018のいずれかの方法。
[本発明1020]
前記抗OX40L抗体が中和性である、本発明1010〜1019のいずれかの方法。
[本発明1021]
前記抗体が、ヒト抗体、ヒト化抗体、組換え抗体、キメラ抗体、抗体誘導体、ベニア抗体（veneered antibody）、ダイアボディ、モノクローナル抗体、またはポリクローナル抗体である、本発明1010〜1020のいずれかの方法。
[本発明1022]
前記抗体がヒト化抗体である、本発明1021の方法。
[本発明1023]
前記抗体またはその抗原結合性断片が改変を含む、本発明1010〜1022のいずれかの方法。
[本発明1024]
前記改変が、VHおよび／またはVLのCDR1領域内、CDR2領域内、および／またはCDR3領域内の保存的アミノ酸突然変異である、本発明1023の方法。
[本発明1025]
前記改変が、Fcヒンジ領域内の保存的アミノ酸突然変異である、本発明1023の方法。
[本発明1026]
前記改変がペグ化である、本発明1023の方法。
[本発明1027]
前記改変が血清タンパク質とのコンジュゲーションである、本発明1023の方法。
[本発明1028]
前記改変がヒト血清アルブミンとのコンジュゲーションである、本発明1023の方法。
[本発明1029]
前記改変が、検出可能な標識とのコンジュゲーションである、本発明1023の方法。
[本発明1030]
前記改変が診断剤とのコンジュゲーションである、本発明1023の方法。
[本発明1031]
前記改変が酵素とのコンジュゲーションである、本発明1023の方法。
[本発明1032]
前記改変が、蛍光物質、発光物質、または生物発光物質とのコンジュゲーションである、本発明1023の方法。
[本発明1033]
前記改変が放射性物質とのコンジュゲーションである、本発明1023の方法。
[本発明1034]
前記改変が治療剤とのコンジュゲーションである、本発明1023の方法。
[本発明1035]
3つの相補性決定領域（CDR）アミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む単離された抗OX40L抗体またはその抗原結合性断片を含み、該CDRの1つまたは複数が、SEQ ID NO：5〜7、19〜21、もしくは33〜35より選択されるアミノ酸配列またはそれらの等価物を含む、薬学的組成物。
[本発明1036]
前記重鎖可変ドメインCDRが、SEQ ID NO：5〜7のアミノ酸配列またはそれらの等価物を含む、本発明1035の薬学的組成物。
[本発明1037]
前記重鎖可変ドメインCDRが、SEQ ID NO：19〜21のアミノ酸配列またはそれらの等価物を含む、本発明1035の薬学的組成物。
[本発明1038]
前記重鎖可変ドメインCDRが、SEQ ID NO：33〜35のアミノ酸配列またはそれらの等価物を含む、本発明1035の薬学的組成物。
[本発明1039]
前記抗OX40L抗体またはその抗原結合性断片が、3つの相補性決定領域（CDR）アミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインをさらに含み、該CDRの1つまたは複数が、SEQ ID NO：12〜14、26〜28、40〜42より選択されるアミノ酸配列またはそれらの等価物を含む、本発明1035〜1038のいずれかの薬学的組成物。
[本発明1040]
前記軽鎖可変ドメインCDRが、SEQ ID NO：12〜14のアミノ酸配列またはそれらの等価物を含む、本発明1039の薬学的組成物。
[本発明1041]
前記軽鎖可変ドメインCDRが、SEQ ID NO：26〜28のアミノ酸配列またはそれらの等価物を含む、本発明1039の薬学的組成物。
[本発明1042]
前記軽鎖可変ドメインCDRが、SEQ ID NO：40〜42のアミノ酸配列またはそれらの等価物を含む、本発明1039の薬学的組成物。
[本発明1043]
前記抗OX40L抗体またはその抗原結合性断片がヒトOX40Lまたはその等価物と結合する、本発明1035〜1042のいずれかの薬学的組成物。
[本発明1044]
前記抗OX40L抗体が中和性である、本発明1035〜1043のいずれかの薬学的組成物。
[本発明1045]
前記抗体が、ヒト抗体、ヒト化抗体、組換え抗体、キメラ抗体、抗体誘導体、ベニア抗体、ダイアボディ、モノクローナル抗体、またはポリクローナル抗体である、本発明1035〜1044のいずれかの薬学的組成物。
[本発明1046]
前記抗体がヒト化抗体である、本発明1045の薬学的組成物。
[本発明1047]
前記抗体またはその抗原結合性断片が改変を含む、本発明1035〜1046のいずれかの薬学的組成物。
[本発明1048]
前記改変が、VHおよび／またはVLのCDR1領域内、CDR2領域内、および／またはCDR3領域内の保存的アミノ酸突然変異である、本発明1047の薬学的組成物。
[本発明1049]
前記改変が、Fcヒンジ領域内の保存的アミノ酸突然変異である、本発明1047の薬学的組成物。
[本発明1050]
前記改変がペグ化である、本発明1047の薬学的組成物。
[本発明1051]
前記改変が血清タンパク質とのコンジュゲーションである、本発明1047の薬学的組成物。
[本発明1052]
前記改変がヒト血清アルブミンとのコンジュゲーションである、本発明1047の薬学的組成物。
[本発明1053]
前記改変が、検出可能な標識とのコンジュゲーションである、本発明1047の薬学的組成物。
[本発明1054]
前記改変が診断剤とのコンジュゲーションである、本発明1047の薬学的組成物。
[本発明1055]
前記改変が酵素とのコンジュゲーションである、本発明1047の薬学的組成物。
[本発明1056]
前記改変が、蛍光物質、発光物質、または生物発光物質とのコンジュゲーションである、本発明1047の薬学的組成物。
[本発明1057]
前記改変が放射性物質とのコンジュゲーションである、本発明1047の薬学的組成物。
[本発明1058]
前記改変が治療剤とのコンジュゲーションである、本発明1047の薬学的組成物。
[本発明1059]
担体をさらに含む、本発明1035〜1058のいずれかの薬学的組成物。
[本発明1060]
SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、およびSEQ ID NO：6の相補性決定領域（CDR）アミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインとSEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、およびSEQ ID NO：12の相補性決定領域（CDR）アミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインとを含む単離されたヒト化IgG抗OX40L抗体またはその抗原結合性断片を含む、薬学的組成物。
[本発明1061]
SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、およびSEQ ID NO：19の相補性決定領域（CDR）アミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインとSEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、およびSEQ ID NO：26の相補性決定領域（CDR）アミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインとを含む単離されたヒト化IgG抗OX40L抗体またはその抗原結合性断片を含む、薬学的組成物。
[本発明1062]
SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、およびSEQ ID NO：33の相補性決定領域（CDR）アミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインとSEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、およびSEQ ID NO：40の相補性決定領域（CDR）アミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインとを含む単離されたヒト化IgG抗OX40L抗体またはその抗原結合性断片を含む、薬学的組成物。
[本発明1063]
3つの相補性決定領域（CDR）アミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む抗OX40L抗体またはその抗原結合性断片のポリペプチド鎖をコードする核酸配列を含み、該CDRの1つまたは複数が、SEQ ID NO：5〜7、19〜21、もしくは33〜35より選択されるアミノ酸配列またはそれらの等価物を含む、単離されたポリヌクレオチド。
[本発明1064]
3つの相補性決定領域（CDR）アミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含む抗OX40L抗体またはその抗原結合性断片のポリペプチド鎖をコードする核酸配列を含み、該CDRの1つまたは複数が、SEQ ID NO：12〜14、26〜28、もしくは40〜42より選択されるアミノ酸配列またはそれらの等価物を含む、単離されたポリヌクレオチド。
[本発明1065]
本発明1063または1064のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
[本発明1066]
調節配列に機能的に連結された本発明1063または1064のポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
本発明の他の目的、特徴、および利点は以下の詳細な説明から明らかとなるであろう。しかし、本発明の趣旨および範囲内にあるさまざまな変更および修正がこの詳細な説明から当業者に明らかとなるであろうから、詳細な説明および具体例は、本発明の好ましい態様を示してはいるが、例としてのみ提供されていることが理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本発明のある特定の局面をさらに示すために含められる。本発明は、これらの図面の1つまたは複数を、本明細書に提示された具体的な態様の詳細な説明と組み合わせて参照することによって、より十分に理解されうる。
【図１】実施例1に記載した方法に従って、5C6（AB104_105.5C6.3F9）抗OX40L mAb、ik-5抗OX40L mAb、または対照抗体（IgG2a）の存在下で、樹状細胞とT細胞を共培養したアッセイ法の結果を図示している。IL-4、IL-5、IL-10、IL-13、TNF-αおよびIFN-γの産生をELISAによって測定した。
【図２】実施例1に記載した方法に従って、19A3（AB104_105.19A3.2C4）抗OX40L mAb、ik-5抗OX40L mAb、または対照抗体（IgG2aおよびIgG2b）の存在下で、樹状細胞とT細胞を共培養したアッセイ法の結果を図示している。IL-4、IL-5、IL-10、IL-13、TNF-αおよびIFN-γの産生をELISAによって測定した。
【図３】実施例1に記載した方法に従って、5C6（AB104_105.5C6.3F9）抗OX40L mAb、44F3（AB104_105.44F3.2F7）抗OX40L mAb、19A3（AB104_105.19A3.2C4）抗OX40L mAb、ik-5抗OX40L mAb、または対照抗体（IgG2aおよびIgG2b）の存在下で、樹状細胞とT細胞を共培養したアッセイ法の結果を図示している。IL-4、IL-5、IL-10、IL-13、TNF-αおよびIFN-γの産生をELISAによって測定した。
【図４】実施例1に記載した方法に従って、5C6（AB104_105.5C6.3F9）抗OX40L mAb、ik-5抗OX40L mAb、または対照抗体（IgG2a）の存在下で、樹状細胞とT細胞を共培養したアッセイ法の結果を図示している。細胞を採取して、細胞の増殖および生存率を判定した。
【図５】実施例1に記載した方法に従って、19A3（AB104_105.19A3.2C4）抗OX40L mAb、ik-5抗OX40L mAb、または対照抗体（IgG2aおよびIgG2b）の存在下で、樹状細胞とT細胞を共培養したアッセイ法の結果を図示している。細胞を採取して、細胞の増殖および生存率を判定した。
【図６】実施例1に記載した方法に従って、5C6（AB104_105.5C6.3F9）抗OX40L mAb、44F3（AB104_105.44F3.2F7）抗OX40L mAb、19A3（AB104_105.19A3.2C4）抗OX40L mAb、ik-5抗OX40L mAb、または対照抗体（IgG2aおよびIgG2b）の存在下で、樹状細胞とT細胞を共培養したアッセイ法の結果を図示している。細胞を採取して、細胞の増殖および生存率を判定した。
【図７】実施例1に記載した方法に従って、19A3（AB104_105.19A3.2C4）または対照抗体（マウスIgG2b）の存在下で、樹状細胞とT細胞を共培養したアッセイ法の結果を図示している。IL-10およびTNF-αの産生をELISAによって測定した。
【図８】図7に記載した実験の繰り返しを示している。
【図９】図9A〜9Cは、炎症性扁桃における骨髄系APCによるOX40L発現の増大を示している。（A）小児扁桃由来の骨髄系CD11c+HLA-DR+ APC上でのOX40L、ICOSL、4-1BBLおよびGITRLの発現。9回の独立した実験のうちの代表的な結果。（B）扁桃骨髄系APCの中でのOX40L+、ICOSL+、GITRL+および4-1BBL+細胞の頻度。平均±s.d.、n＝9。一元配置ANOVA。*** p＜0.001。（C）炎症性扁桃におけるOX40L+CD11c+ APC。GC：胚中心；MZ：外套層；Epi：上皮層。上および下のパネルのスケールバーは、それぞれ100μmおよび10μmを示している。
【図１０】図10A〜10Eは、SLE患者由来の骨髄系APCによるOX40L発現を示している。（A）成人SLE患者および自己免疫疾患を有しない対象由来の皮膚および腎臓の生検試料におけるOX40L+骨髄系APC。SLE患者由来の5件の皮膚生検試料および3件の腎臓生検試料、ならびに対照由来の5件の皮膚生検試料および2件の腎臓生検試料による代表的な結果。スケールバー＝100μm。（B）以下の3群：健常ドナー（HD）、非活動性（iSLE）および活動性（aSLE）SLE患者に由来する血中骨髄系CD11c+HLA-DR+ APCによるOX40L発現に関する代表的なフローデータ。（C）成人コホートおよび小児コホートでの3群における、血中骨髄系APCの中でのOX40L+細胞の頻度。上：成人コホート；16件のHD試料、38件のiSLE試料、および31件のaSLE試料。下：子供コホート；14件のHD試料、20件のiSLE試料、および14件のaSLE試料。一元配置ANOVA。* p＜0.05、** p＜0.01、*** p＜0.001。（D）CD11c+HLA-DR+骨髄系APCの中でのOX40L+細胞のパーセンテージ（成人：n＝69および子供：n＝38）と、SLEDAIによって評価した疾患活動性との間の相関。統計分析はSpearman検定によって行った。（E）成人（n＝28）および小児（n＝34）SLE患者における、種々のサブセット（CD14+CD16-、CD14+CD16+、CD14-CD16-、CD14-CD16+）別にみた血中OX40L+骨髄系APCの組成。平均±s.d.。
【図１１】図11A〜11Cは、OX40シグナルがTfh遺伝子の上方制御を誘導することを示している。（A）sOX40Lの存在下または非存在下で、抗CD3および抗CD28によって48時間にわたって活性化されたナイーブTh細胞およびメモリーTh細胞（ドナー3人に由来）によるTfh遺伝子の発現。培養Th細胞における転写物カウント数を、規準化の後に示している。平均±s.d、n＝3。対応t検定。* p＜0.05、** p＜0.01。（B）指定の試薬の存在下で抗CD3および抗CD28によって48時間にわたって活性化されたナイーブTh細胞およびメモリーTh細胞によるTfh遺伝子発現プロファイル。指定の試薬の存在下で培養したTh細胞における転写物カウント数を、各ドナーにおける対照Th細胞のものに対して規準化した。（C）指定の試薬の存在下で抗CD3および抗CD28によって活性化されたメモリーTh細胞における転写物カウント数。各棒グラフにおけるバーは、左から右の順に、「なし」、「OX40L」、「IL-2」、「IL-2+OX40L」、および「IFN-γ」を表している。平均±s.d.、n＝3。一元配置ANOVA。* P＜0.05、** P＜0.01、*** P＜0.001。
【図１２】図12A〜12Cは、OX40L刺激により、ナイーブT細胞およびメモリーT細胞のTfh様細胞への分化が促進されることを示している。（A）sOX40Lおよび／またはIL-12の存在下または非存在下で、抗CD3および抗CD28によって4日間にわたって活性化されたナイーブTh細胞およびメモリーTh細胞によるCXCR5、IL-21およびCD40Lの発現。FSChiSSChi活性化細胞に対してゲーティングされている。3回の独立した実験のうちの代表的な結果を示している。（B）sOX40Lおよび／またはIL-12の存在下または非存在下で、抗CD3および抗CD28による活性化の後にナイーブTh細胞またはメモリーTh細胞において発生したCXCR5+IL-21+細胞およびCXCR5+CD40L+細胞の頻度。一元配置ANOVA。* p＜0.05、** p＜0.01、*** P＜0.001、n＝3。（C）ナイーブTh細胞またはメモリーTh細胞を、sOX40Lおよび／またはIL-12の存在下で抗CD3および抗CD28によって4日間にわたって活性化し、続いて自家性メモリーB細胞とともに培養した。各ウェルの上清中のIgG濃度を示している。2回の独立した実験のうちの代表的な結果を示している。
【図１３】図13A〜13Fは、ヒトSLEにおける血中CD14+ APCが、OX40Lを介したTfh様細胞の生成を促進することを示している。（A）非活動性（iSLE、n＝5）および活動性（aSLE、n＝5）SLE患者由来の同種異系CD14+ APCとの7日間にわたる培養後にナイーブTh細胞において発生した、（FSChiSSChi活性化細胞の中での）CXCR5+IL-21+細胞の頻度。Mann-Whitney U検定。** p＜0.01。（B）OX40L中和性mAbまたは対照IgGの存在下で、同種異系SLE CD14+ APCとともに培養したナイーブTh細胞によるCXCR5およびIL-21の発現。5回の実験のうちの代表的な結果を示している。（C）抗OX40Lによる、CXCR5+IL-21+細胞（FSChiSSChi活性化細胞の中での）の生成の減少。活動性SLE患者由来のAPCによる結果を示している。対応t検定。** p＜0.01。（D）CD14+ APCの中でのOX40L+細胞の頻度と、培養物中で生成されたCXCR5+IL-21+ Th細胞の頻度との間の相関。Spearman相関検定、n＝10。（E）以下の3群；aSLE、iSLEおよびHDにおける、血中Tfh細胞上でのICOSの発現。代表的なフローの結果を示している。（F）SLE患者における、血中骨髄系APCの中でのOX40L+細胞の頻度と、血中Tfh細胞の中でのICOS+細胞の頻度との間の相関。Spearman相関検定、n＝19。
【図１４】図14A〜14Eは、RNP／抗RNP ICが、骨髄系APCによるOX40L発現をTLR7依存的な様式で促進することを示している。（A）対照血清（n＝7）またはSLE血清（n＝21）に曝露された精製正常単球によるOX40Lの発現（MFI）。Mann-Whitney U検定。** p＜0.01。代表的な染色を左のパネルに示している。（B）TLR3アゴニスト、TLR7アゴニストまたはTLR9アゴニストによる精製正常単球の刺激に応じたOX40L発現。4つの異なる実験のうちの代表的な染色を示している。（C）TLR7阻害物質の存在下または非存在下において、SLE血清（n＝7）に曝露された正常単球におけるOX40L発現（MFI）。対応t検定。** p＜0.01。代表的な染色を左のパネルに示している。（D）抗RNPneg SLE血清（n＝5）または抗RNPpos SLE血清（n＝16）に曝露された正常単球におけるOX40L発現（MFI）。Mann-Whitney U検定。** p＜0.01。（E）抗RNPneg SLE血清（上のパネル）、抗RNP含有IgGを加えた血清（中央のパネル）、TLR7阻害物質の存在下で抗RNP含有IgGを混入させた血清（下のパネル）に曝露された精製正常単球のOX40L発現。3回の独立した実験のうちの代表的な染色を示している。
【図１５】SLEにおける骨髄系APCによるOX40L発現を示している。15人の健常ドナー（HD）、37人のSLE患者、13人の全身性硬化症（SSc）患者および11人の関節リウマチ（RA）患者における、血中CD11c+HLA-DR+細胞によるOX40L発現の分析。一元配置ANOVA。*** P＜0.001。
【図１６】図16Aおよび16Bは、活動性SLE患者における血中骨髄系APCが、ICOSL、4-1BBLおよびGITRLをいずれも発現しないことを実証している。8人の活動性SLE患者における、血中骨髄系APCによるOX40L、GITRL、ICOSL、4-1BBLの発現の分析。代表的なフローの結果をパネルa. bに示している。一元配置ANOVA。** P＜0.01、* P＜0.05。
【図１７】血中OX40L+骨髄系APCの大多数がCD14を発現することを実証している。成人SLE患者および小児SLE患者における、血中OX40L+骨髄系APC上でのCD14およびCD16の発現を分析した。11件の成人SLE患者試料および12件の小児SLE患者試料による代表的なフローの結果を示している。
【図１８】成人SLE患者において、治療後に血中骨髄系APC上のOX40L発現が減少することを示している。過去に治療を受けていない発赤のある11人の成人SLE患者において、血中骨髄系APC上でのOX40Lの発現を、治療（Tx）の前および後に分析した。治療の前および後の、血中骨髄系APCの中でのOX40L+細胞のパーセンテージを示している。対応t検定、n＝11。
【図１９】OX40シグナルが、Tfh遺伝子を発現するようにナイーブTh細胞を誘導することを実証している。指定の試薬の存在下で、抗CD3および抗CD28によって48時間にわたって活性化されたナイーブTh細胞によるTfh遺伝子発現プロファイル。各棒グラフにおけるバーは、左から右の順に、「なし」、「OX40L」、「IL-2」、「IL-2＋OX40L」、および「IFN-γ」を表している。平均±s.d.、n＝3。一元配置ANOVA。* P＜0.05、** P＜0.01、*** P＜0.001。
