(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
歯周炎の診断を補助する方法であって、
歯毎に採取された歯肉溝滲出液からｍｉＲＮＡを抽出し、
得られた試料中の歯周炎患者で発現増強するｍｉＲＮＡとしてｈｓａ−ｍｉＲ−２２３−３ｐ、及び歯周炎患者で発現減少するｍｉＲＮＡとしてｈｓａ−ｍｉＲ−２００ｃ−３ｐのｍｉＲＮＡ量と、
ｈｓａ−ｍｉＲ−１０１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７４ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５８２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９４−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０１ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４０−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５９０−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３８−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４４−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４４−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｅ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４３−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ｂ−５ｐからなる歯周炎患者で発現増強するｍｉＲＮＡ群から選択される少なくとも１つ、
及びｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０３ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２００ｃ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８７−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２００ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９９ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１０−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｉ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１００−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２００ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２００ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｅ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０５−５ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９３ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６５ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２−３ｐからなる歯周炎患者で発現減少するｍｉＲＮＡ群から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡ量を検出し、
参照標準として、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２４−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｃ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０７、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２４−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｄ−５ｐの少なくとも１つ以上を用い、
参照標準に対して比較解析することを特徴とする検査方法。
【請求項２】
歯周炎の診断を補助する方法であって、
歯毎に採取された歯肉溝滲出液からｍｉＲＮＡを抽出し、
ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７４ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５８２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９４−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０１ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４０−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５９０−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３８−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４４−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４４−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｅ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２００ｃ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０３ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２００ｃ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８７−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２００ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９９ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１０−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｉ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１００−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２００ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２００ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｅ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０５−５ｐからなるｍｉＲＮＡ量を検出し、
参照標準として、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２４−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｃ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０７、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２４−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｄ−５ｐからなるｍｉＲＮＡを用い、
健常者、歯周炎患者のｍｉＲＮＡ発現パターン、及び参照標準に対して比較解析することを特徴とする検査方法。
【請求項３】
ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７４ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５８２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９４−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０１ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４０−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５９０−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３８−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４４−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４４−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｅ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４３−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ｂ−５ｐからなる歯周炎患者で発現増強するｍｉＲＮＡ群から選択される少なくとも１つ、
