(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２で表されるアミノ酸配列において、
７８２位のグルタミン酸がリジンに置換し、
８００位のロイシンがアルギニンに置換し；
９６８位のアスパラギンがアルギニンに置換し；
９８５位のアスパラギンがアラニンに置換し；
９９１位のアルギニンがアラニンに置換し；
１０２１位のアラニンがセリンに置換し；
９２７位のスレオニンがリジンに置換し；
９２９位のリジンがアスパラギンに置換し；
１０１７位のイソロイシンがフェニルアラニンに置換した；
アミノ酸配列を含む配列からなり、且つ、ガイドＲＮＡとの結合能を有する、タンパク質。
【請求項２】
ＲＮＡ誘導性ＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を有する、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
さらに、配列番号２で表されるアミノ酸配列において、ヌクレアーゼ活性を欠失する変異を有する、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項４】
請求項３で表されるタンパク質において、配列番号２で表されるアミノ酸配列の１０位、５５６位、５５７位及び／又は５８０位に相当する位置に変異を有する、請求項３に記載のタンパク質。
【請求項５】
１０位の変異がアスパラギン酸のアラニンへの置換であり；５５６位の変異がアスパラギン酸のアラニンへの置換であり；５５７位の変異がヒスチジンのアラニンへの置換であり；５８０位の変異がアスパラギンのアラニンへの置換である、請求項４に記載のタンパク質。
【請求項６】
転写制御因子タンパク質又はドメインを連結した、請求項３〜５のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項７】
転写制御因子が転写活性化因子である、請求項６記載のタンパク質。
【請求項８】
転写制御因子が転写サイレンサー又は転写抑制因子である、請求項６記載のタンパク質。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のタンパク質をコードする核酸。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のタンパク質と、標的二本鎖ポリヌクレオチド中のＰＡＭ（Proto-spacer Adjacent Motif）配列の１塩基上流から２０塩基以上２４塩基以下上流までの塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むガイドＲＮＡと、を備えるタンパク質−ＲＮＡ複合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、より標的可能な領域が拡張された、改変されたＣａｓ９タンパク質及びその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
クラスター化した規則的な配置の短い回文反復配列（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔｓ：ＣＲＩＳＰＲ）は、Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）遺伝子と共に、細菌及び古細菌において侵入外来核酸に対する獲得耐性を提供する適応免疫系を構成することが知られている。ＣＲＩＳＰＲは、ファージまたはプラスミドＤＮＡに起因することが多く、大きさの類似するスペーサーと呼ばれる独特の可変ＤＮＡ配列が間に入った、２４〜４８ｂｐの短い保存された反復配列からなる。また、リピート及びスペーサー配列の近傍には、Ｃａｓタンパク質ファミリーをコードする遺伝子群が存在する。【０００３】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムにおいて、外来性のＤＮＡは、Ｃａｓタンパク質ファミリーによって３０ｂｐ程度の断片に切断され、ＣＲＩＳＰＲに挿入される。Ｃａｓタンパク質ファミリーの一つであるＣａｓ１及びＣａｓ２タンパク質は、外来性ＤＮＡのｐｒｏｔｏ−ｓｐａｃｅｒ  ａｄｊａｃｅｎｔ  ｍｏｔｉｆ（ＰＡＭ）と呼ばれる塩基配列を認識して、その上流を切り取って、宿主のＣＲＩＳＰＲ配列に挿入し、これが細菌の免疫記憶となる。免疫記憶を含むＣＲＩＳＰＲ配列が転写されて生成したＲＮＡ（ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡと呼ぶ。）は、一部相補的なＲＮＡ（ｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ）と対合し、Ｃａｓタンパク質ファミリーの一つであるＣａｓ９タンパク質に取り込まれる。Ｃａｓ９に取り込まれたｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡはＲＮａｓｅＩＩＩにより切断され、外来配列（ガイド配列）を含む小さなＲＮＡ断片（ＣＲＩＳＰＲ−ＲＮＡｓ：ｃｒＲＮＡｓ）となり、Ｃａｓ９−ｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体が形成される。Ｃａｓ９−ｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体はｃｒＲＮＡと相補的な外来侵入性ＤＮＡに結合し、ＤＮＡを切断する酵素（ｎｕｃｌｅａｓｅ）であるＣａｓ９タンパク質が、外来侵入性ＤＮＡを切断することよって、外から侵入したＤＮＡの機能を抑制及び排除する。【０００４】
Ｃａｓ９タンパク質は外来侵入性ＤＮＡ中のＰＡＭ配列を認識して、その上流で二本鎖ＤＮＡを平滑末端になるように切断する。ＰＡＭ配列の長さや塩基配列は細菌種によってさまざまであり、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）では「ＮＧＧ」（Ｎ＝Ａ/Ｃ/Ｔ/Ｇ）の３塩基を認識する。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）は２つのＣａｓ９を持っており、それぞれ「ＮＧＧＮＧ」（Ｎ＝Ａ/Ｃ/Ｔ/Ｇ）又は「ＮＮＡＧＡＡ」（Ｎ＝Ａ/Ｃ/Ｔ/Ｇ）の５〜６塩基をＰＡＭ配列として認識する。Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｎｏｖｉｃｉｄａ（Ｆ．ｎｏｖｉｃｉｄａ）では「ＮＧＲ」（Ｎ＝Ａ/Ｃ/Ｔ/Ｇ；Ｒ＝Ａ/Ｇ）の３塩基を認識する。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）では「ＮＮＧＲＲＴ」（Ｎ＝Ａ/Ｃ/Ｔ/Ｇ；Ｒ＝Ａ/Ｇ）の６塩基を認識する。【０００５】
近年、細菌でのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムを、ゲノム編集に応用する技術が盛んに開発されている。ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡを融合させて、ｔｒａｃｒＲＮＡ−ｃｒＲＮＡキメラ（以下、ガイドＲＮＡ（ｇｕｉｄｅ  ＲＮＡ：ｇＲＮＡ）と呼ぶ。）として発現させ、活用している。これによりｎｕｃｌｅａｓｅ（ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ｎｕｃｌｅａｓｅ：ＲＧＮ）を呼び込み、目的の部位でゲノムＤＮＡを切断する。
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムを用いた方法は、目的のＤＮＡ配列と相同な短いｇＲＮＡを合成するだけでよく、単一のタンパク質であるＣａｓ９タンパク質を用いてゲノム編集ができる。そのため、従来用いられていたジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）やトランス活性化因子様作動体（ＴＡＬＥＮ）のようにＤＮＡ配列ごとに異なる大きなタンパク質を合成する必要がなく、簡便かつ迅速にゲノム編集を行うことができる。【０００６】
特許文献１には、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムを活用したゲノム編集技術が開示されている。
特許文献２には、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムを活用したゲノム編集技術が開示されている。さらに、特許文献２には、Ｃａｓ９タンパク質のＤ３１Ａ又はＮ８９１Ａ変異体が、一方のＤＮＡ鎖のみにｎｉｃｋを入れるＤＮＡ切断酵素であるｎｉｃｋａｓｅとして機能することが開示されている。さらに、ＤＮＡ切断後の修復メカニズムで挿入欠失などの変異を起こしやすい非相同末端結合の発生率は少ないままで、野生型Ｃａｓ９タンパク質と同程度の相同組み換え効率を有することが示されている。
非特許文献１には、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９を使用したＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムであって、２つのＣａｓ９タンパク質のＤ１０Ａ変異体と、該Ｄ１０Ａ変異体と複合体を形成する１対の標的特異的ガイドＲＮＡを利用するダブルニッカーゼシステムが開示されている。各Ｃａｓ９タンパク質のＤ１０Ａ変異体及び標的特異的ガイドＲＮＡの複合体は、ガイドＲＮＡと相補するＤＮＡ鎖に１つだけニックを作る。一対のガイドＲＮＡは約２０塩基程度ずれており、標的ＤＮＡの反対鎖に位置する標的配列のみを認識する。各Ｃａｓ９タンパク質のＤ１０Ａ変異体及び標的特異的ガイドＲＮＡの複合体によって作られた２つのニックはＤＮＡ二本鎖切断（ＤＮＡ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ｂｒｅａｋ：ＤＳＢ）を模倣する状態になり、一対のガイドＲＮＡを利用することで高レベルの効率を維持しつつ、Ｃａｓ９タンパク質媒介型遺伝子編集の特異性を改善できることが示されている。
特許文献３には、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９タンパク質の各種変異体が、特許文献４には、Ｆ．ｎｏｖｉｃｉｄａ由来のＣａｓ９タンパク質の各種変異体が開示されている。【０００７】
現在、ゲノム編集ツールとしてはＳｐＣａｓ９が広く利用されているが、分子量が大きくウイルスベクターへの導入の効率が低いなどの問題点が残されていた。この問題の解決策として開発されたのがＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓに由来する小型のＣａｓ９（ＳａＣａｓ９）であり（非特許文献２）、構造解析も為されている（非特許文献３、特許文献５）。ＳａＣａｓ９（１０５３残基）はＳｐＣａｓ９（１３６８残基）に比べ分子量が小さく、配列同一性も低い（１７％）。ＳｐＣａｓ９はＰＡＭとして５’−ＮＧＧ−３’を認識する一方、ＳａＣａｓ９は５’−ＮＮＧＲＲＴ−３’（Ｒはプリン塩基，ＡまたはＧ）を認識する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】ＷＯ２０１４／０９３６６１
【特許文献２】特表２０１５−５１０７７８号公報
【特許文献３】ＷＯ２０１６／１４１２２４
【特許文献４】ＷＯ２０１７／０１０５４３
【特許文献５】ＷＯ２０１６／２０５７５９
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ran, F. A., et al., Double Nicking by RNA-Guided CRISPR Cas9 for Enhanced Genome Editing Specificity. Cell, vol.154, p1380-1389, 2013.
