(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
メソテリンポリペプチドと融合された上皮増殖因子受容体変異型ＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）ポリペプチドを含む融合タンパク質ポリペプチドであって、配列番号８のアミノ酸配列を含む融合タンパク質ポリペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載の融合タンパク質ポリペプチドであって、配列番号８のアミノ酸配列からなる融合タンパク質ポリペプチド。
【請求項３】
細菌によって発現される、請求項１または２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
前記細菌がリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）である、請求項３に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
請求項１または２に記載の融合タンパク質をコードする核酸分子。
【請求項６】
発現カセットの一部である、請求項５に記載の核酸分子。
【請求項７】
請求項６に記載の核酸分子を含む宿主細胞。
【請求項８】
リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）がΔａｃｔＡ／ΔｉｎｌＢ突然変異体である、請求項７に記載の宿主細胞。
【請求項９】
請求項６に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項１０】
請求項７に記載の宿主細胞と、薬学的に許容される賦形剤とを含むワクチン。
【請求項１１】
対象において免疫応答を誘発するための、請求項７または８に記載の宿主細胞を含む組成物。
【請求項１２】
前記宿主細胞がリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）ΔａｃｔＡ／ΔｉｎｌＢ突然変異体である、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
メソテリンポリペプチドの発現を増大させる方法であって、宿主細胞において、配列番号８の配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子を発現させるステップを含む方法。
【請求項１４】
癌の治療のための、請求項７または８に記載の宿主細胞を含む組成物。
【請求項１５】
前記癌がメソテリン発現癌、ＥＧＦＲｖＩＩＩ発現癌、又はその両方である、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記癌が高レベルのメソテリン発現を有する、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１７】
前記癌が肺癌である、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１８】
前記肺癌が非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）腺癌、ＮＳＣＬＣ扁平上皮癌、大細胞癌、又はこれらの任意の組合せである、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
前記肺癌が進行ＮＳＣＬＣ腺癌又は転移性ＮＳＣＬＣ腺癌である、請求項１８に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、２０１５年４月１３日に出願された米国仮特許出願第６２／１４６，５５９号明細書及び２０１５年１０月１９日に出願された米国仮特許出願第６２／２４３，３９７号明細書の利益を主張する。上記出願の教示全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
ＡＳＣＩＩテキストファイルの資料の参照による組み込み
本願は、本願と一緒に提出される下記ＡＳＣＩＩテキストファイルに含まれる配列表を参照により組み込むものとする：
ａ）ファイル名：５３１６１０００００３Ｓｅｑｕｅｎｃｅ．ｔｘｔ；２０１６年４月８日作成、サイズ４５ＫＢ。
【０００３】
本明細書では、対象において免疫応答を誘発するための組成物及び方法が提供される。特に、本開示は、上皮増殖因子受容体変異型ＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）ポリペプチドとメソテリンポリペプチドとを含む融合タンパク質と、前記融合タンパク質をコードする核酸分子を含む宿主細胞を用いて免疫応答を誘発する方法とに関する。
【背景技術】
【０００４】
肺癌は、世界的に癌死亡の第１位の原因であり、毎年１３０万人の新たな患者発生が推定されている。米国では、肺癌は２番目に多く一般的に診断されている癌であり、毎年２００，０００超の人がこの疾患を診断され、これは、癌関連死亡の主要な原因であり、毎年ほぼ１６０，０００人がこの疾患により死亡すると見積もられている。肺癌と新たに診断される患者の約８０％〜８５％が非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）（腺癌、扁平上皮癌及び大細胞癌）であり、１５％〜２０％が小細胞肺癌である。外科的切除は、治癒のために最も堅実且つ成功する選択肢であるが、完全に切除可能な癌である必要があり、患者の７０％は切除不能及び／又は不治の疾患を呈することから、これは、大部分の患者には実現不可能である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
過去数十年間の癌診断及び治療の進歩により転帰の実質的な向上がもたらされたが、ＮＳＣＬＣなどの一部の腫瘍は、疾患の早期段階で診断することが依然として難しく、最初に進行した疾患を呈する患者又は初期治療後に増悪する患者の場合、全生存期間（ＯＳ）は不良のままである。こうした患者のためにさらなる療法が求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本明細書では、メソテリンポリペプチドと融合された上皮増殖因子受容体変異型ＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）ポリペプチドを含む融合タンパク質が開示される。一部の実施形態では、融合タンパク質は、各々が配列番号９に示されるＥＧＦＲｖＩＩＩと少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一のアミノ酸配列を含む１つ又は複数のＥＧＦＲｖＩＩＩポリペプチド、及び配列番号１１に示されるメソテリン３５〜６２２と少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一のアミノ酸配列を含むメソテリンポリペプチドを含み得る。
【０００７】
また、開示される融合タンパク質をコードする核酸分子も提供される。一部の実施形態では、核酸分子は、配列番号４に示されるＥＧＦＲｖＩＩＩポリヌクレオチドと少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一である１つ又は複数のＥＧＦＲｖＩＩＩポリヌクレオチド、及び配列番号６に示されるメソテリン３５〜６２２ポリヌクレオチドと少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一であるメソテリンポリヌクレオチドを含み得る。
【０００８】
本明細書では、開示の核酸分子を含む宿主細胞が開示される。一部の実施形態では、宿主細胞は、配列番号４に示されるＥＧＦＲｖＩＩＩポリヌクレオチドと少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一である１つ又は複数のＥＧＦＲｖＩＩＩポリヌクレオチド、及び配列番号６に示されるメソテリン３５〜６２２ポリヌクレオチドと少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一であるメソテリンポリヌクレオチドを含む核酸分子を含み得る。
【０００９】
また、対象において免疫応答を誘発する方法も提供される。一部の実施形態では、本方法は、宿主細胞を含む組成物を対象に投与するステップを含んでよく、宿主細胞は、ＥＧＦＲｖＩＩＩ−メソテリン融合タンパク質をコードする核酸分子を含む。一部の態様では、核酸分子は、配列番号４に示されるＥＧＦＲｖＩＩＩポリヌクレオチドと少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一である１つ又は複数のＥＧＦＲｖＩＩＩポリヌクレオチド、及び配列番号６に示されるメソテリン３５〜６２２ポリヌクレオチドと少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一であるメソテリンポリヌクレオチドを含み得る。
【００１０】
さらに、メソテリンポリペプチドの発現を増大させる方法も開示され、これは、宿主細胞において、ＥＧＦＲｖＩＩＩポリヌクレオチドと、メソテリンポリペプチドをコードするメソテリンポリヌクレオチドとを含む核酸分子を発現させるステップを含む。一部の実施形態では、核酸分子は、配列番号４に示されるＥＧＦＲｖＩＩＩポリヌクレオチドと少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一である１つ又は複数のＥＧＦＲｖＩＩＩポリヌクレオチド、及び配列番号６に示されるメソテリン３５〜６２２ポリヌクレオチドと少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一であるメソテリンポリヌクレオチドを含み得る。
【００１１】
また、癌の治療を、それを必要とする対象において行う方法も提供される。一部の実施形態では、本方法は、治療有効量の、宿主細胞を含む組成物を対象に投与するステップを含んでよく、宿主細胞は、ＥＧＦＲｖＩＩＩ−メソテリン融合タンパク質をコードする核酸分子を含む。一部の実施形態では、核酸分子は、各々が配列番号９に示されるＥＧＦＲｖＩＩＩと少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一のアミノ酸配列を含む１つ又は複数のＥＧＦＲｖＩＩＩポリペプチド、及び配列番号１１に示されるメソテリン３５〜６２２と少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一のアミノ酸配列を含むメソテリンポリペプチドを含む融合タンパク質をコードすることができる。一部の態様では、核酸分子は、配列番号４に示されるＥＧＦＲｖＩＩＩポリヌクレオチドと少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一である１つ又は複数のＥＧＦＲｖＩＩＩポリヌクレオチド、及び配列番号６に示されるメソテリン３５〜６２２ポリヌクレオチドと少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一であるメソテリンポリヌクレオチドを含み得る。
【００１２】
概要及び以下の詳細な説明は、添付の図面と一緒に読まれる場合にさらによく理解されるであろう。開示される組成物及び方法を例証する目的で、組成物及び方法の例示的実施形態の図面が提供されるが、組成物及び方法は、開示される具体的な実施形態に限定されない。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１Ａ及び図１Ｂを含み、（Ａ）ＥＧＦＲｖＩＩＩｘ５−メソテリン３５〜６２２（本明細書ではＡＤＵ−２１４とも呼ばれる）及び（Ｂ）ＣＲＳ−２０７（参照のために示す）の例示的な概略図を示す。
【図２】ブロス培養物におけるＡＤＵ−２１４の発現を示す。ＥＧＦＲｖＩＩＩ−Ｍｅｓｏ＝ＡＤＵ−２１４融合タンパク質；Ｍｅｓｏ＝ＣＲＳ−２０７融合タンパク質。Ｌｍ１１は、負の対照として使用した。
【図３】図３Ａ及び図３Ｂを含み、ワクチン接種したマウスにおける抗原特異的Ｔ細胞免疫応答を示す。（Ａ）ＡＤＵ−２１４は、Ｂａｌｂ／ｃマウスにおいて頑健なメソテリン特異的Ｔ細胞媒介性免疫応答を誘導した。（Ｂ）ＡＤＵ−２１４は、Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマウスにおいて頑健なＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答を誘導した。
【図４】野生型リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）攻撃に対するＡＤＵ−２１４によるワクチン接種の防御免疫を示す。
【図５】ＡＤＵ−２１４による治療用ワクチン接種を示す。ＨＢＳＳ及び空のプラットフォーム株を対照として使用した。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
開示される組成物及び方法は、本開示の一部を成す添付の図面に関連して行われる以下の詳細な説明を参照することによってより容易に理解されるであろう。開示される組成物及び方法が本明細書に記載及び／又は示される具体的な組成物及び方法に限定されないことと、本明細書で使用される専門用語があくまで例として具体的な実施形態を説明することを目的とし、特許請求される組成物及び方法の限定を意図するものではないこととを理解すべきである。
【００１５】
特に別途記載のない限り、考えられる作用機構若しくは作用モード又は改善の理由は、例示を意図するに過ぎず、開示される組成物及び方法が、このような提案される作用機構若しくは作用モード又は改善の理由の正確さ又は不正確さによって束縛されるわけではない。
【００１６】
本文全体を通して、これらの説明は、組成物及び前記組成物を使用する方法に関連する。本開示が、組成物に関連する特徴又は実施形態を説明又は特許請求する場合、こうした特徴又は実施形態は、前記組成物を使用する方法にも等しく適用可能である。同様に、開示内容は、組成物を使用する方法に関連する特徴又は実施形態を説明又は特許請求する場合、こうした特徴又は実施形態は、組成物にも等しく適用可能である。
【００１７】
明瞭化のために個別の実施形態に関して本明細書に記載される開示の組成物及び方法のいくつかの特徴は、単一の実施形態において組み合わせて提供してもよいことを理解すべきである。反対に、簡略化のために単一の実施形態に関して記載される開示の組成物及び方法の様々な特徴は、個別に又は任意の部分組合せで提供してもよい。
【００１８】
本明細書で使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」は、複数形を含む。
【００１９】
以下の略語は、本開示全体を通して使用される：ＥＧＦＲｖＩＩＩ（上皮増殖因子受容体変異型ＩＩＩネオアンチゲン結合領域）；ＥＧＦＲｖＩＩＩｘ５（ＥＧＦＲｖＩＩＩの５つのコピー）；Ｍｅｓｏ（メソテリン）；ＡＤＵ−２１４（ＥＧＦＲｖＩＩＩｘ５−メソテリン３５〜６２２）；Ｌｍ（リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ））；ＬＡＤＤ（二重欠失リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ））。
【００２０】
デルタ記号（Δ又は「．ＤＥＬＴＡ．」）は、欠失を指す。例えば、「ΔａｃｔＡ」（又は「．ＤＥＬＴＡ．ａｃｔＡ」）は、ａｃｔＡ遺伝子の全部又は一部が欠失していることを意味する。
【００２１】
数値範囲、カットオフ、又は具体的な値に関して使用されるとき、「約」という用語は、記載された値が列記された値から最大１０％変動し得ることを示すために用いられる。従って、「約」という用語は、明示された値から±１０％以下の変動、±５％以下の変動、±１％以下の変動、±０．５％以下の変動、又は±０．１％以下の変動を包含するために使用される。
【００２２】
本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、ヒト又は非ヒト生物を指す。従って、本明細書に記載する方法及び組成物は、ヒト及び脊椎動物の両方に適用可能である。いくつかの実施形態では、対象は、「患者」、すなわち疾患又は病状のための医療を受けている生きたヒトである。これは、確定されていない疾病を有し、疾病の兆候につい検査中の人を含む。ＥＧＦＲｖＩＩＩ、及びメソテリンの１つ又は複数、好ましくはこれらの各々を発現する悪性腫瘍を有する対象が好ましい。いくつかの実施形態では、対象は、肺癌、好ましくは進行（ＩＩＩｂ期）又は転移性（ＩＶ期）非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）腺癌に罹患している。
【００２３】
本明細書で使用される場合、「同一パーセント」、「配列同一性」、及び「同一性パーセント」という用語は、２つ以上のポリペプチド間で同じ（すなわち、同一の）アミノ酸のパーセントを指す。２つ以上のポリペプチド間の配列同一性は、ポリペプチドのアミノ酸配列をアラインメントし、同じアミノ酸残基を含有するアラインメントされたポリペプチド中の位置の数をスコアリングして、これをアラインメントされたポリペプチド中の異なる位置の数と比較することにより決定することができる。ポリペプチドは、例えば、異なるアミノ酸を含有すること（すなわち、置換若しくは突然変異）により、又はアミノ酸が欠失すること（すなわち、ポリペプチドの１つ又は両方へのアミノ酸挿入若しくはアミノ酸欠失）により異なり得る。配列同一性は、同じアミノ酸残基を含有する位置の数をポリペプチド中のアミノ酸残基の総数で割ることによって計算することができる。例えば、同一性パーセントは、同じアミノ酸残基を含有する位置の数をポリペプチド中のアミノ酸残基の総数で割り、１００を掛けることによって計算することができる。
【００２４】
「その免疫原性断片」は、対象において免疫原性応答を誘発することができる融合タンパク質の部分を含む。一部の態様では、免疫原性断片は、ＥＧＦＲｖＩＩＩ−メソテリンを含むか、これからなるか、又はこれから実質的になる。他の態様では、免疫原性断片は、シグナル配列−ＥＧＦＲｖＩＩＩ−メソテリンを含むか、これからなるか、又はこれから実質的になる。
【００２５】
本明細書で使用される場合、「融合タンパク質」は、２つ以上のポリペプチドの結合から作製されるタンパク質を指す。融合タンパク質は、ポリペプチドを化学的に共役させることによって作製することができる。好ましくは、融合タンパク質は、遺伝子融合によって作製され、この場合、核酸分子の転写及び翻訳により、個々のポリペプチドを含む単一のタンパク質が産生されるように、個々のポリペプチドをコードする核酸分子をフレーム内結合する。開示される融合タンパク質は、ポリペプチド間に１つ又は複数のリンカー残基を有してよい。
【００２６】
本明細書で使用される場合、「シグナル配列」は、融合タンパク質の分泌を駆動するために機能するポリペプチド配列、及びこれをコードするヌクレオチド配列を指す。シグナル配列は、融合タンパク質を含むポリペプチドに作動可能に連結されており、融合タンパク質を含むポリペプチドと共に翻訳リーディングフレーム内にある。「シグナル配列」はまた、「分泌シグナル配列」と呼ぶこともできる。
