(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルスに起因する呼吸器感染を有する対象において、二次感染に関連する疾患を処置または予防する薬剤の製造のための、呼吸器感染に対する抗ウイルス剤と、膜型１マトリックスメタロプロテイナーゼ−１（ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｔｙｐｅ  １−ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  １）（ＭＴ１−ＭＭＰ１）に特に結合する阻害抗体の使用。
【請求項２】
ウイルスに起因する感染を処置する薬剤の製造のための、呼吸器感染を引き起こすウイルスに対する抗ウイルス剤と、ＭＴ１−ＭＭＰ１に特に結合する阻害抗体の使用。
【請求項３】
前記二次感染が、血液感染である、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
前記疾患が、敗血症である、請求項１の使用。
【請求項５】
前記ウイルスが、インフルエンザである、請求項１または２のいずれかに記載の使用。
【請求項６】
前記抗ウイルス剤が、ノイラミニダーゼ阻害剤（ＮＡＩ）である、請求項１または２のいずれかに記載の使用。
【請求項７】
前記二次感染が、細菌感染である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項８】
前記細菌感染が、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）である、請求項７に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、いくつかの実施形態において、細胞外マトリックスリモデリングをダウンレギュレートする薬剤を用いた、病原体に感染した対象における、二次感染の予防方法に関する。
【０００２】
インフルエンザなど、ウイルスが原因のパンデミックは、世界中で無数の死者を出してきた。甚だしい例は、１９１８年のパンデミックであり、六大陸に蔓延し、約５億人に感染し、死者数は５千万人に達した。臨床症例およびオートプシー試料の研究によって、症例の死者の９５％超が、二次的細菌感染、最も一般的には肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ））の二次的感染を併発していたことが示された。感染部位に動員される免疫細胞は、インフルエンザクリアランスのために不可欠である。しかしながら、浸潤性免疫細胞はまた、過剰な炎症反応を生じさせ、付随的な組織損傷および血液空気関門の破壊も引き起こし得ることを示す証拠が増加している。
【０００３】
病原体に対する組織耐性は、組織機能を維持しながら病原体に対する宿主免疫応答のバランスを取るという、進化における重要なトレードオフである。しかしながら、耐性能力は種々の器官の間で異なり、肺は組織耐性能力が比較的低く、組織損傷をより受けやすい。したがって、呼吸器がウイルス感染している間の主な死亡原因は、ウイルス力価よりもむしろ宿主由来の無制御な免疫応答であろうということが議論されてきた。この免疫応答は、主に炎症性の単球、顆粒球、マクロファージ、および樹状細胞と関連する。したがって、インフルエンザに感染した肺は広汎出血性であり、このことが宿主の免疫応答を組織破壊に結びつけている可能性がある。組織の破綻は、組織破壊に結びつく二次的な細菌の侵入を導く可能性があり、極端な例では、死亡という結果を生じさせ得る。インフルエンザと二次的細菌感染との間の相互の影響については長い間研究されてきたが、インフルエンザ感染が組織の二次感染を導く分子的なメカニズムは、未だ十分には理解されていない。
【０００４】
宿主の耐性要素の１つは、呼吸器における、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）に結合した上皮性関門の完全性である。ＥＣＭスキャフォールドは、組織内の細胞によって産生され、２つの層、すなわち、Ｉ）間質マトリックス、つまり多糖類と線維状タンパク質の３次元ゲル、およびＩＩ）基底膜、つまり上皮組織の基部に形成されたメッシュ状シート、からなる。ＥＣＭターンオーバーは、正常な状態および病的な状態における過剰なＥＣＭ分子の不可逆的切断に重要なマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）を含む、複数のタンパク質分解酵素によって制御される。タンパク質分解活性の調節不全は、炎症、がん、および感染症に付随していることが多い。したがって、病的な状態の研究によって、ＥＣＭ分子および関連するタンパク質線維のタンパク質分解の調節不全が、組織機能に対して重要な影響を及ぼすことが示されてきた。特に、ＭＭＰは、肺器官形成に決定的な役割を果たすことが示されており、多くのＭＭＰが肺炎症性疾患の急性および慢性期に関与している（Ｇｒｅｅｎｌｅｅ，ｅｔ  ａｌ．，２００７、Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｅｖｉｅｗｓ、８７、６９−９８）。ＥＣＭスキャフォールドタンパク質、細胞接着分子、成長因子、サイトカイン、およびケモカインを含む、ＭＭＰの種々の基質が、肺発生中に確認されている（Ｇｒｅｅｎｌｅｅ，ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｅｖｉｅｗｓ  ８７，６９−９８）。
【０００５】
膜係留型コラゲナーゼである膜型１マトリックスメタロプロテイナーゼ（Ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｔｙｐｅ−Ｉ  ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）（ＭＴ１−ＭＭＰ／ＭＭＰ−１４）は、肺の発生と恒常性の主要制御因子であり、かつ創傷治癒、気道リモデリング、および細胞トラフィッキングを媒介する。したがって、この膜型１マトリックスメタロプロテイナーゼは、気道において、線維芽細胞、内皮細胞、およびマクロファージを含む複数の細胞集団で発現している（Ｇｒｅｅｎｌｅｅ，ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｅｖｉｅｗｓ  ８７，６９−９８）。炎症中のマクロファージ由来プロテアーゼの機能は、典型的には、組織浸潤または分解イベントに関連している。マクロファージにおいて、ＭＴ１−ＭＭＰは、ＥＣＭに作用するプロテアーゼとして働くだけではなく、マクロファージの免疫反応の制御も行う。動員された単球およびマクロファージは、種々のＭＭＰを含む広範な範囲のＥＣＭリモデラーをアップレギュレートする。条件によって、マクロファージは、ある範囲のＭＭＰとその阻害剤とを発現し、これらは生理的な肺リモデリングイベントと病的な肺リモデリングイベントの両方に関連している。ＭＭＰ−９（ゼラチナーゼＢ）は、感染部位への好中球の移動を促進することにより、インフルエンザ感染からの回復に有用であることが示された（Ｂｒａｄｌｅｙ，ｅｔ  ａｌ．，２０１２，ＰＬｏＳ  ｐａｔｈｏｇｅｎｓ  ８，ｅ１００２６４１）。これらの知見は重要であるが、ＥＣＭの完全性と免疫防御との間のトレードオフを含む、呼吸器感染している間のＥＣＭタンパク質分解経路に関する体系的な分析は、全く完結していない。
【背景技術】
【０００６】
背景技術としては、Ｃｈｅｕｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｐａｔｈｏｌ．２００６  Ｍａｒ−Ａｐｒ；１５（２）：６３−７４，Ｅｌｋｉｎｇｔｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，２００５  Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１４２：１２−２０；Ｄｅｖｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｖｏｌｕｍｅ  ２０１１，Ａｒｔｉｃｌｅ  ＩＤ  １９１６７０，ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１１／１９１６７０；Ｒｅｎｃｋｅｎｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００６；１７６：３７３５−３７４１；Ｖａｎｌａｅｒｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，Ａｐｒ．２００９，Ｖｏｌ  ２２，ｐ．２２４−２３９；およびＵｄｉ，ｅｔ  ａｌ．，２０１５，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２３，１−１２，Ｊａｎｕａｒｙ  ６，２０１５が挙げられる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｇｒｅｅｎｌｅｅ，ｅｔ  ａｌ．，２００７、Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｅｖｉｅｗｓ、８７、６９−９８
【非特許文献２】Ｇｒｅｅｎｌｅｅ，ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｅｖｉｅｗｓ  ８７，６９−９８
【非特許文献３】Ｂｒａｄｌｅｙ，ｅｔ  ａｌ．，２０１２，ＰＬｏＳ  ｐａｔｈｏｇｅｎｓ  ８，ｅ１００２６４１
【非特許文献４】Ｃｈｅｕｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｐａｔｈｏｌ．２００６  Ｍａｒ−Ａｐｒ；１５（２）：６３−７４
【非特許文献５】Ｅｌｋｉｎｇｔｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，２００５  Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１４２：１２−２０
【非特許文献６】Ｄｅｖｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＩｎｔｅＲＮＡｔｉｏｎａｌ，Ｖｏｌｕｍｅ  ２０１１，Ａｒｔｉｃｌｅ  ＩＤ  １９１６７０，ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１１／１９１６７０
【非特許文献７】Ｒｅｎｃｋｅｎｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００６；１７６：３７３５−３７４１
【非特許文献８】Ｖａｎｌａｅｒｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，Ａｐｒ．２００９，Ｖｏｌ  ２２，ｐ．  ２２４−２３９
【非特許文献９】Ｕｄｉ，ｅｔ  ａｌ．，２０１５，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２３，１−１２，Ｊａｎｕａｒｙ  ６，２０１５
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明のいくつかの実施形態の１つの態様によれば、病原体に感染した対象における、二次感染に関連する疾患の処置または予防方法であって、病原体に対する治療有効量の抗病原体剤と、少なくとも１つの細胞外マトリックス関連ポリペプチドをダウンレギュレートする治療有効量の薬剤とを対象に投与し、それによって、対象における、二次感染に関連する疾患を処置または予防することを含む、疾患の処置または予防方法が提供される。
【０００９】
本発明のいくつかの実施形態の１つの態様によれば、病原体に感染した対象の処置方法であって、病原体に対する治療有効量の抗病原体剤と、少なくとも１つの細胞外マトリックス関連ポリペプチドをダウンレギュレートする治療有効量の薬剤とを対象に投与し、それによって、対象を処置することを含む、処置方法が提供される。
【００１０】
本発明のいくつかの実施形態の１つの態様によれば、抗病原体剤と、少なくとも１つの細胞外マトリックス関連ポリペプチドをダウンレギュレートする薬剤とを含む、製造品が提供される。
【００１１】
本発明のいくつかの実施形態の１つの態様によれば、第１の活性薬剤として抗病原体剤と、第２の活性薬剤として少なくとも１つの細胞外マトリックス関連ポリペプチドをダウンレギュレートする薬剤と、医薬的に許容され得る担体とを含む、医薬組成物が提供される。
【００１２】
本発明のいくつかの実施形態の１つの態様によれば、インフルエンザの処置を必要とする対象における、インフルエンザの処置方法であって、細胞外マトリックス関連ポリペプチドをダウンレギュレートする治療有効量の薬剤を対象に投与し、それによって、インフルエンザを処置することを含む、処置方法が提供される。
【００１３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、細胞外マトリックス関連ポリペプチドは、表１に示されるものである。
【００１４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、二次感染は、細菌感染、ウイルス感染、または真菌感染である。
【００１５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、二次感染は、血液感染である。
【００１６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、疾患は、敗血症である。
【００１７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、投与は、共投与を含む。
【００１８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、病原体は、ウイルス、細菌、および真菌からなる群から選択される。
【００１９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、少なくとも１つのポリペプチドは、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）である。
【００２０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、マトリックスメタロプロテイナーゼは、膜型１マトリックスメタロプロテイナーゼ−１（ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｔｙｐｅ  １−ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  １）（ＭＴ１−ＭＭＰ１）、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−８、およびＭＭＰ−３からなる群から選択される。
【００２１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、少なくとも１つのポリペプチドは、膜型１マトリックスメタロプロテイナーゼ−１（ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｔｙｐｅ  １−ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  １）（ＭＴ１−ＭＭＰ１）である。
【００２２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、感染は、呼吸器感染である。
【００２３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、病原体は、ウイルスである。
【００２４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ウイルスは、呼吸器ウイルスである。
【００２５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、呼吸器ウイルスは、インフルエンザである。
【００２６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、抗病原体剤は、ノイラミニダーゼ阻害剤（ＮＡＩ）である。
【００２７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ノイラミニダーゼ阻害剤は、ラニナミビル、オセルタミビル、ペラミビル、およびザナミビルからなる群から選択される。
【００２８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ノイラミニダーゼ阻害剤は、オセルタミビルである。
【００２９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、二次感染は、細菌感染である。
【００３０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、細菌感染は、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）である。
【００３１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、少なくとも１つのポリペプチドをダウンレギュレートする薬剤は、抗体である。
【００３２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、少なくとも１つのポリペプチドをダウンレギュレートする薬剤は、ポリヌクレオチド剤である。
【００３３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、細胞外マトリックス関連ポリペプチドは、表１に示されるものである。
【００３４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、少なくとも１つのポリペプチドは、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）である。
【００３５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、マトリックスメタロプロテイナーゼは、膜型１マトリックスメタロプロテイナーゼ−１（ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｔｙｐｅ  １−ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  １）（ＭＴ１−ＭＭＰ１）、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−８、およびＭＭＰ−３からなる群から選択される。
【００３６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、少なくとも１つのポリペプチドは、膜型１マトリックスメタロプロテイナーゼ−１（ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｔｙｐｅ  １−ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  １）（ＭＴ１−ＭＭＰ１）である。
【００３７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、抗病原体剤は抗ウイルス剤である。
【００３８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、抗ウイルス剤は、ノイラミニダーゼ阻害剤（ＮＡＩ）である。
【００３９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ノイラミニダーゼ阻害剤は、ラニナミビル、オセルタミビル、ペラミビル、およびザナミビルからなる群から選択される。
【００４０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ノイラミニダーゼ阻害剤は、オセルタミビルである。
【００４１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、細胞外マトリックス関連ポリペプチドは、表１に示されるものである。
【００４２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、細胞外マトリックス関連ポリペプチドは、ＭＴ１−ＭＭＰ１である。
【００４３】
別段の定めがないかぎり、本明細書で用いられる全ての専門用語および／または科学用語は、本発明が属する分野の当業者が一般に理解している通りの意味を有する。本明細書に記載されているものと類似または同等の方法および材料を、本発明の実施形態を実施または試験するために使用することができるが、例示的な方法および／または材料を以下に記載する。不一致がある場合、定義を含めて本明細書が優先する。さらに、材料、方法、および実施例は例示にすぎず、必ずしも限定を意図するものではない。
本発明のいくつかの実施形態を、単なる例示として、添付の図面を参照して本明細書で説明する。図面への以下の詳細な具体的言及に関して、示された事項は、本発明の実施形態に関する例示および実例的な考察のためであることを強調する。この関連で、図面を合わせた本説明により、本発明の実施形態をどのようにして実施し得るかが当業者に明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１Ａ】インフルエンザウイルス感染している間の細胞外マトリックス遺伝子回路の網羅的解析である。図１Ａは、インフルエンザ感染後１０の時点における、３５３０個の肺特異的発現遺伝子のＫ平均クラスタリング（ｋ＝２０）（実験手順）である（各時点につきｎ＝４）。ダイナミックレンジは、倍率変化−２〜２の間に調整し、色分けする。１３．５％（４７９）の発現が上昇した遺伝子は、ＥＣＭリモデリングに関連するものとしてアノテーションした。機能アノテーションは、（ｃｂｌ−ｇｏｒｉｌｌａｄｏｔｃｓｄｏｔｔｅｃｈｎｉｏｎｄｏｔａｃｄｏｔｉｌ）を用いて行われ、クラスターは、それぞれに応じてアノテーションし、色分けする。
【図１Ｂ】インフルエンザウイルス感染している間の細胞外マトリックス遺伝子回路の網羅的解析である。図１Ｂは、感染した肺で富化（ｐ＜１０−４）しているジーンオントロジー（ＧＯ）のサブセットを示す。
【図１Ｃ】インフルエンザウイルス感染している間の細胞外マトリックス遺伝子回路の網羅的解析である。図１Ｃは、インフルエンザ感染に続く、ＥＣＭリモデリング遺伝子の遺伝子発現動態に関するサブマトリックスである。
【図１Ｄ】インフルエンザウイルス感染している間の細胞外マトリックス遺伝子回路の網羅的解析である。図１Ｄは、ｑＰＣＲ測定法を用いた、インフルエンザ感染に続くＭＴ１−ＭＭＰ発現の、時間Ｔ０に対する倍率変化を示す棒グラフである。各試料は、４匹のマウス（２つの生物学的繰り返し）から３重で測定した。エラーバーは、平均値に関する標準偏差（ＳＤ）を表す。標的遺伝子は、内因性の標準遺伝子ＧＡＰＤＨで標準化し、ΔΔＣＴ標準化法を用いて、非感染対照試料と比較した。
【図２Ａ】ＭＴ１−ＭＭＰ発現は、インフルエンザ感染に続いて、主として骨髄細胞で誘導される。図２Ａは、ウイルス感染から７４時間後のインフルエンザ感染マウスの肺を、非感染対照（ｎ＝２５）と比較したＦＡＣＳ分析である（実験手順、ｎ＝２５）。Ｇａｔｅｄは、抗ＭＴ１−ＭＭＰ抗体ならびにＣＤ４５、ＣＤ１１ｂ、およびＥｐｃａｍ抗体を用いて染色したＭＴ１−ＭＭＰ発現細胞、（実験手順）である。
【図２Ｂ】ＭＴ１−ＭＭＰ発現は、インフルエンザ感染に続いて、主として骨髄細胞で誘導される。ＭＴ１−ＭＭＰ、Ｅｐｃａｍ、およびＣＤ１１ｂを示すヒストグラムプロットは、インフルエンザウイルス感染前（灰色）、および感染から７４時間後（赤）の蛍光強度を意味する。
【図２Ｃ】ＭＴ１−ＭＭＰ発現は、インフルエンザ感染に続いて、主として骨髄細胞で誘導される。図２Ｃは、ソートした細胞集団におけるＭＴ１−ＭＭＰ発現のｑＰＣＲ測定を示す棒グラフである。エラーバーは、平均値に関するＳＤを表す。＊＊は、ｔ−ｔｅｓｔでｐ＜０．００１であることを示す。
