(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＨ３ＹＬ１遺伝子の発現レベルまたはＳＨ３ＹＬ１タンパク質のレベルを測定することができる物質を含有する糖尿病性腎症診断用の組成物。
【請求項２】
上記ＳＨ３ＹＬ１遺伝子の発現レベルは発現の可否、発現量及び発現パターンで構成された群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の糖尿病性腎症診断用の組成物。
【請求項３】
上記ＳＨ３ＹＬ１タンパク質のレベルは上記タンパク質の存在の可否、発現量及び発現パターンで構成された群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の糖尿病性腎症診断用の組成物。
【請求項４】
上記ＳＨ３ＹＬ１遺伝子の発現レベルを測定することができる物質はＳＨ３ＹＬ１遺伝子を増幅することができるプライマー対または上記ＳＨ３ＹＬ１遺伝子とハイブリダイズすることができるプローブであることを特徴とする請求項１に記載の糖尿病性腎症診断用の組成物。
【請求項５】
上記ＳＨ３ＹＬ１タンパク質のレベルを測定することができる物質はＳＨ３ＹＬ１遺伝子がコードするタンパク質に特異的に結合する抗体またはアプタマーであることを特徴とする請求項１に記載の糖尿病性腎症診断用の組成物。
【請求項６】
糖尿病性腎症診断に必要な情報を提供するために、請求項１に記載の糖尿病性腎症診断用の組成物を生物学的試料に処理して、試料中のＳＨ３ＹＬ１遺伝子の発現レベルまたはＳＨ３ＹＬ１タンパク質のレベルを検出する方法。
【請求項７】
生物学的試料は、組織、細胞、血液、血清、血漿、唾液及び尿で構成された群から選択されることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ＳＨ３ＹＬ１遺伝子と特異的にハイブリダイズすることができるプローブが固定されている糖尿病性腎症診断用のマイクロアレイ。
【請求項９】
ＳＨ３ＹＬ１遺伝子またはＳＨ３ＹＬ１遺伝子に特異的に存在する塩基配列を含む断片を増幅することができるプライマー対、上記ＳＨ３ＹＬ１遺伝子と特異的にハイブリダイズすることができるプローブまたはＳＨ３ＹＬ１遺伝子がコードするタンパク質に特異的な抗体またはアプタマーを含有する糖尿病性腎症診断用のキット。
【請求項１０】
次の段階を含む糖尿病性腎症の予防または治療用の物質をスクリーニングする方法：
（ａ）ＳＨ３ＹＬ１遺伝子を発現する細胞に候補物質を接触させる段階；
（ｂ）ＳＨ３ＹＬ１遺伝子の発現レベル及び／またはＳＨ３ＹＬ１タンパク質のレベルを測定する段階；及び
（ｃ）ＳＨ３ＹＬ１遺伝子の発現レベル及び／またはＳＨ３ＹＬ１タンパク質のレベルが減少する場合の候補物質を糖尿病性腎症の予防または治療用の物質として選別する段階。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は腎症診断用のマーカーとしてのＳＨ３ＹＬ１の用途に関するもので、さらに詳しくはＳＨ３ＹＬ１遺伝子の発現レベルまたはＳＨ３ＹＬ１遺伝子がコードするタンパク質のレベルを測定することができる物質を含有する腎症診断用の組成物、腎症診断用のマイクロアレイ及び腎症診断用のキットに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
腎症疾患の中糖尿病性の血管合併症の中一つである糖尿病性腎症は末期腎不全症（ｅｎｄ  ｓｔａｇｅ  ｒｅｎａｌ  ｄｉｓｅａｓｅ：ＥＳＲＤ）を誘発する第一原因の疾患で、韓国で糖尿病によるＥＳＲＤ患者は１９９６年３０．８％から２００６年４２．３％、２０１３年４８．０％へ持続的に増加する傾向である。このような状況は現在まで知られている普遍的治療である食事、運動及び薬物療法が適切ではなかったという点と既存の糖尿病及び糖尿病性腎症の治療法の以外に病因に対する多様な接近が必要であることを示唆する。
【０００３】
現在糖尿病による腎症を予防するためにレニン−アンジオテンシン系（ｒｅｎｉｎ−ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  ｓｙｓｔｅｍ：ＲＡＳ）の抑制剤を主に使用している。ＲＡＳ抑制剤は血液動力学的の効能だけではなく慢性炎症反応あるいは繊維化を誘導するｃｙｔｏｋｉｎｅ、ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ、ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒなどの生成を阻害して腎臓機能を保護する優れた効果を示したが、患者個々の遺伝的性向が違って長期的治療による不作用及び治療剤に対する耐性問題があって治療効果がその期待に及ばない。
【０００４】
また、去る数年間、腎症に対する原因究明、診断方法及び治療方法に対する集中的な研究が行われたにもかかわらず今まで腎症を効果的に治療することができる確実な治療剤が開発されていない。従って糖尿病性腎症を初期段階で発見して治療することが最も効果的な方法と言える。
【０００５】
微細蛋白尿（２４時間尿アルブミン３０−３００ｍｇ／ｄまたはアルブミン排泄比率２０−２００μｇ／ｍｉｎ）は糖尿病性腎症の進行を初期に予測して、腎症外の血管合併症を予測するバイオマーカーで最も多く使用されている。既存の観察研究によると、微細蛋白尿は糸球体濾過率が減少を予測する危険因子でありながら、慢性腎不全へ進行する独立的な危険因子でもある。このような理由で、現在糖尿病の診断及び治療指針にも微細蛋白尿の測定を勧告している。
【０００６】
しかしながら、最近の研究は微細蛋白尿のみで腎症を早期診断して、進行する指標で判断するには制限があると報告している。
【０００７】
一つ目の理由で糖尿患者で微細蛋白尿の自然所失頻度が高いということである。微細蛋白尿を示した第１型または２型の糖尿患者で約２１−６４％の頻度で経過中微細蛋白尿の自然消失を示して、第１型の糖尿患者の１０年の追跡をした大規模の研究結果も、顕性蛋白尿へ進行した患者の頻度は２８％、微細蛋白尿の自然消失を示した患者の頻度は４０％で高かった。