(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
結核（ＴＢ）の診断のための組成物であって、前記組成物が
ａ）Ｒｖ３８７４（配列番号１）およびＲｖ３６１５（配列番号２）；または
ｂ）Ｒｖ３８７４（配列番号１）およびＲｖ３６１５（配列番号２）と、Ｒｖ３８６５（配列番号３）、Ｒｖ２３４８（配列番号４）、およびＲｖ３８７７（配列番号７）から選択される１つ以上；または
ｃ）前記ポリペプチドからの免疫原性エピトープを含む断片；
から選択されるアミノ酸配列から構成される実質的に純粋なポリペプチドの混合物を含み、  ここで、前記ポリペプチドまたは前記ポリペプチドの断片の選択される混合物が、ａ）またはｂ）での前記選択からの前記ポリペプチドの何れかに対して少なくとも９０％の配列同一性を有し、同時に免疫原性であることを特徴とする、結核（ＴＢ）の診断のための組成物。
【請求項２】
請求項１に記載の組成物において、Ｒｖ３８７４（配列番号１）、Ｒｖ３６１５（配列番号２）およびＲｖ３８６５（配列番号３）またはそれらの免疫原性エピトープを含む断片を含むことを特徴とする、組成物。
【請求項３】
請求項１に記載の組成物において、Ｒｖ３８７４（配列番号１）、Ｒｖ３６１５（配列番号２）およびＲｖ２３４８（配列番号４）またはそれらの免疫原性エピトープを含む断片を含むことを特徴とする、組成物。
【請求項４】
請求項１に記載の組成物において、Ｒｖ３８７４（配列番号１）、Ｒｖ３６１５（配列番号２）およびＲｖ３８７７（配列番号７）またはそれらの免疫原性エピトープを含む断片を含むことを特徴とする、組成物。
【請求項５】
請求項１に記載の組成物において、Ｒｖ３８７４（配列番号１）、Ｒｖ３６１５（配列番号２）、Ｒｖ３８６５（配列番号３）およびＲｖ２３４８（配列番号４）またはそれらの免疫原性エピトープを含む断片を含むことを特徴とする、組成物。
【請求項６】
請求項１乃至４の何れか１項に記載の組成物において、配列番号１の免疫原性エピトープを含む前記断片が、配列番号９〜１４から選択されることを特徴とする、組成物。
【請求項７】
請求項１乃至４の何れか１項に記載の組成物において、配列番号２の免疫原性エピトープを含む前記断片が、配列番号１５〜１８または配列番号５９〜６３から選択されることを特徴とする、組成物。
【請求項８】
請求項１乃至７の何れか１項に記載の組成物において、配列番号３の免疫原性エピトープを含む前記断片が配列番号１９〜２１から選択されることを特徴とする、組成物。
【請求項９】
請求項１乃至７の何れか１項に記載の組成物において、配列番号４の免疫原性エピトープを含む前記断片が配列番号２２〜２５から選択されることを特徴とする、組成物。
【請求項１０】
請求項１乃至７の何れか１項に記載の組成物において、配列番号７の免疫原性エピトープを含む前記断片が配列番号４６〜５０から選択されることを特徴とする、組成物。
【請求項１１】
請求項１乃至１０の何れか１項に記載の組成物において、Ｒｖ３８７５（配列番号５１）または１つ以上のその断片をさらに含むことを特徴とする、組成物。
【請求項１２】
請求項１１に記載の組成物において、前記断片および配列番号５１の免疫原性エピトープを含む前記断片が配列番号５２〜５８から選択されることを特徴とする、組成物。
【請求項１３】
請求項１に記載の組成物において、前記ポリペプチドからの免疫原性エピトープを含む断片が少なくとも１０アミノ酸長の重複ペプチドとして存在することを特徴とする、組成物。
【請求項１４】
請求項５に記載の組成物において、前記混合物が配列番号９〜２５を含むことを特徴とする、組成物。
【請求項１５】
請求項１乃至１４の何れか１項に記載の組成物において、前記ポリペプチドの一部または全てが任意選択によりリンカーまたはスペーサーを介して一緒に融合されることを特徴とする、組成物。
【請求項１６】
病原性マイコバクテリアにより引き起こされる結核（ＴＢ）の診断のための医薬組成物の調製のための、請求項１乃至１５の何れか１項に記載の組成物の使用。
【請求項１７】
請求項１６に記載の使用において、前記病原性マイコバクテリアが、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、マイコバクテリウム・ボビス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ）またはマイコバクテリウム・アフリカヌム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｆｒｉｃａｎｕｍ）であることを特徴とする、使用。
【請求項１８】
結核（ＴＢ）のインビトロまたはインビボ診断のためのＣＭＩ診断ツールまたはキットであって、請求項１乃至１５の何れか１項に記載の組成物を含むことを特徴とする、ＣＭＩ診断ツールまたはキット。
【請求項１９】
ヒトを含む動物において病原性マイコバクテリアにより引き起こされる結核（ＴＢ）を、インビトロで診断するための方法であって、前記方法が、陽性反応を検出するために、前記ヒトを含む動物から得られた試料を請求項１乃至１５の何れか１項に記載の組成物と接触させるステップを備えることを特徴とする、方法。
【請求項２０】
請求項１９に記載の方法において、前記病原性マイコバクテリアが、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、マイコバクテリウム・アフリカヌム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｆｒｉｃａｎｕｍ）またはマイコバクテリウム・ボビス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ）であることを特徴とする、方法。
【請求項２１】
請求項１９又は２０に記載の方法において、前記陽性反応が、細胞の増殖またはサイトカインの放出であることを特徴とする、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトまたは動物におけるインビボまたはインビトロでの細胞が介在する結核の免疫学的診断の改善のための、医薬的または診断試薬としての使用のための組成物を開示する。本発明は、特異性（偽陽性の量）を低下させることなく、既存の抗原の組合せと比較して感度を上昇させる（偽陰性を付与することが少ない）抗原の組合せに関する。特に、本発明は、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）感染を検出するための、登録商品において現在使用される早期分泌抗原標的（ｅａｒｌｙ  ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｔａｒｇｅｔ）６ｋＤａ（ＥＳＡＴ−６）と呼ばれる抗原を含まない抗原組成物に関する。あるいは、新規診断または免疫原性組成物は、細胞が介在する診断の感度をさらに向上させるために、ＥＳＡＴ−６と組み合わせて使用することができる。
【背景技術】
【０００２】
結核（ＴＢ）は、世界中で罹患および死亡の主要な原因となっている。４秒に１人がＴＢを発症し、２０〜３０秒ごとにこの疾患で死亡する者がいると推定される。これに加えて、世界人口のおよそ１／３が、ＴＢの原因物質であるマイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）（Ｍ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ））に潜伏感染している。
【０００３】
Ｍ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）に感染している免疫適格性の個体は一般に、活動性ＴＢ疾患を発症する生涯リスクが１０％であり、このリスクは、例えば個体がＨＩＶに同時感染しているか（Ｓｏｎｎｅｎｂｅｒｇ，２００５）または糖尿病に罹患している（Ｙｏｕｎｇ，２００９）場合に劇的に上昇する。未処置のままで放置すると、活動性肺ＴＢである者からそれぞれ年間１０〜１５人が感染する（Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  Ｆａｃｔ  Ｓｈｅｅｔ  Ｎｏ  １０４，２００２）。したがって、活動性伝染性肺ＴＢに対するＭ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）感染の進行を予防するために、感染の初期段階でＭ．ツベルクローシス（Ｍ．Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）に感染した個体を検出できることは重要である。これは、診断後の可能な最初期の時点での予防的処置によって達成され得る。したがって、Ｍ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）感染の迅速で正確な診断は、疾患を制御するための世界的な健康対策の重要な要素である。
【０００４】
Ｍ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）感染を判定するための現在の診断アッセイは、培養、顕微鏡および関連患者物質のＰＣＲ、胸部Ｘ線、標準的なツベルクリン皮膚テスト（ＴＳＴ）およびインターフェロン−γ放出アッセイ（ＩＧＲＡ）を含む。最初の３つの方法は、活動性の伝染性ＴＢを診断するために使用され、Ｍ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）細菌の同定に基づき、したがって試料中の細菌の存在に依存する。これは、ある一定の細菌量および感染性物質へのアクセスが必要であり、したがって、この方法は、感染の早期診断に対して、すなわち臨床疾患の発症前には適切ではない。胸部Ｘ線は感度が高くなく、肺ＴＢに対して、およびより進んだステージのＴＢを検出するためにしか適用可能ではない。
【０００５】
遅延型過敏反応（ＤＴＨ）を示す標準的なツベルクリン皮膚テストは、曝露された個体におけるマイコバクテリア抗原の免疫学的認識に基づく単純で安価なアッセイである。しかし、Ｍ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）感染を検出することにおいて理想からほど遠い。これは、ワクチン亜系Ｍ．ボビス（Ｍ．ｂｏｖｉｓ）カルメット・ゲラン桿菌（ＢＣＧ）からおよび非結核性の環境マイコバクテリアからのタンパク質と一部が共有されるマイコバクテリア抗原の粗製の明確に定義されない混合物である、精製タンパク質誘導体（ＰＰＤ）の皮内注射を使用する。ＰＰＤのこの広い交差反応性によって、ＴＳＴの特異性が低くなり、これは、ＢＣＧワクチン接種および非結核マイコバクテリアへの曝露が、Ｍ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）感染個体で見られるものと同様のテスト結果を与えるという状況につながる。
【０００６】
Ｍ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）感染は強力な細胞性免疫（ＣＭＩ）反応を媒介し、Ｍ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）感染に対する特異的な反応の一部として生じる、免疫細胞およびこのような細胞由来の何らかの生成物の検出は、感染を検出するための適切な方法である（Ａｎｄｅｒｓｅｎ，２０００）。このような特異的な反応を生じさせるために、試薬は、１）Ｍ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）感染個体によって広く認識され、２）Ｍ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）に特異的であり、それによってＴＢ感染、ＢＣＧワクチン接種と非結核環境のマイコバクテリアへの曝露とが区別されなければならない。
【０００７】
Ｍ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）のゲノムは、４０１８オープン・リーディング・フレームを予測する（ｈｔｔｐ：／／ｔｕｂｅｒｃｕｌｉｓｔ．ｅｐｆｌ．ｃｈ／、Ｒ２７−Ｍａｒｃｈ  ２０１３にリリース）。しかし、これらのうちごく少数のみが、ヒトＴＢ患者からの末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）による強力で広い認識を有するＴ細胞抗原である。Ｔ細胞エピトープを予測するためのアルゴリズムが開発されたが、免疫優性抗原ＣＦＰ１０およびＥＳＡＴ−６を同定するために実験的検証は必須であった。Ｍ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）細胞外または培養ろ液（ＣＦ）タンパク質は、Ｔ細胞抗原が濃縮されたタンパク質分画を構成し（Ａｎｄｅｒｓｅｎ  １９９４）、二次元プロテオミクスに基づくアプローチによるＣＦタンパク質の分離によって、５９個のヒトＴ細胞抗原の同定につながったが、この５９個のうち３５個が以前に記載されている（Ｄｅｅｎａｄａｙａｌａｎ，２０１０）。このリストは完全なものではない可能性があるものの、これは、およそ９００個のＣＦタンパク質のうちごく少数のみが（Ａｌｂｒｅｔｈｓｅｎ，２０１３）Ｔ細胞抗原であることを強調する。論理的に、Ｍ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）ゲノムからコードされる最も免疫優性な抗原が発現最大のサブセットであり、現在の技術を用いて、ある一定の増殖条件下で転写レベルに従い遺伝子をランク付けすることが可能であることが予想される。しかし、免疫原性に対して転写レベルがなす寄与は低く、これは、遺伝子が関連抗原をコードする正確な位置に体系的に使用することができない（Ｓｉｄｄｅｒｓ，２００８）。
【０００８】
非常に特異的な試薬候補は、Ｍ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）ゲノムのＲＤ領域（欠失の領域）からの抗原間で探索され得る。これらの領域は、病原性Ｍ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）株と比較すると、Ｍ．ボビス（Ｍ．ｂｏｖｉｓ）ＢＣＧワクチン株からのゲノム欠失に相当する（Ｂｅｈｒ，１９９９）。したがって、理論上、これらの領域からのタンパク質（ＲＤタンパク質）は、ＴＢ診断試薬として優れた候補であり、すなわち、これらは、それらのＢＣＧワクチン状態または非病原性マイコバクテリア株への曝露とは無関係に、健康な非感染個体によって認識されるべきものではない。しかし、ＢＣＧから欠失される予想されるゲノムＯＲＦの（オープン・リーディング・フレーム）の全てのうち、タンパク質として実際に発現されるものはそれ自身公知ではなく、さらに免疫学的反応性は、Ｍ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）感染個体からの感作リンパ球を用いて試験されるまでは未知のままである。これは、ＰＢＭＣの再刺激によって、またはＰＰＤ／マントゥーテストが行われるのと同様に皮膚に物質を注射することによって、例えば、全血アッセイにおいて行われ得る。例えばＲｖ３８７２の評価から、診断から１〜４カ月後に被験ヒトＴＢ患者（ｎ＝７）において低インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）反応が示され（国際公開第９９／２４５７７号パンフレット）、これは、このＲＤタンパク質が頻繁には認識されず、したがってＣＭＩに基づく診断テストに対してＲｖ３８７２がさらに追跡されなかったことを明らかにする。