及びｈｓａ−ｍｉＲ−２００ｃ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０３ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２００ｃ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８７−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２００ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９９ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１０−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｉ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１００−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２００ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２００ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｅ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０５−５ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９３ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６５ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２−３ｐからなる歯周炎患者で発現減少するｍｉＲＮＡ群から選択される少なくとも１つ、
及び参照標準として、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２４−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｃ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０７、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２４−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｄ−５ｐの少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現量を検出するための配列を有する核酸を固定したアレイを含む歯周炎検査キット。
【請求項４】
前記アレイが少なくともｈｓａ−ｍｉＲ−２２３−３ｐ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−２００ｃ−３ｐの発現量を検出するための配列を有する核酸を固定したものであることを特徴とする請求項３記載の歯周炎検査キット。
【請求項５】
前記アレイが、
少なくともｈｓａ−ｍｉＲ−２２３−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７４ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５８２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９４−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０１ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４０−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５９０−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３８−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４４−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４４−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｅ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２００ｃ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０３ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２００ｃ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８７−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２００ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９９ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１０−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｉ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１００−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２００ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２００ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｅ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０５−５ｐの発現量を検出するための配列を有する核酸と、
参照標準として、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２４−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｃ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０７、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２４−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｄ−５ｐを固定したアレイであることを特徴とする請求項３又は４記載の歯周炎検査キット。
【請求項６】
歯肉溝滲出液採取用ペーパーストリップ、
ｍｉＲＮＡ抽出試薬、
ｍｉＲＮＡ検出試薬を含むことを特徴とする請求項３〜５いずれか１項記載の歯周炎検査キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規の分子マーカーを用いた歯周炎検査キット、及び検査方法に関する。特に、歯肉溝滲出液（Ｇｉｎｇｉｖａｌ  Ｃｒｅｖｉｃｕｌａｒ  Ｆｌｕｉｄ、以下ＧＣＦと記載することもある。）からｍｉＲＮＡを抽出し、ｍｉＲＮＡをマーカーとする検査キット、及び検査方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
歯周病はう蝕とともに、歯の二大疾患である。歯周病は歯肉炎と歯周炎とに分けられるが、最終的な歯の喪失に至るのは、いわゆる歯槽膿漏といわれる歯周炎である。歯周病は世界で最も多い疾患の一つであるともいわれ、成人の約半数が罹患していると言われている（非特許文献１）。【０００３】
歯周炎は、歯根と歯槽骨間の歯根膜組織に影響を及ぼす慢性炎症性疾患である。進行した歯周炎では、歯と歯肉間の隙間である歯周ポケットが深くなり、歯を支持している結合組織である歯根膜線維や歯槽骨の破壊が生じ、歯がぐらつくようになり、最終的には歯が抜けてしまう。【０００４】
高齢者では、生活の質を損なうような重度の歯周炎に罹患する傾向がある。歯周炎は、メタボリック・シンドローム、冠動脈疾患、糖尿病のような全身性疾患と関連性があることも指摘されており（非特許文献２〜４）、歯周炎の治療と予防は歯科分野だけではなく、一般的な健康状態に関わる問題ともなる。したがって、歯周炎の早期発見は、全身の健康状態を維持するうえでも重要である。【０００５】
現在のところ、歯周炎の検査は、プロービング、Ｘ線写真、歯肉炎指数、プラークの付着状態、動揺度の検査などによって行われている。これらの検査は、歯科医の主観が入り込みやすい非定量的な検査であり、歯科医の経験による部分が大きかった。そのため、歯周炎の治療法に関しても、プラークコントロールを中心とした画一的なものとなっていた。したがって、より客観的に歯周組織の状態を捉え、歯周炎の検査を行うことのできる方法が必要とされていた。【０００６】
従来から歯周炎を含む歯周病に関して客観的なデータを得ることができる検査方法として様々な方法が提案されている。特許文献１には、歯肉溝滲出液及び／又は唾液サンプル中のタンパク質バイオマーカーをプロテオーム分析により歯周疾患の状態を診断する方法が記載されている。特許文献２には、遺伝子多型を検出することにより侵襲性歯周炎を検査する方法が開示されている。特許文献３〜５には、歯肉溝滲出液や唾液中のタンパク質を免疫学的に検出することにより歯周病を検査する方法が開示されている。【０００７】
また、近年、様々な疾患においてｍｉＲＮＡによって診断や治療を行う方法が開示されている。ｍｉＲＮＡは、鎖長２１〜２５ｎｔの短いＲＮＡであり、標的ｍＲＮＡの３´-ＵＴＲに結合して遺伝子の発現を調節する機能を担っている。最近の研究によって、ｍｉＲＮＡは、細胞の分化のような生物学的過程、あるいは癌化のような病理学的過程を調節することが明らかとなってきている（非特許文献５、６）。特に血液や尿などの体液からｍｉＲＮＡを抽出し、検出することにより診断を行ったり、ｍｉＲＮＡを治療に用いる方法が開示されている（例えば、特許文献６、７）。歯周疾患でもｍｉＲＮＡを用いた検査、診断方法が開示されている（非特許文献７〜９）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特表２０１５−５２９３３３号公報
【特許文献２】国際公開第２００４／０４２０５４号
【特許文献３】特開２０１６−０３１３０６号公報
【特許文献４】特開２０１３−２５７３１２号公報
【特許文献５】特開２００９−０５２９４５号公報
【特許文献６】特開２０１５−２３１３７６号公報
【特許文献７】特表２０１４−５２７８０７号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Eke, P.I. et al., 2015, J Periodontol.Vol.86(5), pp.611-622.
