(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（I）の化合物またはそのメソメリー形：
【化１】
0006750006.tif 000063
(I)
式中、mCat+またはmAn-は、有機または無機の正／負に帯電した対イオンであり、
mは0〜3の整数であり；
pは1〜2の整数であり；
qは1〜5の整数であり；
alkは、1つ以上の二重または三重結合を任意に含有する1〜5個の炭素原子の鎖であり；
YはOであり；
ZはOHであり；
nは0〜3の整数であり；
XはOHもしくはO-またはそれらのアミドもしくはエステルコンジュゲートであり；
Ra1およびRa2の各々は、独立して、H、SO3-、スルホンアミド、ハロゲン、または隣接する炭素原子に縮合した追加的環であり；ならびに
Rc1またはRc2の各々は、独立して、アルキルまたは置換アルキルであり、Ra1もしくはRa2の少なくとも1つはSO3-であるか、またはRa1もしくはRa2は隣接する炭素原子に縮合した追加的環であり、その追加的環はSO3-を有するか、またはRc1もしくはRc2はアルキルスルホン酸基である。
【請求項２】
nが0である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
（alk）が(CH2)3である、請求項１または２に記載の化合物。
【請求項４】
pが1である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項５】
pが2である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項６】
Ra1がHまたはSO3-である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項７】
Ra2がHまたはSO3-である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項８】
Ra1が隣接する炭素原子に縮合した追加的環である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項９】
Ra2が隣接する炭素原子に縮合した追加的環である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１０】
Rc1またはRc2が、メチル、エチル、プロピルまたはtが1〜6の-(CH2)tSO3-である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１１】
Rc1またはRc2のいずれかが(CH2)4-SO3-である、請求項１０に記載の化合物。
【請求項１２】
nが0である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１３】
nが1である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１４】
前記OH基が4位にある、請求項１３に記載の化合物。
【請求項１５】
いずれかのインドールが以下の構造の一部である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の化合物：
【化２】
0006750006.tif 000064
式中、Rdは、H、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、ハロゲン、カルボキシ、スルホンアミド、またはスルホン酸であってよい。
Rc1はアルキルまたは置換アルキルである。
【請求項１６】
式（VIIIa）で表される、請求項１に記載の化合物：
【化３】
0006750006.tif 000065
(VIIIa)
式中、mCat+またはmAn-は、有機または無機の正／負に帯電した対イオンであり、
mは0〜3の整数であり；
qは1〜5の整数であり；
rは1〜5の整数であり；および
Xは、OHもしくはO-またはそれらのアミドもしくはエステルコンジュゲートである。
【請求項１７】
式（VIId）で表される、請求項１に記載の化合物：
【化４】
0006750006.tif 000066
(VIId)
式中、mCat+またはmAn-は、有機または無機の正／負に帯電した対イオンであり、
mは0〜3の整数であり；
qは1〜5の整数であり；
rは1〜5の整数であり；
tは1〜6の整数であり；および
Xは、OHもしくはO-またはそれらのアミドもしくはエステルコンジュゲートである。
【請求項１８】
前記化合物がヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドに結合している、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１９】
請求項１〜１７に記載の化合物で標識されたヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド。
【請求項２０】
前記標識が、C(=O)-X部位から形成されるアミド結合を介して結合している、請求項１９に記載の標識ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド。
【請求項２１】
前記標識が、ピリミジン塩基のC5位または7-デアザプリン塩基のC7位にリンカー部位を介して結合している、請求項１９または２０に記載の標識ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド。
【請求項２２】
前記ヌクレオチドのリボースまたはデオキシリボース糖に共有結合した3'OH保護基をさらに含む、請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の標識ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド。
【請求項２３】
2つ以上のヌクレオチドを含むキットであって、少なくとも1つのヌクレオチドが請求項１９〜２２のいずれか一項に記載の標識ヌクレオチドである、キット。
【請求項２４】
単一レーザーを使用して2つの前記標識ヌクレオチドが励起される、請求項２３に記載のキット。
【請求項２５】
4つのヌクレオチドのうちの第1ヌクレオチドが請求項１９〜２２のいずれか一項に記載の標識ヌクレオチドであり、第2、第3、および第4ヌクレオチドがそれぞれ異なる化合物で標識されており、各化合物が特異的な吸光度最大値を有し、該化合物の各々が他の3つの該化合物とは識別可能である、請求項２４に記載のキット。
【請求項２６】
4つのヌクレオチドを含む請求項２３に記載のキットであって、4つの該ヌクレオチドのうちの第1ヌクレオチドが請求項１９〜２２に記載の標識ヌクレオチドであり、4つの該ヌクレオチドのうちの第2ヌクレオチドが請求項１９〜２２に記載の標識ヌクレオチドであり、第3ヌクレオチドが第3標識を保持し、第4ヌクレオチドが標識されていない（暗色）、キット。
【請求項２７】
4つのヌクレオチドを含む請求項２３に記載のキットであって、4つの該ヌクレオチドのうちの第1ヌクレオチドが請求項１９〜２２に記載の標識ヌクレオチドであり、4つの該ヌクレオチドのうちの第2ヌクレオチドが請求項１９〜２２に記載の標識ヌクレオチドであり、第3ヌクレオチドが2つの標識の混合物を保持し、第4ヌクレオチドが標識されていない（暗色）、キット。
【請求項２８】
請求項１９〜２２のいずれか一項に記載のヌクレオチド、請求項１９〜２２のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド、または請求項２３〜２７のいずれか一項に記載のキットの、配列決定、発現分析、ハイブリダイゼーション分析、遺伝子分析、RNA分析、またはタンパク質結合アッセイにおける使用。
【請求項２９】
自動配列決定装置での請求項２８に記載の使用であって、前記自動配列決定装置が、異なる波長で作動する2つのレーザーを含む、使用。
【請求項３０】
以下の出発物質を利用して、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の化合物を合成する方法：
【化５】
0006750006.tif 000067
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、新規ポリメチン化合物および蛍光マーカーとしてのそれらの使用に関する。特に、該化合物は、核酸配列決定用途においてヌクレオチドの蛍光標識として使用され得る。
【背景技術】
【０００２】
本開示が関連する最新技術をより十分に説明するために、いくつかの刊行物および特許文献がこの出願で参照されている。これらの刊行物および文書のそれぞれの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００３】
蛍光標識を利用する核酸の非放射性検出は、分子生物学における重要な技術である。組み換えDNA技術で用いられる多くの方法は、以前は、例えば32Pなどで放射性標識されたヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの使用に大きく依存していた。放射性化合物は、核酸および他の目的の分子の高感度検出を可能にする。しかし、放射性同位体の使用には、費用、限られた貯蔵寿命、さらに重要な安全性の考慮事項などの重大な制限がある。放射性標識の必要性を排除することにより、安全性が向上し、環境への影響や試薬廃棄などに関連する費用が削減される。非放射性蛍光検出に適した方法には、非限定的な例として、自動化DNA配列決定、ハイブリダイゼーション法、ポリメラーゼ連鎖反応生成物のリアルタイム検出およびイムノアッセイが挙げられる。
【０００４】
多くの用途では、複数の空間的に重複する検体の独立検出を達成するために、複数のスペクトル的に識別可能な蛍光標識を用いることが望ましい。そのような多重方式では、反応容器の数を減らし、実験プロトコルを単純化し、アプリケーション固有の試薬キットの製造を容易にすることができる。例えば、多色自動DNA配列決定では、多重蛍光検出により、単一の電気泳動レーン内の複数のヌクレオチド塩基の分析が可能になり、それによって単色法よりもスループットが向上し、レーン間電気泳動移動度変動に伴う不確実性が低減される。
【０００５】
しかしながら、多重蛍光検出は問題がある可能性があり、蛍光標識の選択を制限するいくつかの重要な因子が存在する。第一に、発光スペクトルが所与の用途において適切にスペクトル分解される色素化合物を見出すことは困難であり得る。さらに、いくつかの蛍光色素を一緒に使用する場合、同時励起によって識別可能なスペクトル領域に蛍光シグナルを生成することは困難である場合があり、なぜなら、これに使用可能な色素の吸収帯が通常広く分離され得るからであり、そのためほぼ同等の蛍光励起効率を達成することは2つの色素についてであっても困難である。多くの励起方法は、レーザーのような高出力光源を使用するため、そのような励起に耐えるのに十分な光安定性を有さなければならない。分子生物学方法において特に重要な最終検討は、蛍光色素が、例えばDNA合成溶媒および試薬、バッファー、ポリメラーゼ酵素およびリガーゼ酵素などの試薬化学物質と適合しなければならない程度である。
【０００６】
配列決定技術が進歩するにつれて、上記制約の全てを満たし、特に固相配列決定などのハイスループット分子法に適したさらなる蛍光色素化合物、それらの核酸コンジュゲートおよび色素セットが必要となっている。
【０００７】
蛍光強度、形状および蛍光バンドの波長極大などの改善された蛍光特性を有する蛍光色素分子は、核酸配列決定の速度および精度を改善することができる。水ベースの生物学的緩衝液中および高温で測定が行われる場合、ほとんどの色素の蛍光強度はそのような条件で著しく低いため、強い蛍光シグナルが特に重要である。さらに、色素が結合している塩基の性質は、蛍光最大値、蛍光強度およびその他のスペクトル色素特性にも影響する。核酸塩基と蛍光色素との間の配列特異的相互作用は、蛍光色素の特定の設計によって調整することができる。蛍光色素の構造の最適化は、ヌクレオチド組み込みの効率を改善し、配列決定エラーのレベルを低下させ、核酸配列決定における試薬の使用を減少させ、したがってその費用も減少させる。
【０００８】
本明細書には、改善されたポリメチン構築物、および生物分子標識としての、特に核酸配列決定に使用されるヌクレオチドの標識としてのそれらの使用が記載される。標識ヌクレオチド組み込みの効率、ならびに新しい蛍光構築物を使用して得ることができる配列決定読み取りの長さおよび正確さにおいて、特定の改善が見られる。以下に記載される分子は、高出力励起源が使用される状況において特に有利である。高出力励起は、励起出力の増加に伴い、標識によって放出される光子の数が直線的でなくなる程度の出力飽和をもたらすことができる。出力飽和は、標識の構造に関連する分子消光効果によって引き起こすことができるか、または所望の蛍光寿命よりも長い蛍光寿命の標識によって引き起こすことができ、それにより、標識は、光子を放出する前に、所望の期間よりも長い期間励起状態でいることになる。複数の異なる標識が並行して使用される場合、標識のうちの1つが出力飽和に達し、他の標識が明るくなり続ける場合、標識の識別がより難しくなる。本明細書に記載の標識は、対応する従来技術の標識化合物よりも高いレベルでの出力飽和に達するのに特に有利である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開第2004/018493号パンフレット
