(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の遺伝子組換え体を含みうる試料から抽出されたＤＮＡと、複数の組換えＤＮＡ配列のそれぞれを認識する、同じ蛍光物質で標識されている複数の組換えＤＮＡ配列認識プローブと、を含む第１の反応ミックスを用意することと、
前記試料から抽出されたＤＮＡと、内在性ＤＮＡ配列を認識する、蛍光物質で標識されている内在性ＤＮＡ配列認識プローブと、を含む第２の反応ミックスを用意することと、
デジタルＰＣＲ装置を用いて、複数の反応ウェルに分配された前記第１の反応ミックス内でＰＣＲを実施し、前記抽出されたＤＮＡの組換えＤＮＡ配列を増幅することと、
デジタルＰＣＲ装置を用いて、複数の反応ウェルに分配された前記第２の反応ミックス内でＰＣＲを実施し、前記抽出されたＤＮＡの内在性ＤＮＡ配列を増幅することと、
前記組換えＤＮＡ配列が検出された反応ウェルの数、及び前記内在性ＤＮＡ配列が検出された反応ウェルの数に基づき、前記試料に含まれる遺伝子組換え体の存在比を算出することと、
を備え、
前記複数の組換えＤＮＡ配列のそれぞれが、前記複数の遺伝子組換え体の少なくとも一部が共通して含む組換えＤＮＡ配列であり、
前記試料に含まれる遺伝子組換え体から抽出されたＤＮＡが、前記複数の組換えＤＮＡ配列認識プローブで認識される少なくとも２つの連結された組換えＤＮＡ配列を含み、
前記組換えＤＮＡ配列が検出された反応ウェルの数に基づき、増幅された組換えＤＮＡ配列のコピー数を算出し、前記内在性ＤＮＡ配列が検出された反応ウェルの数に基づき、増幅された内在性ＤＮＡ配列のコピー数を算出する、
遺伝子組換え体の定量法。
【請求項２】
前記複数の組換えＤＮＡ配列認識プローブを標識する蛍光物質と、前記内在性ＤＮＡ配列認識プローブを標識する蛍光物質と、が、同じである、請求項１に記載の遺伝子組換え体の定量法。
【請求項３】
前記複数の組換えＤＮＡ配列認識プローブを標識する蛍光物質と、前記内在性ＤＮＡ配列認識プローブを標識する蛍光物質と、が、異なる、請求項１に記載の遺伝子組換え体の定量法。
【請求項４】
複数の遺伝子組換え体を含みうる試料から抽出されたＤＮＡと、複数の組換えＤＮＡ配列のそれぞれを認識する、同じ第１の蛍光物質で標識されている複数の組換えＤＮＡ配列認識プローブと、内在性ＤＮＡ配列を認識する、第２の蛍光物質で標識されている内在性ＤＮＡ配列認識プローブと、を含む反応ミックスを用意することと、
デジタルＰＣＲ装置を用いて、複数の反応ウェルに分配された前記反応ミックス内でＰＣＲを実施し、前記抽出されたＤＮＡの組換えＤＮＡ配列及び前記抽出したＤＮＡの内在性ＤＮＡ配列を同時に増幅することと、
前記組換えＤＮＡ配列が検出された反応ウェルの数、及び前記内在性ＤＮＡ配列が検出された反応ウェルの数に基づき、前記試料に含まれる遺伝子組換え体の存在比を算出することと、
を備え、
前記複数の組換えＤＮＡ配列のそれぞれが、前記複数の遺伝子組換え体の少なくとも一部が共通して含む組換えＤＮＡ配列であり、
前記試料に含まれる遺伝子組換え体から抽出されたＤＮＡが、前記複数の組換えＤＮＡ配列認識プローブで認識される少なくとも２つの連結された組換えＤＮＡ配列を含み、
前記組換えＤＮＡ配列が検出された反応ウェルの数に基づき、増幅された組換えＤＮＡ配列のコピー数を算出し、前記内在性ＤＮＡ配列が検出された反応ウェルの数に基づき、増幅された内在性ＤＮＡ配列のコピー数を算出する、
遺伝子組換え体の定量法。
【請求項５】
前記少なくとも２つの組換えＤＮＡ配列が連結されたまま、前記複数の反応ウェルに分配される、請求項１から４のいずれか１項に記載の遺伝子組換え体の定量法。
【請求項６】
前記複数の組換えＤＮＡ配列が、プロモーター、導入遺伝子、又はターミネーターを含む、請求項１から５のいずれか１項に記載の遺伝子組換え体の定量法。
【請求項７】
前記複数の組換えＤＮＡ配列が、プロモーター及びターミネーターを含む、請求項１から５のいずれか１項に記載の遺伝子組換え体の定量法。
【請求項８】
前記増幅された組換えＤＮＡ配列のコピー数及び前記増幅された内在性ＤＮＡ配列のコピー数に基づき、前記試料に含まれる遺伝子組換え体の存在比を算出する、請求項１から７のいずれか１項に記載の遺伝子組換え体の定量法。
【請求項９】
前記増幅された組換えＤＮＡ配列のコピー数を、前記増幅された内在性ＤＮＡ配列のコピー数及び内標比で除して、前記試料に含まれる遺伝子組換え体の存在比を算出する、請求項１から８のいずれか１項に記載の遺伝子組換え体の定量法。
【請求項１０】
前記内標比が、純粋な遺伝子組換え体の抽出ＤＮＡ中の組換えＤＮＡ配列の数を、前記純粋な遺伝子組換え体の抽出ＤＮＡ中の内在性ＤＮＡ配列の数で除して得られる、請求項９に記載の遺伝子組換え体の定量法。
【請求項１１】
前記試料が植物を含む、請求項１から１０のいずれか１項に記載の遺伝子組換え体の定量法。
【請求項１２】
前記試料がトウモロコシを含む、請求項１から１１のいずれか１項に記載の遺伝子組換え体の定量法。
【請求項１３】
前記複数の組換えＤＮＡ配列認識プローブで認識される複数の組換えＤＮＡ配列が、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター配列及びＮＯＳターミネーター配列を含む、請求項１２に記載の遺伝子組換え体の定量法。
【請求項１４】
前記試料が微生物を含む、請求項１から１０のいずれか１項に記載の遺伝子組換え体の定量法。
【請求項１５】
前記複数の組換えＤＮＡ配列の数が、前記複数の遺伝子組換え体の数より少ない、請求項１から１４のいずれか１項に記載の遺伝子組換え体の定量法。
【請求項１６】
前記複数の組換えＤＮＡ配列が、２つの組換えＤＮＡ配列である、請求項１から１５のいずれか１項に記載の遺伝子組換え体の定量法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は遺伝子技術に関し、遺伝子組換え体の定量法に関する。
【背景技術】
【０００２】
試料に含まれるデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）や、遺伝子組換え体の定量には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が広く用いられている（例えば、特許文献１から４参照。）。近年においては、デジタルＰＣＲも広く用いられている（例えば、非特許文献１から６、及び特許文献５、６参照。）。試料に含まれる遺伝子組換え体の存在比は、正確に算出されることが望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特表２０１３−５１１９９１号公報
