(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下を含む、眼の角膜へ処置を適用するための組成物：
光活性化光への曝露に応答して角膜で架橋活性を生成する架橋剤（ここで、架橋剤はリボフラビンを含む）；
鉄添加物；及び
クエン酸緩衝液。
【請求項２】
少なくとも０．１％のリボフラビン及び少なくとも０．２５mMの鉄添加物を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
鉄添加物がＦｅＳＯ４を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
鉄添加物がクエン酸緩衝液に溶解される、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
光活性化光が紫外線である、請求項１に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本出願は、２０１４年１２月２日に出願された米国仮特許出願第６２／０８６，５７２号に対する優先権を主張するものであり、その内容は、参照によって本明細書に全体的に組み入れられる。
【０００２】
［背景］
分野
本開示は、眼の障害を処置するためのシステム及び方法、より特定すると、眼の架橋処置のためのシステム及び方法に関する。
【０００３】
関連技術の説明
架橋処置は、円錐角膜などの障害に罹患した眼を処置するために採用され得る。特に、円錐角膜は、角膜内の構造変化が角膜の脆弱化を引き起こし異常な円錐形へと変化させる、眼の変性障害である。架橋処置は、円錐角膜によって脆弱化した領域を強化及び安定化させ、かつ望ましくない形状変化を防止することができる。
【０００４】
架橋処置はまた、レーザー角膜内切削形成（Laser-Assisted in situ Keratomileusis）（ＬＡＳＩＫ）手術などの外科手術後に採用され得る。例として、ＬＡＳＩＫ後拡張症として公知の合併症が、ＬＡＳＩＫ手術によって引き起こされる角膜の菲薄化及び脆弱化に起因して起こり得る。ＬＡＳＩＫ後拡張症では、角膜は、進行性の前方突出（膨隆）を経験する。したがって、架橋処置は、ＬＡＳＩＫ手術後の角膜の構造を強化及び安定化させ、かつＬＡＳＩＫ後拡張症を防止することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
【図１】本開示の態様に係る、角膜コラーゲンの架橋を生成するために眼の角膜に架橋剤及び光活性化光を送達する例示的なシステムを解説する。
【図２Ａ】本開示の態様に係る、角膜の架橋処置の間に適用されるリボフラビン及び光活性化光（例えば、紫外線Ａ（ＵＶＡ））が関与する光化学速度論的反応のダイアグラムを解説する。
【図２Ｂ】本開示の態様に係る、角膜の架橋処置の間に適用されるリボフラビン及び光活性化光（例えば、紫外線Ａ（ＵＶＡ））が関与する光化学速度論的反応のダイアグラムを解説する。
【図３】本開示の態様に係る光化学速度論的反応のモデルを採用する例示的なシステムを解説する。
【図４】電子移動反応によるオキシダントの形成及び水素引き抜きによる可能な重合の開始に関するダイアグラムを解説する。
【図５】異なる溶液中濃度の鉄（ＩＩ）が架橋の間に適用された、非架橋対照（Ｆ／Ｆｏ）に相対的な４５０nmでの角膜消化物の蛍光を解説する。
【図６】以下で処置された、パパイン消化された角膜フラップの蛍光カウントを解説する：（１）ｄＨ２Ｏ；（２）Ｈ２Ｏ２；並びに（３）Ｈ２Ｏ２及び０．１％鉄（ＩＩ）。
【図７】以下についての４５０nmで記録された蛍光（未処置対照に相対的な）を解説する：（１）０．１％リボフラビン（無変調連続波（ＣＷ））；（２）０．１％リボフラビン＋０．５mM ＦｅＳＯ４（ＣＷ）；（３）０．１％リボフラビン（パルス波（ＰＷ）＋Ｏ２）；及び（４）０．１％リボフラビン＋０．５mM ＦｅＳＯ４（ＰＷ＋Ｏ２）。
【図８】以下についての張力学（tensiometry）によって測定された各角膜フラップの平均の力対変位を解説する：対照（１）に相対的な、０．１％リボフラビン（ＣＷ）（２）及び０．１％リボフラビン＋０．５mM ＦｅＳＯ４（ＣＷ）（３）。
【図９】対照（１）に相対的な、０．１％リボフラビン（ＰＷ＋Ｏ２）（２）及び０．１％リボフラビン＋０．５mM ＦｅＳＯ４（ＰＷ＋Ｏ２）（３）についての張力学によって測定された各角膜フラップの平均の力対変位を繰り返し実験で解説する。
【図１０】対照（１）に相対的な、０．１％リボフラビン（ＰＷ＋Ｏ２）（２）及び０．１％リボフラビン＋０．５mM ＦｅＳＯ４（ＰＷ＋Ｏ２）（３）についての張力学によって測定された各角膜フラップの平均の力対変位を繰り返し実験で解説する。
【図１１】リボフラビン及び一重項酸素からの２，３−ブタンジオンの形成についての機構を解説する。
【図１２】紫外線（ＵＶ）なし（左パネル）及びＵＶ線あり（右パネル）（３６５nm、３０mWで４分間）のｄＨ２Ｏ中の２，３−ブタンジオン（ＢＤ）の１％溶液で処置された角膜フラップの変位−力ダイアグラムを解説する。
【図１３】ＵＶ線あり及びなしのＢＤの１％溶液で処置された、パパイン消化された２００μm厚の角膜フラップからの４５０nmで記録された蛍光（未処置対照Ｆｏに相対的な）を解説する。
【図１４】ＵＶ線（３６５nm、３０mWで４分間）並びに：ｄＨ２Ｏ中のリボフラビンの０．１％溶液（２）；ｄＨ２Ｏ中の０．１％ＢＤ（４）；及びｄＨ２Ｏ中の０．１％リボフラビンと０．１％ＢＤの混合物（３）で処置された、対照（１）に相対的な角膜フラップの変位−力ダイアグラムを解説する。
【図１５】３０mW ＵＶＡで４分間、並びに：ｄＨ２Ｏ中のリボフラビンの０．１％溶液；ｄＨ２Ｏ中の０．１％ＢＤ；及びｄＨ２Ｏ中の０．１％リボフラビンと０．１％ＢＤの混合物で処置された、パパイン消化された２００μm厚の角膜フラップからの４５０nmで記録された蛍光（未処置対照Ｆｏに相対的な）を解説する。
【図１６】葉酸（ＦＡ）を解説する。
【図１７】プテリン−６−カルボン酸（ＰＣＡ）（ＦＡの光産物）を解説する。
【図１８】ＰＢＳ中の０．００１％ＦＡの吸収スペクトルを解説する。
【図１９】ＰＢＳ中の０．００１％ＦＡの蛍光スペクトルを解説する（励起３６０nm）。
【図２０】３６０nmでのリン酸緩衝液中のＦＡの吸光度を解説する。
【図２１】角膜試料の変位対力曲線を解説する：（１）ＵＶ線に曝露なし；（２）０．１％リボフラビン、ＵＶ線に曝露；（３）０．１％ＦＡ、ＵＶ線に曝露；及び（４）０．１％リボフラビンと０．１％ＦＡの混合物、ＵＶ線に曝露。ここで、ＵＶ曝露は３６５nm、３０mW/cm2、パルス１秒オン：１秒オフを合計８分間、角膜全体に酸素雰囲気。
【図２２】パパインで消化後の角膜試料の蛍光を解説する（励起３６０nm）：（１）ＵＶ線に曝露なし；（２）０．１％リボフラビン、ＵＶ線に曝露；（３）０．１％ＦＡ、ＵＶ線に曝露；及び（４）０．１％リボフラビンと０．１％ＦＡの混合物、ＵＶ線に曝露。ここで、ＵＶ曝露は３６５nm、３０mW/cm2、パルス１秒オン：１秒オフを合計８分間、角膜全体に酸素雰囲気。
【図２３】角膜試料の変位対力曲線を解説する（厚さ３００μm、各群に３試料）：（１）ＵＶ線に曝露なしの対照；（２）緩衝液中の０．１％ＦＡ、ＵＶ線に曝露；（３）緩衝生理食塩水中の０．１％リボフラビン、ＵＶ線に曝露；及び（４）緩衝生理食塩水中の０．１％リボフラビン中の０．１％ＦＡの混合物、ＵＶ線に曝露。ここで、ＵＶ曝露は３６５nm、３０mW/cm2、パルス１秒オン：１秒オフを合計８分間、角膜全体に酸素雰囲気。
【図２４】対照（１）に相対的な、３０mW/cm2（ＣＷ）で４分間の照射（２）並びに３０mW/cm2のパルスＵＶＡ線で８分間の照射（１秒オン：１秒オフ）及びＯ２（３）を伴う、ＰＢＳ中０．４％オラキンドックスに浸漬させた２００μm厚の角膜フラップの二軸伸縮学（biaxial extensiometry）を解説する。
【図２５】ＰＢＳ中０．４％オラキンドックスで架橋されたフラップの４５０nmで記録された相対蛍光を解説する：（１）照射なしの対照；（２）３０mW/cm2で連続的（ＣＷ）に４分間照射；並びに（３）：３０mW/cm2のパルスＵＶＡ線で８分間の照射（１秒オン：１秒オフ）及びＯ２。
【図２６】リボフラビン（Ａ）から１，２−ジヒドロ−６，７−ジメチル−２−ケト−１−Ｄ−リビチル−３−キノキサリン−カルボン酸（Ｂ）へのアルカリ加水分解を解説する。
【図２７】１２０℃で異なる時間量維持されたＢＢＢＳ中の０．１％リボフラビン−５−リン酸塩のＵＶ／Ｖｉｓスペクトルを解説する。
【図２８】４５０nmでの吸光度によって測定した場合のＢＢＢＳ中１２０℃でのリボフラビンの加水分解速度を解説する（０．１％溶液及び０．５％溶液、Ａ０は、加熱前の吸光度である）。
【図２９】残りのリボフラビンの吸光度を減算することによって図２７から得られたＵＶ／Ｖｉｓスペクトルを解説する。
【図３０】１２０℃で９０分後の加水分解溶液のスペクトル分析を解説する（残留リボフラビンの吸光度を、分析したスペクトルから減算した）。
【図３１】加水分解時間中の異なるピークの吸光度の変化を解説する。
【図３２】１，２−ジヒドロ−６，７−ジメチル−２−ケト−１−Ｄ−リビチル−３−キノキサリンカルボン酸一水和物のナトリウム塩２（リボフラビンの初期アルカリ分解産物）の合成を解説する。
【図３３】合成されたリボフラビン分解産物２のＮＭＲスペクトルを解説する。
【図３４】熱処理なしの緩衝血液バンク生理食塩水中の一リン酸化リボフラビン（５−ＦＭＮ）を解説する。
【図３５】熱処理の１時間後の緩衝血液バンク生理食塩水中の５−ＦＭＮを解説する。
【図３６】熱処理の２時間後の緩衝血液バンク生理食塩水中の５−ＦＭＮを解説する。
【図３７】熱処理の３時間後の緩衝血液バンク生理食塩水中の５−ＦＭＮを解説する。
【図３８】熱処理の４時間後の緩衝血液バンク生理食塩水中の５−ＦＭＮを解説する。
【図３９】合成されたリボフラビン分解産物２のＨＰＬＣトレースを解説する。
【図４０】熱的に加熱された（赤線）及び加熱なしの（青線）リボフラビン溶液の吸収スペクトルを解説する（２００μm光路長の石英キュベット中で記録）。
【図４１】図３４中の２つのスペクトル間の差を解説する。
【図４２】消化された角膜の蛍光を解説する：非架橋対照（黒線）、加熱なしの０．１％リボフラビンで架橋された（青線）、熱的に処理されたリボフラビン溶液で架橋された（赤線）。
【図４３】架橋された角膜試料の相対蛍光を解説する：赤−熱的に処理されたリボフラビン溶液を使用、青−加熱なしの０．１％リボフラビン溶液を使用。
【図４４】１，２−ジヒドロ−６，７−ジメチル−２−ケト−１−Ｄ−リビチル−３−キノキサリンカルボン酸一水和物のナトリウム塩を解説する。
【図４５】ＢＢＢＳ中の１，２−ジヒドロ−６，７−ジメチル−２−ケト−１−Ｄ−リビチル−３−キノキサリンカルボン酸一水和物のナトリウム塩の０．００１％溶液の吸光スペクトルを解説する（石英、１cm光路長）。
【図４６】３６０nmでの１，２−ジヒドロ−６，７−ジメチル−２−ケト−１−Ｄ−リビチル−３−キノキサリンカルボン酸一水和物のナトリウム塩のＵＶ吸光度を解説する（ＢＢＢＳ中の溶液、１cm光路長の石英キュベット）。
【図４７】ＢＢＢＳ溶液中の１，２−ジヒドロ−６，７−ジメチル−２−ケト−１−Ｄ−リビチル−３−キノキサリンカルボン酸一水和物のナトリウム塩の蛍光を解説する（励起３６０nm）。
【図４８】消化された角膜の蛍光を解説する：非架橋対照（黒線）、ＢＢＢＳ中の０．１％リボフラビンで架橋された（赤線）、０．１％の１，２−ジヒドロ−６，７−ジメチル−２−ケト−１−Ｄ−リビチル−３−キノキサリンカルボン酸一水和物のナトリウム塩で架橋された（青線）。
【図４９】消化された角膜フラップの蛍光を解説する：非架橋対照（黒線）、ＢＢＢＳ中の０．１％リボフラビンで架橋された（赤線）、０．１％の１，２−ジヒドロ−６，７−ジメチル−２−ケト−１−Ｄ−リビチル−３−キノキサリンカルボン酸一水和物のナトリウム塩で架橋された（青線）。
【図５０】３−ヒドロキシ−２−キノキサリンカルボン酸を解説する。
【図５１】３−ヒドロキシ−２−キノキサリンカルボン酸の吸光スペクトルを解説する。
【図５２】３６０nmの励起で記録された、ＢＢＢＳ中の異なる濃度の３−ヒドロキシ−２−キノキサリンカルボン酸の溶液の蛍光を解説する。
【図５３】非架橋対照（黒線）に相対的な、ＢＢＢＳ中の３−ヒドロキシ−２−キノキサリンカルボン酸の０．１７％（赤線）及び０．０１７％（青線）溶液で架橋された、パパイン消化された角膜フラップ（２００μm厚）の蛍光を解説する（上皮なし、浸漬時間２０分、３０mW/cm2で４分間）。