【特許文献２】国際公開第07020457号パンフレット
【特許文献３】英国特許出願第0517097.2号
【特許文献４】国際公開第2004/018497号パンフレット
【特許文献５】国際公開第2005/024010号パンフレット
【特許文献６】国際公開第06120433号パンフレット
【特許文献７】米国特許第5,302,509号明細書
【特許文献８】国際公開第0157248号パンフレット
【特許文献９】国際公開第2005/047301号パンフレット
【特許文献１０】国際公開第00006770号パンフレット
【特許文献１１】国際公開第00/31148号パンフレット
【特許文献１２】国際公開第01/01143号パンフレット
【特許文献１３】国際公開第02/12566号パンフレット
【特許文献１４】国際公開第03/014392号パンフレット
【特許文献１５】米国特許第6,465,178号明細書
【特許文献１６】国際公開第00/53812号パンフレット
【特許文献１７】国際公開第2005/065814号パンフレット
【特許文献１８】米国特許第6,172,218号明細書
【特許文献１９】国際公開第98/44151号パンフレット
【特許文献２０】国際公開第00/18957号パンフレット
【特許文献２１】米国特許第5,268,486号明細書
【特許文献２２】国際公開第0226891号パンフレット
【特許文献２３】米国特許第6,924,372号明細書
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Scheit, Nucleotide analogs (John Wiley & Son, 1980)
【非特許文献２】Uhlman et al., Chemical Reviews 90:543-584, 1990
【非特許文献３】Nature. 437, 376-380 (2005)
【非特許文献４】Science. 309, 5741, 1728-1732 (2005)
【発明の概要】
【００１１】
第一態様によれば、本開示は、式（I）の化合物またはそのメソメリー形を提供する：
【化１】
0006750006.tif 000002
(I)
式中、mCat+またはmAn-は、有機または無機の正／負に帯電した対イオンであり、ならびに
mは0〜3の整数であり；
pは1〜2の整数であり；
qは1〜5の整数であり；
alkは、1つ以上の二重または三重結合を任意に含有する1〜5個の炭素原子の鎖であり；
YはS、OまたはCH2であり；
ZはOHであり；
nは0〜3の整数であり；
XはOHもしくはO-またはそれらのアミドもしくはエステルコンジュゲートであり；
Ra1およびRa2の各々は、独立して、H、SO3-、スルホンアミド、ハロゲン、または隣接する炭素原子に縮合した追加的環であり；
Rc1またはRc2の各々は、独立して、アルキルまたは置換アルキルである。
【００１２】
Pは1の可能性がある；その場合、化合物は、式（Ia）の化合物またはそのメソメリー形である：
【化２】
0006750006.tif 000003
(Ia)
式中、mCat+またはmAn-は、有機または無機の正／負に帯電した対イオンであり、ならびに
mは0〜3の整数であり；
qは1〜5の整数であり；
alkは、1つ以上の二重または三重結合を任意に含有する1〜5個の炭素原子の鎖であり；
YはS、OまたはCH2であり；
ZはOHであり；
nは0〜3の整数であり；
XはOHもしくはO-またはそれらのアミドもしくはエステルコンジュゲートであり；
Ra1およびRa2の各々は、独立して、H、SO3-、スルホンアミド、ハロゲン、または隣接する炭素原子に縮合した追加的環であり；
Rc1またはRc2の各々は、独立して、アルキルまたは置換アルキルである。
【００１３】
Pは2の可能性がある；その場合、化合物は、式（Ib）の化合物またはそのメソメリー形である：
【化３】
0006750006.tif 000004
(Ib)
式中、mCat+またはmAn-は、有機または無機の正／負に帯電した対イオンであり、ならびに
mは0〜3の整数であり；
qは1〜5の整数であり；
alkは、1つ以上の二重または三重結合を任意に含有する1〜5個の炭素原子の鎖であり；
YはS、OまたはCH2であり；
ZはOHであり；
nは0〜3の整数であり；
XはOHもしくはO-またはそれらのアミドもしくはエステルコンジュゲートであり；
Ra1およびRa2の各々は、独立して、H、SO3-、スルホンアミド、ハロゲン、または隣接する炭素原子に縮合した追加的環であり；
Rc1またはRc2の各々は、独立して、アルキルまたは置換アルキルである。
【００１４】
Ra1またはRa2がHである特定の実施例では；Rc1またはRc2のいずれかがアルキルスルホン酸基であってもよい。Ra1もしくはRa2の少なくとも1つがSO3-であるか、またはRa1もしくはRa2が隣接する炭素原子に縮合した追加的環であり、その追加的環がSO3-を有するか、またはRc1もしくはRc2がアルキルスルホン酸基であるように、この化合物は1つ以上のスルホン酸置換基を必要とする。
【００１５】
pが2である特定の実施例では、Rc1またはRc2はアルキルスルホン酸基である。
【００１６】
特定の実施例では、rは3に等しい。
【００１７】
特定の実施例では、nは1である。OH基は、環上の4位に存在し得る。特定の実施例では、nは0であり、フェニル環は非置換である。nが0である特定の実施例では、YはSまたはOである（およびCH2ではない）。
【００１８】
別の実施形態では、本開示の化合物は、例えば、ヌクレオシド、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、炭水化物、リガンド、粒子、細胞、半固体表面（例えば、ゲル）および固体表面などの様々な基質部位とコンジュゲートすることができる。コンジュゲーションはカルボキシル基C(=O)-Xを介して行うことができ、それをアミドまたはエステルに変えることができる。
【００１９】
したがって、本開示のさらなる態様によれば、例えば、そのような基質部位への共有結合を可能にするリンカー基を含む色素化合物が提供される。
【００２０】
さらなる態様によれば、本開示は、式：N-L-色素によって規定されるヌクレオシドまたはヌクレオチド化合物を提供し、ここで、Nはヌクレオチドであり、Lは任意のリンカー部位であり、色素は本開示による蛍光化合物である。
【００２１】
さらなる態様では、本開示は、本開示の色素化合物を使用する配列決定方法を提供する。
【００２２】
さらなる態様によれば、本開示はまた、種々の免疫学的アッセイ、オリゴヌクレオチドおよび核酸標識、ならびに合成によるDNA配列決定に使用され得る色素化合物（遊離またはコンジュゲート型）を含むキットを提供する。さらに別の態様では、本開示は、自動化装置プラットフォーム上での合成による配列決定のサイクルに特に適した色素「セット」を含むキットを提供する。
【００２３】
本開示のさらなる態様は、本開示の化合物の化学的調製である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
この開示は、蛍光検出および合成による配列決定の方法に特に適した新規化合物を提供する。インドールN-フェニル部位を有する化合物は、N-アルキル類似体と比較して、蛍光強度、光安定性において有利であり、したがって、特定の核酸配列決定用途を改善する。
【００２５】
第一態様によれば、本開示は、式（I）の化合物またはそのメソメリー形を提供する：
【化４】
0006750006.tif 000005
(I)
式中、mCat+またはmAn-は、有機または無機の正／負に帯電した対イオンであり、ならびに
mは0〜3の整数であり；
pは1〜2の整数であり；
qは1〜5の整数であり；
alkは、1つ以上の二重または三重結合を任意に含有する1〜5個の炭素原子の鎖であり；
YはS、OまたはCH2であり；
ZはOHであり；
nは0〜3の整数であり；
XはOHもしくはO-またはそれらのアミドもしくはエステルコンジュゲートであり；
Ra1およびRa2の各々は、独立して、H、SO3-、スルホンアミド、ハロゲン、または隣接する炭素原子に縮合した追加的環であり；
Rc1またはRc2の各々は、独立して、アルキルまたは置換アルキルである。
【００２６】
本開示は、式（I）の化合物またはそのメソメリー形を提供する：
【化５】
0006750006.tif 000006
(I)
式中、mCat+またはmAn-は、有機または無機の正／負に帯電した対イオンであり、
mは0〜3の整数であり；
pは1〜2の整数であり；
qは1〜5の整数であり；
alkは、1つ以上の二重または三重結合を任意に含有する1〜5個の炭素原子の鎖であり；
YはS、OまたはCH2であり；
ZはOHであり；
nは0〜3の整数であり；
XはOHもしくはO-またはそれらのアミドもしくはエステルコンジュゲートであり；
Ra1およびRa2の各々は、独立して、H、SO3-、スルホンアミド、ハロゲン、または隣接する炭素原子に縮合した追加的環であり；ならびに
Rc1またはRc2の各々は、独立して、アルキルまたは置換アルキルであり、Ra1もしくはRa2の少なくとも1つはSO3-であるか、またはRa1もしくはRa2は隣接する炭素原子に縮合した追加的環であり、その追加的環はSO3-を有するか、またはRc1もしくはRc2はアルキルスルホン酸基である。
【００２７】
本開示は、式（I）の化合物またはそのメソメリー形を提供する：
【化６】
0006750006.tif 000007
(I)
式中、mCat+またはmAn-は、有機または無機の正／負に帯電した対イオンであり、
mは0〜3の整数であり；
pは1〜2の整数であり；
qは1〜5の整数であり；
alkは、1つ以上の二重または三重結合を任意に含有する1〜5個の炭素原子の鎖であり；
YはS、OまたはCH2であり；
ZはOHであり；
nは0〜3の整数であり；
XはOHもしくはO-またはそれらのアミドもしくはエステルコンジュゲートであり；
Ra1およびRa2の各々は、独立して、H、SO3-、スルホンアミド、ハロゲン、または隣接する炭素原子に縮合した追加的環であり；ならびに
Rc1およびRc2の各々は、独立して、アルキルまたは置換アルキルであり、nが0である場合、YはSまたはOである。
【００２８】
本開示は、式（I）の化合物またはそのメソメリー形を提供する：
【化７】
0006750006.tif 000008
(I)
式中、mCat+またはmAn-は、有機または無機の正／負に帯電した対イオンであり、
mは0〜3の整数であり；
pは1〜2の整数であり；
qは1〜5の整数であり；
alkは、1つ以上の二重または三重結合を任意に含有する1〜5個の炭素原子の鎖であり；
YはS、OまたはCH2であり；
ZはOHであり；
nは0〜3の整数であり；
XはOHもしくはO-またはそれらのアミドもしくはエステルコンジュゲートであり；
Ra1およびRa2の各々は、独立して、H、SO3-、スルホンアミド、ハロゲン、または隣接する炭素原子に縮合した追加的環であり；ならびに
Rc1またはRc2の各々は、独立して、アルキルまたは置換アルキルであり、Ra1もしくはRa2の少なくとも1つはSO3-であるか、またはRa1もしくはRa2は隣接する炭素原子に縮合した追加的環であり、その追加的環はSO3-を有するか、またはRc1もしくはRc2はアルキルスルホン酸基であり、nが0である場合、YはSまたはOである。
【００２９】
分子は、1つ以上のスルホンアミドまたはSO3-部位を、位置Raに含んでもよい。Ra1および／またはRa2は、SO3-またはスルホンアミドであってよい。他のRa（Ra1またはRa2）は、独立して、H、SO3-、スルホンアミド、ハロゲン、または隣接する炭素原子に縮合した追加的環であり得る。Ra1またはRa2は、Hであり得る。Ra1またはRa2は、SO3-であり得る。Ra1はRa2と異なっていてもよく、例えば、その構造は単一スルホンアミド基をRa1に有し、HをRa2として有することができる。Ra1およびRa2は両方ともスルホンアミドであり得る。スルホンアミドは、Rがアルキル、置換アルキル、アリールまたは置換アリール基であるSO2NH2またはSO2NHRであり得る。Ra1またはRa2の両方とも、SO3-でも、隣接する炭素原子に縮合した追加的環でもない場合、Rc1またはRc2は、アルキルスルホン酸基でなければならない。
【００３０】
Ra1またはRa2は、インドール環の隣接する炭素に縮合した追加的脂肪族環、芳香族環または複素環であり得る。例えば、そのような場合で芳香族環が縮合している場合には、色素末端基は以下のタイプの構造を表すことができる：
【化８】
0006750006.tif 000009
