(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
医薬的に許容可能なキャリアと、式（Ｉ）の化合物またはその塩とを含む、医薬組成物：
【化１】
0006782710.tif 000007
（式中、ＸはＮまたはＣＨであり；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５の各々は独立に、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ２〜Ｃ１０アルケニル、Ｃ２〜Ｃ１０アルキニル、Ｃ３〜Ｃ２０シクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ２０シクロアルケニル、Ｃ１〜Ｃ２０ヘテロシクロアルキル、Ｃ１〜Ｃ２０ヘテロシクロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、ハロ、ＯＲａ、ＳＲａ、ＣＯＯＲａ、ＯＣ（Ｏ）Ｒａ、Ｃ（Ｏ）Ｒａ、Ｃ（Ｏ）ＮＲａＲｂ、Ｓ（Ｏ）２ＮＲａＲｂ、またはＮＲａＲｂであり；
Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８およびＲ９の各々は独立に、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ２〜Ｃ１０アルケニル、Ｃ２〜Ｃ１０アルキニル、Ｃ３〜Ｃ２０シクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ２０シクロアルケニル、Ｃ１〜Ｃ２０ヘテロシクロアルキル、Ｃ１〜Ｃ２０ヘテロシクロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、ハロ、ＯＲａ、ＳＲａ、ＣＯＯＲａ、ＯＣ（Ｏ）Ｒａ、Ｃ（Ｏ）Ｒａ、Ｃ（Ｏ）ＮＲａＲｂ、Ｓ（Ｏ）２ＮＲａＲｂ、もしくはＮＲａＲｂであるか；または、Ｒ６およびＲ７、Ｒ７およびＲ８、もしくはＲ８およびＲ９が、それらに結合している炭素原子と一緒にアリール、ヘテロアリール、Ｃ３〜Ｃ２０シクロアルキルもしくはＣ１〜Ｃ２０ヘテロシクロアルキルになっており；
Ｒ１０はＣ１〜Ｃ１０アルキルであり；
各Ｒａは独立に、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ２〜Ｃ１０アルケニル、Ｃ２〜Ｃ１０アルキニル、Ｃ３〜Ｃ２０シクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ２０シクロアルケニル、Ｃ１〜Ｃ２０ヘテロシクロアルキル、Ｃ１〜Ｃ２０ヘテロシクロアルケニル、アリールまたはヘテロアリールであり；
各Ｒｂは独立に、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ２〜Ｃ１０アルケニル、Ｃ２〜Ｃ１０アルキニル、Ｃ３〜Ｃ２０シクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ２０シクロアルケニル、Ｃ１〜Ｃ２０ヘテロシクロアルキル、Ｃ１〜Ｃ２０ヘテロシクロアルケニル、アリールまたはヘテロアリールである）。
【請求項２】
ＸがＮである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８およびＲ９の各々が独立に、ＨまたはＣ１〜Ｃ１０アルキルである、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
Ｒ７がＣＨ２ＣＨ３である、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
Ｒ１０がＣＨ３である、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記化合物が
【化２】
0006782710.tif 000008
である、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
ＸがＣＨである、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８およびＲ９の各々が独立に、ＨまたはＣ１〜Ｃ１０アルキルである、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
Ｒ７がＣＨ２ＣＨ３である、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
Ｒ１０がＣＨ３である、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記化合物が
【化３】
0006782710.tif 000009
である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
抗癌剤をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記抗癌剤が、デキサメタゾン、ビンクリスチン、またはＰＡＫ阻害剤である、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
被験体のＲａｃ−ＧＴＰアーゼ媒介性障害の処置に用いるためのものである、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１５】
前記Ｒａｃ−ＧＴＰアーゼ媒介性障害が癌である、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記癌が白血病である、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
癌が小児急性リンパ球性白血病である、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記Ｒａｃ−ＧＴＰアーゼ媒介性障害が炎症性障害である、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１９】
前記Ｒａｃ−ＧＴＰアーゼ媒介性障害が骨吸収障害である、請求項１４に記載の組成物。
【請求項２０】
医薬として使用するための請求項１〜１３のいずれかに記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下、２０１５年４月２４日に出願された米国仮特許出願第６２／１５２，３５０号に基づく優先権を主張するものであり、その開示はその全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
背景
Ｒｈｏ  ＧＴＰアーゼは、低分子量ＧＴＰアーゼのＲａｓスーパーファミリーの分科を構成する。それらは、細胞遊走、細胞分極、膜輸送、細胞骨格配置、増殖、アポトーシスおよび転写制御を含めた多様な細胞プロセスの調節において重要な役割を果たす（Ｅｔｉｅｎｎｅ−Ｍａｎｎｅｖｉｌｌｅ，Ｓ．ら（２００２）、Ｎａｔｕｒｅ  ４２０、６２９−６３５；Ｂｏｅｔｔｎｅｒ，Ｂ．ら（２００２）、Ｇｅｎｅ  ２８６、１５５−１７４）。それゆえにＲｈｏ  ＧＴＰアーゼは、心血管疾患および癌を含めた様々なヒト疾患の発病機序と関係があるとされてきた（Ｈａｌｌ，Ａ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９８、２７９、５０９−５１４；Ｗｅｎｎｅｒｂｅｒｇ，Ｋ．およびＤｅｒ，Ｃ．Ｊ．（２００４）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．１１７、１３０１−１３１２；Ｒｉｄｌｅｙ，Ａ．Ｊ．（２００６）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１６、５２２−５２９）。
【０００３】
Ｒｈｏファミリーは、Ｒａｃを含めてヒトの少なくとも２５個のタンパク質をコードする２２個の遺伝子からなる。ＲｈｏファミリーメンバーはＧＴＰに結合し、不活性型ＧＤＰ結合状態と活性型ＧＴＰ結合状態との間で遷移する。そうすることでＲｈｏファミリーメンバーの多くは、それらの活性状態にあるときにＧＴＰアーゼ活性を呈する。状態間でのこのサイクルは、グアニンヌクレオチド交換因子（ＧＥＦ）；ＧＴＰアーゼ活性化タンパク質（ＧＡＰ）；および負の制御因子として作用するＧＤＰ解離阻害因子（ＧＤＩ）によって制御される。（Ｍａｌｕｍｂｒｅｓ，Ｍ．ら（２００３）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ  ３、４５９−４６５）。静止細胞においてＲｈｏ  ＧＴＰアーゼは主として不活性型ＧＤＰ結合状態にあるが、成長刺激があるとＧＥＦが活性化され、続いてグアニンヌクレオチド交換活性を刺激して活性型ＧＴＰ結合Ｒｈｏの形成を促進する。ＧＴＰに結合すると活性型Ｒｈｏ  ＧＴＰアーゼは、タンパク質キナーゼとアダプター機能を有するその他のタンパク質とを含めた下流エフェクターと相互作用する。Ｒｈｏ  ＧＴＰアーゼの内在的ＧＴＰ加水分解機能性は、後にＲｈｏ特異的なＧＴＰアーゼ活性化タンパク質によって刺激される。これはＲｈｏタンパク質をその不活性状態に戻す。Ｒａｃ特異的なＲｈｏＧＥＦとしては、例えば、Ｔｉａｍ１およびＴｒｉｏが挙げられる（Ｇａｏ，Ｙ．ら（２００４）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１０１、７６１８−７６２３）。
【０００４】
Ｒａｃサブファミリーも細胞形質転換と関連付けられており、それゆえにＲｈｏ  ＧＴＰアーゼの異常活性は癌と関係がある。それらは、Ｒａｓおよび他の癌遺伝子によって引き起こされる形質転換において本質的な役割を果たす。Ｒａｃ１のＲａｃ１ｂスプライシング変異型は、恒常的に活性であることおよび形質転換性であることが示されており；その過剰発現は乳癌においても結腸癌においても認められた（Ｑｉｕ，Ｒ．Ｇ．ら（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ  ３７４、４５７−４５９；Ｋｈｏｓｒａｖｉ−Ｆａｒ，Ｒ．ら（１９９５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５、６４４３−６４５３；Ｒｅｎｓｈａｗ，Ｍ．Ｗ．ら（１９９６）Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．６、７６−８３；Ｆｅｒｒａｒｏ，Ｄ．ら（２００６）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２５、３６８９−３６９８）。例えば、Ｒａｃ３突然変異体は脳腫瘍に認められ、Ｒａｃ１およびＲａｃ３はどちらも神経膠芽腫の浸潤と関連付けられた（Ｈｗａｎｇ，Ｓ．Ｌ．ら（２００５）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１２、５７１−５７４）。
【０００５】
