(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
共有結合した２つのポリペプチドを含む修飾ＧＤＦ１５二量体であって、２つのポリペプチドそれぞれが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、２つのポリペプチドそれぞれが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１中の対応するアミノ酸の置換の以下の対：Ｋ９１ＮおよびＤ９３Ｔ／ＳまたはＤ９３ＮおよびＧ９５Ｔ／Ｓの少なくとも１つを含む、前記修飾ＧＤＦ１５二量体。
【請求項２】
前記修飾ＧＤＦ１５二量体が、代謝疾患、代謝関連疾患、体重障害、グルコース代謝障害、もしくは肥満の治療における使用に好適である、請求項１に記載の修飾ＧＤＦ１５二量体。
【請求項３】
前記２つのポリペプチドが、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１または２に記載の修飾ＧＤＦ１５二量体。
【請求項４】
前記２つのポリペプチドが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のＮ末端に存在している最初の３個のアミノ酸を欠いている、請求項１〜３のいずれか１項に記載の修飾ＧＤＦ１５二量体。
【請求項５】
前記２つのポリペプチドそれぞれが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１中の対応するアミノ酸の置換の以下の対：Ｋ９１ＮおよびＤ９３Ｔ／Ｓを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の修飾ＧＤＦ１５二量体。
【請求項６】
前記２つのポリペプチドそれぞれが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１中の対応するアミノ酸の置換の以下の対：Ｄ９３ＮおよびＧ９５Ｔ／Ｓを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の修飾ＧＤＦ１５二量体。
【請求項７】
前記２つのポリペプチドそれぞれが、以下のアミノ酸配列：
ｉ）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３；
ｉｉ）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４；
ｉｉｉ）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０；もしくは
ｉｖ）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１
を含む、請求項１に記載の修飾ＧＤＦ１５二量体。
【請求項８】
前記２つのポリペプチドそれぞれが、以下のアミノ酸配列：
ｉ）  残基９３においてＴがＳに置換された、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３；
ｉｉ）  残基９５においてＴがＳに置換された、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４；
ｉｉｉ）  残基９０においてＴがＳに置換された、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０；もしくは
ｉｖ）  残基９２においてＴがＳに置換された、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１
を含む、請求項１に記載の修飾ＧＤＦ１５二量体。
【請求項９】
前記２つのポリペプチドそれぞれが、残基９０においてＴがＳに置換された、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の修飾ＧＤＦ１５二量体。
【請求項１０】
前記２つのポリペプチドそれぞれが、残基９０においてＴがＳに置換された、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０のアミノ酸配列からなる、請求項１に記載の修飾ＧＤＦ１５二量体。
【請求項１１】
前記２つのポリペプチドそれぞれが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の修飾ＧＤＦ１５二量体。
【請求項１２】
前記２つのポリペプチドそれぞれが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の修飾ＧＤＦ１５二量体。
【請求項１３】
前記２つのポリペプチドそれぞれが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の修飾ＧＤＦ１５二量体。
【請求項１４】
前記ポリペプチドの少なくとも一つが、異種ポリペプチドに融合されており、任意で該異種ポリペプチドが、血清アルブミン、マルトース結合タンパク質、または免疫グロブリンＦｃポリペプチドであり、かつ該異種ポリペプチドが、該少なくとも一つのポリペプチドのＮ末端またはＣ末端にコンジュゲートされている、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の修飾ＧＤＦ１５二量体。
【請求項１５】
前記２つのポリペプチドのそれぞれが、異種ポリペプチドに融合されており、任意で該異種ポリペプチドが、血清アルブミン、マルトース結合タンパク質、または免疫グロブリンＦｃポリペプチドであり、かつ該異種ポリペプチドが、該２つのポリペプチドのそれぞれのＮ末端またはＣ末端にコンジュゲートされている、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の修飾ＧＤＦ１５二量体。
【請求項１６】
Ｎ−グリコシル化されている、請求項１〜１５のいずれか1項に記載の修飾ＧＤＦ１５二量体。
【請求項１７】
２つのポリペプチドそれぞれが同じアミノ酸配列を含むホモ二量体である、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の修飾ＧＤＦ１５二量体。
【請求項１８】
共有結合した２つのポリペプチドを含む修飾Ｎ−グリコシル化ＧＤＦ１５二量体であって、２つのポリペプチドそれぞれが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０のアミノ酸配列を含む、修飾Ｎ−グリコシル化ＧＤＦ１５二量体。
【請求項１９】
共有結合した２つのポリペプチドを含む修飾Ｎ−グリコシル化ＧＤＦ１５二量体であって、前記２つのポリペプチドそれぞれが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０のアミノ酸配列からなる、修飾Ｎ−グリコシル化ＧＤＦ１５二量体。
【請求項２０】
請求項１〜１９のいずれか１項に記載の修飾ＧＤＦ１５二量体のポリペプチドをコードし、任意で、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで該核酸分子を発現させる発現制御エレメントに機能的に連結されている、核酸分子。
【請求項２１】
請求項２０に記載の核酸分子を含み、任意で、ウイルスベクターを含む、ベクター。
【請求項２２】
請求項１〜１９のいずれか１項に記載の修飾ＧＤＦ１５二量体を発現する宿主細胞。
【請求項２３】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載の修飾ＧＤＦ１５二量体、および製剤的に許容可能な希釈剤、担体、もしくは賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項２４】
修飾Ｎ−グリコシル化ＧＤＦ１５二量体、および製剤的に許容可能な希釈剤、担体、もしくは賦形剤を含む医薬組成物であって、該二量体は共有結合した２つのポリペプチドを含み、該２つのポリペプチドそれぞれは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０のアミノ酸配列を含む、医薬組成物。
【請求項２５】
修飾Ｎ−グリコシル化ＧＤＦ１５二量体、および製剤的に許容可能な希釈剤、担体、もしくは賦形剤を含む医薬組成物であって、該二量体は共有結合した２つのポリペプチドを含み、該２つのポリペプチドそれぞれは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０のアミノ酸配列からなる、医薬組成物。
【請求項２６】
請求項２３、２４、または２５に記載の医薬組成物を含み、任意で、シリンジである、滅菌容器。
【請求項２７】
請求項１〜１９のいずれか１項に記載の修飾ＧＤＦ１５二量体の生成方法であって、
修飾ＧＤＦ１５二量体を発現する宿主細胞を培養する工程；および
発現した修飾ＧＤＦ１５二量体を精製する工程を含む、前記方法。
【請求項２８】
対象の体重障害またはグルコース代謝障害の治療に使用するための、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の修飾ＧＤＦ１５二量体。
【請求項２９】
前記グルコース代謝障害が、糖尿病である、請求項２８に記載の修飾ＧＤＦ１５二量体。
【請求項３０】
前記グルコース代謝障害が、メタボリックシンドロームである、請求項２８に記載の修飾ＧＤＦ１５二量体。
【請求項３１】
前記グルコース代謝障害が、高血糖、高インスリン血症、またはグルコース不耐性である、請求項２８に記載の修飾ＧＤＦ１５二量体。
【請求項３２】
前記対象が、肥満である、請求項２８〜３１のいずれか１項に記載の修飾ＧＤＦ１５二量体。
【請求項３３】
前記対象が、ヒトである、請求項２８〜３２のいずれか１項に記載の修飾ＧＤＦ１５二量体。
【請求項３４】
対象の体重障害またはグルコース代謝障害の治療に使用するための、請求項２３〜２５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項３５】
前記グルコース代謝障害が、糖尿病である、請求項３４に記載の医薬組成物。
【請求項３６】
前記グルコース代謝障害が、メタボリックシンドロームである、請求項３４に記載の医薬組成物。
【請求項３７】
前記グルコース代謝障害が、高血糖、高インスリン血症、またはグルコース不耐性である、請求項３４に記載の医薬組成物。
【請求項３８】
前記対象が、肥満である、請求項３４〜３７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項３９】
前記対象が、ヒトである、請求項３４〜３８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項４０】
対象の代謝疾患もしくは代謝関連疾患の治療に使用するための、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の修飾ＧＤＦ１５二量体。
【請求項４１】
前記対象が、肥満である、請求項４０に記載の修飾ＧＤＦ１５二量体。
【請求項４２】
前記対象が、ヒトである、請求項４０または４１に記載の修飾ＧＤＦ１５二量体。
【請求項４３】
対象の代謝疾患もしくは代謝関連疾患の治療に使用するための、請求項２３〜２５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項４４】
前記対象が、肥満である、請求項４３に記載の医薬組成物。
【請求項４５】
前記対象が、ヒトである、請求項４４に記載の医薬組成物。
【請求項４６】
対象の肥満の治療に使用するための、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の修飾ＧＤＦ１５二量体。
【請求項４７】
前記対象が、ヒトである、請求項４６に記載の修飾ＧＤＦ１５二量体。
【請求項４８】
対象の肥満の治療に使用するための、請求項２３〜２５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項４９】
前記対象が、ヒトである、請求項４８に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
テキストファイルとして提供された配列表の参照による組み込み
配列表が、２０１５年７月２２日に作成され、サイズが１３３ＫＢであるテキストファイル「ＮＧＭＢ−１３９ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ．ｔｘｔ」として、本明細書に提供される。テキストファイルの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年７月３０日に出願された米国仮特許出願第６２／０３１，０６３号、および２０１５年７月２３日に出願された米国仮特許出願第６２／１９５，９０８号の優先権利益を主張し、これらの出願は、その全体が参照により組み込まれる。
【０００３】
本発明は、特に、代謝関連状態を治療するのに有用なポリペプチドおよびその組成物に関する。
【背景技術】
【０００４】
序論
肥満は、エネルギー消費の制限および／または身体運動の欠如に連動して過剰な食物摂取によるものが最も一般的である。肥満は、さまざまな疾患、例えば、糖尿病、高血圧症、アテローム動脈硬化、冠動脈疾患、睡眠時無呼吸、痛風、リウマチおよび関節炎の発現の可能性を増大する。更に、死亡リスクが、肥満と直接相関し、その結果、例えば、ボディマスインデックスが４０を越えると、平均余命が１０年超短くなる。
【０００５】
現在実施されている薬理療法としては、受容体クラス標的食欲抑制剤（例えば、ＣＢ１、５−ＨＴ２Ｃ、およびＮＰＹ）；視床下部中の食欲回路の調節剤およびグレリンの分子作用；およびリパーゼ標的栄養吸収阻害薬が挙げられる。残念なことに、現在実施されている治療法では、副作用を生じることなく、肥満を効果的に治療することを示しておらず、副作用の一部は、極めて重度である可能性がある。
【０００６】
血中グルコースレベルが高いと、膵臓ベータ細胞によるインスリンの分泌を刺激する。次にインスリンが、筋肉および脂肪細胞中へのグルコースの流入を刺激し、グリコーゲンおよびトリグリセリドを貯蔵し、タンパク質を合成する。さまざまな細胞型でのインスリン受容体の活性化は、グルコース摂取量および利用度を増大させること、および肝臓グルコース放出を減少させることによって、循環グルコースレベルが減少する。この調節ネットワーク内の混乱の結果、人口に影響を及ぼす割合が大きく、その割合が増大している糖尿病および関連する病的症候群を生じる可能性がある。
【０００７】
グルコース代謝障害である患者は、高血糖、高インスリン血症、および／またはグルコース不耐性を来たす可能性がある。グルコースおよび／またはインスリンの異常なレベルと関係することが多い障害の例が、インスリン抵抗性であり、これは、肝臓、脂肪、および筋肉細胞中で、正常な血中インスリンレベルに反応する能力を失う。
【０００８】
肥満、糖尿病および関連代謝障害および非代謝障害の有病率および重症度の点からみて、例えば、患者の食欲、グルコースおよび／またはインスリンレベルを調節し、変動グルコースレベルへの生物学的反応を向上させる治療法に興味が残されている。
【０００９】
ＭＩＣ−１（マクロファージ抑制サイトカイン−１）としても知られる野生型ＧＤＦ１５が、体重の制御に関連付けられている（Ｔｓａｉ  ＶＷ，ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ２０１３；８（２）：ｅ５５１７４；ＵＳ８，１９２，７３５（非特許文献１））。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｔｓａｉ  ＶＷ，ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ２０１３；８（２）：ｅ５５１７４；ＵＳ８，１９２，７３５
【発明の概要】
【００１１】
概要
成熟野生型ヒトＧＤＦ１５のアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）と少なくとも９０％同一である連続アミノ酸配列を有するポリペプチドが提供される。本開示のポリペプチドは、ＧＤＦ１５突然変異タンパク質、修飾ＧＤＦ１５、および修飾ＧＤＦ１５突然変異タンパク質を包含する。これらのポリペプチドの組成物も提供される。本開示は、体重関連障害および／またはグルコース代謝障害を治療または予防する場合に、本明細書に記載されたポリペプチド、およびその組成物の使用を企図する。
【００１２】
上述のとおり、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である連続アミノ酸配列を含むポリペプチドが提供される。連続アミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１中の対応するアミノ酸の置換の以下の対の少なくとも１つを含む：ｉ）Ｄ５Ｔ／ＳおよびＲ２１Ｎ；ｉｉ）Ｒ１６ＮおよびＨ１８Ｔ／Ｓ；ｉｉｉ）Ｓ２３ＮおよびＥ２５Ｔ／Ｓ；ｉｖ）Ｌ２４ＮおよびＤ２６Ｔ／Ｓ；ｖ）Ｓ５０ＮおよびＦ５２Ｔ／ＳまたはＦ５２ＮおよびＡ５４Ｔ／Ｓ；ｖｉ）Ｑ５１ＮおよびＲ５３Ｔ／ＳまたはＲ５３ＮおよびＡ５５Ｔ／Ｓ；ｖｉ）Ｓ６４ＮおよびＨ６６Ｔ／Ｓ；ｖｉｉ）Ｌ６５ＮおよびＲ６７Ｔ／Ｓ；ｖｉｉｉ）Ｓ８２ＮおよびＮ８４Ｔ／Ｓ；ｉｘ）Ｋ９１ＮおよびＤ９３Ｔ／ＳまたはＤ９３ＮおよびＧ９５Ｔ／Ｓ；ｘ）Ｔ９４ＮおよびＶ９６Ｔ／ＳまたはＶ９６ＮおよびＬ９８Ｔ／Ｓ；ｘｉ）Ｓ９７ＮおよびＱ９９Ｔ／Ｓ；およびｘｉｉ）Ａ１０６ＮおよびＤ１０８Ｔ／Ｓ。
【００１３】
例えば、連続アミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１中の対応するアミノ酸の置換の以下の対の少なくとも１つを含んでよい：ｉ）Ｄ５ＴおよびＲ２１ＮまたはＤ５ＳおよびＲ２１Ｎ；ｉｉ）Ｒ１６ＮおよびＨ１８ＴまたはＲ１６ＮおよびＨ１８Ｓ；ｉｉｉ）Ｓ２３ＮおよびＥ２５ＴまたはＳ２３ＮおよびＥ２５Ｓ；ｉｖ）Ｌ２４ＮおよびＤ２６ＴまたはＬ２４ＮおよびＤ２６Ｓ；ｖ）Ｓ５０ＮおよびＦ５２Ｔ；Ｓ５０ＮおよびＦ５２Ｓ；Ｆ５２ＮおよびＡ５４Ｔ；またはＦ５２ＮおよびＡ５４Ｓ；ｖｉ）Ｑ５１ＮおよびＲ５３Ｔ；Ｑ５１ＮおよびＲ５３Ｓ；Ｒ５３ＮおよびＡ５５Ｔ；またはＲ５３ＮおよびＡ５５Ｓ；ｖｉ）Ｓ６４ＮおよびＨ６６ＴまたはＳ６４ＮおよびＨ６６Ｓ；ｖｉｉ）Ｌ６５ＮおよびＲ６７ＴまたはＬ６５ＮおよびＲ６７Ｓ；ｖｉｉｉ）Ｓ８２ＮおよびＮ８４ＴまたはＳ８２ＮおよびＮ８４Ｓ；ｉｘ）Ｋ９１ＮおよびＤ９３Ｔ；Ｋ９１ＮおよびＤ９３Ｓ；Ｄ９３ＮおよびＧ９５Ｔ；またはＤ９３ＮおよびＧ９５Ｓ；ｘ）Ｔ９４ＮおよびＶ９６Ｔ；Ｔ９４ＮおよびＶ９６Ｓ；Ｖ９６ＮおよびＬ９８Ｔ；またはＶ９６ＮおよびＬ９８Ｓ；ｘｉ）Ｓ９７ＮおよびＱ９９ＴまたはＳ９７ＮおよびＱ９９Ｓ；およびｘｉｉ）Ａ１０６ＮおよびＤ１０８ＴまたはＡ１０６ＮおよびＤ１０８Ｓ。
【００１４】
ある特定の実施形態では、ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１中の対応するアミノ酸の置換の以下の対の少なくとも１つを含んでよい：Ｄ５ＴおよびＲ２１Ｎ；Ｓ２３ＮおよびＥ２５Ｔ／Ｓ；Ｒ５３ＮおよびＡ５５Ｔ／Ｓ；Ｓ６４ＮおよびＨ６６Ｔ／Ｓ；Ｋ９１ＮおよびＤ９３Ｔ／Ｓ；Ｄ９３ＮおよびＧ９５Ｔ／Ｓ；Ｓ９７ＮおよびＱ９９Ｔ／Ｓ；およびＡ１０６ＮおよびＤ１０８Ｔ／Ｓ。
【００１５】
ある特定の実施形態では、ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１中の対応するアミノ酸の置換の以下の対の少なくとも１つを含んでよい：Ｄ５ＴおよびＲ２１Ｎ；Ｄ５ＳおよびＲ２１Ｎ；Ｓ２３ＮおよびＥ２５Ｔ；Ｓ２３ＮおよびＥ２５Ｓ；Ｒ５３ＮおよびＡ５５Ｔ；Ｒ５３ＮおよびＡ５５Ｓ；Ｓ６４ＮおよびＨ６６Ｔ；Ｓ６４ＮおよびＨ６６Ｓ；Ｋ９１ＮおよびＤ９３Ｔ；Ｋ９１ＮおよびＤ９３Ｓ；Ｄ９３ＮおよびＧ９５Ｔ；Ｄ９３ＮおよびＧ９５Ｓ；Ｓ９７ＮおよびＱ９９Ｔ；Ｓ９７ＮおよびＱ９９Ｓ；Ａ１０６ＮおよびＤ１０８Ｔ；およびＡ１０６ＮおよびＤ１０８Ｓ。
【００１６】
ある特定の実施形態では、ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１中の対応するアミノ酸の置換の以下の対の少なくとも１つを含んでよい：Ｄ５ＴおよびＲ２１Ｎ；Ｓ６４ＮおよびＨ６６Ｔ／Ｓ；Ｋ９１ＮおよびＤ９３Ｔ／Ｓ；Ｄ９３ＮおよびＧ９５Ｔ／Ｓ；およびＳ９７ＮおよびＱ９９Ｔ／Ｓ。
【００１７】
他の実施形態では、ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１中の対応するアミノ酸の置換の以下の対の少なくとも１つを含んでよい：Ｋ９１ＮおよびＤ９３ＴまたはＫ９１ＮおよびＤ９３Ｓ；およびＤ９３ＮおよびＧ９５ＴまたはＤ９３ＮおよびＧ９５Ｓ。他の実施形態では、ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１中の対応するアミノ酸の置換の以下の対を含んでよい：Ｋ９１ＮおよびＤ９３Ｔ。
【００１８】
例示的な実施形態では、連続アミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一でよい。
【００１９】
他の実施形態では、連続アミノ酸配列は、少なくとも９８アミノ酸長でよく、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一でよく、ポリペプチドのＣ末端側アミノ酸が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１中の位置１１２でイソロイシンと対応する。
【００２０】
他の実施形態では、連続アミノ酸配列は、少なくとも９８アミノ酸長でよく、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一でよく、ポリペプチドのＣ末端側アミノ酸は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１中の位置１１２でイソロイシンと対応する。
【００２１】
本明細書に開示された例示的なポリペプチドは、少なくとも９８アミノ酸長であり、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であり、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対してアミノ酸が欠失している連続アミノ酸配列を含む。例えば、ポリペプチドに、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対して、Ｎ末端側切断があってよい。切断は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４以上のアミノ酸の切断でよく、例えば、１−１４アミノ酸、３−１４アミノ酸、６−１４アミノ酸、または３−６アミノ酸である。
【００２２】
ある特定の場合では、少なくとも９８アミノ酸長であり、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であり、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のＮ末端に存在する最初の３個のアミノ酸に対応する最初の３個のアミノ酸を含まず、Ｃ末端側アミノ酸は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の位置１１２でイソロイシンに対応する、連続アミノ酸配列。
【００２３】
ある特定の場合では、連続アミノ酸配列は、少なくとも９８アミノ酸長であり、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であり、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のＮ末端に存在する最初の６個のアミノ酸に対応する最初の６個のアミノ酸を含まず、Ｃ末端側アミノ酸は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の位置１１２でイソロイシンに対応する。
【００２４】
ある特定の場合では、連続アミノ酸配列は、少なくとも９８アミノ酸長であり、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であり、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のＮ末端に存在する最初の１４個のアミノ酸に対応する最初の１４個のアミノ酸を含まず、Ｃ末端側アミノ酸は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の位置１１２でイソロイシンに対応する。
【００２５】
ある特定の場合では、ポリペプチドは、Ｎ末端で、シグナル配列、例えば、ＩｇＫシグナル配列を含んでよい。シグナル配列は、リンカーを介してポリペプチドにコンジュゲートさせてよく、リンカーは、開裂可能リンカーとしてよい。
【００２６】
また、Ｎ末端からＣ末端に連続的に以下を含む融合タンパク質が、本明細書に提供される：異種ポリペプチド−［（Ｇ４Ｓ）］５−ＧＤＦ１５；異種ポリペプチド−［（Ｇ４Ｓ）］５−ΔＮ３−ＧＤＦ１５；または異種ポリペプチド−［（Ｇ４Ｓ）］５−ΔＮ６−ＧＤＦ１５。
【００２７】
例示的な実施形態では、異種ポリペプチドは、血清アルブミン、マルトース結合タンパク質、または免疫グロブリンＦｃポリペプチドとしてよい。血清アルブミンは、ヒト血清アルブミン、カニクイザル（ｃｙｎｏ）血清アルブミンまたはウシ血清アルブミンとしてよい。融合タンパク質は、Ｎ末端でシグナル配列を含んでよい。シグナル配列は、ＩｇＫシグナル配列としてよい。
【００２８】
また、上記のポリペプチドまたは融合タンパク質をコードする核酸分子が、本明細書に提供される。核酸分子は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで、ポリペプチドまたは融合タンパク質をコードする核酸分子を発現させる発現制御エレメントに機能的に連結させてよい。核酸分子を含むベクターもまた企図される。ベクターは、ウイルスベクターとしてよい。
【００２９】
いくつかの実施形態では、１個以上の前述したポリペプチドを発現する形質転換または宿主細胞が含まれる。
【００３０】
本開示の特定の実施形態では、１個以上の前述したポリペプチドが、医薬組成物を生成するように製剤化され、組成物は、また、１個以上の製剤的に許容可能な希釈剤、担体または賦形剤を含む。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、また、少なくとも１つ追加の予防薬または治療薬を含む。
【００３１】
本開示のなお更なる実施形態では、前述した突然変異タンパク質ポリペプチドの１つに特異的に結合する抗体を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、別々のポリペプチドまたは単一ポリペプチド中に存在する軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含む。ある特定の実施形態では、本開示の抗体は、約１０７のＭ−１〜約１０１２のＭ−１の親和性で、ポリペプチドと結合する。更に他の実施形態では、抗体は、アイソタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４の重鎖定常領域を含む。更に別の実施形態では、抗体は、検出可能に標識付けされ、他の実施形態では、抗体は、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、またはＦａｂ’である。
【００３２】
本開示は、また、共有結合した非ポリペプチドポリマー（例えば、ポリ（エチレングリコール）ポリマー）を含む抗体を企図する。他の実施形態では、抗体は、脂質部分、脂肪酸部分、多糖部分、および糖質部分から選択される共有結合部分を含む。
【００３３】
いくつかの実施形態では、抗体は、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体であり、他の実施形態では、ｓｃＦｖが、多量体化される。
【００３４】
本開示の抗体は、単クローン性抗体、多クローン性抗体、またはヒト化抗体としてよいが、これらに限定されない。
【００３５】
更に、本開示は、上記のとおり、少なくとも１つの製剤的に許容可能な賦形剤、担体または希釈剤とともに製剤化された抗体を含む医薬組成物を企図する。かかる医薬組成物は、また、少なくとも１つの追加の予防薬または治療薬を含有してよい。
【００３６】
本開示のある特定の実施形態では、上記の医薬組成物の１つ、および任意で１つ以上の追加の成分を含有する滅菌容器を企図する。例えば、滅菌容器は、シリンジとしてよく、これに限定されない。なお更なる実施形態では、滅菌容器は、キットの１つの構成部品である；キットは、また、例えば、少なくとも１つの予防薬または治療薬を含有する第２の滅菌容器を含有してよい。
【００３７】
また、前述したポリペプチドまたは融合タンパク質の生成方法が、本明細書に開示される。本方法は、ポリペプチドまたは融合タンパク質を発現する宿主細胞を培養すること；および発現したポリペプチドまたは融合タンパク質を精製することを含んでよい。
【００３８】
本開示は、また、対象に治療有効量の前述したポリペプチドまたは融合タンパク質を投与することによって、対象（例えば、ヒト）のグルコース代謝障害を治療または予防する方法を企図する。いくつかの方法では、治療または予防の結果、対象中の血漿グルコース、対象中の血漿インスリン、体重および／または食物摂取が減少する、または対象中のグルコース耐性が増大する。特定の実施形態では、グルコース代謝障害は、糖尿病である。
【００３９】
対象の体重障害を治療または予防する方法も開示される。本方法は、対象に本開示のポリペプチドまたは融合タンパク質を投与することを含んでよく、ポリペプチドまたは融合タンパク質は、対象の体重障害を治療または予防するのに有効な量で投与される。いくつかの方法では、治療または予防の結果、対象の体重および／または食物摂取が減少する。
【００４０】
いくつかの実施形態では、対象は、肥満である、および／または体重障害を有する。
【００４１】
特定の投与経路または投与計画に限定されないが、いくつかの実施形態では、投与は、非経口的（例えば、皮下）注入によるものである。
[本発明1001]
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：1のアミノ酸配列と少なくとも90％同一である連続アミノ酸配列を含むポリペプチドであって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：1中の対応するアミノ酸の置換の以下の対：
ｉ）Ｄ5Ｔ／ＳおよびＲ21Ｎ；
ｉｉ）Ｒ16ＮおよびＨ18Ｔ／Ｓ；
ｉｉｉ）Ｓ23ＮおよびＥ25Ｔ／Ｓ；
ｉｖ）Ｓ50ＮおよびＦ52Ｔ／ＳまたはＦ52ＮおよびＡ54Ｔ／Ｓ；
ｖ）Ｒ53ＮおよびＡ55Ｔ／Ｓ；
ｖｉ）Ｓ64ＮおよびＨ66Ｔ／Ｓ；
ｖｉｉ）Ｋ91ＮおよびＤ93Ｔ／ＳまたはＤ93ＮおよびＧ95Ｔ／Ｓ；
ｖｉｉｉ）Ｔ94ＮおよびＶ96Ｔ／ＳまたはＶ96ＮおよびＬ98Ｔ／Ｓ；
ｉｘ）Ｓ97ＮおよびＱ99Ｔ／Ｓ；ならびに
ｘ）Ａ106ＮおよびＤ108Ｔ／Ｓ
の少なくとも1つを含む、前記ポリペプチド。
[本発明1002]
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：1中の対応するアミノ酸の置換の以下の対：
Ｄ5ＴおよびＲ21Ｎ；
Ｓ23ＮおよびＥ25ＴまたはＳ23ＮおよびＥ25Ｓ；
Ｒ53ＮおよびＡ55ＴまたはＲ53ＮおよびＡ55Ｓ；
Ｓ64ＮおよびＨ66ＴまたはＳ64ＮおよびＨ66Ｓ；
Ｋ91ＮおよびＤ93ＴまたはＫ91ＮおよびＤ93Ｓ；
Ｄ93ＮおよびＧ95ＴまたはＤ93ＮおよびＧ95Ｓ；
Ｓ97ＮおよびＱ99ＴまたはＳ97ＮおよびＱ99Ｓ；ならびに
Ａ106ＮおよびＤ108ＴまたはＡ106ＮおよびＤ108Ｓ
の少なくとも1つを含む、本発明1001のポリペプチド。
[本発明1003]
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：1中の対応するアミノ酸の置換の以下の対：
Ｄ5ＴおよびＲ21Ｎ；
Ｓ64ＮおよびＨ66Ｔ；
Ｋ91ＮおよびＤ93Ｔ；
Ｄ93ＮおよびＧ95Ｔ；ならびに
Ｓ97ＮおよびＱ99Ｔ
の少なくとも1つを含む、本発明1001のポリペプチド。
[本発明1004]
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：1中の対応するアミノ酸の置換の以下の対：
Ｋ91ＮおよびＤ93Ｔ／Ｓ；ならびに
Ｄ93ＮおよびＧ95Ｔ／Ｓ
の少なくとも1つを含む、本発明1001のポリペプチド。
[本発明1005]
前記連続アミノ酸配列が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：1のアミノ酸配列と少なくとも95％同一である、前記本発明のいずれかのポリペプチド。
[本発明1006]
前記連続アミノ酸配列が、少なくとも98アミノ酸長であり、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：1のアミノ酸配列と少なくとも95％同一であり、前記ポリペプチドのＣ末端側アミノ酸が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：1中の位置112でイソロイシンに対応する、前記本発明のいずれかのポリペプチド。
[本発明1007]
前記連続アミノ酸配列が、少なくとも98アミノ酸長であり、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：1のＮ末端に存在している最初の3個のアミノ酸に対応する最初の3個のアミノ酸を含まず、前記Ｃ末端側アミノ酸が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：1中の位置112でイソロイシンに対応する、前記本発明のいずれかのポリペプチド。
[本発明1008]
前記連続アミノ酸配列が、少なくとも98アミノ酸長であり、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：1のＮ末端に存在している最初の6個のアミノ酸に対応する最初の6個のアミノ酸を含まず、前記Ｃ末端側アミノ酸が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：1中の位置112でイソロイシンに対応する、前記本発明のいずれかのポリペプチド。
[本発明1009]
前記連続アミノ酸配列が、少なくとも98アミノ酸長であり、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：1のＮ末端に存在している最初の14個のアミノ酸に対応する最初の14個のアミノ酸を含まない、前記本発明のいずれかのポリペプチド。
[本発明1010]
Ｎ末端にシグナル配列を含む、前記本発明のいずれかのポリペプチド。
[本発明1011]
前記シグナル配列が、ＩｇＫシグナル配列である、本発明1010のポリペプチド。
[本発明1012]
前記シグナル配列が、リンカーを介して前記ポリペプチドにコンジュゲートされている、本発明1010または1011のポリペプチド。
[本発明1013]
前記リンカーが、開裂可能リンカーである、本発明1012のポリペプチド。
[本発明1014]
異種ポリペプチドに融合されている、本発明1001〜1013のいずれかのポリペプチド。