【図５４】０．１７％リボフラビン（赤線）及び０．１７％の３−ヒドロキシ−２−キノキサリンカルボン酸（３Ｈ２ＱＸＣＡ、緑線）で２０分間予備飽和された、３０mW/cm2で４分間照射された２００μm厚の角膜フラップの、非架橋対照（黒線）に相対的な張力学プロットを解説する。
【図５５】０．１％リボフラビン（青棒、溶液２）及びＢＢＢＳ中の３−ヒドロキシ−２−キノキサリンカルボン酸の０．０２％溶液を含有する０．１％リボフラビン（赤棒、溶液１）で架橋された、パパイン消化された角膜フラップ（２００μm厚）の相対蛍光を解説する（上皮なし、浸漬時間２０分、３０mW/cm2で４分間）。図中、Ｆ０−非架橋フラップの蛍光。
【図５６】４−メチル−３−オキソ−３，４−ジヒドロ−２−キノキサリンカルボン酸を解説する。
【図５７】ＢＢＢＳ中の４−メチル−３−オキソ−３，４−ジヒドロ−２−キノキサリンカルボン酸の０．０１mg/ml溶液の吸光スペクトルを解説する（石英、１cm光路長）。
【図５８】ＢＢＢＳ溶液中の４−メチル−３−オキソ−３，４−ジヒドロ−２−キノキサリンカルボン酸の蛍光を解説する（励起３６０nm）。
【図５９】パパイン消化された角膜フラップの蛍光を解説する：非架橋対照（黒線）、ＢＢＢＳ中の４−メチル−３−オキソ−３，４−ジヒドロ−２−キノキサリンカルボン酸の０．１mg/ml（赤線）及び１mg/ml（緑線）溶液で架橋された［ここで、角膜を上皮除去し、架橋剤の溶液で２０分間浸漬させ、次に、３０mW/cm2のＵＶＡ線（３６０nm）で４分間照射した］。
【図６０】ベンゼン環及びピラジン環からなる環複合体を含有する複素環式化合物としてのキノキサリン（ベンゾピラジンとも呼ばれる）を解説する。
【図６１】キノキサリン−２，３−ジチオン環状ジチオ−カルボナート（Morestan）及びトリチオカルボナート（Eradox）を解説する。
【図６２】メトトレキサートを解説する。
【図６３】メナジオン（ビタミンＫ３）を解説する。
【図６４】０．１％リボフラビン（緩衝生理食塩水）対０．１％リボフラビン（緩衝生理食塩水）＋０．２５mM 鉄＋０．５mM クエン酸緩衝液で架橋されたフラップの相対蛍光を解説する。
【図６５】０．１％リボフラビン（緩衝生理食塩水）対０．１％リボフラビン（緩衝生理食塩水）＋０．５mM 鉄＋０．２５mM クエン酸緩衝液で架橋されたフラップの相対蛍光を解説する。
【０００６】
本開示は種々の改変及び代替形態を受ける余地があるが、その具体的な実施態様が例として図面で示されており、本明細書において詳述される。しかしながら、本開示は、開示される特定の形態に限定されることを意図しておらず、それどころか、その意図は、本開示の精神の範囲内にある全ての改変物、等価物及び代替物を網羅することであると理解されるべきである。
【０００７】
概要
本開示の態様は、眼障害の処置のための架橋活性を生成する、システム、方法及び組成物を提供する。架橋処置のための種々の薬剤、添加物、緩衝液などが、例えば、本明細書に開示される研究において同定される。その種々の薬剤、添加物、緩衝液などの特徴は、架橋処置を増強するために架橋剤と共に製剤において採用され得る。
【０００８】
ある例示的な実施態様では、眼の角膜へ処置を適用するための組成物は、光活性化光への曝露に応答して角膜で架橋活性を生成する架橋剤を含む。該組成物はまた、鉄添加物及びクエン酸緩衝液を含む。いくつかの場合に、架橋剤は、リボフラビンを含み得る。他の場合に、鉄添加物は、ＦｅＳＯ４を含み得る。さらなる場合に、鉄添加物は、クエン酸緩衝液に溶解され得る。なお他の場合に、光活性化光は、紫外線であり得る。
【０００９】
別の例示的な実施態様では、眼の角膜へ処置を適用するための方法は、組成物を角膜へ適用することを含む。該組成物は、光活性化光への曝露に応答して角膜で架橋活性を生成する架橋剤を含む。該組成物はまた、鉄添加物及びクエン酸緩衝液を含む。該方法はまた、光活性化光を角膜に適用して、角膜で架橋活性を生成することを含む。いくつかの場合に、架橋剤は、リボフラビンを含み得る。他の場合に、鉄添加物は、ＦｅＳＯ４を含み得る。さらなる場合に、鉄添加物は、クエン酸緩衝液に溶解され得る。なお他の場合に、光活性化光は、紫外線であり得る。いくつかの場合に、光活性化光は、パルスされ得る。他の場合に、光活性化光は、連続波（Continuous Wave）であり得る。該方法は、選択された濃度の酸素を眼に適用することをさらに含み得、ここで、選択された濃度は、大気中の酸素の濃度より大きい。
【００１０】
説明
図１は、眼１の角膜２でコラーゲンの架橋を生成するためのある例示的な処置システム１００を解説する。処置システム１００は、架橋剤１３０を角膜２に適用するための適用器具１３２を含む。例示的な実施態様では、適用器具１３２は、光増感剤１３０を液滴として角膜２に適用する、点眼器、注射器などであり得る。架橋剤１３０は、架橋剤１３０が角膜上皮２ａを通過して角膜基質の下層領域２ｂに達することを可能にする製剤中に提供され得る。代替的に、角膜上皮２ａは、架橋剤１３０が下層組織により直接的に適用されるようにするために、除去され得るか又はそうでなければ切開され得る。
【００１１】
処置システム１００は、光源１１０、及び光を角膜２に指向させための光学素子１１２を含む。光は、架橋剤１３０の光活性化を引き起こして、角膜２で架橋活性を生成する。例えば、架橋剤は、リボフラビンを含み得、そして、光活性化光は、紫外線Ａ（ＵＶＡ）（例えば、３６５nm）であり得る。代替的に、光活性化光は、可視波長（例えば、４５２nm）などの別の波長を有し得る。さらに以下に記載の通り、角膜の架橋は、光化学速度論的反応の系に従って角膜組織内で化学結合を生み出すことによって、角膜強度を改善する。例として、円錐角膜又はＬＡＳＩＫ後拡張症などの疾患に対処するために、リボフラビン及び光活性化光が角膜組織を安定化及び／又は強化するために適用される。追加的に、さらに以下に記載の通り、種々の薬剤、添加物、緩衝液などが、架橋処置を増強するために架橋剤と共に製剤において採用され得る。
【００１２】
処置システム１００は、光源１１０及び／又は光学素子１１２を含むシステム１００の態様を制御する、１以上の制御器１２０を含む。ある実施では、角膜２は、架橋剤１３０でより広範に処置され得（例えば、点眼器、注射器などで）、そして、光源１１０からの光活性化光は、特定のパターンに従って、処置された角膜２の領域に選択的に指向させられ得る。
【００１３】
光学素子１１２は、光源１１０によって放出された光活性化光を角膜２上で特定のパターンに指向及び集束させるための、１以上のミラー又はレンズを含み得る。光学素子１１２は、光源１１０によって放出された光の波長を部分的に遮断するための及び架橋剤１３０を活性化するために角膜２に指向されるべき光の特定の波長を選択するための、フィルターをさらに含み得る。加えて、光学素子１１２は、光源１１０によって放出された光のビームを分割するための１以上のビームスプリッターを含み得、かつ、光源１１０によって放出された光を吸収するための１以上のヒートシンクを含み得る。光学素子１１２はまた、角膜２内の特定の焦点面に、例えば、架橋活性が望まれる下層領域２ｂの特定の深度で、正確にかつ精密に光活性化光を集束し得る。
【００１４】
さらに、光活性化光の具体的なレジームは、角膜２の選択された領域で所望の架橋度を達成するために調節され得る。以下の任意の組み合わせに従って光活性化光を精密に送達するために、１以上の制御器１２０が光源１１０及び／又は光学素子１１２の操作を制御するために使用され得る：波長、帯域幅、強度、電力、位置、浸透の深度及び／又は処置の期間（曝露サイクル及び暗サイクルの期間ならびに曝露サイクルと暗サイクル期間の比率）。
【００１５】
架橋剤１３０の光活性化に関するパラメーターは、例えば、所望の架橋を達成するのに必要な時間量を減少させるために、調整され得る。ある例示的な実施では、時間は、分〜秒で減少され得る。いくつかの構成は、光活性化光を５mW/cm2の放射照度で適用し得るが、例えば５mW/cm2の倍数のより大きな放射照度の光活性化光が、所望の架橋を達成するのに必要な時間を減少させるために適用され得る。角膜２で吸収されるエネルギーの総線量は、角膜上皮２ａの領域を通過して吸収されるエネルギーの量である有効線量として記載され得る。例えば、角膜表面２Ａの領域に対する有効線量は、例えば、５J/cm2、又は２０J/cm2又は３０J/cm2ほどのであり得る。記載される有効線量は、単回のエネルギー適用から、又は繰り返しのエネルギー適用から送達され得る。
【００１６】
処置システム１００の光学素子１１２は、光活性化光の適用を空間的かつ時間的に調節する、デジタルマイクロ−ミラーデバイス（ＤＭＤ）を含み得る。ＤＭＤ技術を使用して、光源１１０からの光活性化光は、半導体チップ上のマトリクスに配列された極めて微小なミラーによって生み出される正確な空間パターンで投射される。各ミラーは、投射光のパターンの１以上の画素を表す。ＤＭＤを用いて、トポグラフィーガイド架橋を行うことができる。トポグラフィーに従ったＤＭＤの制御は、いくつかの異なる空間的及び時間的な放射照度及び線量プロファイルを採用し得る。これらの空間的及び時間的な線量プロファイルは、連続波照明を使用して生み出され得るが、上述した通りの変動周波数及びデューティサイクルのレジーム下で照明源をパルシングすることによってパルス照明を介しても調節され得る。代替的に、ＤＭＤは、連続波照明を使用して最終的なフレキシビリティを与えるために、異なる周波数及びデューティサイクルを画素毎に調節することができる。あるいは代替的に、パルス照明及び調節されたＤＭＤ周波数の両方とデューティサイクルの組み合わせとが組み合わせられ得る。これは、特定量の空間的に決定された角膜の架橋を可能にする。この空間的に決定された架橋は、前処置計画ならびに／あるいは処置の間のリアルタイムモニタリング及び角膜架橋の調節のために、線量測定法、干渉測定法、光干渉断層撮影（ＯＣＴ）、角膜トポグラフィーなどと組み合わせられ得る。追加的に、前臨床患者の情報が、患者の具体的な前処置計画を生み出すために有限要素生物力学コンピューターモデリングと組み合わせられ得る。
【００１７】
光活性化光の送達の態様を制御するために、実施態様はまた多重光子励起顕微鏡の態様を採用し得る。特に、特定の波長の単一光子を角膜２に送達するよりはむしろ、処置システム１００は、架橋を開始するために組み合わせるより長い波長、すなわち、より低いエネルギーの複数の光子を送達し得る。有利なことに、より長い波長はより短い波長よりも低い度合で角膜２内で散乱し、これは、より長い波長の光がより短い波長の光よりも効率的に角膜２に浸透することを可能にする。また、光増感剤による光の吸収はより長い波長では極めて少ないため、角膜内のより深度における入射した照射光の遮蔽効果が従来の短い波長の照明よりも低減される。これは、深度特異的な架橋の増強された制御を可能にする。例えば、いくつかの実施態様において、２個の光子が採用され得る。その場合、それぞれの光子は、以下にさらに記載される光化学速度論的反応を生成する架橋剤１３０中の分子を励起するのに必要なエネルギーの約半分を持つ。架橋剤分子が両方の光子を同時に吸収するときに、角膜組織中に反応性ラジカルを放出するのに十分なエネルギーを吸収する。実施態様はまた、反応性ラジカルを放出するために、架橋剤分子が、例えば３、４又は５個の光子を同時に吸収しなければならないような、より低いエネルギーの光子を利用し得る。複数の光子をほぼ同時に吸収する可能性は低いため、高流束の励起光子が必要とされ得、そして、高流束がフェムト秒レーザーによって送達され得る。
【００１８】
多数の条件及びパラメーターが架橋剤１３０を用いた角膜コラーゲンの架橋に影響を与える。例えば、架橋剤１３０がリボフラビンであり、かつ光活性化光がＵＶＡ線である場合、放射照度及び線量の両方が架橋の量及び速度に影響を与える。ＵＶＡ線は、連続的に（連続波（ＣＷ））又はパルス光として適用され得、そして、この選択は、架橋の量、速度及び程度に影響を及ぼす。
【００１９】
ＵＶＡ線がパルス光として適用される場合、曝露サイクル及び暗サイクルの期間ならびに曝露サイクルと暗サイクル期間の比率が結果として生じる角膜補強に影響を及ぼす。パルス光照明は、同じ量又は線量の送達されるエネルギーで連続波照明により達成され得るよりも大きな又は小さな角膜組織の補強を生み出すために使用され得る。好適な長さ及び周波数の光パルスが、より最適な化学増幅を達成するために使用され得る。パルス光処置のために、オン／オフデューティサイクルは、およそ１０００／１〜およそ１／１０００の間であり得；放射照度は、およそ１mW/cm2〜およそ１０００mW/cm2の間の平均放射照度であり得、そして、パルス率は、およそ０．０１HZ〜およそ１０００Hzの間又はおよそ１０００Hz〜およそ１００，０００Hzであり得る。
【００２０】
