(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ｒ）−レチクリンまたは（Ｒ）−レチクリン前駆体を調製するための方法であって、
（ａ）宿主細胞に、
（ｉ）作動可能に連結される成分として、配列番号３２５と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むシトクロムＰ４５０（ＣＹＰ４５０）ポリペプチドをコードする第１の核酸配列と、細胞における第１の核酸配列の発現を制御する第２の核酸配列とを含む第１のキメラ核酸配列と、
（ｉｉ）作動可能に連結される成分として、配列番号３２７または配列番号３２９と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むアルド・ケト還元酵素（ＡＫＲ）ポリペプチドをコードする第３の核酸配列と、細胞における前記第３の核酸配列の発現を制御する第４の核酸配列とを含む第２のキメラ核酸配列と、
を導入するステップと、
（ｂ）前記宿主細胞を増殖させて（Ｒ）−レチクリンまたは（Ｒ）−レチクリン前駆体を産生させるステップと、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法において、前記ＣＹＰ４５０ポリペプチドが、配列番号３２５のアミノ酸配列を含み、前記ＡＫＲポリペプチドが、配列番号３２７または配列番号３２９のアミノ酸配列を含むことを特徴とする方法。
【請求項３】
（Ｒ）−レチクリンまたは（Ｒ）−レチクリン前駆体を調製するための方法であって、
（ａ）作動可能に連結される成分として、
（ｉ）シトクロムＰ４５０（ＣＹＰ４５０）ポリペプチドをコードする第１の核酸配列と、
（ｉｉ）アルド・ケト還元酵素（ＡＫＲ）ポリペプチドをコードする第２の核酸配列と、
（ｉｉｉ）宿主細胞における発現を制御することができる１つまたは複数の核酸配列と
を含むキメラ核酸配列を導入するステップと、
（ｂ）前記宿主細胞を増殖させて、（Ｒ）−レチクリンまたは（Ｒ）−レチクリン前駆体を産生させるステップと
を含み、前記（Ｒ）−レチクリン前駆体が、化学式：
0006783655.tif 000020
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４はそれぞれ、水素原子、ヒドロキシル基、またはメトキシ基であり；
Ｒ５は、水素原子またはメチル基である］
を有するが、（Ｒ）−レチクリンが前記式から除外されており、
前記第１の核酸配列が、配列番号３２５と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードし、かつ、前記第２の核酸配列が、配列番号３２７または配列番号３２９と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、または、
前記キメラ核酸配列が、配列番号３２３と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドをコードすることを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法において、前記第１の核酸配列が、配列番号３２５のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードし、かつ、前記第２の核酸配列が、配列番号３２７または配列番号３２９のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、または、前記キメラ核酸配列が、配列番号３２３のアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドをコードすることを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項３または４に記載の方法において、前記第１および第２の核酸配列が、ＣＹＰ４５０ポリペプチドおよびＡＫＲポリペプチドを含む融合ポリペプチドを産生させるために作動可能に連結されており、前記融合ポリペプチドが配列番号３２３のアミノ酸配列を含むことを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項１乃至５の何れか１項に記載の方法において、前記方法が、（Ｒ）−レチクリンを産生することを特徴とする方法。
【請求項７】
シトクロムＰ４５０（ＣＹＰ４５０）ポリペプチドおよびアルド・ケト還元酵素（ＡＫＲ）ポリペプチドを含む単離された組成物であって、
前記ＣＹＰ４５０ポリペプチドが、配列番号３２５と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、
前記ＡＫＲポリペプチドが、配列番号３２７または配列番号３２９と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、
または、
前記ＣＹＰ４５０ポリペプチドおよび前記ＡＫＲポリペプチドが、配列番号３２３と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドを形成することを特徴とする組成物。
【請求項８】
請求項７に記載の組成物において、前記ＣＹＰ４５０ポリペプチドが、配列番号３２５のアミノ酸配列を含み、かつ、前記ＡＫＲポリペプチドが、配列番号３２７または配列番号３２９のアミノ酸配列を含む、または、前記融合ポリペプチドが、配列番号３２３のアミノ酸配列を含むことを特徴とする組成物。
【請求項９】
請求項７または８に記載の組成物において、前記融合ポリペプチドが、配列番号３２３のアミノ酸配列を含むことを特徴とする組成物。
【請求項１０】
作動可能に連結される成分として、
（ａ）宿主細胞における発現を制御することができる核酸配列と、
（ｂ）（ｉ）配列番号３２５と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むシトクロムＰ４５０（ＣＹＰ４５０）ポリペプチド、および、配列番号３２７または配列番号３２９と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むアルド・ケト還元酵素（ＡＫＲ）ポリペプチド、または、
（ｉｉ）配列番号３２３と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドと、
をコードする核酸配列とを含む組換え発現ベクターであって、前記発現ベクターが、宿主細胞における発現に適していることを特徴とする組換え発現ベクター。
【請求項１１】
請求項１０に記載のベクターにおいて、前記ＣＹＰ４５０ポリペプチドが、配列番号３２５のアミノ酸配列を含み、かつ、前記ＡＫＲポリペプチドが、配列番号３２７または配列番号３２９のアミノ酸配列を含む、または、前記融合ポリペプチドが、配列番号３２３のアミノ酸配列を含むことを特徴とするベクター。
【請求項１２】
植物の外で（Ｒ）−レチクリンを製造する方法であって、
最適な条件下で、（Ｓ）−レチクリンを（Ｒ）−レチクリンに変換することができる１つまたは複数の酵素と（Ｓ）−レチクリンを接触させるステップと
を含み、
前記１つまたは複数の酵素が、
（ａ）配列番号３２５のアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むシトクロムＰ４５０（ＣＹＰ４５０）ポリペプチド、および、配列番号３２７または配列番号３２９と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むアルド・ケト還元酵素（ＡＫＲ）である、または、
（ｂ）ＣＹＰ４５０およびＡＫＲポリペプチドを含み、かつ配列番号３２３と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有する融合ポリペプチドであることを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法において、前記ＣＹＰ４５０ポリペプチドが配列番号３２５のアミノ酸配列を含み、かつ、前記ＡＫＲポリペプチドが、配列番号３２７または配列番号３２９のアミノ酸配列を含む、または前記融合ポリペプチドが、配列番号３２３のアミノ酸配列を含むことを特徴とする方法。
【請求項１４】
ａ）（Ｓ）−レチクリンを１，２−デヒドロレチクリンへと酸化することができる第１のポリペプチド；および／または
ｂ）１，２−デヒドロレチクリンを（Ｒ）−レチクリンへと還元することができる第２のポリペプチド
を発現するキメラ核酸を含む微生物であって、
前記第１のポリペプチドが配列番号３２５と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、前記第２のポリペプチドが配列番号３２７または配列番号３２９と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、または、
前記第１および第２のポリペプチドが、配列番号３２３と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドを形成することを特徴とする微生物。
【請求項１５】
請求項１４に記載の微生物において、前記第１のポリペプチドが配列番号３２５のアミノ酸配列を含み、かつ、前記第２のポリペプチドが配列番号３２７または配列番号３２９のアミノ酸配列を含む、または、前記融合ポリペプチドが配列番号３２３のアミノ酸配列を含むことを特徴とする微生物。
【請求項１６】
請求項１４または１５に記載の微生物において、前記微生物が酵母であることを特徴とする微生物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本特許協力条約出願は、米国特許法第１１９（ｅ）項に基づいて、２０１３年１２月０４日に出願された米国の仮特許出願第６１／９１１，７５９号明細書および２０１４年９月１５日に出願された米国仮特許出願第６２／０５０，３９９号明細書の利益を主張するものであり、これらは両方とも、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本明細書に開示する組成物および方法は、二次代謝産物およびそれを製造するための方法に関する。さらに詳細には、本開示は、（Ｒ）−レチクリンおよびその特定の前駆体、ならびに（Ｒ）−レチクリンおよび上記前駆体を製造するための方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
以下の段落では、本開示の背景について提示する。しかしながら、ここで論じるいかなることも従来技術または当業者の知識の一部であると認めるものではない。
【０００４】
生体の生化学経路は一般に、一次代謝部分または二次代謝部分のいずれかとして分類される。生細胞の一次代謝部分である経路は、エネルギー産生のための異化作用または細胞の構成要素を産生するための同化作用に関与する。一方、二次代謝産物は、生細胞により産生されるが、何ら明白な同化機能も異化機能も示さない。しかしながら、多くの二次代謝産物は、例えば治療剤または天然阻害物質としてなど、多くの点で有用であると長い間認識されてきた。
【０００５】
二次代謝産物（Ｒ）−レチクリンは、ケシ（パパヴェル・ソムニフェルム（Ｐａｐａｖｅｒ  ｓｏｍｎｉｆｅｒｕｍ））ならびに植物のケシ科（Ｐａｐａｖｅｒａｃｅａｅ）、クスノキ科（Ｌａｕｒａｃｅａｅ）、バンレイシ科（Ａｎｎｏｎａｃｅａｅ）、トウダイグサ科（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａｃｅａｅ）、およびクワ科（Ｍｏｒａｃｅａｅ）の他のメンバーにより産生され、モルヒネおよびコデインを含む、医薬として活性な化合物を製造するための原料物質として使用することができる。
【０００６】
植物中の（Ｒ）−レチクリンは、（Ｓ）−レチクリンから生成することが知られている。しかしながら、どの遺伝子およびポリペプチドがこの転換反応を触媒することに関与しているかは明らかではない。
【発明の概要】
【０００７】
現在、（Ｒ）−レチクリンは、ケシなどの天然供給源から採取することができる。あるいは、（Ｒ）−レチクリンは合成的に調製することができる。しかしながら、（Ｒ）−レチクリンの既存の製造方法は、（Ｒ）−レチクリンの低収率および／または高コストが問題となっている。（Ｓ）−レチクリンから（Ｒ）−レチクリンを生合成的に製造するための方法は存在しない。したがって、当技術分野では、（Ｒ）−レチクリンを合成するための方法の改善が求められている。
【０００８】
以下の段落は、その後のより詳細な説明に読者を案内することを意図するものであり、本開示の請求内容を定義するものでも限定するものでもない。
【０００９】
本開示は、二次代謝産物（Ｒ）−レチクリンおよびその特定の前駆体に関し、また（Ｒ）−レチクリンおよびその特定の前駆体の製造方法に関する。
【００１０】
したがって、本開示は、少なくとも１つの態様において、（Ｒ）−レチクリンまたは（Ｒ）−レチクリンの前駆体を製造する方法であって、
（ａ）ベンジルイソキノリン誘導体を準備するステップと、
（ｂ）（Ｒ）−レチクリンまたは（Ｒ）−レチクリン前駆体へのベンジルイソキノリン誘導体の変換を可能にする条件下で、ベンジルイソキノリン誘導体を（Ｒ）−レチクリンまたは（Ｒ）−レチクリン前駆体に変換することができる酵素混合物とベンジルイソキノリン誘導体を接触させるステップと
を含む方法の少なくとも１つの実施形態を提供する。
【００１１】
本開示はさらに、少なくとも１つの態様において、（Ｒ）−レチクリンまたはその前駆体を製造する方法であって、
（ａ）ベンジルイソキノリン誘導体を準備するステップと、
（ｂ）（Ｒ）−レチクリンまたは（Ｒ）−レチクリン前駆体へのベンジルイソキノリン誘導体の変換を可能にする条件下で、ベンジルイソキノリン誘導体を（Ｒ）−レチクリンまたは（Ｒ）−レチクリン前駆体に変換することができる酵素混合物とベンジルイソキノリン誘導体を接触させるステップと
を含み、
ベンジルイソキノリン誘導体は、化学式（Ｉ）：
0006783655.tif 000002
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４はそれぞれ、水素原子、ヒドロキシル基、またはメトキシ基を表し；
Ｒ５は、水素原子またはメチル基を表す］
を有し；かつ（Ｒ）−レチクリン前駆体は、化学式（ＩＩ）：
0006783655.tif 000003
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４はそれぞれ、水素原子、ヒドロキシル基、またはメトキシ基を表し；
Ｒ５は、水素原子またはメチル基を表す］
を有するが、化学式（ＩＩ）は（Ｒ）−レチクリンを除外する方法の少なくとも１つの実施形態を提供する。
【００１２】
好ましい実施形態では、ベンジルイソキノリン誘導体において、Ｒ１はメトキシ基であり；Ｒ２はヒドロキシル基であり；Ｒ３はヒドロキシル基であり；Ｒ４はメトキシ基であり、Ｒ５はメチル基であり、（Ｓ）−レチクリンとしても知られる化学式：
0006783655.tif 000004
で示される。
【００１３】
さらに好ましい実施形態では、酵素混合物は、ベンジルイソキノリン誘導体を酸化して、化学式（ＩＶ）：
0006783655.tif 000005
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４はそれぞれ、水素原子、ヒドロキシル基、またはメトキシ基を表し；
Ｒ５は、水素原子またはメチル基を表す］
を有する酸化ベンジルイソキノリン誘導体を形成させることができる第１のポリペプチドと、酸化ベンジルイソキノリン誘導体（ＩＶ）を還元して、（Ｒ）−レチクリンまたは化学式（ＩＩ）：
0006783655.tif 000006
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４はそれぞれ、水素原子、ヒドロキシル基、またはメトキシ基を表し；
Ｒ５は、水素原子またはメチル基を表す］
（ただし、化学式（ＩＩ）は（Ｒ）−レチクリンを除外する）を有する（Ｒ）−レチクリン前駆体を形成させることができる第２のポリペプチドとを含む。
【００１４】
さらに好ましい実施形態では、酵素混合物は、（Ｓ）−レチクリンを酸化して１，２−デヒドロレチクリンを形成させることができる第１のポリペプチドと、１，２−デヒドロレチクリンを還元して（Ｒ）−レチクリンを形成させることができる第２のポリペプチドとを含む。
【００１５】
さらに好ましい実施形態では、ベンジルイソキノリン誘導体を酸化して酸化ベンジルイソキノリン誘導体を形成させることができる第１のポリペプチドは、シトクロムＰ４５０であり、酸化ベンジルイソキノリン誘導体を還元して（Ｒ）−レチクリンまたは（Ｒ）−レチクリン前駆体を形成させることができる第２のポリペプチドは、アルド・ケト還元酵素（ＡＫＲ）である。
【００１６】
本開示によれば、本方法は、以下に限定されるものではないが、植物、植物細胞培養物、微生物、および無細胞系を含む、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで行うことができる。
【００１７】
本明細書ではさらに、ＣＹＰ４５０およびＡＫＲまたはそれらの混合物からなる群から選択される酵素を調製するための方法であって、
（ａ）作動可能に連結される成分として、
（ｉ）ＣＹＰ４５０およびＡＫＲからなる群から選択されるポリペプチドの１つまたは複数をコードする１つまたは複数の核酸配列と、
（ｉｉ）宿主細胞における発現を制御することができる１つまたは複数の核酸配列と
を含むキメラ核酸配列を準備するステップと、
（ｂ）キメラ核酸配列を宿主細胞に導入し、宿主細胞を増殖させて、ＣＹＰ４５０およびＡＫＲからなる群から選択されるポリペプチドを産生させるステップと、
（ｃ）ＣＹＰ４５０およびＡＫＲからなる群から選択されるポリペプチドを宿主細胞から回収するステップと
を含む方法を提供する。
【００１８】
本明細書ではまたさらに、（Ｒ）−レチクリンまたは化学式（ＩＩ）を有する（Ｒ）−レチクリン前駆体を調製するための方法であって、
（ａ）作動可能に連結される成分として、
（ｉ）ＣＹＰ４５０ポリペプチドをコードする第１の核酸配列と、
（ｉｉ）ＡＫＲポリペプチドをコードする第２の核酸配列と、
（ｉｉｉ）宿主細胞における発現を制御することができる１つまたは複数の核酸配列と
を含むキメラ核酸配列を準備するステップと、
（ｂ）キメラ核酸配列を宿主細胞に導入し、宿主細胞を増殖させて、ＣＹＰ４５０およびＡＫＲを産生させ、かつ（Ｒ）−レチクリンまたは化学式（ＩＩ）を有する（Ｒ）−レチクリン前駆体を産生させるステップと、
（ｃ）（Ｒ）−レチクリンまたは化学式（ＩＩ）を有する（Ｒ）−レチクリン前駆体を回収するステップと
を含む方法を提供する。
【００１９】
好ましい実施形態では、第１および第２の核酸配列は、ＣＹＰ４５０およびＡＫＲを含む融合ポリペプチドを産生させるために作動可能に連結される。
【００２０】
本明細書ではさらに、（Ｒ）−レチクリンまたは化学式（ＩＩ）を有する（Ｒ）−レチクリン前駆体を調製するための方法であって、
（ａ）作動可能に連結される成分として、ＣＹＰ４５０ポリペプチドをコードする第１の核酸配列と、細胞におけるこの第１の核酸配列の発現を制御する第１の核酸配列とを含む第１のキメラ核酸配列を準備するステップと、
（ｂ）作動可能に連結される成分として、ＡＫＲポリペプチドをコードする第２の核酸配列と、細胞におけるこの第２の核酸配列の発現を制御する第２の核酸配列とを含む第２のキメラ核酸配列を準備するステップと、
（ｃ）第１および第２のキメラ核酸配列を宿主細胞に導入し、宿主細胞を増殖させて、ＣＹＰ４５０およびＡＫＲを産生させ、かつ（Ｒ）−レチクリンまたは化学式（ＩＩ）を有する（Ｒ）−レチクリン前駆体を産生させるステップと、
