(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも両端部を有する第１流体流路を備えるバイオリアクターと、
前記バイオリアクター内に設けられ、毛細管内側部分を有し、前記毛細管内側部分に連通する第１ポートに毛細管内側循環ループの第１端部が接続され、前記毛細管内側部分に連通する第２ポートに前記毛細管内側循環ループの第２端部が接続された中空糸膜と、
前記第１流体流路を介して前記毛細管内側循環ループと接続された流体入口路と、
前記流体入口路及び前記第１流体流路を介して前記毛細管内側循環ループと流体的に関連付けられ、複数の細胞を収容した細胞投入バッグと、
前記毛細管内側循環ループにおいて流体を循環させる毛細管内側循環ポンプと、
前記バイオリアクターの毛細管外側部分に連通し、前記中空糸膜の毛細管の外側を流れる毛細管外側循環ループと、
前記毛細管外側循環ループにおいて流体を循環させる毛細管外側循環ポンプと、
前記毛細管外側循環ループに設けられ、前記毛細管外側循環ループ内を流れる培地に対してガス成分を授受するガス移送モジュールと、
前記バイオリアクターの出口と前記毛細管外側循環ポンプとの間の前記毛細管外側循環ループに連通し、廃棄バッグ及び培地バッグの何れか一方が選択的に接続される毛細管外側廃棄バルブと、
前記毛細管外側循環ループに補充流体を供給する培地バッグと、を備えた細胞増殖システムで行われる化学的シグナル伝達を制御する方法であって、該方法は、
前記バイオリアクターを、たんぱく質を含む膜でコーティングするステップと、
前記コーティングするステップの後、前記細胞投入バッグから、前記細胞を前記バイオリアクターへ投入するステップと、
前記細胞を投入するステップにおいて前記毛細管内側循環ポンプを稼動させるステップと、
前記細胞を投入するステップの後、前記細胞増殖システムに取り付けられた前記廃棄バッグを前記培地バッグに交換するステップと、
前記廃棄バッグを前記培地バッグに交換する前記ステップの後、前記毛細管内側循環ポンプを停止するステップと、
を有することを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１記載の方法において、前記培地バッグからの培地は、前記毛細管外側廃棄バルブを通って、前記毛細管外側循環ループを流れて、前記毛細管外側循環ループにおける前記ガス移送モジュールから蒸発する流体を補充することを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項１記載の方法において、前記細胞増殖システムは、前記第１流体流路に設けられた毛細管内側入口ポンプと、前記毛細管外側循環ループに接続された毛細管外側入口流路に設けられた毛細管外側入口ポンプと、を備え、前記廃棄バッグを前記培地バッグに交換する前記ステップの後に、
前記毛細管内側入口ポンプを停止するステップと、
前記毛細管外側入口ポンプを停止するステップと、
前記毛細管外側循環ポンプを稼動状態に維持するステップと、
前記毛細管外側廃棄バルブを開位置に維持するステップと、
をさらに有することを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項１記載の方法において、前記細胞は接着性細胞であることを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項４記載の方法において、該方法は、
前記接着性細胞を前記バイオリアクターの前記中空糸膜に付着させるステップと、
前記毛細管外側循環ポンプを稼動状態に維持することによって、前記毛細管外側循環ループの流れを維持するステップと、
をさらに有することを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項５記載の方法において、前記接着性細胞は、１８時間から２４時間の第１期間、前記バイオリアクターの前記中空糸膜に付着させることを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項６記載の方法において、該方法は、
前記廃棄バッグを前記培地バッグに交換したままの状態で且つ毛細管内側投入ポンプを動作停止にした状態で、前記細胞増殖システムの前記バイオリアクターにおける前記細胞に対してフィーディングを行うステップをさらに有し、
前記フィーディングを行うステップは、前記毛細管内側循環ポンプを稼動させるステップを有することを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項７記載の方法において、該方法は、４５時間から５０時間の第２期間、前記フィーディングを行った後、前記フィーディングを停止するステップをさらに有することを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項７記載の方法において、該方法は、４８時間の第２期間、前記フィーディングを行った後、前記フィーディングを停止するステップをさらに有することを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項７記載の方法において、該方法は、
前記細胞から生成される乳酸の濃度を測定するステップと、
前記乳酸の濃度が６ｍｍｏｌ／Ｌ以上になった時に前記フィーディングを停止するステップと、
をさらに有することを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項１０記載の方法において、該方法は、
前記培地バッグを取り外すステップと、
前記廃棄バッグを挿入するステップと、
毛細管内側入口ポンプを稼動させるステップと、
前記毛細管内側循環ポンプを稼動させるステップと、
前記毛細管外側循環ポンプを稼動状態に維持するステップと、
をさらに有することを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項１１記載の方法において、
前記毛細管内側入口ポンプは、０．１ｍＬ／分の毛細管内側投入レートで稼動し、
前記毛細管内側循環ポンプは、２０ｍＬ／分の毛細管内側循環レートで稼動し、
前記毛細管外側循環ポンプは、３０ｍＬ／分の毛細管外側循環レートで稼動する、
ことを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項１２記載の方法において、該方法は、前記細胞が所望の数で収穫できるようになるまで、前記毛細管内側投入レートを２倍にするステップをさらに有することを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項１３記載の方法において、該方法は、前記細胞が前記所望の数で収穫できるようになった時、
前記バイオリアクターの前記中空糸膜から前記細胞を剥離するステップと、
前記毛細管内側循環ループに前記細胞を懸濁させるステップと、
懸濁状態の前記細胞を収穫バッグへ移送するステップと、
をさらに有することを特徴とする方法。
【請求項１５】
請求項１記載の方法において、前記バイオリアクターをコーティングする前記ステップと前記細胞を前記バイオリアクターへ投入する前記ステップは、前記細胞増殖システムによって自動的に行われることを特徴とする方法。
【請求項１６】
請求項１５記載の方法において、前記バイオリアクターをコーティングする前記ステップと前記細胞を前記バイオリアクターへ投入する前記ステップは、メモリに記憶された予めプログラムされたタスクを実行するプロセッサによって行われることを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項１記載の方法において、前記廃棄バッグを前記培地バッグに交換する前記ステップは、手動で行われることを特徴とする方法。
【請求項１８】
請求項１記載の方法において、前記廃棄バッグを前記培地バッグに交換する前記ステップは、前記細胞増殖システムによって自動的に行われることを特徴とする方法。
【請求項１９】
請求項１８記載の方法において、前記廃棄バッグを前記培地バッグに交換する前記ステップを自動的に行うことは、前記廃棄バッグを交換するタスクを実行するための命令を受け取ることを含み、前記タスクは、前記細胞増殖システムのメモリに記憶されていることを特徴とする方法。
【請求項２０】
請求項１記載の方法において、前記培地バッグには、基本培地が含まれていることを特徴とする方法。
【請求項２１】
請求項２０記載の方法において、前記培地バッグには、５００ｍＬの前記基本培地が含まれていることを特徴とする方法。
【請求項２２】
請求項１記載の方法において、該方法は、
直接供給源から、細胞シグナル伝達タンパク質分子を、前記毛細管内側循環ループに投入するステップと、
前記毛細管内側循環ポンプを稼動させて、前記細胞シグナル伝達タンパク質分子を前記バイオリアクターへ移送するステップと、
をさらに有することを特徴とする方法。
【請求項２３】
請求項２２記載の方法において、前記細胞シグナル伝達タンパク質分子は、前記毛細管内側循環ループのサンプリングコイルに投入されることを特徴とする方法。
【請求項２４】
請求項２２記載の方法において、前記細胞シグナル伝達タンパク質分子は、前記毛細管内側循環ループのサンプルポートに投入されることを特徴とする方法。
【請求項２５】
請求項２３記載の方法において、前記サンプリングコイルと前記毛細管内側循環ループは、ディスポーザブル配管セットの一部であることを特徴とする方法。
【請求項２６】
請求項２４記載の方法において、前記サンプルポートと前記毛細管内側循環ループは、ディスポーザブル配管セットの一部であることを特徴とする方法。
【請求項２７】
請求項１記載の方法において、該方法は、前記細胞を前記バイオリアクターへ投入する前記ステップの前に、
前記毛細管内側循環ループと前記毛細管外側循環ループの流体を、毛細管内側培地バッグからの培地と交換するステップと、
前記毛細管内側培地バッグからの前記培地をガス供給との平衡に達するようにするステップと、
をさらに有することを特徴とする方法。
【請求項２８】
請求項１記載の方法において、該方法は、前記細胞を前記バイオリアクターの前記中空糸膜に分配するステップをさらに有し、前記分配するステップは、前記毛細管内側循環ポンプを稼動させる前記ステップによって行われることを特徴とする方法。
【請求項２９】
少なくとも両端部を有する第１流体流路を備えるバイオリアクターと、
前記バイオリアクター内に設けられ、毛細管内側部分を有し、前記毛細管内側部分に連通する第１ポートに毛細管内側循環ループの第１端部が接続され、前記毛細管内側部分に連通する第２ポートに前記毛細管内側循環ループの第２端部が接続された中空糸膜と、
前記第１流体流路を介して前記毛細管内側循環ループと接続された流体入口路と、
前記流体入口路及び前記第１流体流路を介して前記毛細管内側循環ループと流体的に関連付けられ、複数の細胞を収容した細胞投入バッグと、
前記毛細管内側循環ループにおいて流体を循環させる毛細管内側循環ポンプと、
前記バイオリアクターの毛細管外側部分に連通し、前記中空糸膜の毛細管の外側を流れる毛細管外側循環ループと、
前記毛細管外側循環ループにおいて流体を循環させる毛細管外側循環ポンプと、
前記毛細管外側循環ループに設けられ、前記毛細管外側循環ループ内を流れる培地に対してガス成分を授受するガス移送モジュールと、
前記バイオリアクターの出口と前記毛細管外側循環ポンプとの間の前記毛細管外側循環ループに連通し、廃棄バッグ及び培地バッグの何れか一方が選択的に接続される毛細管外側廃棄バルブと、
前記毛細管外側廃棄バルブを介して、前記毛細管外側循環ループに補充流体を供給する培地バッグと、を備え、
前記培地バッグから前記補充流体を前記毛細管外側循環ループへ受動的に付加する、ことを特徴とする細胞増殖システム。
【請求項３０】
請求項２９記載の細胞増殖システムであって、さらに、
前記細胞増殖システムに結合されたプロセッサと、
前記プロセッサと通信を行い、データを表示するように動作可能な表示装置と、
前記プロセッサと通信を行い、前記プロセッサによって読取可能なメモリと、
を備え、
前記流体入口路を介して、前記毛細管内側循環ループに、前記複数の細胞が導入され、
前記メモリは一連の命令を有し、前記一連の命令が、前記プロセッサによって実行される場合、前記プロセッサは、
前記バイオリアクターをコーティングする命令を受け取り、
前記バイオリアクターをコーティングする前記命令に応答して、前記バイオリアクターをコーティングするステップを実行し、
前記複数の細胞を前記バイオリアクターへ投入する命令を受け取り、
前記複数の細胞を前記バイオリアクターへ投入する前記命令に応答して、前記細胞投入バッグから前記複数の細胞を前記バイオリアクターへ投入するステップを実行し、
前記複数の細胞を前記バイオリアクターへ投入した後、毛細管内側入口ポンプと前記毛細管内側循環ポンプと毛細管外側入口ポンプを停止する命令を受け取り、
前記毛細管外側廃棄バルブを開位置の状態にして、前記培地バッグから前記毛細管外側廃棄バルブを通じて、培地を流す、
ことを特徴とする細胞増殖システム。
【請求項３１】
請求項３０記載の細胞増殖システムにおいて、前記プロセッサは前記メモリから前記毛細管外側循環ループにおいて前記培地をポンピングして前記毛細管外側循環ループに配置された前記ガス移送モジュールから蒸発する流体を補充する命令を受け取ることを特徴とする細胞増殖システム。
【請求項３２】
請求項３１記載の細胞増殖システムにおいて、前記培地バッグ内の前記培地は、基本培地であることを特徴とする細胞増殖システム。
【請求項３３】
請求項２９又は３０記載の細胞増殖システムにおいて、前記複数の細胞は、接着性細胞であることを特徴とする細胞増殖システム。
【請求項３４】
請求項２９又は３０記載の細胞増殖システムにおいて、前記複数の細胞は、非接着性細胞であることを特徴とする細胞増殖システム。
【請求項３５】
請求項２９記載の細胞増殖システムであって、
前記毛細管内側循環ポンプの動作を制御するコントローラを備え、
前記流体入口路を介して、前記毛細管内側循環ループに、前記複数の細胞が導入され、
前記コントローラは、前記毛細管内側循環ポンプを制御することによって、
前記毛細管内側循環ループ内において、流体を、第１レートにて循環させ、
前記細胞増殖システムにおいて前記廃棄バッグを前記培地バッグに交換する際、前記複数の細胞が前記バイオリアクターへ投入された後、前記毛細管内側循環ループ内における前記流体の循環を停止する、
ことを特徴とする細胞増殖システム。
【請求項３６】
請求項３５記載の細胞増殖システムにおいて、前記培地バッグには、基本培地が含まれることを特徴とする細胞増殖システム。
【請求項３７】
請求項３５記載の細胞増殖システムにおいて、前記細胞増殖システムは閉鎖系であることを特徴とする細胞増殖システム。
【請求項３８】
請求項３５記載の細胞増殖システムにおいて、前記複数の細胞は、接着性細胞であることを特徴とする細胞増殖システム。
【請求項３９】
請求項３５記載の細胞増殖システムにおいて、前記複数の細胞は、非接着性細胞であることを特徴とする細胞増殖システム。
【請求項４０】
請求項３５記載の細胞増殖システムにおいて、
毛細管内側投入流体を収容するとともに、前記第１流体流路に流体的に関連付けられた毛細管内側培地バッグと、
前記毛細管内側培地バッグからの前記毛細管内側投入流体を前記毛細管内側循環ループに移送する毛細管内側入口ポンプと、
前記毛細管内側入口ポンプの動作を制御する第２コントローラと、
をさらに備え、
前記第２コントローラは前記毛細管内側入口ポンプを制御することによって、
前記複数の細胞を前記細胞投入バッグから前記毛細管内側循環ループに移送し、
前記細胞増殖システムの前記廃棄バッグを前記培地バッグに交換する際、前記複数の細胞が前記バイオリアクターへ投入された後、前記細胞投入バッグからの前記複数の細胞の移送を停止する、
ことを特徴とする細胞増殖システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１４年３月２５日に出願された米国特許仮出願第６１／９７０，２７４号明細書（タイトル：培地の受動的補充）の優先権を主張するものであり、該米国特許仮出願の全体は、ここでの開示により明確に本出願に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
