(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
発酵ブロスからコハク酸を精製するための方法であって、発酵ブロスを濾過する工程と、ｐＨ値が３．０以下であるスクシネート含有濾液を得るためにｐＨを調整する工程と、前記酸性化された濾液を、非官能化樹脂を有するクロマトグラフ用カラムであって、連続擬似移動床（ＳＭＢ）システムの一部であるクロマトグラフ用カラムに、少なくとも２種の異なる画分が得られ、そのうち少なくとも１種が遊離コハク酸を含有するように、５０℃〜１００℃の範囲の操作温度で選択的に送液する工程と、を含み、遊離コハク酸を生成する操作が、脱イオン水のイソクラティック溶離である、方法。
【請求項２】
遊離コハク酸のための前記操作温度が５０℃〜９０℃である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
遊離コハク酸のための前記操作温度が５５℃〜８５℃である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
遊離コハク酸を晶析する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記遊離コハク酸の純度が１回のみの晶析を行った後に≧９０％である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記コハク酸の明確なピークが３ベッド体積以内に出現する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
コハク酸の明確なピークが１．０〜２．７５ベッド体積の間に出現する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記濾液のｐＨが１．０〜３．０の範囲にある、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記濾液のｐＨが１．５〜２．８の範囲にある、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記非官能性樹脂が、疎水性ポリスチレン−ジビニルベンゼン（ＰＳ−ＤＶＢ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
コハク酸塩を製造するための方法であって、スクシネート含有濾液を得るために、発酵ブロスを濾過する工程であって、前記濾液のｐＨが３．０未満である工程と、前記濾液を液体クロマトグラフ用カラムであって、連続擬似移動床（ＳＭＢ）システムの一部であるクロマトグラフ用カラムに通液して非官能化樹脂上で５０℃未満の温度で処理し、コハク酸塩を形成するために、塩基により溶出する工程と、を含む方法。
【請求項１２】
前記コハク酸塩がコハク酸ジアンモニウムである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記温度が２０℃〜４５℃である、請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権の利益
本特許出願は、２０１２年５月７日に出願された米国仮特許出願第６１／６４３，４０５号の優先権の利益を主張するものである。
【０００２】
発明の分野
本発明は、コハク酸および／または二塩基性スクシネートを発酵ブロスから分離するための方法に関する。特に本発明は、非官能化(non-functionalized)樹脂上でクロマトグラフィーを行うことを含む、コハク酸および／またはその塩を精製する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
コハク酸およびその誘導体は、ポリマー、燃料添加剤、インク、化粧品の製造においても、食品や医薬品の添加剤としても幅広く利用されている有用なプラットフォーム化合物(platform chemical)である。例えば、コハク酸は、顔料、溶剤、洗剤、金属メッキおよびポリブチレンコハク酸エステルポリマーの製造における投入原料(input)として使用することができ、可撓性包装材、農業用フィルムおよびコンポスト化可能なプラスチック袋(compostable bag)等の用途において、従来のプラスチックの代替品として使用することができる。
【０００４】
コハク酸は、従来、石油化学製品から製造されてきたが、石油化学製品には限りがあり、価格が高く、汚染問題の原因にもなる。その代替として、様々な分野に応用できるバイオコハク酸を製造するための方法がここ数年で注目を集めるようになってきた。より環境に優しい手法として、嫌気性菌を用いてグルコースからコハク酸を発酵生産させる手法が大きな注目を集めている。コハク酸の発酵生産は、その生産に再生可能な基質が使用されることのみならず、発酵の際にＣＯ２がコハク酸中に組み込まれることからも、グリーンテクノロジー（green technology）と見なすことができる。したがって、発酵由来のコハク酸は、合成樹脂、生分解性ポリマーおよび化学製品の中間体を製造するための、グリーンなバイオ由来の供給原料を得るための一助となる。
【０００５】
コハク酸の発酵生産は石油化学に基づく方法と比較して有利な点も幾つかあるが、バイオテクノロジーに基づく方法が石油化学製品の生産と競合できるようになるには、製造コストを最小限に抑えることが望ましい（例えば、James McKinlay et al., “Prospects for a Bio-based Succinate Industry,” APPL. MICROBIOL. BIOTECHNOL., (2007) 76:727-740参照；本明細書の一部を構成するものとしてここに援用する）。製造コスト全体の約６０％は下流における処理、例えば、発酵ブロスに含まれる生成物を単離および精製する処理によって発生する。コハク酸を回収する方法を開発するに当たっては、この酸を発酵ブロスから精製する段階が、費用対効果を高めるとともに高い成果を挙げるための鍵となる。
【０００６】
コハク酸を単離するための手法は、長年に亘って様々なものが開発されてきた。これらの技法は、限外濾過、酸化カルシウムまたはアンモニアによる沈殿、晶析、電気透析、液液抽出、イオン交換クロマトグラフィーによる収着を用いることを含むものであった（Tanja Kurzrock et al., “Recover of Succinic Acid from Fermentation Broth,” Review, BIOTECHNOLOGY LETTER, (2010) 32:331-339参照；本明細書の一部を構成するものとしてここに援用する）。塩、有機酸および残留バイオマスを含む様々な不純物が、純粋なコハク酸の単離またはその下流におけるコハク酸含有流れの処理を妨げる可能性がある。こうした理由から、コハク酸を精製するための多種多様な解決策が提案されてきたが、これらの解決策には欠点がある。
