(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的分子を潜在的に含む溶液を流過させるように構成されてなる流路と、
偏光源と、
偏光源からの光を、該光が流路を通過した後に受けるために配設された検出器と、
使用するとき、流路において使用するように配設された複数のセンサ素子であって、各センサ素子は、（ｉ）足場部分と、（ｉｉ）足場／受容体複合体を形成するように足場部分に付着された、標的分子に対する１以上の受容体分子とを含み、
足場／受容体複合体が、発色団を組み込むように修飾され、修飾された足場／受容体複合体が、５：１よりも大きなアスペクト比を有する、複数のセンサ素子とを含むことを特徴とする分子センサ。
【請求項２】
前記修飾された足場／受容体複合体は、１０：１よりも大きなアスペクト比を有することを特徴とする請求項１に記載の分子センサ。
【請求項３】
前記足場部分は、５：１よりも大きなアスペクト比を有することを特徴とする請求項１または２に記載の分子センサ。
【請求項４】
前記足場部分は、合成ポリマー、カーボンナノチューブ、生体分子繊維、結晶、無機粒子、および合成生物学的コンストラクトからなる群から選択されることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の分子センサ。
【請求項５】
前記生体分子繊維は、脂質小胞、糸状バクテリオファージ、ポリペプチド、タンパク質、および核酸ポリマーからなる群から選択されることを特徴とする請求項４に記載の分子センサ。
【請求項６】
前記発色団は、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（ＡＦ）色素、スピロ化合物、フルオレセイン、ＤＮＡインターカレータ、ベンゾピロン、ランタニド複合体、量子ドット、Ｂｏｄｉｐｙｓ  Ｂｌａｃｋ  ｈｏｌｅ  ｑｕｅｎｃｈｅｒ、およびローダミンからなる群から選択されることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の分子センサ。
【請求項７】
前記発色団は、Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ  ＡＦ４０５、ＡＦ４８８、ＡＦ５５５、ＡＦ６１０、ＡＦ６４７、ＡＦ７００、フルオレスカミン、フルオレセイン−イソチオシアネート、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド−フルオレセイン、ローダミン−イソチオシアネート、テトラ−メチル−ローダミン−イソチオシアネート、エオシン−５−マレイミド、ＮＢＤ−クロリド、およびＢＨＱ−１０−サクシニミジルエステル、およびエチジウムブロマイドからなる群から選択されることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の分子センサ。
【請求項８】
各センサ素子は、同一の足場部分、発色団、および同一の受容体分子を含むことを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の分子センサ。
【請求項９】
前記センサは、複数の異なる群のセンサ素子を含み、
各群は、同一の足場部分を有するが、異なる発色団と、各群のセンサ素子の二色性吸光度が、他の群の波長とは異なる波長におけるものであり、各群が異なる標的分子を検出するように、異なる各標的分子に対する受容体分子とを有することを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の分子センサ。
【請求項１０】
（ｉ）足場部分と、
（ｉｉ）当該足場部分に付着されて足場／受容体複合体を形成するように、標的分子のための１以上の受容体分子とを含むセンサ素子であって、
足場／受容体複合体が、発色団を組み込むように修飾され、修飾された足場／受容体複合体は、５：１よりも大きなアスペクト比を有することを特徴とするセンサ素子。
【請求項１１】
複数の異なる群のセンサ素子を含むセンサ素子のキットであって、
各センサ素子は、足場部分と、足場／受容体複合体を形成する、標的分子のための受容体と、を含み、
各群の前記足場／受容体複合体は、異なる発色団で修飾され、
前記各受容体分子は、それぞれ異なる標的分子に対するものであり、
全ての修飾された足場／受容体複合体は、５：１よりも大きなアスペクト比を有し、
各群のセンサ素子の二色性吸光度は、他の群の波長とは異なる波長におけるものであることを特徴とする、センサ素子のキット。