【００２７】
本明細書で使用される場合、「作動可能に連結された」は、成分の正常な機能が維持される様式におけるプロモータリボソーム結合部位などの制御配列の並置を指す。「制御配列」は、典型的に、宿主生物における作動可能に連結されたコード配列の発現のために必要なＤＮＡ配列を指す。制御配列は、プロモータ、リボソーム結合部位、及び任意選択でＳｈｉｎｅ／Ｄａｌｇａｒｎｏ配列を含んでよい。このように、コードされたシグナル配列に「作動可能に連結された」コード配列は、シグナルペプチドが宿主細胞によってプロセシングされて、プロセシングされたタンパク質が分泌されるように、コード配列がシグナル配列に結合されている立体配置を指す。プロモータに作動可能に連結されたシグナル配列は、分泌シグナル配列の転写及び翻訳がプロモータ、リボソーム結合部位、及び必要に応じてＳｈｉｎｅ／Ｄａｌｇａｒｎｏ配列によって制御されるようにプロモータに結合されている。
【００２８】
本明細書で使用される場合、「ｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一」は、参照項目（例えば、生物学的配列）と少なくとも９０％同一、９１％同一、９２％同一、９３％同一、９４％同一、９５％同一、９６％同一、９７％同一、９８％同一、９９％同一、又は１００％同一を包含する。
【００２９】
ＥＧＦＲｖＩＩＩポリペプチド及びこれを含む免疫原性融合タンパク質の場合、本明細書に記載するいずれかの配列変異性は、配列番号９のアミノ酸残基７〜１４（ＥＥＫＫＧＮＹＶ）の外部で起こらなければならない。換言すれば、配列変異性は、配列番号９のアミノ酸残基１〜６（ＰＡＳＲＡＬ）若しくはこれを含む免疫原性融合タンパク質、及び／又は配列番号９のアミノ酸残基１５〜２１（ＶＴＤＨＧＳＣ）若しくはこれを含む免疫原性融合タンパク質に起こり得る。例えば、配列番号９と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むＥＧＦＲｖＩＩＩポリペプチドは、配列番号９と少なくとも９０％同一、９１％同一、９２％同一、９３％同一、９４％同一、９５％同一、９６％同一、９７％同一、９８％同一、９９％同一、又は１００％同一であるアミノ酸配列を包含し、配列番号９のアミノ酸残基１〜６又は１５〜２１に変異性が起こる。従って、各ＥＧＦＲｖＩＩＩポリペプチド及びこれを含む免疫原性融合タンパク質は、配列番号９のアミノ酸残基７〜１４（ＥＥＫＫＧＮＹＶ）を含有し得る。
【００３０】
ＥＧＦＲｖＩＩＩポリヌクレオチドは、配列番号９の短い部分を含むように長さを調節することができる。例えば、一部の実施形態では、ＥＧＦＲｖＩＩＩポリペプチドは、配列番号９のアミノ酸残基６〜１８と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むか、これからなるか、又はこれから実質的になり得る。一部の実施形態では、ＥＧＦＲｖＩＩＩポリペプチドの１つ又は複数のコピーは、配列番号９のアミノ酸残基６〜１４と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むか、これからなるか、又はこれから実質的になり得る。前述したように、これらの短いポリペプチドの変異性は、配列番号９のアミノ酸残基１〜６又は１５〜２１で起こることになる。従って、配列番号９のアミノ酸残基６〜１８と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列の場合、変異性は、配列番号９のアミノ酸残基６又は１５〜１８で起こり得る。配列番号９のアミノ酸残基６〜１４のアミノ酸残基と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列の場合、変異性はアミノ酸残基６で起こり得る。
【００３１】
開示される融合タンパク質は、ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗原とメソテリン抗原とを含むか、これらからなるか、又はこれらから実質的になり得る。本明細書に記載する抗原は、完全長タンパク質配列由来のＭＨＣクラスＩエピトープ又はＭＨＣクラスＩＩエピトープである配列を含んでもよい。一実施形態では、記載されるＥＧＦＲｖＩＩＩポリヌクレオチドは、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ又は少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩエピトープをコードする配列を含む。同様に、本明細書に記載されるＥＧＦＲｖＩＩＩポリペプチドは、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ又は少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩエピトープを含む。一実施形態では、記載されるメソテリンポリヌクレオチドは、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ又は少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩエピトープをコードする配列を含む。同様に、本明細書に記載のメソテリンポリペプチドは、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩエピトープ又は少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩエピトープを含む。
【００３２】
ＥＧＦＲは、細胞増殖及び生存に重要な受容体チロシンキナーゼである。ＥＧＦＲ遺伝子は、頭部及び頚部、結腸、膵臓、乳房、卵巣、腎臓、並びに悪性神経膠腫をはじめとするヒト癌に過剰発現又は突然変異することが多い。ＥＧＦＲ受容体変異型ＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）は、エキソン２〜７の２６７アミノ酸欠失及びエキソン１とエキソン８との融合によって生じ、結合部に新たなグリシンを有する腫瘍特異的ペプチドを産生する。ＥＧＦＲｖＩＩＩは、構成的リガンド非依存性シグナル伝達を呈示する。
【００３３】
メソテリンは、胸膜、腹膜、及び心膜を覆う正常メソテリン細胞上に存在するグリコシルホスファチジルイノシトール結合型細胞表面糖タンパク質である。メソテリンはまた、膵臓腺癌、中皮腫、ＮＳＣＬＣ、及び卵巣癌をはじめとするいくつかのヒト腫瘍によって高度に発現される腫瘍関連抗原でもある。
【００３４】
予測アルゴリズム「ＢＩＭＡＳ」は、ペプチド／ＨＬＡ複合体の予測半減期解離に従って潜在的ＨＬＡ結合エピトープを等級付けする。「ＳＹＦＰＥＩＴＨＩ」アルゴリズムは、一次及び二次ＨＬＡ結合アンカー残基の存在を明らかにするスコアに従ってペプチドを等級付けする。いずれのコンピュータ化アルゴリズムも、以前公開されたＨＬＡ結合エピトープと類似する結合モチーフを有する所与のタンパク質内のアミノ酸配列に基づいて候補エピトープをスコアリングする。また、他のアルゴリズムを用いて別の生物学的試験のための候補を見出すこともできる。
【００３５】
融合タンパク質及び前記融合タンパク質の抗原部分、並びにこれらをコードする核酸分子の例示的なヌクレオチド及びアミノ酸配列を表２に記載する。
【００３６】
融合タンパク質
本明細書では、メソテリンポリペプチドに融合された上皮増殖因子受容体変異型ＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）ポリペプチドを含む融合タンパク質（ＥＧＦＲｖＩＩＩ−メソテリン融合タンパク質）が開示される。
【００３７】
融合タンパク質は、ＥＧＦＲｖＩＩＩポリペプチドの１つ又は複数のコピーを含み得る。一部の実施形態では、融合タンパク質は、１つのＥＧＦＲｖＩＩＩポリペプチドを含み得る。他の実施形態では、融合タンパク質は、複数のＥＧＦＲｖＩＩＩポリペプチドを含み得る。ＥＧＦＲｖＩＩＩポリペプチドの好適なコピー数として、限定はしないが、２つ、３つ、４つ、５つ、又はそれを超えるコピーが挙げられる。一部の実施形態では、融合タンパク質は、ＥＧＦＲｖＩＩＩポリペプチドの１つのコピー（ＥＧＦＲｖＩＩＩｘ１）を含み得る。一部の実施形態では、融合タンパク質は、ＥＧＦＲｖＩＩＩポリペプチドの２つのコピー（ＥＧＦＲｖＩＩＩｘ２）を含み得る。一部の実施形態では、融合タンパク質は、ＥＧＦＲｖＩＩＩポリペプチドの３つのコピー（ＥＧＦＲｖＩＩＩｘ３）を含み得る。一部の実施形態では、融合タンパク質は、ＥＧＦＲｖＩＩＩポリペプチドの４つのコピー（ＥＧＦＲｖＩＩＩｘ４）を含み得る。一部の実施形態では、融合タンパク質は、ＥＧＦＲｖＩＩＩポリペプチドの５つのコピー（ＥＧＦＲｖＩＩＩｘ５）を含み得る。
【００３８】
一部の実施形態では、ＥＧＦＲｖＩＩＩポリペプチドの１つ又は複数のコピーの各々は、配列番号９と少なくとも９０％同一、９１％同一、９２％同一、９３％同一、９４％同一、９５％同一、９６％同一、９７％同一、９８％同一、９９％同一、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。一部の態様では、例えば、ＥＧＦＲｖＩＩＩポリペプチドは、配列番号９と少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一のアミノ酸配列を含み得る。他の実施形態では、ＥＧＦＲｖＩＩＩポリペプチドは、ＥＧＦＲｖＩＩＩポリペプチドの２つ、３つ、４つ、５つ、又はそれを超えるコピーを含んでよく、各コピーは、配列番号９と少なくともｉ）９０％同一のアミノ酸配列を有する。
【００３９】
一部の態様では、ＥＧＦＲｖＩＩＩポリペプチドの１つ又は複数のコピーの各々は、配列番号９と少なくとも９０％同一、９１％同一、９２％同一、９３％同一、９４％同一、９５％同一、９６％同一、９７％同一、９８％同一、９９％同一、又は１００％同一であるアミノ酸配列からなり得る。一部の実施形態では、ＥＧＦＲｖＩＩＩポリペプチドの１つ又は複数のコピーの各々は、配列番号９と少なくとも９０％同一、９１％同一、９２％同一、９３％同一、９４％同一、９５％同一、９６％同一、９７％同一、９８％同一、９９％同一、又は１００％同一であるアミノ酸配列から実質的になり得る。
【００４０】
一部の実施形態では、ＥＧＦＲｖＩＩＩポリペプチドの１つ又は複数のコピーは、配列番号９のアミノ酸残基６〜１８と少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一のアミノ酸配列を含むか、これからなるか、又はこれから実質的になり得る。一部の実施形態では、ＥＧＦＲｖＩＩＩポリペプチドの１つ又は複数のコピーは、配列番号９のアミノ酸残基６〜１４と少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一のアミノ酸配列を含むか、これからなるか、又はこれから実質的になり得る。
【００４１】
ＥＧＦＲｖＩＩＩポリペプチドは、ＥＧＦＲｖＩＩＩポリペプチドのＮ末端、Ｃ末端、又はＮ末端及びＣ末端の両方で１つ又は複数の切断配列によってフランキングされ得る。切断配列は、対象に存在するプロテアーゼによってプロセシングされるように立体配置されている。ＥＧＦＲｖＩＩＩポリペプチドがＥＧＦＲｖＩＩＩポリペプチドの２つ以上のコピーを含む場合、切断配列は、ＥＧＦＲｖＩＩＩポリペプチドの個々のコピー間に存在してよい。例えば、限定はしないが、配列番号１０は、ＥＧＦＲｖＩＩＩポリペプチドの５つのコピー（配列番号９に示されるＥＧＦＲｖＩＩＩポリペプチドの各コピー）と、切断配列（ＡＳＫＶＬ／ＡＤＧＳＶＫＴＳ（配列番号２６）、ＡＳＫＶＡ／ＧＤＧＳＩＫ（配列番号２７）、ＬＳＫＶＬ／ＡＤＧＳＶＫ（配列番号２８）、ＡＳＫＶＡ／ＧＤＧＳＩＫ（配列番号２９）、及びＬＳＫＶＬ／ＡＤＧＳＶＫ（配列番号３０）；ここで、「／」は、ＥＧＦＲｖＩＩＩポリペプチドを表す）とを含む。これらの切断配列は、本来、例示的なものに過ぎない。好適な切断配列は、米国特許出願第１３／９８８，０７６号明細書（米国特許出願公開第２０１４／０３７６６２号明細書）；Ｔｏｅｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（２００１）１９４：１−１２；Ｌａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．（２００８）７６：３７４２−５３；及びＳｉｎｎａｔｈａｍｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．（２００９）３２：８５６−６９に記載されており、これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００４２】
ＥＧＦＲｖＩＩＩポリペプチドは、メソテリンポリペプチドのＮ末端又はＣ末端側であってよい。一部の実施形態では、ＥＧＦＲｖＩＩＩポリペプチドは、メソテリンポリペプチドのＮ末端側であってよい。
【００４３】
好適なメソテリンポリペプチドは、メソテリンのアミノ酸３５〜６２２（本明細書では「メソテリン３５〜６２２」と称する）と少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一のアミノ酸配列を有するメソテリンポリペプチドを含む。
【００４４】
一部の態様では、メソテリンポリペプチドは、配列番号１１に示されるメソテリン３５〜６２２と少なくとも９０％同一、９１％同一、９２％同一、９３％同一、９４％同一、９５％同一、９６％同一、９７％同一、９８％同一、９９％同一、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。このように、一部の実施形態では、メソテリンポリペプチドは、配列番号１１に示されるメソテリン３５〜６２２と少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一のアミノ酸配列を含み得る。一部の態様では、メソテリンポリペプチドは、配列番号１１に示されるメソテリン３５〜６２２と少なくとも９０％同一、９１％同一、９２％同一、９３％同一、９４％同一、９５％同一、９６％同一、９７％同一、９８％同一、９９％同一、又は１００％同一であるアミノ酸配列からなり得る。一部の態様では、メソテリンポリペプチドは、配列番号１１に示されるメソテリン３５〜６２２と少なくとも９０％同一、９１％同一、９２％同一、９３％同一、９４％同一、９５％同一、９６％同一、９７％同一、９８％同一、９９％同一、又は１００％同一であるアミノ酸配列から実質的になり得る。
【００４５】
融合タンパク質は、各々が配列番号９に示されるＥＧＦＲｖＩＩＩと少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一のアミノ酸配列を含む１つ又は複数のＥＧＦＲｖＩＩＩポリペプチド、及び配列番号１１に示されるメソテリン３５〜６２２と少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一のアミノ酸配列を含むメソテリンポリペプチドを含むか、これらからなるか、又はこれらから実質的になり得る。融合タンパク質は、配列番号１０に示されるＥＧＦＲｖＩＩＩｘ５と少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一のアミノ酸配列を含むＥＧＦＲｖＩＩＩｘ５ポリペプチド、及び配列番号１１に示されるメソテリン３５〜６２２と少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一のアミノ酸配列を含むメソテリンポリペプチドを含むか、これらからなるか、又はこれらから実質的になり得る。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号８のアミノ酸残基８９〜８４０として示されるＥＧＦＲｖＩＩＩｘ５−メソテリン３５〜６２２と少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一であるアミノ酸配列を含むか、これからなるか、又はこれから実質的になり得る。例えば、一部の態様では、融合タンパク質は、配列番号８のアミノ酸残基８９〜８４０として示されるＥＧＦＲｖＩＩＩｘ５−メソテリン３５〜６２２と少なくとも９０％同一、９１％同一、９２％同一、９３％同一、９４％同一、９５％同一、９６％同一、９７％同一、９８％同一、９９％同一、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。一部の態様では、融合タンパク質は、配列番号８のアミノ酸残基８９〜８４０として示されるＥＧＦＲｖＩＩＩｘ５−メソテリン３５〜６２２と少なくとも９０％同一、９１％同一、９２％同一、９３％同一、９４％同一、９５％同一、９６％同一、９７％同一、９８％同一、９９％同一、又は１００％同一であるアミノ酸配列からなり得る。一部の態様では、融合タンパク質は、配列番号８のアミノ酸残基８９〜８４０として示されるＥＧＦＲｖＩＩＩｘ５−メソテリン３５〜６２２と少なくとも９０％同一、９１％同一、９２％同一、９３％同一、９４％同一、９５％同一、９６％同一、９７％同一、９８％同一、９９％同一、又は１００％同一であるアミノ酸配列から実質的になり得る。
【００４６】
開示される融合タンパク質は、シグナル配列をさらに含んでもよく、シグナル配列は、ＥＧＦＲｖＩＩＩポリペプチド及びメソテリンポリペプチドと共に翻訳リーディングフレーム内にある。好適なシグナル配列として、例えば、ＡｃｔＡＮ１００（配列番号３２に示される）、ＡｃｔＡＮ１００＊（配列番号１２に示される）、ＬＬＯ４４１（配列番号２０に示される）、ＬＬＯ４４１ΔＰＥＳＴ（配列番号２２に示される）、及びＬＬＯ４４１Δ２６（配列番号２４に示される）が挙げられる。一部の実施形態では、シグナル配列は、配列番号３２に示されるＡｃｔＡＮ１００と少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一のアミノ酸配列を含み得る。一部の実施形態では、融合タンパク質は、シグナル配列をさらに含んでよく、シグナル配列は、配列番号１２に示されるＡｃｔＡＮ１００＊シグナル配列と少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一のアミノ酸配列を含む。従って、融合タンパク質は、配列番号８に示されるＡｃｔＡＮ１００＊−ＥＧＦＲｖＩＩＩｘ５−メソテリン３５〜６２２又はその免疫原性断片と少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一であるアミノ酸配列を含み得る。他の態様では、融合タンパク質は、配列番号８に示されるＡｃｔＡＮ１００＊−ＥＧＦＲｖＩＩＩｘ５−メソテリン３５〜６２２又はその免疫原性断片と少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一であるアミノ酸配列からなり得る。また別の態様では、融合タンパク質は、配列番号８に示されるＡｃｔＡＮ１００＊−ＥＧＦＲｖＩＩＩｘ５−メソテリン３５〜６２２又はその免疫原性断片と少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一であるアミノ酸配列から実質的になり得る。
【００４７】
