(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液中の白血球の活性化度を測定する方法であって、
複数の血液について、第１の圧力を印加しつつ測定した、第１の抗凝固剤を添加した血液が毛細血管を模擬した構造がベース基板上に形成されたマイクロチャネルアレイ構造を通過する時間と、前記第１の抗凝固剤と異なる第２の抗凝固剤を添加した血液が前記マイクロチャネルアレイ構造を通過する時間との通過時間差と、血液中の白血球の活性化度との相関を示す算出関数（ｆｉ）を求めるステップと、
前記第１の抗凝固剤を添加した測定対象の血液を、前記第１の圧力を印加しつつ、前記マイクロチャネルアレイ構造に通過させるステップと、
前記第２の抗凝固剤を添加した測定対象の血液を、前記第１の圧力を印加しつつ、前記マイクロチャネルアレイ構造に通過させるステップと、
前記第１の抗凝固剤を添加した前記測定対象の血液が前記マイクロチャネルアレイ構造を通過した時間と、前記第２の抗凝固剤を添加した前記測定対象の血液が前記マイクロチャネルアレイ構造を通過した時間との通過時間差を、前記算出関数（ｆｉ）に代入して、前記測定対象の血液中の白血球の活性化度を算出するステップと
を含む前記方法。
【請求項２】
前記第１及び第２の抗凝固剤が、ヘパリン溶液及びヘパリンとＥＤＴＡとの混合溶液から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
血液中の白血球の活性化度を測定する方法であって、
複数の血液について、第１の圧力を印加しつつ測定した、抗凝固剤が添加された血液が毛細血管を模擬した構造がベース基板上に形成されたマイクロチャネルアレイ構造を通過する前に生理食塩水が前記マイクロチャネルアレイ構造を通過する時間と、該血液が前記マイクロチャネルアレイ構造を通過した後に生理食塩水が前記マイクロチャネルアレイ構造を通過する時間との通過時間差と、血液中の白血球の活性化度との相関を示す算出関数（ｇｉ）を求めるステップと、
生理食塩水を、前記第１の圧力を印加しつつ、前記マイクロチャネルアレイ構造に通過させる第１ステップと、
前記抗凝固剤を添加した測定対象の血液を、前記第１の圧力を印加しつつ、前記マイクロチャネルアレイ構造に通過させる第２ステップと、
生理食塩水を、前記第１の圧力を印加しつつ、前記マイクロチャネルアレイ構造に通過させる第３ステップと、
前記第１ステップにおいて生理食塩水が前記マイクロチャネルアレイ構造を通過した時間と、前記第３ステップにおいて生理食塩水が前記マイクロチャネルアレイ構造を通過した時間との通過時間差を、前記算出関数（ｇｉ）に代入して、前記測定対象の血液中の白血球の活性化度を算出するステップと
を含む前記方法。
【請求項４】
前記ベース基板はシリコン製であり、シリコン酸化膜が前記マイクロチャネルアレイ構造上に形成され、前記シリコン酸化膜の厚さが、０．４〜１．０μｍである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、白血球の活性化度の測定装置及び測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
人間の冠動脈は、複数回分岐して毛細血管にたどり着き、毛細血管の密度は人の臓器の中で最も高く、心筋微小血管を流れる血液のミクロな流動性は、動脈硬化性疾患をはじめ様々な疾患の病態生理に影響を及ぼしていることが知られている。人の血液は非ニュートン流体であり、血液のマクロな流動性は、コーンプレート型レオメーター等の工業用粘度計やＣＯＮＴＲＡＶＡＳ社製の血液専用二重円筒型粘度計Ｌｏｗ  Ｓｈｅａｒ  ３０等で測定されてきた。
【０００３】
特許文献１には、表面に微小な溝のアレイを備えたベース基板に対して透明基板を密着させて形成したマイクロチャネルアレイに、有形成分を含む流体試料の流動性を測定する際に予め該流体試料に所期のずり応力を印加した後に、その流体試料を該マイクロチャネルアレイに通過させることにより、有形成分の流動性とずり応力印加による有形成分の流動性の変化を測定する技術が開示されている。
【０００４】
特許文献２には、流路を有するフィルタを有形成分含有液体が通過する際に、該有形成分含有液体中の白血球が引き起こす流動性を阻害する度合いを表す指数を算出し、該指数を流動性を定量評価する指数とする技術が開示されている。特許文献２の技術では、白血球を含む血液と白血球を含まない血液について時間と流量の関係を測定し、その差を基に流動性を阻害する度合いが定量的に測定される。
【０００５】
また、血液流動性測定装置に関して、ＭＣヘルスケア株式会社の製品名ＭＣＦＡＮ ＨＲ３００としてすでに市販された装置が存在するが、該装置が使用する特許文献３に開示されている細胞マイクロレオロジー観察・測定用ディスポーザブルチップによる測定値の再現性に課題がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００６−１４５３４５号公報
【特許文献２】特開２００９−２７６０７５号公報
【特許文献３】特開２００７−１２４９０４号広報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
近年、高齢化社会、食生活の欧米化と運動不足等により生活習慣病が増加し、全身の動脈硬化性疾患の患者数が増加している。循環器疾患の研究及び臨床において、血液の流動性、とくにその重要な因子である白血球の活性化の度合いを信頼性・再現性高く評価できる評価方法が望まれている。この点、従来では、微細な流路を流れる血液を撮影し、その画像上で目視により白血球の活性化の度合いを評価しているが、この方法では人の目で活性化した白血球を探しカウントするものであるため、時間や手間のかかる作業である。
【０００８】
そこで、本発明は、心筋微小血管を模したマイクロチャネルアレイ回路による微小血管の生体外モデル（ex vivo）を開発し、血液の流動性、とくに白血球の活性化度の臨床検査に標準化できる装置及び方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明には、以下の態様が含まれる。
［１］
血液中の白血球の活性化度を測定する装置であって、
毛細血管を模擬した構造がベース基板上に形成されたマイクロチャネルアレイ構造を有するマイクロチャネルチップと、  
第１の抗凝固剤を添加した血液が前記マイクロチャネルアレイ構造を通過する時間と、前記第１の抗凝固剤と異なる第２の抗凝固剤を添加した血液が前記マイクロチャネルアレイ構造を通過する時間との通過時間差を基に、前記血液中の白血球の活性化度を算出する端末とを備えた、前記装置。
［２］
前記第１の抗凝固剤がヘパリン溶液であり、前記第２の抗凝固剤がヘパリンとＥＤＴＡとの混合溶液である、［１］に記載の装置。
［３］
前記端末は、前記通過時間差と前記血液に印加される圧力とを基に、前記血液中の白血球の活性化度を算出する、［１］又は［２］に記載の装置。
［４］
血液中の白血球の活性化度を測定する装置であって、
毛細血管を模擬した構造がベース基板上に形成されたマイクロチャネルアレイ構造を有するマイクロチャネルチップと、
抗凝固剤が添加された血液が前記マイクロチャネルアレイ構造を通過する前に生理食塩水が前記マイクロチャネルアレイ構造を通過した時間と、前記血液が前記マイクロチャネルアレイ構造を通過した後に生理食塩水が前記マイクロチャネルアレイ構造を通過する時間との通過時間差を基に、前記血液中の白血球の活性化度を算出する端末とを備えた、前記装置。
［５］
前記端末は、前記通過時間差と前記血液に印加される圧力とを基に、前記血液中の白血球の活性化度を算出する、［４］に記載の装置。
［６］
前記ベース基板はシリコン製であり、シリコン酸化膜が前記マイクロチャネルアレイ構造上に形成され、前記シリコン酸化膜の厚さが、０．４〜１．０μｍである、［１］〜［５］のいずれかに記載の装置。
［７］
血液中の白血球の活性化度を測定する方法であって、
第１の抗凝固剤を添加した血液を、毛細血管を模擬した構造がベース基板上に形成されたマイクロチャネルアレイ構造に通過させるステップと、
前記第１の抗凝固剤と異なる第２の抗凝固剤を添加した血液を、前記マイクロチャネルアレイ構造に通過させるステップと、
前記第１の抗凝固剤を添加した血液が前記マイクロチャネルアレイ構造を通過した時間と、前記第２の抗凝固剤を添加した血液が前記マイクロチャネルアレイ構造を通過した時間との差を基に、前記血液中の白血球の活性化度を算出するステップとを含む、前記方法。
［８］
前記第１及び第２の抗凝固剤が、ヘパリン溶液及びヘパリンとＥＤＴＡとの混合溶液から選択される、［７］に記載の方法。
［９］
血液中の白血球の活性化度を測定する方法であって、
生理食塩水を、毛細血管を模擬した構造がベース基板上に形成されたマイクロチャネルアレイ構造に通過させる第１ステップと、
抗凝固剤を添加した血液を、前記マイクロチャネルアレイ構造に通過させる第２ステップと、
生理食塩水を、前記マイクロチャネルアレイ構造に通過させる第３ステップと、
前記第１ステップにおいて生理食塩水が前記マイクロチャネルアレイ構造を通過した時間と、前記第３ステップにおいて生理食塩水が前記マイクロチャネルアレイ構造を通過した時間との差を基に、前記血液中の白血球の活性化度を算出するステップとを含む、前記方法。
［１０］
前記ベース基板はシリコン製であり、シリコン酸化膜が前記マイクロチャネルアレイ構造上に形成され、前記シリコン酸化膜の厚さが、０．４〜１．０μｍである、［７］〜［９］のいずれかに記載の方法。
［１１］
血液が入った第１の容器と生理食塩水が入った第２の容器を設定温度に保温又は保冷する恒温水槽をさらに備え、
前記第１及び第２の容器と前記マイクロチャネルアレイ構造とをつなぐ輸入管、前記マイクロチャネルアレイ構造、並びに前記マイクロチャネルアレイ構造と血液及び生理食塩水の回収容器とをつなぐ輸出管を通過する血液及び生理食塩水の温度は、±１℃以内の精度で前記設定温度に一致する、［１］〜［６］のいずれか１項に記載の装置。
［１２］
前記第１の抗凝固剤を添加した血液が前記マイクロチャネルアレイ構造を通過する時間を測定する直前と、前記第２の抗凝固剤を添加した血液が前記マイクロチャネルアレイ構造を通過する時間を測定する直前とに、前記マイクロチャネルアレイ構造、前記輸入管及び前記輸出管のそれぞれに、前記生理食塩水を還流させることによって、前記輸入路、前記マイクロチャネルアレイ構造、及び前記輸出管を、±１℃以内の精度で前記設定温度に保温又は保冷する［１１］に記載の装置。
［１３］
前記マイクロチャネルチップの背面に直接する形で前記マイクロチャネルチップに対するチップホルダー内に付加的に設けられた流路に前記生理食塩水を還流させることによって、前記マイクロチャネルチップを、±１℃以内の精度で前記設定温度に保温又は保冷する［１１］又は［１２］に記載の装置。
