(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
反応容器、又は、反応容器を備える核酸解析装置を用いた核酸解析方法であって、
前記反応容器は、
基材に、核酸を特異的に検出可能な定量試薬及び核酸の解析に用いられる核酸解析試薬が配置されている、少なくとも１つ以上のコントロール反応ウェルと、
前記核酸解析試薬が配置されている、その他の複数の反応ウェルと、を備え、
核酸を含有するサンプルが、前記コントロール反応ウェル及び前記その他の複数の反応ウェルへと分配され得るように構成されており、
ｂ１）核酸を含有するサンプルを前記コントロール反応ウェル及び前記その他の複数の反応ウェルに注入する工程と、
ｂ２）前記コントロール反応ウェルにおいて、前記サンプルに含有される核酸と前記定量試薬とを会合させた会合状態を形成させる工程と、
ｂ３）前記会合状態で発せられるシグナルを測定する測定工程と、
ｂ４）前記測定工程で測定されたシグナルから、前記コントロール反応ウェル及び前記その他の複数の反応ウェルにおいて解析され得るサンプルに含有される核酸の量を算出する工程と、
からなる核酸定量工程Ｂと、
工程Ｂの後に、前記核酸を含有するサンプルを前記コントロール反応ウェル及び前記その他の複数の反応ウェルに注入して該コントロール反応ウェル及び該その他の複数の反応ウェルにおいて該核酸の識別を行う核酸解析工程Ｃと、
を含み、
前記定量試薬の濃度が、前記核酸解析工程Ｃで行われる反応を阻害しない濃度である核酸解析方法。
【請求項２】
前記核酸解析装置は、核酸を抽出する抽出部をさらに備える請求項１に記載の核酸解析方法。
【請求項３】
前記核酸定量工程Ｂの前に、生体試料からの核酸抽出を行う核酸抽出工程Ａをさらに含み、
前記核酸定量工程Ｂ及び前記核酸解析工程Ｃにて定量及び解析される核酸が、前記核酸抽出工程Ａにおいて得られた核酸である請求項１又は２に記載の核酸解析方法。
【請求項４】
前記核酸抽出工程Ａの後且つ前記核酸定量工程Ｂの前に、核酸精製工程Ｐをさらに含む請求項３に記載の核酸解析方法。
【請求項５】
前記核酸解析装置は、前記核酸を精製する精製部をさらに備える請求項１〜４のいずれか一項に記載の核酸解析方法。
【請求項６】
前記核酸定量工程Ｂの後且つ前記核酸解析工程Ｃの前に、核酸精製工程Ｐをさらに含み、
前記核酸解析装置は、前記核酸を精製する精製部を、さらに備える請求項１〜３のいずれか一項に記載の核酸解析方法。
【請求項７】
前記核酸定量工程Ｂによって算出された核酸の量により前記核酸精製工程Ｐへの移行の可否を判断する工程Ｊ´を、該核酸定量工程Ｂの後且つ該核酸精製工程Ｐの前にさらに含む請求項４又は６に記載の核酸解析方法。
【請求項８】
前記核酸定量工程Ｂの後に、
該核酸定量工程Ｂによって算出された核酸の量により前記核酸解析工程Ｃにより得られた解析結果の妥当性を判断する工程Ｄを含む請求項１〜７のいずれか一項に記載の核酸解析方法。
【請求項９】
前記核酸定量工程Ｂによって算出された核酸の量及び前記核酸解析工程Ｃにより得られた解析結果から、前記解析結果の妥当性を判断する工程Ｄと同時に、核酸解析装置の不具合を検知する工程Ｅをさらに含む請求項１〜８のいずれか一項に記載の核酸解析方法。
【請求項１０】
前記核酸定量工程Ｂによって算出された核酸の量により前記核酸解析工程Ｃへの移行の可否を判断する工程Ｊを、該核酸定量工程Ｂの後且つ該核酸解析工程Ｃの前にさらに含む請求項１〜９のいずれか一項に記載の核酸解析方法。
【請求項１１】
前記基材は、光透過性を有する樹脂からなる請求項１〜１０のいずれか一項に記載の核酸解析方法。
【請求項１２】
前記基材に、流路と、溶液を注入可能な注入口と、をさらに備え、該流路によって、前記サンプルが含有する核酸が、前記コントロール反応ウェル及び前記その他の複数の反応ウェルへと分配され得る請求項１〜１１のいずれか一項に記載の核酸解析方法。
【請求項１３】
前記定量試薬が、蛍光物質である請求項１〜１２のいずれか一項に記載の核酸解析方法。
【請求項１４】
前記定量試薬及び／または前記核酸解析試薬が乾燥状態で配置される請求項１〜１３のいずれか一項に記載の核酸解析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、反応容器、該反応容器を備えた核酸解析装置、および核酸解析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
疫学的・科学的根拠に基づき患者の持つ遺伝的背景に応じた効果的な治療・投薬方法を提供するという「オーダーメイド医療」は、各個人のＱＯＬ（生活の質）を向上させるだけでなく、薬剤の副作用に伴う医療費増加の抑制も期待される。薬剤の効果、副作用等を判定するにあたっては種々の手法が存在するが個人間における遺伝子の違いを解析する遺伝子診断も有効な手法の一つである。オーダーメイド医療は現場で簡便かつ迅速な診断が可能であることが望ましく、それらを実現するための手段として遺伝子を含有する微量の試料溶液を処理する反応装置であるμ−ＴＡＳ（Ｔｏｔａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ）やＬａｂ−ｏｎ−Ｃｈｉｐと呼ばれる技術の利用があげられる。
【０００３】
これは、１個のチップやカートリッジに複数の反応室や流路を備えたものであり、複数の検体の解析、あるいは複数種類の項目を同時処理できる。これらの技術はチップ及びカートリッジを小型化することで扱う薬品を少量にすることが出来るなど様々なメリットがある手法である。遺伝子解析の大筋としては患者から採取した血液や口腔粘膜、喀痰などの生体サンプルから遺伝子解析のための核酸を抽出もしくは精製して取り出し、調べたい遺伝子領域や核酸配列をＰＣＲなどで増幅し、遺伝子型などの検査したい対象固有の配列を検出する過程から成る。
特許文献１や特許文献２、非特許文献１には、生体サンプルからの核酸取り出し後に、増幅・検出という工程が全自動で進行される遺伝子診断装置が開示されている。
特許文献１０〜１２には、核酸増幅工程を行うインキュベーターの位置や形に工夫をほどこした、小型で、反応効率のよい遺伝子診断装置が開示されている。
特許文献９には、全自動で進行される核酸の抽出・精製装置が開示されている。
特許文献３〜７、非特許文献２には、核酸を検出しうる、迅速、高感度、かつ選択的な方法として、非対称シアニン染料による染色方法が開示されている。