悪性細胞において、異常なＲｈｏ  ＧＴＰアーゼ活性は、Ｒｈｏ  ＧＴＰアーゼの発現の変化、またはＲｈｏの機能を制御するＧＥＦまたはＧＡＰの撹乱された機能に起因している（Ｋａｒｎｏｕｂ，Ａ．Ｅ．ら（２００４）、Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．Ｔｒｅａｔ．８４、６１−７１）。細胞形質転換にＲｈｏが関与している証拠ゆえに、Ｒｈｏ  ＧＴＰアーゼは抗癌療法の妥当な標的である。ＧＥＦとそれらの各々のＲｈｏファミリーメンバーとの相互作用を阻害する化合物は、Ｒｈｏ活性の有用な阻害剤となるであろうとともに大きな特異性を呈するであろう。Ｒａｃ１に結合し、Ｒａｃ特異的なＲｈｏＧＥＦによるＲａｃ１の活性化を妨げるものとして、これまでに小分子ＮＳＣ２３７６６（すなわち、Ｎ６−［２−［［４−（ジエチルアミノ）−１−メチルブチル］アミノ］−６−メチル−４−ピリミジニル］−２−メチル−４，６−キノリンジアミン三塩酸塩）が同定されている。しかし、いくらかのＧＥＦ活性は遮断されなかった。
【０００６】
慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）は、フィラデルフィア染色体の産物であるｐ２１０−ＢＣＲ−ＡＢＬの発現を特徴とする悪性疾患である。それは、慢性顆粒球性白血病（ＣＧＬ）としても知られているが、白血球の癌であり、主に骨髄中の骨髄細胞の成長の増加およびアップレギュレーションならびに血中でのこれらの細胞の蓄積を特徴とする。マウスモデルにおいてＲｈｏ  ＧＴＰアーゼＲａｃ１およびＲａｃ２の欠損は、ｐ２１０−ＢＣＲ−ＡＢＬ媒介性増殖の著しい低減を示した。Ｒａｃはまた、他の種類の白血病、例えばＭＬＬ媒介性急性白血病において役割を担うことも示された（Ｍｉｚｕｋａｗａ  Ｂ．ら、Ｂｌｏｏｄ  ２０１１；１１８：５２３５−４５）。上記証拠はＲａｃを白血病治療の潜在的標的として強く示唆した（Ｅ  Ｋ  Ｔｈｏｍａｓら、Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ２２、８９８−９０４、２００８年５月）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｅｔｉｅｎｎｅ−Ｍａｎｎｅｖｉｌｌｅ，Ｓ．ら（２００２）、Ｎａｔｕｒｅ  ４２０、６２９−６３５
【非特許文献２】Ｂｏｅｔｔｎｅｒ，Ｂ．ら（２００２）、Ｇｅｎｅ  ２８６、１５５−１７４
【非特許文献３】Ｈａｌｌ，Ａ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９８、２７９、５０９−５１４
【非特許文献４】Ｗｅｎｎｅｒｂｅｒｇ，Ｋ．およびＤｅｒ，Ｃ．Ｊ．（２００４）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．１１７、１３０１−１３１２
【非特許文献５】Ｒｉｄｌｅｙ，Ａ．Ｊ．（２００６）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１６、５２２−５２９
【非特許文献６】Ｍａｌｕｍｂｒｅｓ，Ｍ．ら（２００３）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ  ３、４５９−４６５
【非特許文献７】Ｇａｏ，Ｙ．ら（２００４）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１０１、７６１８−７６２３
【非特許文献８】Ｑｉｕ，Ｒ．Ｇ．ら（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ  ３７４、４５７−４５９
【非特許文献９】Ｋｈｏｓｒａｖｉ−Ｆａｒ，Ｒ．ら（１９９５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５、６４４３−６４５３
【非特許文献１０】Ｒｅｎｓｈａｗ，Ｍ．Ｗ．ら（１９９６）Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．６、７６−８３
【非特許文献１１】Ｆｅｒｒａｒｏ，Ｄ．ら（２００６）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２５、３６８９−３６９８
【非特許文献１２】Ｈｗａｎｇ，Ｓ．Ｌ．ら（２００５）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１２、５７１−５７４
【非特許文献１３】Ｋａｒｎｏｕｂ，Ａ．Ｅ．ら（２００４）、Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．Ｔｒｅａｔ．８４、６１−７１
【非特許文献１４】Ｍｉｚｕｋａｗａ  Ｂ．ら、Ｂｌｏｏｄ  ２０１１；１１８：５２３５−４５
【非特許文献１５】Ｅ  Ｋ  Ｔｈｏｍａｓら、Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ２２、８９８−９０４、２００８年５月
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
概要
本開示は、Ｒａｃ−ＧＴＰアーゼタンパク質に対するドッキングの解析によって同定された特定の抗癌化合物の発見に基づく。特に、この検査によって同定されたこれらの化合物の１つ以上は、思いがけないことに、正常細胞に対して低い毒性を有しながら癌細胞の増殖を阻害する優れた活性を呈した。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
一態様において本開示は、薬学的に許容可能なキャリアと、（例えば活性薬剤としての）式（Ｉ）の化合物またはその塩とを含む、医薬組成物を特徴とする。
【００１０】
【化１】
0006782710.tif 000002
【００１１】
式（Ｉ）中、ＸはＮまたはＣＨであり；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５の各々は独立に、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ２〜Ｃ１０アルケニル、Ｃ２〜Ｃ１０アルキニル、Ｃ３〜Ｃ２０シクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ２０シクロアルケニル、Ｃ１〜Ｃ２０ヘテロシクロアルキル、Ｃ１〜Ｃ２０ヘテロシクロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、ハロ、ＯＲａ、ＳＲａ、ＣＯＯＲａ、ＯＣ（Ｏ）Ｒａ、Ｃ（Ｏ）Ｒａ、Ｃ（Ｏ）ＮＲａＲｂ、Ｓ（Ｏ）２ＮＲａＲｂ、またはＮＲａＲｂであり；Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８およびＲ９の各々は独立に、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ２〜Ｃ１０アルケニル、Ｃ２〜Ｃ１０アルキニル、Ｃ３〜Ｃ２０シクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ２０シクロアルケニル、Ｃ１〜Ｃ２０ヘテロシクロアルキル、Ｃ１〜Ｃ２０ヘテロシクロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、ハロ、ＯＲａ、ＳＲａ、ＣＯＯＲａ、ＯＣ（Ｏ）Ｒａ、Ｃ（Ｏ）Ｒａ、Ｃ（Ｏ）ＮＲａＲｂ、Ｓ（Ｏ）２ＮＲａＲｂ、もしくはＮＲａＲｂであるか；または、Ｒ６およびＲ７、Ｒ７およびＲ８、もしくはＲ８およびＲ９が、それらに結合している炭素原子と一緒にアリール、ヘテロアリール、Ｃ３〜Ｃ２０シクロアルキルもしくはＣ１〜Ｃ２０ヘテロシクロアルキルになっており；Ｒ１０はＣ１〜Ｃ１０アルキルであり；各Ｒａは独立に、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ２〜Ｃ１０アルケニル、Ｃ２〜Ｃ１０アルキニル、Ｃ３〜Ｃ２０シクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ２０シクロアルケニル、Ｃ１〜Ｃ２０ヘテロシクロアルキル、Ｃ１〜Ｃ２０ヘテロシクロアルケニル、アリールまたはヘテロアリールであり；そして各Ｒｂは独立に、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ２〜Ｃ１０アルケニル、Ｃ２〜Ｃ１０アルキニル、Ｃ３〜Ｃ２０シクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ２０シクロアルケニル、Ｃ１〜Ｃ２０ヘテロシクロアルキル、Ｃ１〜Ｃ２０ヘテロシクロアルケニル、アリールまたはヘテロアリールである。
【００１２】
式（Ｉ）を参照して、上記の化合物のサブセットは、ＸがＮである化合物である。そのような化合物において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８およびＲ９の各々は独立に、ＨまたはＣ１〜Ｃ１０アルキル（例えばＣＨ２ＣＨ３）であることができる。例えば、これらの化合物において、Ｒ７はＣＨ２ＣＨ３であることができ、Ｒ１０はＣＨ３であることができる。そのような化合物の一例は、
【００１３】
【化２】
0006782710.tif 000003
【００１４】
（すなわち化合物１）である。
式（Ｉ）を参照して、上記化合物の別のサブセットは、ＸがＣＨである化合物である。そのような化合物において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８およびＲ９の各々は独立に、ＨまたはＣ１〜Ｃ１０アルキル（例えばＣＨ２ＣＨ３）であることができる。例えば、これらの化合物において、Ｒ７はＣＨ２ＣＨ３であることができ、Ｒ１０はＣＨ３であることができる。そのような化合物の一例は、
【００１５】
【化３】
0006782710.tif 000004
【００１６】
（すなわち化合物２）である。
用語「アルキル」は、飽和の直鎖または分枝の炭化水素部分、例えば、−ＣＨ３または−ＣＨ（ＣＨ３）２を指す。用語「アルケニル」は、少なくとも１つの二重結合を含有する直鎖または分枝の炭化水素部分、例えば、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ３を指す。用語「アルキニル」は、少なくとも１つの三重結合を含有する直鎖または分枝の炭化水素部分、例えば、−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ３を指す。用語「シクロアルキル」は、飽和環式炭化水素部分、例えばシクロヘキシルを指す。用語「シクロアルケニル」は、少なくとも１つの二重結合を含有する非芳香族系環式炭化水素部分、例えばシクロヘキセニルを指す。用語「ヘテロシクロアルキル」は、少なくとも１個の環構成ヘテロ原子（例えば、Ｎ、ＯまたはＳ）を有する飽和環式部分、例えば、４−テトラヒドロピラニルを指す。用語「ヘテロシクロアルケニル」は、少なくとも１つの環構成ヘテロ原子（例えば、Ｎ、ＯまたはＳ）および少なくとも１つの環構成二重結合を有する非芳香族系環式部分、例えばピラニルをいう。用語「アリール」は、１つ以上の芳香族環を有する炭化水素部分を指す。アリール部分の例としては、フェニル（Ｐｈ）、フェニレン、ナフチル、ナフチレン、ピレニル、アントリルおよびフェナントリルが挙げられる。用語「ヘテロアリール」は、少なくとも１つのヘテロ原子（例えば、Ｎ、ＯまたはＳ）を含有する１つ以上の芳香族環を有する部分を指す。ヘテロアリール部分の例としては、フリル、フリレン、フルオレニル、ピロリル、チエニル、オキサゾリル、イミダゾリル、チアゾリル、ピリジル、ピリミジニル、キナゾリニル、キノリル、イソキノリルおよびインドリルが挙げられる。