【非特許文献２】Ran, F. A., et al., In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9. Nature vol. 520, p186-191, 2015
【非特許文献３】Nishimasu H, et al., Crystal Structure of Staphylococcus aureus Cas9. Cell. Vol.162, No. 5, p1113-1126, 2015
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
Ｓ．ａｕｒｅｕｓ由来のＣａｓ９（本明細書中、ＳａＣａｓ９とも称する）タンパク質は、認識可能なＰＡＭ配列が「ＮＮＧＲＲＴ（Ｎは任意の塩基、Ｒはプリン残基（Ａ又はＧ）を示す）」の６塩基である。
ＳａＣａｓ９は従来のＣａｓ９タンパク質に比べて小さいという利点はあるものの、認識可能なＰＡＭ配列に制限があるため、編集可能な標的配列が制限されるという問題点があった。
本発明は、ガイドＲＮＡとの結合能は維持しつつ標的配列の制限が緩和された改変されたＳａＣａｓ９タンパク質及びその用途を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、Ｃａｓ９タンパク質として、ＳａＣａｓ９タンパク質に着目し、上記課題を解決すべく鋭意検討した。結果、ＳａＣａｓ９タンパク質の所定の位置のアミノ酸を特定のアミノ酸に置換する（変異を導入する）ことによって、ガイドＲＮＡとの結合能は維持しつつ、従来ＮＮＧＲＲＴであったＰＡＭ配列ををＮＮＧＮＮＮの配列とすることに成功し、本発明を完成するに至った。
本明細書中、変異を導入する前のＣａｓ９タンパク質を野生型Ｃａｓ９タンパク質、変異を導入した後のＣａｓ９タンパク質を改変されたＣａｓ９タンパク質あるいは変異型Ｃａｓ９タンパク質と称する場合がある。
即ち、本発明は以下の通りである。
［１］配列番号２で表されるアミノ酸配列において、
９８５位及び９９１位、並びに任意で９８６位に変異を有し、且つ、７８２位、８００位、８８８位、９６８位、９８８位、１０１７位及び１０２１位からなる群より選ばれる少なくとも１つの部位に変異を有するアミノ酸配列を含む配列からなり、且つ、ガイドＲＮＡとの結合能を有するタンパク質。
［２］７８２位、８００位、８８８位、９６８位、９８８位、１０１７位及び１０２１位からなる群より選ばれる少なくとも２つの部位に変異を有する、上記［１］記載のタンパク質。
［３］７８２位、８００位、８８８位、９６８位、９８８位、１０１７位及び１０２１位からなる群より選ばれる少なくとも３つの部位に変異を有する、上記［１］記載のタンパク質。
［４］７８２位、８００位、８８８位、９６８位、９８８位、１０１７位及び１０２１位からなる群より選ばれる少なくとも４つの部位に変異を有する、上記［１］記載のタンパク質。
［５］７８２位、８００位、８８８位、９６８位、９８８位、１０１７位及び１０２１位からなる群より選ばれる少なくとも５つの部位に変異を有する、上記［１］記載のタンパク質。
［６］７８２位、８００位、８８８位、９６８位、９８８位、１０１７位及び１０２１位からなる群より選ばれる少なくとも６つの部位に変異を有する、上記［１］記載のタンパク質。
［７］７８２位の変異が、リジン又はアルギニンへの置換であり；
８００位の変異が、アルギニン又はリジンへの置換であり；
８８８位の変異が、リジン、アルギニン、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン及びセリンからなる群より選ばれるアミノ酸への置換であり；
９６８位の変異が、アルギニン又はリジンへの置換であり；
９８５位の変異が、アラニン、セリン、スレオニン、システイン、バリン及びイソロイシンからなる群より選ばれるアミノ酸への置換であり；
９８６位の変異が、アラニン、セリン、スレオニン、システイン、バリン及びイソロイシンからなる群より選ばれるアミノ酸への置換であり； 
９８８位の変異が、ヒスチジンへの置換であり；
９９１位の変異が、非芳香族アミノ酸への置換であり；
１０１７位の変異が、フェニルアラニン、メチオニン、チロシン、トリプトファン及びプロリンからなる群より選ばれるアミノ酸への置換であり；
１０２１位の変異が、セリン、スレオニン及びアスパラギンからなる群より選ばれるアミノ酸への置換である
上記［１］〜［６］のいずれかに記載のタンパク質。
［８］７８２位の変異が、リジンへの置換であり；
８００位の変異が、アルギニンへの置換であり；
８８８位の変異が、リジンへの置換であり；
９６８位の変異が、アルギニンへの置換であり；
９８５位の変異が、アラニンへの置換であり；
９８６位の変異が、アラニンへの置換であり；
９９１位の変異が、アラニンへの置換であり； 
９８８位の変異が、ヒスチジンへの置換であり；
１０１７位の変異が、フェニルアラニンへの置換であり；
１０２１位の変異が、セリンへの置換である
上記［１］〜［７］のいずれかに記載のタンパク質。
［９］さらに、
（ｉ）９２７位及び９２９位の変異、
（ｉｉ）９２９位の変異、
（ｉｉｉ）９２７位の変異、
（ｉｖ）８８９位の変異、又は
（ｖ）９２７位、９２９位及び８８９位の変異
を有する、上記［１］〜［８］のいずれかに記載のタンパク質。
［１０］（ｉ）の変異が、９２７位のリジン又はアルギニンへの置換、及び９２９位のアスパラギン、アスパラギン酸又はアラニンへの置換であり；
（ｉｉ）の変異が、９２９位のアルギニンへの置換であり；
（ｉｉｉ）の変異が、９２７位のリジン又はアルギニンへの置換であり；
（ｉｖ）の変異が、８８９位のアスパラギン、セリン、リジン、アルギニン又はヒスチジンへの置換であり；
（ｖ）の変異が、９２７位のリジン又はアルギニンへの置換、９２９位のアスパラギン、アスパラギン酸又はアラニンへの置換、及び８８９位のアスパラギンへの置換である
上記［９］記載のタンパク質。
［１１］（ｉ）の変異が、９２７位のリジンへの置換、及び９２９位のアスパラギンへの置換であり；
（ｉｉ）の変異が、９２９位のアルギニンへの置換であり；
（ｉｉｉ）の変異が、９２７位のリジンへの置換であり；
（ｉｖ）の変異が、８８９位のアスパラギンへの置換であり；
（ｖ）の変異が、９２７位のリジンへの置換、９２９位のアスパラギンへの置換、及び８８９位のアスパラギンへの置換である
上記［９］記載のタンパク質。
［１２］配列番号２で表されるアミノ酸配列において、
７８２位のグルタミン酸がリジンに置換し、
８００位のロイシンがアルギニンに置換し；
９６８位のアスパラギンがアルギニンに置換し；
９８５位のアスパラギンがアラニンに置換し；
９８６位のアスパラギンがアラニンに置換し；
９９１位のアルギニンがアラニンに置換し；
９８８位のロイシンがヒスチジンに置換し；
１０２１位のアラニンがセリンに置換し；
９２７位のスレオニンがリジンに置換し；
９２９位のリジンがアスパラギンに置換した；
アミノ酸配列を含む配列からなり、且つ、ガイドＲＮＡとの結合能を有する、上記［９］記載のタンパク質。
［１３］配列番号２で表されるアミノ酸配列において、
７８２位のグルタミン酸がリジンに置換し、
８００位のロイシンがアルギニンに置換し；
９６８位のアスパラギンがアルギニンに置換し；
９８５位のアスパラギンがアラニンに置換し；
９８６位のアスパラギンがアラニンに置換し；
９９１位のアルギニンがアラニンに置換し；
９８８位のロイシンがヒスチジンに置換し；
１０２１位のアラニンがセリンに置換し；
８８９位のアラニンがアスパラギンに置換し；
９２７位のスレオニンがリジンに置換し；
９２９位のリジンがアスパラギンに置換した；
アミノ酸配列を含む配列からなり、且つ、ガイドＲＮＡとの結合能を有する、上記［９］記載のタンパク質。
［１４］配列番号２で表されるアミノ酸配列において、
７８２位のグルタミン酸がリジンに置換し、
８００位のロイシンがアルギニンに置換し；
９６８位のアスパラギンがアルギニンに置換し；
９８５位のアスパラギンがアラニンに置換し；
９８６位のアスパラギンがアラニンに置換し；
９９１位のアルギニンがアラニンに置換し；
９８８位のロイシンがヒスチジンに置換し；
１０２１位のアラニンがセリンに置換した；
アミノ酸配列を含む配列からなり、且つ、ガイドＲＮＡとの結合能を有する、上記［１］記載のタンパク質。
［１５］配列番号２で表されるアミノ酸配列において、
７８２位のグルタミン酸がリジンに置換し、
８００位のロイシンがアルギニンに置換し；
９６８位のアスパラギンがアルギニンに置換し；
９８５位のアスパラギンがアラニンに置換し；
９９１位のアルギニンがアラニンに置換し；
１０２１位のアラニンがセリンに置換し；
９２７位のスレオニンがリジンに置換し；
９２９位のリジンがアスパラギンに置換し；
１０１７位のイソロイシンがフェニルアラニンに置換した；
アミノ酸配列を含む配列からなり、且つ、ガイドＲＮＡとの結合能を有する、上記［１］記載のタンパク質。
［１６］配列番号２の変異が施された位置以外の部位において８０％以上の同一性を有する、上記［１］〜［１５］のいずれかに記載のタンパク質。
［１７］配列番号２の変異が施された位置以外の部位において１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加された、上記［１］〜［１５］のいずれかに記載のタンパク質。
［１８］ＲＮＡ誘導性ＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を有する、上記［１］〜［１７］のいずれかに記載のタンパク質。
［１９」さらに、配列番号２で表されるアミノ酸配列において、ヌクレアーゼ活性を欠失する変異を有する、上記［１］〜［１７］のいずれかに記載のタンパク質。
［２０］上記［１９」で表されるタンパク質において、配列番号２で表されるアミノ酸配列の１０位、５５６位、５５７位及び／又は５８０位に相当する位置に変異を有する、上記［１］〜［１７］のいずれかに記載のタンパク質。
［２１］１０位の変異がアスパラギン酸のアラニンへの置換であり；５５６位の変異がアスパラギン酸のアラニンへの置換であり；５５７位の変異がヒスチジンのアラニンへの置換であり；５８０位の変異がアスパラギンのアラニンへの置換である、上記［２０］に記載のタンパク質。
［２２］転写制御因子タンパク質又はドメインを連結した、上記［１９］〜［２１］記載のタンパク質。
［２３］転写制御因子が転写活性化因子である、上記［２２］記載のタンパク質。
［２４］転写制御因子が転写サイレンサー又は転写抑制因子である、上記［２３］記載のタンパク質。
［２５］上記［１］〜［２４］のいずれかに記載のタンパク質をコードする核酸。
［２６］上記［１］〜［２４］のいずれかに記載のタンパク質と、標的二本鎖ポリヌクレオチド中のＰＡＭ（Proto-spacer Adjacent Motif）配列の１塩基上流から２０塩基以上２４塩基以下上流までの塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むガイドＲＮＡと、を備えるタンパク質−ＲＮＡ複合体。
［２７］標的二本鎖ポリヌクレオチドを部位特異的に改変するための方法であって、
標的二本鎖ポリヌクレオチドと、タンパク質と、ガイドＲＮＡとを混合し、インキュベートする工程と、
前記タンパク質が、ＰＡＭ配列の上流に位置する結合部位で前記標的二本鎖ポリヌクレオチドを改変する工程と、を備え、
前記標的二本鎖ポリヌクレオチドは、ＮＮＧＮＮＮ（Ｎは任意の塩基を、Ｇはグアニンをそれぞれ意味する）からなるＰＡＭ配列を有し、
前記タンパク質は、上記［１］〜［２４］のいずれかに記載のタンパク質であり、
前記ガイドＲＮＡは、前記標的二本鎖ポリヌクレオチド中の前記ＰＡＭ配列の１塩基上流から２０塩基以上２４塩基以下上流までの塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むものである方法。
［２８］改変が、標的二本鎖ポリヌクレオチドの部位特異的な切断である、上記［２７］記載の方法。
［２９］改変が、標的二本鎖ポリヌクレオチドにおける部位特異的な、１以上のヌクレオチドの置換、欠失及び／又は付加である、上記［２７］記載の方法。
［３０］細胞の標的遺伝子の発現を増大させる方法であって、前記細胞内で上記［２３］に記載のタンパク質と、前記標的遺伝子に対する１つ又は複数のガイドＲＮＡとを発現させることを含む、方法。
［３１］細胞の標的遺伝子の発現を減少させる方法であって、前記細胞内で上記［２４］に記載のタンパク質と、前記標的遺伝子に対する１つ又は複数のガイドＲＮＡとを発現させることを含む、方法。
［３２］細胞が真核細胞である、上記［３０］又は［３１］に記載の方法。
［３３］細胞が酵母細胞、植物細胞又は動物細胞である、上記［３０］又は［３１］に記載の方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、ガイドＲＮＡへの結合力を保ちながら、ＰＡＭ配列の認識が広範化されたＣａｓ９タンパク質を得ることができる。また、前記Ｃａｓ９タンパク質を利用した簡便且つ迅速で標的配列に部位特異的なゲノム編集技術を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、実施例１におけるＤＮＡ切断活性測定試験のアガロースゲル電気泳動の結果を表わした図である。ＰＡＭ配列として「（ＮＮ）ＧＡＡＡ」を用いた。
【図２】図２は、実施例１おけるＤＮＡ切断活性測定試験のアガロースゲル電気泳動の結果を表わした図である。ＰＡＭ配列として「（ＮＮ）ＧＡＡＡ」を用いた。
【図３】図３は、実施例１におけるＤＮＡ切断活性測定試験のアガロースゲル電気泳動の結果を表わした図である。ＰＡＭ配列として「（ＮＮ）ＧＡＡＡ」を用いた。
【図４】図４は、実施例２におけるＤＮＡ切断活性測定試験のアガロースゲル電気泳動の結果を表わした図である。種々の変異型Ｃａｓ９タンパク質についてＰＡＭ配列を調べた。
【図５】図５は、実施例３において、動物細胞（ＨＥＫ２９３細胞）での切断活性を指標に、変異体のＰＡＭ配列の改変を検証した結果を示す図である。
【図６】図６は、NLS-WT-dSaCas(D10A,N580A)-NLS-KRAB-P2A-Puro融合タンパク質（WT-dSaCas9-KRABと略記することもある）のアミノ酸配列（図６−１）及びそれをコードする塩基配列（図６−２）を示す。
【図７】図７は、NLS-PF(v15)-dSaCas(D10A,N580A)-NLS-KRAB-P2A-Puro融合タンパク質（PF(v15)-dSaCas9(D10A, N580A)-KRABと略記することもある）のアミノ酸配列（図７−１）及びそれをコードする塩基配列（図７−２）を示す。