（ｄ）（Ｒ）−レチクリンまたは化学式（ＩＩ）を有する（Ｒ）−レチクリン前駆体を回収するステップと
を含む方法を提供する。
【００２１】
本開示はさらに、（Ｓ）−レチクリンを酸化して１，２−デヒドロレチクリンを形成させることができる第１のポリペプチドと、１，２−デヒドロレチクリンを還元して（Ｒ）−レチクリンを形成させることができる第２のポリペプチドとを含む酵素混合物を含む、（Ｒ）−レチクリンを製造するための組成物を提供する。
【００２２】
好ましい実施形態では、酵素混合物は、（Ｓ）−レチクリンを酸化して１，２−デヒドロレチクリンを形成させることができる第１のポリペプチドと、１，２−デヒドロレチクリンを還元して（Ｒ）−レチクリンを形成させることができる第２のポリペプチドとを含む。
【００２３】
さらに好ましい実施形態では、（Ｓ）−レチクリンを酸化して１，２−デヒドロレチクリンを形成させることができる第１のポリペプチドは、シトクロムＰ４５０であり、１，２−デヒドロレチクリンを還元して（Ｒ）−レチクリンを形成させることができる第２のポリペプチドは、アルド・ケト還元酵素である。
【００２４】
本発明はまたさらに、（Ｓ）−レチクリンを酸化して１，２−デヒドロレチクリンを形成させることができる第１のポリペプチドと、１，２−デヒドロレチクリンを還元して（Ｒ）−レチクリンを形成させることができる第２のポリペプチドとをコードする核酸配列を含む組成物を提供する。好ましい実施形態では、核酸配列は、一緒になって（Ｓ）−レチクリンを酸化して１，２−デヒドロレチクリンを形成させることができるシトクロムＰ４５０およびアルド・ケト還元酵素と、２−デヒドロレチクリンを還元して（Ｒ）−レチクリンを形成させることができる第２のポリペプチドとをコードする核酸配列である。
【００２５】
本開示はさらに、試料、例えば植物細胞を含む試料中のＡＫＲおよび／またはＣＹＰ４５０の有無を検出するために、植物細胞および他の細胞におけるＡＫＲおよび／またはＣＹＰ４５０の発現を調節するために、また植物集団における、ＡＫＲおよび／またはＣＹＰ４５０に遺伝学的に連鎖した遺伝子の分離を評価するためのマーカーとして、ＡＫＲおよび／またはＣＹＰ４５０をコードする核酸配列を使用する方法を含む。
【００２６】
さらなる実施形態では、本開示は、ＡＫＲおよび／またはＣＹＰ４５０をコードする核酸配列の有無を検出する方法であって、
（ａ）ＡＫＲおよび／またはＣＹＰ４５０をコードする核酸配列を含むと推測される試料を準備するステップと、
（ｂ）ＡＫＲおよび／またはＣＹＰ４５０をコードするヌクレオチド配列の存在について試料を分析するステップと
を含む方法を提供する。
【００２７】
さらなる実施形態では、本開示は、ＡＫＲおよび／またはＣＹＰ４５０を天然に発現する細胞における核酸配列の発現を調節するための方法であって、
（ａ）ＡＫＲおよび／またはＣＹＰ４５０を天然に発現する細胞を準備するステップと、
（ｂ）細胞を突然変異誘発させるステップと、
（ｃ）細胞を増殖させて複数の細胞を得るステップと、
（ｄ）この複数の細胞が、レベル調節されたＡＫＲおよび／またはＣＹＰ４５０を含む細胞を含むか否かを判定するステップと
を含む方法を提供する。
【００２８】
またさらなる実施形態では、本開示は、細胞におけるＡＫＲおよび／またはＣＹＰ４５０の発現を低減する方法であって、
（ａ）ＡＫＲおよび／またはＣＹＰ４５０を発現する細胞を準備するステップと、
（ｂ）細胞におけるＡＫＲおよび／またはＣＹＰ４５０の発現をサイレンシングするステップと
を含む方法を提供する。
【００２９】
本開示の他の特徴と利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、詳細な説明は、本開示の好ましい実行形態を示すものであるが、本開示の精神および範囲に入る種々の変更形態および修正形態が詳細な説明から当業者には明らかになる以上、例示のみを目的としてなされるものであることを理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
以下の本開示において、図に関して説明する段落を提示する。本明細書に提供する図は、例示目的のために提供されるものであり、本開示を限定することを意図するものではない。
【００３１】
【図１】図１は、種々のベンジルイソキノリン前駆体の（Ｒ）−レチクリン、（Ｒ）−レチクリン前駆体、モルヒネ、およびサルタリジンへの合成経路を示す図である。記載化合物の化学構造が含まれる。
【図２】図２は、（Ｓ）−レチクリンおよびその合成中間体から（Ｒ）−レチクリンを製造するための合成経路を示す図である。合成中間体の化学構造および合成中間体の化学変換を触媒することができる酵素が含まれる。
【図３】図３は、実施例１にさらに詳細に記載される、（Ｓ）−レチクリンの（Ｒ）−レチクリンへの変換を提供する本開示の実施形態の一連のＨＰＬＣトレースを示す図である。
【図４】図４は、実施例２にさらに詳細に記載される、（Ｓ）−レチクリンの１，２−デヒドロレチクリンへの変換を提供する本開示の実施形態の一連のＨＰＬＣトレースを示す図である。
【図５】図５は、実施例３にさらに詳細に記載される、１，２−デヒドロレチクリンの（Ｒ）−レチクリンへの変換を提供する本開示の実施形態の一連のＨＰＬＣトレースを示す図である。
【図６】図６は、実施例４にさらに詳細に記載される、（Ｓ）−Ｎ−メチルコクラウリンの（Ｒ）−Ｎ−メチルコクラウリンへの変換を提供する本開示の実施形態の一連のＨＰＬＣトレースを示す図である。
【図７】図７は、実施例５にさらに詳細に記載される、遺伝子サイレンシング実験に関して得られた結果を示す図である。図７Ａおよび図７Ｃは、ＲＥＰＩ遺伝子の２つの異なる領域を標的にし、図７Ｂは、ＣＯＲ１．３遺伝子の１つの領域を標的にしている。図７Ａ〜７Ｃのそれぞれにおいて、異なるパネルは以下のことを表す。（パネルＡ）ｐＴＲＶ２コンストラクトを構築するために使用したＲＥＰＩまたはＣＯＲ１．３のｃＤＮＡのフラグメント（灰色ボックス）。黒色ボックスはコード領域を表し、一方黒線は隣接する非翻訳領域である。矢印は、ｑＲＴ−ＰＣＲ分析に使用したプライマーのアニーリング部位を示す。（パネルＢ）ｐＴＲＶ２−ＲＥＰＩ−ａ、ｐＴＲＶ２−ＲＥＰＩ−５’、もしくはｐＴＲＶ２ＣＯＲ１．３のコンストラクト、またはｐＴＲＶ２空ベクター対照を保持するアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）が浸潤した個々の植物から抽出した全ＲＮＡを使用するＲＴ−ＰＣＲによるｐＴＲＶ２ベクターの検出を示す臭化エチジウム染色アガロースゲル。ＰＣＲプライマー（ＴＲＶ２−ＭＣＳ）を、ｐＴＲＶ２のマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）に隣接する領域にアニールするように設計した。（パネルＣ）対照（ｐＴＲＶ２）と比較した、ＲＥＰＩサイレンシング（ｐＴＲＶ２−ＲＥＰＩ−ａ；ｐＲＴＶ２−ＲＥＰＩ−５’）またはＣＯＲｌ．３サイレンシング（ｐＲＴＶ２−ＣＯＲ１．３）植物における茎および根の相対的なＲＥＰＩまたはＣＯＲ１．３転写物レベル。（パネルＤ）対照（ｐＴＲＶ２）と比較した、ＲＥＰＩサイレンシング（ｐＴＲＶ２−ＲＥＰＩ−ａ；ｐＲＴＶ２−ＲＥＰＩ−５’）またはＣＯＲｌ、３サイレンシング（ｐＲＴＶ２−ＣＯＲ１．３）植物における主要なアルカロイドのプロファイルを示す全イオンクロマトグラム。（パネルＥ）対照（ｐＴＲＶ２）と比較して、ＲＥＰＩサイレンシング（ｐＴＲＶ２−ＲＥＰＩ−ａ；ｐＲＴＶ２−ＲＥＰＩ−５’）またはＣＯＲｌ．３サイレンシング（ｐＲＴＶ２−ＣＯＲ１．３）植物において抑制されたレベルを示す主要なラテックスアルカロイドおよび他のアルカロイドの相対的存在量。（パネルＦ）対照（ｐＴＲＶ２）と比較した、ＲＥＰＩサイレンシング（ｐＴＲＶ２−ＲＥＰＩ−ａ；ｐＲＴＶ２−ＲＥＰＩ−５’）またはＣＯＲｌ、３サイレンシング（ｐＲＴＶ２−ＣＯＲ１．３）植物における（Ｓ）−レチクリンと（Ｒ）−レチクリンとの比。アスタリスクは、不対両側スチューデントｔ検定（ｐ＜０．０５）を使用して判定された有意差を示す。バーは、６つの個々に浸潤された植物のそれぞれについて、３つの技術的レプリケートから得られた値の平均±標準偏差を表す。
【図８】図８は、実施例６にさらに詳細に記載される、還元剤および酸化剤の存在下でＡＫＲポリペプチドの活性を評価すると得られた結果を示す図である。図８Ａは、パパヴェル・ソムニフェルム（Ｐａｐａｖｅｒ  ｓｏｍｎｉｆｅｒｕｍ）のレチクリンエピメラーゼ（ＲＥＰＩ）の１，２−デヒドロレチクリンレダクターゼ（ＰｓＤＲＲ）成分の活性を示す。ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの存在下で、ＰｓＤＲＲは、１，２−デヒドロレチクリン［１］を（Ｒ）−レチクリン［２］に変換する（図８Ａ、パネルＡ）。ＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋の存在下で、ＰｓＤＲＲは、（Ｒ）−レチクリン［２］を１，２−デヒドロレチクリン［１］に変換する（図８Ａ、パネルＢ）。図８Ｂは、パパヴェル・ロエアス（Ｐａｐａｖｅｒ  ｒｈｏｅａｓ）由来の１，２−デヒドロレチクリンレダクターゼ（ＰｒＤＲＲ）の活性を示す。ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの存在下で、ＰｒＤＲＲは、１，２−デヒドロレチクリン［１］を（Ｒ）−レチクリン［２］に変換する（図８Ｂ、パネルＡ）。ＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋の存在下で、ＰｒＤＲＲは、（Ｒ）−レチクリン［２］を１，２−デヒドロレチクリン［１］に変換する（図８Ｂ、パネルＢ）。
【図９】図９は、実施例７にさらに詳細に記載される、ＣＹＰ４５０およびＡＫＲポリペプチドのｐＨ依存性を評価すると得られた結果を示す図である。ＮＡＤＰＨ（ＰｓＤＲＳ順方向）の存在下およびＮＡＤＰ＋（ＰｓＤＲＳ逆方向）の存在下で、パヴェル・ソムニフェルム（Ｐａｐａｖｅｒ  ｓｏｍｎｉｆｅｒｕｍ）のＣＹＰ４５０（ＰｓＤＲＳ）およびＡＫＲを使用して得られた結果を示す（パネルＡ）。さらに、ＮＡＤＰＨ（ＰｒＤＲＳ順方向）の存在下およびＮＡＤＰ＋（ＰｒＤＲＳ逆方向）の存在下で、パパヴェル・ロエアス（Ｐａｐａｖｅｒ  ｒｈｏｅａｓ）のＣＹＰ４５０（ＰｒＤＲＳ）およびＡＫＲを使用して得られた結果を示す（パネルＢ）。
【図１０】図１０は、実施例８にさらに詳細に記載される、ウイルス誘導遺伝子サイレンシング（ＶＩＧＳ）を受けたケシ植物におけるＲＥＰＩおよびＣＯＲの転写物レベルの同時抑制を示す図である。ＣＯＲのサイレンシングが標的にされた植物（ｐＴＲＶ２−ＣＯＲ１．３）は、ＣＯＲの有意な抑制を示し（図１０−下部パネル）、さらにＲＥＰＩの抑制も示した（図１０−上部パネル）。ＲＥＰＩおよびＣＯＲの両方に見出される保存領域を使用して、ＲＥＰＩのサイレンシングが標的にされた植物（ｐＴＲＶ２−ＲＥＰＩａ）も、ＣＯＲ（図１０−下部パネル）およびＲＥＰＩ（図１０−上部パネル）の有意な抑制を示した。ＲＥＰＩのユニークな領域であって、ＣＯＲには見出されない領域を使用して、ＲＥＰＩのサイレンシングが標的にされた植物（ｐＴＲＶ２−ＲＥＰＩｂ）は、ＣＯＲの同時サイレンシングを示さなかった（図１０−下部パネル）。ｐＴＲＶ２は空ベクトル対照である。アスタリスクは、不対スチューデントｔ検定（Ｐ＜０．０５）を使用すると、対照と比較して有意に差がある値を示す。エラーバーは平均±標準偏差を表す。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
各請求内容の実施形態の例を提供するために、種々の組成物および方法を以下に記載する。以下に記載の実施形態は、請求内容を何ら限定するものではなく、いずれの請求内容も、以下に記載のものと異なる方法、工程、組成物、またはシステムを包含することができる。請求内容は、以下に記載のいずれか１つの組成物、方法、システム、または工程の特徴のすべてを有する組成物または方法、あるいは以下に記載の組成物、システム、または方法の複数またはすべてに共通の特徴に限定されるものではない。以下に記載の組成物、システム、方法、または工程がいずれの請求内容の実施形態でもないことはあり得る。本文書に請求されていない、以下に記載の組成物、システム、方法、または工程において開示されるいずれの内容も、別の保護文書、例えば継続特許出願の内容であり得るものであり、出願人、発明者、または所有者は、本文書における開示によって、何らそのような内容を放棄、否認、または公開する意図はない。
【００３３】
本明細書に使用する「実質的に」、「本質的に」、「約」、および「およそ」などの程度に関する用語は、最終結果があまり変化しないような、修飾された用語の妥当な量の偏差を意味する。程度に関するこのような用語は、この偏差によりそれが修飾する用語の意味が打ち消されない場合に、修飾された用語の偏差を含むものとして解釈されるべきである。
【００３４】
本明細書で使用する場合、「および／または」という語法は、包含的論理和を表すことを意図する。すなわち、「Ｘおよび／またはＹ」は、例えば、ＸもしくはＹまたはその両方を意味することを意図する。さらなる例として、「Ｘ、Ｙ、および／またはＺ」は、ＸもしくはＹもしくはＺまたはそれらの組合せを意味することを意図する。
【００３５】
刊行物、特許、および特許出願はすべて、あたかも個々の刊行物それぞれであるように、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００３６】
本明細書で上述するように、本開示は、二次代謝産物（Ｒ）−レチクリンおよびその前駆体に関し、また（Ｒ）−レチクリンおよびその前駆体の製造方法に関する。本開示はさらに、（Ｓ）−レチクリンを変換して（Ｒ）−レチクリンを形成させる反応を触媒することができる特定の酵素に関する。本明細書に提供する方法は、（Ｒ）−レチクリンおよびその前駆体を製造する新規で効率的な手段を表す。本明細書に提供する方法は、化学合成に依存せず、工業規模で行うことができる。本発明者らが知る限りでは、本開示は、通常は（Ｒ）−レチクリンおよびその前駆体を合成することができない生細胞を使用して、（Ｒ）−レチクリンおよびその前駆体を製造する方法論を初めて提供する。（Ｒ）−レチクリンおよびその前駆体を経済的に抽出することができる供給源として、そのような細胞を使用することができる。本開示に従って産生される（Ｒ）−レチクリンおよびその前駆体は、モルヒネおよびコデインを含む医薬組成物の製造にとりわけ有用である。
【００３７】
したがって、本開示は、少なくとも１つの態様において、（Ｒ）−レチクリンまたはその前駆体を製造する方法であって、
（ａ）ベンジルイソキノリン誘導体を準備するステップと、
（ｂ）（Ｒ）−レチクリンまたは（Ｒ）−レチクリン前駆体へのベンジルイソキノリン誘導体の変換を可能にする条件下で、ベンジルイソキノリン誘導体を（Ｒ）−レチクリンまたは（Ｒ）−レチクリン前駆体に変換することができる酵素混合物とベンジルイソキノリン誘導体を接触させるステップと
を含む方法の少なくとも１つの実施形態を提供する。
【００３８】
本開示はさらに、少なくとも１つの態様において、（Ｒ）−レチクリンまたは（Ｒ）−レチクリンの前駆体を製造する方法であって、
（ａ）ベンジルイソキノリン誘導体を準備するステップと、
（ｂ）（Ｒ）−レチクリンまたは（Ｒ）−レチクリン前駆体へのベンジルイソキノリン誘導体の変換を可能にする条件下で、ベンジルイソキノリン誘導体を（Ｒ）−レチクリンまたは（Ｒ）−レチクリン前駆体に変換することができる酵素混合物とベンジルイソキノリン誘導体を接触させるステップと
を含み、
ベンジルイソキノリン誘導体は、化学式（Ｉ）：
0006783655.tif 000007
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４はそれぞれ、水素原子、ヒドロキシル基、またはメトキシ基を表し；
Ｒ５は、水素原子またはメチル基を表す］
を有し；かつＲ−レチクリン前駆体は、化学式：
0006783655.tif 000008
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４はそれぞれ、水素原子、ヒドロキシル基、またはメトキシ基を表し；
Ｒ５は、水素原子またはメチル基を表す］
を有する方法の少なくとも１つの実施形態を提供する。
【００３９】
定義
「ベンジルイソキノリン誘導体」という用語は、化学式（ＶＩＩ）：
0006783655.tif 000009
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４はそれぞれ独立にまたは同時に、水素原子、ヒドロキシル基、アルキル基（例えば、Ｃ１〜Ｃ１０−アルキル）またはアルコキシ基（例えば、Ｃ１〜Ｃ１０−アルコキシ）であり、Ｒ５は水素原子またはアルキル基（例えば、Ｃ１〜Ｃ１０−アルキル）を表す］を有する化合物を指す。
【００４０】
本明細書で使用する「（Ｒ）−レチクリン前駆体」という用語は、化学式（ＶＩＩＩ）：
0006783655.tif 000010
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４はそれぞれ独立にまたは同時に、水素原子、ヒドロキシル基、アルキル基（例えば、Ｃ１〜Ｃ１０−アルキル）またはアルコキシ基（例えば、Ｃ１〜Ｃ１０−アルコキシ）であり、Ｒ５は、水素原子またはアルキル基（例えば、Ｃ１〜Ｃ１０−アルキル）を表す］を有する化合物を指すが、化学式（ＶＩＩＩ）は（Ｒ）−レチクリンを除外する、すなわち、本明細書で使用する（Ｒ）−レチクリン前駆体という用語から具体的に除外されるのは、Ｒ１がメトキシ基、Ｒ２がヒドロキシル基、Ｒ３がヒドロキシル基、Ｒ４がメトキシ基、Ｒ５がメチル基である化合物である。
【００４１】
本明細書で使用する「（Ｓ）−レチクリン」という用語は、レチクリンの（Ｓ）−エナンチオマーおよび化学構造（ＩＩＩ）：
0006783655.tif 000011
を有する化合物を指す。
【００４２】
「酸化ベンジルイソキノリン誘導体」という用語は、化学式（ＩＸ）：
0006783655.tif 000012
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４はそれぞれ独立にまたは同時に、水素原子、ヒドロキシル基、アルキル基（例えば、Ｃ１〜Ｃ１０−アルキル）またはアルコキシ基（例えばＣ１〜Ｃ１０−アルコキシ）であり、Ｒ５は、水素原子またはアルキル基（例えば、Ｃ１〜Ｃ１０−アルキル）を表す］を有する化合物を指す。
【００４３】
本明細書で使用する「（Ｒ）−レチクリン」という用語は、レチクリンの（Ｒ）−エナンチオマーおよび化学構造（Ｖ）：
0006783655.tif 000013
を有する化合物を指す。
【００４４】
「１，２−デヒドロレチクリン」という用語は、化学構造（ＶＩ）：
0006783655.tif 000014
を有する化合物を指す。
【００４５】
本明細書で互換的に使用することができる、「（Ｒ）−レチクリン経路」または「（Ｒ）−レチクリン合成経路」という用語は、図１に示す（Ｒ）−レチクリンの合成のための代謝経路を指す。（Ｒ）−レチクリン経路内の第１の化合物が、この経路の第２の化合物の“”として参照される場合、第１の化合物の合成が第２の化合物の合成に先行することを本明細書では意味する。反対に、（Ｒ）−レチクリン経路において、第１の化合物が第２の化合物の「下流」として参照される場合、第２の化合物の合成が第１の化合物の合成に先行することを本明細書では意味する。
【００４６】