１年間２−３回の測定期間中、持続的に微細蛋白尿を示した第１型の糖尿患者を５年間追跡した研究でも６４％の頻度で微細蛋白尿の消失を報告した（Ｔａｂａｅｉ  ＢＰ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ，２４；１５６０−１５６６，２００１；Ｐｅｒｋｉｎｓ  ＢＡ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ  Ｅｎｇ  Ｊ  Ｍｅｄ，３４８：２２８５−２２９３，２００３；Ｈｏｖｉｎｄ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＪ，３２８：１１０５，２００４；Ｓｔｅｉｎｋｅ  ＪＭ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ，５４：２１６４−２１７１，２００５；Ｄｅ  Ｂｏｅｒ  ＩＨ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈ  Ｉｎｔｅｒｎ  Ｍｅｄ，１７１：４１２−４２０，２０１１；Ｇａｅｄｅ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｐｈｒｏｌ  Ｄｉａｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，１９：１７８４−１７８８，２００４；Ａｒａｋｉ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ，５４：２９８３−２９８７，２００５；Ｙａｍａｄａ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ，２８：２７３３−２７３８，２００５；ＲＪ  Ｍａｃｌｓａａｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｋｉｎｄｎｅｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，８６：５０−５７，２０１４）。
【０００８】
二つ目の理由で微細蛋白尿がなく腎機能が低下された（糸球体濾過率＜６０ｍｌ／ｍｉｎ／１．７３ｍ２）糖尿患者の頻度が高いということである。１９９０年代初の研究によると微細蛋白尿のなく腎機能が低下されている第１型の糖尿患者で組織検査結果、典型的な糖尿病性腎症を示した患者群があって、第１型及び２型の糖尿患者で約３０％で腎機能の低下が進行された。また、第２型の糖尿患者を追跡した研究では微細蛋白尿の発生に先行して腎機能の低下が発生する結果を示した（Ｔｓａｌａｍａｎｄｒｉｓ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．，４３：６４９−６５５，１９９４；Ｙｏｋｏｙａｍａ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｐｈｒｏｌ  Ｄｉａｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，２４：１２１２−１２１９，２００９；Ｍｏｌｉｔｈ  ＭＥ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ，３３：１５３６−１５４３，２０１０；Ｋｒａｍｅｒ  ＨＪ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＡＭＡ，２８９：３２７３−３２７７，２００３）。
【０００９】
よって、本発明者らは腎症を早期に診断することができる新しい方法を開発しようと鋭意努力した結果、腎症患者の血液でＳＨ３ＹＬ１遺伝子の発現レベルまたはＳＨ３ＹＬ１タンパク質のレベルが非−腎症患者の血液での数値に比べ有意的に増加することを確認して本発明を完成するようになった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的はＳＨ３ＹＬ１遺伝子の発現レベル及び／またはＳＨ３ＹＬ１タンパク質のレベルを測定して腎症を早期に診断することができる腎症診断用の組成物を提供することである。
【００１１】
本発明の他の目的は腎症診断に必要な情報を提供するために、ＳＨ３ＹＬ１遺伝子の発現レベル及び／またはＳＨ３ＹＬ１タンパク質のレベルを測定及び検出する方法を提供することである。
【００１２】
本発明のまた他の目的はＳＨ３ＹＬ１遺伝子の発現レベル及び／またはＳＨ３ＹＬ１タンパク質のレベルを検出することができるマイクロアレイを提供することである。
【００１３】
本発明のまた他の目的はＳＨ３ＹＬ１遺伝子の発現レベル及び／またはＳＨ３ＹＬ１タンパク質のレベルを測定して腎症を早期に診断することに活用されることができるキットを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
上記目的を達成するために本発明はＳＨ３ＹＬ１遺伝子の発現レベルまたはＳＨ３ＹＬ１タンパク質のレベルを測定することができる物質を含有する腎症診断用の組成物を提供する。
【００１５】
本発明はまた、腎症診断に必要な情報を提供するために、上記腎症診断用の組成物を患者から採取した生物学的試料に処理して、試料中のＳＨ３ＹＬ１遺伝子の発現レベルまたはＳＨ３ＹＬ１タンパク質のレベルを検出する方法を提供する。
【００１６】
本発明はまた、ＳＨ３ＹＬ１遺伝子またはその断片とハイブリダイズすることができるプローブが固定されている腎症診断用のマイクロアレイを提供する。
【００１７】
本発明はまた、ＳＨ３ＹＬ１遺伝子またはその断片を増幅することができるプライマー対、上記ＳＨ３ＹＬ１遺伝子とハイブリダイズすることができるプローブまたはＳＨ３ＹＬ１遺伝子がコードするタンパク質に特異的な抗体またはアプタマーを含有する腎症診断用のキットを提供する。
【００１８】
本発明はまた、（ａ）ＳＨ３ＹＬ１遺伝子を発現する細胞に候補物質を接触させる段階；（ｂ）ＳＨ３ＹＬ１遺伝子の発現レベル及び／またはＳＨ３ＹＬ１タンパク質のレベルを測定する段階；（ｃ）ＳＨ３ＹＬ１遺伝子の発現レベル及び／またはＳＨ３ＹＬ１タンパク質のレベルが減少される場合の候補物質を腎症の予防または治療用の物質で選別する段階を含む腎症の予防または治療用の物質をスクリーニングする方法を提供する。
【００１９】
本発明はまた、ＳＨ３ＹＬ１遺伝子またはＳＨ３ＹＬ１タンパク質の腎症診断用のマーカーとしての用途を提供する。
【００２０】
本発明はまた、生物学的試料中のＳＨ３ＹＬ１遺伝子の発現レベルまたはＳＨ３ＹＬ１タンパク質のレベルを測定することを特徴とする腎症の診断方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１はＳＨ３ＹＬ１の線形構造を示したものである。
【図２】図２はＬＰＳによる細胞内のＳＨ３ＹＬ１の発現増加を確認した結果を示したものである。
【図３】図３はＨＰＭＥＣ細胞でＬＰＳ刺激によるＳＨ３ＹＬ１の細胞外分泌を確認した結果を示したものである。
【図４】図４は各患者群からＳＨ３ＹＬ１の濃度変化を示したものである。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
他の式で定義されない限り、本明細書で使用された全ての技術的及び科学的用語は本発明が属する技術分野で熟練された専門家によって通常的に理解されるものと同一な意味を有する。一般的に本明細書で使用された命名法は本技術分野でよく知られて通常的に使用されるものである。
【００２３】
既存に腎症診断のためにはＡｌｂｕｍｉｎｕｒｅａ、ｅＧＦＲ、ＵＡＣＲ、血中クレアチンなどがマーカーとして使用されているが、上記マーカーによる診断は腎臓が７０％以上壊れた後になってこそ可能であるという問題点があった。
