(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療有効量の小孔形成ポリエン・マクロライドを含む、対象においてイオンチャネルの発現の低下又は機能の低下によって特徴付けられる疾患又は状態を治療するための組成物であって、
前記小孔形成ポリエン・マクロライドは、アムホテリシンＢ（ＡｍＢ）、ナイスタチン、ナタマイシン、カンジシジン、及びメパルトリシン、並びにそれらの任意の組合せからなる群より選択され、
前記疾患又は状態は、発作性運動失調症、脊髄小脳失調症１３型、ＱＴ延長症候群、ブルガダ症候群、高カリウム血性周期性四肢麻痺、及びカリウム惹起性ミオトニーからなる群より選択される、組成物。
【請求項２】
前記疾患又は状態が、発作性運動失調症、脊髄小脳失調症１３型、ＱＴ延長症候群、及びブルガダ症候群からなる群より選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記疾患又は状態が、高カリウム血性周期性四肢麻痺、又はカリウム惹起性ミオトニーである、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記対象が、感染症の治療のために前記小孔形成ポリエン・マクロライドの投与を受けていない、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記小孔形成ポリエン・マクロライドがアムホテリシンＢ（ＡｍＢ）である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記小孔形成ポリエン・マクロライドが、サッカロミセス・セレビシエの最小発育阻止濃度未満の用量で投与される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
前記小孔形成ポリエン・マクロライドが全身投与される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
前記小孔形成ポリエン・マクロライドが、前記対象の気道に投与される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
前記小孔形成ポリエン・マクロライドが、前記対象の気道にエアロゾルとして投与される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記対象がヒトである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記ヒトが１２歳未満である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記ヒトが１２歳以上である、請求項１０に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本出願は、２０１４年１１月４日出願の米国仮特許出願第６２／０７４，８７８号に対する優先権の利益を主張する。
【政府の支援】
【０００２】
本発明は、アメリカ国立衛生研究所によって承認された許可番号第ＧＭ０８０４３６号の下、米国政府の支援により成された。米国政府は本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
嚢胞性線維症は、多臓器系、とりわけ肺及び消化器系に影響を及ぼす、広く知られた常染色体劣性遺伝子疾患である。この疾患は、出生数３，０００人に対して１人の割合で発症し、脊椎動物における膜発現塩化物チャネルタンパク質である嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）をコードするＣＦＴＲ遺伝子における突然変異を原因とする。慢性かつ死に至る可能性がある呼吸器感染によって典型的には特徴づけられるが、嚢胞性線維症には、現在、対症療法しか存在せず、患者の生存期間中央値は僅か３３年である。
【０００４】
ＣＦＴＲは、上皮細胞膜を横断して塩化物イオンを伝導する、ＡＢＣ輸送体クラスのイオンチャネルである。塩化物イオンチャネルの機能に影響を及ぼすＣＦＴＲ遺伝子の突然変異は、肺、膵臓及び他の臓器における上皮の流体輸送の調節異常を引き起こし、結果的に嚢胞性線維症を生じる。合併症には、頻繁な呼吸器感染を伴う肺の粘稠な粘液、並びに、栄養失調及び糖尿病を生じさせる膵不全が含まれる。これらの状態は、慢性障害及び平均余命の低下につながる。男性患者では、異常な管腔内分泌に起因して、発達中の精管及び精巣上体の進行性の閉塞及び破壊が生じ、それによって、精管の先天性無形成及び男性不妊が生じるように思われる。
【０００５】
ＣＦＴＲは、ｃＡＭＰ活性化ＡＴＰ依存性陰イオンチャネルとしての役割を担い、ある特定の陰イオン（例えばＣｌ−）がそれらの電気化学的勾配に従って流れるようにコンダクタンスを高める。ＣＦＴＲにおけるＡＴＰ駆動性の構造変化は、ゲートを開閉して、電気化学的勾配に従う陰イオンの膜透過の流れを可能にする。これは、ＡＴＰ駆動性の構造変化によって、細胞膜を横断する上り方向の基質輸送が刺激される、他のＡＢＣタンパク質とは対照的である。本質的に、ＣＦＴＲは、開構造のときに漏れる「破損」したＡＢＣ輸送体として進化したイオンチャネルである。
【０００６】
ＣＦＴＲは、肺、肝臓、膵臓、消化管、生殖器官、及び皮膚を含む多くの臓器の上皮細胞に見られる。通常は、そのタンパク質は、塩化物イオン及びチオシアン酸イオン（負電荷を有する）を上皮細胞内から被覆粘液に移動させる。正電荷を持つナトリウムイオンが受動的に従い、粘液中の総電解質濃度を増加させ、結果的に、浸透作用によって水を細胞の外へ移動させる。
【発明の概要】
【０００７】
本発明のある態様は、イオンチャネルの発現の低下又は機能の低下によって特徴付けられる疾患又は状態を治療する方法であって、該方法は、治療有効量の小孔形成ポリエン・マクロライド又はその小孔形成誘導体を、それを必要とする対象に投与し、それにより、イオンチャネルの発現の低下又は機能の低下によって特徴付けられる疾患又は状態を治療することを含む。小孔形成ポリエン・マクロライド又はその小孔形成誘導体は、本来ならばイオンチャネルによって調節されるイオンの膜透過（transmembrane）輸送を可能にする。
【０００８】
ある特定の実施形態では、イオンチャネルの発現の低下又は機能の低下によって特徴付けられる疾患又は状態は、嚢胞性線維症である。
【０００９】
ある特定の実施形態では、ポリエン・マクロライドは、アムホテリシンＢ（ＡｍＢ）、ナイスタチン、ナタマイシン（ピマリシンとしても知られる）、及びそれらの任意の組合せからなる群より選択される。
【００１０】
ある特定の実施形態では、ポリエン・マクロライドは、アムホテリシンＢ（ＡｍＢ）である。
【００１１】
ある特定の実施形態では、ポリエン・マクロライドは、サッカロミセス・セレビシエの最小発育阻止濃度未満の用量で投与される。
【００１２】
ある特定の実施形態では、対象はヒトである。
【００１３】
ある特定の実施形態では、対象は１２歳未満のヒトである。
【００１４】
ある特定の実施形態では、対象は１２歳以上のヒトである。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】典型的なイオンチャネル形成小分子であるアムホテリシンＢ（ＡｍＢ）、及び、ＡｍＢのチャネル不活性化誘導体であるＣ３５−デオキシアムホテリシンＢ（Ｃ３５ｄｅＯＡｍＢ）の化学構造
【図２Ａ】ＡｍＢイオンチャネルが、イオンポンプＰｍａ１（細胞膜ＡＴＰａｓｅ  １）及びＶ−ＡＴＰａｓｅ（液胞Ｈ＋−ＡＴＰａｓｅ）と協働してｔｒｋ１Δｔｒｋ２Δ細胞の増殖を回復させると予想した、機能相補実験の概略図
【図２Ｂ】野生型サッカロミセス・セレビシエ（S. cerevisia）酵母細胞（左）、カリウムイオン輸送体欠損ｔｒｋ１Δｔｒｋ２Δ酵母細胞（中央）、及び、低濃度（０．１２５μＭ）のＡｍＢを補足したｔｒｋ１Δｔｒｋ２Δ酵母細胞（右）の、正常カリウム（１０ｍＭ）ＹＰＡＤプレートにおける増殖
【図２Ｃ】ＡｍＢを含浸させたペーパーディスクをｔｒｋ１Δｔｒｋ２Δ細胞のプレートに添加する際に観察される細胞増殖のＡｍＢ介在レスキューの濃度依存性
【図２Ｄ】ＡｍＢ（□）及びＣ３５ｄｅＯＡｍＢ（〇）の指定濃度におけるｔｒｋ１Δｔｒｋ２Δ細胞増殖回復を示すグラフ。データ点は平均±ＳＥＭを表す。
【図２Ｅ】正常条件（１０ｍＭ  ＫＣｌ、□）及び許容条件（１００ｍＭ  ＫＣｌ、×）下で増殖させたｔｒｋ１Δｔｒｋ２Δ細胞において観察されたＡｍＢ介在性の増殖回復に対する、ＡｍＢイオンチャネルを遮断するテトラエチルアンモニウム（ＴＥＡ）の効果を示すグラフ。データ点は平均±ＳＥＭを表す。
【図２Ｆ】野生型サッカロミセス・セレビシエ（◇）、未処理のｔｒｋ１Δｔｒｋ２Δ細胞（△）、ＡｍＢ処理したｔｒｋ１Δｔｒｋ２Δ細胞（□）、及び、Ｃ３５ｄｅＯＡｍＢ処理したｔｒｋ１Δｔｒｋ２Δ細胞（〇）における、Ｋ＋の代用である、細胞外８６Ｒｂ＋の取り込みを示すグラフ。データ点は平均±ＳＥＭを表す。
【図２Ｇ】野生型サッカロミセス・セレビシエ、未処理のｔｒｋ１Δｔｒｋ２Δ細胞、及びＡｍＢ処理したｔｒｋ１Δｔｒｋ２Δ細胞の液体培養物（２４時間後）の最大ＯＤ６００を示す棒グラフ。ＮＳ：有意ではない。＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１
【図２Ｈ】野生型サッカロミセス・セレビシエ及びＡｍＢ処理したｔｒｋ１Δｔｒｋ２Δ細胞のヨウ化プロピジウム染色による判定での細胞生存率を示す棒グラフ。ＮＳ：有意ではない。
【図２Ｉ】野生型サッカロミセス・セレビシエ（◇）及びＡｍＢでレスキューしたｔｒｋ１Δｔｒｋ２Δ細胞（□）の増殖の持続時間を示すグラフ。データ点は平均±ＳＥＭを表す。
【図３Ａ】多くのカリウム輸送性ポリエン・マクロライド天然物及び他のイオンを輸送する他の小分子のいずれかで処理したｔｒｋ１Δｔｒｋ２Δ酵母の細胞増殖
【図３Ｂ】経路外（off-pathway）微小管阻害剤ノコダゾールに対する、ＡｍＢ処理した野生型サッカロミセス・セレビシエ（◇）及びｔｒｋ１Δｔｒｋ２Δ（□）細胞の感受性を示すグラフ。データ点は平均±ＳＥＭを表す。
【図３Ｃ】Ｐｍａ１阻害剤エブセレンに対する、野生型サッカロミセス・セレビシエ（◇）及びＡｍＢレスキューしたｔｒｋ１Δｔｒｋ２Δ（□）細胞の感受性を示すグラフ。データ点は平均±ＳＥＭを表す。
【図３Ｄ】Ｖ−ＡＴＰａｓｅ阻害剤バフィロマイシンに対する、野生型サッカロミセス・セレビシエ（◇）及びＡｍＢレスキューしたｔｒｋ１Δｔｒｋ２Δ（□）細胞の感受性を示すグラフ。データ点は平均±ＳＥＭを表す。
【図３Ｅ】ＡｍＢ（０．５μＭ）、ナイスタチン（１μＭ）、カンジシジン（０．００８μＭ）、及びメパルトリシン（０．００８μＭ）の最適レスキュー濃度で処理した野生型（黒色バー）及びｔｒｋ１Δｔｒｋ２Δ（白色バー）細胞に対する、微小管運動阻害剤ノコダゾールのＥＣ５０値を示す棒グラフ。データ点は平均±ＳＥＭを表す。ＮＳ：有意ではない。＊Ｐ≦０．０５
【図３Ｆ】ＡｍＢ（０．５μＭ）、ナイスタチン（１μＭ）、カンジシジン（０．００８μＭ）、及びメパルトリシン（０．００８μＭ）の最適レスキュー濃度で処理した野生型（黒色バー）及びｔｒｋ１Δｔｒｋ２Δ（白色バー）細胞に対する、Ｐｍａ１阻害剤エブセレンのＥＣ５０値を示す棒グラフ。＊＊＊Ｐ≦０．００１、＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１
【図３Ｇ】ＡｍＢ（０．５μＭ）、ナイスタチン（１μＭ）、カンジシジン（０．００８μＭ）、及びメパルトリシン（０．００８μＭ）の最適レスキュー濃度で処理した野生型（黒色バー）及びｔｒｋ１Δｔｒｋ２Δ（白色バー）細胞に対する、Ｖ−ＡＴＰａｓｅ阻害剤バフィロマイシンのＥＣ５０値を示す棒グラフ。データ点は平均±ＳＥＭを表す。＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１
【図４】平面脂質二重膜、リポソーム、及び／又は細胞を塩化物に対して透過性にすることが以前に報告された化合物１〜４
【図５Ａ】ビヒクル処理した正常ヒト肺上皮（左）、ビヒクル処理したＣＦヒト肺上皮（中央）、及びＡｍＢ処理したＣＦヒト肺上皮（右）における気道表面液（ＡＳＬ）の高さを示す、一連の３枚の共焦点蛍光顕微鏡画像
【図５Ｂ】未処理の正常ヒト肺上皮細胞、未処理のＣＦヒト肺上皮細胞；頂端に添加したＡｍＢで処理したＣＦヒト肺上皮細胞；頂端に添加したＣ３５ｄｅＯＡｍＢで処理したＣＦヒト肺上皮細胞；及び、側底に添加したＡｍＢで処理したＣＦヒト肺上皮細胞における、ＡＳＬの高さを示すグラフ