開示される融合タンパク質は、本明細書の他の箇所に開示する通り、いくつかの好適な宿主細胞に発現させることができる。一部の実施形態では、例えば、融合タンパク質は、細菌、例えば、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）又はその遺伝子修飾形態に発現させることができる。
【００４８】
開示される融合タンパク質は、融合タンパク質を受ける対象において、体液性応答、抗原特異的Ｔ細胞応答（ＣＤ４＋及び／又はＣＤ８＋）、又はその両方を誘発するための免疫原性ポリペプチドとして用いることができる。
【００４９】
核酸分子
本明細書では、ＥＧＦＲｖＩＩＩ−メソテリン融合タンパク質をコードする核酸分子が開示される。開示の核酸分子は、本明細書に開示されるＥＧＦＲｖＩＩＩ−メソテリン融合タンパク質のいずれをコードすることもできる。
【００５０】
本開示全体を通して、１つ又は複数のＥＧＦＲｖＩＩＩポリペプチドを含むＥＧＦＲｖＩＩＩ−メソテリン融合タンパク質、及び１つ又は複数のＥＧＦＲｖＩＩＩポリペプチドを含む前記融合タンパク質をコードする核酸が記載されている。ＥＧＦＲｖＩＩＩポリペプチドは、表１に記載されるＥＧＦＲｖＩＩＩヌクレオチド配列のいずれか１つによってコードされ得る。従って、本開示全体を通して、ＥＧＦＲｖＩＩＩポリヌクレオチドが「配列番号４（表１に示す共通配列）と少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一である」と言うとき、配列番号１３と少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一、配列番号１４と少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一、配列番号１５と少なくとも９０％同一、配列番号１６と少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一、及び／又は配列番号１７と少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一であることを含むことが意図される。同様に、様々な免疫原性融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１３〜１７のいずれか１つを含み得る。従って、本明細書に記載される各ＥＧＦＲｖＩＩＩ−メソテリン融合タンパク質は、核酸分子によってコードされ得るが、核酸分子は、配列番号１３と少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一、配列番号１４と少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一、配列番号１５と少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一、配列番号１６と少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一、及び／又は配列番号１７と少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一である１つ又は複数のポリヌクレオチドを含む。
【００５１】
【表１】
0006782253.tif 000002
【００５２】
核酸分子は、１つ又は複数のＥＧＦＲｖＩＩＩポリペプチドを含むＥＧＦＲｖＩＩＩ−メソテリン融合タンパク質をコードすることができる。一部の実施形態では、核酸分子は、１つのＥＧＦＲｖＩＩＩポリペプチド（ＥＧＦＲｖＩＩＩｘ１）を含むＥＧＦＲｖＩＩＩ−メソテリン融合タンパク質をコードすることができる。他の実施形態では、核酸分子は、複数のＥＧＦＲｖＩＩＩポリペプチドを含むＥＧＦＲｖＩＩＩ−メソテリン融合タンパク質をコードすることができる。開示される核酸分子によってコードされるＥＧＦＲｖＩＩＩポリペプチドの好適な数として、限定はしないが、２つ、３つ、４つ、５つ、又はそれを超えるコピーが挙げられる。一部の実施形態では、核酸分子は、ＥＧＦＲｖＩＩＩポリペプチドの２つのコピー（ＥＧＦＲｖＩＩＩｘ２）を含むＥＧＦＲｖＩＩＩ−メソテリン融合タンパク質をコードすることができる。一部の実施形態では、核酸分子は、ＥＧＦＲｖＩＩＩポリペプチドの３つのコピー（ＥＧＦＲｖＩＩＩｘ３）を含むＥＧＦＲｖＩＩＩ−メソテリン融合タンパク質をコードすることができる。一部の実施形態では、核酸分子は、ＥＧＦＲｖＩＩＩポリペプチドの４つのコピー（ＥＧＦＲｖＩＩＩｘ４）を含むＥＧＦＲｖＩＩＩ−メソテリン融合タンパク質をコードすることができる。一部の実施形態では、核酸分子は、ＥＧＦＲｖＩＩＩポリペプチドの５つのコピー（ＥＧＦＲｖＩＩＩｘ５）を含むＥＧＦＲｖＩＩＩ−メソテリン融合タンパク質をコードすることができる。
【００５３】
ＥＧＦＲｖＩＩＩポリペプチドをコードするＥＧＦＲｖＩＩＩヌクレオチドの例示的な核酸配列は、配列番号４に示される。一部の実施形態では、開示される核酸分子は、配列番号４に示されるＥＧＦＲｖＩＩＩｘ５ポリヌクレオチドと少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一である１つ又は複数のＥＧＦＲｖＩＩＩポリヌクレオチドを含み得る。ＥＧＦＲｖＩＩＩｘ５ポリペプチドをコードするＥＧＦＲｖＩＩＩｘ５ポリヌクレオチドの例示的な核酸配列は、配列番号５に示される。一部の実施形態では、開示される核酸分子は、配列番号５に示されるＥＧＦＲｖＩＩＩｘ５ポリヌクレオチドと少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一であるＥＧＦＲｖＩＩＩｘ５ポリヌクレオチドを含み得る。
【００５４】
核酸分子によってコードされる好適なメソテリンポリヌクレオチドは、メソテリン３５〜６２２を含む。メソテリン３５〜６２２の核酸配列は、配列番号６に示される。従って、開示される核酸分子は、ＥＧＦＲｖＩＩＩ−メソテリン融合タンパク質をコードすることができ、メソテリンポリペプチドは、配列番号６に示されるメソテリン３５〜６２２ポリヌクレオチドと少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一であるポリヌクレオチドによってコードされる。
【００５５】
一部の実施形態では、核酸分子は、配列番号４に示されるＥＧＦＲｖＩＩＩポリヌクレオチドと少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一である１つ又は複数のＥＧＦＲｖＩＩＩポリヌクレオチド、及び配列番号６に示されるメソテリン３５〜６２２ポリヌクレオチドと少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一であるメソテリンポリヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態では、核酸分子は、配列番号５に示されるＥＧＦＲｖＩＩＩｘ５ポリヌクレオチドと少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一であるポリヌクレオチド、及び配列番号６に示されるメソテリン３５〜６２２ポリヌクレオチドと少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一であるポリヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態では、核酸分子は、配列番号７と少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一であるＥＧＦＲｖＩＩＩｘ５−メソテリン３５〜６２２ポリヌクレオチドを含み得る。
【００５６】
開示される核酸分子は、プロモータ、シグナル配列、又はその両方をさらに含んでもよい。シグナル配列は、宿主細胞からのコードされた融合タンパク質の分泌を指令するために使用することができる。好適なプロモータとして、例えば、ａｃｔＡ（配列番号２に示される）又はｈｌｙ（配列番号１８に示される）が挙げられる。一部の実施形態では、核酸分子は、プロモータをさらに含んでもよく、プロモータは、配列番号２に示されるａｃｔＡプロモータと少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一であるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、核酸分子は、プロモータをさらに含んでもよく、プロモータは、配列番号１８に示されるｈｌｙプロモータと少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、核酸分子は、ＥＧＦＲｖＩＩＩポリペプチドをコードするヌクレオチド配列及びメソテリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と共に翻訳フレーム内にあるシグナル配列をさらに含んでもよい。シグナル配列は、宿主細胞からのコードされた融合タンパク質の分泌を指令するために使用することができる。好適なシグナル配列として、例えば、ＡｃｔＡＮ１００（配列番号３１に示される）、ＡｃｔＡＮ１００＊（配列番号３に示される）、及びＬＬＯ４４１（配列番号１９に示される）、ＬＬＯ４４１ΔＰＥＳＴ（配列番号２１に示される）、及びＬＬＯ４４１Δ２６（配列番号２３に示される）が挙げられる。一部の実施形態では、核酸分子は、シグナル配列をさらに含んでもよく、シグナル配列は、配列番号３１に示されるＡｃｔＡＮ１００シグナル配列と少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一であるヌクレオチド配列を含み得る。一部の実施形態では、核酸分子は、シグナル配列をさらに含んでもよく、シグナル配列は、配列番号３に示されるＡｃｔＡＮ１００＊シグナル配列と少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一であるヌクレオチド配列を含み得る。一部の実施形態では、核酸分子は、シグナル配列をさらに含んでもよく、シグナル配列は、配列番号１９に示されるＬＬＯ４４１シグナル配列と少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一であるヌクレオチド配列を含み得る。一部の実施形態では、核酸分子は、シグナル配列をさらに含んでもよく、シグナル配列は、配列番号２１に示されるＬＬＯ４４１ΔＰＥＳＴシグナル配列と少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一であるヌクレオチド配列を含み得る。一部の実施形態では、核酸分子は、シグナル配列をさらに含んでもよく、シグナル配列は、配列番号２３に示されるＬＬＯ４４１Δ２６シグナル配列と少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一であるヌクレオチド配列を含み得る。従って、一部の実施形態では、核酸分子は、配列番号１に示される塩基対ａｃｔＡｐ−ＡｃｔＡＮ１００＊−ＥＦＧＲｖＩＩＩｘ５−メソテリン３５〜６２２と少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一であるポリヌクレオチドを含むか、これからなるか、又はこれから実質的になり得る。
【００５７】
一部の実施形態では、核酸分子は、ＥＧＦＲｖＩＩＩ−メソテリン融合タンパク質をコードすることができ、融合タンパク質は、各々が配列番号９に示されるＥＧＦＲｖＩＩＩと少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一のアミノ酸配列を含む１つ又は複数のＥＧＦＲｖＩＩＩポリペプチド、及び配列番号１１に示されるメソテリン３５〜６２２と少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一のアミノ酸配列を含むメソテリンポリペプチドを含む。
【００５８】
一部の実施形態では、核酸分子は、ＥＧＦＲｖＩＩＩ−メソテリン融合タンパク質をコードすることができ、融合タンパク質は、配列番号１０に示されるＥＧＦＲｖＩＩＩｘ５と少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一のアミノ酸配列を含むＥＧＦＲｖＩＩＩｘ５ポリペプチド、及び配列番号１１に示されるメソテリン３５〜６２２と少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一のアミノ酸配列を含むメソテリンポリペプチドを含む。
【００５９】
一部の実施形態では、核酸分子は、ＥＧＦＲｖＩＩＩ−メソテリン融合タンパク質をコードし、ＥＧＦＲｖＩＩＩ−メソテリン融合タンパク質は、配列番号８のアミノ酸残基８９〜８４０に示されるＥＧＦＲｖＩＩＩｘ５−メソテリン３５〜６２２と少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一であるアミノ酸配列を含むか、これからなるか、又はこれから実質的になる。
【００６０】
核酸分子は、限定はしないが、制限的エンドヌクレアーゼ切断部位（クローニングリンカー）をはじめとする別の核酸配列をさらに含んでもよい。核酸分子は、いくつかの好適な制限エンドヌクレアーゼを用いて作製することができ、エンドヌクレアーゼ切断部位は、最終核酸分子中に残留してもよい。配列番号１は、ＢａｍＨＩクローニングリンカー（ＧＧＡＴＣＣ）及びＭｆｅＩクローニングリンカー（ＣＡＡＴＴＧ）を含む。当業者は、ＢａｍＨＩ及び／又はＭｆｅＩの代わりに他のクローニングリンカーを用いてもよいことを認識するであろう。
【００６１】
核酸分子に含有させることができる別の核酸配列として、個別のＥＧＦＲｖＩＩＩポリヌクレオチドとフランキングする「切断配列」（本明細書の他の箇所で定義する通り）がある。
【００６２】
核酸分子は発現カセットの一部であってよい。発現カセットは、プロモータ、開示の核酸分子を含むオープンリーディングフレーム、及び３’非翻訳領域を含んでよい。宿主細胞の機構に指令して開示の融合タンパク質を産生させるために発現カセットを使用することができる。
【００６３】
さらに、開示の核酸分子を含むベクターも提供される。好適なベクターとして、例えば、細菌ベクター、ウイルスベクター、ネイキッドＤＮＡベクター、及びネイキッドＲＮＡベクターが挙げられる。
【００６４】
宿主細胞
本明細書で開示される核酸分子のいずれかを含む宿主細胞も提供される。
【００６５】
好適な宿主細胞として、例えば、細菌が挙げられる。宿主細胞は、弱毒化、片利共生、及び／又は死滅しているが、代謝的に活性であってよい。例示的な実施形態では、宿主細胞は、弱毒化、片利共生、及び／又は死滅しているが、代謝的に活性の細菌であってよい。好適な細菌として、限定はしないが、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、フレキシナ赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、エルシニア・エンテロコリチカ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、腸チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）若しくはマイコバクテリウム属（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、又はこれらの修飾形態が挙げられる。一部の実施形態では、例えば、宿主細胞は、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）又はその修飾形態であってよい。修飾としては、突然変異、改変、及びその他の遺伝子変化／変異、並びに熱処理又は化学修飾が挙げられ、これらにより対象に対する宿主細胞の毒性を軽減する。例えば、対象における細胞との結合を低減するか、１細胞から別の細胞への広がりを低減するか、対象における細胞外増殖を低減するか、又は対象における細胞内増殖を低減するために細菌を修飾することができる。
【００６６】
宿主細胞として好適な細菌株は、米国特許出願第１３／９８８，０７６号明細書（米国特許出願公開第２０１４／０３７６６２号明細書）に記載されているものがあり、この文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。例えば、宿主細胞は、ａｃｔＡ及び／又はｉｎｌＢに弱毒変異、並びに好ましくはａｃｔＡ及びｉｎｌＢの全部又は一部の欠失（本明細書では「Ｌｍ  ΔａｃｔＡ／ΔｉｎｌＢ」と称する）を含むように遺伝子修飾され、且つＥＧＦＲｖＩＩＩ−メソテリン融合タンパク質をコードする核酸分子を含有する、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）の弱毒生株であってよい。一部の実施形態では、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）は、ａｃｔＡ欠失（ΔａｃｔＡ）突然変異体、ａｃｔＡ挿入突然変異体、ｉｎｌＢ欠失（ΔｉｎｌＢ）突然変異体、ｉｎｌＢ挿入突然変異体、又はこれらの組み合わせであってよい。例えば、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）は、ΔａｃｔＡ／ΔｉｎｌＢ突然変異体であってよい。
【００６７】
宿主細胞は、ＥＧＦＲｖＩＩＩ−メソテリン融合タンパク質をコードする核酸分子を含んでもよく、核酸分子は、宿主細胞ゲノムに組み込まれる。核酸分子は、ａｃｔＡ遺伝子座、ｉｎｌＢ遺伝子座又はｔＲＮＡＡｒｇ遺伝子座に組み込むことができる。一部の実施形態では、核酸分子は、ａｃｔＡ遺伝子座に組み込むことができる。一部の実施形態では、核酸分子は、ｉｎｌＢ遺伝子座に組み込むことができる。一部の実施形態では、核酸分子は、ｔＲＮＡＡｒｇ遺伝子座に組み込むことができる。こうした宿主細胞は、宿主細胞発現配列の制御下にあるため、真核生物の転写又は翻訳エレメントを必要としない核酸を含有している。
【００６８】
宿主細胞は、ＥＧＦＲｖＩＩＩ−メソテリン融合タンパク質をコードする核酸分子を含んでもよく、核酸分子は、宿主細胞内において染色体外に組み込まれる。例えば、ＥＧＦＲｖＩＩＩ−メソテリン融合タンパク質をコードする核酸分子は、宿主細胞内でエピソームプラスミド上の発現カセットに挿入することができる。
【００６９】
開示される核酸分子のいずれかを含むように修飾された組換えリステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）属細菌が提供される。この核酸分子は、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）属に染色体外で存在してよく、又は細菌ゲノムに組み込んでもよい。一部の実施形態では、例えば、宿主細胞は、ｔＲＮＡＡｒｇ遺伝子座に組み込まれたＥＧＦＲｖＩＩＩ−メソテリン融合タンパク質をコードする核酸分子を有するリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）ΔａｃｔＡ／ΔｉｎｌＢ突然変異体であってよい。リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）属は、宿主細胞と異種である開示の融合タンパク質を発現するための発現プラットフォームとして使用することができる。このような発現により、例えば、宿主細胞を含有する対象において異種融合タンパク質に対する免疫応答をもたらすことができる。