非特許文献３には、インベーダー法を活用した核酸検出方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００４−２１２０５０号公報
【特許文献２】特開２００４−０９３２９７号公報
【特許文献３】特開平７−１９６９３０号公報
【特許文献４】米国特許第５４３６１３４号明細書
【特許文献５】米国特許第５６５８７５１号明細書
【特許文献６】米国特許第５３２１１３０号明細書
【特許文献７】米国特許第５５８２９７７号明細書
【特許文献８】特許第５５２１４５４号公報
【特許文献９】米国特許第８６３３０３２号明細書
【特許文献１０】特許第５３４３８０１号公報
【特許文献１１】特許第４９６９６５０号公報
【特許文献１２】特許第５５５３３６７号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５１：  ８８２−８９０，  ２００５
【非特許文献２】Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ.３１:６２２７−６２３４,  ２００３
【非特許文献３】Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ４：３５３−３６４、１９９９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
核酸の抽出工程が以降の増幅および検出の工程から独立している場合、外部の装置を用いた操作で核酸の量を確認できる。しかし、特許文献１や特許文献２、非特許文献１に示される装置では、生体サンプルからの核酸抽出後に増幅・検出という工程が全自動で進行され、得られた核酸の量を確認できない。このため取り出された核酸量は不明確であり、検査対象が遺伝子変異などの検出を目的とした場合は十分ではない。
例えば、癌などに代表される遺伝子変異の場合、全体で９９．９％は正常な野生型で、残り０．１％の変異型を検出したいとき、増幅前に必要な核酸の量は１０００コピー以上でなければ変異が０．１％であることを担保することはできない。
また、特定の核酸配列の有無や遺伝子多型の解析においてもイレギュラーな結果が出力された際に核酸の量が不足しているのか、あるいは系中に反応阻害物などが混入して起きた現象なのか区別できないことも考えられる。
このように、全自動の遺伝子解析システムでは核酸の量が不明確であり、解析結果の信頼性は検査項目の特性に左右されるケースがある。
【０００７】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、全自動遺伝子解析システムにおいて好適に用いられ、生体試料から抽出で得られた核酸の定量と、該核酸の解析とが同一のウェルにて可能な反応容器、該反応容器を備えた核酸解析装置、並びに核酸解析方法の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（１）反応容器、又は、反応容器を備える核酸解析装置を用いた核酸解析方法であって、
前記反応容器は、
基材に、核酸を特異的に検出可能な定量試薬及び核酸の解析に用いられる核酸解析試薬が配置されている、少なくとも１つ以上のコントロール反応ウェルと、
前記核酸解析試薬が配置されている、その他の複数の反応ウェルと、を備え、
核酸を含有するサンプルが、前記コントロール反応ウェル及び前記その他の複数の反応ウェルへと分配され得るように構成されており、
ｂ１）核酸を含有するサンプルを前記コントロール反応ウェル及び前記その他の複数の反応ウェルに注入する工程と、
ｂ２）前記コントロール反応ウェルにおいて、前記サンプルに含有される核酸と前記定量試薬とを会合させた会合状態を形成させる工程と、
ｂ３）前記会合状態で発せられるシグナルを測定する測定工程と、
ｂ４）前記測定工程で測定されたシグナルから、前記コントロール反応ウェル及び前記その他の複数の反応ウェルにおいて解析され得るサンプルに含有される核酸の量を算出する工程と、
からなる核酸定量工程Ｂと、
工程Ｂの後に、前記核酸を含有するサンプルを前記コントロール反応ウェル及び前記その他の複数の反応ウェルに注入して該コントロール反応ウェル及び該その他の複数の反応ウェルにおいて該核酸の識別を行う核酸解析工程Ｃと、
を含み、
前記定量試薬の濃度が、前記核酸解析工程Ｃで行われる反応を阻害しない濃度である核酸解析方法。
（２）前記核酸解析装置は、核酸を抽出する抽出部をさらに備える（１）に記載の核酸解析方法。
（３）前記核酸定量工程Ｂの前に、生体試料からの核酸抽出を行う核酸抽出工程Ａをさらに含み、前記核酸定量工程Ｂ及び前記核酸解析工程Ｃにて定量及び解析される核酸が、前記核酸抽出工程Ａにおいて得られた核酸である（１）又は（２）に記載の核酸解析方法。
（４）前記核酸抽出工程Ａの後且つ前記核酸定量工程Ｂの前に、核酸精製工程Ｐをさらに含む（３）に記載の核酸解析方法。
（５）前記核酸解析装置は、前記核酸を精製する精製部をさらに備える（１）〜（４）のいずれか一つに記載の核酸解析方法。
（６）前記核酸定量工程Ｂの後且つ前記核酸解析工程Ｃの前に、核酸精製工程Ｐをさらに含み、前記核酸解析装置は、前記核酸を精製する精製部を、さらに備える（１）〜（３）のいずれか一つに記載の核酸解析方法。
（７）前記核酸定量工程Ｂによって算出された核酸の量により前記核酸精製工程Ｐへの移行の可否を判断する工程Ｊ´を、該核酸定量工程Ｂの後且つ該核酸精製工程Ｐの前にさらに含む（４）又は（６）に記載の核酸解析方法。
（８）前記核酸定量工程Ｂの後に、該核酸定量工程Ｂによって算出された核酸の量により前記核酸解析工程Ｃにより得られた解析結果の妥当性を判断する工程Ｄを含む（１）〜（７）のいずれか一つに記載の核酸解析方法。
（９）前記核酸定量工程Ｂによって算出された核酸の量及び前記核酸解析工程Ｃにより得られた解析結果から、前記解析結果の妥当性を判断する工程Ｄと同時に、核酸解析装置の不具合を検知する工程Ｅをさらに含む（１）〜（８）のいずれか一つに記載の核酸解析方法。
（１０）前記核酸定量工程Ｂによって算出された核酸の量により前記核酸解析工程Ｃへの移行の可否を判断する工程Ｊを、該核酸定量工程Ｂの後且つ該核酸解析工程Ｃの前にさらに含む（１）〜（９）のいずれか一つに記載の核酸解析方法。
（１１）前記基材は、光透過性を有する樹脂からなる（１）〜（１０）のいずれか一つに記載の核酸解析方法。
（１２）前記基材に、流路と、溶液を注入可能な注入口と、をさらに備え、該流路によって、前記サンプルが含有する核酸が、前記コントロール反応ウェル及び前記その他の複数の反応ウェルへと分配され得る（１）〜（１１）のいずれか一つに記載の核酸解析方法。