【図５Ｃ】未処理の正常ヒト肺上皮細胞；未処理のＣＦヒト肺上皮細胞；及び、示される濃度で添加したＡｍＢで処理したＣＦヒト肺上皮細胞における、ＡＳＬの高さを示すグラフ
【図５Ｄ】側底へのブメタニドの添加の有無による、未処理の正常ヒト肺上皮細胞；未処理のＣＦヒト肺上皮細胞；及び、頂端に添加したＡｍＢで処理したＣＦヒト肺上皮細胞における、ＡＳＬの高さを示すグラフ
【発明を実施するための形態】
【００１６】
生体システムのスペクトル（spectrum）全体を通じて、ポンプ及びチャネルで構成される頑強なタンパク質ネットワークは、目的のイオンを目的の方向に駆動する。酵母において、液胞及び細胞膜におけるＡＴＰ駆動Ｖ−ＡＴＰａｓｅ及びＰｍａ１プロトンポンプは、それぞれ、細胞膜の受動的なＴｒｋカリウムチャネルと協働して、細胞増殖に必要とされるカリウムの細胞内移動を達成する。同様に、ヒト肺上皮において、側底膜のＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅポンプが塩化物イオンを上皮細胞内へと移動するための駆動力を生成し、頂端膜のＣＦＴＲが気道表面へのこれらのイオンの受動放出を媒介する。このステップによって、気道表面の水和状態が維持され、それによって、肺感染症から保護する粘膜繊毛の運動も維持される。Treacy, K. et al. Paediatr Child Health 21, 425-430(2011)。
【００１７】
タンパク質イオンチャネルの欠損は、劇的な表現型を引き起こしうる。酵母においてＴｒｋチャネルが喪失すると、周囲のカリウムの必要な取り込みが損なわれるため、細胞増殖が不可能になる。ヒトにおけるＣＦＴＲの喪失は、一般的な致死性の遺伝子疾患である嚢胞性線維症を生じる。嚢胞性線維症のリードモデルは、細胞内塩化物の頂端放出が損なわれ、気道表面の脱水、粘膜繊毛の運動の喪失、及び慢性的な感染症を生じることを想起させる。Treacy, K. et al. Paediatr Child Health 21, 425-430(2011)。重要なことには、これらの事例の両方において、イオン移動の主要な原動力である、対応するＡＴＰ駆動ポンプは、なおも活発なままである。よって、我々は、カリウム及び塩化物の両方に対して透過性の小分子イオンチャネルが、生理機能を回復させるために、各系において、それぞれのタンパク質イオンポンプと協働可能であるという仮説を立てた。
【００１８】
タンパク質イオンチャネル様活性を有する多くの小分子が知られており、以前の研究は、このような化合物が平面脂質二重膜、リポソーム、及び／又は細胞を透過性にすることができることを実証している。El-Etri, M. et al. Am. J. Physiol. 270, L386-392(1996)；Jiang, C. et al. Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 281, L1164-L1172(2001)；Koulov A.V et al. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 42, 4931-4933(2003)；Shen, B. et al. PloS One 7, e34694(2012)。しかしながら、完全に分化した肺上皮の頂端膜は、小分子介在性の透過化を不可能にするかもしれない多くの固有の障壁(barriers)を有する。よって、リポソーム又は細胞のモデルにおける研究は、必ずしも、疾患に関連する系へと置き換えられない。さらに、小分子を用いたミッシングタンパク質イオンチャネルの不完全な模倣が、細胞の増殖又は上皮における正常な粘膜繊毛の運動などの、全体的な表現型の読み出しにより判定した場合に、生理機能の回復に十分となり得るか否かは、これまで特定されていない。
【００１９】
しかしながら、ウッシングチャンバ実験において、我々は、分化したヒト肺上皮を透過化する能力について、リポソーム及び／又は細胞における塩化物輸送を可能にすることが以前に報告された幾つかの小分子（Ｎ１，Ｎ３−ビス（（（Ｒ）−１−（イソブチルアミノ）−４−メチル−１−オキソペンタン−２−イル）オキシ）イソフタルアミド（２）、メチル３α−アセトキシ−７α，１２α−ジ［（４−ニトロフェニルアミノカルボニル）アミノ］−５β−コラン−２４−オアート（３）、及び、ヒドロキシビスノルコレン酸−スペルミン−スルホナート（４））について試験したが、これらの化合物は、以前の報告で使用した濃度より１０倍高い濃度においてでさえも、そのような透過化を示さなかった。
【００２０】
イオンチャネルを形成する天然物であるアムホテリシンＢ（ＡｍＢ）を、我々の仮説を試験するための小分子プローブとして特定した。この物質は、酵母細胞及びヒト肺上皮の両方を透過化することができ、ＡｍＢに基づくチャネルは、カリウム及び塩化物イオンの両方を伝導することができる。Ermishkin, L.N. et al. Nature 262, 698-699(1976)；Ermishkin, L.N. et al. Biochim. Biophys. Acta 470, 357-367(1977)。ＡｍＢは毒性も強く、この毒性はその膜透過化と密接不可分であると考えられていた。しかしながら、我々は、Ｃ３５の位置で単一酸素原子を欠いたＡｍＢの合成誘導体（Ｃ３５ｄｅＯＡｍＢ）（図１）が、エルゴステロールに結合するが、イオンチャネルを形成せず、かつ、強力な抗真菌活性をまだなお維持することを見出した。Gray, K.C. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 2234-2239(2012)。さらなる研究により、ＡｍＢが、主に、ステロールに結合して膜から抜き取ることにより酵母を死滅させること、及び、ＡｍＢの量がエルゴステロールの量を超えたときにのみ、細胞毒性であることが解明された。Gray, K.C. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 2234-2239(2012)；及び、erson, T.M. et al. Nat. Chem. Biol. 10, 400-4006(2014)。証拠は、コレステロールへの同様の結合が、ヒト細胞における毒性を主に生じるという見解を裏付けている。Wilcock, B.C et al. J. Am. Chem. Soc. 135, 8488-8491(2013)。
【００２１】
したがって、我々はさらに、単にこの化合物を低濃度で添加することによって、ＡｍＢのチャネル活性を、ＡｍＢの殺細胞活性と分離できるかもしれないという仮説を立てた。この論理に導かれて、我々は、非毒性のナノモル濃度のＡｍＢが、酵母細胞及び分化したヒト肺上皮の単層の両方を容易に透過化することを見出した。分化した肺上皮は小分子介在性の透過化に対して障壁を有することから、分化したヒト肺上皮の単層の透過化は特に注目に値する。
【００２２】
重要なことには、Ｃ３５ｄｅＯＡｍＢはこのような透過化を生じさせず、この単一原子が改変されたＡｍＢの変異体は、酵母細胞及びヒト上皮の両方に対する、天然物ＡｍＢの観察された影響が、そのイオンチャネル活性によって特異的に媒介されるか否かを判定するための特異かつ重要なプローブとなる。
【００２３】
本発明のある態様は、治療有効量の小孔形成ポリエン・マクロライド又はその小孔形成誘導体を、それを必要とする対象に投与し、それによって、イオンチャネルの発現の低下又は機能の低下によって特徴付けられる疾患又は状態を治療することを含む、イオンチャネルの発現の低下又は機能の低下によって特徴付けられる疾患又は状態を治療する方法である。小孔形成ポリエン・マクロライド又はその小孔形成誘導体は、本来ならばイオンチャネルによって調節される、イオンの膜透過輸送を可能にする。
【００２４】
イオンチャネルの発現の低下又は機能の低下によって特徴付けられる疾患及び状態（チャネロパチーとも称されることがある）の例としては、限定はしないが、２型色覚不全（色覚異常）、３型色覚不全、不整脈源性右室異形成症２型、常染色体優性の（トムゼン病）ミオトニー、常染色体優性のＱＴ延長症候群（ロマノ−ウォード症候群）、常染色体優性の夜間前頭葉てんかん、常染色体優性の腎多嚢胞病（ＡＤＰＫＤ）、常染色体劣性（ベッカー病）ミオトニー、難聴を伴う常染色体劣性ＱＴ延長症候群（ジャーベル‐ランゲニールセン症候群）、常染色体劣性網膜色素変性、バーター症候群（腎臓の塩類喪失、低カリウム性アルカローシス）、バーター症候群ＩＩＩ型、バーター症候群ＩＶ型（感音性難聴に関連）、ＢＦＮＣ（良性家族性新生児痙攣；てんかん）、筋波動症を伴うＢＦＮＣ（てんかん）、ブルガダ症候群（特発性心室性不整脈）、カルシウモパチー（calciumopathy）、カテコールアミン誘発性多形性心室性頻拍、セントラルコア病、小児欠神てんかん、ＣＭＴＸ（Ｘ連鎖性シャルコー・マリー・トゥース神経障害）、精管の先天性両側性欠損、先天性高インスリン症、先天性無痛症、嚢胞性線維症、デント病（Ｘ連鎖性タンパク尿及び腎臓結石）、ＤＦＮＡ２（優性の聴力損失）、ＤＦＮＡ３（常染色体優性の聴力損失）、ＤＦＮＢ１（常染色体劣性の聴力損失）、てんかん、発作性運動失調症、筋波動症を伴う発作性運動失調症、紅痛症、家族性心房細動、家族性片麻痺性偏頭痛、巣状分節性糸球体硬化症、熱性痙攣を伴う／熱性痙攣を伴わない全身性てんかん、全身性てんかん−熱性痙攣プラス（ＧＥＦＳ＋）、過剰驚愕症（びっくり病）、高カリウム血性周期性四肢麻痺、低カリウム血性周期性四肢麻痺、低カリウム血性感覚過剰刺激、二次性低カルシウム血症を伴う低マグネシウム血症、若年性ミオクロニーてんかん、リドル症候群、リドル症候群（優性の高血圧）、ＱＴ延長症候群、異形症を伴うＱＴ延長症候群（アンダーソン症候群）、黄斑症、悪性高熱症、ムコリピドーシスＩＶ型、先天性筋無力症、先天性ミオトニー、非症候性難聴、大理石骨病（劣性又は優性）、先天性パラミオトニア、発作性激痛症、周期性麻痺、新生児持続性高インスリン性低血糖症（ＰＨＨＩ）、カリウム惹起性ミオトニー、進行性家族性心臓伝導障害Ｉ型、偽低アルドステロン症１型（ＰＨＡ１）、網膜色素変性、ローランドてんかん、ＱＴ短縮症候群、脊髄小脳失調症６型、脊髄小脳失調症１３型、チモシー症候群、及びＸ連鎖性先天性停止性夜盲症が挙げられる。
【００２５】
ある特定の実施形態では、イオンチャネルの発現の低下又は機能の低下によって特徴付けられる疾患又は状態は、アンダーセン・タウィル症候群、常染色体優性の夜間前頭葉てんかん、常染色体優性の多発性嚢胞腎、バーター症候群、良性家族性新生児痙攣、ブルガダ症候群、カルシウモパチー、チャネローム（channelome）、小児欠神てんかん、先天性高インスリン症、先天性無痛症、嚢胞性線維症、デント病、発作性運動失調症、紅痛症、家族性心房細動、家族性片麻痺性偏頭痛、巣状分節性糸球体硬化症、全身性てんかん−熱性痙攣プラス、高カリウム血性周期性四肢麻痺、低カリウム血性感覚過剰刺激、二次性低カルシウム血症を伴う低マグネシウム血症、若年性ミオクロニーてんかん、ＱＴ延長症候群、黄斑症、悪性高熱症、ムコリピドーシスＩＶ型、先天性ミオトニー、非症候性難聴、先天性パラミオトニア、発作性激痛症、周期性麻痺、カリウム惹起性ミオトニー、偽低アルドステロン症、網膜色素変性、ローランドてんかん、ロマノ−ウォード症候群、ＱＴ短縮症候群、脊髄小脳失調症６型、脊髄小脳失調症１３型、テンプレート：チャネロパチー、チモシー症候群、及びＸ連鎖性先天性停止性夜盲症からなる群より選択される。
【００２６】
ある特定の実施形態では、イオンチャネルの発現の低下又は機能の低下によって特徴付けられる疾患又は状態は、嚢胞性線維症（cystic fibrosis）、高カリウム血性周期性四肢麻痺（hyperkalemic periodic paralysis）、先天性パラミオトニア（paramyotonia congenit）、カリウム惹起性ミオトニー（potassium aggravated myotonia）、全身性てんかん−熱性痙攣プラス（generalized epilepsy with febrile seizures plus）（ＧＥＦＳ＋）、発作性運動失調症（episodic ataxia）、家族性片麻痺性偏頭痛（familial hemiplegic migraine）、脊髄小脳失調症１３型（spinocerebellar ataxia type 13）、ＱＴ延長症候群（long QT syndrome）、ブルガダ症候群（Brugada syndrome）、及びムコリピドーシスＩＶ型（mucolipidosis type IV）からなる群より選択される。