【０００７】
例えば、他者が検討してきた一部の手法（prescription）の問題点として、所望のコハク酸を分離するために従来のイオン交換を用いるという解決策においては、その容量が比較的限られていることが挙げられる。イオン交換は、商業規模の操作に転換して実用化された処理技法としての実績がない。現在のところ、コハク酸を効率的に収着する方法を達成するほど十分に高い容量を有する樹脂は示されていない。このように、吸着クロマトグラフィーには、コハク酸に対する選択性に関しても容量に関しても限界があった。発酵流れから塩を取り出すためにイオン交換を用いることは可能ではあるが、酸および塩基を使用して樹脂を再生することが必要になるため、存在する塩の量が比較的少ない場合に限り有効である。発酵ブロスの塩含有量が高ければ、イオン交換系の進行が遅くなり、処理量が低下することによって効率が低下するであろう。したがって、塩を他の有機酸から分離するのにイオン交換樹脂を用いると効率が悪くなるであろう。したがって、塩の量が多い場合、これは有効ではない。さらに、従来のイオン交換技法では、ブロス中に存在する異なる有機酸を分離するのは容易ではない。電気脱塩（ＥＤＩ）の場合は、膜ファウリングに伴う問題のため、異なる有機酸を処理量の高い用途に適用できる程度まで分離することができない。反応抽出等の他の手法は有機溶媒および高価な試薬が必要となる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
これらの技法はすべてある程度の成果を挙げているものの、費用、副生物および廃棄物の発生、規模の経済性のいずれかが原因で限られた成果しか得られていなかった。したがって、これらの理由から、この方法を簡素化すると共に、下流の処理コストに加えて廃棄物も低減することができる、コハク酸を回収するためのより優れたより直接的な方法が求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明の概要
本発明においては、発酵ブロス中のコハク酸または二塩基性スクシネートのいずれかを不純物から精製する方法について述べる。特に、本方法は、発酵ブロスを濾過することと；スクシネートを含有するｐＨ値が約３．０以下の濾液を生成するためにｐＨを調整することと；酸性化された濾液を、非官能化樹脂を有するクロマトグラフ用カラム内に、少なくとも２つの異なる画分（そのうち少なくとも１つは遊離コハク酸またはコハク酸塩を含む）が得られるように約２０℃〜約１００℃の範囲内の操作温度を選択して送液することと、を含む。
【００１０】
本発明の他の態様においては、遊離コハク酸を発酵ブロスから精製する方法について述べる。この方法は、発酵ブロスを濾過することにより清澄なブロスを得ることと；ｐＨ値が３．０未満になるように、上記清澄なブロスを提供するかまたは酸性化することと；遊離コハク酸を分離するために、この清澄な濾液を非官能化樹脂を有する連続クロマトグラフ装置に、使用される特定の樹脂に関して予め定められた操作温度で導入することと；コハク酸を晶析させることと、を含む。
【００１１】
本方法の利点は、遊離酸を晶析させると、１回のみの晶析で９０％以上の純度の生成物を得ることができることにある。二塩基性コハク酸塩を分離するためには、クロマトグラフィーによる分離の最中に無機強塩基を使用して、遊離酸を後の方で溶出させることができる。
【００１２】
本発明の他の態様においては、コハク酸塩を製造するための方法について述べる。この方法は、スクシネート含有濾液を得るために、発酵ブロスを濾過することであって、前記濾液のｐＨが３．０未満であることと；この濾液を液体クロマトグラフ用カラム内の非官能化樹脂上で約７０℃までの温度で処理することと；コハク酸塩を形成するために強塩基または有機溶媒を用いて溶出させることと、を含む。
【００１３】
さらに、他の利点は、コハク酸ジアンモニウム等の二塩基性の化学種の流れを単離できることにあり、これらは、Ｎ−メチルコハク酸アミド、Ｎ−メチル−ピロリジノン、ピロリジノンおよびＮ−ビニルピロリドンを含む様々な窒素含有誘導体に直接変換することができる可能性を持つものである。本発明は、下流の処理における変換に用いるための前駆体物質がより高純度で得られる、より容易で、より単純で、より費用対効果が高いことを特徴とする方法を開示するものである。
【００１４】
本発明の他の態様においては、上述の概念を、高処理量または連続的分離を達成するために適応させることができる。擬似移動床（ＳＭＢ）クロマトグラフィー方式を主要な用途に用いることが可能である。
【００１５】
次に示す詳細な説明において本精製方法のさらなる特徴および利点を開示する。上述の概要も次に示す詳細な説明および実施例も単に本発明を代表するものに過ぎず、特許請求の範囲において請求されている本発明を理解するための概要を提供することを意図するものであることが理解される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明の実施形態による処理工程を表すフローチャートである。
【図２】本発明の手順（iteration）に従い、発酵ブロスから得られたｐＨ２の濾液を約５０℃の温度でカラムに送液してイソクラティック分離を行うことにより得られたパルス試験のグラフを示す。
【図３】図２と同様のパルス試験によるイソクラティック分離を約６０℃の温度で運転した場合のグラフを示す。
【図４】図２と同様のパルス試験によるイソクラティック分離を約７５℃の温度で運転した場合のグラフを示す。
【図５】図２と同様のパルス試験によるイソクラティック分離を約９０℃の温度で運転した場合のグラフを示す。
【図６Ａ】一連のパルス試験におけるイソクラティック分離のグラフであり、温度を６０℃とし、原料のｐＨ値を２．５として運転を行った。
【図６Ｂ】一連のパルス試験におけるイソクラティック分離のグラフであり、温度を６０℃とし、原料のｐＨ値を３．０として運転を行った。
【図６Ｃ】一連のパルス試験におけるイソクラティック分離のグラフであり、温度を６０℃とし、原料のｐＨ値を４．３として運転を行った。
