(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗S100A8を含む、白血病治療用の医薬組成物であって、
前記抗S100A8が抗体であり、
前記抗S100A8抗体が、配列番号:3に示されるヌクレオチド配列によってコードされる重鎖可変領域又は配列番号:4から成る重鎖可変領域を含み、かつ配列番号:5に示されるヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖可変領域又は配列番号:6からなる軽鎖可変領域を含む、医薬組成物。
【請求項２】
前記抗S100A8抗体が注射用に処方される、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
化学療法剤とともに投与するために処方される、請求項１−２のいずれか1項に記載の医薬組成物。
【請求項４】
当該化学療法剤がダウノルビシン、ドキソルビシン及びシタラビンの少なくとも1つである、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記抗S100A8抗体が化学療法剤との同時投与又は分離投与のために処方される、請求項２又は３に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記抗S100A8抗体が対象動物の化学療法剤治療後の投与のために処方される、請求項１−５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記抗S100A8抗体がS100A8タンパク質の一部分と特異的に結合する、請求項１−６のいずれか1項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記抗S100A8抗体が、S100A8/S100A8ホモダイマー又はS100A8/S100A9ヘテロダイマーと特異的に結合する、請求項１−７のいずれか1項に記載の医薬組成物。
【請求項９】
当該S100A8タンパク質がヒトS100A8である、請求項７又は８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
当該ヒトS100A8が配列番号:1に示されるアミノ酸配列を含む、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記抗S100A8抗体がモノクローナル又はポリクローナル抗体である、請求項１−１０のいずれか1項に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記抗S100A8抗体がマウス抗体、ヤギ抗体、ヒト抗体又はウサギ抗体である、請求項１−１１のいずれか1項に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記抗S100A8抗体がヒト化抗体である、請求項１−１１のいずれか1項に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記抗S100A8抗体がFv、F(ab’)又はF(ab’)2から成る群から選択されるエピトープ結合フラグメントを含む、請求項１−１３のいずれか1項に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記抗S100A8抗体及び担体を含む、請求項１−１４のいずれか1項に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
前記白血病が、急性リンパ芽球性白血病（ALL）、急性骨髄性白血病（AML）、慢性リンパ球性白血病（CLL）、慢性骨髄性白血病（CML）及び慢性骨髄単球性白血病（CMML）である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
細胞分化促進のための、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
細胞分裂阻害のための、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
急性骨髄性白血病（AML）の治療のための、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
抗S100A8を含む、白血病治療用の医薬組成物であって、
前記抗S100A8が抗体であり、
前記抗S100A8抗体が、配列番号:3に示されるヌクレオチド配列によってコードされる重鎖可変領域又は配列番号:4から成る重鎖可変領域を含み、かつ配列番号:5に示されるヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖可変領域又は配列番号:6からなる軽鎖可変領域を含み、
さらにS100A9ペプチド又はそのペプチド模倣物を含む、医薬組成物。
【請求項２１】
当該S100A9ペプチドがヒトS100A9タンパク質である、請求項２０に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
当該ペプチドが配列番号:7に示されるアミノ酸配列を含む、請求項２０又は  ２１に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
当該ペプチドが、配列番号:7と少なくとも60%、少なくとも70%若しくは少なくとも80%、少なくとも90%同一性、又は少なくとも約95%同一性を有する、請求項２２に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
当該ペプチドが配列番号:7に示されるアミノ酸配列から成る、請求項２２又は２３に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