【特許文献２】特許第４３１７４５０号公報
【特許文献３】特表２００２−５３６０２４号公報
【特許文献４】特許第４９２５６０７号公報
【特許文献５】特表２０１３−５２１７６４号公報
【特許文献６】特許第５７０７１３２号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】「Digital PCR」、PNAS.、96(16)、9236-9241
【非特許文献２】「Evaluation of Digital PCR for Absolute DNA Quantification」、Anal. Chem.、2011、83 (17)、pp 6474-6484
【非特許文献３】「Assessment of droplet digital PCR for absolute quantification of genetically engineered OXY235 canola and DP305423 soybean samples」、Food Control.、2014、46、pp 470-474
【非特許文献４】「Copy number ratios determined by two digital polymerase chain reaction systems in genetically modified grains」、Metrologia.、2014、51(1)、pp 61-66
【非特許文献５】「The applicability of digital PCR for the assessment of detection limits in GMO analysis」、Eur Food Res Technol.、2010, 231(3)、pp353-362
【非特許文献６】「Multiplex Quantification of 12 European Union Authorized Genetically Modified Maize Lines with Droplet Digital Polymerase Chain Reaction」、Anal. Chem.、2015、87、8218-8226
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、試料に含まれる遺伝子組換え体の存在比を正確に算出可能な遺伝子組換え体の定量法を提供することを目的の一つとする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の態様によれば、（ａ）試料から抽出されたＤＮＡと、複数の組換えＤＮＡ配列のそれぞれを認識する、同じ蛍光物質で標識されている複数の組換えＤＮＡ配列認識プローブと、を含む第１の反応ミックスを用意することと、（ｂ）試料から抽出されたＤＮＡと、内在性ＤＮＡ配列を認識する、蛍光物質で標識されている内在性ＤＮＡ配列認識プローブと、を含む第２の反応ミックスを用意することと、（ｃ）デジタルＰＣＲ装置を用いて、複数の反応ウェルに分配された第１の反応ミックス内でＰＣＲを実施し、抽出されたＤＮＡの組換えＤＮＡ配列を増幅することと、（ｄ）デジタルＰＣＲ装置を用いて、複数の反応ウェルに分配された第２の反応ミックス内でＰＣＲを実施し、抽出されたＤＮＡの内在性ＤＮＡ配列を増幅することと、（ｅ）組換えＤＮＡ配列が検出された反応ウェルの数、及び内在性ＤＮＡ配列が検出された反応ウェルの数に基づき、試料に含まれる遺伝子組換え体の存在比を算出することと、を備え、（ｆ）試料に含まれる遺伝子組換え体から抽出されたＤＮＡが、複数の組換えＤＮＡ配列認識プローブで認識される少なくとも２つの連結された組換えＤＮＡ配列を含む、遺伝子組換え体の定量法が提供される。
【０００７】
上記の遺伝子組換え体の定量法において、複数の組換えＤＮＡ配列認識プローブを標識する蛍光物質と、内在性ＤＮＡ配列認識プローブを標識する蛍光物質と、が、同じであってもよい。あるいは、複数の組換えＤＮＡ配列認識プローブを標識する蛍光物質と、内在性ＤＮＡ配列認識プローブを標識する蛍光物質と、が、異なっていてもよい。
【０００８】
また、本発明の態様によれば、（ａ）試料から抽出されたＤＮＡと、複数の組換えＤＮＡ配列のそれぞれを認識する、同じ第１の蛍光物質で標識されている複数の組換えＤＮＡ配列認識プローブと、内在性ＤＮＡ配列を認識する、第２の蛍光物質で標識されている内在性ＤＮＡ配列認識プローブと、を含む反応ミックスを用意することと、（ｂ）デジタルＰＣＲ装置を用いて、複数の反応ウェルに分配された反応ミックス内でＰＣＲを実施し、抽出されたＤＮＡの組換えＤＮＡ配列及び抽出したＤＮＡの内在性ＤＮＡ配列を同時に増幅することと、（ｃ）組換えＤＮＡ配列が検出された反応ウェルの数、及び内在性ＤＮＡ配列が検出された反応ウェルの数に基づき、試料に含まれる遺伝子組換え体の存在比を算出することと、を備え、（ｄ）試料に含まれる遺伝子組換え体から抽出されたＤＮＡが、複数の組換えＤＮＡ配列認識プローブで認識される少なくとも２つの連結された組換えＤＮＡ配列を含む、遺伝子組換え体の定量法が提供される。
【０００９】
上記の遺伝子組換え体の定量法において、試料に含まれる遺伝子組換え体から抽出されたＤＮＡが、複数の組換えＤＮＡ配列認識プローブで認識される少なくとも２つの連結された組換えＤＮＡ配列を含みうる。この場合、少なくとも２つの組換えＤＮＡ配列が連結されたまま、複数の反応ウェルに分配されうる。
【００１０】
上記の遺伝子組換え体の定量法において、複数の組換えＤＮＡ配列が、プロモーター、導入遺伝子、又はターミネーターを含んでいてもよい。複数の組換えＤＮＡ配列が、プロモーター及びターミネーターを含んでいてもよい。
【００１１】
上記の遺伝子組換え体の定量法において、組換えＤＮＡ配列が検出された反応ウェルの数に基づき、増幅された組換えＤＮＡ配列のコピー数を算出し、内在性ＤＮＡ配列が検出された反応ウェルの数に基づき、増幅された内在性ＤＮＡ配列のコピー数を算出してもよい。増幅された組換えＤＮＡ配列のコピー数及び増幅された内在性ＤＮＡ配列のコピー数に基づき、試料に含まれる遺伝子組換え体の存在比を算出してもよい。増幅された組換えＤＮＡ配列のコピー数を、増幅された内在性ＤＮＡ配列のコピー数及び内標比で除して、試料に含まれる遺伝子組換え体の存在比を算出してもよい。内標比が、純粋な遺伝子組換え体の抽出ＤＮＡ中の組換えＤＮＡ配列の数を、純粋な遺伝子組換え体の抽出ＤＮＡ中の内在性ＤＮＡ配列の数で除して得られてもよい。
