(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト型結核菌タンパク質Ａｇ８５ＡおよびＡｇ８５Ｂのキメラ体を含むヒト型結核菌免疫抗原を発現するセンダイウイルスベクターを含むワクチンであって、前記ヒト型結核菌免疫抗原は、配列番号８のアミノ酸配列を有する、ワクチン。
【請求項２】
Ｆ遺伝子欠損のセンダイウイルスベクターである、請求項１に記載のワクチン。
【請求項３】
予防性抗結核ワクチンである、請求項１または２に記載のワクチン。
【請求項４】
鼻腔内接種により免疫を行うものである、請求項３に記載のワクチン。
【請求項５】
多価ワクチンの形態で少なくとも１回接種されるものである、請求項３または４に記載のワクチン。
【請求項６】
治療性抗結核ワクチンである、請求項１または２に記載のワクチン。
【請求項７】
ヒト型結核菌タンパク質に対する特異的細胞性免疫応答をインビトロで誘導する方法であって、
（ａ）ヒト型結核菌関連タンパク質を融合して発現するセンダイウイルスベクターを抗原提示細胞に導入する工程、
（ｂ）抗原提示細胞と細胞傷害性Ｔリンパ球とを接触させる工程、を含む方法であって、
前記結核菌関連タンパク質は、ヒト型結核菌タンパク質Ａｇ８５ＡおよびＡｇ８５Ｂのキメラ体を含み、前記結核菌関連タンパク質は、配列番号８のアミノ酸配列を含む、方法。
【請求項８】
ヒト型結核菌タンパク質Ａｇ８５ＡおよびＡｇ８５Ｂのキメラ体のアミノ酸配列を含むヒト型結核菌タンパク質Ａｇ８５をコードするセンダイウイルスベクターを含む、ヒト型結核菌タンパク質Ａｇ８５に対する特異的細胞性免疫応答を誘導するための医薬品であって、前記ヒト型結核菌タンパク質Ａｇ８５は、配列番号８のアミノ酸配列を含む、医薬品。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のワクチンを含む組成物。
【請求項１０】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のワクチンを含む組合せ物。
【請求項１１】
少なくとも一つの追加の結核菌治療剤を含む、請求項１０に記載の組合せ物。
【請求項１２】
リファンピシンを含む、請求項１０または１１に記載の組合せ物。
【請求項１３】
ＢＣＧワクチンを含む、請求項１０または１１に記載の組合せ物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はベクターとしてセンダイウイルスを用いた抗結核菌ワクチンに関する。また、本発明はセンダイウイルスベクターを用いて接種する方法、およびヒト型結核菌感染の予防または治療におけるその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
結核病は人間の健康に影響を及ぼす主要な危険要因の１つである。結核病（ＴＢ）の病原体として、ヒト型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）は世界中の細菌感染病の最も主要な死因であり、潜伏性感染は世界人口の３分の１に影響を与える。世界保健機関の最新報告により、２０１２年に世界では合計８６０万の新たな症例と１３０万の死亡症例がある。人類の歴史の上で感染症と戦う最も効果的な方法の１つとして、ワクチンは多くの疾病の予防管理に重要な役割を果たしている。ＢＣＧワクチン（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｕｒｉｎ，  ＢＣＧ）はウシ型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ）由来の弱毒化株であって、今までＴＢに対して承認された唯一のワクチンである。しかしながら、特に異なる人種間では、成人に対するＢＣＧの効果の違いが大きいことが判明された。ＢＣＧの有効性は年齢の増加とともに低下するため、特にＴＢ多発地域では、成人疾患の予防効果は良くない。ＢＣＧワクチン接種は、すでに結核性髄膜炎の予防と肺のヒト型結核菌の肺外部位への拡散を防ぐことに役立っているが、感染を予防することができない。ＢＣＧワクチンのもう１つの制限は、非経口投与が肺粘膜においる強力なＴ細胞免疫を誘導できないことであるが、これは肺のヒト型結核菌の防御には重要である。
【０００３】
肺結核に対するＢＣＧの弱い防御効果を説明するために、いくつかの仮説が提案された。その１つはＢＣＧが十分なＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘導できないことである（文献参照）。最近の研究により、Ｔｈ１型ＣＤ４＋Ｔ細胞免疫に加えて、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答の誘導が、ヒト型結核菌感染に対する免疫に極めて重要であることが示されている。
【０００４】
ＢＣＧの効果の有限性とＴＢの世界的な流行により、各国の研究者は、より効果的な新しい抗ＴＢワクチンの開発に取り組んでいる。
【０００５】
生きたウイルスベクターを基にしたワクチンは、効果的かつ持続的な抗原発現を誘導する能力を有し、最も広く研究されているワクチンベクターの１つである（Ｃａｉｒｎｓ，  Ｊ．Ｓ．ａｎｄ  Ｓａｒｖｅｒ，  Ｎ．，  １９９８，  ＡＩＤＳ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｆｏｒ  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ）  （ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．  Ｈｕｍ．  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  ）  Ｖｏｌ  １４：  ｐ．１５０１−１５０８；  Ｈｉｒｓｃｈ，  Ｖ．  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，１９９６，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ  ７０：ｐ．３７４１−３７５２；Ｂｕｇｅ，  Ｓ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ  ７１：ｐ．８５３１−８５４１）。その中、ポックスウイルスベクターおよびアデノウイルスベクターは最も広く研究されているベクターであり、いずれも臨床試験が完了された。しかし、第ＩＩａ相臨床試験では、抗結核ポックスウイルスベクターワクチンが十分な防御性抗結核免疫応答を誘導できないことを判明した。研究は、ウイルスベクターにより効果的な防御免疫応答を誘導することは、例えば、抗原発現のレベルと持続性、ベクターウイルス複製のカイネティクス、およびベクターウイルスのトロピズムや病原性などの多くの要因に依存することを示唆している。現在利用可能なウイルスベクターはいずれも、それぞれの長所と短所がある。したがって、最適なウイルスベクターを基にした免疫戦略の選択には、正確な評価および比較が必要である。
【０００６】
ウイルスベクターを基にしたワクチン免疫戦略における決定的なデメリットの１つは、標的抗原よりもむしろ、ベクターウイルスに由来する抗原に対する強い免疫応答が誘導されてしまうことである。この問題は、２つまたはそれ以上の異なる種類のベクターワクチンを用いてそれぞれに「初回免疫（ｐｒｉｍｉｎｇ）」と「追加免疫（ｂｏｏｓｔｉｎｇ）」を行うという方法で解決することができる。その中でも、ＤＮＡベクター初回免疫（以下、単に初回免疫とも称する）・ウイルスベクター追加免疫は最も広く研究されている免疫方式の１つである（Ｈａｎｋｅ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，  １９９９，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ  ７３：ｐ．７５２４−７５３２；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｈ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，Ｖｏｌ  ５：ｐ．５２６−５３４）。そのため、新しいクラスのウイルスベクターの開発が依然として必要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ヒト型結核菌感染の増加および世界的な流行のリスクが高まるため、効果的で安全な結核ワクチンの開発が急務となる。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、結核菌タンパク質をコードするセンダイウイルスベクター及びこのベクターから製造されたワクチンを提供する。具体的に、本発明は、ヒト型結核菌タンパクＡｇ８５を融合して発現するセンダイウイルスベクター及びそのワクチンを提供する。
【０００９】
１つの好適な実施形態においては、コードされた結核菌タンパク質は、Ａｇ８５Ａ、Ａｇ８５Ｂ、それらの断片或いは上記のいずれか一つの組み合わせからなる群から選択されるタンパク質或いは断片のアミノ酸配列を含むＡｇ８５である。一実施形態においては、前記結核菌タンパク質はＡｇ８５ＡとＡｇ８５Ｂタンパク或いはそれらの断片のアミノ酸配列のキメラ体を含む。さらなる実施形態においては、前記結核菌タンパク質は、Ａｇ８５Ａタンパクのアミノ酸配列（配列番号２）とＡｇ８５Ｂの第１２５〜２８２位のアミノ酸（配列番号５）のアミノ酸配列のキメラ体（配列番号８）を含み、前記Ａｇ８５Ｂタンパクの第１２５〜２８２位のアミノ酸配列断片をコードする遺伝子はＡｇ８５Ａ遺伝子の配列に挿入され、挿入部位はＡｇ８５Ａ遺伝子の第２４５〜２５０位の制限酵素Ｋｐｎ  Ｉ認識配列および／または第４３０〜４３５位のエンドヌクレアーゼＡｃｃ  Ｉ認識配列である。
【００１０】
一実施形態においては、本発明は当分野で公知のプラスミド構築方法により結核菌キメラ遺伝子をセンダイウイルスベクターに挿入することに関する。上記のように、当該キメラ遺伝子はＡｇ８５Ａタンパクをコードする配列（配列番号１）とＡｇ８５Ｂの第１２５〜２８２位のアミノ酸（配列番号５）をコードする塩基配列のキメラ体（配列番号６又は７）を含むことが好ましく、挿入部位はＡｇ８５Ａ遺伝子の第２４５〜２５０位の制限酵素Ｋｐｎ  Ｉ認識配列および／または第４３０〜４３５位のエンドヌクレアーゼＡｃｃ  Ｉ認識配列であることが好ましい。さらに、本発明は当該キメラ遺伝子にコードされるキメラ結核菌Ａｇ８５タンパクに関する。
【００１１】
一実施形態においては、結核菌タンパク質をコードする遺伝子が挿入される前記センダイウイルスベクター（ＳｅＶ）は、Ｆ遺伝子の欠損がある。具体的に、前記センダイウイルスベクターはＦ遺伝子を欠いている。一実施形態においては、構築された組換えセンダイウイルスベクターはＬＬＣ−ＭＫ２細胞にＡｇ８５タンパクを発現することができる。
【００１２】
さらに、本発明は、結核菌感染或いは結核病の予防および／または治療のためのワクチンの製造における、上記のいずれか一つの組換えセンダイウイルスベクターの使用に関する。また、本発明は、被験者に上記のような組換えセンダイウイルスベクターのワクチンを投与することを含む結核菌感染或いは結核病の予防および／または治療の方法に関する。好ましくは、前記結核病は肺結核病である。
【００１３】
一実施形態においては、本発明は、予防性抗結核ワクチンとして使用可能な上記のいずれか一つのセンダイウイルスベクターのワクチンを提供する。他の実施形態においては、治療性抗結核ワクチンとして使用可能な上記のいずれか一つのセンダイウイルスベクターワクチンを提供する。
【００１４】
一態様において、本発明のセンダイウイルスベクターのワクチンは鼻腔内投与または筋肉注射によって被験者に１回以上投与することができる。
【００１５】
一実施形態においては、本発明のセンダイウイルスベクターワクチンが多価ワクチン接種で少なくとも１回接種される。具体的に、前記センダイウイルスベクターワクチンはＢＣＧワクチンと組み合わせて投与され、ＢＣＧワクチンの投与は、前記センダイウイルスベクターワクチンの投与の前、投与と同時、または投与の後に行ってもよい。好ましくは、被験者が事前にＢＣＧワクチンの初回免疫をすでに受けて、本発明のセンダイウイルスベクターワクチンで追加免疫を行う。さらに、本発明は、任意に上記の組換えセンダイウイルスベクターワクチンおよび少なくとも１つの他の免疫学的薬剤の被験者における結核菌感染の予防への使用を提供する。その中、前記他の免疫学的薬剤は、ＢＣＧワクチン、或いは核酸ワクチン或いは組換えサブユニットワクチン等の結核菌免疫優性抗原を発現させる任意の他の免疫学的製剤であってもよい。好ましくは、本発明が結核病の予防に使用するための前記センダイウイルスベクターワクチンとＢＣＧワクチンの組み合わせを提供する。
【００１６】
一実施形態においては、本発明は、結核病の治療のためのワクチンの製造における前記結核菌タンパク質をコードするセンダイウイルスベクターの使用を提供する。さらに、本発明は、結核に罹患している被験者を治療するための前記組換えセンダイウイルスベクターワクチンの使用を提供し、任意に前記組換えセンダイウイルスベクターワクチンと少なくとも１種の他の結核菌治療剤とを組み合わせて投与してもよい。その中でもに、前記他の結核菌治療剤はリファンピシン（ＲＦＰ）または結核菌を抑制する任意の他の薬剤であってもよい。好ましくは、本発明が結核の治療のための前記センダイウイルスベクターワクチンとリファンピシンの組み合わせの使用を提供する。
【００１７】
前記被験者は、マウスまたはヒト等の、結核菌に感染されるリスクがある或いは結核に罹患した動物であってもよい。
【００１８】
一実施形態においては、さらに、本発明は、結核菌タンパク質に対する特異的細胞性免疫応答を誘導するための、結核菌タンパク質をコードするセンダイウイルスベクターを提供する。他の実施形態においては、本発明は、結核菌タンパク質に対する特異的細胞性免疫応答を誘導する医薬品の製造における、結核菌タンパク質をコードするセンダイウイルスベクターの使用を提供する。一実施形態では、本発明の組換えセンダイウイルスベクターは、肺臓と脾臓とのいずれにも当該結核菌タンパク質に対する強い細胞性免疫応答を誘導する。また、一実施形態では、本発明の組換えセンダイウイルスベクターは、肺臓において当該結核菌タンパク質に対するより強い細胞性免疫応答を誘導する。
【００１９】
一実施形態においては、本発明は、（ａ）結核菌関連タンパク質を融合して発現するセンダイウイルスベクターを抗原提示細胞に導入する工程、（ｂ）抗原提示細胞と細胞傷害性Ｔリンパ球とを接触させる工程を含む結核菌タンパク質に対する特異的細胞性免疫応答を誘導する方法を提供する。前記方法はインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）、エクスビボ（ｅｘ  ｖｉｖｏ）またはインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で行うことができる。具体的に、コードされる結核菌タンパク質は、Ａｇ８５Ａ、Ａｇ８５Ｂ、それらの断片或いは上記のいずれかの組み合わせからなる群から選択されるタンパク質或いは断片のアミノ酸配列を含むＡｇ８５である。一実施形態においては、前記結核菌タンパク質はＡｇ８５ＡとＡｇ８５Ｂタンパクまたはそれらの断片のアミノ酸配列のキメラ体を含む。さらなる実施形態においては、前記結核菌タンパク質はＡｇ８５Ａタンパクのアミノ酸配列（配列番号２）とＡｇ８５Ｂの第１２５〜２８２位のアミノ酸（配列番号５）のアミノ酸配列のキメラ体（配列番号８）を含み、前記Ａｇ８５Ｂタンパクの第１２５〜２８２位のアミノ酸配列断片をコードする遺伝子はＡｇ８５Ａ遺伝子の配列に挿入され、挿入部位はＡｇ８５Ａ遺伝子の第２４５〜２５０位の制限酵素Ｋｐｎ  Ｉ認識配列および／または第４３０〜４３５位のエンドヌクレアーゼＡｃｃ  Ｉ認識配列である。
【００２０】
一実施形態においては、本発明は、上記の何れか一つの組換えセンダイウイルスベクターと少なくとも１種の薬学的に許容されるベクター或いは媒介体（ｖｅｈｉｃｌｅ）を含むワクチン組成物を提供する。一実施形態においては、前記薬学的に許容されるベクターはアジュバントである。好ましくは、アジュバントはレバミゾールである。
【００２１】
一実施形態においては、本発明は結核菌タンパク質Ａｇ８５ＡＢをコードするセンダイウイルスベクターに関し、このセンダイウイルスベクターは中国典型培養物保藏中心（ＣＣＴＣＣ、アドレス：武漢市武昌珞珈山、４３００７２）に寄託され、分類はＰａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ／Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓｅｓであり、寄託日は２０１５年４月１９日であり、寄託番号はＣＣＴＣＣ  Ｖ２０１５１８である。
【００２２】
具体的に、本発明は以下の要旨に関する。
１．ヒト型結核菌免疫抗原を発現し、好ましくはヒト型結核菌分泌蛋白Ａｇ８５を発現するセンダイウイルスベクターのワクチン。
２．発現されたヒト型結核菌抗原がＡｇ８５Ａタンパク、および／またはＡｇ８５Ｂタンパク、および／またはそれらの一部および上記したもののキメラ体のアミノ酸配列を含む、１に記載のワクチン。
３．使用されたベクターがＦ遺伝子欠損のセンダイウイルスベクターである、１または２に記載のワクチン。
４．予防性抗結核ワクチンとしての、１〜３のいずれか一項に記載のセンダイウイルスベクターワクチンの使用。
５．前記ワクチンが鼻腔内接種により免疫を行う、４に記載の使用。
６．前記ワクチンが多価ワクチンとして少なくとも１回接種される、４または５に記載の使用。
７．治療性抗結核ワクチンとしての、１〜３のいずれか一項に記載のセンダイウイルスベクターワクチンの使用。
８．（ａ）結核菌関連タンパク質を融合して発現するセンダイウイルスベクターを抗原提示細胞に導入する工程、
（ｂ）抗原提示細胞と細胞傷害性Ｔリンパ球とを接触させる工程、を含み方法であって、前記結核菌のタンパク質は、Ａｇ８５Ａ、Ａｇ８５Ｂ、それらの断片、或いは前記の何れか一つの任意の組み合わせからなる群から選択されるタンパク質を含む、結核菌タンパク質に対する特異的細胞性免疫応答を誘導する方法。
９．インビトロで実施される、８に記載の方法。
