(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞集団がＡＬＳ治療用の治療薬として適しているか否かを判定するための方法であって、
（ａ）塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ヘレグリンおよびｃＡＭＰを含む分化培地中で、少なくとも２日間、間葉系幹細胞集団をインキュベートして、神経栄養因子分泌細胞の集団を得るステップと、
（ｂ）前記神経栄養因子分泌細胞の集団におけるＣＤ４９ａの発現を分析するステップであって、ＣＤ４９ａの発現量が所定のレベルを上回ることをもって、前記神経栄養因子分泌細胞の集団が治療薬として適していることの指標とするステップと
を含む、方法。
【請求項２】
前記ＣＤ４９ａの発現を分析するステップが、前記神経栄養因子分泌細胞の集団中のＣＤ４９ａを発現している神経栄養因子分泌細胞数を分析するステップを含み、前記細胞数が８０％超であることをもって、前記神経栄養因子分泌細胞の集団が治療薬として適していることの指標とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
平均蛍光強度によって測定した、前記神経栄養因子分泌細胞の集団におけるＣＤ４９ａ発現レベルが、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）集団におけるＣＤ４９ａ発現と比較して２倍超に増加することをもって、前記神経栄養因子分泌細胞の集団が治療薬として適していることの指標とし、但し、前記神経栄養因子を分泌する前記細胞の集団および前記ＭＳＣ集団は同一ドナー由来である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記間葉系幹細胞が骨髄に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記インキュベートするステップは６日間を超えない、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞から分泌された神経栄養因子の量を決定するステップをさらに含み、前記神経栄養因子の量が所定のレベルを上回ることをもって、前記細胞集団が治療薬として適していることのさらなる指標とする、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記神経栄養因子が、ＧＤＮＦ、ＶＥＧＦおよびＨＧＦからなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記分化培地が、ホスホジエステラーゼ阻害剤を含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記分化培地が、トリヨードチロニンを含まない、請求項１または８に記載の方法。
【請求項１０】
前記分析するステップが、フローサイトメトリーによって実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
ＡＬＳ治療用の治療薬として有用であると判定された、神経栄養因子を分泌する細胞の単離された集団であって、前記細胞は、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ヘレグリンおよびｃＡＭＰを含む分化培地中における間葉系幹細胞の、１ステップで実施される少なくとも２日間のインキュベーションによって、ｅｘｖｉｖｏで分化したものであり、平均蛍光強度によって測定した、前記細胞集団におけるＣＤ４９ａ発現レベルが、未分化間葉系幹細胞におけるＣＤ４９ａ発現と比較して少なくとも２倍に増加し、前記集団の細胞の少なくとも８０％がＣＤ４９ａを発現している、単離された細胞集団。
【請求項１２】
前記集団の細胞の少なくとも９０％がＣＤ４９ａを発現している、請求項１１に記載の単離された細胞集団。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、そのいくつかの実施形態において、細胞表面マーカーの発現に基づいて神経栄養因子分泌細胞の適性を判定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）は、成人における最も一般的な神経変性疾患の１種である。ＡＬＳは脳および脊髄における運動ニューロン細胞死を特徴とする致死的な進行性神経変性疾患であり、筋肉機能の急速な喪失および最終的な完全麻痺を伴う。
【０００３】
現在実験段階にあるＡＬＳ薬は、推定される病態生理学的機序に基づいて開発されており、抗グルタミン酸作動性薬剤、タンパク質のミスフォールディングおよび蓄積を標的とする薬物、抗酸化薬療法、免疫調節薬および幹細胞などがあげられる。
【０００４】
現在試験段階にある治療法のうち、幹細胞移植は最も可能性の高いものであると考えられる。幹細胞移植療法は、失われたまたは損傷を受けた運動ニューロンを置換することに加えて、独立した細胞保護作用によってＡＬＳ患者に恩恵をもたらし得る。さらに幹細胞は、星状細胞やミクログリアなどの支持的間質細胞に分化する可能性があり、これら細胞は、神経栄養因子のみならず、神経毒性に対して拮抗する酵素系およびパラクリン系のメディエーターを産生し得るものである。さらなる実験データから、非ニューロン細胞置換は、運動ニューロンの生存率向上および神経筋機能の改善を促進するために極めて重要な療法になりうることがわかってきた（Corti S et al. Brain (2010) 133 (2): 465-481）。
【０００５】
パーキンソン病および多発性硬化症など、その他の神経変性疾患のための細胞置換療法における細胞供給源として幹細胞を使用することも示唆されている。
【０００６】
神経栄養因子（ＮＴＦ）は、ニューロンの発達および生存を支える天然に存在する小さなポリペプチドであり、そのためここ数年、ＡＬＳを含めた種々の神経変性疾患治療の選択肢の候補と考えられてきた。ＡＬＳ動物モデルによる研究において、種々の神経栄養因子の投与後の疾患の発症および／または進行の遅延が示された。
【０００７】
しかし、ＡＬＳ患者に対する組換え増殖因子の全身投与またはくも膜下腔内投与を行った臨床試験は効果的ではなく、おそらくその理由の一部は、組換え増殖因子の半減期が短いこと、標的部位において低濃度となること、および副作用の高発生率であると考えられる。
【０００８】
いくつかの研究によって、種々の因子にｉｎ  ｖｉｔｒｏで曝露した後の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、その表現型が変化し、ニューロンおよびグリアマーカーを提示することが示された［Kopen, G.C., et al., Proc Natl Acad USA. 96(19):10711-6, 1999； Sanchez-Ramos, et al. Exp Neurol. 164(2):247-56. 2000； Woodbury, D., J Neurosci Res. 61(4):364-70,2000； Woodbury, D., et al., J Neurosci Res. 69(6):908-17, 2002； Black, I.B., Woodbury, D. Blood Cells Mol Dis. 27(3):632-6, 2001； Kohyama, J., et al. Differentiation. 68(4-5):235-44, 2001； Levy, Y.S. J Mol Neurosci. 21(2):121-32, 2003, Blondheim N.R.,. Stem Cells & Dev. 15:141-164, 2006］。
【０００９】
国際公開第２００６／１３４６０２号および国際公開第２００９／１４４７１８号は、間葉系幹細胞から神経栄養因子分泌細胞を作製するための分化プロトコールを教示している。
国際公開第２００７／０６６３３８号は、間葉系幹細胞から乏突起神経膠細胞様細胞を作製するための分化プロトコールを教示している。
国際公開第２００４／０４６３４８号は、間葉系幹細胞からニューロン様細胞を作製するための分化プロトコールを教示している。
国際公開第２０１４／０２４１８３号は、神経栄養因子を分泌する細胞を作製するためのさらなる分化プロトコールを教示している。
【００１０】
発明の概要
本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、細胞集団が治療薬として適しているか否かを判定するための方法であって、
（ａ）塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ヘレグリンおよびｃＡＭＰを含む分化培地中で、少なくとも２日間、未分化間葉系幹細胞（ＭＳＣ）集団をインキュベートして、分化ＭＳＣ集団を得るステップと、
（ｂ）分化ＭＳＣ集団におけるＣＤ４９ａの発現を分析するステップであって、ＣＤ４９ａの発現量が所定のレベルを上回ることをもって、細胞集団が治療薬として適していることの指標とするステップと
を含む、方法が提供される。
【００１１】
本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、神経栄養因子を分泌する細胞へとｅｘ  ｖｉｖｏで分化した間葉系幹細胞の単離された集団であって、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ヘレグリンおよびｃＡＭＰを含む分化培地中における少なくとも２日間のインキュベーションによって分化ＭＳＣ集団となり、集団の細胞の少なくとも８０％がＣＤ４９ａを発現している、単離されたＭＳＣ集団が提供される。
【００１２】
本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、治療を必要とする対象において免疫関連疾患または炎症関連疾患を治療するための方法であって、対象に、神経栄養因子を分泌する細胞へとｅｘ ｖｉｖｏで分化させた間葉系幹細胞を治療有効量投与することによって、疾患を治療するステップを含み、免疫関連疾患または炎症関連疾患が、神経変性疾患または重症筋無力症ではない、方法が提供される。
【００１３】
本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、免疫関連疾患または炎症関連疾患の治療用神経栄養因子を分泌する細胞へとｅｘ  ｖｉｖｏで分化させた間葉系幹細胞の、疾患治療のための使用であって、免疫関連疾患または炎症関連疾患が、神経変性疾患または重症筋無力症ではない使用が提供される。
【００１４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＣＤ４９ａの発現を分析するステップは、分化ＭＳＣ集団中のＣＤ４９ａを発現している細胞数を分析するステップを含み、細胞数が８０％超であることをもって、細胞集団が治療薬として適していることの指標とする。
【００１５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＣＤ４９ａの発現を分析するステップは、分化ＭＳＣ集団におけるＣＤ４９ａの発現レベルを分析するステップを含み、分化ＭＳＣ集団におけるＣＤ４９ａ発現レベルが、未分化ＭＳＣ集団におけるＣＤ４９発現と比較して２倍超に増加することをもって、細胞集団が治療薬として適していることの指標とし、但し、分化ＭＳＣ集団および未分化ＭＳＣ集団は同一ドナー由来とする。
【００１６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＭＳＣは、骨髄に由来する。
【００１７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、未分化ＭＳＣの前記集団の細胞の９５％超が、ＣＤ７３、ＣＤ９０およびＣＤ１０５を発現している。
【００１８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、未分化ＭＳＣ集団は、フローサイトメトリーによる測定において、ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ３４、ＣＤ４５およびＨＬＡ−ＤＲを発現していない。
【００１９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、インキュベートするステップは、６日間を超えない。
【００２０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、細胞集団中の細胞数は、少なくとも１×１０６細胞である。
【００２１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、細胞数が８５％超であることをもって、細胞集団が治療薬として適していることの指標とする。
【００２２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、本発明の方法においては、細胞から分泌された神経栄養因子の量を決定するステップをさらに含み、神経栄養因子の量が所定のレベルを上回ることをもって、細胞集団が治療薬として適していることのさらなる指標とする。
【００２３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、神経栄養因子は、ＧＤＮＦである。
【００２４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、神経栄養因子は、ＧＤＮＦ、ＶＥＧＦおよびＨＧＦからなる群から選択される。
【００２５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、所定のレベルは、同一ドナーから得られた分化していない間葉系幹細胞から分泌されたＧＤＮＦの量の少なくとも５倍である。
【００２６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、分化培地は、ホスホジエステラーゼ阻害剤を含まない。
【００２７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、分化培地は、トリヨードチロニンを含まない。
【００２８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ホスホジエステラーゼ阻害剤は、ＩＢＭＸを含む。
【００２９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、分化培地は、異種由来成分を含まない。
【００３０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、分化培地は、抗生物質を含まない。
【００３１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、本発明の方法においては、インキュベートするステップに先立って、未分化ＭＳＣ集団を培養するステップをさらに含み、培養するステップは、細胞分化を促進しない条件下で実施される。