【図２０】OX40L刺激により、ナイーブTh細胞およびメモリーTh細胞がTfh細胞の表現型を獲得することが促進されることを示している。IL-12および／または可溶性OX40Lの存在下または非存在下で、ナイーブTh細胞およびメモリーTh細胞を、抗CD3およびCD28とともに培養した。第5日に、活性化（FSChiSSChi）細胞の表現型を、フローサイトメトリーによって分析した。代表的なフローの結果を上のパネルに示している。種々の条件下における、活性化細胞の中でのCXCR5+ICOS+細胞およびCXCR5+CCR7-細胞のパーセンテージを、下のパネルに示している。一元配置ANOVA。*** P＜0.001、** P＜0.01、* P＜0.05。
【図２１】OX40L刺激により、ナイーブTh細胞およびメモリーTh細胞がIL-21、IL-2およびTNF-αを発現するように誘導されることを示している。sOX40Lの存在下または非存在下における、抗CD3および抗CD28によって活性化されたナイーブTh細胞およびメモリーTh細胞によるCXCR5、IL-21およびCD40Lの発現。培養したTh細胞を、細胞質内（intracytplasmic）サイトカインを分析するためのブレフェルジンAおよびモメンシンの存在下で、PMAおよびイオノマイシンによって6時間にわたって再刺激した。対応t検定。*** P＜0.001、** P＜0.01、* P＜0.05。
【図２２】SLE患者において、血中骨髄系APCの中でのOX40L+細胞のパーセンテージが、血中Tfh細胞の頻度と相関することを示している。19人のSLE患者において、血中骨髄系APCの中でのOX40L+細胞の頻度と、血中Tfh細胞の頻度との間の相関を分析した。統計分析はSpearman検定によって行った。
【図２３】SLE患者において、血中骨髄系APCの中でのOX40L+細胞のパーセンテージが、血中Th1、Th2およびTh17細胞の頻度と相関しないことを示している。（メモリーCXCR5- Th細胞の中での）血中Th1、Th2およびTh17細胞の分析のためのゲーティング戦略を、上のパネルに示している。19人のSLE患者において、血中骨髄系APCの中でのOX40L+細胞の頻度と、血中Th1、Th2およびTh17細胞の頻度との間の相関を分析した。統計分析はSpearman検定によって行った。
【図２４】SLE血清によるOX40L発現がRNAに依存することを示している。RNアーゼ（0.1mg／ml. Qiagen）の存在下または非存在下における、SLE血清に曝露された精製正常単球によるOX40L発現。5人のSLE患者由来の血清試料による結果。対応t検定、*** P＜0.001。
【図２５】移植片組織の移植後の動物の生存パーセントを示している。
【図２６Ａ】抗OX40L抗体がヒトのキメラ現象に干渉しないことを示している。IgG2b処置マウスによるFACSプロットが示されている。
【図２６Ｂ】抗OX40L抗体がヒトのキメラ現象に干渉しないことを示している。抗OX40L処置マウスによるFACSプロットが示されている。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
例示的な態様の説明
シクロスポリン、タクロリムス、メトトレキサートまたは抗TNFa／IL-6などの免疫抑制剤を用いる従来の免疫療法は、宿主において非病原性T細胞を含むT細胞の機能を非特異的に抑制する。このため、これらの免疫抑制剤を用いる治療では、多くの場合、結果として重症感染症の発症がもたらされ、時には致死的な転帰をたどることもある。本明細書に記載の方法および組成物は、OX40-OX40L相互作用の計画的遮断および炎症性T細胞の近時活性化の特異的抑制を対象とする。その結果として、全体的な免疫抑制を伴うことなく、IL-10の誘導およびTNF-a産生阻害によって、炎症性T細胞の分化が調節性T細胞へと転換される。重要なこととして、OX40Lのターゲティングにより、他のT細胞レパートリーの機能を撹乱することなく、抗原特異的T細胞レパートリーのみをモジュレートすることができ、その結果、免疫抑制性副作用の減少がもたらされる。
【００４１】
独自のスクリーニング方法を用いて、本出願人らは、（1）ヒトOX40L上の独特のエピトープを認識する；（2）TSLP-mDCによって刺激されるIL-10低産生性／TNFa高産生性の炎症性Th2の分化を阻害する；かつ（3）TNF-aの増殖および産生を阻害し、OX40Lがトランスフェクトされた細胞株とともに培養されたCD4 T細胞によってIL-10を促進する、抗ヒトOX40L中和性MAbを作製した。これらのOX40L阻止性モノクローナル抗体は強力な免疫調節薬であり、移植片対宿主病、全身性エリテマトーデス（system lupus erythematosus）、心血管疾患（例えば、アテローム性動脈硬化症）などの炎症性疾患、および本明細書に記載されたものなどの炎症性疾患に対する有望な治療薬となる。
【００４２】
I．OX40L阻害物質
A．抗体
本開示の方法および組成物は、OX40L阻害物質に関する。「OX40L」という用語は、T細胞抗原提示細胞（APC）相互作用に関与することが見いだされている、あるタンパク質のことを指す。OX40Lはまた、TNFSF4、GP34、CD252、OX40L、TXGP1、およびCD134Lとしても知られている。このタンパク質は、OX40（CD134、TNFRSF4、ACT35、IMD16、およびTXGP1Lとしても知られる）のリガンドである。OX40Lのヒトタンパク質配列は、Genbankアクセッション番号：NP_003317.1、P23510.1、BAB18304.1、およびP43489.1によって表されている。これらのアクセッション番号と関連づけられている配列は、参照により具体的に組み入れられる。
【００４３】
ある特定の態様において、OX40L阻害物質は、抗体またはその抗原結合性断片である。本明細書において用いる場合、「抗体」には、全長抗体およびそれらの任意の抗原結合性断片または単鎖が含まれる。したがって、「抗体」という用語には、免疫グロブリン分子の少なくとも一部分を含む任意のタンパク質またはペプチド含有分子が含まれる。そのようなものの例には、重鎖もしくは軽鎖もしくはそれらのリガンド結合部分の相補性決定領域（CDR）、重鎖可変領域もしくは軽鎖可変領域、重鎖定常領域もしくは軽鎖定常領域、フレームワーク（FR）領域もしくはその任意の部分、または結合性タンパク質の少なくとも1つの部分が非限定的に含まれる。ある特定の態様において、抗体または抗原結合性断片は、ヒトOX40Lと特異的に結合する。
【００４４】
抗体は本明細書に記載のさまざまな抗体のいずれであってもよく、そのようなものの非限定的な例には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、ベニア抗体、ダイアボディ、ヒト化抗体、抗体誘導体、組換え抗体、組換えヒト化抗体、操作された抗体、多重特異性抗体、DARPin、またはそれらのそれぞれの誘導体もしくは断片が含まれる。
【００４５】
抗体は、当技術分野において公知であって文献中に十分に記載されている従来の手法を用いて作製することができる。ポリクローナル抗体の作製のためには、いくつかの方法が存在する。例えば、ポリクローナル抗体は典型的には、適した哺乳動物、例えば、限定はされないが、ニワトリ、ヤギ、モルモット、ハムスター、ウマ、マウス、ラットおよびウサギなどの免疫処置によって作製される。抗原を哺乳動物に注入し、抗原に対して特異的な免疫グロブリンを産生するようにBリンパ球を誘導する。免疫グロブリンを哺乳動物の血清から精製する。この方法の一般的な変法には、最適な産生および動物の人道的な処置のための、アジュバント、投与の経路および部位、部位あたりの注射体積および動物あたりの部位数の変更が含まれる。例えば、アジュバントは典型的には、抗原に対する免疫応答を改善または増強するために用いられる。ほとんどのアジュバントは注射部位に抗原デポーをもたらし、これは流入領域リンパ節内への抗原の徐放を可能にする。他のアジュバントには、広い表面積にわたるタンパク質抗原分子および免疫賦活性分子の濃縮を促進する界面活性剤が含まれる。ポリクローナル抗体を産生するためのアジュバントの非限定的な例には、フロイントアジュバント、Ribiアジュバント系、およびTitermaxが含まれる。ポリクローナル抗体は、米国特許第7,279,559号；同第7,119,179号；同第7,060,800号；同第6,709,659号；同第6,656,746号；同第6,322,788号；同第5,686,073号；および同第5,670,153号に記載された方法を用いて作製することができる。
【００４６】
別に指定する場合を除き、抗体はポリクローナル性またはモノクローナル性であってよく、任意の適した生物供給源、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ラクダ科動物、メンヨウ、またはイヌ科動物などから単離することができる。
【００４７】
本明細書において用いる場合、「モノクローナル抗体」とは、実質的に均質な抗体集団から得られた抗体のことを指す。モノクローナル抗体は、それぞれのモノクローナル抗体が抗原上の単一の決定基を対象とするので、高度に特異的である。抗体は、例えば、放射性同位体、検出可能な産物を生成する酵素、蛍光性タンパク質などを用いて検出可能に標識することができる。抗体は、さらに他のモイエティー、例えば、特異的結合対のメンバー、例えば、ビオチン（ビオチン−アビジン特異的結合対のメンバー）などとコンジュゲートさせることができる。また、抗体を、ポリスチレン製のプレートまたはビーズなどを非限定的に含む固体支持体と結合させることもできる。場合によっては、抗体は間接的に標識される。間接的標識には、抗体と結合するタンパク質、例えば二次抗体などの標識が含まれうる。
【００４８】
モノクローナル抗体は、当技術分野において公知であって文献中に十分に記載されている従来のハイブリドーマ手法を用いて作製することができる。例えば、ハイブリドーマは、適した不死細胞株（例えば、骨髄腫細胞株、例えば、限定はされないが、Sp2／0、Sp2／0-AG14、NSO、NS1、NS2、AE-1、L.5、P3X63Ag8,653、Sp2 SA3、Sp2 MAI、Sp2 SS1、Sp2 SA5、U397、MIA 144、ACT IV、MOLT4、DA-1、JURKAT、WEHI、K-562、COS、RAJI、NIH 313、HL-60、MLA 144、NAMAIWA、NEURO 2A、CHO、PerC.6、YB2／Oなど）など、またはヘテロミエローマ、それらの融合産物、またはそれらから派生する任意の細胞または融合細胞、または当技術分野において公知の任意の他の適した細胞系を、抗体産生細胞、例えば、限定はされないが、単離もしくはクローン化された脾臓、末梢血、リンパ、扁桃、または他の免疫細胞もしくはB細胞を含む細胞と融合させること、あるいは、内因性または異種の核酸として、組換え性もしくは内因性のウイルス、細菌、藻類、原核生物、両生類、昆虫、爬虫類、魚類、哺乳類、齧歯類、ウマ、ヒツジ、ヤギ、メンヨウ、霊長動物、真核生物のゲノムDNA、cDNA、rDNA、ミトコンドリアDNAまたはRNA、葉緑体DNAまたはRNA、hnRNA、mRNA、tRNA、一本鎖、二本鎖もしくは三本鎖、ハイブリダイズ性、およびそれらの任意の組み合わせなどとして、重鎖または軽鎖の定常配列または可変配列またはフレームワーク配列またはCDR配列を発現する、任意の他の細胞と融合させることによって作製される。また、抗体産生細胞を、関心対象の抗原による免疫処置を行ったヒトまたは他の適した動物の末梢血、または好ましくは脾臓またはリンパ節から得ることもできる。任意の他の適した宿主細胞を、本発明の、抗体、その特定の断片または変異体をコードする異種性または内因性の核酸を発現させるために用いることもできる。融合細胞（ハイブリドーマ）または組換え細胞は、選択的な培養条件または他の適した公知の方法を用いて単離した上で、限界希釈法または細胞分取法または他の公知の方法を用いてクローン化することができる。
【００４９】
必要な特異性を有する抗体を作製または単離する他の適した方法を用いることもでき、それには、当技術分野において公知の方法を用いて、ペプチドまたはタンパク質ライブラリー（例えば、限定はされないが、バクテリオファージ、リボソーム、オリゴヌクレオチド、cDNAなどのディスプレイライブラリー；例えば、MorphoSys（Martinsreid／Planegg, Del.）、Biolnvent（Lund, Sweden）、Affitech（Oslo, Norway）などのさまざまな製造販売元から入手しうるもの）から組換え抗体を選択する方法が非限定的に含まれる。当技術分野において公知の方法は特許文献に記載されており、そのいくつかには、米国特許第4,704,692号；同第5,723,323号；同第5,763,192号；同第5,814,476号；同第5,817,483号；同第5,824,514号；同第5,976,862号が含まれる。代替的な方法は、当技術分野において公知である、かつ／または本明細書において記載されているように、ヒト抗体のレパートリーを産生しうるトランスジェニック動物（例えば、SCIDマウス）（Nguyen et al., 1977；Sandhu et al., 1996)；Eren et al., 1998）の免疫処置に依拠している。そのような手法には、リボソームディスプレイ（Wanes et al., 1997；Hanes et al., 1998）；単細胞抗体産生技術（例えば、選択リンパ球抗体法（「SLAM」）（米国特許第5,627,052号, Wen et al., 1987；Babcook et al., 1996)；ゲル微小液滴およびフローサイトメトリー（Powell et al., 1990；Gray et al., 1995；Kenny et al., 1995）；B細胞選択（Steenbakkers et al., 1994）が非限定的に含まれる。
【００５０】
本明細書において用いる「ポリクローナル抗体」または「ポリクローナル抗体組成物」という用語は、異なるB細胞系に由来する抗体の調製物のことを指す。それらは、それぞれが異なるエピトープを認識する、特異的抗原に対して分泌された免疫グロブリン分子の混合物である。
【００５１】
「マウス抗体」という用語は、本明細書において用いる場合、マウス生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する抗体を含むことを意図している。
【００５２】
本明細書において用いる場合、キメラ抗体とは、その軽鎖遺伝子および重鎖遺伝子が、典型的には遺伝子工学によって、異なる種に属する抗体可変領域遺伝子および定常領域遺伝子から構築されている抗体のことである。
【００５３】
1つの態様において、抗OX40L抗体またはその抗原結合性断片は、中和抗体またはその抗原結合性断片である。OX40L中和抗体の文脈における「中和性」という用語は、以下のうち1つまたは複数を行いうる抗体のことを指す：OX40／OX40L相互作用に干渉すること；対象もしくは細胞におけるOX40／OX40L相互作用種の濃度を低下させること；対象もしくは細胞におけるOX40／OX40L相互作用を妨げること；ならびに／または、TNF-aの増殖および産生の阻害、CD4+ T細胞によるIL-10産生の促進、炎症性T細胞の活性化の抑制、および／もしくは炎症性T細胞から調節性T細胞への分化の転換のうち1つもしくは複数を含みうる、OX40Lの生物学的機能を低下させること。
【００５４】
さらなる態様において、抗体は改変を含み、「抗体誘導体」である。「抗体誘導体」という用語は、抗体または断片の直鎖状ポリペプチド配列への翻訳後改変を含む。例えば、米国特許第6,602,684 B1号は、免疫グロブリンのFc領域に等価な領域を含み、Fe媒介細胞毒性が強化された、全長抗体分子、抗体断片または融合タンパク質を含む改変グリコール形態の抗体の作製方法、およびそのように作製された糖タンパク質を記載している。
【００５５】
また、本明細書の抗体には、抗体が抗イディオタイプ応答を生じることを共有結合が妨げないように、抗体に対する任意の種類の分子の共有結合によって改変された誘導体も含まれる。抗体誘導体には、抗体誘導体には、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、公知の保護基／遮断基による誘導体化、タンパク質分解性切断、細胞内リガンドまたは他のタンパク質への連結などによって改変された抗体が非限定的に含まれる。加えて、誘導体が1つまたは複数の非古典的アミノ酸を含有してもよい。
【００５６】
また、そのような抗体をその乳中に産生するトランスジェニック動物または哺乳動物、例えばヤギ、ウシ、ウマ、メンヨウなどを得るために、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドを適した宿主に送達することによって、本発明の抗体誘導体を調製することもできる。これらの方法は当技術分野において公知であり、例えば米国特許第5,827,690号；同第5,849,992号；同第4,873,316号；同第5,849,992号；同第5,994,616号；同第5,565,362号；および同第5,304,489号に記載されている。
【００５７】
また、そのような抗体、特定の部分または変異体を、植物部分またはそれらから培養された細胞において産生する、トランスジェニック植物および培養植物細胞（例えば、限定はされないが、タバコ、トウモロコシ、およびウキクサなど）を得るために、本発明のポリヌクレオチドを送達することによって、抗体誘導体を調製することもできる。抗体誘導体はまた、タバコ種子およびジャガイモ塊茎を含め、単鎖抗体（scFv）などの抗体断片を含むトランスジェニック植物の種子からも大量に産生されている。例えば、Conrad et al., 1998およびその中に引用された参照文献を参照されたい。このように、抗体を、公知の方法に従ってトランスジェニック植物を用いて産生させることもできる。
【００５８】
また、例えば、免疫原性を改変するか、または結合性、親和性、オン速度、オフ速度、結合力、特異性、半減期、もしくは他の任意の適した特徴を低下させるため、強化するため、もしくは改変するために外因性配列を付加することによって、抗体誘導体を作製することもできる。一般に、非ヒトまたはヒトのCDR配列のうちの一部または全部を維持しながら、その一方で可変領域および定常領域の非ヒト配列をヒトアミノ酸または他のアミノ酸で置き換える。
【００５９】
「可変領域」という用語は、抗体に抗原と結合するためのその特異性を与える、抗体の一部分のことを指す。可変領域は典型的には、重鎖および軽鎖の末端に位置する。軽鎖（VL）および重鎖（VH）上にそれぞれ3つあるβ鎖の可変ループが、抗原に対する結合を担当する。これらのループは「相補性決定領域」（CDR）と呼ばれる。
【００６０】
一般に、CDR残基は、抗原結合に影響を及ぼすことに直接的かつ最も実質的に関与している。抗体のヒト化または操作は、任意の公知の方法、例えば、限定はされないが、米国特許第5,723,323号同；第5,976,862号；同第5,824,514号；同第5,817,483号；同第5,814,476号；同第5,763,192号；同第5,723,323号；同第5,766,886号；同第5,714,352号；同第6,204,023号；同第6,180,370号；同第5,693,762号；同第5,530,101号；同第5,585,089号；同第5,225,539号；および同第4,816,567号に記載されたものを用いて行うことができる。
【００６１】
「定常領域」という用語は、同じアイソタイプのすべての抗体において同一である、抗体の一部分のことを指す。定常領域は、異なるアイソタイプの抗体では異なる。
【００６２】
本明細書において用いる場合、「ヒト化抗体」または「ヒト化免疫グロブリン」という用語は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含有するヒト／非ヒトキメラ抗体を指す。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、レシピエントの可変領域由来の残基が、所望の特異性、親和性および能力を有する非ヒト種（ドナー抗体）、例えば、マウス、ラット、ウサギなど、または非ヒト霊長類の可変領域由来の残基と交換されているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体においては見いだされない残基を含んでよい。ヒト化抗体は、場合によって、一般にはヒト免疫グロブリンの、免疫グロブリン定常領域（Fc）の少なくとも一部分も含んでよい。非ヒト抗体は、フレームワーク領域、定常領域またはCDRに、ヒト抗体由来の同様に位置づけされたアミノ酸と置換されている1つまたは複数のアミノ酸を含有する。一般に、ヒト化抗体は、同じ抗体の非ヒト化型と比較して、ヒト宿主において生じる免疫応答を減少させることが予測される。ヒト化抗体は、抗原結合性または他の抗体機能に対する影響を実質的に有さない保存されたアミノ酸置換を有しうる。保存された置換のグループ分けには、以下が含まれる：グリシン-アラニン、バリン-ロイシン-イソロイシン、フェニルアラニン-チロシン、リジン-アルギニン、アラニン-バリン、セリン-トレオニン、およびアスパラギン-グルタミン。
【００６３】
本発明のキメラ抗体、ヒト化抗体、または霊長類化抗体は、標準的な分子生物学手法を用いて調製された参照モノクローナル抗体の配列に基づいて調製することができる。重鎖および軽鎖免疫グロブリンをコードするDNAを関心対象のハイブリドーマから入手し、標準的な分子生物学の手法を用いて、非参照（例えば、ヒト）免疫グロブリン配列を含むように操作することができる。例えば、キメラ抗体を生成するためには、当技術分野において公知の方法を用いて、マウス可変領域をヒト定常領域に連結させることができる（米国特許第4,816,567号）。ヒト化抗体を生成するためには、当技術分野において公知の方法を用いて、マウスCDR領域をヒトフレームワークに挿入することができる（米国特許第5,225,539号、および米国特許第5,530,101号；同第5,585,089号；同第5,693,762号および同第6,180,370号）。同様に、霊長類化抗体を生成するためには、当技術分野において公知の方法を用いて、マウスCDR領域を霊長動物フレームワークに挿入することができる（WO 93／02108およびWO 99／55369）。
【００６４】