１０．結核菌Ａｇ８５タンパクがＡｇ８５Ａ、Ａｇ８５Ｂ、それらの断片、または前記の何れか一つの任意の組み合わせからなる群から選択されるタンパク質を含む、結核菌タンパク質Ａｇ８５コードするセンダイウイルスベクターの、当該タンパク質に対する特異的細胞性免疫応答を誘導する医薬品の製造における使用。
１１．中国典型培養物保藏中心に寄託され、寄託番号がＣＣＴＣＣ  Ｖ２０１５１８である、組換えセンダイウイルスベクター。
【００２３】
前述の概要は例示的なものに過ぎず、何ら限定するものではない。上記の例示的な態様、実施形態、および特徴に加えて、他の態様、実施形態、および特徴は、以下、詳細に説明する。
【００２４】
添付の図面に基づいて以下の説明および添付の特許請求の範囲から、本発明の前述特徴および他の特徴はより明らかになる。これらの図面は、本発明に係るいくつかの実施形態を示すに過ぎず、本発明の範囲を制限するものではない。以下、図面を参照して本発明をより詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１はｐＳｅＶ８５ＡＢプラスミドの構築を示す図であって、構築されたＡｇ８５ＡおよびＡｇ８５Ｂのキメラ体がＦ遺伝子欠損性ＳｅＶベクターのＮｏｔ  Ｉ部位に挿入された。
【図２】図２は、構築されたｐＳｅＶ８５ＡＢプラスミドのＳｅＶ８５ＡＢ発現の同定結果を示す図であって、感染多重度（ＭＯＩ）の異なるＳｅＶ８５ＡＢでＬＬＣ−ＭＫ２細胞を感染させた後、マウス抗Ａｇ８５Ａ抗体およびフルオレセインと結合したヤギ抗マウス免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）を用いて細胞分解物に対してウェスタンブロット分析を行った。
【図３】図３と図４は、それぞれ、ＳｅＶ８５ＡＢを鼻腔内で免疫接種した後に、マウスの肺臓または脾臓由来のＴリンパ球をインビトロで刺激して分泌されたＩＦＮ−γのレベルのＥＬＩＳＰＯＴによる測定を示す図である。
【図４】図３の説明参照。
【図５】図５は、マウスに対してＰＢＳ、２回量のＳｅＶ８５ＡＢおよび２回量のＳｅＶブランクベクターを投与した後のマウスの体重の変化を示す図である。その結果、ＳｅＶ８５ＡＢの点鼻免疫はマウスの体重の異常変化を引き起こさなかったことが判明した。
【図６】図６と図７は、それぞれ、ＳｅＶ８５ＡＢを筋肉内で免疫接種した後に、マウスの肺臓または脾臓由来のＴリンパ球をインビトロで刺激して分泌されたＩＦＮ−γのレベルのＥＬＩＳＰＯＴによる測定を示す図である。
【図７】図６の説明参照。
【図８】図８は、マウスに対してＰＢＳ、２回量のＳｅＶ８５ＡＢおよび２回量のＳｅＶブランクベクターを投与した後のマウスの体重の変化を示す図である。その結果、ＳｅＶ８５ＡＢの筋肉内免疫はマウスの体重の異常変化を引き起こさなかったことが判明した。
【図９】図９と図１０は、実施例６に記載のような８つの初回免疫−追加免疫戦略を用いて得られたマウスの肺臓と脾臓細胞におけるＴ細胞応答の結果を示す図である。
【図１０】図９の説明参照。
【図１１】図１１は、マウスに対して８つの初回免疫−追加免疫戦略を実施した後のマウスの体重の変化を示す図である。その結果、ＢＣＧ＋ＳｅＶ８５ＡＢで免疫したマウスは、他の試験グループに比べて体重の有意な変化を示さなかったことが判明した。
【図１２】図１２は、マウスをＳｅＶブランクベクター、ＢＣＧおよび用量の異なるＳｅＶ８５ＡＢで免疫した後に、結核菌で感染を行うことにより、測定された免疫学的効果を示す図である。
【図１３】図１３は、ＰＢＳ、ＢＣＧ、ＢＣＧ−ＳｅＶ８５ＡＢおよびＳｅＶ８５ＡＢなどの異なる免疫戦略の実施でマウスを免疫した後に、結核菌で感染を行うことにより、測定された免疫学的効果を示す図である。縦軸はＣＦＵ（コロニー形成単位）の対数であり、左図は肺臓における結果を示し、右図は脾臓における結果を示す。結果として、高濃度（１０７ＣＩＵ）のＳｅＶ８５ＡＢでマウスを免疫すると、ＢＣＧワクチンの接種と同様の免疫防御効果を誘導することができ、また、ＢＣＧ初回免疫マウスを追加免疫すると、その細菌量が著しく減少する。これは、ＳｅＶ８５ＡＢベクターワクチンがＢＣＧの追加免疫ワクチンとして有望な候補の１つであることを示している。
【図１４】図１４は、結核菌に感染されたマウスに対して、リファンピシンまたはＳｅＶ８５ＡＢを用いた治療効果を示す図である。
【図１５】図１５は、結核菌に感染されたマウスに対して、ＰＢＳのみ、リファンピシン（ＲＦＰ）のみ、およびリファンピシンとＳｅＶ８５ＡＢとの組み合わせを用いた治療効果を示す図である。これらの結果から、ＳｅＶ８５ＡＢのみによる免疫療法はＲＦＰの薬物治療に相当する効果を取得できることが分かる。また、リファンピシンとＳｅＶ８５ＡＢとの併用療法は、マウスの肺臓に存在する細菌量を著しく減少させることができる。これは、ＳｅＶ８５ＡＢ免疫療法と抗結核医薬品の併用は、抗結核治療の治療効果を向上させることができることを示している。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明は、ヒト型結核菌免疫優性抗原を融合して発現する組換えセンダイウイルスベクターワクチンを提供する。このワクチンは、治療性と予防性の抗結核ワクチンとして使用することができる。本発明者らは、このワクチンの鼻腔内免疫により、結核菌に対する防御免疫応答を成功かつ効果的に誘導し、免疫による病理学的症状が観察されなかった。このワクチンを予防性抗結核ワクチンとして使用する場合、その鼻腔内接種は、マウスモデルにおいて顕著な抗原特異的細胞性免疫応答を成功に誘導した。結核菌の防御に関する実験から、対照動物に比べて、免疫したマウスの肺臓と脾臓における結核菌の量が顕著に減少し、そのメカニズムが、肺臓で誘導された強い抗原特異的Ｔ細胞免疫応答、特にＣＤ８＋Ｔ細胞免疫反応に関することを見出した。また、このワクチンを治療性抗結核ワクチンとして使用する場合、８週間の鼻腔内免疫治療後に、ヒト型結核菌感染マウスの肺臓と脾臓における細菌の量は、リファンピシン（ＲＦＰ）治療グループに相当し、また、ＲＦＰと併用する場合、ＲＦＰの治療効果を著しく高めた。
【００２７】
このワクチンは、少なくとも１種類の結核菌のタンパク質を使用する。本発明によれば、Ａｇ８５抗原のみを発現しても効果的な免疫応答を誘導することができる。また、複数のタイプのタンパク質を抗原として使用することにより、より高い免疫性が得られる。使用された結核菌Ａｇ８５タンパクでは、結核菌Ａｇ８５ＡとＡｇ８５Ｂ抗原タンパク質のアミノ酸配列の１〜１２５位は互いにほとんど差異がないが、アミノ酸配列の１２５〜２８２位は大きく異なり、約４０のアミノ酸が異なり、このセグメントをコードする両者の核酸配列には９０数の塩基が同じではない。このセグメントでは、Ａｇ８５Ｂは、Ｔｈ１型応答反応サイトカインＩＦＮ−γとＩＬ−２を誘導できる重要なエピトープが存在している（Ｓ．Ｄ’Ｓｏｕｚａ，Ｖ．Ｒｏｓｓｅｅｌｓ  Ｍ．Ｒｏｍａｎｏ，Ａ  ｅｔ  ａｌ；Ｍａｐｐｉｎｇ  ｏｆ  Ｍｕｒｉｎｅ  Ｔｈ１  Ｈｅｌｐｅｒ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ｏｆ  Ｍｙｃｏｌｙｌ  Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ  Ａｇ８５Ａ，Ａｇ８５Ｂ，ａｎｄ  Ａｇ８５Ｃ  ｆｒｏｍ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ．  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，  Ｊａｎｕａｒｙ  ２００３，７１（１）：４８３−４９３）。
【００２８】
本発明らは、コンピュータソフトウェアサービス会社であるＩｎｔｅｎｅｔ−Ｂａｓｅｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ＣｏｍｐａｎｙのＥｐｉｔｏｐｅ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓソフトウェアにより、結核菌構造タンパク質であるＡｇ８５Ａの遺伝子の抗原エピトープを検索したところ、その抗原エピトープが主にＡｇ８５Ａのアミノ末端とカルボキシル末端に集まっていることを見出した（Ｓ．Ｄ’Ｓｏｕｚａ，Ｖ．Ｒｏｓｓｅｅｌｓ，Ｍ．Ｒｏｍａｎｏ，Ａ  ｅｔ  ａｌ；Ｍａｐｐｉｎｇ  ｏｆ  Ｍｕｒｉｎｅ  Ｔｈ１  Ｈｅｌｐｅｒ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ｏｆ  Ｍｙｃｏｌｙｌ  Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ  Ａｇ８５Ａ，Ａｇ８５Ｂ，ａｎｄ  Ａｇ８５Ｃ  ｆｒｏｍ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，Ｊａｎｕａｒｙ  ２００３，７１（１）：４８３−４９３）。抗原エピトープを含まないＡｇ８５Ａ親遺伝子の中間セグメントの第２４５〜２５０位はＫｐｎ  Ｉ酵素切断部位（ＧＧＴＡＣＣ）を含み、第４３０〜４３５位はＡｃｃ  Ｉ酵素切断部位（ＧＴＣＴＡＣ）を含むので、そこにＡｇ８５Ｂの１２５〜２８２位のアミノ酸をコードする塩基配列断片を挿入するように設計する。
【００２９】
本発明において、センダイウイルスベクターに挿入された結核菌タンパク質コード遺伝子は、Ａｇ８５Ａ、Ａｇ８５Ｂ、それらの断片、またはそれらの任意の組み合わせをコードするポリ塩基配列であってもよく、このポリ塩基配列の誘導体または変異体であってもよい。この誘導体または変異体は、前記塩基配列にコードされるタンパク質がＡｇ８５Ａ、Ａｇ８５Ｂタンパク、それらの断片、またはそれらの任意の組み合わせと同じ免疫原性を有する限り、Ａｇ８５Ａ、Ａｇ８５Ｂタンパクまたはそれらの断片をコードするポリ塩基配列に対して、少なくとも７０％の相同性を有し、好ましくは少なくとも７５％の相同性、より好ましくは少なくとも８０％の相同性、より好ましくは少なくとも８５％の相同性、好ましくは少なくとも９０％の相同性、より好ましくは少なくとも９５％の相同性、より好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％、９９％の相同性を有する。
【００３０】
本発明者らは、組換え型センダイウイルス（Ｓｅｎｄａｉ  ｖｉｒｕｓ，  ＳｅＶ）を用いて、効率的に抗原を発現させる系を確立させた（Ｋａｔｏ，  Ａ．ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｇｅｎｅ  Ｃｅｌｌ  Ｖｏｌ  １：ｐ．５６９−５７９）。マウスパラインフルエンザウイルス１型であるＳｅＶは、非分節性（ｎｏｎ−ｓｅｇｍｅｎｔｅｄ）ネガティブ鎖ＲＮＡゲノムを持つエンベロープウイルスであり、パラミクソウイルス属に属する（Ｎａｇａｉ，Ｙ．１９９９，Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．Ｖｏｌ  ９：ｐ．８３−９９）。このウイルスはマウスに対して致命的な呼吸器疾患を引き起こすが、非ヒト霊長類およびヒトに対して病原性がない（Ｎａｇａｉ，Ｙ．１９９９，Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．Ｖｏｌ  ９：ｐ．８３−９９；Ｈｕｒｗｉｔｚ，Ｊ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ，Ｖｏｌ  １５：ｐ．５３３−５４０，１９９７）。
【００３１】
センダイウイルスは細胞質内に複製を行うので、抗原タンパク質は、細胞核でなく組換えセンダイウイルスベクターワクチンにより効率的に発現できる。また、センダイウイルスベクターによる感染は細胞分裂を引き起こさないので、外来遺伝子が効率的かつ持続的に発現されることは重要である。例えば、培養上清中に、組換えヒトセンダイウイルスベクターによる１型ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１）のＥｎｖタンパクのｇｐ１２０の発現量は、６μｇ／ｍｌ（１０６細胞あたり６μｇ相当）と高く、これは哺乳動物細胞培養系におけるベクターで最も高い（Ｙｕ、Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｇｅｎｅ  Ｃｅｌｌｓ，Ｖｏｌ．２：ｐ．４５７−４６６）。
【００３２】
ＳｅＶの複製にエンベロープをプロセシングするプロテアーゼが必要であるので、その複製のトロピズムは気道上皮細胞などの特定の組織に限定される（Ｎａｇａｉ，Ｙ．，１９９３，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．  １：ｐ．８１−８７）。また、気道以外の他の組織にも広がらないことが予想されるため、ＳｅＶベクターはその複製型であっても安全面で利点があることが示唆される。
【００３３】
本発明者らは、Ｆ遺伝子欠損ＳｅＶをベクターとして用いて、ヒト型結核菌の免疫優性抗原Ａｇ８５Ａ及びＡｇ８５Ｂを発現する抗結核組換えセンダイウイルスベクターワクチン（ＳｅＶ８５ＡＢと命名された）を構築した。ウェスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔ）により、当該組換えワクチンがこの２種の結核菌タンパク質のキメラタンパク質を発現できることを確認した。
【００３４】
一方、このワクチンが結核菌に対する予防ワクチンとして使用され、マウスモデルにおける結核菌感染に対する予防効果を評価した。具体的に、ＳＰＦ実験室において、１０７ＣｌＵのＳｅＶ８５ＡＢを用いて鼻腔内接種または筋肉注射でＢａｌｂ／ｃマウス（メス、６〜８週齢）を免疫した。ＢＣＧ免疫およびＰＢＳを対照とした。免疫してから４週間後、マウスを殺し、肺臓および脾臓の器官を回収し、無菌でホモジナイズした後に単細胞懸濁液に消化した。抗原特異的ペプチドおよびＰＰＤを使用してインビトロ刺激を行い、ＥＬＩＳＰＯＴおよび多色フロー法によって、特異的刺激後のこれらの細胞のサイトカインの分泌能力を評価した。一方、免疫したマウスをＰ３実験室に送り、ヒト型結核菌Ｈ３７Ｒｖ株のエアロゾル攻撃を行った。攻撃から４週間後、肺臓と脾臓組織を採取してホモジナイズし、ＣＦＵコロニーをカウントして、ワクチンの免疫によるマウスへの保護効率を分析した。実験結果から、ＳｅＶ８５ＡＢによる免疫、特に鼻腔内接種は、マウスに対して強い抗原特異的免疫応答を誘導することができ、単回用量の免疫でも、ＢＣＧワクチンの免疫と同等のヒト型結核菌攻撃に対する防御効果をもたらすことができ；ＢＣＧ初回免疫−ＳｅＶ８５ＡＢ追加免疫の方法を使用すると、ヒト型結核菌を攻撃した後に、感染されたマウスへの保護効率を著しく改善できることが確認された。
【００３５】
一方、このワクチンが結核菌に対する治療性ワクチンとして使用され、マウスモデルにおける結核菌感染に対する治療効果を評価した。具体的に、Ｐ３実験室において、ヒト型結核菌Ｈ３７Ｒｖ株を用いてＢａｌｂ／ｃマウス（メス、６〜８週齢）を感染させた（エアロゾル攻撃、１００ＣＦＵ）。感染後４週目、６週目および８週目に、３つの１０７ＣｌＵのＳｅＶ８５ＡＢで点鼻免疫治療を行い、ブランク対照グループの場合は、ＰＢＳで点鼻し、薬物グループの場合は、４週目からマウスの飲料水に１０ｍｇ／ｋｇ／日のリファンピシン（ＲＦＰ）を加えた。感染後４週目、６週目、８週目および１２週目に、それぞれグループ毎に３〜４匹のマウスを殺し、ＳｅＶ８５ＡＢの治療効果を分析した。結果として、ＳｅＶ８５ＡＢで免疫治療してから８週間後、マウスの肺臓、脾臓における細菌の量はＲＦＰ薬物治療グループに相当することが判明した。別の独立した試験において、マウスを感染してから３週間後に、マウスの飲料水にＲＦＰを加えて治療するか、またはＲＦＰ治療しながら１０７ＣＩＵのＳｅＶ８５ＡＢを鼻腔内接種して、１週間おきに１回治療を行い、合計３回行った。対照グループはＰＢＳのみを接種した。治療が終了してから１週間後、マウスの肺組織を採取してホモジナイズし、ＣＦＵコロニーをカウントし、そして治療効果を分析した。結果として、ＲＦＰ＋ＳｅＶ８５ＡＢ併用の治療方案は、ＲＦＰのみの治療方案に比べて、マウスの肺臓におけるコロニーの数を著しく減少させ、この組換えウイルスは抗結核ワクチンとして良好な免疫治療効果を有し、また、抗結核医薬品との併用は治療効果がより良くなることを確認した。
【００３６】
鼻腔内接種は、粘膜免疫応答を誘導することができる利点を有する。咽頭後ＬＮ（ｒｅｔｒｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ  ＬＮ）および顎下ＬＮ（ｓｕｂｍａｎｄｉｂｕｌａｒ  ＬＮ）は、鼻腔からのリンパ球が最初に流入するＬＮである（Ｓｕｅｎ，Ｊ．Ｙ．  ａｎｄ  Ｓｔｅｒｎ，Ｓ．Ｊ．１９９６，Ｃａｎｃｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｅｃｋ．，  ３ｒｄ  ｅｄ．，Ｅ．Ｎ．Ｍｙｅｒｓ  ａｎｄ  Ｊ．Ｙ．Ｓｕｅｎ，ｅｄｉｔｏｒｓ．  Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ｐ．４６２−４８４，Ｃａｎｃｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｅｃｋ）。これらのＬＮは、粘膜免疫応答に関与している可能性が高い。研究は、マウスにおいてＮＡＬＴ（ｎａｓａｌａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｌｙｍｐｈｏｉｄ  ｔｉｓｓｕｅ：鼻関連リンパ系組織）が粘膜免疫応答の重要な構成要素であることが示された（Ｙａｎｇａｇｉｔａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１６２、ｐ．３５５９−３５６５）。マウスＮＡＬＴに対応するＷａｌｄｅｙｅｒ’ｓ  ｒｉｎｇから調製した細胞の解析により、組織内にＳｅＶの発現及び免疫応答が存在することを確認することができる。しかしながら、咽頭後ＬＮ（ｒｅｔｒｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ  ＬＮ）および顎下ＬＮ（ｓｕｂｍａｎｄｉｂｕｌａｒ  ＬＮ）におけるＳｅＶの発現の検出では、両方の組織において有意なＲＮＡが検出された。これらのＬＮにはＳｅＶタンパクのプロセシングに必要なプロテアーゼが存在しないので（Ｎａｇａｉ，Ｙ．，１９９３，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１，ｐ．８１−８７）、ＬＮにおけるＳｅＶの複製は起こらないと予想され、これらのＬＮにおけるｍＲＮＡは、鼻腔内から流入したＳｅＶ感染リンパ球に由来するものである。ＳｅＶの鼻腔内接種により、鼻腔内粘膜のみならず局所ＬＮでも効率的な抗原の発現が見られたことから、粘膜免疫応答の誘導におけるＳｅＶの能力が示唆される（Ｇａｌｌｉｃｈａｎ，Ｗ．Ｓ．  ａｎｄ    Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ，Ｋ．Ｌ．，１９９６，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｖｏｌ．１８４，ｐ．１８７９〜９０）。
