(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
人工的な哺乳類皮膚代替製品であって、
（ａ）第１のヒドロゲル担体中に生きた哺乳類の脂肪細胞（例えば、誘導された前脂肪細胞）を含む第１の（「皮下組織様」）層；
（ｂ）前記第１層の上にあるかまたは直接接触し、第２のヒドロゲル担体中に生きた哺乳類の線維芽細胞および生きた哺乳類の毛乳頭細胞を一緒に含む、第２の（「真皮様」）層；及び
（ｃ）前記第２層の上にあるかまたは直接接触し、第３のヒドロゲル担体中に生きた哺乳類のケラチノサイトおよび生きた哺乳類のメラノサイトを一緒に含む、第３の（「表皮様」）層
を含む、人工的な哺乳類皮膚代替製品。
【請求項２】
前記第１、第２および／もしくは第３のヒドロゲル担体が、ヒアルロン酸及び／またはゼラチンを含む架橋ヒドロゲル担体である、請求項１に記載の製品。
【請求項３】
前記第２層および第３層が、少なくとも部分的に互いに架橋している、請求項１または２に記載の製品。
【請求項４】
前記第１層および第２層が少なくとも部分的に互いに架橋している、請求項１から３のいずれか１項に記載の製品。
【請求項５】
（ｉ）前記第１層が、１００、２００または３００マイクロメートルから最大４００、６００または８００マイクロメートルの厚さを有し；
（ｉｉ）前記第２層が、１００、２００または３００マイクロメートルから最大４００、６００または８００マイクロメートルの厚さを有し；
（ｉｉｉ）前記第３層が、１００、２００または３００マイクロメートルから最大４００、６００または８００マイクロメートルの厚さを有し；および／または
（ｉｖ）前記製品が、３００、６００もしくは９００マイクロメートルから最大１２００、１８００もしくは２４００マイクロメートルの総厚さを有する、請求項１から４のいずれか１項に記載の製品。
【請求項６】
前記第１層、前記第２層および前記第３層のそれぞれが、０．５、１または１０平方センチメートルから最大５０、２００または４００平方センチメートルの被覆表面積を有する、請求項１から５のいずれか１項に記載の製品。
【請求項７】
（ｉ）前記脂肪細胞が、立方センチメートル当たりの細胞数１００万または２００万から８００万、１０００万または２０００万の量で、前記第１のヒドロゲル担体に含まれ；および／または
（ｉｉ）前記線維芽細胞および前記真皮乳頭細胞が、約８：１もしくは６：１から２：１もしくは１：１の比でおよび／または立方センチメートル当たりの細胞数約５００万もしくは８００万から１５００万、２０００万、２５００万もしくは３０００万の複合密度で前記第２のヒドロゲル担体に含まれ；および／または
（ｉｉｉ）前記ケラチノサイトおよび前記メラノサイトが、約２０：１もしくは１０：１から８：１、５：１、３：１もしくは２：１の比で、および／または立方センチメートル当たりの細胞数約５００万もしくは８００万から１５００もしくは２０００万、２５００万、３０００万もしくは３５００万の複合密度で前記第３のヒドロゲル担体に含まれる、請求項１から６のいずれか１項に記載の製品。
【請求項８】
前記生きた哺乳類の脂肪細胞がヒト脂肪細胞であり；前記生きた哺乳類の線維芽細胞がヒト線維芽細胞であり、前記生きた哺乳類の毛乳頭細胞がヒト毛乳頭細胞であり、前記生きた哺乳類のケラチノサイトがヒトケラチノサイトであり、前記生きた哺乳類のメラノサイトがヒトメラノサイトである、請求項１から７のいずれか１項に記載の製品。
【請求項９】
前記第１層と前記第２層の間に、前記第２層に、前記第２層と前記第３層の間に、および／または前記第３層に、抗原提示樹状細胞またはその前駆体をさらに含む、請求項１から８のいずれか１項に記載の製品。
【請求項１０】
前記第１層と前記第２層の間に、前記第２層に、前記第２層と前記第３層の間に、および／または前記第３層に、神経系細胞またはその前駆体をさらに含む、請求項１から９のいずれか１項に記載の製品。
【請求項１１】
前記第１層と前記第２層の間に、前記第２層に、前記第２層と前記第３層の間に、および／または前記第３層に、血管細胞またはその前駆体をさらに含む、請求項１から１０のいずれか１項に記載の製品。
【請求項１２】
治療を必要とする対象の創傷を治療するための請求項１から１１のいずれか１項に記載の皮膚代替製品であって、治療に効果的な形態で前記創傷に局所適用するために用いられ、任意選択で、構造体の細胞が、自家細胞および／または同種異系細胞である、製品。
【請求項１３】
前記第３層の上にあるかまたは接触している不活性モールド層をさらに含む、請求項１２に記載の製品。
【請求項１４】
前記不活性モールド層が、（例えば、スキャンデータに基づいて）顔面の創傷に個別に適合するように寸法設定される、請求項１３に記載の製品。
【請求項１５】
前記顔面の創傷が、額、眉間、鼻根、鼻（例えば、鼻梁、鼻背、鼻先、鼻突、鼻橋、鼻翼側壁）、鼻唇溝、人中、口唇、顎先、頬、顎、耳（例えば、耳輪、舟状窩、対耳輪のひだ、対耳輪、対珠、耳垂、耳珠、甲介、窩）、および／または眼の周囲の皮膚（例えば瞼）の創傷である、請求項１４に記載の製品。
【請求項１６】
前記不活性モールド層がポリウレタンを含む、請求項１３から１５のいずれか１項に記載の製品。
【請求項１７】
前記不活性モールド層が多孔質である、請求項１３から１６のいずれか１項に記載の製品。
【請求項１８】
哺乳類対象の皮膚に適用される場合の活性に関して化合物または組成物をスクリーニングする方法であって、
前記製品の構成細胞を生存させておく条件下で、請求項１から１１に記載のいずれか一項の皮膚代替製品を用意すること；
前記製品に前記化合物または組成物を適用すること；次いで
前記皮膚代替製品に対する反応を検出すること
を含み、前記皮膚代替製品に対するこのような反応の存在が、前記化合物または組成物が哺乳類対象の皮膚に適用された場合に活性である可能性があることを示す、方法。
【請求項１９】
皮膚代替製品を作製する方法であって、
（ａ）第１のヒドロゲル担体中に生きた哺乳類の脂肪細胞（例えば、誘導された前脂肪細胞）を含む第１の（「皮下組織様」）層を基質上に堆積させるステップ；次いで
（ｂ）第２のヒドロゲル担体中に、生きた哺乳類の線維芽細胞および生きた哺乳類の毛乳頭細胞を含む第２の（「真皮様」）層を、前記第１層上に堆積させるステップ；次いで
（ｃ）第３のヒドロゲル担体中に生きた哺乳類のケラチノサイトおよび生きた哺乳類のメラノサイトを含む第３の（「表皮様」）層を、前記第２層上に堆積させるステップ
を含む、方法。
【請求項２０】
前記第１のヒドロゲル担体が、予備重合または部分重合された形態で堆積され；
前記第２のヒドロゲル担体が、予備重合または部分重合された形態で堆積され；および／または
前記第３のヒドロゲル担体が、予備重合または部分重合された形態で堆積される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記堆積ステップ（ａ）および（ｂ）が、前記第１層中の前記第１のヒドロゲルおよび前記第２層中の前記第２のヒドロゲルが少なくとも部分的に互いに架橋する条件下で実行され；