本明細書で使用する「酵素混合物」という用語は、１つまたは２つ以上の酵素を含む混合物を指す。２つ以上の酵素を含有する混合物では、酵素は、相互作用または配位して混合物を形成することなく、独立して生物学的に活性であり得る。一実施形態では、酵素混合物に含有される酵素は、独立した不連続のポリペプチド鎖として結合または相互作用することができる。別の実施形態では、酵素混合物は、２つのポリペプチド間の融合ポリペプチドとして調製することができる。
【００４７】
本明細書で互換的に使用することができる、「シトクロムＰ４５０」、「ＣＹＰ４５０」、または「Ｐ４５０」という用語は、（ｉ）例えば、配列番号２１９〜配列番号３２１；配列番号３２５；および配列番号３３８を含む、本明細書に示す任意のＣＹＰ４５０ポリペプチドを構成するアミノ酸配列に実質的に同一であるか、または（ｉｉ）同義コドンの使用を除いて、本明細書に示す任意のＣＹＰ４５０ポリペプチドをコードする任意の核酸配列に、少なくとも中程度のストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる核酸配列によりコードされるアミノ酸残基の配列を含むあらゆる酵素を指す。
【００４８】
本明細書で互換的に使用することができる、「アルド・ケト還元酵素」または「ＡＫＲ」という用語は、（ｉ）例えば、配列番号５９〜配列番号１１５；配列番号３２７；配列番号３２９；配列番号３３０；および配列番号３４０を含む、本明細書に示す任意のＡＫＲポリペプチドを構成するアミノ酸配列に実質的に同一であるか、または（ｉｉ）同義コドンの使用を除いて、本明細書に示す任意のＡＫＲポリペプチドをコードする任意の核酸配列に、少なくとも中程度のストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる核酸配列によりコードされるアミノ酸残基の配列を含むあらゆる酵素を指す。
【００４９】
本明細書で使用する「核酸配列」という用語は、天然に存在する塩基、糖、および糖間（骨格）結合からなるヌクレオシドまたはヌクレオチドの単量体の配列を指す。この用語はまた、天然に存在しないモノマーまたはその一部を含む修飾または置換配列を含む。本開示の核酸配列は、デオキシリボ核酸配列（ＤＮＡ）であってもリボ核酸配列（ＲＮＡ）であってもよく、アデニン、グアニン、シトシン、チミジン、およびウラシルを含む天然に存在する塩基を含むことができる。配列はまた、修飾塩基を含有することができる。そのような修飾塩基の例としては、アザおよびデアザアデニン、グアニン、シトシン、チミジン、およびウラシル、ならびにキサンチンおよびヒポキサンチンが挙げられる。
【００５０】
本明細書で互換的に使用する「ＣＹＰ４５０をコードする核酸配列」および「ＣＹＰ４５０ポリペプチドをコードする核酸配列」という用語は、例えば、配列番号１１６〜配列番号２１８；配列番号３２４；および配列番号３３７を含む、ＣＹＰ４５０ポリペプチドをコードするあらゆる核酸配列を指す。ＣＹＰ４５０ポリペプチドをコードする核酸配列はさらに、（ｉ）本明細書に示すＣＹＰ４５０ポリペプチド配列に実質的に同一であるポリペプチドをコードするか；または（ｉｉ）同義コドンの使用を除いて、少なくとも中程度のストリンジェントな条件下で、本明細書に示す任意のＣＹＰ４５０核酸配列にハイブリダイズするか、もしくは少なくとも中程度のストリンジェントな条件下で、それにハイブリダイズするであろうあらゆる核酸配列を含む。
【００５１】
本明細書で互換的に使用する「ＡＫＲをコードする核酸配列」および「ＡＫＲポリペプチドをコードする核酸配列」という用語は、例えば、配列番号１〜配列番号５８；配列番号３２６；配列番号３２８；および配列番号３３９を含む、ＡＫＲポリペプチドをコードするあらゆる核酸配列を指す。ＡＫＲポリペプチドをコードする核酸配列はさらに、（ｉ）本明細書に示すＡＫＲポリペプチド配列に実質的に同一であるポリペプチドをコードするか；または（ｉｉ）同義コドンの使用を除いて、少なくとも中程度のストリンジェントな条件下で、本明細書に示す任意のＣＹＰ４５０核酸配列にハイブリダイズするか、もしくは少なくとも中程度のストリンジェントな条件下で、それにハイブリダイズするであろうあらゆる核酸配列を含む。
【００５２】
「実質的に同一の」という用語は、２つのポリペプチド配列が、好ましくは少なくとも７０％同一であり、より好ましくは少なくとも８５％同一であり、最も好ましくは少なくとも９５％同一であり、例えば、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であることを意味する。２つのポリペプチド配列間の同一性のパーセントを決定するために、そのような２つの配列のアミノ酸配列は、例えば、２つの配列間で最高位のマッチが得られ、かつ２つの配列間で同一アミノ酸の数が決定されるように、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．，１９８１，２：４８２）により修正された、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９７０，４８：４４３）のアライメント方法を使用して、アライメントされる。２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性を算出する方法は、一般に当技術分野で認識されており、例えば、ＣａｒｉｌｌｏおよびＬｉｐｔｏｎ（ＳＩＡＭ  Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．，１９８８，４８：１０７３）に記載のもの、およびＣｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，ｅ．ｄ．Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８８，Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓに記載のものが含まれる。一般に、そのような計算のためにコンピュータプログラムが使用される。この点に関して使用することができるコンピュータプログラムとしては、以下に限定されるものではないが、ＧＣＧ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９８４，１２：３８７）ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、およびＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．，１９９０：２１５：４０３）が挙げられる。２つのポリペプチド間のパーセント同一性を決定するための特に好ましい方法には、２つの配列のうちの一方の全長の少なくとも５０％がアライメントに含まれる２つの配列間で最高位マッチが得られるように、１０のギャップ開始ペナルティおよび０．１のギャップ伸長ペナルティを使用して、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  Ｓ  ＆  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｊ  Ｇ，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５−１０９１９）と一緒に用いる、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアルゴリズム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ  Ｄ，Ｈｉｇｇｉｎｅｓ，Ｄ  Ｇ  ａｎｄ  Ｇｉｂｓｏｎ  Ｔ  Ｊ，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ  ２２（２２）：４６７３−４６８０）が含まれる。
【００５３】
「少なくとも中程度のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、溶液中の２つの相補的な核酸分子間の選択的なハイブリダイゼーションを促進する条件が選択されていることを意味する。ハイブリダイゼーションは、核酸配列分子のすべてに生じることも一部に生じることもある。ハイブリダイズする部分は、典型的には、少なくとも１５（例えば、２０、２５、３０、４０、または５０）ヌクレオチド長である。当業者ならば、核酸二本鎖またはハイブリッドの安定性は、ナトリウム含有緩衝液中では、ナトリウムイオン濃度および温度の関数であるＴｍにより判定される（Ｔｍ＝８１．５℃−１６．６（Ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（％（Ｇ＋Ｃ）−６００／ｌ）、または同様の式）ことを認識していよう。したがって、ハイブリッド安定性を決定する洗浄条件のパラメーターは、ナトリウムイオン濃度および温度である。既知核酸分子に同様であるが同一ではない分子を同定するために、１％のミスマッチがＴｍの１℃の低下をもたらすと仮定することができ、例えば、９５％超の同一性を有する核酸分子を求める場合、最終的な洗浄温度は約５℃低下させることになる。これらの考察に基づいて、当業者は、適切なハイブリダイゼーション条件を容易に選択することができる。好ましい実施形態では、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件が選択される。例として、下記の条件を、ストリンジェントなハイブリダイゼーションを達成するために使用することができる：Ｔｍ（上記の式に基づいて）−５℃における５×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）／５×デンハート液／１．０％ＳＤＳでのハイブリダイゼーション、次いで６０℃での０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳの洗浄。中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、４２℃で３×ＳＳＣの洗浄ステップを含む。しかしながら、代替のバッファー、塩、および温度を使用して、等価なストリンジェンシーを達成することができることは理解されている。ハイブリダイゼーション条件に関するさらなる手引きは、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．，１９８９，６．３．１．−６．３．６、およびＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９，Ｖｏｌ．３に見出される。
【００５４】
核酸配列の文脈では、本明細書で使用する「キメラ」という用語は、天然では連結していない少なくとも２つの連結した核酸配列を指す。キメラ核酸配列には、異なる天然起源からなる連結した核酸配列が含まれる。例えば、ＣＯＲタンパク質をコードする核酸配列に酵母プロモーターを構成する核酸配列を連結すると、キメラであると見なされる。キメラ核酸配列はまた、同じ天然起源であるが、天然には連結していない核酸配列を含むこともある。例えば、特定の細胞型から得られたプロモーターを構成する核酸配列を、同じ細胞型から得られるが、プロモーターを構成する核酸配列に通常は連結していないポリペプチドをコードする核酸配列に連結してもよい。キメラ核酸配列にはまた、任意の天然に存在しない核酸配列に連結した任意の天然に存在する核酸配列を含む核酸配列が含まれる。
【００５５】
本明細書で互換的に使用することができる「実質的に純粋な」および「単離された」という用語は、それに天然では付随する成分から分離されている化合物、例えば、経路合成中間体またはポリペプチドを記載する。典型的には、試料中の全物質の少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、または９８％、および最も好ましくは少なくとも９９％（容積基準で、湿潤もしくは乾燥重量基準で、モルパーセントまたはモル分率基準で）が目的の化合物である場合に、化合物は実質的に純粋である。純度は、任意の適切な方法、例えば、ポリペプチドの場合には、クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、またはＨＰＬＣ分析により測定することができる。
【００５６】
酵素またはタンパク質に関連して本明細書で使用する「回収された」という用語は、酵素またはタンパク質の多かれ少なかれ純粋な形態を指す。
【００５７】
（Ｒ）−レチクリンまたは（Ｒ）−レチクリン前駆体を製造する方法を記載するために、本明細書で使用する「ｉｎ  ｖｉｖｏ」という用語は、例えば微生物細胞または植物細胞を含む生細胞内で、ベンジルイソキノリン誘導体の変換を触媒して（Ｒ）−レチクリンまたは（Ｒ）−レチクリン前駆体を形成させることができる酵素とベンジルイソキノリン誘導体を接触させることを指す。
【００５８】
（Ｒ）−レチクリンまたは（Ｒ）−レチクリン前駆体を製造する方法を記載するために、本明細書で使用する「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」という用語は、限定されるものではないが、例えばマイクロウェルプレート、チューブ、フラスコ、ビーカー、タンク、反応器等を含む、生細胞の外の環境で、ベンジルイソキノリン誘導体の変換を触媒して（Ｒ）−レチクリンまたは（Ｒ）−レチクリン前駆体を形成させることができる酵素とベンジルイソキノリン誘導体を接触させることを指す。
【００５９】
実施概要
（Ｒ）−レチクリンおよび（Ｒ）−レチクリン前駆体の合成
本開示は、少なくとも１つの態様において、（Ｒ）−レチクリンまたは（Ｒ）−レチクリン前駆体を製造する少なくとも１つの実施形態であって、
（ａ）ベンジルイソキノリン誘導体を準備するステップと、
（ｂ）（Ｒ）−レチクリンまたは（Ｒ）−レチクリン前駆体へのベンジルイソキノリン誘導体の変換を可能にする条件下で、ベンジルイソキノリン誘導体を（Ｒ）−レチクリンまたは（Ｒ）−レチクリン前駆体に変換することができる酵素混合物とベンジルイソキノリン誘導体を接触させるステップと
を含み、
ベンジルイソキノリン誘導体は、化学式（Ｉ）：
0006783655.tif 000015
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４はそれぞれ、水素原子、ヒドロキシル基、またはメトキシ基を表し；
Ｒ５は、水素原子またはメチル基を表す］
を有し；また（Ｒ）−レチクリン前駆体は、化学式（ＩＩ）：
0006783655.tif 000016
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４はそれぞれ、水素原子、ヒドロキシル基、またはメトキシ基を表し；
Ｒ５は、水素原子またはメチル基を表す］
を有するが、化学式（ＩＩ）は（Ｒ）−レチクリンを除外する実施形態を提供する。
【００６０】
好ましい実施形態では、ベンジルイソキノリン誘導体（Ｉ）は、Ｒ１がメトキシ基であり、Ｒ２がヒドロキシル基であり、Ｒ３が水素原子またはヒドロキシル基であり、Ｒ４がヒドロキシル基またはメトキシ基であり、かつＲ５が水素原子またはメチル基である誘導体である。
【００６１】
さらに好ましい実施形態では、ベンジルイソキノリン誘導体（Ｉ）は、Ｒ１がメトキシ基であり、Ｒ２がヒドロキシル基であり、Ｒ３が水素原子であり、Ｒ４がヒドロキシル基であり、かつＲ５が水素原子である誘導体である。この化合物は、（Ｓ）−コクラウリンとしても知られている（図１を参照のこと）。
【００６２】
さらに好ましい実施形態では、ベンジルイソキノリン誘導体（Ｉ）は、Ｒ１がメトキシ基であり、Ｒ２がヒドロキシル基であり、Ｒ３が水素原子であり、Ｒ４がヒドロキシル基であり、かつＲ５がメチル基である誘導体である。この化合物は、（Ｓ）−Ｎ−メチル−コクラウリンとしても知られている（図１を参照のこと）。
【００６３】
さらに好ましい実施形態では、ベンジルイソキノリン誘導体（Ｉ）は、Ｒ１がメトキシ基であり、Ｒ２がヒドロキシル基であり、Ｒ３がヒドロキシル基であり、Ｒ４がヒドロキシル基であり、かつＲ５がメチル基である誘導体である。この化合物は、（Ｓ）−３’−ヒドロキシ−Ｎ−メチルコクラウリンとしても知られている（図１を参照のこと）。
【００６４】
さらに好ましい実施形態では、ベンジルイソキノリン誘導体（Ｉ）は、Ｒ１がメトキシ基であり、Ｒ２がヒドロキシル基であり、Ｒ３がヒドロキシル基であり、Ｒ４がメトキシ基であり、かつＲ５がメチル基である誘導体である。この化合物は、（Ｓ）−レチクリンとしても知られている（図１；化合物（ＩＩＩ）を参照のこと）。
【００６５】
さらに好ましい実施形態では、（Ｒ）−レチクリン誘導体（ＩＩ）は、Ｒ１がメトキシ基であり、Ｒ２がヒドロキシル基であり、Ｒ３が水素原子またはヒドロキシル基であり、Ｒ４がヒドロキシル基であり、かつＲ５がメチル基である誘導体である。
【００６６】
さらに好ましい実施形態では、（Ｒ）−レチクリン誘導体（ＩＩ）は、Ｒ１がメトキシ基であり、Ｒ２がヒドロキシル基であり、Ｒ３が水素原子であり、Ｒ４がヒドロキシル基であり、かつＲ５がメチル基である誘導体である。この化合物は、（Ｒ）−Ｎ−メチルコクラウリンとしても知られている（図１を参照のこと）。
【００６７】
さらに好ましい実施形態では、（Ｒ）−レチクリン誘導体（ＩＩ）は、Ｒ１がメトキシ基であり、Ｒ２がヒドロキシル基であり、Ｒ３がヒドロキシル基であり、Ｒ４がヒドロキシル基であり、かつＲ５がメチル基である誘導体である。この化合物は、（Ｒ）−３’−ヒドロキシ−Ｎ−メチルコクラウリンとしても知られている（図１を参照のこと）。
【００６８】
さらに好ましい実施形態では、ベンジルイソキノリン誘導体（Ｉ）は、Ｒ１がメトキシ基であり、Ｒ２がヒドロキシル基であり、Ｒ３が水素原子であり、Ｒ４がヒドロキシル基であり、かつＲ５がメチル基である誘導体であり；（Ｒ）−レチクリン誘導体（ＩＩ）は、Ｒ１がメトキシ基であり、Ｒ２がヒドロキシル基であり、Ｒ３が水素原子であり、Ｒ４がヒドロキシル基であり、かつＲ５がメチル基である誘導体である。
【００６９】
さらに好ましい実施形態では、ベンジルイソキノリン誘導体（Ｉ）は、Ｒ１がメトキシ基であり、Ｒ２がヒドロキシル基であり、Ｒ３がヒドロキシル基であり、Ｒ４がヒドロキシル基であり、かつＲ５がメチル基である誘導体であり；（Ｒ）−レチクリン誘導体（ＩＩ）は、Ｒ１がメトキシ基であり、Ｒ２がヒドロキシル基であり、Ｒ３がヒドロキシル基であり、Ｒ４がヒドロキシル基であり、かつＲ５がメチル基である誘導体である。
【００７０】
本開示の好ましい実施形態では、（Ｒ）−レチクリンを製造する方法であって、
（ａ）（Ｓ）−レチクリンを準備するステップと、
（ｂ）（Ｓ）−レチクリンの（Ｒ）−レチクリンへの変換を可能にする条件下で、（Ｓ）−レチクリンを（Ｒ）−レチクリンに変換することができる酵素混合物と（Ｓ）−レチクリンを接触させるステップと
を含む方法を提供する。
【００７１】
好ましい実施形態では、酵素混合物は、（Ｓ）−レチクリンを酸化して１，２−デヒドロレチクリンを形成させることができる第１のポリペプチドと、１，２−デヒドロレチクリンを還元して（Ｒ）−レチクリンを形成させることができる第２のポリペプチドとを含む（図２を参照のこと）。
【００７２】
好ましい実施形態では、酵素混合物は、ベンジルイソキノリン誘導体（Ｉ）を酸化して、化学式ＩＶ：
0006783655.tif 000017