【００３７】
細胞性免疫応答は、体がヒト型結核菌の感染および複製を制御するための重要な構成要素である（Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １，２０−３０（２００１年１０月））。したがって、結核菌特異的Ｔ細胞免疫応答の誘導はＴＢ感染の防御に極めて重要である。また、結核菌は主に呼吸器および肺臓を介して体内に侵入することを考えると、肺粘膜で抗原特異的免疫応答を誘導することが非常に重要である。本発明者らは、ＥＬＩＳＰＯＴ、細胞内因子（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｆａｃｔｏｒ）染色および四量体染色などの方法で、ＳｅＶ８５ＡＢでの免疫は、マウスの肺臓において強い抗原特異的Ｔ細胞免疫応答を誘導し得ることを検証した。
【００３８】
Ｆ遺伝子欠損のセンダイウイルスベクターＳｅＶまたは組換えＳｅＶ８５ＡＢワクチンを接種した後、マウスはウイルス感染および死亡の症状を示さなかった。また、マウスの体重モニタリングでも、このウイルスベクターまたは組換えワクチンによる接種が、接種されたマウスの体重の異常変化を起こさないことを実証し、したがって、このワクチンの安全性を検証する。
【００３９】
具体的に、本発明は、組換えＳｅＶ８５ＡＢにより媒介される免疫が、マウスのヒト型結核菌に対する応答を誘導することを初めて開示する。本発明の結果は、抗原に特異的な細胞性免疫応答は、鼻腔内免疫した全てのマウスにおいて効果的に誘導されたことを示している。抗原の発現は局在化され、且つよく制御される。これらの結果は、ＳｅＶ系が有望な結核ワクチンのベクターとして使用できることを示唆している。
【００４０】
本発明は、結核菌タンパク質をコードするセンダイウイルスベクターを含むワクチンを提供することを目的とする。本発明のワクチンは、結核の予防及び治療に好適に用いることができる。本発明は、このワクチンの接種方法をさらに含む。具体的に、本発明は、以下の内容に関する。
【００４１】
（１）結核菌タンパク質をコードするセンダイウイルスベクターを含むワクチン。
（２）組換えタンパク質が、Ａｇ８５Ａおよび／またはＡｇ８５Ｂタンパク、および／またはその一部および上記のそれらのキメラ体を含む、（１）に記載のワクチン。
（３）センダイウイルスベクターはＦ遺伝子欠損のものである、（１）または（２）に記載のワクチン。
（４）結核菌タンパク質をコードするセンダイウイルスベクターを含むワクチンを接種する、接種の方法。
（５）鼻腔内でワクチンを接種する、（４）に記載の方法。
（６）複数のワクチンの接種において、このワクチンを少なくとも１回接種する、（４）または（５）に記載の方法。
（７）（ａ）結核菌タンパク質をコードするセンダイウイルスベクターを抗原提示細胞に導入する工程、および（ｂ）抗原抗原提示細胞とＴヘルパー細胞および細胞傷害性Ｔ細胞とを接触させる工程を含む、結核菌タンパク質に対する特異的細胞性免疫応答を誘導する方法。
【００４２】
本発明で用いられる「ワクチン」という用語とは、感染症の予防または治療のための組成物を指す。ワクチンは、抗原を含むか、または抗原を発現可能であり、これにより抗原に対する免疫応答を誘導することができる。本発明のセンダイウイルスベクターを含むワクチンは、所望の形態で病原微生物の感染、伝播および流行の予防または治療のために使用することができる。
【００４３】
「接種」とは、ワクチンを接種することにより、生体または培養系において免疫（体液性免疫性、細胞性免疫性、または両者）を能動的に作らせることを指す。これにより、病原体の感染、増殖、伝播および／または流行を予防や防止することができる。また、病原体感染後の症状の発症および／または進展を抑制することができる。
【００４４】
「抗原」とは、１つ或いはそれ以上のエピトープを含む分子であり、宿主の免疫系を刺激して抗原特異的な免疫応答を誘導することができるタンパク質を指す。免疫応答は、体液性免疫応答および／または細胞性免疫応答であっても良い。３個〜数個のアミノ酸でも１つのエピトープとなり得るが、通常、蛋白質中の１つのエピトープは、約７〜約１５アミノ酸を含み、例えば８、９、１０、１２または１４アミノ酸を含む。抗原は免疫原とも呼ばれる。本発明において、抗原タンパク質をコードするポリヌクレオチドまたはベクターは抗原を発現させる場合、このポリヌクレオチドまたはベクターが抗原を言う。これもワクチンの成分として使用することができる。
【００４５】
「免疫応答」または「免疫学的応答」とは、抗原またはワクチンに対する体液性免疫応答および／または細胞性免疫応答を指す。体液性免疫応答とは、抗体分子により媒介される免疫応答を指す。細胞性免疫応答とは、Ｔリンパ球および／または他の白血球により媒介される免疫応答を指す。細胞性免疫には、例えば、ＣＴＬ産生、ヘルパーＴ細胞の産生または活性化が含まれる。細胞性免疫応答は、例えばＣＤ８＋Ｔ細胞などの活性化Ｔ細胞または他の白血球で産生されるサイトカインまたはケモカインを調べることにより検出することができる。また、既知のリンパ球増殖アッセイ、ＣＴＬアッセイ、または抗原特異的Ｔ細胞のアッセイにより決定することもできる。
【００４６】
「組換え体」とは、組換えポリヌクレオチドを介して生成した化合物または組成物を指す。  組換えポリヌクレオチドとは、自然の状態と同じようには結合していないポリヌクレオチドを指す。組み換え蛋白質は、組み換えポリヌクレオチドを発現させて得ることができる。また、「組換え」ウイルスベクターとは、遺伝子操作により組換えポリヌクレオチドまたはその増幅産物を介して構築されたウイルスベクターを言う。
【００４７】
本発明において使用する「パラミクソウイルス」という用語は、パラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）に属するウイルスを言う。パラミクソウイルスとしては、例えば、センダイウイルス（Ｓｅｎｄａｉ  ｖｉｒｕｓ）、ニューカッスル病ウイルス（Ｎｅｗ  ｃａｓｔｌｅ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｖｉｒｕｓ）、おたふくかぜウイルス（Ｍｕｍｐｓ  ｖｉｒｕｓ）、麻疹ウイルス（ｍｅａｓｌｅｓ  ｖｉｒｕｓ）、ＲＳウイルス（Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ）、牛疫ウイルス（ｒｉｎｄｅｒｐｅｓｔ  ｖｉｒｕｓ）、ジステンパーウイルス（ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ  ｖｉｒｕｓ）、サルパラインフルエンザウイルス（ＳＶ５）、ヒトパラインフルエンザウイルス１，２，３型が挙げられるが、これらに限定されない。センダイウイルスは、野生株、変異株、ラボ継代株、または人為的に構築された株などであっても良い。ＤＩ粒子（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９４，Ｖｏｌ．６８：ｐ．８４１３−８４１７）などの不完全なウイルス、および合成されたオリゴヌクレオチドなども、本発明のワクチンを製造するための物質として使用することができる。
【００４８】
パラミクソウイルスのタンパク質をコードする遺伝子としては、ＮＰ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよびＬ遺伝子が含まれる。本発明において、「ＮＰ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよびＬ遺伝子」とは、それぞれヌクレオキャプシド、ホスホ、マトリックス、フュージョン、ヘマグルチニン・ノイラミニダーゼおよびラージ蛋白質をコードするものを指す。パラミクソウイルス亜科に属する各ウイルスの遺伝子は、一般的に下記のように記載されている。通常、ＮＰ遺伝子は「Ｎ遺伝子」と表記されることもある。
パラミクソウイルス属  ＮＰ  Ｐ／Ｃ／Ｖ    Ｍ    Ｆ    ＨＮ  −    Ｌ
ルブラウイルス属  ＮＰ      Ｐ／Ｖ        Ｍ    Ｆ    ＨＮ（ＳＨ）  Ｌ
麻疹ウイルス属  ＮＰ        Ｐ／Ｃ／Ｖ    Ｍ    Ｆ    Ｈ  −      Ｌ
【００４９】
パラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）レスピロウイルス属（Ｒｅｓｐｉｒｏｖｉｒｕｓ）に分類されるセンダイウイルスの各遺伝子の塩基配列のデータベースのアクセッション番号は、ＮＰ遺伝子については、Ｍ２９３４３、Ｍ３０２０２、Ｍ３０２０３、Ｍ３０２０４，Ｍ５１３３１、Ｍ５５６５、Ｍ６９０４６、およびＸ１７２１８を参照し；Ｐ遺伝子については、Ｍ３０２０２、Ｍ３０２０３、Ｍ３０２０４、Ｍ５５５６５、Ｍ６９０４６、Ｘ００５８３、Ｘ１７００７、およびＸ１７００８を参照し；Ｍ遺伝子については、Ｄ１１４４６、Ｋ０２７４２、Ｍ３０２０２、Ｍ３０２０３、Ｍ３０２０４、Ｍ６９０４６、Ｕ３１９５６、Ｘ００５８４、Ｘ５３０５６を参照し；Ｆ遺伝子については、Ｄ００１５２、Ｄ１１４４６、Ｄ１７３３４、Ｄ１７３３５、Ｍ３０２０２、Ｍ３０２０３、Ｍ３０２０４、Ｍ６９０４６、Ｘ００１５２、およびＸ０２１３１を参照し；ＨＮ遺伝子については、Ｄ２６４７５、Ｍ１２３９７、Ｍ３０２０２、Ｍ３０２０３、Ｍ３０２０４、Ｍ６９０４６、Ｘ００５８６、Ｘ０２８０８、Ｘ５６１３１を参照し；Ｌ遺伝子については、Ｄ０００５３、Ｍ３０２０２、Ｍ３０２０３、Ｍ３０２０４、Ｍ６９０４０、Ｘ００５８７、およびＸ５８８８６を参照する。
【００５０】
本発明で用いられる用語「遺伝子」とは、ＲＮＡ、ＤＮＡなどの核酸を含む遺伝物質を指す。遺伝子は、天然由来または人為的に設計された配列を持つものであっても良い。本明発明で用いられるパラミクソウイルスベクターは、結核菌のタンパク質またはその一部をコードする外来遺伝子を含む。外来遺伝子は、天然の結核菌に含有される遺伝子またはそれらの断片であっても良い。また、外来遺伝子は例えば欠失体、変異体、不活化蛋白質または他のタンパク質と融合した結核菌タンパク質をコードする核酸を含んでも良い。また、ここで使用される「ＤＮＡ」とは、一本鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡを含む。
【００５１】
本発明で用いられる「ヒト型結核菌」という用語とは、結核病を引き起こす病原体を指す。肺結核が最も一般的な形であり、全身の各器官に侵入することができる。ヒト型結核菌は、ゲノムおよび地域などに応じて様々な株に分けることができる。例えば、中国および東南アジアでは、北京型ファミリーの結核菌が流行している。本発明に使用される株は、結核菌の標準株、すなわちＨ３７Ｒｖ株である。
【００５２】
本発明で用いられる「センダイウイルスベクター」という用語とは、センダイウイルスに由来し、遺伝子を宿主細胞に導入するために使用されるベクターを言う。センダイウイルスはリボ核タンパク質（ＲＮＰ）であっても良く、感染力を持つウイルス粒子であっても良い。ここで、「感染性」とは、組換えセンダイウイルスベクターが細胞への接着能及び膜融合能によって、ベクター内の遺伝子を、ベクターが接着される細胞に導入する能力を言う。本発明のセンダイウイルスベクターは、抗原となる結核菌タンパク質をコードする外来遺伝子を発現することができるように保持する。センダイウイルスベクターは、野生型ベクターと同じ複製能力を有しても良く、また遺伝子変異によって弱くなっても良い。また、本発明のセンダイウイルスベクターは、複製能力を有さない欠損型ベクターであっても良い。「複製能力」とは、感染細胞内でベクターが複製され、感染性ウイルス粒子が産生されることを指す。
【００５３】
本発明は、結核菌タンパク質の遺伝子またはその一部を含むセンダイウイルスベクターのワクチンを提供する。センダイウイルスにコードされる結核菌タンパク質としては、抗原性を有する限り、限定されない。結核菌タンパク質としては、結核菌の構造タンパク質、調節タンパク質およびアクセサリータンパク質が含まれる。これらのタンパク質またはそれらのポリペプチドの一部などは、ワクチンの製造に使用することができる。本発明のワクチンは、上記タンパク質またはその一部を発現するセンダイ発現ベクターを構築することにより製造することができる。これらのタンパク質は、単独でも良く、複数の組み合わせても良い。本発明においては、結核菌の構造蛋白質を発現するＳｅＶを用いることが好ましい。
【００５４】
本発明者らは、鼻腔内接種されたマカクサルにおける組換えＳｅＶベクターの遺伝子発現は、接種後１週間以内にピークに達し、且つ少なくとも１３日まで持続することをすでに見出した。また、反復投与は発現を持続することができる。これらの特徴は、組換えＳｅＶベクターを用いて接種する場合、早急かつ持続的な治療効果を得るという利点がある。
【００５５】
安全性の観点から、ＳｅＶベクターはヒトへの臨床適用に好適に用いられうる可能性が示唆される。第一に、多くのベクター場合、外来遺伝子の発現は、導入したＤＮＡが核に入ることを必要とし、それは遺伝子導入の成功率を影響する主要な障害である。しかしながら、センダイウイルスの場合、外来遺伝子の発現は、細胞質において細胞性チューブリンおよび自身が持つＲＮＡポリメラーゼ（Ｌタンパク質）の両方によって駆動される。これは、ＳｅＶが宿主細胞のゲノムと相互作用しないことを示し、癌化などの安全性の問題が生じないと考えられる。第二に、ＳｅＶは齧歯類にとって病原性で肺炎を引き起こすことが知られているが、ヒトには病原性ではない。これは、野生型ＳｅＶの鼻腔内投与によって非ヒト霊長類に厳重な有害作用を示さないという報告によっても支持されている（Ｂｕｒｗｉｔｚ  Ｊ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ，１９９７，Ｖｏｌ．１５，ｐ．５３３−５４０）。ＳｅＶのこれらの特徴は、ヒトに適用される場合、ＳｅＶベクターが非常に安全であることを示唆し、且つ抗原タンパク質を発現できるベクターの有望な１つとなることを支持するものである。実際に、本発明では、ＳｅＶを接種されたマウスは明確な病理学的症状が見られず、体重の有意な減少も観察されなかった。本発明のワクチンは、特に結核菌を標的とする接種に好ましく用いられる。言い換えれば、本発明のワクチンの接種は、結核菌に対する免疫を誘導して、結核菌の感染および／または増殖を防止することができる。本発明のワクチンは、結核菌感染前の予防および結核菌感染後の治療に使用されることが好ましい。
【００５６】
本発明において、接種に用いられるＳｅＶベクターとしては特に限定されない。例えば、好適なＳｅＶベクターとしては、複製能力を有し、自立的に増殖するベクターであってもよい。例えば、一般的に野生型ＳｅＶのゲノムでは、３’ の短いリーダー領域に続き、Ｎ（ヌクレオカプシド）、Ｐ（ホスホ）、Ｍ（マトリックス）、Ｆ（フュージョン）、ＨＮ（ヘマグルチニン・ノイラミニダーゼ）およびＬ（ラージ）タンパク質をコードする６つの遺伝子が並んでおり、他端に短い５’トレイラー領域を有する。これと同様の構造を有するゲノムを設計することにより、自律複製可能なベクターを製造することができる。ゲノム内に外来遺伝子を挿入することにより、外来遺伝子を発現するベクターを製造することができる。ＳｅＶベクターのウイルス遺伝子は、野生型と異なって配置されてもよい。
【００５７】
本発明の免疫に用いられるＳｅＶベクターとしては、野生型ＳｅＶに含まれる遺伝子の一部を欠損したものであってもよい。例えば、ＳｅＶベクターを構築して遺伝子を発現させるためには、ＮＰ、Ｐ／Ｃ、およびＬ遺伝子にコードされるタンパク質が必要と考えられるため、これらのタンパク質をコードする遺伝子がＳｅＶベクターのゲノムに含まれている必要がある。ＳｅＶベクターを構築する場合、例えばＭ、ＦおよびＨＮタンパク質などの他の遺伝子は、トランス法（Ｔｒａｎｓ：他の形態）によって供給することができる。また、これらのタンパク質をコードする遺伝子を有する発現ベクターを、ＳｅＶベクターゲノムをコードする発現ベクターとともに、宿主細胞にトランスフェクションすることにより、ＳｅＶベクターを構築することができる。また、ウイルスゲノムをコードする発現ベクターを、これらのタンパク質をコードする遺伝子を有する宿主細胞に導入し、宿主細胞から提供されるタンパク質を用いてＳｅＶベクターを再構築することができる。核酸の導入における活性が天然型のそれと同等かそれ以上ならば、これらのタンパク質のアミノ酸配列は、ウイルス自体の配列と異なっていても良く、変異を導入したり、あるいは他のウイルスの相同遺伝子で代用してもよい。
【００５８】
ＳｅＶベクターをＲＮＰとして調製する場合、ＳｅＶベクターの細胞間伝達に必要であると考えられる。Ｍ、Ｆ及びＨＮ遺伝子にコードされるタンパク質は必要ない。ＲＮＰに含まれるゲノムに、Ｍ、Ｆ、ＨＮ遺伝子が含まれていれば、宿主細胞に導入された時に、これらの遺伝子産物が生産され、感染性ウイルス粒子が形成される。感染性ウイルスを産生するＲＮＰベクターとしては、Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよびＬ遺伝子をコードするゲノムＲＮＡと、Ｎタンパク質、Ｐタンパク質およびＬタンパク質とを含むＲＮＰであっても良い。このようなＲＮＰを細胞に導入すると、Ｎタンパク質、Ｐタンパク質およびＬタンパク質の働きにより、ウイルスゲノムが発現、複製され、その結果、感染性ウイルスベクターが増幅する。
【００５９】
