(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
パーキンタンパク質、及びパーキンタンパク質の一方の末端又は両方の末端に融合しており、細胞又は組織に対する改善された透過性を有する進化型巨大分子導入ドメイン(aMTD)を含む、iCP(細胞透過性が改善された)パーキン組換えタンパク質であって、
aMTDが、配列番号74、配列番号78、配列番号80、配列番号83、配列番号122、配列番号143、配列番号152、配列番号154、配列番号155、及び配列番号156からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、
iCPパーキン組換えタンパク質。
【請求項２】
1つ以上の可溶化ドメイン(SD)が、パーキンタンパク質及びaMTDのうちの1つ以上の末端にさらに融合している、請求項1に記載のiCPパーキン組換えタンパク質。
【請求項３】
以下の構造式のいずれか１つ:
A-B-C及びA-C-B-C
[式中、Aは、細胞又は組織に対する改善された透過性を有するaMTDであり、Bは、パーキンタンパク質であり、Cは、SDである]
により示される、請求項2に記載のiCPパーキン組換えタンパク質。
【請求項４】
パーキンタンパク質が、配列番号814のアミノ酸配列を有する、請求項1又は請求項3に記載のiCPパーキン組換えタンパク質。
【請求項５】
パーキンタンパク質が、配列番号815のポリヌクレオチド配列によりコードされる、請求項4に記載のiCPパーキン組換えタンパク質。
【請求項６】
aMTDが、配列番号314、配列番号318、配列番号320、配列番号323、配列番号362、配列番号383、配列番号392、配列番号394、配列番号395、及び配列番号396からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列によりコードされる、請求項1又は3に記載のiCPパーキン組換えタンパク質。
【請求項７】
SDが、配列番号798、799、800、801、802、803及び804からなる群から独立に選択されるアミノ酸配列を有する、請求項2又は請求項3に記載のiCPパーキン組換えタンパク質。
【請求項８】
SDが、配列番号805、806、807、808、809、810及び811からなる群から独立に選択されるポリヌクレオチド配列によりコードされる、請求項7に記載のiCPパーキン組換えタンパク質。
【請求項９】
融合が、ペプチド結合又は化学的な結合を介して形成される、請求項1又は請求項3に記載のiCPパーキン組換えタンパク質。
【請求項１０】
請求項1に記載のiCPパーキン組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１１】
ポリヌクレオチドの配列が、配列番号816又は配列番号822により示される、請求項10に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２】
請求項3に記載のiCPパーキン組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１３】
ポリヌクレオチドの配列が、配列番号818、824、828、830及び832からなる群から選択される、請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１４】
請求項10又は請求項12に記載のポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクター。
【請求項１５】
請求項14に記載の組換え発現ベクターを用いて形質転換された形質転換体。
【請求項１６】
iCPパーキン組換えタンパク質の調製方法であって、
請求項14に記載の組換え発現ベクターを調製するステップと、
組換え発現ベクターを使用して、形質転換体を調製するステップと、
形質転換体を培養するステップと、
培養のステップにより発現した組換えタンパク質を回収するステップと
を含む調製方法。
【請求項１７】
パーキンソン関連疾患を治療又は予防するための医薬組成物であって、活性成分としての、請求項1又は請求項3に記載のiCPパーキン組換えタンパク質、及び薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物。
【請求項１８】
請求項1又は請求項3に記載のiCPパーキン組換えタンパク質を含む医薬品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新たに進化させた疎水性CPP(細胞浸透性ペプチド(cell-penetrating peptide))、すなわち、in vitro及びin vivoにおいて巨大分子の細胞透過性をもたらす進化型巨大分子導入ドメイン(advanced macromolecule transduction domain)(aMTD)により可能になる巨大分子細胞内導入技術(macromolecule intracellular transduction technology)(MITT)に基づく、特に、神経変性障害を標的にする新規なタンパク質に基づく治療剤に関する。本発明の組換えタンパク質は、血液脳関門(BBB)透過性、組織透過性及び生体内移入(bio-transfer)機能を解消し得るという点で、パーキンソン病を治療するための細胞内タンパク質療法として、新しい技術上の利点を有する。
【背景技術】
【０００２】
パーキンソン病は、ドーパミンの不安定な生成及び分泌により発症する主要な神経変性疾患うちの1つである(16)。パーキンソン病を有する患者において、中脳におけるドーパミン作動性ニューロンの傷害;病理学的特徴、例えば、レビー小体の形成;運動性の欠陥、例えば、動作緩慢、静止時振戦及び硬直;並びに非運動性の症状、例えば、うつ病、認知症及び不眠が認められている(17〜19)。
【０００３】
パーキンソン病は大部分、高齢の世代において見出される神経変性疾患である。統計的に、55歳超の人々のおよそ1%及び75歳超の人々の3%が、この疾患を有すると診断されている(20)。高齢者人口が増加するにつれ、パーキンソン病を有すると診断される患者の数は、ますます増加している。全世界で、この疾患を有する患者人口は、2005年の410万人から2030年までに870万人に増加すると推定されている(21、22)。
【０００４】
パーキンソン病の原因は分かっていない。しかし、これまでの研究により、パーキンソン病は、遺伝的因子及び環境的因子の両方が組み合わさることによって発症し、とりわけ、パーキン遺伝子の突然変異が、パーキンソン病を引き起こす多様な遺伝的因子のうちで、最も高い有病率を示すことが報告された。パーキン遺伝子は最初に、常染色体劣性若年性パーキンソニズム(ARJP)を有する日本人の系統から発見された(23)。パーキン遺伝子の突然変異は、早発性遺伝性パーキンソン病のおよそ50%及び50歳未満の孤発性の患者の18%から発見することができた(24)。
【０００５】
パーキンは、ユビキチン-プロテアソーム系におけるE3-リガーゼとしての機能を有する465個のアミノ酸配列から構成される。パーキンタンパク質は、細胞内部の傷害を受けた、酸化されている、及び/又は不規則な構造のタンパク質を除去することによって、細胞内の酸化性のストレスを低下させるように機能する。
【０００６】
パーキン変異が生じると、パーキンは、E3-リガーゼとしてのその特性を失い、封入体及び/又は不規則なタンパク質が、細胞内部に蓄積し、それにより、ドーパミンの分泌の低下及びドーパミン作動性ニューロンのアポトーシスが生じる(25)。ドーパミンの分泌の減少による運動機能の減少を示した、ショウジョウバエを使用したパーキンソン病に関する最近の研究がある。ドーパミンの分泌が、ドーパミン作動性ニューロンの不活性化に起因して減少しており、ドーパミン作動性ニューロンにおけるパーキン及びPINK1(PTEN誘導推定キナーゼ1)の機能が明らかになった(26)。さらに、PINK1を発現しないショウジョウバエ中でパーキンを過剰発現させると、PINK1により引き起こされるパーキンソン病に関連する症状、例えば、ミトコンドリアの機能不全及びドーパミン作動性ニューロンの分解が回復することも確認された(26〜28)。これらの因子に基づけば、パーキンソン関連疾患を治療するために、パーキンタンパク質は、標的タンパク質に基づく薬剤として首尾よく作用し得る。パーキンは、ユビキチン-プロテアソーム系において主要な酵素として機能して、酸化性のストレスからミトコンドリアの機能を維持することによって、封入体を破壊し、ドーパミン作動性ニューロンのアポトーシスを抑制する。
【０００７】
0006664464.tif 000002
0006664464.tif 000003
0006664464.tif 000004
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
巨大分子、例えばパーキンタンパク質は、細胞膜を横切って移動することができず、さらに、血液脳関門を通って脳内にも輸送され得ない。したがって、巨大分子の細胞/組織内への移動を可能にする巨大分子細胞内導入技(MITT)を開発する必要性があった。
【０００９】
これまでの研究では、膜移動配列(membrane translocating sequence)(MTS)及び膜移動モチーフ(membrane translocating motif)(MTM)と名付けられた、線維芽細胞増殖因子4(FGF4)の疎水性シグナルペプチドに由来する、MITTに基づく疎水性CPPが報告され、これらを使用して、動物において生物学的に活性なペプチド及びタンパク質、例えばパーキンタンパク質が全身性に送達された。
【００１０】
しかし、CPPは、in vivoでパーキンタンパク質を有効に送達することができず、また、in vitroでの送達効率も、タンパク質の凝集、低い溶解性/収率、及び細胞/組織に対する不十分な透過性に起因して十分でなかった。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
これらの限界を克服し、こうしたCPPにより、in vitro及びin vivoにおける巨大分子の細胞透過性をもたらすCPPを改善するために、本発明において、CPPの細胞内送達性を改善するための、理論的な重要因子(critical factor)(CF)を同定し、検証する。決定したCFに基づいて、新規の疎水性CPP配列を、新たに作製し、細胞透過性について定量的に評価し、参照CPP配列と、生存細胞中でのそれらの細胞内送達性において相互に比較する。本発明では、新たに開発した疎水性CPPを提示する。「進化型巨大分子導入ドメイン」(aMTD)と呼ぶ新規のペプチド配列を、多様な異なる治療用タンパク質に融合させ、aMTD融合組換えタンパク質を、生存している細胞及び動物組織に体系的に送達し得る。タンパク質療法に関して、これらのタンパク質は、多様なヒト疾患を治療するためのタンパク質に基づく生物学的治療剤の臨床における開発及び適用に大きな影響を及ぼすであろう。
【００１２】
パーキンソン病は、黒質中のドーパミン作動性ニューロンの喪失に起因するドーパミンの不安定な分泌に由来して、動きに欠陥をもたらす進行性神経変性障害である。したがって、傷害を受けたドーパミン作動性ニューロンの回復を通して、ドーパミンの分泌を調節することが、パーキンソン病を治療するのに必須となるであろう。
【００１３】
細胞透過性が改善されたパーキン組換えタンパク質(iCP-パーキン)に基づく巨大分子細胞内導入技術は、組換えタンパク質を脳内に有効に送達するためのBBBへ効率的な浸透のための、タンパク質に基づく抗神経変性剤として開発された。
【００１４】
パーキンタンパク質は、ドーパミン作動性ニューロンの細胞死の阻害物質であり、これを、新たに開発した進化型巨大分子導入ドメイン(aMTD)と、好ましくは、可溶化ドメイン(SD)と共に融合させて、この組換えタンパク質の溶解性/収率及び細胞/組織に対する透過性を増加させた。さらに、我々が新たに開発したaMTD/SD融合組換えiCP-パーキンタンパク質は、BBB透過性も示した。in vitro及びin vivoの両方において、我々のiCP-パーキン組換えタンパク質は、ドーパミン作動性神経細胞のアポトーシスを抑制することにより脳中のドーパミンレベルを増加させることによって、パーキンソン病の典型的な表現型である運動技能を改善した。
【００１５】
本発明は、細胞において、タンパク質、ペプチド、核酸、化学物質等を含めた、生物学的に活性な巨大分子が細胞膜を横切るのを促進する、生物医学、前臨床及び臨床研究に適用可能である細胞透過性をもたらす、無制限の数の設計に適用され得るベースラインのプラットフォームに関する。
【００１６】
本発明は、aMTD配列の細胞透過力を促進するこれらの重要因子を分析し、同定し、決定する。これまでに公開した疎水性CPPの綿密な分析から決定した重要因子(CF)に基づいて、これらのaMTD配列を人工的にアセンブルする。
【００１７】
本発明の一態様は、新規の進化型巨大分子導入ドメイン(aMTD)配列に関する。
【００１８】
本発明のaMTD配列はペプチド、ポリペプチド、タンパク質ドメイン又は完全長タンパク質を含めた、生物学的に活性な巨大分子が、細胞膜を通って導入されることを媒介することが可能な、最初の人工的に開発された細胞透過性ポリペプチドである。
【００１９】
本発明の別の態様は、aMTD配列を生物学的に活性なカーゴ分子に融合させることによって、細胞透過性を有する生物学的に活性な分子を遺伝子工学的に作製する方法に関する。
【００２０】
また、本発明は、aMTDを、生物学的に活性なカーゴ分子に付着させた細胞透過性組換えタンパク質が関与する、生物学的に活性な分子を細胞に送達するために、本発明を治療に適用することにも関する。
【００２１】
本発明の別の態様は、生物学的に活性な巨大分子が、生物学的に活性な巨大分子に融合させたaMTD配列から構成されている細胞透過性組換えタンパク質の構築物として、生存細胞内に進入することが可能である方法に関する。
【００２２】
本発明の他の態様は、分子送達、薬物送達、タンパク質療法、細胞内タンパク質療法、タンパク質置換療法、ペプチド療法、遺伝子送達等のための、aMTD配列の効率的な使用に関する。
【００２３】
本発明の別の態様は、240種の新規疎水性CPP配列-aMTD、組換えタンパク質のaMTDにより媒介される細胞内送達活性の決定、及びFGF4由来のMTS/MTM及びHRSS由来のMTD配列より高いか、又は同等のレベルでの生きた細胞による増強されたタンパク質取り込みの比較に関する。新たに発明されたaMTDのこれらの強さは、臨床開発及び適用のための参照疎水性CPPの停滞に対処することができた。
【００２４】
本発明は、生物学的に活性な巨大分子を細胞膜に伝達する進化型巨大分子伝達ドメイン(aMTD)配列に関する。
本発明の別の態様は、
以下の特徴:
a.アミノ酸長:9〜13
b.変角ポテンシャル:配列の中央(5'、6'、7'、又は8')及び末端に位置するプロリン(P)
c.硬性/柔軟性:不安定指数(II):40〜60
d.構造特性:脂肪族指数(AI):180〜220
e.ヒドロパシー:GRAVY:2.1〜2.6
f.アミノ酸組成:構成アミノ酸の全てが、疎水性かつ脂肪族アミノ酸(A、V、L、I、及びP)を有するアミノ酸配列からなる、aMTDに関する。
【００２５】
一実施形態において、アミノ酸配列は、下記の12個のアミノ酸配列から構成される、一般式
[一般式]
【化１】
0006664464.tif 000005
(式中、Xは、アラニン(A)、バリン(V)、ロイシン(L)、又はイソロイシン(I)のいずれかを指し、プロリン(P)は、U(5'、6'、7'、又は8'のいずれか)の1つに位置することができる。残りのUは、A、V、L、又はIのいずれかから構成され、12'のPは、プロリンである)を有する。
【００２６】
一実施形態において、前記一般式を有するアミノ酸配列は、配列番号1〜配列番号240からなる群から選択される。
【００２７】
一実施形態において、aMTDの二次構造はα−へリックスである。
【００２８】
本発明は、上記aMTD配列をコードする、単離されたポリヌクレオチドをさらに提供する。
【００２９】
一実施形態において、単離されたポリヌクレオチドは配列番号241〜配列番号480からなる群から選択される。
【００３０】
本発明は、aMTDの重要な特性を同定する方法をさらに提供する。本方法は、優れた疎水性CPPを以前に公開された参照疎水性CPPから選択するステップ、選択された疎水性CPPの生理学的及び化学的特徴を分析するステップ、これらの生理学的及び化学的特徴の中から細胞透過性と関連する特性を同定するステップ、以前に公開された参照疎水性CPPを少なくとも2つのグループにカテゴリー分けし、それらの細胞透過性及び相対的特徴にしたがってCPPの各群の詳細分析により、特有の特性を決定するステップ、決定された特有の特性を分析することを介して同定された重大な因子を設定するステップ、重大な因子が、実験研究を介して検証されることを確認するステップ;並びに確認された実験研究に基づく、重大な因子を決定するステップを含む。
【００３１】
一実施形態において、同定された特有の特性は、アミノ酸長、分子量、pI値、変角ポテンシャル、硬性、柔軟性、構造特性、ヒドロパシー、残基構造、アミノ酸組成、及び二次構造である。
【００３２】
一実施形態において、決定された6個の重大な因子は、以下の特徴:
a.アミノ酸長:9〜13
b.変角ポテンシャル:配列の中央(5'、6'、7'、又は8')及び末端に位置するプロリン(P)
c.硬性/柔軟性:不安定指数(II):40〜60
d.構造特性:脂肪族指数(AI):180〜220
e.ヒドロパシー:GRAVY:2.1〜2.6
f.アミノ酸組成:構成アミノ酸の全てが、疎水性かつ脂肪族アミノ酸(A、V、L、I、及びP)
G.二次構造：α−へリックス
からなる。
【００３３】
本発明は、aMTD配列を開発する方法をさらに提供する。方法は、下記に記載する下記の一般式:
[一般式]
【００３４】
【化２】
0006664464.tif 000006
[式中、配列の末端(12')の(P)はプロリンであり、U部位のうちの1つはプロリンであり、プロリンでないX及びUは、A、V、L及び/又はIである]
を有するaMTDのプラットフォームを設計するステップと、設計されたアミノ酸配列が、以下に示す6つの重要因子：
a.アミノ酸長:9〜13
b.変角ポテンシャル:配列の中央(5'、6'、7'、又は8')及び末端に位置するプロリン(P)
c.硬性/柔軟性:不安定指数(II):40〜60
d.構造特性:脂肪族指数(AI):180〜220
e.ヒドロパシー:GRAVY:2.1〜2.6
f.アミノ酸組成:構成アミノ酸の全てが、疎水性かつ脂肪族アミノ酸(A、V、L、I、及びP)
ことを満たすかどうかを確認するステップとを含む。
【００３５】
一実施形態において、aMTDの固有の特性を同定する方法を得た、6個の重大な因子は、以下の因子:
a.アミノ酸配列:12
b.変角ポテンシャル:配列の中央(5'、6'、7'、又は8')及び末端に位置するプロリン(P)
c.硬性/柔軟性:不安定指数(II):40〜60
d.構造特性:脂肪族指数(AI):180〜220
e.ヒドロパシー:GRAVY:2.1〜2.6
f.アミノ酸組成:構成アミノ酸の全てが、疎水性かつ脂肪族アミノ酸(A、V、L、I、及びP)
からなる。
【００３６】
一実施形態において、aMTDの二次構造はα−へリックスである。
【００３７】
一実施形態において、本方法は、カーゴタンパク質に融合されたaMTD配列の発現ベクターを開発するステップ、誘導可能な発現に適切な細菌株を選択するステップ、可溶型で、カーゴタンパク質に融合されたaMTDを精製及び調製するステップ、並びにそれらの細胞透過性を確認するステップをさらに含む。
【００３８】
本発明は、細胞透過性を有する単離された組換えタンパク質をさらに提供する。本単離された組換えタンパク質は、配列番号1〜配列番号240からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する進化型巨大分子伝達ドメイン(aMTD)配列、及び生物学的に活性な分子を含む。
【００３９】
一実施形態において、生物学的に活性な分子は、成長因子、酵素、転写因子、毒素、抗原性ペプチド、抗体、及び抗体フラグメントからなる群から選択されるいずれか1つである。
【００４０】
一実施形態において、生物学的に活性な分子は、酵素、ホルモン、担体、免疫グロブリン、抗体、構造タンパク質、運動機能ペプチド、受容体、シグナル伝達ペプチド、保存ペプチド、膜ペプチド、膜貫通型ペプチド、内部ペプチド、外部ペプチド、分泌ペプチド、ウイルスペプチド、未変性のペプチド、糖化タンパク質、断片化タンパク質、ジスルフィド結合したタンパク質、組換えタンパク質、化学的に修飾されたタンパク質、及びプリオンからなる群から選択されるいずれか1つである。
【００４１】
一実施形態において、生物学的に活性な分子は、核酸、コード核酸配列、mRNA、アンチセンスRNA分子、炭水化物、脂質、及び糖脂質からなる群から選択されるいずれか1つである。
【００４２】
一実施形態において、生物学的に活性な分子は、生物学的治療用化学物質、及び毒性化学物質からなる群から選択される少なくとも1つである。
【００４３】
本発明は、細胞透過性を有するように生物学的に活性な分子を遺伝子的又は後成的に操作及び/又は修飾する方法をさらに提供する。本方法は、最適化された有効な条件下でaMTDを生物学的に活性な分子に融合させて、細胞透過性であり得る生物学的に活性な分子を生成するステップを含み、ここでaMTDは、配列番号1〜配列番号240からなる群から選択されるアミノ酸配列のいずれか1つからなる。
【００４４】
また、本発明は、生物学的に活性な巨大分子が生存細胞内に導入されることを媒介することが可能な進化型巨大分子導入ドメイン(aMTD)配列に基づくパーキンソン病を治療するための細胞透過性組換えタンパク質にも関する。
【００４５】
本発明のその他の態様は、薬物送達、タンパク質療法、細胞内タンパク質療法、タンパク質置換療法及びペプチド療法のための、aMTD配列の効率的な使用に基づくパーキンソン病のための、細胞/組織/BBB透過性のタンパク質に基づく治療剤に関する。
【００４６】
本発明の一態様は、パーキンタンパク質、及び9〜13個のアミノ酸配列で構成されており、細胞又は組織の改善された透過性を有する進化型巨大分子導入ドメイン(aMTD)を含む、iCP(細胞透過性が改善された)パーキン組換えタンパク質であって、aMTDが、パーキンタンパク質の一方の末端又は両方の末端に融合しており、以下の特徴：
(a)Ala、Val、Ile、Leu及びProからなる群から選択される、3つ以上のアミノ酸配列で構成されており、
(b)そのアミノ酸配列の5位〜8位及び12位のうちの任意の1つ以上に対応するアミノ酸配列として、プロリンを有し、
(c)Protparamにより測定する場合に、40〜60の不安定指数、180〜220の脂肪族指数、及び2.1〜2.6のヒドロパシーの全平均(grand average of hydropathy)(GRAVY)を有する
を有する、iCPパーキン組換えタンパク質を提供する。
【００４７】
一実施形態によれば、1つ以上の可溶化ドメイン(SD)が、パーキンタンパク質及びaMTDのうちの1つ以上の末端にさらに融合している。
【００４８】
別の実施形態によれば、aMTDが、α-へリックス構造を有し得る。さらに別の実施形態によれば、aMTDが、12個のアミノ酸配列で構成され、以下の一般式:
[一般式]
【００４９】
【化３】
0006664464.tif 000007
[式中、Xは独立に、アラニン(A)、バリン(V)、ロイシン(L)又はイソロイシン(I)を指し、プロリン(P)は、U(5'、6'、7'又は8'のいずれか)のうちの1つにおいて位置することができる。残りのUは独立に、A、V、L又はIで構成されており、12'のPは、プロリンである]
により示すことができる。
【００５０】
本発明の別の態様は、以下の構造式のいずれか１つ:
A-B-C及びA-C-B-C
[式中、Aは、細胞又は組織の改善された透過性を有する進化型巨大分子導入ドメイン(aMTD)であり、Bは、パーキンタンパク質であり、Cは、可溶化ドメイン(SD)であり、
aMTDが、9〜13個のアミノ酸配列で構成されており、以下の特徴：
(a)Ala、Val、Ile、Leu及びProからなる群から選択される3種以上のアミノ酸で構成されており、
(b)そのアミノ酸配列の5位〜8位及び12位のうちの任意の1つ以上に対応するアミノ酸配列として、プロリンを有し、
