(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
変異したヒト遺伝子ＣＬＣＮ７のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）における点変異を含む領域に相補的な短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、又はその誘導体若しくは前駆体であって、
該変異が、対応するタンパク質ＣｌＣ−７の以下の変異：ｐ．Ｙ９９Ｃ、ｐ．Ｄ１４５Ｇ、ｐ．Ｗ１７９Ｘ、ｐ．Ｇ２０３Ｄ、ｐ．Ｌ２１３Ｆ、ｐ．Ｇ２１５Ｒ、ｐ．Ｐ２４９Ｌ、ｐ．Ｒ２８６Ｗ、ｐ．Ｒ２８６Ｑ、ｐ．Ｐ４７０Ｑ、ｐ．Ｒ４０９Ｗ、ｐ．Ｌ４９０Ｆ、ｐ．Ｇ６７７Ｖ、ｐ．６８８ｄｅｌ、ｐ．Ｋ６８９Ｅ、ｐ．Ｒ７６２Ｌ、ｐ．Ｇ７６５Ｂ、ｐ．Ｌ７６６Ｐ、ｐ．Ｒ７６７Ｗ、ｐ．Ａ７８８Ｄ、Ｒ２２３Ｌ、Ｒ２２３Ｐ、Ｒ２２３Ｇ、Ｒ２２３Ｋ、Ｒ２２３Ｗ、Ｒ２２３Ｉ、Ｒ２２３Ｍ、Ｒ２２３Ｃ、Ｒ２２３Ｓ、Ｒ２６５Ｌ、Ｒ２６５Ｐ、Ｒ２６５Ｇ、Ｒ２６５Ｋ、Ｒ２６５Ｗ、Ｒ２６５Ｉ、Ｒ２６５Ｍ、Ｒ２６５Ｃ、Ｒ２６５Ｓ、Ｒ２７１Ｌ、Ｒ２７１Ｐ、Ｒ２７１Ｇ、Ｒ２７１Ｋ、Ｒ２７１Ｗ、Ｒ２７１Ｉ、Ｒ２７１Ｍ、Ｒ２７１Ｃ、Ｒ２７１Ｓ、Ｒ２８０Ｌ、Ｒ２８０Ｐ、Ｒ２８０Ｇ、Ｒ２８０Ｋ、Ｒ２８０Ｗ、Ｒ２８０Ｉ、Ｒ２８０Ｍ、Ｒ２８０Ｃ、Ｒ２８０Ｓ、Ｒ２８１Ｌ、Ｒ２８１Ｐ、Ｒ２８１Ｇ、Ｒ２８１Ｋ、Ｒ２８１Ｗ、Ｒ２８１Ｉ、Ｒ２８１Ｍ、Ｒ２８１Ｃ、Ｒ２８１Ｓ、Ｒ２８６Ｌ、Ｒ２８６Ｐ、Ｒ２８６Ｇ、Ｒ２８６Ｋ、Ｒ２８６Ｉ、Ｒ２８６Ｍ、Ｒ２８６Ｃ、Ｒ２８６Ｓ、Ｒ３２６Ｌ、Ｒ３２６Ｐ、Ｒ３２６Ｇ、Ｒ３２６Ｋ、Ｒ３２６Ｗ、Ｒ３２６Ｉ、Ｒ３２６Ｍ、Ｒ３２６Ｃ、Ｒ３２６Ｓ、Ｒ３６２Ｌ、Ｒ３６２Ｐ、Ｒ３６２Ｇ、Ｒ３６２Ｋ、Ｒ３６２Ｗ、Ｒ３６２Ｉ、Ｒ３６２Ｍ、Ｒ３６２Ｃ、Ｒ３６１Ｓ、Ｒ４０３Ｌ、Ｒ４０３Ｐ、Ｒ４０３Ｇ、Ｒ４０３Ｋ、Ｒ４０３Ｗ、Ｒ４０３Ｉ、Ｒ４０３Ｍ、Ｒ４０３Ｃ、Ｒ４０３Ｓ、Ｒ４０５Ｌ、Ｒ４０５Ｐ、Ｒ４０５Ｇ、Ｒ４０５Ｋ、Ｒ４０５Ｗ、Ｒ４０５Ｉ、Ｒ４０５Ｍ、Ｒ４０５Ｃ、Ｒ４０５Ｓ、Ｒ４０９Ｌ、Ｒ４０９Ｐ、Ｒ４０９Ｇ、Ｒ４０９Ｋ、Ｒ４０９Ｗ、Ｒ４０９Ｉ、Ｒ４０９Ｍ、Ｒ４０９Ｃ、Ｒ４０９Ｓ、Ｒ４３６Ｌ、Ｒ４３６Ｐ、Ｒ４３６Ｇ、Ｒ４３６Ｋ、Ｒ４３６Ｗ、Ｒ４３６Ｉ、Ｒ４３６Ｍ、Ｒ４３６Ｃ、Ｒ４３６Ｓ、Ｒ５２６Ｌ、Ｒ５２６Ｐ、Ｒ５２６Ｇ、Ｒ５２６Ｋ、Ｒ５２６Ｗ、Ｒ５２６Ｉ、Ｒ５２６Ｍ、Ｒ５２６Ｃ、Ｒ５２６Ｓ、Ｃ２１１Ｆ、Ｃ２１１Ｓ、Ｃ２１１Ｙ、Ｃ２１１Ｒ、Ｃ２１１Ｇ、Ｃ２１１Ｗ、Ｃ４１１Ｆ、Ｃ４１１Ｓ、Ｃ４１１Ｙ、Ｃ４１１Ｒ、Ｃ４１１Ｇ、Ｃ４１１Ｗ、Ｃ４３８Ｆ、Ｃ４３８Ｓ、Ｃ４３８Ｙ、Ｃ４３８Ｒ、Ｃ４３８Ｇ、Ｃ４３８Ｗ、Ｗ５４１Ｒ、Ｗ５４１Ｓ、Ｗ５４１Ｌ、Ｗ５４１Ｇ、Ｗ６１６Ｒ、Ｗ６１６Ｓ、Ｗ６１６Ｌ、Ｗ６１６Ｇ、Ｌ２２４Ｓ、Ｌ２２４Ｐ、Ｌ２２４Ｗ、Ｌ２２４Ｈ、Ｌ２２４Ｑ、Ｌ２２４Ｒ、Ｌ２２４Ｆ、Ｌ２２４Ｉ、Ｌ２２４Ｍ、Ｌ２２４Ｖ、Ｌ２２４Ｓ、Ｌ２２４Ｐ、Ｌ２２４Ｗ、Ｌ２２４Ｈ、Ｌ２２４Ｑ、Ｌ２２４Ｒ、Ｌ２２４Ｆ、Ｌ２２４Ｉ、Ｌ２２４Ｍ、Ｌ２２４Ｖ、Ｌ２２７Ｓ、Ｌ２２７Ｐ、Ｌ２２７Ｗ、Ｌ２２７Ｈ、Ｌ２２７Ｑ、Ｌ２２７Ｒ、Ｌ２２７Ｆ、Ｌ２２７Ｉ、Ｌ２２７Ｍ、Ｌ２２７Ｖ、Ｌ５６４Ｓ、Ｌ５６４Ｐ、Ｌ５６４Ｗ、Ｌ５６４Ｈ、Ｌ５６４Ｑ、Ｌ５６４Ｒ、Ｌ５６４Ｆ、Ｌ５６４Ｉ、Ｌ５６４Ｍ、Ｌ５６４Ｖ、Ｓ２９０Ｙ、Ｓ２９０Ｃ、Ｓ２９０Ｗ、Ｓ２９０Ｆ、Ｓ２９０Ｐ、Ｓ２９０Ｌ、Ｓ２９０Ｔ、Ｓ２９０Ａ、Ｓ２９０Ｎ、Ｓ３６５Ｙ、Ｓ３６５Ｃ、Ｓ３６５Ｗ、Ｓ３６５Ｆ、Ｓ３６５Ｐ、Ｓ３６５Ｌ、Ｓ３６５Ｔ、Ｓ３６５Ａ、Ｓ３６５Ｎ、Ｓ４７３Ｙ、Ｓ４７３Ｃ、Ｓ４７３Ｗ、Ｓ４７３Ｆ、Ｓ４７３Ｐ、Ｓ４７３Ｌ、Ｓ４７３Ｔ、Ｓ４７３Ａ、Ｓ４７３Ｎ、Ｇ２４１Ｒ、Ｇ２４１Ｓ、Ｇ２４１Ｗ、Ｇ２４１Ｃ、Ｇ２４１Ｄ、Ｇ２４１Ｅ、Ｇ２４１Ａ、Ｇ２４１Ｖ、Ｇ３４７Ｒ、Ｇ３４７Ｓ、Ｇ３４７Ｗ、Ｇ３４７Ｃ、Ｇ３４７Ｄ、Ｇ３４７Ｅ、Ｇ３４７Ａ、Ｇ３４７Ｖ、Ｇ３６１Ｒ、Ｇ３６１Ｓ、Ｇ３６１Ｗ、Ｇ３６１Ｃ、Ｇ３６１Ｄ、Ｇ３６１Ｅ、Ｇ３６１Ａ、Ｇ３６１Ｖをもたらす変異の１つから選択され；
該ｓｉＲＮＡが、該点変異を含有する１５から２５ヌクレオチドのフラグメントを含むヌクレオチド配列を有し；
該ｓｉＲＮＡが、変異タンパク質ＣｌＣ−７の発現を低減し；
正常タンパク質と比較した変異タンパク質ＣｌＣ−７の発現の低減における該ｓｉＲＮＡの有効性の比率が１より大きく；
前記ｓｉＲＮＡの配列が、前記変異したヌクレオチドに加えて、前記変異を含有する前記ｍＲＮＡに対応する標的配列と比較して１〜３個のヌクレオチドミスマッチを含むことを特徴とする、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、その誘導体又は前駆体。
【請求項２】
前記ｓｉＲＮＡの配列が、３’末端に突出した短い配列ｄＴｄＴ又はｄＡｄＴを含むことを特徴とする、請求項１に記載の短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、その誘導体又は前駆体。
【請求項３】
前記誘導体が、１つ又は複数の化学的に改変されたヌクレオチドを含むｓｉＲＮＡであることを特徴とする、請求項１又は２に記載の短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、その誘導体又は前駆体。
【請求項４】
前記誘導体が、２’−アルコキシ誘導体、２’−メトキシ誘導体、２’−エトキシ誘導体、２’−フッ素誘導体、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）誘導体、２’−Ｏ−ベンジル誘導体、２’−Ｏ−メチル−４−ピリジニル誘導体、２’−アミノ誘導体、２’−アミノエチル誘導体、２’−グアニジノプロピル誘導体又はＬＮＡ誘導体を含む群から選択される、請求項３に記載の短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、その誘導体又は前駆体。
【請求項５】
前記ｓｉＲＮＡ又はその誘導体若しくは前駆体が、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、又はポリエチレンイミン−ポリエチレン−グリコール−Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＰＥＩ−ＰＥＧ−ＧＡＬ）複合体、若しくはポリエチレンイミン−ポリエチレングリコール−トリ−Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＰＥＩ−ＰＥＧ−トリＧＡＬ）複合体から選択されるその誘導体と、結合しているか、又は会合しているか、又は複合体化している、請求項１から４までのいずれか一項に記載の短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、その誘導体又は前駆体。
【請求項６】
前記前駆体がｓｈＲＮＡであることを特徴とする、請求項１から５までのいずれか一項に記載の短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、その誘導体又は前駆体。
【請求項７】
配列：
0006795492.tif 000010
から選択され、全ての配列は、３’末端に突出した短いｄＴｄＴ又はｄＡｄＴ配列を任意選択で有する、請求項１から６までのいずれか一項に記載の短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、その誘導体若しくは前駆体。
【請求項８】
治療的処置における使用のための、請求項１から７までのいずれか一項に記載の短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、その誘導体又は前駆体を含む、医薬組成物。
【請求項９】
大理石骨病の治療的処置における使用のための、請求項１から７までのいずれか一項に記載の短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、その誘導体又は前駆体を含む、医薬組成物。
【請求項１０】
前記遺伝子ＣＬＣＮ７の変異によって引き起こされるＡＤＯ２の治療的処置における使用のための、請求項１から７までのいずれか一項に記載の短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、その誘導体又は前駆体を含む、医薬組成物。
【請求項１１】
前記治療的処置が、毎日の投与、又は２、３、４、５、６若しくは７日毎の投与を提供する、請求項８から１０までのいずれか一項に記載の使用のための、医薬組成物。
【請求項１２】
前記治療的処置が、体重１ｋｇ当たり約１ｎｇから体重１ｋｇ当たり約１００ｍｇの単回投与のための投薬量、又は体重１Ｋｇ当たり約１μｇから２０ｍｇの投薬量、又は約１ｍｇ／Ｋｇから約１０ｍｇ／Ｋｇの投薬量を提供する、請求項８から１１までのいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記治療的処置が、静脈内、腹膜内、筋肉内、皮内、皮下、骨内、軟骨内、関節内、経口、頬側での溶解による経口、舌下での溶解による経口、直腸、膣、気管支内投与、又は吸入による投与を提供する、請求項８から１２までのいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記治療的処置が、エレクトロポレーション、超音波誘導ポレーション、カチオン性リポソーム媒介トランスフェクション、マイクロインジェクション、エレクトロパルセーションを介した投与を提供する、請求項８から１３までのいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記治療的処置が、ウイルス若しくは非ウイルスベクターを介した、又は前記ｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡを介した、又は単離された（裸の）ＲＮＡとしての、又は３次元の生体適合性マトリックス若しくはインプラントを介した投与を提供する、請求項８から１４までのいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
前記ｓｉＲＮＡ又はその誘導体若しくは前駆体が、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、又はポリエチレンイミン−ポリエチレングリコール−Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＰＥＩ−ＰＥＧ−ＧＡＬ）複合体、若しくはポリエチレンイミン−ポリエチレングリコール−トリ−Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＰＥＩ−ＰＥＧ−トリＧＡＬ）複合体から選択されるその誘導体と、結合しているか、又は会合しているか、又は複合体化している、請求項８から１５までのいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記治療的処置が、１種又は複数の追加の有効成分を併せた、ｓｉＲＮＡ、その誘導体又は前駆体の投与を提供する、請求項８から１６までのいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記ｓｉＲＮＡが、化学合成及びそれに続く精製によって調製されることを特徴とする、請求項１から７までのいずれか一項に記載のｓｉＲＮＡ、又はその誘導体若しくは前駆体を調製するための方法。
【請求項１９】
活性成分として請求項１から７までのいずれか一項に記載の１つ又は複数の短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、その誘導体又は前駆体、及び薬理学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項２０】