細胞増殖システム（ＣＥＳ）は、細胞を増殖させ、分化させるために使用される。細胞増殖システムを使用することにより、間葉系幹細胞やヒト間葉系幹細胞のような幹細胞を増殖（例えば、成長）させることができる。細胞増殖システムはまた、例えば骨髄細胞のようなその他のタイプの細胞を増殖させることもできる。ドナー細胞から増殖した幹細胞を使用することで、損傷を受けた又は欠陥のある組織を修復又は交換することができ、広範囲な疾病に対する幅広い臨床応用が存在する。接着性及び非接着性の両タイプの細胞の成長は、細胞増殖システムのバイオリアクターにおいて行われる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本開示の実施形態は一般に、培地を維持させ、細胞成長の促進の助けとなる環境を提供するために行う細胞増殖システムにおける培地の受動的交換に関する。例えば、ヒト間葉系幹細胞のような細胞の増殖では、外部における細胞間の化学的シグナル伝達を利用して、細胞内部における遅滞期シグナル伝達経路を抑制することにより、細胞増殖を起こす。ある実施形態では、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞のような他の細胞の増殖は、細胞間の化学的シグナル伝達に対して特に敏感である。例えば、ＣＨＯ細胞は、化学的シグナル伝達を通じて、細胞培養維持及び増殖に部分的に関与する調節ホルモンである、コレシストキニン（ＣＣＫ）を分泌する。ある実施形態では、ＣＣＫは、中空糸バイオリアクターの微多孔膜を通過できるほど小さい。このような膜通過特性によって、細胞増殖システムの毛細管内側ループ又は毛細管外側ループへの注入培地の付加にかかわらず、化学的シグナル伝達の希薄化が起こる。閉鎖された自動細胞増殖システムにおける外部における化学的シグナル伝達の希薄化を減らす又は抑制するため、ひいては細胞の遅滞期を減らすため、実施形態のある態様では、実行中のプロトコル処理を停止し、細胞増殖システムで使用されている廃棄バッグ又は出口バッグを培地バッグに交換することによって、培地を受動的に補充する。ある実施形態では、基本培地を含むバッグが、細胞増殖システムの廃棄ラインに取り付けられる。そのような構成によって、能動的な流体投入が無いという条件下での蒸発速度で、基本培地をシステムに付加することができる。ある実施形態では、他のタイプの補充流体が、例えば、完全培地やサイトカインやその他の細胞シグナル伝達タンパク質分子のような流体が、培地バッグ内で使用される。他の実施形態において、実行されているプロトコルプロシージャを中断し、（廃棄バッグ又は出口バッグ内に、細胞成長に対して毒性を示す成分が存在しないという条件で）廃棄バッグ又は出口バッグの流体が、流体の能動的投入が無い条件下における蒸発速度で、システムに受動的に付加されるようにすることによって、流体は受動的に補充される。そのような流体の受動的付加は、過剰な量の流体の付加を回避する。すなわち、細胞増殖を引き起こすために使用される化学的シグナル伝達物質の希釈が回避される。さらに、最終的には、培地構成物質が節約されて、システム効率の増加及び供給源の節約に帰着する。
【０００４】
本開示の実施形態はさらに、バイオリアクター内の増殖する細胞集団に対して、サイトカインのような細胞シグナル伝達タンパク質分子のような分子を付加することによって、化学的シグナル伝達を増大することに関する。一実施形態において、例えば、サイトカイン供給源に接続された配管ライン又はその他の部材或いはサイトカイン又はその他の所望の成分を予め充填した配管ライン又はその他の部材、を細胞増殖システムのサンプリングコイル又はサンプルコイルに接合することによって、サイトカイン又はその他のタイプの細胞シグナル伝達タンパク質分子をバイオリアクターに付加する。このようにして、サイトカインは、サンプルコイルにおいてバイオリアクターに付加される。このような直接付加は、高価なサイトカインを大幅に節約することになる。何故なら、サイトカイン供給源自身のみだけでバイオリアクターを補充する場合に必要とされる量と比べて、培地によるサイトカイン希釈の補充においては、より多くの量のサイトカインを培地バッグに付加する必要があるからである。さらに、サイトカインは、時間と共に又は紫外線（ＵＶ）光に暴露されることで、急速に分解する傾向にあるが、サイトカインを、増殖する細胞集団の近くに、例えば、ＵＶ光源から隔絶されたバイオリアクターのサンプルコイルにおいて、付加することによって、そのような分解を最小化できる。そのような実施形態において、バイオリアクター内のサイトカインは、一定のレベルに維持され、資源を節約できる。
【０００５】
ここで使用される「少なくとも１つ」、「１以上の」、「及び／又は」は、結合的及び選言的の両方として機能する非限定的表現である。例えば、「Ａ、Ｂ及びＣのうち少なくとも１つ」、「Ａ、Ｂ又はＣのうち少なくとも１つ」、「Ａ、Ｂ及びＣのうち１以上」、「Ａ、Ｂ又はＣのうち１以上」、「Ａ、Ｂ及び／又はＣ」のこれら各表現は、Ａのみ、Ｂのみ、Ｃのみ、ＡとＢ、ＡとＣ、ＢとＣ、又は、ＡとＢとＣ、のいずれかであることを意味する。
【０００６】
このセクションは、一連の概念を簡単な形式で提示するために設けられる。これら概念は、以下でより詳細に、詳細な説明で記載される。このセクションは、請求項が定義する主題の範囲を制限するために用いられることを意図されていない。ここで提示される特徴に加えて、等価物及び変更等を含む特徴を含んでよい。
【０００７】
以下では、本発明の実施形態が、添付図面を参照して説明される。図面中、同じ参照符号は、同じ構成要素を示す。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、本開示の実施形態に係る中空糸型バイオリアクターの斜視図である。
【図２】図２は、本開示の実施形態に係る、予め設けられた流体搬送装置を備えた細胞増殖システムの斜視図である。
【図３】図３は、本開示の実施形態に係る細胞増殖システムのハウジングの斜視図である。
【図４】図４は、本開示の実施形態に係る、予め設けられる流体搬送装置の斜視図である。
【図５】図５は、本開示の実施形態に係る細胞増殖システムの概略図である。
【図６】図６は、細胞増殖システムの他の実施形態の概略図である。
【図７】図７は、本開示の実施形態に係る、廃棄バッグを培地バッグに交換した状態の図６の細胞増殖システムの図である。
【図８】図８は、本開示の実施形態に係る、廃棄バッグを培地バッグに交換した状態の図５の細胞増殖システムの図である。
【図９】図９は、本開示の実施形態に係る、予め設けられた流体搬送装置の一部として分子供給源を含む図６の細胞増殖システムの図である。
【図１０】図１０は、本開示の実施形態に係る、細胞増殖システムにおいて培地を受動的に補充するためのプロセスの動作特徴を示すフローチャートである。
【図１１】図１１は、本開示の実施形態に係る、細胞増殖システム自身の一部として実施される、分子供給源から分子を付加するためのプロセスの動作特徴を示すフローチャートである。
【図１２】図１２は、細胞増殖システムにおいて培地を受動的に補充するためのプロセスの他の実施形態の動作特徴を示すフローチャートである。
【図１３】図１３は、本開示の実施形態が実施される細胞増殖システムの処理システムの一例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下の詳細な説明では、例示的な実施形態が、添付図面を参照して、説明される。ここでは特定の実施形態を含むことになるが、本開示を限定又は制限するものと解釈されるべきではない。また、実施形態を記載する際、例えば、特徴、動作、及び／又は構造に対して特有な言い回しが使用される場合があるが、本開示の請求項の範囲は、これら特徴、動作、及び／又は構造に制限されるものではない。当業者であれば、改良を含む他の実施形態は、本開示の精神及び範囲内にあることは理解できよう。
【００１０】
本開示の実施形態は一般に、細胞増殖システムにおいて培地を受動的に補充するための装置及び方法に関する。培地の受動的補充は、システムに対して実行されている１以上のプロトコル（例えば、細胞投入、細胞フィーディング等）を中断し、システムにおいて使用されている廃棄バッグ又は出口バッグを培地バッグに交換することによって、実現される。細胞増殖システムのそれぞれの機構部分の実行中のプロトコルに従った動作を中断、又は停止することによって、システムへの能動的な流体の投入を止めることで、閉鎖系システムのバイオリアクターにおいて細胞集団を誘導期に維持し続ける内部シグナル伝達経路を阻害するために用いられる化学的シグナル伝達物質の希釈を減らす若しくは抑制することができる。そのような希釈を減らすか又は抑制することによって、細胞成長の誘導期を減らせる。従って、本開示の実施形態によれば、より効率的な且つ高められた細胞増殖が行え、より多くの細胞がより短い期間で増殖される。
【００１１】
細胞増殖システムへの流体の投入によって、システムからの流体の蒸発が過度に補填される場合、化学的シグナル伝達の希釈が発生する。例えば、閉鎖系細胞増殖システムでは、酸素供給器又はガス移送モジュールを用いて、バイオリアクターの中空糸における培地を所望のガス濃度、例えば、５％ＣＯ2、２０％Ｏ2、７５％Ｎ2、の状態におくようにする。一例として、ガス移送モジュールでの蒸発は、１４ｍＬ／日である。投入が無い場合、そのような蒸発があると、システム内でのエアの集積が生じる可能性がある。或いは、例えば、ポンプによって閉塞されていないシステムにおいて、廃棄ラインが唯一の流体供給源である実施形態では、廃棄ライン又は出口ラインからの流体のバックフローが生じる可能性がある。しかしながら、投入によって蒸発に対処すると、蒸発によって失われる流体の実際の量に対して過度に補充が行われることになる。例えば、一実施形態において、細胞増殖システムへの投入流量は、最小流量をもつ。一例として、投入流量を最小流量の０．１ｍＬ／分すなわち１４４ｍＬ／日に設定する。ガス移送モジュールでの蒸発が１４ｍＬ／日で行われる場合、蒸発によって失われる流体は、１３０ｍＬ／日だけ過剰に補充される。その過剰な１３０ｍＬ／日は、細胞増殖を引き起こすための化学的シグナル伝達を希釈する。例えば、化学的シグナル伝達分子が中空糸膜を介して毛細管内側から毛細管外側へ通過できる場合、そのような希釈は発生する。従って、毛細管内側又は毛細管外側のいずれかに補充流体を付加すると、システムへの継続的な流体付加によって化学的シグナル伝達分子の増大が抑えられ或いは減らされ、それによって化学的シグナル伝達物質の希釈へと帰結する。そのような希釈が発生する場合、化学的シグナル伝達細胞間の伝達が大きな影響を受け、細胞は増殖さらには生存することもできなくなる。そのような希釈は、他の細胞と比較していくつかの特定の細胞に対して特に大きな影響となる。ある実施形態では、例えば、化学的シグナル伝達分子の希釈を減らす或いは抑制することは、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞の増殖に大きな影響がある。
【００１２】
ある実施形態では、システムからの流体蒸発に対して過度に補充することになる流体の能動的な投入を用いる代わりに、システムへの能動的な流体投入を停止して、バイオリアクターの細胞集団を誘導期に維持させるシグナル伝達経路を阻害するために用いられる化学的シグナル伝達の希釈を抑制又は最小化する。能動的な投入は、例えば、実行中プトロコルに従ったシステム機構部分の動作を中断又は停止することによって停止される。過剰な補充を行う能動的な流体投入の代わりに、能動的な流体投入を停止して、培地の受動的補充を行う場合、エアの蓄積や廃棄ラインからのバックフローは起こらない。そのような培地の受動的補充を実現するには、システムで通常使用されている１以上の廃棄バッグ又は出口バッグを１以上の培地バッグに交換し使用することによって、システムからの蒸発速度（例えば、ガス移送モジュールからの蒸発速度）と等しい流量で、例えば、基本培地のような流体をシステムに付加する。従って、能動的な流体投入が停止された状態で、交換した又は置換した培地バッグからの培地は、蒸発によってシステムから失われた流体を補充する。そのような流体の受動的付加は、過剰な量の流体の付加を回避する。すなわち、細胞増殖を引き起こすために使用される化学的シグナル伝達物質が過剰な量の流体で希釈されることが回避される。従って、消失した流体は、略蒸発速度で培地が付加されることで補充され、細胞集団を誘導期に維持するためのシグナル伝達経路を阻害するために用いられる化学的シグナル伝達物質が希釈されることはない。その結果、細胞成長の誘導期は、大幅に減少させられる。さらに、最終的には、培地構成物質が節約されて、システム効率の増加及び供給源の節約に帰着する。
【００１３】
他の実施形態において、実行されているプロトコルプロシージャを中断し、（廃棄バッグ又は出口バッグ内に、細胞成長に対して毒性を示す成分が存在しないという条件で）廃棄バッグ又は出口バッグ内の流体を、流体の能動的投入が無い条件下における蒸発速度で、システムに受動的に付加することによって、流体は受動的に補充される。
【００１４】
細胞培地が高価な添加剤を含む場合、化学的シグナル伝達物質の希釈は、特にコストがかかる。例えば、サイトカインのような細胞シグナル伝達タンパク質は、細胞成長を促進するために、バイオリアクター内にて使用される。サイトカインが希釈されると、大幅なコスト高となる。従って、過剰な培地（例えば、１３０ｍＬ／日）を抑えることは、細胞増殖プロセス全体にわたって、大幅なコスト節減となる。過剰補充となる流体の能動的投入の代わりに、本開示の実施形態では、培地の受動的補充が用いられ、培地構成物質の濃度が維持され、全般において培地が節約される。さらに、ある実施形態では、培地バッグにおいて他のタイプの補充流体が用いられる。例えば、サイトカインやその他の細胞シグナル伝達タンパク質分子が培地バッグに格納される。
【００１５】
ある実施形態では、細胞シグナル伝達タンパク質分子のような分子が、該分子供給源からバイオリアクターへ付加される。例えば、サイトカイン供給源のような分子供給源に接続された配管又は他の部材が、細胞増殖システムのサンプルコイルに無菌接合され、バイオリアクター内のサイトカインは、そのようなサイトカイン直接供給源によって補充される。一実施形態において、そのような配管又は他の部材は、サンプルコイルに付加される追加容積である。他の実施形態において、そのような配管又は他の部材は、サンプルコイルのある部分と交換される部分である。ある実施形態では、そのような配管又は他の部材には、例えばサイトカインのような所望の成分が予め充填されてもよい。他の実施形態において、そのような配管又は他の部材は、そのような所望の成分を含む容器又はバッグに接続されてもよい。サイトカインの供給源によって、使用されるサイトカインの量は節約される。何故なら、サイトカインの希釈となるため、同じような補充濃度を達成するには、より多くの量のサイトカインを使用することになるサイトカインのＩＣ培地バッグへの付加ではないからである。さらに、サイトカインは、増殖中の細胞集団の近傍に付加されてもよい。これにより、サイトカインの分解が最小化される。サイトカインの分解は、サイトカインが貯蔵される培地バッグのＵＶ光に対する暴露時間と共に増加する。サイトカインが増殖中の細胞集団近傍に付加される場合、サイトカインは、ＵＶ光源から保護された環境において、より短い時間で、増殖中の細胞集団に達するため、分解は減少する。ある実施形態によれば、サイトカインは、バイオリアクターに受動的又は能動的に付加されてよい。これにより、化学的シグナル伝達特性は増大する。一実施形態によれば、例えば、サイトカインが、流体の能動的投入無しの条件下での蒸発速度で、廃棄バッグに対して交換を行った培地バッグからシステムに付加される場合、サイトカインの受動的付加が行われる。
【００１６】