処置システム１００は、ＤＭＤを採用すること、光源１１０をオン及びオフに電子的に切り替えること、並びに／あるいは、機械式若しくは光電式（例えば、ポッケルスセル）シャッター又は機械式チョッパー又は回転アパーチャを使用することによって、パルス光を生成し得る。ＤＭＤの画素特異的調節能、並びに、調節された周波数、デューティサイクル、放射照度及び角膜に送達される線量に基づく後続の剛性付与が理由で、複合的な生物力学的剛性パターンが、種々の量の屈折矯正を可能にするために角膜に付与され得る。これらの屈折矯正は、例えば、近視、遠視、乱視、不正乱視、老視、並びに、眼疾患（円錐角膜、ペルーシド角膜辺縁疾患、ＬＡＳＩＫ後拡張症など）及び角膜の生物力学的変質／変性などの他の疾患が理由の複合的な角膜の屈折面矯正の組み合わせを包含し得る。ＤＭＤシステム及び方法の具体的な利点は、ランダム化された非同期パルスのトポグラフィーパターニングを可能にし、２Hz〜８４Hzの間のパルス周波数に対する光過敏性てんかん発作又はフリッカーバーティゴを誘発する可能性を排除する、非周期的かつ均一に現れる照明を生み出すことである。
【００２１】
例示的な実施態様は、段階的なオン／オフパルス光の関数を採用し得るが、類似の効果を達成するために光を角膜に適用するための他の関数が採用され得ることが理解される。例えば、シヌソイド関数、のこぎり波関数、又は他の複素関数若しくは曲線、又は任意の関数若しくは曲線の組み合わせに従って、光が角膜に適用され得る。実際のところ、該関数は、実質的に段階的であり得、その場合、オン／オフ値の間により漸進的な移行が存在し得ることが理解される。加えて、放射照度は、オフサイクルの間にゼロ値まで減少する必要はなく、そして、オフサイクルの間にゼロを超え得ることが理解される。所望の効果は、２以上の値の間で放射照度が変動する曲線に従って角膜に光を適用することによって達成され得る。
【００２２】
光活性化光を送達するためのシステム及び方法の例は、例えば、２０１１年３月１８日に出願された「Systems and Methods for Applying and Monitoring Eye Therapy」という表題の米国特許出願公報第２０１１／０２３７９９９号、２０１２年４月３日に出願された「Systems and Methods for Applying and Monitoring Eye Therapy」という表題の米国特許出願公報第２０１２／０２１５１５５号、及び２０１３年３月１５日に出願された「Systems and Methods for Corneal Cross-Linking with Pulsed Light」という表題の米国特許出願公報第２０１３／０２４５５３６号に記載されており、これらの出願の内容は、参照によって本明細書に全体的に組み入れられる。
【００２３】
酸素の添加もまた角膜補強の量に影響を与える。ヒト組織では、Ｏ２含量は大気に比べはるかに低い。しかしながら、角膜における架橋速度は、光活性化光で照射される場合に、Ｏ２の濃度と関連性がある。それ故、照射の間にＯ２の濃度を積極的に増加又は減少させて、所望の量の架橋が達成されるまで、架橋速度を制御することが有利であり得る。酸素は、架橋処置の間に多くの異なる方法で適用され得る。１つのアプローチは、リボフラビンをＯ２で過飽和させることを包含する。したがって、リボフラビンが眼に適用されるときに、より高い濃度のＯ２が、リボフラビンと共に角膜に直接送達され、リボフラビンが光活性化光に曝露されるときにＯ２が関与する反応に影響を与える。別のアプローチによれば、角膜を選択された量のＯ２に曝露させてＯ２を角膜へ侵入させるために、角膜の表面で定常状態のＯ２（選択された濃度での）が維持され得る。図１に示される通り、例として、処置システム１００はまた、酸素源１４０、及び選択された濃度の酸素を角膜２に場合により送達する酸素送達デバイス１４２を含む。架橋処置の間に酸素を適用するためのシステム及び方法の例は、例えば、２０１０年１０月２１日に出願された「Eye Therapy」という表題の米国特許第８，５７４，２７７号、２０１２年１０月３１日に出願された「Systems and Methods for Corneal Cross-Linking with Pulsed Light」という表題の米国特許出願公報第２０１３／００６０１８７号に記載されており、これらの出願の内容は、参照によって本明細書に全体的に組み入れられる。
【００２４】
リボフラビンが放射エネルギー、特に光を吸収するとき、リボフラビンは光活性化を受ける。リボフラビン光活性化のための２つの光化学速度論的経路（Ｉ型及びＩＩ型）が存在する。Ｉ型機構とＩＩ型機構の両方に関与する反応のいくつかは以下の通りである：
【００２５】
共通の反応：
【数１】
0006674462.tif 000002
Ｉ型反応：
【数２】
0006674462.tif 000003
ＩＩ型反応：
【数３】
0006674462.tif 000004
【００２６】
本明細書に記載される反応では、Ｒｆは、基底状態のリボフラビンを表す。Ｒｆ＊１は、励起一重項状態のリボフラビンを表す。Ｒｆ＊３は、三重項励起状態のリボフラビンを表す。Ｒｆ・−は、リボフラビンの還元型ラジカルアニオン形態である。ＲｆＨ・は、リボフラビンのラジカル形態である。ＲｆＨ２は、リボフラビンの還元型形態である。ＤＨは、基質である。ＤＨ・＋は、中間ラジカルカチオンである。Ｄ・は、ラジカルである。Ｄｏｘは、基質の酸化型形態である。
【００２７】
リボフラビンは、反応（ｒ１）〜（ｒ３）に示される通りその三重項励起状態Ｒｆ＊３へと励起される。三重項励起状態Ｒｆ＊３から、リボフラビンは、一般にＩ型又はＩＩ型機構に従ってさらに反応する。Ｉ型機構では、基質が励起状態のリボフラビンと反応して、水素原子又は電子移動によってそれぞれラジカル又はラジカルイオンを生成する。ＩＩ型機構では、励起状態のリボフラビンが酸素と反応して、一重項分子酸素を形成する。次いで、一重項分子酸素が、組織上に作用して、追加の架橋された結合を産生する。
【００２８】
角膜中の酸素濃度は、ＵＶＡ放射照度及び温度によって調節され、ＵＶＡ曝露の開始時に素早く減少する。特定のデューティサイクル、周波数及び放射照度のパルス光を利用して、Ｉ型及びＩＩ型の両方の光化学速度論的機構からの入力を採用し、より大きな光化学的効率を達成することができる。さらに、パルス光を利用することは、リボフラビンが関与する反応速度を調節することを可能にする。反応速度は、必要に応じて、放射照度、線量、オン／オフデューティサイクル、リボフラビン濃度、浸漬時間などのパラメーターの１つを調節することによって増加又は減少され得る。さらに、反応及び架橋の速度に影響を与える追加の成分が角膜に添加され得る。
【００２９】
酸素枯渇後直ちにＵＶＡ照射が停止されるならば、酸素濃度の増加（補給）を始める。酸素は、ラジカル種と相互作用して鎖終結過酸化物分子を形成することによってフリーラジカル光重合反応を阻害することが可能であるので、過剰な酸素は、角膜の架橋プロセスにおいて有害であり得る。パルス率、放射照度、線量及び他のパラメーターが、より最適な酸素再生速度を達成するために調整され得る。酸素再生速度を計算及び調整することは、所望の量の角膜補強を達成するために反応パラメーターを調整する別の例である。
【００３０】
酸素含量は、酸素の拡散が反応の速度論に対応することが可能な非常に薄い角膜層を除き、種々の化学反応によって角膜全体にわたって枯渇され得る。この拡散が制御される領域は、酸素を摂取する基質の反応能が減少するにつれて、角膜内へより深く漸進的に移動するだろう。
【００３１】
リボフラビンは、放射照度が増加するにつれて大幅に、可逆的若しくは不可逆的に還元（不活化）されるか及び／又は光分解される。光子最適化は、還元型リボフラビンをＩ型反応で基底状態のリボフラビンに戻すことによって達成され得る。還元型リボフラビンがＩ型反応で基底状態に戻る速度は、多くの因子によって決定される。これらの因子は、限定されないが、パルス光処置のオン／オフデューティサイクル、パルス率周波数、放射照度及び線量を含む。さらに、リボフラビン濃度、浸漬時間及び他の薬剤（酸化剤を含む）の添加は、酸素の摂取速度に影響を与える。これらのならびにデューティサイクル、パルス率周波数、放射照度及び線量を含む他のパラメーターは、より最適な光子効率を達成するために、かつ、リボフラビン光増感のためのＩ型及びＩＩ型の両方の光化学速度論的機構を効率的に使用するために、選択され得る。さらに、これらのパラメーターは、より最適な化学増幅効果を達成するように選択され得る。
【００３２】
しかしながら、上記の光化学速度論的反応（ｒ１）〜（ｒ８）に加えて、本発明者等は、またリボフラビン光活性化の間に起こる以下の光化学速度論的反応（ｒ９）〜（ｒ２６）を同定した：
【数４】
0006674462.tif 000005
【００３３】
図２Ａは、上記の反応（ｒ１）〜（ｒ２６）に提供される光化学速度論的反応のダイアグラムを解説する。ダイアグラムは、ＵＶＡ光活性化光下のリボフラビン（Ｒｆ）の光化学的変換及び電子移動を介した種々のドナー（ＤＨ）とのその相互作用をまとめる。示される通り、架橋活性は、（Ａ）反応（ｒ６）〜（ｒ８）で一重項酸素の存在を通して（ＩＩ型機構）；（Ｂ）反応（ｒ４）及び（ｒ１７）で酸素を使用することなく（Ｉ型機構）；並びに（Ｃ）反応（ｒ１３）〜（ｒ１７）で過酸化物（Ｈ２Ｏ２）、スーパーオキシド（Ｏ２−）及びヒドロキシルラジカル（・ＯＨ）の存在を通して起こる。
【００３４】
図２Ａに示される通り、本発明者等はまた、過酸化物、スーパーオキシド及びヒドロキシルラジカルが関与する反応から、より大きな程度で架橋活性が生成されることを決定した。一重項酸素が関与する反応から及び非酸素反応からは、より小さな程度で架橋活性が生成される。反応（ｒ１）〜（ｒ２６）に基づくいくつかのモデルは、それぞれの反応によって生成された架橋活性のレベルを説明し得る。例として、架橋活性の生成において一重項酸素がより小さな役割を担う場合、モデルは、一重項酸素から生じる架橋活性を一定として処理することによって単純化され得る。
【００３５】
反応は全て、反応（ｒ１）〜（ｒ３）に提供される通りＲｆ３＊から開始する。Ｒｆ３＊のクエンチングは、反応（ｒ１０）で基底状態のＲｆとの化学反応を通して、かつ反応（ｒ９）で水との相互作用による不活性化を通して起こる。
【００３６】
上述した通り、過剰な酸素は、角膜の架橋プロセスにおいて有害であり得る。図２Ａに示される通り、該システムが光子制限及び酸素豊富になるとき、架橋は、スーパーオキシド、過酸化物及びヒドロキシルラジカルが関与するさらなる反応から破壊され得る。実際に、いくつかの場合に、過剰な酸素は、正味の架橋の破壊対架橋の生成をもたらし得る。
【００３７】
上述した通り、多種多様な因子が、架橋反応の速度及び架橋に起因して達成される生物力学的剛性の量に影響を与える。多くのこれらの因子は、ある因子を変化させることが別の因子に予期しない効果を及ぼし得るような相互関係にある。しかしながら、架橋処置のための異なる因子間の関係を理解するためのより包括的なモデルが、上に特定される光化学速度論的反応（ｒ１）〜（ｒ２６）によって提供される。したがって、酸素動力学及び架橋活性の統一的記述を提供するこの光化学速度論的架橋モデルに従って、システム及び方法は架橋処置のための種々のパラメーターを調整することができる。該モデルは、処置パラメーターの異なる組み合わせに基づく期待される成果を評価するため、かつ、所望の結果を提供する処置パラメーターの組み合わせを特定するために採用され得る。パラメーターは、例えば、限定されないが、以下を含み得る：適用される架橋剤の濃度（複数）及び／又は浸漬時間；光活性化光の線量（複数）、波長（複数）、放射照度（複数）、期間（複数）及び／又はオン／オフデューティサイクル（複数）；組織の酸素化条件；並びに／あるいは追加の薬剤及び溶液の存在。
【００３８】
反応（ｒ１）〜（ｒ２６）の態様に基づくモデルが、架橋活性を評価する少なくとも５つの異なる方法によって検証されている：
・酸素枯渇実験
・非線形の光学顕微鏡蛍光実験
・パパイン消化法実験に基づく蛍光データ
・角膜基質の境界線相関実験
・ブリルアン顕微鏡実験（Brillouin microscopy experiements）
【００３９】
これらの評価は、例えば、２０１５年１０月２７日に出願されたＰＣＴ国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１５／５７６２８号、及び２０１５年１１月１４日に出願された米国仮特許出願第６２／２５５，４５２号に記載されており、これらの出願の内容は、参照によって本明細書に全体的に組み入れられる。
【００４０】