溶液、懸濁液、エマルジョンの形態の、請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
エキソゾーム、リポソーム、小胞、ミセルを含む、請求項１９又は２０に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
追加の有効成分を含む、請求項１９から２１までのいずれか一項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、治療用途を有する「短鎖干渉ＲＮＡ」として公知の分子の分野にある。ｓｉＲＮＡは、極めて特異的な方法で遺伝子発現を低減する能力を有する（１）。これらは、通常実験室で細胞の機能を改変するのに使用される二本鎖ＲＮＡの小さい配列であり、これまで不可能であった分子操作を可能にすることにより細胞生物学に改革をもたらした。
【背景技術】
【０００２】
ＣＬＣＮ７依存性ＡＤＯ２は、１００，０００人の新生児のうち５個体が影響を受ける遺伝学的状態である（２）。ＣＬＣＮ７依存性ＡＤＯ２は、一般的に、十代又は成人の対象で出現するが（３）、幼児期におけるＣＬＣＮ７依存性ＡＤＯ２の様々なケースが公知である（４）。この疾患は、破骨細胞と呼ばれる骨細胞の機能が欠如していることを特徴とし（５）、非常に高密度であるが脆い骨、造血及び感覚運動性の機能障害、骨髄炎並びに歯の問題を呈する。一般的に期待寿命は正常であり、まれではあるが罹患した個体の早期死亡が起こる可能性がある。その代わりに、外科的に低減することが難しい多数の非外傷性骨折、並びに多くの場合重度の衰弱性の血液学的及び神経学的な総体的症状のために、生活の質が著しく損なわれる可能性がある（６）。一般的に認知能力は保たれるが、最も重度のケースでは著しい欠陥が出現する可能性がある（６）。変異の影響を受けた個体の約６６％しか疾患を顕示しないため、ＣＬＣＮ７依存性ＡＤＯ２は、不完全浸透度を特徴とする（７）。ＣＬＣＮ７依存性ＡＤＯ２は、症状の非存在を特徴とする患者から著しく機能が損なわれた患者に至る範囲の極めて変化しやすい重症度を有する（６〜８）。
【０００３】
ＣＬＣＮ７依存性ＡＤＯ２は、２５個のヘキソンを含み、ヒトでは１６番染色体及びマウスでは１７番染色体に局在するＣＬＣＮ７遺伝子（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／ＮＭ＿００１１１４３３１．２）の変異に起因しており、このＣＬＣＮ７遺伝子は、破骨細胞の機能に必須であり（５）、塩素の膜透過輸送に役立つＣｌＣ−７と呼ばれるタンパク質（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｒｏｔｅｉｎ／ＮＰ＿００１１０７８０３．１）をコードする。ＡＤＯ２は、遺伝子が非性染色体中に存在することから常染色体性であり、ホモ二量体タンパク質をコードする遺伝子の点変異であることから優性である。点変異において、タンパク質全体が産生されるが、その機能を改変するアミノ酸の変化を示す。ホモ二量体において、２つの同一なサブユニットがある。各遺伝子の２つのコピーが存在し、ＣＬＣＮ７依存性ＡＤＯ２では２つの遺伝子のうち一方のみが変異体であり（変異しており）、それゆえに、細胞中では、両方のサブユニットが正常なホモ二量体に加えて、１つのサブユニットのみが変異体であるヘテロ二量体、及び両方のサブユニットが変異体であるホモ二量体が形成される。本質的に、罹患した個体では、タンパク質の３分の１しか正確に機能しない。
【０００４】
変異がタンパク質の完全欠如を引き起こしている患者において、この疾患は常染色体劣性大理石骨病と呼ばれており、両方の遺伝子が変異体であるためにより一層重症である（９）。その代わりに遺伝子の一方が変異体ではない場合、疾患を発症させない程十分な正常タンパク質の産生を引き起こす。この状態は、「ハプロサフィシエンシー（ｈａｐｌｏｓｕｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）」として公知である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ｓｉＲＮＡ（短鎖干渉ＲＮＡ）は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の特異的配列に相補的な小さいＲＮＡ配列であり、その分解を誘導する（１）。これまでの研究において、本発明者らは、ＣＬＣＮ７依存性ＡＤＯ２を引き起こすタンパク質の変異した対立遺伝子の発現をサイレンシングするための変異特異的なｓｉＲＮＡの使用を提案した（１０）。一部のｓｉＲＮＡが変異した対立遺伝子の発現をある程度までブロックできることが実証されたものの、変異した対立遺伝子へのその選択性及び変異した対立遺伝子と野生型（ＷＴ）対立遺伝子とを識別する能力は、公然の難題であり続けている。
【０００６】
本発明の目的は、ＣＬＣＮ７依存性ＡＤＯ２疾患の処置に最適化された新規のｓｉＲＮＡを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本出願の発明の主題は、点変異を含むｍＲＮＡの配列に対する相補性が、全体を考慮したとしても、有効で選択的なｓｉＲＮＡ、すなわち、変異タンパク質の発現をサイレンシングすることにおいて有効であるがＷＴタンパク質の発現に対しては不活性なｓｉＲＮＡを得るにはそれ自身十分ではないという本発明者らによってなされた確認に基づく。
【０００８】
それとは逆に、有効性及び選択性の最適な組合せは、ｍＲＮＡへの変異それ自身、変異に隣接している配列の長さ、したがってｓｉＲＮＡ配列中における変異したヌクレオチドの位置、ｍＲＮＡのＷＴ配列と比較した１つ又は複数のヌクレオチドミスマッチの存在又は非存在、及びｓｉＲＮＡ配列における前記ミスマッチの位置など、要するにｓｉＲＮＡの設計からその配列それ自身に至る複数の要因に依存する。
【０００９】
それゆえに、本出願の第１の目的は、変異したヒト遺伝子ＣＬＣＮ７のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）における点変異を含む領域に相補的な短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）及びその誘導体又はその前駆体である。本出願のｓｉＲＮＡの目的は、（ｉ）前記変異が、対応するＣｌＣ−７タンパク質の変異：Ｙ９９Ｃ、Ｄ１４５Ｇ、Ｗ１７９Ｘ、Ｇ２０３Ｄ、Ｌ２１３Ｆ、Ｌ２１３Ｆ、Ｌ２１３Ｆ、Ｇ２１５Ｒ、Ｐ２４９Ｌ、Ｒ２８６Ｗ、Ｒ２８６Ｑ、Ｐ４７０Ｑ、Ｒ４０９Ｗ、Ｌ４９０Ｆ、Ｇ６７７Ｖ、６８８ｄｅｌ、Ｋ６８９Ｅ、Ｒ７６２Ｌ、Ｇ７６５Ｂ、Ｌ７６６Ｐ、Ｒ７６７Ｗ、Ａ７８８Ｄを反映していること；（ｉｉ）ｓｉＲＮＡが、点変異を含む１５から２５ヌクレオチドのフラグメントを含むヌクレオチド配列を有すること；（ｉｉｉ）ｓｉＲＮＡが、変異ＣｌＣ−７タンパク質の発現を選択的に低減すること、及び（ｉｖ）正常タンパク質と比較した変異ＣｌＣ−７タンパク質の発現の低減における本発明のｓｉＲＮＡの有効性の比率が１より大きいことを特徴とする。
【００１０】
任意選択で、本発明の短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の配列は、変異したヌクレオチドに加えて、変異を含有するｍＲＮＡの対応する標的配列と比較して１つ又は複数のヌクレオチドミスマッチを含む。
【００１１】
任意選択で、本発明の短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の配列はまた、ヌクレオチドｄＡ及びｄＴからなる、３’末端に易結合性の（ｓｔｉｃｋｙ）短い配列も含む。
【００１２】
本発明の第２の目的は、治療的処置における、具体的にはＣＬＣＮ７遺伝子の変異によって引き起こされるＡＤＯ２の治療的処置における使用のための、上で示したｓｉＲＮＡによって表される。
【００１３】
本発明の第３の目的は、上で開示されたｓｉＲＮＡを調製するための方法である。
【００１４】
本発明の第４の目的は、活性成分として１つ又は複数のｓｉＲＮＡ、及び薬理学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物によって表される。このような組成物は、好ましくは非経口投与用である。
【００１５】
本発明のさらなる目的は、第２の活性成分も併せた、ＡＤＯ２の治療的処置における使用のための同組成物によって表される。
【００１６】
本発明によるｓｉＲＮＡは、単離された細胞及び動物モデルで設計し試験したところ、変異遺伝子に高度に特異的であることが証明された。これらは、変異遺伝子の転写を９５％まで選択的に消滅させ、ハプロサフィシエンシーと類似した状況を作り出すことにより、破骨細胞の機能を回復させて疾患の症状を軽減する。
【００１７】
本発明のｓｉＲＮＡはさらに、いかなるトランスフェクション剤も必要とせずに単なるインキュベーションによって破骨細胞中に内在化させること、及び細胞中に長時間残存することというさらなる利点をもたらす。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｈｏＩによってｐＥＧＦＰ−Ｃ１発現ベクターにおけるヒトＣＬＣＮ７のｃＤＮＡの完全配列をクローニングすることにより得られたＷＴ−ＣＬＣＮ７コンストラクトのスキームを示す図である。
【図２】直接のＤＮＡ配列決定によってチェックされたコンストラクトの配列を示す図である。標準配列は上の列で報告され、変異したヌクレオチドはその下の列に示される。各配列の前と後の数値は、ヒトＣＬＣＮ７遺伝子のｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡの同じ内部の位置を示す（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／ＮＭ＿００１１１４３３１．２）。
【図３】ＨＥＫ２９３細胞を、空のベクターで、又はＷＴ−、ｐ．Ｒ７６７Ｗ−、ｐ．Ｇ２１５Ｒ−、ｐ．Ｒ２８６Ｗ−及びｐ．Ａ７８８Ｄ−ＥＧＦＰベクターでトランスフェクトしたことを示す図である。ＣＬＣＮ７の相対的な発現をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって定量化した。平均±ｓ．ｅ．は、ＧＡＰＤＨについて正規化し、空のＥＧＦＰプラスミドでトランスフェクトされた細胞に対して、＊ｐ＜０．０００００１であった（スチューデントのｔ検定）。
【図４】ＨＥＫ２９３細胞を、ＷＴ−ＥＧＦＰ、ｐ．Ｒ７６７Ｗ−ＥＧＦＰ及びｐ．Ｇ２１５Ｒ−ＥＧＦＰコンストラクトを有するベクターでトランスフェクトし、次いで蛍光融合タンパク質ＥＧＦＰの発現及び局在化を、ゴルジ装置マーカー（ガンマ−アダプチン）、初期エンドソーム（ＥＥＡ１）、酸性小胞（Ｌｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄ）及びリソソーム（ｌａｍｐ−１）の発現と共に共焦点顕微鏡法によって検出したことを示す図である。融合タンパク質ＥＧＦＰと示されたマーカーとの共局在化は、「統合」パネルに示される。対物レンズの倍率＝６３×。変異ｐ．Ａ７８８Ｄ及びｐ．Ｒ２８６Ｗについても類似の結果が得られた（示されていない）。
【図５】ＲＡＷ２６４．７細胞を、空のＥＧＦＰベクター又はｐ．Ｒ７６７Ｗ−ＥＧＦＰベクターでトランスフェクトし、１００ｎｇ／ｍｌのＲＡＮＫＬで処置することによりウシの骨切片上で破骨細胞に分化させたことを示す図である。次いで切片を超音波処理して、細胞を除去し、０．１％トルイジンブルーで染色した後に吸収窩（ピット）の形成に関して評価した（ピットインデックス）。平均±ｓ．ｅ．、空のＥＧＦＰベクターでトランスフェクトした細胞に対して、＊ｐ＜０．０５（スチューデントのｔ検定）。