【００２７】
ある特定の実施形態では、イオンチャネルの発現の低下又は機能の低下によって特徴付けられる疾患又は状態は、嚢胞性線維症である。
【００２８】
小孔形成ポリエン・マクロライドの例としては、限定はしないが、次の３６種類の構造的に特徴付けられたマイコサミン含有ポリエン・マクロライドが挙げられる。
【化１−１】
0006796581.tif 000002
【化１−２】
0006796581.tif 000003
【化１−３】
0006796581.tif 000004
【化１−４】
0006796581.tif 000005
【化１−５】
0006796581.tif 000006
【化１−６】
0006796581.tif 000007
【化１−７】
0006796581.tif 000008
【化１−８】
0006796581.tif 000009
【００２９】
以下のモチーフは、これらの化合物において１００％保存される：
【化２】
0006796581.tif 000010
これまでに収集した分光及び構造活性の証拠はすべて、上記の高度に保存されたモチーフが、アムホテリシンＢのステロール結合ドメイン（すなわち、分子におけるエルゴステロール及びコレステロールに直接結合する部分）であるという結論を裏付けている。
【００３０】
ある特定の実施形態では、ポリエン・マクロライドは、アムホテリシンＢ（ＡｍＢ）、ナイスタチン（Ａ１、Ａ２、又はＡ３）、ナタマイシン（ピマリシンとしても知られる）、カンジシジン、及びメパルトリシン、並びに、それらの任意の組合せからなる群より選択される。
【００３１】
ある特定の実施形態では、ポリエン・マクロライドは、アムホテリシンＢ（ＡｍＢ）、ナイスタチン、ナタマイシン、及びそれらの任意の組合せからなる群より選択される。
【００３２】
ある特定の実施形態では、ポリエン・マクロライドは、アムホテリシンＢ（ＡｍＢ）である。
【００３３】
ある特定の実施形態では、対象は、小孔形成ポリエン・マクロライド又はその小孔形成誘導体で治療可能な感染症を有しておらず、例えば、対象は、酵母又は真菌感染症を有する対象ではない。例えば、ある特定の実施形態では、対象は、ＡｍＢで治療可能な酵母又は真菌感染症を有していない。
【００３４】
ある特定の実施形態では、対象は、感染症を治療するために、小孔形成ポリエン・マクロライド又はその小孔形成誘導体を投与されていない。例えば、ある特定の実施形態では、対象は、感染症を治療するために、ＡｍＢを投与されていない。
【００３５】
ある特定の実施形態では、ポリエン・マクロライドは、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）の最小発育阻止濃度未満の用量で投与される。本明細書で用いられる場合、「サッカロミセス・セレビシエの最小発育阻止濃度未満の用量」とは、サッカロミセス・セレビシエの最小発育阻止濃度未満である、全身又は局所濃度を達成するのに十分な用量を指す。一実施形態では、「サッカロミセス・セレビシエの最小発育阻止濃度未満の用量」は、サッカロミセス・セレビシエの最小発育阻止濃度未満である全身濃度を達成するのに十分な用量を指す。一実施形態において、「サッカロミセス・セレビシエの最小発育阻止濃度未満の用量」は、サッカロミセス・セレビシエの最小発育阻止濃度未満である局所濃度を達成するのに十分な用量を指す。
【００３６】
ある特定の実施形態では、「サッカロミセス・セレビシエの最小発育阻止濃度未満の用量」は、サッカロミセス・セレビシエの最小発育阻止濃度の９０パーセント未満である全身又は局所濃度を達成するのに十分な用量を指す。ある特定の実施形態では、「サッカロミセス・セレビシエの最小発育阻止濃度未満の用量」は、サッカロミセス・セレビシエの最小発育阻止濃度の８０パーセント未満である全身又は局所濃度を達成するのに十分な用量を指す。ある特定の実施形態では、「サッカロミセス・セレビシエの最小発育阻止濃度未満の用量」は、サッカロミセス・セレビシエの最小発育阻止濃度の７０パーセント未満である全身又は局所濃度を達成するのに十分な用量を指す。ある特定の実施形態では、「サッカロミセス・セレビシエの最小発育阻止濃度未満の用量」は、サッカロミセス・セレビシエの最小発育阻止濃度の６０パーセント未満である全身又は局所濃度を達成するのに十分な用量を指す。ある特定の実施形態では、「サッカロミセス・セレビシエの最小発育阻止濃度未満の用量」は、サッカロミセス・セレビシエの最小発育阻止濃度の５０パーセント未満である全身又は局所濃度を達成するのに十分な用量を指す。ある特定の実施形態では、「サッカロミセス・セレビシエの最小発育阻止濃度未満の用量」は、サッカロミセス・セレビシエの最小発育阻止濃度の４０パーセント未満である全身又は局所濃度を達成するのに十分な用量を指す。ある特定の実施形態では、「サッカロミセス・セレビシエの最小発育阻止濃度未満の用量」は、サッカロミセス・セレビシエの最小発育阻止濃度の３０パーセント未満である全身又は局所濃度を達成するのに十分な用量を指す。ある特定の実施形態では、「サッカロミセス・セレビシエの最小発育阻止濃度未満の用量」は、サッカロミセス・セレビシエの最小発育阻止濃度の２０パーセント未満である全身又は局所濃度を達成するのに十分な用量を指す。ある特定の実施形態では、「サッカロミセス・セレビシエの最小発育阻止濃度未満の用量」は、サッカロミセス・セレビシエの最小発育阻止濃度の１０パーセント未満である全身又は局所濃度を達成するのに十分な用量を指す。
【００３７】
ある特定の実施形態では、小孔形成ポリエン・マクロライド又はその小孔形成誘導体は、全身投与される。
【００３８】
ある特定の実施形態では、小孔形成ポリエン・マクロライド又はその小孔形成誘導体は、局所的に投与される。
【００３９】
ある特定の実施形態では、小孔形成ポリエン・マクロライド又はその小孔形成誘導体は、対象の気道に投与される。本明細書で用いられる場合、「気道」とは、呼吸器の誘導又は気道上皮を指す。よって、用語「気道」には、鼻道、副鼻腔、咽頭、喉頭、気管、気管支、細気管支、肺胞管、肺胞嚢、及び肺胞を含む、上気道と下気道が含まれる。
【００４０】
ある特定の実施形態では、小孔形成ポリエン・マクロライド又はその小孔形成誘導体は、対象の気道に、エアロゾルとして投与される。
【００４１】
本明細書で用いられる場合、用語「治療する」及び「治療」とは、（ａ）状態又は疾患を発症する危険性がありうる又は状態又は疾患を有する傾向がありうるが、まだ状態又は疾患を有しているとは診断されていない対象において、状態又は疾患が生じることを予防する；（ｂ）例えばその発症の遅延又は阻止など、状態又は疾患を抑止する；又は、（ｃ）例えば状態又は疾患の退縮を生じるなど、状態又は疾患を軽減又は改善する、という結果を生じる介入を行うことを指す。一実施形態において、用語「治療する」及び「治療」は、（ａ）例えばその発現の遅延又は阻止など、状態又は疾患を抑止する；又は、（ｂ）例えば状態又は疾患の退縮を生じるなど、状態又は疾患を軽減又は改善する、という結果を生じる介入を行うことを指す。
【００４２】
本明細書で用いられる「酵母又は真菌感染（症）」は、本明細書に定められる酵母又は真菌類による感染（症）を指す。
【００４３】
本明細書で用いられる場合、「対象」とは、生きている哺乳動物を指す。さまざまな実施形態において、対象は、限定はしないが、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、イヌ、ブタ、ウマ、ウシ、又は非ヒト霊長類を含む、非ヒト哺乳類である。
【００４４】
ある特定の実施形態では、対象はヒトである。
【００４５】
ある特定の実施形態では、対象は１２歳未満のヒトである。
【００４６】
ある特定の実施形態では、対象は１２歳以上のヒトである。
【００４７】
本明細書で用いられる場合、「酵母又は真菌感染症を有する対象」とは、酵母又は真菌感染の少なくとも１つの客観的な兆候を示す対象を指す。一実施形態において、酵母又は真菌感染症を有する対象は、酵母又は真菌感染症を有すると診断されており、かつ、その治療を必要とする、対象である。酵母又は真菌感染症を診断する方法は、広く知られており、本明細書で詳細に説明する必要はない。
【００４８】
本明細書で用いられる場合、「投与する」は、その通常の意味を有し、限定はしないが、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下、直接注入（例えば腫瘍内への）、粘膜、肺（例えば吸入又は点滴（洗浄）による）、経口、及び局所を含む、適切な投与経路による投与を包含する。
【００４９】
一実施形態において、投与とは、全身投与することである。
【００５０】
一実施形態において、投与とは、局所的に投与することである。
【００５１】
本明細書で用いられる場合、「有効量」という句は、所望の生物学的効果を達成するのに十分な量を指す。「治療有効量」は、例えば、イオンチャネルの発現の低下又は機能の低下によって特徴付けられる疾患又は状態を治療するために、所望の治療効果を達成するのに十分な量である。
【００５２】
本発明に従った医薬品有効成分（ＡＰＩ）は、他の治療剤と併用されうる。ＡＰＩ及び他の１種類以上の治療剤を同時に又は連続的に併用投与してもよい。他の１種類以上の治療剤が同時に投与される場合、それらを同一又は別々の調剤で投与してよいが、それらはＡＰＩと実質的に同時に投与される。他の１種類以上の治療剤の投与がＡＰＩの投与とは時間的に隔てられている場合には、他の１種類以上の治療剤は、互いに、及びＡＰＩと、連続的に投与される。これらの化合物の投与時間間隔は、数分間であるか、あるいはそれより長くてもよい。
【００５３】
他の治療剤の例としては、ＡｍＢを含む他の抗真菌剤、並びに、他の抗生物質、抗ウイルス薬、抗炎症薬、免疫抑制剤、及び抗がん剤が挙げられる。
【００５４】
上記のように、「有効量」とは、所望の生物学的効果を達成するのに十分な量を指す。本明細書で提供される教示と併せて、さまざまな活性化合物の中から選択し、かつ、有効性、相対的バイオアベイラビリティ、患者の体重、有害な副作用の重症度、及び、好ましい投与方式などの因子に重み付けすることによって、有効な予防的又は治療的処方計画を、実質的に望ましくない毒性を生じさせず、かつ、なお特定の対象の治療に有効となるように、計画することができる。特定の用途のための有効量は、治療される疾患又は状態、投与される特定のＡＰＩ、対象のサイズ、又は、疾患又は状態の重症度などの因子に応じて変動しうる。当業者は、特定のＡＰＩ及び／又は他の１種類以上の治療剤の有効量を、過度の実験を必要とすることなく、経験的に決定することができる。一般的に、最大用量、すなわち、幾つかの医学的判断に従った最大安全用量が用いられることが好ましい。化合物の適切な全身濃度を実現するために、１日当たり複数回の投与が予定されてもよい。適切な全身濃度は、例えば、患者における薬物のピーク又は持続細胞質濃度の測定によって、決定されうる。「投与量」及び「用量」は、本明細書では同じ意味で用いられる。
【００５５】
一般的に、例えばＡｍＢなどのＡＰＩの１日の静脈内投与量は、ヒト対象では、ＡｍＢの通常の１日の静脈内投与量と同様であるか、又はそれより少ないであろう。同様に、例えばＡｍＢなどのＡＰＩの毎日の他の非経口投与量は、ヒト対象では、ＡｍＢの通常の毎日の他の非経口投与量と同様であるか、又はそれより少ないであろう。
【００５６】
一実施形態において、ＡＰＩの静脈内投与は、典型的には、０．１ｍｇ／ｋｇ／日〜２０ｍｇ／ｋｇ／日でありうる。一実施形態において、ＡＰＩの静脈内投与は、典型的には、０．２ｍｇ／ｋｇ／日〜１０ｍｇ／ｋｇ／日でありうる。一実施形態において、ＡＰＩの静脈内投与は、典型的には、０．５ｍｇ／ｋｇ／日〜５ｍｇ／ｋｇ／日でありうる。一実施形態において、ＡＰＩの静脈内投与は、典型的には、１ｍｇ／ｋｇ／日〜１０ｍｇ／ｋｇ／日でありうる。よって、静脈内投与は、ＡｍＢの最大耐用量と同様であるか、又は有利には、ＡｍＢの最大耐用量未満でありうる。
【００５７】
一般に、ＡＰＩの１日の経口投与量は、ヒト対象では、１日当たり約０．０１ｍｇ／ｋｇから１日当たり１０００ｍｇ／ｋｇであろう。１日当たり１回以上の投与において、０．５〜５０ｍｇ／ｋｇの範囲の経口投与量が、治療結果を生じると予想される。用量は、投与形態に応じて、局所又は全身の所望の薬物濃度を達成するために適切に調節されうる。例えば、静脈内投与量は、１桁から数桁少ない１日当たりの投与量であろうと予想される。このような投与量で対象における応答が不十分な場合には、さらに高い投与量（又は、異なる、より局所的な送達経路による、効果的なより高い投与量）を、患者の耐容性が許容する程度まで用いてもよい。化合物の適切な全身濃度を達成するために、１日当たり複数回の投与が考えられる。