【図７】図３と同様のパルス試験によるイソクラティック分離を６０℃の温度で行った場合のグラフを示す。このグラフは、コハク酸の明確なピークおよびコハク酸が他の有機酸と分離されたことを示している。
【図８】本発明の他の実施形態によるパルス試験のグラフを示し、操作温度を約４０℃とし、原料のｐＨを２として、塩基（例えば、ＮａＯＨ）を用いてグラジエント溶離すなわち二峰溶離（binary elution）を行うことにより得られたグラフである。
【図９】図８と同様の二峰溶離のパルス試験を、温度を２５℃、原料のｐＨを２として行った場合のグラフを示す。
【図１０Ａ】温度を２５℃、原料のｐＨを２として操作を行った、ＮＨ４ＯＨを用いた二峰溶離のパルス試験のグラフを示す。
【図１０Ｂ】図１０Ａと同様のグラジエント溶離のパルス試験のグラフであるが、周囲温度でスクシネートが確かに塩としてシャープなピークで溶出することを実証するために後から塩基を添加した。
【図１１】本発明の手順に従いコハク酸（プロトン化）に適合させた擬似移動床式クロマトグラフィーシステムの略図を示す。
【図１２】脱プロトン化されたコハク酸塩（例えば、コハク酸ジアンモニウム）の溶出に適合させた擬似移動床式クロマトグラフィーシステムの略図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
詳細な説明
第Ｉ項−定義
本発明を詳細に説明する前に、特定の実施形態の説明に用いられる専門用語を理解し、これらが限定を意図するものではないことを理解されたい。本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される単数形「a）、「an」および「the」は、特に明示的な指示がない限り、複数の指示対象も含む。文脈内に特段の指定がない限り、本明細書において使用される技術用語および科学用語はすべて本発明に関連する当業者が従来理解している通常の意味を有する。
【００１８】
本明細書において用いられる「発酵」という語は、有機酸、アルコールおよび他の対象化学物質を生物学的に変換および生物学的に生産することを指す。この語は、微生物の任意選択的な増殖段階（定常期（stationary）、プラトー期（plateau）、複製期等）における、単独で、順番にまたは一緒に起こる１以上の変換または生産プロセスを含む。
【００１９】
「発酵ブロス」という語は、微生物が有機炭素源を対象である他の有機物質に変換する液体培地を指す。
【００２０】
「炭素源」という語は、微生物が代謝することができる任意の炭素供給源を指す。この炭素源は、少なくとも１個の炭素原子を含む。炭素源としては、例えば、様々な炭水化物（デキストロース、グルコース、フルクトース、スクロース、デンプン等）、アルコール、有機酸およびその対応する塩または植物もしくは動物由来の油、脂肪およびトリグリセリドを挙げることができる。
【００２１】
「ベッド体積」または「カラム容量」という語は、充填材およびその隙間に入り込んだ液体全体の体積を指す。カラム内の収着材を規定量まで湿潤させるのに必要な溶媒の最小体積は収着材の性質に応じて変化し得る（例えば、６０Åのシリカゲル収着材１００ｍｇ当たり約１２０μｌであり、６０Åのシリカゲル収着材５００ｍｇ当たり約６００μｌである）。
【００２２】
「クロマトグラフィーの分離能」という語は、クロマトグラフ用カラムから連続的に排出される分析物の分離の程度を指す。
【００２３】
「イソクラティック溶離」という語は、移動相の組成が分離工程全体を通して一定のままである、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）による分離を指す。イソクラティック溶離は、通常、固定相に対する親和性の差がさほど大きくない試料成分を分離する場合に有効である。
【００２４】
「グラジエント溶離」という語は、クロマトグラフィー分析の最中に移動相の組成が変更されるかまたは変動する分離を指す。特に「二峰溶離」という語は、２種類の異なる溶離媒体を用いる分離を指す。
【００２５】
第ＩＩ項−説明
本発明の一部は、発酵ブロス由来の遊離有機酸から化学製品の供給原料となる分子を製造する方法に関する。本明細書において用いられる「遊離有機酸」という語は、溶液中でプロトン化状態にある（すなわち、そのｐＫａ値以下にある）有機酸化合物を指す。本分離方法は、遊離酸またはその塩のいずれかを回収するために用いることができる。本方法によれば、遊離酸の分離はイソクラティック溶離で行われ、塩の生成はグラジエントまたは二峰溶離で行われる。イソクラティック溶離法は量が多い場合に有用であり、コハク酸を他の有機酸、糖および塩等から分離するための費用対効果の高い方法である。
【００２６】
本発明の方法は、クロマトグラフィー精製に疎水性の非官能化樹脂床を用いるものである。特に注目すべきは、本方法が遊離コハク酸またはコハク酸塩のいずれかをブロスの濾液中に存在する他の有機酸、塩および溶解した糖類から分離できる能力である。クロマトグラフィー条件に応じて、精製されたコハク酸の流れまたは精製された二塩基性スクシネートの流れのいずれかを単離することができる。溶離条件を変化させることにより、コハク酸または二塩基性スクシネートのいずれかを単離するように分離方法を選択的に操作することができる。操作温度は約２０℃〜約１００℃の範囲とすることができる。特定の実施形態においては、本発明に従い用いられる具体的なクロマトグラフ用樹脂に応じて、二峰溶離を用いることにより、コハク酸が高温で単離され、それよりも低い温度で二塩基性スクシネートが単離される。分離のための操作温度は、平衡結合定数、ピーク形状およびコハク酸対不純物の分離度により決定される。
【００２７】
この方式の精製は、電気透析膜のファウリング、有機溶媒の使用、イオン交換樹脂の容量の低さおよび晶析の感度といった他の精製法の固有の問題を一部回避しながら、一元化された１回の工程で、スクシネートの流れを、残りの塩、窒素含有不純物および他の有機酸から単離する確実な方法を提供するので有利である。従来のイオン交換樹脂が、再生に酸／塩基を使用することを必要とし、収着(sorption)過程においてはコハク酸に対する容量に劣るという欠点を有することを考えると、クロマトグラフィーを用いた精製方法を達成するための新規かつ能率的な手法は高く評価されるであろう。
【００２８】
従来のイオン交換クロマトグラフィーとは異なり、非官能化樹脂床は塩の交換を行わず、再生も不要である。したがって、本方法は、分離を不連続な回分方式のクロマトグラフィーまたは最適な連続処理方式のクロマトグラフィーのどちらで行っても時間および費用の両方を節約する。