【図６】ヒト破骨細胞を、２０ｎｇ／ｍｌのＭ−ＣＳＦ及び３０ｎｇ／ｍｌのＲＡＮＫＬと１４日間インキュベートすることによって、健康なドナーの末梢血単核細胞から分化させたことを示す図である。細胞を、ＡＭＡＸＡ方法によってＷＴ−ＥＧＦＰベクターでトランスフェクトした。２日後、ＥＧＦＰ融合タンパク質の蛍光を共焦点顕微鏡法によって検出した。ゴルジ装置（ガンマ−アダプチン）、初期エンドソーム（ＥＥＡ−１）、酸性小胞（Ｌｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄ）及びリソソーム（ｌａｍｐ−１）に関して示されたマーカーとの適正な共局在化は、「統合」パネルに示される。対物レンズの倍率＝６３×。
【図７】ＨＥＫ２９３細胞を、ＷＴベクター又はＣＬＣＮ７遺伝子の変異ｐ．Ｒ７６７Ｗを有するベクターでトランスフェクトし、対照のスクランブル化ｓｉＲＮＡ又は増加する濃度のｐ．Ｒ７６７Ｗ１  ｓｉＲＮＡで４８時間処置したことを示す図である。インキュベーションの最後に、ＲＮＡを抽出し、ＣＬＣＮ７転写の発現をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって評価した。平均±ｓ．ｅ．は、ＧＡＰＤＨについて正規化し、スクランブル化ｓｉＲＮＡでの処置（Ｘ軸上のポイント０）に対するパーセンテージとして示した。ｐ．Ｒ７６７Ｗ−及びＷＴ−ＥＧＦＰでトランスフェクトされ、対照（ＳＣＲ、スクランブル化）ｓｉＲＮＡで処置された細胞に対して、＊ｐ＜０．０５（スチューデントのｔ検定）。
【図８】ＲＡＷ２６４．７細胞を、空のベクターで、又はＷＴ−若しくはｐ．Ｒ７６７Ｗ−ＥＧＦＰベクターでトランスフェクトし、ウシの骨切片上で破骨細胞に分化させ、対照（ＳＣＲ）ｓｉＲＮＡ、又は変異ｐ．Ｒ７６７Ｗを有する転写に特異的なｓｉＲＮＡ（ｐ．Ｒ７６７Ｗ１  ＲＮＡ）で処置したことを示す図である。骨吸収の定量化は、変異コンストラクトによって低減した骨吸収を改善するｐ．Ｒ７６７Ｗ１  ｓｉＲＮＡの能力（黒色のバーと薄灰色のバーとの比較）を示す。その代わりに、ＷＴ−ＥＧＦＰベクターでトランスフェクトされた細胞では、ｐ．Ｒ７６７Ｗ１  ｓｉＲＮＡは骨吸収を有意に改変しなかった（白色のバーと暗い灰色のバーとの比較）。平均±ｓ．ｅ．、空のＥＧＦＰベクターでトランスフェクトされた細胞に対して、＊ｐ＜０．０５（スチューデントのｔ検定）。
【図９】ＷＴ−及びｐ．Ｒ７６７Ｗ−ＥＧＦＰベクターでトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞を、対照のスクランブル化ｓｉＲＮＡ又は図に示された増加する濃度のｐ．Ｒ７６７ＷのｓｉＲＮＡ（表２中の配列）で処置し、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによってＣＬＣＮ７転写発現について評価したことを示す図である。ｐ．Ｒ７６７Ｗ  ｓｉＲＮＡ  ２Ｃは、他のｐ．Ｒ７６７Ｗ  ｓｉＲＮＡと比較してより大きい有効性及び特異性を示した。平均±ｓ．ｅ．は、ＧＡＰＤＨについて正規化し、スクランブル化ｓｉＲＮＡでの処置（Ｘ軸上のポイント０）に対するパーセンテージとして示した。ｐ．Ｒ７６７Ｗ−ＥＧＦＰでトランスフェクトされ、対照（ＳＣＲ、スクランブル化）ｓｉＲＮＡで処置された細胞に対して、＊ｐ＜０．０５。ＷＴ−ＥＧＦＰベクターでトランスフェクトされ、対照（ＳＣＲ）ｓｉＲＮＡで処置された細胞に対して、＃ｐ＜０．０５（スチューデントのｔ検定）。
【図１０】図１０Ａは、ヒト破骨細胞を、健康なドナーの末梢血単核細胞から分化させ、３００ｎＭのＣｙ３−ＣＬＣＮ７  ＷＴ  ｓｉＲＮＡと４８時間インキュベートしたことを示す図であることを示す図である。次いで細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、破骨細胞内部のＣｙ３蛍光を共焦点顕微鏡法によって検出した。対物レンズの倍率＝６３×。          図１０Ｂ、図１０Ｃは、ヒト破骨細胞を、空のベクターで、又はｐ．Ｒ７６７Ｗ−ＥＧＦＰベクターでトランスフェクトしたことを示す図である。ｐ．Ｒ７６７Ｗ−ＥＧＦＰベクターでトランスフェクトされた破骨細胞を、対照（ＳＣＲ）ｓｉＲＮＡ又はｐ．Ｒ７６７Ｗ  ｓｉＲＮＡ  ２Ｃ（表２）で示された濃度で４８時間処置した。４８時間後、ＥＧＦＰ転写の発現（Ｂ）をＧＡＰＤＨについて正規化し、（Ｃ）それぞれリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ及びピットアッセイによって骨吸収を分析した。平均±ｓ．ｅ．、ｐ．Ｒ７６７Ｗ−ＥＧＦＰでトランスフェクトされ、対照（ＳＣＲ）ｓｉＲＮＡで処置された破骨細胞に対して、＃ｐ＜０．００５。空のＥＧＦＰベクターでトランスフェクトされた破骨細胞に対して、＊ｐ＜０．０５（スチューデントのｔ検定）。
【図１１】ヒト破骨細胞を、健康なドナーの末梢血単核細胞から分化させ、図に示されたＷＴ  ｓｉＲＮＡ又はｐ．Ｒ７６７Ｗ  ｓｉＲＮＡ  ２Ｃの濃度で４８時間処置したことを示す図である。ＲＮＡを抽出して、ＲＴ−ＰＣＲに供した。正常なＣＬＣＮ７転写の発現に対するｐ．Ｒ７６７Ｗ  ｓｉＲＮＡ  ２Ｃの作用（ＧＡＰＤＨについて正規化）がないことに留意されたい。
【図１２】ヒト破骨細胞を、健康なドナーの末梢血単核細胞から分化させ、骨切片上で平板培養し、インキュベートし、スクランブル化ｓｉＲＮＡ又は示された濃度のｐ．Ｒ７６７Ｗ  ｓｉＲＮＡ  ２Ｃで４８時間処置したことを示す図である。次いで骨吸収をピットアッセイによって定量化した。平均±ｓ．ｅ．を、スクランブル化ｓｉＲＮＡでの処置（Ｘ軸上のポイント０）に対するパーセンテージとして示した。ｐ．Ｒ７６７Ｗ  ｓｉＲＮＡ  ２Ｃでの処置により吸収窩の形成において統計学的に有意な作用がないことに留意されたい（スチューデントのｔ検定）。
【図１３】（Ａ）ＨＥＫ２９３細胞及び（Ｂ）初代ヒト破骨細胞を、ＷＴ−又はｐ．Ｇ２１５Ｒ−ＥＧＦＰベクターでトランスフェクトし、１００ｎＭの対照（ＳＣＲ、スクランブル化）ｓｉＲＮＡ、又はｐ．Ｇ２１５Ｒ−ＥＧＦＰ（ｐ．Ｇ２１５Ｒ）特異的ｓｉＲＮＡで４８時間処置したことを示す図である。ＣＬＣＮ７  ｍＲＮＡ発現を、ＨＥＫ２３９細胞の場合はＣＬＣＮ７（これは、内因性遺伝子ＣＬＣＮ７を発現しない）、及びヒト破骨細胞の場合はＥＧＦＰ（変異した外因性ＣＬＣＮ７遺伝子を正常な内因性のものと区別するため）に特異的なプライマーを使用したリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって、評価した。平均±ｓ．ｅ．をＧＡＰＤＨで正規化した（スチューデントのｔ検定）。
【図１４】初代破骨細胞を、ＷＴ−及びｐ．Ｇ２１３Ｒ−ｃｌｃｎ７  ＡＤＯ２（ｐ．Ｇ２１３Ｒ  ＫＩ）マウスの骨髄の単核細胞から、５０ｎｇ／ｍｌのＭ−ＣＳＦ及び１２０ｎｇ／ｍｌのＲＡＮＫＬとのインキュベーションによって生成し、これを骨切片上で平板培養し、対照（ＳＣＲ）ｓｉＲＮＡ、又はｐ．Ｇ２１３Ｒ−ｃｌｃｎ７（ｐ．Ｇ２１３Ｒ）特異的ｓｉＲＮＡで１００ｎＭの濃度で７日間処置したことを示す図である。インキュベーションの最後に、細胞を超音波処理によって除去し、切片を０．１％トルイジンブルーで染色し、骨吸収をピットアッセイによって評価した。平均±ｓ．ｅ．、ＷＴに対して、＊ｐ＝０．０００１、ｐ．Ｇ２１３Ｒ  ＫＩに対して、＃ｐ＝０．００３（スチューデントのｔ検定）。
【図１５】１月齢のＣＤ１マウスを、ＴｒａｎｓＩＴ−ＱＲハイドロダイナミックデリバリーキットによって、対照のスクランブル化ｓｉＲＮＡ又は体重１Ｋｇ当たり２ｍｇのｃｌｃｎ７−ｓｉＲＮＡで処置したことを示す図である。２４及び４８時間後、動物を屠殺し、腎臓、脳、肝臓、肺、心臓、脾臓及び脛骨からＲＮＡを抽出した。ｃｌｃｎ７遺伝子の転写レベルをリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって分析し、ＧＡＰＤＨについて正規化し、スクランブル化ｓｉＲＮＡでの処置（Ｘ軸上のポイント０）に対するパーセンテージとして示した。
【図１６】図１６Ａは、ｐ．Ｇ２１３Ｒ  ｍＲＮＡに特異的なプライマー（Ｆｗ：ＣＡＡＧＴＧＣＴＴＣＣＴＣＡＡＴＧ（配列番号３２）；Ｒｖ：ＧＣＣＣＴＣＴＴＣＣＡＡＧＣＴＡＡＡ（配列番号３３）を使用したＲＴ−ＰＣＲによれば、ヘテロ接合型及びホモ接合型ｐ．Ｇ２１３Ｒ  ＫＩマウスの初代破骨細胞でのみ転写物の増幅が示されるが、野生型（ＷＴ）破骨細胞では転写物の増幅はみられないことを示す図である。          図１６Ｂは、図（Ａ）に示されるヘテロ接合型ｐ．Ｇ２１３Ｒ／ＷＴ破骨細胞における増幅された転写物の直接のＤＮＡ配列決定を示す図であり、変異配列のみを示す。
【図１７】ＷＴ及びｐ．Ｇ２１３Ｒ  ＫＩマウスの骨髄の単核細胞から生成した破骨細胞を、示された濃度の対照（ＳＣＲ）ｓｉＲＮＡ又はｐ．Ｇ２１３Ｒ−ｃｌｃｎ７特異的ｓｉＲＮＡで処置したことを示す図である。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを、図１４に示された変異した転写物に特異的なプライマーを使用して実行した。平均±ｓ．ｅ．（スチューデントのｔ検定）
【図１８】３月齢のｐ．Ｇ２１３Ｒ  ＫＩマウスに４ｍｇ／ｋｇのｐ．Ｇ２１３Ｒ−ｃｌｃｎ７易結合性ｓｉＲＮＡ／ｊｅｔＰＥＩ（登録商標）（コンジュゲート）を腹膜内（ｉ．ｐ．）注射し、示されたタイムポイントで屠殺したことを示す図である。血清を収集し、Ｎａｎｏｄｒｏｐにより全ＲＮＡレベルに関して評価した。平均±ｓ．ｅ．（ＡＮＯＶＡ）。
【図１９】１０日齢のｐ．Ｇ２１３Ｒ  ＫＩマウスに、４ｍｇ／ｋｇのｐ．Ｇ２１３Ｒ−ｃｌｃｎ７易結合性ｓｉＲＮＡ／ｊｅｔＰＥＩ（登録商標）コンジュゲートを、４週間にわたり週３回ｉ．ｐ．注射したことを示す図である。実験の最後に、マウスを屠殺し、ＲＮＡを図に示された臓器から抽出し、図１４に示された変異体転写物に特異的なプライマーを使用したＲＴ−ＰＣＲに供し、ｇａｄｐｈで正規化した。平均±ｓ．ｅ．（スチューデントのｔ検定）
【図２０】ｐ．Ｇ２１３Ｒ  ＡＤＯ２マウスに、対照（ＳＣＲ、スクランブル化）ｓｉＲＮＡ又はｐ．Ｇ２１３Ｒ−ｃｌｃｎ７易結合性ｓｉＲＮＡ／ｊｅｔＰＥＩ（ｐ．Ｇ２１３Ｒ）をＸ軸に示された用量でｉ．ｐ．注射したことを示す図である。４８時間後、脛骨を収集し、ＲＮＡを抽出し、ｐ．Ｇ２１３Ｒ−ｃｌｃｎ７変異ｍＲＮＡのレベルを、図１４に示された変異配列に特異的なプライマー対を使用したリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって評価した。平均±ｓ．ｅ．は、ＧＡＰＤＨについて正規化した。
【図２１】ｐ．Ｇ２１３Ｒ  ＫＩマウスに、４ｍｇ／ｋｇのＳＲＣ−ｓｉＲＮＡ又はｐ．Ｇ２１３Ｒ−ｃｌｃｎ７易結合性ｓｉＲＮＡ／ｊｅｔＰＥＩを、４週間にわたり週３回ｉ．ｐ．注射したことを示す図である。実験の最後に、マウスを屠殺し、ヘマトキシリン／エオシン染色によって図に示された臓器の組織病理学的な評価に供した（バーは、脾臓及び腎臓の場合は１００μｍであり、肝臓の場合は２０μｍである）。
【図２２】血清を、図２０で説明したマウスから収集し、Ｒｅｆｌｏｔｏｎ方法によって、腎臓（尿酸）及び肝臓［グルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ（ＧＯＴ）］機能のバイオマーカーに関して、さらにＡＤＯ２バイオマーカーであるクレアチンキナーゼ（ＣＫ）に関して分析したことを示す図である。正常値は、点線の間に含まれる。平均±ｓ．ｅ．（スチューデントのｔ検定）。
【図２３】ＷＴ及びｐ．Ｇ２１３Ｒ  ＫＩマウスに、４ｍｇ／ｋｇのＳＲＣ−ｓｉＲＮＡ又はｐ．Ｇ２１３Ｒ−ｃｌｃｎ７易結合性ｓｉＲＮＡ／ｊｅｔＰＥＩを、２及び４週間にわたり週３回ｉ．ｐ．注射したことを示す図である。実験の最後に、マウスを屠殺し、破骨細胞（ＴＲＡｃＰ酵素のアイソフォーム５ｂ）及び骨吸収（ＣＴＸ）バイオマーカーのレベルを評価するために、及びＣＴＸ／ＴＲＡｃＰ比率を計算するために血清を収集した。