【００２４】
本発明では新しい腎症診断用のマーカーを発掘するために腎臓組織及び非―腎臓組織で発現の違いを示す遺伝子の発現レベルまたはタンパク質のレベルを調査した結果、ＳＨ３ＹＬ１遺伝子及び／またはＳＨ３ＹＬ１タンパク質が非―腎臓組織に比べ腎臓組織で過発現されることを確認して、特にＳＨ３ＹＬ１遺伝子及び／またはＳＨ３ＹＬ１タンパク質が腎症組織で過発現されたという結果を基にして上記ＳＨ３ＹＬ１遺伝子及び／またはＳＨ３ＹＬ１タンパク質が腎症の発病を診断及び予測することができるバイオマーカーに活用されることができるだけではなく、ＳＨ３ＹＬ１遺伝子の発現及び／またはＳＨ３ＹＬ１タンパク質のレベルを抑制することができる物質が腎症の予防及び治療の用途に活用されることができることを発見した。
【００２５】
本発明において、「ＳＨ３ＹＬ１タンパク質」は配列番号１のアミノ酸配列を有するタンパク質、またはこれと９０％以上、好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９９％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列のタンパク質を意味する。
【００２６】
また、「ＳＨ３ＹＬ１遺伝子」または「ｓｈ３ｙｌ１」は「ＳＨ３ＹＬ１タンパク質」のアミノ酸配列をコードする遺伝子として、配列番号２の核酸配列、またはこれと９０％以上、好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上の配列相同性を有する核酸配列の遺伝子を意味する。
【００２７】
本発明における「ＳＨ３ＹＬ１タンパク質レベル」はＳＨ３ＹＬ１タンパク質の体内での濃度または活性を意味し、「ＳＨ３ＹＬ１遺伝子発現レベル」は「ＳＨ３ＹＬ１遺伝子」の体内での発現量を意味する。
【００２８】
本発明で、「診断」という用語は病理状態を確認することを意味することとして、本発明の目的上、上記診断は腎症診断マーカーの発現の有無を確認して腎症の進行程度を確認することを意味し、また、本発明での「診断」は腎症診断マーカーの発現の有無及び発現の程度を確認して腎症の発展及び軽減などを判断することも含む。
【００２９】
したがって、本発明は一観点から、ＳＨ３ＹＬ１遺伝子の発現レベルまたはＳＨ３ＹＬ１遺伝子がコードするタンパク質のレベルを測定することができる物質を含有する腎症診断用の造成物に関するものである。
【００３０】
本発明の一様態では炎症誘発因子であるＬＰＳを処理したＨＡＥＣ（ｈｕｍａｎ  ａｏｒｔｉｃ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ）、ＨＰＭＥＣ（ｈｕｍａｎ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ）でＳＨ３ＹＬ１遺伝子の発現が増加して、細胞外ＳＨ３ＹＬ１タンパク質の分泌が増加することを確認した。
【００３１】
本発明の他の様態では腎症患者群のａｌｂｕｍｉｎｕｒｅａの等級によって血液でＳＨ３ＹＬ１遺伝子の発現量及びタンパク質の量を正常群と比較した結果、正常群に比べて腎症患者の場合ＳＨ３ＹＬ１遺伝子の発現量がさらに増加したことを確認することができた。
【００３２】
本発明において、上記ＳＨ３ＹＬ１遺伝子の発現レベルは発現の可否、発現量及び発現パターンで構成された群から選択されることを特徴とすることができて、上記ＳＨ３ＹＬ１遺伝子がコードするタンパク質のレベルは上記タンパク質の存在の可否、量及び発現パターンで構成された群から選択されることを特徴とすることができる。
【００３３】
本発明で上記ＳＨ３ＹＬ１遺伝子の発現レベルを測定することができる物質はＳＨ３ＹＬ１遺伝子を増幅することができるプライマー対または上記ＳＨ３ＹＬ１遺伝子とハイブリダイズすることができるプローブであることを特徴とすることができる。
【００３４】
本発明において、上記ＳＨ３ＹＬ１遺伝子の発現量またはタンパク質の量を測定する方法は逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）、ウエスタンブロット、ノーザンブロット、ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ  ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）、放射線免疫測定法（ＲＩＡ：ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、放射免疫拡散法（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）及び免疫沈降分析法（ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）でなっている群の中から選択されるものであることができる。
【００３５】
本発明で上記ＳＨ３ＹＬ１遺伝子のレベルは、好ましくＳＨ３ＹＬ１遺伝子が発現されたｍＲＮＡのレベル、すなわち、ｍＲＮＡの量を意味し、上記レベルを測定することができる物質ではＳＨ３ＹＬ１遺伝子に特異的なプライマーまたはプローブを含むことができる。本発明で上記ＳＨ３ＹＬ１遺伝子に特異的なプライマーまたはプローブは配列番号２で示すＳＨ３ＹＬ１遺伝子全体または遺伝子の特定領域を特異的に増幅することができるプライマーまたはプローブであることができ、上記プライマーまたはプローブは当業界に知られた方法を通じてデザインすることができる。
【００３６】
本発明で上記「プライマー」という用語は適合な温度及び緩衝液内で適した条件（即ち、４種の異なるヌクレオチド三リン酸及び重合反応酵素）の下で鋳型−指示ＤＮＡ合成の開始点として作用することができる単一鎖のオリゴヌクレオチドを意味する。プライマーの適合した長さは多様な要素、例えば、温度とプライマーの用途によって変化のあることができる。また、プライマーの配列は鋳型の一部の配列と完全に相補的な配列を有する必要はなく、鋳型とハイブリダイズされてプライマー固有の作用ができる範囲内での十分な相補性を有していれば十分である。したがって、本発明でのプライマーは鋳型であるＳＨ３ＹＬ１遺伝子のヌクレオチド配列に完璧に相補的な配列を有する必要はなく、この遺伝子配列にハイブリダイズされてプライマーの作用ができる範囲内で十分な相補性を有すると十分である。また、本発明によるプライマーは遺伝子増幅反応に利用されることができるものである。
【００３７】
上記「増幅反応」は核酸分子を増幅する反応をいい、このような遺伝子の増幅反応に対してはダ当業界によく知られていて、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写介在増幅（ＴＭＡ）、核酸塩基配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）などが含まれることができる。