（１３）前記定量試薬が、蛍光物質である（１）〜（１２）のいずれか一つに記載の核酸解析方法。
（１４）前記定量試薬及び／または前記核酸解析試薬が乾燥状態で配置される（１）〜（１３）のいずれか一つに記載の核酸解析方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、生体サンプルからの核酸抽出で得られた核酸の量を確認することが可能となり、核酸の解析結果に対する信頼性を向上させることができる。また、核酸解析装置の不具合を検知することが可能となり、装置の保全に役立てることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明の第一実施形態の反応容器の斜視図である。
【図２】（ａ）（ｂ）本発明の反応容器における、流路の一態様を示す模式図である。
【図３】（ａ）（ｂ）（ｃ）本発明の第二実施形態の反応容器の模式的な平面図および側面図である。
【図４】本発明の核酸解析方法の第一実施形態を説明したフローチャートである。
【図５】本発明の核酸解析方法の第二実施形態を説明したフローチャートである。
【図６】本発明の核酸解析方法の第三実施形態を説明したフローチャートである。
【図７】本発明の核酸解析方法の第四実施形態を説明したフローチャートである。
【図８】本発明の核酸解析方法の第五実施形態を説明したフローチャートである。
【図９】本発明の核酸解析方法の第六実施形態を説明したフローチャートである。
【図１０】本発明の核酸解析方法の第七実施形態を説明したフローチャートである。
【図１１】ＰＣＲにて増幅された標準ＤＮＡの濃度とＲｅｄｍｏｎｄ  Ｒｅｄ（５９５ｎｍの蛍光）による蛍光強度の関係性を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
≪反応容器≫
［第一実施形態］
本発明の第一実施形態の反応容器は、基材に、核酸を特異的に検出可能な定量試薬及び核酸の解析に用いられる核酸解析試薬が配置され、核酸を含有するサンプルの核酸の量を定量することと、該サンプルに含有する核酸を解析することが可能である少なくとも１つ以上のコントロール反応ウェルと、前記核酸解析試薬が配置され、前記サンプルに含有する核酸を解析することが可能であるその他の複数の反応ウェルと、を備え、前記サンプルが含有する核酸が、前記コントロール反応ウェルおよび前記その他の複数の反応ウェルへと分配され得るものである。
【００１２】
本発明の第一実施形態の反応容器について、図１を参照してさらに詳しく説明する。図1に示すように反応容器１０は、核酸の解析に用いられる核酸解析試薬３が配置されており核酸を含有するサンプルを解析することが可能であるその他の複数の反応ウェル１（図１では１つしか記載されていないが、複数あってもかまわない。）と、前記核酸解析試薬３および核酸を特異的に検出可能な定量試薬４が配置されており、前記サンプルに含有される核酸の量の定量と核酸の解析が可能であるコントロール反応ウェル２と、流路５と、溶液を注入可能な注入口６と、が基材７に備えられており、流路５によって、注入口６から流路５へと注入された前記サンプルが、前記コントロール反応ウェル２および前記その他の複数の反応ウェル１へと分配され得る。
【００１３】
本発明において、「核酸」とは、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はその類縁体を指し、天然のものであってもよく、合成されたものであってもよい。前記類縁体としては、ＰＮＡ、ＬＮＡ等の人工核酸が挙げられる。天然の核酸として、例えば、生物から回収されたゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ等がある。また、合成された核酸として、β−シアノエチルホスフォロアミダイト法ＤＮＡ固相合成法等の公知の化学的合成法により合成されたＤＮＡや、ＰＣＲ等の公知の核酸増幅法により合成された核酸、逆転写反応により合成されたｃＤＮＡ等がある。
【００１４】
本発明において、「核酸を含有するサンプル」とは、動物、植物、微生物、培養細胞等の生物から抽出又は精製したものでよく、また、核酸増幅反応により増幅された核酸を含むものでもよい。動物から核酸を抽出する方法としては、フェノール／クロロホルム法等の公知の手法があげられる。核酸増幅反応としては、例えば、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、ＳＭＡＰ法、ＮＡＳＢＡ法、ＲＣＡ法等があげられる。増幅された核酸が２本鎖核酸である場合には、熱変性処理や化学変性処理等により、１本鎖化した後に用いることができる。
【００１５】
前記「核酸を特異的に検出可能な定量試薬」とは、核酸と会合して会合状態を示すシグナルを発する物質であって、サンプル溶液中の核酸量に応じたシグナルの変化によって、核酸量を定量可能な試薬であれば特に制限されず、核酸特異的に会合して蛍光発光する物質であることが好ましく、二本鎖ＤＮＡ特異的に会合した後、蛍光発光する物質であることがさらに好ましい。蛍光発光する物質は、３００〜８００ｎｍの範囲の蛍光発光を示す化合物が好ましい。二本鎖ＤＮＡ特異的に会合する際の温度は０〜８０℃が好ましい。
上記物質としては、例えばＳＹＢＲＧｒｅｅｎ、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ、ＥｖａＧｒｅｅｎ、臭化エチジウム、ヘキスト３３２５８（ＣＡＳ番号２３４９１−４５−４；フェノール（４−［５−（４−メチル−１−ピペラジニル）［２，５’−ビ−１Ｈ−ベンゾイミダゾール］−２’−イル］）−三塩酸）、ＴＯＴＯ−１、ＹＯＹＯ−１、ＹＯ−ＰＲＯ−１、ＢＥＢＯ、ＢＥＴＯ、ＢＯＸＴＯなどが挙げられる。
【００１６】
