(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
【化１】
0006721572.tif 000027
（式中、円は、ポリペプチドを表し、前記ポリペプチドは、抗体または抗体Ｆｃであり、各Ｓは、前記抗体または抗体Ｆｃのシステイン残基の硫黄原子であり、
ここで、Ｔ１に結合する前記２個の硫黄原子が、コンジュゲートしていない前記抗体または抗体Ｆｃにおいてジスルフィド結合を形成し、および、
Ｔ２に結合する前記２個の硫黄原子が、コンジュゲートしていない前記抗体または抗体Ｆｃにおいてジスルフィド結合を形成し、
Ｔ１は、式−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｎ−Ｏ−［Ｌ１］）−ＣＨ２−（式中［Ｌ１］は、Ｔ１のＬ１への結合点を示す）の基を表し、
Ｔ２は、式−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｎ−Ｏ−［Ｌ２］）−ＣＨ２−（式中［Ｌ２］は、Ｔ２のＬ２への結合点を示す）の基を表し、
Ｌ１およびＬ２はそれぞれ、Ｔ１またはＴ２をそれぞれＡに連結する連結基を表し、
Ｌ３はＡをＲに連結する連結基であり、
Ａは、Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３を連結する基を表し、および
Ｒは、ペイロードまたはペイロードを結合するための反応性官能基を表す）
を含むポリペプチド−ペイロードコンジュゲート。
【請求項２】
Ｌ１およびＬ２が同一である、請求項１に記載のポリペプチド−ペイロードコンジュゲート。
【請求項３】
Ｒが、治療剤、検出可能な標識、抗原、または結合基を表す、請求項２に記載のポリペプチド−ペイロードコンジュゲート。
【請求項４】
Ｒが細胞毒を表す、請求項３に記載のポリペプチド−ペイロードコンジュゲート。
【請求項５】
Ａが、Ｎ、ＣＨ、フェニル、Ｃ３〜６シクロアルキル、または環員としてＮ、Ｏ、およびＳから選択される最大２個のヘテロ原子を有する５〜６員のヘテロ環基もしくはヘテロアリール基である、請求項４に記載のポリペプチド−ペイロードコンジュゲート。
【請求項６】
式
【化２】
0006721572.tif 000028
（式中、円は抗体を表す）
のものである、請求項５に記載のポリペプチド−ペイロードコンジュゲート。
【請求項７】
式（ＩＩＩａ）または（ＩＩＩｂ）：
【化５】
0006721572.tif 000029
（式中、円は、挿入したカルボニル基により活性化されたポリペプチドを表し、前記ポリペプチドは、抗体または抗体のＦｃ部分であり、
前記ポリペプチドは、抗体または抗体Ｆｃの少なくとも２つのジスルフィド結合を還元して、還元されたポリペプチドを作製するステップと、前記還元されたポリペプチドをジクロロアセトンと接触させて、前記活性化されたポリペプチドを提供するステップとを含む方法により、活性化され、
各Ｓは、前記活性化されたポリペプチドに含まれるシステイン残基の硫黄原子を表し、前記硫黄原子の対が、３炭素原子のテーザーを介して互いに連結し、前記活性化されたポリペプチドは、２または４つの硫黄原子の連結した対を含む。）
の活性化されたポリペプチドを、下記構造：
【化７】
0006721572.tif 000030
（式中、Ｒ３は、Ｈまたは（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル；および、
Ｒ−Ｌ３−が、式Ｒ−Ｚ−Ｃ（＝Ｏ）−
［式中、Ｚは、−（ＣＨ２）１〜６−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）１〜６−、および−（ＯＣＨ２ＣＨ２）１〜６−から選択される少なくとも１つの基を含む］である）
を有する化合物と、接触させるステップを含む、ポリペプチド−ペイロードコンジュゲートを調製する方法。
【請求項８】
請求項１に記載のポリペプチド−ペイロードコンジュゲートおよび少なくとも１つの薬学的に許容される担体、希釈剤、または緩衝液を含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
[背景技術]
広範な種類の化学的部分（「ペイロード」）が、酵素、抗体、および他のポリペプチドまたはタンパク質に共有結合し、コンジュゲートを形成してきた。ペイロードは、それらが結合しているタンパク質を位置付けるため（例えば、標識）、タンパク質の物理化学的性質もしくは安定性を改変するため（例えば、ＰＥＧ化）、タンパク質を別の分子もしくはタンパク質に結合することを可能にするため（コンジュゲートを別の化合物または別のコンジュゲートに連結するための官能基またはカップリング基）、またはペイロードもしくはタンパク質の機能もしくは活性を改変するために（例えば、ワクチンコンジュゲート）使用され得る。タンパク質は、また、抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）など、結合したペイロードを特定の組織または細胞種に送達する担体としても作用し得る。タンパク質に有用に連結され得る部類のペイロードとしては、検出可能な部分（標識）、タンパク質を表面または別の化合物に結合するアンカー部分、タンパク質にコンジュゲートされた場合に免疫応答を誘発する抗原、化学相補性のカップリングパートナー（coupling partner）と容易に反応する（したがって、タンパク質を別の構成体（entity）に連結する）カップリング基、ならびに細胞毒（cytotoxins）および他の生物活性剤などの治療的な部分が挙げられる。
【０００２】