【請求項１２】
流れている溶液中の複数の異なる標的分子を検出する方法であって、
流路に、複数の異なる群のセンサ素子であって、
各センサ素子が、足場部分と、足場／受容体複合体を形成する、標的分子のための受容体とを含み、
各群の足場／受容体複合体が、異なる発色団で修飾され、各群の受容体分子が、異なる標的分子に対するものであり、
修飾された足場／受容体複合体が、５：１よりも大きなアスペクト比を有し、
各群のセンサ素子の二色性吸光度が、他の群の波長とは異なる波長におけるものである、センサ素子を設けることと、
流路に沿って標的分子を潜在的に含む溶液を流過させることと、
光を流路に光を通すことと、
流路を通過した後に光を検出することとを含んで、
溶液の直線二色性スペクトルを生成することを特徴とする方法。
【請求項１３】
流路を通過した光は、直線偏光されることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、物質中の特定分子の存在を検出するために二色性を利用する分子センサに関する。また、本発明は、センサで用いるセンサ素子に関する。
【背景技術】
【０００２】
もともと、生物は、多くの複合分子と、分子集合体とを含む。最も重要な分子および集合体のいくつかは、大きく、高いアスペクト比を有する（すなわち、１つの軸が、他のどの軸よりも有意に長い）。これらの高アスペクト比の分子を特異的に検出するために光学的な装置を使用することが知られている。そのような装置は、これらの長い分子が偏光（すなわち、一方向にのみ固定された電界を有する光）と相互作用する方法に依存している。
【０００３】
上述の装置において利用されている現象は、二色性として知られている。入射光は、直線偏光されて直線二色性（ＬＤ）を生じさせるか、または円偏光されて円二色性（ＣＤ）を生じさせるかのいずれかとなる。ＬＤは、いくつかの分子構造によって示される特性であり、これによって直線偏光は、２つの直交軸に沿って異なって吸収される。ＣＤは、左円偏光および右円偏光の吸収における差異に関連している。選択的光吸収を可能にする分子は、発色団として知られている。二色性分子、すなわち二色性特性を示す分子は、特定の種類の発色団である。二色性物質の例としては、いくつかの天然結晶、延伸ポリマー、および他の非等方性分子である。生体分子は、広い範囲の発色団（芳香族側鎖、ヌクレオチド、およびペプチド骨格など）を含む。
【０００４】
二色性効果を観察することを可能にするために、発色団を、入射偏光光ビームに関して、整列させることが、または少なくとも部分的に整列させることが必要である。この要件は、非整列分子の環境における整列分子からのみ、データ抽出を可能にするという利点を有する。しかしながら、この要件が、今日まで、上述の技術の用途を、主に、高アスペクト比を有する巨大分子の研究に限定してきた。なぜなら、これらは、容易に整列可能だからである。分子は、一つの軸が他の軸よりも実質的に長い場合、高アスペクト比を有すると考えられる。適切な分子としては、棒状、円盤状、または十字形状とすることが可能である。うまく整列された関心部分のいくつかの例は、ＤＮＡ、繊維性タンパク質、および膜（膜タンパク質）の形態である直線状生体分子を含む（Marrington R, Small E, Rodger A, Dafforn TR, Addinall SG, “FtsZ fiber bundling is triggered by a conformational change in bound GTP” J Biol Chem 2004;279(47):48821-48829; Dafforn TR, Rajendra J, Halsall DJ, Serpell LC, Rodger A, “Protein fiber linear dichroism for structure determination and kinetics in a low-volume, low-wavelength couvette flow cell” Biophys J 2004;86(1 Pt 1):404-410; Dafforn TR, Rodger A, “Linear dichroism of biomolecules: which way is up?” Curr Opin Struct Biol 2004;14(5):541-546; Halsall DJ, Rodger A, Dafforn TR, “Linear dichroism for the detection of single base pair mutations” Chem Commun (Camb) 2001(23):2410-2411）。