【００１７】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物はさらに抗癌剤を含むことができる。例えば、抗癌剤は、デキサメタゾン、ビンクリスチン、またはＰＡＫ阻害剤であることができる。
【００１８】
別の態様では、本開示は、Ｒａｃ−ＧＴＰアーゼ媒介性障害を処置する方法を特徴とする。当該方法は、それを必要とする被験体に上記化合物のうちの１つ以上を有効量投与することを含む。Ｒａｃ−ＧＴＰアーゼ媒介性障害の例としては、心血管疾患、免疫不全疾患、炎症性障害および癌が挙げられる。Ｒａｃの例としては、Ｒａｃ１、Ｒａｃ２およびＲａｃ３が挙げられる。Ｒａｃ−ＧＴＰアーゼの例としては、Ｒａｃ１−ＧＴＰアーゼ、Ｒａｃ２−ＧＴＰアーゼ、およびＲａｃ３−ＧＴＰアーゼが挙げられる。
【００１９】
「処置する」または「処置」という用語は、上記化合物のうちの１つ以上を、そのような化合物による処置が可能な障害および／またはそのような障害の症候および／またはそのような障害の素因を有する被験体に、治療作用を与える目的で、例えば上記の障害、その症候またはその素因に対して治癒、緩和、変化、作用、改善または予防をもたらす目的で、投与することを指す。
【００２０】
本明細書に記載の化合物には、化合物自体が含まれるだけでなく、適用可能な場合にはそれらの塩、プロドラッグおよび溶媒和物も含まれる。プロドラッグの例には、被験体への投与に際して活性化合物を提供することができるエステルおよびその他の医薬的に許容可能な誘導体が含まれる。溶媒和物は、活性化合物と医薬的に許容可能な溶媒との間で形成される複合体を指す。医薬的に許容可能な溶媒の例としては、水、エタノール、イソプロパノール、酢酸エチル、酢酸およびエタノールアミンが挙げられる。
【００２１】
上記障害の処置に使用するための上記化合物のうちの１つ以上を含有する組成物、および上記処置のための医薬を製造するためのそのような組成物の使用も、本発明の範囲内に含まれる。
【００２２】
以下の記載において１つ以上の実施形態の詳細を示す。その他の特徴、目的および利点は、説明、図面および特許請求の範囲から明らかとなろう。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は、Ｒａｃと、そのそれぞれのＧＥＦであるＴｉａｍとの相互作用のｉｎ  ｓｉｌｉｃｏドッキングを描写する。
【図２Ａ】図２Ａは、ウェスタンブロット分析を示し、化合物１が用量依存的にＲａｃ活性化を低減したものの、総Ｒａｃレベルに対して有意な影響を及ぼさなかったことを指し示している。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ＤＭＳＯ、ＮＳＣ２３７６６および化合物１から得られたプルダウン実験の定量を示す。
【図３Ａ】図３Ａは、ＭＴＳ検査によって測定した、ＳＥＭ細胞における化合物１の用量依存的な増殖阻害を例示するグラフを示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ＭＴＳ検査によって測定した、Ｐ１２−Ｉｃｈｉｋａｗａ細胞における化合物１による用量依存的な増殖阻害を例示するグラフを示す。
【図３Ｃ】図３Ｃは、ＭＴＳ検査によって測定した、Ｌｏｕｃｙ細胞における化合物１の用量依存的な増殖阻害を例示するグラフを示す。
【図４Ａ】図４Ａは、ＳＥＭ細胞株の細胞アポトーシスおよび細胞死に対するＤＭＳＯ、ＮＳＣ２３７６６および化合物１の効果を示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、Ｐ１２細胞株の細胞アポトーシスおよび細胞死に対するＤＭＳＯ、ＮＳＣ２３７６６および化合物１の効果を示す。
【図５】図５は、コロニー形成単位検査でのＤＭＳＯ、ＮＳＣ２３７６６および化合物１の毒性試験結果を示す。
【図６】図６は、用量２５０ｍｇ／ｋｇの化合物１またはビヒクルで１日２回、２１日間処置した白血病マウスの、最終投与後の化合物１またはビヒクルの血漿中レベルを示す。
【図７】図７は、化合物１またはビヒクルで処置したマウスにおいて白血病性芽球で浸潤した脾臓に対してＥｌｉｓａ検査を用いることにより決定した、Ｒａｃ活性化状態を示す。
【図８Ａ】図８Ａは、化合物１およびビヒクルで処置したグループのマウスの相対重量を示す。
【図８Ｂ】図８Ｂは、化合物１およびビヒクルで処置したマウスから得られた、マウスを仰臥位で撮像したときの生物発光データを示す。
【図８Ｃ】図８Ｃは、化合物１およびビヒクルで処置したマウスから得られた、マウスを腹臥位で撮像したときの生物発光データを示す。
【図９】図９は、化合物１およびビヒクルで２１日間処置したグループのマウスから得られた、マウスを仰臥位および腹臥位で撮像したときの代表的な実際の画像を示す。
【図１０Ａ】図１０Ａは、ウェスタンブロット分析を示し、化合物１が用量依存的にＣＤＣ４２活性化を低減したものの、総ＣＤＣ４２レベルに対して有意な影響を及ぼさなかったことを指し示している。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、ＤＭＳＯ、ＮＳＣ２３７６６および化合物１から得られたプルダウン実験の定量を示す。
【図１１Ａ】図１１Ａは、ＲＨＯＡ活性化に関する化合物１のウェスタンブロット分析、ならびにＤＭＳＯ、ＮＳＣ２３７７６および化合物１から得られたプルダウン実験の定量を示す。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、ＲＡＳ活性化に関する化合物１のウェスタンブロット分析、ならびにＤＭＳＯ、ＮＳＣ２３７７６および化合物１から得られたプルダウン実験の定量を示す。
【図１２Ａ】図１２Ａは、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ検査によって測定した、ＳＥＭ細胞における化合物２の用量依存的な増殖阻害を示す。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、ＳＥＭ細胞株の細胞アポトーシスおよび細胞死に対するＤＭＳＯ、ＮＳＣ２３７６６および化合物２の効果を示す。
【図１２Ｃ】図１２Ｃは、コロニー形成単位検査でのＤＭＳＯ、ＮＳＣ２３７６６および化合物２の毒性試験結果を示す。
【図１３Ａ】図１３Ａは、化合物２およびビヒクルで処置したグループのマウスの相対重量を示す。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、化合物２およびビヒクルで処置したマウスから得られた、マウスを仰臥位で撮像したときの生物発光データを示す。
【図１３Ｃ】図１３Ｃは、化合物２およびビヒクルで１５日間処置したグループのマウスから得られた、マウスを仰臥位で撮像したときの代表的な実際の画像を示す。
【図１４Ａ】図１４Ａは、化合物２とデキサメタゾンとを含有する薬物合剤のアイソボログラムを示す。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、化合物２とビンクリスチンとを含有する薬物合剤のアイソボログラムを示す。
【図１４Ｃ】図１４Ｃは、化合物２とＰＦ−３７５８３０９とを含有する薬物合剤のアイソボログラムを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
詳細な説明
本開示は、ＲｈｏファミリーメンバーであるＲａｃとその特異的活性化因子ＧＥＦであるＴｉａｍとの相互作用に基づく定量的高処理能アッセイ、およびＲａｃ２結晶構造に対する個々の化合物のｉｎ  ｓｉｌｉｃｏドッキングを用いて、抗癌活性を有するものとして同定された、特定の化合物に関する。当該化合物は、思いがけないことに、インビトロでの白血病細胞の増殖阻害を呈し、特定の化合物の場合には正常な骨髄細胞に対する毒性が最小限に抑えられる。
【００２５】
本明細書に記載の化合物は全て、当該技術分野において周知の方法によって調製することができ、かつ／または商業的供給源から得ることができる。例えば、これらの化合物は、Ｅｖｏｔｅｃ  ＡＧのＥＶＯｓｏｕｒｃｅデータベースで特定することができ、シグマアルドリッチ（ミシガン州セントルイス）などの商業的供給源から購入することができる。合成した化合物は、カラムクロマトグラフィー、高圧液体クロマトグラフィーまたは再結晶などの適切な方法で精製することができる。
【００２６】
本明細書に記載の化合物は、非芳香族性二重結合および１つ以上の不斉中心を含有し得る。したがって、それらは、ラセミ体およびラセミ混合物、単一のエナンチオマー、個々のジアステレオマー、ジアステレオマー混合物、ならびにシスまたはトランス異性体として生じる可能性がある。全てのそのような異性体が企図される。
【００２７】
化合物は、スクリーニング方法、例えば、癌細胞の増殖を阻害する化合物を同定するアッセイによって同定することができる。これに代えて、またはそれに加えて、標的タンパク質（例えば、Ｒａｃ−ＧＴＰアーゼ）の活性化を阻害する化合物を同定する検査を用いて、かつ／または標的タンパク質の構造に対する化合物ドッキングのｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ解析によって、化合物を同定することができる。
【００２８】
例えば、スクリーニング方法としては、様々な期間に亘って様々な用量の化合物に白血病細胞株（例えば、ＲＥＭ、ＳＥＭ、ＭＶ４１１、ＲＳ４１１、Ｊｕｒｋａｔ、Ｒａｊｉ、Ｎｏｍｏ−１、Ｍａｉｍ６またはＭＬ２）を曝露することを挙げることができる。細胞の生存を阻害する候補化合物は、化合物の存在下で細胞が増殖する能力に基づいて同定することができる。そのようなスクリーニング方法は、特定細胞株からの細胞と、液体培地と、候補化合物とを含む容器の中で行うことができる。容器は、例えば、ペトリ皿、組織培養フラスコ、２４ウェルプレート、４８ウェルプレート、９６ウェルプレート、３８４ウェルプレート、１５３６ウェルプレート、３４５６ウェルプレート、またはその他の任意の適切な容器とすることができる。高処理能スクリーニング方法において、容器の各ウェルは、異なる候補化合物を収容し得る。当該技術分野において理解されるように、スクリーニング方法は、ハイスループットを得るために自動化され得る。例えば、標準的なマイクロタイタープレートにおいて液体培地中でＭＴＳアッセイを実施することができる。さらに、手動でのプレートのスクリーニングは遅く、労働集約的で主観的になる可能性があるので、生細胞と死細胞とを区別するハイスループットスクリーニング法において自動染色法を用いることができる。