【００３２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、培養するステップは、前記未分化ＭＳＣの播種後３日間実施される。
【００３３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、播種は、約６０００〜８０００細胞／ｃｍ２の密度で実施される。
【００３４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、培養するステップは、血小板溶解物を含む培養培地中で実施される。
【００３５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、培養培地中の血小板溶解物のパーセンテージは約１０％である。
【００３６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、培養培地は、Ｌ−グルタミン、ピルビン酸ナトリウムおよびヘパリンをさらに含む。
【００３７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、分析するステップは、フローサイトメトリーによって実施される。
【００３８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＭＳＣ集団の細胞の少なくとも９０％がＣＤ４９ａを発現している。
【００３９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、細胞集団の少なくとも８０％がＣＤ４９ａを発現している。
【００４０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、細胞は、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ヘレグリンおよびｃＡＭＰを含む分化培地中でのインキュベーションによってｅｘ  ｖｉｖｏで分化されたものである。
【００４１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、集団の細胞の少なくとも９０％は、ＣＤ４９ａを発現している。
【００４２】
別途定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および／または科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同一の意味を有する。本発明の実施形態の実施または試験において、本明細書に記載されるものと同様または同等の方法および材料を使用することができるが、例示的方法および／または材料は、以下に記載されている。矛盾する場合には、本明細書およびそこに記載された定義が支配する。さらに、材料、方法および具体例は、単に例示的なものであり、必ずしも本発明の限定を意図するものではない。
【００４３】
本発明のいくつかの実施形態は、付随する図面を参照して、単なる例示として本明細書に記載される。ここで特定の図面に対して参照して説明するが、ここで示す詳細は例示あり、且つ本発明の態様を具体的に考察することを目的とするものであることを強調しておく。これに関連して、図面と共に本明細書の説明を読むことによって、本発明の態様が実施され得る方法が明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】同一ドナー由来のＭＳＣ細胞（黒線）およびＭＳＣ−ＮＴＦ細胞（太い黒線）の、分化終了時の表面ＣＤ４９ａ発現の代表的フローサイトメトリー分析の図である。左側の点線は、アイソタイプ対照である（アイソタイプ対照のＭＦＩは、０．３９５であり、ＭＳＣのＭＦＩは２．８３であり、ＭＳＣ−ＮＴＦのＭＦＩは１３．５である）。
【図２Ａ】ＡＬＳ患者由来の骨髄ＭＳＣにおける、分化前および分化後のＧＤＦ−１５量を示すグラフである。
【図２Ｂ】ＡＬＳ患者由来の骨髄ＭＳＣにおける、分化前および分化後のＩＬ−８量を示すグラフである。
【図３】貯蔵培地における細胞の安定性を示すグラフである。細胞を２〜８℃でシリンジ内でインキュベートした。２４、４８、７２および９６時間後、細胞をサンプリングし、各時点における生存細胞の回収率および生存率を評価した（図３のＡ）。各時点において、細胞を培養培地に播種し、３日間培養した。それぞれの３日間の培養期間の終了時には、生存細胞の回収率および生存率を評価した（０時間で播種した細胞数に対する回収率％として算出した；図３のＢ）。結果は、２回の実験の平均を示した。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
本発明は、そのいくつかの実施形態では、細胞表面マーカー発現に基づいて神経栄養因子分泌細胞の適性を判定する方法に関する。
【００４６】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明は、その適用において、以下の説明によって示される、または実施例によって例示される詳細に必ずしも制限されルものではないことを理解されたい。本発明は、その他の実施形態も可能であり、また、種々の方法で実施もしくは実行可能である。
【００４７】
神経栄養因子（ＮＴＦ）は、神経細胞の生存、機能維持および表現型の発達を調節する分泌タンパク質である。ＮＴＦレベルの変化は、ニューロンにおけるプログラムされた細胞死の誘発に関与しており、したがって、パーキンソン病およびその他の神経変性疾患の病理発生に寄与する。
【００４８】
しかし、神経栄養因子は、血液脳関門を通過せず、全身注射後に正しく分布しないので、神経栄養因子の直接使用は適用可能ではない。したがって、神経栄養因子の治療的特性を利用するには、その他の手法を開発しなければならない。
【００４９】
ヒト間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を神経栄養因子分泌細胞に分化させるためのプロトコールは、当技術分野で公知である。例えば、国際公開第２００６／１３４６０２号および国際公開第２００９／１４４７１８号を参照のこと。
【００５０】
本発明者らは、ＭＳＣからの神経栄養因子の分泌を増強する、新規な１ステップ分化プロトコールをこれまでに開発した。グリア由来増殖因子（ＧＤＮＦ）および脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）の分泌のレベルは、分化プロセス後に一貫して上方制御され、同一ドナーから得られた対応する分化していない細胞集団と比較して、ＧＤＮＦは２０倍程度、ＢＤＮＦは３倍程度、上方制御されることが示された。
【００５１】
上記プロトコールは、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ヘレグリンおよびｃＡＭＰを含む単一培地中で行う、未分化ＭＳＣの直接分化を含む。
【００５２】
本発明者らは、このプロトコールに従って分化に成功した間葉系幹細胞集団を選択するための、細胞表面マーカーの発現に基づく独自の簡単な方法を見出した。これらの分化細胞上に発現された無数の潜在的細胞表面マーカーのうち、本発明者らは、ＣＤ４９ａが分化の成功を実証するための単一マーカーとして使用し得ることを見出した。
【００５３】
図１に詳述されるように、分化成功後に得られた細胞の８０％超が、その細胞表面上にＣＤ４９ａを発現していた。対照的に、分化前には細胞の約６５％しか、その細胞表面上にＣＤ４９ａを発現していなかった。さらに、本発明者らは、分化に成功したＭＳＣにおけるＣＤ４９ａ発現レベルは、未分化ＭＳＣにおけるＣＤ４９ａ発現レベルよりも高いことを示した。
【００５４】
したがって、本発明の一態様によれば、
（ａ）塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ヘレグリンおよびｃＡＭＰを含む分化培地中で、少なくとも２日間、未分化間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の集団をインキュベートして、分化ＭＳＣ集団を得るステップと、
（ｂ）分化ＭＳＣ集団におけるＣＤ４９ａの発現を分析するステップであって、所定のレベルを上回るＣＤ４９ａの量が、細胞集団が治療薬として適していることを示すステップと
を含む、細胞集団が適した治療薬であるか否かを判定する方法が提供される。
【００５５】
本明細書において、「治療に適した」とは、神経変性疾患および免疫疾患（例えば、自己免疫疾患）を治療するための細胞集団の適合性を指す。特定の実施形態によれば、治療に適した細胞は、特定の疾患に対して治療効果を発揮し得るのに十分な神経栄養因子を分泌するものである。
【００５６】
本明細書において「神経変性疾患」とは、中枢神経系の損傷によって引き起こされる疾患を表すために使用する。本発明の細胞および方法を使用して治療され得る例示的な神経変性疾患としては、例えば、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病、多系統萎縮（ＭＳＡ）、ハンチントン舞踏病、アルツハイマー病、レット症候群、サンフィリポ症候群などのリソソーム蓄積症（例えば、Folkerth, J. Neuropath. Exp. Neuro., September 1999, 58:9に記載の「白質疾患」またはグリア／脱髄疾患）、ゴーシェ病、テイ・サックス病（β−ヘキソサミニダーゼ欠乏症）、その他の遺伝病、多発性硬化症（ＭＳ）、虚血、事故、環境障害などによって引き起こされた脳傷害または外傷、脊髄損傷、運動失調が挙げられる。さらに、本発明は、患者における卒中、そうでなければ、患者の脳内の部位への血流の欠如または虚血によって引き起こされる中枢神経系に対する影響、または脳および／または脊髄への物理的傷害から生じた中枢神経系に対する影響を、低減および／または排除するために使用され得る。神経変性疾患はまた、例えば、自閉症スペクトラム障害および統合失調症などの関連神経疾患を含めた神経発達障害を、多数の他の疾患と共に含む。
【００５７】
本明細書に記載された細胞を使用して治療され得る神経系の自己免疫疾患としては、例えば、多発性硬化症および重症筋無力症、ギランバレー症候群、多系統萎縮（ＭＳＡ；種々の程度のパーキンソン症状、自律神経障害および小脳性運動失調を伴う、孤発性進行性の成人発症型神経変性障害）が挙げられる。その他の自己免疫疾患は、参照によりその内容が本明細書に組み込まれる、Kraker et al., Curr Neuropharmacol. 2011 September; 9(3): 400-408に記載されている。
【００５８】
本発明の細胞は、未分化骨髄由来ＭＳＣと比較して、増強された免疫調節効果を示す（下記表５を参照）。したがって、本発明の細胞は、任意の免疫関連異常または炎症性障害の治療において有用であり得る。
【００５９】
本明細書において、「炎症性障害」とは、慢性炎症性疾患および急性炎症性疾患を含むが、これらに限定されるものではない。このような疾患および状態の例を、以下にまとめた。
【００６０】
過敏症を伴う炎症性疾患
過敏症の例として、Ｉ型過敏症、ＩＩ型過敏症、ＩＩＩ型過敏症、ＩＶ型過敏症、即時型過敏症、抗体媒介性過敏症、免疫複合体媒介性過敏症、Ｔリンパ球媒介性過敏症およびＤＴＨが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００６１】
Ｉ型または即時型過敏症の例は、喘息である。
ＩＩ型過敏症としては、リウマチ性疾患、リウマチ性自己免疫疾患、関節リウマチ(Krenn V. et al., Histol Histopathol 2000 Jul;15 (3):791)、脊椎炎、強直性脊椎炎(Jan Voswinkel et al., Arthritis Res 2001; 3 (3): 189)、全身性疾患、全身性自己免疫疾患、全身性エリテマトーデス(Erikson J. et al., Immunol Res 1998;17 (1-2):49)、硬化症、全身性硬化症(Renaudineau Y. et al., Clin Diagn Lab Immunol. 1999 Mar;6 (2):156); Chan OT. et al., Immunol Rev 1999 Jun;169:107)、腺疾患、腺性自己免疫疾患、膵性自己免疫疾患、糖尿病、Ｉ型糖尿病(Zimmet P. Diabetes Res Clin Pract 1996 Oct;34 Suppl:S125)、甲状腺疾患、自己免疫性甲状腺疾患、グレーブス病(Orgiazzi J. Endocrinol Metab Clin North Am 2000 Jun;29 (2):339)、甲状腺炎、特発性自己免疫性甲状腺炎(Braley-Mullen H. and Yu S, J Immunol 2000 Dec 15;165 (12):7262)、橋本甲状腺炎(Toyoda N. et al., Nippon Rinsho 1999 Aug;57 (8):1810)、粘液水腫、突発性粘液水腫(Mitsuma T. Nippon Rinsho. 1999 Aug;57 (8):1759)；自己免疫生殖疾患、卵巣疾患、卵巣自己免疫(Garza KM. et al., J Reprod Immunol 1998 Feb;37 (2):87)、自己免疫性抗精子不妊症(Diekman AB. et al., Am J Reprod Immunol. 2000 Mar;43 (3):134)、反復性流産(Tincani A. et al., Lupus 1998;7 Suppl 2:S107-9)、神経変性疾患、神経疾患、神経学的自己免疫疾患、多発性硬化症(Cross AH. et al., J Neuroimmunol 2001 Jan 1;112 (1-2):1)、アルツハイマー病(Oron L. et al., J Neural Transm Suppl. 1997;49:77)、重症筋無力症(Infante AJ. And Kraig E, Int Rev Immunol 1999;18 (1-2):83)、運動神経障害(Kornberg AJ. J Clin Neurosci. 2000 May;7 (3):191)、ギランバレー症候群、神経障害および自己免疫神経障害(Kusunoki S. Am J Med Sci. 2000 Apr;319 (4):234)、筋無力症疾患、ランバート・イートン筋無力症症候群(Takamori M. Am J Med Sci. 2000 Apr;319 (4):204)、腫瘍随伴神経疾患、小脳性萎縮、腫瘍随伴小脳性萎縮、非腫瘍随伴スティフ・マン症候群、小脳性萎縮症、進行性小脳性萎縮症、脳炎、ラスムッセン脳炎、筋萎縮性側索硬化症、シデナム舞踏病、ジル・ドゥ・ラ・トゥレット症候群、多腺性内分泌障害、自己免疫性多腺性内分泌障害(Antoine JC. and Honnorat J. Rev Neurol (Paris) 2000 Jan;156 (1):23)；神経障害、免疫異常神経障害(Nobile-Orazio E. et al., Electroencephalogr Clin Neurophysiol Suppl 1999;50:419)；神経性筋強直症、後天性神経性筋強直症、先天性多発性関節拘縮症(Vincent A. et al., Ann N Y Acad Sci. 1998 May 13;841:482)、心血管疾患、心血管自己免疫疾患、アテローム性動脈硬化症(Matsuura E. et al., Lupus. 