(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
異種導入遺伝子に作動可能に連結されたヨザルヘルペスウイルス１型（Ａｏｔｉｎｅ  Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ  １）主要最初期プロモーター（ＡｏＨＶ−１プロモーター）を含む核酸分子であり、
前記ＡｏＨＶ−１プロモーターは、配列番号２５のヌクレオチド１３１〜２８６に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む、核酸分子。
【請求項２】
前記ＡｏＨＶ−１プロモーターは、配列番号１、２２、２３、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３３または３４からなる群から選択される配列を含む、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項３】
前記ＡｏＨＶ−１プロモーターは、前記ＡｏＨＶ−１プロモーターからの転写を調節する調節配列に作動可能に連結されている、請求項１または２に記載の核酸分子。
【請求項４】
前記ＡｏＨＶ−１プロモーターは、１つ以上のテトラサイクリンオペレーター配列（ｔｅｔＯ部位）を含む調節配列に作動可能に連結されている、請求項１〜３のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の核酸分子を含むベクターまたはウイルス。
【請求項６】
前記ベクターはプラスミドベクターである、請求項５に記載のベクター。
【請求項７】
前記ウイルスはアデノウイルスである、請求項５に記載のウイルス。
【請求項８】
前記アデノウイルスは、そのゲノムに、少なくとも１つの欠失を有する、請求項７に記載のアデノウイルス。
【請求項９】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の核酸分子、または請求項５〜８のいずれか一項に記載のベクターもしくはウイルスを含む細胞。
【請求項１０】
そのゲノム中にＡｏＨＶ−１プロモーターを含む核酸分子を含み、
前記ＡｏＨＶ−１プロモーターは、配列番号２５のヌクレオチド１３１〜２８６に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む、細胞。
【請求項１１】
前記ＡｏＨＶ−１プロモーターは、配列番号１、２２、２３、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３３または３４からなる群から選択される配列を含む、請求項１０に記載の細胞。
【請求項１２】
前記ゲノム中の前記ＡｏＨＶ−１プロモーターは、テトラサイクリンリプレッサー（ＴｅｔＲ）タンパク質をコードする核酸に作動可能に連結されている、請求項１０または１１に記載の細胞。
【請求項１３】
（ｉ）第１の導入遺伝子に作動可能に連結されたＡｏＨＶ−１プロモーターを含む核酸分子、および（ｉｉ）第２の導入遺伝子に作動可能に連結されたｈＣＭＶプロモーターを含む核酸分子を含み、
前記ＡｏＨＶ−１プロモーターは、配列番号２５のヌクレオチド１３１〜２８６に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む、細胞。
【請求項１４】
前記ＡｏＨＶ−１プロモーターは、配列番号２５のヌクレオチド１３１〜２８６と少なくとも９５％同一である配列を含み、かつ前記ｈＣＭＶプロモーターは、配列番号４のヌクレオチド５７８〜７３６に対して、少なくとも９５％の同一性を有する配列を含む、請求項１３に記載の細胞。
【請求項１５】
前記第１の導入遺伝子はＴｅｔＲをコードする、請求項１３または１４に記載の細胞。
【請求項１６】
第２の導入遺伝子に作動可能に連結されたｈＣＭＶプロモーターを含む前記核酸分子は、アデノウイルスの一部である、請求項１５に記載の細胞。
【請求項１７】
（ｉ）第１の導入遺伝子に作動可能に連結されたＡｏＨＶ−１プロモーターを含む核酸分子、および（ｉｉ）第２の導入遺伝子に作動可能に連結されたｈＣＭＶプロモーターを含む核酸分子を含み、
前記ＡｏＨＶ−１プロモーターは、配列番号２５のヌクレオチド１３１〜２８６に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む、ベクター。
【請求項１８】
前記ＡｏＨＶ−１プロモーターは、配列番号２５のヌクレオチド１３１〜２８６と少なくとも９５％同一である配列を含む、請求項１７に記載のベクター。
【請求項１９】
目的の発現産物を生産する方法であって、請求項１〜４のいずれか一項に記載の核酸分子からの導入遺伝子を宿主細胞で発現させる工程を含み、前記導入遺伝子は前記目的の発現産物をコードする、方法。
【請求項２０】
前記発現産物はタンパク質である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記宿主細胞から、または前記宿主細胞が培養されている培養培地から、または前記宿主細胞および前記培養培地の両方から、前記目的の発現産物を回収する工程をさらに含む、請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２２】
ウイルスを作製する方法であって、前記ウイルスを増殖させる機能を有する異種遺伝子を発現させる細胞中で前記ウイルスを増殖させる工程であって、前記異種遺伝子は、ＡｏＨＶ−１プロモーターの制御下にある工程、および前記細胞から、または前記細胞が培養されている培養培地から、または前記細胞および前記培養培地の両方から、前記ウイルスを回収する工程を含み、
前記ＡｏＨＶ−１プロモーターは、配列番号２５のヌクレオチド１３１〜２８６に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む、方法。
【請求項２３】
前記ＡｏＨＶ−１プロモーターは、配列番号１、２２、２３、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３３または３４からなる群より選択される配列を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
請求項５〜８のいずれか一項に記載のベクターまたはウイルス、および薬学的に許容される担体または賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項２５】
アデノウイルスを調製する方法であって、請求項１２に記載の細胞中で、１つ以上のｔｅｔＯ部位に作動可能に連結されたｈＣＭＶプロモーターの制御下で、導入遺伝子をコードするアデノウイルスを増殖させる工程を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物学的研究、医学、および異種遺伝子発現に関連する他の用途の分野に関する。より詳しくは、本発明は、プラスミド、ウイルスベクターおよび細胞株の発現カセットにおける異種遺伝子発現のための強力かつ短いプロモーターであって、単独で、またはｈＣＭＶプロモーターなどの一般に使用されるプロモーターと組み合わせて使用され得るプロモーターに関する。
【背景技術】
【０００２】
組換え発現ベクターは、例えば、生物学的研究のための哺乳動物遺伝子発現系を含む、異種タンパク質の発現のための種々の分子生物学的用途において、ウイルスベクター作製用細胞株を生産するために、また遺伝子治療およびワクチン接種のためのウイルスベクターとして、広範に使用されている。遺伝子治療およびワクチン接種の用途では、ウイルスベクターなどのベクターは、細胞に導入する１つまたは複数の目的の遺伝子のキャリアとして使用される。例えば、ウイルスベクターは、所望の抗原をコードする遺伝子またはその一部を発現させて、免疫応答を惹起するために使用され得る。
【０００３】
発現ベクターの一部であるシス作用エレメントは、プラスミドおよびウイルスベクターの適用成功に大きく影響し得る。プロモーターは、発現ベクターの発現カセットに配置され、発現の全体的な強度を決定する主要なシス作用エレメントである。プロモーターは転写を開始し、したがって、目的のクローン化遺伝子の発現を制御する重要な点である。発現ベクターにおいて一般に使用されるプロモーター配列は、ウイルスまたは真核生物の遺伝子調節配列に由来する。
【０００４】
発現ベクターおよびウイルスベクターにおいて一般に使用されるエンハンサーおよびプロモーター配列のいくつかは、例えば、ｈＣＭＶ、ＣＡＧ、ＳＶ４０、ｍＣＭＶ、ＥＦ−１αおよびｈＰＧＫプロモーターである。その高い効力および約０．８ｋＢの中程度のサイズのために、ｈＣＭＶプロモーターは、これらのプロモーターの中で最も一般的に使用されているものの１つである。ｈＰＧＫプロモーターは小さいサイズ（約０．４ｋＢ）を特徴とするが、ｈＣＭＶプロモーターよりも効力が低い。一方、サイトメガロウイルス初期エンハンサーエレメント、プロモーター、ニワトリベータ−アクチン遺伝子の第１エキソンおよびイントロン、ならびにウサギベータ−グロビン遺伝子のスプライスアクセプターからなるＣＡＧプロモーターは、ｈＣＭＶプロモーターに匹敵する非常に強力な遺伝子発現を指示することができるが、その大きなサイズのために、空間的制約が大きな問題であり得るウイルスベクター、例えば、アデノウイルスベクター（ＡｄＶ）、アデノ関連ウイルスベクター（ＡＡＶ）またはレンチウイルスベクター（ＬＶ）には、あまり適していない。
【０００５】
ある場合には、１つのベクターから少なくとも２つの抗原を発現させることが望ましい。２つの異なる遺伝子を発現させるために、２つの発現カセットがベクターに配置される状況では、一般に発現カセット、特にプロモーター配列のサイズの制約がとりわけ重要である。サイズの制約に加えて、２つの発現カセットをベクターに配置する場合、同一または非常に類似したプロモーター配列さえも、作製中にベクターの遺伝的不安定性をもたらし得るので、使用することは不利である。したがって、２つの異なる遺伝子を発現するために、２つの発現カセットをベクターに配置する場合、互いに配列同一性をほとんどまたは全く有さない、比較的小さく、比較的強力な異なる異種プロモーター配列を使用することが望ましい。
【０００６】
また、ウイルスベクター作製用細胞株を生産する場合、ウイルスベクターの発現カセットにおいて一般的に使用される他のプロモーター（例えば、一般的に使用されているｈＣＭＶプロモーター）とは異なる配列を有する強力なプロモーターを有することが望ましい。細胞株のゲノムとその中で産生されるベクターとの間の配列同一性の有意なストレッチは、相同組換え、および、したがって産生されたベクターバッチの遺伝的不安定性または不均一性をもたらし得（例えば、Ｌｏｃｈｍｕｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ，１９９４）、したがって回避することが好ましい（例えば、Ｆａｌｌａｕｘ  ｅｔ  ａｌ，１９９８；Ｍｕｒａｋａｍｉ  ｅｔ  ａｌ，２００２）。また、このような用途では、一般的に使用されるｈＣＭＶプロモーターと配列同一性がほとんどないか、または全くない強力なプロモーターを使用することが望ましいであろう。
【０００７】
したがって、例えばプラスミド、ウイルスベクターおよび細胞株において使用するために、好ましくは短いサイズであり、かつｈＣＭＶプロモーターと配列同一性がほとんどないか、または全くないであろう強力なプロモーターを見出す必要性が依然として存在している。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、ヨザルヘルペスウイルス１型（Ａｏｔｉｎｅ  ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ−１）の主要な最初期プロモーター領域（ＡｏＨＶ−１プロモーター）を含む組換え核酸分子、ならびに導入遺伝子に作動可能に連結されたＡｏＨＶ−１プロモーターを含むベクター（例えば、プラスミドベクター、ウイルスベクター）、組換えウイルス、および組換え細胞株を提供する。本発明はまた、ＡｏＨＶ−１プロモーターからの転写を調節するために使用され得る調節配列に作動可能に連結されたＡｏＨＶ−１プロモーターを含む組換え核酸分子を提供する。
【０００９】
一般的でかつ好ましい実施形態は、本明細書に添付の独立請求項および従属請求項によってそれぞれ定義されており、簡潔にするために、それらは、参照により本明細書に組み込まれる。本発明の様々な態様の他の好ましい実施形態、特徴および利点は、下の詳細な説明と添付の図面とから明らかになるであろう。
【００１０】
一実施形態において、本発明は、ＡｏＨＶ−１プロモーターであって、プラスミドベクター、ウイルスベクターもしくは組換えウイルスにより、またはＡｏＨＶ−１プロモーターを含む宿主細胞のゲノムにおいて、導入遺伝子を発現させるために、導入遺伝子に作動可能に連結されたＡｏＨＶ−１プロモーターを提供する。
【００１１】
特定の実施形態では、本発明はＡｏＨＶ−１プロモーターを含むプラスミドベクターであって、１ｋｂ未満のＡｏＨＶ−１  ＤＮＡを含むプラスミドベクターを提供する。
【００１２】
特定の実施形態では、本発明は、導入遺伝子に作動可能に連結されたＡｏＨＶ−１プロモーターを含む発現カセットであって、その導入遺伝子はＡｏＨＶ−１プロモーターに異種であり、例えば、導入遺伝子は天然ではＡｏＨＶ−１プロモーターに作動可能に連結されていない、かつ／または導入遺伝子はＡｏＨＶ−１に由来しない、発現カセットを提供する。発現カセットは、例えば、プラスミド、ベクター、ウイルスゲノム、細胞株などに組み込まれ得る。本発明はまた、このような発現カセットを作製する方法であって、組換え手段または核酸合成によって発現カセットを構築する工程を含む方法を提供する。本発明はまた、導入遺伝子を発現させる方法であって、例えば組換え細胞株において、本発明の発現カセットから導入遺伝子を発現させることを含む方法を提供する。
【００１３】
特定の実施形態では、本発明は、ＡｏＨＶ−１プロモーターを含む組換え細胞株であって、ＡｏＨＶ−１プロモーターが導入遺伝子に作動可能に連結されている、組換え細胞株を提供する。特定の実施形態では、導入遺伝子に作動可能に連結されたＡｏＨＶ−１プロモーターは、例えば、導入遺伝子を発現させるためのプラスミドベクター、ウイルスベクター、または組換えウイルスに統合されて、細胞株中に存在し得る。特定の実施形態において、導入遺伝子に作動可能に連結されたＡｏＨＶ−１プロモーターは、導入遺伝子を発現する組換え細胞株のゲノムに組み込まれている。特定の実施形態では、導入遺伝子は、細胞株のゲノムに組み込まれ、テトラサイクリンリプレッサー（ＴｅｔＲ）タンパク質をコードする。その特定の実施形態では、前記細胞株は、ＰＥＲ．Ｃ６細胞株である。
【００１４】
別の実施形態では、本発明はまた、細胞において導入遺伝子を発現させる方法であって、導入遺伝子に作動可能に連結されたＡｏＨＶ−１プロモーターを含む組換えベクターを細胞に提供することを含む方法を提供する。
【００１５】
特定の実施形態では、本発明はまた、目的のタンパク質を生成する方法であって、ＡｏＨＶ−１プロモーターが目的のタンパク質をコードする導入遺伝子に作動可能に連結されている方法において、目的のタンパク質をコードする核酸配列に作動可能に連結されたＡｏＨＶ−１タンパク質を含む細胞を提供する工程、およびこの細胞から目的のタンパク質を発現させる工程を含む方法を提供する。特定の実施形態では、本方法はさらに、目的のタンパク質を、例えば、細胞から、または培養培地から、または細胞および培養培地から回収する工程を含む。特定の実施形態では、本方法はさらに、目的のタンパク質を精製する工程を含む。目的のタンパク質は、好ましくは、天然のヨザルヘルペスウイルス１型（Ａｏｔｉｎｅ  ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ−１）によってコードされないタンパク質、すなわち、異種タンパク質である。
【００１６】
特定の実施形態では、本発明は、ＡｏＨＶ−１プロモーターからの転写を調節するために使用され得る調節配列に作動可能に連結されたＡｏＨＶ−１プロモーターを提供する。その特定の実施形態では、それは、例えば、ＡｏＨＶ−１プロモーターに作動可能に連結されているリプレッサー結合配列へのリプレッサーの結合によって抑制され得る。特定の実施形態では、ＡｏＨＶ−１プロモーターは、リプレッサーを除去することによって、または誘導シグナルもしくは誘導剤を提供することによって誘導され得る。
【００１７】
特定の実施形態では、本発明は、発現が可逆的に制御され得るように、１つ以上のテトラサイクリンオペレーター配列（ｔｅｔＯ部位）に作動可能に連結されたＡｏＨＶ−１プロモーターを提供する。
【００１８】
別の実施形態では、本発明はまた、ＡｏＨＶ−１プロモーターを含む組換えウイルスを作製する方法であって、導入遺伝子に作動可能に連結されたＡｏＨＶ−１プロモーターを含むコンストラクトを調製する工程、および前記コンストラクトを組換えウイルスのゲノムに組み込む工程を含む方法を提供する。
【００１９】
本発明の特定の実施形態では、ＡｏＨＶ−１プロモーターは目的のタンパク質をコードする導入遺伝子に作動可能に連結され、目的のタンパク質は治療用タンパク質または抗原である。
【００２０】
特定の実施形態では、導入遺伝子に作動可能に連結されたＡｏＨＶ−１プロモーターを含むウイルスおよびウイルスベクターは、組換えアデノウイルス（ｒＡｄ）およびｒＡｄベクターである。
【００２１】
特定の実施形態では、本発明は、導入遺伝子に作動可能に連結されたＡｏＨＶ−１プロモーターを含むｒＡｄおよびｒＡｄベクター、ならびにｒＡｄおよびｒＡｄベクターを作製および／または使用する方法であって、ｒＡｄおよびｒＡｄベクターは、導入遺伝子に作動可能に連結されたＡｏＨＶ−１プロモーターを含む方法に関する。
【００２２】
特定の実施形態では、本発明の組換えアデノウイルスはＥ１領域に欠失を有し、特定の実施形態において、本発明の組換えアデノウイルスは、このＥ１領域に、導入遺伝子に作動可能に連結されたＡｏＨＶ−１プロモーターを含む。代替として、組換えアデノウイルスの他の領域も使用され得る。例えば、導入遺伝子に作動可能に連結されたＡｏＨＶ−１プロモーターを含む発現カセットはまた、組換えアデノウイルスの、Ｅ３領域に、またはゲノムの右端、Ｅ４領域と右ＩＴＲとの間に配置され得る。
【００２３】
特定の実施形態では、本発明によるｒＡｄベクターは、ウイルス複製に必要なアデノウイルスゲノムのＥ１領域、例えばＥ１ａ領域および／またはＥ１ｂ領域の少なくとも１つの必須遺伝子機能が欠損している。特定の実施形態では、本発明によるアデノウイルスベクターは、非必須Ｅ３領域の少なくとも一部が欠損している。特定の実施形態では、ベクターは、Ｅ１領域の少なくとも１つの必須遺伝子機能と、非必須Ｅ３領域の少なくとも一部とが欠損している。アデノウイルスベクターは、「多重欠損」であり得、これは、アデノウイルスベクターがアデノウイルスゲノムの２つ以上の領域のそれぞれに１つ以上の必須遺伝子機能が欠損していることを意味する。例えば、前述のＥ１−欠損またはＥ１−、Ｅ３−欠損アデノウイルスベクターは、Ｅ４領域の少なくとも１つの必須遺伝子および／またはＥ２領域（例えば、Ｅ２Ａ領域および／またはＥ２Ｂ領域）の少なくとも１つの必須遺伝子がさらに欠損していることができる。
【００２４】
別の実施形態では、本発明はまた、導入遺伝子に作動可能に連結されたＡｏＨＶ−１プロモーターを含む組換えアデノウイルスのゲノムを含む組換えＤＮＡ分子を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】異なるプロモーターコンストラクトからのルシフェラーゼの発現を、ＨＥＫ２９３細胞における一過性トランスフェクションで評価した。ルシフェラーゼ発現を相対発光量（ＲＬＵ）として測定し、ＳＥＡＰレベルを測定することによってトランスフェクション効率を補正した。示したプロモーターについての結果を、ｈＣＭＶプロモーターの制御下でのルシフェラーゼの陽性対照および非トランスフェクト細胞の陰性対照と比較して示す。
【図２−１】図２：ＣＬＣ  ｗｏｒｋｂｅｎｃｈを用いて行われたｈＣＭＶとｃｈＣＭＶショートまたはＡｏＨＶ−１ショートとの間の配列アラインメント。灰色の陰影は、整列した配列間のヌクレオチドの相違を示す。完全なプロモーター配列を用いてアラインメントを行った。しかし、配列が整列する領域が潜在的な相同組換え事象に関連するので、これらの領域のみを図に示す。ダッシュは、アラインメントのない領域（ギャップ）を示す。（Ａ）ｈＣＭＶとｃｈＣＭＶショートとのアラインメント領域。（Ｂ）ｈＣＭＶとＡｏＨＶ−１ショートとのアラインメント領域。
【図２−２】（上記の通り。）
【図３】発現を調節するためのｔＴＡ応答プロモーターとしての適用性についての「７×ＴｅｔＯ−ＡｏＨＶ−１」の試験。ベロ細胞を、ガウシアルシフェラーゼ発現が７×ＴｅｔＯ−ＡｏＨＶ−１（コアＡｏＨＶ−１プロモーターの上流に配置された７×ＴｅｔＯ）（これは最小のプロモーター活性を与える）の制御下にあるプラスミドで一時的にトランスフェクトした。プロモーター活性を誘導するために、テトラサイクリントランスアクチベータータンパク質（ｔＴＡ）を発現するプラスミドを同時トランスフェクトした。ｔＴＡプラスミドで同時トランスフェクトした細胞の培養培地にドキシサイクリンを添加して、プロモーター活性を止めた。ラウス肉腫ウイルスプロモーター（ＲＳＶ）を陽性対照として使用した。
【図４−１】図４：細胞における目的の遺伝子（ＧＯＩ）の発現調節に対するＡｏＨＶ−１ショートのＴｅｔＲ抑制バージョンの試験。（Ａ）一過性プラスミドトランスフェクションにおけるｅＧＦＰ発現を誘導するプロモーターｈＣＭＶ、ｈＰＧＫおよびＡｏＨＶ−１ショートの効力の比較。Ｅｖｏｓ蛍光顕微鏡で撮影したｅＧＦＰ発現の写真を示す。（Ｂ）ＡｏＨＶ−１ショートの調節バージョンの設計および試験。ＰＥＲ．Ｃ６−ｈＣＭＶ．ＴｅｔＲ細胞におけるＡｏＨＶ．２×ｔｅｔＯまたは標準ｈＣＭＶプロモーター（ｐＣＤＮＡ）によるｅＧＦＰの一過性発現。（Ｃ）安定な細胞株におけるＡｏＨＶ．２×ｔｅｔＯによるＧＯＩの調節された発現。ウエスタンブロットアッセイにおけるＧＯＩの発現を示す。レーンのラベル表示：レーン１：クローン１１、レーン２：クローン１１＋ドキシサイクリン、レーン３：クローン７３、レーン４：クローン７３＋ドキシサイクリン、レーン５：陽性発現対照、ＡｏＨＶ−１プロモーターの制御下でＧＯＩを発現するプラスミドで一過性にトランスフェクトされた細胞、レーン６：陰性対照（トランスフェクトされていないＰＥＲ．Ｃ６細胞）。
【図４−２】（上記の通り。）
【図５−１】図５：（Ａ）Ａｄ２６．ＣＭＶ＿ＧＬｕｃ．ＡｏＨＶ１＿ＲＦＬおよびＡｄ２６．ＣＭＶｔｅｔＯ＿ＧＬｕｃ．ＡｏＨＶ１＿ＲＦＬベクターゲノムの概略図。白抜きの矢印は、２つの導入遺伝子カセットの挿入を示す：Ｅ１領域欠失の位置に挿入されたＣＭＶまたはＣＭＶｔｅｔＯプロモーター駆動Ｇｌｕｃ発現カセット、およびＥ４領域とＲＩＴＲとの間に挿入されたＡｏＨＶ−１プロモーター駆動ＲＦＬ発現カセット。黒色の矢印は、導入遺伝子カセットを駆動するプロモーターを示す。灰色の矢印はコード配列を示す。ＧＬｕｃ、ガウシアルシフェラーゼ。ＲＦＬ、赤色発光ホタルルシフェラーゼ。ＬＩＴＲおよびＲＩＴＲ、左および右の逆位末端配列。ＣＭＶ、ヒトサイトメガロウイルス主要最初期プロモーター（ｈＣＭＶ  ＭＩＥｐ）。ＣＭＶｔｅｔＯ、２つのテトラサイクリンオペレーター（ＴｅｔＯ）配列（ＴｅｔＲ抑制発現のため）を備えたｈＣＭＶ  ＭＩＥｐ。ＡｏＨＶ−１  Ｐ、ＡｏＨＶ−１ショートプロモーター。ＳＶ４０ｐＡ、ＳＶ４０ウイルス由来ポリアデニル化シグナル。ＢＧＨｐＡ、ウシ成長ホルモン遺伝子由来ポリアデニル化シグナル。Ｅ４、Ａｄ２６のＥ４領域。（Ｂ）同一性ＰＣＲによる、Ａｄ２６．ＣＭＶ＿ＧＬｕｃ．ＡｏＨＶ１＿ＲＦＬおよびＡｄ２６．ＣＭＶｔｅｔＯ＿ＧＬｕｃ．ＡｏＨＶ１＿ＲＦＬの精製バッチに対する導入遺伝子（ＴＧ）カセット完全性の分析。ＰＣＲを行って、Ｅ１に挿入されたＴＧカセット（「Ｅ１  ＰＣＲ」）、およびＥ４とＲＩＴＲとの間に位置するＴＧカセット（「Ｅ４  ＰＣＲ１」および「Ｅ４  ＰＣＲ２」）を増幅させた。異なるＰＣＲで予想されたＰＣＲ産物サイズを挿入図に示す。Ｌ，１  Ｋｂ  Ｐｌｕｓ  ＤＮＡ  Ｌａｄｄｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｐ１＝「エンプティ」発現カセット（すなわち、ｈＣＭＶプロモーターおよびＳＶ４０ポリアデニル化シグナルからなるが、ＴＧコード配列はない）を有するｐＡｄＡｐｔ２６（Ａｂｂｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。Ｐ２、ｐＷＥ．Ａｄ２６．ｄＥ３．５ｏｒｆ６（Ａｂｂｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）、Ｅ４領域とＲＩＴＲとの間に導入遺伝子カセットの挿入なし。Ｗ、ＤＮＡ鋳型のない対照。Ｖ１、Ａｄ２６．ＣＭＶｔｅｔＯ＿ＧＬｕｃ．ＡｏＨＶ１＿ＲＦＬウイルスＤＮＡ。Ｖ２、Ａｄ２６．ＣＭＶ＿ＧＬｕｃ．ＡｏＨＶ１＿ＲＦＬウイルスＤＮＡ。（ＣおよびＤ）Ａｄ２６．ＣＭＶ＿ＧＬｕｃ．ＡｏＨＶ１＿ＲＦＬおよびＡｄ２６．ＣＭＶｔｅｔＯ＿ＧＬｕｃ．ＡｏＨＶ１＿ＲＦＬ精製バッチによる導入遺伝子発現の分析。９６ウェルプレートに播種したＡ５４９細胞を、示したウイルス粒子対細胞比（ＶＰ／細胞）で３連で感染させ、ＧＬｕｃおよびＲＦＬ活性を、感染の２日後に採取したサンプルにおいて検出した。ＲＬＵ、相対発光量。Ａｄ２６．ＣＭＶ（エンプティ）、ＧＬｕｃまたはＲＦＬコード配列を有さない適合対照Ａｄ２６ウイルスベクター。＊、Ａｄ２６．ＣＭＶｔｅｔＯ＿Ｇｌｕｃ．ＡｏＨＶ１＿ＲＦＬの１０ＶＰ／細胞での感染で見られた１８７ＲＬＵの１つの異常値を除いた（この３連の感染での他の２つの値は、１４および２６ＲＬＵであった）。