(c)Protparamにより測定する場合に、40〜60の不安定指数、180〜220の脂肪族指数、及び2.1〜2.6のヒドロパシーの全平均(GRAVY)を有し、
(d)α-へリックス構造を有する
を有する]
により示される、iCPパーキン組換えタンパク質を提供する。
【００５１】
本発明の一実施形態によれば、パーキンタンパク質は、配列番号814のアミノ酸配列を有し得る。
【００５２】
本発明の別の実施形態によれば、パーキンタンパク質は、配列番号815のポリヌクレオチド配列によりコードされ得る。
【００５３】
本発明のさらに別の実施形態によれば、パーキンタンパク質は、細胞、組織又は臓器の受容体に選択的に結合するリガンドをさらに含むことができる。
【００５４】
本発明のさらに別の実施形態によれば、aMTDは、配列番号1〜240からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し得る。
【００５５】
本発明のさらに別の実施形態によれば、aMTDは、配列番号241〜480からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列によりコードされ得る。
【００５６】
本発明のさらに別の実施形態によれば、SDは、配列番号798、799、800、801、802、803及び804からなる群から独立に選択されるアミノ酸配列を有し得る。
【００５７】
本発明のさらに別の実施形態によれば、SDは、配列番号805、806、807、808、809、810及び811からなる群から独立に選択されるポリヌクレオチド配列によりコードされ得る。
【００５８】
本発明のさらに別の実施形態によれば、iCPパーキン組換えタンパク質は、その一方の末端に融合したヒスチジンタグ親和性ドメインをさらに有し得る。
【００５９】
本発明のさらに別の実施形態によれば、ヒスチジンタグ親和性ドメインは、配列番号812のアミノ酸配列を有し得る。
【００６０】
本発明のさらに別の実施形態によれば、ヒスチジンタグ親和性ドメインは、配列番号813のポリヌクレオチド配列によりコードされ得る。
【００６１】
本発明のさらに別の実施形態によれば、融合は、ペプチド結合又は化学的な結合を介して形成することができる。
【００６２】
本発明のさらに別の実施形態によれば、iCPパーキン組換えタンパク質は、パーキンソン関連疾患の治療又は予防のために使用することができる。
【００６３】
本発明のさらに別の態様は、iCPパーキン組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を提供する。
【００６４】
本発明の一実施形態によれば、ポリヌクレオチド配列は、配列番号816又は配列番号822により示されるポリヌクレオチド配列であり得る。
【００６５】
本発明の別の実施形態によれば、ポリヌクレオチド配列は、配列番号818、824、828、830及び832からなる群から選択することができる。
【００６６】
本発明のさらに別の態様は、ポリヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターを提供する。
【００６７】
本発明のさらに別の態様は、組換え発現ベクターを用いて形質転換された形質転換体を提供する。
【００６８】
本発明のさらに別の態様は、iCPパーキン組換えタンパク質の調製方法であって、組換え発現ベクターを調製するステップと、組換え発現ベクターを使用して、形質転換体を調製するステップと、形質転換体を培養するステップと、培養のステップにより発現した組換えタンパク質を回収するステップとを含む調製方法を提供する。
【００６９】
本発明のさらに別の態様は、iCPパーキン組換えタンパク質を活性成分として含む組成物を提供する。
【００７０】
本発明のさらに別の態様は、活性成分としてiCPパーキン組換えタンパク質、及び薬学的に許容できる担体を含む、パーキンソン病を治療又は予防するための医薬組成物を提供する。
【００７１】
本発明のさらに別の態様は、パーキンソン関連疾患を治療又は予防するための医薬品としてのiCPパーキン組換えタンパク質の使用を提供する。
【００７２】
本発明のさらに別の態様は、iCPパーキン組換えタンパク質を含む医薬品を提供する。
【００７３】
本発明のさらに別の態様は、パーキンソン関連疾患を治療又は予防するための医薬品の調製におけるiCPパーキン組換えタンパク質の使用を提供する。
【００７４】
本発明のさらに別の態様は、対象においてパーキンソン関連疾患を治療又は予防する方法であって、パーキンソン関連疾患の治療又は予防を必要とする対象を同定するステップと、治療有効量のiCPパーキン組換えタンパク質を対象に投与するステップとを含む方法を提供する。
【００７５】
本発明の一実施形態によれば、対象は、哺乳動物であり得る。
【００７６】
別段の定義がない限り、本明細書で使用する用語は全て、本発明が属する技術に関して当業者が一般に理解するのと同じ意味を有する。本明細書には、ある特定の方法、及び材料を記載するが、それらに限定されると解釈してはならず、また、それらに類似する又は均等な方法及び材料はいずれも、本発明の実行又は試験に際して使用することができる。本明細書で言及する刊行物は全て、それらの全体が、引用する刊行物が関連する方法及び/又は材料を開示し、記載するために、参照により本明細書に組み込まれている。本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用する場合、単数形「a」、「an」及び「the」は、文脈からそうでないことが明らかでない限り、複数の指示対象を含むことに留意しなければならない。
【００７７】
本発明の「ペプチド」は、ペプチド結合を介して相互に連結するアミノ酸残基により形成される鎖型のポリマーを指し、「ポリペプチド」と交換可能に使用される。さらに、「ポリペプチド」は、ペプチドもタンパク質も含む。
【００７８】
さらに、用語「ペプチド」は、本明細書で具体的に例を示すペプチドの保存的な変異体であるアミノ酸配列も含む。用語「保存的な変異体」は、本明細書で使用する場合、アミノ酸残基の、生物学的に類似する別の残基による交換を意味する。保存的な変異体の例えば1つの疎水性残基、例えばイソロイシン、バリン、ロイシン、アラニン、システイン、グリシン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、チロシン、ノルロイシン若しくはメチオニンの、別の疎水性残基による置換、又は1つの極性残基の別の極性残基による置換、例えば、アルギニンのリジンによる置換、グルタミン酸のアスパラギン酸による置換、若しくはグルタミンのアスパラギンによる置換等が挙げられる。相互に置換することができる中性親水性アミノ酸には、アスパラギン、グルタミン、セリン及びスレオニンが含まれる。
【００７９】
用語「保存的な変異体」はまた、置換されているポリペプチドに対して作られた抗体が、置換されていないポリペプチドとも免疫反応する限り、置換されていない親アミノ酸の代わりに、置換されているアミノ酸を使用することも含む。そのような保存的置換は、本発明のペプチドのクラスの定義内の保存的置換である。
【００８０】
当業者であれば、類似の置換を行って、より高い細胞透過性及びより広い宿主の範囲を有するペプチドを得ることができる。例えば、本発明は、本明細書に提供するアミノ酸配列(例えば、配列番号1〜240)に対応するペプチドを提供し、ペプチドの細胞透過性が維持される限り、それらの類似体、相同体、異性体、誘導体、アミド化変異体及び保存的な変異体も提供する。
【００８１】
本発明のペプチドの一次アミノ酸配列の軽微な改変により、本明細書に記載する特定のペプチドと比較して実質的に同等な又は増強された細胞透過性を有するペプチドを得ることができる。そのような改変は、部位特異的変異誘発による場合には意図的であり得、又は自発的であり得る。
【００８２】
ペプチドはいずれも、L-アミノ酸を使用して合成することができるが、それらのペプチド全てのD形を、合成により生成することができる。さらに、本発明のペプチドの細胞透過性を増加させるために、C-末端誘導体、例えばC-末端メチルエステル及びC-末端アミデートを生成することもできる。
【００８３】
これらの改変により生成されるペプチドは全て、ペプチドのアミデート化バージョンの場合には、アミデート化ペプチドが治療に有用となるように、元々のペプチドの細胞透過性が変化しているか又は増強されている限り、本明細書に含まれる。そのような改変は、特定のペプチドの細胞透過性を変化させるか又は増強するのに有用であると想定されている。
【００８４】
さらに、1つ以上のアミノ酸の欠失によってもまた、その細胞透過性を何ら顕著に変化させることなく、結果として得られる分子の構造を改変することができる。こうして、有用性を有し得るより小型の活性な分子を開発することができる。例えば、、特定のペプチドにとっては、細胞透過性に必要でない場合があるアミノ末端又はカルボキシル末端のアミノ酸は、除去することができる。
【００８５】
用語「遺伝子」は、タンパク質のコーディング若しくは転写、又はその他の遺伝子の発現の調節における機能的役割を有する任意の核酸配列又はその部分を指す。遺伝子は、機能性タンパク質をコードする核酸の全部、又はタンパク質をコードするか若しくは発現させる核酸の一部であり得る。核酸配列は、エクソン、イントロン、開始領域若しくは終結領域、プロモーター配列、その他の調節配列、又は遺伝子に隣接するユニークな配列中の遺伝子の突然変異を含むことができる。
【００８６】
用語「プライマー」は、RNA又はDNAの相補的な標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズし、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応において生じるような、モノヌクレオチドからの、ヌクレオチジルトランスフェラーゼの作用によるポリヌクレオチドの段階的合成のための出発点として働くオリゴヌクレオチド配列を指す。
【００８７】
用語「コード領域」又は「コーディング配列」は、発現が望まれる特定の遺伝子産物又はその断片を、正常な塩基対形成、及びコドンの使用関係に従ってコードする核酸配列、その相補体又はその部分を指す。コード配列は、細胞の生化学的機構により一緒にされて成熟したmRNAをもたらす、ゲノムDNA中のエクソン、又は未熟な一次RNA転写物を含む。アンチセンス鎖は、そうした核酸の相補体であり、そこから、コード配列を推定することができる。
【００８８】
本発明は、パーキンタンパク質、及び9〜13個のアミノ酸配列、好ましくは、10〜12個のアミノ酸配列で構成されており、細胞又は組織の改善された透過性を有する進化型巨大分子導入ドメイン(aMTD)を含む、iCPパーキン組換えタンパク質であって、aMTDが、パーキンタンパク質の一方の末端又は両方の末端に融合しており、以下の特徴：
(a)好ましくは、Ala、Val、Ile、Leu及びProからなる群から選択される、3つ以上のアミノ酸配列で構成されており、
(b)そのアミノ酸配列の5位〜8位及び12位のうちの任意の1つ以上に;好ましくは、そのアミノ酸配列の5位〜8位のうちの1つ以上、及び12位に対応するアミノ酸配列として、プロリンを有し、
(c)Protparam(http://web.expasy.org/protparam/を参照されたい)により測定する場合に、好ましくは、40〜60、より好ましくは、41〜58の不安定指数;好ましくは、180〜220、より好ましくは、185〜225の脂肪族指数;及び好ましくは、2.1〜2.6、より好ましくは、2.2〜2.6のヒドロパシーの全平均(GRAVY)を有する
を有する、iCPパーキン組換えタンパク質を提供する。
【００８９】
一実施形態によれば、1つ以上の可溶化ドメイン(SD)が、パーキンタンパク質及びaMTDのうちの1つ以上、好ましくは、パーキンタンパク質の一方の末端又は両方の末端、より好ましくは、パーキンタンパク質のC-末端にさらに融合している。
【００９０】
別の実施形態によれば、aMTDが、α-へリックス構造を有し得る。
【００９１】
さらに別の実施形態によれば、aMTDは、好ましくは、12個のアミノ酸配列で構成され、以下の一般式:
[一般式]
【００９２】
【化４】
0006664464.tif 000008
[式中、Xは独立に、アラニン(A)、バリン(V)、ロイシン(L)又はイソロイシン(I)を指し、プロリン(P)は、U(5'、6'、7'又は8'のいずれか)のうちの1つにおいて位置することができ、残りのUは独立に、A、V、L又はIで構成されており、12'のPは、プロリンである]
により示すことができる。
【００９３】
本発明のさらに別の態様は、構造式:A-B-C及びA-C-B-Cのいずれか、好ましくは、A-B-C
[式中、Aは、細胞又は組織の改善された透過性を有する進化型巨大分子導入ドメイン(aMTD)であり、Bは、パーキンタンパク質であり、Cは、可溶化ドメイン(SD)であり、
aMTDが、9〜13個、好ましくは、10〜12個のアミノ酸配列で構成されており、以下の特徴：
(a)Ala、Val、Ile、Leu及びProからなる群から選択される、3つ以上のアミノ酸配列で構成されており、
(b)そのアミノ酸配列の5位〜8位及び12位のうちの任意の1つ以上に;好ましくは、そのアミノ酸配列の5位〜8位のうちの1つ以上、及び12位に対応するアミノ酸配列として、プロリンを有し、
(c)Protparam(http://web.expasy.org/protparam/を参照されたい)により測定する場合に、好ましくは、40〜60、より好ましくは、41〜58の不安定指数;好ましくは、180〜220、より好ましくは、185〜225の脂肪族指数;及び好ましくは、2.1〜2.6、より好ましくは、2.2〜2.6の疎水性親水性指標の全平均(GRAVY)を有し、
(d)好ましくは、α-へリックス構造を有する、
を有する]
により示される、iCPパーキン組換えタンパク質を提供する。
【００９４】
本発明の一実施形態では、パーキンタンパク質は、配列番号814のアミノ酸配列を有し得る。
【００９５】
本発明の別の実施形態では、パーキンタンパク質は、配列番号815のポリヌクレオチド配列によりコードされ得る。
【００９６】
iCPパーキン組換えタンパク質を、特定の細胞、組織又は臓器に送達することを意図する場合は、パーキンタンパク質は、特定の細胞、組織若しくは臓器上で特異的に発現する受容体に選択的に結合することが可能なリガンドの細胞外ドメイン、又は受容体若しくはリガンドに特異的に結合することが可能なモノクローナル抗体(mAb);並びにそれらの改変された形態と一緒になって、融合産物を形成することができる。
【００９７】
ヌクレオチドレベルにおける、発現ベクターを使用するクローニング技法による間接的な連結、又はペプチドと生物学的に活性な物質との化学的若しくは物理的な共有結合若しくは非共有結合を介する直接的な連結のいずれかによって、ペプチドと生物学的に活性な物質との結合を形成することができる。
【００９８】
本発明のさらに別の実施形態では、パーキンタンパク質は、好ましくは、細胞、組織又は臓器の受容体に選択的に結合するリガンドをさらに含むことができる。
【００９９】
本発明の一実施形態では、aMTDは、配列番号1〜240からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し得る。aMTDは、好ましくは、配列番号74のaMTD321又は配列番号122のaMTD524、より好ましくは、配列番号122のaMTD524であり得る。
【０１００】
本発明のさらに別の実施形態では、aMTDは、配列番号241〜480からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列によりコードされ得る。aMTDは、好ましくは、配列番号314のポリヌクレオチド配列によりコードされるaMTD321又は配列番号362のポリヌクレオチド配列によりコードされるaMTD524、より好ましくは、配列番号362のポリヌクレオチド配列によりコードされるaMTD524であり得る。
【０１０１】
本発明のさらに別の実施形態では、SDは、配列番号798、799、800、801、802、803及び804からなる群から独立に選択されるアミノ酸配列を有し得る。SDは、好ましくは、配列番号798のSDA、配列番号799のSDB又は配列番号804のSDB'、より好ましくは、優れた構造安定性を有する配列番号799のSDB、又はSDBのアミノ酸配列の改変を有して、in vivoにおける適用時に免疫応答を回避する配列番号804のSDB'であり得る。SDB中のアミノ酸配列の改変は、SDBのアミノ酸配列(配列番号799)の28位に対応するアミノ酸残基バリンのロイシンによる交換であり得る。
【０１０２】
本発明のさらに別の実施形態では、SDは、配列番号805、806、807、808、809、810及び811からなる群から独立に選択されるポリヌクレオチド配列によりコードされ得る。SDは、好ましくは、配列番号805のポリヌクレオチド配列によりコードされるSDA、配列番号806のポリヌクレオチド配列によりコードされるSDB、又は配列番号811のポリヌクレオチド配列によりコードされる、免疫回避(deimmunization)のためのSDB'、より好ましくは、配列番号806のポリヌクレオチド配列によりコードされ、優れた構造安定性を有するSDB、又は配列番号811のポリヌクレオチド配列によりコードされ、SDBのポリヌクレオチド配列の改変を有して、in vivoにおける適用時に免疫応答を回避するSDB'であり得る。
【０１０３】
パーキンタンパク質は、細胞内への又はin-vivoでの送達により、生理学的現象に関連する活性又は治療目的に関連する活性を示すことができる。組換え発現ベクターは、組換えタンパク質を精製するのを容易にするタグ配列、例えば、連続的なヒスチジンコドン、マルトース結合性タンパク質のコドン、Mycコドン等を含むことができ、組換えタンパク質の溶解性を増強する融合パートナー等をさらに含むことができる。さらに、それぞれの遺伝子がコードする組換えタンパク質の全体的な構造及び機能の安定性又はタンパク質の柔軟性のために、組換え発現ベクターは、グリシン、プロリン、及びAAYアミノ酸を含めた、スペーサーのアミノ酸の配列、又はポリヌクレオチド配列の1つ以上をさらに含むこともできる。さらに、組換え発現ベクターは、組換えタンパク質の不必要な領域を除去するために酵素により特異的に消化される配列、発現調節配列、及び細胞内への送達を確認するためのマーカー又はレポーターの遺伝子配列も含むことができるが、これらに限定されない。
【０１０４】
本発明のさらに別の実施形態では、iCPパーキン組換えタンパク質は、好ましくは、その一方の末端に、さらに融合させたヒスチジンタグ親和性ドメインを有し得る。
【０１０５】
本発明のさらに別の実施形態では、ヒスチジンタグ親和性ドメインは、配列番号812のアミノ酸配列を有し得る。
【０１０６】
本発明のさらに別の実施形態では、ヒスチジンタグ親和性ドメインは、配列番号813のポリヌクレオチド配列によりコードされ得る。
【０１０７】
本発明のさらに別の実施形態では、融合は、ペプチド結合又は化学的な結合を介して形成することができる。
【０１０８】
化学的な結合は、好ましくは、ジスルフィド結合、ジアミン結合、スルフィド-アミンの結合、カルボキシル-アミンの結合、エステル結合及び共有結合からなる群から選択することができる。
【０１０９】
本発明のさらに別の実施形態では、iCPパーキン組換えタンパク質は、パーキンソン関連疾患の治療又は予防のために使用することができる。
【０１１０】
本発明のさらに別の態様は、iCPパーキンをコードするポリヌクレオチド配列を提供する。
【０１１１】
本発明の一実施形態によれば、ポリヌクレオチド配列は、配列番号816又は配列番号822により示されるポリヌクレオチド配列であり得る。
【０１１２】
本発明の別の実施形態によれば、ポリヌクレオチド配列は、SDとさらに融合させることができ、配列番号818、824、828、830及び832からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列により示すことができる。
【０１１３】
本発明のさらに別の実施形態によれば、ポリヌクレオチド配列は、ヒスチジンタグ親和性ドメインと融合させることができ、配列番号820又は配列番号826のポリヌクレオチド配列であり得る。
【０１１４】
好ましくは、本発明のiCPパーキン組換えタンパク質は、配列番号:817、819、821、823、825、827、829及び831からなる群から選択されるアミノ酸配列で構成することができる。
【０１１５】
本発明のさらに別の態様は、ポリヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターを提供する。
【０１１６】
好ましくは、ベクターは、宿主細胞中に挿入し、宿主細胞のゲノムと組み換えることができ、又はベクターは、エピソームとして自発的に複製するのにコンピテントなヌクレオチド配列を含む任意の核酸を指す。そのようなベクターとして、線状の核酸、プラスミド、ファージミド、コスミド、RNAベクター、ウイルスベクター等を挙げることができる。
【０１１７】
好ましくは、ベクターを遺伝子工学的に作製して、組換えタンパク質をコードする核酸配列を、正確なリーディングフレーム中に、目的のペプチド、ポリペプチド、タンパク質ドメイン又は完全長タンパク質をコードする核酸配列に対してN-末端及び/又はC-末端に配置して組み込むことができ、それにより、aMTDと、パーキンタンパク質と、好ましくは、SDとからなる組換えタンパク質を発現することができる。発現ベクターは、原核生物又は真核生物の発現系において使用するための容易に入手可能なものから選択することができる。
【０１１８】
組換え核酸の標準的な方法を使用して、遺伝子工学的に作製する組換えタンパク質を発現させることができる。本発明の組換えタンパク質をコードする核酸配列を、例えば、適切なシグナル配列及びプロセシング配列並びに転写及び翻訳のための調節配列と共に、核酸発現ベクター中にクローニングしてもよく、タンパク質を、自動化された有機合成の方法を使用して合成してもよい。タンパク質を生成する合成方法は、例えば、文献[Methods in Enzymology、Volume 289: Solid-Phase Peptide Synthesis、Gregg B. Fields編、Sidney P. Colowick、Melvin I. Simon編、Academic Press (1997)]に記載されている。
【０１１９】
クローニングされる遺伝子又は核酸、例えば、本発明の組換えタンパク質をコードするcDNAの高いレベルの発現を得るために、組換えタンパク質配列は典型的には、転写を導くための強力なプロモーター、転写/翻訳ターミネーター、及びタンパク質をコードする核酸の場合の、翻訳を開始するためのリボゾーム結合部位を含む発現ベクター中にサブクローニングすることができる。適切な細菌性プロモーターが、当技術分野で周知であり、例えば、文献[Sambrook及びRussell、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3d Edition、Cold Spring Harbor Laboratory、N.Y.(2001);並びにAusubelら、Current Protocols in Molecular Biology、Greene Publishing Associates and Wiley Interscience、N.Y.(1989)]に記載されている。本発明の組換えタンパク質の発現のための細菌性の発現系は、例えば、大腸菌(Escherichia coli)、バチルス属の菌種及びサルモネラから入手可能である(Palvaら、Gene 22: 229〜235 (1983);Mosbachら、Nature 302: 543〜545 (1983))。そのような発現系のためのキットが市販されている。哺乳動物細胞、酵母及び昆虫細胞のための真核生物の発現系が当技術分野で周知であり、また、これらも市販されている。真核生物の発現ベクターは、好ましくは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター又はレトロウイルスベクターであり得る。
【０１２０】