1998;7 Suppl 2:S135)、心筋梗塞(Vaarala O. Lupus. 1998;7 Suppl 2:S132)、血栓症(Tincani A. et al., Lupus 1998;7 Suppl 2:S107-9)、肉芽腫症、ウェジナー肉芽腫症、動脈炎、高安動脈炎および川崎症候群(Praprotnik S. et al., Wien Klin Wochenschr 2000 Aug 25;112 (15-16):660);抗第ＶＩＩＩ因子自己免疫疾患(Lacroix-Desmazes S. et al., Semin Thromb Hemost.2000;26 (2):157);血管炎、壊死性小血管血管炎、顕微鏡的多発血管炎、チャーグ・ストラウス症候群、糸球体腎炎、微量免疫型限局性壊死性糸球体腎炎、半月体形成性糸球体腎炎(Noel LH. Ann Med Interne (Paris). 2000 May;151 (3):178)；抗リン脂質症候群(Flamholz R. et al., J Clin Apheresis 1999;14 (4):171)；心不全、心不全におけるアゴニスト様β-アドレナリン受容体抗体(Wallukat G. et al., Am J Cardiol. 1999 Jun 17;83 (12A):75H)、血小板減少性紫斑病(Moccia F. Ann Ital Med Int. 1999 Apr-Jun;14 (2):114)；溶血性貧血、自己免疫性溶血性貧血(Efremov DG. et al., Leuk Lymphoma 1998 Jan;28 (3-4):285)、胃腸疾患、胃腸管の自己免疫疾患、腸疾患、慢性炎症性腸疾患(Garcia Herola A. et al., Gastroenterol Hepatol. 2000 Jan;23 (1):16)、セリアック病(Landau YE. and Shoenfeld Y. Harefuah 2000 Jan 16;138 (2):122)、筋系の自己免疫疾患、筋炎、自己免疫筋炎、シェーグレン症候群(Feist E. et al., Int Arch Allergy Immunol 2000 Sep;123 (1):92)；平滑筋自己免疫疾患(Zauli D. et al., Biomed Pharmacother 1999 Jun;53 (5-6):234)、肝疾患、肝性自己免疫疾患、自己免疫肝炎(Manns MP. J Hepatol 2000 Aug;33 (2):326)および原発性胆汁性肝硬変(Strassburg CP. et al., Eur J Gastroenterol Hepatol. 1999 Jun;11 (6):595)が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００６２】
ＩＶ型またはＴ細胞媒介性過敏症としては、リウマチ性疾患、関節リウマチ(Tisch R, McDevitt HO. Proc Natl Acad Sci U S A 1994 Jan 18;91 (2):437)、全身性疾患、全身性自己免疫疾患、全身性エリテマトーデス (Datta SK., Lupus 1998;7 (9):591)、腺疾患、腺性自己免疫疾患、膵性疾患、膵性自己免疫疾患、１型糖尿病(Castano L. and Eisenbarth GS. Ann. Rev. Immunol. 8:647)；甲状腺疾患、自己免疫性甲状腺疾患、グレーブス病(Sakata S. et al., Mol Cell Endocrinol 1993 Mar;92 (1):77)；卵巣疾患(Garza KM. et al., J Reprod Immunol 1998 Feb;37 (2):87)、前立腺炎、自己免疫性前立腺炎(Alexander RB. et al., Urology 1997 Dec;50 (6):893)、多腺性症候群、自己免疫性多腺性症候群、Ｉ型自己免疫性多腺性症候群(Hara T. et al., Blood. 1991 Mar 1;77 (5):1127)、神経疾患、自己免疫性神経疾患、多発性硬化症、神経炎、視神経炎(Soderstrom M. et al., J Neurol Neurosurg Psychiatry 1994 May;57 (5):544)、重症筋無力症(Oshima M. et al., Eur J Immunol 1990 Dec;20 (12):2563)、スティフ・マン症候群(Hiemstra HS. et al., Proc Natl Acad Sci U S A 2001 Mar 27;98 (7):3988)、心血管疾患、シャーガス病における心臓自己免疫(Cunha-Neto E. et al., J Clin Invest 1996 Oct 15;98 (8):1709)、自己免疫血小板減少性紫斑病(Semple JW. et al., Blood 1996 May 15;87 (10):4245)、抗ヘルパーＴリンパ球自己免疫(Caporossi AP. et al., Viral Immunol 1998;11 (1):9)、溶血性貧血(Sallah S. et al., Ann Hematol 1997 Mar;74 (3):139)、肝疾患、肝性自己免疫疾患、肝炎、慢性活動性肝炎(Franco A. et al., Clin Immunol Immunopathol 1990 Mar;54 (3):382)、胆汁性肝硬変、原発性胆汁性肝硬変(Jones DE. Clin Sci (Colch) 1996 Nov;91 (5):551)、腎臓病、腎臓自己免疫疾患、腎炎、間質性腎炎(Kelly CJ. J Am Soc Nephrol 1990 Aug;1 (2):140)、結合組織疾患、耳疾患、自己免疫結合組織疾患、自己免疫耳疾患(Yoo TJ. et al., Cell Immunol 1994 Aug;157 (1):249)、内耳の疾患(Gloddek B. et al., Ann N Y Acad Sci 1997 Dec 29;830:266)、皮膚疾患、皮膚疾患(cutaneous diseases)、皮膚疾患(dermal diseases)、水疱性皮膚疾患、尋常性天疱瘡、水疱性類天疱瘡および落葉状天疱瘡が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００６３】
遅延型過敏症の例としては、接触皮膚炎および薬疹が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００６４】
過敏症を媒介するＴリンパ球種の例としては、ヘルパーＴリンパ球および細胞傷害性Ｔリンパ球が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００６５】
ヘルパーＴリンパ球媒介性過敏症の例としては、Ｔｈ１リンパ球媒介性過敏症およびＴｈ２リンパ球媒介性過敏症が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００６６】
自己免疫疾患
自己免疫疾患には、心血管疾患、リウマチ性疾患、腺疾患、胃腸疾患、皮膚疾患、肝疾患、神経疾患、筋疾患、腎臓病、生殖と関連する疾患、結合組織疾患および全身性疾患が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００６７】
自己免疫心血管疾患の例としては、アテローム性動脈硬化症(Matsuura E. et al., Lupus. 1998;7 Suppl 2:S135)、心筋梗塞(Vaarala O. Lupus. 1998;7 Suppl 2:S132)、血栓症(Tincani A. et al., Lupus 1998;7 Suppl 2:S107-9)、ウェジナー肉芽腫症、高安動脈炎、川崎症候群(Praprotnik S. et al., Wien Klin Wochenschr 2000 Aug 25;112 (15-16):660)、抗第VIII因子自己免疫疾患(Lacroix-Desmazes S. et al., Semin Thromb Hemost.2000;26 (2):157)、壊死性小血管脈管炎、顕微鏡的多発血管炎、チャーグ・ストラウス症候群、微量免疫型限局性壊死性および半月体形成性糸球体腎炎(Noel LH. Ann Med Interne (Paris). 2000 May;151 (3):178)、抗リン脂質症候群(Flamholz R. et al., J Clin Apheresis 1999;14 (4):171)、抗体誘導性心不全(Wallukat G. et al., Am J Cardiol. 1999 Jun 17;83 (12A):75H)、血小板減少性紫斑病(Moccia F. Ann Ital Med Int. 1999 Apr-Jun;14 (2):114; Semple JW. et al., Blood 1996 May 15;87 (10):4245)、自己免疫性溶血性貧血(Efremov DG. et al., Leuk Lymphoma 1998 Jan;28 (3-4):285; Sallah S. et al., Ann Hematol 1997 Mar;74 (3):139)、シャーガス病における心臓自己免疫(Cunha-Neto E. et al., J Clin Invest 1996 Oct 15;98 (8):1709)および抗ヘルパーＴリンパ球自己免疫(Caporossi AP. et al., Viral Immunol 1998;11 (1):9)が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００６８】
自己免疫リウマチ性疾患の例としては、関節リウマチ(Krenn V. et al., Histol Histopathol 2000 Jul;15 (3):791; Tisch R, McDevitt HO. Proc Natl Acad Sci units S A 1994 Jan 18;91 (2):437)および強直性脊椎炎(Jan Voswinkel et al., Arthritis Res 2001; 3 (3): 189)が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００６９】
自己免疫性腺疾患の例としては、膵性疾患、Ｉ型糖尿病、甲状腺疾患、グレーブス病、甲状腺炎、自発性自己免疫性甲状腺炎、橋本甲状腺炎、突発性粘液水腫、卵巣自己免疫、自己免疫性抗精子不妊症、自己免疫性前立腺炎およびＩ型自己免疫性多腺性症候群が挙げられる。疾患として、それだけには限らないが、膵臓の自己免疫疾患、１型糖尿病(Castano L. and Eisenbarth GS. Ann. Rev. Immunol. 8:647; Zimmet P. diabetes Res Clin Pract 1996 Oct;34 Suppl:S125)、自己免疫性甲状腺疾患、グレーブス病(Orgiazzi J. Endocrinol Metab Clin North Am 2000 Jun;29 (2):339; Sakata S. et al., Mol Cell Endocrinol 1993 Mar;92 (1):77)、自発性自己免疫性甲状腺炎(Braley-Mullen H. and Yu S, J Immunol 2000 Dec 15;165 (12):7262)、橋本甲状腺炎(Toyoda N. et al., Nippon Rinsho 1999 Aug;57 (8):1810)、突発性粘液水腫(Mitsuma T. Nippon Rinsho. 1999 Aug;57 (8):1759)、卵巣自己免疫(Garza KM. et al., J Reprod Immunol 1998 Feb;37 (2):87)、自己免疫性抗精子不妊症(Diekman AB. et al., Am J Reprod Immunol. 2000 Mar;43 (3):134)、自己免疫性前立腺炎(Alexander RB. et al., Urology 1997 Dec;50 (6):893)およびＩ型自己免疫性多腺性症候群(Hara T. et al., Blood. 1991 Mar 1;77 (5):1127)が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００７０】
自己免疫性胃腸疾患の例としては、慢性炎症性腸疾患(Garcia Herola A. et al., Gastroenterol Hepatol. 2000 Jan;23 (1):16)、セリアック病(Landau YE. and Shoenfeld Y. Harefuah 2000 Jan 16;138 (2):122)、大腸炎、回腸炎およびクローン病が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００７１】
自己免疫性皮膚疾患の例としては、尋常性天疱瘡、水疱性類天疱瘡および落葉状天疱瘡などの自己免疫水疱性皮膚疾患が挙げられる。
【００７２】
自己免疫性肝疾患の例としては、肝炎、自己免疫性慢性活動性肝炎(Franco A. et al., Clin Immunol Immunopathol 1990 Mar;54 (3):382)、原発性胆汁性肝硬変(Jones DE. Clin Sci (Colch) 1996 Nov;91 (5):551; Strassburg CP. et al., Eur J Gastroenterol Hepatol. 1999 Jun;11 (6):595)および自己免疫肝炎(Manns MP. J Hepatol 2000 Aug;33 (2):326)が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００７３】