【図３Ａ】インフルエンザ感染は、ＥＣＭ構造の変化を伴う。図３Ａは、無細胞ＥＣＭスキャフォールドの網羅的質量分析である（実験手順参照）。定量的なタンパク質存在量を、−１〜１の範囲の白から黒へのグレースケールの塗り分けを用いて、（対照の非感染組織を基準とした）相対的測定によって示す。感染後にＥＣＭから失われるタンパク質に、アノテートし白に色づけした。色分け図は、非感染対照と比較した場合の、脱細胞化された感染肺組織中のタンパク質定量における有意な変化（ｐ＜０．０１、ｔ−ｔｅｓｔ）を示している。試料は、インフルエンザ感染における致死量の感染後、２時点（感染後７４時間、１２２時間）で、Ｍａｓｃｏｔ  ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて２重で分析した。
【図３Ｂ】インフルエンザ感染は、ＥＣＭ構造の変化を伴う。図３Ｂは、対照肺と比較した、感染肺の典型的な走査型電子顕微鏡画像である。矢印および矢じりは、コラーゲン原線維の方向変化を、部分図において定量した場合のＤバンドパターンと共に示す。
【図３Ｃ】インフルエンザ感染は、ＥＣＭ構造の変化を伴う。肺胞の境界における線維の方向性を、Ｆｉｊｉ  ｐａｃｋａｇｅを用いて分析する（実験手順）。
【図３Ｄ】インフルエンザ感染は、ＥＣＭ構造の変化を伴う。図３Ｄは、動物（ｎ＝２０）から採取した多数の組織切片、および同じ暴露条件で画像化したスライドからスクリーニングした、感染中のＥＣＭ成分の典型的な免疫染色画像である。
【図３Ｅ】インフルエンザ感染は、ＥＣＭ構造の変化を伴う。図３Ｅは、ｉｍａｇｅＪ  ｐａｃｋａｇｅを用いた免疫染色の定量であり（実験手順）、エラーバーは、平均値に関するＳＤを表す。
【図３Ｆ】インフルエンザ感染は、ＥＣＭ構造の変化を伴う。図３Ｆは、動物（ｎ＝２０）から採取した多数の組織切片、および同じ暴露条件で画像化したスライドからスクリーニングした、感染中のＥＣＭ成分の典型的な免疫染色画像である。
【図３Ｇ】インフルエンザ感染は、ＥＣＭ構造の変化を伴う。図３Ｇは、ｉｍａｇｅＪ  ｐａｃｋａｇｅを用いた免疫染色の定量であり（実験手順）、エラーバーは、平均値に関するＳＤを表す。
【図３Ｈ】インフルエンザ感染は、ＥＣＭ構造の変化を伴う。図３Ｈは、動物（ｎ＝２０）から採取した多数の組織切片、および同じ暴露条件で画像化したスライドからスクリーニングした、感染中のＥＣＭ成分の典型的な免疫染色画像である。
【図３Ｉ】インフルエンザ感染は、ＥＣＭ構造の変化を伴う。図３Ｉは、ｉｍａｇｅＪ  ｐａｃｋａｇｅを用いた免疫染色の定量であり（実験手順）、エラーバーは、平均値に関するＳＤを表す。
【図４Ａ】ＭＴ１−ＭＭＰ活性をブロックすると、肺ＥＣＭ成分が保護される。図４Ａは、種々の処置を施したインフルエンザ感染に関する実験の設定を示す模式図である。マウスを、致死量に達しないＰＲ８インフルエンザ株に感染させた（実験手順）。
【図４Ｂ】ＭＴ１−ＭＭＰ活性をブロックすると、肺ＥＣＭ成分が保護される。図４Ｂは、全肺から採取し、厚さ３００μｍに薄切し、ＡｉｒＳＥＭ用に染色した、固定した組織切片を用いて、感染後７４時間の肺胞区画および気管支区画のＡｉｒＳＥＭ画像である（実験手順）。肺胞壁の厚さおよび気管支細胞数を、多数の切片の異なる部分で測定した。スケールは、主画像が５０μｍであり、挿入図が２０μｍである。棒グラフは、それぞれ肺胞壁の厚さと気管支細胞数を数値化したものである。エラーバーは、平均値に関するＳＤを表し、ＦＯＶは視野（ｆｉｅｌｄ  ｏｆ  ｖｉｅｗ）である。
【図４Ｃ】ＭＴ１−ＭＭＰ活性をブロックすると、肺ＥＣＭ成分が保護される。図４Ｃは、全肺から採取し、厚さ３００μｍに薄切し、ＡｉｒＳＥＭ用に染色した、固定した組織切片を用いて、感染後７４時間の肺胞区画および気管支区画のＡｉｒＳＥＭ画像である（実験手順）。肺胞壁の厚さおよび気管支細胞数を、多数の切片の異なる部分で測定した。スケールは、主画像が５０μｍであり、挿入図が２０μｍである。棒グラフは、それぞれ肺胞壁の厚さと気管支細胞数を数値化したものである。エラーバーは、平均値に関するＳＤを表し、ＦＯＶは視野（ｆｉｅｌｄ  ｏｆ  ｖｉｅｗ）である。
【図４Ｄ】ｃｆ  ＭＴ１−ＭＭＰ活性をブロックすると、肺ＥＣＭ成分が保護される。図４Ｄは、全肺から採取し、厚さ３００μｍに薄切し、ＡｉｒＳＥＭ用に染色した、固定した組織切片を用いて、感染後７４時間の肺胞区画および気管支区画のＡｉｒＳＥＭ画像である（実験手順）。肺胞壁の厚さおよび気管支細胞数を、多数の切片の異なる部分で測定した。スケールは、主画像が５０μｍであり、挿入図が２０μｍである。棒グラフは、それぞれ肺胞壁の厚さと気管支細胞数を数値化したものである。エラーバーは、平均値に関するＳＤを表し、ＦＯＶは視野（ｆｉｅｌｄ  ｏｆ  ｖｉｅｗ）である。
【図４Ｅ】ＭＴ１−ＭＭＰ活性をブロックすると、肺ＥＣＭ成分が保護される。図４Ｅは、全肺から採取し、厚さ３００μｍに薄切し、ＡｉｒＳＥＭ用に染色した、固定した組織切片を用いて、感染後７４時間の肺胞区画および気管支区画のＡｉｒＳＥＭ画像である（実験手順）。肺胞壁の厚さおよび気管支細胞数を、多数の切片の異なる部分で測定した。スケールは、主画像が５０μｍであり、挿入図が２０μｍである。棒グラフは、それぞれ肺胞壁の厚さと気管支細胞数を数値化したものである。エラーバーは、平均値に関するＳＤを表し、ＦＯＶは視野（ｆｉｅｌｄ  ｏｆ  ｖｉｅｗ）である。
【図４Ｆ】ＭＴ１−ＭＭＰ活性をブロックすると、肺ＥＣＭ成分が保護される。図４Ｆは、厚さ５０μｍの非染色肺組織切片由来の、典型的な第二次高調波発生（ＳＨＧ）画像である。Ｉｍａｒｉｓソフトウェアパッケージバージョン７．７．１を用いたｚ−ｓｔａｃｋ再構成後、検出されたコラーゲンを表すＳＨＧシグナルは、赤で示されている。
【図４Ｇ】ＭＴ１−ＭＭＰ活性をブロックすると、肺ＥＣＭ成分が保護される。図４Ｇは、棒グラフは、Ｉｍａｒｉｓパッケージソフトウェアを用いて分析および定量したコラーゲンの体積を示し、有意性をｔ−ｔｅｓｔで検定した。エラーバーは、平均値に関するＳＤを表す。
【図４Ｈ】ＭＴ１−ＭＭＰ活性をブロックすると、肺ＥＣＭ成分が保護される。図４Ｈは、肺のラミニン免疫染色である。
【図４Ｉ】ＭＴ１−ＭＭＰ活性をブロックすると、肺ＥＣＭ成分が保護される。図４Ｉは、棒グラフは、ＩｍａｇｅＪパッケージソフトウェアを用いて分析したラミニン強度を示す。
【図４Ｊ】ＭＴ１−ＭＭＰ活性をブロックすると、肺ＥＣＭ成分が保護される。図４Ｊは、高感受性の肺切片におけるコラーゲン分解活性を検出するための蛍光発生基質を用いた、肺組織におけるＩ型コラーゲンのｉｎ  ｓｉｔｕザイモグラフィである。緑色のシグナルおよび矢印は、気管支上皮内層細胞または浸潤性免疫細胞中の活性型コラゲナーゼの局在を示す。スケールは５０μｍである。
【図４Ｋ】ＭＴ１−ＭＭＰ活性をブロックすると、肺ＥＣＭ成分が保護される。エラーバーは、平均値に関するＳＤを表し、ＦＯＶは視野（ｆｉｅｌｄ  ｏｆ  ｖｉｅｗ）である。
【図５Ａ】抗ウイルス処置とＥＣＭ保護との併用により、生存が維持され、全身的な細菌性敗血症が予防される。インフルエンザと肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の重複感染に関する、予防モードおよび治療モードにおける実験の設定を示す模式図である。マウスを、致死量に達しないインフルエンザに感染させ、次いで肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に感染させた（実験手順）。処置群は、タミフル、抗ＭＴ１−ＭＭＰ  Ｆａｂ、または両者の組合せを含んでいた。投与は、予防モード（感染の１日前（Ａ〜Ｃ））、または治療モード（感染の１日後（Ｄ〜Ｅ）を用いて行った。ビヒクル処置マウスを対照とした（各群あたり７〜１０匹のマウスによる３回の独立した実験からのデータを合わせた）。
【図５Ｂ】抗ウイルス処置とＥＣＭ保護との併用により、生存が維持され、全身的な細菌性敗血症が予防される。投与は、予防モード（感染の１日前（Ａ〜Ｃ））、または治療モード（感染の１日後（Ｄ〜Ｅ）を用いて行った。図５Ｂは、感染の１日前（−１）または１日後（＋１）に異なる処置を受けた重複感染マウスの生存曲線（カプラン−マイヤー）である。データは、各群あたり５匹のマウスによる３回の独立した実験から収集した。Ｌｏｇ−ｒａｎｋ（Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ）ｔｅｓｔを用い、＊は、Ｐ＜０．０１であることを示し、＊＊は、ｐ＜０．００１であることを示す。
【図５Ｃ】抗ウイルス処置とＥＣＭ保護との併用により、生存が維持され、全身的な細菌性敗血症が予防される。投与は、予防モード（感染の１日前（Ａ〜Ｃ））、または治療モード（感染の１日後（Ｄ〜Ｅ）を用いて行った。図５Ｃは、ウイルス感染後の種々の時点における、重複感染マウスの相対的な体重減少を示す。エラーバーは、平均からのＳＤを表す。
【図５Ｄ】抗ウイルス処置とＥＣＭ保護との併用により、生存が維持され、全身的な細菌性敗血症が予防される。インフルエンザと肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の重複感染に関する、予防モードおよび治療モードにおける実験の設定を示す模式図である。投与は、予防モード（感染の１日前（Ａ〜Ｃ））、または治療モード（感染の１日後（Ｄ〜Ｅ）を用いて行った。マウスを、致死量に達しないインフルエンザに感染させ、次いで肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に感染させた（実験手順）。処置群は、タミフル、抗ＭＴ１−ＭＭＰ  Ｆａｂ、または両者の組合せを含んでいた。ビヒクル処置マウスを対照とした（各群あたり７〜１０匹のマウスによる３回の独立した実験からのデータを合わせた）。
【図５Ｅ】抗ウイルス処置とＥＣＭ保護との併用により、生存が維持され、全身的な細菌性敗血症が予防される。投与は、予防モード（感染の１日前（Ａ〜Ｃ））、または治療モード（感染の１日後（Ｄ〜Ｅ）を用いて行った。図５Ｅは、感染の１日前（−１）または１日後（＋１）に異なる処置を受けた重複感染マウスの生存曲線（カプラン−マイヤー）である。データは、各群あたり５匹のマウスによる３回の独立した実験から収集した。Ｌｏｇ−ｒａｎｋ（Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ）ｔｅｓｔを用い、＊は、Ｐ＜０．０１であることを示し、＊＊は、ｐ＜０．００１であることを示す。
【図５Ｆ】抗ウイルス処置とＥＣＭ保護との併用により、生存が維持され、全身的な細菌性敗血症が予防される。投与は、予防モード（感染の１日前（Ａ〜Ｃ））、または治療モード（感染の１日後（Ｄ〜Ｅ）を用いて行った。図５Ｆは、ウイルス感染後の種々の時点における、重複感染マウスの相対的な体重減少を示す。エラーバーは、平均からのＳＤを表す。
【図５Ｇ】抗ウイルス処置とＥＣＭ保護との併用により、生存が維持され、全身的な細菌性敗血症が予防される。投与は、予防モード（感染の１日前（Ａ〜Ｃ））、または治療モード（感染の１日後（Ｄ〜Ｅ）を用いて行った。図５Ｇは、ウイルス感染６日後の感染マウスの脾臓ライセート由来のＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ細菌量である（実験手順）。
【図５Ｈ】抗ウイルス処置とＥＣＭ保護との併用により、生存が維持され、全身的な細菌性敗血症が予防される。投与は、予防モード（感染の１日前（Ａ〜Ｃ））、または治療モード（感染の１日後（Ｄ〜Ｅ）を用いて行った。図５Ｈは、ウイルス感染６日後の感染マウスの脾臓ライセート由来のＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ細菌量である（実験手順）。
【図６Ａ】インフルエンザ感染過程の間の、ＥＣＭモジュレーターの遺伝子発現レベルおよびタンパク質発現レベルである。図６Ａは、インフルエンザ感染の致死量の感染を受けた全肺組織における、感染後種々の時点の間の、ＥＣＭ代表遺伝子をｑＰＣＲ測定した結果（時間Ｔ０における発現レベルに対する倍率変化）を示す棒グラフである（実験手順）。各試料は、４匹のマウス（２つの生物学的繰り返し）から３重で測定した。エラーバーは、標準偏差（ＳＤ）を表す。
【図６Ｂ】インフルエンザ感染過程の間の、ＥＣＭモジュレーターの遺伝子発現レベルおよびタンパク質発現レベルである。図６Ｂは、インフルエンザ感染の種々の時点の間の、種々の代表プロテアーゼの、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを用いたウェスタンブロット分析である（ｎ＝１０）。
【図６Ｃ】インフルエンザ感染過程の間の、ＥＣＭモジュレーターの遺伝子発現レベルおよびタンパク質発現レベルである。図６Ｃは、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いた、ウェスタンブロット結果の定量である。対象タンパク質の平均相対密度は、内部標準ＧＡＰＤＨに対する相対値である。
【図６Ｄ】インフルエンザ感染過程の間の、ＥＣＭモジュレーターの遺伝子発現レベルおよびタンパク質発現レベルである。図６Ｄは、インフルエンザ感染過程の間の、体重の平均値（青、左のＹ軸）およびウイルス力価（赤、右のＹ軸）である。エラーバーは、３回の独立した実験から、各時点あたり２〜４匹の動物について計算した、体重の標準偏差を表す。マトリックスタンパク質２（Ｍ２）のゲノムコピー数のためにｑＰＣＲを用い、次いで検量線を用いてウイルス粒子数に変換した、マウス肺における全肺ホモジネートのウイルス負荷である。
【図７Ａ】免疫細胞は、感染している間、活性型ＭＴ１−ＭＭＰを発現している。図７Ａは、健常対照群と比較した、感染肺（感染後７４時間）におけるＭＴ１−ＭＭＰとＦ４／８０マーカーとの共局在の免疫染色および定量の棒グラフである。矢印は、ＭＴ１−ＭＭＰ染色細胞を示す。多数の切片の典型的な画像である。
【図７Ｂ】免疫細胞は、感染している間、活性型ＭＴ１−ＭＭＰを発現している。図７Ｂは、図７Ａの写真を定量化した棒グラフである。エラーバーは、ｔ−ｔｅｓｔにおけるＳＤを表し、＊は、Ｐ≦０．０１を表す。
【図７Ｃ】免疫細胞は、感染している間、活性型ＭＴ１−ＭＭＰを発現している。図７Ｃは、Ｉ型コラーゲンの、ＣＤ４５染色と組み合わせた、ｉｎ  ｓｉｔｕザイモグラフィである。矢印は、対照切片および感染切片（感染後７４時間）において、いずれかのマーカーが発現している細胞を示す。スケールバーは、５０μｍである。
【図７Ｄ】免疫細胞は、感染している間、活性型ＭＴ１−ＭＭＰを発現している。図７Ｄは、写真Ｃを定量化した棒グラフである。エラーバーは、ｔ−ｔｅｓｔにおけるＳＤを表し、＊はＰ≦０．０１を表す。
【図８】ＭＴ１−ＭＭＰ発現細胞の網羅的発現解析である。（Ａ）感染から７４時間後にソートした細胞の、ＣＤ４５陽性群とＣＤ４５陰性群における２１６９個の特異的発現遺伝子のＫ平均クラスタリング（ｋ＝６）である（感染群および非感染対照群の各群は、ｎ≧５のマウスを含む）。マウスは、致死量である４×１０３ＰＦＵのＰＲ８インフルエンザの感染を受けた（実験手順）。
【図９Ａ】全肺または脱細胞化された組織のＡｉｒＳＥＭ画像を用いて示した、破壊性表現型の肺である。図９Ａは、全肺組織の画像である。矢印は、細胞（非感染対照）または空になった細胞（感染）における、肺胞開口部の境界を示す。
【図９Ｂ】全肺または脱細胞化された組織のＡｉｒＳＥＭ画像を用いて示した、破壊性表現型の肺である。図９Ｂは、健常対照群と比較した、感染肺のＥＣＭスキャフォールド画像（脱細胞化後）である。矢印は、厚く組織化されたコラーゲン束（非感染対照）または歪んだフィブリル（感染）を含む肺胞管の境界を示す。
【図９Ｃ】全肺または脱細胞化された組織のＡｉｒＳＥＭ画像を用いて示した、破壊性表現型の肺である。図９Ｃは、多数の肺切片のスキャン（ｎ＝５）による、対照肺および感染肺における肺細胞の個数である。
【図９Ｄ】全肺または脱細胞化された組織のＡｉｒＳＥＭ画像を用いて示した、破壊性表現型の肺である。図９Ｄは、Ｆｉｊｉ  ｐａｃｋａｇｅを用いて行った、指向性に関する画像解析である。グラフは、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６を用いてプロットした。線維の空間的な配向性の相対頻度を、Ｆｉｊｉ  ｐａｃｋａｇｅバージョン６．１．１の「指向性」プラグイン分析ツールを用いて測定した。
【図１０Ａ】単一のウイルス感染のキャリブレーションである。図１０Ａは、種々の用量で単一のウイルス感染を受けたマウスの体重減少を示す。データセットは、各時点において、５匹のマウスから分析した。エラーバーはＳＤを表し、ｔ−ｔｅｓｔを用いて分析した。
【図１０Ｂ】単一のウイルス感染のキャリブレーションである。図１０Ｂは、種々の用量で単一のウイルス感染を受けたマウスの生存を示す。エラーバーはＳＤを表し、ｔ−ｔｅｓｔを用いて分析し、＊＊はＰ≦０．００１を表す。
【図１０Ｃ】単一のウイルス感染のキャリブレーションである。図１０Ｃは、感染４日後の肺における、標準ＰＦＵアッセイを用いた、全肺ホモジネートのウイルス負荷を示す。試料は、各時点において、２つの生物学的繰り返しの３匹の動物を用いて測定した。Ｘ軸は、感染に用いたウイルス量を表す。
【図１１Ａ】ＭＴ１−ＭＭＰの阻害によって、免疫細胞の動員またはサイトカインの誘導は妨げられない。図１１Ａは、感染から７４時間後、かつ抗ＭＴ１−ＭＭＰ阻害剤抗体または非関連のＧＳＴ対照抗体によって処置した、インフルエンザ感染させた全肺組織のＦＡＣＳ分析である。マウスは、致死量に達しないインフルエンザに感染させた（実験手順）。データは、ＭＴ１−ＭＭＰ抗体ならびにＣＤ４５、Ｌｙ６Ｇ、Ｌｙ６Ｃ、ＣＤ１１ｂ、ＮＫ４６、ＴＣＲβで染色したＭＴ１−ＭＭＰ発現細胞でゲーティングした（実験手順）。実験は、１群あたり３匹のマウスを用いて２回行った。
【図１１Ｂ】ＭＴ１−ＭＭＰの阻害によって、免疫細胞の動員またはサイトカインの誘導は妨げられない。図１１Ｂは、感染から７４時間後に採取し、Ｆ４／８０マーカーを用いてマクロファージを染色した、肺組織の典型的な切片である。スケールバーは、５０μｍである。ＦＯＶは、倍率２０倍における全視野を示す。
【図１１Ｃ】ＭＴ１−ＭＭＰの阻害によって、免疫細胞の動員またはサイトカインの誘導は妨げられない。図１１Ｃは、１群あたり少なくとも３匹のマウスからの多数の組織切片を用いた、図１１Ｂに関する定量である。エラーバーは、ｔ−ｔｅｓｔにおけるＳＤを表し、＊＊＊はＰ≦０．０００１を表す。
【図１１Ｄ】ＭＴ１−ＭＭＰの阻害によって、免疫細胞の動員またはサイトカインの誘導は妨げられない。図１１Ｄは、単一のウイルス感染を受けたマウスから、感染から２４、４８、７２、１２２時間後に採取した気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）中の、浸潤性免疫細胞である。マウスは、致死量に達しないインフルエンザに感染させた。試料は、２つの生物学的繰り返しで測定した。試験は、ｔ−ｔｅｓｔを用いて、非感染マウスに対して有意であった（＊はＰ≦０．０１である）。
【図１１Ｅ】ＭＴ１−ＭＭＰの阻害によって、免疫細胞の動員またはサイトカインの誘導は妨げられない。図１１Ｅは、単一のウイルス感染を受けさせ、感染から２４、４８、７２、９６、１２２時間後に採取したマウスのＢＡＬＦ中のＴＮＦ−αおよびＩＬ−１βレベルを示す。試料は、２つの生物学的繰り返しで測定した。エラーバーはＳＤを表し、ｔ−ｔｅｓｔを用いて分析し、＊はＰ≦０．０１である。
【図１１Ｆ】ＭＴ１−ＭＭＰの阻害によって、免疫細胞の動員またはサイトカインの誘導は妨げられない。図１１Ｆは、単一のウイルス感染を受けさせ、感染から２４、４８、７２、９６、１２２時間後に採取したマウスのＢＡＬＦ中のＴＮＦ−αおよびＩＬ−１βレベルを示す。試料は、２つの生物学的繰り返しで測定した。エラーバーはＳＤを表し、ｔ−ｔｅｓｔを用いて分析し、＊はＰ≦０．０１である。
【図１２Ａ】感染から７４時間後に抗ＭＴ１−ＭＭＰ抗体処置した後の、肺におけるウイルス負荷量である。図１２Ａは、タミフル、対照抗体、および抗ＭＴ１−ＭＭＰ抗体を用いてインフルエンザウイルスを染色した、典型的な肺組織切片である。マウスは、致死量に達しないインフルエンザに感染させた（実験手順）。
【図１２Ｂ】感染から７４時間後に抗ＭＴ１−ＭＭＰ抗体処置した後の、肺におけるウイルス負荷量である。図１２Ｂは、感染から２４および４８時間後におけるインフルエンザウイルスの定量の棒グラフである。エラーバーは、ｔ−ｔｅｓｔにおけるＳＤを表し、＊＊は、Ｐ≦０．００１を表す。ＦＯＶは、倍率２０倍における全視野を示す。感染細胞数は、ＩｍａｇｅＪを用いて、ＤＡＰＩで標準化した。
【図１２Ｃ】感染から７４時間後に抗ＭＴ１−ＭＭＰ抗体処置した後の、肺におけるウイルス負荷量である。図１２Ｃは、感染から２４および４８時間後におけるインフルエンザウイルスの定量の棒グラフである。エラーバーは、ｔ−ｔｅｓｔにおけるＳＤを表し、＊＊は、Ｐ≦０．００１を表す。ＦＯＶは、倍率２０倍における全視野を示す。感染細胞数は、ＩｍａｇｅＪを用いて、ＤＡＰＩで標準化した。
【図１２Ｄ】感染から７４時間後に抗ＭＴ１−ＭＭＰ抗体処置した後の、肺におけるウイルス負荷量である。図１２Ｄは、ウイルス感染４日後および７日後の全肺組織のＰＦＵ値である（実験手順）。試料は、２つの生物学的繰り返しで、３重で測定した。エラーバーはＳＤを表す。ＬＥＭ−１、Ｔａｍｉ−１、Ｔａｍｉ＋ＬＥＭ−１は、種々の処置、すなわち、単剤または合剤、および感染１日前（感染日−１）の投与を示す。ＬＥＭ＋１、Ｔａｍｉ＋１、Ｔａｍｉ＋ＬＥＭ＋１は、種々の処置、すなわち、単剤または合剤、および感染１日後（感染日＋１）の投与を示す。ＬＥＭは、抗ＭＴ１−ＭＭＰ抗体（ＬＥＭ２／１５）を指し、ＧＳＴは、非関連抗体を指す。
【図１２Ｅ】感染から７４時間後に抗ＭＴ１−ＭＭＰ抗体処置した後の、肺におけるウイルス負荷量である。図１２Ｅは、感染から２４、４８、および９６時間後の肺におけるウイルス負荷を示す。全肺ホモジネートをＰＦＵアッセイに用い、各時点において２匹の動物を試験し、２つの生物学的繰り返しで行った。エラーバーはＳＤを表し、２要因ＡＮＯＶＡを用い、＊は、Ｐ≦０．０１である。
【図１２Ｆ】感染から７４時間後に抗ＭＴ１−ＭＭＰ抗体処置した後の、肺におけるウイルス負荷量である。図１２Ｆは、細菌感染２日後の重複感染マウスの肺におけるＣＦＵ値である。エラーバーは、平均からのＳＤを表す。各群あたり５匹のマウスによる２回の独立した実験からのデータを合わせた。
【００４５】
【図１３Ａ】ＥＣＭの破壊は、ウイルス力価が低いことによって乱されない。図１３Ａは、タミフル処置マウス、ビヒクル処置マウス、または対照マウスからの、感染から７４時間後の肺のＡｉｒＳＥＭ画像である。
【図１３Ｂ】ＥＣＭの破壊は、ウイルス力価が低いことによって乱されない。図１３Ｂは、ＩｍａｇｅＪを用いて測定した細胞壁厚であり（実験手順）、それぞれのマークは、個々の動物に関する、切片に基づく領域の測定値の平均を表す。
【図１３Ｃ】ＥＣＭの破壊は、ウイルス力価が低いことによって乱されない。図１３Ｃは、ｑＰＣＲを用いた、ビヒクル処置およびタミフル処置マウス肺におけるウイルスの個数を表す棒グラフである。各カラムは、３匹のマウスの平均を表す。バーは、平均および平均からのＳＤを示す。Ｘ軸は、ウイルス感染後の時間を示す。
【図１３Ｄ】ＥＣＭの破壊は、ウイルス力価が低いことによって乱されない。図１３Ｄは、９０ＰＦＵのＰＲ８インフルエンザ株に感染し、異なる処置を受けているマウス肺におけるＭＴ１−ＭＭＰ発現レベルである。エラーバーはＳＤを表し、ｔ−ｔｅｓｔを用いて分析し、＊＊はＰ≦０．００１である。
【図１４Ａ】抗ウイルスと組織保護療法との併用によって、肺の構造的特徴が維持される。図１４Ａは、感染を受け、種々の様式の処置を受けている間の、肺気管支および肺胞における変化を表す肺切片のＡｉｒＳＥＭ画像である。スケールバーは、２０μｍである。
【図１４Ｂ】抗ウイルスと組織保護療法との併用によって、肺の構造的特徴が維持される。図１４Ｂは、多数の切片から得た種々の処置における細胞数を定量化した棒グラフである。
【図１５】インフルエンザ感染の際のヒト呼吸器上皮細胞におけるＭＴ１−ＭＭＰ発現である。ＭＴ１−ＭＭＰのＬｏｇ２相対発現レベルは、Ｈ１Ｎ１株Ａ／ＰＲ／８／３４（ＰＲ８）に感染したヒト気管支上皮細胞の感染経過（感染後の時間）と関連性がある。エラーバーは、ＳＤを表す。データは、（Ｓｈａｐｉｒａ  ＳＤ，２００９）により分析した。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
本発明は、いくつかの実施形態において、細胞外マトリックスリモデリングをダウンレギュレートする薬剤を用いた、病原体に感染した対象における、二次感染の予防方法に関する。