一般に、カーゴタンパク質、すなわち、パーキンタンパク質が、aMTDのN-末端、C-末端又は両方の末端に付着している本発明の細胞透過性組換えタンパク質を発現させるための発現ベクターは、進化型巨大分子導入ドメインをコードする配列に作動可能に付着している、例えば、プロモーターを含めた、調節配列を含むことができる。使用することができる誘導性プロモーターの非限定的な例えばステロイドホルモン応答性プロモーター(例えば、エクダイソン応答性プロモーター、エストロゲン応答性プロモーター及び糖質コルチコイド応答性プロモーター)、テトラサイクリンの「Tet-On」及び「Tet-Off」の系、並びに金属応答性プロモーターが挙げられる。
【０１２１】
組換えタンパク質を、適切な宿主細胞、例えば、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞又は組織培養細胞内に導入することができる。また、組換えタンパク質は、トランスジェニック生物を生成するために、胚性幹細胞内に導入することもできる。本発明の組換えタンパク質を生成するための多数の適切なベクター及びプロモーターが、当業者に公知であり、市販されている。
【０１２２】
公知の方法を使用して、本発明のポリヌクレオチド配列及び転写/翻訳を制御する適切なシグナルを含むベクターを構築することができる。これらの方法は、in vitroでの組換えDNAの技法、合成の技法、及びin vivoでの組換え/遺伝子組換えを含む。例えば、これらの技法は、文献[Sambrook及びRussell、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3d Edition、Cold Spring Harbor Laboratory、N.Y.(2001);並びにAusubelら、Current Protocols in Molecular Biology、Greene Publishing Associates and Wiley Interscience、N.Y.(1989)]に記載されている。
【０１２３】
本発明のさらに別の態様は、組換え発現ベクターを用いて形質転換された形質転換体を提供する。
【０１２４】
形質転換は、トランスフェクションを含み、それによって、外来(細胞外)DNAを、付随する材料の有無にかかわらず、宿主細胞内に進入させるプロセスを指す。「トランスフェクトされた細胞」は、その中に外来DNAが導入されている細胞を指し、したがって、当該細胞は、外来DNAをもつ。DNAは、細胞内に導入され得、それにより、その核酸が、染色体内に統合され得るか、又は染色体外エレメントとして複製可能であり得る。外来DNA等が導入された細胞は、形質転換体と呼ばれる。
【０１２５】
本明細書で使用する場合、細胞内にタンパク質、ペプチド、有機化合物を「導入する(introducing)」は、「運ぶ」、「浸透させる」、「輸送する」、「送達する」、「透過させる」又は「通過させる」という表現と交換可能に使用することができる。
【０１２６】
宿主細胞は、その中に1つ以上のDNA又はベクターが導入される真核生物又は原核細胞を指し、特定の対象の細胞のみならず、また、子孫又は潜在的な子孫も指すことが理解される。ある特定の改変が、後代において、突然変異又は環境的な影響のいずれかに起因して生じる場合があることから、そのような子孫は、実際には親細胞と同一でないことがあるが、本明細書で使用する場合には依然として、この用語の範囲のうちに含まれる。
【０１２７】
宿主細胞は、好ましくは、細菌細胞であり得、細菌細胞としては、原則として、制限はない。宿主細胞は、遺伝子操作して、目的の遺伝子の挿入、好ましくは、部位特異的な統合を行うことが可能である限り、真正細菌類(グラム陽性若しくはグラム陰性)、又は古細菌であってよく、製造規模で培養することができる。好ましくは、宿主細胞は、高い細胞密度まで培養することを可能にする特性を有し得る。
【０１２８】
組換えタンパク質の調製において使用することができる細菌性の宿主細胞の例は、大腸菌(Lee、1996;Hannig及びMakrides、1998)、枯草菌(Bacillus subtilis)、蛍光菌(Pseudomonas fluorescens)(Squiresら、2004;Retallackら、2006)、並びにコリネバクテリウム属の多様な細菌(US2006/0003404A1)、並びにラクチス乳酸菌(Lactococcus lactis)(Mierauら、2005)の株である。好ましくは、宿主細胞は、大腸菌細胞である。
【０１２９】
より好ましくは、宿主細胞は、目的の遺伝子を調節するプロモーターに結合することが可能なRNAポリメラーゼを含むことができる。RNAポリメラーゼは、宿主細胞にとって、内因性であっても、又は外因性であってもよい。
【０１３０】
好ましくは、外来の強力なRNAポリメラーゼを有する宿主細胞を使用することができる。例えば、宿主細胞のゲノム中に統合されて、外来のRNAポリメラーゼを担持するように工学的に作製された大腸菌株(例えば、いわゆる「T7株」において、T7プロモーターを使用する場合のT7様RNAポリメラーゼ等)を使用することができる。T7株の例、例えば、BL21(DE3)、HMS174(DE3)、及びそれらの誘導株又は近縁株(Novagen、pET System manual, 11th editionを参照されたい)を広く使用することができ、これらは、市販されている場合がある。好ましくは、BL21-CodonPlus (DE3)-RIL、又はBL21-CodonPlus (DE3)-RIPL(Agilent Technologies)を使用することができる。これらの株は、lacUV5プロモーターの制御下にあるT7 RNAポリメラーゼ遺伝子を含有するDE3溶原菌である。IPTGを用いる誘発により、T7 RNAポリメラーゼの生成が可能になり、次いで、これが、目的の遺伝子の発現を、T7プロモーターの制御下で導く。
【０１３１】
宿主細胞株である大腸菌のBL21(DE3)又はHMS174(DE3)は、それらのゲノムに基づくT7 RNAポリメラーゼを、ファージDE3を介して受容するに至っており、溶原性である。宿主細胞中に含有されるT7 RNAポリメラーゼは、宿主細胞のゲノム中への残余のファージ配列の挿入を回避する、又は好ましくは、除外する方法により統合されていることが好ましい;その理由は、溶原性の株は、溶解特性を示す可能性があり、望ましくないファージの放出及び細胞の溶解をもたらす欠点を有するからである。
【０１３２】
本発明のさらに別の態様は、iCPパーキン組換えタンパク質の調製方法であって、組換え発現ベクターを調製するステップと、組換え発現ベクターを使用して、形質転換体を調製するステップと、形質転換体を培養するステップと、培養のステップにより発現した組換えタンパク質を回収するステップとを含む調製方法を提供する。
【０１３３】
培養のステップは、好ましくは、補給培地の添加を利用するモードにおいて行うことができ、このモードは、流加モード、半連続モード又は連続モードから選択され;発現のための細菌性の宿主細胞は、宿主細胞のゲノム中に統合されたDNA構築物を含むことができ、前記タンパク質の発現を可能にするプロモーターの制御下で目的のタンパク質をコードするDNA配列を担持する。
【０１３４】
培地のタイプに制限はない。培地は、半規定培地、すなわち、複雑な培地化合物(例えば、酵母抽出物、大豆ペプトン、カザミノ酸)を含有する培地であっても、又はいずれの複雑な化合物も有さない、化学的に定義された培地であってもよい。好ましくは、限定培地を使用することができる。規定培地(最小培地又は合成培地ともまた呼ばれる)はもっぱら、化学的に定義された物質、すなわち、炭素供給源、例えばグルコース又はグリセロール;塩;ビタミン;及び株が栄養素要求性である可能性がある観点から、特定のアミノ酸又はその他の物質、例えばチアミンで構成される。最も好ましくは、グルコースを、炭素供給源として使用することができる。通常、補給培地の炭素供給源は、成長を制限する構成成分として働き、特定の成長速度を制御する。
【０１３５】
凍結融解のサイクルの実施、超音波処理、機械的な破壊、又は細胞溶解剤の使用を含めた、いずれの好都合な方法によっても、宿主細胞を破壊することができる。文献[Scopes、Protein Purification: Principles and Practice、New York: Springer-Verlag (1994)]が、組換え(及び非組換え)のタンパク質を精製するためのいくつかの一般的な方法を記載している。これらの方法として、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、分子ふるいクロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、選択的沈殿、透析及び疎水性相互作用クロマトグラフィーを挙げることができる。これらの方法を、細胞透過性組換えタンパク質のための精製の戦略を考案するために適合させることができる。細胞透過性組換えタンパク質が、精製のためのハンドル、例えばエピトープタグ又は金属キレート化配列を含む場合には、親和性クロマトグラフィーを使用して、タンパク質を容易に精製することができる。
【０１３６】
進化型巨大分子導入ドメインを、直接的に(例えば、ウエスタン分析を使用して)か、又は間接的に(例えば、細胞に由来する材料を、特定のDNA結合活性について、アッセイすること、例えば電気泳動移動度シフトアッセイにより)検出することによって、生成したタンパク質の量を評価することができる。精製の前、精製の任意の段階の間、又は精製の後に、タンパク質を検出することができる。いくつかの実行形態では、精製も完全な精製も必要でない場合がある。
【０１３７】
本発明の方法により調製する、遺伝子工学的に作製する組換えタンパク質は、細胞透過性タンパク質であり、特に、死滅させたか又は減弱化した全生物ワクチンが実現困難である場合に、タンパク質に基づくワクチンとして使用することができる。
【０１３８】
本発明の方法により調製する細胞透過性組換えタンパク質は、好ましくは、パーキンソン関連疾患の予防又は治療のために使用することができる。細胞透過性組換えタンパク質を、細胞の内側に送達することができ、これにより組換えベクターを用いて、細胞をトランスフェクト又は形質転換する必要性が排除される。本発明の細胞透過性組換えタンパク質をin vitroで使用して、タンパク質の機能を検討することができ、又は本発明の細胞透過性組換えタンパク質を使用して、所望の状況において細胞を維持することができる。
【０１３９】
本発明のさらに別の態様は、iCPパーキン組換えタンパク質を活性成分として含む組成物を提供する。
【０１４０】
本発明のさらに別の態様は、活性成分としてのiCPパーキン組換えタンパク質、及び薬学的に許容できる担体を含む、パーキンソン病を治療又は予防するための医薬組成物を提供する。
【０１４１】
好ましくは、組成物は、(例えば、腹腔内、静脈内及び動脈内等への)注射用の組成物であり得、ヒトについては、活性成分を、0.01mg/kg〜30mg/kg、好ましくは、0.1mg/kg〜10mg/kg、より好ましくは、0.1mg/kg〜6mg/kgの量で含むことができる。
【０１４２】
例えば、1日当たりの投与量は通例、約0.01〜約30mg/kg体重の範囲に収まる。成人ヒトを治療する場合には、約0.1〜約6mg/kg/日の範囲で、単回又は複数回投与するのが、とりわけ好ましい。しかし、実際に投与するiCP-パーキン組換えタンパク質の濃度は、治療しようとする状態、選ばれた投与経路、個々の患者の年齢、体重及び応答、並びに患者の症状の重症度を含めた、関連する状況の観点から、医師が決定することが理解されるであろう;したがって、いかなる場合であっても、上記の投与量の範囲により、本発明の範囲を限定する意図はない。上記の範囲の下限未満の投与量レベルが十分以上であり得る一方、より高い用量が、最初、いくつかのより低い用量に分けて、1日かけて投与する限り、さらにより高い用量を、いずれの有害な副作用も引き起こさず利用し得る
【０１４３】
本発明のさらに別の態様は、パーキンソン関連疾患を治療又は予防するための医薬品としての、細胞透過性が改善された(iCP)パーキン組換えタンパク質の使用を提供する。
【０１４４】
本発明のさらに別の態様は、iCPパーキン組換えタンパク質を含む医薬品を提供する。
【０１４５】
本発明のさらに別の態様は、パーキンソン関連疾患を治療又は予防するための医薬品の調製ための、iCPパーキン組換えタンパク質の使用を提供する。
【０１４６】
本発明のさらに別の態様は、対象においてパーキンソン関連疾患を治療又は予防する方法であって、パーキンソン関連疾患の治療又は予防を必要とする対象を同定するステップと、治療有効量のiCPパーキン組換えタンパク質を対象に投与するステップとを含む方法を提供する。
【０１４７】
本発明の一実施形態では、対象は、好ましくは、哺乳動物であり得る。
【０１４８】
活性成分に加えて、薬学的に適切なかつ生理的に許容できる添加剤を使用することによって、本発明の医薬組成物を調製することができ、添加剤は、賦形剤、崩壊剤、甘味剤、結合剤、コーティング剤、発泡剤、滑沢剤、流動促進剤、矯味矯臭剤等を含むことができる。
【０１４９】
投与のためには、医薬組成物は、好ましくは、上記に記載した活性成分に加えて、1つ以上の薬学的に許容できる担体をさらに含めることによって製剤化することができる。
【０１５０】
医薬組成物の投与剤型は、顆粒剤、散剤、錠剤、被覆錠剤、カプセル剤、坐剤、液体製剤、シロップ剤、ジュース、懸濁剤、乳剤、滴下剤、注射用液体製剤等を含むことができる。組成物を錠剤又はカプセル剤に製剤化するためには、例えば、活性成分を、任意の経口用、無毒性の薬学的に許容できる不活性な担体、例えばエタノール、グリセロール、水等と組み合わせることができる。所望により又は必要であれば、適切な結合剤、滑沢剤、崩壊剤及び着色剤を、混合物としてさらに含めることもできる。
【０１５１】
適切な結合剤の例えばこれらに限定されないが、デンプン、ゼラチン、グルコース又はベータ-ラクトース等の天然の糖、トウモロコシ甘味剤、アカシア、トラガント等の天然及び合成のガム、又はオレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム等を挙げることができる。崩壊剤の例えばこれらに限定されないが、デンプン、メチルセルロース、寒天、ベントナイト、キサンタンガム等を挙げることができる。組成物を液体調製物に製剤化するためには、無菌のかつ生体適合性である薬学的に許容できる担体、例えば生理食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝生理食塩水、アルブミン注入用溶液、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール及びエタノールを使用することができ、これらの材料は、単独又はそれらの任意の組合せで使用することができる。必要であれば、その他の一般的な添加剤、例えば抗酸化剤、緩衝液、静菌剤等を添加することもできる。さらに、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤及び滑沢剤もさらに添加して、注射用製剤、例えば水溶液、懸濁剤及び乳剤、又は丸剤、カプセル剤、顆粒剤若しくは錠剤を調製することもできる。さらに、好ましくは、疾患及び成分に応じて、Remington's Pharmaceutical Science、Mack Publishing Company、Easton PAに開示されているような当技術分野で公知の任意の適切な方法を使用して、組成物を製剤化することもできる。
【０１５２】
好ましくは、治療(treatment)又は治療する(treating)は、対象の状態若しくは疾患の改善若しくは安定化、又は対象の状態若しくは疾患と関連がある症状の発生若しくは悪化の予防若しくは緩和を行うことを意味する。
【０１５３】
患者が、パーキンソン病(PD)に罹患しているか又はそれに罹患するリスクを有すると診断する方法は、当技術分野で周知である。組み合わせて使用して、パーキンソン病を診断する多様な症状及び診断テストがある。神経内科医がPDの診断を検討するためには、4つの主要な症状のうちの少なくとも2つが、一定期間にわたり出現しなければならない。PDの4つの主要な運動症状は、振とう又は震え;動作緩慢と呼ばれる、動きが緩慢であること;腕、脚又は体幹の凝り（stiffness）又は硬直（rigidity）;並びに姿勢の不安定性ともまた呼ばれる、バランスに関する困難及び転倒の可能性である。対象の症状、活動、投薬、併発している医学的な問題、又は毒性への曝露の可能性の精査もまた、PDの診断に有用であり得る。
【０１５４】
予防(prevention)、発症予防(prophylaxis)及び予防的治療(preventive treatment)は、本明細書では、同義語として使用する。これらは、特に、パーキンソン病の運動症状及び/又はさらに、ドーパミン作動性ニューロンの、特に、黒質における喪失の発生又はその顕著な程度を予防するか又は遅延させるために、上記に記載したパーキンソン病の4つの最も重要な症状のうちの少なくとも2つが、初期状態としてのみならず、部分的にも出現している個体に、薬物を投与することを含む。
【０１５５】
対象及び患者は、本明細書では、交換可能に使用する。対象は、疾患又は障害(例えば、PD)に罹患する恐れがあるか又は罹患しやすいが、そうした疾患又は障害を有していてもよく又はそうでなくてもよいヒト、又は別の哺乳動物(例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ若しくは霊長類)を指す。ある特定の実施形態では、対象はヒトである。
【０１５６】
好ましくは、効果を示す量又は有効量は、本明細書に開示する活性成分又は医薬組成物の量であって、疾患を治療するために対象に投与する場合に、疾患のそのような治療をもたらすのに十分である量である。患者の改善はいずれも、治療の十分な達成であるとみなされる。パーキンソン病を治療するために使用する、本明細書に開示する活性成分又は医薬組成物の有効量は、投与の様式、患者の年齢、体重及び全身健康状態に応じて変化させることができる。最終的には、処方者又は研究者が、適切な量及び投与レジメンを決める。
【０１５７】
本発明の治療又は予防の方法においては、iCPパーキン組換えタンパク質を活性成分として含む組成物を、経口、頬側、直腸、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、胸骨内、経皮、外用、眼内又は皮下経路、より好ましくは、腹腔内、静脈内又は動脈内注射経路を介する一般的な様式で投与することができる。
【発明の効果】
【０１５８】
本発明は、制限された多様性、及び予測不可能な細胞透過性のような、先行技術(MTM/MTS/MTD)の制限を克服する、重大な因子(CF)に基づく人工的に構築されたaMTD配列を提供する。細胞透過性を保証するCFに基づき、aMTDは、生物学的に活性な巨大分子を生きた細胞に送達するその先行技術と比較して、最大109.9の相対的倍数増強された能力を有するこれらの配列を提示する。それ故、本発明により、分子送達、薬物送達、タンパク質療法、細胞内タンパク質療法、タンパク質置換療法、ペプチド療法、遺伝子送達などにおいてそれらの実質的に有効な適用が可能になるだろう。
【０１５９】
aMTD/SD融合パーキン組換えタンパク質は、溶解性及び収率が増強されており、大量に生成することができるであろう。さらに、組換えタンパク質の有効なBBB透過性により、これまでに開発された抗神経変性治療の欠点も克服される。したがって、本発明、すなわち、組換えiCP-パーキンタンパク質を、実際に適用して、パーキンソン関連疾患を効率的に治療することが可能になるであろう。
【０１６０】
しかし、本発明の効果は、上記に言及した効果に限定されず、以下の説明から、言及されていない別の効果が当業者には明確に理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１６１】
【図１】aMTD又はrペプチド融合組換えタンパク質の構造を示す図である。Hisタグ付けされたCRA組換えタンパク質の模式図が説明され、本発明により構築される。親和性精製のためのhisタグ(白色)、aMTD又はrペプチド(灰色)、及びカーゴA(CRA、黒色)が示される。
【図２ａ】aMTD-又はrペプチド融合組換えタンパク質のための発現ベクターの構築を示す図である。これらの図は、本発明による、pET28a(+)ベクターにクローニングされたaMTD又はrペプチド融合CRAをコードする645bpの挿入物におけるプラスミドDNAフラグメントを示すアガロースゲル電気泳動分析を示す。
【図２ｂ】図２ａの続きである。
【図２ｃ】図２ａの続きである。
【図３ａ】aMTD-又はrペプチド融合組換えタンパク質の誘導可能な発現を示す図である。発現された組換えaMTD-又はランダムペプチド融合CRA組換えタンパク質は、大腸菌(E. coli)BL21(DE3)株に形質転換された。IPTGでの誘導前(-)及び後(+)の大腸菌における組換えタンパク質の発現は、SDS-PAGEによりモニターされ、クーマシーブルーで染色された。
【図３ｂ】図３aの続きである。
【図３ｃ】図３aの続きである。
【図３ｄ】図３aの続きである。
【図４ａ】aMTD-又はrペプチド融合組換えタンパク質の精製を示す図である。発現された組換えタンパク質は、天然条件下でのNi2+アフィニティークロマトグラフィーにより精製された。組換えタンパク質の精製は、SDS-PAGE分析を介して提示した。
【図４ｂ】図４aの続きである。
【図５ａ】aMTDにより媒介される細胞透過性の決定を示す図である。陰性対照(A:rP38)及び参照疎水性CPP(MTM12及びMTD85)の細胞透過性が示される。それぞれのaMTD及び/又はrペプチドの細胞透過性は、ペプチド配列を欠くカーゴタンパク質(HCA)のものと視覚的に比較される。灰色の斜線領域は、未処置のRAW264.7細胞(ビヒクル)を表し、細い明るい灰色の線は、等しいモル濃度のFITCで処理された細胞(FITCのみ)を表し、暗い太い線は、FITC-hisタグ付けされたCRAタンパク質で処理された細胞(HCA)を示し、陰性対照(rP38)、参照CPP(MTM12又はMTD85)、又は新規疎水性CPP(aMTD)に融合された、FITC-タンパク質で処理された細胞(HMCA)は、明るい太い線で示され、矢印により示される。
【図５ｂ】図５aの続きである。
【図５ｃ】図５aの続きである。
【図５ｄ】図５aの続きである。
【図５ｅ】図５aの続きである。
【図５ｆ】図５aの続きである。
【図５ｇ】図５aの続きである。
【図５ｈ】図５aの続きである。
【図５ｉ】図５aの続きである。
【図５ｊ】図５aの続きである。
【図５ｋ】図５aの続きである。
【図５ｌ】図５aの続きである。
【図５ｍ】図５aの続きである。
【図５ｎ】図５aの続きである。
【図５ｏ】図５aの続きである。
【図５ｐ】図５aの続きである。
【図５ｑ】図５aの続きである。
【図５ｒ】図５aの続きである。
【図５ｓ】図５aの続きである。
【図５ｔ】図５aの続きである。
【図５ｕ】図５aの続きである。
【図６ａ】rペプチドにより媒介される細胞透過性の決定を示す図である。それぞれのaMTD及び/又はrペプチドの細胞透過性は、ペプチド配列を欠くカーゴタンパク質(HCA)のものと視覚的に比較される。灰色の斜線領域は、未処置のRAW264.7細胞(ビヒクル)を表し、細い明るい灰色の線は、等しいモル濃度のFITCで処理された細胞(FITCのみ)を表し、暗い太い線は、FITC-hisタグ付けされたCRAタンパク質で処理された細胞(HCA)を示し、rペプチドに融合された、FITC-タンパク質で処理された細胞は、明るい太い線で示され、矢印により示される。
【図６ｂ】図６aの続きである。
【図６ｃ】図６aの続きである。
【図７ａ】aMTDに融合された組換えタンパク質の視覚化された細胞透過性を示す図である。NIH3T3細胞は、aMTDに融合された、FITC標識されたタンパク質(10μM)で1時間、37℃にて処理された。タンパク質の細胞透過性は、レーザー走査型共焦点顕微鏡(LSM700バージョン)により視覚化された。
【図７ｂ】図７aの続きである。
【図７ｃ】図７aの続きである。
【図７ｄ】図７aの続きである。
【図７ｅ】図７aの続きである。
【図７ｆ】図７aの続きである。
【図７ｇ】図７aの続きである。
【図７ｈ】図７aの続きである。
【図７ｉ】図７aの続きである。
【図７ｊ】図７aの続きである。
【図７ｋ】図７aの続きである。
【図８】rペプチドに融合された組換えタンパク質の視覚化された細胞透過性を示す図である。rペプチドに融合された組換えタンパク質の細胞透過性は、レーザー走査型共焦点顕微鏡(LSM700バージョン)により視覚化された。