【非特許文献２】Kaye, E.K. et al., 2016, J Dent Res.,. pii:0022034516641053.
【非特許文献３】Ryden, L., et al., 2016, Circulation. Vol.133(6),pp.576-583.
【非特許文献４】Gurav, A. & Jadhav, V. 2011, J.Diabetes. Vol.3(1), pp.21-28.
【非特許文献５】Gregory, P.A. et al., 2008, Nat. Cell Biol.Vol.10(5), pp.593-601.
【非特許文献６】Johnson, S.M. et al., 2005, Cell.Vol.120(5), pp.635-647.
【非特許文献７】Stoecklin-Wasmer C.et al., 2012, J. Dent. Res. Vol.91(10), pp.934-940.
【非特許文献８】Xie Y.F. et al., 2011, Int. J. Oral. Sci. Vol.3(3), pp.125-134.
【非特許文献９】Ogata Y. et al., 2014, J. Oral Sci. Vol.56(4), pp.253-260.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかしながら、特許文献１〜５に記載のいずれの方法も、臨床的に実用化されていない。特許文献１に記載の方法は、正確な診断を行えると考えられるが、プロテオーム解析を行う必要があるため、大掛かりな機械と複雑な解析方法が必要である。特許文献２に記載の方法は、ＳＮＰｓ解析であることから、現在の歯周炎の状態を把握するものではない。特許文献３〜５に記載の方法は、試験紙を用いる方法であることから歯科クリニックでも行うことが可能な方法ではあるが、従来から行われているプロービング等の診断方法に比べて、より正確に診断を行うことができるというわけではなく、さほど普及していないのが現状である。また、非特許文献７〜９に開示されている方法は、患者の歯周組織を用いて行う必要があるため、一般的な歯周炎の検査として普及するにはいたっていない。【００１１】
本発明は、歯周炎の客観的なデータが得られるだけではなく、歯肉滲出液（ＧＣＦ）を用いた非侵襲的検査方法、及び検査キットを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、以下の検査方法、バイオマーカー、及び検査キットに関する。
（１）歯毎に採取された歯肉溝滲出液からｍｉＲＮＡを抽出し、得られた試料中のｈｓａ−ｍｉＲ−２２３−３ｐ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−２００ｃ−３ｐのｍｉＲＮＡ量と、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７４ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５８２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９４−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０１ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４０−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５９０−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３８−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４４−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４４−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｅ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４３−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ｂ−５ｐからなる群から選択される少なくとも１つ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０３ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２００ｃ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８７−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２００ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９９ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１０−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｉ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１００−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２００ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２００ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｅ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０５−５ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９３ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６５ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２−３ｐからなる群から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡ量を検出し、参照標準に対して比較解析することを特徴とする歯周炎の検査方法。