【００２９】
本開示はまた、式（Ｉ）に描かれる少なくとも１つ（例えば、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、または少なくとも６つ）の化合物（例えば、化合物１〜２）または医薬的に許容可能なその塩と、医薬的に許容可能なキャリアとを含む、医薬組成物を提供する。
【００３０】
本明細書に記載の化合物は、増殖阻害を誘導することができる。増殖阻害の誘導は、細胞内の増殖シグナルの抑制を誘導または増強することを意味し得る。例えば、増殖阻害の誘導は、細胞の細胞死を誘導または増強することを意味し得る。別の例として、増殖阻害の誘導は、細胞のアポトーシスを誘導または増強することを意味し得る。別の例として、増殖阻害の誘導は、細胞の静止状態を誘導または増強することを意味し得る。さらに別の例として、増殖阻害の誘導は、自食作用を誘導または増強することを意味し得る。したがって、本明細書に記載の化合物は、細胞の増殖抑制を誘導する方法において使用することができる。当該方法は、細胞の増殖抑制を誘導するのに有効な量の本明細書に記載の化合物、塩または組成物に細胞を接触させることを含むことができる。接触は、インビボまたはインビトロで行うことができる。
【００３１】
いくつかの実施形態では、本開示は、Ｒａｃ−ＧＴＰアーゼ媒介性障害を処置する方法を特徴とする。方法は、それを必要とする被験体（例えば患者）に、上記化合物のうちの１つ以上を有効量含む医薬組成物を投与することを含む。Ｒａｃ−ＧＴＰアーゼ媒介性障害の例としては、心血管疾患、免疫不全疾患、炎症性障害および癌が挙げられる。
【００３２】
用語「患者」は、本開示全体を通して、本明細書に記載の方法による処置が提供される動物、ヒトまたは非ヒトを表すために使用される。当該用語は、限定されないが、鳥類、爬虫類、両生類、および哺乳類、例えば、ヒト、その他の霊長類、ブタ、齧歯類、例えばマウスおよびラット、ウサギ、モルモット、ハムスター、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、ヒツジおよびヤギを包含する。好ましい被験体は、ヒト、家畜、および飼育ペット、例えばネコおよびイヌである。
【００３３】
細胞増殖性障害および／または細胞分化性障害の例としては、癌、例えば、癌腫、肉腫、転移性障害、および造血新生物障害、例えば白血病が挙げられる。
【００３４】
転移性腫瘍は、限定されないが前立腺、結腸、肺、乳房、骨および肝臓を起源とするものを含めた多数の原発腫瘍タイプから生じる可能性がある。転移は、例えば、原発腫瘍から流出した腫瘍細胞が血管内皮に付着し、周囲の組織の中へ浸透し、原発腫瘍から離れた部位で増殖して独立した腫瘍を形成する場合に、発生する。
【００３５】
用語「癌」は、自律増殖能を有する細胞を指す。そのような細胞の例には、急速に増殖する細胞増殖を特徴とする異常な状態または症状を有する細胞が含まれる。当該用語は、組織病理学的種類または浸潤段階にかかわらず、癌性増殖、例えば腫瘍（例えば固形腫瘍）；癌化プロセス、転移組織および、悪性形質転換された細胞、組織または器官を包含することを意味する。また、様々な器官系、例えば、呼吸器、心血管、腎臓、生殖器、血液、神経、肝臓、胃腸および内分泌系の悪性腫瘍；ならびに悪性腫瘍を含む腺癌、例えば、大抵の結腸癌、腎細胞癌腫、前立腺癌および／または精巣腫瘍、肺の非小細胞癌腫、小腸癌、および食道癌も包含する。「自然に生じる」癌は、被験体への癌細胞の移植によって実験的に誘導されるものでない任意の癌を包含し、例えば、自発的に生じる癌、（１つ以上の）発癌物質への患者の曝露によって引き起こされる癌、遺伝子導入用癌遺伝子の挿入または腫瘍抑制遺伝子のノックアウトによって生じる癌および、感染、例えばウイルス感染によって引き起こされる癌を包含する。用語「癌腫」は、当該技術分野において認識されており、上皮組織または内分泌組織の悪性腫瘍を指す。当該用語は、癌腫組織および肉腫組織からなる悪性腫瘍を含むものである癌肉腫も包含する。「腺癌」は、腺組織に由来する癌腫、または認識可能な腺構造を腫瘍細胞が形成している癌腫を指す。
【００３６】
用語「肉腫」は、当該技術分野において認識されており、間葉系由来の悪性腫瘍を指す。用語「造血新生物障害」は、造血起源の過形成細胞／新生細胞を伴う疾患を包含する。造血新生物障害は、骨髄系統、リンパ系統もしくは赤血球系統またはそれらの前駆細胞から生じる可能性がある。
【００３７】
本開示の方法および組成物を用いて処置され得る癌としては、数ある中でも例えば、胃、結腸、直腸、口腔／咽頭、食道、喉頭、肝臓、膵臓、肺、乳房、子宮頸部、子宮体部、卵巣、前立腺、精巣、膀胱、皮膚、骨、腎臓、脳／中枢神経系、頭部、頸部および喉の癌；ホジキン病、非ホジキン白血病、肉腫、絨毛癌およびリンパ腫が挙げられる。
【００３８】
癌を発症する危険性があると考えられる個体は特に、障害の何らかの兆候がある前に予防的処置を開始できることが主な理由で、本発明による恩恵を享受し得る。「危険性がある」個体には、例えば、罹患しやすい個体において癌を促進することが統計的に示されたレベルで発癌物質に（例えば、吸入および／または消化などの摂取によって）曝露された個体が含まれる。また、紫外線への曝露または環境、職業および／もしくは遺伝ゆえに危険性のある個体、ならびにポリープなどの前癌症状の徴候を示す個体も含まれる。同様に、癌または転移発生の非常に早い段階にある（つまり、個体の身体または個体の組織の特定部位にたった１つまたはごくわずかな異常細胞が存在している）個体は、そのような予防的処置の恩恵を享受し得る。
【００３９】
本明細書に記載の化合物によって処置できる細胞増殖性障害および／または細胞分化障害の他の例としては、炎症性疾患および骨吸収障害が挙げられる。炎症性障害の例としては、神経変性疾患、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、アテローム性動脈硬化症、脳炎、髄膜炎、肝炎、腎炎、敗血症、サルコイドーシス、乾癬、湿疹、蕁麻疹、Ｉ型糖尿病、喘息、結膜炎、耳炎、アレルギー性鼻炎、慢性閉塞性肺疾患、副鼻腔炎、皮膚炎、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、ベーチェット症候群、痛風、ウイルス感染、細菌感染、臓器移植症状、皮膚移植症状、移植片拒絶反応（同種異系移植片拒絶反応および移植片対宿主病を含む）、脊椎関節症、強皮症、脈管炎、および乾癬（Ｔ細胞媒介性乾癬を含む）が挙げられる。他の炎症性障害は例えば米国特許出願公開第２００２０１５５１６６号に記載されており、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【００４０】
幾つかの実施形態において、本開示は、患者の望ましくない血管新生を処置する方法を特徴とする。方法は、望ましくない血管新生に罹患しているかまたはその危険性があると診断された患者に、本明細書に記載の化合物のうちの１つ以上を含有する医薬組成物を有効量投与することを含む。方法は、場合により、望ましくない血管新生に罹患しているかまたはその危険性があると患者を同定（例えば診断）するステップを含むことができる。
【００４１】
幾つかの実施形態において、本開示は、望ましくない血管新生に関連する症状を処置する方法を特徴とする。方法は、癌ではない、望ましくない血管新生に関連する症状に罹患しているかまたはその危険性があると診断された患者に、本明細書に記載の化合物のうちの１つ以上を含有する医薬組成物を有効量投与することを含む。方法は、場合によって、望ましくない血管新生に関連する症状に罹患しているかまたはその危険性があると患者を同定（例えば診断）するステップを含むことができる。一実施形態において、当該症状は、関節リウマチ、狼瘡、乾癬、糖尿病網膜症、未熟児網膜症、黄斑変性、角膜移植拒絶反応、新生血管緑内障、水晶体後線維増殖症、ルベオーシス、オスラー−ウェーバー症候群、心筋血管新生、プラーク新血管形成、毛細血管拡張症もしくは血管線維腫、またはそれらの任意の組み合わせである。
【００４２】
処置方法
当該技術分野において既知の任意の方法、例えば、患者の病歴を評価すること、診断試験を実施すること、および／または撮像技法を使用することによって、患者を本明細書に記載の症状（例えば癌）に罹患しているかまたはその危険性があると医師（または、診断される患者に適した獣医）が診断できることは、当業者であれば理解するであろう。
【００４３】
患者を診断した（または患者のために組成物を処方した）のと同じ個人が患者に本明細書に記載の組成物を投与する必要はないことも、当業者であれば理解するであろう。組成物は、例えば、診断および／または処方する個人および／またはその他の任意の個体、例えば患者自身（例えば患者が自己投与可能である場合）によって投与されることができる（かつ／または投与を監督されることができる）。
【００４４】
本明細書に記載の障害（例えば癌）を処置するのに有効な量の組成物は、これらの障害のいずれかに罹患しているかまたは、そのような（１つ以上の）障害もしくは（１つ以上の）症状を患者が発症する可能性の増加に関連する任意の危険因子を有している（例えば、（１つ以上の）発癌物質に患者が最近曝露された、曝露されている、または曝露されることになる）、と患者が診断された日に、例えば医師または獣医によって患者に投与（または処方）されることができる。組成物は、患者に断続的または連続的に投与することができる。例えば、組成物の投与は、少なくとも約１、２、４、６、８、１０、１２、１４、１８もしくは２０日間または２０日超（例えば、１、２、３、５または６ヶ月間）に亘って、または患者が症状または障害の症候をもはや呈しなくなるまで、または患者に症状または障害の危険性がもはやないと診断されるまで、行うことができる。所与の１日において、組成物の投与は、１日中連続的に、または断続的に、または１日当たり２３時間まで、例えば１日当たり２０、１５、１２、１０、６、３または２時間まで、または１日１時間まで行うことができる。
【００４５】