【０００９】
例えばＥｓｐＣタンパク質（Ｒｖ３６１５ｃ）がヒトＴＢ患者およびＭ．ボビス（Ｍ．ｂｏｖｉｓ）感染ウシで特異的に認識され、遺伝子がＢＣＧに存在する場合でもＢＣＧワクチン接種／感染では認識されないので、可能性のある特異的なＭ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）タンパク質はＲＤタンパク質に限定されない（国際公開第２００９０６０１８４号パンフレット；Ｓｉｄｄｅｒｓ，２００８；Ｍｉｌｌｉｎｇｔｏｎ，２０１１）。Ｒｖ３６１５ｃの分泌は、部分的にＲＤ１遺伝子座に位置し、ＢＣＧに存在しないＥＳＸ−１分泌系に依存するので、ＢＣＧワクチン接種個体での反応の欠如は、おそらくＲｖ３６１５ｃの分泌がＢＣＧにおいて消失しているからであると思われる。この抗原は、同等で強力なＩＦＮ−γ反応を誘導するＥＳＡＴ−６およびＣＦＰ１０と同程度に強力と考えられるＣＭＩ診断試薬である（同書）。
【００１０】
特異的である可能性があるＴ細胞抗原が同定された場合、その抗原が、Ｍ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）感染個体において特異的に認識され、ＢＣＧワクチン接種者では認識されないことを確認すべきである。ＲＤ１からのＲｖ３８７３の場合、そのタンパク質は、他のＭ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）タンパク質にも存在するアミノ酸１１８〜１３５において保存的モチーフがあるタンパク質ファミリーのメンバーであったと思われた。広く認識されるＴ細胞エピトープがこのモチーフに存在するので、ＢＣＧワクチン接種個体はまた、この配列にわたるペプチドにも反応した（Ｌｉｕ，２００４）。しかし、他の既知のマイコバクテリアタンパク質の配列と比較することによって相同性が検出されなかったにもかかわらず、Ｒｖ３８７８およびＲｖ３８７９ｃに対して交差反応性も観察され（Ｌｉｕ，２００４）、これにより、可能性のある診断候補の特異性を実験的に立証する必要があることが強調される。同様にして、ＢＬＡＳＴアルゴリズムでのデータベース検索から、観察された交差反応性を説明し得る明白なマイコバクテリアタンパク質が全く明らかにならなかったにもかかわらず、ＢＣＧワクチン接種ドナーおよびＴＢ患者の両方においてＲＤ１３からのＲｖ２６５３ｃが認識された（Ａａｇａａｒｄ，２００４）。
【００１１】
ＣＭＩに基づくアッセイによるＭ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）感染の診断に対する可能性があるＭ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）特異的タンパク質が同定されているが、このようなタンパク質／ペプチドのプールが診断テストに対して所望の感度を提供する場合、まだ調べるべきことが残っている。ある抗原が、既に定義されている診断抗原と組み合わせた後に、感度をどの程度増大させるかを予想することは不可能であり；これは、各抗原に対して、好ましくは異なる遺伝学的背景を有する世界中の様々な地域からのＴＢ患者において、実験的に評価しなければならない。
【００１２】
ＣＦＰ１０（Ｒｖ３８７４）、ＥＳＡＴ−６（Ｒｖ３８７５）、ＲＤ１領域からの２個の低分子タンパク質およびＴＢ７．７（Ｒｖ２６５４）の診断可能性は非常によく実証されており（Ｂｒｏｃｋ，２００４；Ｍｏｏｎ，２０１３，国際公開第２００４０９９７７１号パンフレット）、ヒトでの使用に対して登録されている様々な診断試薬において現在使用されている。Ｔ−ＳＰＯＴ（登録商標）では、ＣＦＰ１０およびＥＳＡＴ−６をカバーするペプチドを使用する。ＴＢテストは、ＥＳＡＴ−６およびＣＦＰ１０で再刺激されたＰＢＭＣで見出されるＴ細胞の免疫反応を検出する細胞性血液試験である。この反応は、ＥＬＩＳＰＯＴと呼ばれる非常に感度の高い酵素結合免疫スポット法によって検出され、Ｔ−ＳＰＯＴ．ＴＢテストとして市販されている。このテストは、非常に感度が高く、ＢＣＧワクチン接種状況に依存しない。Ｍ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）感染の検出のための別の登録済みテストは、ＱｕａｎｔｉＦＥＲＯＮ（登録商標）−ＴＢ  Ｇｏｌｄであり、これは、ＥＳＡＴ−６、ＣＦＰ１０をカバーするペプチドおよびＴＢ７．７からの単一ペプチドでの再刺激時に全血試料中で免疫反応の検出を可能にするインビトロ診断技術である。これらのテストの両方とも、選択された特異的な抗原ペプチドプールでの曝露に反応したインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）の産生を測定し、現時点で最先端であると考えられる。Ｔ−ＳＰＯＴ．ＴＢおよびＱｕａｎｔｉＦＥＲＯＮ（登録商標）−ＴＢ  Ｇｏｌｄテストは、合わせてＩＦＮ−γ放出アッセイ（ＩＧＲＡ）として認識されている。
【００１３】
ＩＦＮ−γ以外の他のサイトカインおよびケモカインも、マイコバクテリア抗原に対する免疫学的反応を監視する際に適用可能性を示している。ＩＦＮ−γ誘導性タンパク質（ＩＰ−１０）は、ＩＦＮ−γと比較して１００倍高いレベルで発現され、ＩＰ−１０の分泌に基づく診断アッセイは、ＩＦＮ−γ放出アッセイと同等な診断性能を示している（Ｒｕｈｗａｌｄ，２００９）。
【００１４】
ヒトでの使用に対して既に登録されおり、世界中で使用されているこれらのインビトロテストに加えて、ＥＳＡＴ−６およびＣＦＰ１０も、皮膚テスト試薬として有効であることが証明されている。臨床研究から、Ｍ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）感染を診断するために、ＰＰＤと同じであるが、組み換えタンパク質として産生され、送達されるＥＳＡＴ−６およびＣＦＰ１０を用いて適用される皮膚テストを使用することができ、ＢＣＧワクチン接種状況により影響を受けないことが示されている（Ａｇｇｅｒｂｅｃｋ，２０１３）。
【００１５】
ＢＣＧおよびＩＧＲＡを含むいくつかの診断法が広く使用されているにもかかわらず、ＴＢは、年間ほぼ２００万人を死に追いやり続けており、感度が改善された免疫診断テストを開発することが必要とされ続けている。免疫無防備状態の患者は、ＴＢを発症するリスクがより高く、残念ながらＴＳＴおよびＩＧＲＡの両方とも、現在の形態では、これらの群において性能は次善のものである。試験の改善を最も必要とする患者群としては、ＨＩＶ感染患者、免疫介在性の炎症性疾患がある患者、免疫抑制的な薬物療法を受けている患者（例えばプレドニゾロンまたはＴＮＦ−α阻害剤）および慢性腎不全がある患者が挙げられる。例えばＨＩＶ感染者において、ＣＤ４細胞数が少ないこと（例えば＜２５０個の細胞／μＬ）は、テスト結果の不確定率が高くなること、活動性ＴＢに対するテスト感度が低下することおよび曝露個体における陽性テスト反応に対する可能性が低下することと強い関連があることがよく知られており、（Ｒｅｄｅｌｍａｎ−Ｓｉｄｉ，２０１３）で概説される。
【００１６】
標的とされる検査に対する別の非常に適切な群は小児である。小児における潜伏ＴＢ感染（ＬＴＢＩ）およびＴＢの診断は困難であり、感染の微生物学的確認が得られないことが多く、処置は臨床症状のみによって指示される。活動性および推定潜伏感染の低年齢小児の両者とも、免疫系が未熟であり、これによりサイトカイン放出がより低くなり、ＩＧＲＡの性能が損なわれると思われる。最近、ＱｕａｎｔｉＦＥＲＯＮ（著作権）−ＴＢ  Ｇｏｌｄテストは、微生物学的にＴＢが確認された８１名の小児中で感度が５３％であることが示されたが、このことから、小児でのＭ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）感染に対する免疫診断テストの改善の必要性が裏付けられる（Ｓｃｈｏｐｆｅｒ，２０１３）。
【００１７】
上述の高リスク患者群（例えば免疫抑制状態、ＨＩＶ感染、小児）におけるＩＧＲＡテスト性能に関する中心的問題は、ＴＢ疾患のリスク上昇を突き進める基本的な免疫抑制性状態が、それ自体、抗原への反応における低ＣＭＩ反応および低ＩＦＮ−γ放出を特徴とすることである。ＩＧＲＡの結果は、カットオフに対するＩＦＮ−γ放出の大きさの比較に基づいて決定されるので、ＩＦＮ−γ放出が損なわれることによって偽陰性となるテスト結果のリスクが上昇する。したがって、より特異的な抗原を含むことによって、より特異的なＴ細胞が動員され、その結果、ＣＭＩ反応およびＩＦＮ−γ放出増強が起こり、結果として反応がカットオフを下回るリスクが低くなることは熟練者にとって明らかである。したがって、さらなる特異的抗原を添加することは、診断感度改善によるＩＧＲＡテストにおける大きな制限に対処するものである。
【００１８】
より大きい反応に基づいてＭ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の感染を診断することから得られる別の利点は、分析的な精度の改善であり、テスト結果の信頼性がより高くなることである。ＱｕａｎｔｉＦＥＲＯＮ（登録商標）−ＴＢ  Ｇｏｌｄテストにおいて、陽性テストに対するカットオフは０．３５ＩＵ／ｍＬまたは１７．５ｐｇ／ｍＬであり、ＥＬＩＳＡのような高感度の方法でさえも高い精度で決定することが困難な非常に低い濃度である。例えば、現在までのＩＧＲＡの最大の精度試験から、同じ患者試料の再テストにおいてＱｕａｎｔｉＦＥＲＯＮ−ＴＢ  Ｇｏｌｄ  Ｉｎ−Ｔｕｂｅによって測定されるＴＢ反応がかなり変動することが分かった。個体内での変動性には、最初の反応が０．２５〜０．８０ＩＵ／ｍＬであった場合に、何れかの方向で最大０．２４ＩＵ／ｍＬの差異が含まれた。このことから、０．５９ＩＵ／ｍＬ未満の陽性ＱｕａｎｔｉＦＥＲＯＮ  ＴＢ  Ｇｏｌｄ  Ｉｎ−Ｔｕｂｅテストの結果は慎重に解釈すべきであるという結論に至った（Ｍｅｔｃａｌｆｅ  ＡＪＲＣＣＭ  ２０１２）。
【００１９】
モデリング研究から、新規のワクチンなく、ＴＢを排除することはできず、新規およびより有効なワクチンが国際的な優先順位であることが示唆される。全体的な考え方は、現在のＢＣＧワクチンにブースターサブユニットワクチンを追加するか、またはＢＣＧに取って代わるように新規ＴＢ生ワクチンを作製するというものである。臨床開発において実験的ワクチンの数が増加しており、ＥＳＡＴ−６が必須のワクチン抗原と思われるというコンセンサスが新たに出現してきている。したがって、現在前臨床レベルまたは臨床試験中の新規ワクチンの多くはＥＳＡＴ−６を含有する。最近、Ａｅｒａｓ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎは、既にＴＢに潜伏感染している者において活動性ＴＢ疾患の発症を予防するために設計されたＥＳＡＴ−６含有ワクチンのヒト初回投与試験を発表した（Ａａｇａａｒｄ，２０１１）。いくつかの生ワクチン候補がまた、ＥＳＡＴ−６、例えばｒＢＣＧ：ＧＥ（Ｙａｎｇ，２０１１）、ｒＭ．Ｓ−ｅ６ｃ１０（Ｚｈａｎｇ，２０１０）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）／Ａｇ８５Ｂ−ＥＳＡＴ−６（Ｈａｌｌ，２００９）、ｒＢＣＧ−Ａ（Ｎ）−Ｅ−Ａ（Ｃ）（Ｘｕ，２００９）またはＥＳＡＴ−６例えばＨ１を組み込む融合タンパク質（ｖａｎ  Ｄｉｓｓｅｌ，２０１０；ｖａｎ  Ｄｉｓｓｅｌ，２０１１）を発現させるために直接的に組み換えにより改変されている。残念ながら、ＩＧＲＡテストおよびＥＳＡＴ−６含有ワクチンによるワクチン接種におけるＥＳＡＴ−６に基づく診断の使用は、ＴＳＴおよびＢＣＧの平行使用に付随する交差反応問題のまさにその繰り返しである。
【００２０】
結果的に、両ＢＣＧおよびＥＳＡＴ−６含有ワクチンと平行して使用することができる特異的な診断試薬が非常に必要とされる。インビボまたはインビトロアッセイを用いて、試薬は、ヒトおよび動物において、Ｍ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）感染を検出することおよび、ＴＢ感染とＢＣＧまたは新規ＥＳＡＴ−６含有ワクチンでのワクチン接種との間だけでなく、非病原性の環境のマイコバクテリアへの曝露も区別することが可能であるべきである。診断試薬は、ＥＳＡＴ−６、ＣＦＰ１０の現在の組合せと、および一部の診断アッセイＴＢ７．７において、少なくとも同じ感度を有するべきである。
【００２１】
欧州特許第２４１７４５６号明細書は、ＣＦＰ−１０と一緒にＲｖ３６１５ｃを使用するような系によって、ＥＳＡＴ−６／ＣＦＰ−１０の組合せと非常に近い診断感度がもたらされることを記載する。
【００２２】
ＥＳＡＴ−６の固有の特徴は免疫原性が高いことであり、Ｍ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）感染に特異的であるので、ＥＳＡＴ−６を単一抗原で置き換えることによって、様々な集団群で試験した場合、ＥＳＡＴと比較して感度が上昇しないと思われる。これは例えば、Ｂｒｏｃｋらによって、ＴＢ患者において１４〜４３％の単一抗原の認識を示し、対してＥＳＡＴ−６が同じ患者群の７５％で反応を生じさせることが明らかにされている。抗原の殆どがＥＳＡＴ−６と比較して免疫原性がより低いとすると、大きな反応および診断感度の改善のために抗原のプールが必要とされる可能性がより高い。
【００２３】
例示されるように、抗原の組合せの感度および特異性を予想することは単純ではなく；むしろ、これは、特異的な抗原の組合せの詳細な設計を必要とする。これに加えて、診断プール中のペプチド数を増加させることによって、偽陽性数を増加させることによりさらに特異性を低下させるリスクを導入し、このことから、ＴＢの特異的な診断のための診断または免疫原性組成物が慎重に選択され、試験される必要があることが強調される。
【００２４】