［１４］
前記マイクロチャネルチップは、前記マイクロチャネルアレイ構造上に水蒸気を流しながら行う熱酸化法（ウェット法）により酸化膜を形成し、前記酸化膜の表面から該酸化膜の厚さの１０分の１の深さまで酸素ガスを流しながら行う熱酸化法（ドライ法）で前記酸化膜を再酸化することにより形成された前記酸化膜をさらに備えている、［１１］〜［１３］のいずれかに記載の装置。
［１５］
前記マイクロチャネルアレイ構造上に水蒸気を流しながら行う熱酸化法（ウェット法）により酸化膜を形成し、
前記酸化膜の表面から該酸化膜の厚さの１０分の１の深さまでが酸素ガスを流しながら行う熱酸化法（ドライ法）で前記酸化膜を再酸化することをさらに含む［７］〜［１０］のいずれかに記載の方法。
［１６］
前記マイクロチャネルアレイ構造がドライエッチング技術を用いて形成され、前記シリコン酸化膜がプラズマ化学気相成長法を用いて形成される、［６］に記載の装置。
［１７］
前記マイクロチャネルアレイ構造がドライエッチング技術を用いて形成され、前記シリコン酸化膜がプラズマ化学気相成長法を用いて形成される、［１０］に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】測定装置の概略構成図である。
【図２Ａ】マイクロチャネルチップの概略構成図である。
【図２Ｂ】マイクロチャネルチップの概略構成図である。
【図３Ａ】マイクロチャネルチップの製造における断面図である。
【図３Ｂ】マイクロチャネルチップの概略断面図である。
【図４Ａ】マイクロチャネルチップの概略構成図である。
【図４Ｂ】マイクロチャネルチップの概略構成図である。
【図４Ｃ】マイクロチャネルチップの概略構成図である。
【図４Ｄ】マイクロチャネルチップの概略構成図である。
【図５Ａ】マイクロチャネルチップの概略模式図である。
【図５Ｂ】マイクロチャネルアレイ構造の概略模式図である。
【図６Ａ】マイクロチャネルチップのホルダーの概略構成図である。
【図６Ｂ】マイクロチャネルチップのホルダーの概略構成図である。
【図６Ｃ】マイクロチャネルチップのホルダーの概略構成図である。
【図７Ａ】一実施例に係るマイクロチャネルチップの写真である。
【図７Ｂ】一実施例に係るマイクロチャネルチップの写真である。
【図８】一実施例に係るマイクロチャネルチップの写真である。
【図９】一実施例に係るマイクロチャネルチップの写真である。
【図１０】一実施例に係る２種類の抗凝固剤の効果の違いを示すグラフである。
【図１１】一実施例に係る２種類の抗凝固剤の効果の違いを示すグラフである。
【図１２】一実施例に係る２種類の抗凝固剤の効果の違いを示すグラフである。
【図１３】別の実施形態に係る測定装置の概略構成図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明にかかる白血球の活性化度の測定装置及び測定方法では、微小な溝及び構造体のアレイ構造（マイクロチャネルアレイ構造）を有するベース基板に透明基板を密着（圧着ないし接合）させることにより形成したマイクロチャネルチップを使用する。そして、該マイクロチャネルアレイチップに生理食塩水又は血液を通過させて測定された生理食塩水又は血液の流動性を基に、血液中の白血球の活性化度が測定（導出）される。ここで、白血球が活性化すると流路等に接着したり詰まったりすることから、「白血球の活性化度」は、マイクロチャネルアレイ構造（流路や微小構造体等）に接着又は詰まった白血球の数に相当する。
以下、本発明の様々な実施形態について、図面を参照しながら詳細に説明する。
【００１２】
＜白血球の活性化度の測定装置＞
図１は、本発明の一実施形態に係る白血球の活性化度の測定装置１００の概略構成図である。測定装置１００は、マイクロチャネルチップ１０、チップホルダー１０１、試料容器１０２、採取注入管１０３、駆動部１０４、回収ライン１０５、バルブ１０６、液面計１０７、回収容器１０８、顕微鏡１１０、及び端末１２０を含む。
【００１３】
マイクロチャネルチップ１０は、詳細には後述するが、ベース基板上に形成された複数のマイクロチャネルアレイ構造を有し、該マイクロチャネルアレイ構造を挟むようにベース基板と可視光を透過する透明基板とが密着（圧着ないし接合）した構成を有する。本発明に係る血液の流動性、とくに白血球の活性化度の測定は、該マイクロチャネルアレイ構造に血液を流して行われる。
【００１４】
チップホルダー１０１は、内部にマイクロチャネルチップ１０を保持する容器である。チップホルダー１０１の少なくとも一部（主にマイクロチャネルチップ１０を載置する部分）は、顕微鏡１１０を通じてマイクロチャネルチップ１０内のマイクロチャネルアレイ構造が見えるように、可視光を透過する透明部材又は中空状に形成されている。
【００１５】
試料容器１０２は、測定する試料（血液や生理食塩水など）を入れておく試験管又はビーカー状の容器である。採取注入管１０３は、試料容器１０２から試料を採取し、マイクロチャネルチップ１０に試料を注入する管状の器具であり、例えば、ガラス細管、金属細管、プラスチックチューブ等である。これらの管には、シリンジやシリンジポンプ等を接続してもよい。なお、採取注入管１０３は、特許文献１に記載の技術のように、マイクロチャネルチップ１０に注入する前の試料に制御されたずり応力を予め印加する構成を有していてもよい。
【００１６】
駆動部１０４は、採取注入管１０３に接続されたシリンジ又はポンプを含み、採取注入管１０３を吸引することにより、試料容器１０２から測定に必要な量の試料を採取注入管１０３中に吸引する。また、駆動部１０４は、測定時に、採取注入管１０３中の圧力を調節し、試料をマイクロチャネルチップ１０の流入口へ注入する。
【００１７】
回収ライン１０５は、測定時にマイクロチャネルチップ１０の流出口に接続され、マイクロチャネルチップ１０からの排液を回収容器１０８へ流す管である。バルブ１０６は、回収ライン１０５を流れる排液の遮断や流出を調整するよう構成されている。バルブ１０６に電磁弁を用い、電磁弁の開閉が端末１２０からの制御信号に応じて自動的に行われるようにしてもよい。バルブ１０６が開くと、落差圧でマイクロチャネルチップ１０からの排液は、回収容器１０８へ流れる。落差圧は、マイクロチャネルチップ１０の流出口と回収ライン１０５の回収容器１０８側の出口との高低差を調節することで、任意に調節できる。減圧ポンプを用い、回収容器１０８内を減圧して、マイクロチャネルチップ１０からの流出（排出）の流れを調節できるようにしてもよいし、駆動部１０４に加圧ポンプを用い、流入側を加圧して流入（注入）の流れを調節できるようにしてもよい。駆動部１０４及びバルブ１０６の一方又は両方を調節することにより、マイクロチャネルチップ１０中を流れる流量（流速）を調節することができる。
【００１８】
液面計１０７は、マイクロチャネルチップ１０を流体の試料が通過する通過時間を測定し、端末１２０へそのデータを出力する。実際の試料の測定時には、液面計１０７に接続するチューブの開放端１０７ａがマイクロチャネルチップ１０の注入口（流入口１２）に接続され、マイクロチャネルチップ１０を流体の試料が通過する通過時間を測定し、端末１２０へそのデータを出力する。また、液面計１０７を設けずに、端末１２０が公知の画像処理技術（例えば特開2012-176095号公報）を用いて顕微鏡１１０からの画像データを処理して流量を計測するようにしてもよい。また、液面計１０７の代わりに、回収ライン１０５に流量計を設けて流量を測定する方法；マイクロチャネルチップ１０を流体試料が通過する速度及び通過時間等を測定する方法；通過中の流体試料の特定光吸収量や特定波長光の発光量を測定する光学的方法；酵素、ＦＥＴセンサ等を使用した電気化学的な検出方法；超音波を利用した測定方法；及び表面プラズモン共鳴を利用した測定方法等いずれを用いてもよい。
【００１９】
回収容器１０８は、測定後の血液等の試料を回収する容器である。回収容器１０８は、血液の廃棄処理を容易にするためにパック状のものであってもよいし、ビーカー状のものであってもよい。その中に吸水性ポリーマー粒子を入れておくと、血液の廃棄処理が容易になる。
【００２０】
顕微鏡１１０は、光学顕微鏡であり、レンズ１１１、ハーフミラー１１２、光源１１３、及び撮像素子１１４を備える。光源１１３で発生した可視光は、ハーフミラー１１２で一部反射され、レンズ１１１を通じてマイクロチャネルチップ１０に照射される。他方、レンズ１１１を通じて入射したマイクロチャネル１０からの反射光は、一部がハーフミラー１１２を透過し、撮像素子１１４に入射する。撮像素子１１４は、ＣＭＯＳ又はＣＣＤイメージセンサであり、検出した光の量や色に応じた画像データを端末１２０に出力する。顕微鏡１１０の倍率は、何ら限定されないが５０倍、１００倍、２００倍、又は３００倍と変更できる。
【００２１】
端末１２０は、ＣＰＵやＲＡＭ、ＲＯＭ等を備えたコンピュータであり、主な機能ブロックとして記憶部１２１、処理部１２２、及び入出力部１２３を有する。端末１２０として、ラップトップコンピュータやタブレット端末を用いてもよい。記憶部１２１は、各種プログラム、詳細には後述する白血球の活性化度の算出関数、及び測定データ等を記憶する。
【００２２】
処理部１２２は、記憶部１２１から読みだしたプログラムにのっとり、液面計１０７（及び／又は液面計１１５）からのデータを基に、マイクロチャネルチップ１０を流れる試料（血液や生理食塩水等）の流量、流速、及び全ての試料がマイクロチャネルチップ１０を通過するのにかかる時間を算出することができる。ここで、全ての試料がマイクロチャネルチップ１０を通過するのにかかる時間を、「全血通過時間」（血液）又は「全生食通過時間」（生理食塩水）といい、両者を合わせて「全試料通過時間」ともいう。また、処理部１２２は、算出した試料の流量、流速、及び試料の通過時間を、上記算出関数に代入して、測定した試料の白血球の活性化度を算出し、算出結果を入出力部１２３を介して外部（モニターやプリンター）に出力する。
【００２３】
入出力部１２３は、入出力インターフェース（Ｉ／Ｏ）であり、キーボードやマウス、タッチ操作等による入力を受け付け、処理部１２２による算出結果や、顕微鏡１１０の撮像素子１１４から出力される顕微鏡画像等を外部のモニターやプリンタ（不図示）に出力し表示させる。顕微鏡画像がモニターに映し出されることで、ユーザは、マイクロチャネルアレイ構造を流れる試料をリアルタイムに観察することができる。
【００２４】