「核酸の解析」とは、該サンプルに含有される核酸の塩基配列、核酸修飾等の核酸情報を識別することを云い、核酸の塩基配列、核酸修飾そのものを示す情報の他、当該情報を間接的に示す情報を識別することも包含される。当該情報を間接的に示す情報とは、例えば、塩基配列の差異から生じる二本鎖核酸形成の有無の検出などを例示できる。識別される核酸の塩基配列の情報とは、識別対象の核酸の塩基配列を含む配列からなる遺伝子配列であることが好ましく、当該遺伝子の遺伝子変異が識別されることがより好ましい。遺伝子変異とは、同一生物種の個体間において存在する遺伝子の塩基配列の相違であることが好ましい。具体的には、塩基配列中の１又は複数の塩基が置換・欠失・挿入されていることにより、塩基配列の相違は生じる。このような遺伝子変異として、例えば、ＳＮＰやＣＮＶ（Ｃｏｐｙ  Ｎｕｍｂｅｒ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ）多型、塩基欠損変異、塩基挿入変異、転座変異等が挙げられる。また、本発明において遺伝子変異とは、ＳＮＰ等の遺伝子多型のような先天的な変異に加えて、同一個体中の細胞間において存在する遺伝子の塩基配列の相違である体細胞変異等のように後天的な変異も含む。なお、当該解析においては、解析対象の核酸の増幅が行われることが好ましい。
【００１７】
「核酸解析試薬」としては、上述の核酸情報の識別に用いられる試薬であれば特に制限されず、識別に際しては、核酸の増幅に用いられる試薬であることが好ましい。該試薬に含まれるものとしては、オリゴプライマーセット、核酸合成酵素、ヌクレオシド等が挙げられ、一般的な核酸の増幅に必要な種々の組み合わせを用いればよい。
また、核酸解析試薬には、核酸の増幅に用いられる分子のほか、二本鎖核酸形成の有無の検出が可能な物質が含有されていてもよい。当該物質としては、上述した核酸を特異的に検出可能な物質もこれに含まれる。
【００１８】
「試薬が配置される」とは、前記サンプルが含有する核酸が前記コントロール反応ウェル又は前記その他の複数の反応ウェルへと分配されるよりも前に、該コントロール反応ウェル又は該その他の複数の反応ウェル中に試薬が配置されていてもよく、前記サンプルが含有する核酸が該コントロール反応ウェル又は該その他の複数の反応ウェルへと分配された後に、該コントロール反応ウェル又は該反応ウェル中に試薬が配置されてもよいことを意味し、前記サンプルが含有する核酸が該コントロール反応ウェル又は該その他の複数の反応ウェルへと分配されるよりも前にあらかじめ配置されていることが好ましい。
前記サンプルが含有する核酸が前記コントロール反応ウェル又は前記その他の複数の反応ウェルへと分配されるよりも後に試薬が配置される方法としては、例えば、試薬を収容した各試薬ウェルを、前記コントロール反応ウェル又は前記その他の複数の反応ウェルとは別に設け、前記核酸がウェルへと分配された後に各試薬ウェルと前記コントロール反応ウェル又は前記その他の複数の反応ウェルとを連通させて、試薬を配置させる方法が挙げられる。
前記サンプルが含有する核酸が前記コントロール反応ウェル又は前記その他の複数の反応ウェルへと分配されるよりも前に試薬が配置される方法としては、試薬を前記コントロール反応ウェル又は前記その他の複数の反応ウェル内壁に乾燥固定させる方法が挙げられる。
従って、本実施形態において、前記定量試薬及び／または前記核酸解析試薬が乾燥状態で配置されていることが好ましい。当該試薬が乾燥状態で配置されていることで、当該試薬の劣化を低減できる。
また、試薬に含まれる全ての物質が、前記核酸が前記コントロール反応ウェル又は前記その他の複数の反応ウェルへと分配されるよりも前に試薬が配置されていなくともよく、前記核酸が前記コントロール反応ウェル又は前記その他の複数の反応ウェルへと分配されるよりも前と後で分けて配置されてもよい。このような例としては、例えば、核酸解析試薬のうち核酸の増幅に用いられる物質があらかじめ固定された前記コントロール反応ウェル及び前記その他の複数の反応ウェルにサンプルを注入し、核酸を増幅させた後、増幅された核酸の量を検出可能な物質を、前記コントロール反応ウェル及び前記その他の複数の反応ウェルへと注入させることが挙げられる。
【００１９】
本実施形態の反応容器は、前記コントロール反応ウェル又は前記その他の複数の反応ウェルへと、前記サンプルが含有する核酸を分配し得る流路を備える。当該流路の分岐の位置、方向等は特に制限されないが、例えば、図２（ａ）〜（ｃ）に示すような態様を例示できる。生体サンプルからの核酸抽出で得られた核酸量を、該サンプルの解析より前に定量可能であるとの観点から、コントロール反応ウェル２は、その他の複数の反応ウェル１よりも注入口の近くに配置されることが好ましい。これにより、前記その他の複数の反応ウェルへよりも先に前記コントロール反応ウェルへと前記核酸を含むサンプルが分配され易くすることができる。
また、例えば図２（ｂ）又は（ｃ）であれば、コントロール反応ウェルにつながる流路とその他の複数の反応ウェルにつながる流路との分岐点よりもその他の複数の反応ウェル側の流路に、流路の開閉が可能なサンプル溶液の塞ぎ止め手段を設けることで、コントロール反応ウェルにおいて算出される核酸の量によりその他の複数の反応ウェルへの送液の可否を判断し、送液を制御することができる。
【００２０】
本実施形態の反応容器の基材７は、光透過性を有する樹脂であることが好ましい。基材７の材料としては、光透過性を有する樹脂を好適に使用することができる。また、前記その他の複数の反応ウェル１又は前記コントロール反応ウェル２内における溶液に対して光学的分析（蛍光測定や比色測定など）をする場合には、基材７の透明性が高いことが好ましい。例えば、基材７の材料は、試料に影響を与えないものであれば特に制限はないが、特にポリプロピレン、ポリカーボネート、アクリルのいずれかを含む樹脂材料を用いれば、良好な可視光透過性を確保することができる。ポリプロピレンとしては、ホモポリプロピレンやポリプロピレンとポリエチレンとのランダム共重合体を使用することができる。また、アクリルとしては、ポリメタクリル酸メチル、または、メタクリル酸メチルとその他のメタクリル酸エステル、アクリル酸エステル、スチレンなどのモノマーとの共重合体を使用することができる。また、これらの樹脂材料を使用する場合、反応容器の耐熱性や強度を確保することもできる。樹脂材料以外としては、アルミニウム、銅、銀、ニッケル、真鍮、金等の金属材料を挙げることができる。金属材料を用いた場合、加えて熱伝導率及び封止性能に優れる。
【００２１】
なお、基材７の前記その他の複数の反応ウェル１又は前記コントロール反応ウェル２の底部を透明とすることで、蛍光等の検出・分析を外部から行うことができる。なお本実施形態における「透明」及び「光透過性」とは、形成した際の光域（波長２３０〜７８０ｎｍ）の全平均透過率が７０％以上であることが好ましい。
【００２２】
基材７の加工方法としては、樹脂材料の場合には、射出成形、真空成形等の各種樹脂成形法や、機械切削などを用いることができる。金属材料の場合には、厚手の基材を用いた研削加工やエッチング、薄手の金属シートにプレス加工や絞り加工を施すことで形成することができる。
