(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
−ＡｐｏＯ、
−配列番号１０、配列番号１１又は配列番号１２の少なくとも１つを含む、ＡｐｏＯと同じ生物学的機能を有するＡｐｏＯのフラグメント、
−前記ＡｐｏＯ又は前記フラグメントをコードするベクター
からなる群より選択される化合物を含む、ガン性細胞におけるアポトーシスを誘導するために使用するための治療組成物。
【請求項２】
−ＡｐｏＯ、
−配列番号１０、配列番号１１又は配列番号１２の少なくとも１つを含む、ＡｐｏＯと同じ生物学的機能を有するＡｐｏＯのフラグメント、
−前記ＡｐｏＯ又は前記フラグメントをコードするベクター
からなる群より選択される化合物を含む、ガン性細胞におけるアポトーシスを誘導することによってガンを処置するための治療組成物。
【請求項３】
前記ガン性細胞が、心臓細胞、肝臓細胞、膀胱細胞、脳細胞、乳房細胞、結腸細胞、直腸細胞、子宮内膜細胞、腎細胞、血液細胞、表皮細胞、膵臓細胞、前立腺細胞及び甲状腺細胞からなる群より選択される、請求項１又は２に記載の治療組成物。
【請求項４】
前記ガン性細胞が脳ガン細胞であり、前記脳ガンが、脊索腫、頭蓋咽頭腫、神経節細胞腫、神経節腫、未分化神経節膠腫、頸静脈小体、髄膜腫、松果体細胞腫、下垂体腺腫、神経鞘腫、神経膠腫、血管芽細胞腫及びラブドイド腫瘍を含む脳ガンから選択される、請求項３に記載の治療組成物。
【請求項５】
前記ガン性細胞が、星状細胞、上衣細胞及び希突起膠細胞からなる群より選択される、請求項４に記載の治療組成物。
【請求項６】
前記ガンが膠芽細胞腫である、請求項２〜５のいずれか一項に記載の治療組成物。
【請求項７】
化合物が、ヒトＡｐｏＯ、好ましくは配列番号１に示されているヒトＡｐｏＯである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の治療組成物。
【請求項８】
化合物が、ＡｐｏＯフラグメントであり、３０〜１９０、好ましくは５０〜１３０、より好ましくは７０〜１２０アミノ酸の長さを有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の治療組成物。
【請求項９】
化合物が、ＡｐｏＯフラグメントであり、８〜１９０、好ましくは８〜１００、より好ましくは８〜５０アミノ酸の長さを有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の治療組成物。
【請求項１０】
化合物が、配列番号１０、配列番号１１及び配列番号１２に示されているフラグメントからなる群より選択されるＡｐｏＯフラグメントである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の治療組成物。
【請求項１１】
化合物が、配列番号１２に示されているＡｐｏＯフラグメントである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の治療組成物。
【請求項１２】
化合物が、ＡｐｏＯフラグメントであり、ネイティブなＡｐｏＯのＮ末端の少なくとも４０アミノ酸を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の治療組成物。
【請求項１３】
化合物が、ＭＰＴＰと相互作用してＭＰＴＰが開口状態をとるようにし、それにより、ミトコンドリア脱共役を誘導する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の治療組成物。
【請求項１４】
化合物が、ＣｙＰＤ又はＡＮＴと相互作用する、請求項１３に記載の治療組成物。
【請求項１５】
化合物が、ミトコンドリア呼吸を増加させ、脂肪酸代謝を増加させ、前記ガン性細胞内の脂質蓄積を誘導する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の治療組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ガン性細胞におけるアポトーシスを誘導するのに使用するための化合物であって、ＡｐｏＯ、その変異体又はフラグメント、それらの混合物及び前記ＡｐｏＯ、その変異体又はフラグメントをコードするベクターからなる群より選択される化合物に関する。本発明はさらに、病態生理学的状態を処置するのに使用するための化合物であって、ＡｐｏＯ活性又はＡｐｏＯ遺伝子発現のインヒビターである化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ガンの流行は過去数十年間で劇的に拡大し、紛れもなく、研究されている主要な現代病となった。ガンの病因に関する新たな遺伝学的側面は、ますます重要と認識されている。最近、ガンを患っている患者を処置するために、新規戦略が開発された。それらのうち、細胞周期の停止を誘導するために、又はアポトーシスを誘導するために、新規化学療法化合物が設計された。実際、アポトーシスの誘導は、患者を処置するための非常に有望な戦略となった。しかしながら、科学界は、現在の化学療法の周知の副作用を緩和し、ガンの処置において効率的な結果を提供する新たな化合物を強く必要としている。
【０００３】
一方、肥満及び糖尿病の流行は世界的規模に達しており、早死につながる、非脂肪組織における外因性脂質沈着による二次臓器不全の前兆である。実際、よく見られる肥満関連障害（非アルコール性脂肪肝疾患、２型糖尿病及び脂肪毒性心筋症）は、臓器内の過剰な脂質蓄積（脂肪毒性と称されている病理学的プロセス）に起因する。しかしながら、前記脂肪毒性に関与する機構は依然として論争中であり、過剰な脂質蓄積に起因する病状を処置するための効率的な治療法であって、これまでに適切であると判明したものはない。したがって、過剰な脂質蓄積に起因する病状を治療及び／又は予防するための新たな治療戦略について、長い間満たされていない必要性が存在する。
【発明の概要】
【０００４】
本発明者らは、ＡｐｏＯがミトコンドリア内に局在し、その発現が、特にマウス及びヒトの心臓におけるミトコンドリア機能不全に関連することを示した。本発明者らは、ＡｐｏＯがアデニンヌクレオチドトランスロカーゼ（ＡＮＴ）及びシクロフィリンＤと相互作用し、ミトコンドリア膜透過性遷移孔（ＭＰＴＰ）が開口状態（これは、マイルドな脱共役を誘導する）をとるようにすることを証明した。
【０００５】
結果として、ミトコンドリア呼吸及び脂肪酸代謝が増強される。このカスケード事象はミトコンドリア代謝シンクを生成し、それにより、細胞が脂質及び脂肪毒性生成物を蓄積して、最終的にはアポトーシスにつながる。
【０００６】
したがって、本発明者らは、驚くべきことに、ガンを処置するための、より正確にはガン細胞におけるアポトーシスを誘導するための新たな治療戦略を開発するために非常に有用なＡｐｏＯの新たな役割を示した。したがって、本発明は、ガン性細胞におけるアポトーシスを誘導するのに使用するための化合物であって、ＡｐｏＯ、その変異体又はフラグメント、それらの混合物及び前記ＡｐｏＯ、その変異体又はフラグメントをコードするベクターからなる群より選択される化合物に関する。
【０００７】
より正確には、マウス及びヒトの心臓において実験することによって、本発明者らは、ＡｐｏＯの過剰発現が、糖尿病性心臓の代謝表現型を模倣する心筋症を誘導することを見出した。したがって、本発明はまた、病態生理学的状態、好ましくは肥満、糖尿病、心筋症、筋障害、脂肪肝、膵炎及び／又は甲状腺機能低下症における脂質過負荷を軽減するための方法において使用するための化合物であって、ＡｐｏＯ活性又はＡｐｏＯ遺伝子発現のインヒビターである化合物に関する。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
発明の詳細な説明
定義
本明細書を通して、いくつかの用語が用いられ、以下の段落で定義される。
【０００９】
本明細書で使用される用語「アポリポタンパク質Ｏ」又は「ＡｐｏＯ」は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、脂質に結合してリポタンパク質（これは、リンパ系及び循環系を介して脂質を輸送する）を形成するアポリポタンパク質のタンパク質ファミリーのメンバーを意味する。ＡｐｏＯは、２３アミノ酸長のシグナルペプチドを含有する１９８アミノ酸のタンパク質である。その配列は、以下の通りである：
【表１】
0006698031.tif 000002
【００１０】
前記配列は、配列番号１によって示される。
【００１１】
アポリポタンパク質Ｏ遺伝子は、一連のヒト組織において発現される。ヒトＡｐｏＯ遺伝子の例示的な配列は、アクセッションナンバーＮＭ＿０２４１２２の下でデータベースに寄託されている。ヒトＡｐｏＯタンパク質の例示的な配列は、選択的スプライシングのため、アクセッションナンバーＱ９ＢＵＲ５及びＣ９Ｊ５７４の下でUniProtKB/Swiss-Protデータベースに寄託されている。
【００１２】
本明細書で使用される表現「ミトコンドリア膜透過性遷移孔」又は「ＭＰＴＰ」は、ミトコンドリア膜上に局在する細孔を指す。この細孔は、分子量１．５kDa未満の代謝産物及び分子（プロトンを含む）のミトコンドリアへの自由な通過を可能にする。ＭＰＴＰを構成するタンパク質は、少なくとも電圧依存性アニオンチャネル（ＶＤＡＣ）、シクロフィリンＤ及びアデニンヌクレオチドトランスロカーゼ（ＡＮＴ）を含み、後者は、ＭＰＴＰ開口のレギュレーターとして作用する。
【００１３】
本明細書で使用される表現「ミトコンドリア脱共役」及び「脱共役」は、ミトコンドリアのプロトン勾配が、酸化的リン酸化のためのエネルギーを提供するという目的を果たし得る前に、その解消を引き起こす現象を指す。
【００１４】
本明細書で使用される用語「アポトーシス」は、プログラム細胞死を指す。本発明との関連では、前記死は、本発明者によって証明された新たな生物学的プロセスを介してＡｐｏＯによって誘導される。前記プロセスは、脱共役を誘導して最終的には脂質及び脂肪毒性生成物の蓄積をもたらし、したがってアポトーシスをもたらすＭＰＴＰの開口を含む。
【００１５】
本明細書で使用される表現「カスパーゼ３」は、カスパーゼ８及びカスパーゼ９と相互作用するカスパーゼタンパク質を指す。それは、ＣＡＳＰ３遺伝子カスパーゼ−３によってコードされ、外因性（デスリガンド）及び内因性（ミトコンドリア）経路の両方によってアポトーシス細胞において活性化される。
【００１６】
その最も広い意味において、用語「処置する」及び「処置」は、このような用語が適用される障害若しくは症状、又はこのような障害若しくは症状の１つ以上の症候の進行の回復、緩和、阻害、又はこれらの予防を指す。
【００１７】
ガンの処置
第１の態様では、本発明は、ガン性細胞におけるアポトーシスを誘導するのに使用するための化合物であって、ＡｐｏＯ、その変異体又はフラグメント、それらの混合物及び前記ＡｐｏＯ、その変異体又はフラグメントをコードするベクターからなる群より選択される化合物に関する。
【００１８】
本発明はまた、ガン性細胞におけるアポトーシスを誘導することによってガンを処置するのに使用するための化合物であって、ＡｐｏＯ、その変異体又はフラグメント、それらの混合物及び前記ＡｐｏＯ、その変異体又はフラグメントをコードするベクターからなる群より選択される化合物に関する。
【００１９】
用語「ガン」は、ガン性細胞とも称される無秩序な細胞成長を特徴とする疾患又は障害を指す。
【００２０】
本発明者らは初めて、タンパク質ＡｐｏＯの新たな役割を示した。心筋芽細胞においてＡｐｏＯのin vivo蛍光標識を実施することによって、本発明者らは、ＡｐｏＯの予想外のミトコンドリア内局在性を証明した。実際、ＡｐｏＯは、ミトコンドリア内膜にアドレスされる。
【００２１】
次いで、本発明者らは、ＡｐｏＯが、ミトコンドリアの機能及びエネルギー生成のレギュレーションにおいて重要な役割を果たすことを証明した。前記目的を達成するために、ＡｐｏＯは、特有の結合パートナー：シクロフィリンＤ及びＡＮＴを有する。本発明者らは、ＡｐｏＯとシクロフィリンＤ及びＡＮＴとの相互作用がＭＰＴＰの開口につながることを示した。したがって、ＭＰＴＰは、ミトコンドリア呼吸のレギュレーションにおいて主要な役割を果たす。本発明者らはさらに、ＡｐｏＯ過剰発現が細胞内活性酸素種（ＲＯＳ）の増加につながることを示した。実際、プロアポトーシス因子Ｂａｘ（Ｂａｄ、Ｂａｋ、カスパーゼ−９）のｍＲＮＡレベルは増強された。これは、in vivoではＡｐｏＯ発現ベクターでトランスフェクションした肝臓において、及びin vitroでは心筋芽細胞において実際に確認された。
【００２２】
本発明者らは、トリグリセリドレベルは有意に改変されなかったが、ジグリセリド及びセラミドレベルはＡｐｏＯの発現によって増加したことを示した。したがって、ＡｐｏＯは、脂肪毒性種の細胞内蓄積をもたらし、アポトーシスに明らかにつながることが示された。新たに発見されたこの生物学的機構を介して、ＡｐｏＯによって引き起こされるＭＰＴＰの開口は、プログラム細胞死のプロセスにおける重要な工程であることが見出された。
【００２３】
さらに、本発明者らは、ＡｐｏＯを過剰発現するガン性細胞株を開発し、前記細胞におけるカスパーゼ−３活性の有意な増加を示したが、これは、アポトーシスの増加を示している。したがって、本発明者らは、ガン性細胞株におけるアポトーシスの誘導におけるＡｐｏＯの役割を示したが、これは、ＡｐｏＯがガン処置の重要なターゲットであることを明確に証明している。
【００２４】
好ましくは、前記ガン性細胞は、高含量のミトコンドリアを有する細胞である。好ましくは、前記ガン性細胞は、少なくとも３０体積％、好ましくは４０体積％のミトコンドリアを含む。
【００２５】
典型的には、このようなガン細胞は、心臓細胞、肝臓細胞、膀胱細胞、脳細胞、乳房細胞、結腸細胞、直腸細胞、子宮内膜細胞、腎細胞、血液細胞、肺細胞、表皮細胞、膵臓細胞、前立腺細胞及び甲状腺細胞からなる群より選択される。
【００２６】
したがって、本発明の化合物は、心臓ガン、肝臓ガン、膀胱ガン、脳ガン、結腸直腸ガン、子宮内膜ガン、腎臓ガン、白血病、肺ガン、黒色腫、リンパ腫、膵臓ガン、前立腺ガン及び甲状腺ガンからなる群より選択されるガンを処置するために非常に有用である。
【００２７】
好ましくは、前記ガンは、心臓ガン、肝臓ガン、膀胱ガン、脳ガン、結腸直腸ガン、子宮内膜ガン、腎臓ガン、白血病、黒色腫、リンパ腫、膵臓ガン、前立腺ガン及び甲状腺ガンからなる群より選択される。
【００２８】