自己免疫性神経疾患の例としては、多発性硬化症(Cross AH. et al., J Neuroimmunol 2001 Jan 1;112 (1-2):1)、アルツハイマー病(Oron L. et al., J Neural Transm Suppl. 1997;49:77)、重症筋無力症(Infante AJ. And Kraig E, Int Rev Immunol 1999;18 (1-2):83; Oshima M. et al., Eur J Immunol 1990 Dec;20 (12):2563)、神経障害、運動神経障害(Kornberg AJ. J Clin Neurosci. 2000 May;7 (3):191);ギランバレー症候群および自己免疫神経障害(Kusunoki S. Am J Med Sci. 2000 Apr;319 (4):234)、筋無力症、ランバート・イートン筋無力症症候群(Takamori M. Am J Med Sci. 2000 Apr;319 (4):204)；腫瘍随伴神経疾患、小脳性萎縮、腫瘍随伴小脳性萎縮およびスティフ・マン症候群(Hiemstra HS. et al., Proc Natl Acad Sci units S A 2001 Mar 27;98 (7):3988)；非腫瘍随伴スティフ・マン症候群、進行性小脳性萎縮症、脳炎、ラスムッセン脳炎、筋萎縮性側索硬化症、シデナム舞踏病、ジル・ドゥ・ラ・トゥレット症候群および自己免疫性多腺性内分泌障害(Antoine JC. and Honnorat J. Rev Neurol (Paris) 2000 Jan;156 (1):23)；免疫異常神経障害(Nobile-Orazio E. et al., Electroencephalogr Clin Neurophysiol Suppl 1999;50:419);後天性神経性筋強直症、先天性多発性関節拘縮症(Vincent A. et al., Ann N Y Acad Sci. 1998 May 13;841:482)、神経炎、視神経炎(Soderstrom M. et al., J Neurol Neurosurg Psychiatry 1994 May;57 (5):544)および神経変性疾患が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００７４】
自己免疫性筋疾患の例としては、筋炎、自己免疫性筋炎および原発性シェーグレン症候群(Feist E. et al., Int Arch Allergy Immunol 2000 Sep;123 (1):92)および平滑筋自己免疫疾患(Zauli D. et al., Biomed Pharmacother 1999 Jun;53 (5-6):234)が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００７５】
自己免疫性腎臓病の例としては、腎炎および自己免疫性間質性腎炎(Kelly CJ. J Am Soc Nephrol 1990 Aug;1 (2):140)が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００７６】
生殖と関連している自己免疫疾患の例としては、反復性流産(Tincani A. et al., Lupus 1998;7 Suppl 2:S107-9)が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００７７】
自己免疫結合組織疾患の例としては、耳疾患、自己免疫耳疾患(Yoo TJ. et al., Cell Immunol 1994 Aug;157 (1):249)および内耳の自己免疫疾患(Gloddek B. et al., Ann N Y Acad Sci 1997 Dec 29;830:266)が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００７８】
自己免疫系疾患の例としては、全身性エリテマトーデス (Erikson J. et al., Immunol Res 1998;17 (1-2):49)および全身性硬化症(Renaudineau Y. et al., Clin Diagn Lab Immunol. 1999 Mar;6 (2):156);Chan OT. et al., Immunol Rev 1999 Jun;169:107)が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００７９】
感染性疾患
感染性疾患の例としては、慢性感染性疾患、亜急性感染性疾患、急性感染性疾患、ウイルス性疾患、細菌性疾患、原虫症、寄生中症、真菌性疾患、マイコプラズマ症およびプリオン疾患が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００８０】
移植片拒絶病
移植片の移植と関連している疾患の例としては、移植片拒絶、慢性移植片拒絶、亜急性移植片拒絶、超急性移植片拒絶、急性移植片拒絶および移植片対宿主病が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００８１】
アレルギー性疾患
疾患の例としては、喘息、じんま疹(hives)、じんま疹(urticaria)、花粉アレルギー、イエダニアレルギー、ハチ毒アレルギー、化粧品アレルギー、ラテックスアレルギー、化学アレルギー、薬物アレルギー、虫刺アレルギー、動物鱗屑アレルギー、棘植物アレルギー、ツタウルシアレルギーおよび食物アレルギーが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００８２】
癌性疾患
癌の例としては、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫および白血病が挙げられる。それだけには限らないが、癌性疾患の特定の例：慢性骨髄性白血病などの骨髄性白血病、分化型急性骨髄性白血病、急性前骨髄球性白血病、好塩基球の増大を伴う急性非リンパ性白血病、急性単球性白血病、好酸球増加症を伴う急性骨髄単球性白血病；バーキット非ホジキンなどの悪性リンパ腫；急性リンパ芽球性白血病などのリンパ球性白血病、慢性リンパ性白血病；固形腫瘍良性髄膜腫などの骨髄増殖性疾患、唾液腺の混合腫瘍、結腸腺腫；小細胞肺癌、腎臓、子宮、前立腺、膀胱、卵巣、結腸などの腺癌、肉腫、脂肪肉腫、粘液型、滑膜肉腫、横紋筋肉腫（肺胞）、骨外性粘液型軟骨肉腫、ユーイング腫瘍；その他のものとして、精巣および卵巣未分化胚細胞腫、網膜芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、神経芽細胞腫、悪性黒色腫、中皮腫、乳房、皮膚、前立腺および卵巣が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００８３】
特定の実施形態によれば、本明細書に記載される方法は、細胞集団がＡＬＳの治療に適しているか否かを判定するためのものである。
【００８４】
「間葉系幹細胞」または「ＭＳＣ」という用語は、同義的に使用されるものであり、最終分化しておらず、分裂して幹細胞をもたらすか、または不可逆的に分化して、間葉系（軟骨細胞、骨細胞および脂肪細胞）の細胞を生じる、成熟細胞である。本発明の間葉系幹細胞は、少なくともいくつかの実施形態においては、自己（例えば、同系）由来または同種異系由来であり得る。
【００８５】
ＭＳＣの集団は、通常、その細胞表面上に特定のマーカーを発現する。特定の実施形態によれば、未分化ＭＳＣは、フローサイトメトリーによる測定において、細胞表面上にＣＤ１０５、ＣＤ７３およびＣＤ９０を発現し（例えば、９５％超が陽性であり）、ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ３４、ＣＤ４５およびＨＬＡ−ＤＲを発現しない（例えば、２％未満が陽性である）。
【００８６】
間葉系幹細胞の存在を確認するために使用され得る例示的な抗体としては、ＣＤ４４  ＦＩＴＣコンジュゲート型（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ７３  ＰＥコンジュゲート型（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ＣＤ７３  ＰＥコンジュゲート型（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ９０  ＰＥ−Ｃｙ５コンジュゲート型（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＤ９０  ＰＥコンジュゲート型（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ１０５  ＰＥコンジュゲート型（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）、ＣＤ３  ＰｅｒＣＰコンジュゲート型（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ１４  ＦＩＴＣコンジュゲート型（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＤ１４  ＦＩＴＣコンジュゲート型（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ１９  ＰＥ−Ｃｙ５コンジュゲート型（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＤ１９  ＦＩＴＣコンジュゲート型（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ３４  ＦＩＴＣコンジュゲート型（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）、ＣＤ４５  ＰＥコンジュゲート型（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＤ４５  ＰｅｒＣＰコンジュゲート型（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびＨＬＡ−ＤＲ  ＰＥ−Ｃｙ５コンジュゲート型（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ＨＬＡ−ＤＲ  ＰｅｒＣＰコンジュゲート型、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓが挙げられる。
【００８７】
間葉系幹細胞の存在を確認するための別の方法としては、細胞が多系統、例えば、脂肪細胞、骨細胞および軟骨細胞などに分化可能であることを実証する方法である。これは、例えば、ヒト間葉系幹細胞機能同定キット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して実施され得る。
【００８８】
本発明のこの態様の好ましい実施形態によれば、間葉系幹細胞は、本明細書に記載される細胞および細胞集団を作製するために遺伝子操作（すなわち、発現構築物を用いて形質転換）されていない。
【００８９】
本発明の細胞は、少なくともいくつかの実施形態では、任意の幹細胞から誘導することが可能であるが、胚性幹（ＥＳ）細胞ではないことが好ましいことは理解されたい。
【００９０】
間葉系幹細胞は種々の組織から単離され得るものであり、このような組織としては、骨髄、末梢血、血液、胎盤および脂肪組織が挙げられるが、これらに限定されるものではない。末梢血から間葉系幹細胞を単離する方法は、Kassis et al [Bone Marrow Transplant. 2006 May; 37(10):967-76]に記載されている。胎盤組織から間葉系幹細胞を単離する方法は、Brooke G et al. [Br J Haematol. 2009 Feb; 144 (4):571-9]に記載されている。
【００９１】
脂肪組織、胎盤および臍帯血から間葉系幹細胞を単離および培養する方法は、Kern et al [Stem Cells, 2006; 24:1294-1301]に記載されている。
【００９２】
本発明のこの態様の好ましい実施形態によれば、間葉系幹細胞はヒト由来である。
【００９３】
骨髄は、吸引によって個体の腸骨稜または胸骨から単離され得る。低密度骨髄（ＢＭ）単核細胞（ＢＭＭＮＣ）は、フィコール−ＰＡＱＵＥ密度勾配遠心分離によって分離され得る。間葉系幹細胞を得るために、間葉系幹細胞（例えば、ＢＭＭＮＣ）を含む細胞集団を、血小板溶解物の存在下で細胞を維持および／または増殖可能な増殖培地で培養され得る。一実施形態によれば、細胞集団をプラスチックの表面（例えば、フラスコ内部の表面）上にプレーティングし、非接着細胞を除去することによって間葉系幹細胞を単離する。あるいは、間葉系幹細胞は、間葉系幹細胞マーカーを使用してＦＡＣＳによって単離され得る。
【００９４】
単離後、単離された細胞は、血小板溶解物の存在下、ｅｘ  ｖｉｖｏで細胞を維持および／または増殖可能な増殖培地中で培養することによって、増殖させることができる。増殖培地は、ＤＭＥＭ、α−ＭＥＭまたはＤＭＥＭ／Ｆ１２であり得る。通常、培地中のグルコース濃度は、約０．５〜３グラム／リットルである。
【００９５】
培養は、間葉系幹細胞の培養に適したプラスチックディッシュおよびバイオリアクターを含む、任意の適切な表面上で実施され得る。
【００９６】
血小板溶解物は、当技術分野で公知の任意の方法を使用して調製され得る。多血小板血漿（ＰＲＰ）は、感染性病原体（すなわち、ＨＩＶ、ＨＴＬＶ、ＨＣＶ、ＨＢｓＡｇ）を含まないと確認された血液バンクの献血に由来し得る。ＰＲＰ含有バッグは、−８０℃で保存され、３７℃の水浴中で解凍され得る。解凍後、多血小板血漿は、通常、遠心分離されて、血小板の粒子および膜を除去する。次いで、血小板溶解物である上清を回収し、使用まで−８０℃で凍結され得る。血小板溶解物は、内毒素、ヘモグロビン、ｐＨ、総タンパク質、アルブミン、浸透圧、無菌性およびマイコプラズマについて試験される。
【００９７】
増殖培地は、例えば、Ｌ−グルタミン、ピルビン酸ナトリウムおよびヘパリン等の、付加的な成分を含み得る。
【００９８】
間葉系幹細胞がヒト由来である場合には、血小板溶解物もヒト細胞から得られたものであることが好ましい点を認識されたい。
【００９９】
一実施形態によれば、増殖／成長培地は、異種混入物を含まない、すなわち、血清、動物由来増殖因子およびアルブミンなどの動物由来成分を含まない。したがって、この実施形態においては、異種混入物の不在下で培養を実施する。
【０１００】
例示的な間葉系幹細胞単離および増殖プロトコールは、本明細書において、後述する実施例に示されている。
【０１０１】
上述したように、血小板溶解物含有培地中で間葉系幹細胞を増殖させた後、適切な数の未分化細胞が得られたら、疾患の治療に有用な細胞を得るために、細胞を分化培地中で分化させる。
【０１０２】
特定の実施形態によれば、細胞は、分化培地の添加に先立って、新鮮な増殖／成長培地に（例えば、１ｃｍ２あたり約６０００〜８０００細胞の密度で）再播種し、１日、２日、３日、４日または５日間経過させる。
【０１０３】
「未分化ＭＳＣ」とは、分化を誘導する培地中で培養していないＭＳＣを表す。したがって、本発明の少なくともいくつかの実施形態によれば、任意の増殖後、分化前ステップを全く介在させることなく、ＭＳＣを分化培地と直接接触させる。
【０１０４】