【０００５】
そのような分子を整列させるための特に便利な方法は、分子を含む溶液を作製し、続いてその溶液を流過させることである。分子の細長い性質のゆえに、流れによって生じたせん断力の結果として整列が生じ、よって、試料を直線二色性の効果を示すために適したものとする。
【０００６】
公知の装置において、関心分子が整列されていれば、直線偏光は、整列された分子の軸に実質的に垂直な方向から溶液を通過して方向付けられる。光の吸収が分子内に生じるが、それは、特定の波長において、放射電界は、分子中の電子を特定の方向に促す。いくつかの分子が同様に整列されるとき、各分子の電子の特徴は、同一の好ましい正味変位方向である。ＬＤは、２つの直行する偏光の間における入射光の吸光度の差異の尺度である。入射光の波長を変化させ、試料から現れる光を検出することで、波長に対する試料の吸光度を示すスペクトルを得ることができる。
【０００７】
分子のＬＤスペクトルは、存在する発色団についての、発色団の配向（したがって、分子配座）、および偏光軸に対する発色団の配向を含む情報を提供する。この情報は、分子構造を理解する上で重要である。ＬＤは、試料のバルク特性の尺度であることに留意されたい。吸光強度は、試料中に存在する標的分子の数を定量化するために使用することができる。また、ＬＤは、整列の変化に非常に敏感であるので、分子構造の異常を検出することができる。たとえば、ＬＤは、ＤＮＡの１３００ｂｐ（塩基対）フラグメントにおける１つのミスマッチ水素結合によって生じる歪みを検出することができる。
【０００８】
さらに、ＬＤは、複合体の形成に非常に敏感である。なぜなら、整列された分子の第２分子に対する結合は、以下の２つの測定可能な効果を有するからである。
１）整列部分の形状が変化すると、その結果、その整列も変化させ、そして観察されるＬＤスペクトルにおける変化をもたらす。
２）第２分子自体は、整列された分子に対する付着によって整列する。このことは、予め整列されていない第２分子の発色団についてのＬＤシグナルの発生をもたらす。したがって、複合体構造の情報を得ることができる。上述の効果は双方とも、複合体の形成を検出するために使用することができる検出可能な現象をもたらす。複合体の性質に関して、構造的情報が分かるだけではなく、相互作用の親和性も測定することができる。
【０００９】
残念ながら、大部分の分子は、高アスペクト比を有しておらず、むしろ約５：１未満のアスペクト比を有する、球に近い形状を有する。これらの分子を整列させるために、それ自体が高アスペクト比を有する受容体に、標的分子を結合させる必要がある。この整列方法は、達成されており、天然に整列可能な受容体（たとえば、ＤＮＡ）に結合するリガンド（たとえば、シスプラチン）の研究に適用された。しかしながら、この方法は、その用途が限られている。なぜなら、天然に整列可能な受容体に結合するそれらの分子のみしか調べることができないからである。
【００１０】
ＷＯ２００８／０５９２８０は、センサ素子が、高アスペクト比を有する足場部分であって、それに付着した受容体部分を有する足場部分を包含した分子センサを提供することによって、上述の問題に取り組んだ。整列可能な足場部分を受容体部分の付着のための基質として使用することは、受容体部分自体も、標的分子も本来の整列特性を必要とすることを意味する。二色性スペクトルを得ることによって整列された分子を検出することができるとともに、センサは、整列された分子を定量し、ミスマッチなどの分子的異常の存在を検出するために使用することができる。受容体部分と標的分子との結合特性は、センサを用いて調べられてもよい。二色性分子の固有の性質は、センサが非常に高感度であることを意味する。
【００１１】
本発明は、ＷＯ２００８／０５９２８０に開示されたセンサがさらに開発されたものであり、二色性分析の用途を拡張することを目的とする。
【発明の概要】
【００１２】
本発明の第１態様によれば、
標的分子を潜在的に含む溶液を流過させるように構成されてなる流路と、
偏光源と、
前記偏光源からの光が前記流路を通過した後、光を受けるように配設された検出器と、
使用するとき、前記流路内に設置される複数のセンサ素子とを含み、
各センサ素子が、（ｉ）足場部分と、（ｉｉ）足場／受容体複合体を形成するように、足場部分に付着された、標的分子に対する１以上の受容体分子とを含み、
