(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象流体を有する試料容器内に配置される試料の位相差顕微鏡法のための方法であって、
ａ）  照明束のうち、前記試料により偏向されず直接ビームとして用いられる部分が、位相シフト素子上に与えられ、
ｂ）  前記対象流体での光学的屈折に基づいて生じる、前記照明束の主ビーム方向の変化を補償するために、前記照明束は、前記対象流体に入射する前に光学的偏向素子により偏向され、前記光学的偏向素子は、形状を変更可能であり、入射面と出射面と前記入射面及び前記出射面との間の粘性質量とを有し、
ｃ） 前記入射面は、重力場内に形成された前記粘性質量の表面によって、定められ、
ｄ） 前記光学的偏向素子は、前記入射面と前記出射面との間の角度の制御可能な変化のために回動軸周りに回動される、
ことを特徴とする方法。
【請求項２】
位相シフト素子の位置での所与のオーバーラップが、直接ビーム及び位相シフト素子によって、コントロールされ、
前記オーバーラップの最適化のために、前記照明束の断面形状及び／又は前記照明束の前記主ビーム方向に垂直な平面内における所与の位置が、前記照明束が前記光学的偏向素子上に衝突する前に、少なくとも１つの変更可能な光学的適応素子により変更される、
請求項１記載の方法。
【請求項３】
ビーム経路内において、前記試料容器の前に光学的パターンが生成され、
前記試料容器の領域内で生成される光学的な前記光学的パターンの歪みが求められ、
前記光学的パターンの歪みの量が、光学的偏向素子の位置及び／又は形状の自動的制御のために、及び／又は、請求項２を引用する場合には光学的適応素子の制御のために、用いられる、
請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
対象流体を有する試料容器内に配置された試料の顕微鏡検査のために適した位相差顕微鏡であって、
ａ）  照明束を生成するための手段と、
ｂ）  前記試料容器を収容するための対象ホルダと、
ｃ）  前記照明束のビーム経路内において、前記対象ホルダの前に配置され、入射面及び出射面を有する少なくとも１つの光学的偏向素子と、前記光学的偏向素子の形状を変化させるための手段と、
ｄ） 前記入射面と前記出射面との間の角度を制御可能に変化させるための手段であって、前記入射面と前記出射面との間に粘性質量が配置されている、手段と、を有し、
ｅ） 前記入射面は、重力場内に形成された前記粘性質量の表面によって、定められ、
ｆ） 前記光学的偏向素子を少なくとも１つの回動軸周りに回動するための手段が設けられている、
位相差顕微鏡。
【請求項５】
前記入射面は、前記粘性質量の表面上に直接的又は間接的に、浮遊又は載置された、剛性で透明なカバー素子を形成する、
請求項４記載の位相差顕微鏡。
【請求項６】
前記光学的偏向素子は、入射する照明束のビーム方向に垂直な少なくとも１つの軸周りに回動可能である、
請求項４記載の位相差顕微鏡。
【請求項７】
前記試料により屈折されていない直接ビームとして用いられる前記照明束の部分のオーバーラップをモニタリングするための、位相シフト素子を有する手段と、前記照明束の断面形状及び／又は前記照明束の主ビーム方向に垂直な平面内における所与の位置を変化させるための少なくとも１つの変更可能な光学的適応素子と、によって、特徴づけられる、
請求項４乃至６のうちいずれか１項記載の位相差顕微鏡。
【請求項８】
前記オーバーラップをモニタリングするための手段は、焦点位置で可変に形成可能な少なくとも１つのレンズを有するバートランドレンズユニットと、前記形成可能な少なくとも１つのレンズを制御するための手段と、を有する
請求項７記載の位相差顕微鏡。
【請求項９】
ビーム経路内において、前記試料容器の前に配置される、光学的パターンを生成するための手段と、
前記試料容器の領域内で作用する、前記光学的パターンの光学的歪みを求めるための手段と、
前記光学的偏向素子の位置及び／又は形状を制御するための、及び／又は請求項７又は８を引用する場合には前記光学的適応素子を制御するための手段と、が設けられた、
請求項７乃至８のうちいずれか１項記載の位相差顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、請求項１の上位概念による位相差顕微鏡法のための方法、請求項４の上位概念による光学ユニット、並びに請求項７の上位概念による位相差顕微鏡に関する。
【背景技術】
【０００２】