【００１２】
上記の遺伝子組換え体の定量法において、試料が複数の遺伝子組換え体を含んでいてもよい。試料がトウモロコシ等の植物を含んでいてもよい。複数の組換えＤＮＡ配列認識プローブで認識される複数の組換えＤＮＡ配列が、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター配列及びＮＯＳターミネーター配列を含んでいてもよい。試料が微生物を含んでいてもよい。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、試料に含まれる遺伝子組換え体の存在比を正確に算出可能な遺伝子組換え体の定量法を提供可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】遺伝子組換えトウモロコシのゲノムに含まれるＤＮＡを示す表である。
【図２】実施例及び比較例で用いた標準物質を説明するための表である。
【図３】実施例の結果を示す表である。
【図４】実施例の結果を示す表である。
【図５】比較例の結果を示す表である。
【図６】比較例の結果を示す表である。
【図７】実施例と比較例の結果を示す表である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下に本発明の実施の形態を説明する。ただし、以下の実施の形態が本発明を限定するものであると理解するべきではない。本開示から当業者には様々な代替実施の形態、実施例及び運用技術が明らかになるはずである。本発明はここでは記載していない様々な実施の形態等を包含するということを理解すべきである。
【００１６】
（第１の実施の形態）
本発明の第１の実施の形態に係る遺伝子組換え体の定量法は、試料から抽出されたデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を用意することと、複数の組換えＤＮＡ配列のそれぞれを認識する、同じ蛍光物質で標識されている複数の組換えＤＮＡ配列認識プローブを用意することと、内在性ＤＮＡ配列を認識する、蛍光物質で標識されている内在性ＤＮＡ配列認識プローブを用意することと、を備える。試料に含まれる遺伝子組換え体から抽出されたＤＮＡは、複数の組換えＤＮＡ配列認識プローブで認識される少なくとも２つの連結された組換えＤＮＡ配列を含む。複数の組換えＤＮＡ配列認識プローブを標識する蛍光物質と、内在性ＤＮＡ配列認識プローブを標識する蛍光物質と、は、同じであってもよいし、異なっていてもよい。
【００１７】
本発明の第１の実施の形態に係る遺伝子組換え体の定量法は、さらに、試料から抽出されたＤＮＡ、及び複数の組換えＤＮＡ配列認識プローブを含む第１の反応ミックスを用意することと、試料から抽出されたＤＮＡ、及び内在性ＤＮＡ配列認識プローブを含む第２の反応ミックスを用意することと、デジタルＰＣＲ装置を用いて、複数の反応ウェルに分配された第１の反応ミックス内でＰＣＲを実施し、抽出されたＤＮＡの組換えＤＮＡ配列を増幅することと、デジタルＰＣＲ装置を用いて、複数の反応ウェルに分配された第２の反応ミックス内でＰＣＲを実施し、抽出されたＤＮＡの内在性ＤＮＡ配列を増幅することと、組換えＤＮＡ配列が検出された反応ウェルの数、及び内在性ＤＮＡ配列が検出された反応ウェルの数に基づき、試料に含まれる遺伝子組換え体の存在比を算出することと、を備える。
【００１８】
試料は、生物の一部又は全部を含む。生物は、特に限定されないが、植物又は微生物を含む。植物は、特に限定されないが、トウモロコシ、コムギ、ジャガイモ、ダイズ、テンサイ、ナタネ、ワタ、アルファルファ、及びパパイア等を含む。微生物は、特に限定されないが、大腸菌、及び酵母等を含む。以下においては、試料が、天然の非遺伝子組換えトウモロコシと、遺伝子組換えトウモロコシと、を含む例を説明する。試料が、複数系統の遺伝子組換えトウモロコシを含んでいてもよい。
【００１９】
特定非営利活動法人国際生命科学研究機構（ＩＬＳＩ）の遺伝子組換え作物データベースに２０１５年１０月において登録されている遺伝子組換えトウモロコシは、６２系統ある。遺伝子組換えトウモロコシの具体例としては、図１に示すように、Ｂｔ１１、Ｅ１７６、ＧＡ２１、ＭＯＮ８１０（Ｍ８１０）、ＭＯＮ８６３（Ｍ８６３）、ＮＫ６０３、Ｔ２５、ＴＣ１５０７、ＭＩＲ６０４、Ｄ５９１２２、及びＭＯＮ８８０１７（Ｍ８８０１７）等がある。
【００２０】
遺伝子組換えトウモロコシは、組換えＤＮＡ配列をゲノム中に有している。組換えＤＮＡ配列とは、例えば天然の非遺伝子組換えトウモロコシのゲノムが有しない導入遺伝子や、導入遺伝子を挟むプロモーター及びターミネーターである。プロモーターは導入遺伝子を発現させるために必要な領域であり、ターミネーターは導入遺伝子の発現を終了するために必要な領域である。
【００２１】
組換えＤＮＡ配列の一例であるカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーター配列（以下、「Ｐ３５Ｓ」ともいう。）は、Ｂｔ１１、Ｅ１７６、Ｍ８１０、Ｍ８６３、ＮＫ６０３、Ｔ２５、ＴＣ１５０７、Ｄ５９１２２、及びＭ８８０１７のゲノムに含まれている。また、組換えＤＮＡ配列の一例であるノパリン合成酵素（ＮＯＳ）ターミネーター配列（以下、「ＴＮＯＳ」ともいう。）は、Ｂｔ１１、ＧＡ２１、Ｍ８６３、ＮＫ６０３、ＭＩＲ６０４、及びＭ８８０１７のゲノムに含まれている。
【００２２】
例えば、ＭＯＮ８１０は、Ｐ３５Ｓをゲノム中に含んでいるが、ＴＮＯＳをゲノム中に含んでいない。ＧＡ２１は、Ｐ３５Ｓをゲノム中に含んでいないが、ＴＮＯＳをゲノム中に含んでいる。Ｂｔ１１、ＭＯＮ８６３、ＮＫ６０３、及びＭＯＮ８８０１７は、Ｐ３５ＳとＴＮＯＳの両方をゲノム中に含んでいる。
【００２３】
天然の非遺伝子組換えトウモロコシと、遺伝子組換えトウモロコシと、は、共通する内在性ＤＮＡ配列ＳＳＩＩｂをゲノム中に有している。内在性ＤＮＡ配列とは、生物種が共通に有するＤＮＡ配列のことである。トウモロコシの場合、内在性ＤＮＡ配列としてＳＳＩＩｂがあるが、これに限定されるものではない。
【００２４】