前記堆積ステップ（ｂ）および（ｃ）が、前記第２層中の前記第２のヒドロゲルおよび前記第３層中の前記第３のヒドロゲルが少なくとも部分的に互いに架橋する条件下で実行される、請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記堆積ステップ（ａ）、（ｂ）、および／または（ｃ）が、プリンティングによって実行される、請求項１９から２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記基質が不活性基質である、請求項１９から２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記基質が、治療の必要な患者の創傷である、請求項１９から２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記第１、第２および／もしくは第３のヒドロゲル担体がヒアルロン酸及び／またはゼラチンを含む架橋ヒドロゲル担体である、請求項１９から２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記第２および第３の層が、少なくとも部分的に互いに架橋している、請求項１９から２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記第１および第２の層が少なくとも部分的に互いに架橋している、請求項１９から２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
（ｉ）前記第１層が、１００、２００または３００マイクロメートルから最大４００、６００または８００マイクロメートルの厚さを有し；
（ｉｉ）前記第２層が、１００、２００または３００マイクロメートルから最大４００、６００または８００マイクロメートルの厚さを有し；
（ｉｉｉ）前記第３層が、１００、２００または３００マイクロメートルから最大４００、６００または８００マイクロメートルの厚さを有し；および／または
（ｉｖ）前記製品が、３００、６００もしくは９００マイクロメートルから最大１２００、１８００もしくは２４００マイクロメートルの総厚さを有する、請求項１９から２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記第１層、前記第２層、および前記第３層のそれぞれが、０．５、１または１０平方センチメートルから最大５０、２００または４００平方センチメートルの被覆表面積を有する、請求項１９から２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
（ｉ）前記脂肪細胞が、立方センチメートル当たりの細胞数１００万または２００万から８００万、１０００万、または２０００万の量で前記第１のヒドロゲル担体に含まれ；および／または
（ｉｉ）前記線維芽細胞および前記真皮乳頭細胞が、約８：１もしくは６：１から２：１もしくは１：１の比でおよび／または立方センチメートル当たりの細胞数約５００万もしくは８００万から１５００万、２０００万、２５００万もしくは３０００万の複合密度で前記第２のヒドロゲル担体に含まれ；および／または
（ｉｉｉ）前記ケラチノサイトおよび前記メラノサイトが、約２０：１もしくは１０：１から８：１、５：１、３：１もしくは２：１の比で、および／または立方センチメートル当たりの細胞数約５００万もしくは８００万から１５００万もしくは２０００万、２５００万、３０００万もしくは３５００万の複合密度で前記第３のヒドロゲル担体に含まれる、請求項１９から２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記生きた哺乳類の脂肪細胞がヒト脂肪細胞であり；前記生きた哺乳類の線維芽細胞がヒト線維芽細胞であり、前記生きた哺乳類の毛乳頭細胞がヒト毛乳頭細胞であり、前記生きた哺乳類のケラチノサイトがヒトケラチノサイトであり、前記生きた哺乳類のメラノサイトがヒトメラノサイトである、請求項１９から３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記第１層と前記第２層の間に、前記第２層に、前記第２層と前記第３層の間に、および／または前記第３層に、抗原提示樹状細胞またはその前駆体を堆積させることをさらに含む、請求項１９から３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記第１層と前記第２層の間に、前記第２層に、前記第２層と前記第３層の間に、および／または前記第３層に、神経系細胞またはその前駆体を堆積させることをさらに含む、請求項１９から３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記第１層と前記第２層の間に、前記第２層に、前記第２層と前記第３層の間に、および／または前記第３層に、血管細胞またはその前駆体を堆積させることをさらに含む、請求項１９から３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
創傷治癒に有用な皮膚代替製品を作製する方法であって、
（ａ）任意選択で、不活性層を堆積させるステップであって、前記不活性層は、任意選択で皮膚創傷に合うように成形される、ステップ；
（ｂ）第３のヒドロゲル担体中に生きた哺乳類のケラチノサイトおよび生きた哺乳類のメラノサイトを含む第３の（「表皮様」）層を、基質（例えば、（ａ）の不活性層）に堆積させるステップ；
（ｃ）第２のヒドロゲル担体中に生きた哺乳類の線維芽細胞および生きた哺乳類の毛乳頭細胞を含む第２の（「真皮様」）層を前記第３層に堆積させるステップ；次いで
（ｄ）第１のヒドロゲル担体中に生きた哺乳類の脂肪細胞（例えば、誘導された前脂肪細胞）を含む第１の（「皮下組織様」）層を前記第２層に堆積させるステップ
を含む、方法。
【請求項３６】
前記第１のヒドロゲル担体が、予備重合または部分重合された形態で堆積され；
前記第２のヒドロゲル担体が、予備重合または部分重合された形態で堆積され；および／または
前記第３のヒドロゲル担体が、予備重合または部分重合された形態で堆積される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記堆積ステップ（ｃ）および（ｄ）が、前記第１層中の前記第１のヒドロゲルおよび前記第２層中の前記第２のヒドロゲルが少なくとも部分的に互いに架橋する条件下で実行され；
前記堆積ステップ（ｂ）および（ｃ）が、前記第２層中の前記第２のヒドロゲルおよび前記第３層中の前記第３のヒドロゲルが少なくとも部分的に互いに架橋する条件下で実行される、請求項３５または３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記堆積ステップ（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および／または（ｄ）がプリンティングによって実行される、請求項３５から３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
前記第１、第２および／もしくは第３のヒドロゲル担体がヒアルロン酸及び／またはゼラチン含む架橋ヒドロゲル担体である、請求項３５から３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
前記第２および第３の層が少なくとも部分的に互いに架橋している、請求項３５から３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
前記第１および第２の層が少なくとも部分的に互いに架橋している、請求項３５から４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
（ｉ）前記第１層が、１００、２００または３００マイクロメートルから最大４００、６００または８００マイクロメートルの厚さを有し；
（ｉｉ）前記第２層が、１００、２００または３００マイクロメートルから最大４００、６００または８００マイクロメートルの厚さを有し；
（ｉｉｉ）前記第３層が、１００、２００または３００マイクロメートルから最大４００、６００または８００マイクロメートルの厚さを有し；および／または
（ｉｖ）前記製品が、３００、６００もしくは９００マイクロメートルから最大１２００、１８００もしくは２４００マイクロメートルの総厚さを有する、請求項３５から４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