【００３８】
本発明において、上記「プローブ」という用語は自然のまたは変形されたモノマーまたは連鎖（ｌｉｎｋａｇｅｓ）の線形オリゴマーを意味し、デオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドを含み、ターゲットヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズすることができ、自然的に存在するかまたは人為的に合成されたものをいう。本発明によるプローブは単一鎖であることができて、好ましくはオリゴデオキシリボヌクレオチドであることができる。本発明のプローブは自然ｄＮＭＰ（即ち、ｄＡＭＰ、ｄＧＭＰ、ｄＣＭＰ及びｄＴＭＰ）、ヌクレオチド類似体または誘導体を含むことができる。また、本発明のプローブはリボヌクレオチドも含むことができる。例えば、本発明のプローブは、骨格の変形されたヌクレオチド、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）（Ｍ．Ｅｇｈｏｌｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６５：５６６−５６８（１９９３））、ホスホロチオエートＤＮＡ、ホスホロジチオエートＤＮＡ、ホスホロアミデートＤＮＡ、アミド結合ＤＮＡ、ＭＭＩ結合ＤＮＡ、２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、アルファ−ＤＮＡ及びメチルホスホン酸ＤＮＡ、糖修飾されたヌクレオチド、例えば、２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、２’−フルオロＲＮＡ、２’−アミノＲＮＡ、２’−Ｏ−アルキルＤＮＡ、２’−Ｏ−アリルＤＮＡ、２’−Ｏ−アルキニルＤＮＡ、ヘキソースＤＮＡ、ピラノシルＲＮＡ及びアンヒドロヘキシトールＤＮＡ及び塩基修飾を有するヌクレオチド、例えば、Ｃ−５置換されたピリミジン（置換基は、フルオロ−、ブロモ−、クロロ−、ヨード−、メチル−、エチル−、ビニル−、ホルミル−、エチニル−、プロピニル−、アルキニル−、チアゾリル−、イミダゾリル−、ピリジル−を含む）、Ｃ−７置換基を有する７−デアザプリン（置換基は、フルオロ−、ブロモ−、クロロ−、ヨード−、メチル−、エチル−、ビニル−、ホルミル−、アルキニル−、アルケニル−、チアゾリル−、イミダゾリル−、ピリジル−を含む）、イノシン及びジアミノプリンを含むことができる。
【００３９】
本発明において、上記ＳＨ３ＹＬ１タンパク質のレベルを測定することができる物質はＳＨ３ＹＬ１タンパク質に特異的な物質であることを特徴としており、好ましくは抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）またはアプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）であることができるが、これに限られることではなく、ＳＨ３ＹＬ１タンパク質に特異的に結合できる物質ならば、どれでも制限なしに使用可能である。
【００４０】
本発明で、上記の抗体はポリクローン抗体、単一クローン抗体及び組換え抗体などを含む概念で、完全な抗体（ｗｈｏｌｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）だけではなく、抗体の断片（ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔ）も含む。本発明での抗体は免疫グロブリン分子のすべての類型（例：ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、及びＩｇＡ）及びその下位部類（例：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）であることができて、どのような種から由来されたものでも使用可能で、本発明での「抗体の断片」は少なくとも抗原に対する結合機能を保有している断片を意味し、単鎖抗体、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｄ、ｓｃＦｖ、ドメイン抗体、ミニボディ、スキャブ（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ，ｓｃＡｂ）、抗体不変領域の誘導体、タンパク質スキャフォールド（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｃａｆｆｏｌｄｓ）に基づいた人工抗体などを含む。
【００４１】
本発明において、上記記述したことのように腎症を診断することができるマーカータンパク質としてＳＨ３ＹＬ１タンパク質が究明されたので、上記のタンパク質を利用して抗体を生成する方法は、当該技術分野の一般的技術者が公知された技術を利用して容易に製造することができる。例えば、ポリクローン抗体の場合にはＳＨ３ＹＬ１抗原を動物に注射して動物から採血して抗体を含む血清を収得する当業界に広く公知された方法によって生産することができ、このようなポリクローン抗体はヤギ、兎、羊、猿、馬、豚、牛、犬などの任意の動物種の宿主から製造可能である。単一クローン抗体の場合には当業界に広く公知されたハイブリドーマ（ｈｙｂｒｉｄｏｍａ）方法（Ｋｏｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｎｒａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６，５１１−５１９，１９７６）を利用して製造することができるか、またはファージ抗体ライブラリー（Ｃｌａｃｋｓｏｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２，６２４−６２８，１９９１；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７，１９９１）技術を利用して製造することができる。また、本発明による抗体は二つの全長の軽鎖及び二つの全長の重鎖を有する完全な形態だけではなく、抗体分子の機能的な断片を含むことができる。抗体分子の機能的な断片というものは少なくとも抗原結合機能を保有している断片を意味し、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖなどがある。
【００４２】
ＳＨ３ＹＬ１（ＳＨ３  ｄｏｍａｉｎ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｙｓｃ８４−ｌｉｋｅ１）はカルボキシル末端領域にＳｒｃ  ｈｏｍｏｌｏｇｙｄｏｍａｉｎ３（ＳＨ３）を有していると、アミノ末端領域にはＳＹＬＦ（ＳＨ３ＹＬ１、Ｙｓｃ８４ｐ／Ｌｓｂ４ｐ、Ｌｓｂ３ｐ、ａｎｄ  ｐｌａｎｔ  ＦＹＶＥ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｔｈａｔ  ｃｏｎｔａｉｎｉｔ）を有しているタンパク質である（図１）。ＳＨ３ＹＬ１遺伝子の塩基配列を配列番号２に示しており、ＳＨ３ＹＬ１タンパク質のアミノ酸配列を配列番号１に示した。