第１の反応ミックスに含まれる複数の組換えＤＮＡ配列認識プローブは、同じ蛍光物質で標識されており、それぞれ、第１の反応ミックスに含まれる抽出ＤＮＡの組換えＤＮＡ配列を認識する。複数の組換えＤＮＡ配列認識プローブは、それぞれ、組換えＤＮＡ配列を含む系統特異的ＤＮＡ配列を認識してもよい。例えば、複数の組換えＤＮＡ配列認識プローブは、組換えＤＮＡ配列を認識するプローブと、系統特異的ＤＮＡ配列を認識するプローブと、を含んでいてもよい。系統特異的ＤＮＡ配列を認識するプローブを含むか否かは、任意である。複数の組換えＤＮＡ配列認識プローブは、例えば、Ｐ３５Ｓを認識するＰ３５Ｓ認識プローブと、ＴＮＯＳを認識するＴＮＯＳ認識プローブと、を含む。Ｐ３５Ｓ認識プローブと、ＴＮＯＳ認識プローブと、は、同じ蛍光物質で標識されている。Ｐ３５Ｓ認識プローブと、ＴＮＯＳ認識プローブと、を標識する蛍光物質としては、例えば、カルボキシフルオレセイン水和物（ＦＡＭ）が使用可能である。
【００２５】
第１の反応ミックスは、さらに、複数の組換えＤＮＡ配列のそれぞれを増幅するための複数のプライマーペアを含んでいる。当該プライマーペアは、組換えＤＮＡ配列を含む系統特異的ＤＮＡ配列を増幅してもよい。例えば、複数のプライマーペアは、組換えＤＮＡ配列を増幅するためのプライマーペアと、系統特異的ＤＮＡ配列を増幅するためのプライマーペアと、を含んでいてもよい。系統特異的ＤＮＡ配列を増幅するためのプライマーペアを含むか否かは、任意である。複数の組換えＤＮＡ配列のそれぞれを増幅するための複数のプライマーペアは、例えば、Ｐ３５ＳのＤＮＡ配列を増幅するためのプライマーペアと、ＴＮＯＳのＤＮＡ配列を増幅するためのプライマーペアと、を含んでいる。
【００２６】
第２の反応ミックスに含まれる内在性ＤＮＡ配列認識プローブは、例えば、トウモロコシの内在性ＤＮＡ配列であるＳＳＩＩｂを認識する。内在性ＤＮＡ配列認識プローブは、例えば、ＦＡＭ又はＶＩＣで標識されている。第２の反応ミックスは、さらに、内在性ＤＮＡ配列を増幅するためのプライマーペアを含んでいる。内在性ＤＮＡ配列を増幅するためのプライマーペアは、例えば、ＳＳＩＩｂのＤＮＡ配列を増幅するためのプライマーペアを含んでいる。
【００２７】
試料に含まれる遺伝子組換え体から抽出されたＤＮＡは、複数の組換えＤＮＡ配列認識プローブで認識される少なくとも２つの連結された組換えＤＮＡ配列を含む。連結された組換えＤＮＡ配列とは、同じ染色体上に存在する組換えＤＮＡ配列のことである。したがって、少なくとも２つの組換えＤＮＡ配列は同じ染色体上に存在しており、好ましくは連結された２つの組換えＤＮＡ配列の間の長さは、１０ｋｂｐ以下である。また、より好ましくは連結された２つの組換えＤＮＡ配列の間の長さは、５ｋｂｐ以下である。
【００２８】
例えば、試料に含まれる遺伝子組換え体がＢｔ１１、ＭＯＮ８６３、ＮＫ６０３、及びＭＯＮ８８０１７である場合、Ｂｔ１１、ＭＯＮ８６３、ＮＫ６０３、及びＭＯＮ８８０１７から抽出されたＤＮＡは、連結されたＰ３５ＳとＴＮＯＳを含む。複数の組換えＤＮＡ配列認識プローブで認識される少なくとも２つの連結された組換えＤＮＡ配列は、制限酵素等で分解されないことが好ましい。
【００２９】
デジタルＰＣＲ装置とは、デジタルＰＣＲを実施する装置である。デジタルＰＣＲにおいては、反応ミックスは、チップに設けられた数千から数万という多数の反応ウェルに分配される。反応ウェルは、例えば、開口の大きさが数十μｍである微小なウェルやナノリットルサイズのドロップレットである。反応ミックスをチップに添加すると、チップ上の一部の反応ウェルには抽出されたＤＮＡに由来する標的ＤＮＡ配列が好ましくは１コピー程度含まれ、その他の反応ウェルには抽出されたＤＮＡに由来する標的ＤＮＡ配列が含まれない状態となるよう、反応ミックスが反応ウェルに分配される。
【００３０】
例えば、試料に含まれる遺伝子組換え体がＢｔ１１、ＭＯＮ８６３、ＮＫ６０３、及びＭＯＮ８８０１７である場合、Ｂｔ１１、ＭＯＮ８６３、ＮＫ６０３、及びＭＯＮ８８０１７から抽出されたＤＮＡにおいて、Ｐ３５ＳとＴＮＯＳは連結されたまま、複数の反応ウェルに分配される。したがって、同じ反応ウェル内にＰ３５ＳとＴＮＯＳが連結されたまま入れられる。
【００３１】
複数の反応ウェルに分配された第１の反応ミックス内で、抽出されたＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを実施すると、抽出されたＤＮＡの複数の組換えＤＮＡ配列の少なくとも一部が存在する反応ウェルでは、複数の組換えＤＮＡ配列の少なくとも一部が増幅され、蛍光物質が蛍光を発する。例えば、複数の組換えＤＮＡ配列認識プローブがＦＡＭで標識されている場合、Ｐ３５ＳのＤＮＡ配列が存在する反応ウェルでは、Ｐ３５ＳのＤＮＡ配列が増幅され、ＦＡＭが蛍光を発する。ＴＮＯＳのＤＮＡ配列が存在する反応ウェルでは、ＴＮＯＳのＤＮＡ配列が増幅され、ＦＡＭが蛍光を発する。Ｐ３５ＳのＤＮＡ配列とＴＮＯＳのＤＮＡ配列の両方が存在する反応ウェルでは、Ｐ３５ＳのＤＮＡ配列とＴＮＯＳのＤＮＡ配列の両方が増幅され、ＦＡＭが蛍光を発する。
【００３２】
第１の反応ミックスについて、デジタルＰＣＲを実施した後、デジタルＰＣＲ装置のリーダーで、蛍光物質が検出された反応ウェルの数を計測する。例えば、複数の組換えＤＮＡ配列認識プローブがＦＡＭで標識されている場合、ＦＡＭの蛍光が検出された反応ウェルの数を計測する。この際、Ｐ３５ＳのＤＮＡ配列が存在するがＴＮＯＳのＤＮＡ配列が存在しない反応ウェルと、ＴＮＯＳのＤＮＡ配列が存在するがＰ３５ＳのＤＮＡ配列が存在しない反応ウェルと、Ｐ３５ＳのＤＮＡ配列とＴＮＯＳのＤＮＡ配列の両方が存在する反応ウェルと、は、いずれもＦＡＭの蛍光を発し、デジタルＰＣＲ装置は、これらの反応ウェルを区別することなく計数する。
【００３３】
さらに、蛍光物質が検出された反応ウェルの数に基づき、増幅された組換えＤＮＡ配列のコピー数を算出する。例えば、ＦＡＭの蛍光が検出された反応ウェルの数に基づき、増幅されたＰ３５Ｓ及び／又はＴＮＯＳのコピー数を算出する。
【００３４】
次に、複数の反応ウェルに分配された第２の反応ミックス内で、抽出されたＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを実施すると、抽出されたＤＮＡの内在性ＤＮＡ配列が存在する反応ウェルでは、内在性ＤＮＡ配列が増幅され、蛍光物質が蛍光を発する。例えば、内在性ＤＮＡ配列認識プローブがＶＩＣで標識されている場合、ＳＳＩＩｂのＤＮＡ配列が存在する反応ウェルでは、ＳＳＩＩｂのＤＮＡ配列が増幅され、ＶＩＣが蛍光を発する。
【００３５】
第２の反応ミックスについて、デジタルＰＣＲを実施した後、デジタルＰＣＲ装置のリーダーで、蛍光物質が検出された反応ウェルの数を計測する。例えば、内在性ＤＮＡ配列認識プローブがＶＩＣで標識されている場合、ＶＩＣの蛍光が検出された反応ウェルの数を計測する。