【００７０】
ＡＤＵ−２１４は、ＥＧＦＲｖＩＩＩ及びメソテリンを発現するように操作されたＬｍ（Ｌｍ  ΔａｃｔＡ／ｉｎｌＢ）の弱毒化生株である。ＥＧＦＲｖＩＩＩ−ｈＭｅｓｏの発現はＬｍ  ａｃｔＡプロモータから駆動されるが、これは、Ｌｍが宿主細胞に感染すると高度に誘導される。ａｃｔＡ遺伝子は、ＰｒｆＡレギュロンに存在するが、これは、一連のＬｍ病原性遺伝子であり、その発現は、ＰｒｆＡ、すなわち、感染宿主細胞に関連して誘導される転写活性化タンパク質によって制御及び誘導される。ＡＤＵ−２１４中のＥＧＦＲｖＩＩＩ−メソテリン発現カセットは、Ｌｍ転写、翻訳及び分泌機構のみを使用し、哺乳動物発現エレメント（例えば、哺乳動物発現系に特有のプロモータ又はターミネータ領域）を一切含まない。そのため、目的の指定遺伝子を発現するために哺乳動物宿主細胞機構を使用しなければならず、且つ定義により、遺伝子移入が遺伝子発現の前提であるプラスミドＤＮＡ−又はウイルスベースのベクターと異なり、Ｌｍは、「自己完結型」自由生活性有機体である。ワクチン接種した宿主の感染細胞では、ＡＤＵ−２１４の原生動物発現機構のみが使用されて細菌内でＥＧＦＲｖＩＩＩ−メソテリン融合タンパク質を合成し、続いて、このタンパク質は、抗原プロセシング及び提示のために宿主細胞の細胞質中に分泌される。
【００７１】
宿主細胞は、薬学的に許容される賦形剤と組み合わせることができる。
【００７２】
また、本明細書では、開示される宿主細胞と、薬学的に許容される賦形剤を含むワクチンが提供される。ワクチンは、本明細書に開示される適切な免疫応答を誘発するのに十分な量で対象に投与することができる。
【００７３】
免疫応答を誘発する方法
また、対象において免疫応答を誘発する方法も提供され、これは、宿主細胞を含む組成物を対象に投与するステップを含み、宿主細胞は、ＥＧＦＲｖＩＩＩ−メソテリン融合タンパク質をコードする核酸分子を含む。
【００７４】
開示の方法は、開示される核酸分子のいずれを含む宿主細胞を用いて実施することもできる。一部の実施形態では、本方法は、宿主細胞を含む組成物を対象に投与するステップを含んでよく、宿主細胞は、ＥＧＦＲｖＩＩＩ−メソテリン融合タンパク質をコードする核酸分子を含み、核酸分子は、配列番号１に示されるａｃｔＡｐ−ＡｃｔＡＮ１００＊−ＥＧＦＲｖＩＩＩ−メソテリン３５〜６２２と少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一であるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、本方法は、宿主細胞を含む組成物を対象に投与するステップを含んでよく、宿主細胞は、配列番号４に示されるＥＧＦＲｖＩＩＩポリヌクレオチドと少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一である１つ又は複数のＥＧＦＲｖＩＩＩポリヌクレオチド、及び配列番号６に示されるメソテリン３５〜６２２ポリヌクレオチドと少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一であるメソテリンポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、本方法は、宿主細胞を含む組成物を対象に投与するステップを含んでよく、宿主細胞は、配列番号５に示されるＥＧＦＲｖＩＩＩｘ５ポリヌクレオチドと少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一であるポリヌクレオチド、及び配列番号６に示されるメソテリン３５〜６２２ポリヌクレオチドと少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一であるポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、本方法は、宿主細胞を含む組成物を対象に投与するステップを含んでよく、宿主細胞は、配列番号７と少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一であるＥＧＦＲｖＩＩＩｘ５−メソテリン３５〜６２２ポリヌクレオチドを含む。
【００７５】
本明細書に開示される宿主細胞のいずれも、開示される方法での使用に好適である。例えば、宿主細胞は、ａｃｔＡ及び／又はｉｎｌＢに弱毒変異、並びに好ましくはａｃｔＡ及びｉｎｌＢの全部又は一部の欠失（本明細書では「Ｌｍ  ΔａｃｔＡ／ΔｉｎｌＢ」と称する）を含むように遺伝子修飾され、且つＥＧＦＲｖＩＩＩ−メソテリン融合タンパク質をコードする核酸分子を含有する、Ｌ．モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）の弱毒生株であってよい。一部の実施形態では、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）は、ａｃｔＡ欠失突然変異体、ａｃｔＡ挿入突然変異体、ｉｎｌＢ欠失突然変異体、ｉｎｌＢ挿入突然変異体、又はこれらの組み合わせであってよい。例えば、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）は、ΔａｃｔＡ／ΔｉｎｌＢ突然変異体であってよい。
【００７６】
対象に投与される宿主細胞は、ＥＧＦＲｖＩＩＩ−メソテリン融合タンパク質をコードする核酸分子を含んでよく、核酸分子は、宿主細胞ゲノムに組み込まれる。一部の実施形態では、核酸分子は、ａｃｔＡ遺伝子座に組み込むことができる。一部の実施形態では、核酸分子は、ｉｎｌＢ遺伝子座に組み込むことができる。一部の実施形態では、核酸分子は、ｔＲＮＡＡｒｇ遺伝子座に組み込むことができる。対象に投与される宿主細胞は、ＥＧＦＲｖＩＩＩ−メソテリン融合タンパク質をコードする核酸分子を含んでもよく、核酸分子は、宿主細胞内において染色体外に組み込まれる。
【００７７】
宿主細胞を対象に投与する好適な態様として、限定はしないが、静脈内、経口、皮下、皮内、筋内、腹腔内、経粘膜、鼻内投与、又はこれらの任意の組合せが挙げられる。一部の実施形態では、投与ステップは静脈内で実施される。
【００７８】
宿主細胞は、開示の融合タンパク質を対象内に発現させ、これによって宿主細胞を含有する対象において異種融合タンパク質に対する免疫応答を誘発するための発現プラットフォームとして使用することができる。例えば、対象内の感染細胞の細胞質中に融合タンパク質を宿主細胞から発現及び分泌させることができる。感染細胞は、宿主細胞を取り込むことができる対象内の任意の細胞を含む。一部の実施形態では、感染細胞は抗原提示細胞であってよい。抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、Ｔ細胞に対して抗原を提示するために用いられる免疫系の細胞である。ＡＰＣとしては、樹状細胞、単球、マクロファージ、辺縁帯クッパー細胞、小膠細胞、ランゲルハンス細胞、Ｔ細胞、及びＢ細胞が挙げられる。一部の実施形態では、融合タンパク質は、対象の１つ又は複数の細胞に発現させることができる。
【００７９】
開示される融合タンパク質のいずれも、対象において免疫応答を誘発するための免疫原性ポリペプチドとして使用することができる。一部の実施形態では、例えば、本方法は、ＥＧＦＲｖＩＩＩ−メソテリン融合タンパク質をコードする核酸分子を含む宿主細胞を対象に投与するステップを含んでよく、融合タンパク質は、配列番号８に示されるＡｃｔＡＮ１００＊−ＥＧＦＲｖＩＩＩｘ５−メソテリン３５〜６２２又はその免疫原性断片と少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
【００８０】
一部の実施形態では、本方法は、ＥＧＦＲｖＩＩＩ−メソテリン融合タンパク質をコードする核酸分子を含む宿主細胞を対象に投与するステップを含んでよく、融合タンパク質は、配列番号８のアミノ酸残基８９〜８４０として示されるＥＧＦＲｖＩＩＩｘ５−メソテリン３５〜６２２と少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
【００８１】
一部の実施形態では、本方法は、ＥＧＦＲｖＩＩＩ−メソテリン融合タンパク質をコードする核酸分子を含む宿主細胞を対象に投与するステップを含んでよく、融合タンパク質は、各々が配列番号９に示されるＥＧＦＲｖＩＩＩと少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一のアミノ酸配列を含む１つ又は複数のＥＧＦＲｖＩＩＩポリペプチド、及び配列番号１１に示されるメソテリン３５〜６２２と少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一のアミノ酸配列を含むメソテリンポリペプチドを含む。
【００８２】
一部の実施形態では、例えば、本方法は、ＥＧＦＲｖＩＩＩ−メソテリン融合タンパク質をコードする核酸分子を含む宿主細胞を対象に投与するステップを含んでよく、融合タンパク質は、配列番号１０に示されるＥＧＦＲｖＩＩＩｘ５と少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一のアミノ酸配列を含むＥＧＦＲｖＩＩＩｘ５ポリペプチド、及び配列番号１１に示されるメソテリン３５〜６２２と少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一のアミノ酸配列を含むメソテリンポリペプチドを含む。
【００８３】
開示される方法は、メソテリン免疫応答、ＥＧＦＲｖＩＩＩ免疫応答、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）属に対する免疫応答、又はこれらの任意の組合せを誘発するために使用することができる。従って、対象においてメソテリン免疫応答を誘発する方法が提供され、これは、宿主細胞を含む組成物を対象に投与するステップを含み、宿主細胞は、ＥＧＦＲｖＩＩＩ−メソテリン融合タンパク質をコードする核酸分子を含む。また、対象においてＥＧＦＲｖＩＩＩ免疫応答を誘発する方法も提供され、これは、宿主細胞を含む組成物を対象に投与するステップを含み、宿主細胞は、ＥＧＦＲｖＩＩＩ−メソテリン融合タンパク質をコードする核酸分子を含む。さらに、対象においてリステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）属に対する免疫応答を誘発する方法も提供され、これは、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）を含む組成物を対象に投与するステップを含み、宿主細胞は、ＥＧＦＲｖＩＩＩ−メソテリン融合タンパク質をコードする核酸分子を含む。
【００８４】
開示される方法は、体液性応答、抗原特異的Ｔ細胞応答（ＣＤ４＋及び／若しくはＣＤ８＋）、又はその両方を誘発することができる。例えば、感染した真核宿主細胞の細胞質ゾルにＡＤＵ−２１４が侵入すると、宿主細胞によってＥＧＦＲｖＩＩＩ−メソテリン融合タンパク質が発現され、分泌された後、感染細胞のプロテアソーム機構によりプロセシングされ得る。ＥＧＦＲｖＩＩＩ−メソテリン融合タンパク質のタンパク質断片は、ＡＰＣの表面上のＭＨＣクラスＩ及びクラスＩＩ分子に関して提示され、これによって全身性ＥＧＦＲｖＩＩＩ−及びメソテリン特異的ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞免疫の誘導が起こり得る。さらに、ＩＶ投与後、ＡＤＵ−２１４の一次標的細胞は、肝臓及び脾臓中の食細胞であると考えられる。これらの細胞が感染すると、Ｉ型インターフェロンの初期産生によって開始される炎症性サイトカインカスケードの誘導を引き起こし得る。重要なことに、ＡＤＵ−２１４は、感染宿主細胞の細胞質ゾル中へのファゴリソソームを免れ、そこで、ＡＤＵ−２１４は、コードされたＥＧＦＲｖＩＩＩ−メソテリン抗原（他の細菌産物以外）を発現及び分泌する。免疫刺激性環境及び宿主細胞によるＥＧＦＲｖＩＩＩ−メソテリン抗原の発現の結果、ＡＤＵ−２１４は、続いて、全身性ＥＧＦＲｖＩＩＩ−メソテリン特異的Ｔ細胞免疫のプライミングを可能にする。
【００８５】
メソテリンポリペプチドの発現を増大させる方法
本明細書では、メソテリンポリペプチドの発現を増大させる方法が開示され、これは、宿主細胞において、ＥＧＦＲｖＩＩＩポリヌクレオチドと、メソテリンポリペプチドをコードするメソテリンポリヌクレオチドとを含む核酸分子を発現させるステップを含む。
【００８６】
開示される方法は、開示の核酸分子の転写、及びメソテリンポリペプチドの発現を支持するか、又は支持するように設計され得る任意の宿主細胞において実施することができ、こうした宿主細胞として、限定はしないが、細菌細胞、ウイルス細胞、酵母細胞、昆虫細胞、及び哺乳動物細胞が挙げられる。発現ステップは、核酸分子を宿主細胞に導入し、宿主細胞機構にメソテリンポリペプチドを産生させることによって実施することができる。或いは、発現ステップは、目的の細胞に宿主細胞を投与することによって実施することができ、メソテリンポリペプチドは、前記目的の細胞内に産生される。一部の実施形態では、発現ステップは、目的の細胞を宿主細胞に感染させることによって実施することができ、メソテリンポリペプチドは、目的の細胞内に産生される。一部の実施形態では、発現ステップは、宿主細胞を対象に投与することによって実施することができ、メソテリンポリペプチドは、対象において産生される。
【００８７】
従って、開示される方法は、対象においてメソテリンの発現を増大させるために使用することができる。本方法は、ＥＧＦＲｖＩＩＩポリヌクレオチドと、メソテリンポリペプチドをコードするメソテリンポリヌクレオチドとを含む核酸分子を発現させるステップを含み得る。
【００８８】
対象におけるメソテリンの発現の増大は、メソテリンポリペプチドをコードする核酸を含む宿主細胞を対象に投与するステップによって実施することができる。本明細書に開示されるいずれの宿主細胞も開示の方法に用いることができる。例えば、宿主細胞は、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）などの弱毒化生細菌株であってよい。リステリア・モノサイトゲネス（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）は、ａｃｔＡ及び／又はｉｎｌＢに弱毒変異、並びに好ましくはａｃｔＡ及びｉｎｌＢの全部又は一部の欠失（本明細書では「Ｌｍ  ΔａｃｔＡ／ΔｉｎｌＢ」と称する）を含み、且つＥＧＦＲｖＩＩＩ−メソテリン融合タンパク質をコードする核酸分子を含有するように遺伝子修飾することができる。一部の実施形態では、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）は、ａｃｔＡ欠失突然変異体、ａｃｔＡ挿入突然変異体、ｉｎｌＢ欠失突然変異体、ｉｎｌＢ挿入突然変異体、又はこれらの組合せであってよい。例えば、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）は、ΔａｃｔＡ／ΔｉｎｌＢ突然変異体であってよい。
【００８９】
宿主細胞は、ＥＧＦＲｖＩＩＩ−メソテリン融合タンパク質をコードする核酸分子を含んでよく、核酸分子は、宿主細胞ゲノムに組み込まれる。一部の実施形態では、核酸分子は、ａｃｔＡ遺伝子座に組み込むことができる。一部の実施形態では、核酸分子は、ｉｎｌＢ遺伝子座に組み込むことができる。一部の実施形態では、核酸分子は、ｔＲＮＡＡｒｇ遺伝子座に組み込むことができる。宿主細胞は、ＥＧＦＲｖＩＩＩ−メソテリン融合タンパク質をコードする核酸分子を含んでよく、核酸分子は、宿主細胞内において染色体外に存在する。
【００９０】
開示される方法での使用に好適な核酸分子として、本明細書の他の箇所に開示される核酸分子が挙げられる。核酸分子は、ＥＧＦＲｖＩＩＩポリヌクレオチドの１コピー又はＥＧＦＲｖＩＩＩポリヌクレオチドの１つ又は複数のコピーを含んでよく、ＥＧＦＲｖＩＩＩポリヌクレオチドは、配列番号４と少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一であるヌクレオチド配列を含む。ＥＧＦＲｖＩＩＩポリヌクレオチドの好適なコピー数として、限定はしないが、２つ、３つ、４つ、５つ、又はそれを超えるコピーが挙げられる。ＥＧＦＲｖＩＩＩポリヌクレオチドは、切断配列をコードする１つ又は複数のヌクレオチド配列によってフランキングされていてもよい。
【００９１】
一部の実施形態では、メソテリンポリペプチドの発現を増大させる方法は、配列番号１に示されるａｃｔＡｐ−ＡｃｔＡＮ１００＊−ＥＧＦＲｖＩＩＩ−メソテリン３５〜６２２と少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸分子を宿主細胞において発現させるステップを含んでよい。一部の実施形態では、メソテリンポリペプチドの発現を増大させる方法は、配列番号４に示されるＥＧＦＲｖＩＩＩポリヌクレオチドと少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一である１つ又は複数のＥＧＦＲｖＩＩＩポリヌクレオチド、及び配列番号６に示されるメソテリン３５〜６２２ポリヌクレオチドと少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一であるメソテリンポリヌクレオチドを含む核酸分子を宿主細胞において発現させるステップを含んでよい。一部の実施形態では、メソテリンポリペプチドの発現を増大させる方法は、配列番号５に示されるＥＧＦＲｖＩＩＩｘ５ポリヌクレオチドと少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一であるポリヌクレオチド、及び配列番号６に示されるメソテリン３５〜６２２ポリヌクレオチドと少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一であるポリヌクレオチドを含む核酸分子を宿主細胞において発現させるステップを含んでよい。一部の実施形態では、メソテリンポリペプチドの発現を増大させる方法は、配列番号７と少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一であるＥＧＦＲｖＩＩＩｘ５−メソテリン３５〜６２２ポリヌクレオチドを含む核酸分子を宿主細胞において発現させるステップを含んでよい。
【００９２】
メソテリンポリヌクレオチドは、メソテリン３５〜６２２ポリペプチドをコードすることができる。一部の実施形態では、メソテリンポリペプチドは、配列番号１１に示されるメソテリン３５〜６２２と少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一であるアミノ酸配列を含むか、これからなるか、又はこれから実質的になり得る。従って、開示の方法を用いてメソテリン３５〜６２２の発現レベルを増大させることができる。
【００９３】