前記足場／受容体複合体が、発色団を組み込むように修飾され、修飾された足場／受容体複合体が、高アスペクト比を有する分子センサを提供する。
【００１３】
修飾された足場／受容体複合体によって意味されることは、センサ素子の示す二色性を所望の波長に調整するために、特定の発色団が組み込まれることであると理解される。
【００１４】
本明細書において使用されるように、高アスペクト比は、５：１を超え、１０：１を超え、２０：１を超え、５０：１を超え、７５：１を超え、およびいくつかの実施形態において１００：１を超えるアスペクト比に関する。
【００１５】
足場部分は、高アスペクト比を有してもよい。修飾された足場／受容体複合体が整列され、二色性に必要な吸光度をもたらすことが重要であることが理解される。しかしながら、足場部分、受容体部分、または実際の足場／受容体複合体自体は、それら自体を吸収、または整列させる必要はない。発色団自体は、整列可能な部分であってもよい（すなわち、高アスペクト比を有し、流れ中で整列される）。また、足場および発色団の組み合わせは、たとえば、アスペクト比および／または足場の剛性を変化させることによって、整列可能な部分を生じてもよい。
【００１６】
好適な足場部分の例は、
・  合成ポリマー、
・  カーボンナノチューブ、
・  生体分子繊維、
・  結晶、
・  無機粒子、たとえば金属フラグメント、
・  合成生物学的構築物、
・  （相分離、続いて少ない相の領域の整列を生じるために）異なる極性の液体の混合物を含む。
【００１７】
本明細書において使用されるように、生体分子繊維は、必要な高アスペクト比を有する任意の生体分子であり、流れ条件下で整列可能である。生体分子繊維の例は、脂質小胞、糸状バクテリオファージ、ならびにアミノ酸ポリマー（すなわち、ポリペプチド、またはタンパク質）などのポリマー、および核酸ポリマー（すなわち、ＲＮＡ、またはＤＮＡ）を含む。
【００１８】
いくつかの実施形態において、修飾された足場／受容体複合体は、可視スペクトル（すなわち、４００〜７００ｎｍ）において二色性を示す。
【００１９】
ある実施形態において、生体分子繊維は、Ｍ１３、ｆ１、ｆｄ、Ｉｋｅ、およびＮ１などの糸状バクテリオファージである。
【００２０】
発色団は、他の足場／受容体複合体と自由に交換されないような方法で、足場／受容体複合体に付着される。ある実施形態において、付着は、１以上の共有結合によってなされる（足場、または受容体部分のいずれに対してでもよい）。
【００２１】
好適な発色団の例は、以下の表１におけるものを含む。
【表１】
0006664337.tif 000002
【００２２】
受容体が、標的を他の非標的分子から識別するように、標的に対して十分な特異性を有する必要があることが正しく理解される。いくつかの実施形態において、受容体は、ペプチド、またはタンパク質であり、たとえばアフィマーである。
【００２３】
いくつかの実施形態において、受容体は、標的分子に特異的に結合することができる、抗体、または抗体フラグメントを含む。
【００２４】
第１シリーズの実施形態において、各センサ素子は、同一の受容体分子で修飾された同一の足場／受容体複合体を含む。
【００２５】
第２シリーズの実施形態において、センサは、複数の明らかに異なる群のセンサ素子を含み、当該群は、同一の足場部分を有するが、異なる発色団と、各群のセンサ素子の二色性吸光度が、他の群の波長とは異なる波長におけるものであり、各群が異なる標的分子を検出するように、異なる標的分子に対する受容体分子とを有する。
【００２６】
第２シリーズの実施形態は、多重化、すなわち、１回のアッセイで複数の標的分子を検出することを可能にすることが理解される。なぜなら、各特異的標的分子に対する二色性吸光度は、異なる波長であるからである。
【００２７】
流路は、クエットセルによって有利に提供される。
【００２８】
本発明は、（ｉ）足場部分と、（ｉｉ）支持体／受容体複合体を形成するように当該足場部分に付着した、標的分子に対する１以上の受容体分子とを含み、前記足場／受容体複合体が、発色団を組み込むように修飾され、修飾された足場／受容体複合体が高アスペクト比を有するセンサに属する。
【００２９】
本発明は、センサ素子のキットであって、複数の明らかに異なる群のセンサ素子を含み、
各センサ素子が、足場部分と、足場／受容体複合体を形成する、標的分子に対する受容体とを含み、各群の足場／受容体複合体が、異なる発色団によって修飾され、受容体分子が、異なる標的分子に対するものであり、全ての修飾された足場／受容体複合体が、高アスペクト比を有し、各群のセンサ素子の二色性吸光度は、他の群の波長とは異なる波長におけるものである、センサ素子のキットに属する。