図３は、上に特定される光化学速度論的反応（ｒ１）〜（ｒ２６）に基づくモデルを採用する、例示的なシステム１００を解説する。制御器１２０は、プロセッサー１２２及びコンピュータ可読記憶媒体１２４を含む。記憶媒体１２４は、光源１１０からの光活性化光が架橋剤で処置される角膜の選択された領域に送達される場合の、架橋の量を決定するためのプログラム命令を記憶する。特に、反応（ｒ１）〜（ｒ２６）に基づく光化学速度論的モデル１２６は、過酸化物、スーパーオキシド、ヒドロキシルラジカル及び／又は一重項酸素の組み合わせを含む反応性酸素種（ＲＯＳ）が関与する反応から生じる架橋を決定するための第一のセットのプログラム命令Ａ、並びに酸素が関与しない反応からの架橋を決定するための第二のセットのプログラム命令Ｂを含み得る。制御器１２０は、処置パラメーター及び／又は他の関連する情報に関する入力を受け取る。次いで、制御器１２０は、プログラム命令Ａ及びＢを実行して、入力に基づく角膜の選択された領域についての３次元架橋分布（複数）に関する情報を出力することができる。次いで、３次元架橋分布（複数）が採用され、角膜の選択された領域における所望の処置を達成するために、光源１１０、光学素子１１２、架橋剤１３０、適用器具１３２、酸素源１４０及び／又は酸素送達デバイス１４２の態様をどのように制御するかが決定され得る。（当然ながら、図３に示されるシステム１００及びこのプロセスは、同じ角膜の２以上の選択された領域の処置に使用され得る）。
【００４１】
１つの実施によれば、３次元架橋分布（複数）は、角膜の選択された領域における架橋及び反応性酸素種の効果に起因する治癒応答に対応する深度閾値を計算するために評価され得る。追加的に又は代替的に、３次元架橋分布（複数）は、角膜の選択された領域における生物力学的組織応答に対応する生物力学的組織剛性の深度閾値を計算するために評価され得る。角膜における治癒応答及び／又は生物力学的組織剛性の深度に関する情報は、光源１１０、光学素子１１２、架橋剤１３０、適用器具１３２、酸素源１４０及び／又は酸素送達デバイス１４２の態様をどのように制御するかを決定するために採用され得る。特定の治癒応答及び／又は生物力学的組織剛性が角膜の特定の深度で望ましい場合もあれば、望ましくない場合もある。
【００４２】
上述した通り、図２Ａ〜Ｂは、角膜の架橋処置の間に適用されるリボフラビン及び光活性化光（例えば、紫外線Ａ（ＵＶＡ））が関与する光化学速度論的反応のダイアグラムを解説する。しかしながら、図２Ａ〜Ｂに示される反応で生成されるスーパーオキシドアニオンが全て反応全体で消費されるわけではない。スーパーオキシドアニオン（その共役酸と平衡状態にある）は、図４のダイアグラムに示される通り、過酸化水素、その後ヒドロキシルラジカルを産生することができる。特に、図４は、電子移動反応によるオキシダントの形成及び水素引き抜きによる可能な重合の開始を示す。図４中の異なる反応性酸素種（ＲＯＳ）のコラーゲンに対する作用の全体像は複雑である。スーパーオキシドアニオンは、それほど反応性ではないが、コラーゲンを分解することが可能である。反対に、ヒドロキシルラジカルは単独でタンパク質凝集を誘導することが可能である。ヒドロキシルラジカルは、タンパク質に対してだけでなく重合の開始剤であると見なされる。しかしながら、ヒドロキシルラジカルとスーパーオキシドアニオンの混合物（前者が過剰）は、タンパク質の分解を刺激する。
【００４３】
図４は、過酸化水素がヒドロキシルラジカルの直接前駆体であることを立証している。ヒドロキシルラジカルの濃度を増加させ、コラーゲンの架橋を加速させるために、過酸化水素の分解が加速され得る。そのようにするための１つの方法は、フェントンの反応を採用することを包含する：
Ｈ２Ｏ２＋Ｆｅ（ＩＩ）→ＯＨ−＋ＯＨ・＋Ｆｅ（ＩＩＩ）
【００４４】
溶液中のＦｅ（ＩＩ）の濃度は、Ｆｅ（ＩＩＩ）がスーパーオキシドアニオンと反応してＦｅ（ＩＩ）を再生するためにそれほど高くない：
Ｆｅ（ＩＩＩ）＋Ｏ２・−→Ｏ２＋Ｆｅ（ＩＩ）
【００４５】
さらに、Ｆｅ（ＩＩＩ）のヒドロキシ複合体は、ＵＶ線で照射されると、Ｆｅ（ＩＩ）へと光化学的に還元する。この光還元の間に生成されたヒドロキシルラジカルは追加のボーナスである：
Ｆｅ（ＩＩＩ）−ＯＨ＋（ＵＶ線）→Ｆｅ（ＩＩ）＋ＯＨ・
【００４６】
鉄の代わりに銅イオンを使用することができ、そして、それは、この条件下でコラーゲンの架橋が観察される有望な兆しである。
【００４７】
リボフラビン製剤への鉄又は銅などの微量な金属の添加は、ＵＶ線での角膜コラーゲンの架橋を増強する。反応性酸素及び窒素種の形成を媒介し得る他の金属は、例えば以下を含む：マンガン、クロム、バナジウム、アルミニウム、コバルト、水銀、カドミウム、ニッケル又はヒ素。
【００４８】
一般に、架橋処置のための種々の薬剤、添加物、緩衝液などが以下の研究で同定される。その種々の薬剤、添加物、緩衝液などの特徴は、架橋処置を増強するために架橋剤と共に製剤において採用され得る。
【００４９】
リボルファビン（Ribolfavin）及び鉄（ＩＩ）を用いた架橋
以下の研究は、リボフラビン溶液中の鉄（ＩＩ）の存在下が、架橋活性の指標となるコラーゲン関連蛍光をどのように増強するかを立証するための調査を実施した。
【００５０】
Ａ．材料及び方法
上皮除去された眼を、３７℃に設定したインキュベーター内、角膜の上部に溶液を保持するゴムリングを使用することによって、ｄＨ２Ｏ中０．１％リボフラビンのみ、又はｄＨ２Ｏ中０．１％リボフラビン中の１mM ＦｅＳＯ４（硫酸鉄（ＩＩ））で２０分間浸漬した。角膜に、酸素を満たしたシリンダー内、トップハットビーム（３％二乗平均平方根）を８分間（総線量７．２Ｊ）、３６５nm光源（パルシング１秒オン、１秒オフ）（UV LED NCSU033B[T]; Nichia Co., Tokushima, Japan）を用いて選択された放射照度（３０mW/cm2）で全角膜的に照射し、放射照度は角膜表面で電力センサー（モデルPD-300-UV; Ophir, Inc., Jerusalem, Israel）によって測定した。照射の開始前、酸素の曝露は２分間であった。角膜フラップ（およそ２００μm厚）を、Intralaseフェムト秒レーザー（Abbot Medical Optics, Santa Ana, CA）を活用して眼から切除した。角膜フラップの平均厚を、ultrasonic Pachymeter（DGH TECHNOLOGY, Exton, PA）を用いて眼からの切除の前後の測定値間の差として計算した。該フラップを蒸留水で２回洗浄し、濾紙で乾燥させ、ｄＨ２Ｏで２回洗浄し、次いで、重量変化が１０％未満になるまで真空中で乾燥させた（Rotary vane vacuum pump RV3 A652-01-903, BOC Edwards, West Sussex, UK）。各フラップを、パパイン緩衝液［ＢＢＢＳ（ｐＨ７．０〜７．２）、２mM Ｌ−システイン及び２mM ＥＤＴＡ］１ml中、２．５ユニット／mlのパパイン（Papaya latex, Sigmaから）を用いて６５℃で２．５時間消化した。パパイン消化物を、２２００×Ｇで５秒間遠心分離し（Mini centrifuge 05-090-100, Fisher Scientific）、ＢＢＢＳで０．５倍希釈し、そして、QM-40 Spectrofluorometer（Photon Technology Int., London, Ontario, Canada）でλｅｘ＝３６０nmの励起によって溶液の蛍光を測定した。組織の非存在下で蛍光を測定し、試料の蛍光からこの値を減算することによって、パパイン緩衝液の蛍光を考慮に入れた。
【００５１】
パパイン消化蛍光を使用してコラーゲン中の非酵素的架橋密度を以前に定量化したので、この方法を使用した。蛍光と増加する架橋活性との間には線形関係がある。
【００５２】
Ｂ．結果／結論
図５は、異なる溶液中濃度の鉄（ＩＩ）が架橋の間に適用された、非架橋対照（Ｆ／Ｆｏ）に相対的な４５０nmでの角膜消化物の蛍光を解説する。図５中の結果が示す通り、リボフラビン溶液中の鉄（ＩＩ）の存在は、ＵＶＡ線への曝露後の４５０nmでのコラーゲン関連蛍光（架橋活性の指標となる）を増強する。
【００５３】
過酸化水素及び鉄（ＩＩ）を用いた架橋
以下の研究は、過酸化水素の前浸漬と共に、ＦｅＳＯ４溶液から作った０．１％鉄（ＩＩ）溶液を使用した、角膜の架橋を試験するための調査を実施した。
【００５４】
Ａ．材料及び方法
ブタの眼を畜殺場（SiouxPreme, Sioux City, IA）から一晩かけて氷上輸送し、生理食塩水中ですすいだ。眼は、実験時点で数日齢であった。眼を清浄し、上皮を除去した。角膜フラップ（およそ２００μm厚）を、Intralaseフェムト秒レーザー（Abbot Medical Optics, Santa Ana, CA）を活用して眼から切除した。角膜フラップの平均厚を、ultrasonic Pachymeter（DGH TECHNOLOGY, Exton, PA）を用いて眼からの切除の前後の測定値間の差として計算した。
【００５５】
角膜フラップを、蒸留水又は希釈Ｈ２Ｏ２（１％）のいずれかで２０分間浸漬した。Ｈ２Ｏ２中に浸漬させたフラップを、蒸留水で２回すすぐか、又は、Ｈ２Ｏ２から取り出し、蒸留水中の０．１％ＦｅＳＯ４溶液中にさらに２０分間入れ、浸漬後蒸留水で２回すすいだ。重量変化が１０％未満になるまでフラップを真空中で乾燥させた（Rotary vane vacuum pump RV3 A652-01-903, BOC Edwards, West Sussex, UK）。各フラップを、パパイン緩衝液［ＢＢＢＳ（ｐＨ７．０〜７．２）、２mM Ｌ−システイン及び２mM ＥＤＴＡ］１ml中、２．５ユニット／mlのパパイン（Papaya latex, Sigmaから）を用いて６５℃で２．５時間消化した。パパイン消化物を、２２００×Ｇで５秒間遠心分離し（Mini centrifuge 05-090-100, Fisher Scientific）、ＢＢＢＳで０．５倍希釈し、そして、QM-40 Spectrofluorometer（Photon Technology Int., London, Ontario, Canada）でλｅｘ＝３６０nmの励起によって溶液の蛍光を測定した。組織の非存在下で蛍光を測定し、試料の蛍光からこの値を減算することによって、パパイン緩衝液の蛍光を考慮に入れた。
【００５６】
処置：
対照：角膜フラップを１．５mLのエッペンドルフチューブに入れ、ｄＨ２Ｏで２０分間浸漬させた。
Ｈ２Ｏ２：角膜フラップを１．５mLのエッペンドルフチューブに入れ、１％Ｈ２Ｏ２で２０分間浸漬させた。乾燥前に角膜フラップをｄＨ２Ｏで２回すすいだ。
Ｈ２Ｏ２＋鉄（ＩＩ）：角膜フラップを１．５mLのエッペンドルフチューブに入れ、１％Ｈ２Ｏ２で２０分間浸漬させた。フラップを元のチューブから取り出し、ｄＨ２Ｏ中０．１％鉄（ＩＩ）溶液と共に新規のエッペンドルフチューブに２０分間移した。乾燥前にフラップをｄＨ２Ｏで２回すすいだ。
【００５７】
Ｂ．結果／結論
図６は、以下で処置された、パパイン消化された角膜フラップの蛍光カウントを解説する：（１）ｄＨ２Ｏ；（２）Ｈ２Ｏ２；並びに（３）Ｈ２Ｏ２及び０．１％鉄（ＩＩ）。図６中の結果が示す通り、Ｈ２Ｏ２＋０．１％鉄（ＩＩ）条件についての蛍光パターンは、正常な架橋パターンと類似している。これは、フラップをＨ２Ｏ２後に鉄溶液に入れた場合に架橋が起こり、フラップをＨ２Ｏ２のみに曝露させた場合では架橋が起こらないことを実証している。
【００５８】
リボフラビン及び鉄（ＩＩ）を用いたさらなる架橋
以下の研究は、角膜コラーゲンの架橋に及ぼすｄＨ２Ｏ中０．１％リボフラビン中の０．５mM ＦｅＳＯ４の効果を調べた。試料を、ＵＶＡで連続的に照射するか、又は酸素と共にパルスＵＶＡで照射した。以下の記述は、２つの別々の実験日のデータを組み合わせている。
【００５９】
Ａ．材料及び方法