核酸分子は、シグナル配列、プロモータ、又はその両方をさらに含んでもよい。一部の実施形態では、核酸分子は、シグナル配列をさらに含んでもよく、シグナル配列は、配列番号３に示されるＡｃｔＡＮ１００＊と少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一であるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、核酸分子は、プロモータをさらに含んでもよく、プロモータは、配列番号２に示されるａｃｔＡプロモータと少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一であるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、核酸分子は、シグナル配列とプロモータとをさらに含んでもよく、シグナル配列は、配列番号３に示されるＡｃｔＡＮ１００＊と少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一であるヌクレオチド配列を含み、プロモータは、配列番号２に示されるａｃｔＡプロモータと少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一であるヌクレオチド配列を含む。
【００９４】
対象の癌を治療する方法
癌ワクチンの治療コンセプトは、悪性腫瘍細胞に対する特定の適応免疫応答を誘導し、増大させることを目的とする広範囲のプラットフォーム技術を包含する。関連する非臨床的癌モデルで初期に開発された複数のワクチン技術は、既存の疾患を有する患者の集団において、又は治癒切除後の補助薬物療法として臨床試験段階に入った。残念ながら、世界的に癌関連死亡の第１位の原因であるＮＳＣＬＣでは、ワクチンによる積極的な免疫療法介入は、腫瘍応答、腫瘍再発又は進行の遅延、及び最終的に全生存期間（ＯＳ）の延長に関する有意な利益を実証することによるクリニカルプルーフオブコンセプトを依然として達成していない。臨床的有効性の不足は、主として特定の耐性機構によるものであり、これにより、ＮＳＣＬＣ細胞は、免疫認識を忌避すると共に、治療用癌ワクチン接種後に誘導及び活性化される抗原指向性Ｔリンパ球による細胞傷害性破壊を回避することができる。開示の方法は、上記及び他の問題に取り組むものである。
【００９５】
本明細書では、癌の治療を、それを必要とする対象において行う方法が開示され、前記方法は、治療有効量の、宿主細胞を含む組成物を対象に投与するステップを含み、宿主細胞は、ＥＧＦＲｖＩＩＩ−メソテリン融合タンパク質をコードする核酸分子を含む。
【００９６】
ＥＧＦＲｖＩＩＩは、ＮＳＣＬＣをはじめとする腫瘍細胞にのみ見出され、身体の正常細胞には見出されない独特な突然変異体である。強力且つ長期生存のＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的Ｔ細胞及び抗体応答を誘発することにより、ＥＧＦＲｖＩＩＩ発現細胞を排除すると共に、ＥＧＦＲｖＩＩＩを発現しない細胞に有利に免疫選択的圧力を及ぼすことができ、潜在的に既存の標的療法による残留腫瘍の治療を促進する。開示の方法は、ネイティブＥＧＦＲではなく、腫瘍細胞中のＥＧＦＲのエキソン２〜７の欠失により発現されるＥＧＦＲｖＩＩＩネオアンチゲン領域のみを特異的にターゲティングするが、これには正常機能細胞集団内のシグナル伝達が必要である。このように、ＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的免疫応答は、このＥＧＦＲ変異型を発現する患者集団に限定されると予想される。さらに、ＥＧＦＲｖＩＩＩは、腫瘍関連抗原であるメソテリンの発現を増大させることができ、これは、正常組織の表面上の発現は限定的であるが、ＮＳＣＬＣをはじめとするいくつかのヒト腫瘍によって高度に発現される。開示の組成物を用いた免疫により誘導される細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）は、宿主細胞に感染した細胞と、ＥＧＦＲｖＩＩＩ及びメソテリンを過剰発現する腫瘍細胞との両方を認識して、選択的に破壊するように特別設計されている。例えば、免疫刺激環境並びに宿主細胞によるＥＧＦＲｖＩＩＩ及びメソテリンの発現の結果、ＡＤＵ−２１４などのＥＧＦＲｖＩＩＩ−メソテリン融合タンパク質は、続いて、全身性ＥＧＦＲｖＩＩＩ−及びメソテリン特異的Ｔ細胞免疫のプライミングを可能にし、これによって抗原発現腫瘍の増殖を局所的に限定する。従って、開示の方法で治療することができる好適な癌として、メソテリン発現癌、ＥＧＦＲｖＩＩＩ発現癌、又はその両方が挙げられる。一部の実施形態では、癌は、メソテリン発現癌であってよい。一部の態様では、例えば、癌は、高レベルのメソテリン発現を有し得る。本明細書で使用される場合、「高レベルのメソテリン発現」は、非癌組織でのメソテリン発現のレベルと比較して、癌組織中のメソテリンタンパク質の過剰発現を指す。一部の実施形態では、癌は、ＥＧＦＲｖＩＩＩ発現癌であってよい。一部の実施形態では、癌は、メソテリン発現癌及びＥＧＦＲｖＩＩＩ発現癌であってよい。
【００９７】
好ましくは、メソテリン発現癌、ＥＧＦＲｖＩＩＩ発現癌、又はメソテリン発現癌及びＥＧＦＲｖＩＩＩ発現癌は、肺癌である。肺癌は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）と小細胞肺癌との両方を含む。好ましい態様では、開示される方法は、ＮＳＣＬＣを有する対象に対して実施することができる。ＮＳＣＬＣは、ＮＳＣＬＣ腺癌、ＮＳＣＬＣ扁平上皮癌、大細胞癌、又はこれらの任意の組合せを含む。一部の実施形態では、癌は、ＮＳＣＬＣ腺癌であってよい。一部の実施形態では、癌は、ＮＳＣＬＣ扁平上皮癌であってよい。一部の実施形態では、癌は、大細胞癌であってよい。一部の実施形態では、癌は、ＮＳＣＬＣ腺癌、ＮＳＣＬＣ扁平上皮癌、及び大細胞癌の任意の組合せであってよい。
【００９８】
開示の方法を用いて、進行（ＩＩＩｂ期）又は転移性（ＩＶ期）ＮＳＣＬＣ腺癌を有する対象、並びに標準療法に失敗した及び／又は増悪している対象を治療することができる。一部の実施形態では、肺癌は、進行ＮＳＣＬＣ腺癌であってよい。他の実施形態では、肺癌は、転移性ＮＳＣＬＣ腺癌であってよい。ＮＳＣＬＣの標準治療として、限定はしないが、手術、放射線、化学療法、又はこれらの任意の組合せが挙げられる。このように、一部の態様では、開示の方法を用いて、手術を受けた対象を治療することができる。他の態様では、開示の方法を用いて、放射線療法を受けた対象を治療することができる。他の態様では、開示の方法を用いて、化学療法を受けた対象を治療することができる。また別の態様では、開示の方法を用いて、事前の手術、放射線、及び化学療法の任意の組合せを受けた対象を治療することができる。
【００９９】
本明細書に開示される宿主細胞のいずれも、開示される方法での使用に好適である。例えば、宿主細胞は、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）であってよい。好ましい態様では、宿主細胞は、ａｃｔＡ及び／又はｉｎｌＢに弱毒変異、並びに好ましくはａｃｔＡ及びｉｎｌＢの全部又は一部の欠失（本明細書では「Ｌｍ  ΔａｃｔＡ／ΔｉｎｌＢ」と称する）を含むように遺伝子修飾され、且つＥＧＦＲｖＩＩＩ−メソテリン融合タンパク質をコードする核酸分子を含有する、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）の弱毒生株であってよい。一部の実施形態では、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）は、ａｃｔＡ欠失（ΔａｃｔＡ）突然変異体、ａｃｔＡ挿入突然変異体、ｉｎｌＢ欠失（ΔｉｎｌＢ）突然変異体、ｉｎｌＢ挿入突然変異体、又はこれらの組み合わせであってよい。例えば、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）は、ΔａｃｔＡ／ΔｉｎｌＢ突然変異体であってよい。
【０１００】
対象に投与される宿主細胞は、ＥＧＦＲｖＩＩＩ−メソテリン融合タンパク質をコードする核酸分子を含んでよく、核酸分子は、宿主細胞ゲノムに組み込まれる。一部の実施形態では、核酸分子は、ｔＲＮＡＡｒｇ遺伝子座に組み込むことができる。対象に投与される宿主細胞は、ＥＧＦＲｖＩＩＩ−メソテリン融合タンパク質をコードする核酸分子を含んでもよく、核酸分子は、宿主細胞内において染色体外に組み込まれる。
【０１０１】
宿主細胞は、対象内でＥＧＦＲｖＩＩＩ−メソテリン融合タンパク質を発現し、これによりＥＧＦＲｖＩＩＩ発現腫瘍細胞、メソテリン発現腫瘍細胞、又はＥＧＦＲｖＩＩＩ−メソテリン及びメソテリン発現腫瘍細胞の両方に対して抗腫瘍応答を誘発するための発現プラットフォームとして使用することができる。融合タンパク質は、対象内の感染細胞の細胞質中に宿主細胞から発現及び分泌させることができる。感染細胞は、宿主細胞を取り込むことができる、対象内の任意の細胞を含む。一部の実施形態では、感染細胞は抗原提示細胞であってよい。
【０１０２】
開示される融合タンパク質のいずれも、対象において抗腫瘍応答を誘発するための免疫原性ポリペプチドとして使用することができる。例えば、融合タンパク質は、１つ又は複数のＥＧＦＲｖＩＩＩポリペプチドを含んでよい。一部の実施形態では、融合タンパク質は、１つのＥＧＦＲｖＩＩＩポリペプチドを含んでよい。他の実施形態では、融合タンパク質は、複数のＥＧＦＲｖＩＩＩポリペプチドを含んでよい。ＥＧＦＲｖＩＩＩポリペプチドの好適なコピー数として、限定はしないが、２つ、３つ、４つ、５つ、又はそれを超えるコピーが挙げられる。一部の実施形態では、例えば、融合タンパク質は、ＥＧＦＲｖＩＩＩポリペプチドの２つ、３つ、４つ、５つ、又はそれを超えるコピーを含んでよい。ＥＧＦＲｖＩＩＩ−メソテリン融合タンパク質は、配列番号９と少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一のアミノ酸配列を有する１つ又は複数のＥＧＦＲｖＩＩＩポリペプチドを含んでよい。
【０１０３】
好適なメソテリンポリペプチドとして、メソテリンのアミノ酸３５〜６２２と少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一であるアミノ酸配列を有するメソテリンポリペプチドがある。例えば、ＥＧＦＲｖＩＩＩ−メソテリン融合タンパク質は、配列番号１１に示されるメソテリン３５〜６２２と少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一のアミノ酸配列を有するメソテリンポリペプチドを含んでよい。
【０１０４】
一部の実施形態では、本方法は、宿主細胞を含む組成物を対象に投与するステップを含んでよく、宿主細胞は、ＥＧＦＲｖＩＩＩ−メソテリン融合タンパク質をコードする核酸分子を含み、融合タンパク質は、配列番号８のアミノ酸残基８９〜８４０として示されるＥＧＦＲｖＩＩＩｘ５−メソテリン３５〜６２２と少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一であるアミノ酸配列を含むか、これからなるか、又はこれから実質的になる。一部の態様では、融合タンパク質は、配列番号８のアミノ酸残基８９〜８４０として示されるＥＧＦＲｖＩＩＩｘ５−メソテリン３５〜６２２と少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一であるアミノ酸配列を含み得る。他の態様では、融合タンパク質は、配列番号８のアミノ酸残基８９〜８４０として示されるＥＧＦＲｖＩＩＩｘ５−メソテリン３５〜６２２と少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一であるアミノ酸配列からなり得る。また別の態様では、融合タンパク質は、配列番号８のアミノ酸残基８９〜８４０として示されるＥＧＦＲｖＩＩＩｘ５−メソテリン３５〜６２２と少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一であるアミノ酸配列から実質的になり得る。
【０１０５】
一部の実施形態では、本方法は、宿主細胞を含む組成物を対象に投与するステップを含んでよく、宿主細胞は、ＥＧＦＲｖＩＩＩ−メソテリン融合タンパク質をコードする核酸分子を含み、融合タンパク質は、各々が配列番号９に示されるＥＧＦＲｖＩＩＩと少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一のアミノ酸配列を含む１つ又は複数のＥＧＦＲｖＩＩＩポリペプチド、及び配列番号１１に示されるメソテリン３５〜６２２と少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一のアミノ酸配列を含むメソテリンポリペプチドを含むか、これらからなるか、又はこれらから実質的になる。一部の実施形態では、本方法は、宿主細胞を含む組成物を対象に投与するステップを含んでよく、宿主細胞は、ＥＧＦＲｖＩＩＩ−メソテリン融合タンパク質をコードする核酸分子を含み、融合タンパク質は、配列番号１０に示されるＥＧＦＲｖＩＩＩｘ５と少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一のアミノ酸配列を含むＥＧＦＲｖＩＩＩｘ５ポリペプチド、及び配列番号１１に示されるメソテリン３５〜６２２と少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一のアミノ酸配列を含むメソテリンポリペプチドを含むか、これらからなるか、又はこれらから実質的になる。
【０１０６】
開示される融合タンパク質は、シグナル配列をさらに含んでもよい。このように、一部の実施形態では、本方法は、宿主細胞を含む組成物を対象に投与するステップを含んでよく、宿主細胞は、ＥＧＦＲｖＩＩＩ−メソテリン融合タンパク質をコードする核酸分子を含み、ＥＧＦＲｖＩＩＩ−メソテリン融合タンパク質は、配列番号８に示されるＡｃｔＡＮ１００＊−ＥＧＦＲｖＩＩＩｘ５−メソテリン３５〜６２２又はその免疫原性断片と少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一であるアミノ酸配列を含むか、これからなるか、又はこれから実質的になる。
【０１０７】
本方法での使用に好適な核酸分子は、本明細書に開示されるもののいずれかを含む。例示的な核酸分子は、配列番号７に示されるＥＧＦＲｖＩＩＩｘ５−メソテリン３５〜６２２ポリヌクレオチドである。一部の実施形態では、例えば、核酸分子は、配列番号７に示されるＥＧＦＲｖＩＩＩｘ５−メソテリン３５〜６２２と少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一であるヌクレオチド配列を含み得る。一部の実施形態では、核酸分子は、配列番号７に示されるＥＧＦＲｖＩＩＩｘ５−メソテリン３５〜６２２と少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一であるヌクレオチド配列からなり得る。一部の実施形態では、核酸分子は、配列番号７に示されるＥＧＦＲｖＩＩＩｘ５−メソテリン３５〜６２２と少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一であるヌクレオチド配列から実質的になり得る。
【０１０８】
一部の実施形態では、核酸分子は、配列番号４に示されるＥＧＦＲｖＩＩＩポリヌクレオチドと少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一である１つ又は複数のＥＧＦＲｖＩＩＩポリヌクレオチド、及び配列番号６に示されるメソテリン３５〜６２２ポリヌクレオチドと少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一であるメソテリンポリヌクレオチドを含むか、これらからなるか、又はこれらから実質的になり得る。一部の実施形態では、核酸分子は、配列番号５に示されるＥＧＦＲｖＩＩＩｘ５ポリヌクレオチドと少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一であるポリヌクレオチド、及び配列番号６に示されるメソテリン３５〜６２２ポリヌクレオチドと少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一であるポリヌクレオチドを含むか、これらからなるか、又はこれらから実質的になり得る。
【０１０９】
好適な核酸分子は、プロモータ、シグナル配列、又はその両方をコードする核酸配列をさらに含んでもよい。例えば、一部の実施形態では、核酸配列は、配列番号１に示されるａｃｔＡｐ−ＡｃｔＡＮ１００＊−ＥＧＦＲｖＩＩＩ−メソテリン３５〜６２２と少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一であるヌクレオチド配列を含むか、これからなるか、又はこれから実質的になり得る。他の実施形態では、核酸分子は、配列番号１と少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一であるヌクレオチド配列からなり得る。また別の実施形態では、核酸分子は、配列番号１と少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一であるヌクレオチド配列から実質的になり得る。
【０１１０】
開示される方法は、組成物を投与する前に対象からの生体サンプル中でメソテリンレベルを測定するステップ、ＥＧＦＲｖＩＩＩを検出するステップ、又はその両方をさらに含んでもよい。対象からの生体サンプル中でメソテリンレベルを測定し、及び／又はＥＧＦＲｖＩＩＩの存在を検出する方法として、限定はしないが、免疫組織化学（ＩＨＣ）、ウエスタンブロッティング、顕微鏡法、免疫沈降、ＢＣＡアッセイ、分光測光法、又はこれらの任意の組合せが挙げられる。メソテリンレベル及び／又はＥＧＦＲｖＩＩＩは、限定はしないが、血液、リンパ液、骨髄、固形腫瘍サンプル、又はこれらの任意の組合せをはじめとする生体サンプル中で検出することができる。
【０１１１】
本組成物は、薬学的に許容される賦形剤をさらに含んでもよい。例えば、限定はしないが、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、及びグリセロールをはじめとする任意の好適な緩衝液と宿主細胞を組み合わせることができる。例示的な実施形態では、組成物をダルベッコリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）及びグリセロール中で製剤化した後、投与まで凍結保存（−６０℃以下で）し、好適な時間にわたり、塩化ナトリウムを用いた静脈内注入により投与することができる。当業者であれば、組成物を投与する時間が部分的に癌の種類、癌の重症度、及び対象の年齢、体重などに応じて変動することは理解するであろう。好ましくは、組成物は、数時間かけて投与することができる。例えば、組成物は、１〜２時間かけて投与することができる。他の実施形態では、１〜２時間未満で組成物を投与することができる。また別の実施形態では、１〜２時間超かけて組成物を投与することができる。
【０１１２】