【００５８】
本明細書に記載される化合物については、治療有効量は、初めに、動物モデルから決定されうる。治療に有効な投与量はまた、ヒトにおいて試験されている本発明の化合物について、及び、他の関連した活性薬剤（例えばＡｍＢ）などの同様の薬理学的活性を示すことが知られている化合物について、ヒトのデータから決定されてもよい。非経口の投与には、より高い投与量が必要とされうる。適用される投与量は、相対的バイオアベイラビリティ及び投与される化合物の有効性に基づいて調整されうる。上述の方法及び当技術分野で周知の他の方法に基づき、投与量を調整して、最大効果を達成することは、十分に当業者の能力でできる範囲内である。
【００５９】
ＡＰＩの調剤は、通常は、薬学的に許容される濃度の塩、バッファー、保存料、相容性の担体、アジュバント、及び必要に応じて他の治療成分を含みうる、薬学的に許容される溶液で投与される。
【００６０】
治療での使用に関して、有効量のＡＰＩは、所望の場所又は表面にＡＰＩを送達する任意の用法で対象に投与されうる。ＡＰＩの医薬組成物の投与は、当業者に知られた任意の手段によって達成されうる。投与経路としては、静脈内、筋肉内、腹腔内、膀胱内（膀胱）、経口、皮下、直接注入（例えば、腫瘍又は膿瘍内）、粘膜（例えば、目への局所適用）、肺（例えば、点滴又は吸入）、及び局所を含むがこれらに限られない。
【００６１】
静脈内及び他の非経口の投与経路については、例えばＡｍＢなどのＡＰＩは、概して、ＡｍＢと同様に調合されうる。例えば、ＡｍＢは、デオキシコール酸とともに凍結乾燥された製剤として、リポソームに挿入された又は封入された活性化合物の凍結乾燥された製剤として、水性懸濁液中の脂質複合体として、又はコレステロール硫酸複合体として、調合されうる。凍結乾燥された調剤は、概して、投与の直前に、例えば、滅菌水又は生理食塩水などの適切な水溶液中で再構成される。
【００６２】
経口投与では、化合物（すなわち、ＡＰＩ及び他の１種類以上の治療剤）は、活性化合物を当技術分野で周知の薬学的に許容される担体と合わせることによって、容易に調合されうる。このような担体は、本発明の化合物を、治療対象による経口摂取のために、錠剤、丸薬、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ剤、スラリー、懸濁液等として調合することを可能にする。経口用途の医薬製剤は、固体状の賦形剤として得ることができ、必要に応じて、得られた混合物を粉砕し、必要に応じて適切な助剤を加えた後、顆粒の混合物を加工し、錠剤又は糖衣錠のコアを得る。適切な賦形剤としては、特に、ラクトース、スクロース、マンニトール、又はソルビトールを含む、糖類などの充填剤；例えば、トウモロコシデンプン、小麦デンプン、米デンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントガム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル−セルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、及び／又はポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などのセルロース調製物などがある。必要に応じて、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、若しくは、アルギン酸又はその塩（例えばアルギン酸ナトリウム）などの崩壊剤を加えてもよい。必要に応じて、経口調剤はまた、生理食塩水又は、例えば、体内の酸性状態を中和するためのＥＤＴＡなどのバッファー中で調合されてよく、あるいは、担体を使用せずに投与してもよい。
【００６３】
上記の１種類以上の成分の経口の投薬形態もまた、特に予定されている。１種類以上の成分は、誘導体の経口送達が有効になるように化学的に修飾されうる。一般に、予定される化学的修飾は、成分分子自体への少なくとも１つの部分の付加であり、その部分は、（ａ）酸加水分解の抑制；及び、（ｂ）胃又は腸から血流への取り込みを可能にする。１種類以上の成分の全体的な安定性の向上、及び、体内における循環時間の増加もまた所望される。このような部分の例としては、次のものが挙げられる：ポリエチレングリコール、エチレングリコールとプロピレングリコールの共重合体、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン及びポリプロリン。Abuchowski and Davis, “Soluble Polymer-Enzyme Adducts”, In: Enzymes as Drugs, Hocenberg and Roberts, eds., Wiley-Interscience, New York, N.Y., pp. 367-383(1981)；Newmark et al., J Appl Biochem 4:185-9(1982)。使用可能な他のポリマーは、ポリ−１，３−ジオキソラン及びポリ−１，３，６−チオキソカンである。医薬用途にとって好ましいものは、前述の通り、ポリエチレングリコール部分である。
【００６４】
成分（又は誘導体）について、放出場所は、胃、小腸（十二指腸、空腸、又は回腸）、又は大腸でありうる。当業者は、胃内では溶解せず、十二指腸又は腸の他の場所において物質を放出する、利用可能な調剤を有する。好ましくは、放出は、ＡＰＩの保護、又は、例えば腸など、胃内環境を過ぎてからの生物活性物質の放出のいずれかによって、胃内環境の有害な影響を回避する。
【００６５】
十分な胃耐性を確実にするために、少なくともｐＨ５．０に対して非浸透性のコーティングが望ましい。腸溶性コーティングとして用いられる、より一般的な不活性成分の例は、トリメリト酸酢酸セルロース（ＣＡＴ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート（ＨＰＭＣＰ）、ＨＰＭＣＰ  ５０、ＨＰＭＣＰ  ５５、ポリビニルアセテートフタレート（ＰＶＡＰ）、Ｅｕｄｒａｇｉｔ  Ｌ３０Ｄ、Ａｑｕａｔｅｒｉｃ、酢酸フタル酸セルロース（ＣＡＰ）、Ｅｕｄｒａｇｉｔ  Ｌ、Ｅｕｄｒａｇｉｔ  Ｓ、及びシェラックである。これらのコーティングは、混合膜として使用してもよい。
【００６６】
コーティング又はコーティング混合物は、胃に対する保護が意図されていない錠剤においても使用することができる。このコーティングには、糖衣、あるいは、錠剤をより飲み込み易くするコーティングが含まれうる。カプセルは、乾燥治療薬（例えば粉末）の送達用の硬質シェル（ゼラチンなど）で構成されうる；液体形態については、軟質ゼラチンシェルが使用されうる。カシェ剤のシェル材料は、濃デンプン又は他の食用紙でありうる。丸薬、トローチ剤、成形錠剤又は湿製錠剤については、湿式塊化法（moist massing techniques）が使用されうる。
【００６７】
治療薬は、粒径約１ｍｍの顆粒又はペレットの形態の細かい多微粒子として、調剤中に含まれうる。カプセル投与用の物質の調剤は、粉末、軽度に圧縮されたプラグ（lightly compressed plugs）、又は錠剤でさえありうる。治療薬は、圧縮によって調製されうる。
【００６８】
着色剤及び香味剤は、すべて、含まれうる。例えば、治療薬（又は誘導体）は、調合されてよく（リポソーム又はマイクロスフィアのカプセル化などによる）、次いで、さらに、着色剤及び香味剤を含む冷蔵された飲料などの可食性の製品内に含まれてもよい。
【００６９】
不活性な物質を用いて、治療薬を希釈し又はその容積を増加させてもよい。これらの希釈剤としては、特に、マンニトール、α−ラクトース、無水乳糖、セルロース、スクロース、改質デキストラン及びデンプンなどの炭水化物を挙げることができる。ある特定の無機塩を、充填剤として使用してもよく、例えば三リン酸カルシウム、炭酸マグネシウム及び塩化ナトリウムが挙げられる。幾つかの市販される希釈剤としては、ファスト−フロ（Fast-Fro）、エムデックス（Emdex）、ＳＴＡ−Ｒｘ  １５００、エンコンプレス（Emcompress）及びアビセル（Avicell）がある。
【００７０】
崩壊剤は、治療薬を固体剤形に処方する際に含まれうる。崩壊剤として使用される材料としては、限定はされないがデンプンが挙げられ、デンプンをベースとした市販の崩壊剤であるエキスプロタブを含む。デンプングリコール酸ナトリウム、アンバーライト、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ウルトラミロペクチン、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、オレンジピール、酸型カルボキシメチルセルロース、天然のスポンジ及びベントナイトは、すべて使用されうる。崩壊剤の別の形態は、不溶性の陽イオン交換樹脂である。粉末状ガムは、崩壊剤及び結合剤として使用してもよく、これらには、寒天、カラヤ又はトラガカントなどの粉末状ガムが含まれうる。アルギン酸及びそのナトリウム塩は、崩壊剤としても有用である。
【００７１】
結合剤は、堅い錠剤を形成するために治療剤を結合させるのに使用してもよく、アカシア、トラガカント、デンプン及びゼラチンなどの天然物由来の材料を含む。他のものとしては、メチルセルロース（ＭＣ）、エチルセルロース（ＥＣ）及びカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）が挙げられる。ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）及びヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）は、両方とも、治療薬を粒状にするためにアルコール溶液において使用することができる。
【００７２】
抗摩擦剤（anti-frictional agent）は、調剤プロセスの間の接着を防止するために治療薬の調剤に含まれうる。潤滑剤は、治療薬とダイ壁との間の層として使用してもよく、これらには、ステアリン酸並びにそのマグネシウム及びカルシウム塩、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、液体パラフィン、植物油及びワックスが含まれうるが、これらに限られない。ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム、さまざまな分子量のポリエチレングリコール、Ｃａｒｂｏｗａｘ  ４０００及び６０００などの可溶性の潤滑剤も使用されうる。
【００７３】
調合の際の薬物の流動特性を改善し、圧縮の際の再配列を補助しうる滑剤を添加してもよい。滑剤としては、デンプン、タルク、焼成シリカ及び水化ケイ酸アルミニウム（hydrated silicoaluminate）が挙げられうる。
【００７４】
水性環境内への治療薬の溶解を補助するために、サーファクタントを湿潤剤として添加してもよい。サーファクタントとしては、ラウリル硫酸ナトリウム、スルホコハク酸ジオクチルナトリウム及びスルホン酸ジオクチルナトリウムなどのアニオン性洗浄剤が挙げられうる。使用可能なカチオン性洗浄剤としては、塩化ベンザルコニウム及び塩化ベンゼトニウムが挙げられうる。調剤にサーファクタントとして含まれる可能性のある非イオン性洗浄剤としては、ラウロマクロゴール４００、ステアリン酸ポリオキシル４０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油１０、５０及び６０、モノステアリン酸グリセリル、ポリソルベート４０、６０、６５及び８０、スクロース脂肪酸エステル、メチルセルロース、並びにカルボキシメチルセルロースが挙げられる。これらのサーファクタントは、誘導体の調剤中に、単独で、又はさまざまな比率の混合物として、存在しうる。
【００７５】