［式中、好ましい実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４はそれぞれ、水素原子、ヒドロキシル基、またはメトキシ基を表し；Ｒ５は、好ましい実施形態では、水素原子またはメチル基を表す］を有する酸化ベンジルイソキノリン誘導体を形成させることができる第１のポリペプチドと、化学式（ＩＶ）を有する酸化ベンジルイソキノリン誘導体を還元して、（Ｒ）−レチクリンまたは化学式（ＩＩ）［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４はそれぞれ、水素原子、ヒドロキシル基、またはメトキシ基を表し；Ｒ５は、水素原子またはメチル基を表す］（ただし、化学式（ＩＩ）は（Ｒ）−レチクリンを除外する）を有する（Ｒ）−レチクリン誘導体を形成させる第２のポリペプチドとを含む。
【００７３】
好ましい実施形態では、ベンジルイソキノリン誘導体（Ｉ）を酸化して酸化ベンジルイソキノリン誘導体（ＩＶ）を形成させることができる第１のポリペプチドは、シトクロムＰ４５０であり、酸化ベンジルイソキノリン誘導体を還元して（Ｒ）−レチクリンまたは（Ｒ）−レチクリン誘導体を形成させることができる第２のポリペプチドは、アルド・ケト還元酵素（ＡＫＲ）である。特に好ましい実施形態では、ＡＫＲポリペプチドは、Ｐ．ソムニフェルム（Ｐ．ｓｏｍｎｉｆｅｒｕｍ）、Ｐ．ブラクテアツム（Ｐ．ｂｒａｃｔｅａｔｕｍ）、およびＰ．ロエアス（Ｐ．ｒｈｏｅａｓ）から得られるか、または得られ得る。
【００７４】
特定の実施形態では、第１および第２のポリペプチドは、２つの別々のポリペプチド、すなわち、共有結合により結合されていないポリペプチドの形態で提供される。特定の好ましい実施形態では、第１および第２のポリペプチドは、ＣＹＰ４５０ポリペプチドをコードする第１の部分と、ＡＫＲポリペプチドをコードする第２の部分とを含む融合ポリペプチドとして調製される。そのような融合ポリペプチドは、組換えにより調製してもよく、配列番号３２３に示すパパヴェル・ソムニフェルム（Ｐａｐａｖｅｒ  ｓｏｍｎｉｆｅｒｕｍ）ポリペプチドなど、使用することができる天然に存在する融合ポリペプチドであってもよい。
【００７５】
本開示に従って使用することができるＣＹＰ４５０ポリペプチドの例としては、配列番号２１９〜配列番号３２１；配列番号３２５；および配列番号３３８に示すポリペプチドが挙げられる。本開示に従って使用することができるＡＫＲポリペプチドの例としては、配列番号５９〜配列番号１１５；配列番号３２７；配列番号３２９；配列番号３３０；および配列番号３４０に示すポリペプチドが挙げられる。
【００７６】
前述の反応は、ベンジルイソキノリン前駆体の（Ｒ）−レチクリンまたは（Ｒ）−レチクリン前駆体への変換を可能にする条件下で行なわれる。この条件は、以下にさらに詳細に記載される、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏでの条件を含む。この条件はさらに典型的には、水および緩衝剤の存在を含む。さらに典型的には、酸化ベンジルイソキノリン前駆体の（Ｒ）−レチクリンまたは（Ｒ）−レチクリン前駆体への変換をもたらす還元反応を可能にするために、還元剤が含まれる。還元剤は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）であってもよく、他の実施形態では、還元剤は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）である。さらに典型的には、ベンジルイソキノリン誘導体を酸化ベンジルイソキノリンに変換する酵素を還元することができる還元酵素および還元剤が反応物に含まれる。好ましい実施形態では、還元酵素は、例えば、ＣＹＰ４５０を還元することができるケシのシトクロムＰ４５０還元酵素などのシトクロムＰ４５０還元酵素であり、還元剤はＮＡＤＨまたはより好ましくはＮＡＤＰＨである。さらに、反応は、種々のｐＨ、例えば、約ｐＨ３、ｐＨ４、ｐＨ５、ｐＨ６、ｐＨ７、ｐＨ８、ｐＨ９、またはｐＨ１０で行うことができることに注目されたい。本明細書の実施例７に示すように、種々のｐＨ範囲で反応を行い、反応速度を評価することによって、最適ｐＨを同定することができることは、当業者には明らかである。最適ｐＨは、例えば、本明細書に従って選択される基質および酵素に応じて変動する可能性がある。したがって、単なる例として、実施例７では、（Ｓ）−レチクリンの１，２−デヒドロレチクリンへの変換に対する最適ｐＨを約ｐＨ８、１，２−デヒドロレチクリンの（Ｒ）−レチクリンへの変換に対する最適ｐＨを約ｐＨ７、また（Ｒ）−レチクリンの１，２−デヒドロレチクリンへの変換に対する最適ｐＨを約ｐＨ９と記述する。
【００７７】
本明細書によると、選択される反応条件に応じて、１，２−デヒドロレチクリンの（Ｒ）−レチクリンへの変換を含む反応が逆転するかまたは部分的に逆転する可能性があることに注目されたい。したがって、実施例６に記述するように、（Ｒ）−レチクリンは、１，２−デヒドロレチクリンに変換されることがある。したがって、本開示はさらに、１，２−デヒドロレチクリンを製造する方法であって、
（ａ）（Ｒ）−レチクリンを準備するステップと、
（ｂ）（Ｒ）−レチクリンの１，２−デヒドロレチクリンへの変換を可能にする条件下で、（Ｒ）−レチクリンを１，２−デヒドロレチクリンに変換することができるＡＫＲポリペプチドと（Ｒ）−レチクリンを接触させるステップと
を含む方法を提供する。前述の反応を行なうために使用することができるＡＫＲポリペプチドには、配列番号５９〜配列番号１１５；配列番号３２７；配列番号３２９；配列番号３３０；および配列番号３４０に示す任意のポリペプチドが含まれる。この変換を可能にする反応条件には、反応混合物における、酸化剤、好ましくはＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋の存在が含まれる。上記のように、反応のためのｐＨは、最適化することができる。前述の反応の可逆性についてさらに図２に示す。
【００７８】
好ましい実施形態では、ベンジルイソキノリン誘導体を酸化して酸化ベンジルイソキノリン誘導体を形成させることができる第１のポリペプチドは、シトクロムＰ４５０であり、酸化ベンジルイソキノリン誘導体を還元して（Ｒ）−レチクリンまたは（Ｒ）−レチクリン誘導体を形成させることができる第２のポリペプチドは、アルド・ケト還元酵素（ＡＫＲ）である。特に好ましい実施形態では、ＡＫＲは、Ｐ．ソムニフェルム（Ｐ．ｓｏｍｎｉｆｅｒｕｍ）、Ｐ．ブラクテアツム（Ｐ．ｂｒａｃｔｅａｔｕｍ）、およびＰ．ロエアス（Ｐ．ｒｈｏｅａｓ）から得られるか、または得られ得る。
【００７９】
特定の実施形態では、第１および第２のポリペプチドは、２つの別々のポリペプチド、すなわち、共有結合により結合されていないポリペプチドの形態で提供される。特定の好ましい実施形態では、第１および第２のポリペプチドは、ＣＹＰ４５０ポリペプチドをコードする第１の部分と、ＡＫＲポリペプチドをコードする第２の部分とを含む融合ポリペプチドとして調製される。そのような融合ポリペプチドは、組換えにより調製してもよく、配列番号３２３に示すパパヴェル・ソムニフェルム（Ｐａｐａｖｅｒ  ｓｏｍｎｉｆｅｒｕｍ）ポリペプチドなど、使用することができる天然に存在する融合ポリペプチドであってもよい。
【００８０】
本開示に従って使用することができるＣＹＰ４５０ポリペプチドの例としては、種々のケシ（Ｐａｐａｖｅｒ）種、例えばパパヴェル・ソムニフェルム（Ｐａｐａｖｅｒ  ｓｏｍｎｉｆｅｒｕｍ）、パパヴェル・ロエアス（Ｐａｐａｖｅｒ  ｒｈｏｅａｓ）、およびパパヴェル・ブラクテアツム（Ｐａｐａｖｅｒ  ｂｒａｃｔｅａｔｕｍ）；アザミゲシ（Ａｒｇｅｍｏｎｅ）種、例えば、アルゲモネ・メキシカーナ（Ａｒｇｅｍｏｎｅ  ｍｅｘｉｃａｎａ）；メギ（Ｂｅｒｂｅｒｉｓ）種、例えば、ベルベリス・ツンベルギイ（Ｂｅｒｂｅｒｉｓ  ｔｈｕｎｂｅｒｇｉｉ）；キケマン（Ｃｏｒｙｄａｌｉｓ）種、例えば、コリダリス・セランティフォリア（Ｃｏｒｙｄａｌｉｓ  ｃｈｅｌａｎｔｉｆｏｌｉａ）；クサノオウ（Ｃｈｅｌｉｄｏｎｉｕｍ）種、例えば、チェリドニウム・マジョス（Ｃｈｅｌｉｄｏｎｉｕｍ  ｍａｊｕｓ）；アブータ（Ｃｉｓｓａｍｐｅｌｏｓ）種、例えば、シサンペロス・ムクロナタ（Ｃｉｓｓａｍｐｅｌｏｓ  ｍｕｃｒｏｎａｔａ）；コクラス（Ｃｏｃｃｕｌｕｓ）種、例えば、コクラス・トリロブス（Ｃｏｃｃｕｌｕｓ  ｔｒｉｌｏｂｕｓ）；キケマン（Ｃｏｒｙｄａｌｉｓ）種、例えば、コリダリス・セランティフォリア（Ｃｏｒｙｄａｌｉｓ  ｃｈｅｌａｎｔｉｆｏｌｉａ）；ツノゲシ（Ｇｌａｕｃｉｕｍ）種、例えば、グラウシウム・フラヴム（Ｇｌａｕｃｉｕｍ  ｆｌａｖｕｍ）；ヒドラスチス（Ｈｙｄｒａｓｔｉｓ）種、例えば、ヒドラスチス・カナデンシス（ｈｙｄｒａｔｉｓ  ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ）；タツタソウ（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎｉａ）種、例えば、ジェファーソニア・ジフィラ（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎｉａ  ｄｉｐｈｙｌｌａ）；ヒイラギナンテン（Ｍａｈｏｎｉａ）種、例えば、マホニア・アクイフォリウム（Ｍａｈｏｎｉａ  ａｑｕｉｆｏｌｉｕｍ）；コウモリカズラ（Ｍｅｎｉｓｐｅｒｍｕｍ）種、例えば、メニスパーマム・カナデンス（Ｍｅｎｉｓｐｅｒｍｕｍ  ｃａｎａｄｅｎｓｅ）；ナンテン（Ｎａｎｄｉｎａ）種、例えば、ナンディナ・ドメスティカ（Ｎａｎｄｉｎａ  ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）；クロタネソウ（Ｎｉｇｅｌｌａ）種、例えば、ニゲラ・サティバ（Ｎｉｇｅｌｌａ  ｓａｔｉｖａ）；サングイナリア（Ｓａｎｇｕｉｎａｒｉａ）種、サングイナリア・カナデンシス（Ｓａｎｇｕｉｎａｒｉａ  ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ）；スティロフォルム（Ｓｔｙｐｌｏｐｈｏｒｕｍ）種、スティロフォルム・ディフィルム（Ｓｔｙｌｏｐｈｏｒｕｍ  ｄｉｐｈｙｌｌｕｍ）、カラマツソウ（Ｔｈａｌｉｃｔｒｕｍ）種、タリクトルム・フラヴム（Ｔｈａｌｉｃｔｒｕｍ  ｆｌａｖｕｍ）；チノスポラ（Ｔｉｎｏｓｐｏｒａ）種、例えば、チノスポラ・コルディフォリア（Ｔｉｎｏｓｐｏｒａ  ｃｏｒｄｉｆｏｌｉａ）；およびザントリザ（Ｘａｎｔｈｏｒｉｚａ）種、例えば、ザントリザ・シンプリシッシマ（Ｘａｎｔｈｏｒｉｚａ  ｓｉｍｐｌｉｃｉｓｓｉｍａ）から得られ得るＣＹＰ４５０ポリペプチドが挙げられる。前述のものには、具体的には、配列番号２１９〜配列番号３２１；配列番号３２５；および配列番号３３８で本明細書に示す、前述の種に由来するポリペプチドが含まれる。本開示に従って使用することができるＡＫＲポリペプチドの例としては、種々のケ���（Ｐａｐａｖｅｒ）種、例えばパパヴェル・ソムニフェルム（Ｐａｐａｖｅｒ  ｓｏｍｎｉｆｅｒｕｍ）、パパヴェル・ロエアス（Ｐａｐａｖｅｒ  ｒｈｏｅａｓ）、およびパパヴェル・ブラクテアツム（Ｐａｐａｖｅｒ  ｂｒａｃｔｅａｔｕｍ）；アザミゲシ（Ａｒｇｅｍｏｎｅ）種、例えば、アルゲモネ・メキシカーナ（Ａｒｇｅｍｏｎｅ  ｍｅｘｉｃａｎａ）；メギ（Ｂｅｒｂｅｒｉｓ）種、例えば、ベルベリス・ツンベルギイ（Ｂｅｒｂｅｒｉｓ  ｔｈｕｎｂｅｒｇｉｉ）；キケマン（Ｃｏｒｙｄａｌｉｓ）種、例えば、コリダリス・セランティフォリア（Ｃｏｒｙｄａｌｉｓ  ｃｈｅｌａｎｔｉｆｏｌｉａ）；クサノオウ（Ｃｈｅｌｉｄｏｎｉｕｍ）種、例えば、チェリドニウム・マジョス（Ｃｈｅｌｉｄｏｎｉｕｍ  ｍａｊｕｓ）；アブータ（Ｃｉｓｓａｍｐｅｌｏｓ）種、例えば、シサンペロス・ムクロナタ（Ｃｉｓｓａｍｐｅｌｏｓ  ｍｕｃｒｏｎａｔａ）；コクラス（Ｃｏｃｃｕｌｕｓ）種、例えば、コクラス・トリロブス（Ｃｏｃｃｕｌｕｓ  ｔｒｉｌｏｂｕｓ）；キケマン（Ｃｏｒｙｄａｌｉｓ）種、例えば、コリダリス・セランティフォリア（Ｃｏｒｙｄａｌｉｓ  ｃｈｅｌａｎｔｉｆｏｌｉａ）；ツノゲシ（Ｇｌａｕｃｉｕｍ）種、例えば、グラウシウム・フラヴム（Ｇｌａｕｃｉｕｍ  ｆｌａｖｕｍ）；ヒドラスチス（Ｈｙｄｒａｓｔｉｓ）種、例えば、ヒドラスチス・カナデンシス（ｈｙｄｒａｔｉｓ  ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ）；タツタソウ（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎｉａ）種、例えば、ジェファーソニア・ジフィラ（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎｉａ  ｄｉｐｈｙｌｌａ）；ヒイラギナンテン（Ｍａｈｏｎｉａ）種、例えば、マホニア・アクイフォリウム（Ｍａｈｏｎｉａ  ａｑｕｉｆｏｌｉｕｍ）；コウモリカズラ（Ｍｅｎｉｓｐｅｒｍｕｍ）種、例えば、メニスパーマム・カナデンス（Ｍｅｎｉｓｐｅｒｍｕｍ  ｃａｎａｄｅｎｓｅ）；ナンテン（Ｎａｎｄｉｎａ）種、例えば、ナンディナ・ドメスティカ（Ｎａｎｄｉｎａ  ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）；クロタネソウ（Ｎｉｇｅｌｌａ）種、例えば、ニゲラ・サティバ（Ｎｉｇｅｌｌａ  ｓａｔｉｖａ）；サングイナリア（Ｓａｎｇｕｉｎａｒｉａ）種、例えば、サングイナリア・カナデンシス（Ｓａｎｇｕｉｎａｒｉａ  ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ）；スティロフォルム（Ｓｔｙｐｌｏｐｈｏｒｕｍ）種、スティロフォルム・ディフィルム（Ｓｔｙｌｏｐｈｏｒｕｍ  ｄｉｐｈｙｌｌｕｍ）、カラマツソウ（Ｔｈａｌｉｃｔｒｕｍ）種、例えば、タリクトルム・フラヴム（Ｔｈａｌｉｃｔｒｕｍ  ｆｌａｖｕｍ）；チノスポラ（Ｔｉｎｏｓｐｏｒａ）種、例えば、チノスポラ・コルディフォリア（Ｔｉｎｏｓｐｏｒａ  ｃｏｒｄｉｆｏｌｉａ）；およびザントリザ（Ｘａｎｔｈｏｒｉｚａ）種、例えば、ザントリザ・シンプリシッシマ（Ｘａｎｔｈｏｒｉｚａ  ｓｉｍｐｌｉｃｉｓｓｉｍａ）から得られ得るＡＫＲポリペプチドが挙げられる。前述のものには、具体的には、配列番号５９〜配列番号１１５；配列番号３２７；配列番号３２９；配列番号３３０；および配列番号３４０で本明細書に示す、前述の種に由来するポリペプチドが含まれる。
【００８１】
前述の反応は、ベンジルイソキノリン前駆体の（Ｒ）−レチクリンまたは（Ｒ）−レチクリン前駆体への変換を可能にする条件下で行なわれる。この条件は、以下にさらに詳細に記載される、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏでの条件を含む。この条件はさらに典型的には、水および緩衝剤の存在を含む。さらに典型的には、酸化ベンジルイソキノリン前駆体の（Ｒ）−レチクリンまたは（Ｒ）−レチクリン前駆体への変換をもたらす還元反応を可能にするために、還元剤が含まれる。還元剤は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）であってもよく、他の実施形態では、還元剤は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）である。さらに典型的には、ベンジルイソキノリン誘導体を酸化ベンジルイソキノリンに変換する酵素を還元することができる還元酵素および還元剤が反応物に含まれる。好ましい実施形態では、還元酵素は、ＣＹＰ４５０を還元することができるシトクロムＰ４５０還元酵素であり、還元剤は、ＮＡＤＨまたはより好ましくはＮＡＤＰＨである。
【００８２】
（Ｒ）−レチクリンまたは（Ｒ）−レチクリン誘導体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成
本開示の特定の態様によれば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ反応条件下でベンジルイソキノリン誘導体の酵素触媒化学変換を可能にする反応条件下で、ベンジルイソキノリン誘導体を、触媒量の酵素ＣＹＰ４５０およびＡＫＲと接触させる。そのようなｉｎ  ｖｉｔｒｏ反応条件下で、開始反応成分は多かれ少なかれ純粋な形態で準備され、必要な化学反応が実質的に進行することを可能にする条件下で混合される。開始ベンジルイソキノリン誘導体の実質的に純粋な形態を購入することができる。（Ｓ）−レチクリンは、例えば、実質的に純粋な化合物として（例えば、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．から）購入することも、前駆化合物から化学的に合成することも、パパヴェル・ソムニフェルム（Ｐａｐａｖｅｒ  ｓｏｍｎｉｆｅｒｕｍ）および所望のそのような化合物を含む植物のケシ科（Ｐａｐａｖｅｒａｃｅａｅ）、クスノキ科（Ｌａｕｒａｃｅａｅ）、バンレイシ科（Ａｎｎｏｎａｃｅａｅ）、トウダイグサ科（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａｃｅａｅ）、またはクワ科（Ｍｏｒａｃｅａｅ）の他のメンバーを含む天然供給源から単離することも可能である。適切なケシ科（Ｐａｐａｖｅｒａｃｅａｅ）メンバーとしては、以下に限定されるものではないが、ケシ（Ｐａｐａｖｅｒ）属、キケマン（Ｃｏｒｙｄａｌｉｓ）属；クサノオウ（Ｃｈｅｌｉｄｏｎｉｕｍ）属；およびロメリア（Ｒｏｍｅｒｉａ）属に属する種が挙げられる。そのような種は、（Ｓ）−レチクリンを作ることができる可能性があり、そのような種としては、以下の限定されるものではないが、種チェリドニウム・マジョス（Ｃｈｅｌｉｄｏｎｉｕｍ  ｍａｊｕｓ）；コリダリス・ブルボサ（Ｃｏｒｙｄａｌｉｓ  ｂｕｌｂｏｓａ）；コリダリス・カヴァ（Ｃｏｒｙｄａｌｉｓ  ｃａｖａ）；コリダリス・オコテニス（Ｃｏｒｙｄａｌｉｓ  ｏｃｈｏｔｅｎｉｓ）；コリダリス・オフィオカルパ（Ｃｏｒｙｄａｌｉｓ  ｏｐｈｉｏｃａｒｐａ）；コリダリス・プラティカルパ（Ｃｏｒｙｄａｌｉｓ  ｐｌａｔｙｃａｒｐａ）；コリダリス・ツベロサ（Ｃｏｒｙｄａｌｉｓ  ｔｕｂｅｒｏｓａ）；パパヴェル・アルメニアクム（Ｐａｐａｖｅｒ  ａｒｍｅｎｉａｃｕｍ）；パパヴェル・ブラクテアツム（Ｐａｐａｖｅｒ  Ｂｒａｃｔｅａｔｕｍ）；パパヴェル・シリンドリクム（Ｐａｐａｖｅｒ  ｃｙｌｉｎｄｒｉｃｕｍ）；パパヴェル・デカイスネイ（Ｐａｐａｖｅｒ  ｄｅｃａｉｓｎｅｉ）；パパヴェル・フガクス（Ｐａｐａｖｅｒ  ｆｕｇａｘ）；パパヴェル・オレオフィルム（Ｐａｐａｖｅｒ  ｏｒｅｏｐｈｙｌｌｕｍ）；パパヴェル・オリエンタレ（Ｐａｐａｖｅｒ  ｏｒｉｅｎｔａｌｅ）；パパヴェル・パエオニフォリウム（Ｐａｐａｖｅｒ  ｐａｅｏｎｉｆｏｌｉｕｍ）；パパヴェル・ペルシクム（Ｐａｐａｖｅｒ  ｐｅｒｓｉｃｕｍ）；パパヴェル・シュードオリエンタレ（Ｐａｐａｖｅｒ  ｐｓｅｕｄｏ−ｏｒｉｅｎｔａｌｅ）；パパヴェル・ロエアス（Ｐａｐａｖｅｒ  ｒｈｏｅａｓ）；パパヴェル・ロパロテセ（Ｐａｐａｖｅｒ  ｒｈｏｐａｌｏｔｈｅｃｅ）；パパヴェル・セティゲルム（Ｐａｐａｖｅｒ  ｓｅｔｉｇｅｒｕｍ）；パパヴェル・ソムニフェルム（Ｐａｐａｖｅｒ  ｓｏｍｎｉｆｅｒｕｍ）；パパヴェル・タウリコルム（Ｐａｐａｖｅｒ  ｔａｕｒｉｃｏｌｕｍ）；パパヴェル・トリニアエフォリウム（Ｐａｐａｖｅｒ  ｔｒｉｎｉａｅｆｏｌｉｕｍ）；およびロメリア・カリカ（Ｒｏｍｅｒｉａ  ｃａｒｉｃａ）から選択される植物種が挙げられる。（Ｓ）−レチクリンの化学合成は、例えば、Ｓ．Ｔｅｉｔｅｌ  ａｎｄ  Ａ．Ｂｒｏｓｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５，８２５−８２９，１９６８に記載されるような標準的方法を使用して行うことができる。
【００８３】