一実施形態において、化学的シグナル伝達は、サンプルコイルにおけるサイトカインの付加によって制御されてよい。他の実施形態では、化学的シグナル伝達は、廃棄バッグを培地バッグへ交換した状態でサンプルコイルにサイトカインを付加することによって制御されてよい。廃棄バッグを培地バッグへ交換することによって、上記したように、バイオリアクターにおける希釈は大幅に減らされる。サイトカインがバイオリアクターの細胞集団増殖において使用される場合、そのような希釈は、特にコスト高となる。従って、実施形態によれば、培地バッグへの交換によって希釈を抑制又は減少することは、大幅な節約となる。
【００１７】
ある実施形態において、ディスポーザブル配管セットを有する閉鎖系細胞増殖システムのバイオリアクターにおける化学的シグナル伝達を制御する方法が提供される。該実施形態において、該方法は、バイオリアクターをコーティングするステップと細胞投入バッグからバイオリアクターへ細胞を投入するステップとを有する。一実施形態において、例えば、循環分配させながら細胞を投入するステップが行われる。他の実施形態において、均一懸濁の状態で細胞を投入するステップが行われる。そして、毛細管内側循環ポンプを稼動させることによって、細胞は、バイオリアクターの膜に分配させられる。ある実施形態において、投入及び分配後、細胞増殖システムに取り付けられた廃棄バッグは、培地バッグに交換されてもよい。一実施形態において、廃棄バッグ交換後、１以上のポンプ（例えば、毛細管内側循環ポンプ、毛細管外側入口ポンプ、毛細管内側入口ポンプ）をＯＦＦ又は稼働停止させてもよい。他の実施形態において、出口バッグ又は廃棄バッグの交換前に、１以上のポンプをＯＦＦ又は稼働停止させてもよい。例えば、接着性細胞を増殖する実施形態において、廃棄バッグ又は出口バッグを培地バッグに交換した後に、毛細管内側循環ポンプを稼動停止してもよい。接着性細胞を増殖する他の実施形態において、廃棄バッグ又は出口バッグを培地バッグに交換する前に、例えば、毛細管内側循環ポンプを稼動停止してもよい。非接着性細胞を増殖するさらに他の実施形態において、毛細管内側循環ポンプを稼動状態のままにして、１以上の他のポンプを稼動停止させてもよい。
【００１８】
少なくとも１つの実施形態において、培地バッグからの培地は、毛細管外側廃棄バルブを通って、毛細管外側循環ループに流れて、毛細管外側循環ループにおけるガス移送モジュールから蒸発する流体を補充する。ある実施形態において、廃棄バッグを培地バッグに交換した後に、該方法は、毛細管内側入口ポンプを停止するステップと、毛細管外側入口ポンプを停止するステップと、毛細管外側循環ポンプを稼動状態に維持するステップと、毛細管外側廃棄バルブを開位置に維持するステップと、をさらに有する。
【００１９】
いくつかの実施形態において、前記細胞は、接着性細胞であり、該方法は、接着性細胞をバイオリアクターの膜に付着させるステップと、毛細管外側循環ポンプを稼動状態に維持することによって毛細管外側循環ループの流れを維持するステップと、をさらに有する。いくつかの実施形態において、前記接着性細胞は、約１８時間から約２４時間の間（例えば、第１期間の間）、バイオリアクターの膜に付着させる。他の実施形態において、前記細胞は、例えば、ＣＨＯ細胞のような非接着性細胞又は懸濁細胞である。
【００２０】
いくつかの実施形態において、該方法は、前記廃棄バッグを前記培地バッグに交換したままの状態で且つ毛細管内側投入レート（流量）を減らした状態で、前記閉鎖系細胞増殖システムの前記バイオリアクターにおける前記細胞に対してフィーディングを行うステップをさらに有する。これらの実施形態において、フィーディングを行う前記ステップは、毛細管内側循環ポンプを稼動させるステップを有する。ある実施形態では、約４５時間から約５０時間の第２期間、前記フィーディングを行った後、前記フィーディングを停止する。さらに他の実施形態において、約４８時間の第２期間、前記フィーディングを行った後、前記フィーディングを停止する。
【００２１】
ある実施形態において、該方法は、前記細胞から生成される乳酸（ｌａｃｔａｔｅ）の濃度を測定するステップと、乳酸の濃度が約６ｍｍｏｌ／Ｌ以上になった時に前記フィーディングを停止するステップと、をさらに有する。いくつかの実施形態において、該方法は、前記培地バッグを取り外すステップと、前記廃棄バッグを挿入するステップと、前記毛細管内側入口ポンプを稼動させるステップと、前記毛細管内側循環ポンプを稼動させるステップと、前記毛細管外側循環ポンプを稼動状態に維持するステップと、をさらに有する。いくつかの実施形態において、前記毛細管内側入口ポンプは、約０．１ｍＬ／分の毛細管内側投入レートで稼動する。いくつかの実施形態において、前記毛細管内側循環ポンプは、約２０ｍＬ／分の毛細管内側循環レートで稼動する。ある実施形態において、前記毛細管外側循環ポンプは、約３０ｍＬ／分の毛細管外側循環レートで稼動する。一実施形態において、該方法は、前記細胞が所望の数で収穫できるようになるまで、前記毛細管内側投入レートを２倍にするか又は増加させるステップをさらに有する。ある実施形態において、前記細胞が前記所望の数で収穫できるようになった時、該方法は、前記バイオリアクターの前記膜から前記細胞を剥離するステップと、毛細管内側循環ループに前記細胞を懸濁させるステップと、懸濁状態の前記細胞を収穫バッグへ移送するステップと、をさらに有する。
【００２２】
いくつかの実施形態において、例えば、前記バイオリアクターをコーティングするステップと前記細胞を前記バイオリアクターへ投入する前記ステップと前記細胞を分配するステップとは、例えば、メモリに記憶された予めプログラムされたタスクを実行するプロセッサによって自動的に行われる。いくつかの実施形態において、廃棄バッグの培地バッグへの交換は、手動で行われ、他の実施形態では、自動で行われる。ある実施形態において、前記廃棄バッグの前記培地バッグへの自動的交換は、前記廃棄バッグを交換するタスクを実行するための命令を受け取るステップを含み、前記タスクは、前記システムのメモリに記憶されている。一実施形態において、例えば、バッグ交換の命令を受け取った時点で、プロセッサは、廃棄バッグ用バルブを閉じ且つ取り付けられた培地バッグ用バルブを開けるための信号を送る。他の実施形態において、単一のバルブ又はその他タイプの機構が、廃棄バッグ又は取り付けられた培地バッグからの流体の流れを制御する。
【００２３】
いくつかの実施形態において、培地バッグは基本培地を含み、例えば、約５００ｍＬの基本培地を含む。一実施形態において、基本培地は、例えば、細胞が成長するためのエネルギ源を与えるために、グルコース等の複数の異なる成分を含む。本開示のある実施形態では、培地バッグは、その他の流体及び／又は成分を含む。
【００２４】
他の実施形態において、該方法は、さらにいくつかのステップを有する。それらステップとしては、細胞シグナル伝達タンパク質分子を、毛細管内側循環ループのサンプルコイルに投入するステップや、前記毛細管内側循環ポンプを稼動させて、前記細胞シグナル伝達タンパク質分子を前記バイオリアクターへ移送するステップ等が挙げられる。いくつかの実施形態において、前記サンプルコイルと前記毛細管内側循環ループは、ディスポーザブル配管セットの一部である。
【００２５】
ある実施形態において、該方法は、前記細胞を前記バイオリアクターへ投入する前記ステップの前に、毛細管内側循環ループと毛細管外側循環ループの流体を、毛細管内側培地バッグからの培地と交換するステップと、前記毛細管内側培地バッグからの前記培地をガス供給との平衡に達するようにするステップと、をさらに有する。
【００２６】
いくつかの実施形態は、上記したように、細胞増殖システムに関する。ある実施形態において、該細胞増殖システムは閉鎖系であり、閉鎖系細胞増殖システムは、大気に直接暴露されない内容物を含む。そのような細胞増殖システムは、自動で動作されてよい。ある実施形態において、接着性細胞及び非接着性細胞の両方とも、該細胞増殖システムのバイオリアクター内で成長される。ある実施形態に係る細胞増殖システムは、基本培地を有する。培地の補充方法は、該閉鎖系細胞増殖システムのバイオリアクター内で行われる細胞成長のためのものである。ある実施形態において、そのようなシステムで使用されるバイオリアクターは、中空糸型バイオリアクターである。本開示の実施形態において、多くのタイプのバイオリアクターを使用することができる。
【００２７】
ある実施形態において、該システムは、少なくとも両端部を有する第１流体流路を備えるバイオリアクターを備え、前記第１流体流路の第１端部は、中空糸膜の第１ポートと流体的に関連付けられ、前記第１流体流路の第２端部は、前記中空糸膜の第２ポートと流体的に関連付けられ、前記第１流体流路は、前記中空糸膜の毛細管内側部分を有する。前記システムはさらに、前記第１流体流路と流体的に関連付けられた流体入口路を備え、第１流体入口路を介して、前記第１流体流路には、複数の細胞が導入される。前記バイオリアクターの前記第１流体流路において流体を循環させる第１ポンプがさらに設けられる。ある実施形態において、前記システムは、前記第１ポンプの動作を制御するコントローラ、例えば、第１コントローラ、を備える。一実施形態において、前記コントローラは、コンピューティングシステムであり、例えば、プロセッサを有する。ある実施形態において、前記コントローラは、前記ポンプを制御することによって、前記第１流体流路内において、流体を、第１レートにて循環させ、前記細胞増殖システムにおいて廃棄バッグを培地バッグに交換する際、前記コントローラは、前記複数の細胞が前記バイオリアクターへ投入された後、前記第１流体流路内における前記流体の循環を停止する。いくつかの実施形態において、毛細管内側培地バッグからの毛細管内側投入流体を前記第１流体流路に移送する第２ポンプと、前記第２ポンプの動作を制御するコントローラ、例えば、第２コントローラと、をさらに備える。ある実施形態において、前記第２コントローラは前記第２ポンプを制御することによって、細胞を細胞投入バッグから前記第１流体流路に移送し、前記細胞増殖システムの廃棄バッグを培地バッグに交換する際、前記複数の細胞が前記バイオリアクターへ投入された後、前記細胞の前記細胞投入バッグからの移送を停止する。ある実施形態において、さらなるコントローラ（例えば第３コントローラ、第４コントローラ、第５コントローラ、第６コントローラ等）が使用されてもよい。本開示の実施形態において、さらなるポンプ（例えば第３ポンプ、第４ポンプ、第５ポンプ、第６ポンプ等）が使用されてもよい。さらに、本開示では、培地バッグ、廃棄バッグ、細胞投入バッグ等について述べられるが、複数のバッグ、例えば、第１培地バッグ、第２培地バッグ、第３培地バッグ、第１廃棄バッグ、第２廃棄バッグ、第３廃棄バッグ、第１細胞投入バッグ、第２細胞投入バッグ、第３細胞投入バッグ等、又はその他のタイプの容器、が使用されてもよい。他の実施形態では、単一の培地バッグ、単一の廃棄バッグ、単一の細胞投入バッグ等が使用される。
【００２８】
実施形態において、前記システムは、例えば、前記細胞増殖システムに結合されたプロセッサと、前記プロセッサと通信を行い、データを表示するように動作可能な表示装置と、前記プロセッサと通信を行い、前記プロセッサによって読取可能であり、一連の命令を有するメモリと、によって制御される。実施形態において、前記一連の命令が前記プロセッサによって実行される場合、例えば、前記プロセッサは、前記バイオリアクターをコーティングする命令を受け取る。前記バイオリアクターをコーティングする前記命令に応答して、前記プロセッサは、例えば、前記バイオリアクターをコーティングする一連のステップを実行し、次に、前記複数の細胞を前記バイオリアクターへ投入する命令を受け取る。前記複数の細胞を前記バイオリアクターへ投入する命令に応答して、前記プロセッサは、細胞投入バッグから前記細胞を前記バイオリアクターへ投入する一連のステップを実行する。前記細胞を前記バイオリアクターへ投入した後、前記プロセッサは、例えば、毛細管内側入口ポンプと毛細管内側循環ポンプと毛細管外側入口ポンプを停止する命令を受け取る。細胞増殖システムは、毛細管外側廃棄バルブを開位置の状態にして、培地バッグから前記毛細管外側廃棄バルブを通じて、培地を流すように動作される。前記プロセッサは、前記毛細管外側循環ループにおいて前記培地をポンピングして前記毛細管外側循環ループに配置されたガス移送モジュールから蒸発する流体を補充する命令を受け取る。
【００２９】
図１は、本発明と共に使用される中空糸型細胞成長チャンバー１００の一例の正面図を示す。細胞成長チャンバー１００は、長手方向軸ＬＡ−ＬＡを有し、細胞成長チャンバーハウジング１０４を備える。少なくとも１つの実施形態において、細胞成長チャンバーハウジング１０４は、４つの開口部又は４つのポート、すなわち、ＩＣ入口ポート１０８、ＩＣ出口ポート１２０、ＥＣ入口ポート１２８、ＥＣ出口ポート１３２を有する。
【００３０】
本開示の実施形態において、第１循環路内の流体は、細胞成長チャンバー１００の第１の長手方向端１１２におけるＩＣ入口ポート１０８を通って細胞成長チャンバー１００に進入し、複数の中空糸１１６の毛細管内側（種々の実施形態において、中空糸膜の毛細管内（「ＩＣ」）側又は「ＩＣ空間」と呼ぶ）に進入して通過し、細胞成長チャンバー１００の第２の長手方向端１２４に位置するＩＣ出口ポート１２０を通って細胞成長チャンバー１００の外に出る。ＩＣ入口ポート１０８とＩＣ出口ポート１２０との間の流体経路は、細胞成長チャンバー１００のＩＣ部分１２６を定義する。第２循環路内の流体は、ＥＣ入口ポート１２８を通って細胞成長チャンバー１００に進入し、中空糸１１６の毛細管外側又は外側（該膜の「ＥＣ側」又は「ＥＣ空間」と呼ぶ）に接触して、ＥＣ出口ポート１３２を通って細胞成長チャンバー１００の外に出る。ＥＣ入口ポート１２８とＥＣ出口ポート１３２との間の流体経路は、細胞成長チャンバー１００のＥＣ部分１３６を構成する。ＥＣ入口ポート１２８を通って細胞成長チャンバー１００に入った流体は、中空糸１１６の外側に接触する。小分子（例えば、イオン、水、酸素、乳酸等）は、中空糸１１６を通じて中空糸の内部すなわちＩＣ空間から外部すなわちＥＣ空間へ、又はＥＣ空間からＩＣ空間へ拡散することができる。成長因子のような高分子量の分子は、通常は、大きすぎるため中空糸を通過できず、中空糸１１６のＩＣ空間内にとどまる。培地は、必要であれば交換補充してもよい。また、必要であれば、培地を、酸素供給装置又はガス移送モジュールを通じて循環させて、ガスを交換してもよい。細胞は、以下で説明されるように、第１循環路及び／又は第２循環路内に含有させることができ、該膜のＩＣ側及び／又はＥＣ側に存在させることができる。
【００３１】
中空糸膜を作製するのに用いられる材料は、中空糸に加工可能な任意の生体適合性高分子材料でよい。本開示の実施形態において、使用可能な一材料としては、合成ポリスルホン系材料が挙げられる。細胞を中空糸の表面に付着させるため、該表面は、少なくとも細胞成長表面をフィブロネクチンやコラーゲンのようなタンパク質でコーティングしたり或いは該表面に放射線を照射したりするような方法で、改質されてよい。膜表面をガンマ線処理することによって、膜に対してフィブロネクチン等による追加コーティングを行わずに、接着性細胞を付着させることが可能になる。ガンマ線処理を行った膜で作製されたバイオリアクターは、再利用することができる。本開示の実施形態において、細胞付着のための他のコーティング及び／又は他の処理を用いてもよい。
【００３２】
図２において、本開示の実施形態に係る、予め設けられた流体輸送組立体を有する細胞増殖システム２００の一実施形態が示される。ＣＥＳ２００は、細胞増殖装置２０２を有する。細胞増殖装置２０２は、細胞増殖装置２０２の後側部分２０６と係合するハッチ又は閉可能なドア２０４を有する。細胞増殖装置２０２内の内部空間２０８は、予め設けられた流体輸送組立体２１０を受容し係合固定できるような特徴を有する。予め設けられた流体輸送組立体２１０は、細胞増殖装置２０２に取り外し可能に取り付けられており、細胞増殖装置２０２において、使用された流体輸送組立体２１０を、新しい又は未使用の流体輸送組立体２１０に比較的迅速に交換できるようになっている。単一の細胞増殖装置２０２の動作によって、第１の流体輸送組立体２１０を用いて細胞の第１のセットを成長又は増殖させ、その後、第１の流体輸送組立体２１０を第２の流体輸送組立体２１０に交換する際に殺菌することなく、第２の流体輸送組立体２１０を用いて細胞の第２のセットを成長又は増殖させることができる。予め設けられた流体輸送組立体は、バイオリアクター１００と酸素供給器又はガス移送モジュール２１２を有する。実施形態において、流体輸送組立体２１０に接続される種々の培地用配管を受容する配管案内スロットが２１４として示される。