【００２３】
また、基材７の厚みが５０μｍ〜３ｍｍの範囲にある場合、良好な光透過性、耐熱性、強度を確保でき、凹部の加工を確実に行うことができるため好ましい。
【００２４】
［第二実施形態］
本実施形態の反応容器は、核酸を特異的に検出可能な定量試薬及び核酸の解析に用いられる核酸解析試薬が配置され、核酸を含有するサンプルの核酸の量を定量することと、該サンプルに含有する核酸を解析することが可能である少なくとも１つ以上のコントロール反応ウェルと、前記核酸解析試薬が配置され、前記サンプルに含有する核酸を解析することが可能であるその他の複数の反応ウェルと、を備え、前記サンプルが含有する核酸が、前記コントロール反応ウェルおよび前記その他の複数の反応ウェルへと分配され得るものである。詳細については、上記、第一実施形態で述べたため省略するが、図３（ａ）〜（ｃ）に示すような反応容器中にウェルが複数存在し、外形が円形の容器でもよい。
【００２５】
反応容器本体２１は、反応容器本体２１の中心から等距離になるように反応容器本体２１の周方向に並べて配置されたその他の複数の反応ウェル１およびコントロール反応ウェル２と、反応容器本体２１上でその他の複数の反応ウェル１およびコントロール反応ウェル２のそれぞれに連通して設けられた流路２３とを有している。本実施形態では２０個のその他の複数の反応ウェル１および３個のコントロール反応ウェル２、合計２３個のウェルが反応容器本体２１に設けられている。
前記コントロール反応ウェル２の数や、反応容器本体２１における前記コントロール反応ウェル２をどのウェルにするかは、反応容器１０での反応の確認や、解析の方法にあわせて、適宜決定することができる。
【００２６】
また、反応容器本体２１の中央部には、精製された核酸を含有する核酸溶液などをその他の複数の反応ウェル１およびコントロール反応ウェル２に送液するための注入口２６と、注入口２６の近傍に形成された出口２７とを有している。注入口２６及び出口２７は、流路２３に連通している。さらに、反応容器本体２１には、注入口２６及び出口２７を取り囲むように反応容器本体２１の外面から突出して形成された突出壁部２８が設けられている。
【００２７】
反応容器本体２１の材料は、上述の第一実施形態の基材７と同様の材料でよく、また少なくともその他の複数の反応ウェル１およびコントロール反応ウェル２の部分において上述の第一実施形態と同様に光透過性を有することが好ましい。
【００２８】
流路２３は、その他の複数の反応ウェル１およびコントロール反応ウェル２よりも径方向内側の反応容器本体２１上に凹部が形成されることで設けられている。また、流路２３は、主流路２４と、分岐流路２５とを有している。主流路２４は、反応容器本体２１の中心と反応容器本体２１の径方向外側との間で蛇行しつつ反応容器本体２１の周方向に延びて形成されている。分岐流路２５は、主流路２４と反応ウェル１およびコントロール反応ウェル２のそれぞれとを連絡するように主流路２４から分岐して形成されている。
【００２９】
主流路２４の一端２４Ａが注入口２６に連通し、主流路２４の他端２４Ｂが出口２７に連通している。また、主流路２４は、反応容器本体２１の周方向で隣り合うその他の複数の反応ウェル１およびコントロール反応ウェル２の間で、中心軸Ｏに沿って突出する山形２４Ｃを有するように形成されている。反応容器本体２１の周方向に隣り合うその他の複数の反応ウェル１およびコントロール反応ウェル２の間で中心軸線Ｏ方向に山形状２４Ｃを有することで、反応容器１０を中心軸線Ｏ回りに回転させたときに、主流路２４に貯留している液体は、山形状２４Ｃの頂点２４Ｄにおいて途切れて反応ウェル１およびコントロール反応ウェル２のそれぞれに液体が送液される。
【００３０】
分岐流路２５は、主流路２４との接続部分において主流路２４の流路面積よりも狭く形成されている。分岐流路２５の主流路２４に接続された部分は、液体が主流路２４から分岐流路２５に流動することを制限する流動制限部２５Ａになっている。
【００３１】
蓋体２９は、反応容器本体２１においてその他の複数の反応ウェル１及びコントロール反応ウェル２、並びに流路２３が形成された側に設けられている。蓋体２９が反応容器本体２１に貼り付けられることで、その他の複数の反応ウェル１及びコントロール反応ウェル２、並びに流路２３となる凹部に蓋がされて、独立した反応空間及び流路になっている。
【００３２】
蓋体２９の材料としては、熱伝導性が高い材料であることが好ましく、例えばアルミニウム、銅、銀、ニッケル、真鍮、及び金などの金属材料を採用することができる。熱伝導性を有する部分は少なくともその他の複数の反応ウェル１及びコントロール反応ウェル２が位置する部分にあればよい。また、その他の複数の反応ウェル１及びコントロール反応ウェル２内での生化学反応（例えばＰＣＲ反応）に十分な速度でその他の複数の反応ウェル１及びコントロール反応ウェル２の内部の液体などに熱を伝達可能であれば、上述の反応容器本体２１と同様の樹脂材料で形成された薄板材によって蓋体２９が構成されていてもかまわない。
【００３３】
本実施形態の反応容器１０は、反応容器１０が中心軸線Ｏ回りに回転して生じる遠心力によって、主流路２４に貯留された液体を分岐流路２５のそれぞれに送液し、分岐流路２５を通じてその他の複数の反応ウェル１及びコントロール反応ウェル２のそれぞれに液体を送液する。
【００３４】
≪核酸解析装置≫
［第一実施形態］
本実施形態の核酸解析装置は、先に記載の反応容器と、核酸を抽出する抽出部と、抽出部において得られた核酸を精製する精製部とを備えるものである。また、本実施形態の核酸解析装置は、コントロール反応ウェル又はその他の複数の反応ウェル内の溶液を光学的に分析する測定部を備えることが好ましい。当該抽出部および当該精製部は、本発明の反応容器の一部として基材に設けられていてもよいが、反応容器とは別の構成であってもよい。本実施形態の核酸解析装置としては、例えば、特許第５００３８４５号に記載されている自動処理可能な核酸解析装置などが好適に用いられる。
先に記載の反応容器を備えた核酸解析装置は、核酸解析装置内からサンプルを取り出すことなく、抽出部又は精製部において得られたサンプルに含有される核酸量を、容易に、高い信頼度で解析できる。
上記のような解析装置での自動解析だけでなく、例えば図１に記載の実施形態１の反応容器を用いて、手作業の分注によって反応を行い、公知の蛍光測定装置・ソフトで解析することも可能である。
【００３５】