対象動物が哺乳動物である、請求項１−２４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
対象動物がマウス又は人間である、請求項１−２４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本記述は白血病治療のための抗S1008タンパク質に関する。
【背景技術】
【０００２】
急性白血病は、造血幹細胞又は前駆細胞で生じる一連の遺伝的及び後成的事象の結果であり、分化能が障害された前駆細胞のクローン性増殖をもたらす。急性白血病の再発性遺伝性病変の認定で過去20年間は非常に実りあるものであった。無白血病状態の生存が改善されたのは、ほとんどがより正確なリスクの階層化（治療の強さの調整を可能にする）及び同種異系造血幹細胞移植によるものであった。しかしながら、急性骨髄性白血病（AML）治療で今日用いられる薬剤は25−30年前と基本的に同じであり、予後も依然として不良である。5年生存率は、AMLの小児では55%と低く、成人（30−40%）及び高齢者（＞65歳）（＜15%）ではさらに低い。したがって、急性白血病患者の無白血病状態の生存を改善するために、新規かつ刷新的なアプローチを開発することが必要である。
したがって、白血病治療のための組成物又は方法を提供することは依然として希求される。
【発明の概要】
【０００３】
本発明にしたがえば、今や白血病治療用抗S100A8が提供される。
ある実施態様では、抗S100A8は抗体である。
別の実施態様では、抗S100A8はS100A8タンパク質の一部分と特異的に結合する。
さらに別の実施態様では、抗S100A8はS100A8/S100A8ホモダイマー又はS100A8/S100A9ヘテロダイマーと特異的に結合する。
付加的実施態様では、S100A8タンパク質はヒトS100A8である。
別の実施態様では、ヒトS100A8は配列番号:1に示されるアミノ酸配列を含む。
さらに別の実施態様では、抗S100A8はモノクローナル又はポリクローナル抗体である。
ある実施態様では、抗S100A8はマウス抗体、ヤギ抗体、ヒト抗体又はウサギ抗体である。
別の実施態様では、抗S100A8はヒト化抗体である。
ある実施態様では、抗S100A8抗体は、Fv、F(ab’)又はF(ab’)2から成る群から選択されるエピトープ結合フラグメントを含む。
別の実施態様では、抗S100A8抗体は、配列番号:3に示されるヌクレオチド配列によってコードされる重鎖可変領域を含む。
補充的実施態様では、抗S100A8抗体は、配列番号:4から成る重鎖可変領域を含む。
別の実施態様では、抗S100A8抗体は、配列番号:5に示されるヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖可変領域を含む。
別の実施態様では、抗S100A8抗体は、配列番号:6からなる軽鎖可変領域を含む。
別の実施態様では、抗S100A8は注射用に処方される。
別の実施態様では、抗S100A8は化学療法剤との投与のために処方される。
ある実施態様では、化学療法剤はダウノルビシン、ドキソルビシン及びシタラビンの少なくとも1つである。
別の実施態様では、抗S100A8は、化学療法剤との同時投与又は分離投与のために処方される。
さらに別の実施態様では、抗S100A8は、対象動物の化学療法剤治療後の投与のために処方される。
【０００４】
本明細書に記載の抗S100A8及び担体を含む組成物もまた本明細書で提供される。
ある実施態様では、本明細書に記載する組成物は白血病治療用である。
ある実施態様では、白血病は急性リンパ芽球性白血病（ALL）、急性骨髄性白血病（AML）、慢性リンパ球性白血病（CLL）、慢性骨髄性白血病（CML）及び慢性骨髄単球性白血病（CMML）である。
ある実施態様では、本明細書に記載する組成物は細胞分化促進用である。
ある実施態様では、本明細書に記載する組成物は細胞分裂阻害用である。
ある実施態様では、本明細書に記載する組成物は急性骨髄性白血病（AML）の治療用である。
対象動物で白血病を治療する方法もまた提供され、前記方法は、抗S100A8又は本明細書に記載の組成物を当該対象動物に投与する工程を含む。
対象動物で細胞分化を促進する方法もまた提供され、前記方法は、抗S100A8又は本明細書に記載の組成物を当該対象動物に投与する工程を含む。
対象動物で細胞分裂を阻害する方法もまた提供され、前記方法は、抗S100A8又は本明細書に記載の組成物を当該対象動物に投与する工程を含む。
ex vivoで細胞分化を促進する方法もまた提供され、前記方法は、抗S100A8又は本明細書に記載の組成物を当該対象動物に投与する工程を含む。
さらに、ex vivoで細胞分裂を阻害する方法が提供され、前記方法は、抗S100A8又は本明細書に記載の組成物を当該対象動物に投与する工程を含む。
【０００５】
加えて、対象動物の白血病治療のための抗S100A8又は本明細書に記載の組成物の使用が提供される。
対象動物の白血病治療用医薬の製造における、抗S100A8又は本明細書に記載の組成物の使用もまた提供される。
細胞分化促進のための抗S100A8又は本明細書に記載の組成物の使用もまた提供される。
細胞分裂阻害のための抗S100A8又は本明細書に記載の組成物の使用もまた提供される。
ある実施態様では、対象動物は哺乳動物である。
別の実施態様では、対象動物はマウス又は人間である。
ある実施態様では、本明細書に記載の組成物はさらにS100A9ペプチド又はそのペプチド模倣物を含む。
別の実施態様では、本明細書に包含する抗S100A8は、S100A9ペプチドとともに投与するために処方される。
別の実施態様では、S100A9ペプチドはヒトS100A9タンパク質である。
さらに別の実施態様では、当該ペプチドは配列番号:7に示されるアミノ酸配列を含む。
