(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトTFPI(配列番号1)の第1のエピトープ及び第2のエピトープに特異的に結合する能力があり、前記第1のエピトープが、ヒトTFPI(配列番号1)の位置1〜76内にあり、かつ前記第2のエピトープが位置77〜161内にあり、
第1の抗原認識部位の重鎖が
・配列番号6のアミノ酸31〜35(NYGVH)に対応するCDR1配列;及び
・配列番号6のアミノ酸50〜65(VIWRGGSIDYNAAFMS)に対応するCDR2配列;及び
・配列番号6のアミノ酸98〜110(NSHGNYVGYAMDY)に対応するCDR3配列
を含み、かつ前記第1の抗原認識部位の軽鎖が
・配列番号7のアミノ酸24〜34(KASQSVGPAVA)に対応するCDR1配列;及び
・配列番号7のアミノ酸50〜56(SASNRYT)に対応するCDR2配列;及び
・配列番号7のアミノ酸89〜96(QQYTSYPT)に対応するCDR3配列
を含み、
第2の抗原認識部位の重鎖が
・配列番号19のアミノ酸31〜35(NYAMS)に対応するCDR1配列;及び
・配列番号25のアミノ酸50〜66(TISRSGSYSYYADSVKG)に対応するCDR2配列;及び
・配列番号19のアミノ酸99〜110(LGGYDEGDAMDS)に対応するCDR3配列
を含み、かつ前記第2の抗原認識部位の軽鎖が
・配列番号20のアミノ酸24〜39(KSSQSLLESDGKTYLN)に対応するCDR1配列;及び
・配列番号20のアミノ酸55〜61(LVSILDS)に対応するCDR2配列;及び
・配列番号20のアミノ酸94〜102(LQATHFPQT)に対応するCDR3配列
を含む、
二重特異性抗体。
【請求項２】
完全長二重特異性抗体、及び2つの抗原結合断片の化学的コンジュゲートからなる群から選択される、請求項1に記載の二重特異性抗体。
【請求項３】
二重特異性Fab-Fabコンジュゲート(BiFab)である、請求項2に記載の二重特異性抗体。
【請求項４】
ヒト化された、又はヒト抗体である、請求項1から3のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項５】
請求項1から4のいずれか一項に記載の二重特性抗体を含む、医薬。
【請求項６】
インヒビターを伴う又は伴わない血友病A又はB等の凝固障害の処置における使用のための請求項5に記載の医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表の参照による組み入れ
「140072 SEQUENCE LISTING_ST25」という題名の配列表が2015年9月16日に作成され、参照により本明細書に組み入れられている。
【０００２】
本発明は、組織因子経路インヒビター(TFPI)のN末端領域(残基1〜161)内の2つのエピトープに同時に結合する能力がある二重特異性抗体及びその組成物に関する。本発明はまた、そのような抗体の薬学的及び治療的使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
出血している個体において、凝血は、血管外組織因子(TF)が血液中の第VIIa因子(FVIIa)に曝露した際、組織因子/第VIIa因子(TF/FVIIa)複合体によって惹起される。TF/FVIIa複合体形成は、第X因子(FX)のFXaへの活性化をもたらし、FXaは、活性化された第V因子(FVa)と共に、限られた量のトロンビンを生成する。少量のトロンビンは、血小板を活性化し、次に、それが、活性化第VIII因子(FVIIIa)及び活性化第IX(IXa)因子で構成されるテナーゼ複合体の組み立て及び結合を支持する血小板リン脂質の表面露出を生じる。テナーゼ複合体は、FX活性化の非常に効率的な触媒であり、この第2のステップにおいて生成されたFXaは、最終のトロンビンバーストに関与するFVa/FXaプロトロンビナーゼ複合体における活性プロテアーゼとしての役割を果たす。トロンビンは、フィブリノーゲンを切断して、フィブリンモノマーを生成し、そのフィブリンモノマーが重合して、漏出性血管を塞ぎ、出血を止めるフィブリンネットワークを形成する。迅速かつ大量のトロンビンバーストは、固形の安定なフィブリン塊の形成に必須である。
【０００４】
FVIII又はFIX欠乏によって引き起こされるFXa及びトロンビン生成の不十分な増加は、それぞれ、血友病A及びB患者における出血素因の根底にある原因である。血友病を有する人々においては、FVIII又はFIX欠乏のためにテナーゼ複合体によるFXa生成が痕跡量でしかないので、FXa生成は、主にTF/FVIIa複合体により駆動される。しかしながら、FXのFXaへのTF/FVIIa媒介性活性化は、一時的である。なぜならば、組織因子経路インヒビター(TFPI)が、第Xa因子及びTF/FVIIa複合体を自己調節的ループにより阻害するからである。フィードバック阻害は、TF/FVIIa/FXa/TFPI複合体の形成をもたらす。TFPI阻害の中和は、凝血の惹起中、FXのTF/FVIIa媒介性活性化を延長し、このことによって、TFPI阻害の中和は、例えば、FVIII又はFIX欠乏が原因となり、テナーゼ活性障害により引き起こされる不十分なFXa生成を有する血友病の人々において止血を促進する。
【０００５】
凝血の惹起後、TF/FVIIa媒介性FXa生成は、TFPIによって厳重に下方制御される。TFPIは、TF-FVIIaとFXaの両方の阻害を通してFX活性化及び活性を制御する、ゆっくりと強力に結合する競合的インヒビターである。FXaがTF/FVIIa複合体と結合している際、又は膜上のその近傍で結合している際のいずれかにおいて、TFPIによるFXaの阻害を律速段階として含む過程によって、TF/FVIIaは、TFPIにより阻害される(Baughら、1998、JBC、273: 4378〜4386頁)。FXaのTFPI阻害は、緩いTFPI-FXa複合体を最初にもたらし、そのTFPI-FXa複合体が、強力結合性TFPI-FXa複合体へゆっくり変化する二相性反応で起こり、TFPIの第2のクニッツ型インヒビタードメイン(KPI-2)がFXaの活性部位に結合してそれをブロックする。TFPIの第1のクニッツ型インヒビタードメイン(KPI-1)は、堅固なTFPI-FXa複合体の形成に寄与し、かつそれは、TFに結合したFVIIaの活性部位に直接的に結合してそれをブロックする。
【０００６】
TFPIに結合する能力がある抗体が当技術分野において知られている。例えば、WO2010/072691、WO2012/001087、及びWO2012/135671は、モノクローナル抗体(mAb)を開示し、それらのそれぞれが、TFPIの1つの特異的エピトープと結合する能力がある。典型的には単一の可変領域によって定義される抗体のパラトープ区域に限定される単一のTFPIエピトープ、例えばKPIドメイン上の単一のTFPIエピトープを標的とする抗体には、以下の限界が当てはまり得る。第一に、TF/FVIIa/FXa複合体の最終的阻害は、TFPIにわたって点在する相補的区域とTF/FVIIa/FXa複合体との間のいくつかの相互作用に依存する。これは、TFPIのKPI-1及びKPI-2の、それぞれ、FVIIa及びFXaの活性部位への直接的結合に当てはまるだけでなく、TFPIのN末端及びC末端領域の領域が関わる、TF/FVIIa/FXaエキソサイトとの相互作用にも当てはまる。例えば、単一のKPIに結合するモノクローナル抗体は、特にTFPIの生理学的に上昇した濃度において、TFPIの全ての阻害機能を完全にはブロックすることができない可能性がある。第二に、単一特異性抗体の効力は、抗体の親和性及び/又はTFPI分子のフレキシビリティによって妨害され得、それらのどちらも、抗体の高い用量を必要とする。第三に、モノクローナル抗体でTFPIを標的とすることは、TFPI-mAb複合体の腎クリアランスの低下の結果として、又はTFPI-mAb複合体形成により低下する他のクリアランス機構の結果として、TFPIを循環中に蓄積させ得る。
【０００７】
本発明者らは、本明細書に開示されている二重特異性抗体がそのような限界に対処し得ると考える。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】WO2010/072691
【特許文献２】WO2012/001087
【特許文献３】WO2012/135671
【特許文献４】WO2005040219
【特許文献５】米国特許出願第20050238646号
【特許文献６】米国特許出願第20020161201号
【特許文献７】EP404,097
【特許文献８】WO93/11161
【特許文献９】米国特許第5,629,384号
【特許文献１０】WO2006134148
【特許文献１１】WO90/13540
【特許文献１２】米国特許第5,932,462号
【特許文献１３】米国特許第5,643,575号
【特許文献１４】WO2003/031464
【特許文献１５】WO2004/099231
【特許文献１６】米国特許第5,677,425号
【特許文献１７】WO2010/017196
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Baughら、1998、JBC、273: 4378〜4386頁
【非特許文献２】Birdら、Science (1988) 242:42S〜426頁
【非特許文献３】Hustonら、PNAS (1988) 85: 5879〜5883頁
【非特許文献４】Illら、Protein Eng (1997) 10:949〜57頁
【非特許文献５】Holliger及びHudson、Nat Biotechnol (2005) 23:1126〜1136頁
【非特許文献６】Cai & Garen、Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1996) 93: 6280〜6285頁
【非特許文献７】Desmyterら、J. Biol. Chem. (2002) 277: 23645〜23650頁
【非特許文献８】Bondら、J. Mol. Biol. (2003) 332: 643〜655頁
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【非特許文献１４】Labrijnら、PNAS、110、5145〜5150頁(2013)
【非特許文献１５】Kontermann、MAbs. 2012年3月〜4月4(2): 182〜197頁
【非特許文献１６】J Immunol 1987; 139:2367〜2375頁
【非特許文献１７】J Immunol 2001; 166:1320〜1326頁
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【非特許文献２９】Juleniusら、Glycobiology、2005、15: 153頁
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【非特許文献３５】Altschul S.F. (1993) J Mol Evol 36: 290〜300頁
【非特許文献３６】Altschul, S.F.ら(1990) J Mol Biol 215: 403〜10頁
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【非特許文献３９】Remington: The Science and Practice of Pharmacy、第19版、1995
【非特許文献４０】Durocherら、Nucleic Acid Research、2002
【非特許文献４１】Kabsch, W.、J.Appl.Crystallogr.、(1993)、26巻、795〜800頁
【非特許文献４２】Yin, J.ら、Proc Natl Acad Sci U S A.2003年2月4日、(100)、100巻、856〜861頁
【非特許文献４３】Berman, H. M.ら、Nucleic Acids Res.、(2000)、28巻、235〜242頁
【非特許文献４４】Vagin, A.ら、J.Appl.Crystallogr.、(1997)、30巻、1022〜1025頁
【非特許文献４５】Collaborative Computational Project, N.、Acta crystallographica.Section D、Biological crystallography、(1994)、50巻、760〜763頁
【非特許文献４６】Langer, G.ら、Nat Protoc、(2008)、3巻、1171〜1179頁
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【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、ヒトTFPI(配列番号1)の位置1〜161内の第1のエピトープ及び第2のエピトープに特異的に結合する能力がある二重特異性抗体に関する。
【００１１】
一態様において、二重特異性抗体の第1のエピトープは、例えば、位置1〜76内、ヒトTFPIのクニッツ型インヒビター1(KPI-1)ドメイン(残基26〜76)内等の位置1〜96内であり得る。KPI-1エピトープは、配列番号1のアミノ酸残基Arg 41、Arg 65、及び/又はGlu 67のうちの1個又は複数を含み得、配列番号1のアミノ酸残基Leu 16、Pro 17、Leu 19、Lys 20、Leu 21、Met 22、Phe 25、Cys 35、Ala 37、Met 39、Tyr 56、Gly 57、Gly 58、Cys 59、Glu 60、Gly 61、Asn 62、Gln 63、Phe 66、Glu 71、及びMet 75のうちの1個又は複数を更に含み得る。
【００１２】
一態様において、二重特異性抗体の第2のエピトープは、例えば、位置97〜161内、ヒトTFPIのクニッツ型インヒビター2(KPI-2)ドメイン(残基97〜147)内等の位置77〜161内であり得る。KPI-2エピトープは、配列番号1のアミノ酸残基Arg 107を含み得、配列番号1のアミノ酸残基Glu 100、Glu 101、Asp 102、Pro 103、Tyr 109、Thr 111、Tyr 113、Phe 114、Asn 116、Gln 118、Gln 121、Cys 122、Glu 123、Arg 124、Phe 125、Lys 126、及びLeu 140のうちの1個又は複数を更に含み得る。
【００１３】
本発明の二重特異性抗体は、完全長IgG型式等のIgG型式であり得、又はそれは、2つのFab断片若しくはscFv断片若しくはその組合せのコンジュゲート等の2つの抗体断片の化学的コンジュゲートであり得る。二重特異性抗体は、好ましくは、ヒト抗体であり、又はヒト化されている。
【００１４】
本発明はまた、本発明による二重特異性抗体及び薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物に関する。前記二重特異性抗体又はそれを含む組成物は、薬物として用いられ得る。前記薬物は、インヒビターを伴う又は伴わない血友病A、及びインヒビターを伴う又は伴わない血友病B等の先天性、後天性、及び/又は医原性の凝固障害の処置において有用であり得る。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】TFPIレベルが増加した血友病A様条件下でのヒト血漿において、トロンビン生成は、ある特定のTFPI(1〜79)抗体及びTFPI KPI-2抗体mAb 2021により増強されることを示す図である。曲線(a)は、更なる添加を含まない正常なヒト血漿において得られた結果を示す。曲線(b)は、血友病A様条件が100μg/ml FVIII抗体(HTI PAHFVIII-S)及び20nM完全長TFPIαの添加により得られる場合の結果を示す。FVIIIの中和と組み合わせた20nM TFPIαの結果としてのトロンビン生成の抑制は、200nMのTFPI(1〜79)抗体mAb 1F91の添加によって影響されなかった(c)。200nMのTFPI(1〜79)抗体mAb 2F22(d)及びKPI-2抗体mAb 2021(e)の添加は、トロンビン生成を反転させたが、FVIII抗体を含まない正常なヒトにおいて得られるレベル(曲線(a))への完全な回復までの反転は得られなかった。
【図２】TFPIレベルが増加した血友病A様条件下でのヒト血漿において、トロンビン生成は、TFPI(1〜79)抗体とTFPI-KPI-2抗体を組み合わせることにより、強く増強されることを示す図である。曲線(a)は、更なる添加を含まない正常なヒト血漿において得られた結果を示す。曲線(b)は、血友病A様条件が100μg/ml FVIII抗体(HTI PAHFVIII-S)、20nM TFPIα、及び200nM KPI-2抗体mAb 2021の添加により得られる場合の結果を示す。200nM mAb 2021を用いる(b)における不完全な中和は、100nMのmAb 2021を100nM TFPI(1〜79)抗体mAb 1F91(c)又はmA 2F22(d)と組み合わせることにより反転した。(c)及び(d)におけるTFPI(1〜79)抗体とKPI-2抗体の組合せは、正常なヒト血漿(a)より高いトロンビンピークを生じた。
【図３】捕捉されている二重特異性抗体mAb 0421及びBiFab 9041とのTFPI FLの結合からの結果を示す図である。
【００１６】
［配列表フリーテキスト］
配列の簡単な説明
配列番号1は、ヒトTFPIアルファのアミノ酸配列を表す。
配列番号2は、TFPI(1〜161)のアミノ酸配列を表す。
配列番号3は、KPI-2を含むタグ付きTFPI断片のアミノ酸配列を表す。
配列番号4は、モノクローナル抗体(mAb)2F3の可変重鎖のアミノ酸配列を表す。
配列番号5は、モノクローナル抗体(mAb)2F3の可変軽鎖のアミノ酸配列を表す。
配列番号6は、モノクローナル抗体(mAb)2F22の可変重鎖のアミノ酸配列を表す。
配列番号7は、モノクローナル抗体(mAb)2F22の可変軽鎖のアミノ酸配列を表す。
配列番号8は、モノクローナル抗体(mAb)2F45の可変重鎖のアミノ酸配列を表す。
配列番号9は、モノクローナル抗体(mAb)2F45の可変軽鎖のアミノ酸配列を表す。
配列番号10は、モノクローナル抗体(mAb)1F91の可変重鎖のアミノ酸配列を表す。
配列番号11は、モノクローナル抗体(mAb)1F91の可変軽鎖のアミノ酸配列を表す。
配列番号12は、抗体重鎖をクローニングするのに用いられるプライマーの核酸配列を表す。
配列番号13は、抗体軽鎖をクローニングするのに用いられるプライマーの核酸配列を表す。
配列番号14は、Fab 0296の切り詰め型マウス-ヒトキメラ重鎖のアミノ酸配列を表す。
配列番号15は、モノクローナル抗体mAb 0294、Fab 0296、Fab 0295、及びmAb 0336のマウス-ヒトキメラ軽鎖のアミノ酸配列を表す。
配列番号16は、タグ付きTFPI KPI-1/N末端(TFPI(1〜79))のアミノ酸配列を表す。
配列番号17は、モノクローナル抗体mAb 0294のマウス-ヒトキメラ重鎖のアミノ酸配列を表す。
配列番号18は、Fab 0295の切り詰め型マウス-ヒトキメラ重鎖のアミノ酸配列を表す。
配列番号19は、mAb 2021の重鎖可変ドメイン(VH)のアミノ酸配列を表す。
配列番号20は、mAb 2021の軽鎖可変ドメイン(VL)のアミノ酸配列を表す。
配列番号21は、Fab 0094の重鎖(HC)のアミノ酸配列を表す。
配列番号22は、Fab 0094の軽鎖(LC)のアミノ酸配列を表す。
配列番号23は、Fab 0088の重鎖(HC)のアミノ酸配列を表す。
配列番号24は、Fab 0088の軽鎖(LC)のアミノ酸配列を表す。
配列番号25は、Fab 0313の重鎖(HC)のアミノ酸配列を表す。
配列番号26は、Fab 0313の軽鎖(LC)のアミノ酸配列を表す。
配列番号27は、mAb 0310の重鎖(HC)のアミノ酸配列を表す。
配列番号28は、mAb 0310の軽鎖(LC)のアミノ酸配列を表す。
配列番号29は、mAb 0336の重鎖(HC)のアミノ酸配列を表す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
インビボで、組織因子経路インヒビター(TFPI)は、いくつかのコンパートメントで見出される。TFPIの大半の割合は血管内皮に会合しており、わずかな割合が血液中に循環している。TFPIの2つのスプライスバリアント、TFPIアルファ(TFPIα)及びTFPIベータ(TFPIβ)が、ヒトにおいて記載されている。TFPIβは、おそらく、内皮細胞表面上に発現した優勢型であり、一方、TFPIαの細胞内貯蔵は、ある特定の刺激で循環へと放出され得る。TFPIαは、血液において、リポタンパク質と会合して、又は血小板中に、完全長か又は切り詰め型かのいずれかのタンパク質として循環している。
【００１８】
成熟ヒトTFPIαは、酸性N末端領域、リンカー領域によって散在した、3つの直列に配置されたクニッツ型インヒビタードメイン(KPI-1、KPI-2、及びKPI-3)、及び塩基性C末端テールで構成される276アミノ酸タンパク質(配列番号1)である。KPI-1、KPI-2、及びKPI-3ドメインは、それぞれ、配列番号1の残基26〜76、残基97〜147、及び残基189〜239として定義される。成熟ヒトTFPIβは、グリコシルホスファチジルイノシトール(GPI)-アンカーを介して内皮細胞表面に、共有結合により付加された193アミノ酸タンパク質である。TFPIβの最初の161アミノ酸は、(配列番号1の残基1〜161に対応する)TFPIαと同一であるが、C末端配列の最後の12アミノ酸は、TFPIαと関連がなく、残基193に付加されたGPI-アンカーを有する。
【００１９】
本発明は、TFPIの残基1〜161内の2つの別個、及び/又は固有のエピトープに結合する二重特異性抗体に関する。それぞれ、固有の抗原認識部位を含む、2つの単一特異性抗体は、本発明の二重特異性抗体の抗原結合断片、又は「アーム」の基礎を形成する。二重特異性抗体の第1の抗原結合断片(又は「アーム」)は、配列番号1のアミノ酸残基1〜96内のエピトープ、すなわち、N末端、KPI-1ドメイン(配列番号1の残基26〜76)、及びKPI-1ドメインとKPI-2ドメインの間のリンカー領域を包含する領域内にあるエピトープに対し指向化されている。前記エピトープは、好ましくは、TFPIのアミノ酸1〜76を包含する領域内にある。二重特異性抗体の第2の抗原結合断片(又は「アーム」)は、配列番号1のアミノ酸77〜161、すなわち、KPI-1とKPI-2の間のリンカー領域、KPI-2ドメイン、及びKPI-2とKPI-3の間のリンカー領域を包含するTFPIの領域内のエピトープに対し指向化されている。前記エピトープは、好ましくは、TFPIのKPI-2ドメイン(配列番号1の残基97〜147)内にある。
【００２０】
KPI-2ドメイン内等の配列番号1のアミノ酸77〜161内で結合する能力がある二重特異性抗体の単一アームは、それ自体で、単一特異性抗体のように、TFPIの阻害活性を有意に阻止することはできない可能性がある。しかしながら、それは、二重特異性抗体の他方のアームが、TFPIのKPI-1ドメイン等のTFPIのアミノ酸1〜76を包含する領域と結合している場合、TFPI阻害の特異的妨害へより有意に寄与し得、逆もまた同様である。
【００２１】