治療は、単回用量の組成物又は複数回用量の組成物を含んでよい。このように、開示される方法は、宿主細胞を含む組成物の１回又は複数回用量を対象に投与するステップを含んでよく、宿主細胞は、ＥＧＦＲｖＩＩＩ−メソテリン融合タンパク質をコードする核酸分子を含む。用量数を決定することができる要因として、例えば、癌の進行、癌症状の重症度、癌症状の頻度、腫瘍サイズ、又はこれらの任意の組合せが挙げられる。限定はしないが、用量数は、進行、又は癌の進行を抑制できないこと、癌症状の重症度の増悪若しくは重症度の無変化、癌症状の頻度の増大若しくは頻度の無変化、腫瘍サイズの増加若しくは腫瘍サイズの無変化、又はこれらの任意の組み合わせに基づいて増加させることができる。例えば、１〜１００回用量以上の組成物を対象に投与することができる。
【０１１３】
宿主細胞の用量を決定することができる要因として、例えば、癌の進行、癌症状の重症度、癌症状の頻度、腫瘍サイズ、又はこれらの任意の組合せが挙げられる。一部の実施形態では、組成物は、約１×１０８〜約１×１０９コロニー形成単位（ＣＦＵ）の宿主細胞を含んでよい。一部の態様では、組成物は、約１×１０８ＣＦＵの宿主細胞を含んでよい。一部の態様では、組成物は、約１×１０９ＣＦＵの宿主細胞を含んでよい。
【０１１４】
組成物は、約７日毎に１回、約１４日毎に１回、約２１日毎に１回、約２８日毎に１回、約３５日毎に１回、約４２日毎に１回、約４９日毎に１回、約５６日毎に１回、約６３日毎に１回、約７０日毎に１回、約７７日毎に１回、約８４日毎に１回、又は約９１日毎に１回投与することができる。
【０１１５】
以上に基づき、当業者は、本明細書に記載される組成物のいずれか１つの上記用量を投与する（投与は、記載される通り、一定の間隔で繰り返される）ことにより、癌の進行、癌症状の重症度、癌症状の頻度、腫瘍サイズ、又はこれらの任意の組合せについて対象を治療し得ることを理解するであろう。従って、一実施形態では、癌の進行、癌症状の重症度、癌症状の頻度、腫瘍サイズ、又はこれらの任意の組合せを治療するため、約１×１０８〜約１×１０９ＣＦＵの用量で組成物を対象に投与してよく、投与は、約７日毎に１回繰り返される。さらに、本明細書に記載の組成物は、この方法で投与しようとするそのような用量に適した医薬製剤として調製することができる。一実施形態では、組成物は、癌の進行、癌症状の重症度、癌症状の頻度、腫瘍サイズ、又はこれらの任意の組合せを治療するため、約１×１０８〜約１×１０９ＣＦＵの用量で組成物を対象に投与してよく、投与は、約１４日毎に１回繰り返される。さらに、本明細書に記載の組成物は、この方法で投与しようとするそのような用量に適した医薬製剤として調製することができる。一実施形態では、癌の進行、癌症状の重症度、癌症状の頻度、腫瘍サイズ、又はこれらの任意の組合せを治療するため、約１×１０８〜約１×１０９ＣＦＵの用量で組成物を対象に投与してよく、投与は、約２１日毎に１回繰り返される。さらに、本明細書に記載の組成物は、この方法で投与しようとするそのような用量に適した医薬製剤として調製することができる。一実施形態では、癌の進行、癌症状の重症度、癌症状の頻度、腫瘍サイズ、又はこれらの任意の組合せを治療するため、約１×１０８〜約１×１０９ＣＦＵの用量で組成物を対象に投与してよく、投与は、約３５日毎に１回繰り返される。さらに、本明細書に記載の組成物は、この方法で投与しようとするそのような用量に適した医薬製剤として調製することができる。一実施形態では、癌の進行、癌症状の重症度、癌症状の頻度、腫瘍サイズ、又はこれらの任意の組合せを治療するため、約１×１０８〜約１×１０９ＣＦＵの用量で組成物を対象に投与してよく、投与は、約４５日毎に１回繰り返される。さらに、本明細書に記載の組成物は、この方法で投与しようとするそのような用量に適した医薬製剤として調製することができる。一実施形態では、癌の進行、癌症状の重症度、癌症状の頻度、腫瘍サイズ、又はこれらの任意の組合せを治療するため、約１×１０８〜約１×１０９ＣＦＵの用量で組成物を対象に投与してよく、投与は、約６０日毎に１回繰り返される。さらに、本明細書に記載の組成物は、この方法で投与しようとするそのような用量に適した医薬製剤として調製することができる。一実施形態では、癌の進行、癌症状の重症度、癌症状の頻度、腫瘍サイズ、又はこれらの任意の組合せを治療するため、約１×１０８〜約１×１０９ＣＦＵの用量で組成物を対象に投与してよく、投与は、約９０日毎に１回繰り返される。さらに、本明細書に記載の組成物は、この方法で投与しようとするそのような用量に適した医薬製剤として調製することができる。一実施形態では、癌の進行、癌症状の重症度、癌症状の頻度、腫瘍サイズ、又はこれらの任意の組合せを治療するため、約１×１０８ＣＦＵの用量で組成物を対象に投与してよく、投与は、約７日毎に１回繰り返される。さらに、本明細書に記載の組成物は、この方法で投与しようとするそのような用量に適した医薬製剤として調製することができる。一実施形態では、癌の進行、癌症状の重症度、癌症状の頻度、腫瘍サイズ、又はこれらの任意の組合せを治療するため、約１×１０８ＣＦＵの用量で組成物を対象に投与してよく、投与は、約１４日毎に１回繰り返される。さらに、本明細書に記載の組成物は、この方法で投与しようとするそのような用量に適した医薬製剤として調製することができる。一実施形態では、癌の進行、癌症状の重症度、癌症状の頻度、腫瘍サイズ、又はこれらの任意の組合せを治療するため、約１×１０８ＣＦＵの用量で組成物を対象に投与してよく、投与は、約２１日毎に１回繰り返される。さらに、本明細書に記載の組成物は、この方法で投与しようとするそのような用量に適した医薬製剤として調製することができる。一実施形態では、癌の進行、癌症状の重症度、癌症状の頻度、腫瘍サイズ、又はこれらの任意の組合せを治療するために約１×１０８ＣＦＵの用量で組成物を対象に投与してよく、投与は、約３５日毎に１回繰り返される。さらに、本明細書に記載の組成物は、この方法で投与しようとするそのような用量に適した医薬製剤として調製することができる。一実施形態では、癌の進行、癌症状の重症度、癌症状の頻度、腫瘍サイズ、又はこれらの任意の組合せを治療するため、約１×１０８ＣＦＵの用量で組成物を対象に投与してよく、投与は、約４５日毎に１回繰り返される。さらに、本明細書に記載の組成物は、この方法で投与しようとするそのような用量に適した医薬製剤として調製することができる。一実施形態では、癌の進行、癌症状の重症度、癌症状の頻度、腫瘍サイズ、又はこれらの任意の組合せを治療するため、約１×１０８ＣＦＵの用量で組成物を対象に投与してよく、投与は、約６０日毎に１回繰り返される。さらに、本明細書に記載の組成物は、この方法で投与しようとするそのような用量に適した医薬製剤として調製することができる。一実施形態では、癌の進行、癌症状の重症度、癌症状の頻度、腫瘍サイズ、又はこれらの任意の組合せを治療するため、約１×１０８ＣＦＵの用量で組成物を対象に投与してよく、投与は、約９０日毎に１回繰り返される。さらに、本明細書に記載の組成物は、この方法で投与しようとするそのような用量に適した医薬製剤として調製することができる。一実施形態では、癌の進行、癌症状の重症度、癌症状の頻度、腫瘍サイズ、又はこれらの任意の組合せを治療するため、約１×１０９ＣＦＵの用量で組成物を対象に投与してよく、投与は、約７日毎に１回繰り返される。さらに、本明細書に記載の組成物は、この方法で投与しようとするそのような用量に適した医薬製剤として調製することができる。一実施形態では、癌の進行、癌症状の重症度、癌症状の頻度、腫瘍サイズ、又はこれらの任意の組合せを治療するため、約１×１０９ＣＦＵの用量で組成物を対象に投与してよく、投与は、約１４日毎に１回繰り返される。さらに、本明細書に記載の組成物は、この方法で投与しようとするそのような用量に適した医薬製剤として調製することができる。一実��形態では、癌の進行、癌症状の重症度、癌症状の頻度、腫瘍サイズ、又はこれらの任意の組合せを治療するため、約１×１０９ＣＦＵの用量で組成物を対象に投与してよく、投与は、約２１日毎に１回繰り返される。さらに、本明細書に記載の組成物は、この方法で投与しようとするそのような用量に適した医薬製剤として調製することができる。一実施形態では、癌の進行、癌症状の重症度、癌症状の頻度、腫瘍サイズ、又はこれらの任意の組合せを治療するため、約１×１０９ＣＦＵの用量で、組成物を対象に投与してよく、投与は、約３５日毎に１回繰り返される。さらに、本明細書に記載の組成物は、この方法で投与しようとするそのような用量に適した医薬製剤として調製することができる。一実施形態では、癌の進行、癌症状の重症度、癌症状の頻度、腫瘍サイズ、又はこれらの任意の組合せを治療するため、約１×１０９ＣＦＵの用量で組成物を対象に投与してよく、投与は、約４５日毎に１回繰り返される。さらに、本明細書に記載の組成物は、この方法で投与しようとするそのような用量に適した医薬製剤として調製することができる。一実施形態では、癌の進行、癌症状の重症度、癌症状の頻度、腫瘍サイズ、又はこれらの任意の組合せを治療するため、約１×１０９ＣＦＵの用量で組成物を対象に投与してよく、投与は、約６０日毎に１回繰り返される。さらに、本明細書に記載の組成物は、この方法で投与しようとするそのような用量に適した医薬製剤として調製することができる。一実施形態では、癌の進行、癌症状の重症度、癌症状の頻度、腫瘍サイズ、又はこれらの任意の組合せを治療するため、約１×１０９ＣＦＵの用量で組成物を対象に投与してよく、投与は、約９０日毎に１回繰り返される。さらに、本明細書に記載の組成物は、この方法で投与しようとするそのような用量に適した医薬製剤として調製することができる。
【０１１６】
好ましくは、治療は、投与間において、組成物を対象に投与しない期間を含んでよい。例えば、本方法は、宿主細胞を含む組成物の第１用量を対象に投与するステップであって、宿主細胞が、ＥＧＦＲｖＩＩＩ−メソテリン融合タンパク質をコードする核酸分子を含む、ステップ、第１用量の有効性をモニターするステップ、及び第１用量が有効でない場合、組成物の１又は複数回用量を対象に投与するステップを含んでよい。組成物の有効性を決定することができる要因として、例えば、癌の進行、癌症状の重症度、癌症状の頻度、腫瘍サイズ、又はこれらの任意の組合せが挙げられる。限定はしないが、進行、又は癌の進行を抑制できないこと、癌症状の重症度の増悪若しくは重症度の無変化、癌症状の頻度の増大若しくは頻度の無変化、腫瘍サイズの増加若しくは腫瘍サイズの無変化、又はこれらの任意の組み合わせは、組成物の第１用量が有効でなかった指標となり得る。投与間の好適な期間としては、数日、数週間、又は数ヵ月が挙げられる。一部の実施形態では、投与間の期間は、約１日〜約９０日、約５日〜約８０日、約１０日〜約７０日、約１５日〜約６０日、約２０日〜約５０日、又は約２５日〜約４０日であってよい。例えば、投与間の期間は、約１日、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約１４日、約２１日、約２８日、約３５日、約４２日、約４９日、約５６日、約６０日、約６５日、約７０日、約８０日、約８５日、又は約９０日であってよい。
【０１１７】
組成物を対象に投与する好適な態様として、限定はしないが、静脈内、経口、皮下、皮内、筋肉内、腹腔内、経粘膜、鼻内投与、又はこれらの任意の組合せが挙げられる。一部の実施形態では、投与ステップは、静脈内経路で実施することができる。
【０１１８】
治療は、組成物の投与後、抗生物質を対象に投与するステップをさらに含んでもよい。例えば、組成物の最終用量を患者に投与してから好適な時間を置いた後、患者に抗生物質を投与することができる。このように、好ましい態様では、組成物の最終用量後に抗生物質を投与する。好適な抗生物質として、限定はしないが、アモキシシリン、又はペニシリンに対してアレルギー性の対象にはトリメトプリム／スルファメトキサゾールがある。当業者は、抗生物質を対象に投与するための十分な投与量及び投与スケジュールを決定することができるであろう。
【０１１９】
以下の実施例は、本明細書に開示される実施形態のいくつかをさらに詳細に説明するために記載する。これらの実施例は、開示される実施形態を例示することを意図し、これらを限定するものではない。
【実施例】
【０１２０】
方法
細菌株
開示される試験で使用する細菌株を表２に列記する。
【０１２１】
【表２】
0006782253.tif 000003
【０１２２】
ＡＤＵ−２１４の分子構造
２２１塩基対（ｂｐ）ａｃｔＡプロモータ及び２５８ｂｐ修飾シグナル配列ＡｃｔＡＮ１００＊を、ＫｐｎＩ−ＢａｍＨＩ断片としてｐＰＬ２組込みベクターの誘導体にクローニングした。ＥＧＦＲｖＩＩＩネオアンチゲン結合領域の５つのコピー（ＥＧＦＲｖＩＩＩｘ５）をコードする４８６ｂｐ配列を、ＢａｍＨＩ−ＭｆｅＩ断片としてＡｃｔＡＮ１００＊と共にフレーム内にクローニングした。ヒトメソテリン（メソテリン３５〜６２２）のアミノ酸３５〜６２２をコードする１７６７ｂｐ配列を、ＭｆｅＩ−ＥａｇＩ断片としてフレーム内にクローニングした。Ｌａｕｅｒ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｔｗｏ  Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｈａｇｅ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（２００２）１８４（１５）：４１７７−４１８６）（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、発現カセット全体をＬＡＤＤプラットフォーム株（Ｌｍ１１、Ｌｍ  ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢとも称する）のｔＲＮＡＡｒｇ遺伝子座に挿入した後、ベクター骨格配列を除去した。
【０１２３】
ＡＤＵ−２１４及びＣＲＳ−２０７の概略図を図１Ａ及び図１Ｂにそれぞれ示す。
【０１２４】
ブロス培養物増殖細胞からのウエスタンブロット及び細胞内感染
ブロス培養物増殖ウエスタンブロットのため、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）属株を酵母培地中に２．０のＯＤ６００まで増殖させた。遠心分離により細菌を除去してから、上清を氷上でＴＣＡ沈殿させた。上清を遠心分離し、ペレットをアセトンで洗浄した後、還元ＬＤＳバッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に再懸濁させた。サンプルを９５℃に１０分間加熱し、等量を４〜１２％ポリアクリルアミドゲル上で泳動させた後、ウエスタンブロット分析のためにニトロセルロース膜に移した。ＡｃｔＡタンパク質の成熟Ｎ末端に対するポリクローナル抗体でブロットをプロービングした。検出を視覚化し、Ｌｉｃｏｒ  Ｏｄｙｓｓｅｙ  ＩＲ検出システムで定量した。
【０１２５】
細胞内ウエスタンブロットのため、１時間かけて多重感染度（ＭＯＩ）１０で各Ｌｍ株をＤＣ２．４細胞に接種し、ＰＢＳ及び５０μｇ／ｍＬゲンタマイシンを添加したＤＭＥＭ培地で細胞を３回洗浄した。感染から７時間後に細胞を採取した。細胞をＳＤＳサンプルバッファーで溶解させ、収集し、４〜１２％ポリアクリルアミドゲル上で泳動させた後、ウエスタンブロット分析のためにニトロセルロース膜に移した。細胞内ウエスタンブロットは、ＡｃｔＡタンパク質の成熟Ｎ末端に対するポリクローナル抗体を使用し、これらのブロットを、抗ｐ−６０モノクローナル抗体を用いたｐ６０発現（非関連Ｌｍタンパク質）に対して正規化した。抗原検出を視覚化し、Ｌｉｃｏｒ  Ｏｄｙｓｓｅｙ  ＩＲ検出システムで定量した。
【０１２６】
ワクチン接種マウスにおける抗原特異的免疫応答
メソテリン特異的免疫原性について、Ｂａｌｂ／ｃマウス（ｎ＝５）に２×１０６ｃｆｕのＡＤＵ−２１４で静脈内に（ＩＶ）ワクチン接種した。７日後、脾臓を採取し、メソテリンのオーバーラップペプチドライブラリー（１１アミノ酸による１５３の１５量体ペプチドオーバーラップ）又は非刺激培地対照を用いたＩＦＮγＥＬＩｓｐｏｔアッセイにより、免疫応答を測定した。ＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的免疫原性について、Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマウス（ｎ＝４）に５×１０６ｃｆｕのＡＤＵ−２１４ＩＶでワクチン接種した。７日後、脾臓を採取して、ＥＧＦＲｖＩＩＩ２６〜３３−Ｋｋ結合ペプチドＥＥＫＫＧＮＹＶを用いたＩＦＮγＥＬＩｓｐｏｔアッセイにより、免疫応答を測定した。
【０１２７】
野生型リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）属攻撃に対する防御免疫
２×１０６ｃｆｕの各Ｌｍ株ＩＶでＢａｌｂ／ｃマウスに１回ワクチン接種した。４０日後、５×１０４ｃｆｕ（２回のＬＤ５０用量）の野生型（ＷＴ）Ｌｍ株ＤＰ−Ｌ４０５６でマウスをＩＶ攻撃した（参照により本明細書に組み込まれるＬａｕｅｒ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｔｗｏ  Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｈａｇｅ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（２００２）１８４（１５）：４１７７−４１８６）に記載されている通り）。３日後、脾臓を採取し、ホモジナイズした。２００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを含有するＢＨＩプレート上で希釈液を平板培養して、ｃｆｕ／臓器を決定した。このアッセイの検出限界（ＬＯＤ）は５０ＣＦＵであった。
【０１２８】
腫瘍試験
ＣＴ２６腫瘍細胞を、ヒトメソテリンを発現するＤＮＡプラスミドでトランスフェクトして、安定した細胞株ＣＴ２６−ｈＭｅｓｏクローン３を産生した。内移植の直前に、凍結した腫瘍細胞のアリコートを解凍し、Ｔ細胞培地中で密集まで増殖させた。密集に達したら細胞を採取し、２×１０５細胞／２００μＬ用量／マウスの内移植のために１×１０６細胞／ｍＬの濃度までＨＢＳＳ中に再懸濁させた。第０日に、Ｂａｌｂ／ｃマウス（群毎に１０匹）に２×１０５ＣＴ２６−ｈＭｅｓｏ細胞を静脈内（ＩＶ）で内移植した。腫瘍の内移植から３日後、ＩＶによりＨＢＳＳ；５×１０６ｃｆｕ、１×１０５ｃｆｕ、若しくは５×１０３ｃｆｕのＡＤＵ−２１４；又は５×１０６ｃｆｕのＬｍ１１（空のプラットフォーム株）をマウスに投与した。生存についてマウスをモニターした。
【０１２９】
癌の治療
標準療法に失敗し、スクリーニングで増悪している進行（ＩＩＩｂ期）又は転移（ＩＶ期）ＮＳＣＬＣ（腺癌）を有する対象における単剤ＡＤＵ−２１４の安全性を評価し、推奨される第２相用量（ＲＰ２Ｄ）を確立し、予備臨床有効性を評価し、免疫応答を決定するため、ファーストインヒューマン（ＦｉＨ）、第Ｉ相、オープンラベル、多施設試験、２部試験を実施した。治療薬は、放射線写真による疾患進行の確認、許容できない毒性、同意の撤回、治験責任医師による治療停止の決定、後の抗癌療法の開始、又はスポンサーによる試験の終了まで投与される。
【０１３０】
