(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、ｃ−ＭｙｃおよびＫｌｆ４を発現する、非胚性末梢神経からの、哺乳動物神経由来の成体多能性幹細胞（当該多能性幹細胞をＮＥＤＡＰＳ細胞という）の集団を調製するエキソビボの方法であって、
（ａ）エキソビボでＮＥＤＡＰＳ細胞増殖条件に晒された非胚性末梢神経を培養して、培養物からＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、ｃ−ＭｙｃおよびＫｌｆ４を発現する細胞を単離すること；または
（ｂ）インビボで対象においてＮＥＤＡＰＳ細胞増殖条件に晒された非胚性末梢神経からの細胞を培養して、培養物からＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、ｃ−ＭｙｃおよびＫｌｆ４を発現する細胞を単離すること、
を含み、前記ＮＥＤＡＰＳ細胞増殖条件が、前記非胚性末梢神経をＢＭＰ２および／または外傷に晒すことを含む、方法。
【請求項２】
前記非胚性末梢神経または前記非胚性末梢神経からの細胞を、非分化培地を使用して培養する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＮＥＤＡＰＳ細胞増殖条件が前記非胚性末梢神経をＢＭＰ２に晒すことを含み、
（ａ）前記非胚性末梢神経が、インビボで対象においてＢＭＰ２に晒されたものであるか；または
（ｂ）前記非胚性末梢神経が、ＢＭＰ２を含む培地において前記神経を培養することによってエキソビボでＢＭＰ２に晒されるものである、
請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記非胚性末梢神経が、インビボで対象においてＢＭＰ２に晒されたものであって、
（ｉ）ＢＭＰ２が前記非胚性末梢神経に直接適用された；
（ｉｉ）ＢＭＰ２が筋肉内注射によって前記対象に投与された；または
（ｉｉｉ）骨折、鈍的傷害、熱傷害および電気ショックから選択される、ＢＭＰ２の局所的産生をもたらす条件に前記対象が晒された、
請求項３に記載の方法。
【請求項５】
（ｉ）ＢＭＰ２が１０ｎｇ〜１ｍｇにわたる量で前記非胚性末梢神経に直接適用された；
（ｉｉ）ＢＭＰ２が１０ｎｇ〜１ｍｇにわたる量で筋肉内注射によって前記対象に投与された；または
（ｉｉｉ）前記対象が、骨折、鈍的傷害、熱傷害および電気ショックから選択される、ＢＭＰ２の局所的産生をもたらす条件に晒された、
請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記非胚性末梢神経が、５ｎｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌにわたる濃度でＢＭＰ２を含む培地中で前記神経を培養することによって、エキソビボでＢＭＰ２に晒される、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記ＮＥＤＡＰＳ細胞増殖条件が外傷を前記非胚性末梢神経に与えることを含み、
（ａ）前記非胚性末梢神経が対象においてインビボで外傷を与えられたものであるか、または
（ｂ）前記非胚性末梢神経がエキソビボで外傷を与えられるものである、
請求項１または２に記載の方法。
【請求項８】
前記非胚性末梢神経が、対象においてインビボで外傷を与えられたものであり、前記外傷が機械的外傷、電気刺激、超音波衝撃波または熱損傷である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記非胚性末梢神経が、エキソビボで外傷を与えられるものであり、前記外傷が機械的外傷、電気刺激、超音波衝撃波または熱損傷である、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記機械的外傷が、前記非胚性末梢神経の圧迫を含んでいたかまたは含む、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
前記非胚性末梢神経が、前記非胚性末梢神経または前記非胚性末梢神経からの細胞を培養する前に崩されている、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記非胚性末梢神経が、前記非胚性末梢神経または前記非胚性末梢神経からの細胞を培養する前に、プロテアーゼによる処理によって崩されている、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記プロテアーゼが、コラゲナーゼまたはマトリックスメタロプロテアーゼである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記非胚性末梢神経が腓腹神経、腓腹神経の枝、手指もしくは足指の固有指神経、閉鎖神経の薄筋枝、内側前腕皮神経のセグメント、外側前腕皮神経、近位第３趾間束神経、または後骨内神経である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記非胚性末梢神経が切断された肢からのものである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃ、およびＫｌｆ４の内因性発現によって特徴付けられる、単離した哺乳動物非胚性神経由来の成体多能性幹細胞（当該多能性幹細胞をＮＥＤＡＰＳ細胞という）。
【請求項１７】
以下のうちの１つ、２つ、３つ、４つまたは全てによって特徴付けられる、請求項１６に記載の単離したＮＥＤＡＰＳ細胞：
（ａ）中胚葉細胞型に分化する能力；
（ｂ）内胚葉細胞型に分化する能力；
（ｃ）外胚葉細胞型に分化する能力；
（ｄ）運動性；および
（ｅ）培養におけるガラスまたはプラスチック基板への付着性。
【請求項１８】
間葉系細胞型である前記中胚葉系細胞型に分化する能力によって特徴付けられる、請求項１７に記載の単離したＮＥＤＡＰＳ細胞。
【請求項１９】
前記間葉系細胞型が(i)骨芽細胞または(ii)内皮細胞である、請求項１８に記載の単離したＮＥＤＡＰＳ細胞。
【請求項２０】
神経幹細胞である外胚葉細胞型に分化する能力によって特徴付けられる、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の単離したＮＥＤＡＰＳ細胞。
【請求項２１】
請求項１６〜２０のいずれか１項に記載の単離したＮＥＤＡＰＳ細胞の集団。
【請求項２２】
少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％均質である、請求項２１に記載の単離したＮＥＤＡＰＳ細胞の集団。
【請求項２３】
分化細胞の集団を調製するための方法であって、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法によって調製された集団または請求項２１もしくは２２に記載の集団を分化条件に晒すことを含む方法。
【請求項２４】
（ａ）前記分化細胞が中胚葉細胞であり、前記分化条件が中胚葉分化培地において前記集団を培養することを含む；
（ｂ）前記分化細胞が内胚葉細胞であり、前記分化条件が内胚葉分化培地において前記集団を培養することを含む；
（ｃ）前記分化細胞が外胚葉細胞であり、前記分化条件が外胚葉分化培地において前記集団を培養することを含む；
（ｄ）前記分化細胞が骨芽細胞であり、前記分化条件が骨原性分化培地において前記集団を培養することを含む；
（ｅ）前記分化細胞が内皮細胞であり、前記分化条件が内皮分化培地において前記集団を培養することを含む；または
（ｆ）前記分化細胞が神経幹細胞であり、前記分化条件が神経幹細胞分化培地において前記集団を培養することを含む、
請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
組織再生で使用するための、請求項２１または２２に記載の単離した細胞の集団。
【請求項２６】
遺伝子治療で使用するための、請求項２１または２２に記載の単離した細胞の集団。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年８月４日に提出された米国仮出願第６２／０３２，９１１号の優先権利益を主張し、その内容は本明細書中への参照によってその全体が本明細書に組み込まれている。
【０００２】
連邦政府資金による研究開発の記載
本発明は、国防省によって与えられたＤＡＲＰＡ−１１−６５−Ｏｐｅｎ−ＢＡＡ−ＦＰ−１６９の下で政府支援で行われた。政府は、本発明における一定の権利を有する。
【０００３】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットにおいて電子的に提出され、その全体が参照によってここに組み込まれている配列表を含む。２０１５年７月３１日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、ＫＮＳ−００１＿ＳＬ．ｔｘｔという名前を付けられ、サイズが２，０５７バイトである。
【背景技術】
【０００４】
幹細胞は、全てではないとしても大部分の多細胞生物に見出される部分的または完全に未分化な細胞である。幹細胞は、有糸分裂細胞分裂を通して自己再生し、脳、骨、軟骨、腺、筋肉、肝臓、皮膚、血管、神経、および血液細胞を含むが、これらに限定されない様々な特殊化した細胞型に分化する能力を有する。幹細胞は、細胞の特定の型に発達する可能性を有し、ほぼ無限に増殖することができるまたは長期間、再生を経ることができるので、それらは、治療的用途に関して特定の可能性を保持する。幹細胞は、それらが多能性であろうと多分化能であろうと、器官修復および置換、変性疾患を含めたいろいろな疾患のための細胞療法、遺伝子治療、ならびに毒性または望ましい活性に関する新薬の試験に使用され得る。
【０００５】