好ましくは、本明細書に開示されているような二重特異性KPI-1/KPI-2結合性抗体についての支配的な結合様式は、分子間(すなわち、二重特異性KPI-1/KPI-2結合性抗体の2つのアームが異なるTFPI分子と結合する場合)よりむしろ、分子内(すなわち、二重特異性KPI-1/KPI-2結合性抗体の2つのアームが、単一のTFPI分子と結合する場合)である。分子内結合は、1:1のTFPI-抗体の複合体をもたらし、一方、分子間結合様式は、TFPIと二重特異性抗体のより大きい集合体の望ましくない形成をもたらし得る。分子内結合様式は、KPI-1結合アーム等の抗体アームの1つの親和性を低下させることにより刺激され得る。
【００２２】
本発明の二重特異性抗体は、それの凝血促進効果が、それが由来する単一特異性抗体の予測される相加効果と比較される場合、より優れたプロファイルを有し得る。例えば、二重特異性抗体は、TFPIの濃度が、例えば、正常な生理的レベルに対して上昇している場合でさえも、TFPIの全ての阻害機能をブロックする能力があり得る。Fab-Fabコンジュゲート(本明細書では、BiFabとも呼ばれる)等の二重特異性抗体を得るための本発明の2つの別々のエピトープに対し指向化されている2つの抗原結合断片の連結は、アビディティ効果によって、2つの別々の抗原結合部分の合わせた効果により得られるものより、TFPI活性のより強力な中和をもたらし得る。
【００２３】
本発明の二重特異性抗体は、TFPIの全てのプールの活性を調節する能力があり得る。
【００２４】
本明細書で用いられる場合、用語「TFPI」は、任意の適切な生物体に由来し得る組織因子経路インヒビター(TFPI)の天然に存在する型を包含する。例えば、本明細書で記載されているように用いられるTFPIは、ヒト、マウス、ラット、霊長類、ウシ、ヒツジ、ウサギ、又はブタTFPI等の哺乳類TFPIであり得る。好ましくは、TFPIはヒトTFPIである。TFPIは、適切な細胞内で翻訳後プロセシングを受けているTFPIタンパク質等の成熟型のTFPIであり得る。そのような成熟TFPIタンパク質は、例えば、グリコシル化され得る。TFPIは、完全長TFPIタンパク質であり得る。TFPIという用語はまた、そのようなTFPI分子のバリアント、アイソフォーム、及び他のホモログを包含する。TFPI活性は、それの阻害活性を指す。バリアントTFPI分子は、一般的に、FXaの触媒活性を中和する能力、又はTF-FVIIa/FXaの複合体を阻害する能力等の、天然に存在するTFPIと同じ型の活性を有することにより特徴付けられる。
【００２５】
本明細書における用語「抗体」は、抗原又はその一部と特異的に結合する能力がある、免疫グロブリン配列に由来するタンパク質を指す。抗体という用語は、任意のクラス(又はアイソタイプ)、すなわち、IgA、IgD、IgE、IgG、IgM、及び/又はIgYの完全長抗体を含むが、それらに限定されない。その用語はまた、完全長抗体の1つ又は複数の抗原結合断片を含み得る。抗原又はその一部と特異的に結合する抗体は、排他的にその抗原若しくはその一部と結合する場合もあるし、又はそれは、限られた数の相同性抗原若しくはその一部と結合する場合もある。
【００２６】
天然の完全長抗体は、通常、ジスルフィド結合によって接続されている少なくとも4つのポリペプチド鎖:2つの重鎖(H)及び2つの軽鎖(L)を含む。場合によっては、天然の抗体は、ラクダ科の動物に見出される重鎖のみの抗体(VHH断片)及び軟骨魚綱(Chondrichthyes)に見出されるIgNARの場合のように、4つより少ない鎖を含む。特に薬学的な関心対象となる免疫グロブリンの1つのクラスは、IgGである。ヒトにおいて、IgGクラスは、それらの重鎖定常領域の配列に基づいて、4つのサブクラス:IgG1、IgG2、IgG3、及びIgG4へ細分類され得る。軽鎖は、それらの配列組成の違いに基づいて2つの型、カッパ鎖及びラムダ鎖へ分類することができる。IgG分子は、2つ以上のジスルフィド結合によって連結された2つの重鎖、及びそれぞれがジスルフィド結合によって重鎖に付加された2つの軽鎖で構成される。IgG重鎖は、重鎖可変領域(VH)並びに最高3つの重鎖定常領域(CH):CH1、CH2、及びCH3を含み得る。軽鎖は、軽鎖可変領域(VL)及び軽鎖定常領域(CL)を含み得る。VH及びVL領域は、フレームワーク領域(FR)と名付けられた、より保存性が高い領域と共に散在した、相補性決定領域(CDR)又は超可変領域(HvR)と名付けられた超可変性の領域へ更に細分類することができる。VH及びVL領域は、典型的には、以下の順序でアミノ末端からカルボキシ末端へ配置された、3つのCDR及び4つのFRで構成される:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鎖及び軽鎖の超可変領域を含む可変ドメインは、抗原と相互作用する能力があるドメインを形成し、一方、抗体の定常領域は、非限定的に免疫系の様々な細胞(エフェクター細胞)、Fc受容体、及び古典的補体系のC1複合体の第1の成分(C1q)を含む宿主組織又は因子との免疫グロブリンの結合を媒介し得る。
【００２７】
本明細書で用いられる場合、用語「単一特異性抗体」は、単一の抗原認識部位を有し(すなわち、一価であり)、又はそれぞれが1つの共通の標的抗原に特異的である2つの同一の抗原認識部位を有する(すなわち、二価である)抗体を指す。
【００２８】
本発明の単一特異性抗体は、それらが、単一のB細胞から、又はB細胞のクローン集団によって発現したように、固有の重鎖可変ドメイン配列及び軽鎖可変ドメイン配列の1セットを示すという意味で、モノクローナル抗体であり得る。本発明の抗体は、当業者に知られている様々な方法を用いて作製及び精製され得る。例えば、抗体は、ハイブリドーマ細胞から産生され得る。抗体は、B細胞増殖によって産生され得る。抗体又はそれらの断片は、哺乳類若しくは微生物の発現系において、又はインビトロ翻訳によって、組換え的に発現し得る。抗体又はそれらの断片はまた、例えば、ファージディスプレイ、細菌ディスプレイ、酵母ディスプレイ、哺乳類細胞ディスプレイ、又はリボソーム若しくはmRNAディスプレイを用いて、細胞表面に結合した分子として組換え的に発現し得る。いったん産生されたならば、抗体は、ヒトTFPI(1〜161)、完全長ヒトTFPIα及びヒトTFPIβ等のTFPI(1〜161)、完全長TFPIα及びTFPIβに結合するそれらの能力についてスクリーニングされ得る。
【００２９】
抗体の抗原結合機能が完全長抗体の断片によって実行され得ることが示されているため、抗体の抗原結合断片もまた、本発明による単一特異性抗体であり得る。抗体の用語「抗原結合断片」は、抗原、例えば、本明細書に記載されているような、TFPIα、ヒトTFPIα(配列番号1)、ヒトTFPI(1〜161)(配列番号2)、ヒトTFPI KPI-2構築物(配列番号3)、又は別の標的分子と特異的に結合し、又はそれを認識する能力を保持する抗体の1つ又は複数の断片を指す。抗原結合断片の例には、Fab、Fab'、Fab2、Fab'2、FabS、Fv(典型的には、抗体の単一アームのVL及びVHドメイン)、一本鎖Fv(scFv;例えば、Birdら、Science (1988) 242:42S〜426頁;及びHustonら、PNAS (1988) 85: 5879〜5883頁参照)、dsFv、Fd(典型的には、VH及びCH1ドメイン)、及びdAb(典型的には、VHドメイン)断片;そのようなものとして、VH、VL、VhH、及びV-NARドメイン;単一のVH鎖及び単一のVL鎖を含む一価分子;ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、及びカッパボディ(例えば、Illら、Protein Eng (1997) 10:949〜57頁参照);ラクダIgG;IgNAR;加えて、1つ若しくは複数の単離されたCDR又は機能的パラトープ(その単離されたCDR又は抗原結合残基若しくはポリペプチドは、機能的抗体断片を形成するように一緒に会合又は連結することができる)が挙げられる。様々な型の抗体断片は、例えば、Holliger及びHudson、Nat Biotechnol (2005) 23:1126〜1136頁;WO2005040219、並びに公開された米国特許出願第20050238646号及び第20020161201号に記載又は概説されている。これらの抗体断片は、当業者に知られている通常の技術を用いて得ることができ、それらの断片は、無傷抗体と同じ方法で有用性についてスクリーニングすることができる。
【００３０】
「Fab」、「Fab'」、及び「Fab'2」断片を含む抗体の「Fab断片」は、前記抗体の重鎖を接続するヒンジシステイン残基のN末端又はC末端側でのヒンジ領域における重鎖の切断により、抗体から引き出すことができる。「Fab」断片は、軽鎖の可変ドメイン及び定常ドメイン、並びに重鎖の可変ドメイン及び第1の定常ドメイン(CH1)を含む。「Fab'2」断片は、一般的にそれらのヒンジシステインによって共有結合している、1ペアの「Fab」断片を含む。Fab'は、正式には、Fab'2における重鎖を接続するヒンジジスルフィド結合の切断により、Fab'2断片から引き出される。抗体断片のジスルフィド結合以外の他の化学的連結もまた当技術分野において知られている。Fab断片は、親抗体のそれの抗原と結合する能力を、潜在的により低い親和性で、保持する。Fab'2断片は、二価結合する能力があるが、Fab及びFab'断片は、一価的に結合することができる。一般的に、Fab断片は、定常CH2及びCH3ドメイン、すなわちFc受容体との相互作用が起こるFc部分を欠く。したがって、Fab断片は、一般的に、エフェクター機能がない。Fab断片は、例えば、Fabを得るためのパパインか、又はFab'2を得るためのペプシンかのいずれかを用いる、抗体の酵素的切断による、当技術分野において知られている方法によって生成され得、Fab、Fab'、Fab'2を含むFab断片は、当業者によく知られている技術を用いて組換え的に産生され得る。
【００３１】
「Fv」断片は、完全な抗原認識及び結合部位を含有する抗体断片であり、一般的に、天然で共有結合性であり得る会合の状態、例えば、一本鎖可変ドメイン断片(scFv)の状態での、1つの重鎖可変ドメインと1つの軽鎖可変ドメインのダイマーを含む。各可変ドメインの3つの超可変領域が、相互作用して、VH-VLダイマーの表面上の抗原結合部位を定義することは、この立体配置においてである。集合的に、6つの超可変領域又はそれらのサブセットが、抗体に抗原結合特異性を与える。しかしながら、抗原に特異的な3つの超可変領域だけを含む単一の可変ドメインでさえ、抗原を認識かつ結合する能力を、通常、結合部位全体より低い親和性においてではあるが、保持することができる(Cai & Garen、Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1996) 93: 6280〜6285頁)。例えば、重鎖可変ドメインのみを有する天然に存在するラクダ科の動物の抗体(VHH)は、抗原に結合することができる(Desmyterら、J. Biol. Chem. (2002) 277: 23645〜23650頁;Bondら、J. Mol. Biol. (2003) 332: 643〜655頁)。
【００３２】
「一本鎖Fv」又は「scFv」抗体断片は、抗体のVHドメイン及びVLドメインを含み、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖中に存在する。一般的に、Fvポリペプチドは、scFvが抗原結合のための望ましい構造を形成することを可能にする、VHドメインとVLドメインの間にポリペプチドリンカーを更に含む。scFvの概説として、Pluckthun、1994、The Pharmacology of Monoclonal Antibodies、113巻、Rosenburg及びMoore編、Springer-Verlag、New York、269〜315頁を参照。
【００３３】
用語「ダイアボディ」は、断片が、同じポリペプチド鎖(VH及びVL)において軽鎖可変ドメイン(VL)へ接続した重鎖可変ドメイン(VH)を含む、2つの抗原結合部位を有する小さい抗体断片を指す。同じ鎖上の2つの可変ドメインの間でのペア形成を可能にするには短すぎるリンカーを用いることにより、可変ドメインが、別の鎖の相補的ドメインとペア形成することを余儀なくされ、2つの抗原結合部位を生じる。ダイアボディは、例えば、EP404,097、WO93/11161、及びHollingerら、1993、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、90:6444〜6448頁により完全に記載されている。
【００３４】
語句「直鎖状抗体」は、Zapataら、1995、Protein Eng.、8(10):1057〜1062頁に記載されているような抗体を指す。簡単に述べれば、これらの抗体は、補完的な軽鎖ポリペプチドと共に、1ペアの抗原結合領域を形成する1ペアの直列型Fdセグメント(VH-CH1-VH-CH1)を含有する。直鎖状抗体は二重特異性又は単一特異性であり得る。
【００３５】
抗体断片は、通常の組換え技術又はタンパク質工学技術を用いて得ることができ、その断片は、無傷抗体と同じ方法で、本明細書に記載されているようなTFPI(1〜161)、完全長TFPIα及びTFPIβ、又はTFPIの別の部分との結合についてスクリーニングすることができる。
【００３６】
本発明の抗体断片は、切り詰め、例えば、ポリペプチドのN末端及び/又はC末端からの1個又は複数のアミノ酸の除去により、生成され得る。断片はまた、1つ又は複数の内部欠失により作製され得る。
【００３７】
本明細書における用語「二重特異性抗体」は、抗体が2つの異なる抗原又は同じ抗原上の2つの異なるエピトープに結合することを可能にする2つの別個の、及び/又は固有の抗原認識部位を有する抗体を指す。用語「多重特異性抗体」は、2つ以上の異なる抗原又は同じ抗原上の2つ以上の異なるエピトープに結合する能力を有する抗体を指す。したがって、多重特異性抗体は、二重特異性抗体を含む。
【００３８】
本発明の二重特異性抗体は、IgG型式の完全長二重特異性抗体であり得る。天然抗体を模倣する完全長IgG型式の二重特異性抗体は、二重特異性ヘテロ二量体化抗体の画分を含む抗体の混合物を生じるハイブリッドクアドローマを形成する2つの個々のハイブリドーマの融合により作製することができる(Chelius D.ら、MAbs. 2010年5月〜6月; 2(3): 309〜319頁)。或いは、二重特異性ヘテロ二量体化抗体は、組換えテクノロジーを用いることにより産生され得る。ヘテロ二量体化はまた、ヘテロ二量体化を促進するようにFc領域の二量体化界面を操作することにより達成することができる。これの1つの例は、いわゆるノブ・イン・ホール(knob-in-hole)突然変異であり、その場合、反対のFc上の立体的に小さい側鎖(ホール)にマッチした、立体的にかさ高い側鎖(ノブ)が1つのFcに導入され、それによりヘテロ二量体化を促進する立体的相補性を生じる。操作されるヘテロ二量体化Fc界面についての他の方法は、静電気的相補性、非IgGヘテロ二量体化ドメインへの融合、又はヘテロ二量体化を調節するためのヒトIgG4の天然のFabアーム交換現象を利用することである。ヘテロ二量体化二重特異性抗体の例は、文献、例えば、(Klein Cら、MAbs. 2012年11月〜12月; 4(6): 653〜663頁)に十分記載されている。ヘテロ二量体抗体における軽鎖に特に注意を払わなければならない。LCとHCの正しいペア形成は、一般的な軽鎖の使用によって達成することができる。やはり、LC/HC界面の操作を、CrossMabsにおけるように、ヘテロ二量体化又は軽鎖クロスオーバー操作を促進するために用いることができる。適切な突然変異を含有する2つの個々のIgGからの抗体の穏やかな還元条件下でのインビトロ再集合もまた、二重特異性を生じるために用いることができる(例えば、Labrijnら、PNAS、110、5145〜5150頁(2013))。天然のFabアーム交換方法も正しい軽鎖ペア形成を確実にすることが報告されている。
【００３９】
多重特異性抗体に基づいた分子はまた、文献に記載されているように、IgGの天然のモジュールを組み合わせて、多重特異性及び多価の抗体誘導体を形成する融合タンパク質として組換え的に発現し得る。融合抗体の例は、DVD-Ig、IgG-scFV、ダイアボディ、DART等である(Kontermann、MAbs. 2012年3月〜4月4(2): 182〜197頁)。特異的な検出若しくは精製タグ、半減期延長部分、又は他のコンポーネントを融合タンパク質に組み込むことができる。追加の非IgG様式もまた、融合タンパク質に組み込み得る。Fcヘテロ二量体化に基づいた二重特異性完全長抗体は、LCペア形成方法論に関係なく、一般的に、非対称IgGと呼ばれる。
【００４０】
多重特異性抗体に基づいた分子はまた、文献に記載されているように、個々の完全長IgGを化学的コンジュゲート若しくは連結して、又はIgGの断片を連結して、多重特異性及び多価の抗体誘導体を形成することにより、作製され得る。融合抗体の例は、化学的に連結されたFab'2、IgG-ダイマー等である(Kontermann、MAbs. 2012年3月〜4月4(2): 182〜197頁)。特異的な検出若しくは精製タグ、半減期延長分子、又は他のコンポーネントをコンジュゲートタンパク質に組み込むことができる。追加の非IgGポリペプチドをこの融合タンパク質に組み込んでもよい。そのような二重特異性抗体の例は、実施例において提供されている。
【００４１】
多重特異性分子はまた、上記の方法を含む、組換え体と化学的方法を組み合わせることにより作製され得る。
【００４２】
本発明の二重特異性抗体は、2つのFab断片のコンジュゲート(BiFab)又は2つのscFv断片のコンジュゲート等の、2つの抗原結合断片の化学的コンジュゲートであり得る。TFPI上の2つの固有のエピトープに結合する二重特異性抗体又は2つの単一特異性抗体は、当業者に知られている方法によって作製され得る。二重特異性型式は、例えば、2つのFab又はscFv断片等の2つの抗体断片の、直接的か、又は適切な機能のために要求される柔軟性を与えるリンカーを介するかのいずれかでの化学的コンジュゲーションにより、調製され得る。Fab断片を連結するための1つの特定の方法は、Fab断片中に適切に配置されたシステイン残基におけるチオール官能性を用いることである。
【００４３】
本発明の二重特異性又は二重機能性抗体は、J Immunol 1987; 139:2367〜2375頁、若しくはJ Immunol 2001; 166:1320〜1326頁に記載されているように、又は以下に記載されているように、(TFPIの異なるエピトープと結合する)2つの抗体又はそれらの断片の化学的コンジュゲーションによって得ることができる:
mAb1(又は断片)-mAb2(又は断片)
mAb1(又は断片)-リンカー-mAb2(又は断片)
【００４４】
連結は、単一共有結合であり得(直接的連結)、又は一般的に以下のように記載されるビラジカルを含み得る:
【００４５】
【化１】
0006783754.tif 000002
【００４６】
式中、Xは、炭素、酸素、イオウ、リン、及び窒素からなる群から選択される少なくとも1個の原子であるが、それに限定されない。*はこのビラジカルの接続点の位置を示す。用語「ビラジカル」は、お互いに独立して作用する2個のフリーラジカル中心を有する偶数電子化学的化合物を指す。
【００４７】
一実施形態において、リンカーは、40個以下の原子で構成される鎖である。
【００４８】
一実施形態において、リンカーにおいて用いられる化学的部分は、以下の構造を有するビラジカルを含む:
【００４９】
【化２】
0006783754.tif 000003
【００５０】
一実施形態において、リンカー部分は、対称構造を有するビラジカルを含む(ホモ二官能性リンカー)。
【００５１】
リンカーはまた、上記に類似している構造のポリマーであり得る。
【００５２】
実施形態において、リンカーにおいて用いられる化学的部分は、共有結合性の化学結合によって接続される2つ以上の繰り返し構造単位で構成される高分子であるポリマーを含む。そのようなポリマーは親水性であり得る。
【００５３】
親水性の、又は「水溶性の」という用語は、水における検出可能なある程度の溶解度を有する部分を指す。水溶性を検出及び/又は定量するための方法は、当技術分野においてよく知られている。
【００５４】
本発明による例示的な水溶性ポリマーとしては、ペプチド、糖類、(ポリ)エーテル、(ポリ)アミン、(ポリ)カルボン酸等が挙げられる。ペプチドは、混合された配列を有することができ、又は単一のアミノ酸で構成することができ、例えば、(ポリ)リジンである。例示的な多糖類は(ポリ)シアル酸である。例示的な(ポリ)エーテルは(ポリ)エチレングリコールである。(ポリ)エチレンイミンは、例示的なポリアミンであり、(ポリ)アクリル酸は、代表的な(ポリ)カルボン酸である。
【００５５】
多くの他のポリマーもまた、本発明に適している。水溶性であるポリマーバックボーンは、本発明において特に有用である。適切なポリマーの例としては、ポリ(プロピレングリコール)(「PPG」)、エチレングリコールとプロピレングリコールのコポリマー等の他のポリ(アルキレングリコール)、ポリ(オキシエチル化ポリオール)、ポリ(ビニルピロリドン)、ポリ(ヒドロキシプロピルメタクリルアミド)、ポリ(α-ヒドロキシ酸)、ポリ(ビニルアルコール)、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、全体として参照により本明細書に組み入れられている米国特許第5,629,384号に記載されているもの等のポリ(N-アクリロイルモルホリン)、加えてそれらのコポリマー、ターポリマー、及び混合物が挙げられるが、それらに限定されない。
【００５６】
ポリマーリンカーは好ましくは直鎖状である。
【００５７】
各個々のポリマー鎖の分子量は様々であり得るが、ポリマーの平均分子量は、典型的には、約1000Da(1kDa)から約40,000Da(40kDa)まで、例えば、約1000Da〜約12,000Da、約2,000Da〜約11,000Da、約2000Da〜約3,000Da、約3000Da〜約4,000Da、約4000〜約5,000Da、約5000〜約6,000Da、約6,000〜約7,000Da、約7,000〜約8,000Da、約8,000〜約9,000Da、約9,000〜約10,000Da、又は約10,000〜約11,000Da等の範囲である。これらのサイズは、正確な測定値というよりむしろ推定値を表すことは理解されるべきである。好ましい実施形態によれば、本発明による分子は、親水性ポリマーの不均一な集団とコンジュゲートされている。
【００５８】
特定の実施形態において、リンカーにおいて用いられる化学的部分は、ポリエチレングリコール(PEG)を含む。
【００５９】
本明細書における用語「PEG」は、以下の構造を含むビラジカルを指す:
【００６０】
【化３】
0006783754.tif 000004
【００６１】
式中、n'は1より大きい整数である。
【００６２】
PEGは、エチレンオキシドの重合によって調製され、幅広い範囲の分子量にわたって市販されている。本発明により用いられるPEGは、好ましくは直鎖状である。
【００６３】
更に、「PEG」は、ポリエチレングリコール化合物、又はカップリング剤、カップリング若しくは活性化部分(例えば、カルボン酸/活性エステル、ケト、アルコキシアミン、チオール、トリフレート、トレシレート(tresylate)、アジリジン、オキシラン、アルキン、アジド、又はマレイミド部分)を含む、若しくは含まない、その誘導体を指し得る。本明細書で述べられた他のリンカーもまた、カップリング剤、カップリング又は活性化部分(例えば、カルボン酸/活性エステル、ケト、アルコキシアミン、チオール、トリフレート、トレシレート、アジリジン、オキシラン、アルキン、アジド、又はマレイミド部分)を含む場合もあるし、含まない場合もある。