なお、測定装置１００は、ユーザがマイクロチャネルチップ１０及び試料容器１０２を所定の位置に設置した後の一連の測定処理を自動で行うように構成されたアクチュエータ及び可動部材（不図示）を備えていてもよい。例えば、ユーザがマイクロチャネルチップ１０及び試料容器１０２を設置した後に測定装置１００の所定のボタンを押すと、採取注入管１０３が試料容器１０２に挿入され、駆動部１０４が作動して採取注入管１０３が試料容器１０２から試料を吸い上げ、マイクロチャネルチップ１０の流入口へ移動し、試料がマイクロチャネルチップ１０に注入され、液面計１０７に接続するチューブの開放端１０７ａがマイクロチャネルチップ１０の注入口（流入口１２）に接続され、バルブ１０６が開かれ、マイクロチャネルチップ１０に注入された試料が回収ライン１０５で吸い上げられ、最終的に回収容器１０８に排出される一連の流れが自動的に行われるようにしてもよい。
【００２５】
次に、図２Ａ及び３を参照し、マイクロチャネルチップ１０について説明する。
【００２６】
マイクロチャネルチップ１０のマイクロチャネルアレイ構造は、人の血管構造、つまり血液が細動脈から比較的小さい径の毛細血管に流れ、毛細血管から細静脈へ流れていく構造を模擬している。マイクロチャネルチップ１０のマイクロチャネルアレイ構造は、流路の大きさ（幅Ｗ及び深さＤ）を複数段階（例えば３〜５段階）変えた流路から構成され、人の血管構造を模擬している。流路の大きさ（幅Ｗ及び深さＤ）を複数段階変更した構成とすることで、血液を流したときに、血液に対して徐々にずり応力が加えられ、これにより血小板の活性化を防止又は低減する。
【００２７】
ここで、流路の「幅」（Ｗ）とはマイクロチャネルチップ１０の平面方向であって、血液等の流れに垂直（略垂直も含む。）な方向の流路の大きさであり、流路の「深さ」（Ｄ）とはマイクロチャネルチップ１０の平面に垂直な断面方向の流路の大きさである。また、流路の「長さ」（Ｌ）とは血液等の流れる方向に沿った流路の長さである。
【００２８】
図２Ａは、（ａ）流路の大きさを複数段階変えたマイクロチャネルチップ１０のシンプルなモデル構成を示す平面図と、（ｂ）そのＡＡ線断面図である。図２Ａでは、流路の幅Ｗを４段階に変え、流路の深さＤを３段階に変えた構成を示す。
【００２９】
マイクロチャネルチップ１０は、シリコン又は樹脂製のベース基板１１上に形成され、ミクロンサイズの溝及び構造体が多数並べられたマイクロチャネルアレイ構造を有する。マイクロチャネルチップ１０は、石英、ガラス、又は樹脂製の透明基板１９で密閉され、血液や生理食塩水等が流入口や流出口以外の部分から漏れないようになっている。透明基板１９は、その全体が透明である必要はなく、少なくとも顕微鏡１１０で観察する部分（特に毛細血管を模擬する流路１５近傍）だけが可視光に対して透明であればよい。
【００３０】
マイクロチャネルチップ１０は、血液や生理食塩水等を注入する流入口１２（径Ｗin、長さＬin）を有する流入領域（幅Ｗ０、深さＤ０）と、該流入領域に接続され形成された第１流路１３（幅Ｗ１、深さＤ１）と、第１流路１３から二手に分かれ形成された第２流路１４（幅Ｗ２、深さＤ２）と、第２流路１４それぞれから二手に分かれ形成された第３流路１５（幅Ｗ３、深さＤ３）とを有する。また、マイクロチャネルチップ１０は、第３流路１５の隣接する２つが合流して形成された第４流路１６（幅Ｗ２、深さＤ２）と、第４流路１６の２つが合流して形成された第５流路１７（幅Ｗ１、深さＤ１）と、第５流路１７に接続され、血液や生理食塩水等を流出（排出）する流出口１８（径Ｗout、長さＬout）を有する流出領域（幅Ｗ０、深さＤ０）とを有する。ここで、幅Ｗと深さＤの大きさは、Ｗ０＞Ｗ１＞Ｗ２＞Ｗ３であり、Ｄ０＝Ｄ１＝Ｄ２＞Ｄ３である。図２Ａでは、マイクロチャネルアレイ構造の加工ステップを低減する構成（Ｄ０＝Ｄ１＝Ｄ２）としているが、Ｄ０＞Ｄ１＞Ｄ２＞Ｄ３とする構成であってもよいし、Ｄ０＞Ｄ１＝Ｄ２＞Ｄ３とする構成であってもよい。また、第１流路１３の幅Ｗ及び深さＤの大きさは、第４流路１７の幅Ｗ及び深さＤの大きさと同じである必要はなく、異なるようにしてもよい。これは、流入領域及び流出領域の幅及び深さの関係、並びに第２流路１４及び第４流路１６の幅及び深さの関係についても同様である。また、図２Ａに示す構成では、流入口１２の長さＬin及び流出口１８の長さＬoutはベース基板１１の厚さにあたり、流入口１２の径Ｗin及び流出口１８の径Ｗoutはそれぞれ流入領域の幅Ｗ０及び流出領域の幅Ｗ０と同じである。なお、流入口１２の経Ｗin及び流出口１８の経Ｗoutと、流入領域及び流出領域の幅Ｗ０は、試料の注入のしやすさ等に応じて調整される。
【００３１】
第１流路１３は動脈〜細動脈、第２流路１４は細動脈、第３流路１５は毛細血管、第４流路１６は細静脈、そして第５流路１７は細静脈〜静脈を模擬している。限定されないが、幅Ｗ０は１ｍｍ〜数ｍｍ、幅Ｗ１は２０〜１５０μｍ、幅Ｗ２は１０〜５０μｍ、幅Ｗ３は３〜２５μｍ程度である。同様に、深さＤ０は１０〜３００μｍ、深さＤ１は１０〜１００μｍ、深さＤ２は１０〜６０μｍ、深さＤ３は３〜２５μｍ程度である。各流路１３〜１７の長さＬは適宜調整してもよい。一例では、マイクロチャネルチップ１０の流入領域及び流出領域並びに第１〜第５流路の幅Ｗ０〜Ｗ３が、Ｗ０＝３００μｍ、Ｗ１＝１００μｍ、Ｗ２＝３０μｍ、Ｗ３＝７μｍであり、深さＤ０〜Ｄ３が、Ｄ０＝Ｄ１＝Ｄ２＝５０μｍ、Ｄ３＝４．５μｍである。
【００３２】
血液中の赤血球の大きさは７〜８μｍ程度、白血球の大きさは７〜２０μｍ、血小板の大きさは１〜４μｍ程度である。そのため、白血球の活性化の影響が生じやすい毛細血管を模擬した第３流路１５の幅Ｗ３は好ましくは５〜１０μｍであり、深さＤ３は好ましくは４〜８μｍである。また、第３流路１５の長さＬは、３０μｍ〜１２０μｍ程度、好ましくは５０〜７０μｍである。
【００３３】
ここで、図３を用いて、マイクロチャネルチップ１０の製造方法の一例について説明する。マイクロチャネルチップ１０は、一般的なフォトリソグラフィー技術を用いて作製することができ、この例に限定されるものではない。深さＤ１＝Ｄ２とすることで加工ステップの数を少なくすることができる。
【００３４】
まず、シリコン製又は樹脂製のベース基板１１を準備する。ベース基板１１として用いる樹脂としては、アクリル系樹脂、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、スチレン系樹脂、アクリル・スチレン系共重合樹脂（ＭＳ樹脂）、ポリカーボネート系樹脂、ポリエチレンテレフタレートなどのポリエステル系樹脂、ポリビニルアルコール系樹脂、エチレン・ビニルアルコール系共重合樹脂、スチレン系エラストマーなどの熱可塑性エラストマー、塩化ビニル系樹脂、ポリジメチルシロキサンなどのシリコン樹脂、酢酸ビニル系樹脂、ポリビニルブチラール系樹脂等を使用することができる。また、これらの中で可視光に対して透明なものを、透明基板１９の材料として使用してもよい。ベース基板１１は、前もって表面を洗浄処理し、不純物等を取り除いておく。
【００３５】
図３Ａ（ａ）に示すように、ベース基板１１上にレジスト膜Ｒを塗布する。図３Ａの例では、レジスト膜Ｒにポジ型のフォトレジストを用いている。図３Ａ（ｂ）に示すように、流路等に対応する部分が紫外線（波長３６５ｎｍ）（又は可視光線、波長４３６ｎｍ）を透過するように形成されているマスクＭでレジスト膜Ｒを覆い、上から紫外線（又は可視光線）を照射する。その後現像して第３流路１５にあたる部分のレジスト膜Ｒを除去し、反応性イオンエッチングや反応性ガスエッチング等のドライエッチング技術を用いて、図３Ａ（ｃ）に示すように、ベース基板１１の一部をエッチング除去し、第３流路１５（深さＤ３）を形成する。
【００３６】
図３Ａ（ｄ）に示すようにベース基板１１上に再度レジスト膜Ｒを塗布する。図３Ａ（ｅ）に示すように、第１流路１３〜第２流路１４及び第４流路１６〜第５流路１７に対応する部分が紫外線（又は可視光線）を透過するように形成されているマスクＭでレジスト膜Ｒを覆い、上から紫外線（又は可視光線）を照射する。その後現像して第１流路１３〜第２流路１４及び第４流路１６〜第５流路１７にあたる部分のレジスト膜Ｒを除去し、図３Ａ（ｆ）に示すように、ベース基板１１の一部をエッチングにより除去して、第１流路１３〜第２流路１４及び第４流路１６〜第５流路１７（深さＤ２）を形成する。
【００３７】
同様に、ベース基板１１上にレジスト膜Ｒを塗布し、図３Ａ（ｇ）に示すように、流入口１２を有する流入領域及び流出口１８を有する流出領域に対応する部分が紫外線（又は可視光線）を透過するように形成されているマスクＭでレジスト膜Ｒを覆い、上から紫外線（又は可視光線）を照射する。その後現像して流入口１２を有する流入領域及び流出口１８を有する流出領域にあたる部分のレジスト膜Ｒを除去し、図３Ａ（ｈ）に示すようにベース基板１１の一部をエッチングにより除去し、流入口１２（長さＬin）を有する流入領域及び流出口１８（長さＬout）を有する流出領域を形成する。
【００３８】
そして、ベース基板１１上にマイクロチャネルアレイ構造を形成した後、図３Ａ（ｉ）に示すように、ベース基板１１上に透明基板１９を密着することにより、マイクロチャネルチップ１０を形成する。ベース基板と透明基板との密着は、それぞれの素材の種類に応じて公知の密着法から選択して行うことができる。例えば、ベース基板がシリコン基板であり、透明基板がガラス基板である場合には、陽極接合法を用いてベース基板と透明基板とを溶着することができる。ベース基板と透明基板が共に樹脂基板である場合には、熱溶着法やエキシマ光照射溶着法等の溶着法により密着させることができる。圧着法だけでも血液等の流体の漏れが生じないレベルでベース基板と透明基板とを密着させることができる。このようにして複数段階異なる幅及び深さを有するマイクロチャネルチップ１０を作製することができる。
【００３９】
なお、マイクロチャネルアレイ構造の形成は、ベース基板の材料や溝のサイズ等に応じて、公知の手法、例えば、精密機械切削、ウェットエッチング、ドライエッチング、レーザー加工、放電加工等の手法を適宜利用して行うようにしてもよい。ドライエッチング技術を用いてマイクロチャネルアレイ構造を形成することで、マイクロチャネルアレイ構造の各表面を比較的平坦に形成することが可能となる。平坦なシリコン面は可視光（波長が４００〜８００ｎｍ程度の光）を反射しやすいため、ベース基板１１の材料にシリコンを用いた場合には、後述する位相差顕微鏡の原理を考慮すると、ドライエッチング技術を用いてマイクロチャネルアレイ構造を形成することが好ましく、さらにドライエッチングの結果表面に形成された微小な凹凸（突起）はドライエッチング後にＫＯＨウェットエッチングを行って平滑化するか、後述するように、プラズマＣＶＤ法によりシリコン酸化膜を形成することによって該凹凸（突起）をならすとよい。良好な光反射面（鏡面）が得られるという点からは、ＫＯＨウェットエッチングによって平滑化する方が好ましい。また、樹脂製のベース基板を射出成形、プレス成形、モノマーキャスト成形、溶剤キャスト成形、ホットエンボス成形、押出成形によるロール転写等により作製するときに、同時にマイクロチャネルアレイ構造を形成するようにしてもよい。