≪核酸解析方法≫
［第一実施形態］
本実施形態の核酸解析方法は、先に記載の反応容器、又は、先に記載の核酸解析装置を用いる核酸解析方法であって、ｂ１)前記その他の複数の反応ウェルにおいて解析され得る核酸と同一の核酸を含有するサンプルを、前記コントロール反応ウェルに注入する工程と、ｂ２)前記コントロール反応ウェルにおいて、前記サンプルに含有される核酸と前記定量試薬とを会合させた会合状態を形成させる工程と、ｂ３)該会合状態で発せられるシグナルを測定する測定工程と、ｂ４)該測定工程で測定されたシグナルから、前記その他の複数の反応ウェルにおいて解析され得るサンプルに含有される核酸の量を算出する工程、を有する核酸定量工程Ｂを含み、前記核酸定量工程Ｂの前に、生体試料からの核酸抽出を行う核酸抽出工程Ａと、該核酸抽出工程Ａの後に、核酸を含有するサンプルを前記その他の複数の反応ウェルに注入して該その他の複数の反応ウェルにおいて前記核酸の識別を行う核酸解析工程Ｃと、を含み、前記核酸が、前記核酸抽出工程Ａにおいて得られた核酸である核酸解析方法である。「前記その他の複数の反応ウェルにおいて解析され得る核酸と同一の核酸」とは、前記その他の複数の反応ウェルにおいて解析され得る核酸の量を算出可能な程度に同一の組成を有する核酸のことを指す。
【００３６】
本発明において、「核酸解析工程」とは、例えばリアルタイムＰＣＲ法、Ｔａｑｍａｎ（登録商標）法、Ｃｙｃｌｅａｖｅ（登録商標）法、Ｓｃｏｐｉｏｎ法、ｉＦＲＥＴ法、Ｉｎｖａｄｅｒ（登録商標）法など、一般的に核酸を解析する際に用いられる手法である。
【００３７】
以下、本実施形態の核酸解析方法を、図５を参照して説明する。まず、生体試料から核酸を抽出し、核酸を得る（工程Ａ）。工程Ａで得られた核酸を含有するサンプルを、その他の複数の反応ウェルへと注入し、核酸解析試薬によって核酸の識別を行う（工程Ｃ）。同様に、工程Ａで得られた核酸を含有するサンプルを、コントロール反応ウェルへと注入する（工程ｂ１）。コントロール反応ウェルへと注入されたサンプルに含有される核酸と定量試薬とが会合し、会合状態を形成させる（工程ｂ２）。次いで、核酸と会合状態となった定量試薬から発せられたシグナルを測定する（工程ｂ３）。測定されたシグナル強度をもとに、工程Ｃの核酸の増幅が行われる前のサンプルに含有される核酸の量を算出する（工程ｂ４）。
【００３８】
核酸解析方法が、工程Ｂを含むことで、その他の複数の反応ウェルにおいて実施される核酸解析に用いられる増幅前の核酸量を算出することができ、前記その他の複数の反応ウェルにおいて実施される核酸解析結果の信頼度および正確性を向上させることができる。
特に遺伝子変異の解析においては核酸の量が重要であるため、工程Ｃの前に核酸の量が十分であることを確認できることは非常に意義がある。
【００３９】
［第二実施形態］
本実施形態の核酸解析方法は、前記核酸抽出工程Ａ及び前記核酸定量工程Ｂの後に、該核酸定量工程Ｂによって算出された核酸の量により核酸解析工程Ｃにより得られた解析結果の妥当性を判断する工程Ｄを含む。
したがって、工程Ｄは、工程Ａ、工程Ｂおよび工程Ｃの後に含まれる。工程Ｄを含む本実施形態の核酸解析方法の一例を図６に示す。核酸解析方法が、工程Ｄを含むことで核酸解析結果の妥当性が判断され、誤った解析結果の採択の回避、再解析の必要性の速やかな提示等を実現することができる。
【００４０】
［第三実施形態］
本実施形態の核酸解析方法は、前記核酸抽出工程Ａ及び前記核酸定量工程Ｂの後に、該核酸定量工程Ｂによって算出された核酸の量及び核酸解析工程Ｃにより得られた解析結果から、前記解析結果の妥当性を判断する工程Ｄと同時に、核酸解析装置の不具合を検知する工程Ｅを含む。
したがって、工程Ｅは、工程Ａ、工程Ｂおよび工程Ｃの後に含まれ、前記解析結果の妥当性を判断する工程Ｄと同時に行われる。工程Ｅを含む本実施形態の核酸解析方法の一例を図７に示す。核酸解析方法が、工程Ｅを含むことで核酸解析装置の不具合が検知され、解析装置の不具合の生じている箇所の断定、不具合に対する速やかな処置等を実現することができる。
【００４１】
［第四実施形態］
本実施形態の核酸解析方法は、前記核酸抽出工程Ａの後且つ前記核酸定量工程Ｂの前に、核酸精製工程Ｐをさらに含む。工程Ｐを含む本実施形態の核酸解析方法の一例を図８に示す。核酸解析方法が、工程Ｐを含むことでサンプル中の核酸の純度が向上し、より正確な核酸解析が可能となる。
第四実施形態以降は、解析結果判断工程（Ｄ）、解析装置不具合検地工程（Ｅ）を行うかは任意で良い。
【００４２】
［第五実施形態］
本実施形態の核酸解析方法は、前記核酸解析工程Ｃが、前記核酸定量工程Ｂの後に含まれており、前記核酸定量工程Ｂの後且つ前記核酸解析工程Ｃの前に、核酸精製工程Ｐを含む。工程Ｐを含む本実施形態の核酸解析方法の一例を図９に示す。前記核酸定量工程Ｂの後且つ前記核酸解析工程Ｃの前に、工程Ｐが含まれることで、工程Ｃにおいて解析されるサンプルに対してのみ核酸精製が行われるため、核酸精製に必要な試薬等を削減できる。
【００４３】
［第六実施形態］
本実施形態の核酸解析方法は、前記核酸解析工程Ｃが、前記核酸定量工程Ｂの後に含まれており、該核酸定量工程Ｂによって算出された核酸の量により該核酸解析工程Ｃへの移行の可否を判断する工程Ｊを、該核酸定量工程Ｂの後且つ該核解析工程Ｃの前にさらに含む。工程Ｊを含む本実施形態の核酸解析方法の一例を図１０に示す。該核酸定量工程Ｂの後且つ該核解析工程Ｃの前に工程Ｊが含まれることで、工程Ｃを行う前に核酸解析の中断を選択でき、不正確な核酸解析結果を得ることを回避できる。また、工程Ｃに必要な試薬等を削減できる。
【００４４】
［第七実施形態］
本実施形態の核酸解析方法は、前記核酸定量工程Ｂによって算出された核酸の量により前記核酸精製工程Ｐへの移行の可否を判断する工程Ｊ´を、該核酸定量工程Ｂの後且つ該核酸精製工程Ｐの前にさらに含む。工程Ｊ´を含む本実施形態の核酸解析方法の一例を図１１に示す。該核酸定量工程Ｂの後且つ該核解析工程Ｐの前に工程Ｊ´が含まれることで、工程Ｐを行う前に核酸解析の中断を選択でき、不正確な核酸解析結果を得ることを回避できる。また、工程Ｐに必要な試薬等を削減できる。
【００４５】
前記「前記定量試薬が、前記核酸解析工程Ｃで行われる反応を阻害しない濃度」とは、核酸定量試薬が、核酸を十分に定量しうる程度の濃度であって、且つ、解析工程で実施される核酸増幅工程及び核酸検出工程にて反応を阻害しない濃度である。