【００４７】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明するのに先立ち、本発明は、その適用において、以下の説明における詳細または実施例による例示に、必ずしも限定されるものではないことを理解すべきである。本発明は、その他の実施形態が可能であり、種々の様式で実施または実行することが可能である。
【００４８】
感染症の処置は、従来、抗微生物薬の投与、またはワクチン接種を用いた宿主免疫応答の刺激、のいずれかによる病原体の除去に焦点が当てられてきた。本発明者らは、インフルエンザマウスモデルの網羅的ゲノミクスおよびプロテオミクス分析を実施し、感染過程の間の調節不全なＥＣＭリモデリングイベントに重要な細胞外マトリックス（ＥＣＭ）関連遺伝子およびタンパク質が、思いもよらず過多状態であることを明らかにした（図１Ａ〜Ｄ、および図６Ａ〜Ｄ）。ＭＴ１−ＭＭＰが、感染マウス肺の肺胞および気管支のＥＣＭスキャフォールドの破壊を導く主要なコラゲナーゼであった。インタクトな肺の電子顕微鏡観察、網羅的質量分析、２光子顕微鏡法と免疫染色、および組織ザイモグラフィによって、基底膜の構成要素の多面的な破壊が明らかとなった（図３Ａ〜Ｉ、および図９Ａ〜Ｄ）。この前例のない肺の損傷は、血液空気関門の喪失に寄与し、肺から内臓への漏出による全身への二次的細菌感染の拡散を引き起こし、敗血症および死をもたらす。これらの破壊性表現型と、結果として生じる致死的な結果は、ＭＴ１−ＭＭＰの活性をブロックすることによって反転し（図４Ａ〜Ｋ）、よって組織の維持による治療的介入の新たなモデルを提供する。図５Ａ〜Ｈに示すように、抗ウイルス処置とＥＣＭ保護との併用により、生存が維持され、全身的な細菌性敗血症が予防される。
【００４９】
本発明者らは、不適当な宿主応答と付随的な組織損傷を緩和しながら、組織形態と恒常性を維持するように設計された、感染のための、この新たな処置の機会を提案する。
【００５０】
よって、本発明の第１の態様によれば、病原体に感染した対象の処置方法であって、病原体に対する治療有効量の抗病原体剤と、少なくとも１つの細胞外マトリックス関連ポリペプチドをダウンレギュレートする治療有効量の薬剤（下記）とを対象に投与し、それによって、対象を処置することを含む、処置方法が提供される。
【００５１】
本明細書で用いられる場合、用語「方法（ｍｅｔｈｏｄ）」は、所定の仕事をを遂行するためのやり方、手段、技法、および手順を指し、例えば知られているやり方、手段、技法、および手順、または知られているやり方、手段、技法、および手順から、化学、薬理学、生物学、生化学、および医学分野の実務家によって、容易に開発できるやり方、手段、技法、および手順のいずれかが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５２】
本明細書で用いられる場合、用語「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」には、ある状態の進行を阻止する、実質的に阻害する、遅らせる、もしくは反転させること、またはある状態の臨床的もしくは審美的な症状を実質的に改善すること、またはある状態の臨床的もしくは審美的な症状の出現を実質的に予防することが含まれる。
【００５３】
本明細書で用いられる場合、用語「対象」は、哺乳動物の対象、例えばヒト対象を指す。
【００５４】
処置を受ける対象は、感染の原因となる病原体を保持する。
【００５５】
本明細書で用いられる場合、用語「病原体」は、疾患（例えば、呼吸器疾患）の原因となる、ウイルス、バクテリア、プリオン、または真菌などの微生物（ｍｉｃｒｏｂｅ）または微生物（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）を指す。
【００５６】
特定の実施形態によれば、病原体は、ヒト病原体である。
【００５７】
典型的な病原性ウイルスは以下の科、すなわちアデノウイルス科、ピコルナウイルス科、ヘルペスウイルス科、ヘパドナウイルス科、フラビウイルス科、レトロウイルス科、オルトミクソウイルス科、パラミクソウイルス科、パポーバウイルス科、ポリオーマウイルス、ラブドウイルス科、トガウイルス科に属するものであり得る。本発明で意図する特定の病原性ウイルスは、天然痘、インフルエンザ、流行性耳下腺炎、麻疹、水疱、エボラ、または風疹の原因となるウイルスである。
【００５８】
特定の実施形態によれば、ウイルスは、呼吸器感染（例えば、上気道感染および／または下気道感染）を引き起こすウイルスである。
【００５９】
よって、特定の実施形態によれば、病原性ウイルスは、インフルエンザウイルス（例えば、インフルエンザウイルスＡ−（例えば、Ｈ１Ｎ１、Ｈ２Ｎ２、Ｈ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、Ｈ７Ｎ７、Ｈ１Ｎ２、Ｈ９Ｎ２、Ｈ７Ｎ２、Ｈ７Ｎ３、Ｈ１０Ｎ７、およびＨ７Ｎ９）、インフルエンザウイルスＢ、またはインフルエンザウイルスＣ）である。
【００６０】
別の実施形態において、病原性ウイルスは、ヒトパラインフルエンザウイルス１型（ｈＰＩＶ−１）（喉頭炎の原因となる）；ヒトパラインフルエンザウイルス２型（ｈＰＩＶ−２）（喉頭炎およびその他の上下気道疾患の原因となる）、ヒトパラインフルエンザウイルス３型（ｈＰＩＶ−３）（細気管支炎および肺炎に関係する）、およびヒトパラインフルエンザウイルス４型（ｈＰＩＶ−４）を含む、パラインフルエンザウイルス（ｈＰＩＶ）である。
【００６１】
さらに別の実施形態において、病原性ウイルスは、ＲＳウイルス（呼吸器合胞体ウイルス）（ＲＳＶ）である。
【００６２】
典型的な病原性細菌には、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）（結核の原因となる）、レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）およびシュードモナス（肺炎の原因となる）、ならびに赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、カンピロバクター、およびサルモネラ（食物性疾患の原因となる）が含まれる。  本発明で意図する、その他の例示的な病原性細菌は、破傷風、腸チフス、ジフテリア、梅毒、およびハンセン病などの感染症の原因となる細菌である。
【００６３】
一実施形態によれば、病原体は、対象の急性感染の原因となる。
【００６４】
別の実施形態によれば、病原体は、対象の慢性感染の原因となる。
【００６５】
用語「抗病原体剤」は、抗微生物剤を指し、抗病原体剤には抗ウイルス剤、抗菌剤、抗ウイルス剤、抗プリオン剤が含まれるが、これらに限定されない。
１．抗ウイルス剤
【００６６】
本発明の態様による併用療法で用いることができる抗ウイルス剤としては、アマンタジン、リマンタジン、およびプレコナリルなどのＣＲＸ４レセプター阻害剤およびＣＣＲ５レセプター阻害剤が挙げられる。本発明のこの態様の併用療法で用いることができるさらなる抗ウイルス剤としては、ウイルスが細胞に侵入した後のウイルス成分を合成するウイルスのプロセスを妨げる薬剤が挙げられる。典型的な薬剤としては、ＲＮＡまたはＤＮＡの構成要素に類似するが、ＲＮＡまたはＤＮＡに組み込まれるとＲＮＡまたはＤＮＡの合成酵素を不活性化する、ヌクレオチドアナログおよびヌクレオシドアナログが挙げられる。アシクロビルはヌクレオシドアナログであり、ヘルペスウイルス感染に対して有効である。ジドブジン（ＡＺＴ）、３ＴＣ、ＦＴＣ、およびその他のヌクレオシド系逆転写酵素阻害剤（ＮＲＴＩ）、ならびに非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（ＮＮＲＴＩ）もまた使用できる。インテグラーゼ阻害剤もまた使用できる。その他の抗ウイルス剤としては、（ウイルスＲＮＡまたはＤＮＡの選択した部位に向けられた）アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびリボザイムが挙げられる。
【００６７】
ＨＩＶなどのいくつかのウイルスはプロテアーゼ酵素を含み、そのプロテアーゼ酵素がウイルスのタンパク質鎖を切り離し、それによってウイルスは最終的な形態に組み立てられることができる。プロテアーゼ阻害剤は、本明細書に記載された併用療法に使用し得る、別のタイプの抗ウイルス剤である。
【００６８】
ウイルスのライフサイクルにおける最終段階は、宿主細胞からの、完成したウイルスの放出である。ザナミビル（リレンザ）およびオセルタミビル（タミフル）などのいくつかの活性薬剤は、インフルエンザウイルスの表面に存在するノイラミニダーゼと呼ばれる分子をブロックすることによって、ウイルス粒子の放出を妨げることによって、インフルエンザを処置する。
【００６９】
さらなるその他の抗ウイルス剤は、患者の免疫系を刺激することによって機能する。インターフェロンは、ペグ化インターフェロンを含めて、このような種類の典型的な化合物である。例えば、インターフェロンαは、Ｂ型肝炎およびＣ型肝炎の処置に用いられる。種々の抗体は、モノクローナル抗体を含めて、ウイルスを標的とするために用いることができる。
抗菌剤
【００７０】
本発明の態様による併用療法に使用することができる抗菌剤は、殺菌性であってもよく、静菌性であってもよい。
【００７１】
一実施形態において、抗菌剤は、抗生剤である。
【００７２】
本明細書で用いられる場合、用語「抗生物質」は、細菌の増殖を阻害する能力、または細菌を破壊する能力を有する、天然源から単離された化学物質、または天然源から単離された抗生物質に由来する化学物質の集まりを指す。抗生物質の例としては、アミカシン；アモキシシリン；アンピシリン；アジスロマイシン；アズロシリン；アズトレオナム；アズトレオナム；カルベニシリン；セファクロール；セフェピム；セフェタメト；セフィネタゾール（Ｃｅｆｉｎｅｔａｚｏｌｅ）；セフィキシム；セフォニシド；セフォペラゾン；セフォタキシム；セフォテタン；セフォキシチン；セフポドキシム；セフプロジル；セフスロジン；セフタジジム；セフチゾキシム；セフトリアキソン；セフロキシム；セファレキシン；セファロチン；セスロマイシン；クロラムフェニコール；シノキサシン；シプロフロキサシン；クラリスロマイシン；クリンダマイシン；クロキサシリン；コアモキシクラブアネート（Ｃｏ−ａｍｏｘｉｃｌａｖｕａｎａｔｅ）；ダルババンシン；ダプトマイシン；ジクロキサシリン；ドキシサイクリン；エノキサシン；エリスロマイシンエストレート；エチルコハク酸エリスロマイシン；グルコヘプトン酸エリスロマイシン；ラクトビオン酸エリスロマイシン；ステアリン酸エリスロマイシン；エリスロマイシン；フィダキソマイシン；フレロキサシン；ゲンタマイシン；イミペネム；カナマイシン；ロメフロキサシン；ロラカルベフ；メチシリン；メトロニダゾール；メズロシリン；ミノサイクリン；ムピロシン；ナフシリン；ナリジクス酸；ネチルマイシン；ニトロフラントイン；ノルフロキサシン；オフロキサシン；オキサシリン；ペニシリンＧ；ピペラシリン；レタパムリン；リファキシミン（Ｒｉｆａｘａｍｉｎ）、リファンピシン；ロキシスロマイシン；ストレプトマイシン；スルファメトキサゾール；テイコプラニン；テトラサイクリン；チカルシリン；チゲサイクリン；トブラマイシン；トリメトプリム；バンコマイシン；ピペラシリンとタゾバクタムとの組合せ；ならびにそれらの種々の塩、酸、塩基、およびその他の誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。抗細菌抗生物質としては、アミノグリコシド系、カルバセフェム系、カルバペネム系、セファロスポリン系、セファマイシン系、フルオロキノロン系、糖ペプチド、リンコサミド系、マクロライド系、モノバクタム系、ペニシリン系、キノロン系、スルホンアミド系、およびテトラサイクリン系抗細菌抗生物質が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７３】
抗菌剤としては、抗菌性ペプチドも挙げられる。例えば、アバエシン（ａｂａｅｃｉｎ）；アンドロピン（ａｎｄｒｏｐｉｎ）；アピデシン系；ボンビニン；ブレビニン類（ｂｒｅｖｉｎｉｎｓ）；ブフォリンＩＩ；ＣＡＰ１８；セクロピン類；セラトトキシン（ｃｅｒａｔｏｔｏｘｉｎ）；ディフェンシン類；ダーマセプチン；ダームシジン；ドロソマイシン（ｄｒｏｓｏｍｙｃｉｎ）；エスクレンチン系（ｅｓｃｕｌｅｎｔｉｎｓ）；インドリシジン；ＬＬ３７；マガイニン；マキシマムＨ５（ｍａｘｉｍｕｍ  Ｈ５）；メリチン；モリシン（ｍｏｒｉｃｉｎ）；プロフェニン（ｐｒｏｐｈｅｎｉｎ）；プロテグリン；および／またはタキプレシン系抗菌性ペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
抗真菌剤
【００７４】
用語「抗真菌剤」は、胞子発芽もしくは基質接着をブロックすることによって、または真菌またはその胞子の成長および発育に必要ないずれかの代謝プロセスまたはステップを妨げることによって、真菌感染を妨げる薬剤または化学物質を指す。
抗原虫剤
【００７５】
本明細書で用いられる場合、用語「抗原虫」は、広範囲の真核微生物および無脊椎蠕形動物の寄生的な特質またはその他の生活環の特質を妨げる、あらゆる化学物質または薬剤を指す。前記薬剤または化学物質は、タンパク質合成、不可欠な脂質の産生、呼吸過程またはその他の代謝イベントもしくは生育調整ステップをブロックし得る。
【００７６】
本明細書において上記したように、本発明は、（上記の部分で詳述したような）病原体に対する薬剤と、少なくとも１つの細胞外マトリックス関連ポリペプチドをダウンレギュレートする薬剤とを、両方とも投与することを意図する。
【００７７】
用語、１つの細胞外マトリックス関連ポリペプチドは、細胞外マトリックスの形成を減少させるポリペプチド、もしくは細胞外マトリックスの分解を高めるポリペプチド、または細胞外マトリックスに含まれるポリペプチドを指す。
【００７８】
特定の実施形態によれば、細胞外マトリックス関連ポリペプチドは、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、およびラミニンなどの線維状タンパク質である。
【００７９】
別の実施形態によれば、細胞外マトリックス関連ポリペプチドは、マトリックスメタロプロテイナーゼなどのプロテアーゼ、ＡＤＡＭＴＳ１−１７を含むＡＤＡＭＴＳ（ｃｌａｓｓ  Ａ  Ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ  Ａｎｄ  Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ｗｉｔｈ  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ  Ｍｏｔｉｆ）に属する酵素、およびリジルオキシダーゼホモログ２（ＬＯＸＬ）などのリジルオキシダーゼファミリーに属する酵素である。
【００８０】
一実施形態において、細胞外マトリックス関連ポリペプチドは、以下の実施例の項目の表２Ｂに示されるものである。
【００８１】
好ましくは、細胞外マトリックス関連ポリペプチドは、以下の表１に示すものである。各遺伝子の例示的なｃＤＮＡ配列は、その表中に示されている。
【表１】
0006783777.tif 000002
【００８２】
ＥＣＭ関連ポリペプチドのダウンレギュレーションは、転写および／または翻訳を妨げる種々の分子［例えば、ＲＮＡサイレンシング剤（例えば、アンチセンス、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ミクロＲＮＡ）、リボザイム、およびＤＮＡザイム］を利用してゲノムおよび／または転写物レベルで、または、例えば、アンタゴニスト、ポリペプチドを切断する酵素などを利用してタンパク質レベルで引き起こされ得る。
【００８３】
ＥＣＭ関連ポリペプチドの発現レベルおよび／または活性をダウンレギュレートさせ得る薬剤のリストを以下に示す。
【００８４】
ＥＣＭ関連ポリペプチドであり得る薬剤の１つの例は、ＥＣＭ関連ポリペプチドに特異的に結合し、その活性をダウンレギュレートすることができる抗体または抗体フラグメントである。
【００８５】
好ましくは、抗体は、１０００ｎｍ未満のＫｉで、より好ましくは１００ｎｍ未満のＫｉで、さらに好ましくは１０ｎｍのＫｉで、標的ポリペプチドに結合する。
【００８６】
好ましくは、抗体は、ポリペプチドの少なくとも１つのエピトープに特異的に結合する。本明細書で用いられる場合、用語「エピトープ」は、抗体のパラトープが結合する、抗原上のあらゆる抗原決定基を指す。
【００８７】
エピトープ決定要素は、通常、アミノ酸または炭水化物側鎖などの、化学的に活性な表面分子群から構成され、通常、特定の３次元構造的特性、ならびに特定の電荷的特性を有する。
【００８８】
一実施形態によれば、エピトープ決定要素は、ポリペプチドの表面にある。
【００８９】
別の実施形態によれば、ポリペプチドがＭＴ１−ＭＭＰ１、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−８、およびＭＭＰ−３などのマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）である場合、抗体は、ハプテン化合物である［２−（２−ミノエチルカルボモイル）−エトキシメチル］−トリス−［２−（Ｎ−（３−イミダゾール−１−イル−プロピル））−エトキシメチル］メタン（［２−（２−ｍｉｎｏｅｔｈｙｌｃａｒｂｏｍｏｙｌ）−ｅｔｈｏｘｙｍｅｔｈｙｌ］−ｔｒｉｓ−［２−（Ｎ−（３−ｉｍｉｄａｚｏｌ−１−ｙｌ−ｐｒｏｐｙｌ））−ｅｔｈｏｘｙｍｅｔｈｙｌ］ｍｅｔｈａｎｅ）に結合する（場合により、前記抗体は、前記ハプテン化合物で免疫することによって作製し得る）。このハプテン分子は、ＭＭＰ内の反応性亜鉛部位の局所構造およびコンフォメーションを厳密に模倣している（国際公開第２００８／１０２３５９号パンフレット参照、その内容は、参照により本明細書に組み込まれる）。
【００９０】
一実施形態において、抗体は、活性型の抗体に特異的に結合することができ、プロ酵素型の抗体には結合しない。
【００９１】
好ましくは、抗体は、特定のマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）に特異的であり、前記特定のＭＭＰに対して、関連のないＭＭＰと比べて少なくとも５倍高いアフィニティーで結合する。
【００９２】
特定の実施形態によれば、ポリペプチドは、ＭＭＰ−１４としても知られる、ＭＴ１−ＭＭＰ１である。
【００９３】
ＭＭＰ−１４に結合し、ダウンレギュレートする抗体の例としては、例えば、Ｕｄｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２３，１−１２，Ｊａｎｕａｒｙ  ６，２０１５（その内容は、参照により本明細書に組み込まれる）に詳細に記載されているような、ＬＥＭ−２／１５ハイブリドーマ細胞によって産生される抗体が挙げられる。
【００９４】
別の実施形態によれば、抗体は、ＭＭＰ−１４の表面エピトープを標的とする。よって、例えば、抗体は、ＭＭＰ−１４のＶ−Ｂループ（例えば、ＭＭＰ−１４の残基の１６０−１７３位、および／または２１８−２３３位）に結合し得る。別の実施形態において、抗体は、ＭＭＰ−１４のＶ−Ｂループに、コンフォメーション的な旋回運動を起こさせる抗体である。
【００９５】
ＭＭＰ−１４をダウンレギュレートする抗体のＶＨの例示的なアミノ酸配列を、配列番号５４に示す。ＭＭＰ−１４をダウンレギュレートする抗体のＶＬの例示的なアミノ酸配列を、配列番号５５に示す。
【００９６】
さらに別の実施形態において、抗体は、ＭＭＰ−１４のコラゲナーゼ活性をダウンレギュレートするが、プロ−ＭＭＰ−２の活性化には影響しない抗体である。
【００９７】
ＭＭＰ−１４をダウンレギュレートするさらなる抗体は、さらに、米国特許第８，５０１，１８１号明細書、およびＤｅｖｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｖｏｌｕｍｅ  ２０１１，Ａｒｔｉｃｌｅ  ＩＤ  １９１６７０，１１  ｐａｇｅｓ，ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１１／１９１６７０に開示されている。
【００９８】
本明細書で用いられる場合、用語「抗体」としては、インタクトな分子ならびにその機能性フラグメント、例えばマクロファージに結合することができるＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ、が挙げられる。これらの機能性抗体フラグメントは、以下のように定義され、すなわち（１）Ｆａｂ、すなわち抗体分子の１価抗原結合性フラグメントを含み、全抗体を酵素であるパパインで消化し、インタクトな軽鎖と１本の重鎖部分とを生じさせることによって作製することができるフラグメント、（２）Ｆａｂ’、すなわち全抗体をペプシンで処理し、次いで還元し、インタクトな軽鎖と重鎖部分とを生じさせることによって得ることができる、抗体分子のフラグメント（１抗体分子あたり２つのＦａｂ’フラグメントが得られる）、（３）（Ｆａｂ’）２、すなわち全抗体を酵素であるペプシンで処理するが、その後の還元を行わずに得ることができる、抗体のフラグメント（Ｆ（ａｂ’）２は、２つのＦａｂ’フラグメントが２つのジスルフィド結合によって結合した二量体である）、（４）Ｆｖ、すなわち２本鎖として発現させた、軽鎖可変領域と重鎖可変領域とを含む遺伝子組換えフラグメントと定義されるフラグメント、および（５）一本鎖抗体（「ＳＣＡ」）、すなわち軽鎖可変領域と重鎖可変領域とを、適当なポリペプチドリンカーによって結合した遺伝子融合一本鎖分子として含む、遺伝子組換え分子、と定義される。
【００９９】
ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、ならびにそれらのフラグメントの作製方法は、当技術分野で周知である（例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８８（参照により本明細書に組み込まれる）参照）。
【０１００】
本発明のいくつかの実施形態による抗体フラグメントは、抗体のタンパク質分解性加水分解によって、またはフラグメントをコードするＤＮＡを大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）もしくは哺乳動物細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞培養物またはその他のタンパク質発現系）で発現させることによって、調製することができる。抗体フラグメントは、通常の方法により、全抗体をペプシン消化またはパパイン消化することによって得ることができる。例えば、抗体フラグメントは、抗体をペプシンで酵素的に切断し、Ｆ（ａｂ’）２で表される５Ｓのフラグメントを生じさせることによって作製することができる。このフラグメントは、チオール還元剤と、場合によりスルフヒドリル基のための保護基とを用いてさらに切断することができ、ジスルフィド結合が切断されて、３．５ＳのＦａｂ’１価フラグメントが生じる。一方、ペプシンを用いた酵素的切断によって、直接的に、２つの１価Ｆａｂ’フラグメントと、Ｆｃフラグメントとが生じる。これらの方法は、例えば、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇによる、米国特許第４，０３６，９４５号明細書および米国特許第４，３３１，６４７号明細書、ならびにこれらの特許に記載されている参考文献に記載されている（これらの特許は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。Ｐｏｒｔｅｒ，Ｒ．Ｒ．［Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．７３：１１９−１２６（１９５９）］も参照のこと。抗体を切断するその他の方法、例えば重鎖を引き離して１価の軽鎖−重鎖フラグメントを形成する方法、フラグメントをさらに切断する方法、またはその他の酵素学的、化学的、もしくは遺伝学的技法もまた、インタクト抗体によって認識される抗原にフラグメントが結合する限り、使用することができる。
【０１０１】