少なくともいくつかの実施形態では、分化のために、本発明の未分化ＭＳＣを線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ヘレグリンおよびｃ−ＡＭＰを含む培地中でインキュベートする。この実施形態においては、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ヘレグリンおよびｃ−ＡＭＰの各々は、単一培地に混合され、培養は、単一ステップで実施される。
【０１０５】
一実施形態によれば、本発明の未分化ＭＳＣを、上記ステップの前および増殖ステップ後に、上皮成長因子（ＥＧＦ）および／またはＮ２サプリメントの存在下でプレインキュベートしない。
【０１０６】
本発明の実施形態における分化培地について考えられるｂＦＧＦの例示的濃度は、５〜５０ｎｇ／ｍｌの範囲内、１０〜４０ｎｇ／ｍｌの範囲内、１０〜２５ｎｇ／ｍｌの範囲内から任意に選択できるものである。
【０１０７】
本発明の実施形態における分化培地について考えられるＰＤＧＦ−ＡＡの例示的濃度は、１〜３０ｎｇ／ｍｌの範囲内、１〜２０ｎｇ／ｍｌの範囲内、１〜１０ｎｇ／ｍｌの範囲内、２．５〜１０ｎｇ／ｍｌの範囲内から任意に選択できるものである。
【０１０８】
本発明の実施形態における分化培地について考えられるヘレグリンβ１の例示的濃度は、５〜１００ｎｇ／ｍｌの範囲内、１０〜９０ｎｇ／ｍ、２５〜７５ｎｇ／ｍｌの範囲内、４０〜６０ｎｇ／ｍｌの範囲内から任意に選択できるものである。
【０１０９】
本発明の実施形態における分化培地について考えられるｄｂｃ−ＡＭＰの例示的濃度は、０．５〜１０ｍＭの範囲内、０．５〜５ｍＭの範囲内、０．５と２．５ｍＭの間の範囲内から任意に選択できるものである。
【０１１０】
１つの実施形態によれば、本発明のこの態様における分化培地は、ホスホジエステラーゼ阻害剤（例えば、ＩＢＭＸ）を含まない、すなわち、培養は、ホスホジエステラーゼ阻害剤の不在下で実施される。
【０１１１】
別の実施形態によれば、本発明のこの態様における分化培地は、トリヨードチロニンを含まない、すなわち、培養は、トリヨードチロニンの不在下で実施される。
【０１１２】
所望により、これらの実施形態および副形態のいずれもを組み合わせてもよい。例えば、分化培地は、所望によりホスホジエステラーゼ阻害剤およびトリヨードチロニンの両方を含まなくてもよい。
【０１１３】
好ましくは、ＭＳＣは、上記の分化培地中で、少なくとも１日、少なくとも２日または少なくとも３日間分化させる。分化工程は、５日を超えて実施されないことが好ましい。
【０１１４】
本発明のこの態様に従って使用される分化培地は、好ましくは、異種不含であり（血清を含まず）、いかなる抗生物質をも含まない、すなわち、培養は、異種混入物の不在下で実施される。
【０１１５】
細胞の収集は、通常、適当な培地、例えば、ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）ＲＰＭＩ、ＰＢＳなどで実施される。低温貯蔵培地もまた企図される（例えば、Ｈｙｐｏｔｈｅｒｍｏｓｏｌ）。
【０１１６】
分化プロセス後、得られた細胞は、ＣＤ４９ａの発現について分析し、所定のレベルを上回るＣＤ４９ａの量は、細胞集団が治療薬として適していることの指標となる。
【０１１７】
得られた細胞のすべてを、ＣＤ４９ａ発現について分析する必要はなく、細胞集団の残りについて、それらの状態に関する情報を提供するサンプルを分析する点を理解されたい。
【０１１８】
通常、サンプル中の細胞数は、約０．５×１０６細胞である。
【０１１９】
単一ドナーから得られる細胞数は、一般に、２０×１０６細胞〜１００×１０７細胞の間である。したがって、細胞数としては、約２０×１０６細胞、約１００×１０６細胞、約２００×１０６細胞を分化させたり、約３００×１０６細胞や約４００×１０６細胞を分化させたり、約５００×１０６細胞を分化させたり、約６００×１０６細胞を分化させたり、約７００×１０６細胞、約８００×１０６細胞、約９００×１０６細胞または約１００×１０７細胞を挙げられる。
【０１２０】
本明細書において、「ＣＤ４９ａ」（インテグリンα１とも呼ばれる）とは、細胞外マトリックスと結合する、インテグリン受容体の細胞表面膜タンパク質のα１サブユニットを表す。このタンパク質は、β１サブユニットとヘテロ二量体化して、コラーゲンおよびラミニンの細胞表面受容体を形成する。ヘテロ二量体受容体は、細胞間接着に関与している。
【０１２１】
ＣＤ４９ａのヒトタンパク質配列は、Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｐ５６１９９、ＮＰ＿８５２４７８に示されており、そのｍＲＮＡ配列は、ＮＭ＿１８１５０１に示されている。
【０１２２】
ＣＤ４９ａは、ＣＤ４９β１と一緒に細胞の表面上にヘテロ二量体を形成するので、本発明の方法はまた、分化細胞の表面上のＣＤ４９β１の量を調べることによっても実施可能である点を理解されたい。
【０１２３】
ＣＤ４９ａまたはＣＤ４９β１の発現を解析する方法は、通常、抗原を特異的に認識する抗体の使用を含む。ＣＤ４９ａを認識する市販の抗体として、例えば、サンタクルズのＲ  ａｎｄ  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（カタログ番号ＳＣ−８１７３３ＰＥ）またはＢｉｏｌｅｇｅｎｄ（例えば、カタログ番号３２８３０３）によって製造されるものが挙げられる。分析は、フローサイトメトリー、ウエスタンブロット、ＨＰＬＣ、ｉｎ  ｓｉｔｕ−ＰＣＲ免疫細胞化学、質量分析、ラジオイムノアッセイなどを含めた当技術分野で公知の任意の方法を使用して実施され得る。特定の実施形態によれば、分析は、タンパク質を特異的に認識する抗体を使用して実施される。
【０１２４】
フローサイトメトリーを行うためには、ＣＤ４９ａまたはＣＤ４９ｂ１抗体を蛍光部分に結合し、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）を使用して分析する。
【０１２５】
本明細書において、「フローサイトメトリー」とは、サンプル中の材料（例えば、特定のマーカーを含む間葉系幹細胞）の割合を、当該材料を標識し（例えば、標識抗体を当該材料と結合することによって）、材料を含有する流体流を光線の中に通過させ、一連のフィルターおよびミラーによってサンプルから発せられた光を構成波長に分離し、光を検出することによって決定するアッセイである。
【０１２６】
例えば、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣＳｃａｎおよびＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（カリフォルニア州、マウテンビュー、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を含めた多数のフローサイトメーターが市販されている。ＦＡＣＳ分析のために使用され得る抗体は、Schlossman S, Boumell L, et al, [Leucocyte Typing V. New York: Oxford University Press; 1995]に教示されており、広く市販されている。
【０１２７】
フローサイトメトリーを含めたいくつかの方法のために、細胞集団は、培養プレートから取り出される必要がある。細胞を分散するために使用され得る薬剤の例としては、コラゲナーゼ、ディスパーゼ、アクターゼ、トリプシン（例えば、トリプシン−ＥＤＴＡ、ＴｒｙｐＬＥ（商標）などのトリプシンの非動物性代替品）、パパインが挙げられるが、これらに限定されるものではない。これらの代替、あるいはこれらに加えて、トリチュレーションも細胞の分散性を増大するために実施され得る。
【０１２８】
使用され得るトリプシンの例示的濃度は、０．００５〜０．５％トリプシン−ＥＤＴＡである。細胞は、分散剤とともに約５〜３０分間、約３７℃の温度でインキュベートされ得る。
【０１２９】
細胞は、通常、例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）、ダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＲＰＭＩ、ＰＢＳなどの適した培地で再懸濁される。
【０１３０】
細胞が治療薬として有用であると判定するためには、ＣＤ４９ａの量が、同一ドナー、同一臓器に由来する未分化ＭＳＣと比較して、統計的に有意なレベルを上回る量に増大していなければならない。
【０１３１】
特定の実施形態によれば、細胞が治療薬として有用であること判定するためには、細胞集団におけるの少なくとも８０％がＣＤ４９ａを発現しなくてはならず、より好ましくは、細胞集団における少なくとも８５％がＣＤ４９ａを発現しなくてはならず、より好ましくは、細胞集団における少なくとも９０％がＣＤ４９ａを発現しなくてはならず、より好ましくは、細胞集団の少なくとも９５％がＣＤ４９ａを発現しなくてはならない。
【０１３２】
別の実施形態によれば、細胞が治療薬として有用であると判定するためには、ＣＤ４９ａ発現のレベル（例えば、平均蛍光強度）は、同一ドナー、同一臓器に由来する未分化ＭＳＣと比較して、少なくとも２倍、より好ましくは少なくとも３倍、より好ましくは少なくとも４倍、さらにより好ましくは少なくとも５倍に増加していなければならない。
【０１３３】
フローサイトメーターを使用して、ＣＤ４９ａについて８０％超陽性である細胞集団が得られ得ることは知られている。したがって、例えば、ＣＤ４９ａについて８５％陽性、ＣＤ４９ａについて９０％陽性、ＣＤ４９ａについて９１％陽性、ＣＤ４９ａについて９２％陽性、ＣＤ４９ａについて９３％陽性、ＣＤ４９ａについて９４％陽性、ＣＤ４９ａについて９５％陽性、ＣＤ４９ａについて９６％陽性、ＣＤ４９ａについて９７％陽性、ＣＤ４９ａについて９８％陽性、ＣＤ４９ａについて９９％陽性、さらにはＣＤ４９ａについて１００％陽性である細胞集団も得られ得る。
【０１３４】
細胞は、ＣＤ４４などのさらなる細胞表面マーカーの発現について分析されしてもよい。ＣＤ４４の発現が少なくとも１．５倍、少なくとも２倍またはそれ以上の倍率に低下した細胞は、治療薬として有用であると判定され得る。
【０１３５】
細胞の適性の判断または特徴づけは、例えば、核型分析、形態学、細胞数と生存率、グラム染色および無菌性を含む、さらなる方法で実施され得る。
【０１３６】
さらに、細胞は、その神経栄養因子（ＮＴＦ）分泌のレベルについて分析され得る。
分泌されたＮＴＦの分析のために、上記の分化手順の最後に、ＭＳＣまたはＮＴＦ分泌性細胞の培養物から上清を回収し、細胞を採取し、計数する。細胞の培養上清中のグリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）や脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）などのＮＴＦの量は、例えば、ＧＤＮＦまたはＢＤＮＦ  ＥＬＩＳＡアッセイ（ＧＤＮＦ  ＤｕｏＳｅｔ  ＤＹ２１２；ＢＤＮＦ  ＤｕｏＳｅｔ  ＤＹ２４８；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を、製造業者のプロトコールに従って使用することによって定量することができるが、これに限定されるものではない。ＩＧＦ−１の量は、例えば、ＩＧＦ  ＥＬＩＳＡアッセイ（ＩＧＦ−１  ＤｕｏＳｅｔカタログ番号ＤＹ２９１；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ）を使用して定量することができるが、これに限定されるものではない。
【０１３７】
ＶＥＧＦの量は、例えば、ＶＥＧＦ  ＥＬＩＳＡアッセイ（ＶＥＧＦ  ＤｕｏＳｅｔ  Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ：ＤＹ２９３Ｂ）を使用して定量することができるが、これに限定されるものではない。ＨＧＦの量は、例えば、ＨＧＦ  ＥＬＩＳＡアッセイ（ＨＧＦ  ＤｕｏＳｅｔ  Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ：ＤＹ２９４）を使用して定量することができるが、これに限定されるものではない。
【０１３８】
本発明の細胞によって分泌されるＧＤＮＦの量は、同じ間葉系幹細胞の分化していない集団における分泌量よりも、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍に増加していることが好ましい。
【０１３９】
ＧＤＮＦの比生産性は、約２００〜２０００ｐｇ／１０６細胞である。
【０１４０】
１つの実施形態によれば、本発明の分化細胞集団の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％またはそれ以上が、ＢＤＮＦを分泌する。
【０１４１】
本発明の細胞によって分泌されるＢＤＮＦの量は、同じ間葉系幹細胞の分化していない集団における分泌量よりも、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍に増加していることが好ましい。
【０１４２】
ＢＤＮＦの比生産性は、約５００〜８０００ｐｇ／１０６細胞である。
【０１４３】
本発明の細胞は、未分化骨髄由来間葉系幹細胞とは様々な点で異なる。
【０１４４】
したがって、例えば、本発明の細胞は、ＧＤＦ−１５のＥＬＩＳＡアッセイ（例えば、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＤＹ９５７または同等物）による測定において、未分化ＭＳＣよりも少なくとも５倍多いＧＤＦ−１５を分泌する。
【０１４５】
さらに、本発明の細胞は、ＩＬ−８のＥＬＩＳＡアッセイ（例えば、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＤＹ２０８−０５または同等物）による測定において、未分化ＭＳＣよりも少なくとも１０倍、２０倍、さらには３０倍多いＩＬ−８を分泌する。
【０１４６】
さらに、本発明の細胞は、少なくとも２倍、４倍、６倍、８倍、さらには１０倍の量の、表２に列挙されるポリペプチド１〜８２のいずれか１種を含む。別の実施形態によれば、本発明の細胞は、少なくとも２倍、４倍、６倍、８倍、さらには１０倍の量の、表２に列挙されるポリペプチド１〜８２の各々を含む。本発明の細胞は、最大２分の１、４分の１、６分の１、８分の１、さらには１０分の１の量の、表２に列挙されるポリペプチド８３〜１２２のうち少なくとも１種を含む。本発明の細胞は、最大２分の１、４分の１、６分の１、８分の１またはさらに１０分の１の量の、表２に列挙されるポリペプチド８３〜１２２の各々を含む。
【０１４７】
本発明の細胞は、特定の遺伝子の発現によって、未分化ＭＳＣと区別され得る。これは、遺伝子によってコードされるｍＲＮＡの細胞中の存在量を分析することによって測定され得る。
【０１４８】