しかしながら、実験的および治療的適用に有用な幹細胞およびより分化した細胞の利用可能な供給源は、限定されており、しばしば低品質で、療法に適しておらず、議論の余地がある。例えば、ヒト療法のための胚性幹細胞（ＥＳＣ）の使用は、倫理的問題、および胚性供給源に由来する細胞が患者の免疫系によって拒絶され得るというリスクによって妨害されている。ＥＳＣの使用に関する第３の問題は、ＥＳＣが奇形腫と呼ばれる腫瘍を形成する可能性があることである。奇形腫は、いくつかの異なる細胞型を含有し、毛髪、歯、および皮膚をしばしば含む。かかる腫瘍は、技術上は良性であるが、非常に重大な問題を示し得る。ＥＳＣの代替物は、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞またはＩＰＳＣ）である。ｉＰＳ細胞は、遺伝的材料を分化した「成体」細胞の核に導入して、胚性表現型を支配する４つの転写因子、すなわち、ｃ−Ｍｙｃ、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、およびＯｃｔ４の発現を強制することによって作り出される。（非特許文献１）これらの遺伝子は、レトロウイルスまたはレンチウイルスベクターを使用してしばしば導入される。細胞をｉＰＳ細胞に変化するように誘導するために使用される上記ベクターは、宿主細胞ゲノム中に組み込まれる。これらの事象は、細胞を胚性幹細胞のように挙動させる。ｉＰＳ細胞も、上で同定した潜在的な問題、最も著しくは、免疫拒絶を有するが、さらに、遺伝子操作のために様々な型の悪性腫瘍に分化する現実のリスクを有する。導入遺伝子は、ｉＰＳ細胞において大部分がサイレンスされているが、かかる導入遺伝子の後の再活性化が起こり得る。重大な懸念は、ｃ−Ｍｙｃをコードする導入遺伝子が腫瘍形成につながり得ることである。（非特許文献２）
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Takakashi K. and Yamanaka S., Cell (2006) 126(4):663-76；Takahashi et al., Cell (2007) 131 (5): 861-872
【非特許文献２】Yamanaka S, Cell (2009)137(1):13-17
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、ＥＳＣおよびｉＰＳ細胞の問題を回避する幹細胞が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本開示は、神経由来成体多能性幹細胞（本明細書でＮＥＤＡＰＳ細胞と称される）、それらを得るための方法、それから分化した細胞、ならびにＮＥＤＡＰＳ細胞およびそれらの分化した子孫の使用を提供する。ＮＥＤＡＰＳ細胞は、胚性幹細胞および多能性幹細胞のマーカーである４つの転写因子である、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃ、およびＫｌｆ４を発現する。ここで記載されたＮＥＤＡＰＳ細胞は、末梢神経に由来し得、操作のいかなる特定の理論にも縛られることなく、ＮＥＤＡＰＳ細胞に形質転換する休眠状態の細胞リザーバーに対する特定の刺激の結果を表す。これらの細胞は、本明細書に記載の多種多様な細胞型に分化し得、胚性供給源由来ではなく、ＮＥＤＡＰＳ細胞核への新しい遺伝的材料の操作、または導入を必要としない。かかる細胞は、ＮＥＤＡＰＳ細胞増殖条件に晒された対象からまたはエキソビボでＮＥＤＡＰＳ細胞増殖条件に晒された神経から安全に収集され得る。ＮＥＤＡＰＳ細胞は、インビトロまたはエキソビボで培養し、医学的、獣医学的、または産業的適用における使用のために分化ありまたはなしで増殖させ得る。例えば、対象が幹細胞療法を必要としている場合、ＮＥＤＡＰＳ細胞を対象から収集し、インビトロで培養かつ増殖させ、次いで、これらの自己由来細胞の免疫拒絶の予期されるリスクなしに、対象に再移植し得る。ＮＥＤＡＰＳ細胞は、組織修復に使用し得るまたはそれらは、培養において完全にまたは部分的に分化させ得る。完全な分化後に移植された場合、ＮＥＤＡＰＳ細胞の子孫は、ｉｎ  ｓｉｔｕで選択された組織または器官（例えば、肝組織）に発達し得る。ＮＥＤＡＰＳ細胞またはそれらの分化した子孫の自家移植は、胚からＥＳＣを収集することに関連する問題を回避し、ドナー組織の移植に関連する免疫拒絶応答を回避する。ＮＥＤＡＰＳ細胞およびそれらの子孫の使用により、移植または幹細胞療法における奇形腫形成および悪性腫瘍のリスクが排除されるかまたは劇的に低減させることも予期される。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１−１】図１Ａは、外科的に切除され、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色された正常マウス坐骨神経（対照）を示す図である。図１Ｂは、経皮注入によりＢＭＰ２に２４時間晒した後に外科的に切除され、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色されたマウス坐骨神経を示す図である。細胞の増殖に注目されたい。図１Ｃは、注入によりＢＭＰ２に４８時間晒した後のマウス坐骨神経を、Ｈ＆Ｅ染色で染色したものを示す図である。細胞の過剰増殖性の増殖に注目されたい。図１Ｄは、ＢＭＰ２に２４時間晒した後のマウス坐骨神経を、Ｏｃｔ４に関して染色したものを示す図である。図１Ｅは、ＢＭＰ２に２４時間晒した後のマウス坐骨神経を、ｎａｎｏｇに関して染色したものを示す図である。図１Ｆは、ＢＭＰ２に２４時間晒した後のマウス坐骨神経を、Ｓｏｘ２に関して染色したものを示す図である。大部分がＳｏｘ２を発現している細胞の増殖に注目されたい。
【図１−２】図１Ｇは、ＢＭＰ２に２４時間晒した後のマウス坐骨神経を、Ｋｌｆ４に関して染色したものを示す図である。大部分がＫｌｆ４を発現している細胞の増殖に注目されたい。図１Ｈは、ＢＭＰ２に２４時間晒した後のマウス坐骨神経を、炎症マーカーであるインターロイキン１に関して染色したものを示す図である。図１Ｉは、ＢＭＰ２に７２時間晒した後のマウス坐骨神経を、Ｏｃｔ４に関して染色したものを示す図である。大部分がＯｃｔ４を発現している細胞の増殖に注目されたい。図１Ｊは、ＢＭＰ２に４８時間晒した後のマウス坐骨神経を、Ｓｏｘ２に関して染色したものを示す図である。大部分がＳｏｘ２を発現している細胞の増殖に注目されたい。図１Ｋは、ＢＭＰ２に７２時間晒した後のマウス坐骨神経を、Ｓｏｘ２に関して染色したものを示す図である。大部分がＳｏｘ２を発現している細胞の増殖に注目されたい。図１Ｌは、ＢＭＰ２に７２時間晒した後のマウス坐骨神経を、Ｏｃｔ４に関して染色したものを示す図である。大部分がＯｃｔ４を発現している細胞の増殖に注目されたい。
【図１−３】図１Ｍは、ＢＭＰ２に７２時間晒した後の、ｃ−Ｍｙｃに関して染色したマウス坐骨神経を示す図である。大部分がｃ−Ｍｙｃを発現している細胞の増殖に注目されたい。図１Ｎは、ＢＭＰ２に２４時間晒した後の、ｃ−Ｍｙｃに関して染色したマウス坐骨神経を示す図である。その大部分がｃ−Ｍｙｃを発現している、細胞の増殖に注目されたい。
【図２−１】図２Ａは、Ｏｃｔ４に関して染色された未処置（対照）マウスからの組織標本における正常マウス坐骨神経を示す図である。Ｏｃｔ４は、非刺激神経において発現されていない。図２Ｂは、筋肉内（ＩＭ）注入によってＢＭＰ２に２４時間直接晒した後のマウス坐骨を、Ｏｃｔ４に関して染色したものを示す図である。過剰増殖性の細胞増殖および著しく異常な神経に注目されたい。増殖細胞の核は、この幹細胞マーカーに関して濃く染色されている。図２Ｃは未処置（対照）マウスからの組織標本における正常マウス坐骨神経を、ｃ−Ｍｙｃに関して染色されたものを示す図である。ｃ−Ｍｙｃ発現は、非刺激神経において最小限にのみ発現されている。図２Ｄは、ＢＭＰ２注入後２４時間のマウス坐骨神経および周囲の組織の組織学的切片を、ｃ−Ｍｙｃに関して染色したものを示す図である。過剰増殖性の細胞増殖、および増殖細胞におけるｃ−Ｍｙｃに関する濃い核ペルオキシダーゼ染色に注目されたい。
【図２−２】図２Ｅは未処置（対照）マウスからの正常マウス坐骨神経を、Ｋｌｆ４に関して染色したものを示す図である。非刺激は、Ｋｌｆ４の発現を示さない。図２Ｆは、ＩＭ  ＢＭＰ２注入後４８ｈで収集されたマウス大腿屈筋における坐骨神経を通る斜めの切片を、Ｋｌｆ４に関して染色したものを示す図である。過剰増殖性の細胞増殖および組織平面を通る移動、およびＫｌｆ４に関する陽性ペルオキシダーゼ染色に注目されたい。図２ＧはＩＭ注入によりＢＭＰ２に７２時間晒した後のマウス坐骨神経の残物を、Ｓｏｘ２に関する免疫染色後のものを示す図である。神経の完全性の喪失および濃い核ペルオキシダーゼ染色に注目されたい。
【図３】機械的圧迫を使用して調製された培養ＮＥＤＡＰＳ細胞を、非特異的核染色ＤＡＰＩ（左のパネル）、Ｓｏｘ２（左から２番目のパネル）、およびｃ−Ｍｙｃ（左から３番目のパネル）に関して染色したものを示す図である。右のパネルは、ＤＡＰＩ、Ｓｏｘ２およびｃ−Ｍｙｃ画像のオーバーレイである。
【図４】機械的圧迫を使用して調製されたＮＥＤＡＰＳ細胞を、非特異的核染色ＤＡＰＩ（左のパネル）、Ｓｏｘ２（左から２番目のパネル）、およびＯｃｔ４（左から３番目のパネル）に関して染色したものを示す図である。右のパネルは、ＤＡＰＩ、Ｓｏｘ２およびＯｃｔ４画像のオーバーレイである。
【図５】機械的圧迫を使用して調製されたＮＥＤＡＰＳ細胞を、非特異的核染色ＤＡＰＩ（左のパネル）、Ｋｌｆ４（左から２番目のパネル）、およびｃ−Ｍｙｃ（左から３番目のパネル）に関して染色したものを示す図である。右のパネルは、ＤＡＰＩ、Ｋｌｆ４およびｃ−Ｍｙｃ画像のオーバーレイである。
【図６】機械的圧迫を使用して調製されたＮＥＤＡＰＳ細胞を、非特異的核染色ＤＡＰＩ（左のパネル）、Ｋｌｆ４（左から２番目のパネル）、およびＯｃｔ４（左から３番目のパネル）に関して染色したものを示す図である。右のパネルは、ＤＡＰＩ、Ｋｌｆ４およびＯｃｔ４画像のオーバーレイである。
【図７】機械的圧迫を使用して調製されたＮＥＤＡＰＳ細胞を、非特異的核染色ＤＡＰＩ（左のパネル）、Ｓｏｘ２（左から２番目のパネル）、およびＫｌｆ４（左から３番目のパネル）に関して染色したものを示す図である。右のパネルは、ＤＡＰＩ、Ｓｏｘ２およびＫｌｆ４画像のオーバーレイである。
【図８】機械的圧迫を使用して調製されたＮＥＤＡＰＳ細胞を、ＤＡＰＩ（左のパネル）、Ｏｃｔ４（左から２番目のパネル）、およびｃ−Ｍｙｃ（左から３番目のパネル）に関して染色したものを示す図である。右のパネルは、ＤＡＰＩ、Ｏｃｔ４およびｃ−Ｍｙｃ画像のオーバーレイである。