したがって、ヒトまたは動物におけるＭ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）による感染の、インビボまたはインビトロでの細胞が介在する免疫学的診断の改善が緊急に必要とされる。抗原の組合せは、特異性（偽陽性の量）を損なうことなく、既存の抗原の組合せと比較して、感度を上昇させる（偽陰性がより低くなる）ことが必要とされる。必要とされる抗原の組合せの改善は、ＥＳＡＴ−６を含むワクチンが導入される場合の状況を見込むためのＥＳＡＴ−６抗原を含まない両抗原組成物および現在の最新の診断試薬を改善するためのＥＳＡＴ−６を含む抗原の組合せに関する。
【００２５】
発明者らのデータから、診断可能性がある３個の新規抗原由来のペプチドを添加することによって、ＣＦＰ１０／ＥＳＡＴ６およびＣＦＰ１０／Ｒｖ３６１５の組合せがさらに改善され得ることが明らかになる。この新規の知見は２つの理由により予想外である。
ａ）ＴＢゲノム上の抗原の殆ど（＞９９％）が非特異的であり、様々なマイコバクテリア種の間で共有されているので、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）に対して特異的である強力に認識される抗原を同定することは非常に困難である。
ｂ）ＣＦＰ１０／ＲＶ３６１５ｃおよびＣＦＰ１０／ＥＳＡＴ６の診断組合せの感度が既に非常に高いので、感度をまたさらに向上させることは、非特異的な反応ゆえに次第に困難になる。
【００２６】
したがって、本発明は、ＣＦＰ１０／ＲＶ３６１５ｃの組合せだけでなくＥＳＡＴ６を含む現在の診断カクテルの感度も上昇させることが可能であり、特異性を損なわないペプチドを記載するので、非常に有望である。
【発明の概要】
【００２７】
本発明は、ＴＢ複合体（Ｍ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、Ｍ．ボビス（Ｍ．ｂｏｖｉｓ）、Ｍ．アフリカヌム（Ｍ．ａｆｒｉｃａｎｕｍ））の種により引き起こされる感染検出の改善およびＴＢ感染とワクチン接種との間の区別に関する。改善診断組成物によって、１）新規ＥＳＡＴ−６含有ＴＢワクチン、２）ＢＣＧまたは３）非病原性の環境のマイコバクテリアへの曝露の何れからの抗原効果も妨害されてはならない。本発明は、診断または免疫原性組成物の改善を開示し、これらは、Ｍ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）感染に対する細胞反応を検出するためにインビボまたはインビトロの何れかで使用することができ、それによってＴＢを診断するために使用することができる。抗原のカクテルもしくはプールまたはこれらの抗原をカバーするペプチドのカクテルもしくはプールを使用することによって、発明者らは、診断免疫原性組成物中にＥＳＡＴ−６がないにもかかわらず、テストを非常に高感度にした。さらに、発明者らは、現在使用されるＥＳＡＴ−６を含む診断免疫原性組成物をさらに改善した。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１は、１００ｐｇ／ｍＬのＩＦＮ−γのカットオフに基づく、エジプトからの３４名のボランティアドナーにおける免疫認識を示すヒートマップ。２例は、潜伏ＴＢ（対象１および２）であり、３２例がＴＢ疾患と診断された（対象３〜３４）。白色コードは反応がないことを示し、灰色コードは反応を示し、黒色はＥＳＡＴ−６またはＣＦＰ１０の何れにも反応なしでの、ある抗原への反応を示す。
【図２】図２は、５０ｐｇ／ｍＬのＩＦＮ−γのカットオフに基づく、グリーンランドからの３１名のボランティアドナーにおけるにおける免疫認識を示すヒートマップ。１４名がＴＢと診断され（対象１〜１４）および１７名が潜伏ＴＢ（対象１５〜３１）であった。白色コードは反応がないことを示し、灰色コードは反応を示し、黒色はＥＳＡＴ−６またはＣＦＰ１０の何れにも反応なしでの、ある抗原への反応を示す。
【図３】図３は、１００ｐｇ／ｍＬのＩＦＮ−γのカットオフに基づく、エジプトからの３０名の感染浸淫地域の対照ドナーにおける免疫認識を示すヒートマップ。全ドナーがＢＣＧワクチン接種を受けており、ＴＢ疾患の病歴またはＴＢ患者との既知の接触がなかった。ドナーは、中等度感染浸淫国とみなされるエジプトで生活していたので、「感染浸淫地域の対照」として定義した。白色コードは反応がないことを示し、灰色コードは反応を示す。調べた抗原は全て、非特異的抗原刺激の例として含まれたＰＰＤと対照的に、非常に特異的であった。ドナー３１および７７は両者とも、広い範囲のＭ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）抗原を認識し、このことから、言及した選択基準にもかかわらず、潜伏感染が示される。
【図４】図４は、Ｑｕａｎｔｉｆｅｒｏｎペプチドプール（ＥＳＡＴ−６、ＣＦＰ１０、Ｒｖ２６５４ｃ（ペプチド４））に対する、およびエジプトからの７３名のＴＢ患者におけるペプチドプールＡに対するＩＰ−１０反応。点線は、Ｑｕａｎｔｉｆｅｒｏｎ抗原に対する６ｎｇ／ｍＬの、およびペプチドプールＡに対する５．５ｎｇ／ｍＬの中間値反応を示す。
【図５】図５は、Ｑｕａｎｔｉｆｅｒｏｎペプチドプール（ＥＳＡＴ−６、ＣＦＰ１０、Ｒｖ２６５４ｃ（ペプチド４））に対する、およびデンマークからの１００名のＭ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）非曝露個体におけるペプチドプールＡに対する、ＩＰ−１０反応。点線は、両抗原プールに対する０ｎｇ／ｍＬの中間値反応を示す。これはペプチドプール全体の高い特異性（偽陽性は少数）を示し、このことから、各ペプチドが高い特異性を有することが示される。
【図６】図６は、Ｑｕａｎｔｉｆｅｒｏｎペプチドプール（ＥＳＡＴ−６、ＣＦＰ１０、Ｒｖ２６５４ｃ（ペプチド４））およびペプチドプールＡに対する、デンマークからの１００名のＭ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）非曝露個体におけるＩＦＮ−γ反応。点線は、ペプチドプールＡに対する０ｐｇ／ｍＬの、およびＱｕａｎｔｉｆｅｒｏｎ抗原に対する４．９ｐｇ／ｍＬの中間値反応を示す。これはペプチドプール全体の高い特異性（偽陽性は少数）を示し、このことから、各ペプチドが高い特異性を有することが示される。
【図７】図７は、１００名のＭ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）非曝露個体および７３名のＴＢ患者における、Ｑｕａｎｔｉｆｅｒｏｎ抗原に対するペプチドプールＡの診断可能性を比較する受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線分析。これはペプチドプール全体の高い特異性（偽陽性は少数）を示し、このことから、各ペプチドが高い特異性を有することが示される。
【図８】図８は、６８例の微生物学的に確認されたＴＢ患者およびタンザニアからの３６名の感染浸淫地域の対照における、Ｑｕａｎｔｉｆｅｒｏｎペプチドプール（ＥＳＡＴ−６、ＣＦＰ１０およびＲｖ２６５４ｃ）に対する、およびペプチドプールＡに対するＩＰ−１０（ｎｇ／ｍＬ）反応。
【図９】図９は、エジプト、カイロからのＴＢが確認された７３名の患者における、ペプチドプールＡおよびＥＳＡＴ−６について濃縮されたペプチドプールＡに対するＩＰ−１０（ｎｇ／ｍＬ）反応。この線は中間値を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
この診断法は、感染中のＭ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）（または結核菌群からの他のマイコバクテリア）細菌によって発現される抗原の細胞性免疫学的（ＣＭＩ）認識に基づく。したがって、このテストは、従来の培養、顕微鏡およびＰＣＲ法のように細菌の存在を必要としない。これは、感染期の初期にこのテストを適用することができること、およびこのテストが感染の解剖学的位置にかかわりなく適用可能であることを意味する。本方法は、現在使用されるＴＳＴに対する代替物として、接触者追跡において理想的である。
【００３０】
理論的診断可能性があるＭ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）特異的な抗原を選択し、一連のヒトＴＢ患者において認識を試験することによって、発明者らは、３つの診断プールを同定することができ、これらのプールは、１）ＥＳＡＴ−６を欠いており、それにより、Ｍ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）感染とワクチン接種とを区別するためにＥＳＡＴ−６ワクチン接種個体でも使用することができ、２）ＥＳＡＴ−６含有診断プールと同じ高い特異性を示し、３）ＥＳＡＴ−６、ＣＦＰ１０およびＴＢ７．７の組合せによって得られるものよりも優れている、Ｍ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）感染に対する感度を呈した。
【００３１】
本発明は、
ａ）Ｒｖ３８７４（配列番号１）、Ｒｖ３６１５（配列番号２）、ならびにＲｖ３８６５（配列番号３）、Ｒｖ２３４８（配列番号４）、Ｒｖ３６１４（配列番号５）、Ｒｖ２６５４（配列番号６）およびＲｖ３８７７（配列番号７）から選択されるさらなる組成物；
またはｂ）前記ポリペプチドの断片の混合物；
またはｃ）ポリペプチドまたは前記ポリペプチドの断片の選択される混合物が、ａ）またはｂ）での選択からのポリペプチドの何れかに対して少なくとも８０％の配列同一性を有し、同時に免疫原性であるもの
から選択されるアミノ酸配列から構成される実質的に純粋なポリペプチドの混合物を含む診断または免疫原性組成物を開示する。
【００３２】
ヒトの使用に対してＥＳＡＴ−６含有ワクチンが登録されないであろう状況下で、ＥＳＡＴ−６含有ワクチンが使用されていない領域で、および他の状況下、例えば診断テストの感度をさらに上昇させるために、上記で開示される診断または免疫原性組成物の何れかにＥＳＡＴ−６（配列番号５１）またはその１つ以上の断片を追加することができる。
【００３３】
好ましい診断組成物は、Ｒｖ３８７４、Ｒｖ３６１５および任意選択によりＥＳＡＴ−６の免疫原性エピトープを含む断片の混合物を含み、ここで配列番号１の免疫原性エピトープを含む断片が配列番号９〜１４から選択され、配列番号２の免疫原性エピトープを含む断片が配列番号１５〜１８または配列番号５９〜６３から選択され、配列番号５１の免疫原性エピトープを含む断片が配列番号５２〜５８から選択され、ここで配列番号３の免疫原性エピトープを含む断片が配列番号１９〜２１から選択され、配列番号４の免疫原性エピトープを含む断片が配列番号２２〜２５から選択され、配列番号５の免疫原性エピトープを含む断片が配列番号２６〜４５から選択され、ここで配列番号６の免疫原性エピトープを含む断片が配列番号８であり、配列番号７の免疫原性エピトープを含む断片が配列番号４６〜５０から選択される。
【００３４】
本診断または免疫原性組成物におけるポリペプチドは、個々のものとして存在し得るかまたはポリペプチドの一部もしくは全てが任意選択によりリンカーまたはスペーサーを介して融合させられる。
【００３５】
好ましい診断または免疫原性組成物は、ペプチドプールＡとして実施例で言及される、配列番号９〜１４、配列番号１５〜１８、配列番号１９〜２１および配列番号２２〜２５の、プールまたは混合物を含む。
【００３６】
好ましいポリペプチドおよび前記ポリペプチドの断片の詳細な説明：
ＣＦＰ１０（配列番号１）は、主要なＥＳＸ−１タンパク質である。ＣＦＰ１０のアミノ酸配列全体をカバーする次の６個のペプチドを選択した（配列番号９〜１４）。
Ｒｖ３６１５ｃ（配列番号２）は、ＥＳＸ−１系により分泌されるタンパク質である。アミノ酸５５〜１０３をカバーする４個のペプチドを選択した（配列番号１５〜１８）。Ｒｖ３６１５のＣ末端部をカバーする代替的ペプチドは、アミノ酸配列、配列番号５９〜６３を有する５ペプチドであった。
Ｒｖ３８６５（配列番号３）は、ＥＳＸ−１分泌関連タンパク質であり：アミノ酸９〜４４をカバーする３個のペプチドを選択した（配列番号１９〜２１）。
Ｒｖ２３４８ｃ（配列番号４）は、ＢＣＧにおいて存在しないことが示されているＲＤ７領域に位置する：全長タンパク質配列のアミノ酸５６〜１０９をカバーする４個のペプチドを選択した（配列番号２２〜２５）。
Ｒｖ３６１４ｃ（配列番号５）は、分泌型タンパク質である：配列全体をカバーする２０個のペプチドを選択した（配列番号２６〜４５）。
Ｒｖ２６５４ｃ（配列番号６））は、ＲＤ１１領域によりコードされる、機能が未知のタンパク質である：ペプチド４を選択した（配列番号８）。
Ｒｖ３８７７（配列番号７）はＲＤ１領域に位置し、ＢＣＧには存在しない：全長タンパク質（５１１ａａ）においてアミノ酸２２０〜２８４をカバーする５個のペプチドを選択した（配列番号４６〜５０）。
ＥＳＡＴ−６（Ｒｖ３８７５；配列番号５１）は主要なＥＳＸ−１タンパク質である。配列全体をカバーする７個のペプチドを選択した（配列番号５２〜５８）。
【００３７】
本発明は、病原性マイコバクテリアによって、例えばＭ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、マイコバクテリウム・ボビス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ）またはマイコバクテリウム・アフリカヌム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｆｒｉｃａｎｕｍ）によって引き起こされるＴＢの診断のための医薬組成物の調製のための診断または免疫原性組成物の使用および、ＴＢのインビトロまたはインビボ診断のための上述の診断または免疫原性組成物を含むＣＭＩ診断ツールまたはキットをさらに開示する。
【００３８】
本発明はまた、ヒトを含む動物において、上述の診断または免疫原性組成物を使用して、病原性マイコバクテリアによって、例えばＭ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、マイコバクテリウム・アフリカヌム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｆｒｉｃａｎｕｍ）またはマイコバクテリウム・ボビス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ）によって引き起こされるＴＢを診断するインビトロおよびインビボ法も開示する。
【００３９】
ＴＢを診断するインビボ法は、ヒトを含め、動物における、上記で定められるような医薬組成物の皮内注射を含み、注射部位での陽性皮膚反応は、動物がＴＢを有することを示し、注射部位での陰性皮膚反応は動物がＴＢを有しないことを示す。
【００４０】
ＴＢを診断するインビトロ法は、陽性反応、例えば細胞増殖またはＩＦＮ−γなどのサイトカイン放出を検出するために、試料、例えば血液試料を本発明による診断または免疫原性組成物と接触させることを含む。
【００４１】