本明細書によると、多かれ少なかれ純粋な形態の酵素は、以下に限定されるものではないが、パパヴェル・ソムニフェルム（Ｐａｐａｖｅｒ  ｓｏｍｎｉｆｅｒｕｍ）、パパヴェル・ブラクテアツム（Ｐａｐａｖｅｒ  ｂｒａｃｔｅａｔｕｍ）、およびパパヴェル・ロエアス（Ｐａｐａｖｅｒ  ｒｈｏｅａｓ）を含む、天然供給源から単離することができるか、または組換えによりもしくは合成的に調製することができる。したがって、本明細書ではさらに、ＣＹＰ４５０およびＡＫＲまたはそれらの混合物からなる群から選択される酵素を調製するための方法であって、
（ａ）作動可能に連結される成分として、
（ｉ）ＣＹＰ４５０およびＡＫＲからなる群から選択されるポリペプチドの１つまたは複数をコードする１つまたは両方の核酸配列と、
（ｉｉ）宿主細胞における発現を制御することができる１つまたは複数の核酸配列と
を含むキメラ核酸配列を準備するステップと、
（ｂ）キメラ核酸配列を宿主細胞に導入し、宿主細胞を増殖させて、ＣＹＰ４５０およびＡＫＲからなる群から選択されるポリペプチドを産生させるステップと、
（ｃ）ＣＹＰ４５０およびＡＫＲからなる群から選択されるポリペプチドを宿主細胞から回収するステップと
を含む方法を提供する。
【００８４】
核酸配列は、上記の配列を含有する任意の天然供給源、例えば植物供給源から得ることができる。好ましい植物供給源としては、ケシ（Ｐａｐａｖｅｒ）種、例えばパパヴェル・ソムニフェルム（Ｐａｐａｖｅｒ  ｓｏｍｎｉｆｅｒｕｍ）、パパヴェル・ロエアス（Ｐａｐａｖｅｒ  ｒｈｏｅａｓ）、およびパパヴェル・ブラクテアツム（Ｐａｐａｖｅｒ  ｂｒａｃｔｅａｔｕｍ）；アザミゲシ（Ａｒｇｅｍｏｎｅ）種、例えば、アルゲモネ・メキシカーナ（Ａｒｇｅｍｏｎｅ  ｍｅｘｉｃａｎａ）；メギ（Ｂｅｒｂｅｒｉｓ）種、例えば、ベルベリス・ツンベルギイ（Ｂｅｒｂｅｒｉｓ  ｔｈｕｎｂｅｒｇｉｉ）；キケマン（Ｃｏｒｙｄａｌｉｓ）種、例えば、コリダリス・セランティフォリア（Ｃｏｒｙｄａｌｉｓ  ｃｈｅｌａｎｔｉｆｏｌｉａ）；クサノオウ（Ｃｈｅｌｉｄｏｎｉｕｍ）種、例えば、チェリドニウム・マジョス（Ｃｈｅｌｉｄｏｎｉｕｍ  ｍａｊｕｓ）；アブータ（Ｃｉｓｓａｍｐｅｌｏｓ）種、例えば、シサンペロス・ムクロナタ（Ｃｉｓｓａｍｐｅｌｏｓ  ｍｕｃｒｏｎａｔａ）；コクラス（Ｃｏｃｃｕｌｕｓ）種、例えば、コクラス・トリロブス（Ｃｏｃｃｕｌｕｓ  ｔｒｉｌｏｂｕｓ）；キケマン（Ｃｏｒｙｄａｌｉｓ）種、例えば、コリダリス・セランティフォリア（Ｃｏｒｙｄａｌｉｓ  ｃｈｅｌａｎｔｉｆｏｌｉａ）；ツノゲシ（Ｇｌａｕｃｉｕｍ）種、例えば、グラウシウム・フラヴム（Ｇｌａｕｃｉｕｍ  ｆｌａｖｕｍ）；ヒドラスチス（Ｈｙｄｒａｓｔｉｓ）種、例えば、ヒドラスチス・カナデンシス（ｈｙｄｒａｔｉｓ  ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ）；タツタソウ（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎｉａ）種、例えば、ジェファーソニア・ジフィラ（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎｉａ  ｄｉｐｈｙｌｌａ）；ヒイラギナンテン（Ｍａｈｏｎｉａ）種、例えば、マホニア・アクイフォリウム（Ｍａｈｏｎｉａ  ａｑｕｉｆｏｌｉｕｍ）；コウモリカズラ（Ｍｅｎｉｓｐｅｒｍｕｍ）種、例えば、メニスパーマム・カナデンス（Ｍｅｎｉｓｐｅｒｍｕｍ  ｃａｎａｄｅｎｓｅ）；ナンテン（Ｎａｎｄｉｎａ）種、例えば、ナンディナ・ドメスティカ（Ｎａｎｄｉｎａ  ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）；クロタネソウ（Ｎｉｇｅｌｌａ）種、例えば、ニゲラ・サティバ（Ｎｉｇｅｌｌａ  ｓａｔｉｖａ）；サングイナリア（Ｓａｎｇｕｉｎａｒｉａ）種、例えば、サングイナリア・カナデンシス（Ｓａｎｇｕｉｎａｒｉａ  ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ）；スティロフォルム（Ｓｔｙｐｌｏｐｈｏｒｕｍ）種、スティロフォルム・ディフィルム（Ｓｔｙｌｏｐｈｏｒｕｍ  ｄｉｐｈｙｌｌｕｍ）、カラマツソウ（Ｔｈａｌｉｃｔｒｕｍ）種、例えば、タリクトルム・フラヴム（Ｔｈａｌｉｃｔｒｕｍ  ｆｌａｖｕｍ）；チノスポラ（Ｔｉｎｏｓｐｏｒａ）種、例えば、チノスポラ・コルディフォリア（Ｔｉｎｏｓｐｏｒａ  ｃｏｒｄｉｆｏｌｉａ）；およびザントリザ（Ｘａｎｔｈｏｒｉｚａ）種、例えば、ザントリザ・シンプリシッシマ（Ｘａｎｔｈｏｒｉｚａ  ｓｉｍｐｌｉｃｉｓｓｉｍａ）が挙げられる。ＣＹＰ４５０に関して、前述の植物種から得られ得るかまたは得られる核酸配列としては、配列番号１１６〜配列番号２１８；配列番号３２４；および配列番号３３７に示す核酸配列が挙げられる。ＡＫＲに関して、前述の植物種から得ら���得るかまたは得られる核酸配列としては、配列番号１〜配列番号５８；配列番号３２６；配列番号３２８；および配列番号３３９に示す核酸配列が挙げられる。さらに好ましい実施形態では、本明細書に配列番号３２２で示す核酸配列を含めて、ＣＹＰ４５０とＡＫＲとの間の天然融合ポリペプチドをコードする核酸配列を使用することができる。
【００８５】
宿主細胞を増殖させると、ＣＹＰ４５０および／またはＡＫＲポリペプチドの産生がもたらされる。ポリペプチドは、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、分子ふるいクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ゲル濾過等を含む、種々の異なるタンパク質精製手法により、宿主細胞成分から順次、回収、単離、および分離することができる。タンパク質精製に関してさらに一般的な手引きは、例えば、Ｃｕｔｌｅｒ，Ｐ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，２００４，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄ．に見出すことができる。したがって、ＣＹＰ４５０および／またはＡＫＲポリペプチドの実質的に純粋な調製物を得ることができる。
【００８６】
本明細書によれば、ベンジルイソキノリン誘導体の酵素触媒化学変換を可能にする反応条件下で、ベンジルイソキノリン誘導体を、触媒量の酵素ＣＹＰ４５０およびＡＫＲの１つまたは複数と接触させる。好ましい実施形態では、薬剤を互いに接触させ、混合して混合物を形成させる。好ましい実施形態では、混合物は、水、さらに場合によっては、緩衝剤、塩、ｐＨ調整剤を含む、酵素触媒を促進するための追加の薬剤を含む水性混合物である。本明細書で上述するように、反応混合物がＮＡＤＰＨおよび還元酵素を含むことは特に好ましい。反応は、一連の異なる温度範囲で行うことができる。好ましい実施形態では、反応は、約１８℃と約３７℃との間の温度で行うことができる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ反応が完了すると、（Ｒ）−レチクリンまたは（Ｒ）−レチクリン前駆体を、多かれ少なかれ純粋な形態で得ることができる。
【００８７】
（Ｒ）−レチクリンまたは（Ｒ）−レチクリン前駆体のｉｎ  ｖｉｖｏ合成
本開示の特定の態様によれば、ｉｎ  ｖｉｖｏ反応条件下でベンジルイソキノリン誘導体の酵素触媒化学変換を可能にする反応条件下で、ベンジルイソキノリン誘導体を、触媒量の酵素ＣＹＰ４５０およびＡＫＲの１つまたは複数と接触させる。そのようなｉｎ  ｖｉｖｏ反応条件下で、生細胞は、（Ｒ）−レチクリンまたは（Ｒ）−レチクリン前駆体を産生するように改変される。特定の実施形態では、生細胞は、細菌細胞および真菌細胞を含む微生物である。他の実施形態では、生細胞は、植物および植物細胞培養物を含む多細胞生物である。
【００８８】
一実施形態では、生細胞は、ベンジルイソキノリン誘導体、（Ｓ）−レチクリン、（Ｒ）−レチクリン前駆体、または（Ｒ）−レチクリンを天然に産生することができない宿主細胞であるように選択される。別の実施形態では、宿主細胞は、（Ｓ）−レチクリンまたはベンジルイソキノリン誘導体を天然に産生することができるが、（Ｒ）−レチクリンまたは（Ｒ）−レチクリン前駆体は産生できない、すなわち、細胞は、（Ｓ）−エナンチオマーから（Ｒ）−エナンチオマーへのエピマー化反応を天然に行なうことができない。別の実施形態では、細胞は、ベンジルイソキノリン誘導体または（Ｓ）−レチクリンおよび（Ｒ）−レチクリンまたは（Ｒ）−レチクリン前駆体を産生することができるが、（Ｒ）−レチクリンまたは（Ｒ）−レチクリン前駆体のレベルが所望のレベルよりも低く、（Ｒ）−レチクリンまたは（Ｒ）−レチクリン前駆体のレベルが非改変細胞のレベルに調節されている。そのような細胞としては、限定されるものではないが、細菌、酵母、他の真菌細胞、植物細胞、または動物細胞が挙げられる。
【００８９】
（Ｒ）−レチクリンまたは（Ｒ）−レチクリン前駆体を産生させるために、本明細書ではさらに、（Ｒ）−レチクリンまたは（Ｒ）−レチクリン前駆体を調製するための方法であって、
（ａ）作動可能に連結される成分として、
（ｉ）ＣＹＰ４５０ポリペプチドをコードする第１の核酸配列と、
（ｉｉ）ＡＫＲポリペプチドをコードする第２の核酸配列と、
（ｉｉｉ）宿主細胞における発現を制御することができる１つまたは複数の核酸配列と
を含むキメラ核酸配列を準備するステップと、
（ｂ）キメラ核酸配列を宿主細胞に導入し、宿主細胞を増殖させて、ＣＹＰ４５０およびＡＫＲを産生させ、かつ（Ｒ）−レチクリンまたは（Ｒ）−レチクリン前駆体を産生させるステップと、
（ｃ）（Ｒ）−レチクリンまたは（Ｒ）−レチクリン前駆体を回収するステップと
を含む方法を提供する。
【００９０】
好ましい実施形態では、第１および第２の核酸配列は、ＣＹＰ４５０およびＡＫＲを含む融合ポリペプチドを産生させるために作動可能に連結される。
【００９１】
さらに、（Ｒ）−レチクリンまたは（Ｒ）−レチクリン前駆体を調製するための方法であって、
（ｂ）作動可能に連結される成分として、ＣＹＰ４５０ポリペプチドをコードする第１の核酸配列と、細胞におけるこの第１の核酸配列の発現を制御する第１の核酸配列とを含む第１のキメラ核酸配列を準備するステップと、
（ｃ）作動可能に連結される成分として、ＡＫＲポリペプチドをコードする第２の核酸配列と、細胞におけるこの第２の核酸配列の発現を制御する第２の核酸配列とを含む第２のキメラ核酸配列を準備するステップと、
（ｃ）第１および第２のキメラ核酸配列を宿主細胞に導入し、宿主細胞を増殖させて、ＣＹＰ４５０およびＡＫＲを産生させ、かつ（Ｒ）−レチクリンまたは（Ｒ）−レチクリン前駆体を産生させるステップと、
（ｄ）（Ｒ）−レチクリンまたは（Ｒ）−レチクリン前駆体を回収するステップと
を含む方法を提供する。
【００９２】
好ましい実施形態では、ＣＹＰ４５０およびＡＫＲをコードする核酸配列は、パパヴェル・ソムニフェルム（Ｐａｐａｖｅｒ  ｓｏｍｎｉｆｅｒｕｍ）および所望の上記の化合物を含む植物のケシ科（Ｐａｐａｖｅｒａｃｅａｅ）、クスノキ科（Ｌａｕｒａｃｅａｅ）、バンレイシ科（Ａｎｎｏｎａｃｅａｅ）、トウダイグサ科（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａｃｅａｅ）、またはクワ科（Ｍｏｒａｃｅａｅ）の他のメンバーから得られ得るかまたは得られるＣＹＰ４５０およびＡＫＲをコードする核酸配列から選択される。適切なケシ科（Ｐａｐａｖｅｒａｃｅａｅ）メンバーとしては、以下に限定されるものではないが、ケシ（Ｐａｐａｖｅｒ）属、キケマン（Ｃｏｒｙｄａｌｉｓ）属；クサノオウ（Ｃｈｅｌｉｄｏｎｉｕｍ）属；およびロメリア（Ｒｏｍｅｒｉａ）属に属する種が挙げられる。そのような種は、（Ｒ）−レチクリンを作ることができる可能性があり、そのような種としては、以下の限定されるものではないが、種チェリドニウム・マジョス（Ｃｈｅｌｉｄｏｎｉｕｍ  ｍａｊｕｓ）；コリダリス・ブルボサ（Ｃｏｒｙｄａｌｉｓ  ｂｕｌｂｏｓａ）；コリダリス・カヴァ（Ｃｏｒｙｄａｌｉｓ  ｃａｖａ）；コリダリス・オコテニス（Ｃｏｒｙｄａｌｉｓ  ｏｃｈｏｔｅｎｉｓ）；コリダリス・オフィオカルパ（Ｃｏｒｙｄａｌｉｓ  ｏｐｈｉｏｃａｒｐａ）；コリダリス・プラティカルパ（Ｃｏｒｙｄａｌｉｓ  ｐｌａｔｙｃａｒｐａ）；コリダリス・ツベロサ（Ｃｏｒｙｄａｌｉｓ  ｔｕｂｅｒｏｓａ）；パパヴェル・アルメニアクム（Ｐａｐａｖｅｒ  ａｒｍｅｎｉａｃｕｍ）；パパヴェル・ブラクテアツム（Ｐａｐａｖｅｒ  Ｂｒａｃｔｅａｔｕｍ）；パパヴェル・シリンドリクム（Ｐａｐａｖｅｒ  ｃｙｌｉｎｄｒｉｃｕｍ）；パパヴェル・デカイスネイ（Ｐａｐａｖｅｒ  ｄｅｃａｉｓｎｅｉ）；パパヴェル・フガクス（Ｐａｐａｖｅｒ  ｆｕｇａｘ）；パパヴェル・オレオフィルム（Ｐａｐａｖｅｒ  ｏｒｅｏｐｈｙｌｌｕｍ）；パパヴェル・オリエンタレ（Ｐａｐａｖｅｒ  ｏｒｉｅｎｔａｌｅ）；パパヴェル・パエオニフォリウム（Ｐａｐａｖｅｒ  ｐａｅｏｎｉｆｏｌｉｕｍ）；パパヴェル・ペルシクム（Ｐａｐａｖｅｒ  ｐｅｒｓｉｃｕｍ）；パパヴェル・シュードオリエンタレ（Ｐａｐａｖｅｒ  ｐｓｅｕｄｏ−ｏｒｉｅｎｔａｌｅ）；パパヴェル・ロエアス（Ｐａｐａｖｅｒ  ｒｈｏｅａｓ）；パパヴェル・ロパロテセ（Ｐａｐａｖｅｒ  ｒｈｏｐａｌｏｔｈｅｃｅ）；パパヴェル・セティゲルム（Ｐａｐａｖｅｒ  ｓｅｔｉｇｅｒｕｍ）；パパヴェル・ソムニフェルム（Ｐａｐａｖｅｒ  ｓｏｍｎｉｆｅｒｕｍ）；パパヴェル・タウリコルム（Ｐａｐａｖｅｒ  ｔａｕｒｉｃｏｌｕｍ）；パパヴェル・トリニアエフォリウム（Ｐａｐａｖｅｒ  ｔｒｉｎｉａｅｆｏｌｉｕｍ）；およびロメリア・カリカ（Ｒｏｍｅｒｉａ  ｃａｒｉｃａ）が挙げられる。特に好ましい実施形態では、ＣＹＰ４５０およびＡＫＲをコードする核酸配列は、パパヴェル・ソムニフェルム（Ｐａｐａｖｅｒ  ｓｏｍｎｉｆｅｒｕｍ）、パパヴェル・ブラクテアツム（Ｐａｐａｖｅｒ  ｂｒａｃｔｅａｔｕｍ）、およびパパヴェル・ロエアス（Ｐａｐａｖｅｒ  ｒｈｏｅａｓ）から得られ得るかまたは得られる、ＣＹＰ４５０およびＡＫ���をコードする核酸配列から選択される核酸配列である。さらに好ましい実施形態では、配列番号１１６〜配列番号２１８；配列番号３２４；および配列番号３３７として本明細書に示されるＣＹＰ４５０をコードする核酸配列の１つ。好ましい実施形態では、ＡＫＲをコードする核酸配列は、配列番号１〜配列番号５８；配列番号３２６；配列番号３２８；および配列番号３３９として本明細書に示される、ＡＫＲをコードする核酸配列の１つである。さらに特に好ましい実施形態では、ＣＹＰ４５０およびＡＫＲをコードする核酸配列は、限定されるものではないが、配列番号３２２に示す配列を含む、ＣＹＰ４５０−ＡＫＲ融合ポリペプチドを産生することができる核酸配列である。
【００９３】
本明細書によれば、ＣＹＰ４５０およびＡＫＲをコードする核酸配列は、宿主細胞におけるＣＹＰ４５０およびＡＫＲの発現を制御することができる核酸配列に連結される。したがって、本開示はまた、宿主細胞における発現を制御することができるプロモーターに連結されたＣＹＰ４５０およびＡＫＲをコードする核酸配列を提供する。本明細書で使用することができる宿主細胞における発現を制御することができる核酸配列には、宿主細胞におけるポリペプチドの発現を制御することができる任意の転写プロモーターが含まれる。一般に、細菌細胞から得られるプロモーターは、細菌宿主が本明細書に従って選択される場合に使用され、一方、真菌プロモーターは、真菌宿主が選択される場合に使用されることになり、植物プロモーターは、植物細胞が選択される場合に使用されることになる等が挙げられる。さらに、宿主細胞における発現を制御することができる核酸エレメントには、転写ターミネーター、エンハンサー等が含まれ、これらのすべてを、本開示のキメラ核酸配列に含むことができる。核酸配列の作動可能な連結には、プロモーターと、コード配列に対して５’から３’の転写方向に発現を制御することができる配列との連結が含まれることは当業者には理解されよう。
【００９４】
本開示によれば、ＣＹＰ４５０およびＡＫＲをコードする核酸配列に連結された、宿主細胞における発現を制御することができるプロモーターを含むキメラ核酸配列は、宿主細胞における良好な発現を保証する組換え発現ベクターに組み込むことができる。したがって、本開示は、作動可能に連結される成分として、
（ｉ）宿主細胞における発現を制御することができる核酸配列と、
（ｉｉ）ＣＹＰ４５０をコードする核酸配列と
を含む組換え発現ベクターであって、宿主細胞における発現に適している発現ベクターを含む。
【００９５】
本開示は、作動可能に連結される成分として、
（ｉ）宿主細胞における発現を制御することができる核酸配列と、
（ｉｉ）ＡＫＲをコードする核酸配列と
を含む組換え発現ベクターであって、宿主細胞における発現に適している発現ベクターを含む。
【００９６】
本開示はさらに、作動可能に連結される成分として、
（ｉ）宿主細胞における発現を制御することができる核酸配列と、
（ｉｉ）ＣＹＰ４５０およびＡＫＲをコードする核酸配列と
を含む組換え発現ベクターであって、宿主細胞における発現に適している発現ベクターを含む。「宿主細胞における発現に適している」という用語は、組換え発現ベクターが宿主細胞における発現を達成するのに必要な遺伝エレメントに連結された本開示のキメラ核酸配列を含むことを意味する。この点に関して発現ベクターに含むことができる遺伝エレメントとしては、転写終結領域、マーカー遺伝子をコードする１つまたは複数の核酸配列、１つまたは複数の複製起点等が挙げられる。好ましい実施形態では、発現ベクターはさらに、宿主細胞ゲノムにおける、ベクターまたはその一部の組込みに必要な遺伝エレメント、例えば、植物宿主細胞が使用される場合、植物の核ゲノムへの組込みを促進する、Ｔ−ＤＮＡの左側および右側境界配列を含む。
【００９７】
本開示に従えば、発現ベクターはさらにマーカー遺伝子を含有することができる。本開示に従って使用することができるマーカー遺伝子には、選択可能およびスクリーニング可能なマーカー遺伝子をすべて含めて、非形質転換細胞と形質転換細胞の識別を可能にする遺伝子すべてが含まれる。マーカー遺伝子は、例えばカナマイシンまたはアンピシリンに対する抗生物質抵抗性マーカーなどの抵抗性マーカーであってもよい。目視検査を通して形質転換細胞を同定するために使用することができるスクリーニング可能なマーカーとしては、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）（米国特許第５，２６８，４６３号明細書および同第５，５９９，６７０号明細書）および緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）（Ｎｉｅｄｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．，１４：４０３）が挙げられる。
【００９８】