【００３３】
図３は、本開示の実施形態に係る、予め設けられた流体輸送組立体２１０（図２参照）を取り外し可能に取り付ける前の、細胞成長装置２０２の後側部分２０６を示す。閉可能なドア２０４（図２参照）は、図３では省略されている。細胞増殖装置２０２の後側部分２０６には、流体輸送組立体２１０の構成要素と組み合わせて動作する複数の異なる構造が設けられている。詳細には、細胞増殖装置２０２の後側部分２０６は、流体輸送組立体２１０におけるポンプループと協働する複数の蠕動ポンプ（ＩＣ循環ポンプ２１８、ＥＣ循環ポンプ２２０、ＩＣ入口ポンプ２２２、ＥＣ入口ポンプ２２４）を有する。また、細胞増殖装置２０２の後側部分２０６は、複数のバルブ（ＩＣ循環バルブ２２６、試薬バルブ２２８、ＩＣ培地バルブ２３０、空気除去バルブ２３２、細胞入口バルブ２３４、洗浄バルブ２３６、分配バルブ２３８、ＥＣ培地バルブ２４０、ＩＣ廃棄バルブ２４２、ＥＣ廃棄バルブ２４４、収穫バルブ２４６）を有する。さらに、複数のセンサ（ＩＣ出口圧力センサ２４８、ＩＣ入口圧力／温度センサ２５０、ＥＣ入口圧力／温度センサ２５２、ＥＣ出口圧力センサ２５４）が、細胞増殖装置２０２の後側部分２０６に関連付けられる。さらに、空気除去チャンバーのための光学センサ２５６が示されている。
【００３４】
実施形態によれば、バイオリアクター１００を回転させるための軸又はロッカー制御部２５８が示されている。軸又はロッカー制御部２５８と関連付けられた軸嵌合部２６０によって、細胞増殖装置２０２の後側部分２０６に対して、流体輸送組立体２１０又は４００の軸アクセス開口部（例えば、配管収納部３００（図４）の開口部４２４（図４））の適切な位置合わせが行える。軸又はロッカー制御部２５８の回転によって、軸嵌合部２６０及びバイオリアクター１００に対して回転運動が付与される。従って、ＣＥＳ２００のオペレータ又はユーザが、新しい又は未使用の流体輸送組立体４００（図４）を、細胞増殖装置２０２に取り付ける際、位置合わせは、軸嵌合部２６０に対して、流体輸送組立体２１０又は４００の軸アクセス開口部４２４（図４）を適切に方向付けるといった比較的簡単な作業となる。
【００３５】
図４は、取り付け・取り外し自在の予め取り付けられる流体輸送組立体４００の斜視図である。予め取り付けられる流体輸送組立体４００は、細胞増殖装置２０２に取り外し可能に取り付けられており、細胞増殖装置２０２において、使用された流体輸送組立体４００を、新しい又は未使用の流体輸送組立体４００に比較的迅速に交換できるようになっている。図４に示されるように、バイオリアクター１００は、軸嵌合部４０２を含むバイオリアクターカップリングに取り付けられる。軸嵌合部４０２は、細胞増殖装置２０２の軸（図３に示されている例えば２５８）を係合させるための１以上の（付勢された腕部又はバネ部材４０４のような）軸締結機構を有する。
【００３６】
実施形態によれば、流体輸送組立体４００は、配管４０８Ａ、４０８Ｂ、４０８Ｃ、４０８Ｄ、４０８Ｅ等及び種々の管継手を有する。これらにより、以下で説明されるように、図５〜図９に示されるような流体路が提供される。ポンプループ４０６Ａ及び４０６Ｂも、ポンプ用に設けられる。細胞増殖装置２０２が配置される場所に、種々の培地が設けられてもよいが、実施形態において、プリマウントタイプの流体輸送組立体４００は、細胞増殖装置２０２の外部に延在する程度に十分な長さの配管を有することで、該配管に対して培地バッグに関連付けられた配管が接合されてもよい。
【００３７】
図５は、細胞増殖システム５００の実施形態の概略図である。図６は、別の実施形態である細胞増殖システム６００の概略図である。図５及び図６に示される実施形態では、以下で説明するように、細胞は、ＩＣ空間で成長される。しかしながら、本発明は、そのような例に限定されない。他の実施形態では、細胞はＥＣ空間で成長されてもよい。
【００３８】
図５は、実施形態に係るＣＥＳ５００を示している。ＣＥＳ５００は、第１流体循環路５０２（「毛細管内側ループ」又は「ＩＣループ」とも呼ぶ）と第２流体循環路５０４（「毛細管外側ループ」又は「ＥＣループ」とも呼ぶ）とを有する。第１流体流路５０６は、細胞成長チャンバー５０１に流体的に関連付けられて、第１流体循環路５０２を構成する。流体は、ＩＣ入口ポート５０１Ａを介して細胞成長チャンバー５０１に流入し、細胞成長チャンバー５０１内の中空糸を通って、ＩＣ出口ポート５０１Ｂを介して流出する。圧力測定器５１０は、細胞成長チャンバー５０１を離れる培地の圧力を測定する。培地は、培地流量を制御するために用いられるＩＣ循環ポンプ５１２を介して、流れる。ＩＣ循環ポンプ５１２は、第１方向又は第１方向の反対の第２方向に、流体をポンピング可能である。出口ポート５０１Ｂは、逆方向では、入口として使用することができる。ＩＣループ５０２に流入する培地は、バルブ５１４を介して流入する。当業者であれば理解できるように、追加のバルブ及び／又は他の装置を種々の位置に配置して、流体経路の特定の部分に沿って、培地を隔離し及び／又は該培地の特性を測定することもできる。従って、示される概略図は、ＣＥＳ５００の複数の要素に対する１つの可能な構成を示すものであり、１以上の実施形態の範囲において、概略図は変形可能であると理解されるべきである。
【００３９】
ＩＣループ５０２に対して、培地のサンプルは、動作中に、サンプルポート５１６又はサンプルコイル５１８から得られる。第１流体循環路５０２に配置された圧力／温度測定器５２０によって、動作中において、培地圧力及び温度が測定できる。そして、培地は、ＩＣ入口ポート５０１Ａに戻って、流体循環路５０２を完了する。細胞成長チャンバー５０１で成長／増殖した細胞は、細胞成長チャンバー５０１から流し出され、バルブ５９８を通って収穫バッグ５９９に入るか、中空糸内に再分配され、さらに成長される。以下では、これが詳細に説明される。
【００４０】
第２流体循環路５０４において、流体は、ＥＣ入口ポート５０１Ｃを介して、細胞成長チャンバー５０１に入り、ＥＣ出口ポート５０１Ｄを介して細胞成長チャンバー５０１を離れる。ＥＣループ５０４では、培地は、細胞成長チャンバー５０１の中空糸の外側と接触し、それによって、小分子の中空糸への及び中空糸からの拡散が可能となる。
【００４１】
培地が細胞成長チャンバー５０１のＥＣ空間に入る前に、第２流体循環路５０４に配置された圧力／温度測定器５２４によって、該培地の圧力及び温度が測定可能である。培地が細胞成長チャンバー５０１を離れた後、圧力測定器５２６によって、第２流体循環路５０４の培地の圧力が測定可能である。ＥＣループに対して、培地のサンプルは、動作中に、サンプルポート５３０から又はサンプルコイルから得られる。
【００４２】
実施形態において、細胞成長チャンバー５０１のＥＣ出口ポート５０１Ｄを離れた後、第２流体循環路５０４の流体は、ＥＣ循環ポンプ５２８を通って、酸素供給器又はガス移送モジュール５３２に至る。ＥＣ循環ポンプ５２８は、両方向に流体をポンピング可能である。第２流体流路５２２は、酸素供給器入口ポート５３４及び酸素供給器出口ポート５３６を介して酸素供給器又はガス移送モジュール５３２と流体的に関連付けられている。動作中は、流体培地は、酸素供給器入口ポート５３４を介して、酸素供給器又はガス移送モジュール５３２に流入し、酸素供給器出口ポート５３６を介して、酸素供給器又はガス移送モジュール５３２から流出する。酸素供給器又はガス移送モジュール５３２は、ＣＥＳ５００における培地に対して、酸素を付加し、気泡を除去する。種々の実施形態において、第２流体循環路５０４における培地は、酸素供給器又はガス移送モジュール５３２に入るガスと平衡状態にある。酸素供給器又はガス移送モジュール５３２は、適当なサイズの任意の酸素供給器又はガス移送装置でよい。空気又はガスは、フィルタ５３８を介して酸素供給器又はガス移送モジュール５３２に流入し、フィルタ５４０を介して、酸素供給器又はガス移送装置５３２から流出する。フィルタ５３８、５４０は、酸素供給器又はガス移送モジュール５３２及び関連する培地の汚染を減少又は防止する。プライミング工程の一部を行っている際にＣＥＳ５００からパージされた空気又はガスは、酸素供給器又はガス移送モジュール５３２を介して大気にベント可能である。
【００４３】
ＣＥＳ５００を図示した構成において、第１流体循環路５０２及び第２流体循環路５０４における流体培地は、同じ方向で（並流構成で）細胞成長チャンバー５０１を流れる。ＣＥＳ５００は、対向流で流れるように構成してもよい。
【００４４】
少なくとも１つの実施形態において、（容器５６２からの）細胞を含む培地及び容器５４６からの流体培地は、第１流体流路５０６を介して第１流体循環路５０２に導入される。流体容器５６２（例えば、細胞投入バッグ又は空気をシステム外にプライミングするための生理食塩水プライミング流体）は、バルブ５６４を介して、第１流体流路５０６及び第１流体循環路５０２に流体的に関連付けられる。
【００４５】
流体容器、すなわち培地バッグ５４４（例えば、試薬）は、バルブ５４８を介して第１流体入口路５４２に、又はバルブ５７６を介して第２流体入口路５７４に流体的に関連付けられ、流体容器、すなわち培地バッグ５４６（例えば、ＩＣ培地）は、バルブ５５０を介して第１流体入口路５４２に、又はバルブ５７０を介して第２流体入口路５７４に流体的に関連付けられる。また、滅菌され密封可能な第１及び第２入力プライミング路５０８、５０９が設けられる。空気除去チャンバー（ＡＲＣ）５５６が、第１循環路５０２に流体的に関連付けられる。空気除去チャンバー５５６は、１以上の超音波センサを有してもよい。該センサには、空気除去チャンバー５５６内における特定の測定点において、空気、流体の不足、及び／又はガス／流体境界、例えば、空気／流体境界、を検知するための上部センサ及び下部センサが含まれる。例えば、空気除去チャンバー５５６の底部近傍及び／又は頂部近傍で、超音波センサを用いて、それらの場所における空気、流体、及び／又は空気／流体境界を検知することができる。実施形態において、本開示の範囲を逸脱しない範囲で、他のタイプのセンサを使用することができる。例えば、本開示の実施形態に従って、光学センサを使用してもよい。プライミング工程の一部又はその他のプロトコルを行っている際にＣＥＳ５００からパージされる空気又はガスは、空気除去チャンバー５５６と流体的に関連付けられたライン５５８を通って、エアバルブ５６０から大気中へベント可能である。
【００４６】
（バッグ５６８からの）ＥＣ培地又は（バッグ５６６からの）洗浄液が第１流体流路又は第２流体流路に加えられる。流体容器５６６は、バルブ５７０と流体的に関連付けられる。バルブ５７０は、分配バルブ５７２及び第１流体入口路５４２を介して第１流体循環路５０２と流体的に関連付けられる。また、バルブ５７０を開け、分配バルブ５７２を閉じることにより、流体容器５６６は、第２流体入口路５７４及びＥＣ入口路５８４を介して第２流体循環路５０４と流体的に関連付けることができる。同様に、流体容器５６８は、バルブ５７６と流体的に関連付けられる。バルブ５７６は、第１流体入口路５４２及び分配バルブ５７２を介して第１流体循環路５０２と流体的に関連付けられる。また、バルブ５７６を開け、分配バルブ５７２を閉じることにより、流体容器５６８は、第２流体入口路５７４と流体的に関連付けることができる。
【００４７】
オプションとして、培地試薬又は洗浄液の導入用に熱交換器５５２を設けてもよい。
【００４８】
ＩＣループにおいて、流体はまず、ＩＣ入口ポンプ５５４によって送られる。ＥＣループでは、流体はまず、ＥＣ入口ポンプ５７８によって送られる。超音波センサのようなエア検知器５８０がＥＣ入口路５８４と関連付けられてもよい。
【００４９】
少なくとも１つの実施形態において、第１及び第２流体循環路５０２、５０４は、廃棄ライン５８８と接続される。バルブ５９０を開けると、ＩＣ培地は、廃棄ライン５８８を介して、廃棄バッグすなわち出口バッグ５８６に至る。同様に、バルブ５８２を開けると、ＥＣ培地は、廃棄ライン５８８を介して廃棄バッグすなわち出口バッグ５８６に流れる。
【００５０】
実施形態において、細胞は、細胞収穫路５９６を介して収穫される。細胞成長チャンバー５０１からの細胞は、細胞を含むＩＣ培地をポンピングすることにより、細胞収穫路５９６及びバルブ５９８を介して、細胞収穫バッグ５９９に収穫される。
【００５１】
ＣＥＳ５００の各部品は、細胞増殖装置２０２（図２及び図３）のような装置又はハウジング内に収容され、該装置は、細胞及び培地を所定温度に維持する。
【００５２】
図６は、細胞増殖システム６００の他の実施形態の概略図である。ＣＥＳ６００は、第１流体循環路６０２（「毛細管内側ループ」又は「ＩＣループ」とも呼ぶ）と第２流体循環路６０４（「毛細管外側ループ」又は「ＥＣループ」とも呼ぶ）とを有する。第１流体流路６０６は、細胞成長チャンバー６０１に流体的に関連付けられて、第１流体循環路６０２を構成する。流体は、ＩＣ入口ポート６０１Ａを介して細胞成長チャンバー６０１に流入し、細胞成長チャンバー６０１内の中空糸を通って、ＩＣ出口ポート６０１Ｂを介して流出する。圧力センサ６１０は、細胞成長チャンバー６０１を離れる培地の圧力を測定する。圧力の他に、実施形態において、センサ６１０は、作動中において、培地圧力及び培地温度を検知する温度センサであってもよい。培地は、培地流量を制御するために用いられるＩＣ循環ポンプ６１２を介して、流れる。ＩＣ循環ポンプ６１２は、第１方向又は第１方向の反対の第２方向に、流体をポンピング可能である。出口ポート６０１Ｂは、逆方向では、入口として使用することができる。ＩＣループに流入する培地は、バルブ６１４を介して流入することができる。当業者であれば理解できるように、追加のバルブ及び／又は他の装置を種々の位置に配置することにより、流体経路の特定の部分に沿って、培地を隔離し及び／又は該培地の特性を測定することもできる。従って、示される概略図は、ＣＥＳ６００の複数の要素に対する１つの可能な構成を示すものであり、概略図に対する変更は、１以上の実施形態の範囲において可能であると理解されるべきである。
【００５３】
ＩＣループに対して、培地のサンプルは、動作中に、サンプルコイル６１８から得られる。そして、培地は、ＩＣ入口ポート６０１Ａに戻って、流体循環路６０２を完了する。細胞成長チャンバー６０１で成長／増殖した細胞は、細胞成長チャンバー６０１から流し出され、バルブ６９８及びライン６９７を介して収穫バッグ６９９に入る。或いは、バルブ６９８が閉じている場合、細胞は、チャンバー６０１に再分配され、さらに成長される。
【００５４】
第２流体循環路６０４において、流体は、ＥＣ入口ポート６０１Ｃを介して、細胞成長チャンバー６０１に入り、ＥＣ出口ポート６０１Ｄを介して細胞成長チャンバー６０１を離れる。ＥＣループでは、培地は、細胞成長チャンバー６０１の中空糸の外側と接触し、それによって、一実施形態では、チャンバー６０１内における小分子の中空糸への及び中空糸からの拡散が可能となる。
【００５５】
培地が細胞成長チャンバー６０１のＥＣ空間に入る前に、第２流体循環路６０４に配置された圧力／温度センサ６２４によって、該培地の圧力及び温度を測定することができる。培地が細胞成長チャンバー６０１を離れた後に、センサ６２６によって、第２流体循環路６０４の培地の圧力及び／又は温度を測定することができる。ＥＣループに対して、培地のサンプルは、動作中に、サンプルポート６３０から又はサンプルコイルから得られる。
【００５６】