【図８】図８は、NLS-PF(v51)-dSaCas(D10A,N580A)-NLS-KRAB-P2A-Puro融合タンパク質（PF(v51)-dSaCas9(D10A, N580A)-KRABと略記することもある）のアミノ酸配列（図８−１）及びそれをコードする塩基配列（図８−２）を示す。
【図９】図９は、PF(v15)-dSaCas9が、WT-dSaCas9に比べKRAS遺伝子の発現をより強く抑制することを示す。
【図１０】図１０は、PF(v15)及びPF(v51)のWT-dSaCas9に対するオフターゲット抑制効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明を説明する。本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味を有する。
【００１５】
＜ＰＡＭ配列の認識が広範化されたＣａｓ９タンパク質＞
本実施形態のタンパク質は、ガイドＲＮＡへの結合力を保ちながら、ＰＡＭ配列の認識が広範化されたＣａｓ９タンパク質である。本実施形態のタンパク質によれば、簡便且つ迅速で標的配列に部位特異的なゲノム編集技術を提供することができる。
【００１６】
本明細書中において、「ガイドＲＮＡ」とは、ｔｒａｃｒＲＮＡ−ｃｒＲＮＡのヘアピン構造を模倣したものであり、標的二本鎖ポリヌクレオチド中のＰＡＭ配列の１塩基上流から、好ましくは２０塩基以上２４塩基以下、より好ましくは２２塩基以上２４塩基以下までの塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを５’末端領域に含むものである。さらに、標的二本鎖ポリヌクレオチドと非相補的な塩基配列からなり、一点を軸として対称に相補的な配列になるように並び、ヘアピン構造をとり得る塩基配列からなるポリヌクレオチドを１つ以上含んでいてもよい。
ガイドＲＮＡは、本発明の変異型Ｃａｓ９タンパク質と結合して、該タンパク質を標的ＤＮＡに導く機能を有する。ガイドＲＮＡは、その５’末端に標的ＤＮＡに相補的な配列を有し、該相補的な配列を介して標的ＤＮＡに結合することにより、本発明の変異型Ｃａｓ９タンパク質を標的ＤＮＡに導く。変異型Ｃａｓ９タンパク質がＤＮＡエンドヌクレアーゼとして機能する場合には、標的ＤＮＡが存在する部位でＤＮＡを切断し、例えば、標的ＤＮＡの機能を特異的に喪失させることができる。
ガイドＲＮＡは、切断あるいは修飾すべき標的ＤＮＡの配列情報に基づき設計され調製される。具体的には実施例で用いられるような配列が挙げられる。
【００１７】
本明細書において、「エンドヌクレアーゼ」とは、ヌクレオチド鎖の途中を切断する酵素を意味する。よって、エンドヌクレアーゼ活性を有する、本実施形態のＰＡＭ配列の認識が広範化されたＣａｓ９タンパク質は、ガイドＲＮＡにより誘導され、ＤＮＡ鎖の途中を切断する酵素活性を有する。
【００１８】
本明細書において、「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」とは、アミノ酸残基のポリマーを意味し、互換的に使用される。また、１つ若しくは複数のアミノ酸が、天然に存在する対応アミノ酸の化学的類似体、又は修飾誘導体である、アミノ酸ポリマーを意味する。
【００１９】
本明細書において、「非芳香族アミノ酸」とは、グルタミン酸、アラニン、プロリン、バリン、ロイシン、イソロイシン等のベンゼン環を持たないアミノ酸を意味する。
【００２０】
本明細書中において、「ＤＮＡ配列」とは、任意の長さのヌクレオチド配列を意味しており、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドであり、線状、環状、又は分岐状であり、一本鎖又は二本鎖である。
本明細書中において、「ＰＡＭ配列」とは、標的二本鎖ポリヌクレオチド中に存在し、Ｃａｓ９タンパク質により認識可能な配列を意味し、ＰＡＭ配列の長さや塩基配列は細菌種によって異なる。本実施形態のＰＡＭ配列の認識が広範化されたＣａｓ９タンパク質により認識可能な配列は、「５’−ＮＮＧＮＮＮ−３’」で表すことができる。
【００２１】
なお、本明細書において、「Ｎ」は、アデニン、シトシン、チミン及びグアニンからなる群から選択された任意の１塩基を意味し、「Ａ」はアデニン、「Ｇ」はグアニン、「Ｃ」はシトシン、「Ｔ」はチミン、「Ｒ」はプリン骨格を有する塩基（アデニン又はグアニン）、「Ｙ」はピリミジン骨格を有する塩基（シトシン又はチミン）を意味する。
【００２２】
本明細書中において、「ポリヌクレオチド」とは、線状又は環状配座であり、一本鎖又は二本鎖形態のいずれかである、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドポリマーを意味し、ポリマーの長さに関して制限するものとして解釈されるものではない。また、天然ヌクレオチドの公知の類似体、並びに塩基部分、糖部分及びリン酸部分のうち少なくとも一つの部分において修飾されるヌクレオチド（例えば、ホスホロチオエート骨格）を包含する。一般に、特定ヌクレオチドの類似体は、同一の塩基対合特異性を有し、例えば、Ａの類似体は、Ｔと塩基対合する。
【００２３】
一実施形態において、本発明は、配列番号２で表されるアミノ酸配列において、９８５位及び９９１位、並びに任意で９８６位に変異を有し、加えて７８２位、８００位、９６８位、８８８位、９８８位、１０１７位及び１０２１位からなる群より選ばれる少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つの部位に変異を有するアミノ酸配列を含む配列からなり、且つ、ガイドＲＮＡとの結合能を有するタンパク質（態様１）を提供する。態様１のタンパク質はＲＮＡ誘導性ＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を有する。
配列番号２は、ＳａＣａｓ９タンパク質の全長アミノ酸配列である。
配列番号２の７８２位における変異は、具体的には、７８２位のグルタミン酸の、リジン又はアルギニンへの置換であり、好ましくはリジンへの置換である。
配列番号２の８００位における変異は、具体的には、８００位のロイシンの、アルギニン又はリジンへの置換であり、好ましくはアルギニンへの置換である。
配列番号２の８８８位における変異は、具体的には、８８８位のアスパラギンのリジン、アルギニン、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン及びセリンからなる群より選ばれるアミノ酸への置換であり、好ましくはリジンへの置換である。
配列番号２の９６８位における変異は、具体的には、９６８位のアスパラギンの、アルギニン又はリジンへの置換であり、好ましくはアルギニンへの置換である。
配列番号２の９８５位における変異は、具体的には、９８５位のアスパラギンの、アラニン、セリン、スレオニン、システイン、バリン及びイソロイシンからなる群より選ばれるアミノ酸への置換であり、好ましくはアラニンへの置換である。
配列番号２の９８６位における変異は、具体的には、９８６位のアスパラギンの、アラニン、セリン、スレオニン、システイン、バリン及びイソロイシンからなる群より選ばれるアミノ酸への置換であり、好ましくはアラニンへの置換である。
配列番号２の９８８位における変異は、具体的には、９８８位のロイシンのヒスチジンへの置換である。
配列番号２の９９１位における変異は、具体的には、９９１位のアルギニンの、非芳香族アミノ酸への置換であり、好ましくはアラニンへの置換である。
配列番号２の１０１７位における変異は、具体的には、１０１７位のイソロイシンのよりかさ高いアミノ酸への置換である。かさ高いアミノ酸への置換により、１０１５位のアルギニンの側鎖と相互作用し安定化することが期待できる。かさ高いアミノ酸としては、フェニルアラニン、メチオニン、チロシン、トリプトファン及びプロリンが挙げられ、好ましくフェニルアラニンへの置換である。
配列番号２の１０２１位における変異は、具体的には、１０２１位のアラニンのセリン、スレオニン及びアスパラギンからなる群より選ばれるアミノ酸への置換であり、好ましくはセリンへの置換である。
【００２４】
本発明の別の一実施態様において、本発明は、前記態様１の変異に加えて、さらに９２７位及び９２９位に変異を有し、且つ、ガイドＲＮＡとの結合能を有するタンパク質（態様２）を提供する。加えて、態様２のタンパク質は、ＲＮＡ誘導性ＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を有する。
９２７位における変異は、具体的には、９２７位のスレオニンのリジン又はアルギニンへの置換、好ましくはリジンへの置換である。
９２９位における変異は、具体的には、９２９位のリジンのアスパラギン、アスパラギン酸又はアラニンへの置換、好ましくはアスパラギンへの置換である。
【００２５】
本発明の別の一実施態様において、本発明は、前記態様１の変異に加えて、さらに、９２９位に変異を有し、且つ、ガイドＲＮＡとの結合能を有するタンパク質（態様３）を提供する。態様３のタンパク質はＲＮＡ誘導性ＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を有する。
該９２９位における変異は、具体的には、９２９位のリジンのアルギニンへの置換である。
【００２６】
本発明の別の一実施態様において、本発明は、前記態様１の変異に加えて、さらに、９２７位に変異を有し、且つ、ガイドＲＮＡとの結合能を有するタンパク質（態様４）を提供する。態様４のタンパク質はＲＮＡ誘導性ＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を有する。
該９２７位における変異は、具体的には、９２７位のスレオニンのリジンへの置換である。
【００２７】
本発明の別の一実施態様において、本発明は、前記態様１の変異に加えて、さらに８８９位に変異を有し、且つ、ガイドＲＮＡとの結合能を有するタンパク質（態様５）を提供する。加えて、態様５のタンパク質は、ＲＮＡ誘導性ＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を有する。
該８８９位における変異は、具体的には、８８９位のアラニンのアスパラギン、セリン、リジン、アルギニン又はヒスチジンへの置換、好ましくはアスパラギンへの置換である。
【００２８】
本発明の別の一実施態様において、本発明は、前記態様１の変異に加えて、さらに９２７位、９２９位及び８８９位に変異を有し、且つ、ガイドＲＮＡとの結合能を有するタンパク質（態様６）を提供する。加えて、態様６のタンパク質は、ＲＮＡ誘導性ＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を有する。
９２７位における変異は、具体的には、９２７位のスレオニンのリジン又はアルギニンへの置換、好ましくはリジンへの置換である。
９２９位における変異は、具体的には、９２９位のリジンのアスパラギン、アスパラギン酸又はアラニンへの置換、好ましくはアスパラギンへの置換である。
８８９位における変異は、具体的には、アスパラギンへの置換である。
【００２９】
本発明の別の一実施態様において、本発明は、前記態様１〜６のタンパク質と機能的に同等なタンパク質（態様７）を提供する。前記態様１〜６のタンパク質と機能的に同等であるためには配列番号２で表されるアミノ酸配列において、前記態様１〜６で変異が施された位置以外の部位において、８０％以上の配列同一性を有し、且つガイドＲＮＡとの結合能を有する。変異によりアミノ酸に増減があった場合には、該「変異が施された位置以外の部位」は「変異が施された位置に相当する位置以外の部位」と解することができる。係る同一性としては、８０％以上が好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上が更に好ましく、９５％以上が特に好ましく、９９％以上が最も好ましい。アミノ酸配列同一性は自体公知の方法により決定できる。例えば、アミノ酸配列同一性（％）は、当該分野で慣用のプログラム（例えば、BLAST、FASTA等）を初期設定で用いて決定することができる。また、別の局面では、同一性（％）は、当該分野で公知の任意のアルゴリズム、例えば、Needlemanら(1970) (J. Mol. Biol. 48: 444-453)、Myers及びMiller (CABIOS, 1988, 4: 11-17)のアルゴリズム等を使用して決定することができる。Needlemanらのアルゴリズムは、GCGソフトウェアパッケージ(www.gcg.comで入手可能)のGAPプログラムに組み込まれており、同一性（％）は、例えば、BLOSUM 62 matrix又はPAM250 matrix、並びにgap weight: 16、14、12、10、8、6若しくは4、及びlength weight: 1、2、3、4、5若しくは6のいずれかを使用することによって決定することができる。また、Myers及びMillerのアルゴリズムは、GCG配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるALIGNプログラムに組み込まれている。アミノ酸配列を比較するためにALIGNプログラムを利用する場合、例えば、PAM120 weight residue table、gap length penalty 12、gap penalty 4を用いることができる。
【００３０】
前記態様１〜６のタンパク質と機能的に同等なタンパク質として、配列番号２で表されるアミノ酸配列において、前記態様１〜６で変異が施された位置以外の部位において、１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加され、且つ、ガイドＲＮＡとの結合能を有するタンパク質（態様７）が提供される。変異によりアミノ酸に増減があった場合には、該「変異が施された位置以外の部位」は「変異が施された位置に相当する位置以外の部位」と解することができる。
「アミノ酸の置換、欠失、挿入及び／又は付加」を人為的に行う場合の手法としては、例えば、所定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡに対して慣用の部位特異的変異導入を施し、その後このＤＮＡを常法により発現させる手法が挙げられる。ここで部位特異的変異導入法としては、例えば、アンバー変異を利用する方法（ギャップド・デュプレックス法、Nucleic Acids Res., 12, 9441-9456 (1984)）、変異導入用プライマーを用いたPCRによる方法等が挙げられる。