【図２４】図２２に示された２週間処置されたマウスの骨表現型の分析を示す図である。          図２４Ａは、脛骨の近位領域のμＣＴ分析の図である。          図２４Ｂは、総組織体積に対する小柱骨の体積（ＢＶ／ＴＶ）の図である。          図２４Ｃは、小柱骨の数（Ｔｈ．Ｎ）の図である。          図２４Ｅは、小柱骨の厚さ（Ｔｂ．Ｔｈ）の図である。          図２４Ｆは、小柱骨の分離（Ｔｂ．Ｓｐ）の図である。グループ１つ当たりマウス４〜７匹の平均±ｓ．ｄ．（スチューデントのｔ検定）。
【図２５】１０日齢のＷＴ及びｐ．Ｇ２１３ｒ  ＫＩマウスに、４ｍｇ／ｋｇのＳＲＣ−ｓｉＲＮＡ又はｐ．Ｇ２１３Ｒ−ｃｌｃｎ７易結合性ｓｉＲＮＡ／ｊｅｔＰＥＩを、４週間にわたり週３回ｉ．ｐ．注射したことを示す図である。実験の最後に、マウスを屠殺し、それらの骨表現型を分析した。          図２５Ａは、脛骨の近位領域のμＣＴの図である。          図２５Ｂは、総組織体積に対する小柱骨の体積（ＢＶ／ＴＶ）の図である。          図２５Ｃは、小柱骨の数（Ｔｂ．Ｎ）の図である。          図２５Ｄは、小柱骨の厚さ（Ｔｂ．Ｔｈ）の図である。          図２５Ｅは、小柱骨の分離（Ｔｂ．Ｓｐ）の図である。          図２５Ｆは、副甲状線ホルモン（ＰＴＨ）の血清濃度の図である。
【図２６】図２４で説明したマウスの破骨細胞表現型の分析を示す図である。          図２６Ａは、破骨細胞（紫色の細胞）を強調するための組織化学的なＴＲＡｃＰ酵素染色の図である。バー＝１００μｍ。          図２６Ｂは、骨面に対する破骨細胞面（Ｏｃ．Ｓ／ＢＳ）の図である。          図２６Ｃは、骨周囲長に対する破骨細胞の数（Ｏｃ．Ｎ／Ｂ  Ｐｍ）の図である。          図２６Ｄは、大腿骨から抽出されたＲＮＡでのリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによる、ｇａｐｄｈで正規化した破骨細胞［Ｔｒａｃｐ及びカテプシンＫ（ＣａｔＫ）］及び骨芽細胞［アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）及びＲｕｎｔ関連転写因子２（Ｒｕｎｘ２）］遺伝子の転写発現の図である。          図２６Ｅは、総骨面に対する破骨細胞侵食面（ＥＳ／ＢＳ）の図である。平均±ｓ．ｄ．（スチューデントのｔ検定）。
【図２７】図２４で説明したマウスにおける皮質、軟骨性及び骨芽細胞パラメーターの分析を示す図である。          図２７Ａは、皮質骨の厚さ（Ｃｏｒ．Ｔｈ）の図である。          図２７Ｂは、成長板の厚さ（幅）の図である。          図２７Ｃは、骨面に対する骨芽細胞面（Ｏｂ．Ｓ／ＢＳ）の図である。          図２７Ｄは、類骨の組織学的な画像（矢印）の図である。バー＝５μｍ。          図２７Ｅは、骨量に対する類骨量（ＯＶ／ＢＶ）の図である。          図２７Ｆは、無機物堆積のカルセインの標識付け（緑色蛍光）（二重の矢印）の図である。バー＝２μｍ。          図２７Ｇは、骨石灰化速度（ｍｉｎｅｒａｌ  ａｐｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｒａｔｅ）（ＭＡＲ）の図である。          図２７Ｈは、骨面に対する石灰化面（ＭＳ／ＢＳ）の図である。          図２７Ｉは、骨形成速度（ＢＦＲ）の図である。
【図２８】図２５で説明したマウスにおける圧入による骨の品質の分析を示す図である。          図２８Ａは、圧入の総距離（ＴＩＤ）の図である。          図２８Ｂは、第１のサイクルの圧入の距離（ＩＤ）の図である。          図２８Ｃは、接地距離（ＴＤＤ）。グループ１つ当たりマウス３〜７匹の平均±ｓ．ｄ．（スチューデントのｔ検定）の図である。
【図２９】ヒト破骨細胞を、図に示された発現ベクターでトランスフェクトし、Ｘ軸に示された（Ａ）ｐ．Ｇ２１３Ｒ−、（Ｂ）ｐ．Ｒ７６７Ｒ−及び（Ｃ）ｐ．Ｒ２８６Ｗ−ＥＧＦＰ特異的ｓｉＲＮＡの濃度で４８時間処置したことを示す図である。ＥＧＦＰに特異的なプライマーを使用したリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを、ＧＡＰＤＨについて正規化した。（Ｄ）破骨細胞をｐ．Ｇ２１５Ｒ変異を有するＡＤＯ２患者の血中単核細胞から生成し、ウシの骨切片上で培養し、示された濃度のＳＣＲ−ｓｉＲＮＡ及びｐ．Ｇ２１５Ｒ−ｓｉＲＮＡで処置した。実験の最後に、細胞を超音波処理によって除去し、吸収窩を測定することによって骨吸収を評価した。複製なしの単一の実験の結果。
【図３０】図３０Ａは、ヒト乳がん細胞ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＭＤＡ）を、ＷＴ−又はｐ．Ｒ７６７Ｗ−ＥＧＦＰベクターでトランスフェクトし、対照のスクランブル化ｓｉＲＮＡ又はｐ．Ｒ７６７Ｗ  ｓｉＲＮＡ  ２ＣでＸ軸に示された濃度で４８時間処置したことを示す図である。グラフは、ＧＡＰＤＨについて正規化されたＥＧＦＰに特異的なプライマー対を使用して実行されたリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって分析した、トランスフェクトされたＣＬＣＮ７遺伝子にコンジュゲートしたＥＧＦＰの発現の結果を示す。平均±ｓ．ｅ．を、スクランブル化ｓｉＲＮＡでの処置（Ｘ軸上のポイント０）に対するパーセンテージとして示した。ｐ＝０．０２（統計的検定：曲線下の面積）。          図３０Ｂは、ヒト乳がん細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１の皮下注射によって異種腫瘍（ｘｅｎｏｔｕｍｏｒ）を得て、これを、Ｂａｌｂ／ｃ  ｎｕ／ｎｕ無胸腺（免疫無防備状態）マウスの体側で、ｐ．Ｒ７６７Ｗ−ＥＧＦＰベクターでトランスフェクトした図である。腫瘍が１ｃｍ３の体積に達したら、マウスを、媒体（ｊｅｔＰＥＩ）、又は体重１Ｋｇ当たり４ｍｇの、対照（ＳＣＲ、スクランブル化）ｓｉＲＮＡ、ＷＴ−ｓｉＲＮＡ若しくはｊｅｔＰＥＩと複合体化したＲ７６７Ｗ  ｓｉＲＮＡ  ２Ｃで一度、９６時間処置した。次いでリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを、ＥＧＦＰに特異的なプライマー対を使用して腫瘍から抽出されたＲＮＡに実行した。平均±ｓ．ｅ．は、ＧＡＰＤＨについて正規化した。ｐ＝０．０２（スチューデントのｔ検定）。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
ヒトＣＬＣＮ７遺伝子のｍＲＮＡは変異を含む可能性があることが公知であり、ＡＤＯ２において病原性の変異は、表１に示される変異タンパク質を生成する。
【表１】
0006795492.tif 000002
【００２０】
ＣｌＣ−７タンパク質由来の可能性のある変異及びそれと同数の本発明によるｓｉＲＮＡをもたらす可能性があるＣＬＣＮ７遺伝子の他の可能性のある変異は、以下に挙げるものである：Ｒ２２３Ｌ、Ｒ２２３Ｐ、Ｒ２２３Ｇ、Ｒ２２３Ｋ、Ｒ２２３Ｗ、Ｒ２２３Ｉ、Ｒ２２３Ｍ、Ｒ２２３Ｃ、Ｒ２２３Ｓ、Ｒ２６５Ｌ、Ｒ２６５Ｐ、Ｒ２６５Ｇ、Ｒ２６５Ｋ、Ｒ２６５Ｗ、Ｒ２６５Ｉ、Ｒ２６５Ｍ、Ｒ２６５Ｃ、Ｒ２６５Ｓ、Ｒ２７１Ｌ、Ｒ２７１Ｐ、Ｒ２７１Ｇ、Ｒ２７１Ｋ、Ｒ２７１Ｗ、Ｒ２７１Ｉ、Ｒ２７１Ｍ、Ｒ２７１Ｃ、Ｒ２７１Ｓ、Ｒ２８０Ｌ、Ｒ２８０Ｐ、Ｒ２８０Ｇ、Ｒ２８０Ｋ、Ｒ２８０Ｗ、Ｒ２８０Ｉ、Ｒ２８０Ｍ、Ｒ２８０Ｃ、Ｒ２８０Ｓ、Ｒ２８１Ｌ、Ｒ２８１Ｐ、Ｒ２８１Ｇ、Ｒ２８１Ｋ、Ｒ２８１Ｗ、Ｒ２８１Ｉ、Ｒ２８１Ｍ、Ｒ２８１Ｃ、Ｒ２８１Ｓ、Ｒ２８６Ｌ、Ｒ２８６Ｐ、Ｒ２８６Ｇ、Ｒ２８６Ｋ、Ｒ２８６Ｉ、Ｒ２８６Ｍ、Ｒ２８６Ｃ、Ｒ２８６Ｓ、Ｒ３２６Ｌ、Ｒ３２６Ｐ、Ｒ３２６Ｇ、Ｒ３２６Ｋ、Ｒ３２６Ｗ、Ｒ３２６Ｉ、Ｒ３２６Ｍ、Ｒ３２６Ｃ、Ｒ３２６Ｓ、Ｒ３６２Ｌ、Ｒ３６２Ｐ、Ｒ３６２Ｇ、Ｒ３６２Ｋ、Ｒ３６２Ｗ、Ｒ３６２Ｉ、Ｒ３６２Ｍ、Ｒ３６２Ｃ、Ｒ３６１Ｓ、Ｒ４０３Ｌ、Ｒ４０３Ｐ、Ｒ４０３Ｇ、Ｒ４０３Ｋ、Ｒ４０３Ｗ、Ｒ４０３Ｉ、Ｒ４０３Ｍ、Ｒ４０３Ｃ、Ｒ４０３Ｓ、Ｒ４０５Ｌ、Ｒ４０５Ｐ、Ｒ４０５Ｇ、Ｒ４０５Ｋ、Ｒ４０５Ｗ、Ｒ４０５Ｉ、Ｒ４０５Ｍ、Ｒ４０５Ｃ、Ｒ４０５Ｓ、Ｒ４０９Ｌ、Ｒ４０９Ｐ、Ｒ４０９Ｇ、Ｒ４０９Ｋ、Ｒ４０９Ｗ、Ｒ４０９Ｉ、Ｒ４０９Ｍ、Ｒ４０９Ｃ、Ｒ４０９Ｓ、Ｒ４３６Ｌ、Ｒ４３６Ｐ、Ｒ４３６Ｇ、Ｒ４３６Ｋ、Ｒ４３６Ｗ、Ｒ４３６Ｉ、Ｒ４３６Ｍ、Ｒ４３６Ｃ、Ｒ４３６Ｓ、Ｒ５２６Ｌ、Ｒ５２６Ｐ、Ｒ５２６Ｇ、Ｒ５２６Ｋ、Ｒ５２６Ｗ、Ｒ５２６Ｉ、Ｒ５２６Ｍ、Ｒ５２６Ｃ、Ｒ５２６Ｓ、Ｃ２１１Ｆ、Ｃ２１１Ｓ、Ｃ２１１Ｙ、Ｃ２１１Ｒ、Ｃ２１１Ｇ、Ｃ２１１Ｗ、Ｃ４１１Ｆ、Ｃ４１１Ｓ、Ｃ４１１Ｙ、Ｃ４１１Ｒ、Ｃ４１１Ｇ、Ｃ４１１Ｗ、Ｃ４３８Ｆ、Ｃ４３８Ｓ、Ｃ４３８Ｙ、Ｃ４３８Ｒ、Ｃ４３８Ｇ、Ｃ４３８Ｗ、Ｗ５４１Ｒ、Ｗ５４１Ｓ、Ｗ５４１Ｌ、Ｗ５４１Ｇ、Ｗ６１６Ｒ、Ｗ６１６Ｓ、Ｗ６１６Ｌ、Ｗ６１６Ｇ、Ｌ２２４Ｓ、Ｌ２２４Ｐ、Ｌ２２４Ｗ、Ｌ２２４Ｈ、Ｌ２２４Ｑ、Ｌ２２４Ｒ、Ｌ２２４Ｆ、Ｌ２２４Ｉ、Ｌ２２４Ｍ、Ｌ２２４Ｖ、Ｌ２２４Ｓ、Ｌ２２４Ｐ、Ｌ２２４Ｗ、Ｌ２２４Ｈ、Ｌ２２４Ｑ、Ｌ２２４Ｒ、Ｌ２２４Ｆ、Ｌ２２４Ｉ、Ｌ２２４Ｍ、Ｌ２２４Ｖ、Ｌ２２７Ｓ、Ｌ２２７Ｐ、Ｌ２２７Ｗ、Ｌ２２７Ｈ、Ｌ２２７Ｑ、Ｌ２２７Ｒ、Ｌ２２７Ｆ、Ｌ２２７Ｉ、Ｌ２２７Ｍ、Ｌ２２７Ｖ、Ｌ５６４Ｓ、Ｌ５６４Ｐ、Ｌ５６４Ｗ、Ｌ５６４Ｈ、Ｌ５６４Ｑ、Ｌ５６４Ｒ、Ｌ５６４Ｆ、Ｌ５６４Ｉ、Ｌ５６４Ｍ、Ｌ５６４Ｖ、Ｓ２９０Ｙ、Ｓ２９０Ｃ、Ｓ２９０Ｗ、Ｓ２９０Ｆ、Ｓ２９０Ｐ、Ｓ２９０Ｌ、Ｓ２９０Ｔ、Ｓ２９０Ａ、Ｓ２９０Ｎ、Ｓ３６５Ｙ、Ｓ３６５Ｃ、Ｓ３６５Ｗ、Ｓ３６５Ｆ、Ｓ３６５Ｐ、Ｓ３６５Ｌ、Ｓ３６５Ｔ、Ｓ３６５Ａ、Ｓ３６５Ｎ、Ｓ４７３Ｙ、Ｓ４７３Ｃ、Ｓ４７３Ｗ、Ｓ４７３Ｆ、Ｓ４７３Ｐ、Ｓ４７３Ｌ、Ｓ４７３Ｔ、Ｓ４７３Ａ、Ｓ４７３Ｎ、Ｇ２４１Ｒ、Ｇ２４１Ｓ、Ｇ２４１Ｗ、Ｇ２４１Ｃ、Ｇ２４１Ｄ、Ｇ２４１Ｅ、Ｇ２４１Ａ、Ｇ２４１Ｖ、Ｇ３４７Ｒ、Ｇ３４７Ｓ、Ｇ３４７Ｗ、Ｇ３４７Ｃ、Ｇ３４７Ｄ、Ｇ３４７Ｅ、Ｇ３４７Ａ、Ｇ３４７Ｖ、Ｇ３６１Ｒ、Ｇ３６１Ｓ、Ｇ３６１Ｗ、Ｇ３６１Ｃ、Ｇ３６１Ｄ、Ｇ３６１Ｅ、Ｇ３６１Ａ、Ｇ３６１Ｖ
【００２１】
ｓｉＲＮＡ
ヒトＣＬＣＮ７遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）における点変異を含む領域に相補的な短鎖干渉ＲＮＡを、表１に報告されたＡＤＯ２に対して病原性であることが公知の全ての遺伝子変異毎に設計して生産した。
【００２２】
本発明の短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、二本鎖（二重鎖）配列であり、そのうち第１の鎖は「ガイド」（又はアンチセンス）と呼ばれ、第２の鎖は「パッセンジャー」（又はセンス）と呼ばれる。ガイド鎖（アンチセンス）は、阻害、サイレンシング又は分解される標的ＲＮＡに相補的な鎖である。
【００２３】
パッセンジャー鎖の配列はガイド鎖に相補的であるため、本出願に示された本発明の全てのｓｉＲＮＡについてガイド鎖の配列のみを報告する。本発明のｓｉＲＮＡは、点変異を含有する１５から２９ヌクレオチド、例えば１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３又は２４、２５、２６、２７又は２８ヌクレオチドを含むフラグメントを含むか又はそこに存在する配列を有する。
【００２４】
本発明のｓｉＲＮＡは、ＣＬＣＮ７遺伝子の変異した対立遺伝子の形態から転写されたｍＲＮＡに選択的に結合して、変異タンパク質ＣｌＣ−７の発現を低減又は抑制するその能力に関して選択される。変異遺伝子のサイレンシングのその選択性のために、発現の低減におけるその有効性は、正常タンパク質より変異タンパク質の場合に大きい。それゆえに、本発明のｓｉＲＮＡは、１より大きい変異ＣｌＣ−７／正常ＣｌＣ−７の有効性の比率を示す。