（２）歯毎に採取された歯肉溝滲出液からｍｉＲＮＡを抽出し、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７４ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５８２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９４−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０１ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４０−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５９０−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３８−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４４−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４４−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｅ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２００ｃ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０３ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２００ｃ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８７−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２００ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９９ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１０−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｉ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１００−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２００ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２００ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｅ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０５−５ｐからなるｍｉＲＮＡ量を検出し、参照標準に対して比較解析することを特徴とする歯周炎の検査方法。
（３）前記参照標準として、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２４−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｃ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０７、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２４−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｄ−５ｐの少なくとも１つ以上を用いることを特徴とする（１）又は（２）に記載の検査方法。
（４）ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７４ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５８２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９４−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０１ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４０−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５９０−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３８−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４４−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４４−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｅ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４３−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ｂ−５ｐからなる群から選択される少なくとも１つ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−２００ｃ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０３ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２００ｃ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８７−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２００ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９９ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１０−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｉ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１００−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２００ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２００ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｅ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０５−５ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９３ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６５ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２−３ｐからなる群から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡを含む歯周炎バイオマーカー。
（５）少なくともｈｓａ−ｍｉＲ−２２３−３ｐ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−２００ｃ−３ｐを含むことを特徴とする（４）記載の歯周炎バイオマーカー。
（６）ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７４ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５８２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９４−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０１ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４０−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５９０−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３８−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４４−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４４−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｅ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２００ｃ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０３ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２００ｃ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８７−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２００ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９９ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１０−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｉ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１００−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２００ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２００ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｅ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０５−５ｐからなるｍｉＲＮＡであることを特徴とする（４）又は（５）記載の歯周炎バイオマーカー。
（７）参照標準として、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２４−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｃ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０７、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２４−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｄ−５ｐの少なくとも１つ以上を含むことを特徴とする（４）〜（６）のいずれか１つ記載の歯周炎バイオマーカー。
（８）ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７４ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５８２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９４−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０１ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４０−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５９０−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３８−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４４−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４４−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｅ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４３−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ｂ−５ｐからなる群から選択される少なくとも１つ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−２００ｃ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０３ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２００ｃ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８７−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２００ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９９ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１０−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｉ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１００−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２００ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２００ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｅ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０５−５ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９３ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６５ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２−３ｐからなる群から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現量を検出するための配列を有する核酸を固定したアレイを含む歯周炎検査キット。
（９）前記アレイが少なくともｈｓａ−ｍｉＲ−２２３−３ｐ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−２００ｃ−３ｐの発現量を検出するための配列を有する核酸を固定したものであることを特徴とする（８）記載の歯周炎検査キット。