【図５−２】（上記の通り。）
【図５−３】（上記の通り。）
【図５−４】（上記の通り。）
【図６−１】図６：（Ａ）ｐＣ＿ＡｏＨＶ＿ＴｅｔＲのプラスミドマップ。灰色の矢印は、テトラサイクリンリプレッサー（ＴｅｔＲ）タンパク質、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ、およびベータ−ラクタマーゼのコード配列を示し、黒色の矢印は、他の遺伝要素を示す。白抜きの矢印は、ｐＣ＿ＡｏＨＶ＿ＴｅｔＲを構築するためにｐｃＤＮＡ２００４Ｎｅｏ（−）に挿入された合成配列を示す。ＡｏＨＶ−１  Ｐ、ＡｏＨＶ−１ショートプロモーター。ＴｅｔＲ、コドン最適化テトラサイクリンリプレッサーコード配列。ＢＧＨ  ｐＡ、ウシ成長ホルモン遺伝子由来ポリアデニル化シグナル。ＳＶ４０  Ｐ、ＳＶ４０ウイルス由来プロモーター。ｐＵＣ  ｏｒｉ、ｐＵＣ複製起点。ｂｌａ  Ｐ、ベータ−ラクタマーゼの発現を駆動するプロモーター。（Ｂ）２０、４０、および６０世代でのフローサイトメトリー細胞内染色による、長期継代でのＰＥＲ．Ｃ６／ＴｅｔＲ細胞クローンによるＴｅｔＲ発現の安定性。各時点で各クローン（選択ありで増殖、および選択なしで増殖）について観察されたＴｅｔＲ陽性画分を示す。ＰＥＲ．Ｃ６、抗生物質による選択なしでのみ増殖させた、ＴｅｔＲ構築物を含まない対照ＰＥＲ．Ｃ６細胞株（Ｃ）長期継代（６０回の集団倍加）後のＴｅｔＲ機能性アッセイ。ＰＥＲ．Ｃ６／ＴｅｔＲ細胞クローンをＡｄ２６．ＣＭＶ＿ＧＬｕｃ．ＡｏＨＶ１＿ＲＦＬおよびＡｄ２６．ＣＭＶｔｅｔＯ＿ＧＬｕｃ．ＡｏＨＶ１＿ＲＦＬに感染させ、その後、ＧＬｕｃおよびＲＦＬ活性を測定した。感染複製毎に、ＣＭＶまたはＣＭＶｔｅｔＯプロモーター駆動ＧＬｕｃ活性を、同じ試料について見られたＡｏＨＶ−１プロモーター駆動ＲＦＬ活性によって正規化した。得られた正規化Ｇｌｕｃ値を、ＴｅｔＲ陰性対照細胞株（ＰＥＲ．Ｃ６）について見出された値と比較して、この図で表す。＋、細胞を抗生物質選択で増殖させた。−、細胞を抗生物質選択なしで増殖させた。Ｃｔｒｌ（＋）、ヒトＣＭＶプロモーターの制御下、ｐＣＤＮＡ６／ＴＲ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号：Ｖ１０２５２０）、ＴｅｔＲ配列を含むプラスミドによる安定なトランスフェクションによってＰＥＲ．Ｃ６から得られた、以前に確立されたＴｅｔＲ陽性対照細胞株。
【図６−２】（上記の通り。）
【図６−３】（上記の通り。）
【図７−１】図７：（Ａ）ＡｏＨＶ−１プロモーターの切断バージョンおよび伸長バージョンの設計。ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号  ＮＣ＿０１６４４７のヌクレオチド番号１５７０７７〜１５４３０４に左から右に対応するヨザルヘルペスウイルス１型（Ａｏｔｉｎｅ  ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ−１）ゲノムの２７７４ｂｐストレッチを示す。ラベルを付したバーは、本明細書において設計し試験された種々のＡｏＨＶ−１プロモーター変異体を示す。配列ｖ００およびｖ０６は、それぞれ、その天然のＡｖｒＩＩ部位を有するＡｏＨＶ−１ショートプロモーター、および天然のＡｖｒＩＩ部位を有さないＡｏＨＶ−１ショートプロモーターを示す。ＤおよびＡ、それぞれ予測されたスプライスドナー部位およびアクセプター部位。ＴＡＴＡ、推定ＴＡＴＡボックス。Ｉｎｒ、推定イニシエーター配列（予測された転写開始部位を含む）。（Ｂ）一過性にトランスフェクトされたＰＥＲ．Ｃ６細胞における異なるバージョンのＡｏＨＶ−１プロモーターの効力試験の結果。２つの実験の平均結果を、ｖ００  ＡｏＨＶ−１ショートプロモーターと比較して示す。
【図７−２】（上記の通り。）
【発明を実施するための形態】
【００２６】
ヨザルヘルペスウイルス１型（Ａｏｔｉｎｅ  ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ−１）の最初期エンハンサー／プロモーター領域に由来する新しいプロモーター（ＡｏＨＶ−１プロモーター）の同定、設計、および試験に関する実験結果を本明細書に記載する。結果は、ＡｏＨＶ−１プロモーターが、異なる細胞株におけるプラスミドベクターによる一過性トランスフェクション、および導入遺伝子に作動可能に連結したＡｏＨＶ−１プロモーターを含むウイルスによるウイルス感染に基づいて、それが作動可能に連結した導入遺伝子の強力な発現を提供することを示す。ＡｏＨＶ−１プロモーターはまた、比較的短いプロモーターであり、そのため、サイズの制約が懸念される多くの適用における使用に好適である。したがって、本発明のＡｏＨＶ−１プロモーターは、強力な発現が優先的である場合、および／またはＡｏＨＶ−１プロモーターの小さいサイズが有用である場合の適用における使用、例えば、他のより長いプロモーターと比較して、限られたサイズのベクターまたはウイルスゲノムに導入遺伝子のためのより多くの空間を残すための使用に好適である。さらに、ｈＣＭＶのような他の一般に使用されるプロモーターとの低い配列相同性のために、ＡｏＨＶ−１プロモーターはまた、同時に使用される２つのプロモーター間の配列同一性が懸念される適用、例えば、同じウイルスベクターから２つの異なる導入遺伝子を発現する場合、またはｈＣＭＶプロモーター配列も含むプロデューサー細胞株を用いてウイルスを生成する場合の適用においても有用である。ＡｏＨＶ−１プロモーターはまた、ＡｏＨＶ−１プロモーターからの転写の調節に使用され得る調節配列と共に使用するのに好適である。
【００２７】
したがって、本発明は、導入遺伝子に作動可能に連結されたＡｏＨＶ−１プロモーターを含む組換え核酸分子に関する。特定の実施形態では、本発明は、細胞中で導入遺伝子を発現させるための導入遺伝子に作動可能に連結されたＡｏＨＶ−１プロモーターを含むベクターおよびウイルスの使用に関する。特定の非限定的な実施形態では、本発明のベクターは、プラスミド、コスミド、ファージミド、バクテリオファージ、細菌人工染色体、酵母人工染色体、ヒト人工染色体、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、アルファウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、エプスタイン・バール・ウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、またはそれらの組み合わせもしくはキメラを含み得る。当業者であれば、本発明のＡｏＨＶ−１プロモーターがまた、遺伝子発現および遺伝子導入の分野で使用される他のベクター、特に、強力な発現が重要であり、そして発現カセットの全体的なサイズが関連する因子であるベクターにおいて有用であることを認識するであろう。
【００２８】
本発明はまた、宿主細胞が異種タンパク質、または他の目的の発現産物を産生することを可能にするためのベクターの使用に関する。例えば、導入遺伝子に作動可能に連結されたＡｏＨＶ−１プロモーターを含むプラスミドベクターは、細胞において異種タンパク質を発現するために使用され得る。このようなプラスミドベクターは、例えば、（１）ＡｏＨＶ−１プロモーターと；（２）導入遺伝子の翻訳開始のためのコザックコンセンサス配列と；（３）導入遺伝子のコード領域、例えば、所望のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と；（４）導入遺伝子のコード全体が読み取られたときに翻訳を終結させる、導入遺伝子の終結配列と；ポリアデニル化シグナル、ならびに／または特定のベクターからの導入遺伝子を発現することが当業者に知られている介在配列および他のエレメントと；そして（６）任意選択により、ベクターがゲノムに直接挿入されない場合に、ベクター全体が細胞内に入ったなら直ちにそれを再生させる複製起点とを含むＤＮＡ配列であり得る。ベクターは、例えば、トランスフェクション、エレクトロポレーション、または感染によって宿主細胞に導入することができ、そして宿主細胞を培養して導入遺伝子を発現させることができる。
【００２９】
特定の実施形態における本発明のプラスミドベクターはまた、いくつかの制限部位を含むＤＮＡの短いセグメントである、ポリリンカーとも呼ばれる多重クローニング部位（ＭＣＳ）を１つ以上含む。ＭＣＳ内のこれらの制限部位は一般に特有のものであり、所与のプラスミド内で１回だけ生じる。ＭＣＳは一般に分子クローニングまたはサブクローニングに関連する手順の間に使用され、一片のＤＮＡまたはいくつかのＤＮＡ片のＭＣＳの領域への挿入、例えば、細胞における発現のために目的のタンパク質をコードする導入遺伝子に作動可能に連結されたＡｏＨＶ−１プロモーターを含む発現カセットの挿入を可能にすることから、バイオテクノロジー、バイオエンジニアリング、および分子遺伝学において極めて有用である。
【００３０】
本発明はまた、本明細書に記載のベクターによって形質転換された細胞、および、ＡｏＨＶ−１プロモーターを含む組換え細胞株であって、ＡｏＨＶ−１プロモーターが導入遺伝子に作動可能に連結されている、組換え細胞株を提供する。この場合、形質転換は、異種核酸物質が細胞に導入され、細胞内で発現されるプロセスを指す。したがって、本明細書で使用される形質転換には、「一過性」で「安定した」トランスフェクション手順、例えば、以下に限定されないが、エレクトロポレーション、カチオン性脂質／ＤＮＡ複合体、タンパク質／ＤＮＡ複合体、リン酸カルシウム媒介性飲作用、ウイルスベクターなどによって媒介されるものが含まれる。この場合、宿主細胞に導入された核酸が染色体外に存在するか、またはトランスフェクトされた核酸が宿主細胞のゲノムに組み込まれている。トランスフェクション手順はまた、選択マーカー（例えば、抗生物質に対する耐性）をコードする第２の核酸を含み得、これは、トランスフェクトされたＡｏＨＶ−１プロモーターを含む核酸が維持されるように、細胞の陽性選択を可能にする。したがって、導入遺伝子に作動可能に連結されたＡｏＨＶ−１プロモーターは、導入遺伝子を発現させるための、例えば、プラスミドベクター、ウイルスベクター、または組換えウイルスに統合されて、細胞株中に存在し得る。特定の実施形態では、導入遺伝子に作動可能に連結されたＡｏＨＶ−１プロモーターは、導入遺伝子を発現する組換え細胞株のゲノムに組み込まれ得る。
【００３１】
本発明はまた、細胞において導入遺伝子を発現させる方法であって、導入遺伝子が、例えば、目的のタンパク質をコードする導入遺伝子、または非コード配列（例えば、マイクロＲＮＡ、短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、またはアンチセンスＲＮＡなどの調節ＲＮＡ）を含む導入遺伝子を含む方法において、導入遺伝子に作動可能に連結されたＡｏＨＶ−１プロモーターを含むベクターを細胞に提供することを含む方法を提供する。特に、特定の実施形態では、本発明はまた、目的のタンパク質を生成する方法であって、ＡｏＨＶ−１プロモーターが目的の発現産物をコードする導入遺伝子に作動可能に連結されている方法において、目的の発現産物をコードする核酸配列に作動可能に連結されたＡｏＨＶ−１タンパク質を含む細胞を提供する工程、およびこの細胞に目的の発現産物を発現させる工程を含む方法を提供する。特定の実施形態では、発現産物はタンパク質である。特定の実施形態では、発現産物はテトラサイクリンリプレッサー（ＴｅｔＲ）タンパク質である。本方法は、目的の発現産物、例えば、タンパク質を、例えば、細胞から、または培養培地から、または細胞および培養培地から回収する工程をさらに含み得る。本方法はまた、例えば、診断、治療または予防目的、研究などを含む、種々の目的のためにタンパク質を精製する工程を含み得る。さらに、任意選択により、精製した目的のタンパク質を医薬組成物に製剤化することができる。治療タンパク質には、例えば、抗凝固剤、血液凝固因子、成長因子、ホルモン、抗体、Ｆｃ融合タンパク質、骨形成タンパク質、人工タンパク質足場、酵素、およびサイトカイン（例えば、ケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、リンホカイン、および腫瘍壊死因子など）が含まれ得る。
【００３２】
本発明はまた、ウイルスを作製する方法であって、前記ウイルスを増殖させる機能を有する遺伝子を発現する細胞中でウイルスを増殖させる工程を含む方法において、前記遺伝子はＡｏＨＶ−１プロモーターの制御下にあり、かつ前記遺伝子は核酸（例えば、調節ＲＮＡ）またはタンパク質、例えば、ウイルス複製サイクルの欠損またはウイルスの他の機能（例えば、感染）を補完するタンパク質をコードする方法を提供する。ウイルスは野生型ウイルスであり得るが、好ましくは、例えば、複製欠損または感染欠損をもたらす欠損を有する組換えウイルスである。さらに、前記遺伝子は、細胞の染色体外エレメントから、または好ましくはゲノムから発現させることができ（この細胞は、この場合、安定な細胞株からのものあり得る）、細胞は、ウイルスが回収され、任意選択により精製され、次いで、他の細胞に感染させるために、または医薬組成物などに製剤化するために使用され得るように、培養培地中で培養することができる。
【００３３】
本発明による「細胞」または「宿主細胞」は、ＡｏＨＶ−１プロモーターが活性であり得る細胞であり得る。特定の実施形態では、細胞はその正常組織から単離され、例えば、培養培地（インビトロ）で培養され得る。特定の実施形態では、本発明による細胞または宿主細胞は、例えば、細胞株由来の不死化細胞である。特定の実施形態では、本発明による細胞または宿主細胞は、哺乳動物または鳥の細胞であり、好ましくは、哺乳動物の細胞である。本発明による細胞または宿主細胞のいくつかの非限定的な例は、齧歯類細胞、ヒト細胞、サル細胞、イヌ細胞、ニワトリ細胞などである。本発明による細胞または宿主細胞のいくつかの非限定的な例は、ベロ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、ＣＨＯ細胞、ニワトリ胚線維芽細胞、ハイブリドーマ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、ヒーラ細胞、Ａ５４９細胞などである。当業者であれば、ＡｏＨＶ−１プロモーターが目的の発現産物の発現を指示するために多くの異なる細胞において使用され得ること、および細胞の種類が本発明に重要ではないことを認識するであろう。
【００３４】
特定の態様では、本発明は、プロデューサー細胞であって、ＡｏＨＶ−１プロモーターがＴｅｔＲタンパク質をコードする核酸配列に作動可能に連結されている、好ましくはＡｏＨＶ−１プロモーターおよびＴｅｔＲをコードする配列がプロデューサー細胞のゲノムに組み込まれている、好ましくは前記細胞が哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞である細胞を提供し、特に好ましい実施形態では、プロデューサー細胞は、ＰＥＲ．Ｃ６細胞（例えば、米国特許第５，９９４，１２８号明細書を参照）から、そのゲノムへＡｏＨＶ−１プロモーターおよびＴｅｔＲをコードする配列を組み込むことによって得られる。したがって、本発明はまた、前記細胞のゲノムに組み込まれた導入遺伝子を含むＰＥＲ．Ｃ６細胞であって、導入遺伝子は、ＴｅｔＲコード配列に作動可能に連結されたＡｏＨＶ−１プロモーターを含む核酸を含むＰＥＲ．Ｃ６細胞を提供する。その非限定的な実施形態では、導入遺伝子は、配列番号２０で示される配列を有する。したがって、このような細胞はＴｅｔＲを発現し、そして例えば、ＴｅｔＲによって調節され得るプロモーター、例えば、１つ以上のｔｅｔＯ部位に作動可能に連結されたＣＭＶまたは他のプロモーターの制御下で、目的の発現産物をコードする組換えアデノウイルスを産生させるために使用することができ、これは、アデノウイルスによってコードされる目的の発現産物がプロデューサー細胞に有毒であるか、またはそれがアデノウイルスの増殖中に産生される場合に、組換えアデノウイルスの安定性もしくは収率を減少させるなら、特に有利であり得る。そのような系では、ＴｅｔＲは、組換えアデノウイルスが増殖し生成される間に目的の発現産物が産生されないか、または非常に低いレベルでのみ産生され、産生の間の組換えアデノウイルスの収率および／または安定性を改善させるように、プロデューサー細胞における産生の間に、ｔｅｔＯ調節プロモーター、例えばｔｅｔＯ調節ｈＣＭＶプロモーターを抑制し得る。一態様では、本発明はまた、（ｉ）ＴｅｔＲをコードする配列に作動可能に連結されたＡｏＨＶ−１プロモーターを含むプロデューサー細胞、および（ｉｉ）１つ以上のｔｅｔＯ部位に作動可能に連結されるプロモーターに作動可能に連結された目的の発現産物をコードする配列を含む組換えアデノウイルスを含む組み合わせを提供する。
【００３５】
本発明はまた、導入遺伝子に作動可能に連結されたＡｏＨＶ−１プロモーターを含むベクターおよびウイルスを用いて、遺伝的疾患、代謝疾患または後天性疾患を治療する方法を提供する。この方法は、細胞を、導入遺伝子に作動可能に連結されたＡｏＨＶ−１プロモーターを含む本発明のベクターまたはウイルスの十分な量と接触させることを含み、その細胞は、導入遺伝子が細胞中で発現するように形質転換される。細胞は、インビトロ、エクスビボまたはインビボで形質転換することができる。
【００３６】
ベクターの重要な側面は、プラスミドベクターなどのＤＮＡベクターであれ、アデノウイルスベクターなどのウイルスベクターであれ、所望の導入遺伝子配列を収容するこれらのベクターの能力である。このような能力は、ベクターのサイズ制約によって制限されることがあり、例えば、あるサイズ限界を超えた場合、不安定になるかまたは生成が不可能になることさえあり得る。したがって、プロモーターによって占められる空間は、そのようなプロモーターが有する機能とは別に、新しいベクターを設計する際の重要な考慮事項である。本発明のＡｏＨＶ−１プロモーターは、比較的短いという利点を有し、これは、ベクターの特定のサイズ限界において、導入遺伝子のためにより多くの空間が残ることを意味し、例えば導入遺伝子が免疫原である場合、より多くのエピトープが含まれることを可能にし、またはより大きいサイズの他のプロモーターと比較してより大きいタンパク質の発現を可能にする。本発明のＡｏＨＶ−１プロモーターのさらなる利点は、例えば、ベクターなどの１つの核酸分子上の両プロモーター、または細胞株中の１つのプロモーターと細胞株中に存在するベクターなどの核酸分子上の他のプロモーターのような、１つの系でｈＣＭＶプロモーターと組み合わせても、ＡｏＨＶ−１プロモーターとｈＣＭＶプロモーターとの間の低い配列相同性のために、プロモーター配列間で相同組換えが起こるリスクが非常に限定されることである。
【００３７】
本明細書では、「低（い）配列相同性」および「低（い）配列同一性」という用語は、それらがｈＣＭＶプロモーター配列に関連して使用される場合、ｈＣＭＶプロモーターに対し約５０％未満の同一性を有する、好ましくは、ｈＣＭＶプロモーターに対し約４０％未満の同一性を有するプロモーター配列を指す。さらに、「低（い）配列相同性」および「低（い）配列同一性」を有するプロモーター配列はまた、好ましくは約１５核酸より長い連続する同一アラインメントのストレッチを有さない、またはより好ましくは約１４核酸より長い同一アラインメントのストレッチを有さない。特定の好ましい実施形態では、プロモーターはＡｏＨＶ−１ショートプロモーター（配列番号１または配列番号３０）であり、ｈＣＭＶプロモーターとの同一性は３６％であり、かつ、１４核酸より長い連続する同一アラインメントのストレッチは存在しない。他の好ましい実施形態では、プロモーターは、プロモーター活性を有する配列番号１または配列番号３０の断片、例えば配列番号２５または配列番号２６を含む。本明細書で使用される場合、アラインメントは、当業者によく知られた方法、例えば、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）などのアルゴリズムを使用して、異なるヌクレオチド配列またはタンパク質配列を整列させ、比較する方法を指す（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｇｉｓｈ，Ｍｉｌｌｅｒ，Ｍｙｅｒｓ，＆  Ｌｉｐｍａｎ，１９９０）。
【００３８】
本発明はまた、ｈＣＭＶプロモーターおよびＡｏＨＶ−１プロモーターを含むベクターまたはウイルスによって形質転換された細胞またはトランスジェニック生物を提供する。ここで、ｈＣＭＶプロモーターおよびＡｏＨＶ−１プロモーターは導入遺伝子に、両方の導入遺伝子が細胞またはトランスジェニック生物において発現するように連結されている。ｈＣＭＶプロモーターおよびＡｏＨＶ−１プロモーターは別々の分子に存在してもよく（例えば、プラスミドもしくはウイルス上の１つのプロモーターと、細胞のゲノム中の他のプロモーター、または異なるプラスミド上の両方のプロモーター、または細胞のゲノム中の両方のプロモーター）、あるいは両方のプロモーターは単一の分子に（例えば、ゲノムの１つの染色体、または１つのプラスミドに、またはウイルスの１つのゲノムに）存在してもよい。
【００３９】
本発明はまた、組換えウイルスを作製する方法であって、ウイルスが標的細胞に導入されると導入遺伝子が強力に発現される方法において、導入遺伝子に作動可能に連結されたＡｏＨＶ−１プロモーターを含むコンストラクトを調製する工程と、前記コンストラクトを組換えウイルスに組み込み、次いで、例えば、ウイルスによる感染によって、ベクターを細胞に導入する工程とを含む方法を提供する。コンストラクト自体の調製は、当業者に知られ、組換えベクターまたは組換えウイルスの技術の分野において日常的に行われており、本明細書中に例示されている、よく知られた標準的な分子クローニング方法の使用を包含する（例えば、（Ｈｏｌｔｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；Ｌｅｍｃｋｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｖｏｇｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ、１９８９；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ  ＦＭ，ｅｔ  ａｌ，ｅｄｓ，１９８７；ｔｈｅ  ｓｅｒｉｅｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；ＰＣＲ２：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ  ＭＪ，Ｈａｍｓ  ＢＤ，Ｔａｙｌｏｒ  ＧＲ，ｅｄｓ，１９９５を参照されたい）。ＡｏＨＶ−１プロモーターは上記のような特徴を有し、本開示を考慮して、ＰＣＲまたはデノボ核酸合成などの日常的な方法によって得ることができる。便宜のため、当業者は、例えば、プラスミド形態の導入遺伝子の容易な操作と導入のために、Ｅ１領域までのアデノウイルスのゲノムの左部分のための第１の部分、および第１の部分との再結合時に完全なアデノウイルスゲノムをもたらすことができるゲノムの残部のためのより大きい第２の部分など、より小型の断片にクローニングすることでウイルスゲノムを操作し得る（例えば、国際公開第９９／５５１３２号パンフレットを参照されたい）。
【００４０】
例えば、本発明のベクターまたはウイルスまたは細胞における「異種核酸」または「異種遺伝子」（本明細書においては「導入遺伝子」または「目的の遺伝子」とも称する）は、ベクターもしくはウイルスもしくは細胞に天然に存在しないか、または天然にはＡｏＨＶ−１プロモーターに作動可能に連結されていない核酸である。それは、例えば、標準的な分子生物学的手法によりベクターまたはウイルスまたは細胞に導入される。特定の実施形態では、それは、目的のタンパク質またはその一部をコードし得る。このような場合、目的のタンパク質は、天然にＡｏＨＶ−１プロモーターに作動可能に連結された配列によって天然にはコードされていないので、「異種タンパク質」と呼ばれ得る。導入遺伝子は例えば、プラスミドベクターに、またはアデノウイルスベクターの欠失したＥ１またはＥ３領域にクローニングすることができる。本発明のいくつかの実施形態では、導入遺伝子に作動可能に連結されたＡｏＨＶ−１プロモーターを有する発現カセットは、アデノウイルスゲノムのＥ１領域に配置される。本発明のいくつかの実施形態では、導入遺伝子に作動可能に連結されたＡｏＨＶ−１プロモーターを有する発現カセットは、アデノウイルスゲノムのＥ３領域に配置される。本発明のいくつかの実施形態では、導入遺伝子に作動可能に連結されたＡｏＨＶ−１プロモーターを有する発現カセットは、アデノウイルスゲノムのＥ４領域と右ＩＴＲとの間に配置される。他の実施形態では、導入遺伝子に作動可能に連結されたＡｏＨＶ−１プロモーターを有する発現カセットは、プラスミドベクター中に存在する。他の実施形態では、導入遺伝子に作動可能に連結されたＡｏＨＶ−１プロモーターを有する発現カセットは、細胞のゲノムに組み込まれる。このような細胞または細胞株は、例えば、プロモーターが活性である条件下で細胞を培養することによって、導入遺伝子を組換え的に発現させるために使用することができ（プロモーターの非調節バージョンが使用される場合、すなわち、プロモーターに調節エレメントが付加されていない場合、この発現は、培養の際に自動的に起こる）、導入遺伝子の発現を駆動する。
