(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
メープルシロップ由来の物質として、グレードＤのメープルシロップに含まれるタンパク質のうち分子量が１０，０００以上のものを有効成分として有する大腸癌の治療用組成物。
【請求項２】
メープルシロップ由来の物質として、グレードＤのメープルシロップに含まれる分子量が１０，０００以上のタンパク質を含む大腸癌細胞増殖抑制用加工食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メープルシロップ由来の大腸癌の治療用組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
大腸癌は、世界的に罹患者数及び死者数の多い疾患である。腫瘍が粘膜層に限局していれば、内視鏡や外科的手術により完治させることが可能であるが、診断された時には既に進行していることが多い。フルオロピリミジンにオキサリプラチンまたはイリノテカンを追加した化学療法が進行性大腸癌の治療法として標準的に実施されている。近年、植物抽出物など植物由来製剤を癌治療へ用いることが興味をもたれるようになってきた。植物抽出物を用いた自然療法は、従来の癌治療法よりも有害事象が少ないことが期待される。
【０００３】
メープルシロップは世界中の人々に使用されている天然甘味料である。メープルシロップには、主成分であるスクロースやグルコースのみならず、オリゴ糖、有機酸、アミノ酸、ビタミン、マグネシウムや亜鉛などのミネラルなど様々な物質が含まれている。さらに、メープルシロップには、リグナン、クマリン、ケベコールやギンナリンのようなフェノール性化合物が含まれていることが近年報告された。
【０００４】
これらのフェノール性化合物は様々な活性を有している。メープルシロップのブタノール抽出物を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏでの研究では、α−グルコシダーゼの阻害作用があることや（特許文献１：非特許文献１）、酢酸エチルエステル抽出物には抗酸化作用や抗腫瘍作用があることが報告された（非特許文献２）。また、ギンナリンＡには大腸癌細胞の増殖抑制効果があることが報告された（非特許文献３）。一方、メープルシロップそのものによる効果についても研究がすすめられ、２型糖尿病モデルラットにメープルシロップを投与した場合、ショ糖溶液を投与したラットに比べて血糖値の上昇が有意に抑制されることが明らかとなった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００６−００８５２３号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ａｐｏｓｔｏｌｉｄｉｓ  Ｅ，  Ｌｉ  ＬＹ，  Ｌｅｅ  Ｃ  ａｎｄ  Ｓｅｅｒａｍ  ＮＰ：  Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｈｅｎｏｌｉｃ−ｅｎｒｉｃｈｅｄ  ｍａｐｌｅ  ｓｙｒｕｐ  ｅｘｔｒａｃｔｓ  ｆｏｒ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  ｈｙｄｒｏｌｙｚｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅｓ  ｒｅｌｅｖａｎｔ  ｔｏ  ｔｙｐｅ  ２  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ．  Ｊ  Ｆｕｎｃｔ  Ｆｏｏｄｓ  ３：  １００−１０６，  ２０１１．
【非特許文献２】Ｌｅｇａｕｌｔ  Ｊ，  Ｇｉｒａｒｄ−Ｌａｌａｎｃｅｔｔｅ  Ｋ，  Ｇｒｅｎｏｎ  Ｃ，  Ｄｕｓｓａｕｌｔ  Ｃ  ａｎｄ  Ｐｉｃｈｅｔｔｅ  Ａ：  Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ  ａｃｔｉｖｉｔｙ，  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ  ｏｖｅｒｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｔｉｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｍａｐｌｅ  ｓａｐ  ａｎｄ  ｓｙｒｕｐ  ｆｒｏｍ  Ａｃｅｒ  ｓａｃｃｈａｒｕｍ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  ｆｏｏｄ  １３：  ４６０−４６８，  ２０１０．
【非特許文献３】Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｓａｒｒｉａｓ  Ａ，  Ｌｉ  Ｌ  ａｎｄ  Ｓｅｅｒａｍ  ＮＰ：  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｍａｐｌｅ  （Ａｃｅｒ）  ｐｌａｎｔ  ｐａｒｔ  ｅｘｔｒａｃｔｓ  ｏｎ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ａｒｒｅｓｔ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃ  ａｎｄ  ｎｏｎ−ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃ  ｃｏｌｏｎ  ｃｅｌｌｓ．  Ｐｈｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ：  ＰＴＲ  ２６：  ９９５−１００２，  ２０１２．