位相差顕微鏡法は、主に透過光で実行され、例えば生きた細胞のような透明な対象に使用される。試料により屈折されない直接ビームと、試料により屈折されるビームとの間のコントラストを増加させるための特別な手段なしでは、試料の視認性は一般に不十分である。コントラストを増加させるための染色は、特に生きている細胞の場合に、試料上への不所望な影響を有する。
【０００３】
位相差顕微鏡法によれば、試料を変化させることなく、コントラストの生成を達成できる。このために、コンデンサ内に配置される通常リング状の位相絞りを使用して、十分な照明開口を有する照明束を生成することが知られている。ビームの元の伝搬方向における主最大部であり、以下では直接ビームと呼ばれる、試料により屈折されていない照明束の部分は、像側の対物焦点面内に配置される、一般に位相リングの形状を備える、位相シフト遅延素子及びグレーフィルタを有する位相シフト素子によって、位相シフトされ、減衰される。試料ビームは同様に試料の通過の際に位相シフトを受ける。位相シフト素子により操作された直接ビームの、試料ビームとの干渉によって、直接ビームと試料ビームとの間に与えられる結果として生じる位相シフトは、振幅変化に変換され、それによって、試料の中間像で所望のコントラスト増加が達成される。位相差のために重要なのは、位相絞りの開口の結像が、位相シフト素子によって、後方対物焦点内で完全にカバーされることであり、従って、直接ビームは位相シフト素子を通過せず、中間像を乱さない。
【０００４】
調査すべき流体、以下対象流体と称する、の試料は、開口した試料容器内に配置されるとき、対象流体メニスカスを形成する。対象流体メニスカスは、特に試料容器のエッジのところで通常は重力方向に対して直角に向かい、従って照明束の主ビーム方向に対して変位する、対象流体の表面経過を有し、従って照明束を相応に屈折させる。このメニスカス効果又はエッジ効果は位相差効果を部分的に相殺し、中間像にアーチファクトをもたらす。これは、特に規格化された細胞培養容器、所謂マイクロタイタープレートにおける場合に当てはまる。これは、複数の相互に隔離された通常円形のカップ状の試料容器、所謂ウェルからなり、その中で検査されるべき細胞が培地に取り囲まれ培養されることができる。マイクロタイタープレートの最も一般的なフォーマットは、１２８×８５ｍｍの底面を有する、６乃至１５３６個の個別ウェルを有する。各ウェル内で凹状に湾曲した対象流体メニスカスが発生し、明視野内のその邪魔な影響はウェルの直径が減少するにつれて増加する。メニスカスがより強く形成されるほど、即ちウェルのエッジに向かうほど、位相リングを通過する直接ビームの割合が大きくなり、そのため顕微鏡は明視野内での作業が増え、従って細胞のイメージングの際のコントラストが顕著に低下する。イメージングするカメラチップの露光がより強くなるため、結果として得られる顕微鏡イメージにおいて、過露光を生じる可能性がある。
【０００５】
マイクロタイタープレートにおける対象流体メニスカスの結像と関連する上述の問題に対処するためのいくつかのアプローチが知られている。そこで、ＥＰ１８５９８６６Ａ１は、ウェルの内壁に疎水性材料の組み合わせを有し、対称流体表面のメニスカスの形成が防止されるべきである、マイクロタイタープレートを開示する。ここでは、従って関連するより高いマイクロタイタープレートの製造コストが不利である。
【０００６】
ＵＳ２０１０／０１９７００４Ａ１又はＵＳ６０７４６１４Ａによれば、カバーが載置された場合に個別のウェル内に突出する透明な円筒を有し、そこで試料を有する対象流体と接触する、特別に形成されたプレートカバーが設けられたマイクロタイタープレートが知られている。これらの円筒の下部は平坦であって、そのため対象流体表面は平らに押圧され、メニスカスは機械的に破壊される。
【０００７】
ＵＳ６２３８９１１Ｂ１によれば、対象流体レンズに対して逆のプラスチックレンズを有するプレートカバーによって、各ウェルの上部がカバーされるマイクロタイタープレートが知られている。このようにして光学的補正がもたらされる。特別な製造コストのほかに、プレートカバーの補正プラスチックレンズがウェル内の対象流体の特有の表面湾曲に調製されることは不利である。もし対象流体の種類が取り換えられると、光学的補正はもはや機能しない場合がある。なぜなら、異なる対象流体はウェル内壁に対して異なる流体静力学上の相互作用を有し、そのため異なる表面湾曲を形成するからである。
【０００８】