【００２９】
具体的には、コハク酸を発酵ブロスから精製する方法は、発酵ブロスを濾過することと；ｐＨを調整することによりｐＨ値が約３．０以下のコハク酸含有濾液を得ることと；酸性化された濾液を、非官能化樹脂を用いた擬似移動床（ＳＭＢ）システム等のクロマトグラフィーシステムに、使用される具体的な樹脂に最適な操作温度で送液することと、を含む。具体的な非官能化ポリ（スチレン−ジビニルベンゼン）（ＰＳ−ＤＶＢ）樹脂の操作温度は、平衡結合定数、保持時間およびピークの分離度に関する経験的なデータを収集することにより決定される。一例として、ＸＡＤ−４等のクロマトグラフ用非官能化樹脂の場合、操作温度は、少なくとも２つの別個の画分が得られるように、ａ）遊離コハク酸を生成するために５０℃超またはｂ）コハク酸の塩を生成するために５０℃未満のいずれかとすることができる。しかしながら、他の樹脂の場合は、操作温度がそれよりも高温側または低温側に及んでも、例えば、二塩基性スクシネートを生成するために約６５℃までまたは約７０℃まで拡張することができるし、そうすることが必要な場合もある。
【００３０】
本方法は、発酵ブロス中に通常存在する他の汚染物質の大部分からコハク酸の流れを１回の操作で精製することが可能な方法を提供する。本発明の利点は、クロマトグラフィーからそれに続く晶析までを一巡すれば、事前の精製を行うことなく、コハク酸またはその塩を高純度（≧９０％）で得ることができることにある。本方法は、最適化を行うことによって、例えば、約９２％または９５％、約９７％までまたは９９％までという高水準の純度を達成することができる。
【００３１】
本分離方法の特徴によれば、コハク酸の明確なピークが３ベッド体積以内に溶出する。通常、明確なピークは約１．０〜約２．７５ベッド体積に観測される。塩ならびに他の有機酸および副生成物は、所望のコハク酸化合物のエキストラクトから容易に分離することができる。この特徴により、「高純度の」（すなわち≧８５％または≧９０％の）コハク酸／スクシネートの流れを、生成物の損失を非常に少なくして単離することができる。濾過されたブロスから遊離酸および塩の形態を少なくとも約６８％または７０％（通常は約７２％または７５％）回収することができる。未処理の濾液からの回収率は約８０％、８５％またはそれを超えることができ、最適化を行うと、酸または塩形態のいずれかを最初の供給原料から約９０％〜９５％またはそれを超える収率で回収することができる。
【００３２】
Ａ．
本発明の一部は、精製が困難な有機化学種をクロマトグラフィーによって分離する技法の改善に寄与するものである。本発明の手法は、従来の手法と比較して、現行の方法よりも効率および費用対効果が高いという点で好ましい。本発明の特徴は、クロマトグラフィー工程の前およびその最中に、温度、ｐＨおよび溶離条件を含む幾つかのパラメータのバランスに基づく操作体制(regime)を見出すことを含む。
【００３３】
本発明の特徴に従い、本発明者らは、発酵ブロス中に通常存在する他の汚染物質の大部分からコハク酸の流れを１回の操作で精製するために液体クロマトグラフィー（ＬＣ）技法を適応させる。ＬＣは、通常、カラム内に収容された様々な種類の固定相（すなわち収着剤）、移動相およびカラムを通過させる試料成分を移動させるポンプならびに試料成分に特徴的な保持時間および検出器を通過した各分析物の量を反映する面積（カウント数）を与えることができる検出器を利用している。分析物の保持時間は、固定相との相互作用の強さ、使用する移動相の組成および流量ならびにカラムの寸法に応じて変化する。本明細書においては、圧力を回避するために比較的大径のカラムおよび比較的大型の粒子を使用する。
【００３４】
上述したように、反応抽出、電気透析、晶析およびイオン交換を含め、コハク酸を精製するための様々な方法が模索されてきたが、それぞれ問題に直面してきた。このような問題を克服するために、本発明は非官能化樹脂を採用している。非官能化樹脂はイオン電荷を介して異なる化学種と結合するのではなく、非官能化樹脂は、親水性および疎水性の親和力のバランスによって作用する。ここに記載する実施形態においては、吸着材樹脂は未修飾(unmodified)であり、疎水性樹脂と見なされる。したがって、疎水性の有機化学種はこれらと結合することができ、水系中で保持されることができる。
【００３５】
この樹脂は官能化されていないので、コハク酸が樹脂と親和性を示すように、投入する材料のｐＨを調整することが必要である。したがって、発酵ブロスから得た未処理の濾液はｐＨ値が約３未満の酸性とすべきである。濾過されたブロスは元々酸性のｐＨ値を有するものであってもよいし、ｐＨが３未満になるように酸性化処理することもできる。特に、濾液のｐＨ値は、約１．０〜約３．０の範囲にある。通常、ｐＨは約１．２または約２．０〜約２．８までまたは約２．９まで、望ましくは、ｐＨは、約１．３または約１．５〜約２．５または約２．７の範囲にある。
【００３６】
この実施形態においては、コハク酸の分離には、ポリ（スチレン−ジビニルベンゼン）（ＰＳ−ＤＶＢ）吸着材樹脂に分類される種類の樹脂を採用することができる。ポリスチレンがジビニルベンゼンと架橋している。ＰＳ−ＤＶＢ樹脂は、１〜１４のｐＨ範囲に亘って安定であることから、様々な種類の化合物を抽出および分離するために魅力的な吸着材である。ＰＳ−ＤＶＢ樹脂は、無極性化合物を強力に保持すると同時に、極性化合物の保持力に劣る疎水性表面を有することが知られている。
【００３７】
疎水性型ＰＳ−ＤＶＢ樹脂は様々な供給業者（例えば、Dow Chemical Company、Rohm & Haas Co.、Mitsubishi Chemical Corporation、Purolite Corporation、Lanxess Corporation等）から市販されている。製造業者および各種樹脂の具体的な規格に応じて、樹脂は様々な細孔径および表面積を有することができ、それに応じて、樹脂の物理的および化学的性質、分離の質、したがって異なる手順ごとに必要な温度が変化する可能性がある。表面積が約１２０ｍ２／ｇまたは約１５０ｍ２／ｇ〜約１１００ｍ２／ｇまでまたは約１２００ｍ２／ｇまでの範囲の樹脂を使用することができる。通常、樹脂の表面積は、約１５０ｍ２／ｇまたは約２００ｍ２／ｇ〜約８００ｍ２／ｇまたは約１０００ｍ２／ｇである。特定の有機溶液（例えば、コーンシロップ、果汁、ＨＦＣＳ、ポリフェノールまたは天然抽出液）に具体的に適合させた樹脂においては、樹脂の表面積は約２５０または約３００ｍ２／ｇ〜約６００または約７５０ｍ２／ｇである。平均細孔径は約５０Åまたは約１００Å〜約６００Åまたは約７００Åの範囲、通常は約１００Åまたは約１５０Å〜約４５０Åまたは約５００Åの範囲とすることができる。樹脂粒子の平均径は約３００μｍまたは約３５０μｍ〜約７５０μｍまたは約８００μｍの範囲、通常は約４００μｍまたは約５００μｍ〜約６５０μｍまたは約７００μｍの範囲とすることができる。樹脂の多孔率は約０．９０または約０．９５ｍｌ／ｇ〜約１．４０または約１．５２ｍｌ／ｇの範囲、通常は約０．９７ｍｌ／ｇ〜約１．１８または約１．２５ｍｌ／ｇの範囲にある。