部分的ヒト抗体から完全ヒト抗体までを作製するための手法は当技術分野において公知であり、そのようなあらゆる手法を用いることができる。1つの態様によれば、完全ヒト抗体配列を、ヒト重鎖抗体遺伝子およびヒト軽鎖抗体遺伝子を発現するように操作されたトランスジェニックマウスにおいて作らせる。種々のクラスの抗体を産生しうる、複数のそのようなトランスジェニックマウス系統が作製されている。所望の抗体を産生するトランスジェニックマウス由来のB細胞を融合させて、所望の抗体の持続的産生のためのハイブリドーマ細胞株を作製することができる（例えば、Russel et al., 2000；Gallo et al., 2000；Green, 1999；Yang et al., 1999A；Yang, 1999B；Jakobovits, 1998；Green and Jakobovits, 1998；Jakobovits, 1998；Tsuda et al., 1997；Sherman-Gold, 1997；Mendez et al., 1997；Jakobovits, 1996；Jakobovits, 1995；Mendez et al., 1995；Jakobovits, 1994；Arbones et al., 1994；Jakobovits, 1993；Jakobovits et al., 1993；米国特許第6,075,181号を参照されたい）。
【００６５】
また、キメラ抗体を生成するために、本発明の抗体を改変することもできる。キメラ抗体とは、抗体の重鎖および軽鎖のさまざまなドメインが複数の種由来のDNAによってコードされる抗体のことである。例えば、米国特許第4,816,567号を参照されたい。
【００６６】
または、本発明の抗体を、ベニア抗体を生成するために修飾することもできる。ベニア抗体とは、第1の種の抗体が第2の種において免疫原性とならず、その結果、この抗体の免疫原性が低下するように、1つの種の抗体の外部のアミノ酸残基を第2の種の外部のアミノ酸残基によって適切な判断で置き換えられているかまたは「ベニア化」されている（veneered）抗体のことである。タンパク質の免疫原性は、主としてその表面の性質に依存するので、別の哺乳動物種の抗体中に通常見いだされる残基とは異なる露出残基を置き換えることによって抗体の免疫原性を低下させうると考えられる。このように外部残基を適切な判断で置き換えることによって、内部ドメインまたはドメイン間の接合部にはほとんどまたは全く影響が及ばないはずである。このため、可変領域のフレームワーク残基に限定される変更の結果として、リガンドの結合特性に影響が及ぶことはないはずである。変更されるのは抗体の外面または外殻（skin）だけであり、支持残基は攪乱されずに維持されるので、この工程は「ベニア化」と称される。
【００６７】
「ベニア化」のための方法には、Kabat et al. (1987) Sequences of Proteins of Immunological interest, 4th ed., Bethesda, Md., National Institutes of Health、このデータベースのアップデート版、ならびに米国および海外の利用可能な他のデータベース（核酸およびタンパク質の両方）によってまとめられた、ヒト抗体可変ドメインの利用可能な配列データを利用する。ベニア抗体を作製するのに用いられる方法の非限定的な例には、EP 519596；米国特許第6,797,492号；およびPadlan et al., 1991に記載されたものが含まれる。
【００６８】
「抗体誘導体」という用語は、2つの抗原結合部位を有する小型抗体断片である「ダイアボディ」も含み、ここで断片は、同じポリペプチド鎖の中に重鎖可変ドメイン（VH）が軽鎖可変ドメイン（VL）に連結されたものを含む（例えば、EP 404,097；WO 93／11161；およびHollinger et al., 1993を参照されたい）。同じ鎖上の2つのドメイン間の対合を可能とするには短すぎるリンカーを用いることによって、これらのドメインは、別の鎖の相補的ドメインと対合して2つの抗原結合部位を生じることを余儀なくされる（1つまたは複数のアミノ酸が親抗体の超可変領域内に挿入されていて、標的抗原に対する結合親和性が、抗原に対する親抗体の結合親和性よりも少なくとも約2倍強い抗体変異体を開示している、Chenらに対する米国特許第6,632,926号も参照されたい）。
【００６９】
「抗体誘導体」という用語は、操作された抗体分子、断片、および単一ドメイン、例えばscFv、dAb、ナノボディ、ミニボディ、ユニボディ、およびアフィボディなどもさらに含む（Holliger & Hudson, 2005；米国特許公報US 2006／0211088；PCT公報WO2007／059782；米国特許第5,831,012号）。
【００７０】
「抗体誘導体」という用語は、「直鎖状抗体」もさらに含む。直鎖状抗体を作製するための方法は当技術分野において公知であり、Zapata et al., 1995に記載されている。手短に述べると、これらの抗体は、抗原結合領域の対を形成する、縦列になったEdセグメントの対（VH-CH1-VH-CH1）を含む。直鎖状抗体は、二重特異性のこともあれば単一特異性のこともある。
【００７１】
本発明の抗体は、プロテインA精製、硫酸アンモニウム沈殿またはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオン交換クロマトグラフィーまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィーを非限定的に含む公知の方法によって、組換え細胞培養物から回収および精製することができる。高速液体クロマトグラフィー（「HPLC」）を精製のために用いることもできる。
【００７２】
ある特定の態様において、本発明の抗体は組換え抗体である。組換え抗体は、内因性に産生される抗体とは異なる。例えば、組換え抗体は、そのグリコシル化状態の点で異なる（例えば、参照により本明細書に組み入れられる、Jefferis, R. "Glycolsylation of Recombinant Antibody Therapeutics" Biotechnol. Prog. 2005, 21:11-16を参照されたい）。
【００７３】
いくつかの態様において、抗体は操作された抗体である。例えば、エフェクター細胞のFcγ受容体に対する結合性を高めるために、Fc領域を人工的に改変することができる。これは、抗体のグリコシル化パターンを改変すること、またはFc領域内のアミノ酸を突然変異させることを伴いうる。糖鎖工学（glycoengineering）は、当技術分野において公知の方法、例えばPOTELLIGENTおよびGlycartなどによって行うことができる。アミノ酸工学のための方法も公知であり、当技術分野において用いられている（例えば、XencorによるXmabアプローチ）。Fc領域に対するアミノ酸の変更により、エフェクター細胞に対する結合性の向上を介して抗体依存性細胞媒介性細胞傷害作用および補体依存性細胞傷害作用を向上させることができるが、また、半減期の延長が可能になることもある。その他の例については、例えば、Evans and Syed, Nature Reviews, 2014, 13:413-414を参照されたい。
【００７４】
本開示の抗体は、単一特異性、二重特異性、または多重特異性であってよい。二重特異性抗体および多重特異性抗体とは、2種または多種の抗原標的を認識する抗体のことである。商業的に用いられている多重特異性抗体プラットフォームはいくつかあり、それには「BiTE」（二重特異性T細胞エンゲージャー（engager））プラットフォームおよびDARTプラットフォームが含まれる。
【００７５】
多重特異性抗体、操作された抗体、およびさまざまな他のプラットフォームは、Evans and Syed, "Next-generation antibodies," Nature Reviews, 2014, 13:413-414に記載されており、これはその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【００７６】
試験されるある抗体がタンパク質またはポリペプチドと結合する場合には、試験された抗体と本発明によって提供される抗体とは等価である。1つの態様において、等価物とは、OX40Lと結合して、同じ中和活性および／または細胞応答（すなわち、TSLP-mDCによって刺激されるIL-10低産生性／TNF-a高産生性の炎症性Th2の分化を阻害する、かつ／またはTNF-1の増殖および産生を阻害してCD4+ T細胞によるIL-10を促進する）を与えるもののことである。
【００７７】
ある抗体が本発明の抗体と同じ特異性を有するか否かは、被験抗体が、本発明の抗体が通常反応性であるタンパク質またはポリペプチドとこの抗体と結合するのを妨げるか否かを判定することによって、不要な実験なしに判定することも可能である。本発明のモノクローナル抗体による結合の減少によって示されるように、被験抗体が本発明の抗体と競合する場合には、この2つの抗体は同じエピトープまたは近似したエピトープと結合する可能性が高い。または、本発明の抗体を、それが通常反応性であるタンパク質とともにプレインキュベートして、被験抗体が抗原と結合するその能力が阻害されるか否かを判定することもできる。被験抗体が阻害される場合、この抗体は、本発明の抗体と同じまたは近似したエピトープ特異性を有する可能性が極めて高い。
【００７８】
「抗体」という用語はまた、すべての免疫グロブリンアイソタイプおよび免疫グロブリンサブクラスの抗体を含むことも意図している。アイソタイプとは、抗体の重鎖および軽鎖の定常領域における遺伝的なばらつきまたは違いのことを指す。ヒトでは、5種類の重鎖アイソタイプ：IgA、IgD、IgG、IgEおよびIgM、ならびに2種類の軽鎖アイソタイプ：κおよびλがある。IgGクラスは4つのアイソタイプに分けられる：ヒトではIgG1、IgG2、IgG3およびIgG4、マウスではIgG1、IgG2a、IgG2bおよびIgG3。それらはFc領域のアミノ酸配列については95％超の相同性を有するが、ヒンジ領域のアミノ酸組成および構造の点では大きな違いを示す。モノクローナル抗体の特定のアイソタイプは、最初の融合体から選択することによって直接調製することもできるか、またはSteplewski et al., 1985；Spira et al., 1984）に記載されている方法を用いてクラススイッチ変異体を単離するための同胞選択法を用いることにより、異なるアイソタイプのモノクローナル抗体を分泌する親ハイブリドーマから二次的に調製することもできる。または、組換えDNA法を用いることもできる。
【００７９】
本明細書に記載のモノクローナル抗体の特異性を有する他のモノクローナル抗体の単離も、抗イディオタイプ抗体を作製することによって当業者により達成されうる（Herlyn et al., 1986）。抗イディオタイプ抗体とは、関心対象のモノクローナル抗体に存在する固有の決定基を認識する抗体のことである。
【００８０】
本発明のいくつかの局面においては、抗体を検出可能にまたは治療的に標識することが有用と考えられる。抗体をこれらの剤とコンジュゲートさせる方法は当技術分野において公知である。例示のみを目的として述べると、抗体を、放射性原子、発色団、フルオロフォアなどの検出可能なモイエティーで標識することができる。そのような標識抗体は、インビボでの、または単離された被験試料における診断手法に用いることができる。
【００８１】
本明細書において用いる場合、「標識」という用語は、検出しようとする組成物、例えば、ポリヌクレオチドまたは抗体などのタンパク質と直接的または間接的にコンジュゲートさせて「標識された」組成物を生じる、直接または間接的に検出可能な化合物または組成物を意図している。また、この用語には、緑色蛍光タンパク質（GFP）などのように、挿入された配列が発現された際にシグナルをもたらす、ポリヌクレオチドとコンジュゲートされた配列も含まれる。標識は、それ自体が検出可能であってもよく（例えば、放射性同位体標識もしくは蛍光標識）、または酵素標識の場合には検出可能な基質化合物もしくは組成物の化学変化を触媒してもよい。標識は小規模での検出に適していてもよいか、またはハイスループットスクリーニングにより適していてもよい。そのため、適した標識には、放射性同位体、蛍光色素、化学発光性化合物、色素、および酵素を含むタンパク質が非限定的に含まれる。標識は単純に検出してもよいか、または定量してもよい。単純に検出される応答は、一般にその存在を単に確認する応答を含み、一方、定量される応答は、一般に、強度、偏光および／または他の特性などの定量可能な（例えば、数値的に報告可能な）値を有する応答を含む。発光または蛍光アッセイ法では、検出可能な応答は、結合に実際に関与するアッセイ構成要素と会合した発光団もしくはフルオロフォアを用いて直接的に、または別の（例えば、レポーターもしくは指示薬の）構成要素と会合した発光団もしくはフルオロフォアを用いて間接的に生じうる。
【００８２】
シグナルを生じる発光標識の例には、生物発光および化学発光が非限定的に含まれる。検出可能な発光応答は一般に、発光シグナルの変化またはその発生を含む。アッセイ構成要素を発光的に標識するための適した方法および発光団は当分野において公知であり、例えば、Haugland, Richard P. (1996) Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (6th ed.)に記載されている。発光プローブの例には、エクオリンおよびルシフェラーゼが非限定的に含まれる。
【００８３】
適した蛍光標識の例には、フルオレセイン、ローダミン、テトラメチルローダミン、エオシン、エリスロシン、クマリン、メチルクマリン、ピレン、マラサイトグリーン、スチルベン、ルシファーイエロー、Cascade Blue（商標）、およびテキサスレッドが非限定的に含まれる。他の適した光学色素は、Haugland, Richard P. (1996) Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (6th ed.)に記載されている。
【００８４】
別の局面において、蛍光標識は、細胞または組織の中またはその表面上に存在する細胞成分、例えば細胞表面マーカーなどとの共有結合を容易にするために官能化されている。適した官能基には、イソチオシアネート基、アミノ基、ハロアセチル基、マレイミド、スクシンイミジルエステル、およびハロゲン化スルホニルが非限定的に含まれ、これらはすべて、蛍光標識を第2の分子と結合させるために用いうる。蛍光標識の官能基の選択は、リンカー、剤、マーカー、または第2の標識剤のいずれかとの結合部位に応じて決まる。
【００８５】
蛍光標識の付着は、細胞成分もしくは化合物に対して直接的であってもよいか、または代替的にリンカーを介することもできる。中間体に蛍光標識を間接的に連結させるのに適した結合対には、抗原／抗体、例えばローダミン／抗ローダミンなど、ビオチン／アビジンおよびビオチン／ストレプトアビジンが非限定的に含まれる。
【００８６】
抗体と低分子量ハプテンとのカップリングにより、アッセイ法における抗体の感度を高めることができる。続いて第2の反応によってハプテンを特異的に検出することができる。例えば、アビジンと反応するビオチン、または特異的抗ハプテン抗体と反応しうるジニトロフェノール、ピリドキサルおよびフルオレセインなどのハプテンを用いることが一般的である。Harlow and Lane (1988)、前記を参照されたい。
【００８７】
抗体の1つまたは複数の結合特性（例えば、親和性）を改善するためにVHおよび／またはVLのCDR1領域内、CDR2領域内、および／またはCDR3領域内のアミノ酸残基を突然変異させることによって、本発明の抗体の可変領域を改変することができる。突然変異は、部位指定突然変異誘発またはPCR媒介突然変異誘発によって導入することができ、抗体の結合または関心対象の他の機能的特性に対する影響を、適切なインビトロアッセイ法またはインビボアッセイ法で評価することができる。保存的改変を導入し、CDR領域内の典型的には1つ、2つ、3つ、4つまたは5つ以下の残基を変化させることが好ましい。変異が、アミノ酸の置換、付加、または欠失であってもよい。
【００８８】
フレームワーク改変は、例えば、1つまたは複数のフレームワーク残基を、対応する生殖系列配列に「復帰突然変異」させることによって、免疫原性を低下させるために抗体に施すことができる。
【００８９】
加えて、抗体の1つまたは複数の機能的特性、例えば血清中半減期、補体結合、Fc受容体結合、および／または抗原依存性細胞傷害作用などを変化させるために、Fc領域内に改変を含むように本発明の抗体を操作することもできる。そのような改変には、軽鎖および重鎖の集合を容易にするため、または抗体の安定性を高めるかもしくは低下させるための、ヒンジ領域内のシステイン残基数の変更（米国特許第5,677,425号）、ならびに抗体の生物学的半減期を短縮するためのFcヒンジ領域内のアミノ酸の突然変異（米国特許第6,165,745号）が非限定的に含まれる。
【００９０】
加えて、本発明の抗体を化学的に改変することもできる。例えば、抗原に対する抗体の親和性を高めるために抗体配列中の1つまたは複数のグリコシル化部位を改変することによって、抗体のグリコシル化を変化させることができる（米国特許第5,714,350号および同第6,350,861号）。または、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害作用を高めるために、グリコシル化機構を変化させた宿主細胞内で抗体を発現させることにより、フコシル残基の量が減少した低フコシル化抗体、または二分岐（bisecting）GlcNac構造が増大した抗体を得ることもできる（Shields, et al., 2002；Umana et al., 1999）。
【００９１】
生物学的半減期を延長させるために、抗体またはその断片を、ポリエチレングリコール（PEG）またはPEGの反応性エステルもしくはアルデヒド誘導体と、1つまたは複数のPEG基が抗体または抗体断片と付着する条件下で反応させることによって、本発明の抗体をペグ化することができる。抗体のペグ化は、反応性PEG分子（または類似の反応性水溶性ポリマー）とのアシル化反応またはアルキル化反応によって実施することができる。本明細書において用いる場合、「ポリエチレングリコール」という用語は、他のタンパク質を誘導体化するために用いられているPEGの形態のいずれか、例えばモノ（C1〜C10）アルコキシポリエチレングリコールもしくはアリールオキシポリエチレングリコールまたはポリエチレングリコールマレイミドなどを範囲に含むことを意図している。ペグ化される抗体は、非グリコシル化抗体であってよい。タンパク質をペグ化する方法は当技術分野において公知であり、本発明の抗体に適用することができる（EP 0 154 316およびEP 0 401 384）。
【００９２】
加えて、抗体の抗原結合領域をヒト血清アルブミンなどの血清タンパク質とコンジュゲートまたは融合させることによって、抗体を化学的に改変して、結果として得られる分子の半減期を延長させることもできる。そのような手法は、例えば、EP 0322094およびEP 0 486 525に記載されている。
【００９３】
例えば、疾患の発症または進行をモニターするため、および所与の処置レジメンの有効性を判定するために、本発明の抗体またはその断片を診断剤とコンジュゲートさせて、診断に用いることもできる。診断剤の例には、酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射性物質、種々のポジトロン放射トモグラフィーを用いるポジトロン放出性金属、および非放射性常磁性金属イオンが含まれる。検出可能な物質は、抗体またはその断片に直接的に連結またはコンジュゲートさせることもでき、当技術分野において公知の手法を用いてリンカーを介して間接的に連結またはコンジュゲートさせることもできる。適した酵素の例には、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、βガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが含まれる。適した補欠分子族複合体の例には、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが含まれる。適した蛍光物質の例には、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド、またはフィコエリトリンが含まれる。発光物質の例には、ルミノールが含まれる。生物発光物質の例には、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンが含まれる。適した放射性物質の例には、125I、131I、インジウム111、ルテチウム171、ビスマス212、ビスマス213、アスタチン211、銅62、銅64、銅67、イットリウム90、ヨウ素125、ヨウ素131、リン32、リン33、スカンジウム47、銀111、ガリウム67、プラセオジム142、サマリウム153、テルビウム161、ジスプロシウム166、ホルミウム166、レニウム186、レニウム188、レニウム189、鉛212、ラジウム223、アクチニウム225、鉄59、セレン75、ヒ素77、ストロンチウム89、モリブデン99、ロジウム1105、パラジウム109、プラセオジム143、プロメチウム149、エルビウム169、イリジウム194、金198、金199、および鉛211が含まれる。モノクローナル抗体は、これらの抗体と共有結合する二官能性キレート化剤を用いることにより、放射性金属イオンと間接的にコンジュゲートさせることができる。キレート化剤は、アミン（Meares et al., 1984）；アミノ酸残基のスルフヒドラル基（Koyama 1994）および糖質基（Rodwell et al., 1986；Quadri et al., 1993）を介して付着させることができる。
【００９４】
コンジュゲートされるそのほかの適した分子には、リボヌクレアーゼ（RNアーゼ）、DNアーゼI、アンチセンス核酸、siRNA分子などの阻害性RNA分子、免疫賦活性核酸、アプタマー、リボザイム、三重鎖形成分子、および外部ガイド配列が含まれる。アプタマーとは、ステムループまたはGカルテットといった規定の二次構造および三次構造へとフォールディングする、長さが15〜50塩基の範囲の低分子核酸であり、ATP（米国特許第5,631,146号）およびテオフィリン（米国特許第5,580,737号）などの低分子のほか、逆転写酵素（米国特許第5,786,462号）およびトロンビン（米国特許第5,543,293号）などの高分子とも結合することができる。リボザイムとは、化学反応を分子内または分子間のいずれかで触媒しうる核酸分子である。リボザイムは、典型的には、後に切断される標的基質を認識してそれと結合することによって核酸基質を切断する。三重鎖形成機能を有する核酸分子は、三重鎖を形成することによって二本鎖核酸および一本鎖核酸と相互作用することができ、この場合にDNAの3本の鎖はワトソン-クリック塩基対合およびフーグスティーン塩基対合の両方に依存して複合体を形成する。三重鎖分子は、標的領域と高い親和性および特異性で結合することができる。