細胞成長チャンバー６０１のＥＣ出口ポート６０１Ｄを離れた後、第２流体循環路６０４の流体は、ＥＣ循環ポンプ６２８を通って、酸素供給器又はガス移送モジュール６３２に至る。実施形態において、ＥＣ循環ポンプ６２８もまた、両方向に流体をポンピング可能である。第２流体流路６２２は、酸素供給器又はガス移送モジュール６３２の入口ポート６３２Ａ及び出口ポート６３２Ｂを介して酸素供給器又はガス移送モジュール６３２と流体的に関連付けられている。動作中は、流体培地は、入口ポート６３２Ａを介して、酸素供給器又はガス移送モジュール６３２に流入し、出口ポート６３２Ｂを介して、酸素供給器又はガス移送モジュール６３２から流出する。酸素供給器又はガス移送モジュール６３２は、ＣＥＳ６００における培地に対して、酸素を付加し、気泡を除去する。種々の実施形態において、第２流体循環路６０４における培地は、酸素供給器又はガス移送モジュール６３２に入るガスと平衡状態にある。酸素供給器又はガス移送モジュール６３２は、酸素供給又はガス移送に有用な、適当なサイズの任意の装置でよい。空気又はガスは、フィルタ６３８を介して酸素供給器又はガス移送モジュール６３２に流入し、フィルタ６４０を介して、酸素供給器又はガス移送装置６３２から流出する。フィルタ６３８、６４０は、酸素供給器又はガス移送モジュール６３２及び関連する培地の汚染を減少又は防止する。プライミング工程の一部を行っている際にＣＥＳ６００からパージされた空気又はガスは、酸素供給器又はガス移送モジュール６３２を介して大気にベント可能である。
【００５７】
ＣＥＳ６００として示された該構成において、第１流体循環路６０２及び第２流体循環路６０４における流体培地は、同じ方向で（並流構成で）細胞成長チャンバー６０１を流れる。ある実施形態において、ＣＥＳ６００は、対向流で流れるように構成してもよい。
【００５８】
少なくとも１つの実施形態において、（細胞容器、例えばバッグのような供給源からの）細胞を含む培地は、取り付け点６６２に取り付けられ、培地源からの流体培地は、取り付け点６４６に取り付けられる。細胞及び培地は、第１流体流路６０６を介して第１流体循環路６０２に導入される。取り付け点６６２は、バルブ６６４を介して、第１流体流路６０６と流体的に関連付けられる。取り付け点６４６は、バルブ６５０を介して、第１流体流路６０６と流体的に関連付けられる。試薬源を、点６４４に流体的に接続して、バルブ６４８を介して流体入口路６４２に関連付けてもよいし、又はバルブ６４８及び６７２を介して第２流体入口路６７４に関連付けてもよい。
【００５９】
空気除去チャンバー（ＡＲＣ）６５６が、第１循環路６０２に流体的に関連付けられる。空気除去チャンバー６５６は、１以上のセンサを有してもよい。該センサには、空気除去チャンバー６５６内における特定の測定点において、空気、流体の不足、及び／又はガス／流体境界、例えば、空気／流体境界、を検知するための上部センサ及び下部センサが含まれる。例えば、空気除去チャンバー６５６の底部近傍及び／又は頂部近傍で、超音波センサを用いて、それらの場所における空気、流体、及び／又は空気／流体境界を検知することができる。実施形態において、本開示の範囲を逸脱しない範囲で、他のタイプのセンサを使用することができる。例えば、本開示の実施形態に従って、光学センサを使用してもよい。プライミング工程の一部又はその他のプロトコルを行っている際にＣＥＳ６００からパージされる空気又はガスは、空気除去チャンバー６５６と流体的に関連付けられたライン６５８を通って、エアバルブ６６０から大気中へベント可能である。
【００６０】
ＥＣ培地源が、ＥＣ培地取り付け点６６８に取り付けられる。洗浄液源が、洗浄液取り付け点６６６に取り付けられる。これにより、ＥＣ培地及び／又は洗浄液が第１流体流路又は第２流体流路に加えられる。取り付け点６６６は、バルブ６７０と流体的に関連付けられる。バルブ６７０は、バルブ６７２及び第１流体入口路６４２を介して第１流体循環路６０２と流体的に関連付けられる。また、バルブ６７０を開け、バルブ６７２を閉じることにより、取り付け点６６６は、第２流体入口路６７４及び第２流体流路６８４を介して第２流体循環路６０４と流体的に関連付けることができる。同様に、取り付け点６６８は、バルブ６７６と流体的に関連付けられる。バルブ６７６は、第１流体入口路６４２及びバルブ６７２を介して第１流体循環路６０２と流体的に関連付けられる。また、バルブ６７６を開け、分配バルブ６７２を閉じることにより、流体容器６６８を、第２流体入口路６７４と流体的に関連付けることができる。
【００６１】
ＩＣループにおいて、流体はまず、ＩＣ入口ポンプ６５４によって送られる。ＥＣループでは、流体はまず、ＥＣ入口ポンプ６７８によって送られる。超音波センサのようなエア検知器６８０がＥＣ入口路６８４と関連付けられてもよい。
【００６２】
少なくとも１つの実施形態において、第１及び第２流体循環路６０２、６０４は、廃棄ライン６８８に接続される。バルブ６９０を開けると、ＩＣ培地は、廃棄ライン６８８を通って、廃棄バッグ又は出口バッグ６８６に至る。同様に、バルブ６９２を開けると、ＥＣ培地は、廃棄バッグ又は出口バッグ６８６に流れる。
【００６３】
細胞が細胞成長チャンバー６０１にて成長された後、該細胞は、細胞収穫路６９７を介して収穫される。細胞成長チャンバー６０１からの細胞は、バルブ６９８を開けた状態において、細胞を含むＩＣ培地をポンピングすることにより、細胞収穫路６９７を介して、細胞収穫バッグ６９９に収穫される。
【００６４】
ＣＥＳ６００の各部品は、細胞増殖装置２０２（図２及び図３）のような装置又はハウジング内に収容され、該装置は、細胞及び培地を所定温度に維持する。さらに、実施形態において、ＣＥＳ６００とＣＥＳ５００（図５）の部品を結び付けてもよい。他の実施形態において、ＣＥＳは、本開示の範囲において、図５及び図６に示される部品よりも少ない数の部品を含んでもよいし、多い数の部品を含んでもよい。
【００６５】
図５及び図６は、細胞増殖システムの異なる実施形態の概略図を示すが、図７及び図８は、これら細胞増殖システムにおいて、本開示の実施形態に従って、廃棄バッグ又は出口バッグ（５８６、６８６）を培地バッグに交換した状態を示す。例えば、図７に示されるように、ＣＥＳ６００（図６）の廃棄バッグ又は出口バッグ６８６は、培地バッグ（例えば基本培地バッグ）７００に交換されている。さらに、一実施形態において、１以上のポンプ（例えば、ＩＣ循環ポンプ６１２、ＥＣ入口ポンプ６７８、ＩＣ入口ポンプ６５４）は、ＯＦＦにされている。そのため、細胞成長チャンバー６０１に能動的に流入する流体はない。酸素供給器又はガス移送モジュール６３２における蒸発による流体の損失を補うため、ＥＣ循環ポンプ６２８はＯＮ状態に置かれ、ＥＣ廃棄バルブ６９２はＯＰＥＮにされる。これにより、培地バッグ７００からの流体が、酸素供給器又はガス移送モジュール６３２からの蒸発速度と等しい流量で、ＣＥＳ６００にバックフローされる。従って、蒸発に起因するシステム内での流体の損失は、細胞成長中にバイオリアクター６０１において起こる化学的シグナル伝達の希薄化なしで、補われる。従って、実施形態において、バイオリアクター６０１における細胞成長の誘導期（ｌａｇ  ｐｈａｓｅ）を大きく減少させることができ、より効率的な細胞増殖を行える。さらに、入口ポンプをＯＦＦにすることによって（或いは動作停止させることによって）、流体がシステムに対して不必要に能動的に流入することがなくなるため、システム資源を節約することができる。図７は、ＩＣ循環ポンプ６１２、ＥＣ入口ポンプ６７８、ＩＣ入口ポンプ６５４をＯＦＦにした一実施形態を示すが、他の実施形態では、それらポンプのうちの１以上のポンプ（例えば、ＩＣ循環ポンプ６１２）をＯＮ又は稼動状態に維持される（図７では図示せず）。例えば、ある実施形態では、増殖させる細胞の種類によっては（例えば、非接着性細胞）、毛細管内側での循環を継続することが望ましい場合がある。
【００６６】
いくつかの実施形態では、流体を培地バッグからＥＣループ６０４へ流出させる動作を重力によってアシストさせるため、培地バッグ（例えば、７００）は、ＥＣループ６０４の少なくとも一部よりも、物理的に高い位置に位置づけられる。いくつかの実施形態において、廃棄培地を廃棄バッグ６８６へ流出させる動作を重力によってアシストさせるため、廃棄バッグ６８６（図６）は、ＥＣループ６０４よりも、低い位置に置かれる。実施形態によれば、廃棄バッグ６８６が培地バッグ７００に代わる場合、取って代わった又は交換された培地バッグ７００は、廃棄バッグ６８６の元の位置よりも、物理的に高い位置に配置される。
【００６７】
図８は、例えば、廃棄バッグ５８６が培地バッグ（例えば基本培地バッグ）８００に交換された同様の構成を示す。さらに、一実施形態において、１以上のポンプ（例えば、ＩＣ循環ポンプ５１２、ＥＣ入口ポンプ５７８、ＩＣ入口ポンプ５５４）は、ＯＦＦにされている。そのため、バイオリアクター５０１に能動的に流入する流体はない。酸素供給器又はガス移送モジュール５３２における蒸発による流体の損失を補うため、ＥＣ循環ポンプ５２８がＯＮにされ、ＥＣ廃棄バルブ５８２はＯＰＥＮにされる。これにより、交換された培地バッグ８００からの流体が、ガス移送モジュール又は酸素供給器５３２での蒸発速度と等しい流量で、システムにバックフローされる。従って、蒸発に起因するシステム内での流体の損失は、細胞成長中にバイオリアクター５０１において起こる化学的シグナル伝達の希薄化なしで、補われる。従って、実施形態において、バイオリアクター５０１における細胞成長の誘導期（ｌａｇ  ｐｈａｓｅ）を大きく減少させることができ、より効率的な細胞増殖を行える。さらに、入口ポンプをＯＦＦにすることによって、流体がシステムに対して不必要に能動的に流入することがなくなるため、システム資源を節約することができる。図８は、ＩＣ循環ポンプ５１２、ＥＣ入口ポンプ５７８、ＩＣ入口ポンプ５５４をＯＦＦにした一実施形態を示すが、他の実施形態では、それらポンプのうちの１以上のポンプ（例えば、ＩＣ循環ポンプ５１２）をＯＮ又は稼動状態に維持される（図８では図示せず）。例えば、ある実施形態では、増殖させる細胞の種類によっては（例えば、非接着性細胞）、毛細管内側での循環を継続することが望ましい場合がある。
【００６８】
いくつかの実施形態では、廃棄バッグ５８６を培地バッグ８００に交換する場合、培地をＥＣループ５０４へ流出させる動作を重力によってアシストさせるため、交換された培地バッグは、廃棄バッグ５８６の元の位置よりも、物理的に高い位置に位置づけられるとよい。
【００６９】
廃棄バッグを培地バッグに交換することにより、蒸発に起因する流体損失の受動的な補充が可能となる。流体の受動的な補充によって、細胞増殖プロセスにおける流体の大幅な節減が可能となる。能動的な培地補充のプロセスでは、蒸発に起因する流体損失を補充するため、細胞付着が行われている間、培地がＩＣループに付加されて循環される。上述のように、培地が、いくつかのプロセスで行われる可能性のある０．１ｍｌ／分の流量で付加されると、例えば、システムにおいて（蒸発した量よりも）余分な量の流体が、１３０ｍＬ／日までに及ぶことになる。廃棄バッグの培地バッグへの交換による流体の受動的付加では、このような余分な量の付加が回避される。よく知られているように、培地は、高価な添加剤を含む場合がある。例えば、約１３０ｍＬ／日の量の節減によって、他の細胞増殖プロセスにわたって、大幅なコスト節減が可能となる。
【００７０】
図７及び図８では、廃棄バッグに代わって、培地バッグを使用することを通じて、閉鎖系細胞増殖システムにおける培地の受動的な補充が行われるが、図９では、分子供給源（例えば細胞シグナル伝達タンパク質分子供給源）が、ＣＥＳ６００（図６）（又はＣＥＳ５００（図５））のような細胞増殖システムに追加された一実施形態が示される。一実施形態において、分子供給源９００は、サンプルコイル又はサンプリングコイル６１８に接合されたサイトカイン供給源である。サイトカイン供給源は、サンプリングコイル６１８に接合される配管又は他の部材を有する。そのような供給源、すなわち直接供給源を通じて、ＩＣ培地バッグにおいてサイトカインが付加される場合に起こるであろうタンパク質の希釈が行わることなく、サイトカインがＩＣループ６０２に付加される。実施形態において、該分子は、ＩＣループ６０２に直接付加される。ある実施形態において、そのような直接付加は、例えば、サンプルポートにて行うことができる。このようにして、細胞成長チャンバー６０１のサイトカインは、サイトカイン供給源によって、受動的に又は能動的に補充される。そのような実施形態では、ＩＣ循環ポンプ６１２はＯＮにされることで、サンプリングコイル６１８においてサイトカインがＩＣループ６０２に流入させられ、バイオリアクター６０１内における増殖中の細胞集団に向かってポンピングされる。バイオリアクター内で使用される化学的シグナル伝達タンパク質が特に高価な場合（例えば、サイトカイン）、そのような細胞供給源によって、最終的に大幅な資源の節減ができる。
【００７１】
細胞増殖システム及び該システムと共働して培地を受動的に補充する方法の種々の実施形態が記載されてきたが、図１０では、本開示の実施形態に係る、閉鎖系細胞増殖システムにおける化学的シグナル伝達を制御するため、流体を受動的に補充する例示的な動作ステップ１０００が示される。ＳＴＡＲＴステップ１００２が開始すると、プロセス１０００は、細胞増殖システムにディスポーザブル配管セットを装填するステップ１００４に進む。次に、ステップ１００６に進んで、例えば、プライミングタスクの選択を通じて、ユーザ又はオペレータがシステムに対してプライミングを行うように指示することによって、システムに対するプライミングを行う。他の実施形態では、ステップ１００６において、ユーザ又はオペレータからのタスクや指示の選択を行わずに、システムは自動的にプライミングを行う。配管セットに対するプライミングの後、プロセス１０００は、ステップ１００８に進み、バイオリアクターのコーティングを行う。ここでは、バイオリアクターは試薬によってコーティングされる。例えば、試薬バッグが空になるまで、試薬はＩＣループ内に投入される。試薬は空気除去チャンバーからＩＣループへと移送され、ＩＣループ内を循環する。バイオリアクターがコーティングされると、ステップ１０１０においてＩＣ／ＥＣ洗浄タスクが行われる。ここでは、ＩＣ循環ループとＥＣ循環ループにおいて、流体が交換される。ある実施形態によれば、交換容量は、ＩＣ容量及びＥＣ容量の交換回数によって決定される。次に、バイオリアクター膜における中空糸にわたって適切な又は所望のガス濃度を維持するため、培地調整タスク１０１２が実行される。ここでは、細胞がバイオリアクターに投入される前に、培地が規定のガス供給に対して平衡に達するようにする。例えば、ＥＣ循環レートを高くすることによって、培地とガス移送モジュール又は酸素供給器によるガス供給との間で、迅速に接触が行われる。ある実施形態において、ユーザ又はオペレータによるバイオリアクターへの細胞投入の準備が整うまで、システムは適切な状態に維持される。他の実施形態において、ユーザ又はオペレータは、上記のステップ／動作を行うために必要ではなく、該ステップ／動作は、細胞増殖システムによって自動的に行われてもよい。
【００７２】
次に、プロセス１０００は、ステップ１０１４に進み、循環分配させながら細胞投入バッグからバイオリアクターへ細胞の投入を行う。一実施形態において、細胞は、細胞投入バッグが空になるまで、該バッグからバイオリアクターへ投入される。細胞は空気除去チャンバーからバイオリアクターへ移送される。より大きな移送体積によって、細胞は、より大きく分散投入され、ＩＣ出口へと向かわせる。細胞の膜への分配は、例えば、ＩＣ入口ではなく、ＩＣ循環ポンプのような、ＩＣ循環によって、促進される。
【００７３】
循環分配させながらの細胞投入のタスク１０１４が完了した後、ステップ１０１６において、廃棄バッグ又は出口バッグは培地バッグに交換される。一実施形態において、培地バッグは、約５００ｍＬの基本培地を含む。ある実施形態によれば、培地バッグは、他の流体及び／又は他の組成物を含んでもよい。ある実施形態では、出口バッグ又は廃棄バッグの培地バッグへの交換を行うステップ１０１６は任意であり、この場合、実行中の規定の手順を中断して、（出口バッグ又は廃棄バッグ内に、細胞成長に対して毒性を示す成分が存在しない場合）出口バッグ又は廃棄バッグ内の流体を、能動的な流体流入が無い条件下での蒸発速度で、システムに受動的に付加することによって、流体を受動的に補充する。このような流体の受動的な付加によって、余分な量の流体の付加が回避され、ひいては化学的シグナル伝達分子の希釈が回避される。
【００７４】