【００４３】
ＳＨ３ＹＬ１のＳＨ３領域はプロリン豊富部位（ｐｒｏｌｉｎｅ−ｒｉｃｈ  ｒｅｇｉｏｎ）を認識し、ＳＹＬＦ領域は膜にあるホスファチジルイノシトール３、４、５−トリホスフェイト｛ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ  ３，４，５−ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＰＩ（３，４，５）Ｐ３）｝を認識する。このような機能のために成長因子であるＰＤＧＦの刺激によりＳＨ３ＹＬ１のＳＹＬＦ領域がＰＩ（３，４，５）Ｐ３を認識して、細胞の移動を調節することで知られている（Ｈａｓｅｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＣＢ，１９３；９０１−９１６，２０１１）。
【００４４】
他の観点から、本発明は腎症診断に必要な情報を提供するため、上記腎症診断用の造成物を生物学的試料に処理して、試料中のＳＨ３ＹＬ１遺伝子の発現レベルまたはＳＨ３ＹＬ１タンパク質のレベルを検出する方法に関するものである。
【００４５】
また他の観点から、本発明はＳＨ３ＹＬ１遺伝子またはＳＨ３ＹＬ１タンパク質の腎症診断用のマーカーとしての用途に関するものである。
【００４６】
また他の観点から、本発明は生物学的試料中のＳＨ３ＹＬ１遺伝子の発現レベルまたはＳＨ３ＹＬ１タンパク質のレベルを測定することを特徴とする腎症の診断方法に関するものである。
【００４７】
本発明で上記「生物学的試料」ということは腎症の発生、または進行程度による上記ＳＨ３ＹＬ１遺伝子の発現レベルまたはタンパク質のレベルが正常対照群とは異なる生体から採取された試料をいい、上記試料では例えば、これに制限されることではないが、組織、細胞、血液、血清、血漿、唾液や尿などが含まれることができる。
【００４８】
上記ＳＨ３ＹＬ１遺伝子の発現レベルの測定は好ましくはｍＲＮＡのレベルを測定することであり、ｍＲＮＡのレベルを測定する方法としては、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応、ＲＮａｓｅ保護分析法、ノーザンブロット及びＤＮＡチップなどがあるが、これに制限されることではない。
【００４９】
上記ＳＨ３ＹＬ１タンパク質レベルの測定はＳＨ３ＹＬ１タンパク質に特異的に結合する物質、好ましくはＳＨ３ＹＬ１タンパク質の特異的抗体、またはアプタマーを利用することができるが、このような場合、生物学的試料内のＳＨ３ＹＬ１マーカータンパク質とこれに特異的な抗体は結合物、すなわち、抗原−抗体複合体を形成し、抗原−抗体複合体の形成量は検出ラベル（ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｌａｂｅｌ）のシグナルの大きさを通じて定量的に測定することができる。このような検出ラベルは酵素、蛍光物、リガンド、発光物、微小粒子（ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ）、酸化還元分子及び放射線同位元素からなっているグループの中から選択することができ、これに制限されることではない。タンパク質レベルを測定するための分析方法としては、これに制限されないが、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、放射線免疫分析、放射線免疫拡散法、オークタロニー免疫拡散法、ロケット免疫電気泳動、組織免疫染色、免疫沈降分析法、補体結合反応分析法、ＦＡＣＳ、タンパク質チップなどがある。
【００５０】
したがって、本発明は上記のような検出方法を通じて、対照群のＳＨ３ＹＬ１のｍＲＮＡ発現量またはタンパク質の量と腎症患者または腎症疑心患者でのＳＨ３ＹＬ１のｍＲＮＡ発現量またはタンパク質の量を確認することができ、上記発現量の程度を対照群と比較することによって腎症発病の可否、進行段階または予後などを予測及び診断することができる。
【００５１】
本発明の実施例によると、腎症患者を含む腎臓疾患患者の血液を収得して上記血液から血清を分離した後、ＳＨ３ＹＬ１特異的抗体を利用したＥＬＩＳＡ方法を遂行し、各患者の試料からＳＨ３ＹＬ１タンパク質の量を測定した後、上記測定値を対照群と比較分析する過程を通じて遂行した。
【００５２】
また他の観点で本発明はＳＨ３ＹＬ１遺伝子またはその断片とハイブリダイズすることができるプローブが固定されている腎症診断用のマイクロアレイに関するものである。
【００５３】
本発明のマイクロアレイにおいて、ＳＨ３ＹＬ１タンパク質またはこれを暗号化する遺伝子の発現レベルを測定することができるプライマー、プローブまたは抗体はハイブリダイズ可能なアレイ要素（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｂｌｅ  ａｒｒａｙ  ｅｌｅｍｅｎｔ）として利用され、基質（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）上に固定化される。好ましい基質は適合した堅固性または半−堅固性支持体として、例えば、膜、フィルター、チップ、スライド、ウェハー、ファイバ、磁気性ビーズまたは非磁気性ビーズ、ゲル、チュービング、プレート、高分子、微小粒子及び毛細管を含むことができる。上記ハイブリダイズ可能なアレイ要素は、上記基質上に配列されて固定化され、このような固定化は化学的結合方法またはＵＶのような共有結合的方法により遂行されることができる。たとえば、上記ハイブリダイズ可能なアレイ要素はエポキシ化合物またはアルデヒド基を含むように変形されたグラスの表面に結合されることができて、またポリリジンコーティング表面でＵＶにとり結合されることができる。また、上記ハイブリダイズ可能なアレイ要素はリンカー（例：エチレングリコールオリゴマー及びジアミン）を通じて基質に結合されることができる。
【００５４】
一方、本発明のマイクロアレイに適用される試料が核酸である場合には標識（ｌａｂｅｌｉｎｇ）されることができて、マイクロアレイ上のアレイ要素とハイブリダイズされることができる。ハイブリダイズの条件は多様であることができて、ハイブリダイズ程度の検出及び分析は標識物質によって多様に実施されることができる。
【００５５】
また、他の観点で、本発明はＳＨ３ＹＬ１遺伝子またはその断片を増幅することができるプライマー対、上記ＳＨ３ＹＬ１遺伝子とハイブリダイズできるプローブまたはＳＨ３ＹＬ１遺伝子がコードするタンパク質に特異的な抗体またはアプタマーを含有する腎症診断用のキットを提供する。
【００５６】