【図９】ＮＥＤＡＰＳ細胞におけるＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃ、およびＫｌｆ４の発現を実証しているＰＣＲゲルを示す図である。Ｍは、分子量マーカーを示し；Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃ、およびＫｌｆ４のＰＣＲ産物がそれぞれパネルＡ〜Ｄにおいて示されている。各パネルにおけるレーン１〜２は、単純な機械的圧迫によって刺激され、４８時間で収集された神経の二つ組みの調製物からのＰＣＲ産物を示し、各パネルにおけるレーン３〜４は、インビボでの直接適用によるｒｈＢＭＰ２に晒され、４８時間で収集された神経の二つ組みの調製物からのＰＣＲ産物を示す。
【図１０】制限幹細胞培地において増殖させたＮＥＤＡＰＳ細胞に典型的な形態を示す平面の顕微鏡写真（plain micrograph）である。平板化された細胞形状および基板への付着性に注目されたい。この形態は、典型的に円形であり基板に付着性が最小である胚性幹細胞とは明確に異なっている。
【図１１】骨芽細胞および内皮細胞をそれぞれ誘導するために培地において培養されたＮＥＤＡＰＳ細胞における骨芽細胞および内皮分化のマーカーの発現を実証しているＰＣＲゲルを示す図である。Ｍは、分子量マーカーを示し；パネルＡのレーン１〜４は、それぞれ、オステオポンチン、Ｉ型コラーゲン、オステオカルシン、および陰性対照ＰＣＲ産物を示す。パネルＢのレーン１〜３は、それぞれ、Ｆｌｔ−１、Ｆｌｋ−１、および陰性対照ＰＣＲ産物を示す。
【図１２】ＮＥＤＡＰＳ細胞のコンフルエントな培養物を、骨芽細胞への分化を誘導するために骨原性培地において培養し、アルカリホスファターゼ活性（骨芽分化のマーカー）に関して染色した後のものを示す図である。骨芽細胞に特徴的である、アルカリホスファターゼ酵素活性の存在を示している色素の蓄積に注目されたい。
【図１３】骨原性培地において培養されたＮＥＤＡＰＳ細胞を示す図である。左上のパネルは、骨芽細胞マーカーＩ型コラーゲンに関する蛍光免疫染色後の細胞を示す。右上のパネルは、ノマルスキー光学系で画像処理された左上のパネルと同じ視野を示す。左下のパネルは、免疫染色された画像およびノマルスキー画像の複合物を示す。右下のパネルは、ブランクである。
【図１４】内皮表現型に分化するように誘導されたＮＥＤＡＰＳ細胞の平面の顕微鏡写真である。細胞体の円形の外見および細長い突起は、それらがコンフルエントになる前の培養内皮細胞に典型的であり、その後、円形になった細胞体のアレイは、「玉石」外見を示す。
【図１５】内胚葉分化培地において培養されたＮＥＤＡＰＳ細胞の４つの異なる顕微鏡写真である。これらの分化細胞の形態は、それらが由来したＮＥＤＡＰＳ細胞とは全く異なっており、より円形になった形状を示し、基板への密接な付着性がより低く、核がより大きいことに注目されたい。
【図１６】外胚葉分化培地において培養されたＮＥＤＥＬ細胞の４つの異なる顕微鏡写真である。これらの細胞は、それらが由来したＮＥＤＡＰＳ細胞とは形態的に全く異なっており、発達中の神経組織と一貫した伸長した細胞形状を示していることに注目されたい。
【図１７】切除された神経をエキソビボで刺激することによって調製されたＮＥＤＡＰＳ細胞を示す図である。上部のパネルは、左から右へ、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ４、およびｃ−Ｍｙｃに関して免疫染色された細胞を示す。下部のパネルは、同じ細胞の明視野画像上の上部のパネルにおいて示された蛍光シグナルのオーバーレイを示す。
【図１８】本開示のＮＥＤＡＰＳ細胞が分化され得る例示的経路を図解する図である。図解は、省略されており、全ての可能な細胞型も各分化経路に沿った全ての中間の細胞型も示していない。例えば、造血幹細胞は、それぞれ、骨髄系列（図１８に示された赤血球および好中球、マスト細胞などを含めた）およびリンパ球系列（リンパ球およびナチュラルキラー細胞を含む）を生じる、骨髄前駆細胞およびリンパ球前駆細胞に分化し得る。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
７．１．哺乳動物末梢神経由来幹細胞（ＮＥＤＡＰＳ細胞）
本開示は、神経由来成体多能性幹細胞（ＮＥＤＡＰＳ細胞）およびその集団を提供する。「ＮＥＤＡＰＳ」の文脈で使用する場合、「成体」という用語は、非胚性供給源を表す。したがって、ＮＥＤＡＰＳ細胞は、若年または成体対象からとすることができ、対象は、哺乳動物、例えば、マウス、ラット、ネコ、イヌ、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ヤギ、もしくはウマなどの家畜化された哺乳動物、またはサルもしくはヒトなどの霊長類とすることができる。
【００１１】
本開示のＮＥＤＡＰＳ細胞は、４つの転写因子、Ｏｃｔ４（Ｏｃｔ３／４およびＰＯＵ５Ｆ１としても既知である）、Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃ、およびＫｌｆ４を発現する。これら４つの転写因子の遺伝子配列は、哺乳動物種間で高度に保存されている（Fritz et al., Journal of Biological Chemistry (2004) vol. 279(47): 48950-48958；Frankenberg et al., Developmental Biology (2010) vol. 337: 162-170；Rodda et al., Journal of Biological Chemistry (2005) vol. 280(26): 24731-24737；Flynn et al., Molecular and Cellular Biology (1998) vol. 18(10): 5961-5969；Stewart et al., Virology (1986) 154(1):121-34；Eladari et al., Biochem and Biophysical Res. Communications (1986) vol. 104(1):313-9）。さらに、マウス、ヒト、ラット、およびアカゲザルからの体細胞は、これらの同じ、同一の４つの因子の発現を誘導することによって、３つ全ての胚葉（外胚葉、内胚葉、および中胚葉）に分化する能力があるｉＰＳ細胞に初期化することに成功した。Takakashi and Yamanaka, Cell (2006) 126(4):663-76；Takahashi et al., Cell (2007) 131 (5): 861 -872;Liu et al., Cell Stem Cell (2008) 3:587-590；Liao et al., Cell Stem Cell (2009) 4(1):1 1-15。本開示のＮＥＤＡＰＳ細胞は、幹細胞マーカーＮａｎｏｇおよびＳＳＥＡ１も発現し得る。好ましくは、これら転写因子の発現は、組換え型ではない（例えば、転写因子の１つまたは複数をコードする１つまたは複数の発現ベクターの導入によって達成されない）。
【００１２】
本開示のＮＥＤＡＰＳ細胞は、適切な分化条件下で培養された場合、中胚葉細胞（例えば、骨芽細胞または内皮細胞などの間葉系細胞）、内胚葉細胞、および外胚葉細胞（例えば、神経幹細胞）に分化する能力がある。ＮＥＤＡＰＳ細胞が分化され得る細胞型の例は、図１８に示されている。様々な細胞型に関する分化条件は、当技術分野で既知であり、分化培地は、市販されている。例示的分化条件は、７．２．３節に記載されている。
【００１３】
ある特定の実施形態では、ＮＥＤＡＰＳ細胞は、インビボとインビトロの両方で運動性であり（例えば、インビボでの細胞移動およびインビトロでの分裂したばかりの細胞の移動によって証明される）、ガラスまたはプラスチックの基板に容易に付着し、かつ／またはごくまれにコロニーを形成することもある。
【００１４】
本開示のＮＥＤＡＰＳ細胞またはそれらの部分的もしくは完全に分化した子孫は、例えば、別の種からの異種遺伝子、同じ種からの相同遺伝子を組み込むために（例えば、ＮＥＤＡＰＳ細胞が由来する対象においてミュータントである遺伝子を置換するために）、野生型タンパク質と比較して、その機能が改善または改変された操作されたタンパク質を発現させるために、またはマーカー（例えば、検出可能なマーカーまたは核酸タグ）を組み込んで、例えば、移植後のそれらの運命を追跡する目的でＮＥＤＡＰＳ細胞もしくはそれらの子孫の同定を可能にするために、組換え型にされ得るかまたは遺伝的に操作され得る。核酸は、当業者に既知の方法を使用して（例えば、その内容が本明細書に参照によって組み込まれている、Wang and Gao, Discov Med. (2014) vol.18 (97):67-77に報告されている方法によって）ＮＥＤＡＰＳ細胞に導入され得、ＮＥＤＡＰＳ細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれ得るかまたはゲノムＤＮＡに組み込まれ得ない。例えば、核酸は、組換えウイルス（例えば、レトロウイルスまたはレンチウイルス）、ネイキッドＤＮＡの注入、またはトランスフェクション（例えば、リン酸カルシウム、リポソーム、またはエレクトロポレーションを使用した方法によって）によってＮＥＤＡＰＳ細胞に導入され得る。
【００１５】
別の態様では、本開示は、ＮＥＤＡＰＳ細胞、ＮＥＤＡＰＳ細胞の集団、ならびにそれから分化した細胞および細胞の集団、例えば、中胚葉細胞（間葉系幹細胞、骨芽細胞、および内皮細胞など）、内胚葉細胞、または外胚葉細胞（神経幹細胞など）を提供する。本開示の様々な態様では、集団は、以下の特徴の１つ、２つ、または３つ全てによって特徴付けられる：
（ａ）それは、単離されている；かつ／または
（ｂ）それは、少なくとも５０％均質である；かつ／または
（ｃ）それは、少なくとも１０の細胞を含有する。
【００１６】
上記の特徴（ｂ）の特定の実施形態では、上記集団は、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または９９％を超えて均質であり、例えば、少なくとも８０％均質であるＮＥＤＡＰＳ細胞の集団に関して、集団における細胞の少なくとも８０％は、ＮＥＤＡＰＳ細胞である。上記の特徴（ｃ）の特定の実施形態では、上記集団は、少なくとも５０の細胞、少なくとも１００の細胞、少なくとも２００の細胞、少なくとも５００、少なくとも１，０００の細胞または少なくとも１０，０００の細胞を含有する。本開示は、特徴（ｂ）および（ｃ）に係る前述の実施形態の任意の入替にも全ての入替にも関し、例えば、集団は、少なくとも７５％均質であり、少なくとも２００の細胞を含有する、または集団は、少なくとも６０％均質であり、少なくとも１００の細胞を含有する、または集団は、少なくとも９０％均質であり、少なくとも５０の細胞を含有する。