前記で改変されるアミノ酸の数については、少なくとも1残基、具体的には1若しくは数個、またはそれ以上である。また前記置換、欠失、挿入または付加のうち、特にアミノ酸の置換が好ましい。当該置換は、疎水性、電荷、pK、立体構造上における特徴等の類似した性質を有するアミノ酸への置換がより好ましい。このような置換としては、例えば、i)グリシン、アラニン；ii)バリン、イソロイシン、ロイシン；iii)アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；iv)セリン、スレオニン；v)リジン、アルギニン；vi)フェニルアラニン、チロシンのグループ内での置換が挙げられる。
【００３１】
本発明の別の一実施態様において、本発明は、前記態様１〜７の変異に加えて、さらに、配列番号２の１０位、５５６位、５５７位及び／又は５８０位に相当する位置に変異を有し、且つ、ガイドＲＮＡとの結合能を有するタンパク質（態様８）を提供する。本明細書において、「相当する位置」のアミノ酸残基の特定は、公知のアルゴリズムを用いて、目的アミノ酸配列を参照配列（配列番号２で示されるアミノ酸配列）と比較し、各変異を有するタンパク質のアミノ酸配列中に存在する保存アミノ酸残基に最大の相同性を与えるように配列を整列（アラインメント）させることにより行なうことができる。各タンパク質のアミノ酸配列をこのような方法で整列させることにより、アミノ酸配列中にある挿入、欠失にかかわらず、変異を施すアミノ酸残基の配列中の位置を決めることが可能になる。
該１０位における変異は、具体的には、１０位のアスパラギン酸のアラニンへの置換である。
該５５６位における変異は、具体的には、５５６位のアスパラギン酸のアラニンへの置換である。
該５５７位における変異は、具体的には、５５７位のヒスチジンのアラニンへの置換である。
該５８０位における変異は、具体的には、５８０位のアスパラギンのアラニンへの置換である。
態様８として好ましくは、１０位のアスパラギン酸がアラニンに置換したタンパク質；５８０位のアスパラギンがアラニンに置換したタンパク質；及び１０位のアスパラギン酸がアラニンに置換し且つ５８０位のアスパラギンがアラニンに置換したタンパク質が挙げられる。前２つのタンパク質はニッカーゼ活性を有し、３番目のタンパク質はガイドＲＮＡと結合し標的ＤＮＡへと運ばれるがエンドヌクレアーゼ活性が失活している。
【００３２】
本発明のＰＡＭ配列の認識が広範化されたＣａｓ９タンパク質として、好ましい例は、配列番号２において７８２位のグルタミン酸がリジンに（Ｅ７８２Ｋ）、８００位のロイシンがアルギニンに（Ｌ８００Ｒ）、９６８位のアスパラギンがアルギニンに（Ｎ９６８Ｒ）、９８５位のアスパラギンがアラニンに（Ｎ９８５Ａ）、９８６位のアスパラギンがアラニンに（Ｎ９８６Ａ）、９９１位のアルギニンがアラニンに（Ｒ９９１Ａ）、９８８位のロイシンがヒスチジンに（Ｌ９８８Ｈ）、１０２１位のアラニンがセリンに（Ａ１０２１Ｓ）、９２７位のスレオニンがリジンに（Ｔ９２７Ｋ）、９２９位のリジンがアスパラギンに（Ｋ９２９Ｎ）変異したアミノ酸配列を含むタンパク質が挙げられる。
本明細書中、置換箇所までのアミノ酸残基数を表わす数字の左側に表示したアルファベットは配列番号２のアミノ酸配列の、置換前のアミノ酸の1文字表記を示し、右側に表示したアルファベットは置換後のアミノ酸の1文字表記を示している。
【００３３】
本発明のＰＡＭ配列の認識が広範化されたＣａｓ９タンパク質として、好ましい別の例は、配列番号２において７８２位のグルタミン酸がリジンに（Ｅ７８２Ｋ）、８００位のロイシンがアルギニンに（Ｌ８００Ｒ）、９６８位のアスパラギンがアルギニンに（Ｎ９６８Ｒ）、９８５位のアスパラギンがアラニンに（Ｎ９８５Ａ）、９８６位のアスパラギンがアラニンに（Ｎ９８６Ａ）、９９１位のアルギニンがアラニンに（Ｒ９９１Ａ）、９８８位のロイシンがヒスチジンに（Ｌ９８８Ｈ）、１０２１位のアラニンがセリンに（Ａ１０２１Ｓ）、８８９位のアラニンがアスパラギンに（Ａ８８９Ｎ）、９２７位のスレオニンがリジンに（Ｔ９２７Ｋ）、９２９位のリジンがアスパラギンに（Ｋ９２９Ｎ）変異したアミノ酸配列を含むタンパク質が挙げられる。
【００３４】
本発明のＰＡＭ配列の認識が広範化されたＣａｓ９タンパク質として、好ましい別の例は、配列番号２において７８２位のグルタミン酸がリジンに（Ｅ７８２Ｋ）、８００位のロイシンがアルギニンに（Ｌ８００Ｒ）、９６８位のアスパラギンがアルギニンに（Ｎ９６８Ｒ）、９８５位のアスパラギンがアラニンに（Ｎ９８５Ａ）、９８６位のアスパラギンがアラニンに（Ｎ９８６Ａ）、９９１位のアルギニンがアラニンに（Ｒ９９１Ａ）、９８８位のロイシンがヒスチジンに（Ｌ９８８Ｈ）、１０２１位のアラニンがセリンに（Ａ１０２１Ｓ）変異したアミノ酸配列を含むタンパク質が挙げられる。
【００３５】
本発明のＰＡＭ配列の認識が広範化されたＣａｓ９タンパク質として、好ましい別の例は、配列番号２において７８２位のグルタミン酸がリジンに（Ｅ７８２Ｋ）、８００位のロイシンがアルギニンに（Ｌ８００Ｒ）、９６８位のアスパラギンがアルギニンに（Ｎ９６８Ｒ）、９８５位のアスパラギンがアラニンに（Ｎ９８５Ａ）、９９１位のアルギニンがアラニンに（Ｒ９９１Ａ）、１０２１位のアラニンがセリンに（Ａ１０２１Ｓ）、９２７位のスレオニンがリジンに（Ｔ９２７Ｋ）、９２９位のリジンがアスパラギンに（Ｋ９２９Ｎ）、１０１７位のイソロイシンがフェニルアラニンに（Ｉ１０１７Ｆ）変異したアミノ酸配列を含むタンパク質が挙げられる。
【００３６】
本発明のＰＡＭ配列の認識が広範化されたＣａｓ９タンパク質として、好ましい例は、配列番号２において７８２位のグルタミン酸がリジンに（Ｅ７８２Ｋ）、８００位のロイシンがアルギニンに（Ｌ８００Ｒ）、９６８位のアスパラギンがアルギニンに（Ｎ９６８Ｒ）、９８５位のアスパラギンがアラニンに（Ｎ９８５Ａ）、９８６位のアスパラギンがアラニンに（Ｎ９８６Ａ）、９９１位のアルギニンがアラニンに（Ｒ９９１Ａ）、９８８位のロイシンがヒスチジンに（Ｌ９８８Ｈ）、１０２１位のアラニンがセリンに（Ａ１０２１Ｓ）、９２７位のスレオニンがリジンに（Ｔ９２７Ｋ）、９２９位のリジンがアスパラギンに（Ｋ９２９Ｎ）、１０位のアスパラギン酸がアラニンに（Ｄ１０Ａ）、５８０位のアスパラギンがアラニンに（Ｎ５８０Ａ）変異したアミノ酸配列を含むタンパク質が挙げられる。
【００３７】
本発明のＰＡＭ配列の認識が広範化されたＣａｓ９タンパク質として、好ましい別の例は、配列番号２において７８２位のグルタミン酸がリジンに（Ｅ７８２Ｋ）、８００位のロイシンがアルギニンに（Ｌ８００Ｒ）、９６８位のアスパラギンがアルギニンに（Ｎ９６８Ｒ）、９８５位のアスパラギンがアラニンに（Ｎ９８５Ａ）、９９１位のアルギニンがアラニンに（Ｒ９９１Ａ）、１０２１位のアラニンがセリンに（Ａ１０２１Ｓ）、９２７位のスレオニンがリジンに（Ｔ９２７Ｋ）、９２９位のリジンがアスパラギンに（Ｋ９２９Ｎ）、１０１７位のイソロイシンがフェニルアラニンに（Ｉ１０１７Ｆ）、１０位のアスパラギン酸がアラニンに（Ｄ１０Ａ）、５８０位のアスパラギンがアラニンに（Ｎ５８０Ａ）変異したアミノ酸配列を含むタンパク質が挙げられる。
【００３８】
本実施形態におけるＰＡＭ認識が広範化されたＣａｓ９タンパク質は、例えば次のような方法により作成することができる。まず、前記本発明のＰＡＭ認識が広範化されたＣａｓ９タンパク質をコードする核酸を含むベクターを用いて、宿主を形質転換する。続いて、当該宿主を培養して前記タンパク質を発現させる。培地の組成、培養の温度、時間、誘導物質の添加等の条件は、形質転換体が生育し、前記タンパク質が効率よく産生されるよう、公知の方法に従って当業者が決定できる。また、例えば、選択マーカーとして抗生物質抵抗性遺伝子を発現ベクターに組み込んだ場合、培地に抗生物質を加えることにより、形質転換体を選択することができる。続いて、宿主が発現した前記タンパク質を適宜自体公知の方法により精製することにより、ＰＡＭ認識が広範化されたＣａｓ９タンパク質が得られる。
宿主としては、特に限定されず、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、又は、大腸菌、枯草菌、酵母等の微生物が挙げられる。 
【００３９】
＜ＰＡＭ配列の認識が広範化されたＣａｓ９タンパク質−ガイドＲＮＡ複合体＞
一実施形態において、本発明は、上述の＜ＰＡＭ配列の認識が広範化されたＣａｓ９タンパク質＞において示されたタンパク質と、標的二本鎖ポリヌクレオチド中のＰＡＭ（Ｐｒｏｔｏ−ｓｐａｃｅｒ  Ａｄｊａｃｅｎｔ  Ｍｏｔｉｆ）配列の１塩基上流から２０塩基以上２４塩基以下上流までの塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むガイドＲＮＡと、を備えるタンパク質−ＲＮＡ複合体を提供する。 
【００４０】
本実施形態のタンパク質−ＲＮＡ複合体によれば、ＰＡＭ配列が広範化され、簡便且つ迅速で標的配列に対し部位特異的な標的二本鎖ポリヌクレオチドの編集をすることができる。 
【００４１】
前記タンパク質及び前記ガイドＲＮＡは、iｎ  ｖｉｔｒｏ及びiｎ  ｖｉｖｏにおいて、温和な条件で混合することで、タンパク質−ＲＮＡ複合体を形成することができる。温和な条件とは、タンパク質が分解又は変性しない程度の温度及びｐＨを示しており、温度は４℃以上４０℃以下が好ましく、ｐＨは４以上１０以下が好ましい。
【００４２】
また、前記タンパク質及び前記ガイドＲＮＡを混合し、インキュベートする時間は、０．５時間以上１時間以下が好ましい。前記タンパク質及び前記ガイドＲＮＡによる複合体は、安定しており、室温で数時間静置しても安定性を保つことができる。 
【００４３】
＜ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓベクターシステム＞
一実施形態において、本発明は、上述の＜ＰＡＭ配列の認識が広範化されたＣａｓ９タンパク質＞において示されたタンパク質をコードする遺伝子を含む第１のベクターと、標的二本鎖ポリヌクレオチド中のＰＡＭ配列の１塩基上流から２０塩基以上２４塩基以下上流までの塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むガイドＲＮＡを含む第２のベクターと、を備えるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓベクターシステムを提供する。 
【００４４】
本実施形態のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓベクターシステムによれば、簡便且つ迅速で標的配列に対し部位特異的な標的二本鎖ポリヌクレオチドの編集をすることができる。 
ガイドＲＮＡは、標的二本鎖ポリヌクレオチド中のＰＡＭ配列の１塩基上流から、好ましくは２０塩基以上２４塩基以下、より好ましくは２２塩基以上２４塩基以下までの塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを５’末端領域に含むものを適宜設計すればよい。さらに、標的二本鎖ポリヌクレオチドと非相補的な塩基配列からなり、一点を軸として対称に相補的な配列になるように並び、ヘアピン構造をとり得る塩基配列からなるポリヌクレオチドを１つ以上含んでいてもよい。
【００４５】
本実施形態のベクターは、発現ベクターであることが好ましい。発現ベクターとしては特に制限されず、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３等の大腸菌由来のプラスミド；ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４等の枯草菌由来のプラスミド；ｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５等の酵母由来プラスミド；λファージ等のバクテリオファージ；アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス等のウイルス；及びこれらを改変したベクター等を用いることができる。 
【００４６】
上述の発現ベクターにおいて、前記Ｃａｓ９タンパク質、及び前記ガイドＲＮＡ発現用プロモーターとしては特に限定されず、例えば、ＥＦ１αプロモーター、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ（サイトメガロウィルス）プロモーター、ＨＳＶ−ｔｋプロモーター等の動物細胞における発現用のプロモーター、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター、ＲＥＦ（ｒｕｂｂｅｒ  ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ）プロモーター等の植物細胞における発現用のプロモーター、ポリヘドリンプロモーター、ｐ１０プロモーター等の昆虫細胞における発現用のプロモーター等を使用することができる。これらプロモーターは、前記Ｃａｓ９タンパク質、及び前記ガイドＲＮＡ、又は前記Ｃａｓ９タンパク質、及び前記ガイドＲＮＡを発現する細胞の種類に応じて、適宜選択することができる。
【００４７】
上述の発現ベクターは、さらに、マルチクローニングサイト、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、複製起点等を有していてもよい。
【００４８】
＜標的二本鎖ポリヌクレオチドを部位特異的に改変するための方法＞
［第１実施形態］
一実施形態において、本発明は、標的二本鎖ポリヌクレオチドを部位特異的に改変するための方法であって、
標的二本鎖ポリヌクレオチドと、タンパク質と、ガイドＲＮＡとを混合し、インキュベートする工程と、前記タンパク質が、ＰＡＭ配列の上流に位置する結合部位で前記標的二本鎖ポリヌクレオチドを改変する工程と、を備え、
前記標的二本鎖ポリヌクレオチドは、ＮＮＧＮＮＮ（Ｎは任意の塩基を、Ｇはグアニンをそれぞれ意味する）からなるＰＡＭ配列を有し、
前記タンパク質は、上述の＜ＰＡＭ配列の認識が広範化されたＣａｓ９タンパク質＞において示されたタンパク質であり、
前記ガイドＲＮＡは、前記標的二本鎖ポリヌクレオチド中の前記ＰＡＭ配列の１塩基上流から２０塩基以上２４塩基以下上流までの塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むものである方法を提供する。