（１０）前記アレイが、少なくともｈｓａ−ｍｉＲ−２２３−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７４ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５８２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９４−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０１ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４０−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５９０−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３８−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４４−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４４−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｅ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２００ｃ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０３ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２００ｃ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８７−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２００ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９９ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１０−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｉ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１００−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２００ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２００ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｅ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０５−５ｐの発現量を検出するための配列を有する核酸を固定したアレイであることを特徴とする（８）又は（９）記載の歯周炎検査キット。
（１１）参照標準として、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２４−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｃ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０７、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２４−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｄ−５ｐの少なくとも１つ以上をアレイに含むことを特徴とする（８）〜（１０）のいずれか１つ記載の歯周炎検査キット。
（１２）歯肉溝滲出液採取用ペーパーストリップ、ｍｉＲＮＡ抽出試薬、ｍｉＲＮＡ検出試薬を含むことを特徴とする（８）〜（１１）いずれか１項記載の歯周炎検査キット。
（１３）歯毎に採取された歯肉溝滲出液からｍｉＲＮＡを抽出し、表３〜表６に記載されるｍｉＲＮＡの群から選択される少なくとも１つ以上のｍｉＲＮＡ量を検出することを特徴とする歯周炎の検査方法。
【発明の効果】
【００１３】
ＧＣＦを用い、正確に歯周炎の診断を行うことのできる検査方法、及び検査キットを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】歯肉溝滲出液から抽出したｍｉＲＮＡの電気泳動図。
【図２】歯肉溝滲出液試料セット＃１のｍｉＲＮＡ解析を示す図。図２Ａは主成分分析結果を、図２Ｂは、Ｖｏｌｃａｎｏプロットを示す図。
【図３】歯肉溝滲出液試料セット＃２のｍｉＲＮＡ解析を示す図。図３Ａは、健常者、歯周炎患者のｍｉＲＮＡ発現の２Ｄ  ｈｉｅｒａｒｃｈｉａｌ  ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ解析の結果を示す図。図３Ｂは、Ｖｏｌｃａｎｏプロットを示す図。図３Ｃは、各ＲＮＡの発現レベルをＢｏｘプロットで表した図。
【図４】２つの異なる試料セットの比較を示した図。図４Ａは、４０個のｍｉＲＮＡの発現の比（-ΔΔＣｑ値）の試料セット＃１、セット＃２間の相関を示した図。図４Ｂは、４０個のｍｉＲＮＡの発現レベルをＢｏｘプロットで表した図。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明はＧＣＦからＲＮＡを単離して、ｍｉＲＮＡを解析することを特徴としている。これまでのｍｉＲＮＡによる歯周炎の検査は、歯肉組織を用いて行われていた。本発明の検査方法はＧＣＦからｍｉＲＮＡを単離して検査する非侵襲的な検査であり、患者の負担が少ない。また、歯周炎が疑われる歯ごとにＧＣＦを採取することができるため、唾液を用いた検査では行うことができなかった、歯周炎に罹患している歯を特定し、歯毎に歯周炎の状態を客観的に判断することが可能となった。
【００１６】
本発明では歯周炎患者で特異的に発現の変化が見られるｍｉＲＮＡを開示し、特に４０のｍｉＲＮＡをパネルとして用いることにより、正確な検査が行えることを開示している。ただし、簡便な検査では、ここで示した歯周炎に特異的なｍｉＲＮＡの発現量を求めることができればいいので、参照となるｍｉＲＮＡ量と、歯周炎で変化が見られたｍｉＲＮＡ量を１つ以上選択して測定すればよい。また、歯周炎患者で発現増強が確認されたｍｉＲＮＡと、減少が確認されたｍｉＲＮＡを組み合わせて検査に用いれば、より正確に診断を行うことができることから好ましい。
【００１７】
また、ｍｉＲＮＡの定量はここでは定量的ＰＣＲ法によって行ったが、ｍｉＲＮＡ量を定量することができれば、どのような方法を用いてもよい。
【００１８】
また、以下で示すパネルとして用いる４０のｍｉＲＮＡは、そのうちのいくつかを選択して用いてもよいし、本発明で開示している他のｍｉＲＮＡと入れ替えて検査に用いてもよい。以下、解析結果を挙げながら本発明を詳細に説明する。
【００１９】
≪対象者≫
以下にデータを示す試料は、東京医科歯科大学の倫理委員会で承認された研究に基づき、インフォームドコンセントを得たうえで患者、及び健常者のボランティアから得られたものである。歯周炎の診断は、歯周ポケットの深さ、プロービングの際の出血によって行った。なお、ＧＣＦの採取は、診断に先立って行っている。また、歯周炎患者の一人が、軽度の糖尿病を併発していた他は、全身性疾患を伴っていたものはいない。なお、糖尿病を併発していた歯周炎患者の糖尿病も軽度であり投薬治療は受けてはいない。
【００２０】
解析を行った対象は、以下の表１、表２に示す健常者、歯周炎患者から得たものである。表１で示す８名の対象は、健常者５名、歯周炎患者３名であり、平均年齢は夫々３８歳、５３歳である。また、表２で示す１２名の対象者は、健常者６名、歯周炎患者６名であり、平均年齢は夫々２８歳、６５歳であった。
【００２１】
【表１】
0006800470.tif 000002