【００４１】
本明細書で使用される場合、「プロモーター」、または「プロモーター領域」、または「プロモーターエレメント」という用語は、同義的に使用され、それが作動可能に連結している核酸配列の転写を制御する核酸配列の断片（典型的にはＤＮＡであるが、これに限定されるものではない）を指す。プロモーター領域は、ＲＮＡポリメラーゼの認識、結合、および転写開始に十分な特異的配列を含む。さらに、プロモーター領域は、任意選択的に、このＲＮＡポリメラーゼの認識、結合、および転写開始活性を調節する配列を含み得る。これらの配列は、シス作用性であるか、またはトランス作用因子応答性であり得る。さらに、プロモーターは、調節の性質により、構成的または調節的であり得る。
【００４２】
プロモーターが核酸配列のストレッチから構築され、多くの場合、転写開始部位、ＲＮＡポリメラーゼの結合部位、ＴＡＴＡボックスなどの一般的転写因子結合部位、特異的転写因子結合部位などのエレメントまたは機能単位を核酸配列のストレッチ中に含むことを当業者は認識するであろう。エンハンサー、ときにプロモーター配列の末端のイントロンなどのさらなる調節配列も存在し得る。このような機能単位は、互いに直接隣接し得るが、プロモーター機能において直接的な役割を有さない核酸のストレッチによって分離されることもある。当業者は、核酸のストレッチ中のヌクレオチドがプロモーター機能に関連するかどうかを試験するため、および標準的な分子生物学的方法によって、例えば、プロモーター活性を保持しながらその長さを最小限にするために、または活性を最適化するために、所与のプロモーター配列に対するヌクレオチドの除去または付加の効果を試験するために、本明細書中の実施例を参照し得る。また、他のプロモーター（例えば、ｈＣＭＶ）との同一性（のストレッチ）を減少させるために、プロモーターに変異を導入することができる（これらのプロモーターが同じ細胞中に存在するか、または同時に使用されることが意図されている場合）。
【００４３】
本明細書中で使用される場合、「エンハンサー」という用語は、遺伝子またはいくつかの遺伝子の転写を刺激または増強するためにタンパク質（アクチベータータンパク質）によって結合され得る調節ＤＮＡ配列（例えば、５０〜１５００ｂｐ）を指す。これらのアクチベータータンパク質（別名、転写因子）は、メディエータ複合体と相互作用し、ポリメラーゼＩＩおよび基本転写因子を動員し、次に遺伝子の転写を開始する。エンハンサーは、一般にシス作用性であるが、それらが調節する１つまたは複数の遺伝子の開始部位の上流または下流に位置し得る。さらに、エンハンサーは、前方向または後方向であり得、かつ転写に影響を及ぼすために転写開始部位の近くに位置する必要はなく、いくつかは、開始部位の数十万塩基対上流または下流に位置することが見出されている。エンハンサーは、イントロン内に見出すこともできる。
【００４４】
本明細書中の配列は、当該技術分野で慣用されているように５’から３’の方向で示される。また、「上流」および「下流」という用語は、当該技術分野で一般に使用されている転写の方向に関してであることにも留意されたい。例えば、慣例により、上流および下流という用語は、ＲＮＡ転写が起こる５’から３’の方向に関する。上流は、ＲＮＡ分子の５’末端方向であり、下流は、３’末端方向である。二本鎖ＤＮＡを考えると、上流は、対象の遺伝子のコード鎖の５’末端方向であり、下流は、３’末端方向である。ＤＮＡの逆平行性により、これは、鋳型鎖の３’末端が遺伝子の上流にあり、５’末端が下流にあることを意味する。
【００４５】
本発明によるＡｏＨＶ−１プロモーターは、好ましくはＴＡＴＡボックス配列、例えば、配列番号２５の２５１〜２５８位に位置する配列を含む。本明細書で定義される「ＴＡＴＡボックス」は、ＴＡＴＡ結合タンパク質（ＴＢＰ）によって結合され得、そしてコンセンサス配列ＴＡＴＡＷＡＷＲ（ここで、ＷはＡまたはＴであり、ＲはＡまたはＧである）を有するＤＮＡ配列である。それは、通常、転写開始部位の約２５〜３５塩基対上流に位置する。特定の実施形態では、本発明のＡｏＨＶ−１プロモーターは、ＴＡＴＡボックス配列ＴＡＴＡＴＡＡＧ（配列番号２５の２５１〜２５８位）を含む。当業者であれば、ＡｏＨＶ−１プロモーターの前記ＴＡＴＡボックス配列（すなわち、ＴＡＴＡＴＡＡＧ）が、プロモーター活性の予想された有意な減少なしに、類似の標準ＴＡＴＡボックス配列、すなわち、コンセンサス配列ＴＡＴＡＷＡＷＲ（ここで、ＷはＡまたはＴであり、ＲはＡまたはＧである）に対応するものによって置換され得ることを理解するであろう。
【００４６】
本発明によるＡｏＨＶ−１プロモーターはまた、配列番号２５の２８０〜２８６位に位置するような（推定）イニシエーターエレメント（Ｉｎｒ）（配列：ＣＣＡＴＴＣＧ）を含み得る。Ｉｎｒが存在する実施形態では、ＡｏＨＶ−１プロモーターの前記Ｉｎｒ配列（すなわち、ＣＣＡＴＴＣＧ）の、Ｉｎｒ配列ＹＹＡＮＷＹＹ（ここで、ＹはＣまたはＴであり；ＮはＡ、Ｃ、ＧまたはＴであり；ＷはＡまたはＴである）に主に付着する別の配列による置換が、前記プロモーターの活性に有意に影響を及ぼさないと予想される。
【００４７】
推定Ｉｎｒが存在する特定の実施形態では、ＡｏＨＶ−１プロモーターは、配列番号２５の、２５１〜２５８位に対応するＴＡＴＡボックス、ならびに約ｎｔ２８６までの配列を含む。理論に縛られることを望むものではないが、本発明のＡｏＨＶ−１プロモーターの特定の実施形態はＴＡＴＡボックスおよびＩｎｒの両方を含むことが有益であり得る。ここで、Ｉｎｒ配列はＴＡＴＡボックスの第１のｎｔの約２５〜４０ｎｔ下流、例えば、約２９〜３６ｎｔ下流に位置する。
また、Ｉｎｒが存在しない実施形態では、ＴＡＴＡボックスの下流、および目的の作動可能に連結された遺伝子のコード配列の上流に、少なくとも約２５〜３５塩基対を含むことが好ましい。本願は、ＴＡＴＡボックスの最初のｎｔの約２９〜３５ｎｔ下流の天然の位置にコンセンサスＩｎｒ配列をもはや含まないＡｏＨＶ−１プロモーターの少なくとも１つの例を含むが、そのようなプロモーターはなお活性であり、その位置のＩｎｒ配列が機能的プロモーターに必須ではないことを示す。
【００４８】
本発明によるＡｏＨＶ−１プロモーターは、本明細書においては、プロモーター活性を有し、配列番号２５の少なくとも５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、または３５０ヌクレオチドからなる断片に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有するか、または１００％同一である配列を含む配列と定義される。前記断片は、配列番号２５のｎｔ２３７〜２８６に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有するか、または１００％同一である、少なくとも５０ｎｔからなる配列を含むことが好ましく、前記少なくとも５０ｎｔは、配列番号２５中の約ｎｔ２５１〜２５８に対応する位置に配列ＴＡＴＡＷＡＷＲ（ＴＡＴＡボックスコンセンサス配列）を含むことが好ましい）。
したがって、特定の好ましい実施形態では、本発明のＡｏＨＶ−１プロモーターは、配列番号２５のｎｔ２３７−２８６に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む。
【００４９】
本発明のＡｏＨＶ−１プロモーターの３’側トランケーションは、おそらく、配列番号２５の約ｎｔ２８６の下流（すなわち、この配列のヌクレオチド２８２にあると予想される、予想転写開始部位を含む推定Ｉｎｒの下流）に、プロモーター活性に強い影響を及ぼさずになされ得るが、一方、推定Ｉｎｒ／転写開始部位を除去する、または特に、前記推定Ｉｎｒ／転写開始部位および前記ＴＡＴＡボックスの両方を除去する、より大きな３’側トランケーションは、プロモーター活性を有意に減少させると予想される。実際、ＡｏＨＶ−１ショートプロモーターの３’側トランケーションバージョン（配列番号３０）（これは、ヌクレオチド３９９の下流のＡｏＨＶ−１配列を含んでいない（すなわち、配列番号２５のヌクレオチド２８７に対応する、配列番号３０では推定Ｉｎｒの下流に１つのＡｏＨＶ−１ヌクレオチドのみを含む））は、，：プロモーターとしてなお活性であることが示された。
【００５０】
ＴＡＴＡボックスの上流にわずかに１２０のヌクレオチドを含む比較的短いプロモーター断片（配列番号２６）が、有意なプロモーター活性を有しており、これは（例えば、配列番号２５におけるように）いくつかのさらなる上流配列を加えることによって、さらにいくらか増大させることができることが、本明細書中に示されている。一方、ＡｏＨＶ−１ショートプロモーター（配列番号３０）の３’末端（すなわち、推定Ｉｎｒ／転写開始部位の下流）における、（例えば、配列番号２７、配列番号２８および配列番号２９のような）特定のさらなる下流配列を含むことによる伸長は、活性をさほど増加させないようである。
【００５１】
好ましい実施形態では、本発明のＡｏＨＶ−１プロモーターは、配列番号２５のヌクレオチド２０１〜２８６と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であるか、または１００％同一である断片を含む。
より好ましい実施形態では、本発明のＡｏＨＶ−１プロモーターは、配列番号２５のヌクレオチド１８７〜２８６と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であるか、または１００％同一である断片を含む。
より好ましい実施形態では、本発明のＡｏＨＶ−１プロモーターは、配列番号２５のヌクレオチド１３７〜２８６と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であるか、または１００％同一である断片を含む。
より好ましい実施形態では、本発明のＡｏＨＶ−１プロモーターは、配列番号２５のヌクレオチド１３１〜２８６と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であるか、または１００％同一である断片を含む。
より好ましい実施形態では、本発明のＡｏＨＶ−１プロモーターは、配列番号２５のヌクレオチド８７〜２８６と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であるか、または１００％同一である断片を含む。
より好ましい実施形態では、本発明のＡｏＨＶ−１プロモーターは、配列番号２５のヌクレオチド３７〜２８６と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であるか、または１００％同一である断片を含む。
より好ましい実施形態では、本発明のＡｏＨＶ−１プロモーターは、配列番号２５のヌクレオチド１〜２８６と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であるか、または１００％同一である断片を含む。
【００５２】
特定の実施形態では、本発明のＡｏＨＶ−１プロモーターは、配列番号２６の少なくとも２００のヌクレオチドに対して少なくとも９８％の同一性を有する配列を含むことが好ましく（また、少なくともＩｎｒ、およびＴＡＴＡボックスを含むその上流の配列、およびさらに上流の配列、例えば、配列番号２５の少なくとも約ｎｔ８７〜２８６を含むことが好ましい）、配列番号２６に対して少なくとも９９％の同一性を有するか、または１００％同一であるヌクレオチド配列を含むことがより好ましく、配列番号２５に対して少なくとも９９％の同一性を有するか、または１００％同一であるヌクレオチド配列を含むことがより一層好ましい。特定の実施形態では、ＡｏＨＶ−１プロモーターは、配列番号３２の断片と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であるか、または１００％同一である２４０〜１５００ヌクレオチド、好ましくは２４０〜１０００ヌクレオチド、より好ましくは２４０〜５００ヌクレオチドの断片を含み、前記配列番号３２の断片は、配列番号２５のヌクレオチド２０１〜２８６（これは、配列番号３２のヌクレオチド１３５９〜１４４４に対応する）と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であるか、または１００％同一である断片を含む。
【００５３】
本発明は、導入遺伝子を有するベクターのサイズ制限との関連で非常に有利であり得る（すなわち、より大きい導入遺伝子を収容することができ、かつ／またはベクターがより安定であり得る）、比較的小さいサイズを有する強力なＡｏＨＶ−１プロモーターを提供する。したがって、本発明のＡｏＨＶ−１プロモーターは、好ましくは長さが２０００ヌクレオチド（２ｋｂ）未満、好ましくは１ｋｂ未満、より好ましくは０．８ｋｂ未満である。特定の好ましい実施形態では、ＡｏＨＶ−１プロモーターは、７００未満、６５０未満、６００未満、５５０未満、５００未満のヌクレオチド長である。特定の好ましい実施形態では、ＡｏＨＶ−１プロモーターは、少なくとも２００、少なくとも２４０、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００ヌクレオチド長である。特定の好ましい実施形態では、ＡｏＨＶ−１プロモーターは、２００〜５００、例えば２４０〜４８５ヌクレオチド長である。本明細書に示すように、比較的短い配列を有するにもかかわらず、この新規のＡｏＨＶ−１プロモーターは、驚くべきことに、それが作動可能に連結している導入遺伝子を強力に発現させることができる。
【００５４】
当業者であれば、提供された配列に変異を作ることができ、得られたプロモーターは日常的な方法によってプロモーター活性を試験することができることを認識するであろう。また、配列の変異体は天然に、例えば、ウイルスの異なる単離物中に存在し得、したがって、このような変異体はヌクレオチド配列にいくらかの差異を有し得るが、同一の機能を維持し得る。一般的には、示されたプロモーター配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列は依然として機能的活性を有し、それ故、ＡｏＨＶ−１プロモーターと考えられる。したがって、本発明のＡｏＨＶ−１プロモーターは、好ましくは、本明細書中で提供される好ましいＡｏＨＶ−１プロモーター配列、例えば、配列番号１、３０、２５または２６のいずれか１つに対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するか、または１００％同一である配列を含む。当業者であればまた、提供されるプロモーター配列の異なる部分の配列の長さがある程度変化し得、そして実質的に類似の結果が得られ得ることを知っているであろう。本明細書中に例示されるプロモーター配列の断片または変異配列が依然としてプロモーター活性を有するか否かの試験は、当業者であれば本明細書中に開示される情報を用いて過度の負担なしに実施することができる。
【００５５】
本発明のＡｏＨＶ−１プロモーターの好ましい実施形態は、配列番号２６を含むＡｏＨＶ−１プロモーターである。本発明のＡｏＨＶ−１プロモーターは、好ましくは、配列番号２６、または５０、１００、１５０もしくは２００ヌクレオチドからなるその断片に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。特定の好ましい実施形態では、ＡｏＨＶ−１プロモーターは、配列番号２６、または少なくとも５０、１００、１５０もしくは２００ヌクレオチドからなるその断片と１００％同一である。
【００５６】
本発明のさらなる好ましいＡｏＨＶ−１プロモーターは、配列番号２５を含むＡｏＨＶ−１プロモーターである。特定の実施形態では、本発明のＡｏＨＶ−１プロモーターは、好ましくは、配列番号２５、または少なくとも５０、１００、１５０、２００、２５０、３００もしくは３５０ヌクレオチドからなるその断片に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するか、または１００％同一である。特定の好ましい実施形態では、ＡｏＨＶ−１プロモーターは、配列番号２５、または少なくとも５０、１００、１５０、２００、２５０、３００もしくは３５０ヌクレオチドからなるその断片と１００％同一である。
【００５７】
さらなる実施形態では、本発明の好ましいＡｏＨＶ−１プロモーターは、配列番号１または配列番号３０を含むＡｏＨＶ−１ショートプロモーターである。特定の実施形態では、本発明のＡｏＨＶ−１プロモーターは、好ましくは、配列番号１、または少なくとも５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０もしくは４００ヌクレオチドからなるその断片に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。特定の好ましい実施形態では、ＡｏＨＶ−１プロモーターは、配列番号１と１００％同一であるか、または配列番号３０と１００％同一であるか、または少なくとも５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０もしくは４００ヌクレオチドからなるこれらの１つの断片と１００％同一である。
【００５８】
他の実施形態では、本発明のＡｏＨＶ−１プロモーターは、配列番号２２に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有するか、または１００％同一である配列を含む。
【００５９】
他の実施形態では、本発明のＡｏＨＶ−１プロモーターは、配列番号２３に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有するか、または１００％同一である配列を含む。
【００６０】
他の実施形態では、本発明のＡｏＨＶ−１プロモーターは、配列番号２７に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有するか、または１００％同一である配列を含む。
【００６１】
他の実施形態では、本発明のＡｏＨＶ−１プロモーターは、配列番号２８に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有するか、または１００％同一である配列を含む。
【００６２】
他の実施形態では、本発明のＡｏＨＶ−１プロモーターは、配列番号２９に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有するか、または１００％同一である配列を含む。
【００６３】
特定の他の実施形態では、本発明のＡｏＨＶ−１プロモーターは、転写を調節するための１つ以上のオペレーター配列および／またはエンハンサー配列、例えば、ｔｅｔＯ配列、クメート（ｃｕｍａｔｅ）オペロン由来のオペレーター配列、ＳＶ４０またはｈＣＭＶのような天然に存在するエンハンサー−プロモーター対由来のエンハンサー（Ｆｏｅｃｋｉｎｇ  ＆  Ｈｏｆｓｔｅｔｔｅｒ，１９８６）、合成エンハンサー（Ｓｃｈｌａｂａｃｈ，Ｈｕ，Ｌｉ，＆  Ｅｌｌｅｄｇｅ，２０１０）、または当業者によく知られている他の調節配列に作動可能に連結されたコアプロモーター（配列番号３１）を含む。本明細書中で使用される場合、「コアプロモーター」という用語は、それ自体のプロモーター活性は非常に低いが、コアプロモーターからの転写を調節する１つ以上の調節配列、例えば、テトラサイクリン制御トランスアクチベータータンパク質（ｔＴＡ）によって結合され得るｔｅｔＯ配列と組み合わされると、導入遺伝子の強力な発現を駆動し得る、プロモーターの最小機能単位を意味するものとする。コアプロモーター配列に関する議論については、例えば、（Ｓｍａｌｅ，２００１）を参照されたい。
【００６４】
ＡｏＨＶ−１プロモーターに作動可能に連結された導入遺伝子は、強力に発現され得る。本明細書中で使用される場合、「強力に発現される」または「強力な発現」は、例えば、ウエスタンブロット、ＦＡＣＳ分析、または発光もしくは蛍光を使用する他のアッセイなどの種々のタンパク質検出手法の１つによって測定された場合に、ＡｏＨＶ−１プロモーターからの発現が、ｈＣＭＶプロモーター（配列番号４を有する）からの発現の少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、もしくは好ましくは約１００％、またはそれ以上であることを意味する。注目すべきことに、ｈＣＭＶプロモーターは、ｈＰＧＫ、ＵＢＩ  ＣまたはＲＳＶ  ＬＴＲプロモーターなどの他の一般に使用されるプロモーターと比較して、はるかに強力である（Ｐｏｗｅｌｌ，Ｒｉｖｅｒａ−Ｓｏｔｏ，＆  Ｇｒａｙ，２０１５）。ｈＣＭＶプロモーターは、ヒトサイトメガロウイルスの主要最初期（ｍＩＥ）領域に由来し、ワクチンおよび遺伝子治療ベクターにおける強力な遺伝子発現のために頻繁に使用される。例えば、ｈＣＭＶプロモーター配列は、ｈＣＭＶ  ＡＤ１６９株ｍＩＥ遺伝子座（Ｘ０３９２２）に由来し得、かつＮＦ１結合部位、エンハンサー領域、ＴＡＴＡボックスおよび第１のエキソンの一部を含み得る。より短い（例えば、エンハンサーおよびプロモーター領域のみを含み、ＮＦ１結合部位を欠く）またはより長い（例えば、追加の細胞因子結合部位および第１のイントロン配列を含む）他のｈＣＭＶプロモーター配列が知られている。長さが異なるこれらのｈＣＭＶプロモーターは全て、強力な遍在的に活性なプロモーターであることがわかった。トランケートされたｈＣＭＶプロモーターの例は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，４０７，８０１号明細書に開示されている。本明細書で使用される場合、「ｈＣＭＶプロモーター」は、配列番号４のｎｔ５７８〜７３６、好ましくはｎｔ５６４〜７３６に対して、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む。本発明者らの研究室における実験（示さず）で、配列番号４のｎｔ５７８〜７３６の断片がプロモーター活性を有することが示され、また配列番号４のｎｔ５６４〜７３６に対していくつかのミスマッチを有する配列が良好な発現レベルを提供することが、他（例えば、米国特許公報第７、４０７、８０１Ｂ２号明細書、その中の配列番号１）によって示されている。特定の実施形態では、ｈＣＭＶプロモーターは、配列番号４に対して、少なくとも８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む。本明細書に記載の発現レベルの比較のためのｈＣＭＶプロモーター配列は、配列番号４であった。例えば、ベクター中の本発明のＡｏＨＶ−１プロモーターからの発現レベルは、好ましくは、導入遺伝子が配列番号４のｈＣＭＶプロモーターの制御下にあるベクターからの発現レベルの少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、も���くは好ましくは約１００％、またはそれ以上である。さらに、ｈＣＭＶプロモーターの制御下で抗原を発現するｒＡｄから、発現が、有意なＴ細胞およびＢ細胞免疫応答を生じさせるのに十分であることは知られている。同様に、ｒＡｄ由来の本発明のＡｏＨＶ−１プロモーターによって発現される導入遺伝子の発現は、導入遺伝子に対し有意なＴ細胞およびＢ細胞免疫応答を生じさせると予想される。例えば、導入遺伝子が対象に投与された際に免疫応答を誘発する抗原をコードする場合、導入遺伝子の強力な発現が、抗原に対して測定可能な免疫応答を生じさせると予測される。
【００６５】
本開示で使用される数値に関する「約」という用語は、値±１０％を意味する。
【００６６】
「コード配列」、「コードする配列」、または「コードする」という用語は、本明細書では同義的に使用され、適切な調節配列に作動可能に連結されると、インビトロまたはインビボで転写され（ＤＮＡ）、ポリペプチドに翻訳される（ｍＲＮＡ）、核酸配列を指す。
【００６７】
ポリアデニル化シグナル、例えば、ウシ成長ホルモンポリＡシグナル（米国特許第５，１２２，４５８号明細書）またはＳＶ４０ポリＡシグナルは、導入遺伝子の後方に存在し得る。
【００６８】