本明細書に記載の組成物による患者の処置は、化学療法、放射線療法、免疫療法、遺伝子療法および／または外科手術で患者を処置することが（例えば医師または獣医によって指示されたために）必要である場合には化学療法、放射線療法および／または外科手術を施す前、最中および／または後に行うことができる。例えば、化学療法、免疫療法、遺伝子療法および放射線療法に関して、患者に対する組成物の投与は、（各個別用量の前に多回分用量を与える場合に）化学療法、免疫療法、遺伝子療法または放射線療法を施すよりも０〜２０日前から開始して、例えば施術の少なくとも約３０分前（例えば、約１、２、３、５、７もしくは１０時間前、または約１、２、４、６、８、１０、１２、１４、１８もしくは２０日前、もしくは２０日よりも前）から開始して断続的または連続的に行うことができる。これに代えて、またはそれに加えて、患者への組成物の投与は、化学療法、免疫療法、遺伝子療法または放射線療法の施術と同時に行うことができる。これに代えて、またはそれに加えて、患者への組成物の投与は、化学療法、免疫療法、遺伝子療法または放射線療法の施術後に、例えば施術直後から開始して約１、２、３、５、７もしくは１０時間または約１、２、５、８、１０、２０、３０、５０もしくは６０日間、１年間、無期限に、または組成物の投与がもはや必要でないと医者が判断するまで、断続的または連続的に続けて行うことができる。外科手技に関して、組成物は、外科手技を実施する前、最中および／または後に患者に全身的または局所的に投与することができる。組成物は、手技の前に１時間、２時間、３時間、４時間、６時間、１２時間または約１、２、４、６、８、１０、１２、１４、１８もしくは２０日間または２０日超に亘って、断続的または連続的に患者に投与することができる。それは、手術の直前の期間に投与することができ、場合によって手技を通して続けることができ、あるいは手術開始の少なくとも１５分前（例えば、手術開始の少なくとも３０分、１時間、２時間、３時間、６時間または２４時間前）に投与を止めることができる。これに代えて、またはそれに加えて、患者への組成物の投与は、手技の最中に、例えば局所投与によって、行うことができる。これに代えて、またはそれに加えて、患者への組成物の投与は、手技の後、例えば手技完了の直後から開始して、約１、２、３、５、７もしくは１０時間または約１、２、５、８、１０、２０、３０、５０もしくは６０日間、１年間、無期限に、または手技完了後に患者に癌の罹患がもはやなくなるかもしくはその危険性がなくなるまで続けて行うことができる。
【００４６】
Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）の処置には、併用化学療法計画の適用を含む場合がある。多くの場合、フルダラビンと、アルキル化剤またはモノクローナル抗体との合剤を、Ｂ−ＣＬＬの処置のために使用することができる。例えば、フルダラビンは、アルキル化剤、例えばシクロホスファミドまたはベンダムスチンとの併用療法において投与することができる。フルダラビンはまた、モノクローナル抗体、例えば、アレムツズマブ、リツキシマブまたはオファツムマブと組み合わせて投与することもできる。フルダラビンはまた、Ｂ−ＣＬＬの処置のために下記の全てと組み合わせて投与することもできる：アルキル化剤、アントラサイクリン系抗生物質、ビンカアルカロイド（vinca alkyloid）およびコルチコステロイド。例えば、フルダラビンは、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチンおよびプレドニゾロンと一緒に投与することができる。
【００４７】
急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）の処置は、プレドニゾン、ビンクリスチン、アントラサイクリン、Ｌ−アスパラギナーゼ、シクロホスファミドの投与を含み得る。
【００４８】
慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）の処置には、イマチニブの投与を含むことができる。前リンパ球性白血病の処置には、プリン類縁体、クロラムブシルならびに、様々な化学療法、例えば：シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、プレドニゾンシクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチンおよびプレドニゾロン、エトポシド、ブレオマイシンＶＡＰＥＣ−Ｂ、およびアレムツズマブを含めることができる。
【００４９】
白血病を包含する疾患の処置には、例えば、下記の治療剤およびこれらの治療計画の組み合わせを含めることができる：多くの場合において、フルダラビン、アルキル化剤、例えばシクロホスファミドもしくはベンダムスチン、モノクローナル抗体、例えば、アレムツズマブ、リツキシマブもしくオファツムマブ、アントラサイクリン系抗生物質、例えば、ドキソルビシン、ビンカアルカロイド、アントラサイクリン、Ｌ−アスパラギナーゼ、シクロホスファミド、イマチニブ、プリン類縁体、クロラムブシル、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、プレドニゾンシクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチンおよびプレドニゾロン、エトポシド、ブレオマイシンＶＡＰＥＣ−Ｂ、およびアレムツズマブ、および／またはコルチコステロイド。
【００５０】
併用療法
幾つかの実施形態では、本開示に記載の化合物または医薬的に許容可能なその塩を別の治療剤と組み合わせて使用して、癌などの疾患を処置することができる。例えば、追加の薬剤は、上記化合物で処置されている疾患または症状を処置するのに有用であると当該技術分野において認識されている治療剤とすることができる。いくつかの実施形態では、追加の薬剤は、抗癌剤、例えば、デキサメタゾン、ビンクリスチン、またはＰＡＫ阻害剤（例えば、Ｍｕｒｒａｙら、ＰＮＡＳ、Ｖｏｌ．１０７、Ｎｏ．２０、９４４６−９４５１（２０１０）に記載のあるＰＦ−３７５８３０９）とすることができる。追加の薬剤は、治療用組成物に有益な属性を付与する薬剤（例えば、組成物の粘度に影響を与える薬剤）とすることができる。
【００５１】
本開示によって企図される併用療法には、例えば、本明細書に記載の１つ以上の化合物または医薬的に許容可能なその塩と、（１つ以上の）追加の薬剤とを単一の医薬製剤または別個の医薬製剤で投与することが含まれる。これに代えて、またはそれに加えて、併用療法には、本明細書に記載の少なくとも２つの化合物または医薬的に許容可能なその塩を同一または別個の医薬製剤で投与することを含めることができる。言い換えると、同時投与は、両薬剤の併用の有益な効果を提供すべく少なくとも２つの薬剤を被験体に投与することを意味するものとする。例えば、薬剤は、ある期間に亘って同時または逐次的に投与され得る。
【００５２】
幾つかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、上に列挙した療法および併用療法と組み合わせて用いることができる。
【００５３】
医薬製剤および剤形
医薬品として使用する場合、本出願において記載される化合物は、医薬組成物の形態で投与することができる。これらの組成物は、医薬分野で周知の方法で調製することができ、局所的処置および全身的処置のどちらが望ましいかに応じて、また、処置する領域に応じて、様々な経路で投与することができる。投与は、局所的投与（経皮、上皮、眼および、粘膜、例えば鼻腔内、膣および直腸への送達を含む）、肺投与（例えば、噴霧器による場合を含めて粉末またはエアロゾルの吸入または吹送による投与；気管内または鼻腔内への投与）、経口投与、または非経口投与であり得る。非経口投与としては、例えば、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内、筋肉内または注射もしくは点滴；または頭蓋内、例えばクモ膜下腔内または脳室内への投与が挙げられる。非経口投与は、単回ボーラス用量の形態とすることができ、あるいは、例えば連続灌流ポンプによる投与であってもよい。局所投与用の医薬組成物および製剤としては、例えば、経皮パッチ剤、軟膏剤、ローション剤、クリーム剤、ゲル剤、滴剤、坐剤、スプレー剤、液体剤および粉末剤が挙げられ得る。一般的な医薬担体、水性、粉末状または油性の基剤、増粘剤などが必要となるかまたは望ましい場合がある。
【００５４】
また、上記の少なくとも１つの化合物と、医薬的に許容可能なキャリアとを含有する医薬組成物も本開示の範囲内に含まれる。さらに、本開示は、例えば本明細書中に記載されているような癌を有する患者に、本明細書に記載の化合物を例えば医薬組成物で有効量投与する方法を包含する。「有効量」または「有効な量」は、処置する患者に治療作用を与えるために必要とされる活性化合物の量を指す。当業者によって認識されるように、処置する疾患の種類、投与経路、賦形剤の使用および、他の治療処置との併用可能性によって、有効量は様々であろう。
【００５５】
治療化合物の投薬量、毒性および治療有効性は、細胞培養物または実験動物での標準的な薬学的手順、例えば、ＬＤ５０（母集団の５０％に対して致死的な用量）およびＥＤ５０（母集団の５０％において治療上有効な用量）を決定するための手順によって決定することができる。毒性作用と治療作用との間での用量比は治療上の指数であり、それはＬＤ５０／ＥＤ５０の比率として表すことができる。高い治療指数を呈する化合物が好ましい。有毒な副作用を呈する化合物を使用してもよいが、未感染細胞に対する潜在的損傷を最小限に抑えて、それによって副作用を軽減するためには、そのような化合物を罹患組織の部位へ差し向ける送達系を作り出すように注意を払わねばならない。
【００５６】
細胞培養検査および動物研究から得られたデータは、ヒト用の投与量の範囲を定式化する際に用いることができる。そのような化合物の投与量は、毒性がほとんどまたは全くない、ＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にあることが好ましい。投与量は、この範囲内で、使用する剤形および利用する投与経路に応じて様々であり得る。本明細書に記載の処置方法において使用するいかなる化合物についても、治療上有効な用量は、最初に細胞培養検査から推定することができる。細胞培養で決定されるＩＣ５０（すなわち、症候の最大半量の阻害を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿中濃度範囲を達成するために、動物モデルで用量を定式化してもよい。そのような情報は、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定するために用いることができる。血漿中レベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定され得る。
【００５７】
典型的な用量は、１日当たり、体重に対して約０．０１μｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ（例えば、約０．１μｇ／ｋｇ〜約２５ｍｇ／ｋｇ、約１μｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約１０μｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、または約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ）とすることができる。いくつかの実施形態では、適切な１日用量は、体重に対して約１０μｇ／ｋｇ〜約１００μｇ／ｋｇの範囲とすることができる。
【００５８】
本開示に記載の方法を実践するには、上記の１つ以上の化合物を有する組成物の投与を、非経口、経口、経鼻、直腸、局所および／または頬側に行うことができる。本明細書で使用される用語「非経口」は、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、動脈内、関節内、関節滑液嚢内、胸骨内、クモ膜下腔内、病巣内または頭蓋内への注射、および任意の適切な点滴技法を指す。