【００３０】
キットは、たとえば、２つ、３つ、４つ、または５つの群のセンサ素子を含んでもよい。
【００３１】
本発明の第２態様によれば、流れている溶液中における複数の異なる標的分子を検出するための方法であって、
複数の異なる群のセンサ素子であって、各センサ素子が、足場と、足場／受容体複合体を形成する、標的分子に対する受容体とを含み、各群の足場／受容体複合体が、異なる発色団によって修飾され、各群の受容体分子が、異なる標的分子に対するものであり、修飾された足場／受容体複合体が、高アスペクト比を有し、各群のセンサ素子の二色性吸光度が、他の群の波長とは異なる波長におけるものである、複数の異なる群のセンサ素子を流路に備えることと、
標的分子を潜在的に含む溶液を流路に沿って流過させることと、
光を流路に通すことと、
光が流路を通過した後、光を検出することとを含み、溶液の直線二色性スペクトルを生じる方法に属する。
【００３２】
流路における入射光は、直線偏光されてもよく（たとえば、偏光源を用いるか、もしくは光が流路に到達する前に光を適切にフィルタリングして）、または入射光は、流路を通過した後、２つの直交配向における偏光を検出することができる検出器を用いることによって偏光されなくてもよいことが理解される。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
本発明は、添付の図面を参照して、例としてのみさらに記載される。
【図１】本発明に係るセンサの模式図である。
【図２】異なる標的分子の存在と、関連したＬＤスペクトルとで働く本発明の方法の図である。
【図３】Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｏ１５７（標的）の不在下、および存在下において、色素（ＢＨＱ１０）によって標識されたＭ１３と、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｏ１５７に対する抗体とに由来するＬＤスペクトルを示す。
【図４】同一試料における複数のＭ１３色素センサ素子の測定値を示す。
【図５】複数のセンサ素子に由来する複数のＬＤシグナルの大きさの変化を独立して検出することができることを示す。
【図６】標的分子の存在に応じたセンサ素子の整列における変化に由来するＬＤシグナルに応じる変化は、標的分子に対する受容体を有さない別のセンサ素子から独立して検出することができることを示す。
【図７】２つのセンサであって、１つは、Ｓ．チフィムリウム（S. typhimurium）（第１標的）に対する抗体を有し、他方は、Ｅ．ｃｏｌｉ（第２標的）に対する抗体を有する２つのセンサによって、細菌の不在下、または１つもしくは双方の種の存在下において、生じるＬＤシグナルにおける変化を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
図１について、本発明に係る分子センサ８を示す。センサ８は、主にプラスチック材料から作製され、不透明である細長いパイプ２の形態の流路を備える。パイプ２の中央部分は、観察窓６として構成され、採用された光の波長に対して透光性である材料から作製された。この特定の例において、観察窓６は、可視光を透過する石英ガラスで作製される。したがって、この例において、観察窓６は、約４００ｎｍ〜７００ｎｍの波長範囲の光が通過できるように構成されてなる。観察窓６の隣接した１側面は、光源３である。光源３は、２つの直交する直線偏光ビームを、観察窓６を通り、それによって流路５を通って放射するように構成されてなる。光源３に対向して、観察窓６および流路５の他方側に配置されるのが、検出器１である。検出器１は、光源３によって放射された光ビームが観察窓６と流路５とを一旦通過すると、それら光ビームを検出するように構成されてなる。
【００３５】
使用において、複数のセンサ素子を含む溶液であって、各センサ素子が、足場／受容体複合体の形態の、標的分子に対する１以上の受容体分子に結合した足場部分を含み、複合体が、修飾された足場／受容体複合体が高アスペクト比を有するように発色団で修飾された溶液が、分析される試料と混合される。目的の関心分子を含む可能性のある溶液は、図１の矢印４によって示される方向にパイプ２を通って流れる。この効果は、２つの群のセンサ素子であって、異なる発色団と異なる標的分子に対する受容体部分とを有することによって、それぞれが他方から区別される、２つの群のセンサ素子があるシステムについて図２に模式的に示される。