【００３８】
吸着材樹脂は無極性または疎水性を示す傾向にあり、このことは、非常に水溶性の有機化合物を容易に吸着することを意味する。例えば、Rohm & Haasから市販されているイオン交換樹脂のシリーズにAMBERLITE（商標）XAD（商標）高分子吸着材があり、これは、高度に架橋した巨大網目構造(macroreticular)を持つポリスチレンポリマーをベースとする非常に多孔性の球体ポリマーである。これらは内部表面積が高いので、使用環境に応じて幅広い種類の異なる化学種を吸着、そして脱着することができる。例えば、水等の極性溶媒中においては、高分子吸着材は無極性または疎水性挙動を示し、水に余り溶解しない有機化学種を吸着することができる。この疎水性の性質はスチレン系吸着材で最も顕著に表れる（炭化水素等の無極性溶媒中と比較すると、ほとんどの吸着材は、わずかに極性またはわずかに親水性の性質を示すので、ある程度の極性を有する化学種を吸着することになる。この極性は、アクリル系吸着材およびフェノール系吸着材で最も顕著である）。表１は、AMBERLITE（商標）シリーズの樹脂の物理的および化学的属性の一部をまとめたものである。
【００３９】
【表１】
0006628604.tif 000002
【００４０】
このような性能特性を利用した精製方法を他者らが発展させてきた。例えば、捕捉／濃縮モードでは、AMBERLITE（商標）XAD（商標）媒体を用いることにより、フェノール系化合物または塩素化炭化水素の回収において極めて優れた第１精製工程を行うことができる。一部の用途においては、ＸＡＤ樹脂を用いて脱色が行われる。AMBERLITE（商標）XAD（商標）吸着材は回分操作および（好ましくは）連続操作のどちらの使用にも対応することができる。他の市販のポリスチレン系吸着材樹脂、例えばPuroliteからのPuroSorb（商標）PAD吸着材は、高純度の(clean)モノマーから作製されており、表面積が高く、塩、金属その他の鉱物等の汚染物質を全く含まないので、食品および医薬品用途に特に適している。ところが、この種の樹脂を、有機酸、特にコハク酸／スクシネートの工業的分離に使用することは、提案されたことも、それに対応させたことも今までなかったようである。
【００４１】
Ｂ．
図１は、本発明の実施形態の分離および精製方法の略図であり、様々な処理段階の各々から得られる主な生成物を示している。通常、本分離方法は、発酵ブロスに由来するコハク酸等の有機酸の供給源（１．）を使用することと、この発酵ブロス（１．）を濾過（２．）することによりバイオマスを除去して未処理の濾液（３．）を得ることとを含む。未処理の濾液（３．）は、元々酸性のｐＨ値を有していてもよいし、濾液を非官能化樹脂を有するクロマトグラフィー用カラム（６．）に供給する前にこの濾液を酸性化処理（４．、５．）することもできる。分離は所望の生成物（プロトン化された酸または二塩基性塩）に応じて２種類の異なる手順に従い選択的に操作することができる。遊離酸を生成する分離（７．）においては、原料は、通常脱イオン水を用いてイソクラティック溶離により高温（例えば、ＸＡＤ−４の場合、操作温度を約５０℃以上、通常は約５２℃〜約８７℃）で処理される。次いで、場合により、所望に応じて未処理の遊離酸（９．）を晶析（１１．）させることにより精製コハク酸（１３．）を得ることができる。塩を生成するための分離（８．）においては、原料を脱イオン水および強塩基を用いてより低い温度における（例えば、ＸＡＤ−４の場合、操作温度は約５０℃未満、約２０℃〜約４５℃）二峰溶離で、またはメタノール、エタノールもしくはアセトン等の有機溶媒を用いて処理する。他のＰＶ−ＤＶＢ樹脂は親和性が異なる可能性もある。したがって、これらを用いる場合は、一般的なパラメータに応じて異なる温度で処理が行われるであろう。この方法には、任意の強塩基性無機物質、アンモニアまたは炭酸塩といった塩基（例えば、ＮａＯＨ、ＫＯＨ、ＬｉＯＨ、ＮＨ３、Ｎａ２ＣＯ３）を使用することができる。別法として、図１に示されているように、イソクラティック溶離を高温で操作して、コハク酸を単離し、次いで水性塩基で処理することにより二塩基性スクシネート（１０．）（例えば、コハク酸ジアンモニウム（１４．））を生成することができる。次いで、どちらかの経路からの生成物を化学的に処理（１２．）することにより、他の商業的に重要な化学物質（１５．）（例えば、テトラヒドロフラン、２−ピロリドン、Ｎ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）、１，４−ブタンジオール、１，４−ジアミノブタン、スクシノニトリル、スクシンアミドまたは二塩基性コハク酸エステル）が得られる。本明細書の一般用語の項に記載したように、本発明に従い様々な異なる順序（permutation）および繰り返し（iteration）が想定されている。したがって、上述の手順の任意の工程を、他の方法の順序に含まれる他の任意の工程と組み合わせることができる。
【００４２】
イソクラティック溶離において、ピーク幅は保持時間に伴い増大する。通常、この特徴のため、後の方に溶出するピークが非常に平坦で幅広くなるという欠点が生じ、このような形状および幅によってピークと認識されにくくなる可能性がある。本イソクラティック溶離系における１つの利点は、試料の保持時間が従来の操作パラメータよりも短縮されていることにある。後の方に溶出する化学種のピークは濃縮されて増幅される。この特徴により、高処理量の処理を短時間で経済的かつ効率的な形で行える可能性が非常に高くなる。特に、ＸＡＤ−４等の樹脂をより低温で（＜４０℃）使用する場合、コハク酸は長い溶出時間で幅広いピーク形状で溶出する。温度を高くするとピーク形状および保持時間はいずれも改善される。さらに、塩基性溶液または有機溶媒で二峰溶離を行うことにより、溶出の遅いコハク酸のピークがはるかに早くより高濃度で溶出する。これらのどちらの処理によっても、高処理量の処理を経済的かつ効率的な形で行える可能性が大幅に増大する。