【００９５】
機能性核酸分子は、標的分子が保有する特定の活性のエフェクター、阻害物質、モジュレーター、および刺激物質として作用してもよいか、または機能性核酸分子が他のいかなる分子にも依存しないデノボ活性を保有してもよい。
【００９６】
コンジュゲートされた剤を、利用可能な多数の方法のうちいずれかを用いて、直接的または間接的に抗体に連結させることができる。例えば、N-スクシニル3-(2-ピリジルジチオ)プロピオネート（SPDP）などの架橋形成剤を用いるジスルフィド結合形成を介して、還元された抗体成分のヒンジ領域に剤を付着させることもできるか、または抗体のFc領域内の糖質モイエティーを介して付着させることもできる（Yu et al., 1994；Upeslacis et al., 1995；Price, 1995）。
【００９７】
抗体に剤をコンジュゲートさせるための手法は周知である（Amon et al., 1985；Hellstrom et al., 1987；Thorpe, 1985；Baldwin et al., 1985；Thorpe et al., 1982）。
【００９８】
本発明の抗体またはその抗原結合領域を、別の機能性分子、例えば別の抗体または受容体のリガンドなどに連結させて、少なくとも2つまたはそれ以上の異なる結合部位または標的分子と結合する二重特異性分子または多重特異性分子を生じさせることができる。抗体を、1つまたは複数の他の結合性分子、例えば別の抗体、抗体断片、ペプチド、または結合性模倣体などに連結させることは、例えば、化学的カップリング、遺伝子融合、または非共有結合性会合によって行うことができる。多重特異性分子は、第1および第2の標的エピトープに加えて、第3の結合特異性をさらに含みうる。
【００９９】
二重特異性分子および多重特異性分子は、当技術分野において公知の方法を用いて調製することができる。例えば、高特異性分子の各結合単位を個別に作製し、続いてこれらを互いにコンジュゲートさせることができる。結合分子がタンパク質またはペプチドである場合には、各種のカップリング剤または架橋剤を共有結合性コンジュゲーションのために用いることができる。架橋剤の例には、プロテインA、カルボジイミド、N-スクシンイミジル-S-アセチル-チオアセテート（SATA）、5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)（DTNB）、o-フェニレンジマレイミド（oPDM）、N-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオ)プロピオネート（SPDP）、およびスルホスクシンイミジル4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-I-カルボキシレート(スルホ-SMCC)が含まれる（Karpovsky et al., 1984；Liu et al., 1985）。結合性分子が抗体である場合は、2つの重鎖のC末端のヒンジ領域をスルフヒドリル結合させることによって、それらをコンジュゲートさせることができる。
【０１００】
本発明の抗体またはその断片を、その抗体が結合する細胞に対して毒性であるモイエティーに連結させて、「枯渇」抗体を形成させることができる。これらの抗体は、NK細胞を枯渇させることが望まれる用途に特に有用である。
【０１０１】
また、本発明の抗体を固体支持体に結合させることもでき、これは標的抗原のイムノアッセイ法または精製のために特に有用である。そのような固体支持体には、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、またはポリプロピレンが非限定的に含まれる。
【０１０２】
また、抗体をさまざまな担体と結合させることもできる。したがって、本発明は、抗体と、活性または不活性である別の物質とを含有する組成物も提供する。周知の担体の例には、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然セルロースおよび変性セルロース、ポリアクリルアミド、アガロース、およびマグネタイトが含まれる。担体の性質は、本発明の目的に応じて、可溶性であってもよいか、または不溶性であってもよい。当業者は、モノクローナル抗体を結合させるのに適する他の担体も承知しているか、または日常的な実験を用いて、そのような担体を確認することもできる。
【０１０３】
B．他のOX40L阻害物質
OX40L阻害物質には、OX40L遺伝子および／またはタンパク質の生物活性を低下させるポリヌクレオチドが含まれ、これは例えば、OX40L DNAもしくはmRNAを対象とするmiRNA、siRNA、shRNA、dsRNAもしくはアンチセンスRNA、またはmiRNA、siRNA、shRNA、dsRNAもしくはアンチセンスRNAをコードするポリヌクレオチド、またはそのポリヌクレオチドを含むベクターであってよい。
【０１０４】
「低分子干渉RNA」（siRNA）とは、RNA干渉（RNAi）を媒介することができる、一般に長さが約10〜約30ヌクレオチドである二本鎖RNA分子（dsRNA）のことを指す。「RNA干渉」（RNAi）とは、低分子干渉RNA（siRNA）によって媒介される遺伝子発現（タンパク質合成）の配列特異的または遺伝子特異的な抑制のことを指す。本明細書において用いる場合、siRNAという用語は、低分子ヘアピン型RNA（shRNA）を含む。遺伝子または遺伝子のmRNAを対象とするsiRNAは、遺伝子のmRNAを認識するsiRNAであってよく、RNA誘導サイレンシング複合体（RISC）をmRNAへと導き、そのmRNAの分解をもたらす。遺伝子または遺伝子のmRNAを対象とするsiRNAが、mRNAを認識してそのmRNAの翻訳を阻害するsiRNAであってもよい。siRNAを、その安定性および安全性を高めるために化学的に改変することができる。例えば、Dykxhoom & Lieberman, 2006および米国特許出願公開第2008／0249055号を参照されたい。
【０１０５】
「二本鎖RNA」（dsRNA）とは、任意の長さであってよく、かつ細胞内でより小型のRNA分子、例えばsiRNAなどに分解されうる二本鎖RNA分子のことを指す。適格性のあるインターフェロン反応を有する細胞では、比較的長いdsRNA、例えば長さが約30塩基対超のものも、インターフェロン反応を惹起することがある。適格性のあるインターフェロン反応を有しない他の細胞では、dsRNAを用いることで、特異的なRNAiを惹起することができる。
【０１０６】
「マイクロRNA」（miRNA）とは、遺伝子発現を調節する、長さが21〜23ヌクレオチドの一本鎖RNA分子のことを指す。miRNAは遺伝子によってコードされており、そのDNAから転写されるが、miRNAはタンパク質には翻訳されない（非コードRNA）；その代わりに各一次転写物（プリ-miRNA（pri-miRNA））は、プレ-miRNA（pre-miRNA）と呼ばれる短いステム-ループ構造にへとプロセシングされ、最終的には機能的miRNAにプロセシングされる。成熟miRNA分子は、1つまたは複数のメッセンジャーRNA（mRNA）分子に対して部分的に相補的であり、それらの主な機能は遺伝子発現を下方制御することである。
【０１０７】
遺伝子発現を阻害するためのsiRNA、dsRNAおよびmiRNAは、当技術分野において公知の方法に従って設計することができる。例えば、Dykxhoorn & Lieberman, 2006；Dykxhoorn et al., 2006；Aagaard & Rossi, 2007；de Fougerolles et al., 2007；Krueger et al., 2007；米国特許出願公開第2008／0188430号；および米国特許出願公開第2008／0249055号を参照されたい。
【０１０８】
siRNA、dsRNA、またはmiRNAの細胞への送達は、当技術分野において公知の方法を用いて行うことができる。例えば、Dykxhoorn & Lieberman, 2006；Dykxhoorn et al., 2006；Aagaard & Rossi, 2007；de Fougerolles et al., 2007；Krueger et al., 2007；米国特許出願公開第2008／0188430号；および米国特許出願公開第2008／0249055号を参照されたい。「アンチセンス」オリゴヌクレオチドは、タンパク質コード配列または「センス」配列に対して相補的なヌクレオチド配列を有する。アンチセンスRNA配列は、相補的mRNA配列とハイブリダイズして翻訳を停止させることによって、遺伝子発現の調節物質として機能する（Mizuno et al., 1984；Heywood et al., 1986）。標的転写物の配列全体またはそのいずれかの部分を含むアンチセンスポリヌクレオチドを、当技術分野において公知の方法を用いて合成することができる。例えば、Ferretti et al., 1986を参照されたい。遺伝子発現を阻害するために、アンチセンスポリヌクレオチドをベクター構築物中に配置して、細胞内にうまく導入することができる（Izant et al., 1984）。一般に、特異的ハイブリダイゼーションを確実なものにするためには、アンチセンス配列は標的配列に対して実質的に相補的である。ある特定の態様において、アンチセンス配列は標的配列に対して厳密に相補的である。しかし、遺伝子に対応する関連のある標的配列に対する特異的結合がポリヌクレオチドの機能的特性として保たれる限り、アンチセンスポリヌクレオチドが、ヌクレオチドの置換、付加、欠失、転位、転移もしくは改変、または他の核酸配列もしくは非核酸モイエティーを含んでもよい。
【０１０９】
アンチセンス核酸（DNA、RNA、改変物、類似体など）は、核酸を作製するために適した任意の方法、例えば、本明細書に開示されており、当業者に公知である化学合成法および組換え法を用いて作製することができる。1つの態様において、例えば、本発明のアンチセンスRNA分子は、デノボ化学合成によって、またはクローニングによって調製することができる。例えば、アンチセンスRNAは、遺伝子配列を、ベクター（例えば、プラスミド）中で、プロモーターに機能的に連結させて逆方向に挿入（ライゲート）することによって作製することができる。プロモーター、ならびに好ましくは終結シグナルおよびポリアデニル化シグナルが適正に配置されていれば、非コード鎖に対応する挿入配列の鎖が転写されて、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドとして作用すると考えられる。
【０１１０】
望ましい特性（例えば、高いヌクレアーゼ耐性、より強固な結合、安定性、または所望のTm）を得るために、標準的でない塩基（例えば、アデニン、シチジン、グアニン、チミンおよびウリジン以外の塩基）または標準的でない骨格構造を用いて、オリゴヌクレオチドを作製しうることは理解されるであろう。オリゴヌクレオチドをヌクレアーゼ耐性にするための手法には、PCT公報WO 94／12633に記載されたものが含まれる。ペプチド-核酸（PNA）骨格を有するオリゴヌクレオチド（Nielsen et al., 1991）、または2'-O-メチルリボヌクレオチド、ホスホロチオエートヌクレオチド、メチルホスホネートヌクレオチド、ホスホトリエステルヌクレオチド、ホスホロチオエートヌクレオチド、ホスホルアミデートが組み入れられたものを含む、多種多様な有用な改変オリゴヌクレオチドを作製することができる。改変の別の例は、ヌクレアーゼ消化に対する耐性を高める、イオウ原子による非架橋性ホスホリル酸素原子の置き換えである。アンチセンスポリヌクレオチドの安定性を、2-メトキシエチル（2-methyoxyethyl）置換骨格を有する分子を用いて達成することもできる。例えば、米国特許第6,451 ,991号および同第6,900,187号を参照されたい。
【０１１１】
別の態様においては、リボザイムを用いることができる（例えば、Cech, 1995；およびEdgington, 1992；Hu et al., PCT公報WO 94／03596を参照されたい）。リボ核酸酵素（「リボザイム」、「RNA酵素」、または「触媒RNA」）は、化学反応を触媒するRNA分子である。多くの天然リボザイムが、それら自体のホスホジエステル結合の1つの加水分解、または他のRNA内の結合の加水分解のいずれかを触媒するが、それらがリボソームのアミノトランスフェラーゼ活性を触媒することも見いだされている。リボザイムの作製および使用の方法は、例えば、米国特許出願公開第2006／0178326号に見ることができる。
【０１１２】
「三重鎖リボザイム」配置は、従来発現されてきたリボザイムに比して標的切断を増大させることを可能にする。三重鎖リボザイムの例にはヘアピン型リボザイムおよびハンマーヘッド型リボザイムが含まれる。三重鎖リボザイムの作製および使用の方法は、例えば、Aguino-Jarguin et al., 2008および米国特許出願公開第2005／0260163に記載がある。
【０１１３】
細胞膜を横切って所望の核酸を移行させるタンパク質が記載されている。典型的には、そのようなタンパク質は、膜移行性担体として作用する能力を有する両親媒性または疎水性の部分配列を有する。例えば、ホメオドメインタンパク質は、細胞膜を横切って移行する能力を有する。ホメオドメインタンパク質の1つであるアンテナペディア（Antennapedia）の最短内部移行ペプチドは、アミノ酸位置43〜58にある、このタンパク質の第3のヘリックスであることが見いだされた（例えば、Prochiantz, 1996を参照されたい）。別の部分配列である、シグナルペプチドのh（疎水性）ドメインは、類似の細胞膜移行特性を有することが見いだされた（例えば、Lin et al., 1995を参照）。そのような部分配列は、細胞膜を横切ってオリゴヌクレオチドを移行させるために用いることができる。オリゴヌクレオチドを、そのような配列によって都合良く誘導体化することができる。例えば、リンカーを用いて、オリゴヌクレオチドと移行配列を連結させることができる。任意の適したリンカー、例えば、ペプチドリンカーまたは他の任意の適した化学リンカーを用いることができる。
【０１１４】
本開示は、細胞内でのOX40Lの生物活性を低下させるための方法および組成物を特徴とする。本明細書に記載のOX40L阻害物質を、発現ベクター、ウイルスベクター、および遺伝物質を患者の細胞に移入するための当技術分野において公知の他の手法を用いて細胞内で発現させることができ、その結果として患者に治療上の利益がもたらされる。いくつかの態様において、本明細書に記載のポリペプチド（例えば、抗体および抗体断片）をコードするポリペプチドまたはポリヌクレオチドを、ヒトにまたは宿主細胞に送達することができる。
【０１１５】
いくつかの態様においては、関心対象のOX40L阻害物質ポリヌクレオチドをコードする発現ベクターを、患者に直接投与する。ベクターが標的細胞（例えば、ニューロンまたは多能性幹細胞）によって取り込まれ、ポリヌクレオチドが発現される。遺伝子治療に用いるための方法および組成物について考察している最近の総説には、Eck et al., in Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 1996；Wilson, 1997；Wivel et al., 1998；Romano et al., 2000)が含まれる。米国特許第6,080,728号も、多種多様な遺伝子送達方法および組成物の考察を提示している。
【０１１６】
アデノウイルスは、非分裂性細胞を含む多種多様な細胞型をトランスフェクトさせることができる。当技術分野において公知である50種超の血清型のアデノウイルスがあるが、遺伝子治療のために最も一般的に用いられる血清型は2型および5型である。典型的には、これらのウイルスは複製能欠損性であり；かつウイルスの意図しない伝播を防ぐために遺伝的に改変されている。これは通常、E1領域の欠失、E2領域もしくはE4領域のいずれかの欠失を伴うE1領域の欠失、またはシス作用性逆方向末端反復配列およびパッケージングシグナルを除くアデノウイルスゲノム全体の欠失を通じて達成される（Gardlik et al., 2005）。
【０１１７】
レトロウイルスもベクターとして有用であり、通常は（レンチウイルスを例外として）非分裂性細胞をトランスフェクトさせることができない。このため、HIV、SIV、FIV、EIAV、およびモロニーマウス白血病ウイルス（MoMLV）を非限定的に含む、当技術分野において公知であるあらゆる適切な種類のレトロウイルスを用いることができる。典型的には、治療的に有用なレトロウイルスは、gag遺伝子、pol遺伝子、またはenv遺伝子の欠失を含む。
【０１１８】
別の局面において、本発明は、患者においてOX40L阻害性ポリヌクレオチドを発現するレンチウイルスベクターを用いてOX40Lを阻害する方法を特徴とする。レンチウイルスは、増殖中の細胞および静止細胞の両方に感染する能力を備えている、レトロウイルスの一種である。遺伝子治療に用いるための例示的なレンチウイルスベクターには、HIV-1レンチウイルスがある。以前に構築されたレンチウイルスの遺伝的改変物は、gag遺伝子、pol遺伝子およびrev遺伝子のものを例外として、タンパク質をコードするすべての遺伝子の欠失を含む（Moreau-Gaudry et al., 2001）。
【０１１９】
核酸を送達するための例示的な非ウイルス性ベクターには、裸のDNA；カチオン性脂質と単独で、またはカチオン性重合体との組み合わせで複合体化されたDNA；アニオン性およびカチオン性のリポソーム；場合によってはリポソーム内に収容された、DNA-タンパク質複合体、ならびに異種混交的ポリリジン、規定長のオリゴペプチドおよびポリエチレンイミンなどのカチオン性重合体とともに凝縮されたDNAを含む粒子；ならびにウイルスおよびポリリジン-DNAを含む三元複合体の使用が含まれる。多種多様な標的部位へのインビボでのDNA媒介性遺伝子移入については詳細に研究されている。裸のDNAは、注入、遺伝子銃または電気穿孔法を用いて投与することができる。裸のDNAは、筋肉における長期的発現をもたらすことができる。Wolff et al., 1992；Wolff et al., 1990を参照されたい。DNA媒介性遺伝子移入は、肝臓細胞、心臓細胞、肺細胞、脳細胞および内皮細胞でも特徴が明らかにされている。Zhu et al., 1993；Nabel et al., 1989を参照されたい。また、遺伝子移入用のDNAを、さまざまなカチオン性脂質、ポリカチオン、および他のコンジュゲート物質と会合させて用いることもできる。Przybylska et al., 2004；Svahn et al., 2004を参照されたい。
【０１２０】
カチオン性リポソームを用いて核酸を送達する方法も、当技術分野において周知である。本発明に用いるための例示的なカチオン性リポソームには、DOTMA、DOPE、DOSPA、DOTAP、DC-Chol、Lipid GL-67.TM.、およびEDMPCがある。これらのリポソームは、標的細胞（例えば、ニューロンまたは多能性幹細胞）内への送達用のベクターを封入するために、インビボまたはエクスビボで用いることができる。
【０１２１】
典型的には、本開示の原理に従って作製されたベクターは、コード配列の構成的発現を生じさせると考えられる調節エレメントを含有すると考えられる。望ましくは、ニューロン特異的プロモーターなどのニューロン特異的調節エレメントが、ベクターが標的領域の外側にある細胞内に組み入れられる事象における異所性遺伝子発現を制限するかまたは消失させる目的で用いられる。例えば、神経特異的エノラーゼ（NSE）およびシナプシン-1プロモーターを含む、ニューロン特異的遺伝子発現を導くいくつかの調節エレメントが、当技術分野において周知である（Morelli et al., 1999）。
【０１２２】
また、本発明のポリペプチドおよびポリペプチド複合体と実質的に相同で生物学的に等価であるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも提供される。実質的に相同で生物学的に等価であるとは、例えば、以上に定義した通りに少なくとも80％、または代替的には少なくとも85％、または代替的には少なくとも90％、または代替的には少なくとも95％、または代替的には少なくとも98％相同であるといった、さまざまな度合いの相同性を有しており、かつ本明細書に記載した通りの生物活性を有するポリペプチドをコードするものを意図している。実質的に相同なポリペプチドおよびポリヌクレオチドに対する態様が、本開示の各局面、例えば、ポリペプチド、ポリヌクレオチドおよび抗体を意図していることが常に明示的に述べられているわけではないことが理解されるべきである。
【０１２３】
本開示のポリヌクレオチドは、従来の組換え手法を用いて複製することができる。または、PCR技術を用いてポリヌクレオチドを複製することもできる。PCRは、米国特許第4,683,195号；同第4,800,159号；同第4,754,065号；および同第4,683,202号の主題であり、PCR: The Polymerase Chain Reaction（Mullis et al. eds, Birkhauser Press, Boston (1994)）およびその中に引用された参照文献に記載されている。さらになお、当業者は、本明細書に提示された配列および市販のDNA合成装置を用いてDNAを複製することもできる。したがって、本開示はまた、ポリヌクレオチドの直鎖状配列、適切なプライマー分子、酵素などの化学物質、およびそれらの複製のための説明書を提供し、かつポリヌクレオチドを得るためにヌクレオチドを適正な向きで化学的に複製または連結させることによって、本開示のポリヌクレオチドを得るための工程も提供する。1つの別個の態様において、これらのポリヌクレオチドはさらに単離される。さらにまた、当業者は、以下に述べるように、宿主細胞におけるそれらの発現のために、ポリヌクレオチドを調節配列に機能的に連結させることができる。ポリヌクレオチドおよび調節配列を、複製および増幅のために宿主細胞（原核性または真核性）に挿入することができる。そのようにして増幅されたDNAは、当業者に周知の方法によって細胞から単離することができる。この方法によってポリヌクレオチドを得るための工程は、そのようにして得られたポリヌクレオチドと同じく、本明細書にさらに提示されている。
【０１２４】