【００１７】
７．２．ＮＥＤＡＰＳ細胞およびＮＥＤＡＰＳ細胞から分化した細胞を調製する方法
７．２．１．ＮＥＤＡＰＳ細胞増殖条件
本開示は、インビボとエキソビボの両方でＮＥＤＡＰＳ細胞およびその集団を調製する方法を提供する。ＮＥＤＡＰＳ細胞およびＮＥＤＡＰＳ細胞の集団は、エキソビボでＮＥＤＡＰＳ細胞増殖条件に晒された末梢神経を培養することによって、またはインビボで対象においてＮＥＤＡＰＳ細胞増殖条件に晒された末梢神経からの細胞を培養することによって調製され得る。ＮＥＤＡＰＳ細胞のエキソビボ調製の文脈では、「末梢神経」という用語は、本明細書で記載されたように崩した末梢神経を含む。ＮＥＤＡＰＳ細胞を産出するのに適した神経は、機能的に重要な神経への傷害を被った神経移植対象のために常法に従って外科的に収集された末梢神経を含む。機能の喪失がたとえあるにせよ最小限で収集され得る、容易に入手可能な神経が数種存在する。末梢神経は、例えば、腓腹神経、腓腹神経の枝、手指もしくは足指の固有指神経（proper digital nerve）、閉鎖神経の薄筋枝（gracilis branch）、内側前腕皮神経のセグメント（segment of a medial antebrachial cutaneous nerve）、外側前腕皮神経、近位第３趾間束神経（proximal third webspace fascicle nerve）、後骨内神経（posterior intraosseous nerve）または他の末梢神経とすることができる。
【００１８】
ＮＥＤＡＰＳ細胞増殖条件は、末梢神経をサイトカインの骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）ファミリーのメンバーなどのサイトカインに晒すことを含み得る。ＮＥＤＡＰＳ細胞を調製する場合の使用のための好ましいＢＭＰタンパク質は、組換えヒトＢＭＰ２（ｒｈＢＭＰ２）などのＢＭＰ２である。ｒｈＢＭＰ２は、ＩＮＦＵＳＥ（登録商標）としてＭｅｄｔｒｏｎｉｃによって販売されており、骨形成を刺激することに関してＦＤＡに認可されている。ＢＭＰ２が神経炎症を誘導することを示唆する研究があり、この神経炎症がＢＭＰ２誘導骨形成のプロセスの基礎となり得ると考えられている。Heggeness, The Spine Journal, (2011) 11 :506。ＢＭＰ２に晒した後の同様の神経炎症反応がマウス、ラット、およびヒトにおいて観察された。例えば、Carragee et al., The Spine Journal, (2011) 11 :471-491；Dmitriev et al., The Spine Journal, (2011) 11 :500-505；Salisbury et al., Journal of Cellular biochemistry (2011) 112:2748-2758を参照されたい。ＮＥＤＡＰＳ細胞は、外科的に露出した末梢神経にＢＭＰ２の溶液（例えば、ＢＭＰ２を含有する生理食塩水）を直接適用するかまたは末梢神経近くの部位への筋肉内（ＩＭ）注入によって、対象においてインビボで調製され得る。
【００１９】
ＢＭＰ２は、典型的に１０ｎｇ〜１ｍｇにわたる量で、露出した神経に直接適用され得るかまたは末梢神経近くの部位に注入され得る。一部の実施形態では、このＢＭＰ２の量は、１０ｎｇ、２５ｎｇ、４０ｎｇ、５０ｎｇ、６０ｎｇ、７５ｎｇ、１００ｎｇ、１５０ｎｇ、２００ｎｇ、２５０ｎｇ、３００ｎｇ、４００ｎｇ、５００ｎｇ、７５０ｎｇもしくは１ｍｇであるか、または前述の値の任意の組を境界とする範囲（例えば、１０ｎｇ〜２５０ｎｇ、４０ｎｇ〜７５ｎｇ、５０ｎｇ〜３００ｎｇ、６０ｎｇ〜１５０ｎｇなど）から選択される。露出した神経に直接適用されるかまたは末梢神経近くの部位に注入されるＢＭＰ２の量は、１μｌ〜１０ｍｌにわたる体積を有する溶液で提供され得る。一部の実施形態では、この体積は、０．１ｍｌ〜２ｍｌ、例えば、０．２５ｍｌ、０．５ｍｌ、０．７５ｍｌ、１ｍｌ、１．２５ｍｌである、または前述の値の任意の組を境界とする範囲(例えば、０．１ｍｌ〜１ｍｌ、０．２５ｍｌ〜１ｍｌ、もしくは０．５ｍｌ〜１．５ｍｌなど)から選択される。適用されるＢＭＰ２の量および使用されるＢＭＰ２溶液の体積は、標的とされた末梢神経のサイズに依存して変動され得る。
【００２０】
代替的に、ＮＥＤＡＰＳ細胞は、対象を骨折、鈍的傷害、熱傷害、または電気ショックなどのＢＭＰ２の局所的産生をもたらす条件に晒することによってインビボで調製され得る。一部の実施形態では、ＮＥＤＡＰＳ細胞は、骨折、鈍的傷害、熱傷害、または電気ショックを被った対象から得られる。
【００２１】
ＮＥＤＡＰＳ細胞増殖条件は、末梢神経を、腫瘍壊死因子α、インターロイキン−１β、神経成長因子、ヒスタミン、インターロイキン６もしくはその組合せなどのＢＭＰ２以外の神経炎症剤（neuroinflammatory agent）にまたはＢＭＰ２に加えた神経炎症剤に晒することも含み得る。
【００２２】
他の実施形態では、ＮＥＤＡＰＳ細胞増殖条件は、外傷を末梢神経に与える（インビボまたはエキソビボで）ことを含む。外傷は、例えば、機械的外傷、例えば、末梢神経を加圧すること（例えば、１〜２秒間）、末梢神経を切るもしくは切断すること、または末梢神経を刻むこと、電気刺激（例えば、過剰刺激）、超音波衝撃波、または熱損傷とすることができる。そのようなものとして、本開示の一態様では、ＮＥＤＡＰＳ細胞の調製は、末梢神経組織を物理的傷害に供することによって刺激され得る。
【００２３】
ＮＥＤＡＰＳ細胞増殖は、ＢＭＰ２を含む培地において神経を培養することによって末梢神経をエキソビボでＢＭＰ２に晒することによっておよび／または神経を機械的外傷（例えば、加圧および／または刻むこと）に供することによっても達成され得る。一部の実施形態では、培地中のＢＭＰ２の濃度は、５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、６０ｎｇ／ｍｌ、７５ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、１５０ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ、２５０ｎｇ／ｍｌ、３００ｎｇ／ｍｌ、４００ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌ、７５０ｎｇ／ｍｌもしくは１ｍｇ／ｍｌであるか、または前述の値の任意の組を境界とする範囲（例えば、５ｎｇ／ｍｌ〜５０ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ〜２５０ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ〜７５ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ〜３００ｎｇ／ｍｌ、６０ｎｇ／ｍｌ〜１５０ｎｇ／ｍｌなど）から選択される。
【００２４】
本明細書で記載されたＮＥＤＡＰＳ細胞増殖条件の組合せもＮＥＤＡＰＳ細胞を調製するために使用され得る。例えば、ＮＥＤＡＰＳ細胞は、末梢神経をＢＭＰ２、加圧、および刻むことのうちの２つまたは３つの組合せに晒すことによって調製され得る。一実施形態では、ＮＥＤＡＰＳ細胞増殖条件は、ＢＭＰ２に晒すことを用いるかまたは用いずに末梢神経を刻むことを含む。
【００２５】
ＮＥＤＡＰＳ細胞を調製するための本開示の方法は、病的状態を最小にしたヒト対象および家畜化動物を使用して、適した末梢神経の同定および使用によって実行され得る。ヒトおよび獣医学的適用に適した神経の例は、腓腹神経またはその枝の１つ、手もしくは足における中央の指への固有指神経、および例えば、傷害もしくは疾患によって切断された肢からの神経である。四肢の部分が切断もしくは廃棄されることになるか、または神経が修復を超えて傷ついている重大な外傷の場合、かかる神経は、収集され、ＮＥＤＡＰＳ細胞を生成するために使用され得、次に、これは、その対象（すなわち、自家移植手順において）のための、または厳密にマッチした対象（すなわち、厳密にマッチしているが、同種移植手順において）のための再生手順およびプロセスに使用され得る。この技法は、ヒトと獣医学的適用の両方における組織操作および他の再生療法のための個々の遺伝的「完全なマッチ」細胞を生成するために特に望ましい。
【００２６】
７．２．２．神経収集およびＮＥＤＡＰＳ細胞培養
インビボでＮＥＤＡＰＳ細胞増殖条件に晒された対象の末梢神経は、ＮＥＤＡＰＳ細胞増殖条件に晒した直後に対象から、例えば、外科的切除によって収集され得るかまたはある期間後に収集され得る。一部の実施形態では、末梢神経は、ＮＥＤＡＰＳ細胞増殖条件に晒した後、最大４日、より好ましくは最大３日で収集される。例えば、末梢神経は、ＮＥＤＡＰＳ細胞増殖条件に晒した後、例えば約８時間（すなわち１／３日）、約１２時間（すなわち半日）、約２４時間（すなわち１日）、約４８時間（すなわち２日）、もしくは約７２時間（すなわち３日）で、または前述の値の任意の組を境界とする範囲（例えば、ＮＥＤＡＰＳ細胞増殖条件に晒した後８時間〜７２時間（すなわち１／３日〜３日）、８〜１２時間（すなわち１／３日〜半日）、１２〜２４時間（すなわち半日〜１日）、２４から４８時間（すなわち１〜２日）、もしくは４８〜７２時間（すなわち２〜３日）など）から選択される期間後に収集され得る。収集後、神経は、神経からのＮＥＤＡＰＳ細胞の出現を促進するように任意選択で崩され得る。
【００２７】
エキソビボでＮＥＤＡＰＳ細胞増殖条件に晒された末梢神経は、ＮＥＤＡＰＳ細胞増殖条件に晒された後ある期間培養され得、培養前または後に任意選択で乱され得る。一部の実施形態では、エキソビボでＮＥＤＡＰＳ細胞増殖条件に晒された末梢神経は、ＮＥＤＡＰＳ細胞増殖条件に晒した後、最大４日、より好ましくは最大３日、例えば、約８時間（すなわち１／３日）、約１２時間（すなわち半日）、約２４時間（すなわち１日）、約４８時間（すなわち２日）、もしくは約７２時間（すなわち３日）、または前述の値の任意の組を境界とする範囲（例えば、８時間〜７２時間（すなわち１／３日〜３日）、８〜１２時間（すなわち１／３日〜半日）、１２〜２４時間（すなわち半日〜１日）、２４〜４８時間（すなわち１〜２日）、または４８〜７２時間（すなわち２〜３日）など）から選択される期間、エキソビボで培養される。