【００２２】
【表２】
0006800470.tif 000003
【００２３】
表中の符号は以下のとおりである。Ｍ：男性、Ｆ：女性、Ｈ：健常者、ＣＰ：慢性歯周炎（ｃｈｒｏｎｉｃ  ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｉｔｉｓ）、ＡｇＰ：侵襲性歯周炎（ａｇｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｉｔｉｓ）、ＰＤ：歯周ポケット深さ（ｐｒｏｂｉｎｇ  ｐｏｃｋｅｔ  ｄｅｐｔｈ）、ＮＳ：非喫煙者、Ｓ：喫煙者なお、以下に示すデータのＨ１〜Ｈ１１は上記表に示す健常者のサンプルであることを示し、Ｐ１〜Ｐ９は同様に上記表に示す歯周炎患者のサンプルであることを示す。
【００２４】
≪歯肉溝滲出液（ＧＣＦ）の採取≫
ＧＣＦを採取する前に、歯肉縁上の歯垢、及び歯の周辺の唾液は綿球で除去し、エアードライヤーによって、ＧＣＦを採取する歯の周辺を乾燥させた。コットンロールによって、周辺から隔離した後に、濾紙片（Ｏｒａｌｆｌｏｗ社製）を歯周ポケットに穏やか挿入し、ＧＣＦを採取した。血液が付着している濾紙片は解析には用いなかった。
複数の濾紙片により、各対象者から約４．８μｌのＧＣＦを採取して解析に用いた。濾紙は６０μｌのリン酸緩衝液を含むチューブに集め、急速凍結し、ＲＮＡを単離するまで保存した。
【００２５】
≪ＲＮＡの単離≫
以下のようにして、ＧＣＦからＴｒｉｚｏｌ  ＬＳ試薬（ライフテクノロジーズ社製）を用いてＲＮＡを抽出した。ＧＣＦは、７５０μｌのＴｒｉｚｏｌ  ＬＳ試薬に溶解し、ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ精製水により１ｍｌになるように調整した。次に、０．２ｍｌのクロロホルムを加え、水相を集め、イソプロパノールを加えた。遠心して沈殿を集め、乾燥してエタノールで洗浄後、５０μｌのｎｕｃｌｅａｓｅ−ｆｒｅｅ精製水に溶解した。ＲＮＡの精製度と濃度はＮａｎｏＤｒｏｐ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を用いて測定した。Ａ２６０／２３０の比が０．９〜１．６、Ａ２６０／２８０の比が１．６〜１．８の試料をｍｉＲＮＡ解析に用いた。
【００２６】
ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ量は、ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  ｎａｎｏ  ａｓｓａｙを用い、Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００  ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ（アジレント・テクノロジー社製）によって測定した。電気泳動図はいずれの試料もきれいなピークを示した。一例を図１に示す。図１の左パネルは健常者、右パネルは歯周炎患者から得られたＲＮＡ試料の電気泳動図を示している。どちらの試料も２５〜２００ｎｔのｓｍａｌｌ  ＲＮＡのピークが観察される。
【００２７】
≪ｍｉＲＮＡの発現解析≫
ｍｉＲＮＡ発現解析は、ｍｉＲＣＵＲＹ  ＬＮＡ（登録商標）  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＲＴ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｅｘｉｑｏｎ社製）を用いて解析した。一本鎖ｃＤＮＡは８μｌのＲＮＡからｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｋｉｔ  ＩＩ（Ｅｘｉｑｏｎ社製）を用いて合成した。合成したｃＤＮＡは希釈し、ＥｘｉＬＥＴ  ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘと混合しＨｕｍａｎ  ｍｉＲＮｏｍｅ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ＰＣＲ  ｐａｎｅｌ（Ｅｘｉｑｏｎ社製）に分注し、定量的ＰＣＲをＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ４８０  Ｒｅａｌ-Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ（ロシュ社製）を用いて行った。
【００２８】
参照プローブとして、ＧＣＦで発現が安定していたｈｓａ−ｍｉＲ−３２４−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｃ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０７、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２４−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｄ−５ｐを正規化に用いた。正規化した値はΔＣｑと表している。
【００２９】
≪解析結果≫
表１に示す５名の健常者、３名の歯周炎患者から採取したＧＣＦのｍｉＲＮＡ（試料セット＃１）を解析した。健常者のＧＣＦを採取した部位は、歯周ポケット深さが３ｍｍ以下であり、プロービングによる出血は見られなかった。一方、歯周炎患者は歯周ポケット深さが３ｍｍより大きく（ほとんどの歯周ポケット深さは４〜８ｍｍ）、多くの患者でプロービングによる出血が観察された。
【００３０】
主成分解析（ＰＣＡ）によるｍｉＲＮＡ発現パターンは健常者、歯周炎患者ではっきりと２つに分かれて分布していた（図２Ａ）。表１に示す５名の健常者（Ｈ１〜Ｈ５）、３名の歯周炎患者（Ｐ1〜Ｐ３）から得られたＲＮＡ試料を解析した結果は、両者の発現パターンが異なることを示している。Ｘ軸は、ＰＣＡ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  １（ＰＣ１：４６．９％  ｖａｒｉａｎｃｅ）、Ｙ軸はＰＣＡ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ２（ＰＣ２：１５．７％  ｖａｒｉａｎｃｅ）を示す。
【００３１】
７５１のヒトｍｉＲＮＡのプライマーセットのうち、健常者、歯周炎患者の各群の夫々少なくとも一人から６１９のｍｉＲＮＡの発現データを得ることができた。それらのうち、歯周炎患者において３３２のｍｉＲＮＡは発現増強が認められ、２８７のｍｉＲＮＡは発現減少が認められた（図２Ｂ）。Ｘ軸は、−ΔΔＣｑ値で表す相対的な発現比を示し、Ｙ軸は２群間でのｔ-テストから得られた−ｌｏｇ１０（ｐ−ｖａｌｕｅ）を表している。
【００３２】
黒丸（●）で示したのは、ｐ値が＜０．０５、ΔΔＣｑ＞１．０、又はΔΔＣｑ＜−１．０（図２Ｂにカットオフとして線で示している。）のｍｉＲＮＡであり、歯周炎患者で有意に発現増強、又は減少が見られるものを示す。
【００３３】
歯周炎患者で、有意に発現減少、又は発現増強が観察されたｍｉＲＮＡは、夫々６３（表３）、５５個（表４）あった。これらのｍｉＲＮＡは歯周炎患者と健常者との間で発現に有意な差が見られたｍｉＲＮＡであることから、単独で用いても、いくつかを組み合わせて検査に用いてもよい。また、正確な診断を行うためには、複数のｍｉＲＮＡを組み合わせて検査に用いるのが好ましい。
【００３４】
【表３】
0006800470.tif 000004
【００３５】
【表４】
0006800470.tif 000005