式中、Rdは、H、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、ハロゲン、カルボキシ、スルホンアミド、またはスルホン酸であり得る。
【００３１】
したがって、本開示の色素は、式（1C）もしくは（ID）またはそれらのメソメリー形によって表すことができる：
【化９】
0006750006.tif 000010
(IC)
0006750006.tif 000011
(ID)
式中、mCat+またはmAn-は、有機または無機の正／負に帯電した対イオンであり、ならびに
mは0〜3の整数であり；
pは1〜2の整数であり；
qは1〜5の整数であり；
alkは、1つ以上の二重または三重結合を任意に含有する1〜5個の炭素原子の鎖であり；
YはS、OまたはCH2であり；
ZはOHであり；
nは0〜3の整数であり；
XはOHもしくはO-またはそれらのアミドもしくはエステルコンジュゲートであり；
Ra1およびRa2の各々は、独立して、H、SO3-、スルホンアミド、ハロゲン、または隣接する炭素原子に縮合した追加的環であり；
Rc1またはRc2の各々は、独立して、アルキルまたは置換アルキルであり；ならびに
Rdは、H、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、ハロゲン、カルボキシ、スルホンアミド、またはスルホン酸である。
【００３２】
したがって、本開示の色素は、式（1C）もしくは（ID）またはそれらのメソメリー形によって表すことができる：
【化１０】
0006750006.tif 000012
(IC)
0006750006.tif 000013
(ID)
式中、mCat+またはmAn-は、有機または無機の正／負に帯電した対イオンであり、ならびに
mは0〜3の整数であり；
pは1〜2の整数であり；
qは1〜5の整数であり；
alkは、1つ以上の二重または三重結合を任意に含有する1〜5個の炭素原子の鎖であり；
YはS、OまたはCH2であり；
ZはOHであり；
nは0〜3の整数であり；
XはOHもしくはO-またはそれらのアミドもしくはエステルコンジュゲートであり；
Ra1およびRa2の各々は、独立して、H、SO3-、スルホンアミド、ハロゲン、または隣接する炭素原子に縮合した追加的環であり；
Rc1またはRc2の各々は、独立して、アルキルまたは置換アルキルであり；ならびに
Rdは、H、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、ハロゲン、カルボキシ、スルホンアミド、もしくはスルホン酸であって、Ra1もしくはRa2の少なくとも1つはSO3-であり、またはRdはSO3-であって、またはRc1もしくはRc2はアルキルスルホン酸性基である。
【００３３】
したがって、本開示の色素は、式（1C）もしくは（ID）またはそれらのメソメリー形によって表すことができる：
【化１１】
0006750006.tif 000014
(IC)
0006750006.tif 000015
(ID)
式中、mCat+またはmAn-は、有機または無機の正／負に帯電した対イオンであり、ならびに
mは0〜3の整数であり；
pは1〜2の整数であり；
qは1〜5の整数であり；
alkは、1つ以上の二重または三重結合を任意に含有する1〜5個の炭素原子の鎖であり；
YはS、OまたはCH2であり；
ZはOHであり；
nは0〜3の整数であり；
XはOHもしくはO-またはそれらのアミドもしくはエステルコンジュゲートであり；
Ra1およびRa2の各々は、独立して、H、SO3-、スルホンアミド、ハロゲン、または隣接する炭素原子に縮合した追加的環であり；
Rc1またはRc2の各々は、独立して、アルキルまたは置換アルキルであり；ならびに
Rdは、H、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、ハロゲン、カルボキシ、スルホンアミド、もしくはスルホン酸であり、nが0である場合、YはSまたはOである。
【００３４】
したがって、本開示の色素は、式（1C）もしくは（ID）またはそれらのメソメリー形によって表すことができる：
【化１２】
0006750006.tif 000016
(IC)
0006750006.tif 000017
(ID)
式中、mCat+またはmAn-は、有機または無機の正／負に帯電した対イオンであり、ならびに
mは0〜3の整数であり；
pは1〜2の整数であり；
qは1〜5の整数であり；
alkは、1つ以上の二重または三重結合を任意に含有する1〜5個の炭素原子の鎖であり；
YはS、OまたはCH2であり；
ZはOHであり；
nは0〜3の整数であり；
XはOHもしくはO-またはそれらのアミドもしくはエステルコンジュゲートであり；
Ra1およびRa2の各々は、独立して、H、SO3-、スルホンアミド、ハロゲン、または隣接する炭素原子に縮合した追加的環であり；
Rc1またはRc2の各々は、独立して、アルキルまたは置換アルキルであり；ならびに
Rdは、H、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、ハロゲン、カルボキシ、スルホンアミド、もしくはスルホン酸であって、Ra1もしくはRa2の少なくとも1つはSO3-であり、またはRdはSO3-であって、またはRc1もしくはRc2はアルキルスルホン酸性基であり、nが0である場合、YはSまたはOである。
【００３５】
式（IC）または（ID）において、インドール環の隣接する炭素原子に縮合した追加的環は、例えば、スルホン酸またはスルホンアミドで任意に置換されていてもよい。
【００３６】
C(=O)-Xカルボキシ基またはその誘導体は、長さqのアルキル鎖によりインドール窒素原子に結合しており、ここでqは1〜5の炭素またはヘテロ原子である。鎖は、(CH2)qであってよく、ここでqは1〜5である。基は、(CH2)5COOHであってもよい。
【００３７】
分子は、1つ以上のアルキルスルホネート部位を位置Rcに含むことができる。Rc1および／またはRc2は、アルキル-SO3-であってもよい。他のRc（Rc1またはRc2）は、独立して、アルキルまたは置換アルキルであり得る。Rc1およびRc2は、独立して、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシルまたは(CH2)tSO3Hであってもよく、ここでtは1〜6である。tは1〜4であってもよい。tは4であってもよい。Rc1およびRc2は置換アルキル基であってもよい。Rc1およびRc2は、COOHまたは-SO3H部位またはそれらのエステルもしくはアミド誘導体を含有してもよい。
【００３８】
特定の実施形態では、Ra1またはRa2の一方がSO3-であり、Ra1またはRa2のもう一方がHまたはSO3-である場合、Rc1またはRc2のいずれかはアルキルスルホン酸基であり得る。
【００３９】
C(=O)-Xとして示されるCOOH基は、追加的結合の連結部分として作用し得るか、または追加的分子に連結され得る。コンジュゲーションが起こると、COOHまたはCOO-はアミドまたはエステルに変換される。
【００４０】
化合物の例には、式（II）もしくは（IIa）の構造またはそれらのメソメリー形が挙げられる：
【化１３】
0006750006.tif 000018
(II)
0006750006.tif 000019
(IIa)
式中、mCat+またはmAn-は、有機または無機の正／負に帯電した対イオンであり、ならびに
mは0〜3の整数であり；
pは1〜2の整数であり；
qは1〜5の整数であり；
alkは、1つ以上の二重または三重結合を任意に含有する1〜5個の炭素原子の鎖であり；
YはS、OまたはCH2であり；
ZはOHであり；
nは0〜3の整数であり；
XはOHもしくはO-またはそれらのアミドもしくはエステルコンジュゲートであり；
Ra1およびRa2の各々は、独立して、H、SO3-、スルホンアミド、ハロゲン、または隣接する炭素原子に縮合した追加的環であり；ならびに
Rc1またはRc2の各々は、独立して、アルキルまたは置換アルキルである。
【００４１】
化合物の例には、式（II）または（IIa）の構造またはそれらのメソメリー形が挙げられる：
【化１４】
0006750006.tif 000020
(II)
0006750006.tif 000021
(IIa)
式中、mCat+またはmAn-は、有機または無機の正／負に帯電した対イオンであり、
mは0〜3の整数であり；
pは1〜2の整数であり；
qは1〜5の整数であり；
alkは、1つ以上の二重または三重結合を任意に含有する1〜5個の炭素原子の鎖であり；
YはS、OまたはCH2であり；
ZはOHであり；
nは0〜3の整数であり；
XはOHもしくはO-またはそれらのアミドもしくはエステルコンジュゲートであり；
Ra1およびRa2の各々は、独立して、H、SO3-、スルホンアミド、ハロゲン、または隣接する炭素原子に縮合した追加的環であり；ならびに
Rc1およびRc2の各々は、独立して、アルキルまたは置換アルキルであり、nが0である場合、YはSまたはOである。
【００４２】
化合物のさらなる例には、式（IIIa）または（IIIb）の構造が挙げられる：
【化１５】
0006750006.tif 000022
(IIIa)
0006750006.tif 000023
(IIIb)
式中、mCat+またはmAn-は、有機または無機の正／負に帯電した対イオンであり、ならびに
mは0〜3の整数であり；
pは1〜2の整数であり；
qは1〜5の整数であり；
alkは、1つ以上の二重または三重結合を任意に含有する1〜5個の炭素原子の鎖であり；
tは1〜6の整数であり；
YはS、OまたはCH2であり；
ZはOHであり；
nは0〜3の整数であり；
XはOHもしくはO-またはそれらのアミドもしくはエステルコンジュゲートであり；
Ra1およびRa2の各々は、独立して、H、SO3-、スルホンアミド、ハロゲン、または隣接する炭素原子に縮合した追加的環であり；ならびに
Rc1またはRc2の各々は、独立して、アルキルまたは置換アルキルである。
【００４３】
化合物のさらなる例には、式（IIIa）または（IIIb）の構造が挙げられる：
【化１６】
0006750006.tif 000024
(IIIa)
0006750006.tif 000025
(IIIb)
式中、mCat+またはmAn-は、有機または無機の正／負に帯電した対イオンであり、
mは0〜3の整数であり；
pは1〜2の整数であり；
qは1〜5の整数であり；
alkは、1つ以上の二重または三重結合を任意に含有する1〜5個の炭素原子の鎖であり；
tは1〜6の整数であり；
YはS、OまたはCH2であり；
ZはOHであり；
nは0〜3の整数であり；
XはOHもしくはO-またはそれらのアミドもしくはエステルコンジュゲートであり；
Ra1およびRa2の各々は、独立して、H、SO3-、スルホンアミド、ハロゲン、または隣接する炭素原子に縮合した追加的環であり；ならびに
Rc1およびRc2の各々は、独立して、アルキルまたは置換アルキルであり、nが0である場合、YはSまたはOである。
【００４４】
化合物のさらなる例には、式（IVa）〜（IVd）の構造が挙げられる：
【化１７】
0006750006.tif 000026
(IVa)
0006750006.tif 000027
(IVb)
0006750006.tif 000028
(IVc)
0006750006.tif 000029
(IVd)
式中、mCat+またはmAn-は、有機または無機の正／負に帯電した対イオンであり、ならびに
mは0〜3の整数であり；
qは1〜5の整数であり；
alkは、1つ以上の二重または三重結合を任意に含有する1〜5個の炭素原子の鎖であり；
YはS、OまたはCH2であり；
ZはOHであり；
nは0〜3の整数であり；
XはOHもしくはO-またはそれらのアミドもしくはエステルコンジュゲートであり；
Ra1は、H、SO3-、スルホンアミド、ハロゲン、または隣接する炭素原子に縮合した追加的環であり；
Rc1はアルキルまたは置換アルキルであり；ならびに
Rdは、H、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、ハロゲン、カルボキシ、スルホンアミド、またはスルホン酸である。
【００４５】
化合物のさらなる例には、式（Va）〜（Vd）の構造が挙げられる：
【化１８】
0006750006.tif 000030
(Va)
0006750006.tif 000031
(Vb)
0006750006.tif 000032
(Vc)
0006750006.tif 000033
(Vd)
式中、mCat+またはmAn-は、有機または無機の正／負に帯電した対イオンであり、ならびに
mは0〜3の整数であり；
qは1〜5の整数であり；
alkは、1つ以上の二重または三重結合を任意に含有する1〜5個の炭素原子の鎖であり；
YはS、OまたはCH2であり；
ZはOHであり；
nは0〜3の整数であり；ならびに
XはOHもしくはO-またはそれらのアミドもしくはエステルコンジュゲートである。
【００４６】
化合物のさらなる例には、式（VIa）〜（VId）の構造が挙げられる：