冒頭で述べた種類の位相差顕微鏡のための方法及び位相差顕微鏡は、ＵＳ２０１２／０２５７０４０Ａ１から知られている。そこでは、通常のリング絞りに代わって、照明束の断面を偏向可能である可変ユニットを用いることが提案されている。ここで、形状変更可能な開口位相絞りとして機能する液晶ディスプレイ（ＬＣＤ）が用いられる。直接ビームが完全に位相リング上に当たる（faellt）かどうかを、半透過ミラーよって接続されるバートランドレンズを用いてコントロールする。位相リングで直接ビームを可能な限り良好にカバーすることを達成するために、必要な場合には、ＬＣＤで実現される位相絞りの形状が変更される。いずれにせよ、ＬＣＤのみによる絞りのフレキシブルな変形は、メニスカス効果の負の作用を改善できないはずである。ＬＣＤは、直接ビームの歪みの僅かな補正につながる唯一の手段として、詳しくは照射ビーム方向に対して垂直な平面内の位相絞り形状の調整のみをもたらすことができる。さらに、これは、メニスカス曲率がある程度を超えない限り満足に機能する。マイクロタイタープレートのウェル内の対象流体メニスカスは、詳しくは、後方対物焦点内の絞り開口の結像をシフトさせるだけでなく、絞り開口と位相リングとの間の結像関係を、局所的に変化される結像倍率によって、軸方向において、劣化させる。ある種の像面湾曲及び絞り開口の結像の歪みがある。従って、絞り開口は後方対物焦点面内では鮮明に結像されることができない。
【０００９】
請求項４の上位概念による光学ユニットは、ＵＳ３５１４１９２Ａから知られている。流体が充填されたプリズムは、複数の透明な境界壁を備え、その角度は相互に変形可能である、従ってプリズムにより生成される屈折は制御可能である。像移動（Bildbewegungen）の補償のために又は色分散（chromatischer Dispersion）の最小化のために、流体が充填された適応プリズムを用いることが知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】欧州特許公開第  １  ８５９  ８６６  号公報
【特許文献２】米国特許公開第  ２０１０／０１９７００４  号公報
【特許文献３】米国特許登録第  ６  ０７４  ６１４  号公報
【特許文献４】米国特許登録第  ６  ２３８  ９１  １  号公報
【特許文献５】米国特許公開第  ２０１２／０２５７０４０  号公報
【特許文献６】米国特許登録第  ３  ５１４  １９２  号公報
【発明の概要】
【００１１】
本発明の課題は、試料容器への対象流体表面の湾曲による不利な点を反対の方法で打ち消すように働く、冒頭で述べたタイプの位相差顕微鏡のための方法、光学ユニット及び位相差顕微鏡を提供することである。
【００１２】
冒頭で述べたタイプの位相差顕微鏡法のための方法において、課題は、請求項１の特徴的発明特定事項により解決される。従って、対象流体での光学的屈折に基づいて生じる、照明束の主ビーム方向の変化を補償するために、照明束は、対象流体への入射の前に、位置及び／又は形状を変更可能な光学的偏向素子により偏向される。
【００１３】
補償は、有利には、試料容器から離れた後の照明束の主ビーム方向が、偏向素子による偏向前の所与の元の主ビーム方向に対して平行になるように、構成される。主ビーム方向の横方向オフセットのみが生じるが、照明束の相応の逆の横方法シフトによって、照明束が偏向素子に入射する前に補正できる。後者は、例えば、照明束の光源、例えば位相絞りの相応のシフトにより実行される。
【００１４】
このようにして、照明側への対象流体表面の作用は、少なくとも部分的に補償され、位相シフト素子による直接ビームのカバーが達成される。形状及び／又は位置における適応素子の変更可能性は、照明束の偏向を顕微鏡の光軸に対する対象流体の角度に依存して選択することを可能にする。
【００１５】
本発明の意図における照明ビームの主ビーム方向は、対称な照明束の場合にはビーム方向に延在する中心軸にあり、特にリング形状の位相絞りの場合にはその対称軸に与えられることが可能である。
【００１６】
本発明による方法は、次のように実施されることができる。直接ビームと位相シフト素子とのオーバーラップが、例えばバートランドレンズユニットを用いて、コントロールされ、オーバーラップの最適化のために、照明束の断面形状及び／又は照明束の光軸に対して垂直な平面内における位置を、偏向素子への衝突の前に、少なくとも１つの変更可能な光学的適応素子を用いて変更できる。
【００１７】