Ｆｖフラグメントは、ＶＨ鎖とＶＬ鎖との結合を含む。この結合は、Ｉｎｂａｒ  ｅｔ  ａｌ．［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ６９：２６５９−６２（１９７２０］に記載されているように、非共有結合であってもよい。一方、可変鎖は、分子間ジスルフィド結合で結合されていてもよく、グルタルアルデヒドなどの化学物質で架橋されていてもよい。好ましくは、Ｆｖフラグメントは、ペプチドリンカーで連結されたＶＨ鎖とＶＬ鎖とを含む。これらの一本鎖抗原結合タンパク質（ｓＦｖ）は、オリゴヌクレオチドで連結されたＶＨドメインとＶＬドメインとをコードするＤＮＡ配列を含む構造遺伝子を作成することによって調製される。構造遺伝子は、発現ベクターに挿入され、発現ベクターは、次に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの宿主細胞に導入される。組換え宿主細胞は、２つのＶドメインを架橋するリンカーペプチドを含む単一のポリペプチド鎖を合成する。ｓＦｖを作製する方法は、例えば、Ｗｈｉｔｌｏｗ  ａｎｄ  Ｆｉｌｐｕｌａ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２：９７−１０５（１９９１）；Ｂｉｒｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６（１９８８）；Ｐａｃｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １１：１２７１−７７（１９９３）；および米国特許第４，９４６，７７８号明細書に記載されている（これらは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０１０２】
別な形態の抗体フラグメントは、単一の相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするペプチドである。ＣＤＲペプチド（「最小認識単位」）は、対象とする抗体のＣＤＲをコードする遺伝子を作成することによって得ることができる。このような遺伝子は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて、抗体産生細胞のＲＮＡから可変領域を合成することによって調製される。例えば、Ｌａｒｒｉｃｋ  ａｎｄ  Ｆｒｙ［Ｍｅｔｈｏｄｓ，２：１０６−１０（１９９１）］を参照のこと。
【０１０３】
ヒト化形態の非ヒト（例えばマウス）抗体は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列を含む、免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、またはそれらのフラグメント（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、または抗体のその他の抗原結合性部分配列）のキメラ分子である。ヒト化抗体としては、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）の相補性決定領域（ＣＤＲ）を形成する残基が、所望の特異性、アフィニティー、およびキャパシティーを持つ、マウス、ラット、またはウサギなどの非ヒト種免疫グロブリン（ドナー抗体）のＣＤＲ由来の残基によって置換された、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）が挙げられる。いくつかの例において、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基で置換される。ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも存在せず、移入されるＣＤＲまたはフレームワーク配列にも存在しない残基も含んでいてもよい。一般に、ヒト化抗体は、実質的に全ての、少なくとも１つの、典型的には２つの可変ドメインを含み、全てのまたは実質的に全てのＣＤＲ領域は非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に相当し、全てのまたは実質的に全てのＦＲ領域はヒト免疫グロブリン共通配列のＦＲ領域であろう。ヒト化抗体は、最適には、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部も含むであろう［Ｊｏｎｅｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２９（１９８８）；およびＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．  Ｏｐ．  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｂｉｏｌ．，２：５９３−５９６（１９９２）］。
【０１０４】
非ヒト抗体をヒト化する方法は、当技術分野で周知である。一般に、ヒト化抗体は、非ヒト源から導入された、１つまたは複数のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、インポート残基と呼ばれることが多く、典型的にはインポート可変ドメインから取られたものである。ヒト化は、基本的に、Ｗｉｎｔｅｒと共同研究者［Ｊｏｎｅｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６（１９８８）］の方法に従って、ヒト抗体の対応する配列を、げっ歯動物のＣＤＲまたはＣＤＲ配列で置換することにより実施することができる。したがって、このようなヒト化抗体はキメラ抗体であり（米国特許第４，８１６，５６７号明細書）、インタクトなヒト可変ドメインよりも大幅に少ない配列が、非ヒト種由来の対応する配列で置換されている。実際に、ヒト化抗体は、典型的には、いくつかのＣＤＲ残基と、場合によりいくつかのＦＲ残基が、げっ歯動物抗体の類似の部位からの残基で置換されたヒト抗体である。
【０１０５】
ヒト抗体は、当技術分野で知られている、ファージディスプレイライブラリ［Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１（１９９１）］を含む種々の技法を用いて作製することもできる。Ｃｏｌｅら、およびＢｏｅｒｎｅｒらの技法もまた、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用することができる［Ｃｏｌｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，ｐ．７７（１９８５）、およびＢｏｅｒｎｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７（１）：８６−９５（１９９１）］。同様に、ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン部位を、トランスジェニック動物、例えば内因性免疫グロブリン遺伝子を部分的または完全に不活化したマウスに導入することによって作成することができる。チャレンジの際、ヒト抗体の産生が観察され、遺伝子再構成、アセンブリー、および抗体レパートリーを含む全ての点において、ヒトで見られるものと酷似している。この手法は、例えば、米国特許第５，５４５，８０７号明細書；米国特許第５，５４５，８０６号明細書；米国特許第５，５６９，８２５号明細書；米国特許第５，６２５，１２６号明細書；米国特許第５，６３３，４２５号明細書；米国特許第５，６６１，０１６号明細書、ならびに以下の科学出版物、すなわちＭａｒｋｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０，：７７９−７８３（１９９２）；Ｌｏｎｂｅｒｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６−８５９（１９９４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８  ８１２−１３（１９９４）；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４，８４５−５１（１９９６）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：８２６（１９９６）；およびＬｏｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３，６５−９３（１９９５）に記載されている。
【０１０６】
ＥＣＭ関連ポリペプチドのダウンレギュレーションは、ＲＮＡサイレンシングによって実現することもできる。本明細書で用いられる場合、語句「ＲＮＡサイレンシング」は、ＲＮＡ分子を介し、対応するタンパク質コード遺伝子の発現を阻害または「サイレンシング」する結果をもたらす制御機構のグループ［例えば、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）、転写型遺伝子サイレンシング（ＴＧＳ）、転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）、クエリング、共抑制、および翻訳抑制］を指す。ＲＮＡサイレンシングは、植物、動物、および真菌を含む、多くの種類の生物で観察されている。
【０１０７】
本明細書で用いられる場合、用語「ＲＮＡサイレンシング剤」は、標的遺伝子の発現を特異的に阻害または「サイレンシング」することができるＲＮＡを指す。ある実施形態において、ＲＮＡサイレンシング剤は、転写後サイレンシングメカニズムによって、ｍＲＮＡ分子の完全なプロセシング（例えば、完全な翻訳および／または発現）を妨げることができる。ＲＮＡサイレンシング剤としては、非コードＲＮＡ分子、例えば、対になった鎖を含むＲＮＡ二重鎖、ならびにこのような低分子非コードＲＮＡを生成し得るＲＮＡ前駆体が挙げられる。例示的なＲＮＡサイレンシング剤としては、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、およびｓｈＲＮＡなどのｄｓＲＮＡが挙げられる。一実施形態において、ＲＮＡサイレンシング剤は、ＲＮＡ干渉を誘導することができる。別の実施形態において、ＲＮＡサイレンシング剤は、翻訳抑制を媒介することができる。
【０１０８】
本発明の実施形態によれば、ＲＮＡサイレンシング剤は、標的ＲＮＡ（例えば、ＭＭＰ−１４）に特異的であり、標的遺伝子に対して９９％以下の全体的相同性を示す遺伝子またはスプライスバリアントを交差阻害または交差サイレンシングせず、例えば、標的遺伝子に対して９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％未満の全体的相同性を示す遺伝子またはスプライスバリアントを交差阻害または交差サイレンシングしない。
【０１０９】
ＲＮＡ干渉は、動物において、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ、ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）によって媒介される、配列特異的な転写後遺伝子サイレンシングプロセスを指す。植物における対応するプロセスは、一般に転写後遺伝子サイレンシングまたはＲＮＡサイレンシングと呼ばれ、真菌においてクエリングとも呼ばれる。転写後遺伝子サイレンシングのプロセスは、外来遺伝子の発現を予防するために用いられる、進化的に保存された細胞防御機構だと考えられ、一般に多様な植物群および動物群によって共有されている。このような外来遺伝子の発現からの保護は、ウイルス感染に由来する、または宿主ゲノムへのトランスポゾンエレメントの無秩序な組込みに由来する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ、ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＲＮＡ）の生成に応答して、相同な一本鎖ＲＮＡまたはウイルスのゲノムＲＮＡを特異的に破壊する細胞応答を経て、おそらく進化したのであろう。
【０１１０】
細胞内に長いｄｓＲＮＡが存在することにより、ダイサー（ｄｉｃｅｒ）と呼ばれるリボヌクレアーゼＩＩＩ酵素の活性が刺激される。ダイサーは、前記ｄｓＲＮＡを、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）として知られるｄｓＲＮＡの短い断片にするプロセシングにかかわっている。ダイサー活性に由来する低分子干渉ＲＮＡは、典型的には、長さが約２１〜約２３ヌクレオチドであり、約１９塩基対の二本鎖を含む。ＲＮＡｉ反応は、一般にＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と呼ばれる、エンドヌクレアーゼ複合体も特徴とし、ｓｉＲＮＡ二重鎖のアンチセンス鎖に相補的な配列を有する一本鎖ＲＮＡの切断を媒介する。標的ＲＮＡの切断は、ｓｉＲＮＡ二重鎖のアンチセンス鎖に相補的な領域の中央で起こる。
【０１１１】
したがって、本発明のいくつかの実施形態は、ｍＲＮＡからのタンパク質発現をダウンレギュレートするためのｄｓＲＮＡの使用を意図する。
【０１１２】
一実施形態によれば、ｄｓＲＮＡは、３０塩基対より大きい。長いｄｓＲＮＡ（例えば、３０塩基対より大きいｄｓＲＮＡ）の使用は、二本鎖ＲＮＡのこのような長い領域はインターフェロンおよびＰＫＲ応答を誘導する結果となるであろうと考えられていたため、非常に限られていた。しかしながら、長いｄｓＲＮＡを用いることによって、細胞が最適なサイレンシング配列を選択することができ、非常に多くのｓｉＲＮＡを試験する必要性が軽減されること、長いｄｓＲＮＡによって、サイレンシングライブラリが有するべき複雑性を、ｓｉＲＮＡで必要にされるものよりも少なくすることを可能にするであろうこと、および、おそらく最も重要な点であるが、長いｄｓＲＮＡは、治療薬として用いた場合、ウイルスのエスケープ変異を予防し得る、という点で非常に多くの利点がもたらされる。
【０１１３】
種々の研究によって、長いｄｓＲＮＡが、ストレス応答を誘導せずに、または著しいオフターゲット作用を引き起こさずに、遺伝子発現をサイレンシングするために使用し得ることが示されており、例えば、［Ｓｔｒａｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００６，Ｖｏｌ．３４，Ｎｏ．１３  ３８０３−３８１０；Ｂｈａｒｇａｖａ  Ａ．，ｅｔ  ａｌ．  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．  Ｐｒｏｔｏｃ．  ２００４；１３：１１５−１２５；Ｄｉａｌｌｏ  Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．２００３；１３：３８１−３９２；Ｐａｄｄｉｓｏｎ  Ｐ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ．２００２；９９：１４４３−１４４８；Ｔｒａｎ  Ｎ．，ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２００４；５７３：１２７−１３４］を参照のこと。
【０１１４】
特に、本発明は、いくつかの実施形態によれば、遺伝子サイレンシングのために、インターフェロン経路が活性化していない細胞（例えば、胚細胞、卵母細胞）内に、長いｄｓＲＮＡ（３０塩基超の転写物）を導入することを意図しており、例えば、Ｂｉｌｌｙ，ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ２００１，Ｖｏｌ  ９８，ｐａｇｅｓ  １４４２８−１４４３３．、およびＤｉａｌｌｏ，ｅｔ  ａｌ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，Ｏｃｔｏｂｅｒ  １，２００３，１３（５）：３８１−３９２．ｄｏｉ：１０．１０８９／１５４５４５７０３３２２６１７０６９を参照のこと。
【０１１５】
本発明は、いくつかの実施形態によれば、インターフェロンおよびＰＫＲ経路を誘導しないように特に設計された、遺伝子発現をダウンレギュレートするための長いｄｓＲＮＡを導入することも意図している。例えば、ＳｈｉｎａｇｗａとＩｓｈｉｉ［Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖ．１７（１１）：１３４０−１３４５，２００３］は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（Ｐｏｌ  ＩＩ）プロモーターから、長い二本鎖ＲＮＡを発現させるための、ｐＤＥＣＡＰと名付けられたベクターを構築した。ｐＤＥＣＡＰからの転写物は、細胞質へのｄｓＲＮＡの輸送を促進する５’−キャップ構造も、３’−ポリＡテールも、いずれも欠いているため、ｐＤＥＣＡＰからの長いｄｓＲＮＡは、インターフェロン応答を誘導しない。
【０１１６】
哺乳動物系における、インターフェロンおよびＰＫＲ経路を回避するための別の方法は、トランスフェクションまたは内因性の発現のいずれかによる、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の導入である。
【０１１７】
用語「ｓｉＲＮＡ」は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路を誘導する、低分子干渉ＲＮＡ二重鎖（一般に、１８〜３０塩基対の間）を指す。典型的には、ｓｉＲＮＡは、中央部に１９塩基対の二重鎖領域と、３’末端に２塩基の対称的なオーバーハングとを有する２１マーとして化学的に合成されるが、近時、化学的に合成された２５〜３０塩基長のＲＮＡ二重鎖は、２１マーと同じ部位で比較して、１００倍も増大した効力を有し得ることが報告されている。ＲＮＡｉの誘発においてより長いＲＮＡを用いて得られ、観察された効力の増大は、Ｄｉｃｅｒを、産物（２１マー）に代えて基質（２７マー）と共に供給し、これがＲＩＳＣ内へのｓｉＲＮＡ二重鎖の移行速度または移行効率を向上させるという結果から理論づけられる。
【０１１８】
３’末端のオーバーハングの位置は、ｓｉＲＮＡの効力に影響し、アンチセンス鎖上に３’末端のオーバーハングを有する非対称な二重鎖は、一般に、センス鎖上に３’末端のオーバーハングを有するものよりも効力が強いことが見いだされている（Ｒｏｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５）。これは、アンチセンス転写物を標的とする場合に逆の効力パターンが観察されることから、ＲＩＳＣ内への非対称な鎖の取り込みに起因するものであり得る。
【０１１９】
二本鎖干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）の鎖（複数）は、結合してヘアピン構造またはステムループ構造（例えば、ｓｈＲＮＡ）を形成し得る。よって、上記した本発明のいくつかの実施形態のＲＮＡサイレンシング剤は、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）でもあり得る。
【０１２０】
本明細書で用いられる場合、用語「ｓｈＲＮＡ」は、ステムループ構造を有するＲＮＡ因子を指し、相補的配列の第１の領域と第２の領域とを含み、それらの領域の相補性の程度と配向とは、前記領域間で塩基対形成が起こるのに十分であり、前記第１の領域と第２の領域とはループ領域で連結され、ループは、ループ領域内のヌクレオチド（またはヌクレオチドアナログ）間に塩基対が欠けている結果として生じる。ループ内のヌクレオチド数は、両端の数値を含み、３〜２３、５〜１５、７〜１３、４〜９、または９〜１１である。ループ内のいくつかのヌクレオチドは、ループ内のその他のヌクレオチドとの塩基対相互作用に関係していてもよい。結果として生じる一本鎖オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡｉ機構と相互作用できる二本鎖領域を含むステムループ構造またはヘアピン構造を形成することを、当業者は認識するであろう。
【０１２１】
本発明のいくつかの実施形態のＲＮＡサイレンシング剤は、ＲＮＡのみを含む分子に限定される必要はなく、さらに化学修飾ヌクレオチドおよび非ヌクレオチドを包含することが理解されよう。
【０１２２】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されたＲＮＡサイレンシング剤は、機能的に細胞透過性ペプチドと関係し得る。 本明細書で用いられる場合、「細胞透過性ペプチド」は、細胞透過性複合体が細胞の原形質膜および／または核膜を横切る移動に関係する、エネルギーに依存しない（すなわち、非エンドサイトーシス的な）移動特性を付与する、短い（約１２〜３０残基）アミノ酸配列または機能モチーフを含むペプチドである。本発明のいくつかの実施形態の膜透過性複合体で用いられる細胞透過性ペプチドは、好ましくは、少なくとも１つの非機能性のシステイン残基を含み、前記システイン残基は、フリーであるか、誘導体化されて、ジスルフィド結合を、そのような結合のために修飾された二本鎖リボ核酸と形成するか、のいずれかである。このような特性を与える典型的なアミノ酸モチーフが、米国特許第６，３４８，１８５号明細書に記載されている（その内容は、参照により明示的に本明細書に組み込まれる）。本発明のいくつかの実施形態の細胞透過性ペプチドとしては、好ましくは、ペネトラチン、トランスポータン、ｐＩｓｌ、ＴＡＴ（４８〜６０）、ｐＶＥＣ、ＭＴＳ、およびＭＡＰが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２３】
ＲＮＡサイレンシング剤を用いて標的化されるｍＲＮＡとしては、その発現が望ましくない表現型形質と関連するｍＲＮＡが挙げられるが、これらに限定されない。標的化され得る例示的なｍＲＮＡは、切断型タンパク質をコードするｍＲＮＡであり、すなわち欠失を含むｍＲＮＡである。したがって、本発明のいくつかの実施形態のＲＮＡサイレンシング剤は、欠失のいずれかの側の架橋領域を標的化し得る。このようなＲＮＡサイレンシング剤を細胞内に導入することによって、非変異タンパク質に影響を与えることなく、変異タンパク質のダウンレギュレーションが引き起こされるであろう。
【０１２４】
別の実施形態によれば、ＲＮＡサイレンシング剤は、ｍｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ模倣物であり得る。
【０１２５】
用語「ｍｉｃｒｏＲＮＡ」、「ｍｉＲＮＡ」、および「ｍｉＲ」は、同義語であり、長さが約１９〜２８ヌクレオチドの非コード一本鎖ＲＮＡ分子の集合であり、遺伝子発現を制御する。ｍｉＲＮＡは、幅広い生物（ウイルス→ヒト）に見られ、発生、恒常性、および疾患の病因において役割を果たしていることが示されている。
【０１２６】
用語「ｍｉｃｒｏＲＮＡ模倣体」は、ＲＮＡｉ経路に入り、遺伝子発現を制御することができる合成非コードＲＮＡを指す。ｍｉＲＮＡ模倣体は、内因性ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の機能を模倣し、成熟した二本鎖分子、または模倣前駆体（例えば、プレｍｉＲＮＡ）として設計することができる。ｍｉＲＮＡ模倣体は、修飾または非修飾ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド、または別の核酸化学物質（例えば、ＬＮＡ、または２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレン−架橋核酸（ＥＮＡ））から構成され得る。成熟した、二本鎖ｍｉＲＮＡ模倣体については、二重鎖領域の長さは、１３〜３３、１８〜２４、または２１〜２３ヌクレオチドの間でさまざまである。ｍｉＲＮＡは、全体で、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０ヌクレオチドを含んでいてもよい。ｍｉＲＮＡの配列は、プレｍｉＲＮＡの初めの１３〜３３ヌクレオチドであってもよい。ｍｉＲＮＡの配列はまた、プレｍｉＲＮＡの終わりの１３〜３３ヌクレオチドであってもよい。
【０１２７】
ＥＣＭ関連ポリペプチドをダウンレギュレートすることができる別の薬剤は、ＥＣＭ関連ポリペプチドのｍＲＮＡ転写物またはＤＮＡ配列を特異的に切断することができるＤＮＡザイム分子である。
【０１２８】
ＥＣＭ関連ポリペプチドのダウンレギュレーションは、ＥＣＭ関連ポリペプチドをコードするｍＲＮＡ転写物と特異的にハイブリダイズすることができるアンチセンスポリヌクレオチドを用いることによって引き起こすこともできる。
【０１２９】
ＥＣＭ関連ポリペプチドをダウンレギュレートすることができる別の薬剤は、ＥＣＭ関連ポリペプチドをコードするｍＲＮＡ転写物を特異的に切断することができるリボザイム分子である。