図１０に戻って、ステップ１０１８において、１以上のポンプ（例えば、ＩＣ入口ポンプ、ＩＣ循環ポンプ、ＥＣ入口ポンプ）がＯＦＦにされるか又は別の方法で動作停止される。そして、ステップ１０２０において、バイオリアクター内における接着性細胞が、ある期間の間（本開示の一実施形態の場合、約１８時間から約２４時間）、バイオリアクター膜に対して付着される。この期間の間、ＥＣ循環ループにおける流れは継続し、ＥＣ循環レートは、ある実施形態においては約３０ｍＬ／分に維持される。ＥＣ循環レートを非ゼロ値にすることで、ガス移送モジュール又は酸素供給器を介して流体をＥＣループにおいてポンピングし続けることになり、それによって、バイオリアクター膜の中空糸全体にわたって適切な又は所望のガス濃度に維持することが促進される。ガス移送モジュールの使用によって適切な又は所望のガス濃度が維持されると同時に、ガス移送モジュールにおいて、流体の蒸発も起こる。しかしながら、ＥＣ廃棄バルブを開状態に維持することにより、（廃棄バッグから交換された）培地バッグからの培地はシステムにバックフローし、ＥＣ循環ポンプによって、ＥＣループを通ってポンピングされる。このようにして、培地は、ガス移送モジュールからの蒸発に起因する流体損失を、その蒸発速度で補充する。従って、バイオリアクター内の膜糸は、過剰な流体で希釈されず、細胞成長の誘導期からの遷移は阻害されない。
【００７５】
接着性細胞を約１８時間から約２４時間の間、付着させた後、ステップ１０２２において、継続して細胞付着期間は、最大４８時間にわたって続けられる。ステップ１０２２中、バイオリアクター膜の最も遠くの中空糸にも培地を供給するため、ＩＣ循環ポンプは稼動され又はＯＮされてよい。例えば、本開示の一実施形態において、ＩＣ循環ポンプは、ＩＣ循環レートが約２０ｍＬ／分に調整されるように稼動される。しかしながら、ステップ１０２２におけるＩＣ循環ポンプの作動を介しての変更されたフィーディングステップでは、ＩＣ投入レートは０ｍＬ／分に維持される。（廃棄バッグから交換された）培地バッグは、膜の希釈や化学的シグナル伝達の阻害を行うことなく、システムに必要な流体補充を継続する。変更された細胞フィーディングステップ１０２２は、バイオリアクター内で起こる化学的シグナル伝達の中断を起こすことなく、細胞付着を継続させることができる。この継続する細胞付着期間は、追加で最大で約４８時間、続けられるか及び／又は細胞の乳酸生成が、約６ｍｍｏｌ／Ｌ以上になるまで、続けられる。一実施形態では、乳酸の濃度が測定される。他の実施形態では、例えば、乳酸生成レートが測定される。一実施形態では、ステップ１０２４において、乳酸生成がチェックされる。ここでは、乳酸の濃度が６ｍｍｏｌ／Ｌ以上かどうかが判定される。他の実施形態では、ステップ１０２４において、ある所定の量に対して乳酸濃度を判定することで、乳酸生成がチェックされる。
【００７６】
次に、プロセス１０００はステップ１０２６に進み、ＩＣ循環ポンプを動作させてから経過時間が４８時間を超えたかどうか又は乳酸濃度が約６ｍｍｏｌ／Ｌ以上かどうかが判定される。経過時間が４８時間未満の場合又は乳酸濃度が約６ｍｍｏｌ／Ｌ未満の場合、プロセス１０００はＮＯへ進み、乳酸をチェックするステップ１０２４及び判断ステップ１０２６を再び行う。本開示は、４８時間が経過したかどうか或いは乳酸濃度が６ｍｍｏｌ／Ｌ以上かどうかを判定することに限定されない。他の実施形態では、プロセス１０００は、異なる経過時間であってもよい。例えば、ステップ１０２６において、約１２時間が経過したか又は約２４時間が経過したか又は約３６時間が経過したか又は約４０時間が経過したかについて判定を行ってもよい。他の実施形態では、該経過時間は、約５０時間又は約６０時間であってもよい。ある実施形態では、経過時間は約１２時間を超えたか又は約２４時間を超えたか又は約３６時間を超えたか又は約４０時間を超えたかについて判定を行ってもよい。他の実施形態では、経過時間は約６０時間未満か又は約５０時間未満かについて判定を行ってもよい。さらに他の実施形態では、プロセス１０００は、乳酸濃度が、約３ｍｍｏｌ／Ｌ、約４ｍｍｏｌ／Ｌ、約５ｍｍｏｌ／Ｌ、約７ｍｍｏｌ／Ｌ、約８ｍｍｏｌ／Ｌのような他の所定量以上かどうかを判定してもよい。ある実施形態では、乳酸濃度が約３ｍｍｏｌ／Ｌより大きいか又は約４ｍｍｏｌ／Ｌより大きいか又は約５ｍｍｏｌ／Ｌより大きいかを判定してもよい。他の実施形態では、乳酸濃度が約８ｍｍｏｌ／Ｌ未満か又は約７ｍｍｏｌ／Ｌ未満かを判定してもよい。
【００７７】
ステップ１０２６において、ＩＣ循環ポンプが動作してから約４８時間が経過した又は乳酸濃度が６ｍｍｏｌ／Ｌ以上であると判定された場合、プロセス１０００は、ＹＥＳへ進み、細胞フィーディングステップ１０２８を行う。ここでは、ＩＣ入口ポンプが稼動され又はＯＮにされて、ＩＣ投入レートを０．１ｍＬ／分に維持する。次に、プロセス１０００は、グルコース消費量を測定するステップ１０３０に進む。一実施形態において、グルコース濃度が測定される。他の実施形態では、例えば、グルコース消費レートが測定される。一実施形態では、ステップ１０３２において、測定されたグルコース消費量が約７０ｍｇ／Ｌ未満かどうかが判定される。グルコース消費量が約７０ｍｇ／Ｌ（或いは他の実施形態では別の所定量）未満の場合、プロセス１０００はＹＥＳに進み、ステップ１０３４において、ＩＣ投入レートを２倍にする。そして、プロセス１０００はステップ１０３０に進み、細胞のグルコース消費量を測定し続け、判定ステップ１０３２に戻る。
【００７８】
本開示は、グルコース消費量が約７０ｍｇ／Ｌ未満かどうかを判定することに限定されない。他の実施形態では、プロセス１０００は、異なる所定量であってもよい。例えば、ある実施形態では、プロセス１０００は、グルコース消費量は、例えば、約６５ｍｇ／Ｌ、約６０ｍｇ／Ｌ、約５５ｍｇ／Ｌのような他の所定量よりも小さいかどうかを判定してもよい。他の実施形態では、プロセス１０００は、グルコース消費量は、例えば、約８５ｍｇ／Ｌ、約８０ｍｇ／Ｌ、約７５ｍｇ／Ｌのような他の所定量よりも小さいかどうかを判定してもよい。ある実施形態において、グルコース消費量は、約５５ｍｇ／Ｌ又は約６０ｍｇ／Ｌ又は約６５ｍｇ／Ｌより大きいかどうかを判定してもよい。他の実施形態では、グルコース消費量は、約８５ｍｇ／Ｌ又は約８０ｍｇ／Ｌ又は約７５ｍｇ／Ｌ未満かどうかを判定してもよい。
【００７９】
ステップ１０３２において、グルコース消費量が７０ｍｇ／Ｌよりも大きいと判定された場合、プロセス１０００はＮＯに進み、細胞剥離ステップ１０３６が行われる。ここでは、細胞がバイオリアクターの膜から剥離され、ＩＣループ内に懸濁される。ある実施形態において、試薬を加えるための準備としてＩＣ／ＥＣ洗浄タスクが行われる。付着細胞の剥離のためのトリプシン又は他の化学的剥離剤の付加を行う準備として、例えば、ＩＣ／ＥＣ培地はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に交換されて、タンパク質、カルシウム（Ｃａ2+）、マグネシウム（Ｍｇ2+）が除去される。試薬は、試薬バッグが空になるまでシステムに投入される。試薬はＩＣループ内に移送され、ＩＣループ内において混合される。付着細胞の剥離の後、収穫ステップ１０３８において、バイオリアクター内に残存する全ての細胞を含むＩＣ循環ループからの懸濁細胞は、収穫バッグへ移送される。そして、プロセス１０００は、ＥＮＤステップ１０４０にて終了する。
【００８０】
次に、図１１は、本開示の実施形態に係る、細胞増殖システム自身の一部として実施される分子供給源から分子を付加するプロセス１１００の動作特徴を示すフローチャートを示す。細胞増殖システム及び細胞増殖システムに分子を付加する方法の種々の実施形態が記載されてきたが、図１１では、本開示の実施形態に係る、閉鎖系細胞増殖システムにおける化学的シグナル伝達に影響を与える分子を付加する例示的な一連の動作ステップ１１００が示される。いくつかの実施形態では、分子供給源からの分子の受動的な付加が行われる。ＳＴＡＲＴ動作１１０２が開始すると、プロセス１１００は、細胞増殖システムにディスポーザブル配管セットを装填するステップ１１０４に進む。次に、ステップ１１０６に進んで、例えば、プライミングタスクの選択を通じて、ユーザ又はオペレータがシステムに対してプライミングを行うように指示することによって、システムに対するプライミングを行う。他の実施形態では、ステップ１１０６において、オペレータ又はユーザからのタスクや指示の選択を行わずに、システムは自動的にプライミングを行う。
【００８１】
配管セットに対するプライミングの後、プロセス１１００は、ステップ１１０８に進み、バイオリアクターのコーティングを行う。ここでは、バイオリアクターは試薬によってコーティングされる。例えば、ある実施形態では、試薬容器が空になるまで、試薬はＩＣループ内に投入される。試薬は空気除去チャンバーからＩＣループへと移送され、ＩＣループ内を循環する。バイオリアクターがコーティングされると、ステップ１１１０においてＩＣ／ＥＣ洗浄タスクが行われる。ここでは、ＩＣ循環ループとＥＣ循環ループにおいて、流体が交換される。ある実施形態によれば、交換容量は、ＩＣ容量及びＥＣ容量の交換回数によって決定される。
【００８２】
次に、バイオリアクター膜における中空糸にわたって適切な又は所望のガス濃度を維持するため、培地調整タスク１１１２が実行される。ここでは、細胞がバイオリアクターに投入される前に、培地が規定のガス供給に対して平衡に達するようにする。例えば、ＥＣ循環レートを高くすることによって、培地とガス移送モジュール又は酸素供給器によるガス供給との間で、迅速に接触が行われる。ある実施形態において、オペレータ又はユーザによるバイオリアクターへの細胞投入の準備が整うまで、システムは適切な又は所望の状態に維持される。ある実施形態において、細胞の投入は自動的に行われる。
【００８３】
次に、プロセス１１００は、ステップ１１１４に進み、循環分配させながら細胞投入バッグからバイオリアクターへ細胞を投入する。一実施形態において、細胞は、細胞投入バッグが空になるまで、該バッグからバイオリアクターへ投入される。細胞は空気除去チャンバーからバイオリアクターへ移送される。より大きな移送体積を利用する実施形態では、細胞はさらに分配され、ＩＣ出口へと向かう。細胞の膜への分配は、例えば、ＩＣ入口ではなく、ＩＣ循環ポンプのような、ＩＣ循環によって、促進される。
【００８４】
循環分配させながらの細胞投入のタスク１１１４が完了した後、ステップ１１１６において、廃棄バッグは培地バッグに交換される。一実施形態において、培地バッグは、約５００ｍＬの基本培地を含む。他の実施形態では、培地バッグは、任意の種類の補充流体を含む。さらに他の実施形態では、ステップ１１１６は任意であり、出口バッグ又は廃棄バッグは接続されたままで、別のバッグに交換されない。さらに他の実施形態では、ステップ１１１６は任意であり、出口バッグ又は廃棄バッグは接続されたままであり、所望の成分又は他の流体をシステムに受動的に付加するため、該成分又は該他の流体が出口バッグ又は廃棄バッグに付加される。
【００８５】
ある実施形態において、ステップ１１１８において、１以上のポンプ（例えば、ＩＣ入口ポンプ、ＩＣ循環ポンプ、ＥＣ入口ポンプ）がＯＦＦにされるか又は別の方法で動作停止される。そして、ステップ１１２０において、バイオリアクター内における接着性細胞が、ある期間の間（本開示の一実施形態の場合、約１８時間から約２４時間）、バイオリアクター膜に対して付着される。この期間の間、ＥＣ循環ループにおける流れは継続し、ＥＣ循環レートは、ある実施形態においては約３０ｍＬ／分に維持される。ＥＣ循環レートを非ゼロ値にすることで、ガス移送モジュール又は酸素供給器を介して流体をＥＣループにおいてポンピングし続けることになり、それによって、バイオリアクター膜の中空糸全体にわたって適切な又は所望のガス濃度に維持することが促進される。ガス移送モジュールの使用によって適切な又は所望のガス濃度が維持されると同時に、ガス移送モジュールにおいて、流体の蒸発も起こる。しかしながら、ＥＣ廃棄バルブを開状態に維持することにより、（廃棄バッグから交換された）培地バッグからの培地はシステムにバックフローし、ＥＣ循環ポンプによって、ＥＣループを通ってポンピングされる。このようにして、培地は、ガス移送モジュールからの蒸発に起因する流体損失を、その蒸発速度で補充する。従って、バイオリアクター内の膜糸は、過剰な流体で希釈されず、細胞成長の誘導期からの遷移は阻害されない。
【００８６】
全ての接着性細胞が付着した後、分子付加ステップ１１２２が行われる。分子は、細胞増殖を促進するために付加されるタンパク質分子であってよい。例えば、該分子は、細胞間通信に関連する１以上のサイトカインや成長因子のようなシグナル伝達分子であってよい。該分子は、細胞間のシグナル伝達を行って、増殖させる。他の実施形態では、該分子は、シグナル伝達においては直接関連しないが、細胞成長を促進する環境の生成に役立つ。そのような分子の例としては、担体タンパク質や緩衝剤やｐＨ調整剤等が挙げられる。ある実施形態では、該分子は、細胞が成長中の空間（例えば、ＩＣ空間又はＥＣ空間）に付加される。ある実施形態では、該分子は、分子の直接供給源からＩＣループに直接付加される。ある実施形態では、そのような直接付加は、例えば、サンプリングコイルやサンプルポートにおいて行われる。サイトカイン又は他の種類の細胞シグナル伝達タンパク質分子は、例えば、サイトカイン供給源に接続された配管又はその他の部材を細胞増殖システムのサンプリングコイル又はサンプルコイルに接合することによって、バイオリアクターに付加される。このようにして、サイトカインは、サンプルコイルにおいてバイオリアクターに付加される。このような直接付加は、高価なサイトカインを大幅に節約することになる。何故なら、サイトカイン供給源自身のみだけでバイオリアクターを補充する場合に必要とされる量と比べて、培地によるサイトカインの希釈の補充においては、より多くの量のサイトカインを培地バッグに付加する必要があるからである。さらに、サイトカインは急速に分解する傾向にあり、増殖中の細胞集団のより近傍に（例えば、バイオリアクターのサンプルコイルにおいて）サイトカインを付加することによって、そのような分解を最小にできる。そのような実施形態では、バイオリアクター内のサイトカインは、ある一定のレベルに維持され、資源が節約される。そのような供給源、すなわち直接供給源を用いることによって、サイトカインは、そのようなタンパク質の希釈なしで、ＩＣループに付加される。すなわち、例えばサイトカインをＩＣ培地バッグに付加する場合に起こるタンパク質の希釈が行われることなく、ＩＣループに付加される。
【００８７】
上述のように、一実施形態において、分子付加ステップ１１２２は、ステップ１１１６において廃棄バッグを培地バックに交換した後に行われる。いくつかの実施形態において、ステップ１１２２において付加される分子は比較的高価であり、細胞成長を促進するための必要最小限の量を使用することが望ましい。先にステップ１１１６を行うことにより、（廃棄バッグから交換した）培地バッグからの培地はシステム内にバックフローして、ＥＣ循環ポンプによって、ＥＣループを通じてポンピングされる。一実施形態によれば、ガス移送モジュールからの蒸発によって失われた培地のみが、その蒸発速度で補充される。従って、分子は、過剰な流体によって希釈されない。よって、一実施形態では、過剰な流体による希釈が起こらないので、成長の促進に効果がある量の分子だけが、ステップ１１２２において付加される。
【００８８】
ステップ１１２２の後、ステップ１１２４において、細胞は成長される。ある実施形態では、ステップ１１２４は、複数のサブステップを含む。いくつかの実施形態では、該サブステップは、プロセス１０００（図１０）において行われるステップを含む。例えば、一実施形態では、細胞フィーディングのための培地循環ステップが行われる。バイオリアクター膜の最も遠くにある中空糸にも培地を供給するため、ＩＣ循環ポンプが稼動され又はＯＮされる。本開示の一実施形態では、ＩＣ循環ポンプは、ＩＣ循環レートが約２０ｍＬ／分に調整されるように稼動される。いくつかの実施形態では、ＩＣ循環ポンプがＯＮの場合でも、ＩＣ投入レートは０ｍＬ／分に維持される。（廃棄バッグから交換された）培地バッグは、分子の希釈や化学的シグナル伝達の阻害を行うことなく、システムに必要な流体補充を継続する。ある実施形態では、ステップ１１２４は、分子の希釈による化学的シグナル伝達の中断を起こすことなく、細胞付着及び細胞成長を行うことができる。ある実施形態において、この細胞付着及び細胞成長は、ある所定期間、継続するか又は細胞の乳酸生成（例えば、一実施形態では約６ｍｍｏｌ／Ｌ）に基づいて行われる。これら実施形態では、乳酸濃度の判定や所定時間の経過の判定のような追加的なサブステップが行われてもよい。