【非特許文献４】Ｋａｎｇ  ＪＳ，  Ｐａｒｋ  ＩＨ，  Ｃｈｏ  ＪＳ，  ｅｔ  ａｌ．：  Ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ−３−ｇａｌｌａｔｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎａｓａｌ  ｐｏｌｙｐ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ．  Ｐｈｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ：  ＰＴＲ  ２８：  ９８−１０３，  ２０１４．
【非特許文献５】Ｚｈａｉ  Ｘ，  Ｃｈｉ  Ｊ，  Ｔａｎｇ  Ｗ，  ｅｔ  ａｌ．：  Ｙｅｌｌｏｗ  Ｗｉｎｅ  Ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌｉｃ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  Ｉｎｈｉｂｉｔ  Ｍａｔｒｉｘ  Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−２，  −９  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｐｒｏｖｅ  Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｔｉｃ  Ｐｌａｑｕｅ  ｉｎ  ＬＤＬ−Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  Ｍｉｃｅ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｃｉｅｎｃｅｓ２０１４．
【非特許文献６】Ｓｉｎｇｈ  Ｔ  ａｎｄ  Ｋａｔｉｙａｒ  ＳＫ：  Ｇｒｅｅｎ  ｔｅａ  ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ，  （−）−ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ−３−ｇａｌｌａｔｅ，  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｓｋｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｂｅｔａ−ｃａｔｅｎｉｎ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｅｄ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ２７３：  ４１８−４２４，  ２０１３．
【非特許文献７】Ｚｈａｏ  Ｍ，  Ｔａｎｇ  ＳＮ，  Ｍａｒｓｈ  ＪＬ，  Ｓｈａｎｋａｒ  Ｓ  ａｎｄ  Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ  ＲＫ：  Ｅｌｌａｇｉｃ  ａｃｉｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｈｕｍａｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ  ｇｒｏｗｔｈ  ｉｎ  Ｂａｌｂ  ｃ  ｎｕｄｅ  ｍｉｃｅ．  Ｃａｎｃｅｒ  ｌｅｔｔｅｒｓ  ３３７：  ２１０−２１７，  ２０１３．
【非特許文献８】Ｔｓａｉ  ＣＭ，  Ｓｕｎ  ＦＭ，  Ｃｈｅｎ  ＹＬ，  Ｈｓｕ  ＣＬ，  Ｙｅｎ  ＧＣ  ａｎｄ  Ｗｅｎｇ  ＣＪ：  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｄｅｐｒｅｓｓｉｎｇ  ＰＭＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｉｎｖａｓｉｖｅ  ｂｅｈａｖｉｏｒｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｌｕｎｇ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｃｉｓ−  ａｎｄ  ｔｒａｎｓ−ｃｉｎｎａｍｉｃ  ａｃｉｄ．  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ：  ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ４８：  ４９４−５０１，  ２０１２．
【非特許文献９】Ｃｈｅｎ  Ｙ，  Ｚｈｅｎｇ  Ｌ，  Ｌｉｕ  Ｊ，  ｅｔ  ａｌ．：  Ｓｈｉｋｏｎｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ｂｙ  ｒｅｄｕｃｉｎｇ  ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−２／−９  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｉａ  ＡＫＴ／ｍＴＯＲ  ａｎｄ  ＲＯＳ／ＥＲＫ１／２  ｐａｔｈｗａｙｓ．  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ２１：  ４４７−４５５，  ２０１４．