【図９ａ】陰性対照(rP38)と比較した、aMTDに融合された組換えタンパク質の相対的細胞透過性を示す図である。図は、aMTD及び陰性対照(A:rP38)に融合された組換えタンパク質の細胞透過性を比較するグラフを示す。
【図９ｂ】図９aの続きである。
【図９ｃ】図９aの続きである。
【図１０ａ】参照CPP(MTM12)と比較した、aMTDに融合された組換えタンパク質の相対的細胞透過性を示す図である。図は、aMTD及び参照CPP(MTM12)に融合された組換えタンパク質の細胞透過性を比較するグラフを示す。
【図１０ｂ】図１０aの続きである。
【図１０ｃ】図１０aの続きである。
【図１１ａ】参照CPP(MTD85)と比較した、aMTDに融合された組換えタンパク質の相対的細胞透過性を示す図である。図は、aMTD及び参照CPP(MTD85)に融合された、組換えタンパク質の細胞透過性を比較するグラフを示す。
【図１１ｂ】図１１aの続きである。
【図１１ｃ】図１１aの続きである。
【図１２】aMTDの平均のものと比較した、rペプチドにより媒介される組換えタンパク質の相対的細胞透過性を示す図である。図は、rペプチドに融合された組換えタンパク質の細胞透過性とaMTDのもの(平均値:aMTD AVE)を比較するグラフを示す。
【図１３ａ】aMTD配列における細胞透過性のアミノ酸組成との関連を示す図である。これらのグラフは、アミノ酸組成(A、I、V、及びL)で影響される、aMTDの送達ポテンシャル(幾何平均)を提示する。
【図１３ｂ】図１３aの続きである。
【図１４ａ】aMTDにおける細胞透過性の重大な因子との関連を示す図である。これらのグラフは、細胞透過性の重大な因子[変角ポテンシャル:プロリン位置(PP)、硬性/柔軟性:不安定指数(II)、構造特性:脂肪族指数(AI)及びヒドロパシー:ヒドロパシーの全平均(GRAVY)]との関連を示す。
【図１４ｂ】図１４aの続きである。
【図１５ａ】aMTDにより媒介される細胞透過性の重大な因子との相対的関連性(relative relevance)を示す図である。それらの送達ポテンシャルにおいて10高く及び10低くランク付けされたaMTDの細胞透過性は、重大な因子[変角ポテンシャル:プロリン位置(PP)、硬性/柔軟性:不安定指数(II)、構造特性:脂肪族指数(AI)及びヒドロパシー:ヒドロパシーの全平均(GRAVY)]とのそれらの関連について調べた。
【図１５ｂ】図１５aの続きである。
【図１６】rペプチドにより媒介される細胞透過性のヒドロパシーレンジ(GRAVY)との相対的関連性を示す図である。このグラフ及びチャートは、rペプチドにより媒介される細胞透過性のそのヒドロパシーレンジ(GRAVY)との相対関連性を説明する。
【図１７】His-aMTD/SD融合パーキン組換えタンパク質の概略図である。本発明に従って、細胞透過性を有するHis-aMTD-SD-パーキン組換えタンパク質の概略図を示し、構築した。組換えパーキン融合タンパク質のデザインは、親和性精製のためのヒスチジンタグ(MGSSHHHHHHSSGLVPRGS(配列番号2)、白色)、カーゴ(パーキン、灰色)、aMTD(黒色)、SDA(ドット)、及びSDB(斜線)を含有した。
【図１８】実施例6に従って、pET28a(+)ベクター中にクローニングした、aMTD-SD融合パーキンをコードするプラスミドDNA断片の挿入を示す、アガロースゲル電気泳動による分析を示す図である。
【図１９】実施例7-1に従って、大腸菌中のiCP-パーキン組換えタンパク質の発現、精製及び溶解性/収率を、実施例7-2に従って、パーキン組換えタンパク質の溶解性/収率を示す図である。
【図２０】実施例7-1に従って、大腸菌中のiCP-パーキン組換えタンパク質の発現、精製及び溶解性/収率を、実施例7-2に従って、パーキン組換えタンパク質の溶解性/収率を示す図である。
【図２１】実施例7-2に従って、陰性対照(HP)と比較したaMTD-SD融合パーキン組換えタンパク質(HM321PSA及びHM321PSB)の相対収率を示す図であり(図21a)、陰性対照(HP)と比較したSDB融合パーキン組換えタンパク質(HPSB)を示す図である(図21b)。
【図２２】実施例7-2に従って、多様なaMTDにより調製したaMTD-SD融合パーキン組換えタンパク質の溶解性/収率、透過性及び生物学的活性を示す図である。
【図２３】実施例9に従って、陰性対照(rP38)並びにこれまでに開発したCPP(MTM12及びMTD85)と比較した、aMTD321が媒介する細胞透過性を示す図である。灰色の網掛け領域は、未処置のRAW264.7細胞(ビヒクル)を示し;線はそれぞれ、左から、FITC融合細胞(FITCのみ);FITC標識化を有するSDAと融合させたヒスチジン(HSA);並びにヒスチジンタグ付きCPP(MTM12、MTM85及びaMTD321)組換えタンパク質(HMSA)を示す。
【図２４】実施例10に従って、aMTDが媒介する細胞内局在化を示す図である。
【図２５】実施例11-1に従って、PBMC中でのHM321PSBのin vivoにおける細胞の取込みを示す図である(上:IPの15分後;下:IPの30分後)。
【図２６】実施例11-2に従って、aMTDが媒介するパーキン組換えタンパク質の細胞透過性の決定を示す図である。
【図２７】実施例12に従って、パーキン組換えタンパク質のin vivoにおける組織分布を示す図である。
【図２８ａ】実施例13に従って、aMTDが媒介するパーキン組換えタンパク質の脳への送達を、ウエスタンブロット分析により決定した図である(図28a)。
【図２８ｂ】図２８ａの続きである。
【図２８ｃ】図２８ａの続きである。
【図２９】実施例13に従って、aMTDが媒介するパーキン組換えタンパク質の脳への送達を、免疫ブロット分析により決定した図である(図29)。
【図３０】実施例14-1に従って、aMTDが媒介するパーキン組換えタンパク質のユビキチン化及び自己ユビキチン化の活性を示す図である。
【図３１】実施例14-2に従って、ドーパミン作動性のCATH.a細胞(図31)並びにSH-SY5Y細胞(図32a及び図32b)におけるアポトーシスの阻害を示す図である。顕微鏡写真は、3回の独立した実験の代表例であり、結果を、平均±S.D.としてプロットした(下)。スチューデントの対応のある2標本t検定により、群間の実験の差を評価した(*p、0.05)。
【図３２ａ】実施例14-2に従って、ドーパミン作動性のCATH.a細胞(図31)並びにSH-SY5Y細胞(図32a及び図32b)におけるアポトーシスの阻害を示す図である。顕微鏡写真は、3回の独立した実験の代表例であり、結果を、平均±S.D.としてプロットした(下)。スチューデントの対応のある2標本t検定により、群間の実験の差を評価した(*p、0.05)。
【図３２ｂ】図３２ａの続きである。
【図３３】実施例14-3に従って、パーキン組換えタンパク質によるα-シヌクレイン凝集体の分解を示す図である。
【図３４】実施例15に従って、MPTP誘発PDマウスモデルのプロトコールを示す図である。
【図３５】実施例16に従って、パーキン組換えタンパク質を用いて処置したMPTP誘発PDマウスにおける尿中のドーパミンを示す図である。
【図３６】実施例17に従って、組換えタンパク質を用いて処置したMPTP誘発PDマウスにおける脳中のドーパミンを示す図である。
【図３７】実施例18に従って、パーキン組換えタンパク質を用いて処置したMPTPによる病変を有するマウスの全体的な運動機能の保存を示す図である。
【図３８】実施例19-1に従って、歩行運動試験における、足跡のパターンの決定を示す図である。
【図３９】実施例19-1に従って、歩行運動試験における、歩幅の長さの決定を示す図である。
【図４０】実施例19-1に従って、歩行運動試験における、ふらつきの長さの決定を示す図である。
【図４１】実施例19-2に従って、パーキン組換えタンパク質を用いて処置したMPTPによる病変を有するマウスにおける、ロータロッド試験による運動活動の回復を示す図である。
【図４２ａ】実施例20に従って、パーキン組換えタンパク質による、黒質及び線条体中のドーパミン作動性ニューロンを示す図である。
【図４２ｂ】実施例20に従って、パーキン組換えタンパク質による、黒質中のドーパミン作動性ニューロンの回復作用を示す図である。
【図４３】実施例20に従って、亜急性MPTP誘発PDモデルにおける、iCP-パーキン組換えタンパク質によるTH発現の回復を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０１６２】
1.進化型MTDの開発のための「重大な因子」を同定するための参照疎水性CPPの分析
以前に報告されたMTDは、1,500種超のシグナルペプチド配列のスクリーニングから選択された。開発されたMTDは、共通配列又は配列モチーフを有しなかったが、それらは全て、それらの疎水性、及びアルファ-らせん形構造に適合する傾向を除き、共通配列又はモチーフも欠く、シグナル配列の疎水性(H)領域（HRSS）に由来するものであった。H-領域配列における広範なバリエーションは、膜転位活性及びSRP/Sec61機構への続く適合を有するタンパク質についての先行する革新を反映し得、それは、SRPにおけるメチオニンに富むシグナルペプチド結合ポケットを利用して、広範なシグナルペプチド配列を適応させる。
【０１６３】
以前に記載された疎水性CPP(例えば、MTS/MTM、及びMTD)は、分泌及び細胞表面タンパク質のシグナルペプチドに存在する疎水性領域に由来するものであった。先行技術は、第1の、H-領域配列(MTS/MTM)の臨機応変な使用、及び第2の、1,500種のシグナル配列(MTM)のスクリーニングから選択される最大CPP活性を有するH-領域配列(修飾あり及びなし)からなる。第2の先行技術、修飾されたH-領域由来の疎水性CPP配列は、線維芽細胞成長因子(FGF)4に由来するMTS/MTMと異なる、複数の利用可能な配列との多様性において前進した。しかしながら、天然に存在する分泌タンパク質から修飾され得る、MTDの数は、いくらか制限される。なぜなら、それらの細胞透過性を決定する際の一連のルールは存在せず、修飾されたMTD配列の細胞透過性についての予測は、それらを試験する前に成され得なかったからである。
【０１６４】
それらの起源となったシグナルペプチド同様に、疎水性CPPはコンセンサス配列に適合せず、タンパク質カーゴに取り込まれたとき、タンパク質溶解性に対する有害な作用を有した。それ故、本発明者らは、最適な配列及び構造決定因子、すなわち、重大な因子(CF)を同定し、タンパク質溶解性を維持しながら、タンパク質を含む巨大分子カーゴを細胞及び組織に送達する、増強された能力を有する新規の疎水性CPPをデザインしようとした。これらの新たに開発されたCPP、進化型巨大分子伝達ドメイン(aMTD)により、重大な因子に基づき、デザインされ、開発され得る、ほぼ無限の可能性のあるデザインが可能になった。また、それらの細胞透過性は、任意のインビトロ及び/又はインビボ実験を行う前にそれらの特徴分析により推定され得た。以下のこれらの重大な因子は、全ての公開された参照疎水性CPPを分析することにより、開発された。
【０１６５】
1-1.疎水性CPPの分析
1995〜2014年(表2)に公開された17種の異なる疎水性CPP(表1)が、選択された。選択された疎水性CPPの生理学的及び化学的特性が分析された後、細胞透過性と関連し得る11種の異なる特徴が、さらなる分析のため選ばれた。これらの11種の特徴は以下の通りである:配列、アミノ酸長、分子量、pI値、変角ポテンシャル、硬性/柔軟性、構造特性、ヒドロパシー、残基構造、アミノ酸組成、及び配列の二次構造(表3)。
【０１６６】
表1は、選ばれた、公開された疎水性細胞浸透性ペプチドの要約を示す。
【０１６７】
【表１】
0006664464.tif 000009
【０１６８】
表2は、参照情報を要約する。
【０１６９】
【表２】
0006664464.tif 000010
【０１７０】
表3は、分析された、公開された疎水性細胞浸透性ペプチド(A)の特徴を示す。
【０１７１】
【表３】
0006664464.tif 000011
【０１７２】
2種のペプチド/タンパク質分析プログラム(ExPasy: SoSui: http://harrier.nagahama-i-bio.ac.jp/sosui/sosui_submit.html)を使用して、ペプチド配列の様々な指標及び構造特性が決定され、新規配列がデザインされた。以下のものが、分析された重要な因子である。
【０１７３】
1-2.分析されたペプチドの特徴:長さ、分子量、及びpl値
分析されたペプチドの平均の長さ、分子量、及びpI値は、それぞれ、10.8±2.4、1,011±189.6、及び5.6±0.1であった(表4)。
【０１７４】
表4は、分析された、公開された疎水性細胞浸透性ペプチド(A)の重大な因子(CF)を要約する。
【０１７５】
【表４】
0006664464.tif 000012
【０１７６】
1-3.分析されたペプチドの特徴:変角ポテンシャル-プロリン位置(PP)
変角ポテンシャル（bending potential）(変角又は非変角)は、プロリン(P)が存在するかどうかの事実、及び/又は組換えタンパク質中のペプチドに変角ポテンシャルをもたらすアミノ酸が位置する場所に基づき、決定された。プロリンは、その側鎖が、骨格窒素原子並びにアルファ-炭素原子に結合する点で、他の共通のアミノ酸と異なる。得られた環状構造は、折り畳まれたペプチド/タンパク質鎖の変角においてしばしば見られる、タンパク質構造に顕著に影響する。
【０１７７】
17種のうち11種が、プロリンが、ペプチド変角のための配列の中央に存在し、及び/又はタンパク質変角のためのペプチドの末端に位置することを意味する、「変角」ペプチドと決定された。上で示された通り、ペプチド配列は、「屈曲」配置において細胞膜に浸透することができた。それ故、変角又は非変角ポテンシャルは、現在の疎水性CPPの改善のための重大な因子の1つと考えられる。
【０１７８】
1-4.分析されたペプチドの特徴:硬性/柔軟性-不安定指数(II)
任意のペプチドの決定的な構造特性の1つは、モチーフが、硬いか、又は柔軟であるかどうかの事実に基づき、それは、ペプチド配列のインタクトな物理化学的特徴であるので、配列の不安定指数(II)が決定された。ペプチドの硬性/柔軟性を表す指標の値は、極端に変動した(8.9〜79.1)が、平均値は、ペプチドが、いくぶん柔軟であるべきだが、硬く又は柔軟過ぎないことを示唆する、40.1±21.9であった(表3)。
【０１７９】
1-5.分析されたペプチドの特徴:構造特性-構造特性(脂肪族指数:AI)、及びヒドロパシー(ヒドロパシーの全平均:GRAVY)
アラニン(V)、バリン(V)、ロイシン(L)、及びイソロイシン(I)は、脂肪族側鎖を含有し、疎水性であり、すなわち、それらは、水などを嫌って、クラスター形成する。疎水性、及び脂肪族残基を有する、これらのアミノ酸により、それらが、一体となって、ほとんど穴を有しないコンパクトな構造を形成することが可能になる。分析されたペプチド配列は、全ての構成アミノ酸が、17種のうち1種(MTD10-表3)のみにおけるグリシン(G)を除き、疎水性(A、V、L、及びI)であり、脂肪族(A、V、L、I、及びP)であったことを示した。それらのヒドロパシー指数(ヒドロパシーの全平均:GRAVY)、及び脂肪族指数(AI)は、それぞれ、2.5±0.4、及び217.9±43.6であった。それらのアミノ酸組成はまた、表3においても示される。
【０１８０】
1-6.分析されたペプチドの特徴:二次構造(らせん度)
上で説明された通り、CPP配列は、α-らせん形構造を有する疎水性配列と「屈曲」配置において膜に挿入された後、細胞膜に直接浸透すると考えられ得る。加えて、本発明者らの分析は、変角ポテンシャルが、膜浸透に決定的であったことを強く示した。それ故、ペプチドの構造分析は、配列が、ヘリックスを形成したかどうかを決定するため行った。9種のペプチドがヘリックスであり、8種がヘリックスでなかった(表3)。これは、ヘリックス構造が必要ではないかもしれないことを示唆しているように思われる。
【０１８１】
1-7.重大な因子(CF)の決定
分析された11個の特徴において、以下の6個が、新規疎水性CPP-進化型MTDの開発のために選択され、すなわち、「重大な因子」である:アミノ酸長、変角ポテンシャル(プロリンの存在及び位置)、硬性/柔軟性(不安定指数:II)、構造特性(脂肪族指数:AI)、ヒドロパシー(GRAVY)、及びアミノ酸組成/残基構造(疎水性及び脂肪族A/a)(表3及び表4)。
【０１８２】
2.「重大な因子」を最適化するための選択された疎水性CPPの分析
過去20年間に既に開発された、17種の異なる疎水性CPPの分析されたデータ(分析A、表3及び4)は、高いバリエーションを示し、共通又はコンセンサス特性を成すのが困難であったので、分析B(表5及び6)、及びC(表7及び8)がまた、改善されたCPP-aMTDのより良好なデザインのための重大な因子を最適化するために行われた。それ故、17種の疎水性CPPは、2つのグループにグループ分けされ、細胞透過特性と関連するそれらの特徴についてグループを分析した。重大な因子は、グループの分析データを比較及び対比し、細胞透過特性について重大であり得る、共通の相同特性を決定することにより、最適化された。
【０１８３】
2-1.インビボの生物学的に活性なカーゴタンパク質に使用されたペプチドの選択的分析(B)
分析Bにおいて、8種のCPPが、インビボでそれぞれの生物学的に活性なカーゴと共に使用された。長さは11±3.2であったが、8種のうち3種のCPPは、ほとんど変角ポテンシャルを有しなかった。硬性/柔軟性(不安定指数：II)は41±15であったが、ペプチドの1つ[MTD85:最小(II:9.1)を伴い、硬い]を取り除くことにより、全体的な不安定指数が45.6±9.3まで増大した。これは、柔軟性が高い(40以上のII)ほど、潜在的に良好であることを示唆していた。8種のCPPの全ての他の特徴が、構造特性及びヒドロパシーを含む、分析Aと同様であった(表5及び6)。
【０１８４】
表5は、公開された疎水性細胞浸透性ペプチド(B):インビボでのそれぞれのカーゴに使用された、選択されたCPPの特徴を示す。
【０１８５】
【表５】
0006664464.tif 000013
【０１８６】
表6は、公開された疎水性細胞浸透性ペプチド(B)の要約された重大な因子を示す。
【０１８７】
【表６】
0006664464.tif 000014
【０１８８】
2-2.変角ポテンシャル及びより高い柔軟性をもたらしたペプチドの選択的分析(C)
分析A、B、及びCにおいて決定された「重大な因子」が、疎水性CPPの現在の問題-タンパク質凝集、低い溶解性/収量、及びMTS/MTM又はMTDに融合した組換えタンパク質の乏しい細胞/組織透過性、並びにペプチドの非共通配列及び非相同な構造を改善するために妥当であったことを証明する、aMTD及びランダムペプチド(rP又はrペプチド)の実際のデザインのための「重大な因子の共通範囲及び/又はコンセンサス特性」を最適化するために、経験的に選択されたペプチドが、それらの構造特性、及び物理化学的因子指数について分析された。
【０１８９】
変角ポテンシャル、硬い若しくは過度に柔軟な配列(過度に小さいか、若しくは過度に大きい不安定指数)、又は低過ぎる若しくは高過ぎる疎水性CPPを有しなかった、疎水性CPPは選択されなかったが、配列のヘリックス構造は要求されなかったので、二次構造は考慮されなかった。
【０１９０】
分析Cにおいて、変角ポテンシャル、及びより高い柔軟性をもたらし得る、8種の選択されたCPP配列が、最終的に分析された(表7及び8)。共通アミノ酸長は、12(11.6±3.0)である。プロリンは、配列の中央、及び/又は末端に存在する。硬性/柔軟性(II)は、45.5〜57.3(平均:50.1±3.6)である。ペプチドの構造特性及び疎水性を表すAI並びにGRAVYは、それぞれ、204.7±37.5、及び2.4±0.3である。全てのペプチドは、疎水性及び脂肪族アミノ酸(A、V、L、I、及びP)と一致した。それ故、分析Cは、新規疎水性CPP-aMTDの新規デザインについての標準として選ばれた。
【０１９１】
表7は、公開された疎水性細胞浸透性ペプチド(C):変角ポテンシャル及びより高い柔軟性をもたらした選択されたCPPの特徴を示す。
【０１９２】
【表７】
0006664464.tif 000015
【０１９３】
表8は、公開された疎水性細胞浸透性ペプチド(C)の要約された重大な因子を示す。
【０１９４】
【表８】
0006664464.tif 000016
【０１９５】
3.最適化された重大な因子に基づく、改善された疎水性CPP-aMTDの新規デザイン
3-1.共通配列及び/又は共通の相同な構造の決定
上で述べられた通り、シグナル配列のH領域(HRSS)に由来するCPP(MTS/MTM、及びMTD)は、共通配列、配列モチーフ、及び/又は共通の構造上相同な特性を有しない。この発明において、目的は、「共通機能」を有するように、すなわち、分析された参照CPPと同様のメカニズムで膜を超えてタンパク質転位を促進するように、新たに決定された「重大な因子」を満たす、共通配列モチーフ及び構造モチーフに形式化された、改善された疎水性CPPを開発することである。分析A、B、及びCに基づき、共通の相同な特性を分析して、細胞透過性に影響する、重大な因子が決定された。それぞれの重大な因子の範囲値は、新規aMTDをデザインするための分析A、B、及びCからそれぞれの重大な因子の分析された指数を含むことが決定された(表9)。これらの特性は、それらの細胞透過性において新規にデザインされたaMTDで実験的に確認された。
【０１９６】
表9は、分析されたCPPの値と、新規aMTD配列の新規デザインについて決定された値との間のそれぞれの重大な因子の比較である範囲/特性を示す。
【０１９７】
【表９】
0006664464.tif 000017
【０１９８】
表9において、普遍的な共通の特性、及び配列/構造モチーフが提供される。長さは、9〜13個のアミノ酸であり、変角ポテンシャルは、ペプチド変角のため配列の中央(5'、6'、7'、又は8'アミノ酸において)における、及び組換えタンパク質変角のためペプチドの末端におけるプロリンの存在でもたらされ、aMTDの硬性/柔軟性は、II>40であり、表9において記載される。
【０１９９】
3-2.進化型MTDの開発のための重大な因子
タンパク質を含む治療上活性なカーゴ分子を生きた細胞に送達するため疎水性CPPに融合された組換え細胞透過性タンパク質が、以前に報告されたが、細菌システムにおいて発現された融合タンパク質は、それらの低い溶解性及び収量に起因して、可溶型として精製することが困難であった。タンパク質ベースの生物学的治療としての細胞透過性タンパク質のさらなる臨床上の開発に関する極めて重大な脆弱性に対処するために、進化型MTD(aMTD)と名付けられた、疎水性CPPの多いに改善された形態が、重大な因子ベースのペプチド分析を介して新たに開発された。aMTDの本発明のため使用された重大な因子が、本明細書にある(表9)。
【０２００】
1.アミノ酸長:9〜13
【０２０１】
2.変角ポテンシャル(プロリン位置:PP)
:プロリンは配列の中央(5'〜8'アミノ酸)、及び末端に存在する
【０２０２】
3.硬性/柔軟性(不安定指数:II):40〜60
【０２０３】
4.構造特性(脂肪族指数:AI):180〜220
【０２０４】
5.ヒドロパシー(GRAVY):2.1〜2.6
【０２０５】
6.アミノ酸組成:疎水性及び脂肪族アミノ酸-A、V、L、I、及びP
【０２０６】
3-3.全ての重大な因子が考慮され、満たされた、ポテンシャル上最善なaMTDのデザイン
疎水性CPPの固有の特性の分析から得られた、6個の重大な因子を注意深く考慮した後、進化型巨大分子伝達ドメイン(aMTD)が、分析から決定されたアミノ酸長(9〜13)を含む、重大な因子を満たす、共通の12個のアミノ酸プラットフォームに基づき、デザインされ、開発された。
【０２０７】
[一般式]
【０２０８】
【化５】
0006664464.tif 000018
【０２０９】
それらの細胞透過性を決定するための多数の実験を要求する、以前に公開された疎水性CPPと異なり、新たに開発されたaMTD配列は、以下の通り、それぞれの重大な因子の決定された範囲値/特性に従うための上述のプラットフォームを使用して、ほんの数ステップを行うことにより、デザインすることができた。
【０２１０】