【００２５】
変異ｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡの選択性及び／又は特異性をさらに強化するために、ｓｉＲＮＡ配列は、前記変異ＲＮＡ配列に非相補的な（ミスマッチの）１つ又は複数のヌクレオチドを含み得る。この戦略を用いて、新規のｓｉＲＮＡを設計した（表２）。様々なｓｉＲＮＡが、Ｗ．Ｔ．ｍＲＮＡと比較して、変異ｍＲＮＡに対してより有意に大きい特異性を示した。それらのうち１つ（ｐ．Ｒ７６７Ｗ  ｓｉＲＮＡ  ２Ｃと呼ばれる）を用いて、ＷＴ  ｍＲＮＡをまったく低減させずに変異ｍＲＮＡの９０％低減の有効性が達成された（図９）。
【００２６】
ｓｉＲＮＡ誘導体
さらに、生産された同じｓｉＲＮＡの安定性を増加させて、生じた作用の効率を改善するために、ｓｉＲＮＡ配列を形成する１つ又は複数のヌクレオチドを、本発明のｓｉＲＮＡの誘導体を得るために化学的に改変することができる。したがって、以降説明される全ての誘導体は、本出願の防衛的範囲に包含される。
【００２７】
まず第一に、３’末端に突出したｄＴｄＴ又はｄＡｄＴ配列を有するｓｉＲＮＡ配列を提供することができる。後者の配列は、安定性を付与し効率を改善する他にも、ＤＮＡを模擬するためにｓｉＲＮＡのオリゴマー化を誘導する（易結合性ｓｉＲＮＡ）。それゆえに易結合性ｓｉＲＮＡは、インビボでの効率的なｓｉＲＮＡ分布を確実にし、炎症促進性サイトカイン及びインターフェロンが媒介する免疫応答を引き起こす能力を減少させる通常の試薬、例えば、ＰｏｌｙＰｌｕｓ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎによって提供される直鎖状ポリエチレンイミン誘導体であるｊｅｔＰＥＩ（登録商標）製品と併用することができる。
【００２８】
マウスＡＤＯ２モデルで実行されるインビボでのアッセイでは、まさにその易結合性ｓｉＲＮＡ／ｊｅｔＰＥＩコンジュゲートが使用された。しかしながら、未改変の又は異なって改変された本発明のｓｉＲＮＡは、以下で説明されるように、等しく効果的に使用することができる。
【００２９】
二重鎖の形態で本発明のｓｉＲＮＡの安定性を改善する他の誘導体は、２’−アルコキシ（Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４）誘導体、例えば２’−メトキシ誘導体（すなわち２’−ＯＭｅ誘導体）である（Ｄｅｎｉｓｅ  Ｍ  Ｋｅｎｓｋｉ、Ｇａｂｏｒ  Ｂｕｔｏｒａ、Ａａｒｒｏｎ  Ｔ  Ｗｉｌｌｉｎｇｈａｍ、Ａｂｂｙ  Ｊ  Ｃｏｏｐｅｒ、Ｗｅｎｌａｎｇ  Ｆｕ、Ｎｉｎｇ  Ｑｉ、Ｆｅｒｄｉｅ  Ｓｏｒｉａｎｏ、Ｉａｎ  Ｗ  Ｄａｖｉｅｓ及びＷ  Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｆｌａｎａｇａｎ．「強化されたインビボでの活性のためのｓｉＲＮＡが最適化された改変（ｓｉＲＮＡ−ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ）」．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ（２０１２）１、ｅ５；ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔｎａ．２０１１．４）。２’−ＯＭｅ誘導体は、通常ｒＲＮＡ及びｔＲＮＡ中に存在しており、本発明のｓｉＲＮＡの無毒の誘導体であり、ここで−ＯＭｅ基は、センス若しくはアンチセンス鎖又は両方におけるリボースコアの２’位に挿入されている。
【００３０】
また２’−フッ素（すなわち２’−Ｆ）誘導体（Ｄｅｎｉｓｅ  Ｍ．Ｋｅｎｓｋｉら、上記）も、本発明のｓｉＲＮＡによって実行される機能に適合しており、ヌクレアーゼ分解に対するその二重鎖の安定性を強化する。リボースコアの２’位に取り込まれたフッ素は、インビトロとインビボの両方においてｓｉＲＮＡ活性を維持し、その安定性を増加させる。ピリミジンヌクレオチド中の２’−Ｆとプリンヌクレオチド中の２’−ＯＭｅの組み合わせ使用は、極端な血清中での安定性及び著しく改善された有効性を有する二重鎖ｓｉＲＮＡをもたらす。
【００３１】
２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）ＲＮＡ誘導体（ＭＯＥ−ＲＮＡ）（Ｍａｒｋ  Ａ．Ｂｅｈｌｋｅ．「インビボで使用するためのｓｉＲＮＡの化学修飾（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉＲＮＡ  ｆｏｒ  Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｕｓｅ）」．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  １８：３０５〜３２０（２００８））も、本発明のｓｉＲＮＡの安定性を強化するのに等しく使用することができる。ＭＯＥ基は、オリゴヌクレオチドにヌクレアーゼに対する高い耐性をもたらし、Ｔｍを高くするためにアンチセンスオリゴヌクレオチドにおいて頻繁に使用される。
【００３２】
本発明に好適な、機能及び安定性が改善された他のｓｉＲＮＡ誘導体は、２’−Ｏ−ベンジル誘導体及び２’−Ｏ−メチル−４−ピリジン（Ｄｅｎｉｓｅ  Ｍ．Ｋｅｎｓｋｉら、上記を参照）、２’−アミノ（２’−ＮＨ）、２’−アミノエチル（２’−ＡＥ）、２’−グアニジノプロピル（２’−ＧＰ）誘導体である。
【００３３】
ｓｉＲＮＡのＬＮＡ（ロックト核酸）誘導体が、その安定性のために本発明の目的にとって特に興味深い（Ｍａｒｋ  Ａ．Ｂｅｈｌｋｅ、上記を参照）。当業者に周知のように、これらの誘導体は、リボースの２’−Ｏ位と４’−Ｃ位との間のメチレン架橋を特徴とする。メチレン架橋は３’末端構造への糖単位をブロックし、それによって有意なＴｍ上昇とヌクレアーゼ耐性がもたらされる。
【００３４】
前駆体
本発明の具体的な実施形態において、ｓｉＲＮＡ又はその誘導体は、インビボにおいてその前駆体の形態で使用され得る。この形態は、本発明の目的でもある。
【００３５】
一例として、ｓｉＲＮＡは、特定には遺伝子治療の範囲内で、対応するｓｈＲＮＡ（短鎖ヘアピンＲＮＡ）で置き換えることができる。当業者に周知のように、ｓｈＲＮＡは、約２〜１０ヌクレオチド、例えば４〜９又は５〜６ヌクレオチドのループによって連結された、それぞれ約１５〜２９ヌクレオチド、通常は１９〜２５又は１５〜２０ヌクレオチドの２つの相補的配列のカップリングによって形成された二本鎖構造に存在する短いＲＮＡ配列又は転写物である。ｓｈＲＮＡを形成する転写物は、細胞に導入され発現されると、細胞中で直接的にループ配列を切断することによってｓｈＲＮＡを対応するｓｉＲＮＡに変換する酵素複合体のＤＩＣＥＲによってプロセシングされる。次いでプロセシングされたものが、その標的とする遺伝子サイレンシング又はノックダウン機能を実行すると予想される。それゆえに、遺伝子治療の範囲内で、本発明のｓｉＲＮＡは、対応するｓｈＲＮＡで置き換えることができる。
【００３６】
上記で説明した誘導体及び前駆体の全てが、本出願の防衛的範囲に包含される。
【００３７】
本研究の範囲内で、表１に示された変異、又はマウスの遺伝子変異ｐ．Ｇ２１３Ｒを含有するヒトＣＬＣＮ７遺伝子の対立遺伝子のｍＲＮＡに特異的な様々なｓｉＲＮＡを設計し、生産した。次いで、ｐ．Ｇ２１５Ｒ、ｐ．Ｒ７６７Ｗ、ｐ．Ｒ２８６Ｗ、ｐ．Ａ７８８Ｄの位置で変異したタンパク質と比較した、タンパク質ＣＬＣ７−ＷＴの発現の阻害における以下に報告される個々のＲＮＡフラグメントの有効性を分析した。
【００３８】
0006795492.tif 000003
【００３９】
本出願で説明される実験研究において、上記で報告された全てのｓｉＲＮＡ配列は、それらの安定性及び有効性を改善するために３’末端に突出したｄＴｄＴ配列を備えていた。インビボで使用するために、ｄＴｄＴ配列はｄＡｄＴ配列で置き換えられるが、このｄＡｄＴ配列は、それらの安定性及び有効性をさらに改善し、さらに、インビボにおける改善されたｓｉＲＮＡの分布をもたらし、あらゆる免疫応答を低減させるあらゆる媒体とのそれらの結合を可能にする。
【００４０】
以下の表２に、インビトロでアッセイしたｓｉＲＮＡを用いて得られた、ＷＴ  ｍＲＮＡ又は変異ｍＲＮＡに対するそれらの有効性に関する結果を列挙する。
【表２−１】
0006795492.tif 000004
【表２−２】
0006795492.tif 000005
【００４１】
インビトロでの研究に使用されるｓｉＲＮＡの配列は、変異ヌクレオチドを太字と下線で報告し（ヒト配列についてはｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／ＮＭ＿００１１１４３３１．２を参照）、追加のミスマッチヌクレオチド（単数又は複数）を太字とイタリックで報告する。第２列で太字で示されたｓｉＲＮＡは、最も有効で特異的とみなされたものである。アッセイはＨＥＫ２９３ヒト細胞で実行され、ただし（＊）でマークを付けたｓｉＲＮＡは、もっぱらヒトＷＴ破骨細胞でアッセイされ、対応する転写物に対するその有効性は決定されなかった（ＮＤ）。
【００４２】
ＣＬＣＮ７遺伝子のｍＲＮＡを認識するｓｉＲＮＡ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／ＮＭ＿０１１９３０．３）も生産し、表３に示されるようにマウスタンパク質の２１３位で変異させた（ｐ．Ｇ２１３Ｒ）（ヒトでは変異ｐ．Ｇ２１５Ｒに対応する）。
【表３】
0006795492.tif 000006
【００４３】
インビボで使用される遺伝子ｐ．Ｇ２１３Ｒ−ｃｌｃｎ７及び正常遺伝子（ｃｌｃｎ７）のｓｉＲＮＡ配列。太字と下線＝変異ヌクレオチド；太字とイタリック＝ミスマッチヌクレオチド。
【００４４】
本発明の好ましいｓｉＲＮＡは、以下である：
0006795492.tif 000007
【００４５】
本発明の好ましい実施形態において、上記で列挙したｓｉＲＮＡの全てが、インビボでの使用のために３’末端に突出した短いｄＡｄＴ配列と共に提供される。
【００４６】
ｓｉＲＮＡを調製するための方法
短いＲＮＡ配列を調製するためのヌクレオチド合成方法は当業者に公知であり、従来技術の水準で説明される。本発明のｓｉＲＮＡは化学合成によって生産されたが、これは、小さいオリゴヌクレオチドの二重鎖で表されている。これらは、３’末端に２つのデオキシリボヌクレオチド「オーバーハング」を有する１９のリボヌクレオチドを含む。合成後、ｓｉＲＮＡを以下の精製プロセスに供した：
・エタノール沈殿による、又はＣ１８−タイプのクロマトグラフィーカラムを使用した塩の除去。
・ＲＮＡ塩基中に存在する２’−ＡＣＥ基の除去。
・アンチセンス配列（別の反応で合成された）との対形成。
・精製１：ｓｉＲＮＡ二重鎖は、アクリルアミドゲル電気泳動によって精製される。
・精製２：上記で説明した工程により得られたｓｉＲＮＡ二重鎖は、イオン交換液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）でさらに精製される。
・精製３：上記で説明した工程により得られたｓｉＲＮＡ二重鎖は、対イオン交換（Ｎａ＋）に供され、脱塩され、ろ過滅菌され、内毒素の存在について試験される。
【００４７】
組成物及び投薬
本発明のｓｉＲＮＡ、その化学的誘導体及び／又は前駆体は、全身又は局所投与することができる。
【００４８】
インビトロで細胞培養に、及びインビボで動物モデルに行われた試験から、本発明のｓｉＲＮＡは、いかなるトランスフェクション剤も必要とせずに、それどころか溶液中の細胞との単なるインキュベーションによって細胞中に効果的に内在化されることが実証された。実際に、細胞培養条件下で、標準的な健康なドナーの末梢血単核細胞から分化した破骨細胞を、本発明のｓｉＲＮＡ又はその誘導体とインキュベートしたところ、細胞へのｓｉＲＮＡ取り込みと処置後最大＋７日のその保存が顕著に認められた（図１０）。