【００３６】
図２のパネルＡについて、第１センサ素子は、第１発色団と、第１標的分子に結合するように設計された第１受容体部分とに共有結合した足場部分を有する。第２センサ素子は、第２発色団と第２標的分子に結合するように設計された第２受容体部分とに共有結合した同一の足場部分を含む。発色団は、それらが生じるＬＤスペクトルが、識別可能であるように選択される。
【００３７】
流れ条件下において、センサ素子は、整列され、標的分子の不在下において、２つの異なるピークがＬＤスペクトルにおいて観察される（パネルＢ）。
【００３８】
第１標的分子が存在するとき（第２標的分子は存在しない）、第１受容体は、それに結合し、第１センサ素子の整列が崩れ、それによってＬＤスペクトルのピークが低下する（パネルＤ）。パネルＢおよびＤにおけるピークの相対高さは、第１標的分子がどのくらい存在するかの定量的測定値であると理解される。第２センサ素子の整列は、影響されないので、ＬＤスペクトルにおける関連したピークは変化しない。第２センサ素子の整列が崩れ、ＬＤスペクトルにおけるその関連するピークが減少することを除いて、第２標的分子が存在し、第１標的分子が存在しない場合に同様の状況が起こることが理解される（図示せず）。
【００３９】
第１標的分子および第２標的分子の双方が存在する場合、第１センサ素子および第２センサ素子の双方の整列が崩れ（パネルＥ）、ＬＤスペクトルにおいて双方に関連するピークの減少が導かれる（パネルＦ）。示されるピークは、同じ量だけ減少するが、ピークの高さは、試験を通じて、試料における第１標的分子および第２標的分子の量に基づいて独立して変化することが当然に理解される。
【００４０】
発色団に由来するＬＤシグナルをもたらすために、それは、理想的には共有結合によって、または発色団が、溶液、もしくは他の足場によって自由に交換されないことが確実である別の方法によって、足場／受容体複合体に付着しなければならない。また、発色団は、異方性であるか、または足場／受容体複合体に対して整列されるように、足場／受容体複合体に配設されなければならない。直線二色性は、直線偏光光線に関して秩序だって整列された発色団をもたらす。
この整列は、
１）発色団、および足場／受容体複合体、および／または他の発色団の間の立体障害、または
２）多重結合（共有、または非共有）による、足場／受容体複合体への１つの発色団の付着によって導入することができる。
【００４１】
以下の実施例において、発色団は、発色団からのＬＤシグナルを誘導するために、バクテリオファージ（整列可能な足場）に共有結合される。発色団は、バクテリオファージＭ１３のｇ８ｐコートタンパク質のリジン残基に結合された。付着された発色団は、上述の表１のものを含む。各色素について、標識有効性は、１００〜３０％の範囲であり、それぞれの場合において、ＬＤスペクトルは、色素の吸収波長に対応する波長において各色素について観察された。
【００４２】
この実施例において、リジン残基のアミン基が、発色団の共役部位として使用されたが、多数の他の方法を、そのような足場に使用することができる。これらは、任意のタンパク質のアミノ末端のアミン基、システイン残基のスルフヒドリル、アスパラギン酸およびグルタミン酸残基のカルボキシレート、ならびに任意のタンパク質のカルボキシル末端を介する結合を含むが、発色団を足場に結合する任意の結合化学作用を使用することができる。たとえば、ＤＮＡ、膜小胞、カーボンナノチューブ、および小分子の整然としたアレイなどの非タンパク質性足場について、整列可能な足場に実質的に集められた前駆体に発色団を組み込むことも含み得る他の結合化学作用が、採用されてもよい。
【００４３】
異なる発色団を含む多数の配列可能な足場／受容体複合体が作製されると、これらの試薬は、複数のアッセイ標的を検出することを可能にするアッセイに組み合わせることができ、ならびに／または当該アッセイに陽性および陰性コントロール反応を組み込むことを可能にする。
【００４４】
方法
病原認識抗体および発色団の、バクテリオファージＭ１３に対する結合
この方法は、以下の工程を用いて実施される。
１）接近可能なアミン基をマレイミド基に変換するための、サクシニミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸塩（ＳＭＣＣ）による抗体（Ａｂ）の誘導体化。
２）２つの部分を結合させ、Ｍ１３−Ａｂをもたらすための、Ｍ１３と抗体との混合。