第1に、aMTDのための12個のアミノ酸配列プラットフォームを調製する。第2に、プロリン(P)を配列の末端(12')に置き、5'、6'、7'、及び8における4個のUの1つにおいてプロリンを置く場所を決定する。第3に、アラニン(A)、バリン(V)、ロイシン(L)、又はイソロイシン(I)は、プロリンを置いていない、X及び/又はUのいずれかに置く。最後に、プラットフォームに基づいてデザインされたアミノ酸配列が、aMTD配列の細胞透過特性を保証するための6個の重大な因子の値又は特性を満たすかどうかを決定する。これらのプロセスを通じて、多数の新規aMTD配列が構築された。それぞれのaMTDに融合された非機能的なカーゴ組換えタンパク質を調製するための発現ベクターが構築され、細菌細胞において強制的に発現された。これらのaMTDに融合された組換えタンパク質は、可溶型で精製され、それらの細胞透過性が定量的に決定された。aMTD配列が新たにデザインされ、表10〜15において示される通り、1〜240まで番号付けられた。表10〜15において、配列ID番号は参照のための配列表であり、aMTD番号は、実験において実際に使用された、アミノ酸の表番号を指す。さらなる実験のため、aMTD番号が使用された。加えて、配列表において示されるポリヌクレオチド配列が、配列番号241〜配列番号480まで番号付けられた。
【０２１１】
表10〜15は、全ての重大な因子を満たすよう開発された、240種の新規疎水性aMTD配列を示す。
【０２１２】
【表１０】
0006664464.tif 000019
【０２１３】
【表１１】
0006664464.tif 000020
【０２１４】
【表１２】
0006664464.tif 000021
【０２１５】
【表１３】
0006664464.tif 000022
【０２１６】
【表１４】
0006664464.tif 000023
【０２１７】
【表１５】
0006664464.tif 000024
【０２１８】
3-4.少なくとも1個の重大な因子を満たさないペプチドのデザイン
上で記載された全ての重大な因子を満たす、新規疎水性CPP-aMTDの本発明は妥当であり、合理的にデザインされることを実証するために、少なくとも1個の重大な因子を満たさないペプチドもデザインされた。計31種のrペプチド(rP)がデザインされ、開発され、以下の通りカテゴリー分けされた:非変角ペプチド、中央並びに末端においてプロリンがないか、及び/又は中央のプロリンがないのいずれか、硬いペプチド(II<40)、過度に柔軟なペプチド、芳香族ペプチド(芳香環の存在)、A、V、L、I、P以外のアミノ酸又は他のプロリン残基を有するが、非芳香ペプチドを有する疎水性ペプチド、親水性だが非脂肪族ペプチド。
【０２１９】
3-4-1.変角ポテンシャルを満たさないペプチド
表16は、配列の中央において(5'、6'、7'又は8'において)、及び末端において任意のプロリンを有しない、ペプチドを示す。加えて、表16は、配列の中央においてプロリンを有しない、ペプチドを記載する。全てのこれらのペプチドは、非変角ポテンシャルを有すると考えられる。
【０２２０】
【表１６】
0006664464.tif 000025
【０２２１】
3-4-2.硬性/柔軟性を満たさないペプチド
配列の硬性/柔軟性が、決定的に重大な因子であることを証明するために、硬い(平均II:21.8±6.6)及びずっと高く柔軟な配列(平均II:82.3±21.0)もデザインされた。不安定指数が、新規aMTDのものよりずっと低い(II:41.3〜57.3、平均II:53.3±5.7)、硬いペプチドが、表17において示される。IIが新規aMTDのものよりずっと高い、変角だが、ずっと高く柔軟なペプチドも、表18において提供される。
【０２２２】
【表１７】
0006664464.tif 000026
【０２２３】
【表１８】
0006664464.tif 000027
【０２２４】
3-4-3.構造特性を満たさないペプチド
新規疎水性CPP-aMTDは、指数AIの平均範囲:180〜220、及びGRAVYの平均範囲:2.1〜2.6を有する、疎水性及び脂肪族アミノ酸(A、V、L、I、及びP)のみと一致する(表9)。構造指標に基づき、芳香族残基(W、F、又はY)を含有するペプチドが、表19において示され、A、V、L、I、P以外のアミノ酸又は他のプロリン残基を有するが、非芳香族配列を有する疎水性ペプチドがデザインされる(表20)。最後に、非脂肪族アミノ酸と一致する、親水性及び/又は変角ペプチドが、表21において示される。
【０２２５】
【表１９】
0006664464.tif 000028
【０２２６】
【表２０】
0006664464.tif 000029
【０２２７】
【表２１】
0006664464.tif 000030
【０２２８】
3-5.新たにデザインされたペプチドの要約
重大な因子に基づき、計457種の配列がデザインされた。重大な因子の全ての範囲/特性を満たす、デザインされた潜在的に最善なaMTD(疎水性、柔軟な、変角、脂肪族、及び12個のA/a長のペプチド)は、316種である。重大な因子の少なくとも1つを満たさない、デザインされたrペプチドは、141種であり、変角ペプチドがない配列が26種であり、硬いペプチド(II<40)配列が23種であり、過度に柔軟なペプチドが24種であり、芳香族ペプチド(芳香環の存在)が27種であり、疎水性だが、非芳香族ペプチドが23種であり、親水性だが、非脂肪族ペプチドが18種である。
【０２２９】
4.aMTD及びrペプチドに融合された組換えレポータータンパク質の調製
aMTD及び他のもの[rペプチド、参照疎水性CPP配列(MTM及びMTD)]に融合された組換えタンパク質が、細菌システムにおいて発現され、シングルステップのアフィニティークロマトグラフィーで精製され、生理学的条件において溶解性のタンパク質として調製された。これらの組換えタンパク質は、フローサイトメトリー及びレーザー走査型共焦点顕微鏡を利用することにより、それらの細胞透過性の能力について試験された。
【０２３０】
4-1.ペプチド配列に融合された組換えタンパク質のためのカーゴタンパク質の選択
臨床上/非臨床上の適用のため、aMTDに融合されたカーゴ材料は、以下の:酵素、転写因子、毒性、抗原性ペプチド、抗体、及び抗体フラグメントの1つであり得る、生物学的に活性な分子であろう。さらに、生物学的に活性な分子は、これらの以下の巨大分子:酵素、ホルモン、担体、免疫グロブリン、膜結合タンパク質、膜貫通型タンパク質、内部タンパク質、外部タンパク質、分泌タンパク質、ウイルスタンパク質、未変性のタンパク質、糖タンパク質、断片化タンパク質、ジスルフィド結合されたタンパク質、組換えタンパク質、化学的に修飾されたタンパク質、及びプリオンの1つであり得る。加えて、これらの生物学的に活性な分子は、以下の:核酸、コード核酸配列、mRNA、アンチセンスRNA分子、炭水化物、脂質、及び糖脂質の1つであり得る。
【０２３１】
これらの予め要求された条件に従い、aMTDにより媒介されるタンパク質取り込みを評価するための非機能的カーゴが選択され、溶解性であり、非機能的であるべき、カーゴA(CRA)と呼ばれた。ドメイン(A/a289〜840;184A/a長)は、プロテインSに由来する(Genbank ID:CP000113.1)。
【０２３２】
4-2.発現ベクターの構築、及び組換えタンパク質の調製
それぞれのaMTDに融合された組換えタンパク質についてのコード配列は、pET-28a(+)(Novagen、Darmstadt、ドイツ)中のNdel(5')及びSalI(3')にPCR増幅されたDNAセグメントからクローニングされた。aMTD及びrペプチドに融合された組換えタンパク質についてのPCRプライマーは、配列番号481〜797で表される。組換えタンパク質の構造は、図1において提示される。
【０２３３】
組換えタンパク質は、0.6のOD600まで成長させた大腸菌BL21(DE3)細胞において、強制的に発現され、0.7mMイソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド(IPTG)で2時間誘導された。タンパク質は、天然の条件において供給者(Qiagen、Hilden、ドイツ)により指示される、Ni2+アフィニティークロマトグラフィーにより精製された。精製後、精製されたタンパク質は、DMEM培地のような生理的緩衝液に溶解された。
【０２３４】
【表２２】
0006664464.tif 000031
【０２３５】
4-3.aMTD又はランダムペプチド(rP)に融合された組換えタンパク質の発現
本発明はまた、細胞透過性を有するaMTD配列の開発方法に関する。標準化された6個の重大な因子を使用して、316種のaMTD配列がデザインされた。加えて、これらの重大な因子の1つを欠く、141種のrペプチドも開発される:非変角ペプチド:i)配列の中央及び末端の両方においてのプロリンの不存在、又はii) 配列の中央若しくは末端のいずれかにおいてのプロリンの不存在、硬いペプチド、過度に柔軟なペプチド、芳香族ペプチド(芳香環の存在)、疎水性だが、非芳香族ペプチド、並びに親水性だが、非脂肪族ペプチド(表22)。
【０２３６】
これらのrペプチドは、ペプチドの細胞内送達ポテンシャルに関して、それぞれの重大な因子の構造/配列活性関係(SAR)を分析するために、aMTDと比較され、対比するよう考案される。組換えタンパク質を含有する全てのペプチド(aMTD又はrペプチド)は、CRAに融合されて、発現され、精製され、調製され、分析される組換えタンパク質の溶解性が増強された。
【０２３７】
これらのデザインされた、CRAに融合された316種のaMTD及び141種のrペプチドは、全てクローニングされ(図2)、大腸菌において誘導可能な発現について試験された(図3)。これらのペプチドのうち、240種のaMTDは、誘導可能に発現され、精製され、可溶型で調製された(図4)。加えて、31種のrペプチドも、可溶型として調製された(図4)。
【０２３８】
rペプチドに融合されたタンパク質を調製するために、非変角ペプチドのカテゴリーにおいて、26種のうち10種のrペプチド(表16);硬いペプチドのカテゴリーにおいて、23種のうち15[不安定指数(II)<40](表17);過度に柔軟なペプチドのカテゴリーにおいて、24種のうち19種(表18);芳香族ペプチドのカテゴリーにおいて、27種のうち6種(表19);疎水性だが、非芳香族ペプチドのカテゴリーにおいて、23種のうち8種(表20);及び親水性だが、非脂肪族ペプチドのカテゴリーにおいて、18種のうち12種(表21)であった、60種のタンパク質が発現された。
【０２３９】
4-4.aMTDに融合された組換えタンパク質の定量的細胞透過性
aMTD及びrペプチドは、蛍光的に標識され、フローサイトメトリー及び共焦点レーザー走査顕微鏡を使用することにより、細胞透過性について重大な因子に基づき比較された(図5〜8)。ペプチド融合非機能的カーゴ組換えタンパク質の細胞の取り込みは、フローサイトメトリーにおいて定量的に評価され得る一方、共焦点レーザー走査顕微鏡により、細胞内取り込みを視覚的に評価することが可能になる。分析は、aMTD(疎水性及び脂肪族配列)と逆の特徴(親水性及び芳香族配列:YYNQSTCGGQCY)を有する、陰性対照[rP38]に融合された組換えタンパク質を含んでいた。aMTDの陰性対照に対する相対的細胞透過性(相対的倍数)も分析された(表23及び図9)。
【０２４０】
表23は、aMTDの細胞透過性の陰性対照(A:rP38)との比較分析を示す。
【０２４１】
【表２３】
0006664464.tif 000032
【０２４２】
aMTDの参照CPP[B:MTM12(AAVLLPVLLAAP)、C:MTD85(AVALLILAV)]に対する相対的細胞透過性(相対的倍数)も分析された(表40及び41)。
【０２４３】
表24は、aMTDの参照CPP(B:MTM12)との細胞透過性の比較分析を示す。
【０２４４】
【表２４】
0006664464.tif 000033
【０２４５】
表25は、aMTDの参照CPP(C:MTD85)との細胞透過性の比較分析を示す。
【０２４６】
【表２５】
0006664464.tif 000034
【０２４７】
いずれかのペプチド(rP38又はaMTD)を欠く、ネイキッドタンパク質(ヒスチジンタグ付けされたCRAタンパク質)のものを引いた、陰性対照(ヒスチジンタグ付けされたrP38融合CRA組換えタンパク質)の幾何平均が、相対的倍数1として標準化された。240種のaMTDの陰性対照(Aタイプ)に対する相対的細胞透過性は、最大164倍まで有意に増大され、平均的増大19.6±1.6であった(表26〜31)。
【０２４８】
【表２６】
0006664464.tif 000035
【０２４９】
【表２７】
0006664464.tif 000036
【０２５０】
【表２８】
0006664464.tif 000037
【０２５１】
【表２９】
0006664464.tif 000038
【０２５２】
【表３０】
0006664464.tif 000039
【０２５３】
さらに、参照CPP(Bタイプ:MTM12、及びCタイプ:MTD85)と比較して、新規240種のaMTDは、それぞれ、平均して13±1.1(最大109.9)及び6.6±0.5(最大55.5)倍高い細胞透過性であった(表26〜31)。
【０２５４】
【表３１】
0006664464.tif 000040
【０２５５】
加えて、31種のrペプチドの細胞透過性が、240種のaMTDのものと比較された(0.3±0.04;表32及び33)。
【０２５６】
【表３２】
0006664464.tif 000041
【０２５７】
【表３３】
0006664464.tif 000042
【０２５８】
要約すると、aMTDの相対的細胞透過性は、それぞれ、rP38、MTM12、及びMTD85に対して最大164.0、109.9、及び55.5倍高いことを示した。計240種のaMTD配列の平均において、19.6±1.6、13.1±1.1、及び6.6±0.5倍高い細胞透過性が、それぞれ、rP38、MTM12、及びMTD85に対して示された(表26〜31)。陰性対照(rP38)の240種のaMTDに対する相対的細胞透過性は、0.3±0.04倍のみであった。
【０２５９】
4-5.aMTD融合組換えタンパク質の細胞内送達及び局在性
aMTDに融合された組換えタンパク質を試験して、陰性対照(rP38)、及び陽性対照参照として以前に公開されたCPP(MTM12及びMTD85)を用いたレーザー走査型共焦点顕微鏡により、それらの細胞内送達並びに局在性が決定された。NIH3T3細胞を、10μMのFITC標識タンパク質に1時間37℃において曝露し、核を、DAPIで対比染色した。次に、細胞を、共焦点レーザー走査顕微鏡により調べた(図7)。aMTDに融合された組換えタンパク質は、典型的には、参照CPP(MTM12及びMTD85)より高い、細胞内送達及び細胞質局在性を明確に提示する(図7)。rP38融合組換えタンパク質は、内部移行された蛍光シグナルを示さなかった(図7a)。加えて、図8において見られる通り、rペプチド(hisタグ付けされた、それぞれのrペプチドに融合されたCRA組換えタンパク質)は、より低い又は非細胞透過性を提示する。
【０２６０】
4-6.新たに開発されたaMTDの定量的及び視覚的細胞透過性の要約
ヒスチジンタグ付けされたaMTD融合カーゴ組換えタンパク質は、それらの溶解性及び収量において大いに増強された。従って、FITCコンジュゲート組換えタンパク質をまた試験して、タンパク質の細胞内局在性が定量され、視覚化され、参照CPPと比較してより高い細胞透過性が実証された。
【０２６１】
疎水性シグナル配列由来のCPP-MTS/MTM又はMTDを使用した従前の研究において、17種の公開された配列が同定され、長さ、分子量、pI値、変角ポテンシャル、硬性/柔軟性、構造特性、ヒドロパシー、アミノ酸残基及び組成、並びにペプチドの二次構造のような様々な特徴において分析された。配列のこれらの分析データに基づき、進化型MTD(aMTD)と名付けられた、新規の人工及び非天然ペプチド配列が発明され、aMTD融合組換えタンパク質での細胞内送達ポテンシャルにおけるそれらの機能的活性が決定された。
【０２６２】
aMTD融合組換えタンパク質は、rペプチド及び/又は参照疎水性CPPを含有する組換えタンパク質(MTM12及びMTD85)と比較して、細胞内へのタンパク質伝達の能力を促進した。結果によると、細胞浸透性ペプチド配列の重大な因子が、細胞膜を浸透することにより、ペプチドにより媒介される細胞内送達を決定するのに主要な役割を果たすことが実証された。加えて、細胞透過性は、重大な因子を全て満たす、以下の有理数により、かなり改善され得る。
【０２６３】
5.aMTDの送達ポテンシャルに対する構造/配列活性関係(SAR)
新規aMTDの細胞透過性を決定した後、構造/配列活性関係(SAR)が、新規aMTDの選択されたいくつか、及び全てにおいてそれぞれの重大な因子について分析された(図13〜16、及び表34)。
【０２６４】
【表３４】
0006664464.tif 000043
【０２６５】
5-1.プロリン位置:変角ポテンシャル(プロリン位置:PP)に関して、それらの配列中の7'又は8'アミノ酸においてそのプロリンを有するaMTDは、それらのプロリン位置が、5'又は6'にある配列と比較して、ずっと高い細胞透過性を有する(図14a及び15a)。
【０２６６】
5-2.ヒドロパシー:加えて、aMTDが、2.1〜2.2の範囲にあるGRAVY(ヒドロパシーの全平均)を有するとき、これらの配列は、比較的低い細胞透過性を提示する一方、GRAVY 2.3〜2.6を有するaMTDは、有意により高い細胞透過性を示す (図14b及び15b)。
【０２６７】
5-3.rペプチドSAR:aMTDのSARに対して、rペプチドは、それらのプロリン位置(PP)及びヒドロパシー(GRAVY)に関連する、細胞透過性における同様のSAR相関を示した。これらの結果は、高いGRAVY(2.4〜2.6)を有するrペプチドが良好な細胞透過性を有することを確認するものである(図16)。
【０２６８】
5-4.アミノ酸組成の分析:プロリン位置及びヒドロパシーに加えて、アミノ酸組成の相違も分析される。aMTDは、重大な因子に基づきデザインされるので、それぞれのaMTD融合組換えタンパク質は、組成において2個のプロリン配列を同等に有する。他の疎水性並びに脂肪族アミノ酸-アラニン、イソロイシン、ロイシン、及びバリン-を合わせて、aMTDペプチド配列の残りが形成される。
【０２６９】
アラニン:アミノ酸の組成において、aMTDの全てが3〜5個のアラニンを有するので、結果は、aMTDの送達ポテンシャルに関して、アラニンの数による有意な相違を示さない。しかしながら、配列において、4個のアラニン組成は、最も有効な送達ポテンシャル(幾何平均)を示す(図13a)。
【０２７０】
ロイシン及びイソロイシン:また、aMTD配列中のイソロイシン並びにロイシンの組成は、アミノ酸(I及びL)の数と、aMTDの送達ポテンシャルとの間で逆の関係を示す。配列中のイソロイシン及びロイシンの数が少ないほど、より高い送達ポテンシャル(幾何平均)を有する傾向にある(図13a及び13b)。
【０２７１】
バリン:逆に、aMTD配列のバリンの組成は、それらの細胞透過性と正の相関を示す。配列中のバリンの数が少ないとき、aMTDの送達ポテンシャルも比較的低い(図13b)。
【０２７２】
最高の細胞透過性を有する10種のaMTDが、選択される(平均した幾何平均:2584±126)。配列中のバリンのそれらの平均数は3.5であり、比較的低い細胞透過性(平均した幾何平均:80±4)を有する10種のaMTDは、平均1.9個のバリンアミノ酸を有した。配列中のバリンの平均数は、図13bにおいて示される通り、それらの細胞透過性がまた低減するにつれて、低減される。より高い細胞透過性aMTDグループと比較して、より少ない配列は、それらのバリン組成において平均1.9を有した。それ故、高い細胞透過性配列を得るために、平均2〜4個のバリンが、配列において構成されるべきである。
【０２７３】
5-5.SAR分析の結論:図15において見られる通り、全240種のaMTDを、細胞透過性と、重大な因子:変角ポテンシャル(PP)、硬性/柔軟性(II)、構造特性(AI)、並びにヒドロパシー(GRAVY)、アミノ酸長及び組成のこれらの関連について調べた。この分析を通じ、aMTDの細胞透過性は、それらの中心のプロリン位置が5'又は6'であり、GRAVYが2.1以下であるとき、より低い傾向にある(図15)。さらに、10種のより高い及び10種のより低い細胞透過性aMTDを調べた後、これらの傾向は、細胞透過性の中心とプロリン位置及びヒドロパシーとの関連を確認することが明確に示される。
【０２７４】
6.重大な因子の指数範囲/特性の実験的な確認
実験及びSAR分析を行う前に、最初に提案された重大な因子の指数範囲並びに特性に含まれる、6個のうち5個の重大な因子の範囲及び特性が、経験的かつ実験的に決定された。新たに開発された240種のaMTDの重大な因子の指数範囲及び特性に関して、変角ポテンシャル(プロリン位置:PP)、硬性/柔軟性(不安定指数:II)、構造特性(脂肪族指数:AI)、ヒドロパシー(GRAVY)、アミノ酸長及び組成は、全て、参照疎水性CPPの分析から得られる重大な因子の特徴内にある。
【０２７５】
それ故、新規疎水性CPP配列を進化型MTDとしてデザインし、開発するための本発明者らの仮説は、重大な因子ベースの新規aMTDの理にかなったデザインが正しいことを、経験的かつ実験的に証明し、実証する。
【０２７６】
【表３５】
0006664464.tif 000044
【０２７７】
7. タンパク質療法についてaMTDにより可能にされるMITTでのタンパク質ベースの新規生物学的治療の発見及び開発
この発明について、240種のaMTD配列が、重大な因子に基づき、デザインされ、開発された。240種のaMTDの定量的及び視覚的細胞透過性(疎水性、柔軟な、変角、脂肪族、及び12個のa/a長のペプチド)が、全て実際に決定される。
【０２７８】
aMTDの細胞透過性を測定するために、rペプチドもデザインされ、試験された。図13〜15において見られる通り、ペプチドの細胞透過性と重大な因子の明らかな関連が存在する。これらの重大な因子のうち、本発明者らは、最も有効な細胞透過性aMTDが、12個のアミノ酸長;、A、V、L、I及びPの組成;7'又は8'のいずれか及び末端(12')に位置する、複数のプロリン;41.3〜57.3の範囲にある不安定指数;187.5〜220.0の範囲にある脂肪族指数;並びに2.2〜2.6の範囲にあるヒドロパシー(GRAVY)を有すると設定することができる。
【０２７９】
これらの調べた重大な因子が、本発明者らが、本発明者らの重大な因子に設定した範囲内にあり、それ故、本発明者らは、これらの重大な因子を満たすaMTDが、過去20年間に報告された参照疎水性CPPと比較して、比較的高い細胞透過性、及びずっと高い細胞内送達ポテンシャルを有することを確認することができる。
【０２８０】
多くのヒト疾患が、機能獲得若しくは機能喪失のような変異を引き起こす、欠乏又は過剰発現を伴うタンパク質により引き起こされることは、広く明らかであった。生物学的に活性なタンパク質が、異常なタンパク質を短い時間枠内、恐らく1又は2時間以内に、定量的方法で置換するために送達され得るなら、投薬量は、タンパク質がいつ、どのように必要とされ得るかに依存して、制御され得る。この発明において新規aMTDの溶解性及び収量を有意に改善することにより(表31)、タンパク質、ペプチド、核酸、及び他の化学化合物のような治療巨大分子を、生きた細胞、並びにヒトを含む生きた哺乳類に有効に送達するための薬剤としてその実際のポテンシャルを予測することができる。それ故、新規aMTDのプール(240種)を利用する、新たに開発されたMITTは、最適なカーゴ-aMTD関係を決定した後に細胞内タンパク質療法をとらえるためのタンパク質ベースの生物学的治療の発見及び開発のためのプラットフォーム技術として使用され得る。
【０２８１】
8.新規の疎水性CPP:iCP-パーキンを開発するためのaMTD
8-1.細胞透過性についてのaMTDの選択
240個のaMTDから、12個のaMTDを選択し、使用して、iCPパーキン組換えタンパク質を構築した。使用した12個のaMTDを、以下の表36に示す。
【０２８２】
多様な疎水性CPPを使用して、哺乳動物の細胞及び組織へのタンパク質カーゴの送達を増強するに至った。同様に、aMTD321及びaMTD524は、フローサイトメトリーにより評価する場合に、RAW264.7細胞において、可溶化ドメインA(SDA)のヒスチジンタグ付きコード配列の取込みを増強することが発見されていた。タンパク質の取込みの相対レベルは、第1世代のCPP(膜移動モチーフ)を含有する参照MTM12タンパク質のレベルよりも7倍高く、第2世代のCPP(巨大分子導入ドメイン)を含有するMTD85参照タンパク質のレベルよりも2.9倍高かった。さらに、SDAと融合させたランダムペプチド組換えタンパク質(rP38)、すなわち、aMTDの特性とは反対の特性を有するペプチド配列に関しては、相対的に8.1倍高いタンパク質の取込みも観察された(図23)。蛍光顕微鏡法を使用して、タンパク質の取込みをモニターすると、NIH3T3細胞においても類似の結果が得られた。細胞内へのaMTD321が媒介するそのような細胞内送達を、図24に示し、aMTD321に関する情報を、表37に示す。