【非特許文献１０】Ｋｕｏ  ＣＬ，  Ｌａｉ  ＫＣ，  Ｍａ  ＹＳ，  Ｗｅｎｇ  ＳＷ，  Ｌｉｎ  ＪＰ  ａｎｄ  Ｃｈｕｎｇ  ＪＧ：  Ｇａｌｌｉｃ  ａｃｉｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎｖａｓｉｏｎ  ｏｆ  ＳＣＣ４  ｈｕｍａｎ  ｏｒａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ａｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ＮＦｋａｐｐａＢ，  Ｒａｓ  ａｎｄ  ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−２  ａｎｄ  −９．  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ｒｅｐｏｒｔｓ  ３２：  ３５５−３６１，  ２０１４．
【非特許文献１１】Ｘｕ  Ｑ，  Ｍａ  Ｊ，  Ｌｅｉ  Ｊ，  ｅｔ  ａｌ．：  ａｌｐｈａ−Ｍａｎｇｏｓｔｉｎ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ  ｔｈｅ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ−ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ  ｐａｔｈｗａｙ．  ＢｉｏＭｅｄ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ２０１４：  ５４６３５３，  ２０１４．
【非特許文献１２】Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｓａｒｒｉａｓ  Ａ，  Ｍａ  Ｈ，  Ｅｄｍｏｎｄｓ  ＭＥ  ａｎｄ  Ｓｅｅｒａｍ  ＮＰ：  Ｍａｐｌｅ  ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌｓ，  ｇｉｎｎａｌｉｎｓ  Ａ−Ｃ，  ｉｎｄｕｃｅ  Ｓ−  ａｎｄ  Ｇ２／Ｍ−ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ａｒｒｅｓｔ  ｉｎ  ｃｏｌｏｎ  ａｎｄ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ｄｅｃｒｅａｓｉｎｇ  ｃｙｃｌｉｎｓ  Ａ  ａｎｄ  Ｄ１  ｌｅｖｅｌｓ．  Ｆｏｏｄ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １３６：  ６３６−６４２，  ２０１３．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
メープルシロップは、樹液を煮詰めることで作られているが、樹液を採取する時期や気温の違いにより、色、香り及び味に変化がでる。そのため、カナダではこれらの違いに基づき、メープルシロップをグレードＡＡ（エキストラライト）、グレードＡ（ライト）、グレードＢ（ミディアム）、グレードＣ（アンバー）、グレードＤ（ダーク）の５つのグレードに分類している。
【０００８】
メープルシロップの色は季節が進むにつれて濃くなっていき、その色の濃さと抗酸化力には相関関係が認められることが報告されている。このことからメープルシロップのグレードが異なると癌細胞に対する効果も違ってくることが示唆されている。
【０００９】
しかしながら、グレードによるメープルシロップの効果の違いについての検討はほとんどなされていない。そのため、メープルシロップを大腸癌治療に用いるには、グレードによる抗腫瘍効果の違いについて評価することが必要となる。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は上記の要求に鑑みて想到されたものであり、色調の異なる３種類のメープルシロップ投与による大腸癌細胞の増殖、遊走、浸潤への影響を検討することで、メープルシロップを用いた有効な大腸癌治療用組成物を提供するものである。
【００１１】
より具体的に本発明に係る大腸癌治療剤は、メープルシロップ由来の物質として、グレードＤのメープルシロップに含まれるタンパク質のうち分子量が１０，０００以上のものを有効成分として有する大腸癌の治療用組成物である。
【発明の効果】
【００１２】
天然甘味料として世界中の人々に使用されているメープルシロップは、ＡＫＴの活性を阻害することで大腸癌細胞の増殖及び浸潤を抑制した。そのため、メープルシロップ（特に色の濃い物）は従来の大腸癌治療法よりも有害事象の少ない治療法として適応できる可能性がある。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】培養大腸癌細胞ＤＬＤ−１やＳＷ４８０に対する高濃度のショ糖による細胞毒性を調べるため、対照として用いるショ糖溶液が０．１−１０％になるように培養液に投与し、その際の細胞増殖能を確認した結果を示すグラフである。
【図２】大腸癌細胞の増殖に対するメープルシロップの効果を検討した結果を示すグラフである。
【図３】正常大腸細胞の増殖に対してメープルシロップが影響を及ぼすかを評価するため、正常大腸上皮細胞ＣＣＤ８４１ＣｏＮを用いて細胞増殖能への影響を調べた結果を示すグラフである。
【図４】培養大腸癌細胞について、ボイデンチャンバー法を用いて、細胞の遊走・浸潤能への効果を検討した結果を示すグラフである。
【図５】ショ糖溶液またはＭａｐｌｅ  Ｓｙｒｕｐ  ＩＩＩ（グレードＤ）を細胞に投与した際のＥＲＫとＡＫＴの活性化（リン酸化）への影響について検討したウェスタンブロットの結果を示す写真である。
【図６】グレードＡＡのメープルシロップとグレードＤのメープルシロップを加えた場合に発現するｍＲＮＡの種類を、リアルタイムＰＣＲでアレイ解析を行った結果を示すグラフである。
【図７】グレードＤのメープルシロップを分子量１０，０００以上とそれ以下の画分に分け、各画分の大腸癌細胞の増殖抑制試験の結果を示すグラフである。