対象流体のメニスカスによる影響の補償は、好ましくはビーム方向において、偏向素子の前に配置される、可変の光学的適応素子の作用によって、サポートされることができる。照明束が位相絞りにより形成される場合、照明束の位置及び／又はその断面形状の変化は、同時に光学的適応素子を構成する位相絞りの開口の形状変化により行われることができる。変形可能な位相絞りは、上述の従来技術ＵＳ２０１２／０２５７０４０Ａ１から知られるように、ＬＣＤを用いて実現できる。位相絞りの結像が完全に位相シフト素子に当たる（ｆａｅｌｌｔ）ことが確実になると、顕微鏡観察されるべき試料のイメージのコントラストが最大になる。位相絞りなしで、適切なビーム源、例えばＬＥＤアレイを用いて照明束を生成することも考えられる。適応素子はこの場合、照明束の異なる形状に対してＬＥＤが異なるように切り換えられるＬＥＤアレイで有り得る。
【００１８】
本発明による方法は、次のように実施されることができる。ビーム経路において、試料容器の前に光学的パターンを生成し、試料容器の領域において、生成される、パターンの光学的歪みを求め、光学的偏向素子の位置及び／又は形状の自動的制御のために、及び／又は、光学的適応素子の制御のために、パターン歪みの量が用いられる。光学的パターンの生成は、例えば、規則的なグリッド構造を用いて、別個のユニットによって、又は同様にＬＣＤによって、実行されることができる。このようにして、顕微鏡イメージのコントラストの完全に自動的な最適化を、特に偏向素子及び／又は適応素子のためのパラメータを調整することによって、確立できる。
【００１９】
請求項４の上位概念による光学ユニットにおいて、本発明の課題は、入射面が、重力場内で形成される粘性質量の表面により画定されることで解決される。このようにして、非常に有効で、シンプルでありながら効果の著しい適応偏向素子の実施例が与えられる。
【００２０】
偏向素子は、位相差顕微鏡内に設けられ、照明束の主ビーム方向を必要に応じて偏向するのに役立つ。光学ユニットは、偏向素子を通過するビームの制御された操作のために適応偏向素子の可変性を使用できるようにするために、位相差顕微鏡の外部に設けられることもできる。
【００２１】
粘性質量は、偏向素子を取り巻く雰囲気、特に空気よりも高い光学的密度を有し、例えば、水などの流体又はゲルからなることができる。粘性質量は材料及び／又は光学的特性において、試料容器内の対象流体の光学的密度に対応しうる。
【００２２】
偏向素子は粘性質量を有する開口容器（offenen Behaelter）を有し、入射面が粘性流体の表面から直接形成される。
【００２３】
粘性質量表面の動作による、例えば振動に基づく、不所望な作用を緩和し、又は完全に消去するために、光学ユニットは次のように形成されることができる。入射面が、直接的に又は間接的に粘性質量の表面上に浮遊する又は載置された、剛性の、透過性のカバー素子を形成する。カバー素子は、好ましくは、粘性質量がカバー素子の上部表面上に溢れ出るのを防止するために、高められたエッジを有する。粘性質量の表面によって、カバー素子の位置が、及び従って入射面の位置も定められる。
【００２４】
本発明によれば、光学ユニットは、偏向素子を少なくとも１つの回動軸周りに回動させる（Verschwenken）手段が設けられている。好ましくは流体の、粘性質量のための担体の透明な底壁内に与えられた出射面によって、回動動作の際にその角度を重力方向に対して変化させる間、重力場において、入射面を画定する粘性質量の上部表面が、重力方向に対して垂直な回動軸周りの回動動作の際にも水平に配向されたままに保たれる。従って、出射面と入射面との間の角度も変化し、適応偏向素子が実現される。好ましくは２つの直線的に（linear）互いに独立した回動軸が設けられている。
【００２５】
冒頭で述べたタイプの位相差顕微鏡において、課題は、請求項７の特徴的発明特定事項により解決される。本発明による位相差顕微鏡の有利な実施形態は、従属請求項８乃至１４に記載される。
【００２６】
適応偏向素子を有する光学ユニットに代えて、形状が一定の偏向素子を使用することもできる。その表面は、照明束に対する入射側上の一方と、照明束に対する出射側上の他方とで、互いに空間的に異なる角度を備える。従って、例えば入射側は平坦に形成され、出射側は１回又は複数回湾曲した経過を有することができる。そのような偏向素子は次のように配置されることができる。照明束が垂直に入射側に入射し、出射面が入射面に対して平行でなく延在する出射側の位置から出射することで、照明束が相応に屈折される。そのような光学的素子が横方向にシフトされると、照明束に対して入射面と出射面との間の角度関係が変化し、照明側の偏向も相応に変更される。
【００２７】