【００３６】
さらに、蛍光物質が検出された反応ウェルの数に基づき、増幅された内在性ＤＮＡ配列のコピー数を算出する。例えば、ＶＩＣの蛍光が検出された反応ウェルの数に基づき、増幅されたＳＳＩＩｂのコピー数を算出する。
【００３７】
次に、増幅された組換えＤＮＡ配列のコピー数を、増幅された内在性ＤＮＡ配列のコピー数及び内標比で除して、試料に含まれる遺伝子組換え体の存在比を算出する。例えば、増幅されたＰ３５Ｓ及び／又はＴＮＯＳのコピー数を、増幅されたＳＳＩＩｂのコピー数及び内標比で除して、さらに１００を乗じて試料に含まれる遺伝子組換え体の存在比（％）を算出する。内標比は、純粋な遺伝子組換え体の抽出ＤＮＡ中の組換えＤＮＡ配列の数を、純粋な遺伝子組換え体の抽出ＤＮＡ中の内在性ＤＮＡ配列の数で除して得られる。純粋な遺伝子組換え体とは、１００％の遺伝子組換え体であり、天然の非遺伝子組換え体を含まない。文献等に記載されている内標比の値を用いてもよい。
【００３８】
遺伝子組換えトウモロコシは、系統毎に、系統特異的ＤＮＡ配列をゲノム中に有している。したがって、系統特異的ＤＮＡ配列を標的にして試料を検査すれば、特定の系統の遺伝子組換えトウモロコシを精度よく検出することが可能である。しかし、試料に含まれる遺伝子組換えトウモロコシの系統は、不明であることが多い。そのため、例えば、Ｂｔ１１の系統特異的ＤＮＡ配列を標的にして、試料を検査しても、試料がＢｔ１１以外の遺伝子組換えトウモロコシを含んでいる場合は、遺伝子組換えトウモロコシを検出することはできない。したがって、例えば、６２系統の遺伝子組換えトウモロコシのそれぞれの系統特異的ＤＮＡ配列に対して、プライマー・プローブセットを用意すれば、試料に含まれている遺伝子組換えトウモロコシが何であれ検出することができるが、作業が繁雑になるという問題が生じる。
【００３９】
そこで、従来、ＧＡ２１の系統特異的ＤＮＡ配列と、Ｐ３５Ｓと、の両方を標的として、遺伝子組換えトウモロコシを検出することが提案されている。この場合、６２系統のうち、５５系統の遺伝子組換えトウモロコシを検出できる。これに対し、Ｐ３５Ｓと、ＴＮＯＳと、の両方を標的とすれば、６２系統のうち、５９系統の遺伝子組換えトウモロコシを検出できる。そのため、従来よりも検出できる遺伝子組換えトウモロコシの系統を増やすことが可能となる。
【００４０】
しかし、試料に含まれる遺伝子組換え体が、例えばＢｔ１１のようにＰ３５ＳとＴＮＯＳの両方をゲノム中に含む場合、リアルタイムＰＣＲで増幅されたＰ３５Ｓのコピー数と、リアルタイムＰＣＲで増幅されたＴＮＯＳのコピー数と、に基づいて算出される遺伝子組換え体の存在比は、実際の遺伝子組換え体の存在比よりも大きくなる傾向にある。この場合、遺伝子組換え体の存在比を正確に測定することができない。これは、リアルタイムＰＣＲで増幅されたＰ３５Ｓのコピー数と、リアルタイムＰＣＲで増幅されたＴＮＯＳのコピー数と、を合算しているためである。
【００４１】
これに対し、第１の実施の形態に係る遺伝子組換え体の定量法は、デジタルＰＣＲを用いるため、一つの反応ウェルの中にＰ３５ＳとＴＮＯＳが存在しても、ＦＡＭの蛍光が検出された一つの反応ウェルとして計数される。そのため、算出される遺伝子組換え体の存在比が、実際の遺伝子組換え体の存在比よりも大きくなることが抑制される傾向にある。そのため、遺伝子組換え体の存在比を正確に測定することが可能となる。
【００４２】
なお、以上においては、複数の組換えＤＮＡ配列がＰ３５ＳとＴＮＯＳの組み合わせである例を説明したが、これに限定されないことはもちろんである。例えば、複数の組換えＤＮＡ配列がＴＮＯＳとＧＡ２１系統特異的ＤＮＡ配列であってもよい。このように、複数の組換えＤＮＡ配列は、プロモーターとターミネーターの組み合わせ、プロモーターと導入遺伝子の組み合わせ、プロモーターと系統特異的ＤＮＡ配列の組み合わせ、ターミネーターと導入遺伝子の組み合わせ、ターミネーターと系統特異的ＤＮＡ配列の組み合わせ、あるいは導入遺伝子と系統特異的ＤＮＡ配列の組み合わせ等を含みうる。
【００４３】
（第２の実施の形態）
本発明の第２の実施の形態に係る遺伝子組換え体の定量法は、試料から抽出されたＤＮＡを用意することと、複数の組換えＤＮＡ配列のそれぞれを認識する、同じ第１の蛍光物質で標識されている複数の組換えＤＮＡ配列認識プローブを用意することと、内在性ＤＮＡ配列を認識する、第２の蛍光物質で標識されている内在性ＤＮＡ配列認識プローブを用意することと、を備える。試料に含まれる遺伝子組換え体から抽出されたＤＮＡは、複数の組換えＤＮＡ配列認識プローブで認識される少なくとも２つの連結された組換えＤＮＡ配列を含む。第２の実施の形態においては、複数の組換えＤＮＡ配列認識プローブを標識する第１の蛍光物質と、内在性ＤＮＡ配列認識プローブを標識する第２の蛍光物質と、は、同じにならない。
【００４４】
本発明の第２の実施の形態に係る遺伝子組換え体の定量法は、さらに、試料から抽出されたＤＮＡと、複数の組換えＤＮＡ配列認識プローブと、内在性ＤＮＡ配列認識プローブと、を含む反応ミックスを用意することと、デジタルＰＣＲ装置を用いて、複数の反応ウェルに分配された反応ミックス内でＰＣＲを実施し、抽出されたＤＮＡの組換えＤＮＡ配列及び抽出したＤＮＡの内在性ＤＮＡ配列を同時に増幅することと、組換えＤＮＡ配列が検出された反応ウェルの数、及び内在性ＤＮＡ配列が検出された反応ウェルの数に基づき、試料に含まれる遺伝子組換え体の存在比を算出することと、を備える。
【００４５】
試料から抽出されたＤＮＡ、複数の組換えＤＮＡ配列認識プローブ、及び内在性ＤＮＡ配列認識プローブのそれぞれの説明は、第１の実施の形態と同様であり、複数の組換えＤＮＡ配列認識プローブは、同じ蛍光物質で標識されている。第２の実施の形態に係る遺伝子組換え体の定量法は、反応ミックスに、複数の組換えＤＮＡ配列認識プローブと内在性ＤＮＡ配列認識プローブとの両方が含まれる点で、第１の実施の形態と異なっている。また、第２の実施の形態に係る遺伝子組換え体の定量法は、複数の組換えＤＮＡ配列認識プローブを標識する第１の蛍光物質と、内在性ＤＮＡ配列認識プローブを標識する第２の蛍光物質と、が同じにならない点でも、第１の実施の形態と異なっている。複数の組換えＤＮＡ配列認識プローブは、例えば、ＦＡＭで標識されている。内在性ＤＮＡ配列認識プローブは、例えば、ＶＩＣで標識されている。
【００４６】