【００４３】
ＸＡＤ−４を用いた添付のパルス試験に例示するように、コハク酸を分離するためには、溶出ピークが出現するまで３ベッド体積を超えて分離を行うことが必要となる可能性があるので、周囲温度ではピークが非常に広がりやすくなるであろうことから、溶出を認識することが一層困難になる。これとは対照的に、本開示内容によれば、操作温度を調整することにより３ベッド体積以内にブロスの濾液中のコハク酸を他の有機酸、溶解している塩および糖等からうまく明確に分離することができる。通常、明確なピークは約２．８ベッド体積以内に溶出する。添付の図２〜９に示すように、コハク酸の明確なピークを約０．８または約１．０〜約２．５または約２．７５ベッド体積に観測することができる。クロマトグラフィーによるスクシネートのピークと塩および他の有機酸のピークの分離度（すなわち分離の程度）は、約０．１または約０．２ベッド体積〜約０．５、約０．７５または約１．０ベッド体積とすることができる。投入物の濃度に応じて、１リットル当たりのコハク酸の生成量を、他の有機酸の生成量よりもはるかに多くすることができる。
【００４４】
異なる非官能化樹脂の操作温度は、平衡結合定数、保持時間およびピーク分離度に基づき変化する可能性があり、ＸＡＤ−４を用いて遊離酸を分離する場合の操作温度は、通常は約５０℃〜約９０℃であり、一方、塩を生成するための操作温度は約２０℃〜約５０℃である。精製方法を約５０℃以上の温度で操作する場合、遊離酸に関しては、観測される分離度、ピーク形状および保持時間が改善され、分離速度および効率に関しても改善される可能性がある。温度を上昇させると、イソクラティック条件下におけるコハク酸の保持時間を約２．０ベッド体積未満に改善することができ、それによって、図２、３、４および５に示されるように、ＳＭＢ装置の効率が高くなる。さらに高い操作温度は、約５０℃または約５３℃〜約８８℃または約９０℃の範囲（端点を含む）である。より詳細には、温度は約５５℃または約５８℃〜約８３℃または約８５℃、望ましくは約６０℃または約６５℃〜約７８℃または約８０℃にある。操作温度を約５５℃または約６０℃〜約７０℃、約７５℃または約８５℃の範囲とすると工業処理に適したものになる可能性がある。非官能化樹脂の操作温度は約１５０℃までとすることができ、具体的な樹脂では約６５〜約９０℃、通常は約７２℃〜約８０℃の温度である。
【００４５】
スクシネートを塩から分離することに加えて、本方法により、スクシネートを濾過ケーク中に損失したり、スクシネートを回収条件に付すことなく、所望に応じてラフィネートから金属塩を沈殿させて回収することが可能になる。イソクラティック溶離をＸＡＤ−４を用いて室温（すなわち約２０℃〜２５℃）で行うと溶出が比較的遅くなる傾向にあるため、実用的でないかまたはＳＭＢクロマトグラフィー等の大量の工業処理には向かなかった。分離したスクシネートのピークの溶出は、多くの場合、滞留時間または保持時間が２．７５または３ベッド体積を超えることになる。二峰溶離を行うと、後の方で溶出する成分の保持が短縮され、それによって、ほとんどの成分に関し、溶出がより早くなり、ピークがより狭く（かつより高く）なる。これにより、溶出物の濃度が高くなることによって、テーリングのあるピーク形状も、ピークのテーリング部分が前方に押し出されるため、改善される。これにより、ピークの高さも高くなる（ピークが「よりシャープに」見える）。このことは効率に関し重要である。ＸＡＤ−４の場合、塩を分離するための操作温度は約２２℃または約２４℃〜約４４℃または約４８℃にある。
【００４６】
グラジエントまたは二峰溶離の場合は、後の方に溶出する成分に対する保持力が低下し、その結果としてコハク酸のピーク形状が改善する。後の方に溶出する成分は、ほとんどの成分に関し、より早く溶出し、ピークがより狭く（かつ高く）なるようである。そして今度は、このことによって、生成物の濃度がより高くなるので、クロマトグラフィー工程の効率がより高くなる。また、このことによって、溶出物がピークのテーリング部分を前方に押し出すので、コハク酸の濃度も高くなり、ピークもより高くなる（すなわちピークが「よりシャープに」見える）。このことは微量成分分析に関し重要である。グラジエントのプログラムは、有機成分の比率の急激な「段階的な」増加または異なる時点における異なる勾配を含むことができ、これらはすべて最小限の時間で最適な分離を行うという要求に従って行われる。塩を分離するための操作温度は約２２℃または約２４℃〜約４４℃または約４８℃である。
【００４７】
図３は、本分離方法が、濾過後の溶液中に残存している可能性がある塩も窒素含有化合物（アミノ酸または尿素等）も容易に除去することができることも示している。窒素化合物は最初の１ベッド体積以内の早い段階で除去される。さらに良好な分離を行うための連続擬似移動床システムにおいては、異なる化学種の明確な分離を増幅することができる。
【００４８】
添付の図６Ａ〜６Ｃに例示するように、供給原料の媒体は約３．０以下の低いｐＨ値で処理するべきである。通常、良好なクロマトグラフィー性能を得るためには、ｐＨ値は約２．８または約２．５を超えないようにする。図６Ａは、供給原料のｐＨを２．５として分離を行ったパルス試験のグラフを示すものである。このパルス試験から、コハク酸、塩および他の有機酸が良好に分離されていることが分かり、それぞれの化学種の明確なピークが見られる。同様に、図６Ｂは、供給原料のｐＨを３．０としたパルス試験のグラフを示している。コハク酸、塩および他の有機酸の分離は依然として良好であるが、約０．５〜０．９ベッド体積でコハク酸の分離曲線に小さな盛り上がりが認められることから、少量のコハク酸が失われている（可能性としてラフィネート中に）可能性がある。図６Ｃのパルス試験は原料のｐＨを約４．３として運転したものである。図６Ｃから明らかなように、供給原料のｐＨが約３．０を超えると、他の塩および不純物の抽出がコハク酸の抽出に接近して重なる傾向にある。したがって、コハク酸の塩からの分離は明確な分離度が得られない傾向にある。
【００４９】
図７は、様々な異なる種類の有機酸を分離するための本方法の相対的な有効性を示すものである。連続クロマトグラフシステム（例えば、擬似移動床（ＳＭＢ））においては、リンゴ酸、乳酸および酢酸をコハク酸から分離することができる。
【００５０】