【図８】グレードＡＡとグレードＤの分子量１０，０００以上の画分のタンパク質が有する大腸癌細胞の増殖抑制効果を確認した実験結果を示すグラフである。
【図９】グレードＡＡとグレードＤの分子量１０，０００以上の画分のタンパク質の電気泳動の結果を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下本発明に係る大腸癌の治療用組成物および加工食品についてグラフを用いながら説明する。なお、以下の説明は本発明の一実施例を示すのであって、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。本発明の趣旨を逸脱しない範囲で、以下の実施例は改変することができる。
【００１５】
本発明はメープルシロップ由来の物質を有効成分として有する大腸癌の治療用組成物を提供するものであるが、より好ましくはこの物質が、グレードＤ（ダーク）の分子量が１０，０００以上の画分に含まれるタンパク質（以後「グレードＤ高画分タンパク質」と呼ぶ。）である。したがって、メープルシロップ自体を含むものではなく、グレードＤ高画分タンパク質を含めばよい。言い換えると、メープルシロップ由来の物質としては、グレードＤ高画分タンパク質だけを有効成分として含む大腸癌の治療用組成物（医薬組成物）である。もちろん、他の効能を有する成分が含まれていてもよい。
【００１６】
医薬組成物としての形態は特に限定されるものではなく、カプセル剤、顆粒剤、溶液、乳濁液、懸濁液、散剤、錠剤、液剤、浸剤、煎剤、トローチ剤、流エキス剤、チンキ剤、点眼剤、点鼻液、軟膏、クリーム、ローション剤、注射剤、座薬等で提供される。
【００１７】
また、グレードＤ高画分タンパク質を含有する加工食品であってもよい。特にメープルシロップ自体が含まれるのではなく、グレードＤ高画分タンパク質と、メープルシロップ以外の素材が混合された加工食品でよい。つまり、この加工食品には、メープルシロップ由来のショ糖は含まれていなくてよい。
【００１８】
また、加工食品としては、例えば、飴、ガム、ゼリー、ビスケット、クッキー、煎餅、パン、麺、魚肉・畜肉練製品、茶、清涼飲料、コーヒー飲料、乳飲料、乳清飲料、乳酸菌飲料、ヨーグルト、アイスクリーム、プリン等といった一般加工食品だけでなく、軟エキス剤、乾燥エキス剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、錠剤、液剤、浸剤、煎剤、トローチ剤、流エキス剤、チンキ剤といったエキス剤や、アルコール飲料を含んでもよい。
【００１９】
これらの加工食品の原料中に、メープルシロップの他の成分を加えることなく、分離精製したグレードＤ高画分タンパク質だけを添加することで、本発明に係る加工食品を得ることができる。言い換えると、その加工食品の材料にメープルシロップ由来の物質としては、グレードＤ高画分タンパク質だけが含まれるものである。
【実施例】
【００２０】
＜材料＞
尿素はＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社のものを使用した。３−（３−ｃｈｏｌａｍｉｄｅｐｒｏｐｙｌ）  ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ−１−ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｐｈｏｎａｔｅ  （ＣＨＡＰＳ）は和光純薬社製のものを使用した。チオウレア、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００はナカライテスク社製のものを使用した。その他の試薬はシグマ社製のものを使用した。
【００２１】
＜メープルシロップ＞
メープルシロップは市販されているものを３種類使用した。色調の違いに基づき分類を次のように行った。
（１）Ｍａｐｌｅ  Ｓｙｒｕｐ  Ｉ：金色
（２）Ｍａｐｌｅ  Ｓｙｒｕｐ  ＩＩ：琥珀色
（３）Ｍａｐｌｅ  Ｓｙｒｕｐ  ＩＩＩ：暗褐色
なお、Ｍａｐｌｅ  Ｓｙｒｕｐ  ＩＩＩはグレードＤ（ダーク）であり、Ｍａｐｌｅ  Ｓｙｒｕｐ  Ｉは、グレードＡＡ（エキストラライド）である。
【００２２】
＜高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）＞
メープルシロップ中のスクロースの濃度を、検出器にＳｈｏｄｅｘ  ＲＩ−７１を搭載したＬＣ−１０Ａｄｖｐ  ＨＰＬＣ（島津社製）を用いて分析を行った。カラムには、Ａｓａｈｉｐａｋ  ＮＨ２Ｐ−５０  ４Ｅ（島津社製）を用いた。移動相にはアセトニトリル／水、３：１（ｖ／ｖ）を用い、流速は１ｍｌ／ｍｉｎとした。１回の分析には２０μｌのサンプル溶液を使用した。サンプル溶液は、メープルシロップを、水を用いて１００倍に希釈したものを用いた。
【００２３】
＜培養大腸癌細胞＞
培養大腸癌細胞ＤＬＤ−１及びＳＷ４８０と正常大腸上皮細胞  ＣＣＤ  ８４１  ＣｏＮは、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ社から購入した。全ての細胞は、１０％牛胎児血清入りＲＰＭＩ  １６４０培地で、５％ＣＯ２環境下で培養した。
【００２４】
＜細胞増殖アッセイ＞
細胞を９６−ｗｅｌｌプレートに５×１０３個／ｗｅｌｌになるように分注し培養した。翌日培養液をメープルシロップまたはスクロース含有培地に交換し、２４、４８、７２、９６時間後にＷＳＴ−８  ｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｒｅａｇｅｎｔ（和光純薬）を用いて細胞増殖能を測定した。
【００２５】