第１部（用量漸増）：安全性及び薬力学的評価に基づいてＲＰ２Ｄを決定するために設計される。２用量のＡＤＵ−２１４（用量コホート１−Ａ：１×１０８コロニー形成単位（ＣＦＵ）及び用量コホート１−Ｂ：１×１０９ＣＦＵ）を順次投与し、修正された毒性発現確率の区間に基づくデザイン（ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ  ｉｎｔｅｒｖａｌ  ｄｅｓｉｇｎ）（ｍＴＰＩ）を適用する。各用量コホートの最後の対象がＤＬＴ観察期間中に処置を完了した後、試験評価チーム（ＳＥＴ）は、全ての安全性データを評価し、治療対象の対象の第２群について、現行の用量を漸増するか、維持するか、又は用量コホートを段階的に縮小するかを決定する。
【０１３１】
第２部（用量拡大）：第２部は、ＡＤＵ−２１４についてのＲＰ２Ｄを決定した後の２つの拡大コホートを評価するために設計される。第２部には、約３０人の対象（コホート２−Ａ［ｎ＝２０］及びコホート２Ｂ［ｎ＝１０］）が登録され、ＲＰ２Ｄで処置を受ける。メソテリンの集中管理免疫組織化学評価のためのアーカイブ腫瘍データは、第２部の全対象について入手可能である。メソテリンを過剰発現する腫瘍を有し、且つ腫瘍コア生検を受けやすい一次腫瘍又は転移性病変を有する対象のみがコホート２Ｂに登録されている。コホート２の対象は、処置前及び処置後の生検に同意している。コホート１Ａ及び１Ｂ、並びにコホート２Ａについては任意であるが、転移性病変の治療前及び治療後生検は、試験薬の分子活性をさらに理解するために強く求められる。生検手順は、ＣＴ又はＰＥＴ  ＣＴイメージングを用いて実施する。
【０１３２】
オープンラベル治療期間中、２１日毎に１回ＡＤＵ−２１４を静脈内投与する。ＡＤＵ−２１４は、１時間かけて静脈内投与するが、必要に応じて注入時間を増加させる選択肢もある。治療薬は、放射線写真による疾患進行の確認、許容できない毒性、同意の撤回、治験責任医師による治療停止の決定、後の抗癌療法の開始、又はスポンサーによる試験の終了まで投与される。安全性及び有効性を評価する。
【０１３３】
試験集団  −  １８歳以上であり、組織学的又は細胞学的に立証されたＮＳＣＬＣ腺癌；ＩＩＩｂ期又はＩＶ期疾患；コンピュータ断層撮影（ＣＴ）イメージングに基づいて立証された腫瘍進行；少なくとも１つの測定可能な疾患部位（第２部のみ）を有すると共に、米国東海岸癌臨床試験グループ（Ｅａｓｔｅｒｎ  Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｇｒｏｕｐ）（ＥＣＯＧ）パフォーマンスステイタススコアが０又は１の対象が、第１部及び第２部を組み合わせた本試験に登録される。対象は、米国食品医薬局（ＦＤＡ）承認の全身療法の少なくとも２つの事前治療を受けたことがなければならず、そのうちの１つの療法は、白金を用いたレジメンでなければならない（例外：白金を用いた第１選択化学療法後に第２選択レジメンを拒絶した対象）。
【０１３４】
有効性評価  −  有効性評価は、固形癌の治療効果判定のための新ガイドライン（Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｃｒｉｔｅｒｉａ  ｉｎ  Ｓｏｌｉｄ  Ｔｕｍｏｒｓ（Ｖ１．１；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ４５：２２８，２００９）、及び免疫関連反応評価基準（Ｉｍｍｕｎｅ−Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｃｒｉｔｅｒｉａ）（Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１５：７４１２，２００９）に従って治験責任医師により評価される。疾患応答は、頸部、胸部、腹部及び骨盤のＩＶコントラストと共にＣＴスキャンを用いて評価する。ＩＶ  ＣＴコントラスト剤に不耐性の対象は、経口造影剤を用いて実施されるＣＴスキャンを使用する。磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）を用いて、ＣＴにより適切に画像表示できない疾患の部位を評価することができる。脳ＭＲＩは、臨床的に指示される場合に限り必要である。放射線画像化、物理的検査、又は必要に応じた他の方法による全ての有効性評価を他の疾患部位を含めた部位で実施する。これらの評価は、ベースラインで疾患を評価するのに用いたのと同じ評価方法を使用して、試験全体を通して各時点で実施する。また、次の抗癌療法について及び治療後の追跡期間中の全生存期間についてもデータを収集する。
【０１３５】
結果
ブロス培養物におけるＡＤＵ−２１４の発現
図２に示すように、ＥＧＦＲｖＩＩＩとメソテリン３５〜６２２との融合は、ブロス培養物中のＣＲＳ−２０７に比べて約５０倍のタンパク質増加をもたらした。ＡＤＵ−２１４融合タンパク質は、約８８ｋＤａであることが予測される（ＥＧＦＲｖＩＩＩ−Ｍｅｓｏと称する）。ＣＲＳ−２０７タンパク質は、約７２ｋＤａであることが予測される（Ｍｅｓｏと称する）。負の対照プラットフォーム株であるＬｍ１１について、バンドは検出されなかった。
【０１３６】
感染細胞におけるＡＤＵ−２１４の発現
図２に示すように、ＥＧＦＲｖＩＩＩとメソテリン３５〜６２２との融合は、ＣＲＳ−２０７に比べて約４２倍の細胞内タンパク質発現増加をもたらした。ＡＤＵ−２１４融合タンパク質は、約８８ｋＤａであることが予測される。ＣＲＳ−２０７タンパク質は、約７２ｋＤａであることが予測される。ｐ６０は、感染細胞中の細菌数と相関する構成的Ｌｍタンパク質であり、約６０ｋＤａである。上のパネルは、ＡｃｔＡポリクローナル抗体を用いて検出された融合タンパク質の発現を示す。下のパネルは、モノクローナル抗体を用いて検出されたｐ６０発現を示す。負の対照プラットフォーム株であるＬｍ１１について、バンドは検出されなかった。
【０１３７】
ワクチン接種マウスにおける抗原特異的Ｔ細胞免疫応答
ＡＤＵ−２１４は、Ｂａｌｂ／ｃマウスにおける頑健なメソテリン特異的Ｔ細胞免疫応答を誘導した（図４Ａ）。ＡＤＵ−２１４は、Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマウスにおいて頑健なＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答を誘導した（図３Ａ及び図３Ｂ）。
【０１３８】
ＡＤＵ−２１４によるワクチン接種は、ＷＴリステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）攻撃に対する防御免疫を誘導する
ＡＤＵ−２１４による１回のワクチン接種は、ワクチンプラットフォーム株Ｌｍ１１と同等のレベルまで、ＷＴリステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）攻撃に対する十分に防御的な長期免疫を誘導した（図４）。ＡＤＵ−２１４によるワクチン接種は、ＷＴ−Ｌｍ攻撃後、６ｌｏｇ超のｃｆｕ減少をもたらした。機能免疫は、抗原特異的免疫応答の大きさと、将来の攻撃から防御する免疫応答の能力との組合せである。この場合、機能性は、十分に毒性の野生型リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）属攻撃を用いて試験した。
【０１３９】
ＡＤＵ−２１４による治療的ワクチン接種は用量依存的抗腫瘍応答をもたらす
治療用ＣＴ２６−ｈＭｅｓｏ肺転移モデルにおいて、ＡＤＵ−２１４の抗腫瘍効果をＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて決定した（図５）。様々な用量のＡＤＵ−２１４、空のＬｍ  ΔａｃｔＡΔｉｎｌＢプラットフォーム株（ＡＮＺ−１００）又はハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）でマウスをＩＶワクチン接種した。ワクチンの強力な免疫原性と一致して、ＡＤＵ−２１４を受けた動物は、ＡＮＺ−１００（Ｌｍ１１と称する）又はＨＢＳＳのいずれかを受けた動物と比較して生存期間が向上した。ＡＤＵ−２１４投与後の生存期間延長は用量依存的であり、長期生存動物の７０％が最高用量（５×１０６ＣＦＵ）を、６０％が中間用量（１×１０５ＣＦＵ）を、２０％が最低用量（５×１０３ＣＦＵ）を受けた群であった。
【０１４０】
当業者は、本明細書で開示される好ましい実施形態に対する多くの変更形態及び改変形態がなされ得ることと、こうした変更形態及び改変形態が本発明の趣旨から逸脱することなくなされ得ることとを理解するであろう。従って、添付の特許請求の範囲は、こうした均等な変形形態の全てを開示の組成物及び方法の真の趣旨及び範囲に含まれるものとして包含することが意図される。
【０１４１】
本明細書に引用又は記載される各特許、特許出願、及び刊行物の開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１４２】
【表３】
0006782253.tif 000004
【０１４３】
【表４】
0006782253.tif 000005
【０１４４】
【表５】
0006782253.tif 000006
【０１４５】
【表６】
0006782253.tif 000007
【０１４６】
【表７】
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【０１４７】
【表８】
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【０１４８】
【表９】
0006782253.tif 000010
【０１４９】
【表１０】
0006782253.tif 000011
【０１５０】
ａｃｔＡｐ−ＡｃｔＡＮ１００＊−ＥＧＦＲｖＩＩＩｘ５−メソテリン３５〜６２２−ストップ（配列番号１）の構成要素は、次の通りである：ａｃｔＡプロモータ（小文字）；ＡｃｔＡＮ１００＊（大文字）；ＢａｍＨＩクローニングリンカー（最初の下線部）；ＥＧＦＲｖＩＩＩｘ５（斜体）；ＭｆｅＩクローニングリンカー（２番目の下線部）；メソテリン３５〜６２２（太字）；ストップコドン（ｔａａ）。
【０１５１】
ＡＤＵ−２１４融合タンパク質アミノ酸配列（配列番号８）の構成要素は、次の通りである：ＡｃｔＡＮ１００＊（通常字体）；ＧＳ：ＢａｍＨＩクローニングリンカー（二重下線部）；ＱＬ：ＭｆｅＩクローニングリンカー（点線下線部）；ＥＧＦＲｖＩＩＩｘ５（斜体）；メソテリン３５〜６２２（太字）。
【０１５２】
一部の実施形態では、本発明は、メソテリンポリペプチドと融合された上皮増殖因子受容体変異型ＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）ポリペプチドを含む融合タンパク質を提供する。
【０１５３】
一部の実施形態では、前記ＥＧＦＲｖＩＩＩポリペプチドは、配列番号９と少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一のアミノ酸配列を含む。
【０１５４】
一部の実施形態では、前記融合タンパク質は、複数のＥＧＦＲｖＩＩＩポリペプチドを含む。一実施形態では、前記融合タンパク質は、ＥＧＦＲｖＩＩＩポリペプチドの５つのコピーを含む。
【０１５５】
一部の実施形態では、前記ＥＧＦＲｖＩＩＩポリペプチドは、１つ又は複数の切断配列によりフランキングされている。一部の実施形態では、ＥＧＦＲｖＩＩＩポリペプチドは、メソテリンポリペプチドのＮ末端側にある。
【０１５６】
一部の実施形態では、メソテリンポリペプチドは、配列番号１１に示されるメソテリン３５〜６２２と少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一のアミノ酸配列を含む。
【０１５７】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、各々が配列番号９に示されるＥＧＦＲｖＩＩＩと少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一のアミノ酸配列を含む１つ又は複数のＥＧＦＲｖＩＩＩポリペプチド、及び配列番号１１に示されるメソテリン３５〜６２２と少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一のアミノ酸配列を含むメソテリンポリペプチドを含む。
【０１５８】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１０に示されるＥＧＦＲｖＩＩＩｘ５と少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一のアミノ酸配列を含むＥＧＦＲｖＩＩＩｘ５ポリペプチド、及び配列番号１１に示されるメソテリン３５〜６２２と少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一のアミノ酸配列を含むメソテリンポリペプチドを含む。
【０１５９】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号８のアミノ酸残基８９〜８４０として示されるＥＧＦＲｖＩＩＩｘ５−メソテリン３５〜６２２と少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１６０】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、シグナル配列をさらに含み、シグナル配列は、ＥＧＦＲｖＩＩＩポリペプチド及びメソテリンポリペプチドと共に翻訳リーディングフレーム内にある。一部の実施形態では、シグナル配列は、配列番号１２に示されるＡｃｔＡＮ１００＊と少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一である。
【０１６１】
一部の実施形態では、前述の実施形態のいずれかの融合タンパク質は、配列番号８と少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１６２】
一部の実施形態では、前記融合タンパク質は、細菌に発現される。一実施形態では、細菌は、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）である。
【０１６３】
一部の実施形態では、本発明は、前述の実施形態のいずれかの融合タンパク質をコードする核酸分子を提供する。
【０１６４】
一部の実施形態では、核酸分子は、配列番号４に示されるＥＧＦＲｖＩＩＩポリヌクレオチドと少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一である１つ又は複数のＥＧＦＲｖＩＩＩポリヌクレオチド、及び配列番号６に示されるメソテリン３５〜６２２ポリヌクレオチドと少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一であるメソテリンポリヌクレオチドを含む。
【０１６５】
一部の実施形態では、核酸分子は、配列番号５に示されるＥＧＦＲｖＩＩＩｘ５ポリヌクレオチドと少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一であるポリヌクレオチド、及び配列番号６に示されるメソテリン３５〜６２２ポリヌクレオチドと少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一であるポリヌクレオチドを含む。
【０１６６】
一部の実施形態では、前記核酸配列は発現カセットの一部である。
【０１６７】
一部の実施形態では、本発明は、前述の実施形態のいずれかの核酸分子を含む宿主細胞を提供する。一部の実施形態では、宿主細胞は細菌である。一実施形態では、細菌は、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）である。一部の実施形態では、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）は、ａｃｔＡ欠失突然変異体、ａｃｔＡ挿入突然変異体、ｉｎｌＢ欠失突然変異体、ｉｎｌＢ挿入突然変異体、又はこれらの組合せである。いくつかの実施形態では、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）は、ΔａｃｔＡ／ΔｉｎｌＢ突然変異体である。
【０１６８】
いくつかの実施形態では、核酸分子は、宿主細胞ゲノムに組み込まれる。一部の実施形態では、核酸分子は、ｔＲＮＡＡｒｇ遺伝子座に組み込まれる。
【０１６９】
一部の実施形態では、本発明は、前述の実施形態のいずれかの核酸分子を含むベクターを提供する。
【０１７０】
一部の実施形態では、本発明は、ＥＧＦＲｖＩＩＩ−メソテリン融合タンパク質をコードする核酸分子を提供し、融合タンパク質は、各々が配列番号９に示されるＥＧＦＲｖＩＩＩと少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一のアミノ酸配列を含む１つ又は複数のＥＧＦＲｖＩＩＩポリペプチド、及び配列番号１１に示されるメソテリン３５〜６２２と少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一のアミノ酸配列を含むメソテリンポリペプチドを含む。
【０１７１】
いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ−メソテリン融合タンパク質は、配列番号１０に示されるＥＧＦＲｖＩＩＩｘ５と少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一のアミノ酸配列を含むＥＧＦＲｖＩＩＩｘ５ポリペプチド、及び配列番号１１に示されるメソテリン３５〜６２２と少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一のアミノ酸配列を含むメソテリンポリペプチドを含む。
【０１７２】
いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ−メソテリン融合タンパク質は、配列番号８のアミノ酸残基８９〜８４０に示されるＥＧＦＲｖＩＩＩｘ５−メソテリン３５〜６２２と少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１７３】
一部の実施形態では、核酸は、シグナル配列をさらに含み、シグナル配列は、ＥＧＦＲｖＩＩＩポリペプチドをコードするヌクレオチド配列及びメソテリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と共に翻訳フレーム内にある。いくつかの実施形態では、シグナル配列は、配列番号３に示されるＡｃｔＡＮ１００＊と少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一である。一部の実施形態では、核酸は、プロモータをさらに含む。様々な実施形態において、プロモータは、配列番号２に示されるａｃｔＡプロモータと少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一である。一部の実施形態では、プロモータは、配列番号１８に示されるｈｌｙプロモータと少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一である。
【０１７４】