【化１９】
0006750006.tif 000034
(VIa)
0006750006.tif 000035
(VIb)
0006750006.tif 000036
(VIc)
0006750006.tif 000037
(VId)
式中、mCat+またはmAn-は、有機または無機の正／負に帯電した対イオンであり、
mは0〜3の整数であり；
qは1〜5の整数であり；
alkは、1つ以上の二重または三重結合を任意に含有する1〜5個の炭素原子の鎖であり；
tは1〜6の整数であり；
YはS、OまたはCH2であり；
ZはOHであり；
nは0〜3の整数であり；ならびに
XはOHもしくはO-またはそれらのアミドもしくはエステルコンジュゲートである。
【００４７】
Alkは、1つ以上の二重または三重結合を任意に含有する1〜5個の炭素原子のアルキル、アルケニルまたはアルキニル鎖である。Alkは、rが1〜5である基(CH2)rであり得る。Alkは、(CH2)3であり得る。あるいは、炭素鎖は、1つ以上の二重結合または三重結合を含んでもよい。鎖は、結合-CH2-CH=CH-CH2-を含んでいてもよく、任意に追加的なCH2基を有する。鎖は、結合-CH2-C≡C-CH2-を含んでいてもよく、任意に追加的なCH2基を有する。
【００４８】
式VII〜VIIIに示される例のいずれかにおいて；rは3に等しくなれる。
【００４９】
式I〜VIIIに示される例のいずれかにおいて；qは5に等しくなれる。
【００５０】
式III、式VIまたは式VIIに示される例のいずれかにおいて；tは4に等しくなれる。
【００５１】
式I〜VIに示される例のいずれかにおいて；nは1〜3に等しくなれる。式I〜VIに示される例のいずれかにおいて；nは1に等しくなれる。式I〜VIに示される例のいずれかにおいて；nは0〜1の整数であり得る。nが1の場合、OH基は環上の任意の位置にあり得る。OH基は4位にあり得る。nが2または3である場合、OH基はフェニル環上の任意の位置にあり得る。
【００５２】
式I〜VIに示される例のいずれかにおいて；nが0の場合、YはOまたはSに等しくなれるが、CH2に等しくなれない。
【００５３】
式I〜VIに示される例のいずれかにおいて；YはOに等しくなれる。
【００５４】
式I〜VIに示される例のいずれかにおいて；YはOに等しくなれる。YがOの場合、nは0〜3である。YがCH2である場合、nは1〜3であり得る。
【００５５】
化合物のさらなる例には、式（VIIa）〜（VIId）の構造が挙げられる：
【化２０】
0006750006.tif 000038
(VIIa)
0006750006.tif 000039
(VIIb)
0006750006.tif 000040
(VIIc)
0006750006.tif 000041
(VIId)
式中、mCat+またはmAn-は、有機または無機の正／負に帯電した対イオンであり、
mは0〜3の整数であり；
qは1〜5の整数であり；
rは1〜5の整数であり；
tは1〜6の整数であり；ならびに
XはOHもしくはO-またはそれらのアミドもしくはエステルコンジュゲートである。
【００５６】
化合物のさらなる例には、式（VIIIa）〜（VIIId）の構造が挙げられる：
【化２１】
0006750006.tif 000042
(VIIIa)
0006750006.tif 000043
(VIIIb)
0006750006.tif 000044
(VIIIc)
0006750006.tif 000045
(VIIId)
式中、mCat+またはmAn-は、有機または無機の正／負に帯電した対イオンであり、
mは0〜3の整数であり；
qは1〜5の整数であり；
rは1〜5の整数であり；ならびに
XはOHもしくはO-またはそれらのアミドもしくはエステルコンジュゲートである。
【００５７】
特に有用な化合物は、本明細書に記載の色素で標識されたヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドである。
【００５８】
標識ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、アルキルカルボキシ基を介してインドールの窒素原子に結合してアミドを形成する標識を有していてもよい。標識ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、ピリミジン塩基のC5位または7-デアザプリン塩基のC7位にリンカー部位を介して結合した標識を有していてもよい。
【００５９】
標識ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドはまた、ヌクレオチドのリボースまたはデオキシリボース糖に共有結合した保護基を有してもよい。保護基は、リボースまたはデオキシリボース糖の任意の位置に結合していてもよい。特定の実施形態では、保護基は、ヌクレオチドのリボースまたはデオキシリボース糖の3'OH位置にある。
【００６０】
2つ以上のヌクレオチドを含むキットであって、少なくとも1つのヌクレオチドが本開示の化合物で標識されたヌクレオチドであるキットが、本明細書で提供される。キットは、2つ以上の標識ヌクレオチドを含んでもよい。ヌクレオチドは、2つ以上の蛍光標識で標識されてもよい。2つ以上の標識は、単一の励起源を用いて励起することができ、それはレーザーであってもよい。例えば、2つ以上の標識の励起帯は、スペクトルの重複領域の励起により両標識が蛍光を発するように、少なくとも部分的に重なり合っていてもよい。特定の実施形態では、発光の光学的識別によって標識の少なくとも1つの存在を判定することができるように、2つ以上の標識からの発光はスペクトルの異なる領域で起こる。
【００６１】
キットは4つの標識ヌクレオチドを含んでもよく、4つのヌクレオチドのうちの第1ヌクレオチドは、本明細書に開示される化合物で標識される。そのようなキットでは、第2、第3、および第4ヌクレオチドはそれぞれ、第1ヌクレオチド上の標識と任意に異なり、互いの標識と任意に異なる化合物で標識され得る。したがって、1つ以上の化合物は、化合物（単数または複数）が他の化合物から識別可能なように、明確な吸光度最大値および／または発光最大値を有することができる。例えば、各化合物は、化合物の各々が他の3つの化合物から識別可能なように、明確な吸光度最大値および／または発光最大値を有することができる。最大値以外の吸光度スペクトルおよび／または発光スペクトルの一部が異なる可能性があり、これらの差異を利用して化合物を識別することができることが理解されよう。キットは、2つ以上の化合物が600nmを超える明確な吸光度最大値を有するようなものであってもよい。本発明の化合物は、典型的には、640nmを超える領域の光を吸収する。
【００６２】
本明細書に記載の化合物、ヌクレオチドまたはキットは、生体システム（例えば、そのプロセスまたは成分を含む）を検出、測定または同定するために使用され得る。化合物、ヌクレオチドまたはキットを使用することができる例示的な技術には、配列決定、発現分析、ハイブリダイゼーション分析、遺伝子分析、RNA分析、細胞アッセイ（例えば、細胞結合もしくは細胞機能分析）、またはタンパク質アッセイ（例えば、タンパク質結合アッセイもしくはタンパク質活性アッセイ）が挙げられる。使用は、自動化配列決定装置などの、特定の技術を実施するための自動化装置上であってもよい。配列決定装置は、異なる波長で動作する2つのレーザーを含み得る。
【００６３】
本開示の化合物の合成方法が本明細書中に開示される。式（X）および／または（X1）、（X2）（X3）もしくは（X4）の化合物またはそれらの塩を、対称または非対称ポリメチン色素の合成の出発物質として使用することができる：
【化２２】
0006750006.tif 000046
またはこれらの塩であって、式中、Ra1は、H、SO3-、スルホンアミド、ハロゲン、または隣接する炭素原子に縮合した追加的環であり；Rc1はアルキルまたは置換アルキルであり；Arは芳香族基であり、Rはアルキル基である。4-ヒドロキシフェニルの特定の例が示されている場合、nが1より大きい例では、追加のヒドロキシル基が環上で置換されていてもよい。rは3に等しくなれる。
【００６４】
本開示の化合物の合成方法が本明細書に開示される。式（X5）の化合物またはその塩を、対称または非対称ポリメチン色素の合成の出発物質として使用することができる：
【化２３】
0006750006.tif 000047
(X5)
【００６５】
本明細書で使用される場合、用語「アルキル」は、C1〜C20炭化水素を指し、C3〜C10非芳香族炭素環を含み得る。特定の実施形態では、アルキル基は、それぞれ1〜6個の炭素原子を含有する飽和直鎖または分枝鎖炭化水素基を指すC1〜C6アルキルである。特定の例では、アルキル基は1つ以上の不飽和基を含んでもよく、したがってアルケニルおよびアルキニルを含む。
【００６６】
本明細書で使用される用語「ハロゲン」は、フルオロ（以下、Fと称する）、クロロ（以下、Clと称する）、ブロモ（以下、Brと称する）またはヨード（以下、Iと称する）を指し、通常、有機化合物中の水素原子の置換に関し、この置換は任意に水素の完全置換である。
【００６７】
用語「置換アルキル」は、限定されないが、ハロ、シアノ、SO3-、SRa、ORa、NRbRc、オキソ、CONRbRc、COOHおよびCOORbで任意に追加的に置換されていてもよい上記定義のアルキル、アルケニルまたはアルキニル基を指す。Ra、RbおよびRcはそれぞれ、独立して、H、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリールおよび置換アリールから選択され得る。さらに、前記置換アルキル、置換アルケニルおよび置換アルキニルは、任意に、O、NRb、tが0〜2であるS(O)tなどから選択される少なくとも1つのヘテロ原子または基によって割り込まれていてもよい。置換アルキルはまた、アルキル基が追加のアリールまたは置換アリール部位を含むベンジルなどの基をも包含する。
【００６８】
本開示による色素は、N-プロピル-4-ヒドロキシフェニルエーテル置換インドールを含む、種々の異なる出発物質から合成され得る。色素は、同じインドールがポリメチン鎖の両端にあるように対称的に、または異なるインドールが発色団のいずれかの末端にあるように非対称に作製され得る。ポリメチン色素を調製する方法は、当該技術分野で知られている。
【００６９】
本開示の一態様によれば、基質部位への結合に適した色素化合物、特に、基質部位への結合を可能にするリンカー基を含む色素化合物が提供される。基質部位は、本開示の色素がコンジュゲートされ得る実質的に任意の分子または物質であってよく、非限定的な例としては、ヌクレオシド、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、炭水化物、リガンド、粒子、固体表面、有機および無機ポリマー、染色体、核、生細胞およびそれらの組み合わせまたは集合体が挙げられる。色素は、任意のリンカーによって、疎水性引力、イオン引力および共有結合を含む様々な手段によってコンジュゲートすることができる。特に、色素は、共有結合によって基質に結合される。より具体的には、共有結合はリンカー基を介するものである。
【００７０】
色素化合物の基質へのコンジュゲーションは、カルボキシル基COXを介して行うことができ、それはアミドまたはエステルに変換することができる。
【００７１】
本開示による色素は、色素を別の分子に共有結合させるための置換基位置の1つに反応性リンカー基を含んでもよい。反応性連結基は、結合（例えば、共有結合または非共有結合）を形成することができる部位である。特定の実施形態では、リンカーは切断可能なリンカーであってもよい。「切断可能なリンカー」という用語の使用は、リンカー全体を除去する必要があることを意味するものではない。切断部位は、切断後にリンカーの一部が色素および／または基質部位に結合したままとなるリンカー上の位置に位置することができ。切断可能なリンカーは、非限定的な例として、求電子的に切断可能なリンカー、酵素的に切断可能なリンカー、求核的に切断可能なリンカー、光切断可能なリンカーであり、還元条件下（例えば、ジスルフィドまたはアジド含有リンカー）、酸化条件下で切断可能であり、安全キャッチリンカーの使用により切断可能であり、および除去機構によって切断可能であり得る。基質部位に色素化合物を結合させるための切断可能なリンカーの使用は、例えば検出後に標識を除去する選択肢を提供し、それにより下流工程における干渉シグナルを回避する。
【００７２】
有用なリンカー基は、特許文献１（参照により本明細書に組み込まれる）において見ることができ、その例には、水溶性ホスフィン、または遷移金属および少なくとも部分的に水溶性の配位子から形成される水溶性遷移金属触媒を用いて切断され得るリンカーが含まれる。水溶液中では、後者は、少なくとも部分的に水溶性の遷移金属錯体を形成する。そのような切断可能なリンカーを使用して、ヌクレオチドの塩基を、本明細書に記載の色素などの標識に連結することができる。
【００７３】
特定のリンカーは、以下の式の部位を含むものなど、特許文献１（参照により本明細書に組み込まれる）において見ることができる：