より好ましくは、前記ガンは、脳ガンである。前記脳ガンは、良性又は悪性ガンであり得る。脳ガンの非限定的なリストとしては、脊索腫、頭蓋咽頭腫、神経節細胞腫、神経節腫、未分化神経節膠腫、頸静脈小体、髄膜腫、松果体細胞腫、下垂体腺腫、神経鞘腫、神経膠腫、血管芽細胞腫及びラブドイド腫瘍が挙げられる。
【００２９】
好ましくは、前記ガンは、神経膠腫である。神経膠腫は、最も一般的な種類の成人脳腫瘍であり、悪性脳腫瘍の７８パーセントを占める。それらは、グリアと称される脳の支持細胞から生じる。これらの細胞は、星状細胞、上衣細胞及び希突起膠細胞（又はオリゴ）に細分される。グリア系腫瘍としては、以下のものが挙げられる：星状細胞腫、上衣腫、多形性神経膠芽腫、髄芽腫、乏突起膠腫。
【００３０】
より好ましくは、前記ガンは、神経膠芽腫である。神経膠芽腫は急速に進行する致命的ガンであり、ヒトにおいて最も一般的で最も浸潤性の原発性悪性脳腫瘍であり、全ての機能性組織の脳腫瘍例の５２％及び全ての頭蓋内腫瘍の２０％を占める。本発明者らは、神経膠芽腫細胞におけるＡｐｏＯの過剰発現が、脂肪毒性及びミトコンドリア機能不全を誘導することを証明した。前記現象は、最終的には、細胞のアポトーシスにつながる。
【００３１】
結果として、本発明はさらに、ガン性細胞における脂肪毒性及びミトコンドリア機能不全を誘導することによってガンを処置するのに使用するための化合物であって、ＡｐｏＯ、その変異体又はフラグメント、それらの混合物及び前記ＡｐｏＯ、その変異体又はフラグメントをコードするベクターからなる群より選択される化合物に関する。ガン性細胞内における脂肪毒性及びミトコンドリア機能不全を誘導することによって、本発明の化合物は、最終的には、前記ガン性細胞のアポトーシスを誘導する。
【００３２】
典型的には、前記ガンのガン性細胞は、大量のＡＴＰを必要とし、及び／又は産生する。前記細胞は、高酸化的リン酸化（すなわち、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）を産生するための増強された代謝活性）を特徴とする。
【００３３】
好ましくは、前記化合物は、ヒトＡｐｏＯ、好ましくはネイティブなヒトＡｐｏＯである。より好ましくは、前記化合物は、配列番号１に開示されている配列である。
【００３４】
好ましくは、前記化合物は、ＭＰＴＰと相互作用してＭＰＴＰが開口状態をとるように促し、それにより、ミトコンドリア脱共役を誘導する。典型的には、前記化合物は、ＭＰＴＰの脂質又はタンパク質成分と相互作用する。
【００３５】
より好ましくは、前記化合物は、シクロフィリンＤ及びＡＮＴと相互作用してＭＰＴＰが開口状態をとるようにし、それにより、ミトコンドリア脱共役を誘導する。ＭＰＴＰの前記開口状態は、ＲＯＳ生成の増加をもたらす酸素消費量及び電子伝達鎖束を増強した。
【００３６】
好ましくは、前記化合物は、ミトコンドリア呼吸を増加させ、脂肪酸代謝を増加させ、前記ガン性細胞内の脂質蓄積を誘導する。これらの現象は、明らかに、ガン性細胞のアポトーシスにつながる。
【００３７】
本明細書で使用される用語「ＡｐｏＯ変異体」は、ネイティブな配列のＡｐｏＯと機能的に同等なタンパク質であって、類似のアミノ酸配列を有し、ネイティブなＡｐｏＯの１つ以上の活性をある程度保持するタンパク質を指す。変異体はまた、活性を維持するフラグメントを含む。このような変異体は、欠失、挿入及び／又は置換などのアミノ酸変化を有するタンパク質を含む。「欠失」は、関連タンパク質における１つ以上のアミノ酸残基の欠如を指す。「挿入」は、関連タンパク質における１つ以上のアミノ酸の追加を指す。「置換」は、ポリペプチドにおける別のアミノ酸残基による１つ以上のアミノ酸残基の置き換えを指す。典型的には、このような変化は、変異体タンパク質の活性がネイティブな配列のタンパク質と実質的に類似するように、性質の点で保存的である（例えば、Creighton (1984) Proteins, W.H. Freeman and Companyを参照のこと）。置換の場合、別のアミノ酸を置換するアミノ酸は、通常、類似の構造的及び／又は化学的性質を有する。挿入及び欠失は、典型的には、１〜５アミノ酸の範囲内であるが、挿入の位置に応じて、より多くのアミノ酸が挿入又は除去され得る。変異は、部位特異的突然変異誘発（Carter, et al. 1985; Nucl. Acids Res. 13:4331; Zoller et al. 1982）、カセット突然変異誘発（Wells et al. 1985）及びＰＣＲ突然変異誘発（Sambrook et al., Molecular Cloning:  A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor Press, N.Y., (2001)）などの当技術分野で公知の方法を使用して作製され得る。
【００３８】
好ましくは、ＡｐｏＯ変異体は、ＡｐｏＯのネイティブなアミノ酸配列に対して少なくとも７０％のアミノ酸配列同一性、好ましくは少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９７％のアミノ酸配列同一性を含むアミノ酸配列を含む。
【００３９】
「アミノ酸配列同一性のパーセント（％）」は、配列をアライメントし、必要であればギャップを導入して配列同一性のパーセントを最大にした後の、ＡｐｏＯ配列中のアミノ酸残基と同一の候補配列中のアミノ酸残基の割合を指し、いかなる保存的置換も配列同一性の一部とみなさない。
【００４０】
本明細書で使用される表現「ＡｐｏＯフラグメント」は、ネイティブなＡｐｏＯと本質的に同じ生物学的機能又は活性を保持し得るポリペプチドであって、ＡｐｏＯアミノ酸配列の領域を含むポリペプチドを指す。好ましくは、前記フラグメントは、３０〜１９０、好ましくは４０〜１６０、より好ましくは７０〜１６０アミノ酸の長さを有する。
【００４１】
好ましくは、前記フラグメントは、少なくとも８アミノ酸、好ましくは少なくとも９アミノ酸、好ましくは少なくとも１０アミノ酸、好ましくは少なくとも１５アミノ酸、好ましくは少なくとも２０アミノ酸、好ましくは少なくとも３０アミノ酸を含む。
【００４２】
好ましくは、前記フラグメントは、８〜１９０、好ましくは８〜１００、より好ましくは８〜５０アミノ酸の長さを有する。
【００４３】
好ましくは、前記フラグメントは、ネイティブなＡｐｏＯのＮ末端の４０アミノ酸。実際、本発明者らは、ＡｐｏＯ配列が、Ｎ末端の４０アミノ酸を含むＮ末端ミトコンドリアアドレスラベルを含むことを証明した。したがって、これらのアミノ酸は、ＡｐｏＯフラグメントがミトコンドリア膜に正しくアドレスされるために必須である。
【００４４】
あるいは、前記フラグメントは、ネイティブなＡｐｏＯのＣ末端の少なくとも６０、好ましくは９０、好ましくは１２０、好ましくは１５８アミノ酸を含む。好ましくは、前記フラグメントは、配列番号１０、配列番号１１及び配列番号１２に示されているフラグメントからなる群より選択される。
【００４５】
前記フラグメントはそれぞれ、以下の通りである：
配列番号１０：ＹＴＴＷＣＱＥＴＹ；
配列番号１１：ＱＷＧＬＤＳＹＤＹ；及び
配列番号１２：ＹＤＷＧＬＲＧＹ。
【００４６】
より好ましくは、前記フラグメントは、配列番号１２に示されているフラグメントである。
【００４７】
いかなる理論にも拘束されないが、本発明者らは、本発明との関連では、これらの非常に特異的なＡｐｏＯフラグメントが、ＡｐｏＯの有益な特性に関与すると考える。
【００４８】
典型的には、前記ＡｐｏＯ又はＡｐｏＯフラグメントは、ベクター中にあり得る。「ベクター」は、別の核酸を輸送することができる核酸である。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド又はファージであり得る。ベクターは、適切な環境に存在する場合、ベクターによって運ばれる１つ以上の遺伝子によってコードされるタンパク質の発現を指令することができる。ベクターは、一般に、望ましくは１つ以上のターゲット細胞において発現されるタンパク質をコードする遺伝子を含む。好ましくは、目的の遺伝子は、５’ＬＴＲ配列と３’ＬＴＲ配列との間に配置される。さらに、目的の遺伝子がターゲット細胞に組み込まれた後、該遺伝子の発現を特定の方法でレギュレーションするために、目的の遺伝子は、好ましくは、他の遺伝要素、例えば転写調節配列、例えばプロモーター及び／又はエンハンサーと機能的な関係にある。特定の実施態様では、有用な転写調節配列は、活性に関して、時間的及び空間的に高度にレギュレーションされるものである。当業者であれば、ベクターを慎重に選択し、ターゲットガン性細胞内においてＡｐｏＯを発現させるためのルーチン技術を認識している。
【００４９】
典型的には、前記ベクターは、ウイルスベクターであり得る。オンコレトロウイルスベクター及びレンチウイルスベクターは、安定なトランスダクションをもたらし、長期間の導入遺伝子発現を維持し、レンチウイルスの場合には非分裂細胞のトランスダクションを可能にするので、有望な特徴を示す。
【００５０】
あるいは、前記ベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。ＡＡＶは、複製欠損パルボウイルスであり、その一本鎖ＤＮＡゲノムは、１４５ヌクレオチドの逆位末端反復（ＩＴＲ）を含む約４．７ｋｂの長さである。ＡＡＶは、例えば、遺伝子療法において外来ＤＮＡを細胞に送達するためのベクターとして魅力的な独特の特徴を有する。培養物中の細胞のＡＡＶ感染は非細胞変性であり、ヒト及び他の動物の自然感染は、不顕性及び無症候性である。また、ＡＡＶは、多くの哺乳動物細胞に感染し、in vivoで多くの異なる組織をターゲティングする可能性がある。また、ＡＡＶは、分裂細胞及び非分裂細胞に徐々にトランスダクションし、それらの細胞の一生にわたって、転写活性な核エピソーム（染色体外因子）として本質的に存続し得る。ＡＡＶプロウイルスゲノムは、プラスミド中のクローニングＤＮＡと同様に感染性であり、それにより、リコンビナントゲノムの構築が実行可能となる。
【００５１】
ＡＡＶの複数の血清型が存在し、様々な組織指向性を提供する。公知の血清型としては、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０及びＡＡＶ１１が挙げられる。
【００５２】
好ましくは、前記ベクターは、アデノ随伴ウイルスベクター、好ましくはリコンビナントアデノ随伴ウイルスベクターである。
【００５３】
より好ましくは、本発明との関連では、前記ベクターは、ＡＡＶ９である。ＡＡＶ９は血液脳関門を通過することができるので、アデノ随伴ウイルス９の使用は、遺伝子を脳細胞に送達するために非常に便利である。
【００５４】
したがって、好ましい実施態様では、本発明は、脂肪毒性、ミトコンドリア機能不全及び最終的には神経膠芽腫細胞のアポトーシスを誘導することによって神経膠芽腫を処置するためのＡｐｏＯをコードするベクターであって、ＡｐｏＯを発現するアデノ随伴ウイルス９であるベクターに関する。
【００５５】
本明細書で使用される表現「ネイティブなＡｐｏＯの生物学的機能及び／又は活性」は、シクロフィリンＤ及びＡＮＴと相互作用してＭＰＴＰが開口状態をとるように促し、及び／又はミトコンドリア呼吸を増加させ、脂肪酸代謝を増加させ、脂質蓄積を誘導するＡｐｏＯの能力を指す。
【００５６】
当業者であれば、最も適切な投与経路を認識している。好ましくは、本発明の化合物は、経口投与、舌下投与、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与、経皮投与、局所投与され得る。最も好ましくは、本発明の化合物は、所望の薬理学的効果を得るのに十分な投与量で、注射によって、例えば、動脈内注射、腹腔内注射又は好ましくは静脈内注射によって投与される。
【００５７】
主治医は、投与を終了、中断又は適合する方法及び時期を理解しているであろう。逆に、主治医はまた、臨床反応が適切でない場合には、処置をより高いレベルに適合することを理解しているであろう。目的の障害の管理における投与量の規模は、処置すべき症状の重症度によって変化するであろう。症状の重篤度は、例えば、標準的な予後評価方法によって部分的に評価され得る。さらに、用量及びおそらく投与頻度もまた、個々の患者の年齢、体重及び反応に応じて変化するであろう。動物医療では、上記と同程度のプログラムが用いられ得る。
【００５８】
過剰な脂質蓄積に起因する病状の処置
ヒトの心臓、マウスの肝臓及び心筋芽細胞（cardiac myobloasts）において実験することによって、本発明者らは、ＡｐｏＯの過剰発現が高レベルのアポトーシス（これは、とりわけ、高いカスパーゼ３活性によって証明された）に関連していたことを見出した。したがって、本発明者らは、ＡｐｏＯの過剰発現がアポトーシス率を増加させることを初めて明らかにした。
【００５９】
したがって、ＡｐｏＯの阻害は、肥満に関連する障害、例えば非アルコール性脂肪肝疾患、２型糖尿病及び脂肪毒性心筋症を治療及び／又は予防するために非常に適切であることが見出された。実際、これらの病状は、アポトーシスの原因となる脂肪毒性につながる臓器内の過剰な脂質蓄積に起因する。したがって、ＡｐｏＯ活性又はＡｐｏＯ遺伝子発現のインヒビターの投与は、脂肪毒性を最小化し、ターゲット細胞の生存率を高める。本発明者らは、脂肪毒性が、ミトコンドリア機能不全の原因ではなく結果であることの立証責任を果たした。
【００６０】
したがって、第２の態様では、本発明は、肥満、糖尿病、脂肪肝、膵炎及び甲状腺機能低下症からなる群より選択される病態生理学的状態を処置するための方法において使用するための化合物であって、ＡｐｏＯ活性又はＡｐｏＯ遺伝子発現のインヒビターである化合物に関する。好ましくは、前記病態生理学的状態は、肥満及び糖尿病からなる群より選択される。
【００６１】
特定の実施態様では、前記化合物は、病態生理学的状態、好ましくは肥満、糖尿病、心筋症、筋障害、脂肪肝、膵炎及び／又は甲状腺機能低下症における脂質過負荷を軽減するための方法において使用され、前記化合物は、ＡｐｏＯ活性又はＡｐｏＯ遺伝子発現のインヒビターである。好ましくは、前記病態生理学的状態は、肥満、糖尿病及び心筋症からなる群より選択される。
【００６２】
好ましくは、前記被験体は、糖尿病及び／又は肥満を患っている。
【００６３】
表現「ＡｐｏＯ活性又はＡｐｏＯ遺伝子発現のインヒビター」は、広く理解されるべきであり、この表現は、ＡｐｏＯ又はＡｐｏＯに結合する化合物の発現をダウンレギュレーションする薬剤を指す。
【００６４】