ＲＮＰを細胞に導入するには、リポフェクトアミン試薬、ポリカチオニックリポソームなどと共に複合体を形成させて導入することが可能である。具体的に、ＤＯＴＭＡ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）、Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ（ＱＩＡＧＥＮ＃３０１３０５）、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＰＥ、ＤＯＳＰＥＲ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ＃１８１１１６９）などの様々なトランスフェクション試薬を使用することができる。クロロキンを添加してエンドソーム中での分解を防ぐことができる（Ｃａｌｏｓ  Ｍ．Ｐ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｐｏｒｔ，１９８３，Ｖｏｌ．８０，ｐ．３０１５）。複製型ウイルスの場合、産生されたウイルスは、培養細胞、ニワトリ胚または生物個体（例えば、マウスなどの哺乳動物）に再感染させることによって増殖または継代することができる。
【００６０】
逆に、Ｍ、Ｆおよび／またはＨＮ遺伝子が欠損したＳｅＶベクターも、本発明に使用することができる。これらのベクターは、欠損している遺伝子産物を外来的に供給することにより再構築される。このようなベクターは、野生型ウイルスと同様に、依然として宿主細胞に接着して、細胞融合を起こすが、細胞に導入されたベクターのゲノムには上記のいずれかの遺伝子欠損しているため、最初と同じような感染力を持つ娘ウイルス粒子は形成されない。したがって、これらのベクターは、１回限りの遺伝子導入能を有する非常に安全なウイルスベクターとして使用することができる。ゲノムから欠損させる遺伝子としては、Ｆおよび／またはＨＮ遺伝子であっても良い。Ｆ遺伝子が欠損した組換えパラミクソウイルスのゲノムをコードする発現プラスミド、Ｆタンパク質の発現ベクターおよびＮＰ、Ｐ／Ｃ、Ｌタンパク質の発現ベクターを、宿主細胞にトランスフェクションすることにより、ウイルスベクターを再構築することができる（国際公開番号ＷＯ００／７００５５およびＷＯ００／７００７０参照）。また、Ｆ遺伝子がゲノムに組み込まれた宿主細胞を用いて製造することもできる。これらのタンパク質を外来的に供給する場合、それらのアミノ酸配列は野生型とは異なっていても良く、遺伝子の導入における活性が天然型のそれと同等かそれ以上ならば、変異を導入したり、あるいは他のウイルスの相同遺伝子で代用してもよい。
【００６１】
ウイルスのエンベロープタンパク質に、ウイルスゲノム由来のエンベロープタンパク質とは異なるタンパク質を含んでもよい。これらのタンパク質に特に制限はない。例えば、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）のＧタンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）などの他のウイルスのエンベロープタンパク質を含むことができる。したがって、本発明のワクチンを構成するＳｅＶベクターとしては、ゲノムが由来するウイルス以外のウイルスに由来するエンベロープタンパク質を含むシュードタイプウイルスベクターが含まれる。
【００６２】
また、本発明のワクチンに用いられるＳｅＶベクターは、そのエンベロープ表面に特定の細胞を標的とする接着タンパク質、リガンドまたは受容体などのタンパク質を有していてもよく、或いは、細胞外領域にこれらのタンパク質を有し、且つ細胞内領域にウイルスのエンベロープタンパク質に由来するポリペプチドを有する、キメラタンパク質を含有する。これにより、特定の組織を標的とするベクターを作製することができる。これらのタンパク質は、ウイルスゲノムにコードされるか、またはウイルスの再構築の際に、ウイルスゲノム以外の遺伝子（例えば、他の発現ベクター或いは宿主細胞の染色体の遺伝子）の発現により供給されてもよい。
【００６３】
ＳｅＶタンパク質に対する抗原性を低下させるために、またはＲＮＡの転写効率および複製効率を高めるために、本発明のワクチンに用いられるＳｅＶベクターに含まれるウイルス遺伝子を改変することができる。具体的に、転写または複製の機能を増強するために、複製因子であるＮＰ遺伝子、Ｐ／Ｃ遺伝子およびＬ遺伝子の少なくとも１つの遺伝子を改変することができる。また、構造タンパク質の１つであるＨＮタンパク質は、ヘマグルチニン（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）活性およびノイラミニダーゼ（ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ）活性を有し、前者の活性を弱めると、血中のウイルスの安定性を高めることが期待でき、後者の活動が変化すると、ウイルスの感染力を調整することが期待できる。また、膜融合に関わるＦタンパク質を改変すると、膜融合リポソームの融合能力を調整することが期待できる。また、細胞表面の抗原分子となりうるＦタンパク質およびＨＮタンパク質のエピトープを解析し、それらを用いて抗原発現能を低下させたＳｅＶを調製することも期待できる。
【００６４】
また、本発明のワクチンに用いられるＳｅＶは、アクセサリー遺伝子が欠損したものであってよい。例えば、ＳｅＶのアクセサリー遺伝子の１つであるＶ遺伝子をノックアウトすることにより、培養細胞において遺伝子発現および複製に影響しないが、マウスに対するＳｅＶの病原性を大幅に減少させる（Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．７１，ｐ．７２６６−７２７２；Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，１９９７，ＥＭＢＯ  Ｊ．Ｖｏｌ．１６，ｐ．５７８−５８７；Ｃｕｒｒａｎ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，ＷＯ０１／０４２７２，ＥＰ１０６７１７９）。このような弱毒化ベクターは、本発明のワクチンを構成するベクターとして特に好ましい。
【００６５】
本発明のワクチンに使用されるウイルスベクターは、そのゲノムＲＮＡにおいて結核菌タンパク質またはこのタンパク質の一部をコードする。前記ＳｅＶベクターのゲノムに外来遺伝子を挿入することにより、外来遺伝子を発現する組換えＳｅＶベクターを得ることができる。外来遺伝子としては、結核菌タンパク質またはこのタンパク質の一部をコードする遺伝子断片であっても良い。このような遺伝子断片は、結核菌タンパク質をコードする天然由来の遺伝子断片であっても良く、また天然型蛋白質と少なくとも部分的に同等の抗原性を有する蛋白質をコードする限り、欠損、置換、或いは挿入等により天然タンパク質をプロセシングして得られるタンパク質をコードする遺伝子であっても良い。
【００６６】
ヒト型結核菌タンパク質とは、結核菌に含まれるタンパク質を指す。研究により、Ｈ３７Ｒｖ株の免疫優性抗原はＡｇ８５ＡおよびＡｇ８５Ｂなどであることが示されている。本発明では、これらのタンパク質のいずれか１つまたはその一部、或いはそれらの混合物を発現するＳｅＶベクターを用いることが好ましい。本発明者らは、これらのタンパク質（プロセシングを受けた蛋白質および受けていない蛋白質を含む）のいずれかの全長またはその一部、或いはそれらの組み合わせを発現するように、ＳｅＶベクターを構築した。タンパク質の一部として、抗原の活性を有する限り、その長さおよび部位が限定されない。例えば、１つ以上のエピトープを含むポリペプチドであってもよい。このようなポリペプチドは、通常、結核菌タンパク質のアミノ酸配列において、連続した少なくとも３個〜数個のアミノ酸を含み、結核菌タンパク質のアミノ酸配列において、約７〜約１５のアミノ酸、例えば８、９、１０、１２または１４のアミノ酸を含むことが好ましい。
【００６７】
本発明のワクチンは少なくとも１つの結核菌のタンパク質を使用する。本発明によれば、Ａｇ８５抗原のみを発現しても効果的な免疫応答を誘導することが可能である。また、複数のタイプのタンパク質を抗原として使用することにより、より高い免疫性が得られる。
【００６８】
また、ワクチンは結核ウイルス由来の１つのタンパク質を用いることができるが、複数のウイルス由来の菌体タンパク質を抗原として用いれば、より広い結核ウイルスに対する免疫を得ることができる。抗原として複数のウイルスを用いる場合、それらの組み合わせは限定されない。例えば、種々の単離されたウイルス由来の遺伝子を用いてワクチンを製造することができる。複数の結核菌遺伝子は、それぞれ別々のＳｅＶベクターゲノムに組み込んでＳｅＶを構築し、それらの組み合わせを使用したり、或いは、複数の遺伝子を同じＳｅＶベクターゲノムに組み込んでこれらの遺伝子を発現させることができる。
【００６９】
結核菌タンパク質を発現するＳｅＶを構築するためには、例えば、標的の結核菌タンパク質をコードする遺伝子を、ＳｅＶゲノムをコードするＤＮＡ（ＳｅＶベクターＤＮＡ）に挿入することができる。ＳｅＶベクターＤＮＡに外来遺伝子を導入する際に、６の倍数の塩基数を有する配列を、転写終結（Ｅ）配列と転写開始（Ｓ）配列との間に挿入する必要がある（Ｃａｌａｉｎ  Ｐ．ａｎｄ  Ｒｏｕｘ  Ｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１９９３，６７（８）、ｐ．４８２２−４８３０）。外来遺伝子は、各ＳｅＶ遺伝子（ＮＰ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよびＬ遺伝子）の上流および／または下流に挿入しても良い。上流と下流の遺伝子の発現を妨害しないようにするために、ＥＩＳ配列を各遺伝子の間に存在するように、外来遺伝子の上流または下流にＥＩＳ配列（転写終結配列−介在配列−転写開始配列）或いはその一部を挿入することができる。あるいは、外来遺伝子は、ＩＲＥＳを挿入することによって発現させることができる。
【００７０】
挿入された外来遺伝子の発現量は、これらの遺伝子の上流に付加する転写開始配列のタイプによって調整することができる。また、挿入部位および遺伝子の前後の配列によっても調整することができる。例えば、ＳｅＶでは、挿入部位がウイルスゲノムのネガティブ鎖ＲＮＡの３’末端（野生型ウイルスゲノムのＮＰ遺伝子に近いほど）に近いほど、挿入された遺伝子の発現量が高い。外来遺伝子の高い発現を得るためには、外来遺伝子を、ＮＰ遺伝子の上流（ネガティブ鎖の３’側）またはＮＰ遺伝子とＰ遺伝子との間など、ネガティブ鎖ゲノムにおいて上流領域に挿入することが好ましい。逆に、挿入部位がネガティブ鎖ＲＮＡの５’末端に近いほど（野生型ウイルスゲノムのＬ遺伝子に近いほど）、挿入された遺伝子の発現量が低くなる。外来遺伝子の発現を減少させるために、それを、ネガティブ鎖の最も５’末端、すなわち野生型ウイルスゲノムのＬ遺伝子の下流（ネガティブ鎖のＬ遺伝子の５’側領域）またはＬ遺伝子の上流（ネガティブ鎖のＬ遺伝子の３’側領域）に挿入することができる。これより分かるように、外来遺伝子の所望の発現量を得るために、外来遺伝子の挿入部位を適切に調整するか、または前後のウイルスタンパク質をコードする遺伝子の組み合わせにより調整できる。例えば、高力価ウイルスベクターの投与による導入遺伝子の高発現が毒性を示す場合は、適用されるウイルス力価を制御することができる他、外来遺伝子の挿入部位をネガティブ鎖の５’末端領域に近接するように設計したり、効率の低い転写開始配列を使用することにより、制御することができる。
【００７１】
一般に、、細胞毒性を示さないので、抗原タンパク質の高発現は、免疫性を得ることに有利である。したがって、抗原性タンパク質をコードする遺伝子は効率の高い転写開始配列に連結し、ネガティブ鎖ゲノムの３’末端の近傍に挿入することが好ましい。好ましいベクターの例として、結核菌タンパク質が、パラミクソウイルスベクターのネガティブ鎖ゲノムにおいて、パラミクソウイルスのウイルスタンパク質のいずれよりも３’側にあるベクターが挙げられる。例えば、Ｎ遺伝子の上流（ネガティブ鎖の３’側）に抗原遺伝子が挿入されたベクターが好ましい。或いはＮ遺伝子のすぐ下流に挿入してもよい。
【００７２】
外来遺伝子を容易に挿入するために、挿入部位にクローニングサイトを設計することができる。例えば、クローニングサイトは制限酵素の認識配列であってもよい。外来遺伝子を、ウイルスベクターＤＮＡの制限部位に挿入することができる。また、クローニングサイトは複数の制限酵素の認識配列を含むマルチクローニングサイトであっても良い。本発明のワクチンに用いられるベクターは、上記の結核菌タンパク質が挿入された部位以外の部位に、他の外来遺伝子を含んでいても良い。このような外来遺伝子としては制限はなく、免疫誘導に関与するサイトカインやケモカインの遺伝子であっても良く、その他の遺伝子であっても良い。
【００７３】
外来遺伝子を含む組換えセンダイウイルスベクターは、Ｈａｓａｎ，Ｍ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．７８：ｐ．２８１３−２８２０，１９９７；Ｙｕ  Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｃｅｌｌｓ，１９９７，２，ｐ．４５７−４６６の記載により、下記の方法で構築することができる。
【００７４】
まず、所望の外来遺伝子のｃＤＮＡ配列を含むＤＮＡ試料を調製する。度が２５ｎｇ／ｍｌ以上で、電気泳動的に単一のプラスミドと確認できるＤＮＡ試料が好ましい。以下の記載は、ウイルスゲノムをコードするＤＮＡのＮｏｔＩ部位に外来遺伝子を挿入する例である。挿入されるｃＤＮＡ配列にＮｏｔＩ部位が含まれる場合、予め部位特異的変異導入法により、コードする蛋白質のアミノ酸配列を変化させないように塩基配列を改変し、この部位を除去する必要がある。この試料から所望のＤＮＡ断片をＰＣＲにより増幅回収する。増幅された断片は両端ともにＮｏｔＩ部位を持たせ、且つ一端に１つのセンダイウイルスの転写終結配列（Ｅ）、介在配列（Ｉ）及び転写開始配列（Ｓ）（ＥＩＳ配列）のコピーを付加するために、ＮｏｔＩ制限部位、転写終結配列（Ｅ）、介在配列（Ｉ）、転写開始配列（Ｓ）、及び目的遺伝子の一部の配列を含むフォワード側プライマー（センス鎖）とリバース側プライマー（アンチセンス鎖）のプライマー対を合成する。
【００７５】
例えば、フォワード側合成ＤＮＡ配列は、ＮｏｔＩによる切断を確保するために、５’末端に任意の２つ以上のヌクレオチド（好ましくは、ＧＣＧ及びＧＣＣなどのＮｏｔＩ認識部位由来の配列が含まれない４塩基、さらに好ましくはＡＣＴＴ）を含む。この配列の３’末端に、ＮｏｔＩ認識配列ＧＣＧＧＣＣＧＣを付加する。また、３’末端に任意の９または９に６の倍数を加えた数のヌクレオチドがスペーサーとして付加される。また、３’末端に、所望のｃＤＮＡの開始コドンＡＴＧからＯＲＦの約２５ヌクレオチドに相当する配列が付加される。フォワード側合成オリゴＤＮＡの３’末端は、所望のｃＤＮＡの約２５ヌクレオチドを含み、且つ最終のヌクレオチドはＧまたはＣであることが好ましい。
【００７６】
リバース側合成ＤＮＡ配列は、５’末端に任意の２つ以上のヌクレオチドを（好ましくは、ＧＣＧおよびＧＣＣなどのＮｏｔＩ認識部位由来の配列が含まれない４塩基、さらに好ましくはＡＣＴＴ）含む。この配列の３’末端に、ＮｏｔＩ認識配列ＧＣＧＧＣＣＧＣを付加する。さらに、３’末端にスペーサーオリゴＤＮＡを付加してプライマーの長さを調整する。下記のように、ＮｏｔＩ認識配列ＧＣＧＧＣＣＧＣ、ｃＤＮＡの相補鎖配列、およびセンダイウイルスゲノム由来のＥＩＳ配列を含むオリゴＤＮＡの長さは、そのヌクレオチドの合計が６の倍数になるように設計する（いわゆる「６のルール」；Ｋｏｌａｋｏｆｓｋｉ  Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９８，Ｖｏｌ．７２，ｐ．８９１〜８９９；Ｃａｌａｉｎ  Ｐ．ａｎｄ  Ｒｏｕｘ  Ｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９３，ｖｏｌ．６７：ｐ．４８２２−４８３０）。さらに付加された配列の３’末端に、センダイウイルスのＳ配列の相補鎖配列、好ましくは５’−ＣＴＴＴＣＡＣＣＣＴ−３’、Ｉ配列の相補鎖配列、好ましくは５’−ＡＡＧ−３’、Ｅ配列の相補鎖配列、好ましくは５’−ＴＴＴＴＴＣＴＴＡＣＴＡＣＧＧ−３’を付加する。さらに、３’末端に、所望のｃＤＮＡの終止コドンから逆に数えて約２５ヌクレオチドの相補鎖の最後のヌクレオチドがＧまたはＣになるように配列を付加する。これにより、リバース側合成オリゴＤＮＡの３’末端とする。
【００７７】
ＰＣＲは、例えばＥｘＴａｑポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ）を用いる通常の方法を用いることができる。Ｖｅｎｔポリメラーゼ（ＮＥＢ）を使用し、増幅したＤＮＡ断片はＮｏｔＩで消化した後、プラスミドベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのＮｏｔＩ部位に挿入することが好ましい。自動ＤＮＡシーケンサーにより、得られたＰＣＲ産物の塩基配列を測定する。正しい配列を有するプラスミドを選択する。ＮｏｔＩ消化により、挿入断片をプラスミドから切り出し、パラミクソウイルスゲノムｃＤＮＡを含むプラスミドのＮｏｔＩ部位にサブクローニングする。ＰＣＲ産物は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミドを介さずに後述のプラスミドのＮｏｔＩ部位に、直接クローニングして、組換えセンダイウイルスｃＤＮＡを得ることもできる。
【００７８】
例えば、文献（Ｙｕ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．２：ｐ．４５７−４６６，１９９７；  Ｈａｓａｎ  Ｍ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９７，Ｖｏｌ．７８：ｐ．２８１３−２８２０）に記載した方法により、組換えセンダイウイルスゲノムのｃＤＮＡを構築することができる。例えば、ＮｏｔＩ部位を有する１８ｂｐのスペーサー配列（５’−（Ｇ）−ＣＧＧＣＣＧＣＡＧＡＴＣＴＴＣＡＣＧ−３’）を、クローニングされたセンダイウイルスゲノムｃＤＮＡ（ｐＳｅＶ（＋））のリーダー配列とＮタンパク質をコードする配列の５’末端との間の隣接遺伝子座に挿入し、デルタ肝炎ウイルスのアンチセンス鎖に由来する自己開裂リボザイム部位を含むプラスミドｐＳｅＶ１８  ＊  ｂ（＋）を得る（Ｈａｓａｎ，Ｍ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９７，Ｖｏｌ．７８：ｐ．２８１３−２８２０）。外来遺伝子断片をｐＳｅＶ１８  ＊  ｂ（＋）のＮｏｔＩ部位に挿入し、所望の外来遺伝子が組込まれた組換えセンダイウイルスのｃＤＮＡを得る。
【００７９】