【００４０】
ここで、図３Ｂに示すように、マイクロチャネルチップ１０のベース基板１１にシリコンを用いた場合には、ベース基板１１上に可視光に対して透明な薄膜２０を設けるようにするとよい。シリコンのベース基板１１上に透明な薄膜２０を設けることで、あたかも位相差顕微鏡又は微分干渉顕微鏡法で観察するかのように、白色光を用いた顕微鏡１１０で観察することが可能となる。薄膜２０は、好ましくはシリコン酸化膜である。シリコン酸化膜は、高い生体親和性を有するため、シリコン酸化膜表面にヘパリン分子やアルブミン分子などの吸着が速やかに進み、それらの生体高分子によってシリコン酸化膜表面が覆われる。そのため、シリコン酸化膜の生体親和性がさらに高まり、測定の妨げとなる付加的な白血球の活性化が引き起こされない。また、シリコン酸化膜は可視光に対して無色透明であり、シリコンのベース基板１１の表面が可視光を反射するので、シリコン酸化膜を透過しシリコン表面で反射した後に白血球に到達する光と白血球に直接到達する光とが干渉して、位相差顕微鏡の原理により白血球を鮮明に観察することが可能となる。
【００４１】
薄膜２０がシリコン酸化膜である場合、シリコン酸化膜は、ベース基板１１上にマイクロチャネルアレイ構造を形成した後（図３Ａ（ｈ））に、熱酸化法、化学気相成長法、又はスパッタリング法を用いて、ベース基板１１のマイクロチャネルアレイ構造上に形成することができる。化学気相成長法（ＣＶＤ）法は、スパッタリング技術等の物理気相成長（ＰＶＤ）法と比較して、「ステップカバレッジ」が良好であるので、好ましくは、シリコン酸化膜の形成をプラズマＣＶＤ法を用いて行うとよい。すなわち、シリコン製のベース基板１１のマイクロチャネルアレイ構造上にプラズマＣＶＤ法によりシリコン酸化膜を形成することで、マイクロチャネルアレイ構造を形成する際に用いるドライエッチングプロセス等の結果として表面に形成される微小な凹凸（突起）をならして、そのような突起の無い（又は低減した）平坦な表面を形成することができる。さらに、マイクロチャネルアレイ構造上の微小な突起がプラズマＣＶＤによりならされることで、マイクロチャネルアレイ構造の表面の微小な突起に起因した白血球の活性化などの測定の妨げとなる現象を抑制（又は低減）することが可能となる。前述のように、良好な光反射面（鏡面）を得るという点からは、ドライエッチング後にＫＯＨウェットエッチングを行ってから、プラズマＣＶＤ法によってシリコン酸化膜を形成することがより好ましい。
【００４２】
薄膜２０がシリコン酸化膜である場合、シリコン酸化膜の厚さは、生体親和性を考慮すると、マイクロチャネルアレイ構造の表面が薄膜で完全に被覆される程度の厚さであればよいので、少なくとも、数ｎｍ〜数十ｎｍ程度あればよい。また、位相差顕微鏡の原理によるとシリコン酸化膜を透過しシリコン表面で反射した後に白血球に到達する光と、白血球に直接到達する光とが干渉すればよいので、シリコン酸化膜の厚さにより大きな位相差を稼ぐ必要はないが、シリコン酸化膜自体に青色の干渉色がつく方が血球がより明瞭に観察できるため、シリコン酸化膜の厚さは、好ましくは０．２〜１．５μｍ、さらに好ましくは０．４〜１．０μｍである。なお、一般的に、シリコン酸化膜の屈折率は１．４６程度であり、空気に触れたシリコン表面の自然酸化膜の厚さは２ｎｍ程度である。
【００４３】
とくに、マイクロチャネルアレイ構造上に厚さ０．４〜１．０μｍのシリコン酸化膜２０を設けたマイクロチャネルチップ１０を用いると、マイクロチャネルアレイ構造を通り抜ける白血球の輪郭まで鮮明に顕微鏡１１０で観察することができる。これにより、染色等により白血球に影響を加えること無く、所定の厚さの酸化膜を追加するだけで、マイクロチャネルアレイ構造内での白血球の挙動を光学顕微鏡を用いてより鮮明に観察することが可能となる。
【００４４】
図２Ａでは、流路の大きさを複数段階に変えたマイクロチャネルチップ１０のシンプルなモデル構成を示した。本発明の一実施形態で実際に用いるマイクロチャネルチップ１０は、毛細血管を模擬する第３流路１５の数を大幅に（例えば数千個に）増加させた構成を有する。図４Ａは、数千個（例えば５,０００〜１０,０００個程度）の第３流路１５が形成されたマイクロチャネルチップ１０の概略構成を示す平面図である。第３流路１５は、隣接する微小構造体（土手）１５ｂ間に設けられ、その前後に流入テラス１５ａ及び流出テラス１５ｃを備える。微小構造体１５ｂは透明基板１９と接し、マイクロチャネルチップ１０を流れる試料が微小構造体１５ｂを越えて流れることはない。
【００４５】
図４Ａに示すように、流入口１２からマイクロチャネルチップ１０内に注入された試料（血液又は生理食塩水）は、流入口１２を含む流入領域（幅Ｗ０）から第１流路１３（幅Ｗ１）及び第２流路１４（幅Ｗ２）に流れ、流入テラス１５ａを通じて多数の第３流路１５（幅Ｗ３）に流れ込む。第３流路１５を通過した試料は、流出テラス１５ｃを通じて隣接する第４流路１６（幅Ｗ２）に流れ、第４流路１６から第５流路１７（幅Ｗ１）及び流出口１８を含む領域（幅Ｗ０）に流れ、流出口１８から外に（回収ライン１０５）排出される。各流路の幅Ｗの大きさ順は、Ｗ０＞Ｗ１＞Ｗ２＞Ｗ３であり、好ましくは、幅Ｗ０は１００μｍ〜１ｍｍ程度、幅Ｗ１は４０〜１５０μｍ程度であり、幅Ｗ２は２０〜４０μｍ程度、幅Ｗ３は、４〜１２μｍ程度である。各流路１２〜１８の長さＬは適宜調整される。
【００４６】
一例として、流入領域及び流出領域の幅Ｗ０を３００μｍ、第１及び第５流路１３、１７の幅Ｗ１を１００μｍ、第２及び第４流路１４、１６の幅Ｗ２を３０μｍ、並びに第３流路１５の幅Ｗ３を７μｍとしてもよい。また、流入領域及び流出領域の深さＤ０を５０μｍ、第１及び第５流路１３、１７の深さＤ１を５０μｍ、第２及び第４流路１４、１６の深さＤ２を５０μｍ、並びに第３流路１５の深さＤ３を４．５μｍとしてもよい。流入テラス１５ａ及び流出テラス１５ｃの深さは第３流路１５の深さと同じ（例えば４．５μｍ）とするとよい。また、第３流路１５の長さＬ３は３０〜９０μｍ、好ましくは５０〜７０μｍであり、流入テラス１５ａ及び流出テラス１５ｃの長さＬａ、Ｌｃは、１５〜４５μｍ、好ましくは２０〜４０μｍである。
【００４７】
マイクロチャネルチップ１０は、図４Ａに示すマイクロチャネルチップ１０の第３流路の数を２倍にした構成を有するようにしてもよい（図４Ｂ）。この構成では、流入口１２からマイクロチャネルチップ１０内に注入された試料は、流入領域から第１流路１３及び第２流路１４に流れ、第２流路１４から二手に（図中上下に）分かれ、流入テラス１５ａを通じて第３流路１５に流れ込む。そして、第３流路１５を通過した試料は、流出テラス１５ｃを通じて隣接する第４流路１６に流れ、第４流路１６から第５流路１７及び流出口１８を含む領域に流れ、流出口１８から回収ライン１０５に排出される。第３流路１３の数が２倍になっている構成により、試料がマイクロチャネルチップ１０を通過する時間が短縮される。
【００４８】
図５Ａは、（ａ）図４Ａに示すマイクロチャネルチップ１０に血液試料を流した際の第３流路１５付近を示す模式平面図であり、（ｂ）そのＡＡ線断面図である。
【００４９】
血液試料中の有形成分とくに白血球３０は、毛細血管を模擬した第３流路１５（幅Ｗ３、深さＤ３）並びに流入テラス１５ａ及び流出テラス１５ｃを流れる際に、第３流路１５並びに流入テラス１５ａ及び流出テラス１５ｃが白血球３０の大きさよりも狭い場合、図５Ａに示すように形を変えて流れていく。図５Ａ（ｂ）に示すように、ユーザは、第３流路１５並びに流入テラス１５ａ及び流出テラス１５ｃを流れる試料を透明基板１９を介して顕微鏡１１０で観察することができる。なお、透明基板１９と微小構造体１５ｂとは接触（密着）しており、微小構造体１５ｂの上部から試料が漏れることは無いようになっている。
【００５０】
図６Ａは、マイクロチャネルチップ１０のホルダー５０の概略構成図である。ホルダー５０は、下受け部５０ａ、押さえ部５０ｂ、及びキャップ部５０ｃを備える。押さえ部５０ｂには貫通孔である流入路５１及び流出路５２が設けられ、それぞれマイクロチャネルチップ１０の流入口１２及び流出口１８に接続される。
【００５１】
試料のセットアップは、ホルダー５０の下受け部５０ａ内に生理食塩水を入れて、マイクロチャネルチップ１０を下受け部５０ａに設置し、押さえ部５０ｂを入れて、キャップ部５０ｃで締める。その後ホルダー５０内の空気を抜いた後、ホルダー５０をチップホルダー１０１に設置して、試料のセットアップが完了する。
【００５２】
＜白血球の活性化度の測定方法＞
本発明の一実施形態に係る白血球の活性化度の測定方法は、（１）第１の抗凝固剤を添加した血液がマイクロチャネルチップ１０を通過する時間（全血通過時間１）と、第１の抗凝固剤とは異なる第２の抗凝固剤を添加した血液がマイクロチャネルチップ１０を通過する時間（全血通過時間２）との差（全血通過時間の差）が、両者の白血球の活性化度の差と相関していることの発見に基づく。また、本発明の別の実施形態に係る白血球の活性化度の測定方法は、（２）血液をマイクロチャネルチップに流す前後の生理食塩水がマイクロチャネルチップ１０を通過する時間の差（生食通過時間の差）が白血球の活性化度と相関していることの発見に基づく。
【００５３】
つまり、試料（血液）中の白血球の活性化度の差「ｙblood」又は血液中の白血球の活性化度「ｙsaline」と、マイクロチャネルチップ１０に流す試料（血液又は生理食塩水）がマイクロチャネルチップ１０を通過する時間の差「ｘblood」（血液）又は「ｘsaline」（生理食塩水）との間には下記式１及び式２の関係がある。
ｙblood＝ｆｉ（ｘblood）  …（式１）
ｙsaline＝ｇｉ（ｘsaline）  …（式２）
この関数ｆｉ及びｇｉが上記した白血球の活性化度の算出関数である。
【００５４】
式１の関数ｆｉは、異なる種類の抗凝固剤を添加した血液がマイクロチャネルチップを通過する時間の差（全血通過時間の差）ｘbloodが両者の白血球の活性化度の差ｙbloodと相関していることを示す関数である。関数ｆｉは、測定時の血液に印加する圧力（通常は吸引圧）（ｉ）によって異なる関数である。
【００５５】
抗凝固剤としては、ＥＤＴＡ (Ethylene-Diamine-Tetraacetic Acid）、ヘパリン（Heparin）、クエン酸ナトリウム、フッ化ナトリウム、ＡＣＤ（Acid Citrate Dextrose solution）、メシル酸ナファモスタット、又はアルガトロバン等を用いることができる。好ましくは、第１の抗凝固剤としてＥＤＴＡとヘパリンとの混合溶液を用い、第２の抗凝固剤としてヘパリン溶液を用いるとよい。
【００５６】