付加的実施態様では、当該ペプチドは、配列番号:7と少なくとも60%、少なくとも70%若しくは少なくとも80%、少なくとも90%同一性、又は少なくとも約95%同一性を有する。
別の実施態様では、当該ペプチドは配列番号:7に示されるアミノ酸配列から成る。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
これから添付の図面について述べる。
【図１】初代白血病を有するマウス血清におけるS100A8/A9の分泌を示す。この場合、初代白血病は、GFPとともに遺伝子HOXA9及びMEIS1又は融合遺伝子MLL-ENLを発現するレトロウイルスをトランスフェクトしたマウス造血幹細胞/前駆細胞を注射することによって惹起され、S100A8/A9濃度は血清のELISAによって測定された（データは3つの独立した測定の算術平均±SEMである）。
【図２】初代白血病を有するマウス血清で分泌されたS100A8、S100A9、及びS100A8/A9のレベルを示す。この場合、初代白血病は、GFPとともに遺伝子HOXA9及びMEIS1を発現するレトロウイルスをトランスフェクトしたマウス造血幹細胞/前駆細胞を注射することによって惹起させ、続いて二代目白血病は、コントロールマウスに白血病マウス由来の100,000個の骨髄細胞を注射することによって誘発され、S100A8/A9濃度は血清のELISAによって測定された（データは3つの独立した測定の算術平均±SEMである）。
【図３】S100A8/A9の分泌と末梢血中の白血病細胞の存在との間の相関性を示す。この場合、初代白血病は、GFPとともに遺伝子HOXA9及びMEIS1を発現するレトロウイルスをトランスフェクトしたマウス造血幹細胞/前駆細胞を注射することによって惹起させ、二代目白血病は、白血病マウス由来の100,000個の骨髄細胞をナイーブマウスに注射することによって誘発され、血中の白血病細胞数はフローサイトメトリーで決定され、S100A8/A9濃度は血清のELISAによって測定された（データは3つの独立した測定の算術平均±SEMである）。
【図４】ある実施態様の抗S100A8抗体はHOXA9-MEIS1白血病を注射された二代目マウスの生存を延長することを示す。この場合、HOXA9-MEIS1初代白血病マウス由来の100,000個の骨髄細胞が、致死量以下で照射した二代目マウスに3日目から35日目まで1週間に3回注射され、それとともにウサギ抗S100A8 pAb又は非特異的ウサギIgG（150μg/注射）、ラット抗S100A9 mAb又はアイソタイプコントロールAb（ラットIgG）又はPBS（コントロール）が注射された（6マウス/グループ）。
【図５】ある実施態様の抗S100A8抗体はHOXA9-MEIS1白血病を注射された二代目マウスの体重低下を軽減することを示す。この場合、HOXA9-MEIS1初代白血病マウス由来の100,000個の骨髄細胞が、致死量以下で照射した二代目マウスに3日目から35日目まで1週間に3回注射され、それとともにウサギ抗S100A8 pAb又は非特異的ウサギIgG（150μg/注射）が注射された（6マウス/グループ）。
【図６】ある実施態様の抗S100A8抗体は末梢血中の白血病細胞の出現を遅らせることを示す。この場合、HOXA9-MEIS1初代白血病マウス由来の100,000個の骨髄細胞が、致死量以下で照射した二代目マウスに3日目から35日目まで1週間に3回注射され、それとともにウサギ抗S100A8 pAb又は非特異的ウサギIgG（150μg/注射）が注射され（6マウス/グループ）、白血病細胞数はフローサイトメトリーで決定された。
【図７】ある実施態様の抗S100A8抗体はAML芽細胞の分化を増進することを示す。この場合、HOXA9-MEIS1初代白血病マウス由来の100,000個の骨髄細胞が、致死量以下で照射した二代目マウスに3日目から35日目まで1週間に3回注射され、それとともにウサギ抗S100A8 pAb又は非特異的ウサギIgG（150μg/注射）が注射され（6マウス/グループ）、さらに瀕死のマウスをサクリファイスして末梢血、脾臓及び骨髄を採集し、細胞を分化マーカー（CD11及びGr1）の発現についてフローサイトメトリーによって分析した（データは3匹の他のマウスを代表する1匹のマウスに由来する）。
【図８】ある実施態様の抗S100A8抗体はAML芽細胞の分裂を阻害することを示す。この場合、HOXA9-MEIS1初代白血病マウス由来の100,000個の骨髄細胞が、致死量以下で照射した二代目マウスに3日目から35日目まで1週間に3回注射され、それとともにウサギ抗S100A8 pAb又は非特異的ウサギIgG（150μg/注射）が注射され（6マウス/グループ）、さらに瀕死のマウスをサクリファイスして骨髄を採集し、細胞周期をヨウ化プロピジウム染色によって分析した（データは3つの実験の算術平均である）。
【図９】抗S100A8処置マウスにおけるAML細胞の分化増進を示す。この場合、HOXA9-MEIS1初代白血病マウス由来の100,000個の骨髄細胞が、致死量以下で照射した二代目マウスに3日目から35日目まで1週間に3回注射され、それとともにウサギ抗S100A8 pAb又は非特異的ウサギIgG（150μg/注射）が注射され（6マウス/グループ）、さらに瀕死のマウスをサクリファイスして末梢血及び骨髄を採集し、続いて細胞をライト-ギムザで染色し細胞の形態を明らかにした（データは3匹の他のマウスを代表する1匹のマウスに由来する）。
【図１０】ある実施態様の抗S100A8抗体はヒト白血病細胞の分化及び増殖停止を促進することを示す。この場合、融合遺伝子MLL-AF9を発現するヒト臍帯血が抗S100A8 mAb 1F8（20μg/mL）又はアイソタイプコントロールAbで72時間刺激された。（A）は抗CD14で標識しフローサイトメトリーで調べた細胞、（B）はヨウ化プロピジウム染色によって分析した細胞周期を示す。