【０２８３】
【表３６】
0006664464.tif 000045
【０２８４】
表37:aMTD321の特徴
【０２８５】
【表３７】
0006664464.tif 000046
【０２８６】
8-2.構造安定性のための可溶化ドメイン(SD)の選択
疎水性CPPに融合させた組換えカーゴ(パーキン)タンパク質は、細菌系中で発現させ、単一ステップの親和性クロマトグラフィーを用いて精製することができたが、生理的緩衝液(例えば、PBS、DMEM又はRPMI1640等)中に溶解させたタンパク質は、極めて不溶性であり、溶解性の形態として極めて低い収率を示した。したがって、溶解性、収率、並びに最終的には、細胞及び組織に対する透過性を改善するために、追加の非機能性タンパク質ドメイン(可溶化ドメイン:SD)を適用し、組換えタンパク質と融合させた。。
【０２８７】
この特定の目的に従って選択されたドメインは、SDA〜SDFである(表38)。aMTD/SD融合組換えタンパク質について、安定性を決定した。
【０２８８】
可溶化ドメイン(SD)及びaMTDは、タンパク質の溶解性/収率及び細胞/組織に対する透過性の増加に大きな影響を及ぼしている。したがって、我々は、臨床に適用するために、SD(SDA及びSDB)並びにaMTDと融合させた、極めて溶解性のかつ極めて安定なパーキン組換えタンパク質を開発した。
【０２８９】
表38:可溶化ドメインの特徴
【０２９０】
【表３８】
0006664464.tif 000047
【０２９１】
8-3.発現ベクターの構築
我々は、パーキンタンパク質について、aMTD及び可溶化ドメインを有する又は有しない、5つの異なるタイプの組換えタンパク質を設計した。タンパク質の構造を、以下に従って標識した:(1)ヒスチジンタグのみを有するカーゴタンパク質、(2)ヒスチジンタグ及びaMTDと融合させたカーゴタンパク質、(3)ヒスチジンタグ、aMTD及び可溶化ドメインA(SDA)と融合させたカーゴタンパク質、(4)ヒスチジンタグ、aMTD及び可溶化ドメインB(SDB)と融合させたカーゴタンパク質、(4C)ヒスチジンタグ及び可溶化ドメインB(SDB)と融合させたカーゴタンパク質、(5)aMTD及び可溶化ドメインB(SDB)と融合させたカーゴタンパク質、並びに(5C)可溶化ドメインB(SDB)と融合させたカーゴタンパク質(図17)。それらのうち、(4)及び(5)の構造を、iCP-パーキン組換えタンパク質の生物学的効能を有する候補タンパク質として使用し、(4C)及び(5C)を、(4)及び(5)に比した対照群(非CPパーキン)としてとして使用した。
【０２９２】
8-4.パーキン組換えタンパク質の調製
それぞれのパーキン組換えタンパク質を、IPTGを添加することによって首尾よく誘発し、精製した(図19)。我々は、SDAと融合させたパーキン(HM321PSA)又はSDBと融合させたパーキン(HM321PSB、HM524PSB、M524PSB)のいずれについても、カーゴタンパク質のみ(HP)又はaMTDのみと融合させたカーゴタンパク質(HM321P)と比較して、溶解性の顕著な増加を観察した。結果から、SDと融合させたパーキン組換えタンパク質は、溶解性及び収率の顕著な改善を示すことが示唆された(図19及び図21a)。
【０２９３】
9.それぞれの組換えタンパク質の細胞透過性、組織透過性の決定
aMTD321/SD融合パーキン組換えタンパク質は、aMTD321配列又はaMTD524配列を欠くパーキン組換えタンパク質(HP、HPSB及びその他のaMTD)と比較して顕著により高い細胞透過性、組織透過性を示す。まとめると、これらのaMTD321/SD融合パーキン組換えタンパク質(HM321PSA及びHM321PSB)は、類似の溶解性及び収率を示すにもかかわらず、aMTD321/SDB融合パーキン組換えタンパク質の細胞及び全身への送達活性は、aMTD321配列を欠くパーキン組換えタンパク質よりも高かった。したがって、aMTD321/SD融合パーキン組換えタンパク質が、組換えタンパク質の最も安定な構造であることが決定された。
【０２９４】
さらに、aMTD321に加えて、さらに選択された10個のタイプのaMTDの溶解性/収率、透過性及び生物学的活性も測定し、図22に示した。
【０２９５】
9-1.パーキン組換えタンパク質の細胞透過性
我々は、開発したパーキン組換えタンパク質の細胞/組織透過性及び生物学的活性について検討した。パーキン組換えタンパク質の細胞透過性を、RAW264.7細胞において、タンパク質処置の1時間後に評価した。aMTDを欠くFITC標識化パーキン組換えタンパク質(HP及びHPSB)は、RAW細胞中で検出することができなかった。対照的に、aMTDを担持するパーキン組換えタンパク質HM321P、HM321PSA、HM321PSB及びM524PSBは、高い細胞透過性を示した(図26)。蛍光共焦点レーザー走査顕微鏡法を使用して、タンパク質の細胞内局在化をモニターすると、NIH3T3細胞中でも、類似の結果が得られた(図24)。特に、aMTD/SD融合パーキン組換えタンパク質(HM321PSA、HM321PSB及びM524PSB)が、最も高い細胞透過性を示した。これらの結果から、aMTDは、タンパク質が短時間(1時間)の間に細胞内に浸透するのを首尾よく可能にし、細胞透過性に積極的に影響を及ぼす、タンパク質の溶解性を改善することが示された。
【０２９６】
9-2.パーキン組換えタンパク質の組織透過性
次に、我々は、in vivoで、FITC標識化タンパク質の腹腔内注射の15分及び30分後に、パーキン組換えタンパク質の組織透過性を決定した(図25)。FITC標識化HPSB又は非コンジュゲート化FITCを投与された対照動物と比較した場合、FACS(蛍光標識細胞分取)により分析したPBMC(末梢血単核球)が、蛍光のゲインを示し、このことは、FITC標識化タンパク質の存在を指し示した。FACS分析のために、CellQues Pro細胞数測定用分析ソフトウエア(FACS Calibur、Beckton-Dickinson、San Diego、CA、米国)を使用して、細胞(1×104個)を分析した。
【０２９７】
2つのパーキン組換えタンパク質うちの1つ、すなわち、HM321PSBが、PBMC中でより高い細胞内シグナルを示した。異なる臓器におけるFITC標識化タンパク質の分布を、凍結切片中で蛍光顕微鏡法により分析した(図25及び図27)。aMTDを欠くパーキン組換えタンパク質(HP及びHPSB)は、類似の結果、すなわち、多様な臓器(脳、心臓、肺、肝臓、脾臓及び腎臓)における限定的な組織透過性を示した。対照的に、aMTD321及びaMTD524は、組織(脳、心臓、肺、肝臓、脾臓及び腎臓)において、パーキン組換えタンパク質の全身への送達を増強した。
【０２９８】
10.脳組織におけるパーキン組換えタンパク質の免疫検出
血液脳関門に対する透過性を、免疫組織化学的標識化(免疫組織化学的検査)を使用することによって決定するために、抗パーキンモノクローナル抗体(1:200、Santa Cruz Biotechnology)を使用して、組織を免疫組織化学的に処理した。パーキン陽性の免疫反応性が、HM321PSB処置マウスの脳において観察されたが、HPSB処置マウスの脳においては観察されなかった(図29)。ウエスタンブロットの結果では、パーキン抗体陽性のバンドが、HM321PSB組換えタンパク質を投与した群においてのみ観察された(図28a)。さらに、図28b及び図28cに示すように、本発明のHM524PSBを用いて処置したマウスの脳において、HPSBを用いて処置したマウスと比較してより多い量のパーキンタンパク質が検出されることも確認した。
【０２９９】
結果から、aMTD/SD融合パーキン組換えタンパク質は、血液脳関門に浸透することによって、脳中の神経細胞に効率的に送達され得るであろうことが示されている。
【０３００】
11.iCP-パーキン組換えタンパク質の生物学的活性の決定
11-1.iCP-パーキン組換えタンパク質のE3リガーゼ活性
パーキン組換えタンパク質のE3リガーゼ活性を決定するために、製造元の使用説明に従って実施する自己ユビキチン化アッセイ(Boston Biochem)を使用することによって、パーキンE3リガーゼ活性を測定した。図30に示すように、本発明のiCP-パーキン組換えタンパク質は、(自己)ユビキチン化活性を示し、このことは、それらがE3リガーゼ活性を有することを示した。
【０３０１】
11-2.iCP-パーキン組換えタンパク質の抗アポトーシス作用
神経毒が引き起こすニューロン死に対するパーキン組換えタンパク質の保護作用を決定するために、CATH.a細胞及びSH-SY5Y細胞を、6-ヒドロキシドーパミン(6-OHDA)を用いて処置した。6-OHDA処置の後に、これらの細胞を、パーキン組換えタンパク質を用いて処置し、TUNELアッセイを実施した。6-OHDAのみで処置した群において、多数の細胞死が観察された。6-OHDA処置群に類似して、aMTDを欠くHPも、アゴニストのみの群に類似するパーセントのアポトーシス細胞死を示すに至った。対照的に、aMTD321/SD融合パーキン組換えタンパク質(HM321PSA及びHM321PSB)は、アポトーシスを、CATH.a細胞及びSH-SY5Y細胞においてそれぞれ、19.7%及び14.2%まで抑制するに至った(*p<0.05)。類似の結果を、CATH.a細胞及びSH-SY5Y細胞の両方において得た。aMTD524パーキンタンパク質を処置した場合も、類似の結果を得た。これらの結果から、aMTD/SD融合パーキン組換えタンパク質が、培養神経細胞において神経保護作用を示すことが示されている。さらに、ニューロンの細胞死を阻害するこれらの作用は、用量依存性の様式で観察された(図31、図32a及び図32b)。
【０３０２】
さらに、α-シヌクレイン凝集体の分解も、トリパンブルー染色の後に細胞計数により測定した。図33に示すように、本発明のiCP-パーキン組換えタンパク質は、優れた神経細胞保護作用及びα-シヌクレイン分解作用を示すことが確認された。
【０３０３】
12.MPTP-PD動物モデルの開発
パーキン組換えタンパク質のin vivoでの作用を決定するために、我々は、パーキンソン病の生理学的及び精神的な症状を、神経毒素を使用することによって模倣する多様なパーキンソン病(PD)の動物モデルを開発した。パーキンソン病様症状を誘発するために、神経毒素であるMPTP(1-メチル-4-フェニル-1,2,3,6-テトラヒドロピリジン)を使用した。このMPTPは、ミトコンドリア内膜において、モノアミンオキシダーゼ(MAO-B)により、毒性物質であるMPP+に変換され、これが、ドーパミン作動性ニューロンを選択的に標的にして、パーキンソン病を誘発する(図34)。
【０３０４】
13.パーキン組換えタンパク質が影響を及ぼす運動活動の評価
13-1.水泳試験
パーキン組換えタンパク質が運動機能を回復させる作用を評価するために、水泳試験を実施した。各群(希釈剤、MPTPのみ、MPTP+HPSB、及びMPTP+HM321PSB)の水泳活動(四つ足)を測定し、無病変の希釈剤対照のパーセントとして表した。MPTPのみの群は、希釈剤の群と比較して、水泳活動の顕著な減少を示した。同様に、HPSB処置群も、MPTPのみの群に類似する結果を示した。対照的に、HM321PSB処置群は、運動活動の改善を示した。したがって、我々は、aMTD321/SD融合パーキン組換えタンパク質が、急性MPTP誘発パーキンソン病のマウスモデルにおいて、運動機能を回復させたことを決定した(図37)。
【０３０５】
13-2.歩行運動試験
パーキン組換えタンパク質が運動機能を回復させる作用を評価するために、歩行運動試験を実施した(図38)。この実験では、歩幅の距離及びふらつきの距離を測定した。MPTPのみ及びHPSB処置群において、希釈剤の群と比較して、歩幅の距離は顕著に低下し、一方、ふらつきの距離は増加した。しかし、HM321PSB処置マウスは、正常群に類似するレベルの歩幅の距離を示し(図39)、MPTPのみ及びHPSB処置群と比較して、ふらつきの距離の顕著な低下を示した(図40)。したがって、我々は、aMTD321/SD融合パーキン組換えタンパク質が、急性MPTP誘発パーキンソン病のマウスモデルにおいて、歩行運動機能を改善させることを決定した。
【０３０６】
13-3.亜慢性MPTP-PDモデル
ロータロッド試験を、亜慢性MPTPモデルにおいて実施し、その結果、aMTD524/SD融合パーキンタンパク質処置群は、ロータロッド上で長時間歩行し、このことは、希釈剤対照に類似した。すなわち、aMTD524/SD融合パーキンタンパク質による運動機能の回復が確認された(図41)。
【０３０７】
14.MPTP-PDマウスモデルにおける、パーキン組換えタンパク質によるドーパミン放出の活性化
14-1.尿中のドーパミン
尿中のドーパミンレベルを測定するために、パーキン組換えタンパク質による最初の処置の10時間後に、全ての群のマウスから尿を収集した。これらの尿試料を、ELISAにより測定した。10時間後の結果において、MPTPのみとHM321PSB処置群との間で、統計学的に有意な差が存在し。希釈剤の群と比較した場合、MPTPのみ群は、尿中レベルの減少を示した一方、HM321PSB処置群は、類似の尿中レベルを示すに至った。結果から、aMTD321/SD融合パーキン組換えタンパク質は、尿中のドーパミンレベルを高めることが示されている。(図35)。
【０３０８】
14-2.脳中のドーパミン
脳中のドーパミンレベルを測定するために、全ての群において、線条体領域のドーパミンレベルを、ELISAにより測定するに至った。線条体のドーパミンレベルは、HM321PSB処置群において、MPTPのみ及びHPSB処置群と比較して2倍超であった。したがって、我々は、線条体のドーパミンレベルを、aMTD321/SD融合パーキン組換えタンパク質は増加させ、MPTP処置は減少させることを決定するに至った(図36)。
【０３０９】
15.MPTP-PDモデルにおける、パーキン組換えタンパク質によるチロシンヒドロキシラーゼの発現の回復
15-1.急性MPTP-PDモデル
パーキン組換えタンパク質がドーパミン作動性ニューロンを保護する効能を決定するために、免疫組織化学的検査を、ドーパミンニューロン中のマーカー酵素であるチロシンヒドロキシラーゼに対する抗体を使用して実施した。aMTD/SD融合パーキン組換えタンパク質を用いて処置したマウスの黒質及び線条体領域中のドーパミン作動性ニューロンの数を観察し、MPTPのみを投与した群及びHPSBを投与した群と比較した。したがって、我々は、aMTD/SD融合パーキン組換えタンパク質は、神経保護機能を有し得るであろうことを決定した。さらに、aMTD/SD融合パーキン組換えタンパク質の、神経細胞の回復作用も、用量依存性の様式で観察された。(図42a及び図42b)。
【０３１０】
15-2.亜急性MPTP-PDモデル
亜急性MPTPモデルの脳において、TH発現の変化を、ウエスタンブロッティングにより調べ、その結果、aMTD/SD融合パーキンタンパク質による、TH発現の回復が観察された。さらに、内因性パーキンタンパク質の発現は変化しなかった(図43)。
【０３１１】
16.本発明の要約
本発明では、aMTDを用いて、細胞透過性パーキン組換えタンパク質を設計及び開発した。aMTDと融合させたパーキン組換えタンパク質及びaMTDを欠く対照の組換えタンパク質を全て、それらの細胞/組織透過性及びBBB透過性について、定量的、視覚的に確認した。我々は、細胞透過性のaMTD321/SD融合パーキン組換えタンパク質及びaMTD524/SD融合パーキン組換えタンパク質が、比較的高い細胞/組織透過性を示すこと(図24〜27)、及びBBBを通って浸透することによって、脳組織へ効率的に送達されること(図28a〜図28c、及び図29)を確認することができた。細胞透過性パーキン組換えタンパク質の生物学的活性を決定するために、我々は、多様な機能試験を実施した。我々は、細胞透過性パーキン組換えタンパク質が、神経毒(6-OHDA及びMPP+)が引き起こすニューロンの細胞死に対する抗アポトーシス作用を有すること(図31、図32a及び図32b)、並びに神経毒(MPTP)が誘発する動きの機能不全を示すPDのマウスモデルにおいて、回復作用を示すこと(図35〜図43)を確認した。
【実施例】
【０３１２】
以下の実施例は、本発明の実施者を助けるため、本発明のための実験的サポートを提供するため、及びモデルプロトコールを提供するために提示される。これらの実施例は、本発明を制限すると解されるべきでは決してない。
【０３１３】
[実施例1]
新規進化型巨大分子伝達ドメイン(aMTD)の開発
シグナル配列のH領域(HRSP)に由来するCPP(MTS/MTM、及びMTD)は、共通配列、配列モチーフ、及び/又は共通の構造上相同な特性を有しない。この発明において、目的は、「共通の機能」を有するよう、分析したCPPと類似のメカニズムで細胞膜を超えてタンパク質が移行することを促進するよう、新たにデザインした「重大な因子」を満たす、共通配列及び構造モチーフにおいて形式化した、改善した疎水性CPPを開発することである。
【０３１４】
以下の構造モチーフ:
【０３１５】
【化６】
0006664464.tif 000048
【０３１６】
表9において、普遍的な共通配列/構造モチーフを以下の通り提供する。この発明におけるペプチドのアミノ酸長は、9〜13個のアミノ酸、大抵12個のアミノ酸の範囲にあり、組換えタンパク質変角についてのそれらの変角ポテンシャルは、ペプチドの配列の中央における(5'、6'、7'、又は8'アミノ酸における)、及び末端における(12'における)プロリンの存在並びに位置に依存する。aMTDの硬性/柔軟性についての不安定指数(II)は、II<40であり、ヒドロパシーについてのヒドロパシーの全平均(GRAVY)は、およそ2.2であり、構造特性についての脂肪族指数(AI)は、およそ200である(表9)。これらの標準化した重大な因子に基づき、この発明における、新規疎水性ペプチド配列、すなわち、進化型巨大分子伝達ドメインペプチド(aMTD)を開発し、表10〜15において要約した。
【０３１７】
[実施例2]
aMTDに融合した組換えタンパク質のための発現ベクターの構築
本発明者らの新たに開発した技術により、本発明者らは、細胞透過性組換えタンパク質を作成する方法を拡大することが可能になった。aMTD又はrペプチドと融合したヒスチジンタグ付けしたCRAタンパク質のため、発現ベクターをデザインした。組換えタンパク質のための発現ベクターを構築するために、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を考案して、それぞれのデザインした、CRAに融合したaMTD又はrペプチドを増幅させた。
【０３１８】
変性(95℃)、アニーリング(62℃)、及び伸長(72℃)をそれぞれ30秒間の35サイクルを含む、PCR反応物(ゲノムDNA100ng、各プライマー10pmol、各0.2mM dNTP混合物、1×反応バッファー、及びPfu(+)DNA polymerase(Doctor protein、韓国)2.5U)をNde I(5')とSal I(3')との間の制限酵素部位で消化した。最終伸長サイクルのため、PCR反応物を5分間72℃のままにした。次に、それらを、pET-28a(+)ベクター(Novagen、Madison、WI、米国)の部位にクローニングした。T4 DNAライゲースを4℃にて終夜使用して、DNAライゲーションを行った。これらのプラスミドを、大腸菌DH5-アルファ株のコンピテント細胞と氷上で10分間混合した。この混合物を、水浴中42℃にて90秒間ヒートショックした後、氷上に2分間置いた。次に、LBブロス培地を加えた混合物を、37℃の振盪インキュベーターにおいて1時間回復させた。形質転換体を、カナマイシン(50μg/mL)(Biopure、Johnson city、TN、米国)を含むLBブロス寒天プレートに置き、その後、37℃にて終夜インキュベーションした。1つのコロニーから、プラスミドDNAを抽出し、Nde I及びSal I制限酵素の切断後、1.2%アガロースゲル電気泳動を使用することにより、切断したDNAを645bpにて確認した(図2)。aMTD及びランダムペプチド(rペプチド)に融合したCRA組換えタンパク質のためのPCRプライマーを、表23〜30において要約する。aMTD及びrペプチドプライマーのアミノ酸配列を、表31〜38において示す。
【０３１９】
[実施例3]
aMTD及びrペプチドに融合した組換えタンパク質の誘導可能な発現、精製、並びに調製
組換えタンパク質を発現させるために、陰性対照[rペプチド38(rP38)]、参照疎水性CPP(MTM12及びMTD85)、及びaMTDに融合したCRAタンパク質の発現のためのpET-28a(+)ベクターを、大腸菌BL21(DE3)株に形質転換した。細胞を、37℃にてカナマイシン(50μg/ml)を含有するLB培地において、勢いよく振盪しながら、成長させ、0.7mM IPTG(Biopure)を加えることにより、OD600=0.6にて、2時間37℃で誘導した。誘導した組換えタンパク質を15%SDS-PAGEゲルに添加し、Coomassie Brilliant Blue(InstantBlue、Expedeon、Novexin、英国)で染色した(図3)。
【０３２０】
5,000×rpmにて10分間遠心分離することにより、大腸菌培養物を回収し、上清を廃棄した。ペレットを、溶解バッファー(50mM NaH2PO4、10mMイミダゾール、300mM NaCl、pH8.0)に再懸濁した。細胞溶解物を、氷上でプローブを備えた超音波処理器(Sonics and Materials、Inc.、Newtowen、CT、米国)を使用して超音波処理した。細胞溶解物を5,000×rpmにて10分間遠心分離して、細胞の残骸をペレット化した後、上清を、オープンカラムシステム(Bio-rad、Hercules、CA、米国)により穏やかに溶解バッファーで平衡化したNi-NTA樹脂(Qiagen、Hilden、ドイツ)とインキュベーションした。タンパク質結合樹脂を、洗浄バッファー(50mM NaH2PO4、20mMイミダゾール、300mM NaCl、pH8.0)200mlで洗浄後、結合したタンパク質を、溶出バッファー(50mM NaH2PO4、250mMイミダゾール、300mM NaCl、pH8.0)で溶出した。
【０３２１】
天然の条件下で精製した組換えタンパク質を、15%SDS-PAGEゲル上で分析し、Coomassie Brilliant Blueで染色した(図4)。組換えタンパク質の全てを、生理学的バッファー、細胞培養培地(ダルベッコ変法イーグル培地:DMEM、Hyclone、Logan、UT、米国)とダルベッコリン酸緩衝食塩水(DPBS、Gibco、Grand Island、NY、米国)の1:1混合物に対して、8時間及び終夜透析した。クローン化した316種のaMTD及び141種のrペプチドから、240種のaMTD-及び31種のrペプチド融合組換えタンパク質を誘導し、精製し、調製し、それらの細胞透過性について分析した。
【０３２２】
[実施例4]
組換えタンパク質の定量的細胞透過性の決定
定量的細胞透過性のため、aMTD-又はrペプチド融合組換えタンパク質を、製造元(Sigma-Aldrich、St. Louis、MO、米国)の指示に従い、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)にコンジュゲートした。RAW264.7細胞を、10μM FITC標識組換えタンパク質で1時間37℃にて処理し、3回冷PBSで洗浄し、0.25%トリプシン/EDTA(Sigma-Aldrich、St. Louis、MO、米国)で20分間37℃にて処理して、細胞表面に結合したタンパク質を取り除いた。これらの組換えタンパク質の細胞透過性を、FlowJoサイトメトリー分析ソフトウエアを使用してフローサイトメトリー(Guava、Millipore、Darmstadt、ドイツ)により、分析した(図5〜6)。aMTDの相対的細胞透過性を測定し、陰性対照(rP38)及び参照疎水性CPP(MTM12及びMTD85)と比較した(表31)。
【０３２３】
[実施例5]
組換えタンパク質の細胞透過性及び細胞内局在性の決定