【００４９】
それゆえに、本発明のｓｉＲＮＡ又はその化学的誘導体の投与に好適な医薬組成物は、好適な、本質的に液体の賦形剤中の、医薬有効量のｓｉＲＮＡ、その誘導体又はその前駆体を含有する組成物である。このような組成物は、溶液、懸濁液又はエマルジョンの形態である。それゆえに、このような適用に好適なあらゆる医薬賦形剤を使用することができる。好適な賦形剤は、非経口用途のための生理溶液、水アルコール性溶液、グリコール溶液、水／油若しくは油／水エマルジョン、リポソーム若しくはエキソゾームのエマルジョン／懸濁液、油性溶液、ミセル性の懸濁液、小胞、又はＰＥＩ（ポリエチレンイミン）との複合体若しくはアテロコラーゲンとの複合体であり、これらはいずれも、通常の医薬添加剤、希釈剤、安定剤及び生理学的な値までのｐＨ調節剤を含有する。
【００５０】
本発明のｓｉＲＮＡ、その誘導体又は前駆体の投与は、非経口的に行うことができ、例えば、静脈内、腹膜内、筋肉内、皮内、皮下、骨内、軟骨内、関節内投与である。代替として、投与は、丸剤、錠剤、頬側若しくは舌下での溶解のための製剤、カプセル剤、ソフトカプセル剤、フィルム剤、散剤、顆粒剤によって経口的に；坐剤又は腔坐剤により経直腸又は経膣的に；吸入によって例えば気管支内で実行することができる。
【００５１】
局所投与は、局所適用に好適なあらゆる製剤を介して、例えば処置される組織上又は中への局所適用又は直接適用により行うことができ、又は再度、ｓｉＲＮＡ前駆体の局所投与と本発明のｓｉＲＮＡのインサイチュ産生によって行うこともできる。ｓｉＲＮＡ又はその前駆体を含有するエキソゾーム、リポソーム、小胞、ミセルをベースとした組成物は、全身及び局所作用の両方を達成するのに有用である。
【００５２】
局所作用を得るために、本発明のｓｉＲＮＡ又はその誘導体若しくは前駆体は、ウイルス若しくは非ウイルスベクターを介して、又はｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡを介して、又は単離された（裸の）ＲＮＡとして（Ｐｅｌｌｅｄら、２０１０  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：パートＢ、１６巻、１号、１３〜２０）、又は例えばフィブリノーゲン及びトロンビンポリマーをベースとし、適用ポイントに配置された、３次元の生体適合性マトリックス若しくはインプラントを介して投与することができる。
【００５３】
具体的な実施形態において、ｓｉＲＮＡ又はその誘導体若しくは前駆体は、ｓｉＲＮＡの有効なインビボでの分布を確実にする通常の試薬、例えばポリエチレンイミン（ＰＥＩ）又はその誘導体、例えばポリエチレンイミン−ポリエチレングリコール−Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＰＥＩ−ＰＥＧ−ＧＡＬ）複合体、若しくはポリエチレンイミン−ポリエチレングリコール−トリ−Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＰＥＩ−ＰＥＧ−トリＧＡＬ）複合体と、結合しているか、又は会合しているか、又は複合体化している。本発明の具体的な実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ＰｏｌｙＰｌｕｓ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎによって提供されるポリエチレンイミン（ｐｏｌｙｅｔｈｙｅｎｅｉｍｉｎｅ）の直鎖状誘導体であるｊｅｔＰＥＩ（登録商標）製品に結合している。
【００５４】
代替として、本発明のｓｉＲＮＡは、遺伝子治療の範囲内で、そのｓｈＲＮＡ前駆体の形態で局所投与することができる。例えば、ｓｈＲＮＡ、又はｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡは、例えば、Ｅｇｅｒｍａｎｎら、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２００６年５月；１７（５）：５０７〜１７で説明されるように、好適なプラスミド又はアデノウイルスベクターを使用することによって哺乳動物細胞に移行させることができる。細胞それ自身によって発現されプロセシングされたｓｈＲＮＡは、標的遺伝子をサイレンシングすることができる対応するｓｉＲＮＡを産生する。
【００５５】
ベクターに代わるインビボでの投与の形態において、ｓｉＲＮＡは、エレクトロポレーション、超音波ポレーション（ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄｐｏｒａｔｉｏｎ）、カチオン性リポソーム媒介トランスフェクション、マイクロインジェクション、エレクトロパルセーション（ｅｌｅｃｔｒｏｐｕｌｓａｔｉｏｎ）を介して細胞に移行させることができる。
【００５６】
別の代替の局所投与の形態において、本発明のｓｉＲＮＡ、その誘導体又は前駆体は、Ｌｕｇｉｎｂｕｅｈｌら、２００４、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｉｏｐｈａｒｍ  ５８：１９７〜２０８によって説明されるような遺伝物質を放出することができるマトリックス（遺伝子活性化マトリックス（ＧＡＭ））に共有結合を介して結合していてもよいし、吸着されていてもよいし、さらには固定されていてもよく、次いでＦａｎｇら、１９９６（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ９３、５７５３）によって説明されるように目的のゾーンに埋め込まれてもよい。
【００５７】
しかし、トランスフェクション剤が、必須ではないが、破骨細胞へのｓｉＲＮＡ内在化を改善するために使用されてもよい。本発明に好適なトランスフェクション剤は、リポフェクタミン、特定のキットを使用したＡｍａｘａ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標）（Ｌｏｎｚａ、Ｃｏｌｏｇｎｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）方法（カタログ番号ＶＰＡ−１００７、Ｌｏｎｚａ）によるヌクレオフェクションである。
【００５８】
薬量学
さらに、本発明の範囲内で行われたインビトロ及びインビボの試験から、細胞中、すなわち破骨細胞中に内在化されたｓｉＲＮＡは、その完全性、したがってその機能性を数日間にわたり保つことが実証された。
【００５９】
したがって、本発明のｓｉＲＮＡを用いた処置レジメンは、１日１回から週１回の投与、例えば１、２、３、４、５、６又は７回の投与／週を提供する。代替として、処置は、毎日の投与、又は２、３、４、５、６、７日毎の投与で行ってもよい。
【００６０】
処置の持続時間は、疾患の重症度によって決まり、数週間の処置から長期の処置の範囲である。
【００６１】
本発明者らによって行われた試験から、本発明のｓｉＲＮＡは、処置される対象、又は大理石骨病進行の症状が出現している対象への、体重１ｋｇ当たり約１ｎｇから体重１ｋｇ当たり約１００ｍｇの広範囲の投薬量で、破骨細胞の機能を回復させるのに効果的であることが実証された。好ましい実施形態において、投薬量は、体重１Ｋｇ当たり約１μｇから２０ｍｇ、好ましくは約１ｍｇ／Ｋｇから約１０ｍｇ／Ｋｇであると予想される。
【００６２】
可能性のある医薬品としてのｓｉＲＮＡのインビボにおける有効性をアッセイできるように、以下の手法を採用した：
１．ｃｌｃｎ７正常ｍＲＮＡのｓｉＲＮＡは、ＷＴマウスにおける正常な遺伝子発現の低減において有効であったことが確認された。
【００６３】
２．ｃｌｃｎ７変異ｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡは、正常な遺伝子発現を変更しなかったことが確認された。
【００６４】
３．ｃｌｃｎ７変異ｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡは、変異ｍＲＮＡの低減とＡＤＯ２マウスの表現型の改善において有効であったことが確認された。
【００６５】
このような確認のための手順は、実験の例で説明される。
【００６６】
組み合わせ療法
本発明のｓｉＲＮＡは、他の有効成分と併せて使用することができる。用語「併せて」は、併用療法又は組み合わせ療法であることと、単一の医薬形態、又は単一の市販パッケージ中の合剤（ｃｏ−ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）、例えば２種以上の有効成分のキット又はブリスターであることとの両方を意味する。
【００６７】
ｓｉＲＮＡと組み合わせることができる有効成分は、例えば、骨組織の同化を増加させることができる薬剤：例えばテリパラチド、ブロソズマブ、ロモソズマブ、又はさらには骨の増殖因子又はそれらをコードする核酸、例えば、ＢＭＰファミリーのタンパク質、例えばＢＭＰ−２及び／若しくはＢＭＰ−７、又は例えばＭＩＲ−３１と拮抗させるＲＮＡのようなＲＮＡ、又は例えばリポフェクタミン、特定のキットを使用したＡｍａｘａ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標）方法（Ｌｏｎｚａ、Ｃｏｌｏｇｎｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）（カタログ番号ＶＰＡ−１００７、Ｌｏｎｚａ）によるヌクレオフェクションなどのトランスフェクション剤である。
【実施例】
【００６８】
（例１）
ＥＧＦＰ（強化緑色蛍光タンパク質）に関する配列とコンジュゲートしたＣＬＣＮ７遺伝子のコンストラクトを有するベクターの生成
インビトロで実験を実行することができるように、蛍光分析による融合タンパク質の可視化とＥＧＦＰのリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子の転写発現の定量化を可能にするためのＥＧＦＰ配列とコンジュゲートしたＣＬＣＮ７遺伝子のＷＴコンストラクトを有する発現ベクターを生成した（ＷＴ  ＣＬＣＮ７／ｐＥＧＦＰ−Ｃ１）（図１）。その目的のために、ヒトＣＬＣＮ７  ｃＤＮＡの全長配列（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／ＮＭ＿００１１１４３３１．２）（ｒｚｐｄ  ＩＲＡＵｐ９６９Ｂ０８５９Ｄ６）を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｈｏＩによってｐＥＧＦＰ−Ｃ１ベクターにクローニングした。ｉＰｒｏｏｆＴＭハイフィデリティＤＮＡポリメラーゼキット（ＢＩＯ−ＲＡＤ１７２−５３０１）によって、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｈｏＩの配列を備えた５’末端を有するプライマーを使用して、ＣＬＣＮ７遺伝子のヒト全長配列を増幅した。次いで、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｈｏＩを使用して、空のｐＥＧＦＰ−Ｃ１ベクターとＣＬＣＮ７のＰＣＲ産物の二重の消化を３７℃で３時間実行した。消化されたベクター及びＰＣＲ産物を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ２８１０４）によって精製した。次いで、消化されたベクターの脱リン酸化を、エビアルカリホスファターゼ（ＳＡＰ）を使用して３７℃で１時間実行した。３００ｎｇの消化されたＣＬＣＮ７のＰＣＲ産物及び１００ｎｇの脱リン酸化されたｐＥＧＦＰ−Ｃ１ベクターをＴ４  ＤＮＡリガーゼによって４℃で一晩ライゲートした。次いでライゲートしたものを使用して、ＸＩＢｌｕｅ１細胞を形質転換した。その後、変異コンストラクトｐ．Ｒ７６７Ｗ−、ｐ．Ｇ２１５Ｒ−、ｐ．Ａ７８８Ｄ−及びｐ．Ｒ２８６Ｗ−ＣＬＣＮ７／ｐＥＧＦＰ−Ｃ１を有するベクターを、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  ＩＩ  ＸＬ部位特異的変異誘発キット（カタログ番号ａ２００５２１、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）により、所望の変異を含有するプライマーを使用して得た。次いで、生じた変異誘発を直接のＤＮＡ配列決定によってチェックした（図２）。