[本発明1015]
前記異種ポリペプチドが、血清アルブミン、マルトース結合タンパク質、または免疫グロブリンＦｃポリペプチドである、本発明1014のポリペプチド。
[本発明1016]
前記異種ポリペプチドが、血清アルブミンであり、該血清アルブミンが、ヒト血清アルブミン、カニクイザル（ｃｙｎｏ）血清アルブミンまたはウシ血清アルブミンである、本発明1015のポリペプチド。
[本発明1017]
前記異種ポリペプチドが、免疫グロブリンＦｃポリペプチドである、本発明1015のポリペプチド。
[本発明1018]
前記異種ポリペプチドが、前記ポリペプチドのＮ末端にコンジュゲートされている、本発明1014〜1017のいずれかのポリペプチド。
[本発明1019]
前記異種ポリペプチドが、前記ポリペプチドのＣ末端にコンジュゲートされている、本発明1014〜1017のいずれかのポリペプチド。
[本発明1020]
Ｎ末端からＣ末端に連続的に、以下：
異種ポリペプチド−［（Ｇ4Ｓ）］5−ＧＤＦ15；
異種ポリペプチド−［（Ｇ4Ｓ）］5−ΔＮ3−ＧＤＦ15；または
異種ポリペプチド−［（Ｇ4Ｓ）］5−ΔＮ6−ＧＤＦ15
を含む融合タンパク質。
[本発明1021]
前記異種ポリペプチドが、血清アルブミン、マルトース結合タンパク質、または免疫グロブリンＦｃポリペプチドである、本発明1020の融合タンパク質。
[本発明1022]
前記異種ポリペプチドが、血清アルブミンであり、該血清アルブミンが、ヒト血清アルブミン、カニクイザル血清アルブミンまたはウシ血清アルブミンである、本発明1021の融合タンパク質。
[本発明1023]
前記Ｎ末端にシグナル配列を含む、本発明1020〜1022のいずれかの融合タンパク質。
[本発明1024]
前記シグナル配列が、ＩｇＫシグナル配列である、本発明1023の融合タンパク質。
[本発明1025]
互いに共有結合した2つの本発明1001のポリペプチドを含み、Ｎ−グリコシル化されている、修飾ＧＤＦ15Ｎ−グリコシル化二量体。
[本発明1026]
前記2つのポリペプチドそれぞれが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：2、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：4、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：8、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：9、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：10、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：13、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：14、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：17、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：18、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：30、または5個までのアミノ酸が異なるアミノ酸から選択されるアミノ酸配列を含み；前記ポリペプチドは、Ｎ−グリコシル化されている少なくとも1つのＮ−グリコシル化部位を含有する、本発明1025の修飾ＧＤＦ15Ｎ−グリコシル化二量体。
[本発明1027]
前記2つのポリペプチドそれぞれが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：81、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：83、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：87、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：88、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：89、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：92、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：93、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：96、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：97またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：100から選択されるアミノ酸配列からなる、本発明1026の修飾ＧＤＦ15Ｎ−グリコシル化二量体。
[本発明1028]
それぞれ同じアミノ酸配列を含む2つのポリペプチドを有するホモ二量体であり、該ポリペプチドが、Ｎ−グリコシル化されている少なくとも1つのＮ−グリコシル化部位を含有する、本発明1025〜1027のいずれかの修飾ＧＤＦ15Ｎ−グリコシル化二量体。
[本発明1029]
本発明1001〜1019のいずれかのポリペプチド、本発明1020〜1024のいずれかの融合タンパク質、または本発明1025〜1028のいずれかの修飾ＧＤＦ15Ｎ−グリコシル化二量体をコードする核酸分子。
[本発明1030]
ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで、前記ポリペプチドまたは前記融合タンパク質をコードする前記核酸分子を発現させる発現制御エレメントに機能的に連結されている、本発明1029の核酸分子。
[本発明1031]
本発明1029または本発明1030の核酸分子を含むベクター。
[本発明1032]
ウイルスベクターを含む、本発明1031のベクター。
[本発明1033]
本発明1001〜1019のいずれかのポリペプチド、本発明1020〜1024のいずれかの融合タンパク質、または本発明1025〜1028のいずれかの修飾ＧＤＦ15Ｎ−グリコシル化二量体を発現する宿主細胞。
[本発明1034]
本発明1029〜1030のいずれかの核酸分子または本発明1031〜1032のいずれかのベクターを含む宿主細胞。
[本発明1035]
本発明1001〜1019のいずれかのポリペプチド、本発明1020〜1024のいずれかの融合タンパク質、または本発明1025〜1028のいずれかの修飾ＧＤＦ15Ｎ−グリコシル化二量体、および製剤的に許容可能な希釈剤、担体、もしくは賦形剤を含む医薬組成物。
[本発明1036]
少なくとも1つの追加の予防薬または治療薬を更に含む、本発明1035の医薬組成物。
[本発明1037]
本発明1001〜1019のいずれかのポリペプチド、または本発明1020〜1024のいずれかの融合タンパク質、または本発明1025〜1028のいずれかの修飾ＧＤＦ15Ｎ−グリコシル化二量体に特異的に結合する抗体。
[本発明1038]
本発明1037の抗体および製剤的に許容可能な希釈剤、担体または賦形剤を含む医薬組成物。
[本発明1039]
少なくとも1つの追加の予防薬または治療薬を更に含む、本発明1038の医薬組成物。
[本発明1040]
本発明1035、1036、1038または1039のいずれかの医薬組成物を含む滅菌容器。
[本発明1041]
シリンジである、本発明1040の滅菌容器。
[本発明1042]
本発明1040〜1041のいずれかの滅菌容器を含むキット。
[本発明1043]
本発明1001〜1019のいずれかのポリペプチド、本発明1020〜1024のいずれかの融合タンパク質、または本発明1025〜1028のいずれかの修飾ＧＤＦ15Ｎ−グリコシル化二量体の生成方法であって、
前記ポリペプチドまたは前記融合タンパク質を発現する宿主細胞を培養する工程；および
前記発現したポリペプチドまたは融合タンパク質を精製する工程を含む、前記方法。
[本発明1044]
対象の体重障害の治療または予防方法であって、該対象に本発明1001〜1019のいずれかのポリペプチド、本発明1020〜1024のいずれかの融合タンパク質、または本発明1025〜1028のいずれかの修飾ＧＤＦ15Ｎ−グリコシル化二量体を投与する工程を含み、前記ポリペプチドまたは前記融合タンパク質が、前記対象の前記体重障害を治療または予防するのに効果的な量で投与される、前記方法。
[本発明1045]
対象のグルコース代謝障害の治療または予防方法であって、該対象に本発明1001〜1019のいずれかのポリペプチド、本発明1020〜1024のいずれかの融合タンパク質、または本発明1025〜1028のいずれかの修飾ＧＤＦ15Ｎ−グリコシル化二量体を投与する工程を含み、前記ポリペプチドまたは前記融合タンパク質が、前記対象の前記グルコース代謝障害を治療または予防するのに効果的な量で投与される、前記方法。
[本発明1046]
前記対象の食物摂取を減少させることを含む、本発明1044〜1045のいずれかの方法。
[本発明1047]
前記対象の体重を減少させることを含む、本発明1044〜1045のいずれかの方法。
[本発明1048]
前記治療または予防が、前記対象の体重の減少を含む、本発明1044〜1045のいずれかの方法。
[本発明1049]
前記治療または予防が、前記対象の食物摂取の減少を含む、本発明1044〜1045のいずれかの方法。
[本発明1050]
前記治療または予防が、前記対象の血中グルコースの減少を含む、本発明1044〜1045のいずれかの方法。
[本発明1051]
前記グルコース代謝障害が、糖尿病である、本発明1045の方法。
[本発明1052]
前記対象が、ヒトである、本発明1044〜1051のいずれかの方法。
[本発明1053]
前記対象が、肥満である、本発明1044〜1052のいずれかの方法。
[本発明1054]
前記投与が、非経口的注入によるものである、本発明1044〜1053のいずれかの方法。
[本発明1055]
前記非経口的注入が、皮下である、本発明1054の方法。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】本明細書に開示されたＧＤＦ１５突然変異タンパク質のアミノ酸配列の、野生型（ＷＴ）成熟ヒトＧＤＦ１５のアミノ酸配列とのアラインメントを示す。
【図２】本明細書に開示されたΔＮ３−ＧＤＦ１５突然変異タンパク質のアミノ酸配列の、ＷＴ成熟ヒトＧＤＦ１５のアミノ酸配列とのアラインメントを示す。ΔＮ３−ｈＧＤＦ１５突然変異タンパク質は、成熟ｈＧＤＦ１５のＮ末端に存在する最初の３個のアミノ酸（ＡＲＮ）を欠いている。
【図３】Ｎ末端からＣ末端に連続的に以下を含む２つの融合タンパク質（コンストラクトＭ１およびＭ２）を示す：ＩｇＫシグナル配列（小文字）（ＩｇＫ）−ヒト血清アルブミンアミノ酸（Ｄ２５−Ｌ６０９）配列（ＨＳＡ）−非開裂可能（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）３リンカー［（Ｇ４Ｓ）］３（下線）−成熟ヒトＧＤＦ１５アミノ酸配列（ｈＧＤＦ１５）（太字）。コンストラクトＭ１（ＩｇＫ−ＨＳＡ−［（Ｇ４Ｓ）］３−ｈＧＤＦ１５）は、完全長成熟ｈＧＤＦ１５を含有し、一方、コンストラクトＭ２（ＩｇＫ−ＨＳＡ−［（Ｇ４Ｓ）］３−ΔＮ３−ｈＧＤＦ１５）は、成熟ｈＧＤＦ１５のＮ末端のアミノ酸に対応する最初の３個のアミノ酸（ＡＲＮ）が欠失しているΔＮ３−ｈＧＤＦ１５を含有する。
【図４】ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳＫＯ安定細胞株培地からのコンストラクトＭ１およびＭ２の非還元、クマシー染色、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ発現ゲルを示す。アスタリスク（＊）は、ＣＨＯＫ１ＳＶからの分泌中にＭ１で生じるクリップ種を示す。クリップ部位のＬＣ／ＭＳ同定の結果、成熟ｈＧＤＦ１５のＮ末端に３つのアミノ酸切断（ΔＡＲＮまたはΔＮ３）を含有する安定度向上コンストラクト（Ｍ２）のデザインとなった。
【図５】非開裂可能［（Ｇ４Ｓ）］５リンカー（下線）を介して成熟ヒトＧＤＦ１５アミノ酸配列（太字）のＮ末端に融合されたＩｇＫシグナル配列（小文字）を有するヒト血清アルブミンアミノ酸（Ｄ２５−Ｌ６０９）配列との２つの融合分子を示す。コンストラクトＭ３（ＩｇＫ−ＨＳＡ−［（Ｇ４Ｓ）］５−ΔＮ３−ｈＧＤＦ１５）は、成熟ｈＧＤＦ１５のＮ末端に３つのアミノ酸切断（ΔＡＲＮ）を含有する；一方、コンストラクトＭ４（ＩｇＫ−ＨＳＡ−［（Ｇ４Ｓ）］５−ΔＮ６−ｈＧＤＦ１５）は、成熟ｈＧＤＦ１５のＮ末端に対して６つのアミノ酸切断（ΔＡＲＮＧＤＨ）を含有する。
【図６】ビヒクル、Ｍ１、Ｍ３およびＭ４融合分子（４０ｎｍｏｌ／ｋｇ）の単一急性皮下投与の後の食餌性肥満（ＤＩＯ）マウスの食物摂取への作用を示す。図に示したとおり、投与後２４時間および投与後７日に、食物摂取パラメーターを測定した。マウスの各群（ｎ＝８）で、対応のないｔ検定によって、それぞれの特定の時点で、さまざまな用量群をビヒクル対照群と比較して、ｐ値（＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１）を測定した。
【図７】ビヒクル、Ｍ１、Ｍ３およびＭ４融合分子（４０ｎｍｏｌ／ｋｇ）の単一急性皮下投与の後のＤＩＯマウスの体重への作用を示す。図に示したとおり、投与後２４時間および投与後７日に、投与前群体重に対して、体重パラメーターを測定した。マウスの各群（ｎ＝８）で、対応のないｔ検定によって、それぞれの特定の時点で、さまざまな用量群をビヒクル対照群と比較して、ｐ値（＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１）を測定した。
【図８Ａ−１】図８Ａは、Ｎ結合グリコシル化コンセンサス部位（Ｍ５〜Ｍ２１）の導入によって生成されたモノグリコシル化およびジグリコシル化突然変異タンパク質のアミノ酸配列を示す。これらの配列は、成熟ヒトＧＤＦ１５アミノ酸配列（太字）のＮ末端に融合されたＩｇＫシグナル配列（小文字）を含む。
【図８Ａ−２】図８Ａは、Ｎ結合グリコシル化コンセンサス部位（Ｍ５〜Ｍ２１）の導入によって生成されたモノグリコシル化およびジグリコシル化突然変異タンパク質のアミノ酸配列を示す。これらの配列は、成熟ヒトＧＤＦ１５アミノ酸配列（太字）のＮ末端に融合されたＩｇＫシグナル配列（小文字）を含む。
【図８Ｂ−１】図８Ｂは、図８Ａに示されたアミノ酸配列をコードする核酸配列を示す。
【図８Ｂ−２】図８Ｂは、図８Ａに示されたアミノ酸配列をコードする核酸配列を示す。
【図８Ｂ−３】図８Ｂは、図８Ａに示されたアミノ酸配列をコードする核酸配列を示す。
【図８Ｂ−４】図８Ｂは、図８Ａに示されたアミノ酸配列をコードする核酸配列を示す。
【図８Ｂ−５】図８Ｂは、図８Ａに示されたアミノ酸配列をコードする核酸配列を示す。
【図８Ｃ】図８Ｃは、ΔＮ３−Ｍ１６およびΔＮ３−Ｍ１６をコードする核酸配列のアミノ酸配列を示す。
【図８Ｄ】図８Ｄは、ＩｇＫシグナル配列（ＩｇＫ−ＷＴ−ＧＤＦ１５）およびＩｇＫ−ＷＴ−ＧＤＦ１５をコードする核酸配列を含有するＷＴ−成熟ヒトＧＤＦ１５アミノ酸配列のアミノ酸配列を示す。
【図９】図８Ａに記載された各操作された組換えＮ−グリコシル化ヒトＧＤＦ１５突然変異タンパク質およびΔＮ３−Ｍ１６について、相対的溶解度の改善に加え、分泌および二量体形成の概要を提供する。
【図１０】ビヒクル（ＰＢＳ）、ＧＤＦ１５、Ｍ１６、ΔＮ３−Ｍ１６およびＭ１７ポリペプチド（１ｍｇ／ｋｇ（４０ｎｍｏｌ／Ｋｇ））の単一皮下投与後の食餌性肥満（ＤＩＯ）マウスの食物摂取への作用を示す。
【図１１】ビヒクル（ＰＢＳ）、ＧＤＦ１５、Ｍ１６、ΔＮ３−Ｍ１６およびＭ１７ポリペプチド（１ｍｇ／ｋｇ（４０ｎｍｏｌ／Ｋｇ））の単一皮下投与後のＤＩＯマウスの体重への作用を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
詳細な説明
本開示の方法および組成物を更に記載する前に、本開示は、本明細書に記載した特定の実施形態に限定されるものではないと理解されるべきであり、また、本明細書に用いられる専門用語は、特定の実施形態だけを記載する目的のためにあり、限定することを意図しないものと理解されるべきである。
【００４４】
値の範囲が提供される場合、その範囲の上限値と下限値の間の各介在値、文脈が別途明白に記載をしない限り下限値の単位の１０分の１まで、およびその示した範囲内の他の示した値または介在値が、本発明内に包含されるものとすると理解される。これより狭い範囲の上限値および下限値は、独立してより狭い範囲に含んでよく、これも、示した範囲内の明確に除外したいずれかの限界値に従う限り、本発明内に包含される。示した範囲が限界値の一方または両方を含む場合、含まれる上限値および下限値のいずれかまたは両方を除外する範囲も本発明に含まれる。別途特に定義しない限り、本明細書に用いられる全技術用語および科学用語は、本発明が関係する当業者によって一般的に理解される意味と同じである。
【００４５】
本明細書および添付したクレームに用いる場合、文脈が明らかに別段の指示をしない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は複数の指示物を含むことに留意しなければならない。したがって、例えば、「突然変異ポリペプチド」への参照は、１つ以上の突然変異ポリペプチドへの参照を含むなどである。クレームが任意の要素を除外するように作成されてもよいことに更に留意する。したがって、この記述は、クレームの要素の列挙に関連した「のみ」、「だけ」などの排他的な用語の使用、すなわち「否定的な」限定の使用と関連のための先の記載としての役目を果たすよう意図している。
【００４６】
本明細書で論じられる出版物は、本出願の出願日の前のその開示のためだけに提供される。本明細書におけるいずれの内容も、本発明が、先行発明を理由にかかる出版物に先行する権利を有しないことを認めるものと解釈されるべきではない。更に、提供される出版物の日付は、実際の出版日とは異なる場合があり、別々に確認する必要があり得る。
【００４７】
定義
「患者」または「対象」という用語は、ヒトまたは非ヒト動物（例えば、哺乳動物）を指すように交換可能で用いられる。
【００４８】
「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」などの用語は、一時的または永続的のいずれかで、対象を苦しめる疾患、障害、または状態の少なくとも１つの根底にある原因、または対象を苦しめる疾患、障害、状態に関連した少なくとも１つの症状を除去する、低減する、抑える、緩和する、または改善するために、疾患、障害または状態、またはこれらの症状が、診断、観察などされた後に開始される一連の行動（薬剤、例えば、ポリペプチドまたはポリペプチドを含む医薬組成物を投与することなど）を指す。したがって、治療は、（例えば、血流中のインスリンおよび／またはグルコースのレベルを減少させるように、グルコースレベルの変動を最小化するようにグルコース耐性を増大するため、および／またはグルコース恒常性の崩壊によって引き起こされる疾患を予防するように）活動性疾患を抑制すること（すなわち、疾患、障害もしくは状態またはこれらに関連した臨床的症状が発現する、または更に進行するのを阻止すること）を含む。
【００４９】
「治療を必要とする」という用語は、本明細書に用いる場合、対象が治療を必要とする、または対象が治療から利益を受けるという、医師または他の看護者による判断を指す。この判断は、医師または看護者の専門的知識の範囲内にあるさまざまな因子に基づいて行われる。
【００５０】
「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔ）」、「予防すること（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」、「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」などの用語は、一般に特定の疾患、障害または状態となる傾向がある対象という状況の中で、一時的または永続的のいずれかで、対象の疾患、障害、状態などを発現するリスク（例えば、臨床的症状がないことによって決定されるとおり）を予防する、抑える、阻害する、または、低減するような様式で（例えば、疾患、障害、状態またはこれらの症状の発症前に）開始される一連の行動（薬剤、例えば、ポリペプチドまたはポリペプチドを含む医薬組成物を投与することなど）を指す。ある特定の場合には、本用語は、疾患、障害もしくは状態の進行を遅らせること、または、これらが有害な状態、もしくはそうでなければ好ましくない状態に進行するのを阻害することも指す。
【００５１】
「予防を必要とする」という用語は、本明細書に用いる場合、対象が予防的ケア必要とする、または対象が予防的ケアから利益を受けるという、医師または他の看護者による判断を指す。この判断は、医師または看護者の専門的知識の範囲内にあるさまざまな因子に基づいて行われる。
【００５２】
「治療有効量」という語句は、患者に投与した場合、疾患、障害または状態の症状、形態、または特性に任意の検出可能な効果があるようにすることができる量で、単独でまたは医薬組成物の一部として、および単回用量または一連の用量の一部として、対象への薬剤の投与を指す。治療有効量は、関係のある生理学的作用を測定することによって確かめることができる。例えば、高血糖状態の場合では、薬剤の量が、高血糖状態を治療するのに有効であるかどうかを決定するために、血中グルコースの低下もしくは減少またはグルコース耐性試験での改善を用いることができる。例えば、治療有効量が、空腹時血漿グルコース（ＦＰＧ）のレベル（例えば、ベースラインレベル）を低減する、または減少させるのに十分な量であり、例えば、当該量は、ＦＰＧレベルを２００ｍｇ／ｄｌ超から２００ｍｇ／ｄｌ未満に低減するのに十分であり、当該量は、ＦＰＧレベルを１７５ｍｇ／ｄｌ〜２００ｍｇ／ｄｌから開始レベル未満に低減するのに十分であり、当該量は、ＦＰＧレベルを１５０ｍｇ／ｄｌ〜１７５ｍｇ／ｄｌから開始レベル未満に低減するのに十分であり、当該量は、ＦＰＧレベルを１２５ｍｇ／ｄｌ〜１５０ｍｇ／ｄｌから開始レベル未満に低減するのに十分である、など（例えば、ＦＰＧレベルを１２５ｍｇ／ｄｌ未満、１２０ｍｇ／ｄｌ未満、１１５ｍｇ／ｄｌ未満、１１０ｍｇ／ｄｌ未満に低減する、など）である。ＨｂＡＩｃレベルの場合では、有効量は、レベルを約１０％〜９％超、約９％〜８％超、約８％〜７％超、約７％〜６％超、約６％〜５％超など低減する、または減少させるのに十分な量である。更に、具体的に、ＨｂＡ１ｃレベルを約０．１％、０．２５％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、１．５％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、３３％、３５％、４０％、４５％、５０％、またはそれ以上低減する、または減少させることが、本開示によって企図される。治療有効量は、投与計画および対象の状態などの診断的分析に関係して調節することができる。
【００５３】
「変化をもたらすのに十分な量で」という語句は、特定の治療法の実施前（例えば、ベースラインレベル）および実施後に測定した指標のレベル間に検出可能な差があることを意味する。指標としては、客観的パラメーター（例えば、グルコースまたはインスリンのレベルまたは食物摂取）または主観的パラメーター（例えば、対象の良好な状態の感覚または食欲）が挙げられる。
【００５４】
「グルコース耐性」という語句は、本明細書に用いる場合、グルコース摂取が変動するときに、血漿グルコースおよび／または血漿インスリンのレベルを制御するための対象の能力を指す。例えば、グルコース耐性は、約１２０分以内に、血漿グルコースのレベルをグルコースの摂取前に測定したレベルに低減する対象の能力を包含する。
【００５５】
「糖尿病」および「糖尿病の」という用語は、インスリンの異常な産生または利用に関係する糖質代謝の進行性疾患を指し、高血糖および糖尿によって特徴づけられることが多い。「前糖尿病」および「前糖尿病の」という用語は、対象が、糖尿病で典型的に観察される特性、症状などがないが、治療しないままであれば、糖尿病に進行する可能性がある特性、症状などがある状態を指す。これらの状態にあることは、例えば、空腹時血漿グルコース（ＦＰＧ）試験または経口グルコース負荷試験（ＯＧＴＴ）を用いて決定してよい。両試験とも通常、対象が試験を開始する前に少なくとも８時間空腹である必要がある。ＦＰＧ試験では、対象の血中グルコースが、空腹時の終結後に測定される；一般に、対象は、一晩空腹であり、血中グルコースは、対象が食事する前の朝に測定される。健康な対象では、一般にＦＰＧ濃度が、約９０〜約１００ｍｇ／ｄｌであり、「前糖尿病」の対象では、一般にＦＰＧ濃度が、約１００〜約１２５ｍｇ／ｄｌであり、「糖尿病」の対象では、一般にＦＰＧレベルが、約１２６ｍｇ／ｄｌ超である。ＯＧＴＴでは、対象の血中グルコースが、空腹時に測定され、高グルコース含有飲料を飲んだ後２時間に再び測定される。高グルコース含有飲料の摂取後２時間に、健康な対象では、一般に血中グルコース濃度が、約１４０ｍｇ／ｄｌ未満であり、前糖尿病の対象では、一般に血中グルコース濃度が、約１４０〜約１９９ｍｇ／ｄｌであり、糖尿病の対象では、一般に血中グルコース濃度が、約２００ｍｇ／ｄｌ以上である。前述した血糖値は、ヒト対象に関するものであり、正常血糖、中等度高血糖および顕性高血糖は、マウス対象で別様に測られる。４時間空腹後の健康なマウス対象では、一般にＦＰＧ濃度が、約１００〜約１５０ｍｇ／ｄｌであり、「前糖尿病」のマウス対象では、一般にＦＰＧ濃度が、約１７５〜約２５０ｍｇ／ｄｌであり、「糖尿病」のマウス対象では、一般にＦＰＧ濃度が、約２５０ｍｇ／ｄｌ超である。
【００５６】
「インスリン抵抗性」という用語は、本明細書に用いる場合、正常な量のインスリンが、正常な生理学的または分子応答を生じさせることができない状態を指す。いくつかの場合では、体内で産生された、または外因的に投与された過剰生理学的量のインスリンが、全体でまたは一部で、インスリン抵抗性を克服することができ、生物学的応答を生じさせる。
【００５７】
「メタボリックシンドローム」という用語は、限定されないが、高インスリン血症、異常グルコース耐性、肥満、腹部または上部身体区画への脂肪の再分布、高血圧症、フィブリン溶解反応異常、および高トリグリセリド、低高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）コレステロール、および高低比重低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）粒子によって特徴づけられる脂質異常症を含む関連する特徴群を指す。メタボリックシンドロームである対象は、２型糖尿病および／または他の障害（例えば、アテローム動脈硬化）を発現するリスクがある。
【００５８】
「グルコース代謝障害」という語句は、健康な個体と比較して対象中のグルコースのレベルの上昇および／またはインスリンのレベルの上昇と関係している臨床的症状または臨床的症状の組み合わせによって特徴づけられる任意の障害を包含する。グルコースおよび／またはインスリンのレベルの上昇は、以下の疾患、障害および状態に現れる可能性がある：高血糖、２型糖尿病、妊娠性糖尿病、１型糖尿病、インスリン抵抗性、グルコース耐性の低下、高インスリン血症、グルコース代謝の低下、前糖尿病、他の代謝障害（例えば、メタボリックシンドローム、シンドロームＸとも称される）、および肥満、など。本開示のポリペプチド、およびこれらの組成物は、例えば、グルコース恒常性を実現する、および／または維持するように、例えば、健康な対象にみられる範囲に血流中のグルコースレベルを低減する、および／またはインスリンレベルを低減するように用いることができる。
【００５９】
「高血糖」という用語は、本明細書に用いる場合、健康な個体と比較してグルコースの量が増加して、対象の血漿中を循環する状態を指す。高血糖は、本明細書に記載したとおり、空腹時血中グルコースレベルの測定を含む当技術分野で知られる方法を用いて、診断することができる。
【００６０】
「高インスリン血症」という用語は、本明細書に用いる場合、付随的に、血中グルコースレベルが上昇する、または正常である場合、循環インスリンのレベルの上昇がある状態を指す。高インスリン血症は、脂質異常症、例えば、高トリグリセリド、高コレステロール、高低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）および低高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）；高尿酸レベル；多嚢胞性卵巣症候群；２型糖尿病および肥満と関係しているインスリン抵抗性によって引き起こされる可能性がある。高インスリン血症は、血漿インスリンレベルが、約２μＵ／ｍＬより高い場合に診断することができる。
【００６１】
本明細書に用いる場合、「体重障害」という語句は、過剰体重および／または食欲の向上と関係している状態を指す。対象が、参照する健康な個体と比べて、太り過ぎかどうかを決定するために対象の年齢、身長、性別および健康状態を含むさまざまなパラメーターが用いられる。例えば、対象の体重（キログラム）を対象の身長（平方メートル）で割ることによって計算される対象のボディマスインデックス（ＢＭＩ）の評価によって、対象が、太り過ぎまたは肥満と考えてよい。ＢＭＩが、約１８．５〜約２４．９ｋｇ／ｍ２の範囲である成人は、正常な体重であると考えられる；ＢＭＩが、約２５〜約２９．９ｋｇ／ｍ２である成人は、太り過ぎ（前肥満）と考えてよい；ＢＭＩが約３０ｋｇ／ｍ２以上である成人は、肥満と考えてよい。食欲の向上が、過剰体重をもたらすことが多い。食欲の向上と関係しているいくつかの状態があり、例えば、朝の食欲不振および不眠と関係していることが多い夜の多食によって特徴づけられるが、視床下部の損傷に関係する可能性がある夜食症候群を含む。
【００６２】
「アクチベーター」という用語は、例えば、代謝障害を治療するまたは予防するのに用いられる１つ以上の薬剤、例えば、ポリペプチドの機能または活性を刺激する、増大させる、活性化させる、促進する、向上させる、活性を増強する、感作する、または上向き調節する薬剤を指す。また、アクチベーターとしては、本発明のポリペプチドと同じ作用の機序により作動し、ポリペプチドの生物学的反応と同等（またはそれ以上）の生物学的反応を誘発することができる薬剤（すなわち、ポリペプチドのシグナリング経路に類似した方法で、ポリペプチドと同じようなシグナリング経路を調節する薬剤）が挙げられる。アクチベーターの例としては、アゴニスト、例えば、小分子化合物が挙げられる。
【００６３】
「モジュレーター」という用語は、ひとまとめにして本発明のポリペプチドおよびアクチベーターを指す。
【００６４】
「調節する」、「調節」などの用語は、直接にまたは間接に１つ以上のポリペプチド（またはこれをコードする核酸分子）の機能または活性を増大させる薬剤（例えば、アクチベーター）の能力；または１つ以上のポリペプチドと同等の作用を生じさせる薬剤の能力を指す。
【００６５】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、本明細書に交換可能で用いられ、任意の長さのアミノ酸のポリマー形態を指し、遺伝子的にコード化されたアミノ酸および非遺伝子的にコード化されたアミノ酸、化学的にまたは生化学的に修飾されたまたは誘導体化されたアミノ酸、および修飾されたポリペプチド主鎖を有するポリペプチドを含むことができる。本用語としては、融合タンパク質、を含み、これには、限定されないが、異種アミノ酸配列を有する融合タンパク質、異種および同種リーダー配列を有する、Ｎ末端メチオニン残基を有するまたはＮ末端メチオニン残基を有しない融合タンパク質；免疫学的に標識を付けられたタンパク質；などが挙げられる。特定の実施形態では、本用語は、遺伝子的にコード化されたアミノ酸を含む任意の長さのアミノ酸のポリマー形態を指す。特定の実施形態では、本用語は、異種アミノ酸配列に融合された遺伝子的にコード化されたアミノ酸を含む任意の長さのアミノ酸のポリマー形態を指す。特定の実施形態では、本用語は、任意で異種配列に融合された長さが１１２アミノ酸のアミノ酸を指す。特定の実施形態では、適宜、本明細書に開示され、記載されたタンパク質および分子を指す場合、「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、本明細書に定義したとおりのポリペプチドを指す。
【００６６】
本開示全体を通じて１文字コードまたは３文字コードに従ってアミノ酸についての参照がなされると理解される。読者の利便性のために、以下に１および３文字アミノ酸コードを提供する。
0006704358.tif 000002
【００６７】
本明細書に用いる場合、「変異体」という用語は、天然変異体（例えば、相同体および対立遺伝子変異体）および非天然変異体（例えば、組換え修飾）を包含する。天然変異体は、相同体、すなわち、種ごとにヌクレオチドまたはアミノ酸配列がそれぞれ異なる核酸およびポリペプチドを含む。天然変異体は、対立遺伝子変異体、すなわち、種内の個体ごとにヌクレオチドまたはアミノ酸配列がそれぞれ異なる核酸およびポリペプチドを含む。非天然変異体は、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列それぞれに変化を含む核酸およびポリペプチドを含み、配列中の変化は、人工的に導入され、例えば、変化は、ヒトの介入（「人間の手」）によって実験室または他の施設で生成される。
【００６８】
「未変性」または「野生型」という用語は、ＧＤＦ１５に関して、生物学的に活性がある天然ＧＤＦ１５変異体を含む生物学的に活性がある天然ＧＤＦ１５を指す。本用語は、１１２アミノ酸ヒトＧＤＦ１５成熟配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）を含む。
【００６９】
「突然変異タンパク質」という用語は、本明細書に用いる場合、広く、組換えタンパク質、すなわち、アミノ酸配列中の人工的に導入された変化、例えば、ヒトの介入（「人間の手」）によって実験室または他の施設で生成されたアミノ酸配列中の変化を含むポリペプチドを指す。これらのポリペプチドは、通常、単一または複数のアミノ酸置換または欠失を保持し、部位特異的変異誘発またはランダム変異誘発されたクローン化遺伝子、または完全合成遺伝子由来であることが多い。したがって、本開示の「ＧＤＦ１５突然変異タンパク質」は、例えば、参照ポリペプチドに対して、例えば、成熟ヒトＧＤＦ１５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）に対して、アミノ酸置換および／またはアミノ酸欠失（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４個以上のアミノ酸のＮ末端側切断）を包含する。
【００７０】