本発明診断または免疫原性組成物は、確立されたＩＧＲＡテストにおいて現在使用されている組成物に取って代わり得る（ＴＢ．ＳＰＯＴ（登録商標）ＴＢテストにおけるＣＦＰ１０／Ｒｖ３８７４およびＥＳＡＴ−６／Ｒｖ３８７５およびＱｕａｎｔｉＦＥＲＯＮ（登録商標）−ＴＢ  ＧｏｌｄにおけるＴＢ７．７／Ｒｖ２６５４ｃ、ＣＦＰ１０／Ｒｖ３８７４およびＥＳＡＴ−６／Ｒｖ３８７５。
【００４２】
本方法は、ＴＢ．ＳＰＯＴ（登録商標）ＴＢテストにおけるＣＦＰ１０／Ｒｖ３８７４およびＥＳＡＴ−６／Ｒｖ３８７５およびＱｕａｎｔｉＦＥＲＯＮ（登録商標）−ＴＢ  ＧｏｌｄにおけるＴＢ７．７／Ｒｖ２６５４ｃ、ＣＦＰ１０／Ｒｖ３８７４およびＥＳＡＴ−６／Ｒｖ３８７５と比較して次の改善点をさらに保持する。
【００４３】
ＥＳＡＴ−６を含むサブユニットタンパク質ワクチンまたはＥＳＡＴ−６を発現するように改変されているかまたは本来的に発現する組み換え生ワクチンなど、ＥＳＡＴ−６含有ワクチンで個体がワクチン接種されている場合、本組成物はＥＳＡＴ−６の使用を回避し、結果的に依然としてＭ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）感染に特異的である。これは、ＴＢ．ＳＰＯＴ（登録商標）．ＴＢテストにおけるＣＦＰ１０およびＥＳＡＴ−６およびＱｕａｎｔｉＦＥＲＯＮ（登録商標）−ＴＢ  ＧｏｌｄまたはＥＳＡＴ−６に基づく何らかの他のテストにおけるＴＢ７．７、ＣＦＰ１０およびＥＳＡＴ−６には当てはまらない。
【００４４】
ＥＳＡＴ−６含有組成物は、ＣＭＩに基づくＭ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）テストで使用されている。与えられるテストは、ＥＳＡＴ−６の使用を回避し得、２個以上のＭ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）特異的抗原を用いることから幅広い認識が得られるという長所がある。発明者らのテストにおいて、発明者らは、Ｑｕａｎｔｉｆｅｒｏｎ抗原を用いた７４％の感度および９６％の特異性と比較して、ＣＦＰ１０、Ｒｖ３６１５ｃ、Ｒｖ３８６５およびＲｖ２３４８（ペプチドプールＡ）の組合せにより８７％の感度および９８％の特異性を得る。したがって、非常に高感度な抗原であり、高い割合のＭ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）感染個体によって認識されることが知られているＥＳＡＴ−６の欠如にもかかわらず、本明細書中で試験した組成物は、ＥＳＡＴ−６に基づき、ＩＧＲＡアッセイで現在使用されている周知の組成物と比較して、＞１０％高い感度率を得る。
【００４５】
本明細書中で、発明者らはまた、ＣＦＰ１０、Ｒｖ３６１５ｃ、Ｒｖ３８６５およびＲｖ２３４８からなるペプチドプールにＥＳＡＴ−６を添加することによって、発明者らが診断性能をさらに改善できることを示すデータも提示する。ＥＳＡＴ−６を指定のペプチドプールに添加することによって、発明者らは、様々な免疫抑制性の合併症、例えばＨＩＶを有する個体での診断に、または例えば小児での使用に適切であり得る反応の大きさを向上させることができる。また、全５個の抗原（ＣＦＰ１０、ＥＳＡＴ−６、Ｒｖ３８６５、Ｒｖ２３４８およびＲｖ３６１５ｃ）からのペプチドの組合せを使用することによって、発明者らは、ＣＦＰ１０、Ｒｖ３６１５ｃ、Ｒｖ２３４８およびＲｖ３８６５単独のプールを有する場合と比較して、ＴＢ診断が確認されている患者の頻度を３％上昇させることができた。
【００４６】
本発明はまた、ＴＢの診断のためのインビボテストも開示する。これは、上述の組成物を用いた、ヒトを含む動物における皮膚テストの方式であり得る。皮膚テストは：動物において皮内注射するかまたは例えばパッチもしくは絆創膏で動物の皮膚に本発明の組成物を適用することである。注射または適用部位での陽性皮膚テスト反応は、動物またはヒトがＴＢであることを示し、注射または適用部位での陰性皮膚反応は動物がＴＢを有しないことを示す。
【００４７】
免疫反応を惹起するには６〜９アミノ酸（Ｔ細胞エピトープ）のみの配列で十分であるが全長タンパク質も有用であるので、本発明のペプチドプールがタンパク質をそれらの全長で含む必要はない。タンパク質に埋め込まれるＴ細胞エピトープに対する正確かつ最小のアミノ酸配列を決定することは当業者にとって可能なので、本発明はまた、全長タンパク質のように特異的なさらなるアミノ酸なく前記Ｔ細胞エピトープ（またはそれに対する類似体）を含むポリペプチドの断片（免疫原性部分）および前記Ｔ細胞エピトープ（任意選択によりリンカーまたはスペーサーを介してカップリング）を含む融合タンパク質、およびこのようなポリペプチドまたは融合タンパク質を含むカクテルまたはプールにも関する。
【００４８】
本発明のさらなる実施形態は、実施例および特許請求の範囲に記載する。
【００４９】
定義
ポリペプチド
「ポリペプチド」という語は、本発明において、その通常の意味を有するものとする。これは、全長タンパク質を含む、何らかの長さのアミノ酸鎖、オリゴペプチド、短いペプチドおよびその断片であり、ここでアミノ酸残基は、共有ペプチド結合により連結される。本ポリペプチドは、グリコシル化されることによって、脂質付加されることによって、例えばＭｏｗａｔら（Ｍｏｗａｔ，１９９１）に記載のようなパルミトイルオキシスクシンイミドでの、もしくは（Ｌｕｓｔｉｇ，１９７６）により記載のようなドデカノイルクロリドでの化学的脂質付加によって、または補欠分子族を含むことによって、または例えばｈｉｓタグもしくはシグナルペプチドなどのさらなるアミノ酸を含有することによって、化学的に修飾され得る。
【００５０】
したがって、各ポリペプチドは、特異的なアミノ酸を特徴とし、特異的な核酸配列によってコードされ得る。このような配列は、組み換えまたは合成法により作製される類似体および変異体を含み、このようなポリペプチド配列は、組み換えポリペプチドにおいて１つ以上のアミノ酸残基の置換、挿入、付加または欠失により修飾されており、本明細書中に記載の生物学的アッセイの何れにおいても免疫原性のままであると理解されよう。置換は好ましくは「保存的」である。これらは次の表に従い定義される。２列目の同じブロックにおける、好ましくは３列目の同じ行におけるアミノ酸は、互いに置換され得る。３列目中のアミノ酸は一文字コードで示される。
0006698530.tif 000002
【００５１】
本発明内の好ましいポリペプチドは、Ｍ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）からの免疫原性抗原の断片である。このような抗原は、例えばＭ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）細胞および／またはＭ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）培養ろ液由来であり得る。したがって、上記抗原の１つの免疫原性部分を含むポリペプチドは、全体的に免疫原性部分からなり得るか、またはさらなる配列を含有し得る。さらなる配列は、ネイティブＭ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）抗原由来であり得るか、または異種であり得、このような配列は免疫原性であり得るがその必要はない。
【００５２】
本発明の関連において、「実質的に純粋なポリペプチド断片」という用語は、最大１０重量％の、元来付随する他のポリペプチド物質を含有するポリペプチド標品を意味する（他のポリペプチド物質はより低いパーセントであることが好ましく、例えば最大で４％、最大で３％、最大で２％および最大で１）。実質的に純粋なポリペプチドは、少なくとも９６％純粋であること、すなわちそのポリペプチドが標品中に存在する総ポリペプチド物質の少なくとも９６重量％を構成し、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．２５％、少なくとも９９．５％および少なくとも９９．７５％など、より高いパーセントが好ましい。ポリペプチド断片が「基本的に純粋な形態」であること、すなわちポリペプチド断片が、元来付随する他の抗原を基本的に含まないこと、すなわち結核菌群に属する細菌または病原性細菌からの他の抗原を一切含まないことが特に好ましい。これは、以下で詳述するような非マイコバクテリア宿主細胞での組み換え法によってポリペプチド断片を調製することによって、または固相もしくは液相ペプチド合成の周知の方法により、例えば（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ  １９６３）により記載される方法もしくはその変法によりポリペプチド断片を合成することによって遂行し得る。
【００５３】
「結核」（ＴＢ）は、動物において、またはヒトにおいてＴＢ感染および疾患を引き起こすことが可能な結核菌群からの病原性細菌によって引き起こされる感染と理解される。病原性マイコバクテリアの例は、Ｍ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、Ｍ．アフリカヌム（Ｍ．ａｆｒｉｃａｎｕｍ）およびＭ．ボビス（Ｍ．ｂｏｖｉｓ）である。関連動物の例は、ウシ、フクロネズミ、アナグマおよびカンガルーである。
【００５４】
「ＴＢ患者」は、培養または顕微鏡的に証明された病原性マイコバクテリアによる感染がある個体および／または臨床的にＴＢと診断された、および抗ＴＢ化学療法に反応性がある個体と理解される。ＴＢの培養、顕微鏡および臨床診断は当業者にとって周知である。
【００５５】
「遅延型の過敏反応」（ＤＴＨ）という用語は、ポリペプチドの皮膚への注射または皮膚への適用後に誘発されるＴ細胞介在性の炎症反応と理解され、前記炎症反応は、ポリペプチド注射または適用から７２〜９６時間後に出現する。
【００５６】
「サイトカイン」という用語は、免疫学的反応の指標として使用され得るインターロイキンおよびインターフェロンなどの何らかの免疫調節剤と理解される。これは、例えば、ＣＸＣＬ１０または「ＩＰ−１０」およびインターロイキン２（ＩＬ−２）としても知られる、インターフェロン−ガンマ「ＩＦＮ−γ」、インターフェロンγ誘導性タンパク質１０を含む。
【００５７】
本願にわたり、文脈から別段の要求がない限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という語または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などのその変形物は、述べられる要素もしくは整数または要素もしくは整数群を含むが、何らかの他の要素もしくは整数または要素もしくは整数群を排除しないものと理解される。
【００５８】
配列同一性
「配列同一性」という用語は、長さが等しい２個のアミノ酸配列間の、または長さが等しい２個のヌクレオチド配列間の相同性の度合いの定量的な目安を示す。比較しようとする２個の配列は、ギャップを挿入して、またはあるいはタンパク質配列の末端での短縮化によって、できる限り最良の可能な一致に対してアライメントしなければならない。配列同一性は、
0006698530.tif 000003
として計算することができ、式中、Ｎｄｉｆは、アライメントした場合の２個の配列における非同一残基の総数であり、Ｎｒｅｆは、配列の一方における残基の数である。ゆえに、ＤＮＡ配列ＡＧＴＣＡＧＴＣは、配列ＡＡＴＣＡＡＴＣ（Ｎｄｉｆ＝２およびＮｒｅｆ＝８）で７５％の配列同一性を有する。具体的な残基の非同一なものとしてギャップを数え、すなわちＤＮＡ配列ＡＧＴＧＴＣは、ＤＮＡ配列ＡＧＴＣＡＧＴＣ（Ｎｄｉｆ＝２およびＮｒｅｆ＝８）で７５％の配列同一性を有する。あるいは配列同一性は、ＢＬＡＳＴプログラム、例えばＢＬＡＳＴＰプログラム（Ｐｅａｒｓｏｎ，１９８８）（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＢＬＡＳＴ）によって計算することができる。本発明のある態様において、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ２．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｃｌｕｓｔａｌｗ／で利用可能なＴｈｏｍｐｓｏｎら（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，１９９４）により記載のような初期設定パラメーターを用いて、配列アライメント法ＣｌｕｓｔａｌＷでアライメントを行う。
【００５９】
配列同一性の好ましい最終パーセンテージは、少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％および少なくとも９９．５％である。
【００６０】
免疫原性エピトープ
ポリペプチドの免疫原性エピトープはそのポリペプチドの一部であり、動物またはヒトにおいておよび／または生体試料中で免疫反応を誘発し、これは本明細書中に記載の生物学的アッセイの何れかにより決定される。ポリペプチドの免疫原性エピトープは、Ｔ細胞エピトープまたはＢ細胞エピトープであり得る。免疫原性エピトープは、ポリペプチドの１または数個の比較的小さな部分と関連し得、これらは、ポリペプチド配列にわたり全体的に散在し得るか、またはポリペプチドの特異的な部分に位置し得る。数個のポリペプチドに対して、エピトープは、配列全体をカバーするポリペプチド全体にわたり分散することも明らかになっている（Ｒａｖｎ，１９９９）。
【００６１】
免疫反応中に認識される関連があるＴ細胞エピトープを同定するために、「総当たり的」方法を使用することが可能である：Ｔ細胞エピトープは直鎖状であるので、ポリペプチドの欠失突然変異体は、体系的に構築される場合、例えばこれらの欠失突然変異体を例えば本明細書中に記載のＩＦＮ−γアッセイに供することによって、免疫認識において必須であるのはどのポリペプチド領域かを明らかにする。別の方法は、ＭＨＣクラスＩＩエピトープの検出のために、好ましくは合成の、本ポリペプチド由来の例えば２０アミノ酸残基の長さを有する重複ペプチドを利用する。生物学的アッセイ（例えば本明細書中で記載のようなＩＦＮ−γアッセイ）においてこれらのペプチドを試験することができ、これらの一部が、ペプチド中のＴ細胞エピトープの存在に対する証拠として、陽性反応（および、それによって免疫原性）となる。ＭＨＣクラスＩエピトープの検出の場合、結合するペプチドを予想し（Ｓｔｒｙｈｎ，１９９６）、その後、これらのペプチド合成物を生成させ、関連がある生物学的アッセイ、例えば本明細書中に記載のようなＩＦＮ−γアッセイにおいてそれらを試験することが可能である。ペプチドは、好ましくは本ポリペプチド由来の例えば８〜１１アミノ酸残基の長さを有する。
【００６２】