したがって、本発明者らは、本方法によって、スクシネートが、非官能化樹脂上のＳＭＢクロマトグラフィーによって発酵ブロスから工業的に高い効率で分離される、実現可能な実施形態を想定している。ＳＭＢは、通常、カラムに収容されている異なる種類の固定相（すなわち収着材）、異なる移動相を移動させるポンプおよび液流に対向するように固定相を「移動」する何らかの装置を利用している。次項で検討するパルス試験は、ＳＭＢクロマトグラフィーに適用するための異なる条件および樹脂を評価する基準を提供するものである。ＳＭＢクロマトグラフィーは、コハク酸の流れを連続方式で精製するように最適化することができる。
【実施例】
【００５１】
第ＩＩＩ項−実験例
本発明の実施形態によれば、スクシネートの供給源は発酵に由来するものである。最初の工程である分離および精製方法には、発酵ブロスから細胞塊、細胞破片、タンパク質および他の不溶性物質を除去するために限外濾過を行うことによってスクシネートを含有する未処理の濾液を得ることを含む。濾液は、元々約３以下のｐＨ値を有するものであってもよいし、濾液のｐＨが３．０未満になるように酸性化することもできる。次いで、処理を行う、すなわち未処理の濾液をクロマトグラフ用カラムに送液する。
【００５２】
実験例のパルス試験はすべてクロマトグラフ用非官能化樹脂上で行った。分離を行うための具体的な操作温度範囲は変化させることができ、他の製造業者からの他の非官能化樹脂を用いる場合は調整することができる。本発明者らは、パルス試験を用いることにより、ＳＭＢ装置の機能的に実用可能であることを実証する。当業者は、他の特定の非官能化樹脂の分離性能が、本実施例の結果および範囲に示す分離性能よりも優れている可能性も劣っている可能性もあり、個々の事例ごとの要求に応じて調整および最適化を行うべきであることを理解する。
【００５３】
クロマトグラフィーパラメータ
疎水性非官能化樹脂（Rohm & Haas Co.からのAMBERLITE（商標）XAD-4）を使用し、パルス試験を複数回行う。この試験を行うことにより、コハク酸および様々な不純物が十分に分離されることを実証する。実施例におけるパルス試験はすべて、樹脂１００ｍｌを用いて１．５ｃｍのジャケット付きガラスカラム内で行った。クロマトグラフ用樹脂はスラリーとして順流でカラムに充填した。試験前に樹脂を脱イオン水で十分に洗浄した。原料を６ｍｌパルスで装入し、脱イオン（ＤＩ）水で流量を３ｍｌ／分として溶出させた。背圧は認められなかった。
【００５４】
Ａ．操作温度範囲
本発明者らは、ＸＡＤ−４を用いた場合は高温の方が良好な分離が促され、それによって、イソクラティック条件下で妥当な溶出体積以内に溶出することを見出した。分離を高温で行うことにより、コハク酸を塩、窒素化合物、他の有機酸（例えば、リンゴ酸、乳酸または酢酸）から単離することができる。添付の図面におけるパルス試験で実証されているように、遊離コハク酸が、水洗によって容易に溶出する他のすべての塩から明確に分離されることが分かる。パルス試験で認められたクロマトグラフィーによる分離に基づけば、プロトン化されたコハク酸は、他の有機酸を含む不純物よりも強力に疎水性樹脂に結合する。一般に、平衡定数または動的結合が低いほど、結合した化学種が樹脂から早く溶出する傾向が高くなるであろう。その逆も同様であり、平衡定数が高いほど化学種の溶出が遅くなり、長く保持される傾向が高くなるであろう。ＸＡＤ−４を用いた試験から、コハク酸を効率的に溶出させるためには高温が必要であることが示唆されるが、正確な操作温度は、使用される具体的な非官能化樹脂の操作パラメータおよび／または対象の化学種に応じて変化し得る。
【００５５】
実施例１、２、３および４は、ＸＡＤ−４クロマトグラフ用非官能化樹脂を使用して供給原料である発酵ブロスからコハク酸を分離する効率に対する温度の効果を例示したものである。ジャケット付きガラスカラム（直径１．５ｃｍ）にＸＡＤ−４を１００ｍｌを充填した。樹脂を水浴を用いて指示された温度に加熱した。樹脂を水約５００ｍｌで洗浄した。原料を６ｍｌパルスで装入し、脱イオン（ＤＩ）水の流量を３ｍｌ／分として溶出させた。背圧は観測されなかった。
【００５６】
パルス試験の結果が示すように、ＳＭＢ装置に適用した場合、５０℃未満の操作温度で分離を実施すると分離の効率がより低くなるので、溶離液を増加することが必要になり、それによって所望の生成物がより希釈される。したがって、ＸＡＤ−４を用いた場合、約５０℃〜約９０℃の温度範囲で濾液中の遊離コハク酸を他の塩および有機酸から効率的に分離できることが実施例のデータから支持される。通常、操作温度は、約５３℃または約５５℃〜約７５℃または約８０℃、望ましくは約５７℃または約６５℃〜約７０℃または約７２℃である。
【００５７】
実施例１：５０℃におけるｐＨ２の発酵ブロスからのコハク酸の精製
図２に本発明の順序に従い５０℃で実施したパルス試験の結果を示す。コハク酸ならびに他の有機酸および塩がクロマトグラフィーにより明確に分離されていることが分かる。塩のピークは約０．４ベッド体積から分離して約０．７ベッド体積でピークに達する。他の有機酸のピークは約１．２ベッド体積の位置に出現している。コハク酸の分離は約０．９または約１．０ベッド体積から開始し、約１．５または約１．６ベッド体積でピークに到達する。コハク酸のほとんどが約２．８ベッド体積までに溶出する。
【００５８】
実施例２：６０℃におけるｐＨ２の発酵ブロスからのコハク酸の精製
実施例１と同様にして、カラムのジャケット温度を水浴で６０℃に加熱して、本発明による実施例２の分離を実施した。図３に６０℃で行ったパルス試験の結果をまとめる。その結果、コハク酸が完全に溶出した。また、この図から、発酵ブロスに一般に見られる混入物である窒素含有物質および他の有機酸からコハク酸が有効に分離されたことが分かる。
【００５９】
予想されたことであるが、この系の電気伝導性により、他の塩の脱着が近接して起こる。図７のさらなる詳細から、未処理の濾液中のコハク酸が、リンゴ酸、乳酸および酢酸からはっきりと明確に分離されることが分かる。コハク酸の曲線は約１．５ベッド体積でピークに到達するが、一方で、他の酸化学種の曲線のピークは約０．７５〜約１．２５ベッド体積で互いに近接して重なり合っている。
【００６０】
実施例３：７５℃におけるｐＨ２の発酵ブロスからのコハク酸の精製
５０℃および６０℃で実施した上述の実施例と同様に、７５℃における溶出でも、塩およびコハク酸がクロマトグラフィーによりほぼ完全に分離することが分かる。同様に、他の有機酸の溶出も比較的良好であった。
【００６１】
実施例４：９０℃におけるｐＨ２の発酵ブロスからのコハク酸の精製