本明細書に用いる場合、未変性ヒトＧＤＦ１５またはＧＤＦ１５突然変異タンパク質に関して、「修飾された」、「修飾」などの用語は、ヒトＧＤＦ１５、天然ＧＤＦ１５変異体、またはＧＤＦ１５突然変異タンパク質の特性を修飾する１つ以上の変化を指し、当該変化は、ＧＤＦ１５の一次アミノ酸配列を変化させない。かかる特性としては、例えば、溶解度、循環半減期、安定度、クリアランス、免疫原性またはアレルギー原性、および製造性（例えば、コストおよび効率）が挙げられる。「修飾」は、ＧＤＦ１５ポリペプチド（未変性または突然変異タンパク質）自体の一次アミノ酸配列を変化させない共有結合的化学修飾を含む。実施してよいヒトＧＤＦ１５、天然ＧＤＦ１５変異体、またはＧＤＦ１５突然変異タンパク質への変化としては、これらに限定されないが、ペグ化（ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、またはこれらの誘導体の１個以上の分子の共有結合）；グリコシル化（例えば、Ｎ−グリコシル化）、ポリシアル化およびＨＥＳ化；マルトース結合タンパク質融合；アルブミン融合（例えば、ＨＳＡ融合）；例えば、コンジュゲート脂肪酸鎖（アシル化）によるアルブミン結合；Ｆｃ融合；およびＰＥＧミメティックとの融合が挙げられる。いくつかの特定の実施形態では、ポリエチレングリコールに関係する修飾を必然的に伴い、他の特定の実施形態では、アルブミンに関係する修飾を必然的に伴い、更に他の特定の修飾では、グリコシル化に関係する修飾またはこれらの組み合わせを必然的に伴う。
【００７１】
「ＤＮＡ」、「核酸」、「核酸分子」、「ポリヌクレオチド」などの用語は、本明細書に交換可能で用いられ、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドのどちらか、またはこれらの類似体を指す。ポリヌクレオチドの非限定例としては、直鎖状および環状核酸、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、組換えポリヌクレオチド、ベクター、プローブ、プライマーなどが挙げられる。
【００７２】
「プローブ」という用語は、目的の遺伝子または配列に対応するＤＮＡまたはＲＮＡのフラグメントを指し、フラグメントは、放射標識されている（例えば、３２Ｐまたは３５Ｓを組み入れることによって）、またはいくつかの他の検出可能な分子、例えば、ビオチン、ジゴキシゲニンまたはフルオレセインで標識されている。相補的配列とのＤＮＡまたはＲＮＡの一続きが、ハイブリダイズする場合、プローブを用いて、例えば、目的の遺伝子を含有するゲル上で、ウイルスプラーク、細菌コロニーまたはバンドに標識を付けることができる。プローブは、クローン化ＤＮＡとすることができる、または合成ＤＮＡストランドとすることができる；後者を用いて、例えば、タンパク質の一部をマイクロシークエンシングし、タンパク質をコードする核酸配列を演繹し、その配列を保持するオリゴヌクレチドを合成し、その配列を放射標識して、ｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムライブラリーをスクリーニングするためにプローブとしてそれを用いて、単離タンパク質からｃＤＮＡまたはゲノムクローンを得ることができる。
【００７３】
「異種」という用語は、異なる供給源に由来する構造によって定義される２つの成分を指す。例えば、ポリペプチドの文脈では、「異種」ポリペプチドが、異なるポリペプチド（例えば、組換えポリペプチドを含む第１の成分および未変性ＧＤＦ１５ポリペプチド由来の第２の成分）由来の機能的に連結されるアミノ酸配列を含んでよい。同様に、キメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの文脈では、「異種」ポリヌクレオチドが、異なる遺伝子（例えば、本明細書に開示された実施形態に従ったポリペプチドをコードする核酸からの第１の成分およびキャリアポリペプチドをコードする核酸からの第２の成分）由来であることができる機能的に連結される核酸配列を含んでよい。他の例示的な「異種」核酸は、コード配列を含む核酸が、コード配列の遺伝的起源と異なる遺伝的起源からの制御エレメント（例えば、プロモーター）に機能的に連結されている（例えば、プロモーター、コード配列または両者と異なる遺伝的起源であり得る目的の宿主細胞中に発現させるため）発現コンストラクトを含む。例えば、ＧＤＦ１５ポリペプチドまたはこれらのドメインをコードするポリヌクレオチドに機能的に連結されるＴ７プロモーターが、異種核酸であると言われる。組換え細胞の文脈では、「異種」は、核酸が存在している宿主細胞と異なる遺伝的起源の核酸（または遺伝子産物、例えば、ポリペプチド）の存在を指すことができる。
【００７４】
「機能的に連結される」という用語は、所望の機能をもたらす分子間の連結を指す。例えば、「機能的に連結される」は、核酸の文脈では核酸配列間の機能的連結を指す。例えば、核酸発現制御配列（プロモーター、シグナル配列、または一連の転写因子結合部位など）を第２のポリヌクレオチドに機能的に連結してよく、発現制御配列は、第２のポリヌクレオチドの転写および／または翻訳に影響を及ぼす。ポリペプチドの文脈では、「機能的に連結される」は、ポリペプチドの記載された活性をもたらすアミノ酸配列（例えば、異なるドメイン）間の機能的連結を指す。
【００７５】
本明細書に用いる場合、ポリペプチドの構造の文脈では、「Ｎ末端」（または「アミノ末端」）および「Ｃ末端」（または「カルボキシル末端」）は、それぞれポリペプチドのアミノおよびカルボキシル最末端を指し、一方、「Ｎ末端側」および「Ｃ末端側」という用語は、それぞれＮ末端およびＣ末端に向かってのポリペプチドのアミノ酸配列中の相対的な位置を指し、それぞれＮ末端およびＣ末端に残基を含むことができる。「隣接Ｎ末端側」または「隣接Ｃ末端側」は、第２のアミノ酸残基に対する第１のアミノ酸残基の位置を指し、第１のアミノ酸残基および第２のアミノ酸残基は、共有結合して連続アミノ酸配列をもたらす。
【００７６】
「由来の」は、アミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列（例えば、ＧＤＦ１５ポリペプチド「由来の」アミノ酸配列）の文脈では、ポリペプチドまたは核酸が、参照ポリペプチドまたは核酸（例えば、天然ＧＤＦ１５ポリペプチドまたはＧＤＦ１５をコードする核酸）の配列に基づいている配列を有することを示すのを意味し、供給源またはタンパク質または核酸が生成される方法について制限することを意味しない。例えば、「由来の」という用語は、参照アミノ酸またはＤＮＡ配列の相同体または変異体を含む。
【００７７】
ポリペプチドの文脈では、「単離された」という用語は、天然ポリペプチドであれば、天然に生じる可能性がある環境と異なる環境にある目的のポリペプチドを指す。「単離された」とは、目的のポリペプチドが実質的に濃縮されている、および／または、目的のポリペプチドが部分的にまたは実質的に精製されている試料内に存在するポリペプチドを含むことを意味する。ポリペプチドが天然ポリペプチドでない場合、「単離された」は、ポリペプチドが合成または組換え手段のいずれかによって作製された環境から分離されていることを示す。
【００７８】
「濃縮された」は、試料が非天然に操作され（例えば、実験室で、例えば、科学者または臨床医によって）、その結果、目的のポリペプチドが、ａ）生体試料などの開始試料（例えば、ポリペプチドが天然に生じる試料、またはポリペプチドが投与後に存在している試料）中のポリペプチドの濃度より濃度が増加（例えば、少なくとも３倍増加、少なくとも４倍増加、少なくとも８倍増加、少なくとも６４倍増加、またはそれ以上）して、またはｂ）ポリペプチドが生成された環境以上の濃度（例えば、細菌性細胞中）で存在していることを意味する。
【００７９】
「実質的に純粋」は、成分（例えば、ポリペプチド）が、組成物の総含有量の約５０％超を構成しており、典型的には総ポリペプチド含有量の約６０％超を構成していることを示す。更に典型的には、「実質的に純粋」は、総組成物の少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％以上が目的の成分である組成物を指す。いくつかの場合では、ポリペプチドが、組成物の総含有量の約９０％超、または約９５％超を構成している。
【００８０】
「抗体」（Ａｂ）および「免疫グロブリン」（Ｉｇ）という用語は、同じ構造的特性を有する糖タンパク質を指す。抗体は、特定の抗原への結合特異性を示し、一方、免疫グロブリンは、抗原特異性を欠いている抗体および他の抗体様分子の両者を含む。以下に詳細に抗体を記載している。
【００８１】
「単クローン性抗体」という用語は、実質的に均質な抗体の集団から得られた抗体を指し、すなわち、集団を含む個々の抗体は、少量で存在する可能性がある天然に生じる可能性がある変異型を除いて、同じものである。単クローン性抗体はきわめて特異的であり、単一抗原部位に向けられる。異なる決定因子（エピトープ）に向けられた異なる抗体を含むことができる多クローン性抗体調製物とは対照的に、それぞれの単クローン性抗体は、抗原上の単一決定因子に向けられる。
【００８２】
抗体の文脈では「単離された」という用語は、その自然環境の汚染成分から単離されたおよび／または回収された抗体を指す；かかる汚染成分は、抗体の診断用利用または治療用利用を妨げる可能性がある物質を含み、酵素、ホルモン、および他のタンパク質溶質または非タンパク質溶質を含んでよい。
【００８３】
「保存的アミノ酸置換」という語句は、以下の群：１）Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｖ、Ｆ；２）Ｒ、Ｋ；３）Ｆ、Ｙ、Ｈ、Ｗ、Ｒ；４）Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｓ；５）Ｑ、Ｎ；および６）Ｄ、Ｅ内でのアミノ酸残基の置換を指す。保存的アミノ酸置換は、酸性度、塩基度、電荷、極性、または側鎖の大きさがほぼ同じ側鎖を有するアミノ酸でタンパク質中のアミノ酸（複数可）を置換することによって、タンパク質の活性を保存する可能性がある。置換、挿入、または欠失のガイダンスは、異なる種からの異なる変異体タンパク質またはタンパク質のアミノ酸配列のアラインメントに基づいてよい。
【００８４】
増殖分化因子１５（ＧＤＦ１５）
ＧＤＦ１５は、また、ＭＩＣ−１（マクロファージ抑制サイトカイン−１）、ＰＤＦ（前立腺分化因子）、ＰＬＡＢ（胎盤骨形態形成タンパク質）、ＮＡＧ−１（非ステロイド系抗炎症薬剤（ＮＳＡＩＤ）活性化遺伝子）、ＴＧＦ−ＰＬ、およびＰＴＧＦＢとして知られ、形質転換成長因子β（ＴＧＦ−β）スーパーファミリーのメンバーである。ＧＤＦ１５は、のちにフューリン様プロテアーゼによって切断される６２ｋＤａ細胞内前駆体タンパク質として合成され、２５ｋＤａジスルフィド結合タンパク質として分泌される。［例えば、Ｆａｉｒｌｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ６５：２−５（１９９９）を参照］。ＧＤＦ１５  ｍＲＮＡは、肝臓、腎臓、すい臓、結腸および胎盤を含むいくつかの組織中にみられ、臓器、例えば、肝臓、腎臓、心臓および肺の損傷中に、肝臓中のＧＤＦ１５発現を有意に上向き調節することができる。
【００８５】
ＧＤＦ１５前駆体は、２９アミノ酸シグナルペプチド、１６７アミノ酸プロドメイン、およびフューリン様プロテアーゼによってプロドメインから切除される１１２アミノ酸の成熟ドメインを含有する３０８アミノ酸ポリペプチド（ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００４８５５．２）である。３０８アミノ酸ＧＤＦ１５ポリペプチドは、「完全長」ＧＤＦ１５ポリペプチドと称される；１１２アミノ酸ＧＤＦ１５ポリペプチド（「完全長」ＧＤＦ１５のアミノ酸１９７〜３０８）は、「成熟」ＧＤＦ１５ポリペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）である。別途特に指示がない限り、「ＧＤＦ１５」という用語は、１１２アミノ酸成熟ヒト配列を指す。また、特定のＧＤＦ１５残基の数値的参照は、１１２アミノ酸成熟配列（すなわち、残基１が、Ａｌａ（Ａ）であり、残基１１２が、Ｉｌｅ（Ｉ）である；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を参照）を指す。重要なことに、ＧＤＦ１５前駆体アミノ酸配列は、３つの除去部位を予測し、「成熟」ヒトＧＤＦ１５の３つの推定形態（すなわち、１１０、１１２および１１５アミノ酸）が得られ、１１２アミノ酸成熟配列は、正しいと受け入れられる。
【００８６】
本開示の範囲は、マウス（ＮＰ＿０３５９４９）、チンパンジー（ＸＰ＿５２４１５７）、オランウータン（ＸＰ＿００２８２８９７２）、アカゲザル（ＥＨＨ２９８１５）、ジャイアントパンダ（ＸＰ＿００２９１２７７４）、テナガザル（ＸＰ＿００３２７５８７４）、モルモット（ＸＰ＿００３４６５２３８）、フェレット（ＡＥＲ９８９９７）、ウシ（ＮＰ＿００１１９３２２７）、ブタ（ＮＰ＿００１１６７５２７）、イヌ（ＸＰ＿５４１９３８）およびカモノハシ（Ｏｒｎｉｔｈｏｒｈｙｎｃｈｕｓ  ａｎａｔｉｎｕｓ；ＡＦＶ６１２７９）を含む他の哺乳動物種からのＧＤＦ１５オーソログ、およびこれらの修飾形態、ならびにこれらの使用を含む。ヒトＧＤＦ１５の成熟形態は、マウスオーソログと約６７％アミノ酸同一性を有する。
【００８７】
利便性のために、以降に記載される修飾ヒトＧＤＦ１５分子、ＧＤＦ１５変異体（例えば、突然変異タンパク質）、および修飾ＧＤＦ１５突然変異タンパク質は、ひとまとめにして以下で「ポリペプチド（複数可）」と称する。本開示のポリペプチドおよび核酸分子に関係して「ヒト」への任意の参照は、ポリペプチドまたは核酸を得る方法または供給源に関して制限することを意味せず、配列が天然ヒトポリペプチドまたは核酸分子の配列に対応する可能性があるために配列への参照だけであるということに留意しなければならない。特定の実施形態では、修飾ヒトＧＤＦ１５分子は、Ｎ−グリコシル化二量体である。特定の実施形態では、修飾ヒトＧＤＦ１５分子は、Ｎ−グリコシル化ホモ二量体である。これらをコードするヒトポリペプチドおよび核酸分子に加えて、本開示は、他の種からのＧＤＦ１５関連ポリペプチドおよび対応する核酸分子を企図する。
【００８８】
Ａ．所望の物理的特性を有するポリペプチド
本開示は、部分的に、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸配列（成熟１１２アミノ酸長ヒトＧＤＦ１５）と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である連続アミノ酸配列を含むポリペプチドを企図する。当該ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸配列に対して１つ以上のアミノ酸置換および／または欠失を含んでよい。ある特定の実施形態では、アミノ酸置換に加えて、本開示のポリペプチドは、また、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸配列に対してアミノ酸欠失を含んでよい。いくつかの実施形態では、本開示のポリペプチドが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸配列に対してアミノ酸欠失を含んでよい。
【００８９】
利便性および明確さのため、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸配列が、本明細書に示したポリペプチドの参照配列として用いられる。このため、本明細書では、アミノ酸残基位置は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を基準としてナンバリングされる。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の配列は、以下に示される。
0006704358.tif 000003
【００９０】
いくつかの実施形態では、本開示のポリペプチドは、１個以上のＮ結合グリコシル化コンセンサス部位（複数可）を、かかる部位がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１中に存在していない位置に導入する１、２、３つ以上のアミノ酸置換、付加、または欠失を含んでよい。Ｎ結合グリコシル化コンセンサス部位は、配列ＮＸＳ／Ｔを含み、Ｎは、Ａｓｎであり；Ｘは、プロリン以外のアミノ酸であり；後にＳｅｒ（Ｓ）またはＴｈｒ（Ｔ）が続く。
【００９１】
本開示のポリペプチドの例としては、１、２、３、４つ、またはそれ以上のグリコシル化コンセンサス部位（例えば、Ｎ結合グリコシル化コンセンサス部位）を、かかる部位がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸配列に存在していないアミノ酸位置に有するポリペプチドが挙げられる。
【００９２】
ある特定の実施形態では、ポリペプチドは、置換の位置（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１中の配列ＮＧＤを、１つの置換によってＮＧＴ／Ｓに変化させてよい；置換の位置には下線を引いた）に１つのＮ結合グリコシル化コンセンサス部位をもたらす１つのアミノ酸置換を、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対して含んでよい。他の場合では、ポリペプチドは、置換の位置（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１中の配列ＫＴＤを、２つの置換によってＮＴＴ／Ｓに変化させてよい；置換の位置には下線を引いた）に１つのＮ結合グリコシル化コンセンサス部位をもたらす２つのアミノ酸置換をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対して含んでよい。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、置換の位置（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１中の配列ＧＰＧを、３つの置換によってＮＴＴ／Ｓに変化させてよい；置換の位置には下線を引いた）に１つのＮ結合グリコシル化コンセンサス部位をもたらす３つのアミノ酸置換をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対して含んでよい。
【００９３】
ある特定の実施形態では、ポリペプチドは、欠失の位置にＮ結合グリコシル化コンセンサス部位をもたらす１つ以上のアミノ酸欠失を、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対して含んでよい。例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１中の
0006704358.tif 000004
配列を、アミノ酸Ｄ〜Ｈ（下線を引いた）の欠失によって変化させてよく、これにより、Ｎ結合グリコシル化コンセンサス部位：ＮＧＴをもたらす。
【００９４】
ある特定の実施形態では、ポリペプチドは、付加（複数可）の位置（複数可）にＮ結合グリコシル化コンセンサス部位をもたらす１つ以上のアミノ酸付加をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対して含んでよい。１つのアミノ酸の付加によるＮ結合グリコシル化コンセンサス部位の導入の例としては、ＮをＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１中の配列ＬＨＴに付加し、これにより、配列ＬＮＨＴを生成することが挙げられ、ＮＨＴは、Ｎ結合グリコシル化コンセンサス部位である。
【００９５】
上述のとおり、ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対して１つ以上の置換を含んでよく、置換は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１中の対応するアミノ酸の位置としてナンバリングしてよい。
【００９６】
ある特定の実施形態では、ポリペプチドが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である連続アミノ酸配列を含んでよく、連続アミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１中の対応するアミノ酸に対して以下の対の少なくとも１つの置換を有する。
ｉ）Ｄ５ＴおよびＲ２１ＮまたはＤ５ＳおよびＲ２１Ｎ；
ｉｉ）Ｒ１６ＮおよびＨ１８ＴまたはＲ１６ＮおよびＨ１８Ｓ；
ｉｉｉ）Ｓ２３ＮおよびＥ２５ＴまたはＳ２３ＮおよびＥ２５Ｓ；
ｉｖ）Ｌ２４ＮおよびＤ２６ＴまたはＬ２４ＮおよびＤ２６Ｓ；
ｖ）Ｓ５０ＮおよびＦ５２Ｔ；Ｓ５０ＮおよびＦ５２Ｓ；Ｆ５２ＮおよびＡ５４Ｔ；またはＦ５２ＮおよびＡ５４Ｓ；
ｖｉ）Ｑ５１ＮおよびＲ５３Ｔ；Ｑ５１ＮおよびＲ５３Ｓ；Ｒ５３ＮおよびＡ５５Ｔ；またはＲ５３ＮおよびＡ５５Ｓ；
ｖｉ）Ｓ６４ＮおよびＨ６６ＴまたはＳ６４ＮおよびＨ６６Ｓ；
ｖｉｉ）Ｌ６５ＮおよびＲ６７ＴまたはＬ６５ＮおよびＲ６７Ｓ；
ｖｉｉｉ）Ｓ８２ＮおよびＮ８４ＴまたはＳ８２ＮおよびＮ８４Ｓ；
ｉｘ）Ｋ９１ＮおよびＤ９３Ｔ；Ｋ９１ＮおよびＤ９３Ｓ；Ｄ９３ＮおよびＧ９５Ｔ；またはＤ９３ＮおよびＧ９５Ｓ；
ｘ）Ｔ９４ＮおよびＶ９６Ｔ；Ｔ９４ＮおよびＶ９６Ｓ；Ｖ９６ＮおよびＬ９８Ｔ；またはＶ９６ＮおよびＬ９８Ｓ；
ｘｉ）Ｓ９７ＮおよびＱ９９ＴまたはＳ９７ＮおよびＱ９９Ｓ；および
ｘｉｉ）Ａ１０６ＮおよびＤ１０８ＴまたはＡ１０６ＮおよびＤ１０８Ｓ。
【００９７】
例えば、上述のｉ）の置換は、ポリペプチドが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１中のアミノ酸位置５に対応するアミノ酸位置にトレオニン（Ｔ）またはセリン（Ｓ）を有し、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１中にアスパレート（Ｄ）が、アミノ酸位置５に存在していることを示す。位置５でのＴまたはＳによるＤの置換は、Ｄ５Ｔ／Ｓによって示すことができる。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対してポリペプチド中の対応するアミノ酸の位置は、アミノ酸配列を整列させることによって決定してよい。
【００９８】
ある特定の実施形態では、ポリペプチドが、Ｎ−グリコシル化コンセンサス配列が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１中に存在していない位置に、単一Ｎ−グリコシル化コンセンサス配列をもたらす２つのアミノ酸置換（１対の置換）を含んでよい。かかる置換の例としては、Ｒ１６ＮおよびＨ１８Ｔ／Ｓ；Ｋ９１ＮおよびＤ９３Ｔ／Ｓ；Ｔ９４ＮおよびＶ９６Ｔ／Ｓ；および上記の他のものが挙げられる。Ｒ１６ＮおよびＨ１８Ｔ／Ｓは、ポリペプチドが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の位置１６に対応する位置にＮを有し、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１中に、Ｒが、存在しており、ポリペプチドが、Ｈが存在しているＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１中の位置１８に対応する位置にＴまたはＳのいずれかを有することを示す。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１中の配列ＲＸＨ（位置１６〜１８に）が、Ｎ結合グリコシル化コンセンサス配列の残基を含まないため、対の置換により、Ｎ結合グリコシル化コンセンサス配列が導入される。
【００９９】
別の実施形態では、Ｎ結合グリコシル化コンセンサス配列をもたらすのに単一アミノ酸置換で、十分である可能性があり、例えば、配列ＮＧＤ（位置３〜５に）が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１中に存在しているため、ＴまたはＳによるＤの単一置換により、それぞれ配列ＮＧＴまたはＮＧＳが生成され、ともにＮ−グリコシル化コンセンサス配列である。
【０１００】
ある特定の場合では、野生型ＧＤＦ１５に１つ以上のＮ−グリコシル化コンセンサス配列を導入してよい。例えば、１、２、３、４つ以上のＮ−グリコシル化コンセンサス配列をもたらすように、置換および／または欠失によって野生型ＧＤＦ１５アミノ酸配列を修飾してよい。ある特定の実施形態では、ポリペプチドが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の１１２アミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する１１２個の連続するアミノ酸を含んでよく、この１１２連続アミノ酸は、１、２、３、４つ以上のＮ−グリコシル化コンセンサス配列、例えば、１〜１２、１〜１０、１〜８、１〜６、１〜４、１〜３、または１〜２のＮ−グリコシル化コンセンサス配列を含む。
【０１０１】
２つのＮ−グリコシル化コンセンサス配列を有するポリペプチドの例としては、位置５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対して）にＴ／Ｓおよび位置２１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対して）にＮを有するＧＤＦ１５突然変異タンパク質が挙げられる。
【０１０２】
本開示の例示的なポリペプチドとしては、２つの以上のＮ結合グリコシル化コンセンサス配列を有するポリペプチドが挙げられる。例えば、ポリペプチドは、以下の対の置換の２つの以上の組み合わせを含んでよい。
ｉ）Ｄ５ＴおよびＲ２１ＮまたはＤ５ＳおよびＲ２１Ｎ；
ｉｉ）Ｒ１６ＮおよびＨ１８ＴまたはＲ１６ＮおよびＨ１８Ｓ；
ｉｉｉ）Ｓ２３ＮおよびＥ２５ＴまたはＳ２３ＮおよびＥ２５Ｓ；
ｉｖ）Ｌ２４ＮおよびＤ２６ＴまたはＬ２４ＮおよびＤ２６Ｓ；
ｖ）Ｓ５０ＮおよびＦ５２Ｔ；Ｓ５０ＮおよびＦ５２Ｓ；Ｆ５２ＮおよびＡ５４Ｔ；またはＦ５２ＮおよびＡ５４Ｓ；
ｖｉ）Ｑ５１ＮおよびＲ５３Ｔ；Ｑ５１ＮおよびＲ５３Ｓ；Ｒ５３ＮおよびＡ５５Ｔ；またはＲ５３ＮおよびＡ５５Ｓ；
ｖｉ）Ｓ６４ＮおよびＨ６６Ｔ；またはＳ６４ＮおよびＨ６６Ｓ；
ｖｉｉ）Ｌ６５ＮおよびＲ６７Ｔ；またはＬ６５ＮおよびＲ６７Ｓ；
ｖｉｉｉ）Ｓ８２ＮおよびＮ８４ＴまたはＳ８２ＮおよびＮ８４Ｓ；
ｉｘ）Ｋ９１ＮおよびＤ９３Ｔ；Ｋ９１ＮおよびＤ９３Ｓ；Ｄ９３ＮおよびＧ９５Ｔ；またはＤ９３ＮおよびＧ９５Ｓ；
ｘ）Ｔ９４ＮおよびＶ９６Ｔ；Ｔ９４ＮおよびＶ９６Ｓ；Ｖ９６ＮおよびＬ９８Ｔ；またはＶ９６ＮおよびＬ９８Ｓ；
ｘｉ）Ｓ９７ＮおよびＱ９９Ｔ；またはＳ９７ＮおよびＱ９９Ｓ；および
ｘｉｉ）Ａ１０６ＮおよびＤ１０８ＴまたはＡ１０６ＮおよびＤ１０８Ｓ。
【０１０３】
ある特定の実施形態では、ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である連続アミノ酸配列を含んでよく、連続アミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１中の対応するアミノ酸に対して以下の対の少なくとも１つの置換を有する。
ｉ）Ｄ５ＴおよびＲ２１ＮまたはＤ５ＳおよびＲ２１Ｎ；
ｉｉ）Ｒ１６ＮおよびＨ１８ＴまたはＲ１６ＮおよびＨ１８Ｓ；
ｉｉｉ）Ｓ２３ＮおよびＥ２５ＴまたはＳ２３ＮおよびＥ２５Ｓ；
ｉｖ）Ｓ５０ＮおよびＦ５２Ｔ；Ｓ５０ＮおよびＦ５２Ｓ；Ｆ５２ＮおよびＡ５４Ｔ；またはＦ５２ＮおよびＡ５４Ｓ；
ｖ）Ｑ５１ＮおよびＲ５３Ｔ；Ｑ５１ＮおよびＲ５３Ｓ；Ｒ５３ＮおよびＡ５５Ｔ；またはＲ５３ＮおよびＡ５５Ｓ；
ｖｉ）Ｓ６４ＮおよびＨ６６Ｔ；またはＳ６４ＮおよびＨ６６Ｓ；
ｖｉｉ）Ｋ９１ＮおよびＤ９３Ｔ；Ｋ９１ＮおよびＤ９３Ｓ；Ｄ９３ＮおよびＧ９５Ｔ；またはＤ９３ＮおよびＧ９５Ｓ；
ｖｉｉｉ）Ｔ９４ＮおよびＶ９６Ｔ；Ｔ９４ＮおよびＶ９６Ｓ；Ｖ９６ＮおよびＬ９８Ｔ；またはＶ９６ＮおよびＬ９８Ｓ；
ｉｘ）Ｓ９７ＮおよびＱ９９Ｔ；またはＳ９７ＮおよびＱ９９Ｓ；および
ｘ）Ａ１０６ＮおよびＤ１０８ＴまたはＡ１０６ＮおよびＤ１０８Ｓ；
【０１０４】
置換により、配列ＮＸＳ／Ｔを有する１つ以上のＮ結合グリコシル化コンセンサス部位が生成され、Ｎは、Ａｓｎであり；Ｘは、プロリン以外のアミノ酸であり；後にＳｅｒ（Ｓ）またはＴｈｒ（Ｔ）のいずれかが続き、更に１つ以上のＮ結合グリコシル化コンセンサス部位は、Ｎ−グリカンに結合される。更なる実施形態では、ポリペプチドは、二量体を形成する。更なる実施形態では、ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対してＮ末端側切断および／またはＣ末端側切断を有する。切断は、参照ポリペプチド、例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４以上のアミノ酸としてよい。特定の実施形態では、ポリペプチドは、ＧＤＦ１５中の最初の３つのＮ末端側残基の切断（ΔＡＲＮまたはΔＮ３）を有する。更なる実施形態では、ポリペプチドは、緩衝溶液中で、少なくとも０．５ｍｇ／ｍｌ、例えば、少なくとも１ｍｇ／ｍｌ、少なくとも２ｍｇ／ｍｌ、少なくとも３ｍｇ／ｍｌ、少なくとも４ｍｇ／ｍｌ、少なくとも５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも８ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも２０ｍｇ／ｍｌ、または少なくとも２５ｍｇ／ｍｌの溶解度、例えば、０．５ｍｇ／ｍｌ〜２５ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ〜２５ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌ、３ｍｇ／ｍｌ〜２５ｍｇ／ｍｌ、３ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ〜２５ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌ、または５ｍｇ／ｍｌ〜１８ｍｇ／ｍｌの範囲の溶解度を有する。ある特定の場合では、ポリペプチドは、緩衝溶液中で、少なくとも０．５ｍｇ／ｍｌ、例えば、少なくとも１ｍｇ／ｍｌ、少なくとも２ｍｇ／ｍｌ、少なくとも３ｍｇ／ｍｌ、少なくとも４ｍｇ／ｍｌ、少なくとも５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも８ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも２０ｍｇ／ｍｌ、または少なくとも２５ｍｇ／ｍｌの溶解度、例えば、０．５ｍｇ／ｍｌ〜２５ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ〜２５ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌ、３ｍｇ／ｍｌ〜２５ｍｇ／ｍｌ、３ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ〜２５ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌ、または５ｍｇ／ｍｌ〜１８ｍｇ／ｍｌの範囲の溶解度を有する。緩衝剤は、リン酸緩衝剤、トリス緩衝剤、ＨＥＰＥＳ緩衝剤、ＭＯＰＳ緩衝剤、ＰＩＰＥＳ緩衝剤など、またはこれらの組み合わせとしてよい。ある特定の場合では、緩衝剤は、リン酸緩衝生理食塩水を含んでよい。ある特定の場合では、緩衝剤は、トリス、リン酸カリウムおよび塩化ナトリウムを含んでよい。いくつかの場合では、緩衝剤は、トリス、リン酸カリウム、塩化ナトリウム、およびギ酸を含んでよい。例えば、緩衝剤は、１０ｍＭ〜１００ｍＭトリスｐＨ７、１ｍＭ〜５０ｍＭリン酸カリウム、１００ｍＭ〜２００ｍＭ塩化ナトリウム、および１０ｍＳ／ｃｍ〜３０ｍＳ／ｃｍギ酸を含んでよい。更なる実施形態では、ポリペプチドは、ポリペプチドの投与前と比較して少なくとも１０％、２０％、３０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％血中グルコースレベル、体重、および／または食物摂取を減少させる。
【０１０５】
ある特定の実施形態では、ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である連続アミノ酸配列を含んでよく、連続アミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１中の対応するアミノ酸に対して以下の対の少なくとも１つの置換を有する。
ｉ）Ｄ５ＴおよびＲ２１Ｎ；
ｉｉ）Ｓ２３ＮおよびＥ２５Ｔ；
ｉｉｉ）Ｆ５２ＮおよびＡ５４Ｔ；
ｉｖ）Ｒ５３ＮおよびＡ５５Ｔ；
ｖ）Ｓ６４ＮおよびＨ６６Ｔ；
ｖｉ）Ｋ９１ＮおよびＤ９３Ｔ；
ｖｉｉ）Ｄ９３ＮおよびＧ９５Ｔ；
ｖｉｉｉ）Ｓ９７ＮおよびＱ９９Ｔ；および
ｉｘ）Ａ１０６ＮおよびＤ１０８Ｔ；
【０１０６】
置換により、配列ＮＸＳ／Ｔを有する１つ以上のＮ結合グリコシル化コンセンサス部位が生成され、Ｎは、Ａｓｎであり；Ｘは、プロリン以外のアミノ酸であり；後にＳｅｒ（Ｓ）またはＴｈｒ（Ｔ）のいずれかが続き、更に、１つ以上のＮ結合グリコシル化コンセンサス部位は、Ｎ−グリカンに結合される。更なる実施形態では、ポリペプチドが、二量体を形成する。更なる実施形態では、ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対してＮ末端側切断および／またはＣ末端側切断を有する。切断は、参照ポリペプチド、例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４以上のアミノ酸としてよい。特定の実施形態では、ポリペプチドは、ＧＤＦ１５中の最初の３つのＮ末端側残基の切断（ΔＡＲＮまたはΔＮ３）を有する。更なる実施形態では、ポリペプチドは、緩衝溶液中で、少なくとも０．５ｍｇ／ｍｌ、例えば、少なくとも１ｍｇ／ｍｌ、少なくとも２ｍｇ／ｍｌ、少なくとも３ｍｇ／ｍｌ、少なくとも４ｍｇ／ｍｌ、少なくとも５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも８ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも２０ｍｇ／ｍｌ、または少なくとも２５ｍｇ／ｍｌの溶解度、例えば、０．５ｍｇ／ｍｌ〜２５ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ〜２５ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌ、３ｍｇ／ｍｌ〜２５ｍｇ／ｍｌ、３ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ〜２５ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌ、または５ｍｇ／ｍｌ〜１８ｍｇ／ｍｌの範囲の溶解度を有する。ある特定の場合では、ポリペプチドは、緩衝溶液中で、少なくとも０．５ｍｇ／ｍｌ、例えば、少なくとも１ｍｇ／ｍｌ、少なくとも２ｍｇ／ｍｌ、少なくとも３ｍｇ／ｍｌ、少なくとも４ｍｇ／ｍｌ、少なくとも５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも８ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも２０ｍｇ／ｍｌ、または少なくとも２５ｍｇ／ｍｌの溶解度、例えば、０．５ｍｇ／ｍｌ〜２５ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ〜２５ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌ、３ｍｇ／ｍｌ〜２５ｍｇ／ｍｌ、３ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ〜２５ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌ、または５ｍｇ／ｍｌ〜１８ｍｇ／ｍｌの範囲の溶解度を有する。緩衝剤は、リン酸緩衝剤、トリス緩衝剤、ＨＥＰＥＳ緩衝剤、ＭＯＰＳ緩衝剤、ＰＩＰＥＳ緩衝剤など、またはこれらの組み合わせとしてよい。ある特定の場合では、緩衝剤は、リン酸緩衝生理食塩水を含んでよい。ある特定の場合では、緩衝剤は、トリス、リン酸カリウムおよび塩化ナトリウムを含んでよい。いくつかの場合では、緩衝剤は、トリス、リン酸カリウム、塩化ナトリウム、およびギ酸を含んでよい。例えば、緩衝剤は、１０ｍＭ〜１００ｍＭトリスｐＨ７、１ｍＭ〜５０ｍＭリン酸カリウム、１００ｍＭ〜２００ｍＭ塩化ナトリウム、および１０ｍＳ／ｃｍ〜３０ｍＳ／ｃｍギ酸を含んでよい。更なる実施形態では、ポリペプチドは、ポリペプチドの投与前と比較して少なくとも１０％、２０％、３０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％血中グルコースレベル、体重、および／または食物摂取を減少させる。特定の実施形態では、ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０を含む、または本質的にこれらからなる。特定の実施形態では、ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９７またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１００を含む、または本質的にこれらからなる。ある特定の実施形態では、ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である連続アミノ酸配列を含んでよく、連続アミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１中の対応するアミノ酸に対して以下の対の少なくとも１つの置換を有する。