【００４９】
本実施形態の方法によれば、ＰＡＭ配列が広範化された変異型Ｃａｓ９タンパク質を用いることで、簡便であって迅速、且つ標的配列に対し部位特異的に標的二本鎖ポリヌクレオチドを改変することができる。 
【００５０】
本実施形態において、標的二本鎖ポリヌクレオチドは、ＮＮＧＮＮＮ（Ｎは任意の塩基を、Ｇはグアニンをそれぞれ意味する）からなるＰＡＭ配列を有するものであればよく、特別な限定はない。
【００５１】
本実施形態において、タンパク質及びガイドＲＮＡについては、上述の＜ＰＡＭ配列の認識が広範化されたＣａｓ９タンパク質＞において示されたとおりである。
【００５２】
標的二本鎖ポリヌクレオチドを部位特異的に改変するための方法について、以下に詳細を説明する。
まず、前記タンパク質及び前記ガイドＲＮＡを温和な条件で混合し、インキュベートする。温和な条件とは、上述のとおりである。インキュベートする時間は、０．５時間以上１時間以下が好ましい。前記タンパク質及び前記ガイドＲＮＡによる複合体は、安定しており、室温で数時間静置しても安定性を保つことができる。
次に、前記標的二本鎖ポリヌクレオチド上において、前記タンパク質及び前記ガイドＲＮＡは複合体を形成する。前記タンパク質は、ＰＡＭ配列を認識し、ＰＡＭ配列の上流に位置する結合部位で、前記標的二本鎖ポリヌクレオチドに結合する。前記タンパク質がエンドヌクレアーゼ活性を有する場合が当該部位で該ポリヌクレオチドを切断する。前記Ｃａｓ９タンパク質がＰＡＭ配列を認識し、ＰＡＭ配列を起点として、前記標的二本鎖ポリヌクレオチドの二重らせん構造が引き剥され、前記ガイドＲＮＡ中の前記標的二本鎖ポリヌクレオチドに相補的な塩基配列とアニーリングすることで、前記標的二本鎖ポリヌクレオチドの二重らせん構造が部分的にほぐれる。このとき、前記Ｃａｓ９タンパク質は、ＰＡＭ配列の上流に位置する切断部位、及びＰＡＭ配列と相補的な配列の上流に位置する切断部位で、前記標的二本鎖ポリヌクレオチドのリン酸ジエステル結合を切断する。 
【００５３】
［第２実施形態］
本実施形態において、インキュベート工程の前に、さらに、上述のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓベクターシステムを用いて、上述の＜ＰＡＭ配列の認識が広範化されたＣａｓ９タンパク質＞において示されたタンパク質と、ガイドＲＮＡとを発現させる発現工程を備えていてもよい。 
【００５４】
本実施形態の発現工程において、まず、上述のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓベクターシステムを用いて、Ｃａｓ９タンパク質及びガイドＲＮＡを発現させる。発現させる具体的な方法としては、Ｃａｓ９タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクター、及びガイドＲＮＡを含む発現ベクターそれぞれを用いて、宿主を形質転換する。続いて、当該宿主を培養してＣａｓ９タンパク質、及びガイドＲＮＡを発現させる。培地の組成、培養の温度、時間、誘導物質の添加等の条件は、形質転換体が生育し、融合タンパク質が効率よく産生されるよう、公知の方法に従って当業者が決定できる。また、例えば、選択マーカーとして抗生物質抵抗性遺伝子を発現ベクターに組み込んだ場合、培地に抗生物質を加えることにより、形質転換体を選択することができる。続いて、宿主が発現したＣａｓ９タンパク質、及びガイドＲＮＡを適宜の方法により精製することにより、Ｃａｓ９タンパク質、及びガイドＲＮＡが得られる。 
【００５５】
＜標的二本鎖ヌクレオチドを部位特異的に修飾するための方法＞
［第１実施形態］
一実施形態において、本発明は、標的二本鎖ポリヌクレオチドを部位特異的に改変するための方法であって、
標的二本鎖ポリヌクレオチドと、タンパク質と、ガイドＲＮＡとを混合し、インキュベートする工程と、前記タンパク質が、ＰＡＭ配列の上流に位置する結合部位で前記標的二本鎖ポリヌクレオチドに結合する工程と、前記ガイドＲＮＡと前記標的二本鎖ポリヌクレオチドの相補的結合によって決定される領域において、修飾された前記標的二本鎖ポリヌクレオチドを得る工程と、を備え、
前記タンパク質は、上述の＜ＰＡＭ配列の認識が広範化されたＣａｓ９タンパク質＞において示されたタンパク質であり、
前記ガイドＲＮＡは、前記標的二本鎖ポリヌクレオチド中の前記ＰＡＭ配列の１塩基上流から２０塩基以上２４塩基以下上流までの塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むものである方法を提供する。 
【００５６】
本実施形態の方法によれば、ガイドＲＮＡとの結合能及び切断活性が向上したＲＮＡ誘導性ＤＮＡエンドヌクレアーゼを用いることで、簡便であって迅速、且つ標的配列に対し部位特異的に標的二本鎖ポリヌクレオチドを修飾することができる。 
【００５７】
本実施形態において、標的二本鎖ポリヌクレオチド、タンパク質及びガイドＲＮＡについては、上述の＜ＰＡＭ配列の認識が広範化されたＣａｓ９タンパク質＞、及び＜標的二本鎖ポリヌクレオチドを部位特異的に改変するための方法＞において示されたとおりである。 
【００５８】
標的二本鎖ポリヌクレオチドを部位特異的に改変するための方法について、以下に詳細を説明する。標的二本鎖ポリヌクレオチドに部位特異的に結合するまでの工程は上述の＜標的二本鎖ポリヌクレオチドを部位特異的に切断するための方法＞に示された工程と同様である。続いて、前記ガイドＲＮＡと前記二本鎖ポリヌクレオチドの相補的結合によって決定される領域において、目的に応じた修飾が施された標的二本鎖ポリヌクレオチドを得ることができる。 
【００５９】
本明細書中において、「改変」とは、標的二本鎖ポリヌクレオチドの塩基配列が変化することを意味する。例えば、標的二本鎖ポリヌクレオチドの切断、切断後の外因性配列の挿入（物理的挿入又は相同指向修復を介する複製による挿入）による標的二本鎖ポリヌクレオチドの塩基配列の変化、切断後の非相同末端連結（ＮＨＥＪ：切断により生じたＤＮＡ末端どうしが再び結合すること）に加え、機能的なタンパク質や塩基配列の付加による標的二本鎖ポリヌクレオチドの塩基配列の変化等が挙げられる。
【００６０】
本実施形態における標的二本鎖ポリヌクレオチドの修飾により、標的二本鎖ポリヌクレオチドへの変異の導入、又は、標的二本鎖ポリヌクレオチドの機能を破壊、改変することができる。 
【００６１】
［第２実施形態］
本実施形態において、インキュベート工程の前に、さらに、上述のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓベクターシステムを用いて、上述の＜ＰＡＭ配列の認識が広範化されたＣａｓ９タンパク質＞において示されたタンパク質と、ガイドＲＮＡとを発現させる発現工程を備えていてもよい。 
本実施形態の発現工程において、まず、上述のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓベクターシステムを用いて、Ｃａｓ９タンパク質及びガイドＲＮＡを発現させる。発現させる具体的な方法としては、上述の＜標的二本鎖ポリヌクレオチドを部位特異的に改変するための方法＞の［第２実施形態］において例示された方法と同様である。 
【００６２】
＜標的二本鎖ポリヌクレオチドを細胞内において部位特異的に改変するための方法＞
一実施形態において、本発明は、標的二本鎖ポリヌクレオチドを細胞内において部位特異的に改変するための方法であって、
上述のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓベクターシステムを細胞に導入し、上述の＜ＰＡＭ配列の認識が広範化されたＣａｓ９タンパク質＞において示されたタンパク質と、ガイドＲＮＡとを発現させる発現工程と、
前記タンパク質が、ＰＡＭ配列の上流に位置する結合部位で前記標的二本鎖ポリヌクレオチドに結合する工程と、
前記ガイドＲＮＡと前記標的二本鎖ポリヌクレオチドの相補的結合によって決定される領域において、改変された前記標的二本鎖ポリヌクレオチドを得る工程と、を備え、
前記ガイドＲＮＡは、前記標的二本鎖ポリヌクレオチド中の前記ＰＡＭ配列の１塩基上流から２０塩基以上２４塩基以下上流までの塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むものである方法を提供する。 
【００６３】
本実施形態の発現工程において、まず、上述のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓベクターシステムを用いて、細胞内において、Ｃａｓ９タンパク質及びガイドＲＮＡを発現させる。 
【００６４】
本実施形態の方法の適用対象となる細胞の由来となる生物としては、例えば、原核生物、酵母、動物、植物、昆虫等が挙げられる。前記動物としては、特別な限定はなく、例えば、ヒト、サル、イヌ、ネコ、ウサギ、ブタ、ウシ、マウス、ラット等が挙げられ、これらに限定されない。また、細胞の由来となる生物の種類は、所望の標的二本鎖ポリヌクレオチドの種類、目的等により任意に選択することができる。 
【００６５】
本実施形態の方法の適用対象となる動物由来の細胞としては、例えば、生殖細胞（精子、卵子等）、生体を構成する体細胞、幹細胞、前駆細胞、生体から分離されたがん細胞、生体から分離され不死化能を獲得して体外で安定して維持される細胞（細胞株）、生体から分離され人為的に遺伝子改変された細胞、生体から分離され人為的に核が交換された細胞等が挙げられ、これらに限定されない。
【００６６】
生体を構成する体細胞としては、例えば、皮膚、腎臓、脾臓、副腎、肝臓、肺、卵巣、膵臓、子宮、胃、結腸、小腸、大腸、膀胱、前立腺、精巣、胸腺、筋肉、結合組織、骨、軟骨、血管組織、血液、心臓、眼、脳、神経組織等の任意の組織から採取される細胞等が挙げられ、これらに限定されない。体細胞として、より具体的には、例えば、線維芽細胞、骨髄細胞、免疫細胞（例えば、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、好中球、マクロファージ、単球、等）、赤血球、血小板、骨細胞、骨髄細胞、周皮細胞、樹状細胞、ケラチノサイト、脂肪細胞、間葉細胞、上皮細胞、表皮細胞、内皮細胞、血管内皮細胞、リンパ管内皮細胞、肝細胞、膵島細胞（例えば、α細胞、β細胞、δ細胞、ε細胞、ＰＰ細胞等）、軟骨細胞、卵丘細胞、グリア細胞、神経細胞（ニューロン）、オリゴデンドロサイト、マイクログリア、星状膠細胞、心筋細胞、食道細胞、筋肉細胞（例えば、平滑筋細胞、骨格筋細胞等）、メラニン細胞、単核細胞等が挙げられ、これらに限定されない。 
【００６７】
幹細胞とは、自分自身を複製する能力と他の複数系統の細胞に分化する能力を兼ね備えた細胞である。幹細胞としては、例えば、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胚性腫瘍細胞、胚性生殖幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞、筋幹細胞、生殖幹細胞、腸幹細胞、がん幹細胞、毛包幹細胞等が挙げられ、これらに限定されない。 
【００６８】
がん細胞とは、体細胞から派生して無限の増殖能を獲得した細胞である。がん細胞の由来となるがんとしては、例えば、乳がん（例えば、浸潤性乳管がん、非浸潤性乳管がん、炎症性乳がん等）、前立腺がん（例えば、ホルモン依存性前立腺がん、ホルモン非依存性前立腺がん等）、膵がん（例えば、膵管がん等）、胃がん（例えば、乳頭腺がん、粘液性腺がん、腺扁平上皮がん等）、肺がん（例えば、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、悪性中皮腫等）、結腸がん（例えば、消化管間質腫瘍等）、直腸がん（例えば、消化管間質腫瘍等）、大腸がん（例えば、家族性大腸がん、遺伝性非ポリポーシス大腸がん、消化管間質腫瘍等）、小腸がん（例えば、非ホジキンリンパ腫、消化管間質腫瘍等）、食道がん、十二指腸がん、舌がん、咽頭がん（例えば、上咽頭がん、中咽頭がん、下咽頭がん等）、頭頚部がん、唾液腺がん、脳腫瘍（例えば、松果体星細胞腫瘍、毛様細胞性星細胞腫、びまん性星細胞腫、退形成性星細胞腫等）、神経鞘腫、肝臓がん（例えば、原発性肝がん、肝外胆管がん等）、腎臓がん（例えば、腎細胞がん、腎盂と尿管の移行上皮がん等）、胆嚢がん、胆管がん、膵臓がん、子宮内膜がん、子宮頸がん、卵巣がん（例、上皮性卵巣がん、性腺外胚細胞腫瘍、卵巣性胚細胞腫瘍、卵巣低悪性度腫瘍等）、膀胱がん、尿道がん、皮膚がん（例えば、眼内（眼）黒色腫、メルケル細胞がん等）、血管腫、悪性リンパ腫（例えば、細網肉腫、リンパ肉腫、ホジキン病等）、メラノーマ（悪性黒色腫）、甲状腺がん（例えば、甲状腺髄様ガン等）、副甲状腺がん、鼻腔がん、副鼻腔がん、骨腫瘍（例えば、骨肉腫、ユーイング腫瘍、子宮肉腫、軟部組織肉腫等）、転移性髄芽腫、血管線維腫、隆起性皮膚線維肉腫、網膜肉腫、陰茎癌、精巣腫瘍、小児固形がん（例えば、ウィルムス腫瘍、小児腎腫瘍等）、カポジ肉腫、ＡＩＤＳに起因するカポジ肉腫、上顎洞腫瘍、線維性組織球腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、慢性骨髄増殖性疾患、白血病（例えば、急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病等）等が挙げられ、これらに限定されない。
【００６９】
細胞株とは、生体外での人為的な操作により無限の増殖能を獲得した細胞である。細胞株としては、例えば、ＨＣＴ１１６、Ｈｕｈ７、ＨＥＫ２９３（ヒト胎児腎細胞）、ＨｅＬａ（ヒト子宮頸がん細胞株）、ＨｅｐＧ２（ヒト肝がん細胞株）、ＵＴ７／ＴＰＯ（ヒト白血病細胞株）、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣細胞株）、ＭＤＣＫ、ＭＤＢＫ、ＢＨＫ、Ｃ−３３Ａ、ＨＴ−２９、ＡＥ−１、３Ｄ９、Ｎｓ０／１、Ｊｕｒｋａｔ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＰＣ１２、Ｓ２、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ、Ｖｅｒｏ等が挙げられ、これらに限定されない。