約９０℃の温度でクロマトグラフィーによる分離を行うと、異なる化学種のピークが収束し始める。この特徴により、ラフィネート部分に失われるコハク酸が増加する可能性があり、本発明が提唱している、スクシネートの溶出量を最大限にするという効果が薄くなり始める。この結果は、操作温度が９０℃を超えると利点を失う可能性があることと、少なくとも特定の種類の非官能化樹脂を使用した場合、操作温度に上限が存在する可能性を示唆している。
【００６２】
実施例５：２５℃におけるｐＨ２の発酵ブロスからのコハク酸ジアンモニウムの精製
同様のパルス試験を周囲温度で実施した。但し、ＮＨ４ＯＨは約２．４ベッド体積まで添加しなかった。この試験においては、コハク酸は約１．５ベッド体積で溶出を開始し、ＮＨ４ＯＨがその溶出を加速することが認められた。
【００６３】
Ｂ．ｐＨ値の範囲
上述の項の実施例と同じく、図６Ａ〜６Ｃにクロマトグラフィーによる分離に対するｐＨの効果を例示する。図６ＡはｐＨが２．５の原料を使用しており、図６ＢはｐＨが３．０、図６ＣはｐＨ４．３である。供給原料のｐＨ値は３未満とすべきである。添付の図面から分かるように、パルス試験を行った結果、ｐＨ２．５においては良好な分離および溶出が見られるが、ｐＨ値が上昇して３以上になるとコハク酸のピークは二峰になる。そのため、生成物がラフィネート中に失われることになる。この分離において所望のコハク酸の二峰ピークの生成を最小限に抑えるような良好な操作を行うためのｐＨ値の範囲は、約２．５および約３の間から開始し、約１．３または約１．０またはそれを下回る値まで低下していくであろう。
【００６４】
Ｃ．二峰溶離
実施例６：４０℃におけるｐＨ２．０の発酵ブロスからのコハク酸二ナトリウムの精製
図８は、コハク酸約５０ｇ／Ｌを含む発酵ブロス６ｍｌをカラムに周囲温度で担持させた後、脱イオン水３ｍｌ／分で溶出させた最初のパルス試験を示すものである。導電性の降下（塩の溶出の終了）が観測された後、溶離液を５％ＮａＯＨに切り替えた。結果として得られた分析から、塩が完全にコハク酸二ナトリウムから分離されていたことが判明した。
【００６５】
実施例７：２５℃におけるｐＨ２．０の発酵ブロスからのコハク酸二ナトリウムの精製
図９は、温度を２５℃としたことを除いて実施例６と同様に行ったパルス試験を示すものである。ここでもやはり、スクシネートおよび塩が完全に分離していた。
【００６６】
実施例８：ｐＨ２．０の発酵ブロスからのコハク酸ジアンモニウムの精製
図１０Ａは、第２の溶離液としてＮＨ４ＯＨを使用したことを除いて実施例６と同様に実施した他のパルス試験を示すものである。こうすることによりコハク酸ジアンモニウムの流れが生じ、これは、下流の処理で他の窒素含有生成物（商業的に望ましいＮ−メチルピロリジノン等）の生成に使用できる可能性がある。
【００６７】
Ｄ．溶離条件
二峰溶離：
ＸＡＤ−４を用いて塩基である塩基性スクシネートを溶出させる場合、操作温度範囲は約２０℃〜約４０℃である。非官能化樹脂を使用することにより、スクシネートを周囲温度で直接塩および他の酸から分離することが可能であった。一実施例においては、ジャケット付きガラスカラム（直径１．５ｃｍ）にＸＡＤ−４樹脂１００ｍｌを装填した。樹脂を水浴を用いて適切な温度（約２２〜約２５℃）に加熱した。樹脂をＤＩ水約５００ｍｌで洗浄した。発酵由来原料を６ｍｌパルスで装入し、ＤＩ水で流速３ｍｌ／分で溶出させた。適切な時間（例えば、約１．２〜約２．０または約２．５〜約３．０ベッド体積以内、端点を含む）、５〜１０重量％の塩基溶液を溶離液として用いてコハク酸塩を生成した（ＮａＯＨおよびＮＨ４ＯＨの両方を使用したが、ＮＨ３、ＬｉＯＨまたはＫＯＨ等の任意の無機強塩基も機能することができる）。背圧は観測されなかった。塩基である二塩基性スクシネートを溶出させるためのさらなる実験を、溶離にＮａＯＨまたはＫＯＨを使用して４０℃で行った。図８〜１０にまとめた実験データから、ＸＡＤ−４を用いた場合、一旦温度が上昇して４０℃を超えると、他の有機酸からコハク酸を精製する能力を発揮し難くなるようであり、したがって、イソクラティック精製の方がより適した手法であろう。
【００６８】
イソクラティック溶離：
上と同様に、ＸＡＤ−４樹脂１００ｍｌをジャケット付きガラスカラム（直径１．５ｃｍ）に装填する。水浴を用いて樹脂を約６０℃に加熱する。樹脂をＤＩ水約５００ｍｌで洗浄する。発酵由来原料を６ｍｌパルスで装入し、ＤＩ水で流量３ｍｌ／分で溶出させる。溶出を行う間ずっと温度を一定に維持する。背圧は観測されない。
【００６９】
収着材の嵩が使用した溶媒の体積に対し高すぎる場合は対象の化合物の溶出が不完全になるであろう。収着材の嵩が不十分である場合は対象化合物の保持が不完全になり、対象化合物が画分中に溶出するかまたは洗浄溶媒中に溶出するであろう。このような場合は、回収率がより低くなる可能性がある。
【００７０】
クロマトグラフィーの当業者によれば、添付の図面にまとめた結果は、本方法が擬似移動床式クロマトグラフィーを用いたコハク酸の連続分離に適合可能であることを示唆している。本発明者らは、イソクラティック条件を用いて、操作温度を、高温の場合と同じように、特定の樹脂の性能に最適化することを想定している。同様に、この結果を、擬似移動床式クロマトグラフィーを用いた二塩基性スクシネートの連続分離にも適応させることができる。この例においては、水および塩基性溶液の両方を用いた４〜５ゾーンを有する装置となるであろう。この方法は、スクシネートをＮＨ４ＯＨと反応させることにより、他の化学物質の前駆体材料として使用することができるより高純度のコハク酸ジアンモニウムを生成するより単純な方法を提供することができる。さらに、図１２と類似の配置で、アルコール等の有機溶媒を溶離液として使用して溶媒／水中の流れとしてコハク酸を単離できることも想定されている。こうすることにより、下流の処理でそのまま使用することができるコハク酸流れが得られる。
【００７１】
本発明を実施例を用いて全般的におよび詳細に説明してきた。当業者らは、本発明が必ずしも具体的に開示した実施形態に限定されるわけではなく、次に記載する特許請求の範囲およびその均等物により定められる本発明の範囲（現時点で知られているかまたは今後開発される、本発明の範囲内で使用することができる他の均等な構成要素を含む）から逸脱することなく修正および変形が可能であることを理解する。したがって、変更が本発明の範囲を逸脱しない限りは、変更も本発明の範囲に包含されると見なすべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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