ｉ）Ｄ５ＴおよびＲ２１Ｎ；
ｉｉ）Ｓ６４ＮおよびＨ６６Ｔ；
ｉｉｉ）Ｋ９１ＮおよびＤ９３Ｔ；
ｉｖ）Ｄ９３ＮおよびＧ９５Ｔ；および
ｖ）Ｓ９７ＮおよびＱ９９Ｔ；置換により、配列ＮＸＳ／Ｔを有する１つ以上のＮ結合グリコシル化コンセンサス部位が生成され、Ｎは、Ａｓｎであり；Ｘは、プロリン以外のアミノ酸であり；後にＳｅｒ（Ｓ）またはＴｈｒ（Ｔ）のいずれかが続き、１つ以上のＮ結合グリコシル化コンセンサス部位は、Ｎ−グリカンに結合される；更に、ポリペプチドは、二量体を形成し；更に、ポリペプチドは、ポリペプチド中に緩衝溶液中で少なくとも１ｍｇ／ｍｌの溶解度を有する。
【０１０７】
更なる実施形態では、ポリペプチドは、緩衝溶液中で少なくとも５ｍｇ／ｍｌの溶解度を有する。緩衝剤は、リン酸緩衝剤、トリス緩衝剤、ＨＥＰＥＳ緩衝剤、ＭＯＰＳ緩衝剤、ＰＩＰＥＳ緩衝剤など、またはこれらの組み合わせとしてよい。ある特定の場合では、緩衝剤は、リン酸緩衝生理食塩水を含んでよい。ある特定の場合では、緩衝剤は、トリス、リン酸カリウムおよび塩化ナトリウムを含んでよい。いくつかの場合では、緩衝剤は、トリス、リン酸カリウム、塩化ナトリウム、およびギ酸を含んでよい。例えば、緩衝剤は、１０ｍＭ〜１００ｍＭトリスｐＨ７、１ｍＭ〜５０ｍＭリン酸カリウム、１００ｍＭ〜２００ｍＭ塩化ナトリウム、および１０ｍＳ／ｃｍ〜３０ｍＳ／ｃｍギ酸を含んでよい。更なる実施形態では、ポリペプチドは、ポリペプチドの投与前と比較して少なくとも１０％、２０％、３０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％血中グルコースレベル、体重、および／または食物摂取を減少させる。更なる実施形態では、ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対してＮ末端側切断および／またはＣ末端側切断を有する。切断は、参照ポリペプチド、例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４以上のアミノ酸としてよい。特定の実施形態では、ポリペプチドは、ＧＤＦ１５中の最初の３つのＮ末端側残基の切断（ΔＡＲＮまたはΔＮ３）を有する。特定の実施形態では、ポリペプチドが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０を含む、または本質的にこれらからなる。特定の実施形態では、ポリペプチドが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９６またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１００を含む、または本質的にこれらからなる。
【０１０８】
ある特定の実施形態では、ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の１１２アミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する１１２個の連続するアミノ酸を含んでよく、この１１２連続アミノ酸は、上に記載の１、２、３、４つ以上の対の置換を含む。
【０１０９】
図１は、野生型成熟ヒトＧＤＦ１５（ＷＴ  ｈＧＤＦ１５；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）のアミノ酸配列と整列させた本開示で企図される例示的なポリペプチド（１〜１７とナンバリングした）のアミノ酸配列を示す。図１に、２つのＮ結合グリコシル化コンセンサス部位（１とナンバリングした突然変異体；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）を含むポリペプチドならびに１つのＮ結合グリコシル化コンセンサス部位（２〜１７とナンバリングした突然変異体；それぞれ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３〜１８）を含むポリペプチドが示されている。
【０１１０】
ある特定の実施形態では、本開示は、修飾ＧＤＦ１５Ｎ−グリコシル化二量体を企図し、前記二量体は、互いに共有結合した本明細書に開示された２つのポリペプチドを含む。特定の実施形態では、２つのポリペプチドそれぞれが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０または５個までのアミノ酸が異なるアミノ酸から選択されるアミノ酸配列を含み；前記ポリペプチドは、Ｎ−グリコシル化されている少なくとも１つのＮ−グリコシル化部位を含有する。特定の実施形態では、２つのポリペプチドそれぞれが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０または２個までのアミノ酸が異なるアミノ酸から選択されるアミノ酸配列を含み；前記ポリペプチドは、Ｎ−グリコシル化されている少なくとも１つのＮ−グリコシル化部位を含有する。特定の実施形態では、２つのポリペプチドそれぞれが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９７またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１００または５個までのアミノ酸が異なるアミノ酸から選択されるアミノ酸配列からなり；前記ポリペプチドは、Ｎ−グリコシル化されている少なくとも１つのＮ−グリコシル化部位を含有する。特定の実施形態では、２つのポリペプチドそれぞれが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９７またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１００または２個までのアミノ酸が異なるアミノ酸から選択されるアミノ酸配列からなり；前記ポリペプチドは、Ｎ−グリコシル化されている少なくとも１つのＮ−グリコシル化部位を含有する。更なる実施形態では、修飾ＧＤＦ１５Ｎ−グリコシル化二量体が、鎖間ジスルフィド結合によって結合されたホモ二量体である。更なる実施形態では、修飾ＧＤＦ１５Ｎ−グリコシル化二量体が、それぞれ同じアミノ酸配列を含む開示された本明細書に開示されたとおりの２つのポリペプチドを有するホモ二量体であり、前記ポリペプチドは、Ｎ−グリコシル化されている少なくとも１つのＮ−グリコシル化部位を含有する。
【０１１１】
本開示は、また、上記ポリペプチドの活性フラグメント（例えば、サブ配列）であるポリペプチドを企図する。活性フラグメントまたはサブ配列の長さは、４０アミノ酸〜１１１アミノ酸、例えば、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８、１０６、１０９、または１１１アミノ酸までとしてよい。
【０１１２】
ポリペプチドは、連続アミノ酸の定義された長さ（例えば、「比較ウィンドウ」）について参照配列と比較して定義された配列同一性を有する。比較のための配列のアラインメントの方法が、当技術分野によく知られている。例えば、Ｓｍｉｔｈ＆Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局地的相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：２４４４（１９８８）の類似性の調査法によって、これらのアルゴリズム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）のコンピュータによる実行によって、または手動アラインメントおよび目視検査によって（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．１９９５  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）を参照）、比較のための配列の最適なアラインメントを実施することができる。
【０１１３】
１つの例として、好適なポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１中の４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５または１１２個のアミノ酸までの連続する範囲と少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％、アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。
【０１１４】
本明細書に開示されたポリペプチドの例示的なフラグメントが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対してアミノ酸の欠失を有するポリペプチドを含む。例えば、ポリペプチドが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対してＮ末端側切断および／またはＣ末端側切断を有してよい。切断は、参照ポリペプチド、例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４以上のアミノ酸としてよい。ある特定の実施形態では、目的のポリペプチドが、Ｎ結合グリコシル化コンセンサス配列、例えば、本明細書に開示されたもの、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対してＮ末端側切断および／またはＣ末端側切断を導入する１つ以上の置換を含んでよい。
【０１１５】
ある特定の実施形態では、ポリペプチドが、少なくとも９８アミノ酸長としてよく、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１中の９８アミノ酸の対応する一続きと少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有してよい。このポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のＣ末端に存在しているアミノ酸は保持しながら、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のＮ末端に存在している最初の３個から最初の１４個のアミノ酸（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４アミノ酸）を欠いていてよい。換言すれば、欠失したアミノ酸（複数可）は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のＮ末端アミノ酸に対応する。
【０１１６】
ある特定の実施形態では、ＧＤＦ１５突然変異タンパク質が、少なくとも１０６アミノ酸長としてよく、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１中の１０６アミノ酸の対応する一続きと少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有してよい。ＧＤＦ１５突然変異タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のＮ末端に存在している最初の６個のアミノ酸を欠いていてよい。
【０１１７】
ある特定の実施形態では、ポリペプチドが、少なくとも１０９アミノ酸長としてよく、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１中の１０９アミノ酸の対応する一続きと少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有してよい。ＧＤＦ１５突然変異タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のＮ末端に存在している最初の３個のアミノ酸を欠いていてよい。
【０１１８】
本開示の例示的なポリペプチドが、図２に示されている。図１に示された例示的なポリペプチド（１〜１７とナンバリングした）は、ＷＴ  ｈＧＤＦ１５と同じ長さである。図２に示された例示的なポリペプチド（１８〜３４とナンバリングした；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９〜３５）は、ＷＴ  ｈＧＤＦ１５に対して３つのＮ末端側アミノ酸の欠失（ΔＮ３）を含むため長さ１０９のアミノ酸である。しかし、アミノ酸置換の位置を指す場合、示された残基番号は、ＷＴ成熟ｈＧＤＦ１５（ＷＴ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）の位置に対応するものである。したがって、ポリペプチドのＮ末端のアミノ酸Ｇは、ポリペプチドアミノ酸配列中の第１のアミノ酸であるが、残基４と称される。
【０１１９】
上述のとおり、これらのポリペプチドフラグメントは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の配列に対してＮ−グリコシル化コンセンサス配列、例えば、１つ、２つ、またはそれ以上の本明細書に開示されたアミノ酸置換を導入する１つ以上のアミノ酸置換を含んでよい。
【０１２０】
上に示したとおり、および以下に更に詳細に記載したとおり、本開示のポリペプチドは、例えば、ペグ化（ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、またはこれらの誘導体の１つ以上の分子の共有結合）；グリコシル化（例えば、Ｎ−グリコシル化）；ポリシアル化；血清アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、カニクイザル血清アルブミン、またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））を含むアルブミン融合分子；例えば、コンジュゲート脂肪酸鎖（アシル化）によるアルブミン結合；Ｆｃ融合；およびＰＥＧミメティックとの融合によって修飾してよい。ある特定の実施形態では、修飾は、部位特異的な方法で導入される。他の実施形態では、修飾は、リンカーを含む。リンカーは、修飾部分をポリペプチドにコンジュゲートしてよい。
【０１２１】
特定の実施形態では、本開示は、アルブミンとのコンジュゲートによる成熟ヒトＧＤＦ１５およびＧＤＦ１５突然変異タンパク質（例えば、上記ポリペプチド）の修飾を企図する。他の実施形態では、本開示は、Ｎ−グリコシル化またはＯ−グリコシル化によるポリペプチドの修飾を企図する。アルブミンおよびこれらのポリペプチドコンジュゲート（例えば、融合タンパク質）、およびグリコシル化ポリペプチドの特性が、更に以下に記載されている。
【０１２２】
ＧＤＦ１５機能を修飾するおよび／または模倣するための特定の修飾
ポリペプチドは、治療法のために製剤化されたタンパク質に好適な特性（例えば、血清半減期）を向上させる修飾、検出アッセイに用いられる抗体（例えば、エピトープタグ）の生成を可能にする修飾、タンパク質精製を容易にする修飾等の１つ以上の修飾を含むことができる。かかる修飾としては、ペグ化（ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、またはこれらの誘導体の１つ以上の分子の共有結合）；グリコシル化（Ｎ−およびＯ−結合）；ポリシアル化；アルブミン融合；コンジュゲート脂肪酸鎖（アシル化）によるアルブミン結合；Ｆｃ融合タンパク質；およびＰＥＧミメティックとの融合が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２３】
本明細書に記載したとおり、本開示は、成熟ＧＤＦ１５ポリペプチド（例えば、成熟ヒトＧＤＦ１５）またはＧＤＦ１５突然変異タンパク質ポリペプチド（例えば、成熟ヒトＧＤＦ１５の突然変異タンパク質）を含む融合分子を企図し、成熟ＧＤＦ１５ポリペプチドまたはＧＤＦ１５突然変異タンパク質ポリペプチドは、そのアミノ酸配列を変化させない少なくとも１つの修飾を含み、当該修飾は、ポリペプチドまたは突然変異タンパク質ポリペプチドの少なくとも１つの物理的特性を改善する。１つの実施形態では、ＧＤＦ１５ポリペプチドまたはＧＤＦ１５突然変異タンパク質ポリペプチド修飾は、血清アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、カニクイザル血清アルブミン、またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））とのコンジュゲートを含む。いくつかの実施形態では、物理的特性は、溶解度である。
【０１２４】
融合分子が修飾ＧＤＦ１５ポリペプチドまたはＧＤＦ１５突然変異タンパク質（例えば、上に開示したポリペプチド）を含む実施形態では、いずれかがアルブミンにコンジュゲートされ、融合分子の溶解度が、一般に非コンジュゲート組換えヒトＧＤＦ１５と比較して改善される。ある特定の実施形態では、融合分子は、ｐＨ７．０のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で少なくとも１ｍｇ／ｍＬの溶解度を有する。他の実施形態では、融合分子は、少なくとも２ｍｇ／ｍＬ、少なくとも３ｍｇ／ｍＬ、少なくとも４ｍｇ／ｍＬ、または少なくとも５ｍｇ／ｍＬの溶解度を有する。他の実施形態では、融合分子は、ｐＨ７．０のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で、少なくとも６ｍｇ／ｍＬ、少なくとも７ｍｇ／ｍＬ、少なくとも８ｍｇ／ｍＬ、少なくとも９ｍｇ／ｍＬ、または少なくとも１０ｍｇ／ｍＬの溶解度を有する。特定の実施形態では、融合分子は、１０ｍｇ／ｍＬ超の溶解度を有する。
【０１２５】
ペグ化：タンパク質治療薬の臨床的効果が、短い血漿半減期およびプロテアーゼ分解への感受性によって制限されることが多い。さまざまな治療用タンパク質（例えば、フィルグラスチム）の試験では、かかる困難が、ポリペプチド配列をさまざまな非タンパク質ポリマーのいずれか、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレンにコンジュゲートまたは結合させること（例えば、典型的には、タンパク質および非タンパク質ポリマー、例えば、ＰＥＧの両方に共有結合した結合部分を介することを参照）を含むさまざまな修飾によって克服される可能性があることを示した。かかるＰＥＧコンジュゲート生体分子が、物理的および熱安定度の良さ、酵素的分解への感受性に対する保護、溶解度の増大、ｉｎ  ｖｉｖｏ循環半減期の延長およびクリアランスの低下、免疫原性および抗原性の減少、および毒性の低下を含む臨床的に有用な特性を保持することを示している。
【０１２６】
ポリペプチド配列へのコンジュゲートに好適なＰＥＧは、一般に室温で水中で溶解し、一般式Ｒ（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｎＯ−Ｒを有し、Ｒは、水素または保護基、例えば、アルキルまたはアルカノール基であり、ｎは、１〜１０００の整数である。Ｒが保護基である場合、一般に１〜８個の炭素を有する。ポリペプチド配列にコンジュゲートされたＰＥＧは、直鎖または分枝鎖とすることができる。分枝鎖ＰＥＧ誘導体、「ｓｔａｒ−ＰＥＧ」およびマルチアーム型ＰＥＧが、本開示によって企図される。本開示で用いられるＰＥＧの分子量は、特定の範囲に制限されるものではないが、ある特定の実施形態では、分子量が５００〜２０，０００であり、他の実施形態では、分子量は、４，０００〜１０，０００である。
【０１２７】
本開示は、また、ＰＥＧが、異なるｎ値を有し、このため、さまざまな異なるＰＥＧが、特定の割合で存在しているコンジュゲート組成物を企図する。例えば、いくつかの組成物が、ｎ＝１、２、３および４のコンジュゲート混合物を含む。いくつかの組成物では、ｎ＝１の場合、コンジュゲートのパーセンテージは１８〜２５％であり、ｎ＝２の場合、コンジュゲートのパーセンテージは５０〜６６％であり、ｎ＝３の場合、コンジュゲートのパーセンテージは１２〜１６％であり、ｎ＝４の場合、コンジュゲートのパーセンテージは５％までである。当技術分野で知られる反応条件および精製方法によってかかる組成物を生成することができる。例えば、コンジュゲートを分離するのに陽イオン交換クロマトグラフィーを用いてよく、そうすると、フラクションが、例えば、所望の数の結合されるＰＥＧを有する、精製されて非修飾タンパク質配列および他の数の結合されるＰＥＧを有するコンジュゲートのないコンジュゲートを含有することが確認される。
【０１２８】
末端反応基を介して、ＰＥＧを本開示のポリペプチドに結合させてよい。末端反応基が、１つ以上のポリペプチド配列およびポリエチレングリコールの遊離アミノまたはカルボキシル基間の結合を媒介してよい。末端反応基を別個の長さのポリエチレングリコールスペーサーに結合させてよい。これらのＰＥＧスペーサーは、非ＰＥＧスペーサーと比較して試薬およびコンジュゲート溶解度を増大させ、毒性作用および免疫学的作用を最小化し、ＰＥＧおよびポリペプチド間の特定の距離を適応させるためのいくつかのオプションをもたらす。反応基との例示的なＰＥＧスペーサーとしては、アミン−反応ペグ化架橋剤（例えば、ビス（スクシンイミジル）ペンタ（エチレングリコール）（ＢＳ（ＰＥＧ）５））；スルフヒドリル−反応ペグ化架橋剤（１，１１−ビスマレイミドトリエチレングリコール（ＢＭ（ＰＥＧ）３））；二官能性ペグ化架橋剤（ＮＨＳ−ＰＥＧｎ−マレイミドスクシンイミジル−（［Ｎ−マレイミドプロピオンアミド］−エチレングリコール）エステル（ＳＭ（ＰＥＧ）ｎ）；ｎ＝２〜２４）が挙げられる。ＰＥＧスペーサーを遊離アミノ基に結合させてよい。ＰＥＧスペーサーは、Ｎ−ヒドロキシスクシニルイミドでポリエチレングリコールのコハク酸エステルを活性化することによって調製してよいＮ−ヒドロキシスクシニルイミドポリエチレングリコールを含む。遊離アミノ基に結合させてよいもう１つの活性化ポリエチレングリコールが、塩化シアヌルとポリエチレングリコールモノメチルエーテルを反応させることによって調製してよい２，４−ビス（Ｏ−メトキシポリエチレングリコール）−６−クロロ−ｓ−トリアジンである。遊離カルボキシル基に結合される活性化ポリエチレングリコールが、ポリオキシエチレンジアミンを含む。
【０１２９】
さまざまな従来の方法によって、１つ以上の本開示のポリペプチド配列のスペーサーを有するＰＥＧへのコンジュゲートを実施してよい。例えば、ｐＨ５〜１０の溶液中で、４℃〜室温の温度で、３０分間〜２０時間、試薬とタンパク質とのモル比４：１〜３０：１を用いてコンジュゲート反応を実施することができる。主として所望の程度の置換を生じるように反応を向けるために反応条件を選択してよい。一般に、低温度、低ｐＨ（例えば、ｐＨ＝５）、および短い反応時間では、結合されるＰＥＧの数を減少させる傾向があるが、高温度、中性〜高ｐＨ（例えば、ｐＨ≧７）、および長い反応時間では、結合されるＰＥＧの数を増大させる傾向がある。反応を終了させるために当技術分野で知られるさまざまな手段を用いてよい。いくつかの実施形態では、反応混合物を酸性化し、例えば、−２０℃で凍結することによって反応を終了させる。
【０１３０】
本開示は、また、ＰＥＧミメティックの使用を企図する。いくつかの追加の有利な特性を与えながら、ＰＥＧの特質（例えば、血清半減期の向上）を保持する組換えＰＥＧミメティックが開発された。例えば、目的のペプチドまたはタンパク質薬剤にあらかじめ融合されたＰＥＧとほぼ同じ伸長配座を形成することができる単純ポリペプチド鎖（例えば、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、ＳｅｒおよびＴｈｒを含む）を組換えで生成することができる（例えば、ＡｍｕｎｉｘのＸＴＥＮ技術；Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）。これは、製造工程中の追加のコンジュゲートステップを不要にする。更に、分子生物学技術の確立により、ポリペプチド鎖の側鎖組成の制御が可能になり、免疫原性および製造特性が最適化される。
【０１３１】
グリコシル化：本開示の目的のため、「グリコシル化」は、グリカンをタンパク質、脂質または他の有機分子に結合させる酵素的プロセスを広く指すことを意味する。本開示と関連して「グリコシル化」という用語の使用は、一般に１つ以上の糖質部分を（基礎をなすグリコシル化部位を除去することによって、または化学的および／または酵素的手段によりグリコシル化をなくすことによって）付加または欠失すること、および／または未変性配列に存在してよい、または存在しなくてよい１つ以上のグリコシル化部位を付加することを意味することを意図する。また、当該語句は、存在しているさまざまな糖質部分の性質および割合の変化に関係する未変性タンパク質のグリコシル化の質的変化を含む。
【０１３２】
グリコシル化は、劇的にタンパク質の物理的特性に影響を及ぼすことができ、また、タンパク質安定度、分泌、および細胞下局在化に重要である可能性がある。確かに、本明細書に記載されたＧＤＦ１５突然変異タンパク質ポリペプチドのグリコシル化は、その物理的特性に有益な改善をもたらす。例えば、これらに限定されないが、グリコシル化によってＧＤＦ１５突然変異タンパク質の溶解度を改善させることができ、かかる改善が、重要である可能性がある（実施例を参照）。本明細書に記載されたグリコシル化ＧＤＦ１５突然変異タンパク質ポリペプチドは、グリコシル化されていない野生型ＧＤＦ１５と比較して高い溶解度を有する。ある特定の実施形態では、本明細書に開示されたグリコシル化ＧＤＦ１５突然変異タンパク質は、緩衝溶液中で、少なくとも０．５ｍｇ／ｍｌ、例えば、少なくとも１ｍｇ／ｍｌ、少なくとも２ｍｇ／ｍｌ、少なくとも３ｍｇ／ｍｌ、少なくとも４ｍｇ／ｍｌ、少なくとも５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも８ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも２０ｍｇ／ｍｌ、または少なくとも２５ｍｇ／ｍｌの溶解度、例えば、０．５ｍｇ／ｍｌ〜２５ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ〜２５ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌ、３ｍｇ／ｍｌ〜２５ｍｇ／ｍｌ、３ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ〜２５ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌ、または５ｍｇ／ｍｌ〜１８ｍｇ／ｍｌの範囲の溶解度を有する。ある特定の場合では、本明細書に開示されたグリコシル化ＧＤＦ１５突然変異タンパク質は、緩衝溶液中で、少なくとも０．５ｍｇ／ｍｌ、例えば、少なくとも１ｍｇ／ｍｌ、少なくとも２ｍｇ／ｍｌ、少なくとも３ｍｇ／ｍｌ、少なくとも４ｍｇ／ｍｌ、少なくとも５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも８ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも２０ｍｇ／ｍｌ、または少なくとも２５ｍｇ／ｍｌの溶解度、例えば、０．５ｍｇ／ｍｌ〜２５ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ〜２５ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌ、３ｍｇ／ｍｌ〜２５ｍｇ／ｍｌ、３ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ〜２５ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌ、または５ｍｇ／ｍｌ〜１８ｍｇ／ｍｌの範囲の溶解度を有してよい。緩衝剤は、リン酸緩衝剤、トリス緩衝剤、ＨＥＰＥＳ緩衝剤、ＭＯＰＳ緩衝剤、ＰＩＰＥＳ緩衝剤など、またはこれらの組み合わせとしてよい。ある特定の場合では、緩衝剤は、リン酸緩衝生理食塩水を含んでよい。ある特定の場合では、緩衝剤は、トリス、リン酸カリウムおよび塩化ナトリウムを含んでよい。いくつかの場合では、緩衝剤は、トリス、リン酸カリウム、塩化ナトリウム、およびギ酸を含んでよい。例えば、緩衝剤は、１０ｍＭ−１００ｍＭトリスｐＨ７、１ｍＭ−５０ｍＭリン酸カリウム、１００ｍＭ−２００ｍＭ塩化ナトリウム、および１０ｍＳ／ｃｍ−３０ｍＳ／ｃｍギ酸を含んでよい。
【０１３３】
本明細書に開示されたグリコシル化ＧＤＦ１５突然変異タンパク質ポリペプチドは、野生型成熟ＧＤＦ１５ポリペプチドより優れている。これらのグリコシル化ＧＤＦ１５突然変異タンパク質ポリペプチドは、野生型成熟ＧＤＦ１５ポリペプチドと比較して、これらに限定されないが以下の１つ以上を含む改善した特性を有する：細胞培養中の収率が大きい、二量体形成の改善、溶解度が大きい、および免疫原性の低下。かかる修飾ＧＤＦ１５突然変異タンパク質によって示される溶解度の改善により、例えば、非グリコシル化ＧＤＦ１５／ＧＤＦ１５突然変異タンパク質より医薬投与に好適な製剤を生成することができる。グリコシル化ＧＤＦ１５／ＧＤＦ１５突然変異タンパク質ポリペプチドは、また、安定度の向上を示す可能性がある。更に、ポリペプチドは、１つ以上の薬物動態学的特性、例えば、半減期を改善する可能性がある。
【０１３４】
上記のとおり、アミノ酸配列を変化させることによって、グリコシル化部位の付加を実施することができる。例えば、１つ以上のセリンもしくはトレオニン残基（Ｏ−結合グリコシル化部位の）またはアスパラギン残基（Ｎ結合グリコシル化部位の）による付加または置換によってポリペプチドを変化させてよい。Ｎ結合およびＯ−結合オリゴ糖ならびに糖残基のそれぞれの型にみられる構造は、異なる可能性がある。通常、両者に通常みられる糖の１つの型が、Ｎ−アセチルノイラミン酸（以下、シアル酸と称する）である。シアル酸は、通常、Ｎ結合およびＯ−結合オリゴ糖の両者の末端側残基であり、その陰電荷によって、糖タンパク質に酸性特性が与えられる可能性がある。本開示の特定の実施形態では、上記のとおり、Ｎ−グリコシル化変異体の生成および使用を含む。
【０１３５】
ポリペプチドの糖質部分の数を増大するもう１つの手段が、グリコシドのポリペプチドへの化学的または酵素的カップリングである。
【０１３６】
ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）欠損チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞が、組換え糖タンパク質の生成のために一般に用いられる宿主細胞である。これらの細胞は、酵素β−ガラクトシドα−２，６−シアリルトランスフェラーゼを発現せず、このため、これらの細胞中に生成される糖タンパク質のＮ結合オリゴ糖へのα−２，６結合中のシアル酸を添加しない。
【０１３７】
ポリシアル化：本開示は、また、ペプチドおよびタンパク質の安定度およびｉｎ  ｖｉｖｏ薬物動態を改善するために、ポリシアル化の使用、天然生分解性α−（２→８）結合ポリシアル酸（「ＰＳＡ」）へのペプチドおよびタンパク質のコンジュゲートを企図する。ＰＳＡは、親水性が高い生分解性の非毒性天然ポリマーであり、その血清半減期を増大させる血中の高い見かけの分子量を与える。また、さまざまなペプチドおよびタンパク質治療薬のポリシアル化により、明らかに、プロテオリシスの低下、ｉｎ  ｖｉｖｏ活性の保持、ならびに免疫原性および抗原性の減少となっている（例えば、Ｇ．Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  ３００（１−２）：１２５−３０を参照）。他のコンジュゲート（例えば、ＰＥＧ）による修飾と同様に、部位特異的なポリシアル化のさまざまな技術が利用可能である（例えば、ＴＬｉｎｄｈｏｕｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ１０８（１８）７３９７−７４０２（２０１１）を参照）。
【０１３８】
融合タンパク質。本開示は、野生型成熟ＧＤＦ１５（例えば、ヒトＧＤＦ１５）の融合タンパク質、ならびに本開示のポリペプチドの融合タンパク質（例えば、修飾ヒトＧＤＦ１５分子、ヒトＧＤＦ１５の突然変異タンパク質、修飾ＧＤＦ１５突然変異タンパク質など）を企図する。かかる融合タンパク質は、一般に非ＧＤＦ１５ポリペプチド（例えば、アルブミン（例えば、ＨＳＡ）またはこれらのフラグメント：アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）；Ｆｃポリペプチド；マルトース結合ドメイン（ＭＢＤ）からなり、本開示の野生型ＧＤＦ１５ポリペプチドまたはポリペプチドにそのＮ末端またはＣ末端でコンジュゲートされる「融合パートナー」と本明細書で称してよい。任意で、融合パートナーは、リンカーポリペプチドを介して野生型ＧＤＦ１５またはポリペプチドにコンジュゲートしてよい。リンカーポリペプチドは、任意で開裂可能リンカー、例えば、酵素的開裂可能リンカーとしてよい。融合パートナーの例が、以下に記載されている。
【０１３９】
アルブミン融合：コンジュゲートの好適な融合パートナーとしては、アルブミン、例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、カニクイザル血清アルブミン、およびウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）が挙げられる。
【０１４０】