【００６４】
1つの特定の実施形態において、本発明により用いられるPEGは、単分散である。別の特定の実施形態において、本発明により用いられるPEGは多分散である。
【００６５】
多分散PEGは、様々な分子量を有するPEG分子で構成される。サイズ分布は、それの重量平均分子量(Mw)及びそれの数平均分子量(Mn)(それらの比は、多分散指数(Mw/Mn)と呼ばれる)によって統計的に特徴付けることができる(例えば、「Polymer Synthesis and Characterization」、J. A. Nairn、University of Utah、2003参照)。Mw及びMnは、質量分析法によって測定することができる。
【００６６】
多分散指数は、1以上の数であり得、ゲル浸透クロマトグラフィーデータから推定され得る。多分散指数が1である場合、その生成物は、単分散であり、したがって、単一の分子量を有する化合物で成り立っている。多分散指数が1より大きい場合、そのポリマーは、多分散であり、多分散指数は、異なる分子量を有するポリマーの分布がどれくらい広いかを語っている。多分散指数は、典型的には、PEGの分子量と共に増加する。特定の実施形態において、本発明により用いられるPEGの多分散指数は、i)1.06未満、ii)1.05未満、iii)1.04未満、iv)1.03未満、又はv)1.02から1.03の間である。
【００６７】
重合過程に用いられる開始剤に依存して、異なる型のPEGが入手できる。
【００６８】
PEG置換基のコンジュゲーションのための多数の方法が、Advanced Drug Delivery Reviews、2002、54、459〜476頁、Nature Reviews Drug Discovery、2003、2、214〜221頁、DOI:10.1038/nrd1033、Adv Polym Sci、2006、192、95〜134頁、DOI 10.1007/12_022、Springer-Verlag、Berlin Heidelberg、2005、及びそれらの中の参考文献に記載されている。或いは、親水性ポリマー置換基のコンジュゲーションは、酵素的方法の使用により起こり得る。そのような方法は、例えば、WO2006134148に記載されているようにトランスグルタミナーゼの使用である。
【００６９】
ポリマー分子のポリペプチドへの共有結合による付加をもたらすために、ポリマー分子の末端基は、活性化型で、すなわち、反応性官能基を有する形とする。適切な活性化ポリマー分子は、例えば、Sigma-Aldrich Corporation社、St. Louis、MO、USA、Rapp Polymere GmbH社、Tubingen、Germany、又はPolyMASC Pharmaceuticals plc社、UKから市販されている。或いは、ポリマー分子は、例えば、WO90/13540に開示されているように、当技術分野において知られている通常の方法によって活性化することができる。活性化PEGポリマーの特定の例は、米国特許第5,932,462号及び第5,643,575号に開示されている。更に、以下の刊行物は、有用なポリマー分子及び/又はPEG化化学物質を開示している:WO2003/031464、WO2004/099231。
【００７０】
モノクローナル抗体又はその断片の活性化ポリマー分子とのコンジュゲーションは、例えば、以下の参考文献(それらはまた、ポリマー分子の活性化のための適切な方法を記載する)に記載されているような、任意の通常の方法の使用によって行われ得る:R. F. Taylor、(1991)、「Protein immobilisation. Fundamental and applications」、Marcel Dekker、N.Y.;S. S. Wong、(1992)、「Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking」、CRC Press、Boca Raton;G. T. Hermansonら、(1993)、「Immobilized Affinity Ligand Techniques」、Academic Press、N.Y.、Bioconjugate Techniques、第2版、Greg T. Hermanson、2008、Amsterdam、Elsevier。用いられ得る活性化方法及び/又はコンジュゲーション化学作用が、ポリペプチドの付加基(それらの例は、上記で更に示されている)、及びポリマーの官能基(例えば、アミン、ヒドロキシル、カルボキシル、アルデヒド、スルフィドリル、スクシンイミジル、マレイミド、ビニルスルホン、又はハロアセテートである)に依存することを当業者は知っているだろう。PEG化は、ポリペプチド上の利用可能な付加基(すなわち、ポリペプチドの表面に露出しているような付加基)へのコンジュゲーションへ向けられ得、又は1つ若しくは複数の特定の付加基、例えば、N末端アミノ基若しくはチオールへ向けられ得る。更に、コンジュゲーションは、1段階で、又は段階的様式で達成され得る。
【００７１】
別の実施形態において、リンカーとして用いられる化学的部分は、ヒドロキシエチルデンプンである。本明細書で用いられる場合、用語「ヒドロキシルデンプン」(HES/HAES)は、非イオン性デンプン誘導体を指す。種々の型のヒドロキシエチルデンプンは、典型的には、それらの平均分子量、典型的には、約130〜200kDaによって記載される。
【００７２】
別の実施形態において、リンカーにおいて用いられる化学的部分は、ポリシアル酸を含む。
【００７３】
別の実施形態において、リンカーにおいて用いられる化学的部分は、例えば、Glycobiology (2011) 21: 1331〜1340頁に記載されているヘパロサンポリマーを含む。
【００７４】
別の実施形態において、リンカーにおける化学的部分は、タンパク質の少なくとも1つを、タンパク質に付加している多糖又はオリゴ糖であるグリカンに付加するために用いられる。
【００７５】
別の実施形態において、リンカーにおける化学的部分は、タンパク質の少なくとも1つをO結合型グリカンに付加するために用いられる。
【００７６】
別の実施形態において、リンカーにおける化学的部分は、タンパク質の少なくとも1つをN結合型グリカンに付加するために用いられる。
【００７７】
N-グリカン及びO-グリカンのどちらも、抗体等のタンパク質に、これらのタンパク質を産生する細胞によって付加される。細胞のN-グリコシル化機構は、新生タンパク質がリボソームから小胞体へ移行する際、アミノ酸鎖におけるN-グリコシル化シグナル(N-X-S/Tモチーフ)を認識し、グリコシル化する(Kielyら、J. Biol. Chem. 1976、251: 5490頁;Glabeら、J. Biol. Chem.、1980、255、9236頁)。同様に、O-グリカンは、アミノ酸鎖における特定のO-グリコシル化部位に付加されるが、O-グリコシル化を引き起こすモチーフは、N-グリコシル化シグナルよりはるかにずっと不均一であり、本発明者らの能力は、アミノ酸配列においてO-グリコシル化部位を予想するにはまだ不十分である(Juleniusら、Glycobiology、2005、15: 153頁)。ポリペプチドを様々なポリマー側基とコンジュゲートさせる方法は、例えば、WO0331464に記載されている。
【００７８】
別の実施形態において、リンカーにおいて用いられる化学的部分は、前記リンカーをタンパク質の少なくとも1つに、以下のビラジカルから選択される構造により付加するために用いられる化学的部分を含む:
【００７９】
【化４】
0006783754.tif 000005
【００８０】
本発明の二重特異性抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、又は操作された抗体であり得る。
【００８１】
本明細書で用いられる場合、用語「ヒト抗体」は、フレームワーク領域の少なくとも一部及び/又はCDR領域の少なくとも一部がヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来している、可変領域を有する抗体を含むことを意図される。(例えば、ヒト抗体は、フレームワーク領域とCDR領域の両方がヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来している可変領域を有し得る。)更に、抗体が定常領域を含有する場合には、定常領域又はその一部もまた、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基(例えば、インビトロでのランダム若しくは部位特異的突然変異誘発により、又はインビボでの体細胞突然変異により導入される突然変異)を含んでもよい。
【００８２】
そのようなヒト二重特異性抗体は、2つのヒトモノクローナル抗体に由来し得る。ヒトモノクローナル抗体は、不死化細胞に融合した、ヒト免疫グロブリン重鎖及び軽鎖遺伝子セグメントレパートリーを含むゲノムを有するトランスジェニック非ヒト動物、例えば、トランスジェニックマウスから得られるB細胞を含むハイブリドーマによって産生され得る。
【００８３】
ヒト抗体は、ヒト生殖系列配列の選択に基づいて構築され、天然及び合成の配列多様性で更に多様化された配列ライブラリーから単離され得る。
【００８４】
ヒト抗体は、ヒトリンパ球のインビトロ免疫化、続いて、そのリンパ球のエプスタイン・バーウイルスでの形質転換によって調製され得る。
【００８５】
用語「ヒト抗体誘導体」は、抗体と別の作用物質又は抗体のコンジュゲート等の、任意の改変された型のヒト抗体を指す。
【００８６】
本明細書で用いられる場合、用語「ヒト化抗体」は、非ヒト免疫グロブリンに由来する配列エレメント(CDR領域又はその部分)を含有するヒト/非ヒトのキメラ抗体を指す。したがって、ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)の少なくとも超可変領域由来の残基が、所望の特異性、親和性、配列組成、及び機能性を有する、マウス、ラット、ウサギ、又は非ヒト霊長類由来等の非ヒト種由来の抗体(ドナー抗体)の超可変領域由来の残基によって置き換えられている、ヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク(FR)残基が、対応する非ヒト残基によって置き換えられている。そのような改変の例は、典型的にはドナー抗体に由来するアミノ酸残基である、1つ又は複数のいわゆる逆突然変異の導入である。抗体のヒト化は、当業者に知られている組換え技術を用いて行われ得る(例えば、Antibody Engineering、Methods in Molecular Biology、248巻、Benny K. Lo編参照)。軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインの両方についての適切なヒトレシピエントフレームワークは、例えば、配列又は構造相同性によって同定され得る。或いは、例えば、構造、生物物理的及び生化学的性質の知識に基づいて、定型的なレシピエントフレームワークが用いられ得る。レシピエントフレームワークは、生殖系列由来又は成熟抗体配列由来であり得る。ドナー抗体由来のCDR領域は、CDRグラフティングによって移すことができる。CDRグラフト化ヒト化抗体は、例えば、親和性、機能性、及び生物物理的性質について、重要なフレームワーク位置の同定によって更に最適化することができ、ドナー抗体由来のアミノ酸残基の再導入(逆突然変異)が、ヒト化抗体の性質に有益な影響を生じる。ドナー抗体に由来した逆突然変異に加えて、ヒト化抗体は、CDR又はフレームワーク領域における生殖系列残基の導入、免疫原性エピトープの除去、部位特異的突然変異誘発、親和性成熟等によって操作することができる。
【００８７】
更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体又はドナー抗体に見出されない残基を含んでもよい。これらの改変は、抗体パフォーマンスを更に洗練させるために行われる。一般的に、ヒト化抗体は、少なくとも1つの、典型的には2つの可変ドメインを含み、その可変ドメインにおいて、CDR領域の全部又は実質的に全部が非ヒト免疫グロブリンのCDR領域に対応し、かつFR残基の全部又は実質的に全部がヒト免疫グロブリン配列のFR残基である。ヒト化抗体は、任意で、免疫グロブリン定常領域(Fc)、典型的にはヒト免疫グロブリンの定常領域、の少なくとも一部も含むことができる。
【００８８】
用語「ヒト化抗体誘導体」は、抗体と、別の化学的作用物質、又は抗体若しくは抗体断片、又はポリペプチドとのコンジュゲート等の、ヒト化抗体の任意の改変型を指す。
【００８９】
本明細書で用いられる場合、用語「キメラ抗体」は、軽鎖及び重鎖遺伝子が、異なる種を起源とする免疫グロブリン可変領域及び定常領域から、典型的には遺伝子操作によって、構築されている、抗体を指す。例えば、マウスモノクローナル抗体由来の遺伝子の可変セグメントがヒト定常領域に連結され得る。
【００９０】
抗体の断片結晶性領域(「Fc領域」/「Fcドメイン」)は、定常CH2及びCH3ドメインを含む、抗体のC末端領域である。Fcドメインは、Fc受容体と呼ばれる細胞表面受容体、及び補体系のいくつかのタンパク質と相互作用し得る。Fc領域は、抗体を免疫系と相互作用できるようにする。本発明の一態様において、抗体は、典型的にはそれの機能的性質、例えば、とりわけ、血清中半減期、補体結合、Fc受容体結合、タンパク質安定性、及び/又は抗原依存性細胞傷害性、若しくはその欠損等の1つ又は複数を変化させるために、Fc領域内に改変を含むように操作され得る。更に、本発明の抗体は、化学修飾され得(例えば、1つ又は複数の化学的部分を抗体に付加することができる)、又はそれのグリコシル化を変化させるように、やはり抗体の1つ若しくは複数の機能的性質を変化させるように改変され得る。IgG1抗体は、結果としてある特定のFc受容体に対する親和性の減少(L234A、L235E、及びG237A)、及びC1q媒介性補体結合の低下(A330S及びP331S)をそれぞれ生じる、突然変異の1つ又は複数、もしかすると全部を含む改変型Fcドメインを有し得る(EUインデックスによる残基ナンバリング)。
【００９１】
本発明の抗体のアイソタイプは、IgG1、IgG2、IgG4等のIgGであり得る。必要に応じて、抗体のクラスは、公知の技術により「スイッチ」され得る。例えば、元々はIgM分子として産生された抗体が、IgG抗体へクラススイッチされ得る。クラススイッチ技術はまた、あるIgGサブクラスから別のサブクラスへ、例えば、IgG1からIgG2若しくはIgG4へ、IgG2からIgG1若しくはIgG4へ、又はIgG4からIgG1若しくはIgG2へ変換するために用いられ得る。異なるIgGサブクラス由来の領域の組合せによる定常領域キメラ分子を作製するための抗体の操作もまた実施することができる。
【００９２】
一実施形態において、CH1のヒンジ領域は、ヒンジ領域におけるシステイン残基の数が変化する、例えば、増加又は減少するように改変される。このアプローチは、例えば、Bodmerらによる米国特許第5,677,425号に更に記載されている。
【００９３】
定常領域は、抗体を安定化するために、例えば、二価抗体が2つの一価VH-VL断片へ分離するリスクを低下させるために、改変され得る。例えば、IgG4定常領域において、ヒンジにおける重鎖間のジスルフィド架橋形成を安定化させるために、残基S228(EUナンバリングインデックスによる、KabatによればS241)が、プロリン(P)残基へ突然変異され得る(例えば、Angalら、Mol Immunol. 1993; 30:105〜8頁参照)。
【００９４】
本発明の二重特異性抗体は、mAb 2F3抗体、mAb 2F22抗体(例えば、Fab 0295又はFab 0296)、mAb 2F45抗体、又はmAb 1F91抗体の抗原結合断片又はそのバリアントを含み得る。
【００９５】
本発明の二重特異性抗体は、mAb 2021抗体(参照により本明細書に組み入れられているWO2010/072691に初めて、記載されたヒト化モノクローナル抗体)の抗原結合断片又はそのバリアントを更に含み得る。そのような抗原結合断片又はそのバリアントの例としては、本明細書に記載されているような、Fab 0088、Fab 0094、又はFab 0313が挙げられる。mAb 2021が由来するモノクローナルのマウス抗体は、WO2010/072691に記載されているように、作製され得る。
【００９６】
mAb 2F3、mAb 2F22、mAb 2F45、mAb 1F91の抗原結合断片又はそのバリアント、及びmAb 2021の抗原結合断片又はそのバリアントを含む、上記の二重特異性抗体のいずれか1つは、IgG型式での完全長二重特異性抗体、又は抗体断片で構成される二重特異性分子であり得る。抗体又はその断片は、それらの相補性決定領域(CDR)に関して定義され得る。本明細書で用いられる場合、用語「相補性決定領域」又は「超可変領域」は、抗原結合に関与するアミノ酸残基が位置している抗体の領域を指す。超可変性の領域又はCDRは、抗体可変ドメインのアミノ酸アラインメントにおいて最も高い可変性を有する領域として同定することができる。Kabatデータベース等のデータベースをCDR同定に用いることができ、CDRは、例えば、軽鎖可変ドメインのアミノ酸残基24〜34(L1)、50〜56(L2)、及び89〜97(L3)、並びに重鎖可変ドメインにおける31〜35(H1)、50〜65(H2)、及び95〜102(H3)を含むと定義されている(Kabatら、Sequences of Proteins of Immunological Interest、1991、Sequences of Proteins of Immunological Interest、第5版、U.S. Department of Health and Human Services、NIH Publication No. 91-3242)。或いは、CDRは、「超可変ループ」由来のそれらの残基として定義することができる(軽鎖可変ドメインにおける残基26〜33(L1)、50〜52(L2)、及び91〜96(L3)並びに重鎖可変ドメインにおける26〜32(H1)、53〜55(H2)、及び96〜101(H3);Chothia及びLesk、J. Mol. Biol 1987; 196: 901〜917頁)。典型的には、この領域におけるアミノ酸残基のナンバリングは、Kabatら、前記に記載された方法によって行われる。本明細書における「Kabat位置」、「Kabat残基」、及び「Kabatによる」等の句は、重鎖可変ドメイン又は軽鎖可変ドメインについてのこのナンバリングシステムを指す。Kabatナンバリングシステムを用いて、ペプチドの実際の直鎖状アミノ酸配列は、可変ドメインのフレームワーク(FR)又はCDRの短縮、又はそれへの挿入に対応する、より少ない、又は追加のアミノ酸を含有し得る。例えば、重鎖可変ドメインは、CDR H2の残基52の後にアミノ酸挿入(Kabatによれば、残基52a、52b、及び52c)、及び重鎖FR残基82の後に挿入された残基(例えば、Kabatによれば、残基82a、82b、及び82c等)を含み得る。残基のKabatナンバリングは、所定の抗体について、抗体の配列の「標準」Kabatナンバリング化配列との相同性の領域におけるアラインメントによって決定され得る。
【００９７】
用語「フレームワーク領域」又は「FR」残基は、本明細書で定義されているように、CDR内ではないそれらのVH又はVLアミノ酸残基を指す。
【００９８】
本発明の二重特異性抗体の抗原認識部位は、本明細書に開示された配列のアミノ酸ナンバリングにより、又はKabatナンバリングを用いて定義されているように、配列番号4〜11、14〜15、17〜26内由来のCDR領域等の、本明細書に開示された特定の抗体又は抗体断片の1つ又は複数由来のCDR領域を含み得る。
【００９９】
二重特異性抗体の第1の抗原認識部位は、
・配列番号4のアミノ酸31〜35(SYGVH)に対応するCDR1配列であって、これらのアミノ酸残基の1個が異なるアミノ酸残基によって置換されていてもよい、CDR1配列;及び/又は
・配列番号4のアミノ酸50〜65(VIWRGGSTDFNAAFMS)に対応するCDR2配列であって、これらのアミノ酸残基の1個、2個、若しくは3個が異なるアミノ酸残基によって置換されていてもよい、CDR2配列;及び/又は
・配列番号4のアミノ酸98〜110(NSHGNYVGYAMDY)に対応するCDR3配列であって、これらのアミノ酸残基の1個若しくは2個が異なるアミノ酸残基によって置換されていてもよい、CDR3配列
を含む重鎖を有し得、並びに前記第1の抗原認識部位は
・配列番号5のアミノ酸24〜34(KASENVGAAVA)に対応するCDR1配列であって、これらのアミノ酸残基の1個、2個、若しくは3個が異なるアミノ酸残基によって置換されていてもよい、CDR1配列;及び/又は
・配列番号5のアミノ酸50〜56(SASNRYT)に対応するCDR2配列であって、これらのアミノ酸残基の1個が異なるアミノ酸残基によって置換されていてもよい、CDR2配列;及び/又は
・配列番号5のアミノ酸89〜96(QQYTNYPT)に対応するCDR3配列であって、これらのアミノ酸残基の1個が異なるアミノ酸残基によって置換されていてもよい、CDR3配列
を含む軽鎖を有し得る。
【０１００】
二重特異性抗体の第1の抗原認識部位は、
・配列番号6のアミノ酸31〜35(NYGVH)に対応するCDR1配列であって、これらのアミノ酸残基の1個が異なるアミノ酸残基によって置換されていてもよい、CDR1配列;及び/又は
・配列番号6のアミノ酸50〜65(VIWRGGSIDYNAAFMS)に対応するCDR2配列であって、これらのアミノ酸残基の1個、2個、若しくは3個が異なるアミノ酸残基によって置換されていてもよい、CDR2配列;及び/又は
・配列番号6のアミノ酸98〜110(NSHGNYVGYAMDY)に対応するCDR3配列であって、これらのアミノ酸残基の1個若しくは2個が異なるアミノ酸残基によって置換されていてもよい、CDR3配列
を含む重鎖を有し得、並びに前記第1の抗原認識部位は
・配列番号7のアミノ酸24〜34(KASQSVGPAVA)に対応するCDR1配列であって、これらのアミノ酸残基の1個、2個、若しくは3個が異なるアミノ酸残基によって置換されていてもよい、CDR1配列;及び/又は
・配列番号7のアミノ酸50〜56(SASNRYT)に対応するCDR2配列であって、これらのアミノ酸残基の1個が異なるアミノ酸残基によって置換されていてもよい、CDR2配列;及び/又は
・配列番号7のアミノ酸89〜96(QQYTSYPT)に対応するCDR3配列であって、これらのアミノ酸残基の1個が異なるアミノ酸残基によって置換されていてもよい、CDR3配列
を含む軽鎖を有し得る。
【０１０１】
二重特異性抗体の第1の抗原認識部位は、
・配列番号8のアミノ酸31〜35(GYGVH)に対応するCDR1配列であって、これらのアミノ酸残基の1個が異なるアミノ酸残基によって置換されていてもよい、CDR1配列;及び/又は
・配列番号8のアミノ酸50〜65(VIWRGGSIDYNAAFMS)に対応するCDR2配列であって、これらのアミノ酸残基の1個、2個、若しくは3個が異なるアミノ酸残基によって置換されていてもよい、CDR2配列;及び/又は
・配列番号8のアミノ酸98〜110(NSHGNYVGYAMDY)に対応するCDR3配列であって、これらのアミノ酸残基の1個若しくは2個が異なるアミノ酸残基によって置換されていてもよい、CDR3配列