経口的に用いることができる医薬製剤は、ゼラチンで作られた押し込み式（push-fit）カプセル、並びに、ゼラチンで作られた軟質の密封カプセル、及び、グリセロール又はソルビトールなどの可塑剤を含む。押し込み式カプセルは、ラクトースなどの充填剤、デンプンなどの結合剤、及び／又は、タルク又はステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、並びに、必要に応じて安定剤と混合した、活性成分を含みうる。軟質カプセルでは、活性化合物は、脂肪油、液体パラフィン、又は液体ポリエチレングリコールなどの適切な液体に溶解又は懸濁されうる。さらに、安定剤を添加してもよい。経口投与用に調合されたマイクロスフィアもまた、使用されうる。このようなマイクロスフィアは、当技術分野で十分に定義されている。経口投与用のすべての調剤は、このような投与に適した用量であろう。
【００７６】
口腔内投与については、組成物は、通常の態様で調合された錠剤又はトローチ剤の形態をとりうる。
【００７７】
吸入による投与については、ＡＰＩは、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素又は他の適切なガスなどの適切な推進剤を使用して、加圧されたパック又は噴霧器から、エアロゾルスプレー形の形態で、便利に送達されうる。加圧されたエアロゾルの場合には、用量単位は、定量を送達するために、弁を設けることによって決定されうる。例えばゼラチンの、吸入器又は吹き付け器での使用のためのカプセル及びカートリッジは、ＡＰＩと、ラクトース又はデンプンなどの適切な粉末基剤との粉末混合物を含むように調合されうる。
【００７８】
ＡＰＩの肺送達もまた、本明細書において予定されている。ＡＰＩは、吸入する間に、哺乳動物の肺に送達され、肺上皮の内膜を横断して、例えば血流へと移動する。吸入された分子の他の報告としては、Adjei et al., Pharm Res 7:565-569(1990)；Adjei et al., Int J Pharmaceutics 63:135-144(1990)（酢酸リュープロリド）；Braquet et al., J Cardiovasc Pharmacol 13(suppl. 5):143-146(1989)（エンドセリン−１）；Hubbard et al., Annal Int Med 3:206-212(1989)（α１−アンチトリプシン）；Smith et al., 1989, J Clin Invest 84:1145-1146（ａ−１−プロテイナーゼ）；Oswein et al., 1990, “Aerozolization of Proteins”, Proceedings of Symposium on Respiratory Drug Derivery II, Keystone, Colorado, March（組換えヒト成長ホルモン）；Debs et al., 1988, J Immunol 140:3482-3488（インターフェロン−γ及び腫瘍壊死因子α）、及び、Ｐｌａｔｚらの米国特許第５，２８４，６５６号明細書（顆粒球コロニー刺激因子）が挙げられる。全身的作用のための薬物の肺送達の方法及び組成物は、１９９５年９月１９日にＷｏｎｇらに対して発行された米国特許第５，４５１，５６９号明細書（参照することにより取り込まれる）に記載されている。
【００７９】
本発明の実施における使用が予定されているのは、そのすべてが当業者によく知られている、噴霧器、定量吸入器、及び、粉末吸入器を含むがそれらに限られない、治療薬品の肺送達用に設計された広範な機械装置である。
【００８０】
本発明の実施に適した市販される装置の幾つかの具体例としては、米国ミズーリ州セントルイス所在のＭａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ，  Ｉｎｃ．社製造のＵｌｔｒａｖｅｎｔ噴霧器；米国コロラド州エングルウッド所在のＭａｒｑｕｅｓｔ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社製のＡｃｏｒｎ  ＩＩ噴霧器；米国ノースカロライナ州リサーチ・トライアングル・パーク所在のＧｌａｘｏ  Ｉｎｃ．社製のベントリン定量吸入器；及び、米国マサチューセッツ州ベッドフォード所在のＦｉｓｏｎｓ  Ｃｏｒｐ．社製のＳｐｉｎｈａｌｅｒ粉末吸入器がある。
【００８１】
このような装置はすべて、ＡＰＩの投薬に適した調剤の使用を必要とする。典型的には、各調剤は、用いられる装置の種類に特有であり、治療に有用な通常の希釈剤、アジュバント、及び／又は担体に加えて、適切な推進用物質の使用も含みうる。また、リポソーム、マイクロカプセル又はマイクロスフィア、包接複合体、又は他の種類の担体の使用も予定されている。化学的に修飾されたＡＰＩもまた、化学的修飾の種類又は用いられる装置の種類に応じて、さまざまな処方において調製されうる。
【００８２】
ジェット式又は超音波式の噴霧器とともに使用するのに適した調剤は、典型的には、溶液１ｍＬあたり約０．１〜２５ｍｇの生物学的に活性なＡＰＩ濃度で水に溶解したＡＰＩを含む。調剤はまた、バッファー及び単糖も含みうる（例えばＡＰＩの安定化及び浸透圧の調節のため）。噴霧調剤はまた、エアロゾルの形成における溶液の微粒子化を原因とする、ＡＰＩの表面誘起性の凝集を低減又は防ぐために、サーファクタントを含みうる。
【００８３】
定量吸入デバイスとともに使用する調剤は、一般に、サーファクタントの助けを借りて推進剤に懸濁されたＡＰＩを含む微細化された粉末を含む。推進剤は、クロロフルオロカーボン、ハイドロクロロフルオロカーボン、ハイドロフルオロカーボン、若しくは、トリクロロフルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタノール、及び１，１，１，２−テトラフルオロエタン、又はそれらの組合せを含む炭化水素など、この目的に用いられる通常の材料でありうる。適切なサーファクタントとしては、ソルビタントリオレエート及び大豆レシチンが挙げられる。オレイン酸もまた、サーファクタントとして有用である。
【００８４】
粉末吸入デバイスから投薬するための調剤は、ＡＰＩを含む微細化された乾燥粉末を含み、また、ラクトース、ソルビトール、スクロース、又はマンニトールなどの増量剤も、例えば調剤の５０〜９０質量％など、装置からの粉末の分散を促進する量で含みうる。ＡＰＩは、有利には、肺深部への最も有効な送達のために、１０マイクロメートル（μｍ）未満、最も好ましくは０．５〜５μｍの平均粒径を有する微粒子の形態で調製されるであろう。
【００８５】
ＡＰＩの経鼻送達もまた予定されている。経鼻送達は、肺における薬品の堆積の必要なく、鼻への治療薬品の投与後すぐに、血流へのＡＰＩの通過を可能にする。経鼻送達用の調剤としては、デキストラン又はシクロデキストランを用いたものが挙げられる。
【００８６】
経鼻投与にとって有用な装置は、定量噴霧器が取り付けられた小さい硬質のボトルである。一実施形態では、溶液中のＡＰＩを容積が画定されたチャンバ内へと引き込むことによって定量が送達され、このチャンバは、チャンバ内の液体が圧縮されたときに噴霧を形成することによってエアロゾル調剤をエアロゾル化するように寸法化された開口部を有する。チャンバは圧縮されてＡＰＩを投与する。特定の実施形態では、チャンバはピストン構成である。このような装置は市販されている。
【００８７】
あるいは、スクイズされたときに噴霧を形成することによってエアロゾル調剤をエアロゾル化するように寸法化された開口部又は開口を備えたプラスチックのスクイズボトルが用いられる。開口は、通常、ボトルの頂部に設けられ、この頂部は、概して、エアロゾル調剤の効率的な投与のために、鼻道に部分的に適合するようにテーパ状になっている。好ましくは、鼻吸入器は、薬物の定量投与のために、定量のエアロゾル調剤を供給する。
【００８８】
ＡＰＩは、その全身送達が望ましい場合には、例えばボーラス注入又は持続注入などの注入による非経口の投与用に調合されうる。注入用の調剤は、例えば、保存料が添加された、アンプル又は多回投与用容器などの単位投薬形態で存在しうる。ＡＰＩは、油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液又はエマルションなどの形態をとってよく、懸濁剤、安定剤及び／又は分散剤などの製剤化剤（formulatory agents）を含みうる。
【００８９】
非経口投与用の薬学的調剤には、水溶性の形態のＡＰＩの水溶液が含まれる。加えて、ＡＰＩの懸濁液は、適切な油性の懸濁注入液として調製されてもよい。適切な親油性溶媒又はビヒクルとしては、ゴマ油などの脂肪油、若しくは、オレイン酸エチル又はトリグリセリド、などの合成脂肪酸エステル、若しくは、リポソームが挙げられる。水性懸濁注入液は、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトール、又はデキストランなど、懸濁液の粘性を高める物質も含みうる。必要に応じて、懸濁液は、化合物の溶解性を高めて非常に濃い溶液の製剤を可能にする、適切な安定剤又は薬剤も含みうる。
【００９０】
あるいは、ＡＰＩは、使用前に、例えば、滅菌した発熱物質を含まない水などの適切なビヒクルで再構成するための粉末の形態でありうる。
【００９１】
ＡＰＩはまた、例えば、ココアバター又は他のグリセリドなどの通常の坐剤基剤を含む、坐剤又は停留浣腸などの直腸又は膣用組成物に調合されてもよい。
【００９２】
上述の調剤に加えて、ＡＰＩはまた、デポー製剤としても調合されうる。このような長時間作用型の調剤は、適切なポリマー性又は疎水性の材料（例えば許容される油中のエマルションとして）又はイオン交換樹脂を用いて、若しくは、例えば難溶性塩などの難溶性誘導体として、調合されうる。
【００９３】
医薬組成物はまた、適切な固体又はゲル相担体又は賦形剤も含みうる。このような担体又は賦形剤の例としては、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、さまざまな糖類、デンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、及び、ポリエチレングリコールなどのポリマーが挙げられるが、これらに限られない。
【００９４】
適切な液体又は固体の医薬製剤の形態は、例えば、吸入用の水溶液又は生理食塩水、マイクロカプセル化、渦巻形に内包化（encochleated）、微細な金粒子上のコーティング、リポソームに内包、ネブライザー投与、エアロゾル、皮膚への移植用ペレット、又は、皮膚を引っ掻くための鋭器上の乾燥形態などである。医薬組成物としては、顆粒、粉末、錠剤、コーティング錠、（マイクロ）カプセル、坐剤、シロップ剤、エマルション、懸濁液、クリーム、点滴剤、又は、活性化合物が持続放出される製剤も挙げられ、該製剤において、賦形剤及び添加剤、及び／又は、例えば、崩壊剤、結合剤、コーティング剤、膨潤剤、潤滑剤、香味剤、甘味剤又は可溶化剤などの助剤が、上述のように慣用的に用いられる。医薬組成物は、さまざまな薬物送達システムにおける使用に適している。薬物送達のための方法の簡単な見直しについては、Langer R, Science 249:1527-33(1990)を参照されたい。
【００９５】
ＡＰＩ及び必要に応じて他の治療薬は、そのまま（ストレート）で、又は薬学的に許容される塩の形態で投与されうる。医薬に用いられる場合、塩は薬学的に許容されるべきであるが、薬学的に許容されない塩は、それらの薬学的に許容される塩の調製に便利に用いられうる。このような塩としては、次の酸から調製されるものが挙げられるが、それらに限られない：塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、ｐ−トルエンスルホン酸、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸、ナフタレン−２−スルホン酸、及びベンゼンスルホン酸。また、このような塩は、カルボン酸基のナトリウム、カリウム又はカルシウム塩など、アルカリ金属又はアルカリ土類塩として調製されうる。
【００９６】
適切なバッファーとしては、次のものが挙げられる：酢酸及び塩（１〜２％ｗ／ｖ）；クエン酸及び塩（１〜３％ｗ／ｖ）；ホウ酸及び塩（０．５〜２．５％ｗ／ｖ）；並びに、リン酸及び塩（０．８〜２％ｗ／ｖ）。適切な保存料としては、塩化ベンザルコニウム（０．００３〜０．０３％ｗ／ｖ）；クロロブタノール（０．３〜０．９％ｗ／ｖ）；パラベン（０．０１〜０．２５％ｗ／ｖ）及びチメロサール（０．００４〜０．０２％ｗ／ｖ）が挙げられる。
【００９７】
本発明の医薬組成物は、薬学的に許容される担体中に含まれる、有効量のＡＰＩ、及び、必要に応じて他の１種類以上の治療剤を含む。用語「薬学的に許容される担体」とは、ヒト又は他の脊椎動物への投与に適した１種類以上の相容性の固体又は液体の充填剤、希釈剤又は内包用物質を意味する。用語「担体」は、適用を容易にするために活性成分と組み合わせる、天然又は合成の有機又は無機の成分を意味する。医薬組成物の成分はまた、実質的に所望の薬剤効率を損なうような相互作用が存在しない態様で、本発明の化合物と、及び、互いに、混合可能である。