【化２４】
0006750006.tif 000048
0006750006.tif 000049
（式中、XはO、S、NHおよびNQを含む群から選択され、QはC1〜10置換または非置換アルキル基であり、YはO、S、NHおよびN(アリル)を含む群から選択され、Tは水素またはC1〜C10置換または非置換アルキル基であり、*はその部位がヌクレオチドまたはヌクレオシドの残部に結合する位置を示す）。
【００７４】
特定の実施形態では、蛍光色素（発蛍光団）とグアニン塩基との間のリンカーの長さは、例えば、ポリエチレングリコールスペーサー基を導入することによって変化させることができ、それにより当該技術分野で知られている他の結合を介してグアニン塩基に結合した同じ発蛍光団と比較して、蛍光強度を増加させる。例示的なリンカーおよびそれらの特性は、特許文献２として公開された特許文献３（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。リンカーの設計、および特にそれらの長さの増加は、DNAなどのポリヌクレオチドに組み込まれた場合、グアノシンヌクレオチドのグアニン塩基に結合した発蛍光団の輝度を改善することができる。したがって、色素が、グアニン含有ヌクレオチドに結合した蛍光色素標識の検出を用いる任意の分析方法で使用するためのものである場合、例えば特許文献２に記載されているように、nが2〜50の整数である式-((CH2)2O)n-のスペーサー基を有するリンカーを使用することが有利であり得る。
【００７５】
本開示は、ヌクレオシドと、本明細書に記載の1つ以上の色素で標識されたヌクレオチド（修飾ヌクレオチド）のコンジュゲートをさらに提供する。標識ヌクレオシドおよびヌクレオチドは、非限定的な例として、PCR増幅、等温増幅、固相増幅、ポリヌクレオチド配列決定（例えば、固相配列決定）、ニックトランスレーション反応などの酵素合成によって形成されたポリヌクレオチドを標識するのに有用である。
【００７６】
ヌクレオシドおよびヌクレオチドは、糖または核酸塩基上の部位で標識され得る。当該技術分野で知られているように、「ヌクレオチド」は、窒素含有塩基、糖、および1つ以上のリン酸基からなる。RNAにおいては、糖はリボースであり、DNAにおいてはデオキシリボース、すなわちリボース中に存在するヒドロキシル基を欠く糖である。窒素含有塩基は、プリンまたはピリミジンの誘導体である。プリンはアデニン（A）またはグアニン（G）である可能性があり、ピリミジンはシトシン（C）、チミン（T）またはRNAの文脈ではウラシル（U）である可能性がある。デオキシリボースのC-1原子は、ピリミジンのN-1またはプリンのN-9に結合している。ヌクレオチドはまた、ヌクレオシドのリン酸エステルであり、糖のC-3またはC-5に結合したヒドロキシル基上でエステル化が起こる。ヌクレオチドは、通常、一、二、または三リン酸である。
【００７７】
「ヌクレオシド」は、ヌクレオチドと構造的に類似しているが、リン酸部位を欠いている。ヌクレオシド類似体の例は、標識が塩基に連結し、糖分子に結合したリン酸基が存在しないものである。
【００７８】
塩基は、通常プリンまたはピリミジンと呼ばれるが、ヌクレオチドまたはヌクレオシドのワトソン-クリック塩基対形成を経る能力を変えない誘導体および類似体が利用可能であることは当業者には理解されよう。「誘導体」または「類似体」は、そのコア構造が親化合物のコア構造と同じかまたは非常に類似しているが、例えば、誘導体ヌクレオチドまたはヌクレオシドを別の分子に連結させる、異なるまたは付加的な側基などの化学的または物理的修飾を有する化合物または分子を意味する。例えば、塩基はデアザプリンであってもよい。特定の実施形態では、誘導体はワトソン-クリック対形成を経ることができる。「誘導体」および「類似体」はまた、例えば、修飾された塩基部位および／または修飾された糖部位を有する合成ヌクレオチドまたはヌクレオシド誘導体を含む。そのような誘導体および類似体は、例えば、非特許文献１および非特許文献２に記載されている。ヌクレオチド類似体は、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホネート、ホスホラニリデート、ホスホルアミデート結合などを含む修飾ホスホジエステル結合を有することもできる。
【００７９】
色素は、ヌクレオチド塩基上の任意の位置に、例えばリンカーを介して結合され得る。特定の実施形態では、ワトソン-クリック塩基対形成は、結果として生じる類似体でもまだ行われる。特定の核酸塩基標識部位には、ピリミジン塩基のC5位または7-デアザプリン塩基のC7位が含まれる。上記のように、リンカー基を使用して、色素をヌクレオシドまたはヌクレオチドに共有結合させすることができる。
【００８０】
特定の実施形態では、標識ヌクレオシドまたはヌクレオチドは、酵素的に組み込み可能であり、酵素的に伸長可能であり得る。したがって、リンカー部位は、化合物が核酸複製酵素によってヌクレオチドの全体的な結合および認識を著しく妨げないように、ヌクレオチドを化合物に連結するのに十分な長さであり得る。したがって、リンカーは、スペーサーユニットを含むこともできる。スペーサーは、例えば、ヌクレオチド塩基を切断部位または標識から遠ざけさせる。
【００８１】
本開示の色素で標識されたヌクレオシドまたはヌクレオチドは、以下の式を有し得る：
【化２５】
0006750006.tif 000050
色素が本開示による色素化合物である場合、Bは、例えばウラシル、チミン、シトシン、アデニン、グアニンなどの核酸塩基であり、Lは存在しても存在していなくてもよい任意のリンカー基である。R'は、H、一リン酸、二リン酸、三リン酸、チオリン酸塩、リン酸エステル類似体、反応性リン含有基に結合している-O-、または保護基で保護されている-O-であり得る。R''は、H、OH、ホスホラミダイトまたは3'OH保護基であり、R'''はHまたはOHである。
【００８２】
R''がホスホラミダイトである場合、R'は酸切断可能なヒドロキシル保護基であり、その後のモノマー結合を自動合成条件下で可能にする。
【００８３】
特定の実施形態では、保護基は、色素化合物から別個で独立している、すなわち直接結合していない。別の実施形態では、色素は、3'OH保護基の全部または一部を含み得る。したがって、R''は、本明細書に開示される色素化合物を含んでも含まなくてもよい3'OH保護基であってもよい。
【００８４】
さらに別の代替実施形態では、ペントース糖の3'炭素上に保護基はなく、塩基に結合した色素（または色素およびリンカー構築物）は、例えば、追加のヌクレオチドの組み込みの保護として作用するのに十分な大きさまたは構造であり得る。したがって、色素が糖の3'位に結合しているか否かにかかわらず、保護は立体障害によるものであってもよく、または大きさ、電荷および構造の組み合わせによるものであってもよい。
【００８５】
さらに別の代替実施形態では、保護基は、ペントース糖の2'または4'炭素上に存在し、追加のヌクレオチドの組み込みの保護として作用するのに十分な大きさまたは構造であり得る。保護基の使用は、修飾ヌクレオチドが組み込まれた際に伸長を停止させることでなど、重合を制御することを可能にする。保護効果が、例えば、非限定的な例として、化学的条件を変更することによって、または化学的保護の除去によって可逆的である場合、ある時点で伸長を停止し、次に続けることができる。
【００８６】
別の特定の実施形態では、3'OH保護基は、特許文献４（参照により本明細書に組み込まれる）に開示される部位を含む。例えば、保護基は、アジドメチル(CH2N3)またはアリルであってもよい。
【００８７】
特定の実施形態では、リンカー（色素とヌクレオチドとの間）および保護基は共に存在し、別個の部位である。特定の実施形態では、リンカーおよび保護基は、両方とも実質的に同様の条件下で切断可能である。したがって、色素化合物および保護の両方を除去するのに1回だけの処理が必要とされるので、脱保護および脱保護プロセスがより効率的であり得る。しかし、いくつかの実施形態では、リンカーおよび保護基は、異なる条件下で個々に切断可能である代わりに、同様の条件下で切断可能である必要はない。
【００８８】
この開示はまた、色素化合物を組み込んだポリヌクレオチドも包含する。そのようなポリヌクレオチドは、ホスホジエステル結合で結合したデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドをそれぞれ含むDNAまたはRNAであり得る。本開示によるポリヌクレオチドは、本開示の修飾ヌクレオチド以外の、天然に存在するヌクレオチド、非天然（または修飾）ヌクレオチド、またはそれらの任意の組み合わせを、本明細書に記載の少なくとも1つの修飾ヌクレオチド（例えば、色素化合物で標識された）と一緒に含み得る。本開示によるポリヌクレオチドはまた、非天然骨格結合および／または非ヌクレオチド化学修飾を含み得る。本開示による少なくとも1つの修飾ヌクレオチドを含むリボヌクレオチドとデオキシリボヌクレオチドとの混合物を含むキメラ構造も検討される。
【００８９】
本開示による色素化合物を含む修飾ヌクレオチド（またはヌクレオシド）は、ヌクレオチドまたはヌクレオシドに結合した蛍光標識の検出を含む方法などの任意の分析方法で、それ自体であろうと、より大きな分子構造またはコンジュゲートに組み込まれていても、会合していても、使用することができる。この文脈において、用語「ポリヌクレオチドに組み込まれる」は、5'リン酸が、ホスホジエステル結合で、それ自体がより長いポリヌクレオチド鎖の一部を形成し得る第2の（修飾または未修飾）ヌクレオチドの3'ヒドロキシル基に加わることを意味し得る。本明細書に記載の修飾ヌクレオチドの3'末端は、ホスホジエステル結合で、追加の（修飾または未修飾）ヌクレオチドの5'リン酸に連結されていても連結されていなくてもよい。したがって、1つの非限定的な実施形態では、本開示は、ポリヌクレオチドに組み込まれた修飾ヌクレオチドを検出する、以下を含む方法を提供する：（a）本開示の少なくとも1つの修飾ヌクレオチドをポリヌクレオチドに組み込むこと、および（b）ポリヌクレオチドに組み込まれた修飾ヌクレオチド（単数または複数）の検出を、前記修飾ヌクレオチド（単数または複数）に結合した色素化合物からの蛍光シグナルを検出することにより行うことを含む。
【００９０】
この方法は、以下を含むことができる：（a）本開示による1つ以上の修飾ヌクレオチドを、ポリヌクレオチドに組み込む合成工程、および（b）ポリヌクレオチドに組み込まれた1つ以上の修飾ヌクレオチド（単数または複数）を、それらの蛍光を検出または定量的に測定することによって検出する検出工程。
【００９１】
本開示の一実施形態では、少なくとも1つの修飾ヌクレオチドは、合成工程において、ポリメラーゼ酵素の作用によってポリヌクレオチドに組み込まれる。しかしながら、修飾ヌクレオチドをポリヌクレオチドに連結する他の方法、例えば、化学的オリゴヌクレオチド合成、または標識オリゴヌクレオチドの非標識オリゴヌクレオチドへのライゲーションなどを使用することができる。したがって、用語「組み込む」は、ヌクレオチドおよびポリヌクレオチドに関して使用される場合、化学的方法ならびに酵素的方法によるポリヌクレオチド合成を包含することができる。
【００９２】
特定の実施形態では、合成工程が実施され、任意に、鋳型ポリヌクレオチド鎖を、本開示の蛍光標識修飾ヌクレオチドを含む反応混合物と共にインキュベートする工程を含み得る。ポリメラーゼはまた、鋳型ポリヌクレオチド鎖にアニーリングされたポリヌクレオチド鎖上の遊離の3'ヒドロキシル基と修飾ヌクレオチド上の5'リン酸基との間のホスホジエステル結合の形成を可能にする条件下で供給され得る。したがって、合成工程は、ヌクレオチドの鋳型鎖への相補的塩基対形成によって方向づけられるポリヌクレオチド鎖の形成を含むことができる。
【００９３】
本方法の全実施形態では、修飾ヌクレオチドが組み込まれたポリヌクレオチド鎖が鋳型鎖にアニーリングされている間に、または2つの鎖が分離される変性工程の後に、検出工程が実施されてもよい。追加の工程、例えば化学的もしくは酵素的な反応工程または精製工程を、合成工程と検出工程との間に含めることができる。特に、修飾ヌクレオチド（単数または複数）を組み込んだ標的鎖は、単離または精製され、次いでさらに処理されるか、またはその後の分析において使用されてもよい。一例として、合成工程において修飾ヌクレオチド（単数または複数）で標識された標的ポリヌクレオチドはその後、標識プローブまたはプライマーとして使用され得る。他の実施形態では、本明細書に記載の合成工程の生成物を追加の反応工程にかけることができ、必要であれば、これらの後続工程の生成物を精製または単離することができる。
【００９４】