本発明の腎症診断用のキットに含まれる腎症診断用の造成物はＳＨ３ＹＬ１タンパク質またはこれを暗号化する遺伝子の発現レベルを測定することができるプライマー、プローブまたは抗体を含むことができて、これらの定義は先に記述されたことのようである。
【００５７】
本発明の腎症診断用のキットがもしＰＣＲ増幅の過程に適用される場合、本発明のキットは選択的にＰＣＲ増幅に必要な試薬、例えば、緩衝液、ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｔｔｈ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ、Ｔｈｅｒｍｉｓ  ｆｌａｖｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｅｒａｌｉｓまたＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ（Ｐｆｕ）から収得した熱安定性のＤＮＡポリメラーゼ）、ＤＮＡポリメラーゼ助因子及びｄＮＴＰｓを含むことができて、本発明の腎症診断用のキットが免疫分析に適用される場合、本発明のキットは選択的に、二次抗体及び標識の基質を含むことができる。ひいては、本発明によるキットは上記した試薬の成分を含む多数の別途のパッケージングまたはコンパートメントで製作されることができる。
【００５８】
また、他の観点から、（ａ）ＳＨ３ＹＬ１遺伝子を発現する細胞に候補物質を接触させる段階；（ｂ）ＳＨ３ＹＬ１遺伝子の発現レベル及び／またはＳＨ３ＹＬ１タンパク質レベルを測定する段階；及び（ｃ）ＳＨ３ＹＬ１遺伝子の発現レベル及び／またはＳＨ３ＹＬ１タンパク質レベルが減少される場合の候補物質を腎症の予防または治療用の物質で選別する段階を含む腎症の予防または治療用の物質をスクリーニングする方法に関するものである。
【００５９】
本発明の方法によると、先ずＳＨ３ＹＬ１遺伝子またはＳＨ３ＹＬ１タンパク質を含む細胞に分析しようとする試料を接触させることができる。ここで上記「試料」または「候補物質」はＳＨ３ＹＬ１遺伝子の発現量、ＳＨ３ＹＬ１タンパク質の量またはＳＨ３ＹＬ１タンパク質の活性に影響を及ぼすかの可否を検査するため、スクリーニングで利用される未知の物質を意味する。上記「試料」または「候補物質」は化学物質、ヌクレオチド、アンチセンス−ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ＲＮＡ）及び天然物の抽出物を含むことができるが、これに制限されない。以後、試料が処理された細胞でＳＨ３ＹＬ１遺伝子の発現量、ＳＨ３ＹＬ１タンパク質レベルを測定することができ、測定結果、ＳＨ３ＹＬ１遺伝子の発現量、ＳＨ３ＹＬ１タンパク質のレベルが減少されることが測定されると、上記試料は腎症を治療または予防することができる物質に判定されることができる。
【００６０】
上記でＳＨ３ＹＬ１遺伝子の発現量、ＳＨ３ＹＬ１レベルを測定する方法は当業界に公知された多様な方法を通じて遂行されることができるが、例を挙げると、これに制限されることではないが、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）、ウエスタンブロット、ノーザンブロット、ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ  ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）、放射線免疫測定法（ＲＩＡ：ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、放射免疫拡散法（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）及び免疫沈降分析法（ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）などを利用して遂行することができる。
【００６１】
本発明はまた、上記ＳＨ３ＹＬ１遺伝子発現レベルまたはＳＨ３ＹＬ１タンパク質レベルを減少させることができる物質である腎症治療剤及びこれを含む腎症治療用の造成物に関するものである。
【００６２】
本発明で上記ＳＨ３ＹＬ１遺伝子発現レベルを減少させることができる物質には好ましくは化学物質、ヌクレオチド、ＳＨ３ＹＬ１遺伝子に特異的なｓｉＲＮＡ、ＳＨ３ＹＬ１遺伝子に特異的なアンチセンス、ｍｉＲＮＡなどを含むことができる。
【００６３】
本発明で上記ＳＨ３ＹＬ１タンパク質レベルを減少させることができる物質にはＳＨ３ＹＬ１タンパク質に特異的な抗体、アプタマーまたは化学物質（ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）などを含むことができる。
【００６４】
また、本発明で上記本発明の治療用の造成物は薬学的に許容される担体を追加で含むことができる。上記で「薬学的に許容される」ということは生理学的に許可されてヒトに投与されるとき、通常的に胃腸障害、めまいなどのようなアレルギー反応またはそれに類似した反応を引き起こさない造成物をいう。薬学的に許容される担体には、例えば、ラクトース、澱粉、セルロース誘導体、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸などのような経口投与用担体及び水、適合したオイル、食塩水、水性グルコース及びグリコールなどのような非経口投与用担体などがあり、安定化剤及び保存剤を追加で含むことができる。適合した安定化剤では亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウムまたはアスコルビン酸のような抗酸化剤がある。適合した保存剤ではベンザルコニウムクロリド、メチル−またはプロピルパラベン及びクロロブタノールがある。その他の薬学的に許容される担体としては次の文献に記載されているものを参考にすることができる（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９ｔｈ  ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ  ＰＡ，１９９５）。
【００６５】
本発明による治療用の造成物は、前述したことのような薬学的に許容される担体とともに当業界に公知された方法によって適した形態で剤形化されることができる。すなわち、本発明の薬学的造成物は公知の方法によって多様な非経口または経口投与用の形態で製造されることができ、非経口投与用の剤形の代表的なものとしては注射用剤形で等張性の水溶液または懸濁液が好ましい。注射用剤型は適合した分散剤または湿潤剤及び懸濁化剤を使用して当業界に公知された技術によって製造することができる。例えば、各成分を食塩水または緩衝液に溶解させて注射用に剤形化されることができる。また、経口投与用の剤形には、これに限定されることではないが、粉末、顆粒、錠剤、丸薬及びカプセルなどがある。上記のような方法で剤形化された薬学的造成物は有効量で経口、経皮、皮下、静脈または筋肉を含めたさまざまな経路を通じて投与されることができるが、上記「投与」とはどのような適切な方法で患者に所定の物質を導入することを意味し、物質の投与経路は目的の組織に到達することができる限りどのような一般的な経路を通じて投与されることができる。