【００７０】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓベクターシステムの細胞への導入方法としては、使用する生細胞に適した方法で行うことができ、エレクトロポレーション法、ヒートショック法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、ＤＥＡＥデキストラン法、マイクロインジェクション法、パーティクル・ガン法、ウイルスを用いた方法や、ＦｕＧＥＮＥ（登録商標） ６  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ロシュ社製）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００  Ｒｅａｇｅｎｔ（インビトロジェン社製）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＬＴＸ  Ｒｅａｇｅｎｔ（インビトロジェン社製）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ３０００  Ｒｅａｇｅｎｔ（インビトロジェン社製）などの市販のトランスフェクション試薬を用いた方法などを挙げることができる。 
【００７１】
続く、修飾工程については、上述の＜標的二本鎖ヌクレオチドを部位特異的に改変するための方法＞の［第１実施形態］に示された方法と同様である。
本実施形態における標的二本鎖ポリヌクレオチドの修飾により、標的二本鎖ポリヌクレオチドへの変異の導入、又は、標的二本鎖ポリヌクレオチドの機能が破壊、改変された細胞を得ることができる。
【００７２】
本発明の変異型Ｃａｓ９タンパク質として、エンドヌクレアーゼ活性を有さない態様を用いた場合には、該タンパク質はＰＡＭ配列の上流に位置する結合部位で前記標的二本鎖ポリヌクレオチドに結合することができるが、そこにとどまって切断することができない。従って、例えば該タンパク質に蛍光タンパク質（例、ＧＦＰ）等の標識タンパク質を融合させておくと、ガイドＲＮＡ−変異型Ｃａｓ９タンパク質を介して標識タンパク質を標的二本鎖ポリヌクレオチドに結合させることができる。変異型Ｃａｓ９タンパク質に結合させる物質を適宜選択することによって多様な機能を標的二本鎖ポリヌクレオチドに与えることが可能となる。
さらに、変異型Ｃａｓ９タンパク質のＮ末端あるいはＣ末端に転写制御因子タンパク質又はドメインを連結することができる。転写制御因子又はそのドメインとしては、転写活性化因子又はそのドメイン（例、ＶＰ６４、ＮＦ−κＢ ｐ６５）及び転写サイレンサー又はそのドメイン（例、ヘテロクロマチンタンパク質１（ＨＰ１））又は転写抑制因子又はそのドメイン（例、クルッペル関連ボックス（ＫＲＡＢ）、ＥＲＦリプレッサードメイン（ＥＲＤ）、ｍＳｉｎ３Ａ相互作用ドメイン（ＳＩＤ））が挙げられる。
ＤＮＡのメチル化状態を修飾する酵素（例、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）、ＴＥＴ）やヒストンサブユニットを修飾する酵素（例、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）、ヒストンメチルトランスフェラーゼ、ヒストンデメチラーゼ）を連結することもできる。
【００７３】
＜遺伝子治療＞
一実施形態において、本発明は、ゲノム編集を実行し、遺伝子を治療するための方法及び組成物を提供する。以前に知られている標的化された遺伝子組換えの方法と対照的に、本実施形態の方法は、実行が、効率的かつ安価であり、そして任意の細胞または生物に適応可能である。細胞又は生物の二本鎖核酸の任意のセグメントは、本実施形態の遺伝子治療方法により改変することができる。本実施形態の遺伝子治療方法は、全ての細胞に内在性である相同組換えプロセス及び非相同組換えプロセスの両方を利用する。 
【００７４】
本明細書において、「ゲノム編集」とは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムやＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ−Ｌｉｋｅ  Ｅｆｆｅｃｔｏｒ  Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ（ＴＡＬＥＮ）等の技術により標的化された遺伝子組換えまたは標的化された変異を実行することにより、特異的な遺伝子破壊やレポーター遺伝子のノックイン等を行う新しい遺伝子改変技術を意味する。
【００７５】
また、一実施形態において、本発明は、標的化されたＤＮＡ挿入又は標的化されたＤＮＡ欠失を行う遺伝子治療方法を提供する。この遺伝子治療方法は、ドナーＤＮＡを含む核酸構築物を用いて、細胞を形質転換する工程を包含する。標的遺伝子切断後のＤＮＡ挿入およびＤＮＡ欠失に関するスキームについては、公知の方法に従って当業者が決定できる。 
【００７６】
また、一実施形態において、本発明は、体細胞及び生殖細胞の両方で利用され、特定の遺伝子座で遺伝子操作を行う遺伝子治療方法を提供する。 
【００７７】
また、一実施形態において、本発明は、体細胞において遺伝子を壊すための遺伝子治療方法を提供する。ここで、遺伝子は、細胞又は生物に対して有害な産物を過剰発現し、細胞又は生物に対して有害な産物を発現する。このような遺伝子は、疾患において生じる１つ以上の細胞型において過剰発現され得る。本実施形態の遺伝子治療方法による、前記過剰発現した遺伝子の破壊は、前記過剰発現した遺伝子に起因する疾患を被る個体に、より良い健康をもたらすることができる。すなわち、細胞のほんの小さな割合の遺伝子の破壊が働き、発現レベルを減少し、治療効果を生じさせる。 
【００７８】
また、一実施形態において、本発明は、生殖細胞において遺伝子を壊すための遺伝子治療方法を提供する。特定の遺伝子が破壊された細胞は、特定の遺伝子の機能を有さない生物を作製するために活用することができる。前記遺伝子が破壊された細胞において、遺伝子は完全にノックアウトさせることができる。この特定の細胞における機能の欠損は、治療効果を有し得る。 
【００７９】
また、一実施形態において、本発明は、遺伝子産物をコードするドナーＤＮＡを挿入する遺伝子治療方法を提供する。この遺伝子産物は、構成的に発現された場合、治療効果を有する。例えば、膵細胞の個体群において、活性プロモーター及びインシュリン遺伝子をコードするドナーＤＮＡの挿入を引き起こすために、前記ドナーＤＮＡを、糖尿病を被る個体に挿入する方法が挙げられる。次いで、前記ドナーＤＮＡを含む膵細胞の前記個体群は、インシュリンを生成し、糖尿病患者を治療することができる。さらに、前記ドナーＤＮＡは作物に挿入され、薬剤的関連遺伝子産物を生成させることができる。タンパク質産物の遺伝子（例えば、インシュリン、リパーゼまたはヘモグロビン）は、制御エレメント（構成的活性プロモーター、または誘導性プロモーター）と一緒に植物に挿入され、植物中で大量の医薬品を生成することができる。次いで、このようなタンパク質産物は、植物から単離することができる。
【００８０】
トランスジェニック植物又はトランスジェニック動物は、核酸移入技術（ＭｃＣｒｅａｔｈ，Ｋ．Ｊ．ら（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  ４０５：１０６６−１０６９；Ｐｏｌｅｊａｅｖａ，Ｉ．Ａ．ら，（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  ４０７：８６−９０）を用いる方法で作製することができる。組織型特異的ベクター又は細胞型特異的ベクターは、選択した細胞内でのみ遺伝子発現を提供するために利用することができる。 
【００８１】
また、上記の方法を生殖細胞に用いた場合、標的遺伝子にドナーＤＮＡを挿入させて、後の全ての細胞分裂により、設計された遺伝的変更を有する細胞を生成することができる。 
【００８２】
本実施形態の遺伝子治療方法の適用対象としては、例えば、任意の生物、培養細胞、培養組織、培養核（培養細胞、培養組織、又は培養核インタクトには、生物を再生するために使用可能な細胞、組織又は核を含む）、配偶子（例えば、発達の様々な段階の卵又は精子）等が挙げられ、これらに限定されない。
【００８３】
本実施形態の遺伝子治療方法の適用対象となる細胞の由来としては、任意の生物（昆虫、真菌、げっ歯類、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、及び他の農業上重要な動物、並びに他の哺乳動物（例えば、イヌ、ネコ及びヒトが挙げられるが、これらに限定されない）が挙げられるが、これらに限定されない）等が挙げられ、これらに限定されない。 
【００８４】
さらに、本実施形態の遺伝子治療方法は、植物において使用することができる。本実施形態の遺伝子治療方法の適用対象となる植物としては、特別な限定はなく、任意の様々な植物種（例えば、単子葉植物又は双子葉植物等）において適用することができる。 
【００８５】
以下に実施例を示して、本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００８６】
実施例１：変異型ＳａＣａｓ９のＤＮＡ切断活性評価
１．野生型及び変異型ＳａＣａｓ９の調製
（１）コンストラクトの設計
遺伝子合成によりコドンが最適化された野生型あるいは変異型ＳａＣａｓ９遺伝子を、ｐＥＳＵＭＯ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ）に組み込んだ。さらに、ＨｉｓタグとＳａＣａｓ９遺伝子の間にＴＥＶ認識配列を付加した。完成したコンストラクトから発現するＣａｓ９のＮ末端には６残基のヒスチジンが連続し（Ｈｉｓタグ）、ＴＥＶプロテアーゼ認識サイトが付加される設計になっている。
使用したＳａＣａｓ９遺伝子の塩基配列は以下の通り。
・野生型ＳａＣａｓ９の塩基配列：配列番号１
・変異型ＳａＣａｓ９（V11_E782K_L800R_A889R_N968R_N985A_N986A_L988H_R991A_A1021S）の塩基配列：配列番号１の塩基配列において、2344-2346位のgagがaaaに、2398-2400位のctgがcgtに、2665-2667位のgccがcgtに、2902-2904位のaacがcgtに、2953-2955位のaacがgcgに、2956-2958位のaatがgcgに、2962-2964位のctgがcacに、2971-2973位のcgcがgcgに、3061-3063位のgccがtctに変換した塩基配列。
・変異型ＳａＣａｓ９（V11a(+N785W)_E782K_N785W_L800R_A889R_N968R_N985A_N986A_L988H_R991A_A1021S）の塩基配列：V11の塩基配列に対し、さらに2353-2355位のaatがtggに変換した塩基配列。
・変異型ＳａＣａｓ９（V11b(+N785Y)_E782K_N785Y_L800R_A889R_N968R_N985A_N986A_L988H_R991A_A1021S）の塩基配列：V11の塩基配列に対し、さらに2353-2353位のaatがtatに変換した塩基配列。
・変異型ＳａＣａｓ９（V11c(+N785S)_E782K_N785S_L800R_A889R_N968R_N985A_N986A_L988H_R991A_A1021S）の塩基配列：V11の塩基配列に対し、さらに2353-2353位のaatがagcに変換した塩基配列。
・変異型ＳａＣａｓ９（V11d(+N888H)_E782K_L800R_N888H_A889R_N968R_N985A_N986A_L988H_R991A_A1021S）の塩基配列：V11の塩基配列に対し、さらに2362-2364位のaatがcatに変換した塩基配列。
・変異型ＳａＣａｓ９（V11e(+N888R)_E782K_L800R_N888R_A889R_N968R_N985A_N986A_L988H_R991A_A1021S）の塩基配列：V11の塩基配列に対し、さらに2362-2364位のaatがcgtに変換した塩基配列。
・変異型ＳａＣａｓ９（V11f(N985S)_E782K_L800R_A889R_N968R_N985S_N986A_L988H_R991A_A1021S）の塩基配列：V11の塩基配列において2953-2955位のgcgがtctに変換した塩基配列。
・変異型ＳａＣａｓ９（V11g(N985V)_E782K_L800R_A889R_N968R_N985V_N986A_L988H_R991A_A1021S）の塩基配列：V11の塩基配列において2953-2955位のgcgがgtgに変換した塩基配列。
・変異型ＳａＣａｓ９（V11h(N985L)_E782K_L800R_A889R_N968R_N985L_N986A_L988H_R991A_A1021S）の塩基配列：V11の塩基配列において2953-2955位のgcgがctgに変換した塩基配列。
・変異型ＳａＣａｓ９（V11i(N985M)_E782K_L800R_A889R_N968R_N985M_N986A_L988H_R991A_A1021S）の塩基配列：V11の塩基配列において2953-2955位のgcgがatgに変換した塩基配列。
・変異型ＳａＣａｓ９（V11j(N985I)_E782K_L800R_A889R_N968R_N985I_N986A_L988H_R991A_A1021S）の塩基配列：V11の塩基配列において2953-2955位のgcgがattに変換した塩基配列。
・変異型ＳａＣａｓ９（V11k(+N995R)_E782K_L800R_A889R_N968R_N985A_N986A_L988H_R991A_N995R_A1021S）の塩基配列：V11の塩基配列に対し、さらに2983-2985位のaatがcgtに変換した塩基配列。
・変異型ＳａＣａｓ９（V11l(+N995K)_E782K_L800R_A889R_N968R_N985A_N986A_L988H_R991A_N995K_A1021S）の塩基配列：V11の塩基配列に対し、さらに2983-2985位のaatがaaaに変換した塩基配列。
・変異型ＳａＣａｓ９（V11m(+K910R)_E782K_L800R_A889R_K910R_N968R_N985A_N986A_L988H_R991A_A1021S）の塩基配列：V11の塩基配列に対し、さらに2728-2730のaagがcgtに変換した塩基配列。
・変異型ＳａＣａｓ９（V11n(A889A)_E782K_L800R_N968R_N985A_N986A_L988H_R991A_A1021S）の塩基配列：V11の塩基配列において2665-2667位のcgtがgcgに変換した（野生型に戻った）塩基配列。