ＷＳＴ−８アッセイに加えて細胞数の計測もＣｏｕｎｔｅｓｓ  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｅｒ  （Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｊａｐａｎ）を用いて実施した。細胞を６−ｗｅｌｌプレートに５×１０４個／ｗｅｌｌになるように分注し培養した。翌日培養液をメープルシロップまたはスクロース含有培地に交換し、２４、４８、７２、９６時間後に細胞数を計測した。
【００２６】
＜細胞遊走及び浸潤能アッセイ＞
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞遊走アッセイを、ボイデンチャンバー法を用いて実施した。細胞をインサート内に１×１０５個／インサートになるように分注し、３７℃、５％ＣＯ２の環境下でインキュベートした。メープルシロップまたはスクロース含有培地を化学誘因因子として下層に添加しておいた。過去の文献に従い、ＤＬＤ−１は４８時間後、ＳＷ４８０は２０時間後にインサートを通過した細胞数を計測した。全てのアッセイはｎ＝３で実施し、盲検下ランダムに撮影した５視野に存在する細胞数を計測した。浸潤能については、インサートの表面をマトリゲルでコーティングしたものを用いて同様に実施した。
【００２７】
＜タンパク質抽出＞
ＤＬＤ−１及びＳＷ４８０を５×１０５個／１００−ｍｍ  ｄｉｓｈになるように分注し培養した。翌日培養液をメープルシロップまたはスクロース含有培地に交換し、７２時間後タンパク質抽出液（７Ｍ尿素、２Ｍチオウレア、５％ＣＨＡＰＳ、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）を用いてタンパク質を抽出した。タンパク質の濃度はブラッドフォード法を用いて測定した。
【００２８】
＜ウェスタンブロット＞
抽出したタンパク質を還元条件下ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った後、分離したタンパク質をＰＶＤＦ（ＰｏｌｙＶｉｎｙｌｉｄｅｎｅ  ＤｉＦｌｕｏｒｉｄｅ）膜に転写した。転写した膜を抗−ｐｈｏｓｐｈｏ−ｐ４４／４２  ＭＡＰＫ抗体または抗−ｐｈｏｓｐｈｏ−ＡＫＴ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．）と４℃で一晩インキュベートした。膜を洗浄後、ＨＲＰ−結合抗ウサギＩｇＧ抗体またはＨＲＰ結合抗ネズミＩｇＧ抗体（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｑｕａｌｅｘ）と室温でインキュベートした。
【００２９】
洗浄後、化学発光試薬を用いて発光させＩｍａｇｅＱｕａｎｔ  ＬＡＳ  ５００  ｓｙｓｔｅｍ  （ＧＥ  ｈｅａｌｔｈ  ｃａｒｅ）を用いて発光像を撮影した。等量のタンパク質を用いて比較検討できているかを確かめるため、同じ膜をストリッピング後、抗ｐ４４／４２  ＭＡＰＫ  （Ｅｒｋ１／２）抗体または抗ＡＫＴ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）と反応させ同様に発光像を撮影した。
【００３０】
＜統計解析＞
全てのデータは平均±標準誤差で示した。データはＤｕｎｎｅｔｔ’ｓ  ｔｅｓｔを用いて解析し、Ｐ値が０．０５以下のとき有意であるとした。解析はＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ５  （ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて実施した。なお、グラフ中「＊」がつけられたものは、Ｐ値が０．０５以下の場合を表している。
【００３１】
＜メープルシロップ中のショ糖濃度＞
まず、メープルシロップの主成分であるショ糖の濃度を測定した。結果を表１に示す。各メープルシロップのショ糖濃度はよくコントロールされており、３種類のメープルシロップの間に有意な差は認められなかった。メープルシロップ投与による癌細胞への効果を正確に評価するため、Ｍａｐｌｅ  Ｓｙｒｕｐ  ＩＩ及びＩＩＩのショ糖濃度がＭａｐｌｅ  Ｓｙｒｕｐ  Ｉと等しくなるように調整した。また、Ｍａｐｌｅ  Ｓｙｒｕｐ  Ｉと同濃度のショ糖溶液を調製し、対照溶液とした。
【００３２】
【表１】
0006741429.tif 000002
【００３３】
＜大腸癌細胞に対するショ糖溶液の細胞毒性評価＞
培養大腸癌細胞ＤＬＤ−１やＳＷ４８０に対する高濃度のショ糖による細胞毒性を調べるため、対照として用いるショ糖溶液が０．１−１０％（ｖ／ｖ）になるように培養液に投与し、その際の細胞増殖能を確認した。結果を図１に示す。図１では、横軸は培養時間（ｈ）であり、縦軸は未処理（ショ糖溶液を加えなかった培地で培養した細胞）に対する細胞増殖能（％）を表す。
【００３４】
また、図１（Ａ）は培養大腸癌細胞ＤＬＤ−１であり、図１（Ｂ）は培養大腸癌細胞ＳＷ４８０の場合である。また、両図とも、実線は未処理の場合、細かい点線は０．１％ショ糖溶液を加えた培地で培養した場合、大きな点線は１％ショ糖溶液を加えた培地で培養した場合、二点鎖線は１０％ショ糖溶液を加えた培地で培養した場合を示す。
【００３５】
図１（Ａ）を参照して、ＤＬＤ−１では、他の濃度では影響がなかったが、未処置の細胞と比較して１０％ショ糖溶液含有培地で培養した時は、４８、７２時間後に有意に細胞増殖能が抑制された。また、１０％ショ糖含有培地では、図１（Ｂ）に示すＳＷ４８０に対しても４８、７２、９６時間後に有意に細胞増殖能を抑制した。そのため、以後の検討では、ショ糖による毒性を避けるため、メープルシロップ及びショ糖溶液を１％で投与することとした。
【００３６】
＜大腸癌細胞の増殖におけるメープルシロップの効果＞