【００８９】
ステップ１１２４は、ＩＣ入口ポンプを稼動させて、所定のＩＣ投入レート（例えば、０．１ｍＬ／分）に維持するサブステップをさらに有してもよい。このサブステップは、例えば、所定の時間が経過したことに基づいて或いは乳酸濃度のような測定に基づいて、引き起こされる。
【００９０】
いくつかの実施形態において、ステップ１１２４は、細胞成長をいつ止めるか、細胞の剥離・収穫をいつ始めるかを判定する複数のサブステップを含む。一実施形態において、これは、グルコース消費量のようなパラメータの測定を含む。いくつかの実施形態において、ある所定のグルコース濃度（例えば、７０ｍｇ／Ｌより大きい値）によって、それに続くステップ（例えば、１１２６、１１２８）を引き起こすようにする。他の実施形態では、他のパラメータ又は所定時間の経過によって、それに続くステップを引き起こす。
【００９１】
ステップ１１２６において、付着細胞がバイオリアクターの膜から剥離され、例えば、ＩＣループ内に、懸濁される。ある実施形態において、試薬を加えて細胞を剥離するための準備としてＩＣ／ＥＣ洗浄タスクが、ステップ１１２６の一部として行われる。付着細胞の剥離のためのトリプシン又は他の化学的剥離剤の付加を行う準備として、例えば、ＩＣ／ＥＣ培地はＰＢＳに交換されて、タンパク質、カルシウム（Ｃａ2+）、マグネシウム（Ｍｇ2+）が除去される。試薬は、試薬バッグが空になるまでシステムに投入される。試薬はＩＣループ内に移送され、ＩＣループ内において混合される。付着細胞の剥離の後、収穫ステップ１１２８において、バイオリアクター内に残存する全ての細胞を含むＩＣ循環ループからの懸濁細胞は、収穫バッグへ移送される。そして、プロセス１１００は、ＥＮＤステップ１１３０にて終了する。
【００９２】
図１２では、本開示の実施形態に係る、閉鎖系細胞増殖システムにおける化学的シグナル伝達を制御するために流体を受動的に補充する例示的な動作ステップ１２００が示される。ＳＴＡＲＴステップ１２０２が開始すると、プロセス１２００は、細胞増殖システムにディスポーザブル配管セットを装填するステップ１２０４に進む。次に、ステップ１２０６において、例えば、プライミングタスクの選択を通じて、ユーザ又はオペレータがシステムに対してプライミングを行うように指示することによって、システムに対するプライミングを行う。他の実施形態において、ステップ１２０６において、ユーザ又はオペレータからのタスクや指示の選択を行わずに、システムは自動的にプライミングを行う。配管セットに対するプライミングの後、プロセス１２００は、ステップ１２０８に進み、ＩＣ／ＥＣ洗浄タスクが行われる。ここでは、細胞培養の準備として、ＩＣ循環ループとＥＣ循環ループにおける流体が交換される。ある実施形態によれば、交換容量は、ＩＣ容量及びＥＣ容量の交換回数によって指定される。次に、細胞投入前に培地がガス供給に対して平衡に達するようにするため、プロセス１２００はステップ１２１０に進んで、培地調整タスクが実行される。例えば、ＥＣ循環レートを高くすることによって、培地とガス供給との間で、迅速に接触が行われる。ある実施形態において、ユーザ又はオペレータによるバイオリアクターへの細胞投入の準備が整うまで、システムは適切な状態に維持される。ある実施形態において、ユーザ又はオペレータは、上記ステップ／操作を行うために必要ではなく、上記ステップ／操作は、細胞増殖システムによって自動的に行われてもよい。
【００９３】
次に、プロセス１２００は、ステップ１２１２に進み、均一懸濁での細胞投入を行う。一実施形態において、細胞は、細胞投入バッグから投入される。ＩＣ循環によって、細胞を分配する。一実施形態において、細胞は、細胞投入バッグからバイオリアクターへ投入される。そして、細胞は、空気除去チャンバーからＩＣループに移送される。ある実施形態によれば、細胞の膜への分配は、例えばＩＣ投入せずに、従って限外濾過を行わずに、ＩＣ循環によって、促進される。
【００９４】
次に、プロセス１２００は、任意（点線で示される）のステップ１２１４に進み、出口バッグ又は廃棄バッグを培地バッグ（例えば、代替え培地バッグ）に交換する。一実施形態において、培地バッグは、約０．２Ｌのタンパク質無し培地を含む。本開示のある実施形態において、培地バッグ内の補充流体は他の体積でもよいし、また他の種類の流体でもよい。次に、プロセス１２００は、ステップ１２１６に進み、１以上のポンプをＯＦＦにするか或いは動作停止にする。一実施形態では、ステップ１２１６において、ＩＣ入口ポンプ及びＥＣ入口ポンプをＯＦＦにし、或いは動作停止を行う。ポンプの動作停止により、ＩＣ循環ループ及びＥＣ循環ループへの培地投入流量がＯＦＦとなり、ＣＣＫのような化学的シグナル伝達物質の濃度が増える。そのような実施形態では、交換バッグからの流体は、能動的な流体流入が無い条件下での蒸発速度で、システムに受動的に付加される。出口バッグ又は廃棄バッグが交換されない実施形態の場合、実行中の規定の手順を中止して、（出口バッグ又は廃棄バッグ内に、細胞成長に対して毒性を示す成分が存在しない場合）出口バッグ又は廃棄バッグ内の流体を、能動的な流体流入が無い条件下での蒸発速度で、システムに受動的に付加することによって、流体は受動的に補充される。そのような流体の受動的な付加によって、余分な量の流体の付加が回避され、ひいては化学的シグナル伝達分子の希釈が回避される。一実施形態において、ＥＣ循環ポンプはＯＮのままである。他の実施形態では、ＩＣ循環ポンプ及びＥＣ循環ポンプの両方が稼動状態又はＯＮに維持される。
【００９５】
次に、プロセス１２００は、ステップ１２１８に進み、細胞に対してフィーディングを行う。一実施形態において、細胞培養では、ＩＣループの代表的な細胞濃度のサンプルを取るため、配管のある部分を切り取って、細胞数カウント用にサンプル採取が行われる。他の実施形態では、細胞は、例えば、サンプリングコイル又はサンプルポートからサンプルを取り出して、カウントされてもよい。
【００９６】
次に、プロセス１２００は、ステップ１２２０に進み、グルコース濃度及び／又は乳酸濃度の測定を行う。ステップ１２２２において、細胞培養条件が、最小許容グルコース濃度又は最大許容乳酸濃度に達したかどうかが判定される。ある実施形態によれば、そのような許容濃度は、第４日目の前後で生じる。許容濃度に達していない場合、プロセス１２００は、ＮＯに進み、ステップ１２２０において引き続きグルコース／乳酸濃度が測定される。許容濃度に達した場合、プロセス１２００は、ＹＥＳに進み、（任意ステップ１２１４にて交換した）交換培地バッグを廃棄バッグに交換する任意（点線で示す）のステップ１２２４を行う。一実施形態では、任意のステップ１２２４において、任意のステップ１２１４にて取り外された元の廃棄バッグ又は出口バッグによって、交換培地バッグは交換される。他の実施形態では、任意のステップ１２２４において、別の廃棄バッグ又は出口バッグによって、交換培地バッグは交換される。
【００９７】
ステップ１２２４の後、プロセス１２００は、細胞フィーディングステップ１２２６へ進む。ここでは、例えば、細胞培養条件が最小許容グルコース濃度又は最大許容乳酸濃度に達した時点で、ＩＣ循環ループ及び／又はＥＣ循環ループに制御された流量を付加することによって、細胞に対するフィーディングを行う。一実施形態では、低い流量を、ＩＣ循環ループ及び／又はＥＣ循環ループに継続的に付加する。ある実施形態では、低流量を継続的に付加しながらのフィーディングは、例えば、第４日目前後に行われる。
【００９８】
次に、収穫ステップ１２２８において、バイオリアクター内に残存する細胞を含むＩＣ循環ループからの懸濁細胞は、収穫バッグへ移送される。そして、プロセス１２００は、ＥＮＤステップ１２３０にて終了する。
【００９９】
本開示の実施形態によれば、図１０、図１１、図１２に示されるプロセスにおいて記述された動作ステップは、あくまで例示の目的であり、変更されてもよく、他のステップと組み合わせてもよく、又他のステップと並行に行われてもよい。従って、それらプロセスは、ステップがある特定の順序で列挙されて記載されているが、本開示は、そのような順序に制限されない。他の実施形態において、ステップは、異なる順序で、或いは並行して、或いは任意の回数で（例えば、別のステップの前後で）、行われてもよい。さらに、ある実施形態では、本開示の精神及び範囲から逸脱しなければ、ステップを減らしてもよいし、ステップを追加してもよい。例えば、懸濁細胞のみ又は非接着性細胞のみが存在する場合、例えば、バイオリアクターのコーティングステップ１００８、１１０８や、細胞の付着ステップ１０２０、１１２０や、細胞剥離ステップ１０３６、１１２６のような、接着性細胞で使用されるいくつかのステップは使用されなくてもよい。ある実施形態において、そのようなステップがない場合でも、例えば、図１０及び図１１は、懸濁細胞又は非接着性細胞の増殖に適用することができる。さらに他の例として、図１０や図１１には示されていないが、（出口バッグ又は廃棄バッグから交換された）交換培地バッグを出口バッグ又は廃棄バッグに交換するステップを追加してもよい。一実施形態では、そのような出口バッグ又は廃棄バッグは、システムにおいて使用されていた元の出口バッグ又は廃棄バッグであってもよい。他の実施形態では、異なる出口バッグ又は廃棄バッグを用いて、交換培地バッグを交換してもよい。また、例えば、所定時間の経過や、乳酸濃度や、グルコース消費量や、循環レートのようなパラメータは、あくまで例示として示した上記パラメータと異なっていてもよい。さらに、上記したように、プロセス１２００は、点線で示したように、いくつかの任意のステップ／サブステップを有する。しかしながら、任意として示されていない上記（プロセス１０００や１１００や１２００）のいずれのステップも、本発明において、必須であると考えるべきではなく、いくつかの実施形態では行われ、他の実施形態では行われなくてもよい。さらに、いくつかのステップ、動作及び／又は副次的動作は、オペレータ又はユーザに関連して記載されたが、ある実施形態では、そのようなステップ、動作及び／又は副次的動作は、自動的に行われてもよい。
【０１００】
図１３は、本発明の実施形態が実行されるコンピュータシステム１３００の構成要素例を示す。コンピュータシステム１３００は、例えば、細胞増殖システムがプロセッサを用いて、（上述のプロセス１０００、１１００、１２００のようなプロセスの一部として行われるカスタムタスクや予めプログラムされたタスクのような）タスクを実行する実施形態において、使用される。例えば、予めプログラムされたタスクとしては、「細胞フィーディング」が挙げられる。
【０１０１】
コンピュータシステム１３００は、ユーザインターフェース１３０２、処理システム１３０４、及び／又は記憶装置１３０６を有する。ユーザインターフェース１３０２は、当業者であればわかるように、出力装置１３０８、及び／又は入力装置１３１０を有する。出力装置１３０８は、１以上のタッチスクリーンを有してよい。タッチスクリーンは、１以上のアプリケーションウィンドウを提供するためのディスプレイ領域を有してよい。タッチスクリーンはまた、例えば、ユーザやオペレータからの物理的な接触を受容可能及び／又は取り込み可能な入力装置１３１０であってもよい。タッチスクリーンは、当業者であれば理解できるように、処理システム１３０４による接触位置の推定を可能とする静電容量構造の液晶ディスプレイ（ＬＣＤ）でもよい。この場合、処理システム１３０４は、接触位置を、アプリケーションウィンドウの所定位置に表示されるユーザインターフェース（ＵＩ）要素に示すことができる。また、タッチスクリーンは、本発明に係る、１以上のその他の電子構造を介して接触を受容することもできる。他の出力装置１３０８としては、プリンター、スピーカ等が挙げられる。その他の入力装置１３１０としては、当業者であれば理解できるように、キーボード、その他のタッチ式入力装置、マウス、音声入力装置等が挙げられる。
【０１０２】
本発明の実施形態において、処理システム１３０４は、処理ユニット１３１２、及び／又はメモリ１３１４を有してもよい。処理ユニット１３１２は、メモリ１３１４に記憶された命令を実行するために動作可能な汎用プロセッサであってよい。処理ユニット１３１２は、本発明の実施形態では、単一のプロセッサ又は複数のプロセッサを含んでよい。さらに、実施形態では、各プロセッサは、個別に命令を読み込んで実行するための１以上のコアを有するマルチコアプロセッサでよい。プロセッサは、当業者であれば理解できるように、汎用プロセッサ、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）、フィールド・プログラマブル・ゲート・アレイ（ＦＰＧＡ）、その他の集積回路を含んでよい。
【０１０３】
本発明の実施形態において、メモリ１３１４は、データ及び／又はプロセッサ実行可能命令を短期に又は長期に記憶する任意の記憶装置を含んでよい。メモリ１３１４は、当業者であれば理解できるように、例えば、ランダム・アクセス・メモリ（ＲＡＭ）、リード・オンリ・メモリ（ＲＯＭ）、又は電気的消去・プログラム可能型リード・オンリ・メモリ（ＥＥＰＲＯＭ）を含む。他の記憶媒体としては、例えば、当業者であれば理解できるように、ＣＤ−ＲＯＭ、テープ、デジタル多用途ディスク（ＤＶＤ）、又は、他の光学記憶装置、テープ、磁気ディスク装置、磁気テープ、その他の磁気記憶装置等がある。
【０１０４】
記憶装置１３０６は、任意の長期データ記憶装置又は部品である。本発明の実施形態において、記憶装置１３０６は、メモリ１３１４と関連して記載されたシステムのうちの１以上を含んでよい。記憶装置１３０６は、常設してもよいし、取り外し可能でもよい。一実施形態において、記憶装置１３０６は、処理システム１３０４によって生成された又は与えられたデータを記憶する。
【０１０５】
実施例
以下では、本発明の特徴を実行する、例えば、ＣＥＳ５００（図５）、ＣＥＳ６００（図６）、ＣＥＳ７００（図７）、ＣＥＳ８００（図８）、ＣＥＳ９００（図９）のような細胞増殖システムに使用されるプロトコルの例が示される。以下のプロトコルの例は、あくまで例示の目的で提供されるものであり、他の実施形態を制限することを意図しない。他の実施形態では、異なるステップ、パラメータ、他の特徴を含んでよい。例えば、細胞の投入や細胞の分配等のステップ（及びサブステップ）を含む例示的なプロトコルは、いくつかの実施形態では、メモリ内に記憶された予めプログラムされたタスクを実行するプロセッサによって、自動的に実行されてよい。他の実施形態において、ステップ（及びサブステップ）は、操作の自動による実行及び手動による実行を組み合わせることによって行われる。さらに他の実施形態において、ステップ（及びサブステップ）は他の手動式手段を介してオペレータ又はユーザによって行われる。
【０１０６】
実施例１  プロトコル１
１日前（Ｄａｙ：−１）バイオリアクターのコーティング
例示されるプロトコルのこの部分は、バイオリアクター膜を試薬にてコーティングする。バイオリアクターは中空糸膜を有する。
・ステップ１：バッグが空になるまで、ＩＣループ内に試薬を投入する。
・ステップ２：ＡＲＣから試薬をＩＣループ内に送る。
・ステップ３：試薬をＩＣループ内で循環させる。
【０１０７】
このタスクが始まる前に、以下の条件を満足させる。
・細胞投入バッグ内に少なくとも４０ｍＬの空気を含ませる。
【０１０８】
表１は、プロトコルのうちのバイオリアクターコーティング部分を行う際に各ラインに取り付けられる溶液バッグを示す。これら溶液及び体積は、使用可能であるデフォルト設定の一例として挙げられている。
【０１０９】
【表１】
0006783143.tif 000002
【０１１０】
ステップ１の各設定において、表２に示される値が用いられる。
【０１１１】
【表２】
0006783143.tif 000003