さらなる調節配列もまた、本発明のＡｏＨＶ−１プロモーターを含むコンストラクトに付加し得る。「調節配列」という用語は、本明細書中で「調節エレメント」と同義的に使用され、それが作動可能に連結している核酸配列の転写を調節し、したがって転写調節因子として働く核酸断片（典型的にはＤＮＡであるが、これに限定されない）を指す。この発現の調節は、タンパク質の発現が宿主細胞に対して有害である場合、例えば、発現が宿主細胞に対して致死的である、または細胞の増殖に負の影響を及ぼす、かつ／またはタンパク質産生を低減もしくは排除する場合に特に有用であり得る。さらに、発現の調節はまた、発現がベクター不安定性を引き起こす場合、またはインビトロまたはインビボで行われる実験のために発現時期が考慮される場合にも有用であり得る。調節配列は、多くは、転写タンパク質および／または転写を活性化または抑制する転写因子の核酸結合ドメインによって認識される核酸配列を含む。例えば、調節配列は、発現がテトラサイクリンリプレッサータンパク質（ｔｅｔＲ）の存在下で阻害されるように、１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０など）のテトラサイクリンオペレーター配列（ｔｅｔＯ部位）を含み得る（例えば、国際公開第１９９９／０００５１０Ａ１を参照されたい）。単一ｔｅｔＯ配列の例は、ＣＣＣＴＡＴＣＡＧＴＧＡＴＡＧＡＧ（配列番号１４）である。テトラサイクリンの非存在下では、ｔｅｔＲタンパク質は、ｔｅｔＯ部位に結合し、このｔｅｔＯ部位に作動可能に連結した遺伝子の転写を抑制することができる。しかし、テトラサイクリンの存在下では、ｔｅｔＲタンパク質は立体構造が変化し、オペレーター配列への結合が妨げられ、作動可能に連結した遺伝子の転写を生じさせる。特定の実施形態では、本発明のベクターまたはｒＡｄは、ｔｅｔＲタンパク質が発現するプロデューサー細胞株で産生されるベクター中で１つ以上の導入遺伝子の発現が阻害されるように、任意選択的に、ＡｏＨＶ−１プロモーターに作動可能に連結された１つ以上のｔｅｔＯ部位を含み得る。その後、ｔｅｔＲタンパク質を発現しない対象または細胞にそのベクターが導入されると、発現は阻害されない（例えば、国際公開第０７／０７３５１３号パンフレットを参照されたい）。特定の他の実施形態では、本発明のベクターは、任意選択的に、クメート（ｃｕｍａｔｅ）遺伝子スイッチ系を含み得る。そこでは、発現の調節が、例えば、プロモーター下流の転写開始部位近傍に配置することによって作動可能に連結されたオペレーター部位（ＣｕＯ）にリプレッサー（ＣｙｍＲ）が結合することによって媒介される（例えば、（Ｍｕｌｌｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）を参照されたい）。他の実施形態では、よく知られているｌａｃリプレッサー系が、本発明のプロモーターと組み合わされ、この場合、１つ以上のｌａｃオペレーター部位がプロモーターに作動可能に連結され、その結果、ｌａｃリプレッサータンパク質の結合が発現を調節するために使用され得る。
【００６９】
本明細書で使用される場合、「リプレッサー」という用語は、組換え発現ベクターの異種タンパク質産物の生成に対して阻害し、干渉し、遅延させ、かつ／または抑制する能力を有する実体（例えば、タンパク質または他の分子）を指す。例えば、発現カセット内などの発現ベクターに沿う適切な位置での結合部位との干渉によるものである。リプレッサーの例としては、ｔｅｔＲ、ＣｙｍＲ、ｌａｃリプレッサー、ｔｒｐリプレッサー、ｇａｌリプレッサー、ラムダリプレッサー、および当該技術分野で知られている他の適切なリプレッサーが挙げられる。
【００７０】
「作動可能に連結された」または「作動的に連結された」という用語は、本明細書では同義的に使用され、核酸配列と、プロモーター、エンハンサー、リプレッサー、転写および翻訳終結部位、ならびに他のシグナル配列などのヌクレオチド制御配列との機能的関係を指し、２つ以上のＤＮＡ断片がそれらの意図した目的のために協力して機能するように結合することを意味する。例えば、典型的にはＤＮＡである核酸配列と、調節配列またはプロモーター領域との作動可能な連結は、ＤＮＡを特異的に認識し、それに結合し、それを転写するＲＮＡポリメラーゼにより、そのようなＤＮＡの転写が調節配列またはプロモーターから開始されるような、ＤＮＡと調節配列またはプロモーターとの間の物理的かつ機能的な関係を指す。発現および／またはインビトロ転写を最適化するために、それが発現される細胞型における核酸またはＤＮＡの発現のための調節配列を改変することが可能であり得る。そのような改変の望ましさまたは必要性は、経験的に決定し得る。
【００７１】
本発明はまた、細胞内で導入遺伝子を発現させる方法であって、導入遺伝子に作動可能に連結されたＡｏＨＶ−１プロモーターを含む組換えウイルス、例えば、組換えアデノウイルスを細胞に提供することを含む方法を提供する。組換えアデノウイルスの細胞への提供は、アデノウイルスを対象へ投与することにより、またはインビトロもしくはエクスビボでアデノウイルスを細胞へ導入（例えば、感染）することにより行われ得る。特定の実施形態では、本発明は、例えば、組換えアデノウイルスを対象に投与することにより、細胞内で導入遺伝子を発現するために使用する組換えアデノウイルスベクターを提供する。
【００７２】
本発明はまた、細胞内で導入遺伝子を発現させる方法であって、例えば、目的のタンパク質（目的のタンパク質は、例えば、治療用タンパク質または抗原である）などの発現産物をコードする導入遺伝子に作動可能に連結されたＡｏＨＶ−１プロモーターを含む組換えウイルス、例えば、組換えアデノウイルスを細胞に提供することを含む方法を提供する。
【００７３】
本発明はまた、導入遺伝子に作動可能に連結されたＡｏＨＶ−１プロモーターを含むベクター、例えば、組換えアデノウイルスを対象に投与することを含む、抗原に対する免疫応答を誘導する方法を提供する。本発明はまた、抗原に対する免疫応答を誘導するために使用する、本発明によるベクターまたは組換えアデノウイルスを提供する。
【００７４】
本発明のＡｏＨＶ−１プロモーターは、特定の実施形態では、例えば、ワクチンの適用においてこれらの抗原に対する免疫応答を生成する目的で、抗原の発現を駆動するために使用することができる。導入遺伝子の同一性は、本発明では重要でなく、このことは、例えば、任意の導入遺伝子を含むベクターまたはアデノウイルスに適している。好適な導入遺伝子は、当業者によく知られており、例えば、遺伝子治療目的などで治療効果を有するポリペプチド、またはワクチン接種目的でベクター、例えばｒＡｄベクターを使用した場合に免疫応答が所望されるポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームなどの導入遺伝子オープンリーディングフレームを挙げることができる。特に好ましい異種核酸は、免疫応答を生じさせる必要がある抗原決定基をコードする目的の遺伝子である。このような抗原決定基も、通常、抗原と称される。組換えベクターが対象に投与されると、抗原に対する免疫応答が生じる。任意の所望の抗原がベクターによってコードされ得る。本発明による典型的な実施形態では、抗原は、疾患または病態を引き起こし得る、生物に由来するペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質である。したがって、好ましいさらなる実施形態では、前記目的の異種核酸は、免疫原性（または抗原性）決定基をコードする。より好ましくは、前記免疫原性決定基は、細菌、ウイルス、酵母または寄生生物に由来する抗原である。このような生物によって引き起こされる疾患は、一般に「感染症」と称される（したがって、疾患は、「感染する」生物に限定されず、宿主に侵入して疾患を引き起こすものも含む）。例えば腫瘍抗原などのいわゆる「自己抗原」も最新技術の一部を形成し、本発明による組換えベクター中の異種核酸によってコードされ得る。抗原決定基（または抗原）を取得する非限定的な例は、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）などのマラリアを引き起こす生物、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）などの結核を引き起こす生物、酵母、またはウイルスである。他の好ましい実施形態では、フラビウイルス（例えば、西ナイルウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、日本脳炎ウイルス、デングウイルス、ジカウイルス）、エボラウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、およびマールブルグウイルスなどのウイルスに由来する抗原が本発明による組成物で使用され得る。抗原の例示的な非限定的実施形態は、熱帯熱マラリア原虫（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）由来のＣＳタンパク質またはその免疫原性部分、Ｍ．ツベロクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）由来の１つの抗原のタンパク質、またはいくつかの抗原の融合タンパク質、例えばＡｇ８５Ａ、Ａｇ８５Ｂおよび／またはＴＢ１０．４タンパク質もしくはその免疫原性部分、ウイルス糖タンパク質またはその免疫原性部分、例えばエボラウイルスまたはマールブルグウイルスなどの糸状ウイルス由来のＧＰ、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、ｎｅｆ、もしくはその変異体などのＨＩＶタンパク質、あるいはインフルエンザウイルス由来のＨＡ、ＮＡ、Ｍ、もしくはＮＰタンパク質、またはこれらのいずれかの免疫原性部分、あるいは呼吸��合胞体ウイルス（ＲＳＶ）抗原、例えばＲＳＶ  Ｆタンパク質もしくはＲＳＶ  Ｇタンパク質、その両方、または他のＲＳＶタンパク質、ヒトパピローマウイルスもしくは他のウイルスの抗原などである。組換えベクター、例えば、ｒＡｄは１つの抗原をコードし得るが、任意選択的に、同じ生物由来の２つの異なる抗原、または任意選択的に、異なる生物由来の抗原の組み合わせ、例えば、第１の生物由来の第１の抗原および第２の生物由来の第２の抗原をコードし得る。例えば、抗原、およびＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニスト、例えばｄｓＲＮＡまたはその模倣体などのＴＬＲ３アゴニストなど、抗原および例えばアジュバントを同じｒＡｄベクターなどのベクターへコードすることも可能である（例えば、国際公開第２００７／１００９０８号パンフレット）。特定の実施形態では、組換えベクター、例えば、組換えアデノウイルスは２つの異なる抗原（１つはＡｏＨＶ−１プロモーターの制御下にあり、１つは、異なるプロモーター（例えば、ｈＣＭＶプロモーター）の制御下にある）をコードする。他の実施形態では、ベクターまたは組換えウイルスは抗原および免疫モジュレーターをコードし、そのうちの１つはＡｏＨＶ−１プロモーターの制御下にあり、他は異なるプロモーター、例えばｈＣＭＶプロモーターの制御下にある。特定の実施形態では、さらなる異種配列または導入遺伝子が、ＡｏＨＶ−１プロモーターの制御下にある導入遺伝子に加えて、ベクターまたは組換えウイルス中に存在し得る。
【００７５】
本発明はまた、導入遺伝子に作動可能に連結された本発明のＡｏＨＶ−１プロモーターを含む組換えＤＮＡ分子を提供する。本発明はまた、導入遺伝子に作動可能に連結された本発明のＡｏＨＶ−１プロモーターを含む組換えアデノウイルスを提供する。当業者は、これがまた、一緒になって本発明の単一組換えＤＮＡ分子を形成し得る、少なくとも２つの異なる組換えＤＮＡ分子の組み合わせであり得ることを認識するであろう。そのような分子は、ゲノムを操作し、新規の組換えアデノウイルスを作製する上で有用である。ゲノムは、許容細胞におけるアデノウイルスの複製およびパッケージングに必要なタンパク質をコードする。
【００７６】
本明細書で使用される場合、組換えアデノウイルスの「組換え」という用語は、野生型アデノウイルスとは対照的に、人の手によって改変されていることを意味し、例えば、異種遺伝子、異種遺伝子群、またはその一部、および導入遺伝子に作動可能に連結されたＡｏＨＶ−１プロモーターを含む。
【００７７】
アデノウイルスベクター、それらを構築する方法、およびそれらを増殖させる方法は、当該技術分野でよく知られており、例えば米国特許第５，５５９，０９９号明細書、米国特許第５，８３７，５１１号明細書、米国特許第５，８４６，７８２号明細書、米国特許第５，８５１，８０６号明細書、米国特許第５，９９４，１０６号明細書、米国特許第５，９９４，１２８号明細書、米国特許第５，９６５，５４１号明細書、米国特許第５，９８１，２２５号明細書、米国特許第６，０４０，１７４号明細書、米国特許第６，０２０，１９１号明細書、米国特許第６，１１３，９１３号明細書、および米国特許第８，９３２，６０７号明細書、ならびにＴｈｏｍａｓ  Ｓｈｅｎｋ，“Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ”Ｍ．Ｓ．Ｈｏｒｏｗｉｔｚ，“Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ”，Ｃｈａｐｔｅｒｓ  ６７  ａｎｄ  ６８，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ｉｎ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，３ｄ  ｅｄ．，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｔｄ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９６）、および本明細書で言及している他の参考文献に記載されている。一般に、アデノウイルスベクターの構築は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）、Ｗａｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ，２ｄ  ｅｄ．，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ（１９９２）、およびＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，ＮＹ（１９９５）、ならびに本明細書で言及している他の参考文献に記載されているものなど、当該技術分野でよく知られている標準的な分子生物学的手法の使用を含む。
【００７８】
本発明によるアデノウイルスは、アデノウイルス科（Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ）に属し、好ましくはマストアデノウイルス属（Ｍａｓｔａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）に属するものである。それは、ヒトアデノウイルスであり得るが、他の種に感染するアデノウイルス、例えば、以下に限定はされないが、ウシアデノウイルス（例えば、ウシアデノウイルス３、ＢＡｄＶ３）、イヌアデノウイルス（例えば、ＣＡｄＶ２）、ブタアデノウイルス（例えば、ＰＡｄＶ３または５）、またはシミアンアデノウイルス（チンパンジーアデノウイルスまたはゴリラアデノウイルスなどのサルアデノウイルスおよび類人猿アデノウイルスを含む）でもあり得る。好ましくは、アデノウイルスは、ヒトアデノウイルス（ＨＡｄＶまたはＡｄＨｕ；本発明では、種を示さずにＡｄに言及する場合はヒトアデノウイルスを意味し、例えば、簡略表記の「Ａｄ５」は、ヒトアデノウイルス血清型５であるＨＡｄＶ５と同じものを意味する）、あるいはチンパンジーもしくはゴリラアデノウイルス（ＣｈＡｄ、ＡｄＣｈ、またはＳＡｄＶ）、またはアカゲザルアデノウイルスなどのシミアンアデノウイルス（ＲｈＡｄ）である。
【００７９】
最も進んだ研究は、ヒトアデノウイルスを用いて実施されており、本発明の特定の態様ではヒトアデノウイルスが好ましい。特定の好ましい実施形態では、本発明による組換えアデノウイルスは、ヒトアデノウイルスをベースとする。好ましい実施形態では、組換えアデノウイルスは、ヒトアデノウイルス血清型５、１１、２６、３４、３５、４８、４９または５０をベースとする。本発明の特に好ましい実施形態によれば、アデノウイルスは、血清型２６および３５の１つのヒトアデノウイルスである。これらの血清型の利点は、ヒト集団における低い血清陽性率および／または低い既存の中和抗体力価である。ｒＡｄ２６ベクターの調製は、例えば、国際公開第２００７／１０４７９２号パンフレットおよび（Ａｂｂｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）に記載されている。  Ａｄ２６のゲノム配列の例は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号  ＥＦ１５３４７４および国際公開第２００７／１０４７９２号パンフレットの配列番号１に見出される。ｒＡｄ３５ベクターの調製は、例えば、米国特許第７，２７０，８１１号明細書、国際公開第００／７００７１号パンフレットおよび（Ｖｏｇｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）に記載されている。  Ａｄ３５のゲノム配列の例は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号  ＡＣ＿００００１９、および国際公開第００／７００７１号パンフレットの図６に見出される。
【００８０】
上記のヒトおよび非ヒトアデノウイルスの大多数の配列は知られており、その他については日常的な手順を用いて得ることができる。
【００８１】
本発明による組換えアデノウイルスは、複製コンピテントまたは複製欠損であり得る。
【００８２】
特定の実施形態では、アデノウイルスは、複製欠損であり、例えば、これは、このアデノウイルスがゲノムのＥ１領域に欠失を含むためである。「Ｅ１領域における欠失」は、野生型アデノウイルスと比較したときのこの領域における欠失を意味し、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ  ５５ＫまたはＥ１Ｂ  ２１Ｋコード領域の少なくとも１つの欠失、好ましくはＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ  ５５Ｋ、およびＥ１Ｂ２１Ｋコード領域の欠失を意味する。当業者に知られているように、アデノウイルスゲノムからの必須領域が欠失している場合、これらの領域でコードされる機能は、好ましくは、プロデューサー細胞によってトランスに提供される必要がある。すなわち、Ｅ１、Ｅ２および／またはＥ４領域の一部または全部がアデノウイルスから欠失している場合、これらは、プロデューサー細胞内、例えばそのゲノムに組み込まれ、またはいわゆるヘルパーアデノウイルスもしくはヘルパープラスミドの形態で存在する必要がある。アデノウイルスは、Ｅ３領域内にも欠失を有し得るが、これは複製に不要であるため、そのような欠失は補完される必要はない。
【００８３】
使用可能なプロデューサー細胞（当該技術分野および本明細書では、時に「パッケージング細胞」または「補完細胞」とも称される）は、所望のアデノウイルスが増殖し得る任意のプロデューサー細胞であり得る。例えば、組換えアデノウイルスベクターの増殖は、アデノウイルス内の欠損を補完するプロデューサー細胞内で行われる。そのようなプロデューサー細胞は、好ましくは、それらのゲノム内に少なくとも１つのアデノウイルスＥ１配列を有し、それによりＥ１領域内に欠失を有する組換えアデノウイルスを補完することができる。Ｅ１によって不死化されたヒト網膜細胞、例えば９１１またはＰＥＲ．Ｃ６細胞（例えば、米国特許第５，９９４，１２８号明細書を参照されたい）、Ｅ１−形質転換羊膜細胞（例えば、欧州特許第１２３０３５４号明細書を参照されたい）、Ｅ１−形質転換Ａ５４９細胞（例えば、国際公開第９８／３９４１１号パンフレット、米国特許第５，８９１，６９０号明細書を参照されたい）、ＧＨ３２９：ヒーラ細胞（Ｇａｏ，Ｅｎｇｄａｈｌ，＆  Ｗｉｌｓｏｎ，２０００）、２９３細胞などの任意のＥ１−補完プロデューサー細胞を使用することができる。（Ｇａｏ，Ｅｎｇｄａｈｌ，＆  Ｗｉｌｓｏｎ，２０００）特定の実施形態では、プロデューサー細胞は、例えば、ＨＥＫ２９３細胞、またはＰＥＲ．Ｃ６細胞、または９１１細胞、またはＩＴ２９３ＳＦ細胞などである。
【００８４】
当業者であれば、アデノウイルスに加えて、他のウイルスも、本発明のＡｏＨＶ−１プロモーターを使用するウイルスベクターとしての使用に好適であることを認識するであろう。例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、麻疹ウイルス、アルファウイルス、ＥＢＮＡウイルス、レトロウイルス、ポックスウイルスおよびレンチウイルスなどのパラミクソウイルスなどもまた、本発明のＡｏＨＶ−１プロモーターを含むように操作され得る。例えば、（Ｈｅｉｌｂｒｏｎｎ  ＆  Ｗｅｇｅｒ，２０１０；Ｒｏｂｂｉｎｓ  ＆  Ｇｈｉｖｉｚｚａｎｉ，１９９８；Ｗａｌｔｈｅｒ  ＆  Ｓｔｅｉｎ，２０００）で論じられているような異なるベクターについての総説を参照されたい。（Ｈｅｉｌｂｒｏｎｎ  ＆  Ｗｅｇｅｒ，２０１０；Ｒｏｂｂｉｎｓ  ＆  Ｇｈｉｖｉｚｚａｎｉ，１９９８；Ｗａｌｔｈｅｒ  ＆  Ｓｔｅｉｎ，２０００）
【００８５】
ヒトに投与するために、例えば、ベクター、組換えウイルス、または本発明の方法を用いて発現される組換えタンパク質、例えば、ｒＡｄ、または本発明のＡｏＨＶ−１プロモーターを用いて発現される組換えタンパク質、および薬学的に許容される担体または賦形剤を含む医薬組成物を使用し得る。本発明との関連では、「薬学的に許容される」という用語は、担体または賦形剤が、使用する投与量および濃度で、それらを投与された被験体に望ましくない影響や有害な影響を引き起こさないことを意味する。このような薬学的に許容される担体および賦形剤は、当該技術分野でよく知られている（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ［１９９０］；Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓ．Ｆｒｏｋｊａｅｒ  ａｎｄ  Ｌ．Ｈｏｖｇａａｒｄ，Ｅｄｓ．，Ｔａｙｌｏｒ  ＆  Ｆｒａｎｃｉｓ［２０００］；およびＨａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｋｉｂｂｅ，Ｅｄ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ［２０００］を参照されたい）。精製されたベクター、例えばｒＡｄ、またはタンパク質は、好ましくは、滅菌溶液として処方され、投与されるが、凍結乾燥製剤を利用することも可能である。滅菌溶液は、滅菌ろ過または当該技術分野でそれ自体知られている他の方法によって調製される。その後、溶液は、凍結乾燥されるか、または医薬投与容器に充填される。溶液のｐＨは、一般に、ｐＨ３．０〜９．５、例えばｐＨ５．０〜７．５の範囲である。ベクターもしくはｒＡｄまたはタンパク質は一般的には好適な緩衝剤を有する溶液中にあり、そしてこの溶液は塩も含み得る。任意選択により、アルブミンなどの安定剤が含まれ得る。特定の実施形態では、洗浄剤が添加される。特定の実施形態では、ベクター、ｒＡｄまたはタンパク質は、注射用製剤に製剤化され得る。これらの製剤は、薬剤成分、例えば、ベクター、ｒＡｄまたはポリペプチドを有効量含有し、滅菌溶液、懸濁液または凍結乾燥バージョンであり、任意選択的に安定剤または賦形剤を含有する。医薬製剤は種々の投与経路、例えば、筋肉内または皮内注射、吸入、静脈内投与、経口投与など用に調製することができる。
【００８６】
アデノウイルス製剤の例は、アデノウイルス世界標準（Ｈｏｇａｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）：２０ｍＭ  トリス  ｐＨ８、２５ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５％グリセロール；または２０ｍＭ  トリス、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２５ｍＭ  ＮａＣｌ、スクロース１０ｗ／ｖ％、ポリソルベート−８０  ０．０２ｗ／ｖ％；または１０〜２５ｍＭ  クエン酸塩緩衝剤  ｐＨ５．９〜６．２、４〜６％（ｗ／ｗ）ヒドロキシプロピル−ベータ−シクロデキストリン（ＨＢＣＤ）、７０〜１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０１８〜０．０３５％（ｗ／ｗ）ポリソルベート−８０、および、任意選択により０．３〜０．４５％（ｗ／ｗ）エタノールである。明らかに、多くの他の緩衝液を用いることができ、貯蔵や精製医薬製剤の医薬投与に好適な製剤が数例知られている。
【００８７】