【０１３０】
ＥＣＭ関連ポリペプチドをダウンレギュレートすることができる別の薬剤は、ＥＣＭ関連ポリペプチドに結合および／またはＥＣＭ関連ポリペプチドを切断することができるあらゆる分子であろう。このような分子は、アンタゴニスト、または阻害性ペプチドであり得る。
【０１３１】
例えば、Ｚａｒｒａｂｉら（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２０１１  Ｓｅｐ  ２３；２８６（３８）：３３１６７−３３１７７）は、ＭＭＰ−１４を阻害するペプチドを開示している。
【０１３２】
開示されたあらゆるポリペプチドの、少なくとも触媒性の、または結合性の部位の非機能性アナログもまた、ＥＣＭ関連ポリペプチドをダウンレギュレートする薬剤として使用し得ることが理解されよう。
【０１３３】
本発明のいくつかの実施形態と共にＥＣＭ関連ポリペプチドをダウンレギュレートするために使用することができる別の薬剤は、ＥＣＭ関連ポリペプチドの活性化を阻害またはＥＣＭ関連ポリペプチドへの基質の結合を阻害する分子である。
【０１３４】
追加の例示的なマトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤としては、ヒドロキサム酸基のヒドロキシル酸素およびカルボニル酸素を介して、二座様式で、触媒部位の亜鉛イオンと特異的に相互作用する、ヒドロキサメート阻害剤、すなわち線維性コラーゲンの低分子ペプチドアナログ、が挙げられる［Ｇｒａｍｓ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９５），Ｂｉｏｃｈｅｍ．３４：１４０１２−１４０２０；Ｂｏｄｅ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９４），ＥＭＢＯ  Ｊ．，１３：１２６３−１２６９］。
【０１３５】
ヒドロキサメート系ＭＭＰ阻害剤は、一般に、炭素バックボーン（国際公開第９５／２９８９２号パンフレット、国際公開第９７／２４１１７号パンフレット、国際公開第９７／４９６７９号パンフレット、およびＥＰ０７８０３８６）、ペプチジルバックボーン（国際公開第９０／０５７１９号パンフレット、国際公開第９３／２００４７号パンフレット、国際公開第９５／０９８４１号パンフレット、および国際公開第９６／０６０７４号パンフレット）、またはペプチド模倣バックボーン［Ｓｃｈｗａｒｔｚ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｇｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２９：２７１−３３４（１９９２）；Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．，７５：６９−７５（１９９７）；Ｄｅｎｉｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ．Ｎｅｗ  Ｄｒｕｇｓ，１５：１７５−１８５（１９９７）］、のいずれかから構成される。一方、ヒドロキサメート系ＭＭＰ阻害剤は、フェニル環の片側に結合したスルホンアミドスルホニル基と、炭素原子１〜４個の鎖を介してヒドロキサメート基に結合したスルホンアミド窒素とを含む（欧州特許第０７５７９８４号明細書（ＥＰ０７５７９８４Ａ１））。
【０１３６】
その他のペプチド系ＭＭＰ阻害剤は、コラゲナーゼ阻害活性を示すチオールアミド（米国特許第４，５９５，７００号明細書）、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−２、およびコラゲナーゼを阻害するビフェニルエチルグリシンを含有するＮ−カルボキシアルキル誘導体（Ｄｕｒｅｔｔｅ，ｅｔ  ａｌ．，国際公開第９５／２９６８９号パンフレット）、ＭＭＰ、ＴＮＦ−α、およびアグリカナーゼを阻害するラクタム誘導体（米国特許第６，４９５，６９９号明細書参照）、および三環系スルホンアミド化合物（米国特許第６，４９２，４２２号明細書参照）である。
【０１３７】
その他のＭＭＰ阻害剤は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでいくつかのＭＭＰの発現をブロックすることが示された、化学修飾非微生物性テトラサイクリン類（ＣＭＴ）である（Ａｘｉｓａ，ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｓｔｒｏｋｅ  ３３：２８５８−２８６４）。
【０１３８】
近時、ＭＭＰ活性部位に関するＸ線結晶学的情報に従って、メカニズムに基づくＭＭＰ阻害剤、すなわちＳＢ−３ＣＴ、が設計された（Ｂｒｏｗｎ，ｅｔ  ａｌ．，２０００）。Ｘ線吸収の研究により、この分子が触媒亜鉛に結合すると、活性部位金属イオン周辺のコンフォメーション環境が再構築され、プロ酵素のものに戻ることが明らかとなった［Ｋｌｅｉｆｅｌｄ，ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：１７１２５−３１］。
【０１３９】
併用療法の面に関して、併用療法化合物は、上記化合物を投与するのと同じ投与経路（例えば、肺内、経口、経腸など）によって投与し得る。代わりに、併用療法のために用いる薬剤は、本明細書に記載された薬剤と共に、異なる投与経路によって投与してもよい。
【０１４０】
ＥＣＭ関連ポリペプチドをダウンレギュレートする薬剤は、抗病原体剤の直前（または直後）に投与してもよく、抗病原体剤と同日に、１日前（または後）、１週間前（または後）、１か月前（または後）、または２か月前（または後）などに投与してもよい。
【０１４１】
ＥＣＭ関連ポリペプチドをダウンレギュレートする薬剤と抗病原体剤とは、同時に投与してもよく、すなわち、これらの各薬剤は、互いの投与が部分的または完全に重なり合う時間間隔で投与がなされてもよい。本明細書に記載された薬剤は、互いに重なり合わない時間間隔の間に投与してもよい。例えば、第１の薬剤をｔ＝０〜１時間の時間帯内に投与してもよく、一方で第２の薬剤をｔ＝１〜２時間の時間帯内に投与してもよい。また、第１の薬剤をｔ＝０〜１時間の時間帯内に投与してもよく、一方で第２の薬剤をｔ＝２〜３時間、ｔ＝３〜４時間、ｔ＝４〜５時間、ｔ＝５〜６時間、ｔ＝６〜７時間、ｔ＝７〜８時間、ｔ＝８〜９時間、ｔ＝９〜１０時間などの時間帯内のどこかで投与してもよい。さらに、第２の薬剤は、ｔ＝−２〜３時間、ｔ＝−３〜４時間、ｔ＝−４〜５時間、ｔ＝５〜６−時間、ｔ＝−６〜７時間、ｔ＝−７〜８時間、ｔ＝−８〜９時間、ｔ＝−９〜１０時間の時間帯中のどこかで投与してもよい。
【０１４２】
本発明の薬剤は、典型的には、感染を処置および／または二次感染に関連する症状または疾患を軽減させるための総量で提供される。この量は、使用のために選択した特定の薬剤、他の処置様式の性質および数、処置、予防および／または緩和すべき状態、対象の種、年齢、性別、体重、健康状態および予後、投与様式、標的化の有効性、滞留時間、クリアランス様式、薬剤の副作用の種類および重大さに明らかに依存し、当業者に明らかであろうその他多くの因子に明らかに依存するであろう。
【０１４３】
本発明者らは、ＭＭＰ−１４に結合し、ダウンレギュレートする抗体の投与によって、二次感染の合併症が予防されることを示した。より具体的には、本発明者らは、ＭＭＰ−１４抗体を抗ウイルス剤と一緒に投与することによって、（一次感染として）インフルエンザウイルスと、（二次感染として）肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）とに感染した動物の症状が軽減することを示した。
【０１４４】
よって、本発明者らは、ＥＣＭ関連ポリペプチドを特異的にダウンレギュレートする薬剤と、抗病原体剤との投与によって、二次感染が予防（または二次感染の症状が軽減）され得ることを提唱する。
【０１４５】
よって、本発明の別の態様によれば、病原体に感染した対象における、二次感染に関連する疾患の処置または予防方法であって、病原体に対する治療有効量の抗病原体剤と、ＥＣＭ関連ポリペプチドをダウンレギュレートする治療有効量の薬剤とを対象に投与し、それによって、対象における、二次感染に関連する疾患を処置または予防することを含む、疾患の処置または予防方法が提供される。
【０１４６】
本明細書で用いられる場合、語句「二次感染」は、別の既存の感染の処置中または処置後に起こる感染を指す。二次感染は、処置自体によって、または免疫系の変化によって起こり得る。
【０１４７】
用語「予防」は、二次感染の発生を阻害もしくは阻止すること、および／または二次感染の症状の予防、減少、軽減、または後退をもたらすことを指す。
【０１４８】
特定の実施形態によれば、本発明が提唱する併用療法は、合併症を減少させ、または二次感染に関連する疾患（例えば敗血症）を処置する。
【０１４９】
二次感染は、細菌感染、ウイルス感染、または真菌感染であり得る。
【０１５０】
一次感染および二次感染は、典型的には、同じ臓器（例えば、肺および／または気道）の感染である。
【０１５１】
一実施形態において、一次感染は、ウイルス感染（例えばインフルエンザ）であり、二次感染は、細菌感染（例えば肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ））である。
【０１５２】
別の実施形態において、一次感染は、細菌感染であり、二次感染は、ウイルス感染である。
【０１５３】
さらに別の実施形態において、一次感染は、ウイルス感染であり、二次感染は、真菌感染である。
【０１５４】
さらに別の実施形態において、一次感染は、細菌感染であり、二次感染は、真菌感染である。
【０１５５】
本発明のさらに別の態様によれば、インフルエンザの処置を必要とする対象における、インフルエンザの処置方法であって、少なくとも１つのＥＣＭ関連ポリペプチドをダウンレギュレートする治療有効量の薬剤を対象に投与し、それによって、インフルエンザを処置することを含む、インフルエンザの処置方法が提供される。
【０１５６】
ＥＣＭ関連ポリペプチドは、上記の部分で説明されている。特定の実施形態によれば、ＥＣＭ関連ポリペプチドは、表１に記載されているもの、例えばＭＴ１−ＭＭＰ１である。
【０１５７】
特定の実施形態によれば、インフルエンザの処置は、かなりの量のＭＴ１−ＭＭＰ１をダウンレギュレートする抗体（例えば、上記の部分で説明したもの）を投与することによって実施される。
【０１５８】
ＥＣＭの崩壊を予防するために、好ましくは、薬剤は、インフルエンザウイルスの症状が始まった後５日以内、インフルエンザウイルスの症状が始まった後４日以内、インフルエンザウイルスの症状が始まった後３日以内、インフルエンザウイルスの症状が始まった後２日以内、さらにインフルエンザウイルスの症状が始まった後１日以内に与えられる。
【０１５９】
本明細書に記載されたあらゆる方法および使用において、薬剤は、それ自体で、またはさらに医薬的に（または化粧的に）許容され得る担体を含む医薬組成物中で用いることができる。
【０１６０】
一実施形態において、薬剤は、同じ医薬組成物中に一緒に製剤化される。
【０１６１】
別の実施形態において、薬剤は、別々の医薬組成物中に製剤化される。  別々の医薬組成物は、単一の製造品、例えばキットに含まれていてもよい。
【０１６２】
本明細書で用いられる場合、「医薬組成物」は、１つまたは複数の本明細書に記載された活性成分の、生理学的に適切な担体および賦形剤などの他の化学成分を共に含む製剤を指す。  医薬組成物の目的は、生物に対する化合物の投与を容易にすることである。
【０１６３】
本明細書において、用語「活性成分」は、本明細書に記載されたあらゆる薬剤を指す。医薬組成物は、特定の疾患の処置に有用だと知られている追加の活性薬剤を含んでいてもよいことが理解されよう。
【０１６４】
以下、語句「生理学的に許容され得る担体」および「医薬的に許容され得る担体」は、互換的に使用されることがあり、生物に対して著しい刺激の原因とならず、投与した化合物の生物学的活性および特性を抑制しない、担体または希釈剤を指す。アジュバントは、これらの語句に含まれる。
【０１６５】
本明細書において、用語「賦形剤」は、活性成分の投与をさらに容易にするために医薬組成物に加えられる不活性物質を指す。賦形剤の例としては、炭酸カルシウム，リン酸カルシウム，種々の糖およびデンプン類、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油、およびポリエチレングリコールが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６６】
本発明の医薬組成物は、当技術分野で周知のプロセス、例えば通常の混合プロセス、溶解プロセス、造粒プロセス、糖衣錠製造プロセス、研和プロセス、乳化プロセス、カプセル化プロセス、封入プロセス、または凍結乾燥プロセスによって製造することができる。
【０１６７】
よって、本発明に従って使用するための医薬組成物は、医薬的に使用することができる賦形剤および助剤（これらは活性成分の製剤への加工を容易にする）を含む１種または複数の生理学的に許容され得る担体を用いて、通常のやり方で製剤化し得る。適切な製剤は、選択される投与経路に依存する。
【０１６８】
注射のために、医薬組成物の活性成分は、水溶液で製剤化してもよく、好ましくは、ハンクス液、リンゲル液、または生理食塩水バッファーなどの生理学的に適合性のバッファーで製剤化してもよい。
【０１６９】
適切な投与経路としては、例えば、経口、直腸、経粘膜、特に経鼻、腸管、または、非経口送達、例えば筋肉内注射、皮下注射、および髄内注射、ならびに髄腔内注射、直接的脳室内注射、心臓内注射、例えば右心室腔内または左心室腔内への心臓内注射、総冠動脈内注射、静脈内注射、腹腔内注射、鼻腔内注射、もしくは眼内注射を含む非経口送達が挙げられ得る。
【０１７０】
特定の実施形態によれば、投与経路は局所送達である。
【０１７１】
あるいは、医薬組成物を、全身的ではなく、局所的に投与してもよく、例えば、医薬組成物を、患者の組織領域内への直接的な注射によって投与してもよい。
【０１７２】
本発明の医薬組成物は、当技術分野で周知のプロセス、例えば通常の混合プロセス、溶解プロセス、造粒プロセス、糖衣錠製造プロセス、研和プロセス、乳化プロセス、カプセル化プロセス、封入プロセス、または凍結乾燥プロセスによって製造することができる。
【０１７３】
よって、本発明に従って使用するための医薬組成物は、医薬的に使用することができる賦形剤および助剤（これらは活性成分の製剤への加工を容易にする）を含む１種または複数の生理学的に許容され得る担体を用いて、通常のやり方で製剤化し得る。適切な製剤は、選択される投与経路に依存する。
【０１７４】
注射のために、医薬組成物の活性成分は、水溶液で製剤化してもよく、好ましくは、ハンクス液、リンゲル液、または生理食塩水バッファーなどの生理学的に適合性のバッファーで製剤化してもよい。経粘膜投与のために、製剤には、透過すべきバリアに適した浸透剤が用いられる。このような浸透剤は、本技術分野で一般に知られている。
【０１７５】
経口投与のために、医薬組成物は、活性化合物を、当技術分野で周知の医薬的に許容され得る担体と組み合わせることによって、容易に製剤化することができる。このような担体は、医薬組成物を、患者が経口摂取するための、錠剤、丸薬、糖衣錠、カプセル、液剤、ゲル、シロップ剤、スラリー、懸濁液などに製剤化することを可能にする。経口使用のための薬理学的製剤は、固形賦形剤を使用して製造することができ、場合により得られた混合物をすりつぶし、細粒混合物を処理し、必要であれば適切な助剤を加えた後、錠剤または糖衣錠の核を得ることができる。適切な賦形剤は、特に、ラクトース、スクロース、マンニトール、またはソルビトールを含む糖類；セルロース調製物、例えば、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、バレイショデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボメチルセルロースナトリウムなど；および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などの生理学的に許容され得るポリマー、などのフィラーである。必要であれば、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、もしくはアルギン酸、またはこれらの塩、例えばアルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤を加えてもよい。
【０１７６】
糖衣錠の核は、適切なコーティングを施して提供される。この目的のために、濃縮糖液を使用してもよく、前記濃縮糖液は、場合により、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、二酸化チタン、ラッカー溶液、および適切な有機溶媒または溶媒混合物を含んでいてもよい。識別のために、または活性化合物の用量に関する種々の配合を特徴付けるために、染料または顔料を、錠剤または糖衣錠のコーティングに加えてもよい。
【０１７７】
経口で使用できる医薬組成物としては、ゼラチンでできた押し込みカプセル、ならびにゼラチンと、グリセロールまたはソルビトールなどの可塑剤とでできたソフトシールドカプセルが挙げられる。押し込みカプセルは、活性成分を、ラクトースなどのフィラー、デンプンなどの結合剤、タルクまたはステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤、および、場合により、安定化剤と混合して含んでいてもよい。ソフトカプセルにおいて、活性成分は、脂肪油、流動パラフィン、または液体ポリエチレングリコールなどの適切な液体に溶解または懸濁していてもよい。さらに、安定化剤を加えてもよい。経口投与のための全ての製剤は、選択された投与経路に適切な用量であるべきである。
【０１７８】
口腔投与のために、組成物は、通常のやり方で製剤化した、錠剤またはロゼンジの形態であってもよい。
【０１７９】
経鼻吸入による投与のために、本発明に従って使用するための活性成分は、適切な噴射剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、または二酸化炭素を使用して、加圧包装またはネブライザーから出るエアゾールスプレーの形態で便宜に送達される。加圧エアゾールの場合、投薬単位は、定量を送達するようにバルブを設けることによって決定することができる。分注器で用いるための、（例えばゼラチンの）カプセルおよびカートリッジは、化合物と、ラクトースまたはデンプンなどの適切な粉末基材とのパウダーミックスを含めて製剤化してもよい。
【０１８０】
本明細書に記載された医薬組成物は、非経口投与、例えば、ボーラス注射または持続注入による非経口投与のために製剤化してもよい。注射のための製剤は単位投与剤形、例えばアンプルで、または複数回投与用容器で、場合により保存剤を加えて提供され得る。組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液、または乳濁液であってもよく、懸濁化剤、安定化剤および／または分散剤などの製剤用薬剤を含んでいてもよい。
【０１８１】
非経口投与のための医薬組成物は、水溶性形態の活性製剤の水溶液を含む。さらに、活性成分の懸濁液は、適切な油性または水性注射用懸濁液として調製してもよい。適切な親油性溶媒またはビヒクルとしては、ゴマ油などの脂肪油、またはオレイン酸エチル、トリグリセリド、またはリポソームなどの合成脂肪酸エステルが挙げられる。水性の注射懸濁液は、懸濁液の粘度を増加させる物質、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランを含んでいてもよい。場合により、懸濁液は、適切な安定化剤、または活性成分の溶解性を増大させ、非常に濃厚な溶液の調製を可能にする薬剤も含んでいてもよい。
【０１８２】
一方、活性成分は、使用前に、適切なビヒクル、例えば、無菌のパイロジェンフリー水を基にした溶液を用いて構成するための、粉末形態であってもよい。
【０１８３】
本発明の医薬組成物はまた、例えば、カカオバター、またはその他のグリセリドなどの通常の坐剤基剤を用いて、坐剤または停留浣腸などの直腸用組成物に製剤化してもよい。
【０１８４】
本発明に関して、使用に適した医薬組成物としては、意図する目的を達成するのに有効な量の活性成分を含む組成物が挙げられる。より具体的には、治療有効量は、障害（例えば、線維性疾患または炎症性疾患）の症状を予防、緩和、もしくは改善、または処置している対象の生存期間を延長するのに有効な、活性成分（例えば、本明細書に記載された化合物）の量を意味する。
【０１８５】
治療有効量の決定は、特に本明細書に示された詳細な開示を考慮すると、十分に当業者の能力の範囲内である。
【０１８６】
本発明の方法で使用されるあらゆる調製物について、治療有効量または治療有効用量は、所望の濃度または力価を達成する動物モデルから推定することができる。このような情報は、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定するために利用することができる。
【０１８７】
本明細書に記載された活性成分の毒性および治療有効性は、実験動物における標準的な製薬学的手順に従って決定することができる。これらの動物実験から得られたデータは、ヒトで用いる用量範囲の策定に利用することができる。用量は、採用する剤型および利用する投与経路によって異なり得る。的確な製剤、投与経路、および用量は、患者の状態を考慮して、個々の医師によって選択され得る（例えば、Ｆｉｎｇｌ，ｅｔ  ａｌ．，１９７５，ｉｎ“Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ”，Ｃｈ．１  ｐ．１を参照のこと）。
【０１８８】
投薬量および間隔は、正常血糖（最小有効濃度、ＭＥＣ）を誘導するのに十分な細胞数をもたらすように、個別に調節しうる。ＭＥＣは、製剤ごとに異なるであろうが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏデータから推定し得る。ＭＥＣを実現するために必要な用量は、個々の特性および投与経路に依存するであろう。検出アッセイを、血漿中濃度を決定するために使用することができる。
【０１８９】
投与する組成物の量は、当然ながら、処置している対象、疾病の重篤度、投与のやり方、処方する医師の判断などに依存するであろう。
【０１９０】
本発明の組成物は、必要であれば、パックまたは分注装置、例えばＦＤＡが承認したキット、で提供してもよく、それらは活性成分を含む１または複数の単位投与剤型を含んでいてもよい。パックは、例えば、ブリスターパックのように、金属またはプラスチックのホイルを含んでいてもよい。パックまたは分注装置には、投与指示書が添付されていてもよい。パックまたは分注器はまた、医薬品の製造、使用、または販売を規制している政府機関が規定する形態で、容器に付けられる注意書きに適応していてもよく、前記注意書きは、組成物の形態、またはヒトもしくは動物への投与に関する政府機関による承認を反映している。このような注意書きは、例えば、処方薬に関する、米国食品医薬品局によって承認されたラベルの注意書きであってもよく、承認された製品への差し入れ物であってもよい。適合する医薬担体で製剤化された、本発明の調製物を含む組成物もまた、上記部分でさらに詳述されているかのごとく、調製し、適切な容器に入れ、指示された状態を処置するためのラベルを付けることができる。
【０１９１】
本出願から生じた特許の期間中に、多くの関連する抗ウイルス／抗菌剤が開発されるであろうことが予期され、用語抗ウイルス／抗菌の範囲は、先験的に、このような新たなテクノロジーの全てを含むことを意図している。
本明細書で用いられる場合、用語「約（ａｂｏｕｔ）」は、±１０％を指す。
【０１９２】
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、およびこれらの活用形は、「含むが、これらに限定されない」を意味する。
【０１９３】
用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」は、「含み、これらに限定される」を意味する。
【０１９４】
用語「から本質的になる」は、組成物、方法、または構造が、追加の成分、工程および／または部分を含み得ることを指すが、追加の成分、工程、および／または部分が、クレームした組成物、方法、または構造の基本的かつ新たな特性を実質的に変えない場合に限られる。
【０１９５】