前記第１層、前記第２層、および前記第３層のそれぞれが、０．５、１または１０平方センチメートルから最大５０、２００または４００平方センチメートルの被覆表面積を有する、請求項３５から４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
（ｉ）前記脂肪細胞が、立方センチメートル当たりの細胞数１００万または２００万から８００万、１０００万または２０００万の量で、前記第１のヒドロゲル担体に含まれ；および／または
（ｉｉ）前記線維芽細胞および前記真皮乳頭細胞が、約８：１もしくは６：１から２：１もしくは１：１の比で、および／または立方センチメートル当たりの細胞数約５００万もしくは８００万から１５００万、２０００万、２５００万もしくは３０００万の複合密度で前記第２のヒドロゲル担体に含まれ、および／または
（ｉｉｉ）前記ケラチノサイトおよび前記メラノサイトが、約２０：１もしくは１０：１から８：１、５：１、３：１もしくは２：１の比で、および／または立方センチメートル当たりの細胞数約５００万もしくは８００万から１５００万、２０００万、２５００万、３０００万もしくは３５００万の複合密度で、前記第３のヒドロゲル担体に含まれる、請求項３５から４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
前記生きた哺乳類の脂肪細胞はヒト脂肪細胞であり；前記生きた哺乳類の線維芽細胞はヒト線維芽細胞であり、前記生きた哺乳類の毛乳頭細胞はヒト毛乳頭細胞であり、前記生きた哺乳類のケラチノサイトはヒトケラチノサイトであり、前記生きた哺乳類のメラノサイトはヒトメラノサイトである、請求項３５から４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
前記第１層と前記第２層の間に、前記第２層に、前記第２層と前記第３層の間に、および／または前記第３層に、抗原提示樹状細胞またはその前駆体を堆積させることをさらに含む、請求項３５から４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
前記第１層と前記第２層の間に、前記第２層に、前記第２層と前記第３層の間に、および／または前記第３層に、神経系細胞またはその前駆体を堆積させることをさらに含む、請求項３５から４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
前記第１層と前記第２層の間に、前記第２層に、前記第２層と前記第３層の間に、および／または前記第３層に、血管細胞またはその前駆体を堆積させることをさらに含む、請求項３５から４７のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１５年１月１２日出願の米国仮特許出願第６２／１０２，１５４号、および２０１５年１０月１５日出願の米国仮特許出願第６２／２４２，００８号の利益を主張し、その開示のそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
本発明は、例えば創傷治療および化合物検査のための、生きた、人工的な、皮膚代替製品ならびにそれを作製および使用する方法に関する。
【０００３】
皮膚交換のための現在の「ゴールドスタンダード」は、自家植皮の使用である。しかし、ドナー部位の組織の入手可能性、このような組織の複雑な管理および費用により、この治療は、患者に対して限定されることが多い。さらに、最新の人工皮膚または皮膚代替物は、多重の皮膚細胞型、三層様の構造および皮膚付属器官がないので、生来の皮膚を完全には再現しない。現在の市販の皮膚細胞モデルも、皮膚腫瘍由来の不死化細胞株または単純であるべき１つもしくは２つの初代細胞型（例えば、ケラチノサイトおよび／または皮膚線維芽細胞）のみを使用するので、限定される；したがって、インビボの皮膚の複雑さをよく表し、再現しない。
【０００４】
Ｅ．Ｂｅｌｌａｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ３Ｄ  ｆｕｌｌ  ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ  ｓｋｉｎ  ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ  ｔｉｓｓｕｅ  ｍｏｄｅｌ  ｕｓｉｎｇ  ｓｉｌｋ  ａｎｄ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，Ｍａｃｒｏｍｏｌ．  Ｂｉｏｓｃｉ  １２，１６２７−１６３６（２０１２）は、三層の皮膚様製品を作るために、幹細胞、ケラチノサイトおよび線維芽細胞由来の脂肪を利用しているが、細胞を播種するシルク足場の使用が必要になる。
【０００５】
Ａ．Ｓｋａｒｄａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｐｒｉｎｔｅｄ  Ａｍｎｉｏｔｉｃ  Ｆｌｕｉｄ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅ  Ｈｅａｌｉｎｇ  ｏｆ  Ｌａｒｇｅ  Ｓｋｉｎ  Ｗｏｕｎｄｓ，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １，７９２−８０２（２０１２）は、皮膚代替物を直接大きな創傷にバイオプリンティングすることを記載しているが、羊水幹細胞および骨髄由来間充織幹細胞のみを使用している。
【０００６】
Ａ．Ｍｏｎｆｏｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｈｕｍａｎ  ｔｉｓｓｕｅ−ｅｎｇｅｎｅｅｒｅｄ  ｓｋｉｎ  ｔｒｉｌａｙｅｒ  ｏｎ  ａ  ｐｌａｓｍａ−ｂａｓｅｄ  ｈｙｐｏｄｅｒｍｉｓ，Ｊ．Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ．Ｒｅｇｅｎ．Ｍｅｄ．７，４７９−４９０（２０１３）は、皮膚様三層製品を記載しているが、脂質生成細胞、線維芽細胞、およびケラチノサイトのみを用いており、完了するのに３５日を要する連続培養技術を使用した。同文献４８０〜８１頁。
【０００７】
Ｖ．Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｋｉｎ  ｂｙ  Ｔｈｒｅｅ−Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｐｒｉｎｔｉｎｇ，Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ２０，４７３−４８４（２０１４）は、３Ｄバイオプリンティングで作られた皮膚様製品を記載しているが、別々のコラーゲン層の間にプリントされたケラチノサイトおよび線維芽細胞のみを利用している。例えば当文献の図２を参照されたい。
【０００８】
前述に基づいて、治療、および薬物検査の目的に使用できる改良された皮膚代替製品の必要性が依然として存在している。
【発明の概要】
【０００９】
本明細書において、人工的な哺乳類皮膚代替製品であって、
（ａ）任意選択だが、いくつかの実施形態において好ましくは、第１のヒドロゲル担体中に生きた哺乳類の脂肪細胞（例えば、誘導された前脂肪細胞）を含む第１の（「皮下組織様」）層；
（ｂ）第１層に接触または直接接触し、第２のヒドロゲル担体中に生きた哺乳類の線維芽細胞および生きた哺乳類の毛乳頭細胞を一緒に含む、第２の（「真皮様」）層；
（ｃ）第２層に接触または直接接触し、第３のヒドロゲル担体中に生きた哺乳類のケラチノサイトおよび生きた哺乳類のメラノサイトを一緒に含む、第３の（「表皮様」）層（すなわち、第１層と反対側にあり、したがって第１層が存在する場合に、第２層が第１層と第３層の間に挟まれている）