第２の実施の形態において、反応ミックスは、さらに、複数の組換えＤＮＡ配列のそれぞれを増幅するための複数のプライマーペアと、内在性ＤＮＡ配列を増幅するためのプライマーペアと、を含んでいる。それぞれのプライマーペアの説明は、第１の実施の形態と同様である。第２の実施の形態に係る遺伝子組換え体の定量法は、反応ミックスに、複数の組換えＤＮＡ配列のそれぞれを増幅するための複数のプライマーペアと、内在性ＤＮＡ配列を増幅するためのプライマーペアと、の両方が含まれる点で、第１の実施の形態と異なっている。
【００４７】
第２の実施の形態においても、複数の組換えＤＮＡ配列認識プローブで認識される少なくとも２つの連結された組換えＤＮＡ配列は、制限酵素等で分解されないことが好ましい。第２の実施の形態においても、例えば、試料に含まれる遺伝子組換え体がＢｔ１１、ＭＯＮ８６３、ＮＫ６０３、及びＭＯＮ８８０１７である場合、Ｂｔ１１、ＭＯＮ８６３、ＮＫ６０３、及びＭＯＮ８８０１７から抽出されたＤＮＡにおいて、Ｐ３５ＳとＴＮＯＳは連結されたまま、複数の反応ウェルに分配される。したがって、同じ反応ウェル内にＰ３５ＳとＴＮＯＳが連結されたまま入れられる。
【００４８】
第２の実施の形態においては、複数の反応ウェルに分配された反応ミックス内で、抽出されたＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを同時に実施すると、抽出されたＤＮＡの複数の組換えＤＮＡ配列の少なくとも一部が存在する反応ウェルでは、複数の組換えＤＮＡ配列の少なくとも一部が増幅され、第１の蛍光物質が蛍光を発する。抽出されたＤＮＡの内在性ＤＮＡ配列が存在する反応ウェルでは、内在性ＤＮＡ配列が増幅され、第２の蛍光物質が蛍光を発する。例えば、Ｐ３５ＳのＤＮＡ配列が存在する反応ウェルでは、Ｐ３５ＳのＤＮＡ配列が増幅され、ＦＡＭが蛍光を発する。ＴＮＯＳのＤＮＡ配列が存在する反応ウェルでは、ＴＮＯＳのＤＮＡ配列が増幅され、ＦＡＭが蛍光を発する。Ｐ３５ＳのＤＮＡ配列とＴＮＯＳのＤＮＡ配列の両方が存在する反応ウェルでは、Ｐ３５ＳのＤＮＡ配列とＴＮＯＳのＤＮＡ配列の両方が増幅され、ＦＡＭが蛍光を発する。ＳＳＩＩｂのＤＮＡ配列が存在する反応ウェルでは、ＳＳＩＩｂのＤＮＡ配列が増幅され、ＶＩＣが蛍光を発する。
【００４９】
デジタルＰＣＲを実施した後、デジタルＰＣＲ装置のリーダーで、第１の蛍光物質が検出された反応ウェルの数と、第２の蛍光物質が検出された反応ウェルの数と、を計測する。 例えば、複数の組換えＤＮＡ配列認識プローブがＦＡＭで標識されており、内在性ＤＮＡ配列認識プローブがＶＩＣで標識されている場合、ＦＡＭの蛍光が検出された反応ウェルの数と、ＶＩＣの蛍光が検出された反応ウェルの数と、を計測する。この際、Ｐ３５ＳのＤＮＡ配列が存在するがＴＮＯＳのＤＮＡ配列が存在しない反応ウェルと、ＴＮＯＳのＤＮＡ配列が存在するがＰ３５ＳのＤＮＡ配列が存在しない反応ウェルと、Ｐ３５ＳのＤＮＡ配列とＴＮＯＳのＤＮＡ配列の両方が存在する反応ウェルと、は、いずれもＦＡＭの蛍光を発し、デジタルＰＣＲ装置は、これらの反応ウェルを区別することなく計数する。
【００５０】
さらに、第１の蛍光物質が検出された反応ウェルの数に基づき、増幅された組換えＤＮＡ配列のコピー数を算出し、第２の蛍光物質が検出された反応ウェルの数に基づき、増幅された内在性ＤＮＡ配列のコピー数を算出する。 例えば、ＦＡＭの蛍光が検出された反応ウェルの数に基づき、増幅されたＰ３５Ｓ及び／又はＴＮＯＳのコピー数を算出し、ＶＩＣの蛍光が検出された反応ウェルの数に基づき、増幅されたＳＳＩＩｂのコピー数を算出する。
【００５１】
その後の、試料に含まれる遺伝子組換え体の存在比を算出する方法は、第１の実施の形態と同様である。第２の実施の形態に係る遺伝子組換え体の定量法によれば、組換えＤＮＡ配列と内在性ＤＮＡ配列を同じチップ内で同時に増幅できるため、増幅工程における煩雑さをより解消することが可能である。
【００５２】
以下に本発明の実施例を説明する。但し、本発明は以下の実施例に限定されないことはもちろんである。
【００５３】
（実施例）
試料として、以下に示す３種類の遺伝子組換えトウモロコシ系統標準物質を用意した。
・１０％（質量濃度）ＭＯＮ８１０認証標準物質（カタログナンバー：ERMBF413GK-1G、シグマアルドリッチ）
・１０％（質量濃度）３２７２認証標準物質（カタログナンバー：ERMBF420C-1G、シグマアルドリッチ）
・５％（質量濃度）Ｂｔ１１認証標準物質（カタログナンバー：ERMBF412F-1G、シグマアルドリッチ）
【００５４】
図２に示すように、ＭＯＮ８１０は、ゲノム中に、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター配列（Ｐ３５Ｓ）を１コピー含んでいるが、ＮＯＳターミネーター配列（ＴＮＯＳ）を含んでいない。３２７２は、ゲノム中に、プロモーターＰ３５Ｓを含んでいないが、ターミネーターＴＮＯＳを１コピー含んでいる。Ｂｔ１１は、ゲノム中に、プロモーターＰ３５Ｓと、ターミネーターＴＮＯＳと、を、それぞれ２コピー含んでいる。また、ＭＯＮ８１０、３２７２、及びＢｔ１１は、いずれも、内在性ＤＮＡ配列であるＳＳＩＩｂを含んでいる。
【００５５】
上記の３種類の遺伝子組換えトウモロコシ系統標準物質から、ＤＮｅａｓｙ（登録商標）  Ｐｌａｎｔ  Ｍａｘｉ  Ｋｉｔ（キアゲン）を用いてＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡを制限酵素等で切断することはしなかった。したがって、Ｂｔ１１認証標準物質から抽出されたＤＮＡにおいて、Ｐ３５Ｓと、ＴＮＯＳと、は連結されたままであった。
【００５６】
次に、Ｐ３５ＳのＤＮＡ配列を増幅するためのプライマーペア（配列番号１、２）と、Ｐ３５ＳのＤＮＡ配列を増幅するためのプライマーペアの間のＤＮＡ配列を認識するＰ３５Ｓ認識プローブ（配列番号３）を用意した。Ｐ３５Ｓ認識プローブは、カルボキシフルオレセイン水和物（ＦＡＭ、登録商標、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で標識した。
Ｐ３５ＳのＤＮＡ配列を増幅するためのプライマーペアの配列は以下のとおりである。
5'-ATTGATGTGATATCTCCACTGACGT-3'
5'- CCTCTCCAAATGAAATGAACTTCCT-3'
Ｐ３５Ｓ認識プローブの配列は以下のとおりである。
5’- FAM-TCGCAAGACCCTTCCT-MGB-3’
【００５７】