成熟ＨＳＡ、５８５アミノ酸ポリペプチド（約６７ｋＤａ）は、血清半減期が約２０日であり、主にコロイド浸透血圧、血中ｐＨの維持ならびに多くの内因性および外因性リガンドの輸送および分配を担う。タンパク質は、３つの構造的に相同なドメイン（ドメインＩ、ＩＩおよびＩＩＩ）を有し、ほとんど全体が、α−ヘリックス配座にあり、１７ジスルフィド架橋によって極めて安定化されている。アルブミンの３つの一次薬剤結合領域が、サブドメインＩＢ、ＩＩＡおよびＩＩＩＡ内の３つのドメインそれぞれの上に位置している。
【０１４１】
アルブミン合成は、肝臓中で行われ、短命の一次生成物プレプロアルブミンを生成する。したがって、完全長ＨＳＡは、１８アミノ酸に６アミノ酸のプロドメインが続くシグナルペプチドを有する；この２４アミノ酸残基ペプチドは、プレプロドメインと称してよい。ＨＳＡを、その内因性シグナルペプチドをプレプロドメインとして用いて発現および分泌することができる。代わりに、成熟ＨＳＡに融合されたＩｇＫシグナルペプチドを用いて、ＨＳＡを発現および分泌することができる。プレプロアルブミンは、そのアミノ末端の小胞体内腔中で、急速に翻訳と共役して切断され、安定した６０９アミノ酸前駆体ポリペプチド、プロアルブミンを生成する。プロアルブミンは、その後、ゴルジ体に進み、フューリン依存性アミノ末端側開裂によって５８５アミノ酸成熟アルブミンに変換される。別途特に指示がない限り、「アルブミン」または「成熟アルブミン」は、ＨＳＡを指す。
【０１４２】
アルブミンの一次アミノ酸配列、構造、および機能は、アルブミン合成および分泌のプロセスと同様に、種を越えて高度に保存される。ＨＳＡと同等のアルブミン血清タンパク質が、例えば、カニクイザル、ウシ、イヌ、ウサギおよびラットにみられる。非ヒト種、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）のものが、ＨＳＡと最も構造的にほぼ同じである。［例えば、Ｋｏｓａ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＰｈａｒｍＳｃｉ．９６（１１）：３１１７−２４（Ｎｏｖ２００７）を参照］。本開示は、例えば、ＧＤＦ１５ポリペプチドへの融合で、限定されないが、上に記載のものを含む非ヒト種からのアルブミンの使用を企図する。ある特定の実施形態では、非ヒト種はウシである。他の実施形態では、非ヒト種はカニクイザルである。
【０１４３】
本開示に従って、カルボキシル末端、アミノ末端、カルボキシルおよびアミノ末端の両者に、または内部に、アルブミンを薬剤分子（例えば、本明細書に記載されたポリペプチド）にコンジュゲートしてよい（例えば、米国特許第５，８７６，９６９号および米国特許第７，０５６，７０１号を参照）。更に、本開示は、複数の同種（例えば、複数のＧＤＦ１５突然変異タンパク質分子）または異種（例えば、ＧＤＦ１５突然変異タンパク質分子および別々の抗糖尿病の薬剤）薬剤分子を含むアルブミン融合タンパク質を企図する。
【０１４４】
本開示によって企図されるＨＳＡ−ポリペプチドコンジュゲートでは、さまざまな形態のアルブミン、例えば、ＨＳＡ変異体、例えば、フラグメントを用いてよい。かかる形態は、一般に１つ以上の所望のアルブミン活性を保持する。追加の実施形態では、本開示が、アルブミン、アルブミンフラグメント、およびアルブミン変異体などに直接または間接に融合されるポリペプチド薬剤分子を含む融合タンパク質を含み、融合タンパク質が、非融合薬剤分子より高い血漿安定度を有する、および／または融合タンパク質が、非融合薬剤分子の治療用活性を保持する。いくつかの実施形態では、間接融合が、リンカー、例えば、ペプチドリンカーまたはこれらの修飾型によって行われる。
【０１４５】
融合タンパク質を生成するためにリンカーを介して本明細書に記載されたポリペプチドにＨＳＡをコンジュゲートしてよい。好適なリンカーの例が、本明細書に記載されている。いくつかの実施形態では、例えば、４〜３０個のアミノ酸のペプチドリンカーを企図する。
【０１４６】
融合タンパク質がリンカーを含む実施形態では、リンカーは、非開裂可能リンカーとしてよい。例えば、１つの実施形態では、本開示が、ＨＳＡ前駆体アミノ酸配列または成熟ＨＳＡが、非開裂可能（Ｇ４Ｓ）３リンカーを介して成熟ヒトＧＤＦ１５またはＧＤＦ１５突然変異タンパク質アミノ酸配列のＮ末端に融合されている融合分子を記載している。
【０１４７】
融合タンパク質がリンカーを含む他の実施形態では、リンカーは、開裂可能リンカーとしてよい。例えば、本開示は、ＨＳＡ前駆体アミノ酸配列または成熟ＨＳＡアミノ酸配列が、プロテアーゼ−感受性（Ｇ４Ｓ）２因子Ｘａ−開裂可能リンカーを介して、本明細書に提供されるとおりの成熟ヒトＧＤＦ１５またはＧＤＦ１５突然変異タンパク質アミノ酸配列のＮ末端に融合されている融合分子を企図する。
【０１４８】
例えば、ＧＤＦ１５／ＧＤＦ１５突然変異タンパク質の溶解度およびｉｎ  ｖｉｖｏ有効性の測定の評価を容易にするために、ＨＳＡ−開裂可能リンカー−成熟組換えＧＤＦ１５／ＧＤＦ１５突然変異タンパク質分子の構成、ならびに成熟組換えＧＤＦ１５／ＧＤＦ１５突然変異タンパク質−開裂可能リンカー−ＨＳＡ融合分子の構成を用いてよい。かかる実施形態では、細胞内開裂またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ酵素的開裂によって、ＨＳＡシャペロンからＧＤＦ１５／ＧＤＦ１５突然変異タンパク質を切除してよい。いくつかの実施形態では、任意の生プロテアーゼを用いて、開裂可能リンカーのタンパク質消化によって、除去が行われる。他の実施形態では、また、本明細書に提供されるポリペプチドに融合されたシグナルペプチドの構成によって、非ＨＳＡ融合物としてＧＤＦ１５突然変異タンパク質を生成することができる。
【０１４９】
酵素的に、例えば、フューリンまたはカスパーゼによって細胞内開裂を実施してよい。融合タンパク質を発現する宿主細胞が、細胞内で融合分子の一部を切断することができる低レベルのこれらの内因性酵素を発現する可能性がある；したがって、いくつかのポリペプチドが、ＨＳＡにコンジュゲートされることなく細胞から分泌される一方、いくつかのポリペプチドが、ＨＳＡを含む融合分子の形態で、分泌される。本開示の実施形態では、さまざまなフューリン融合コンストラクトの使用を企図する。例えば、配列
0006704358.tif 000005
を含むコンストラクトを設計してよい。かかるコンストラクトは、以下の一般構造：Ｉｇｋ−ＨＳＡ−（Ｇ４Ｓ）２−フューリン配列−ｈＧＤＦ１５を有することができる。
【０１５０】
本開示は、また、細胞外開裂（すなわち、ｅｘ−ｖｉｖｏ開裂）を企図し、これにより、融合分子が、細胞から分泌され、精製に供され、その後、（例えば、因子Ｘａタンパク質分解感受性リンカーまたはエンテロキナーゼを用いて）切断される。除去により、ポリペプチド（例えば、成熟ＧＤＦ１５またはＧＤＦ１５突然変異タンパク質）からＨＳＡ−リンカー複合体全体を分離する可能性がある、またはＨＳＡ−リンカー複合体全体未満を分離する可能性があると理解される。
【０１５１】
上記のとおり、例えば、遺伝子操作によって、アルブミンの１つ以上の本開示のポリペプチドへの融合を実現することができる、この結果、ＨＳＡ、またはこれらのフラグメントをコードするＤＮＡが、１つ以上のポリペプチド配列をコードするＤＮＡに結合される。その後、融合ポリペプチドを発現するように、例えば、好適なプラスミドの形態で、融合されたヌクレオチド配列により、好適な宿主を形質転換またはトランスフェクトすることができる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、例えば、原核細胞または真核細胞から、またはｉｎ  ｖｉｖｏで、例えば、トランスジェニック生物から発現させてよい。本開示のいくつかの実施形態では、融合タンパク質の発現が、哺乳動物細胞株、例えば、ＣＨＯ細胞株中で実施される。形質転換は、その環境から細胞膜（複数可）を介して吸収される外因性遺伝的物質（外因性ＤＮＡ）の直接取込み、組込みおよび発現から生じる細胞の遺伝的変化を指すように本明細書に広く用いられる。形質転換は、細菌のいくつかの種で自然に生じるが、また、他の細胞中の人工的手段によって影響を受ける可能性がある。
【０１５２】
更に、アルブミンそれ自体を、その循環半減期を延長するように修飾してよい。上記遺伝的操作／組換え技術によって、または化学的コンジュゲートによって修飾アルブミンを本開示の１つ以上のポリペプチドに融合させることができる；得られた融合分子は、非修飾アルブミンによる融合より半減期が延長する。（例えば、ＷＯ２０１１／０５１４８９を参照）。
【０１５３】
確立した技術プラットホームが、ポリペプチド（例えば、本明細書に記載されたポリペプチド）および組換えアルブミンの遺伝的融合および化学的コンジュゲートのために存在している。例えば、１つ以上の組換えアルブミン分子を１つ以上のポリペプチドに遺伝的に融合させるために、ＡＬＢＵＦＵＳＥ（登録商標）フレックスプラットホーム（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａ  Ａ／Ｓ；Ｄｅｎｍａｒｋ）を用いることができる、これにより、単一の均質なタンパク質を生成するポリペプチド（複数可）およびアルブミン（複数可）をコードする連続ｃＤＮＡが生成される。例えば、酵母および哺乳動物宿主発現系によりプラットホームを用いることができる。更なる例では、更にアルブミンを誘導体化することなく、本開示のポリペプチドを組換えアルブミンに化学的コンジュゲートさせるように、ＲＥＣＯＭＢＵＭＩＮ（登録商標）フレックスプラットホーム（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａ  Ａ／Ｓ；Ｄｅｎｍａｒｋ）を用いることができる。いくつかのアミノ酸残基（例えば、リジンおよびチロシン）でコンジュゲートを実施してよいが、Ｃｙｓ３４の遊離チオールが、より均質の最終生成物を生成する部位特異性による通常の戦略である。
【０１５４】
別のアルブミン結合戦略：コンジュゲート脂肪酸鎖（アシル化）を介したアルブミン結合を含む直接融合の代替案として、いくつかのアルブミン結合戦略が開発された。血清アルブミンが、脂肪酸の輸送タンパク質であるため、低分子タンパク質治療薬の半減期延長のために、アルブミン結合活性を有するこれらの天然リガンドが、用いられている。例えば、糖尿病用に承認された製品であるインスリンデテミル（ＬＥＶＥＭＩＲ）は、遺伝子修飾インスリンにコンジュゲートされたミリスチル鎖を含み、長時間作用インスリン類似体が得られる。
【０１５５】
本開示は、また、アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）ポリペプチド配列および１つ以上の本明細書に記載されたポリペプチドの配列を含む融合タンパク質を企図する。本明細書または文献に記載されたいずれのＡＢＤポリペプチド配列も、融合タンパク質の成分とすることができる。融合タンパク質の成分は、任意でリンカー、例えば、本明細書に記載されたリンカーを介して共有結合させることができる。本開示のいくつかの実施形態では、融合タンパク質は、Ｎ末端側部分としてＡＢＤポリペプチド配列およびＣ末端側部分として本明細書に記載されたポリペプチドを含む。
【０１５６】
本開示は、また、アルブミン結合ポリペプチドのフラグメントであって、実質的にアルブミン結合を保持するフラグメント；またはアルブミン結合ポリペプチドまたはこれらのフラグメントのマルチマーであって、モノマー単位として少なくとも２つのアルブミン結合ポリペプチドまたはこれらのフラグメントを含むマルチマーを含む、融合タンパク質を企図する。
【０１５７】
理論に束縛されるものでないが、本明細書に記載されたポリペプチドが、ＡＢＤポリペプチド配列に結合し、これにより、対象中のポリペプチドを封鎖し、対象中の作用の持続時間が増加すると考えられる。
【０１５８】
ＡＢＤおよび関連技術の一般的考察には、ＷＯ２０１２／０５０９２３、ＷＯ２０１２／０５０９３０、ＷＯ２０１２／００４３８４およびＷＯ２００９／０１６０４３を参照。
【０１５９】
マルトース結合タンパク質またはこれらのフラグメントを有する融合タンパク質：本開示は、また、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、またはこれらのフラグメント、および１つ以上の本明細書に記載されたポリペプチドのアミノ酸配列を含む融合タンパク質を企図する。いくつかの実施形態では、ＭＢＰフラグメントが、マルトース結合ドメイン（ＭＢＤ）を含む。いずれのＭＢＰ、もしくはこれらのフラグメント、または本明細書に記載されたＭＢＤポリペプチド配列または当技術分野で知られるＭＢＤポリペプチド配列も、本開示の融合タンパク質の成分とすることができる。融合タンパク質の成分は、任意でリンカー、例えば、本明細書に記載されたリンカーを介して共有結合させることができる。本開示のいくつかの実施形態では、融合タンパク質は、ＭＢＰ、もしくはこれらのフラグメント、またはＮ末端側部分としてＭＢＤポリペプチド配列およびＣ末端側部分として本明細書に記載されたポリペプチドを含む。
【０１６０】
本開示は、また、ＭＢＰまたはＭＢＤポリペプチドのフラグメントであって、実質的にマルトース結合活性を保持するフラグメント；マルトース結合ポリペプチド、またはこれらのフラグメントのマルチマー（例えば、ＭＢＤのマルチマー）であって、モノマー単位として少なくとも２つのマルトース結合ポリペプチド、またはこれらのフラグメント（例えば、２つ以上のＭＢＤポリペプチド）を含むマルチマーを含む、融合タンパク質を企図する。
【０１６１】
ＭＢＰおよびＭＢＤならびに関連技術の一般的考察には、例えば、Ｋａｐｕｓｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ８（８）：１６６８−７４を参照。
【０１６２】
Ｆｃ融合タンパク質：本開示は、また、Ｆｃポリペプチドまたはこれらのフラグメント、および１つ以上の本明細書に記載されたポリペプチド（例えば、ヒトＧＤＦ１５分子、修飾ヒトＧＤＦ１５分子、ＧＤＦ１５突然変異タンパク質、および修飾ＧＤＦ１５突然変異タンパク質）のアミノ酸配列を含む融合タンパク質を企図する。本明細書に記載されたいずれのＦｃポリペプチド配列または当技術分野で知られるＦｃポリペプチド配列も、本開示の融合タンパク質成分とすることができる。融合タンパク質の成分は、任意でリンカー、例えば、本明細書に記載されたリンカーを介して共有結合させることができる。本開示のいくつかの実施形態では、融合タンパク質は、Ｎ末端側部分としてＦｃポリペプチド配列およびＣ末端側部分として本明細書に記載されたポリペプチドを含む。
【０１６３】
本開示は、また、Ｆｃポリペプチド融合パートナーが、荷電Ｆｃ対の１つのパートナーであるように修飾されることを含むＦｃポリペプチド融合パートナー、および融合タンパク質を企図する。「荷電Ｆｃ対のパートナー」は、（ｉ）荷電対突然変異を含む「陰性荷電」Ｆｃ配列（任意でヒンジ領域を欠いている）または（ｉｉ）荷電対突然変異を含む「陽性荷電」Ｆｃ配列（任意でヒンジ領域を欠いている）を指す。「陽性荷電」および「陰性荷電」は、Ｆｃ配列中の荷電対突然変異の性質を記載して参照を容易にし、全配列またはコンストラクトが、必ず陽性または陰性荷電を有するということを示さないように本明細書に用いられる。本開示のポリペプチドコンストラクト（例えば、ＧＤＦ１５突然変異タンパク質、修飾ＧＤＦ１５突然変異タンパク質）の使用に好適な荷電Ｆｃアミノ酸配列が、例えば、ＷＯ２０１３／１１３００８に記載されている。
【０１６４】
陽性荷電Ｆｃ（「Ｆｃ（＋）」）の例としては、ヒンジ領域を欠いているＦｃ配列のアスパラギン酸からリジンへの突然変異（Ｅ３５６Ｋ）およびグルタミン酸からリジンへの突然変異（Ｄ３９９Ｋ）を含むＦｃが挙げられる。陰性荷電Ｆｃ（「Ｆｃ（−）」）の例としては、ヒンジ領域を欠いているＦｃ配列中の２つのリジンからアスパルテートへの突然変異（Ｋ３９２Ｄ、Ｋ４０９Ｄ）を含むＦｃが挙げられる。また、任意でＣ末端側リジン（Ｋ４７７）を欠失させてよい。Ｆｃ（＋）ポリペプチド融合タンパク質（例えば、Ｆｃ（＋）ＧＤＦ１５突然変異タンパク質融合タンパク質）およびＦｃ（−）ポリペプチド融合タンパク質（例えば、Ｆｃ（−）ＧＤＦ１５突然変異タンパク質融合タンパク質）をともにインキュベートする場合、アスパルテート残基が静電力によりリジン残基と結合し、ＧＤＦ１５ポリペプチド融合タンパク質のＦｃ（＋）およびＦｃ（−）配列間のＦｃヘテロ二重体の形成を容易にする。
【０１６５】
本開示は、また、第１のＦｃ配列のＮ末端を第２のＦｃ配列のＣ末端に結合させるリンカーによって、並んで結合された２つのＦｃ配列を含む「ｈｅｍｉ」または「ｈｅｍｉＦｃ」コンストラクトと称されるコンストラクトを企図する。いくつかの実施形態では、モノマーが、ＧＤＦ１５配列のＮ末端を第１のＦｃ配列のＣ末端に結合する第１のリンカーによって、第１のＦｃ配列に結合されたポリペプチド（例えば、成熟修飾ＧＤＦ１５または突然変異タンパク質ＧＤＦ１５）配列を含み、第１のＦｃ配列が、第１のＦｃ配列のＮ末端を第２のＦｃ配列のＣ末端に結合する第２のリンカーによって、第２のＦｃ配列に結合される。第１のＦｃ配列および第２のＦｃ配列は、また、Ｆｃヒンジ領域によって結合される。２つのかかるモノマーは、モノマーが２つのポリペプチド配列間の鎖間ジスルフィド結合を介して結合される二量体を形成するように結合する。本開示のＧＤＦ１５突然変異タンパク質との使用に好適なｈｅｍｉＦｃポリペプチドの例には、ＷＯ２０１３／１１３００８を参照。
【０１６６】
本開示は、また、荷電Ｆｃ対のパートナーを含むＦｃポリペプチド、またはこれらのフラグメントのマルチマー（例えば、Ｆｃのマルチマー）を有する融合タンパク質を企図する。
【０１６７】
他の分子とのコンジュゲート：コンジュゲートのための追加の好適な成分および分子としては、例えば、チログロブリン；破傷風トキソイド；ジフテリアトキソイド；ポリアミノ酸、例えば、ポリ（Ｄ−リジン：Ｄ−グルタミン酸）；ロタウイルスのＶＰ６ポリペプチド；インフルエンザウイルスヘマグルチニン、インフルエンザウイルス核タンパク質；キーホールリンペットヘモシニアン（ＫＬＨ）；およびＢ型肝炎ウイルスコアタンパク質および表面抗原；または前述のものの任意の組み合わせが挙げられる。
【０１６８】
したがって、本開示は、ポリペプチド配列のＮ末端および／またはＣ末端の１つ以上の追加の成分または分子、例えば、もう１つのタンパク質（例えば、対象タンパク質と異種のアミノ酸配列を有するタンパク質）、または担体分子のコンジュゲートを企図する。したがって、もう１つの成分または分子とのコンジュゲートとして例示的なポリペプチド配列を提供することができる。
【０１６９】
コンジュゲート修飾の結果、追加もしくは相補的機能を有する活性、または第２の分子の活性を保持するポリペプチド配列となる可能性がある。例えば、溶解度、貯蔵、ｉｎ  ｖｉｖｏまたは貯蔵半減期または安定度、免疫原性の減少、ｉｎ  ｖｉｖｏでの遅延または制御放出などを容易にするように、例えば、ポリペプチド配列を分子にコンジュゲートしてよい。他の機能または作用が、非コンジュゲートポリペプチド配列と比較して毒性を低下させるコンジュゲート、非コンジュゲートポリペプチド配列よりもより効率的にある種の細胞または臓器を標的にするコンジュゲート、すなわち、更に本明細書に記載したとおりの障害または疾患（例えば、糖尿病）と関係している原因または作用に更に対抗する薬剤を含む。
【０１７０】
また、大きくゆっくりと代謝される高分子、例えば、タンパク質；多糖、例えば、セファロース、アガロース、セルロース、セルロースビーズ；ポリマーアミノ酸、例えば、ポリグルタミン酸、ポリリジン；アミノ酸コポリマー；非活性化ウイルス粒子；非活性化細菌毒素、例えば、ジフテリアからのトキソイド、破傷風、コレラ、白血球毒分子；非活性化細菌；および樹状細胞に、ポリペプチドをコンジュゲートしてよい。所望であれば、本開示のポリペプチドに対する抗体を生成するように、かかるコンジュゲート形態を用いることができる。
【０１７１】
コンジュゲートのための追加の候補成分および分子が、単離または精製に好適なものを含む。特定の非限定例としては、結合分子、例えば、プラスチックもしくはポリスチレンビーズ、プレートまたはビーズ、磁気ビーズ、試験ストリップ、および膜を含む固体支持体を含む、例えば、ビオチン（ビオチン−アビジン特異的結合対）、抗体、受容体、リガンド、レクチン、または分子が挙げられる。
【０１７２】
効率的にコンジュゲートをそれらのさまざまな分子量に分離する荷電差によってコンジュゲートを分離するために、精製方法、例えば、陽イオン交換クロマトグラフィーを用いてよい。例えば、陽イオン交換カラムに負荷し、その後、ｐＨ約４の約２０ｍＭ酢酸ナトリウムで洗浄し、その後、ｐＨ約３〜５．５、例えば、ｐＨ約４．５で、勾配緩衝した線状（０Ｍ〜０．５Ｍ）ＮａＣｌで溶離することができる。従来の方法、例えば、質量分析法、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、または分子量によって分子実体を分離するための他の知られる方法を用いて、分子量によって陽イオン交換クロマトグラフィーによって得られたフラクションの含有量を同定してよい。
【０１７３】
他の修飾：本開示は、１つ以上の特性を改善するポリペプチドの現在知られている、または、将来開発される他の修飾の使用を企図する。本開示のポリペプチドの循環半減期を延長し、安定度を増大し、クリアランスを減少し、または、免疫原性またはアレルギー原性を変化させるための１つのかかる方法が、分子の特性を修飾するために他の分子に結合されたヒドロキシエチルスターチ誘導体を利用するＨＥＳ化によるポリペプチド配列の修飾を含む。ＨＥＳ化のさまざまな実施形態が、例えば、米国特許出願第２００７／０１３４１９７号および２００６／０２５８６０７号に記載されている。
【０１７４】
本開示は、また、融合タグとしてＳＵＭＯ（ＬｉｆｅＳｅｎｓｏｒｓ、Ｉｎｃ；Ｍａｌｖｅｒｎ、ＰＡ）を含む融合分子を企図する。本明細書に記載されたポリペプチドのＳＵＭＯへの融合が、ポリペプチドに、発現の向上、溶解度の改善、および／または精製方法の開発の助成を含むいくつかの有益な作用をもたらす可能性がある。ＳＵＭＯプロテアーゼが、ＳＵＭＯの三次構造を認識し、ＳＵＭＯのＣ末端で融合タンパク質を切断し、このため、所望のＮ末端側アミノ酸を有する本明細書に記載されたポリペプチドを放出する。
【０１７５】
リンカー：本開示のポリペプチド配列を修飾するのに用いられる前述の成分および分子のいずれも任意でリンカーを介してコンジュゲートしてよい。好適なリンカーが、修飾ポリペプチド配列および結合成分および分子間のいくつかの移動を可能にする一般に十分な長さがある「可動性リンカー」を含む。リンカー分子は、約６〜５０原子長とすることができる。リンカー分子は、また、例えば、アリールアセチレン、２〜１０モノマー単位を含有するエチレングリコールオリゴマー、ジアミン、二塩基酸、アミノ酸、またはこれらの組み合わせとしてよい。好適なリンカーは、容易に選択することができ、好適な長さ、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１０〜２０、２０〜３０、３０〜５０アミノ酸のリンカーとすることができる。
【０１７６】
例示的な可動性リンカーとしては、グリシンポリマー（Ｇ）ｎ、グリシン−アラニンポリマー、アラニン−セリンポリマー、グリシン−セリンポリマー（例えば、（ＧｍＳｏ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ、（ＧｍＳｏＧｍ）ｎ、（ＧｍＳｏＧｍＳｏＧｍ）ｎ、（ＧＳＧＧＳｍ）ｎ、（ＧＳＧＳｍＧ）ｎおよび（ＧＧＧＳｍ）ｎ、およびこれらの組み合わせ（ｍ、ｎ、およびｏが、それぞれ独立して少なくとも１〜２０（例えば、１〜１８、２〜１６、３〜１４、４〜１２、５〜１０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）の整数から選択される）、および他の可動性リンカーが挙げられる。グリシンおよびグリシン−セリンポリマーが、比較的非構造化され、このため成分間のニュートラルなテザーとして役割を果たす可能性がある。例示的な可動性リンカーとしては、ＧＧＳＧ、ＧＧＳＧＧ、ＧＳＧＳＧ、ＧＳＧＧＧ、ＧＧＧＳＧ、およびＧＳＳＳＧが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７７】
追加の可動性リンカーとしては、グリシンポリマー（Ｇ）ｎまたはグリシン−セリンポリマー（例えば、（ＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ、（ＧＧＧＳ）ｎおよび（ＧＧＧＧＳ）ｎ（ｎ＝１〜５０、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１０〜２０、２０〜３０、３０〜５０））が挙げられる。例示的な可動性リンカーとしては、
0006704358.tif 000006
が挙げられるが、これらに限定されない。異種アミノ酸配列を本明細書に開示されたポリペプチドにコンジュゲートするために用いてよい可動性リンカーをもたらすために、これらのリンカー配列のマルチマー（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１０〜２０、２０〜３０、または３０〜５０）を、ともに結合させてよい。本明細書に記載したとおり、異種アミノ酸配列は、シグナル配列および／または融合パートナー、例えば、アルブミン、Ｆｃ配列などとしてよい。
【０１７８】
リンカーの例としては、例えば、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（ｎが、１〜約１０（例えば、ｎ＝１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）の整数である）；
0006704358.tif 000007
が挙げられる。
【０１７９】
いくつかの場合では、リンカーは、開裂可能リンカー、例えば、酵素的に開裂可能リンカーとしてよい。他の場合では、リンカーは、非開裂可能リンカー、例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏで、正常な生理学的条件下で、酵素的に切断されないリンカーとしてよい。
【０１８０】
例えば、タンパク質分解開裂可能リンカーが、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）開裂部位、例えば、コラーゲナーゼ−１、−２、および−３（ＭＭＰ−１、−８、および−１３）、ゼラチナーゼＡおよびＢ（ＭＭＰ−２および−９）、ストロメライシン１、２、および３（ＭＭＰ−３、−１０、および−１１）、マトリライシン（ＭＭＰ−７）、および膜メタロプロテアーゼ（ＭＴ１−ＭＭＰおよびＭＴ２−ＭＭＰ）から選択されるＭＭＰのための開裂部位を含むことができる。ＭＭＰ−９の開裂配列は、Ｐｒｏ−Ｘ−Ｘ−Ｈｙ（Ｘは任意の残基を示す；Ｈｙ、疎水性残基）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１）、例えば、Ｐｒｏ−Ｘ−Ｘ−Ｈｙ−（Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２）、例えば、Ｐｒｏ−Ｌｅｕ／Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３）またはＰｒｏ−Ｌｅｕ／Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４）である。プロテアーゼ開裂部位のもう１つの例は、プラスミノゲンアクチベーター開裂部位、例えば、ウロキナーゼ−型プラスミノゲンアクチベーター（ｕＰＡ）または組織プラスミノゲンアクチベーター（ｔＰＡ）開裂部位である。ｕＰＡおよびｔＰＡの開裂配列の特定の例としては、Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｒｇを含む配列が挙げられる。もう１つの例が、トロンビン開裂部位、例えば、ＣＧＬＶＰＡＧＳＧＰ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５）である。プロテアーゼ開裂部位を含む追加の好適なリンカーとしては、以下のアミノ酸配列の１つ以上を含むリンカーが挙げられる：１）カテプシンＢによって切断される
0006704358.tif 000008
；エプスタインバーウイルスプロテアーゼによって切断される
0006704358.tif 000009
；ＭＭＰ−３（ストロメライシン）によって切断される
0006704358.tif 000010
；ＭＭＰ−７（マトリライシン）によって切断される
0006704358.tif 000011
；ＭＭＰ−９によって切断される
0006704358.tif 000012
；サーモリシン様ＭＭＰによって切断される
0006704358.tif 000013
；マトリックスメタロプロテアーゼ２（ＭＭＰ−２）によって切断される
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；カテプシンＬによって切断される
0006704358.tif 000015
；カテプシンＤによって切断される
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；マトリックスメタロプロテアーゼ１（ＭＭＰ−１）によって切断される
0006704358.tif 000017
；ウロキナーゼ−型プラスミノゲンアクチベーターによって切断される
0006704358.tif 000018
；膜型１マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＴ−ＭＭＰ）によって切断される
0006704358.tif 000019
；ストロメライシン３（またはＭＭＰ−１１）、サーモリシン、線維芽球コラーゲナーゼおよびストロメライシン−１によって切断される
0006704358.tif 000020
；マトリックスメタロプロテアーゼ１３（コラーゲナーゼ−３）によって切断される
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；組織型プラスミノゲンアクチベーター（ｔＰＡ）によって切断される
0006704358.tif 000022
；ヒト前立腺特異的抗原によって切断される
0006704358.tif 000023
；カリクレイン（ｈＫ３）によって切断される
0006704358.tif 000024
；好中球エラスターゼによって切断される
0006704358.tif 000025
；およびカルパイン（カルシウム活性化中性プロテアーゼ）によって切断される
0006704358.tif 000026
。
【０１８１】
図３は、本明細書に企図される２つの融合タンパク質Ｍ１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７）およびＭ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８）のアミノ酸配列を示す。融合タンパク質Ｍ１では、Ｎ末端からＣ末端に連続的に、ＩｇＫシグナル配列（小文字）がＨＳＡアミノ酸配列に融合されており、それが（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）３リンカー（下線）と共に成熟ヒトＧＤＦ１５（太字）のＮ末端に融合されている。融合タンパク質Ｍ２では、Ｎ末端からＣ末端に連続的に、ＩｇＫシグナル配列（小文字）がＨＳＡアミノ酸配列に融合されており、それが（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）３リンカー（下線）と共に、３アミノ酸欠失（ΔＡＲＮ）を含有する成熟ヒトＧＤＦ１５（太字）のＮ末端に融合されている。
【０１８２】
図５は、本明細書に企図される２つの融合タンパク質Ｍ３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７９）およびＭ４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８０）のアミノ酸配列を示す。融合タンパク質Ｍ３では、Ｎ末端からＣ末端に連続的に、ＩｇＫシグナル配列（小文字）がＨＳＡアミノ酸配列に融合されており、それが（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）５リンカー（下線）と共に、３アミノ酸欠失（ΔＡＲＮまたはΔＮ３で示した）を含有する成熟ヒトＧＤＦ１５（太字）アミノ酸配列のＮ末端に融合されている。融合タンパク質Ｍ４では、Ｎ末端からＣ末端に連続的に、ＩｇＫシグナル配列（小文字）がＨＳＡアミノ酸配列に融合されており、それが（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）５リンカー（下線）と共に、成熟ｈＧＤＦ１５のＮ末端に対して６アミノ酸切断（ΔＡＲＮＧＤＨ）を含有する成熟ヒトＧＤＦ１５（太字）アミノ酸配列のＮ末端に融合されている。
【０１８３】
本発明は、また、本明細書に記載された配列、ポリペプチドおよび二量体をコードする組換え核酸配列を企図する。ある特定の実施形態では、組換え核酸は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である連続アミノ酸配列を有するポリペプチドをコードし、連続アミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１中の対応するアミノ酸に対して以下の対の少なくとも１つの置換を有する。
ｉ）Ｄ５ＴおよびＲ２１ＮまたはＤ５ＳおよびＲ２１Ｎ；
ｉｉ）Ｒ１６ＮおよびＨ１８ＴまたはＲ１６ＮおよびＨ１８Ｓ；
ｉｉｉ）Ｓ２３ＮおよびＥ２５ＴまたはＳ２３ＮおよびＥ２５Ｓ；
ｉｖ）Ｓ５０ＮおよびＦ５２Ｔ；Ｓ５０ＮおよびＦ５２Ｓ；Ｆ５２ＮおよびＡ５４Ｔ；またはＦ５２ＮおよびＡ５４Ｓ；
ｖ）Ｑ５１ＮおよびＲ５３Ｔ；Ｑ５１ＮおよびＲ５３Ｓ；Ｒ５３ＮおよびＡ５５Ｔ；またはＲ５３ＮおよびＡ５５Ｓ；
ｖｉ）Ｓ６４ＮおよびＨ６６Ｔ；またはＳ６４ＮおよびＨ６６Ｓ；
ｖｉｉ）Ｋ９１ＮおよびＤ９３Ｔ；Ｋ９１ＮおよびＤ９３Ｓ；Ｄ９３ＮおよびＧ９５Ｔ；またはＤ９３ＮおよびＧ９５Ｓ；
ｖｉｉｉ）Ｔ９４ＮおよびＶ９６Ｔ；Ｔ９４ＮおよびＶ９６Ｓ；Ｖ９６ＮおよびＬ９８Ｔ；またはＶ９６ＮおよびＬ９８Ｓ；
ｉｘ）Ｓ９７ＮおよびＱ９９Ｔ；またはＳ９７ＮおよびＱ９９Ｓ；および
ｘ）Ａ１０６ＮおよびＤ１０８ＴまたはＡ１０６ＮおよびＤ１０８Ｓ；
【０１８４】