を含む、製品が記載されている。
【００１０】
いくつかの実施形態において、第１、第２および／もしくは第３のヒドロゲル担体は、架橋ヒアルロン酸を含み、ならびに／または第２および／もしくは第３のヒドロゲル担体は、任意選択だが好ましくは、コラーゲンをさらに含む。
【００１１】
いくつかの実施形態において、第２層および第３層は、（直接、または介在する架橋性層を介して）少なくとも部分的に互いに架橋している。
【００１２】
いくつかの実施形態において、第１層が存在し、第１層および第２層は、少なくとも部分的に互いに架橋している。
【００１３】
いくつかの実施形態において、
（ｉ）第１層は、存在する場合、１００、２００または３００マイクロメートルから最大４００、６００または８００マイクロメートルの厚さを有し；
（ｉｉ）第２層は、１００、２００または３００マイクロメートルから最大４００、６００または８００マイクロメートルの厚さを有し；
（ｉｉｉ）第３層は、１００、２００または３００マイクロメートルから最大４００、６００または８００マイクロメートルの厚さを有し；および／または
（ｉｖ）製品は、前記第１層が存在しない場合は、約２００、４００もしくは６００マイクロメートルから最大８００、１２００もしくは１６００マイクロメートルの総厚さを有する、または前記第１層が存在する場合は、３００、６００もしくは９００マイクロメートルから最大１２００、１８００もしくは２４００マイクロメートルの総厚さを有する。
【００１４】
いくつかの実施形態において、第１層（存在する場合）、第２層および第３層のそれぞれは、０．５、１または１０平方センチメートルから最大５０、２００または４００平方センチメートル、またはそれ以上の被覆表面積を有する。
【００１５】
いくつかの実施形態において、
（ｉ）脂肪細胞は、立方センチメートル当たりの細胞数１００万または２００万から８００万、１０００万、１５００万または２０００万（好ましくは４００万から６００万または１０００万から２０００万）の量で、前記第１のヒドロゲル担体に含まれ；および／または
（ｉｉ）線維芽細胞および真皮乳頭細胞は、約８：１もしくは６：１から２：１もしくは１：１（好ましくは５：１から３：１）の比で、および／または立方センチメートル当たりの細胞数約５００万または８００万から１５００万、２０００万、２５００万もしくは３０００万（好ましくは約１０００万または約２０００万〜２５００万）の複合密度（ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｄｅｎｓｉｔｙ）で、第２のヒドロゲル担体に含まれる：および／または
（ｉｉｉ）ケラチノサイトおよびメラノサイトは、約２０：１もしくは１０：１から８：１、５：１、３：１もしくは２：１（好ましくは１２：１から３：１）の比で、および／または立方センチメートル当たりの細胞数約５００万もしくは８００万から１５００万、２０００万、２５００万、３０００万もしくは３５００万（好ましくは約１０００万もしくは約２０００万〜３０００万）の複合密度で、第３のヒドロゲル担体に含まれる。
【００１６】
いくつかの実施形態において、生きた哺乳類の脂肪細胞は、ヒト脂肪細胞であり；前記生きた哺乳類の線維芽細胞は、ヒト線維芽細胞であり、前記生きた哺乳類の毛乳頭細胞は、ヒト毛乳頭細胞であり、前記生きた哺乳類のケラチノサイトは、ヒトケラチノサイトであり、前記生きた哺乳類のメラノサイトは、ヒトメラノサイトである。
【００１７】
いくつかの実施形態は、（例えば、立方センチメートル当たりの細胞数１００万または２００万から８００万または１０００万（好ましくは４００万から６００万）の総量で）第１層および第２層の間に、第２層に、第２層および第３層の間に、および／または前記第３層に、抗原提示樹状細胞またはその前駆体をさらに含む。
【００１８】
いくつかの実施形態は、（例えば、立方センチメートル当たりの細胞数１００万または２００万から８００万または１０００万（好ましくは４００万から６００万）の総量で）前記第１層と前記第２層の間に、前記第２層に、前記第２層と前記第３層の間に、および／または前記第３層に、神経系細胞またはその前駆体をさらに含む。
【００１９】
創傷治療および化合物または組成物のスクリーニングのために前述したものを作製および使用する方法も、本明細書で開示される。
【００２０】
Ｙｏｏ，ＸｕおよびＡｔａｌａら、米国特許出願公開番号ＵＳ２００９／０２０８４６６（Ａｕｇ．２００９）は、３頁の段落００３７〜００４１で皮膚代替製品を提案しているが、本明細書に記載の発明と異なるその他の点のなかで、乳頭細胞がどのように効果的に皮膚代替製品に組み込まれ得るかは提案も記載もされておらず、異なる層が、少なくとも部分的に互いに架橋することを提案しておらず、（本明細書に記載の組織に反して）脂肪細胞および線維芽細胞が同じ「真皮」層に一緒に組み込まれることを提案している。
【００２１】
本発明は、本明細書の図面および以下に記載の明細書でより詳細に説明される。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】細胞生存性に対する血清濃度の効果（３Ｄ）を示す図である。
【図２】ヒドロゲル構造体内に混合された５つの皮膚細胞（Ｎ＝４）を示す図である。
【図３】ヒドロゲル内に封入された個々の皮膚細胞（Ｎ＝４）を示す図である。
【図４】インビトロでバイオプリントした皮膚代替構造体（ｔ＝６ｄ、１０００万〜５００〜５００万／層（上から下へ））を示す図である。
【図５】インビトロでの３週間の成長後の、バイオプリントした皮膚代替構造体中の毛の成長を示す図である。
【図６】ＣＡＤ／ＣＡＭモデリングを使用したバイオマスクモールドのデータの収集および３Ｄプリンティングを示す図である。
【図７】形成されたバイオマスクの多孔質のポリウレタン層、ケラチノサイトを含む表皮様層、および線維芽細胞を含む真皮様層の図である。
【図８】バイオマスクの各層のプリンティングの概略を示す図である。
【図９】バイオマスク構造および創傷上への、インビボでの適用の概略設計を示す図である。ポリウレタンモールドは、多孔質（細孔径３００μＭ）である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明は、本明細書の図面および以下に記載の明細書でより詳細に説明される。本明細書で引用されるすべての米国特許文献の開示は、引用することにより本明細書の一部をなすものとする。
【００２４】
本発明を、ここで、本発明の実施形態が示される添付の図面を参照してより完全に以下で説明する。しかし、本発明は、多くの異なる形態で実施することができ、本明細書に記載の実施形態に限定されると解釈されるべきではない。むしろ、これらの実施形態は、本開示が十分かつ完全であり、本発明の範囲が当業者に完全に伝わるように、提供される。
【００２５】
本明細書で使用する専門用語は、特定の実施形態のみを説明することを目的とし、本発明を限定することを意図しているものではない。本明細書で使用する単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、その文脈に明確に別段の指示が無い限り、同様に複数形を含むことを意図する。用語「含む」、または「含むこと」は、この明細書で使用される場合、記述された特性、整数、ステップ、作業、要素、構成要素および／もしくは群またはそれら組合せの存在を特定するが、１つまたは複数のその他の特性、整数、ステップ、作業、要素、構成要素および／もしくは群またはそれら組合せの存在もしくは追加を除外していないことがさらに理解されよう。
【００２６】
本明細書で使用する、用語「および／または」は、任意のおよびすべての可能な組合せまたは１つもしくは複数の関連する列挙した項目、ならびに代替えの（「ｏｒ」）で解釈される場合の組合せの欠如を含める。