【図１１】ある実施態様のS100A9ペプチドと組み合せた抗S100A8抗体は、HOXA9-MEIS1白血病を注射された二代目マウスの生存を延長することを示す。この場合、HOXA9-MEIS1初代白血病マウス由来の骨髄細胞が、致死量以下で照射した二代目マウスに抗S100A8、S100A9ペプチド又は前記の組合せとともに注射された。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
白血病を治療又は予防する抗S100A8が提供される。
したがって、抗体である抗S100A8の白血病の治療又は予防のための使用が本明細書に記載される。
本明細書に包含される白血病は、急性リンパ芽球性白血病（ALL）、急性骨髄性白血病（AML）、慢性リンパ球性白血病（CLL）、慢性骨髄性白血病（CML）及び/又は慢性骨髄単球性白血病（CMML）であり得る。
S100タンパク質ファミリーは、22メンバーの小さい（10から14kDa）酸性カルシウム結合タンパク質を含み、前記メンバーは、それらの発見時期及びそれらが見出される染色体にしたがってS100A1、S100A2などと名付けられる。これらの細胞内タンパク質は、タンパク質リン酸化の制御、酵素活性、Ca2+恒常性、及び介在フィラメント重合化に関与する。S100A8、S100A9及びS100A12は、もっぱら好中球（細胞質タンパク質の30%）及び単球で発現されるので骨髄関連タンパク質（MRP）と称されるサブセットに属する（好中球及び単球は骨髄系前駆細胞に由来する）。
S100A8及びS100A9は非共有結合したホモダイマーとしての形を有する。カルシウムの存在下で、S100A8及びS100A9は、S100A8/A9又はカルプロテクチンと称される非共有結合ヘテロダイマーを形成し、カルシウム濃度の細胞内制御に関与すると推定される。
S100A8及びS100A9は非共有結合したホモダイマーとしての形を有する。S100A8及びS100A9はまた、カルシウムの存在下で、S100A8/A9又はカルプロテクチンと称される非共有結合ヘテロダイマーを形成し、このヘテロダイマーはカルシウム濃度の細胞内制御に関与すると推定される。細胞内でカルプロテクチンは脂質と結合し、アラキドン酸をNADPHオキシダーゼに移転させることによって好中球内のNADPHオキシダーゼを少なくとも部分的に活性化する。S100A8及びS100A9は、RAGE（スカベンジャー受容体（CD36）又はToll様受容体4（TLR4））と結合すると推定される。
S100A8のヒトペプチド配列は以下から成る：
MLTELEKALNSIIDVYHKYSLIKGNFHAVYRDDLKKLLETECPQYIRKKGADVWFKELDINTDGAVNFQEFLILVIKMGVAAHKKSHEESHKE（配列番号:1）。
【０００８】
したがって、S100A8及び特にヒトS100A8に対するヒト化抗体及び非ヒト種抗体が開示される。前記抗体のタンパク質配列は改変されて、ヒトで天然に生成される抗体変種に対しそれらの類似性を高めることができる。ヒト化は、特異抗体の開発プロセスが非ヒト免疫系（例えばマウス免疫系）での生成を必要とするときに要求され得る。抗体のヒト化方法は、ヒトに適用するとき最小限の免疫原性を有するが親の非ヒト抗体の特異性及び親和性は維持される分子を生成するように設計される。この方法で生成される抗体のタンパク質配列は、ヒトで天然に存在する相同な抗体と部分的にはっきり異なり、したがってヒト患者に投与されるときは潜在的に免疫原性である。
本明細書に包含されるヒト化抗体は濃縮技術を介して生成でき、例えばファージディスプレー又は抗体ヒト遺伝子レパートリーを保持するトランスジェニックマウスの免疫は、ヒト抗体を生成する強力な手段を提供した。
より具体的には、本明細書に記載する抗体はS100A8のエピトープと特異的に結合する。
具体的な実施態様では、抗体は、Fv及び/又はF(ab’)及び/又はF(ab’)2から選択されるエピトープ結合フラグメントを含む。特に、抗体はエピトープ結合単鎖抗体を含む。
特に、本明細書に包含される抗体は、以下のヌクレオチド配列によってコードされる重鎖可変領域を含む：
GGATCCCAGGTTCAGCTGCAGCAGTCAGGGGCAGAGCTTGTGAAGCCAGGGGCCTCAGTCAAGTTGTCCTGCACAGCTTCTGGCTTCAACATTAAAGACACCTATTTGCACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGAGCAGGGCCTGGAGTGGGTTGGAAGGATTGATCCTGCGAATGGTGATACTAAATATGACCCGAAGTTCCAGGCCAAGGCCACTATAACAGCTGACACAACCTCCAACACAGCCTACGTGCACCTCAACAGCCTGACATCTGAGGACACTGCCGTCTATTTCTGTACTGGGGGATGGCAGATGGGGGGCCGGTACTTCGATGTCTGGGGCGCAGGGACAACGGTCACCGTCTCCTCAGCCAAAACGACACCCCCATCTGTCTATGGTGGCGGTGGTTCT（配列番号:3）。
具体的な実施態様では、抗体は下記から成る重鎖可変領域を含む：
GSQVQLQQSGAELVKPGASVKLSCTASGFNIKDTYLHWVKQRPEQGLEWVGRIDPANGDTKYDPKFQAKATITADTTSNTAYVHLNSLTSEDTAVYFCTGGWQMGGRYFDVWGAGTTVTVSSAKTTPPSVYGGGGS（配列番号:4）。
【０００９】
特に、本明細書に包含される抗体は、下記のヌクレオチドによってコードされる軽鎖可変領域を含む：