【００６９】
（例２）
トランスフェクション
ベクターを使用して、リポフェクタミンを用いる標準的なトランスフェクション技術によってヒトＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクトし、次いで対応するｍＲＮＡの発現をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって定量化した。ＷＴコンストラクト及び変異コンストラクトのトランスフェクションは、類似レベルの転写発現を誘導した（図３）。
【００７０】
次いで、トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞におけるＷＴ−及び変異タンパク質の発現を、融合タンパク質ＥＧＦＰの検出のための共焦点顕微鏡法によって評価した。ゴルジ装置マーカー（ガンマ−アダプチン）、初期エンドソーム（ＥＥＡ−１）、酸性小胞（Ｌｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄ）及びリソソーム（ｌａｍｐ−１）の共局在化によって蛍光タンパク質の適正な局在化が実証された（図４）。
【００７１】
本発明者らの変異コンストラクトの、破骨細胞系で発現されて骨吸収を阻害する能力を実証するために、ＲＡＷ２６４．７破骨細胞前駆体のマウス系を、空のベクター、又は変異コンストラクトを有するベクターでトランスフェクトした。ｍＲＮＡ及びタンパク質発現を、それぞれリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ及び共焦点顕微鏡法によってチェックし、次いで細胞をウシの骨切片上で平板培養し、４日間１００ｎｇ／ｍｌのＲＡＮＫＬで処置することにより成熟破骨細胞に分化させた。破骨細胞に対する吸収窩（ピット）の横穴の数（ピットインデックスアッセイ）によって骨吸収を定量化した。結果から、空のベクターでトランスフェクトされた同じ細胞と比較して、変異コンストラクトでトランスフェクトされたＲＡＷ２６４．７細胞では骨吸収が約７０％低減したことが実証された（図５）。この骨吸収のパーセンテージは、健康なドナー由来の破骨細胞と比較したＡＤＯ２患者の末梢血液から分化した破骨細胞で観察されたパーセンテージに非常に類似している（６）。
【００７２】
これらの実験は、生成されたベクターは、本発明者らの変異遺伝子のインビトロにおけるサイレンシングの戦略を評価するための妥当なツールに相当し得るという優れた証拠をもたらした。しかしながら、本方法は初代ヒト破骨細胞でも機能することを確認するために、ＡＭＡＸＡ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒによるヌクレオフェクションプロセスを設定した。手順は成功し、健康なドナーの末梢血単核細胞から分化した破骨細胞における本発明者のＥＧＦＰ融合タンパク質を良好に高発現させることができた（図６）。
【００７３】
ヒトコンストラクトでトランスフェクトしたヒト破骨細胞における骨吸収の評価から、空のベクターでトランスフェクトされた細胞と比較して７０％低減されたことが再度実証された（示されていない）。
【００７４】
（例３）
インビトロにおけるｓｉＲＮＡでの処置
調査方法を設定した後、上述したＣＬＣＮ７遺伝子の変異（表２）に対するｓｉＲＮＡを設計し、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社に合成を手配した。さらに、市販のＷＴ  ＣＬＣＮ７遺伝子に対するｓｉＲＮＡ及びスクランブル化（混成のヌクレオチド配列）対照ｓｉＲＮＡのプールを購入した。
【００７５】
ｐ．Ｒ７６７Ｗ変異に対するｓｉＲＮＡを用いて手順の設定を行った。次いでその設定を他の変異にも拡張した。ｐ．Ｒ７６７Ｗ変異を有するトランスクリプター（ｔｒａｓｃｒｉｐｔｏｒ）に特異的なｓｉＲＮＡ（Ｒ２８６Ｗ  ｓｉＲＮＡ１）を、ＷＴ−又はｐ．Ｒ７６７Ｗ−ＣｌＣＮ７／ＥＧＦＰベクターでトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞における有効性及び特異性に関して評価した。結果から、変異ｍＲＮＡ発現の≦６０％の低減が示された。しかしながら、この肯定的な結果は、ＷＴ  ＣＬＣＮ７／ＥＧＦＰベクターでトランスフェクトされた細胞における正常ｍＲＮＡの類似の低減によって無効となった（図７）。
【００７６】
このｓｉＲＮＡは変異遺伝子に特異性を示さなかったが、変異した転写物のｍＲＮＡの低減におけるその優れた有効性は有望であった。それゆえに、その骨吸収への作用を、Ｒ７６７Ｗ−又はＷＴ−ＣＬＣＮ７／ＥＧＦＰコンストラクトでトランスフェクトされたＲＡＷ２６４．７細胞を使用することによって評価した。これらの実験条件下で、変異ｍＲＮＡに関するｓｉＲＮＡは、対照のスクランブル化ｓｉＲＮＡと比較して、骨吸収を再活性化する部分的な能力を示したことが実証された。この実験において、ＷＴ−ＣＬＣＮ７／ＥＧＦＰベクターでトランスフェクトされ、ｐ．Ｒ７６７Ｗ変異に対するｓｉＲＮＡでの処置に供された細胞で、中程度の骨吸収の阻害が観察された（図８）。この低減は、変異したベクターでトランスフェクトされた細胞で観察されたものよりも低く（左から第２のバーと第３のバーとを比較した）、内因性ｍＲＮＡとトランスフェクトされたコンストラクトによって生産されたｍＲＮＡの両方の存在に起因する、ＲＡＷ２６４．７細胞における多量のＣＬＣＮ７  ｍＲＮＡ発現に起因する可能性がある。
【００７７】
この時点で、変異ｍＲＮＡに対する特異性を増加させる戦略を採用した。これは、変異したヌクレオチド下流の様々な位置に非相補的（ミスマッチ）ヌクレオチドを挿入することによって達成された（１１）。この戦略を用いて、ｐ．Ｒ７６７Ｗ変異に関する３つの新規のｓｉＲＮＡを設計した（表２）。全ての３つのｓｉＲＮＡが、ＷＴ  ｍＲＮＡと比較して変異ｍＲＮＡにより大きい特異性を示した。それらのうち１つ（ｐ．Ｒ７６７Ｗ  ｓｉＲＮＡ  ２Ｃと呼ばれる）を用いて、ＷＴ  ｍＲＮＡをまったく低減させずに変異ｍＲＮＡ低減の９０％の有効性が達成された（図９）。
【００７８】
次いで、ヒト破骨細胞を、Ｃｙ３フルオロフォアとコンジュゲートしたｓｉＲＮＡ（Ｃｙ３−ＷＴ  ｓｉＲＮＡ）を使用して、正常なＣＬＣＮ７遺伝子に関するｓｉＲＮＡで処置した。その目的は、初代細胞へのｓｉＲＮＡ内在化の戦略を、それをチェックするための共焦点顕微鏡法を使用して設定することであった。これらの条件下で、破骨細胞は、いかなるトランスフェクション剤も必要とせずにｓｉＲＮＡを内在化することが観察された。実際に、標準的な培養条件下で、健康なドナーの末梢血単核細胞から分化した破骨細胞を３００ｎＭのＣｙ３−ＷＴ  ｓｉＲＮＡと共にインキュベートしたところ、細胞へのｓｉＲＮＡの取り込みと処置後最大＋７日のその保存が顕著に認められた（図１０Ａ）。
【００７９】
ＣＬＣＮ７変異ｐ．Ｒ７６７Ｗの発現を低減して、その骨吸収への有害作用を減少させるＲ７６７Ｗ  ｓｉＲＮＡ  Ｃの能力を実証するために、ヒト破骨細胞を、ｐ．Ｒ７６７Ｗ  ＣＬＣＮ７／ｐＥＧＦＰベクターでトランスフェクトし、５００ｎＭのｐ．Ｒ７６７Ｗ  ｓｉＲＮＡ  ２Ｃで処置した。これらの環境下で、ｐ．Ｒ７６７Ｗ  ｓｉＲＮＡ  ２Ｃで処置された細胞において、スクランブル化ｓｉＲＮＡで処置された破骨細胞と比較して、ＥＧＦＰ蛍光タンパク質配列の低減した転写発現（図１０Ｂ）と破骨細胞の骨を吸収する能力の回復（図１０Ｃ）が顕著に認められた。
【００８０】
次いで、ｐ．Ｒ７６７Ｗ  ｓｉＲＮＡ  ２Ｃでの処置が、健康なドナー由来のヒト破骨細胞における正常なＣＬＣＮ７転写物の転写発現及び骨を吸収する能力に影響を与えたかどうかを評価した。結果から、正常なＣＬＣＮ７に対して向けられたｓｉＲＮＡ（陽性対照として使用された）の、このｍＲＮＡを減少させることにおける優れた効力が示されたが、それに対してｐ．Ｒ７６７Ｗ  ｓｉＲＮＡ  ２Ｃによるそれへの作用は観察されなかった（図１１）。この結果によれば、ｐ．Ｒ７６７Ｗ  ｓｉＲＮＡ  ２Ｃは、健康なドナー由来の破骨細胞の骨吸収を改変しなかった（図１２）。
【００８１】
全般的に、これらの結果は、本発明者らの戦略が成功し、ヒト破骨細胞の正常ｍＲＮＡには作用がなかったが、ＣＬＣＮ７遺伝子のｐ．Ｒ７６７Ｗ変異に対する高度に特異的なｓｉＲＮＡの設計を可能にしたことを示す。
【００８２】
同じ戦略に従って、前述した他の３つの変異、ｐ．Ｇ２１５Ｒ、ｐ．Ａ７８８Ｄ及びｐ．Ｒ２８６Ｗ（表２）に対するｓｉＲＮＡを設計した。結果の詳細な分析から、ｐ．Ａ７８８Ｄ変異について、ＣＬＣＮ７依存性ＡＤＯ２療法でそれらを使用するのに必要な有効性及び特異性の基準を満たすｓｉＲＮＡが未だ同定されていなかったことが明らかになった。その代わりに、変異ｐ．Ｒ２８６Ｗ及びｐ．Ｇ２１５Ｒに関して、有効性及び特異性の基準が満たされたｓｉＲＮＡが同定された（表２）。
【００８３】
ｐ．Ｇ２１５Ｒ  ｓｉＲＮＡ変異については疾患のマウスモデルが現在利用可能であるため、表２で同定されたｐ．Ｇ２１５Ｒ  ２Ｍという略称の有効なｓｉＲＮＡの特色を研究した。それにより、ＨＥＫ２９３細胞及び初代ヒト破骨細胞における変異ｍＲＮＡの発現の低減において高度に活性であることが証明された（図１３、図２８）。
【００８４】
さらに、ヒト変異（ｐ．Ｇ２１５Ｒ）のマウス相同体（ｐ．Ｇ２１３Ｒ）を有する、本発明者らの実験室で生成した動物ＡＤＯ２モデル由来のマウス破骨細胞を使用することによって（１０）、ｐ．Ｇ２１３Ｒ  ｓｉＲＮＡでの処置（表３）が骨吸収の増加を可能にしたことが実証された（図１４）。
【００８５】
（例４）
インビボにおける処置
インビボで医薬品としてのｓｉＲＮＡの有効性をアッセイできるようにするために、以下の手順に従った：
ｉ）ｃｌｃｎ７正常ｍＲＮＡのｓｉＲＮＡは、ＷＴマウスにおける正常な遺伝子発現の低減において有効であることを確認すること。
【００８６】
ｉｉ）ｃｌｃｎ７変異ｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡは、正常な遺伝子発現を変更しないことを確認すること。
【００８７】
ｉｉｉ）ｃｌｃｎ７変異ｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡは、変異ｍＲＮＡの低減とＡＤＯ２マウス表現型の改善において有効であることを確認すること。
【００８８】
ｉ）ｃｌｃｎ７正常ｍＲＮＡのｓｉＲＮＡは、ＷＴマウスにおける正常な遺伝子発現の低減において有効であることを確認すること
この実験のグループを、Ｄｈａｒｍａｃｏｎにより市販されている、そのヌクレオチド配列が未知の正常なｃｌｃｎ７遺伝子に対するｓｉＲＮＡのプールを用いて実行した。１月齢のＣＤ１マウス（ｎ＝４）を、ＴｒａｎｓＩＴ−ＱＲ（クイックリカバリー）ハイドロダイナミックデリバリーキットによって植え付けた２ｍｇ／Ｋｇのｃｌｃｎ７−ｓｉＲＮＡで処置した。ＴｒａｎｓＩＴ溶液は、尾静脈での流体力学的な注射手順を使用した核酸の安全で有効な投与のために具体的に研究されたものである。２４〜４８時間後、動物を屠殺し、解剖学的な切開に供して、心臓、脾臓、肝臓、腎臓、脳、肺及び脛骨を収集した（図１５）。この後者の結果は、ｃｌｃｎ７−ｓｉＲＮＡが血液脳関門を通過できないことによるものと予想される。
【００８９】