【００５９】
滅菌注射剤組成物は、非毒性の非経口的に許容可能な希釈剤または溶媒中の溶液または懸濁液、例えば、緩衝生理食塩水または１，３−ブタンジオール中の溶液とすることができる。使用できる許容可能なビヒクルおよび溶媒としては、数ある中でも、マンニトール、水、リンガー溶液、および等張塩化ナトリウム溶液が挙げられる。さらに、固定油は、溶媒または懸濁媒として従来使用されている（例えば、合成のモノグリセリドまたはジグリセリド）。天然の医薬的に許容可能な油、例えばオリーブ油またはヒマシ油、特にそれらのポリオキシエチル化型と同様に、脂肪酸、例えばオレイン酸およびそのグリセリド誘導体は注射剤の調製に有用である。これらの油性溶液または懸濁液はさらに、長鎖アルコールの希釈剤もしくは分散剤、カルボキシメチルセルロース、または類似の分散剤も含有することができる。他の一般的に使用される界面活性剤、例えばＴＷＥＥＮもしくはＳＰＡＮ、または医薬的に許容可能な固体、液体もしくはその他の剤形を製造する際に一般的に使用される他の類似の乳化剤もしくは生物学的利用能増強剤も、製剤目的で使用することができる。
【００６０】
経口投与用の組成物は、カプセル、錠剤、乳剤ならびに水性の懸濁液、分散液および溶液を含めた任意の経口的に許容可能な剤形とすることができる。錠剤の場合、一般的に使用される担体としては、例えば、ラクトースおよびコーンスターチが挙げられる。ステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤もまた典型的に添加される。カプセル形態での経口投与の場合、有用な希釈剤としては、例えば、乳糖および乾燥コーンスターチが挙げられる。水性の懸濁液または乳剤を経口投与する場合、乳化剤または懸濁化剤と組み合わせて活性成分を油相に懸濁または溶解させることができる。所望により、特定の甘味料、香味料または着色料を添加することができる。
【００６１】
鼻用エアロゾルまたは吸入用組成物は、医薬製剤分野で周知の技法に従って調製することができる。例えば、そのような組成物は、ベンジルアルコールもしくはその他の適切な保存料、生物学的利用能を増強する吸収促進剤、フッ化炭素、および／または当該分野で既知のその他の可溶化剤もしくは分散剤を使用して、生理食塩水中の溶液として調製することができる。
【００６２】
上記の１つ以上の活性化合物を有する組成物はまた、直腸投与のための坐剤の形態で投与することもできる。
【００６３】
医薬組成物中の担体は、それが組成物の活性成分と相性がよく（好ましくは、活性成分を安定化することができ）かつ、処置される被験体に有害でない、という意味で「許容可能」でなければならない。１つ以上の可溶化剤を、上記活性化合物の送達のための医薬品賦形剤として利用することができる。その他の担体の例としては、コロイド状酸化ケイ素、ステアリン酸マグネシウム、セルロース、ラウリル硫酸ナトリウム、およびＤ＆Ｃ  Ｙｅｌｌｏｗ＃１０が挙げられる。
【００６４】
治療化合物はまた、身体から治療化合物が迅速に排出されるのを防ぐものとなる担体、例えば徐放性製剤（移植片およびマイクロカプセル化送達システムを含む）を使用して調合することもできる。生分解性の生体適合性ポリマー、例えば、エチレンビニルアセテート、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸を使用することができる。そのような製剤は、標準的な技法を用いて調製することができ、または例えばＡｌｚａ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から商業的に入手することができる。リポソーム懸濁液（選択された細胞を細胞抗原に対するモノクローナル抗体によって標的化するリポソームを含む）もまた、医薬的に許容可能なキャリアとして使用することができる。これらは、例えば米国特許第４，５２２，８１１号に記載されているように、当業者に既知の方法に従って調製することができる。
【００６５】
医薬組成物は、投与のための説明書と一緒にして容器、パックまたはディスペンサーに収容することができる。
【００６６】
適切な医薬組成物を調合する方法は、当該分野において既知である。例えば、シリーズの書籍Ｄｒｕｇｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ：ａ  Ｓｅｒｉｅｓ  ｏｆ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋｓ  ａｎｄ  Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｓ（Ｄｅｋｋｅｒ、ニューヨーク）を参照されたい。
【００６７】
上記化合物は、上記疾患を処置する際のそれらの有効性について本明細書に記載のスクリーニング方法で事前にスクリーニングすることができ、その後、追加の動物実験および／または臨床試験で確認することができる。その他のスクリーニング方法も当業者には明らかであろう。
【００６８】
合成
本開示において記載される化合物は、それらの塩を含めて、既知の有機合成技法を用いて調製することができ、可能な多数の合成経路のいずれかに従って、例えば、Ｇｅｒａｒｄら、ＡＣＳ  Ｃｏｍｂ．Ｓｃｉ．２０１１、１３、３６５に記載の方法に類似する方法によって、合成することができる。
【００６９】
本願の化合物を調製する反応は、有機合成の当業者によって容易に選択されることのできる適切な溶媒中で行うことができる。適切な溶媒は、反応を行う温度、例えば溶媒の凍結温度から溶媒の沸点までの範囲内とすることができる温度で、出発物質（反応物）、中間体または生成物に対して実質的に非反応性のものとすることができる。所与の反応は、１つの溶媒中、または２つ以上の溶媒の混合物中で行うことができる。当業者であれば、特定の反応ステップに応じて、特定の反応ステップに適した溶媒を選択することができる。
【００７０】
本願に記載の化合物の調製は、様々な化学基の保護および脱保護を含むことができる。当業者であれば、保護および脱保護の必要性ならびに適切な保護基の選択を容易に判断することができる。保護基の化学は、例えば、Ｔ．Ｗ．ＧｒｅｅｎｅおよびＰ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、第３版、Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、ニューヨーク（１９９９）に見出すことができ、それは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００７１】
反応は、当該分野で既知の任意の適切な方法に従ってモニタリングすることができる。例えば、生成物形成のモニタリングは、分光学的手段、例えば、核磁気共鳴分光法（例えば、１Ｈまたは１３Ｃ）、赤外分光法、分光光度法（例えば、ＵＶ−可視）、質量分析法によって、またはクロマトグラフィー法、例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣＭＳ）もしくは薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によって行うことができる。
【００７２】
光学不活性な出発材料から光学活性体を調製する仕方に関する方法は当該技術分野で既知であり、例えば、ラセミ混合物の分割、または立体選択的合成によるものがある。本明細書に記載の化合物にはオレフィン、Ｃ＝Ｎ二重結合などの多くの幾何異性体も存在することができ、そのような安定な異性体の全てが本願において企図される。本願の化合物のシスおよびトランス幾何異性体が記載されており、異性体の混合物として、または分離された異性体として単離され得る。
【００７３】
化合物のラセミ混合物の分割は、当該技術分野で既知の多数の方法のいずれかによって行うことができる。方法の一例としては、光学活性な塩形成性の有機酸であるキラル分割酸を使用する分別再結晶が挙げられる。分別再結晶法に適した分割剤は、例えば光学活性な酸、例えば、Ｄ体およびＬ体の酒石酸、ジアセチル酒石酸、ジベンゾイル酒石酸、マンデル酸、リンゴ酸、乳酸、または種々の光学活性カンファースルホン酸、例えばβ−カンファースルホン酸である。分別結晶化法に適したその他の分割剤としては、例えば、α−メチル−ベンジル−アミンの立体異性体的に純粋な形態（例えば、Ｓ体およびＲ体、またはジアステレオマー的に純粋な形態）、２−フェニルグリシノール、ノルエフェドリン、エフェドリン、Ｎ−メチルエフェドリン、シクロヘキシルエチルアミン、１，２−ジアミノシクロヘキサンなどが挙げられる。
【００７４】
ラセミ混合物の分割は、光学活性な分割剤（例えば、ジニトロベンゾイルフェニルグリシン）を充填したカラムでの溶出によって行うこともできる。当業者であれば適切な溶出溶媒の組成を決定することができる。
【００７５】
本願の化合物には、互変異性体も含まれる。互変異性体は、付随するプロトン移動を伴って単結合とその隣の二重結合とが交換することによって生じる。互変異性体としては、例えば、同じ実験式および総電荷を有する異性体プロトン化状態であるプロトン互変異性体が挙げられる。プロトン互変異性体の例としては、ケトン−エノール対、アミド−イミド酸対、ラクタム−ラクチム対、エナミン−イミン対ならびに、プロトンが複素環系の２つ以上の位置を占めることができるものである環状体、例えば、１Ｈ−および３Ｈ−イミダゾール、１Ｈ−、２Ｈ−および４Ｈ−１，２，４−トリアゾール、１Ｈ−および２Ｈ−イソインドール、ならびに１Ｈ−および２Ｈ−ピラゾールが挙げられる。互変異性体は、平衡状態にあることができ、または適切な置換によって１つの型に立体的に固定されることができる。
【００７６】
本願に記載の化合物には、中間体または最終化合物に生じる原子のあらゆる同位体も含めることができる。同位体は、同じ原子番号を有してはいるが質量数が異なっている原子を含む。例えば、水素の同位体には三重水素および重水素が含まれる。
【００７７】
全ての化合物および医薬的に許容可能なそれらの塩は、水および溶媒などの他の物質と合わさって見出されることができ（例えば、水和物および溶媒和物）、または単離することができる。
【００７８】
幾つかの実施形態では、本願に記載の化合物またはその塩は、実質的に単離されている。「実質的に単離されている」とは、化合物がその形成または検出された環境から少なくとも部分的または実質的に隔離されていることを意味する。部分的な分離は、例えば、本願に記載の化合物が濃縮された組成物を含むことができる。実質的な分離には、本願に記載の化合物またはその塩を重量表示で少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、または少なくとも約９９％含有する組成物を含めることができる。化合物およびそれらの塩を単離する方法は当該技術分野において確立されている。
【００７９】