「発現のインヒビター」は、遺伝子の発現を阻害又は有意に低減する生物学的効果を有する天然化合物又は合成化合物を指す。したがって、「ＡｐｏＯ遺伝子発現のインヒビター」は、ＡｐｏＯタンパク質をコードする遺伝子の発現を阻害又は有意に低減する生物学的効果を有する天然化合物又は合成化合物を指す。
【００６５】
本明細書で使用される用語「ＡｐｏＯ活性」は、脂質に結合してリンパ系及び循環系を介して輸送し、又は細胞内の脂質取り込み及び脂質代謝を増強するＡｐｏＯの能力を意味する。
【００６６】
一実施態様では、本発明の化合物は、低分子量インヒビター、例えば（天然又は非天然）小有機分子であり得る。
【００６７】
「小有機分子」という用語は、医薬品に一般に使用されるこのような有機分子と同程度のサイズの（天然又は非天然）分子を指す。この用語は、生物学的な巨大分子（例えば、タンパク質、核酸など）を除外する。好ましい小有機分子は、最大約５０００Ｄａ、より好ましくは最大２０００Ｄａ、最も好ましくは最大約１０００Ｄａのサイズの範囲内である。
【００６８】
別の実施態様では、本発明の化合物は、ＡｐｏＯタンパク質に結合してＡｐｏＯ活性を阻害する抗体である。
【００６９】
ＡｐｏＯタンパク質に対する抗体は、例えばとりわけブタ、ウシ、ウマ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ及びマウスから選択される宿主動物に適切な抗原又はエピトープを投与することによって、公知の方法にしたがって生じ得る。当技術分野で公知の様々なアジュバントを使用して、抗体産生を増強し得る。本発明の実施に有用な抗体はポリクローナルであり得るが、モノクローナル抗体が好ましい。ＡｐｏＯタンパク質に対するモノクローナル抗体は、培養液中の連続細胞株によって抗体分子の産生を提供する任意の技術を使用して調製及び単離され得る。産生及び単離のための技術としては、限定されないが、Kohler and Milstein (1975)に最初に記載されているハイブリドーマ技術；ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Cote et al., 1983）；及びＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Cole et al. 1985）が挙げられる。あるいは、一本鎖抗体の産生について記載されている技術（例えば、米国特許第４，９４６，７７８号を参照のこと）を、抗ＡｐｏＯ一本鎖抗体の産生に適応させ得る。本発明の実施に有用なＡｐｏＯインヒビターはまた、限定されないが、インタクトな抗体分子のペプシンによる消化によって生成され得るＦ（ａｂ’）２フラグメント、及びＦ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド橋の還元によって生成され得るＦａｂフラグメントを含む抗ＡｐｏＯ抗体フラグメントを含む。あるいは、Ｆａｂ及び／又はｓｃＦｖ発現ライブラリーを構築して、ＡｐｏＯに対する所望の特異性を有するフラグメントの迅速な同定を可能にし得る。
【００７０】
ヒト化抗ＡｐｏＯ抗体及びその抗体フラグメントはまた、公知の技術にしたがって調製され得る。「ヒト化抗体」は、非ヒト免疫グロブリンから誘導された最小配列を含む非ヒト（例えば、齧歯類）キメラ抗体の形態である。大部分において、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域（ＣＤＲ）由来の残基が、所望の特異性、親和性及び能力を有するマウス、ラット、ウサギ又は非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）の超可変領域由来の残基によって置換されているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。いくつかの場合では、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体又はドナー抗体に見られない残基を含み得る。抗体の能力をさらに洗練するために、これらの改変が行われる。一般に、ヒト化抗体は、超可変ループの全て又は実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲの全て又は実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列のものである少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含むであろう。ヒト化抗体はまた、場合により、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンのものを含むであろう。ヒト化抗体を作製するための方法は、例えばWinter（米国特許第５，２２５，５３９号）及びBoss（Celltech、米国特許第４，８１６，３９７号）によって記載されている。
【００７１】
さらに別の実施態様では、ＡｐｏＯインヒビターは、アプタマーから選択され得る。アプタマーは、分子認識の点において、抗体の代替物を代表する分子クラスである。アプタマーは、高い親和性及び特異性で実質的に任意のクラスのターゲット分子を認識する能力を有するオリゴヌクレオチド又はオリゴペプチド配列である。このようなリガンドは、Tuerk C. and Gold L., 1990に記載されているランダム配列ライブラリーの試験管内進化法（ＳＥＬＥＸ）を通して単離され得る。ランダム配列ライブラリーは、ＤＮＡのコンビナトリアル化学合成によって得られる。このライブラリーでは、各メンバーは、独特な配列の最終的に化学的に改変された線状オリゴマーである。この分子クラスの可能な改変、使用及び利点は、Jayasena S.D., 1999に概説されている。ペプチドアプタマーは、ツーハイブリッド法（Colas et al., 1996）によってコンビナトリアルライブラリーから選択されるプラットフォームタンパク質（例えば、E. coliチオレドキシンＡ）によってディスプレイされるコンフォメーション的に制限された抗体可変領域からなる。また、アプタマーは、in vitro及びin vivoでシャペロン媒介性オートファジーを介して内因性タンパク質を迅速かつ可逆的にノックダウンする膜透過性ターゲティングペプチドベースの方法に組み合わされ得る（Fan X, Nature Neuroscience 2014）。
【００７２】
別の実施態様では、阻害性低分子ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）もまた、本発明において使用するためのＡｐｏＯ遺伝子発現のインヒビターとして機能し得る。ＡｐｏＯ遺伝子発現は、被験体又は細胞を、ＡｐｏＯ遺伝子発現が特異的に阻害されるように、低分子二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）又は低分子二本鎖ＲＮＡの産生を引き起こすベクター若しくは構築物と接触させることによって減少され得る（すなわち、ＲＮＡ干渉すなわちＲＮＡｉ）。配列が公知の遺伝子について、適切なｄｓＲＮＡ又はｄｓＲＮＡをコードするベクターを選択するための方法は、当技術分野で周知である（例えば、Tuschl, T. et al. (1999); Elbashir, S. M. et al. (2001); Hannon, GJ. (2002); McManus, MT. et al. (2002); Brummelkamp, TR. et al. (2002)；米国特許第６，５７３，０９９号及び米国特許第６，５０６，５５９号；並びに国際公開公報第０１／３６６４６号、国際公開公報第９９／３２６１９号及び国際公開公報第０１／６８８３６号を参照のこと）。
【００７３】
リボザイムもまた、本発明において使用するためのＡｐｏＯ遺伝子発現のインヒビターとして機能し得る。リボザイムは、ＲＮＡの特異的切断を触媒することができる酵素的ＲＮＡ分子である。リボザイムの作用機序は、相補的ターゲットＲＮＡへのリボザイム分子の配列特異的ハイブリダイゼーションと、それに続くヌクレオチド鎖切断を含む。ＡｐｏＯｍＲＮＡ配列のヌクレオチド鎖切断を特異的かつ効率的に触媒する人工ヘアピン型又はハンマーヘッド型モチーフのリボザイム分子は、その結果、本発明の範囲内で有用である。最初に、典型的には以下の配列ＧＵＡ、ＧＵＵ及びＧＵＣを含むリボザイム切断部位についてターゲット分子をスキャンすることによって、任意のＲＮＡターゲット候補内の特異的リボザイム切断部位を同定する。同定したら、切断部位を含有するターゲット遺伝子の領域に対応する約１５〜２０リボヌクレオチドの短いＲＮＡ配列を、オリゴヌクレオチド配列を不適切なものにし得る予測される構造特徴（例えば、二次構造）について評価し得る。候補ターゲットの適切性はまた、例えばリボヌクレアーゼ保護アッセイを使用して、相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションのアクセス性を試験することによって評価され得る。
【００７４】
ＡｐｏＯ遺伝子発現のインヒビターとして有用なアンチセンスオリゴヌクレオチド及びリボザイムは両方とも、公知の方法によって調製され得る。これらとしては、例えば固相ホスホアミダイト化学合成などによる化学合成技術が挙げられる。あるいは、アンチセンスＲＮＡ分子は、ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列のin vitro又はin vivoにおける転写によって生成され得る。このようなＤＮＡ配列は、Ｔ７又はＳＰ６ポリメラーゼプロモーターなどの適切なＲＮＡポリメラーゼプロモーターを組み込んだ多種多様なベクターに組み込まれ得る。本発明のオリゴヌクレオチドへの様々な改変は、細胞内安定性及び半減期を増加させる手段として導入され得る。可能な改変としては、限定されないが、分子の５’末端及び／又は３’末端へのリボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドのフランキング配列の付加、あるいは、オリゴヌクレオチド骨格内におけるホスホジエステラーゼ結合ではなくホスホロチオエート又は２’−Ｏ−メチルの使用が挙げられる。
【００７５】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドｓｉＲＮＡ及びリボザイムは、in vivoにおいて単独で又はベクターと共に送達され得る。その最も広い意味において、「ベクター」は、アンチセンスオリゴヌクレオチドｓｉＲＮＡ又はリボザイム核酸を細胞（好ましくは、ＡｐｏＯを発現する細胞）に輸送するのを容易にすることができる任意のビヒクルである。好ましくは、ベクターは、ベクターの非存在下において生じる分解程度と比べて低い分解程度で、核酸を細胞に輸送する。一般に、本発明において有用なベクターとしては、限定されないが、プラスミド、ファージミド、ウイルス、アンチセンスオリゴヌクレオチドｓｉＲＮＡ又はリボザイム核酸配列の挿入又は取り込みによって操作されたウイルス又は細菌源由来の他のビヒクルが挙げられる。ウイルスベクターは好ましい種類のベクターであり、限定されないが、以下のウイルス：レトロウイルス、例えばモロニーマウス白血病ウイルス、ハーベイマウス肉腫ウイルス、マウス乳ガンウイルス及びラウス肉腫ウイルス；アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス；ＳＶ４０型ウイルス；ポリオーマウイルス；エプスタイン・バーウイルス；パピローマウイルス；ヘルペスウイルス；ワクシニアウイルス；ポリオウイルス；並びにＲＮＡウイルス、例えばレトロウイルス由来の核酸配列を含む。命名されていないが当技術分野で公知の他のベクターを容易に用い得る。
【００７６】
好ましいウイルスベクターは、非必須遺伝子が目的の遺伝子で置換された非細胞変性真核生物ウイルスをベースとする。非細胞変性ウイルスとしては、生活環が、ゲノムウイルスＲＮＡからＤＮＡへの逆転写、続いて、宿主細胞ＤＮＡへのプロウイルスの組み込みを含むレトロウイルス（例えば、レンチウイルス）が挙げられる。レトロウイルスは、ヒト遺伝子療法の治験に認可されている。最も有用なのは、複製欠損性の（すなわち、所望のタンパク質の合成を指令することができるが、感染性粒子を製造することができない）レトロウイルスである。このような遺伝子改変レトロウイルス発現ベクターは、in vivoにおける遺伝子の高効率なトランスダクションのための一般用途を有する。（外因性遺伝物をプラスミドに組み込む工程、プラスミドでパッケージング細胞株をトランスフェクションする工程、パッケージング細胞株によってリコンビナントレトロウイルスを産生する工程、組織培養培地からウイルス粒子を回収する工程、ウイルス粒子をターゲット細胞に感染させる工程を含む）複製欠損性レトロウイルスを生産するための標準的なプロトコールは、Kriegler, 1990及びMurry, 1991に提供されている。
【００７７】
特定用途のための好ましいウイルスは、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルスであり、これらは、遺伝子療法におけるヒトへの使用について既に認可されている二本鎖ＤＮＡウイルスである。アデノ随伴ウイルスは、複製欠損性となるように操作され得、広範囲の細胞型及び種に感染することができる。それはさらに、熱及び脂質溶媒に対する安定性；造血細胞を含む多様な系統の細胞における高いトランスダクション頻度；並びに、重感染阻害の欠如（したがって、複数回のトランスダクションが可能である）などの利点を有する。報告によれば、アデノ随伴ウイルスは、ヒト細胞ＤＮＡに部位特異的に組み込まれ得るので、レトロウイルス感染に特徴的な挿入突然変異誘発の可能性及び挿入遺伝子発現の変動性が最小限になる。加えて、野生型アデノ随伴ウイルス感染は、選択的圧力の非存在下において、１００継代超にわたって組織培養液中で継続し、これは、アデノ随伴ウイルスのゲノム組み込みが比較的安定な事象であることを意味する。アデノ随伴ウイルスはまた、染色体外で機能し得る。
【００７８】