・変異型ＳａＣａｓ９（V11o(A889A_+T927K)_E782K_L800R_T927K_N968R_N985A_N986A_L988H_R991A_A1021S）の塩基配列：V11の塩基配列において2665-2667位のcgtがgcgに変換し（野生型に戻り）、さらに2779-2781位のactがaaaに変換した塩基配列。
・変異型ＳａＣａｓ９（V11p(A889A_+T927K_+K929A)_E782K_L800R_T927K_K929A__N968R_N985A_N986A_L988H_R991A_A1021S）の塩基配列：V11の塩基配列において2665-2667位のcgtがgcgに変換し（野生型に戻り）、さらに2779-2781位のactがaaaに、2785-2787位のaagがgcgに変換した塩基配列。
・変異型ＳａＣａｓ９（V11q(A889A_+K929R)_E782K_L800R_K929R_N968R_N985A_N986A_L988H_R991A_A1021S）の塩基配列：V11の塩基配列において2665-2667位のcgtがgcgに変換し（野生型に戻り）、2785-2787位のaagがcgtに変換した塩基配列。
・変異型ＳａＣａｓ９（V11r(+T927K)_E782K_L800R_A889R_T927K_N968R_N985A_N986A_L988H_R991A_A1021S）の塩基配列：V11の塩基配列に対し、さらに2779-2781位のactがaaaに変換した塩基配列。
・変異型ＳａＣａｓ９（V11s(+K929R)_E782K_L800R_A889R_K929R_N968R_N985A_N986A_L988H_R991A_A1021S）の塩基配列：V11の塩基配列に対し、さらに2785-2787位のaagがcgtに変換した塩基配列。
・変異型ＳａＣａｓ９（V11t(K929A)_E782K_L800R_A889R_T927A_N968R_N985A_N986A_L988H_R991A_A1021S）の塩基配列：V11の塩基配列に対し、さらに2785-2787位のaagがgcgに変換した塩基配列。
・変異型ＳａＣａｓ９（V12_E782K_L800R_N888K_A889R_N968R_N985A_N986A_L988H_R991A_A1021S）の塩基配列：配列番号１の塩基配列において、2344-2346位のgagがaaaに、2398-2400位のctgがcgtに、2662-2664位のaatがaaaに、2665-2667位のgccがcgtに、2902-2904位のaacがcgtに、2953-2955位のaacがgcgに、2956-2958位のaatがgcgに、2962-2964位のctgがcacに、2971-2973位のcgcがgcgに、3061-3063位のgccがtctに変換した塩基配列。
・変異型ＳａＣａｓ９（V15_E782K_L800R_T927K_K929N_N968R_N985A_N986A_L988H_R991A_A1021S）の塩基配列：配列番号１の塩基配列において、2344-2346位のgagがaaaに、2398-2400位のctgがcgtに、2779-2781位のactがaaaに、2785-2787位のaagがaacに、2902-2904位のaacがcgtに、2953-2955位のaacがgcgに、2956-2958位のaatがgcgに、2962-2964位のctgがcacに、2971-2973位のcgcがgcgに、3061-3063位のgccがtctに変換した塩基配列。
・変異型ＳａＣａｓ９（V15a(+N785S)_E782K_N785S_L800R_T927K_K929N_N968R_N985A_N986A_L988H_R991A_A1021S）の塩基配列：V15の塩基配列に対し、さらに2353-2355位のaatがagcに変換した塩基配列。
・変異型ＳａＣａｓ９（V15b(+N888H)_E782K_L800R_N888H_T927K_K929N_N968R_N985A_N986A_L988H_R991A_A1021S）の塩基配列：V15の塩基配列に対し、さらに2662-2664位のaatがcatに変換した塩基配列。
・変異型ＳａＣａｓ９（V15c(+N888K)_E782K_L800R_N888K_T927K_K929N_N968R_N985A_N986A_L988H_R991A_A1021S）の塩基配列：V15の塩基配列に対し、さらに2662-2664位のaatがaaaに変換した塩基配列。
・変異型ＳａＣａｓ９（V15d(+A889S)_E782K_L800R_A889S_T927K_K929N_N968R_N985A_N986A_L988H_R991A_A1021S）の塩基配列：V15の塩基配列に対し、さらに2665-2667位のgcgがtctに変換した塩基配列。
・変異型ＳａＣａｓ９（V15e(K929L)_E782K_L800R_T927K_K929L_N968R_N985A_N986A_L988H_R991A_A1021S）の塩基配列：V15の塩基配列において2785-2787位のaacがctgに変換した塩基配列。
・変異型ＳａＣａｓ９（V15f(N929I)_E782K_L800R_T927K_N929I_N968R_N985A_N986A_L988H_R991A_A1021S）の塩基配列：V15の塩基配列において2785-2787位のaacがatcに変換した塩基配列。
・変異型ＳａＣａｓ９（V16_E782K_L800R_A889N_T927K_K929N_N968R_N985A_N986A_L988H_R991A_A1021S）の塩基配列：配列番号１の塩基配列において、2344-2346位のgagがaaaに、2398-2400位のctgがcgtに、2665-2667位のgccがaacに、2779-2781位のactがaaaに、2785-2787位のaagがaacに、2902-2904位のaacがcgtに、2953-2955位のaacがgcgに、2956-2958位のaatがgcgに、2962-2964位のctgがcacに、2971-2973位のcgcがgcgに、3061-3063位のgccがtctに変換した塩基配列。
・変異型ＳａＣａｓ９（V17_E782K_L800R_T927K_K929D_N968R_N985A_N986A_L988H_R991A_A1021S）の塩基配列：配列番号１の塩基配列において、配列番号１の塩基配列において、2344-2346位のgagがaaaに、2398-2400位のctgがcgtに、2779-2781位のactがaaaに、2785-2787位のaagがgatに、2902-2904位のaacがcgtに、2953-2955位のaacがgcgに、2956-2958位のaatがgcgに、2962-2964位のctgがcacに、2971-2973位のcgcがgcgに、3061-3063位のgccがtctに変換した塩基配列。
・変異型ＳａＣａｓ９（V43_E782K_L800R_T927K_K929N_N968R_N985A_R991A_A1021S）の塩基配列：配列番号１の塩基配列において、2344-2346位のgagがaaaに、2398-2400位のctgがcgtに、2779-2781位のactがaaaに、2785-2787位のaagがaacに、2902-2904位のaacがcgtに、2953-2955位のaacがgcgに、2971-2973位のcgcがgcgに、3061-3063位のgccがtctに変換した塩基配列。
・変異型ＳａＣａｓ９（V51_E782K_L800R_T927K_K929N_N968R_N985A_R991A_A1021S_I1017F）の塩基配列：V43の塩基配列において3049-3051位のatcがttcに変換した塩基配列。【００８７】
（２）作成したベクターを大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｒｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）株へ形質転換した。その後、２０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢ培地培養した。ＯＤ＝０．８になるまで培養した時点で、発現誘導剤としてイソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ  β−Ｄ−１−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ：ＩＰＴＧ）（終濃度０．５ ｍＭ）を添加し、２０℃で２０時間培養した。培養後、大腸菌を遠心（８，０００ｇ、１０分）により回収した。 【００８８】
（３）野生型及び変異型ＳａＣａｓ９の精製
（２）で回収した菌体を緩衝液Ａで懸濁し、超音波破砕した。遠心（２５，０００ｇ，３０分）により上清を回収し、緩衝液Ａで平衡化したＭｇ−Ｈｉｓビーズと混合し、１時間穏やかに混和した。非吸着画分を回収した後、緩衝液Ａで1回洗浄した。高塩濃度緩衝液Ｂで1回洗浄し、その後、高濃度緩衝液Ａで1回洗浄した。最終的に、高イミダゾール濃度緩衝液Ｃで目的タンパク質を溶出した。
緩衝液Ａ〜Ｃの組成を以下に示す。【００８９】
緩衝液Ａ：20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 300 mM NaCl, 20 mM imidazole
緩衝液Ｂ：20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1000 mM NaCl, 20 mM imidazole
緩衝液Ｃ：20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 300 mM NaCl, 300 mM imidazole【００９０】
２．ガイドＲＮＡの調製
目的のガイドＲＮＡ配列が挿入されたベクターの作製を行った。ガイドＲＮＡ配列の上流にＴ７プロモーター配列を付加し、線状化したｐＵＣ１１９ベクター（ＴａＫａＲａ）に組み込んだ。作製したベクターを元に、ＰＣＲを用いてｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応の鋳型ＤＮＡを作製した。この鋳型ＤＮＡを用いて、３７℃、４時間、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼによるｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応を行った。転写産物はＲＮｅａｓｙにより精製した。ガイド配列及びscaffoldの部分からなる塩基配列を配列番号３に示す。【００９１】
３．プラスミドＤＮＡ切断活性測定試験
ＤＮＡ切断活性測定試験に用いるために、標的ＤＮＡ配列およびＰＡＭ配列（５’−ＮＮＧＡＡＡ−３’）が挿入されたベクターの作製を行った。標的ＤＮＡ配列にＰＡＭ配列をそれぞれ付加し、線状化したｐＵＣ１１９ベクターに組み込んだ（配列番号４）。【００９２】
作製したベクターを用いて、大腸菌Ｍａｃｈ１株（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を形質転換し、２０μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ培地で３７℃にて培養した。
培養後、菌体を遠心（８，０００ｇ、１分）により回収し、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドＤＮＡを精製した。
精製したＰＡＭ配列が付加した標的プラスミドＤＮＡを用いて切断実験を行った。プラスミドＤＮＡは、制限酵素により１本に線状化した。この線状化ＤＮＡ中の標的ＤＮＡ配列を野生型、又は変異型のＳａＣａｓ９が切断すると、約１，０００ｂｐと約２，０００ｂｐの切断産物ができる。切断の際のバッファーとしては下記の組成のcleavage buffer Ｂを用いた。
cleavage buffer Ｂ(×１０）の組成
200 mM HEPES 7.5
1000 mM KCl
50% glycerol
10 mM DTT
5 mM EDTA
20 mM MgCl2
反応後のサンプルについて、１％濃度のアガロースゲルを用いて電気泳動を行い、切断産物のバンドを確認した。結果を図１〜３に示す。【００９３】
実施例２：変異型ＳａＣａｓ９のＰＡＭ配列嗜好性の確認
変異型ＳａＣａｓ９として、実施例１で調製した、各変異型及び野生型ＳａＣａｓ９を用い、実施例１と同様にして切断活性を調べ、種々のＰＡＭ配列に対する嗜好性を確認した。ＰＡＭ配列１〜４を表１に示す。【００９４】
【表１】
0006628387.tif 000002
【００９５】
野生型ＳａＣａｓ９では、標的プラスミドＤＮＡに対し制限された切断活性を有することに対し、変異型ＳａＣａｓ９では、標的プラスミドＤＮＡに対する切断活性の制限が改善されることが確かめられた（図４−１、図４−２）。
野生型ＳａＣａｓ９(SaCas9 WT)及び変異型ＳａＣａｓ９(SaCas9 v15)を用い、実施例１と同様にし、処理時間を変えて標的プラスミドＤＮＡに対する切断活性を調べ、種々のＰＡＭ配列に対する嗜好性を確認した。ＰＡＭ配列は表１に記載のＰＡＭ配列１〜４に加え、５’-ＮＮＧＡＡＴ-３’についても調べた（ＰＡＭ配列５）。結果を図４−３に示す。SaCas9 WTはＰＡＭ配列４ではいずの処理時間でも切断活性は殆ど見られなかったが、SaCa9 v15では一定時間以上の処理でＰＡＭ配列４に対しても切断活性が認められた。また、別の変異型ＳａＣａｓ９であるSaCas9 v51では、より短い処理時間でもＰＡＭ配列４（ここでは５’-ＴＴＧＣＣＣ-３’）に対しても切断活性が認められた（図４−４）。【００９６】
実施例３
１．真核細胞におけるターゲット遺伝子切断活性の検証
（１）コンストラクトの設計
遺伝子合成によりコドンが最適化された野生型あるいは変異型ＳａＣａｓ９遺伝子を、ＣＰ−ＬｖＣ９ＮＵ−０９  ｖｅｃｔｏｒ（Ｇｅｎｏｃｏｐｉａ）のＢｇｌＩＩ／ＸｈｏＩサイトに組み込んだ。また、ＨＰＲＴ及びＥＭＸ１遺伝子中の複数の配列をターゲットにすべく、ｐＣＲＩＳＰＲ−ＬｖＳＧ０３（Ｇｅｎｏｃｏｐｉａ）ベクターのＢｓｍＢ１サイトにガイドＲＮＡをそれぞれ組み込んで各種ガイドＲＮＡ発現プラスミドを作成した。表２に各ガイドＲＮＡ発現プラスミドの構成を示す。【００９７】
【表２−１】
0006628387.tif 000003
【００９８】
【表２−２】
0006628387.tif 000004
【００９９】
【表２−３】