本明細書において、「医薬的に許容可能」という表現は、過度の毒性、刺激、アレルギー反応またはその他の問題もしくは合併症を有することなくヒトおよび動物の組織と接触させて使用することが、合理的な恩恵／危険性の比率に見合って健全な医学的判断の範囲内で適している、化合物、材料、組成物および／または剤形を指して使用される。
【００８０】
本願は、本明細書に記載の化合物の医薬的に許容可能な塩も包含する。本明細書中で使用される場合、「医薬的に許容可能な塩」は、既存の酸部分または塩基部分をその塩形態に変換することによって親化合物を修飾した、開示の化合物の誘導体を指す。医薬的に許容可能な塩の例としては、限定されないが、アミンなどの塩基性残基の無機塩または有機酸塩；カルボン酸などの酸性残基のアルカリ塩または有機塩；およびそれに類似するものが挙げられる。本願の医薬的に許容可能な塩としては、例えば非毒性の無機酸または有機酸から形成された、親化合物の一般的非毒性塩が挙げられる。本願の医薬的に許容可能な塩は、塩基性部分または酸性部分を含有する親化合物から、慣習的な化学的方法で合成することができる。一般に、そのような塩は、これらの化合物の遊離酸型または遊離塩基型を水中もしくは有機溶媒中またはこれらの２種の混合物中で化学量論量の適切な塩基または酸と反応させることによって調製することができる。通常は、エーテル、酢酸エチル、アルコール（例えば、メタノール、エタノール、イソプロパノールまたはブタノール）またはアセトニトリル（ＡＣＮ）のような非水性媒体が好ましい。適切な塩の一覧表は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１７版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．、１９８５、ｐ．１４１８および、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、６６、２（１９７７）（それらの各々はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に示されている。
【００８１】
キット
本願はさらに、例えばＲａｃ−ＧＴＰアーゼ媒介性疾患（例えば癌）の処置または予防に有用な、治療上有効な量の本願の化合物を含む医薬組成物を収容した１つ以上の容器を含む医薬キットも包含する。当業者であればすぐに分かるように、そのようなキットは、所望により、１つ以上の様々な慣習的医薬キット構成要素、例えば、医薬的に許容される１つ以上のキャリアを含む容器、追加の容器などをさらに含むことができる。投与すべき成分の量、投与のための指針、および／または成分を混合するための指針を指示する挿入物またはラベルのどちらかとしての説明書も、キットに含めることができる。
【００８２】
本明細書中で引用される全ての刊行物（例えば、特許、特許出願公開および論文）の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００８３】
実施例
以下の具体的な実施例は、単なる例示として解釈されるべきであり、決して本開示の残りの部分を限定するものではない。それ以上の詳述なしに、本明細書の記載に基づいて当業者は本発明を最大限に利用することができると考えられる。
【実施例１】
【００８４】
実施例１：Ｒａｃ阻害剤のｉｎ  ｓｉｌｉｃｏスクリーニング
方法
Ｒａｃ−ＧＥＦ相互作用
Ｒａｃ阻害剤についての仮想スクリーニングを実施するためには、Ｒａｃ２結晶構造に対するｉｎ  ｓｉｌｉｃｏドッキングが必要である。Ｒａｃ−ＧＥＦ相互作用のｉｎ  ｓｉｌｉｃｏドッキングを行って、小分子の結合によってタンパク質とのＧＥＦ相互作用が妨害されるであろうＲａｃタンパク質上の潜在的標的部位を解読した。図１は、ＧＥＦであるＴＩＡＭの模型をＲＡＣと共に示す（ＴＩＡＭ−Ｒａｃ）。Ｒａｃは灰色で示されており、ＴＩＡＭは棒状の模型として描写されている。ＴｉａｍのＴｒｐ５６残基は青色で強調されている。マッピングされているのは、Ｒａｃ−ＧＥＦ相互作用を妨害する潜在的な場所である「ホットスポット」である。マッピングされた「ホットスポット」は、ＴｉａｍとＲａｃとが有意に相互作用する標的場所として定義され、黄色の表面として示されている。ＧＴＰ分子も存在している。
【００８５】
ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏスクリーニング
Ｅｖｏｔｅｘ  ＡＧライブラリーからの１４００万個の化合物のスクリーニングを実施した。薬物様特性についての特異的フィルターによって４８０万個の化合物が得られた。これらの化合物をドッキングのために選択した。選択した化合物の中での化学的多様性を最大にするために、社内のアルゴリズムを適用した。Ｒａｃ２結晶構造に対する化合物のｉｎ  ｓｉｌｉｃｏドッキングを行い、さらなる評価のために上位１２０万個の化合物を選択した。これは、選択した化合物の上位３０％に相当する。これらの化合物を２つのグループに分けて解析した。第１グループの化合物をＲａｃ１構造に対する化合物のドッキングによって解析し、Ｒａｃ−１とＲａｃ−２との両方における類似の結合様式、Ｒａｃ１とＲａｃ２との両方における高いドッキングスコア、および既知の活性化合物に対する結合性の仮定によるファーマコフォアマッチングに基づいて、選択を行った。第２グループの解析は、ＡＳＰスコア関数およびＣｈｅｍｓｃｏｒｅスコア関数を用いてドッキングポーズを再スコアリングすること、ならびに３つのスコアリング方法、すなわちＧｏｌｄ、ＡＳＰ、Ｃｈｅｍｓｃの全てにおいて高いスコア値を有する化合物を選択することを含んでいた。
【００８６】
結果
多様な集まりの選択およびその後の目視点検を行ったところ、グループ１から７５個の化合物が選択された。多様な集まりの選択およびその後の目視点検を行ったところ、グループ２から７７個の化合物が選択された。これらの１５２個の優先化合物のうちの１００個をさらなるスクリーニングのために商業的供給源から購入した。
【実施例２】
【００８７】
実施例２：リード化合物の選択
用量依存的な増殖阻害
最初のｉｎ  ｓｉｌｉｃｏスクリーニングから選択した１００個の化合物を、２つの白血病細胞株、ＳＥＭおよびＰ１２における増殖阻害についてＣｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏで検査した。増殖検査のための細胞を遠心沈殿させ、再懸濁させた。その後、細胞懸濁液を分割し、試験する化合物を所望の濃度で添加し、続いて播種した。インキュベート期間の後、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ  ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６（登録商標）水性非放射性細胞増殖検査）を添加し、インキュベートした。続いて、プレートリーダーを使用して４９０ｎｍで吸光度を測定する。各化合物を、細胞増殖に対するその効果について分析した。
【００８８】
これらの化合物のうちのどれをさらに追求すべきかを決定するために、生化学的プルダウン検査を実施し、ＲａｃとＧＴＰアーゼとの相互作用の分裂によって指し示されるＲａｃ活性化の特異的阻害を確認した。検査は、初めに細胞の処理、続いてプルダウンおよびウェスタンブロットによる分析を必要とした。まず、細胞を無血清培地中で２時間飢餓状態にした。次いでそれらを血清含有培地中に再懸濁させ、阻害剤を所望の濃度で添加した。所望の長さの時間インキュベートした後、細胞をペレット化し、マグネシウム溶解用緩衝液（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｍｇ２＋溶解／洗浄用緩衝液）で溶解させた。その後、Ｒａｃタンパク質およびあらゆる結合タンパク質をＰａｋビーズ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｒａｃ／ｃｄｃ４２検査試薬（ＰＡＫ−１  ＰＢＤ、アガロース））で回収した。続いて、結合したタンパク質を溶解用緩衝液で除去し、ウェスタンブロット分析に供した。
【００８９】
上記分析から、リード化合物として化合物１が同定された。図２Ａは、ウェスタンブロット分析を示し、化合物１が用量依存的にＲａｃ活性化を低減したものの、総Ｒａｃレベルに対して有意な影響を及ぼさなかったことを指し示している。図２Ｂは、化合物１から得られた３つの独立したプルダウン実験の定量を示す。ウェスタンブロットおよびプルダウン分析は、化合物ＤＭＳＯの場合および、Ｒａｃ１結合とＲａｃ特異的なＲｈｏＧＥＦによるＲａｃ活性化とに対する既知阻害剤である化合物ＮＳＣ２３７７６の場合についても示されている。
【実施例３】
【００９０】
実施例３：白血病細胞株の阻害における化合物１の有効性に関する化合物１の分析
リード化合物、すなわち化合物１を、３つの異なる白血病細胞株：ＳＥＭ、Ｐ１２およびＬｏｕｃｙにおいて細胞増殖に対するその効果について様々な用量で分析した。細胞増殖の阻害率を定量するために、上記実施例２に記載のＣｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ分析を完了した。
【００９１】
図３Ａ、図３Ｂおよび図３Ｃは、ＭＴＳアッセイによって測定した、ＳＥＭ細胞、Ｐ１２細胞およびＬｏｕｃｙ細胞における化合物１の用量依存的な増殖阻害を例示するグラフを示す。これらの３つの図に示すように、化合物１はＳＥＭ細胞、Ｐ１２細胞およびＬｏｕｃｙ細胞に対してそれぞれ４３．８μＭ、３９．２μＭおよび１６０μＭのＩＣ５０値を呈した。
【００９２】
アネキシンＶ染色を用いるフローベースのアッセイを用いて、化合物１を細胞アポトーシスおよび細胞死に対するその効果についてさらに分析した。結果を図４Ａおよび図４Ｂに示すが、これらは、ＳＥＭ細胞株およびＰ１２細胞株のアポトーシスおよび細胞死に対するＤＭＳＯ、ＮＳＣ２３７６６および化合物１の効果を示している。これらの２つの図に示すように、化合物１は、用量依存的な様式でＳＥＭ細胞株およびＰ１２細胞株に細胞アポトーシスおよび細胞死を引き起こした。
【実施例４】
【００９３】
実施例４：化合物１のその毒性についての評価
様々な用量の化合物１、ＮＳＣ２３７６６およびＤＭＳＯを補充した半固形培地に正常な骨髄造血細胞および前駆細胞を播種することによって実施したコロニー形成単位検査（ＣＦＵ検査）で、化合物１を毒性について試験した。試験結果を図５に示す。図５に示すように、化合物１は正常な骨髄細胞に対して毒性を呈さなかった。
【実施例５】
【００９４】
実施例５：化合物１の薬物動態および抗白血病活性を評価するためのインビボ検査
化合物１をその薬物動態および抗白血病活性についてマウスでアッセイを行った。具体的には、ＳＥＭ白血病細胞株を、ｍＣｈｅｒｒｙタグおよびルシフェラーゼをコードするベクターで標識した。５００，０００万個の標識細胞を免疫不全マウス（ＮＳＧマウス）に注射した。白血病の確立（生物発光イメージングによって評価した）の後に、マウスを用量２５０ｍｇ／Ｋｇの化合物１またはビヒクルで２１日間、１日２回処置した。処置の間、マウスを１日おきに撮像し、ＢＬＩを記録および分析した。最終投与から２時間後、動物を殺し、ＰＫおよびＰＤの分析のために器官を採取した。図６は、最終投与後の化合物１の血漿中レベルを示す。図７は、化合物１またはビヒクルで処置したマウスにおいて白血病性芽球で浸潤した脾臓に対してＥｌｉｓａ検査を用いることにより決定した、Ｒａｃ活性化状態を示す。図７の右側のグラフに示すように、化合物１はビヒクルと比較してＲａｃ活性化を低減した。