他のベクターとしては、プラスミドベクターが挙げられる。プラスミドベクターは当技術分野で詳細に記載されており、当業者に周知である。例えば、Sambrook et al., 1989を参照のこと。過去数年間、プラスミドベクターは、抗原をコードする遺伝子をin vivoで細胞に送達するためのＤＮＡワクチンとして使用されている。それらは、ウイルスベクターの多くと同じ安全性の懸念がないので、これに特に有利である。しかしながら、宿主細胞と適合性のプロモーターを有するこれらのプラスミドは、プラスミド内の作動的にコードされる遺伝子からペプチドを発現し得る。いくつかの一般に使用されるプラスミドとしては、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＲＣ／ＣＭＶ、ＳＶ４０及びｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔが挙げられる。他のプラスミドも当業者に周知である。加えて、制限酵素及びライゲーション反応を使用してプラスミドを特注設計して、ＤＮＡの特定のフラグメントを除去及び付加し得る。プラスミドは、様々な非経口、粘膜及び外用経路によって送達され得る。例えば、ＤＮＡプラスミドは、筋肉内、眼、皮内、皮下又は他の経路によって注入され得る。それはまた、鼻腔内スプレー又は液滴、直腸坐剤及び経口によって投与され得る。それはまた、遺伝子銃を使用して表皮又は粘膜表面に投与され得る。プラスミドを水溶液に加え、金粒子上で乾燥させ、又は別のＤＮＡ送達システム（限定されないが、リポソーム、デンドリマー、コクリエート及びマイクロカプセル化を含む）と併用し得る。
【００７９】
好ましい実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又はリボザイム核酸配列は、異種調節領域、例えば異種プロモーターのコントロール下にある。プロモーターは、ミューラーグリア細胞、ミクログリア細胞、内皮細胞、周皮細胞および星状細胞に特異的であり得る。例えば、ミューラーグリア細胞における特異的発現は、グルタミンシンターゼ遺伝子のプロモーターを通して得られ得る。プロモーターはまた、例えばウイルスプロモーター、例えばＣＭＶプロモーター又は任意の合成プロモーターであり得る。
【００８０】
好ましい実施態様では、本発明の化合物は、ｓｈＲＮＡである。前記ｓｈＲＮＡは、ＡｐｏＯ活性のインヒビター又はＡｐｏＯ遺伝子発現のインヒビターとして作用する。好ましくは、前記ｓｈＲＮＡは、MISSION shRNA setのものであり、Sigma Aldrich, Saint Quentin Fallavierによって販売されているsh4 (TRCN 72707)及びSh5 (TRCN 72705)から選択される。
【００８１】
治療組成物
本発明の別の目的は、ガンを処置するための、より好ましくはガン細胞におけるアポトーシスを誘導するための化合物を含む治療組成物であって、前記化合物が、ＡｐｏＯ、その変異体又はフラグメント及びそれらの混合物及びからなる群より選択される治療組成物に関する。
【００８２】
本発明の別の目的はまた、肥満、糖尿病、脂肪肝、膵炎及び甲状腺機能低下症からなる群より選択される病態生理学的状態を処置及び／又は予防するための化合物を含む治療組成物であって、前記化合物が、ＡｐｏＯ活性又はＡｐｏＯ遺伝子発現のインヒビターである治療組成物に関する。
【００８３】
当業者であれば、所望の目的を果たすために投与するＡｐｏＯ、その変異体又はフラグメント、それらの混合物及び前記ＡｐｏＯ、その変異体又はフラグメントをコードするベクターの有効量を認識しているであろう。
【００８４】
「ＡｐｏＯ、そのフラグメント若しくは誘導体、それらの混合物又は前記ＡｐｏＯ、その変異体若しくはフラグメントをコードするベクターの有効量」は、任意の医療処置に適用可能な妥当な利益／リスク比で、ガン性細胞のアポトーシスを誘導し、又は病態生理学的状態における脂質過負荷を低減するために十分な量を意味する。しかしながら、ＡｐｏＯ、そのフラグメント若しくは誘導体、それらの混合物又は前記ＡｐｏＯ、その変異体若しくはフラグメントをコードするベクターの１日総使用量は、健全な医学的判断の範囲内で、主治医によって決定されると理解されよう。それを必要とする任意の特定の被験体のための特定の治療有効用量レベルは、処置される障害の病期、特定のＡｐｏＯ、そのフラグメント若しくは誘導体又は用いられるＡｐｏＯをコードする核酸を含むベクターの活性、被験体の年齢、体重、一般健康状態、性別及び食事、投与時間、投与経路、処置期間、処置と組み合わせて又は同時に使用される薬物を含む様々な要因に依存するであろう。
【００８５】
本発明の任意の治療剤を、薬学的に許容し得る賦形剤、及び場合により持続放出マトリックス、例えば生分解性ポリマーと組み合わせて、治療組成物を形成し得る。
【００８６】
「薬学的に」又は「薬学的に許容し得る」は、適宜、哺乳動物、特にヒトに投与した場合に有害な反応、アレルギー反応又は他の望ましくない反応を生じない分子実体及び組成物を指す。薬学的に許容し得る担体又は賦形剤は、無毒性固体、半固体又は液体の充填剤、希釈剤、封入材料又は任意の種類の製剤補助剤を指す。
【００８７】
医薬組成物の剤形、投与経路、投与量及びレジメンは、当然ながら、処置すべき症状、病気の重度、患者の年齢、体重及び性別などに依存する。
【００８８】
好ましくは、医薬組成物は、注射可能な製剤に対して薬学的に許容し得るビヒクルを含有する。これらは、特に、等張無菌食塩水溶液（リン酸一ナトリウム又は二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム又は塩化マグネシウムなど又はこのような塩の混合物）、又は場合に応じて滅菌水若しくは生理食塩水を追加すると注射可能な溶液を構成可能な乾燥（特に、凍結乾燥）組成物であり得る。
【００８９】
投与に使用される用量は、様々なパラメーターの関数として、特に、使用される投与様式、関連病状又はあるいは所望の処置期間の関数として適合され得る。
【００９０】
加えて、他の薬学的に許容し得る形態としては、例えば、経口投与用の錠剤又は他の固体；徐放性カプセルが挙げられ；任意の他の形態が現在使用され得る。
【００９１】
以下の図面及び実施例によって、本発明をさらに説明する。しかしながら、これらの実施例及び図面は、本発明の範囲を限定すると決して解釈されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００９２】
【図１】心筋芽細胞におけるＡｐｏＯ及びＡｐｏＯ  Δ１−４０の発現及び局在性。（ａ）コントロール心筋芽細胞、及びＡｐｏＯを安定に過剰発現するトランスフェクタントにおけるＡｐｏＯ  ｍＲＮＡレベル。ＳＨ２、ＳＨ３、ＳＨ４及びＳＨ５は、その後、４つの異なるｓｈＲＮＡ−ＡｐｏＯ発現ベクターで安定トランスフェクションした４つの独立したＡｐｏＯクローンを示す；（ｂ）コントロール、ＡｐｏＯ及びｓｈＲＮＡ−ＡｐｏＯ細胞から調製した全タンパク質抽出物を用いたＡｐｏＯウエスタンブロット分析；（ｃ）カルレティキュリン抗体を用いて同じ膜をプローブすることによって、同等のレーンローディング及び転写を確認した；（ｄ）カルレティキュリンシグナルに対するＡｐｏＯの定量；（ｅ）ＡｐｏＯ及びコントロール細胞から調製した膜タンパク質抽出物を用いたＡｐｏＯウエスタンブロット分析。カルレティキュリン抗体を用いて同じ膜をプローブすることによって、同等のレーンローディング及び転写を確認した；（ｆ）ＡｐｏＯ又は（ｇ）ＡｐｏＯ  ＡｂとハイブリダイゼーションしたＡｐｏＯ  Ｄ１−４０を過剰発現する心筋芽細胞の細胞質画分及びミトコンドリア画分のウエスタンブロット分析。アクチン及びＡＮＴを、細胞質及びミトコンドリア精製コントロールとしてそれぞれ使用した。１回の実験からの代表的なデータが示されている。実験を３回繰り返した。ラベルは、ミトコンドリア（Ｍｉｔ）、細胞質（Ｃｙｔｏ．）である。＊＊ｐ＜０．０１。
【図２】in vivoトランスフェクション肝臓におけるｈＡｐｏＯ発現。コントロール（ｎ＝１２）及びＡｐｏＯ（ｎ＝１２）発現ベクターの急速尾静脈注射による流体力学的in vivo肝臓トランスフェクション後のマウス肝臓におけるヒトＡｐｏＯ  ｍＲＮＡレベル。＊＊ｐ＜０．０１。
【図３】ＡｐｏＯは、ミトコンドリア性である。（Ａ）コントロール（ｎ＝１２）、ｈＡｐｏＯ発現ベクター（ｎ＝１２）及び生理食塩水（ｎ＝１２）の急速尾静脈注射による流体力学的in vivo肝臓トランスフェクション後のマウス肝臓から得られたＰＣＲ増幅産物の２％臭化エチジウム染色アガロースゲル電気泳動。（Ｂ）ＡＮＴ抗体を用いて転写膜をプローブすることによって実施したローディング／転写コントロールの上に示されている、ＡｐｏＯ抗体でプローブした単離された肝臓ミトコンドリア由来のタンパク質抽出物のウエスタンブロット。
【図４】心筋芽細胞における呼吸及び酸化ストレスにおけるＡｐｏＯの役割。（ａ）コントロール細胞、ＡｐｏＯ、ＡｐｏＯ  Ｄ１−４０又はｓｈＲＮＡＡｐｏＯ処理ＡｐｏＯを発現する安定トランスフェクタントにおける基礎酸素消費量（ｎ＝５）。（ｂ）異なる薬物：１．５μg/mlオリゴマイシン（Ｏｌｉｇｏ）、２μMカルボニルシアニドｍ−クロロフェニルヒドラゾン（ＣＣＣＰ）及び１μMアンチマイシン（Ａｎｔｉ．）で処理したコントロール及びＡｐｏＯ細胞の酸素消費量（ｎ＝５）。（ｃ）コントロール及びＡｐｏＯ細胞における呼吸制御指数（ＲＣ）。（ｄ）コントロール及びＡｐｏＯ細胞における漸増用量（１〜６μM）の２′，７′ジクロロジヒドロフルオレセインジアセタート（ＤＣＦＤＡ）の存在下で測定した活性酸素種（ｎ＝４）。（ｅ）コントロール及びＡｐｏＯ細胞におけるシトクロムＣオキシダーゼ活性（ｎ＝４）。コントロール、ＡｐｏＯ、ｓｈＲＮＡＡｐｏＯ及びＡｐｏＯ  Ｄ１−４０細胞におけるミトコンドリア複合体Ｉ（ｆ）及び複合体ＩＩＩ（ｇ）の遺伝子発現レベル（ｎ＝５）。Ａ．Ｕ．：任意単位。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。データは、平均±ＳＥＭを表す。
【図５】ＡｐｏＯは、ミトコンドリアにおけるＡＮＴ及びＣｙＰＤと相互作用する。（Ａ）マウス心臓由来のミトコンドリアタンパク質複合体の一次元ＢＮ−ＰＡＧＥゲル分析。（１）：４〜１３％ポリアクリルアミド一次元勾配ブルーネイティブゲルのクーマシーブルー染色。（２）：転写ＰＶＤＦ膜のポンソーＳ染色。それぞれＡｐｏＯ、ＡＮＴ又はＣｙｐＤ抗体を用いて転写ＰＶＤＦ膜の増強化学発光を使用して、ＡｐｏＯ、ＡＮＴ及びＣｙｐＤを検出した。同じ複合体（黒色の四角形）において、ＡｐｏＯ、ＡＮＴ及びＣｙｐＤが検出された。（Ｂ）ＡｐｏＯ−ＧＳＴプルダウンのウエスタンブロット分析。上のパネル：ローディング及び転写をコントロールするために使用した転写膜のポンソーＳ染色。下のパネル：ＡＮＴ又はＣｙｐＤ抗体でプローブした同じ膜の増強化学発光を使用したＡＮＴ及びＣｙｐＤ検出、ラベルは、以下のものである：心臓ミトコンドリアタンパク質抽出物なしで（ＧＳＴ−ＡｐｏＯ）若しくはありで（ＧＳＴ−ＡｐｏＯ＋Ｍｉｔ）インキュベーションしたＧＳＴ−ＡｐｏＯ融合タンパク質、ＧＳＴのみ（ＧＳＴ）、又はＧＳＴと心臓ミトコンドリアタンパク質抽出物（ＧＳＴ＋Ｍｉｔ）。（Ｃ）ＣｙｐＤの不活性化は、ＡｐｏＯ誘導性呼吸を減少させる：コントロール心筋芽細胞、及び２００nMシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）ありで又はなしで５０分間処理したＡｐｏＯを過剰発現する心筋芽細胞における酸素フロー（ｎ＝５）。
【図６】ＡｐｏＯは、心筋芽細胞における脂肪酸代謝を誘導する。コントロール細胞、ＡｐｏＯ細胞、及びその後にｓｈＲＮＡ  ＡｐｏＯ（ｓｈＡｐｏＯ）でノックダウンしたＡｐｏＯ細胞における（Ａ）Ｆａｔｐ４及び（Ｂ）Ｃｄ３６  ｍＲＮＡ発現レベル（ｎ＝５）。（Ｃ）５μMトリアクシンＣ（ＡＣＳＬインヒビター）あり及びなしの場合の、コントロール及びＡｐｏＯ細胞におけるパルミトイルＣｏＡ合成速度（ｎ＝５）。（Ｄ）BODIPY−パルミタート（パルミタートの蛍光類似体）と共に２分間インキュベーションしたコントロール及びＡｐｏＯ細胞の共焦点顕微鏡画像、スケールバー＝１０μM。（Ｅ）コントロール及びＡｐｏＯ細胞発現細胞における総脂肪酸（ＦＡＭＥ又は脂肪酸メチルエステルとして示される）の細胞内レベル（ｎ＝６）。（Ｆ）コントロール、ＡｐｏＯ又はＡｐｏＯ  Ｄ１−４０細胞における（Ｆ）Ｆａｔｐ４及び（Ｇ）Ｃｄ３６  ｍＲＮＡレベル。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。データは、平均±ＳＥＭを表す。
【図７】シクロフィリンＤのノックダウンは、心筋芽細胞におけるＡｐｏＯ誘導性脂肪毒性を軽減する：（Ａ）、（Ｂ）２０nM ＣｓＡの８時間処理あり及びなしの場合の、コントロール及びＡｐｏＯ細胞における総脂肪酸及びＦＡＴＰ４  ｍＲＮＡレベル（ｎ＝５）。（Ｃ）コントロール細胞（Ｃｏｎｔ．）及びＡｐｏＯ細胞、並びにその後のｓｈＲＮＡ−シクロフィリンＤ発現ベクターによるトランスフェクションあり及びなしの場合のコントロール細胞及びＡｐｏＯ細胞（Ｃｏｎｔ．−ｓｈＣｙｐＤ及びＡｐｏＯ−ｓｈＣｙｐＤ）におけるＦＡＭＥの細胞内レベル。（Ｄ）これらの細胞におけるＦＡＴＰ４  ｍＲＮＡレベルのＲＴ−ｑＰＣＲ分析。（Ｅ）、（Ｆ）１００μMパルミタートの８時間インキュベーションあり又はなしの場合の、コントロール及びＡｐｏＯ細胞におけるジグリセリド（ＤＧ）及びトリグリセリド（ＴＧ）の細胞内レベル（ｎ＝５）。（Ｇ）１００μMパルミタート及び２０nMシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）の８時間インキュベーションあり又はなしの場合の、コントロール及びＡｐｏＯ細胞におけるジグリセリドレベル（ｎ＝５）。コントロール、ＡｐｏＯ、Ｃｏｎｔ．−ｓｈＣｙｐＤ及びＡｐｏＯ−ｓｈＣｙｐＤ細胞におけるジグリセリドレベル（ｎ＝４）。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図８】ＡｐｏＯは、マウス及びヒトの心臓における脂肪毒性副産物の細胞内レベルを高める。（ａ）、（ｂ）野生型（ＷＴ、ｎ＝１２）及び心臓特異的ＡｐｏＯトランスジェニックマウス心臓（ＡｐｏＯ−Ｔｇ、ｎ＝１１）におけるジグリセリド及びトリグリセリドレベル。（ｃ）、（ｄ）コントロール（ｎ＝１２）及びＡｐｏＯ（ｎ＝１２）発現ベクターの急速尾静脈注射による流体力学的in vivoトランスフェクション後の肝臓におけるジグリセリド及びトリグリセリドレベル。（ｅ）、（ｆ）ヒト心耳サンプルにおけるＡｐｏＯ  ｍＲＮＡレベルと、ジグリセリド（ｎ＝３０）又はトリグリセリド（ｎ＝２７）の細胞内濃度との間の相関関係。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。