を含む重鎖を有し得、並びに前記第1の抗原認識部位は
・配列番号9のアミノ酸24〜34(KASQNVGTAVA)に対応するCDR1配列であって、これらのアミノ酸残基の1個、2個、若しくは3個が異なるアミノ酸残基によって置換されていてもよい、CDR1配列;及び/又は
・配列番号9のアミノ酸50〜56(SASNRYT)に対応するCDR2配列であって、これらのアミノ酸残基の1個が異なるアミノ酸残基によって置換されていてもよい、CDR2配列;及び/又は
・配列番号9のアミノ酸89〜96(QQYTSYPT)に対応するCDR3配列であって、これらのアミノ酸残基の1個が異なるアミノ酸残基によって置換されていてもよい、CDR3配列
を含む軽鎖を有し得る。
【０１０２】
二重特異性抗体の第1の抗原認識部位は、
・配列番号10のアミノ酸31〜36(SDYAWN)に対応するCDR1配列であって、これらのアミノ酸残基の1個が異なるアミノ酸残基によって置換されていてもよい、CDR1配列;及び/又は
・配列番号10のアミノ酸51〜66(YISYSGSTSYNPSLKS)に対応するCDR2配列であって、これらのアミノ酸残基の1個、2個、若しくは3個が異なるアミノ酸残基によって置換されていてもよい、CDR2配列;及び/又は
・配列番号10のアミノ酸99〜104(WAYDGP)に対応するCDR3配列であって、これらのアミノ酸残基の1個が異なるアミノ酸残基によって置換されていてもよい、CDR3配列
を含む重鎖を有し得、並びに前記第1の抗原認識部位は
・配列番号11のアミノ酸24〜33(RASSSVSHMH)に対応するCDR1配列であって、これらのアミノ酸残基の1個若しくは2個が異なるアミノ酸残基によって置換されていてもよい、CDR1配列;及び/又は
・配列番号11のアミノ酸49〜55(ATSNLAS)に対応するCDR2配列であって、これらのアミノ酸残基の1個が異なるアミノ酸残基によって置換されていてもよい、CDR2配列;及び/又は
・配列番号11のアミノ酸88〜96(QQWSSNPFT)に対応するCDR3配列であって、これらのアミノ酸残基の1個が異なるアミノ酸残基によって置換されていてもよい、CDR3配列
を含む軽鎖を有し得る。
【０１０３】
二重特異性抗体の第2の抗原認識部位は、
・配列番号19のアミノ酸31〜35(NYAMS)に対応するCDR1配列であって、これらのアミノ酸残基の1個が異なるアミノ酸残基によって置換されていてもよい、CDR1配列;及び/又は
・配列番号19のアミノ酸50〜66(TISRSGSYSYFPDSVQG)、配列番号21のアミノ酸50〜66(TISRSGSYSYYPDSVKG)、若しくは配列番号25のアミノ酸50〜66(TISRSGSYSYYADSVKG)に対応するCDR2配列であって、これらのアミノ酸残基の1個、2個、若しくは3個が異なるアミノ酸残基によって置換されていてもよい、CDR2配列;及び/又は
・配列番号19のアミノ酸99〜110(LGGYDEGDAMDS)に対応するCDR3配列であって、これらのアミノ酸残基の1個、2個、若しくは3個が異なるアミノ酸残基によって置換されていてもよい、CDR3配列
を含む重鎖を有し得、並びに前記第2の抗原認識部位は
・配列番号20のアミノ酸24〜39(KSSQSLLESDGKTYLN)に対応するCDR1配列であって、これらのアミノ酸残基の1個、2個、若しくは3個が異なるアミノ酸残基によって置換されていてもよい、CDR1配列;及び/又は
・配列番号20のアミノ酸55〜61(LVSILDS)に対応するCDR2配列であって、これらのアミノ酸残基の1個若しくは2個が異なるアミノ酸残基によって置換されていてもよい、CDR2配列;及び/又は
・配列番号20のアミノ酸94〜102(LQATHFPQT)に対応するCDR3配列であって、これらのアミノ酸残基の1個若しくは2個が異なるアミノ酸残基によって置換されていてもよい、CDR3配列
を含む軽鎖を有し得る。
【０１０４】
前記アミノ酸置換は、下記のように、保存的置換であり得る。
【０１０５】
したがって、TFPI(1〜79)特異的抗体断片は、そのKPI-2ドメイン特異的抗体断片と組み合わされて、とりわけ、融合型式、IgG断片型式、完全長IgG型式で、又はFab-Fabコンジュゲート(BiFab)として、二重特異性抗体を形成する。
【０１０６】
1つのそのような実施形態において、mAb 1F91のVH及びVL領域(配列番号10、11)を有するFab断片が、mAb 2021のVH、VL領域(配列番号19、20)を有するFab断片と組み合わせられる。
【０１０７】
1つのそのような実施形態において、mAb 1F91のVH及びVL領域(配列番号10、11)を有するFab断片が、Fab断片0094(配列番号21、22)と組み合わせられる。
【０１０８】
1つのそのような実施形態において、mAb 1F91のVH及びVL領域(配列番号10、11)を有するFab断片が、Fab断片0313(配列番号25、26)と組み合わせられる。
【０１０９】
1つのそのような実施形態において、mAb 2F3のVH及びVL領域(配列番号4、5)を有するFab断片が、mAb 2021のVH、VL領域(配列番号19、20)を有するFab断片と組み合わせられる。
【０１１０】
1つのそのような実施形態において、mAb 2F3のVH及びVL領域(配列番号4、5)を有するFab断片が、Fab断片0094(配列番号21、22)と組み合わせられる。
【０１１１】
1つのそのような実施形態において、mAb 2F3のVH及びVL領域(配列番号4、5)を有するFab断片が、Fab断片0313(配列番号25、26)と組み合わせられる。
【０１１２】
1つのそのような実施形態において、mAb 2F22のVH及びVL領域(配列番号6、7)を有するFab断片が、mAb 2021のVH、VL領域(配列番号19、20)を有するFab断片と組み合わせられる。
【０１１３】
1つのそのような実施形態において、mAb 2F22のVH及びVL領域(配列番号6、7)を有するFab断片が、Fab断片0094(配列番号21、22)と組み合わせられる。
【０１１４】
1つのそのような実施形態において、mAb 2F22のVH及びVL領域(配列番号6、7)を有するFab断片が、Fab断片0313(配列番号25、26)と組み合わせられる。
【０１１５】
1つのそのような実施形態において、mAb 2F45のVH、VL領域(配列番号8、9)を有するFab断片が、mAb 2021のFab断片(配列番号19、20)と組み合わせられる。
【０１１６】
1つのそのような実施形態において、mAb 2F45のVH及びVL領域(配列番号8、9)を有するFab断片が、Fab断片0094(配列番号21、22)と組み合わせられる。
【０１１７】
1つのそのような実施形態において、mAb 2F45のVH及びVL領域(配列番号8、9)を有するFab断片が、Fab断片0313(配列番号25、26)と組み合わせられる。
【０１１８】
本発明による1つのFab-Fabコンジュゲート(BiFab)は、BiFab 9041 (Fab 0295(配列番号15、18)にコンジュゲートしたFab 0088(配列番号23、24))であり得る。
【０１１９】
本発明による別のFab-Fabコンジュゲート(BiFab)は、Fab 0295(配列番号15、18)にコンジュゲートしたFab 0313(配列番号25、26)であるBiFab 9042であり得る。
【０１２０】
一実施形態において、完全長型式での二重特異性抗体(mAb 0421)は、mAb 0310(配列番号27、28)及びmAb 0336(配列番号15、29)由来の個々のアームからなる。バリアント抗体は、上記で論じられた特定の配列及び断片から1個、2個、3個、4個、5個、最高10個、又はそれ以上のアミノ酸置換及び/又は欠失及び/又は挿入を含み得る。「欠失」バリアントは、個々のアミノ酸の欠失、1個、2個、3個、4個、若しくは5個のアミノ酸等の少数のアミノ酸群の欠失、又は特定のアミノ酸ドメイン若しくは他の特徴の欠失等のより大きいアミノ酸領域の欠失を含み得る。「挿入」バリアントは、個々のアミノ酸の挿入、1個、2個、3個、4個、若しくは5個のアミノ酸等の少数のアミノ酸群の挿入、又は特定のアミノ酸ドメイン若しくは他の特徴の挿入等のより大きいアミノ酸領域の挿入を含み得る。「置換」バリアントは、好ましくは、1個又は複数のアミノ酸の、同じ数のアミノ酸との、保存的アミノ酸置換を生じる置き換えを含む。例えば、アミノ酸は、類似した性質を有する代替のアミノ酸、例えば、別の塩基性アミノ酸、別の酸性アミノ酸、別の中性アミノ酸、別の荷電アミノ酸、別の親水性アミノ酸、別の疎水性アミノ酸、別の極性アミノ酸、別の芳香族アミノ酸、又は別の脂肪族アミノ酸によって置換されていてもよい。適切な置換を選択するために用いることができる20個の主要なアミノ酸のいくつかの性質は以下の通りである:
【０１２１】
【表１】
0006783754.tif 000006
【０１２２】
好ましい「誘導体」又は「バリアント」としては、配列に現れるアミノ酸が、天然に存在するアミノ酸の代わりに、その構造類似体であるものが挙げられる。配列に用いられるアミノ酸はまた、抗体の機能が有意には悪影響を及ぼされないという条件で、誘導体化又は修飾化、例えば、標識化され得る。
【０１２３】
置換は、保存的置換であり得るが、それに限定されない。
【０１２４】
上記のような誘導体及びバリアントは、抗体の合成中に、又は産生後の修飾により、又は抗体が組換え型である場合、部位特異的突然変異誘発、ランダム突然変異誘発、若しくは酵素切断、及び/若しくは核酸のライゲーションの公知の技術を用いて、調製され得る。
【０１２５】
本発明はまた、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドに関する。したがって、本発明のポリヌクレオチドは、本明細書に記載されているような任意の抗体をコードし得る。用語「核酸分子」及び「ポリヌクレオチド」は、本明細書で交換可能に用いられ、デオキシリボヌクレオチドか若しくはリボヌクレオチドのいずれか、又はその類似体の、任意の長さのヌクレオチドの重合体型を指す。ポリヌクレオチドの非限定的例としては、遺伝子、遺伝子断片、メッセンジャーRNA(mRNA)、cDNA、組換えポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたDNA、任意の配列の単離されたRNA、核酸プローブ及びプライマーが挙げられる。本発明のポリヌクレオチドは、単離された、又は精製された形で提供され得る。選択されたポリペプチドを「コードする」核酸配列は、適切な制御配列の調節下に配置された場合、インビボでポリペプチドへ転写(DNAの場合)及び翻訳(mRNAの場合)される核酸分子である。コード配列の境界は、5'(アミノ)末端における開始コドン及び3'(カルボキシ)末端における翻訳停止コドンによって決定される。本発明の目的のために、そのような核酸配列としては、ウイルス、原核生物又は真核生物mRNAからのcDNA、ウイルス又は原核生物のDNA又はRNAからのゲノム配列、及び更に合成DNA配列を挙げることができるが、それらに限定されない。転写終結配列は、コード配列の3'側に位置し得る。
【０１２６】
一実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、上記のようなVH又はVLアミノ酸配列をコードする配列を含む。例えば、本発明のポリヌクレオチドは、上記のような配列番号4〜11、14〜15、又は17〜26のいずれか1つの配列を含むポリペプチドをコードし得る。或いは、適切なポリヌクレオチド配列は、これらの特定のポリヌクレオチド配列の1つのバリアントであり得る。例えば、バリアントは、上記の核酸配列のいずれかの置換、欠失、又は付加バリアントであり得る。バリアントポリヌクレオチドは、配列表に示された配列からの1個、2個、3個、4個、5個、最高10個、最高20個、最高30個、最高40個、最高50個、最高75個、又はそれ以上の核酸置換及び/又は欠失を含み得る。
【０１２７】
適切なバリアントは、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと少なくとも70%相同、好ましくは、それと少なくとも80%又は90%、より好ましくは少なくとも95%、97%、又は99%相同であり得る。相同性を測定する方法は、当技術分野においてよく知られており、本関連において相同性が核酸同一性に基づいて計算されることは、当業者に理解されているだろう。そのような相同性は、少なくとも15個、好ましくは少なくとも30個、例えば、少なくとも40個、60個、100個、200個、又はそれ以上の連続したヌクレオチドの領域に関して存在し得る。そのような相同性は、非改変ポリヌクレオチド配列の全長に関して存在し得る。
【０１２８】
ポリヌクレオチド相同性又は同一性を測定する方法は、当技術分野において知られている。例えば、UWGCGパッケージは、相同性を計算するために用いることができるBESTFITプログラム(例えば、それのデフォルト設定で用いられる)を提供する(Devereuxら(1984) Nucleic Acids Research 12: 387〜395頁)。
【０１２９】
PILEUP及びBLASTアルゴリズムもまた、例えば、Altschul S.F. (1993) J Mol Evol 36: 290〜300頁;Altschul, S.F.ら(1990) J Mol Biol 215: 403〜10頁に記載されているように、相同性を計算し、又は配列を並べるために(典型的には、それらのデフォルト設定で)用いることができる。
【０１３０】
BLAST分析を実施するためのソフトウェアは、National Centre for Biotechnology Information(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)を通して公開されている。このアルゴリズムは、まず、データベース配列における同じ長さのワードとアライメントされた場合、一致するか又はある正の値の閾値スコアTを満たすかのいずれかである、クエリー配列における長さWの短いワードを同定することにより、高いスコアリング配列ペア(HSP)を同定することを含む。Tは、隣接ワードスコア閾値と呼ばれる(Altschulら、前記)。これらの最初の隣接ワードヒットは、それらを含有するHSPを見出すための検索を開始する種として働く。ワードヒットは、累積のアラインメントスコアが増加し得る限り、各配列に沿って両方向に伸長される。各方向におけるワードヒットのための伸長は、累積アラインメントスコアが、1つ若しくは複数の負のスコアリング残基アラインメントの蓄積のために、ゼロ以下になると、又はいずれかの配列の末端に達すると停止する。BLASTアルゴリズムパラメータW、T、及びXは、アラインメントの感度及び速度を決定する。BLASTプログラムは、デフォルトとして、11のワード長(W)、BLOSUM62スコアリングマトリックス(Henikoff及びHenikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915〜10919頁)、50のアラインメント(B)、10の期待数(E)、M=5、N=4、及び両方の鎖の比較を用いる。
【０１３１】
BLASTアルゴリズムは、2つの配列間の類似性の統計的解析を実施する(例えば、Karlin及びAltschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873〜5787頁参照)。
【０１３２】
本明細書における用語「抗原」(Ag)は、そのAgを認識する抗体(Ab)を産生するために免疫適格性脊椎動物の免疫化に用いられる実体を指す。本発明の関連において、適切な抗原としては、ヒトTFPI(1〜161)及び完全長ヒトTFPIαが挙げられる。本明細書において、Agは、より広く名付けられ、一般的に、Abによって特異的に認識される標的分子を含むことを意図され、したがって、Agとしては、Abを産生するために用いられる、免疫化方法、又は他の方法、例えば、ファージディスプレイに用いられるその分子の断片又は模倣体が挙げられる。
【０１３３】
本明細書で用いられる場合、用語「エピトープ」は、抗体(Ab)等の「抗原結合性ポリペプチド」と、それの対応する抗原(Ag)との間の分子相互作用の関連において定義される。一般的に、「エピトープ」は、Abが特異的に結合するAg上の区域又は領域、すなわち、Abと物理的に接触する区域又は領域を指す。物理的接触は、Ab分子及びAg分子における原子についての様々な判断基準(例えば、3Å、4Å、5Å等の2〜6Åの距離カットオフ、又は溶媒露出度)を用いて定義され得る。タンパク質エピトープは、Abとの結合に直接的に関与するAgにおけるアミノ酸残基(エピトープの免疫優性成分とも呼ばれる)、及び結合に直接的には関与しない他のアミノ酸残基、例えば、Abによって効果的にブロックされるAgのアミノ酸残基、すなわち、「溶媒排除表面」、及び/又はAbによる「フットプリント」内のアミノ酸残基を含み得る。
【０１３４】
本明細書における用語「エピトープ」は、他に指定がない限り、本発明による単一特異性若しくは二重特異性TFPI抗体、又は別のTFPI特異的作用物質と特異的に結合するTFPIの任意の特定の領域における両方の型の結合領域を含む。TFPIは、いくつかの異なるエピトープを含み得、それには、非限定的に、(1)直鎖状ペプチドエピトープ、(2)成熟TFPI立体構造においてお互いに近くに位置した1個又は複数の非連続性アミノ酸からなる立体構造的エピトープ、及び(3)全体か又は部分のいずれかが、含水炭素基等の、TFPIに共有結合により付加された分子構造からなる翻訳後エピトープが挙げられ得る。
【０１３５】
所定の抗体(Ab)/抗原(Ag)ペアについてのエピトープは、様々な実験による、及びコンピュータによるエピトープマッピング方法を用いて詳細の種々のレベルで記載し、かつ特徴付けることができる。実験方法としては、突然変異誘発、X線結晶解析、核磁気共鳴(NMR)分光法、水素重水素交換質量分析(HX-MS)、及び様々な競合結合方法、当技術分野において知られている方法が挙げられる。各方法は固有の原理に依存しているため、エピトープの記載は、それが決定されている方法に深く関係している。したがって、使用されたエピトープマッピング方法によって、所定のAb/Agペアについてのエピトープは、異なって記載され得る。
【０１３６】
AgとAbとの間の相互作用に関するエピトープは、それの最も詳細なレベルにおいて、Ag-Ab相互作用に存在する原子接触を定義する空間座標、及び結合熱力学へのそれらの相対的寄与についての情報によって記載することができる。あまり詳細ではないレベルにおいて、エピトープは、AgとAbとの間の原子接触を定義する空間座標によって特徴付けることができる。更により詳細ではないレベルにおいては、エピトープは、Ab:Ag複合体における原子間の距離、又は原子の溶媒露出度等の特定の判断基準によって定義されるように、それが含むアミノ酸残基によって特徴付けることができる。更にもっと詳細ではないレベルにおいて、エピトープは、機能を通して、例えば、他のAbとの競合結合により、特徴付けることができる。エピトープはまた、別のアミノ酸による置換がAbとAgとの間の相互作用の特性を変化させるだろう、アミノ酸残基を含むとして、より一般的に定義することができる。
【０１３７】
Ab、例えば、Fab断片と、それのAgとの間の複合体の空間座標により定義された、X線により導かれた結晶構造の関連において、エピトープという用語は、本明細書において、他に規定がなく、又は文脈によって否定されない限り、Abにおける重原子(すなわち、非水素原子)から4Åの距離内に重原子を有するTFPI残基であると具体的に定義される。
【０１３８】
用いられるエピトープマッピング方法によって、エピトープの記載及び定義が、異なるレベルの詳細さで得られるという事実から、同じAg上の異なるAbについてのエピトープの比較は、同様に、当然、異なるレベルの詳細さで行われ得るということになる。
【０１３９】
例えば、X線構造から決定された、アミノ酸レベルで記載されるエピトープは、それらが同じセットのアミノ酸残基を含有する場合には、同一であると言われる。エピトープは、少なくとも1個のアミノ酸がそれらのエピトープによって共有されている場合には、重複すると言われる。エピトープは、それらのエピトープによって共有されるアミノ酸残基がない場合には、別個(固有)であると言われる。
【０１４０】
用語「パラトープ」の定義は、視点を逆転させることにより、「エピトープ」の上記の定義から導かれる。したがって、用語「パラトープ」は、Agが特異的に結合するAb上の区域又は領域(すなわち、それを用いて、Agと物理的に接触する)を指す。
【０１４１】
Fab断片等のAbと、そのAgとの間の複合体の空間座標により定義された、X線により導かれた結晶構造の関連において、パラトープという用語は、本明細書において、他に規定がなく、又は文脈によって否定されない限り、TFPIにおける重原子(すなわち、非水素原子)から4Åの距離内に重原子を有することにより特徴付けけられるAb残基として具体的に定義される。
【０１４２】
所定の抗体(Ab)/抗原(Ag)ペアについてのエピトープ及びパラトープは、日常的な方法により同定され得る。例えば、エピトープの一般的な位置は、抗体の、異なる断片又はバリアントTFPIポリペプチドと結合する能力を評価することにより決定され得る。抗体と接触するTFPI内の特定のアミノ酸(エピトープ)、及びTFPIと接触する抗体における特定のアミノ酸(パラトープ)もまた、日常的な方法を用いて決定され得る。例えば、抗体及び標的分子が組み合わせられ得、Ab:Ag複合体が結晶化され得る。その複合体の結晶構造が決定され得、それを用いて、抗体とそれの標的との間の相互作用の特定の部位を同定し得る。
【０１４３】
同じ抗原と結合する抗体は、それらの共通の抗原と同時に結合するそれらの能力に関して特徴付けることができ、「競合結合」/「ビニング」に供し得る。本関連において、用語「ビニング」は、同じ抗原と結合する抗体をグループ化する方法を指す。抗体の「ビニング」は、表面プラズモン共鳴(SPR)、ELISA、又はフローサイトメトリー等の標準技術に基づいたアッセイにおいて、2つの抗体のそれらの共通の抗原との競合結合に基づき得る。
【０１４４】
抗体の「ビン」は、参照抗体を用いて定義される。第2の抗体が、参照抗体と同時に抗原と結合することができない場合には、その第2の抗体は、参照抗体と同じ「ビン」に属すると言われる。この場合、参照抗体と第2の抗体は、抗原の同じ部分に競合的に結合し、新造語の「競合抗体」である。第2の抗体が参照抗体と同時に抗原と結合することができる場合には、その第2の抗体は別個の「ビン」に属すると言われる。この場合、参照抗体と第2の抗体は、抗原の同じ部分に競合的に結合せず、新造語の「非競合抗体」である。
【０１４５】
抗体「ビニング」は、エピトープについての直接的情報を提供しない。競合抗体、すなわち、同じ「ビン」に属する抗体は、同一のエピトープ、重複するエピトープ、又は更に別個のエピトープを有する場合がある。後者は、抗原上のそれのエピトープと結合した参照抗体が、第2の抗体が抗原上のそれのエピトープと接触するのに必要とされるスペースを占める(「立体障害」)場合である。非競合抗体は、一般的に別個のエピトープを有する。
【０１４６】
用語「結合親和性」は、本明細書において、2つの分子、例えば、抗体又はその断片と抗原との間での非共有結合性相互作用の強度の測定尺度として用いられる。用語「結合親和性」は、本明細書において、一価と二価の両方の相互作用(内因活性)を記載するために用いられる。
【０１４７】