【００９８】
ＡＰＩを特に含むがそれに限られない治療剤は、粒子内に提供されてもよい。本明細書で用いられる粒子は、ナノ粒子又はマイクロ粒子（又は、場合によっては、より大きい粒子）を意味し、該粒子は、本明細書に記載されるＡＰＩ又は他の治療剤の全部又は一部で構成することができる。粒子は、腸溶性コーティングを含むがそれに限られないコーティングによって取り囲まれたコア内に、治療剤を含みうる。治療剤はまた、粒子全体に分散されてもよい。治療剤はまた、粒子内に吸着されていてもよい。粒子は、ゼロ次放出、一次放出、二次放出、遅延放出、徐放、即時放出、及びそれらのいずれかの組合せ等を含む、任意の次数の放出速度論を示しうる。粒子は、治療剤に加えて、崩壊性（erodible）、非崩壊性、生分解性、又は非生分解性の物質又はそれらの組合せを含むがそれらに限られない薬学及び医学の分野で、日常的に使用される物質を含みうる。粒子は、溶液中又は半固体状態内にＡＰＩを含む、マイクロカプセルでありうる。粒子は、事実上、どのような形状であってもよい。
【００９９】
非生分解性及び生分解性の両方のポリマー物質を、治療剤の送達のための粒子の製造に使用することができる。このようなポリマーは、天然のポリマーであっても合成のポリマーであってもよい。ポリマーは、放出が望まれる期間に基づいて選択される。特に注目される生体接着性のポリマーとしては、その教示が本明細書に援用される、Sawhney H S et al. (1993) Macromolecules 26:581-7に記載される生体内分解性のハイドロゲルが挙げられる。これらには、ポリヒアルロン酸、カゼイン、ゼラチン、グルチン、ポリ無水物、ポリアクリル酸、アルギン酸塩、キトサン、ポリ（メタクリル酸メチル）、ポリ（メタクリル酸エチル）、ポリ（メタクリル酸ブチル）、ポリ（メタクリル酸イソブチル）、ポリ（メタクリル酸ヘキシル）、ポリ（メタクリル酸イソデシル）、ポリ（メタクリル酸ラウリル）、ポリ（メタクリル酸フェニル）、ポリ（アクリル酸メチル）、ポリ（アクリル酸イソプロピル）、ポリ（アクリル酸イソブチル）、及びポリ（アクリル酸オクタデシル）が含まれる。
【０１００】
治療剤は、制御放出システム内に含まれうる。用語「制御放出」は、調剤からの薬物放出の態様及びプロファイルが制御された、いずれかの薬物含有調剤を指すことが意図されている。これは、即時放出性及び即時放出性ではない調剤のことを指し、即時放出性ではない調剤には、徐放性及び遅延放出性の調剤が含まれるがこれらに限られない。用語「徐放性」（「持続放出」とも称される）は、長期間にわたって薬物の逐次放出をもたらし、かつ、好ましくは、必ずというわけではないが、長期間にわたり薬物の実質的に一定の血中濃度を生じる、製剤のことを指す、通常の意味で用いられる。用語「遅延放出性」は、調剤の投与と、調剤からの薬物の放出との間に時間の遅延が存在する製剤のことを指す、通常の意味で用いられる。「遅延放出性」は、長期間にわたる薬物の逐次の放出を含んでも含まなくてもよく、したがって、「徐放性」であってもなくてもよい。
【０１０１】
長期徐放性インプラントの使用は、慢性的な状態の治療に特に適しうる。「長期」放出は、本明細書で用いられる場合、インプラントが、少なくとも７日間、好ましくは３０〜６０日間、治療レベルの活性成分を送達するように構成かつ配置されることを意味する。長期徐放性インプラントは、当業者に広く知られており、上述の放出システムの幾つかを含む。
【実施例】
【０１０２】
これまで本発明を詳細に説明してきたが、本発明は、単なる例証の目的で本明細書に含まれ、本発明の範囲を限定することは意図されていない、次の実施例を参照することによってさらに明確に理解されよう。
【０１０３】
一般的な材料及び方法
酵母細胞株及び成長条件。野生型サッカロミセス・セレビシエ（ＡＴＣＣ  ９７６３）、及びｔｒｋ１Δｔｒｋ２Δサッカロミセス・セレビシエ（ＳＧＹ  １５２８）を、１０ｇ／Ｌの酵母エキス、２０ｇ／Ｌのペプトン、２０ｇ／Ｌのデキストロース、０．０１５ｇ／Ｌのアデニンヘミ硫酸塩からなる酵母ペプトン・アデニン・デキストロース（ＹＰＡＤ）成長培地（最終的なカリウム濃度＝１０ｍＭ）を用いて維持した。固体培地では、２０ｇ／Ｌの寒天を、この同じ混合物に加えた。ｔｒｋ１Δｔｒｋ２Δサッカロミセス・セレビシエを培養するため、追加のカリウムを、塩化カリウム（１００ｍＭ  ＫＣｌ）として加えた。クエン酸を使用して培地をｐＨ５．０に調整した。オートクレーブ滅菌の後、続いて、デキストロースを、滅菌した２０％ｗ／ｖ水溶液として加えた（０．２２μｍのフィルタを使用してデキストロース溶液をフィルタ滅菌した）。液体培養物をロータリーシェーカー（２００ｒｐｍ）上、３０℃でインキュベートした。固体培養物をインキュベータ内で３０℃に維持した。ＡｍＢ（ＡＫ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を含む固体培地については、１２５ｎＭの最終濃度でＡｍＢを添加する前に、培地を１５分間、放冷した。ＡｍＢを、ＤＭＳＯ中の溶液として培地に加えた。インキュベーションの２４〜４８時間後の増殖について、プレートを検査した。
【０１０４】
ディスク拡散アッセイ。アッセイを先に説明した通りに行った。National Committee for Clinical Laboratory Standards in Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests;M2-A8 Approved Standard(NCCLS, Wayne)(2003)。
【０１０５】
ブロス微量希釈最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）アッセイ。ＭＩＣブロス微量希釈アッセイのプロトコルは、米国臨床検査標準協議会の文書Ｍ２７−Ａ２を出典とし、先に説明した通りに行った。Gray, K.C. et. al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 2234-2239 (2012)；Palacios, D.S. et al. J. Am. Chem. Soc. 129, 13804-13805 (2007)。
【０１０６】
小分子アッセイを用いたタンパク質の機能相補。以下の条件を追加して、上記ＭＩＣアッセイに記載されるように、レスキューブロス微量希釈アッセイのプロトコルを行った：ｔｒｋ１Δｔｒｋ２Δ酵母を高カリウム（１００ｍＭ）ＹＰＡＤ液体培地内で一晩増殖させ、ビヒクル又は指定濃度のＡｍＢを含む正常カリウムＹＰＡＤ液体培地に移した。
【０１０７】
テトラエチルアンモニウムブロックアッセイ。指定濃度のテトラエチルアンモニウムを正常カリウムＹＰＡＤ培地へ、及び、指定濃度のテトラエチルアンモニウムを高カリウム（１００ｍＭ）ＹＰＡＤ培地へ、それぞれ１２５ｎＭのＡｍＢとともに追加的に添加して、上記機能相補アッセイに記載されるようにテトラエチルアンモニウムブロックアッセイのプロトコルを行った。
【０１０８】
８６Ｒｂ＋取り込みアッセイ。８６Ｒｂ＋の取り込み手順は、Mulet, J.M. et al. Mol. Cell. Biol. 19, 3328-3337 (1999)を出典とした。一晩、酵母培養物を上述のように増殖させた。上清を捨て、細胞を滅菌水に懸濁した。この洗浄をさらに２回繰り返した。次に、細胞を、４０ｍＬのカリウム欠乏／アップテイクバッファー（５０ｍＭコハク酸、２％グルコース；Ｔｒｉｓを用いてｐＨ５．５に調整）に再懸濁した。カリウム欠乏バッファー中で３時間のインキュベーション後、細胞を遠心分離し、滅菌水で２回洗浄した。細胞を、１ｍＬのカリウム欠乏／アップテイクバッファーに再懸濁した。ＩＮＣＹＴＯ（登録商標）Ｎｅｕｂａｕｅｒディスポーザブル細胞計算盤を使用して細胞濃度を決定し、野生型サッカロミセス・セレビシエ及びｔｒｋ１Δｔｒｋ２Δ細胞を同一の細胞密度に希釈した。７００μＬの酵母懸濁液を１．５ｍＬのエッペンドルフチューブに加えた。カリウム欠乏／アップテイク培地中での５分間のプレインキュベーション後、ＡｍＢ又はＣ３５ｄｅＯＡｍＢをＤＭＳＯ溶液として加えた（最終濃度３μＭ）。次に、８６ＲｂＣｌ（１．１μＣｉ）を反応混合物に加えた。均質な溶液を確実にするために、反応混合物をボルテックス攪拌した。指定された時点において、反応混合物から１００μＬのアリコートを採取し、１０ｍＬの氷冷した２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２で希釈することによって、取り込み反応を停止した。次に、細胞を、小孔径０．４５μｍのニトロセルロースフィルタ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＨＡＷＰ）に通す減圧濾過によって回収した。細胞を、２０ｍＭの氷冷したＭｇＣｌ２の２つの１５ｍＬのアリコートを用いて洗浄した。放射能を測定するために、湿ったフィルタをプラスチックのバイアルに移した。Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｗｉｚａｒｄ自動ガンマカウンターを使用して、放射能をモニタリングした。結果は、３回の生物学的反復の平均として、１分間あたりのカウント数で報告される。
【０１０９】
細胞の生存率アッセイ。ＷＴ細胞及びｔｒｋ１Δｔｒｋ２Δ細胞を、高カリウム（１００ｍＭ  ＫＣｌ）ＹＰＡＤに植菌した。種培養を、３０℃で１４〜１５時間、増殖させた。次に、細胞を、高カリウムＹＰＡＤにおいて３０℃で２〜２．５時間、培養した。１００μＬの０．２５ｍｇ／ｍＬヨウ化プロピジウム（ＰＩ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｐ４８６４）溶液を調製した。２〜２．５時間後、細胞を８００ｇで５分間、２３℃において遠心分離した。上清をデカンテーションし、細胞を４０ｍＬの高カリウムＹＰＡＤ中に再懸濁し、ボルテックス攪拌し、遠心分離した。洗浄工程を繰り返した。上清を捨てた後、細胞を１５ｍＬの高カリウムＹＰＡＤに再懸濁し、ボルテックス攪拌し、０．５のＯＤ６００まで希釈した。セット１（ＷＴ、ＷＴ＋ＰＩ、ｔｒｋ１Δｔｒｋ２Δ、及びｔｒｋ１Δｔｒｋ２Δ＋ＰＩ）及びセット２（ＷＴ＋ＰＩ＋ＡｍＢ、ｔｒｋ１Δｔｒｋ２Δ＋ＰＩ＋ＡｍＢ）に２６．４μＬのＤＭＳＯを加えて、ＷＴ及びｔｒｋ１Δｔｒｋ２Δの１ｍＬのアリコートとし、３０℃で３０分間、インキュベートした。１％ｗ／ｖの低ゲル化温度のアガロース（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ａ９４１４）を、正常カリウム（１０ｍＭ）ＹＰＡＤにおいて調製した。セット１のインキュベーションの完了後、細胞をパルス遠心分離にかけ、上清を取り除き、正常カリウムＹＰＡＤ中に再懸濁して洗浄した。細胞を遠心分離し、２５０μＬの正常カリウムＹＰＡＤ中に再懸濁した。その後、１μＬの０．２５ｍｇ／ｍＬのＰＩ染料を適切な試料に添加し、２５０μＬの１％アガロースを加えた。試料を、カバーガラスを有する顕微鏡スライド上に播種し、３０℃で２４時間、湿度チャンバ内でインキュベートした。セット２については、細胞を、１２５ｎＭのＡｍＢを代わりに含む正常カリウムＹＰＡＤ中に再懸濁し、洗浄した。細胞を、０．２５０μＭのＡｍＢを含む２５０μＬの正常カリウムＹＰＡＤ中に再懸濁した後、１％アガロースを加えた（最終的に１２５ｎＭのＡｍＢが得られた）。共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ７００）画像を４０倍で撮像し、ここで、実験ごとの処理群ごとのスライドごとに、最大で１５枚のランダム画像を撮像した。ＰＩで染色された細胞の総数を、記録された全細胞数から除算し、全細胞数で割って、％生存率を得た。処理群ごとに少なくとも２００細胞について記録され、４つの独立したデータセットが得られた。
【０１１０】