【００２７】
別段の定義がない限り、本明細書で使用するすべての用語（技術的および科学的な用語を含める）は、この発明が属する当分野の技術者によって通常理解されるのと同様の意味を有する。通常使用される辞書において定義されるものなどの用語は、本明細書および特許請求の範囲の文脈におけるそれらの意味と一致する意味を有するものと解釈されるべきであり、本明細書でそのように明確に定義されない限り、理想的または過度に形式的な意味に解釈されるべきではないことがさらに理解されるであろう。周知の機能または構造は、簡潔および／または明白にするために、詳細に記載されていないことがある。
【００２８】
要素が、別の要素の「上にある」、別の要素に「付着している」、別の要素と「接続している」、別の要素と「カップリングしている」、別の要素に「接触している」などと述べられる場合、直接その他の要素の上に、付着、接続、カップリングおよび／もしくは接触していてもよいし、または介在する要素が存在していてもよい理解されるであろう。対照的に、要素が、例えば別の要素の「直接その上にある」、別の要素と「直接接触している」、別の要素と「直接接続している」、別の要素と「直接カップリングしている」または別の要素に「直接接触している」と述べられる場合、介在する要素は存在しない。隣接した構造または特徴への言及は、別の特徴が、隣接する特徴と重複するまたはその基礎になる部分を有し得ることも、当業者によって理解されるであろう。
【００２９】
第１、第２などの用語は、様々な要素、構成要素、領域、層および／または区域を説明するために本明細書で使用することができるが、これらの要素、構成要素、領域、層および／または区域は、これらの用語によって限定されるべきではないことが理解されよう。むしろ、これらの用語は、１つの要素、構成要素、領域、層および／または区域を別の要素、構成要素、領域、層および／または区域から区別する目的にのみ使用される。
【００３０】
本明細書で使用する「哺乳類」は、ヒト対象（および細胞源）、ならびに例えばイヌ、ネコ、マウス、サルなど（例えば獣医学または研究目的）の非ヒト対象（および細胞源または細胞型）の両方を指す。
【００３１】
本明細書で使用する「ヒドロゲル」は、任意の適したヒドロゲルとすることができる。一般に、ヒドロゲルは水を含み、さらに、ポリアルキレンオキシド、ポロキサミン、セルロース、ヒドロキシアルキル化セルロース、ポリペプチド、多糖類、炭水化物、タンパク質、これらのコポリマーまたはこれらの組合せからなるもしくはこれらから由来し、より特定すれば、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（エチルオキサゾリン）、ポリ（エチレンオキシド）−コ−ポリプロピレンオキシド）ブロックコポリマー、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、メチルヒドロキシプロピルセルロース、ポリスクロース、ヒアルロン酸、デキストラン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、ヘパリン、アルギン酸塩、ゼラチン、コラーゲン、アルブミン、オボアルブミン、これらのコポリマーおよびこれらの組合せからなるまたはこれらから由来し、これらのすべては、既知の技術または当業者にはあきらかであるそれらの変形に従って、様々な度合いで架橋していることが好ましい。米国特許第８，８１５，２７７号；同第８，８０８，７３０号；同第８，７５４，５６４号；同第８，６９１，２７９号を参照されたい。いくつかの実施形態において、架橋ヒアルロン酸ヒドロゲル（任意選択でゼラチンなどの追加的なポリマーを含む）が好ましい。
【００３２】
その前駆体を含めた抗原提示樹状細胞（例えば、誘導または分化胚性幹細胞；ＣＤ３４＋骨髄前駆細胞）が、知られている。例えば米国特許第６，００８，００４号および同第８，７８５，１８９号を参照されたい。
【００３３】
その前駆体を含めた神経幹細胞が、知られている。例えば米国特許第６，００１，６５４号および同第８，７８５，１８７号を参照されたい。
【００３４】
その前駆体、および血管細胞に自己組織化できる細胞を含めた血管細胞が、知られている。例えば米国特許出願公開番号ＵＳ２０１４／０２７３２２０およびＵＳ２０１４／０２０１９８８を参照されたい。
【００３５】
１．皮膚代替製品およびそれを作製する方法。
本発明の製品は、
（ａ）任意選択で、第１のヒドロゲル担体中の生きた哺乳類の脂肪細胞（例えば、誘導された前脂肪細胞）を含む第１の（「皮下組織様」）層を、基質（例えば、不活性基質、例えば多孔質ポリマーメッシュ；コラーゲンなど；または治療を必要とする対象の創傷）に堆積させるステップ；次いで（好ましくは１時間半以内で）；
（ｂ）第２のヒドロゲル担体中に、生きた哺乳類の線維芽細胞および生きた哺乳類の毛乳頭細胞を含む第２の（「真皮様」）層を、存在する場合は前記第１層上に（前記第１層が存在しない場合は前記基質上に）堆積させるステップ；次いで（好ましくは１時間半以内で）；
（ｃ）第３のヒドロゲル担体中に生きた哺乳類のケラチノサイトおよび生きた哺乳類のメラノサイトを含む第３の（「表皮様」）層を、前記第２層上に堆積させるステップ
によって作製することができる。
【００３６】
いくつかの実施形態において、第１のヒドロゲル担体は、堆積されるとき、予備重合または部分重合された形態で堆積され；第２のヒドロゲル担体は、予備重合または部分重合された形態で堆積され；および／または第３のヒドロゲル担体は、予備重合または部分重合された形態で堆積される。
【００３７】
いくつかの実施形態において、堆積ステップ（ａ）および（ｂ）は、存在する場合は、前記第１層中の前記第１のヒドロゲルおよび前記第２層中の前記第２のヒドロゲルが、少なくとも部分的に互いに架橋する条件下で実行され；前記堆積ステップ（ｂ）および（ｃ）は、前記第２層中の前記第２のヒドロゲルおよび前記第３層中の前記第３のヒドロゲルが、少なくとも部分的に互いに架橋する条件下で実行される。これらの層は、直接、または介在する架橋性層を介して架橋していてもよい。
【００３８】
いくつかの実施形態において、第１、第２および／もしくは第３のヒドロゲル担体は、架橋ヒアルロン酸を含み、ならびに／または第２および／もしくは第３のヒドロゲル担体は、任意選択だが好ましくは、コラーゲンをさらに含む。
【００３９】
いくつかの実施形態において、堆積は、第２層および第３層が少なくとも部分的に互いに架橋し、ならびに／または第１層および第２層が、少なくとも部分的に互いに架橋する条件下で−典型的には、２つの層の間の架橋反応が発生し得るように十分近い時間で堆積ステップを実行することによって、実行される。
【００４０】
いくつかの実施形態において、部分または完全な介在層（複数可）、例えば介在するヒドロゲル層（複数可）は、第１および第２、ならびに／または第２および第３のヒドロゲル層を任意選択でこれらのそれぞれの介在するヒドロゲル層（複数可）と架橋させて、第１および第２のヒドロゲル層（ｈｙｄｒｏｇｅｎ  ｌａｙｅｒ）、ならびに／または第２および第３のヒドロゲル層の間に差し挟むことができる。「部分的な」介在層とは、層が、第１および第２、ならびに／または第２および第３の層が互いに直接接触している開口部を有することを意味する。追加的に、以下に記載するような追加的な細胞型は、任意選択で、このような介在する層に堆積させることができる。これらの介在する層（複数可）のヒドロゲルは、存在する場合、第１、第２、および／または第３のヒドロゲル層と同様の材料の形態とすることができ、同様に、これらの層は、部分的に架橋した形態で堆積させることができる。
【００４１】