一部の実施形態では、前述の実施形態のいずれかの核酸分子は、配列番号１と少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一であるヌクレオチド配列を含む。
【０１７５】
一部の実施形態では、本発明は、前述の実施形態のいずれかの核酸分子を含む宿主細胞を提供する。いくつかの実施形態では、前記宿主細胞は細菌である。一実施形態では、前記細菌は、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）である。様々な実施形態では、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）は、ａｃｔＡ欠失突然変異体、ａｃｔＡ挿入突然変異体、ｉｎｌＢ欠失突然変異体、ｉｎｌＢ挿入突然変異体、又はこれらの組合せである。いくつかの実施形態では、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）は、ΔａｃｔＡ／ΔｉｎｌＢ突然変異体である。一部の実施形態では、核酸分子は、宿主細胞ゲノムに組み込まれる。例えば、核酸分子は、ｔＲＮＡＡｒｇ遺伝子座に組み込まれる。
【０１７６】
一部の実施形態では、宿主細胞は、薬学的に許容される賦形剤と組み合わされる。
【０１７７】
一部の実施形態では、本発明は、前述の実施形態のいずれかの宿主細胞と、薬学的に許容される賦形剤とを含むワクチンを提供する。
【０１７８】
一部の実施形態では、本発明は、前述の実施形態のいずれかの核酸分子をコードするベクターを提供する。
【０１７９】
一部の実施形態では、本発明は、対象において免疫応答を誘発する方法を提供し、これは、宿主細胞を含む組成物を対象に投与するステップを含み、宿主細胞は、ＥＧＦＲｖＩＩＩ−メソテリン融合タンパク質をコードする核酸分子を含む。
【０１８０】
一部の実施形態では、核酸分子は、配列番号４に示されるＥＧＦＲｖＩＩＩポリヌクレオチドと少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一である１つ又は複数のＥＧＦＲｖＩＩＩポリヌクレオチド、及び配列番号６に示されるメソテリン３５〜６２２ポリヌクレオチドと少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一であるメソテリンポリヌクレオチドを含む。
【０１８１】
一部の実施形態では、核酸分子は、配列番号５に示されるＥＧＦＲｖＩＩＩｘ５ポリヌクレオチドと少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一であるポリヌクレオチド、及び配列番号６に示されるメソテリン３５〜６２２ポリヌクレオチドと少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一であるポリヌクレオチドを含む。
【０１８２】
様々な実施形態において、核酸分子は、配列番号１と少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一であるヌクレオチド配列を含む。
【０１８３】
一部の実施形態では、核酸分子は、前記宿主細胞のゲノムに組み込まれる。例えば、核酸分子は、ｔＲＮＡＡｒｇ遺伝子座に組み込まれる。
【０１８４】
前述の方法のいずれかの一部の実施形態では、宿主細胞は、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）である。いくつかの実施形態では、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）は、ａｃｔＡ欠失突然変異体、ａｃｔＡ挿入突然変異体、ｉｎｌＢ欠失突然変異体、ｉｎｌＢ挿入突然変異体、又はこれらの組合せである。一実施形態では、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）は、ΔａｃｔＡ／ΔｉｎｌＢ突然変異体である。
【０１８５】
前述の方法のいずれかの一部の実施形態では、投与ステップは、静脈内で実施する。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、対象内の感染細胞の細胞質ゾル中に宿主細胞から発現及び分泌される。一実施形態では、感染細胞は抗原提示細胞である。
【０１８６】
前述の方法のいずれかの一部の実施形態では、ＥＧＦＲｖＩＩＩ−メソテリン融合タンパク質は、各々が配列番号９に示されるＥＧＦＲｖＩＩＩと少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一のアミノ酸配列を含む１つ又は複数のＥＧＦＲｖＩＩＩポリペプチド、及び配列番号１１に示されるメソテリン３５〜６２２と少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一のアミノ酸配列を含むメソテリンポリペプチドを含む。
【０１８７】
前述の方法のいずれかの一部の実施形態では、ＥＧＦＲｖＩＩＩ−メソテリン融合タンパク質は、配列番号１０に示されるＥＧＦＲｖＩＩＩｘ５と少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一のアミノ酸配列を含むＥＧＦＲｖＩＩＩｘ５ポリペプチド、及び配列番号１１に示されるメソテリン３５〜６２２と少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一のアミノ酸配列を含むメソテリンポリペプチドを含む。
【０１８８】
前述の方法のいずれかの一部の実施形態では、ＥＧＦＲｖＩＩＩ−メソテリン融合タンパク質は、配列番号８のアミノ酸残基８９〜８４０に示されるＥＧＦＲｖＩＩＩｘ５−メソテリン３５〜６２２と少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１８９】
いくつかの実施形態では、本発明は、メソテリンポリペプチドの発現を増大させる方法を提供し、これは、宿主細胞において、ＥＧＦＲｖＩＩＩポリヌクレオチドと、メソテリンポリペプチドをコードするメソテリンポリヌクレオチドとを含む核酸分子を発現させるステップを含む。
【０１９０】
一部の実施形態では、ＥＧＦＲｖＩＩＩポリヌクレオチドは、配列番号４と少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一である。
【０１９１】
いくつかの実施形態では、核酸分子は、複数のＥＧＦＲｖＩＩＩポリヌクレオチドを含み、各ＥＧＦＲｖＩＩＩポリヌクレオチドは、配列番号４と少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一であるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、核酸分子は、ＥＧＦＲｖＩＩＩポリヌクレオチドの５つのコピーを含み、ＥＧＦＲｖＩＩＩポリヌクレオチドは、配列番号５と少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一である。
【０１９２】
様々な実施形態において、メソテリンポリペプチドは、配列番号１１に示されるメソテリン３５〜６２２と少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸分子は、配列番号４に示されるＥＧＦＲｖＩＩＩポリヌクレオチドと少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一である１つ又は複数のＥＧＦＲｖＩＩＩポリヌクレオチド、及び配列番号６に示されるメソテリン３５〜６２２ポリヌクレオチドと少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一であるメソテリンポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、核酸分子は、配列番号５に示されるＥＧＦＲｖＩＩＩｘ５ポリヌクレオチドと少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一であるポリヌクレオチド、及び配列番号６に示されるメソテリン３５〜６２２ポリヌクレオチドと少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一であるポリヌクレオチドを含む。
【０１９３】
いくつかの実施形態では、核酸分子は、シグナル配列、プロモータ、又はその両方をさらに含み、プロモータ、シグナル配列、又はその両方は、ＥＧＦＲｖＩＩＩポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、及びメソテリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と作動可能に連結されている。
【０１９４】
一部の実施形態では、核酸分子は、配列番号１と少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一であるヌクレオチド配列を含む。前述の方法のいずれかの一部の実施形態では、宿主細胞は、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）である。
【０１９５】
前述の方法のいずれかの一部の実施形態では、前記発現ステップは、目的の細胞を宿主細胞に感染させるステップを含む。一部の実施形態では、前記発現ステップは、宿主細胞を対象に投与するステップを含む。
【０１９６】
一部の実施形態では、本発明は、癌の治療を、それを必要とする対象において行う方法を提供し、前記方法は、治療有効量の、宿主細胞を含む組成物を対象に投与するステップを含み、宿主細胞は、ＥＧＦＲｖＩＩＩ−メソテリン融合タンパク質をコードする核酸分子を含む。一部の実施形態では、癌は、メソテリン発現癌、ＥＧＦＲｖＩＩＩ発現癌、又はその両方である。一部の実施形態では、癌は、高レベルのメソテリン発現を有する。いくつかの実施形態では、癌は、肺癌である。様々な実施形態において、肺癌は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）腺癌、ＮＳＣＬＣ扁平上皮癌、大細胞癌、又はこれらの任意の組合せである。一部の実施形態では、肺癌は、進行ＮＳＣＬＣ腺癌又は転移性ＮＳＣＬＣ腺癌である。一実施形態では、対象は、標準療法に失敗している。一部の実施形態では、対象は、手術、放射線、化学療法、又はこれらの任意の組合せを受けたことがある。
【０１９７】
一部の実施形態では、ＥＧＦＲｖＩＩＩ−メソテリン融合タンパク質は、配列番号９と少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一のアミノ酸配列を有するＥＧＦＲｖＩＩＩポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、複数のＥＧＦＲｖＩＩＩポリペプチドを含む。一実施形態では、融合タンパク質は、ＥＧＦＲｖＩＩＩポリペプチドの５つのコピーを含む。
【０１９８】
いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲｖＩＩＩ−メソテリン融合タンパク質は、配列番号１１に示されるメソテリン３５〜６２２と少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一のアミノ酸配列を有するメソテリンポリペプチドを含む。
【０１９９】
一部の実施形態では、ＥＧＦＲｖＩＩＩ−メソテリン融合タンパク質は、各々が配列番号９に示されるＥＧＦＲｖＩＩＩと少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一のアミノ酸配列を含む１つ又は複数のＥＧＦＲｖＩＩＩポリペプチド、及び配列番号１１に示されるメソテリン３５〜６２２と少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一のアミノ酸配列を含むメソテリンポリペプチドを含む。
【０２００】
一部の実施形態では、ＥＧＦＲｖＩＩＩ−メソテリン融合タンパク質は、配列番号１０に示されるＥＧＦＲｖＩＩＩｘ５と少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一のアミノ酸配列、及び配列番号１１に示されるメソテリン３５〜６２２と少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一のアミノ酸配列を含むメソテリンポリペプチドを含む。
【０２０１】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号８のアミノ酸残基８９〜８４０として示されるＥＧＦＲｖＩＩＩｘ５−メソテリン３５〜６２２と少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０２０２】
一部の実施形態では、ＥＧＦＲｖＩＩＩ−メソテリン融合タンパク質は、配列番号８に示されるＥＧＦＲｖＩＩＩｘ５−メソテリン３５〜６２２と少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０２０３】
いくつかの実施形態では、核酸分子は、配列番号４に示されるＥＧＦＲｖＩＩＩポリヌクレオチドと少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一である１つ又は複数のＥＧＦＲｖＩＩＩポリヌクレオチド、及び配列番号６に示されるメソテリン３５〜６２２ポリヌクレオチドと少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一であるメソテリンポリヌクレオチドを含む。
【０２０４】
一部の実施形態では、核酸分子は、配列番号５に示されるＥＧＦＲｖＩＩＩｘ５ポリヌクレオチドと少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一であるポリヌクレオチド、及び配列番号６に示されるメソテリン３５〜６２２ポリヌクレオチドと少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一であるポリヌクレオチドを含む。
【０２０５】
一部の実施形態では、核酸分子は、配列番号１に示されるａｃｔＡｐ−ＡｃｔＡＮ１００＊−ＥＧＦＲｖＩＩＩ−メソテリン３５〜６２２と少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一であるヌクレオチド配列を含む。
【０２０６】
一部の実施形態では、核酸分子は、配列番号７に示されるＥＧＦＲｖＩＩＩｘ５−メソテリン３５〜６２２と少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一であるヌクレオチド配列を含む。
【０２０７】
いくつかの実施形態では、前記核酸分子は、宿主細胞ゲノムに組み込まれる。一実施形態では、核酸分子は、ｔＲＮＡＡｒｇ遺伝子座に組み込まれる。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）である。いくつかの実施形態では、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）は、ａｃｔＡ欠失（ΔａｃｔＡ）突然変異体、ａｃｔＡ挿入突然変異体、ｉｎｌＢ欠失（ΔｉｎｌＢ）突然変異体、ｉｎｌＢ挿入突然変異体、又はこれらの組合せである。一部の実施形態では、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）は、ΔａｃｔＡ／ΔｉｎｌＢ突然変異体である。
【０２０８】
様々な実施形態において、融合タンパク質は、対象内の感染細胞の細胞質ゾル中に宿主細胞から発現及び分泌される。一部の実施形態では、感染細胞は抗原提示細胞である。一部の実施形態では、本方法は、組成物を投与する前に対象からの生体サンプル中のメソテリンレベルを測定するステップ、ＥＧＦＲｖＩＩＩを検出するステップ、又はその両方をさらに含む。
【０２０９】
前述の方法のいずれかの一部の実施形態では、組成物は、薬学的に許容される賦形剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、薬学的に許容される賦形剤として、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）及びグリセロールが挙げられる。いくつかの実施形態では、投与ステップは、静脈内で実施する。一部の実施形態では、本方法は、組成物の投与後、抗生物質を対象に投与するステップをさらに含む。一部の実施形態では、組成物の最後の投与後、抗生物質を投与する。いくつかの実施形態では、抗生物質は、アモキシシリン又はトリメトプリム／スルファメトキサゾールである。
【０２１０】
いくつかの実施形態では、前述の実施形態のいずれかの宿主細胞の核酸分子は、宿主細胞内のエピソームプラスミド上の発現カセットに挿入される。
【０２１１】
一部の実施形態では、前述の実施形態のいずれかの融合タンパク質は、シグナル配列をさらに含み、シグナル配列は、ＥＧＦＲｖＩＩＩポリペプチド及びメソテリンポリペプチドと共に翻訳リーディングフレーム内にあり、シグナル配列は、配列番号２０に示されるＬＬＯ４４１シグナル配列と少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一、配列番号２２に示されるＬＬＯ４４１ΔＰＥＳＴシグナル配列と少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一、又は配列番号２４に示されるＬＬＯ４４１Δ２６シグナル配列と少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一である。
【０２１２】
一部の実施形態では、前述の実施形態のいずれかの核酸は、シグナル配列をさらに含み、シグナル配列は、ＥＧＦＲｖＩＩＩポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、及びメソテリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と共に翻訳フレーム内にあり、シグナル配列は、配列番号２０に示されるＬＬＯ４４１シグナル配列と少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一、配列番号２２に示されるＬＬＯ４４１ΔＰＥＳＴシグナル配列と少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一、又は配列番号２４に示されるＬＬＯ４４１Δ２６シグナル配列と少なくともｉ）９０％同一、ｉｉ）９５％同一、又はｉｉｉ）９９％同一である。
【０２１３】
本明細書に引用されるあらゆる特許、公開出願、及び参照文献の教示は、その全体が参照により組み込まれる。
【０２１４】
本発明をその例示的な実施形態に関して具体的に示し、説明してきたが、当業者は、特許請求の範囲に包含される本発明の範囲から逸脱することなく、形態及び詳細に対する様々な変更形態がなされ得ることを理解するであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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