2つの分子、例えば、抗体又はその断片と抗原との間での一価相互作用を通しての結合親和性は、平衡解離定数(KD)を決定することにより定量化され得る。順繰りに、KDは、複合体形成及び解離の反応速度の、例えばSPR方法による、測定により、決定することができる。一価複合体の会合及び解離に対応する速度定数は、それぞれ、会合速度定数ka(又はkon)及び解離速度定数kd(又はkoff)と呼ばれる。KDは、等式KD=kd/kaを通してkaとkdに関係付けられる。
【０１４８】
上記の定義後、所定の抗原に対する異なる抗体の結合親和性の比較等の、異なる分子相互作用に関連した結合親和性は、個々の抗体/抗原複合体についてのKD値の比較により比較され得る。
【０１４９】
本発明による抗体は、天然に存在するリガンド若しくは受容体、又は別の抗体等の別の分子と、TFPIとの結合において競合し、それにより、これらの相互作用に関連した機能に影響を及ぼし得る可能性がある。抗体の天然のリガンド/受容体と競合する能力は、TFPI阻害についての見かけ上のKIへの効果を測定する様々な活性アッセイにより評価され得る。その後、KD値は、見かけ上のKI値から推定され得る。典型的には、標的(TFPI)に関する抗体についての関心対象となるKD値は、他のTFPIリガンドのKDの2分の1、好ましくは5分の1、より好ましくは10分の1である。より好ましくは、KDは、100分の1又は200分の1等の50分の1、更により好ましくは1,000分の1又は10,000分の1等の500分の1である。
【０１５０】
この解離定数の値は、よく知られている方法により直接的に決定することができる。抗体等のリガンドの標的への結合能力を評価するための標準アッセイは、当技術分野において知られており、そうしたものとしては、例えば、ELISA、ウェスタンブロット、RIA、等温滴定熱量測定、及びフローサイトメトリー分析が挙げられる。抗体の結合反応速度及び結合親和性もまた、SPR等の当技術分野において知られている標準アッセイにより評価することができる。
【０１５１】
抗体の標的への結合が、その標的の別のリガンド、例えば、別の抗体によるその標的の結合と比較される、競合結合アッセイを行うことができる。
【０１５２】
本明細書に開示されているような二重特異性抗体は、それのそれぞれの「アーム」の合わされた親和性より高い親和性及び/又はアビディティで、完全長TFPI又はTFPI(1〜161)に結合し得る。
【０１５３】
本明細書に開示されているような二重特異性抗体は、それが、本明細書に開示されているようなTFPI(1〜96)、TFPI(1〜76)、TFPI(26〜76)、TFPI(77〜161)、TFPI(97〜147)、及び/又は任意の他のTFPI断片に結合するより高い親和性及び/又はアビディティで、完全長TFPIに結合し得る。
【０１５４】
本明細書に開示されているような二重特異性抗体は、1×10-11M以下、又は1×10-12M以下、又は1×10-13M以下、又は1×10-14M以下、又は1×10-15M以下の完全長TFPI又はTFPI(1〜161)についてのKDを有し得る。
【０１５５】
本発明の二重特異性抗体の任意の「アーム」は、1×10-5M以下、1×10-6M以下、1×10-7M以下、1×10-8M以下、又は1×10-9M以下、1×10-10M以下、1×10-11M以下、又は1×10-12M以下、又は1×10-13M以下、又は1×10-14M以下、又は1×10-15M以下のそれの標的についてのKDを有し得る。本発明の抗体のKDは、例えば、0.7nM未満、0.6nM未満、0.5nM未満、0.4nM未満、0.3nM未満、0.2nM未満、0.1nM未満、0.05nM未満、0.025nM未満、0.015nM未満、0.015nMから0nMの間等の0.8nM未満であり得る。
【０１５６】
一態様において、本明細書に開示されているような、2つの(完全長)抗体又はFab断片の二重特異性コンジュゲートは、TFPI(1〜79)結合剤及びTFPI KPI-2結合剤を含み、TFPI(1〜79)結合剤のKDは、2×10-9M以下、3×10-9M以下、4×10-9M以下、5×10-9M以下、6×10-9M以下、7×10-9M以下、8×10-9M以下、9×10-9M以下、1×10-8M以下、2×10-8M以下、3×10-8M以下、4×10-8M以下、5×10-8M以下、6×10-8M以下、7×10-8M以下、8×10-8M以下、9×10-8M以下、1×10-7M以下、2×10-7M以下、3×10-7M以下、4×10-7M以下、5×10-7M以下、6×10-7M以下、7×10-7M以下、8×10-7M以下、9×10-7M以下、1×10-6M以下、2×10-6M以下、3×10-6M以下、4×10-6M以下、5×10-6M以下、6×10-6M以下、7×10-6M以下、8×10-6M以下、9×10-6M以下、1×10-5M以下、2×10-5M以下、3×10-5M以下、4×10-5M以下、5×10-5M以下、6×10-5M以下、7×10-5M以下、8×10-5M以下、9×10-5M以下である。
【０１５７】
一態様において、TFPI(1〜79)結合剤のKDは、範囲5×10-7M〜1×10-5M内である。1つのそのような態様において、TFPI(1〜79)結合剤のKDは、範囲1×10-7M〜1×10-5M内である。1つのそのような態様において、TFPI(1〜79)結合剤のKDは、範囲1×10-7M〜1×10-6M内である。
【０１５８】
一態様において、TFPI(1〜79)結合剤のKDは、範囲5×10-7M〜1×10-7M内である。
【０１５９】
一態様において、TFPI(1〜79)結合剤のKDは、範囲1×10-7M〜5×10-5M内である。
【０１６０】
一態様において、TFPI(1〜79)結合剤は、1つ又は複数の置換を含む、mAb2F22、Fab 0295、又はFab 0296のバリアントである。
【０１６１】
一態様において、KPI-2結合剤は、1つ又は複数の置換を含む、mAb 2021、mAb 0310、Fab 0088、又はFab 0313のバリアントである。
【０１６２】
一態様において、本明細書に開示されているような、2つの(完全長)抗体又はFab断片の二重特異性コンジュゲートは、TFPI(1〜79)結合剤及びTFPI KPI-2結合剤を含み、KPI-2結合剤のKDは、2×10-9M以下、3×10-9M以下、4×10-9M以下、5×10-9M以下、6×10-9M以下、7×10-9M以下、8×10-9M以下、9×10-9M以下、1×10-8M以下、2×10-8M以下、3×10-8M以下、4×10-8M以下、5×10-8M以下、6×10-8M以下、7×10-8M以下、8×10-8M以下、9×10-8M以下、1×10-7M以下、2×10-7M以下、3×10-7M以下、4×10-7M以下、5×10-7M以下、6×10-7M以下、7×10-7M以下、8×10-7M以下、9×10-7M以下、1×10-6M以下、2×10-6M以下、3×10-6M以下、4×10-6M以下、5×10-6M以下、6×10-6M以下、7×10-6M以下、8×10-6M以下、9×10-6M以下、1×10-5M以下、2×10-5M以下、3×10-5M以下、4×10-5M以下、5×10-5M以下、6×10-5M以下、7×10-5M以下、6×10-5M以下、5×10-5M以下、4×10-5M以下、3×10-5M以下、2×10-5M以下、1×10-5M以下である。
【０１６３】
一態様において、KPI-2結合剤のKDは、範囲5×10-7M〜1×10-5M内である。1つのそのような態様においてKPI-2結合剤のKDは、範囲1×10-7M〜1×10-5M内である。1つのそのような態様において、KPI-2結合剤のKDは、範囲1×10-7M〜1×10-6M内である。
【０１６４】
一態様において、KPI-2結合剤のKDは、範囲5×10-7M〜1×10-7M内である。
【０１６５】
一態様において、KPI-2結合剤のKDは、範囲1×10-7M〜5×10-5M内である。
【０１６６】
一態様において、本明細書に開示されているような二重特異性抗体は、範囲1×10-9M〜1×10-6M内のKDを有するTFPI(1〜79)結合剤、及び範囲1×10-14M〜1×10-10M内のKDを有するKPI-2結合剤を含む。1つのそのような態様において、TFPI(1〜79)結合剤のKDは、範囲1×10-8M〜1×10-6M内であり、かつKPI-2結合剤のKDは、範囲1×10-14M〜1×10-11M内である。
【０１６７】
一態様において、本明細書に開示されているような二重特異性抗体は、範囲1×10-14M〜1×10-10M内のKDを有するTFPI(1〜79)結合剤、及び範囲1×10-12M〜1×10-11M内のKDを有するKPI-2結合剤を含む。
【０１６８】
一態様において、本明細書に開示されているような二重特異性抗体は、範囲1×10-12M〜1×10-10M内のKDを有するTFPI(1〜79)結合剤、及び範囲1×10-12M〜1×10-8M内のKDを有するKPI-2結合剤を含む。1つのそのような態様において、TFPI(1〜79)結合剤のKDは、範囲1×10-11M〜5×10-10M内であり、かつKPI-2結合剤のKDは、範囲1×10-10M〜1×10-8M内である。
【０１６９】
一態様において、TFPI(1〜79)結合剤は、mAb 0336であり、かつKPI-2結合剤は、mAb 0310である。
【０１７０】
一態様において、KPI-2結合剤はFab 0088である。代替の態様において、KPI-2結合剤はFab 0094である。別の代替の態様において、KPI-2結合剤はFab 0313である。
【０１７１】
一態様において、Fab 0094、Fab 0313、Fab 0094、又はFab 0088は、1つ又は複数の置換を含むFab 0295のバリアントであるKPI-1結合剤と組み合わせられる。
【０１７２】
一態様において、トロンビン生成への相乗効果は、TFPI(1〜79)及びTFPI KPI-2、それぞれと結合する2つの抗体断片を、二重特異性抗体へ組み合わせることにより得られる。
【０１７３】
一態様において、トロンビン生成への相乗効果は、TFPI(1〜79)及びTFPI KPI-2、それぞれと結合する2つのFab断片を、二重特異性Fab(BiFab)へ組み合わせることにより得られる。
【０１７４】
一態様において、上記で言及される相乗効果は、二重特異性抗体のアームの1つ又はFabのそれの標的に対する親和性が低下している場合でさえも存在し得る。
【０１７５】
一態様において、本発明の二重特異性抗体は、TFPIとの結合において、FXa、TF/FVIIa、及び/又はTF/FVIIa/FXaと競合し得る。
【０１７６】
別の態様において、本発明は、本明細書に記載された二重特異性抗体等の本発明の分子を含む組成物及び製剤を提供する。例えば、本発明は、薬学的に許容される担体と共に製剤化された、本発明の1つ又は複数の二重特異性TFPI抗体を含む薬学的組成物を提供する。
【０１７７】
したがって、本発明の1つの目的は、0.25mg/mlから250mg/mlまでの濃度で存在するそのような二重特異性TFPI抗体を含む薬学的製剤であって、前記製剤が2.0から10.0までのpHを有する、薬学的製剤を提供することである。製剤は、バッファー系、保存剤、等張化剤、キレート剤、安定剤、又は界面活性剤の1つ又は複数、加えて、それらの様々な組合せを更に含み得る。薬学的組成物における保存剤、等張剤、キレート剤、安定剤、及び界面活性剤の使用は、当業者によく知られている。Remington: The Science and Practice of Pharmacy、第19版、1995が参照され得る。
【０１７８】
一実施形態において、薬学的製剤は、水性製剤である。そのような製剤は、典型的には、溶液又は懸濁液であるが、それには、コロイド、分散体、乳濁液、及び多相性材料もまた挙げられ得る。用語「水性製剤」は、少なくとも50% w/w水を含む製剤として定義される。同様に、用語「水溶液」は、少なくとも50% w/w水を含む溶液として定義され、用語「水性懸濁液」は、少なくとも50% w/w水を含む懸濁液として定義される。
【０１７９】
別の実施形態において、薬学的製剤は、凍結乾燥した製剤であり、使用前に、それに、医師又は患者が、溶媒及び/又は希釈剤を加える。
【０１８０】
更なる態様において、薬学的製剤は、そのような抗体の水溶液及びバッファーを含み、抗体が、1mg/ml以上の濃度で存在し、かつ前記製剤が約2.0から約10.0までのpHを有する。
【０１８１】
二重特異性抗体又はそれを含む薬学的製剤は、凝固障害を有する対象を処置するために用いられ得る。
【０１８２】
本明細書で用いられる場合、用語「対象」は、任意のヒト患者、又は非ヒト脊椎動物を含む。
【０１８３】
本明細書で用いられる場合、用語「凝固障害」は、正常な凝血カスケードの任意の凝血促進成分の任意の質的若しくは量的欠乏、又は線維素溶解の任意の上方制御により引き起こされ得る出血傾向の増加を指す。そのような凝固障害は、先天性及び/又は後天性及び/又は医原性であり得、当業者により同定される。
【０１８４】
先天性凝血低下障害の非限定的例は、血友病A、血友病B、第VII因子欠乏症、第X因子欠乏症、第XI因子欠乏症、フォンビルブランド病、並びにグランツマン血小板無力症及びベルナール・スーリエ症候群等の血小板減少症である。前記血友病A又はBは、重度、中等度、又は軽度であり得る。血友病の臨床的重症度は、血液中のFIX/FVIIIの機能的単位の濃度によって決定され、軽度、中等度、又は重度として分類される。重度の血友病は、正常レベルの<1%に相当する<0.01U/mlの凝固因子レベルによって定義され、中等度及び軽度の患者は、それぞれ、1〜5%及び>5%のレベルを有する。「インヒビター」(すなわち、第VIII因子に対する同種抗体)を有する血友病A及び「インヒビター」(すなわち、第IX因子に対する同種抗体)を有する血友病Bは、部分的に先天性であり、かつ部分的に後天性である凝固障害の非限定的例である。
【０１８５】
後天性凝固障害の非限定的例は、ビタミンK欠乏により引き起こされるセリンプロテアーゼ欠乏症である;そのようなビタミンK欠乏は、ワルファリン等のビタミンKアンタゴニストの投与により引き起こされ得る。後天性凝固障害はまた、広範な外傷後、起こり得る。別名「血液悪循環」として知られているこの場合、それは、血液希釈(希釈性血小板減少、及び凝固因子の希釈)、低体温、凝固因子の消費、及び代謝異常(アシドーシス)によって特徴付けられる。輸液療法及び線維素溶解の増加は、この状況を憎悪させ得る。前記出血は、身体の任意の部分からの出血であり得る。
【０１８６】
医原性凝固障害の非限定的例は、血栓性塞栓性疾患を処置するために処方され得る抗凝固薬物(例えば、ヘパリン、アスピリン、ワルファリン、及び他の血小板凝集阻害剤等)の過量投与である。医原性凝固障害の第2の非限定的例は、輸血によって誘導され得るもの等の、過剰及び/又は不適切な輸液療法により誘導されるものである。
【０１８７】
本発明の一実施形態において、出血は、血友病A又はBと関連している。別の実施形態において、出血は、後天性インヒビターを有する血友病A又はBと関連している。別の実施形態において、出血は、血小板減少症と関連している。別の実施形態において、出血は、フォンビルブランド病と関連している。別の実施形態において、出血は、重度の組織損傷と関連している。別の実施形態において、出血は、重度の外傷と関連している。別の実施形態において、出血は、手術と関連している。別の実施形態において、出血は、出血性胃炎及び/又は腸炎と関連している。別の実施形態において、出血は、胎盤早期剥離において等の大量の子宮出血である。別の実施形態において、出血は、頭蓋内に、耳内に、又は眼内に等、機械的止血の可能性の限界により器官において生じる。別の実施形態において、出血は、抗凝固療法と関連している。
【０１８８】
本明細書で用いられる場合、用語「処置」は、それを必要としている任意のヒト又は他の脊椎動物対象の医学的治療を指す。前記対象は、医師又は獣医師による健康診断を受けていることが見込まれ、その医師が、前記の特定の処置を用いることが、前記ヒト又は他の脊椎動物の健康に有益であることを示す仮の、又は確定の診断を下している。前記処置のタイミング及び目的は、対象の健康の現状により、個体間で異なり得る。したがって、前記処置は、予防的、対症的、症候的、及び/又は治癒的であり得る。本発明の関連において、予防的、対症的、症候的、及び/又は治癒的処置は、本発明の別々の態様を表し得る。
【０１８９】
本発明の抗体は、静脈内、筋肉内、皮下等の非経口的に投与され得る。皮下投与が好ましい。或いは、本発明の抗体は、経口的又は局所的等の経口経路を介して投与され得る。本発明の抗体は、予防的に投与され得る。本発明の抗体は、治療的に(要求に応じて)投与され得る。
【０１９０】
一実施形態において、本発明の二重特異性抗体は、TFPIαレベルをインビトロで測定するために用いられる。
【０１９１】
以下は本発明の非限定的実施形態である:
【０１９２】
実施形態1:ヒトTFPI(配列番号1)の位置1〜161内の第1のエピトープ及び第2のエピトープに特異的に結合する能力がある二重特異性抗体又はBiFab。
【０１９３】
実施形態2:前記第1のエピトープがヒトTFPIの位置1〜76内にあり、かつ前記第2のエピトープが位置77〜161内にある、実施形態1に記載の二重特異性抗体。
【０１９４】
実施形態3:前記第1のエピトープがヒトTFPIの位置1〜96内にあり、かつ前記第2のエピトープが位置97〜161内にある、実施形態1に記載の二重特異性抗体。
【０１９５】
実施形態4:前記第1のエピトープが、ヒトTFPIのクニッツ型インヒビター1ドメイン(残基26〜76)内である、実施形態2から3のいずれか1つに記載の二重特異性抗体。
【０１９６】
実施形態5:前記第2のエピトープが、ヒトTFPIのクニッツ型インヒビター2ドメイン(残基97〜147)内である、実施形態2から3のいずれか1つに記載の二重特異性抗体。
【０１９７】
実施形態6:前記KPI-1エピトープが配列番号1のアミノ酸残基Arg 41、Arg 65、及び/又はGlu 67を含む、実施形態5に記載の二重特異性抗体。
【０１９８】
実施形態7:前記KPI-1エピトープが配列番号1のアミノ酸残基Leu 16、Pro 17、Leu 19、Lys 20、Leu 21、Met 22、Phe 25、Cys 35、Ala 37、Met 39、Arg 41、Tyr 56、Gly 57、Gly 58、Cys 59、Glu 60、Gly 61、Asn 62、Gln 63、Arg 65、Phe 66、Glu 67、Glu 71、及びMet 75を含む、実施形態4又は6に記載の二重特異性抗体。
【０１９９】
実施形態8:前記第2のエピトープが配列番号1のアミノ酸残基Arg 107を含む、実施形態5に記載の二重特異性抗体。
【０２００】
実施形態9:前記第2のエピトープが配列番号1のアミノ酸残基Glu 100、Glu 101、Asp 102、Pro 103、Arg 107、Tyr 109、Thr 111、Tyr 113、Phe 114、Asn 116、Gln 118、Gln 121、Cys 122、Glu 123、Arg 124、Phe 125、Lys 126、及びLeu 140を含む、実施形態5に記載の二重特異性抗体。
【０２０１】
実施形態10:第1の抗原認識部位の重鎖が
・配列番号4のアミノ酸31〜35(SYGVH)、配列番号6のアミノ酸31〜35(NYGVH)、若しくは配列番号8のアミノ酸31〜35(GYGVH)に対応するCDR1配列であって、これらのアミノ酸残基の1個が異なるアミノ酸残基によって置換されていてもよい、CDR1配列;及び/又は
・配列番号4のアミノ酸50〜65(VIWRGGSTDFNAAFMS)、配列番号6のアミノ酸50〜65(VIWRGGSIDYNAAFMS)、若しくは配列番号8のアミノ酸50〜65(VIWRGGSIDYNAAFMS)に対応するCDR2配列であって、これらのアミノ酸残基の1個、2個、若しくは3個が異なるアミノ酸残基によって置換されていてもよい、CDR2配列;及び/又は
・配列番号4のアミノ酸98〜110(NSHGNYVGYAMDY)、配列番号6のアミノ酸98〜110、若しくは配列番号8のアミノ酸98〜110(NSHGNYVGYAMDY)に対応するCDR3配列であって、これらのアミノ酸残基の1個若しくは2個が異なるアミノ酸残基によって置換されていてもよい、CDR3配列
を含み、かつ前記第1の抗原認識部位の軽鎖が
・配列番号5のアミノ酸24〜34(KASENVGAAVA)、配列番号7のアミノ酸24〜34(KASQSVGPAVA)、若しくは配列番号9のアミノ酸24〜34(KASQNVGTAVA)に対応するCDR1配列であって、これらのアミノ酸残基の1個、2個、若しくは3個が異なるアミノ酸残基によって置換されていてもよい、CDR1配列;及び/又は
・配列番号5のアミノ酸50〜56(SASNRYT)、配列番号7のアミノ酸50〜56(SASNRYT)、若しくは配列番号9のアミノ酸50〜56(SASNRYT)に対応するCDR2配列であって、これらのアミノ酸残基の1個が異なるアミノ酸残基によって置換されていてもよい、CDR2配列;及び/又は
・配列番号5のアミノ酸89〜96(QQYTNYPT)、配列番号7のアミノ酸89〜96(QQYTSYPT)、若しくは配列番号9のアミノ酸89〜96(QQYTSYPT)に対応するCDR3配列であって、これらのアミノ酸残基の1個が異なるアミノ酸残基によって置換されていてもよい、CDR3配列
を含む、実施形態1に記載の二重特異性抗体。
【０２０２】
実施形態11:第1の抗原認識部位の重鎖が
・配列番号4のアミノ酸31〜35(SYGVH)、配列番号6のアミノ酸31〜35(NYGVH)、又は配列番号8のアミノ酸31〜35(GYGVH)に対応するCDR1配列;及び
・配列番号4のアミノ酸50〜65(VIWRGGSTDFNAAFMS)、配列番号6のアミノ酸50〜65(VIWRGGSIDYNAAFMS)、又は配列番号8のアミノ酸50〜65(VIWRGGSIDYNAAFMS)に対応するCDR2配列;及び
・配列番号4、配列番号6、又は配列番号8のアミノ酸98〜110(NSHGNYVGYAMDY)に対応するCDR3配列
を含み、かつ前記第1の抗原認識部位の軽鎖が
・配列番号5のアミノ酸24〜34(KASENVGAAVA)、配列番号7のアミノ酸24〜34(KASQSVGPAVA)、又は配列番号9のアミノ酸24〜34(KASQNVGTAVA)に対応するCDR1配列;及び
・配列番号5、配列番号7、又は配列番号9のアミノ酸50〜56(SASNRYT)に対応するCDR2配列;及び
・配列番号5のアミノ酸89〜96(QQYTNYPT)、配列番号7のアミノ酸89〜96(QQYTSYPT)、又は配列番号9のアミノ酸89〜96(QQYTSYPT)に対応するCDR3配列
を含む、実施形態1に記載の二重特異性抗体。
【０２０３】
実施形態12:第1の抗原認識部位の重鎖が
・配列番号6のアミノ酸31〜35(NYGVH)に対応するCDR1配列;及び
・配列番号6のアミノ酸50〜65(VIWRGGSIDYNAAFMS)に対応するCDR2配列;及び
・配列番号6のアミノ酸98〜110(NSHGNYVGYAMDY)に対応するCDR3配列
を含み、かつ前記第1の抗原認識部位の軽鎖が
・配列番号7のアミノ酸24〜34(KASQSVGPAVA)に対応するCDR1配列;及び
・配列番号7のアミノ酸50〜56(SASNRYT)に対応するCDR2配列;及び
・配列番号7のアミノ酸89〜96(QQYTSYPT)に対応するCDR3配列
を含む、実施形態1に記載の二重特異性抗体。
【０２０４】
実施形態13:第1の抗原認識部位の重鎖が
・配列番号10のアミノ酸31〜36(SDYAWN)に対応するCDR1配列であって、これらのアミノ酸残基の1個が異なるアミノ酸残基によって置換されていてもよい、CDR1配列;及び/又は