0006628387.tif 000005
【０１００】
【表２−４】
0006628387.tif 000006
【０１０１】
【表２−５】
0006628387.tif 000007
【０１０２】
【表２−６】
0006628387.tif 000008
【０１０３】
（２）ＨＥＫ細胞での発現
作成した２種類のＳａＣａｓ９発現ベクターＬｖＮＵＣ９−０９ＳａＣａｓ９（wildtype (WT)、PAM-flexible variant(PF)）２５０ｎｇとガイドＲＮＡ発現プラスミド（ＬｖＳＧ０３  ｓｇＲＮＡ）を２４ウェルプレートにてＨＥＫ株へリポフェクトアミン（Lipofectamine 2000）を用いて形質転換した。１日培養後、１μｇ／ｍｌピューロマイシンを培地に添加し４日目に細胞を回収した。【０１０４】
（３）ＰＣＲ
回収した細胞からGuide-itTM Mutation Detection Kit (631448) （Clontech）のExtraction Buffer 1 及び2を用いてサンプルを調製した。次いで、Q5（登録商標） Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix (M0494) （NEB）を用いてPCRを実施した。詳細なPCR条件は以下の通り。
・HPRT PCR プライマー(Amplicon size: 468 bps)
Forward: TACACGTGTGAACCAACCCG（配列番号３１）
Reverse: GTAAGGCCCTCCTCTTTTATTT（配列番号３２）
・EMX1 region A PCR プライマー (Amplicon size: 643 bps)
Forward: AGTTTCTCATCTGTGCCCCTCC（配列番号３３）
Reverse: CTGAACGCGTTTGCTCTACCAG（配列番号３４）
・EMX1 region B PCRプライマー (Amplicon size: 732 bps)
Forward: TTTCACTTGGGTGCCCTAGG（配列番号３５）
Reverse: CCCTCTTGCCAGAACTTCC（配列番号３６）
・Cycling Conditions
Initial Denaturation：98℃、30秒
35サイクル：98℃（5秒）、63℃（20秒）、72℃（20秒）
Final Extension：72℃、2分
Hold：4-10℃【０１０５】
（４）Ｔ７エンドヌクレアーゼI処理
得られたPCR産物を熱変性し再度アニーリングした。得られた反応物をＴ７エンドヌクレアーゼI（T7 Enconuclease I (M0302)）で処理して得られたサンプルについて１％濃度のアガロースゲルを用いた電気泳動を行い、切断産物のバンドを確認した。結果を図５（図５−１〜５−６）に示す。【０１０６】
実施例４：Ｃａｓ９変異体のオフターゲット解析
（方法）
１．クローニング
ｄＳａＣａｓ９（配列番号２で表されるアミノ酸配列において１０位のアスパラギン酸がアラニンに、５８０位のアスパラギンがアラニンに置換されたタンパク質：ｄＳａＣａｓ９（Ｄ１０Ａ，Ｎ５８０Ａ）とも称する）及びそれに変異を導入して作製された変異型ｄＳａＣａｓ９を用いてオフターゲット解析を行った。ｄＳａＣａｓ９は野生型ＳａＣａｓ９にヌル変異を導入したものである。
核移行シグナル（ＮＬＳ）を両端に連結したｄＳａＣａｓ９（Ｄ１０Ａ，Ｎ５８０Ａ）タンパク質のＣ末端にＫＲＡＢ−Ｐ２Ａ−Ｐｕｒｏを連結させた変異型ｄＳａＣａｓ９の遺伝子構築物をｐＸ６０１ベクターに組み込んだ（F. Ann Ran et al., Nature 2015; 520(7546); pp.186-191）。
変異型ｄＳａＣａｓ９は、野生型ＳａＣａｓ９の代わりに、実施例１で作製した変異型ＳａＣａｓ９（ｖ１５）または変異型ＳａＣａｓ９（ｖ５１）を用いヌル変異（Ｄ１０Ａ，Ｎ５８０Ａ）を導入して作製した。 
WT-dSaCas9-KRAB（配列番号３７及び配列番号３８；図６）
PF(v15)-dSaCas9(D10A, N580A)-KRAB（配列番号３９及び配列番号４０；図７）
PF(v51)-dSaCas9(D10A, N580A)-KRAB（配列番号４１及び配列番号４２；図８）【０１０７】
２．ｓｇＲＮＡ（single-molecule guide RNA）配列の選択とクローニング
Benchlingソフトウェア(www.benchling.com)によって得られた予測されたオンターゲット及びオフターゲットスコアに基づいてＫＲＡＳ遺伝子をターゲッティングするガイド配列を選択した。該配列はUCSCゲノムブラウザ(Human GRCh38/hg38 assembly)によって公開されているchr12:25,249,500-25,253,000領域内にある。ＰＡＭ配列が変更されているためWT-dSaCas9 (#1, 2, 3)と互換性のあるガイドＲＮＡは、PF(v15)-dSaCas9 (#4, 5, 6)と互換性のあるガイドＲＮＡとは異なる。
３つのコントロールＲＮＡガイド(C1, C2, C3)は、Human CRISPR Knockout Pooled Library (Sanjana N. et al, Nat Methods. 2014 Aug;11(8):783-784.)から選択した。スタッファー配列はガイドＲＮＡをクローニング前のエフェクタープラスミドに予め存在していたヌクレオチド配列であり、別のコントロールガイドＲＮＡ配列として働く。
全てのガイドＲＮＡをtracer RNA配列に融合させてｓｇＲＮＡを作製し、以下の通り、エフェクターベクターにクローニングした：
px601-AIO-CMV-WT-dSaCas9-Puro; #1, 2, 3, C1, C2, C3, スタッファー
px601-AIO-CMV-PF(v15)dSaCas9-Puro; #4, 5, 6, C1, C2, C3, スタッファー
px601-AIO-CMV-PF(v51)dSaCas9-Puro; C1, C2, C3
ｓｇＲＮＡ発現はＵ６プロモーターに駆動され、ベクターは、ｓｇＲＮＡ発現細胞の追跡及び選択を容易にする為にＰ２Ａプロモーター下でピューロマイシン遺伝子を発現するよう構築されている。
各ｓｇＲＮＡ及びスタッファー配列の配列情報は以下の通り。
sgRNA-KRAS#1 (WT); GGGAAGGCTGGACCGAGGCAG（配列番号４３）
sgRNA-KRAS#2(WT); CAGTCCGAAATGGCGGGGGCC（配列番号４４）
sgRNA-KRAS#3(WT); AATCGAGCTCCGAGCACACCG（配列番号４５）
sgRNA-KRAS#4(PF-v15); GTGCGGGAGAGAGGTACGGAG（配列番号４６）
sgRNA-KRAS#5(PF-v15); GGAGCGAGCGCGGCGCAGGCA（配列番号４７）
sgRNA-KRAS#6 (PF-v15); CGGCCGCGGCGGCGGAGGCAG（配列番号４８）
sgRNA-C1; ACGGAGGCTAAGCGTCGCAA（配列番号４９）
sgRNA-C2; CGCTTCCGCGGCCCGTTCAA（配列番号５０）
sgRNA-C3; GTAGGCGCGCCGCTCTCTAC（配列番号５１）
Stuffer sequence; GAAACACCGGAGACCACGGCAGGTCTCA（配列番号５２）【０１０８】
３．細胞培養とトランスフェクション
ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞をトランスフェクションの２４時間前に１ウェルあたり７５，０００細胞の密度で２４ウェルプレートに播種し、１０％ＦＢＳ、２ｍＭの新鮮なＬ−グルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム及び非必須アミノ酸を添加したＤＭＥＭ培地で培養した。細胞を、それぞれｓｇＲＮＡのうちの１つを含む、５００ｎｇのpx601-CMV-WT-dSaCas9-Puro、px601-CMV-PF(v15)dSaCas9-Puro又はpx601-CMV-PF(v51)dSaCas9-Puroを１．５μｌのリポフェクトアミン２０００(Life technologies)を用い、取扱説明書に従ってトランスフェクトした。トランスフェクション後７２時間（１μｇ／ｍｌのピューロマイシン選択後４８時間）で細胞を回収しＲＬＴバッファー(Qiagen)に溶解しRNeasy kit (Qiagen)を用いて全ＲＮＡを抽出した。【０１０９】
４．ＲＮＡｓｅｑ解析の為のサンプル提出
各実験についてサンプルをデュプリケートで調製し、１サンプルあたり２．５μｇの全ＲＮＡをＧＥＮＥＷＩＺで解析した。ＲＮＡライブラリーをポリＡセレクション、続いてＧＥＮＥＷＩＺ(www.genewiz.com)で示されているようにシークエンシング（Illumina HiSeq, 2x 150b.p., single index per lane sequencing configuration）を行い調製した。全てのＲＮＡはＧＥＮＥＷＩＺのＱＣ基準を満たした。ターゲットとなる未処理のペアードエンドリードはサンプルあたり２５Ｍであった。【０１１０】
５．標準的なペアードエンドイルミナシークエンシングによって得られたraw fastqファイルをH. sapiens genome build, GRCh38.p12 (https://useast.ensembl.org/Homo_sapiens/Info/Index)にSpliced Transcripts Alignment to a Reference (STAR) (http://labshare.cshl.edu/shares/gingeraslab/www-data/dobin/STAR/STAR.posix/doc/STARmanual.pdf)を用いてアラインした。バイオロジカルレプリケートをグループ化し、サンプル間での差分解析（differential analysis）をprocessed alignment dataを用いたDESeq2 (https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/DESeq2.html)を用いて予め行った。
FKPMデータファイルを処理した；サンプルのいずれにおいてもリードを有さない遺伝子群、発現が平均で１.0リード未満の遺伝子、及び小さな転写物(microRNAsやSNORs)を有する遺伝子群は解析から除外した。
全てのレプリケートサンプルは相関係数>98%を示した。２つのレプリケートからの平均発現を各クラスの各遺伝子の代表的な発現値を算出するのに用いた。ＭｖＡプロットをMultiplotStudio softwareを用いて作製した。Ｘ軸は平均2-クラス発現を、Ｙ軸は２つのクラス間でのlog 2 fold-changeを示す。【０１１１】
（結果）
PF(v15)-dSaCas9は、WT-dSaCas9に比べKRAS遺伝子の発現をより強く抑制しかつ低いオフターゲット抑制を示すことがわかった（図９）。
KRAS-sgRNAとcontrol-stuffer sgRNAを有するクラスのMvAプロットをWT-dSaCas9及びPF(v15)-dSaCas9についてそれぞれ示した。X軸は2-class発現の平均を示しY軸は２つのクラス間でのlog 2 fold-changeを示す。KRAS遺伝子は、３つの異なるsgRNA （sgRNA#1, #2 and #3）を有するWTdSaCas9、及び３つの異なるsgRNA（sgRNA#4, #5、#6）を有するPF(v15)-Cas9で抑制された。control-stuffer sgRNA に対するlog 2 fold-change suppressionは以下の通りであった; -2.261 (sgRNA#1), -1.888 (sgRNA#2) 及び -2.934 (sgRNA#3), -5.041 (sgRNA#4), -2.538 (sgRNA#5) 及び -2.642 (sgRNA#6)。
PF(v15)-dSaCas9はより少ないオフターゲット抑制を示した。control-stuffer sgRNAに比べて２倍以上抑制された遺伝子の数はWT-dSaCas9では71 (sgRNA#1), 93 (sgRNA#2) 及び 57 (sgRNA#3)であったのに対し、PF(v15)-dSaCas9では、38 (#4), 23 (#5) 及び 35 (#6)であった。
PF(v15)及びPF(v51)のWT-dSaCas9に対するオフターゲット抑制効果を調べた（図１０）。
MvAプロットはWT-dSaCas9に対するPF(v15)及びPF(v51)で２倍以上抑制された遺伝子の数を示す。比較は３つのコントロールsgRNA; C1, C2 and C3を用い、PF(v15) vs. WT 及びPF(v51) vs. WTで行った。PF(v15)は、C1, C2 及びC3についてそれぞれ5, 7 及び7遺伝子と極めて少ない数のオフターゲット抑制(２倍を超える抑制)数を示した。PF(v51)は、C1, C2 及びC3についてそれぞれ84, 26及び16遺伝子とより多くの数のオフターゲット抑制(２倍を超える抑制)を示した。X軸は2-class発現の平均を示しY軸は２つのクラス間でのlog 2 fold-changeを示す。
【産業上の利用可能性】
【０１１２】
本発明によれば、ガイドＲＮＡへの結合力を保ちながら、ＰＡＭ配列の認識が広範化されたＣａｓ９タンパク質を得ることができる。このCas9タンパク質はWT Cas9タンパク質に比べて強い標的DNA結合能を有し、かつ低いオフターゲット結合能を示す。また、前記Ｃａｓ９タンパク質を利用した簡便且つ迅速で標的配列に部位特異的なゲノム編集技術を提供することができる。
本出願は、米国で出願された米国仮特許出願第６２／５５４，２２７（出願日２０１７年９月５日）、米国仮特許出願第６２／６６８，９６８（出願日２０１８年５月９日）及び米国仮特許出願第６２／７２４，９８１（出願日２０１８年８月３０日）を基礎としておりその内容は本明細書に全て包含されるものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【図５−５】
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【図５−６】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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