また、本開示のポリペプチドまたはポリヌクレオチドの1つまたは複数を含む宿主細胞も提供される。本開示のさらに別の局面は、単離されたポリペプチド、抗体、または本開示の抗体の生物活性断片を発現する、単離された形質転換宿主細胞を提供する。単離された宿主細胞は、原核細胞または真核細胞であってよい。1つの局面においては、ポリペプチドを発現させて、宿主細胞から単離することができる。別の局面において、ポリペプチドは発現されて、分泌される。さらに別の局面において、ポリペプチドは発現されて、細胞表面上（細胞外）に存在する。本発明のポリペプチドを含有する適した細胞には、原核細胞および真核細胞が含まれ、これには細菌細胞、藻類細胞、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞、動物細胞、哺乳動物細胞、マウス細胞、ラット細胞、メンヨウ細胞、サル細胞、およびヒト細胞が非限定的に含まれる。藻類細胞の非限定的な例には、グリフィスシン（Griffithsin）が単離された供給源である、紅藻類のカザシグサ属種（Griffithsia sp.）が含まれる（Toshiyuki et al., 2005）。植物細胞の非限定的な例には、グリフィスシンを大規模に産生させることができる、ベンサミアナタバコ（Nicotiana benthamiana）の葉細胞がある（O'Keefe、2009）。細菌細胞の例には、大腸菌（Escherichia coli）（Giomarelli et al.（2006）、前記）、サルモネラ・エンテリカ（Salmonella enteric）、ストレプトコッカス・ゴルドニ（Streptococcus gordonii）および乳酸菌が含まれる（Tiu et al., 2007；Rao et al., 2005；Chang et al., 2003；Liu et al., 2006）。細胞はAmerican Type Culture Collection（ATCC, Rockville Md., USA）などの民間の供給元から購入することができ、または当技術分野において公知の方法を用いて分離株から培養することもできる。適した真核細胞の例には、293T HEK細胞、ならびにハムスター細胞株CHO、BHK-21；NIH3T3、NSO、C127と名づけられたマウス細胞株、サル細胞株COS、Vero；およびヒト細胞株HeLa、PER.C6（Crucellから販売されている）U-937およびHep G2が非限定的に含まれる。昆虫細胞の非限定的な例には、ヨトウガ（Spodoptera frugiperda）が含まれる。発現のために有用な酵母の例には、サッカロミセス属（Saccharomyces）、シゾサッカロミセス属（Schizosaccharomyces）、ハンゼヌラ属（Hansenula）、カンジダ属（Candida）、トルロプシス属（Torulopsis）、ヤロウイア属（Yarrowia）またはピキア属（Pichia）が非限定的に含まれる。例えば、米国特許第4,812,405号；同第4,818,700号；同第4,929,555号；同第5,736,383号；同第5,955,349号；同第5,888,768号および同第6,258,559号を参照されたい。
【０１２５】
また、OX40L阻害物質が分子阻害物質であってもよい。タンパク質の活性をモジュレートするさまざまな剤をスクリーニングするための方法は当技術分野において公知であり、本明細書に記載されている。本開示において、「分子阻害物質」は、例えば、単純または複雑な有機分子もしくは無機分子、ペプチド、タンパク質（例えば、抗体）、ポリヌクレオチド（例えば、アンチセンス）またはリボザイムなどの生物学的または化学的な化合物を非限定的に含むことを意図している。極めて多種の化合物を、例えばポリペプチドおよびポリヌクレオチドなどの重合体、ならびに合成有機化合物を、さまざまなコア構造に基づいて合成することができ、これらも「分子阻害物質」という用語に含まれる。加えて、さまざまな天然供給源からも、植物または動物の抽出物などといったスクリーニング用の化合物が得られる。常に明示的に述べられているわけではないが、分子阻害物質は単独で、または本発明のスクリーニングによって同定された剤と同じもしくは異なる生物活性を有する他の剤と組み合わせて用いられることが理解されるべきである。
【０１２６】
いくつかの態様において、OX40L阻害物質は、OX40Lタンパク質と相互作用しうる小分子である。本発明において、「小分子」は低分子量（MW）を有する分子のことであり、1つの態様において、それは関心対象のタンパク質と結合し、それによってタンパク質の機能を変更することができる。好ましくは、小分子のMWは1,000を上回らない。タンパク質の機能を変更しうる小分子をスクリーニングするための方法は、当技術分野において公知である。例えば、細胞における小分子-タンパク質相互作用を検出するための小型化アレイ（miniaturized arrayed）アッセイ法が、You et al., 1997）によって考察されている。
【０１２７】
小分子阻害物質をインビトロでスクリーニングするためには、治療しようとする微生物に感染した、適した細胞培養物または組織をまず用意する。細胞を、密度依存的な制約を伴わずに指数的増殖を得るための条件（温度、増殖培地または培地、およびガス（CO2））下で、適切な長さの時間にわたって培養する。また、感染していないさらなる別個の細胞培養物を対照として維持管理することも望ましい。
【０１２８】
当業者には明らかであるように、適した細胞をマイクロタイタープレート内で培養し、遺伝子型の変化、表現型の変化または微生物力価の減少に注目することによって、いくつかの小分子阻害物質を同時にアッセイすることができる。小分子阻害物質を細胞培養物に直接添加することもでき、または添加用の培地に添加することもできる。当業者には明らかであるように、経験的に決定することができる「有効」量を添加しなければならない。
【０１２９】
II．薬学的組成物
本発明は、それを必要とする対象においてOX40Lの阻害をするための方法および組成物を含む。本発明による組成物の投与は、典型的には、任意の一般的な経路を介すると考えられる。これには、非経口的、同所性、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、鼻腔内、または静脈内注射によるものが含まれる。ある特定の態様において、ワクチン組成物は吸入されうる（例えば、米国特許第6,651,655号、これは参照により具体的に組み入れられる）。他の投与様式に適するそのほかの製剤には、経口製剤が含まれる。経口製剤は、例えば、薬剤等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどのような、通常使用される賦形剤を含む。これらの組成物は、液剤、懸濁剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、徐放性製剤、または散剤の形態をとり、活性成分を約10％〜約95％、好ましくは約25％〜約70％含有する。
【０１３０】
典型的には、本発明の組成物は、投薬製剤と適合する様式で、治療的に有効で、かつ免疫調節性であるような量で投与される。投与される量は、処置を受ける対象に依存する。投与に必要とされる活性成分の正確な量は、医師の判断に依存する。
【０１３１】
適用の様式は広くさまざまであってよい。ワクチン投与のための従来の方法のいずれもが適用可能である。これらは、固体の生理学的に許容される基剤上での、または生理学的に許容される分散液中での経口適用、非経口的、注射によるものなどを含むと考えられる。薬学的組成物の投薬量は投与経路に依存すると考えられ、対象のサイズおよび健康状態に応じて異なると考えられる。
【０１３２】
多くの場合には、最大で約、または少なくとも約3、4、5、6、7、8、9、10回、またはそれ以上の複数回投与が望ましい。投与は、2日〜12週間の間隔、より一般的には1〜2週間の間隔の範囲であってよい。投与の過程に続いて、同種反応性免疫応答およびT細胞活性についてアッセイ法を行うことができる。
【０１３３】
「薬学的に許容される」または「薬理学的に許容される」という語句は、動物またはヒトに投与された場合に、有害反応、アレルギー反応、または他の不都合な反応を生じない分子的実体および組成物のことを指す。本明細書において用いる場合、「薬学的に許容される担体」は、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌薬および抗真菌薬、等張剤および吸収遅延剤などを含む。薬学的活性物質に対するそのような媒体および薬剤の使用は、当技術分野において周知である。いずれかの従来の媒体または薬剤が活性成分と不適合性である場合を除いて、免疫原性組成物および治療用組成物におけるその使用を想定している。
【０１３４】
本発明の薬学的組成物は、非経口投与用に製剤化することができ、例えば、静脈内、筋肉内、皮下、またはさらに腹腔内経路を介する注射用に製剤化することができる。OX40L抗体または阻害物質を含有する水性組成物の調製は、本開示に鑑みて当業者には公知であると考えられる。典型的には、そのような組成物は、液体溶液または懸濁液のいずれかとして注射剤として調製することができ；注射前の液体の添加によって溶液または懸濁液を調製するための使用に適した固体形態を調製することもでき；調製物を乳化させることもできる。
【０１３５】
注射用途に適した薬学的形態には、無菌の水溶液または分散液；ゴマ油、ラッカセイ油、または水性プロピレングリコールを含む製剤；および無菌の注射溶液または分散液の即時調製用の無菌粉末が含まれる。いずれの場合にも、形態は無菌でなければならず、容易に注射されうる程度に流動性でなければならない。また、それは製造および貯蔵の条件下で安定であるべきであり、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に抗して保存されなければならない。
【０１３６】
組成物は、中性形態または塩形態に製剤化されうる。薬学的に許容される塩には、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基とともに形成される）が含まれ、これらは、例えば塩酸もしくはリン酸などの無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などのような有機酸とともに形成される。また、遊離カルボキシル基とともに形成される塩を、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、または水酸化第二鉄などの無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどのような有機塩基から得られることもできる。
【０１３７】
担体はまた、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、それらの適切な混合物、および植物油を含む溶媒または分散媒であってよい。微生物活動の防止は、さまざまな抗菌薬および抗真菌薬、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらされうる。多くの場合、等張剤、例えば糖類または塩化ナトリウムを含めることが好ましい。注射用組成物の持続的吸収は、吸収遅延剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの組成物中での使用によってもたらされうる。
【０１３８】
無菌注射溶液は、上記に列挙されるさまざまな他の成分とともに適切な溶媒中に必要量の活性化合物を組み入れ、必要に応じてその後に滅菌することによって調製される。一般に、分散液は、基本の分散媒および上記に列挙されるものからの必要とされる他の成分を含む無菌媒体中に、滅菌されたさまざまな活性成分を組み入れることによって調製される。無菌注射溶液の調製用の無菌粉末の場合、好ましい調製方法は真空乾燥および凍結乾燥手法であり、これにより、あらかじめ滅菌濾過されたその溶液から活性成分および任意の付加的な所望の成分の粉末が得られる。
【０１３９】
治療用組成物または予防用組成物の有効量は、意図する目標に基づいて決定される。「単位用量」または「投薬量」という用語は、対象における使用に適した物理的に別個の単位を指し、各単位は、その投与、すなわち適切な経路および投与計画に関連して上記で考察した所望の応答を生じるように計算された所定量の組成物を含む。治療回数および単位用量の両方に従って投与される量は、所望の結果および／または防御に依存する。組成物の正確な量は医師の判断にも依存し、各個体に特有である。用量に影響を及ぼす因子には、対象の身体および臨床状態、投与経路、治療の意図する目標（症状の緩和かそれとも治癒か）、ならびに特定の組成物の効力、安定性および毒性が含まれる。製剤化されると、溶液は、投薬製剤と適合する様式で、治療的または予防的に有効であるような量で投与される。製剤は、上記の注射溶液の種類などの種々の剤形として容易に投与される。
【０１４０】
III．疾患の治療
本発明の方法は、炎症および自己免疫の治療または予防を含む。炎症性T細胞の分化を阻害し、調節T細胞の生成および機能を、IL-10を誘導してTNF-αを阻害することによって促進し、かつ異常なTh2細胞応答を低下させるOX40L阻害物質を投与することによって、炎症を治療することができる。炎症は、自己免疫と関連のない機能不全（例えば、癌、損傷など）の結果としての自己免疫疾患または炎症の構成要素であってもよい。さらに別の場合に、炎症は特発性または原因不明のものであってよい。
【０１４１】
本発明の方法はまた、自己免疫疾患の病原性の一因となりうる異常な濾胞性ヘルパーT細胞（Tfh）応答を消失または低下させるOX40L阻害物質の投与による自己免疫の治療または予防も含む。本発明の組成物は、GVHDおよび移植片拒絶の治療に対するインビボでの有用性を有することが示されている。
【０１４２】
本発明の態様を、数多くの免疫媒介性、炎症性または自己免疫疾患、例えば、糖尿病、移植片拒絶などを治療または改善するために用いることができる。そのような疾患または障害の例には、以下が非限定的に含まれる：関節炎（関節リウマチ、例えば、急性関節炎、慢性関節リウマチなど、痛風もしくは痛風性関節炎、急性痛風性関節炎、急性免疫学的関節炎、慢性炎症性関節炎、変形性関節炎、II型コラーゲン誘導関節炎、感染性関節炎、ライム関節炎、増殖性関節炎、乾癬性関節炎、スティル病、脊椎関節炎、および若年発症関節リウマチ、変形性関節症、進行性慢性関節炎（arthritis chronica progrediente）、変形性関節炎、原発性慢性多発性関節炎（polyarthritis chronica primaria）、反応性関節炎、および強直性脊椎炎）、炎症性過剰増殖性皮膚疾患、乾癬、例えば、尋常性乾癬（plaque psoriasis）、滴状乾癬、膿疱性乾癬、および爪の乾癬など、枯草熱およびヨブ症候群などのアトピー性疾患を含むアトピー、接触皮膚炎、慢性接触皮膚炎、剥脱性皮膚炎、アレルギー性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、疱疹状皮膚炎、貨幣状皮膚炎、脂漏性皮膚炎、非特異的皮膚炎、一次刺激性接触皮膚炎、およびアトピー性皮膚炎を含む皮膚炎、x連鎖性高IgM症候群、アレルギー性眼内炎症性疾患、蕁麻疹、例えば、慢性アレルギー性蕁麻疹、および慢性自己免疫性蕁麻疹を含む慢性特発性蕁麻疹など、筋炎、多発性筋炎／皮膚筋炎、若年性皮膚筋炎、中毒性表皮壊死症、強皮症（全身性強皮症を含む）、硬化症、例えば、全身性硬化症、多発性硬化症（MS）、例えば脊椎-眼（spino-optical）MS、原発性進行性MS（PPMS）および再発性寛解MS（RRMS）など、進行性全身性硬化症、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、播種性硬化症、失調性硬化症、視神経脊髄炎（NMO）、炎症性腸疾患（IBD）（例えば、クローン病、自己免疫媒介性胃腸疾患、大腸炎、例えば、潰瘍性大腸炎、大腸性潰瘍、顕微鏡的大腸炎、コラーゲン蓄積大腸炎、ポリープ様大腸炎、壊死性全腸炎、および全層性大腸炎など、ならびに自己免疫性炎症性腸疾患）、腸炎、壊疽性膿皮症、結節性紅斑、原発性硬化性胆管炎、成人または急性呼吸窮迫症候群（ARDS）を含む呼吸窮迫症候群、髄膜炎、ブドウ膜の全部または一部の炎症、虹彩炎、脈絡膜炎、自己免疫性血液障害、リウマチ性脊椎炎、リウマチ性滑膜炎、遺伝性血管浮腫、髄膜炎におけるような脳神経損傷、妊娠性ヘルペス、妊娠性類天疱瘡、陰嚢掻痒（pruritis scroti）、自己免疫性早発性卵巣機能不全、自己免疫状態に起因する突発性聴覚消失、IgE媒介性疾患、例えば、アナフィラキシーならびにアレルギー性およびアトピー性鼻炎など、脳炎、例えばラスマッセン脳炎ならびに辺縁および／または脳幹脳炎など、ブドウ膜炎、例えば、前部ブドウ膜炎、急性前ブドウ膜炎、肉芽腫性ブドウ膜炎、非肉芽腫性ブドウ膜炎、水晶体抗原性ブドウ膜炎、後部ブドウ膜炎、または自己免疫性ブドウ膜炎など、ネフローゼ症候群を有するかまたは有しない糸球体腎炎（GN）、例えば、慢性または急性糸球体腎炎、例えば、原発性GN、免疫介在性GN、膜性GN（膜性腎症）、特発性膜性GNまたは特発性膜性腎症、I型およびII型を含む膜または膜性増殖性GN（MPGN）、および急速進行性GNなど、増殖性腎炎、自己免疫性多腺性内分泌腺不全症、形質細胞亀頭��を含む亀頭炎、亀頭包皮炎、遠心性環状紅斑、色素異常性固定性紅斑、多形性紅斑（eythema multiform）、環状肉芽腫、光沢苔癬、硬化性萎縮性苔癬、慢性単純性苔癬、棘状苔癬、扁平苔癬、葉状魚鱗癬、表皮剥離性角質増殖症、前悪性角化症、壊疽性膿皮症、アレルギー状態およびアレルギー応答、アレルギー反応、アレルギー性またはアトピー性湿疹、皮脂欠乏性湿疹、異汗性湿疹、および小胞状掌蹠（vesicular palmoplantar）湿疹を含む湿疹、喘息、例えば、喘息気管支炎（asthma bronchiale）、気管支喘息および自己免疫性喘息など、T細胞の浸潤を伴う状態および慢性炎症応答、妊娠中の胎児A-B-O血液型などの外来抗原に対する免疫反応、慢性肺炎症性疾患、自己免疫性心筋炎、白血球接着不全症、ループス腎炎、ループス脳炎、小児ループス、非腎性ループス、腎外ループス、円板状ループス、円板状ループスエリテマトーデス、脱毛症ループス、全身性エリテマトーデス（SLE）、例えば、皮膚SLE、または亜急性皮膚SLE、新生児期ループス症候群（NLE）、および播種性紅斑性狼瘡を含むループス、小児インシュリン依存性真正糖尿病（IDDM）、ならびに成人発症型真正糖尿病（II型糖尿病）および自己免疫性糖尿病を含む若年発症（I型）真正糖尿病。また、以下も想定している：サイトカインおよびTリンパ球によって媒介される急性および遅延型過敏症に関連する免疫応答、リンパ腫様肉芽腫症、ヴェーゲナー肉芽腫症を含む肉芽腫症、顆粒球減少症、脈管炎、大型脈管炎（リウマチ性多発性筋痛および巨細胞（高安）動脈炎を含む）、中型脈管炎（川崎病および結節性多発性動脈炎／結節性動脈周囲炎を含む）、顕微鏡的多発性動脈炎、免疫脈管炎（immunovasculitis）CNS脈管炎、皮膚脈管炎、過敏性脈管炎、壊死性脈管炎、例えば、全身性壊死性脈管炎など、およびANCA関連脈管炎、例えば、チャーグ-ストラウス脈管炎または症候群（CSS）およびANCA関連小型脈管炎などを含む血管炎、側頭動脈炎、再生不良性貧血、自己免疫性再生不良性貧血、クームズ陽性貧血、ダイアモンドブラックファン貧血、自己免疫性溶血性貧血（AIHA）を含む溶血性貧血または免疫性溶血性貧血、アジソン病、免疫性好中球減少症、汎血球減少症、白血球減少症、白血球漏出を伴う疾患、CNS炎症性障害、アルツハイマー病、パーキンソン病、多臓器損傷症候群、例えば、敗血症、外傷または出血に続発するものなど、抗原-抗体複合体媒介性疾患、抗糸球体基底膜病、抗リン脂質抗体症候群、アレルギー性神経炎、ベーチェット病／症候群、キャッスルマン症候群、グッドパスチャー症候群、レーノー症候群、シェーグレン症候群、スティーヴンズ-ジョンソン症候群、類天疱瘡、例えば、水疱性類天疱瘡および皮膚類天疱瘡など、天疱瘡（尋常性天疱瘡、落葉状天疱瘡、天疱瘡粘膜類天疱瘡（pemphigus mucusmembrane pemphigoid）、および紅斑性天疱瘡を含む）、自己免疫性多発性内分泌腺症、ライター病または症候群、熱傷、子癇前症、免疫複合体障害、例えば、免疫複合体腎炎、抗体媒介性腎炎など、多発性神経障害、慢性神経障害、例えば、IgM多発性神経障害またはIgM媒介性神経障害など、自己免疫性または免疫介在性血小板減少症、例えば、慢性または急性ITPを含む特発性血小板減少性紫斑病（ITP）など、強膜炎、例えば、特発性角膜強膜炎、上強膜炎など、自己免��性精巣炎および卵巣炎を含む精巣および卵巣の自己免疫疾患、原発性甲状腺機能低下症、副甲状腺機能低下症、甲状腺炎、例えば、自己免疫性甲状腺炎、橋本病、慢性甲状腺炎（橋本甲状腺炎）、または亜急性甲状腺炎など、自己免疫性甲状腺疾患、特発性甲状腺機能低下症、グレーヴズ病を含む自己免疫性内分泌疾患、多腺性症候群、例えば、自己免疫性多腺性症候群（または多腺性内分泌障害症候群）など、新生物随伴症候群、例えば、神経学的新生物随伴症候群、例えば、ランバート-イートン筋無力症症候群またはイートン-ランバート症候群、スティッフマンまたはスティッフパーソン症候群など、脳脊髄炎、例えば、アレルギー性脳脊髄炎またはアレルギー性脳脊髄炎（encephalomyelitis allergica）および実験的アレルギー性脳脊髄炎（EAE）、実験的自己免疫性脳脊髄炎など、重症筋無力症、例えば、胸腺腫関連重症筋無力症など、小脳変性症、神経性筋強直症、眼球クローヌスまたはオプソクローヌス・ミオクローヌス症候群（OMS）、および感覚性ニューロパシー、多巣性運動神経障害、シーハン症候群、自己免疫性肝炎、慢性肝炎、ルポイド肝炎、巨細胞性肝炎、慢性活動性肝炎または自己免疫性慢性活動性肝炎、リンパ球性間質性肺炎（LIP）、閉塞性細気管支炎（非移植片）対NSIP、ギラン-バレー症候群、ベルガー病（IgA腎症）、特発性IgA腎症、線状IgA皮膚病、急性熱性好中球性皮膚症、角層下膿疱性皮膚炎、一過性棘融解性皮膚症、肝硬変、例えば、原発性胆汁性肝硬変および肺性肝硬変（pneumonocirrhosis）、自己免疫性腸症症候群、セリアック（Celiac）病またはセリアック（Coeliac）病、セリアックスプルー（グルテン性腸症）、難治性スプルー、特発性スプルー、クリオグロブリン血症、筋萎縮性側索硬化症（ALS；ルー・ゲーリック病）、冠動脈疾患、自己免疫性耳疾患、例えば、自己免疫性内耳疾患（AIED）、自己免疫性聴覚消失など、多発性軟骨炎、例えば、難治性または再発または再発性多発性軟骨炎など、肺胞タンパク質症、コーガン症候群／非梅毒性角膜実質炎、ベル麻痺、スウィート病／症候群、酒さ性自己免疫、帯状疱疹関連疼痛、アミロイドーシス、非癌性リンパ球増加症、原発性リンパ球増加症、例えば、モノクローナルB細胞リンパ球増加症（例えば、良性モノクローナル高ガンマグロブリン血症および意義未確定のモノクローナル高ガンマグロブリン血症、MGUS）など、末梢性ニューロパシー、新生物随伴症候群、チャネル病、例えば、てんかん、片頭痛、不整脈、筋肉障害、難聴、盲、周期性四肢麻痺、およびCNSのチャネル病など、自閉症、炎症性ミオパシー、巣状もしくは分節状または巣状分節状糸球体硬化症（FSGS）、内分泌性眼障害、ぶどう膜網膜炎、脈絡網膜炎、自己免疫性肝臓障害、線維筋痛症、多発性内分泌腺不全、シュミット症候群、副腎炎、胃萎縮症、初老期痴呆、脱髄疾患、例えば、自己免疫性脱髄疾患および慢性炎症性脱髄性多発性ニューロパシーなど、ドレスラー症候群、円形脱毛症（alopecia greata）、全脱毛症、CREST症候群（石灰沈着症、レーノー現象、食道運動障害、強指症、および毛細血管拡張症）、抗精子抗体などによる男性および女性の自己免疫性不妊症、混合結合組織病、シャーガス病、リウマチ熱、反復流産、農夫肺、多形性紅斑、心術後症候群、クッシング症候���、鳥飼育者肺、アレルギー性肉芽腫性血管炎、良性リンパ球性血管炎、アルポート症候群、肺胞炎、例えば、アレルギー性肺胞炎および線維化肺胞炎など、間質性肺疾患、輸血反応、らい病、マラリア、寄生虫性疾患、例えば、リーシュマニア症、キパノソミアシス（kypanosomiasis）、住血吸虫症、回虫症など、アスペルギルス症、サンプター症候群、キャプラン症候群、デング熱、心内膜炎、心内膜心筋線維症びまん性間質性肺線維症、間質性肺線維症、肺線維症、特発性肺線維症、嚢胞性線維症、眼内炎、持久性隆起性紅斑（erythema elevatum et diutinum）、胎児赤芽球症、好酸球性筋膜炎、シャルマン症候群、フェルティ症候群、フィラリア症（flariasis）、毛様体炎、例えば、慢性毛様体炎、異時性毛様体炎（heterochronic cyclitis）、虹彩毛様体炎（急性または慢性）、またはフックス毛様体炎など、ヘーノホ-シェーンライン紫斑病、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）感染症、SCID、後天性免疫不全症候群（AIDS）、エコーウイルス感染症、敗血症、内毒素血症、膵臓炎、甲状腺中毒症（thyroxicosis）、パルボウイルス感染症、風疹ウイルス感染症、予防接種後症候群、先天性風疹感染症、エプスタイン-バーウイルス感染症、ムンプス、エヴァンズ症候群、自己免疫性性腺機能不全、シドナム舞踏病、連鎖球菌感染後腎炎、閉塞性血栓性血管炎（thromboangitis ubiterans）、甲状腺中毒症、脊髄癆、脈絡膜炎（chorioiditis）、巨細胞性多発筋痛（gianT cell polymyalgia）、慢性過敏性肺炎、乾性角結膜炎、流行性角結膜炎、特発性腎炎症候群、微小変化ネフロパシー、良性家族性および虚血-再灌流障害、移植器官再灌流、網膜自己免疫、関節炎症、気管支炎、慢性閉塞性気道／肺疾患、珪肺症、アフタ、アフタ性口内炎、動脈硬化性障害、アスペルニオゲニーズ（asperniogenese）、自己免疫性溶血、ベック病、クリオグロブリン血症、デュプュイトラン拘縮、水晶体過敏性眼内炎（endophthalmia phacoanaphylactica）、アレルギー性腸炎、らい性結節性紅斑、特発性顔面神経麻痺、慢性疲労症候群、リウマチ熱（febris rheumatica）、ハマン-リッチ病、感音難聴（sensoneural hearing loss）、血色素尿症発作（haemoglobinuria paroxysm