置換により、配列ＮＸＳ／Ｔを有する１つ以上のＮ結合グリコシル化コンセンサス部位が生成され、Ｎは、Ａｓｎであり；Ｘは、プロリン以外のアミノ酸であり；後にＳｅｒ（Ｓ）またはＴｈｒ（Ｔ）のいずれかが続き、更に、発現した場合、１つ以上のＮ結合グリコシル化コンセンサス部位は、Ｎ−グリカンに結合される。更なる実施形態では、組換え核酸は、発現した場合二量体を形成するポリペプチドをコードする。更なる実施形態では、組換え核酸は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対してＮ末端側切断および／またはＣ末端側切断を有するポリペプチドをコードする。切断は、参照ポリペプチド、例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４以上のアミノ酸としてよい。特定の実施形態では、組換え核酸は、ＧＤＦ１５中の最初の３つのＮ末端側残基の切断（ΔＡＲＮまたはΔＮ３）を有するポリペプチをコードする。特定の実施形態では、本開示は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０または５個までのアミノ酸が異なるアミノ酸から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする組換え核酸分子を企図し；前記ポリペプチドは、発現した場合、Ｎ−グリコシル化されている少なくとも１つのＮ−グリコシル化部位を含有する。特定の実施形態では、本開示は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０または２個までのアミノ酸が異なるアミノ酸から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする組換え核酸分子を企図し；前記ポリペプチドは、発現した場合、Ｎ−グリコシル化されている少なくとも１つのＮ−グリコシル化部位を含有する。特定の実施形態では、組換え核酸は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９７またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１００または５個までのアミノ酸が異なるアミノ酸から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードし；前記ポリペプチドは、発現した場合、Ｎ−グリコシル化されている少なくとも１つのＮ−グリコシル化部位を含有する。特定の実施形態では、組換え核酸は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９７またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１００または２個までのアミノ酸が異なるアミノ酸から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードし；前記ポリペプチドは、発現した場合、Ｎ−グリコシル化されている少��くとも１つのＮ−グリコシル化部位を含有する。本開示は、また、哺乳動物細胞、例えば、ＣＨＯ細胞中の前述の組換え核酸を発現させるステップを含む修飾ＧＤＦ１５Ｎ−グリコシル化ホモ二量体を生成する方法を企図する。本開示は、また、前述の方法によって生成される修飾ＧＤＦ１５Ｎ−グリコシル化ホモ二量体を包含する。
【０１８５】
本明細書に提供される特定のアミノ酸配列および核酸配列に加えて、本開示は、また、アミノ酸および核酸と配列が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％同一である配列を有するポリペプチドおよび核酸を企図する。「同一」またはパーセント「同一性」という用語は、２つ以上のポリヌクレオチド配列、または２つ以上のアミノ酸配列の文脈では、比較し、特定領域にわたって対応が最大となるように整列させた場合、同じである２つ以上の配列またはサブ配列、または同じ（例えば、特定の領域にわたって少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％同一である）である特定のパーセンテージのアミノ酸残基またはヌクレオチドを有する２つ以上の配列またはサブ配列を指す。本開示は、特に、配列が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２〜３５または７７〜９７のアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを企図する。
【０１８６】
ポリペプチドの生成方法
組換えおよび非組換え方法（例えば、化学的合成）を含む任意の好適な方法によって、本開示のポリペプチドを生成することができる。
【０１８７】
Ａ．化学的合成
ポリペプチドが、化学的に合成される場合、液相または固相を介して合成を進めてよい。固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）により、非天然アミノ酸および／またはペプチド／タンパク質主鎖修飾が組込まれることが可能になる。ＳＰＰＳのさまざまな形態、例えば、ＦｍｏｃおよびＢｏｃが、本開示のポリペプチドを合成するのに利用可能である。化学的合成の詳細が、当技術分野で知られている（例えば、Ｇａｎｅｓａｎ  Ａ．２００６  Ｍｉｎｉ  Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．６：３−１０；およびＣａｍａｒｅｒｏ  Ｊ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，２００５  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｅｐｔ  Ｌｅｔｔ．１２：７２３−８）。
【０１８８】
以下に記載したとおり、固相ペプチド合成を実施してよい。酸不安定性または塩基不安定性基で、α官能基（Ｎα）および任意の反応側鎖を保護する。保護基は、アミド結合を連結するための条件下で、安定しているが、形成されたペプチド鎖を損なうことなく、容易に切断することができる。α−アミノ官能基のための好適な保護基としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）、ｏ−クロロベンジルオキシカルボニル、ｂｉ−フェニルイソプロピルオキシカルボニル、ｔｅｒｔ−アミルオキシカルボニル（Ａｍｏｃ）、α，α−ジメチル−３，５−ジメトキシ−ベンジルオキシカルボニル、ｏ−ニトロスルフェニル、２−シアノ−ｔ−ブトキシ−カルボニル、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキサ（ｄｉｏｘｏｃｙｌｏｈｅｘ）−１−イリデン）エチル（Ｄｄｅ）など。
【０１８９】
好適な側鎖保護基としては、アセチル、アリル（Ａｌｌ）、アリルオキシカルボニル（Ａｌｌｏｃ）、ベンジル（Ｂｚｌ）、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）、ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、ベンジルオキシメチル（Ｂｏｍ）、ｏ−ブロモベンジルオキシカルボニル、ｔ−ブチル（ｔＢｕ）、ｔ−ブチルジメチルシリル、２−クロロベンジル、２−クロロベンジルオキシカルボニル（２−ＣＩＺ）、２，６−ジクロロベンジル、シクロヘキシル、シクロペンチル、１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキサ−１−イリデン）エチル（Ｄｄｅ）、イソプロピル、４−メトキシ−２，３−６−トリメチルベンジルスルホニル（Ｍｔｒ）、２，３，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル（Ｐｍｃ）、ピバリル、テトラヒドロピラン−２−イル、トシル（Ｔｏｓ）、２，４，６−トリメトキシベンジル、トリメチルシリルおよびトリチル（Ｔｒｔ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１９０】
固相合成では、Ｃ末端側アミノ酸を好適な支持材料に結合させる。好適な支持材料は、試薬、および合成プロセスの段階的縮合および開裂反応のための反応条件に対して不活性であり、用いられる反応媒質中で溶解しないものである。市販されている支持材料の例としては、反応基および／またはポリエチレングリコールで修飾されたスチレン／ジビニルベンゼンコポリマー；クロロメチル化スチレン／ジビニルベンゼンコポリマー；ヒドロキシメチル化またはアミノメチル化スチレン／ジビニルベンゼンコポリマーなどが挙げられる。ペプチド酸を調製するのを意図する場合、４−ベンジルオキシベンジル−アルコール（Ｗａｎｇ−アンカー）または２−クロロトリチルクロリドで誘導体化されたポリスチレン（１％）−ジビニルベンゼンまたはＴｅｎｔａＧｅｌ（登録商標）を用いることができる。ペプチドアミドの場合では、５−（４’−アミノメチル）−３’，５’−ジメトキシフェノキシ）バレリアン酸（ＰＡＬ−アンカー）またはｐ−（２，４−ジメトキシフェニル−アミノメチル）−フェノキシ基（Ｒｉｎｋアミドアンカー）で誘導体化されたポリスチレン（１％）ジビニルベンゼンまたはＴｅｎｔａＧｅｌ（登録商標）を用いることができる。
【０１９１】
室温で、または温度を上昇させて（例えば、４０℃〜６０℃）、例えば、２〜７２時間の反応時間で、支持材料とＣ末端側Ｆｍｏｃ保護アミノ酸を反応させることによってエタノール、アセトニトリル、Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジクロロメタン、テトラヒドロフラン、Ｎ−メチルピロリドンまたはほぼ同じ溶媒中で、活性化試薬の添加により、ポリマー支持体への連結を実現することができる。
【０１９２】
例えば、カップリング試薬、例えば、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）または他のカルボジイミド、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（ＴＢＴＵ）または他のウロニウム塩、ｏ−アシル−尿素、ベンゾトリアゾール−１−イル−トリス−ピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ）または他のホスホニウム塩、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、他のＮ−ヒドロキシイミドまたはオキシムを用いて、１−ヒドロキシベンゾトリアゾールまたは１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾールが存在して、または、これが存在しないでも、例えば、ＴＢＴＵを用いて、ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）を添加して、塩基、例えば、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）、トリエチルアミンまたはＮ−メチルモルホリン、例えば、ジイソプロピルエチルアミンを添加して、または添加しないで、２〜７２時間の反応時間（例えば、３時間、１．５〜３倍超過のアミノ酸およびカップリング試薬中で、例えば、２倍超過させて、約１０℃〜５０℃の温度、例えば、２５℃で、溶媒、例えば、ジメチルホルムアミド、Ｎ−メチルピロリドンまたはジクロロメタン、例えば、ジメチルホルムアミド中で）で、Ｎα保護アミノ酸（例えば、Ｆｍｏｃアミノ酸）のＰＡＬ、ＷａｎｇまたはＲｉｎｋアンカーへのカップリングを実施することができる。
【０１９３】
カップリング試薬の代わりに、また、上記条件下で、活性エステル（例えば、ペンタフルオロフェニル、ｐ−ニトロフェニルなど）、Ｎα−Ｆｍｏｃ−アミノ酸の対称無水物、その酸塩化物または酸フッ化物を使用することができる。
【０１９４】
ＤＩＥＡの添加により１０〜１２０分の反応時間で、例えば、２０分で、ジクロロメタン中の２−クロロトリチルレジンにＮα−保護アミノ酸（例えば、Ｆｍｏｃアミノ酸）をカップリングさせることができるが、この溶媒およびこの塩基の使用に限定されない。
【０１９５】
ペプチド合成の従来の方法に従って、典型的には自動ペプチド合成装置で、保護アミノ酸の連続的カップリングを実施することができる。処理、例えば、５〜２０分間、ジメチルホルムアミド中のピペリジン（１０％〜５０％）による処理（例えば、ＤＭＦ中の５０％ピペリジンによる２ｘ２分、およびＤＭＦ中の２０％ピペリジンによる１ｘ１５分）によって、固相上でカップリングしたアミノ酸のＮα−Ｆｍｏｃ保護基の開裂後、不活性、非水性、極性溶媒中で、例えば、ジクロロメタン、ＤＭＦまたはその２つの混合物中で、約１０℃〜５０℃の温度で、例えば、２５℃で、３〜１０倍超過、例えば、１０倍超過の次の保護アミノ酸を、前のアミノ酸にカップリングさせる。第１のＮα−Ｆｍｏｃアミノ酸をＰＡＬ、ＷａｎｇまたはＲｉｎｋアンカーにカップリングさせるための先に述べた試薬が、カップリング試薬として好適である。また、別の試薬として、保護アミノ酸の活性エステル、または塩化物もしくはフッ化物またはこれらの対称無水物を用いることができる。
【０１９６】
固相合成の終わりに、ペプチドが、支持材料から切断され、同時に側鎖保護基を切断する。０．５〜３時間内で、例えば、２時間で、５％〜２０％Ｖ／Ｖのスカベンジャー、例えば、ジメチルスルフィド、エチルメチルスルフィド、チオアニソール、チオクレゾール、ｍ−クレゾール、アニソールエタンジチオール、フェノールまたは水の添加、例えば、１５％ｖ／ｖジメチルスルフィド／エタンジチオール／ｍ−クレゾール１：１：１の添加により、トリフルオロ酢酸または他の強酸性媒質で、開裂を実施することができる。氷酢酸／トリフルオロエタノール／ジクロロメタン２：２：６で、２−クロロトリチルアンカーを切断することによって、完全保護側鎖を有するペプチドが得られる。シリカゲル上のクロマトグラフィーによって保護ペプチドを精製することができる。ペプチドが、Ｗａｎｇアンカーを介して固相に結合されている場合、および、Ｃ末端側アルキルアミド化によりペプチドを得ることを意図する場合、アルキルアミンまたはフルオロアルキルアミンによるアミノリシスによって開裂を実施することができる。アミノリシスは、約−１０℃〜５０℃（例えば、約２５℃）の温度で、約１２〜２４時間（例えば、約１８時間）の反応時間で、実施される。また、例えば、メタノールによる再エステル化によって、支持からペプチドを切断することができる。
【０１９７】
ペプチドを沈殿させ、その結果、スカベンジャーおよびエーテル中に残っている切断された保護基を分離するために、３〜２０倍の量の冷エーテルまたはｎ−ヘキサン、例えば、１０倍超過のジエチルエーテルで、得られた酸性溶液を混合してよい。何度か氷酢酸からペプチドを再沈殿させることによって更なる精製を実施することができる。水もしくはｔｅｒｔ−ブタノールまたはその２つの溶媒の混合物、例えば、ｔｅｒｔ−ブタノール／水の１：１混合物中に得られた沈殿物を溶かし、凍結乾燥することができる。
【０１９８】
アセテート形態中の弱塩基性レジン上でのイオン交換；非誘導体化ポリスチレン／ジビニルベンゼンコポリマー（例えば、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＸＡＤ）上での疎水性吸収クロマトグラフィー；シリカゲル上での吸収クロマトグラフィー；例えば、カルボキシメチルセルロース上でのイオン交換クロマトグラフィー；例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ｇ−２５上での分配クロマトグラフィー；向流分配クロマトグラフィー；または高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）例えば、オクチルまたはオクタデシルシリルシリカ（ＯＤＳ）相上での逆相ＨＰＬＣを含むさまざまなクロマトグラフィー法によって、得られたペプチドを精製することができる。
【０１９９】
Ｂ．組換え生成
組換え技術を用いてポリペプチドを生成する場合、任意の好適なコンストラクト、および、原核細胞または真核細胞、例えば、それぞれ、細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）または酵母宿主細胞とすることができる任意の好適な宿主細胞を用いて、細胞内タンパク質または分泌されるタンパク質として、ポリペプチドを生成してよい。宿主細胞として用いてよい真核細胞の他の例としては、昆虫細胞、哺乳動物細胞、および／または植物細胞が挙げられる。哺乳動物宿主細胞が用いられる場合、ヒト細胞（例えば、ＨｅＬａ、２９３、Ｈ９およびＪｕｒｋａｔ細胞）；マウス細胞（例えば、ＮＩＨ３Ｔ３、Ｌ細胞、およびＣ１２７細胞）；霊長類細胞（例えば、Ｃｏｓ１、Ｃｏｓ７およびＣＶ１）およびハムスター細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞）を含んでよい。特定の実施形態では、ポリペプチドは、ＣＨＯ細胞中で生成される。他の実施形態では、ポリペプチドは、酵母細胞で生成され、特定の実施形態では、哺乳動物様Ｎ−グリカンで糖タンパク質を生成するために遺伝子操作された酵母細胞としてよい。
【０２００】
当技術分野で知られる標準手順に従って、ポリペプチドの発現に好適なさまざまな宿主−ベクター系を用いてよい。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、ＮｅｗＹｏｒｋ；およびＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．１９９５  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｅｄｓ．Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓを参照。遺伝的物質の宿主細胞への導入方法としては、例えば、形質転換、電気穿孔法、コンジュゲーション、リン酸カルシウム法などが挙げられる。導入されるポリペプチドコード核酸の安定した発現をもたらすように、転換方法を選択することができる。ポリペプチドをコードする核酸は、遺伝性エピソーム要素（例えば、プラスミド）として、提供することができる、またはゲノムに統合することができる。目的のポリペプチドの生成に使用するのに好適なさまざまなベクターが、市販されている。
【０２０１】
ベクターは、宿主細胞中の染色体外維持をもたらすことができる、または宿主細胞ゲノムへの統合をもたらすことができる。発現ベクターは、転写および翻訳制御配列をもたらし、コード領域が、転写開始領域ならびに転写および翻訳停止領域の転写調節下で、機能的に連結される、誘導的発現または構成的発現をもたらすことができる。一般に、転写および翻訳制御配列は、プロモーター配列、リボソーム結合部位、転写開始および停止配列、翻訳開始および停止配列、およびエンハンサーまたはアクチベーター配列を含んでよいが、これらに限定されない。プロモーターは、構成的または誘導的とすることができ、強い構成的プロモーター（例えば、Ｔ７）とすることができる。
【０２０２】
発現コンストラクトは、一般に目的のタンパク質をコードする核酸配列の挿入をもたらすためにプロモーター配列の近くに位置する簡便な制限部位を有する。ベクターを含有する細胞の選択を容易にするために、発現宿主中で作用する選択可能マーカーが、存在してよい。更に、発現コンストラクトが、追加の要素を含んでよい。例えば、発現ベクターは、１つのまたは２つの複製系を有してよく、このため、生物において、例えば、発現のために哺乳動物または昆虫細胞において、およびクローン化および増幅のために原核宿主においてそれを維持することが可能である。また、発現コンストラクトが、形質転換宿主細胞の選択が可能となるように選択可能マーカー遺伝子を含有してよい。選択可能遺伝子が、当技術分野でよく知られており、用いられる宿主細胞により異なる。
【０２０３】
当技術分野で知られる方法に従って、タンパク質の単離および精製を実現することができる。例えば、構成的におよび／または誘導時にタンパク質を発現する遺伝子組換された細胞の可溶化液から、または、合成反応混合物から、試料を抗タンパク質抗体と接触させ、非特異的結合物質を除去するために洗浄し、および特異的結合タンパク質を溶離することを一般に含む免疫アフィニティ精製によってタンパク質を単離することができる。透析およびタンパク質精製方法に通常用いられる他の方法によって単離タンパク質を更に精製することができる。１つの実施形態では、金属キレートクロマトグラフィー法を用いてタンパク質を単離してよい。タンパク質は、単離を容易にする修飾を含有してよい。
【０２０４】
実質的に純粋または単離形態（例えば、他のポリペプチドを含まない）で、ポリペプチドを調製してよい。存在する可能性がある他の成分（例えば、他のポリペプチドまたは他の宿主細胞成分）と比較してポリペプチドが濃縮されている組成物中にポリペプチドを存在させることができる。例えば、ポリペプチドが、他の発現したタンパク質を実質的に含まない、例えば、組成物の９０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、または１％未満が、他の発現したタンパク質から構成される組成物中に存在するように精製されたポリペプチドを提供してよい。
【０２０５】
抗体
本開示は、本開示のポリペプチドまたは融合タンパク質と特異的に結合する単離抗体を含む抗体を提供する。「抗体」という用語は、本開示のポリペプチドまたは融合タンパク質と特異的に結合するという条件で、インタクト単クローン性抗体、多クローン性抗体、少なくとも２つのインタクト抗体から形成される多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、およびＦａｂおよびＦ（ａｂ）’２を含む抗体結合フラグメントを包含する。基本的全抗体構造単位が、テトラマーを含み、各テトラマーは、２つの同一対のポリペプチド鎖からなり、それぞれの対が、１つの「軽」鎖（約２５ｋＤａ）および１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端側部分は、主に抗原認識を担う約１００〜１１０以上のアミノ酸の可変領域を含む。それとは対照的に、各鎖のカルボキシ末端側部分は、主にエフェクター機能を担う定常領域を定義する。ヒト軽鎖は、カッパおよびラムダに分類され、ヒト重鎖は、ミュー、デルタ、ガンマ、アルファ、またはイプシロンに分類され、それぞれ抗体のイソ型をＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥと定義する。結合フラグメントは、組換えＤＮＡ技術によって、またはインタクト抗体の酵素的もしくは化学的開裂によって生成される。結合フラグメントとしては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、および単鎖抗体が挙げられる。
【０２０６】
各重鎖は、１つの末端に可変ドメイン（ＶＨ）を有し、それに複数の定常ドメインが続く。各軽鎖は、１つの末端に可変ドメイン（ＶＬ）およびそのもう１つの末端に定常ドメインを有し；軽鎖の定常ドメインが、重鎖の第１の定常ドメインと整列され、軽鎖可変ドメインが、重鎖の可変ドメインと整列される。軽鎖および重鎖内では、可変および定常領域が、約１２以上のアミノ酸の「Ｊ」領域によって結合され、重鎖は、また、約１０以上のアミノ酸の「Ｄ」領域を含む。全抗体鎖は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」とも称される、３つの超可変領域によって結合される比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）の同じ一般構造を示す。各対の２本の鎖からのＣＤＲは、フレームワーク領域によって整列され、特定のエピトープに結合することができる。Ｎ末端側からＣ末端側まで、軽鎖および重鎖ともドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４を含む。
【０２０７】
インタクト抗体は、２つの結合部位を有し、二官能性または二重特異性抗体中を除いて、２つの結合部位は同じである。二重特異性または二官能性抗体は、２つの異なる重鎖／軽鎖対および２つの異なる結合部位を有する人工ハイブリッド抗体である。ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’フラグメントの結合を含むさまざまな方法によって、二重特異性抗体を生成することができる。
【０２０８】
上に記載のとおり、インタクト抗体の酵素的または化学的開裂によって結合フラグメントを生成してよい。酵素パパインによる抗体の消化の結果、「Ｆａｂ」フラグメント、および抗原結合活性を有しない「Ｆｃ」フラグメントとしても知られる２つの同一抗原結合フラグメントとなる。酵素ペプシンによる抗体の消化の結果、抗体分子の２つのアームが結合されたままであり、２つの抗原結合部位を含むＦ（ａｂ’）２フラグメントとなる。Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、抗原を架橋する能力を有する。
【０２０９】
本明細書に用いる場合、「Ｆａｂ」という用語は、ＶＨおよびＶＬ領域ならびに軽鎖の定常ドメインおよび重鎖のＣＨ１ドメインを含む抗体のフラグメントを指す。
【０２１０】
本明細書に用いる場合、「Ｆｖ」という用語は、抗原認識部位および抗原結合部位の両者を保持する抗体の最小フラグメントを指す。２本鎖Ｆｖ種では、この領域は、非共有結合の１本の重鎖および１本の軽鎖可変ドメインの二量体を含む。単一鎖Ｆｖ種では、軽鎖および重鎖が、２本鎖Ｆｖ種のものに類似した「二量体」構造で結合することができる可動性ペプチドリンカーによって、１本の重鎖および１本の軽鎖可変ドメインを共有結合させることができる。各可変ドメインの３つのＣＤＲが、相互作用し、ＶＨ−ＶＬ二量体の表面に抗原結合部位を定義するのが、この立体配置である。６つのＣＤＲが、まとめて、抗体に抗原結合特異性を与える、一方、単一可変ドメイン（または抗原に特異的な３つのＣＤＲだけを含むＦｖの半分）でも抗原を認識し、それと結合する能力を有する。
【０２１１】
本明細書に用いる場合、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」という用語は、特定のリガンドと接触し、その特異性を決定する免疫学的受容体の一部を指す。
【０２１２】
「超可変領域」という用語は、抗原結合を担う抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、一般にＣＤＲからのアミノ酸残基および／または「超可変ループ」からのその残基を含む。
【０２１３】
本明細書に用いる場合、「エピトープ」という用語は、タンパク質抗原上の抗体の結合部位を指す。エピトープ決定基は、通常、分子の化学的に活性がある表面基、例えば、アミノ酸または糖側鎖、ならびに特定の３次元構造特性および荷電特性を含む。解離定数が、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、または≦１０ｎＭである場合、抗体は、抗原と結合すると言われている。平衡定数（「ＫＤ」）の増大は、エピトープおよび抗体間の親和性が減少していることを意味し、一方、平衡定数の減少は、エピトープおよび抗体間の親和性が増大していることを意味する。ある特定の量「を超えない」ＫＤを有する抗体は、抗体が、一定のＫＤで、またはそれより強力にエピトープに結合することを意味する。ＫＤは、エピトープおよび抗体の結合特性を示し、一方、「力価」は、抗体の機能についての抗体それ自体の効果を示す。必ずしも平衡定数および力価間の相関はない；したがって、例えば、比較的低いＫＤが、必然的に高い力価を意味するものではない。
【０２１４】
抗体に関する「選択的に結合する」という用語は、抗体が単一物質に結合することだけを意味せず、抗体の第１の物質に対するＫＤが、抗体の第２の物質に対するＫＤ未満であることを意味する。もっぱらエピトープだけに結合する抗体は、単一エピトープに結合する。
【０２１５】
ヒトに投与される場合、げっ歯類動物（すなわち、マウスまたはラット）可変および／または定常領域を含有する抗体は、時には、例えば、身体からの急速なクリアランス、または抗体に対する身体による免疫応答の発生と関係している。げっ歯類動物から誘導された抗体の利用を回避するために、ヒト抗体機能のげっ歯類動物への導入により完全ヒト抗体を生成することができ、その結果、げっ歯類動物が、完全ヒト抗体を生成する。別途特に本明細書に特定しない限り、「ヒト」および「完全ヒト」抗体は、交換可能で用いることができる。「完全ヒト」という用語は、部分的だけヒトである抗体と、全くまたは完全にヒトである抗体を識別する場合、有用とすることができる。当業者は、完全ヒト抗体を生成するさまざまな方法を知っている。
【０２１６】
可能性があるヒト抗マウス抗体応答に対処するために、キメラ抗体またはそうでなければヒト化抗体を用いることができる。キメラ抗体は、ヒト定常領域およびマウス可変領域を有し、したがって、ヒト抗キメラ抗体応答が、患者の一部で観察される可能性がある。このため、可能性があるヒト抗マウス抗体またはヒト抗キメラ抗体応答を回避するために、多量体酵素に対する完全ヒト抗体をもたらすのが有利である。
【０２１７】
例えば、当業者に知られる技術によるハイブリドーマ細胞株の生成によって、完全ヒト単クローン性抗体を調製することができる。他の調製方法は、好適な哺乳動物宿主細胞、例えば、ＣＨＯ細胞の形質転換のための特定の抗体をコードする配列の使用を含む。形質転換は、ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための任意の公知の方法によるものとすることができ、この方法は、例えば、ウイルス（またはウイルスベクター中に）中にポリヌクレオチドをパッケージすること、およびウイルス（またはベクター）で、または当技術分野で知られるトランスフェクション方法によって宿主細胞を形質導入することを含む。哺乳動物細胞に異種ポリヌクレオチドを導入する方法が、当技術分野でよく知られており、デキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、ポリヌクレオチド（複数可）のリポソーム中への封入、およびＤＮＡの核中への直接マイクロインジェクションを含む。発現のための宿主として利用可能な哺乳動物細胞株が、当技術分野でよく知られており、ＣＨＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、およびヒト肝細胞癌細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２１８】
本開示のポリペプチドを検出するために抗体を用いることができる。例えば、対象中の本開示の１つ以上のポリペプチドのレベルを検出すること、および標準対照レベルまたは以前（例えば、病気の前）に測定した対象中のベースラインレベルのいずれかと検出レベルを比較することによって診断薬として抗体を用いることができる。
【０２１９】
本開示のもう１つの実施形態では、１つ以上のヒトドメイン抗体（ｄＡｂ）の使用を含む。ｄＡｂは、ヒト抗体（ＩｇＧ）の最小の機能的結合単位であり、好ましい安定度および溶解度特性を有する。当該技術は、ＨＳＡにコンジュゲートされたｄＡｂ（複数可）（これにより、「ＡｌｂｕｄＡｂ」を形成する；例えば、ＥＰ１５１７９２１Ｂ、ＷＯ２００５／１１８６４２およびＷＯ２００６／０５１２８８を参照）および目的の分子（例えば、本開示のポリペプチド配列）を含む。ＡｌｂｕｄＡｂは、小さいことが多く、ポリペプチドの血清半減期を延長するために用いられる現在実施されている技術より、微生物発現系、例えば、細菌または酵母中で製造するのに容易である。ＨＳＡは、約３週間の半減期を有するため、得られたコンジュゲート分子は、目的の分子の半減期を改善する。ｄＡｂ技術の使用が、また、目的の分子有効性を向上させる可能性がある。
【０２２０】
治療的用法および予防的用法
本開示は、本明細書に記載したとおり、ポリペプチド、またはこれらの組成物の投与によって、代謝疾患および代謝関連疾患、例えば、肥満および他の体重障害、高血糖、高インスリン血症、グルコース不耐性、およびグルコース代謝障害を治療または予防する方法を提供する。かかる方法は、また、例えば、症状の重症度または頻度を低下させることによって、疾患、障害または状態と関係している１つ以上の症状への有利な作用を有し得る。特定の実施形態では、本開示は、ポリペプチド、Ｎ−グリコシル化二量体またはこれらの組成物の投与によってグルコース代謝または体重障害を治療する方法を提供する。特定の実施形態では、本開示は、ポリペプチド、Ｎ−グリコシル化二量体またはこれらの組成物の投与によって、食物摂取を減少させる、または体重を減少させる方法。本開示は、更に、代謝疾患および代謝関連疾患、例えば、肥満および他の体重障害、高血糖、高インスリン血症、グルコース不耐性、およびグルコース代謝障害から選択される状態を治療するのに使用するための医薬品の製造への前述の配列、ポリペプチド、Ｎ−グリコシル化二量体またはこれらの組成物の使用を提供する。本開示は、更に、グルコース代謝または体重障害を治療するのに使用するための医薬品の製造への前述の配列、ポリペプチド、Ｎ−グリコシル化二量体またはこれらの組成物の使用を提供する。本開示は、更に、食物摂取または体重を減少させるのに使用するための医薬品の製造への前述の配列、ポリペプチド、Ｎ−グリコシル化二量体またはこれらの組成物の使用を提供する。
【０２２１】
対象が、本明細書に提供される方法によって、体重障害（例えば、肥満）の治療または予防の候補としてよいかどうかを決定するために、パラメーター、例えば、限定されないが、発病因子および対象の状態の程度（例えば、参照する健康な個体と比較して対象の太り過ぎの程度）を評価しなければならない。例えば、ＢＭＩが、約２５〜約２９．９ｋｇ／ｍ２である成人は、太り過ぎ（前肥満）と考えてよく、一方、ＢＭＩが、約３０ｋｇ／ｍ２以上である成人は、肥満と考えてよい。本明細書に記載したとおり、本発明のポリペプチドは、食欲を抑制し、例えば、食欲の低下により体重を減少させることができる。
【０２２２】
対象が、高血糖、高インスリン血症、グルコース不耐性、および／またはグルコース障害の本明細書に提供される方法による治療または予防の候補としてよいかどうかを決定するために、当技術分野で知られるさまざまな診断方法を利用してよい。かかる方法は、本明細書の他の箇所に記載したもの（例えば、空腹時血漿グルコース（ＦＰＧ）評価および経口グルコース負荷試験（ｏＧＴＴ））を含む。
【０２２３】
本明細書に提供されるポリペプチドおよび融合タンパク質は、代謝疾患および代謝関連疾患、例えば、肥満および他の体重障害、高血糖、高インスリン血症、グルコース不耐性、グルコース代謝障害を治療または予防するために対象に投与した場合、血中グルコースレベルの減少、体重の減少、および／または食物摂取の減少をもたらす可能性がある。
【０２２４】
ある特定の実施形態では、本明細書に企図されるポリペプチドおよび融合タンパク質が、ポリペプチドまたは融合タンパク質を投与しない場合と比較して、少なくとも５％血中グルコースレベル、体重、および／または食物摂取を減少させる可能性がある。例えば、本明細書に企図されるポリペプチドおよび融合タンパク質は、治療または予防の開始前と比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％血中グルコースレベル、体重、および／または食物摂取を減少させる可能性がある。
【０２２５】
医薬組成物
本開示のポリペプチドは、対象への投与に好適な組成物の形態としてよい。一般に、かかる組成物は、１つ以上のポリペプチドおよび１つ以上の製剤的に許容可能、または生理的に許容可能な希釈剤、担体または賦形剤を含む「医薬組成物」である。ある特定の実施形態では、ポリペプチドが、治療有効量で存在している。本開示の方法に当該医薬組成物を用いてよく；したがって、例えば、本明細書に記載された治療方法および予防方法ならびに用法を実施するために、対象にｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで、当該医薬組成物を投与することができる。
【０２２６】
意図される投与方法または投与経路と適合するように、本開示の医薬組成物を製剤化することができ；例示的な投与経路が、本明細書に記載されている。更に、本開示によって企図されるとおり、疾患、障害および状態を治療または予防するために、本明細書に記載したとおり、他の治療的に活性がある薬剤または化合物（例えば、グルコース低下薬剤）と併用して、当該医薬組成物を用いてよい。
【０２２７】