ブタの眼を畜殺場（SiouxPreme, Sioux City, IA）から一晩かけて氷上輸送し、生理食塩水中ですすいだ。眼を清浄し、上皮を除去した。眼を、３７℃に設定したインキュベーター内、上部に溶液を保持するゴムリングを使用することによって、ｄＨ２Ｏ、ｄＨ２Ｏ中の０．１％リボフラビン、又はｄＨ２Ｏ中０．１％リボフラビン中の０．５mM ＦｅＳＯ４で２０分間浸漬した。特定の場合には、照射前にインキュベーションチャンバー内で、眼をビーカーに軽酸素流と共に２分間入れた。角膜に、トップハットビーム（３％二乗平均平方根）を選択した時間（４又は８分間）、３６５nm光源（UV LED NCSU033B[T]; Nichia Co., Tokushima, Japan）を用いて選択された放射照度（３０mW/cm2、パルス又は非パルス）で全角膜的に照射し、放射照度は角膜表面で電力センサー（モデルPD-300-UV; Ophir, Inc., Jerusalem, Israel）によって測定した。角膜フラップ（およそ２００μm厚）を、Intralaseフェムト秒レーザー（Abbot Medical Optics, Santa Ana, CA）を活用して眼から切除した。角膜フラップの平均厚を、ultrasonic Pachymeter（DGH TECHNOLOGY, Exton, PA）を用いて眼からの切除の前後の測定値間の差として計算した。該フラップを、全体が３mm幅の５タインを有するbiorakeアタッチメントを使用して二軸伸縮計（CellScale Biotester 5000, Waterloo, ON）内に入れた。各試料を、生理食塩水中３７℃で、４μm/sの一定速度で試料が破損するまで伸長させた。該フラップを蒸留水で２回洗浄し、濾紙で乾燥させ、ｄＨ２Ｏで２回洗浄し、次いで、重量変化が１０％未満になるまで真空中で乾燥させた（Rotary vane vacuum pump RV3 A652-01-903, BOC Edwards, West Sussex, UK）。各フラップを、パパイン緩衝液［ＢＢＢＳ（ｐＨ７．０〜７．２）、２mM Ｌ−システイン及び２mM ＥＤＴＡ］１ml中、２．５ユニット／mlのパパイン（Papaya latex, Sigmaから）を用いて６５℃で２．５時間消化した。パパイン消化物を、２２００×Ｇで５秒間遠心分離し（Mini centrifuge 05-090-100, Fisher Scientific）、１×ＢＢＢＳで０．５倍希釈し、そして、QM-40 Spectrofluorometer（Photon Technology Int., London, Ontario, Canada）でλｅｘ＝３６０nmの励起によって溶液の蛍光を測定した。組織の非存在下で蛍光を測定し、試料の蛍光からこの値を減算することによって、パパイン緩衝液の蛍光を考慮に入れた。
【００６０】
処置：
対照：ｄＨ２Ｏ中に浸漬した後、角膜フラップをおよそ２００μmにカットした。
０．１％リボフラビン、ＣＷ：０．１％リボフラビン中に浸漬した後、眼に、３０mW/cm2のＵＶＡ線を連続波（ＣＷ）で４分間照らした。角膜フラップをおよそ２００μmにカットした。
０．１％リボフラビン＋
０．５mM ＦｅＳＯ４、ＣＷ：０．１％リボフラビン＋０．５mM ＦｅＳＯ４中に浸漬した後、眼に、３０mW/cm2のＵＶＡ線を連続波（ＣＷ）で４分間照らした。角膜フラップをおよそ２００μmにカットした。
０．１％リボフラビン、
ＰＷ＋Ｏ２：０．１％リボフラビン中に浸漬した後、眼をビーカーに酸素流と共に２分間入れ、次いで、３０mW/cm2のパルスＵＶＡ線を８分間照らした（１秒オン：１秒オフ）（パルス波（ＰＷ））。曝露時間中、ビーカーに酸素を連続的に供給した。角膜フラップをおよそ２００μmにカットした。
０．１％リボフラビン＋
０．５mM ＦｅＳＯ４、
ＰＷ＋Ｏ２：０．１％リボフラビン＋０．５mM ＦｅＳＯ４中に浸漬した後、眼をビーカーに酸素流と共に２分間入れ、次いで、３０mW/cm2のパルスＵＶＡ線を８分間照らした（１秒オン：１秒オフ）（パルス波（ＰＷ））。曝露時間中、ビーカーに酸素を連続的に供給した。角膜フラップをおよそ２００μmにカットした。．
【００６１】
Ｂ．結果
図７は、以下についての４５０nmで記録された蛍光（未処置対照に相対的な）を解説する：（１）０．１％リボフラビン（連続波（ＣＷ））；（２）０．１％リボフラビン＋０．５mM ＦｅＳＯ４（ＣＷ）；（３）０．１％リボフラビン（パルス波（ＰＷ）＋Ｏ２）；及び（４）０．１％リボフラビン＋０．５mM ＦｅＳＯ４（ＰＷ＋Ｏ２）。
【００６２】
図８は、以下についての張力学によって測定された各角膜フラップの平均の力対変位を解説する：対照（１）に相対的な、０．１％リボフラビン（ＣＷ）（２）及び０．１％リボフラビン＋０．5mM ＦｅＳＯ４（ＣＷ）（３）。
【００６３】
図７〜８は、対照（１）に相対的な、０．１％リボフラビン（ＰＷ＋Ｏ２）（２）及び０．１％リボフラビン＋０．５mM ＦｅＳＯ４（ＰＷ＋Ｏ２）（３）についての張力学によって測定された各角膜フラップの平均の力対変位を繰り返し実験で解説する。
【００６４】
Ｃ．結論
２つの方法を使用して、角膜フラップにおける角膜の架橋を決定した。第一に、パパイン消化結果は、ＦｅＳＯ４を添加した連続（ＣＷ）及びパルシング（ＰＷ）＋Ｏ２の両条件下で蛍光の増加を示す。第二の方法、張力学は、ＦｅＳＯ４を加えた場合にＰＷ＋Ｏ２条件で二軸張力学の増加を唯一提示した。
【００６５】
図７の相対蛍光グラフは、ＦｅＳＯ４を０．１％リボフラビンに加えた場合並びにＵＶＡ適用を連続投与から酸素を伴うパルス投与に変化させた場合に、蛍光カウントの増加を示す。
【００６６】
図８は、連続ＵＶＡ投与処置群からの張力学の結果を示す。０．１％リボフラビン群及び０．１％リボフラビン＋０．５mM ＦｅＳＯ４群の両方は、変位が増加するにつれて類似の力と変位間の相互関係を提示する。両群は、対照群よりも高い。
【００６７】
図９及び１０は、酸素を伴うパルスＵＶＡ適用処置群からの張力学の結果を示す。０．１％リボフラビン＋０．５mM ＦｅＳＯ４群は、変位が増加するにつれてわずかに大きい力を示す。力の増加は、ＣＷ処置群での増加よりもＰＷ＋Ｏ２処置群で大きかった。
【００６８】
クエン酸緩衝液に溶解した鉄（ＩＩ）を伴うリボフラビンを用いた架橋
以下の研究は、緩衝生理食塩水中の０．１％リボフラビン（AVEDRO（登録商標）PHOTREXA ZD（商標）で入手可能）対クエン酸緩衝液に溶解した鉄（ＩＩ）を伴う緩衝生理食塩水中の０．１％リボフラビンで処置された角膜フラップにおけるコラーゲンの架橋のレベルを調べた。
【００６９】
この処置を用いて、クエン酸塩配位子は、第二鉄及び第一鉄イオンを、低い溶解度積の水酸化第二鉄及び他の不溶解性の第二鉄又は第一鉄種を引き起こす水及び酸素の作用から保護する。鉄（ＩＩ）とクエン酸塩の錯体形成は、鉄（ＩＩ）酸化の動力学を遅らせるだろうが、いくつかの鉄イオンは、研究したシステムにおいて依然としてフェントン様反応に関与し得る。
【００７０】
Ａ．材料及び方法
ＦｅＳＯ４をクエン酸緩衝液（ストック１００mM クエン酸緩衝液：ｄＨ２Ｏ中クエン酸及び０．３３％ＮａＣｌ、クエン酸三ナトリウムでｐＨ６．０に調整；緩衝液をｄＨ２Ｏで所望の濃度に希釈した）に加えた。各Ｆｅ−クエン酸塩溶液１００μLを、最終ｐＨ７．１〜７．２のために、緩衝生理食塩水中の０．１％リボフラビン１０mLに加えた。ブタの眼を畜殺場（SiouxPreme, Sioux City, IA）から一晩かけて氷上輸送し、生理食塩水中ですすいだ。眼を清浄し、上皮を除去した。眼を、３７℃に設定したインキュベーター内、上部に溶液を保持するゴムリングを使用することによって、緩衝生理食塩水中の０．１％リボフラビン、緩衝生理食塩水中の０．１％リボフラビン＋０．２５mM ＦｅＳＯ４＋０．５mM クエン酸緩衝液、又は緩衝生理食塩水中の０．１％リボフラビン＋０．５mM ＦｅＳＯ４＋０．２５mM クエン酸緩衝液で２０分間浸漬した。照射前にインキュベーションチャンバー内で、眼をビーカーに軽酸素流と共に２分間入れた。角膜に、トップハットビーム（３％二乗平均平方根）を４分間、３６５nm光源（UV LED NCSU033B[T]; Nichia Co., Tokushima, Japan）を用いて選択された放射照度（３０mW/cm2、パルス１秒オン：１秒オフ）で全角膜的に照射し、放射照度は角膜表面で電力センサー（モデルPD-300-UV; Ophir, Inc., Jerusalem, Israel）によって測定した。角膜フラップ（およそ２００μm厚）を、Ｉntralaseフェムト秒レーザー（Abbot Medical Optics, Santa Ana, CA）を活用して眼から切除した。角膜フラップの平均厚を、ultrasonic Pachymeter（DGH TECHNOLOGY, Exton, PA）を用いて眼からの切除の前後の測定値間の差として計算した。該フラップを蒸留水で２回洗浄し、濾紙で乾燥させ、ｄＨ２Ｏで２回洗浄し、次いで、重量変化が１０％未満になるまで真空中で乾燥させた（Rotary vane vacuum pump RV3 A652-01-903, BOC Edwards, West Sussex, UK）。各フラップを、パパイン緩衝液［ＢＢＢＳ（ｐＨ７．０〜７．２）、２mM Ｌ−システイン及び２mM ＥＤＴＡ］１ml中、２．５ユニット／mlのパパイン（Papaya latex, Sigmaから）を用いて６５℃で２．５時間消化した。パパイン消化物を、２２００×Ｇで５秒間遠心分離し（Mini centrifuge 05-090-100, Fisher Scientific）、１×ＢＢＢＳで０．５倍希釈し、そして、QM-40 Spectrofluorometer（Photon Technology Int., London, Ontario, Canada）でλｅｘ＝３６０nmの励起によって溶液の蛍光を測定した。組織の非存在下で蛍光を測定し、試料の蛍光からこの値を減算することによって、パパイン緩衝液の蛍光を考慮に入れた。
【００７１】
処置：
対照：緩衝生理食塩水中の０．１％リボフラビン中に２０分間浸漬した後、角膜フラップをおよそ２００μmにカットした。
０．１％リボフラビン（緩衝生理食塩水）、ＰＷ＋Ｏ２：
緩衝生理食塩水中の０．１％リボフラビン中に２０分間浸漬した後、眼をビーカーに軽酸素流と共に２分間入れ、次いで、酸素と共に３０mW/cm2のパルスＵＶＡ線を４分間照らした（１秒オン：１秒オフ）。角膜フラップをおよそ２００μmにカットした。
０．１％リボフラビン（緩衝生理食塩水）＋０．２５mM 鉄＋０．５mM クエン酸緩衝液  ＰＷ＋Ｏ２：
緩衝生理食塩水中の０．１％リボフラビン＋０．２５mM 鉄＋０．５mM クエン酸緩衝液中に２０分間浸漬した後、眼をビーカーに軽酸素流と共に２分間入れ、次いで、酸素と共に３０mW/cm2のパルスＵＶＡ線を４分間照らした（１秒オン：１秒オフ）。角膜フラップをおよそ２００μmにカットした。
０．１％リボフラビン（緩衝生理食塩水）＋０．５mM 鉄＋０．２５mM クエン酸緩衝液  ＰＷ＋Ｏ２：
緩衝生理食塩水中の０．１％リボフラビン＋０．５mM 鉄＋０．２５mM クエン酸緩衝液中に２０分間浸漬した後、眼をビーカーに軽酸素流と共に２分間入れ、次いで、酸素と共に３０mW/cm2のパルスＵＶＡ線を４分間照らした（１秒オン：１秒オフ）。角膜フラップをおよそ２００μmにカットした。
【００７２】
Ｂ．結果
図６４は、０．１％リボフラビン（緩衝生理食塩水）対０．１％リボフラビン（緩衝生理食塩水）＋０．２５mM 鉄＋０．５mM クエン酸緩衝液で架橋されたフラップの相対蛍光を解説する。ここでは、眼に、３０mW/cm2のＣＷ  ＵＶＡ線を４分間照らし、酸素をパルスした。
【００７３】
図６５は、０．１％リボフラビン（緩衝生理食塩水）対０．１％リボフラビン（緩衝生理食塩水）＋０．５mM 鉄＋０．２５mM クエン酸緩衝液で架橋されたフラップの相対蛍光を解説する。ここでは、眼に、３０mW/cm2のＣＷ  ＵＶＡ線を４分間照らし、酸素をパルスした。
【００７４】
Ｃ．結論
硫酸鉄（ＩＩ）を、クエン酸緩衝液に、５０mM クエン酸緩衝液中２５mM ＦｅＳＯ４又は２５mM クエン酸緩衝液中５０mM ＦｅＳＯ４のいずれかで溶解した。両溶液について、１００uLを０．１％リボフラビン（緩衝生理食塩水）１０mLに加え、所望の濃度にした。両方の場合に、沈殿は視認できず、溶液は室温で長期間安定なままであった。
【００７５】
０．２５mM ＦｅＳＯ４を伴う０．１％リボフラビン（緩衝生理食塩水）は、０．１％リボフラビン（緩衝生理食塩水）単独よりもパパイン消化由来の平均蛍光カウントがわずかに高かった。０．５mM ＦｅＳＯ４を伴う０．１％リボフラビン（緩衝生理食塩水）は、０．１％リボフラビン（緩衝生理食塩水）単独よりもパパイン消化由来の蛍光カウントが約２６％高かった。
【００７６】
リボフラビン及び２，３−ブタンジオンを用いた架橋
ジアセチル（２，３−ブタンジオン）は、バター並びに細菌発酵の産物としての乳製品及びアルコール飲料を含む様々な食品に天然に存在するα−ジケトンである。米国食品医薬品局は、ジアセチルを直接食品成分としてＧＲＡＳ（一般に安全であると認められている）ステータスであると承認しており、そして、食品中に存在する低レベルのジアセチルの消費は、ヒトの健康リスクを示すと報告されていない。
【００７７】
研究によれば、２，３−ブタンジオンは、ＵＶ線を照射した後にリボフラビン溶液中に検出される主要な揮発性産物である。その機構は、一重項酸素とリボフラビンとの相互作用を含む。図１１は、リボフラビン及び一重項酸素からの２，３−ブタンジオンの形成についての機構を解説する。研究は、ＵＶ照射後のリボフラビン溶液中の２，３−ブタンジオンの生成を確認しており、そして、角膜の架橋におけるその関与が提唱されている。以下の研究は、リボフラビンあり及びなしの角膜の架橋に使用した場合の２，３−ブタンジオンの架橋効率を定量的に測定するための調査を実施した。