本発明の細胞は、少なくとも６倍、８倍、さらには１０倍の量の、表３に列挙される遺伝子１〜４１のいずれか１種を発現する。別の実施形態によれば、本発明の細胞は、少なくとも６倍、８倍、１０倍、２０倍、さらには３０倍の量の、表３に列挙される遺伝子１〜４１の各々を発現する。本発明の細胞は、最大で６分の１、８分の１、１０分の１、２０分の１、さらには３０分の１の、表３に列挙される遺伝子４２〜５６の少なくとも１種を発現する。本発明の細胞は、最大で６分の１、８分の１、１０分の１、さらには２０分の１の、表３に列挙される遺伝子４２〜５６の各々を発現する。
【０１４９】
本発明の細胞は、その他の骨髄間葉系幹細胞由来ＮＴＦ分泌性細胞（例えば、国際公開第２００９／１４４７１８号に開示されるもの − それらの細胞は、本明細書において２ステッププロトコールＮＴＦと呼ばれる）とは異なる。
【０１５０】
したがって、本発明の細胞は、２ステッププロトコールＮＴＦと比較して、少なくとも２倍、４倍、６倍、８倍またはさらに１０倍の量の、表４に列挙されるポリペプチド１および／または９のいずれか１種を含む。本発明の細胞は、２ステッププロトコールＮＴＦと比較して、最大２分の１、４分の１、６分の１、８分の１、さらには１０分の１の、表４に列挙されるポリペプチド２〜８のうち少なくとも１種を含む。本発明の細胞は、２ステッププロトコールＮＴＦと比較して、最大２分の１、４分の１、６分の１、８分の１、さらには１０分の１の、表４に列挙されるポリペプチド２〜８の各々を含む。
【０１５１】
本発明の細胞は、２ステッププロトコールＮＴＦと比較して、少なくとも２倍、４倍、さらには６倍の量の、表５に列挙される遺伝子１〜８２のいずれか１種を発現する。別の実施形態によれば、本発明の細胞は、２ステッププロトコールＮＴＦと比較して、少なくとも２倍、４倍、さらには６倍の量の、表５に列挙される遺伝子１〜８２の各々を発現する。本発明の細胞は、２ステッププロトコールＮＴＦと比較して、最大２分の１、４分の１、さらに６分の１の、表５に列挙される遺伝子８３〜１２６のうち少なくとも１種を発現する。本発明の細胞は、２ステッププロトコールＮＴＦと比較して、最大２分の１、４分の１、さらには６分の１の、表５に列挙される遺伝子８３〜１２６の各々を発現する。
【０１５２】
本発明の細胞のその他の特徴は、その全文が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１４／０２４１８３号によって提供される。
【０１５３】
ひと度、適性が判定されると、細胞は、それに応じて標識され、当技術分野で公知の方法に従って保存され得る（例えば、凍結されるか、または低温保存される）か、または対象に直接投与され得る。
【０１５４】
記載されるように、本発明のこの態様の細胞は、免疫関連疾患または炎症関連疾患の治療において有用であり得る。
【０１５５】
したがって、本発明の別の態様によれば、治療を必要とする対象において免疫関連疾患または炎症関連疾患を治療するための方法であって、対象に、神経栄養因子を分泌する細胞へとｅｘ ｖｉｖｏで分化させた間葉系幹細胞を治療有効量投与することによって、疾患を治療する方法が提供される。
【０１５６】
このような疾患の例は、本明細書において上述した通りである。
特定の実施形態によれば、免疫関連疾患または炎症関連疾患は、神経変性疾患ではない。
別の実施形態によれば、免疫関連疾患または炎症関連疾患は、神経系の免疫疾患ではない。
さらに別の実施形態によれば、免疫関連疾患または炎症関連疾患は、重症筋無力症ではない。
【０１５７】
神経栄養因子を分泌するようｅｘ  ｖｉｖｏで分化させた間葉系幹細胞を得る方法は、国際公開第２０１４／０２４１８３号、国際公開第２００６／１３４６０２号および国際公開第２００９／１４４７１８号に開示されており、各々の内容は、参照により本明細書に組み込まれている。
【０１５８】
細胞は、それ自体で、または好ましくは、医薬上許容される担体をさらに含む医薬組成物の一部として投与され得る。
【０１５９】
本明細書において「医薬組成物」とは、本明細書に記載の１種または数種の化学コンジュゲートと、薬学的に適当な担体および賦形剤などのその他の化学成分とを含む製剤である。医薬組成物の目的は、対象への化合物の投与を容易にすることである。
【０１６０】
本明細書において、以下、「薬学的に許容される担体」とは、対象に対して顕著な刺激作用を引き起こさず、投与された化合物の生物活性および特性を抑制しない担体または希釈剤を示す。担体の例として、プロピレングリコール、生理食塩水、エマルジョン、バッファー、ＤＭＥＭまたはＲＰＭＩなどの培養培地、低温下での細胞内環境の平衡を保つためにフリーラジカルを除去し、ｐＨの緩衝化、膨張／浸透圧支持体、エネルギー基質およびイオン濃度を提供する成分を含有する低温貯蔵用培地、および有機溶媒と水との混合物が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１６１】
通常、医薬担体は、組成物中で少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、さらには少なくとも９６時間にわたり、細胞数を維持する（例えば、９０％未満に低減させない）。
【０１６２】
本明細書において、「賦形剤」とは、化合物の投与をさらに容易にし、移植／注射の前に、予め決定された温度において、適当な期間、細胞生存率を維持するために、医薬組成物に添加される不活性物質である。賦形剤の例として、アルブミン、血漿、血清および脳脊髄液（ＣＳＦ）、Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）またはレスベラトロールなどの抗酸化物質が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１６３】
本発明の好ましい実施形態によれば、医薬担体は、バッファーまたはＤＭＥＭなどの培養培地の水溶液である。
【０１６４】
薬物の処方および投与のための技術は、参照により本明細書に組み込まれる「Remington’s Pharmaceutical Sciences」, Mack Publishing Co., Easton, PA, 最新版に記載されている。
【０１６５】
本発明の方法において使用される任意の製剤について、その治療有効量または用量は、初めにｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイおよび細胞培養アッセイから推定することができる。好ましくは、動物モデルにおいて所望の濃度または力価を達成するように用量を処方する。このような情報は、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定するために使用され得る。
【０１６６】
本明細書に記載される有効成分の毒性および治療効果は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、細胞培養物、または実験動物を用いた標準的な薬学的手法によって決定され得る。
【０１６７】
これらのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ、細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータは、ヒトにおいて使用するための様々な投与量の処方において使用され得る。さらなる情報は、臨床試験から得られ得る。例えば、Salem HK et al., Stem Cells 2010; 28:585-96およびUccelli et al. Lancet Neurol. 2011; 10:649-56を参照のこと。
【０１６８】
投与量は、使用される投与形および利用される投与経路に応じて変わり得る。正確な処方、投与経路および投与量は、患者の状態を鑑みて個々の医師によって選択され得る（例えば、Fingl, et al., 1975、in 「The Pharmacological Basis of Therapeutics」, Ch. 1 p.1.を参照のこと）。
【０１６９】
注射用には、医薬組成物の有効成分を水溶液、好ましくはハンクス溶液、リンガー溶液または生理学食塩水バッファーなどの生理学的に適合するバッファーと、本明細書において上述した付加的な薬剤とを用いて、製剤化され得る。
【０１７０】
投与量および投与間隔は、免疫調節効果を効果的に引き起こすのに十分な有効成分のレベルに合わせて、個別に調整され得る。所望の効果を達成するのに必要な投与量は、個々の特徴および投与経路に応じて変化する。
【０１７１】
治療すべき病状の重症度および応答性に応じて、細胞の投与は、単回または複数回で実施し、治療工程は、疾患状態の減少が達成される時期に応じて、数日から数週間または数ヶ月間持続する。
【０１７２】
投与される組成物の量は、もちろん、治療される個体、苦痛の重症度、投与様式、処方医師の判断などに応じて変わる。投与量および投与のタイミングは、個々の変化する病態の注意深い連続モニタリングに対応する。
【０１７３】
本発明の細胞は、少なくともいくつかの実施形態では、直ちに使用可能なシリンジ中に単位投与量を予めパッケージングされてもよい。シリンジは、細胞の名称およびその材料をラベルに付してもよい。ラベルはまた、細胞の機能と関連する情報（例えば、それから分泌される神経栄養因子の量）を含んでもよい。シリンジは、細胞に関する情報をラベルに付したパッケージ中に梱包されていてもよい。
【０１７４】
本明細書において、「約」という用語は、±１０％を示す。
「包含する(comprises)」、「包含している(comprising)」、「含む(includes)」、「含んでいる(including)」、「有する(having)」という用語およびその同根語は、「含むが、それに限定されない」を意味する。
「からなる(consisting of)」という用語は、「含み、それに限定される」ことを意味する。
「実質的になる(consisting essentially of)」という用語は、組成物、方法または構造体がさらなる材料、工程及び／または構造を含み得るが、追加される材料、工程及び／または構造が、請求項に記載の組成物、方法または構造体の基本的且つ新規な特徴を実質的に変更しない場合に限られることを意味する。
本明細書において、単数形を表す”ａ”、”ａｎ”および”ｔｈｅ”は、文脈から明確ではない限り、複数に対する言及をも含む。例えば、用語「１種の化合物」または「少なくとも１種の化合物」は、その混合物を含めた、複数の化合物を含み得る。
【０１７５】
本明細書を通じて、本発明の種々の実施形態は、様々な範囲を用いて提示され得る。範囲を用いた記載は、単に便宜および簡潔さのためであるということを理解されなければならず、本発明の範囲に対する確固たる制限と解釈されてはならない。したがって、範囲に関する記載は、具体的に開示されたすべての可能性ある副範囲ならびにその範囲内の個々の数値を開示するものと捉えなければならない。例えば、１から６などの範囲の記載は、１から３、１から４、１から５、２から４、２から６、３から６などといった、その範囲内の副範囲と、その範囲内の個々の数値、例えば、１、２、３、４、５および６を特異的に開示するものと有すると捉えなければならない。これは、範囲の広さに関わらず、全てに当てはまる。
【０１７６】
本明細書において、「方法」とは、与えられた課題を達成するための様式、手段、技術および手順であり、化学的、薬理学的、生物学的、生化学的および医学的技術の実施者にとって公知の様式、手段、技術および手順、または公知の様式、手段、技術および手順から容易に開発されるものであるが、これらに限定されるものではない。
【０１７７】
本明細書において、「治療する」とは、病態の進行を抑制、実質的に阻害、減速または逆転させること、病態に係わる臨床症状もしくは審美的症状を実質的に寛解させること、または病態に係わる臨床症状もしくは審美的症状の出現を実質的に防ぐことを含む。
【０１７８】
明確にするために別個の実施形態に関連して記載した本発明の特定の特徴も、単一の実施形態に組み合わせて提供され得るということを理解されたい。逆に、簡潔さのために、単一の実施形態に関連して記載した本発明の特徴はまた、別個に、または任意の適切な副次的な組合せで、または適当な場合には、本発明の任意の他の実施形態として提供され得る。種々の実施形態に関連して記載される特定の特徴は、実施形態がそれらの要素なしでは実施不可能な場合を除いて、それらの実施形態の必須要件であると考えてはならない。
【０１７９】
本明細書において上記で説明し、後述する特許請求の範囲に記載の本発明の種々の実施形態および態様について、実験的サポートを以下の実施例に示す。
【０１８０】
実施例
次に、以下の実施例に参照するが、これらは上記説明と共に本発明のいくつかの実施形態を例示するが、本発明を限定するものではない。
【０１８１】
全般的に、本明細書において使用される命名法および本発明において利用される実験手順は、分子的技術、生化学的技術、微生物学的技術および組換えＤＮＡ技術を含む。このような技術は、文献において完全に説明されている。例えば、「Molecular Cloning: A laboratory Manual」Sambrook et al., (1989);「Current Protocols in Molecular Biology」 Volumes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et al.,「Current Protocols in Molecular Biology」, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal,「A Practical Guide to Molecular Cloning」, John Wiley & Sons, New York (1988);Watson et al.,「Recombinant DNA」, Scientific American Books, New York; Birren et al. (eds)「Genome Analysis: A Laboratory Manual Series」, Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998);米国特許第４，６６６，８２８号明細書；同４，６８３，２０２号明細書；同４，８０１，５３１号明細書；同５，１９２，６５９号明細書および同５，２７２，０５７号明細書に示されるような方法論;「Cell Biology: A Laboratory Handbook」, Volumes I-III Cellis, J. E., ed. (1994);「Culture of Animal Cells - A Manual of Basic Technique」 by Freshney, Wiley-Liss, N. Y. (1994), Third Edition;「Current Protocols in Immunology」 Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994);Stites et al. (eds),「Basic and Clinical Immunology」(8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994);Mishell and Shiigi (eds), 「Selected Methods in Cellular Immunology」, W. H. Freeman and Co., New York (1980)を参照のこと。