【００６６】
また、上記で「有効量」とは患者に投与した時、予防または治療効果を示す量をいう。本発明による薬学的造成物の投与量は患者の疾患の種類及び重症度、年齢、性別、体重、薬物に対する敏感度、現在治療法の種類、投与方法、敵細胞など多様な要因によって異なることができ、当該分野の専門家によって、容易に決定されることができる。また、本発明の薬学的造成物は従来の治療剤と併用して投与されることができて、従来の治療剤とは順次的または同時に投与されることができ、単一または多重投与されることができる。好ましくは上記要素をすべて考慮して不作用なしに最小限の量で最大効果の得られる量を投与することができ、さらに好ましくは１〜１００００μｇ／体重ｋｇ／ｄａｙ、もっと好ましくは１０〜１０００ｍｇ／体重ｋｇ／ｄａｙの有効容量で１日に数回繰り返して投与されることができる。
【実施例】
【００６７】
以下、実施例を通じて本発明をさらに詳細に説明しようとする。これらの実施例は単に本発明を例示するためのものとして、本発明の範囲がこれらの実施例により制限されるものと解釈されないことは当業界で通常の知識を有した者において明らかである。
【００６８】
実施例１．ＬＰＳ処理による細胞内のＳＨ３ＹＬ１レベル分析
ＳＨ３ＹＬ１は細胞質タンパク質で存在し、細胞の移動に関係するが、細胞の炎症誘発刺激であるＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）処理後、ＨＡＥＣ（ｈｕｍａｎ  ａｏｒｔｉｃ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ，Ｌｏｎｚａ，ｃｃ−２５３５）、ＨＰＭＥＣ（ｈｕｍａｎ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ，Ｐｒｏｍｏ  Ｃｅｌｌ，ｃ−１２２８１）でＳＨ３ＹＬ１の発現レベルを確認した。
【００６９】
ＨＡＥＣはＬｏｎｚａのＥｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｍｅｄｉｕｍ  ２  Ｋｉｔ（ｃｃ−６１６２）を、ＨＰＭＥＣはＰｒｏｍｏ  ＣｅｌｌのＥｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｍｅｄｉｕｍ  ＭＶ  ｋｉｔ（ｃ−２２１２０）を使用して３７℃５％ＣＯ２条件の培養基で培養した。細胞にＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）を２４時間処理後ｃｅｌｌ  ｌｙｓａｔｅでＳＨ３ＹＬ１  ｌｅｖｅｌを確認した。
【００７０】
その結果、図２に示したことのようにＳＨ３ＹＬ１はＬＰＳによる炎症刺激により細胞内でその発現が増加されることを知ることができた。
【００７１】
実施例２．発現が増加されたＳＨ３ＹＬ１の細胞外部への分泌可否の確認
炎症刺激因子であるＬＰＳによって発現が増加したＳＨ３ＹＬ１が細胞外部へ分泌されるのかを確認した。
【００７２】
ＨＰＭＥＣ細胞にＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）を時間帯別に処理して培養した後、収得した培養液を遠心分離して、培養上層液と細胞分画でＳＨ３ＹＬ１のタンパク質の量を測定した。ＢＣＡ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙ（Ｐｉｅｒｃｅ）を通じて濃度を測定し、同量のｓａｍｐｌｅにＬａｅｍｍｌｉ’ｓ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  ｓａｍｐｌｅ  ｂｕｆｆｅｒを添加して９５℃で１０分間、沸騰させてｌｏａｄｉｎｇ  ｓａｍｐｌｅを作る。ｓａｍｐｌｅはＳＤＳ−ＰＡＧＥを遂行し、以後にｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅにｅｌｅｃｔｒｏｔｒａｎｓｆｅｒして５％  ｓｋｉｍ  ｍｉｌｋで３０分間、非特異的なｂａｎｄを除去する。その後１次ａｎｔｉｂｏｄｙを５％  ｓｋｉｍ  ｍｉｌｋに希釈して４℃で一晩反応させる。ＴＢＳ−Ｔ  ｂｕｆｆｅｒを利用して１０分ずつ３回洗浄してＨｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅまたはＲａｂｂｉｔ  ＩｇＧ（ｓａｎｔａｃｒｕｚ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）をＲＴで１時間の間つけて再びＴＢＳ−Ｔ  ｂｕｆｆｅｒに１０分ずつ３回洗浄した後、ＬＡＳ−３０００（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ）機械を利用してｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ｉｍａｇｅを得て分析した。
【００７３】
その結果、図３に示したことのように培養上層液（ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ）の分画でＳＨ３ＹＬ１タンパク質が確認されて、ＬＰＳ刺激によりＳＨ３ＹＬ１タンパク質の細胞外部へ分泌されることを確認した。
【００７４】
実施例３．糖尿病性腎症患者で血漿内のＳＨ３ＹＬ１タンパク質の濃度増加確認
糖尿病性腎症患者の血漿で実質的にＳＨ３ＹＬ１タンパク質の濃度が増加するかを確認した。
【００７５】
総２３６名の患者を対象にして、総６５名の正常対照群及び１７１名の第２型糖尿病患者を含めた断面調査研究（Ｃｒｏｓｓ−ｓｅｃｔｉｏｎａｌ）で単一の研究機関で行われた。
【００７６】
総２２３名の患者で血漿ＳＨ３ＹＬ１タンパク質の濃度をＭｙｏｂｉｏｓｏｕｒｃｅ社の酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）キット（ＭＢＳ９３６５５９）を使用して定量した。この試薬はサンドイッチ型の酵素免疫測定法の原理を活用し、血清または血漿ＳＨ３ＹＬ１の濃度を測定する。
【００７７】
ＳＨ３ＹＬ１の特異抗体が付着された９６−ｗｅｌｌ  ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅに五つの濃度の標準物質、ｂｌａｎｋ、陽性及び陰性対照物質とともに血清の検体を添加し、２時間の間反応させて洗浄後、ｂｉｏｔｉｎが付着された２次抗体を添加後、再び１時間反応させた。洗浄後、ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎとともにｈｏｒｓｅ−ｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅが付着されたｃｏｎｊｕｇａｔｅ溶液を添加して１時間反応させて洗浄した後、光を避けて発色試薬を添加して３０分後４５０ｎｍで吸光度を測定した。