式２の関数ｇｉは、血液をマイクロチャネルチップ１０に流す前後の生理食塩水がマイクロチャネルチップを通過する時間の差（全生食通過時間の差）ｘsalineが白血球の活性化度と相関していることを示す関数である。関数ｆｉ及びｇｉは、それぞれｘblood及びｘsalineの一次関数又は二次以上の高次の関数である。
【００５７】
本発明の一実施形態における白血球の活性化度の測定では、式１の関数ｆｉを予め求め端末１２０の記憶部１２１に記憶させておく。次に、白血球の活性化度が未知の血液に第１及び第２の抗凝固剤を添加した試料をマイクロチャネルチップ１０に流し、処理部１２２が、それらの全血通過時間の差（ｘblood）を測定する。この測定値を、記憶部１２１に記憶された算出関数ｆｉに代入して当該血液の白血球の活性化度（ｙblood）を算出し、その結果を外部のモニター等に出力する。このように、測定装置１００は、血液がマイクロチャネルチップ１０を通過する時間を測定するだけで、血液中の白血球の活性化度を測定することができるので、従来のように画像から目視により白血球の活性化の度合いを評価する技術に比べ、時間や手間が大きく低減される。
【００５８】
ここで、関数ｆｉは、次のようにして求めることができる。まず、多数の被験者（例えば５０〜１００人程度）の血液を準備する。ある被験者の同量の血液に対して第１の抗凝固剤を添加した試料１と第２の抗凝固剤を添加した試料２を測定装置１００のマイクロチャネルチップ１０に流す。試料１の全血通過時間と試料２の全血通過時間との差（ｘblood）を算出する。また、毛細血管を模擬した第３流路１５近傍の顕微鏡画像（全血通過後の画像、又は所定量の試料が流れたときにランダムに選択された複数の画像）から目視により又は公知の画像処理技術（例えば国際公開第2011/065177号）を用いて、試料１及び試料２それぞれについてマイクロチャネルアレイ構造（流路や微小構造体）に接着した白血球の数を数え、その差（ｙblood）を全血通過時間の差（ｘblood）に対してグラフ上にプロットする。全ての被験者に対する測定が終了したら、該グラフ上のプロットを最小二乗法等を用いて一次関数（又は２次以上の高次関数）でフィッティングする。フィッティングにより得られた係数（一次関数ならばｙblood＝ａ１ｘblood＋ｂ１の係数ａ１、ｂ１の値）を有する関数ｆｉを、ｆｉを求めた際に印加した圧力（ｉ）に関連付けて、測定装置１００の記憶部１２１に記憶させておく。
【００５９】
また、本発明の別の実施形態における白血球の活性化度の測定（算出）では、式２の関数ｇｉを予め求め端末１２０の記憶部１２１に記憶させておく。白血球の活性化度が未知の血液を流す前後に同量の生理食塩水をマイクロチャネルチップ１０に流し、処理部１２２が、それらの全生食通過時間の差（ｘsaline）を測定する。この測定値を、記憶部１２１に記憶された算出関数号ｇｉに代入して当該血液の白血球の活性化度（ｙsaline）を算出し、その結果を外部のモニター等に出力する。このように、測定装置１００は、血液をマイクロチャネルチップ１０へ流す前後の生理食塩水の全生食通過時間を測定するだけで、血液中の白血球の活性化度を測定することができるので、従来のように画像から目視により白血球の活性化の度合いを評価する技術に比べ、時間や手間が大きく低減される。
【００６０】
ここで、関数ｇｉは、以下のようにして求めることができる。まず、多数の被験者（例えば５０〜１００人程度）の血液を準備する。ある被験者の血液をマイクロチャネルチップ１０に流す前後に生理食塩水をマイクロチャネルチップ１０に流し、その全生食通過時間の差（ｘsaline）を算出する。また、マイクロチャネルチップ１０に血液を流したときに撮影した、毛細血管を模擬した第３流路１５近傍の顕微鏡画像（全血通過後の画像、又は所定量の試料が流れたときにランダムに選択された複数の画像）から目視により又は公知の画像処理技術を用いて、マイクロチャネルアレイ構造（流路や微小構造体１５ｂ）に接着した白血球の数（ｙsaline）を求め、その値を全生食通過時間の差（ｘsaline）に対してグラフ上にプロットする。全ての被験者に対する測定が終了したら、該グラフ上のプロットを最小二乗法等を用いて一次関数（又は２次以上の高次関数）でフィッティングする。フィッティングにより得られた係数（一次関数ならばｙsaline＝ａ２ｘsaline＋ｂ２の係数ａ２、ｂ２の値）を有する関数ｇｉを、測定装置１００の記憶部１２１に記憶させておく。
【００６１】
このようにして、白血球の活性化度の算出関数ｆｉ（ｘblood）又はｇｉ（ｘsaline）を求め、端末１２０の記憶部１２１に予め記憶させておくことができる。
【００６２】
ここで、測定装置１００による白血球の活性化度の測定の流れについて再度説明する。
【００６３】
まず、式１の関数ｆｉを用いて白血球の活性化度を測定する場合は以下の流れのように測定が行われる。まず、被験者から血液を採取し、第１の抗凝固剤を添加した試料１と、異なる第２の抗凝固剤を添加した試料２（試料１と同量）を準備する。次に、試料１を試料容器１０２に入れ、駆動装置１０４を作動させ、採取注入管１０３で試料容器１０２から試料１を採取し、バルブ１０６の調整（又は回収ライン１０５の高さの調整）を行い試料１に印加されるべき圧力を調整し（第１の圧力とする。）、マイクロチャネルチップ１０に試料１を注入する。液面計１０７のチューブの開放端１０７ａをマイクロチャネルチップ１０の流入口１２に接続する。処理部１２２は、液面計１０７からのデータを基に、マイクロチャネルチップ１０を流れる試料１の全血通過時間１を求め、記憶部１２１に一時的に記憶させておく。また、処理部１２２は、同様のことを試料２についても行い、試料２に関する全血通過時間２を求め、記憶部１２１に一時的に記憶させておく。処理部１２２は、全血通過時間１と全血通過時間２との差（ｘblood）を求め、第１の圧力（ｉ）に関する算出関数ｆｉを記憶部１２１から読み出し、求めたｘbloodの値を代入して、最終的に被験者の血液中の白血球の活性化度（ｙblood）を導出し、その結果を入出力部１２３を介してモニターやプリンターに出力する。
【００６４】
次に、式２の関数ｇｉを用いて白血球の活性化度を測定する場合は以下の流れのように測定が行われる。まず、被験者から血液を採取し、任意の抗凝固剤を添加した試料を準備する。次に、第１の量の生理食塩水を試料容器１０２に入れ、駆動装置１０４を作動させ、採取注入管１０３で試料容器１０２から生理食塩水を採取し、バルブ１０６の調整（又は回収ライン１０５の高さの調整）を行い生理食塩水に印加されるべき圧力を調整し（第１の圧力とする。）、マイクロチャネルチップ１０に生理食塩水を注入する。液面計１０７のチューブの開放端１０７ａをマイクロチャネルチップ１０の流入口１２に接続する。処理部１２２は、液面計１０７からのデータを基に、マイクロチャネルチップ１０を流れる生理食塩水の全生食通過時間１を求め、記憶部１２１に一時的に記憶させておく。また、処理部１２２は、同様のことを被験者の血液についても行う。血液をマイクロチャネルチップ１０に流した後、再度第１の量の生理食塩水を試料容器１０２に入れ、同様に、処理部１２２は、マイクロチャネルチップ１０に血液を流した後の生理食塩水の全生食通過時間２を求め、記憶部１２１に一時的に記憶させておく。処理部１２２は、全生食通過時間１と全生食通過時間２との差（ｘsaline）を算出し、第１の圧力（ｉ）に関する算出関数ｇｉを記憶部１２１から読み出し、求めたｘsalineの値を代入して、最終的に被験者の血液中の白血球の活性化度（ｙsaline）を導出し、その結果を入出力部１２３を介してモニターやプリンターに出力する。
【００６５】
このようにして、試料（血液）中の白血球の活性化度「ｙblood」又は「ｙsaline」と、マイクロチャネルチップ１０に流す試料（血液又は生理食塩水）の通過時間の差（全試料通過時間の差）「ｘblood」（血液）又は「ｘsaline」（生理食塩水）との間の相関関係を基にして、白血球の活性化度を容易に求めることができる。
【実施例】
【００６６】
本発明の一実施例について、図面を参照しながら説明する。本実施例におけるマイクロチャネルチップ７００は、図４Ａに示すマイクロチャネルアレイ構造を有する。
【００６７】
＜マイクロチャネルチップ＞
図７Ａ及び図７Ｂは、本実施例で用いたマイクロチャネルチップ７００のマイクロチャネルアレイ構造の一部を顕微鏡１１０（倍率５０倍）で撮影した顕微鏡写真である。図７Ａ及び図７Ｂに示すように、マイクロチャネルチップ７００は、動脈〜細動脈を模擬した第１流路（１３）に相当する流路７０１（幅Ｗ１：１００μｍ、深さＤ１：５０μｍ）、細動脈を模擬した第２流路（１４）に相当する流路７０２（幅Ｗ２：３０μｍ、深さＤ２：５０μｍ）、及び毛細血管を模擬した第３流路（１５）に相当する流路７０３（幅Ｗ３：７μｍ、深さＤ３：４．５μｍ、長さＬ３：６０μｍ）を有している。マイクロチャネルチップ７００は、流路７０３の前後に、流入テラス７０３ａ（幅Ｗａ：６４０μｍ、深さＤａ：４．５μｍ、長さＬａ：３０μｍ）と、流出テラス７０３ｂ（幅Ｗｂ：６４０μｍ、深さＤｂ：４．５μｍ、長さＬｂ：３０μｍ）とをさらに有している。また、マイクロチャネルチップ７００は、細静脈を模擬した第４流路（１６）に相当する流路７０４（幅Ｗ２：３０μｍ、深さＤ２：５０μｍ）、及び細動脈〜静脈を模擬した第５流路（１３）に相当する流路７０５（幅Ｗ１：１００μｍ、深さＤ１：５０μｍ）をさらに有する。
【００６８】
図７Ａ及び図７Ｂに示すマイクロチャネルアレイ構造は、心筋微小血管の構成（幅３００μｍの細動脈から３回分岐して多数の７μｍの毛細血管にたどり着き、その後３回合流しながら幅３００μｍの細静脈に到達する構成）をモデルとしている。一つのマイクロチャネルチップ７００には毛細血管を模擬する流路７０３は数千個含まれている。
【００６９】
＜算出関数を求める手順＞
算出関数ｆｉ及びｇｉを求めるために、下記表１に示す臨床的特徴を有する９４名の被験者（男性４１名、女性５３名）に協力してもらった。表１中の数字は平均値と標準偏差、ｐ値を示す。
【表１】
0006664608.tif 000002
【００７０】
（手順１）全ての被験者に２００ｍｌの水を飲んでもらい、５分間静かに座った状態にした後、各被験者から１０ｍｌの血液を採取した。５ｍｌの血液は、ヘパリン採血管（テルモ株式会社社製ベノジェクト（登録商標）ＩＩ 真空採血管５ｍｌ）に入れ、さらにヘパリン溶液を０．２５ｍｌ添加した（即ち、ヘパリン溶液を添加した試料）。残りの５ｍｌの血液は、ＥＤＴＡ−２Ｎａ採血管（テルモ株式会社社製ベノジェクトＩＩ  真空採血管５ｍｌ）に入れ、さらにヘパリン溶液を０．２５ｍｌ添加した（即ち、ヘパリンとＥＤＴＡとの混合溶液を添加した試料）。
（手順２）吸引圧が−３０ｃｍＨ２Ｏの場合と−６０ｃｍＨ２Ｏの場合に関して、血液試料の測定の前に１００μｌの生理食塩水をマイクロチャネルチップ７００に流し、その全生食通過時間を測定した。