【００９５】
さらに、図８Ａは、化合物１およびビヒクルで処置したグループのマウスの相対体重を示す。図８Ａに示すように、これら２つのグループのマウスの相対体重（言い換えればその各々は、各グループのマウスの平均体重に基づくものであり、処置前の平均体重に対して標準化されている）は、ほぼ同一であり、化合物１が毒性を全く呈さないか、または、低い毒性を呈することを示唆している。図８Ｂおよび図８Ｃは、化合物１およびビヒクルで処置したマウスから得られた、マウスをそれぞれ仰臥位および腹臥位で撮像したときの生物発光データを示す。これらの２つの図に示すように、化合物１は、どちらの位置で撮像した場合でもマウスにおける生物発光を有意に低減し、この化合物が白血病増殖を効果的に阻害したことを示唆した。図９は、化合物１およびビヒクルで２１日間処置したグループのマウスから得られた、マウスを仰臥位および腹臥位で撮像したときの代表的な実際の画像を示す。
【実施例６】
【００９６】
実施例６：ＣＤＣ４２、ＲＨＯＡおよびＲＡＳの活性化に対する化合物１の効果についての化合物１の評価
化合物１を試験して、ＣＤＣ４２活性化に対するその効果を評価した。この場合、免疫沈降用ビーズをＣＤＣ４２エフェクタードメインでコーティングした。図１０Ａは、ウェスタンブロット分析を示し、化合物１が用量依存的にＣＤＣ４２活性化を低減したものの、総ＣＤＣ４２レベルに対して有意な影響を及ぼさなかったことを指し示している。図１０Ｂは、化合物１から得られた５つの独立したプルダウン実験の定量を示す。ウェスタンブロットおよびプルダウン分析は、ＤＭＳＯの場合およびＮＳＣ２３７７６の場合についても示されている。
【００９７】
化合物１をさらに試験して、ＲＨＯＡおよびＲＡＳの活性化に対するその効果を評価した。図１１Ａは、ＲＨＯＡ活性化に関する化合物１のウェスタンブロット分析、ならびにＤＭＳＯ、ＮＳＣ２３７７６および化合物１から得られたプルダウン実験の定量を示す。図１１Ｂは、ＲＡＳ活性化に関する化合物１のウェスタンブロット分析、ならびにＤＭＳＯ、ＮＳＣ２３７７６および化合物１から得られたプルダウン実験の定量を示す。図１１Ａおよび図１１Ｂに示すように、化合物１は、ＲＨＯＡまたはＲＡＳの活性化に対して有意な影響を及ぼさなかった。
【実施例７】
【００９８】
実施例７：化合物１とＲａｃ１との結合性の評価
２つの独立した結合性アッセイ、すなわち二次元ＮＭＲ分光法および均一系時間分解蛍光アッセイ（ＨＴＲＦ）において、化合物１をＲａｃ１との結合におけるその有効性について試験した。
【００９９】
二次元ＮＭＲ検査では、５０μＭのＲａｃ１と２５０μＭまたは４００μＭの化合物１とを含有する試料を使用した。上記試料から得られたＮＭＲスペクトルは、Ｒａｃ１に対するこの化合物の結合を何ら指し示さなかった。さらに、ＨＴＲＦアッセイでは結合が全く観察されなかった。
【０１００】
要するに、上記結果は、化合物１がＲａｃ１に実質的に結合しないことを示唆している。この実施例および実施例６で示された結果を考慮すると、理論に拘泥するものではないが、化合物１は、Ｒａｃ１の上流のタンパク質に結合することによってＲａｃ１活性化を阻害すると考えられる。
【実施例８】
【０１０１】
実施例８：化合物１に対するキナーゼスクリーニングおよびＧＰＣＲ特性プロファイリング
４０個のキナーゼの活性の阻害および、拮抗薬と作動薬との両方としての１２個のＧＰＣＲとの結合における化合物１の有効性について、化合物１を試験した。化合物１およびＮＳＣ２３７６６のキナーゼ阻害率を以下の表１に示す。化合物１およびＮＳＣ２３７６６のＧＰＣＲ結合率を以下の表２に示す。表１および２に示すように、化合物１は、試験した４０個のキナーゼの有意な阻害を呈さず、試験した１２個のＧＰＣＲとの有意な結合を呈さず、分析したタンパク質に対してこの化合物がオフターゲット作用を全く有さないことを示唆した。
【０１０２】
【表１】
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【０１０３】
【表２】
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【実施例９】
【０１０４】
実施例９：リード化合物１の最適化
ＳＡＲを実施して、向上した特性を有する化合物の類縁体を同定した。このＳＡＲ試験で同定された５６個の化合物を合成した。それらのうちの４８個の化合物を細胞増殖アッセイで試験した。試験結果に基づき、化合物２は、癌細胞増殖作用の最も強い阻害を呈し、もう１つのリード化合物として同定された。
【実施例１０】
【０１０５】
実施例１０：化合物２の白血病細胞株を阻害する有効性および化合物２の毒性についての化合物２の評価
化合物２を、ＳＥＭ白血病細胞株での細胞増殖に対する化合物２の効果について様々な用量で分析し、同じ細胞株で化合物１の効果と比較した。結果を図１２Ａに示す。図１２Ａに示すように、化合物２は、ＳＥＭ細胞の増殖を阻害することにおいて向上した有効性を示した。
【０１０６】
アネキシンＶ染色を用いるフローベースの検査を用いて化合物２を、細胞アポトーシスおよび細胞死に対するその効果についてさらに分析した。結果を図１２Ｂに示すが、これは、ＳＥＭ細胞株のアポトーシスおよび細胞死に対するＤＭＳＯ、ＮＳＣ２３７６６および化合物２の効果を示している。図１２Ｂに示すように、化合物２は、用量依存的な様式でＳＥＭ細胞株において細胞アポトーシスおよび細胞死を引き起こした。
【０１０７】
様々な用量の化合物２、ＮＳＣ２３７６６およびＤＭＳＯを補充した半固形培地に正常な骨髄造血細胞および前駆細胞を播種することによって実施したコロニー形成単位アッセイ（ＣＦＵアッセイ）で、化合物２を毒性について試験した。試験結果を図１２Ｃに示す。図１２（ｃ）に示すように、化合物１は、正常な骨髄細胞に対して毒性を呈さなかった。
【実施例１１】
【０１０８】
実施例１１：化合物２とＲａｃ１との結合性の評価
２つの独立した結合性アッセイ、すなわち二次元ＮＭＲ分光法および均一系時間分解蛍光アッセイ（ＨＴＲＦ）において、化合物２をＲａｃ１との結合におけるその有効性について試験した。
【０１０９】
二次元ＮＭＲアッセイでは、５０μＭのＲａｃ１と２５０μＭの化合物２とを含有する試料を使用した。得られたＮＭＲスペクトルは、Ｒａｃ１に対するこの化合物の有意な結合を何ら指し示さなかった。ＨＴＲＦ結合アッセイにおいてこの化合物をＴｉａｍ１−Ｒａｃ複合体に添加しても、タンパク質の蛍光放出の摂動は生じず、化合物が複合体に結合しないことが示唆された。
【０１１０】
要するに、上記結果は、化合物２がＲａｃ１に実質的に結合しないことを示唆している。理論に拘泥するものではないが、化合物２は、Ｒａｃ１の上流のタンパク質に結合することによってＲａｃ１活性化を阻害すると考えられる。
【実施例１２】
【０１１１】
実施例１２：化合物２の抗白血病活性を評価するインビボアッセイ
化合物２をその抗白血病活性についてマウスで評価した。具体的には、細胞株Ｐ１２−ＩＣＨＩＫＡＷＡを、ルシフェラーゼとｍＣｈｅｒｒｙ蛍光タグとを共発現するレンチウイルスベクターで印付けした。選別したｍＣｈｅｒｒｙ陽性Ｐ１２−ＩＣＨＩＫＡＷＡ細胞を免疫不全（ＮＳＧ）マウスに注射した。注射から約３週間後、インビボでの生物発光イメージング（ＢＬＩ）の定量的評価による腫瘍負荷の見積もりに基づいてマウスの処置を開始した。マウスに１日２回、化合物２（５０ｍｇ／ｋｇ体重）または偽薬を経口投与で与えた。化合物２グループおよびビヒクルグループの各々は８匹のマウスを有していた。週に３回ＢＬＩ分析を行って腫瘍負荷を評価した。毒性の評価は、ビヒクルグループと比べて処置マウスの体重を評価することによって行った（図１３Ａ参照）。ビヒクルグループにおける疾患の非常に侵攻的な性質ゆえに、処置開始後１８日目に実験を中止した。マウスを仰臥位および腹臥位で撮像した。図１３Ｂは、化合物２グループとビヒクルグループとの両方において処置開始に対して標準化した、仰臥位でのＢＬＩ値をまとめたものである。
【０１１２】
これらの図１３Ｂに示すように、化合物２は、仰臥位で撮像した場合にマウスにおける生物発光を有意に低減し、この化合物が白血病増殖を効果的に阻害したことを示唆した。さらに、図１３Ａに示すように、化合物２グループのマウスはビヒクルグループのマウスと同様の体重減少を呈し、化合物２がマウスに有毒でないことを示唆した。図１３Ｃは、化合物２およびビヒクルで１５日間処置したグループのマウスから得られた、マウスを仰臥位で撮像したときの代表的な実際の画像を示す。
【実施例１３】
【０１１３】
実施例１３：別の抗癌化合物と組み合わせたときの化合物２の抗白血病活性の評価
化合物２を、以下の３つの抗癌化合物の各々と組み合わせたときのその抗白血病活性について評価した：デキサメタゾン（Ｄｅｘ）、ビンクリスチン（ＶＣＲ）ならびにＲＡＣおよびＣＤＣ４２の非常によく特性評価されたエフェクターであるＰＦ−３７５８３０９（すなわち、ｐ２１活性化キナーゼ（ＰＡＫ）の阻害剤）。各薬剤の５回分用量を組み合わせ、読み出しとして増殖アッセイ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒのＡＴＰＬｉｔｅ（登録商標））を用いて、併用実験を行った。薬物の合剤をＲａｓ突然変異Ｐ１２−ＩＣＨＩＫＡＷＡ細胞で試験し、培養培地に薬物合剤を添加してから７２時間後に増殖データを記録した。薬物相互作用の解析のためのＣａｌｃｕＳｙｎソフトウェアを用いてアイソボログラムを得た。結果を図１４Ａ〜１４Ｃにまとめる。これらの３つの図に示されているように、各合剤の組合せ指数（ＣＩ）中央値が１未満であるので、３つの合剤は全て相乗効果を呈した。特に、化合物２とＰＡＫ阻害剤ＰＦ−３７５８３０９とを含有する合剤は、０．３４のＣＩ中央値を有して最も高い相乗効果を示した。
【０１１４】
その他の実施形態
本明細書において開示される特徴の全ては、任意の組み合わせで組み合わされ得る。本明細書において開示される各特徴は、代替の特徴と置き換えて同じ目的、同等の目的、または類似の目的を果たし得る。したがって、特に明記していない限り、開示された各特徴は、同等または類似の特徴の包括的連続の一例に過ぎない。
【０１１５】
当業者であれば、上記記載から本発明の本質的な特徴を容易に確認することができ、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、本発明の様々な変更および改変を行ってそれを様々な用途および条件に適合させることができる。したがって、他の実施形態もまた、別記の請求項の範囲内に含まれる。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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