照明側の偏向に対する可能性（Moeglichkeiten）を高めるために、形状が一定の偏向素子に対して、少なくとも１つの入射面に平行な回動軸に対して平行な回動動作、又は例えば入射する照明の方向に対して平行な回転軸周りの回転を実行するための手段を設けることも考えられる。
【００２８】
本発明による位相差顕微鏡は、有利には次のように構成され得る。偏向素子が好ましくはプリズム状であり、第１境界壁により形成された入射面及び第２境界壁により形成された出射面と、入射面と出射面との間の角度を制御可能に変更するための手段とを備え、入射面と出射面との間には粘性質量が配置されている。
【００２９】
その際、偏向素子は、任意の照明方向を、特に水平方向であっても、考慮することができ、従って、重力場の配向に対する依存性が最早存在しないように構成されている。その際、偏向素子が形成する容器はまた、上部が開口していてもよく、又はフレキシブルな被覆、例えば膜でカバーされていてもよい。従って、粘性質量が１つ以上の境界壁の動作に追従できる。粘性質量の漏れを防止するために、パッキン又は境界壁を相互に連結するフレキシブルな、例えばフィルム状の、例えばゴムからなる、隣り合う境界壁の相対する動作を可能にする壁素子が設けられることが可能である。
【００３０】
少なくとも１つの境界壁の制御された動作のための手段は、モータを備えたアクチュエータであってもよいし、油圧式または空気圧式に駆動されるアクチュエータであってもよい。
【００３１】
本発明による光学ユニットは、偏向素子の並進動作及び／又は回転動作のための手段が設けられることが可能である。これらの措置は、適応偏向素子によるビームの操作の可能性をさらに高める。
【００３２】
既に上述したように、直接ビーム及び位相シフト素子によるオーバーラップは、光学的にコントロールされ、そのために好ましくは、少なくとも１つの焦点位置を可変に形成可能なレンズを有するバートランドレンズユニットが使用される。焦点位置は、少なくとも１つの形成可能なレンズを制御するための手段により設定されることができる。このようにして、バートランドレンズユニットは、長期間顕微鏡内に残されることが可能であり、顕微鏡法のための、即ち、試料の観察のための運転状態と、位相シフト素子との直接ビームのオーバーラップをコントロールするための、即ち、位相絞りの正確な結像をコントロールするための運転状態との間で切換可能である。
【００３３】
したがって、バートランドレンズの回転又は半透明性ミラーの使用はもはや必要ではない。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
以下では、図面を参照して、位相差顕微鏡法のための本発明による方法の有利な実施形態と、光学ユニット及び本発明による位相差顕微鏡の有利な実施形態とが示される。
【００３５】
【図１】位相差顕微鏡を示す図である。
【図２ａ】偏向素子による照明束の偏向の無い位相差顕微鏡の部分を示す図である。
【図２ｂ】図２ａに示された状態の位相リングの位置を示す図である。
【図３ａ】照明束の偏向を有する図２ａによる部分を示す図である。
【図３ｂ】図３ａに示された状態の位相リングの位置を示す図である。
【図４】バートランドレンズユニットを有する位相差顕微鏡の、バートランドレンズの第１動作状態における、さらなる部分を示す図である。
【図５】バートランドレンズユニットの第２動作状態における、図４による部分を示す図である。
【図６】偏向素子の代替的実施形態を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
図１は、位相差顕微鏡を概略的に示す図であり、個別の部品は、図示の簡略化のために実際のサイズ比とは異なる。図示されない光源から生成されたソース・ビーム束１は、照明束３が通過する位相絞り２上に入射する。図２及び３には、照明束３の断面形状は図示されておらず、ただ概略的に一領域のみが示唆されており、その中で照明束３は、ここでは実線で示される主ビーム方向２８に延在する。
【００３７】
位相絞り２から出射された後、照明束３はコンデンサ４上に集束される。コンデンサ４は、照明束３をここでは特に図示されていない試料に集光する。試料は、対象流体６を有する試料容器５内にある。試料容器５は例えば、マイクロタイターのカップでありえる。試料容器５は個別の容器であっても又は他の容器の組み合わせであってもよい。図１、２ａ及び３ａでは試料容器５が対象ホルダ７に担持されており、その位置を好ましくは制御部２２を用いて変化可能である。相応の方法で、マイクロタイタープレート又は少なくとも１つの試料容器５を備える他の対象も、対象ホルダ７により担持されてもよい。