いくつかの実施形態において、（ｉ）前記第１層は、存在する場合、１００、２００または３００マイクロメートルから最大４００、６００または８００マイクロメートルの厚さを有し；（ｉｉ）前記第２層は、１００、２００または３００マイクロメートルから最大４００、６００または８００マイクロメートルの厚さを有し；（ｉｉｉ）前記第３層は、１００、２００または３００マイクロメートルから最大４００、６００または８００マイクロメートルの厚さを有し；および／または
（ｉｖ）前記製品は、前記第１層が存在しない場合は、約２００、４００もしくは６００マイクロメートルから最大８００、１２００もしくは１６００マイクロメートルの総厚さを有する、または、前記第１層が存在する場合は、３００、６００もしくは９００マイクロメートルから最大１２００、１８００もしくは２４００マイクロメートルの総厚さを有する。
【００４２】
いくつかの実施形態において、第１層（存在する場合）、前記第２層および前記第３層のそれぞれは、０．５、１または１０平方センチメートルから最大５０、２００または４００平方センチメートルの被覆表面積を有する。
【００４３】
細胞は、任意の適した量で含むことができる。いくつかの実施形態において、（ｉ）前記脂肪細胞は、立方センチメートル当たりの細胞数１００万または２００万から８００万、１０００万、１５００万または２０００万（好ましくは４００万から６００万または１０００万から２０００万）の量で、前記第１のヒドロゲル担体に含まれ；および／または（ｉｉ）前記線維芽細胞および前記真皮乳頭細胞は、約８：１もしくは６：１から２：１もしくは１：１（好ましくは５：１から３：１）の比で、および／または立方センチメートル当たりの細胞数約５００もしくは８００万から１５００万、２０００万、２５００万もしくは３０００万（好ましくは約１０００万または約２０００万〜２５００万）の複合密度で、前記第２のヒドロゲル担体に含まれ、および／または（ｉｉｉ）前記ケラチノサイトおよび前記メラノサイトは、約２０：１もしくは１０：１から８：１、５：１、３：１もしくは２：１（好ましくは１２：１から３：１）の比で、および／または立方センチメートル当たりの細胞数約５００万もしくは８００万から１５００万、２０００万、２５００万、３０００万もしくは３５００万（好ましくは約１０００万または約２０００万〜３０００万）の複合密度で前記第３のヒドロゲル担体に含まれる。
【００４４】
細胞は、樹立培養物、ドナー、またはこれらの組合せから得ることができる。いくつかの実施形態において、前記生きた哺乳類の脂肪細胞は、ヒト脂肪細胞であり；前記生きた哺乳類の線維芽細胞は、ヒト線維芽細胞であり、前記生きた哺乳類の毛乳頭細胞は、ヒト毛乳頭細胞であり、前記生きた哺乳類のケラチノサイトは、ヒトケラチノサイトであり、および／または前記生きた哺乳類のメラノサイトは、ヒトメラノサイトである。
【００４５】
前述したものに対する様々な追加的な強化を、行うことができる。例えば、いくつかの実施形態において、方法は、前記第１層と前記第２層の間に、前記第２層に、前記第２層と前記第３層の間に、および／または前記第３層に（例えば、立方センチメートル当たりの細胞数１００万または２００万から８００万または１０００万（好ましくは４００万から６００万）の総量で）、抗原提示樹状細胞またはその前駆体を堆積させることをさらに含むことができる。
【００４６】
いくつかの実施形態において、方法は、前記第１層と前記第２層の間に、前記第２層に、前記第２層と前記第３層の間に、および／または前記第３層に（例えば、立方センチメートル当たりの細胞数１００万または２００万から８００万または１０００万（好ましくは４００万から６００万）の総量で）、神経系細胞またはその前駆体を堆積させることをさらに含むことができる。
【００４７】
いくつかの実施形態において、方法は、前記第１層と前記第２層の間に、前記第２層に、前記第２層と前記第３層の間に、および／または前記第３層に（例えば、立方センチメートル当たりの細胞数１００万または２００万から８００万または１０００万（好ましくは４００万から６００万）の総量で）、血管細胞またはその前駆体を堆積させることをさらに含むことができる。
【００４８】
いくつかの実施形態において、構造体の直径または幅は、１から５ミリメートル、または３から７ミリメートルまたは５から１０ミリメートル、または８から１６ミリメートル、または１０から２０ミリメートル、または２０から５０ミリメートル、または３０から８０ミリメートル、または５０から１００ミリメートルである。
【００４９】
堆積は、噴霧、展着／塗装、コーティングなどを含めた任意の適した技術によって実行することができるが、これらだけには限らない。いくつかの好ましい実施形態において、堆積ステップは、「インクジェット」型プリンティングおよびシリンジ注入型プリンティングの両方を含めた任意の適した技術に従って、プリンティングまたはバイオプリンティングによって実行される。このようなバイオプリンティングを実行するための装置が知られており、例えば、Ｂｏｌａｎｄら、米国特許第７，０５１，６５４号；Ｙｏｏら、米国特許出願公開番号ＵＳ２００９／０２０８４６６；およびＫａｎｇら、米国特許出願公開番号ＵＳ２０１２／００８９２３８に記載されている。
【００５０】
不活性基質上に堆積した場合、上述の製品は、そこから取り出して、すぐに使用することができる、または任意の適した培養地においてインビトロでその支持体上で維持してさらに増殖させることができる。製品は、適切な栄養および／または培養地と一緒に、必要に応じて、次の使用のために無菌の容器またはパッケージに（支持体の有無にかかわらず、または異なる支持体に移して）包装することができる。
【００５１】
支持体は、多孔質または非孔質とすることができる。例えば、支持体は、構造体、例えば１つまたは複数の層の生細胞に拡散するために、栄養培地に対して透過性のある多孔質フィルター、膜またはメッシュとすることができる。
【００５２】
２．創傷治療での使用の方法。
対象の例えば熱傷、切創（切開痕を含める）、擦り傷、裂傷などの創傷は、本明細書に記載の皮膚代替製品を、治療に効果的な形態でその創傷に局所適用する（例えば、その治癒を助けるために創傷を十分に保護または被覆する）ことによって治療することができる。例えば深くない熱傷など、その創傷の性質によっては、第１の「皮下組織様」層は、必要でないことがある。適した対象として、ヒト対象および獣医学的（獣医薬および薬事審査を含める）目的のためのその他の動物（典型的には哺乳類）被験体（例えば、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマなど）の両方が挙げられる。
【００５３】
いくつかの実施形態において、創傷は、顔面の創傷、例えば額、眉間、鼻根、鼻（例えば、鼻梁、鼻背、鼻先、鼻突、鼻橋、鼻翼側壁）、鼻唇溝、人中、口唇、顎先、頬、顎、耳（例えば、耳輪、舟状窩、対耳輪のひだ（ａｎｔｉｈｅｌｉｃａｌ  ｆｏｌｄ）、対耳輪、対珠、耳垂、耳珠、甲介、窩）、眼の周囲の皮膚（例えば瞼）の創傷とすることができる。
【００５４】
いくつかの実施形態において、生きた皮膚製品は、不活性基質でできたカスタマイズしたモールドで製造し、創傷治癒のための個別の形状をもたらすことができる。モールドは、任意選択で、創傷の治癒のための所望の形状および特性を与えるために修正されたＣＴデータなどの臨床画像データに基づいて製造することができる。非限定的な例として、モールドは、任意選択で、本明細書で教示するプリンターから分注される、ポリマー材料（例えば、ポリウレタン）から形成され得る。いくつかの実施形態において、創傷は、手術またはその他の医療処置、例えば形成外科手術の結果であってもよい。
【００５５】
いくつかの実施形態において、表皮層は、不活性基質上に堆積し、真皮層は、表皮層上に堆積し、任意選択で、皮下組織層は（創傷の特質および創傷治療における皮下組織の必要性によって）真皮層上に堆積する。
【００５６】