atica）、性腺機能低下症、局部性回腸炎、白血球減少症、伝染性単球増加症、横移動脊髄炎、原発性特発性粘液水腫、ネフローゼ、交感神経眼炎（ophthalmia symphatica）、精巣炎肉芽腫症、膵炎、急性多発性神経根炎、壊疽性膿皮症、ケルヴァン甲状腺炎、後天性脾臓萎縮、非悪性胸腺腫、白斑、毒素性ショック症候群、食中毒、T細胞の浸潤を伴う状態、白血球接着不全症、サイトカインおよびTリンパ球によって媒介される急性及び遅発性過敏症関連免疫応答、白血球血管外遊出を伴う疾患、多器官損傷症候群、抗原-抗体複合体媒介性疾患、抗糸球体基底膜疾患、アレルギー性神経炎、自己免疫多腺性内分泌障害、卵巣炎、原発性粘液水腫、自己免疫萎縮性胃炎、交感性眼炎、リウマチ性疾患、ネフローゼ症候群、膵島炎、多内分泌性不全、自己免疫性多腺性症候群I型、成人発症型特発性副甲状腺機能低下症（AOIH）、心筋症、例えば、拡張型心筋症など、後天性表皮水疱症（EBA）、ヘモクロマトーシス、心筋炎、ネフローゼ症候群、原発性硬化性胆管炎、化膿性または非化膿性副鼻腔炎、急性または慢性副鼻腔炎、篩骨、正面、上顎骨または蝶形骨副鼻腔炎、好酸球関連疾患、例えば、好酸球増加症、肺浸潤好酸球増加症、好酸球増加症-筋肉痛症候群、レフラー症候群、慢性好酸性肺炎、熱帯肺好酸球増加症など、気管支肺炎アスペルギルス症、アスペルギローム、または好酸球性を含有する肉芽腫、アナフィラキシー、血清陰性脊椎関節炎、多内分泌性自己免疫性疾患、硬化性胆管炎、強膜、上強膜、慢性皮膚粘膜カンジダ症、ブラットン症候群、乳児期の一過性低ガンマグロブリン血症、ウィスコット-アルドリッチ症候群、毛細血管拡張運動失調症候群、血管拡張症、膠原病と関係する自己免疫障害、リウマチ、神経病学的疾患、リンパ節炎、血圧応答の低下、血管機能不全、組織損傷、心血管乏血、痛覚過敏、腎虚血、脳虚血、および脈管化を伴う疾患、アレルギー性過敏症疾患、糸球体腎炎、再灌流障害、虚血性再灌流障害、心筋または他の組織の再灌流障害、リンパ腫気管気管支炎、炎症性皮膚病、急性炎症性成分を有する皮膚病、多臓器不全、水疱性疾患、腎皮質壊死、急性化膿性髄膜炎または他の中枢神経系炎症障害、眼および眼窩の炎症性障害、顆粒球輸血関連症候群、サイトカイン誘導性毒性、ナルコレプシー、急性の重篤な炎症、慢性難治性炎症、腎盂炎、動脈内過形成、消化性潰瘍、弁膜炎、移植片対宿主病、接触過敏症、喘息気道反応性亢進、重症筋無力症、免疫性血小板減少性紫斑病、抗好中球細胞質自己抗体媒介性疾患、IgA媒介性血管炎、Ig4関連障害、ならびに子宮内膜症。
【０１４３】
IV．インビトロ投与またはエクスビボ投与
本明細書において用いる場合、インビトロ投与という用語は、培養下の細胞を非限定的に含む、対象から取り出されたかまたは対象の外部の細胞に対して行われる操作のことを指す。エクスビボ投与という用語は、インビトロで操作され、続いて対象に投与される細胞のことを指す。インビボ投与という用語は、投与を含む対象内で行われるすべての操作を含む。
【０１４４】
本発明のある特定の局面において、組成物は、インビトロ、エクスビボ、またはインビボのいずれかで投与することができる。ある特定のインビトロ態様では、自家性T細胞を本発明の組成物とともにインキュベートする。続いて、細胞を、インビトロ分析のために、または代替的にはエクスビボ投与のために用いることができる。
【０１４５】
V．併用療法
本発明の組成物および関連する方法、特にOX40L抗体または抗原結合性断片の投与を、従来の治療法の投与と組み合わせて用いることもできる。これらには、免疫抑制性または免疫調節性の治療法または治療の適用が非限定的に含まれる。
【０１４６】
1つの局面において、OX40L抗体または抗原結合性断片は、別の治療法とともに用いることを想定している。または、抗体投与が、数分間〜数週間の範囲にわたる間隔で他の治療に先行するかまたは後に続いてもよい。他の薬剤を別個に投与する態様では、一般に、各送達時点の間に大幅な時間が経過しないことが保証され、その結果、薬剤および抗体は対象に対して有利に組み合わされた効果を依然として発揮することができる。そのような場合には、互いに約12〜24時間以内、より好ましくは互いに約6〜12時間以内に、両方の様式を投与しうると想定している。しかし、状況によっては、投与の期間を大幅に延長することが望ましいことがあり、その場合には各々の投与の間に数日間（2、3、4、5、6または7日間）〜数週間（1、2、3、4、5、6、7、または8週間）をおく。
【０１４７】
本発明のOX40L抗体または抗原結合性断片の患者／対象に対する投与は、もしあれば毒性を考慮した上で、そのような化合物の投与に関する一般的なプロトコールに従う。必要に応じて治療サイクルを繰り返すことが予想される。また、さまざまな標準的治療法、例えば水分補給などを、記載の治療法と組み合わせて適用しうることも想定している。
【０１４８】
VI．配列表
SEQ ID NO：1‐マウス抗hOX40L_19A3（9295）-抗体重鎖mIgGH2b
0006628787.tif 000002
【０１４９】
SEQ ID NO：2‐マウス抗hOX40L_19A3（9295）-抗体重鎖mIgGH2b。古典的TTXPシグネチャーには下線を付している。
0006628787.tif 000003
【０１５０】
SEQ ID NO：3‐マウス抗hOX40L_19A3（9295）-抗体重鎖mIgGH2bのVH領域のリーダーペプチド
0006628787.tif 000004
【０１５１】
SEQ ID NO：4‐マウス抗hOX40L_19A3（9295）-抗体重鎖mIgGH2bの可変領域
0006628787.tif 000005
【０１５２】
SEQ ID NO：5‐マウス抗hOX40L_19A3（9295）-抗体重鎖mIgGH2bのVH領域のCDR1
0006628787.tif 000006
【０１５３】
SEQ ID NO：6‐マウス抗hOX40L_19A3（9295）-抗体重鎖mIgGH2bのVH領域のCDR2
0006628787.tif 000007
【０１５４】
SEQ ID NO：7‐マウス抗hOX40L_19A3（9295）-抗体重鎖mIgGH2bのVH領域のCDR3
0006628787.tif 000008
【０１５５】
SEQ ID NO：8‐マウス抗hOX40L_19A3（9295）-抗体κ軽鎖mIgK
0006628787.tif 000009
【０１５６】
SEQ ID NO：9‐マウス抗hOX40L_19A3（9295）-抗体κ軽鎖mIgK。LE古典的シグネチャーには下線を付している。
0006628787.tif 000010
【０１５７】
SEQ ID NO：10‐マウス抗hOX40L_19A3（9295）-抗体κ軽鎖mIgKのVL領域のリーダーペプチド
0006628787.tif 000011
【０１５８】
SEQ ID NO：11‐マウス抗hOX40L_19A3（9295）-抗体κ軽鎖mIgKの可変領域
0006628787.tif 000012
【０１５９】
SEQ ID NO：12‐マウス抗hOX40L_19A3（9295）-抗体κ軽鎖mIgKのVL領域のCDR1
0006628787.tif 000013
【０１６０】
SEQ ID NO：13‐マウス抗hOX40L_19A3（9295）-抗体κ軽鎖mIgKのVL領域のCDR2
0006628787.tif 000014
【０１６１】
SEQ ID NO：14‐マウス抗hOX40L_19A3（9295）-抗体κ軽鎖mIgKのVL領域のCDR3
0006628787.tif 000015
【０１６２】
SEQ ID NO：15‐クローン5C6（8703）ハイブリドーマOX40L抗体重鎖のDNA配列；hIgG4に対するキメラ
0006628787.tif 000016
【０１６３】
SEQ ID NO：16‐クローン5C6（8703）ハイブリドーマOX40L抗体重鎖のアミノ酸配列；古典的TXXPシグネチャーには下線を付している。
0006628787.tif 000017
【０１６４】
SEQ ID NO：17‐クローン5C6（8703）ハイブリドーマOX40L抗体重鎖のシグナル配列
0006628787.tif 000018
【０１６５】
SEQ ID NO：18‐クローン5C6（8703）ハイブリドーマOX40L抗体重鎖の可変領域
0006628787.tif 000019
【０１６６】
SEQ ID NO：19‐クローン5C6（8703）ハイブリドーマOX40L抗体重鎖のCDR1
0006628787.tif 000020
【０１６７】
SEQ ID NO：20‐クローン5C6（8703）ハイブリドーマOX40L抗体重鎖のCDR2
0006628787.tif 000021
【０１６８】
SEQ ID NO：21‐クローン5C6（8703）ハイブリドーマOX40L抗体重鎖のCDR3
0006628787.tif 000022
【０１６９】
SEQ ID NO：22‐クローン5C6（8703）ハイブリドーマOX40L抗体軽鎖のDNA配列；hIgGK-C骨格に対するキメラ
0006628787.tif 000023
【０１７０】
SEQ ID NO：23‐クローン5C6（8703）ハイブリドーマOX40L抗体軽鎖のアミノ酸配列；LE古典的シグネチャーには下線を付している。hIgGK-C骨格に対するキメラ
0006628787.tif 000024
【０１７１】
SEQ ID NO：24‐クローン5C6（8703）ハイブリドーマOX40L抗体軽鎖のシグナル配列
0006628787.tif 000025
【０１７２】
SEQ ID NO：25‐クローン5C6（8703）ハイブリドーマOX40L抗体軽鎖の可変領域
0006628787.tif 000026
【０１７３】
SEQ ID NO：26‐クローン5C6（8703）ハイブリドーマOX40L抗体軽鎖のCDR1
0006628787.tif 000027
【０１７４】
SEQ ID NO：27‐クローン5C6（8703）ハイブリドーマOX40L抗体軽鎖のCDR2
0006628787.tif 000028
【０１７５】
SEQ ID NO：28‐クローン5C6（8703）ハイブリドーマOX40L抗体軽鎖のCDR3
0006628787.tif 000029
【０１７６】
SEQ ID NO：29‐hIgG4に対するキメラであるクローン44F3（8704）ハイブリドーマOX40L抗体重鎖のDNA配列
0006628787.tif 000030
【０１７７】
SEQ ID NO：30‐hIgG4に対するキメラであるクローン44F3（8704）ハイブリドーマOX40L抗体重鎖のアミノ酸配列；古典的TXXPシグネチャーには下線を付している。
0006628787.tif 000031
【０１７８】
SEQ ID NO：31‐クローン44F3（8704）ハイブリドーマOX40L抗体重鎖のシグナル配列
0006628787.tif 000032
【０１７９】
SEQ ID NO：32‐クローン44F3（8704）ハイブリドーマOX40L抗体重鎖の可変領域
0006628787.tif 000033
【０１８０】
SEQ ID NO：33‐クローン44F3（8704）ハイブリドーマOX40L抗体重鎖のCDR1
0006628787.tif 000034
【０１８１】
SEQ ID NO：34‐クローン44F3（8704）ハイブリドーマOX40L抗体重鎖のCDR2
0006628787.tif 000035
【０１８２】
SEQ ID NO：35‐クローン44F3（8704）ハイブリドーマOX40L抗体重鎖のCDR3
0006628787.tif 000036
【０１８３】
SEQ ID NO：36‐クローン44F3（8704）ハイブリドーマOX40L抗体軽鎖のDNA配列；hIgGK-C骨格に対するキメラ
0006628787.tif 000037
【０１８４】
SEQ ID NO：37‐hIgGK-Cに対するキメラであるクローン44F3（8704）ハイブリドーマOX40L抗体軽鎖のアミノ酸配列；LE古典的シグネチャーには下線を付している。
0006628787.tif 000038
【０１８５】
SEQ ID NO：38‐クローン44F3（8704）ハイブリドーマOX40L抗体軽鎖のシグナル配列
0006628787.tif 000039
【０１８６】
SEQ ID NO：39‐クローン44F3（8704）ハイブリドーマOX40L抗体軽鎖の可変領域
0006628787.tif 000040
【０１８７】
SEQ ID NO：40‐クローン44F3（8704）ハイブリドーマOX40L抗体軽鎖のCDR1
0006628787.tif 000041
【０１８８】
SEQ ID NO：41‐クローン44F3（8704）ハイブリドーマOX40L抗体軽鎖のCDR2
0006628787.tif 000042
【０１８９】
SEQ ID NO：42‐クローン44F3（8704）ハイブリドーマOX40L抗体軽鎖のCDR3
0006628787.tif 000043
【実施例】
【０１９０】
VII．実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい態様を実証するために含められる。以下の実施例において開示される手法は、本発明の実施において十分に機能すると本発明者によって見いだされた技術を表しており、それ故にその実施のための好ましい態様であると見なしうることが当業者に認識されるべきである。しかし、当業者は、本開示に鑑みて、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、開示される特定の態様に多くの変更を施すことができ、それでもなお同様または類似の結果を得ることができることを認識すべきである。
【０１９１】
実施例1：OX40L抗体の特徴決定
OX40L抗体である5C6（AB104_105.5C6.3F9とも表示される）、19A3（AB104_105.19A3.2C4とも表示される）および44F3（AB104_105.44F3.2F7とも表示される）を、それらがmDCと共培養したナイーブT細胞によるサイトカイン産生を促進する能力について、以下のアッセイ法を用いて試験した。mDC培養物の増殖および生存率に対するOX40L抗体の効果についても、本実施例に記載しているアッセイ法を用いて試験した。
【０１９２】
OX40L抗体クローン5C6、19A3および44F3は、（1）ヒトOX40L上の独特のエピトープを認識すること、（2）TSLP-mDCによって刺激されるIL-10低産生性／TNFa高産生性の炎症性Th2の分化を阻害すること、（3）TNF-aの増殖および産生を阻害し、かつOX40Lがトランスフェクトされた細胞株とともに培養したCD4 T細胞によるIL-10を促進することが見いだされた。これらの結果は図1〜8に示されている。
【０１９３】
TSLP-mDCとナイーブCD4 T細胞の共培養‐血中骨髄系DC（mDC）の単離および培養。PBMCを、成人健常志願者から入手したバフィーコートまたはアフェレーシス血液試料から単離した。mDC（系列-、CD4+、CD11c+）を、ヒト汎DCプレエンリッチメントキット（pan-DC pre-enrichment kit）（STEMCELL# 19251）またはヒト骨髄系DC濃縮キット（STEMCELL# 19061）を当技術分野において公知の方法に従って用いることによって、PBMCから濃縮した。濃縮されたmDCを、FITC-CD3（#349201）、CD14（#347493）、CD16（#555406）、CD19（#555412）、CD20（#555622）、CD56（#3032769）、APC-CD11c（#340544）およびV450-CD4（#2342693）によって染色し（抗体はすべてBDによる）、続いて系列-CD11c+CD4+集団を、FACS Aria2（BD Biosciences）によって骨髄系DCとして選別した。mDCを、10％ヒトAB血清（GemCell#100-512）を含有するRPMI+GlutaMAX（gibco）、10mM HEPES（gibco）、ペニシリン／ストレプトマイシン（Streptmycin）／L-グルタミン（gibco）、1mMピルビン酸ナトリウム（SIGMA）およびMEM非必須アミノ酸溶液（Hyclone）中で培養した。細胞を、20ng／ml組換えヒトTSLPの存在下で、平底96ウェルプレート内に1〜2×105個／200ul培地の密度で播種した。組換えヒトTSLPは、以前に記載された通りにアデノウイルスベクター系を用いて施設内で調製した（Soumelis, et al., 2002）。20〜24時間のインキュベーション後に、mDCを採取して、培地によって洗浄した。
【０１９４】
ナイーブT細胞の単離。成人健常志願者から入手したバフィーコート血液またはアフェレーシス血液試料から、PBMCを単離した。CD4+ナイーブT細胞を、ヒトCD4+ T細胞濃縮カクテル（Enrichment Cocktail）（STEMCELL#15062）およびヒトナイーブCD4+ T細胞濃縮キット（Enrichment kit）（STEMCELL#19155）を用いて、PBMCから濃縮した。濃縮されたCD4+ナイーブT細胞を、FITC-CD8（#340692）、CD14（#347493）、CD16（#555406）、CD19（#555412）、CD20（#555622）、CD25（#340694）、CD56（#3032769）、BDCA-2（130-090-510；Miltenyi Biotech）、CD11c（#301 1791）、TCRγδ（#347903）、PE-CCR7（#353204；BioLegend）、PE-Cy7-CD45RO（#337168）、APC-CD45RA（#3041 12；BioLegend）、およびV450-CD4（#2342693）によって染色した（BDCA-2、CCR7およびCD45RAを除く抗体はすべてBDによる）。系列-CD4+CD45RA+CD45RO-CCR7+集団を、FACS Aria2によってナイーブCD4+ T細胞として選別した。
【０１９５】
DCとT細胞の共培養。新たに精製した同種異系ナイーブCD4+ T細胞（ウェル当たり細胞2.5×104個）を、50ug／ml抗OX40L mAb（ik-5、Dr. Toshiyuki Horiにより提供）、施設内で作製した抗OX40L mAb（5C6、19A3および44F3）の存在下で、TSLP DC（ウェル当たり細胞5×103個）と、DC／T細胞比1：5で丸底96ウェル培養プレート内で共培養した。マウスIgG2a（16-4724-85；eBioscience）およびIgG2b（MAB004；R&D systems）を対照として用いた。6〜8日間の培養後に、ナイーブT細胞を採取して、固定化した抗CD3（OKT3：1ug／ml）+抗CD28（1ug／ml）によって、平底96ウェルプレート内で細胞105個／100ulの濃度で20〜24時間にわたって再刺激した。IL-4、IL-5、IL-10、IL-13、TNF-αおよびIFN-γの産生を、ELISA（キットはすべてR&D Systemsによる）またはLuminex（Milliopore）によって測定した。
【０１９６】
バルクCD4+ T細胞の単離。バルクCD4+ T細胞を、ヒトCD4+ T細胞Enrichment Cocktail（STEMCELL# 15062）を用いることによって、健常成人志願者由来の血液のバフィーコートから単離し、その後に、FITC-CD8（#340692）、CD14（#347493）、CD16（#555406）、CD19（#555412）、CD20（#555622）、CD25（#340694）、CD56（#3032769）、BDCA-2（130-090-510；Miltenyi Biotech）、CD11c（#301 1791）、TCRγδ（#347903）およびAPC-Cy7 CD4（#）（BDCA-2を除き、抗体はすべてBDによる）を用いて、CD4+系列-画分として細胞選別を行った。選別の後に、CD4+ T細胞をCSFEによって製造元の指示の通りに標識した。