このように作製した組換えパラミクソウイルスベクターＤＮＡをインビトロまたは細胞内で転写し、Ｌ、ＰおよびＮＰタンパク質の存在下でＲＮＰを再構築して、ＲＮＰを含有するウイルスベクターを生成することができる。本発明は、結核菌タンパク質をコードするパラミクソウイルスベクターを含むワクチンの製造方法を提供し、この方法は、ウイルスのゲノムＤＮＡを転写させる工程を含む。また、本発明は、このＤＮＡから産生される、本発明のワクチンの成分として用いるパラミクソウイルスベクター製造用ＤＮＡを提供する。本発明は、本発明のワクチンの成分となるパラミクソウイルスベクターを製造するための、このベクターのゲノムをコードするＤＮＡの使用に関する。ウイルスは、既知の方法によってウイルスベクターから再構築することができる（ＷＯ９７／１６５３９；ＷＯ９７／１６５３８；Ｄｕｒｂｉｎ  Ａ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１９９７，Ｖｏｌ．２３５：ｐ．３２３−３３２；Ｗｈｅｌａｎ  Ｓ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｏｃｅｓｓ、１９９５，Ｖｏｌ．９２，ｐ．８３８８−８３９２；Ｓｃｈｎｅｌｌ  Ｍ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．  １９９４，Ｖｏｌ．１３，ｐ．４１９５〜４２０３；  Ｒａｄｅｃｋｅ  Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．Ｖｏｌ．１４，ｐ．５７７３−５７８４；Ｌａｗｓｏｎ  Ｎ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｏｃｅｓｓ，１９９５，Ｖｏｌ．９２，ｐ．４４７７−４４８１；Ｇａｒｃｉｎ  Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１９９５，Ｖｏｌ．１４，ｐ．６０８７−６０９４；Ｋａｔｏ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｃｅｌｌｓ，１９９６，Ｖｏｌ．１，ｐ．５６９−５７９；Ｂａｒｏｎ  Ｍ．Ｄ．  ａｎｄ  Ｂａｒｒｅｔｔ  Ｔ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９７，Ｖｏｌ．７１，ｐ．１２６５−１２７１；Ｂｒｉｄｇｅｎ  Ａ．ａｎｄ  Ｅｌｌｉｏｔｔ  Ｒ．Ｍ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｐｏｒｔ  １９９６，ｖｏｌ．９３：ｐ．１５４００−１５４０４）。これらの方法によれば、パラインフルエンザ、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス、麻疹ウイルス、牛疫ウイルスおよびセンダイウイルスなどを含むパラミクソウイルスベクターを、ＤＮＡから再構成させることができる。ウイルスベクターＤＮＡの中にＦ、ＨＮおよび／またはＭ遺伝子を欠失させた場合、そのままでは感染性を有するウイルス粒子を形成することができない。これら欠失させた遺伝子、或いは他のウイルス由来のエンベロープタンパク質をコードする遺伝子を、宿主細胞に導入し発現させることにより、感染性ウイルス粒子を形成させることが可能である。
【００８０】
ベクターＤＮＡを細胞内に導入する方法には、（１）目的の細胞に組み込むことができるＤＮＡ沈殿物を形成する方法、（２）目的の細胞による取りこみに適し、かつ細胞毒性の少ない陽電荷特性を持つＤＮＡを含む複合体を作る方法、及び（３）目的の細胞膜に、ＤＮＡ分子が通り抜けられるだけに十分な穴を電気パルスによって瞬間的に開ける方法などがある。
【００８１】
（２）としては、例えばＤＯＴＭＡ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）、Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ（ＱＩＡＧＥＮ＃３０１３０５）、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＰＥ、ＤＯＳＰＥＲ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ＃１８１１１６９）などの種々のトランスフェクション試薬を使用することができる。方法（１）において、リン酸カルシウムを用いてトランスフェクションを行うことができる。この方法では、細胞に入ったＤＮＡは貪食小胞に取り込まれるが、核内にも十分な量のＤＮＡが存在することが知られている（Ｇｒａｈｍ  Ｆ．Ｌ．ａｎｄ  ｖａｎ  Ｄｅｒ  Ｅｂ  Ｊ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９７３，５２，４５６；Ｗｉｇｌｅｒ  Ｍ．  ａｎｄ  Ｓｉｌｖｅｒｓｔｅｉｎ  Ｓ．，Ｃｅｌｌ，１９７７，Ｖｏｌ．１１，ｐ．２２３）。ＣｈｅｎおよびＯｋａｙａｍａは、ランスファー技術を最適化し、（１）細胞および沈殿の培養条件は、２〜４％のＣＯ２、３５℃で１５〜２４時間であること、（２）環状ＤＮＡは線状ＤＮＡよりも活性が高いこと；及び（３）混合溶液中のＤＮＡ濃度が２０〜３０ｍｇ／ｍｌである場合、最適な沈殿が得られること、を報告した（Ｃｈｅｎ  Ｃ．ａｎｄ  Ｏｋａｙａｍａ  Ｈ．，Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９８７，Ｖｏｌ．７、ｐ．２７４５）。方法（２）は一過性トランスフェクションに適している。以前の方法は、ＤＥＡＥ−デキストラン（Ｓｉｇｍａ＃Ｄ−９８８５  Ｍ．Ｗ．  ５×１０５）の溶液とＤＮＡを所望の濃度比で混合してトランスフェクションを行う。ほとんどの複合体は核内で分解されるので、クロロキンの添加によりトランスフェクションの効率を高めることができる（Ｃａｌｏｓ  Ｍ．Ｐ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９８３，Ｖｏｌ．８０，ｐ．３０１５）。方法（３）は電気穿孔法と呼ばれ、いずれの種類の細胞でも使えるので、方法（１）や（２）に比べて広い適用範囲を有する。パルス電流の持続時間、パルスの形態、電界（電極間のギャップ、電圧）の強さ、バッファーの導電率、ＤＮＡ濃度および細胞密度の最適条件下で、効率が最大化される。
【００８２】
前記の３つの方法において、方法（２）は、その操作が簡便で大量の細胞を用いて多数の検体を検討することができるため、ベクターを再構成する際に細胞にＤＮＡを導入するのに適する。Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔトランスフェクション試薬（ＱＩＡＧＥＮ、＃３０１３０５）或いはＤＯＳＰＥＲリポフェクトアミン試薬（Ｂｏｅｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ＃１８１１１６９）を使用することが好ましい。
【００８３】
具体的に、ｃＤＮＡからの再構築は次のようにして行うことができる。
【００８４】
２４穴−６穴のプラスチックプレート或いは１００ｍｍのペトリ皿上で、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）と抗生物質（１００単位／ｍｌペニシリンＧおよび１００ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン）を含む最小必須培地（ＭＥＭ）の中に、サル腎由来細胞系ＬＬＣ−ＭＫ２を、７０〜８０％コンフルエントになるまでに培養する。次いで、１ｍｇ／ｍｌのソラーレン存在下ＵＶ照射を２０分間で不活性化した、Ｔ７ポリメラーゼを発現するの組換えワクシニアウイルスｖＴＦ７−３（Ｆｕｅｒｓｔ  Ｔ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｏｃｅｓｓ，１９８６，Ｖｏｌ．８３，ｐ．８１２２−８１２６，Ｋａｔｏ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｃｅｌｌｓ，１９９６，Ｖｏｌ．１，ｐ．５６９−５７９）を２ｐｆｕ／細胞でを感染させる。ソラーレンの量及びＵＶ照射時間は、適切に調整することができる。感染１時間後に、例えば、Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、２〜６０ｍｇ、より好ましくは３〜５ｍｇの組換えセンダイウイルスｃＤＮＡ、およびセンダイウイルス全長ゲノムの生成に必要なトランスに作用するウイルスタンパク質を発現するプラスミド（例えば、２４〜０．５ｍｇのｐＧＥＭ−Ｎ、１２〜０．２５ｍｇのｐＧＥＭ−Ｐ、２４〜０．５ｍｇのｐＧＥＭ−Ｌ、或いは、より好ましくは１ｍｇのｐＧＥＭ−Ｎ、０．５ｍｇのｐＧＥＭ−Ｐ、および１ｍｇのｐＧＥＭ−Ｌ）（Ｋａｔｏ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｃｅｌｌｓ，１９９６，Ｖｏｌ．１，ｐ．５６９−５７９）を、細胞にトランスフェクションする。トランスフェクションを行った細胞は、必要に応じて１００ｍｇ／ｍｌのリファンピシン（Ｓｉｇｍａ）およびシトシンアラビノシド（ＡｒａＣ）（Ｓｉｇｍａ）を含む、血清を含まないＭＥＭ中に培養し、より好ましくは４０ｍｇ／ｍｌのシトシンアラビノシドのみを含むＭＥＭ中に培養する。ワクシニアウイルスによる細胞毒性を最少にとどめ、ウイルスの回収率を最大にするように必要に応じて薬物の濃度を最適に調整する（Ｋａｔｏ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｃｅｌｌ，１９９６，Ｖｏｌ．１：ｐ．５６９−５７９）。トランスフェクションから４８〜７２時間細胞培養した後、細胞を回収し、凍結融解を３回繰り返して細胞を破砕して、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞にトランスフェクションする。培養３〜７日後に培養液を回収する。エンベロープタンパク質をコードする遺伝子を欠損した複製能を持たないウイルスベクターを再構築させるために、エンベロープタンパク質を発現するＬＬＣ−ＭＫ２細胞にベクターをトランスフェクションするか、またはエンベロープタンパク質の発現プラスミドを共にトランスフェクションしてもよい。また、トランスフェクションを行った細胞にエンベロープタンパク質を発現するＬＬＣ−ＭＫ２細胞に重層して培養することによって欠損型ウイルスベクターを増幅することもできる（ＷＯ００／７００５５およびＷＯ  ００７００７０）。培養液中のウイルス力価は、ヘマグルチニンの活性（ＨＡ）を測定することにより確認することができる。また、ＨＡは、「ｅｎｄｏ−ｐｏｉｎｔ希釈法」（Ｋａｔｏ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｃｅｌｌｓ，１９９６，Ｖｏｌ．１，ｐ．５６９−５７９��Ｙｏｎｅｍｉｔｓｕ  Ｙ．ａｎｄ  Ｋａｎｅｄａ  Ｙ．，Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｃｏａｇｕｌａｎｓ−Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  Ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ  Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｂａｋｅｒ  Ａ．Ｈ．，Ｈｕｍａｎａ，１９９９，ｐ．２９５−３０６）により確認することができる。混入（残存）し得るｖＴＦ７−３は、得られた尿膜（ａｌｌａｎｔｏｉｃ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）試料を適切に希釈（例えば、１０６倍）し、卵で再増幅することによりを除去し得る。再増幅は、３回以上繰り返しても良い。得られたウイルスは−８０℃で保存することができる。
【００８５】
ウイルスベクターが細胞内で再構築できれる限り、構築に用いる宿主細胞は、いかなる特定の細胞タイプに限定されない。宿主細胞は、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞、サル腎由来のＣＶ−１細胞、ハムスター腎由来のＢＨＫ細胞などの培養細胞系を含んでも良く、またはヒト由来の細胞を使用しても良い。大量のセンダイウイルスベクターを得るために、上記の宿主細胞から得られたウイルスベクターを、胚となった鶏卵を感染させてベクターを増幅することができる。鶏卵によってウイルスベクターを作製する方法はすでに開発されている（神経科学研究の先端技術プロトコールＩＩＩ、分子神経細胞生理学、中西ら編，厚生社、大阪、１９９３，ｐ．１５３−１７２）。具体的に、例えば、受精した鶏卵を培養器に置いて、３７〜３８℃で９〜１２日間培養して胚を成長させる。ウイルスベクターを尿膜腔に接種し、鶏卵を数日間連続培養して、ベクターを増殖させる。培養の時間などの条件は、使用する組換えセンダイウイルスの種類によより変わり得る。その後、ウイルスを含有する尿膜腔液を回収する。常法で尿膜試料からセンダイウイルスベクターを単離、精製する（Ｔａｓｈｉｒｏ  Ｍ．，Ｖｉｒｕｓ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ，ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｎａｇａｉ  ａｎｄ  Ｉｓｈｉｈａｍａ，Ｍｅｄｉｃａｌ  ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ，１９９５，ｐ．６８−７３）。
【００８６】
例えば、以下の方法により、Ｆタンパク質を欠失したセンダイウイルスベクターを構築、調製することができる（ＷＯ００／７００５５およびＷＯ００／７００７０）。
【００８７】
（１）Ｆ遺伝子を欠損したセンダイウイルスゲノムｃＤＮＡ及びＦ発現プラスミドの構築
センダイウイルス（ＳｅＶ）全長ゲノムｃＤＮＡ−ｐＳｅＶ１８（Ｈａｓａｎ  Ｍ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  １９９７，Ｖｏｌ．７８，ｐ．２８１３−２８２０）（ｐＳｅＶ１８＋ｂ（＋）はｐＳｅＶ１８（＋）ともいう）をＳｐｈＩとＫｐｎＩで消化して、得られた断片（１４６７３ｂｐ）を回収し、ｐＵＣ１８にクローニングしてプラスミドｐＵＣ１８／ＫＳとする。Ｆ欠損部位はｐＵＣ１８／ＫＳを用いて構築される。Ｆ遺伝子の欠損はＰＣＲ−ライゲーション法により行い、結果としてＦ遺伝子のＯＲＦ（１６９８ｂｐ）を除去し、配列５’−ａｔｇｃａｔｇｃｃｇｇｃａｇａｔｇａで連結してＦ遺伝子欠損ＳｅＶゲノムｃＤＮＡ（ｐＳｅＶ１８＋／ΔＦ）を構築し、ＥｃｏＴ２２１を用いて、プライマー（フォワード側：５’−ｇｔｔｇａｇｔａｃｔｇｃａａｇａｇｃ；リバース側：５’−ｔｔｔｇｃｃｇｇｃａｔｇｃａｔｇｔｔｔｃｃｃａａｇｇｇｇａｇａｇｔｔｔｔｇｃａａｃｃ）によって得られたＦ遺伝子の上流のＰＣＲ産物、及ぶプライマー（フォワード側：５’−ａｔｇｃａｔｇｃｃｇｇｃａｇａｔｇａ；リバース側：５’−ｔｇｇｇｔｇａａｔｇａｇａｇａａｔｃａｇｃ）によって得られたＦ遺伝子の下流のＰＣＲ産物を消化、連結して。そして、ＳａｃＩおよびＳａｌＩで得られたプラスミドを消化し、Ｆ遺伝子欠損部位を含む断片（４９３１ｂｐ）を回収し、ｐＵＣ１８にクローニングしてｐＵＣ１８／ｄＦＳＳを得る。ＤｒａＩＩＩでｐＵＣ１８／ｄＦＳＳを消化して断片を回収し、ｐＳｅＶ１８＋のＦ遺伝子含有ＤｒａＩＩＩ断片を置換し、連結してｐＳｅＶ１８／ΔＦを得る。外来遺伝子は、ｐＵＣ１８／ｄＦＳＳのＦ遺伝子欠損部位にあるＮｓｉＩまたはＮｇｏＭＩＶ部位に挿入することができる。このために、外来遺伝子を含む断片は、ＮｓｉＩ−ｔａｉｌｅｄプライマーおよびＮｇｏＭＩＶ−ｔａｉｌｅｄプライマーを用いて増幅することができる。
【００８８】
（２）ＳｅＶ−Ｆタンパク質を誘導発現するヘルパー細胞の作製
以下のように、センダイウイルスＦ遺伝子（ＳｅＶ−Ｆ）を発現するＣｒｅ／ｌｏｘＰ誘導発現可能なプラスミドを構築する。ＰＣＲでＳｅＶ−Ｆ遺伝子を増幅し、ｐＣＡＬＮｄＬｗプラスミド（Ａｒａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９８，Ｖｏｌ．７２，ｐ．１１１５−１１２１）のユニークサイトＳｗａＩ部位にクローニングする。このプラスミドは、Ｃｒｅ  ＤＮＡリコンビナーゼの作用により遺伝子産物の発現を誘導されるように設計して、ｐＣＡＬＮｄＬｗ／Ｆが得られる。
【００８９】
Ｆ遺伝子を欠損したゲノムから感染性ウイルス粒子を得るために、ＳｅＶ−Ｆタンパク質を発現するヘルパー細胞系が確立される。一般にＳｅＶの増殖によく用いられているサル腎臓由来細胞株ＬＬＣ−ＭＫ２細胞を使用することができる。３７℃、５％ＣＯ２で、１０％の熱処理した不動化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ペニシリンＧナトリウム５０単位／ｍｌおよびストレプトマイシン５０ｍｇ／ｍｌを添加したＭＥＭを用いて、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞を培養する。ＳｅＶ−Ｆ遺伝子産物は細胞傷害性を有するので、この遺伝子をｐＣＡＬＮｄＬｗにクローニングする。このプラスミドにおいて、Ｆ遺伝子の発現をＣｒｅ  ＤＮＡリコンビナーゼにより誘導することができる。標準方法に従って、リン酸カルシウム法（哺乳動物トランスフェクションキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））により前記ｐＣＡＬＮｄＬｗ／ＦをＬＬＣ−ＭＫ２細胞にトランスフェクションする。
【００９０】
１０ｃｍのプレートに４０％コンフルエントまでに培養したＬＬＣ−ＭＫ２細胞に１０ｍｇのｐＣＡＬＮｄＬｗ／Ｆをトランスフェクションし、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞を１０ｍｌの１０％ＦＢＳで３７℃の５％ＣＯ２下に２４時間培養する。その後、細胞を剥離し、１０ｍｌの培地に懸濁し、５枚の１０ｃｍプレートに接種し、それぞれ１枚のプレートに５ｍｌの細胞懸濁液を接種し、２枚のプレートに２ｍｌを接種し、２枚のプレートに０．２ｍｌを接種する。１０％ＦＢＳと１２００ｍｇ／ｍｌのＧ４１８（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）を含有する１０ｍｌのＭＥＭ中で１４日間培養し、二日毎に培地を交換し、安定なトランスフェクタントを選択する。クローニングリングによって培地上に増殖したＧ４１８に耐性を示す細胞を回収する。回収された各コロニーの細胞を、１０ｃｍプレート中で１００％コンフルエントになるまで培養し続ける。