【図９】ＡｐｏＯは、in vivoで及びin vitroでアポトーシスを誘導する。（ａ）ヒト心耳サンプルにおけるＡｐｏＯとＢａｘ  ｍＲＮＡレベルとの間の正の相関関係（ｎ＝４８）。（ｂ）、（ｃ）野生型（ＷＴ、ｎ＝１５）及び心臓特異的トランスジェニックマウス（ＡｐｏＯ−Ｔｇ、ｎ＝１６）におけるＢａｘ  ｍＲＮＡレベル及びカスパーゼ−３活性。（ｄ）、（ｅ）コントロール及びＡｐｏＯ発現ベクター（ｎ＝１２）の急速尾静脈注射による流体力学的in vivo肝臓トランスフェクションの４８時間後の肝臓におけるＢａｘ  ｍＲＮＡレベル及びカスパーゼ−３活性。（ｆ）、（ｇ）コントロール細胞、ＡｐｏＯ細胞、及びその後にｓｈＲＮＡ−ＡｐｏＯ発現ベクターで安定トランスフェクションしたＡｐｏＯ細胞（ｓｈＡｐｏＯ）におけるＢａｘ  ｍＲＮＡレベル及びカスパーゼ−３活性。（ｈ）漸増濃度のパルミタートと共に一晩インキュベーションしたコントロール及びＡｐｏＯ発現細胞におけるカスパーゼ−３活性（ｎ＝６）。（ｉ）１００μMパルミタート及び２０nMシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）又は３０μMボンクレティック酸（ＢＡ）の１２時間インキュベーションあり又はなしの場合の、ＡｐｏＯを安定に発現するＨ９ｃ２心筋芽細胞のカスパーゼ−３活性（ｎ＝４）。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図１０】ＡｐｏＯを過剰発現する心筋芽細胞におけるミトコンドリアの変質及び分解。（ａ）、（ｂ）１００μMパルミタートで２４時間処理したコントロール及びＡｐｏＯ細胞の透過型電子顕微鏡分析。（ｃ）、（ｄ）ＡｐｏＯ細胞における自食作用胞及び多層体（ミエリン像、ｍｆ）におけるミトコンドリアの分解。正常なミトコンドリア（ｎＭ）及び核（Ｎ）がラベルされている。（ｅ）ＡｐｏＯの役割を示す概略図。（１）ＡｐｏＯ誘導性のマイルドな脱共役は、より多くのＮＡＤＨ／ＦＡＤＨ２を必要とする電子伝達鎖を活性化する。（２）成体心臓では、ＮＡＤＨ及びＦＡＤＨ２産生は、長鎖脂肪酸（ＬＣＦＡ）のβ−酸化によって主に生成され、それらの消費は、ミトコンドリアの代謝シンクを生成する。（３）ＬＣＦＡは、ＣＰＴ−１及び開口ＭＰＴＰを介してミトコンドリアに迅速に入る。（４）ＬＣＦＡトランスポーター（ＦＡＴＰ）の発現の増加は、ミトコンドリアの消費量の増加を補う。（５）ＬＣＦＡ取り込みは、ミトコンドリアの脂肪酸酸化能力を超え、脂肪毒性につながる。（６）酸化ストレス及びミトコンドリア機能不全の増強は、脂質取り込み、β−酸化及びミトコンドリア生合成に関与する遺伝子（例えば、ＰＧＣ１α及びＰＰＡＲα）の発現を増加させる。（７）ＲＯＳレベルの増加は、ＭＰＴＰ開口及びプロトン勾配の喪失をさらに刺激し、Ｂａｘと共に作用してアポトーシス誘導因子（ＡＩＦ）及びシトクロムＣを放出させ、細胞死をもたらす。ミトコンドリア外膜（ＯＭＭ）及びミトコンドリア内膜（ＩＭＭ）がラベルされている。
【図１１】ＡｐｏＯは、心筋芽細胞におけるジグリセリドレベルを増加させる。（ａ）１００μMパルミタート及び１０μMオレアートによる１２時間インキュベーションあり又はなしの場合の、コントロール（ｎ＝４）及びＡｐｏＯ発現ベクター（ｎ＝４）で安定トランスフェクションしたＨ９ｃ２心筋芽細胞におけるジグリセリドの細胞内レベル。（ｂ）１００μMパルミタート及び１０μMオレアートによる１２時間インキュベーションあり又はなしの場合の、コントロール（ｎ＝４）及びＡｐｏＯ発現ベクター（ｎ＝４）で安定トランスフェクションしたＨ９ｃ２心筋芽細胞におけるジグリセリド（ＤＧ）とトリグリセリド（ＴＧ）との細胞内比。（ｃ）１００μMパルミタート及び１又は１０μMオレアートによる１２時間インキュベーションあり又はなしの場合の、コントロール（ｎ＝６）及びＡｐｏＯ発現ベクター（ｎ＝６）で安定トランスフェクションしたＨ９ｃ２心筋芽細胞のカスパーゼ−３活性。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１
【図１２】ＡｐｏＯを過剰発現するＵ８７トランスフェクタント。（Ａ）空ベクターでトランスフェクションしたＵ８７コントロール細胞（ｐＴＴ）、及びＡｐｏＯを安定に過剰発現するトランスフェクタント（ｐＴＴ−ＡｐｏＯ）におけるヒトＡｐｏＯ  ｍＲＮＡレベル。（Ｂ）コントロール及びＡｐｏＯ細胞から調製した全タンパク質抽出物を用いたＡｐｏＯウエスタンブロット分析。カルレティキュリン抗体を用いて同じ膜をプローブすることによって、同等のレーンローディング及び転写を確認した。（Ｃ）カルレティキュリンシグナルに対するＡｐｏＯのImageJ定量。１回の実験からの代表的なデータが示されている。実験を３回繰り返した。＊ｐ＜０．０５。
【図１３】ＡｐｏＯは、Ｕ８７細胞におけるアポトーシスを誘導する。１００μMパルミタートと共に一晩インキュベーションしたコントロール及びＡｐｏＯ発現細胞におけるカスパーゼ−３活性（ｎ＝４）。＊ｐ＜０．０５。データは、平均±ＳＥＭを表す。
【図１４】ＡＰＯＯの過剰発現は、ガン細胞の呼吸を増強する。コントロール細胞、ＡＰＯＯ発現細胞（ＡＰＯＯ細胞）、及びその後にｓｈＡＰＯＯでトランスフェクションしたＡＰＯＯ細胞における基礎酸素消費率（ＯＣＲ）（ｎ＝３）。＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。データは、平均±ＳＥＭを表す。
【図１５】ＡＰＯＯの過剰発現は、ガン細胞における脂肪毒性を促進する。１００μMパルミタートと共に一晩インキュベーションしたコントロール（左）及びＡＰＯＯ発現（右）細胞の透過型電子顕微鏡検査（ｎ＝６）。黒色の矢印は、脂肪滴を示す。
【図１６】ＡＰＯＯの過剰発現は、ガン細胞における膜小疱形成を促進する。コントロール（左）及びＡＰＯＯ発現（右）細胞の透過型電子顕微鏡検査。黒色の矢印は、小疱を示す（ｎ＝３）。
【実施例】
【００９３】
実施例１：ミトコンドリア機能不全とＡｐｏＯによる脂肪毒性との関連性
アポリポタンパク質（Ａｐｏ）は、リンパ系及び循環系を介して血漿脂質輸送プロセスを促進するリポタンパク質に結合することを初めて特性評価した。しかしながら、Ａｐｏについて、異なる予想外の機能も同定した。ＡｐｏＥはＡｋｔ／ＰＫＢリン酸化を活性化し、ＡｐｏＪは核に移行され得、ＤＮＡ修復タンパク質Ｋｕ８０に結合する。最終的に、Ｂｃｌ２ファミリーメンバーと構造相同性を有するＡｐｏＬ６は、オートファジーなどの経路をレギュレーションする。
【００９４】
肥満によって心臓においてディファレンシャルにレギュレーションされる遺伝子を同定することを目的とする機能ゲノミクス研究を通じて、本発明者らは、アポリポタンパク質（ＡｐｏＯ）が、糖尿病患者由来の心臓において過剰発現されることを発見した。このタンパク質の発現の変化が心機能の改変にどのように関係するかを明らかにするために、本発明者らは、心筋芽細胞、生理学的レベルでＡｐｏＯを発現する３つの独立した心臓特異的トランスジェニックマウス系統、in vivoトランスフェクションマウス肝臓、及びヒト心臓サンプルを利用したin vitro及びin vivo操作を実施した。本発明者らは最初に、ＡｐｏＯがミトコンドリアに局在し、シクロフィリンＤ及びアデニンヌクレオチドトランスロカーゼ（ＡＮＴ）と相互作用して、ミトコンドリア膜透過性遷移孔（ＭＰＴＰ）が開口状態（これは、マイルドな脱共役を誘導する）をとるようにすることを示す。最初、ＭＰＴＰは、細胞の「生死」の決定において重要な役割を果たすと考えられており、心臓病における心臓保護のターゲットとして提案された。この細孔は、分子量１．５kDa未満の代謝産物及び分子（プロトンを含む）のミトコンドリアへの自由な通過を可能にし、これが脱共役につながる。ＭＰＴＰの正確なタンパク質組成は依然として論争中であるが、調節成分として機能すると提案されているシクロフィリンＤ及びＡＮＴを最低限含む。
【００９５】
心臓効率の低下は、齧歯類及びヒトの両方において、肥満及び２型糖尿病の顕著な特徴の１つである。心筋Ｖｏ２の増加及び心臓効率の低下の機構は、完全には理解されていない。ミトコンドリア脱共役の増加は、心筋細胞のエネルギー特性及び収縮性に影響を与える基本機構の１つであり、糖尿病性心筋症の流行の増大に寄与することが示唆された。したがって、ＭＰＴＰレギュレーターは、ミトコンドリア機能不全及び心筋細胞の運命をコントロールするために非常に重要である。
【００９６】
材料及び方法
ヒト心臓サンプル。倫理委員会の承認後、参加前に、本研究における患者全員から、サンプル採取及び分子分析に関する書面による同意を得た。冠動脈バイパス手術前に、Department of Cardiology, Toulouse University Hospitalの医師が、患者を慎重に選択した。
【００９７】
バイオインフォマティクス。ヒト心臓サンプルからのマイクロアレイ発現データは、GEO repository (GSE1145)からダウンロードした。このシリーズは、心臓移植を受けた患者であって、その失敗が異なる病因（例えば、特発性拡張型心筋症、虚血性心筋症、弁膜心筋症及び肥大型心筋症）に起因する患者から、及び「正常」臓器のドナーであって、その心臓を移植に使用することができないドナーから採取した１０７個の心筋サンプルから構成されていた。アレイの強度を正規化し、階層的クラスタリング（平均連鎖群、ピアソン相関、閾値ｒ＝０．８）を適用して、共発現遺伝子群を同定した。試験した１０７個のヒト心臓について、ＡｐｏＯ発現レベルをプロットし、Toppgene及びIngenuity Pathway Analysis (Ingenuity systems, Redwood City, CA, USA)の両方を使用して関連分子経路を定義するために使用した。Mitopred、mitoprot及びYLocを使用して、ＡｐｏＯの細胞内局在性を予測した。
【００９８】
動物：
全ての動物研究は、INSERM Institute Animal Facilityのガイドラインにしたがっており、INSERM I2MC UMR 1048の動物管理委員会によって承認された。French Ministry of Agricultureのガイドラインにしたがって、全ての動物手順を実施した。Toulouse I2MC animal facilityにおいて、明期１２時間／日（６ＡＭ〜６ＰＭ）、周囲温度２２＋／−１℃の部屋で、動物を飼育した。
【００９９】
ＡｐｏＯ発現ベクターの構築
ヒトＡｐｏＯ（ｐＴＴ−ＡｐｏＯ）を過剰発現させるために、プライマーｈＡｐｏＯ５ＢａｍＰＴＴ（配列番号２）及びｈＡｐｏＯ３ＢａｍＰＴＴ（配列番号３）を使用して、ＡｐｏＯコード配列を増幅し、ｐＴＴ発現ベクターのＢａｍＨ１部位にクローニングした。プライマーＳｎａｐＡｐｏＥｃｏｒＶ−Ｆ（配列番号４）及びＳｎａｐＡｐｏＥｃｏｒＶ−Ｒ（配列番号５）を使用してｐＴＴ−ＡｐｏＯのＰＣＲ増幅によって、ｐＳＮＡＰ−ＡｐｏＯを作製し、pSNAP-tag（登録商標）(Ozyme, Saint-Quentin-en-Yvelines, France)のＥｃｏＲＶ部位にクローニングした。ｈＡｐｏＯｐＧＥＸ１ＦＢａｍ（配列番号６）及びｈＡｐｏＯｐＧＥＸ１ＲＳｍａ（配列番号７）を使用してｐＴＴ−ＡｐｏＯのＰＣＲ増幅によって、ｐＧＥＸ２Ｔ−ＡｐｏＯを構築し、ｐＧＥＸ２Ｔ（Promega, Charbonnieres-les-Bains）のＢａｍＨＩ／ＳｍａＩ部位にクローニングした。本研究で使用した全てのプライマーは、Eurogentec France (Angers)によって合成された。使用した全ての制限酵素は、New England Biolabs (Ozyme, Saint-Quentin-en-Yvelines)製であった。ABI PRISM（登録商標）BigDye（商標）Terminator version 3.1 Ready反応サイクル配列決定キット(Life  Technologies SAS, Villebon sur Yvette)を使用してＤＮＡ二本鎖配列決定によって、発現ベクター内の全てＡｐｏＯ配列を確認し、ABI 3130XL DNA配列決定機器(Life Technologies SAS, Villebon sur Yvette)にロードした。
【０１００】
Ｈ９ｃ２心筋芽細胞の細胞培養及びトランスフェクション
Ｈ９ｃ２は、European Collection of Cell Cultures (Salisbury, England)から入手した。１．５ｇ／リットルの重炭酸ナトリウムを含有するように調整し、抗生物質−抗真菌溶液（Life Technologies SAS, Villebon sur Yvette）及び１０％ウシ胎児血清（FBS, AbCys s.a., Paris）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（Life Technologies SAS, Villebon sur Yvette）中で、Ｈ９ｃ２細胞を培養した。細胞を直径１０cmの組織培養皿上にプレーティングし、３７℃、飽和湿度の５％ＣＯ２インキュベーターで成長させ、培地を２日ごとに交換した。エレクトロポレーションによってＨ９ｃ２心筋芽細胞を安定トランスフェクションし、以前に公開されているように、トランスフェクタントのプールを選択した。
【０１０１】
ＡｐｏＯ過剰発現のノックダウン
ＡｐｏＯ遺伝子発現をノックダウンするために使用したｓｈＲＮＡ及びコントロールは、MISSION shRNA set; Sh2 = TRCN 72707; Sh4 = TRCN 72704; Sh5= TRCN 72705 (Sigma Aldrich, Saint-Quentin Fallavier)のものであり、安定トランスフェクタントのプールを作製することによって、推奨されるように使用した。空ベクター（ｓｈＲＮＡインサートなし）コントロールもトランスフェクションしたが、有意な効果はなかった。
【０１０２】
膜調製
Harmancey, R. et al, western diet changes cardiac acyl-CoA composition in obese rats: a potential role for hepatic lipogenesis. J Lipid Res 51, 1380-1393, (2010)に記載されているように、膜調製を実施した。
【０１０３】
機能ゲノミクス