本明細書で用いられる場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、明らかに文脈に反しない限り、複数形への言及を含む。例えば、用語「化合物（ａ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」、または「少なくとも１つの化合物」は、複数の化合物を含んでもよく、その混合物も含み得る。
【０１９６】
本出願全体にわたって、本発明の種々の実施形態が範囲の形式で示されているであろう。範囲の形式での記載は、便宜および簡潔のために過ぎず、本発明の範囲に対する硬直的な限定と解釈すべきではないことを理解すべきである。したがって、範囲の記載は、その範囲内の、可能な全てのサブレンジ、ならびに個々の数値を具体的に開示しているものとみなすべきである。例えば、１〜６のような範囲の記載は、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６などのサブレンジ、ならびにこの範囲内の個々の数値、例えば、１、２、３、４、５、および６を具体的に開示しているものとみなすべきである。これは、範囲の広さとは無関係にあてはまる。
【０１９７】
本明細書で数値範囲が示されている場合はいつでも、示された範囲内の、引用されたあらゆる数値（分数または整数）を含むことを意味する。第１の指示数および第２の指示数の間の「範囲（ｒａｎｇｉｎｇ／ｒａｎｇｅｓ）」、ならびに第１の指示数から第２の指示数までの「範囲（ｒａｎｇｉｎｇ／ｒａｎｇｅｓ」、という語句は、本明細書において互換的に用いられ、第１の指示数および第２の指示数、ならびにその間の全ての分数および整数を含むことを意味する。
【０１９８】
本発明の特定の特徴は、明確性のために、別々の実施形態の文脈中に記載されているが、単一の実施形態の中で組み合わせて提供することもできることが理解される。逆に、本発明の種々の特徴は、簡潔性のために、単一の実施形態の文脈中に記載されているが、別々に提供すること、もしくは適切なあらゆるサブコンビネーションで提供すること、または他に記載された本発明のあらゆる実施形態において適切なように提供することができる。種々の実施形態の文脈中に記載された特定の特徴は、その実施形態がそれらの要素なしでは機能しない場合を除き、それらの実施形態の不可欠な特徴とみなすべきではない。
【０１９９】
上述の部分で記載し、下記の特許請求の範囲の項目で記載した、本発明の種々の実施形態および態様には、以下の実施例における実験的なサポートがある。
【実施例】
【０２００】
以下の実施例を参照し、上記の詳細な説明と合わせて、本発明のいくつかの実施形態を、非限定的な様式で例証する。
【０２０１】
一般に、本明細書で用いられる命名法および本発明で利用される実験手順としては、分子的、生化学的、微生物学的、および組換えＤＮＡ技法が挙げられる。このような技法は、文献で十分に説明されている。例えば、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）；“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＩＩ  Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．，ｅｄ．（１９９４）；Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ（１９８９）；Ｐｅｒｂａｌ，“Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ”，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８）；Ｗａｔｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ”，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｂｉｒｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ）“Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ”，Ｖｏｌｓ．１−４，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９８）；米国特許第４，６６６，８２８号明細書；米国特許第４，６８３，２０２号明細書；米国特許第４，８０１，５３１号明細書；米国特許第５，１９２，６５９号明細書；米国特許第５，２７２，０５７号明細書に記載された方法論；“Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ”，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＩＩ  Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．  Ｅ．，ｅｄ．（１９９４）；“Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ−Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ”ｂｙ  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９９４），Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ；“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＩＩ  Ｃｏｌｉｇａｎ  Ｊ．Ｅ．，ｅｄ．（１９９４）；Ｓｔｉｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ），“Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”（８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ａｐｐｌｅｔｏｎ＆Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ（１９９４）；Ｍｉｓｈｅｌｌ  ａｎｄ  Ｓｈｉｉｇｉ（ｅｄｓ），“Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８０）を参照のこと；利用可能なイムノアッセイは、特許および学術文献に広く記載されており、例えば、米国特許第３，７９１，９３２号明細書；米国特許第３，８３９，１５３号明細書；米国特許第３，８５０，７５２号明細書；米国特許第３，８５０，５７８号明細書；米国特許第３，８５３，９８７号明細書；米国特許第３，８６７，５１７号明細書；米国特許第３，８７９，２６２号明細書；米国特許第３，９０１，６５４号明細書；米国特許第３，９３５，０７４号明細書；米国特許第３，９８４，５３３号明細書；米国特��第３，９９６，３４５号明細書；米国特許第４，０３４，０７４号明細書；米国特許第４，０９８，８７６号明細書；米国特許第４，８７９，２１９号明細書；米国特許第５，０１１，７７１号明細書；および米国特許第５，２８１，５２１号明細書；“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”  Ｇａｉｔ，Ｍ．  Ｊ．，ｅｄ．（１９８４）；“Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ”  Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．，ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．，ｅｄｓ．（１９８５）；“Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ”  Ｈａｍｅｓ，Ｂ．  Ｄ．，ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．  Ｊ．，ｅｄｓ．（１９８４）；“Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ”  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．  Ｉ．，ｅｄ．（１９８６）；“Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ”ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８６）；“Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ”Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．，（１９８４）ａｎｄ  “Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”Ｖｏｌ．１−３１７，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；“ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）；Ｍａｒｓｈａｋ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ”  ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）を参照のこと；（これら全ては、参照によりあたかも本明細書に全て記載されているかのように組み込まれる）。その他の一般的な参考文献は、本文書全体にわたって示されている。それらの参考文献中の手順は、当業者に周知であると考えられ、読者の便宜のために提供する。参考文献中に含まれる情報は、全て参照により本明細書に組み込まれる。
材料および方法
【０２０２】
インフルエンザウイルスおよび肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）バクテリア剤マウス馴化ＰＲ８ウイルス、すなわちインフルエンザＡ／プエルトリコ／８／３４（Ａ／ＰＲ／８／３４，Ｈ１Ｎ１）、を、鶏卵羊膜で持続的に増殖させ、インフルエンザ有効力価を、以前の報告通りに定量した（Ａｃｈｄｏｕｔ，ｅｔ  ａｌ．，２００３）。肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ））の莢膜を有する株であるＤ３９タイプ２株を、トッド−ヒューイットブロス（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で増殖させた。
単離およびマウスの感染のために、細菌を、３％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ヒツジ赤血球を補足したトリプチックソイ寒天（Ｈｙｌａｂ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）上で、３７℃で終夜増殖させ、次いで４０００ｇ、２０分間の遠心によって収集して細菌をペレット化し、それを所望の濃度に希釈した。
【０２０３】
感染手順  雌性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（４〜５週齢）をケタミン−キシラジンで麻酔し、５０μｌの希釈したウイルスを鼻腔内に接種した。インフルエンザＡ／プエルトリコ／８／３４（Ａ／ＰＲ／８／３４、Ｈ１Ｎ１）株、９×１０７ＰＦＵ／ｍｌ、ＨＡ  １：１，０２４を含有する同一のストックを、全ての実験に使用した。インフルエンザ感染の病因を研究するために、致死量に等しい４×１０３ＰＦＵのインフルエンザＰＲ８ウイルスを、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの鼻腔内に感染させた。マウスは、感染から３、７、１１、２６、３２、４９、７４、９８、１２２、１４８時間後に屠殺し、肺を回収してＲＮＡを単離するためにホモジナイズした。抗ＭＴ１−ＭＭＰ阻害剤の有効性を、単一ウイルス感染モデル、および肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（致死量に達しない８００ＰＦＵを用いた）を組み合わせた二重感染モデルの両方において研究するために、適宜希釈して同じ経路で投与した。肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）は、３％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ヒツジ赤血球を補足したトリプチックソイ寒天（Ｈｙｌａｂ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）上で増殖させた。肺炎球菌を無菌ＰＢＳで希釈し、ウイルス感染の４日後に３０ＣＦＵの用量で、容積５０μｌを鼻腔内に投与した。マウスを麻酔し、接種の間、立位に保った。マウスは、加重し、少なくとも１日１回、疾病および死亡をモニターした。全ての動物手順は、ＩＡＣＵＣのガイドラインに従って実施し、ワイツマン科学研究所の委員会によって承認された。
【０２０４】
動物の処置  マウスは、単一感染実験ならびに重複感染実験において、注射あたり合計量１００μｌで、毎日腹腔内投与によって、３ｍｇ／ｋｇのＬＥＭ２／１５Ｆａｂフラグメントで処置された。ＧＳＴ−Ｆａｂ（本文中では対照Ｆａｂとして示されている）は、非関連対照としての役割を果たし、ＬＥＭ２／１５処置群と同じ用量で投与された。ＰＢＳは、ビヒクル対照として用いた。
【０２０５】
ＬＥＭ２／１５（抗ＭＴ１−ＭＭＰ抗体）の精製  ＬＥＭ−２／１５のハイブリドーマ細胞は、ＤＣＣＭ（ハイブリドーマ細胞の増殖およびモノクローナル抗体の産生のために設計された無血清培地、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓから購入）で増殖させた。細胞を１９３ｇの遠心によって沈殿させ、上清を集めた。上清を、２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ８）に対して透析した。１ｍｌのＨｉＴｒａｐ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ＨＰカラムを１００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ８）で平衡化し、上清を１ｍｌ／分で負荷した。抗体を、１００ｍＭクエン酸バッファー（ｐＨ６）で溶出させ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌに対して透析した。
【０２０６】
パパインによる抗体消化  パパインを、０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、５ｍＭジチオスレイトール中、３７０℃で１５分間活性化した。活性型パパインを、インタクトなＬＥＭ−２／１５の溶液に１：１，０００の割合で加え、消化処理を３７０℃で３時間行った。消化反応を、２０ｍＭヨードアセトアミドを加え、暗所、室温、３０分間で終了させた。Ｆａｂフラグメントを、プロテインＡカラムによってＦｃから分離し、素通り画分からＦａｂフラグメントを集め、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌに対して透析した。Ｆａｂフラグメントの純度は、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルによって推定した。純粋なＦａｂフラグメントをフィルターにかけて無菌性を確実にし、使用まで−８０℃の条件で保存した。
【０２０７】
グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）−Ｆａｂフラグメント  全ＧＳＴ抗体から、上記の部分に記載したようにして（パパインによる抗体消化）、Ｆａｂフラグメントを作製した。
【０２０８】
ウイルス負荷および細菌負荷の定量  肺におけるウイルス力価は、ＭＤＣＫ細胞上で器官ホモジネートを滴定することによって決定し、プラーク形成単位（ＰＦＵ）は、（Ｏｋｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）に記載されているようにして定量した。肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）レベルは、滴定した量の器官ホモジネートを、３％ヒツジ赤血球（Ｈｙｌａｂ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を補足したトリプチックソイ寒天プレート上で培養することによって決定した。器官は、ＧｅｎｔｌｅＭＡＣＳを用いて、ＰＦＵのためには、１ｍｌの適切なバッファーで、または肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）についてのＣＦＵのためには、１０ｍｌの滅菌水でホモジナイズした。ウイルス負荷もまた、以前に患者のウイルスの検出に関して記載されているようにして（Ｈｉｎｄｉｙｅｈ，ｅｔ  ａｌ．，２００５）、ｑＰＣＲを用いて定量した。肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の同定は、以前に記載されているようにして（Ｏｇｕｎｎｉｙｉ，ｅｔ  ａｌ．，２００２）、ｑＰＣＲを用いて行った。メイディン・ダービー・イヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞上で滴定したインフルエンザＡ（Ａ／ＰＲ／８／３４）ウイルスの段階希釈物は、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）によってインフルエンザウイルス量を決定するための標準品として用い、ｑＰＣＲ結果をウイルス負荷数に変換した。
【０２０９】
ＲＮＡの単離  肺を取り出し、直ちにＲＮＡ  Ｌａｔｔｅｒ溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に移した。ＲＮＡ単離のために、ＱＩＡｚｏｌ存在下で肺を小片に切断し、ＳＰＥＸ  ＣｅｒｔｉＰｒｅｐホモジナイザーを用いてホモジナイズし、全ＲＮＡをｍｉＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）で抽出した。ＲＮＡ  ｉｎｔｅｇｒｉｔｙを決定し（Ｔａｐｅｓｔａｔｉｏｎ、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、Ｑｕｂｉｔ  Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ定量装置（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で濃度を測定した。
【０２１０】
ＲＮＡシークエンシングライブラリの調製ＲＮＡシークエンシングのために、（Ｊａｉｔｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，２０１４）に記載されているように、ＭＡＲＳ−ｓｅｑ技法の派生法を用いた。簡潔に言えば、全ＲＮＡを、化学的な加熱処理（９５℃）を４時間３０分にわたって行うことにより、平均サイズが３００ヌクレオチドのフラグメントに断片化した（ＮＥＢＮｅｘｔ  Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ  ＲＮＡ  Ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｍｏｄｕｌｅ）。３’ポリアデニル化フラグメントを、ポリｄＴビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で選択することによって濃縮した。鎖特異的なｃＤＮＡを、ポリＴ−ＶＮオリゴ（１８Ｔ）およびＡｆｆｉｎｉｔｙ  Ｓｃｒｉｐｔ逆転写酵素（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いて合成した。二本鎖ＤＮＡを、Ｓｅｃｏｎｄ  ｓｔｒａｎｄ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｋｉｔ  （ＮＥＢ）を用いて得た。ＤＮＡの末端を、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼおよびＴ４ポリメラーゼ（ＮＥＢ−Ｎｅｘｔ）を用いて修復した。クレノウ酵素（ＮＥＢ−Ｎｅｘｔ）を用いて、アデニン塩基の残基を５’末端に付加した後、各フラグメントにｂａｒｃｏｄｅ  Ｉｌｌｕｍｉｎａ互換性アダプター（ＩＤＴ）をライゲートした。洗浄したＤＮＡフラグメントを、ライゲートしたアダプターに特異的なプライマー（ＩＤＴ）を用いてＰＣＲ（１２サイクル）で増幅させた。各ライブラリの品質は、ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ（Ａｇｉｌｅｎｔ）によって解析した。
【０２１１】
ＲＮＡ−Ｓｅｑデータの前処理  ＲＮＡ−ｓｅｑは、Ｌａｖｉｎら（２０１４）が記載しているようにして行った。簡潔に言えば、全ての読み取りデータ（全肺（図１）から、および細胞集団（図８）からの両方とも）を、ＴｏｐＨａｔ  ａｌｉｇｎｅｒを用いて、マウスリファレンスゲノム（ＮＣＢＩ３７／ＭＭ９）に対してアラインさせた。正規化した発現テーブルを、負の二項分布および局所回帰モデルに基づく、ＥＳＡＴ  ｇａｒｂｅｒｌａｂｄｏｔｕｍａｓｓｍｅｄｄｏｔｅｄｕ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｅｓａｔ／を用いて作成した。データ操作：値が１度だけ０超であった遺伝子をテーブルから除外する；データの結果が３３である（ノイズは３２にセットした）７５パーセンタイルを計算する；列の最大値を見つけ、最大値が＜３２であった場合は除外する；ｘ＋３２のとしてのｌｏｇ２の値；平均複製数；最大値が、０．８分超（２倍ではなく、１．７５倍であることに留意）である列はそのままにする；２０クラスターについてのｍａｔｌａｂにおけるＫ平均；遺伝子Ｅにおいて、視覚目的の写真についてのクラスターを手作業で順に並べた。
【０２１２】
ｑＰＣＲ：  全ＲＮＡを、ｈｉｇｈ  ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて逆転写し、ｃＤＮＡにした。ＲＴ−ＰＣＲを、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０  ＳＹＢＲ  ｇｒｅｅｎ  Ｉマスターミックス（Ｒｏｃｈｅ）で、正規化のためにＧＡＰＤＨおよびβ−アクチンを用いて、３重で行った。プライマーのリストを、以下の表２Ａに示す。
【表２Ａ】
0006783777.tif 000003
【０２１３】
ゲル内タンパク質分解および質量分析  肺試料を、２％Ｔｒｉｔｏｎを補足した０．５％ＥＤＴＡを用いて、２４時間振盪して脱細胞化した。次いで試料を、Ｓｐｅｅｄｖａｃを用いて脱水し、加重した。次いで、試料を（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ７．４）中のＴＮＣバッファー中で、容積１２０μｌ、３０℃で、２４時間振盪して、５００ｎＭの活性化ＭＭＰ−１３を用いて、溶液内消化させた。活性化ＭＭＰ−１３の容積および濃度は、各試料の重量に従って調節し、各試料は２重で実施した。タンパク質抽出物を、短時間用のＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。ゲル中のタンパク質は２．８ｍＭ  ＤＴＴ（６０℃、３０分間）で還元し、１００ｍＭ炭酸水素アンモニウム中、８．８ｍＭヨードアセトアミド（暗所、室温、３０分間）で変性させ、１０％アセトニトリルおよび１０ｍＭ炭酸水素アンモニウム中、修飾トリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ）、酵素−基質比１：１０、終夜、３７℃で消化した。さらに、２回目のトリプシン処理を４時間行った。得られたトリプシンペプチドを、Ｒｅｐｒｏｓｉｌ逆相材料（Ｄｒ  Ｍａｉｓｃｈ  ＧｍｂＨ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を充填した０．０７５×２００ｍｍの溶融シリカキャピラリー（Ｊ＆Ｗ）で逆相クロマトグラフィーによって分離した。ペプチドは、流速０．２５μｌ／分で、７〜４０％の９５分間のリニアグラジエントと、８分間の９５％アセトニトリル／０．１％ギ酸（水中）によって溶出させた。質量分析は、イオントラップ質量分析計（Ｏｒｂｉｔｒａｐ  ＸＰ、Ｔｈｅｒｍｏ）によって、ポジティブモードで、反復的ＭＳフルスキャンを用いて行い、続いて最初のＭＳスキャンから選んだ７つの最も顕著なイオンについて、衝突誘起解離（ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）（ＣＩＤ）を用いて行った。