【００７８】
Ａ．材料及び方法
ブタの眼を畜殺場（SiouxPreme, Sioux City, IA）から一晩かけて氷上輸送し、生理食塩水中ですすいだ。眼を清浄し、上皮を除去した。眼を、３７℃に設定したインキュベーター内、眼の上部に溶液を保持するゴムリングを使用することによって、ｄＨ２Ｏ中の０．１％リボフラビン、又はｄＨ２Ｏ中の０．１％２，３−ブタンジオン（ＢＤ）で２０分間浸漬した。角膜に、トップハットビーム（３％二乗平均平方根）を４分間、３６５nm光源（UV LED NCSU033B[T]; Nichia Co., Tokushima, Japan）を用いて放射照度３０mW/cm2で全角膜的に照射し、放射照度は角膜表面で電力センサー（モデルPD-300-UV; Ophir, Inc., Jerusalem, Israel）によって測定した。角膜フラップ（およそ２００μm厚）を、Intralaseフェムト秒レーザー（Abbott Medical Optics, Santa Ana, CA）を活用して眼から切除した。角膜フラップの平均厚を、ultrasonic Pachymeter（DGH TECHNOLOGY, Exton, PA）を用いて眼からの切除の前後の測定値間の差として計算した。次いで、該フラップを、全体が３mm幅の５タインを有するbiorakeアタッチメントを使用して二軸伸縮計（CellScale Biotester 5000, Waterloo, ON）内に入れた。各試料を、生理食塩水中３７℃で、４μm/sの一定速度で試料が破損するまで伸長させた。該フラップを蒸留水で洗浄し、重量変化が１０％未満になるまで真空中で乾燥させた（Rotary vane vacuum pump RV3 A652-01-903, BOC Edwards, West Sussex, UK）。各フラップを、パパイン緩衝液［ＢＢＢＳ（ｐＨ７．０〜７．２）、２mM Ｌ−システイン及び２mM ＥＤＴＡ］１ml中、２．５ユニット／mlのパパイン（Papaya latex, Sigmaから）を用いて６５℃で２．５時間消化した。パパイン消化物を、２２００×Ｇで５秒間遠心分離し（Mini centrifuge 05-090-100, Fisher Scientific）、１×ＢＢＢＳで０．５倍希釈し、そして、QM-40 Spectrofluorometer（Photon Technology Int., London, Ontario, Canada）でλｅｘ＝３６０nmの励起によって溶液の蛍光を測定した。組織の非存在下で蛍光を測定し、試料の蛍光からこの値を減算することによって、パパイン緩衝液の蛍光を考慮に入れた。
【００７９】
Ｂ．結果／結論
図１２は、紫外線（ＵＶ）なし（左パネル）及びＵＶ線あり（右パネル）（３６５nm、３０mWで４分間）のｄＨ２Ｏ中の２，３−ブタンジオン（ＢＤ）の１％溶液で処置された角膜フラップの変位−力ダイアグラムを解説する。
【００８０】
図１３は、ＵＶ線あり及びなしのＢＤの１％溶液で処置された、パパイン消化された２００μm厚の角膜フラップからの４５０nmで記録された蛍光（未処置対照Ｆｏに相対的な）を解説する。
【００８１】
図１４は、ＵＶ線（３６５nm、３０mWで４分間）並びに：ｄＨ２Ｏ中のリボフラビンの０．１％溶液（１）；ｄＨ２Ｏ中の０．１％ＢＤ（４）；及びｄＨ２Ｏ中の０．１％リボフラビンと０．１％ＢＤの混合物（３）で処置された、対照（１）に相対的な角膜フラップの変位−力ダイアグラムを解説する。
【００８２】
図１５は、３０mWＵＶＡで４分間、並びに：ｄＨ２Ｏ中のリボフラビンの０．１％溶液；ｄＨ２Ｏ中の０．１％ＢＤ；及びｄＨ２Ｏ中の０．１％リボフラビンと０．１％ＢＤの混合物で処置された、パパイン消化された２００μm厚の角膜フラップからの４５０nmで記録された蛍光（未処置対照Ｆｏに相対的な）を解説する。
【００８３】
図１２及び１３に示される通り、２，３−ブタンジオンはそれ自体（ＵＶ線なし）、角膜フラップを架橋しないが、３６５nmのＵＶ線で照射した場合、処置された角膜から記録される角膜剛性及び蛍光出力の増加を導く。図１４及び１５は、ＢＤとリボフラビンの混合物を架橋に使用した場合の角膜フラップの剛性の変化を示す。
【００８４】
したがって、２，３−ブタンジオンは、架橋効率を増加させるためのリボフラビン製剤への添加物として使用され得る。
【００８５】
また、上述される角膜の架橋へのその関与に基づいて、２，３−ブタンジオンがまた一次架橋剤（リボフラビンなし）として使用され得ることが企図される。
【００８６】
リボフラビンの加水分解からの産物を用いた架橋
リボフラビンは、アルカリ溶液中で加水分解されて、加水分解産物に含まれる尿素及び１，２−ジヒドロ−６，７−ジメチル−２−ケト−１−Ｄ−リビチル−３−キノキサリン−カルボン酸を与える。図２６は、リボフラビン（Ａ）から１，２−ジヒドロ−６，７−ジメチル−２−ケト−１−Ｄ−リビチル−３−キノキサリン−カルボン酸（Ｂ）へのアルカリ加水分解を解説する。
【００８７】
アルカリ分解の動力学は、分光光度的に追跡されており、そして、元のリボフラビン溶液の光学密度が４５０及び３７０nmで減少するが３１０nmで増加することが言及されている。本発明者等が０．８５％血液緩衝バンク生理食塩水（ＢＢＢＳ）（Thermo Scientific）中の０．１％リボフラビン−５−リン酸塩溶液を１２０℃で加熱した場合に、彼らは類似の展開を検出した（図２７に示される通り）。特に、図２７は、１２０℃で異なる時間量維持されたＢＢＢＳ中の０．１％リボフラビン−５−リン酸塩のＵＶ／可視（Ｖｉｓ）光スペクトルを解説する。
【００８８】
加熱手順の間、リボフラビンの濃度は時間と共に減少する（図２７、４５０nmでの吸光度変化を参照）。リボフラビンの破壊速度はまた、その溶液中濃度にも依存する。例えば、本発明者等は、０．１％溶液が０．５％溶液よりも１．３倍迅速に加水分解することを見いだした（図２８に示される通り）。特に、図２８は、４５０nmでの吸光度によって測定した場合のＢＢＢＳ中１２０℃でのリボフラビンの加水分解速度を解説する（０．１％溶液及び０．５％溶液、Ａ０は、加熱前の吸光度である）。
【００８９】
同時に、加水分解から生じる産物の蓄積がある（図２９に示される通り）。特に、図２９は、残りのリボフラビンの吸光度を減算することによって図２７から得られたＵＶ／Ｖｉｓスペクトルを解説する。
【００９０】
ガウス（Gaussian）吸収ピークの形状を組み合わせることによって図２９からスペクトルを分析することが可能である（図３０に示される通り）。特に、図３０は、１２０℃で９０分後の加水分解溶液のスペクトル分析を解説する（残留リボフラビンの吸光度を、分析したスペクトルから減算した）。
【００９１】
リボフラビン加水分解の間の産物の蓄積は、２０９、２３７、２５７、３００及び３５５nmでの吸収の線形増加に従う（図３１に示される通り）。特に、図３１は、加水分解時間中の異なるピークの吸光度の変化を解説する。
【００９２】
リボフラビンの分解産物のＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）分析のために、Merck MilliporeからのLichrospher WP300 RP18カラム（２５０mm×４．０mm、５μm）を備えたDionex UltiMate 3000を使用した。移動相（Ａ）は、一塩基性リン酸カリウム（７．３５g/L）を含有する水であり、（Ｂ）はメタノールであった。一般に、アイソクラティック条件（１５％Ｂ、流速１．７０mL／分、３０分、４０℃）が分解プロセスの分析に好適であった。ＨＰＬＣ分析の間にダイオードアレイ検出器（λ＝２００〜４５０nm）及びchromeleonソフトウェアを使用してＵＶスペクトルを得た。
【００９３】
種々のＴＦＡ濃度の移動相としての水（Ａ）及びアセトニトリル（Ｂ）を用いた手順は、最終産物分析（上記参照）に使用して成功したが、分解プロセスの分析では失敗した。
【００９４】
架橋処置のため、１，２−ジヒドロ−６，７−ジメチル−２−ケト−１−Ｄ−リビチル−３−キノキサリンカルボン酸一水和物のナトリウム塩２（リボフラビンの初期アルカリ分解産物、図３２に示される通り）が合成され得る。キノキサリン２は、Surrey et al. J. Am. Chem. Soc. 1951, 73, 3236-2338 からの合成プロトコールを使用して調製され得る。図３３は、合成されたリボフラビン分解産物２のＮＭＲスペクトルを解説する。
【００９５】
分解実験は、合成された化合物２がまた一リン酸化リボフラビン（５−ＦＭＮ）の熱分解によって産生され、これが図３５〜３９中のピークＢに相当することを証明した。図３４は、熱処理なしの緩衝血液バンク生理食塩水中の一リン酸化リボフラビン（５−ＦＭＮ）を解説する。図３５は、熱処理の１時間後の緩衝血液バンク生理食塩水中の５−ＦＭＮを解説する。図３６は、熱処理の２時間後の緩衝血液バンク生理食塩水中の５−ＦＭＮを解説する。図３７は、熱処理の３時間後の緩衝血液バンク生理食塩水中の５−ＦＭＮを解説する。図３８は、熱処理の４時間後の緩衝血液バンク生理食塩水中の５−ＦＭＮを解説する。図３９は、合成されたリボフラビン分解産物２のＨＰＬＣトレースを解説する。
【００９６】
また、第二の分解産物Ａも５−ＦＭＮの熱分解の間に産生される。そのより極性の特性（より短い保持時間）に起因して、このピークがリン酸化キノキサリン化合物に相当することが想定される。この想定は、両方の化合物のＵＶスペクトルを比較することによって確認され得る。該スペクトルの類似性は、発色団に変化が起こっていないことを示す。それ故、このキノキサリン中間体が亜リン酸エステルの加水分解なしに１分子の尿素の喪失によって形成されることが想定される。
【００９７】
０．８５％血液バンク緩衝生理食塩水（Thermo Scientific）中のリボフラビン−５−リン酸塩溶液（０．５％リボフラビン）をプラスチック容器中に密閉し、１２０℃で２時間維持した。この溶液の吸収を加熱処理後に測定し、０．８５％ＢＢＢＳ中の未処理の溶液（約０．１％リボフラビを含有）の吸収と比較した（溶液のｐＨは、熱処理の場合に＝６．６、未処理の場合に６．９）。図４０は、熱的に加熱された（赤線）及び加熱なしの（青線）リボフラビン溶液の吸収スペクトルを解説する（２００μm光路長の石英キュベット中で記録）。図４１は、図３４中の２つのスペクトル間の差を解説する。
【００９８】
２つのリボフラビン溶液をブタの角膜の架橋に使用した（上皮なし、２０分間の浸漬、３０mW/cm2で４分間の連続ＵＶＡ曝露、照射の間リボフラビン液滴の適用なし）。フラップを平均厚２００μmにカットした。パパイン緩衝液で消化した角膜の蛍光を図４２に提示する。特に、図４２は、消化された角膜の蛍光を解説する：非架橋対照（黒線）、加熱なしの０．１％リボフラビンで架橋された（青線）、熱的に処理されたリボフラビン溶液で架橋された（赤線）。図４３は、架橋された角膜試料の相対蛍光を解説する：赤−熱的に処理されたリボフラビン溶液を使用、青−加熱なしの０．１％リボフラビン溶液を使用。
【００９９】
図４４に示される通りの１，２−ジヒドロ−６，７−ジメチル−２−ケト−１−Ｄ−リビチル−３−キノキサリンカルボン酸一水和物のナトリウム塩は、３６０nmで強い吸光度を有し（図４５及び４６に示される通り）、４６０nm前後で最大の顕著な蛍光を有する（図４７に示される通り）。図４５は、ＢＢＢＳ中の１，２−ジヒドロ−６，７−ジメチル−２−ケト−１−Ｄ−リビチル−３−キノキサリンカルボン酸一水和物のナトリウム塩の０．００１％溶液の吸光スペクトルを解説する（石英、１cm光路長）。図４６は、３６０nmでの１，２−ジヒドロ−６，７−ジメチル−２−ケト−１−Ｄ−リビチル−３−キノキサリンカルボン酸一水和物のナトリウム塩のＵＶ吸光度を解説する（ＢＢＢＳ中の溶液、１cm光路長の石英キュベット）。図４７は、ＢＢＢＳ溶液中の１，２−ジヒドロ−６，７−ジメチル−２−ケト−１−Ｄ−リビチル−３−キノキサリンカルボン酸一水和物のナトリウム塩の蛍光を解説する（励起３６０nm）。
【０１００】