・配列番号10のアミノ酸51〜66(YISYSGSTSYNPSLKS)に対応するCDR2配列であって、これらのアミノ酸残基の1個、2個、若しくは3個が異なるアミノ酸残基によって置換されていてもよい、CDR2配列;及び/又は
・配列番号10のアミノ酸99〜104(WAYDGP)に対応するCDR3配列であって、これらのアミノ酸残基の1個が異なるアミノ酸残基によって置換されていてもよい、CDR3配列
を含み、かつ前記第1の抗原認識部位の軽鎖が
・配列番号11のアミノ酸24〜33(RASSSVSHMH)に対応するCDR1配列であって、これらのアミノ酸残基の1個若しくは2個が異なるアミノ酸残基によって置換されていてもよい、CDR1配列;及び/又は
・配列番号11のアミノ酸49〜55(ATSNLAS)に対応するCDR2配列であって、これらのアミノ酸残基の1個が異なるアミノ酸残基によって置換されていてもよい、CDR2配列;及び/又は
・配列番号11のアミノ酸88〜96(QQWSSNPFT)に対応するCDR3配列であって、これらのアミノ酸残基の1個が異なるアミノ酸残基によって置換されていてもよい、CDR3配列
を含む、実施形態1に記載の二重特異性抗体。
【０２０５】
実施形態14:第2の抗原認識部位の重鎖が
・配列番号19のアミノ酸31〜35(NYAMS)に対応するCDR1配列であって、これらのアミノ酸残基の1個が異なるアミノ酸残基によって置換されていてもよい、CDR1配列;及び/又は
・配列番号19のアミノ酸50〜66(TISRSGSYSYFPDSVQG)、配列番号21のアミノ酸50〜66(TISRSGSYSYYPDSVKG)、若しくは配列番号25のアミノ酸50〜66(TISRSGSYSYYADSVKG)に対応するCDR2配列であって、これらのアミノ酸残基の1個、2個、若しくは3個が異なるアミノ酸残基によって置換されていてもよい、CDR2配列;及び/又は
・配列番号19のアミノ酸99〜110(LGGYDEGDAMDS)に対応するCDR3配列であって、これらのアミノ酸残基の1個、2個、若しくは3個が異なるアミノ酸残基によって置換されていてもよい、CDR3配列
を含み、かつ前記第2の抗原認識部位の軽鎖が
・配列番号20のアミノ酸24〜39(KSSQSLLESDGKTYLN)に対応するCDR1配列であって、これらのアミノ酸残基の1個、2個、若しくは3個が異なるアミノ酸残基によって置換されていてもよい、CDR1配列;及び/又は
・配列番号20のアミノ酸55〜61(LVSILDS)に対応するCDR2配列であって、これらのアミノ酸残基の1個若しくは2個が異なるアミノ酸残基によって置換されていてもよい、CDR2配列;及び/又は
・配列番号20のアミノ酸94〜102(LQATHFPQT)に対応するCDR3配列であって、これらのアミノ酸残基の1個若しくは2個が異なるアミノ酸残基によって置換されていてもよい、CDR3配列
を含む、実施形態10から13のいずれか1つに記載の二重特異性抗体。
【０２０６】
実施形態15:前記置換が保存的置換である、実施形態10から14のいずれか1つに記載の二重特異性抗体。
【０２０７】
実施形態16:完全長二重特異性抗体、及び2つの抗原結合断片の化学的コンジュゲートからなる群から選択される、実施形態1から15のいずれか1つに記載の二重特異性抗体。
【０２０８】
実施形態17:2つのFab断片のコンジュゲートである、実施形態16に記載の二重特異性抗体。
【０２０９】
実施形態18:ヒト化されており、又はヒト抗体である、実施形態1から17のいずれか1つに記載の二重特異性抗体。
【０２１０】
実施形態19:1×10-11M以下、又は1×10-12M以下、又は1×10-13M以下、又は1×10-14M以下、又は1×10-15M以下の完全長TFPI又はTFPI(1〜161)に対する結合親和性を有する、実施形態1から18のいずれか1つに記載の二重特異性抗体。
【０２１１】
実施形態20:実施形態1から18のいずれか1つに記載の二重特異性抗体及び薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物。
【０２１２】
実施形態21:薬物としての使用のための、実施形態1から19のいずれか1つに記載の二重特異性抗体、又は実施形態20に記載の薬学的組成物。
【０２１３】
実施形態22:凝固障害の処置における使用のための、実施形態1から19のいずれか1つに記載の二重特異性抗体、又は実施形態20に記載の薬学的組成物。
【０２１４】
実施形態23:前記対象が、インヒビター伴う若しくは伴わない血友病A、又はインヒビター伴う若しくは伴わない血友病B等の先天性、後天性、及び/又は医原性凝固障害を有する、実施形態22に規定の使用のための二重特異性抗体。
【０２１５】
実施形態24:凝固障害を有する対象を処置する方法であって、実施形態1から19のいずれか1つに記載の二重特異性抗体を前記対象に投与する工程を含む方法。
【０２１６】
実施形態25:凝固障害の処置のための薬物の製造のための、実施形態1から19のいずれか1つに記載の二重特異性抗体の使用。
【０２１７】
実施形態26:前記凝固障害が、先天性、後天性、及び/又は医原性凝固障害である、実施形態25に記載の使用。
【０２１８】
実施形態27:前記凝固障害が、インヒビター伴う若しくは伴わない血友病A、又はインヒビター伴う若しくは伴わない血友病Bである、実施形態26に記載の使用。
【０２１９】
本発明を、以下の実施例によって更に例証するが、これらの実施例は、更に限定を加えるものとして解釈されるべきではない。この出願を通して引用された全ての図、並びに全ての参考文献、特許、及び公開された特許出願の内容は、参照により本明細書に明確に組み入れられている。
【実施例】
【０２２０】
(実施例1)
免疫化、融合、及びスクリーニング
RBFマウスを、ヒトTFPIα(配列番号1)又はTFPI(1〜161)(配列番号2)で免疫した。マウスを皮下注射した:初回の注射について、20μgのヒトTFPIを完全フロイントアジュバントと混合した。その後の免疫化について、不完全フロイントアジュバントを、同じ濃度の抗原と共に用いた。最終の免疫化から10日後、マウス由来の眼血を、ヒトTFPI特異的抗体についてELISAを用いてスクリーニングした。陽性血清力価を有するマウスを、10μgのヒトTFPIα又はTFPI(1〜161)で静脈内注射によりブーストし、3日後、屠殺した。脾臓を無菌的に摘出し、単細胞懸濁液へと分散させた。脾臓細胞と骨髄腫細胞の融合を、PEG方法を用いて、又は電気融合により行った。生じたハイブリドーマ細胞を、マイクロタイタープレートへの限界希釈によりクローニングした。個々のハイブリドーマからの上清を、最初、完全長TFPIα又はTFPI(1〜161)と結合する能力がある抗体の発現について、ELISAによりスクリーニングした。TFPI(1〜79)に特異的な抗体を産生するハイブリドーマを同定するために、完全長TFPIα又はTFPI(1〜161)との結合について陽性のハイブリドーマを、(配列番号1のアミノ酸残基97〜147により表される)TFPI KPI-2断片との結合について逆スクリーニングした(counter screened)。TFPI(1〜161)との結合について陽性で、かつTFPI KPI-2断片との結合について陰性のハイブリドーマを単離し、抗体の産生のために増殖させた。
【０２２１】
抗体を、上清から、標準プロテインAアフィニティークロマトグラフィーにより精製し、それを用いて、ヒトTFPIα及びTFPI(1〜79)への結合性及び親和性、並びに血漿におけるTFPI中和活性(TGTアッセイ)を決定した。関心対象となる抗体、すなわち、TFPI(1〜79)に特異的な抗体を産生するハイブリドーマを限界希釈によりサブクローニングし、サブクローニングされたハイブリドーマ由来の材料について、本来の抗体プロファイルを検証した。サブクローニングされたハイブリドーマ由来の細胞を用いて、RNAの単離、続いて抗体クローニング、及び配列同定を行った。
【０２２２】
(実施例2)
マウス抗ヒトTFPI(1〜79)特異的抗体のクローニング及びシーケンシング
この実施例は、TFPI抗体mAb 2F3、mAb 2F22、mAb 2F45、mAb 1F56、及びmAb 1F91のマウス重鎖及び軽鎖配列のクローニング及びシーケンシングを記載する。全RNAを、ハイブリドーマ細胞からQiagen社製のRNeasy-Mini Kitを用いて抽出し、cDNA合成のための鋳型として用いた。cDNAを、Clontech社製のSMART(商標)RACE cDNA増幅キットを用いて5'-RACE反応において合成した。その後のHC及びLC配列の標的増幅を、Phusion Hot Startポリメラーゼ(Finnzymes社)、及びフォワードプライマーとしてSMART(商標)RACEキットに含まれるユニバーサルプライマーミックス(UPM)を用いるPCRにより実施した。配列番号12に示された配列を有するリバースプライマーをHC(VHドメイン)増幅に用い、配列番号13に示された配列を有するリバースプライマーをLC増幅に用いた。PCR産物をゲル電気泳動により分離し、GE Healthcare Bio-Sciences社製のGFX PCR DNA&ゲルバンド精製キットを用いて抽出し、Zero Blunt TOPO PCRクローニングキット及びケミカルコンピテントTOP10大腸菌(E. coli)(Life Technologies社)を用いてシーケンシングのためにクローニングした。コロニーPCRを、選択されたコロニーに、Applied Biosystems社製のAmpliTaq Gold Master Mix及びM13uni/M13revプライマーを用いて実施した。コロニーPCRクリーンアップを、ExoSAP-IT酵素ミックス(USB)を用いて実施した。シーケンシングを、MWG Biotech社、Martinsried Germanyにおいて、M13uni(-21)/M13rev(-29)シーケンシングプライマーを用いて実施した。配列を、Vector NTI Advance 11プログラム(Life Technologies社)を用いて分析し、アノテートした。全てのキット及び試薬を、製造会社の使用説明書に従って用いた。
【０２２３】
単一の固有のマウスカッパ型LC及び単一の固有のマウスHC、サブクラスIgG1を、以下のハイブリドーマのそれぞれについて同定した:mAb 2F3、mAb 2F22、mAb 2F45、及びmAb 1F91。mAb 1F56のLC及びHC配列により、この抗体が、配列においてmAb 1F91と同一であることが示された。可変重鎖及び可変軽鎖配列についてのアミノ酸配列(リーダーペプチド配列を除く)は、配列番号4〜11に示されている。
【０２２４】
抗体LC及びHC発現ベクターの作製
mAb 2F22のマウス-ヒトキメラバージョンの一過性発現のために、CMVプロモーターに基づいた発現ベクター(pTTベクター)を作製した。pTTベクターは、Yves Durocher(Durocherら、Nucleic Acid Research、2002)により一過性タンパク質発現用に開発されている。CMVプロモーターに加えて、pTTに基づいたベクターは、pMB1起点、EBV起点、及びAmp耐性遺伝子を含有する。
【０２２５】
mAb 0294、Fab 0296、及びFab 0295発現(配列番号15)のために、マウス2F22軽鎖可変領域及びヒトカッパ定常領域を有するキメラmAb 2F22軽鎖の発現ベクターを作製した。マウス2F22重鎖可変領域、及びmAb 0294発現(配列番号17)のための完全長ヒトIgG4(S241P)定常領域、又はFab 0296発現(配列番号14)若しくはFab 0295発現(配列番号18)のための切り詰め型ヒトIgG4定常領域を有するキメラmAb 2F22重鎖のための発現ベクターを作製した。
【０２２６】
キメラmAb 2F22抗体及び抗体断片の一過性発現のために、pTTに基づいたLC発現ベクターを作製した。最初に、mAb 2F22のVLドメインに対応する領域を、最初のTOPOシーケンシングクローンから、そのN末端及びC末端配列に特異的なプライマーを用いて、2段階反応でPCR増幅した。最初のマウスシグナルペプチドを、2段階重複PCRにより、ヒトCD33シグナルペプチドと交換した。一次センスプライマーは、CD33シグナルペプチド配列のC末端部分を有し、二次センスプライマーは、クローニングのためのHindIII制限部位、ATG開始コドンのすぐ上流にコザック配列(5'-GCCGCCACC-3')、及びCD33シグナルペプチド配列のN末端部分を含有した。アンチセンスプライマーは、VL/CL転移配列においてインフレームのBsiWI制限部位を含有した。増幅された断片を、ヒトカッパCLドメインの配列を含有する直線化pTTに基づいたベクターへクローニングし、その後、選択のために大腸菌へ形質転換した。最終構築物の配列をDNAシーケンシングにより検証した。
【０２２７】
キメラmAb 2F22及びFab 2F22断片の一過性発現のために、pTTに基づいたHC発現ベクターを作製した。そのキメラmAb及びFab断片は、それぞれ、mAb 0294、Fab 0296、及びFab 0295と呼ばれる。最初に、mAb 2F22のVHドメインに対応する領域を、最初のTOPOシーケンシングクローンから、そのN末端及びC末端配列に特異的なプライマーを用いて、2段階反応でPCR増幅した。最初のマウスシグナルペプチドを、2段階重複PCRにより、ヒトCD33シグナルペプチドと交換した。一次センスプライマーは、CD33シグナルペプチド配列のC末端部分を有し、二次センスプライマーは、クローニングのためのHindIII制限部位、ATG開始コドンのすぐ上流にコザック配列(5'-GCCGCCACC-3')、及びCD33シグナルペプチド配列のN末端部分を含有した。アンチセンスプライマーは、VH/CH転移地点にインフレームのNheI制限部位を含有した。完全長HC発現ベクター(mAb 0294のHC)の作製のために、産生されたVHドメインPCR断片を制限消化し、ヒトIgG4(S241P)定常領域の配列を含有する直線化pTTに基づいたベクターへクローニングした。ハーフ抗体(half-antibody)の形成を排除することによりIgG4抗体を安定させるために、IgG4ヒンジのセリン241からプロリンへの突然変異が含まれる。突然変異したヒンジ位置は、Kabatに従ってナンバリングされた場合、S241P、又は代わりに、EUインデックスに従ってナンバリングされた場合、S228Pと呼ばれる。
【０２２８】
Fab 0296発現のための切り詰め型HC発現ベクターの作製について、産生されたVHドメインPCR断片を制限消化し、切り詰め型ヒトIgG4定常領域の配列を含有する直線化pTTに基づいたベクターへクローニングした。IgG4に基づいたHCを、Fab 0296 HCの配列(配列番号14)に見られるように、ヒンジ領域において、ヒトIgG4ヒンジリジン残基の後を切り詰めた。その後、クローニング反応物を、選択のために大腸菌へ形質転換した。最終構築物の配列をDNAシーケンシングにより検証した。
【０２２９】
Fab 0295発現のための切り詰め型HC発現ベクターの作製について、産生されたVHドメインPCR断片を制限消化し、第2の切り詰め型ヒトIgG4定常領域の配列を含有する直線化pTTに基づいたベクターへクローニングした。Fab 0295のためのIgG4に基づいたHCを、Fab 0295 HCの配列(配列番号18)に見られるように、ヒンジ領域において、ヒトIgG4ヒンジの最初のシステイン残基の後を切り詰めた。その後、クローニング反応物を、選択のために大腸菌へ形質転換した。最終構築物の配列をDNAシーケンシングにより検証した。
【０２３０】
mAb及びFab断片の発現及び精製
抗TFPI抗体及びFab断片を、EXPI293F細胞(Life Technologies社)の懸濁培養物において、pTTに基づいたLC発現ベクター及びHC発現ベクターの同時トランスフェクションにより、一過性に発現させた。以下の手順は、懸濁用に適合させたEXPI293F細胞のための一般的なトランスフェクションプロトコールを記載する。
【０２３１】
EXPI293Fトランスフェクション
1)DNA及びトランスフェクション試薬の別個の希釈溶液を、最初、調製する。
a)1mlの細胞培養物あたり合計1μgのベクターDNA(0.5ug LCベクター及び0.5ug HCベクター)を用いる。そのDNAを、Opti-MEM培地(Gibco社)50μl培地/μg DNA中に希釈し、混合し、室温(23〜25℃)で5分間、インキュベートする。
b)トランスフェクション試薬としてExpifectamin(商標)293(Life Technologies社)を1μg DNAあたり2.7μlの濃度で用いる。Expifectamin(商標)溶液をOpti-MEM培地(Gibco社)中に18.5×希釈し、混合し、室温(23〜25℃)で5分間、インキュベートする。
2)DNA希釈溶液とExpifectamin(商標)293希釈溶液を混合し、室温(23〜25℃)で10分間、インキュベートさせておく。
3)DNA-Expifectamin(商標)293混合物をEXPI293F細胞培養物へ直接、加える。
a)トランスフェクションの時点において、EXPI293F培養物の細胞密度は、2.8〜3.2×106細胞/mlであるべきである。
4)トランスフェクションされた細胞培養物を、36.5℃、8%CO2、及び85〜125rpmにおけるオービタルシェーカーインキュベーターへ移す。
5)トランスフェクションから18時間後、5ul Expifectamin(商標)293トランスフェクションエンハンサー1/ml培養物及び50ul Expifectamin(商標)293トランスフェクションエンハンサー2/ml培養物を加え、36.5℃、8%CO2、及び85〜125rpmにおけるオービタルシェーカーインキュベーターに戻して培養する。
6)トランスフェクションから5日後、細胞培養上清を、遠心分離により収集し、続いて、0.22μm PESフィルターユニット(Corning社)を通して濾過する。
【０２３２】
一般的な精製プロトコール
mAbバリアントを、GE Healthcare社製のMabSelect SuRe樹脂を用い製造会社の使用説明書に従って、標準アフィニティークロマトグラフィーにより精製した。精製された抗体を、PBSバッファーpH7.2へバッファー交換した。
【０２３３】
Fab断片を、GE Healthcare社により開発されたKappaSelect樹脂を用いて、標準アフィニティークロマトグラフィーにより精製した。精製されたFab断片を、PBSバッファーpH7.2へバッファー交換した。品質評価及び濃度決定を、SEC-HPLCにより行った。
【０２３４】
(実施例3)
抗体ビニング
完全長TFPIαとの結合におけるTFPI抗体1F91、2F3、2F22、2F45、MBS532510(MyBioSource.com)、10R-T141A(Fitzgerald Industries International社)、及びBay 2A8-K95Lの間での競合を、Biolayer Interferometry(Fortebio Octet RED384装置、PALL Life Sciences社)を用いて測定した。(Bay 2A8は、WO2010/017196に開示された、2A8 FabのヒトIgG4(S241P)抗体バリアントである。Bay 2A8-K95Lは、HC CDR3においてK95L置換(Kabatナンバリング)(WO2012/135671に開示されているような、2A8に対する「Fab B」に見出される置換と同一)を有する、Bay 2A8のヒトIgG4(S241P)抗体バリアントである。)mAb 1F91、mAb 2F3、mAb 2F22、mAb 2F45、及びBay 2A8-K95Lを、1:1.2のモルmAb:モルビオチン試薬(Thermo Scientific社カタログ#21335)の比を用いて、他の点では製造会社の仕様に従って、リジン残基上にビオチンでランダムに標識化した。ビオチン標識化抗体を、ストレプトアビジンFortebioセンサーチップ(PALL Life Sciences社)上に捕捉し、続いて、ヒトTFPIαに結合させ、その後、mAb 1F91、mAb 2F3、mAb 2F22、mAb 2F45、Bay 2A8-K95L、MBS532510、又は10R-T141Aに結合させた。結果は、Table 1(表2)に示されている(黒色は、mAbがTFPIとの結合において競合することを表す。灰色は、mAbがTFPIとの結合において競合しないことを表す)。
【０２３５】
これらのデータから抗体が3つの異なるビンに分類されることが分かり、これにより、それらが、異なる結合エピトープを有することが示される。ビン1:mAb 1F91、MBS532510、及び10R-T141A。ビン2:mAb 2F3、2F22、及び2F45。ビン3:Bay2A8 K95L。
【０２３６】
【表２】
0006783754.tif 000007
【０２３７】
(実施例4)
mAb 2F22のFab断片と複合したTFPI(1〜79)の結晶構造
mAb 2F22のFab断片、Fab 0296(配列番号14及び15)と複合した、酸性N末端領域及びクニッツ型プロテアーゼインヒビタードメイン1(KPI-1)からなるヒトTFPI(1〜79)(配列番号16)のN末端部分の3D構造を、X線結晶解析を用いて高分解能で決定した。結果は、その抗体が、TFPIのKPI-1及びその前のN末端の部分に結合する能力があることを実証している。生じたヒトTFPIエピトープ残基は、Leu 16、Pro 17、Leu 19、Lys 20、Leu 21、Met 22、Phe 25、Cys 35、Ala 37、Met 39、Arg 41、Tyr 56、Gly 57、Gly 58、Cys 59、Glu 60、Gly 61、Asn 62、Gln 63、Arg 65、Phe 66、Glu 67、Glu 71、及びMet 75(配列番号2)を含む。
【０２３８】
材料及び方法
結晶学を目的として、実施例2に記載されているように、結晶学のためのmAb 2F22抗体断片に対応するFab断片の一過性発現のために、CMVプロモーターに基づいた発現ベクター(pTTベクター)を作製した。
【０２３９】
mAb 2F22のFab断片を、EXPI293F細胞において、マウス-ヒトキメラ型Fab 0296(配列番号14及び15)として発現させ、実施例2に記載されているように、KappaSelect樹脂を用いて標準アフィニティークロマトグラフィーにより精製した。
【０２４０】
ヒトTFPIのN末端部分及び追加として、N末端に付加されたGSSGSSGタグを含むヒトTFPI KPI-1(配列番号16)、並びに配列番号15に対応する軽鎖及び配列番号14に対応する重鎖断片からなるFab 0296(どちらもリン酸緩衝食塩水(PBS)バッファー(2リットルの水中4錠、GIBCOカタログNo. 18912-014 Invitrogen Corporation社)中)を、わずかにモル過剰(1.1:1)のTFPI種と混合した。その後、その複合体を、10,000Daの分子量カットオフを有するAmicon Ultra-4遠心フィルターを用いて約10.0mg/mlまで濃縮した。TTP Lab Tech社製の96ウェルTTP IQプレートno:4150-05800及びウェルあたり100μlの沈殿剤溶液を用いてシッティングドロップ技術により結晶を成長させた。沈殿剤溶液は、20% w/v PEG 3350、200mMギ酸カリウムを含有し、タンパク質溶液と3:1の比で混合した。最初の総ドロップサイズは200nlであり、数日後、結晶が現れた。クリオ凍結(cryo-freezing)のために、75%の沈殿剤溶液及び25%のグリセロールを含有する1μlのクリオ溶液(cryo-solution)混合物を、結晶を含有するドロップへ移入することにより、結晶を調製した。約2分間、浸漬した。その後、結晶を引き上げ、液体N2中で急速冷凍し、データ収集中、低温N2ガス流により100Kの温度に保った。MAX-lab、Lund、Swedenにおいて、ビームラインBL911-3での1.65Å分解能で、結晶学データを収集した。データの空間群決定、統合、及びスケーリングが、XDSソフトウェアパッケージ[Kabsch, W.、J.Appl.Crystallogr.、(1993)、26巻、795〜800頁]によりなされた。空間群は、C2であると決定され、シンクロトロンデータについての格子パラメータは、それぞれ、89.010、66.660、106.110Åであると決定され、111.18°のβ角を有した。1.65Å分解能に対するR-symは8.4%であり、完全性99.5%であった。強度の平均/固有の反射のシグマ(強度)は、約1.8Å分解能において2.0に等しかった。