特に好都合に使用することができる宿主細胞の１つは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）である。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ベクターの調製は、制限消化、ライゲーション、ゲル電気泳動、ＤＮＡシークエンシング、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、およびその他の方法論などの一般に公知の手法を使用して行うことができる。組換え発現ベクターを調製するために必要とされる必須ステップを行うための多種多様のクローニングベクターが入手可能である。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で機能的な複製系を有するベクターには、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ系列のベクター、Ｍ１３  ｍｐ系列のベクター、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ等のベクターがある。典型的には、これらのクローニングベクターは、形質転換細胞の選択を可能にするマーカーを含有する。核酸配列はこれらのベクターに導入することができ、ベクターは、コンピテント細胞を調製し、エレクトロポレーションまたは当業者に周知の他の方法論を使用することにより、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に導入することができる。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、これに限定されるものではないが、ルリア・ブロス培地を含む適切な培地中で増殖させることができる。組換え発現ベクターは、細胞を採取し溶解させると、細胞から容易に回収することができる。さらに、組換えベクターの調製および組換え生物の増殖に関する一般的な手引きは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２００１，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄ．に見出すことができる。
【００９９】
さらに本開示には、作動可能に連結される成分として、ＣＹＰ４５０およびＡＫＲからなる群から選択されるポリペプチドの１つまたは複数をコードする、１つまたは複数の核酸配列を含むキメラ核酸配列を含む宿主細胞が含まれる。本明細書で上述するように、宿主細胞は、好ましくは、ベンジルイソキノリン誘導体、（Ｓ）−レチクリンも、（Ｒ）−レチクリンおよび（Ｒ）−レチクリン前駆体も天然に産生することができない宿主細胞である。別の実施形態では、宿主細胞は、（Ｓ）−レチクリン、ベンジルイソキノリン誘導体を天然に産生することができるが、（Ｒ）−レチクリンも（Ｒ）−レチクリン前駆体も産生することができない。別の実施形態では、宿主細胞は、ベンジルイソキノリン誘導体、（Ｓ）−レチクリン、または（Ｒ）−レチクリンもしくは（Ｒ）−レチクリン前駆体を産生することができるが、（Ｒ）−レチクリンまたは（Ｒ）−レチクリン前駆体のレベルが所望のレベルよりも低く、かつ（Ｒ）−レチクリンまたは（Ｒ）−レチクリン前駆体のレベルが天然の非改変細胞における（Ｒ）−レチクリンまたは（Ｒ）−レチクリン前駆体のレベルに調節されている。細胞が（Ｓ）−レチクリンまたはベンジルイソキノリン誘導体を天然に産生することができない実施形態では、（Ｓ）−レチクリンまたはベンジルイソキノリン誘導体を、細胞増殖培地の一部として細胞に提供することができる。細胞が（Ｓ）−レチクリンもベンジルイソキノリン誘導体も天然に産生することができない他の実施形態では、細胞により（Ｓ）−レチクリンまたはベンジルイソキノリン誘導体にそれぞれ変換され得る、（Ｓ）−レチクリンまたはベンジルイソキノリン誘導体の前駆化合物を提供することができる。細胞増殖培地の一部として細胞に提供することができる別の基質としては、以下に限定されるものではないが、（Ｓ）ノルコクラウリン、（Ｓ）−Ｎ−メチルノルコクラウリン、（Ｓ）−ノルラウダノサリン（Ｎｏｒｌａｕｄａｎｏｓａｌｉｎｅ）、（Ｓ）−Ｎ−メチルノルラウダノサリン（Ｍｅｔｈｙｌｎｏｒｌａｕｄａｎｏｓａｌｉｎｅ）、（Ｓ）−コクラウリン、（Ｓ）−Ｎ−メチルコクラウリン、（Ｓ）−３’−ヒドロキシコクラウリン、（Ｓ）−３’−ヒドロキシ−Ｎ−メチルコクラウリン、（Ｓ）−ヒゲナミン、（Ｓ）−Ｎ−メチルヒゲナミン、（Ｓ）−ラウダノソリン（Ｌａｕｄａｎｏｓｏｌｉｎｅ）、（Ｓ）−ノルレチクリン、（Ｓ）−コレチン（Ｃｏｌｌｅｔｉｎｅ）、および（Ｓ）−オリエンタリンが挙げられる。本明細書に従って使用することができる細胞としては、限定されるものではないが、細菌、酵母もしく他の真菌細胞、植物細胞、動物細胞、または合成細胞が挙げられる。
【０１００】
本開示にはさらに、ベンジルイソキノリン誘導体を酸化ベンジルイソキノリン誘導体に酸化することができる第１のポリペプチドと、酸化ベンジルイソキノリン誘導体を（Ｒ）−レチクリン前駆体に還元することができる第２のポリペプチドとを含む酵素混合物を含む、またさらには、（Ｓ）−レチクリンを酸化して１，２−デヒドロレチクリンを形成させることができる第１のポリペプチドと、１，２−デヒドロレチクリンを還元して（Ｒ）−レチクリンを形成させることができる第２のポリペプチドとを含む酵素混合物を含む、（Ｓ）−エナンチオマーを（Ｒ）−エナンチオマーにエピマー化するための組成物が含まれる。好ましい実施形態では、第１のポリペプチドはシトクロムＰ４５０であり、第２のポリペプチドはＡＫＲである。
【０１０１】
一部の実施形態では、ＡＫＲおよびＣＹＰ４５０のポリペプチドを作動可能に連結して融合ポリペプチドを形成させる。したがって、本開示にはさらに、配列番号３２３を含むかまたはそれからなるポリペプチドが含まれる。
【０１０２】
本発明はさらに、（Ｓ）−エナンチオマーを（Ｒ）−エナンチオマーにエピマー化することができるポリペプチドをコードする核酸配列を含む組成物を含む。好ましい実施形態では、核酸配列は、一緒になって、（Ｓ）−エナンチオマーを（Ｒ）−エナンチオマーにエピマー化することができる、好ましくは、ベンジルイソキノリン誘導体を酸化ベンジルイソキノリン誘導体に酸化し、ベンジルイソキノリン誘導体を（Ｒ）−レチクリン前駆体に還元することができる、より好ましくは、（Ｓ）−レチクリンを酸化して１，２−デヒドロレチクリンを形成させ、１，２−デヒドロレチクリンを還元して（Ｒ）−レチクリンを形成させることができる、ＣＹＰ４５０およびＡＫＲをコードする核酸配列である。好ましい実施形態では、ＡＫＲおよびＣＹＰ４５０をコードする核酸配列を、作動可能に連結してＣＹＰ４５０−ＡＫＲ融合ポリペプチドを作製する。したがって、本開示にはさらに、配列番号３２２が含まれる。
【０１０３】
宿主細胞に蓄積する（Ｒ）−レチクリンの量は変動し得る。宿主細胞が（Ｒ）−レチクリンおよび（Ｓ）−レチクリンを天然に産生する（例えば、パパヴェル・ソムニフェルム（Ｐａｐａｖｅｒ  ｓｏｍｎｉｆｅｒｕｍ）細胞）本開示の実施形態では、本開示に従ってキメラ核酸配列を含むように調製されたそのような細胞により、ｉｎ  ｖｉｖｏで合成される（Ｒ）−レチクリン対（Ｓ）−レチクリンの比は、天然の宿主細胞（すなわち、キメラ核酸配列を含まない細胞）または宿主細胞抽出物中に存在する（Ｒ）−レチクリン対（Ｓ）−レチクリンの比を超える。好ましくは、宿主細胞または宿主細胞抽出物中の（Ｒ）−レチクリン対（Ｓ）−レチクリンの比は、２１：７９を超える、例えば、少なくとも０．３：１、少なくとも０．４：１、少なくとも０．５：１、少なくとも１：１、少なくとも２：１、少なくとも３：１、または少なくとも４：１である。
【０１０４】
（Ｒ）−レチクリンおよび（Ｒ）−レチクリン前駆体の使用
本開示に従って得られる（Ｒ）−レチクリンは、薬剤、治療剤、または医薬品として使用するために製剤化することができる。したがって、本開示はさらに、本開示の方法に従って調製された（Ｒ）−レチクリンを含む医薬組成物を含む。本開示による（Ｒ）−レチクリンを含む医薬製剤は、好ましくはさらに、ビヒクル、賦形剤、希釈剤、および補助物質、例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質等を含む。これらのビヒクル、賦形剤、および補助物質は、一般に、過度の毒性を示すことなく投与することができる薬剤である。薬学的に許容される賦形剤としては、以下に限定されるものではないが、水、生理食塩水、ポリエチレングリコール、ヒアルロン酸、グリセリン、およびエタノールなどの液体が挙げられる。薬学的に許容される塩として、例えば、塩酸塩、リン酸塩、硫酸塩等の鉱酸塩；および酢酸塩、プロピオン酸塩、安息香酸塩等の有機酸塩もその中に含めることができる。安定剤として有用である薬学的に許容される賦形剤を製剤が含有することも、要求されるものではないが、好ましい。ペプチドに対する安定剤としても作用する適切な担体の例としては、限定されるものではないが、医薬品グレードのデキストロース、スクロース、ラクトース、ソルビトール、イノシトール、デキストラン等が挙げられる。他の適切な担体としては、これも限定されるものではないが、デンプン、セルロース、リン酸ナトリウムまたはカルシウム、クエン酸、グリシン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、およびそれらの組合せが挙げられる。医薬組成物は、経口および静脈内投与、ならびに所望される他の投与経路のために製剤化することができる。投薬は多様であり得るものであり、ルーチン的な実験を使用して最適化することができる。（Ｒ）−レチクリンを含む医薬組成物は、脱毛症または筋肉緊張を処置するために使用することができる。
【０１０５】
さらなる実施形態では、本開示は、本開示に従って調製された（Ｒ）−レチクリンを含む医薬組成物で患者を処置する方法を提供する。したがって、本開示はさらに、本開示の方法に従って調製された（Ｒ）−レチクリンで患者を処置する方法であって、前記方法が、（Ｒ）−レチクリンを含む組成物を患者に投与するステップであって、（Ｒ）−レチクリンが患者の病状を寛解させるのに十分な量で投与されるステップを含む方法を提供する。好ましい実施形態では、病状は、脱毛症および筋肉緊張の解除からなる群から選択される。
【０１０６】
さらに、本明細書で提供する（Ｒ）−レチクリンは、限定するものではないが、サルタリジン、コデイン、およびモルヒネを含み、さらにテバイン、パパベリン、ノスカピン、コダミン、ラウジンおよびラウダノシン、（＋）−パリジン、（−）−イソボルジン、ならびに（−）−コリツベリンを含む他の二次代謝産物または医薬組成物を製造するための薬剤として有用である。
【０１０７】
本明細書で提供する（Ｒ）−レチクリン前駆体は、他の二次代謝産物、特に（Ｒ）−レチクリンを製造するための薬剤として有用である。図１に示すように、（Ｒ）−Ｎ−メチルコクラウリンは、（Ｒ）−３’−ヒドロキシ−Ｎ−メチルコクラウリンを製造するための薬剤として使用することができる。（Ｒ）−３’−ヒドロキシ−Ｎ−メチルコクラウリンは、（Ｒ）−レチクリンを製造するための薬剤として使用することができる。
【０１０８】
ＡＫＲおよびＣＹＰ４５０のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の代替使用
さらなる態様では、ＡＫＲおよび／またはＣＹＰ４５０をコードする核酸配列は、試料中の遺伝子の有無を検出するために使用することができる。したがって、本開示の一実施形態では、ＡＫＲおよび／またはＣＹＰ４５０をコードする核酸配列の有無を検出する方法であって、
（ａ）ＡＫＲおよび／またはＣＹＰ４５０をコードする核酸配列を含むと推測される試料を準備するステップと、
（ｂ）ＡＫＲおよび／またはＣＹＰ４５０をコードするヌクレオチド配列の存在について試料を分析するステップと
を含む方法を提供する。
【０１０９】
好ましい実施形態では、試料は、ゲノムＤＮＡを含む細胞を含む。したがって、好ましい実施形態では、細胞におけるＡＫＲおよび／またはＣＹＰ４５０をコードする核酸配列の有無を検出する方法であって、
（ａ）細胞を準備するステップと、
（ｂ）細胞からゲノムＤＮＡを抽出するステップと、
（ｃ）ＡＫＲおよび／またはＣＹＰ４５０をコードする核酸配列の存在についてゲノムＤＮＡを分析するステップと
を含む方法を提供する。
【０１１０】
ゲノムＤＮＡを分析する方法は、当技術分野で一般に知られており、例えば、ＡＫＲおよび／またはＣＹＰ４５０をコードするヌクレオチド配列の特定部分を増幅するためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）および特異的ポリヌクレオチドプライマーの使用を含む。さらに制限消化およびサザンブロット解析を使用することができる。この分析はさらに、ＡＫＲおよび／もしくはＣＹＰ４５０をコードする核酸配列のイントロン、エキソン、または上流もしくは下流領域を対象とすることができる。この分析はさらに、ＡＫＲおよび／またはＣＹＰ４５０をコードする核酸配列を含むゲノム遺伝子座の同定を対象とすることができるが、そのような遺伝子座はＡＫＲおよび／またはＣＹＰ４５０の発現レベルの調節に連結している。
【０１１１】
好ましい実施形態では、細胞は植物細胞である。さらに好ましい実施形態では、細胞は、植物のケシ科（Ｐａｐａｖｅｒａｃｅａｅ）、クスノキ科（Ｌａｕｒａｃｅａｅ）、バンレイシ科（Ａｎｎｏｎａｃｅａｅ）、トウダイグサ科（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａｃｅａｅ）、またはクワ科（Ｍｏｒａｃｅａｅ）に属する植物、より好ましくは、パパヴェル・ソムニフェルム（Ｐａｐａｖｅｒ  ｓｏｍｎｉｆｅｒｕｍ）種、パパヴェル・ブラクテアツム（Ｐａｐａｖｅｒ  ｂｒａｃｔｅａｔｕｍ）種、またはパパヴェル・ロエアス（Ｐａｐａｖｅｒ  ｒｈｏｅａｓ）種に属する植物から得られる植物細胞である。
【０１１２】
好ましい実施形態では、前述の分析を行なうために使用されるＣＹＰ４５０および／またはＡＫＲ配列は、配列番号１１６〜配列番号２１８；配列番号３２４；および配列番号３３７に示される配列；または配列番号１〜配列番号５８；配列番号３２６；配列番号３２８；および配列番号３３９に示される配列；または配列番号３２２に示される配列である。
【０１１３】
さらなる態様では、ＡＫＲおよび／またはＣＹＰ４５０をコードする核酸配列は、ＡＫＲおよび／またはＣＹＰ４５０の発現レベルが調節されている細胞を作製するために使用することができる。そのような細胞は、好ましくは、ＡＫＲおよび／またはＣＹＰ４５０を天然に発現する植物細胞、より好ましくは、植物のケシ科（Ｐａｐａｖｅｒａｃｅａｅ）、クスノキ科（Ｌａｕｒａｃｅａｅ）、バンレイシ科（Ａｎｎｏｎａｃｅａｅ）、トウダイグサ科（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａｃｅａｅ）、またはクワ科（Ｍｏｒａｃｅａｅ）に属する植物から得られる植物細胞、最も好ましくは、パパヴェル・ソムニフェルム（Ｐａｐａｖｅｒ  ｓｏｍｎｉｆｅｒｕｍ）種、パパヴェル・ブラクテアツム（Ｐａｐａｖｅｒ  ｂｒａｃｔｅａｔｕｍ）種、またはパパヴェル・ロエアス（Ｐａｐａｖｅｒ  ｒｈｏｅａｓ）種に属する植物から得られる植物細胞である。したがって、本開示はさらに、ＡＫＲおよび／またはＣＹＰ４５０を天然に発現する細胞における核酸配列の発現を調節するための方法であって、
（ａ）ＡＫＲおよび／またはＣＹＰ４５０を天然に発現する細胞を準備するステップと、
（ｂ）細胞を突然変異誘発させるステップと、
（ｃ）細胞を増殖させて複数の細胞を得るステップと、
（ｄ）この複数の細胞が、レベル調節されたＡＫＲおよび／またはＣＹＰ４５０を含む細胞を含むか否かを判定するステップと
を含む方法を提供する。
【０１１４】
好ましい実施形態では、この方法はさらに、以下のようなステップ（ｅ）を含む：
（ｅ）レベル調節されたＡＫＲおよび／またはＣＹＰ４５０を含む細胞を選択し、かつ複数の細胞を得るためにそのような細胞を増殖させるステップ。
【０１１５】
さらに好ましい実施形態では、植物種子細胞を使用して突然変異誘発を行なう。使用することができる突然変異誘発物質は、限定されるものではないが、塩基類似体、脱アミノ化剤、アルキル化剤、挿入剤、トランスポゾン、臭素、アジ化ナトリウム、エチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）を含む化学物質、ならびに限定されるものではないが、電離放射線およびＵＶ照射などの放射線を含む物理作用である。したがって、本開示はさらに、ＡＫＲおよび／またはＣＹＰ４５０を天然に発現する細胞における核酸配列の調節された発現を含む結実植物を作製するための方法であって、
（ａ）ＡＫＲおよび／またはＣＹＰ４５０を天然に発現する結実植物を準備するステップと、
（ｂ）植物の種子を突然変異誘発して、突然変異誘発された種子を得るステップと、
（ｃ）突然変異誘発された種子を生育して、次世代種子の実を結ばせることができる次世代突然変異誘発された植物にするステップと、
（ｄ）次世代種子または突然変異誘発された植物の別の部分を得るステップと、次世代植物または次世代種子がＡＫＲおよび／またはＣＹＰ４５０の調節された発現を示す場合、分析するステップと
を含む方法を提供する。
【０１１６】
好ましい実施形態では、複数世代の植物および／または種子を得ることができ、そのような世代のいずれかまたはすべてにおいて、植物および／または種子の一部を分析することができる。分析は、典型的には、突然変異誘発された植物または種子における発現と突然変異誘発されていない（野生型）植物における発現レベルを比較することによって行うことができる。さらに好ましい実施形態では、ステップ（ｄ）の分析は、野生型ＤＮＡと突然変異型ＤＮＡとの間のヘテロ二本鎖形成を分析することにより行うことができる。したがって、好ましい実施形態では、ステップ（ｄ）の分析は、
ｉ．突然変異型植物からＤＮＡを抽出するステップと、
ｉｉ．ＡＫＲおよび／またはＣＹＰ４５０をコードする核酸配列を含むＤＮＡの一部を増幅して、増幅した突然変異型ＤＮＡを得るステップと、
ｉｉｉ．野生型植物からＤＮＡを抽出するステップと、
ｉｖ．増幅した突然変異型ＤＮＡと野生型植物由来のＤＮＡを混合してヘテロ二本鎖ポリヌクレオチドを形成させるステップと、
ｖ．ミスマッチしたヘテロ二本鎖ポリヌクレオチドの領域に制限することができる一本鎖制限ヌクレアーゼとヘテロ二本鎖ポリヌクレオチドとをインキュベートするステップと、
ｖｉ．ヘテロ二本鎖ポリヌクレオチドにおけるミスマッチの部位を決定するステップと
を含む。
【０１１７】
好ましい実施形態では、使用されるＡＫＲおよび／またはＣＹＰ４５０をコードする核酸配列は、配列番号１１６〜配列番号２１８；配列番号３２４；および配列番号３３７に示される配列；または配列番号１〜配列番号５８；配列番号３２６；配列番号３２８；および配列番号３３９に示される配列；または配列番号３２２に示される配列である。
【０１１８】
さらなる態様では、ＡＫＲおよび／またはＣＹＰ４５０をコードする核酸配列を使用して、遺伝子サイレンシングによりＡＫＲおよび／またはＣＹＰ４５０の発現レベルが調節された細胞を作製することができる。したがって、本開示はさらに、細胞におけるＡＫＲおよび／またはＣＹＰ４５０の発現を低減する方法であって、
（ａ）ＡＫＲおよび／またはＣＹＰ４５０を発現する細胞を準備するステップと、
（ｂ）細胞におけるＡＫＲおよび／またはＣＹＰ４５０の発現をサイレンシングするステップと
を含む方法を含む。
【０１１９】
好ましい実施形態では、細胞は植物細胞である。好ましくは、植物は、植物のケシ科（Ｐａｐａｖｅｒａｃｅａｅ）、クスノキ科（Ｌａｕｒａｃｅａｅ）、バンレイシ科（Ａｎｎｏｎａｃｅａｅ）、トウダイグサ科（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａｃｅａｅ）、またはクワ科（Ｍｏｒａｃｅａｅ）に属するメンバーであり、最も好ましくは、パパヴェル・ソムニフェルム（Ｐａｐａｖｅｒ  ｓｏｍｎｉｆｅｒｕｍ）種、パパヴェル・ブラクテアツム（Ｐａｐａｖｅｒ  ｂｒａｃｔｅａｔｕｍ）種、またはパパヴェル・ロエアス（Ｐａｐａｖｅｒ  ｒｈｏｅａｓ）種に属する植物である。ＡＫＲおよび／またはＣＹＰ４５０をサイレンシングする好ましい方法論は、ウイルス誘導遺伝子サイレンシングである（ＶＩＧＳとして当技術分野で知られている）。一般に、非改変ウイルスに感染した植物では、ウイルスゲノムが標的になる。しかしながら、ウイルスベクターが宿主遺伝子に由来する挿入断片（例えば、ＡＫＲおよび／またはＣＹＰ４５０をコードする配列部分）を担持するように改変されている場合、この工程はさらに、それに対応するｍＲＮＡも標的にする。したがって、本開示はさらに、レベル低下したＡＫＲおよび／またはＣＹＰ４５０を発現する植物を作製する方法であって、