これらの多様な構造を、制御して、再現可能にタンパク質に結合させることは、特にそれらが治療剤として使用される場合に、コンジュゲートが正確に機能するためにしばしば重大な意味を持つ。ＡＤＣにおいて、例えば、抗体に結合したペイロード化合物の数を注意深く制御することが重要であるが、担体が大きな複合タンパク質であるためそれは容易ではない。例えば、特定の標的、リンカー、および細胞毒により、有効性、安定性、および安全性などの要因の均衡を保つため、ＡＤＣの最適なＤＡＲ（ｄｒｕｇ  ｔｏ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｒａｔｉｏ：薬物抗体比）は１から６以上まで異なってもよい。ＡＤＣが、異なる薬物／抗体比（ＤＡＲ）を有する混合物として作製される場合、分離が難しく、生成物の一貫性が、治療および調節双方の理由から重要である。したがって、薬物−抗体比の良好な制御、ならびに有効なコンジュゲートおよびペイロード結合点の一貫した配置を有するＡＤＣを生成する方法が必要である。
【０００３】
これらの問題のいくつかに対処するために、ペイロードをタンパク質に結合するいくつもの方法が開発されてきた。例えば、Sletten, E. M. and Bertozzi, C. R.  Angew. Chem. Int. Ed. 2009, 48, 6974-6998；Basle', E.; Joubert, N.; Pucheault, M. Chemistry & Biology 2010, 17, 213-227；およびHermanson, G. T. Bioconjugate Techniques, 2nd ed.; Academic Press: San Diego, CA, 2008参照。最も一般的なコンジュゲート方法は、多くの天然タンパク質において天然に存在する特定のアミノ酸の化学反応性に依拠し、リシンおよびシステインは、ペイロードをタンパク質に連結するための反応部位を与えるため、しばしば使用される。タンパク質は、しばしば結合されるペイロードの最適な数よりも多くのリシンを有するが、一貫した均質な生成物をもたらすために、利用可能なリシンの全てを占拠するのに十分なペイロード部分を加えることは、最適な有効性に対して過剰のペイロード分子を加える可能性があり、部分的なローディング（loading）は典型的には、様々な理由で問題となり得る不均質な生成物をもたらし、最初に商業化されたＡＤＣであるＭｙｌｏｔａｒｇ（商標）の場合、例えば、ＡＤＣ製品の不均質さは、製品を登録から取り下げる決定をもたらす問題の一因になったように思われる。Fuenmayor, et al., Cancers, vol.3, 3370-93 (2011)。
【０００４】
天然タンパク質におけるシステインの出現頻度は、リシンの出現頻度より低く、システインは、十分な数が利用できる場合コンジュゲートの部位として使用するのに好適となり得る。存在するシステインが少な過ぎる場合、標準的なタンパク質修飾方法により１つまたは複数を挿入し得る。しかし、システインの挿入またはジスルフィドの除去による天然タンパク質配列の修飾を避けることがしばしば好ましい。ジスルフィドを還元することにより、ジスルフィドを２つの遊離システインに変換することは難しくないが、そうすることは、タンパク質の二次または三次構造を破壊する可能性がある。
【０００５】
タンパク質上のジスルフィドを還元することにより形成されるシステイン残基の間にテザーを挿入するためのいくつかの方法が報告されている。この手法は、典型的な抗体構造が、タンパク質工学を使わずに利用され得る４つの還元可能な鎖間ジスルフィドを含有するため、ＡＤＣ製造に特に魅力的である。そのようなコンジュゲートのために使用される１つの方法は、スルホン置換メタクリレート誘導体を含む。米国特許出願公開第２００６／０２１０５２６号明細書。この方法は、第二の硫黄原子のアルキル化が起こる前に除去ステップを必要とする反応性中間体を形成する。その多段プロセスの条件は、システイン間のリンカー（テザー）の不完全な形成をもたらす可能性があり、反応条件はタンパク質の変性を起こし得る。別の手法は、マレイミド誘導体、例えば３，４−ジブロモマレイミドを使用する。国際公開第２０１１／０１８６１３号パンフレット。しかし、このプロセスで形成されるコンジュゲートは、マレイミド環へのチオールのマイケル付加が可逆的であるため、安定性の問題を受ける可能性があり、その結果、硫黄原子間のテザーまたはペイロードそれ自体が失われ得る。したがって、有効なコンジュゲート、安定性、および一貫したペイロード／タンパク質比も提供しながら、鎖間ジスルフィドの安定化効果を諦めることなくジスルフィド基をコンジュゲート部位に変える新規の方法が必要である。本発明は、このようなＡＤＣを作製するための有用な方法を提供する。
【発明の概要】
【０００６】
一態様では、本発明は、抗体上の２つのジスルフィドを使用して、ペイロードをタンパク質に連結し、タンパク質コンジュゲートを形成する方法を提供する。該方法は、ジスルフィドを還元して遊離チオール基を与えるステップ、および２つのチオール基を、それらがジスルフィドを形成した場合に占拠するほぼ同じ位置にそれらを保持する橋かけ基と相互に結び付けるステップを含む。システイン基を、それらのほぼ同じ位置に保持することは、ジスルフィドの還元時に起こり得るタンパク質の構造への任意の有害効果を最小限にする。２つのチオール基を相互に連結するために導入されるテザーは、対象のペイロードを結合するのに使用され得る反応性官能基を含有する。いくつかの実施形態では、テザーはヒドロキシルアミン基とオキシム連結部（linkage）を形成するのに十分反応性であるカルボニル基を含有し、ペイロードはそのような連結部を形成することにより活性化タンパク質にコンジュゲートされる。例えば、還元タンパク質はジクロロアセトンまたはジブロモアセトンなどの１，３−ジハロアセトンと反応し、それにより２個の硫黄原子を相互に連結する３炭素テザーを挿入することができる。