当該医薬組成物は、通常、治療有効量の少なくとも１つの本開示によって企図されるポリペプチド、および１つ以上の製剤的におよび生理的に許容可能な製剤を含む。好適な製剤的に許容可能または生理的に許容可能な希釈剤、担体または賦形剤としては、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸および重硫酸ナトリウム）、防腐剤（例えば、ベンジルアルコール、メチルパラベン、エチルまたはｎ−プロピル、ｐ−ヒドロキシベンゾエート）、乳化剤、懸濁化剤、分散剤、溶媒、充填剤、増量剤、界面活性剤、緩衝剤、ビヒクル、希釈剤、および／または補助剤が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、好適なビヒクルは、生理的食塩水またはクエン酸緩衝生理食塩水としてよく、非経口的投与のための医薬組成物でよくみられる他の材料を補うことができる。中性緩衝生理食塩水または血清アルブミンと混合した生理食塩水が、更なる例示的なビヒクルである。当業者であれば、医薬組成物および剤形に用いることができるさまざまな緩衝剤を容易に理解する。通常の緩衝剤としては、製剤的に許容可能な弱酸、弱塩基、またはこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。１つの例として、緩衝剤成分は、水溶性物質、例えば、リン酸、酒石酸、乳酸、コハク酸、クエン酸、酢酸、アスコルビン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、およびこれらの塩とすることができる。許容可能な緩衝剤としては、例えば、トリス緩衝剤、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（２−エタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ）、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸ナトリウム塩（ＭＥＳ）、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、およびＮ−トリス［ヒドロキシメチル］メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）が挙げられる。
【０２２８】
医薬組成物を製剤化した後、溶液、懸濁液、ゲル、エマルション、固体、または無水粉末もしくは凍結乾燥粉末として滅菌バイアル中に保管してよい。かかる製剤は、使用準備済の形態、使用前に再構成が必要な凍結乾燥形態、使用前に希釈が必要な液体形態、または他の許容可能な形態のいずれかで保管してよい。いくつかの実施形態では、医薬組成物が、単回使用容器（例えば、単回使用バイアル、アンプル、シリンジ、または自己注射器（例えば、ＥｐｉＰｅｎ（登録商標））に類似したもの））中に提供され、一方、他の実施形態では、多回使用容器（例えば、多回使用バイアル）が、提供される。ポリペプチドを送達するために、任意の薬剤送達装置を用いてよく、この装置は、移植物（例えば、埋込ポンプ）およびカテーテル系を含み、両者とも当業者によく知られている。また、規定された期間にわたって本明細書に開示されたポリペプチドを放出するために、一般に皮下にまたは筋肉内に投与されるデポ注射を用いてよい。デポ注射は、通常、固体ベースまたはオイルベースのいずれかであり、一般に少なくとも１つの本明細書に記載された製剤成分を含む。当業者は、デポ注射の可能性のある製剤および使用をよく知っている。
【０２２９】
当該医薬組成物は、滅菌注射可能水性または油性懸濁液の形態としてよい。この懸濁液は、本明細書に記載の好適な分散剤または湿潤剤および懸濁化剤を用いて、公知の技術分野に従って、製剤化してよい。滅菌注射可能調製物は、また、非毒性の非経口で許容可能な希釈剤または溶媒中（例えば、１，３−ブタンジオール中の溶液として）の滅菌注射可能溶液または懸濁液としてよい。水、リンゲル液、等張性塩化ナトリウム溶液、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、ＮＪ）またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール）、およびこれらの好適な混合物を含む許容可能な希釈剤、溶媒および分散媒質を用いてよい。また、滅菌固定油が、従来から溶媒または懸濁媒質として用いられる。この目的では、合成モノグリセリドまたはジグリセリドを含む任意の無刺激性固定油を用いてよい。更に、脂肪酸、例えば、オレイン酸は、注射可能物の調製に使用される。吸収を遅らせる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウムまたはゼラチン）を含むことによって、特定の注射可能製剤の吸収の持続を実現することができる。
【０２３０】
活性成分（例えば、本開示のポリペプチド）を含有する医薬組成物は、経口使用に好適な形態としてよく、例えば、錠剤、カプセル、トローチ剤、ロゼンジ剤、水性または油性懸濁液、分散性粉末または顆粒、エマルション、硬カプセルまたは軟カプセル、またはシロップ、溶液、ミクロビーズまたはエリキシル剤としてよい。医薬組成物の製造のために当技術分野に知られる任意の方法に従って、経口使用を意図した医薬組成物を調製してよく、製剤的に上品さを与え、味のいい調製物を提供するために、かかる組成物が、１つ以上の薬剤、例えば、例えば、甘味剤、風味剤、着色剤および防腐剤を含有してよい。錠剤、カプセルなどは、錠剤の製造に好適である非毒性の製剤的に許容可能な賦形剤と混合して活性成分を含有する。これらの賦形剤は、例えば、希釈剤（炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウムまたはリン酸ナトリウムなど）；造粒剤および崩壊剤（コーンスターチ、またはアルギン酸など）；結合剤（デンプン、ゼラチンまたはアカシアなど）、および潤滑剤（ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルクなど）としてよい。
【０２３１】
消化管中での崩壞および吸収を遅らせ、これにより、作用の持続がもたらされるように、公知の技術によって経口投与に好適な錠剤、カプセルなどを被覆しないでよい、または被覆してよい。例えば、徐放化材料、例えば、モノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリルを用いてよい。また、制御放出のための浸透性治療用錠剤を形成するために、当技術分野で知られる技術によって、これらを被覆してよい。追加の薬剤としては、投与された組成物の送達を制御するための生分解性もしくは生体適合性粒子またはポリマー物質、例えば、ポリエステル、ポリアミン酸、ヒドロゲル、ポリビニルピロリドン、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、エチレン−酢酸ビニル、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、硫酸プロタミン、またはラクチド／グリコリドコポリマー、ポリラクチド／グリコリドコポリマー、またはエチレン酢酸ビニルコポリマーが挙げられる。例えば、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセルまたはポリ（メタクリル酸メチル）マイクロカプセルの使用によって、それぞれ、コアセルヴェーション技術によってまたは界面重合によって調製されるマイクロカプセル、またはコロイド薬剤送達系に経口薬剤を封入することができる。コロイド状分散系としては、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ミクロビーズ、および脂質ベース系を含み、それには水中油型エマルション、ミセル、混合ミセル、およびリポソームが挙げられる。リポソームの調製方法が、例えば、米国特許第４，２３５，８７１号、４，５０１，７２８号、および４，８３７，０２８号に記載されている。上記の製剤の調製方法は、当業者に明らかである。
【０２３２】
また、活性成分が、不活性固体希釈剤、例えば、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、カオリンまたは微結晶セルロースと混合されている硬ゼラチンカプセルとして、または活性成分が、水または油性媒質、例えば、ピーナッツ油、流動パラフィン、またはオリーブ油と混合されている軟ゼラチンカプセルとして、経口使用のための製剤を示してよい。
【０２３３】
水性懸濁液は、その製造に好適な賦形剤と混合して活性材料を含有する。かかる賦形剤は、懸濁化剤、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントガムおよびアカシアガム；分散剤または湿潤剤、例えば、天然ホスファチド（例えば、レシチン）、または脂肪酸とアルキレンオキシドの縮合物（例えば、ステアリン酸ポリオキシエチレン）、または長鎖脂肪族アルコールとエチレンオキシドの縮合物（例えば、ヘプタデカエチレンオキシセタノール）、または脂肪酸およびヘキシトール由来の部分エステルとエチレンオキシドの縮合物（例えば、ポリオキシエチレンソルビトールモノオレート）、または脂肪酸およびヘキシトール無水物由来の部分エステルとエチレンオキシドの縮合物（例えば、ポリエチレンソルビタンモノオレート）とすることができる。水性懸濁液は、また、１つ以上の防腐剤を含有してよい。
【０２３４】
植物油、例えば、落花生油、オリーブ油、ゴマ油またはヤシ油、または鉱油、例えば、流動パラフィン中に活性成分を懸濁させることによって、油性懸濁液を製剤化してよい。油性懸濁液は、増粘剤、例えば、ビーズワックス、固形パラフィンまたはセチルアルコールを含有してよい。味のいい経口調製物を提供するために、甘味剤、例えば、上に記載のもの、および香味剤を添加してよい。
【０２３５】
水の添加による水性懸濁液の調製に好適な分酸性粉末および顆粒では、分散剤または湿潤剤、懸濁化剤および１つ以上の防腐剤と混合して活性成分を提供する。好適な分散剤または湿潤剤および懸濁化剤は、本明細書に例示されている。
【０２３６】
本開示の医薬組成物は、また、水中油型エマルションの形態としてよい。油相は、植物油、例えば、オリーブ油または落花生油、または鉱油、例えば、流動パラフィン、またはこれらの混合物としてよい。好適な乳化剤は、天然ガム、例えば、アカシアガムまたはトラガカントガム；天然ホスファチド、例えば、大豆、レシチン、および脂肪酸由来のエステルまたは部分エステル；ヘキシトール無水物、例えば、ソルビタンモノオレート；およびエチレンオキシドと部分エステルの縮合物、例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレートとしてよい。
【０２３７】
製剤は、また、急速な分解または身体からの排出に対して組成物を保護するために、担体、例えば、インプラント、リポソーム、ヒドロゲル、プロドラッグおよびマイクロカプセル化送達系を含む制御放出製剤を含むことができる。単独で、またはワックスと組み合わせて、例えば、徐放化材料、例えば、モノステアリン酸グリセリルまたはステアリン酸グリセリルを用いてよい。
【０２３８】
本開示は、薬剤の直腸投与のために坐剤の形態でのポリペプチドの投与を企図する。通常の温度で固体であるが直腸の温度で液体であり、このため薬剤を放出する直腸中で融解する好適な非刺激性賦形剤と薬剤を混合することによって、坐剤を調製することができる。かかる材料としては、カカオバターおよびポリエチレングリコールが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２３９】
本開示によって企図されるポリペプチドは、現在知られている、または将来開発される任意の他の好適な医薬組成物の形態（例えば、鼻または吸入使用のためのスプレー）としてよい。
【０２４０】
製剤中のポリペプチドまたはこれらのフラグメントの濃度は、広く変えることができ（例えば、約０．１重量％未満から、通常、約２重量％または少なくとも約２重量％から２０重量％〜５０重量％以上ほどまで）、通常、主に、例えば、選択された特定の投与方法に従って、液体量、粘度、および対象に基づく要因に基づいて選択される。
【０２４１】
Ｎａｎｏ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉｃａｌのデポ送達技術（Ｎａｎｏ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ；Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、ＣＡ）の使用が、本明細書に企図される。当該技術は、高分子、例えば、タンパク質およびペプチド治療薬のゼロ次放出速度をもたらすチタニアナノチューブ膜を利用する。生体適合性膜は、小さな皮下インプラント中に入れられ、治療用高分子の長期（例えば、１年まで）で定速度の送達をもたらす。当該技術は現在２型糖尿病の治療のためのＧＬＰ−１アゴニストの送達に評価されている。ある特定の実施形態では、本明細書に開示されたポリペプチド（複数可）は、膜を有する製剤としてよい。例えば、ポリペプチドは、膜に含浸させてよい、または膜によって囲まれてよい。膜は、ディスク、管または球体の形状としてよい。ある特定の実施形態では、管は、ナノチューブとしてよい、または球体は、ナノスフェアとしてよい。
【０２４２】
いくつかの実施形態では、患者に貼ることができ、患者に所定の用量のポリペプチドを送達することができるオンボディ送達系を用いることによって本明細書に記載されたポリペプチドを対象に投与してよい。例示的なオンボディ送達系としては、パッチまたはポンプが挙げられる。ある特定の場合では、本明細書に開示されたポリペプチドを投与するために、オンボディ送達系、例えば、Ｎｅｕｌａｓｔａ（登録商標）を送達するのに用いられるオンボディインジェクターを用いてよい。他の実施形態では、患者に本明細書に記載されたポリペプチドを送達するために、浸透ポンプ、例えば、埋込型浸透ポンプ（例えば、ＤＵＲＯＳ（登録商標）ポンプまたはＡＬＺＥＴ（登録商標）浸透ポンプ）を用いてよい。
【０２４３】
投与経路
本開示は、任意の好適な方法での、開示されたポリペプチド、およびこれらの組成物の投与を企図する。好適な投与経路としては、非経口（例えば、筋肉内、静脈内、皮下（例えば、注入またはインプラント）、腹腔内、脳槽内、関節内、腹腔内、脳内（実質内）および脳室内）、経口、経鼻、経腟、舌下、眼内、直腸内、局所（例えば、経皮）、舌下および吸入が挙げられる。
【０２４４】
また、規定された期間にわたって本明細書に開示されたポリペプチドを放出するために、一般に皮下にまたは筋肉内に投与されるデポ注射を用いてよい。デポ注射は、通常、固体ベースまたはオイルベースのいずれかであり、一般に少なくとも１つの本明細書に記載された製剤成分を含む。当業者は、デポ注射の可能性のある製剤および使用をよく知っている。
【０２４５】
抗体に関して、１つの例示的な実施形態では、本開示の抗体または抗体フラグメントが、注入のために４℃で滅菌等張性水性生理食塩溶液中に１０ｍｇ／ｍｌで保存され、対象への投与前に、注入のために１００ｍｌまたは２００ｍｌの０．９％塩化ナトリウム中に希釈される。１時間の間に０．２〜１０ｍｇ／ｋｇの用量で、静脈内注入によって抗体が投与される。他の実施形態では、１５分〜２時間の間に静脈内注入によって抗体が投与される。更に他の実施形態では、投与方法が、皮下ボーラス注入によるものである。
【０２４６】
本開示は、本開示のポリペプチドまたは抗体もしくは抗体フラグメントが、少なくとも１日に２回、少なくとも１日に１回、少なくとも４８時間ごとに１回、少なくとも７２時間ごとに１回、少なくとも１週間に１回、少なくとも２週間ごとに１回、少なくとも１ヶ月に１回、少なくとも２ヶ月ごとに１回、または少なくとも３ヶ月ごとに１回、またはこれより少ない頻度で対象に投与される方法を企図する。
【０２４７】
併用療法
本開示は、１つ以上の活性がある治療用薬剤または他の予防的もしくは治療的モダリティと組み合わせたポリペプチドの使用を企図する。かかる併用療法では、さまざまな活性がある薬剤が、作用の異なる機序を有することが多い。かかる併用療法は、１つ以上の薬剤の用量を減少させ、これにより、１つ以上の薬剤と関係している副作用を減少させる、または除去することによって特に有利となる可能性があり；更に、かかる併用療法は、基にある疾患、障害、または状態への治療的または予防的相乗作用を有する可能性がある。
【０２４８】
本明細書に用いる場合、「併用」は、別々に投与することができる治療法、例えば、別々の投与のために別々に製剤化することができる（例えば、キット中に提供してよい）治療法、および単一製剤で投与することができる（すなわち、「同時処方」）治療法を含むことを意味する。
【０２４９】
ある特定の実施形態では、ポリペプチドが、順次投与される、または塗布される、例えば、１つの薬剤が、１つ以上の他の薬剤の前に投与される。他の実施形態では、ポリペプチドが、同時に投与される、例えば、２つの以上の薬剤が、同じ時間に、またはほぼ同じ時間に投与される；２つの以上の薬剤が、２つの以上の別々の製剤中に、または単一製剤に混合して（すなわち、同時処方）、存在してよい。２つの以上の薬剤が順次または同時に投与されるかどうかに関わらず、これらは、本開示の目的のために併用して投与されると考えられる。
【０２５０】
本開示のポリペプチドは、本明細書に記載された疾患、障害または状態の治療、予防、抑制または改善に有用な他の薬剤と併用することができ、通常、肥満、摂食障害、高血糖、高インスリン血症、グルコース不耐性、および他のグルコース代謝障害を患っている対象に投与されるものを含む。
【０２５１】
本開示は、多くの薬剤（およびこれらのクラス）による併用療法を企図し、以下を含む。１）スルホニル尿素（例えば、クロルプロパミド、トラザミド、アセトヘキサミド、トルブタミド、グリブリド、グリメピリド、グリピジド）およびメグリチニド（例えば、ミチグリニド、レパグリニド（ＰＲＡＮＤＩＮ）およびナテグリニド（ＳＴＡＲＬＩＸ））を含むインスリン、インスリンミメティックおよびインスリン分泌の刺激を必然的に伴う薬剤；２）ビグアニド（例えば、メトホルミン（ＧＬＵＣＯＰＨＡＧＥ）、およびその製剤的に許容可能な塩、特に、メトホルミンヒドロクロリド、およびこれらの放出持続製剤、例えば、Ｇｌｕｍｅｔｚａ（商標）、Ｆｏｒｔａｍｅｔ（商標）、およびＧｌｕｃｏｐｈａｇｅＸＲ（商標））ならびにグルコース利用を促進すること、肝臓グルコース産生を減少させることおよび／または腸グルコース排出を減らすことによって作用する他の薬剤；３）α−グルコシダーゼ阻害剤（例えば、アカルボース、ボグリボースおよびミグリトール）および糖質消化を遅らせ、その結果、腸からの吸収を遅らせ、および食後高血糖を低減する他の薬剤；４）チアゾリジンジオン（例えば、ロシグリタゾン（ＡＶＡＮＤＩＡ）、トログリタゾン（ＲＥＺＵＬＩＮ）、ピオグリタゾン（ＡＣＴＯＳ）、グリピジド、バラグリタゾン、リボグリタゾン、ネトグリタゾン、ＡＭＧ１３１、ＭＢＸ２０４４、ミトグリタゾン、ロベグリタゾン、ＩＤＲ−１０５、トログリタゾン、エングリタゾン、シグリタゾン、アダグリタゾン、ダルグリタゾン（これらは、インスリン、およびインスリンミメティック（例えば、インスリンデグルデク、インスリングラルギン、インスリンリスプロ、インスリンデテミル、インスリングルリシンおよびそれぞれの吸入可能製剤）を含むインスリン作用を向上させ（例えば、インスリン増感作用によって）、その結果、末梢組織中のグルコース利用を促進する）；５）ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤（例えば、アログリプチン、オマリグリプチン、リナグリプチン、ビルダグリプチン（ＧＡＬＶＵＳ）およびシタグリプチンリン（ＪＡＮＵＶＩＡ））を含むグルカゴン様ペプチドならびにグルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）およびＧＬＰ−１アゴニストおよび類似体（例えば、エキセナチド（ＢＹＥＴＴＡおよびＩＴＣＡ６５０（１２ヶ月間にわたってエキセナチド類似体を送達する皮下に挿入される浸透ポンプ；Ｉｎｔａｒｃｉａ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ））ならびにＧＬＰ−１受容体アゴニスト（例えば、デュラグルチド、セマグルチド、アルビグルチド、エキセナチド、リラグルチド、リキシセナチド、タスポグルチド、ＣＪＣ−１１３１、およびＢＩＭ−５１０７７、これらの鼻腔内、経皮、および１週間に１回の製剤を含む）；６）およびＤＰＰ−ＩＶ−耐性類似体（インクレチンミメティック）、ＰＰＡＲγアゴニスト、ＰＰＡＲαアゴニスト例えば、フェノフィブリン酸誘導体（例えば、ゲムフィブロジル、クロフィブレート、シプロフィブレート、フェノフィブレート、ベザフィブレート）、二重作用ＰＰＡＲアゴニスト（例えば、ＺＹＨ２、ＺＹＨ１、ＧＦＴ５０５、チグリタザル、ムラグリタザル、アレグリタザル、ソデルグリタザル、およびナベグリタザル）、汎作用ＰＰＡＲアゴニスト、ＰＴＰ１Ｂ阻害剤（例えば、ＩＳＩＳ−１１３７１５およびＴＴＰ８１４）、ＳＧＬＴ阻害剤（例えば、ＡＳＰ１９４１、ＳＧＬＴ−３、エンパグリフロジン、ダパグリフロジン、カナグリフロジン、ＢＩ−１０７７３、ＰＦ−０４９７１７２９、レモグリフロジン、ＴＳ−０７１、トホグリフロジン、イプラグリフロジン、およびＬＸ−４２１１）、インスリン分泌促進剤、アンジオテンシン変換酵素阻害剤（例えば、アラセプリル、ベナゼプリル、カプトプリル、セロナプリル、シラザプリル、デラプリル、エナラプリル、エナラプリラト、フォシノプリル、イミダプリル、リシノプリル、モベルチプリル、ペリンドプリル、キナプリル、ラミプリル、スピラプリル、テモカプリル、またはトランドラプリル）、アンジオテンシンＩＩ受容体アンタゴニスト（例えば、ロサルタンすなわち、ＣＯＺＡＡＲ（登録商標）、バルサルタン、カンデサルタン、オルメサルタン、テルメサルタンおよび以下と併用されるこれらの薬剤の任意のもの、ヒドロクロロチアジド、例えば、ＨＹＺＡＡＲ（登録商標））または他の抗高血圧薬剤、例えば、ＬＣＺ６９６、ＲＸＲアゴニスト、グリコーゲンシンターゼキナーゼ−３阻害剤、免疫モジュレーター、交感神経抑制薬、β−アドレナリン遮断薬（例えば、プロプラノロール、アテノロール、ビソプロロール、カルベジロール、メトプロロール、または酒石酸メトプロロール）、αアドレナリン遮断薬（例えば、ドキサゾシン、プラゾシンまたはαメチルドーパ）中枢性αアドレナリンアゴニスト、末梢血管拡張薬（例えば、ヒドララジン）；β−３アドレナリン受容体アゴニスト、１１β−ＨＳＤ１阻害剤、中性エンドペプチダーゼ阻害剤（例えば、チオルファンおよびホスホラミドン）、アルドステロンアンタゴニスト、アルドステロンシンターゼ阻害剤、レニン阻害剤（例えば、ジおよびトリペプチドの尿素誘導体（米国特許第５，１１６，８３５号を参照）、アミノ酸および誘導体（米国特許第５，０９５，１１９号および５，１０４，８６９号）、非ペプチド結合により連結されたアミノ酸鎖（米国特許第５，１１４，９３７号）、ジおよびトリペプチド誘導体（米国特許第５，１０６，８３５号）、ペプチジルアミノジオール（米国特許第５，０６３，２０８号および４，８４５，０７９号）およびペプチジルβ−アミノアシルアミノジオールカルバメート（米国特許第５，０８９，４７１号）；また、以下の米国特許第５，０７１，８３７号；５，０６４，９６５号；５，０６３，２０７号；５，０３６，０５４号；５，０３６，０５３号；５，０３４，５１２号および４，８９４，４３７号に開示されたとおりのさまざまな他のペプチド類似体、および小分子レニン阻害剤（ジオールスルホンアミドおよびスルフィニル（米国特許第５，０９８，９２４号）、Ｎ−モルホリノ誘導体（米国特許第５，０５５，４６６号）、Ｎ−複素環式アルコール（米国特許第４，８８５，２９２号）およびピロールイミダゾロン（米国特許第５，０７５，４５１号）；また、ペプスタチン誘導体（米国特許第４，９８０，２８３号）およびスタトン含有ペプチドのフルオロ−およびクロロ−誘導体（米国特許第５，０６６，６４３号）、エナルクレイン、ＲＯ４２−５���９２、Ａ６５３１７、ＣＰ８０７９４、ＥＳ１００５、ＥＳ８８９１、ＳＱ３４０１７、アリスキレン（２（Ｓ），４（Ｓ），５（Ｓ），７（Ｓ）−Ｎ−（２−カルバモイル−２−メチルプロピル）−５−アミノ−４−ヒドロキシ−２，７−ジイソプロピル−８−［４−メトキシ−３−（３−メトキシプロポキシ）−フェニル］−オクタンアミドヘミフマレート）ＳＰＰ６００、ＳＰＰ６３０およびＳＰＰ６３５を含む）、エンドセリン受容体アンタゴニスト、ホスホジエステラーゼ−５阻害剤（例えば、シルデナフィル、タダルフィルおよびバルデナフィル）、血管拡張薬、カルシウムチャンネル遮断薬（例えば、アムロジピン、ニフェジピン、ベラパルミル、ジルチアゼム、ガロパミル、ニルジピン、ニモジピン、ニカルジビン）、カリウムチャネル活性剤（例えば、ニコランジル、ピナシジル、クロマカリム、ミノキシジル、アプリルカリム、ロプラゾラム）、脂質低下薬、例えば、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤、（ラクトンプロドラッグ形態および機能でＺＯＣＯＲ（登録商標）およびＭＥＶＡＣＯＲ（登録商標）として市販され、投与後に阻害剤として機能するシンバスタチンおよびロバスタチンなど）、およびジヒドロキシオープンリング酸ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤の製剤的に許容可能な塩、例えば、アトルバスタチン（特に、ＬＩＰＩＴＯＲ（登録商標）で売られているカルシウム塩）、ロスバスタチン（特にＣＲＥＳＴＯＲ（登録商標）で売られているカルシウム塩）、プラバスタチン（特にＰＲＡＶＡＣＨＯＬ（登録商標）で売られているナトリウム塩）、セリバスタチン、およびフルバスタチン（特にＬＥＳＣＯＬ（登録商標）で売られているナトリウム塩）；コレステロール吸収阻害剤、例えば、エゼチミブ（ＺＥＴＩＡ（登録商標）および他のいずれかの脂質低下薬と併用されるエゼチミブ、例えば、上述のＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤および特にシンバスタチン（ＶＹＴＯＲＩＮ（登録商標））またはアトルバスタチンカルシウムと併用されるもの；ＨＤＬ増加薬、（例えば、ナイアシンおよびニコチン酸受容体アゴニスト、およびこれらの放出持続または放出制御型、および／またはＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤と併用されるもの；ナイアシン受容体アゴニスト、例えば、アシピモックスおよびアシフラン、ならびにナイアシン受容体部分アゴニスト；グルカゴン受容体アンタゴニスト（例えば、ＭＫ−３５７７、ＭＫ−０８９３、ＬＹ−２４０９０２１およびＫＴ６−９７１）；胆汁酸封鎖剤（例えば、コレスチラン、コレスチミド、コレセバラムヒドロクロリド、コレスチポール、コレスチラミン、および架橋デキストランのジアルキルアミノアルキル誘導体）、アシルＣｏＡ：コレステロールアシルトランスフェラーゼ阻害剤、（例えば、アバシミブ）；炎症状態での使用を意図した薬剤、例えば、アスピリン、非ステロイド系抗炎症薬すなわちＮＳＡＩＤ、グルココルチコイド、および選択的シクロオキシゲナーゼ−２またはＣＯＸ−２阻害剤；グルコキナーゼアクチベーター（ＧＫＡ）（例えば、ＡＺＤ６３７０）；１１β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ１型の阻害剤（例えば、米国特許第６，７３０，６９０号、およびＬＹ−２５２３１９９に開��されたもの）；ＣＥＴＰ阻害剤（例えば、アナセトラピブ、エバセトラピブ、およびトルセトラピブ）；フルクトース１，６−ビスホスファターゼの阻害剤、（例えば、米国特許第．６，０５４，５８７号；６，１１０，９０３号；６，２８４，７４８号；６，３９９，７８２号；および６，４８９，４７６号に開示されたもの）；アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ−１または２（ＡＣＣ１またはＡＣＣ２）の阻害剤；ＰＣＳＫ９阻害剤；ＧＰＲ−４０部分アゴニスト；ＳＣＤモジュレーター；脂肪酸シンターゼの阻害剤；アミリンおよびアミリン類似体（例えば、プラムリンチド）；化学的に可能な場合上述の活性薬剤の製剤的に許容可能な塩形態を含む。
【０２５２】
更に、本開示は、体重減少を促進するための薬剤および方法、例えば、代謝を刺激する、または食欲を減少させる薬剤、ならびに体重減少を促進するための食事および／または運動修正計画との併用療法を企図する。
【０２５３】
本開示のポリペプチドは、環境下で好適な方法で、１つ以上の他の薬剤と併用して、用いてよい。１つの実施形態では、少なくとも１つの活性薬剤および少なくとも１つの本開示のポリペプチドによる治療が、一定の時間の間に維持される。もう１つの実施形態では、少なくとも１つの活性薬剤による治療が、減らされ、または中止され（例えば、対象が安定している場合）、一方、本開示のポリペプチド（複数可）による治療が、一定の投与計画で維持される。更なる実施形態では、少なくとも１つの活性薬剤による治療が、減らされ、または中止され（例えば、対象が安定している場合）、一方、本開示のポリペプチド（複数可）による治療が、減らされる（例えば、用量を減らし、投与の頻度を減らす、または治療計画を短くする）。更に別の実施形態では、少なくとも１つの活性薬剤による治療が、減らされ、または中止され（例えば、対象が安定している場合）、本開示のポリペプチド（複数可）による治療が、増やされる（例えば、用量を増やし、投与の頻度を増やす、または治療計画を長くする）。更に別の実施形態では、少なくとも１つの活性薬剤による治療が、維持され、本開示のポリペプチド（複数可）による治療が、減らされ、または中止される（例えば、用量を減らし、投与の頻度を減らす、または治療計画を短くする）。更に別の実施形態では、少なくとも１つの活性薬剤による治療および本開示のポリペプチド（複数可）による治療が、減らされ、または中止される（例えば、用量を減らし、投与の頻度を減らす、または治療計画を短くする）。
【０２５４】
投薬
本開示のポリペプチドは、例えば、投与の目標（例えば、所望の消散の程度）；治療される対象の年齢、体重、性別、および健康および身体的状態；投与されるポリペプチドおよび／または製剤の性質；投与経路；およびこれらの疾患、障害、状態または症状の性質（例えば、グルコース／インスリンの調節異常の重症度および障害のステージ）に依存した量で、対象に投与してよい。投与計画では、また、投与される薬剤（複数可）と関係している副作用の存在、性質、および程度を考慮してよい。例えば、安全性および用量漸増試験、ｉｎ  ｖｉｖｏ試験（例えば、動物モデル）、および当業者に知られる他の方法によって、効果的用量および用量計画を容易に決定することができる。
【０２５５】
一般に、投与パラメーターにより、用量が、対象に不可逆的に毒性がある可能性がある量（すなわち、最大耐性服用量、「ＭＴＤ」）未満となり、対象への計測可能な作用が生じるために必要な量未満にならないように要求される。投与経路および他の因子を考慮に入れ、例えば、吸収、分配、代謝、および排出（「ＡＤＭＥ」）と関係している薬物動態学的および薬力学的パラメーターによって、かかる量が決定される。
【０２５６】
有効量（ＥＤ）は、薬剤を服用する対象のある一定の割合において、治療反応または所望の作用を生じる薬剤の用量または量である。薬剤の「半有効量」またはＥＤ５０は、投与される集団の５０％で治療反応または所望の作用を生じる薬剤の用量または量である。ＥＤ５０は、一般に薬剤の作用の妥当な期待の測定値として用いられるが、必ずしも、臨床医がすべての関連要因を考慮に入れた、好適と考える用量であるとは限らない。したがって、いくつかの状況では、有効量は、ＥＤ５０の計算値以上であり、他の状況では、有効量は、ＥＤ５０の計算値未満であり、更に他の状況では、有効量は、ＥＤ５０計算値と同じである。
【０２５７】
また、本開示のポリペプチド（複数可）の有効量は、対象に１つ以上の用量で投与される場合、健康な対象と比較して所望の結果を生じる量としてよい。例えば、有効量は、血漿グルコースおよび／または血漿インスリンが上昇している対象に投与される場合、健康な対象と比較して少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または８０％超、所望の減少が実現する用量としてよい。
【０２５８】
好適な用量レベルは、一般に、単一または複数の用量で投与することができる１日当たり患者体重の約０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇとなる。いくつかの実施形態では、用量レベルが、１日当たり約０．０１〜約２５ｍｇ／ｋｇとなり、他の実施形態では、１日当たり約０．０５〜約１０ｍｇ／ｋｇとなる。好適な用量レベルは、１日当たり約０．０１〜２５ｍｇ／ｋｇ、１日当たり約０．０５〜１０ｍｇ／ｋｇ、または１日当たり約０．１〜５ｍｇ／ｋｇとしてよい。この範囲内では、用量は、１日当たり０．００５〜０．０５、０．０５〜０．５または０．５〜５．０ｍｇ／ｋｇとしてよい。
【０２５９】
経口薬剤の投与では、組成物は、１．０〜１０００ミリグラムの有効成分、特に１．０、３．０、５．０、１０．０、１５．０、２０．０、２５．０、５０．０、７５．０、１００．０、１５０．０、２００．０、２５０．０、３００．０、４００．０、５００．０、６００．０、７５０．０、８００．０、９００．０、および１０００．０ミリグラムの有効成分を含有する錠剤、カプセルなどの形態で提供することができる。ポリペプチド（複数可）は、例えば、１日当たり１〜４時間の計画で投与してよく、１日当たり１回または２回で投与されることが多い。
【０２６０】
本開示のポリペプチド（複数可）の用量は、好適な頻度で繰り返してよく、頻度は、ポリペプチド（複数可）の薬物動態（例えば半減期）および薬力学的反応（例えばポリペプチド（複数可）の治療用作用の持続時間）に応じて、１日当たり１回〜３ヶ月ごとに１回の範囲としてよい。いくつかの実施形態では、投与が、１週間当たり１回〜３ヶ月ごとに１回の頻度で繰り返される。他の実施形態では、ポリペプチド（複数可）が、１ヶ月当たり約１回で投与される。
【０２６１】
ある特定の実施形態では、開示されたポリペプチド（複数可）の用量が、「単位剤形」に含有されている。「単位剤形」という語句は、物理的に別個の単位を指し、各単位が、単独で、または１つ以上の追加の薬剤と併用して、所望の作用を生じさせるのに十分な本開示のポリペプチド（複数可）の所定量を含有する。単位剤形のパラメーターは、特定の薬剤および実現される作用に依存すると理解される。
【０２６２】
キット
本開示は、また、開示されたポリペプチド（複数可）、およびこれらの医薬組成物を含むキットを企図する。キットは、一般に以下に記載したとおり、さまざまな構成部品を収納する物理的構造の形態であり、例えば、上記方法（例えば、体重減少が必要な対象へのポリペプチド（複数可）の投与）を実施するのに使用してよい。
【０２６３】
キットは、１つ以上の本明細書に開示されたポリペプチド（複数可）（例えば、滅菌容器中に提供される）を含むことができ、これは、対象への投与に好適な医薬組成物の形態としてよい。ポリペプチド（複数可）は、使用準備済の形態で、または、例えば、投与前に再構成または希釈が必要な形態で提供することができる。ポリペプチド（複数可）が、使用者によって再構成が必要な形態である場合、キットは、また、ポリペプチド（複数可）とともにパッケージされ、またはポリペプチド（複数可）から分離されてパッケージされる、緩衝剤、製剤的に許容可能な賦形剤などを含んでよい。併用療法が企図される場合、キットは、別々にいくつかの薬剤を含有してよい、またはあらかじめキット中に組み合わせてよい。個々の容器内にキットの各構成部品を内包することができ、さまざまな容器のすべてを単一パッケージ内とすることができる。本開示のキットは、その中に収納された構成部品を適切に維持するのに必要な条件（例えば、冷凍または凍結）のために設計することができる。