【００３６】
さらに、上記の結果において、ΔＣｑ値が低いほどｍｉＲＮＡの発現量が多く、検出感度が比較的良いと想定される。したがってΔＣｑ＜−２．５、ｐ値が＜０．０５、ΔΔＣｑ＞０．７、又はΔΔＣｑ＜−０．７、との基準を満たすｍｉＲＮＡを歯肉溝滲出液試料セット＃１の解析結果から抽出した（表５）。したがって、表５に示すｍｉＲＮＡは単独、あるいはいくつかを組み合わせて歯周炎の診断マーカーとして好ましく用いることができる。特に、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２００ｃ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐは、感度も再現性も良いことから、マーカーとして好ましく用いることができる。
【００３７】
【表５】
0006800470.tif 000006
【００３８】
また、各ｍｉＲＮＡの機能により着目して、次の５つの基準に基づいて発現量に変化が見られたｍｉＲＮＡから４０個のｍｉＲＮＡを抽出した。
（１）健常者、歯周炎患者で有意に差が認められるもの（できればｐ値が０．０５より小さいもの）
（２）初期の発現レベルが高いと考えられるΔＣｑ値が比較的小さいもの
（３）ΔＣｑ値の差（ΔΔＣｑ）が大きいもの
（４）標的遺伝子が機能的に重要であると示唆されているもの、又はこれまでの研究成果により確認されているもの
（５）歯周炎との関連が今までの研究により報告されているもの
【００３９】
各ｍｉＲＮＡについて上記５つの基準で評価し、表６に示す１９の歯周炎患者で発現増強が認められるｍｉＲＮＡ、２１の発現減少が認められるｍｉＲＮＡを抽出した。また、上述のように、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２４−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｃ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０７、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２４−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｄ−５ｐの５つのｍｉＲＮＡは、すべての試料で安定して発現していたことから、参照ｍｉＲＮＡ（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｍｉＲＮＡ）として、以後の実験解析に含め、正規化に用いた。なお、表６の分子のうち、表中ハイライトの付してあるｈｓａ−ｍｉＲ−１０１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７４ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５８２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８７−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２００ｃ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２００ｃ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０３ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１−３ｐは、今までに歯周炎、歯周病との関連が全く知られていない分子である。
【００４０】
【表６】
0006800470.tif 000007
【００４１】
表１の試料を用いて得られた結果を評価するために、次に表２で示した対象から得られた試料を用いて上記で選択した４０のｍｉＲＮＡの発現を測定した。健常者６名、歯周炎患者６名から得られた結果は、両者ではっきりとした差があることが示された（図３Ａ）。なお、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ−５ｐはＰ７の試料で増幅することができなかったため、図３Ａでは、これを除いて表示している。
【００４２】
選択した４０のｍｉＲＮＡの発現レベルをＶｏｌｃａｎｏプロットで示す（図３Ｂ）。図２Ｂと同様に、Ｘ軸は、−ΔΔＣｑ値で表す相対的な発現比を示し、Ｙ軸は２群間でのｔ-テストから得られた−ｌｏｇ１０（ｐ−ｖａｌｕｅ）を表している。黒丸（●）で示したのは、ｐ値が＜０．０５、｜ΔΔＣｑ｜＞１．０のｍｉＲＮＡを示す。３４のｍｉＲＮＡは発現レベルのｐ値＜０．００５であり、１７のｍｉＲＮＡはΔΔＣｑ＞１．０、又は＜−１．０と有意差があった。
【００４３】
さらに、各ｍｉＲＮＡの発現レベルをＢｏｘプロットで表した（図３Ｃ）。白抜きの四角は、健常者、灰色の四角は歯周炎患者の結果を示す。横棒は各中央値を示している。上段のパネルは１９の歯周炎患者で発現増強の見られたｍｉＲＮＡ、下段は発現減少の見られたｍｉＲＮＡの解析結果である。ΔＣｑ値から判断すると、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０３ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０５−５ｐがＧＣＦでの発現レベルが高いことが明らかとなった。したがって、これらのｍｉＲＮＡの少なくともいずれかを検出することにより、感度良く測定を行うことができる。
【００４４】
次に、表１、表２で示した試料間で、４０のｍｉＲＮＡの発現の比（−ΔΔＣｑ値）に相関があるか解析を行った。図４Ａは試料間の値を散布図で示したものである。Ｓｐｅａｒｍａｎの相関係数（ρ）は０．９５であり両者に強い相関があることが示された。
【００４５】
さらに、各対象において、歯周炎患者において発現増強が認められた１９のｍｉＲＮＡ、発現減少が認められた２１のｍｉＲＮＡに関して、表１、表２の各対象において、ΔＣｑ値の分布を比較した（図４Ｂ）。表１、表２、どちらの試料であっても発現増強、発現減少を示すｍｉＲＮＡの特徴的なパターンは同様であった。これらの結果は選択した４０のｍｉＲＮＡの発現が歯周炎患者の特徴を表す、再現性の良いものであることを示している。
【００４６】
以上の結果から、歯周炎の診断を行う検査には、上記表６に選択した４０のｍｉＲＮＡをパネルとして用いれば正確な診断を行うことができる。しかし、これら４０のｍｉＲＮＡをすべて使用する必要はなく、必要に応じて選択して用いることもできる。また、表６の４０のｍｉＲＮＡ以外にも、表３〜５に示したｍｉＲＮＡは歯周炎の患者で特異的に変化が見られることから好ましく用いることができる。特に、ｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４３−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９３ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６５ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２−３ｐは感度も良く検出を行うことができるので、歯周炎の検査に好ましく用いることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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