特定の実施形態では、本発明のベクターまたは組換えウイルス、例えば、ｒＡｄを含む組成物は、１つ以上のアジュバントをさらに含む。適用される抗原決定基に対する免疫応答をさらに増大させるアジュバントは、当該技術分野で知られており、アデノウイルスおよび好適なアジュバントを含む医薬組成物は、例えば、国際公開第２００７／１１０４０９号パンフレット（参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている。「アジュバント」および「免疫刺激剤」という用語は、本明細書では同義的に使用され、免疫系の刺激を引き起こす１種以上の物質と定義される。この場合、アジュバントは、本発明のアデノウイルスベクターの免疫応答を増強させるために使用される。好適なアジュバントの例としては、水酸化アルミニウムおよび／またはリン酸アルミニウムなどのアルミニウム塩；ＭＦ５９などのスクアレン−水エマルションをはじめとする油エマルション組成物（または水中油型組成物）（例えば、国際公開第９０／１４８３７号パンフレットを参照されたい）；例えば、ＱＳ２１および免疫賦活性錯体（ＩＳＣＯＭＳ）などのサポニン製剤（例えば、米国特許第５，０５７，５４０号明細書；および国際公開第９０／０３１８４号パンフレット、国際公開第９６／１１７１１号パンフレット、国際公開第２００４／００４７６２号パンフレット、国際公開第２００５／００２６２０号パンフレットを参照されたい）；細菌または微生物の派生物（その例として、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、３−Ｏ−脱アシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）、ＣｐＧモチーフ含有オリゴヌクレオチド、ＡＤＰリボース化細菌毒素またはそれらの変異体（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）易熱性エンテロトキシンＬＴ、コレラ毒素ＣＴなど）がある）が挙げられる。例えば、Ｃ４結合タンパク質（Ｃ４ｂｐ）のオリゴマー化ドメインと目的の抗原との融合をコードする異種核酸（Ｏｇｕｎ，Ｄｕｍｏｎ−Ｓｅｉｇｎｏｖｅｒｔ，Ｍａｒｃｈａｎｄ，Ｈｏｌｄｅｒ，＆  Ｈｉｌｌ，２００８）、またはｄｓＲＮＡなどのＴＬＲ３アゴニストなどのトール様受容体（ＴＬＲ）アゴニストをコードする異種核酸（例えば、国際公開第２００７／１００９０８号パンフレットを参照されたい）、または免疫賦活性サイトカイン、例えば、インターロイキン、例えば、ＩＬ−１２をコードする異種核酸（例えば、米国特許第５，７２３，１２７号明細書を参照されたい）などを使用することによって、ベクターコードアジュバントを使用することも可能である。
【００８８】
本発明による医薬組成物は、特定の実施形態では、ワクチンであり得る。
【００８９】
本発明のベクターまたは組換えウイルス、例えば、アデノウイルス組成物の投与は、標準的な投与経路を使用して行われ得る。非限定的な実施形態としては、例えば、皮内、筋肉内などの注射などによる非経口投与、あるいは皮下もしくは経皮、または、例えば鼻腔内、口腔などの粘膜投与が挙げられる。当業者は、ワクチン中の抗原に対する免疫応答を誘導するために、組成物、例えばワクチンを投与する様々な可能性を認識している。
【００９０】
アデノウイルス組成物は、対象、例えばヒト対象に投与され得る。１回の投与で対象に提供されるアデノウイルスの総用量は、当業者に知られているように様々であり得、一般に１×１０７ウイルス粒子（ｖｐ）〜１×１０１２ｖｐ、好ましくは１×１０８ｖｐ〜１×１０１１ｖｐ、例えば３×１０８〜５×１０１０ｖｐ、例えば１０９〜３×１０１０ｖｐである。
【００９１】
本明細書で用いられる対象は、好ましくは、哺乳動物、例えば、齧歯類（例えばマウス）、または非ヒト霊長類、またはヒトである。好ましくは、対象は、ヒト対象である。
【００９２】
１種以上のワクチンの１回以上の追加免疫投与を提供することも可能である。追加ワクチン接種を行う場合、一般に、そのような追加ワクチン接種は、組成物を対象に最初に投与（このような場合、「初回ワクチン接種」と称される）した後、１週間〜１年、好ましくは２週間〜４カ月の時点で、同じ対象に投与されるであろう。代替の追加免疫レジメンでは、異なるベクター、例えば、血清型の異なる１つ以上のアデノウイルス、またはＭＶＡなどの他のベクター、またはＤＮＡ、またはタンパク質を初回ワクチン接種または追加ワクチン接種として対象に投与することも可能である。
【００９３】
本明細書全体にわたり、特許、公開公報、技術論文および学術論文などの各種刊行物が括弧に入れて引用されており、それぞれの完全引用は、本明細書の最後に見出し得る。これらの引用刊行物はそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００９４】
実施形態
実施形態１は、異種導入遺伝子に作動可能に連結されたヨザルヘルペスウイルス（Ａｏｔｉｎｅ  Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ）主要最初期プロモーター（ＡｏＨＶ−１プロモーター）を含む組換え核酸分子である。
【００９５】
実施形態２は、ＡｏＨＶ−１プロモーターと、それに続く多重クローニング部位とを含むプラスミドベクターである。
【００９６】
実施形態３は、ＡｏＨＶ−１プロモーターがＡｏＨＶ−１プロモーターからの転写を調節する調節配列に作動可能に連結されている、実施形態１の組換え核酸分子または実施形態２のプラスミドベクターである。
【００９７】
実施形態４は、ＡｏＨＶ−１プロモーターが１つ以上のテトラサイクリンオペレーター配列（ｔｅｔＯ部位）を含む調節配列に作動可能に連結されている、実施形態１の組換え核酸分子または実施形態２のプラスミドベクターである。
【００９８】
実施形態５は、実施形態１、３または４のいずれか１つに記載の組換え核酸分子を含む、組換えベクターまたは組換えウイルスである。
【００９９】
実施形態６は、ベクターがプラスミドベクターである、実施形態５に記載の組換えベクターである。
【０１００】
実施形態７は、ウイルスがアデノウイルスである、実施形態５に記載の組換えウイルスである。
【０１０１】
実施形態８は、アデノウイルスがそのゲノムの領域に欠失を有する、実施形態７に記載の組換えアデノウイルスである。
【０１０２】
実施形態９は、欠失がＥ１領域、Ｅ３領域、またはＥ１領域およびＥ３領域にある、実施形態８に記載の組換えアデノウイルスである。
【０１０３】
実施形態１０は、実施形態１、３または４に記載の組換え核酸分子、実施形態２、３または４に記載のプラスミドベクター、あるいは実施形態５〜９のいずれか１つに記載の組換えベクターまたは組換えウイルスを含む細胞である。
【０１０４】
実施形態１１は、そのゲノム中にＡｏＨＶ−１プロモーターを含む組換え核酸分子を含む細胞であり、好ましくは、前記プロモーターは目的のタンパク質をコードする核酸に作動可能に連結されている細胞である。
【０１０５】
実施形態１２は、（ｉ）第１の導入遺伝子に作動可能に連結されたＡｏＨＶ−１プロモーターを含む組換え核酸分子、および（ｉｉ）第２の導入遺伝子に作動可能に連結されたｈＣＭＶプロモーターを含む組換え核酸分子を含む細胞である。
【０１０６】
実施形態１３は、（ｉ）第１の導入遺伝子に作動可能に連結されたＡｏＨＶ−１プロモーターを含む組換え核酸分子、および（ｉｉ）第２の導入遺伝子に作動可能に連結されたｈＣＭＶプロモーターを含む組換え核酸分子を含むベクターである。
【０１０７】
実施形態１４は、導入遺伝子に作動可能に連結されたＡｏＨＶ−１プロモーターを含む組換えアデノウイルスを作製する方法であって、アデノウイルスが標的細胞に感染すると、導入遺伝子は強力に発現される方法において、
ａ）導入遺伝子に作動可能に連結されたＡｏＨＶ−１プロモーターを含むコンストラクトを調製する工程；および
ｂ）前記コンストラクトを組換えアデノウイルスのゲノムに組み込む工程
を含む方法である。
【０１０８】
実施形態１５は、目的のタンパク質をコードする導入遺伝子に作動可能に連結されたＡｏＨＶ−１プロモーターを含む組換え核酸分子を作製する方法であって、ＡｏＨＶ−１プロモーターに作動可能に連結された導入遺伝子の分子クローニングを含む方法である。
【０１０９】
実施形態１６は、実施形態７〜９のいずれか１つに記載の組換えアデノウイルスのゲノムを含む組換えＤＮＡ分子である。
【０１１０】
実施形態１７は、ＡｏＨＶ−１プロモーターを細胞に導入する工程、およびＡｏＨＶ−１プロモーターをゲノムに組み込む工程を含む、実施形態１１の細胞を作製する方法であり、好ましくは、前記プロモーターは目的のタンパク質をコードする核酸に作動可能に連結されている方法である。
【０１１１】
実施形態１８は、目的の発現産物を生産する方法であって、宿主細胞で目的の発現産物をコードする導入遺伝子を発現させる工程を含む方法において、導入遺伝子はＡｏＨＶ−１プロモーターに作動可能に連結されている方法である。
【０１１２】
実施形態１９は、発現産物がタンパク質である、実施形態１８の方法である。
【０１１３】
実施形態２０は、実施形態１、３、４、５または６のいずれか１つに記載の組換え核酸分子由来の導入遺伝子を宿主細胞で発現させることを含む、目的の導入遺伝子を発現させる方法である。
【０１１４】
実施形態２１は、目的の導入遺伝子が宿主細胞で発現される目的のタンパク質をコードする、実施形態２０の方法である。
【０１１５】
実施形態２２は、宿主細胞から、または宿主細胞が培養されている培養培地から、または宿主細胞および培養培地の両方から、目的のタンパク質を回収する工程をさらに含む、実施形態１９または２１の方法である。
【０１１６】
実施形態２４は、ウイルスを作製する方法であって、前記ウイルスを増殖させる機能を有する遺伝子を発現させる細胞中でウイルスを増殖させる工程を含む方法において、前記遺伝子はＡｏＨＶ−１プロモーターの制御下にある方法である。
【０１１７】
実施形態２５は、前記ウイルスがそれ自体のゲノムから機能的形態の前記遺伝子を生成せず、かつ前記遺伝子が前記ウイルスの複製に必須である、実施形態２４に記載の方法である。
【０１１８】
実施形態２６は、実施形態５〜９のいずれか１つに記載の組換えベクターまたは組換えウイルス、および薬学的に許容される担体または賦形剤を含む医薬組成物である。
【０１１９】
実施形態２７は、ゲノム中のＡｏＨＶ−１プロモーターがテトラサイクリンリプレッサー（ＴｅｔＲ）タンパク質をコードする核酸に作動可能に連結されている、実施形態１１に記載の細胞である。
【０１２０】
実施形態２８は、第１の導入遺伝子がＴｅｔＲをコードする、実施形態１２に記載の細胞である。
【０１２１】
実施形態２９は、第２の導入遺伝子に作動可能に連結されたｈＣＭＶプロモーターを含む組換え核酸分子を含む組換えアデノウイルスをさらに含む、実施形態２８に記載の細胞である。
【０１２２】
実施形態３０は、ｈＣＭＶプロモーターがＴｅｔＲによって、例えば、１つ以上のｔｅｔＯ部位に作動可能に連結されることによって調節され得る、実施形態２９に記載の細胞である。
【０１２３】
実施形態３１は、細胞がＰＥＲ．Ｃ６細胞である、実施形態２７、２８、２９、または３０に記載の細胞である。
【０１２４】
実施形態３２は、導入遺伝子がＴｅｔＲをコードする、実施形態２０に記載の方法である。
【０１２５】
実施形態３３は、細胞がＰＥＲ．Ｃ６細胞である、実施形態３２に記載の方法である。
【０１２６】
実施形態３４は、組換えアデノウイルスを増殖させる方法であって、実施形態２７、２９、または３１に記載の細胞中で、１つ以上のｔｅｔＯ部位に作動可能に連結されたｈＣＭＶプロモーターの制御下で、導入遺伝子をコードする組換えアデノウイルスを増殖させる工程、および、好ましくは、組換えアデノウイルスを単離する工程を含む方法である。
【０１２７】
実施形態３５は、ＡｏＨＶ−１プロモーターが、配列番号２５のｎｔ２３７〜２８６に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む、実施形態１〜３４のいずれか１つである。
【０１２８】
実施形態３６は、ＡｏＨＶ−１プロモーターが配列番号２５のｎｔ２３７〜２８６に対して少なくとも８６％の同一性、好ましくは少なくとも９０％の同一性、好ましくは少なくとも９６％の同一性、好ましくは少なくとも９８％の同一性、より好ましくは１００％の同一性を有する配列を含む、実施形態１〜３５のいずれか１つである。
【０１２９】
実施形態３７は、ＡｏＨＶ−１プロモーターが、配列番号２５のｎｔ１３１〜２８６に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む、実施形態１〜３６のいずれか１つである。
【０１３０】
実施形態３８は、ＡｏＨＶ−１プロモーターが、配列番号３１を少なくとも９５％同一である配列を含む、実施形態１〜３７のいずれか１つである。
【０１３１】
実施形態３９は、ＡｏＨＶ−１プロモーターが配列番号３２の２４０〜１５００ヌクレオチド、好ましくは２４０〜１０００ヌクレオチド、より好ましくは２４０〜５００ヌクレオチドを含む、実施形態１〜３８のいずれか１つである。
【０１３２】
実施形態４０は、ＡｏＨＶ−１プロモーターが、配列番号２６を含む、実施形態１〜３９のいずれか１つである。
【０１３３】
実施形態４１は、ＡｏＨＶ−１プロモーターが、配列番号２５の少なくとも３００ヌクレオチドからなる断片と少なくとも９５％同一である配列を含む、実施形態１〜４０のいずれか１つである。
【０１３４】
実施形態４２は、ＡｏＨＶ−１プロモーターが配列番号２５を含む、実施形態１〜４１のいずれか１つである。
【０１３５】
実施形態４３は、ＡｏＨＶ−１プロモーターが、配列番号１の少なくとも４００ヌクレオチドからなる断片と少なくとも９５％同一である配列を含む、実施形態１〜４２のいずれか１つである。
【０１３６】
実施形態４４は、ＡｏＨＶ−１プロモーターが配列番号１または配列番号３０を含む、実施形態４３である。
【０１３７】
実施形態４５は、好ましくは細胞のゲノム内に、配列番号２０を含む導入遺伝子を含む細胞である。，
【０１３８】
実施形態４６は、細胞はＰＥＲ．Ｃ６細胞である、実施形態４５に記載の細胞である。
【実施例】
【０１３９】
さらなる説明なしに、当業者であれば、ここまでの説明ならびに次の具体的な方法および実施例により、本発明を作成して使用し、かつ請求項に記載された方法を実施することができるであろう。したがって、次の実施例は、本発明のいくつかの実施形態、特徴および利点を具体的に示すが、本開示の残りの部分を限定するものとして決して解釈されるべきではない。実施例は、単に本発明を明確にするに過ぎない。
【０１４０】
方法
細胞培養：
ＨＥＫ２９３細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で維持した。ベロ細胞を、５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補充した最小必須培地（ＭＥＭ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で培養した。ＰＥＲ．Ｃ６細胞（Ｆａｌｌａｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）を、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２を補充した１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＤＭＥＭ中で培養した。
【０１４１】
ＰＥＲ．Ｃ６−ｈＣＭＶ．ＴｅｔＲ細胞（本明細書に記載）を、２ｕｇ／ｍｌのブラスチシジン（Ｇｉｂｃｏ  Ａ１１１３９−０３）を補充した以外はＰＥＲ．Ｃ６細胞について上記したのと同様の培地中で培養した。
【０１４２】
上記細胞の継代培養は、細胞を分離するためにＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔ  Ｅｎｚｙｍｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号：１２５６３０１１）を用いて、標準的なプロトコルに従って行った。
【０１４３】
ｐＡｄＡｐｔ３５プラスミド：
異なるプロモーターコンストラクトを、ＡｖｒＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素認識部位を用いて、ｐＡｄＡｐｔ３５（Ｖｏｇｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．２００７）にクローニングした。ホタルルシフェラーゼをコードする遺伝子を、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩ制限酵素認識部位を用いて挿入し、異なる試験プロモーター（ｐＡｄａｐｔ３５．Ｐ．Ｌｕｃ）下でＬｕｃ遺伝子が発現するｐＡｄａｐｔプラスミドを得た。これらのプラスミドを実施例１で使用した。
【０１４４】
一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞における発現の分析。
ＨＥＫ２９３細胞をマルチウェル６ポリ−Ｌ−リシン（ＰＬＬ）コーティングプレートに播種し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅを製造業者（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって提供された使用説明書に従って使用して、１μｇのｐＡｄａｐｔ．Ｐ．Ｌｕｃプラスミドでトランスフェクトした。その後、プレートを３７℃、１０％ＣＯ２中で２４時間インキュベートした。トランスフェクトした２４時間後、ルシフェラーゼ活性を、Ｌｕｍｉｎｏｓｋａｎ（商標）Ａｓｃｅｎｔマイクロプレート照度計において、０．１％ＤＴＴ（１Ｍ）の存在下、細胞溶解物中で測定した。トランスフェクション効率の対照として、分泌胚性アルカリホスファターゼをコードするプラスミドを同時トランスフェクトした（８０ｎｇ／ウェル）。ＳＥＡＰレベルを、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｇｒｅａｔ  ＥｓｃＡＰｅ（商標）ＳＥＡＰ化学発光キット２．０およびＴｒｉｌｕｘ  Ｍｉｃｒｏｂｅｔａワークステーションを用いて測定した。一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞における発現分析を、実施例１において使用する。
【０１４５】
一過性トランスフェクトＶｅｒｏ細胞におけるｔＴＡ応答性人工プロモーター「７ｘＴｅｔＯ−ＡｏＨＶ−１」の制御下でのガウシアルシフェラーゼの発現分析
ベロ細胞を、１．２５×１０４細胞／ウェルの播種密度でマルチウェル９６プレートに播種した。播種の１日後に、７ｘｔｅｔＯ−ＡｏＨＶ−１の制御下で、細胞をガウシアルシフェラーゼ遺伝子を含むｐＤｕａｌＬｕｃ由来プラスミドでトランスフェクトした。ルシフェラーゼプラスミドの他に、テトラサイクリン制御トランスアクチベーター（ｔＴＡ）タンパク質をコードするプラスミド、または陰性対照プラスミド（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）で、細胞を同時トランスフェクトした。細胞トランスフェクションは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ３０００を用いて、製造業者のプロトコル（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に従って行った。トランスフェクションの２４時間後に、ルシフェラーゼ活性を、Ｌｕｍｉｎｏｓｋａｎ（商標）Ａｓｃｅｎｔマイクロプレート照度計において、Ｐｉｅｒｃｅガイウシアホタルルシフェラーゼデュアルアッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて測定した。トランスフェクション効率の照合のために、測定されたガウシアルシフェラーゼ単位を、赤色ホタルルシフェラーゼ（ＡｏＨＶ−１ショートによって駆動される発現カセットを、同じｐＤｕａｌＬｕｃプラスミドに位置させた）のレベルに正規化した。一過性にトランスフェクトしたベロ細胞における発現分析を、実施例２において行った。
【０１４６】
一過性トランスフェクトＰＥＲ．Ｃ６細胞におけるＡｏＨＶ−１プロモーター変異体の制御下でのガウシアルシフェラーゼの発現分析
ＰＥＲ．Ｃ６細胞を、５×１０４細胞／ウェルの播種密度でマルチウェル９６プレートに播種した。播種の１日後に、実施例６に記載のように、異なるＡｏＨＶ−１プロモーター変異体の制御下で、ガウシアルシフェラーゼ遺伝子を含むｐＤｕａｌＬｕｃ由来プラスミドを使用して細胞をトランスフェクトした。細胞トランスフェクションは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００  ＣＤを用いて、製造業者のプロトコル（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に従って行った。トランスフェクションの２４時間後に、ルシフェラーゼ活性を、Ｐｉｅｒｃｅガイウシアホタルルシフェラーゼデュアルアッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）およびＬｕｍｉｎｏｓｋａｎ（商標）Ａｓｃｅｎｔマイクロプレート照度計を用いて測定した。トランスフェクション効率の照合のために、測定されたガウシアルシフェラーゼ単位を、赤色ホタルルシフェラーゼ（ＡｏＨＶ−１ショートによって駆動される発現カセットを、同じｐＤｕａｌＬｕｃプラスミドに位置させた）のレベルに正規化した。この方法の項は、実施例６に適用可能である。
【０１４７】
ＰＥＲ．Ｃ６−ｈＣＭＶ．ＴｅｔＲおよびＰＥＲ．Ｃ６−ＡｏＨＶ．ＴｅｔＲ細胞
ＴｅｔＲを安定に発現する２種類のＰＥＲ．Ｃ６細胞を作製し、ここで使用した。まず、ｈＣＭＶプロモーターの制御下でＴｅｔＲを発現するＰＥＲ．Ｃ６−ｈＣＭＶ．ＴｅｔＲ細胞を、プラスミドｐＣＤＮＡ６／ＴＲ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  カタログ番号：Ｖ１０２５２０）を用い、製造業者のプロトコルに記載されている標準手順に従って、ＰＥＲ．Ｃ６細胞を安定にトランスフェクトすることによって生成した。次に、ＡｏＨＶ−１ショートプロモーターの制御下でＴｅｔＲを発現するＰＥＲ．Ｃ６−ＡｏＨＶ．ＴｅｔＲ細胞を、実施例５（および、そこで言及されている方法の項）に記載の手順に従って、ＰＥＲ．Ｃ６細胞をプラスミドｐＣ＿ＡｏＨＶ＿ＴｅｔＲで安定にトランスフェクションすることによって生成した。
【０１４８】
ＴｅｔＲ調節ＡｏＨＶ−１ショートプロモーターの制御下で目的のさらなる遺伝子を発現するＰＥＲ．Ｃ６−ｈＣＭＶ．ＴｅｔＲ細胞の細胞クローン生成
ＰＥＲ．Ｃ６−ｈＣＭＶ．ＴｅｔＲ細胞を、トランスフェクションの１日前に、Ｔ８０培養フラスコに播種した。トランスフェクションに使用したプラスミドは、ＡｏＨＶ．２×ｔｅｔＯプロモーター（配列番号７）の制御下で目的の遺伝子（ＧＯＩ）を担持した。さらに、それは、ＳＶ４０由来のプロモーターによって制御されるネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ遺伝子発現カセットを含有する。プラスミドは、いくつかのクローニング工程により、ｐｃＤＮＡ２００４Ｎｅｏ（−）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号  ＦＢ６７４８７６）のｈＣＭＶプロモーター含有ＭｆｅＩ−ＸｂａＩ断片を、ＡｏＨＶ．２×ｔｅｔＯを含む断片で置き換え、続いてＧＯＩのコード配列で置き換えることによって構築した。トランスフェクションを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ  ２０００を用いて製造業者のプロトコル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従って行った。トランスフェクションの翌日、細胞を１０ｃｍ培養皿に１：２、１：４、１：８および１：１６の比率で継代し播種した。播種の１日後、細胞培養培地を、０．５ｍｇ／ｍｌのジェネティシン（Ｇｉｂｃｏ  １０１３１−０１９）を補充したＰＥＲ．Ｃ６−ｈＣＭＶ．ＴｅｔＲ培地と交換した。培地を週２回交換した。トランスフェクションの２〜３週間後にクローンを採取した。この方法の項は、実施例３に適用可能である。
【０１４９】
目的の遺伝子の発現を分析するためのウエスタンブロット
播種した細胞を、ドキシサイクリン（１μｇ／ｍｌ）と共に、またはドキシサイクリンなしで２日間インキュベートし、ＲＩＰＡ緩衝液（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００、０．５％デオキシコール酸塩、０．１％ＳＤＳ、５０ｍＭ  トリス−ＨＣＬ）に回収した。
【０１５０】