（手順３）吸引圧が−３０ｃｍＨ２Ｏの場合と−６０ｃｍＨ２Ｏの場合に関して、１００μｌの血液試料がマイクロチャネルチップ７００を通過するのにかかった時間（全血通過時間）を測定した。このとき、マイクロチャネルチップ１０を流れる血液を顕微鏡１１０（倍率は固定）で撮影し、画像（動画）を記憶部１２１に記憶しておいた。
（手順４）吸引圧が−３０ｃｍＨ２Ｏの場合と−６０ｃｍＨ２Ｏの場合に関して、血液試料の測定後に、１００μｌの生理食塩水をマイクロチャネルチップ７００に流し、その全生食通過時間を測定した。
（手順５）０．０８〜０．１０ｍｌの血液試料がマイクロチャネルチップ７００を流れたときの５つの異なる画像をランダムに選択し、接着した（又は詰まった）白血球の数を目視によりカウントした。
（手順２）〜（手順５）を全ての試料に対して行った。
全血通過時間（１００μｌ／秒）は、生理食塩水通過時間で補正した値を下記の式で算出する。１００μｌの血液試料の通過時間（秒）×１２（秒）／１００μｌの生理食塩水の通過時間（秒）とした。式中、「１２」（秒）は経験的定数であり、「１００μｌの生理食塩水の通過時間」（秒）は、血液試料をマイクロチャネルチップ７００に流す前の全生食通過時間（手順２）である。
【００７１】
図８は、血液試料がマイクロチャネルチップ７００を通過している状態で、マイクロチャネルチップ７００の一部を顕微鏡１１０（５０倍に拡大）により撮影した写真である。図８中の黒の矢印で指し示す部分に流路に接着した白血球（つまり活性化した白血球）が見られた。
【００７２】
図９は、血液試料がマイクロチャネルチップ７００を通過している状態で、マイクロチャネルチップ７００の一部を顕微鏡１１０（２００倍に拡大）により撮影した写真である。図９（ａ）はヘパリン採血管の血液試料に関する画像であり、図９（ｂ）はヘパリン＋ＥＤＴＡ−２Ｎａ採血管の血液試料に関する画像である。両者は同一被験者の血液検体である。図９中の黒の矢印で指し示す部分に流路に接着した白血球（つまり活性化した白血球）が見られた。なお、図９（ａ）の破線で囲んだ部分は赤血球が流線型に変形しながら毛細血管を模擬した流路中を通過する様子を示している。
【００７３】
図９（ａ）のヘパリン採血管の血液試料（ヘパリン溶液添加血液）に関する画像と、図９（ｂ）のヘパリン＋ＥＤＴＡ−２Ｎａ採血管の血液試料（ＥＤＴＡとヘパリンとの混合溶液添加血液）に関する画像とを比較すると、ヘパリン＋ＥＤＴＡ−２Ｎａ採血管の血液試料では、ヘパリン採血管の血液試料に比べて明らかに接着した白血球（つまり活性化した白血球）の数が少なく、流れもスムーズであることがわかった。
【００７４】
図１０は、同一被験者のヘパリン採血管の血液試料（ヘパリン溶液添加血液）とヘパリン＋ＥＤＴＡ−２Ｎａ採血管の血液試料（ＥＤＴＡとヘパリンとの混合溶液添加血液）との間で、マイクロチャネルチップ７００を通過する時間（全血通過時間）の違いを示すグラフである。図１０（ａ）は、吸引圧を−３０ｃｍＨ２Ｏとした場合の結果であり、図１０（ｂ）は、吸引圧を−６０ｃｍＨ２Ｏとした場合の結果である。図１０中、各線で繋がれた値が同一被験者の試料の値を示し、線が異なれば被験者も異なることを示している。
【００７５】
図１１は、１視野（１画像）あたりのヘパリン採血管の血液試料（ヘパリン溶液添加血液）の接着した白血球の数からヘパリン＋ＥＤＴＡ−２Ｎａ採血管の血液試料（ＥＤＴＡとヘパリンとの混合溶液添加血液）の接着した白血球の数を引いた値（カウント数）を縦軸に表し、ヘパリン採血管の血液試料の全血通過時間からヘパリン＋ＥＤＴＡ−２Ｎａ採血管の血液試料の全血通過時間を引いた値（秒）を横軸に表したグラフである。図１１（ａ）は、吸引圧を−３０ｃｍＨ２Ｏとした場合の結果であり、図１１（ｂ）は、吸引圧を−６０ｃｍＨ２Ｏとした場合の結果である。
【００７６】
図１１（ａ）中の破線１１０１は、最小二乗法により一次関数ｙ＝ａｘ＋ｂでフィッティングした場合の直線であり、図１１（ｂ）中の破線１１０２は、最小二乗法により一次関数ｙ＝ｃｘ＋ｄでフィッティングした場合の直線である（グラフの縦軸をｙ、横軸をｘとした。）。図１１の結果から、係数ａ＝26.4、ｂ＝33.9、ｃ＝8.04、及びｄ＝9.02であった。
【００７７】
以上より式１に関する算出関数ｆが以下のように求まった。
吸引力が−３０ｃｍＨ２Ｏの場合、
ｙblood＝ｆ１（ｘblood）＝26.4ｘblood＋33.9 （ｐ値＜0.0001、Ｒ値＝0.547）
吸引力が−６０ｃｍＨ２Ｏの場合、
ｙblood＝ｆ2（ｘblood）＝8.04ｘblood＋9.02 （ｐ値＜0.0001、Ｒ値＝0.131）
ここで、ｙbloodは、ヘパリン採血管の血液試料（ヘパリン溶液添加血液）の接着白血球の数からヘパリン＋ＥＤＴＡ−２Ｎａ採血管の血液試料（ＥＤＴＡとヘパリンとの混合溶液添加血液）の接着白血球の数を引いた値であり、白血球の活性化度を示す指標である。また、ｘbloodは、ヘパリン採血管の血液試料の全血通過時間からヘパリン＋ＥＤＴＡ−２Ｎａ採血管の血液試料の全血通過時間を引いた値である。
【００７８】
次に、図１２は、１視野（１画像）あたりのヘパリン採血管の血液試料の接着した白血球の数に対する、該血液試料を通過させる前後の（手順２及び４で測定した）生理食塩水の通過時間の差（秒）をプロットしたグラフである。図１２（ａ）は、吸引圧を−３０ｃｍＨ２Ｏとした場合の結果であり、図１２（ｂ）は、吸引圧を−６０ｃｍＨ２Ｏとした場合の結果である。
【００７９】
図１２（ａ）中の破線１２０１は、最小二乗法により一次関数ｙ＝ａｘ＋ｂでフィッティングした場合の直線であり、図１２（ｂ）中の破線１２０２は、最小二乗法により一次関数ｙ＝ｃｘ＋ｄでフィッティングした場合の直線である。図１２の結果から、係数ａ＝2.20、ｂ＝0.106、ｃ＝1.92、及びｄ＝4.4455であった。
【００８０】
以上より式２の形式に改めると、算出関数ｇｉは以下のように求まった。
吸引力が−３０ｃｍＨ２Ｏの場合、
ｙsaline＝ｇｉ（ｘsaline）＝0.455ｘsaline−0.048 （ｐ値＜0.001、Ｒ値＝0.509）
吸引力が−６０ｃｍＨ２Ｏの場合、
ｙsaline＝ｇｉ（ｘsaline）＝0.521ｘsaline−2.315 （ｐ値＜0.0015、Ｒ値＝0.29）
ここで、ｙsalineは、ヘパリン採血管の血液試料（ヘパリン溶液添加血液）の接着白血球の数であり、白血球の活性化度を示す指標である。また、ｘsalineは、該ヘパリン採血管の血液試料をマイクロチャネルチップに通過させる前後に通過させた生理食塩水の通過時間（全生食通過時間）の差である。
【００８１】
次に、図１３等を参照し、本発明の別の実施形態に係る、血液の流動性、とくに白血球の活性化度の測定装置及び測定方法について説明する。なお、上記ですでに説明した同一の構成及び事項については適宜説明を省略する。
【００８２】
上記特許文献２には、血液流動性に及ぼす温度変化の影響を避けるため、血液流動性測定装置の装置内の温度を３４〜３６℃の間で均一に保持する装置及び方法が開示されている。しかしながら、該装置及び方法において用いられる温風量と放熱板による放熱量のみによる該装置内温度保持性能を達成するのは困難と考えられる。上記した実際の製品「ＭＣＦＡＮ ＨＲ３００」には未だそのような装置内温度制御装置は組み込まれていない。また、特許文献１に開示されている装置にも流体試料の温度と該流体試料の流動性を測定する装置内の温度とを厳密に一致させて制御できるような温度制御装置は組み込まれていない。一般に、顕微鏡観察台上の観察物の温度を室温（限定されないが一般的に１５〜２８℃程度）以外の特定温度に制御することは、観察物の大きさやその熱容量また顕微鏡の観察倍率等によっても異なるが、技術的に容易なことではなく、そのような観察物の温度制御の試みはかえって観察物の温度の不安定性を招く結果になりやすい。
【００８３】
このようなことから、精密な温度制御の下に室温以外の温度（例えば体温３６〜３８℃程度）での測定を可能にすることが求められている。室温での測定は、血液の流動性、とくに白血球の活性化度に及ぼす体温との温度差の影響および室温自体の変動の影響を受けることがある。さらに室温や体温での測定だけでなく、臨床的には体温より高い温度（例えば３９℃以上）、体温と室温の中間の温度（例えば２９〜３５℃）、室温より低い温度（例えば１４℃以下）での血液の流動性、とくに白血球の活性化度の測定、すなわち、より広範囲にわたる温度依存性の測定も求められている。
【００８４】
そこで、本実施形態では、心筋微小血管を模したマイクロチャネルアレイ回路による微小血管の生体外モデルにおいて、血液試料及び生理食塩水が恒温水槽内で保温ないし保冷される際の設定温度と同一（±１℃の精度）の温度で該血液の流動性、とくに白血球の活性化度の臨床検査に標準化できる装置及び方法を提供する。併せて、測定値の再現性が課題である特許文献３に開示されている細胞マイクロレオロジー観察・測定用ディスポーザブルチップの改良型も提供する。
【００８５】
図１３は、本実施形態に係る血液の流動性、とくに白血球の活性化度の測定装置１０００の概略構成図である。
【００８６】
測定装置１０００は、マイクロチャネルチップ１０、チップホルダー１０１、試料容器１０２、生理食塩水容器１０３ａ、輸入管１０４ａ、１０４ｂ、１０４ｃ、二方電磁弁１０５ａ、１０５ｂ、１０５ｃ、１０５ｄ、１０５ｅ、三方活栓１０６ａ、１０６ｂ、シリンジ１０７ｂ、回収容器１０８、輸出管１０９ａ、１０９ｂ、１０９ｃ、顕微鏡１１０、端末１２０、液面計１３０、恒温水槽１４０、恒温水槽循環輸入出路１４１ａ、１４１ｂ、エアーポンプ１４２ａ、そのエアー排出口１４３、エアー吸引口１４４、三方電磁弁１４５、エアーポンプ１４２ｂ、そのエアー吸引口１４６、エアー排出口１４７、熱交換器１４８、及びエアーノズル１４９を含む。
【００８７】
本実施形態では、試料容器１０２（第１の容器）は、測定する血液試料を入れておく試験管又は採血した血液の入った採血管である。生理食塩水容器１０３ａ（第２の容器）はビーカー状の容器であり、試料容器１０２と共に恒温水槽１４０内で、恒温水槽１４０の設定温度（水温）と同じ温度に保温ないし保冷される。恒温水槽１４０は、恒温水槽循環輸入出路１４１ａ、１４１ｂによって不図示の循環ポンプを備えた本体低温恒温水槽とつながる構成になっていてもよいし、それ自身が温度センサ、液体加熱機構、液体冷却機構、及び水温制御部等を備える構成になっていてもよい。あるいは、恒温水槽１４０の代わりに、試料容器１０２と生理食塩水容器１０３ａそれぞれが入る孔を有するアルミブロックをペルチェ素子等で加温・冷却するドライ低温恒温水槽を用いてもよい。
【００８８】