【０２１４】
質量分析データは、ＭａｘＱｕａｎｔ  １．３．０．５ソフトウェアを用いて、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベースのマウスセクションを、マストレランスを前駆体質量に対して２０ｐｐｍに設定して検索し、解析した。ペプチドレベルおよびタンパク質レベルの偽発見率（ＦＤＲ、ｆａｌｓｅ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｒａｔｅ）は、ターゲットデコイストラテジー（ｔａｒｇｅｔ−ｄｅｃｏｙ  ｓｔｒａｔｅｇｙ）を用いて、１％でフィルタリングした。タンパク質テーブルは、リバースデータベースからの同定、ならびに一般的な混入物および単一ペプチドの同定を除外するためにフィルタリングした。データは、前記と同じソフトウェアを用いて、ペプチドに関する抽出したイオンカレント（ＸＩＣ、ｅｘｔｒａｃｔｅｄ  ｉｏｎ  ｃｕｒｒｅｎｔ）に基づいて、ラベルフリー分析によって定量した。抽出したイオンカレント（ＸＩＣ）によって、あらゆる実験において同定した各ペプチドの各ＬＣ／ＭＳ測定からの定量が可能となる。ＥＣＭ関連タンパク質を探索するために、ＧＯＲＩＬＬＡ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓを用いてアノテーションを決定した。
【０２１５】
ウェスタンブロット  肺試料を、ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）をメーカーの使用説明書に従って使用して、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ）を含む、５００μｌのｒｉｐｐａバッファーを用いてホモジナイズした。次いで、タンパク質レベルをＢＣＡキット（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて測定し、２重で、小型電気泳動装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで泳動した。分離したポリペプチドを、２５％メタノールを含むトリスグリシンバッファー中でニトロセルロース膜に転写した。膜を５％粉乳でブロッキングし、次いでヤギ抗ＭＭＰ−８抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚ）、ウサギ抗ＭＭＰ−９抗体（Ａｂｃａｍ）、またはウサギ抗ＭＴ１ＭＭＰ抗体（Ａｂｃａｍ）とインキュベートした。各手順において、アッセイ間の変動を避けるために、ウサギ抗ＧＡＰＤＨ抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚ）を含めた。ニトロセルロース膜を、ヤギ抗ウサギＨＲＰ標識抗体（Ａｂｃａｍ）、またはウシ抗ヤギＨＲＰ標識抗体（Ｓｉｇｍａ）とインキュベートした。膜は、ＥＺ−ＥＣＬ化学発光検出キット（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）を用いて現像した。各アッセイにおいて、タンパク質分子量標準品（ＰａｇｅＲｕｌｅｒ  Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｌａｄｄｅｒ、Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を含めた。
【０２１６】
画像化のための肺の調製物  肺を、ｉｎ  ｓｉｔｕザイモグラフィのためにＰＢＳを用いて膨らませ、またはその他の画像化のために４％ＰＦＡを用いて膨らませた。これは、気管を露出させ、２２Ｇ、０．８×２５ｍｍのカニューレ（Ｃａｔｈｙ  ＩＶカニューレ、ＨＭＤ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＬＴＤ）を挿入し、５ｍｌの流体を注入することによって行った。カニューレは、漏出を防ぐために気管に結紮した。マウス肺を感染後種々の時点で採取し、ＯＣＴ中に包埋し、分析まで−８０℃で凍結させた。
【０２１７】
２光子顕微鏡法および第二次高調波発生  画像化前に、肺を３００μｍに薄切し、ただちに２光子顕微鏡を用いて可視化した（Ｗｅｉｚｍａｎｎ  ｉｎｓｔｉｔｕｔｅのｉｎ  ｖｉｖｏイメージングユニット（２ＰＭ：Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ５１０  ＭＥＴＡ  ＮＬＯ；２光子励起のために、Ｓｐｅｃｔｒａｐｈｙｓｉｃｓからの、７００〜１，０２０ｎｍの広帯域自動波長可変装置付、広帯域Ｍａｉ  Ｔａｉ−ＨＰフェムト秒シングルボックス波長可変チタンサファイア発振器を装備）内で、前記可視化を行った）。第二次高調波によるコラーゲンの画像化のために、８００ｎｍの波長を用いた（４００ｎｍで検出）。
【０２１８】
インタクトな肺組織および肺ＥＣＭスキャフォールドのＡｉｒＳＥＭイメージングおよびＳＥＭイメージング  固定した肺を、３００μｍ切片に薄切した。切片を大量のＰＢＳ中で３回洗浄し、ＯＣＴ残存物を除去し、次いでＤＤＷで３回洗浄した。組織の画像化のために、薄片をＳｕｐｅｒＦｒｏｓｔ  Ｐｌｕｓガラススライド上にそっと置き、以前に記載されているようにして染色した。簡潔に言えば、切片を、ＤＤＷを用いて洗浄し、０．１Ｍカコジル酸ナトリウムバッファーｐＨ７．４（分析用スタンダード、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）中、０．１％ルテニウムレッド（ＥＭグレード、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で１５分間染色した。次いで、切片を、ＤＤＷで十分に洗浄し、２％酢酸ウラニル溶液で１０分間染色した。次いで、試料をＤＤＷで洗浄し、ａｉｒＳＥＭ（商標）観察の前に、空気中、室温で５〜７分間乾燥させた。ＥＣＭスキャフォールドは、最初に、２％Ｔｒｉｔｏｎを補足した０．５％ＥＤＴＡを用いて２４時間脱細胞化した。染色は、以前に記載されているようにして行った。通常の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）試料は、２ｋＶで稼働させるＵｌｔｒａ  ５５  Ｆｅｇ  Ｚｅｉｓｓ  ＳＥＭを用いたＳＥＭイメージング用の標準的な試料調製手順に従って、エタノールシリーズで濃度を１００％エタノールに高めながらさらに脱水し、臨界点乾燥装置で乾燥させ、Ａｕ−Ｐｄ（金／パラジウム）でコーティングした。
【０２１９】
免疫組織化学  免疫組織化学は、標準的な技法を用いて、１０μｍ凍結切片で行った。切片は、４％ＰＦＡで固定し、３％ＢＳＡでブロックし、ウサギ抗ラミニン一次抗体（Ｓｉｇｍａ）、ウサギ抗ルミカン一次抗体（ａｂｃａｍ）、もしくはウサギ抗コラーゲンＩＶ一次抗体、またはＦ４／８０およびＣＤ４５細胞表面タンパク質に対するラット一次抗体（ａｂｃａｍ）と終夜インキュベートした。ＬＥＭ２／１５を、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５タンパク質に、ラベリングキット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を用いて、メーカーの使用説明書に従ってコンジュゲートした。次いで、切片をＰＢＳで洗浄し、ヤギ抗ウサギＨＲＰ標識抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ）とインキュベートした。それぞれ、フルオレセインまたはＣｙ３標識抗ＨＲＰキット（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｈｌｍｅｒ）を用い、次いでＤＡＰＩ染色（Ｓｉｇｍａ）を行い、ｉｍｍｕｎｅ−ｍｏｕｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でマウンティングした。試料は、ニコン８０ｉ  ＥＣＬＩＰＳＥ顕微鏡で画像化した。
【０２２０】
Ｉ型コラーゲンｉｎ  ｓｉｔｕザイモグラフィ  非固定化肺試料を、１０μｍ切片に薄切し、穏やかに洗浄してＯＣＴを除去した。洗浄後、１ｍｇ／ｍｌのＤＱ  Ｉ型コラーゲン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を、ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇバッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２）で４０ｍｇ／ｍｌに希釈した。
試料を、３７℃で４時間インキュベートした。４％パラホルムアルデヒドで反応を停止させ、次いで必要な免疫染色を行い、ｉｍｍｕｎｅ−ｍｏｕｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でマウンティングし、ニコン８０ｉ  ＥＣＬＩＰＳＥ顕微鏡で画像化した。
【０２２１】
線維配向解析における相対度数  画像解析は、Ｆｉｊｉ  ｐａｃｋａｇｅのＤｉｒｅｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ解析によって行った。    
【０２２２】
フローサイトメトリー  感染および対照非感染Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスからの肺を、冷ＰＢＳ中に浸漬し、１０％ウシ胎仔血清を含む５ｍｌのＤＭＥＭ（ＦＡＣＳバッファー）中で小片に切断した。細胞懸濁液を、１ｍｌシリンジカップを用いて、７０ｌｍセルストレーナー（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ）ですりつぶした。細胞を、氷冷ＰＢＳで洗浄した。残った赤血球は、塩化アンモニウム溶液（Ｓｉｇｍａ）を用いて溶解させた。細胞を回収し、１ｍｌのＦＡＣＳバッファー［ＰＢＳ＋２％ＦＣＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ］に浸漬した。肺細胞は、以下の複数の表面抗原に対する抗体、すなわちＰＥ標識ＬＥＭ２／１５抗体（抗マウスＭＴ１−ＭＭＰ抗体）、ＰｅｒＣＰ／ｃｙ５．５標識抗マウスＣＤ４５抗体（クローンＦ１１）またはＰａｃｉｆｉｃ  ｂｌｕｅ−抗マウスＣＤ４５抗体、ＡＰＣ−Ｃｙ７標識ＥＰＣＡＭ抗体、ＡＰＣ標識抗ＣＤ１１ｂ抗体、ＰｅｒＣＰ／ｃｙ５．５−抗マウスＬｙ６Ｃ抗体、ＦＩＴＣ−抗マウスＬｙ６Ｇ抗体（クローン１Ａ８）、ＦＩＴＣ抗マウスＮＫｐ４６抗体、ＦＩＴＣ抗マウス−ＴＣＲ−β抗体で染色した。フローサイトメトリーを、ＦＡＣＳＡｒｉａＩＩＩフローサイトメーター（ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて実施し、データを、ＦｌｏｗｊｏＶ  １０．０．８ソフトウェアを用いて解析した。非感染対照マウスおよび感染マウスからのソートした細胞を、ＰＢＳで処理し、さらに上記のＲＮＡ抽出のセクションに記載したようにしてＲＮＡを抽出し、ＲＮＡ−ＳｅｑプロファイリングおよびｑＰＣＲを用いてシーケンシングした。
【実施例１】
【０２２３】
細胞外マトリックス遺伝子は、インフルエンザ感染の間に誘導される
【０２２４】
インフルエンザ感染（ｉｎｆｌｅｃｔｉｏｎ）が宿主のＥＣＭ領域に対して与える影響を体系的に説明するために、ゲノム全域にわたるＲＮＡ−ｓｅｑを用いて、７日間にわたるインフルエンザ過程の間の、全肺組織の経時的な転写応答を測定した（Ａｌｔｂｏｕｍ，ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。遺伝子発現を、感染後１０の時点で測定した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、致死用量または致死量に達しない用量のマウス馴化ＰＲ８インフルエンザＡ  Ｈ１Ｎ１ウイルスの鼻腔内接種によって感染させた。ＰＲ８感染は、厳しい肺胞伝播、急性肺出血、および激しい宿主応答からなるインフルエンザ感染モデルとして広く用いられる（Ｍｏｒｅｎｓ，ｅｔ  ａｌ．，２００８；Ｔａｔｅ，ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｔａｕｂｅｎｂｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｍｏｒｅｎｓ，２００６；Ｗａｔａｎａｂｅ，ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。疾患の進行とともに、感染から２４〜４８時間後に、肺におけるウイルス負荷量の増加と共に、症状が現れ、体重減少が起きる（図６Ｄ）。予測されるように、インフルエンザ感染は、炎症走化性（ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ１０、Ｉｌ１ｂ、Ｉｌ１ｒ）、ウイルス感染に対する防御（ＩＳＧ１５、ＩＦＮＢ１、ＩＲＦ７、ＩＦＩＴ１、およびＩＦＩＴ３）、および種々のケモカイン（ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＸＣＬ２）に関連する遺伝子の誘導、ならびに肺の恒常性（セクレトグロビン、および関連する転写因子（例えば、ＮＫｘ２．１））に関連する遺伝子のダウンレギュレーションをもたらした（図１Ａ）。さらに、感染に続いてダウンレギュレートされる遺伝子は、酸素還元過程、表面活性物質（ＳＦＴＰＡ１，ＳＦＴＰＣ）の恒常性、インテグリン、カドヘリン、クローディン（ＣＬＤＮ１８、ＩＴＧＢ２、ＣＤＨ５）などの細胞間接着分子、ならびに脂質代謝（ＡＰＯＥ、ＡＰＯＣ１、ＡＰＯＡ１ＢＰ）遺伝子に属している場合が多い。統計的に有意にアップレギュレートされるさらなる遺伝子は、以下の表２Ｂに示すものである。
【表２Ｂ】
0006783777.tif 000004
0006783777.tif 000005
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【０２２５】
遺伝子の多くのグループが、巨大分子の代謝およびプロテアーゼ合成を含む、ＥＣＭリモデリングに関与していることは、特に注目される（図１Ａ）。注目すべきことに、この遺伝子グループは、感染期間を通じて極めて過剰に表れており、複数のＥＣＭリモデリングイベントに関与する、幅広い経路パネルを示している（図１Ａ〜Ｃ）。タンパク質分解、コラーゲンリモデリングおよび異化、線維素溶解、創傷治癒，恒常性、ならびに細胞遊走（ｐ≦１０−４）に関与する細胞外モジュレーター関連の機能的カテゴリーが富化すること明らかとなり、感染から７４時間後に最大となった（図１Ｂ）。合わせて３５３０個の特異的発現遺伝子のうち、４７９個（１３．６％）がＥＣＭリモデリングに関与している。これらには、セリンプロテアーゼ、リジルオキシダーゼ、カテプシン、ディスインテグリン（ＡＤＡＭ）、メタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）、およびそれらの天然の阻害剤（ＴＩＭＰ）が含まれ、種々のＥＣＭ成分のターンオーバーを決定する、ＥＣＭモディファイアーとして働く。この遺伝子グループの中で、ＲＮＡレベル（倍率変化４００；図１Ｄ）と、タンパク質レベル（感染から４８時間後（図６Ａ〜Ｂ））の両方における、ＭＴ１−ＭＭＰの強い誘導が見られた。定量的リアルタイムＰＣＲを用いて、ＭＴ１−ＭＭＰの発現における経時的な変化、ならびにＭＭＰファミリーに属し（ＭＭＰ−３、８、および９）、ＥＣＭをモジュレートする（図６Ａ、Ｂ、Ｃ）、その他の代表的な遺伝子の発現における経時的な変化を確証した。
【実施例２】
【０２２６】
ＭＴ１−ＭＭＰ発現は、インフルエンザ感染後、骨髄細胞内で誘導される
【０２２７】
感染過程の間にＭＴ１−ＭＭＰの供給源として働く細胞集団を同定するために、フローサイトメトリーを実施した。非感染肺におけるＭＴ１−ＭＭＰ発現細胞集団の中で、圧倒的多数は非造血性細胞集団（ＣＤ４５−、８９．５％）であり、一方わずか１０．５％が造血細胞起源（ＣＤ４５＋）であった（図２Ａ）。感染後、ＣＤ４５＋のＭＴ１−ＭＭＰ発現集団は、４倍（４０．９％）に増加した。特に、免疫細胞のＣＤ１１ｂ＋のＭＴ１−ＭＭＰ＋部分は、３２．９％から６４．９％に増加し、一方非造血性（ＣＤ４５−）のＭＴ１−ＭＭＰ発現細胞は、２分の１に減少した（図２Ａ）。ヒストグラムプロット（図２Ｂ）は、感染後に全体的なＭＴ１−ＭＭＰ発現が増加（図２Ｂ）していることをさらに示しており、感染後にＭＴ１−ＭＭＰが減少している肺上皮細胞（図２Ｂ）とではなく、ＣＤ１１ｂ＋細胞におけるＭＴ１−ＭＭＰ発現の増加と関連している可能性がある（図２Ｂ）。感染前および感染している間の、ソーティングしたＣＤ４５＋集団におけるＭＴ１−ＭＭＰ発現と、ソーティングしたＣＤ４５−集団におけるＭＴ１−ＭＭＰ発現との対比を、ｑＰＣＲを用いてＲＮＡレベルでさらに確認した（図２Ｃ）。インフルエンザに感染した肺におけるＭＴ１−ＭＭＰマーカーならびにＦ４／８０マーカーの免疫染色により、感染から７４時間後に、ＭＴ１−ＭＭＰ発現細胞はＦ４／８０陽性細胞と大部分が共局在しているという、発明者らの観察が確証される。マクロファージは、いずれもＣＤ１１ｂ＋かつＦ４／８０＋の免疫細胞であるため、これらの発見は、マクロファージが感染後のＭＴ１−ＭＭＰの重要な供給源であることを示唆している（図７Ａ矢じり、図７Ｂ）。インフルエンザに感染した肺のコラゲナーゼ活性をモニターするために、ｉｎ  ｓｉｔｕザイモグラフィを用いた。感染後、コラーゲン分解活性は、大部分がＣＤ４５＋細胞と関連しており、ＣＤ４５−細胞は、感染した肺の気管支内を覆っていることが見いだされた（図７Ｃ矢印、図７Ｄ）。
【０２２８】
感染前および感染後（７４時間）の、ＭＴ１−ＭＭＰ発現集団をさらに特徴付けするために、ソーティングしたＭＴ１−ＭＭＰ発現ＣＤ４５＋副次集団と、ソーティングしたＭＴ１−ＭＭＰ発現ＣＤ４５−副次集団に対してＲＮＡ−ｓｅｑ分析を行った。全部で２１６９個の遺伝子が、ＣＤ４５＋集団とＣＤ４５−集団の両方における非感染細胞と比較して、感染後に細胞に特異的に発現していることが見いだされた（図８）。全肺ＲＮＡ−ｓｅｑからの分析結果と矛盾なく、ＭＴ１−ＭＭＰを発現している免疫細胞（ＣＤ４５＋）および間質性細胞（ＣＤ４５−）の両方において、炎症性シグナリング経路の活性化およびサイトカイン産生が、感染後に増大していることが観察された（図８）。特に、免疫細胞は、サイトカイン（ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＸＣＬ２、ＩＬ１ｂ）および抗ウイルス応答遺伝子（例えば、ＳＬＦＮ４、ＩＦＩＴ１、およびＩＦＩＴ２）の顕著なアップレギュレーションを示したが、間質性細胞は、表面活性物質産生などの肺恒常性機能に関連する遺伝子（例えば、ＳＦＴＰＢ、ＳＦＴＰＣ）のダウンレギュレーションを示した。免疫系集団は、単球／マクロファージ／ＤＣマーカー（例えば、ＣＤ１１ｂ）発現の増加と、複数のＢ細胞マーカー（例えば、ＣＤ１９、ＣＤ３７、ＣＤ７９）発現の減少とを示した。よって、感染後のＭＴ１−ＭＭＰ発現は、骨髄性コンパートメントからの活性化した免疫細胞と関連している（図８）。
【実施例３】
【０２２９】
インフルエンザ感染は、ＥＣＭ構造およびＥＣＭ構成の破壊を誘導する
【０２３０】
ＭＴ１−ＭＭＰは、線維性コラーゲン、ラミニン、およびその他のＥＣＭ成分の分解による、がん関連の浸潤過程において主要な役割を果たす。インフルエンザ感染におけるＭＴ１−ＭＭＰの機能的役割を評価するために、感染前および感染後に、細胞内コンパートメントがない（脱細胞化された）肺組織の質量分析（図３Ａ）ならびに走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）イメージングを行った（図９Ａ〜Ｂ）。インフルエンザに感染した肺のＳＥＭ分析により、特に肺胞壁において、ＥＣＭ構造の大規模な歪曲（図３Ｂ〜Ｃ）ならびにコラーゲン繊維の再構成が示された。感染から７４時間後、肺胞嚢境界のコラーゲン繊維束は、繊維末端がほぐれ、配向角が散乱していることが示された（図３Ｂ）。このことは、肺胞壁を構成する原繊維の配向性を測定することによって、さらに確証された（図３Ｃ）。加えて、肺胞腔および肺胞中隔は、感染肺において歪曲していた（図３Ｂ）。これらの結果を確証し、感染の間の（自然な環境における細胞とＥＣＭとを含む）全組織の完全性をさらに分析するために、新たな方式の電子顕微鏡画像化法であるＡｉｒＳＥＭ（Ｓｏｌｏｍｏｎｏｖ，ｅｔ  ａｌ．，２０１４）を用いた。ＡｉｒＳＥＭは、周囲条件で、自然状態の水和した組織の映像化を可能にし、よってＳＥＭ用の試料調製に関連して生じうるアーティファクトを避けることができる。ウイルス感染肺組織の画像化によって、肺胞細胞と気管支細胞の両方の喪失、ならびに肺胞嚢と肺胞管の歪曲、引き続いて肺胞壁が薄くなることを特徴とする組織破壊が示された（図９Ａ〜Ｂ）。最後に、新鮮な肺ＥＣＭスキャフォールド（脱細胞化された組織）のＡｉｒＳＥＭ画像によって、通常のＳＥＭ分析で観察されたものと同様な、肺胞コラーゲンの分解および歪曲バターンが示された（図９Ａ〜Ｂ）。
【実施例４】
【０２３１】
網羅的なプロテオミクス解析によって、インフルエンザ感染の間におけるＥＣＭスキャフォールドの分解が同定される
【０２３２】
インフルエンザ感染の間のＥＣＭリモデリングに対するタンパク質分解の意義を網羅的に検討するために、タンデム質量分析（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）手法を用いた（図３Ａ、以下の表３）。感染から７４時間後と１２０時間後の脱細胞化された肺組織を、非感染組織と比較して分析したところ、肺胞壁内を覆っているコラーゲン原繊維構造で見られた構造的変化と関連し得る組成的変化が示された（図３Ｂ〜Ｃ）。特に、インフルエンザに感染した肺のプロテオミクスデータ解析によって、コラーゲンおよびラミニン分子のサブタイプが次第に失われることを含む、ＥＣＭの分子的組成の変化が確認された（図３Ａ）。加えて、複数の基底膜関連成分ならびに基底細胞接着分子（例えば、ナイドジェン、デコリン、ＩＶ型コラーゲン、ＸＩＩ型コラーゲン、ＸＩＶ型コラーゲン、およびフィブリリン；図３Ａ）が感染肺組織から失われ、これはＥＣＭの完全性および分子的組成の大規模な変換を示している。典型的なＥＣＭ分子（ＩＶ型コラーゲン、デコリン、およびルミカン）の喪失は、感染肺および非感染肺のＥＣＭスキャフォールドを染色することによって確証された（図３Ｄ〜Ｉ）。重要なことには、Ｉ型コラーゲン，ラミニン  ナイドジェン、ルミカン、ミメカン、フィブリリン、およびデコリンなど、感染の間に失われる成分のうちのいくつかは、ＭＴ１−ＭＭＰの既知の基質である（Ｋｏｚｉｏｌ，ｅｔ  ａｌ．，２０１２；ＭｃＱｕｉｂｂａｎ，ｅｔ  ａｌ．，２０００；Ｎｏｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，２０１２；Ｏｖｅｒａｌｌ，２００２；Ｓｈｉｍｉｚｕ−Ｈｉｒｏｔａ，ｅｔ  ａｌ．，２０１２；Ｓｔｅｇｅｍａｎｎ，ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。インフルエンザ感染の過程の間に複数のＭＴ１−ＭＭＰ基質が分解されるため、肺ＥＣＭタンパク質の分解および宿主の死亡は、ＭＴ１−ＭＭＰのコラゲナーゼ活性を特異的にブロックすることによって防ぎ得ると仮定された。
【表３】
0006783777.tif 000012
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0006783777.tif 000014
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【実施例５】
【０２３３】