合成工程の適切な条件は、標準的な分子生物学技術に精通した者にはよく知られている。一実施形態では、合成工程は、本明細書に記載の修飾ヌクレオチドを含むヌクレオチド前駆体を使用し、適切なポリメラーゼ酵素の存在下で鋳型鎖に相補的な伸長標的鎖を形成する、標準プライマー伸長反応に類似し得る。他の実施形態では、合成工程は、それ自体で、標的および鋳型ポリヌクレオチド鎖のコピー由来のアニーリングした相補鎖からなる標識二本鎖増幅産物を産生する増幅反応の一部を形成し得る。他の例示的な合成工程には、ニックトランスレーション、鎖置換重合、ランダムプライムドDNA標識などが挙げられる。合成工程のための特に有用なポリメラーゼ酵素は、本明細書に記載の1つ以上の修飾ヌクレオチドの組み込みを触媒することができるものである。様々な天然または修飾ポリメラーゼを使用することができる。一例として、熱安定性ポリメラーゼは、熱サイクル条件を使用して実施される合成反応に使用され得るが、熱安定性ポリメラーゼは、等温プライマー伸長反応には望ましくない可能性がある。本開示による修飾ヌクレオチドを組み込むことができる適切な熱安定性ポリメラーゼには、各々が参照により本明細書に組み込まれる特許文献５または特許文献６に記載のものが挙げられる。37℃などの低温で実施される合成反応では、ポリメラーゼ酵素は必ずしも熱安定性ポリメラーゼである必要はなく、したがって、ポリメラーゼの選択は、反応温度、pH、鎖置換活性などの多くの要因に依存する。
【００９５】
特定の非限定的な実施形態では、本開示は、核酸配列決定、再配列決定、全ゲノム配列決定、一塩基多型スコアリング、または、本明細書に記載の色素で標識された修飾ヌクレオチドまたはヌクレオシドの検出を、ポリヌクレオチドに組み込まれた場合に伴う他の用途を包含する。蛍光色素を含む修飾ヌクレオチドで標識されたポリヌクレオチドの使用の恩恵を受ける様々な他の用途のいずれも、本明細書に記載の色素で標識された修飾ヌクレオチドまたはヌクレオシドを使用することができる。
【００９６】
特定の実施形態では、本開示は、本開示による色素化合物を含む修飾ヌクレオチドの、合成によるポリヌクレオチド配列決定反応における使用を提供する。合成による配列決定は、配列決定される鋳型核酸に相補的な成長ポリヌクレオチド鎖を形成するために、一般に、ポリメラーゼまたはリガーゼを用いて、1つ以上のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを、5'から3'方向に伸長するポリヌクレオチド鎖へ逐次付加することを伴う。付加されたヌクレオチド（単数または複数）の1つ以上に存在する塩基の同一性は、検出または「画像化」工程で決定することができる。添加された塩基の同一性は、各ヌクレオチド組み込み工程後に決定されてもよい。次いで、鋳型の配列は、従来のワトソン-クリック塩基対形成規則を使用して推定され得る。単一塩基の同一性の決定のための、本明細書に記載の色素で標識された修飾ヌクレオチドの使用は、例えば一塩基多型のスコアリングにおいて有用であり、そのような一塩基伸長反応は本開示の範囲内である。
【００９７】
本開示の一実施形態では、鋳型ポリヌクレオチドの配列は、組み込まれたヌクレオチド（単数または複数）に結合した蛍光標識（単数または複数）の検出によって配列決定される鋳型ポリヌクレオチドに相補的な新生鎖への1つ以上のヌクレオチドの組み込みを検出することによって決定される。鋳型ポリヌクレオチドの配列決定は、適切なプライマー（またはヘアピンの一部としてプライマーを含むヘアピン構築物として調製される）を用いてプライミングすることができ、新生鎖は、ポリメラーゼ触媒反応においてプライマーの3'末端にヌクレオチドを付加することによって階段的に伸長される。
【００９８】
特定の実施形態では、異なるヌクレオチド三リン酸（A、T、GおよびC）のそれぞれは、特有の発蛍光団で標識されてよく、制御されない重合を防ぐために、3'位に保護基も含む。あるいは、4つのヌクレオチドのうちの1つが非標識（暗色）であってもよい。ポリメラーゼ酵素は、鋳型ポリヌクレオチドに相補的な新生鎖にヌクレオチドを組み込み、保護基は、ヌクレオチドのさらなる組み込みを防ぐ。任意の組み込まれていないヌクレオチドは洗い流すことができ、組み込まれた各ヌクレオチドからの蛍光シグナルは、レーザー励起および適切な発光フィルターを用いる電荷結合素子などの適切な手段によって光学的に「読み取る」ことができる。その後、3'-保護基および蛍光色素化合物を（同時にまたは逐次的に）除去（脱保護）し、追加のヌクレオチド組み込みのために新生鎖を露出させることができる。典型的には、組み込まれたヌクレオチドの同一性は、各組み込み工程の後に決定されるが、これは厳密に必須ではない。同様に、特許文献７（参照により本明細書に組み込まれる）は、固体支持体上に固定化されたポリヌクレオチドを配列決定する方法を開示する。
【００９９】
本方法は、上記に例示されるように、DNAポリメラーゼの存在下で、蛍光標識された3'保護ヌクレオチドA、G、CおよびTの、固定化ポリヌクレオチドに相補的な成長鎖への組み込みを利用する。ポリメラーゼは、標的ポリヌクレオチドに相補的な塩基を組み込むが、さらなる付加は3'保護基により防がれる。その後組み込まれたヌクレオチドの標識を測定し、保護基を化学的切断によって除去し、さらなる重合が起こるのを可能にすることができる。合成による配列決定反応において配列決定される核酸鋳型は、配列決定することが望まれる任意のポリヌクレオチドであり得る。配列決定反応のための核酸鋳型は、典型的には、配列決定反応において追加のヌクレオチドを付加するためのプライマーまたは開始点としての機能を果たす遊離3'ヒドロキシル基を有する二本鎖領域を含む。配列決定される鋳型の領域は、相補鎖上のこの遊離3'ヒドロキシル基を突出させる。配列決定される鋳型のオーバーハング領域は一本鎖であってもよいが、配列決定反応の開始のための遊離3'OH基を提供する配列決定される鋳型鎖に相補的な鎖上に「ニックが存在する」という条件で、二本鎖であってもよい。そのような実施形態では、配列決定は鎖置換によって進行し得る。特定の実施形態では、遊離3'ヒドロキシル基を有するプライマーを、配列決定される鋳型の一本鎖領域にハイブリダイズする別個の成分（例えば、短いオリゴヌクレオチド）として添加してもよい。あるいは、配列決定されるプライマーおよび鋳型鎖は、例えばヘアピンループ構造など、分子内二本鎖を形成することができる部分的に自己相補的な核酸鎖の一部をそれぞれ形成することができる。ヘアピンポリヌクレオチドおよびそれらが固体支持体に結合され得る方法は、各々が参照により本明細書に組み込まれる特許文献８および特許文献９に記載されている。ヌクレオチドを成長プライマーに連続して添加し、5'から3'方向のポリヌクレオチド鎖を合成することができる。添加された塩基の性質は、必ずしも必要でははないがとりわけ各塩基付加の後に決定され、核酸鋳型の配列情報を提供し得る。このように、ヌクレオチドの5'リン酸基とのホスホジエステル結合の形成を介して核酸鎖の遊離の3'ヒドロキシル基にヌクレオチドを結合させることにより、ヌクレオチドが核酸鎖（またはポリヌクレオチド）に組み込まれる。
【０１００】
配列決定される核酸鋳型は、DNAもしくはRNA、またはデオキシヌクレオチドおよびリボヌクレオチドを含むハイブリッド分子であってもよい。核酸鋳型は、配列決定反応における鋳型のコピーを妨げない限り、天然および／または非天然ヌクレオチドならびに天然または非天然骨格結合を含み得る。
【０１０１】
特定の実施形態では、配列決定される核酸鋳型は、当該技術分野で知られている任意の適切な連結方法を介して、例えば共有結合を介して固体支持体に結合され得る。特定の実施形態では、鋳型ポリヌクレオチドは、固体支持体（例えば、シリカベースの支持体）に直接結合され得る。しかしながら、本開示の他の実施形態では、固体支持体の表面は、鋳型ポリヌクレオチドの直接共有結合を可能にするように、またはそれ自体が固体支持体に非共有結合し得るヒドロゲルもしくは高分子電解質多層を介して鋳型ポリヌクレオチドを固定化するように修飾され得る。
【０１０２】
ポリヌクレオチドがシリカベースの支持体に直接結合されているアレイは、例えば、特許文献１０（参照により本明細書に組み入れられる）に開示されているようなものであり、ポリヌクレオチドが、ガラス上のペンダントエポキシド基とポリヌクレオチド上の内部アミノ基との間の反応によってガラス支持体上に固定化されている。さらに、例えば特許文献９（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、ポリヌクレオチドを硫黄ベースの求核試薬と固体支持体との反応によって固体支持体に結合させることができる。固体支持型鋳型ポリヌクレオチドのさらに別の例は、鋳型ポリヌクレオチドがシリカベースまたは他の固体支持体上に支持されたヒドロゲルに結合している場合であり、例えば、各々が参照により本明細書に組み込まれる特許文献１１、特許文献１２、特許文献１３、特許文献１４、特許文献１５および特許文献１６に記載されている。
【０１０３】
鋳型ポリヌクレオチドが固定化され得る特定の表面は、ポリアクリルアミドヒドロゲルである。ポリアクリルアミドヒドロゲルは、上記の参考文献および参照により本明細書に組み込まれる特許文献１７に記載されている。
【０１０４】
DNA鋳型分子は、例えば、特許文献１８（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、ビーズまたは微粒子に結合させることができる。ビーズまたは微粒子への結合は、配列決定用途に有用であり得る。各ビーズが異なるDNA配列を含有するビーズライブラリーを調製することができる。例示的なライブラリーおよびその作製方法は、各々が参照により本明細書に組み込まれる非特許文献３；非特許文献４に記載されている。本明細書に記載のヌクレオチドを使用するそのようなビーズのアレイの配列決定は、本開示の範囲内である。
【０１０５】
配列決定される鋳型（単数または複数）は、固体支持体上の「アレイ」の一部を形成してもよく、この場合、アレイは任意の都合のよい形態を取ることができる。したがって、本開示の方法は、単一分子アレイ、クラスター化アレイおよびビーズアレイを含む、全てのタイプの高密度アレイに適用可能である。固体支持体上への核酸分子の固定化によって形成されるものを含むが、これに限定されない本質的に任意のタイプのアレイ上の鋳型の配列決定に、本開示の色素化合物で標識された修飾ヌクレオチドが使用され得る。
【０１０６】
しかし、本開示の色素化合物で標識された修飾ヌクレオチドは、クラスター化アレイの配列決定という状況において特に有利である。クラスター化アレイでは、アレイ上の異なる領域（しばしば部位または特徴と呼ばれる）は、複数のポリヌクレオチド鋳型分子を含む。一般に、複数のポリヌクレオチド分子は、光学的手段によって個々に分解することができず、その代わりにアンサンブルとして検出される。アレイがどのように形成されるかに応じて、アレイ上の各部位は、1つの個別のポリヌクレオチド分子の複数のコピー（例えば、その部位は特定の一本鎖または二本鎖核酸種に対して相同である）、または少数の異なるポリヌクレオチド分子の複数のコピー（例えば、2つの異なる核酸種の複数のコピー）さえをも含み得る。核酸分子のクラスター化アレイは、当該技術分野で一般的に知られている技術を用いて生成され得る。例として、各々が本明細書に組み込まれる特許文献１９および特許文献２０は、固定化された核酸分子のクラスターまたは「コロニー」からなるアレイを形成するために、鋳型および増幅産物の両方が固体支持体上に固定化されたままである核酸の増幅方法を記載する。これらの方法に従って調製されたクラスター化アレイ上に存在する核酸分子は、本開示の色素化合物で標識された修飾ヌクレオチドを用いた配列決定に適切な鋳型である。
【０１０７】
本開示の色素化合物で標識された修飾ヌクレオチドは、単一分子アレイ上の鋳型の配列決定にも有用である。本明細書で使用される用語「単一分子アレイ」または「SMA」は、固体支持体上に分布（または配置）されたポリヌクレオチド分子の集団を指し、個々のポリヌクレオチドの集団の他の全てからの間隔は、個々のポリヌクレオチド分子を個別に分解することが可能であるようになっている。したがって、固体支持体の表面上に固定化された標的核酸分子は、いくつかの実施形態において光学的手段によって分解されるのが可能となる。これは、各々が1つのポリヌクレオチドを表す1つ以上の別個のシグナルが、使用される特定の画像化装置の分解可能な領域内で生じることを意味する。
【０１０８】
アレイ上の隣接するポリヌクレオチド分子間の間隔が、少なくとも100nm、より具体的には少なくとも250nm、さらにより具体的には少なくとも300nm、さらにより具体的には少なくとも350nmである単一分子検出が達成され得る。したがって、各分子は個々に分解可能であり、単一分子蛍光点として検出可能であり、前記単一分子蛍光点からの蛍光も単一工程光退色を示す。
【０１０９】
用語「個別に分解される」および「個別の分解」が本明細書で使用し、可視化した場合、アレイ上の1つの分子をその隣接する分子と識別することが可能であることを明確に述べる。アレイ上の個々の分子間の分離は、部分的に、個々の分子を分解するために使用される特定の技術によって測定される。単一分子アレイの一般的な特徴は、各々が参照により本明細書に組み込まれる特許文献１０および特許文献８を参照することによって理解される。本開示の修飾ヌクレオチドの1つの使用は、合成による配列決定反応にあるが、修飾ヌクレオチドの有用性はそのような方法に限定されない。実際、ヌクレオチドは、ポリヌクレオチドに組み込まれたヌクレオチドに結合した蛍光標識の検出を必要とする任意の配列決定方法において有利に使用され得る。