細胞透過性の視覚的参照のため、24ウェルチャンバースライドにおけるカバーガラス上で24時間、NIH3T3細胞を培養し、10μMのFITCコンジュゲート組換えタンパク質で1時間37℃にて処理し、3回冷PBSで洗浄した。処理した細胞を、4%パラホルムアルデヒド(PFA、Junsei、Tokyo、日本)にて10分間室温で固定し、3回PBSで洗浄し、VECTASHIELD Mounting Medium(Vector laboratories、Burlingame、CA、米国)でマウントし、DAPI(4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール)で対比染色した。蛍光シグナルの細胞内局在性を、共焦点レーザー走査顕微鏡(LSM700、Zeiss、ドイツ;図7及び8)により決定した。
【０３２４】
[実施例6]
組換えタンパク質のための発現ベクターの構築
我々の新たに開発した技術、すなわち、aMTDに基づくMITTにより、細胞透過性組換えタンパク質を開発するための方法を改善するのが可能となった。発現ベクターを設計して、aMTD及び可溶化ドメインA(SDA)又は可溶化ドメインB(SDB)と融合しているパーキンタンパク質又は融合していないパーキンタンパク質を得た。組換えタンパク質のための発現ベクターを獲得するために、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を考案して、これらの組換えタンパク質を増幅した。
【０３２５】
PCR(100ngのゲノムDNA、10ピコモルの各プライマー、各0.2mMのdNTP混合物、1Xの反応緩衝液、及び2.5UのPfu(+)DNAポリメラーゼ(Doctor protein、韓国))を実施し、産物を、BamHI(5')とHindIII(3')との間の制限酵素部位において消化した;それぞれが、30秒間の変性(95℃)、30秒間のアニーリング(60℃)、及び2分間の伸長(72℃)であるサイクルを35回行った。最後の伸長サイクルについては、PCR産物を、72℃で5分間維持した。次いで、それらを、pET-28a(+)ベクター(Novagen、Madison、WI、米国)の部位中にクローニングした。T4DNAリガーゼ(NEB、米国)を使用して、DNAのライゲーションを4℃で一晩実施した。これらのプラスミドを、大腸菌DH5α及び大腸菌(BL21(DE3) codon plus RIL)株(ATCC、米国)のコンピテントな細胞と、氷上で10分間混合した。この混合物に42℃の水浴中で90秒間熱ショックを与えた後、それを氷上に2分間置いた。次いで、混合物にLBブロス培地(ELPIS、韓国)を添加し、37℃の振とうインキュベーター中で1時間かけて回収した。形質転換体を、カナマイシン(50μg/mL)を有するLBブロス寒天プレート上に蒔き、激しく振とうし、0.7mMのIPTG(Biopure、Johnson city、TN、米国)を用いて、OD600=0.6で誘発してから、37℃で一晩インキュベートした。単一コロニーから、プラスミドDNAを抽出し、BamHI制限酵素及びHindIII制限酵素(NEB、米国)により消化した後に、消化されたDNAを、1.2%のアガロースゲル電気泳動を使用することによって確認した(図18)。ヒスチジンタグが付いた(又はヒスチジンタグが付かない)、aMTD及びSDに融合させたパーキン組換えタンパク質のためのPCRプライマーを、表39及び表40に要約する。
【０３２６】
表39及び表40:ヒスチジンタグが付いたパーキンタンパク質のためのPCRプライマー
【０３２７】
【表３９】
0006664464.tif 000049
【０３２８】
【表４０】
0006664464.tif 000050
【０３２９】
[実施例7-1]
ヒスチジンタグ付きパーキン組換えタンパク質の発現及び精製
変性させた組換えタンパク質を、変性溶解緩衝液(8Mの尿素、10mMのトリス、100mMのNaH2PO4)を使用して溶解させ、Ni-NTA樹脂を添加することによって精製した。タンパク質に結合している樹脂を、30mLの変性洗浄緩衝液(8Mの尿素、10mMのトリス、20mのイミダゾール、100mMのNaH2PO4)を用いて3回洗浄した。タンパク質を、30mLの変性溶出緩衝液(8Mの尿素、10mMのトリス、250mMのイミダゾール)を用いて3回溶出した。精製の後、タンパク質を、リフォールディング緩衝液(550mMのグアニジン-HCl、440mMのL-アルギニン、50mMのトリス、100mMのNDSB、150mMのNaCl、2mMの還元型グルタチオン及び0.2mMの酸化型グルタチオン)に対して2回透析した。最後に、タンパク質を、生理的緩衝液、例えばDMEMに対して、透析量が300×105倍超に達するまで、4℃で透析した。精製したタンパク質の濃度を、ブラッドフォードアッセイを使用して、製造元の使用説明に従って定量化した。上記に示したように、タンパク質は、精製の後に、DMEMに対して透析された。最後に、IPTGによる誘発の前(-)及び後(+)の細胞可溶化液のSDS-PAGE分析を;Ni2+親和性により精製したタンパク質(P)の一定分量;並びに分子量標準物質(M)について実施して、標的タンパク質の存在を確認した(図19及び図20)。
【０３３０】
[実施例7-2]
パーキン組換えタンパク質の溶解性/収率の決定
SDA又はSDBを含有するaMTD融合パーキンタンパク質を、クローニングし、発現させ、精製し、変性条件下にある溶解性の形態として調製した。aMTD及び/又はSDに融合させたそれぞれの組換えタンパク質のそれらのサイズ(アミノ酸の数)、収率(mg/L)及び溶解性を、10%のSDS-PAGEゲル上で決定し、クーマシーブリリアントブルーを用いて染色した。溶解性を、それらの濁度(A450)を測定することによって、高度に溶解性のタンパク質であり、沈殿する傾向はほとんどない(+++++)から、概して不溶性のタンパク質(+)までの範囲に及ぶ5点評価によりスコア化した。また、それぞれの組換えタンパク質の収率(mg/L)も、生理的緩衝液の条件下において決定した。細胞透過性パーキン組換えタンパク質は、単一のバンドとして観察され、この場合、タンパク質を精製するこの手順で最終的に精製されたタンパク質の量は、最大46mg/Lであった(図19及び図20)。
【０３３１】
さらに、aMTD321に加えて、さらに選択された10個のタイプのaMTDの溶解性/収率、透過性及び生物学的活性も測定し、図22に示した。図22に示すように、aMTD524を使用するiCPパーキン組換えタンパク質が、最も優れた生物学的活性を示すことを確認することができた。
【０３３２】
aMTD-SD融合パーキン組換えタンパク質の、陰性対照(HP)と比較した相対収率、及びSDB融合パーキン組換えタンパク質(HPSB)の、陰性対照(HP)と比較した相対収率を、図21a及び図21bに示す。結果から、可溶化ドメイン(SDA及びSDB)は、HPと比較して、タンパク質の相対収率を首尾よく改善し(図21b)、HM321PSA及びHM321PSBは、カーゴタンパク質のみ(HP)と比較して、溶解性の4倍の増加を示す(図21a)ことが明らかになった。
【０３３３】
[実施例8]
ヒスチジンタグを含有しないパーキン融合タンパク質の発現及び精製
大腸菌に対してコドンが最適化され、ヒスチジンタグを含有しない、aMTDに融合している組換えパーキンタンパク質の配列もまた、特定のプライマー(表39)を用いて合成し、次いで最終的に、pET28a及びpET22b中にクローニングした。0.5〜0.7のA600まで成長させ、0.7mMのIPTGを用いて3時間誘発した大腸菌のBL21-CodonPlus(DE3)細胞中で、タンパク質を発現させた。細胞を収集し、緩衝液A(50mMのトリス-HCl;pH8.0、100mMのNaCl、0.1%のTriton X-100)中で30分間超音波処理すること(20秒間のオン/40秒間のオフ)によって破壊した。封入体を、遠心分離(5,000rpm、4Cにて30分間)により単離し、緩衝液B(50mMのトリス-HCl;pH10.0、8Mの尿素)中に溶解させて、一晩かけて変性させた。変性させた封入体を、緩衝液C(30mMのリン酸ナトリウム;pH8.0、0.02%のTween-20)に対して4℃で48時間透析して、リフォールディングさせた。不溶性の粒子を、遠心分離(9,000rpm、4μCにて30分間)により除去した。精製を、イオン交換カラムクロマトグラフィーにより、AKTA Purifier FPLCシステム(GE HealthCare、Pittsburgh、PA、米国)を用いて実施した。手短に述べると、Q-Sepharoseアニオン性カラムに、緩衝液C中のタンパク質溶液を流して、タンパク質を結合させ、緩衝液D(30mMのリン酸ナトリウム;pH8.0、30mMのNaCl)を用いて洗浄して、未結合のタンパク質を除去した。タンパク質を、溶出緩衝液E(30mMのリン酸ナトリウム;pH8.0)の塩勾配(30mM〜1MのNaCl)を用いて溶出した。全ての組換えタンパク質が、大きな単一のピークとして溶出された。タンパク質を、精製の後に、生理的緩衝液に対して透析した。
【０３３４】
[実施例9]
パーキン組換えタンパク質の細胞内送達
細胞透過性を定量化するために、aMTD/SD融合パーキン組換えタンパク質を、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)に、製造元(Sigma-Aldrich、St. Louis、MO、米国)の使用説明に従ってコンジュゲートさせた。RAW264.7細胞(ATCC、米国)を、10μMのFITC標識化組換えタンパク質を用いて37℃で1時間処置し、冷PBSを用いて3回洗浄し、プロテイナーゼK(5μg/ml)を用いて37℃で10分間処置して、細胞表面に結合しているタンパク質を除去した。これらの組換えタンパク質の細胞透過性を、フローサイトメトリー(FACS Calibur;BD、Franklin Lakes、NJ、米国)により、FlowJo分析ソフトウエアを使用して分析した(図23)。図23に、陰性対照(rPeptide38)並びにこれまでに開発した疎水性CPP(MTM12及びMTD85)の細胞透過の効力を、参照として示し、aMTD321の細胞透過の効力を、SDAのみ(HSA)の効力と視覚的に比較した。aMTD321は、陰性対照(rPeptide38)並びにこれまでに開発した疎水性CPP(MTM12及びMTD85)と比較して、細胞透過性の目覚しい改善を示すことが確認された。
【０３３５】
[実施例10]
iCP-パーキン組換えタンパク質の細胞内局在化の決定
細胞透過性を視覚的に参照するために、NIH3T3細胞(ATCC、米国)を、24ウエルチャンバーのスライド中のカバーガラス上で24時間培養し;10μMのビヒクル(培地、DMEM)、FITCのみ、FITCコンジュゲート化された陰性対照(rP38)、FITCコンジュゲート化された、これまでに開発したCPP(MTM12及びMTD85)、FITCコンジュゲート化された組換えタンパク質(FITC-HP、FITC-HPSB、FITC-HM321P、FITC-HM321PSA、FITC-HM321PSB及びFITC-M524PSB)を用いて37℃で1時間処置し;冷PBSを用いて3回洗浄した。処置した細胞を、4%のパラホルムアルデヒド(PFA、Junsei、東京、日本)中で室温にて10分間固定し、PBSを用いて3回洗浄し、核染色のための標本を、DAPI(4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール)を有するVECTASHIELD Mounting培地(Vector laboratories、Burlingame、CA、米国)を用いて処置した。蛍光シグナルの細胞内局在化を、同じ細胞について、共焦点レーザー走査顕微鏡法(上)及びNomarski干渉顕微鏡画像(LSM700、Zeiss、ドイツ)(下)により決定した(図24)。図24に示すように、aMTD321及びaMTD524が、これまでに開発したCPP(MTM12及びMTD85)と比較して優れた細胞透過性を示し、それらをSDと融合させると、透過性はさらに改善されることを確認した。
【０３３６】
[実施例11-1]
パーキン組換えタンパク質のin vivoにおける送達のPBMC中での決定
in vivoにおける送達を決定するために、ICRマウス(5週齢、雌)に、FITCのみ又はFITCコンジュゲート化タンパク質(FITC-HPSB及びFITC-HM321PSB)の腹腔内注射(IP、600μg/頭部)を行った。15分及び30分後に、末梢血単核球(PBMC)を、マウスの全血から単離し、フローサイトメトリー(BD、GUABA)により分析した(図25)。図25に示すように、aMTD/SD融合組換えタンパク質は、in vivoにおける優れた細胞透過性を示した。
【０３３７】
[実施例11-2]
パーキン組換えタンパク質のin vitroにおける送達のRAW264.7細胞及びNIH3T3細胞中での決定
in vitroにおける送達を決定するために、RAW264.7細胞を、FITCコンジュゲート化されたパーキン組換えタンパク質(FITC-HP、FITC-HM321P、FITC-HM321PSA、FITC-HM321PSB、及びFITC-M524PSB)10μMと共に、37℃で1時間インキュベートし(図26)、NIH3T3細胞を、FITCコンジュゲート化され、aMTD321配列を有するパーキン組換えタンパク質、又はFITCコンジュゲート化され、aMTD321配列を欠くパーキン組換えタンパク質(FITC-HPSB、及びFITC-HM321PSB)10μMと共に、37℃で1時間インキュベートした(図26)。
【０３３８】
等モル濃度の非コンジュゲート化FITC(FITCのみ)又はビヒクル(培地、DMEM)を、細胞に関連するが、内部移行していないタンパク質を除去するように処置し、フローサイトメトリーにより分析した(図26)。
【０３３９】
図26に示すように、パーキンタンパク質をSDのみと融合させた場合、細胞透過性の大きな変化はなかった。対照的に、細胞透過性が、aMTDのみの融合により、SDの有無に関わらず、改善されることが見出され、これは、aMTD配列の付加により細胞透過性の改善がもたらされ、SD配列の付加により組換えタンパク質の親水性の特性が最大化され、それにより細胞透過性の著しい改善をもたらしたことを示している。
【０３４０】
[実施例12]
in vivoにおけるパーキン組換えタンパク質の組織透過性の決定
組織透過性を視覚的に参照するために、希釈剤、FITCのみ、並びに30mg/kgのFITC標識化パーキン組換えタンパク質(FITC-HP、FITC-HPSB、FITC-HM321P、FITC-HM321PSA、FITC-HM321PSB、及びFITC-M524PSB)を、ICRマウス(5週齢、雌)に腹腔内注射した。2時間後に、マウスを屠殺し、肝臓、腎臓、脾臓、肺、心臓及び脳を単離し、OCT化合物(Sakura、Alphen anden Rijn、オランダ)を用いて包埋し、凍結し、次いで、20μmの厚さに切片化した。ガラス上に組織の標本を固定し、蛍光顕微鏡法(Nikon、東京、日本)により観察した(図27)。図27に示すように、aMTD/SD融合組換えパーキンタンパク質は、組織内に効率的に送達されることが確認された。
【０３４１】
[実施例13]
脳におけるパーキン組換えタンパク質の検出
免疫組織化学的検査のために、6週齢の雌のICRマウスに、希釈剤(PBS)又は600μgのヒスチジンタグ付きパーキン組換えタンパク質を腹腔内注射した。2時間後、マウスを、0.9%のNaClを用いて灌流し、4%の冷パラホルムアルデヒドを用いて固定した。脳を取り出した後、4%のパラホルムアルデヒドを用いて後固定し、30%のスクロースに移した。凍結しているミクロトームを使用して、脳を30μmの冠状切片に切断した。脳の凍結切片(30μm)を、抗パーキンモノクローナル抗体(1:100、Santa Cruz Biotechnology)、続いて、ビオチンコンジュゲート化ヤギ抗マウス二次抗体(Vector Laboratories)を用いて免疫染色し、Avidin-Biotin Complexキット(Vectastainキット、Vector Laboratories)を用いて発色させた。ウエスタンブロット分析のために、タンパク質を用いて処置したマウスを、0.9%のNaClを用いて灌流した。脳を単離し、線条体領域を解体し、溶解緩衝液(Intron、Seongnam、韓国)中でホモジナイズした。遠心分離(13,000rpm、4℃にて10分間)から得られた上清を、パーキン(1:200)及びβ-アクチン(1:2,000)に対する抗体を用いて探索するウエスタンブロットにより分析する。二次抗体は、ヤギ抗マウスIgG-HRPである(抗体は全て、Santa Cruz Biotechnology製であった)(図28a)。
【０３４２】
詳細に述べると、iCP-パーキン組換えタンパク質がどれだけ脳の神経細胞中に存在するかを調べるために、マウスを、FITC標識化されたHPSB及びHM524PSBの静脈内注射から10分、1、2、4、8、12、16及び24時間後に屠殺した。次いで、脳の神経細胞を分離し、それらの蛍光強度を、フローサイトメトリーにより測定し、図28bに示した。この図に示すように、最も高い値が、iCP-パーキン組換えタンパク質の注射の2時間後に測定され、それは約8時間まで維持され、12時間で減少し、その後、24時間まで一定に維持された。
【０３４３】
さらに、この実験から得られた脳組織を凍結切片(20μm)化して、組織切片を得、ここで蛍光の分布を、蛍光顕微鏡下で調べ、図28cに示した。この図に示すように、FITC標識化タンパク質が、aMTDの存在下においてのみ、神経細胞の形状で観察され、このことは、iCP-パーキンが、BBBを通過して、脳の神経細胞を透過することを示した。
【０３４４】
さらに、脳への、aMTDが媒介するパーキン組換えタンパク質の送達を、免疫ブロットにより調べ、図29に示した。図29は、小脳におけるパーキン組換えタンパク質の免疫ブロットを示す。希釈剤単独、又はaMTDを有さないか若しくはaMTD配列を欠く、ヒスチジンタグを付けたパーキン組換えタンパク質の600μgのIP(腹腔内)注射の2時間後の小脳を通る矢状切片を、抗パーキン抗体(1:100、Santa Cruz Biotechnology)を用いて免疫染色した。
【０３４５】
図28a〜図28c及び図29に示すように、大量のパーキンタンパク質を、本発明のHM321PSB及びHM524PSBを注射したマウスの脳において、HPSBを注射した脳と比較して検出し、このことは、iCP-パーキン組換えタンパク質が、BBBを通過し、本発明の組換えタンパク質が、in vivoにおいて優れた血液脳関門透過性を示すことを示した。
【０３４６】
[実施例14-1]
E3リガーゼ活性の評価
製造元の使用説明に従って実施する自己ユビキチン化アッセイ(Boston Biochem)を使用することによって、パーキンE3リガーゼ活性を測定した。手短に述べると、1μgの精製したパーキンタンパク質を、0.1μMのE1、1μMのE2、50μMのユビキチン、及び10μMのMg-ATPと37℃で1時間反応させ、続いて、ウエスタンブロットを、抗ユビキチン抗体(1:1,000、Enzo Life Science)用いて行った。図30に示すように、本発明のiCP-パーキン組換えタンパク質は、(自己)ユビキチン化活性を示し、このことは、それらがE3リガーゼ活性を有することを示した。
【０３４７】
[実施例14-2]
神経細胞中のパーキン組換えタンパク質の抗アポトーシス作用
末端dUTPニック末端標識(TUNEL)アッセイを、製造元(Roche)の使用説明に従って実施する。マウスドーパミン作動性ニューロン(CATH.a)細胞(ATCC:American Type Culture Collection)を、(3×104個/ウエルで)播種し、70%のコンフルエンスのCATH.a細胞を、50μMの6-ヒドロキシドーパミン(6-OHDA、アゴニスト)を用いて、37℃で1時間前処置し、続いて、2.5μMのHP、パーキン組換えタンパク質(HM321P、HM321PSA、又はHM321PSB)を用いて、37℃で2.5時間処置し、アポトーシスについて、TUNEL染色により評価する。また、ヒト脳腫瘍(SH-SY5Y)細胞(Korea Cell Line Bank)も培養し、(3×104個/ウエルで)播種し、70%のコンフルエンスのSH-SY5Y細胞を、100μMの6-ヒドロキシドーパミン(6-OHDA、アゴニスト)を用いて、6時間前処置し、続いて、2.5μMのHP、パーキン組換えタンパク質(HM321P、HM321PSA、又はHM321PSB)を用いて、37℃で2.5時間処置し、アポトーシスについて、TUNEL染色により評価した。多くのaMTDsを、生物学的活性試験に同じ様式で付し、細胞死を、TUNEL染色及びアネキシンV染色により調べた。
【０３４８】
M524PSBの用量依存性を試験するために、70%のコンフルエンスのSH-SY5Y細胞を、1mMのMPP+(1-メチル-4-フェニルピリジニウム)及び異なる濃度のM524PSBを用いて24時間同時処置し(co-treated)、細胞死を、TUNELアッセイ、並びに抗Bcl2抗体(Santa cruz、sc-7382)及び抗カスパーゼ3抗体(Cell signaling、9665)を用いるウエスタンブロットアッセイにより分析した。
【０３４９】
図31及び図32に示すように、iCP-パーキン組換えタンパク質処置群は、優れた抗アポトーシス作用を示して、ドーパミン作動性神経細胞に対する保護作用を有することが示された。aMTD524/SD融合パーキン組換えタンパク質による処置も、類似する結果を示し(図32a、下)、特に、図32bに示すように、SH-SY5Y細胞のアポトーシスを、神経毒のMPP+(1-メチル-4-フェニルピリジニウム)による処置によって誘発し、次いで、M524PSBをその濃度を変更しながら処置すると、神経細胞に対する抗アポトーシス作用が、用量依存性の様式で観察された。分子レベルでは、抗アポトーシスのバイオマーカーであるBcl2の発現が、M524PSBにより維持され、一方、アポトーシス促進性のバイオマーカーのカスパーゼ3の発現は抑制されることが確認された(図32b)。
【０３５０】
[実施例14-3]
α-シヌクレイン凝集体の分解の評価
静置インキュベーター中で、1mg/mlのα-シヌクレイン(ATGEN番号:SNA2001)を37℃で5週間凝集させることによって、α-シヌクレインオリゴマーを生成した。ヒト脳腫瘍(SH-SY5Y)細胞(Korea Cell Line Bank)を培養し、(3×105個/ウエルで)播種し、アポトーシスを誘発するために、1μMの凝集させたα-シヌクレインオリゴマーを用いて2時間前処置し、続いて、10μMのパーキン組換えタンパク質により、37℃で24時間同時処置し、トリパンブルー染色した後、変化を、細胞計数により分析した。
【０３５１】
タンパク質を、ブラッドフォードアッセイにより定量化し、次いで化学発光検出(Ez-Western Lumi Femto、DOGEN番号:DG-WF200)を、ウエスタンブロット上で、一次抗α-シヌクレイン抗体(1:200、Santa cruz番号:sc-7011-R)、二次抗ウサギIgG HRP連結抗体(1:5000、Cell signaling番号:7074S)を使用して実施した(図33)。図33に示すように、本発明のiCP-パーキン組換えタンパク質は、優れた神経細胞保護作用及びα-シヌクレイン分解作用を示すことが確認された。
【０３５２】
[実施例15]
MPTP誘発パーキンソン病マウスモデル及び治療プロトコール
8週齢のC57BL/6マウス、雄及び雌を、温度及び湿度を制御した室内のプラスチックケージ中で、12時間の明所/12時間の暗所のサイクルにて飼育した。4つの実験の群(希釈剤、MPTPのみ、MPTP+HPSB、及びMPTP+HM321PSB又はMPTP+M524PSB)のうちの1つに、マウスを無作為に割り当てた。急性MPTP誘発PDモードについては、希釈剤の群を除く3つの群のマウスに、MPTPの腹腔内注射(15mg/kg、×3回/日、2時間間隔)を連続して3日間投与した。神経毒の1-メチル-4-フェニル-1,2,3,6-テトラヒドロピリジン(Sigma-Aldrich、St. Louis、MO)を、0.9%のNaCl中に溶解させた。対照は、0.9%のNaClを用いて、同じ期間にわたり処置した。3日後に、MPTP+HPSB群及びMPTP+HM321PSB群のマウスにそれぞれ、HPSB、HM321PSB組換えタンパク質の腹腔内注射(600μg /頭部、1回/日)を連続して5日間投与した。亜急性MPTP誘発PDモードについては、MPTP(30mg/kg/日)を、5日間腹腔内注射し、タンパク質(HPSB、HM321PSB)の注射を、9日目に開始し、5日間続けた。亜慢性MPTP誘発PDモードについては、MPTP(20mg/kg、×4回/日、2時間間隔)を1日腹腔内注射し、タンパク質(HPSB、M524PSB)の注射を、36日目に開始し、5日間続けた。尿及び脳のドーパミンレベル、全体的な運動機能、及び脳の病変(TH免疫染色)を、図34に示す後の日に分析した。我々は、動物実験が、Institutional Animal Care and Use Committeeのガイドラインに従って実施されることを確認している。(図34〜図42b)。