持続可能な細胞増殖回復アッセイ。野生型及びｔｒｋ１Δｔｒｋ２Δ酵母を上述の機能相補実験に記載されるように処理し、ｔｒｋ１Δｔｒｋ２Δ酵母を１２５ｎＭのＡｍＢで処理した。ＯＤ６００を、ゼロ時の時点の読み取りを含めて、毎時間、２４時間にわたって測定した。次に、野生型酵母を正常カリウムＹＰＡＤ寒天プレート上に画線塗抹し、ＡｍＢレスキューしたＴｒｋ１Δｔｒｋ２Δ酵母をＡｍＢ含有（０．１２５μＭ）正常カリウムＹＰＡＤ寒天プレート上に画線塗抹した。次いで、これらの寒天プレートを、３０℃で約４８時間、インキュベートした。次に、４２日間以上にわたり、同一の手順を繰り返し、３日に一度、最大ＯＤ６００及び倍加時間を測定した。次の方程式を使用して倍加時間を求めた：Ｔｄ＝（ｔ２−ｔ１）×［ｌｏｇ（２）／ｌｏｇ（ｑ２／ｑ１）］、式中、ｔ２及びｔ１は２つの時点における時間を表し、ｑ２及びｑ１は、増殖の対数期におけるＯＤ６００値（０．２〜０．６のＯＤ６００）を表す。
【０１１１】
既知の化学阻害剤に対する感受性調査アッセイ。ＭＩＣアッセイに記載されるように一夜培養した。細胞を採取する前に、小分子ＡｍＢ、ナイスタチンＡ１（Ｒｉｅｄｅｌ−ｄｅ−Ｈａｅｎ社）、カンジシジン（ＴＯＫＵ−Ｅ社）、又はメパルトリシン（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）及び化学阻害剤ノコダゾール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）、エブセレン（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社）、又はバフィロマイシンＢ１（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を、ＤＭＳＯ中のストック溶液として調製した。飽和細胞培養物を、１０００×ｇで５分間、遠心分離した。上清を捨て、細胞を、滅菌したＭｉｌｌｉＱ水に再懸濁した。細胞を再び遠心分離し、上清を捨てた。洗浄工程を繰り返した。上清を捨て、細胞を、正常カリウムＹＰＡＤ中に再懸濁した。細胞を、正常カリウムＹＰＡＤで０．０１のＯＤ６００まで希釈した。次に、適量のＡｍＢ、ナイスタチンＡ１、カンジシジン、又はメパルトリシンを加えて、それぞれ、１２５ｎＭ、１０００ｎＭ、８ｎＭ、及び８ｎＭの最終的なレスキュー濃度を得た。対応する量のＤＭＳＯをｔｒｋ１Δｔｒｋ２Δ細胞に加えることにより、対照を調製した。１９５μＬのＷＴ＋小分子、１９５μＬのｔｒｋ１Δｔｒｋ２Δ＋小分子、及び１９５μＬのｔｒｋ１Δｔｒｋ２Δ＋ＤＭＳＯを、９６ウェルプレートに加えた。次に、５μＬのＤＭＳＯ又は化学阻害剤を各ウェルに加え、各濃度を、ＷＴ及びｔｒｋ１Δｔｒｋ２Δの両方について３連で試験した。プレートを覆い、３０℃で２４時間、インキュベートした。ＢｉｏＴｅｋ  Ｓｙｎｅｒｇｙ社のＨ１  Ｈｙｂｒｉｄ  Ｒｅａｄｅｒを使用してＯＤ６００を測定した。ＧｒａｐｈＰａｄ  ＰＲＩＳＭを利用して、データを、非線形回帰、阻害用量応答、可変勾配（４つのパラメータ）に当てはめ、ＳＥＭとともにＥＣ５０値を得た。統計分析のため、２つの処理群から得たＥＣ５０値を、対応のないｔ検定によって比較した。
【０１１２】
ヒト細胞株及び成長条件。ＮｕＬｉ及びＣｕＦｉ−１細胞を、２％ｖ／ｖのＵｌｔｒｏｓｅｒ  Ｇ（Ｃｒｅｓｃｅｎｔ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社）を補足したＤＭＥＭ：ＨａｍのＦ−１２の１：１混合物を使用して、先に説明したように気相液相界面で培養した。Zabner, J. et al. Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 284, L844-L854 (2003)。使用した膜担体は、ウッシングチャンバ実験についてはＭｉｌｌｉｃｅｌｌ  ０．４μｍＰＣＦインサート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＰＩＨＰ０１２５０）、回転粘液輸送実験についてはＣｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｓｔａｒ０．４μｍトランズウェル・クリア・ポリエステル・メンブレン・インサート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ３４７０）、及び、ＡＳＬ実験についてはＭｉｌｌｉｃｅｌｌ  １．０μｍＰＣＦインサート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＰＩＲＰ１５Ｒ４８）であった。これらの膜を、完全な分化に達するように、最低でも１４日間の間、気相液相界面で成熟させた。
【０１１３】
イオノフォアの合成及び特徴付け。化合物Ｎ１，Ｎ３−ビス（（（Ｒ）−１−（イソブチルアミノ）−４−メチル−１−オキソペンタン−２−イル）オキシ）イソフタルアミド（２）、メチル３α−アセトキシ−７α，１２α−ジ［（４−ニトロフェニルアミノカルボニル）アミノ］−５β−コラン−２４−オアート（３）、及びヒドロキシビスノルコレン酸−スペルミン−スルホナート（４）を、先に記載したように合成し、分取ＨＰＬＣによって精製した。Jiang, C. et. al. Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 281, L1164-L1172 (2001)；Deng, G. et al. J. Am. Chem. Soc. 118, 8975-8976 (1996)；Sadownik, A. et al. J. Am. Chem. Soc. 117, 6138-6139 (1995)；Davis, A.P. et al. Synlett S1, 991-993 (1999)；del Amo, V. et al. Org. Biomol. Chem. 2, 3320-3328(2004)；Koulov, A.V. et al. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 42, 4931-4933 (2003)；Li, X. et al. J. Am. Chem. Soc. 129, 7264-7265 (2007)；Shen, B. et al. PloS One 7, e34694 (2012)。
【０１１４】
ウッシングチャンバ実験。実験は、Zabner, J. et al. Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 284, L844-L854 (2003)に記載される手順を出典とした。Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ  ０．４μｍＰＣＦインサート上で成長させた、成熟かつ分化したＣｕＦｉ膜を、Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌアダプタ、１２ｍｍ（Ｕ９９２４Ｍ−１２）用の培養カップインサートを使用して、デュアルチャネルのウッシングチャンバ（Ｗａｒｎｅｒ  Ｕ２５００）に取り付けた。１００ｍＭのアミロライド及び４，４’−ジイソチオシアノ−２，２’−スチルベンジスルホン酸（ＤＩＤＳ）のストック溶液をＤＭＳＯ中で調製した。ＤＭＳＯ中、ＡｍＢ、Ｃ３５ｄｅＯＡｍＢ、及び１〜４の実験溶液のストックを、バッファー中の所望の最終濃度より１０００倍高い濃度で調製した。３．５％の寒天及び３ＭのＫＣｌを用いて電極を調製した。５ｍＬの３７℃高塩化物バッファー（１３５ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２．４ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４、０．６ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１．２ｍＭ  ＣａＣｌ２、１．２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５ｍＭデキストロース；１０Ｎ  ＮａＯＨを用いてｐＨ７．４に調整）を、チャンバの両側に置き、３７℃に保ち、圧縮空気を供給した。上皮のナトリウムチャネル（ＥＮａＣ）及びカルシウム活性化塩化物チャネル（ＣａＣＣ）を、それぞれ、５μＬのアミロライド及びＤＩＤＳで抑制し、小分子介在性の透過化のベースラインを得た。側底（１３５ｍＭ）から頂端（４．９ｍＭ）に至る塩化物勾配を確立するため、膜の頂端側のバッファーを、５ｍＬの低塩化物バッファー（１３５ｍＭ  グルコン酸ナトリウム、５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２．４ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４、０．６ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１．２ｍＭ  ＣａＣｌ２、１．２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５ｍＭ  デキストロース；１０Ｎ  ＮａＯＨを用いてｐＨ７．４に調整）に置き換えた。ベースラインの安定後、５μＬの試験用の小分子を、頂端のバッファーに加え、次に、短絡電流を少なくとも１０分間、モニタリングした。化合物の添加後のデータの１５分間の短絡電流のトレースの曲線下の面積について報告した。三重反復試験にわたってこれらの値を平均化し、標準誤差とともに報告した。
【０１１５】
気道表面液（ＡＳＬ）の高さ調査。確立された蛍光染料アッセイを使用して、ＡＳＬの高さを調べた。Worthington, E.N. et al. Methods Mol. Biol. 742, 77-92 (2011)；Myerburg、M.M. et al. Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 42, 676-684 (2010)。成熟かつ分化した膜を、Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ  ０．１μＭポリエチレンテレフタラートハンギングセルカルチャーインサート上で成長させた。野生型（ＮｕＬｉ）肺上皮をパーフルオロカーボン（ＦＣ−７２）ビヒクルで処理し、ＣｕＦｉ上皮をビヒクル又は５００ｎＭのＡｍＢで処理し、３７℃で２４時間、インキュベートした。撮像日に、２．５μＬの７０ｋＤａテキサスレッド−デキストラン複合体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社）のＰＢＳ溶液を膜の頂端側に加え、続いて蒸発を防ぐために１００μＬのＦＣ−７７０を加えた。これらを、撮像（Ｗｏｒｌｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社）のために１０ｍｍガラス底のＦｌｕｏｒｏｄｉｓｈ上の１００μＬ  ＰＢＳ上に置いた。染料の添加直後と、今回も２４時間の時点とで膜を撮像し、染料の吸収を調べた。生体膜数ｎ＝６で、１つの膜あたり３つのＺスタック画像を、Ｚｅｉｓｓ社のＬＳＭ７００共焦点顕微鏡上で４０倍の油浸において撮影した。これらの画像を、ＩｍａｇｅＪを使用して分析し、各画像の左側の２００μｍ幅の蛍光の面積を求めた。画像を８ビットに変換し、ガウシアンぼかしを適用し、２値化した。Ａｎａｌｙｚｅ  Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ（粒子解析）のためのパラメータは、１〜∞μｍ２の大きさ及び０％〜１００％の真円度の粒子であった。
【０１１６】
実施例１：ＡｍＢはカリウムチャネル欠損酵母の細胞増殖を回復させる
我々は、最初に、修正した機能相補実験を使用することにより、ＡｍＢによるカリウムチャネル欠損酵母の細胞増殖が回復可能であろうという仮説について試験を行った。Lee, M.G. et al. Nature 327, 31-35 (1987)。ヒト上皮と比較して、酵母は、単純で、明確に定義され、かつ、実験的に扱いやすい真核モデル生物の代表であり、膜透過イオン輸送を媒介する主要なものは知られており、比較的よく理解されている。我々は、正常な細胞外カリウム濃度（１０ｍＭ）の存在下では成長できないＴｒｋカリウムイオン輸送体を欠く酵母（ｔｒｋ１Δｔｒｋ２Δ）に特に着目した。Ko, C.H. et al. Mol. Cell. Biol. 11, 4266-4273 (1991)。Ｔｒｋタンパク質は、カリウム選択性、内向き整流性、かつ、広範調節性であり、したがって、完全な機能複製にとって難易度の高い目標となる。しかしながら、酵母はまた、血漿及び液胞膜内に、それぞれ、生理学的膜透過カリウム移動のための電気化学的駆動力を生じることによってＴｒｋイオンチャネルと協働するプロトンポンプであるＰｍａ１及びＶ−ＡＴＰａｓｅを有する。酵母はまた、ナトリウムを選択的に排出する専用の排出ポンプなど、他のイオンについてのＡｍＢの選択性の欠如に対処する多重機構も有している。よって、我々は、Ｔｒｋ欠損酵母において、Ｐｍａ１及びＶ−ＡＴＰａｓｅが、ＡｍＢに基づいたイオンチャネルと協働して生理学的膜透過カリウム輸送を集合的に回復させ、したがって、細胞増殖も回復させるかもしれないという仮説を立てた。