また、ＴＮＯＳのＤＮＡ配列を増幅するためのプライマーペア（配列番号４、５）と、ＴＮＯＳのＤＮＡ配列を増幅するためのプライマーペアの間のＤＮＡ配列を認識するＴＮＯＳ認識プローブ（配列番号６）を用意した。ＴＮＯＳ認識プローブは、Ｐ３５Ｓ認識プローブと同じく、カルボキシフルオレセイン水和物（ＦＡＭ、登録商標、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で標識した。
ＴＮＯＳのＤＮＡ配列を増幅するためのプライマーペアの配列は以下のとおりである。
5'- GTAATAATTAACATGTAATGCATGACGTTATTT-3'
5'- CGCTATATTTTGTTTTCTATCGCGT-3'
ＴＮＯＳ認識プローブの配列は以下のとおりである。
5’- FAM-AGATGGGTTTTTATGATTAGAGTCCCGCAA-TAMRA-3’
【００５８】
また、ＳＳＩＩｂのＤＮＡ配列を増幅するためのプライマーペア（配列番号７、８）と、ＳＳＩＩｂのＤＮＡ配列を増幅するためのプライマーペアの間のＤＮＡ配列を認識するＳＳＩＩｂ認識プローブ（配列番号９）を用意した。ＳＳＩＩｂ認識プローブは、ＶＩＣ（登録商標、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で標識した。
ＳＳＩＩｂのＤＮＡ配列を増幅するためのプライマーペアの配列は以下のとおりである。
5'- CTCCCAATCCTTTGACATCTGC-3'
5'- TCGATTTCTCTCTTGGTGACAGG-3'
ＳＳＩＩｂ認識プローブの配列は以下のとおりである。
5’- VIC-AGCAAAGTCAGAGCGCTGCAATGCA-TAMRA-3’
【００５９】
デジタルＰＣＲ装置として、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ（登録商標）３ＤデジタルＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用意した。当該システムは、均一なサイズの２００００個の反応ウェルが設けられたチップを格納し、それぞれの反応ウェル内でＰＣＲを実施する。
【００６０】
３つの試料のそれぞれについて、デジタルＰＣＲの反応ミックスを調製した。８μＬのＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ（登録商標）３Ｄ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に、終濃度がそれぞれ０．９μｍｏｌ／ＬとなるようＰ３５ＳのＤＮＡ配列を増幅するためのプライマーペアとＴＮＯＳのＤＮＡ配列を増幅するためのプライマーペアとＳＳＩＩｂのＤＮＡ配列を増幅するためのプライマーペアとを添加し、また、終濃度がそれぞれ０．２５μｍｏｌ／ＬとなるようＰ３５Ｓ認識プローブとＴＮＯＳ認識プローブとＳＳＩＩｂ認識プローブとを添加し、さらに、調製後の反応ミックスあたり１００ｎｇの標準物質の抽出ＤＮＡが含まれるよう、標準物質の抽出ＤＮＡを添加した。またさらに、反応ミックスの液量が１６μＬとなるよう、蒸留水を添加した。
【００６１】
３つの試料のそれぞれについて、用意した１６μＬの反応ミックスのうち１４．５μＬをデジタルＰＣＲ用のチップに分配した。上述したように、標準物質の抽出ＤＮＡは切断されていないため、Ｂｔ１１認証標準物質から抽出されたＤＮＡにおいて、Ｐ３５Ｓと、ＴＮＯＳと、は連結されたまま、反応ウェルに分配された。その後、反応ウェルにおいてＰＣＲを実施し、抽出ＤＮＡを鋳型として、各試料の組換えＤＮＡ配列（Ｐ３５Ｓ及び／又はＴＮＯＳ）と、内在性ＤＮＡ配列（ＳＳＩＩｂ）と、を同時に増幅した。ＰＣＲにおいては、９６℃１０分間のＤＮＡポリメラーゼ活性化ステップを実施した後、６０℃２分間のアニーリング及びＤＮＡ伸長ステップと、９８℃３０秒の変性ステップと、を含むサイクルを３９回繰り返し、その後、６０℃２分間のＤＮＡ伸長最終ステップを経て、１０℃に冷却するステップを実施した。
【００６２】
ＰＣＲの後、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ（登録商標）３ＤデジタルＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）でチップの反応ウェルにおけるＦＡＭによる蛍光の有無、及びＶＩＣによる蛍光の有無を測定した。その後、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ（登録商標）３Ｄ  ＡｎａｌｙｓｉｓＳｕｉｔｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）ソフトウェアによって、蛍光の測定データを分析し、ＦＡＭによる蛍光が検出された反応ウェルの数から、増幅された組換えＤＮＡ配列（Ｐ３５Ｓ及び／又はＴＮＯＳ）のコピー数を算出し、ＶＩＣによる蛍光が検出された反応ウェルの数から、増幅された内在性ＤＮＡ配列（ＳＳＩＩｂ）のコピー数を算出した。なお、ＦＡＭの蛍光の有無の閾値としては５０００を用い、ＶＩＣの蛍光の有無の閾値としては２０００を用いた。
【００６３】
分析の結果、試料が１０％ＭＯＮ８１０認証標準物質であった場合、図３に示すように、増幅された組換えＤＮＡ配列（Ｐ３５Ｓ）の１μＬあたりのコピー数は１１９．５であり、増幅された内在性ＤＮＡ配列（ＳＳＩＩｂ）の１μＬあたりのコピー数は２６９４．１であった。増幅された組換えＤＮＡ配列のコピー数を増幅された内在性ＤＮＡ配列のコピー数で除した値は、０．０４４であった。試料が１０％ＭＯＮ８１０認証標準物質であったため、０．０４４に１０を乗じた０．４４を、試料が１００％ＭＯＮ８１０であった場合の増幅された組換えＤＮＡ配列のコピー数を増幅された内在性ＤＮＡ配列のコピー数で除した値で定義される内標比とした。
【００６４】
図４に示すように、試料が１０％ＭＯＮ８１０認証標準物質であった場合、内標比０．４４を用いて算出される遺伝子組換え体の存在比は、１０．０％であった。試料が１０％３２７２認証標準物質であった場合、内標比０．４４を用いて算出される遺伝子組換え体の存在比は、１０．５％であった。試料が５％Ｂｔ１１認証標準物質であった場合、内標比０．４４を用いて算出される遺伝子組換え体の存在比は、５．９％であった。
【００６５】
（比較例）
実施例と同様に、１０％ＭＯＮ８１０認証標準物質、１０％３２７２認証標準物質、及び５％Ｂｔ１１認証標準物質のそれぞれからＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡを制限酵素等で切断することはしなかった。