試料容器１０２とマイクロチャネルチップ１０のマイクロチャネル構造は輸入管１０４ａでつながれ、生理食塩水容器１０３ａと該マイクロチャネル構造は輸入管１０４ａ〜１０４ｃでつながれ、該マイクロチャネル構造と回収容器１０８は輸出管１０９ａ〜１０９ｃでつながれている。
【００８９】
輸入管１０４ａ〜１０４ｃの先端が生理食塩水容器１０３ａ内に入った状態で、二方電磁弁１０５ａ〜１０５ｄ、三方電磁弁１４５およびエアーポンプ１４２ａがオン状態（ＮＯ(normal open)弁の場合は弁が閉じた状態、ＮＣ(normal close)弁の場合は弁が開いた状態、ポンプについてはポンプが作動した状態）になると、生理食塩水容器１０３ａ内の生理食塩水が急速に吸引され、輸入管１０４ａと輸出管１０９ａの経路、輸入管１０４ｂと輸出管１０９ｂの経路、及び輸入管１０４ｃと輸出管１０９ｃの径路を通じて回収容器１０８に排出される。各経路内を通過する血液及び生理食塩水の温度が、±１℃、好ましくは±０．５℃以内の精度で恒温水槽１４０の設定温度に一致するように保たれる。またその後、２方電磁弁１０５ａ、１０５ｄだけをオン状態にすると、生理食塩水を輸入管１０４ａからマイクロチャネルチップ１０内を通って輸出管１０９ｂへと流すことができる。これにより、マイクロチャネルチップ１０のマイクロチャネル構造を通過する血液及び生理食塩水の温度も、±１℃、好ましくは±０．５℃以内の精度で恒温水槽１４０の設定温度に一致するように保たれる。さらにその後、二方電磁弁１０５ｄ、１０５ｅだけをオン状態にすると、液面計１３０内の液面位置と輸出管１０９ｂの出口端位置の高さの差の水柱差の下で、生理食塩水のマイクロチャネルアレイ構造の通過時間を測定することができる。
【００９０】
前記生理食塩水の通過時間を測定した後、輸入管１０４ａの先端を生理食塩水容器１０３ａ内から試料容器１０２内に移し、二方電磁弁１０５ａだけをオン状態にして、シリンジ１０７ｂを用いて、試料容器内から血液試料を所定量（例えば２００マイクロリットル）輸入管１０４ａ内に採取する。その後、輸入管１０４ａの先端を試料容器１０２の外に出してから、シリンジ１０７ｂをさらに引いて、輸入管１０４ａ内の血液試料をその端面が輸出管１０９ａに付けた矢印の位置１０１０に来るまで移動させる。この矢印位置１０１０は、限定されないが、輸入管１０４ａ内から輸出管１０９ａ内に移動する液量が、例えばちょうど１５０マイクロリットルになり、輸入管１０４ａ内に残る液量が５０マイクロリットルになるように決めた位置である。該血液試料を移動させた後、二方電磁弁１０５ａを閉じ、二方電磁弁１０５ｅを開いて、シリンジ１０７ｂを用いて液面計１３０内の液面位置を初期位置に合わせて、それから二方電磁弁１０５ｅを開いたままで二方電磁弁１０５ｄを開けば、血液試料１００マイクロリットルがマイクロチャネルアレイ構造を通過する時間を測定することができる。
【００９１】
前記血液試料がマイクロチャネルアレイ構造を通過する時間を測定した後、輸入管１０４ａの先端を生理食塩水容器１０３ａ内に戻し、二方電磁弁１０５ａと１０５ｃを開くことにより、輸入管１０４ｃ内と輸出管１０９ｃ内に残っている血液試料を回収容器１０８内に排出するとともに、輸入管１０４ｃ内と輸出管１０９ｃ内を再度生理食塩水で満たすことができる。その後、二方電磁弁１０５ａ及び１０５ｃを閉じ、二方電磁弁１０５ｅを開いてシリンジ１０７ｂを用いて液面計１３０内の液面位置を初期位置に合わせ、二方電磁弁１０５ｅを開いたまま二方電磁弁１０５ｄを開けば、血液試料のマイクロチャネルアレイ構造通過後の生理食塩水のマイクロチャネルアレイ構造通過時間を測定することができる。
【００９２】
前記生理食塩水および血液試料のマイクロチャネルアレイ構造通過時間の測定中にも、生理食塩水容器１０３ａ内から輸入管１０４ｃとチップホルダー１０１内の付加的に設けられた流路（流路口５３と５４の間をつなぐ、一部がマイクロチャネルチップ１０の背面に直接する流路）と輸出管１０９ｃとを経て回収容器１０８内に排出される生理食塩水の流れは継続しており、それによってマイクロチャネルチップホルダー内の温度は、±１℃、好ましくは±０．５℃以内の精度で恒温水槽１４０の設定温度に一致するように保たれる。この生理食塩水の流量は三方活栓１０６ａによって調節される。
【００９３】
室温以下、とくに１０℃以下の温度で血液の流動性の測定を行う場合、マイクロチャネルチップ１０に密着した透明基板１９の表面に結露が生じて、顕微鏡による観察が妨げられるおそれがある。しかし、エアーポンプ１４２ｂから排気されるエアーが熱交換器１４８で恒温水槽１４０の設定温度にまで冷やされ、エアーノズル１４９から該透明基板１９の表面に吹き付けられるように構成されており、透明基板１９の表面の結露が防止される。
【００９４】
液面計１３０は、マイクロチャネルチップ１０を流体の試料が通過する通過時間を測定し、端末１２０へそのデータを出力する。また、液面計１３０を設けずに、端末１２０が公知の画像処理技術（例えば特開2012-176095号公報）を用いて顕微鏡１１０からの画像データを処理して流量を計測するようにしてもよい。また、液面計１３０の代わりに、輸出管１０９ｂに流量計を設けて流量を測定する方法；マイクロチャネルチップ１０を流体試料が通過する速度及び通過時間等を測定する方法；通過中の流体試料の特定光吸収量や特定波長光の発光量を測定する光学的方法；酵素、ＦＥＴセンサ等を使用した電気化学的な検出方法；超音波を利用した測定方法；及び表面プラズモン共鳴を利用した測定方法等いずれを用いてもよい。
【００９５】
なお、測定装置１０００は、ユーザがマイクロチャネルチップ１０及び試料容器１０２と生理食塩水容器１０３ａを所定の位置に設置した後の一連の測定処理を自動で行うように構成されたアクチュエータ及び可動部材（不図示）を備えていてもよい。例えば、ユーザがマイクロチャネルチップ１０と試料容器１０２と生理食塩水容器１０３ａを設置した後に測定装置１０００の所定のボタンを押すと、輸入管１０４ａ〜１０４ｃが生理食塩水容器１０３ａに挿入され、電磁弁１０５ａ〜１０５ｅ、１４５と、エアーポンプ１４２ａ、及びシリンジ１０７ｂが自動的に駆動されて、生理食塩水の通過時間の測定が行われ、次に、輸入管１０４ａが移動して試料容器１０２に挿入されて、前記一連の動作により血液試料の通過時間の測定が行われ、その後さらに、輸入管１０４ａが移動して生理食塩水容器１０３ａ又は生理食塩水の入った別の試料容器に挿入され、前記一連の動作により生理食塩水の通過時間が再度測定される一連の流れが自動的に行われるようにしてもよい。また、輸入管１０４ａの先端部に３方電磁弁（不図示）を挿入して、生理食塩水容器１０３ａからの輸入管と試料容器１０２からの輸入管を切り替えるようにして、輸入管１０４ａの移動操作及び移動機構を省くようにしてもよい。さらに、シリンジ１０７ｂによる液面計１３０内の液面を初期位置に合わせる操作と試料容器から試料を採取・輸入する操作をマニュアルで行う半自動装置にしてもよい。
【００９６】
次に、図２Ｂを参照し、本発明の別の実施形態に係るマイクロチャネルチップ１０について説明する。
【００９７】
図２Ｂ（ａ）は、流路の大きさを複数段階変えたマイクロチャネルチップ１０のシンプルなモデル構成を示す平面図であり、（ｂ）及び（ｃ）は、そのＡＡ線断面図である。マイクロチャネルチップ１０は、（ｂ）に示す流路の深さ（Ｄ１＝Ｄ２＞Ｄ３）を有する構成であってもよいし、（ｃ）に示す流路の深さ（Ｄ１＞Ｄ２＞Ｄ３）を有する構成であってもよい。また、図２Ｂ（ｄ）は、ベース基板１１として表面が（１００）面又は（１１０）面であるシリコン基板を用い、酸化膜を耐エッチングマスクとして、ＫＯＨ溶液でエッチングした時に形成される流路の断面図である。このような断面形状の流路が形成されるのは、シリコン基板の（１１１）方向（（１１１）面に垂直な方向）に進むエッチング速度を１としたとき、（１００）方向（（１００）面に垂直な方向）に進むエッチング速度は１００、（１１０）方向（（１１０）面に垂直な方向）に進むエッチング速度は１６となる、結晶軸方向によって極めて大きくエッチング速度が異なる異方性があるからである。
【００９８】
前述したように、本実施形態のマイクロチャネルチップ１０は、シリコン又は樹脂製のベース基板１１上に形成され、ミクロンサイズの溝及び構造体が多数並べられたマイクロチャネルアレイ構造を有する。マイクロチャネルチップ１０は、石英、ガラス、又は樹脂製の透明基板１９で密閉され、血液や生理食塩水等が流入口や流出口以外の部分から漏れないようになっている。透明基板１９は、その全体が透明である必要はなく、少なくとも顕微鏡１１０で観察する部分（特に毛細血管を模擬する流路１５近傍）だけが可視光に対して透明であればよい。
【００９９】
マイクロチャネルチップ１０は、血液や生理食塩水等を注入する流入口１２（径Ｗin、長さＬin）を有する流入領域（幅Ｗ０、深さＤ０）と、該流入領域に接続され形成された第１流路１３（幅Ｗ１、深さＤ１）と、第１流路１３から二手に分かれ形成された第２流路１４（幅Ｗ２、深さＤ２）と、第２流路１４それぞれから二手に分かれ形成された第３流路１５（幅Ｗ３、深さＤ３）とを有する。また、マイクロチャネルチップ１０は、第３流路１５の隣接する２つが合流して形成された第４流路１６（幅Ｗ２、深さＤ２）と、第４流路１６の２つが合流して形成された第５流路１７（幅Ｗ１、深さＤ１）と、第５流路１７に接続され、血液や生理食塩水等を流出（排出）する流出口１８（径Ｗout、長さＬout）を有する流出領域（幅Ｗ０、深さＤ０）とを有する。
【０１００】
ここで、幅Ｗと深さＤの大きさは、Ｗ０≧Ｗ１＞Ｗ２＞Ｗ３であり、図２Ｂ（ｂ）ではＤ０＝Ｄ１＝Ｄ２＞Ｄ３であり、図２Ｂ（ｃ）ではＤ０＝Ｄ１＞Ｄ２＞Ｄ３である。図２Ｂ（ｂ）では、マイクロチャネルアレイ構造の加工ステップを低減する構成（Ｄ０＝Ｄ１＝Ｄ２）としているが、Ｄ０＞Ｄ１＞Ｄ２＞Ｄ３とする構成であってもよいし、Ｄ０＞Ｄ１＝Ｄ２＞Ｄ３とする構成であってもよい。図２Ｂ（ｃ）では、表面が（１００）面のシリコン基板にＫＯＨウェットエッチングで流路を加工した例であり、図２Ｂ（ｄ）に示すように、上記の異方性の結果、基板面に対して５４．７度の角度を持つ斜面（（１１１）面）に沿ってエッチングが進むため、適当な流路幅の大小関係Ｗ０≧Ｗ１＞Ｗ２（＞Ｗ３）を設定した時に、Ｄ０の深さまでエッチングを進めることで、Ｄ０＝Ｄ１＞Ｄ２（＞Ｄ３）の関係を実現できることを示している。また、第１流路１３の幅Ｗ及び深さＤの大きさは、第４流路１７の幅Ｗ及び深さＤの大きさと同じである必要はなく、異なるようにしてもよい。これは、流入領域及び流出領域の幅及び深さの関係、並びに第２流路１４及び第４流路１６の幅及び深さの関係についても同様である。また、図２Ｂに示す構成では、流入口１２の長さＬin及び流出口１８の長さＬoutはベース基板１１の厚さにあたり、流入口１２の径Ｗin及び流出口１８の径Ｗoutはそれぞれ流入領域の幅Ｗ０及び流出領域の幅Ｗ０と同じである。なお、流入口１２の経Ｗin及び流出口１８の経Ｗoutと、流入領域及び流出領域の幅Ｗ０は、試料の注入のしやすさ等に応じて調整される。