【０１１２】
ステップ２の各設定において、表３に示される値が用いられる。
【０１１３】
【表３】
0006783143.tif 000004
【０１１４】
ステップ３の各設定において、表４に示される値が用いられる。
【０１１５】
【表４】
0006783143.tif 000005
【０１１６】
０日目（Ｄａｙ：０）  ＩＣ・ＥＣ洗浄
例示されるプロトコルのこの部分は、ＩＣ循環ループ及びＥＣ循環ループの両方における流体を交換するために行われる。交換容積は、交換されるＩＣ体積及びＥＣ体積の回数によって指定される。
【０１１７】
表５は、この例示されるプロトコルのうちのＩＣ・ＥＣ洗浄を行う際、各ラインに取り付けられる溶液バッグを示す。これら溶液及び体積は、使用可能であるデフォルト設定の一例として挙げられている。
【０１１８】
【表５】
0006783143.tif 000006
【０１１９】
ＩＣ・ＥＣ洗浄において、表６に示される値が用いられる。
【０１２０】
【表６】
0006783143.tif 000007
【０１２１】
０日目（Ｄａｙ：０）  培地調整
例示されるプロトコルのこの部分は、細胞を投入する前に、培地を、規定のガス供給と平衡になるようにするために行われる。このタスクは、２つのステップを有する。
・ステップ１：高いＥＣ循環レートを使用することによって、培地とガス供給とを迅速に接触させる。
・ステップ２：オペレータが細胞投入をできる状態になるまで、システムを適切な状態に維持する。
【０１２２】
表７は、培地調整を行う際、各ラインに取り付けられる溶液バッグを示す。これら溶液及び体積は、使用可能であるデフォルト設定の一例として挙げられている。
【０１２３】
【表７】
0006783143.tif 000008
【０１２４】
ステップ１では、表８に示される値が使用される。
【０１２５】
【表８】
0006783143.tif 000009
【０１２６】
ステップ２では、表９に示される値が使用される。
【０１２７】
【表９】
0006783143.tif 000010
【０１２８】
０日目（Ｄａｙ：０）  循環分配での細胞投入
例示されるプロトコルのうちのこの部分は、細胞投入バッグから、細胞をバイオリアクター内に投入するために行われる。ＩＣ循環を使用して、細胞を分配し、細胞を、ラインからバイオリアクター内へは送り込まない。このタスクは、３つのステップを有する。
・ステップ１：細胞投入バッグから細胞をバイオリアクター内へ投入する。
・ステップ２：ＡＲＣから、細胞をバイオリアクターへ追い込む。追い込み体積（ｃｈａｓｅ  ｖｏｌｕｍｅｓ）が大きい程、細胞を分配させ、ＩＣ出口へと移動させる。
・ステップ３：ＩＣ投入ひいては限外濾過によらず、ＩＣ循環によって、膜への細胞分配を促進する。
【０１２９】
このタスクを始める前に、以下の条件を満足させる。
・細胞投入バッグ内に少なくとも４０ｍＬの空気を含ませる。
【０１３０】
表１０は、循環分配での細胞投入を行う際、各ラインに取り付けられる溶液バッグを示す。これら溶液及び体積は、使用可能であるデフォルト設定の一例として挙げられている。
【０１３１】
【表１０】
0006783143.tif 000011
【０１３２】
ステップ１では、表１１に示される値が用いられる。
【０１３３】
【表１１】
0006783143.tif 000012
【０１３４】
ステップ２では、表１２に示される値が用いられる。
【０１３５】
【表１２】
0006783143.tif 000013
【０１３６】
ステップ３では、表１３に示される値が用いられる。
【０１３７】
【表１３】
0006783143.tif 000014
【０１３８】
０日目（Ｄａｙ：０）  細胞付着
例示されるプロトコルのこの部分は、ＥＣ循環ループのフローを行いながら、バイオリアクター膜に接着性細胞を付着させるために行われる。ＩＣループに対するポンプ流量は略ゼロに設定される。
【０１３９】
表１４は、細胞付着を行う際、各ラインに取り付けられる溶液バッグを示す。これら溶液及び体積は、使用可能であるデフォルト設定の一例として挙げられている。
【０１４０】
【表１４】
0006783143.tif 000015
【０１４１】
細胞付着では、表１５に示される値が用いられる。
【０１４２】
【表１５】
0006783143.tif 000016
【０１４３】
１日目（Ｄａｙ：１）  細胞フィーディング
例示されるプロトコルのうちのこの部分は、ＩＣ循環ループ及び／又はＥＣ循環ループに対して、低い流量を連続して与えるために行われる。システムに付加される流体を除去するために使用できる出口用の設定がいくつかある。
【０１４４】
表１６は、細胞フィーディングを行う際、各ラインに取り付けられる溶液バッグを示す。これら溶液及び体積は、使用可能であるデフォルト設定の一例として挙げられている。
【０１４５】
【表１６】
0006783143.tif 000017
【０１４６】
ステップ１では、表１７に示される値が用いられる。
【０１４７】
【表１７】
0006783143.tif 000018
【０１４８】
ＩＣ投入レートは必要に応じて増やしてもよい。一例として、ＩＣ投入レートは以下のように増やしてもよい：１日目〜２日目：０．０ｍＬ／分；２日目〜３日目：０．１ｍＬ／分；３日目〜４日目：０．２ｍＬ／分；４日目〜５日目：０．４ｍＬ／分；５日目〜６日目：０．８ｍＬ／分。
【０１４９】
付着細胞の剥離
例示されるプロトコルのうちのこの部分は、細胞を膜から剥離させ、ＩＣループに放つために行われる。
・ステップ１：試薬付加に備えて、ＩＣ・ＥＣ洗浄タスクを行う。例えば、システムにおいて、トリプシン付加に備えて、ＩＣ・ＥＣ培地をＰＢＳに置換して、タンパク質、Ｃａ＋＋、Ｍｇ＋＋を除去する。
・ステップ２：バッグが空になるまで、システムに試薬を投入する。
・ステップ３：試薬をＩＣループに追い込む。
・ステップ４：ＩＣループ内で試薬を混ぜる。
【０１５０】
このタスクを始める前に、以下の条件を満足させる。
・細胞投入バッグに少なくとも４０ｍＬの空気を含ませる。
【０１５１】
表１８は、付着細胞の剥離を行う際、各ラインに取り付けられる溶液バッグを示す。これら溶液及び体積は、使用可能であるデフォルト設定の一例として挙げられている。
【０１５２】
【表１８】
0006783143.tif 000019
【０１５３】
ステップ１では、表１９に示される値が用いられる。
【０１５４】
【表１９】
0006783143.tif 000020
【０１５５】
ステップ２では、表２０に示される値が用いられる。
【０１５６】
【表２０】
0006783143.tif 000021
【０１５７】
ステップ３では、表２１に示される値が用いられる。
【０１５８】
【表２１】
0006783143.tif 000022
【０１５９】
ステップ４では、表２２に示される値が用いられる。
【０１６０】
【表２２】
0006783143.tif 000023
【０１６１】
サンプルは、トリプシン分析のため、サンプルコイル及び／又はサンプルポートから取り出されてよい。
【０１６２】
細胞収穫
例示されるプロトコルのこの部分は、バイオリアクター内の細胞を含むＩＣ循環ループからの懸濁細胞を、収穫バッグへ移送するために行われる。
【０１６３】
表２３は、細胞収穫を行う際、各ラインに取り付けられる溶液バッグを示す。これら溶液及び体積は、使用可能であるデフォルト設定の一例として挙げられている。
【０１６４】
【表２３】
0006783143.tif 000024
【０１６５】
細胞収穫では、表２４に示される値が用いられる。
【０１６６】
【表２４】
0006783143.tif 000025
【０１６７】
実施例２：  プロトコル２
コレシストキニン（ＣＣＫ）は、細胞から分泌される調節ホルモンであり、多くの場合、化学的シグナル伝達を介して、細胞培養の維持継続及び増殖に部分的に関与している。培養培地中のＣＣＫ濃度が閾値に達していない場合、細胞集団に障害が生じている可能性がある。実施例２では、細胞分泌の化学的シグナルを用いて、イン・ビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）での細胞集団（この場合はＣＨＯ細胞）を維持し増殖させる例が提示される。一実施形態によれば、略４０００ダルトンのＣＣＫの分子量は、中空糸バイオリアクターの微多孔膜を容易に通過できる程度に小さい。一実施形態において、ＩＣ循環ループ又はＥＣ循環ループに対する培地の投入付加に関わらず、上記のように膜を自由に通過できるため、化学的シグナルの希釈は発生する。しかしながら、実施形態に係る、培地の受動的補充を通じて、化学的シグナル伝達のそのような希釈は、最小化されるか又は完全に除去される。以下のプロトコルでは、ＣＨＯ細胞のような非接着性細胞又は懸濁細胞の細胞増殖において培地の受動的補充が行われる。
【０１６８】
０日目（Ｄａｙ：０）  ＩＣ・ＥＣ洗浄
例示されるプロトコルのこの部分は、細胞培養の準備として、ＩＣ循環ループ及びＥＣ循環ループの両方における流体を交換するために行われる。交換容積は、交換されるＩＣ体積及びＥＣ体積の回数によって指定される。
【０１６９】
表２５は、この例示されるプロトコルのうちのＩＣ・ＥＣ洗浄を行う際、各ラインに取り付けられる溶液バッグを示す。これら溶液及び体積は、使用可能であるデフォルト設定の一例として挙げられている。
【０１７０】
【表２５】
0006783143.tif 000026
【０１７１】
ＩＣ・ＥＣ洗浄では、表２６に示される値が用いられる。
【０１７２】
【表２６】
0006783143.tif 000027
【０１７３】
０日目（Ｄａｙ：０）  培地調整
例示されるプロトコルのこの部分は、細胞を投入する前に、培地を、規定のガス供給と平衡になるようにするために行われる。このタスクは、２つのステップを有する。
・ステップ１：高いＥＣ循環レートを使用することによって、培地とガス供給とを迅速に接触させる。
・ステップ２：オペレータが細胞投入をできる状態になるまで、システムを適切な状態に維持する。
【０１７４】
表２７は、培地調整を行う際、各ラインに取り付けられる溶液バッグを示す。これら溶液及び体積は、使用可能であるデフォルト設定の一例として挙げられている。
【０１７５】
【表２７】
0006783143.tif 000028
【０１７６】
ステップ１では、表２８に示される値が用いられる。
【０１７７】
【表２８】
0006783143.tif 000029
【０１７８】
ステップ２では、表２９に示される値が用いられる。
【０１７９】
【表２９】
0006783143.tif 000030
【０１８０】
０日目（Ｄａｙ：０）  均一懸濁での細胞投入
例示されるプロトコルのうちのこの部分は、細胞投入バッグから、細胞をバイオリアクター内に投入するために行われる。例えば、一実施形態において、そのような細胞はＣＨＯ細胞である。ＩＣ循環を使用して、細胞を分配させ、細胞を、ラインからバイオリアクター内へは送らない。このタスクは、３つのステップを有する。
・ステップ１：細胞投入バッグから細胞をバイオリアクター内へ投入する。
・ステップ２：ＡＲＣから、細胞をＩＣループへ追い込む。
・ステップ３：ＩＣ投入ひいては限外濾過によらず、ＩＣ循環によって、膜への細胞分配を促進する。
【０１８１】
このタスクを始める前に、以下の条件を満足させる。
・細胞投入バッグ内に少なくとも４０ｍＬの空気を含ませる。
【０１８２】
表３０は、均一懸濁での細胞投入を行う際、各ラインに取り付けられる溶液バッグを示す。これら溶液及び体積は、使用可能であるデフォルト設定の一例として挙げられている。
【０１８３】
【表３０】
0006783143.tif 000031
【０１８４】
ステップ１では、表３１に示される値が用いられる。
【０１８５】
【表３１】
0006783143.tif 000032
【０１８６】
ステップ２では、表３２に示される値が用いられる。
【０１８７】
【表３２】
0006783143.tif 000033
【０１８８】
ステップ３では、表３３に示される値が用いられる。
【０１８９】
【表３３】
0006783143.tif 000034
【０１９０】
０日目（Ｄａｙ：０）  細胞フィーディング
例示されるプロトコルのうちのこの部分は、ＩＣ循環ループ及びＥＣ循環ループ対して培地投入流量をＯＦＦにすることによって、ＣＣＫのようなシグナル伝達物質の濃度を増やすために行われる。この構成では、ＩＣ又はＥＣ出口を使用することができる。
【０１９１】
表３４は細胞フィーディングを行う際、各ラインに取り付けられる溶液バッグを示す。これら溶液及び体積は、使用可能であるデフォルト設定の一例として挙げられている。
【０１９２】
【表３４】
0006783143.tif 000035
【０１９３】
ステップ１では、表３５に示される値が用いられる。
【０１９４】
【表３５】
0006783143.tif 000036
【０１９５】
一実施形態では、各日において、以下の設定で、細胞カウントのために、細胞培養のサンプリングが行われる。
【０１９６】
【表３６】
0006783143.tif 000037
【０１９７】
一実施形態において、停止条件の直後に、約６インチの長さ（１ｍＬ）の配管を切り取る。このサンプルの体積は、ＩＣループ全体の細胞濃度を代表するサンプルとなる。これによって、ユーザは、培養期間にわたって、細胞をモニターすることができる。
【０１９８】
４日目（Ｄａｙ：４）  細胞フィーディング
例示されるプロトコルのこの部分は、細胞培養条件が最小許容グルコース濃度又は最大許容乳酸濃度に達した時点で、ＩＣ循環ループ及び／又はＥＣ循環ループに低流量を継続的に付加するために行われる。ある実施形態では、これは、４日目前後に行われる。システムに付加される流体を除去するために使用される出力設定にはいくつかがある。
【０１９９】
表３７は細胞フィーディングを行う際、各ラインに取り付けられる溶液バッグを示す。これら溶液及び体積は、使用可能であるデフォルト設定の一例として挙げられている。
【０２００】
【表３７】
0006783143.tif 000038
【０２０１】
ステップ１では、表３８に示される値が用いられる。
【０２０２】
【表３８】
0006783143.tif 000039
【０２０３】
一実施形態では、各日において、細胞カウントのために、細胞培養のサンプリングが行われる（例えば、表３６参照）。
【０２０４】
７日目（Ｄａｙ：７）  細胞収穫
例示されるプロトコルのこの部分は、バイオリアクター内の細胞を含む懸濁細胞を、ＩＣ循環ループから収穫バッグへ移送するために行われる。
【０２０５】
表３９は、細胞収穫を行う際、各ラインに取り付けられる溶液バッグを示す。これら溶液及び体積は、使用可能であるデフォルト設定の一例として挙げられている。
【０２０６】
【表３９】
0006783143.tif 000040
【０２０７】
細胞収穫では、表４０に示される値が用いられる。
【０２０８】
【表４０】
0006783143.tif 000041
【０２０９】
ここで記載される装置、システム、構造及び方法は、種々の変形や変更が可能なことは当業者であれば理解できよう。従って、上述の実施形態は本開示において記載された主題に限定されないと理解されるべきである。むしろ、本開示は、変形、変更及び／又は等価物を含むことを意図している。作用、特徴、構造及び／又は培地は、本請求項を実施するための例示的な実施形態として開示される。
【図１】
0006783143.tif 000042
【図２】
0006783143.tif 000043
【図３】
0006783143.tif 000044
【図４】
0006783143.tif 000045
【図５】
0006783143.tif 000046
【図６】
0006783143.tif 000047
【図７】
0006783143.tif 000048
【図８】
0006783143.tif 000049
【図９】
0006783143.tif 000050
【図１０】
0006783143.tif 000051
【図１１】
0006783143.tif 000052
【図１２】
0006783143.tif 000053
【図１３】
0006783143.tif 000054