大腸癌細胞の増殖に対するメープルシロップの効果を検討した。結果を図２に示す。図２（Ａ）は、培養大腸癌細胞ＤＬＤ−１のＷＳＴ−８アッセイの結果を示す。横軸は培養時間（ｈ）であり、縦軸は４５０ｎｍの吸収率である。図２（Ｂ）は、培養大腸癌細胞ＤＬＤ−１の細胞数計測法による結果である。横軸は培養時間（ｈ）であり、縦軸は１ウエルあたりの細胞数（×１０５個）である。
【００３７】
図２（Ｃ）は、培養大腸癌細胞ＳＷ４８０のＷＳＴ−８アッセイの結果を示す。横軸は培養時間（ｈ）であり、縦軸は４５０ｎｍの吸収率である。図２（Ｄ）は、培養大腸癌細胞ＳＷ４８０の細胞数計測法による結果である。横軸は培養時間（ｈ）であり、縦軸は１ウエルあたりの細胞数（×１０５個）である。
【００３８】
図２の４つの図において、白丸（○）は１％ショ糖含有培地で培養された場合（「Ｓｕｃｒｏｓｅ」と示した。）であり、黒四角（■）は、Ｍａｐｌｅ  Ｓｙｒｕｐ  Ｉを含有させた培地で培養された場合である。また、黒三角（▲）は、Ｍａｐｌｅ  Ｓｙｒｕｐ  ＩＩを含有させた培地で培養された場合であり、黒丸（●）は、Ｍａｐｌｅ  Ｓｙｒｕｐ  ＩＩＩを含有させた培地で培養された場合である。
【００３９】
図２（Ａ）を参照して、ＷＳＴ−８アッセイの結果、メープルシロップ投与によりＤＬＤ−１細胞の増殖能が、２４時間後（Ｍａｐｌｅ  Ｓｙｒｕｐ  ＩＩ  及びＩＩＩ）、４８時間後（Ｍａｐｌｅ  Ｓｙｒｕｐ  ＩＩＩ）、７２時間後（Ｍａｐｌｅ  Ｓｙｒｕｐ  ＩＩ及びＭａｐｌｅ  Ｓｙｒｕｐ  ＩＩＩ）で有意に抑制された（Ｐ＜０．０１、図２（Ａ））。また、図２（Ｂ）を参照して、細胞数計測法においてもＤＬＤ−１細胞の増殖能は、４８時間後（Ｍａｐｌｅ  Ｓｙｒｕｐ  ＩＩＩ）で有意に抑制された（Ｐ＜０．０１、図２（Ｂ））。
【００４０】
ＳＷ４８０についても図２（Ｃ）を参照して、ＷＳＴ−８アッセイで４８時間後（Ｍａｐｌｅ  Ｓｙｒｕｐ  ＩＩ及びＭａｐｌｅ  Ｓｙｒｕｐ  ＩＩＩ）、７２時間後（Ｍａｐｌｅ  Ｓｙｒｕｐ  ＩＩＩ）、９６時間後（Ｍａｐｌｅ  Ｓｙｒｕｐ  ＩＩＩ）  で有意に細胞増殖が抑制された（Ｐ＜０．０１、図２（Ｃ））。また、図２（Ｄ）を参照して、細胞数計測法においても７２時間後（Ｍａｐｌｅ  Ｓｙｒｕｐ  ＩＩＩ）、９６時間後（Ｍａｐｌｅ  Ｓｙｒｕｐ  ＩＩＩ）で有意に抑制された（Ｐ＜０．０１、図２（Ｄ））。
【００４１】
＜正常大腸上皮細胞の増殖におけるメープルシロップの効果＞
次に、正常大腸細胞の増殖に対してメープルシロップが影響を及ぼすかを評価するため、正常大腸上皮細胞ＣＣＤ８４１ＣｏＮを用いて細胞増殖能への影響を評価した。結果を図３に示す。図３では、横軸に培地の種類を表し、縦軸は７２時間培養した細胞数（×１０４個）を表す。癌細胞では細胞増殖能が有意に抑制されたが、正常大腸上皮細胞ＣＣＤ８４１ＣｏＮはメープルシロップを投与しても７２時間後で細胞増殖能に差が認められなかった（図３）。
【００４２】
＜癌細胞の遊走・浸潤におけるメープルシロップの効果＞
さらに、ボイデンチャンバー法を用いて、細胞の遊走・浸潤能への効果を検討した。結果を図４に示す。図４（Ａ）は培養大腸癌細胞ＤＬＤ−１の細胞遊走の結果であり、図４（Ｂ）は培養大腸癌細胞ＳＷ４８０の細胞遊走の結果である。両図とも、横軸は培地の種類を表し、縦軸はコントロール（１％ショ糖含有培地で培養した場合「Ｓｕｃｒｏｓｅ」）に対する遊走細胞の数の比率（％）を表す。
【００４３】
図４（Ｃ）は培養大腸癌細胞ＤＬＤ−１の浸潤能の結果であり、図４（Ｄ）は培養大腸癌細胞ＳＷ４８０の浸潤能の結果である。両図とも、横軸は培地の種類を表し、縦軸はコントロール（１％ショ糖含有培地で培養した場合「Ｓｕｃｒｏｓｅ」）に対する浸潤した細胞の数の比率（％）を表す。
【００４４】
図４（Ａ）、図４（Ｂ）を参照して、メープルシロップによる細胞遊走能への影響はＤＬＤ−１及びＳＷ４８０共に認められなかった。しかしながら、図４（Ｃ）を参照すると、Ｍａｐｌｅ  Ｓｙｒｕｐ  ＩＩ及びＭａｐｌｅ  Ｓｙｒｕｐ  ＩＩＩによりＤＬＤ−１の浸潤能が有意に抑制された（Ｐ＜０．０１）。また、図４（Ｄ）を参照すると、ＳＷ４８０についてもＭａｐｌｅ  Ｓｙｒｕｐ  ＩＩＩにより浸潤能が抑制される傾向が認められた（Ｐ＝０．０７７９）。
【００４５】
＜大腸癌細胞のシグナル伝達経路におけるメープルシロップの効果＞
メープルシロップ投与によるシグナル伝達経路への影響を調べるため、ショ糖溶液またはＭａｐｌｅ  Ｓｙｒｕｐ  ＩＩＩを細胞に投与した際のＥＲＫとＡＫＴの活性化（リン酸化）への影響について検討した。結果を図５に示す。
【００４６】
図５（Ａ）は、培養大腸癌細胞ＤＬＤ−１のｐ−ＥＲＫ１／２とＥＲＫ１／２のウェスタンブロットの写真である。図５（Ｂ）は、培養大腸癌細胞ＳＷ４８０のｐ−ＥＲＫ１／２とＥＲＫ１／２のウェスタンブロットの写真である。また、図５（Ｃ）は、培養大腸癌細胞ＤＬＤ−１のｐ−ＡＫＴとＡＫＴのウェスタンブロットの写真である。図５（Ｄ）は、培養大腸癌細胞ＳＷ４８０のｐ−ＡＫＴとＡＫＴのウェスタンブロットの写真である。
【００４７】
また、全ての写真において、１％ショ糖を投与した場合（「Ｓｕｃｒｏｓｅ」と表した。）と、Ｍａｐｌｅ  Ｓｙｒｕｐ  ＩＩＩを投与した場合のウェスタンブロットの写真を示した。
【００４８】
図５（Ａ）では、ｐ−ＥＲＫ１／２の場合もＥＲＫ１／２の場合も、１％ショ糖およびＭａｐｌｅ  Ｓｙｒｕｐ  ＩＩＩの投与において、薄いながら２本のラインが確認できる。それぞれのラインは、ショ糖を加えた場合と、Ｍａｐｌｅ  Ｓｙｒｕｐ  ＩＩＩを加えた場合で、ラインの濃さおよび太さに変化はなかった。
【００４９】