【０３５３】
[実施例16]
パーキン組換えタンパク質を用いて処置したMPTP-PD動物モデルの尿中のドーパミンの測定
合成されたドーパミンを尿中で測定するために、我々は、パーキン組換えタンパク質の処置の第1日目の10時間後に、全ての群のマウスの尿を収集した。尿中で合成されたドーパミンを、製造元(GenWay、San Diego、CA、米国)が提供する使用説明に従って市販のELISAキットを使用することによって測定した。手短に述べると、ウサギ抗ドーパミン抗体を、尿又は組織抽出物に添加し、免疫複合体を、ヤギ抗ウサギ抗体を用いてコートしたウエル中に回収した。異なるエピトープに対する、第2の、酵素コンジュゲート化抗ドーパミン抗体により、検量線に対して比較した場合の抗原の量に比例する反応産物が生じる。
【０３５４】
HPSB及びHM321PSBによるタンパク質処置の10時間後に、MPTPによる病変を有するマウスにおける尿のドーパミンレベルを、ELISAにより測定した。スチューデントの対応のある2標本t検定により、群間の実験の差を評価した(*p<0.05) (図35)。
【０３５５】
図35に示すように、不十分なドーパミンの分泌が、ドーパミンニューロンのアポトーシスにより引き起こされたが、尿のドーパミンレベルは、iCPパーキン組換えタンパク質の投与により増加し、このことは、本発明のiCPパーキン組換えタンパク質が、ドーパミンの分泌を改善させることを示した。
【０３５６】
[実施例17]
パーキン組換えタンパク質を用いて処置したMPTP-PD動物モデルの、脳中のドーパミンの測定
脳中で合成されたドーパミンを測定するために、我々は、パーキン組換えタンパク質の処置の8日目の10時間後に、全ての群のマウスの脳を収集した。
【０３５７】
脳抽出物中の合成されたドーパミンを、製造元(GenWay、San Diego、CA)が提供する使用説明に従って市販のELISAキットを使用することによって測定した。手短に述べると、ウサギ抗ドーパミン抗体を、尿又は組織抽出物に添加し、免疫複合体を、ヤギ抗ウサギ抗体を用いてコートしたウエル中に回収した。異なるエピトープに対する、第2の酵素コンジュゲート化抗ドーパミン抗体により、検量線に対して比較した場合の抗原の量に比例する反応産物が生じる。
【０３５８】
図34に示す様に、病変を有したが、タンパク質処置を行わなかったマウス、又は病変を有し、HM321PSBを用いて毎日処置した後のマウスにおいて、線条体生検中のドーパミンレベルを、ELISAにより決定する。4匹のマウスの群のドーパミンレベルを、平均±S.D.として示す。スチューデントの対応のある2標本t検定により、群間の実験の差を評価した(*p<0.05) (図36)。
【０３５９】
図36に示すように、脳中のドーパミンレベルが、iCPパーキン組換えタンパク質の投与により増加し、このことは、本発明のiCPパーキン組換えタンパク質が、ドーパミンの分泌を改善させることを示した。
【０３６０】
[実施例18]
パーキン組換えタンパク質を用いて処置したMPTP-PD動物モデルの、運動活動の水泳試験を用いる評価
MPTPによる病変を有するマウスの全体的な運動機能を、水泳試験を使用することによって評価する。MPTPによる最後の処置から9時間後にマウスを、600μgのタンパク質(IP、HPSB又はHM321PSB)を用いて3時間処置し、タンパク質処置の24時間後に、運動能力を、マウスを37℃の水浴中に入れ、その後の動きを映像により記録することによって評価した。各処置群中のマウスが四つ足運動に従事した時間のパーセントを、平均±S.D.として示す。各群中のマウスの数を、以下に示す:希釈剤、12匹;MPTPのみ、7匹;MPTP+HPSB、14匹;MPTP+HM321PSB、12匹。
【０３６１】
無病変のマウスは、98%の時間を、四つ足全てを使用して泳いだ。各群(MPTPのみ、MPTP+HPSB、又はMPTP+HM321PSB)が(四つ足で)泳いで過ごした時間のパーセントを測定し、無病変の希釈剤対照のパーセントとして表す。スチューデントの対応のある2標本t検定により、群間の実験の差を評価した(*p<0.05)(図37)。
【０３６２】
図37に示すように、MPTP処置が引き起こした運動機能不全が、iCPパーキン組換えタンパク質により処置することによって回復することが確認された。
【０３６３】
[実施例19]
パーキン組換えタンパク質を用いて処置したMPTP-PD動物モデルの、歩行運動試験及びロータロッド試験を用いる運動活動の評価
19-1.歩行運動試験
マウスを、10cmの高い壁を有する、長さ50cm、幅10cmの通路に沿って、閉鎖型のボックス内に歩行させた。足跡の分析において歩行の進行の方向(DoP)を示す点線を用いて測定したパラメータを示す。MPTPによる病変を有するマウスの足跡を、歩幅の長さ(cm)及びふらつきの長さ(cm)について評価した(図38)。歩幅の長さ及びふらつきの長さを、歩幅間及びふらつき間それぞれの前方への動きの平均距離として測定した。ヒストグラムは、差を示し、ここでは、4匹のマウスの群における歩幅の長さ及びふらつきの長さを、平均±S.D.として示す。スチューデントの対応のある2標本t検定により、群間の実験の差を評価した(*p<0.05)(図39及び図40)。
【０３６４】
図38〜図40に示すように、運動活動が、MPTP処置により失われ、したがって、歩幅のパターンさえ観察されず、一方、iCPパーキン組換えタンパク質処置群は、運動活動の99%の回復を示し、正常な歩幅のパターンを維持することが確認された。
【０３６５】
19-2.ロータロッド試験
この実験のために、マウスを、MPTP注射の前に、15rpmのスピードで10分間3回トレーニングした。この実験では、MPTP注射の後に、マウスを、ロータロッド上に10分間置き、この間に、スピードを4rpmから30rpmまで加速させ、マウスが転倒するまでロータロッド上に留まる時間を測定した。この手順を、3回繰り返した。全て試験を、ビデオカメラを用いて記録した。
【０３６６】
図41に示すように、運動活動は、MPTPによる処置によって、80%以上低下するが、iCPパーキン組換えタンパク質による処置によって、ほとんど正常レベルまで回復することが確認された。
【０３６７】
[実施例20]
チロシンヒドロキシラーゼの発現の回復
図34に示すように、MPTMによる病変を有するマウスを、パーキン組換えタンパク質(IP、30mg/kg)を用いて5日間処置した。パーキン組換えタンパク質処置の最後の日に、マウスを、0.9%のNaClを用いて灌流し、4%の冷パラホルムアルデヒドを用いて固定した。次いで、脳を取り出し、4%のパラホルムアルデヒドを用いて後固定し、30%のスクロースに移した。凍結しているミクロトームを使用して、脳を30μmの冠状切片に切断した。脳内のドーパミン作動性神経細胞のマーカーであるチロシンヒドロキシラーゼ(TH)を、抗THモノクローナル抗体(1:50、Thermo Scientific、Rockford、米国)、続いて、ビオチン-コンジュゲート化ヤギ抗ウサギ二次抗体(1:100、Santa Cruz Biotechnology、Santa cruz、CA)を用いて免疫染色し、ABCキット(Vectastainキット、Vector laboratories、Burlingame、CA)を用いて発色させた(図42a)。各処置群のTH陽性細胞のパーセントを計算した。スチューデントの対応のある2標本t検定により、群間の実験の差を評価した(*p<0.05)(図42b)。
【０３６８】
図34の手順に従って調製した亜急性MPTP PDモデルにおいて、TH発現を、ウエスタンブロッティングにより測定し、その結果、THレベルが、iCP-パーキン組換えタンパク質により回復することが見出された(図43)。詳細に述べると、脳を取り出し、Pro-Prep(Intron、17081)を用いてホモジナイズし、上清を、13,000rpmで4℃にて10分間遠心分離することによって得た。こうして得られた上清中のタンパク質を、ブラッドフォードアッセイを使用して定量化し、SDS-PAGEを、10μgのタンパク質を使用して実施した。
【０３６９】
パーキン(1:200、Santa cruz、カタログ番号:32282)、チロシンヒドロキシラーゼ(TH、1:2000、Millipore、カタログ番号:AB152)、β-アクチン(1:5000、Cell signaling、カタログ番号:4967S)を、一次抗体として使用し、抗マウスIgG-HRP様抗体(Cell signaling、カタログ番号:7074s)、及び抗ウサギIgG-HRP様抗体(Cell signaling、カタログ番号:7076s)を、二次抗体として使用した。ブロッキングを、5%のBSAを用いて、室温で1時間実施し、一次抗体を添加し、4℃で16時間以上又は室温で3時間反応させた。TBS-T(10mMのトリス-HCl;pH8.0、50mMのNaCl、0.05%のTween-20)を用いて洗浄してから、二次抗体による処置を、室温で1時間行い、続いて、TBS-Tを用いて洗浄した。化学発光の検出のために、観察及び分析を、ECL(Enhanced Chemiluminescence)を使用して実施した。全ての実験群において、内因性パーキンの発現の大きな変化は観察されなかった。
【０３７０】
図42a及び図42bに示すように、MPTPのみを用いて処置したマウスにおける活性化されたドーパミン分泌細胞の数は、正常対照群の10%であり、一方、MPTP処置の後にiCP-パーキン組換えタンパク質を注射した実験群における活性化されたドーパミン分泌細胞の数は、正常対照群の60%であった。さらに、本発明の組換えタンパク質の神経細胞の回復作用も、用量依存性の様式で観察された(図42a、下)。こうして、本発明のiCP-パーキン組換えタンパク質は、脳組織の血液脳関門を有効に通過して、ドーパミン分泌細胞の約50%を活性化し、したがって、本発明の組換えタンパク質は、MPTPが誘発した脳の細胞死に対して優れた脳細胞の保護作用を有することが確認された。
【０３７１】
[実施例21]
統計学的分析
培養細胞を使用した実験データは全て、少なくとも3回の独立した実験についての平均±S.D.として表す。スチューデントの両側t検定又は分散分析法を使用して、統計学的有意性を評価する。スチューデントの対応のあるt検定を使用して、群間の実験の差を評価する。動物実験については、分散分析を使用し、群間及び群内で比較して、有意性を決定する。p<0.05を有する差を、統計学的に有意であるとみなす。
【０３７２】
本発明が関係する分野における当業者であれば、本発明を、その必須の特徴から逸脱することなく、種々の形態で実行することができることを理解するであろう。したがって、開示する実施形態は、限定的なものではなく、全ての面において例示的なものであることを理解すべきである。本発明の範囲は、上記の説明ではなく、添付の特許請求の範囲によりなされ、したがって、特許請求の範囲の均等物の範囲内にある全ての変更形態は、そこに包含されることが意図される。
本発明に含まれる様々な態様を以下に示す。
１．パーキンタンパク質、及び9〜13個のアミノ酸配列で構成され、細胞又は組織に対する改善された透過性を有する進化型巨大分子導入ドメイン(aMTD)を含む、iCP(細胞透過性が改善された)パーキン組換えタンパク質であって、
aMTDが、パーキンタンパク質の一方の末端又は両方の末端に融合しており、以下の特徴：
(a)Ala、Val、Ile、Leu及びProからなる群から選択される、3つ以上のアミノ酸配列で構成されており、
(b)そのアミノ酸配列の5位〜8位及び12位のうちの任意の1つ以上に対応するアミノ酸配列として、プロリンを有し、
(c)Protparamにより測定する場合に、40〜60の不安定指数、180〜220の脂肪族指数、及び2.1〜2.6のヒドロパシーの全平均(GRAVY)を有する
を有する、
iCPパーキン組換えタンパク質。
２．1つ以上の可溶化ドメイン(SD)が、パーキンタンパク質及びaMTDのうちの1つ以上の末端にさらに融合している、上記1に記載のiCPパーキン組換えタンパク質。
３．aMTDがα-へリックス構造を有する、上記1に記載のiCPパーキン組換えタンパク質。
４．aMTDが、12個のアミノ酸配列で構成されており、以下の一般式:
[一般式]
【化７】
0006664464.tif 000051
[式中、Xは独立に、アラニン(A)、バリン(V)、ロイシン(L)又はイソロイシン(I)を指し、プロリン(P)は、U(5'、6'、7'又は8'のうちのいずれか)のうちの1つにおいて位置することができ、残りのUは独立に、A、V、L又はIで構成されており、12'のPは、プロリンである]
により示される、
上記1に記載のiCPパーキン組換えタンパク質。
５．以下の構造式のいずれか１つ:
A-B-C及びA-C-B-C
[式中、Aは、細胞又は組織に対する改善された透過性を有する進化型巨大分子導入ドメイン(aMTD)であり、Bは、パーキンタンパク質であり、Cは、可溶化ドメイン(SD)であり、
aMTDが、9〜13個のアミノ酸配列で構成されており、以下の特徴：
(a)Ala、Val、Ile、Leu及びProからなる群から選択される、3つ以上のアミノ酸配列で構成されており、
(b)そのアミノ酸配列の5位〜8位及び12位のうちの任意の1つ以上に対応するアミノ酸配列として、プロリンを有し、
(c)Protparamにより測定する場合に、40〜60の不安定指数、180〜220の脂肪族指数、及び2.1〜2.6のヒドロパシーの全平均(GRAVY)を有し、
(d)α-へリックス構造を有する
を有する]
により示される、iCPパーキン組換えタンパク質。
６．パーキンタンパク質が、配列番号814のアミノ酸配列を有する、上記1又は上記5に記載のiCPパーキン組換えタンパク質。
７．パーキンタンパク質が、配列番号815のポリヌクレオチド配列によりコードされる、上記6に記載のiCPパーキン組換えタンパク質。
８．パーキンタンパク質が、細胞、組織又は臓器の受容体に選択的に結合するリガンドをさらに含む、上記1又は上記5に記載のiCPパーキン組換えタンパク質。
９．aMTDが、配列番号1〜240からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、上記1又は上記5に記載のiCPパーキン組換えタンパク質。
１０．aMTDが、配列番号241〜480からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列によりコードされる、上記9に記載のiCPパーキン組換えタンパク質。
１１．SDが、配列番号798、799、800、801、802、803及び804からなる群から独立に選択されるアミノ酸配列を有する、上記2又は上記5に記載のiCPパーキン組換えタンパク質。
１２．SDが、配列番号805、806、807、808、809、810及び811からなる群から独立に選択されるポリヌクレオチド配列によりコードされる、上記11に記載のiCPパーキン組換えタンパク質。
１３．その一方の末端に融合したヒスチジンタグ親和性ドメインをさらに有する、上記1又は上記5に記載のiCPパーキン組換えタンパク質。
１４．ヒスチジンタグ親和性ドメインが、配列番号812のアミノ酸配列を有する、上記13に記載のiCPパーキン組換えタンパク質。
１５．ヒスチジンタグ親和性ドメインが、配列番号813のポリヌクレオチド配列によりコードされる、上記14に記載のiCPパーキン組換えタンパク質。
１６．融合が、ペプチド結合又は化学的な結合を介して形成される、上記1又は上記5に記載のiCPパーキン組換えタンパク質。
１７．パーキンソン関連疾患の治療又は予防のために使用される、上記1又は上記5に記載のiCPパーキン組換えタンパク質。
１８．上記1に記載のiCPパーキン組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列。
１９．配列番号816又は配列番号822により示される、上記18に記載のポリヌクレオチド配列。
２０．上記5に記載のiCPパーキン組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列。
２１．配列番号818、824、828、830及び832からなる群から選択される、上記20に記載のポリヌクレオチド配列。
２２．上記18又は上記20に記載のポリヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクター。
２３．上記22に記載の組換え発現ベクターを用いて形質転換された形質転換体。
２４．上記1又は上記5に記載のiCPパーキン組換えタンパク質の調製方法であって、
上記22に記載の組換え発現ベクターを調製するステップと、
組換え発現ベクターを使用して、形質転換体を調製するステップと、
形質転換体を培養するステップと、
培養のステップにより発現した組換えタンパク質を回収するステップと
を含む調製方法。
２５．上記1又は上記5に記載のiCPパーキン組換えタンパク質を活性成分として含む組成物。
２６．パーキンソン関連疾患を治療又は予防するための医薬組成物であって、活性成分としての、上記1又は上記5に記載のiCPパーキン組換えタンパク質、及び薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物。
２７．パーキンソン関連疾患を治療又は予防するための医薬品としての、上記1又は上記5に記載のiCPパーキン組換えタンパク質の使用。
２８．上記1又は上記5に記載のiCPパーキン組換えタンパク質を含む医薬品。
２９．パーキンソン関連疾患を治療又は予防するための医薬品の調製ための、上記1又は上記5に記載のiCPパーキン組換えタンパク質の使用。
３０．対象においてパーキンソン関連疾患を治療又は予防する方法であって、
パーキンソン関連疾患の治療又は予防を必要とする対象を同定するステップと、
治療有効量の上記1又は上記5に記載のiCPパーキン組換えタンパク質を対象に投与するステップと
を含む方法。
【図１】
0006664464.tif 000052
【図２ａ】
0006664464.tif 000053
【図２ｂ】
0006664464.tif 000054
【図２ｃ】
0006664464.tif 000055
【図３ａ】
0006664464.tif 000056
【図３ｂ】
0006664464.tif 000057
【図３ｃ】
0006664464.tif 000058
【図３ｄ】
0006664464.tif 000059
【図４ａ】
0006664464.tif 000060
【図４ｂ】
0006664464.tif 000061
【図５ａ】
0006664464.tif 000062
【図５ｂ】
0006664464.tif 000063
【図５ｃ】
0006664464.tif 000064
【図５ｄ】
0006664464.tif 000065
【図５ｅ】
0006664464.tif 000066
【図５ｆ】
0006664464.tif 000067
【図５ｇ】
0006664464.tif 000068
【図５ｈ】
0006664464.tif 000069
【図５ｉ】
0006664464.tif 000070
【図５ｊ】
0006664464.tif 000071
【図５ｋ】
0006664464.tif 000072
【図５ｌ】
0006664464.tif 000073
【図５ｍ】
0006664464.tif 000074
【図５ｎ】
0006664464.tif 000075
【図５ｏ】
0006664464.tif 000076
【図５ｐ】
0006664464.tif 000077
【図５ｑ】
0006664464.tif 000078
【図５ｒ】
0006664464.tif 000079
【図５ｓ】
0006664464.tif 000080
【図５ｔ】
0006664464.tif 000081
【図５ｕ】
0006664464.tif 000082
【図６ａ】
0006664464.tif 000083
【図６ｂ】
0006664464.tif 000084
【図６ｃ】
0006664464.tif 000085
【図７ａ】
0006664464.tif 000086
【図７ｂ】
0006664464.tif 000087
【図７ｃ】
0006664464.tif 000088
【図７ｄ】
0006664464.tif 000089
【図７ｅ】
0006664464.tif 000090
【図７ｆ】
0006664464.tif 000091
【図７ｇ】
0006664464.tif 000092
【図７ｈ】
0006664464.tif 000093
【図７ｉ】
0006664464.tif 000094
【図７ｊ】
0006664464.tif 000095
【図７ｋ】
0006664464.tif 000096
【図８】
0006664464.tif 000097
【図９ａ】
0006664464.tif 000098
【図９ｂ】
0006664464.tif 000099
【図９ｃ】
0006664464.tif 000100
【図１０ａ】
0006664464.tif 000101
【図１０ｂ】
0006664464.tif 000102
【図１０ｃ】
0006664464.tif 000103
【図１１ａ】
0006664464.tif 000104
【図１１ｂ】
0006664464.tif 000105
【図１１ｃ】
0006664464.tif 000106
【図１２】
0006664464.tif 000107
【図１３ａ】
0006664464.tif 000108
【図１３ｂ】
0006664464.tif 000109
【図１４ａ】
0006664464.tif 000110
【図１４ｂ】
0006664464.tif 000111
【図１５ａ】
0006664464.tif 000112
【図１５ｂ】
0006664464.tif 000113
【図１６】
0006664464.tif 000114
【図１７】
0006664464.tif 000115
【図１８】
0006664464.tif 000116
【図１９】
0006664464.tif 000117
【図２０】
0006664464.tif 000118
【図２１】
0006664464.tif 000119
【図２２】
0006664464.tif 000120
【図２３】
0006664464.tif 000121
【図２４】
0006664464.tif 000122
【図２５】
0006664464.tif 000123
【図２６】
0006664464.tif 000124
【図２７】
0006664464.tif 000125
【図２８ａ】
0006664464.tif 000126
【図２８ｂ】
0006664464.tif 000127
【図２８ｃ】
0006664464.tif 000128
【図２９】
0006664464.tif 000129
【図３０】
0006664464.tif 000130
【図３１】
0006664464.tif 000131
【図３２ａ】
0006664464.tif 000132
【図３２ｂ】
0006664464.tif 000133
【図３３】
0006664464.tif 000134
【図３４】
0006664464.tif 000135
【図３５】
0006664464.tif 000136
【図３６】
0006664464.tif 000137
【図３７】
0006664464.tif 000138
【図３８】
0006664464.tif 000139
【図３９】
0006664464.tif 000140
【図４０】
0006664464.tif 000141
【図４１】
0006664464.tif 000142
【図４２ａ】
0006664464.tif 000143
【図４２ｂ】
0006664464.tif 000144
【図４３】
0006664464.tif 000145
【配列表】
0006664464000001.app