利用可能なイムノアッセイは、特許および科学文献において広く記載されている。例えば、米国特許第３，７９１，９３２号明細書；同３，８３９，１５３号明細書；同３，８５０，７５２号明細書；同３，８５０，５７８号明細書；同３，８５３，９８７号明細書；同３，８６７，５１７号明細書；同３，８７９，２６２号明細書；同３，９０１，６５４号明細書；同３，９３５，０７４号明細書；同３，９８４，５３３号明細書；同３，９９６，３４５号明細書；同４，０３４，０７４号明細書；同４，０９８，８７６号明細書；同４，８７９，２１９号明細書；同５，０１１，７７１号明細書および同５，２８１，５２１号明細書;「Oligonucleotide Synthesis」 Gait, M. J., ed. (1984);「Nucleic Acid Hybridization」 Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1985);「Transcription and Translation」 Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1984);「Animal Cell Culture」 Freshney, R. I., ed. (1986);「Immobilized Cells and Enzymes」IRL Press, (1986);「A Practical Guide to Molecular Cloning」 Perbal, B., (1984)および「Methods in Enzymology」Vol. 1-317, Academic Press;「PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications」, Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak et al.,「Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual」CSHL Press (1996)を参照のこと。それらのすべては、本明細書に十分に記載されたかのように、参照により組み込まれる。その他の一般的な参照文献は、本明細書を通じて提供される。本明細書における手順は、当技術分野で周知であると考えられており、読者の便宜のために提供される。本明細書に含まれるすべての情報は、参照により本明細書に組み込まれる。
【実施例１】
【０１８２】
分化細胞における表面マーカーの分析
材料および方法
骨髄吸引（ＢＭＡ）：麻酔医による局所麻酔および鎮静化のもと、慣例的な医療センターの手順に従って、患者の腸骨稜から新鮮骨髄を吸引した。骨髄（３０〜６０ｍｌ）を、吸引針を使用してヘパリン含有チューブ内に吸引した。
【０１８３】
ＭＮＣの分離およびＭＳＣの濃縮：このステップは、全骨髄からの単核細胞（ＭＮＣ）の分離を含む。
【０１８４】
全骨髄ＭＮＣの０．０１％を含むと推定されるヒト多能性間葉系間質細胞（ＭＳＣ）を、プラスチックに接着するその能力によってＭＮＣからｉｎ  ｖｉｔｒｏで濃縮した。
【０１８５】
骨髄吸引物を、ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）で１：１（ｖ：ｖ）に希釈し、フィコール密度勾配遠心分離によって全骨髄細胞からＭＮＣを分離した。
【０１８６】
ＭＮＣを計数し、トリパンブルー色素排除試験によって細胞数および生存率を決定した。密度勾配遠心分離後に回収されたＭＮＣの収量は、ドナー間で変化し、採取される骨髄の容量に左右される。ＡＬＳ患者の骨髄吸引物３０〜５０ｍｌから回収されるＭＮＣの収量は、７０〜４００×１０６ＭＮＣの範囲内であり、全製造プロセスに必要なＭＳＣ数を単離するのに十分であった。
【０１８７】
一次骨髄単核細胞の播種および製造プロセス中のＭＳＣの増殖に使用する培地は、血小板成長培地（ＰＭ）とした。ＰＭ培地を、ＭＳＣ製造プロセスを通じて（継代数０代〜４代に）［Ｐ０−Ｐ４］使用し、ＰＭ培地は低グルコースＤＭＥＭ、Ｌ−グルタミンピルビン酸ナトリウム、ヘパリンおよび血小板溶解物を含有していた。
【０１８８】
ＭＮＣを、フラスコ（ＰＭ／フラスコ）に１００，０００〜４００，０００細胞／ｃｍ２の密度で播種し、３７℃／５％  ＣＯ２加湿インキュベーター中で一晩インキュベートした。翌日、細胞培養物を顕微鏡下で調べた。この段階では、非接着性の単核細胞は培養上清中に浮遊しており、プラスチック接着性のＭＳＣはフラスコ表面に付着していた。非接着性の単核細胞を含有する培養上清を取り除き、ＤＭＥＭを用いて接着細胞を穏やかに洗浄した。ＤＭＥＭを除去し、プラスチック接着性ＭＳＣ細胞を含有する各フラスコに新鮮なＰＭを添加した。ＭＮＣの播種からＭＳＣの回収までのプロセス段階を、継代数０（Ｐ０）とした。
【０１８９】
Ｐ０細胞を、３７℃／５％ＣＯ２加湿インキュベーター中でインキュベートし、培養がサブコンフルエントとなるまで、週に２回、ＰＭを新鮮なＰＭと交換した。
【０１９０】
ＭＳＣの増殖：ＭＳＣの一次培養物を、プラスチック基板と付着した単細胞層としてｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖させた。ひと度、利用可能な基板表面が細胞によって覆われると（コンフルエントな培養物）、成長は減速し、次いで、停止した。したがって、細胞を健常な活発に成長する状態に維持するためには、培養物がサブコンフルエントになった時点で、一定間隔でそれらを継代培養する必要があった。各継代培養周期を、継代と言う。ＭＳＣ培養物は、５００〜２，０００細胞／ｃｍ２の密度で継代した。
【０１９１】
ＭＳＣを継代するために、フラスコから培養上清を除去し、各フラスコにトリプシン（ＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｓｅｌｅｃｔ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加した。フラスコを３７℃で数分間インキュベートし、得られた細胞懸濁液をフラスコから遠心管に回収し、トリプシンを希釈し、残りの細胞を回収するために各フラスコにＤＭＥＭを添加した。
【０１９２】
細胞懸濁液を遠心分離し、ＰＭに再懸濁し、計数し、新しい培養容器中に５００〜２，０００細胞／ｃｍ２の密度で再播種した。次いで、培養物を３７℃／５％  ＣＯ２加湿インキュベーター中でインキュベートした。
【０１９３】
各継代の過程で、培養上清をすべて除去し、同一容量の新鮮なＰＭと交換することによって、３〜４日毎にＰＭを交換した。
【０１９４】
分化の誘導：分化の誘導のために、約６，０００〜８，０００細胞／ｃｍ２の濃度でＭＳＣをＰＭに播種した。３日後、１ｍＭジブチリルｃＡＭＰ（ｃＡＭＰ）、２０ｎｇ／ｍｌのヒト塩基性線維芽細胞増殖因子（ｈｂＦＧＦ）、５ｎｇ／ｍｌのヒト血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ−ＡＡ）および５０ｎｇ／ｍｌのヒトヘレグリンβ１を添加した低グルコースＤＭＥＭを含有する分化培地（Ｓ２Ｍ）でＰＭを置換することによって、分化を誘導した。培養物は、分化培地で回収まで３日間維持した。
【０１９５】
ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞を、分化終了の２４時間前（２日目）および／または分化終了時（３日目）に採取した。ＭＳＣ細胞は、同じドナーまたは患者由来であり、同じ継代数で、同時に採取した。
【０１９６】
サンプルの調製、獲得および分析：細胞を、０．５〜１×１０６細胞／チューブの濃度でＰＢＳに懸濁し、インテグリンα１に対するマウスモノクローナル抗体（ＩｇＧ１、クローンＴＳ２／７．１．１、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、カタログ番号ＳＣ−８１７３３ＰＥ）を用いて氷上で３０分間染色した。アイソタイプの対照は、マウスＩｇＧ１  ｋ−ＰＥコンジュゲート型アイソタイプ対照（クローンＭＯＰＣ−２１、カタログ番号５５５７４９、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）とした。細胞はフローサイトメトリー（Ｃｙｔｏｍｉｃｓ  ＦＣ  ５００、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｉｎｃ．）によって分析し、データはＣＸＰソフトウェア（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｉｎｃ．）を使用して分析した。
【０１９７】
結果
インテグリンα１（ＣＤ４９ａ）の発現を、ＭＳＣおよび向神経性因子を分泌するよう誘導されたＭＳＣ細胞（ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞）の表面について検討した。
【０１９８】
分化プロセスの最後（３日目）には、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞集団の約９０±４．４３％（平均±標準偏差）がＣＤ４９ａを発現し、一方、同一ドナー由来の未分化ＭＳＣ細胞集団は６８．７５±４．２９％（平均±標準偏差）だった（ｎ＝８）。２集団間の相違は、高度に有意である（ｐ＜０．０００１、３日目、表１Ａ）。
【０１９９】
３日目には、平均蛍光強度（ＭＦＩ）も、ＭＳＣの２．７５±０．４８％（平均±標準偏差）からＭＳＣ−ＮＴＦ細胞の１３．２±４．７７％（平均±標準偏差）に、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞集団において有意に増加し、誘導は平均４．８７±１．５６倍であった（ｎ＝８、表１Ａ）。
【０２００】
分化の終了の１日前（２日目）には、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞集団の９０．５５±６．６２％（平均±標準偏差）がＣＤ４９ａを発現し、一方、同一ドナー由来の未分化ＭＳＣ細胞集団は７３±６％（平均±標準偏差）だった。２集団間の相違は、高度に有意である（ｐ＜０．００５、２日目、表１Ａ）。
【０２０１】
２日目に、平均蛍光強度（ＭＦＩ）もまた、ＭＳＣの２．８４±０．９８％（平均±標準偏差）からＭＳＣ−ＮＴＦ細胞の１１．５８±７．１８％（平均±標準偏差）へと、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞集団において有意に増加し、誘導は平均３．７７±１．４３倍であった（ｎ＝４、表１Ａ）。
【０２０２】
【表１Ａ】
0006628253.tif 000002
【０２０３】
２種のさらなる実験を実施して、これらの結果を実証した。第１の実験においては、分化プロセスの最後（３日目）に、約８０．９％のＭＳＣ−ＮＴＦ細胞集団がＣＤ４９ａを発現し、一方、同一ドナー由来の未分化ＭＳＣ細胞集団は５６．０５％だった（表１Ｂ）。第２の実験においては、分化プロセスの最後（３日目）に、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞集団の約８９％がＣＤ４９ａを発現し、一方、同一ドナー由来の未分化ＭＳＣ細胞集団は６０％だった（表１Ｂ）。
【０２０４】
【表１Ｂ】
0006628253.tif 000003
【実施例２】
【０２０５】
ＭＳＣ−ＮＴＦの未分化ＭＳＣとの比較
材料および方法
分化の誘導：実施例１に詳述される通りである。
【０２０６】
成長／分化因子−１５（ＧＤＦ−１５）およびインターロイキン８（ＩＬ−８）の測定  分化終了時の細胞培養上清中のＧＤＦ−１５およびＩＬ−８の量を定量した。定量には、例えば、ＧＤＦ−１５  ＥＬＩＳＡアッセイ（ＧＤＦ−１５  ＤｕｏＳｅｔ  ＤＹ９５７；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＩＬ−８  ＥＬＩＳＡアッセイ（ＩＬ−８  ＤｕｏＳｅｔ  ＤＹ２０８；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を製造業者のプロトコールに従って使用することができるが、これらに限定されるものではない。
【０２０７】
プロテオミクス
タンパク質分解：９Ｍの尿素、４００ｍＭの重炭酸アンモニウムおよび１０ｍＭのＤＴＴと、２サイクルの超音波処理によって、細胞ペレットからタンパク質を抽出した。各サンプルから得た２０μｇのタンパク質を、２．８ｍＭのＤＴＴ（６０℃で３０分）を用いて還元し、４００ｍＭの重炭酸アンモニウム中８．８ｍＭのヨードアセトアミドを用いて（暗所、室温で３０分間）修飾し、２Ｍの尿素、２５ｍＭの重炭酸アンモニウム中、酵素対基質比１：５０の条件で修飾トリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて３７℃で一晩消化した。さらなる第２のトリプシン処理は４時間行った。
【０２０８】
質量分析解析：トリプシン処理ペプチドをＣ１８チップ（Ｈａｒｖａｒｄ）を使用して脱塩し、乾燥させ、０．１％ギ酸に再懸濁した。
【０２０９】
ペプチドを、Ｒｅｐｒｏｓｉｌ逆相材料（ドイツ国、Ｄｒ  Ｍａｉｓｃｈ  ＧｍｂＨ）を詰めた０．０７５×１８０ｍｍの溶融石英キャピラリー（Ｊ＆Ｗ）上での逆相クロマトグラフィーによって分離した。ペプチドを、流速０．１５μｌ／分、０．１％ギ酸水溶液に対してアセトニトリル濃度を変化させた以下の条件で溶出した：５〜２８％を１８０分の直線濃度勾配、２８〜９５％を５分の直線濃度勾配、および９５％アセトニトリルで２５分。質量分析は、Ｑ  Ｅｘａｃｔｉｖｅ  ｐｌｕｓマススペクトロメーター（Ｔｈｅｒｍｏ）をポジティブモードで使用し、フルＭＳスキャンとそれに続くイオンの衝突誘導解離（ＣＩＤ）の繰り返しによって実施し、ＣＩＤは最初のＭＳスキャンで選択した１０種の最も優位なイオンに対して実施した。
【０２１０】
３種の生物学的反復から得た質量分析データは、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベースのヒト欄に対してＭａｘＱｕａｎｔソフトウェア１．４．１．２（Ｍａｔｈｉａｓ  Ｍａｎｎ’ｓ  ｇｒｏｕｐ）を使用して、１％ＦＤＲの条件で分析した。データは、同じソフトウェアを使用してラベルフリー解析によって定量した。
【０２１１】
強度データは、正規分布を得るためにｌｏｇ２に変換した。
【０２１２】
Ａ群とＢ群間の、並べ替えに基づくＦＤＲを用いたウェルチＴ検定（２５０ランダム化、閾値＝０．０５とした）は、Ｐｒｅｓｅｕｓｅ１．４を使用して行った。同じソフトウェアをさらなるアノテーションおよびデータ相関のために使用した。