【０１９７】
L細胞とT細胞の共培養。T細胞との共培養の前に、0.2ug／mlの抗CD3抗体（OKT3）を、あらかじめ播種したL細胞に加えて、1〜2時間にわたってインキュベートした。続いてCSFE標識CD4+ T細胞を添加し、1ug／mlの抗CD28抗体（CD28.2、BD pharmingen）の存在下で、L細胞上で6日間にわたって培養した。活性化されたCD4+ T細胞を、再刺激した。固定化した抗CD3（OKT3：1ug／ml）+抗CD28（1ug／ml）によって、平底96ウェルプレート内で細胞105個／100ulの濃度で24時間にわたって再刺激した。IL-4、IL-5、IL-10、IL-13、TNF-αおよびIFN-γの産生を、ELISA（キットはすべてR&D Systemsによる）またはLuminex（Milliopore）によって測定した。
【０１９８】
実施例2：OX40リガンドは濾胞性Tヘルパー応答を促進することによってヒトのループス病態に寄与する
全身性エリテマトーデス（SLE）は、核抗原に対する寛容の破綻を特徴とする、慢性の全身炎症性自己免疫疾患である（Tsokos, 2011）。SLEは臨床症状発現および疾患経過の点でかなりの多様性を示す。SLE病態のより包括的な理解が長く待ち望まれている；これまでの50年で、SLE治療のために承認された新薬は1つしかない（Murphy et al., 2013；Stohl et al., 2012）。ゲノムワイド関連研究（GWAS）により、SLEに関する多くの感受性遺伝子座が同定され、SLE患者がdisplay素因となる遺伝要因を示すことが確かめられた（Cunninghame Graham et al., 2008；Delgado-Vega et al., 2009；Gateva et al., 2009；Han et al., 2009；International Consortium for Systemic Lupus Erythematosus et al., 2008）。SLEでは、素因を有する免疫系と環境要因との相互作用が、抗原提示細胞（APC）およびリンパ球の機能の変化を引き起こす。樹状細胞（DC）を含むAPCがSLE患者では異常に活性化されており、自己反応性T細胞およびB細胞の活性化を促進する（Blanco et al., 2001；Blanco et al., 2008）。生じた自己反応性形質細胞が、核成分を対象とする病原性自己抗体を産生して、組織傷害を引き起こす。
【０１９９】
マウスモデルを用いた数多くの研究により、B細胞に援助を与えるために特化したCD4+ヘルパーT（Th）細胞サブセットの1つである（Crotty, 2011）、濾胞性ヘルパーT細胞（Tfh）（Craft, 2012；Linterman et al., 2009；Vinuesa et al., 2005）が、ループスにおいて主要な病因的役割を果たすことが実証されている。例えば、Roquin遺伝子において単一の劣性欠陥を示すsanroqueマウスは、過度のTfh細胞応答を生じることによってループス様自己免疫疾患を発症する（Linterman et al., 2009；Vinuesa et al., 2005）。Tfh細胞は、高親和性B細胞の選択および記憶B細胞の発生のための部位である胚中心（GC）の形成のために必須である（MacLennan, 1994；Vinuesa and Cyster, 2011）。Tfh細胞には、B細胞の援助のために必要とされる複数の特徴が備わっている（Crotty, 2011；King et al., 2008）。Tfh細胞およびそれらの前駆細胞によって分泌されたIL-21（Bentebibel et al., 2011；Bryant et al., 2007；Chtanova et al., 2004）は、B細胞の増殖、分化およびクラススイッチを強力に促進する（Spolski and Leonard, 2008）。誘導性共刺激因子（ICOS）はGC Tfh細胞によって高度に発現され、B細胞との相互作用を媒介する（Crotty, 2011；King et al., 2008；Xu et al., 2013）。Tfh細胞によって発現されるCD40リガンド（CD40L）は、CD40を経由して、B細胞に対してその分化およびクラススイッチのためのシグナルを与える（Banchereau et al., 1994）。ループス病態におけるこれらのTfh分子の重要性は、CD40L（Boumpas et al., 2003；Kalled et al., 1998）、ICOS（Odegard et al., 2008）、IL-21および／またはIL-21受容体（Bubier et al., 2009；Herber et al., 2007）の機能の阻害により、疾患経過が遅延し、臨床症状が改善するという、ループスのマウスモデルにおける観察所見によっても強く示される。その上、SAP分子を枯渇させることによる、ループスを起こしやすいsanroqueマウスモデルにおけるTfh細胞の阻害により、阻害による腎病態の発生が無効化された（Linterman et al., 2009）。これらの研究は、感受性遺伝子座を有する対象のループス疾患の予防のため、および／またはループス患者の治療のために、Tfh細胞の生成および／または活性を抑制することの強力な根拠となる。
【０２００】
ヒトのループスでは、大多数のIgGクラス自己抗体産生性B細胞に体細胞突然変異があり（Tiller et al., 2007）、このことはそれらがTfh細胞との相互作用を経たGCに由来することを示唆する。複数の研究により、活動性SLE患者では活動性表現型を有する血中Tfh細胞の頻度が高いことが示されている（He et al., 2013；Simpson et al., 2000）。その上、Tfh細胞は、T細胞およびB細胞の凝集物、ならびにループス腎炎の患者の腎臓における異所性胚中心にも見いだされている（Chang et al., 2011；Liarski et al., 2014）。これらの観察所見は、ヒトのループスにおけるTfh細胞の病因的役割を裏づけるものである。しかし、SLE患者におけるTfh応答の増大に関与する機序は未だに不明である。
【０２０１】
ここで、骨髄系APCによって発現されるOX40リガンド（OX40L）が、SLEにおける異常なTfh応答に寄与することが示された。OX40Lは血中の骨髄系APCによって発現されるほか、成人および小児の活動性SLE患者における炎症組織においても発現された。OX40L刺激は、Tfh関連分子を発現するようにヒトCD4+ T細胞を誘導し、それは、それらを機能的ヘルパーB細胞となるように誘導するのに十分であった。さらに、ループス血清中に存在するリボ核タンパク質（RNP）を含む免疫複合体（IC）が、TLR7の活性化を経由して骨髄系APCによるOX40L発現を誘導することも今回示された。このように、本研究は、RNP IC-OX40L軸が、SLEにおける自己抗体の生成の増幅ループをもたらしている可能性が高いことを示す。
【０２０２】
材料および方法
患者試料‐米国リウマチ学会（American College of Rheumatology）によるSLEの改訂基準（Hochberg, 1997）に適合する成人SLE患者（計61人：女性53人と男性8人）および小児SLE患者（計38人：女性34人および男性4人）を組み入れた。患者のすべての臨床情報および生物学的に意義のある情報を以下の表1および2に示している。臨床的な疾患活動性は、SLE疾患活動性指数（SLEDAI）を用いて評価した。活動性患者は、SLEDAIスコアが6以上であると定義した。成人SLE試料については、インフォームドコンセントが得られた後に、通常の検査分析による血液試料を用いた。小児SLE試料については、試験がBaylor Research Instituteの施設内審査委員会（Institutional Review Board）の承認を受けた上で、すべての参加者またはその親からインフォームドコンセントを得た。対照PBMCは、成人志願者からのバフィーコート試料、採血試料、またはアフェレーシス血液試料から得た。
【０２０３】
（表１）試験に含められた成人SLE患者の臨床パラメーターおよび検査パラメーター
0006628787.tif 000044
表１の続き
0006628787.tif 000045
【０２０４】
（表２）試験に含められた小児SLE患者の臨床パラメーターおよび検査パラメーター
0006628787.tif 000046
略号： F：女性、M：男性、A：関節、C：皮膚、D：消化器、H：血液、M：心筋、N：神経、P：胸膜心膜、R：腎臓、V：血管、APS：抗リン脂質症候群、HCQ：ヒドロキシクロロキン、AZA：アザチオプリン、CYC：シクロホスファミド、MMF：ミコフェノール酸モフェチル、MPA：ミコフェノール酸、MTX：メトトレキサート、RTX：リツキシマブ。
【０２０５】
皮膚および腎臓の生検試料（クラスIVループス腎炎）を、成人SLE集団から、患者特徴に関して無作為に選択した。対照皮膚試料は、形成外科手術を受ける患者から入手した。対照腎臓試料は、腎摘出術を受けた癌患者から入手した。
【０２０６】
フローサイトメトリーによる血中免疫細胞の表現型検査‐OX40L発現の分析のためには、全血試料を抗CD14-PC5、CD16-FITC、CD11c-APC、HLA-DR-PC7、およびOX40L-PE mAbによって染色し、赤血球をVersalyse（Beckman Coulter）によって溶解させた。血中Tfh細胞の分析のためには、全血試料を抗CXCR5-AF488、CCR6-PE、CXCR3-PC5、CCR4-PC7、CD3-AF700、CD8-APCH7、CD4-Pacific Blue（いずれもBecton Dickinsonによる）、CD45RA-ECD（Beckman Coulter）、ICOS-APC（Biolegend）およびCD45-Pacific Orange（Invitrogen）によって染色した。データはBD LSRII装置（BD Biosciences）を用いて収集し、Flowjoソフトウェア（Tree StarInc.）を用いて分析した。
【０２０７】
皮膚および腎臓の生検分析‐SLE患者および自己免疫疾患を有しない対象由来の皮膚および腎臓の生検試料におけるOX40LおよびCD11cの発現を、免疫蛍光顕微鏡を用いて分析した。手短に述べると、皮膚および腎臓由来のホルマリン固定パラフィン包埋組織の5μm厚切片を脱パラフィン処理して、加熱によるエピトープ回収段階に供した。スライドを低温流水ですすぎ洗いし、Tris緩衝食塩水、pH 7.4で洗浄した後に、一次抗CD11c（Novocsatra、クローン5D11）および抗OX40L（R&D Systems、クローン159403）またはアイソタイプを一致させた対照抗体とのインキュベーションを一晩かけて行った。続いてスライドを3回洗浄して、適切な二次抗体：AF488結合抗マウスもしくはラット抗体またはAF568結合抗マウス抗体（Invitrogen）とともにインキュベートした。免疫蛍光画像は、Cytovision System（Applied Imaging）と接続したOlympus BX51／52システム顕微鏡にて分析した。
【０２０８】
扁桃試料の表現型分析‐扁桃試料を、扁桃摘出術を受ける健常対象から入手し、機械的破砕によって単一の細胞を収集した。表面染色のためには、細胞を、蛍光色素結合抗体である、BD BiosciencesによるCD11c-PC7（B-ly6）、HLA-DR-PerCP（L243）、CD19-FITC（HIB19）、CD19-APC（HIB19）および41BBL-PE（C65-485）、Ancell CorporationによるOX40L-PE（ANC10G1）、InvitrogenによるCD14-APC-AF750（TuK4）、CD16-APC（3G8）およびCD3-PB（UCHT1）、MiltenyiによるICOSL-FITC（MIH12）、R&DによるGITRL-PE（109101）とともに、LIVE／DEAD FIXABLE Aqua（Invitrogen）の存在下で15分間インキュベートして、その後にBD LSRIIで分析を行った。データを、FlowJoソフトウェア（Tree Star Inc.）を用いてさらに分析した。
【０２０９】
Th細胞の培養‐ナイーブTh細胞（CD45RA+CCR7+）およびメモリーTh細胞（CD45RA-）を、前記の通りにフローサイトメトリーによって選別した（Schmitt et al., 2009）。10％ FCSを加えたRPMI完全培地中で、Th細胞をCD3／CD28 Dynabeads（Invitrogen）によって一晩かけて刺激し、続いて細胞を、組換えIL-12（100pg／ml）および／または可溶性OX40L（100ng／ml（R&D systems）の存在下または非存在下で、可溶性CD28 mAb（1μg／ml．CD28.2）を加えた、CD3 mAb（5μg／ml、OKT3）でコーティングした平底96ウェルプレートに移した。一部の実験では、選別されたナイーブTh細胞を、活動性SLE患者のPBMCからの選別によって単離された同種異系単球（CD14+細胞）とともに培養した（T：単球比＝1：1）。抗CXCR5-AF647、抗CD40L APC-eFluor 780および抗ICOSビオチン／ストレプトアビジン-PerCPによる表現型分析のため；ならびにB細胞との共培養のために、T細胞を第4日（CD3／CD28で刺激したT細胞の場合）または第7日（単球-T細胞の共培養の場合）に採取した。IL-21発現の評価のためには（抗IL21-PEによる）、培養した細胞を、25ng／ml PMA、1μg／mlイオノマイシンによって6時間にわたって再刺激し、このうち後の4時間はBrefeldine（eBioscience）およびモメンシンの存在下とした。
【０２１０】
Th細胞とB細胞の共培養‐活性化されたTh細胞を、96ウェル丸底プレート内で、エンドトキシン減少SEB（0.25ng／ml；Toxin technology, Inc.）の存在下で、Yssel培地／10％ FBS中にて、自家性ナイーブB細胞またはメモリーB細胞（ウェル当たり5×103個のT細胞に対して40×103個のメモリーB細胞）と共培養した。第14日に、培養物中に産生されたIgGを、ELISAによって分析した。
【０２１１】
単球の培養‐CD14+単球を、健常ドナー由来の血液試料から陰性選択によって精製し（Schmitt et al., 2009）、続いて6ウェルプレート内で、SLE血清（10％）または対照血清に3日間にわたって曝露させた。表現型を、抗CD14-PC5、抗HLA-DR-PC7および抗OX40L-PEを用いるFACSによって分析した。TLR3アゴニスト（ポリ-IC、10μg／ml）、TLR7アゴニスト（R837、5μg／ml）、TLR9アゴニスト（ODN2216、10μg／ml）は、InvivoGenから購入した。TLR7阻害物質IRS-661（1μM）（Barrat et al., 2005）を、SLE血清または抗RNP IgG（50μg／ml）を添加した上で、単球とともに10分間にわたってインキュベートした。
【０２１２】
抗RNPの精製‐抗RNP力価レベルを、市販の酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）キット（Corgenix）を用いて測定した。試料を、製造元によって提供された陽性対照と比較した。陽性抗RNP試料は、22U／ml超の活性を有していた。HiTrapタンパク質G HPカラム（GE Healthcare）を用いて、IgGを抗RNP+ SLE患者の血清試料から精製した。精製されたIgGを脱塩処理し、続いて定量した。
【０２１３】
ナノストリング（Nanostring）‐IL-12および／またはsOX40Lとともに48時間にわたって培養したTh細胞を、RLT緩衝液中で溶解させた。RNeasy Micro Kit（Qiagen）を用いて全RNAを精製した。ナノストリング反応を製造元の指示に従って行った。データは、コードセットに含まれるハウスキーピング遺伝子に対して規準化した。
【０２１４】
統計分析‐変数分布の正規性を評価し、分布の正規性が棄却されたことから、分析はノンパラメトリック対応Wilcoxon検定または独立Mann-Whitney U検定によって適宜行った。必要な場合には、比較をKruskall Wallis検定によって分析し、その後にDunn事後検定によって分析した。3つ超のパラメーターを比較するためには、多重比較検定を伴う一元配置ANOVAを用いた。変数間の相関は、Spearman検定を用いることによって判定した。統計分析はすべて、StatView 5.0ソフトウェア（SAS Institute）を用いて行った。
【０２１５】
結果
OX40Lは炎症性扁桃において大量に発現される‐本出願人らは以前に、真皮CD14+ DCがインビトロでTfh様細胞の生成を選好的に誘導することを実証した（Klechevsky et al., 2008）。真皮CD14+ DCを含む皮膚DCサブセットは所属リンパ節内に遊走して（Segura et al., 2012）、T細胞ゾーンでT細胞と相互作用する。遊走性真皮CD14+ DCの対応物と提唱されている、リンパ節内のCD206+ DCは、Tfh細胞によって大量に発現されるケモカインである（Bentebibel et al., 2011；Kim et al., 2004）CXCL13を産生するように、ナイーブTh細胞を促進する（Segura et al., 2012）。これらの観察所見は、皮膚の所属リンパ節におけるTfh細胞の生成および抗体応答における、真皮CD14+ DCの関与を示唆する。しかし、扁桃などの炎症性リンパ系器官におけるTfh応答と関連のあるAPCの表現型は明らかにされていない。
【０２１６】
マウスモデルでの以前の研究により、Tfh細胞の分化のためにDCによって発現されるICOSリガンド（ICOSL）の重要性が実証されている（Choi et al., 2011）。本出願人らは、骨髄系APC（CD11c+HLA-DR+）が、GCとともに成熟Tfh細胞が豊富である小児扁桃においてICOSLを発現するか否かについて分析した（Bentebibel et al., 2011）。本出願人らは、炎症性扁桃内の骨髄系APCがICOSLをほとんど発現しないことを見いだした（図9A、9B）。その代わりに骨髄系APC、特にCD14+細胞は、共刺激因子OX40Lを発現した（CD11c+HLA-DR+細胞の9.3±7.1％、平均±s.d.、n＝9。図9A）。GITRLおよび4-1BBLなどの他のTNFリガンドファミリー分子は検出不能であるかまたは低レベルでしか発現されなかった（図9A、B）。しかし、骨髄系APCによるOX40L発現は、Tfh応答およびGC応答が小児扁桃におけるよりもはるかに不明瞭な箇所である（Bentebibel et al., 2013）、脾臓にはほとんど存在しなかった（CD11c+HLA-DR+細胞の0.3±0.5％、平均±s.d.、n＝4）。このことからみて、OX40L+骨髄系APCは二次リンパ系器官にはいずれも存在せず、炎症を伴うものに限定されると考えらる。
【０２１７】
それらの局在を明らかにするために、扁桃組織を抗OX40Lおよび抗CD11cによって染色し、免疫蛍光顕微鏡によって分析した。本出願人らは、OX40Lが扁桃、特に上皮下領域、T細胞ゾーンおよび外套層において大量に発現されるが、GCではそれよりも少ないことを見いだした（図9C）。OX40L+ CD11c+骨髄系APCは主としてT細胞ゾーンに見いだされた（図9C）。OX40LがCD11c-細胞によっても発現されたことは注目に値する。このことは、OX40Lが、B細胞、血管内皮細胞、マスト細胞、活性化NK細胞および活性化Th細胞を含む広範囲にわたる免疫細胞によって発現されうるという事実に一致する（Croft, 2010）。これらの観察所見は、扁桃における炎症環境が、未知の機序によって、さまざまな種類の細胞上でのOX40L発現の上方制御を誘導することを示唆する。
【０２１８】
活動性の成人SLE患者および小児SLE患者に由来する骨髄系APCはOX40Lを発現する‐炎症性扁桃におけるOX40Lの顕著な発現に鑑みて、本出願人らは、OX40LがSLE患者由来の炎症組織でも発現されているのではないかと考えた。本出願人らは、腎炎を伴う活動性の成人SLE患者由来の炎症腎臓組織ではCD11c+骨髄系APCを含む細胞によってOX40Lが大量に発現されているが、自己免疫疾患を有しない対象由来の組織ではそれが存在しないことを見いだした（図10A）。また、OX40L+骨髄系APCは、SLE患者からの皮膚生検試料中にも見いだされたが、対照からは見いだされなかった（図10A）。扁桃と同様に、OX40L+ CD11c-細胞はSLE患者からの両方の組織中にも存在していた。
【０２１９】
本出願人らは次に、SLEの患者における末梢骨髄系APCもOX40Lを発現するか否かについて分析した。OX40Lの発現は、活動性SLEの成人患者および小児患者由来の血中骨髄系APCの表面で、健常対象、非活動性SLE患者および他の自己免疫疾患患者と比較して、有意に増大していた（図12Bおよび図15）。扁桃骨髄系APCと同様に（図9A、9B）、血中骨髄系APC上で、ICOSL、GITRLおよび4-1BBLの発現はいずれも観察されなかった（図16）。血中のOX40L+細胞のパーセンテージは、成人SLEおよび小児SLEのいずれにおいても、活動性患者（SLE疾患活動性指数（SLEDAI）によって評価）の方が非活動性患者よりも有意に高かった（図10C）。その上、骨髄系APCの中でのOX40L+細胞の頻度は、成人SLEおよび小児SLEのいずれにおいても、SLEDAIによって評価した疾患活動性と相関した（図10D）。OX40Lは主としてCD14+CD16+単球およびCD14+CD16-単球によって発現された（図10Eおよび図17）。過去に治療を受けていない発赤のある成人SLE患者11人の長期追跡調査において、OX40L+骨髄系APCのパーセンテージは治療後に疾患活動性の低下とともに実質的に減少した（図18、P＜0.01、n＝11）。
【０２２０】
以上を総合すると、これらの結果は、活動性SLE患者では、血中骨髄系APCおよび組織に浸潤した骨髄系APCの表面にOX40Lが発現されていることを示している。
【０２２１】