ＢＢＢＳ中の０．１％リボフラビン−５−リン酸塩及び０．１％の１，２−ジヒドロ−６，７−ジメチル−２−ケト−１−Ｄ−リビチル−３−キノキサリンカルボン酸一水和物のナトリウム塩の溶液をブタの角膜の架橋に使用した（上皮なし、２０分間の浸漬、３０mW/cm2で４分間の連続ＵＶＡ曝露、照射の間リボフラビン又は他の架橋剤液滴の適用なし）。フラップを平均厚２００μmにカットした。パパイン緩衝液で消化した角膜の蛍光を提示する。リボフラビン又は１，２−ジヒドロ−６，７−ジメチル−２−ケト−１−Ｄ−リビチル−３−キノキサリンカルボン酸一水和物のナトリウム塩で架橋された角膜は共に、領域４５０nmにおいて蛍光の上昇を実証した（図４８に示される通り）。図４８は、消化された角膜の蛍光を解説する：非架橋対照（黒線）、ＢＢＢＳ中の０．１％リボフラビンで架橋された（赤線）、０．１％の１，２−ジヒドロ−６，７−ジメチル−２−ケト−１−Ｄ−リビチル−３−キノキサリンカルボン酸一水和物のナトリウム塩で架橋された（青線）。
【０１０１】
別の実験において、上皮なしの２００μm厚の角膜フラップをブタの眼から切り取り、ＢＢＢＳ中のリボフラビンの０．１％溶液又はＢＢＢＳ中の１，２−ジヒドロ−６，７−ジメチル−２−ケト−１−Ｄ−リビチル−３−キノキサリンカルボン酸一水和物のナトリウム塩の０．１％溶液１mLに入れ、アルゴンで３分間バブリングすることによって脱酸素化し、次いで、石英板間に密閉し、ＣＯ２雰囲気中３０mW/cm2で４分間照射した。フラップを蒸留水中ですすいで、真空乾燥し、パパイン緩衝液中で消化した。コラーゲンの蛍光を評価するために、得られた溶液の蛍光を３６０nmの励起で記録した（図４９に示される通り）。図４９は、消化された角膜フラップの蛍光を解説する：非架橋対照（黒線）、ＢＢＢＳ中の０．１％リボフラビンで架橋された（赤線）、０．１％の１，２−ジヒドロ−６，７−ジメチル−２−ケト−１−Ｄ−リビチル−３−キノキサリンカルボン酸一水和物のナトリウム塩で架橋された（青線）。
【０１０２】
１，２−ジヒドロ−６，７−ジメチル−２−ケト−１−Ｄ−リビチル−３−キノキサリンカルボン酸一水和物のナトリウム塩で架橋された角膜フラップの蛍光は、リボフラビンで架橋された角膜フラップの蛍光より高かった。これは、１，２−ジヒドロ−６，７−ジメチル−２−ケト−１−Ｄ−リビチル−３−キノキサリンカルボン酸一水和物のナトリウム塩が架橋剤として使用される場合に、酸素の存在に対する感受性がより低いことを示唆している。したがって、本開示の態様によれば、実施態様は、酸素の存在に対する感受性がより低いことが有利である処置にこの塩を採用し得る。
【０１０３】
図５０に示される通りの３−ヒドロキシ−２−キノキサリンカルボン酸の０．１７％及び０．０１７％溶液をＢＢＢＳ中に調製し、図５１に提示される通り吸光度（２００μm及び１cm厚の石英キュベット中）を記録した。図５１は、３−ヒドロキシ−２−キノキサリンカルボン酸の吸光スペクトルを解説する。
【０１０４】
３−ヒドロキシ−２−キノキサリンカルボン酸の０．１７％溶液は、希釈時に大きく増加したその蛍光が理由で、強い蛍光クエンチングを示した（図５２に示される通り）。図５２は、３６０nmの励起で記録された、ＢＢＢＳ中の異なる濃度の３−ヒドロキシ−２−キノキサリンカルボン酸の溶液の蛍光を解説する。図５３は、非架橋対照（黒線）に相対的な、ＢＢＢＳ中の３−ヒドロキシ−２−キノキサリンカルボン酸の０．１７％（赤線）及び０．０１７％（青線）溶液で架橋された、パパイン消化された角膜フラップ（２００μm厚）の蛍光を解説する（上皮なし、浸漬時間２０分、３０mW/cm2で４分間）。図５４は、０．１７％リボフラビン（赤線）及び０．１７％の３−ヒドロキシ−２−キノキサリンカルボン酸（３Ｈ２ＱＸＣＡ、緑線）で２０分間予備飽和された、３０mW/cm2で４分間照射された２００μm厚の角膜フラップの、非架橋対照（黒線）に相対的な張力学プロットを解説する。図５５は、０．１％リボフラビン（青棒、溶液２）及びＢＢＢＳ中の３−ヒドロキシ−２−キノキサリンカルボン酸の０．０２％溶液を含有する０．１％リボフラビン（赤棒、溶液１）で架橋された、パパイン消化された角膜フラップ（２００μm厚）の相対蛍光を解説する（上皮なし、浸漬時間２０分、３0mW/cm2で４分間）。図中、Ｆ０−非架橋フラップの蛍光。
【０１０５】
図５６に示される通りの４−メチル−３−オキソ−３，４−ジヒドロ−２−キノキサリンカルボン酸は、３６０nmで強い吸光度を有し（図５７に示される通り）、４６０nm前後で最大の蛍光を多少有する（図５８に示される通り）。図５７は、ＢＢＢＳ中の４−メチル−３−オキソ−３，４−ジヒドロ−２−キノキサリンカルボン酸の０．０１mg/ml溶液の吸光スペクトルを解説する（石英、１cm光路長）。図５８は、ＢＢＢＳ溶液中の４−メチル−３−オキソ−３，４−ジヒドロ−２−キノキサリンカルボン酸の蛍光を解説する（励起３６０nm）。図５９は、パパイン消化された角膜フラップの蛍光を解説する：非架橋対照（黒線）、ＢＢＢＳ中の４−メチル−３−オキソ−３，４−ジヒドロ−２−キノキサリンカルボン酸の０．１mg/ml（赤線）及び１mg/ml（緑線）溶液で架橋された。ここで、角膜を上皮除去し、架橋剤の溶液で２０分間浸漬させ、次に、３０mW/cm2のＵＶＡ線（３６０nm）で４分間照射した。
【０１０６】
本開示の態様によれば、眼を処置するためのシステム及び方法は、リボフラビンの加水分解の間に産生された架橋剤を採用する。例えば、リボフラビンの加水分解は、１，２−ジヒドロ−６，７−ジメチル−２−ケト−１−Ｄ−リビチル−３−キノキサリンカルボン酸一水和物のナトリウム塩を産生する。この塩が従来のリボフラビンの処置溶液よりも酸素飢餓に影響を受けにくい（すなわち、酸素の存在に対する感受性がより低い）ことが発見された。この塩が単独で又はリボフラビンの溶液との組み合わせで使用される場合、眼処置についてより効果的な架橋が達成され得る。
【０１０７】
本開示の態様によれば、システム及び方法は、架橋剤の産生を含むリボフラビンの加水分解の成果を得るために、リボフラビン溶液の熱処理を採用する。
【０１０８】
本開示の態様によれば、システム及び方法は、眼処置のための架橋活性を引き起こすためにキノキサリンを採用する。キノキサリン（ベンゾピラジンとも呼ばれる）は、図６０に示される通り、ベンゼン環及びピラジン環からなる環複合体を含有する複素環式化合物である。キノキサリン誘導体は天然に広く分布しており、そして、それらの多く（抗生物質エキノマイシン、レボマイシン及びアクチノルイチン（actinoleutin）など）は、非常に有用な生物活性を有する。加えて、多数の合成キノキサリン類はまた、抗菌性、抗真菌性、殺虫性、抗癌性、鎮静性及び抗鬱性を示している。本開示の態様によれば、架橋剤として作用するキノキサリン類の能力は、これらの他の利益、例えば、抗菌又は抗真菌特性と共に特定の眼処置に採用され得る。種々の生理活性キノキサリン類を生み出すために、合成及びスクリーニング研究グループによる共同作業が継続的に実施されている。したがって、キノキサリン１，４−ジオキシドは、抗菌性を示しており、そして、キノキサリン−２，３−ジチオン環状ジチオ−カルボナート（Morestan）及びトリチオカルボナート（Eradox）（図６１に示される通り）は、抗真菌及び殺虫効果を有する。２，３，７−トリクロロ−６−メチルスルファモイルキノキサリンは、抗癌剤として特許されている。２−フェニル−３−ピペリジノキノキサリン及びその誘導体のいくつかは、選択的除草剤である。
【０１０９】
オラキンドックスを用いた架橋
オラキンドックス（Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−３−メチル−２−キノキサリンカルボキサミド１，４−ジオキシド）（VETRANAL（商標））は、抗菌特性を有するという理由から、家畜用の成長促進剤として１９７５年から使用されている。オラキンドックスは、キノキサリン類の一般クラスと関連性がある。市販の調製物は、調製の間の粉塵を低減させるために１．５％リシノール酸ポリエチレングリコールグリセリルと一緒に炭酸カルシウム担体中に１０％オラキンドックスを活性成分として含有する。餌中のオラキンドックスの濃度は一般に５０ppmである。ヒト血清アルブミンの存在下で照射すると、オラキンドックスは２０秒以内に完全に消失し；Ｎ−モノオキシドが形成され、等電点電気泳動（isoelectric focussing）及び電気泳動装置において変化した特性を有する改変アルブミン。以下の研究は、オラキンドックスの架橋潜在性を評価した。
【０１１０】
Ａ．材料及び方法
ブタの眼を畜殺場（SiouxPreme, Sioux City, IA）から一晩かけて氷上輸送し、生理食塩水中ですすいだ。眼を清浄し、上皮を除去した。眼を、３７℃に設定したインキュベーター内、上部に溶液を保持するゴムリングを使用することによって、ＰＢＳ中０．４％オラキンドックスで２０分間浸漬した。一部の眼に空中で連続ＵＶＡ線を照射し、そして一部は、照射前にインキュベーションチャンバー内で、ビーカーに軽酸素流と共に２分間入れた。角膜に、トップハットビーム（３％二乗平均平方根）を４又は８分間、３６５nm光源（UV LED NCSU033B[T]; Nichia Co., Tokushima, Japan）を用いて選択された放射照度（３０mW/cm2、パルス１秒オン１秒オフ）で全角膜的に照射した。ＵＶ放射照度は角膜表面で電力センサー（モデルPD-300-UV; Ophir, Inc., Jerusalem, Israel）によって測定した。角膜フラップ（およそ２００μm厚）を、Intralaseフェムト秒レーザー（Abbot Medical Optics, Santa Ana, CA）を活用して眼から切除した。角膜フラップの平均厚を、ultrasonic Pachymeter（DGH TECHNOLOGY, Exton, PA）を用いて眼からの切除の前後の測定値間の差として計算した。該フラップを、全体が３mm幅の５タインを有するbiorakeアタッチメントを使用して、二軸伸縮計（CellScale Biotester5000, Waterloo, ON）内に入れた。各試料を、生理食塩水中３７℃で、４μm/sの一定速度で試料が破損するまで伸長させた。該フラップを蒸留水で２回洗浄し、濾紙で乾燥させ、ｄＨ２Ｏで２回洗浄し、次いで、重量変化が１０％未満になるまで真空中で乾燥させた（Rotary vane vacuum pump RV3 A652-01-903, BOC Edwards, West Sussex, UK）。各フラップを、パパイン緩衝液［ＢＢＢＳ（ｐＨ７．０〜７．２）、２mM Ｌ−システイン及び２mM ＥＤＴＡ］１ml中、２．５ユニット／mlのパパイン（Papaya latex, Sigmaから）を用いて６５℃で２．５時間消化した。パパイン消化物を、２２００×Ｇで５秒間遠心分離し（Mini centrifuge 05-090-100, Fisher Scientific）、１×ＢＢＢＳで０．５倍希釈し、そして、QM-40 Spectrofluorometer（Photon Technology Int., London, Ontario, Canada）でλｅｘ＝３６０nmの励起によって溶液の蛍光を測定した。組織の非存在下で蛍光を測定し、試料の蛍光からこの値を減算することによって、パパイン緩衝液の蛍光を考慮に入れた。
【０１１１】
Ｂ．結果／結論
図２４は、対照（１）に相対的な、３０mW/cm2（ＣＷ）で４分間の照射（２）並びに３０mW/cm2のパルスＵＶＡ線で８分間の照射（１秒オン：１秒オフ）及びＯ２（３）の、ＰＢＳ中０．４％オラキンドックスで浸漬させた２００um厚の角膜フラップの二軸伸縮学を解説する。
【０１１２】
図２５は、ＰＢＳ中０．４％オラキンドックスで架橋されたフラップの４５０nmで記録された相対蛍光を解説する：（１）照射なしの対照；（２）３０mW/cm2で連続的（ＣＷ）に４分間照射；並びに（３）：３０mW/cm2のパルスＵＶＡ線で８分間の照射（１秒オン：１秒オフ）及びＯ２。
【０１１３】
ＵＶＡで曝露後、角膜コラーゲンはより硬くなり、４５０nmで蛍光を取得した。故に、オラキンドックスは、効果的な水溶性架橋剤である。
【０１１４】
リボフラビン及び葉酸を用いた架橋
図１６に示される通りの葉酸（ＦＡ）、すなわちビタミンＢ９は、米国食品医薬品局によって21 CFR § 172.345(f)下で安全な医療食品成分の１つと具体的に見なされている。ＦＡそれ自体は、強い蛍光を有さず、かつ一重項酸素の形成を効率的に増感しない（非効率的な項間交差を導く、一重項励起状態の無放射性不活性化による内部蛍光クエンチングにおけるｐ−アミノベンゾイルグルタマート置換基の関与に起因する可能性が高い）。しかしながら、ＵＶ照射は、ＦＡの酸化を引き起こし、６−ホルミルプテリン、次いで、図１７に示される通りのプテリン−６−カルボン酸（ＰＣＡ）の形成を導く。
【０１１５】
ＰＣＡは、効率的な光増感剤及び一重項酸素の生成剤である。それ故、ＦＡとＰＣＡは共に、コラーゲンの架橋を生成させることができる。リボフラビンの添加はＦＡの酸化を顕著に強め、一方で、リボフラビンの大部分は分解されず残るため、ＦＡはリボフラビンと組み合わせて使用され得る。