３）サクシンイミド基をマレイミド基に変換し、ＢＨＱ１０−マレイミドをもたらすための、アミノ−エチル−マレイミドによる色素分子（ＢＨＱ１０−サクシンイミド）の誘導体化。
４）Ｍ１３−Ａｂ−ＢＨＱ１０をもたらすための、Ｍ１３−ＡｂとＢＨＱ１０−マレイミドとの混合。
【００４５】
得られるセンサ素子は、ＢＨＱ１０の吸光度の波長に対応するＬＤシグナルをもたらす（図３の細い線）。標的分析物（この場合、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｏ１５７）の添加は、Ｅ．ｃｏｌｉのＯ−抗原と相互作用するセンサ素子上の抗体の相互作用、続いてセンサ素子の整列の混乱、ＬＤシグナルにおける変化（この場合は減少）をもたらす（図３の太い線）。Ｍ１３に結合した色素ＢＨＱ１０は、有用性を示すために役立つが、広いバンド幅を有するので、シグナルが他のシグナルに重複する高度に多重化された用途に適していない。
【００４６】
非常に狭いバンド幅を有する色素は、入手可能であり、このシステムにおいて利用された。たとえば、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ色素（ＡＦ４８８、ＡＦ５５５、およびＡＦ６４７）は、図４に示されるようにＭ１３に結合した。これらのセンサ素子からもたらされる、ＬＤシグナルにおける変化は、有用な他のシグナルから十分に独立して検出することができる。この実証は、３つのＭ１３−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒセンサ素子の濃度が、３つの別の測定において別々に減少した図５に示される。
【００４７】
実施例
２種類のセンサ素子は、以下の特性で作製された。
センサ１：以下の付着部分を有するＭ１３バクテリオファージ
ａ．  ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ５５５  色素
ｂ．  Ｓ．チフィムリウム細菌（S. typhimurium）に結合する抗体
センサ２：以下の付着部分を有するＭ１３バクテリオファージ
ａ．  ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ６４７  色素
ｂ．  Ｅ．ｃｏｌｉ細菌に結合する抗体
【００４８】
図７について、ＬＤシグナルは、細菌の不在下（「緩衝液」）、Ｅ．ｃｏｌｉの存在下（「Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｏ１５７  １０＾７  細胞／ｍＬ」）、Ｓ．チフィムリウム存在下（「Ｓ．チフィムリウム  １０＾７  細胞／ｍＬ」）、ならびにＥ．ｃｏｌｉおよびＳ．チフィムリウムの存在下（「Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｏ１５７  １０＾７、およびＳ．チフィムリウム  １０＾７」）において測定された。５５８ｎｍにおけるシグナルは、Ｓ．チフィムリウム検出に関連付けられ（斜線）、６６０ｎｍにおけるシグナルは、Ｅ．ｃｏｌｉ検出に関連付けられる（塗りつぶしなし）。Ｓ．チフィムリウムの存在下において５５８ｎｍのシグナルが減少し、Ｅ．ｃｏｌｉの存在下において６６０ｎｍのシグナルが減少し、Ｓ．チフィムリウムおよびＥ．ｃｏｌｉの双方の存在下において５５８ｎｍおよび６６０ｎｍのシグナルが減少した。このアッセイは、溶液に単独で、または標的の混合物の一部として存在する標的の検出における本発明の有用性の証拠を提供する。
【００４９】
このことは、内部標準を測定に組み込む機会を示し、それによってセンサ素子からのＬＤシグナルは、標的分子（この場合、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｏ１５７）の存在に応じて減少し、異なる波長におけるＬＤシグナルを有する内部標準センサ素子は、変化しない。このことは、多重測定と、アッセイシステムのせん断流の相違による、整列における任意の相違を正すために内部基準を使用することとの有用性を示すために役立つ。
【００５０】
他の標的分子の包含は、この方法論の結果として生じ、それによって受容体分子および発色団が、異なる標的分子に対して異なることと、これらは、同一試料中において同時に測定されてもよいこととが理解される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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