（ａ）ＡＫＲおよび／またはＣＹＰ４５０を発現する植物を準備するステップと、
（ｂ）ウイルス誘導遺伝子サイレンシングを使用して、植物におけるＡＫＲおよび／またはＣＹＰ４５０の発現を低減するステップと
を含む方法を含む。
【０１２０】
本開示のこの態様は、実施例５においてさらに詳述される。
【０１２１】
ＡＫＲおよび／またはＣＹＰ４５０の発現レベルを調節する、本明細書で前述の方法により、限定されるものではないが、モルヒネ、コデイン、テバイン、パパベリン、ノスカピン、（Ｓ）−レチクリン、（Ｒ）−レチクリン、コダミン、ラウダニン、およびラウダノシンを含む、植物における植物アルカロイドのレベルを調節することができる。この方法によりさらに、（Ｓ）−レチクリン、（Ｒ）−レチクリンの比を調節することができる。好ましくは、そのような調節により、植物細胞または植物細胞抽出物における（Ｒ）−レチクリン対（Ｓ）−レチクリンの比が２１：７９未満、より好ましくは０．１未満、より好ましくは０．０５未満、より好ましくは０．０２５未満、より好ましくは０．０１未満になる。そのような調節は実施例５で示される。したがって、本開示は、植物アルカロイドを天然に産生することができる植物における植物アルカロイドのレベルを改変する方法論の使用を含む。好ましくは、そのような植物は、植物のケシ科（Ｐａｐａｖｅｒａｃｅａｅ）、クスノキ科（Ｌａｕｒａｃｅａｅ）、バンレイシ科（Ａｎｎｏｎａｃｅａｅ）、トウダイグサ科（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａｃｅａｅ）、またはクワ科（Ｍｏｒａｃｅａｅ）に属し、より好ましくは、パパヴェル・ソムニフェルム（Ｐａｐａｖｅｒ  ｓｏｍｎｉｆｅｒｕｍ）種、パパヴェル・ブラクテアツム（Ｐａｐａｖｅｒ  ｂｒａｃｔｅａｔｕｍ）種、またはパパヴェル・ロエアス（Ｐａｐａｖｅｒ  ｒｈｏｅａｓ）種に属する。
【０１２２】
本開示のまたさらなる態様によれば、ＡＫＲおよび／またはＣＹＰ４５０をコードする核酸配列を使用して、植物の遺伝子型を同定することができる。好ましくは、植物は、植物のケシ科（Ｐａｐａｖｅｒａｃｅａｅ）、クスノキ科（Ｌａｕｒａｃｅａｅ）、バンレイシ科（Ａｎｎｏｎａｃｅａｅ）、トウダイグサ科（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａｃｅａｅ）、またはクワ科（Ｍｏｒａｃｅａｅ）に属するメンバーであり、より好ましくは、パパヴェル・ソムニフェルム（Ｐａｐａｖｅｒ  ｓｏｍｎｉｆｅｒｕｍ）種、パパヴェル・ブラクテアツム（Ｐａｐａｖｅｒ  ｂｒａｃｔｅａｔｕｍ）種、またはパパヴェル・ロエアス（Ｐａｐａｖｅｒ  ｒｈｏｅａｓ）種に属する。一般に、遺伝子型同定は、染色体対のホモログを識別する手段を提供し、植物集団の後続世代における分離個体を同定するために使用することができる。分子マーカー方法論は、系統発生学研究、植物変種間の遺伝的関係の特徴づけ、交雑種または体細胞雑種の同定、一遺伝子性形質に影響を及ぼす染色体セグメントの局在、マップベースクローニング、および量的遺伝に関する研究のために使用することができる。例えば、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ７，Ｃｌａｒｋ，Ｅｄ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ（１９９７）を参照されたい。分子マーカー方法論ついては、一般的に、Ｔｈｅ  ＤＮＡ  Ｒｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｂｙ  Ａｎｄｒｅｗ  Ｈ．Ｐａｔｅｒｓｏｎ  １９９６（Ｃｈａｐｔｅｒ  ２）ｉｎ：Ｇｅｎｏｍｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔｓ（ｅｄ．Ａｎｄｒｅｗ  Ｈ．Ｐａｔｅｒｓｏｎ）ｂｙ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ／Ｒ．Ｇ．Ｌａｎｄｉｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ａｕｓｔｉｎ，Ｔｅｘ．，ｐｐ．７−２１を参照されたい。本開示による遺伝子型同定の特定の方法には、これに限定されるものではないが、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）を含む任意の分子マーカー分析手法の使用が含まれることがある。ＲＦＬＰは、ヌクレオチド配列の可変性により引き起こされるＤＮＡ制限断片間の対立遺伝子の差を反映する。当業者に公知のように、ＲＦＬＰは、典型的には、植物ゲノムＤＮＡの抽出、および１つまたは複数の制限酵素によるゲノムＤＮＡの消化により検出される。典型的には、得られた断片を、サイズに従って分離し、核酸プローブとハイブリダイズさせる。相同染色体由来の制限断片が明らかになる。対立遺伝子間の断片サイズの差がＲＦＬＰを表す。したがって、本開示はさらに、ＲＦＬＰ分析のような手法を使用して、ＡＫＲおよび／またはＣＹＰ４５０をコードするゲノムＤＮＡ部分、ならびにこれらのＡＫＲおよび／またはＣＹＰ４５０をコードする核酸配列に遺伝学的に連鎖された染色体の核酸配列の分離を追跡する手段を提供する。連鎖した染色体核酸配列は、ＡＫＲおよび／またはＣＹＰ４５０をコードするゲノム核酸配列の５０センチモルガン（ｃＭ）以内、多くの場合４０または３０ｃＭ以内、好ましくは２０または１０ｃＭ以内、より好ましくは５、３、２、または１ｃＭ以内である。したがって、本開示によれば、植物集団において、本開示のＡＫＲおよび／またはＣＹＰ４５０をコードする配列をマーカーとし���使用して、それに遺伝学的に連鎖した核酸配列の分離を評価することができる。好ましくは、植物集団は、植物のケシ科（Ｐａｐａｖｅｒａｃｅａｅ）、クスノキ科（Ｌａｕｒａｃｅａｅ）、バンレイシ科（Ａｎｎｏｎａｃｅａｅ）、トウダイグサ科（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａｃｅａｅ）、またはクワ科（Ｍｏｒａｃｅａｅ）に属する植物を含むかそれらからなり、より好ましくは、植物集団は、パパヴェル・ソムニフェルム（Ｐａｐａｖｅｒ  ｓｏｍｎｉｆｅｒｕｍ）種、パパヴェル・ブラクテアツム（Ｐａｐａｖｅｒ  ｂｒａｃｔｅａｔｕｍ）種、またはパパヴェル・ロエアス（Ｐａｐａｖｅｒ  ｒｈｏｅａｓ）種に属する植物を含むかそれらからなる。
【０１２３】
本開示によれば、植物核ゲノムの分子マーカーマッピングに使用される核酸プローブは、選択的なハイブリダイゼーション条件下で、ＡＫＲおよび／またはＣＹＰ４５０をコードするゲノム配列に選択的にハイブリダイズする。好ましい実施形態では、プローブは、本開示により提供されるＡＫＲおよび／またはＣＹＰ４５０をコードする核酸配列から選択される。典型的には、これらのプローブはｃＤＮＡプローブである。典型的には、これらのプローブは、少なくとも１５塩基長、より好ましくは、少なくとも２０、２５、３０、３５、４０、または５０塩基長である。しかしながら、一般に、プローブの長さは約１キロベース未満である。好ましくは、プローブは、半数体植物染色体組のユニークな遺伝子座にハイブリダイズする単一コピープローブである。ＲＦＬＰマッピングで使用される例示的な制限酵素の一部は、ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲｖ、およびＳｓｔＩである。本明細書で使用する場合、「制限酵素」という用語は、特定のヌクレオチド配列でポリヌクレオチドを認識し、単独でまたは別の組成物と共同して切断する組成物を指すことを含む。
【０１２４】
本開示の核酸配列の多型（対立遺伝子）変異体を識別する他の方法は、限定されるものではないが、１）一本鎖配座解析（ＳＳＣＰ）；２）変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）；３）ＲＮアーゼプロテクションアッセイ；４）対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）；５）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｍｕｔＳタンパク質など、ヌクレオチドミスマッチを認識するタンパク質の使用；および６）対立遺伝子特異的ＰＣＲを含む、当業者に周知の分子マーカー手法の利用により使用することができる。２つの相補ＤＮＡ鎖間のミスマッチの検出に基づく他の手法としては、限定されるものではないが、クランプ変性ゲル電気泳動（ＣＤＧＥ）；ヘテロ二本鎖分析（ＨＡ）、および化学的ミスマッチ切断（ＣＭＣ）が挙げられる。したがって、本開示はさらに、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、ＡＫＲおよびＣＹＰ４５０をコードする核酸を含むと推測される試料を、それにハイブリダイズすることができる核酸プローブと接触させるステップを含む遺伝子型同定の方法を提供する。一般的に、試料は植物試料であり、好ましくは、ＡＫＲおよび／またはＣＹＰ４５０をコードするパパヴェル・ソムニフェルム（Ｐａｐａｖｅｒ  ｓｏｍｎｉｆｅｒｕｍ）核酸配列（例えば、遺伝子、ｍＲＮＡ）を含むと推測される試料である。核酸プローブは、ストリンジェントな条件下で、多型マーカーを含むＡＫＲおよび／またはＣＹＰ４５０をコードする核酸配列のサブ配列に選択的にハイブリダイズする。核酸プローブの多型マーカー核酸配列への選択的なハイブリダイゼーションにより、ハイブリダイゼーション複合体が生じる。ハイブリダイゼーション複合体を検出すると、その多型マーカーが試料中に存在することが示される。好ましい実施形態では、核酸プローブは、ＡＫＲおよび／またはＣＹＰ４５０をコードする核酸配列の一部を含む。
【実施例】
【０１２５】
以下の本明細書において、本開示の方法を行うための特定の実施形態および本開示の組成物を表す実施形態の実施例を提供する。実施例は、説明目的のためのみに提供されるものであり、本開示の範囲を何ら限定することを意図するものではない。
【０１２６】
実施例１−（Ｓ）−レチクリンの（Ｒ）−レチクリンへの変換
この実施例では、ＣＹＰ４５０およびＡＫＲの部分で構成される、パパヴェル・ソムニフェルム（Ｐａｐａｖｅｒ  ｓｏｍｎｉｆｅｒｕｍ）の融合ポリペプチド（配列番号３２３）の形態の酵素混合物を使用する、（Ｓ）−レチクリンの（Ｒ）−レチクリンへのｉｎ  ｖｉｔｒｏ変換が示される。
【０１２７】
下記のように、ｐＥＳＣ−ｌｅｕ２ｄ：：ＰｓＣＰＲ／ＰｓＲＥＰＩを保持するサッカロミセス・セレビシア（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株ＹＰＨ４９９を増殖させ、ミクロソームを精製した。手短に言えば、２％グルコースを添加した、ロイシン不含合成完全（ＳＣ）培地中で、この酵母株を３０℃で１６時間、２５０ｒｐｍで増殖させた。１ミリリットルの培養物を、１．８％ガラクトース、０．２％グルコース、および１％ラフィノースを添加した、ロイシン不含ＳＣ培地５０ｍＬに加え、３０℃で７２時間、２５０ｒｐｍで増殖させた。次いで、培養物を４，０００ｇで５分間遠心分離し、ＴＥＫ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１００ｍＭ  ＫＧ）５ｍＬで洗浄した。ペレットを、ＴＥＳＢ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．６Ｍソルビトール）ｌｍＬに再懸濁し、０．５ｍｍのガラスビーズを等量加えた。チューブを１０℃で４分間、手で振盪した。ビーズをＴＥＳＢで洗浄し、洗浄液を集め、１４，０００ｇで１０分間遠心分離した。上清を１２５，０００ｇで１時間超遠心分離し、上清を廃棄した。次いで、ミクロソームを５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５に再懸濁した。
【０１２８】
酵素アッセイ液は、ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）中に５００μΜ  ＮＡＤＰＨおよび５０μΜ  （Ｓ）−レチクリンおよび上記のように調製したミクロソームを含有した。アッセイ液を、３０℃で一晩インキュベートした。反応後、アッセイ試料を０．２ｍｌ／分の流量でＡｇｉｌｅｎｔ  １２６０  ＨＬＰＣに供し、ＬＵＸセルロース−１のキラルカラム（１５０ｍｍ×２．１ｍｍ内径；Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）を使用して、０．１％ジエチルアミンを添加した７５％重炭酸アンモニウム（溶媒Ａ）および０．１％ジエチルアミン含有２５％アセトニトリル（溶媒Ｂ）により化合物を分離した。（Ｒ）−レチクリンおよび（Ｓ）−レチクリンを波長２８４ｎｍでモニターした。
【０１２９】
結果を図３に示す。図３からわかるように、キラルカラムで標準試料の（Ｒ）−レチクリンおよび（Ｓ）−レチクリンの保持時間はそれぞれ、約１３．５分（最上部パネル）；および１５分（最上部から２番目のパネル）である。最下部パネルは、酵素が混合物中にないアッセイの結果を示し、これらの反応条件下では、（Ｓ）−レチクリンが（Ｒ）−レチクリンにエピマー化されないことが示される。上から３番目のパネルでは、酵素混合物の存在下で、（Ｓ）−レチクリンが（Ｒ）−レチクリンにエピマー化されることが示される（矢印を参照のこと、約１５分の保持時間にピークが出現）。
【０１３０】
実施例２−（Ｓ）−レチクリンの１，２−デヒドロレチクリンへの変換
この実施例では、パパヴェル・ロエアス（Ｐａｐａｖｅｒ  ｒｈｏｅａｓ）のＣＹＰ４５０（配列番号３２５）を使用する、酵母における（Ｓ）−レチクリンの１，２−デヒドロレチクリンへのｉｎ  ｖｉｔｒｏ変換が示される。下記のように、ｐＥＳＣ−ｌｅｕ２ｄ：：ＰｓＣＰＲ／ＰｒＤＲＳを保持するサッカロミセス・セレビシア（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株ＹＰＨ４９９を増殖させ、ミクロソームを精製した。手短に言えば、２％グルコースを添加した、ロイシン不含合成完全（ＳＣ）培地中で、この酵母株を３０℃で１６時間、２５０ｒｐｍで増殖させた。この培養物の１ミリリットルを、１．８％ガラクトース、０．２％グルコース、および１％ラフィノースを添加した、ロイシン不含ＳＣ培地５０ｍＬに加え、３０℃で７２時間、２５０ｒｐｍで増殖させた。次いで、培養物を４，０００ｇで５分間遠心分離し、ＴＥＫ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１００ｍＭ  ＫＣｌ）５ｍＬで洗浄した。次いで、ペレットを、ＴＥＳＢ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．６Ｍソルビトール）１ｍＬに再懸濁し、０．５ｍｍのガラスビーズを等量加えた。チューブを１０℃で４分間、手で振盪した。ビーズをＴＥＳＢで洗浄し、洗浄液を集め、１４，０００ｇで１０分間遠心分離した。次いで、上清を１２５，０００ｇで１時間超遠心分離し、上清を廃棄した。次いで、ミクロソームを５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５に再懸濁した。
【０１３１】
酵素アッセイ液は、ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）中に５００μΜ  ＮＡＤＰＨおよび５０μΜ  （Ｓ）−レチクリンおよび上記のように調製したミクロソームを含有した。アッセイ液を、３０℃で一晩インキュベートした。反応後、アッセイ試料を、ポジティブモードで作動するエレクトロンスプレーイオン化源を有する６４００Ｂ質量分析計に連結したＡｇｉｌｅｎｔ  １２６０  ＨＬＰＣに供した。質量分析計は２００〜４００ｍ／ｚの範囲を走査した。以前に記載された酵素アッセイに関するＨＬＰＣ法を使用して、化合物を分離した（Ｆａｒｒｏｗ  ＳＣ  ａｎｄ  Ｆａｃｃｈｉｎｉ，ＰＪ，（２０１３），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２８８）ｐｐ２８，９９７−２９，０１２；ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅｓ  ｃａｔａｌｙｚｅ  Ｏ−ｄｅｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｏ，Ｏ−ｄｅｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｗｉｄｅｓｐｒｅａｄ  ｒｏｌｅｓ  ｉｎ  ｂｅｎｚｙｌｉｓｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅ  ａｌｋａｌｏｉｄ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｉｎ  ｏｐｉｕｍ  ｐｏｐｐｙ）。
【０１３２】
結果を図４に示す。図４（最上部パネル）からわかるように、保持時間が約３．１分のピークが、酵素を含まない対照試料のＨＰＬＣカラム上で観察される。このピークは、ｍ／ｚ３３０の（Ｓ）−レチクリンの衝突誘起解離スペクトルの最大断片に対する３．１３分の予想保持時間に対応する。最上部から２番目のパネルは、同じ対照試料中にｍ／ｚ３２８のピークが観察されないことを示し、これにより、１，２−デヒドロレチクリンが対照試料中にないことが示される。最上部から３番目のパネルは、酵素を含む試料中において、約３．１分の保持時間にｍ／ｚ３３０のピークが観察されることを示し、これにより、アッセイ試料中に（Ｓ）−レチクリンが存在することが示される。最下部パネルは、アッセイ試料において、保持時間が約３．０のピークがｍ／ｚ３２８で観察されることを示す。このピークは、ｍ／ｚ３２８の１，２−デヒドロレチクリンの衝突誘起解離スペクトルの最大断片に対する３．０２分の予想保持時間に対応し（表１を参照のこと）、酵素の存在下でアッセイ試料中に１，２−デヒドロレチクリンが存在することが示される。
【０１３３】
実施例３−１，２−デヒドロレチクリンの（Ｒ）−レチクリンへの変換
この実施例では、パパヴェル・ロエアス（Ｐａｐａｖｅｒ  ｒｈｏｅａｓ）のＡＫＲ（配列番号３２７）を使用する、酵母における１，２−デヒドロレチクリンの（Ｒ）−レチクリンへのｉｎ  ｖｉｔｒｏ変換が示される。
【０１３４】