【０２４１】
構造決定のために、タンパク質データバンク(PDB)[Berman, H. M.ら、Nucleic Acids Res.、(2000)、28巻、235〜242頁]のアクセッションコード1NGZでのFab分子の座標[Yin, J.ら、Proc Natl Acad Sci U S A.2003年2月4日、(100)、100巻、856〜861頁]を使用する分子置換(MR)方法を用いた。Fab分子を2つのドメイン、可変ドメインと定常ドメインに分け、それらそれぞれを、MR計算における検索モデルとして用いた。定常及び可変Fabドメインの位置を見出すために、CCP4パッケージCCP4[Collaborative Computational Project, N.、Acta crystallographica.Section D、Biological crystallography、(1994)、50巻、760〜763頁]のMolrepソフトウェア[Vagin, A.ら、J.Appl.Crystallogr.、(1997)、30巻、1022〜1025頁]を用いた。KPI-1ドメインはMRステップにおいて見出されなかったが、差電子密度図(difference electron density map)により、このステージにおけるKPI-1ドメインのおよその位置が示された。CCP4ソフトウェアパッケージのDMソフトウェアによる電子密度の改善、続いてARP-wARPソフトウェアを用いる自動モデル構築及び相の改善[Langer, G.ら、Nat Protoc、(2008)、3巻、1171〜1179頁][Murshudov, G. N.ら、Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography、(2011)、67巻、355〜367頁]により、Fab 0296分子とKPI-1ドメイン構造の両方のほとんど完全な構造、及びKPI-1ドメインに先行するN末端の一部が示された。TFPI(配列番号2)について、KPI-1ドメインに加えて、KPI-1(残基26〜76)のN末端側のいくつかの残基も含む、15から77までの残基が、X線モデルにおいて含まれている。Fab 0296断片について、軽鎖残基1〜212及び重鎖残基1〜221が観察される。電子密度図のコンピュータグラフィクスによる精査、Cootソフトウェアプログラムを用いるモデル修正及び構築[Emsley, P.ら、Acta Crystallogr.Sect.D-Biol.Crystallogr.、(2004)、60巻、2126〜2132頁]、続いて、CCP4ソフトウェアパッケージのソフトウェアプログラムRefmac5を用いる結晶学的精密化[Murshudov, G. N.ら、Acta Crystallographica Section D Biological Crystallograph、(2011)、67巻、355〜367頁]の手順を入力した。この手順を、モデルが更に有意に改善され得なくなるまで反復した。1.65Å分解能に対する全てのデータについての最終R及びR- freeは、それぞれ、0.192及び0.220であった。
【０２４２】
結果
CCP4プログラムパッケージのソフトウェアプログラムAreaimol[Lee, B.ら、J Mol Biol、(1971)、55巻、379〜400頁][Saff, E. B.ら、Math Intell、(1997)、19巻、5〜11頁]により対の相互作用において排除された平均面積を計算すると、結晶構造のヒトTFPI断片/抗TFPI mAb 2F22 Fab断片分子複合体について1195Å2であることが示された。
【０２４３】
結晶構造に観察されるTFPIのN末端部分を含むTFPI KPI-1(配列番号2)とFab 0296(配列番号14及び15)との間の直接的接触が、Fab 0296とTFPI断片分子の間の4.0Åのカットオフ距離を用いてCCP4プログラムパッケージのContactsソフトウェア[Bailey, S.、Acta Crystallogr.Sect.D-Biol.Crystallogr.、(1994)、50巻、760〜763頁]を実行することにより、同定された。可溶性TFPI断片/Fab 0296複合体結晶構造からの結果はTable 2(表3)に示されている。
【０２４４】
その結果得られた、TFPI KPI-1のエピトープである、TFPI N末端領域を含むFab 0296は、TFPIの以下の残基(配列番号2のTFPIとしての配列ナンバリングを用いる)を含むことが見出された:Leu 16、Pro 17、Leu 19、Lys 20、Leu 21、Met 22、Phe 25、Cys 35、Ala 37、Met 39、Arg 41、Tyr 56、Gly 57、Gly 58、Cys 59、Glu 60、Gly 61、Asn 62、Gln 63、Arg 65、Phe 66、Glu 67、Glu 71、及びMet 75。距離、電荷間の相互作用、水素結合、極性及び疎水性相互作用、並びに低い溶媒露出度から評価すると、以下の残基は、エピトープの特に重要な残基であると思われる:Arg 41、Arg 65、及びGlu 67(配列番号2)。
【０２４５】
したがって、(Fab 0296によって代表される)mAb 2F22のTFPIエピトープは、短いN末端α-ヘリックスを含むKPI-1ドメインに先行する残基、KPI-1ドメインのβ鎖1の前のループにおける残基、及びβ鎖1の始めにおける残基を含む。それはまた、β鎖2の末端における残基、及びKPI-1のβ鎖2とC末端αヘリックスとの間のループにおける残基、及びKPI-1のC末端αヘリックス内の残基を含む。
【０２４６】
それゆえに、結果は、Fab 0296、及びしたがって、mAb 2F22が、TFPI KPI-1、及びその先行するN末端領域の部分と特異的に結合することを示している。
【０２４７】
TFPI KPI-1に対するFab 0296パラトープは、重鎖(H)(配列番号14、Table 2(表3))の残基Val 2、Phe 27、Tyr 32、Trp 52、Arg 53、Gly 54、Gly 55、Ser 56、Ile 57、Asp 58、Tyr 59、Ala 61、Met 64、Lys 97、Ser 99、His 100、Asn 102、Tyr 103、Val 104、Gly 105、及びTyr 106、並びに軽鎖(L)(配列番号15、Table 2(表3))の残基Pro 31、Ala 32、Tyr 49、Ser 50、Asn 53、Tyr 55、Thr 56、Tyr 91、Thr 92、Ser 93、及びTyr 94を含む。
【０２４８】
【表３Ａ】
0006783754.tif 000008
【０２４９】
【表３Ｂ】
0006783754.tif 000009
【０２５０】
【表３Ｃ】
0006783754.tif 000010
【０２５１】
【表３Ｄ】
0006783754.tif 000011
【０２５２】
【表３Ｅ】
0006783754.tif 000012
【０２５３】
【表３Ｆ】
0006783754.tif 000013
【０２５４】
【表３Ｇ】
0006783754.tif 000014
【０２５５】
これらの結果は、抗TFPI Fab 0296がTFPI KPI-1及びその先行するN末端の一部と特異的に結合することを示している。
【０２５６】
(実施例5)
mAb 2021及びmAb 2021バリアントのクローニング及び操作
この実施例は、抗TFPI抗体:mAb 2021及びそのバリアントのクローニング及び操作を記載する。
【０２５７】
全RNAを、Qiagen社製のRNeasy-Mini Kitを用いてM-hTFPI 4F36A1B2ハイブリドーマから抽出し、cDNA合成のための鋳型として用いた。cDNAを、Clontech社製のSMART(商標)RACE cDNA増幅キットを用いて5'-RACE反応において合成した。その後のHC及びLC配列の標的増幅を、Phusion Hot Startポリメラーゼ(Finnzymes社)及びフォワードプライマーとしてSMART(商標)RACEキットに含まれるユニバーサルプライマーミックス(UPM)を用いて、PCRにより実施した。以下の配列を有するリバースプライマーを、HC(VHドメイン)増幅に用いた:
5'-CCCTTGACCAGGCATCCCAG-3'(配列番号12)
【０２５８】
以下の配列を有するリバースプライマーをLC増幅に用いた:
5'-GCTCTAGACTAACACTCATTCCTGTTGAAGCTCTTG-3'(配列番号13)
【０２５９】
PCR産物を、ゲル電気泳動により分離し、GE Healthcare Bio-Sciences社製のGFX PCR DNA &ゲルバンド精製キットを用いて抽出し、Zero Blunt TOPO PCRクローニングキット及びケミカルコンピテントTOP10大腸菌(Invitrogen社)を用いてシーケンシングのためにクローニングした。Applied Biosystems社製のAmpliTaq Gold Master Mix及びM13uni/M13revプライマーを用いて、選択されたコロニーにコロニーPCRを実施した。ExoSAP-IT酵素ミックス(USB)を用いてコロニーPCRクリーンアップを実施した。シーケンシングを、Eurofins MWG Operon、Germanyにおいて、M13uni(-21)/M13rev(-29)か又はT3/T7シーケンシングプライマーのいずれかを用いて実施した。配列を、VectorNTIプログラムを用いて分析し、かつアノテートした。全てのキット及び試薬を、製造会社の使用説明書に従って用いた。
【０２６０】
単一の固有のマウスカッパ型LC及び単一の固有のマウスHC、サブクラスIgG1を同定した。
【０２６１】
グラフト化抗HzTFPI4F36A1B2についての発現ベクターの作製
Yves Durocher(Durocherら、Nucleic Acid Research、2002)により開発されたHEK293-6E EBNAに基づいた発現系における抗TFPI抗体/抗体断片の一過性発現のため、CMVプロモーターに基づいた一連の発現ベクター(pTTベクター)を作製した。CMVプロモーターに加えて、pTTに基づいたベクターは、pMB1起点、EBV起点、及びAmp耐性遺伝子を含有する。
【０２６２】
クローニングされたマウス抗TFPI4F36A1B2 VH及びVL配列に基づいて、抗TFPI4F36のヒト化バージョンを、ヒト生殖系列配列上のCDRグラフティングにより設計した。グラフト化HzTFPI4F36 VH及びVL領域についてのDNA配列を、上記の抗体のヒト化設計に従って合成した(GENEART AG社)。基本的な最小CDRグラフティングを含み、かつ追加の逆突然変異を含まない配列が得られた。それぞれのLC及びHC生殖系列リーダーペプチド配列、並びにATG開始コドンのすぐ上流のコザック配列(5'-GCCGCCACC-3')が構築物内に含まれた。
【０２６３】
ヒトカッパ/IgG4(S241P)アイソタイプとしての抗体である、グラフト化HzTFPI4F36の一過性発現のためにpTTに基づいた発現ベクターを作製した。単量体抗体断片、すなわち、1つのLC及び1つのHCで構成される「ハーフ抗体」の形成を排除するために、IgG4ヒンジ領域に、位置241(Kabatによるナンバリングであり、EUナンバリングシステムによれば残基228に対応する(Edelman G.M.ら、Proc. Natl. Acad. USA 63、78〜85頁(1969))におけるプロリン突然変異を導入した。
【０２６４】
HC発現ベクターについて、VH断片を、GENEARTクローニングベクターから制限酵素消化により切り出し、ヒトIgG4(S241P)CHドメインの配列を含有する直線化されたpTTに基づいたベクターへクローニングし、その後、選択のために大腸菌へ形質転換した。最終構築物の配列を、DNAシーケンシングにより検証した。LC発現ベクターについて、VL断片を、GENEARTクローニングベクターから制限酵素消化により切り出し、ヒトカッパCLドメインの配列を含有する直線化されたpTTに基づいたベクターへクローニングし、その後、選択のために大腸菌へ形質転換した。最終構築物の配列を、DNAシーケンシングにより検証した。
【０２６５】
mAb 2021を単離するための部位特異的突然変異誘発
グラフト化HzTFPI4F36の軽鎖(LC)及び重鎖(HC)において、一連のヒトからマウスへの復帰突然変異(逆突然変異と呼ばれる)を発生させた。
【０２６６】
グラフト化構築物を最適化するために、グラフト化HzTFPI4F36 LC/HC構築物において特定の残基にヒトからマウスへの復帰突然変異(以下、逆突然変異と呼ぶ)を導入するように部位特異的突然変異誘発を行った。突然変異を以下の2つの異なる方法により導入した:
1.Stratagene社製のQuikChange(登録商標)部位特異的又は多部位特異的突然変異誘発キットを用いて、点突然変異及び組合せ突然変異を導入した。キットを製造会社のプロトコールに従って用いた。
2.点突然変異を導入するため、及び組合せ突然変異を発生させるために、標準2段階重複PCR方法も用いた。
【０２６７】
グラフト化HzTFPI4F36についてのLC及びHC発現プラスミドを突然変異誘発のための鋳型として用いた。全ての最終構築物の配列を、DNAシーケンシングにより検証した。
【０２６８】
mAb 2021 HCについての最終配列は、フレームワーク配列を最初のマウスFR2と同一にする4つの逆突然変異を有するFR2領域、及び3つのCDR2突然変異体、すなわち、最初のグラフト化配列と比較して合計7つのHC逆突然変異(A40T、G42E、G44R、S49A、Y59F、A60P、K64Q)(Kabatによるナンバリング)を有する。LC配列はグラフト化HzTFPI4F36 LC配列である。CDR及びフレームワークはKabatにより定義されている。
【０２６９】
最終mAb 2021のVH及びVL領域についてのアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号19及び配列番号20として列挙されている。
【０２７０】
発現収率を向上させるために、HCとLCの両方についての最初のシグナルペプチド配列(ヒト生殖系列配列)を、ヒトCD33シグナルペプチド(SP)と交換した。シグナルペプチド配列を、コザックエレメント(GCCGCCACC)、開始コドン、及びCD33シグナル配列(センスプライマー)、並びに停止コドン及びEcoRI制限部位(アンチセンスプライマー)を含有するプライマーを用いる、HC又はLC断片の標準PCR増幅により交換した。増幅された断片を、直線化されたpTTに基づいたベクターへクローニングし、選択のために大腸菌へ形質転換した。最終構築物の配列を、DNAシーケンシングにより検証した。
【０２７１】
mAb 2021のより低い親和性のバリアントの作製
mAb 2021を得るための抗TFPI4F36A1B2のヒト化の間、いくつかのより低い親和性のバリアントが同定された。そのバリアントは、上記のように、部位特異的突然変異誘発により作製された。mAb 2007は、そのようなより低い親和性のバリアントを代表する。mAb 2007は、グラフト化HzTFPI4F36の配列と比較してVHドメインにおいて単一のA60P逆突然変異を有する(Kabatによるナンバリング)。そのバリアントは、mAb 2021と比較して、それぞれ、高くとも10分の1であるTFPI結合親和性を有する。最初のグラフト化HzTFPI4F36バリアント(mAb 2000)は、mAb 2021と比較しておよそ1000分の1のTFPI結合親和性を示した。
【０２７２】
mAb 2021及びmAb 2021バリアントのFab断片の発現のための発現ベクターを実施例6に記載されているように作製した。
【０２７３】
(実施例6)
二重特異性分子のためのFabコンポーネント
Fab-Fab化学的コンジュゲートについて、mAb 2021の切り詰め型HCの発現のための発現ベクターを作製した。mAb 2021のクローニング、ヒト化、及び発現は、参照により本明細書に組み入れられているWO2010/072691に記載されている。mAb 2021のIgG4に基づいたHCを、配列番号23に見られるように、mAb 2021 HCのヒトIgG4定常領域において、ヒンジ領域における最初のシステイン残基の後を切り詰めた。その切り詰めは、化学的コンジュゲーションに利用可能なC末端システインを残す。切り詰め型ヒトIgG4 CHドメインの配列を含有する直線化されたpTTに基づいたツールボックスベクターへmAb 2021 HCのVH断片を導入するために、標準制限酵素に基づいたクローニングを用いることによりその切り詰め型配列を作製した。全ての最終構築物の配列をDNAシーケンシングにより検証した。mAb 2021のFab断片を、mAb 2021 LCベクター及び上記の切り詰め型HCベクター(配列番号24及び配列番号23)を用いてFab 0088として発現した。Fab 0088のためのLC発現ベクターは、上記のように、すなわち、そのVL断片を、GENEARTクローニングベクターから制限酵素消化により切り出し、ヒトカッパCLドメインの配列を含有する直線化されたpTTに基づいたベクターへクローニングして作製された、mAb 2021のためのLC発現と同一であった。mAb 2021のより低い親和性バリアントの発現のための重鎖発現ベクターもまた作製した。mAb 2021バリアントは、mAb 2021のヒト化から生じ、WO2010/072691及び実施例5に記載されている。発現ベクターを組み立てるために、実施例5に記載されたmAb 2007及びmAb 2000のHCのVHドメインに対応する領域を、切り詰め型ヒトIgG4 CHドメインの配列を含有する直線化されたpTTに基づいたツールボックスベクターへ標準制限酵素に基づいたクローニングを用いてクローニングした。IgG4に基づいたHCを、IgG4ヒンジにおける最初のシステインの後を切り詰め、化学的コンジュゲーションに利用可能なC末端システインを残した。最終構築物の配列をDNAシーケンシングにより検証した。mAb 2007及びmAb 2000のより低い親和性のFab断片を、それぞれ、Fab 0094(配列番号21及び配列番号22)及びFab 0313(配列番号25及び配列番号26)として発現させた。Fab 0094及びFab 0313は、Fab 0088と同じLCを有する。
【０２７４】
(実施例7a)
1,16-ビス(2,5-ピロールジオン-1-イル)-4,13-ジアザ-7,10-ジオキサ-3,14-ジオキソヘキサデカンの合成
【０２７５】
【化５】
0006783754.tif 000015
【０２７６】
3-(2,5-ピロールジオン-1-イル)プロパン酸(3.0g、18mmol)をジクロロメタン(20ml)中に溶解した。その溶液を、予洗された固定化ジシクロヘキシルカルボジイミド樹脂(Novabiochem社、製品#8.55029.0025、バッチ:S5092229 036、2.3mmol/g、10g)、100ml総体積に加えた。その混合物を30分間、撹拌した。
【０２７７】
ジクロロメタン(50ml)中の1,8-ジアミノ-3,6-ジオキサオクタン(1.3g、8.9mmol)の溶液を、撹拌中の溶液へ60分間にわたって滴下した。その混合物を2時間、撹拌した。その溶液を濾過し、減圧下で濃縮して乾燥させた。収量:3.4gの薄茶色の固体。
【０２７８】
その生成物をLCMS([M+H]+:451)及びNMR(1H及び13C)によって特徴付けた。
【０２７９】
調製された材料の一部分を無水酢酸中、摂氏90度まで3時間、加熱した。その溶液を冷却し、水と混合し、凍結させ、凍結乾燥した。
【０２８０】
その生成物をLCMS([M+Na]+:473)によって特徴付けた。この材料を、以下の2つの実施例に記載されたコンジュゲーションのために用いた。
【０２８１】
(実施例7b)
BiFab 9041をもたらす、1,16-ビス(2,5-ピロールジオン-1-イル)-4,13-ジアザ-7,10-ジオキサ-3,14-ジオキソヘキサデカンによるFab 0088とFab 0295のコンジュゲーション
【０２８２】
【化６】
0006783754.tif 000016
【０２８３】
Fab分子(4mgの各Fab)の溶液をリン酸緩衝食塩水(PBS)中に2.5mg/ml(50マイクロモル濃度)に調整した。PBS中に溶解したビス(スルホナトフェニル)フェニルホスフィン二水和物二カリウム塩(CAS:151888-20-9、Sigma-Aldrich社)の溶液を、PBS中のFabの溶液に加え、50マイクロモル濃度のFab及び200マイクロモル濃度のホスフィン試薬の濃度を生じた。その溶液を室温で一晩、インキュベートした。
【０２８４】
Fab 0088をAmicon Ultracel遠心フィルター(MWCO 10kDa、Millipore A/S社、Hellerup、Denmark)を用いて、15mM酢酸ナトリウムバッファー、1.0M NaCl、pH5.0へバッファー交換した(1ml最終体積)。
【０２８５】
Fab 0295をAmicon Ultracel遠心フィルター(MWCO 10kDa、Millipore A/S社、Hellerup、Denmark)を用いて、15mM酢酸ナトリウムバッファー、pH4.5へバッファー交換した。最終体積:300マイクロリットル。
【０２８６】
1,16-ビス(2,5-ピロールジオン-1-イル)-4,13-ジアザ-7,10-ジオキサ-3,14-ジオキソヘキサデカン(5mg)を、還元型Fabタンパク質に加えた。生じた混合物を室温で50分間、インキュベートした。
【０２８７】
試料を、HiTrap SP HPカラム(1ml、15mM酢酸ナトリウムバッファー、pH4.5中に前条件付けされている、GE Healthcare Europe GmbH社、DK-2605、Denmark)に添加した。固定化されたタンパク質を15mM酢酸ナトリウムバッファー、pH4.5(15カラム体積)で洗浄し、15mM酢酸ナトリウムバッファー、1M NaCl、pH5.0で溶出した。2つのタンパク質溶液を混合し、Amicon Ultracel遠心フィルター(MWCO 10kDa、Millipore A/S社、Hellerup、Denmark)を用いて濃縮した。最終体積:100マイクロリットル。
【０２８８】
その混合物を室温で20時間、インキュベートした。10mM HEPES、150mM NaCl、pH7.3中に前条件付けされているSuperdex200 16/60カラム(GE Healthcare Europe GmbH社、DK-2605、Denmark)にその溶液を添加した。化合物BiFab 9041を、前記バッファーを用いて溶出した。選択された画分をプールし、濃縮し、SDS-PAGE分析、SEC-MALS、LCMS、及びエドマン配列決定を用いて分析した。