【０２６４】
キットは、その中の構成部品の情報を確認することおよびそれらの使用の説明書（例えば、作用の機序、薬物動態および薬力学、副作用、禁忌などを含む有効成分（複数可）の投与パラメーター、臨床的薬理）を含むラベルまたは添付文書を含有してよい。ラベルまたは添付文書は、製造者情報、例えば、ロット番号および使用期限を含むことができる。ラベルまたは添付文書は、例えば、物理的構造内に別々に含有され、またはキットの構成部品（例えば、アンプル、管またはバイアル）に取り付けられ、構成部品を収納する物理的構造中に統合してよい。例示的な説明書としては、開示されたモジュレーター、およびこれらの医薬組成物ともに、血中グルコースの減少または低下、高血糖の治療、糖尿病の治療などが挙げられる。
【０２６５】
ラベルまたは添付文書は、追加で、コンピュータ読取可能媒体、例えば、ディスク（例えば、ハードディスク、カード、メモリーディスク）、光ディスク、例えば、ＣＤ−もしくはＤＶＤ−ＲＯＭ／ＲＡＭ、ＤＶＤ、ＭＰ３、磁気テープ、または電気ストレージメディア、例えば、ＲＡＭおよびＲＯＭもしくはこれらのハイブリッド、例えば、磁気／光ストレージメディア、フラッシュメディアもしくはメモリー型カードを含むことができる、またはこれらに組み入れることができる。いくつかの実施形態では、実際の説明書が、キット中に存在していないが、遠隔源から、例えば、インターネットを介して説明書を得るための手段が、提供される。
【実施例】
【０２６６】
実験
以下の実施例は、本発明の実施方法および使用方法の包括的な開示および説明を当業者に提供するために記載され、発明者が自身の発明と考えるものの範囲を制限することを意図せず、以下の実験が、実施した全実験または唯一の実験であることを示すことも意図しない。用いられる数（例えば、量、温度など）に関して正確さを確保するために努力がなされてきたが、いくつかの実験誤差および偏差を考慮なければならない。
【０２６７】
別途特に指示がないかぎり、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏温度（℃）であり、圧力は大気圧または近大気圧である。以下を含む標準略語が用いられ得る：ｂｐ＝塩基対（複数可）；Ｋｂ＝キロベース（複数可）；ｐｌ＝ピコリットル（（複数可））；ｓまたはｓｅｃ＝秒（（複数可））；ｍｉｎ＝分（（複数可））；ｈまたはｈｒ＝時間（（複数可））；ａａ＝アミノ酸（（複数可））；ｋｂ＝キロベース（（複数可））；ｎｔ＝ヌクレオチド（（複数可））；ｎｇ＝ナノグラム；μｇ＝マイクログラム；ｍｇ＝ミリグラム；ｇ＝グラム；ｋｇ＝キログラム；ｄｌまたはｄＬ＝デシリットル；μｌまたはμＬ＝ミクロリットル；ｍｌまたはｍＬ＝ミリメートル；ｌまたはＬ＝リットル；μＭ＝マイクロモル；ｍＭ＝ミリモル；Ｍ＝モル；ＫＤａ＝キロダルトン；ｉｍ＝筋肉内の（筋肉内で）；ｉｐ＝腹腔内の（腹腔内で）；ｓｃ＝皮下の（皮下で）；ｂｉｄ＝１日に２回；ＨＰＬＣ＝高速液体クロマトグラフィー；ＢＷ＝体重；Ｕ＝単位；ｎｓ＝統計的に有意でない；ＰＧ＝空腹時血漿グルコース；ＦＰＩ＝空腹時血漿インスリン；ＩＴＴ＝インスリン耐性試験；ＰＴＴ＝ピルビン酸耐性試験；ｏＧＴＴ＝経口グルコース負荷試験；ＧＳＩＳ＝グルコース刺激インスリン分泌；ＰＢＳ＝ホスフェート緩衝生理食塩水；ＰＣＲ＝ポリメラーゼ鎖反応；ＮＨＳ＝Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド；ＤＭＥＭ＝ダルベッコ修飾イーグル培地；ＧＣ＝ゲノムコピー；ＥＤＴＡ＝エチレンジアミンテトラ酢酸。
【０２６８】
材料および方法
以下の実施例では、以下の方法および材料が用いられる。
【０２６９】
動物  １２〜２０週間、６０ｋｃａｌ％脂肪、２０ｋｃａｌ％タンパク質および２０ｋｃａｌ％糖質を含有する高脂肪食餌（Ｄ１２４９２、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ、ＮＪ）で、食餌性肥満（ＤＩＯ）オスＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）を維持した。全動物試験が、動物実験委員会によって承認された。ＤＩＯ  Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスが、肥満のヒト様モデルを提供し、肥満は、カロリーの過剰摂取に基づいている。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスは、肥満傾向があり、明らかな体重増、ならびに高インスリン血症が観察され、時には高血糖が観察されている。この株が、食餌性肥満をモデル化するために最も一般に用いられるマウス株である。（Ｎｉｌｓｓｏｎ  Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｃｔａ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａ  Ｓｉｎｉｃａ（２０１２）３３：１７３−１８１）。
【０２７０】
核酸およびアミノ酸配列  ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＣ０００５２９．２が、ヒトＧＤＦ１５変異体をコードするＯＲＦのｃＤＮＡを示し、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００４８５５．２が、当該ｃＤＮＡによってコードされたアミノ酸配列を示す。ホモサピエンス血清アルブミンｃＤＮＡをＯｒｉｇｅｎｅ（ＳＣ３１９９３７）から購入した（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００４７７．３、ＮＰ＿０００４６８）。
【０２７１】
ＰｍｅＩおよびＥｃｏＲＩ部位の間のｐＴＴ５ベクター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｕｎｃｉｌ  Ｃａｎａｄａ）に、コザックエレメントおよびヒトＩｇＫ−シグナルペプチド配列
0006704358.tif 000027
を挿入した。両制限部位を除去し、更にインフレームクローニングのためにＡｇｅＩ部位を形成した。ｈＩｇＫ−ＧＤＦ１５コンストラクトを形成するために、フォワードプライマー：
0006704358.tif 000028
およびリバースプライマー：
0006704358.tif 000029
およびＳａｐｐｈｉｒｅ  ＰＣＲ  ミックス（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて、ＰＣＲによってＧＤＦ１５ＤＮＡを増幅した。ＰＣＲ生成物をゲル精製（Ｑｉａｇｅｎ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット）し、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いてｐＴＴ５−ｈＩｇＫ（ＡｇｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで線状化）中にクローン化した。ｈＩｇＫ−ＨＳＡ−リンカー−ＧＤＦ１５コンストラクトを形成するために、個々に好適なプライマーを用いてＰＣＲによってＨＳＡ−リンカーおよびＧＤＦ１５を増幅した。ゲル精製後、Ｇｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘを用いて、２つのＰＣＲフラグメントおよび線状化ｐＴＴ５ベクターを構成した。星状またはＮＥＢ５α−細胞それぞれをＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎおよびギブソン反応で形質転換し、カルベニシリンを含有するＬＢ−寒天プレート上にプレートし、３７℃で一晩、インキュベートした。単一コロニーを選択し、シークエンシングによって分析した。陽性コロニーからのＤＮＡを精製し（ＤＮＡ−Ｍａｘｉ−ｐｒｅｐ、Ｑｉａｇｅｎ）、完全配列を確認し、これを用いて、組換えタンパク質発現のために哺乳動物細胞をトランスフェクトした。
【０２７２】
特定の突然変異タンパク質を形成するために、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇキット（Ａｇｉｌｅｎｔ）および好適なプライマーで部位特異的突然変異生成を実施した。
【０２７３】
一時的発現  Ｅｘｐｉ  ２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中で全ＧＤＦ１５突然変異タンパク質を一時的にトランスフェクトした。Ｅｘｐｉ発現培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で、通常通りに細胞を二次培養し、さまざまなサイズの振とうフラスコ中に懸濁培養として維持した。典型的には、細胞を二次培養前に、３日間、成長させ、５ｅ５生存可能細胞／ｍｌの細胞密度で二次培養した。３７℃および５％ＣＯ２レベルで維持された加湿ＣＯ２インキュベーター中にフラスコを維持した。１２０ＲＰＭの撹拌速度で、Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋシェーカープラットフォーム（Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅｄｉｓｏｎ、ＮＪ）上に、細胞を維持した。
【０２７４】
培養物の細胞密度が、９５％以上の生存能力で２．５ｅ６生存可能細胞／ｍｌに達した場合、トランスフェクションを実施した。典型的には、５０ｍｌトランスフェクションでは、２５０ｍｌ振とうフラスコ中で、４２．５ｍｌ培養容量で、２．５ｅ６細胞／ｍｌＸ５０ｍｌ細胞に接種した。２．５ｍｌＯＰＴＩ−ＭＥＭ血清低減培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で、目的の遺伝子を含有する発現ベクターからなる５０μｇプラスミドＤＮＡを最初に希釈した。同時に、また、２．５ｍｌＯＰＴＩ−ＭＥＭ血清低減培地中で、Ｅｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅトランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、２．６７倍の容量（プラスミドＤＮＡ量の）に希釈した。室温で５分のインキュベーション後に、トランスフェクションコンピテント複合体を形成するために、ゆっくりと希釈したプラスミドＤＮＡに希釈したトランスフェクション試薬を添加した。室温で２０分間のインキュベーション後に、４２．５ｍｌ細胞培養に５ｍｌのトランスフェクション複合体を添加した。その後、１２０ＲＰＭに維持したオービタルシェーカー上の加湿ＣＯ２インキュベーター中にトランスフェクトされた細胞を入れた。トランスフェクションの２４時間後、トランスフェクトされた培養に２５０μｌエンハンサー１溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および２．５ｍｌエンハンサー２溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を供給した。その後、再び、オービタルシェーカー上の加湿ＣＯ２インキュベーター中に培養を入れた。トランスフェクションの６〜７日後、０．２μｍフィルター（Ｎａｌｇｅｎｅ）を介して濾過する前に、３０分間、３０００ＲＰＭで遠心分離することによって培養を採集した。その後、発現のためのクマシー染色ゲル上で試料を分析した。
【０２７５】
安定したＣＨＯ細胞発現  ＣＨＯＫ１ＳＶ細胞のためのロンザの確立した発現システムに基づいているＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ宿主細胞株によるＧＳ  Ｘｃｅｅｄ（商標）システムから安定してＧＤＦ１５突然変異タンパク質を発現させた。ＧＳ  Ｘｃｅｅｄシステムにより、高発現細胞株が可能になり、ｃＧＭＰ製造に好適なものが生成される。当該システムは、ｃＧＭＰバンク化ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ宿主細胞、ＧＳ発現ベクター、細胞培養の全プロトコール、トランスフェクション、細胞株の選択およびスクリーニング、およびＶ８生成プロセス（培地および餌料）を含む。ＧＤＦ１５突然変異タンパク質のための細胞株を発現するため、製造者の提案した推奨は、最初に非クローン化細胞株を確立するため、以下のとおりである。その後、高発現単一細胞クローンを単離するために、非クローン化細胞株に限界希釈クローニングを行う。
【０２７６】
ＧＤＦ１５組換えタンパク質の精製  ブルーセファロースアフィニティーキャプチャーまたはイオン−交換キャプチャーを用いて、培養培地からＨＳＡ−ＧＤＦ１５融合を精製した。いずれの場合でも、宿主細胞タンパク質不純物からの最適な溶離および分離の助けとなる好適な塩／ｐＨ条件の勾配を用いて、ＨＳＡ−ＧＤＦ１５融合を溶離させた。その後、更にＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００（２６／６０）カラムを用いて、泳動緩衝液として１ＸＰＢＳを用いて、全ＨＳＡ−ＧＤＦ１５融合を精製した。更に、ＬＣ／ＭＳ（Ａｇｉｌｅｎｔ  ６５００−シリーズＱ−ＴＯＦ）で、精製した融合物を特徴づけ、配列を確認し、ゲル−ろ過−ＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ  １２００−ＨＰＬＣ）ならびにクマシーおよび／またはシルバー染色付きＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（非還元および還元）によって、単分散性を確認した。ｉｎ  ｖｉｖｏ実験では、エンドトキシンが、皮下注入のため５ＥＵ／ｍｇ未満であることを確認した。
【０２７７】
イオン−交換キャプチャーを用いて、培養培地からＧＤＦ１５グリコシル化突然変異タンパク質を精製した。すべての場合で、宿主細胞タンパク質不純物からの溶離および分離の助けとなる好適な塩／ｐＨの勾配を用いて、ＧＤＦ１５突然変異タンパク質を溶離させた。その後、更に、ｐＨ８．０で、ＧＥ  ＨｉＴｒａｐ  Ｐｈｅｎｙｌ  ＨＰを用いて、硫酸アンモニウムの直線減少勾配を用いて、全ＧＤＦ１５突然変異タンパク質を精製した。非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上のゲル−シフトによる純度およびグリコシル化特性に基づいて、フラクションを評価し、プールした。その後、更に、ＬＣ／ＭＳ（Ａｇｉｌｅｎｔ  ６５００−シリーズＱ−ＴＯＦ）により、各ＧＤＦ１５突然変異タンパク質の最終プールを特徴づけ、配列／グリカンを確認し（＋／−ＰＮＧａｓｅＦ、ＮＥＢカタログ番号Ｐ０７０４Ｓ）、ゲル−ろ過−ＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ  １２００−ＨＰＬＣ）ならびにクマシーおよび／またはシルバー染色付きＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（非還元および還元）によって、単分散性を確認した。ｐＨ４．０で、１０ｍＭ酢酸ナトリウム中で、全ＧＤＦ１５突然変異タンパク質を製剤化した。
【０２７８】
ヒトＧＤＦ１５突然変異タンパク質の溶解度評価  再生ニトロセルロース１０、０００ＮＭＷＬ（ＵＦＣ９０１０９６）（いくつかの場合では、１０ｍｇ／ｍＬ超）からなるＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  Ｆｉｌｔｅｒｓを用いて、０．０１％（ｖ／ｖ）ギ酸（ｐＨ２．０）中に突然変異タンパク質を透析により分離し、濃縮した。２８０ｎｍ波長の吸光度およびベールの法則（吸光係数＝１４４００、分子量＝１２、２８７Ｄａ）を用いて、各突然変異タンパク質の開始濃度を測定した。その後、０．０１％ギ酸中に２倍に各突然変異タンパク質を連続希釈し、９６ウェルプレートに９０μＬの各希釈液を添加した。各ウェルに１０μＬの１０ＸＰＢＳ（０．５ＭトリスｐＨ７．０を含有する）を添加し、ｐＨが７であるのを確認した。続いて一晩、振とうしながら、室温でインキュベーションし、３７０ｎｍで、濁度を測定した。混濁が生じ始める変曲点を各突然変異タンパク質の最大溶解度として受け入れる。それらの溶解度のレベルに応じて、突然変異タンパク質を５つの群の１つに分類した：＜０．２ｍｇ／ｍＬ＝＋；≧０．２ｍｇ／ｍＬ＝＋＋；≧０．５ｍｇ／ｍＬ＝＋＋＋；≧１．０ｍｇ／ｍＬ＝＋＋＋＋；≧５．０ｍｇ／ｍＬ＝＋＋＋＋＋。
【実施例１】
【０２７９】
安定化ＨＳＡ−ＧＤＦ１５融合分子のエンジニアリング
コンストラクトＭ１の発現が、ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳＫＯ安定細胞株中の生成物チャレンジを示した（図４）。細胞培養媒質中で、ＨＳＡ−ＧＤＦ１５二量体融合分子の有意なクリッピングが観察された。更に特性付けのために濃縮された種の供給源を生成するために、イオン−交換および／または疎水性相互作用クロマトグラフィーおよび／またはゲルろ過を用いてクリップ種を単離した。続いて、Ａｇｉｌｅｎｔ６５００−シリーズＱ−ＴＯＦ上でＬＣ／ＭＳ分析を行い、クリッピングの部位が、ＨＳＡ融合のＣ末端、リンカー、およびＧＤＦ１５のＮ末端中で、明らかであった。コンストラクトＭ１からの主な種が、以下のとおり（リンカー＝下線、ＧＤＦ１５＝太字）、確認された。
【０２８０】
種１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０３）：
0006704358.tif 000030
【０２８１】
種２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０４）：
0006704358.tif 000031
【０２８２】
種３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０５）：
0006704358.tif 000032
【０２８３】
種３が、成熟ヒト血清アルブミンアミノ酸配列およびリンカー配列の１つの（第１の）アミノ酸を含むことを明記する。種１および２は、成熟ヒト血清アルブミンアミノ酸配列のＣ末端で、最後の８つのアミノ酸および最後の１つのアミノ酸を欠損している。
【０２８４】
種４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０６）：
0006704358.tif 000033
【０２８５】
種５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０７）：
0006704358.tif 000034
【０２８６】
融合分子のリンカー領域の近くで観察されたクリッピングの問題を最小化し、正すために、コンストラクトＭ１と同等であるが、ＧＤＦ１５中の最初の３つのＮ末端側残基が切断された（ΔＡＲＮまたはΔＮ３）コンストラクトＭ２を設計した（図３）。得られた安定化Ｍ２コンストラクトは、ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳＫＯ安定細胞株中で発現した場合、各発現したコンストラクトの条件付き培地と比較した場合、Ｍ１で観察されたものと同じように最小のクリッピングの問題を示した。図４は、Ｍ１で観察された重大なクリッピングおよびコンストラクトＭ２の安定度を示している。
【０２８７】
コンストラクトＭ２で観察された安定度向上に基づいて、更に最適なリンカー長さおよびクリッピング可能性のためにエンジニアリングを実施した。［（Ｇ４Ｓ）］５の最適化したリンカー長さを実現し、３つの残基（Ｍ３−ΔＡＲＮまたはΔＮ３）または６つの残基（Ｍ４−ΔＡＲＮＧＤＨまたはΔＮ６）のいずれかのＧＤＦ１５Ｎ末端側欠失とつなげた（図５を参照）。
【実施例２】
【０２８８】
ＤＩＯマウスモデルでの安定度向上ＨＳＡ−ＧＤＦ１５融合分子の体重および食物摂取への作用
７日間にわたり、組換えヒトＧＤＦ１５に融合された組換えＨＳＡを有する皮下に投与された融合分子の体重および食物摂取への作用を評価した。簡潔にいうと、体重約３８ｇ〜４０ｇのＤＩＯマウスに、４ｎｍｏｌ／ｋｇ、１２ｎｍｏｌ／ｋｇおよび４０ｎｍｏｌ／ｋｇの用量で、単一皮下ボーラス注入（１０ｍＬ／ｋｇ）として、融合タンパク質Ｍ１（図３）、Ｍ３およびＭ４（図５）を投与した。ビヒクル対照または融合タンパク質の投与に続いて、有効性をモニターするために、投与後２４時間および７日間、体重および食物摂取をモニターした。４０ｎｍｏｌ／ｋｇの用量で投与されたＤＩＯマウスで得られた結果を図６および７に示している。
【０２８９】
図６に示したとおり、４０ｎｍｏｌ／ｋｇ（４ｎｍｏｌ／ｋｇおよび１２ｎｍｏｌ／ｋｇは、示していない）の用量で融合タンパク質を投与した結果、食物摂取減少に有意な改善がみられた。マウスの各群（ｎ＝８）で、対応のないスチューデントのｔ検定によって、それぞれの特定の時点で、さまざまな濃度での食物摂取をビヒクル対照群と比較して、ｐ値（＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１、ｎｓ＝有意でない）を測定した。
【０２９０】
図６を参照すると、融合タンパク質対ビヒクル対照の投与後２４時間（第１日）に、以下の食物摂取減少の結果となった（ビヒクル＝２．８ｇ＋／−０．１３ｇ）：４ｎｍｏｌ／ｋｇ用量群（Ｍ１＝１．９ｇ＋／−０．２５ｇ、＊＊；Ｍ３＝１．８ｇ＋／−０．１８ｇ、＊＊＊；Ｍ４＝１．８ｇ＋／−０．１０ｇ、＊＊＊）、１２ｎｍｏｌ／ｋｇ用量群（Ｍ１＝１．５ｇ＋／−０．１９ｇ、＊＊＊；Ｍ３＝１．９ｇ＋／−０．１６ｇ、＊＊＊；Ｍ４＝１．７ｇ＋／−０．１２ｇ、＊＊＊）、および４０ｎｍｏｌ／ｋｇ用量群（Ｍ１＝１．３ｇ＋／−０．１１ｇ、＊＊＊；Ｍ３＝１．８ｇ＋／−０．０６ｇ、＊＊＊；Ｍ４＝１．５ｇ＋／−０．１５ｇ、＊＊＊）。融合分子対ビヒクル対照の投与後７日に、以下の食物摂取減少の結果となった（ビヒクル＝２．７ｇ＋／−０．０９ｇ）：４ｎｍｏｌ／ｋｇ用量群（Ｍ１＝２．０＋／−０．１８ｇ、＊＊；Ｍ３＝２．５ｇ＋／−０．０８ｇ、ｎｓ；Ｍ４＝２．５ｇ＋／−０．０９ｇ、ｎｓ）、１２ｎｍｏｌ／ｋｇ用量群（Ｍ１＝２．０ｇ＋／−０．２０ｇ、＊＊；Ｍ３＝２．２ｇ＋／−０．１７ｇ、＊；Ｍ４＝２．４ｇ＋／−０．２８ｇ、ｎｓ）および４０ｎｍｏｌ／ｋｇ用量群（Ｍ１＝１．７ｇ＋／−０．１４ｇ、＊＊＊；Ｍ３＝２．４ｇ＋／−０．２５ｇ、ｎｓ；Ｍ４＝２．２ｇ＋／−０．２４ｇ、ｎｓ）。
【０２９１】
図７に示したとおり、４０ｎｍｏｌ／ｋｇ（４ｎｍｏｌ／ｋｇおよび１２ｎｍｏｌ／ｋｇは、示していない）の用量で融合分子を投与した結果、体重で有意な減少がみられた。マウスの各群（ｎ＝８）で、対応のないスチューデントのｔ検定によって、それぞれの特定の時点で、さまざまな濃度での食物摂取をビヒクル対照群と比較して、ｐ値（＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１、ｎｓ＝有意でない）を測定した。
【０２９２】
図７を参照すると、融合分子対ビヒクル対照の投与前の投与時（第０日）に、以下の体重が記録された（ビヒクル＝３９．０ｇ＋／−０．９２ｇ）：４ｎｍｏｌ／ｋｇ用量群（Ｍ１＝３９．２ｇ＋／−０．６６ｇ；Ｍ３＝３９．４ｇ＋／−０．９１ｇ；Ｍ４＝３９．３ｇ＋／−０．７７ｇ）、１２ｎｍｏｌ／ｋｇ用量群（Ｍ１＝３９．４ｇ＋／−０．７８ｇ；Ｍ３＝３９．３ｇ＋／−１．０９ｇ；Ｍ４＝３９．３ｇ＋／−０．８１ｇ）、および４０ｎｍｏｌ／ｋｇ用量群（Ｍ１＝３９．２ｇ＋／−０．６４ｇ；Ｍ３＝３９．２ｇ＋／−０．６８ｇ；Ｍ４＝３８．９ｇ＋／−０．６０ｇ）。融合分子対ビヒクル対照の投与後２４時間（第１日）に、以下の体重が記録された（％減少＝デルタ差対投与前の用量群の体重）。ビヒクル＝＋０．３ｇ＋／−０．１１ｇ、＋０．６％）、４ｎｍｏｌ／ｋｇ用量群（Ｍ１＝−０．６ｇ＋／−０．２１ｇ、−１．５％、＊＊＊；Ｍ３＝−０．６ｇ＋／−０．１７ｇ、−１．６％、＊＊＊；Ｍ４＝−０．９ｇ＋／−０．１３ｇ、−２．４％、＊＊＊）、１２ｎｍｏｌ／ｋｇ用量群（Ｍ１＝−０．９ｇ＋／−０．１１ｇ、−２．３％、＊＊＊；Ｍ３＝−０．７ｇ＋／−０．１８ｇ、−１．６％、＊＊＊；Ｍ４＝−０．６ｇ＋／−０．１６ｇ、−１．７％、＊＊＊）、および４０ｎｍｏｌ／ｋｇ用量群（Ｍ１＝−１．０ｇ＋／−０．１４ｇ、−２．５％、＊＊＊；Ｍ３＝−０．６ｇ＋／−０．０９ｇ、−１．５％、＊＊＊；Ｍ４＝−０．８ｇ＋／−０．２２ｇ、−２．１％、＊＊＊）。融合分子対ビヒクル対照の投与後７日に、以下の体重が記録された（％減少＝デルタ差対投与前の用量群の体重）。ビヒクル＝＋１．２ｇ＋／−０．２５ｇ、＋３．１％）、４ｎｍｏｌ／ｋｇ用量群（Ｍ１＝−１．３ｇ＋／−０．３０ｇ、−３．３％、＊＊＊；Ｍ３＝−１．１ｇ＋／−０．３２ｇ、−２．８％、＊＊＊；Ｍ４＝−２．０ｇ＋／−０．２９ｇ、−５．０％、＊＊＊）、１２ｎｍｏｌ／ｋｇ用量群（Ｍ１＝−１．８ｇ＋／−０．３４ｇ、−４．７％、＊＊＊；Ｍ３＝−１．４ｇ＋／−０．４３ｇ、−３．６％、＊＊＊；Ｍ４＝−１．５ｇ＋／−０．３２ｇ、−３．７％、＊＊＊）、および４０ｎｍｏｌ／ｋｇ用量群（Ｍ１＝−２．６ｇ＋／−０．２８ｇ、−６．７％、＊＊＊；Ｍ３＝−２．１ｇ＋／−０．２８ｇ、−５．４％、＊＊＊；Ｍ４＝−２．６ｇ＋／−０．３１ｇ、−６．７％、＊＊＊）。
【０２９３】
図６および７のデータは、リンカー最適化およびＧＤＦ１５のＮ末端側切断を有するＨＳＡ融合が、活性があること、およびかかる融合分子が、ＧＤＦ１５分子の特定の有益な特性を向上させるための実行可能なアプローチであることを示す。
【実施例３】
【０２９４】
改善した物理的特性を有するヒトＧＤＦ１５突然変異タンパク質
実施例３に記載されたデータは、成熟ヒトＧＤＦ１５に固有の表面疎水性および親水性と関係している溶解度限界を扱う。また、成熟ヒトＧＤＦ１５の配列にＮ結合グリコシル化コンセンサス部位（複数可）を導入することの溶解度への作用を評価した。成熟組換えヒトＧＤＦ１５突然変異タンパク質の発現特性；グリコシル化特性および溶解度の評価を容易にするために、図８Ａに示したとおり、ＩｇＫシグナルペプチド配列と融合された成熟突然変異タンパク質として、すべてを構成した。１７のＧＤＦ１５突然変異タンパク質（それぞれＭ５〜Ｍ２１；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８１〜９７と示した）を生成した。Ｍ１６では、Ｎ末端側欠損型：ΔＮ３−Ｍ１６突然変異タンパク質を生成し、その溶解度を測定した。Ｍ５突然変異タンパク質は、ｗｔ  ＧＤＦ１５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）中の位置５のＤをＴと置換することによって、およびｗｔ  ＧＤＦ１５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）中の位置２１のＲをＮと置換することによって導入された２つのＮ結合グリコシル化コンセンサス部位を含有する。突然変異タンパク質Ｍ６〜Ｍ２１では、１つのＮ結合グリコシル化コンセンサス部位を導入した（図８Ａを参照）。突然変異タンパク質は、置換の位置を表す目的でＮ末端にＩｇＫシグナル配列を含むが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１中の対応する残基の位置として残基をナンバリングすることを明記する。したがって、例えば、Ｔは、Ｍ５突然変異タンパク質中の位置２７に存在しているが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１中の対応するＤ残基に位置は、５であるため、位置５として表される。
【０２９５】
１０ＸＰＢＳ＋０．５ＭトリスｐＨ７．０中で、成熟ヒトＧＤＦ１５と比較して突然変異タンパク質の溶解度の改善を評価することができるストリンジェント緩衝剤のスパイクによって、突然変異タンパク質（０．０１％ギ酸中）に対する溶解度評価を実施した。
【０２９６】
吸光係数（成熟ヒトＧＤＦ１５＝１４，４００／モノマー）および分子量（成熟ヒトＧＤＦ１５＝１２，２７８Ｄａ／モノマー）を用いて計算し、ベールの法則を用いて、２８０ｎｍの吸光度に基づいて、溶解度の評価を決定した。
【０２９７】
溶解度を評価する前に、折りたたまれたＧＤＦ１５ホモ二量体としての哺乳動物組織培養媒質への分泌およびＮ−グリカン部位占有について、図８Ａに記載された遺伝子操作されたＮ−グリカン突然変異タンパク質およびΔＮ３−Ｍ１６突然変異タンパク質のそれぞれを評価した。図９に記載したとおり、１８のグリコシル化突然変異タンパク質のうち１４が、折りたたまれたＧＤＦ１５ホモ二量体として分泌され、一方、Ｍ８、Ｍ１０、Ｍ１４およびＭ１５の結果では、二量体が形成されず、凝集物として発現された。その後、条件付き培地から精製後のコンセンサス部位上のＮ−グリカン基の占有を測定するために、ＬＣ／ＭＳおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルシフトによって、ホモ二量体として分泌された１４の発現したグリコシル化突然変異タンパク質のすべてを評価した。１４のすべての場合で、発現した突然変異タンパク質が、高程度の占有を含有し、物理的特性、例えば、溶解度の改善について、サブセットを分析した。
【０２９８】
溶解度の改善について、成熟ヒトＧＤＦ１５と比較して、ホモ二量体として分泌され、コンセンサス部位内に高グリカン占有を保持した、操作されたＮ−グリカンＧＤＦ１５突然変異タンパク質をモニターした。混濁が生じ始める変曲点を各突然変異タンパク質の最大溶解度として受け入れる。それらの溶解度のレベルに応じて、突然変異タンパク質を５つの群の１つに分類した：＜０．２ｍｇ／ｍＬ＝＋；≧０．２ｍｇ／ｍＬ＝＋＋；≧０．５ｍｇ／ｍＬ＝＋＋＋；≧１．０ｍｇ／ｍＬ＝＋＋＋＋；≧５．０ｍｇ／ｍＬ＝＋＋＋＋＋。評価したＮ−グリカンＧＤＦ１５突然変異タンパク質のそれぞれが、成熟ヒトＧＤＦ１５と比較して溶解度の改善を示した：Ｍ５：＋＋＋＋、Ｍ７：＋＋＋、Ｍ１１：＋＋＋、Ｍ１２：＋＋＋、Ｍ１３：＋＋＋＋、Ｍ１６：＋＋＋＋＋、ΔＮ３−Ｍ１６：＋＋＋＋＋、Ｍ１７：＋＋＋＋＋、Ｍ２０：＋＋＋＋、Ｍ２１：＋＋＋。
【実施例４】
【０２９９】
ＤＩＯマウスモデルでのＭ１６、ΔＮ３−Ｍ１６およびＭ１７突然変異タンパク質の食物摂取への作用
皮下に投与された糖突然変異タンパク質（ｇｌｙｃｏｍｕｔｅｉｎ）の食物摂取への作用を評価した。糖突然変異タンパク質Ｍ１６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９２）およびＭ１７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９３）は上述の実施例３に記載されている。ΔＮ３−Ｍ１６として示される糖突然変異タンパク質も評価した。ΔＮ３−Ｍ１６糖突然変異タンパク質の配列を以下に提供する。
0006704358.tif 000035
【０３００】
マウスに投与されたポリペプチドは、ＩｇＫシグナル配列が、細胞（２９３細胞）により発現したシグナルペプチダーゼによって、分泌されたポリペプチドから切断されているため、ＩｇＫシグナル配列（ｍｄｍｒｖｐａｑｌｌｇｌｌｌｌｗｌｒｇａｒｃ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０１）を含まないことを明記する。
【０３０１】
図１０を参照すると、１７週齢オスＤＩＯマウス（ｎ＝９）に、単一１．０ｍｇ／ｋｇ（４０ｎｍｏｌ／Ｋｇ）用量のＰＢＳビヒクル、成熟ヒトＧＤＦ１５またはＮ−グリカン突然変異タンパク質を皮下投与した。皮下投与後の２４時間にわたって、食物摂取（グラム／動物）をモニターした。対応のないスチューデントのｔ検定によって、ビヒクル（ＰＢＳ）対照群と比較して、Ｐ値を測定した。
【０３０２】
図１０に示したとおり、糖突然変異タンパク質の投与の結果、食物摂取が減少した。マウスの各群で、対応のないスチューデントのｔ検定によって、食物摂取をビヒクル対照群と比較して、ｐ値（＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１）を測定した。野生型ＧＤＦ１５でも、食物摂取が減少した。
【実施例５】
【０３０３】
ＤＩＯマウスモデルでのＭ１６、ΔＮ３−Ｍ１６およびＭ１７突然変異タンパク質の体重への作用
皮下に投与された糖突然変異タンパク質の体重への作用を評価した。１７週齢オスＤＩＯマウス（ｎ＝９）に、単一１．０ｍｇ／ｋｇ（４０ｎｍｏｌ／Ｋｇ）用量のＰＢＳビヒクル、成熟ヒトＧＤＦ１５またはＮ−グリカン突然変異タンパク質（Ｍ１６、Ｍ１７、およびΔＮ３−Ｍ１６）を皮下投与した。皮下投与後の２４時間にわたって、体重をモニターした。対応のないスチューデントのｔ検定によって、ビヒクル（ＰＢＳ）対照群と比較して、Ｐ値を測定した。
【０３０４】
糖突然変異タンパク質の投与の結果、体重が減少した（図１１）。マウスの各群で、対応のないスチューデントのｔ検定によって、食物摂取をビヒクル対照群と比較して、ｐ値（＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１）を測定した。野生型ＧＤＦ１５でも、体重が減少した。
【０３０５】
本発明の特定の実施形態は、本発明を実施するために発明者らに知られた最も好ましい方法を含み、本明細書に記載される。前述の説明を読む場合、開示された実施形態の変更は、当技術分野に従事する者には明らかである可能性があり、当業者が、適宜、かかる変更を用いてよいと推測される。したがって、本発明が、特に本明細書に記載されたものと別の方法で実施されること、および本発明が、適用法令によって許可される通り、本明細書に添付された請求項に記載の対象事項のすべての修正および同等物を含むことを意図する。更に、本明細書に別段に指示しない限り、または、文脈により明確に否定しない限り、上記の要素の可能な変更すべてにおいて、上記の要素のあらゆる組み合わせが、本発明に含まれる。
【０３０６】
本明細書に示した文献、特許出願、登録番号、および他の参照のすべてが、あたかも個々の文献または特許出願それぞれが、特定的に、個々に参照によって組み込まれるように示されたように、参照によって本明細書に組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ−１】
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【図８Ａ−２】
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【図８Ｂ−１】
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【図８Ｂ−２】
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【図８Ｂ−３】
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【図８Ｂ−４】
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【図８Ｂ−５】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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