GATGTTGTGATGACCCAGTCTCCTGCTTCCTTAGCTGTATCTCTGGGGCAGAGGGCCACCATCTCATACAGGGCCAGCAAAAGTGTCAGTACATCTGGCTATAGTTATATGCACTGGAACCAACAGAAACCAGGACAGCCACCCAGACTCCTCATCTATCTTGTATCCAACCTAGAATCTGGGGTCCCTGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCAACATCCATCCTGTGGAGGAGGAGGATGCTGCAACCTATTACTGTCAGCACATTAGGGAGCTTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAA（配列番号:5）。
具体的な実施態様では、抗体は下記から成る軽鎖可変領域を含む：
DVVMTQSPASLAVSLGQRATISYRASKSVSTSGYSYMHWNQQKPGQPPRLLIYLVSNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHIRELTRSEGGPSWK（配列番号:6）。
本明細書に記載する抗S100 Abは、適切な生理学的又は医薬的担体と混合して用いることができる。そのような組成物は、治療的に有効な量の抗体、及び生理学的又は医薬的に許容できる担体又は賦形剤を含む。そのような担体には、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、及びその組合せが含まれるが、ただし前記に限定されない。当該処方は投与態様に適合しているべきである。
本明細書に定義する、S100A8タンパク質の阻害剤又はアンタゴニストとして作用する抗体は、単独で又は他の補足的標的に対する抗体と組み合わせて投与することができる（前記補足的標的には他のS100ポリヌクレオチド又はポリペプチドが含まれるが、ただしこれらに限定されない）。
【００１０】
本明細書に包含される抗体は、有利には他のモノクローナル抗体若しくはキメラ抗体と、サイトカインと、又はS100タンパク質と組み合わせて利用することができる。抗体は単独で又は他のタイプの治療と組み合わせて投与できる。例えば、本明細書に記載する抗体は、例えば化学療法剤（例えばダウノルビシン（セルビジン）、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、及びシタラビン）と組み合わせて、同時に又は別々に投与することができる。概して、患者の種と同じ種起原又は種反応性（抗体の場合）を有する生成物を投与することが好ましい。したがって、好ましい実施態様では、ヒトの抗体、フラグメント、誘導体又はアナローグがヒト又は動物の患者に治療又は予防のために投与される。
S100ポリヌクレオチド又はポリペプチド（そのフラグメントを含む）に関係する異常の治療のために、本明細書に包含されるS100ポリペプチド又はポリヌクレオチド、そのフラグメント又は領域に対して高親和性の及び/又は強力なin vivo阻害性及び/又は中和性抗体を使用することが好ましい。そのような抗体、フラグメント又は領域は、本明細書に包含されるS100ポリペプチドに対し好ましくは親和性を有するであろう。
特に、白血病を治療する方法が提供され、前記方法は、本明細書に定義する抗体又は本明細書に定義する組成物の有効量をその必要がある対象動物に投与する工程を含む。
【００１１】
癌ゲノムアトラス（The Cancer Genome Atlas（TCGA））リサーチネットワークによって、200人の成人AML症例における全ゲノム/全エキソームの配列決定が、RNA、ミクロRNA及びDNAメチル化分析と併せて実施された。S100A8及びS100A9が、主として骨髄単球性及び単球性AML（高RPKMレベルを有する）で構成される1つの重要な下位グループのための上位5つの特徴的遺伝子の中に入っていた（Cancer Genome Atlas Research, N., 2013, The New England journal of medicine, 368: 2059-2074）。高濃度のS100A8及びS100A9タンパク質が急性及び慢性骨髄性白血病の患者の血清で見出され（Ivanov et al., 1996, Immunology letters, 49: 7-13）、これらの濃度は前記血清の増殖刺激活性と相関性を有する。加えて、S100A8は、de novo AML患者では生存不良の予想因子と認定されている（Nicolas et al., 2011, Leukemia: official journal of the Leukemia Society of America, Leukemia Research Fund, U.K., 25: 57-65）。S100A8/A9の構成的過剰発現はまたMLL-再構成B-ALLにおけるプレドニソロン治療に対する耐性と密接に関係し、MLL-再構成B-ALL細胞のS100A8/A9強制発現は、プレドニソロン感受性細胞のプレドニソロン非感受性細胞へのin vitro変換を生じる（Spijkers-Hagelstein et al., 2012, Leukemia: official journal of the Leukemia Society of America, Leukemia Research Fund, U.K.,26: 1255-1265）。
【００１２】