【００７８】
五つの濃度の標準物質及びｂｌａｎｋ物質で測定した吸光度を利用して標準曲線を導出した後、各検体で測定した吸光度をＳＨ３ＹＬ１（ｐｇ／ｍｌ）の濃度に換算した。測定可能な濃度は３１．２５〜２０００ｐｇ／ｍｌであって、検査内精密度（ｉｎｔｒａ−ａｓｓａｙ  ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ）の変動係数（Ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｏｆ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ，ＣＶ％）は＜８％であり、検査間の精密度（ｉｎｔｅｒ−ａｓｓａｙ  ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ）のＣＶ％は＜１０％であった。
【００７９】
糖尿病患者群は糖尿病性腎症の段階によって各々正常蛋白尿群（アルブミン−クレアチニン比３０μｇ／ｍｇＣｒ未満）、微細アルブミン尿群（アルブミン−クレアチニン比３０−３００ｍｇＣｒの間）及び顕性蛋白尿群（３００ｍｇ／ｍｇＣｒまたは３００ｍｇ／日以上）に分類した。患者の義務記録及び診察を通じて基底疾患、性別、年齢、身長、体重、体質量指数及び血圧などの資料を確認した。
【００８０】
患者の血液サンプルを収集して血色素、白血球、血小板、Ｃ−反応性タンパク質、血中尿素（ｂｕｎ）、クレアチニン、脂質の数値を測定した。糖尿病性腎症の他のバイオマーカーとされるレチノール結合タンパク質４（Ｒｅｔｉｎｏｌ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ４，ＲＢＰ４）の濃度もＰｈｏｅｎｉｘ社のキットを使用して定量した。
【００８１】
蛋白尿の測定のために尿のサンプルを収集して尿の微細アルブミン対クレアチニン比（ｍｉｃｒｏａｌｂｕｍｉｎ  ｔｏ  ｃｒｅａｔｉｎｉｎｅ  ｒａｔｉｏ）及び尿タンパク対クレアチニン比（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｏ  ｃｒｅａｔｉｎｉｎｅ  ｒａｔｉｏ）を計算した。糸球体濾過率の計算のために計算式ＣＫＤ−ＥＰＩの公式（糸球体濾過率＝１４１×ｍｉｎ（Ｓｃｒ／κ、１）α×ｍａｘ（Ｓｃｒ／κ、１）−１．２０９×０．９９３年齢×１．０１８（女性）×１．１５９（黒人）、κ＝０．７（女性）、κ＝０．９（男性）、α＝＝０．３２９（女性）、α＝−０．４１１（男性）を使用して、インスリン抵抗数値をＨＯＭＡ−ＩＲ（ｈｏｍｏｓｔａｔｉｃ  ｍｏｄｅｌ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ＝（空腹血中インスリン（ｍＵ／Ｉ）×空腹血糖（ｎｍｏｌ／ｌ）／２２．５）の公式を使用して計算した。
【００８２】
資料分析のためにＩＢＢＭ  ＳＰＳＳ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃ２０プログラムを利用しており、ｐ値が０．０５の有意水準で、両側の検証で分析した。非正規分布を示す変数値を正規分布化するためにｌｏｇ型値に変換して分析した。連続型試料の場合、正規性の仮定満足の可否によって、ｔ−ｔｅｓｔまたはＷｉｌｃｏｘｏｎ  ｒａｎｋ  ｓｕｍ  ｔｅｓｔ、ＡＮＯＶＡ  ｔｅｓｔ  ｗｉｔｈ  ｐｏｓｔ  ｈｏｃ  ａｎａｌｙｓｉｓを施行し、二分け型資料の場合、期待度数の分布によってＣｈｉ−ｓｑｕａｒｅ  ｔｅｓｔまたはＦｉｓｈｅｒ’ｓ  ｅｘａｃｔ  ｔｅｓｔを実施して、関連性を確認するたにＰｅａｒｓｏｎ’ｓ  ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ、ｌｉｎｅａｒ及びｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓを使用した。
【００８３】
その結果、各群間の年齢、男女比間の差はなかったが、対照群と比較して糖尿病性腎症全体群の腎臓の機能が有意に低く、収縮期血圧及びインスリン抵抗数値が有意に高かった（表１）。その他、Ｃ反応性タンパク質及び脂質数値の差は観察されなかった。
【００８４】
ＳＨ３ＹＬ１濃度は正常対照群に比べて糖尿病患者で有意に高く、これは正常蛋白尿群及び微細蛋白尿、顕性蛋白尿群で全て有意に高かった。顕性蛋白尿を示す患者で顕著に増加されていることを確認した（図４）。
【００８５】
ＳＨ３ＹＬ１が基底腎機能に影響を受けることができて、その独立的な関連性を確認しようとした。単純の相関関係を分析した結果、ＳＨ３ＹＬ１は蛋白尿及び微細蛋白尿、ＲＢＰ４の濃度、体質量指数、収縮期血圧及びインスリン抵抗数値と陽の相関関係を示しており、糸球体濾過率と関連性を示さなかった（表２及び表３）。年齢、性別及び糸球体濾過率を補正した後にもＳＨ３ＹＬ１濃度と微細蛋白尿は独立的な陽の相関関係を示しており、その他にもＲＢＰ４の濃度と陽の相関関係、体質量指数と陰の相関関係を示していた（表４）。
【００８６】
上記の結果を通じて、糖尿病性腎症の進行の診断及び治療の目標になる微細蛋白尿とＳＨ３ＹＬ１の関連性を確認することができて、糖尿病性腎症進行の予測マーカーとしてＳＨ３ＹＬ１タンパク質を使用できるということを確認することができた。
【００８７】
【表１】
0006698154.tif 000002
【００８８】
【表２】
0006698154.tif 000003
【００８９】
【表３】
0006698154.tif 000004
【００９０】
【表４】
0006698154.tif 000005
【００９１】
【表５】
0006698154.tif 000006
【産業上の利用可能性】
【００９２】
本発明によると、腎症を早期に迅速で正確に診断及び予測することができる効果があって、患者の血液だけでも正確な診断が可能で、さらに腎症治療剤の開発のための標的に活用することができる効果がある。
【００９３】
以上で本発明内容の特定な部分を詳細に記述したところ、当業界の通常の知識を有した者において、このような具体的技術は単に好ましい実施態様に過ぎず、これにより本発明の範囲が制限されないことは明らかである。したがって、本発明の実質的な範囲は添付された請求項とそれらの等価物によって定義されるといえる。
【図１】
0006698154.tif 000007
【図２】
0006698154.tif 000008
【図３】
0006698154.tif 000009
【図４】
0006698154.tif 000010
【配列表】
0006698154000001.app