【００９１】
Ｆタンパク質の発現を誘導するために、６ｃｍプレートで１００％コンフルエントになるまで細胞を培養し、斉藤らの方法（Ｓａｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｖｉｅｗ，１９９５，Ｖｏｌ．２３，ｐ．３８１６−３８２１；Ａｒａｉ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９８，Ｖｏｌ．７２，ｐ．１１１５−１１２１）により、ｍｏｉ＝３のＡｘＣＡＮＣｒｅアデノウイルスにより感染する。
【００９２】
（３）Ｆ遺伝子を欠損したＳｅＶウイルスの再構築及び増殖
以下のように、外来遺伝子が挿入されたｐＳｅＶ１８＋／ΔＦをＬＬＣ−ＭＫ２細胞にトランスフェクションする。５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈでＬＬＣ−ＭＫ２細胞を１００ｍｍのペトリ皿に接種し、２４時間培養した後に、ソラーレンおよび２０分間のＵＶ（３６５ｎｍ）で処理した、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを発現する組換えワクシニアウイルス（Ｆｕｒｅｓｔ  Ｔ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｏｃｅｓｓ，１９８６，Ｖｏｌ．８３，ｐ．８１２２〜８１２６）をさせ、室温下で１時間感染させる（ｍｏｉ＝２〜３；好ましくはｍｏｉ＝２）。ワクシニアウイルスへの紫外線照射は、１５ワットの電球を５本装備したＵＶ  ｓｔｒａｔａｋｉｎｋｅｒ  ２４００（カタログ番号４００６７６（１００Ｖ）、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ、ＵＳＡ）によって行う。細胞を３回洗浄した後、それぞれ１２ｍｇ／プレート、４ｍｇ／プレート、２ｍｇ／プレートおよび４ｍｇ／プレートの量比で、プラスミドｐＳｅＶ１８＋／ＤＦ−ＧＦＰ、ｐＧＥＭ／ＮＰ、ｐＥＧＭ／ＰおよびｐＧＥＭ／Ｌ（Ｋａｔｏ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｃｅｌｌｓ，１９９６，Ｖｏｌ．１，ｐ．５６９−５７９）をＯｐｔｉＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ）に懸濁し、ＳｕｐｅｒＦｅｃｔトランスフェクション試薬（１ｍｇＤＮＡ／５ｍｌのＳｕｐｅｒＦｅｃｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いる）と混合した後、室温下で１０分間置いて、濃度３％のＦＢＳを含むＯｐｔｉＭＥＭ  ３ｍｌに添加して、細胞に加える。培養器の中に３時間培養後、血清を含まないＭＥＭで細胞を２回洗浄し、さらに、４０ｍｇ／ｍｌのアラビノシド（ＡｒａＣ、Ｓｉｇｍａ）および７．５ｍｇ／ｍｌのトリプトン（ＧＩＢＣＯ）を含むＭＥＭの中に７０時間培養する。そして、細胞を回収し、１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌで細胞をＯｐｔｉＭＥＭ中に再懸濁する。細胞を３回凍結融解した後、リポフェクトアミン試薬ＤＯＳＰＥＲ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  ｍａｎｎｈｅｉｍ）と混合し（１０６ｃｅｌｌｓ／２５ｍｌ  ＤＯＳＰＥＲ）、室温下で１５分間放置し、前記クローニングしたＦを発現するヘルパー細胞系、例えばＬＬＣ−ＭＫ２／Ｆ７細胞にトランスフェクション（１０６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ、１２ｗｅｌｌ−ｐｌａｔｅ）し、４０ｍｇ／ｍｌのＡｒａｃと７．５ｍｇ／ｍｌのトリプトンを含む、かつ血清を含まないＭＥＭの中に培養し、上清を回収する。混入する可能性があるワクシニアウイルスは、得られた上清を希釈してＬＬＣ−ＭＫ２Ｆ７細胞に感染させ、上清を回収する操作を数回繰り返すことで除去することができる。
【００９３】
欠損したウイルスベクターを調製する際に、ウイルスゲノム中に欠損しているエンベロープ遺伝子が異なる２種のウイルスベクターを同じ細胞にトランスフェクションすることができる。この場合、それぞれで欠損するエンベロープタンパク質は、もう一方のベクターの発現により提供される。このように互いに相補しあって感染性ウルス粒子が形成され、複製サイクルがまわりウイルスベクターが複製される。言い換えると、２種以上のベクターを、エンベロープタンパク質を相補する組み合わせで接種することにより、それぞれのエンベロープ欠損ウィルスベクターの混合物を安価で大規模に製造することができる。これらのウイルスはエンベロープ遺伝子を欠損しているので、エンベロープ遺伝子を欠損しないウイルスに比べて、ゲノムは小さいため、より長い外来遺伝子を挿入することができる。また、こ元々感染性を有しないこれらのウイルスは、細胞外細胞外で希釈され共感染の維持が困難であることから、不稔化するため、環境管理上の利点がある。
【００９４】
回収されたパラミクソウイルスは実質的に純粋になるよう精製することができる。精製は、ろ過、遠心分離、カラムクロマトグラフィー精製、を含む公知の精製・分離法或いはこれらの方法の組合せを用いて行うことができる。「実質的に純粋」とは、例えば、化合物、ポリペプチド、ウイルスなどの単離した物質は、それが存在する試料中の成分として主要な割合を占めることを言う。一般的に、試料中に存在する実質的に純粋な成分は、他の成分を合わせた試料全体の５０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上を占める。この割合は、例えば重量比率（ｗ／ｗ）などで当業者が既知した方法により、算出することができる。この割合を算出する際には、溶媒、塩、添加化合物等を除去する必要がある。具体的に、パラミクソウイルスの精製方法としては、例えばセルロース硫酸または架橋ポリサッカライド硫酸エステルを用いる方法がある（特許出願公開番号：特開昭６２−３０７５２号、特開昭６２−３３８７９号、特開昭６２−３０７５３号）。また、硫酸を含む多糖類および／またはその分解物に吸着させる方法（ＷＯ９７／３２０１０）などがある。
【００９５】
回収されたＳｅＶベクターは、生組換えワクチンとして使用することができる。ここで、生ワクチンは、投与された個体の細胞において、ベクターゲノムが増幅し、抗原タンパク質を発現させ、免疫性を得ることができる組成物を言う。実施例に示すように、ＳｅＶベクターの接種は、マカクサルにおいて免疫性を良く誘導し、顕著な臨床症状を示さないので、生ワクチンとして好適に用いられる。このような生ワクチンを接種する対象には、制限がなく、例えばヒト、サル、ネコ、イヌ、ブタ、ウマ、ウシなどの免疫不全ウイルスに感染する全ての動物が含まれる。また、前記伝播力を欠くＳｅＶベクターを用いることにより、ベクターが伝播しない生ワクチンを製造することができる。
【００９６】
また、発現タンパク質がＳｅＶ粒子に組み込まれる場合、ＳｅＶベクターを不活性の粒子ワクチンとして使用することができる。或いは、発現タンパク質がＳｅＶ粒子に組み込まれる場合、ＳｅＶベクターから、発現させた免疫不全ウイルスタンパク質を分離・精製して、ワクチンとして使用することができる。ＳｅＶベクターベクターには、限られた種類の蛋白質しか含まれないため、発現ベクター等を用いて細胞内で発現させた免疫不全ウイルスタンパク質を細胞全抽出物から分離するのに比べ、はるかに容易である。例えば、免疫不全ウイルスタンパク質に対する抗体によるイムノアフィニティーカラムクロマトグラフィーなどの公知の単離技術がタンパク質の精製に使用することができる。生ワクチンおよび不活化ワクチンに比べて、精製タンパク質をワクチンとして使用することで、接種後に発生する発熱および局所反応の頻度が抑えられることが期待できる。
【００９７】
必要に応じて、ＳｅＶベクターを含むワクチンは、薬学的に許容される所望のキャリアまたは媒介体と結合することができ、或いは所望の薬学的に許容されるキャリアまたは媒介体を含むことができる。ここで、「薬学的に許容されるキャリア」とは、ベクターと共に投与することができ、ベクターによる遺伝子導入を有意に阻害しないものを言う。例えば、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）等でＳｅＶベクターを適宜希釈して組成物を調製することができる。
【００９８】
鶏卵内でＳｅＶベクターを増殖する場合、組成物には尿膜液を含んでも良い。また、ＳｅＶベクターを含有するワクチン組成物は、脱イオン水または５％のデキストラン水溶液のような媒体を含んでも良い。また、植物油、懸濁化剤、界面活性剤、安定化剤、抗生物質などを含んでも良い。また、保存剤および他の添加剤を添加してもよい。免疫原性を高めるために、サイトカイン、コレラ毒素、サルモネラ毒素などの免疫促進剤を添加することができる。また、ミョウバン、不完全フロイントアジュバント（ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ  ａｄｊｕｖａｎｔ）、ＭＦ５９（オイルエマルジョン）、ＭＴＰ−ＰＥ（ミコバクテリア細胞壁由来のムラミルトリペプチド）およびＱＳ−２１（ｓｏａｐｂａｒｋ  ｔｒｅｅ  Ｑｕｉｌａｊａ  ｓａｐｏｎａｒｉａ  由来）をワクチンと組み合わせることができる。好ましい一実施形態では、ＳｅＶベクターはアジュバントであるレバミゾールと組み合わせてワクチン組成物を調製する。
【００９９】
本出願のワクチンによる接種は、結核菌の感染の予防および／または感染後の結核菌の排除または結核菌増殖の抑制のために用いられ得る。また、結核の発症の予防または発症後の治療のために用いられ得る。これは、結核菌の感染モデルにおいて予防方法および／または治療方法の開発または評価においても有用である。
【０１００】
本発明のワクチンは、有効量のベクターを対象組織の細胞に導入するのに十分な用量で投与される。本明細書で使用する「有効量」とは、所望の免疫応答を少なくとも部分的にもたらすように対象組織の細胞に遺伝子を導入することができる用量を言う。所望の遺伝子を含む有効量のＳｅＶベクターの投与は、トランスフェクションを行った細胞から遺伝子産物が産生される。所望の遺伝子を含む有効量のＳｅＶの投与は、トランスフェクションを行った遺伝子が投与された組織または血液において有意なレベルの発現が検出されることが好ましい。「有意なレベル」とは、ＳｅＶベクターでトランスフェクションを行った遺伝子の発現（転写産物または翻訳産物の量）が検出できることを言う。しかし、トランスフェクションを行った遺伝子の発現量は、その有効レベルおよび毒性レベルを考慮して決定することが必要である。
【０１０１】
細胞にトランスフェクションを行った遺伝子の発現量は、当業者に公知の測定方法によって測定することができる。転写産物は、ノーザンハイブリダイゼーション、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮＡプロテクションアッセイなどによって検出、定量することができる。ノーザンハイブリダイゼーション、ＲＴ−ＰＣＲなどによる検出はｉｎ  ｓｉｔｕでも行い得る。翻訳産物を検出するためには、抗体を利用したウェスタンブロット、免疫沈降、ＲＩＡ、ＥＬＩＳＡ、プルダウンアッセイなどにより行うことができる。トランスフェクションを行った遺伝子の発現を容易に検出するために、発現させるタンパク質にテールタグ（ｔａｉｌ  ｔａｇ）を付加したり、ベクターにレポーター遺伝子を組み込むことができる。レポーター遺伝子は、β−ガラクトシダーゼ、ＣＡＴ、アルカリホスファターゼ、またはＧＦＰをコードする遺伝子であっても良いが、これらに限定されない。
【０１０２】
免疫応答は、抗体または免疫細胞の試験によって検出することができる。例えば、結核菌に対する体液性免疫応答は、様々な病原タンパク質との結合（ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロッティングなど）、シンシチウム形成の阻害の検出、補体結合反応、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）能、感染または細胞融合に対する中和能などの試験などの様々な公知の試験方法によって検出することができる。
【０１０３】
細胞性免疫応答は、例えば、抗原に特異的なＣＴＬ活性、ＣＴＬ産生、またはヘルパーＴ細胞の産生と活性などの試験によって検出することができる。また、細胞性免疫応答は、ＣＤ８＋Ｔ細胞などの活性化Ｔ細胞、または白血球によって産生される他のサイトカイン或いはケモカインなどを調べることにより検出することもできる。また、それは、公知のリンパ球増殖アッセイ、ＣＴＬアッセイ、抗原特異的Ｔ細胞のアッセイなどによって検出することができる。
【０１０４】
投与用ベクターの投与量は、疾患、患者の体重、年齢、性別、症状、投与の目的、ワクチンの形態及び投与方法等によって異なるが、当業者であれば適宜決定することが可能である。ワクチンに含まれるベクターの投与量は、約１０５ｐｆｕ／ｍｌ〜１０１１ｐｆｕ／ｍｌの範囲内であることが好ましく、約１０７ｐｆｕ／ｍｌ〜１０９ｐｆｕ／ｍｌであることがより好ましい。約１×１０８ｐｆｕ／ｍｌ〜５×１０８ｐｆｕ／ｍｌの範囲内の量を薬学上容認可能なキャリア中で投与することが最も好ましい。ワクチンは、経皮内、経皮下、鼻腔内、経気管支、筋肉内、静脈内、または経口で接種することができる。例えば、上気道付近のワクチン接種、すなわち、鼻腔内粘膜および上気道への接種によって、粘膜免疫を誘導することができる。従って、鼻内噴霧等等によってＳｅＶワクチンを気管内に接種することは非常に有効である。鼻腔内投与は、例えばカテーテルを介した投与などにより行うこともできる。また、Ｓｅｖが導入された細胞は、ワクチンとして接種することができる。例えば、ワクチンを接種する個体由来の細胞をＳｅＶで感染させた後、インビボ投与によって接種することもできる。
【０１０５】
また、単回投与だけでなく、例えば２回以上の接種により十分な免疫を誘導することも有効である。ヒトの場合、複数回接種の間隔は通常２〜４週間である。
【０１０６】
複数回接種の場合、ＳｅＶを含む本発明のワクチンは、複数回接種しても良いが、ＳｅＶワクチンと他のワクチンの組合せを利用することも好ましい。上記のように、ウイルスベクターを基にしたワクチン戦略の欠点の１つは、最終的に、標的抗原でなくベクターウイルスに由来する抗原に対して強い免疫応答が誘導されてしまうことである。この問題は、初回免疫と追加免疫をする時に、２つ以上の異なる種類のウイルスベクターをそれぞれ用いることにより解決することができる。したがって、上記のように、ＤＮＡワクチンを基にした初回免疫後に、ウイルスベクターを基にした追加免疫を行うことも、好ましい戦略の１つである。また、同じ組換えウイルスの再接種は、追加的な抗原特異的応答を引き起こすには不十分である可能性がある。したがって、ＳｅＶベクターを用いて初回免疫を行い、異なるウイルスベクターまたはＤＮＡワクチンを用いて追加免疫を行うことも有効である。さらに、組換えＳｅＶベクターを用いて複数の抗原を発現することは、防御効率を高めることができる。
【０１０７】
したがって、異なる種類のワクチンを用いて初回免疫−追加免疫を行う戦略において、ＳｅＶワクチンと組み合わせるワクチンに特に制限はなく、所望のワクチンを使用することができる。例えば、組換えサブユニットワクチン、ＳｅＶ以外のウイルスまたは微生物による生組換えワクチン、ＢＣＧ、ポリペプチドワクチン、ＤＮＡワクチンなどを含むが、これらに限定されない。サブユニットワクチンとは、標的結核菌の全ての抗原を有さず、１つまたは複数の選択されたタンパク質抗原のみを含むワクチンを言う。このようなワクチンは、結核菌の他の成分または感染細胞に由来する成分から少なくとも部分的に単離される。サブユニットワクチンは、結核菌タンパク質を少なくとも部分的に精製することにより調製することができる。また、サブユニットワクチンは、組換えまたは合成によって調製することもできる。生組換えワクチンの基本成分として使用される微生物の実例としては、ポックスウイルス、アデノウイルス、サルモネラ、ポリオウイルス、マイコバクテリア、インフルエンザウイルス、及びセムリキフォレストウイルス等が挙げられるが、これらに限定されない。ＳｅＶワクチンとその他のワクチンとの接種の順番は制限されない。ＳｅＶワクチンを接種した後に他のワクチンを接種しても良く、逆に、他のワクチンを接種した後にＳｅＶワクチンを接種しても良い。
【０１０８】
例えば、ＤＮＡワクチンで初回免疫した後、ＳｅＶワクチンで追加免疫を行う。このような接種は、（ａ）ＤＮＡワクチンを投与する工程、その後（ｂ）結核菌タンパク質をコードするパラミクソウイルスを投与する工程を含む方法である。ＤＮＡワクチンは、例えば、結核菌のゲノムをコードするＤＮＡを利用することができる。ＤＮＡワクチンは、例えば、筋肉内投与および／またはジーンガンによる投与により接種することができる。例えば、ＤＮＡワクチンの接種を数回行った後、本発明のＳｅＶによるワクチンを接種する。接種の間隔は通常数日間〜数週間である。
【０１０９】
ワクチンを接種できる動物としては、免疫システムを有する、且つ結核菌に感染し得るあらゆる宿主が挙げられ、ヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、トリなどを含む、全ての哺乳動物等が含まれる。本発明のワクチンを接種する動物は、霊長類であることが好ましい。ヒトに加えて、本発明のワクチンを接種できる霊長類（非ヒト霊長類）の例としては、レムール、ロリス、およびメガネザルなどの原猿；広鼻猿および狭鼻猿などの真猿；ギボン、オランウータン、ゴリラ、チンパンジー、ボノボなどの類人猿が含まれる。狭鼻猿において、特にマカクサル、具体的にはニホンザル、カニクイザル、アカゲザル、ボンネットサル、ブタオザル、ベニガオザル、アッサムサルなどを含む。非ヒト霊長類に対するワクチン接種は、ヒトの臨床適用に向けた結核ワクチンの開発および評価に特に有用である。
【０１１０】