試料を１０％ビス−トリスゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＮＰ０３０１ＰＫ２）にロードし、ＭＯＰＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＮＰ０００１）中で泳動した。ＳＤＳゲルをｉＢｌｏｔ２システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でブロットし、タンパク質をニトロセルロース膜（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＩＢ２３００１）に移した。膜をブロッキング緩衝液（ＬＩ−ＣＯＲ  ９２７−４００００）中、４℃で一晩ブロッキングした。ウエスタンブロット膜をブロッキング緩衝液中で一次抗体（１：２００  Ａｄ３５ウイルスに対しマウスポリクローナル（社内））と共に２時間インキュベートし、ＴＢＳＴで洗浄した。ウエスタンブロットをブロッキング緩衝液中で二次抗体（１：５０００  ヤギ抗マウス−８００ＣＷ）と共に１時間インキュベートし、ＴＢＳＴで複数回洗浄した。ＬＩ−ＣＯＲ  Ｏｄｅｓｓｅｙイメージャーで可視化した。この方法の項は、実施例３に適用可能である。
【０１５１】
デュアルルシフェラーゼプラスミドｐＤｕａｌＬｕｃの生成
ｐＤｕａｌＬｕｃ（配列番号２１）は、２つの発現カセット、すなわちヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）プロモーターの制御下でガウシアルシフェラーゼ（Ｇｌｕｃ）を発現する第１の発現カセット、およびＡｏＨＶ−１ショートプロモーターの制御下で赤色発光ホタルルシフェラーゼ（ＲＦＬ）を発現する第２のカセットを担持するプラスミドである。ｐＤｕａｌＬｕｃ内では、ＧｌｕｃおよびＲＦＬ発現カセットが互いに対してテールトゥテール配向に位置付けられている。
【０１５２】
ｐＤｕａｌＬｕｃは、ＧｅｎｅＡｒｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で行われた、いくつかの遺伝子合成およびサブクローニング工程によって生成された。最初に、それぞれの発現カセットを有する合成断片「ＣＭＶ＿ＧＬｕｃ＿ＳＶ」（配列番号１７）および「ＡｏＨＶ１＿ＲＦＬ＿ＢＧＨ」（配列番号１９）を生成し、標準ＧｅｎｅＡｒｔプラスミド（ｐＭＫ−ＲＱ）中にクローニングした。続いて、ＭｌｕＩおよびＮｓｉＩ制限部位を用いて、合成断片ＡｏＨＶ１＿ＲＦＬ＿ＢＧＨを、ＣＭＶ＿ＧＬｕｃ＿ＳＶ含有コンストラクトにさらにサブクローニングした。
【０１５３】
ｐＤｕａｌＬｕｃのガウシアルシフェラーゼ駆動ＣＭＶプロモーター配列に、特有の制限部位ＸｈｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩが隣接しており、本明細書中の実施例２および６において行われたように、このプロモーターの代替プロモーター配列による置換を可能にする。
【０１５４】
Ａｄ２６ベクターゲノムプラスミドｐＡｄ２６．ｄＥ１．ｄＥ３．５ｏｒｆ６の生成
以前に生成されたＡｄ２６ベースのベクターについて記載されているように、ｐＡｄ２６．ｄＥ１．ｄＥ３．５ｏｒｆ６は、Ｅ１欠失、Ｅ３欠失、およびＡｄ２６  Ｅ４  ｏｒｆ６のＡｄ５のそれによる置換を担持する完全長のＡｄ２６ベクターゲノムを含むプラスミドである（Ａｂｂｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。ｐＡｄ２６．ｄＥ１．ｄＥ３．５ｏｒｆ６のプラスミド骨格は、ｐＭＢ１複製起点およびアンピシリン耐性遺伝子を含み、ｐＢＲ３２２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号  Ｊ０１７４９．１）に由来する。ｐＡｄ２６．ｄＥ１．ｄＥ３．５ｏｒｆ６はさらに、ベクターゲノムのＥ１欠失の代わりに特有のＡｓｉＳＩ制限部位を含み、ベクターゲノムのＥ４領域と右逆位末端配列（ＲＩＴＲ）との間に特有のＰａｃＩ制限部位を含む。これらの部位を用いて、それぞれの位置に導入遺伝子カセットを挿入することができる。最後に、ｐＡｄ２６．ｄＥ１．ｄＥ３．５ｏｒｆ６内のアデノウイルスベクターゲノムはその末端の各々にＳｗａＩ制限部位が隣接され、ＳｗａＩ消化によるプラスミド骨格からのその放出を可能にする。
【０１５５】
ｐＡｄ２６．ｄＥ１．ｄＥ３．５ｏｒｆ６の構築は、いくつかの合成およびクローニング工程を伴った。（所望の）Ａｄ２６ベクターゲノムの左端および右端断片を含む２ｋｂ配列（配列番号１６）を、ＧｅｎｅＡｒｔ／Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓで合成した。この配列の左端ベクターゲノム断片は、ベクターゲノムの左逆位末端配列（ＬＩＴＲ）から、（野生型）Ａｄ２６ウイルスゲノム（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号  ＥＦ１５３４７４．１）の３７５５〜３７６７位のＳｆｉＩ部位に対応するＳｆｉＩ部位にまで及ぶ。右端のウイルスゲノム断片は、野生型Ａｄ２６ウイルスゲノムの３４０７９〜３４０８４位のＮｈｅＩ部位に対応するＮｈｅＩ部位から右ＩＴＲ（ＲＩＴＲ）にまで及ぶ。この合成配列は、Ｅ１欠失（Ａｄ２６、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号  ＥＦ１５３４７４．１、の４７２〜３３６５位）、ならびに上記の制限部位（すなわち、Ｅ１欠失の代わりのＡｓｉＳＩ部位、Ｅ４とＲＩＴＲとの間のＰａｃＩ部位、およびベクターゲノム配列に直接隣接する２つのＳｗａＩ部位）を有するように設計された。遺伝子合成断片は、クローニングを促進するために２つの外側制限部位をさらに含んだ：ＭｆｅＩ部位は左端側に含まれ、一方、ＡｓｅＩ部位は右端側に含まれた。合成された断片を、ＭｆｅＩ−ＡｓｅＩ制限断片として、ＥｃｏＲＩおよびＮｄｅＩ消化ｐＢＲ３２２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号  Ｊ０１７４９．１）に連結（それによって、ｐＢＲ３２２の２．３ｋｂ、テトラサイクリン耐性遺伝子含有ＥｃｏＲＩ−ＮｄｅＩ断片を置換）して、それぞれの連結断片を生成するために消化された制限部位を廃棄した。最終的に、ベクターゲノムの左端および右端を有する得られたプラスミドを用いて、２回の連続クローニング工程によりｐＡｄ２６．ｄＥ１．ｄＥ３．５ｏｒｆ６を構築した。まず、ｐＷＥ．Ａｄ２６．ｄＥ３．５ｏｒｆ６に由来する１２．７ｋｂのＳｆｉＩ−ＮｈｅＩ  Ａｄ２６ベクターゲノム制限断片（Ａｂｂｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）を、ＳｆｉＩおよびＮｈｅＩによって消化された「左端／右端」プラスミドに連結した。次に、ｐＷＥ．Ａｄ２６．ｄＥ３．５ｏｒｆ６に由来する１３．７ｋｂのＳｆｉＩ−ＳｆｉＩ  Ａｄ２６ベクターゲノム制限断片を、得られた部分ベクターゲノムプラスミドのＳｆｉＩ部位に挿入した。
【０１５６】
Ａｄ２６ベクターゲノムプラスミドのｐＡｄ２６．ＣＭＶ＿ＧＬｕｃ．ＡｏＨＶ１＿ＲＦＬおよびｐＡｄ２６．ＣＭＶｔｅｔＯ＿ＧＬｕｃ．ＡｏＨＶ１＿ＲＦＬの生成
ｐＡｄ２６．ＣＭＶ＿ＧＬｕｃ．ＡｏＨＶ１＿ＲＦＬは、ｐＡｄ２６．ｄＥ１．ｄＥ３．５ｏｒｆ６のＡｄ２６ベクターゲノムを含むプラスミドであり（上記を参照）、以下の２つの導入遺伝子発現カセットを有するように改変されている：（１）（欠失）Ｅ１領域に挿入されたヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）プロモーター駆動ガウシアルシフェラーゼ（Ｇｌｕｃ）発現カセット、および（２）Ｅ４とＲＩＴＲとの間に挿入されたＡｏＨＶ−１プロモーター駆動赤色蛍光ホタルルシフェラーゼ（ＲＦＬ）発現カセット。
【０１５７】
ｐＡｄ２６．ＣＭＶｔｅｔＯ＿ＧＬｕｃ．ＡｏＨＶ１＿ＲＦＬは、ＧＬｕｃ発現カセットのｈＣＭＶプロモーター内に２つのテトラサイクリンオペレーター（ｔｅｔＯ）配列をさらに有することを除いて、ｐＡｄ２６．ＣＭＶ＿ＧＬｕｃ．ＡｏＨＶ１＿ＲＦＬと同一である。
【０１５８】
プラスミドｐＡｄ２６．ＣＭＶ＿ＧＬｕｃ．ＡｏＨＶ１＿ＲＦＬおよびｐＡｄ２６．ＣＭＶｔｅｔＯ＿ＧＬｕｃ．ＡｏＨＶ１＿ＲＦＬの構築は、必要な発現カセットを担持する中間コンストラクトの生成、続いてＧｉｂｓｏｎアセンブリ（Ｇｉｂｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）によるｐＡｄ２６．ｄＥ１．ｄＥ３．５ｏｒｆ６のＡｄ２６ベクターゲノムへのこれらのカセットの挿入を含んだ。合成配列「ＣＭＶ＿ＧＬｕｃ＿ＳＶ」（配列番号１７）、「ＣＭＶｔｅｔＯ＿ＧＬｕｃ＿ＳＶ」（配列番号１８）、および「ＡｏＨＶ１＿ＲＦＬ＿ＢＧＨ」（配列番号１９）を有する中間コンストラクトは、遺伝子合成サービス提供者ＧｅｎｅＡｒｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で生成された。配列ＣＭＶ＿ＧＬｕｃ＿ＳＶは、ＧＬｕｃ発現用の発現カセットを含む。それは、ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）プロモーター（配列番号４）、Ｇｌｕｃコード配列、およびＳＶ４０由来ポリアデニル化シグナル配列を含む。配列ＣＭＶｔｅｔＯ＿ＧＬｕｃ＿ＳＶは、そのｈＣＭＶプロモーター由来のプロモーター内に、ＣＭＶｔｅｔＯ（配列番号１５）（２つのテトラサイクリンオペレーター（ｔｅｔＯ）配列を含む５４ｂｐ挿入）を有する点で、配列ＣＭＶ＿ＧＬｕｃ＿ＳＶとは異なる。配列ＡｏＨＶ１＿ＲＦＬ＿ＢＧＨは、ＲＦＬ発現用の発現カセットを含む。それは、ＡｏＨＶ−１ショート（配列番号３０）、ＲＦＬコード配列、およびウシ成長ホルモン遺伝子由来ポリアデニル化シグナル配列を含む。配列ＣＭＶ＿ＧＬｕｃ＿ＳＶおよびＣＭＶｔｅｔＯ＿Ｇｌｕｃ＿ＳＶは、ｐＡｄ２６．ｄＥ１．ｄＥ３．５ｏｒｆ６のＡｓｉＳＩ部位に直接隣接する配列に対応する短いフランキング配列をさらに含むように設計した。これらのフランキング配列は、インビトロアセンブリー（ＩＶＡ）法（例えば、Ｇｉｂｓｏｎら（Ｇｉｂｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）によって記載されるような）によって、ｐＡｄ２６．ｄＥ１．ｄＥ３．５ｏｒｆ６のＡｓｉＳＩ部位（すなわち、ＡｄベクターゲノムのＥ１欠失の位置）への関連発現カセットの挿入を可能にする。同様に、配列ＡｏＨＶ１＿ＲＦＬ＿ＢＧＨは、ＩＶＡによるｐＡｄ２６．ｄＥ１．ｄＥ３．５ｏｒｆ６のＰａｃＩ部位（すなわち、ベクターゲノムのＥ４領域とＲＩＴＲとの間）への関連発現カセットの挿入を可能にするフランキング配列を含む。３つの配列はすべて、それぞれのプラスミド骨格からこれらの配列を除くためのフランキング外側制限部位をさらに備えていた（それらは遺伝子合成サービス供給者によって提供される）。ｐＡｄ２６．ＣＭＶ＿ＧＬｕｃ．ＡｏＨＶ１＿ＲＦＬは、ＡｓｉＳＩとＰａｃＩの両方で消化されるプラスミドｐＡｄ２６．ｄＥ１．ｄＥ３．５ｏｒｆ６と合成配列ＣＭＶ＿ＧＬｕｃ＿ＳＶおよびＡｏＨＶ１＿ＲＦＬ＿ＢＧＨ（これらは、それぞれのプラスミド骨格から、それぞれＰｍｌＩおよびＰｓｈＡＩで消化されて除去された）との間で４断片Ｇｉｂｓｏｎアセンブリ反応（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を行うことによって構築された。ｐＡｄ２６．ＣＭＶｔｅｔＯ＿ＧＬｕｃ．ＡｏＨＶ１＿ＲＦＬは、ｐＡｄ２６．ｄＥ１．ｄＥ３．５ｏｒｆ６と同じ方法で生成されたが、Ｇｉｂｓｏｎアセンブリ反応���ＣＭＶ＿Ｇｌｕｃ＿ＳＶの代わりに合成配列ＣＭＶｔｅｔＯ＿ＧＬｕｃ＿ＳＶを用いた。
【０１５９】
導入遺伝子カセットの完全性の分析のためのプライマー
「Ｅ１  ＰＣＲ」プライマー対配列：
ＴＧＧＣＧＣＧＡＡＡＡＣＴＧＡＡＴＧＡＧ−フォアード（配列番号８）
ＧＣＡＧＧＣＧＧＧＴＴＧＴＣＡＡＡＴＡＡＧ−リバース（配列番号９）
「Ｅ４  ＰＣＲ１」プライマー対配列：
ＧＡＣＧＧＧＡＧＣＡＡＴＣＣＣＴＣＣＡＧ−フォアード（配列番号１０）
ＣＣＣＣＡＣＡＡＡＧＴＡＡＡＣＡＡＡＡＧ−リバース（配列番号１１）
「Ｅ４  ＰＣＲ２」プライマー対配列：
ＣＧＴＴＣＴＣＡＣＴＴＣＣＴＣＧＴＡＴＣ−フォアード（配列番号１２）
ＣＡＡＣＧＣＴＧＡＴＴＧＧＡＣＧＡＧ−リバース（配列番号１３）
この項に記載のプラスミドは、実施例４で使用する。
【０１６０】
ＴｅｔＲ発現プラスミドｐＣ＿ＡｏＨＶ＿ＴｅｔＲ
ｐＣ＿ＡｏＨＶ＿ＴｅｔＲを構築するために、ＡｏＨＶ−１ショート（配列番号３０）の後にコドン最適化ＴｅｔＲコード配列を含む１．３Ｋｂｐ  ＤＮＡ（配列番号２０）断片を合成し（ＧｅｎｅＡｒｔ／ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｇｉｅｓにおいて）、続いてＭｆｅＩおよびＸｂａＩ制限部位を用いてｐｃＤＮＡ２００４Ｎｅｏ（−）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号  ＦＢ６７４８７６）にサブクローニングした。図６Ａは、１．３Ｋｂｐ挿入の位置が示されているｐＣ＿ＡｏＨＶ＿ＴｅｔＲのマップを示す。
【０１６１】
ＰＥＲ．Ｃ６−ＡｏＨＶ．ＴｅｔＲ細胞株の生成手順
安定なＰＥＲ．Ｃ６−ＡｏＨＶ．ＴｅｔＲ細胞株を、標準的な細胞株生成手順によって生成した。簡潔に記載すると、４ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Ｌｏｎｚａ）を補充したＣＤＭ４  ＰｅｒＭＡｂ培地（ＨｙＣｌｏｎｅ）中で増殖させた無血清増殖懸濁適合ＰＥＲ．Ｃ６細胞（Ｆａｌｌａｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）を、ＢｉｏＲａｄエレクトロポレーターを使用するエレクトロポレーションによってプラスミドｐＣ＿ＡｏＨＶ＿ＴｅｔＲでトランスフェクトした。「ＰｅｒＭＡｂ選択培地」、すなわち、４ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよび１２５μｇ／ｍＬジェネティシン（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＣＤＭ４  ＰｅｒＭＡｂ培地中での回収および抗生物質選択の後、トランスフェクトされた細胞を、単一細胞クローニングのために、４ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよび１２５μｇ／ｍＬジェネティシンを補充したＭＡｂ培地（ＳＡＦＣ）に入ったＭＷ９６プレートに１ウェルあたり１生細胞で播種した。細胞コロニーが形成されたところで、ＰｅｒＭＡｂ選択培地中、静的培養で、単離されたクローンを数継代培養して増殖させた。続いて、１００個のクローンを、抗ＴｅｔＲ抗体（Ｔｅｔ０３、ＭｏＢｉＴｅｃ）を用いるフローサイトメトリー細胞内染色手順によって、ＴｅｔＲを発現する能力について分析した。この最初のスクリーニングにおいて、試験した１００個のクローンのうち９４個がＴｅｔＲ陽性であることがわかった。これらのＴｅｔＲ陽性クローンのうち４７個を選択し、４ｍＭのＬ−グルタミンおよび１２５μｇ／ｍＬのジェネティシンを補充したＰｅｒｍｅｘｃｉｓ培地（Ｌｏｎｚａ）中での増殖に適応させた後、フローサイトメトリー細胞内染色手順によるＴｅｔＲ発現、ならびにＴｅｔＲ機能アッセイによるＴｅｔＲ活性について再び試験した（本明細書の方法の項に記載）。次いで、３０時間以下の集団倍加時間を示し、広範囲のＴｅｔＲ活性レベルを示す２４個のＴｅｔＲ陽性クローンを選択した。ＰＥＲ．Ｃ６−ＡｏＨＶ．ＴｅｔＲクローン＃１〜＃２４と示されるこれらのクローンを、振盪フラスコ中で増殖するように（再）適合され、その後、最終的に小規模研究細胞バンク中に凍結保存された。この方法の項は、実施例５に適用可能である。
【０１６２】
ＰＥＲ．Ｃ６−ＡｏＨＶ．ＴｅｔＲクローンからのＴｅｔＲ発現の安定性
長期継代を行った際のＰＥＲ．Ｃ６−ＡｏＨＶ．ＴｅｔＲ細胞クローンによるＴｅｔＲ発現の安定性の分析。振盪フラスコ中、抗生物質選択が行われた場合と行われなかった場合で、ＰＥＲ．Ｃ６−ＡｏＨＶ．ＴｅｔＲ細胞クローンを、約６０回の集団倍加（または世代）に達するまで、複数継代、増殖させた。ＴｅｔＲ発現を、第２０代、第４０代、および第６０代で、フローサイトメトリー細胞内染色によって分析した。これらの時点の各々において、各クローンの細胞をフローサイトメトリー細胞内二重染色プロトコルに供して、ＴｅｔＲおよびチューブリンの両方を検出した。染色は、標準的なフローサイトメトリー細胞内手順に従い、そして２つの抗体インキュベーション工程、すなわち抗ＴｅｔＲマウスモノクローナル抗体（Ｔｅｔ０３、ＭｏＢｉＴｅｃ）を用いる第１の工程、および抗マウスＩｇＧ−ＦＩＴＣ複合体（５５４００１、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を抗チューブリン抗体−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７複合体（ａｂ１９５８８４、Ａｂｃａｍ）と組み合わせて用いる第２の工程を含んだ。クローン毎に、ＴｅｔＲ陽性細胞およびＴｅｔＲ陰性細胞の画分を、ストリンジェントなチューブリン陽性ゲート内で決定した。この方法の項は、実施例５に適用可能である。
【０１６３】
ＴｅｔＲ機能アッセイ
ＴｅｔＲ機能アッセイを、ＰＥＲ．Ｃ６−ＡｏＨＶ．ＴｅｔＲ細胞クローンの長期継代後に行った。振盪フラスコ中、抗生物質選択が行われた場合と行われなかった場合で、ＰＥＲ．Ｃ６−ＡｏＨＶ．ＴｅｔＲ細胞クローンを、約６０回の集団倍加（または世代）に達するまで、複数継代、増殖させた。その後、ＰＥＲ．Ｃ６−ＡｏＨＶ．ＴｅｔＲ細胞クローンおよび対照ＰＥＲ．Ｃ６細胞を、４ｍＭのＬ−グルタミンを補充したＰｅｒｍｅｘｃｉｓ培地の入ったポリ−Ｌ−リシン被覆マルチウェル９６プレートに播種し、２時間のインキュベーション後、ベクターＡｄ２６．ＣＭＶ＿ＧＬｕｃ．ＡｏＨＶ１＿ＲＦＬおよびＡｄ２６．ＣＭＶｔｅｔＯ＿ＧＬｕｃ．ＡｏＨＶ１＿ＲＦＬ（実施例４に記載）によって４連で感染させた。感染後１日目に、感染細胞をルシフェラーゼ細胞溶解緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ／Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中に回収した。続いて、各細胞溶解物の別々のアリコートを使用して、ＧＬｕｃおよびＲＦＬ活性を、それぞれ、ＢｉｏＬｕｘガウシアルシフェラーゼアッセイキット（ＮＥＢ）およびルシフェラーゼアッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ／Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）試薬、ならびにＬｕｍｉｎｏｓｋａｎ  Ａｓｃｅｎｔマイクロプレート照度計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、製造業者の使用説明書に従って使用して測定した。感染複製毎に、Ｇｌｕｃ活性をＲＦＬ活性によって正規化した。この方法の項は、実施例５に適用可能である。
【０１６４】
実施例１：異種遺伝子の発現のための強力なプロモーターとしてのＡｏＨＶ−１ショートの同定
ウイルスまたは動物／ヒトゲノムに由来するプロモーターは、異種タンパク質発現のために、例えば、細胞または宿主生物において目的の遺伝子を発現するためのプラスミドベクターまたはウイルスベクターにおける発現カセットにおいて頻繁に使用される。この目的のために一般的に使用されるプロモーターは、ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）の最初期領域に由来するプロモーターである（Ｐｏｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。他の宿主に感染するいくつかのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）もまた知られている。それらは、例えば、アカゲザル（ｒｈＣＭＶ）（Ｂａｒｒｙ，Ａｌｃｅｎｄｏｒ，Ｐｏｗｅｒ，Ｋｅｒｒ，＆  Ｌｕｃｉｗ，１９９６；Ｃｈａｎ，Ｃｈｉｏｕ，Ｈｕａｎｇ，＆  Ｈａｙｗａｒｄ，１９９６；Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３；Ｈａｎｓｅｎ，Ｓｔｒｅｌｏｗ，Ｆｒａｎｃｈｉ，Ａｎｄｅｒｓ，＆  Ｗｏｎｇ，２００３）およびチンパンジー（ｃｈＣＭＶ）（Ｃｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９６）に感染する。
【０１６５】
好ましくは強力で短く、また一般に使用されるｈＣＭＶプロモーターとの配列同一性の低いプロモーターを同定するために、いくつかの推定プロモーター配列を同定し、試験した。本発明者らが試験したいくつかの推定プロモーターであって、ｈＣＭＶとより遠縁のヘルペスウイルスに由来するものは、プロモーター活性が非常に低いか、または全く示さなかった。異なるＣＭＶ種に由来し、そして強力なプロモーターであることが知られているいくつかの他のプロモーターについて、本発明者らはプロモーター活性を確認したが、残念なことに、このようなプロモーターはしばしば以下の欠点のうちの１つを示す：これらは、例えばエンハンサーおよびイントロン配列を含むために、より大きなサイズを特徴とし、かつ／またはｈＣＭＶプロモーター配列に高い相同性を示す。
【０１６６】
ヨザルヘルペスウイルス１型（Ａｏｔｉｎｅ  ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ  １）（ＡｏＨＶ−１）は、サイトメガロウイルスとして暫定的に分類される。興味深いことに、ＡｏＨＶ−１の完全なゲノム配列が公開され、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が配列に注釈されているが、主要最初期プロモーターはこれまで記載されていない。本発明者らはＡｏＨＶ−１ゲノムの領域の異なる長さの２つの異なる設計を試験し、それぞれの推定プロモーター配列をＡｏＨＶ−１ロングおよびＡｏＨＶ−１ショートと称した。これらの配列に対するプロモーター活性を実証する以下に記載の結果に基づいて、本発明者らは、これらとその誘導体を、ＡｏＨＶ−１主要最初期プロモーター、または簡単にＡｏＨＶ−１プロモーターと称する。
【０１６７】
異種遺伝子発現の効力について、同定した推定プロモーター配列を試験するために、本発明者らは、推定プロモーター配列をＧｅｎｅＡｒｔ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓで合成してもらい、ホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子の上流のＡｖｒＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限部位によりｐＡｄａｐｔ３５．Ｌｕｃプラスミドにサブクローニングした。トランスフェクションの２４時間後にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞において、ホタルルシフェラーゼレベルを測定し、ｈＣＭＶプロモーター（配列番号４）によって誘導されたホタルルシフェラーゼ発現と比較した。
【０１６８】
本発明者らは、あり得るプロモーターのパネルから、いくつかの強力なプロモーター（データは示さず）を選択したが、そのうち、ｃｈＣＭＶショートおよびＡｏＨＶ−１ショートは、非常に小さいサイズおよび効力のために好ましいであろう。選択したプロモーターＡｏＨＶ−１ショート（配列番号１）、ＡｏＨＶ−１ロング（配列番号２）、ｃｈＣＭＶショート（配列番号３）およびｈＣＭＶプロモーターの効力試験の結果を図１に示す。ＡｏＨＶ−１ショートプロモーター、ＡｏＨＶ−１ロングプロモーター、ｃｈＣＭＶショートプロモーターおよびｈＣＭＶプロモーターの全てが、この実験において、同等のプロモーター効力を示す。
【０１６９】
しかし、図２Ａに示すように、ｃｈＣＭＶショートは、アラインメント領域においてｈＣＭＶと非常に高い配列同一性（配列同一性  約６４％）を有し、特にｃｈＣＭＶショートプロモーターの下流部分は、ｈＣＭＶと有意なアラインメントおよび長い配列同一性ストレッチを示す（１９ヌクレオチドまでのいくつかの同一ストレッチと、ほんのわずかなヌクレオチドが異なっているだけの１００を超えるヌクレオチドの相同ストレッチとを有する）。対照的に、図２Ｂに示すように、新規プロモーターのＡｏＨＶ−１ショートは、アラインメント領域においてｈＣＭＶとの配列同一性が低く（配列同一性  約３６％）、かつｈＣＭＶ対照に匹敵する効力を有している。相同プロモーター領域間の潜在的な相同組換えに関して、２つの配列における同一のストレッチの長さは、全体的な配列相同性よりも関連性が高い。注目すべきことに、ＡｏＨＶ−１ショートプロモーターはｈＣＭＶと、最大で１４ヌクレオチド長の、短い同一配列ストレッチをほんのわずかしか共有せず、これは、より多くの、および／またはより長い同一ヌクレオチドのストレッチを共有するプロモーター、例えば（Ｒｕｂｎｉｔｚ  ＆  Ｓｕｂｒａｍａｎｉ，１９８４）と比較して、ｈＣＭＶプロモーターとＡｏＨＶ−１ショートプロモーターとの間の相同組換えリスクの大幅な低減をもたらすものと考えられる。したがって、ｈＣＭＶプロモーターとＡｏＨＶ−１ショートプロモーターとの間の望ましくない相同組換えの危険性は、非常に低いと考えられる。必要であれば、これらのプロモーター間の配列同一性の既に非常に限定されたレベルを、いずれかのプロモーターに１つ以上の標的変異を作り、これがプロモーター活性を失わない日常的な方法によって試験することによって、さらに減少することができよう。