例えば、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉについては、市販の１００００×ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉを、０．５×ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ以上２×ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ未満に希釈したものが好ましい。より好ましくは、１×ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ以上２×ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ未満に希釈したものが好ましい。
【実施例】
【００４６】
次に、実施例を示して本発明をさらに詳細に説明する。なお、下記の実施例は、本発明が適用された具体的な一例であり、本発明を何ら限定しない。
【００４７】
≪解析準備≫
１）定量試薬の選定
定量試薬として、二本鎖ＤＮＡ特異的に会合する物質であるＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉを選定した。ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉはシアニン系の非対称蛍光物質であり、二本鎖ＤＮＡの塩基間に入り込んだ（インターカレート）際に４８８ｎｍの励起光を照射されると５２２ｎｍを極大とする蛍光を発する特徴を有している。
【００４８】
２）核酸解析試薬の選定
核酸解析工程として、Ｉｎｖａｄｅｒ（登録商標）法とＰＣＲ法を組み合わせたＩｎｖａｄｅｒ  Ｐｌｕｓ法を用いた。Ｉｎｖａｄｅｒ  Ｐｌｕｓ法では、予め反応容器にPCR反応用の試薬類とＩｎｖａｄｅｒ反応用の試薬類とをあわせて配置しておく。発光色素として、Ｒｅｄｍｏｎｄ  Ｒｅｄを選定した。Ｒｅｄｍｏｎｄ  Ｒｅｄは、Ｉｎｖａｄｅｒ反応において、Ｃｌｅａｖａｓｅ（登録商標）が作用し、蛍光色素及び蛍光消光物質が修飾されたＤＮＡ基質であるＦＲＥＴカセットの該蛍光色素と該蛍光抑制因子が切り離された際に５７９ｎｍの励起光を照射されると５９５ｎｍを極大とする蛍光を発する特徴を有している。
【００４９】
３）ＰＣＲ用プライマーの選定
ＰＣＲ用プライマーとして、ハウスキーピング遺伝子である（常に発現又は機能している遺伝子）ＴＣＦ４の多型を含まない領域を増幅するものを選定した。
【００５０】
４）混合試薬の調整
ｉ）コントロール試薬液（０×ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ）
２０ｍＭ  ＭＯＰＳ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．５）
０．４ｍＭ  ｄＮＴＰ
１Ｕ／ｗｅｌｌ ポリメラーゼ
５０Ｕ／ｗｅｌｌ  Ｃｌｅａｖａｓｅ（登録商標）
８０ｍＭ  トレハロース
０．８μＭ  アレルプローブオリゴＤＮＡ
０．０５μＭ  インベーダーオリゴＤＮＡ
０．７μＭ  ＦＲＥＴカセットオリゴＤＮＡ
０．９μＭ  ＦプライマーオリゴＤＮＡ
０．９μＭ  ＲプライマーオリゴＤＮＡ
ｉｉ）低濃度ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ含有試薬液
２０ｍＭ  ＭＯＰＳ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．５）
０．４ｍＭ  ｄＮＴＰ
１Ｕ／ｗｅｌｌ ポリメラーゼ
５０Ｕ／ｗｅｌｌ  Ｃｌｅａｖａｓｅ（登録商標）
８０ｍＭ  トレハロース
０．８μＭ  アレルプローブオリゴＤＮＡ
０．０５μＭ  インベーダーオリゴＤＮＡ
０．７μＭ  ＦＲＥＴカセットオリゴＤＮＡ
０．９μＭ  ＦプライマーオリゴＤＮＡ
０．９μＭ  ＲプライマーオリゴＤＮＡ
低濃度ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ
※「低濃度ＳＹＢＥＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ」とは、特許文献９〜１２に記載の遺伝子解析装置により、０．１ｎｇ／μＬゲノムＤＮＡを励起波長４８８ｎｍ、蛍光波長５２２ｎｍを測定して得られる蛍光強度の値がおよそ１６０，０００となるように調製されたＳＹＢＥＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ試薬である。
ｉｉｉ）高濃度ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ含有試薬液
２０ｍＭ  ＭＯＰＳ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．５）
０．４ｍＭ  ｄＮＴＰ
１Ｕ／ｗｅｌｌ ポリメラーゼ
５０Ｕ／ｗｅｌｌ  Ｃｌｅａｖａｓｅ（登録商標）
８０ｍＭ  トレハロース
０．８μＭ  アレルプローブオリゴＤＮＡ
０．０５μＭ  インベーダーオリゴＤＮＡ
０．７μＭ  ＦＲＥＴカセットオリゴＤＮＡ
０．９μＭ  ＦプライマーオリゴＤＮＡ
０．９μＭ  ＲプライマーオリゴＤＮＡ
高濃度ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ
※「高濃度ＳＹＢＥＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ」とは、特許文献９〜１２に記載の遺伝子解析装置により、０．１ｎｇ／μＬゲノムＤＮＡを励起波長４８８ｎｍ、蛍光波長５２２ｎｍを測定して得られる蛍光強度の値がおよそ２８０，０００となるように調製されたＳＹＢＥＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ試薬である。
本実施例で使用したオリゴ配列を表１に示した。
【００５１】
【表１】
0006641706.tif 000002
【００５２】
５）核酸解析用反応容器（解析チップ）の作製
図３に記載の流路を有する反応容器を使用した。あらかじめ、上記ｉ）〜ｉｉｉ）に示す組成の試薬を、ウェル１、２、３、１１、１２、１３、２０、２１、２２（注入口から近いウェルから順番に番号付けした）の合計９ウェルに配置した３種類の解析チップを作製した。
【００５３】
６）サンプルゲノムＤＮＡ溶液の調整