S100A8及びS100A9タンパク質がAMLに密接に関係している可能性を明らかにするために、良く特徴が知られた2つの骨髄性白血病モデルを用いて、前記タンパク質の発現を測定した（前記モデルは、致死量照射レシピエントに移植された造血前駆細胞及び造血幹細胞（HPSC）のHoxa9及び補助因子Meis1の過剰発現、又はオンコジーンMLL-ENLの発現によって誘発された）。AML患者のように、Hoxa9及びMeis1（H9M）或いはMLL-ENLを発現する初代レシピエントマウスの血漿では、コントロールマウス（5.0μg/mL±0.08μg/mL）と比較してS100A8/A9の実質的な濃度増加が観察された（それぞれ5.0μg/mL±1.0μg/mL及び3.8μg/mL±0.5μg/mL）（図1参照）。H9M二代目レシピエントの血漿中のS100A8/A9レベルもまた約10倍増加した。ヘテロダイマー型が優勢であったが、S100A8及びS100A9の両ホモダイマーもAMLマウスの血漿で観察された（図2参照）。S100A8/A9の濃度上昇がAMLレシピエントの骨髄及び脾臓上清で観察され、細胞外液でもまたこれらタンパク質濃度が増加することが示された。S100A8/A9濃度は白血病の進行につれて徐々に増加し、骨髄から血液への白血病細胞の逆行と強い相関性を示した（図3参照）。
【００１３】
白血病進行におけるS100A8及びS100A9の役割を精査するために、pAb抗S100A8又はmAb抗S100A9のどちらかの10mg/kgをH9M駆動AML二代目レシピエントの腹腔内に処置した。これらの抗体は、S100A8/A8又はS100A9/A9のそれぞれ両ホモダイマー及びヘテロダイマーS100A8/A9と相互作用する。抗S100A8の注射は白血病進行の顕著な遅延をもたらし、コントロールの免疫グロブリンと比較して生存の有意な延長をもたらした（図4）。このことは、抗S100A8処置マウスにおける体重低下の緩和及び白血病マウスの行動の改善と密接に関係していた（図5）。抗S100A8処置マウスの末梢血の白血病細胞のパーセンテージ及びS100A8/A9濃度もまた顕著に低下した（図6）。対照的に、コントロールIgGと抗S100A9処置マウスとの間では、血漿S100A8/A9レベル、血中の白血病細胞又は全生存期間に関して相違は観察されなかった（図4）。抗S100A8処置マウスの分析は、成熟骨髄性細胞マーカーCD11b及びGr1の発現の増加（図7）、細胞周期G0/G1期の細胞の増加（図8）及び顆粒球性細胞の細胞学的な改変特徴の増加（図9）を明示し、一方、AML細胞分化の強化を提唱する変化は抗S100A9では観察されず、抗S100A8は骨髄系の分化を誘発したことを示した。したがって、S100A8は、骨髄性細胞の分化を妨げることによってAML病変を促進する。
【００１４】
抗S100A8の作用を確認するために、融合遺伝子MLL-AF9をトランスフェクトしたヒト臍帯血細胞を抗S100A8で72時間刺激した。細胞分化マーカーとしてCD14の発現を用いて、細胞分化を試験した。抗S100A8 mAb 1F8はCD14を発現する細胞の数を二倍にし（図10A）、細胞分化を刺激することを示唆した。加えて、抗S100A8 mAb 1F8は、G0/G1及びS期の細胞の数を増加させ（図10B）、細胞分裂の阻害を示した。
図11に示すように、本明細書に包含される抗S100A8抗体をS100A9ペプチドとともに投与して、コントロール免疫グロブリンと比較して或いは抗S100A8抗体又はS100A9ペプチドの単独投与と比較して、白血病の進行遅延及び生存延長を有意に増強できる。
S100A9（カルグラヌリンB及び骨髄関連タンパク質-14（MRP-14）としてもまた知られている）はカルシウム及び亜鉛結合タンパク質であり、S100タンパク質ファミリーに属する。S100A9は骨髄性細胞系列によって高度に発現され、炎症時に細胞外環境で見いだされる。S100A9は、S100A8（S100ファミリーの別のメンバー）とヘテロダイマーを形成する。しかしながら、S100A9はまたモノマーを形成し、前記は特別な機能を遂行する。ヒトS100A9は約13kDaの分子量を有し、114アミノ酸残基で構成される。
ヒトS100A9
10         20         30         40         50
MTCKMSQLER NIETIINTFH QYSVKLGHPD TLNQGEFKEL VRKDLQNFLK
60         70         80         90        100
KENKNEKVIE HIMEDLDTNA DKQLSFEEFI MLMARLTWAS HEKMHEGDEG
110 
PGHHHKPGLG EGTP              （配列番号:7）
したがって抗S100A8抗体及びS100A9ペプチドを含む組成物が開示される。
より具体的には、白血病を治療するために、配列番号:3若しくは4に示されるヌクレオチド配列によってコードされる重鎖可変領域、配列番号:5若しくは6に示されるヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖可変領域を含む抗S100A8抗体、及び配列番号:7に示されるアミノ酸配列を含むS100A9ペプチドを含む組成物が開示される。
したがって、抗S100A8の注射は、白血病細胞の分化を促進し分裂低下をもたらすことによってAMLを防ぐ。
本開示は、下記の実施例を参考にすることによってより容易に理解されよう。当該実施例は本開示の範囲を制限するのではなく実施態様を例証するために提供される。
【実施例１】
【００１５】
骨髄前駆細胞の形質導入及び移植手順
5-フルオロウラシル処置C57BL/6マウス（8−12週齢雌）から単離した骨髄細胞を、15%ウシ胎児血清、10ng/mLのIL-3、10ng/mLのIL-6及び100ng/mLの幹細胞因子を含むDMEMで2日間培養して細胞周期の開始を促進した。続いて、骨髄細胞を、MSCV-hoxa9-ires-meis1 hpgk-EGFPをトランスフェクトした照射GP+E86細胞（ウイルス産生細胞）とともに5μg/mLのポリブレンの存在下で2日間共同培養した。
初代白血病レシピエントC57BL/6マウスを照射し（7Gy）、24時間後に4×105の感染骨髄細胞（Hoxa9、Meis1及びEgfpを発現する）を静脈内に注射した。白血病の徴候について毎日マウスを追跡観察した。末梢血を毎週採集し、白血病細胞（GFPを発現する）の数をフローサイトメトリーによって定量した。瀕死マウスをサクリファイスし、末梢血及び骨髄を採集した。