【０１１６】
ＦＡは、ｐＨ及び温度に依存して水溶性である。以下の研究で、例えば、リン酸緩衝液中のその溶解度は２５℃で５．５mg/mlであり、そして、最終溶液のｐＨは７．０であった。ＦＡは、４００nm以下でＵＶ線吸光度を有し（図１８に示される通り３６０nmに長波ピーク）、４６０nm前後に最大の蛍光を有する（図１９に示される通り）。図２０は、リン酸緩衝液中のＦＡ濃度に応じた、３６０nmでのＦＡの吸光度を示す。
【０１１７】
Ａ．材料及び方法
ブタの眼を畜殺場（SiouxPreme, Sioux City, IA）から一晩かけて氷上輸送し、生理食塩水中ですすいだ。眼を清浄し、上皮を除去した。リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．６、蒸留水中のリン酸ナトリウム一塩基性、リン酸ナトリウム二塩基性及び塩化ナトリウムで作製）を、全ての溶液用の緩衝液として使用した。リボフラビン溶液、ＦＡ溶液及びそれらの混合物についての最終ｐＨ値は、７．３〜７．４の範囲であった。眼を、３７℃に設定したインキュベーター内、上部に溶液を保持するゴムリングを使用することによって、０．１％ＦＡ、０．１％リボフラビン又は０．１％ＦＡ＋０．１％リボフラビンで２０分間浸漬した。照射前にインキュベーションチャンバー内で、眼を純粋な酸素で満たしたビーカーに２分間入れた。角膜に、トップハットビーム（３％二乗平均平方根）を８分間、３６５nm光源（UV LED NCSU033B[T]; Nichia Co., Tokushima, Japan）を用いて選択された放射照度（３０mW/cm2、パルス１秒オン：１秒オフ）で全角膜的に照射し、放射照度は角膜表面で電力センサー（モデルPD-300-UV; Ophir, Inc., Jerusalem, Israel）によって測定した。角膜フラップ（およそ２００μm厚）を、Intralaseフェムト秒レーザー（Abbot Medical Optics, Santa Ana, CA）を活用して眼から切除した。角膜フラップの平均厚を、ultrasonic Pachymeter（DGH TECHNOLOGY, Exton, PA）を用いて眼からの切除の前後の測定値間の差として計算した。該フラップを、全体が３mm幅の５タインを有するbiorakeアタッチメントを使用して二軸伸縮計（CellScale Biotester 5000, Waterloo, ON）内に入れた。各試料を、生理食塩水中３７℃で、４μm/sの一定速度で試料が破損するまで伸長させた。該フラップを蒸留水で２回洗浄し、濾紙で乾燥させ、ｄＨ２Ｏで２回洗浄し、次いで、重量変化が１０％未満になるまで真空中で乾燥させた（Rotary vane vacuum pump RV3 A652-01-903, BOC Edwards, West Sussex, UK）。各フラップを、パパイン緩衝液［ＢＢＢＳ（ｐＨ７．０〜７．２）、２mM Ｌ−システイン及び２mM ＥＤＴＡ］１ml中、２．５ユニット／mlのパパイン（Papaya latex, Sigmaから）を用いて６５℃で２．５時間消化した。パパイン消化物を、２２００×Ｇで５秒間遠心分離し（Mini centrifuge 05-090-100, Fisher Scientific）、１×ＢＢＢＳで０．５倍希釈し、そして、QM-40 Spectrofluorometer（Photon Technology Int., London, Ontario, Canada）でλｅｘ＝３６０nmの励起によって溶液の蛍光を測定した。組織の非存在下で蛍光を測定し、試料の蛍光からこの値を減算することによって、パパイン緩衝液の蛍光を考慮に入れた。
【０１１８】
Ｂ．結果／結論
図２１は、角膜試料の変位対力曲線を解説する：（１）ＵＶ線に曝露なし；（２）０．１％リボフラビン、ＵＶ線に曝露；（３）０．１％ＦＡ、ＵＶ線に曝露；及び（４）０．１％リボフラビンと０．１％ＦＡの混合物、ＵＶ線に曝露。ＵＶ曝露は３６５nm、３０mW/cm2、パルス１秒オン：１秒オフを合計８分間、角膜全体に酸素雰囲気。
【０１１９】
図２２は、パパインで消化後の角膜試料の蛍光を解説する（励起３６０nm）：（１）ＵＶ線に曝露なし；（２）０．１％リボフラビン、ＵＶ線に曝露；（３）０．１％ＦＡ、ＵＶ線に曝露；及び（４）０．１％リボフラビンと０．１％ＦＡの混合物、ＵＶ線に曝露。ＵＶ曝露は３６５nm、３０mW/cm2、パルス１秒オン：１秒オフを合計８分間、角膜全体に酸素雰囲気。
【０１２０】
図２１に示される通り、角膜コラーゲンに及ぼすＵＶ線の曝露の効果は、研究した溶液の３群（０．１％リボフラビン、０．１％ＦＡ及び０．１％リボフラビンと０．１％ＦＡの混合物）全てで非常に類似している。非曝露対照と比較すると、溶液の浸漬、その後のＵＶへの曝露は、角膜試料の顕著な補強を導く。図２２は、架橋されたコラーゲン試料の蛍光がＵＶ非曝露の対照試料と比較して増加することを示す。
【０１２１】
また、上述した通り、ＦＡが一次架橋剤（リボフラビンなし）としても使用され得ることが企図される。
【０１２２】
Ｃ．追加実験
緩衝生理食塩水中の０．１％リボフラビンを含有する製剤溶液（AVEDRO（登録商標）PHOTREXA ZD（商標）で入手可能）にＦＡを溶解した場合の追加実験を実施した。図２３は、角膜試料の変位対力曲線を解説する（厚さ３００um、各群に３試料）：（１）ＵＶ線に曝露なしの対照；（２）緩衝液中の０．１％ＦＡ、ＵＶ線に曝露；（３）緩衝生理食塩水中の０．１％リボフラビン、ＵＶ線に曝露；及び（４）緩衝生理食塩水中の０．１％リボフラビン中の０．１％ＦＡの混合物、ＵＶ線に曝露。ここで、ＵＶ曝露は３６５nm、３０mW/cm2、パルス１秒オン：１秒オフを合計８分間、角膜全体に酸素雰囲気。
【０１２３】
他の架橋剤
薬物のクロロキン、ヒドロキシクロロキン、キニン及びジブカインは、例えば、３６５nmのＵＶ線での照射によって、水溶液中で光増感能を有し得る。クロロキン、ヒドロキシクロロキン及びキニンは、キノリン類の一般クラスと関連性がある。本開示の態様によれば、これらの薬物は、それらの光増感能に基づいて、角膜の処置における架橋剤として適用され得る。
【０１２４】
図６２に示される通りのメトトレキサートは、特定の癌並びに関節リウマチ及びブドウ膜炎などの炎症性疾患の処置のために使用されている免疫抑制薬の一般名称である。ＦＡと同様に、ＭＴＸは、３６０nmに顕著なＵＶ線吸光度を有する。可能なコラーゲンの架橋剤としてＭＴＸを使用する考えは、ウサギの眼の結膜で測定されたＭＴＸの光増感特性に関するデータに由来する。
【０１２５】
チミジンの著しいＵＶＡ光増感が、図６３に示される通りのメナジオン（ビタミンＫ３）を用いて観察されており、そして、三重項状態のメナジオンとチミジンと間の一重項電子移動反応後に、光酸化産物５，６−ジヒドロキシ−５，６−ジヒドロチミジンの形成が起こる。メナジオンは、ＵＶＡ光増感剤であり得るので、コラーゲン用の架橋剤であり得る。
【０１２６】
したがって、架橋処置のための種々の薬剤及び添加物が研究で同定及び記載される。その種々の薬剤及び添加物の特徴が、眼の架橋処置に適用される製剤に有利に採用され得る。いくつかの実施態様において、リボフラビンによって生成される架橋活性を増強するために、リボフラビンが鉄（ＩＩ）と組み合わされる。他の実施態様において、架橋処置は、過酸化水素前浸漬と組み合わせた鉄（ＩＩ）溶液を採用する。なお他の実施態様において、リボフラビンなどの光増感剤を用いた角膜の架橋の効率を高めるために、２，３−ブタンジオンが採用される。さらなる実施態様において、架橋活性を増強させるために、葉酸がリボフラビンなどの光増感剤と組み合わせて採用される。なおさらなる実施態様において、２，３−ブタンジオン、葉酸、キノキサリン、キノリン、ジブカイン、メトトレキサート、メナジオン又はその誘導体が架橋剤として適用される。
【０１２７】
上述した通り、本開示のいくつかの態様によれば、上述及び解説した手順の工程の一部又は全ては、自動化されるか又は制御器（例えば、制御器１２０）の制御下でガイドされ得る。一般に、制御器は、ハードウェア要素とソフトウェア要素の組み合わせとして実施され得る。ハードウェアの態様は、マイクロプロセッサ、論理回路、通信／ネットワークポート、デジタルフィルタ、メモリ又は論理回路を含む、動作連結したハードウェアコンポーネントの組み合わせを含み得る。制御器は、コンピュータ可読媒体上に記憶され得るコンピュータ実行可能コードによって特定される操作を行うように適応され得る。
【０１２８】
上述した通り、制御器は、ソフトウェア又は記憶された命令を実行する、従来の外部コンピュータ又はオンボードフィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）又はデジタル信号プロセッサ（ＤＳＰ）などのプログラム可能処理デバイスであり得る。一般に、任意の処理又は評価のために本開示の実施態様によって採用される物理的プロセッサー及び／又は機械は、コンピュータ及びソフトウェア技術の当業者によって理解されるように、本開示の例示的な実施態様の教示に従ってプログラムされた１以上のネットワーク化又は非ネットワーク化汎用コンピュータシステム、マイクロプロセッサ、フィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）、デジタル信号プロセッサー（ＤＳＰ）、マイクロコントローラなどを含み得る。物理的プロセッサー及び／又は機械は、画像取得装置（複数）と外部的にネットワーク化され得るか、又は、画像取得装置内に在留するように統合され得る。適切なソフトウェアは、ソフトウェア技術の当業者によって理解されるように、例示的な実施態様の教示に基づいて通常の技能のプログラマーによって容易に作製され得る。加えて、例示的な実施態様のデバイス及びサブシステムは、電気技術（複数）の当業者によって理解されるように、特定用途向け集積回路の調製によって、又は、従来のコンポーネント回路の適切なネットワークを相互接続することによって実施され得る。したがって、例示的な実施態様は、ハードウェア回路及び／又はソフトウェアの任意の特定の組み合わせに限定されない。
【０１２９】
本開示の例示的な実施態様は、例示的な実施態様のデバイス及びサブシステムを制御するため、例示的な実施態様のデバイス及びサブシステムを駆動するため、例示的な実施態様のデバイス及びサブシステムが人間ユーザーと対話することを可能にするなどのための、コンピュータ可読媒体のいずれか一つ又は組み合わせの上に記憶されたソフトウェアを含み得る。そのようなソフトウェアは、非限定的に、デバイスドライバ、ファームウェア、オペレーティングシステム、開発ツール、アプリケーションソフトウェアなどを含むことができる。そのようなコンピュータ可読媒体はさらに、実施において行われる処理の全て又は一部分（処理が分散される場合）を行うために、本開示の実施態様のコンピュータプログラム製品を含むことができる。本開示の例示的な実施態様のコンピュータコードデバイスは、スクリプト、解釈可能なプログラム、ダイナミックリンクライブラリ（ＤＬＬ）、Java（登録商標）クラス及びアプレット、完全実行可能プログラムなどを非限定的に含む、任意の好適な解釈可能又は実行可能なコード機構を含むことができる。さらに、本開示の例示的な実施態様の処理の一部は、より良好な性能、信頼性、コストなどのために分散され得る。
【０１３０】
一般的な形態のコンピュータ可読媒体は、例えば、フロッピーディスク、フレキシブルディスク、ハードディスク、磁気テープ、任意の他の好適な磁気媒体、ＣＤ−ＲＯＭ、ＣＤＲＷ、ＤＶＤ、任意の他の好適な光学媒体、パンチカード、紙テープ、光学マークシート、孔若しくは他の光学的に認識可能な印のパターンを有する任意の他の好適な物理媒体、ＲＡＭ、ＰＲＯＭ、ＥＰＲＯＭ、ＦＬＡＳＨ−ＥＰＲＯＭ、任意の他の好適なメモリチップ若しくはカートリッジ、搬送波又はコンピュータが読むことができる任意の他の好適な媒体を含み得る。
【０１３１】
本開示は、１以上の特定の実施態様に関連して説明されているが、当業者であれば、本開示の精神及び範囲から逸脱することなくそれに対して多くの変化がなされ得ることが理解されよう。これらの実施態様及びその自明な変形の各々は、本開示の精神及び範囲内にあるものと企図される。また、本開示の態様に係る追加の実施態様は、本明細書に記載されるいずれかの実施態様からのいずれかの特徴を組み合わせ得ることが企図される。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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