抽出工程を経て全血などのサンプルからゲノムＤＮＡを得る場合は、同じ全血からの抽出液であっても、当該工程を実施するたびにゲノムＤＮＡの濃度は異なる。そこで比較が成立するように標準品として市販のゲノムＤＮＡを調整し測定することにした。サンプルゲノムＤＮＡ溶液の組成は下記のとおりである。
０．１ｎｇ／μＬ  ゲノムＤＮＡ
６．２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２
１５ｍＭ  ＮａＣｌ
上記サンプルゲノムＤＮＡ溶液を一解析チップあたり２７０μＬずつ解析チップの注入口から送液して、試薬が配置された全てのウェルを満たした。２７０μＬは、それぞれのウェルが溶液を介してつながることのない溶液量である。
【００５４】
≪解析工程≫
７）核酸定量工程
各解析チップを核酸解析装置（特許文献９〜１２参照）にセットし、解析を開始した。まず、解析チップを４０℃で２分間加温した。４０℃の状態を保ったまま、各解析チップのウェルについて、３０秒１サイクルとして５サイクル、合計２．５分間、励起波長４８８ｎｍ、蛍光波長５２２ｎｍで蛍光測定を行った。検出された蛍光強度の値を表２〜４に示す。
【００５５】
【表２】
0006641706.tif 000003
ｉ）の試薬を含む解析チップのＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉによる蛍光強度
【００５６】
【表３】
0006641706.tif 000004
ｉｉ）の試薬を含む解析チップのＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉによる蛍光強度
【００５７】
【表４】
0006641706.tif 000005
ｉｉｉ）の試薬を含む解析チップのＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉによる蛍光強度
【００５８】
８）定量結果
ｉ）については、核酸を定量するための蛍光色素であるＳＹＢＥＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉを含まれないため、５２２ｎｍの蛍光は検出されなかった。
ｉｉ）およびｉｉｉ）については、核酸を定量するための蛍光色素であるＳＹＢＥＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉを含むため、５２２ｎｍの蛍光を検出した。特にｉｉｉ）については、高濃度のＳＹＢＥＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉを含むため、蛍光強度がおよそ２８０，０００と高い値であった。
【００５９】
９）核酸増幅工程
ｉ）〜ｉｉｉ）の試薬を含む解析チップについて、前記定量工程を経た後に次に示す条件で各々ＰＣＲを行った。
初期変性９５℃：２分間
（変性９５℃：３０秒間、伸長７２℃：１６秒）×３５サイクル
ＰＣＲ停止９９℃：２分間
【００６０】
１０）核酸解析工程
前記増幅工程を経た後に６３℃の状態に保ったまま、各解析チップのウェル部分に対して、３０秒１サイクルとして２０サイクル、合計１０分間、励起波長５７９ｎｍ、蛍光波長５９５ｎｍで蛍光測定を行った。ｉ）〜ｉｉｉ）の試薬を含む解析チップについて、検出された蛍光強度の値をまとめてプロットしたものを図１２に示す。
【００６１】
１１）解析結果
ｉ）ｉｉ）については、Ｒｅｄｍｏｎｄ  Ｒｅｄの５９５ｎｍの蛍光が検出されたが、ｉｉｉ）についてはＲｅｄｍｏｎｄ  Ｒｅｄの５９５ｎｍの蛍光が検出されなかった（図１２参照。なお、図１２において、ｉ）コントロール試薬液は黒い丸、ｉｉ）低濃度ＳＹＢＥＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ含有試薬液は白い四角、ｉｉｉ）高濃度ＳＹＢＥＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ含有試薬液は白い三角でプロットされた曲線である）。ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉの濃度が高く、核酸増幅工程を阻害したためであると考えられる。
また、ｉｉ）のように至適濃度の核酸定量試薬及び核酸増幅試薬を含むウェルを反応容器中に少なくとも１つ以上含めることで、核酸解析工程のコントロールとしての役割を果たし、解析結果の妥当性の判断及び解析装置の不具合を検知することが可能となる。
【００６２】
以上、本発明の実施形態について、図面を参照し、実施例を交えて詳述したが、具体的な構成はこれらの実施形態に限られるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲の設計変更等も含まれる。
【産業上の利用可能性】
【００６３】
本発明の反応容器、核酸解析装置、核酸解析方法によれば、生体試料から取り出された核酸の定量工程及び該生体試料を用いた核酸解析工程を同一ウェルで処理することにより、解析結果の妥当性の判断及び解析装置の不具合の検知が可能である。そのため、生体試料から得られた核酸の量を確認することの難しい全自動遺伝子解析システムにおいて好適に用いられる。また、医療分野、創薬分野等に広く活用される可能性があり、オーダーメイド医療の質の向上が期待される。
【符号の説明】
【００６４】
１  反応ウェル
２  コントロール反応ウェル
３  核酸解析試薬
４  定量試薬
５  流路
６  注入口
７  基材
１０  反応容器
２１  反応容器本体
２３  流路
２４  主流路
２４Ａ  一端
２４Ｂ  他端
２４Ｃ  山形状
２４Ｄ  頂点
２５  分岐流路
２５Ａ  流動性制限部
２６  注入口
２７  出口
２８  突出壁部
２９  蓋体
Ｏ  中心軸線（回転軸）
【図１】
0006641706.tif 000006
【図２】
0006641706.tif 000007
【図３】
0006641706.tif 000008
【図４】
0006641706.tif 000009
【図５】
0006641706.tif 000010
【図６】
0006641706.tif 000011
【図７】
0006641706.tif 000012
【図８】
0006641706.tif 000013
【図９】
0006641706.tif 000014
【図１０】
0006641706.tif 000015
【図１１】
0006641706.tif 000016