これはジスルフィドの効果、すなわちジスルフィドが存在した場合に有したものと非常に類似した構造のタンパク質を保持することを適切に模倣している可能性があるが、ジスルフィドよりも優れた安定性ならびにペイロードに結合する場所も与える。本発明の方法および組成物において使用されるテザーは、化学的な反応性官能基を与え、２つのシステインの硫黄原子間にこの種のテザーを含有するタンパク質は、本明細書において活性化タンパク質と呼ばれる。各ケトンがペイロードを結合するために使用され得るが、本発明において２つのそのようなケトンまたは他のテザー形成基（tethering groups）は、ペイロードに新しい結合点を与える橋かけ基と共に連結される。２つのＳ−Ｓテザーを使用して、１つのペイロードを担持する橋かけ基を結合した結果として、所与のポリペプチドにおけるペイロード化合物の数は、コンジュゲート方法において使用されるジスルフィドの数の半分である。本明細書における図面は、本発明のコンジュゲートの略図を提供する。ジスルフィドを使用して、コンジュゲートを形成する他の方法は、国際公開第２０１４／０８３５０５号パンフレットおよびＰＣＴ／ＩＢ２０１４／０６６３００に記載される。国際公開第２０１４／０８３５０５号パンフレットおよびＰＣＴ／ＩＢ２０１４／０６６３００の全内容および優先権書類は、全ての目的に関して参照により本明細書に明確に組み込まれる。
【０００７】
これらの方法は、２つ以上の接触可能なジスルフィド連結部を有する任意のタンパク質に適用でき、５００Ｄａを超える、典型的には２，０００Ｄａを超える分子量を有し、ジスルフィドが本来の形態または活性な形態のタンパク質に存在する、天然タンパク質に通常有用である。該方法は、１つを超えるジスルフィド、２〜１０個など、または典型的には最大６個のジスルフィド基（その少なくとも２つは、従来のジスルフィド還元剤により還元されるのに十分接触可能である）を含有するタンパク質と共に使用され得る。これらの方法は、利用されるジスルフィド基のそれぞれの対に少なくとも１つのペイロードを含有するコンジュゲートをもたらし、コンジュゲートはタンパク質の本来の構造または活性な構造を実質的に保持する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１はどのようにジスルフィドが活性化され、ポリペプチド−ペイロードコンジュゲートを作製するために使用され得るかを例示するスキームを示す図である。
【図２】図２はコンジュゲートを形成するための本発明の方法において使用され得る鎖間ジスルフィドの存在および位置を例示する、一般的な抗体の図解を提供する図である。
【図３Ａ】図３Ａは活性化ポリペプチド、および本発明のポリペプチド−ペイロードコンジュゲートを作製するために使用されるジスルフィドを有する抗体のサブユニットを表す図である。
【図３Ｂ】図３Ｂは活性化ポリペプチド、および本発明のポリペプチド−ペイロードコンジュゲートを作製するために使用されるジスルフィドを有する抗体のサブユニットを表す図である。
【図３Ｃ】図３Ｃは活性化ポリペプチド、および本発明のポリペプチド−ペイロードコンジュゲートを作製するために使用されるジスルフィドを有する抗体のサブユニットを表す図である。
【図４】Ｆｃ、１２、および１４（実施例１）のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す図である。
【図５】実施例２の生成物のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す図である。
【図６】実施例４および５の生成物のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本明細書で使用される「タンパク質」およびポリペプチドは、アミド（ペプチド）結合により連結された１０個以上のアミノ酸残基を含有するペプチドを指す。タンパク質またはポリペプチドは単一の連続した鎖であってよく、自然に会合して安定な複合体を形成する２つ以上の鎖を含んでもよく、環状ポリペプチドであるか、環状ポリペプチドを含んでよい。典型的には、本明細書に記載のタンパク質は、天然に存在するアミノ酸を主として含むか、または天然に存在するアミノ酸のみを含むが、本明細書に記載の方法は、１つまたは複数の非天然アミノ酸を含有するポリペプチドでも同等に有用である。通常（必ずしもそうではないが）、アミノ酸はほとんどが、または完全にＬ配置を有し、一般の「必須」アミノ酸から選択される。該方法は、２つ以上のペプチド鎖を含有するポリペプチド複合体との使用にも好適であり、本発明の方法のために使用されるジスルフィド結合は鎖間または鎖内ジスルフィドであってよい。
【００１０】
略語
ＤＣＭ  ジクロロメタン
ＤＩＣ  ジイソプロピルカルボジイミド
ＤＩＰＥＡ  ジイソプロピルエチルアミン
ＥＤＴ  エタンジチオール
ＨＢＴＵ  Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−Ｏ−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）ウロニウムヘキサフルオロリン酸
ＭｅＣＮ  アセトニトリル
ＮＭＰ  Ｎ−メチルピロリジノン
ＰＢＳ  リン酸緩衝化生理食塩水
ＴＣＥＰ  トリス（カルボキシエチル）ホスフィン
ＴＦＡ  トリフルオロ酢酸
ＴＩＰＳ  トリイソプロピルシラン
【００１１】