Ｔ細胞エピトープの最小長は少なくとも６アミノ酸であることが示されているにもかかわらず、このようなエピトープがより長く伸びているアミノ酸から構成されることは普通である。ゆえに、本発明のポリペプチド断片の長さが少なくとも７アミノ酸残基、例えば少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１４、少なくとも１６、少なくとも１８、少なくとも２０、少なくとも２２、少なくとも２４および少なくとも３０アミノ酸残基であることが好ましい。ゆえに、本発明の方法の重要な実施形態において、ポリペプチド断片の長さが最長で５０アミノ酸残基、例えば最長で４０、３５、３０、２５および２０アミノ酸残基であることが好ましい。１０〜３０アミノ酸残基の長さを有するペプチドは、ＭＨＣクラスＩＩエピトープとして最も効率的であることが判明すると予想され、したがって本発明の方法で使用されるポリペプチド断片の特に好ましい長さは、１８、例えば１５、１４、１３、１２などおよびさらには１１アミノ酸残基である。７〜１２アミノ酸残基の長さを有するペプチドは、ＭＨＣクラスＩエピトープとして最も効率的であることが判明すると予想され、したがって本発明の方法で使用されるポリペプチド断片の特に好ましい長さは、１１、例えば１０、９、８などおよびさらには７アミノ酸残基である。
【００６３】
免疫原性エピトープを含むポリペプチドの免疫原性部分（免疫原性エピトープを含む断片）は、異型遺伝子性のヒト集団の幅広い部分（高頻度）によって、または少数の部分（低頻度）によって認識され得る。さらに一部の免疫原性部分は、高い免疫学的反応（ドミナント）を誘導し、一方で他のものが誘導する反応はより低いが、なお著しい反応（サブドミナント）である。高頻度＞＜低頻度は、広く分布するＭＨＣ分子（ＨＬＡ型）に、または複数のＭＨＣ分子によっても結合する、免疫原性部分に関連し得る（Ｓｉｎｉｇａｇｌｉａ，１９８８；Ｋｉｌｇｕｓ，１９９１）。前記ポリペプチドからの免疫原性エピトープを含む断片は、少なくとも１０アミノ酸長の重複ペプチドとして存在し得、それによりいくつかのエピトープに及ぶ。
【００６４】
変異体
本発明の組成物のポリペプチドの共通する特性は、それらが実施例で説明されるように免疫学的反応を誘発することができることである。置換、挿入、付加または欠失により作製される本発明のポリペプチドの変異体も免疫原性であり、これは本明細書中に記載のアッセイの何れかにより決定されることが理解される。
【００６５】
免疫個体
免疫個体は、病原性マイコバクテリアによる感染が排除されているかまたは制御されているかまたはＭ．ボビス（Ｍ．ｂｏｖｉｓ）ＢＣＧでのワクチン接種を受けている人間または動物として定義される。
【００６６】
免疫原性
免疫原性ポリペプチドは、現在または以前に病原性マイコバクテリアに感染している生体試料または個体中で免疫反応を誘導するポリペプチドとして定義される。免疫原性ポリペプチドは、抗原または抗原性ポリペプチドと同義であり、この２つの用語、免疫原および抗原は、この開示において区別なく使用され；抗原に対する厳密な定義は、ＴまたはＢ細胞受容体に特異的に結合することができることであり、免疫原に対する厳密な定義は、免疫反応を引き起こすことができることであるが、診断の場合には、この２つの用語の効果は同じであり、ゆえに本明細書中で無差別に使用される。
【００６７】
ＣＭＩ診断
免疫反応は次の方法のうち１つによって監視され得る：インビトロＣＭＩ反応は、現在または以前に病原性マイコバクテリアに感染している動物またはヒトから採取されるリンパ球からの関連サイトカイン、例えばＩＦＮ−γなどの放出によって、またはこれらのＴ細胞の増殖の検出によって、決定される。誘導は、ウェルあたり好ましくは１×１０５個の細胞〜１×１０６個の細胞を含む血液細胞の懸濁液に免疫原性組成物を添加することによって行われる。細胞は、血液、脾臓、肝臓または肺の何れかから単離され、免疫原性組成物の添加の結果、例えば１〜２００μｇ／ｍＬ懸濁液の濃度となり、刺激は、２〜５日間行われる。細胞増殖を監視するために、細胞に放射性標識化チミジンを瞬間適用し、温置から１６〜２２時間後、液体シンチレーション測定または何らかの他の方法によって増殖を検出して、増殖反応を検出する。ＩＦＮ−γの放出は、当業者にとって周知のＥＬＩＳＡ法によって決定することができる。ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−α、ＩＬ−４、ＴＧＦ−β、ＩＰ−１０、ＭＩＰ−１β、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１ＲＡおよびＭＩＧなど、ポリペプチドに対する免疫学的反応を監視する場合、ＩＦＮ−γ以外の他のサイトカインおよびケモカインが適切であり得る。サイトカイン（例えばＩＦＮ−γ）の存在を判定するための別のおよびより高感度の方法はＥＬＩＳＰＯＴ法であり、ここで例えば血液から単離される細胞を好ましくは１〜４×１０６個の細胞／ｍＬの濃度に希釈し、診断または免疫原性組成物の存在下で１８〜２２時間温置し、その結果、好ましくは１〜２００μｇ／ｍＬの濃度となる。その後、細胞懸濁液を１〜２×１０６／ｍＬに希釈し、抗ＩＦＮ−γで被覆されたポリビニリデンフルオリド膜マイクロタイタープレートに移し、好ましくは４〜１６時間温置する。ＩＦＮ−γ産生細胞は、標識二次抗ＩＦＮ−γ抗体およびスポットを生じさせる適切な基質の使用によって判定し、解剖顕微鏡を用いて数え上げることができる。ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔアッセイはＥＬＩＳＰＯＴアッセイの改変法であり、同じアッセイで２種のサイトカインをスポットすることを可能にする複数の蛍光抗サイトカインを用いることに基づき、これはＩＬ−２およびＩＦＮ−γ同時判定に対して以下に記載のような疾患リスク予想を改善できる可能性がある。ラテラルフロー技術を用いて、サイトカインまたはケモカイン反応の存在を判定することも可能である。迅速妊娠検査から周知であるこのタイプのアッセイによって、放出されるサイトカインまたはケモカインのレベルの迅速検出が可能になり、非常に制約がある設定でも感染および疾患の診断が可能になる。比濁法などの比色分析アッセイを含む他の免疫アッセイは当業者にとって周知であり、サイトカインまたはケモカインレベルのハイスループット検出のために使用することができる。これはまた、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術の使用によって関連サイトカインをコードするｍＲＮＡの存在を判定する可能性でもある。ｍＲＮＡレベルでのサイトカインまたはケモカインの検出は通常、ｍＲＮＡ転写がタンパク質合成に先行するので、タンパク質レベルでの検出よりも速い。例えば、サイトカインＩＦＮ−γおよびケモカインＩＰ−１０のｍＲＮＡレベルは、タンパク質レベルと比較して、より短い温置時間で最適となる。ｍＲＮＡレベルで検出されるサイトカインおよびケモカインシグナルは、刺激から２時間という早い時間で行い得、６〜１０時間で最大レベルに到達する。通常、例えばＰＣＲ、ラテラルフロー、ＥＬＩＳＰＯＴまたはＥＬＩＳＡを利用して１種以上のサイトカインを測定する。当業者にとって当然のことながら、特異的なポリペプチドにより誘導されるこれらのサイトカインの何れかの量の顕著な増加または減少は、ポリペプチドの免疫学的活性の評価で使用することができる。また、熟練者は、ある一定のパターンのサイトカイン放出が、ある一定の臨床状態と関連することを認めるであろう。特にＩＬ−２に対するＩＦＮ−γの優位性は、初発の活動性ＴＢ疾患の兆候として示唆されており、一方でＩＦＮ−γに対するＩＬ−２の優位性は、テストに供される哺乳動物において感染が存在するものの、感染制御およびＴＢ疾患発症低リスクを示唆する（Ｂｉｓｅｌｌｉ，２０１０；Ｓｅｓｔｅｒ，２０１１）。
【００６８】
インビトロＣＭＩ反応は、ＩＬ−７および／またはＩＬ−１５などのサイトカインの添加によって増大し得、また放出増大は、ＩＬ−１０、ＩＬ−４、ＩＬ−５および／またはＩＬ−１３などの阻害性物質を阻止することによっても行い得る。インビトロ培養条件が刺激を受ける細胞にとって最適である場合、同様のＣＭＩ反応をより確実に検出することができる。このような条件は、例えば単糖および複合糖類の形態で栄養を添加することによって促進することができる。
【００６９】
単純であり、さらに感度が高い方法は、単核細胞を予め単離しない全血試料の使用である。この方法を用いて、５０〜１０００ｍＬの量においてヘパリン添加全血試料（赤血球を予め溶解させるかまたは溶解させない）および温置は、本発明の診断または免疫原性組成物とともに１８時間〜６日間行い、その結果、好ましくは１〜２００μｇ／ｍＬ懸濁液の濃度となる。上清を回収し、ＩＦＮ−γ（または何らかの他の関連がある放出サイトカイン、例えばＩＰ−１０、ＩＬ−２など）の放出は、当業者にとって周知のＥＬＩＳＡ法によって判定することができる。
【００７０】
ＣＭＩ反応を判定するための別の単純でさらに感度が高いインビトロ法は、温置後に、診断または免疫原性組成物とともに、ろ紙、例えばＷｈａｔｍａｎ  ９０３またはＷｈａｔｍａｎ  ＦＴＡ紙上に試料をスポット添加することによる。乾燥後、スポット添加した試料を安定化させ、後の段階で試料中のサイトカインおよびケモカインレベルを検出することができる。ＣＭＩ反応は、タンパク質またはｍＲＮＡ測定に対して上述の技術で容易に検出される。この方法は、低リソース設定またはハイスループット試料調製および分析に対して特に適切である。
【００７１】
別のインビトロ法は、ヘパリンおよび／または栄養素などの血液安定化剤も任意選択により添加される、免疫原性ポリペプチドまたはその融合タンパク質で予め被覆されたバキュテナー血液回収チューブを含む。予め被覆された温置チューブによって血液回収が単純になり、インビトロ温置のための試料を調製する際の血液由来の感染への曝露のリスクがなくなる。このようなバキュテナーチューブは、ハイスループット処理および自動化に理想的である。
【００７２】
したがって、本発明はまた、動物またはヒトにおいて病原性マイコバクテリアによる進行中のまたは以前の感作を診断するためのインビトロ法であり、本方法は、動物またはヒトからの血液試料を提供し、本発明のポリペプチドまたは組成物と動物からの試料を接触させることを含み、血液試料中の単核細胞による少なくとも１種のサイトカインの細胞外フェーズへの顕著な放出が、動物が感作されていることを示す、方法にも関する。陽性反応は、ＴＢ診断＋２標準偏差がない患者由来の血液試料からの放出を超える反応である。
【００７３】
インビトロＣＭＩ反応はまた、生マイコバクテリア、細菌細胞からの抽出物またはＩＬ−２を添加した１０〜２０日にわたる培養ろ液の何れかでＴ細胞株が推進されている、免疫個体またはＭ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）感染者由来のＴ細胞株の使用によっても決定され得る。誘導は、例えば１×１０５個の細胞〜３×１０５個の細胞／ウェルを含有するＴ細胞株への、好ましくは１〜２００μｇポリペプチド／ｍＬ懸濁液の添加によって行われ、２〜６日間温置を行う。ＩＦＮ−γの誘導または別の関連サイトカインの放出はＥＬＩＳＡによって検出される。上記のように放射活性標識チミジンを用いて細胞増殖を検出することによって、Ｔ細胞の刺激を監視することもできる。両アッセイに対して、陽性反応は、バックグラウンド＋２標準偏差を超える反応である。
【００７４】
インビボＣＭＩ反応（例えば皮膚テスト、経皮皮膚テスト、パッチ皮膚テスト）は、本発明の診断または免疫原性組成物において、病原性マイコバクテリアに臨床的にまたは無症候性に感染している個体に対する、好ましくは１〜２００μｇの各ポリペプチドでの皮内注射または局所適用パッチ後の陽性ＤＴＨ反応として決定され得、陽性反応は、注射または適用から７２〜９６時間後に直径が少なくとも５ｍｍとなる。
【００７５】
診断精度およびカットオフ
いかなる診断テストの感度も、テストにより正確に同定または診断される陽性反応個体の割合を定め、例えばある状態にある個体全てが陽性テストを有する場合、感度は１００％である。あるスクリーニングテストの特異性は、テストによって正確に同定または診断される、症状がない個体の割合を反映し、例えば状態がない個体全てが陰性のテスト結果となる場合、１００％特異的である。
【００７６】
感度は、本発明の記載方法によって（例えば陽性ＩＦＮ−γテスト結果を有する）、正確に診断される、ある状態（例えば活動性ＴＢ感染）にある個体の割合として定められる。
【００７７】
本明細書中での特異性は、本発明の記載される方法によって（例えば陰性ＩＦＮ−γテスト結果を有する）、正確に同定される、ある状態がない（例えば活動性ＴＢ感染に曝露されていない）個体の割合として定義される。
【００７８】
受信者操作特性
診断テストの精度は、その受信者操作特性（ＲＯＣ）によってより詳細に説明される（Ｚｗｅｉｇ，１９９３）。ＲＯＣグラフは、観察されるデータの範囲全体にわたり識別閾値を連続的に変動させることから得られる感度／特異性ペアの全てのプロットである。
【００７９】
検査室検査の臨床成績は、その診断精度または臨床的に関連があるサブグループに対象を正確に分類できることに依存する。診断精度は、そのテストが、検査される対象の２つの異なる状態を正確に区別できることの目安である。このような状態は、例えば健康および疾患、潜伏または最近の感染対非感染または良性対悪性疾患である。
【００８０】
各例において、ＲＯＣプロットは、識別閾値の全範囲に対する、感度対１−特異性をプロットすることによって２つの分配間の重複を示す。ｙ軸は感度または真陽性分率である［（真陽性のテスト結果数）（真陽性の数＋偽陰性のテスト結果数として定義］。これはまた、疾患または状態の存在下において陽性とも呼ばれる。これは専ら罹患サブグループから計算される。ｘ軸は、偽陽性分率または１−特異性である［（偽陽性の結果数）／（真陰性数＋偽陽性の結果数）として定義］。これはまた、特異性の指標でもあり、完全に非罹患サブグループから計算される。
【００８１】
真および偽陽性分率は完全に個別に、２個の異なるサブグループからのテスト結果を用いることによって計算されるので、ＲＯＣプロットは、試料中の疾患の有病率とは独立している。ＲＯＣプロット上の各点は、特定の識別閾値に対応する感度／−特異性ペアを表す。完全な鑑別（結果の２つの分布において重複なし）があるテストは、左上隅を通過するＲＯＣプロットを有し、真陽性分率は１．０または１００％（完全な感度）であり、偽陽性分率は０（完全な特異性）である。鑑別なしのテストに対する理論的プロット（２群に対する結果分布が同一）は、左下隅から左上隅への４５°対角線である。殆どのプロットは、これらの２つの両端の間に入る。（ＲＯＣプロットが４５°対角線より下に完全に入る場合、「陽性」に対する基準を「より大きい」から「より小さい」に、または「より小さい」から「より大きい」に逆転することによってこれは容易に矯正される。定性的に、プロットが左上隅に近いほど、テストの全体的精度が高くなる。