Qiacube (Qiagen, Courtaboeuf)自動プロトコールによってRNeasyキット(Qiagen, Courtaboeuf)を使用して、全ＲＮＡを精製した。Experionキャピラリー電気泳動(Bio-Rad, Marnes La Coquette)によって、全ＲＮＡの完全性を確認した。ＲＮＡ品質指数が８．５／１０以上のサンプルを分析のために選択した。RiboGreen及びVictor（商標）X5 2030マルチラベルリーダー(Perkin Elmer, Courtaboeuf)を使用して、全ＲＮＡを正確に定量した。ChipShot（商標）ダイレクトラベリングキット(Promega, Charbonnieres-les-Bains)による蛍光標識のために、全ＲＮＡを使用した。標識ＲＮＡをパンゲノムラットガラスマイクロアレイにハイブリダイゼーションさせた。標準的なハイブリダイゼーションの後、Ventanaディスカバリーハイブリダイゼーション洗浄システム(Ventana Medical Systems SA, Illkirch)によってガラスアレイを洗浄し、GenPix 4000スキャナー(Molecular Devices France, St. Gregoire)を使用してスキャンした。X-dotリーダーソフトウェア(COSE, Paris)によって、スキャン画像を処理し、オペレーターがスポット検出を検証した。Toppgene及びIngenuity pathway analysisソフトウェア(Ingenuity systems, Redwood City, CA, USA)の両方を使用して、マイクロアレイデータを分析した。
【０１０４】
パルミタートの調製及びカスパーゼ３活性のモニタリング
Hickson-Bick et al, J Mol Cell Cardiol 32, 511-519, (2000)及びHirota, et al. Life Sci 79, 1312-1316, (2006)に記載されているように、パルミタートの調製及びカスパーゼ−３活性の測定を実施した。
【０１０５】
心エコー分析
ｉ１３ Ｌ １４−MHzリニアアレイトランスデューサーを備えるVivid 7 PRO心エコーシステム(GE Medical System, Velizy)を使用することによって、心エコー図検査を実施した。１〜２％イソフルラン（Baxter, Maurepas）によって軽度麻酔した胸部剃毛ラットを仰向け、トランスデューサーを左半胸郭上に置いて、画像を取得した。左心室の二次元傍胸骨長短軸画像を取得し、二次元ターゲットＭモードトレーシングを掃引速度２００mm／秒で記録した。American Society for Echocardiographyの推奨にしたがって、全ての測定を実施した。画像が軸上にあることを基準として、最先端の方法を、円形の左心室腔（２Ｄ画像）を有する３連続の心周期（ｎ）に適用した。多大な努力を払って良好な画質を達成し、徐々に移動させてトランスデューサーを角張らせることによって、心臓の心内膜及び心外膜の境界を可視化した。式ＦＳ＝（ＥＤＤ−ＥＳＤ）／ＥＤＤ×１００（式中、ＥＤＤ及びＥＳＤは、それぞれ拡張末期径及び収縮末期径である）によって、左心室（ＬＶ）短縮（ＦＳ）のパーセント（ＬＶ収縮機能の尺度）を計算した。
【０１０６】
心電図
ADIシステム(ADinstruments LTD, Oxford, UK)を使用して、表面心電図（ＥＣＧ）を記録した。
【０１０７】
心臓特異的ヒトＡｐｏＯトランスジェニックマウスの作製
フランスの法律及びINSERMの動物管理ガイドラインにしたがって、トランスジェニックマウスの研究を行った。マウスαＭＨＣプロモーターを含有する５．５ｋｂのＢａｍＨＩ−ＳａｌＩフラグメントと、ヒトＡｐｏＯコード配列を含有するＳａｌＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ  ｃＤＮＡフラグメントとから、αミオシン重鎖（αＭＨＣ）−ＡｐｏＯ導入遺伝子を構築した。αＭＨＣ−ＡｐｏＯ導入遺伝子をＮｏｔＩで線状化し、電気溶出によって精製し、elutip-dカラム(Schleicher and Schuell)で濃縮し、Ｂ６Ｄ２／Ｆ１ハイブリッド雌の受精卵の核注入に使用した。次いで、マイクロインジェクションした卵母細胞を、Ｂ６ＣＢＡ／Ｆ１ハイブリッド偽妊娠養母に再移植した。３つのトランスジェニックマウス系統を作製し、Ｃ５７Ｂ６ｌ６／Ｊマウスと交配した。QIAcube装置のDNAeasy血液組織キット（Qiagen, Courtaboeuf）を使用して、ゲノムＤＮＡを抽出した。推奨されるようにプライマーｒｔｉＭＨＣＰ１Ｆ（配列番号８）及びｒｔｉＭＨＣＰ１Ｒ（配列番号９）並びにDynazyme II酵素（Ozyme, Saint-Quentin-en-Yvelines）を使用してＰＣＲによって、子孫を追跡した。ＰＣＲをマウス１匹当たり少なくとも３回実施し、ＰＣＲ産物をアクリルアミドゲル電気泳動によって分析した。
【０１０８】
マウス肝臓の流体力学的in vivoトランスフェクション
若干の修正を加えた以外は記載されているように、プラスミド５０μgを含む等張ＮａＣｌ ２mlを、２０〜２４ｇのマウスの尾静脈に６〜８秒間かけて単回水圧注入することによって、ＤＮＡを投与した。
【０１０９】
ＲＮＡ抽出及び品質コントロール
以前に記載されているように、組織サンプルから単離した全ＲＮＡを品質チェック及び濃度コントロールした。製造業者のプロトコール（Ozyme, Saint-Quentin-en-Yvelines）にしたがってRNeasyカラム及びQIAcube自動装置を使用して、培養Ｈ９ｃ２心筋芽細胞から全ＲＮＡを単離した。
【０１１０】
遺伝子発現のリアルタイムＰＣＲ分析
オリゴは、Perlプライマーソフトウェアで設計し、Eurogentec Companyが合成した。MyiQ（商標）リアルタイムＰＣＲ装置(Bio-Rad)に記載されているように、SurePrimeキット試薬(MP Biomedicals, Illkirch)を使用して、リアルタイムＰＣＲを実施した。SigmaStat3ソフトウェアを用いて、リアルタイムＰＣＲを統計的に分析した。
【０１１１】
Ｏ２消費量の測定
OROBOROS Oxygraph-2k (Oroboros Instruments GmbH, Innsbruck, Austria)及び標準Oroboros手順を使用して、Ｏ２フローを測定した。ＣＣＣＰの存在下における酸素消費量を、オリゴマイシンで測定したもので割ることによって、呼吸制御指数（ＲＣ）の計算を行った。ＲＣは、呼吸とリン酸化との間の共役のタイトネスを示す。
【０１１２】
活性酸素（ＲＯＳ）種の評価
Victor（商標）X5 2030マルチラベルリーダー(Perkin Elmer, Courtaboeuf)を用いて、製造業者（Life Technologies SAS, Villebon sur Yvette）によって推奨されるように、５−（及び−６）−カルボキシ−２’，７’−ジクロロフルオレセインジアセタート（カルボキシ−ＤＣＦＤＡ）を使用した。
【０１１３】
カスパーゼ−３酵素活性のモニタリング
カスパーゼ−３基質ＩＶ蛍光基質（VWR, Strasbourg）及びVictor（商標）X5 2030マルチラベルリーダー(Perkin Elmer, Courtaboeuf)を使用して、カスパーゼ−３アッセイを実施した。
【０１１４】
アシル−ＣｏＡシンテターゼ活性
Askari, B. et al., Diabetes 56, 1143-1152, (2007)に記載されているように、アシル−ｃｏＡシンテターゼ活性を実施した。
【０１１５】
シトクロムＣオキシダーゼ活性
シトクロムｃオキシダーゼアッセイキットSigma Aldrich (Saint-Quentin-Fallavier)及びVictor（商標）X5 2030マルチラベルリーダー(Perkin Elmer, Courtaboeuf)を使用して、推奨されるように、シトクロムＣオキシダーゼ活性を実施した。
【０１１６】
共免疫沈降及びＧＳＴプルダウン
Harlow, E et al., Cold spring Harbor Laboratory Press, (1999)に記載されているように、ＲＩＰＡ緩衝液中で、共免疫沈降（Ｃｏ−ＩＰ）及びＧＳＴプルダウンを実施した。
【０１１７】
共焦点顕微鏡検査
Falcon培養スライド(BD Biosciences, Le Pont de Claix)上で、Bodipy−パルミタート（Life Technologies SAS, Villebon sur Yvette）の蛍光検出を実施した。サブコンフルエント細胞を、Bodipy−パルミタート１μMと共に２分間インキュベーションし、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、４％ホルムアルデヒドを含有するＰＢＳによって室温で１５分間固定し、続いて、−２０℃で５分間固定した。次いで、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、蛍光封入剤及びカバースリップで覆ってから、Zeiss LSM 510共焦点顕微鏡(Carl Zeiss Meditec France SAS, Le Pecq)上で分析した。
【０１１８】
透過型電子顕微鏡検査。組織を、２％グルタルアルデヒドの０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）によって４℃で４時間固定し、０．２Ｍリン酸緩衝液で一晩洗浄し、次いで、１％四酸化オスミウムの２５０mMサッカロース及び０．０５Ｍリン酸緩衝液によって室温で１時間後固定した。次いで、サンプルを、一連の段階的エタノール溶液、続いてプロピレンオキシドで脱水し、Epon-araldite樹脂(Embed 812-Araldite 502, Electron Microscopy Sciences)に包埋した。最後に、組織を厚さ７０nmの切片（Ultracut Reichert Jung）にスライスし、１００メッシュコロジオンコーティングカッパーグリッド上にマウントしてから、３％酢酸ウラニルの５０％エタノール溶液及びレイノルズクエン酸鉛で染色した。付着細胞を固定し、上記のように洗浄し、２％酢酸ウラニルで一晩染色した。透過型Hitachi HU12A電子顕微鏡上で、加速電圧７５kVで検査を行った。
【０１１９】
脂質プロファイリング
FAST-PREP (MP Biochemicals)用いてメタノール／５mM ＥＧＴＡ（２：１v/v）２ml中で、細胞又は組織をホモジナイズした。５０μlを蒸発させ、乾燥ペレットをＮａＯＨ（０．１Ｍ）０．２mlに一晩溶解し、Bio-Radアッセイを用いてタンパク質を測定した。
【０１２０】
中性脂質分子種分析。
内部標準：スティグマステロール３μg、１，３−ジミリスチン２μg、ヘプタデカン酸コレステリル３μg及びトリヘプタデカン酸グリセリル５μgの存在下、クロロホルム／メタノール／水（２．５：２．５：２．１、v/v／ｖ）で脂質を抽出した。クロロホルム相を蒸発乾固した。SPEカラム(Macherey Nagel glass Chromabond pure silice, 200 mg)によって、中性脂質を分離した。クロロホルム２mlでカートリッジを洗浄した後、抽出物を、クロロホルム２０□ｌ中のカートリッジにアプライし、中性脂質をクロロホルム：メタノール溶液（９０：１０、v/v）２mlで溶出した。有機相を蒸発乾固し、酢酸エチル２０μlに溶解した。Zebron-1 Phenomenex融合シリカキャピラリカラム（内径５ｍ×０，３２mm膜厚０．５０μm）を使用してFOCUSサーモエレクトロンシステムの気液クロマトグラフィーによって、脂質抽出物１μlを分析した。キャリアガスとして水素（０．５bar）を使用して５℃／分の速度で、オーブン温度を２００℃〜３５０℃にプログラムした。注入器及び検出器は、それぞれ３１５℃及び３４５℃であった。
【０１２１】
脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）の定量。
内部標準トリヘプタデカン酸グリセリル２μgの存在下でホモジネートを乾燥させ、１４％三フッ化ホウ素メタノール溶液（ＳＩＧＭＡ）１ml及びヘキサン１ml中、５５℃で１時間メチル基転移した。水１mlを抽出物に追加した後、ＦＡＭＥをヘキサン３mlで抽出し、蒸発乾固し、酢酸エチル２０μlに溶解した。Famewax RESTEK融合シリカキャピラリカラム（内径３０ｍ×０，３２mm膜厚０．２５μm）を使用してClarus 600 Perkin Elmerシステムの気液クロマトグラフィーによって、ＦＡＭＥ（１μl）を分析した。２℃／分の速度で、オーブン温度を１１０℃〜２２０℃にプログラムし、キャリアガスは水素（０．５bar）であった。注入器及び検出器は、それぞれ２２５℃及び２４５℃であった。
【０１２２】
ウエスタンブロット
哺乳動物MCL-1細胞溶解キット溶液(Sigma Aldrich, Saint-Quentin-Fallavier)を用いて、プロテアーゼインヒビターの混合物の存在下で、心臓組織又は肝臓組織を破砕した。製造業者のプロトコールにしたがって、手順を実施した。タンパク質６０μgを１０％ポリアクリルアミド−ＳＤＳゲルにロードし、0.45 μmニトロセルロース膜BA85 (Schleicher and Schuell, Ecquevilly, France)上にブロットした。ウエスタンブロットでは、ローディングコントロールとしてアクチンの代わりにリバーシブルポンソーＳ染色を使用した。MultiMarkマルチカラースタンダード(Life Technologies SAS, Villebon sur Yvette)を使用して、タンパク質の分子量を決定した。０．１％Ｔｗｅｅｎ２０及び３％脱脂粉乳を含むＴＢＳ（７mM Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５；１５０mM ＮａＣｌ）中で、ニトロセルロース膜を２時間ブロッキングした。ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ０．１％中で、抗ＡｐｏＯ血清のハイブリダイゼーションを２時間実施した。ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ０．１％で３回洗浄した後、ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ０．１％＋３％脱脂粉乳中で、西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート（１０−４希釈）を膜と共に２時間インキュベーションした。ブロットをＴｗｅｅｎ−ＴＢＳで３回洗浄し、ＴＢＳで１回洗浄してから、製造業者のプロトコール（Fisher Scientific SAS, Illkirch, France）にしたがってSuperSignal West Pico化学発光基質を用いて、ハイブリダイゼーションを明らかにした。