本発明の一実施形態の例を図３Ａ〜３Ｃに示す。図は一般的な抗体を模式的に示し、４つの鎖間ジスルフィド結合を示す。一実施形態では、鎖間ジスルフィドは全て還元され、ジスルフィド由来の８つの遊離チオールを有する還元タンパク質を形成している。次いで還元ポリペプチドは、ジハロアセトンまたは類似のビス求電子剤（例えば、１，３−ジクロロアセトンまたは１，３−ジブロモアセトン）と反応して、活性化タンパク質を形成することができ、ここでチオールの各対は官能化されたテザーを介して相互に連結され、この例におけるテザーは、シッフ塩基の形成に対して反応性である遊離ケトン基を含有する。次いで、ビスアルコキシアミン橋かけ基を活性化ポリペプチドのケトンと反応させ、ここで単一のペイロード基は橋かけ基に結合する。
【００１２】
本発明の方法は、ジスルフィドの硫黄原子間に他のテザー形成基と共に使用することもできる。例えば、環状基を用いてスルフヒドリル基を相互に結び付ける方法は、当技術分野において公知であり、環窒素にペイロードが結合したジブロモマレイミドを用いる。これらは、ここに描いたように、リンカー部分を相互に結び付けて、１つのペイロード化合物を担持する橋かけを形成することにより、本発明のコンジュゲートの生成に適応できる。この二重の結合は、ペイロード（細胞毒）を早まって放出し得る、マレイミド環上へのＳの可逆的なマイケル付加によって起こる可能性のある問題も減らすはずである。４個の硫黄原子で結合したコンジュゲートでは、ペイロードの早まった放出のリスクは減少するはずである。
【００１３】
【化１】
0006721572.tif 000002
【００１４】
同様に、置換したメタクリレートからマイケル付加／脱離によりペイロードを連結するために、一対の硫黄原子を用いる方法も当技術分野において公知であり、本発明のコンジュゲートを提供するように適応できる。１つのペイロードを、メタクリレートのカルボキシレートを介して連結する代わりに、２つのメタクリレート基を、ここに示すように、タンパク質とのコンジュゲート前後のいずれかで相互に橋かけすることができる。
【００１５】
【化２】
0006721572.tif 000003
【００１６】
本発明の方法は、タンパク質を変性することなく還元し得る少なくとも２つのジスルフィド連結部を含有する、または１，３−ジハロアセトン反応剤との反応により対で連結され得る４つ以上の遊離システイン残基を含有する、ほとんどのポリペプチドからコンジュゲートを形成するための使用に好適である。典型的には、ポリペプチドは本明細書に記載の条件下でチオールがジクロロアセトンまたはジブロモアセトンと反応し、２つのチオールの少なくとも５０％の架橋をもたらし、架橋の程度はしばしば少なくとも約７０％、８０％、または９０％であるものである。
【００１７】
相互に連結される一対のシステインは、単一のポリペプチド鎖上に存在することができ、またはポリペプチド複合体を形成する別々のポリペプチド鎖上に存在することができる。特定の実施形態では、該方法は２〜６個のジスルフィド連結部または４〜８個の遊離システイン残基を有するタンパク質またはポリペプチドを利用し、ジスルフィドの少なくとも２つの還元を含む。ジスルフィド含有ポリペプチドは、単一のポリペプチド配列内に一対のジスルフィド連結部を含有する、ジスルフィド（または２つ以上のジスルフィド）が１つのポリペプチド配列を別のアミノ酸またはポリペプチドに連結するポリペプチド複合体を含む、少なくとも１０個のアミノ酸残基、好ましくは少なくとも５０個のアミノ酸を有する任意のポリペプチドであってよく、ただし、硫黄原子間にテザーを挿入するためにジスルフィドを還元するときに、複合体が急速に解離しないものとする。本発明の方法において使用する典型的なタンパク質としては、約５０〜約５０００個のアミノ酸、典型的には少なくとも１００個のアミノ酸および最大約２０００個を含有する環状ペプチドおよび線状ペプチド、例えば、酵素または受容体などの機能性タンパク質；少なくとも２つのジスルフィド連結部（２つの別個のポリペプチド鎖をしばしば連結している）を有するタンパク質複合体；構造タンパク質；ワクチンの足場として使用されるＣＲＭ１９７またはアジュバント活性を有する他のタンパク質などのタンパク質；および特に、少なくとも２つの還元可能なジスルフィド結合、例えばＦｃを有する抗体または抗体断片が挙げられる。これらの方法に特に有用なタンパク質としては、抗体、特に操作された抗体を含むモノクローナル抗体、改変抗体、および２つの鎖間ジスルフィドを有する抗体断片；ＣＲＭ１９７などのワクチン担体タンパク質；および少なくとも２つのジスルフィド連結部または少なくとも４つのシステイン残基を有し、５００と５００，０００の間、典型的には１，０００と２００，０００の間の分子量を有する単鎖タンパク質が挙げられる。抗体または他のタンパク質を操作して、例えば、２つ以上のシステイン残基を導入する方法、および抗体を修飾する方法は、当技術分野において周知である。
【００１８】
該方法は、当技術分野において公知の方法により容易に還元される２〜４個の接触可能な鎖間ジスルフィド結合を有する、ＩｇＧおよびＦｃを含む、少なくとも２つの還元可能なジスルフィドを含有する抗体または抗体サブユニットで特に有用である。
【００１９】
本発明の方法および組成物において使用するジスルフィド含有タンパク質のジスルフィド連結部は、還元されて４つ以上の遊離チオール基を形成し、そのような還元のための方法は、当技術分野において周知である。いくつかの実施形態では、還元は、タンパク質の周囲の溶媒に容易に接触可能なジスルフィド連結部を選択的に還元する還元剤を使用して実施される。１つの好適な還元剤は、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）およびその塩である−Analytical Biochemistry 273, 73-80 (1999)参照。ジチオトレイトール、２−メルカプトエタノール、システアミン、およびジチオブチルアミンなどの他の公知のジスルフィド還元剤（JM Perkel, Chem. Eng'g News, Feb. 29, 2012；Lukesh, et al., J. Am. Chem. Soc., 134, 4057-59(2012)）ならびにトリブチルホスフィンなどのトリアルキルホスフィン（国際公開第２００８／１５７３８０号パンフレット）も使用できる。