【００２８】
機械的および／または酵素的手段が末梢神経を崩すために使用され得る。例えば、神経は、刻まれ得、染色され得、かつ／またはトリプシン、コラゲナーゼ（例えば、クロストリジウム・ヒストリチクム（c. histolyticum）コラゲナーゼ）、もしくはマトリックスメタロプロテアーゼなどの１つまたは複数のプロテアーゼでの処置に供され得る。
【００２９】
一部の実施形態では、末梢神経からの細胞は、末梢神経が加圧され、収集され、刻むことおよび／または１つもしくは複数のプロテアーゼでの処置によって崩された後、ＢＭＰ２を含む培地中で培養される。好ましい実施形態では、末梢神経からの細胞は、末梢神経が加圧され、収集され、刻むことおよび１つまたは複数のプロテアーゼでの処置によって崩された後、ＢＭＰ２を含む培地中で培養される。
【００３０】
収集された末梢神経、崩された末梢神経からの細胞、および単離されたＮＥＤＡＰＳ細胞は、未分化状態でＮＥＤＡＰＳ細胞を維持するために非分化培地（non-differentiating medium）において培養され得る。実施例３は、非分化状態でＮＥＤＡＰＳ細胞を培養するのに適した培地を記載している。他の適した非分化培地は、当技術分野で既知であり、その多くは、市販されており、例えば、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ（商標）  ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ，カタログ番号１０８２９−０１８）およびｍＴｅＳＲ（商標）１培地（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，カタログ番号０５８５７）である。ＮＥＤＡＰＳ細胞は、神経中に存在する他の細胞型からＮＥＤＡＰＳ細胞を単離することなく、末梢神経から培養され得る。代替的に、単一または複数のＮＥＤＡＰＳ細胞が、例えば、顕微操作、フローサイトメトリー、または当技術分野で既知の細胞を選別もしくは分離するための他の方法によって、１つまたは複数の他の細胞型から分離され、ＮＥＤＡＰＳ細胞の集団または増殖した集団を生成するために培養され得る。
【００３１】
ＮＥＤＡＰＳ細胞増殖条件に神経を晒した後、ＮＥＤＡＰＳ細胞集団は、未分化形態の標準培地において維持され得るか、または例えば、７．２．３節に記載されているようにより低能力（less potent）の細胞型中で分化され得る。分化は、増殖条件に晒した直後または未分化形態でのＮＥＤＡＰＳ細胞の維持後に行われ得る。
【００３２】
７．２．３．幹細胞分化
ＮＥＤＡＰＳ細胞の集団は、例えば、幹細胞が特定の細胞型に分化するように誘導する分化培地において集団を培養することによって、集団を分化条件に晒することによってより低能力の細胞型に分化され得る。本開示のＮＥＤＡＰＳ細胞は、内胚葉、中胚葉、および外胚葉系列の細胞に分化され得る。ＮＥＤＡＰＳ細胞が分化され得る細胞型の特定の例は、図１８に示されている。様々な細胞型に関する分化条件が当技術分野で既知であり、ＥＳＣまたはｉＰＳ細胞を分化させるための分化培地などの分化培地が市販されている。例示的方法および培地は、実施例４〜６に記載されている。例えば、ＳｔｅｍＸＶｉｖｏ（商標）  Ｅｃｔｏｄｅｒｍ  Ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，カタログ＃ＳＣ０３１）、ＳｔｅｍＸＶｉｖｏ（商標）  Ｍｅｓｏｄｅｒｍ  Ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，カタログ＃ＳＣ０３０）、およびＳｔｅｍＸＶｉｖｏ（商標）  Ｅｎｄｏｄｅｒｍ  Ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，カタログ＃ＳＣ０１９）は、それぞれ、ＮＥＤＡＰＳ細胞を外胚葉、中胚葉、および内胚葉細胞に分化させるために使用され得、実施例４に記載された培地は、ＮＥＤＡＰＳ細胞の集団を骨芽細胞または内皮細胞（すなわち２つの間葉系細胞型）に分化させるために使用され得、実施例５に記載された培地は、ＮＥＤＡＰＳ細胞の集団を内胚葉細胞に分化させるために使用され得、実施例６に記載された培地は、ＮＥＤＡＰＳ細胞の集団を神経幹細胞（すなわち、外胚葉細胞型）に分化させるために使用され得る。
【００３３】
７．３．使用
本明細書で記載された方法は、ＮＥＤＡＰＳ細胞およびそれから分化した細胞型の集団（例えば、（ａ）単離されていることおよび／または（ｂ）少なくとも５０％均質であることおよび／または（ｃ）少なくとも１０の細胞を含有すること、および７節に記載されたその実施形態のいずれかによって特徴付けられる集団）を生成するために使用され得る。これら集団は、自家適用、すなわち、ＮＥＤＡＰＳ細胞が由来した（ヒトまたは他の動物）対象における移植のための特定の利点を見出す。
【００３４】
ＮＥＤＡＰＳ細胞およびそれらの分化した子孫は、対象の処置のための細胞を生成するためにエキソビボで操作され得る。この細胞は、細胞再生または器官再生から利益を得る任意の状態に使用され得る。特定の適用としては、器官培養、創傷治癒（例えば、糖尿病性下肢創傷、シャルコー関節症、褥瘡、または骨折を処置するためのもの）、神経再生、免疫機能を回復すること、造血、組織操作、遺伝子治療（例えば、その内容が本明細書に参照によって組み込まれている、Wang and Gao, Discov Med. (2014) vol.18 (98):151-161に報告されているように）、および培養物中で増殖され分化誘導された幹細胞が有用である任意の他の医学的状況が挙げられる。
【００３５】
一実施形態では、未分化ＮＥＤＡＰＳ細胞またはＮＥＤＡＰＳ細胞から分化した骨芽細胞は、インビトロで増殖され、次いで、骨形成が望ましい部位（例えば、骨折部位、部分的骨欠陥部位（例えば腫瘍切除後）または移植片（例えば人工関節構成成分）中への骨内植が望ましい部位など）の中に配置され得る。別の実施形態では、未分化ＮＥＤＡＰＳ細胞またはＮＥＤＡＰＳ細胞から分化された内皮細胞は、培養物中で増殖され、次いで、血液供給不全を有する肢などの、血管形成が望ましい解剖的領域中に外科的に配置または注入され得る。別の実施形態では、ＮＥＤＡＰＳ細胞から分化した線維芽細胞は、培養物中で増殖され、次いで、例えば糖尿病性足部潰瘍などの治癒が遅い創傷を処置するために、軟部組織治癒が望ましい解剖的領域中に配置され得る。別の実施形態では、ＮＥＤＡＰＳ細胞から分化した造血細胞は、貧血を有する対象の血流中または骨髄中に注入され得る。次いで、注入された造血細胞は、対象のための血液細胞を生じ得る。
【００３６】
本開示のＮＥＤＡＰＳ細胞は、例えば、米国特許第８，７０３，４８３号明細書（その内容が本明細書に参照によって組み込まれている）に報告された方法でＮＥＤＡＰＳ細胞を使用することによって、医薬品および他の化学物質の毒性を評価するためにも使用され得る。
【００３７】
ＮＥＤＡＰＳ細胞およびそれから分化した細胞は、例えば、遺伝子治療における使用のために組換え型にされ得る。
【００３８】
対象への移植のために、ＮＥＤＡＰＳ細胞またはそれから分化した細胞の集団は、薬学的に許容される培地もしくは賦形剤または生体適合性かつ／もしくは生分解性の足場もしくはマトリックス中で製剤化され得る。
【実施例１】
【００３９】
８．１．ＢＭＰ２を使用したＮＥＤＡＰＳ細胞の調製
材料および方法：１０匹のマウスに麻酔をかけ（ＩＡＣＵＣ承認プロトコールの下で）、右坐骨神経を標準的方法を使用して露出させた。７匹の動物においては、５０ナノグラムのＢＭＰ２を神経に直接配置した。３匹の対照動物においては、神経に薬剤を適用しなかった。
【００４０】
動物を１２、２４または４８時間後に人道的に屠殺し、坐骨神経を再び露出させ、収集した。神経をホルムアルデヒド中で固定し、パラフィンに包埋し、標準的方法によって切片にした。
【００４１】
結果：未処置神経は、おそらくは外科的露出のためと考えられるいくらかの軽度の炎症性の所見を例外として、正常に見えた（図１Ａを参照されたい）。
【００４２】
ＢＭＰ２処置神経は、断片化され、崩されていることが見出された（図１を参照されたい）が、細胞の著しい増殖が神経内で注目された。処置神経は、切片化プロセス中またはその後に自発的に断片化することが注目された。ＢＭＰ２で処置された神経は、異常であり、非常に脆弱であった。
【実施例２】
【００４３】
８．２．ＩＭ注入ＢＭＰ２を使用したＮＥＤＡＰＳ細胞の調製
材料および方法：２０匹のマウスに麻酔をかけ、５０ｎｇまたは１００ｎｇのＢＭＰ２を各マウスの右大腿屈筋中に経皮的に注入した（ＩＭ）。このマウスを２４、４８、または７２時間で屠殺した。大腿屈筋を坐骨神経まで解剖せずに収集したが、収集した組織がこの神経の通常の解剖的部位を含有することに気をつけた。反対側の（未処置）大腿屈筋を４匹の動物から収集し、対照組織として利用した。
【００４４】
ＢＭＰ２をＩＭ注入によって投与したので、組織の収集および処理後に、注入部位が任意の所与の顕微鏡視野にどれだけ近いかを知ることは困難であった。切片を幹細胞マーカーのアレイおよび炎症マーカーのパネルに関して染色した。
【００４５】
結果：ＢＭＰ２を注入された肢からの神経は、２４時間の動物であっても崩されわずかに断片化されているように見えた（図２Ｂおよび２Ｄを参照されたい）。処置動物からの神経は、７２時間までに著しい異常性を示した（図２Ｆを参照されたい）。７２時間標本は、重度に異常な神経を示した。普遍的に、異常な神経は、４つ全てのＥＳＣマーカーＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃ、およびＫｌｆ４を発現する圧倒的多数の細胞を表していた。
【００４６】
神経内の細胞の頑強な増殖が２４および４８時間で一貫して見られ、大部分のこれらの増殖細胞は、４つ全てのＥＳＣマーカーに関して陽性に染色された（図２Ｂ、２Ｄ、２Ｆおよび２Ｇを参照されたい）。
【実施例３】
【００４７】
８．３．ＮＥＤＡＰＳ細胞の調製、単離および培養