図５（Ｂ）では、ｐ−ＥＲＫ１／２の場合もＥＲＫ１／２の場合も、１％ショ糖およびＭａｐｌｅ  Ｓｙｒｕｐ  ＩＩＩの投与において、太い２本のラインが確認できる。それぞれのラインは、ショ糖を加えた場合と、Ｍａｐｌｅ  Ｓｙｒｕｐ  ＩＩＩを加えた場合で、ラインの濃さおよび太さに変化はなかった。
【００５０】
図５（Ｃ）では、ＡＫＴの場合は、Ｍａｐｌｅ  Ｓｙｒｕｐ  ＩＩＩの投与の場合と、ショ糖の投与の場合で、ラインの濃さがほぼ同じであった。しかし、ｐ−ＡＫＴの場合はＭａｐｌｅ  Ｓｙｒｕｐ  ＩＩＩを投与した方はショ糖を投与した場合よりラインが薄くなった。
【００５１】
図５（Ｄ）でも、ＡＫＴの場合は、Ｍａｐｌｅ  Ｓｙｒｕｐ  ＩＩＩ投与の場合と、ショ糖の投与の場合で、ラインの濃さがほぼ同じであった。しかし、ｐ−ＡＫＴの場合はＭａｐｌｅ  Ｓｙｒｕｐ  ＩＩＩを投与した方はショ糖を投与した場合よりラインが薄くなった。
【００５２】
図５（Ａ）および図５（Ｂ）を参照して、メープルシロップ投与によりＥＲＫの活性への影響は認められなかった。しかし、図５（Ｃ）と図５（Ｄ）を参照して、ＤＬＤ−１およびＳＷ４８０ともに、Ｍａｐｌｅ  Ｓｙｒｕｐ  ＩＩＩの投与によりＡＫＴの活性が顕著に抑制された。
【００５３】
以上のように、異なる３種類のメープルシロップによる大腸癌細胞への作用について検討を行った。まず、メープルシロップによる抗腫瘍効果を正確に評価するために、メープルシロップに含まれている高濃度のショ糖が大腸癌細胞の増殖に影響を与えるかについて検討を行ったところ、高濃度のショ糖（１０％投与）により大腸癌細胞の増殖は有意に抑制された（図１）。このことから、メープルシロップに含まれるショ糖は、その高い浸透圧による細胞毒性を示すことが示唆された。
【００５４】
メープルシロップにより前立腺癌（７４％抑制）、肺がん（６３％抑制）、乳癌（４５％抑制）、大腸癌（３７％抑制）の増殖が抑制されることが報告されている（非特許文献２）。この報告では、５％メープルシロップ含有培地で検討を行っていたため、高濃度のショ糖による高浸透圧の影響を受けて細胞増殖が抑制された可能性が考えられた。そこで本願では、対照溶液として、メープルシロップに含まれるショ糖と同濃度のショ糖溶液を調製し、このショ糖溶液による細胞毒性を受けない濃度で検討を行うこととした。
【００５５】
その結果、ショ糖溶液を投与した大腸癌細胞に比べてメープルシロップを投与した細胞では、ＷＳＴ−８アッセイ及び細胞数計測法ともに細胞増殖能が抑制された（図２）。興味深いことに、メープルシロップの色調が濃くなるにつれて増殖抑制効果が強くなった。また、正常大腸細胞の増殖への影響についても検討を行ったが、こちらにはメープルシロップによる増殖抑制効果は認められなかった（図３）。これらの結果より、メープルシロップは癌細胞のように増殖の速い細胞に対して効果的に作用することが示唆された。
【００５６】
さらに、細胞遊走能には影響はなかったが、Ｍａｐｌｅ  Ｓｙｒｕｐ  ＩＩ及びＭａｐｌｅ  Ｓｙｒｕｐ  ＩＩＩではＤＬＤ−１の細胞浸潤能が有意に抑制された。また、Ｍａｐｌｅ  Ｓｙｒｕｐ  ＩＩＩ  では、ＳＷ４８０の細胞浸潤能が抑制傾向にあった（図４）。
【００５７】
これらのことから、メープルシロップは、基底膜のような細胞外基質に対する浸潤に重要な役割を果たしているＭＭＰ−２やＭＭＰ−９のような酵素の活性や発現に影響を与えていることが示唆された。
【００５８】
これまでにメープルシロップによる浸潤能への効果についての報告はないが、近年、エピガロカテキン−３−ガレートのようなポリフェノールがＭＭＰ−２やＭＭＰ−９の発現を抑制することが報告された（非特許文献４−８）。そのため、メープルシロップに含まれるケベコールやギンナリンのようなポリフェノールにより大腸癌細胞におけるＭＭＰ−２やＭＭＰ−９の発現が抑制された可能性がある。
【００５９】
次に最も抗腫瘍効果の強かったＭａｐｌｅ  Ｓｙｒｕｐ  ＩＩＩを用いて細胞増殖や浸潤に重要な役割を果たしているＥＲＫ及びＡＫＴのリン酸化状態を検討した。ＥＲＫの活性には影響を与えなかったが、Ｍａｐｌｅ  Ｓｙｒｕｐ  ＩＩＩ  投与により、ＡＫＴの活性化が顕著に抑制された（図５）。
【００６０】
このことから、メープルシロップによる増殖抑制効果にはアポトーシスの誘導が関与することが示唆された。また、ＡＫＴの活性阻害は、ＭＭＰ−２やＭＭＰ−９の発現抑制による細胞浸潤阻害と関連があることが報告されている（非特許文献９−１１）。
【００６１】
近年、メープルシロップに含まれるポリフェノールの一種であるギンナリンＡ−Ｃによりアポトーシスの誘導ではなく、細胞周期の停止により細胞増殖が抑制されることが報告された（非特許文献１２）。そのため、メープルシロップには、ポリフェノール以外の有効成分が含まれている可能性が強く示唆される。
【００６２】
図６には、リアルタイムＰＣＲを用いたｍＲＮＡの発現を比較した結果を示す。横軸はタンパク質をコードする遺伝子名であり、縦軸は相対発現量（無単位）である。メープルシロップのグレードＡＡ（エキストラライト）を投与した細胞（グラフ中で「ＥＸＴＲＡ」と表示した白棒線である。）とグレードＤ（ダーク）を投与した細胞（グラフ中で「ＤＡＲＫ」と表記した黒棒線である。）の場合のそれぞれの遺伝子の発現を測定したものである。「ＥＸＴＲＡ」を基準にしているので、「ＥＸＴＲＡ」の相対発現量は１．０である。
【００６３】
図６を参照して、ダークを投与すると、ＣＤＫＮ２Ａの発現がエキストラライトを投与した場合と比較して２倍以上になっている。ＣＤＫＮ２Ａはサイクリン依存性キナーゼ阻害２Ａと呼ばれるがん抑制タンパク質であり、グレードＤ（ダーク）を投与することによって、細胞内にＣＤＫＮ２Ａを産生するためのｍＲＮＡが多く発現することを示している。このことからも、Ｍａｐｌｅ  Ｓｙｒｕｐ  ＩＩＩの投与によるガン抑制効果があることがわかる。
【００６４】