OX40シグナルはナイーブT細胞およびメモリーT細胞におけるTfh遺伝子の発現を促進する‐血中および炎症組織におけるOX40L+骨髄系APCの存在は、活動性SLE患者において骨髄系APC上でのOX40L発現が全体的に増大していることを示唆する。特に、SLE患者における炎症組織は、Th細胞がT細胞受容体シグナルと一緒にOX40シグナルを受け取る、OX40Lに富む環境を生じさせると考えられる（図10A）。OX40シグナルは、T細胞の増殖および生存のために重要なシグナルを与える一方で、APC、微小環境およびTh細胞それ自体に由来する他の因子と協働して、Th分化も調節する（Croft, 2010）。本出願人らは、OX40シグナルは、ヒトTh細胞のTfh系列に向けての分化を促進するという固有の特性を示す可能性があるとの仮説を立てた。この仮説を取り扱う上で、本出願人らは、APCおよび微小環境に由来する因子の寄与を回避するためにAPCを含まない系を利用し、ナイーブTh細胞およびメモリーTh細胞を、アゴニスト性可溶性OX40L（sOX40L）の存在下で抗CD3および抗CD28とともに培養した。T細胞固有の因子の影響を最小限に抑えるために、本出願人らは、培養48時間の時点で遺伝子発現プロファイルをナノストリングによって分析した。遺伝子発現パターンに対するOX40シグナルの影響の評価のためには、sOX40Lの存在下で刺激したTh細胞における転写物存在量を、sOX40Lの非存在下で刺激したTh細胞における値に対して規準化した。本出願人らは、OX40シグナル伝達により、ナイーブTh細胞およびメモリーTh細胞のいずれにおいても、CXCR5、BCL6、IL21、CXCL13およびPDCD1（PD-1をコードする）を含む複数のTfh遺伝子が上方制御されることを見いだした（図11A）。その上、OX40L刺激により、Tfh生成を阻害する転写リプレッサーである（Crotty, 2011）、PRDM1（Blimp-1をコードする）の発現が下方制御された。
【０２２２】
以前に、本出願人らおよび他の研究者らは、IL-12が、IL-21、ICOS、CXCR5およびBcl-6を含む複数のTfh分子を他のサイトカインよりも高いレベルで発現するように、活性化ヒトナイーブTh細胞を誘導することを示している（Ma et al., 2009；Schmitt et al., 2013；Schmitt et al., 2009）。IL-12受容体β1（IL-12R β1）鎖を欠損した対象はTfh応答およびGC応答の低下を示し（特に子供）、このことはIL-12受容体を介するシグナルがヒトにおけるTfh細胞分化が生じるために必須であるというインビボでの証拠を与えるものである（Schmitt et al., 2013）。このため、本出願人らは、OX40で刺激したTh細胞とIL-12で刺激したTh細胞との間で、Tfh遺伝子の発現を比較した。驚いたことに、OX40シグナルは、Tfh遺伝子をIL-12シグナルと等価なレベルで発現するようにナイーブTh細胞を誘導した（図19）。その上、Tfh遺伝子の全体的な発現パターンは、OX40で刺激したTh細胞とIL-12で刺激したナイーブTh細胞との間でほぼ同じであった（図11B、左）。マウス研究からは、IFN-γがTfh細胞の生成に積極的な役割を果たすことが示唆されるが（Lee et al., 2012）、これらの細胞におけるTfh分子の上方制御は、IFN-γで刺激したナイーブTh細胞が同様の遺伝子パターンを示さなかったことからみて、培養物中に分泌されたIFN-γに起因するのではなかった（図19B、左）。この2種のシグナルの組み合わせにより、IL21の発現はさらに増大したが、他のTfh分子についてはそうではなかった。
【０２２３】
ナイーブTh細胞での観察所見とは対照的に、OX40シグナルは、全体的なTfh遺伝子の発現をモジュレートするようにメモリーTh細胞を誘導する点（図11B、右）、ならびにTfh遺伝子（BCL6、CXCR5、IL-21、CXCL13およびPDCD1）の上方制御およびPRDM1遺伝子の下方制御を促進する点で（図11C）、IL-12シグナルよりも強力であった。OX40シグナルが、ナイーブTh細胞とメモリーTh細胞との間で、Tfhの発生および機能に関連のある遺伝子であるMAFおよびBATF（Crotty, 2011）の発現を差異を伴ってモジュレートしたことは注目に値した。OX40シグナルは、ナイーブTh細胞ではこの2つの遺伝子の上方制御を誘導したが、メモリーTh細胞では下方制御を誘導した（図11B）。しかしながら、IL-12シグナルはOX40シグナルと協働的に作用して、メモリーTh細胞によるIL21の発現を増大させた（図11C）。
【０２２４】
OX40シグナルは機能的ヘルパーの生成を促進する‐Tfh分子の発現をタンパク質レベルで分析するために、ナイーブTh細胞およびメモリーTh細胞をsOX40Lの存在下または非存在下で抗CD3および抗CD28によって3日間にわたって活性化し、フローサイトメトリーによって表現型を分析した。転写データと一致して（図11A、11B）、OX40シグナルは、CXCR5、CD40LおよびIL-21を含むTfh分子を発現するようにナイーブTh細胞およびメモリーTh細胞の両方を促進し、かつIL-21、CD40LおよびICOSを共発現するCXCR5+細胞の生成を増大させた（図12Aおよび12B；図20）。注目されることとして、OX40シグナルは、IL-21のほかにIL-2およびTNF-αの発現も誘導したが、IFN-γおよびIL-4の発現は誘導しなかった（図21）。その上、OX40L刺激は、CXCR5+細胞上でのCCR7の発現を下方制御するようにナイーブTh細胞を誘導し（図20）、B細胞濾胞へのホーミングのために必要なケモカイン受容体発現プロファイルであるCXCR5+CCR7-細胞の生成を増大させた（Haynes et al., 2007）。驚いたことに、OX40シグナルは、IL-12シグナルよりも効率的に、CXCR5、CD40LおよびIL-21を含むTfh分子を発現するようにメモリーTh細胞を誘導した（図12B）。本出願人らは、OX40シグナルが、メモリーTh細胞上でのICOSの発現を対照培養物と比較して減少させたことも認めたが（図20）、これは転写データと一致した（図11B）。しかし、ICOS発現レベルは高く保たれ、OX40シグナルによって刺激されたCXCR5+細胞の80％超がICOSを発現した。
【０２２５】
本出願人らは、OX40シグナルが、Th細胞を機能的ヘルパーになるように誘導するのに十分ではないかと考えた。この目的に向けて、刺激されたTh細胞を自家性B細胞と共培養し、産生されたIgGを第14日に測定した。OX40シグナルは、ナイーブTh細胞およびメモリーTh細胞の両方をヘルパーB細胞になるように誘導するのに十分であった（図12C）。注目されることとして、OX40シグナルは、メモリーTh細胞をヘルパーになるように誘導する上で、IL-12シグナルよりも効率的であった（図12C）。これらの結果は、OX40L刺激が、Tfh様細胞に分化するようにナイーブTh細胞およびメモリーTh細胞を促すことを示している。
【０２２６】
以上を総合すると、これらの結果は、OX40シグナルが、複数種のTfh分子を発現するように、かつ機能的ヘルパーB細胞になるように、ヒトナイーブTh細胞およびメモリーTh細胞を誘導する固有の特性を示すことを示している。
【０２２７】
SLE患者由来の骨髄系APCはIL-21+Th細胞の生成をOX40L依存的な様式で促進する‐これらのデータは、OX40シグナルがSLEにおける異常なTfh応答の生成に寄与することを示唆する。このため、本出願人らは、活動性SLE患者からの血中OX40L+骨髄系APCが、Tfh分子を発現するようにTh細胞を誘導するか否かについて調べた。本出願人らは全CD14+単球を実験のために用いたが、これはOX40L+単球の単離が実行不能であったためである。CD14+単球を活動性および非活動性の成人SLE患者から単離して、同種異系ナイーブTh細胞とともに培養した。本出願人らは、活動性患者由来のCD14+単球が、非活動性SLE患者由来のものよりも効率的に、CXCR5+IL-21+T細胞になるようにナイーブTh細胞を誘導したことを見いだした（図13A）。CXCR5+IL-21+細胞の生成はOX40Lに大きく依存していたが、これはOX40-OX40L相互作用をOX40L中和性mAbで遮断することによってそれが強く阻害されたことによる（図13Bおよび13C）。その上、生成されたCXCR5+IL-21+細胞の数は、培養物におけるOX40L+単球の頻度と正に相関した（図13D）。
【０２２８】
以前の研究により、活動性SLE患者では、活動性表現型（ICOS+CXCR5+）を有する血中Tfh細胞の頻度の上昇が認められることが示されている（He et al., 2013；Simpson et al., 2010）。本出願人らは、この観察所見をこのコホートで確認することができた（図13E）。本出願人らはさらに、血中Tfh細胞の中でのICOS+細胞の頻度が、血中骨髄系APCの中でのOX40L+細胞の頻度と正に相関することも見いだした（図13F）。OX40L+ APCの頻度は血中Tfh細胞（全Th細胞におけるCXCR5+）の頻度とも正に相関したが（図22）、血中CXCR5- Th1細胞（CXCR3+CCR6-）、Th2細胞（CXCR3-CCR6-）、Th17（CXCR3-CCR6+）細胞の頻度とは全く相関を示さなかった（Morita et al., 2011）（図23）。以上を総合すると、これらの結果は、SLE患者由来のOX40Lを発現する骨髄系APCが、Tfh細胞の発生および／または活性化を促進することを示唆する。
【０２２９】
RNP／抗RNP ICは、TLR7活性化を通じてOX40L発現を促進する。本出願人らは、活動性SLE患者における骨髄系APCによるOX40L発現にどの機序が関与しているかと考えた。本出願人らは以前、SLE血清が、DCの特性を獲得するように単球を誘導することを実証した（Blanco et al., 2001）。このため、本出願人らは、SLE血清が、骨髄系APCによるOX40L発現を誘導する成分を含有する可能性があるという仮説を立てた。それにより、本出願人らは、SLE血清は正常単球上でのOX40L発現をさまざまなレベルで誘導したが、対照血清は誘導しなかったことを見いだした（図14A）。本出願人らは、自己核酸を含有する免疫複合体（IC）の関与を疑っているが、これはエンドソームの核酸センサーを通じてのAPCの活性化がSLEの病態において重要な役割を果たすためである（Barrat and Coffman, 2008）。事実、TLR7のアゴニストによる刺激は、OX40Lを発現するように正常単球を誘導したが、TLR9およびTLR3のアゴニストではそうではなかった（図14B）。SLE血清によるOX40L上方制御にTLR7が直接関与するか否かを検証するために、本出願人らは、特異的TLR7阻害物質IRS-661（Barrat et al., 2005）またはRNアーゼの存在下で、正常単球をSLE血清に曝露させた。TLR7阻害物質およびRNアーゼは両方とも、SLE血清がOX40L発現を誘導する能力を有意に低下させ（図14C；図24）、このことはRNAを含有するICが主な役割を果たすことを示唆する。この仮説に合致するように、本出願人らは、SLE血清中の抗リボ核タンパク質（RNP）抗体の存在は正常単球上のOX40L発現を促進する能力と関連しているが、抗DNA抗体はそうではないことを観察した（図14D）。
【０２３０】
RNP／抗RNP ICがOX40L発現に直接関与するか否かを検証するために、単球を抗RNP陰性SLE血清とともに培養し、精製IgGを含有するRNP／抗RNP ICを培養物中にスパイク投与した。本出願人らは、RNP／抗RNP ICの添加により、抗RNP陰性SLE血清がOX40L発現を促進させうるようになったことを見いだした（図14E）。TLR7特異的阻害物質の添加によってOX40Lの上方制御が無効化されたことから、この効果はTLR7依存性であった（図14E）。
【０２３１】
これらのデータは、RNP／抗RNP ICが、活動性SLEにおいて、骨髄系APCにおけるTLR7活性化を通じてOX40L発現を促進することを示している。
【０２３２】
自己反応性抗体の産生は、SLEを含む種々の自己免疫疾患の顕著な特徴である。本研究は、骨髄系APCによって発現されたOX40Lが、Tfh細胞の生成を促進することによってエリテマトーデス病態に寄与するという証拠を与えるものである。
【０２３３】
骨髄系APCによるOX40Lの発現は、活動性SLE患者における炎症組織のほかに、血中でも増大していた。活動性SLE患者の血中のOX40L+骨髄系APCの多くはCD14+CD16-およびCD14+CD16+単球集団に限局されていた。小児扁桃におけるOX40L+骨髄系APCも、多くはCD14+集団に限定されていた。血中単球集団上でのOX40L発現の増大は、敗血症の患者（Karulf et al., 2010）および慢性C型肝炎の患者（Zhang et al., 2013）でも報告されている。興味深いことに、いずれの疾患状態も、多くの場合に高γグロブリン血症と関連があることが知られている。これらの観察所見は、単球およびマクロファージが炎症環境においてOX40Lを上方制御し、抗体応答に寄与することを示唆する。
【０２３４】
自己核酸を含有するICの病因的役割は、SLEにおいて十分に確立されている。ICはTLR9およびTLR7を介して形質細胞様DCを活性化し、それらが大量のI型インターフェロンを産生するように誘導する（Lovgren et al., 2006）。I型IFN刺激は、TLR7を上方制御するように好中球を誘導し、それらがRNP／抗RNP ICに応答しうるようにする。続いて好中球が、pDCを活性化するDNA含有成分を産生する（Garcia-Romo et al., 2011；Lande et al., 2011）。RNP／抗RNP ICは、CD16+CD14dim単球集団も標的とし、これらの細胞が、TNF-α、IL-1およびCCL3を含む、内皮を障害させるサイトカインを産生するように誘導する（Cros et al., 2010）。これらの機序は自然免疫系を活性化して炎症を引き起こすが、本研究はRNP／抗RNP ICが適応免疫系も活性化することを示す。本発明者らは、RNP／抗RNP ICが、TLR7を介する単球／マクロファージによるOX40L発現に寄与することを見いだした。RNP／抗RNP IC-OX40L軸によって増大したTfh応答は、自己核酸に対するものを含む自己抗体の生成をさらに早める。したがって、RNP／抗RNP IC-OX40L軸は、SLEにおける自己抗体の生成の増幅ループをもたらすと考えられる。
【０２３５】
本発明者らは、OX40シグナルが、TCRシグナルおよびCD28シグナルと相伴って、CXCR5、IL-21およびBcl-6を含む複数のTfh分子を発現するようにナイーブTh細胞およびメモリーTh細胞を促進する一方で、Blimp-1の発現を抑制することを示した。本発明者らはまた、OX40シグナルおよびIL-12シグナルが、Tfh分子を発現するようにヒトナイーブTh細胞を誘導する上でほぼ等価に効率的であることも見いだした。その上、この2種のシグナルは、Th細胞によるIL-21発現の上方制御においても協働的に作用する。注目すべきこととして、OX40シグナルは、Tfh分子を発現するようにメモリーTh細胞を誘導する上でIL-12シグナルよりも強力であり、それらを効率的なヘルパーB細胞にするのに十分であった。これらの結果は、OX40シグナルが、Tfh系列に向けてのTh分化の動因となる固有の特性を示すことを示している。SLEにおける炎症組織中のOX40L発現性APCとの相互作用によって、メモリーT細胞をTfh細胞に分化するようにさせ、それによってインサイチューでのB細胞自己免疫応答を永続化させる可能性はある。しかしながら、ICOS、CD40L（Bossaller et al., 2006）、IL-12Rβ1鎖（Schmitt et al., 2013）およびSTAT3（Ma et al., 2012）に欠損のある対象におけるTfh応答およびGC応答の低下は、OX40シグナルがそれ自体ではこれらのシグナルの欠如を代償するのには不十分であることを示唆する。その上、OX40に欠損のある対象は、血中メモリーB細胞が少ないにもかかわらず、インビボで無傷の抗体応答を示しており（Byun et al., 2013）、このことはOX40シグナルが抗体応答が生じるのに不可欠でないことを指し示している。このため、本発明者らは、過剰なOX40シグナルはヒトにおいて異常なTfh応答および自己免疫を引き起こすと推測している。活動性SLE患者におけるICOS+血中Tfh細胞の頻度とOX40L+骨髄系APCの頻度との間の正の相関は、この仮説を裏づけるものである。
【０２３６】
初期のマウス研究により、OX40L刺激が、CXCR5の発現（Flynn et al., 1998）およびB細胞濾胞内へのそれらの遊走（Brocker et al., 1999；Fillatreau and Gray, 2003）を行うように、マウスのナイーブTh細胞を促進することが示されている。その上、OX40L-トランスジェニックマウスモデル（T細胞特異的な過剰発現）は、間質性肺炎、結腸炎および高レベルの抗核抗体を特徴とする自己免疫様疾患の発症を示した（Murata et al., 2002）。最近の研究では、sanroqueマウスにおけるRoquin遺伝子の突然変異がTh細胞上でのOX40の上方制御を引き起こすことが示されており、このことはTfh細胞の生成に対するOX40シグナルの積極的な役割を示唆する（Pratama et al., 2013；Vogel et al., 2013）。その一方で、少なくとも2件の研究で、OX40シグナルの欠如は、Th細胞によるCXCR5発現、Tfh分化、GC発生または抗体生成のいずれにも影響をおよぼさなかったと結論づけられている（Akiba et al., 2005；Kopf et al., 1999）。その上、アゴニスト性OX40 mAbによるインビボ治療は、急性ウイルス感染モデル（Boettler et al., 2013）およびリステリア感染モデル（Marriott et al., 2014において、マウスにおけるTfh細胞生成を阻害した。Boettler et al.は、インビトロでヒトTh細胞を用いた本発明者らの観察所見に反して、アゴニスト性抗OX40 mAbが、特異的Th細胞によるBlimp-1の発現増大を誘導する一方で、インビボでのBcl-6の発現は抑制したことを示している（Boettler et al., 2013）。OX40シグナルが、APC、微小環境およびTh細胞それ自体に由来する他の因子との協働作用によってTh分化を調節することに鑑みれば（Croft, 2010）、OX40シグナルが、Th細胞がAPCと相互作用する微小環境に応じてTfh細胞分化を促進するかまたは抑制することは可能である。別の可能性は、OX40シグナルが、ヒトTh細胞とマウスTh細胞との間で差異を伴ってTfh分子を誘導することである。
【０２３７】
本発明者らの結論は、自己免疫疾患におけるGWASでの所見によっても裏づけられる。TNFSF4（OX40Lをコードする）多型は、SLE（Cunninghame Graham et al., 2008；Delgado-Vega et al., 2009）ならびに他の自己免疫疾患、例えばシェーグレン症候群および関節リウマチ（Kim et al., 2014；Nordmark et al., 2011）に対する感受性を付与することが見いだされている。TNFSF4リスクアレルは、白人SLE患者における腎障害とも関連がある（Sanchez et al., 2011）。その上、TLR7遺伝子座でのコピー数の差異および／または多型が、SLE感受性と関連があることも示されている（Shen et al., 2010）。本研究は、RNPを含有するIC-OX40L-OX40軸およびTLR7を標的とする治療法が、自己抗体の発生に影響を及ぼし、それ故にヒトSLEに対して有益であるという根拠を与える。
【０２３８】
実施例3：GVHDの抑制に対する抗OX40Lのインビボ有効性
有害作用を伴わずに同種移植片が生着することが、移植の究極的な目標である。これまで数十年にわたって、多岐にわたる免疫抑制剤が開発され、移植手術を受ける患者に対して用いられてきた。しかし、そのような免疫抑制薬は、臓器、組織、および造血幹細胞（HPSC）の移植を受ける患者において長期にわたる同種反応の予防を保証するものではなかった。その結果、患者は、移植片宿主病（GVHD）のほか、生涯にわたって続く免疫抑制による重篤な副作用のために死亡する。
【０２３９】
このため、微生物病原体に対する宿主の免疫を弱めることなしにGVHDを予防する新規治療戦略の開発には特に重要性がある。抗OX40L抗体はヒトのキメラ現象に干渉しない。
【０２４０】
抗OX40L抗体はヒトのキメラ現象に干渉しない（図26A〜B）。続いて、抗OX40L抗体（クローン19A3、IgG2b）治療が動物モデルにおけるGVHDの抑制をもたらすか否かについて試験した。異種性GVHDマウスモデルにおいて、ヒトDCによって活性化されたヒトT細胞は疾患の主要な原因となる。15匹のNOGマウスに対して、ヒトPBMC（細胞1億個、静脈内）移植の前日にγ線照射を行った。マウスを3群に分け（マウス5〜6匹／群）、続いて200μgのqanアイソタイプ対照、2μgの抗OX40L（クローン19A3）または200μgの抗OX40L（クローン19A3）の投与を週3回行った。図25は、200μgの抗OX40Lを投与された動物個体がすべて第112日の時点で生存しており、一方、アイソタイプ対照を投与された動物個体はすべて、第42日までに死亡した（または健康上の有害な理由のために殺処理する必要があった）ことを示している。2μgの抗OX40Lを投与された動物個体の3分の2は第112日までに死亡し、3分の1は依然として生存していた。これらのデータは、抗OX40LがインビボでGVHDを抑制しうることを指し示している。
【０２４１】
本明細書において開示され、特許請求される方法のすべてを、本開示に鑑みて、不要な実験を行わずに構成して実行することができる。本発明の組成物および方法を好ましい態様に関して説明してきたが、方法に対して、および本明細書に記載の方法の段階または段階の順序において、本発明の概念、趣旨および範囲から逸脱することなく変更を加えることができることは当業者には明らかであろう。より具体的には、化学的にも生理学的にも関連しているある特定の剤を本明細書に記載の剤の代わりに用いることができ、その場合にも同一または類似の結果が得られることは明らかであろう。当業者に明らかなこれらすべての類似した置換物および改変物は、特許請求の範囲によって定義される本発明の趣旨、範囲および概念の範囲内にあると考えられる。
【０２４２】
参照文献
以下の参照文献は、本明細書に記載のものを補足する例示的な手順上の詳細または他の詳細を提供する範囲で、参照により本明細書に明確に組み入れられる。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【配列表】
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