インビボでのＮＥＤＡＰＳ細胞調製：動物についての活動は全てＷｉｃｈｉｔａ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙにおいて行い、これは、Ｗｉｃｈｉｔａ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認された。８から１２週齢メスＢＡＬＢ／ｃマウスをＴｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）から購入し、研究における使用前に少なくとも１から６週間、施設に順応させた。外科的処置の日に、マウスに、予防的鎮痛のために外科的処置１時間前に皮下注射によって０．０５ｍｇ／ｋｇのブプレノルフィンを与えた。マウスに、ノーズコーンによって、１〜２％イソフルランを補充した９０ｍｇ／ｋｇケタミンおよび８ｍｇ／ｋｇキシラジンの腹腔内注入によって麻酔をかけた。各動物の右足を剪毛し、外科手術領域をポビドンヨードおよびエタノールで消毒した。切り込みを大腿の外側面に作り、鈍的切開によって坐骨神経を露出させた。露出された神経の全長に沿って４つまたは５つの部位で１ｍｍの幅でピンセットを使用してその本来の直径の約２５％まで手動で神経を加圧するか、または１０μｌの無菌生理食塩水（ＩＮＦＵＳＥ（登録商標）  Ｂｏｎｅ  Ｇｒａｆｔ，Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ  Ｓｐｉｎａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｅｓ，Ｍｅｍｐｈｉｓ，ＴＮ）中の６０ｎｇのＢＭＰ２に晒した。各動物の切り込みを縫合して閉じ、動物をＣＯ２吸入による屠殺まで８、２４、４８、または７２時間ケアした。組織学的分析、細胞培養またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を使用した遺伝子発現に関するスクリーニングのために、屠殺後直ちに神経を収集した。
【００４８】
実験をマウス大腿後部の大腿屈筋塊へのＢＭＰ２の経皮注入を使用しても行った。上記のように同一の麻酔、鎮痛および安楽死を用いた。動物を注入後２４、４８、および７２時間で屠殺した。死後直ちに、大腿屈筋塊を鋭的切開によって収集し、標本をホルマリン中で固定し、パラフィンに包埋し、切片にした。合計３７匹のマウスを６０ｎｇのＢＭＰ２を含有する５μｌの無菌生理食塩水（ＩＮＦＵＳＥ（登録商標））のＩＭ注入によって処置した。
【００４９】
ＮＥＤＡＰＳ細胞単離および培養：ＮＥＤＡＰＳ細胞をマウス坐骨神経から単離し、公開されたプロトコール（Wu et al., Biotechnology letters 2009; 31 :1703-1708）に改変を加えて培養した。簡潔に述べると、坐骨神経セグメントをＰＢＳ中で１ｍｍの小片に刻み、６００×ｇでの５分間の遠心分離によってペレット化した。次いで、この神経組織を、無菌ＤＭＥＭ中の０．２％（０．２７Ｕ／ｍｌ）コラゲナーゼ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ）０．５ｍｌ中で３７℃で９０分間インキュベートし、その後、撹拌しながら５分間、等体積の０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡ溶液を追加した。３００μｌの熱不活化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を混合物に加えて、酵素消化を停止した。１００μｍサイズのメッシュを通したろ過後、単離された細胞を６００×ｇで１０分間遠心分離した。細胞ペレットを再懸濁し、２０％Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ｓｅｒｕｍ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ，Ｇｉｂｃｏ）、１００μＭ  ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（Ｇｉｂｃｏ）、１×ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）−Ｉ（Ｃａｔ．ｎｏ．３５０５０−０７９，Ｇｉｂｃｏ）；５５μＭ  β−メルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）、２０ｎｇ／ｍｌヒト白血病阻害因子（ＬＩＦ，Ｇｉｂｃｏ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）、および１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充したＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を入れた、６ウェル培養皿または４ウェルチャンバースライドに分配した。細胞を３７℃、５％ＣＯ２雰囲気で培養した。
【００５０】
ＮＥＤＡＰＳ細胞の特徴付け：ＮＥＤＡＰＳ細胞を特徴付けるために、一組のＥＳＣマーカー（Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ４、およびｃ−Ｍｙｃ）に対する二重染色を行った。簡潔に述べると、チャンバースライドにおいて増殖させた細胞を室温で３０分間、４％パラホルムアルデヒドで固定し、ＰＢＳで３回洗浄し、３％正常ロバ血清および０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００でブロッキングした。一次抗体は、ヤギ抗Ｋｌｆ４（Ｒ＆Ｄ）、ヤギ抗Ｓｏｘ２（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ヤギおよびウサギ抗Ｏｃｔ４（Ａｂｃｏｍ）、ならびにウサギ抗ｃ−Ｍｙｃ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を含む。使用した二次抗体は、Ａｌｅｘａ  ４８８とコンジュゲートしているロバ抗ヤギＩｇＧ、およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）  ５９４を有するロバ抗ウサギＩｇＧであった（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。細胞を３７℃で６０分間、一次ヤギ抗体およびウサギ抗体の組（Ｋｌｆ−４＋ｃ−Ｍｙｃ、Ｓｏｘ２＋ｃ−Ｍｙｃ、Ｋｌｆ−４＋Ｏｃｔ４、およびＳｏｘ２＋ＯＣＴ４）で二重染色した。ＰＢＳでのリンス後、細胞を３７℃で３０分間、明瞭な蛍光波長を有する二次抗体（１：２００）中でインキュベートし、ＤＡＰＩ  Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ  Ｇ（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ）を有する切片（これも細胞核を対比染色した）上にカバーガラスをマウントした。染色された細胞をＴＣＳ  ＳＰ５  ＩＩ共焦点レーザー走査顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）下で視認し、ＬＡＳ  Ｉｍａｇｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｐｔｉｏｎａｌソフトウェアで画像を取得した。０．２１μｍのピクセルサイズで１０２４×１０２４ピクセルの走査モードフォーマットで光学的な単一切片を取得した。チャネル間のスペクトルクロストークを減少させるために多チャネル画像の自動化連続収集を取得して、二重染色シグナルの個々の画像をオーバーレイして、共局在化画像を作成した。
【００５１】
試験群間のＫｌｆ−４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｓｏｘ２、およびＯｃｔ４の遺伝子発現プロファイルを以前詳述されたＲＴ−ＰＣＲ技法（Yang et al., J Bone Joint Surg Am. (2005) 87(5): 1088-97）を使用して決定した。簡潔に述べると、ＳＴＡＴ−６０（商標）（Ｔｅｌ−Ｔｅｓｔ，Ｆｒｉｅｎｄｓｗｏｏｄ，ＴＸ）溶液中の細胞を５ｍｌのＤｏｕｎｃｅホモジナイザー中でホモジナイズし、全ＲＮＡをクロロホルム分離およびイソプロパノール沈殿によって単離した。０．５ｇの全ＲＮＡから、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を、２５℃で１０分間、４８℃で２５分間、および９５℃で５分間、Ｖｅｒｉｔｉ  ９６−ｗｅｌｌ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）上で、４０μｌ  ＰＣＲ緩衝液（５．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５００μＭの各デオキシヌクレオチド三リン酸、０．５Ｕ／μｌ  ＲＮａｓｅ阻害剤、２．５μＭランダムヘキサマー、および１．２５Ｕ／μｌ逆転写酵素（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）を含有する）中で逆転写した。ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、２μｌ  ｃＤＮＡ、および４００ｎＭ試験遺伝子プライマー対を含有するＲＴ−ＰＣＲ反応混合物を、、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ（登録商標）  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）において４０サイクルの間実行させた。蛍光シグナルを動的に記録した。各標的遺伝子に関するプライマー対をＰｒｉｍｅｒ３プログラム（ｂｉｏｉｎｆｏ．ｕｔ．ｅｅ／ｐｒｉｍｅｒ３−０．４．０／ｐｒｉｍｅｒ３）を使用して設計し、Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ（Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ，Ｔｅｘａｓ）が構築した。プライマー配列を表１に示す。
【表１】
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【００５２】