結核菌のタンパク質をコードするＳｅＶベクターを含有するワクチンは、宿主の免疫応答を局所および全身で誘導することができる。特に、このベクターを導入した細胞は、抗原特異的免疫応答の刺激細胞として機能し、細胞性免疫応答を誘導する。本発明は、（ａ）結核菌タンパク質をコードするセンダイウイルスベクターを抗原提示細胞に導入する工程、（ｂ）抗原提示細胞とＴヘルパー細胞および細胞傷害性Ｔ細胞とを接触させる工程、を含む、結核菌タンパク質に特異的細胞性免疫応答を誘導する方法を提供する。ここで、細胞を「接触させる」とは、とは細胞の接触を許すことも含む。言い換えれば、例えば、ベクター導入細胞を血中に注入したり（体内のＴヘルパー細胞および細胞傷害性Ｔ細胞と接触することができる）；あるいは同じ培地中でベクター導入細胞とＴヘルパー細胞および細胞傷害性Ｔ細胞とを共培養する等を含む。また、抗原に特異的な「細胞性免疫応答の誘導」とは、この細胞性免疫応答の過程の少なくとも一部の誘導を意味する。例えば、抗原に特異的なＣＴＬの刺激、ＣＴＬの頻度および活性（例えば、細胞毒性）の上昇などであってよい。
【０１１１】
抗原提示細胞とは、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩが提示される細胞で、抗原タンパク質のペプチドを各分子に結合できる能力を有する細胞を言う。抗原提示細胞としては、例えば樹状細胞（ＤＣ）が挙げられる。ＭＨＣクラスＩ分子とは、抗原ペプチドに結合し、それを細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８＋）に提示する分子である。ＭＨＣクラスＩＩ分子とは、抗原ペプチドに結合し、それを細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ４＋）に提示する分子である。Ｔヘルパー細胞とは、ＭＨＣクラスＩＩ分子に提示された抗原を認識し、免疫応答の一連のシグナル伝達を組織化する、Ｔ細胞ファミリーの細胞群を指す。細胞傷害性Ｔ細胞とは、ＭＨＣクラスＩ分子に提示される抗原を認識するＴ細胞ファミリーの細胞群であり、結核菌に感染された細胞、癌細胞、移植片などの細胞を殺す細胞である（Ｘｕ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １８（４）：１６７−７２，２０００）。
【０１１２】
例えば、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）などに結核菌タンパク質をコードするＳｅＶベクターを導入した後、インビトロでＰＢＭＣと共培養することにより、ＩＦＭ−γ産生の誘導および結核菌タンパク質に特異的なＣＴＬの増殖などの細胞性免疫応答を誘導することができる。また、インビボ投与は、宿主において抗原に特異的な細胞性免疫応答を誘導することができる。
【０１１３】
細胞性免疫応答は、ＩＦＮ−γの量のアッセイ、及びＣＤ８＋ＩＦＮ−γ＋Ｔ細胞の頻度の測定により確認することができる。また、ＣＴＬの活性は、結核菌タンパク質を発現させた細胞を標的細胞として、標的細胞の溶解を測定することにより測定することができる。このような標的細胞は、上記のＳｅＶベクターの導入により作製することができる。例えば、自家ヘルペスウイルス・パピオ（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ  ｐａｐｉｏ）不死化Ｂリンパ球系（ＢＬＣ）に、結核菌タンパク質を発現するＳｅＶを導入して、ＣＴＬを含むことが予想される試料と共にインキュベートし、５１Ｃｒの放出などを指標としてＢＬＣの溶解程度を測定することができる。また、不死化細胞系Ｈ９（ヒトＴ細胞由来）等も例示することができる。
【０１１４】
本発明は、結核菌タンパク質に特異的細胞性免疫応答を誘導または検出するための、結核菌タンパク質をコードするＳｅＶベクター或いは本発明のベクターの導入細胞の使用に関する。また、本発明は、結核菌タンパク質をコードするＳｅｖベクターを導入した細胞を含む、結核菌タンパク質に特異的細胞性免疫応答の刺激細胞に関する。本発明は、結核菌タンパク質をコードするＳｅｖベクターを導入した細胞を含む、結核菌タンパク質に特異的細胞性免疫応答の標的細胞に関する。さらに、本発明は、前記刺激細胞または標的細胞において結核菌タンパク質を発現させるため、結核菌タンパク質をコードするＳｅＶベクターの使用に関する。
【０１１５】
ＳｅＶベクターにコードされる結核菌タンパク質には限定されない。上記に示したように、それらは、結核菌の構造タンパク質、調節タンパク質、アクセサリータンパク質などであっても良い。構造タンパク質としては、Ａｇ８５Ａ、Ａｇ８５Ｂ等が挙げられる。例えば、結核菌のＡｇ８５ＡタンパクをコードするＳｅＶを用いて、Ａｇ８５Ａに特異的細胞性免疫応答を誘導することができる。
【実施例】
【０１１６】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。本出願に引用された参考文献の内容すべては、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１１７】
［実施例１］Ａｇ８５ＡＢキメラ遺伝子の単離、増幅及び構築
ＰＣＲにより、ヒト型結核菌のゲノムからＡｇ８５Ａ遺伝子を増幅した。ＰＣＲ増幅後に、ＮｈｅＩ／ＢａｍＨＩでのダブルダイジェストを行い、ｐＶＡＸ１ベクターに連結した。使用されたプライマーは、この配列の５’末端に対する上流プライマーであるＰ１配列および３’末端に対する下流プライマーであるＰ２配列である（５’−ＡＴＡ  ＧＣＴ  ＡＧＣ  ＡＴＧ  ＧＴＴ  ＴＣＣ  ＣＧＧ  ＣＣＧ  ＧＧＣ  ＴＴＧ  Ｃ  −３’および５’−ＴＡＡ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＣＴＡ  ＧＧＣ  ＧＣＣ  ＣＴＧ  ＧＧＧ  ＣＧＣ  −３’）。その後、外来ＤＮＡ断片をＡｇ８５Ａ遺伝子に挿入可能な２４５〜２５０位のＫｐｎ  Ｉ制限部位または４３０〜４３５位のＡｃｃ  Ｉ制限部位を選択し、それぞれエンドヌクレアーゼＫｐｎ  ＩまたはエンドヌクレアーゼＡｃｃ  ＩでＡｇ８５Ａ遺伝子を消化して、アルカリホスファターゼで脱リン酸化を行った。次に、エンドヌクレアーゼＫｐｎ  Ｉ認識配列を有するプライマー対またはエンドヌクレアーゼＡｃｃ  Ｉ認識配列を有するプライマー対を用い、ポリメラーゼ連鎖反応により、ヒト型結核菌のゲノムからＡｇ８５Ｂタンパクの１２５位〜２８２位のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片を増幅させた。本発明者らは、この配列の５’末端に対する上流プライマーであるＰ３配列および３’末端に対する下流プライマーであるＰ４配列
【化１】
0006783794.tif 000002
および
【化２】
0006783794.tif 000003
を設計し、両方ともＡｃｃ  Ｉ制限部位（ＧＴＣＴＡＣ）を有し；或いは、上流プライマーであるＰ５配列および下流プライマーであるＰ６配列
【化３】
0006783794.tif 000004
および
【化４】
0006783794.tif 000005
を設計し、両方ともＫｐｎＩ制限部位（ＧＧＴＡＣＣ）を有し、それぞれエンドヌクレアーゼＫｐｎ  ＩまたはエンドヌクレアーゼＡｃｃ  ＩでＡｇ８５Ａ遺伝子を消化して、アルカリホスファターゼで脱リン酸化を行った。
【０１１８】
そして、消化されたＡｇ８５Ａ遺伝子をＴ４  ＤＮＡリガーゼでＡｇ８５Ｂ断片に連結し、得られたプラスミドを大腸菌に導入した後、カナマイシン耐性培養プレートの中に培養、増殖させて、コロニーとなった。単一のコロニーを選んでそれぞれ試験管の中に培養した後に、それぞれのプラスミドを抽出し、電気泳動で同定を行い、その後、酵素で切断して、電気泳動で同定を行った。最初に正しいものを選択してシークエンシングにより確認して、組換えＡｇ８５ＡＢキメラ遺伝子を成功に構築した。
【０１１９】
［実施例２］ＳｅＶ８５ＡＢ組換えセンダイウイルスベクターの構築
Ｆ遺伝子を欠損したＳｅＶベクター（配列番号９）は、ＤＮＡＶＥＣ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  Ｊａｐａｎ（Ｈ．  Ｌｉ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２０００，ｖｏｌ．７４：ｐ．６５６４−６５６９）により構築して提供された。このベクターを用いてヒト型結核菌のＡｇ８５ＡＢタンパク質を発現する組換えＳｅＶベクターワクチン（即ちＳｅＶ８５ＡＢ、以下、ＳｅＶ８５ＡＢと略記する）を構築した。具体的に、先行実験は、組換え技術によりＳｅＶフュージョンのＦ遺伝子をノックアウトすることは培養細胞におけるこのベクターウイルスの複製および遺伝子発現に影響を及ぼさず、且つ感染細胞は感染性ウイルス粒子を生成や放出しないことが検証された。したがって、Ｆ遺伝子のノックアウトは、ウイルスの感染と複製の有効性を確保するとともに、このベクターの安全性を高める。本発明者は、上記の論文に記載されている（Ｈ．Ｌｉ．ｅｔ  ａｌ．，前文参照）ように、全長のＦ遺伝子の欠失を有する弱毒化ＳｅＶゲノムｃＤＮＡプラスミドｐＳｅＶ（＋）１８／ｄＦを説明した。
【０１２０】
ＰＣＲ増幅によりＡｇ８５ＡＢ（Ａｃｃ  Ｉを挿入部位とする）をコードする遺伝子断片を調製し、ｐＳｅＶ（＋）１８／ｄＦにクローニングしてｐＳｅＶ（＋）１８  ｄＦ／Ａｇ８５ＡＢを得た。ＰＣＲに用いられるプライマーであるＰ７とＰ８の配列は、５’−ＡＴＴ  ＧＣＧ  ＧＣＣ  ＧＣＧ  ＡＣＡ  ＴＧＧ  ＴＴＴ  ＣＣＣ  ＧＧＣ  ＣＧＧ  ＧＣＴ  ＴＧ−３’；５’−ＡＴＴ  ＧＡＴ  ＧＡＡ  ＣＴＴ  ＴＣＡ  ＣＣＣ  ＴＡＡ  ＧＴＴ  ＴＴＴ  ＣＴＴ  ＡＣＴ  ＡＣＧ  ＧＣＴ  ＡＧＧ  ＣＧＣ  ＣＣＴ  ＧＧＧ  ＧＣＧ  ＣＧＧ  ＧＣＣ  ＣＧＧ  ＴＧＴ  ＴＧＧ  ＧＣＧ  ＴＧ−３’である。まず、［実施例１］により上記プライマーを単離して、それを用いてヒト型結核菌の免疫優性遺伝子Ａｇ８５ＡＢを増幅させた。その後、Ｎ末端コード領域の上流のＮｏｔＩ部位を介してｐＳｅＶ（＋）１８／ｄＦベクターに挿入した（図１）。Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼの作用で、このプラスミドｐＳｅＶ（＋）１８  ｄＦ／Ａｇ８５ＡＢは、全長のＳｅＶ８５ＡＢのアンチゲノムＲＮＡを生成することができる。続いて、プラスミドｐＳｅＶ（＋）１８  ｄＦ／Ａｇ８５ＡＢをＬＬＣ−ＭＫ細胞にトランスフェクションし、組換えＳｅＶ、即ちＳｅＶ８５ＡＢを回収した（Ｋａｔｏ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｃｅｌｌｓ，１９９６，Ｖｏｌ．１、ｐ．５６９−５７９）。具体的に、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを発現する組換えワクシニアウイルス（ＶＶ）ｖＴＦ７−３（Ｆｕｅｒｓｔ，Ｔ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，１９８６，Ｖｏｌ．８３：ｐ．８１２２−８１２６）を用いて、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞を感染させた後、ｐＳｅＶ（＋）１８  ｄＦ／Ａｇ８５ＡＢをｐＧＥＭ−Ｎ、ｐＧＥＭ−Ｐ、およびｐＧＥＭ−Ｌ（Ｇａｒｃｉｎ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１９９５，Ｖｏｌ．１４：ｐ．６０８７−６０９４）とともにをこの細胞にトランスフェクションした。細胞培養器で３時間培養した後、細胞培養上清を除去し、血清を含まないＤＭＥＭ培地で細胞を２回洗浄し、そして４０ｍｇ／ｍｌのシトシンアラビノシド（ＡｒａＣ、Ｓｉｇｍａ）と７．５ｍｇ／ｍｌのトリプトン（ＧＩＢＣＯ）を含むＤＭＥＭ中で７０時間培養した。その後、細胞を回収し、１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌの割合で培地に再懸濁した。細胞を３回繰り返し凍結融解した後、リポフェクトアミン試薬ＤＯＳＰＥＲ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  ｍａｎｎｈｅｉｍ）（１０６ｃｅｌｌｓ／２５ｍｌＤＯＳＰＥＲ）と混合し、室温下で１５分間置いて、例えばＬＬＣ−ＭＫ２／Ｆ７細胞（１０６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ、１２ｗｅｌｌ−ｐｌａｔｅ）のようなＦ遺伝子を発現するヘルパー細胞系にトランスフェクションし、４０ｍｇ／ｍｌのＡｒａｃと７．５ｍｇ／ｍｌのトリプトンを含む、血清を含まないＤＭＥＭ培地で培養し、上清を回収した。
【０１２１】
同じ方法に従って、ＳｅＶ８５ＡＢの対照としてブランクＳｅＶを製造した。ＬＬＣ−ＭＫ２細胞および抗ＳｅＶ抗体で免疫染色を行って組替えＳｅＶベクターワクチンをスクリーニング、同定した。力価（ＣＩＵ［細胞感染単位］／ｍｌ）の測定は、文献（Ｋｉｙｏｔａｎｉ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９０，１７７：ｐ．６５−７４）のように行った。
【０１２２】
本実施例で得られたＳｅＶ８５ＡＢ組換えセンダイウイルスベクターは、中国典型培養物保藏中心（ＣＣＴＣＣ、アドレス：武漢市武昌珞珈山、４３００７２）に寄託され、分類はＰａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ／Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓｅｓであり、寄託日は２０１５年４月１９日であり、寄託番号はＣＣＴＣＣ  Ｖ２０１５１８である。
【０１２３】
［実施例３］Ａｇ８５ＡＢを発現するＳｅＶ８５ＡＢ組換えウイルスの同定
ＳｅＶ８５ＡＢで細胞を感染させ、発現されたタンパク質を分析した。具体的には、６穴プレートの中で、１穴あたり４×１０５個の細胞の密度でＬＬＣ−ＭＫ２細胞を一晩培養し、その後、感染多重度ｍ．ｏ．ｉ．が１、３、１０、３０、１００であるＳｅＶ或いはＳｅＶ８５ＡＢでこの細胞を感染させた。２日後、細胞を回収し、１ＸＳＤＳ  ｓａｍｐｌｅ  ｂｕｆｆｅｒで細胞を溶解した。１００℃で熱処理した後、１０μｌの細胞分解物を各レーンに添加してＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を行った。抗Ａｇ８５Ａのマウスモノクローナル抗体を一次抗体として使用し、フルオレセインを結合したヤギ抗マウス免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）を二次抗体として使用し、細胞分解物に対してウェスタンブロット分析を行った。データから、ＳｅＶ８５ＡＢ感染したＬＬＣ−ＭＫ２細胞においてＡｇ８５ＡＢを発現したことを検証したが、ＳｅＶブランクベクター対照は陰性の結果を示した（図２）。
【０１２４】
［実施例４］マウスに対するＳｅＶ８５ＡＢによる鼻腔免疫は、抗原特異的Ｔ細胞免疫応答を誘導することができる
特定病原体フリー（ＳＰＦ）のメスのＢＡＬＢ／ｃマウス（６〜８週齢）はＳｈａｎｇｈａｉ  ＳＬＡＣ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．（中国上海）から購入した。このマウスを使用してＳｅＶ８５ＡＢの経鼻免疫がＡｇ８５ＡＢ特異的免疫応答を誘導できるかどうかを検証した。２×１０６ＣＩＵ／動物および１０７ＣＩＵ／動物のＳｅＶ８５ＡＢ（２０ｕｌ、ＰＢＳ中）でマウスを鼻腔内免疫し、ブランクウイルス（結核抗原を発現しないＳｅＶベクター）およびＰＢＳを接種したマウスを対照として使用した。免疫してから２週間後、マウスを殺し、マウスから肺臓（気管組織を含む）と脾臓を取り出した。
【０１２５】
肺リンパ球および脾臓細胞の単細胞懸濁液を以下のように調製した。脾臓を機械的に破砕し、メッシュガーゼ（ｍｅｓｈ  ｇａｕｚｅ）で単一の脾臓細胞を濾過させた。ＲＢＣ溶解バッファー（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で赤血球（ＲＢＣ）を溶解した。一方、肺を無菌で摘出して、はさみで砕いて、１０ｍｌのＲ１０培地（１０％ＦＢＳ［ウシ胎児血清］と１％ペニシリン＋ストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ−１６４０培地）中の１ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼＩＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および１０Ｕ  ＤＮａｓｅ  Ｉ（Ｔｈｅｒｍｏ）とを３７℃で３０分間培養した。組織を単一細胞に解離するために、コラゲナーゼ処理された肺片を７０μｍ細胞フィルター（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で穏やかに濾過し、シリンジのプランジャーで押した。その後、細胞懸濁液を遠心分離して、ＲＢＣ溶解を行った。洗浄後、単一の肺リンパ球をＲ１０培地に再懸濁し、計数してさらなる分析に供した。
【０１２６】
Ａｇ８５ＡＢポリペプチドまたはタンパク質（５μｇ／ｍｌ）とＰＰＤ（ツベルクリン純タンパク質誘導体、Ｓｔａｔｅｎｓ  Ｓｅｒｕｍ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＳＳＩ）から購入し、１０μｇ／ｍｌ）の刺激で、ＥＬＩＳＰＯＴ法を用いて、ＩＦＮ−γを特異的に分泌するＣＤ４＋ＴおよびＣＤ８＋Ｔ細胞の数を検出した。刺激用Ａｇ８５ＡＢポリペプチドまたはタンパク質に関する情報は以下の通りであった：Ａｇ８５Ａ−ＣＤ４ペプチド（ヒト型結核菌タンパク質Ａｇ８５Ａ（ＬＴＳＥＬＰＧＷＬＱＡＮＲＨＶＫＰＴＧＳ、ＭＨＣクラスＩＩ特異的ペプチド）、ＦＵＮＡＫＯＳＨＩカタログ番号［ＡＮＡ］６２４２５）、Ａｇ８５Ａ−ＣＤ８ペプチド（ヒト型結核菌タンパク質Ａｇ８５Ａ−ＣＤ８（ＭＰＶＧＧＱＳＳＴ、ＭＨＣクラスＩ特異的ペプチド）、ＦＵＮＡＫＯＳＨＩカタログ番号［ＡＳＩ］６２４２４）、Ａｇ８５Ｂ−ＣＤ４ペプチド（ヒト型結核菌タンパク質Ａｇ８５Ｂ（２４０〜２５４）（ＦＱＤＡＹＮＡＡＧＧＨＮＡＶＦ、ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞（Ｔｈ）１を誘導できる）、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号［ＡＮＡ］６５３９１）、ｒＡｇ８５Ａ（組換えＡｇ８５Ａタンパク、実験室精製、配列は配列番号１０に示される）。