【００６６】
次に、Ｐ３５ＳのＤＮＡ配列を増幅するためのプライマーペア（配列番号１、２）と、Ｐ３５ＳのＤＮＡ配列を増幅するためのプライマーペアの間のＤＮＡ配列を認識するＰ３５Ｓ認識プローブ（配列番号３）を用意した。
【００６７】
また、ＴＮＯＳのＤＮＡ配列を増幅するためのプライマーペア（配列番号４、５）と、ＴＮＯＳのＤＮＡ配列を増幅するためのプライマーペアの間のＤＮＡ配列を認識するＴＮＯＳ認識プローブ（配列番号６）を用意した。
【００６８】
また、ＳＳＩＩｂのＤＮＡ配列を増幅するためのプライマーペア（配列番号７、８）と、ＳＳＩＩｂのＤＮＡ配列を増幅するためのプライマーペアの間のＤＮＡ配列を認識するＳＳＩＩｂ認識プローブ（配列番号９）を用意した。
【００６９】
３つの試料のそれぞれについて、リアルタイムＰＣＲの反応ミックスを調製した。１２．５μＬのＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に、終濃度が０．５μｍｏｌ／ＬとなるようＰ３５ＳのＤＮＡ配列を増幅するためのプライマーペア、ＴＮＯＳのＤＮＡ配列を増幅するためのプライマーペア、又はＳＳＩＩｂのＤＮＡ配列を増幅するためのプライマーペアを添加し、また、終濃度が０．２μｍｏｌ／ＬとなるようＰ３５Ｓ認識プローブ、ＴＮＯＳ認識プローブ、又はＳＳＩＩｂ認識プローブを添加し、さらに、反応系あたり５０ｎｇの標準物質の抽出ＤＮＡが含まれるよう、標準物質の抽出ＤＮＡを添加した。またさらに、反応ミックスの液量が２５μＬとなるよう、蒸留水を添加した。
【００７０】
その後、「ＪＡＳ  分析試験ハンドブック  遺伝子組換え食品検査・分析マニュアル  第３版」にしたがって、リアルタイムＰＣＲ装置（ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００、登録商標、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてＰＣＲを実施し、抽出ＤＮＡを鋳型として、各試料のＰ３５Ｓと、ＴＮＯＳと、ＳＳＩＩｂと、を別々に増幅して、Ｐ３５Ｓのコピー数と、ＴＮＯＳのコピー数と、ＳＳＩＩｂのコピー数と、を算出した。
【００７１】
図５に示すように、試料が１０％３２７２認証標準物質であった場合、Ｐ３５Ｓのコピー数は０であり、ＴＮＯＳのコピー数は８８５であり、ＳＳＩＩｂのコピー数は２０９００であった。ＴＮＯＳのコピー数をＳＳＩＩｂのコピー数で除した値は、０．０４２であった。試料が１０％３２７２認証標準物質であったため、０．０４２に１０を乗じた０．４２を、試料が１００％３２７２であった場合のＴＮＯＳの内標比とした。また、「ＪＡＳ  分析試験ハンドブック  遺伝子組換え食品検査・分析マニュアル  第３版」にしたがって、０．３９をＰ３５Ｓの内標比とした。
【００７２】
図６に示すように、試料が１０％ＭＯＮ８１０認証標準物質であった場合、内標比０．３９を用いて算出される遺伝子組換え体の存在比は、１２．６％であった。試料が１０％３２７２認証標準物質であった場合、内標比０．４２を用いて算出される遺伝子組換え体の存在比は、１０．１％であった。試料が５％Ｂｔ１１認証標準物質であった場合、Ｐ３５Ｓの内標比０．３９及びＴＮＯＳの内標比０．４２を用いて算出される遺伝子組換え体の存在比は、１４．９％であった。
【００７３】
図７に示すように、比較例に係るリアルタイムＰＣＲで定量された遺伝子組換え体の存在比は、ＭＯＮ８１０及び３２７２については、認証標準物質中における遺伝子組換え体の実際の存在比に近かったが、Ｂｔ１１については、認証標準物質中における遺伝子組換え体の実際の存在比よりも大きかった。これは、Ｂｔ１１は、ゲノム中にＰ３５ＳとＴＮＯＳをそれぞれ２コピーずつ含んでいるため、リアルタイムＰＣＲで増幅されたＰ３５Ｓのコピー数と、リアルタイムＰＣＲで増幅されたＴＮＯＳのコピー数と、を合算したためと考えられる。
【００７４】
なお、例えばトウモロコシの遺伝子組換え体の実際の定量工程においては、試料がＢｔ１１のようなＰ３５ＳとＴＮＯＳの両方を含むトウモロコシを含んでいるのか、ＭＯＮ８１０のようなＰ３５Ｓを含むトウモロコシと３２７２のようなＴＮＯＳを含むトウモロコシとを含んでいるのかは通常分からない。リアルタイムＰＣＲでＰ３５ＳとＴＮＯＳの両方が増幅された場合、リアルタイムＰＣＲで増幅されたＰ３５Ｓのコピー数と、リアルタイムＰＣＲで増幅されたＴＮＯＳのコピー数と、を合算して遺伝子組換え体の存在比を算出する。したがって、試料がＢｔ１１のようなＰ３５ＳとＴＮＯＳの両方を含むトウモロコシを含んでいた場合、算出された遺伝子組換え体の存在比は実際の存在比よりも大きくなってしまう。
【００７５】
これに対し、実施例に係るデジタルＰＣＲで定量された遺伝子組換え体の存在比は、ＭＯＮ８１０、３２７２、及びＢｔ１１のいずれについても、認証標準物質中における遺伝子組換え体の実際の存在比に近かった。実施例に係るデジタルＰＣＲにおいては、Ｐ３５Ｓ認識プローブとＴＮＯＳ認識プローブを同じ蛍光物質で標識する。また、Ｂｔ１１のＰ３５ＳとＴＮＯＳが連結されたままの抽出ＤＮＡは同じ反応ウェルに入る。そのため、同じ反応ウェル内でＰ３５ＳとＴＮＯＳの両方が増幅され、Ｐ３５Ｓ認識プローブ由来の蛍光物質と、ＴＮＯＳ認識プローブ由来の蛍光物質と、の両方が蛍光を発しても、デジタルＰＣＲにおいては、反応ウェルにおいて閾値以上の蛍光が発せられたか否かのみを判定してコピー数を算出するため、Ｂｔ１１の存在比を実際以上に大きく定量しないと考えられる。
【００７６】
以上示したように、実施例に係るデジタルＰＣＲで定量された遺伝子組換え体の存在比は正確であった。また、リアルタイムＰＣＲでは、Ｐ３５Ｓと、ＴＮＯＳと、ＳＳＩＩｂと、を別々に増幅させる必要があるが、デジタルＰＣＲでは、組換えＤＮＡ配列（Ｐ３５Ｓ／ＴＮＯＳ）と内在性ＤＮＡ配列（ＳＳＩＩｂ）を認識するプローブを異なる蛍光物質で標識すれば、組換えＤＮＡ配列と内在性ＤＮＡ配列を同じチップ内で同時に増幅できるため、増幅工程における煩雑さを解消できた。さらに、リアルタイムＰＣＲでは、標準分子を用いて、Ｐ３５ＳとＴＮＯＳとＳＳＩＩｂのそれぞれについて検量線を作成する必要があるが、デジタルＰＣＲでは、検量線を作成する必要がなく、分析工程が容易であった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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