二代目白血病は、致死量以下（4Gy）を照射したレシピエントに初代白血病マウス由来の2×105骨髄細胞を注射することによって誘発した。
【実施例２】
【００１６】
抗S100A8抗体処置
初代白血病マウスの骨髄から単離した白血病細胞を致死量以下（4Gy）照射レシピエントC57BL/6マウスに注射した。AML細胞（EGFP+）の末梢血における存在を14日後にフローサイトメトリーで判定した。100μgの精製ウサギIgG抗S100A8を、3日目から開始して毎週3回マウスの腹腔内に注射した。病気の徴候を示すマウスをサクリファイスし、末梢血及び骨髄を組織学及びフローサイトメトリー分析のために採集した。
【実施例３】
【００１７】
MLL-AF9の刺激
融合遺伝子MLL-AF9をトランスフェクトしたヒト臍帯血細胞を、15%ウシ胎児血清、IL-6及び幹細胞因子を補充したIMDMで培養した。細胞を96ウェルのマイクロタイタープレートに播種し（200,000細胞/ウェル）、続いて20μg/mLのmAb 1F8抗S100A8又はPBSで刺激した。72時間後に細胞を収集し、免疫表現型検査をフローサイトメトリーで実施し、続いて抗CD14で染色した。細胞周期はヨウ化プロピジウム染色で分析した。
【実施例４】
【００１８】
抗S100A8及びS100A9ペプチドの組合せ
初代白血病マウスの骨髄から単離した白血病細胞を致死量以下（4Gy）照射レシピエントC57BL/6マウスに注射した。AML細胞（EGFP+）の末梢血における存在を14日後にフローサイトメトリーで判定した。100μgの精製ウサギIgG抗S100A8、20μgの組換えマウスS100A9タンパク質又は抗S100A8及びS100A9タンパク質の組合せを、3日目から開始して毎週3回マウスの腹腔内に注射した。病気の徴候を示すマウスをサクリファイスし、末梢血及び骨髄を組織学及びフローサイトメトリー分析のために採集した。
本開示をその具体的な実施態様と連係して記載してきたが、更なる改変が可能であること、及び本出願が以下の一切の変型、使用又は応用を包含しようとしていることは理解されよう。前記には、本開示が属する技術分野で公知又は慣行であり、上記提示の本質的特色に適用され得る、添付の特許請求の範囲に従属する本開示の変更が含まれる。
本発明のまた別の態様は、以下のとおりであってもよい。
〔１〕白血病治療用抗S100A8。
〔２〕前記抗S100A8が抗体である、前記〔1〕に記載の抗S100A8。
〔３〕前記抗S100A8がS100A8タンパク質の一部分と特異的に結合する、前記〔1〕又は〔2〕に記載の抗S100A8。
〔４〕前記抗S100A8が、S100A8/S100A8ホモダイマー又はS100A8/S100A9ヘテロダイマーと特異的に結合する、前記〔1〕−〔3〕のいずれか1項に記載の抗S100A8。
〔５〕当該S100A8タンパク質がヒトS100A8である、前記〔3〕又は〔4〕に記載の抗S100A8。
〔６〕当該ヒトS100A8が配列番号:1に示されるアミノ酸配列を含む、前記〔5〕に記載の抗S100A8。
〔７〕前記抗S100A8がモノクローナル又はポリクローナル抗体である、前記〔1〕−〔6〕のいずれか1項に記載の抗S100A8。
〔８〕前記抗S100A8がマウス抗体、ヤギ抗体、ヒト抗体又はウサギ抗体である、前記〔1〕−〔7〕のいずれか1項に記載の抗S100A8。
〔９〕前記抗S100A8がヒト化抗体である、前記〔1〕−〔7〕のいずれか1項に記載の抗S100A8。
〔１０〕前記抗S100A8抗体がFv、F(ab’)又はF(ab’)2から成る群から選択されるエピトープ結合フラグメントを含む、前記〔2〕−〔9〕のいずれか1項に記載の抗S100A8。
〔１１〕前記抗S100A8抗体が、配列番号:3に示されるヌクレオチド配列によってコードされる重鎖可変領域を含む、前記〔2〕−〔9〕のいずれか1項に記載の抗S100A8。
〔１２〕前記抗S100A8抗体が配列番号:4から成る重鎖可変領域を含む、前記〔2〕−〔11〕のいずれか1項に記載の抗S100A8。
〔１３〕前記抗S100A8抗体が、配列番号:5に示されるヌクレオチド配列によってコードされる軽鎖可変領域を含む、前記〔2〕−〔9〕、〔11〕及び〔12〕のいずれか1項に記載の抗S100A8。
〔１４〕前記抗S100A8抗体が配列番号:6からなる軽鎖可変領域を含む、前記〔2〕−〔9〕及び〔11〕−〔13〕のいずれか1項に記載の抗S100A8。
〔１５〕抗S100A8が注射用に処方される、前記〔1〕−〔14〕のいずれか1項に記載の抗S100A8。
〔１６〕化学療法剤とともに投与するために処方される、前記〔1〕−〔15〕のいずれか1項に記載の抗S100A8。
〔１７〕当該化学療法剤がダウノルビシン、ドキソルビシン及びシタラビンの少なくとも1つである、前記〔16〕に記載の抗S100A8。
〔１８〕当該抗S100A8が化学療法剤との同時投与又は分離投与のために処方される、前記〔15〕又は〔16〕に記載の抗S100A8。
〔１９〕当該抗S100A8が対象動物の化学療法剤治療後の投与のために処方される、前記〔1〕−〔18〕のいずれか1項に記載の抗S100A8。
〔２０〕前記〔1〕−〔19〕のいずれか1項に記載の抗S100A8及び担体を含む組成物。
〔２１〕白血病治療のための、前記〔20〕に記載の組成物。
〔２２〕前記白血病が、急性リンパ芽球性白血病（ALL）、急性骨髄性白血病（AML）、慢性リンパ球性白血病（CLL）、慢性骨髄性白血病（CML）及び慢性骨髄単球性白血病（CMML）である、前記〔21〕に記載の組成物。
〔２３〕細胞分化促進のための、前記〔20〕に記載の組成物。
〔２４〕細胞分裂阻害のための、前記〔20〕に記載の組成物。
〔２５〕急性骨髄性白血病（AML）の治療のための、前記〔20〕に記載の組成物。
〔２６〕さらにS100A9ペプチド又はそのペプチド模倣物を含む、前記〔20〕−〔25〕のいずれか1項に記載の組成物。