【０１２７】
このデータは、ＳｅＶ８５ＡＢでの鼻腔免疫が、マウスの肺臓と脾臓において強い抗原特異的Ｔ細胞免疫応答を誘導することができるが、陰性対照であるブランクベクターおよびＰＢＳは、対応する免疫応答を誘導できないことを検証した。図３は、肺リンパ球の検出結果を示す。この結果から、Ａｇ８５Ａ−ＣＤ４ポリペプチド、ｒＡｇ８５ＡタンパクおよびＰＰＤによる刺激は、免疫したマウスのリンパ球のＩＦＮ−γ分泌を誘導できることを確認した。脾臓においても同様の結果が得られた（図４）。投与量の点から、２×１０６ＣＩＵの低投与量免疫群に比べて、１０７ＣＩＵの高投与量免疫群は、抗原特異的Ｔ細胞の誘導の効果がより良好であることを示した（図３−４）。これらの結果から、ＳｅＶ８５ＡＢワクチンは、ブランクＳｅｖベクターおよびＰＢＳと比較して、鼻腔免疫後、結核抗原Ａｇ８５Ａに対する局所（肺）および系統性（脾臓）免疫応答を有意に誘導できることが分かった。また、１０７ＣＩＵの免疫群と２×１０６ＣＩＵの免疫群の両方とも、結核抗原の発現の有無に関わらず、体重の有意な減少などの毒性反応が観察されなかった（図５）。
【０１２８】
［実施例５］ＳｅＶ８５ＡＢによるマウスの筋肉内免疫は抗原特異的Ｔ細胞免疫応答を誘導できる
特定病原体フリー（ＳＰＦ）のメスのＢＡＬＢ／ｃマウス（６〜８週齢）はＳｈａｎｇｈａｉ  ＳＬＡＣ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．（中国上海）から購入した。このマウスを使用して、ＳｅＶ８５ＡＢの筋肉内注射による接種がＡｇ８５ＡＢ特異的免疫応答を誘導できるかどうかを検証した。２×１０６ＣＩＵ／動物および１０７ＣＩＵ／動物のＳｅＶ８５ＡＢ（２０μｌ、ＰＢＳ中）でマウスを筋肉内接種させた。対照として、ブランクウイルス（結核抗原を発現しないＳｅＶベクター）およびＰＢＳを接種したマウスを使用した。免疫してから２週間後、マウスを殺し、マウスから肺臓（気管組織を含む）と脾臓を取り出し、実施例４に記載のように、肺リンパ球および脾臓細胞の単一細胞懸濁液を調製した。
【０１２９】
Ａｇ８５ＡＢポリペプチドまたはタンパク質（５μｇ／ｍｌ）とＰＰＤ（ツベルクリン純タンパク質誘導体、Ｓｔａｔｅｎｓ  Ｓｅｒｕｍ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＳＳＩ）から購入し、１０μｇ／ｍｌ）の刺激で、ＥＬＩＳＰＯＴ法を用いて、ＩＦＮ−γを特異的に分泌するＣＤ４＋ＴおよびＣＤ８＋Ｔ細胞の数を検出した。刺激用Ａｇ８５ＡＢポリペプチドまたはタンパク質に関する情報は以下の通りである：Ａｇ８５Ａ−ＣＤ４ペプチド（ヒト型結核菌タンパク質Ａｇ８５Ａ（ＬＴＳＥＬＰＧＷＬＱＡＮＲＨＶＫＰＴＧＳ、ＭＨＣクラスＩＩ特異的ペプチド）、ＦＵＮＡＫＯＳＨＩカタログ番号［ＡＮＡ］６２４２５）、Ａｇ８５Ａ−ＣＤ８ペプチド（ヒト型結核菌タンパク質Ａｇ８５Ａ−ＣＤ８（ＭＰＶＧＧＱＳＳＴ、ＭＨＣクラスＩ特異的ペプチド）、ＦＵＮＡＫＯＳＨＩカタログ番号［ＡＳＩ］６２４２４）、Ａｇ８５Ｂ−ＣＤ４ペプチド（ヒト型結核菌タンパク質Ａｇ８５Ｂ（２４０〜２５４）（ＦＱＤＡＹＮＡＡＧＧＨＮＡＶＦ、ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞（Ｔｈ）１を誘導できる）、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号［ＡＮＡ］６５３９１）、ｒＡｇ８５Ａ（組換えＡｇ８５Ａタンパク、実験室精製、配列は配列番号１０に示される）。
【０１３０】
データは、ＳｅＶ８５ＡＢでの筋肉内免疫が、マウスの肺臓と脾臓において抗原特異的Ｔ細胞免疫応答を誘導することができるが、ブランクベクターおよびＰＢＳの対照群は、対応する免疫応答を検出しないことを示した。図６は、肺リンパ球の検出結果を示す。この結果から、Ａｇ８５Ａ−ＣＤ４ポリペプチド、ｒＡｇ８５ＡタンパクおよびＰＰＤによる刺激が、肺リンパ球のＩＦＮ−γ特異的分泌を誘導できることを確認した。脾臓においても同様の結果が得られた（図７）。これらの結果から、ＳｅＶ８５ＡＢワクチンは、ブランクＳｅｖベクターおよびＰＢＳと比較して、筋肉内免疫の場合、結核抗原Ａｇ８５Ａに対する局所（肺）および系統性（脾臓）免疫応答を誘導できることが分かる。また、１０７ＣＩＵの免疫群と２×１０６ＣＩＵの免疫群の両方とも、結核抗原の発現の有無に関わらず、体重の有意な減少などの毒性反応が観察されなかった（図８）。
【０１３１】
［実施例６］ＳｅＶ８５ＡＢ及びＢＣＧワクチンが多価ワクチンとして併用免疫する場合の追加免疫効果
前記ように、特定病原体フリー（ＳＰＦ）のメスのＢＡＬＢ／ｃマウス（６〜８週齢）はＳｈａｎｇｈａｉ  ＳＬＡＣ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．（中国上海）から購入した。このマウスを使用して、ＢＣＧワクチン（ＢＣＧ  Ｄａｎｉｓｈ株、Ｓｈａｎｇｈａｉ  Ｉｎｓｉｔｉｔｕｅ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｃｏ．，  Ｌｔｄ．，  Ｃｈｉｎａ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  ｂｉｏｔｅｃ  Ｇｒｏｕｐ  Ｃｏｍｐａｎｙ  Ｌｉｍｉｔｅｄから購入し）に対するＳｅＶ８５ＡＢの追加免疫効果を評価した。マウスをランダムに８グループに分け、それぞれのグループにＢＣＧ或いは対照でるるＰＢＳで初回免疫を行い、８週間後、さらにＰＢＳ、ＢＣＧ、ＳｅＶ／対照あるいはＳｅＶ８５ＡＢで追加免疫を行い、そして、結核抗原ＳｅＶ８５ＡＢ特異的細胞免疫応答を誘導できるかどうかを検出した。実験デザインの詳細は次のとおりである。
【表１】
0006783794.tif 000006
【０１３２】
ＰＢＳで初回免疫を行う場合、１００μｌを右後肢の鼠径の皮下部位（内側と外側にそれぞれ５０μｌ）に注射した。ＢＣＧで初回免疫を行う場合、右後肢の鼠径の皮下部位（内側と外側にそれぞれ５０μｌ）に１０６コロニー形成単位（ＣＦＵ）／１００μｌ／動物で注射した。
【０１３３】
初回免疫を行ってから８週間後、鼻腔免疫の方法で追加免疫を実施した。ＰＢＳ追加免疫の用量は２０μｌ／動物、ＢＣＧの用量は１０６ＣＦＵ／２０μｌ／動物、ブランクＳｅＶベクターの用量は１０７ＣＩＵ／２０μｌ／動物であり、ＳｅＶ８５ＡＢベクターの用量は１０７ＣＩＵ／２０μｌ／動物であった。追加免疫を行ってから２週間後、マウスから肺（気管組織を含む）と脾臓を取り出し、実施例４に記載のように肺リンパ球および脾臓細胞の単一細胞懸濁液を調製した。
【０１３４】
Ａｇ８５ＡＢポリペプチドまたはタンパク質（５μｇ／ｍｌ）とＰＰＤ（ツベルクリン純タンパク質誘導体、Ｓｔａｔｅｎｓ  Ｓｅｒｕｍ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＳＳＩ）から購入し、１０μｇ／ｍｌ）の刺激で、ＥＬＩＳＰＯＴ法を用いて、ＩＦＮ−γを特異的に分泌するＣＤ４＋ＴおよびＣＤ８＋Ｔ細胞の数を検出した。刺激用Ａｇ８５ＡＢポリペプチドまたはタンパク質に関する情報は以下の通りであった：Ａｇ８５Ａ−ＣＤ４ペプチド（ヒト型結核菌タンパク質Ａｇ８５Ａ（ＬＴＳＥＬＰＧＷＬＱＡＮＲＨＶＫＰＴＧＳ、ＭＨＣクラスＩＩ特異的ペプチド）、ＦＵＮＡＫＯＳＨＩカタログ番号［ＡＮＡ］６２４２５）、Ａｇ８５Ａ−ＣＤ８ペプチド（ヒト型結核菌タンパク質Ａｇ８５Ａ−ＣＤ８（ＭＰＶＧＧＱＳＳＴ、ＭＨＣクラスＩ特異的ペプチド）、ＦＵＮＡＫＯＳＨＩカタログ番号［ＡＳＩ］６２４２４）、Ａｇ８５Ｂ−ＣＤ４ペプチド（ヒト型結核菌タンパク質Ａｇ８５Ｂ（２４０〜２５４）（ＦＱＤＡＹＮＡＡＧＧＨＮＡＶＦ、ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞（Ｔｈ）１を誘導できる）、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号［ＡＮＡ］６５３９１）、ｒＡｇ８５Ａ（組換えＡｇ８５Ａタンパク、実験室精製、配列は配列番号１０に示される）。
【０１３５】
肺リンパ球のＥＬＩＳＰＯＴ結果を図９に示す。ＢＣＧ初回免疫−ＳｅＶ８５ＡＢ追加免疫を受けたマウスは、ＢＣＧ追加免疫と比較して、ＩＦＮ−γを分泌するリンパ球をより良好に誘導することができる。脾臓の結果を図１０に示す。ＢＣＧ初回免疫−ＳｅＶ８５ＡＢ追加免疫を受けたマウスは、ＢＣＧ追加免疫と比較して、ＩＦＮ−γを分泌するリンパ球を著しく多く誘導することができる。すなわち、第８グループの免疫戦略を受けたマウスは、他の７つのグループより、結核抗原Ａｇ８５Ａに対する局所（肺）および系統性（脾臓）免疫応答を著しく良好に誘導した。一方、ＳｅＶ８５ＡＢ免疫マウスでは、他の試験グループと比較して、有意な体重変化が観察されなかった（図１１）。
【０１３６】
［実施例７］ＢＣＧに比べるヒト型結核菌感染に対するＳｅＶ８５ＡＢの予防効果
前記ように、特定病原体フリー（ＳＰＦ）のメスのＢＡＬＢ／ｃマウス（６〜８週齢）はＳｈａｎｇｈａｉ  ＳＬＡＣ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．（中国上海）から購入した。このマウスを使用して、結核菌感染に対するＳｅＶ８５ＡＢの予防効果を検出した。
【０１３７】
このマウスを４つのグループに分け、ブランクＳｅＶベクター、ＢＣＧワクチン（皮下注射で１０６ＣＦＵを１回接種した）、低用量（２×１０６ＣＩＵ）のＳｅＶ８５ＡＢおよび高用量のＳｅＶ８５ＡＢ（１０７ＣＩＵ）をそれぞれ用いて１回免疫を行った。４週間後、Ｐ３研究室でヒト型結核菌Ｈ３７Ｒｖ株のエアロゾルでマウスを攻撃した（１００〜２００ＣＦＵ）。そして、５週間後、マウスを殺し、マウスの肺臓組織と脾臓組織を取り出し、ホモジナイズしてホモジェネートとなり、Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ  ７Ｈ１１寒天プレート上に塗布した。この寒天プレートには、１０％のＯＡＤＣを多く含む、汚染微生物の成長を防止するための４つの抗生物質の混合物（４０Ｕ／ｍｌのポリマイシンＢ、４μｇ／ｍｌのアンフォテリシン、５０μｇ／ｍｌのカルベニシリン、および２μｇ／ｍｌのトリメトプリム）を添加した。３７℃で３週間培養した後、ＣＦＵコロニーを計数し、ワクチンの防御効果を評価した。ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ検定で任意の２つのグループ間の有意性を比較し、図１２には＊（ｐ＜０．０５の場合）および＊＊＊（ｐ＜０．０１の場合）で示した。図１２に示したように、低用量のＳｅＶ８５ＡＢによる１回経鼻免疫は、少なくともＢＣＧと同等の免疫防御効果を誘導することができ、さらに、高用量のＳｅＶ８５ＡＢによる効果はＢＣＧよりも優れている。
【０１３８】
［実施例８］異なる免疫戦略でのヒト型結核菌感染に対するＳｅＶ８５ＡＢの予防効果
前記ように、特定病原体フリー（ＳＰＦ）のメスのＢＡＬＢ／ｃマウス（６〜８週齢）はＳｈａｎｇｈａｉ  ＳＬＡＣ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．（中国上海）から購入した。このマウスを使用して、結核菌感染に対するＳｅＶ８５ＡＢの予防効果を検出した。
【０１３９】
まず、このマウスを４つのグループに分けた。第１〜第３グループは、それぞれ、ＰＢＳ（２０μｌ）、ＢＣＧ（皮下注射で１０６ＣＦＵを１回接種した）、およびＢＣＧ（皮下注射で１０６ＣＦＵを１回接種した）で処理した。４週間後、第３グループでは１０７ＣＩＵのＳｅＶ８５ＡＢを鼻腔内で１回追加接種（追加免疫）し、第４グループでは１０７ＣＩＵのＳｅＶ８５ＡＢを鼻腔で１回接種した。また、４週間後、Ｐ３研究室でヒト型結核菌Ｈ３７Ｒｖ株（１００〜２００ＣＦＵ）のエアロゾルでマウスを攻撃した。そして、５週間後、マウスを殺し、マウスの肺臓組織と脾臓組織を取り出し、ホモジナイズしてホモジェネートとなり、Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ  ７Ｈ１１寒天プレート上に塗布した。この寒天プレートには、１０％のＯＡＤＣを多く含む、汚染微生物の成長を防止するための４つの抗生物質の混合物（４０Ｕ／ｍｌのポリマイシンＢ、４μｇ／ｍｌのアンフォテリシン、５０μｇ／ｍｌのカルベニシリン、および２μｇ／ｍｌのトリメトプリム）を添加した。３７℃で３週間培養した後、ＣＦＵコロニーを計数し、ワクチンの防御効果を評価した。ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ検定で任意の２つのグループ間の有意性を比較し、図１３には＊（ｐ＜０．０５の場合）および＊＊＊（ｐ＜０．０１の場合）で示した。図１３に示したように、肺では、ＳｅＶ８５ＡＢのみによる１回経鼻免疫は、ＢＣＧのみの場合と同等の免疫防御効果を誘導することができ、さらに、ＳｅＶ８５ＡＢをＢＣＧの追加ワクチンとして使用すると、防御効果を著しく向上させる（図１３の右側）；脾臓では、ＳｅＶ８５ＡＢのみによる経鼻免疫は、ＢＣＧのみの場合と同等の免疫防御効果を誘導することができ、さらに、ＳｅＶ８５ＡＢをＢＣＧの追加ワクチンとして使用すると、その効果は、ＢＣＧのみ、またはＳｅＶ８５ＡＢのみの場合より著しく優れている（図１３の左側）。
【０１４０】
［実施例９］リファンピシンに比べる結核菌を感染したマウス体内の結核菌に対するＳｅＶ８５ＡＢの抑制効果
前記ように、特定病原体フリー（ＳＰＦ）のメスのＢＡＬＢ／ｃマウス（６〜８週齢）はＳｈａｎｇｈａｉ  ＳＬＡＣ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．（中国上海）から購入した。このマウスを使用して、体内の結核菌に対するＳｅＶ８５ＡＢの抑制効果を検出した。
【０１４１】
まず、１００〜２００ＣＦＵのＨ３７Ｒｖ  ＭＴＢ株のエアロゾルでこのマウスを攻撃した。感染されてから４週間後、マウスを３つのグループに分け、各グループには２０匹のマウスがあった。第１グループでは、マウスの飲料水にリファンピシン（ＲＦＰ）を添加して治療し（用量は１０ｍｇ／ｋｇ／日）；第２グループでは、１０７ＣＩＵのＳｅＶ８５ＡＢを鼻腔内で接種し（１週間おきに１回、合計３回）；対照グループでは、点鼻でＰＢＳ（２０μｌ）のみを接種した。感染後１日目と感染後４、６、８および１２週目に、各時点で各グループから３〜４匹のマウスを採取し、殺して、マウスの肺臓と脾臓を取り出し、ホモジナイズしてホモジェネートとなり、Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ  ７Ｈ１１寒天プレート上に塗布した。この寒天プレートには、１０％のＯＡＤＣを多く含む、汚染微生物の成長を防止するための４つの抗生物質の混合物（４０Ｕ／ｍｌのポリマイシンＢ、４μｇ／ｍｌのアンフォテリシン、５０μｇ／ｍｌのカルベニシリン、および２μｇ／ｍｌのトリメトプリム）を添加した。３７℃で３週間培養した後、ＣＦＵコロニーを計数し、ワクチンの防御効果を評価した。その結果から、ＳｅＶ８５ＡＢで４週間治療した後の細菌の数は、ＰＢＳグループと比較して著しく減少し、８週間治療した後の治療効果はＲＦＰグループと同等であった（図１４）。
【０１４２】
［実施例１０］結核菌を感染したマウス体内の結核菌に対するＳｅＶ８５ＡＢとリファンピシンとの併用投与による抑制効果
前記ように、特定病原体フリー（ＳＰＦ）のメスのＢＡＬＢ／ｃマウス（６〜８週齢）はＳｈａｎｇｈａｉ  ＳＬＡＣ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．（中国上海）から購入した。このマウスを使用して、体内の結核菌に対するＳｅＶ８５ＡＢの抑制効果を検出した。
【０１４３】
まず、１００〜２００ＣＦＵのＨ３７Ｒｖ  ＭＴＢ株のエアロゾルでこのマウスを攻撃した。感染されてから３週間後、マウスを３つのグループに分けた。第１グループでは、マウスの飲料水にリファンピシン（ＲＦＰ）を添加して治療し（用量は１０ｍｇ／ｋｇ／日）；第２グループでは、リファンピシンを投与して治療しながら、１０７ＣＩＵのＳｅＶ８５ＡＢを鼻腔内で接種し（治療は毎週１回、合計３回）；対照グループでは、点鼻でＰＢＳ（２０μｌ）のみを接種した。感染されてから６週間後、マウスを殺して、マウスの肺臓と脾臓を取り出し、ホモジナイズしてホモジェネートとなり、Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ  ７Ｈ１１寒天プレート上に塗布した。この寒天プレートには、１０％のＯＡＤＣを多く含む、汚染微生物の成長を防止するための４つの抗生物質の混合物（４０Ｕ／ｍｌのポリマイシンＢ、４μｇ／ｍｌのアンフォテリシン、５０μｇ／ｍｌのカルベニシリン、および２μｇ／ｍｌのトリメトプリム）を添加した。３７℃で３週間培養した後、ＣＦＵコロニーを計数し、その治療効果を分析した。図１５に示したように、肺における結果から、リファンピシンとＳｅＶ８５ＡＢの併用投与は、ＰＢＳ対照およびリファンピシンのみの場合に比べて、マウスの肺臓に存在する細菌量を著しく減少させることができる（図１５）。
【産業上の利用可能性】
【０１４４】
本発明は、結核菌タンパク質をコードするセンダイウイルスベクターを含むワクチンを提供する。センダイウイルスは毒性が低く、細胞培養を使って大量に製造できるため、生きた組換えワクチンを安全かつ容易に製造することが期待できる。さらに、本発明のワクチンは、結核菌の感染および／または結核の発症および進展を阻止する有望なワクチン戦略を提供する。
【０１４５】
寄託：
組換えＳｅＶ８５ＡＢベクターは、中国典型培養物保藏中心（ＣＣＴＣＣ、アドレス：武漢市武昌珞珈山、４３００７２）に寄託され、分類はＰａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ／Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓｅｓであり、寄託日は２０１５年４月１９日であり、寄託番号はＣＣＴＣＣ  Ｖ２０１５１８である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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