【００８２】
検査室テストの診断精度を定量するためのある１つの都合の良い目標は、１つの数によってその性能を表すことである。最も一般的で包括的な目安は、ＲＯＣプロット下面積である。慣習により、この面積は常に＞０．５である（そうでない場合、そうなるように判定規則を逆転することができる）。値は、１．０（２群のテスト値が完全に分離）〜０．５（テスト値の２群間での明白な分布の相違なし）の範囲である。面積は、対角線に最も近い点または９０％特異性での感度などのプロットの特定の部分にのみ依存するものではなく、プロット全体にも依存する。これは、ＲＯＣプロットが完全なもの（面積＝１．０）にどの程度近いかの定量的な記載的表現である。
【００８３】
新規抗原プールの臨床的有用性は、ある感染に対する他の診断ツールと比較して、およびこれと組み合わせて、評価し得る。Ｍ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）による感染の場合、ＣＭＩ結果の臨床的有用性は、ＩＧＲＡまたは受信者動作曲線分析を用いたＴＳＴなどの確立された診断テストと比較して評価し得る。
【００８４】
調製方法
一般に、様々な手順のうち何れか１つを用いて、Ｍ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）抗原およびこのような抗原をコードするＤＮＡ配列を調製し得る。
【００８５】
これらは、上記のものなどの手順によって、Ｍ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）細胞または培養ろ液からのネイティブタンパク質として精製し得る。免疫原性抗原は、抗原をコードするＤＮＡ配列を用いて、組み換えによっても作製し得、この抗原は、発現ベクターに挿入されており、適切な宿主中で発現される。宿主細胞の例はＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）である。約１００アミノ酸より少ない、一般的には５０アミノ酸より少ないポリペプチドまたはその免疫原性部分はまた、合成によっても作製することができ、伸長しているアミノ酸鎖にアミノ酸を連続的に付加する、市販の固相技術など、当業者にとって周知の技術を用いて作製し得る。
【００８６】
ポリペプチドをコードするプラスミドＤＮＡの構築および調製において、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの宿主株を使用することができる。次いで、関心のあるプラスミドを保有する宿主株の一晩培養物からプラスミドＤＮＡを調製し、例えば内毒素除去段階を含むＱｉａｇｅｎ  Ｇｉｇａ−プラスミドカラムキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒｉｔａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて精製することができる。
【００８７】
融合タンパク質
個別のものであることを除き、２つ以上の免疫原性ポリペプチドは融合タンパク質としても作製され得、この方法によって本発明のポリペプチドの優れた特徴を達成することができる。例えば、組み換え作製される場合にポリペプチドの輸送を促進する融合パートナー、ポリペプチドの精製を促進する融合パートナーおよび本発明のポリペプチド断片の免疫原性を促進する融合パートナーは全て興味深い可能性である。したがって、本発明はまた、少なくとも２つ（例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１０を超えるなど）のポリペプチドまたは上記で定められる免疫原性断片および任意選択により少なくとも１つのさらなる融合パートナーを含む融合ポリペプチド、ならびに融合タンパク質を含む組成物にも関係する。融合パートナーは、免疫原性を促進するために、ＥＳＡＴ−６、ＴＢ１０．４、ＣＦＰ１０、ＲＤ１−ＯＲＦ２、Ｒｖ１０３６、ＭＰＢ６４、ＭＰＴ６４、Ａｇ８５Ａ、Ａｇ８５Ｂ（ＭＰＴ５９）、ＭＰＢ５９、Ａｇ８５Ｃ、１９ｋＤａリポタンパク質、ＭＰＴ３２およびアルファ−クリスタリンなど、結核菌群に属する細菌由来のポリペプチド断片または上述の抗原の何れかの少なくとも１つのＴ細胞エピトープなどの、Ｍ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）由来の別のポリペプチドであり得る（国際公開第０１７９２７４号パンフレット；同第０１０４１５１９号パンフレット；（Ｎａｇａｉ，１９９１；Ｒｏｓｅｎｋｒａｎｄｓ，１９９８；Ｓｋｊｏｔ，２０００）。本発明はまた、本発明のポリペプチド（またはその免疫原性部分）の２つ以上（例えば３、４、５、６、７、８、９、１０または１０を超えるなど）の相互融合を含む融合ポリペプチドにも関係する。
【００８８】
［実施例］
実施例１．抗原の初回選択
ＴＢの免疫診断のために選択されたＴ細胞抗原は、ＢＣＧでのワクチン接種および最も流行性の非定型マイコバクテリアからの干渉を回避するために、Ｍ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）感染に対して特異的であるべきである。同時に、ＴＢに対する新規ワクチンの多くにおいてＥＳＡＴ−６が存在することを考えると、ＥＳＡＴ−６を回避することは重要である。上記背景技術のように、発明者らは、理論的な考察、実際のテスト実施および数百個の可能性のある抗原の文献検索に基づく、詳細で厳密なダウン・セレクション（ｄｏｗｎ−ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）過程を通じて、さらなるテストのために９個以下のＭ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）抗原を選択した。これらは次のとおりである。
【００８９】
ＣＦＰ１０（Ｒｖ３８７４）。１０ｋＤａ培養ろ液抗原は、ＥＳＡＴ−６とともに、ＩＦＮ−γ放出アッセイ（ＩＧＲＡ）によるＭ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）感染に対する現在の細胞に基づく診断血液テストの基礎である。ＣＦＰ１０は、免疫優性Ｍ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）抗原およびＣＦＰ１０およびＥＳＡＴ−６の診断特異性は、リージョン・オブ・ディファレンス１（ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ  １（ＲＤ１））でのそれらのゲノムの位置により生じ、この領域は全ＢＣＧ株に存在せず（Ｂｅｈｒ，１９９９）、Ｍ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の病態に関与する。ＥＳＸ−１分泌経路のコンポーネントをコードする遺伝子もＲＤ１に位置する。インターフェロン−γアッセイ研究の観点で、ＴＢ患者において６１〜７１％のＣＦＰ１０に対する感度が報告された（Ｐａｉ，２００４）。ＥＳＡＴ−６とは対照的に、ＣＦＰ１０は、評価中の現在のワクチン候補の何れの一部でもない。
【００９０】
Ｒｖ３８７７。ＣＦＰ１０に関して、Ｒｖ３８７７遺伝子は、Ｍ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）染色体上のＲＤ１領域に位置し、Ｍ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）ゲノムの他の場所には近いホモローグはない。本タンパク質は、Ｍ．ボビス（Ｍ．ｂｏｖｉｓ）ＢＣＧまたは環境性マイコバクテリアＭ．アビウム（Ｍ．ａｖｉｕｍ）には存在せず、したがって、可能性のある以前のＢＣＧワクチン接種からの干渉またはＭ．アビウム（Ｍ．ａｖｉｕｍ）などの環境性マイコバクテリア、への強い曝露なく、特異的なＭ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）診断に対して使用することができる。Ｒｖ３８７７は、膜貫通タンパク質であり、ＥＳＸ−１基質が分泌される孔を形成するので、ＥＳＸ−１分泌の重要なコンポーネントである（Ａｂｄａｌｌａｈ，２００７）。Ｒｖ３８７７タンパク質をカバーする合成ペプチドのプールは、ヒトＴＢ患者から単離されたＰＢＭＣの３３％による陽性反応を誘導した（Ｍｕｓｔａｆａ，２００８）。
【００９１】
Ｒｖ３６１４ｃおよびＲｖ３６１５ｃ。ｅｓｐＡ−ｅｓｐＣ−ｅｓｐＤ（Ｒｖ３６１６ｃ−Ｒｖ３６１５ｃ−Ｒｖ３６１４ｃ）遺伝子クラスターはＥＳＸ−１依存性タンパク質分泌およびＭ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）毒性（Ｆｏｒｔｕｎｅ，２００５；ＭａｃＧｕｒｎ，２００５）に必須であり、３個の遺伝子が同時転写されることが最近明らかになった（Ｃｈｅｎ，２０１２）。Ｒｖ３６１６ｃおよびＲｖ３６１５ｃはＥＳＡＴ−６およびＣＦＰ１０と同時分泌され（Ｆｏｒｔｕｎｅ，２００５；ＭａｃＧｕｒｎ，２００５）、一方でＲｖ３６１４ｃ分泌は、ＥＳＸ−１機能を必要とするとは限らない（Ｃｈｅｎ，２０１２）。ウシにおいて、Ｒｖ３６１５ｃのＭ．ボビス（Ｍ．ｂｏｖｉｓ）対応物Ｍｂ３６４５ｃは、Ｍ．ボビス（Ｍ．ｂｏｖｉｓ）感染動物の３７％においてＩＦＮ−γ反応を刺激したが、ナイーブおよびＢＣＧ−ワクチン接種動物では刺激しなかった（Ｓｉｄｄｅｒｓ，２００８）。Ｍｂ３６４５ｃおよびＲｖ３６１５ｃは１００％アミノ酸同一性を示す。ウシにおいて、Ｍｂ３６４５ｃタンパク質のＣ末端部分（アミノ酸５７〜１０３）は、最も免疫原性が高かった（Ｓｉｄｄｅｒｓ，２００８）。ヒトにおいて、ＴＢ症例を認識し、ＢＣＧワクチン接種において反応が低い、Ｍ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）特異的なＴ細胞に基づく免疫診断に対する可能性のある候補としてＲｖ３６１５ｃも同定された（Ｍｉｌｌｉｎｇｔｏｎ，２０１１）。活動性ＴＢの患者において、最も頻繁に認識されるペプチドは、分子のＣ末端部分（アミノ酸６６〜９０）に位置した。Ｒｖ３６１５ｃをコードする遺伝子がＢＣＧに存在するにもかかわらず、Ｒｖ３６１５ｃタンパク質は、Ｍ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）感染個体において特異的に認識されるが、ＢＣＧワクチン接種者での認識は限定的である。
【００９２】
ＥｓｐＦ（Ｒｖ３８６５）。Ｅｗｅｒら（Ｅｗｅｒ，２００６）によって、実験的にまたは自然にＭ．ボビス（Ｍ．ｂｏｖｉｓ）に感染したウシにおいて有望な診断マーカーとして、ＥＳＸ−１分泌関連タンパク質ＥｓｐＦタンパク質またはＭ．ボビス（Ｍ．ｂｏｖｉｓ）Ｍｂ３８９５（Ｍ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）からのＲｖ３８６５と同一）が同定された。実験的感染ウシの５０パーセントはＭｂ３８９５ペプチドプールに反応し、一方でＢＣＧワクチン接種した仔牛はこのペプチドプールに反応しなかった。
【００９３】
Ｒｖ２３４８ｃ。Ｒｖ２３４８ｃは、機能未知の仮説的なタンパク質である。Ｒｖ２３４８ｃ遺伝子はＲＤ７領域に位置する。この領域は、ＢＣＧにはないことが示されており（Ｂｅｈｒ，１９９９）、したがって以前のＢＣＧワクチン接種からの干渉なく、ＴＢ診断のために本タンパク質を使用できる。この遺伝子はインビトロで高い割合で転写され（Ａｒｎｖｉｇ，２０１１）、タンパク質がプロテオーム研究において同定された（ｄｅ  Ｓｏｕｚａ，２０１１）。Ｒｖ２３４８ｃＯＲＦ（オープン・リーディング・フレーム）におけるアミノ酸断片２３〜５０は、Ｍ．アビウム（Ｍ．ａｖｉｕｍ）遺伝子Ｍａｖ＿２０４０と非常に高い相同性を有する。
【００９４】
Ｒｖ３８７３。Ｒｖ３８７３のアミノ酸配列から、アミノ酸１２〜７０をカバーする領域が重複ペプチドによってカバーされた。評価したいくつかのＲＤペプチドプールの中で、Ｒｖ３８７３Ａと呼ばれる、Ｒｖ３８７３ペプチドのこのプールが、ＴＢ患者からのＰＢＭＣの４６％により認識される最も有望なプールの１つとして同定された（Ｂｒｏｃｋ，２００４）。可能性のある交差反応区画は、分子のこの部分に存在しなかった。
【００９５】
Ｒｖ３８７８。上記でＲｖ３８７３に対して記載されるように、このＲＤ１タンパク質のアミノ酸１２２〜１８９をカバーする、Ｒｖ３８７８Ｂと名付けられたペプチドプールを定め、評価した。ヒトＴＢ患者からのＰＢＭＣの３２％によってこれが認識され、感度を最大にするためにＥＳＡＴ−６およびＣＦＰ１０と組み合わせ得るペプチドカクテルまたはプールとして示唆された（Ｂｒｏｃｋ，２００４）。
【００９６】
Ｒｖ２６５４ｃ。Ｒｖ２６５４ｃ遺伝子はＲＤ１１領域によりコードされ、機能未知である、可能性のあるＰｈｉＲｖ２プロファージタンパク質をコードする。Ｒｖ２６５４ｃのタンパク質産物全体（ＴＢ７．７と呼ばれる）をカバーする重複ペプチドをスクリーニングすることによって、Ｂｒｏｃｋらは、ＢＣＧ−ワクチン接種個体において交差認識を見出さず、さらに４７％の感度を示した（Ｂｒｏｃｋ，２００４）。選択されたペプチド（配列番号８）はＱｕａｎｔｉＦＥＲＯＮ（登録商標）ＴＢ  Ｇｏｌｄテストに含まれる。
0006698530.tif 000004
【００９７】
実施例２．抗原の選択
エジプトおよびグリーンランドの２回の独立した試験において、ＴＢ患者または潜伏感染個体における認識について上記テキストで列挙される抗原のうち７個を試験した。両試験において、比較物およびベンチマーク抗原としてＥＳＡＴ−６（Ｒｖ３８７５）も含まれた。さらに、非特異的抗原刺激の例として、エジプトにおいてＰＰＤが含まれた。
【００９８】
概説したような抗原からの選択ペプチドで新鮮試料採取した希釈全血を再刺激し、ＥＳＡＴ−６およびＣＦＰ１０のペプチドプールに対する反応がベンチマークとして含まれた。
【００９９】
エジプトでの試験において、陽性対照として３４名のボランティアドナー（女性８名および男性２６名）が含まれた。これらのうち３２名が、陽性痰培養物が明らかになったＴＢ疾患として診断された（対象３〜３４）。２例が潜伏ＴＢ（対象１および２）であった。さらに、３０名の感染浸淫地域の陰性対照ドナー（女性５名および男性２５名）が含まれた。これらは、全てＢＣＧワクチン接種が推定され、ＴＢ疾患の病歴はなく、ＴＢ患者との既知の接触はなかった。グリーンランドでの試験において、３１名の対象が含まれた（女性１５名および男性１６名）。１４名がＴＢ疾患と診断され（対象１〜１４）；１１例で陽性痰培養物が明らかになり、４例で臨床の立場でＴＢ診断が行われた。残りの１７名の対象は潜伏ＴＢであった（対象１５〜３１）。
【０１００】