ＭＴ１−ＭＭＰの阻害は、免疫応答を変化させることなく、組織破壊から保護する
【０２３４】
ＭＴ１−ＭＭＰノックアウトマウスは、複数の異常症を患い、生後３〜５週間以内に死亡する（Ｈｏｌｍｂｅｃｋ，ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。
よって、ＭＴ１−ＭＭＰの役割は、ナノモル濃度で有効な、ＭＴ１−ＭＭＰの選択的アロステリック阻害抗体（ＬＥＭ２／１５）を用いて評価した（Ｕｄｉ，ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。重要なことには、この抗体は、細胞表面におけるプロＭＭＰ−２の活性化および酵素の二量体形成に著しく干渉することなく、細胞表面に発現するＭＴ１−ＭＭＰと選択的に相互作用し、そのコラゲナーゼ活性を阻害することが示されている（Ｕｄｉ，ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。インフルエンザ感染の間のＭＴ１−ＭＭＰの役割を評価するために、マウスを、致死量に達しないインフルエンザウイルスに感染させ、疾患経過の間、ビヒクル（ＰＢＳ）、対照抗体、または抗ＭＴ１−ＭＭＰ抗体のいずれかによって処置した（２６、４９、７４時間；図４Ａ〜Ｋ）。感染から７４時間後における組織切片から、典型的な画像を図４Ａ〜Ｋに示す。水和している脱細胞化された組織のＡｉｒＳＥＭ画像により、ＭＴ１−ＭＭＰのコラーゲン分解活性をブロックすると、組織の完全性（肺胞構造および気管支構造の両方）、ＥＣＭ構造、およびコラーゲン構造、ならびにＥＣＭスキャフォールドの分子的組成が保護されることが示された（図４Ｂ〜Ｅ）。第二次高調波発生における２光子顕微鏡法の３Ｄ解析により、感染マウスが抗ＭＴ１−ＭＭＰ阻害剤による処置を受けた場合、Ｉ型コラーゲン線維はより豊富であり、連続的な肺胞嚢境界を維持していることが示された（図４Ｆ〜Ｇ）。さらに、ＭＴ１−ＭＭＰのタンパク質分解活性をブロックすることにより、基底膜の主要な構成要素であるラミニンもまた、感染肺において、分解から保護されることが示された（図４Ｈ〜Ｊ）。最後に、機能的なｉｎ  ｓｉｔｕザイモグラフィによって、処置後の著しいタンパク質分解の減弱が示され（図４Ｊ〜Ｋ）、ＭＴ１−ＭＭＰが、感染状況における組織破壊の主要な促進要因であることが示唆された。
【０２３５】
ＭＴ１−ＭＭＰが、免疫調節に関わっているか否かをさらに理解するために、感染から７４時間後に、抗ＭＴ１−ＭＭＰ阻害剤または対照抗体のいずれかを用いて、マクロファージ、好中球、リンパ球、およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の存在量を分析した。その結果、感染肺へのマクロファージと好中球の動員がいずれも亢進しており、抗ＭＴ１−ＭＭＰで処置した動物と対照で処置した動物との間で検出可能な違いは見られなかった（図１１Ａ）。さらに、Ｆ４／８０マーカーを染色した肺組織切片において、抗ＭＴ１−ＭＭＰ処置による同様なマクロファージの浸潤が観察された（図１１Ｂ〜Ｃ）。加えて、主要な免疫調節サイトカイン（ＩＬ−１β、およびＴＮＦ−α）（これらは、感染過程において主要な役割を果たすことが示されている（Ａｌｄｒｉｄｇｅ，ｅｔ  ａｌ．，２００９；Ｇｌａｃｃｕｍ，ｅｔ  ａｌ．，１９９７；Ｇｏｌｄｂａｃｈ−Ｍａｎｓｋｙ  ａｎｄ  Ｋａｓｔｎｅｒ，２００９））のサイトカインレベルを評価するために、抗ＭＴ１−ＭＭＰで処置したマウスならびに対照で処置したマウスの両方から気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）を集めた。インフルエンザ感染マウスにおいて、ＭＴ１−ＭＭＰ活性とは無関係に、ＩＬ−１βとＴＮＦ−αの両方が強力に誘導されており（図１１Ｄ〜Ｆ）、免疫応答が影響を受けないことが示唆された。
【０２３６】
ＭＴ１−ＭＭＰ活性によって、インフルエンザ感染の間にウイルス負荷量が調節されるか否かを評価するために、プラーク形成単位（ＰＦＵ）アッセイを行い（図１２Ａ）、ＰＦＵアッセイを用いてウイルスＲＮＡも定量した（図１２Ｂ）。さらに、感染から２４時間後および７４時間後の両方におけるウイルス存在量のための染色を、肺組織切片に施した（図１２Ｄ〜Ｆ）。全体的には、これらの分析によって、ＭＴ１−ＭＭＰの阻害は、ウイルス負荷に対して最小限の効果しか示さないことが示され、その効果は感染の初期段階（２４時間）に限られており、後期段階には効果は認められなかった。これらの結果によって、ＭＴ１−ＭＭＰは、免疫調節またはウイルス負荷量の制御と顕著な関係がないことが実証され、よって、インフルエンザ感染に対するＭＴ１−ＭＭＰの主要な影響は、ＥＣＭ線維タンパク質の大規模な分解と、そのコラゲナーゼ活性に基づく組織損傷である。
【実施例６】
【０２３７】
組織損傷は、ウイルスの細胞病理に基づくものではなく、宿主のタンパク質分解活性に基づくものである
【０２３８】
本発明者らは、次いで、肺組織における破壊性表現型が、ウイルスの細胞病理による直接的な結果であるのか、あるいは調節不全なＥＣＭのタンパク質分解を促進する宿主の免疫応答の結果であるのかを検討した。一般的なインフルエンザ処置であるリン酸オセルタミビル（タミフル）（インフルエンザウイルスＡ型およびＢ型のノイラミニダーゼの選択的阻害剤）を分析した（図１３Ａ〜Ｄ）。ビヒクル処置マウスと、タミフル処置マウスの全肺ホモジネートに基づくウイルス力価を、ｑＰＣＲを用いて定量し（図１３Ｃ）、ＡｉｒＳＥＭを用いて肺組織切片において可視化した、肺の構造的特徴のトポグラフィーと比較した（図９Ａ〜Ｂ）。タミフルは、ウイルス負荷を劇的に減少させ（１０〜１００分の１）、これは、組織が程度は低いが持続的に存在するウイルスにさらされていることを示している（図１３Ｃ）。ウイルス力価がより低いにもかかわらず、ビヒクル処置マウスとタミフル処置マウスの両方において、同様な破壊性の肺組織表現型およびＥＣＭ表現型（これには多病巣性の細胞壁薄化および肺胞細胞の大幅な喪失が含まれる）が観察された（図１３Ａ、およびＢ）。このような不可逆的な破壊は、バリアの完全性喪失の主要な原因であり、これにより細菌の侵入を可能にする機会をもたらし得る。これらの結果から、本発明者らは、ＭＴ１−ＭＭＰのタンパク質分解をブロックしてＥＣＭの完全性を保護することによって、インフルエンザ−細菌重複感染の致死的な結果を改善しうるか否かを検討することにした。
【実施例７】
【０２３９】
感染マウスにおけるＭＴ１−ＭＭＰをブロックすることによって、組織維持および敗血症予防が促進される
【０２４０】
上記したように、インフルエンザウイルスの感染は、現在の第１選択であるウイルスを標的とするインフルエンザ薬物治療にもかかわらず、ＥＣＭの分子的組成および肺の構造に壊滅的な損傷を与える。インフルエンザによって誘発されるＥＣＭタンパク質分解の生理学的意義をさらに裏づけ、インフルエンザに感染した入院患者を脅かす頻発する状態を模倣するために、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）を用いた、インフルエンザの二次的細菌感染に関する確立されたプロトコルを使用した（ＭｃＣｕｌｌｅｒｓ  ａｎｄ  Ｈｅｒｍａｎ，２００１；ＭｃＣｕｌｌｅｒｓ，２００３；ＭｃＣｕｌｌｅｒｓ，２００４）。マウスの１０個の群（各群あたりマウス１０匹）を、ＰＲ８インフルエンザウイルスと、それに続く肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（いずれも致死量に達しない）とを合わせて、９６時間内に２回感染させ（図５）、別々の群を、ビヒクル、無関係な対照抗体、タミフル、抗ＭＴ１−ＭＭＰ、または両薬剤の併用療法のいずれかによって処置した。潜在的な処置モードを模倣するために、マウスを２つの異なるプロトコル、すなわち予防（感染前）または治療（感染後）、で処置した（図５Ａ〜Ｂ）。予防剤（タミフル−１）としてタミフルによる処置を受けたマウス群は、抗ＭＴ１−ＭＭＰの投与を受けた群と同じ生存率および臨床スコアを示し（図５Ｂ〜Ｃ）、これは、予防処置として投与した場合、重複感染によって引き起こされる死亡の予防において、抗ウイルスまたはＥＣＭ保護の有効性が同等であることを示唆している。
【０２４１】
タミフルを感染後に投与した場合、入院期間またはインフルエンザ症状の減少に有効ではないことを実証する報告（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，２０１４）と一致して、タミフルで処置した重複感染マウス（＋１群）は、ビヒクル群（２０％生存）に対して、反応の改善を示さなかった（図５Ｅ〜Ｆ）。これらの同じ治療状況において（図５Ｄ）、抗ＭＴ１−ＭＭＰ阻害剤による処置は著しく優れており、顕著な治療効果を示している（７０％生存）。重要なことには、タミフルと、抗ＭＴ１−ＭＭＰとの併用投与処置の適用は、予防的または処置的に使用した場合に、１００％の生存率という結果をもたらす（図５Ｂ〜Ｅ）。これは、タミフル（−１）群の、肺胞構造および気管支構造の破壊性表現型を実証するＡｉｒＳＥＭ画像によってさらに裏づけられ、このことは、予防的手段としてであっても、タミフルは肺ＥＣＭにおける付随的な損傷の予防に有効ではないことを示唆している（図１４）。インフルエンザ感染における、ＥＣＭ線維性タンパク質の分解、基底膜の構成要素の破壊、および空気血液関門の破壊に関するこれらの観察結果を拡張するために、本発明者らはさらに、重複感染マウスについて、血流中への細菌の伝播（敗血症）、および遠隔臓器の感染に関する検討を行った。ビヒクル処置マウスは、細菌感染の２日後に、菌血症を発症し、脾臓への肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の伝播を示したが、抗ＭＴ１−ＭＭＰ阻害剤の投与を受けたマウスは、全身的な細菌伝播を起こさず、局部に限られた肺感染を維持していた（図５Ｇ〜Ｈ）ことが見いだされた。
考察
【０２４２】
本実施例により、インフルエンザ感染と戦うための治療戦略は、ウイルスの伝染性を標的とするだけではなく、組織耐性を増大させることも目的とすべきであることが示唆される。これは、とりわけ（ハイリスク集団内で生存者を減少させる、主要なリスクファクターである）肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、およびインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）を含む二次的細菌感染を考慮した場合に特にあてはまる（ＭｃＣｕｌｌｅｒｓ  ａｎｄ  Ｈｅｒｍａｎ，２００１；ＭｃＣｕｌｌｅｒｓ，２０１４；Ｍｏｒｅｎｓ，ｅｔ  ａｌ．，２００８）。重複感染は、多くの場合、ウイルスの侵襲に対する免疫系の強い応答によって引き起こされる重篤な肺炎症をもたらす。これらの応答は、組織の恒常性に劇的な障害（呼吸器上皮成分、ＥＣＭ成分、および基底膜成分の破壊を含む）を与える。ウイルス感染に対する宿主応答としては、酸化ストレスに関連する組織損傷が挙げられる（Ａｖｉｓｓａｒ，ｅｔ  ａｌ．，１９９６；Ｂｏｚｉｎｏｖｓｋｉ，ｅｔ  ａｌ．，２０１２；Ｃａｍｐｂｅｌｌ，ｅｔ  ａｌ．，１９８７；Ｓｕｌｉｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｙａｔｍａｚ，ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。一方で、ＭＭＰ活性は、感染に対する正常な免疫応答のために必要である。他方、宿主由来のＭＭＰは、感染に関連する免疫病理を引き起こし得る。このパラドックスは、正常なＭＭＰ機能と、破壊性のＭＭＰに関連する宿主組織損傷との、微妙なバランスの結果としてもたらされる（Ｅｌｋｉｎｇｔｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，２００５）。ＭＭＰはＥＣＭの不可逆的なリモデリングにおいて決定的な役割を果たすので、これらの強いプロテアーゼは、厳密に調節および制御されている（Ｇａｆｆｎｅｙ  Ｊ，２０１５；Ｌｏｐｅｚ−Ｏｔｉｎ  ａｎｄ  Ｍａｔｒｉｓｉａｎ，２００７；Ｔｕｒｋ，２００６）。さらに、感染の間の組織恒常性の維持は、活性型プロテアーゼを発現している免疫細胞が呼吸器の病原体に向けて動員される場合、困難であり得る。
【０２４３】
インフルエンザに感染した肺の、ゲノム全域にわたる転写プロファイリングを用いることにより、細胞外マトリックスの代謝回転およびタンパク質異化に関与する桁外れに多数の遺伝子が、感染過程の間の種々の時点で観察された。以前の研究では、ヒト呼吸器の気管支細胞株および上皮細胞株を用いた種々のインフルエンザウイルス株に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏ宿主応答の比較、ならびにマウスおよびフェレットにおけるｉｎ  ｖｉｖｏ実験の比較によって、インフルエンザ感染の間の転写特性を評価した（Ｂｏｒｔｚ，ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｂｒａｎｄｅｓ  Ｍ，２０１３；Ｃｈｅｖｒｉｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｅｌｋｉｎｇｔｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ｈａｒｔｍａｎｎ，ｅｔ  ａｌ．，２０１５；Ｊｏｓｓｅｔ，ｅｔ  ａｌ．，２０１４；Ｋａｓｈ，ｅｔ  ａｌ．，２００４；Ｌｅｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，２０１３；Ｌｊｕｎｇｂｅｒｇ，ｅｔ  ａｌ．，２０１２；Ｐｅｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，２０１４；Ｓｈａｐｉｒａ，ｅｔ  ａｌ．，２００９）。ＭＴ１−ＭＭＰとヒトへの感染との関連性を評価するために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＨ１Ｎ１インフルエンザ株Ａ／ＰＲ／８／３４に感染させた初代ヒト気管支上皮細胞からのデータを解析した。ヒトマクロファージはより優れたモデルであろうが、このデータによって、ＭＴ１−ＭＭＰが、初代ヒト細胞モデルにおいてもアップレギュレートされることが示され（図１５）（Ｓｈａｐｉｒａ，ｅｔ  ａｌ．，２００９）、本発明者らの発見と、インフルエンザ感染に対するヒトＥＣＭリモデリング応答との関連性を示唆している。
【０２４４】
これらの研究から発展し、本発明者らは、インフルエンザ感染の間のＥＣＭリモデリング、および、特にＭＴ１−ＭＭＰの活性に体系的な分析を集中させた。注目すべきことには、恒常性を保っている間、ＭＴ１−ＭＭＰは、健康な肺において間質細胞によってほとんど全体的に発現されていることが見いだされた。これに対し、感染後、ＭＴ１−ＭＭＰの発現は主に免疫区画で観察され、コラーゲン分解活性の増大を伴っていた。ＭＴ１−ＭＭＰ発現細胞集団の解析によって、サイトカイン、ケモカイン、および抗ウイルス応答遺伝子との強い関連が示され、ＭＴ１−ＭＭＰが、宿主の抗ウイルス応答プログラムの内因性回路であることが裏づけられた。線維性コラーゲンおよび基底膜コラーゲン（ｃｏｌＩＶ、ｃｏｌＸＩＩ、ｃｏｌＸＩＶ）ならびにプロテオグリカンを含む複数の既知のＭＴ１−ＭＭＰ基質（Ｋｏｚｉｏｌ  Ａ１，２０１２；Ｓｔｅｇｅｍａｎｎ，ｅｔ  ａｌ．，２０１３）が、不可逆的に切断され、インフルエンザ感染マウスの肺から失われることもまた見いだされた。これらの組成的な変化は、ＥＣＭスキャフォールドの分解および上皮細胞の喪失を伴い、よって、肺胞腔の喪失、肺胞壁の菲薄化、および気道構造の歪曲を含む破壊性表現型をもたらす。合わせると、インフルエンザ感染は、ＭＴ１−ＭＭＰの発現および活性を促進し、それが肺の完全性および機能の維持に必要な、構造的なＥＣＭ成分の無制御な分解をもたらすことが示された。
【０２４５】
ＭＴ１−ＭＭＰ発現レベルの上昇は、進行したステージおよび予後不良に関係する浸潤性マーカーとしてのＭＴ１−ＭＭＰに関連がある、がん細胞転移の文脈で説明されてきた（Ｚａｒｒａｂｉ，ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。この特性は、ＭＴ１−ＭＭＰのコラーゲン分解活性が原因だとされ、細胞周囲の環境および内皮バリアを分解し、転移細胞の通り道を形成する。しかしながら、インフルエンザ感染におけるＭＴ１−ＭＭＰの役割について、以前に報告されたことはなかった。したがって、大部分のメタロプロテイナーゼの内因性阻害剤であるＴＩＭＰ−１およびＴＩＭＰ−３などの、メタロプロテイナーゼ（ＴＩＭＰ）の組織阻害剤に関する発現レベルの上昇が注目された。しかしながら、ＭＴ１−ＭＭＰの内因性阻害剤であるＴＩＭＰ−２の発現レベルは、著しい変化を示さなかった。その他のＥＣＭ酵素は、インフルエンザ感染においても役割を果たすことが示されていた（Ｂｒａｄｌｅｙ，ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。タンパク質レベルでのＭＭＰ−８の著しい増加もまた注目された（図６Ａ〜Ｄ）。
【０２４６】
以前の研究は、インフルエンザ感染の間の、炎症に付随する障害に由来する、ウイルスの細胞変性効果からの解放を探求してきた（Ｂｏｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｋａｓｈ，ｅｔ  ａｌ．，２００４；Ｋｏｂａｓａ，ｅｔ  ａｌ．，２００７；Ｔａｔｅ，ｅｔ  ａｌ．，２００９）。本研究において、ウイルス力価が低い場合であっても、肺のＥＣＭ破壊は著しいことが示された。このことは、感染の間のＥＣＭの主要な障害は、直接的なウイルス負荷量とは無関係の、宿主応答に関連するタンパク質分解イベントによって促進される、並列の経路であることを示唆している（Ｊａｍｉｅｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，２０１３；Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖ，ｅｔ  ａｌ．，２０１２；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  ａｎｄ  Ａｙｒｅｓ，２００８）。このような状況において、ＥＣＭ障害は、ＭＴ１−ＭＭＰのタンパク質分解活性を選択的に調節することによって、ほとんど完全に救済しうることが、本研究で示された。抗ＭＴ１−ＭＭＰ阻害Ｆａｂフラグメントを用いて、ウイルス複製とは無関係に、組織構造の維持、およびインフルエンザ感染の転帰の改善が可能であった。注目すべきことに、このＭＴ１−ＭＭＰ抗体は、コラゲナーゼ活性の標的化について選択性が非常に高く、組織の恒常性に必要とされる、酵素の二量体形成およびプロＭＭＰ−２の成熟を阻害しない（Ｕｄｉ，ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。本研究によって、ＭＴ１−ＭＭＰは、免疫細胞の動員、またはＩＬ−１βおよびＴＮＦ−αの産生に決定的には関与していないことが示される。これは、マクロファージ由来ＭＴ１−ＭＭＰが、下位の細胞タンパク質分解を調節し、宿主組織を通した遊走または細胞トラフィッキングに直接的には関与していない、という以前の研究と一致している（Ｓｈｉｍｉｚｕ−Ｈｉｒｏｔａ，ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。
【０２４７】
自然な疾患進行を模倣するために、インフルエンザと肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）との重複感染状態を用いて、タミフル単独によるウイルスの標的化は、ＥＣＭ障害の制御に不十分であり、細菌感染後の疾患管理が成功することを予期できないことが示された。重要なことに、ＭＴ１−ＭＭＰ活性の阻害（これは、ウイルス負荷量に著しい影響を与えることなく、組織構造および組成を保護する）は、予防剤または治療剤のいずれかとして投与した場合、疾患管理の改善を示す。これと一致して、タミフルで処置したマウスは、肺から体循環への細菌の伝播によって敗血症を発症するが、ＭＴ１−ＭＭＰ阻害抗体で処置したマウスは、血液空気関門の破壊による細菌の拡散が減少することが示された。これは、組織恒常性の維持は、少なくとも我々のインフルエンザモデルにおいて、ウイルス負荷量の調節と治療上同じように重要な、並列的なプロセスであることをさらに示唆している。重要なことに、これらの２つの処置を組み合わせることによって、予防モードおよび治療モードの両方において、完全な生存率が達成された。これは、２つの戦略、すなわちウイルス複製の標的化、ならび宿主バリアの恒常性の維持および組織破壊の阻止を組み合わせることにより、生存転帰が著しく増大するという、本発見をさらに裏づけている。
【０２４８】
（引用・参考文献）
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【０２４９】
本発明を、特定の実施形態と共に説明してきたが、多くの代替、改変、および変形が当業者には明らかであろう。したがって、添付されている特許請求の範囲の趣旨および幅広い範囲内の、全てのこのような代替、改変、および変形を包含することが意図されている。
【０２５０】
本明細書で言及した全ての刊行物、特許、および特許出願は、個々の刊行物、特許、または特許出願が、具体的および個別的に、参照により本明細書に組み込まれるものと表示されているのと同じ程度に、参照により、その全体が本明細書に組み込まれる。加えて、本出願におけるあらゆる参考文献の引用および同定は、そのような参考文献が本発明に対する先行技術として利用できることを認めるものと解釈すべきではない。セクションの表題が用いられている場合、それらは必ずしも限定と解釈すべきではない。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ−１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ−２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ−３Ｉ】
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【図４Ａ−４Ｅ】
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【図４Ｆ−４Ｋ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ−５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ−５Ｈ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ−６Ｄ】
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【図７Ａ−７Ｄ】
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【図８】
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【図９Ａ−９Ｄ】
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【図１０Ａ−１０Ｃ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ−１１Ｆ】
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【図１２Ａ−１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ−１２Ｆ】
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【図１３Ａ−１３Ｄ】
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【図１４Ａ−１４Ｂ】
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【図１５】
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【配列表】
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