結果：培養ＮＥＤＡＰＳ細胞は、図３〜９に示されたように、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ４、およびｃ−Ｍｙｃを発現した。細胞は、概して全く平らであり、ガラスまたはプラスチック基板上に広がることが観察され（図１０を参照されたい）、これは、細胞が付着性であったことを示している。細胞は、培地を交換した時に「洗い落ち（rinse off）」せず、これも、細胞が基板に付着していたことを示している。細胞を新しいプレートに継代するには、それらをトリプシンに晒して剥離する必要があった。
【実施例４】
【００５３】
８．４．骨原性および内皮性細胞分化（中胚葉細胞分化）
細胞培養：ＮＥＤＡＰＳ細胞を胚性幹細胞培地中で５日間培養した維持した後、細胞を分化のために実験した。骨芽細胞誘導のために、ＮＥＤＡＰＳ細胞を、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中の１０ｍＭβ−グリセロリン酸ナトリウム、５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸および１０ｎＭデキサメタゾンを含み、加えて１０％ウシ胎仔血清、１００ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび１００Ｕ／ｍｌペニシリンを含む骨原性培地で培養した。アルカリホスファターゼ染色およびＩ型コラーゲン染色を７日後に行って、骨芽細胞の構造特性および機能特性を識別した。内皮細胞分化へと方向づけられたＮＥＤＡＰＳ細胞をフィブロネクチンでコーティングされたフラスコ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＳ）上に蒔き、５％ＦＢＳ、１０ｎｇ／ｍｌヒト上皮増殖因子（ｈＥＧＦ）、５０ｎｇ／ｍｌヒト血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、５０ｎｇ／ｍｌヒトインスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）、１μｇ／ｍｌヒドロコルチゾンならびに１００Ｕ／ｍｌペニシリン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳ）および１００ｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳ）を含有する、ＥＧＭ（商標）−２−ＭＶ  ＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔｓ（商標）を補充した内皮細胞基本培地−２（Ｌｏｎｚａ  Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，Ｉｎｃ．Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）中で培養した。
【００５４】
分化細胞の特徴付け：市販のアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）染色キット（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を、以前報告されているように、分化骨芽細胞におけるアルカリホスファターゼ活性の半定量的実証に使用した（Jiang et al., J Biomed Mater Res A (2013)101 :2817-2825）。簡潔に述べると、アルカリ−色素混合物を調製して、Ｆａｓｔ  Ｖｉｏｌｅｔ  ＢカプセルおよびＮａｐｈｔｈｏｌ  ＡＳ＿ＭＸ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅを蒸留水に溶解した。クエン酸緩衝アセトン中で３０秒間固定した後、細胞を２６℃で３０分間、アルカリ−色素混合物中でインキュベートし、その後、Ｍａｙｅｒのヘマトキシリン対比染色を１分間行った。得られた細胞質内の不溶性の赤色色素の散在性の沈着は、アルカリホスファターゼ活性を示している。併せてＩ型コラーゲンに関する免疫染色も行った。
【００５５】
骨芽マーカーオステオポンチン、Ｉ型コラーゲン、およびオステオカルシンに関する遺伝子発現プロファイル、ならびに内皮マーカーＦｌｔ−１およびＦｌｋ−１に関する遺伝子発現プロファイルを、実施例３に記載したＲＴ−ＰＣＲ技法を使用して決定した。使用したプライマーを表２に示す。
【表２】
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【００５６】
結果：骨原性培地において培養された細胞は、骨原性マーカーオステオポンチン、Ｉ型コラーゲン、およびオステオカルシンを発現し（図１１を参照されたい）、アルカリホスファターゼおよびＩ型コラーゲンに関して陽性に染色された（図１２〜１３を参照されたい）。これらはＮＥＤＡＰＳ細胞が骨芽細胞に分化したことを示している。内皮培地において培養された細胞は、小さい丸みを帯びた細胞体および複数の長く伸びた突起を有する、内皮細胞に典型的な形態を有し（図１４を参照されたい）、内皮マーカーＦｌｔ−１およびＦｌｋ−１を発現した（図１１を参照されたい）。
【実施例５】
【００５７】
８．５．胚体内胚葉（Definitive Endoderm）（ＤＥ）誘導
細胞培養：ＮＥＤＡＰＳ細胞をＧｉｂｃｏ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）製の市販のキットを使用してＤＥ系列に誘導した。簡潔に述べると、ＮＥＤＡＰＳ細胞をＧｉｂｃｏ（登録商標）Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ８（商標）培地を有する１２ウェルプレートにおいて３７℃、５％ＣＯ２で培養した。第１日に、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ８（商標）培地を、２４時間予熱したＤＥ誘導培地Ａと交換した。第２日に、ＤＥ誘導培地Ａを完全に吸引し、予熱されたＤＥ誘導培地Ｂと交換した。プレートを３７℃で２４時間インキュベートした。細胞の形態変化を倒立顕微鏡下でモニタリングした。
【００５８】
結果：ＤＥ誘導培地における培養後、増殖細胞は、誘導前のＮＥＤＡＰＳ細胞とは形態的に著しく異なっていた。細胞は、より丸みを帯びて（すなわち、鱗片状がより少ない）、未分化ＮＥＤＡＰＳ細胞よりも大きな核を示した（図１５を参照されたい）。これらは、ＮＥＤＡＰＳ細胞とはかけ離れた明らかな分化および内胚葉特徴の発達を示している。
【実施例６】
【００５９】
８．６．神経幹細胞の分化（外胚葉細胞分化）
細胞培養：ＮＥＤＡＰＳ細胞を増殖させ、誘導して、神経幹細胞に分化させた。細胞の増殖のために、ＮＥＤＡＰＳ細胞を、ＮＳＣ基本培地（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，カタログ番号０５７００）中の１０％ＮｅｕｒｏＣｕｌｔ（商標）ＮＳＣ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ｖ／ｖ）（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，カタログ番号０５７０１）を含有するＣｏｍｐｌｅｔｅ  ＮｅｕｒｏＣｕｌｔ（商標）  ＮＳＣ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍ中で培養した。２０ｎｇ／ｍｌの最終濃度でｒｈＥＧＦも培養物に含めた。３０％細胞コンフルエンスに到達した時、培地を除去し、１０％ＮｅｕｒｏＣｕｌｔ（商標）ＮＳＣ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，カタログ番号０５７０３）を含有するＣｏｍｐｌｅｔｅ  ＮｅｕｒｏＣｕｌｔ（商標）  ＮＳＣ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍと交換し、培養物を３７℃で２日間インキュベートした。細胞の形態変化を倒立顕微鏡下でモニタリングした。
【００６０】
結果：分化培地における培養後、細胞は、分化前のＮＥＤＡＰＳ細胞とは著しく異なる形態を有していた。細胞は、元のＮＥＤＡＰＳ細胞の全体的に鱗片状の細胞形態とは著しく異なる、非常に伸長した細胞体を有していた（図１６を参照されたい）。これらの伸長した細胞は、外胚葉に特徴的である、神経始原細胞の特色を示した。
【実施例７】
【００６１】
８．７．ＮＥＤＡＰＳ細胞の一段階調製
材料および方法：マウス坐骨神経を外科的に露出させ、無菌技法を使用して回収した。身体から解剖して取り出す前に、神経に沿って１〜２秒間、緩やかな加圧を適用した。神経組織を１ｍｍの小片に刻み、実施例３に記載されたようにコラゲナーゼおよびトリプシンで消化した。細胞を遠心分離によって収集し、実施例３に記載された幹細胞培地を入れた１２ウェル培養プレートまたは８ウェルチャンバースライド中に入れた。２４時間後に７５０ｎｇ／ｍｌの最終濃度でＢＭＰ２を培地に加え、２４時間培養し、その後、この培地を取り出し、実施例３に記載された幹細胞培地：２０％Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ｓｅｒｕｍ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ，Ｇｉｂｃｏ）、１００μＭ  ＭＥＭ可欠アミノ酸溶液（Ｇｉｂｃｏ）、１×ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）−Ｉ（Ｃａｔ．ｎｏ．３５０５０−０７９，Ｇｉｂｃｏ）；５５μＭ  β−メルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）、２０ｎｇ／ｍｌヒト白血病阻害因子（ＬＩＦ，Ｇｉｂｃｏ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）、および１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充したＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と交換した。全ての段階において、細胞を５％ＣＯ２雰囲気中で３７℃で培養した。
【００６２】
細胞特徴付け：細胞をＫｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ４、およびｃ−Ｍｙｃに関して染色した。