【００３８】
コンデンサ４と試料容器５との間には適応偏向素子８があり、その中に偏向素子・流体９が存在する。偏向素子・流体９は、照明束３のビームに対して透明で、図１の場合には照明束３に対して入射面２９を形成し、例えば水でありえる。必須ではないが、好ましくは、偏向素子８のために対象流体６、例えば培地、の光学的挙動に対応する流体が使用される。この場合、水に比べて増加した粘度を有する液体は、むしろ有利であるとみなされる。
【００３９】
図２ａ及び３ａに示されるように、偏向素子・流体９は部分的にカバー１０が設けられることができ、カバーは同様に、使用される照明束３のビームに対して透明であり、従って、偏向素子８への入射面２９が形成される。カバー１０は、例えば、ペトリ皿で形成されることができ、例えば振動によって、発生する、偏向素子・流体９の表面の波又は他の平坦でない箇所が不所望な影響を及ぼすことを防止する。偏向素子８の作用方法は下記でさらに詳細に説明する。
【００４０】
さらに、照明束３は、位相リング１２を有する対物レンズ１１を通過する。位相リング１２は、位相シフト遅延素子及びグレーフィルタ（これらはここでは詳細には図示されていない）を有し、それによって、照明束３の衝突する部分が減衰され、位相がシフトされる。対物レンズ１１への接続において、ビームは、カメラ１６のイメージセンサ１５に当たる前に、位相差顕微鏡の種類に応じた任意の円筒レンズ１３及びバートランドレンズユニット１４を通過する。
【００４１】
透過照明された試料の可能な限りコントラストの高いイメージングという目標を達成するために、試料により屈折されていない照明束３の部分を用いて位相絞り２のリング形状の開口が完全に位相リング１２上に結像されるべきである。これは、以下では直接ビームと称される、試料により屈折されない照明束３の部分となり、既に述べたように、位相リング１２内で減衰され、位相シフトされる。試料により屈折される照明束３の部分は、反対に、位相リング１２を通過し、試料のコントラストの高い顕微鏡イメージングのために直接ビームと干渉する。イメージングは、接眼レンズ又は、ここで有利な変形例として示されているように、カメラ１６のイメージセンサ１５を用いて観察される。
【００４２】
図２ａは、照明束３が試料容器５の中央に当たる状況を示す。ここで、対象流体６の表面のメニスカスは形成されていないか、又は僅かにだけ形成されている。したがって、照明ビーム３は、試料容器６及びその対象流体６を通る実質的な屈折を経験することなく、対物レンズ１１及び位相リング１２上に当たる（図１参照）。位相リング１２及び位相絞り２は、この、試料容器５により妨害されないビーム経路のために、相対向して整列されているので、直接ビームは完全に位相リング１２上に当たる。
【００４３】
図３は、メニスカス形成に基づいて対象流体６のミラーが水平に対して既に顕著な傾斜を形成している、試料容器５のエッジ付近に位置する試料領域が検査されるべき状況を示す。特別な処置がなければ照明束３は対象流体６への入射の際に屈折してしまい、従って直接ビームは位相リング１２を少なくとも部分的に外れてしまう。この効果に対抗して作用するために、偏向素子８は傾けられ、ビームに対する出射面２３として働く偏向素子８の下部境界面は、最早主ビーム方向２８に対して垂直ではなく、主ビーム方向２８の変化によって、出射面２３において、照明束３の屈折が起こる。偏向素子８の傾斜の量及びそれに伴う主ビーム方向の偏向は、照明束３が試料容器５から出射した後の主ビーム方向２８が、ビーム方向において、試料容器５につながり（anschliessenden）、顕微鏡の部分の光軸に平行になるように選択される。偏向素子８の光学密度が対象流体６の光学密度と同じであれば、傾斜は好ましくは、出射面２３が対象流体６の表面湾曲の接線に平行になるように選択される。偏向素子８と対象流体６との光学的密度が異なる場合は、表面湾曲の接線と出射面２３との間に相応の角度があると有益である（zielfuehrend）。接線について決定的なことは、主ビーム方向２８又は照明束３の光軸と、対象流体６の表面との交差部の場所である。相応の傾動又は回動運動（Kipp- oder Schwenkbewegung）を可能にするために、偏向素子８は、２つの回動軸周りに回動可能な、ここでは図示されていない止め具上に支持される。両回動軸は、照明束３の主ビーム方向２８に対して垂直である。
【００４４】
回動に基づいて、偏向素子８はその形状が変化する。偏向素子・流体９の表面は、依然として重力方向に対して垂直に整列するからである。偏向素子８は従って、図２ａ及び３ａに図示されていない、適応プリズムを回動させるための手段により形成される。