５０μｇ／ｍＬカナマイシン一硫酸塩および３５μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを添加した５０ｍＬのＬＢ中、ｐＥＴ４７ｂ：：ＰｒＤＲＲを保持する大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）株Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）の１６時間培養物を、同じ培地１Ｌに加え、３７℃、１８０ｒｐｍで、ＯＤ６００が０．６になるまで増殖させた。次いで、ＩＰＴＧを最終濃度が１ｍＭになるように加え、２５℃で４時間、１８０ｒｐｍで増殖させ、細胞ペレットを遠心分離により集めた。２ｍＭフェニルメタンスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）を添加した緩衝液Ａ（１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．０、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール）中で、フレンチプレスを用いて、細胞を溶解した。１４，０００ｇで１５分間遠心分離して細胞デブリを除去した。全可溶性タンパク質抽出物を、緩衝液Ａ−平衡化ＴＡＬＯＮ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）樹脂と４℃で４５分間、６５ｒｐｍで混合した。樹脂を緩衝液Ａで２回洗浄し、緩衝液Ａ中のイミダゾールの勾配（２．５、１０、１００、２００ｍＭ）を使用して、タンパク質を段階的に溶出した。精製されたタンパク質は、１００ｍＭイミダゾールで溶出された。
【０１３５】
酵素アッセイ液は、リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中に５００μΜ  ＮＡＤＰＨ、５０μΜ  １，２−デヒドロレチクリン、および上記のように調製したタンパク質を含有した。アッセイ液を、３０℃で一晩放置した。反応後、アッセイ試料を、ポジティブモードで作動するエレクトロンスプレーイオン化源を有する６４００Ｂ質量分析計に連結したＡｇｉｌｅｎｔ  １２６０  ＨＬＰＣに供した。質量分析計は２００〜４００ｍ／ｚの範囲を走査した。以前に記載された酵素アッセイに関するＨＬＰＣ法を使用して、化合物を分離した（Ｆａｒｒｏｗ  ＳＣ  ａｎｄ  Ｆａｃｃｈｉｎｉ，ＰＪ，（２０１３），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２８８）ｐｐ２８，９９７−２９，０１２；ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅｓ  ｃａｔａｌｙｚｅ  Ｏ−ｄｅｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｏ，Ｏ−ｄｅｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｗｉｄｅｓｐｒｅａｄ  ｒｏｌｅｓ  ｉｎ  ｂｅｎｚｙｌｉｓｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅ  ａｌｋａｌｏｉｄ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｉｎ  ｏｐｉｕｍ  ｐｏｐｐｙ）。
【０１３６】
結果を図５に示す。図５（最上部パネル）からわかるように、保持時間が約３．０分のピークが、酵素を含まない対照試料のＨＰＬＣカラム上で観察される。このピークは、ｍ／ｚ３２８の１，２−デヒドロレチクリンの衝突誘起解離スペクトルの最大断片に対する３．０２分の予想保持時間に対応する（表１を参照のこと）。最上部から２番目のパネルでは、約３．１分の保持時間にピークが観察されないため、（Ｒ）−レチクリンが試料中にないことが示される。同じ対照試料で小さなピークが約３．０分に観察される。このピークは、基質１，２−デヒドロレチクリンの同位体形態を表す。最上部から３番目のパネルは、酵素を含有する試料において、保持時間が約３．０分のピークがｍ／ｚ３２８で観察されることを示し、これにより、このアッセイ試料中に未消費の１，２−デヒドロレチクリンが少量存在することが示される。最下部パネルは、アッセイ試料において、保持時間が約３．１のピークがｍ／ｚ３３０で観察されることを示す。このピークは、ｍ／ｚ３３０の（Ｒ）−レチクリンの衝突誘起解離スペクトルの最大断片に対する３．１３分の予想保持時間に対応し（表１を参照のこと）、酵素の存在下でアッセイ試料中に（Ｒ）−レチクリンが存在することが示される。
【０１３７】
実施例４−（Ｓ）−Ｎ−メチルコクラウリンの（Ｒ）−Ｎ−メチルコクラウリンへの変換
この実施例では、ＣＹＰ４５０およびＡＫＲの部分で構成される、パパヴェル・ソムニフェルム（Ｐａｐａｖｅｒ ｓｏｍｎｉｆｅｒｕｍ）の融合ポリペプチド（配列番号３２３）の形態の酵素混合物を使用する、酵母における（Ｓ）−Ｎ−メチルコクラウリンの（Ｒ）−Ｎ−メチルコクラウリンへのｉｎ ｖｉｔｒｏ変換が示される。
【０１３８】
下記のように、ｐＥＳＣ−ｌｅｕ２ｄ：：ＰｓＣＰＲ／ＰｓＲＥＰＩを保持するサッカロミセス・セレビシア（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株ＹＰＨ４９９を増殖させ、ミクロソームを精製した。手短に言えば、２％グルコースを添加した、ロイシン不含合成完全（ＳＣ）培地中で、この酵母株を３０℃で１６時間、２５０ｒｐｍで増殖させた。１ミリリットルの培養物を、１．８％ガラクトース、０．２％グルコース、および１％ラフィノースを添加した、ロイシン不含ＳＣ培地５０ｍＬに加え、３０℃で７２時間、２５０ｒｐｍで増殖させた。次いで、培養物を４，０００ｇで５分間遠心分離し、ＴＥＫ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１００ｍＭ  ＫＧ）５ｍＬで洗浄した。ペレットを、ＴＥＳＢ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．６Ｍソルビトール）ｌｍＬに再懸濁し、０．５ｍｍのガラスビーズを等量加えた。チューブを１０℃で４分間、手で振盪した。ビーズをＴＥＳＢで洗浄し、洗浄液を集め、１４，０００ｇで１０分間遠心分離した。上清を１２５，０００ｇで１時間超遠心分離し、上清を廃棄した。次いで、ミクロソームを５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５に再懸濁した。
【０１３９】
酵素アッセイ液は、ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）中に５００μΜ  ＮＡＤＰＨおよび５０μΜ  （Ｓ）−Ｎ−メチルコクラウリンおよび上記のように調製したミクロソームを含有した。アッセイ液を、３０℃で一晩インキュベートした。反応後、アッセイ試料を０．２ｍｌ／分の流量でＡｇｉｌｅｎｔ  １２６０  ＨＬＰＣに供し、ＬＵＸセルロース−１のキラルカラム（１５０ｍｍ×２．１ｍｍ内径；Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）を使用して、０．１％ジエチルアミンを添加した７５％重炭酸アンモニウム（溶媒Ａ）および０．１％ジエチルアミン含有２５％アセトニトリル（溶媒Ｂ）により化合物を分離した。（Ｒ）および（Ｓ）−Ｎ−メチルコクラウリンを波長２３０ｎｍでモニターした。
【０１４０】
結果を図６に示す。図６からわかるように、キラルカラムで標準試料の（Ｓ）−Ｎ−メチルコクラウリンの保持時間は約１３．９分（最上部パネル）である。最下部パネルは、酵素が混合物中にないアッセイの結果を示し、これらの反応条件下では、（Ｓ）−Ｎ−メチルコクラウリンが（Ｒ）−Ｎ−メチルコクラウリンにエピマー化されないことが示される。中段のパネルは、酵素混合物の存在下では、（Ｓ）−Ｎ−メチルコクラウリンが（Ｒ）−Ｎ−メチルコクラウリンにエピマー化されることを示す（矢印を参照のこと、約１６．３分の保持時間にピークが出現）。
【０１４１】
実施例５−ＡＫＲおよびＡＫＲ−ＣＹＰ４５０融合遺伝子の遺伝子サイレンシング
この実施例では、ウイルス誘導遺伝子サイレンシング（ＶＩＧＳ）を使用する、ＡＫＲおよび／またはＣＹＰ４５０をコードする遺伝子のサイレンシングが示される。
【０１４２】
ケシ（パパヴェル・ソムニフェルム（Ｐａｐａｖｅｒ  ｓｏｍｎｉｆｅｒｕｍ））のＢｅａ選択化学型の、ケシ（パパヴェル・ソムニフェルム（Ｐａｐａｖｅｒ  ｓｏｍｎｉｆｅｒｕｍ））由来のＲＥＰＩおよび／またはＣＯＲ１．３（コデイノン還元酵素をコードする）の転写物レベル（それぞれ配列番号３２２および配列番号３２８により転写される）は、タバコラットルウイルス（ＴＲＶ）ベクター系を使用して抑制された。ＲＥＰＩ  ｃＤＮＡの２つの領域（ＲＥＰＩ−（図７Ａ；パネルＡ）およびＲＥＰＩ−５’（図７Ｃ；パネルＡ））およびＣＯＲ１．３  ｃＤＮＡの１つの領域（図７Ｂ；パネルＡ）を、以下のプライマー対を使用して増幅した：
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【０１４３】
ＲＥＰＩ−ａ領域およびＣＯＲ１．３領域はかなりの類似性を示し、それぞれの場合に、ＲＥＰＩおよびＣＯＲ１．３の相互同時サイレンシングが得られる。これに対して、ＲＥＰＩ−５’領域はユニークであり、ＲＥＰＩのサイレンシングのみが得られ、ＣＯＲ１．３のサイレンシングは得られない。
【０１４４】
アンプリコンは、個々にｐＴＲＶ２にクローニングし、ベクターは以前に記載のようにアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）中に動員した。２〜３週齢の実生の頂端分裂組織に、ｐＴＲＶｌおよび遺伝子特異的断片を含有する構築されたｐＴＲＶ２を保持するＡ．ツメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）の１：１混合物を浸潤させた。空ｐＴＲＶ２を陰性対照として使用し、フィトエンデサチュラーゼをコードするｐＴＲＶ２−ＰＤＳコンストラクトを陽性浸潤対照として使用した。浸潤された植物を、８〜１０週間温室で栽培した。以前に記載のように、Ａ．ツメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）による浸潤、ならびにアルカロイドについて、ラテックス、茎、および根の試料の収集および処理、ならびに転写物分析を行った。典型的には、２０〜３０本の植物に、ｐＴＲＶｌおよび１つのｐＴＲＶ２コンストラクトを保持するＡ．ツメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）を浸潤させた。浸潤された植物の約７０〜８０％において、ｐＴＲＶ２コンストラクトの動員された断片が、ＲＴ−ＰＣＲにより検出され（図７Ａ（パネルＢ）；図７Ｂ（パネルＢ）；図７Ｃ、パネルＢ）、これらの植物への感染が成功したことが示された。メタノールを使用して、凍結乾燥したラテックスからアルカロイドを抽出した。相対的な転写物存在量を、ｑＲＴ−ＰＣＲにより測定した（図７Ａ（パネルＣ）；図７Ｂ（パネルＣ）；図７Ｃ、パネルＣ）。アルカロイド含量および相対的な転写物存在量のデータを、６本の個々に浸潤された植物から作成し、それぞれの試料について、３つの技術的レプリケートが使用された。浸潤された植物のラテックス試料をＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより分析した。ｐＴＲＶｌおよび別々のコンストラクト中にＲＥＰＩの２つの領域のそれぞれまたはＣＯＲ１．３を保持するＡ．ツメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）で浸潤されたケシ植物のアルカロイド含量に対する効果を、全イオンクロマトグラム（図７Ａ（パネルＤ）；図７Ｂ（パネルＤ）；図７Ｃ、パネルＤ）を使用し、ラテックスおよび根の中の９つの異なるアルカロイド（モルヒネ、コデイン、テバイン、パパベリン、ノスカピン、コダミン、ラウジン、およびラウダノシン）の相対的存在量を測定することによって（図７Ａ（パネルＥ）；図７Ｂ（パネルＥ）；図７Ｃ、パネルＥ）評価した。モルヒネ含量が低くなることに加えて、ＲＥＰＩまたはＣＯＲ１．３のサイレンシングにより、コデインおよびテバインのレベルが顕著に低下した。ＲＥＰＩ（すなわち、ＡＫＲ−ＣＹＰ４５０遺伝子）のサイレンシングもＣＯＲ１．３（すなわち、ＡＫＲ遺伝子）のサイレンシングも、レチクリン、コダミン、ラウダニン、ラウダノシン、ならびに一貫性は少ないがパパベリンおよびノスカピンの蓄積を顕著に増加させた。（Ｒ）−レチクリン対（Ｓ）−レチクリンの比は、対照（ｐＴＲＶ２）植物のラテックス中で約２１：７９であったが、ｐＴＲＶ２−ＲＥＰＩ−ａ植物およびｐＴＲＶ２−ＣＯＲ１．３植物（図７Ｂ（パネルＦ））のラテックス中では、（Ｒ）−レチクリン対（Ｓ）−レチクリンの比は約２：９８に低下し（図７Ａ（パネルＦ）���、またラテックスおよび根の中でｐＴＲＶ２−ＲＥＰＩ−５’植物のラテックス中では、約５：９５に低下した（図７Ｃ、パネルＦ）。
【０１４５】
実施例６−ＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰ＋／ＮＡＤ＋の存在下でのＡＫＲの触媒活性
この実施例では、還元剤ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの存在下でＡＫＲポリペプチドにより触媒される１，２−デヒドロレチクリンの（Ｒ）−レチクリンへの変換が示される。この実施例ではさらに、酸化剤ＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋の存在下での前述の反応の可逆性が示される。
【０１４６】
パパヴェル・ソムニフェルム（Ｐａｐａｖｅｒ  ｓｏｍｎｉｆｅｒｕｍ）およびパパヴェル・ロエアス（Ｐａｐａｖｅｒ  ｒｈｏｅａｓ）から得られたＡＫＲを使用して反応を行った点、および逆反応では（Ｒ）−レチクリンを基質として用意し、ＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋のいずれかを酸化剤として使用して酵素反応を行なった点を除いて、基本的に上記の実施例３に記載するように実験を行った。後半に述べた反応は、ｐＨ９で行った。図８に示すように、ＮＡＤＨ存在下およびＮＡＤＰＨ存在下の両方において、１，２−デヒドロレチクリンは、パパヴェル・ソムニフェルム（Ｐａｐａｖｅｒ  ｓｏｍｎｉｆｅｒｕｍ）（ＰｓＤＲＲ）（図８Ａ、パネルＡ）およびパパヴェル・ロエアス（Ｐａｐａｖｅｒ  ｒｈｏｅａｓ）（ＰｒＤＲＲ）（図８Ｂ、パネルＡ）のどちらに由来する触媒量のＡＫＲポリペプチドを使用しても、（Ｒ）−レチクリンに変換される。さらに図８に示すように、パパヴェル・ソムニフェルム（Ｐａｐａｖｅｒ  ｓｏｍｎｉｆｅｒｕｍ）ＡＫＲポリペプチドＰｓＤＲＲ（図８Ａ、パネルＢ）およびパパヴェル・ロエアス（Ｐａｐａｖｅｒ  ｒｈｏｅａｓ）ポリペプチドＰｒＤＲＲ（図８Ｂ、パネルＢ）のどちらを使用しても、反応を逆転させることができ、ＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋の存在下で、（Ｒ）−レチクリンは１，２−デヒドロレチクリンに変換される。
【０１４７】
実施例７−ＡＫＲ活性のｐＨ依存性
この実施例では、還元剤存在下および酸化剤存在下の両方におけるＡＫＲポリペプチドのｐＨ依存性が示される。
【０１４８】
パパヴェル・ソムニフェルム（Ｐａｐａｖｅｒ  ｓｏｍｎｉｆｅｒｕｍ）およびパパヴェル・ロエアス（Ｐａｐａｖｅｒ  ｒｈｏｅａｓ）の両方のＣＹＰ４５０およびＡＫＲポリペプチドのｐＨ依存性を検討した。酵素反応は、各反応でのｐＨをｐＨ３．５からｐＨ１０に段階的に増加させた点を除いて、基本的に実施例３および実施例６に記載するように行った。各評価ｐＨにおける酵素活性は、ポジティブモードで作動するエレクトロンスプレーイオン化源を有する６４００Ｂ質量分析計に連結したＡｇｉｌｅｎｔ  １２６０  ＨＬＰＣで試料を分析することにより定量した。質量分析計は２００〜４００ｍ／ｚの範囲を走査した。以前に記載された酵素アッセイに関するＨＬＰＣ法を使用して、化合物を分離した（Ｆａｒｒｏｗ  ＳＣ  ａｎｄ  Ｆａｃｃｈｉｎｉ，ＰＪ，（２０１３），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２８８）ｐｐ２８，９９７−２９，０１２；ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅｓ  ｃａｔａｌｙｚｅ  Ｏ−ｄｅｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ０，０−ｄｅｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｗｉｄｅｓｐｒｅａｄ  ｒｏｌｅｓ  ｉｎ  ｂｅｎｚｙｌｉｓｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅ  ａｌｋａｌｏｉｄ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｉｎ  ｏｐｉｕｍ  ｐｏｐｐｙ）。
【０１４９】
結果を図９に示す。ＮＡＤＰＨ（ＰｓＤＲＳ、順方向）の存在下およびＮＡＤＰ＋（ＰｓＤＲＳ、逆方向）の存在下、パパヴェル・ソムニフェルム（Ｐａｐａｖｅｒ  ｓｏｍｎｉｆｅｒｕｍ）のＣＹＰ４５０（ＰｓＤＲＳ）およびＡＫＲを使用して、ｐＨの関数として酵素活性を示すグラフをパネルＡに示す。ＮＡＤＰＨ（ＰｒＤＲＳ、順方向）の存在下およびＮＡＤＰ＋（ＰｒＤＲＳ、逆方向）の存在下、パパヴェル・ロエアス（Ｐａｐａｖｅｒ  ｒｈｏｅａｓ）のＣＹＰ４５０（ＰｒＤＲＳ）およびＡＫＲを使用して、ｐＨの関数として酵素活性を示すグラフをパネルＢに示す。図９からわかるように、ＰｓＤＲＳおよびＰｒＤＲＳは、約ｐＨ８で最適に（Ｓ）−レチクリンを１，２−デヒドロレチクリンに変換する。ＮＡＤＰＨの存在下で、ＰｓＤＲＲおよびＰｒＤＲＲは、約ｐＨ７で最適に１，２−デヒドロレチクリンを（Ｒ）−レチクリンに変換する。ＮＡＤＰ＋の存在下で、ＰｓＤＲＲおよびＰｒＤＲＲは、約ｐＨ９で最適に（Ｒ）−レチクリンを１，２−デヒドロレチクリンに変換する。
【０１５０】
実施例８−ＡＫＲおよびＡＫＲ−ＣＹＰ４５０融合遺伝子の遺伝子サイレンシング
この実施例ではさらに、ウイルス誘導遺伝子サイレンシング（ＶＩＧＳ）を使用する、ＡＫＲおよび／またはＣＹＰ４５０をコードする遺伝子のサイレンシングを示す。
【０１５１】
遺伝子サイレンシング実験は、ＣＯＲ（ＡＫＲ）およびＲＥＰＩ（ＣＹＰ４５０）遺伝子を以下のコンストラクト：ＲＥＰＩａ、ＲＥＰＩｂ、およびＣＯＲ．１．３を使用して標的化したことを除いて、基本的に実施例５に記載するように行った。ＲＥＰＩａは、ＣＯＲ遺伝子およびＲＥＰＩ遺伝子の両方の保存配列を標的にするコンストラクトを表す。これに対して、ＲＥＰＩｂは、ＲＥＰＩにユニークな領域を標的にする。ＣＯＲ１．３は、ＣＯＲにユニークな領域を標的にする。ＲＥＰＩおよびＣＯＲの転写物レベルを、実施例５に記載するように測定した。空ベクターを対照として使用した（ＰＴＲＶ２）。図１０からわかるように、ＲＥＰＩｂによりＲＥＰＩがユニークに標的にされた植物では、対照に比較してＲＥＰＩ転写物のレベルが低下することが示されるが（図１０−上部パネル）、ＣＯＲ転写物レベルは実質的に同じままである（図１０−下部パネル）。ＲＥＰＩａによりＲＥＰＩおよびＣＯＲが両方とも標的にされた植物では、ＲＥＰＩ（図１０−上部パネル）およびＣＯＲ（図１０−下部パネル）の転写物レベルが低下することが示される。ＣＯＲ１．３を使用してＣＯＲを標的にした場合には、ＣＯＲ転写物レベルが低下した（図１０−下部パネル）。さらに、ＲＥＰＩ転写物レベルも、ＣＯＲ１．３によるＣＯＲ転写物レベルのサイレンシングに呼応して、対照に対して低下した（図１０−上部パネル）。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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