【０１７０】
結論として、ＡｏＨＶ−１ショートプロモーターは、ゴールドスタンダード（ｇｏｌｄ  ｓｔａｎｄａｒｄ）ｈＣＭＶの範囲において非常に良好な効力を示し、同時に、非常に短い配列（４８４ｂｐ）を有し、かつｈＣＭＶプロモーターに対し低い配列同一性を有するので、好ましい。
【０１７１】
実施例２：哺乳動物細胞における目的の遺伝子の誘導発現のための小分子−制御可能なトランスアクチベーターーベースの系におけるＡｏＨＶ−１コアプロモーターの適用
遺伝子の誘導発現は、バイオテクノロジーの分野、特に毒性遺伝子産物の一過性発現に高い適用性を有し得る。哺乳動物細胞における異種遺伝子調節のための特定のよく確立された系は、ｈＣＭＶコアプロモーターに連結されたＴｅｔオペレーター（ＴｅｔＯ）配列の多数のコピーからなる人工プロモーターを利用する（Ｇｏｓｓｅｎ  ＆  Ｂｕｊａｒｄ，１９９２；Ｇｏｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）。これらの系において、基礎転写活性を全く示さないか、または非常に低い基礎転写活性を示す前記人工プロモーターは、テトラサイクリン制御性トランスアクチベータータンパク質（ｔＴＡ）またはリバーステトラサイクリン制御性トランスアクチベータータンパク質（ｒｔＴＡ）として知られる特定の組換え転写因子のＴｅｔＯ配列に特異的に結合することによって活性化され得る。ここでは、ｈＣＭＶコアプロモーターの代わりに、ＡｏＨＶ−１プロモーターの配列エレメントを用いて、同様のｔＴＡ／ｒｔＴＡ応答性人工プロモーターを生成することができるか否かを試験した。
【０１７２】
この目的のために、推定最小（コア）ＡｏＨＶ−１プロモーターのみを７つのＴｅｔオペレーターのすぐ下流に配置したプロモーター（７×ＴｅｔＯ−ＡｏＨＶ−１、配列番号５）を構築した。プロモーター配列をＧｅｎｅＡｒｔ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓで合成し、ＸｈｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限部位によって本明細書中の方法の項に記載のプラスミドｐＤｕａｌＬｕｃにサブクローニングし、それによってこのプラスミドのガウシアルシフェラーゼレポーター遺伝子を制御するＣＭＶプロモーターを置換した。トランスフェクションの２４時間後に、トランスフェクトされたＶｅｒｏ細胞においてガウシアルシフェラーゼレベルを測定し、トランスアクチベータータンパク質ｔＴＡの存在下での同じプロモーターによるガウシアルシフェラーゼ発現と比較した。発現カセットが同じｐＤｕａｌＬｕｃプラスミド上に位置するＡｏＨＶ−１短プロモーターの制御下での赤色蛍光ホタルルシフェラーゼ（ＲＦＬ）の測定によって、発現データをトランスフェクション効率について正規化した。図３は、７×ＴｅｔＯ−ＡｏＨＶ−１プロモーターの制御下でのガウシアルシフェラーゼ遺伝子の発現を示す。４つの独立した実験（Ｎ＝４）にわたって、７×ＴｅｔＯ−ＡｏＨＶ−１プロモーターの基礎発現レベルは、バックグラウンドレベル（培地のみでトランスフェクトした細胞、陰性対照）に近く、トランスアクチベータータンパク質ｔＴＡ（７×ＴｅｔＯ−ＡｏＨＶ−１＋ｔＴＡ）をコードするプラスミドで同時トランスフェクトした場合よりも平均で１４００倍低かった。プロモーターのｔｅｔＯ配列へのｔＴＡの結合を阻害するであろうドキシサイクリンを添加すると（２回実施、Ｎ＝２）、発現の基礎レベルが再び観察された。７×ＴｅｔＯ−ＡｏＨＶ−１の誘導された発現レベルもまた、ＲＳＶプロモーター（ラウス肉腫ウイルスのＬＴＲに由来する；これはバイオテクノロジー発現系で使用するために記載された別のプロモーターである）と比較し、誘導された７×ＴｅｔＯ−ＡｏＨＶ−１プロモーターがＲＳＶプロモーターによるよりも約１ｌｏｇ高いガウシアルシフェラーゼ発現をもたらすことが示された。
【０１７３】
結論として、ＡｏＨＶ−１プロモーター由来の推定コアプロモーター含有配列を用いて、テトラサイクリン制御性トランスアクチベータータンパク質に応答する人工プロモーターを構築することができる。これに関連して、この配列の適用により、目的の遺伝子の発現の厳密に制御された調節が可能になることがわかった。したがって、前記配列は、本明細書で定義されるように、それ自体のプロモーター活性は非常に低いが、天然または人工転写因子の結合部位などの他の調節配列と組み合わせると、強力な遺伝子発現を駆動することができる、真の「コアプロモーター」を表す。
【０１７４】
実施例３：哺乳動物細胞における目的の遺伝子の調節発現のための小分子−制御可能な細菌リプレッサータンパク質ーベースの系におけるＡｏＨＶ−１コアプロモーターの適用
実施例２で述べたとおり、言及したように、細胞株における、例えば、目的の毒性遺伝子の調節発現は、タンパク質またはウイルスベクターの組換え産生に必須であり得る。ｈＣＭＶプロモーターを有する発現カセットを既に含むウイルスベクターを使用する場合、産生細胞系における目的の遺伝子（ＧＯＩ）の発現のためには異なる配列を有する強力なプロモーターを使用することが望ましい。ｈＣＭＶプロモーターの代替物を同定するために、ＡｏＨＶ−１ショートプロモーターおよびヒトホスホグリセリン酸キナーゼ１（ｈＰＧＫ）プロモーター（バイオテクノロジー発現系で使用するために記載された別のプロモーター）を、ＰＥＲ．Ｃ６細胞におけるｅＧＦＰの一過性発現について試験した。実施例１の結果と一致して、ＡｏＨＶ−１ショートプロモーターは再び、異種遺伝子を発現するための強力なプロモーターであり、ｅＧＦＰ発現レベルの駆動が、（配列番号４の）ｈＣＭＶと同程度で、ｈＰＧＫプロモーター（配列番号６）よりもはるかに高いことを示した（図４Ａ）。
【０１７５】
以下において、通常は構成的に活性であるＡｏＨＶ−１短プロモーター（実施例１および本実施例の最初の部分を参照）を、ＴＡＴＡボックスの下流およびＡｏＨＶ−１ショートプロモーターの転写開始部位（ＴＳＳ）の上流に２つのＴｅｔオペレーターを挿入することによって、テトラサイクリンリプレッサータンパク質（ＴｅｔＲ）調節プロモーターとして設計した（ＡｏＨＶ．２×ｔｅｔＯ、配列番号７）。この設計は、以前に、ｈＣＭＶプロモーターに作用することが示されていた（例えば、国際公開第１９９９／０００５１０Ａ１号パンフレットを参照）。このプロモーターは、ＴｅｔＲを発現しない細胞において活性である。この設計においては、プロモーター活性はＴｅｔＲの存在下、例えば、ＴｅｔＲを発現する細胞株において抑制される。抑制は、ＴｅｔＲタンパク質に対して高い親和性を有するドキシサイクリン（Ｄｏｘ）の添加によって軽減され得る。図４Ｂは、ＡｏＨＶ．２×ＴｅｔＯの下流にクローニングされたｅＧＦＰの発現がＰＥＲ．Ｃ６−ｈＣＭＶ．ＴｅｔＲ細胞において実際に抑制されることを示す。Ｄｏｘの添加により、ｈＣＭＶによって駆動されるｅＧＦＰ発現レベルと同程度にまで、ｅＧＦＰタンパク質発現レベルを増加させる。
【０１７６】
目的の遺伝子のＴｅｔＲ調節発現を示す安定な細胞クローンを確立するために、ｈＣＭＶプロモーターの制御下でＴｅｔＲを発現するＰＥＲ．Ｃ６−ｈＣＭＶ．ＴｅｔＲ細胞を、ＡｏＨＶ．２×ｔｅｔＯの制御下で目的の遺伝子を発現するプラスミドでトランスフェクトした。８５個のクローンを、抗生物質選択培地を用いて選択した。この実験では、目的の遺伝子（ＧＯＩ）の誘導発現を試験するために、２つのクローンを選択した。図４Ｃは、ＧＯＩを誘導発現させるために選択された２つのクローンの試験を示す。ウエスタンブロットから分かるように、試験した両クローンはＤｏｘの非存在下で低いバックグラウンドシグナルを示すが、Ｄｏｘの存在下ではＧＯＩは強力に発現される。陽性対照として、ＡｏＨＶ−１ショートプロモーターの制御下でＧＯＩを発現するプラスミドで一過性にトランスフェクトした細胞を使用した。陽性対照は細胞クローンよりも高いＧＯＩの発現レベルを示し、これは、安定な細胞株を作製した場合に一般に観察される。
【０１７７】
クメート（ｃｕｍａｔｅ）オペレーター配列（ＣｕＯ）がＡｏＨＶ−１ショートプロモーターの（推定）開始エレメントのすぐ下流に配置された、代替の細菌リプレッサー調節プロモーターもまた設計されて試験され、そしてまた機能的であることが証明された（データ示さず）。このプロモーター設計においては、ＣｙｍＲリプレッサータンパク質が、ＣｕＯ配列に結合し、それによって発現を阻害することができる。
【０１７８】
さらに、記載されたＴｅｔＲ調節ＡｏＨＶ１プロモーターベースの系およびＣｙｍＲ調節ＡｏＨＶ１プロモーターベースの系に類似して、Ｌａｃオペレーター（ＬａｃＯ）含有ＡｏＨＶ−１ショートプロモーターが生成され、Ｌａｃリプレッサー（ＬａｃＲ）によって強く抑制可能であることが証明された（データは示さず）。
【０１７９】
結論として、この実施例が、異種遺伝子の発現に一般的に使用されている他のプロモーターに比べて、ＡｏＨＶ−１ショートプロモーターが高い効力を有することを確認するものである。さらに、哺乳動物細胞におけるＧＯＩの調節発現を可能にする、ＡｏＨＶ−１プロモーターのＴｅｔＲ−、ＣｙｍＲ−、およびＬａｃＲ調節バージョンが生成された。これは、例えば、細胞に対して毒性のあるタンパク質の発現に、または細胞もしくはベクターの不安定性をもたらすタンパク質の発現に使用することができる。
【０１８０】
実施例４：２つの発現カセットを有するウイルスベクターにおけるＡｏＨＶ−１プロモーターの適用
ＡｏＨＶ−１ショートプロモーター（ＡｏＨＶ−１ショート）は、ワクチン抗原または他の目的のタンパク質の発現を駆動するウイルスベクターに適用することができる。これは、アデノウイルスベクターＡｄ２６．ＣＭＶ＿ＧＬｕｃ．ＡｏＨＶ１＿ＲＦＬおよびＡｄ２６．ＣＭＶｔｅｔＯ＿ＧＬｕｃ．ＡｏＨＶ１＿ＲＦＬ．との関連におけるＡｏＨＶ−１ショートの適用によって本明細書中で説明される。これらはいずれも、２つの発現カセット、すなわち（欠失）Ｅ１領域の代わりに挿入されたガウシアルシフェラーゼ（ＧＬｕｃ）をコードする第１のカセット、およびＥ４領域と右の逆位末端配列（ＲＩＴＲ）との間に位置する赤色蛍光ホタルルシフェラーゼ（ＲＦＬ）をコードする第２のカセットを担持する、２つのＡｄ２６ベースの組換えアデノウイルスベクターである。２つのウイルスのＧｌｕｃ発現カセットは、それぞれ、ｈＣＭＶプロモーター（配列番号４）およびＣＭＶｔｅｔＯ（配列番号１５）によって駆動される。ＣＭＶｔｅｔＯは、２つのテトラサイクリンオペレーター（ＴｅｔＯ）配列モチーフを含む配列の挿入を担持し、このプロモーターがテトラサイクリンリプレッサー（ＴｅｔＲ）タンパク質によって抑制可能であるという点で、ｈＣＭＶプロモーターとは異なる。両ウイルスにおいて、ＲＦＬ発現カセットは、ＡｏＨＶ−１ショート（配列番号３０）の制御下にある。２つのベクターのゲノムの概略図については、図５Ａを参照されたい。
【０１８１】
上記の２つのベクターを、本明細書の方法の項に記載される完全ゲノムプラスミドのｐＡｄ２６．ＣＭＶ＿ＧＬｕｃ．ＡｏＨＶ１＿ＲＦＬおよびｐＡｄ２６．ＣＭＶｔｅｔＯ＿ＧＬｕｃ．ＡｏＨＶ１＿ＲＦＬの、ＰＥＲ．Ｃ６細胞へのトランスフェクションによって生成した。これらのトランスフェクションは、前日に１フラスコあたり３×１０６個のＰＥＲ．Ｃ６細胞を播種したＴ２５組織培養フラスコ中で、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００トランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および１回のトランスフェクションあたり４μｇのＳｗａＩ消化プラスミドＤＮＡを用いて、標準的な手順に従って行った。（ＳｗａＩ消化は、プラスミド骨格からアデノウイルスベクターゲノムを放出する働きをする）。ウイルスレスキュートランスフェクションの回収後、大規模ウイルス生成感染がトランスフェクション後のウイルス継代数（ＶＰＮ）５で行われるまで、ＰＥＲ．Ｃ６細胞での数回の連続した感染ラウンドによってウイルスをさらに増幅させた。ウイルスは、前述のように、２段階塩化セシウム（ＣｓＣｌ）密度勾配超遠心分離手順を用いて粗ウイルス回収物から精製した（Ｈａｖｅｎｇａ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。前述のように、両方の場合において、ウイルス粒子（ＶＰ）力価を決定する分光光度法に基づく手順、および感染単位（ＩＵ）力価を決定するＴＣＩＤ５０アッセイによって、ウイルスを定量した（Ｍａｉｚｅｌ，Ｗｈｉｔｅ，＆  Ｓｃｈａｒｆｆ，１９６８）。
【０１８２】
Ａｄ２６．ＣＭＶ＿ＧＬｕｃ．ＡｏＨＶ１＿ＲＦＬおよびＡｄ２６．ＣＭＶｔｅｔＯ＿ＧＬｕｃ．ＡｏＨＶ１＿ＲＦＬの精製バッチのＶＰおよびＩＵ定量結果を表１に示す。２つのバッチで得られたウイルス収量ならびにＶＰ対ＩＵ比は、標準的な単一導入遺伝子発現カセット含有Ａｄ２６ベースのベクターでルーチン的に得られるものと同じ範囲である。例えば、Ａｄ２６．ＣＭＶ＿ＧＬｕｃ．ＡｏＨＶ１＿ＲＦＬおよびＡｄ２６．ＣＭＶｔｅｔＯ＿ＧＬｕｃ．ＡｏＨＶ１＿ＲＦＬのバッチで得られたＶＰ対ＩＵ比、すなわち２３および１４は両方とも、異なる（単一の）導入遺伝子発現カセットを有するＡｄ２６ベースのベクターのパネルについて以前に報告された、１８、１１、２４、１０、１２および２６のＶＰ対ＩＵ比の範囲内にある。（Ｚａｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。
【０１８３】
アデノウイルスのＥ１領域からの２つの導入遺伝子の発現のための２つの同一のプロモーターの使用は、おそらく相同組換えによって、遺伝的不安定性を生じ得ることが以前に報告されている（例えば、（Ｂｅｌｏｕｓｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）および国際公開第２０１６／１６６０８８Ａ１号パンフレットの実施例２を参照されたい）。これが、それぞれＥ１およびＥ４＿ｒＩＴＲの位置においてｈＣＭＶプロモーターと同じ系に本発明のＡｏＨＶ−１プロモーターの組み合わせを使用することによって解決され得るか否かを調べるために、本発明者らはこの組み合わせについて導入遺伝子カセットの完全性を試験した。導入遺伝子（ＴＧ）カセットの完全性を、Ａｄ２６．ＣＭＶ＿ＧＬｕｃ．ＡｏＨＶ１＿ＲＦＬおよびＡｄ２６．ＣＭＶｔｅｔＯ＿ＧＬｕｃ．ＡｏＨＶ１＿ＲＦＬの２つの精製バッチについて、ＰＣＲに基づく増幅と、それに続く導入遺伝子カセット挿入領域の配列を決定することによって確認した（図５Ｂ）。具体的には、ＰＣＲを行って、Ｅ１に挿入されたＴＧカセットを増幅させ（「Ｅ１  ＰＣＲ」）、かつＥ４とＲＩＴＲとの間に位置するＴＧカセットを標的とする２つのＰＣＲを行った（「Ｅ４  ＰＣＲ１」および「Ｅ４  ＰＣＲ２」）。これらのＰＣＲにおいて使用するプライマーは全て、Ａｄ２６特異的配列に相補的である（すなわち、それらは、それぞれのＴＧカセット自体内に位置する配列にアニールしない）。全てのＰＣＲで、予想されるサイズの産物が得られたが、欠失を示すより小さいサイズの産物は識別できなかった。ＰＣＲ産物の配列決定によっても、いかなる変異も見出されなかった。したがって、本発明のＡｏＨＶ−１プロモーターとｈＣＭＶプロモーターとの単一ベクターにおける組み合わせは、遺伝的に安定なベクターを生じた。
【０１８４】
最後に、Ａｄ２６．ＣＭＶ＿ＧＬｕｃ．ＡｏＨＶ１＿ＲＦＬおよびＡｄ２６．ＣＭＶｔｅｔＯ＿ＧＬｕｃ．ＡｏＨＶ１＿ＲＦＬ精製バッチを、それらがコードする２つのルシフェラーゼを発現する能力について試験した。この目的のために、ヒト細胞株Ａ５４９を、２つのウイルスにより異なる感染効率で感染させ、ＧＬｕｃおよびＲＦＬ活性を、２日後に採取したサンプルにおいて検出した。結果は、両ベクターがＧＬｕｃおよびＲＦＬの両方を発現することができたことを示す（図５ＣおよびＤ）。これは、関連する導入遺伝子発現カセット構成が、それらが試験されたアデノウイルスゲノム状況内で完全に機能的であることを示している。
【０１８５】
結論として、ＡｏＨＶ−１ショートは、ウイルスベクターに挿入された導入遺伝子発現カセットから目的のタンパク質の発現を駆動するプロモーターとして適用され得る。これが、それぞれが、アデノウイルスベクターゲノム内の異なる位置に挿入された２つの別々の導入遺伝子発現カセットを含む２つのアデノウイルスベクターという状況下で、ＡｏＨＶ−１ショートを用いてＲＦＬを発現させた上記で例示されている。これらのアデノウイルスベクターは容易に生成され、良好なＶＰ対ＩＵ比を示し、遺伝的および機能的に無傷の導入遺伝子発現カセットを有する高力価精製ベクターバッチに生産可能であることがわかった。
【０１８６】
実施例５：細胞における目的の遺伝子の安定した発現のためのプラスミドにおけるＡｏＨＶ−１プロモーターの適用
ＡｏＨＶ−１プロモーターは、安定な細胞株における異種遺伝子の発現を駆動するために適用することができる。本明細書では、これを、ＴｅｔＲ遺伝子発現がＡｏＨＶ−１プロモーターによって駆動されるプラスミドであるｐＣ＿ＡｏＨＶ＿ＴｅｔＲを用いて、ＴｅｔＲ発現細胞株を生成することによって説明する。
【０１８７】
ｐＣ＿ＡｏＨＶ＿ＴｅｔＲは、図６Ａに示されており、本明細書の方法の項に記載されている。これは、ＡｏＨＶ−１プロモーターの制御下にあるＴｅｔＲコード発現カセット、およびＳＶ４０由来プロモーターの制御下にあるネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ遺伝子発現カセットを含む。後者のカセットは、ジェネティシン補充細胞増殖培地を使用することによって、安定にトランスフェクトされた細胞の選択を可能にする。
【０１８８】
本明細書中の「ＰＥＲ．Ｃ６−ＡｏＨＶ．ＴｅｔＲ細胞株生成手順」の方法の項にさらに詳述されているように、ｐＣ＿ＡｏＨＶ＿ＴｅｔＲを使用して、ヒト細胞株ＰＥＲ．Ｃ６へ安定にトランスフェクションした。これにより、単一細胞クローニング後、多数のＴｅｔＲ発現「ＰＥＲ．Ｃ６−ＡｏＨＶ．ＴｅｔＲ」細胞クローンが効率的に生成された。試験した１００個のジェネティシン耐性クローンのうち９４個が、ＴｅｔＲを検出するフローサイトメトリー細胞内染色プロトコルに基づく第１のスクリーニング工程において、ＴｅｔＲ発現に陽性であることがわかった（データは示さず）。これらのＴｅｔＲ陽性クローンの４７についての第２のスクリーニング工程の後（データは示さず）、２４クローンの選択を、小規模研究細胞バンクに凍結保存した。
【０１８９】
凍結保存したＰＥＲ．Ｃ６−ＡｏＨＶ．ＴｅｔＲの１２個のクローンを、ジェネティシン選択の存在下および非存在下の両方で、振盪フラスコ中でのそれらの解凍後増殖性能、および長期継代（６０集団倍加まで）時に（機能的）ＴｅｔＲを発現するそれらの能力のさらなる評価に供した。全てのクローンが、親懸濁液ＰＥＲ．Ｃ６対照細胞株と少なくとも同程度の効率で、かつ同様の生存率で増殖することがわかった（データは示さず）。フローサイトメトリー細胞内染色によるＴｅｔＲ発現の分析により、ＴｅｔＲ陽性細胞画分が長期継代実験を通して高いままであった（すなわち、９７％以上）ことがさらに示された。これを、３つの代表的なクローン（ＰＥＲ．Ｃ６−ＡｏＨＶ．ＴｅｔＲクローン１〜３）について図６Ｂに示す。最後に、ＴｅｔＲ機能性アッセイは、ＰＥＲ．Ｃ６−ＡｏＨＶ．ＴｅｔＲクローン１〜３について図６Ｃに示すように、１２個のクローンが全て、それらの長期継代後に有意なＴｅｔＲ媒介抑制活性を示すことを実証した。具体的には、第６０世代において、１２個のＰＥＲ．Ｃ６−ＡｏＨＶ．ＴｅｔＲクローンは全て、ＴｅｔＲ調節プロモーターによって駆動されるアデノウイルスベクターコードレポーター遺伝子の発現を抑制する能力を維持した。１２の異なるクローンで観察された抑制レベルは、ヒトＣＭＶプロモーターによって制御されるＴｅｔＲ発現カセットを含むプラスミドである、以前に記載されたＴｅｔＲ発現プラスミドｐＣＤＮＡ６／ＴＲを用いて作製された陽性対照細胞株（ＰＥＲ．Ｃ６−ｈＣＭＶ．ＴｅｔＲ）で観察されたレベルと同様であった（またはそれよりも高かった）。
【０１９０】
結論として、ＴｅｔＲ発現がＡｏＨＶ１プロモーターによって駆動される安定なｓＰＥＲ．Ｃ６−ＡｏＨＶ．ＴｅｔＲ細胞株が首尾よく生成された。これは、本発明のＡｏＨＶ−１プロモーターに作動可能に連結された導入遺伝子を宿主細胞のゲノムに組み込んだ後の、目的のタンパク質の安定な発現の１つの非限定的な例である。
【０１９１】
実施例６：ＡｏＨＶ−１プロモーターの異なるバージョンの設計
異種遺伝子を発現するためのＡｏＨＶ−１主要最初期調節領域の必須部分をマッピングするために、ＡｏＨＶ−１プロモーターの異なるバージョンのパネルを作製した。異なる設計を図７Ａに示す。この短いプロモーター配列の必須部分をマッピングするために、既に非常に短いＡｏＨＶ−１ショート配列をトランケートして、２つの設計を行った。他の設計は、ＡｏＨＶ−１ショートの効力が増大され得るか否かを試験するために、さらなる推定ドメインおよび細胞因子結合部位、ならびに予測されるイントロン配列を含む。
試験したプロモーターバージョンは、バージョンｖ００〜ｖ０９と命名し、以下に記載する：
ｖ００：配列番号３０（天然のＡｖｒＩＩ部位を有する）
ｖ０１：配列番号２２
ｖ０２：配列番号２３
ｖ０３：配列番号２４
ｖ０４：配列番号２５
ｖ０５：配列番号２６
ｖ０６：配列番号１（ＡｖｒＩＩ部位は、ヌクレオチド３６０位でのシトシン（ｃ）の単一ヌクレオチド挿入により除去）
ｖ０７：配列番号２７
ｖ０８：配列番号２８
ｖ０９：配列番号２９
【０１９２】
プロモーター活性を、ＰＥＲ．Ｃ６細胞へのプラスミドの一過性トランスフェクションを用いて試験した。異なるプロモーターバージョンは、本明細書中の方法の項に記載されるｐＤｕａｌＬｕｃプラスミドにおけるガウシアルシフェラーゼの発現を駆動する。図７Ｂは、ＡｏＨＶ−１ショート（バージョン００）の活性と比べたプロモーター効力試験の結果を示す。実験は２回行った。それぞれの個々の値を、同じ実験におけるｖ００の平均に対して算出した。平均および標準偏差を計算するために、２つの実験の値をプールし、これをＡｏＨＶ−１ショートｖ００に対して示した。ｖ００およびｖ０６（それぞれＡｖｒＩＩ部位を有するおよび有さないＡｏＨＶ−１ショート）の活性は、同じ範囲にあると考えられる。
【０１９３】
興味深いことに、切断したバージョン０４は、ＡｏＨＶ−１ショート（バージョン００および０６）に匹敵するプロモーター活性を示す。このバージョン０４は、長さがわずか３７１ヌクレオチド長である。対照的に、さらに切断した２４１ヌクレオチド長のバージョン０５は、ＡｏＨＶ−１ショートと比較して活性が減少しており、これは、いくつかの予測される細胞因子結合部位が存在しないことによって説明され得る。このプロモーターバージョン０５は、依然として強力なプロモーターと考えることができる。プロモーターの活性は、さらなる切断と共に徐々に減少すると予想される。
【０１９４】
ＡｏＨＶ−１ショートプロモーターと比較して全ての伸長を含む他のほとんどのプロモーターバージョンの効力は、ＡｏＨＶ−１短プロモーターの範囲内である。これらの伸長されたＡｏＨＶ−１プロモーター変異体のうち、ｖ０３のみ（データは示さず）がＡｏＨＶ−１ショートと比較してプロモーター活性の大幅な低下を示すが、これは、ｖ０３における不完全なイントロン配列の存在によって説明することができ、ｖ０３はその伸長内に予測スプライスドナー部位を有するが、さらに下流に位置するいくつかの予測スプライスアクセプターは欠いている。対照的に、それぞれそれらの予測スプライスドナー部位（のいずれか）の下流に少なくとも１つの予測スプライスアクセプター部位を有する伸長ＡｏＨＶ−１プロモーター変異体ｖ０７、ｖ０８およびｖ０９はそれぞれ、ＡｏＨＶ−１ショートプロモーターの範囲内の発現を示した。配列ｖ０９はｖ０７の欠失変異体であり、ｖ０７と比較して、ｖ０９は、特定の予測スプライスドナーおよびアクセプター配列を無傷のまま残す内部欠失を有する。データは、ｖ０９が予測イントロンを有する短いが強力なＡｏＨＶ−１プロモーター変異体の例であることを示す。同様の短いが強力なイントロン含有プロモーターが、ＡｏＨＶ−１プロモーター変異体ｖ０８に（ｖ０７に適用される前記内部欠失と）同様の欠失を適用することによって生成され得ることが想定され得る。
【０１９５】
２つのさらなるＡｏＨＶ−１プロモーター配列、配列番号３３および配列番号３４もまた設計し、目的の遺伝子の発現を駆動する能力を試験した。ＡｏＨＶ−１ショート（すなわち、配列番号３０）と比較して、これら２つの配列はそれぞれ８４ｂｐ長の３’トランケーションを持ち、さらにＡｏＨＶ−１プロモーターコア領域内にそれぞれ２個および７個の単一ヌクレオチド置換を持つ。前記３’トランケーションのために、配列番号３３および配列番号３４はいずれも、ＡｏＨＶ−Ｉプロモーターの推定イニシエーター配列の下流にたった１個のＡｏＨＶ−１ヌクレオチドを含む。