両実験において、選択された抗原（各ペプチド１０μｇ／ｍＬ）が入ったプレート上で新鮮試料採取した希釈全血を刺激した。両試験において、抗原ＥＳＡＴ−６、ＣＦＰ１０、Ｒｖ３８７３、Ｒｖ３８７８、Ｒｖ３６１５ｃ、Ｒｖ３８６５、Ｒｖ３８７７およびＲｖ２３４８からの合成ペプチド（Ｇｅｎｅｃｕｓｔより入手）をスクリーニングし、陽性（ＰＨＡ）および陰性（培地のみ）対照および（エジプトのみ）ＰＰＤも含まれた（図示せず）。希釈全血を３７℃で５日間温置し、続いて上清を回収し、社内ＥＬＩＳＡによって（ＩＦＮ−γ）について試験した。これらの試験における陽性反応は、エジプトおよびグリーンランド試験に対して、それぞれ、ＩＦＮ−γ濃度が１００または５０ｐｇ／ｍＬであるものとして定義した。
【０１０１】
図１、２および３は、データをグラフで表現（ヒートマップ）したものであり、含有される個々の値が、反応を示さない場合は白色で表され、灰色はある抗原に対して反応があることを示し、黒色は、同じドナーがＥＳＡＴ−６および／またはＣＦＰ１０に反応せずに、ある抗原に対して反応することを表す。示されるように、テスト抗原のうちいくつかは、ＴＢ患者または潜伏感染ドナーにおいて認識され、最も主要な反応はＲｖ３６１５ｃによる刺激由来である（ドナーの４９％において認識）。重要なこととして、ＥＳＡＴ−６のみが、ＣＦＰ１０での刺激時に認識されない３名の患者を認識し（図１の患者番号９および１７および図２の患者番号３）、このうちＲｖ３６１５は、全３名の患者を認識可能である。さらに、Ｒｖ３６１５ｃによる再刺激は、ＥＳＡＴ−６およびＣＦＰ１０により認識されない、それぞれ１１名および９名のドナーにおいて認識を示した。対照的に、これらの抗原のうち２つは非常に限られた数のドナーにおいて認識され；Ｒｖ３８７３は６５名のドナーのうち僅か２名で認識され、Ｒｖ３８７８は６５名のドナーのうち７名で認識された。したがって、感度が中程度であるデンマークおよびオランダからのＴＢ患者でのこれらの抗原における以前のデータにもかかわらず（Ｒｖ３８７３はＲｖ３８７８に対して３２％、およびＲｖ３８７３に対して４６％（Ｂｒｏｃｋ，２００４）、本明細書中で得たデータは、全ての抗原が、全ての設定において高感度で働くとは予想されないことを強調する。Ｒｖ３８６５、Ｒｖ３８７７およびＲｖ２３４８は中程度の感度を示し、６５名のドナーのうち１６名、１２名および１５名で認識された。重要なこととして、抗原、Ｒｖ３６１５ｃ、Ｒｖ３８６５およびＲｖ２３４８は全て、ＥＳＡＴ−６および／またはＣＦＰ１０を認識しなかった多くのドナーにおいて反応を生じ、これにより、これらの抗原の診断可能性がさらに明らかになる。エジプトからの３０名の感染浸淫地域の陰性対照ドナーのパネルにおいて、選択された抗原の特異性が確認された（図３）。示されるように、研究対象の抗原は全て、非特異的抗原刺激の例として含まれたＰＰＤとは対照的に、非常に特異的であった。ドナー３１および７７は両者とも、ＥＳＡＴ−６およびＣＦＰ−１０の両方を含む、広い範囲のＭ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）抗原を認識し、言及した選択基準にもかかわらず、潜伏感染が強く示される。
【０１０２】
実施例３．ＣＦＰ１０および３６１５ｃはＣＦＰ１０およびＥＳＡＴ−６に対して同等である
続いて、組合せＣＦＰ１０およびＲｖ３６１５ｃの診断性能を組合せＣＦＰ１０およびＥＳＡＴ−６と比較した。発明者らは、グリーンランドからの３５名からの全血試料を含め、このうち１８名は、陽性Ｑｕａｎｔｉｆｅｒｏｎテストとして定義される、潜伏性Ｍ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）感染を有し、および／またはＭ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）およびツベルクリン皮膚テスト転換に対する曝露が証明された者であり、１７名の患者は、微生物学的にＴＢが確認された。７日間にわたり、加湿３７℃インキュベーター中で、２００μＬの未希釈全血の個々のアリコートを５μｇ／ｍＬの最終濃度でＣＦＰ１０（配列番号１）またはＲｖ３６１５（配列番号１５〜１８）またはＥＳＡＴ−６（配列番号５１）に相当する重複ペプチドで刺激した。陰性対照試料（ｎｉｌ）を平行して調製した。温置後、血漿上清を単離し、ＥＬＩＳＡを用いてＩＦＮ−γのレベルを決定した。
【０１０３】
個々の抗原での刺激に反応した、測定レベルの抗原特異的ＩＦＮ−γ産生（刺激した全血のレベルから未刺激ウェル中のレベルを差し引いたもの）を付加することによって、この３個の抗原の診断能を評価し、続いてカットオフに対してこの合計を比較した。カットオフは、少なくとも５０ｐｇ／ｍＬの合わせた抗原特異的反応および個々の患者においてニル（ｎｉｌ）値よりも４倍高いものとして定義した。カットオフを上回る抗原特異的なレベルによって、抗原陽性として個々の患者を分類し、カットオフを下回る抗原特異的なレベルを抗原陰性として分類した。
【０１０４】
表２は、個々の抗原ＣＦＰ１０、Ｒｖ３６１５ｃ、ＥＳＡＴ−６および組合せの感度を示す。示されるように、組合せＣＦＰ１０およびＲｖ３６１５ｃの診断性能は、ＣＦＰ１０およびＥＳＡＴ−６と同等であり、両組合せとも６０％感度を示す。ＣＦＰ１０、Ｒｖ３６１５ｃおよびＥＳＡＴ−６を組み合わせることによって、感度が６０％から６９％へとさらに向上する。
0006698530.tif 000005
【０１０５】
実施例４．３個の抗原：Ｒｖ２３４８、Ｒｖ３８６５およびＲｖ３８７７との組合せＣＦＰ１０およびＲｖ３６１５ｃの濃縮
上記と同じ全血試料（グリーンランドから３５名；潜伏Ｍ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）感染者１８名および微生物学的に確認されたＴＢ患者１７名）および同じアッセイ条件を用いて、発明者らは、３個の異なる抗原：Ｒｖ２３４８、Ｒｖ３８６５およびＲｖ３８７７との、ＣＦＰ１０およびＲｖ３６１５ｃの組合せの効果を評価した。
【０１０６】
個々の抗原に反応にしたＩＦＮ−γの測定レベルの抗原特異的な産生（刺激した全血のレベルから未刺激ウェルのレベルを差し引く）を付加し、続いてカットオフと合計を比較することによって、３個の抗原の診断能を評価した。カットオフは、少なくとも５０ｐｇ／ｍＬの合わせた抗原特異的反応および個々の患者においてニル（ｎｉｌ）値よりも４倍高いものとして定義した。カットオフを上回る抗原特異的なレベルによって、抗原陽性として個々の患者を分類し、カットオフを下回る抗原特異的なレベルを抗原陰性として分類した。
【０１０７】
表３は、個々の抗原Ｒｖ３８６５、ＣＦＰ１０、Ｒｖ３６１５ｃおよび組合せの感度を示す。Ｒｖ３８６５の感度は比較的穏やかであり、僅か２０％の感度であったが、Ｒｖ３８６５をＣＦＰ１０およびＲｖ３６１５ｃに添加すると、ＣＦＰ１０およびＲｖ３８６５単独と比較して、全体的な診断感度が６％増強した。
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【０１０８】
同様に、Ｒｖ３８７７の診断能は僅か１１％であったが、この抗原もまた、ＣＦＰ１０およびＲｖ３６１５ｃの全体的感度を６０％から６９％へと向上させた（表４）。
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【０１０９】
最後に、発明者らは、Ｒｖ２３４８もまたＣＦＰ１０およびＲｖ３６１５ｃの診断能を向上させることが可能であったか否かを評価した（表５）。示されるように、Ｒｖ２３４８の感度は２９％であり、Ｒｖ２３４８をＣＦＰ１０およびＲｖ３６１５ｃに添加すると、ＣＦＰ１０およびＲｖ３６１５ｃ単独で使用した場合と比較して、診断感度が２３％増強する。
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【０１１０】
発明者らは、単一ペプチドプール（ペプチドプールＡ）にこれらの４個の抗原を組み合わせた場合の感度および特異性のさらなる評価のために次の抗原（ＣＦＰ１０、Ｒｖ３６１５ｃ、Ｒｖ３８６５およびＲｖ２３４８）を選択した。
【０１１１】
実施例５．感度−および特異性−ペプチドプールＡの試験実施
本技術分野で、ＥＳＡＴ−６、ＣＦＰ１０およびＴＢ７．７ｐ４を含む免疫診断カクテルが、Ｍ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）による感染を診断するための好ましい方法であることは周知である。この抗原カクテルは高感度かつ特異的と考えられ、これはＱｕａｎｔｉｆｅｒｏｎテストの基礎を形成する。先の実施例から明らかであるように、抗原の組合せは、ＩＦＮ−γ反応の基礎的な度合いがより高く、抗原のみを有するものと比較してよりロバストに検出されるので、診断感度およびテストの信頼性を改善する。
【０１１２】
免疫診断に対する非常にユーザーフレンドリーなアプローチは、カクテル中の抗原で予めコーティングしたバキュテナーチューブを使用することである。例えばＱｕａｎｔｉｆｅｒｏｎテストにおいて、抗原カクテルに相当する凍結乾燥ペプチドが、バキュテナーチューブ中でヘパリンによりコーティングされる。血液をこのチューブに採取し、ペプチドが抗原特異的なＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞と相互作用できるようにする。１６〜２４時間温置後、チューブを遠心し、産生されたＩＦＮ−γのレベルを血漿上清中で測定し、陰性および陽性対照試料と比較することができる。レベルが陽性試験結果に対するカットオフを上回る場合、感染または非感染の何れかとして、被験対象をさらに分類することができる。
【０１１３】
ＩＦＮ−γシグナル伝達と関連する他の免疫エフェクター分子が、Ｍ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）感染を診断するために有用であることは周知である（Ｃｈｅｇｏ  ＥＲＪ  ２０１４）。ケモカインＩＰ−１０が非常に高レベルで産生され、ＩＦＮ−γに対する同等な診断性能を有する。
【０１１４】
いくつかの抗原を１つの抗原カクテルに組み合わせることの有用性を明らかにするために、発明者らは、次の抗原を「ペプチドプールＡ」に組み合わせた。ペプチドプールＡは次のペプチドから構成された：
・ＣＦＰ１０：ＣＦＰ１０のアミノ酸配列全体をカバーする６個のペプチド（配列番号９〜１４）
・Ｒｖ３６１５ｃ：アミノ酸５５〜１０３をカバーする４個のペプチド（配列番号１５〜１８）
・Ｒｖ３８６５：アミノ酸９〜４４をカバーする３個のペプチド（配列番号１９〜２１）
・Ｒｖ２３４８ｃ：全長タンパク質配列のアミノ酸５６〜１０９をカバーする４個のペプチド（配列番号２２〜２５）。
【０１１５】
ペプチドプールＡに組み合わせた場合の４個の抗原の感度を試験するために、エジプトにおける第二の独立した試験を行った。この試験において、陽性痰培養物が明らかな７３名のＴＢ患者が含まれ、各対象が血液試料を供与し、事前に調製した抗原コーティング真空チューブに直接採取した。ＥＳＡＴ−６＋ＣＦＰ１０＋Ｒｖ２６５４ｃペプチド（すなわちＱｕａｎｔｉｆｅｒｏｎテストと同じペプチド、ベンチマークとして使用、Ｑｕａｎｔｉｆｅｒｏｎペプチドプールと命名）またはペプチドプールＡ（上で示されるようなＣＦＰ１０＋Ｒｖ３５１６ｃ＋Ｒｖ３８６５＋Ｒｖ２３４８）の何れかでチューブをコーティングした。温置１６〜２４時間後に、上清を回収し、社内ＥＬＩＳＡアッセイによりサイトカインＩＰ−１０の放出について試験した。図４で示されるように、高い割合のＴＢ患者が、ペプチドプールＡならびにＱｕａｎｔｉｆｅｒｏｎペプチドプールの両方を認識した。中央値反応は、ペプチドプールＡの場合はＩＰ１０の５．５ｎｇ／ｍＬおよびＱｕａｎｔｉｆｅｒｏｎペプチドプールの場合は６．０であった。
【０１１６】
平行して、ペプチドプールＡの特異性を試験するために、デンマークにおいて独立した試験を行った。この試験において、ＴＢ有病率が非常に低い地域（デンマーク）に居住しており、Ｍ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）への既知の曝露がない１００名の対象が含まれた。１７例において、対象はＢＣＧワクチン接種が実証され、１９例においてＢＣＧワクチン接種状況が不明／記載されていなかった。残りの参加者はＢＣＧワクチンを接種していなかった。感度実験と同様に、ペプチドプールＡ（ＣＦＰ１０＋Ｒｖ３６１５ｃ＋Ｒｖ３８６５＋Ｒｖ２３４８）またはベンチマークＱｕａｎｔｉｆｅｒｏｎペプチドプール（ＥＳＡＴ−６＋ＣＦＰ１０＋Ｒｖ２６５４ｃ）の何れかで予めコーティングしたバキュームチューブに新鮮な全血を直接採取した。温置１６〜２４時間後に、上清を回収し、社内ＥＬＩＳＡアッセイによってサイトカインＩＰ−１０およびＩＦＮ−γの含有量について試験した。ペプチドプールＡおよびＱｕａｎｔｉｆｅｒｏｎペプチドプールに対する中央値ＩＰ−１０反応が両者とも０ｎｇ／ｍＬであったにもかかわらず（図５）、Ｑｕａｎｔｉｆｅｒｏｎ−抗原での再刺激時に数名の非曝露ドナーが陽性反応を呈し、ＩＰ−１０レベルがおよそ５ｎｇ／ｍＬであった。ＩＦＮ−γの分泌を分析した場合、偽陽性反応を示す非曝露ドナーで同じ傾向が観察された（図６；ペプチドプールＡ中央値０ｐｇ／ｍＬ、四分位範囲（ＩＱＲ）−０．５〜５．２ｐｇ／ｍＬおよびＱｕａｎｔｉｆｅｒｏｎペプチドプール中央値４．９ｐｇ／ｍＬ、ＩＱＲ−０．６〜３２．４５ｐｇ／ｍＬ。
【０１１７】
感度および特異性実験からのデータを合わせることによって、発明者らは、Ｑｕａｎｔｉｆｅｒｏｎ抗原プールとペプチドプールＡの診断可能性を比較する、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線分析を行うことができた（図７）。曲線下面積（ＡＵＣ）は、ペプチドプールＡについては０．９７９、Ｑｕａｎｔｉｆｅｒｏｎ抗原プールについては０．９４７であった。ＲＯＣ曲線分析によって、ペプチドプールＡおよびＱｕａｎｔｉｆｅｒｏｎペプチドプール両方に対する最適カットオフが、ペプチドプールＡについては１．４ｎｇ／ｍＬ（９８．１％特異性で感度８７．７％）；Ｑｕａｎｔｉｆｅｒｏｎペプチドプールについては２．３ｎｇ／ｍＬ（９６．２％特異性で感度７５．３％）であると特定された。
【０１１８】
これらのカットオフを用いて、発明者らは、ＱｕａｎｔｉｆｅｒｏｎペプチドプールおよびペプチドプールＡでの再刺激時の、陽性および陰性反応の数を直接付き合わせて比較した（表６および７）。７３名のＴＢ患者のうち、５４名（７４％）がＱｕａｎｔｉｆｅｒｏｎペプチドプールを認識し、これは、６４〜８９％のＱｕａｎｔｉｆｅｒｏｎ抗原の感度において公開されている範囲内である（Ｄｅｗａｎ，２００７）。対照的に、ペプチドプールＡは、この試験において、８８％の推定感度に対応する、より高い割合のＴＢ患者を認識した（７３名の患者のうち６４名）。マクマネーテストを用いて、ペプチドプールＡが、Ｑｕａｎｔｉｆｅｒｏｎペプチドプールと比較して、この試験において、有意に高い感度を明らかにした（ｐ＜０．０１２）。
0006698530.tif 000009