【０１１０】
特に、本開示の色素化合物で標識された修飾ヌクレオチドは、自動蛍光配列決定プロトコル、特にサンガーおよび共同研究者の連鎖停止配列決定法に基づく蛍光色素ターミネーターサイクル配列決定に使用され得る。そのような方法は、一般に、酵素およびサイクル配列決定を使用し、プライマー伸長配列決定反応において蛍光標識されたジデオキシヌクレオチドを組み込む。いわゆるサンガー配列決定法および関連プロトコル（サンガー型）は、標識ジデオキシヌクレオチドでのランダム鎖終結を利用する。
【０１１１】
このように、本開示はまた、3'位および2'位の両方にヒドロキシル基を欠くジデオキシヌクレオチドである色素化合物で標識された修飾ヌクレオチドを包含し、そのような修飾ジデオキシヌクレオチドは、サンガー型配列決定法などにおける使用に適している。
【０１１２】
修飾ジデオキシヌクレオチドを使用することによって達成され得るのと同じ効果が、3'-OH保護基を有する修飾ヌクレオチドを使用することによって得られるため、3'保護基を組み込んだ本開示の色素化合物で標識された修飾ヌクレオチドは、サンガー法および関連するプロトコルにおいても有用であり得ることが認識されるであろう：両方とも後続のヌクレオチドの組み込みを防ぐ。本開示によるヌクレオチド、および3'保護基を有するヌクレオチドがサンガー型配列決定法で使用される場合、ヌクレオチドに結合した色素化合物または検出可能な標識は、切断可能なリンカーを介して連結される必要はないが、なぜなら、本発明の標識されたヌクレオチドが組み込まれる各例において；ヌクレオチドをその後に組み込む必要はなく、したがって、標識をヌクレオチドから除去する必要はないためであることが理解されるであろう。
【０１１３】
本開示はまた、色素で標識された修飾ヌクレオシドおよび／またはヌクレオチドを含むキットを提供する。そのようなキットは、一般に、本明細書に記載の色素で標識された少なくとも1つの修飾ヌクレオチドまたはヌクレオシドを、少なくとも1つの追加的成分と共に含む。追加的成分（単数または複数）は、上記の方法または下記の実施例の項で同定された成分の1つ以上であってもよい。本開示のキットに組み合わせることができる成分のいくつかの非限定的な例、を以下に示す。
【０１１４】
特定の実施形態では、キットは、本明細書に記載の色素で標識された少なくとも1つの修飾ヌクレオチドまたはヌクレオシドを、修飾または未修飾ヌクレオチドもしくはヌクレオシドと共に含むことができる。例えば、本開示による色素で標識された修飾ヌクレオチドは、非標識もしくは天然ヌクレオチドと組み合わせて、および／または蛍光標識ヌクレオチドと組み合わせて、またはそれらの任意の組合せで供給され得る。したがって、キットは、本開示による色素で標識された修飾ヌクレオチド、および他の、例えば先行技術の色素化合物で標識された修飾ヌクレオチドを含むことができる。ヌクレオチドの組み合わせは、別個の個々の成分（例えば、容器もしくはチューブごとに1つのヌクレオチドタイプ）として、またはヌクレオチド混合物（例えば、同じ容器もしくはチューブに混合された2つ以上のヌクレオチド）として提供され得る。
【０１１５】
キットが、複数の、特に2つの、より具体的には4つの、色素化合物で標識された修飾ヌクレオチドを含む場合、異なるヌクレオチドは異なる色素化合物で標識されていてもよく、または色素化合物を含まない暗色であってもよい。異なるヌクレオチドが異なる色素化合物で標識される場合、前記色素化合物はスペクトル的に識別可能な蛍光色素であることがキットの特徴である。本明細書中で使用される場合、用語「スペクトル的に識別可能な蛍光色素」は、1つの試料中に2つ以上のそのような色素が存在する場合に、蛍光検出装置（例えば、市販のキャピラリーベースのDNA配列決定プラットフォーム）によって識別することができる波長で蛍光エネルギーを放射する蛍光色素を指す。蛍光色素化合物で標識された2つの修飾ヌクレオチドがキットの形態で供給される場合、いくつかの実施形態の特徴は、スペクトル的に識別可能な蛍光色素が、同じ波長で、例えば同じレーザーなどによって励起され得ることである。蛍光色素化合物で標識された4つの修飾ヌクレオチドがキットの形態で供給される場合、いくつかの実施形態の特徴は、2つのスペクトル的に識別可能な蛍光色素が両方とも1つの波長で励起され、ならびに他2つのスペクトル的に識別可能な色素が両方とも別の波長で励起され得ることである。特定の励起波長は、532nm、630nm〜700nm、特に660nmである。
【０１１６】
一実施形態では、キットは、本開示の化合物で標識された修飾ヌクレオチド、および第2の色素で標識された第2修飾ヌクレオチドを含み、これら色素は少なくとも10nm、特に20nm〜50nmの吸光度最大値差を有する。より詳細には、2つの色素化合物は、15〜40nmのストークスシフトを有し、「ストークスシフト」は、ピーク吸収波長とピーク発光波長との間の距離である。
【０１１７】
さらなる実施形態では、キットは、蛍光色素で標識された2つの他の修飾ヌクレオチドをさらに含むことができ、これら色素は488nm〜550nm、特に532nmの同じレーザーによって励起される。色素は、少なくとも10nm、特に20nm〜50nmの吸光度最大値差を有し得る。より詳細には、2つの色素化合物は、20〜40nmのストークスシフトを有し得る。さらにより詳細には、2つの色素化合物は、640nm未満、特に600nm未満の異なる吸光度最大値を有し得る。本開示のポリメチン色素からスペクトル的に識別可能であり、上記の基準を満たす特定の色素は、各々が参照により本明細書に組み込まれる、特許文献２１（例えばCy3）もしくは特許文献２２（Alexa 532; Molecular Probes A20106）に記載のポリメチン類縁体、または特許文献２３に記載の非対称ポリメチンである。代替の色素には、ローダミン類似体、例えばテトラメチルローダミンおよびその類縁体が挙げられる。
【０１１８】
別の実施形態では、本開示のキットは、同じ塩基が2つの異なる化合物で標識されているヌクレオチドを含んでもよい。第1ヌクレオチドは、本開示の化合物で標識されてよい。第2ヌクレオチドは、スペクトル的に異なる化合物、例えば600nm未満で吸収する「緑色」色素で標識され得る。第3ヌクレオチドは、本開示の化合物とスペクトル的に異なる化合物との混合物として標識されてよく、第4ヌクレオチドは「暗色」であり、標識を含まなくてよい。簡単に言えば、ヌクレオチド1〜4は、「緑色」、「赤色」、「赤色／緑色」、および暗色と標識され得る。器具の使用をさらに単純化するために、4つのヌクレオチドを、単一のレーザーで励起された2つの色素で標識することができ、したがって、ヌクレオチド1〜4の標識は、「赤色1」、「赤色2」、「赤色1／赤色2」、および暗色または「緑色1」、「緑色2」、「緑色1／緑色2」、および暗色であり得る。
【０１１９】
ヌクレオチドは、本開示の2つの色素を含み得る。Ra1またはRa2がインドール環の隣接する炭素に縮合した追加的芳香環である色素は、色素が追加的芳香族結合を有さない場合よりも長い波長で吸収する。キットは、本開示の色素で標識された2つ以上のヌクレオチドを含み得る。キットは、Ra1およびRa2の各々が独立してH、SO3-、スルホンアミドまたはハロゲンである本発明の化合物で標識されたヌクレオチド、ならびにRa1およびRa2の一方または両方が隣接する炭素原子に縮合した追加的環である本発明の化合物で標識されたヌクレオチドを含有してもよい。キットは、ヌクレオチドが520nm〜560nmの領域を吸収する色素で標識されている追加的ヌクレオチドを含むことができる。キットはさらに、非標識ヌクレオチドを含み得る。
【０１２０】
ヌクレオチドは、本開示の2つの色素を含み得る。pが1である色素は、pが2である場合よりも短い波長で吸収する。キットは、本開示の色素で標識された2つ以上のヌクレオチドを含み得る。キットは、pが1である本開示の化合物で標識されたヌクレオチド、およびpが2である本開示の化合物で標識された1つのヌクレオチドを含み得る。キットは、ヌクレオチドが第3の標識で標識されている追加的ヌクレオチドを含み得る。キットはさらに、非標識ヌクレオチドまたは第4の標識で標識されたヌクレオチドを含み得る。
【０１２１】
キットは、異なる色素化合物で標識された異なるヌクレオチドを有する構成に関して上に例示されているが、キットは、同じ色素化合物を有する2、3、4またはそれ以上の異なるヌクレオチドを含み得ることが理解される。
【０１２２】
特定の実施形態では、キットは、修飾ヌクレオチドのポリヌクレオチドへの組み込みを触媒することができるポリメラーゼ酵素を含み得る。そのようなキットに含まれる他の成分は、緩衝液などを含み得る。本開示による色素で標識された修飾ヌクレオチド、および異なるヌクレオチドの混合物を含む他の任意のヌクレオチド成分は、使用前に希釈される濃縮形態でキットに供給され得る。そのような実施形態では、適切な希釈緩衝液を含んでもよい。ここでも、本明細書に記載の方法で同定された1つ以上の成分を、本開示のキットに含めることができる。
【０１２３】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用されるように、単数形「a」、「an」および「the」は、明示的および明白に1つの指示対象に限定されない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。本教示の趣旨または範囲から逸脱することなく、本明細書に記載の様々な実施形態に対して様々な修正および変形を行うことができることは、当業者には明らかであろう。したがって、本明細書に記載の様々な実施形態は、添付の特許請求およびそれらの等価物の範囲内の他の修正ならびに変形を包含することが意図される。
【０１２４】
（実験の詳細）
（4-(3-ブロモプロポキシ)フェノールの調製）
【化２６】
0006750006.tif 000051
メタノール（30mL）中のヒドロキノン（3g、27.2mmol）の溶液に、N2下で、水酸化カリウム（2g、35.4mmol）および1,3-ジブロモプロパン（8.3mL、81.7mmol）を添加した。反応液を65℃で一晩撹拌した。次いで、揮発性物質を真空除去し、ジエチルエーテル（30mL）を添加した。有機層を塩化アンモニウム飽和水溶液および水（それぞれ30mL）で洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、揮発性物質を真空除去した。得られたベージュ色のスラリーをシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィー（溶離液：石油エーテル/酢酸エチル70/30）で精製し、2.6gの白色スラリーを得た。収率：41%。
プロトンNMR（CDCl3）: 6.87-6.73 (4H, m, H-Ar); 5.36 (1H, s, OH); 4.04 (2H, t, J = 6.2 Hz); 3.60 (2H, J = 6.2 Hz); 2.28 (2H, q, J = 6.2 Hz, H-2). 13C NMR (CDCl3): 152.8, 149.6, 116.1; 116.0; 66.7; 34.4; 30.2.
【０１２５】
（4-(2,3-ジメチル-3H-インドール-3-イル)ブタン-1-スルホン酸の調製）
【化２７】
0006750006.tif 000052
氷酢酸（19ml）中のフェニルヒドラジン（8.6mmol、850μL）および5-メチル-6-オキソヘプタンスルホン酸（7.2mmol、1.5g）を130℃で3時間撹拌した。反応混合液を室温に冷却し、溶媒を真空除去した。残渣をシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィー（溶離液：ジクロロメタン/メタノール80/20）により精製し、1.23gの淡黄色泡状物を得た。収率：61%。MS (DUIS): E-: 280 (M-1); プロトンNMR (D2O): 7.42 (1H, d, J = 7.8Hz, H-4); 7.27 (1H, t, J = 7.8Hz, H-5); 7.24 (1H, d, J = 7.8Hz, H-7); 7.17 (1H, t, J = 7.8Hz, H-6); 2.59 (2H, dd, J = 7.6, 8.9Hz, H-11); 2.21-2.13 (1H, m); 1.88-1.73 (2H,m, H-8); 1.52-1.43 (2H, m, H-10); 1.13 (3H, s, CH3 on C-3); 0.70-0.63 (1H, m, H-9a); 0.51-0.44 (1H, m, H-9b). 13C NMR (D2O): 190.8; 152.3; 143.7; 127.8; 125.7; 122.2; 118.6; 57.9; 50.5; 48.9; 35.6; 24.0; 22.5; 21.8; 14.8.