【００４５】
照明束３は角度φだけ回動された偏向素子８の場合に出射面２３によって、屈折、即ち主ビーム方向２８の偏向を受け、対象流体６の表面で屈折される。試料容器５から出射する際には、照明束３は更なる屈折を受け、そうすると主ビーム方向２８は再び、偏向素子８への衝突前に生じていた元の主ビーム方向２８に対して平行に進む。側方へのシフトだけが起こる。
【００４６】
偏向素子８及び対象流体６における屈折に基づいて生じる、照明束３の平行シフトは、位相絞り２の相応及びその開口３０のシフトにより補償される。位相絞りのシフトは図３ｂに記号化されて示されている。そのようなシフトは、図２ａに示される状況では、図２ｂに記号化して示されるように必要ない。対称流体６の流体メニスカスに基づくイメージングの歪みは、このようにして十分に又は理想的には完全に削減される。
【００４７】
図１、２ａ、３ａに模式的に示される位相絞り２は、従って、中間面に平行な平面内でのみシフト可能な、通常の剛性の位相絞りボディにより実現されることができる。
【００４８】
代替的に、位相絞り２を、冒頭で説明したＵＳ  ２０１  ２１０２５７０４０  Ａ１から知られるような、液晶ディスプレイ（ＬＣＤ）によって、実現することも可能である。このようにして、平面内における機械的なシフトを回避できる。ＬＣＤは電気的に変化可能な位相絞り２として機能することができ、位相絞り開口３０全体のシフトが可能であるだけでなく、位相絞り開口３０の形状の変更も行えることが有利である。
【００４９】
後者は、例えば、対象流体６のメニスカスの湾曲が特に強いことに基づいて、位相絞り開口３０の歪んだイメージングが生じる場合に必要となることがある。
【００５０】
図１に示されるバートランドレンズユニット１４は、図４及び図５を参照してより詳細に説明される。ここで示されるバートランドレンズユニット１４の実施例は必須ではない。代替的に、本発明の位相差顕微鏡において、既知のバートランドレンズを位相差顕微鏡のビーム経路内へ進入させること、又は、外部バートランドレンズを接続するために半透過ミラーを設けることが可能である。バートランドレンズを位相絞り２の開口のイメージングをコントロールする（Ｋｏｎｔｒｏｌｌｅ）ために位相リング１２に設けることが、従来技術から知られている。
【００５１】
図１並びに部分的に図４及び図５は、実施形態の有利な変形例として、位相差顕微鏡のビーム経路に常時存在しうるバートランドレンズユニット１４を有する位相差顕微鏡を示す。試料容器５内に試料が配置されている対象平面の結像と、位相リング１２が置かれている像側の顕微鏡焦点面結像との間をイメージセンサ１５上で切り替えることができるように、バートランドレンズユニット１４は切り替え可能であり、  例えば電気的に変形可能なレンズ１７を備える。このようにして、必要に応じて後方焦点面の像又はそこに配置される位相リング１２を提供できるとともに、システムを試料上に集束させることができる光学系を製造することが可能になる。バートランドレンズ動作（第１動作状態）に切り替えるために、焦点可変レンズ１７が小焦点距離から大焦点距離に切り換えられ、したがって対物レンズ１１と管状レンズ１３との間の調整されたビーム束がこのようにして変化され、位相リング１２のイメージセンサ上のイメージが変化する。この状況が図４に示される。
【００５２】
図５は、「切り換えられた」バートランドレンズユニット１４の状況を示す。この場合、試料はイメージセンサ１５上に鮮明に結像される。
【００５３】
本発明による位相差顕微鏡は、偏向素子８の位置又は回動角度、及び／又は位相絞り２の位置及び場合によっては形状を自動的に設定することを可能にする。その際、例えば次のように行われる。
【００５４】
先ず、対象流体６の表面の湾曲が、Ｘ−Ｙ平面内での試料容器の位置に依存して、例えば温度Ｔ、粘度Ｖ、試料容器の直径Ｄ、対象流体６の充填状態などの既知のパラメータから、イメージング過程の前に解析的に近似される。表面湾曲は、その際、簡単化のために、表面湾曲の接線と試料容器８の底面の平らな面の間の角度φ’及びΘ’を用いて表すことができる。対象流体６における照明束３の屈折の補償のために必要な照明束３の偏向を得るために、偏向素子８及び対象流体６が少なくと類似の光学密度であるという仮定の下で、偏向素子の振出角度φ及びΘ（図１にはφだけが示されている）は、先ず、観察されるべき試料位置の中心の上方での対象流体表面の接線の角度値φ’及びΘ’が同一視される。大きく異なる光学密度の場合には適応された角度値を使用することもできる。さらに位相絞り２は、主ビーム方向２８の所期の平行シフトに適合する量だけ、ソース光束のビーム方向に対して垂直なＸー／Ｙ−平面内でシフトされる。