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【０１１９】
結論として、ペプチドプールＡは、Ｑｕａｎｔｉｆｅｒｏｎ抗原と比較して、有意に高い感度（真の陽性がより多い；表６）を呈し、少なくとも同程度に特異的であった（同等な偽陽性；表７）。これらの結果は、１）現在のＱｕａｎｔｉｆｅｒｏｎ抗原と比較してより感度が高い、ＥＳＡＴ−６を欠いているＴＢ−診断ペプチドプールを設計すること、２）現在のＱｕａｎｔｉｆｅｒｏｎと特異性が同等である非ＥＳＡＴ−６含有抗原プールを設計することが可能であることを明らかに立証する。
【０１２０】
実施例６．ペプチドプールＡの検証
免疫診断テストに対するカットオフの検証は、独立コホートでの確認を必要とすることは、当業者にとって周知である。この目的のために、発明者らは、６８例の微生物学的に確認されたＴＢ患者および３６名の感染浸淫地域の対照を含め、すなわちこれらの一部は、タンザニアからの、既に存在するが、制御されているＭ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）感染個体である。
【０１２１】
各ドナーから、凍結乾燥ヘパリン（１８ＩＵ）および次のようなペプチド（５μｇ／ペプチド）：Ｑｕａｎｔｉｆｅｒｏｎペプチドプール（ＥＳＡＴ−６、ＣＦＰ１０およびＴＢ７．７ｐ４（チューブ１）、Ｑｕａｎｔｉｆｅｒｏｎテストと同等）；ペプチドプールＡ（ＣＦＰ１０、Ｒｖ３６１５、Ｒｖ３８６５およびＲｖ２３４８Ｂ（チューブ２））および陰性対照チューブ（チューブ３）を含む５本のバキュテナーチューブに１ｍＬの血液を採取した。
【０１２２】
図８において、発明者らは、念のため、ＩＰ−１０（ｎｇ／ｍＬ）反応を差し引いた陰性対照チューブ（チューブ３）およびチューブ１およびチューブ２からの対照を示す。ＴＢ例において反応度が高いことについてＱｕａｎｔｉｆｅｒｏｎペプチドプールおよびペプチドプールＡが同等であることは明らかである。予想されるように、感染浸淫地域の対照反応はより不均一であり、これは、一部の被験個体が感染していることを裏付ける。
【０１２３】
実施例５で特定された、予め定められたカットオフ（１．４ｎｇ／ｍＬ）を用いて、ＴＢ患者（表８）および感染浸淫地域の対照（表９）の両方に対して診断精度を比較した。ＴＢ患者群において、標準的Ｑｕａｎｔｉｆｅｒｏｎペプチドプールの診断感度は６６％（含まれる６８名の患者のうち４５名が陽性と定義）であり、ペプチドプールＡに対してはより高く、７２％の感度（６８名の患者のうち４９名が陽性と判定）である。予想されるように、２つのテスト間の一致は非常に高く、９１％一致であった（両テストにおいて４４名が陽性、両テストにおいて１８名が陰性で、全体的一致は６８名中６２名）。
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【０１２４】
感染浸淫地域の対照集団において、感染に対する究極の判断基準はなく、したがって、発明者らは、陽性反応者として判定する。ペプチドプールＡは３９％（１４／３６）を陽性として検出し、標準的Ｑｕａｎｔｉｆｅｒｏｎペプチドプールは３１％（１１／３６）であり、繰り返すが、これは、より高い感度を示唆する。一致も非常に高かった（９２％は、含まれる３６名からの３３例における一致に対応する）。
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【０１２５】
実施例７．ペプチドプールＡは、ＥＳＡＴ−６と組み合わせることによって、さらに改善することができる。
発明者らは、診断性能をまたさらに改善する目的で、ペプチドプールＡにＥＳＡＴ−６を添加することの可能性をさらに評価した。したがって、発明者らは、エジプトのカイロでの、実施例５に記載のものと同じアッセイ条件を用いて、ＴＢ確認の７３例のコホートにおいて、ペプチドプールＡ＋ＥＳＡＴ−６およびペプチドプールＡを試験した。図９において、ペプチドプールＡをＥＳＡＴ−６と組み合わせた場合、反応の大きさを増大させることが明らかであり、中央値が６．８６ｎｇ／ｍＬ  ＩＰ−１０であるＥＳＡＴ−６があるペプチドプールＡと比較して、ペプチドプールＡの中央値反応はＩＰ−１０の５．５０ｎｇ／ｍＬである。０．７５ｎｇ／ｍＬのカットオフを用いて、発明者らは、２群において反応者頻度を比較した。ペプチドプールＡにおいて、反応者頻度は９３％であり、７３名の被験患者のうち６８名が陽性であり、一方でＥＳＡＴ−６があるペプチドプールＡの頻度は９６％（７３名の患者のうち７０名−９６％）であった。したがって、ペプチドプールＡをＥＳＡＴ−６と組み合わせることによって、偽陰性率が７％から４％へと低下した。
【０１２６】
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Ｐａｉ，Ｍ．，Ｌ．Ｗ．Ｒｉｌｅｙ，ｅｔ  ａｌ．（２００４）．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｇａｍｍａ  ａｓｓａｙｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｏｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ：ａ  ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｒｅｖｉｅｗ．Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｄｉｓｅａｓｅｓ  ４（１２）：７６１−７７６．
Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｗ．Ｒ．ａｎｄ  Ｄ．Ｊ．Ｌｉｐｍａｎ（１９８８）．Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ８５（８）：２４４４−２４４８．
Ｒａｖｎ，Ｐ．，Ａ．Ｄｅｍｉｓｓｉｅ，ｅｔ  ａｌ．（１９９９）．Ｈｕｍａｎ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ＥＳＡＴ−６  Ａｎｔｉｇｅｎ  ｆｒｏｍ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  １７９（３）：６３７−６４５．
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Ｒｏｓｅｎｋｒａｎｄｓ，Ｉ．，Ｐ．Ｂ．Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９９８）．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ２９−ｋｉｌｏｄａｌｔｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｒｏｍ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｆｉｌｔｒａｔｅ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ  ｂｙ  ｍｏｕｓｅ  ｍｅｍｏｒｙ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ６６（６）：２７２８−２７３５．
Ｒｕｈｗａｌｄ，Ｍ．ａｎｄ  Ｐ．Ｒａｖｎ（２００９）．Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  ｏｆ  ｌａｔｅｎｔ  ＴＢ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｅｘｐｅｒｔ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３（４）：３８７−４０１．
Ｓｃｈｏｐｆｅｒ，Ｋ．，Ｈ．Ｌ．Ｒｉｅｄｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）．Ｔｈｅ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ａｎ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｇａｍｍａ  ｒｅｌｅａｓｅ  ａｓｓａｙ  ｉｎ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ  ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ．Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ．
Ｓｅｓｔｅｒ，Ｕ．，Ｍ．Ｆｏｕｓｓｅ，ｅｔ  ａｌ．（２０１１）．Ｗｈｏｌｅ−Ｂｌｏｏｄ  Ｆｌｏｗ−Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ａｎｔｉｇｅｎ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＣＤ４  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｐｒｏｆｉｌｅｓ  Ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈｅｓ  Ａｃｔｉｖｅ  Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｆｒｏｍ  Ｎｏｎ−Ａｃｔｉｖｅ  Ｓｔａｔｅｓ．ＰｌｏＳ  ｏｎｅ  ６（３）：ｅ１７８１３．
Ｓｉｄｄｅｒｓ，Ｂ．，Ｃ．Ｐｉｒｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．（２００８）．Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｏｆ  ｈｉｇｈｌｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｇｅｎｅｓ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  Ｒｖ３６１５ｃ  ａｓ  ａ  ｕｓｅｆｕｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｃｏｍｐｌｅｘ．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ７６（９）：３９３２−３９３９．
Ｓｉｎｉｇａｇｌｉａ，Ｆ．，Ｍ．Ｇｕｔｔｉｎｇｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（１９８８）．Ａ  ｍａｌａｒｉａ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ  ｉｎ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｍｏｓｔ  ｍｏｕｓｅ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎ  ＭＨＣ  ｃｌａｓｓ  ＩＩ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ３３６（６２０１）：７７８−７８０．
Ｓｋｊｏｔ，Ｒ．Ｌ．，Ｔ．Ｏｅｔｔｉｎｇｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（２０００）．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｏｗ−ｍｏｌｅｃｕｌａｒ−ｍａｓｓ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｒｏｍ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  ｍｅｍｂｅｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＥＳＡＴ−６  ｆａｍｉｌｙ  ａｓ  ｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｔ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ａｎｔｉｇｅｎｓ．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ６８（１）：２１４−２２０．
Ｓｏｎｎｅｎｂｅｒｇ，Ｐ．，Ｊ．Ｒ．Ｇｌｙｎｎ，ｅｔ  ａｌ．（２００５）．Ｈｏｗ  ｓｏｏｎ  ａｆｔｅｒ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ＨＩＶ  ｄｏｅｓ  ｔｈｅ  ｒｉｓｋ  ｏｆ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｓｔａｒｔ  ｔｏ  ｉｎｃｒｅａｓｅ？  Ａ  ｒｅｔｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  ｃｏｈｏｒｔ  ｓｔｕｄｙ  ｉｎ  Ｓｏｕｔｈ  Ａｆｒｉｃａｎ  ｇｏｌｄ  ｍｉｎｅｒｓ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｄｉｓｅａｓｅｓ  １９１（２）：１５０−１５８．
Ｓｔｒｙｈｎ，Ａ．，Ｌ．Ｏ．Ｐｅｄｅｒｓｅｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９９６）．Ｐｅｐｔｉｄｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｍａｊｏｒ  ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｃｌａｓｓ  Ｉ  ｒｅｓｏｌｖｅｄ  ｉｎｔｏ  ａｎ  ａｒｒａｙ  ｏｆ  ａｐｐａｒｅｎｔｌｙ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｓｕｂｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ：ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  ａｎｄ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｎｄｉｎｇ．Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２６（８）：１９１１−１９１８．
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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