〔２７〕当該S100A9ペプチドがヒトS100A9タンパク質である、前記〔26〕に記載の組成物。
〔２８〕当該ペプチドが配列番号:7に示されるアミノ酸配列を含む、前記〔26〕又は〔27〕に記載の組成物。
〔２９〕当該ペプチドが、配列番号:7と少なくとも60%、少なくとも70%若しくは少なくとも80%、少なくとも90%同一性、又は少なくとも約95%同一性を有する、前記〔28〕に記載の組成物。
〔３０〕当該ペプチドが配列番号:7に示されるアミノ酸配列から成る、前記〔28〕又は〔29〕に記載の組成物。
〔３１〕対象動物で白血病を治療する方法であって、前記方法が、前記〔1〕−〔19〕のいずれか1項に記載の抗S100A8、又は前記〔20〕−〔30〕のいずれか1項に記載の組成物を前記対象動物に投与する工程を含む、前記方法。
〔３２〕前記白血病が、急性リンパ芽球性白血病（ALL）、急性骨髄性白血病（AML）、慢性リンパ球性白血病（CLL）、慢性骨髄性白血病（CML）及び慢性骨髄単球性白血病（CMML）である、前記〔31〕に記載の方法。
〔３３〕さらに、前記対象動物に化学療法剤を投与する工程を含む、前記〔31〕又は〔32〕に記載の方法。
〔３４〕当該化学療法剤がダウノルビシン、ドキソルビシン及びシタラビンの少なくとも1つである、前記〔33〕に記載の方法。
〔３５〕当該抗S100A8又は組成物が化学療法剤と同時に又は分離して投与される、前記〔33〕又は〔34〕に記載の方法。
〔３６〕当該抗S100A8又は組成物が前記対象動物の化学療法剤治療後に投与される、前記〔31〕−〔35〕のいずれか1項に記載の方法。
〔３７〕対象動物で細胞分化を促進する方法であって、前記方法が、前記〔1〕−〔19〕のいずれか1項に記載の抗S100A8、又は前記〔20〕−〔30〕のいずれか1項に記載の組成物を前記対象動物に投与する工程を含む、前記方法。
〔３８〕対象動物で細胞分裂を阻害する方法であって、前記方法が、前記〔1〕−〔19〕のいずれか1項に記載の抗S100A8、又は前記〔20〕−〔30〕のいずれか1項に記載の組成物を前記対象動物に投与する工程を含む、前記方法。
〔３９〕ex vivoで細胞分化を促進する方法であって、前記方法が、前記〔1〕−〔19〕のいずれか1項に記載の抗S100A8、又は前記〔20〕−〔30〕のいずれか1項に記載の組成物を投与する工程を含む、前記方法。
〔４０〕ex vivoで細胞分裂を阻害する方法であって、前記方法が、前記〔1〕−〔19〕のいずれか1項に記載の抗S100A8、又は前記〔20〕−〔30〕のいずれか1項に記載の組成物を投与する工程を含む、前記方法。
〔４１〕対象動物の白血病治療のための、前記〔1〕−〔19〕のいずれか1項に記載の抗S100A8、又は前記〔20〕−〔25〕のいずれか1項に記載の組成物の使用。
〔４２〕対象動物の白血病治療用医薬の製造における、前記〔1〕−〔19〕のいずれか1項に記載の抗S100A8、又は前記〔20〕−〔30〕のいずれか1項に記載の組成物の使用。
〔４３〕前記白血病が、急性リンパ芽球性白血病（ALL）、急性骨髄性白血病（AML）、慢性リンパ球性白血病（CLL）、慢性骨髄性白血病（CML）及び慢性骨髄単球性白血病（CMML）である、前記〔41〕又は〔42〕に記載の使用。
〔４４〕前記抗S100A8又は組成物が化学療法剤とともに投与するために処方される、前記〔41〕−〔43〕のいずれか1項に記載の使用。
〔４５〕当該化学療法剤がダウノルビシン、ドキソルビシン及びシタラビンの少なくとも1つである、前記〔44〕に記載の使用。
〔４６〕当該抗S100A8又は組成物が化学療法剤との同時投与又は分離投与のために処方される、前記〔44〕又は〔45〕に記載の使用。
〔４７〕当該抗S100A8又は組成物が対象動物の化学療法剤治療後の投与のために処方される、前記〔41〕−〔46〕のいずれか1項に記載の使用。
〔４８〕細胞分化促進のための、前記〔1〕−〔19〕のいずれか1項に記載の抗S100A8又は前記〔20〕−〔30〕のいずれか1項に記載の組成物の使用。
〔４９〕細胞分裂阻害のための、前記〔1〕−〔19〕のいずれか1項に記載の抗S100A8又は前記〔20〕−〔30〕のいずれか1項に記載の組成物の使用。
〔５０〕前記対象動物が哺乳動物である、前記〔26〕−〔38〕のいずれか1項に記載の方法、又は前記〔41〕−〔47〕のいずれか1項に記載の使用。
〔５１〕前記対象動物がマウス又は人間である、前記〔26〕−〔38〕及び〔50〕のいずれか1項に記載の方法、又は前記〔41〕−〔47〕及び〔50〕のいずれか1項に記載の使用。
〔５２〕前記抗S100A8が、S100A9ペプチド又はそのペプチド模倣物との投与のために処方される、前記〔26〕−〔38〕、〔50〕及び〔51〕のいずれか1項に記載の方法、又は前記〔41〕−〔47〕及び〔50〕−〔51〕のいずれか1項に記載の使用。
〔５３〕当該S100A9ペプチドがヒトS100A9タンパク質である、前記〔52〕に記載の方法、又は前記〔52〕に記載の使用。
〔５４〕当該ペプチドが配列番号:7に示されるアミノ酸配列を含む、前記〔52〕若しくは〔53〕に記載の方法、又は前記〔52〕若しくは〔53〕に記載の使用。
〔５５〕当該ペプチドが、配列番号:7と少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%同一性、又は少なくとも約95%同一性を有する、前記〔52〕若しくは〔53〕に記載の方法、又は前記〔52〕若しくは〔53〕に記載の使用。
〔５６〕当該ペプチドが配列番号:7に示されるアミノ酸配列から成る、前記〔52〕若しくは〔53〕に記載の方法、又は前記〔52〕若しくは〔53〕に記載の使用。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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