【０１０１】
第１流路１３は動脈〜細動脈、第２流路１４は細動脈、第３流路１５は毛細血管、第４流路１６は細静脈、そして第５流路１７は細静脈〜静脈を模擬している。限定されないが、幅Ｗ０は１ｍｍ〜数ｍｍ、幅Ｗ１は２０〜１５０μｍ、幅Ｗ２は１０〜５０μｍ、幅Ｗ３は３〜２５μｍ程度である。同様に、深さＤ０は１０〜３００μｍ、深さＤ１は１０〜１００μｍ、深さＤ２は１０〜６０μｍ、深さＤ３は３〜２５μｍ程度である。各流路１３〜１７の長さＬは適宜調整してもよい。一例では、マイクロチャネルチップ１０の流入領域及び流出領域並びに第１〜第５流路の幅Ｗ０〜Ｗ３が、Ｗ０＝３００μｍ、Ｗ１＝１００μｍ、Ｗ２＝３０μｍ、Ｗ３＝７μｍであり、深さＤ０〜Ｄ３が、Ｄ０＝Ｄ１＝Ｄ２＝５０μｍ、Ｄ３＝４．５μｍである。
【０１０２】
血液中の赤血球の大きさは７〜８μｍ程度、白血球の大きさは７〜２０μｍ、血小板の大きさは１〜４μｍ程度である。そのため、白血球の活性化の影響が生じやすい毛細血管を模擬した第３流路１５の幅Ｗ３は好ましくは５〜１０μｍであり、深さＤ３は好ましくは４〜８μｍである。また、第３流路１５の長さＬは、３０μｍ〜１２０μｍ程度、好ましくは５０〜７０μｍである。
【０１０３】
マイクロチャネルチップ１０は、前述のように一般的なフォトリソグラフィー技術を用いて作製することができるが、この例に限定されるものではない。
【０１０４】
マイクロチャネルチップ１０のベース基板１１として、樹脂製のベース基板を用いることができる。樹脂製ベース基板１１として用いる樹脂としては、アクリル系樹脂、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、スチレン系樹脂、アクリル・スチレン系共重合樹脂（ＭＳ樹脂）、ポリカーボネート系樹脂、ポリエチレンテレフタレートなどのポリエステル系樹脂、ポリビニルアルコール系樹脂、エチレン・ビニルアルコール系共重合樹脂、スチレン系エラストマーなどの熱可塑性エラストマー、塩化ビニル系樹脂、ポリジメチルシロキサンなどのシリコン樹脂、酢酸ビニル系樹脂、ポリビニルブチラール系樹脂等を使用することができる。また、これらの中で可視光に対して透明なものを、透明基板１９の材料として使用してもよい。
【０１０５】
前述のように、マイクロチャネルチップ１０のベース基板１１として表面が（１００）面又は（１１０）面であるシリコン基板を用い、酸化膜を耐エッチングマスクとして用いて、ＫＯＨ溶液でエッチングすることにより第３流路１５（深さＤ３）を形成してもよい。
【０１０６】
同様に、マイクロチャネルチップ１０のベース基板１１として表面が（１００）面又は（１１０）面であるシリコン基板を用い、酸化膜を耐エッチングマスクとして用いて、ＫＯＨ溶液でエッチングすることにより第１流路１３〜第２流路１４及び第４流路１６〜第５流路１７（深さＤ２）を形成してもよい。
【０１０７】
同様に、マイクロチャネルチップ１０のベース基板１１として表面が（１００）面又は（１１０）面であるシリコン基板を用い、酸化膜を耐エッチングマスクとして用いて、ＫＯＨ溶液で基板背面からエッチングすることにより流入口１２（長さＬin）を有する流入領域及び流出口１８（長さＬout）を有する流出領域を形成してもよい。又は、金属マスクを用いたサンドブラスト法により該流入領域及び該流出領域を形成してもよい。
【０１０８】
マイクロチャネルチップ１０に設ける薄膜２０（酸化膜２０）は、形成される酸化膜の質・特性を考え、熱酸化法を用いて形成してもよい。この場合、マイクロチャネルチップのマイクロチャネルアレイ構造上に水蒸気中を流しながら熱酸化を行うウェット法を用いて酸化膜を形成する。そして、形成した酸化膜中に混成されるＳｉＯをＳｉＯ２に再酸化するために、ウェット法に続いて、該酸化膜の表面から該酸化膜の厚さの１０分の１の深さまで酸素ガスを流しながら熱酸化を行うドライ法を行う。この再酸化処理によって、特許文献３に開示されている細胞マイクロレオロジー観察・測定用ディスポーザブルチップによる再現性の課題を改善することが可能となる。再酸化処理は初めにドライ法で安定な酸化膜を形成してから、次にウェット法で酸化膜の厚さを増加させる順番で行ってもよい。このようにして形成する酸化膜の厚さは、血球像の明瞭さとマイクロチャネルアレイ構造の強度補強の点から、好ましくは０．４〜１．０μｍである。
【０１０９】
マイクロチャネルチップ１０は、図４Ｂに示す基板貫通孔とマイクロチャネルの配置を図４Ｃや図４Ｄに示す構成にしてもよい。図４Ｃや図４Ｄに示す構成とすることで、図４Ｂに示す構成に比べて、同一基板サイズの場合にはマイクロチャネルの数をさらに増やすことができ、同一マイクロチャネル数の場合には基板サイズをより小さくすることが可能となる。例えば、７ｍｍ ｘ １４ｍｍの基板サイズを７ｍｍ ｘ １０ｍｍの基板サイズへと約３０％基板の面積を小さくすることができる。なお、図４Ｃ及び図４Ｄ中のハッチング部分は、図中の拡大図に示すように、微細な流路が形成されていることを示している。
【０１１０】
図４Ｃと図４Ｄに示すマイクロチャネルチップ１０の幅Ｗ０の流路にはそれぞれ二つの基板貫通孔１２ａ、１２ｂ及び１８ａ、１８ｂが形成され、基板貫通孔１２ａ、１２ｂ及び１８ａ、１８ｂそれぞれの間の中間位置には血球計算盤として使用することができる升目４０ａ、４０ｂがそれぞれ彫り込まれている。
【０１１１】
図１３に示す測定装置１０００の概略構成図において、マイクロチャネルチップ１０の入出力口１２、１８それぞれに同軸二重チューブ（１０４ａと１０９ａ、１０４ｂと１０９ｂ）が接続されているが、図４Ｃと図４Ｄに示すマイクロチャネルチップ１０に対しては、該同軸二重チューブの内側輸入管（１０４ａ、１０４ｂ）と外側輸出管（１０９ａ、１０９ｂ）のそれぞれが単独に該基板貫通孔１２ａ、１８ａ及び１２ｂ、１８ｂそれぞれに接続する構成になる。つまり、輸入管１０４ａが貫通孔１２ａに接続され、輸出管１０９ａが貫通孔１２ｂに接続され、輸入管１０４ｂが貫通孔１８ａに接続され、輸出管１０９ｂが貫通孔１８ｂに接続される。この接続によって、血液試料はマイクロチャネルチップ内のＷ０幅の流路内まで注入されることになる。
【０１１２】
血液試料の通過時間が測定された後、このマイクロチャネルチップ１０内の血球計算盤４０ａ、４０ｂを用いて該血液試料中の血球数が顕微鏡画像として測定されることの利点は大きい。また、白血球浮遊液試料や希釈率の大きい全血希釈試料をマイクロチャネルチップ１０に流した時の入力側の白血球数（血球計算盤４０ａで計測した白血球数）と出力側の白血球数（血球計算盤４０ｂで計測した白血球数）との差は、マイクロチャネルアレイ構造に捕捉された白血球数に相当し、この値も白血球の活性化度の指標となる。
【０１１３】
図５Ｂは、本発明の別の実施形態に係るマイクロチャネルアレイ構造の多様なパターンのバリエーションを示す。
【０１１４】
白血球の活性化度の違いによって、図５Ｂの各種パターンのマイクロチャネルアレイ構造を通過する時間は大きく違ってくると考えられる。図５Ｂ（ａ）は個々のマイクロチャネル（流路１５）の側壁に毛細血管壁表面を模擬する０．５〜２．０マイクロメーターの段差幅の凹凸構造５００を加工した例を示す。この側壁の微小な凹凸構造５００は、通過する血液（白血球）に対して摩擦力を与える。また、図５Ｂ（ｂ）〜（ｄ）に示すように、流路１５が形成されていてもよい。
【０１１５】
図６Ｂは、本発明の別の実施形態に係るマイクロチャネルチップ１０のホルダー１０１の概略構成図である。ホルダー１０１は、下受け部５０ａ及び押さえ部５０ｂを備え、下受け部５０ａにマイクロチャネルチップ１０とゴムシール５５を重ねて入れ、その上に押さえ部５０ｂを入れた状態で、顕微鏡観察台６０上に固定されたホルダー受け６１に挿入される。ホルダー受け６１上に固定された押しネジ機構６２、６３によって押さえ部５０ｂを下受け部５０ａに対して押し付けることにより、ゴムシール５５を介してマイクロチャネルチップ１０は透明基板１９に圧着される。押さえ部５０ｂには貫通孔である流入路５１及び流出路５２と流入路５３と流出路５４が設けられている。流入路５１及び流出路５２はそれぞれマイクロチャネルチップ１０の流入口１２及び流出口１８に接続される。流入路５３と流出路５４は押さえ部５０ｂの底部に彫られた溝により連通している。図６Ｃはガラス基板１９がマイクロチャネルチップ１０の表面に接合されているマイクロチャネルチップに対するホルダーの概略構成図であり、下受け部５０ａの構造がわずかに図６Ｂに示したものから異なっているだけである。
【０１１６】
上記実施形態及び実施例で説明される寸法、材料、形状、構成要素の相対的な位置等は任意であり、本発明が適用される装置の構造又は様々な条件に応じて変更される。また、本発明は、具体的に記載された上記実施形態に限定されるものではない。本発明には、前述の実施形態を任意に組み合わせた形態も含まれる。
【符号の説明】
【０１１７】
１０：マイクロチャネルチップ
１００、１０００：測定装置
１０１：チップホルダー
１０２：試料容器（第１の容器）
１０３ａ：生理食塩水容器（第２の容器）
１０４ａ〜１０４ｃ：輸入管
１０６：バルブ
１０７、１３０：液面計
１０７ｂ：シリンジ
１０８：回収容器
１０９ａ〜１０９ｃ：輸出管
１１０：顕微鏡
１２０：端末
１２１：記憶部
１２２：処理部
１４０：恒温水槽
【図１】
0006664608.tif 000003
【図２Ａ】
0006664608.tif 000004
【図２Ｂ】
0006664608.tif 000005
【図３Ａ】
0006664608.tif 000006
【図３Ｂ】
0006664608.tif 000007
【図４Ａ】
0006664608.tif 000008
【図４Ｂ】
0006664608.tif 000009
【図４Ｃ】
0006664608.tif 000010
【図４Ｄ】
0006664608.tif 000011
【図５Ａ】
0006664608.tif 000012
【図５Ｂ】
0006664608.tif 000013
【図６Ａ】
0006664608.tif 000014
【図６Ｂ】
0006664608.tif 000015
【図６Ｃ】
0006664608.tif 000016
【図７Ａ】
0006664608.tif 000017
【図７Ｂ】
0006664608.tif 000018
【図８】
0006664608.tif 000019
【図９】
0006664608.tif 000020
【図１０】
0006664608.tif 000021
【図１１】
0006664608.tif 000022
【図１２】
0006664608.tif 000023
【図１３】
0006664608.tif 000024