いくつかの実施形態において、不活性基質層を含む生きた皮膚製品は、顔面の創傷の複雑な輪郭、形状および構造にぴったりと合うように成型される。
【００５７】
いくつかの実施形態において、製品の１つまたは複数の細胞型は、治療される対象に対して自家である。いくつかの実施形態において、製品の１つまたは複数の細胞型は、治療される対象に対して同種異系である。
【００５８】
３．化合物検査における使用の方法。
本明細書に記載の生きた皮膚代替製品は、化合物または組成物のスクリーニング（例えば、有効性、毒性、浸透、刺激、またはその他の代謝もしくは生理作用に関するスクリーニング）のために生きた動物を検査する代替手段として使用することができる。このような検査は、（例えば、酸素化培地中で）その製品の構成細胞を生存させておく条件下で、本明細書に記載の皮膚代替製品を用意すること；検査される化合物または組成物（例えば、典型的にビヒクルまたは担体、例えば石鹸または化粧品などの局所組成物中にもたらされる薬剤候補）を、この製品に（例えば、前記第３層への局所適用によって）適用すること；次いで、前記皮膚代替製品（例えば、熱傷、細胞死、マーカー放出、例えばヒスタミン放出、サイトカイン放出、遺伝子発現の変化など）に対する生理反応（例えば、損傷、瘢痕組織形成、刺激、浸透、細胞増殖など）を検出することによって、実行することができ、このような生理反応の存在は、前記化合物または組成物が哺乳類の被験体の皮膚に適用された場合に、治療の有効性、毒性、刺激、浸透もしくはその他の代謝または生理作用を有することを示している。代替の皮膚の対照試料は、対照化合物または組成物（例えば、生理食塩水、化合物、ビヒクルまたは担体）が適用され得るような同様な条件下で維持することができ、したがって、比較結果が得られる、または過去のデータとの比較もしくは検査化合物または組成物などの希釈レベルの適用によって得られるデータとの比較に基づいて、損傷を判断することができる。
【００５９】
いくつかの実施形態において、生きた皮膚代替構造体は、細胞培養インサートなどの細胞培養ディッシュ（例えばペトリ皿、２−ウェルプレート、６−ウェルプレート、１２−ウェルプレート、２４−ウェルプレート、４８−ウェルプレート、９６−ウェルプレートなど）に配置されるように構成されたインサート上に形成および／または提供される。細胞培養インサートは知られており、例えば米国特許第５，６５２，１４２号、同第５，５７８，４９２号、同第５，４６８，６３８号、同第５，４７０，４７３号などに記載されている。
【００６０】
本発明は、以下の非限定的な実施例でさらに詳細に説明される。
【実施例】
【００６１】
インビトロでバイオプリントした皮膚代替物の製造
この実施例において、ヒアルロナン−ゼラチンベースのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ヒドロゲル内に播種した５つのヒト初代皮膚細胞を用いて、３Ｄで復元またはバイオプリントしたインビトロの皮膚代替物に対する培養条件を最適化するための予備実験を提示する。
【００６２】
これらの実施例の目的は、［１］培地条件の異なるゲル（血清濃度０、１、５、および１０％）内に播種した細胞の生存性および増殖を検査および比較すること；［２］均一に分布したヒドロゲル内に５つの異なる皮膚細胞を封入する実現可能性を検査し、構造体当たりの適切な細胞密度を求めること；ならびに［３］層化および細胞提示が良好な三層化した３Ｄの皮膚構造体をインビトロでバイオプリンティングする実現可能性を示すことである。
【００６３】
細胞源。ヒト成人のケラチノサイト（Ｋ）、メラノサイト（Ｍｅｌ）、皮膚線維芽細胞（ＤＦ）、毛乳頭細胞（ＦＤＰＣ）、および前脂肪細胞（ｐ−Ａｄ）ならびに関連する成長培地（ＧＭ）および分化培地（ＤＭ）を、Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）およびＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）から購入した。バイオプリンティングに使用するすべての細胞を、Ｎ＝３−４ドナー（Ｐ３−Ｐ８）からプールした。表皮用に、ケラチノサイトとメラノサイトとの比を、９：１に保持し、細胞濃度を、細胞１０００万個／ｍｌで保持した。真皮用に、皮膚線維芽細胞と毛乳頭細胞との比を、４：１で保持し、細胞濃度を、これも細胞１０００万個／ｍｌで保持した。皮下組織用に、前脂肪細胞を前培養し、前標準化した分化培地（Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で２〜３日、単分子層において誘導し、誘導された脂肪細胞（ｉＡｄ）を使用して、細胞５００万個／ｍｌでプリントした。
【００６４】
ヒドロゲル調製物。市販のヒアルロン酸−ゼラチンベースヒドロゲル（ＨｙＳｔｅｍ（登録商標）−Ｃ，ＥＳＩ−ＢＩＯ，Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ）を、「バイオペーパー」として使用した。より詳細には、２〜４％のＰＥＧＤＡ（Ｅｘｔｒａｌｉｎｋ）または４−ａｒｍ−ＰＥＧＡ（Ｃｒｅａｔｉｖｅ  ＰＥＧｗｏｒｋｓ，Ｗｉｎｓｔｏｎ  Ｓａｌｅｍ，ＮＣ，ＵＳＡ）を含む１％チオール化ヒアルロン酸（グリコシル）−１％チオール化ゼラチン（Ｇｅｌｉｎ−Ｓ）を、様々なゲル化時間および剛性のための架橋剤として使用した。さらに、ヒトコラーゲン（１０〜２０％（ｖ／ｖ）、３ｍｇ／ｍｌ、ＥＳＩ−ＢＩＯ）溶液を、ヒドロゲルを作製する際に真皮および表皮層に添加した。
【００６５】
３Ｄプリンティング。カスタマイズした３Ｄバイオプリンター（Ａ．Ｓｋａｒｄａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｐｒｉｎｔｅｄ  Ａｍｎｉｏｔｉｃ  Ｆｌｕｉｄ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅ  Ｈｅａｌｉｎｇ  ｏｆ  Ｌａｒｇｅ  Ｓｋｉｎ  Ｗｏｕｎｄｓ，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １，７９２−８０２（２０１２））を使用した。細胞ならびに混合細胞およびヒドロゲル（「バイオインク」および「バイオペーパー」）を、異なる各層用の滅菌シリンジに充填してプリントした。各ヒドロゲルの粘度によって３００μｍサイズのノズルおよび圧力２０〜８０ｋＰａを使用し、細胞／ゲル溶液を、様々なスキャン速度で、等間隔の、コイル形状のパターンにしたがって、プリントした。一般に、シリンジ充填当たり６〜８つの構造体を印刷した。細胞を含まないヒドロゲルをコーティングした後、細胞／ゲル溶液を、ポリカーボネートトランズウェルフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｄ＝１２ｍｍ）の上部にプリントし、各層を、次の層をプリントする前に確実に完全にゲル化した。一般に、各層は、３００〜３５０μｍであった。したがって、三層構造全体は、厚さ約９００〜１２００μｍであった。
【００６６】
プリンティング後、インサートの内部にプリントされた各皮膚構造体を、６−ウェルプレートに配置し、５％の加熱不活性化血清ケラチノサイトベースの培地（５％のＨＫＭ、Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で培養した。浸漬培養用に、インサートの内側および外側に対して３００〜４００μｌおよび２．５〜３ｍｌの５％のＨＫＭをそれぞれ使用して、培地を、一日おきに変えた。バイオプリントした皮膚構造体を、３７℃の一定温度およびＣＯ２５％で、標準細胞培養インキュベーター中で培養した。
【００６７】