【０１１７】
以前の報告（Minor, D.L. et al. Cell 96, 879-891 (1999)）と一致して、野生型サッカロミセス・セレビシエを、正常濃度のカリウムを含む寒天プレートに画線塗抹した場合には増殖が観察されたが（図２Ｂ、左）、カリウムチャネル欠損株ｔｒｋ１Δｔｒｋ２Δについては増殖が観察されなかった（図２Ｂ、中央）。寒天プレートへの低濃度のＡｍＢ（１２５ｎＭ）の添加は、驚くほどに、ｔｒｋ１Δｔｒｋ２Δ突然変異体の活発な増殖を回復させた（図２Ｂ、右）。
【０１１８】
一連の追加実験により、観察された細胞増殖の回復が、小分子に基づいたイオンチャネル活性によって生じることが確認された。ディスク拡散アッセイにより、ＡｍＢ濃度に対する、増殖レスキューの予測された依存性が視覚的に明らかになった（図２Ｃ）。濃度依存性を定量化し及び潜在的に複雑にする平板効率の問題を排除するため、我々はまた、ブロス希釈法アッセイにおいても、ｔｒｋ１Δｔｒｋ２Δ酵母細胞の増殖を測定した（図２Ｄ）。ディスク拡散法の結果と一致して、ＡｍＢの不存在下では細胞増殖は観察されず、中間濃度において用量依存的な増殖の増加が観察され、この抗真菌剤の最小発育阻止濃度又はそれ以上では増殖は観察されなかった。さらには、あらゆる種類の一般的なホルミシス効果を除外すると、野生型細胞をＡｍＢで処理した場合には増殖刺激効果は観察されなかった。
【０１１９】
実施例２：チャネル不活性化変異体Ｃ３５ｄｅＯＡｍＢはカリウムチャネル欠損酵母の細胞増殖を回復させない
ＡｍＢのイオンチャネル活性の重要性を直接的に調べるため、我々はまた、チャネル不活性化変異体Ｃ３５ｄｅＯＡｍＢについても試験した（図１）。この誘導体は、いずれの試験濃度においてもｔｒｋ１Δｔｒｋ２Δ細胞の増殖を回復させなかった（図２Ｄ）。
【０１２０】
実施例３：立体的に嵩高いテトラエチルアンモニウムカチオンはＡｍＢの使用によって観察される機能相補を阻止する
機能相補実験において、我々は、立体的に嵩高いテトラエチルアンモニウムカチオンを使用して、ＡｍＢに基づくイオンチャネルをブロックした。Borisova, M.P. et al. Biochim. Biophys. Acta 553, 450-459 (1979)。このカチオンは、一般的な毒性を生じることなく、用量依存的様式で、ＡｍＢを用いて観察される機能相補を阻害した（図２Ｅ）。
【０１２１】
実施例４：カリウムチャネル欠損酵母における８６Ｒｂ＋の取り込みを、ＡｍＢは回復させるがチャネル不活性化変異体Ｃ３５ｄｅＯＡｍＢは回復させない
我々はさらに、膜透過カリウム移動のレポーターとしての放射性８６Ｒｂ＋の取り込みをモニタリングした（図２Ｆ）。８６Ｒｂ＋の取り込みは、野生型酵母では観察されたが、ｔｒｋ１Δｔｒｋ２Δ突然変異体では観察されず、ｔｒｋ１Δｔｒｋ２Δ突然変異体をチャネル不活性化誘導体Ｃ３５ｄｅＯＡｍＢで処理した場合には、取り込みは観察されなかった。対照的に、ｔｒｋ１Δｔｒｋ２Δ細胞をＡｍＢで処理した場合には、８６Ｒｂ＋の取り込みが回復した。
【０１２２】
実施例５：ＡｍＢイオンチャネル介在性の酵母細胞増殖回復の強さ（Vigor）及び持続可能性
我々はまた、このＡｍＢイオンチャネル介在性の酵母細胞増殖回復の強さ及び持続可能性も定量化した。ＡｍＢ処理したｔｒｋ１Δｔｒｋ２Δ細胞は、野生型の最大細胞密度と一致する最大細胞密度に達し（図２Ｇ）、ＡｍＢレスキューしたｔｒｋ１Δｔｒｋ２Δ細胞の倍加時間は、僅かに１．７倍長いだけであった。野生型及びＡｍＢレスキューしたｔｒｋ１Δｔｒｋ２Δ細胞における同等レベルの細胞生存率も観察された（図２Ｈ）。このレスキュー効果の持続可能性を調べるため、我々は、最大細胞密度及び倍加時間の実験を１カ月以上にわたって繰り返した。細胞を、それぞれ１２５ｎＭのＡｍＢを含む固体培地と液体培地の間を３日おきに行き来させ、各液体植菌の２４時間後の液体培養物の最大ＯＤ６００を求めた。野生型細胞と同様に、ＡｍＢレスキューしたｔｒｋ１Δｔｒｋ２Δ細胞は、この全期間を通じて、持続された活発な細胞増殖を示した（図２Ｉ）。任意の時点で培地からＡｍＢを除去することにより、ｔｒｋ１Δｔｒｋ２Δ細胞の増殖の急速な喪失が生じた。
【０１２３】
実施例６：他のポリエン・マクロライド抗生物質分子もカリウムチャネル欠損酵母の細胞増殖を回復させる
不完全な模倣に関する許容範囲及び限界を調べるため、一連の追加のイオン輸送天然物を評価した。ナイスタチン、カンジシジン、及びメパルトリシンを含む、カリウムを輸送する他のポリエン・マクロライド抗生物質分子を用いた場合には、ｔｒｋ１Δｔｒｋ２Δ細胞増殖の力強い回復が観察されたが、ＮＨ４＋（ノナクチン）、Ｃｌ−（プロジギオシン；４−メトキシ−５−［（Ｚ）−（５−メチル−４−ペンチル−２Ｈ−ピロール−２−イリデン）メチル］−１Ｈ，１’Ｈ−２，２’−ビピロール）、及びＣａ２＋（カルシマイシン；Ａ２３１８７；５−（メチルアミノ）−２−（｛（２Ｒ，３Ｒ，６Ｓ，８Ｓ，９Ｒ，１１Ｒ）−３，９，１１−トリメチル−８−［（１Ｓ）−１−メチル−２−オキソ−２−（１Ｈ−ピロール−２−イル）エチル］−１，７−ジオキサスピロ［５．５］ウンデカ−２−イル｝メチル）−１，３−ベンゾオキサゾール−４−カルボン酸）を選択的に輸送する小分子を用いた場合には、そのような回復は観察されなかった（図３Ａ）。
【０１２４】
実施例７：カリウムチャネル欠損酵母のＡｍＢ介在レスキューにおけるプロトンポンプの協働性
我々は、次に、これらのカリウムチャネル形成小分子が、Ｖ−ＡＴＰａｓｅ及びＰｍａ１プロトンポンプと協働することによって生理機能を回復させるという機構的仮説について調査した。このようなモデルは、これらのポンプの化学的阻害に対する、小分子レスキューした突然変異体の選択的感受性を予測するものである。陰性対照として、ＡｍＢ処理した野生型及びＡｍＢレスキューしたｔｒｋ１Δｔｒｋ２Δ細胞は、微小管運動の経路外阻害剤であるノコダゾールに対して同程度に感受性であった（図３Ｂ）。対照的に、エブセレンを用いたＰｍａ１の阻害（図３Ｃ）及びバフィロマイシンを用いたＶ−ＡＴＰａｓｅの阻害（図３Ｄ）に対して、ＡｍＢレスキューしたｔｒｋ１Δｔｒｋ２Δ細胞は際立って(exceptionally)感受性であった。同様の結果が、ナイスタチン、カンジシジン、及びメパルトリシンでレスキューしたｔｒｋ１Δｔｒｋ２Δ細胞において観察された（図３Ｅ−Ｇ）。
【０１２５】
実施例８：ＡｍＢはＣＦＴＲ欠損ヒト肺上皮における正常な頂端表面液（ＡＳＬ）の容積を回復させる
我々はまた、共焦点蛍光顕微鏡検査によって、頂端表面液（ＡＳＬ）の容積に対するＡｍＢの影響についても試験した。Worthington, E.N. et al. Methods Mol. Biol. 742, 77-92 (2011)；Myerburg, M.M. et al. Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 42, 676-684 (2010)。ＣＦ肺上皮は、正常な上皮と比べて著しく脱水状態であった。ＡｍＢ（５００ｎＭ）でＣＦ上皮を処理すると、正常なＡＳＬ容積が回復した。
【０１２６】
実施例９：ＡｍＢはＣＦＴＲ欠損ヒト肺上皮における正常な頂端表面液（ＡＳＬ）の高さを回復させる
我々は、ＡｍＢ介在性の透過化が、嚢胞性線維症細胞株の上皮単層における生理機能の重要なマーカーであるＡＳＬの高さも回復させ得るかについて、共焦点蛍光顕微鏡検査によって試験した。ＮｕＬｉ上皮単層（正常ヒト肺上皮由来の細胞株）をビヒクルで処理し、ＣｕＦｉ−１上皮単層（最も一般的なΔＦ５０８／ΔＦ５０８突然変異を有する患者に由来する細胞株）をビヒクル又はＡｍＢで処理した。ＣｕＦｉ−１上皮は、ＮｕＬｉ上皮と比べて著しく脱水状態であり、これらの細胞株についてのＡＳＬの高さに関する以前の報告と一致した。ＣｕＦｉ−１上皮をＡｍＢ（５００ｎＭ）で処理すると、正常なＡＳＬの高さが回復した（図５Ａ）。チャネル不活性化誘導体であるＣ３５ｄｅＯＡｍＢでの処理、又は側底表面へのＡｍＢの添加によっては、ＡＳＬの高さの増加は観察されず、この回復が頂端膜を透過化するＡｍＢによって特異的に生じることを実証した。これらの結果は、ＩｍａｇｅＪ自動分析器を使用して定量的に確認された（図５Ｂ）。ＡｍＢによるＡＳＬの回復は、用量依存的様式で観察され、ＡｍＢの最適用量は０．５μｍであった（図５Ｃ）。この回復効果は、正常な肺上皮においてＡＳＬを低下させることが既に示されているブメタニドの側底への添加によりＮＫＣＣを阻害することによって妨げられた（図５Ｄ）。
【０１２７】
参照による取り込み
上記説明において言及されたすべての特許公報及び特許出願公開公報は、その全体が、ここに参照することによって本明細書に取り込まれる。
【０１２８】
等価物
これまで本発明を、明確な理解の目的で、例証及び実例として幾分詳細に説明してきたが、同じことが、本発明の範囲又はそのいずれかの特定の実施形態に影響を与えることなく、条件、配合及び他のパラメータの幅広い等価の範囲内において、本発明を修正または変更することによって行われうること、及び、このような修正及び変更が、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図されていることは、当業者にとって明白であろう。
他の実施形態
１．イオンチャネルの発現の低下又は機能の低下によって特徴付けられる疾患又は状態を治療する方法であって、治療有効量の小孔形成ポリエン・マクロライド又はその小孔形成誘導体を、それを必要とする対象に投与し、それによって、前記イオンチャネルの発現の低下又は機能の低下によって特徴付けられる前記疾患又は状態を治療することを含む、方法。
２．イオンチャネルの発現の低下又は機能の低下によって特徴付けられる前記疾患又は状態が、嚢胞性線維症、高カリウム血性周期性四肢麻痺、先天性異常筋強直症、カリウム惹起性ミオトニー、全身性てんかん−熱性痙攣プラス（ＧＥＦＳ＋）、一過性運動失調症、家族性片麻痺性偏頭痛、脊髄小脳性運動失調症１３型、ＱＴ延長症候群、ブルガダ症候群、及びムコリピドーシスＩＶ型からなる群より選択される、実施形態１に記載の方法。
３．イオンチャネルの発現の低下又は機能の低下によって特徴付けられる前記疾患又は状態が嚢胞性線維症である、実施形態１に記載の方法。
４．前記対象が、感染症の治療のために前記小孔形成ポリエン・マクロライド又はその小孔形成誘導体を投与されていない、実施形態１〜３のいずれかに記載の方法。
５．前記ポリエン・マクロライドが、アムホテリシンＢ（ＡｍＢ）、ナイスタチン、ナタマイシン、カンジシジン、及びメパルトリシン、並びにそれらの任意の組合せからなる群より選択される、実施形態１〜４のいずれかに記載の方法。
６．前記ポリエン・マクロライドがアムホテリシンＢ（ＡｍＢ）であることを特徴とする、実施形態１〜４のいずれかに記載の方法。
７．前記ポリエン・マクロライドが、サッカロミセス・セレビシエの最小発育阻止濃度未満の用量で投与される、実施形態１〜５のいずれかに記載の方法。
８．前記小孔形成ポリエン・マクロライド又はその小孔形成誘導体が全身投与される、実施形態１〜７のいずれかに記載の方法。
９．前記小孔形成ポリエン・マクロライド又はその小孔形成誘導体が、前記対象の気道に投与される、実施形態１〜７のいずれかに記載の方法。
１０．前記小孔形成ポリエン・マクロライド又はその小孔形成誘導体が、前記対象の気道にエアロゾルとして投与される、実施形態１〜７のいずれかに記載の方法。
１１．前記対象がヒトである、実施形態１〜１０のいずれかに記載の方法。
１２．前記ヒトが１２歳未満である、実施形態１１に記載の方法。
１３．前記ヒトが１２歳以上である、実施形態１１に記載の方法。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図２Ｈ】
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【図２Ｉ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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