【０１２３】
統計分析、及びディファレンシャルに発現される遺伝子の同定。
全ての結果は、平均±ＳＥとして示されている。ＡＮＯＶＡを使用して多重比較を分析し、続いて適切な場合にはStatview 4.5ソフトウェア(Abacus Concepts, Inc., Berkeley, CA)を使用してダネット事後検定によって分析した。対応のないスチューデントｔ検定を使用して、単一比較を実施し、０．０５以下のｐ値を有意であるとみなした。
【０１２４】
結果
この結果は、ミトコンドリア機能不全と脂肪毒性との間の相互作用を識別し、マウス及びヒトの心臓における透過性遷移孔と脂質代謝との関連を初めて実証している。また、本発明者らは、ミトコンドリア機能及び脂質代謝の新たなシグナルレギュレーターとしてＡｐｏＯの重要性を実証する。本発明者らが開発したＡｐｏＯモデルは、ミトコンドリア心機能障害と脂質蓄積との間の最初の関連性を表す。
【０１２５】
生理学的レベル（内因性の２倍未満）でヒトＡｐｏＯを構成的に発現するマウス心臓は、心室機能の低下、収縮機能障害の特徴的なパターン、及び拡張型心筋症を示した。具体的には、心臓特異的ＡｐｏＯ−Ｔｇマウスは、ＰＲ間隔の延長、並びに短縮率及び駆出率の減少を示した。心筋縦断面の透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）分析により、ミトコンドリアのクリステの喪失又は不連続などの変性変化が明らかになった。公的に入手可能なヒト心臓マイクロアレイデータセットの検査により、ＡｐｏＯ  ｍＲＮＡレベルは、１〜５の任意単位で変動することが明らかになった。最高及び最低のＡｐｏＯ発現を有するマイクロアレイ間の合成発現比を使用した経路分析により、様々な代謝経路における有意な富化が明らかになり、最も有意なものは、酸化的リン酸化及びミトコンドリア機能不全であった。次いで、本発明者らは、ＡｐｏＯを過剰発現する心筋芽細胞トランスフェクタントを作製するための発現ベクターを設計した。in vivo蛍光標識、並びにＡｐｏＯを過剰発現する心筋芽細胞由来のタンパク質抽出物及び細胞内画分を用いた研究により、ＡｐｏＯのミトコンドリア局在性が明らかになった（図１）。
【０１２６】
in vivo蛍光標識、並びにＡｐｏＯを過剰発現する心筋芽細胞由来のタンパク質抽出物及び細胞内画分（図１ｅ、ｆ）を用いた研究により、ＡｐｏＯのミトコンドリア局在性が明らかになった。ＡｐｏＯ配列のin silico調査により、推定Ｎ末端ミトコンドリア「アドレスラベル」が明らかになった。Ｎ末端の４０残基の欠失（ＡｐｏＯ  Δ１−４０）は、ミトコンドリアから細胞質へのＡｐｏＯ分布を変化させた（図１ｇ）。
【０１２７】
さらに、ｐＴＴ−ｈＡｐｏＯ発現ベクターの急速尾静脈注射による流体力学的in vivoマウス肝臓トランスフェクションは、発現ベクターのＰＣＲ増幅（図３Ａ）によって証明されるように、ＡｐｏＯ  ｍＲＮＡレベルの上昇（図２）をもたらし、肝細胞由来の単離されたミトコンドリアにおけるＡｐｏＯタンパク質のレベルを増加させた（図３Ｂ）。最近の研究では、酵母及びC. elegansオルソログで得られた証拠により、並びにヒト細胞株のプロテオミクス及び共焦点顕微鏡検査を通じて、ＡｐｏＯはミトコンドリア性であると提案されている。興味深いことに、C. elegansのＡｐｏＯオルソログの突然変異は、マウス心臓における適度なＡｐｏＯ過剰発現で観察されたものと同様のクリステの崩壊をもたらした。
【０１２８】
ＡｐｏＯは、ミトコンドリア呼吸を増加させる。
ヒト心臓のトランスクリプトームバイオインフォマティクス分析にしたがって、本発明者らは、ＡｐｏＯを過剰発現する心筋芽細胞における酸化的リン酸化遺伝子の発現の有意な増加を測定した。この増加は、ＡｐｏＯのＮ末端欠失及び心筋芽細胞のｓｈＡｐｏＯ処理の両方によって減少した。本発明者らはまた、基礎酸素消費量の２倍の増加（これは、ＡｐｏＯのミトコンドリア局在性に依存し、ＡｐｏＯ  ｓｈＲＮＡ処理によって縮小した）を示したＡｐｏＯ−Ｔｇ心臓及びＡｐｏＯ細胞の両方において、シトクロムＣオキシダーゼ活性（呼吸鎖の必須要素）の増加を見出した（図４Ａ）。アンチマイシン（キノンサイクルのインヒビター）は、酸素消費をほぼ完全に阻害したが、これは、測定された呼吸の大部分がミトコンドリア性であることを示している（図４Ｂ）。ＡｐｏＯ細胞では、オリゴマイシンによって基礎酸素消費が部分的に阻害され、脱共役剤カルボニルシアニドｍ−クロロフェニルヒドラゾン（ＣＣＣＰ）の追加は、酸素消費量の２倍の増加をもたらしたが、これは、これらの細胞が高い電子伝達活性を有することを示唆している。呼吸共役（ＲＣ）の計算により、ＡｐｏＯ細胞では、ＲＣが減少していることが確認された（図４Ｃ）。したがって、ＡｐｏＯは、ミトコンドリア機能に対する２つの異なる効果（総呼吸の増加及びマイルドな脱共役）を有する。これらの効果はまた、細胞内の活性酸素種（ＲＯＳ）の増加に関連していた（図４Ｄ）。本発明者らは、流体力学的in vivoトランスフェクションマウス肝臓由来の単離されたミトコンドリア（これは、酸素消費量の有意な増加を示した）を用いて、同等の結果を観察した。
【０１２９】
ＡｐｏＯは、シクロフィリンＤ及びアデニンヌクレオチドトランスロカーゼと相互作用する。
公知の治療ターゲットであるミトコンドリア膜透過性遷移孔（ＭＰＴＰ）の適切なレギュレーションは、ミトコンドリア呼吸及び心臓ホメオスタシスに必須である。ＡｐｏＯのミトコンドリア局在性、並びに適度なＡｐｏＯ過剰発現でミトコンドリア構造及び心機能に対して観察された効果を考慮して、本発明者らは、ＡｐｏＯが、ＭＰＴＰ機能に関与するタンパク質と相互作用すると仮説した。ＭＰＴＰ構造は、まだ完全には決定されていない。当初、ＭＰＴＰは、マトリックスにシクロフィリン−Ｄ（ＣｙｐＤ）と、内膜にアデニンヌクレオチドトランスロカーゼ（ＡＮＴ）と、外膜に電位依存性アニオンチャネル（ＶＤＡＣ）とを含むと提案された。最近、遺伝子ターゲティングマウス実験により、ＶＤＡＣはＭＰＴＰに不要であったことが示された。この細孔は、１．５kDa未満の分子及び代謝産物（プロトンを含む）のミトコンドリアへの自由な通過を可能にし、これがミトコンドリア脱共役につながる。ＡｐｏＯはミトコンドリア内膜に局在するというコンピュータ予測と一致して、ブルーネイティブページ及びＧＳＴプルダウン実験により、ＡｐｏＯとシクロフィリン−Ｄ及び／又はＡＮＴとの間の相互作用が実証され（図５Ａ及びＢ）、ＶＤＡＣとの相互作用が排除された。
【０１３０】
ＡｐｏＯとＭＰＴＰとの間の機能的関係を試験するために、本発明者らは、シクロフィリンＤに結合するＭＰＴＰ遮断薬シクロスポリンＡ（ＣｓＡ）でＡｐｏＯ細胞を処理した。ＣｓＡは、ミトコンドリア呼吸に対するＡｐｏＯ過剰発現の効果を低減したが（図５Ｃ）、これは、ＡｐｏＯがシクロフィリンＤと相互作用することを裏付けている。ミトコンドリアカルセイン−コバルトアッセイによって示されるように、本発明者らはまた、ＡｐｏＯが、培養心筋芽細胞におけるＭＰＴＰの開口動態を変化させることを示した。ＡｐｏＯ−Ｔｇマウス心臓から単離したミトコンドリアでは、カルシウム保持能力も有意に減少した。
【０１３１】
ＡｐｏＯ誘導性のＭＰＴＰ開口により、観察されたマイルドなミトコンドリア脱共役及び酸素消費量の増加が説明される。いくつかの研究では、糖尿病におけるミトコンドリア機能不全を説明する機構として、脱共役が提案されている。ＡｐｏＯ媒介性のレギュレーションは、ＣｓＡ（シクロフィリンＤ（ＣｙｐＤ）をターゲティングする薬物）によって減少したように、本発明者らは、ＡｐｏＯ細胞におけるＣｙｐＤ遺伝子のノックダウンが、ＡｐｏＯ媒介性の呼吸を部分的に妨げることを示すことができた。
【０１３２】
総合すると、この結果は、ミトコンドリア機能のレギュレーションにおけるＡｐｏＯの役割を示している。
【０１３３】
ＡｐｏＯ誘導性のＭＰＴＰ開口は、脂肪酸代謝及び脂肪毒性を増加させる。
エネルギー源として脂肪酸を使用するミトコンドリアが豊富な組織、例えば心臓及び褐色脂肪組織では、ＡｐｏＯが高発現されている。したがって、本発明者らは、電子伝達鎖フラックスのＡｐｏＯ誘導性増加が、長鎖脂肪酸（ＬＣＦＡ）のミトコンドリア輸送を増加させると仮定した。ＬＣＦＡをミトコンドリアに提供するために、細胞は、最終的には、原形質膜における脂肪酸取り込みを増加させるであろう。
【０１３４】
本発明者らは、ＡｐｏＯ発現細胞における緑色蛍光BODIPY−パルミタートの急速な蓄積を測定し（図６Ｄ）、細胞内の総脂肪酸が１２０％増加したことを見出した（図６Ｅ）。したがって、本発明者らは、ＡｐｏＯが、脂肪酸代謝に関与する遺伝子の発現を誘導することができるかを分析した。ＡｐｏＯ細胞では、脂肪酸トランスポーター（ＣＤ３６及びＦＡＴＰ４）の発現及び長鎖アシル−ＣｏＡシンテターゼ（ＡＣＳＬ）の活性が大きく増加しており、この効果は、ＡｐｏＯ  ｓｈＲＮＡ又はトリアクシンＣ（ＡＣＳＬインヒビター）のいずれかによる処理によって有意に低減した（図６Ａ〜Ｃ）。ＡＣＳＬ及びＦＡＴＰ４は、ＬＣＦＡのエステル化を触媒して、脂質チャネリングを可能にする。ＡＣＳＬの過剰発現を介して脂質取り込みを増加させることによって、心臓脂肪毒性の動物モデルを作製した。本発明者らの仮説を検証するために、本発明者らは、ＡｐｏＯ細胞を低用量のＣｓＡ（２００nM）と共にインキュベーションし、細胞内脂肪酸レベル及び特にＦＡＴＰ４発現の有意な減少を示した（図７Ａ及びＢ）。Ｎ末端の４０残基の欠失、又はｓｈＣｙｐＤによるＡｐｏＯ心筋芽細胞の処理は、脂肪酸トランスポーターの発現、及び脂肪酸の細胞レベルを減少させたが、これは、ＡｐｏＯ誘導性のＭＰＴＰ開口が、ミトコンドリア呼吸だけではなく脂肪酸代謝にも影響を与えることを示している（図７Ｃ及びＤ）。本発明者らは、ＬＣＦＡが、カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼＩ（ＣＰＴ１）及び非特異的ＭＰＴＰ（１．５kDa未満の溶質が透過可能）を介して迅速にミトコンドリアに入ることができると仮定した。同様に、ＡｐｏＯ−Ｔｇマウス由来の心臓は、脂肪酸トランスポーターの発現及びＡＣＳＬの活性の有意な増加を示した。ヒト心耳サンプルでは、ＡｐｏＯ発現は、ＣＤ３６、ＦＡＴＰ４及びＡＣＳＬ−３の発現と正に相関していた。マイクロアレイデータマイニングは、これらの結果と一致しており、ＡｐｏＯ発現が上昇している患者の心臓では、ＣＤ３６及びＦＡＴＰ２も増加していたことを示した。これらの変化は、脂質取り込み及びβ−酸化に関与することが公知の転写因子であるペルオキシソーム増殖因子活性化レセプター（ＰＰＡＲα）の増加に関連するはずである。実際、ヒト心耳サンプル、ＡｐｏＯ−Ｔｇマウス由来の心臓、in vivoトランスフェクションマウスの肝臓、及びＡｐｏＯ細胞において、ＡｐｏＯ発現は、ＰＰＡＲα  ｍＲＮＡレベルの増加をもたらした。
【０１３５】
過剰な脂肪酸取り込みが、ミトコンドリアの脂肪酸酸化能力を超えると、毒性脂質の貯蔵が増加して、脂肪毒性をもたらす。本発明者らのモデルシステムの脂質組成分析により、ＡｐｏＯ発現は、細胞内トリグリセリドのレベルを有意に改変しなかったことが明らかになったが、ＡｐｏＯ−Ｔｇ心臓及びトランスフェクション肝臓では、ジグリセリドなどの毒性種のレベルが増加した（図８ａ〜ｄ）。ヒト心臓サンプルでは、内因性ＡｐｏＯ  ｍＲＮＡレベルは、トリグリセリドレベルではなくジグリセリドレベルと相関していた（図８ｅ〜ｆ）。また、ＡｐｏＯ細胞のパルミタート処理は、ジグリセリドの劇的な細胞内蓄積を誘導し、トリグリセリドレベルに有意に影響を与えなかった（図７Ｅ及びＦ）。
【０１３６】
ＡｐｏＯのＮ末端の４０残基の欠失、又はｓｈＣｙｐＤによるＡｐｏＯ心筋芽細胞の処理は、細胞ジグリセリドレベルを減少させた。ＡｐｏＯ細胞を２０nM ＣｓＡと共にインキュベーションすると、細胞内ジグリセリドレベルが有意に減少したが（図７Ｇ及びＨ）、これは、ＡｐｏＯ媒介性のＭＰＴＰ開口が脂肪毒性を促進することを裏付けている。
【０１３７】
ＡｐｏＯは、アポトーシスを増加させる。
ＭＰＴＰ開口は、プログラム細胞死のプロセスにおける重要な工程である。本発明者らは、ＡｐｏＯ過剰発現がアポトーシスを促進すると仮説し、ヒト心臓におけるＡｐｏＯ  ｍＲＮＡレベルとプロアポトーシス因子Ｂａｘとの間の正の相関関係を見出した（図９ａ）。ＡｐｏＯ−Ｔｇマウス由来の心臓におけるＡｐｏＯ過剰発現が適度であっても、Ｂａｘ発現及びカスパーゼ３活性（図９ｂ〜ｃ）は増強された。ＡｐｏＯトランスフェクション肝臓を用いてin vivoで（図９ｄ〜ｅ）、及びＡｐｏＯ細胞を用いてin vitroでこれらの結果を確認したところ、Ｂａｘ発現及びカスパーゼ−３活性の増加は、ＡｐｏＯ  ｓｈＲＮＡ処理によって有意に低減した（図９ｆ〜ｇ）。また、ＴＥＭにより、ＡｐｏＯ細胞の原形質膜における小疱形成（これは、プロアポトーシス状態の指標である）が明らかになった。これらの細胞の機能ゲノミクス分析により、プログラム細胞死及び代謝経路のレギュレーションに関与する遺伝子の発現の大幅な増加が明らかになった。低用量のＣｓＡによる処理は、基礎カスパーゼ−３活性及びＢａｘ発現の減少を示したＡｐｏＯ細胞を治癒した。実際、これらの細胞は、細胞体凝縮及び細胞質空胞変性の減少を含む特徴的な形態改善を示した。また、ＡｐｏＯ過剰発現は、漸増用量のパルミタートのアポトーシス効果を劇的に増幅し、コントロール細胞におけるカスパーゼ−３活性がやや増加した（図９ｈ）。興味深いことに、パルミタート誘導性のカスパーゼ−３活性は、ＣｓＡによる処理によって有意に減少した（図９ｉ）。ＡｐｏＯは、シクロフィリンＤ及びＡＮＴをターゲティングし、ＭＰＴＰ開口をモデュレーションすることによってアポトーシス及び脂肪毒性を増加させ得る。これらの結果により、病的なＡｐｏＯ過剰発現とミトコンドリア機能不全（これは、最終的には、ミトコンドリア生合成をトリガーするはずである）の誘導との間の潜在的関連性が示唆された。したがって、心臓手術を受けた患者由来のヒト右心耳サンプル、及びＡｐｏＯ−Ｔｇマウス由来の心臓では、ＡｐｏＯ及びＰＰＡＲ−γコアクチベーター１α（ＰＧＣ−１α）（ミトコンドリア生合成のマスターレギュレーター）の発現は密接に相関している。本発明者らは、ミトコンドリア合成の増加が、ＡｐｏＯ−Ｔｇ心臓及びＡｐｏＯ細胞で観察された自食作用胞及び多層体におけるミトコンドリアの変質及び分解をバランスすると仮定した（図１０ａ〜ｄ）。本発明者らは、ＡｐｏＯ誘導性のアポトーシス及びミトコンドリアの変質が、細胞死に至る悪循環へと細胞を誘導すると仮説した。本発明者らが線維形成及びアポトーシスの発生によって証明したように、この仮説により、ＡｐｏＯ−Ｔｇ心臓で観察された筋原線維及び心筋細胞の喪失が説明される。本発明者らの結果に基づいて、本発明者らは、ＡｐｏＯが、図１０ｅに示されているモデルにおける中心的分子であると提案する。