【０２１３】
遺伝子アレイ：遺伝子アレイ解析は、Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｒｒａｙ  Ｇｅｎｅ  ＳＴ  ２．０  ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）ヒト遺伝子２．０ＳＴアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を使用して実施した。
【０２１４】
細胞ペレットをＲＮＡ  Ｐｒｏｔｅｃｔ（Ｑｉａｇｅｎ）に再懸濁した。総ＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌｕｓ  Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号７４１３４）を使用して抽出した。ＲＮＡの品質は、ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して測定した。２５０ｎｇのＲＮＡを、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）ＷＴ  ＰＬＵＳ試薬キット（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、カタログ番号９０２２８０）を製造業者のマニュアル（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘカタログ番号７０３１７４  Ｒｅｖ．２）に従って使用して標識した。簡単には、ランダムプライマーを使用して、Ｔ７プロモーターテイルを付加しながらｃＤＮＡをＲＮＡから合成した。次いで、Ｔ７−ＲＮＡ−ポリメラーゼを使用したｉｎ  ｖｉｔｒｏの転写によってｃＲＮＡを作製した。一本鎖ｃＤＮＡを合成し、次いで断片化し、末端標識した。３．５μｇをＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）ヒト遺伝子２．０ＳＴアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、カタログ番号９０２４９９）とハイブリダイズさせた。ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｗａｓｈ  ａｎｄ  Ｓｔａｉｎ  Ｋｉｔ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘカタログ番号９００７２０）を使用してアレイの洗浄と染色を行い、スキャンした。得られたイメージを目視で検査し、続いてＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｃｏｎｓｏｌｅ  ｂｕｉｌｄ  １．３．１．１８７（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を使用して、定量（ＲＭＡ−遺伝子）、正規化（Ｓｋｅｔｃｈ−Ｑｕａｎｔｉｌｅ）およびＱＣを実施した。すべてのパラメータがＱＣマトリックスを通過し、異常値は観察されなかった。差異的発現が認められた遺伝子の一覧を、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｃｏｎｓｏｌｅ  ２．０（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を用いる対象ＡＮＯＶＡ（独立）間の一元配置を使用して作製した。
【０２１５】
実験は、未処理ＭＳＣ対照と、実施例１に記載した１ステッププロトコールによって分化を誘導したＭＳＣ−ＮＴＦ細胞とを比較した。３種の無関係の対象から得たサンプルを各条件について分析した。個体間の全体的な相違は、条件間よりも小さいとわかった。
【０２１６】
結果
２３人のＡＬＳ患者において、ＭＳＣにおけるＧＤＦ−１５の比生産性は、２２５．７９±９９．７２ｐｇ／ｍｌ／１０６細胞の範囲であり、同一患者の分化の前のＭＳＣ−ＮＴＦ細胞においては１２５７．２０±８９０．６０ｐｇ／ｍｌ／×１０６個に増加し、増加は平均９．４倍であるとわかった（図２Ａ）。
【０２１７】
さらに、ＡＬＳ患者のＭＳＣ−ＮＴＦ細胞は、同一患者の分化の前のＭＳＣと比べて、有意な量のＩＬ−８（平均で８１±４３ｎｇ／ｍｌ／１０６細胞）を分泌し、その増加は平均１７０倍とわかった（図２Ｂ）。
【０２１８】
ＡＬＳ患者から得た骨髄由来ＭＳＣを、材料および方法に記載したプロトコールを用いた分化の前および後の両方に、プロテオミクスによって分析した。
【０２１９】
３回繰り返した質量分析において少なくとも２回検出されるペプチドに基づいて同定され、タンパク質の検出強度に対して正規化された、最も有意に上方制御または下方制御されたタンパク質を下記の表２に示した。
【０２２０】
【表２−１】
0006628253.tif 000004
【０２２１】
【表２−２】
0006628253.tif 000005
【０２２２】
【表２−３】
0006628253.tif 000006
【０２２３】
【表２−４】
0006628253.tif 000007
【０２２４】
【表２−５】
0006628253.tif 000008
【０２２５】
【表２−６】
0006628253.tif 000009
【０２２６】
ＡＬＳ患者から得た骨髄由来ＭＳＣを、材料および方法に記載したプロトコールを用いた分化の前および後の両方に、遺伝子アレイによって分析した。
【０２２７】
分析された合計４８，２２６種の遺伝子のうち、１６２３種の遺伝子が、差異的発現を示し、その内の５１８種の遺伝子は上方制御されており、５６７種の遺伝子は下方制御されていると判明した。
【０２２８】
下記の表３に、分化後に有意に上方制御または下方制御された例示的な遺伝子の一覧を示す。
【０２２９】
【表３−１】
0006628253.tif 000010
【０２３０】
【表３−２】
0006628253.tif 000011
【実施例３】
【０２３１】
２つの異なる分化プロトコールを使用したＭＳＣ−ＮＴＦの比較
材料および方法
分化プロトコール１：実施例１に記載されるように実施した。この方法を本明細書において、１ステッププロトコールとする。
分化プロトコール２：国際公開第２００９／１４４７１８号に記載されるように実施した。この方法を、２ステッププロトコールとする。
【０２３２】
簡単には、ヒトＭＳＣ（１２，０００細胞／ｃｍ２）を、ＳＰＮ、２ｍＭのＬ−グルタミン（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）、２０ｎｇ／ｍｌのヒト上皮成長因子（ｈＥＧＦ）、２０ｎｇ／ｍｌのヒト塩基性線維芽細胞増殖因子（ｈｂＦＧＦ）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）およびＮ２サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加したＤＭＥＭにまず加えた。７２時間後に培地を、１ｍＭのジブチリルｃＡＭＰ（ｄｂｃＡＭＰ）、０．５ｍＭのイソブチルメチルキサンチン（ＩＢＭＸ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、５ｎｇ／ｍｌのヒト血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、５０ｎｇ／ｍｌのヒトニューレグリン１−β１／ＨＲＧ１−β１  ＥＧＦドメインおよび２０ｎｇ／ｍｌのｈｂＦＧＦ（すべてＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ製）を添加したＤＭＥＭと交換し、更に３日間放置した。
【０２３３】
プロテオミクス：実施例２に記載されるように実施した。
【０２３４】
遺伝子アレイ分析：実施例２に記載されるように実施した。
【０２３５】
実験は、１ステッププロトコールによって、または２ステッププロトコールによって分化誘導されたＭＳＣ−ＮＴＦ細胞を比較した。３人の無関係の対象から得たサンプルを、各条件について分析した。個体間の全体的な相違は、条件間よりも小さいとわかった。各分化プロトコールおよび対照間の全体的な相違は、プロトコール間よりも大きいとわかった。
【０２３６】
結果
３回繰り返した質量分析において少なくとも２回検出されるペプチドに基づいて同定され、タンパク質の検出強度に対して正規化された、最も有意に上方制御または下方制御されたタンパク質を下記の表４に示した。
【０２３７】
【表４】
0006628253.tif 000012
【０２３８】
分析された合計４８，２２６種の遺伝子のうち、１００種の遺伝子が、１ステッププロトコールと比べて２ステッププロトコールにおいて上方制御されており、６９種の遺伝子が、１ステッププロトコールと比べて、２ステッププロトコールにおいて下方制御されると判明した。
【０２３９】
下記の表５に、分化後に有意に上方制御または下方制御された例示的な遺伝子の一覧を示す。
【０２４０】
【表５−１】
0006628253.tif 000013
【０２４１】
【表５−２】
0006628253.tif 000014
【０２４２】
【表５−３】
0006628253.tif 000015
【実施例４】
【０２４３】
ＭＳＣおよびＭＳＣ−ＮＴＦの免疫調節効果
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、相当な免疫調節性活性を有することが示されている。それらは、その免疫抑制特性故に、種々の疾患の治療のための臨床試験において現在試験されている。
【０２４４】
ＣＤ４陽性細胞数の決定、およびＥＬＩＳＡアッセイによるＴ細胞のサイトカイン産生によって、Ｔ細胞の活性化に対する効果を測定するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを使用して、ＭＳＣおよびＭＳＣ−ＮＴＦの免疫調節性特性を比較した。
【０２４５】
材料および方法
フィコール密度遠心分離によって、健常なボランティアの新鮮な末梢血から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離した。
【０２４６】
ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞に対して、実施例１に記載の１ステッププロトコールを使用して分化を誘導した。ＰＢＭＣを、ＭＳＣまたはＭＳＣ−ＮＴＦ細胞のいずれかとともに、ＲＰＭＩと１０％  ＦＢＳを含有する培養培地中、１２ウェルプレートで共培養した。ＰＢＭＣは、ＰＨＡ  １０μｇ／ｍｌを用いて活性化した。活性化されたＰＢＭＣを、単独で培養するか、あるいはＭＳＣまたはＭＳＣ−ＮＴＦ細胞と共培養した。
【０２４７】
４日間の共培養後に、穏やかなピペッティングによって非接着性ＰＢＭＣを回収し、培養上清をＥＬＩＳＡによるサイトカイン分析（ＩＬ−１０およびＩＦＮ−γ）のために回収した。
【０２４８】
非接着性のＰＢＭＣは、ＣＤ４陽性Ｔ細胞のレベルを得るために、フローサイトメトリーによって分析した。
【０２４９】
結果
結果を下記表６にまとめた。
【０２５０】
【表６】
0006628253.tif 000016
【０２５１】
これらの結果は、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞の免疫調節性効果を追認し、このような効果は、同一ドナーの未分化ＭＳＣと比べて増加されていることを示した。活性化ＰＢＭＣによるインターフェロン−γおよびＩＬ−１０の分泌は、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞によって、それぞれ８５倍および３．３倍に有意に下方制御されていた。ＭＳＣとＭＳＣ−ＮＴＦ細胞のいずれもが、単独ではインターフェロン−γまたはＩＬ−１０を分泌しないと判明した。
【０２５２】
さらに、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞は、ＣＤ４陽性細胞の減少をもたらし、ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞不在下での対照培養物におけるその数の半分へと減少させた（２６．４から１３．８％）。
【実施例５】
【０２５３】
ＭＳＣ−ＮＴＦの安定性
ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞の採取後の安定性を評価するために、新鮮な採取されたばかりのＭＳＣ−ＮＴＦ細胞（その細胞の８０％超がＣＤ４９ａを発現することを分析によって確認された集団）を培養培地に再懸濁し、患者への投与のために使用されるシリンジに詰め、２〜８℃で最大４日間インキュベートした。２４、４８、７２および９６時間の時点で、細胞をサンプリングし、細胞を計数し、生存細胞濃度および生存率を求めた。各時点で、細胞をまた再播種し、培養培地中、３７℃でさらに３日間培養して、遅延発症型細胞死について評価した。各時点で、生存細胞の回収し、生存率を確定した。
【０２５４】
結果
生存率および生存ＭＳＣ−ＮＴＦ細胞濃度は、臨床試験において患者への投与に使用されるのと同様のシリンジに詰められた場合に、最大９６時間維持された。生存細胞濃度は、最初の７２時間は事実上変化せず、シリンジ中で０時間から９６時間の間に約９６％までしか低下しなかった（図３Ａ）。さらに、遅延発症細胞死を評価するためのさらなる３日間のインキュベーションによって、細胞が少なくとも７２時間にわたって安定性と生存率を維持することが確認された。９６時間の時点では、回収された生存細胞数が８６％へと低下した（図３Ｂ）。シリンジ内の生存細胞の回収とそれに続く３日間の培養によれば、細胞安定性は最大９６時間維持されるようである。細胞は、安定性を維持する９６時間の期間を通じて、その特徴的表現型および神経栄養因子分泌特性を維持することが示された。
【０２５５】
本発明がその特定の実施形態とともに記載されているが、多数の代替法、改変および変法が、当業者には明らかである。したがって、添付の特許請求の範囲の趣旨および広い範囲内に入るこのような代替法、改変および変法のすべてが、本発明に包含されることを意図している。
【０２５６】
本明細書に記載されるすべての刊行物、特許および特許出願は、個々の刊行物、特許または特許出願の各々について、具体的かつ個別に参照して本明細書に組み込まれた場合と同程度に、その明細書の参照することによってその全文が本明細書に組み込まれるものとする。さらに、本願におけるいかなる文献に関する引用または同定は、本発明の先行技術として利用可能であることの承認と解釈されてはならない。章の見出しが使用される範囲について、見出しは必ずしも限定と解釈してはならない。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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