【００２０】
連結基Ｌ１、Ｌ２およびＬ３は、Ｔ１およびＴ２をＡに連結する、およびＡをペイロードＲに連結する任意の好適な有機連結部であってよい。Ｌ１およびＬ２の好適な例としては、同一または異なっていてもよく、［Ｔ］−（ＣＨ２）１〜６−［Ａ］、［Ｔ］−（ＣＨ２）１〜６Ｃ（＝Ｏ）−［Ａ］、［Ｔ］−（ＣＨ２）１〜６Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−［Ａ］、［Ｔ］−（ＣＨ２）Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−［Ａ］、［Ｔ］−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−［Ａ］、［Ｔ］−フェニル−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−［Ａ］、およびこれらの組み合わせが挙げられ、ここで、ｎは典型的には１〜２０であり、［Ｔ］および［Ａ］はそれぞれリンカーのどの末端が基Ｔ１またはＴ２に結合され、どの末端が基Ａに連結するかを示す。Ｌ３の好適な連結部のいくつかの例としては、［Ａ］−Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ２）１〜６−［Ｒ］、［Ａ］−ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）−［Ｒ］、［Ａ］−ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−［Ｒ］、［Ａ］−ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−［Ｒ］、［Ａ］−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−［Ｒ］、［Ａ］−フェニル−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−［Ｒ］などが挙げられ、ここで、ｎは典型的には１〜２０であり、［Ａ］および［Ｒ］はそれぞれリンカーのどの末端が基Ａに結合され、どの末端がペイロードＲに連結するかを示す。いくつかの実施形態では、リンカーＬ３は、コンジュゲート上のペイロードローディングを増加させるために２つのペイロードを結合することができる。他の実施形態では、リンカーＬ３は、コンジュゲート上のペイロードローディングを増加させるために３つのペイロードを結合することができる。１つを超えるペイロードが所与のリンカーに結合される場合、ペイロードは同一または異なっていてよい。好適なリンカーはまた、これらの基の構成成分の組み合わせも含み：リンカーの性質は本発明の実行にとって重要ではなく、少なくとも１つのペイロードＲへの結合のための方法の便利さおよび入手可能性、またはコンジュゲートの所望の物理化学的性質、またはその意図された使用に基づくことができる。好適なリンカーの選択は、通常の技量のレベル内であり、ペイロードＲの構造、およびペイロードＲをリンカーＬ３に結合するために修飾する利用可能な方法、ならびに計画する用途にとって開裂可能なリンカーの使用が望ましいかどうかに依存する。典型的には、リンカーはアミドまたはエステル基を介して一端または両端で結合され、しばしば、リンカーＬはプロテアーゼまたはエステラーゼ活性により生体内での溶解を可能にするペプチド結合を含有し（例えば、カテプシンＢにより開裂されるジペプチドのｖａｌ−ｃｉｔ、または同様にカテプシンＢにより開裂可能なＧｌｙ−ｐｈｅ−ｌｅｕ−ｇｌｙ）またはエステルを含有し；任意選択でリンカーは１つまたは複数のエチレンオキシド単位（−ＯＣＨ２ＣＨ２−）；多くの実施形態では、リンカーは少なくとも１つおよび最大６個のアミノ酸部分を含有する。リンカーＬ１、Ｌ２、およびＬ３の好適な実施形態は、以下の群；
（ａ）結合、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ−Ｓ−、−ＮＨ−、−Ｎ（（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル）−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−、
（ｂ）（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキレン、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニレン、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニレン、−Ｚ−（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキレン−、−Ｚ−（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニレン、−Ｚ−（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニレン、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキレン−Ｚ−（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキレン、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニレン−Ｚ−（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニレン、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニレン−Ｚ−（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニレン、［式中、Ｚは−Ｃ（Ｏ）−、−ＮＨ−、−Ｎ（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル）−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−、（Ｃ３〜Ｃ７）シクロアルキレン、フェニレン、ヘテロアリーレン、またはヘテロシクレンであり、前記（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキレン、前記（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニレン、および前記（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニレン部分はそれぞれ独立に、酸素原子が少なくとも１個および好ましくは２個の炭素原子により分けられるように、前記部分内に内部分散された１個または複数の酸素原子を任意選択で含有する］、
（ｃ）（Ｃ３〜Ｃ７）シクロアルキレン、（Ｃ３〜Ｃ７）シクロアルキレン−Ｙ−（Ｃ３〜Ｃ７）シクロアルキレン、−Ｙ−（Ｃ３〜Ｃ７）シクロアルキレン、フェニレン、−Ｙ−フェニレン、フェニレン−Ｙ−フェニレン、ヘテロアリーレン、Ｙ−ヘテロアリーレン、ヘテロアリーレン−Ｙ−ヘテロアリーレン、ヘテロシクレン、−Ｙ−ヘテロシクレン、またはヘテロシクレン−Ｙ−ヘテロシクレン、［式中、Ｙは、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキレン、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルケニレン、（Ｃ２〜Ｃ２０）アルキニレン、−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ−、−ＮＨ−、−Ｎ（（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル）−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、または−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−であり、前記（Ｃ３〜Ｃ７）シクロアルキレン、前記フェニレン、前記ヘテロアリーレン、および前記ヘテロシクレン部分は、それぞれ独立に、ハロ、（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル、またはハロ置換（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルから選択される１〜３個の置換基で任意選択で置換される］、
（ｄ）−［ＯＣＨ２ＣＨ２］ｖ−（式中、ｖは１〜２０、好ましくは１〜１０である）、および
（ｅ）１〜１００個のアミノ酸、好ましくは１〜３０個または１〜６個のアミノ酸を含むペプチド
から選択される１つまたは複数の構成成分も含み得る。
【００２１】
さらに、Ｌ３は、Ｖａｌ−Ｃｉｔ（バリン−シトルリン、カテプシンＢにより選択的に開裂されるジペプチド）、またはｖａｌ−ｃｉｔ−ＰＡＢＣ（バリン−シトルリンｐ−アミノベンジルカルバメート、Bioconjugate Chem. 19(10), 1960-63 (2008)参照）、ジスルフィド、またはこの式：
【００２２】
【化３】
0006721572.tif 000004
（式中、［Ａ］は式（Ｉ）における基Ａへの結合点を示し、［Ｒ］はペイロードＲへの結合点を表す）に存在するリンカーなどの、グルクロニダーゼにより開裂されるリンカーなどの開裂可能なリンカーであってよい、またはそれを含んでよい。（ACS Med. Chem. Letters, vol. 1, 277-280 (2010)）。このような開裂可能なリンカーは好ましくは式（Ｉ）におけるＬ３として使用されるが、Ｌ１および／またはＬ２としても使用され得る。
【００２３】
ペイロード（Ｒ）は、タンパク質に結合するのに有用である任意の部分であってよい。タンパク質に有用に結合され得る化合物の多くの例は、当技術分野において公知である。例には、金属イオンを結合し、コンジュゲートの検出性をもたらすキレート剤を含む、使用者がタンパク質を位置付けまたは同定することを可能にする標識部分；タンパク質の精製もしくは単離、またはその表面への固定を容易にする、ビオチンまたはアビジン、ポリヌクレオチド、抗体またはその断片、５〜１５個のアミノ酸残基を含有するポリ−Ａｒｇまたはポリ−ｌｙｓなどの結合部分；脂肪酸基またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの性質改変基；特定の種類の細胞またはバクテリアに特有である多糖または細胞表面タンパク質などの抗原性基；修飾タンパク質またはペプチドが別の分子に結合することによる、二重特異性抗体など、より複雑なコンジュゲートの作製を可能にするカップリング基（図２参照）；ならびに医薬化合物を含む生物活性化合物、および所望の効果をもたらし得る所望の組織または細胞までタンパク質上でヒッチハイクできる放射性核種ならびに細胞毒が挙げられる。これらのヒッチハイクする化合物は、それらがタンパク質またはその部分にコンジュゲートされたままで作用できるか、連結基が生体内で容易に開裂できるものである場合、それらの化合物は最初にタンパク質から離れ得る。これらの方法での使用に好適な医薬ペイロードとしては、微小管重合阻害剤、トポイソメラーゼＩ阻害剤、挿入剤、細胞内シグナル伝達経路の阻害剤、キナーゼ阻害剤、およびＤＮＡ小溝結合剤が挙げられ、マイタンシノイド、アウリスタチン、カリチアマイシン、プシンベリン（psymberins）、ジュオカルマイシン、アントラサイクリン、カンプトテシン、ドキソルビシン、タキソール、ピロロベンゾジアゼピンなどの化合物の部類が挙げられる。