【０２８９】
(実施例7c)
BiFab 9042をもたらす、1,16-ビス(2,5-ピロールジオン-1-イル)-4,13-ジアザ-7,10-ジオキサ-3,14-ジオキソヘキサデカンによるFab 0313とFab 0295のコンジュゲーション
【０２９０】
【化７】
0006783754.tif 000017
【０２９１】
Fab分子の溶液(5mgのFab 0313及び7mgのFab 0295)を、リン酸緩衝食塩水(PBS)中に2.5mg/ml(50マイクロモル濃度)に調整した。PBS中に溶解したビス(スルホナトフェニル)フェニルホスフィン二水和物二カリウム塩(CAS番号:151888-20-9、Sigma-Aldrich社)の溶液を、PBS中のFabの溶液に加え、50マイクロモル濃度のFab及び200マイクロモル濃度のホスフィン試薬の濃度を生じた。その溶液を室温で一晩、インキュベートした。
【０２９２】
Fab 0313をAmicon Ultracel遠心フィルター(MWCO 10kDa、Millipore A/S社、Hellerup、Denmark)を用いて、15mM酢酸ナトリウムバッファー、1.0M NaCl、pH5.0へバッファー交換した(1ml最終体積)。
【０２９３】
Fab 0295をAmicon Ultracel遠心フィルター(MWCO 10kDa、Millipore A/S社、Hellerup、Denmark)を用いて、15mM酢酸ナトリウムバッファー、pH4.5へバッファー交換した。最終体積:300マイクロリットル。
【０２９４】
1,16-ビス(2,5-ピロールジオン-1-イル)-4,13-ジアザ-7,10-ジオキサ-3,14-ジオキソヘキサデカン(5mg)を、還元型Fabタンパク質に加えた。生じた混合物を室温で50分間、インキュベートした。
【０２９５】
試料を、HiTrap SP HPカラム(1ml、15mM酢酸ナトリウムバッファー、pH4.5中に前条件付けされている、GE Healthcare Europe GmbH社、DK-2605、Denmark)に添加した。固定化されたタンパク質を15mM酢酸ナトリウムバッファー、pH4.5(15カラム体積)で洗浄し、15mM酢酸ナトリウムバッファー、1M NaCl、pH5.0で溶出した。
【０２９６】
2つのタンパク質溶液を混合し、Amicon Ultracel遠心フィルター(MWCO 10kDa、Millipore A/S社、Hellerup、Denmark)を用いて濃縮した。最終体積:100マイクロリットル。
【０２９７】
その混合物を室温で20時間、インキュベートした。10mM HEPES、150mM NaCl、pH7.3中に前条件付けされているSuperdex200 16/60カラム(GE Healthcare Europe GmbH社、DK-2605、Denmark)にその溶液を添加した。化合物BiFab 9042を、前記バッファーを用いて溶出した。選択された画分をプールし、濃縮し、SDS-PAGE分析、SEC-MALS、及びLCMSを用いて分析した。
【０２９８】
(実施例8)
結合相互作用分析
結合試験を、表面プラズモン共鳴によってリアルタイムに分子相互作用を測定するBiacore T200(GE Healthcare社)により実施した。実験を25℃で実行し、試料を試料コンパートメントにおいて15℃で保存した。Biacoreにより報告されるシグナル(RU、応答単位)は、4つの連続のフローセルにおける個々のセンサーチップ表面上の質量に直接的に相関する。ヤギ抗Fabカッパ軽鎖抗体(Nordic Biosite社)を、CM4センサーチップの全ての4つのフローセル上に製造会社の使用説明書に従って固定化した。精製二重特異性分子の捕捉は、そのタンパク質をランニングバッファー(10mM Hepes、0.3M NaCl、5mM CaCl2、0.05%界面活性剤P20、10mg/ml BSA、pH7.4)中へ希釈し、フローセル2、3、又は4の上に注射することにより行い、抗Fab抗体だけが固定化されているフローセル1において参照表面を生じさせた。二重特異性分子は、二重特異性mAb 0421(配列番号27、28及び15、29)か又はBiFab 9041(配列番号15、18、23、24)のいずれかであった。TFPI FL(配列番号1)、TFPI(1〜79)、及びTFPI KPI-2タンパク質の結合を、分析物(抗原)を全てのフローセル上へ注射することにより行い、参照表面との結合に対する、捕捉されている異なる二重特異性分子との結合の比較分析を可能にした。TFPI(1〜79)断片は、N末端に付加されたGSSGSSGタグを含むTFPIのN末端及びKPI-1ドメインを含む(配列番号16)。TFPI KPI-2断片は、C末端HIS6タグを含むTFPIのKPI-2ドメインを含む(配列番号3)。抗原をランニングバッファー中へ段階希釈し、30μl/分で240秒間、注射し、600秒間又は14000秒間、解離させた。1E-5s-1にほぼ等しいkdでゆっくり解離する抗原についての解離相のモニタリングの延長は、解離速度についてのロバストな値を得るために重要である。分析物の各注射サイクルの後、10mMグリシン、pH2.1の注射によりCM4表面を再生した。この再生ステップは、固定化捕捉抗体表面から抗TFPI二重特異性分子及びいかなる結合した抗原をも除去し、次の相互作用試料ペアのその後の結合を可能にした。再生手順は、直接的に固定化された抗Fab捕捉抗体をチップ表面から除去しなかった。
【０２９９】
BiFab又は二重特異性mAbと抗原との間の結合親和性を、複合体形成及び解離の反応速度の測定により決定される平衡解離定数(KD)の決定により定量化した。ka(会合速度)及びkd(解離速度)等の一価複合体の会合及び解離に対応する速度定数を、データ解析用のBiacore評価ソフトウェアを用いて、ローカルRmaxで1:1ラングミュアモデルへデータをグローバルフィットさせることにより、取得した。KDは、等式KD=kd/kaによりkaとkdに関係付けられる。
【０３００】
結合曲線を、二重参照(データ解析の前の、参照表面シグナル、及び捕捉されている二重特異性分子上へのブランクバッファー注射の引き算)により処理した。これは、装置ノイズ、バルクシフト、及び試料注射中のドリフトについての補正を可能にした。
【０３０１】
【表４】
0006783754.tif 000018
【０３０２】
TFPI(1〜79)の結合及びTFPI KPI-2結合においてBiFab 9041とmAb 0421に大きな差は見出されなかった(Table 3(表4))。TFPI FLの結合は、低いリガンド密度においてさえも多価性又はアビディティ結合により影響されてより高い見かけの親和性を生じるようであるという点において、両方の二重特異性分子に対し、単一のTFPIドメインと比較して異なる結合プロファイルを示す。TFPI FLのmAb 0421及びBiFab 9041との結合は、結合曲線の形が類似しており、このことから、この実施例に用いられたBiFabにおけるように2つの抗体断片の化学的コンジュゲーションによって二重特異性結合を導入することにより、結合プロファイルに対し、二重特異性抗体の場合と同じ効果が達成されることが実証される(図3参照)。
【０３０３】
(実施例9)
トロンビン生成アッセイ
抗体のトロンビン生成への効果を、正常なヒト血漿(CryoCheck正常血漿)において試験した。凝血の惹起を、再石灰化及び4μMリン脂質ベシクルと共の1pM組織因子(PPP-Reagent low)の添加により誘導した。血友病A様血漿を、100μg/mlヒツジ抗ヒトFVIII抗体(Haematologic Technologies Inc.社、PAHFVIII-S)の添加により得た。必要があれば、10〜20nM外因性組換えヒトTFPIα(配列番号1)を血漿に加えた。トロンビン活性を、Bachem社(Bubendorf、Switzerland)製の蛍光発生基質Z-Gly-Gly-Arg-AMC.HCl(I-1140)の変換後、連続して評価した。蛍光を、マイクロタイタープレートFluorskan Ascent fluorometer(Thermo Labsystems社、Helsinki、Finland)において、368nm及び460nm、それぞれに設定された励起波長及び放射波長で測定した。キャリブレータを用いて、形成されたトロンビンの量の計算、並びに得られた相対的蛍光単位の、内部フィルター効果及び蛍光発生基質消費についての補正を可能にした。加えて、トロンビン-α2-マクログロブリン複合体による基質変換への寄与を引き算した。これらの補正は、Thrombinoscope BV社(Maastricht、the Netherlands)により提供された較正自動化トロンボグラム(CAT)コンピュータソフトウェアを用いて自動的に実施された。トロンビン生成曲線を生じるデータの一次導関数が引き出され、i)ラグタイム、ii)曲線下総面積、内因性トロンビン産生能(ETP)、iii)トロンビンピーク高さ(ピーク)、iv)ピークまでの時間(ttピーク)、及びv)トロンビン生成の最大速度(速度)の計算を可能にした。
【０３０４】
(実施例10)
TFPIαレベルが上昇したヒトFVIII中和化血漿における組織因子誘導性トロンビン生成へのTFPI(1〜161)に特異的な抗TFPI抗体の効果
抗TFPI(1〜79)抗体mAb 1F91、mAb 2F22、mAb 2F45、及びmAb 2F3、並びにTFPI KPI-2抗体mAb 2021のトロンビン生成への効果を、実施例9によるトロンビン生成アッセイにおいて試験した(図1)。図1におけるトロンビン生成からのパラメータはTable 4(表5)に見ることができる。ピークまでの時間(ttピーク、分)及びトロンビンピーク(nM)は、全て、n=3の平均値である。200nMの抗体を、20nM TFPIαを追加したFVIII中和化血漿に加えた。
【０３０５】
【表５】
0006783754.tif 000019
【０３０６】
全部ではないが、一部の高親和性TFPI(1〜79)抗体は、20nM TFPIαを含む血友病A様血漿においてトロンビン生成を部分的に回復させる能力があった。Table 4(表5)におけるデータは、循環中のTFPI抗体の存在が、血漿TFPI濃度の蓄積及び増加を生じる場合、TFPI阻害のより効率的な妨害が必要とされることを示唆している。
【０３０７】
各抗TFPI(1〜79)抗体の抗TFPI KPI-2 mAb 2021との組合せの、トロンビン生成への効果を、実施例9によるトロンビン生成アッセイにおいて試験し、図2に示した。図2におけるトロンビン生成からのパラメータはTable 5(表6)に見ることができる。ピークまでの時間(ttピーク、分)及びトロンビンピーク(nM)は、全て、n=3の平均値である。100nMの抗体を、20nM TFPIα及び100nM mAb 2021を追加したFVIII中和化血漿に加えた。
【０３０８】
【表６】
0006783754.tif 000020
【０３０９】
Table 5(表6)におけるデータは、TFPI阻害のより効率的な妨害が、TF/FVIIa/FXa/TFPI複合体の安定化に関与する1つより多いエピトープの中和により得られることを示唆している。
【０３１０】
(実施例11)
ヒト血友病A血漿における組織因子誘導性トロンビン生成への抗TFPI BiFabの相乗効果
TFPI(1〜79)、TFPIのKPI-2ドメインに対するFab断片及びBiFabを、実施例2、及び5〜7に従って調製した。TFPI(1〜79)及びKPI-2ドメインを標的とするBiFabのトロンビン生成への効果を、単独又は組み合わせての対応する非コンジュゲート型Fab断片の効果と比較した。FVIII中和化血漿、及び10nM TFPIαを追加したFVIII中和化血漿におけるトロンビン生成への効果を、実施例9に従って測定し、そのデータはTable 6(表7)に列挙されている。パラメータは、トロンビン生成曲線から導かれた。ピークまでの時間(ttピーク、分)及びトロンビンピーク(nM)は、全て、n=2の平均値である。
【０３１１】
【表７】
0006783754.tif 000021
【０３１２】
Table 6(表7)におけるデータは、TFPI阻害のより効率的な妨害が、TFPI上の1つより多いエピトープの中和により得られることを示唆している。したがって当然、BiFab 9042のTFPIとの結合におけるアビディティ効果により得られる高親和性(実施例8)により、対応する2つの非コンジュゲート型Fab断片を組み合わせることにより得られる効果より高い、トロンビン生成への相乗効果がもたらされる。
【０３１３】
(実施例12)
ヒト血友病A血漿における組織因子誘導性トロンビン生成への抗TFPI二重特異性抗体の効果
ヒト血友病A血漿における組織因子誘導性トロンビン生成への凝血促進効果は、TFPI(1〜79)及びTFPIのKPI-2領域におけるエピトープを標的とする抗体のFcヘテロ二量体化により組み立てられた非対称性二重特異性抗体を用いることによって得ることができる。
【０３１４】
非対称性二重特異性抗体の作製
二重特異性TFPI(1〜79)/KPI-2結合性抗体を、非対称性IgG型式に基づいて、すなわち、Fcヘテロ二量体化により作製した。FCヘテロ二量体化を達成するために、1セットの適合性突然変異を、mAb 2021(KPI-2結合性)及びmAb 2F22(TFPI(1〜79)結合性)のhIgG1バリアントのFc領域の中へ操作した。
【０３１５】
実施例5に記載されたヒト化mAb 2021のHC発現ベクター、及びmAb 2F22のHC発現ベクターから、制限酵素消化によりVH断片を切り出し、ヒトIgG1定常領域の配列を含有する直線化されたpTTに基づいたツールボックスベクターへクローニングした。その後、そのクローニング反応物を、選択のために大腸菌へ形質転換した。最終構築物の配列をDNAシーケンシングにより検証した。
【０３１６】
制御されたFabアーム交換によるFCヘテロ二量体化を支援するために、単一のリジンからアルギニンへの突然変異を、配列番号27の位置413に対応する、mAb 2021のIgG1 HCのCH3ドメインへ導入した。突然変異を、Stratagene社製のQuikChange(登録商標)部位特異的突然変異誘発キットを用いる部位特異的突然変異誘発により導入した。全ての最終構築物の配列をDNAシーケンシングにより検証した。mAb 2021の操作されたIgG1バージョンは、実施例2に記載されているようにEXPI293F細胞においてmAb 0310(配列番号27及び28)として発現した。LC発現ベクターは、実施例5に記載されているようなmAb 2021の発現に用いられたベクターと一致する。精製を、GE Healthcare社製のMabSelectSuRe樹脂を製造会社の使用説明書に従って用いる標準アフィニティークロマトグラフィーにより実施した。精製された抗体を、PBSバッファー、pH7.2へバッファー交換した。
【０３１７】
適合するフェニルアラニンからロイシンへの突然変異を、配列番号29の位置409に対応する、mAb 2F22のIgG1 HCのCH3ドメインへ導入した。突然変異を、Stratagene社製のQuikChange(登録商標)部位特異的突然変異誘発キットを用いる部位特異的突然変異誘発により導入した。全ての最終構築物の配列をDNAシーケンシングにより検証した。mAb 2F22の操作されたIgG1バージョンは、実施例2に記載されているようにEXPI293F細胞においてmAb 0336(配列番号15及び29)として発現した。LC発現ベクターは、実施例2に記載されているようなmAb 2F22の発現に用いられたベクターと一致する。精製を、GE Healthcare社製のMabSelectSuRe樹脂を製造会社の使用説明書に従って用いる標準アフィニティークロマトグラフィーにより実施した。精製された抗体を、PBSバッファー、pH7.2へバッファー交換した。
【０３１８】
二重特異性TFPI(1〜79)/KPI-2結合性抗体を、mAb2021(KPI-2結合性)の操作されたIgG1バリアントであるmAb 0310と、mAb 2F22(TFPI(1〜79)結合性)の操作されたIgG1バリアントであるmAb 0336との間の制御されたFabアーム交換により調製した。その二重特異性抗体を、本質的に、公開された方法(Labrijnら、PNAS、110、5145〜5150頁(2013))に従って調製した。簡単に述べれば、mAb 0310(mAb 2021 IgG1 LysからArgへのバリアント配列番号27)をmAb 0336(mAb 2F22 IgG1 PheからLeuへのバリアント配列番号29)と、PBSバッファー中、1:1モル比(抗体あたり1mg/ml)で混合した。抗体を、25mM 2-メルカプトエチルアミン(MEA)の存在下での1:1混合物の37℃で90分間のインキュベーションにより選択的に還元して、ハーフ抗体を形成させ、Fabアーム交換を可能にした。最後に、還元剤の除去(MEAを含まないPBSバッファーへのダイアフィルトレーション)及び+5℃での少なくとも16時間の保存後、自発的再構築及び再酸化が得られた。CH3ドメイン突然変異により促進されたヘテロ二量体化が、90%を超える効率で観察された。mAb 0310及び0336から導かれた最終の二重特異性抗体を、mAb 0421(配列番号27、28、及び15、29)と名付けた。
【０３１９】
ヒト血友病A血漿における組織因子誘導性トロンビン生成への抗TFPI二重特異性抗体の効果
ヒト血友病A血漿における組織因子誘導性トロンビン生成への凝血促進効果は、TFPI(1〜79)及びTFPIのKPI-2領域におけるエピトープを標的とする抗体のFcヘテロ二量体化により組み立てられた非対称性二重特異性抗体を用いることによって得ることができる。FVIII中和化血漿、及び10nM TFPIアルファを追加したFVIII中和化血漿におけるトロンビン生成への効果を、実施例9によるトロンビン生成アッセイにおいて試験した。そのデータはTable 7(表8)に列挙されている。パラメータは、トロンビン生成曲線から導かれた。
【０３２０】
【表８】
0006783754.tif 000022
【０３２１】
Table 7(表8)は、血友病A様状態をシミュレートするための抗ヒトFVIII抗体の正常な血漿への添加が、トロンビン生成を強く低下させたことを示している。トロンビンピーク(ピーク)及びピークまでの時間(ttピーク)の両方が影響された。mAb 0310(mAb 2021のFc操作型バージョン)、mAb 0336(抗TFPI mAb 2F22のFc操作型バージョン)、及びmAb 0421(mAb 0310とmAb 0336に由来する非対称性二重特異性抗体)を含むいくつかの抗TFPI抗体のFVIII中和化血漿への添加が、トロンビンピーク(ピーク)とピークまでの時間(ttピーク)の両方を効率的に取り戻している。最大半量応答(EC50)を与えるのに必要とされるmAb 0421濃度は、1.1nMであると推定された(Table 7(表8)に示された2つの実験の平均であるそのデータは、GraphPad PrismRソフトウェアを用いて4パラメータ用量反応曲線へフィットされた)。
【０３２２】
更に、Table 7(表8)は、10nM完全長TFPIアルファのFVIII中和化血漿への添加が、測定可能なトロンビン生成を完全に阻止したこと、及び100nMのTFPI(1〜79)に対する高親和性抗体(mAb 0336)又はKPI-2に対する高親和性抗体(mAb 0310)の添加がこれらの条件下でTFPI阻害を完全には抑止することができなかったことを示している。対照的に、非対称性二重特異性抗体mAb 0421は、ロバストなトロンビンピークを用量依存的に確立し、ピークまでの時間(ttピーク)を低下させ、推定EC50は9.5nM(単一の実験)であった。
【０３２３】
Table 7(表8)におけるデータは、TFPI阻害のより効率的な妨害が、TFPI上の1つより多いエピトープの中和により得られることを示唆している。
【０３２４】
(実施例13)
TFPI KPI-2に対し高親和性かつTFPI KPI-1に対し低親和性の二重特異性分子の結合
二重特異性TFPI(1〜79)/KPI-2結合性分子のある特定の適用について、一方のアームによるTFPI KPI-2との高親和性結合、及び他方のアームによるTFPI(1〜79)との低親和性結合を有することが有利であり得る。
【０３２５】
mAb 2F22に対応するFab 0296(配列番号14(重鎖)及び15(軽鎖))は、TFPI(1〜79)に対して高親和性で結合し、Fab 0296と比較して、TFPI(1〜79)に対する親和性が低下したバリアントを設計するための鋳型としての役割を果たすことができる。
【０３２６】
実施例4に記載されているように、Fab 0296についてのパラトープは決定されており、重鎖(配列番号14)の残基Val 2、Phe 27、Tyr 32、Trp 52、Arg 53、Gly 54、Gly 55、Ser 56、Ile 57、Asp 58、Tyr 59、Ala 61、Met 64、Lys 97、Ser 99、His 100、Asn 102、Tyr 103、Val 104、Gly 105、及びTyr 106、並びに軽鎖(配列番号15)の残基Pro 31、Ala 32、Tyr 49、Ser 50、Asn 53、Tyr 55、Thr 56、Tyr 91、Thr 92、Ser 93、及びTyr 94を含む。
【０３２７】
Fab 0296の高親和性は、上記で述べられたそれのパラトープ残基とTFPI(1〜79)上のエピトープ残基との間のいくつかの相互作用、例えば、静電気的、極性、疎水性、及び水素結合の相互作用の組合せに起因する。したがって、Fab 0296のTFPI(1〜79)に対する結合親和性は、パラトープ残基の1つ又は複数を異なるアミノ酸残基によって置換することにより、パラトープ-エピトープ相互作用を弱め、又は強めることによって、調節される。
【０３２８】
Fab 0296のTFPI(1〜79)に対する親和性は、例えば、単一の位置における保存的置換、数個の位置における保存的置換、又は1個若しくは複数の位置におけるより低い保存性の置換により、様々な程度で減弱される。
【０３２９】
Fab 0295(配列番号18(重鎖)及び15(軽鎖))は、重鎖のC末端における追加のシステインを除いて、Fab 0296と同一であり、Fab 0296と同じパラトープを有する。したがって、TFPI(1〜79)に対する低親和性を有する二重特異性TFPI(1〜79)/KPI-2結合性分子は、実施例7に記載されているように、単一又は複数のパラトープ残基が置換されているFab 0295のバリアントを用いて、それをKPI-2結合性Fabへコンジュゲートすることにより調製される。KPI-2結合性Fabは、例えば、Fab 0088であってよいが、他のKPI-2結合性Fab断片であってもよい。
【０３３０】
この実施例に記載されたFab断片に対応する完全長抗体を用いることによって、実施例12に記載された方法により、対応する二重特異性抗体を得ることが可能である。
【０３３１】
本発明のある特定の特徴が本明細書に例証され、かつ記載されているが、多くの改変、置換、変化、及び均等物を当業者は今や、思い付くであろう。それゆえに、添付された特許請求の範囲が、本発明の真の精神の範囲に入るような全ての改変及び変化を網羅することを意図するものであることは理解されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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