【０１３８】
この図に示されているカスケード事象は、ＡｐｏＯ刺激性のＭＰＴＰ開口から始まる。高い発現レベルでは、ＡｐｏＯはＭＰＴＰの開口率を高めて、マイルドな脱共役、呼吸の増加及び反応性酸素種（ＲＯＳ）の産生をもたらす。成体の心臓では、ＮＡＤＨ及びＦＡＤＨ２産生は、ＬＣＦＡのβ−酸化によって主に引き起こされるので、活性化された電子伝達鎖は、より多くのＮＡＤＨ／ＦＡＤＨ２（これは、ミトコンドリア代謝シンク生成する）を必要とする（図１０ｅ１及び２）。これは、ＡｐｏＯ細胞で観察されたβ−酸化の誘導によって裏付けられる。ＣＰＴ−１、おそらくは開口ＭＰＴＰを通じて、ＬＣＦＡはミトコンドリアに迅速に入る（図１０ｅ３）。ＬＣＦＡトランスポーター（ＦＡＴＰ）の発現の増加は、ミトコンドリアの消費量の増加を補う（図１０ｅ４）。ＬＣＦＡ取り込みは、ミトコンドリアの脂肪酸酸化能力を超え、特にパルミタートなどの飽和ＬＣＦＡの存在下では、脂肪毒性をもたらす。過剰なパルミタートは、ジグリセリドなどの毒性脂質副産物を生成する（図１０ｅ５）。パルミタートから非毒性トリグリセリドを強制的に生成させるオレアートのような不飽和脂質の追加によって、この毒性は減少され得る。パルミタート及びオレアートの両方で処理したＡｐｏＯ細胞は、ジグリセリド／トリグリセリド比の２倍の減少（図１１ａ〜ｂ）、及びカスパーゼ−３活性の１２倍の減少（図１１ｃ）を示した。したがって、ＭＰＴＰ開口によって誘導されるアポトーシスは、脂質取り込みによって増大される。強い酸化ストレス及びミトコンドリア機能不全は、脂質取り込み、β−酸化及びミトコンドリア生合成に関与する遺伝子、例えばＰＧＣ１α及びＰＰＡＲαの発現を増加させる（図１０ｅ６）。ＲＯＳレベルの増加は、ＭＰＴＰ開口及びプロトン勾配の喪失をさらに刺激し、Ｂａｘと共に作用してアポトーシス誘導因子（ＡＩＦ）及びシトクロムＣを放出させ、細胞死をもたらす（図１０ｅ７）。本発明者らは、ＭＰＴＰを遮断することによって、脂肪毒性及びアポトーシスを含む全ての後続工程が抑制され得ることを示した。実際、Ｂａｘなどのプロアポトーシス遺伝子の発現及びカスパーゼ−３の活性の減少によって示されるように、ＣｓＡは、呼吸速度だけではなくアポトーシスも減少させた。ＭＰＴＰ遮断薬はまた、脂肪酸トランスポーターの発現レベルを減少させ、脂質蓄積を減少させた。したがって、ＭＰＴＰは、脂肪酸代謝に関与する。
【０１３９】
肥満及び糖尿病は、過剰な異所性脂質沈着による二次臓器不全の前兆である。この脂肪毒性は、心筋症、筋障害、脂肪肝、膵炎、甲状腺機能低下症及び糖尿病として現れる。細胞における持続的な脂質取り込みにつながるシグナルの性質は、依然として不明である。動物脂肪毒性モデルは、明らかなミトコンドリア機能不全を示す。これらのモデルでは、脂肪蓄積は、ミトコンドリア機能の低下に先行すると提案されている。しかしながら、ミトコンドリア機能不全がより原因としての役割を果たすという逆の機構も提案されている。本発明者らは、脂肪毒性は、ミトコンドリア機能不全の原因ではなく結果であるという証拠を示した。
【０１４０】
酵母及びC. elegansにおける研究により、ＡｐｏＯオルソログは、ミトフィリン複合体の内膜内に位置することが明らかになった。ミトフィリンは、ミトコンドリア内膜組織システム（ＭＩＴＯＳ又はＭＩＣＯＳとも称されるＭＩＮＯＳ）と称されているヘテロオリゴマータンパク質複合体に関与する。外膜及びクリステ膜に近接して並置する内側境界領域を有するミトコンドリア内膜の特徴的な形態の維持のためには、ＭＩＮＯＳの完全性が必要である。ミトフィリンタンパク質は、ミトコンドリアのアーキテクチャの重要なオーガナイザーである。本研究では、本発明者らは、この複合体由来の少なくとも１つのタンパク質（すなわち、ＡｐｏＯ）が、構造オーガナイザーよりも積極的な役割を果たし、ＭＰＴＰ開口をレギュレーションすることを示した。
【０１４１】
したがって、心臓におけるＡｐｏＯの生理学的役割は、糖尿病及び肥満における心機能障害の主要な病理学的プロセスに関する新たな知見を与え得る。本研究はまた、ミトコンドリア心機能障害の発症と、新たなミトコンドリア作用因子ＡｐｏＯによる脂質蓄積との間の関連性を立証する。
【０１４２】
実施例２：ＡｐｏＯは、ガン細胞株におけるアポトーシスを誘導する
材料及び方法
Ｕ８７神経膠芽腫の細胞培養及びトランスフェクション
Ｕ８７は、European Collection of Cell Cultures (Salisbury, England). p y, g )から入手した。１．５ｇ／リットルの重炭酸ナトリウムを含有するように調整し、抗生物質−抗真菌溶液（Life Technologies SAS, Villebon sur Yvette）及び１０％ウシ胎児血清（FBS, AbCys s.a., Paris）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（Life Technologies SAS, Villebon sur Yvette）中で、Ｕ８７細胞を培養した。細胞を直径１０cmの組織培養皿上にプレーティングし、３７℃、飽和湿度の５％ＣＯ２インキュベーターで成長させ、培地を２日ごとに交換した。エレクトロポレーションによってＵ８７神経膠芽腫を安定トランスフェクションし、以前に記載されているように（Smih et al 2002）、トランスフェクタントのプールを選択した。
【０１４３】
ウエスタンブロット分析
プロテアーゼインヒビターの混合物の存在下で、培養細胞をＲＩＰＡ緩衝液（０．１５Ｍ塩化ナトリウム、１％ＮＰ−４０、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ、５０mM Ｔｒｉｓ、ｐＨ８）に再懸濁した。溶解物を６秒間超音波処理し、６，５００×ｇで１０分間遠心分離した。タンパク質２０μgを１２％ポリアクリルアミド−ＳＤＳゲルにロードし、0.45 μmニトロセルロース膜BA85 (Schleicher and Schuell, Ecquevilly, France)上にブロットした。ローディングコントロールとしてリバーシブルポンソーＳ染色を使用した。MultiMarkマルチカラースタンダード(Life Technologies SAS, Villebon sur Yvette)を使用して、タンパク質の分子量を決定した。０．１％Ｔｗｅｅｎ２０及び３％脱脂粉乳を含むＴＢＳ（１０mM Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．８、１５０mM ＮａＣｌ）中で、ニトロセルロース膜を２時間ブロッキングした。次いで、膜を所望の抗体とハイブリダイゼーションさせた。ＡｐｏＯタンパク質を明らかにするために、膜を、ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ０．１％緩衝液を含む抗ＡｐｏＯ血清と共に４℃で一晩インキュベーションした。ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ０．１％で３回洗浄した後、ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ０．１％＋３％脱脂粉乳中で、１００，０００倍希釈の西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ウサギ抗体（Life Technologies SAS, Saint Aubin, France）を膜と共に２時間インキュベーションした。ブロットをＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ１％で３回洗浄し、ＴＢＳで１回洗浄してから、製造業者のプロトコール（Fisher Scientific SAS, Illkirch, France）にしたがってSuperSignal West Pico化学発光基質を用いて、ハイブリダイゼーションを明らかにした。製造業者のプロトコールにしたがって、カルレティキュリン（Epitomics, Burlingame, USA）抗体によるハイブリダイゼーション及び顕色を実施した。ImageJソフトウェアを用いて、タンパク質の免疫バンドのデンシトメトリーを定量した。
【０１４４】
パルミタートの調製及びカスパーゼ−３活性のモニタリング
ｐＴＴのみ又はｐＴＴ−ＡｐｏＯで予めトランスフェクションした神経膠芽腫を１００μMパルミタートで一晩処理した。以前に記載されているように（Hickson−Bick et al. 2000; Hirota et al. 2006）、パルミタートの調製及びカスパーゼ−３活性のアッセイを実施した。カスパーゼ−３基質ＩＶ蛍光基質（VWR, Strasbourg）及びVictorTM X5 2030マルチラベルリーダー（Perkin Elmer, Courtaboeuf）を用いて、カスパーゼ−３活性を測定した。
【０１４５】
結果
本発明者らは、ＡｐｏＯを過剰発現するＵ８７トランスフェクタント細胞を開発した（図１２）。Ｕ８７は、本発明者らが本実験のためにEuropean Collection of Cell Culturesから入手したヒト初代神経膠芽腫細胞株である。
【０１４６】
本発明者らは、
−コントロールＵ８７細胞（ｐＴＴ）；及び
−ＡｐｏＯを過剰発現するＵ８７トランスフェクタント（ｐＴＴ−ＡｐｏＯ）において、
カスパーゼ−３活性を測定及び比較した。
【０１４７】
結果は、ＡｐｏＯを過剰発現するＵ８７トランスフェクタント細胞では、コントロールＵ８７細胞と比較して、カスパーゼ−３活性が有意に増加していることを示しているが（図１３）、これは、アポトーシス効果の増幅を示している。実際、前述のように、アポトーシス細胞では、カスパーゼ−３活性が上昇していることが証明されている。
【０１４８】
したがって、これらの結果は、ＡｐｏＯを過剰発現するガン性細胞株では、アポトーシスが誘導されることを明らかに示しているが、これは、アポトーシスの誘導におけるＡｐｏＯの重要な役割を裏付けている。
【０１４９】
したがって、これらの結果は、特にアポトーシスを誘導することによってガン処置戦略を実行するために、ＡｐｏＯが中心的なターゲットであることを証明している。
【０１５０】
実施例３：ＡｐｏＯは、ガン細胞株におけるアポトーシスを誘導する
現在では、代謝調節障害は、ガン細胞の顕著な特徴であることが広く認められている。加えて、神経膠芽腫細胞は、浸潤性腫瘍の成長中にミトコンドリアのグルコース酸化を使用することが公知である。
【０１５１】
さらに、腫瘍と周囲の脳組織との間の代謝の違いは、代謝活性がガン治療の重要なターゲットを構成することを示している。
【０１５２】
前述のように、本発明者らは、アポリポタンパク質Ｏ（ＡｐｏＯ）が、ミトコンドリア呼吸、脂肪酸代謝及び脂肪毒性を増強することを本明細書で示した。
【０１５３】
さらに、本発明者らは、ＡｐｏＯを発現するように神経膠芽腫細胞をトランスフォーメーションする効果を調査することを決定した。この目的のために、ＡｐｏＯをコードするポリヌクレオチドを含むアデノ随伴ウイルス９で、神経膠芽腫細胞をトランスフォーメーションした。
【０１５４】
ａ）ＡｐｏＯは、神経膠芽腫の呼吸を誘導する
本発明者らは、ＡｐｏＯの発現をサイレンシングするショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＡｐｏＯ）で神経膠芽腫細胞を処理した後、酸素消費量を比較した。
【０１５５】
本発明者らは、ＡｐｏＯを発現する細胞では、ｓｈＡｐｏＯで処理した細胞（すなわち、前記発現が抑制されている細胞）と比較して、酸素消費量がより重大であることを示した（図１４）。
【０１５６】
したがって、本発明者らは、ＡＰｏＯが神経膠芽腫の呼吸を誘導するという事実を明らかにした。
【０１５７】
ｂ）ＡｐｏＯは、神経膠芽腫における脂肪毒性を誘導する
加えて、本発明者らは、
−ＡｐｏＯを発現しない神経膠芽腫細胞では、パルミタートの存在下であっても、脂質が蓄積しないのに対して；
−ＡｐｏＯを発現する神経膠芽腫細胞では、パルミタートの存在下で、脂質が蓄積することを説明した。
【０１５８】
図１５において、脂質小胞は矢印によって示されている。
【０１５９】
これらの結果は、ＡｐｏＯの発現又は過剰発現が、脂肪毒性の原因である脂質蓄積を明らかに誘導することを示している。
【０１６０】
ｃ）ＡｐｏＯは、神経膠芽腫におけるミトコンドリア機能不全を促進し、アポトーシスを誘導する
最後に、本発明者らは、神経膠芽腫細胞におけるＡｐｏＯの発現又は過剰発現が、異常ミトコンドリアの発生を誘導することを明らかにした。
【０１６１】
これらの知見は、ＡｐｏＯが、神経膠芽腫におけるミトコンドリア機能不全を促進することを明らかに示している。
【０１６２】
また、本発明者らは、ＡｐｏＯを発現する細胞では、アポトーシスが起こるのに対して、ＡｐｏＯを発現しない細胞では、前記結果が見られないことを確認した（図１６）。アポトーシスの現象は、矢印によって示されている。
【０１６３】
結論
本発明者らは、神経膠芽腫細胞において、ＡｐｏＯを発現するＡＡＶ９を使用することによってＡｐｏＯの過剰発現を誘導することの立証責任を果たした。ＡＡＶ９は血液脳関門を通過することができるので、アデノ随伴ウイルス９の使用は、遺伝子を脳細胞に送達するのに非常に便利である。
【０１６４】
本発明者らは、ＡｐｏＯの発現又は過剰発現が、ターゲティングしたガン性細胞内における脂肪毒性及びミトコンドリア機能不全につながることを確認した。これらの現象は、最終的には、神経膠芽腫細胞のアポトーシスにつながる。
【０１６５】
したがって、これらの結果は、ＡｐｏＯが、ガン処置の非常に有望な治療戦略であることを裏付けている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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