【０１９６】
配列番号３３を、合成遺伝子断片の一部として、プラスミドｐＣ＿ＡｏＨＶ＿ＴｅｔＲ（本明細書の方法の項に記載）に挿入し、そのプラスミドのＡｏＨＶ−１ショートプロモーターを置換することによって、ＴｅｔＲコード配列に作動可能に連結させた。ＰＥＲ．Ｃ６細胞への一過性トランスフェクション、続く抗ＴｅｔＲモノクローナル抗体（ＴｅｔＲ０３、ＭｏＢｉＴｅｃ）を用いた細胞溶解物の免疫ブロッティングによって、その後、配列番号３３のプロモーター活性がＡｏＨＶ−１ショートのプロモーター活性と類似していることが示された（データは示さず）。
【０１９７】
配列番号３４を、ＡｖｒＩＩおよびＡｓｃＩ制限部位を使用して、合成遺伝子断片をｐＤｕａｌＬｕｃ（本明細書の方法の項に記載）にクローニングすることによって、ＲＦＬコード配列に作動可能に連結させた。ＰＥＲ．Ｃ６細胞への一過性トランスフェクション実験、続く細胞溶解物におけるＲＦＬ活性の測定によって、配列番号３４が機能的プロモーター配列であることが示された（データは示さず）。
【０１９８】
これらのプロモーター変異体の活性は、プロモーターの活性に、推定Ｉｎｒの最初のヌクレオチド３’（すなわち、配列番号２５のヌクレオチド２８７に対応する、配列番号３０のヌクレオチド３９９）の下流にＡｏＨＶ−１配列を含む必要がないことを示している。，：
【０１９９】
結論
上記のように、短くかつ強力なプロモーターが、ヨザルヘルペスウイルス１型（Ａｏｔｉｎｅ  ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ−１）から特定された。ＡｏＨＶ−１プロモーターは短い配列を有し、かつｈＣＭＶプロモーターに匹敵する効力を有する。これらの特徴は、ＡｏＨＶ−１プロモーターを、ｈＣＭＶプロモーターが使用される状況下で代替として使用する理想的なプロモーターにする。さらに、ＡｏＨＶ−１プロモーターはｈＣＭＶプロモーターに対する配列同一性が比較的低く、これは、ＡｏＨＶ−１プロモーターを、同じウイルスベクターから２つの異なる導入遺伝子を発現する場合、または同様の配列を含み得るプロデューサー細胞株を用いてウイルスを生成する場合、ｈＣＭＶプロモーターと組み合わせて使用するのに適したものとする。ＡｏＨＶ−１プロモーターはまた、ＡｏＨＶ−１プロモーターからの転写の調節に使用され得る調節配列と共に使用するのに好適である。
【０２００】
【表１】
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本発明は、以下を提供する。
[１]  異種導入遺伝子に作動可能に連結されたヨザルヘルペスウイルス１型（Ａｏｔｉｎｅ  Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ  １）主要最初期プロモーター（ＡｏＨＶ−１プロモーター）を含む核酸分子。
[２]  前記ＡｏＨＶ−１プロモーターは、配列番号２５のｎｔ２３７〜２８６に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含み、好ましくは、前記ＡｏＨＶ−１プロモーターは、配列番号２５のヌクレオチド２０１〜２８６と少なくとも少なくとも９５％同一である配列を含む、上記[１]に記載の核酸分子。
[３]  前記ＡｏＨＶ−１プロモーターは、前記ＡｏＨＶ−１プロモーターからの転写を調節する調節配列に作動可能に連結されている、上記[１]または[２]に記載の核酸分子。
[４]  前記ＡｏＨＶ−１プロモーターは、１つ以上のテトラサイクリンオペレーター配列（ｔｅｔＯ部位）を含む調節配列に作動可能に連結されている、上記[１]〜[３]のいずれかに記載の核酸分子。
[５]  上記[１]〜[４]のいずれかに記載の核酸分子を含むベクターまたはウイルス。
[６]  前記ベクターはプラスミドベクターである、上記[５]に記載のベクター。
[７]  前記ウイルスはアデノウイルスである、上記[５]に記載のウイルス。
[８]  前記アデノウイルスは、そのゲノムに、好ましくはそのゲノムの少なくともＥ１領域に、少なくとも１つの欠失を有する、上記[７]に記載のアデノウイルス。
[９]  上記[１]〜[４]のいずれかに記載の核酸分子、または上記[５]〜[８]のいずれかに記載のベクターもしくはウイルスを含む細胞。
[１０]  そのゲノム中にＡｏＨＶ−１プロモーターを含む核酸分子を含み、好ましくは、前記プロモーターは目的のタンパク質をコードする核酸に作動可能に連結されている細胞。
[１１]  前記ＡｏＨＶ−１プロモーターは、配列番号２５のｎｔ２３７〜２８６に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含み、好ましくは、前記ＡｏＨＶ−１プロモーターは、配列番号２５のヌクレオチド２０１〜２８６と少なくとも少なくとも９５％同一である配列を含む、上記[１０]に記載の細胞。
[１２]  前記ゲノム中の前記ＡｏＨＶ−１プロモーターは、テトラサイクリンリプレッサー（ＴｅｔＲ）タンパク質をコードする核酸に作動可能に連結されており、好ましくは前記細胞はＰＥＲ．Ｃ６細胞である、上記[１０]または[１１]に記載の細胞。
[１３]  （ｉ）第１の導入遺伝子に作動可能に連結されたＡｏＨＶ−１プロモーターを含む核酸分子、および（ｉｉ）第２の導入遺伝子に作動可能に連結されたｈＣＭＶプロモーターを含む核酸分子を含む細胞。
[１４]  前記ＡｏＨＶ−１プロモーターは、配列番号２５のｎｔ２３７〜２８６に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含み、好ましくは、前記ＡｏＨＶ−１プロモーターは、配列番号２５のヌクレオチド２０１〜２８６と少なくとも少なくとも９５％同一である配列を含み、かつ前記ｈＣＭＶプロモーターは、配列番号４のｎｔ５７８〜７３６に対して、好ましくはｎｔ５６４〜７３６に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列を含む、上記[１３]に記載の細胞。
[１５]  前記第１の導入遺伝子はＴｅｔＲをコードし、好ましくは、前記細胞はＰＥＲ．Ｃ６細胞である、上記[１３]または[１４]に記載の細胞。
[１６]  第２の導入遺伝子に作動可能に連結されたｈＣＭＶプロモーターを含む前記核酸分子は、アデノウイルスの一部である、上記[１５]に記載の細胞。
[１７]  （ｉ）第１の導入遺伝子に作動可能に連結されたＡｏＨＶ−１プロモーターを含む核酸分子、および（ｉｉ）第２の導入遺伝子に作動可能に連結されたｈＣＭＶプロモーターを含む核酸分子を含むベクター。
[１８]  前記ＡｏＨＶ−１プロモーターは、配列番号２５のｎｔ２３７〜２８６に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含み、好ましくは、前記ＡｏＨＶ−１プロモーターは、配列番号２５のヌクレオチド２０１〜２８６と少なくとも少なくとも９５％同一である配列を含む、上記[１７]に記載のベクター。
[１９]  目的の発現産物を生産する方法であって、上記[１]〜[８]のいずれかに記載の核酸分子からの導入遺伝子を宿主細胞で発現させる工程であって、前記導入遺伝子は前記目的の発現産物をコードする工程を含む方法。
[２０]  前記発現産物はタンパク質である、上記[１９]に記載の方法。
[２１]  前記宿主細胞から、または前記宿主細胞が培養されている培養培地から、または前記宿主細胞および前記培養培地の両方から、前記目的の発現産物を回収する工程をさらに含む、上記[１９]または[２０]に記載の方法。
[２２]  ウイルスを作製する方法であって、前記ウイルスを増殖させる機能を有する異種遺伝子を発現させる細胞中で前記ウイルスを増殖させる工程であって、前記異種遺伝子は、ＡｏＨＶ−１プロモーターの制御下にある工程、および前記細胞から、または前記細胞が培養されている培養培地から、または前記細胞および前記培養培地の両方から、前記ウイルスを回収する工程を含む方法。
[２３]  前記ＡｏＨＶ−１プロモーターは、配列番号２５のｎｔ２３７〜２８６に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含み、好ましくは、前記ＡｏＨＶ−１プロモーターは、配列番号２５のヌクレオチド２０１〜２８６と少なくとも少なくとも９５％同一である配列を含む、上記[２２]に記載の方法。
[２４]  上記[５]〜[８]のいずれかに記載のベクターまたはウイルス、および薬学的に許容される担体または賦形剤を含む医薬組成物。
[２５]  アデノウイルスを調製する方法であって、上記[１２]に記載の細胞中で、１つ以上のｔｅｔＯ部位に作動可能に連結されたｈＣＭＶプロモーターの制御下で、導入遺伝子をコードするアデノウイルスを増殖させる工程、および、好ましくは、前記アデノウイルスを単離する工程を含む方法。
【０２０１】
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ＷＯ２００７１１０４０９Ａ１（１０／４／２００７）．“ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＣＯＭＰＲＩＳＩＮＧ  Ａ  ＲＥＣＯＭＢＩＮＡＮＴ  ＡＤＥＮＯＶＩＲＵＳ  ＡＮＤ  ＡＮ  ＡＤＪＵＶＡＮＴ”．ＨＡＶＥＮＧＡ，Ｍｅｎｚｏ  Ｊａｎｓ  Ｅｍｋｏ；ＲＡＤＯＳＥＶＩＣ，Ｋａｔａｒｉｎａ
ＷＯ２００９０２６１８３Ａ１（２／２６／２００９）．“ＵＳＥ  ＯＦ  ＣＨＩＭＥＲＩＣ  ＨＩＶ／ＳＩＶ  ＧＡＧ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ  ＴＯ  ＯＰＴＩＭＩＺＥ  ＶＡＣＣＩＮＥ−ＩＮＤＵＣＥＤ  Ｔ  ＣＥＬＬ  ＲＥＳＰＯＮＳＥＳ  ＡＧＡＩＮＳＴ  ＨＩＶ  ＧＡＧ”．ＮＡＢＥＬ，Ｇａｒｙ，Ｊ．；ＹＡＮＧ，Ｚｈｉ−Ｙｏｎｇ；ＳＨＩ，Ｗｅｉ；ＢＡＲＯＵＣＨ，Ｄａｎ，Ｈ．
ＷＯ２００９１１７１３４Ａ２（９／２４／２００９）．“ＡＥＲＯＳＯＬＩＺＥＤ  ＧＥＮＥＴＩＣ  ＶＡＣＣＩＮＥＳ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＯＦ  ＵＳＥ”．ＲＯＥＤＥＲＥＲ，Ｍａｒｉｏ；ＲＡＯ，Ｓｒｉｎｉｖａｓ；ＮＡＢＥＬ，Ｇａｒｙ，Ｊ．；ＡＮＤＲＥＷＳ，Ｃｈａｒｌａ，Ａｎｎｅ
ＷＯ２０１００８５９８４Ａ１（８／５／２０１０）．“ＳＩＭＩＡＮ  ＡＤＥＮＯＶＩＲＵＳ  ＮＵＣＬＥＩＣ  ＡＣＩＤ−ＡＮＤ  ＡＭＩＮＯ  ＡＣＩＤ−ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ，ＶＥＣＴＯＲＳ  ＣＯＮＴＡＩＮＩＮＧ  ＳＡＭＥ，ＡＮＤ  ＵＳＥＳ  ＴＨＥＲＥＯＦ”．ＣＯＬＬＯＣＡ，Ｓｔｅｆａｎｏ；ＮＩＣＯＳＩＡ，Ａｌｆｒｅｄｏ；ＣＯＲＴＥＳＥ，Ｒｉｃｃａｒｄｏ；ＡＭＭＥＮＤＯＬＡ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ；ＡＭＢＲＯＳＩＯ，Ｍａｒｉａ
ＷＯ２０１００８６１８９Ａ２（８／５／２０１０）．“ＳＩＭＩＡＮ  ＡＤＥＮＯＶＩＲＵＳ  ＮＵＣＬＥＩＣ  ＡＣＩＤ−ＡＮＤ  ＡＭＩＮＯ  ＡＣＩＤ−ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ，ＶＥＣＴＯＲＳ  ＣＯＮＴＡＩＮＩＮＧ  ＳＡＭＥ，ＡＮＤ  ＵＳＥＳ  ＴＨＥＲＥＯＦ”．ＣＯＬＬＯＣＡ，Ｓｔｅｆａｎｏ；ＮＩＣＯＳＩＡ，Ａｌｆｒｅｄｏ；ＣＯＲＴＥＳＥ，Ｒｉｃｃａｒｄｏ；ＡＭＭＥＮＤＯＬＡ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ；ＡＭＢＲＯＳＩＯ，Ｍａｒｉａ
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ＷＯ２０１１０４５３８１Ａ１（４／２１／２０１１）．“ＰＲＯＣＥＳＳ  ＦＯＲ  ＡＤＥＮＯＶＩＲＵＳ  ＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮ  ＦＲＯＭ  ＨＩＧＨ  ＣＥＬＬ  ＤＥＮＳＩＴＹ  ＣＵＬＴＵＲＥＳ”．ＤＥ  ＶＯＣＨＴ，Ｍａｒｃｅｌ，Ｌｅｏ；ＶＥＥＮＳＴＲＡ，Ｍａｒｌｏｅｓ
ＷＯ２０１３１３９９１１Ａ１（９／２６／２０１３）．“ＶＡＣＣＩＮＥ  ＡＧＡＩＮＳＴ  ＲＳＶ”．ＲＡＤＯＳＥＶＩＣ，Ｋａｔａｒｉｎａ；ＣＵＳＴＥＲＳ，Ｊｅｒoｍｅ  Ｈ．Ｈ．Ｖ．；ＶＥＬＬＩＮＧＡ，Ｊｏｒｔ；ＷＩＤＪＯＪＯＡＴＭＯＤＪＯ，Ｍｙｒａ  Ｎ．
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パンフレット２０１６１６６０８８Ａ１（１０／２０／２０１６）．双方向性プロモーターを有する２つの導入遺伝子を発現する組換えアデノウイルスＫｅｒｓｔｉｎ  Ｗｕｎｄｅｒｌｉｃｈ，Ｊｅｒoｍｅ  Ｈ  Ｈ  Ｖ  ＣＵＳＴＥＲＳ，Ｊｏｒｔ  Ｖｅｌｌｉｎｇａ，Ｂａｒｂａｒａ  Ｐｅｔｒｏｎｅｌｌａ  ＳＡＮＤＥＲＳ．
他の参考文献：
書籍
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Ｈａｖｅｎｇａ，Ｍ．，Ｖｏｇｅｌｓ，Ｒ．，Ｚｕｉｊｄｇｅｅｓｔ，Ｄ．，Ｒａｄｏｓｅｖｉｃ，Ｋ．，Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ｓ．，Ｓｉｅｕｗｅｒｔｓ，Ｍ．，．．．Ｇｏｕｄｓｍｉｔ，Ｊ．（２００６）．Ｎｏｖｅｌ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｉｎｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  Ｂ−ｇｒｏｕｐ  ｖｅｃｔｏｒｓ：ｈｉｇｈ  ｖｅｃｔｏｒ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｙｉｅｌｄ  ｉｎ  ＰＥＲ．Ｃ６  ｃｅｌｌｓ．Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ，８７（Ｐｔ  ８），２１３５−２１４３．ｄｏｉ：１０．１０９９／ｖｉｒ．０．８１９５６−０
Ｈｅｉｌｂｒｏｎｎ，Ｒ．，＆  Ｗｅｇｅｒ，Ｓ．（２０１０）．Ｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ：ｃｕｒｒｅｎｔ  ｓｔａｔｕｓ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｈａｎｄｂ  Ｅｘｐ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ（１９７），１４３−１７０．ｄｏｉ：１０．１００７／９７８−３−６４２−００４７７−３＿５
Ｈｏｇａｎｓｏｎ，Ｄ．Ｋ．，Ｍａ，Ｊ．Ｃ．，Ａｓａｔｏ，Ｌ．，Ｏｎｇ，Ｍ．，Ｐｒｉｎｔｚ，Ｍ．Ａ．，Ｈｕｙｇｈｅ，Ｂ．Ｇ．，．．．Ｄ’Ａｎｄｒｅａ，Ｍ．Ｊ．（２００２）．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  Ｓｔａｂｌｅ  Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ．ＢｉｏＰｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｊ．，１（１），４３−４８．
Ｈｏｌｔｅｒｍａｎ，Ｌ．，Ｖｏｇｅｌｓ，Ｒ．，ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｖｌｕｇｔ，Ｒ．，Ｓｉｅｕｗｅｒｔｓ，Ｍ．，Ｇｒｉｍｂｅｒｇｅｎ，Ｊ．，Ｋａｓｐｅｒｓ，Ｊ．，．．．Ｈａｖｅｎｇａ，Ｍ．（２００４）．Ｎｏｖｅｌ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｉｎｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｖｅｃｔｏｒ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １１（Ａｄ１１）  ｆｏｒ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ：ｌｏｗ  ｓｅｒｏｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｎｏｎ−ｃｒｏｓｓ−ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ  ｗｉｔｈ  Ａｄ５．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，７８（２３），１３２０７−１３２１５．ｄｏｉ：１０．１１２８／ＪＶＩ．７８．２３．１３２０７−１３２１５．２００４
Ｌｅｍｃｋｅｒｔ，Ａ．Ａ．，Ｇｒｉｍｂｅｒｇｅｎ，Ｊ．，Ｓｍｉｔｓ，Ｓ．，Ｈａｒｔｋｏｏｒｎ，Ｅ．，Ｈｏｌｔｅｒｍａｎ，Ｌ．，Ｂｅｒｋｈｏｕｔ，Ｂ．，．．．Ｈａｖｅｎｇａ，Ｍ．Ｊ．（２００６）．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｉｎｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  ４９：ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅ  ｏｎ  ＰＥＲ．Ｃ６  ｃｅｌｌｓ，ｔｒｏｐｉｓｍ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ．Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ，８７（Ｐｔ  １０），２８９１−２８９９．ｄｏｉ：１０．１０９９／ｖｉｒ．０．８２０７９−０
Ｍａｉｚｅｌ，Ｊ．Ｖ．，Ｊｒ．，Ｗｈｉｔｅ，Ｄ．Ｏ．，＆  Ｓｃｈａｒｆｆ，Ｍ．Ｄ．（１９６８）．Ｔｈｅ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｏｆ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ．Ｉ．Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｖｉｒｉｏｎ  ａｎｄ  ａ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｔｙｐｅｓ  ２，７Ａ，ａｎｄ  １２．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３６（１），１１５−１２５．
Ｍｕｌｌｉｃｋ，Ａ．，Ｘｕ，Ｙ．，Ｗａｒｒｅｎ，Ｒ．，Ｋｏｕｔｒｏｕｍａｎｉｓ，Ｍ．，Ｇｕｉｌｂａｕｌｔ，Ｃ．，Ｂｒｏｕｓｓａｕ，Ｓ．，．．．Ｍａｓｓｉｅ，Ｂ．（２００６）．Ｔｈｅ  ｃｕｍａｔｅ  ｇｅｎｅ−ｓｗｉｔｃｈ：ａ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ．ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，６，４３．ｄｏｉ：１０．１１８６／１４７２−６７５０−６−４３
Ｏｇｕｎ，Ｓ．Ａ．，Ｄｕｍｏｎ−Ｓｅｉｇｎｏｖｅｒｔ，Ｌ．，Ｍａｒｃｈａｎｄ，Ｊ．Ｂ．，Ｈｏｌｄｅｒ，Ａ．Ａ．，＆  Ｈｉｌｌ，Ｆ．（２００８）．Ｔｈｅ  ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  Ｃ４−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｃ４ｂｐ）  ａｃｔｓ  ａｓ  ａｎ  ａｄｊｕｖａｎｔ，ａｎｄ  ｔｈｅ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ  ｏｆ  ｔｈｅ  １９−ｋｉｌｏｄａｌｔｏｎ  ｍｅｒｏｚｏｉｔｅ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １  ｆｕｓｅｄ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｍｕｒｉｎｅ  Ｃ４ｂｐ  ｄｏｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ｍｉｃｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ｍａｌａｒｉａ．Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ，７６（８），３８１７−３８２３．ｄｏｉ：１０．１１２８／ＩＡＩ．０１３６９−０７
Ｐｏｗｅｌｌ，Ｓ．Ｋ．，Ｒｉｖｅｒａ−Ｓｏｔｏ，Ｒ．，＆  Ｇｒａｙ，Ｓ．Ｊ．（２０１５）．Ｖｉｒａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｃａｓｓｅｔｔｅ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ｔｏ  ｅｎｈａｎｃｅ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅ  ｔａｒｇｅｔ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｄｉｓｃｏｖ  Ｍｅｄ，１９（１０２），４９−５７．
Ｒｏｂｂｉｎｓ，Ｐ．Ｄ．，＆  Ｇｈｉｖｉｚｚａｎｉ，Ｓ．Ｃ．（１９９８）．Ｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｈｅｒ，８０（１），３５−４７．
Ｒｕｂｎｉｔｚ，Ｊ．，＆  Ｓｕｂｒａｍａｎｉ，Ｓ．（１９８４）．Ｔｈｅ  ｍｉｎｉｍｕｍ  ａｍｏｕｎｔ  ｏｆ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，４（１１），２２５３−２２５８．
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Ｖｏｇｅｌｓ，Ｒ．，Ｚｕｉｊｄｇｅｅｓｔ，Ｄ．，ｖａｎ  Ｒｉｊｎｓｏｅｖｅｒ，Ｒ．，Ｈａｒｔｋｏｏｒｎ，Ｅ．，Ｄａｍｅｎ，Ｉ．，ｄｅ  Ｂｅｔｈｕｎｅ，Ｍ．Ｐ．，．．．Ｈａｖｅｎｇａ，Ｍ．（２００３）．Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｈｕｍａｎ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  ３５  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ：ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｂｙｐａｓｓ  ｏｆ  ｐｒｅｅｘｉｓｔｉｎｇ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，７７（１５），８２６３−８２７１．
Ｗａｌｔｈｅｒ，Ｗ．，＆  Ｓｔｅｉｎ，Ｕ．（２０００）．Ｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ：ａ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｔｈｅｉｒ  ｕｓｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｄｒｕｇｓ，６０（２），２４９−２７１．
Ｚａｈｎ，Ｒ．，Ｇｉｌｌｉｓｅｎ，Ｇ．，Ｒｏｏｓ，Ａ．，Ｋｏｎｉｎｇ，Ｍ．，ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｈｅｌｍ，Ｅ．，Ｓｐｅｋ，Ｄ．，．．．Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ，Ａ．（２０１２）．Ａｄ３５  ａｎｄ  ａｄ２６  ｖａｃｃｉｎｅ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｉｎｄｕｃｅ  ｐｏｔｅｎｔ  ａｎｄ  ｃｒｏｓｓ−ｒｅａｃｔｉｖｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ａｎｄ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｆｉｌｏｖｉｒｕｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，７（１２），ｅ４４１１５．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００４４１１５
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【配列表】
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