評価。組織学（Ｈ＆Ｅ、Ｍａｓｏｎ  Ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ）、免疫組織化学（ＩＨＣ）、移動および生存性（生／死）に対する前標識細胞の２Ｄおよび３Ｄの共焦点／顕微鏡画像（Ｑｔｒａｃｋｅｒｓ）、ならびにＭＴＳアッセイ。
【００６８】
結果。細胞生存性に対する血清濃度の効果（３Ｄ）を、図１に示す。無血清ＫＧＭ２培地（Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ）は、最も低い細胞生存性を示し、５％および１０％の血清を添加したＫＧＭ２培地は、拮抗し、質的に細胞生存性の観点から最も適していると思われた。生／死からの定性的結果を、［１］ヒドロゲル内に混合した５つの皮膚細胞、および［２］ヒドロゲル内に封入した個々の皮膚細胞の２回のＭＴＳ細胞生存性アッセイによって裏付けた。
【００６９】
図２は、ヒドロゲル構造体内に混合した５つの皮膚細胞（Ｎ＝４）に関する報告である。量的に同時に異なる血清濃度の有意な差異は見出されなかった。無血清および１％血清−ケラチノサイト培地は、おそらく、経時的に十分にはその他の細胞の成長を支持しない。
【００７０】
図３は、ヒドロゲル内に封入された個々の皮膚細胞（Ｎ＝４）に関する報告である。ケラチノサイトは、５％の血清濃度で最も著しく増殖した。５％の血清濃度の培地は、メラノサイトを除いたすべての皮膚細胞に対して最も高い増殖を示した。血清の条件にかかわらず、ケラチノサイトは、その他の皮膚細胞型と比較して最も低い増殖を示した。
【００７１】
図４は、インビトロでバイオプリントした皮膚代替構造体（ｔ＝６ｄ、１０００万〜５００万〜５００万／層（上から下へ））を示す。三層の３Ｄインビトロ皮膚構造体のバイオプリンティング（表皮：ケラチノサイト＋メラノサイト；真皮：皮膚線維芽細胞＋毛乳頭細胞；皮下組織：前脂肪細胞）を、各層において良好な位置にある細胞を用いて成功裏に行った；本発明者らは、層の間の明確な差異、および本発明者らがプリントした各特定の細胞型を有する三層の存在を観測することができた。各細胞の表現型は、培養最大６日間まで、良好に維持されていると思われた。
【００７２】
図５は、マウスへの局所移植の３週間後の、そこに形成した毛包およびその毛包から成長した毛を有する、図４の構造体に類似した、バイオプリントした皮膚代替構造体を示す。
【００７３】
結論。手での播種およびバイオプリンティングによって、ヒアルロナンベースのヒドロゲル内に５つの異なる初代皮膚細胞を封入することは実行可能である。インビトロでのケラチノサイトの単純細胞培養とは異なり、検査条件の中で、インビトロでの多重の皮膚細胞共培養に対する細胞生存性を維持するために、少なくとも５％の血清濃度が必要である。生／死およびＭＴＳアッセイの両方に基づいて、５％の血清濃度ケラチノサイト成長培地は、プリンティング後の５つの皮膚細胞のインビトロ培養に使用される。
【００７４】
インビトロでバイオプリントした皮膚代替物のさらなる製造
ヒアルロナン−ゼラチンベースポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ヒドロゲルに播種した、プールしておいた５つのヒト初代皮膚細胞型（ケラチノサイト（Ｋ）、メラノサイト（Ｍ）、皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）、毛乳頭細胞（ＦＤＰＣ）、および誘導前脂肪細胞（Ｐ−Ａｄ／ｉＡｄ））を用いて、３Ｄバイオプリントしたインビトロ皮膚構造体に対するインビトロ培養およびバイオファブリケーション条件を最適化するためのさらなる研究を実施した。表皮、真皮および皮下組織をプリントするために使用される総細胞数は、それぞれ、２０００万〜３０００万／ｍｌ、２０００万〜２５００万／ｍｌ、１０００万〜２０００万／ｍｌであった。各層に対する細胞対細胞の比は、表皮：Ｋ：Ｍ＝５：１、真皮：ＨＤＦ：ＦＤＰＣ＝４：１、および皮下組織：Ｐ−ＡｄまたはｉＡｄであった。プリンティングに使用されるバイオインクは、２部（グリコシル）：２部（Ｇｅｌｉｎ−Ｓ）：１部（８％（ｗ／ｖ）４−ＡｒｍＰＥＧ−アクリレート、Ｃｒｅａｔｉｖｅ  ＰＥＧ  ＷｏｒｋｓからのＭＷ５ｋ（ＰＳＢ−４２３）、および１０〜２０％（ｖ／ｖ）の３ｍｇ／ｍｌヒトコラーゲン溶液：ＶｉｔｒｏＣｏｌ））で構成されていた。バイオプリンティング用の圧力は、細胞数またはバイオインクの密度によって４０〜８０ｋＰａで変更した。プリントされた構造体を、最大３週間、５％のウシ胎児血清を含有するケラチノサイト成長培地で培養し、細胞分布および生存性をさらに分析した。
【００７５】
結果は、ヒト初代皮膚細胞のバイオプリンティングおよび３Ｄ共培養が、細胞の生存性に影響を及ぼさず、皮膚構造体は、プリントされた層の間で細胞の移動はあまり多くなく、それらの元々のプリントされた三層構造を維持したことを示した。この研究が、インビトロのバイオプリントした多重皮膚細胞型ベースの細胞モデルを発展させる実現可能性を証明している。
【００７６】
顔面皮膚再生のための３Ｄバイオマスクの製造
顔面の火傷は、依然として、創傷ケアにおける最大の課題の１つであり、その治療は、罹患者の生活の質および社会的統合に大きな影響を与え得る。しかし、顔面の多様な輪郭および複雑な運動は、顔面の創傷の修復の課題であった。現在の負傷後の治療戦略では、瘢痕化、感染、生着不全および不十分な化粧効果に繋がることが多い。この研究において、顔面の創傷の複雑な輪郭、形状および構造にぴったりと合うカスタマイズした人工皮膚代替物が、カスタマイズされた顔の形状の構造に皮膚細胞を組み合わせて３−Ｄ製造されたバイオマスク（図６）を使用して開発された。
【００７７】
統合臓器プリンティング（ＩＯＰ）システムを使用して、ヒト初代ケラチノサイトを含有する層およびヒト初代皮膚線維芽細胞を含有する層を用いて顔の形状の多孔質ポリウレタン（ＰＵ）を含有するバイオマスクを製造した（図７）。各構成要素を、気圧の制御および３軸ステージによって正確に分注し、配置した。
【００７８】
バイオマスク構造体を作製するために、ポリウレタン（ＰＵ）を、支持構造体用に使用した。ＰＵを分注するために、高温（およそセ氏１５０度）および高圧（１５００ｋＰａ）を使用した。表皮層用の細胞／ヒドロゲル混合物；次に真皮層を、次いで形成されたＰＵ構造体上にプリントした（図８）。表皮および真皮層用に、ケラチノサイトおよび線維芽細胞を、それぞれ、ヒドロゲルに混合した。図９に示すように、ＰＵ構造体は、表皮および真皮層の上部のヒドロゲル構造体を支持している。移植後、ＰＵ構造体は、皮膚創傷の包帯（a dressing）のように作用することができる。
【００７９】
プリントされた構造体を、マウスの全層皮膚創傷モデルで実証した。プリントされた構造体を、ｎｕ／ｎｕマウスの全層皮膚創傷（１×１ｃｍ２）に適用した。人工皮膚構造体を、多孔質のＰＵ層で送達した。１４日で採集したＨ＆Ｅ染色組織切片の皮膚試料は、対照（未処理）と人工皮膚の群の間の創傷領域の中心近くの表皮層の質においてはっきりとした差異を示した。
【００８０】
バイオマスクは、正確に多重の細胞型を送達し、迅速な創傷の保護および閉合を促進しながら、カスタマイズした輪郭を維持する能力をもたらすが、これは、複雑な顔面全層創傷の場合に最も重要である。３−ＤのＩＯＰシステムで製造されたバイオマスクの臨床用途は、創傷の治癒および皮膚の再生を強化し、治癒した創傷の機能性および化粧の外観を強化するためにパーソナライズされることが期待される。
【００８１】
上記は、本発明を例示しており、これを限定するものとして解釈されるべきではない。本発明は、以下の特許請求の範囲によって、そこに含まれる特許請求の範囲の等価物と共に、定義される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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