【００２４】
治療的または診断的用途を有するこれらの医薬ペイロードの具体的な例としては、パクリタキセル、ドセタキセル、エトポシド、テノポシド（tenoposide）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ミトラマイシン、アクチノマイシン、グルコルチコイド（glucorticoid）、ピューロマイシン、エピルビシン、シクロフォスファミド、メトトレキサート、シタラビン、ｆ−フルオロウラシル、プラチン、ストレプトゾトシン、ミノマイシンＣ、アントラサイクリン、ダクチノマイシン、またはアクチノマイシン、ブレオマイシン、ミトラマイシン、アントラマイシン、ジュオカルマイシン、イフォスファミド、ミトキサントロン、ダウノマイシン、カルミノマイシン、アニモテリン、メルファラン、エスペラミシン、レキシトロプシン、アウリスタチン（例えば、アウリスタチンＥ、アウリスタチンＦ、ＡＥＢ、ＡＥＶＢ、ＡＥＦＰ、ＭＭＡＥ、ＭＭＡＦ）、エロイトロビン、ネトロプシン、ポドフィロトキシン、マイタンシノイド（maytansiods）（マイタンシンおよびＤＭ１を含む）、およびコンブレタスタチン（combretestatins）が挙げられる。
【００２５】
ペイロードとして使用され得る好適なカップリング基（コンジュゲートを別の部分にカップリングするのに使用され得る基）としては、マレイミド、チオール、α−ハロケトン（例えば、−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ２−Ｘ、ここでＸはクロロ、ブロモ、またはヨードである）、カルボン酸、アミン、ヒドロキシル、アルケン、アルキン（銅不含「クリック」化学で使用され得る環状オクチンを含む）、アジドなどが挙げられる。これらのカップリング基を使用して、本発明のコンジュゲートを相補的カップリング基を有する他の化合物に連結するための方法は、当技術分野において周知であり、チオールのマレイミドへのマイケル付加、チオールのα−ハロケトンでのアルキル化、アミンとカルボン酸の間のアミド結合形成、１，２，３−トリアゾール環を形成することによってアジドをアルキンに連結するための「クリック」化学（例えば、Meldal, et al., Chem Rev., vol.108, 2952-3015 (2008)参照）、および「銅不含クリック」化学が挙げられる。例えば、Meeuwissen, et al. Polymer Chemistry, vol.3, 1783-95 (2012)参照。「相補的」カップリング基は、容易に化合して共有結合を形成する２つのカップリング基、例えば前述した対（アミドを形成するためのカルボキシレート＋アミン；１，２，３−トリアゾールを形成するためのアジド＋アルキン；チオールがマイケル付加を介して二重結合に付加する、マレイミド＋チオール；チオールのアルキル化によってα−チオケトンを形成するα−ハロケトン＋チオールなど）である。特定の例において、ペイロード（Ｒ）として役立つためのカップリング基は、ハロゲン、−Ｃ≡ＣＨ、−Ｃ＝ＣＨ２、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＳＯ２−ＣＨ＝ＣＨ２、−Ｏ−ＮＨ２、−Ｎ３、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｃ（Ｏ）−Ｈ、−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ３、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−Ｉ、マレイミジル、３，５−ジオキソ−１，２，４−トリアゾリジン−４−イル、１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン−１−イル、ピリジン−２−イル−ジスルファニル、テトラヒドロ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−２（３Ｈ）−オン−４−イル、１−カルボニルオキシ−２，５−ジオキソピロリジン、１−カルボニルオキシ−２，５−ジオキソピロリジン−３−スルホン酸ナトリウム、−ＳＳＲ１、−Ｃ（Ｏ）−ＯＲ１、−Ｎ（Ｒ１）Ｈ、−ＮＨ−Ｎ（Ｒ１）Ｈからなる群から選択され、ここでＲ１は、Ｈまたは（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、および−Ｃ（Ｏ）−Ｒ２であり、Ｒ２は、Ｈ、（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル、ハロ置換（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル、−ＣＨ＝ＣＨ２、Ｎ（Ｒ１）Ｈ、または−ＮＨ−Ｎ（Ｒ１）Ｈである。
【００２６】
以下に挙げる実施形態は本発明の特定の態様を例示する。
【００２７】
１．
【００２８】
【化４】
0006721572.tif 000005
（式中、円は、示したもの以外の修飾を含み得るポリペプチドまたはポリペプチド複合体を表し、