以上のようにグレードＤは、ガン抑制効果があることがわかった。そこで次にグレードＤに含まれる主たる有効成分について調べた。Ｍａｐｌｅ  Ｓｙｒｕｐ  ＩＩＩの１０倍希釈液（シロップ３０ｍｌを希釈して全量を３００ｍｌにしたもの）を、限外ろ過ユニット（Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）  Ｕｌｔｒａ−１５：メルクミリポア社製）を使って分画した。分画分子量は１０，０００のフィルタを用いた。
【００６５】
遠心分離の条件は、５０００×ｇ（「×」は乗算を表し「ｇ」は重力加速度である。）で１５分間行った。遠心分離することにより、分子量が１０，０００以上の画分と１０，０００より小さい画分に分けた。分子量１０，０００以上の画分を「グレードＤ高画分」とよび、分子量１０，０００より小さい画分を「グレードＤ低画分」と呼ぶ。
【００６６】
グレードＤ高画分とグレードＤ低画分の大腸癌細胞に対する影響を、培養大腸癌細胞ＤＬＤ−１を用いた細胞増殖アッセイで確認した。なお、実験方法は、＜細胞増殖アッセイ＞の欄での説明に準じた。各添加物は培地に対して１重量％の濃度で添加した。培養時間は７２時間である。
【００６７】
図７に結果を示す。図７を参照して、横軸は培地に添加した物質の種類である。「Ｎｏｎ−ｔｒｅａｔｍｅｎｔ」は、培地に特別に加えたものはないことを表す。
【００６８】
「Ｓｕｃｒｏｓｅ」はショ糖を示す。「Ｍａｐｌｅ  ＳｙｒｕｐＩＩＩ（ＭＷ＜１００００）」は、グレードＤ低画分を表し、「Ｍａｐｌｅ  ＳｙｒｕｐＩＩＩ（ＭＷ＞１００００）」は、グレードＤ高画分を表す。「Ｍａｐｌｅ  ＳｙｒｕｐＩＩＩ」は、グレードＤ低画分もグレードＤ高画分も含めた「Ｍａｐｌｅ  ＳｙｒｕｐＩＩＩ」自体である。
【００６９】
また、縦軸は細胞数（Ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ（×１０５））である。
【００７０】
図７のグラフより、コントロール（Ｎｏｎ−ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）に対して、ショ糖（Ｓｕｃｒｏｓｅ）とグレードＤ低画分（Ｍａｐｌｅ  ＳｙｒｕｐＩＩＩ（ＭＷ＜１００００））は、有意な細胞増殖抑制があるとは言えなかった。
【００７１】
これに対して、グレードＤ高画分（Ｍａｐｌｅ  ＳｙｒｕｐＩＩＩ（ＭＷ＞１００００））と、Ｍａｐｌｅ  ＳｙｒｕｐＩＩＩは、コントロールに対して有意な細胞増殖抑制があった。
【００７２】
したがって、グレードＤのメープルシロップの中でも分子量が１０，０００以上のグレードＤ高画分が大腸癌細胞に対する細胞増殖抑制作用があるといえる。
【００７３】
さらに、確認するために、エキストラライトとダークの分子量が１０，０００以上の画分のタンパク質で大腸癌細胞の細胞増殖抑制作用を確認した。メープルシロップのエキストラライトとダークについて１０％の溶液を遠心分離し、分子量が１０，０００以上の画分を得た。これらの画分を硫安沈殿し、タンパク質を得た。それぞれのタンパク質を「グレードＡＡ高画分タンパク質」、「グレードＤ高画分タンパク質」と呼ぶ。
【００７４】
培養大腸癌細胞ＤＬＤ−１に対して、培地（全量で２ｍｌ）にそれぞれの画分のタンパク質を５μｇ、１０μｇ、２０μｇの量を添加し、７２時間の培養を行った。
【００７５】
細胞増殖抑制作用試験の結果を図８に示す。図８（ａ）および図８（ｂ）とも横軸はサンプルの種類を表す。グレードＡＡ高画分タンパク質は「ＧｒａｄｅＡＡ」と表し、その区分に含まれる５、１０、２０は、それぞれ５μｇ、１０μｇ、２０μｇを添加した場合を示す。同様に、グレードＤ高画分タンパク質は「ＧｒａｄｅＤ」と表し、その区分に含まれる５、１０、２０は、それぞれ５μｇ、１０μｇ、２０μｇを添加した場合を示す。
【００７６】
図８（ａ）の縦軸は細胞数（Ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ（×１０５））であり、図８（ｂ）の縦軸は細胞数を「コントロール」に対する割合（％）で示したものである。なお、「コントロール」は培地に上記のタンパク質を入れない培地で培養大腸癌細胞ＤＬＤ−１を培養した場合を表す。
【００７７】
図８を参照して、グレードＡＡ高画分タンパク質を入れた場合は、細胞数に減少は認められるものの、有意な抑制とは言えなかった。一方、グレードＤ高画分タンパク質では、添加量を増やすに従い、細胞増殖は抑制され、添加量が１０μｇおよび２０μｇではコントロールに比べて有意に抑制効果があると認められた。以上のことより、グレードＤ高画分の中にあるタンパク質（グレードＤ高画分タンパク質）が、大腸癌細胞の増殖抑制効果を有することがわかった。
【００７８】
図９は、グレードＡＡ高画分タンパク質とグレードＤ高画分タンパク質を還元環境下でＳＤＳ−ＰＡＧＥした後、電気泳動させ、銀染色で可視化した写真である。縦軸は分子量（ｋＤａ）である。左側のレーンはグレードＡＡ高画分タンパク質（「ＧｒａｄｅＡＡ」と記載した）であり、右側のレーンはグレードＤ高画分タンパク質（「ＧｒａｄｅＤ」と記載した）である。
【００７９】
グレードＤ高画分タンパク質は、符号１から符号５（図９では符号を丸で囲んで示した。）に示すように、特有の発現パターンを示すタンパク質が存在している。一方、グレードＡＡ高画分タンパク質には、同じ位置に発現するタンパク質はほとんどなかった。したがって、グレードＤ高画分タンパク質が大腸癌細胞の増殖抑制の有効成分であるといえる。
【産業上の利用可能性】
【００８０】
本発明に係る癌治療剤は、大腸癌等の治療に好適に利用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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