【００６３】
結果：この方法を使用して作製された細胞は、４つの胚性幹細胞マーカーＫｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ４、およびｃ−Ｍｙｃを発現する（図１７を参照されたい）。
【００６４】
９．特定の実施形態
本開示は、以下の特定の実施形態によって例証される。
１．末梢神経における幹細胞の調製を誘導するための方法であって、
対象を提供すること；
対象の選択された末梢神経を選択された期間、外因的刺激に晒すこと；
選択された期間後、刺激された末梢神経から幹細胞を収集すること；および
非分化培地においてインビトロで胚性幹細胞を培養すること
を含む方法。
２．幹細胞が全能性細胞、多能性細胞、多分化能細胞、オリゴポーテント細胞（oligopotent cell）、単能性細胞、およびその組合せからなる群から選択される、実施形態１に記載の方法。
３．外因的刺激が物理的傷害、機械的操作、撹乱、電気的刺激、またはサイトカインに晒すことの１つまたは複数である、実施形態１に記載の方法。
４．サイトカインがサイトカインの骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）ファミリーのメンバーである、実施形態３に記載の方法。
５．サイトカインがＢＭＰ２である、実施形態４に記載の方法。
６．ＢＭＰ２をｉｎ  ｓｉｔｕで末梢神経に適用して、幹細胞の増殖を刺激すること；
末梢神経を外科的に切除すること、および
幹細胞の増殖を促進するために非分化培地においてインビトロで幹細胞を培養して、幹細胞の集団を作り出すこと
をさらに含む、実施形態５に記載の方法。
７．電気的刺激をｉｎ  ｓｉｔｕで末梢神経に適用して、幹細胞の増殖を刺激すること；
末梢神経を外科的に切除すること、および
幹細胞の増殖を促進するために非分化培地においてインビトロで幹細胞を培養して、幹細胞の集団を作り出すこと
をさらに含む、実施形態３に記載の方法。
８．インビトロで幹細胞を１つまたは複数の分化因子に晒して、組織前駆細胞を形成するように幹細胞の分化を引き起こすこと
をさらに含む、実施形態１に記載の方法。
９．組織前駆細胞を対象の身体に再移植することをさらに含む、実施形態８に記載の方法。
１０．対象が実施形態１に記載の末梢神経のドナーである、実施形態９に記載の方法。
１１．対象から刺激された末梢神経を収集すること；および
培養を開始する前または後に神経を機械的に崩して、末梢神経からの胚性幹細胞の出現を促進すること
をさらに含む、実施形態１に記載の方法。
１２．機械的に崩すことが、末梢神経の鞘を刻むことまたは分割することのうちの１つまたは複数を含む、実施形態１１に記載の方法。
１３．対象から刺激された末梢神経を収集すること；および
培養を開始する前または後に神経を酵素処理して、末梢神経からの幹細胞の出現を促進すること
をさらに含む、実施形態１に記載の方法。
１４．酵素的に処置することがプロテアーゼでの処置を含む、実施形態１３に記載の方法。
１５．プロテアーゼがコラゲナーゼまたはマトリックスメタロプロテイナーゼのうちの少なくとも１つである、実施形態１４に記載の方法。
１６．対象から末梢神経の少なくとも一部を外科的に切除すること；
外科的に切除された末梢神経を選択された期間、外因的刺激に晒すること；
選択された期間後、刺激された末梢神経から胚性幹細胞を収集すること；および
非分化培地においてインビトロで胚性幹細胞を培養すること
をさらに含む、実施形態１に記載の方法。
【００６５】
様々な特定の実施形態が例証され、記載されたが、様々な変更が本開示の本質および範囲から逸脱することなく、行われ得ることが理解されよう。
【００６６】
１０．参考文献の引用
本出願において引用された全ての刊行物、特許、特許出願および他の文書は、各個々の刊行物、特許、特許出願または他の文書が全ての目的のために参照によって組み込まれていると個々に示されている場合と同じ程度まで、全ての目的のためにその全体が参照によってここに組み込まれている。本明細書に組み込まれた参考文献の１つまたは複数の教示と本開示間に矛盾がある場合、本明細書の教示が意図されている。
本出願が提供する発明の例として以下のものが挙げられる。
[１]  Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃ、およびＫｌｆ４の発現によって特徴付けられる哺乳動物神経由来成体多能性幹細胞（ＮＥＤＡＰＳ細胞）。
[２]  単離されている、[１]に記載のＮＥＤＡＰＳ細胞。
[３]  以下のうちの１つ、２つ、３つ、４つまたは全てによって特徴付けられる、[１]または[２]に記載のＮＥＤＡＰＳ細胞：
（ａ）中胚葉細胞型、任意選択で、間葉系細胞型に分化する能力；
（ｂ）内胚葉細胞型に分化する能力；
（ｃ）外胚葉細胞型、任意選択で、神経幹細胞に分化する能力；
（ｄ）運動性；および
（ｅ）培養におけるガラスまたはプラスチック基板への付着性。
[４]  前記間葉系細胞型が（ａ）骨芽細胞または（ｂ）内皮細胞である、[３]に記載のＮＥＤＡＰＳ細胞。
[５]  [１]から[４]のいずれか１項に記載のＮＥＤＡＰＳ細胞の集団。
[６]  単離されており、任意選択で、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％均質である、[５]に記載の集団。
[７]  [６]に記載の集団を調製する方法であって、
（ａ）エキソビボでＮＥＤＡＰＳ細胞増殖条件に晒された末梢神経を培養すること；または
（ｂ）インビボで対象においてＮＥＤＡＰＳ細胞増殖条件に晒された末梢神経からの細胞を培養すること、ならびに
（ｉ）任意選択で、培養する前に前記末梢神経を収集すること；および
（ｉｉ）任意選択で、収集する前に前記末梢神経を前記ＮＥＤＡＰＳ細胞増殖条件に晒すこと
を含む方法。
[８]  前記ＮＥＤＡＰＳ細胞増殖条件が、
（ａ）前記末梢神経をＢＭＰ２に晒すこと；
（ｂ）前記末梢神経をＢＭＰ２以外の神経炎症剤に晒すこと；
（ｃ）外傷を前記末梢神経に与えること；
（ｄ）（ａ）〜（ｃ）の２つの組合せ；または
（ｅ）（ａ）〜（ｃ）の３つの組合せ
を含む、[７]に記載の方法。
[９]  前記ＮＥＤＡＰＳ細胞増殖条件が前記末梢神経をＢＭＰ２に晒すことを含み、
（ａ）前記末梢神経がインビボで対象においてＢＭＰ２に晒され、任意選択で、
（ｉ）ＢＭＰ２が、任意選択で１０ｎｇ〜１ｍｇにわたる量で、前記末梢神経に直接適用される；
（ｉｉ）ＢＭＰ２が、任意選択で１０ｎｇ〜１ｍｇにわたる量で、筋肉内注射を通して前記対象に投与される；もしくは
（ｉｉｉ）前記対象がＢＭＰ２の局所的産生をもたらす条件に晒され、任意選択で、前記条件が骨折、鈍的傷害、熱傷害、または電気ショックを含む；または
（ｂ）前記末梢神経が、任意選択で５ｎｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌにわたる濃度で、ＢＭＰ２を含む培地において前記神経を培養することによってエキソビボでＢＭＰ２に晒される、
[８]に記載の方法。
[１０]  前記ＮＥＤＡＰＳ細胞増殖条件が外傷を前記末梢神経に与えることを含み、任意選択で、前記外傷が機械的外傷、電気刺激、超音波衝撃波、または熱損傷である、[８]に記載の方法。
[１１]  前記ＮＥＤＡＰＳ細胞増殖条件が前記末梢神経をＢＭＰ２以外の神経炎症剤に晒すことを含み、任意選択で、前記神経炎症剤が腫瘍壊死因子α、インターロイキン−１β、神経成長因子、ヒスタミン、インターロイキン６、またはその組合せである、[８]に記載の方法。
[１２]  前記末梢神経が、前記末梢神経または前記末梢神経からの細胞を培養する前に、任意選択でプロテアーゼ（任意選択でコラゲナーゼまたはマトリックスメタロプロテアーゼ）による処置によって、崩されている、[７]〜[１１]のいずれか１項に記載の方法。
[１３]  前記末梢神経が腓腹神経、腓腹神経の枝、手指もしくは足指の固有指神経、閉鎖神経の薄筋枝、内側前腕皮神経のセグメント、外側前腕皮神経、近位第３趾間束神経、または後骨内神経であり、任意選択で前記神経が切断された肢からのものである、[７]〜[１２]のいずれか１項に記載の方法。
[１４]  分化細胞の集団を調製するための方法であって、[５]から[６]のいずれか１項に記載の集団または[７]〜[１３]のいずれか１項に記載の方法によって調製された集団を分化条件に晒すことを含む方法。
[１５]（ａ）前記分化細胞が中胚葉細胞であり、前記分化条件が中胚葉分化培地において前記集団を培養することを含む；
（ｂ）前記分化細胞が内胚葉細胞であり、前記分化条件が内胚葉分化培地において前記集団を培養することを含む；または
（ｃ）前記分化細胞が外胚葉細胞であり、前記分化条件が外胚葉分化培地において前記集団を培養することを含む、
[１４]に記載の方法。
[１６]（ａ）前記分化細胞が骨芽細胞であり、前記分化条件が骨原性分化培地において前記集団を培養することを含む；
（ｂ）前記分化細胞が内皮細胞であり、前記分化条件が内皮分化培地において前記集団を培養することを含む；または
（ｃ）前記分化細胞が神経幹細胞であり、前記分化条件が神経幹細胞分化培地において前記集団を培養することを含む、
[１４に記載の方法。
[１７]  [１４]〜[１６]のいずれか１項に記載の方法によって調製された分化細胞の集団。
[１８]  組織再生を必要としている対象を処置する方法であって、前記対象に、前記組織再生に適した細胞の集団を移植することを含み、前記細胞の集団が、
（ａ）[７]〜[１６]のいずれか１項に記載の方法によって調製され；または
（ｂ）[５]〜[６]および[１７]のいずれか１項に記載の細胞の集団であり、
任意選択で、前記細胞の集団が前記対象にとって自家性である、方法。
[１９]  遺伝子治療を必要としている対象を処置する方法であって、前記対象に、前記対象が必要としている遺伝子の導入によって組換え型にされた細胞の集団を移植することを含み、前記細胞の集団が、
（ａ）[７]〜[１６]のいずれか１項に記載の方法によって調製され；または
（ｂ）[５]〜[６]および[１７]のいずれか１項に記載の細胞の集団であり、
任意選択で、前記細胞の集団が前記対象にとって自家性である、方法。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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