【０１２６】
（1-(3-(4-ヒドロキシフェノキシ)プロピル)-2,3-ジメチル-3-(4-スルホブチル)-3H-インドール-1-イウムの調製）
【化２８】
0006750006.tif 000053
スルホラン（2ml）中の4-(3-ブロモプロポキシ)フェノール（1.90mmol、438mg）および4-(2,3-ジメチル-3H-インドール-3-イル)ブタン-1-スルホン酸（1.58mmol、504mg）を120℃で4.5時間撹拌した。反応混合液を室温まで冷却し、シリカゲルのフラッシュクロマトグラフィー（溶離液：ジクロロメタン/メタノール65/35）により直接精製し、329mgの淡灰色油状物を得た。収率：40%。MS (DUIS): E-: 430 (M-1), E+: 432 (M+1); プロトンNMR (TFA): 7.75-7.65 (4H, m, H-4/5/6/7); 6.98 (2H, d, J = 8.9 Hz, Har on phenyl); 6.85 (2H, d, J = 8.9 Hz, Har on phenyl); 4.82 (2H, bt, J = 6.6 Hz, H-12); 4.24-4.13 (2H, m, H-14); 3.69 (1H, s); 3.20-3.06 (2H, m, H-11); 2.91 (3H, s, CH3 on C-2); 2.63-2.52 (2H, m, H-13); 2.41-2.75 (2H,m, H-8); 1.90-1.83 (2H, m, H-10); 1.66 (3H, s, CH3 on C-3); 1.13-0.93 (2H, m, H-9).
【０１２７】
（1-(3-(4-ヒドロキシフェノキシ)プロピル)-2,3,3-トリメチル-3H-インドール-1-イウムの調製）
【化２９】
0006750006.tif 000054
スルホラン（1ml）中の4-(3-ブロモプロポキシ)フェノール（1.40mmol、324mg）およびトリメチルインドレニン（0.80mmol、129μl）を120℃で3時間撹拌した。反応混合液を室温に冷却し、シリカゲルのフラッシュクロマトグラフィー（溶離液：ジクロロメタン/メタノール90/10）により直接精製し、260mgの淡灰色油状物を得た。収率：84%。プロトンNMR (MeOD): 7.06 (1H, d, J = 7.2 Hz, H-4); 7.00 (1H, bt, J = 7.8Hz, H-5); 6.77-6.64 (5 H, m, H-6 & H-on phenyl ortho & meta); 6.58 (1H, d, J = 7.8Hz, H-7); 3.90 (2H, t, J = 5.8Hz, H-8), 3.71 (2H, J = 6.5Hz, H-10); 2.04 (2H, bq, J = 6.1Hz, H-9); 1.30 (6H, s, 2xCH3 on C-3). 13C NMR (MeOD): 162.7; 153.6; 152.3; 147.2; 138.6; 128.6; 122.7; 119.5; 116.8; 116.6; 116.5; 103.3; 66.8; 45.1; 39.7; 30.6; 27.5.
【０１２８】
（AF670POPOの調製）
生成物合成スキーム：
【化３０】
0006750006.tif 000055
色素合成手順：
4-(2,3-ジメチル-3H-インドール-3-イル)ブタン-1-スルホン酸（204mg、400μmol）およびマロンアルデヒドビス(フェニルイミン)一塩酸塩（114mg、440μmol）を、無水酢酸/酢酸（2/0.6ml）の混合液中、100℃で1.5時間撹拌した。酢酸カリウム（118mg、1.20mmol）およびスルホン化ベンズインドリウム塩X（193mg、400μmol）を添加した。反応混合液を100℃で3時間撹拌した。次いでそれを室温に冷却し、ジエチルエーテル（40mL）を添加した。暗青色固体が沈殿した。これを濾過し、追加のジエチルエーテル（40mL）で洗浄し、アセトニトリルを〜30%含有する水（25mL）に溶解した。得られた暗青色溶液を濾過し、分取HPLCにより精製した。主要な青色（吸収最大〜665nm）画分を集め、溶媒を真空除去した。MS (DUIS): E-: 869 (M-1), 434.1 (M-2/2).
【０１２９】
色素DX-DXは、同様に、適切な出発物質を使用して調製された。
【０１３０】
表１において、このようにして調製されたいくつかの色素（水溶液、OD〜0.2）のスペクトル特性を、既知の構造類似体色素Std（特許：P6240WO）の同様のパラメータと比較した。
【化３１】
0006750006.tif 000056
【表１】
0006750006.tif 000057
【０１３１】
（AF550POPOS0の調製）
生成物合成スキーム：
【化３２】
0006750006.tif 000058
色素合成手順：
1-(3-(4-ヒドロキシフェノキシ)プロピル)-2,3,3-トリメチル-3H-インドール-1-イウム（150mg、385μmol）およびN、N'-ジフェニルホルムアミジン（74mg、385μmol）を無水酢酸（2mL）中、80℃で2時間撹拌した。酢酸（0.5mL）、酢酸カリウム（567mg、5.78mmol）およびスルホン化インドリウム塩X（166mg、385μmol）を添加した。反応混合液を80℃で2.5時間撹拌した。次いで、揮発性物質を減圧除去し、ジエチルエーテル（20mL）を添加した。暗赤色固体が沈殿した。それを濾過し、追加のジエチルエーテル（20mL）で洗浄し、アセトニトリルを〜5%含有する水（15mL）に溶解した。得られた暗赤色溶液を濾過し、分取HPLCにより精製した。主要な赤色（吸収最大〜550nm）画分を集め、溶媒を真空除去した。MS (DUIS): 非アセチル化E-: 671.0 (M-1); E+: 673.3 (M+1), 774.4 (Et3N+salt).
【０１３２】
表２において、このようにして調製されたいくつかの色素（水溶液、OD〜0.2）のスペクトル特性を、既知の構造類似体色素（特許：P6240WO）の同様のパラメーターと比較した。
【化３３】
0006750006.tif 000059
【表２】
0006750006.tif 000060
【０１３３】
（色素AF670POPOヌクレオチドコンジュゲート（FFA-AF670POPO））
【化３４】
0006750006.tif 000061
無水DMA（3mL）、TSTU（18mg、58.8μmol）およびヒューニッヒ塩基（0.05mL）を、色素AF670POPOの乾燥試料（60mg、53.5μmol）に添加した。活性化エステルの青色が発色した。反応混合液を室温で30分間撹拌した。TLC（CH3CN中20%H2O）により、活性化が完了した。活性化が完了した後、DMA／水（0.5/0.3mL）中のトリエチルアンモニウム塩（53mg、56.1μmol）としての5pphA-LN3の溶液を、反応液に添加した。反応混合液を室温で窒素雰囲気下で18時間撹拌した。カップリングの進行をTLC（アセトニトリル中20%H2O）によって確認した。反応混合液を氷浴で〜4℃に冷却し、次いで0.1M TEAB（5mL）の10水溶液を加え、混合液を室温で10分間撹拌した。反応混合液を、0.05M TEAB水溶液中の〜25gのDEAE Sephadex樹脂懸濁液を有するカラムに添加し、TEAB（0.1M〜1Mまでの濃度勾配）で洗浄した。着色した画分を集め、蒸発させた後、再び水で共蒸発させて、より多くのTEABを除去し、真空にして乾燥させた。次いで、残留物をTEAB 0.1Mに再溶解させた。この溶液を0.2nm孔径のシリンジフィルターに通し、コーニング20フラスコに濾過した。生成物を、アセトニトリル-0.1M TEABを含むC18逆相カラムを使用するHPLCにより精製した。収率74%（推定吸光係数を用いる溶液の光学濃度に基づく）。
【０１３４】
（色素AF550POPOS0ヌクレオチドコンジュゲート（FFT-AF550POPOS0））
【化３５】
0006750006.tif 000062
無水DMA（3mL）、TSTU（19mg、63.5μmol）およびヒューニッヒ塩基（0.05mL）を、色素AF550POPOS0（39mg、57.7μmol）の乾燥試料に添加した。活性化エステルの赤色が発色した。反応混合液を室温で30分間撹拌した。DMA／水（0.5/0.3mL）中のトリエチルアンモニウム塩（59mg、63.5μmol）としてのpppT-LN3の溶液を、反応液に添加した。反応混合液を室温で窒素雰囲気下で18時間撹拌した。カップリングの進行をTLC（アセトニトリル中20%H2O）によって確認した。反応混合液を氷浴で〜4℃に冷却し、次いで0.1M TEAB（5mL）の10水溶液を加え、混合液を室温で10分間撹拌した。反応混合液を、0.05M TEAB水溶液中の〜25gのDEAE Sephadex樹脂懸濁液を有するカラムに添加し、TEAB（0.1M〜1Mまでの濃度勾配）で洗浄した。着色した画分を集め、蒸発させた後、再び水で共蒸発させて、より多くのTEABを除去し、真空にして乾燥させた。次いで、残留物をTEAB 0.1Mに再溶解させた。この溶液を0.2nm孔径のシリンジフィルターに通し、コーニング20フラスコに濾過した。生成物を、アセトニトリル-0.1M TEABを含むC18逆相カラムを使用するHPLCにより精製した。収率48%（推定吸光係数を用いる溶液の光学濃度に基づく）。
【図面の簡単な説明】
【０１３５】
【図１】AF670POPOおよびその類似体で標識されたFFAをffA-NR650C5と共に、改変Illumina HiseqXシークエンシングシステムで試験し、このシステムでは、両レーザー（赤色および緑色）の励起出力の約33%の増加は、それぞれ読み取り1および2のサイクル101および251で展開された（図１の信号を参照）。
【図２】予期しないことに、ffA-NR650C5（図２）の場合、赤色信号が、赤色レーザーの出力変化に比例して応答しないことが観察された。結果的に、塩基分離散布図の形状はサイクル101で変更された。右上の円は左上の円に近く、それぞれの標識を識別することがより困難であることを意味する。発生する現象は、NR650C5がおそらく、HiSeqXで使用される最大出力密度で光飽和またはほぼ飽和していることを示した。この散布図の変化は、配列決定の質に悪影響を及ぼす。興味深いことに、AF670POPOおよびその類縁体では、顕著な改善が観察された。それらの信号は、レーザー出力密度の変化に比例して増加した。散布図は、最大出力が展開されたときにサイクル100からサイクル101までの分離と形状を維持した（図２）。図２の右上の円は、図１の右上の円よりも、左上の円からさらに離れている。したがって、図２では、標識がよりよく分離されている。
【図３】550nm類似体上では、フェニル環上のヒドロキシルの存在が蛍光強度に有害な影響を及ぼすことを観察することは興味深いものであった（図３）。フェノール性OHを含まないAF550POPS0の蛍光は、OHを有するAF550POPOS0よりも3倍強かった。
【図４】これらの新しい類似体は、配列決定アプリケーションのために散布図の分布を調整し、最適化する機会を提供した。例えば、TがAF550POPOS0で標識され、AがAF670POPOとNR550S0の混合物で標識された場合、きれいな正方形の散布図が得られた（図４ａ）。さらに、緑色AについてNR550S0をAF550POPS0で置換すると、きれいな正方形の散布図を示した（図４ｂ）。
【図５】これらの新しい特性に基づいて、ffT-LN3-AF550POPOS0およびffA-LN3-AF670POPOを用い、改変HiSeqX上でヒト鋳型を配列決定した。高品質の2x150bp配列決定は、読み取り1の誤差率が1%未満であり、読み取り2の誤差率が1.5%未満で達成した（図５に示される主な配列決定基準）。先行技術の標識を用いて得られた散布図は、2×150bpの読み取りが完了できないことを意味していた。
【図１】
0006750006.tif 000068
【図２】
0006750006.tif 000069
【図３】
0006750006.tif 000070
【図４】
0006750006.tif 000071
【図５】
0006750006.tif 000072