次いで、繰り返しの処置の実行可能性を確認するために、正常なＣＤ１マウスでも、どれが最良のｃｌｃｎ７−ｓｉＲＮＡ投与経路なのかを確認した。ＴｒａｎｓＩＴ−ＱＲハイドロダイナミックデリバリーキットによる注射が有効であることが証明されたが、成体マウスでは１回のみ実行可能である。腹膜内投与は、動物の生後数日から簡単に実行されることが証明された。また静脈点滴も効率的であるが、これは、成体マウスに非常に限られた回数しか実行できなかった。それゆえに、それに続く研究には腹膜内注射が選択された。さらに、最良の投与頻度は、４８時間の投与頻度であることが試験され、それによれば骨と他の臓器の両方で最良の用量依存性応答が実証された。この一連の実験で使用された３週間にわたり週３回投与された最大用量（体重１Ｋｇ当たり０．５ｍｇ）は、コンピューター顕微鏡断層撮影（μＣＴ）によって測定された構造的な骨パラメーターの改変を誘導しなかった。本発明者らは、遺伝子がハプロサフィシエント（ｈａｐｌｏｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ）であり、この処置レジメンは、ｃｌｃｎ７ｍＲＮＡのみを６０％低減し、残りのｍＲＮＡの４０％がその機能を実行するのに恐らく十分であるという見解でこの否定的な結果を説明している。どのような場合においても、処置は、罹患の兆候も誘導せず、動物への明らかな苦痛もまったく引き起こさなかった。
【００９０】
ｉｉ）ｃｌｃｎ７変異ｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡは、正常な遺伝子発現を変更せず、逆の作用を誘導しないことの確認
この形態を実証するために、正常なＣＤ１マウスをｐ．Ｇ２１３Ｒ−ｃｌｃｎ７  ｓｉＲＮＡ（表３）（０．５ｍｇ／Ｋｇ）で処置したところ、正常な転写に対して向けられたｃｌｃｎ７−ｓｉＲＮＡでの処置で見出されたものとは異なり、正常な転写が低減されなかったことが観察された。全てのこれらの実験において、対照のスクランブル化ｓｉＲＮＡは、正常な又は変異したｃｌｃｎ７遺伝子のどちらの発現の変更も決して引き起こさなかった。それゆえにこれらの実験によって、本発明者らは、ｃｌｃｎ７遺伝子の変異の１つに関するｓｉＲＮＡは正常な転写に効果がなく、副作用を誘導しないことを実証した。
【００９１】
ｉｉｉ）ｃｌｃｎ７変異ｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡが、変異ｍＲＮＡの低減及びＡＤＯ２マウス表現型の改善において有効であることの確認
したがって、それらの処置の効力を試験するために、入手可能な唯一のマウスＡＤＯ２モデルで実験を行った（１２）。このモデルは、Ｃ５７ＢＬ／６マウス株で、タンパク質変異ｐ．Ｇ２１３Ｒに対応するＤＮＡの１４３６５位においてｃｌｃｎ７遺伝子の正常なヘキソン７をＧ−Ａトランジションにより変異したヘキソン７で置換させるノックイン技術によって作製された。
【００９２】
この変異に関するマウスホモ接合型は、小さく、歯の発生がなく、柔らかい食物を与えたとしても生後３０日以内に死亡する。これらは、極めて重度の大理石骨病の表現型、繊維状の骨髄、並びにｃｌｃｎ７ノックアウトマウスモデル及びヒト常染色体劣性大理石骨病で見出されるものに類似した海馬及び小脳皮質の変性を示す。
【００９３】
ヘテロ接合型マウスは、正常なメンデルの法則の頻度で生まれ、生存可能であり、繁殖能があり、大きさ、体重及び歯の発生の変化による影響を受けない。その代わりにこれらマウスは、明らかな神経変性の徴候を伴わない比較的軽度の大理石骨病の典型的な徴候を示す。ヘテロ接合型の成体（３月齢）マウスは、脛骨、大腿骨及び椎骨の小柱骨の構造的骨パラメーターをμＣＴ分析することによって確認された、より大きいミネラル密度及びより大きい骨量を示す。この骨量の増加は持続的であり、老齢のマウスでも見出すことができ、雄と雌とで類似している。３月齢のヘテロ接合型マウスの組織学的試験から、破骨細胞特異的な酵素ＴＲＡｃＰの発現の増加及び破骨細胞数／面積／骨面の増加が示された。この増加にもかかわらず、破骨細胞酵素ＴＲＡｃＰの血清活性に正規化された骨吸収マーカーＣＴＸの血清レベルによって示されるように、骨吸収は低減する。それとは逆に、全ての骨形成パラメーター［血清マーカー（オステオカルシン）、骨芽細胞面積／骨面、骨形成速度、類骨の厚さ、成長板の厚さ］から、骨芽細胞又は軟骨細胞の関与もなく、マウスは大理石骨病性くる病素因（ｏｓｔｅｏｐｅｔｒｏｒａｃｈｉｔｉｓｍ）に適合する表現型も有さないことが実証される。
【００９４】
マウスから収集された骨髄は、インビトロにおいて、Ｍ−ＣＳＦ及びＲＡＮＫＬの存在下での破骨細胞前駆体数の増加及びより多くの破骨細胞形成を示す。それにもかかわらず、骨吸収は、正常なマウスの骨髄から得られた破骨細胞と比較して低減する。ヘテロ接合型マウスは、正常な血液学的及び血清パラメーター（膵臓アミラーゼ、肝臓トランスアミナーゼ、カリウム、カルシウム、リン、筋肉クレアチンキナーゼ及びグルコース濃度）を有し、それに対して副甲状線ホルモンレベルは、破骨細胞形成の増加に従って増加する。
【００９５】
信頼できるマウスＡＤＯ２モデルが得られたら、それにおいて変異ｐ．Ｇ２１５Ｒに対して向けられたｓｉＲＮＡを用いた療法が有効かどうかを確認した。まず第一に、ｐ．Ｇ２１３Ｒ−ｃｌｃｎ７  ｓｉＲＮＡの最適な用量及び投与回数を確立した。この目的を達成するために、変異した転写物を独占的に増幅することができるプライマー（図１６及び１７）をまず設計した。次いで、ｐ．Ｇ２１３Ｒ−ｃｌｃｎ７  ＡＤＯ２マウスを、体重１Ｋｇ当たり２又は４ｍｇのｐ．Ｇ２１３Ｒ−ｃｌｃｎ７易結合性ｓｉＲＮＡ／ｊｅｔＰＥＩで腹膜内注射によって処置して、全ＲＮＡの血清中の速度論を検証し（図１８）、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって、対照（スクランブル化）ｓｉＲＮＡで処置されたマウス（図１９）と比較した、ｐ．Ｇ２１３Ｒ−ｃｌｃｎ７易結合性ｓｉＲＮＡ／ｊｅｔＰＥＩで処置されたマウスにおけるｐ．Ｇ２１３Ｒ−ｃｌｃｎ７変異ｍＲＮＡ発現の低減を確認した。この低減は脛骨でも確認され（図２０）、ｐ．Ｇ２１３Ｒ−ｃｌｃｎ７易結合性ｓｉＲＮＡ／ｊｅｔＰＥＩ投与から９６時間後にはもはや明らかではなかったことから、状況から、最良の処置頻度が４８時間の処置頻度であることが示される。
【００９６】
この処置がインビボで骨吸収に作用を有する可能性があるかどうかを確認するために、１０日齢のｐ．Ｇ２１３Ｒ−ｃｌｃｎ７  ＡＤＯ２マウスを、体重１Ｋｇ当たり４ｍｇの対照（スクランブル化した）易結合性ｓｉＲＮＡ／ｊｅｔＰＥＩ、又はｐ．Ｇ２１３Ｒ−ｃｌｃｎ７特異的ｓｉＲＮＡで、２週間及び４週間にわたり週３回処置した。処置は十分許容されるものであり、生命の維持に必要な臓器への組織病理学的な損傷を誘導しなかった（図２１）。さらに処置は、腎臓、肝臓及び筋肉損傷のバイオマーカーを改善した（図２２）。破骨細胞バイオマーカーＴＲＡｃＰに正規化された骨吸収バイオマーカーＣＴＸに対する処置の治療効果を分析した。結果から、破骨細胞の骨吸収の活性化が起こった証拠として、ｐ．Ｇ２１３Ｒ−ｃｌｃｎ７易結合性ｓｉＲＮＡ／ｊｅｔＰＥＩで処置されたマウスにおけるＣＴＸ血清レベル及びＣＴＸ／ＴＲＡｃＰ比率の有意な増加が実証された（図２３）。それと一致して、脛骨の近位端のμＣＴ分析から、２週間の処置後すでに小柱骨の体積／総組織体積のパーセンテージの低減及び構造的な小柱骨の変数の改善が示された（図２４）。４週間後、骨芽細胞パラメーターに望ましくない作用をまったく与えることなく、構造的なパラメーター（図２５）及び破骨細胞の機能性（図２６）の総合的な回復が証明された（図２７）。最終的に、優れた骨組織品質の回復を示す生物力学的パラメーターの改善も証明された（図２８）。これらの結果から、本発明者らの処置により誘導された骨吸収の増加は、ＡＤＯ２マウスの骨表現型を修正することにおいて有効であったことが示される。
【００９７】
治療の研究を完成させるために、変異ｐ．Ｇ２１５Ｒ、ｐ．Ｒ２８６Ｗ及びｐ．Ｒ７６７Ｗを有するコンストラクトでトランスフェクトされた健康なドナー由来の破骨細胞におけるヒト変異ＣＬＣＮ７発現の低減における同定されたｓｉＲＮＡの能力、加えて患者から得られた破骨細胞における骨吸収を改善するｐ．Ｇ２１５Ｒ特異的ｓｉＲＮＡの能力（図２９）をさらに確認した。
【００９８】
インビボで分析されるｐ．Ｒ７６７Ｗ変異及び他のあらゆる変異に関するｓｉＲＮＡと同様に、実行の時間とコストの両方を考慮すれば、現時点で各変異につきマウスモデルを生成する可能性を提案することはできない。それゆえに、本発明者らがインビトロで活性であることを見出したｐ．Ｒ７６７Ｗ  ｓｉＲＮＡ  ２Ｃのインビボにおける有効性を試験するために、代替の戦略を採用した。ヒト乳がんＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、ｐ．Ｒ７６７Ｗ−ＣＬＣＮ７／ＥＧＦＰ−Ｃ１ベクターで安定してトランスフェクトし、インビトロにおいてＲ７６７Ｗ  ｓｉＲＮＡ  ２Ｃで処置して、ＣＬＣＮ７変異ｍＲＮＡのサイレンシングに対するその有効性及び特異性を確認した（図３０Ａ）。次いで、ｐ．Ｒ７６７Ｗ−ＣＬＣＮ７／ＥＧＦＰ−Ｃ１ベクターでトランスフェクトされた細胞を、無胸腺（免疫無防備状態）のＢａｌｂ／ｃ  ｎｕ／ｎｕマウスの皮下組織に注射したところ、マウスは肉眼的に明らかな腫瘍を形成した。腫瘍が１ｃｍ３の体積に達したら、マウスを、体重１Ｋｇ当たり４ｍｇのＲ７６７Ｗ  ２Ｃ／ｊｅｔＰＥＩ  ｓｉＲＮＡの単回の腹膜内注射で処置した。４８時間後、マウスを屠殺し、腫瘍を切り出し、変異遺伝子にコンジュゲートしたＥＧＦＰ転写の発現についてリアルタイムＲＴ−ＰＣＲで分析した。これらの実験条件下で、腫瘍で発現されたｐ．Ｒ７６７Ｗ−ＣＬＣＮ７／ＥＧＦＰ転写物の約５０％の低減が達成された。本発明者らが企図したｓｉＲＮＡの特異性をチェックするために、同様にＷＴ  ＣＬＣＮ７遺伝子に関するｓｉＲＮＡを使用することによって同じ処置プロトコールを実行したところ、変異コンストラクトとコンジュゲートしたＥＧＦＰの転写発現の変化は見出されなかった（図３０）。
（参考文献）
0006795492.tif 000008
0006795492.tif 000009
【図１】
0006795492.tif 000011
【図２】
0006795492.tif 000012
【図３】
0006795492.tif 000013
【図４】
0006795492.tif 000014
【図５】
0006795492.tif 000015
【図６】
0006795492.tif 000016
【図７】
0006795492.tif 000017
【図８】
0006795492.tif 000018
【図９】
0006795492.tif 000019
【図１０】
0006795492.tif 000020
【図１１】
0006795492.tif 000021
【図１２】
0006795492.tif 000022
【図１３】
0006795492.tif 000023
【図１４】
0006795492.tif 000024
【図１５】
0006795492.tif 000025
【図１６】
0006795492.tif 000026
【図１７】
0006795492.tif 000027
【図１８】
0006795492.tif 000028
【図１９】
0006795492.tif 000029
【図２０】
0006795492.tif 000030
【図２１】
0006795492.tif 000031
【図２２】
0006795492.tif 000032
【図２３】
0006795492.tif 000033
【図２４】
0006795492.tif 000034
【図２５】
0006795492.tif 000035
【図２６】
0006795492.tif 000036
【図２７】
0006795492.tif 000037
【図２８】
0006795492.tif 000038
【図２９】
0006795492.tif 000039
【図３０】
0006795492.tif 000040
【配列表】
0006795492000001.app