【００５５】
その後、バートランドレンズユニット１４によって、イメージセンサ１５上への位相リング１２の結像のために切り換えられる。これは図１に模式的に示されるバートランドレンズユニット１４のための制御部１９により実行される。カメラ１６のイメージセンサ１５上に生成される位相リングの像は、自動的に評価され、位相絞り２の開口の結像の位相リング１２とのオーバーラップに関して調査される。偏向素子制御部２０と、Ｘ−／Ｙ−シフトと、必要な場合には位相絞り制御部２１を用いて位相絞り２の形状を変化させることとを介して、偏向素子８のロール角及びピッチ角（Ｒｏｌｌ−  ｕｎｄ  Ｎｉｃｋｗｉｎｋｅｌ）φ及びΘについてパラメータを段階的に調節することによって、一方では位相絞り２の、及び他方では位相リング２の開口の像同士のオーバーラップが、その場で観察され、最適化される。像同士のオーバーラップは、位相リング１２の中間像に基づいて評価されることができるだけでなく、代替的又は付加的に、バートランドレンズユニット１４の切り換えにより戻されることができる再形成された対象画像の画像コントラストに基づいて、直接評価されることができる。
【００５６】
代替的に、偏向素子８及び位相絞り２の回動を段階的に変化させることによって、表面湾曲は中間像から直接求められ、そこで位相絞り開口の代わりに所定のパターン、例えばグリッド構造が後方対物焦点上に結像される。図面に示されていないパターンは、有利には、電気的に制御可能な適応素子によって、例えば位相絞り２としても機能できる同じＬＣＤにより生成されることができる。イメージセンサ１５により決定される生じたパターンの歪みに基づいて、アルゴリズムを介して、対象流体６の表面の湾曲により生成されるパターン歪みの形状が求めることができる。これらの情報から位相絞り２及び偏向素子８の適応のためのパラメータが計算されることができる。
【００５７】
図６は、中実材料からなる代替的な偏向要素２４を模式的に示す。試料容器５の上半分は部分的にしか示されていない。上部入射面２５は平面に形成され、対向する出射面２６は凸状に湾曲する。照明束３の複数の代替的な主ビーム方向２７ａ乃至２７ｅが記号化されて示される。
【００５８】
主ビーム方向２７ａを有する照明束３は、屈折せずに偏向素子２４を通過するが、主ビーム方向２７ｂ乃至２７ｅの場合、照明束３はより強い屈折を受ける。
【００５９】
図６に示される状況では、偏向素子２４によってもたらされる主ビーム方向２７ｄの偏向は、対象流体６により生成される屈折の所望の補償につながる。試料容器５内の、池沼流体６の表面の湾曲を有する、ここでは図示されていない試料の別の位置が調査されるべきであるとき、照明束３の偏光を相性流体６の表面の別の湾曲に適応させるために、偏向素子２４を試料容器５に対して相対的にシフトすることが必要である場合がある。偏向素子２４と試料容器５との間の相対運動は、位相差顕微鏡の偏向素子２４の平行移動によってもたらされる。
【符号の説明】
【００６０】
１  ソース・ビーム束
２  位相絞り
３  照明束
４  コンデンサ
５  試料容器
６  対象流体
７  対象ホルダ
８  偏向素子
９  偏向素子・流体
１０  カバー
１１  対物レンズ
１２  位相リング
１３  円筒レンズ
１４  バートランドレンズユニット
１５  イメージセンサ
１６  カメラ
１７  変形可能レンズ
１９  バートランドレンズユニットの制御部
２０  偏向素子制御部
２１  位相絞り制御部
２２  対象ホルダ制御部
２３  出射面
２４  偏向素子
２５  入射面
２６  出射面
２７  照明束
２８  主ビーム方向
２９  入射面
３０  位相絞りの開口
【図１】
0006782761.tif 000002
【図２ａ】
0006782761.tif 000003
【図２ｂ】
0006782761.tif 000004
【図３ａ】
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【図３ｂ】
0006782761.tif 000006
【図４】
0006782761.tif 000007
【図５】
0006782761.tif 000008
【図６】
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