各Ｓは、ポリペプチドまたはポリペプチド複合体のシステイン残基の硫黄原子であり、
Ｔ１およびＴ２は、それぞれ１〜５個の炭素原子を介して２個の硫黄原子を連結するテザーを表し、Ｔ１はＬ１にも結合し、Ｔ２はＬ２にも結合しており、
Ｌ１およびＬ２はそれぞれ、Ｔ１またはＴ２をそれぞれＡに連結する連結基を表し、
Ｌ３は、ＡをＲに連結する連結基であり、
Ａは、Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３を連結する基を表し、
Ｒは、ペイロードまたはペイロードを結合するための反応性官能基を表す）
を含むポリペプチド−ペイロードコンジュゲート。
【００２９】
２．ポリペプチドが抗体または抗体Ｆｃである、実施形態１のポリペプチド−ペイロードコンジュゲート。
【００３０】
３．Ｔ１およびＴ２のそれぞれが、結合した硫黄原子同士を連結する３炭素原子の鎖を含む、実施形態１または２のポリペプチド−ペイロードコンジュゲート。
【００３１】
４．Ｔ１が、式−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｎ−Ｏ−［Ｌ１］）−ＣＨ２−（式中［Ｌ１］は、Ｔ１のＬ１への結合点を示す）の基を表す、実施形態１〜３のいずれかのポリペプチド−ペイロードコンジュゲート。
【００３２】
５．Ｔ２が、式−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｎ−Ｏ−［Ｌ２］）−ＣＨ２−（式中［Ｌ２］は、Ｔ２のＬ２への結合点を示す）の基を表す、実施形態１〜４のいずれかのポリペプチド−ペイロードコンジュゲート。
【００３３】
６．Ｌ１およびＬ２が同一である、実施形態１〜５のいずれかのポリペプチド−ペイロードコンジュゲート。
【００３４】
７．ポリペプチドが抗体または抗体Ｆｃであり、コンジュゲートしていない抗体または抗体ＦｃにおいてＴ１に結合する２個の硫黄原子がジスルフィド結合を形成する、実施形態１〜６のいずれかのポリペプチド−ペイロードコンジュゲート。
【００３５】
８．ポリペプチドが抗体または抗体Ｆｃであり、コンジュゲートしていないポリペプチドにおいてＴ２に結合する２個の硫黄原子がジスルフィド結合を形成する、実施形態１〜７のいずれかのポリペプチド−ペイロードコンジュゲート。
【００３６】
９．Ｒが、治療剤、検出可能な標識、抗原、または結合基を表す、実施形態１〜８のいずれかのポリペプチド−ペイロードコンジュゲート。
【００３７】
１０．Ｒが、細胞毒を表す、実施形態９のポリペプチド−ペイロードコンジュゲート。
【００３８】
１１．Ａが、Ｎ、ＣＨ、フェニル、Ｃ３〜６シクロアルキル、または環員としてＮ、Ｏ、およびＳから選択される最大２個のヘテロ原子を有する５〜６員のヘテロ環基もしくはヘテロアリール基である、実施形態１〜１０のいずれかのポリペプチド−ペイロードコンジュゲート。
【００３９】
１２．式
【００４０】
【化５】
0006721572.tif 000006
（式中、円は抗体を表す）
のものである、実施形態１〜１１のいずれかのポリペプチド−ペイロードコンジュゲート。
【００４１】
１３．式（ＩＩａ）
【００４２】
【化６】
0006721572.tif 000007
（式中、Ｒは、治療剤、検出可能な標識、またはＮ３、ＣＯＯＨ、ＮＨ２、ＳＨ、−Ｓ−Ａｒ、マレイミド、およびＨＣ≡Ｃ−から選択される官能基であり、Ａｒはフェニルまたはピリジルを表し、
Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３は、連結基であり、
Ａは、Ｎ、ＣＨ、フェニル、Ｃ３〜６シクロアルキル、または環員としてＮ、Ｏ、およびＳから選択される最大２個のヘテロ原子を有する５〜６員のヘテロ環基もしくはヘテロアリール基である）
の化合物またはその塩。
【００４３】
１４．Ｌ１およびＬ２が同一である、実施形態１３の化合物。
【００４４】
１５．Ｒが細胞毒である、実施形態１３または１４の化合物。
【００４５】
１６．Ｌ３が、−（ＣＨ２）１〜６−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）１〜６−、および−（ＯＣＨ２ＣＨ２）１〜６−から選択される少なくとも１つの基を含む、実施形態１３または１４の化合物。
【００４６】
１７．式
【００４７】
【化７】
0006721572.tif 000008
（式中、Ｒ３は、Ｈまたは（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルである）
のものである、実施形態１３〜１６のいずれか１つの化合物。
【００４８】
１８．Ｒ−Ｌ３−が、式Ｒ−Ｚ−Ｃ（＝Ｏ）−（式中、Ｚは、−（ＣＨ２）１〜６−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）１〜６−、および−（ＯＣＨ２ＣＨ２）１〜６−から選択される少なくとも１つの基を含む）のものである、実施形態１３〜１７のいずれか１つの化合物。
【００４９】
１９．式（ＩＩａ）または（ＩＩＩｂ）：
【００５０】
【化８】
0006721572.tif 000009
（式中、円は、挿入したカルボニル基により活性化されたポリペプチドまたはポリペプチド複合体を表し、各Ｓは、ポリペプチドまたはポリペプチド複合体に含まれるシステイン残基の硫黄原子を表す）
の活性化されたポリペプチドまたはポリペプチド複合体を実施形態１３〜１８のいずれか１つの化合物と接触させるステップを含む、ポリペプチド−ペイロードコンジュゲートを調製する方法。
【００５１】
２０．ポリペプチドまたはポリペプチド複合体が、抗体または抗体のＦｃ部分である、実施形態１９の方法。
【００５２】
２１．抗体または抗体Ｆｃの少なくとも２つのジスルフィド結合を還元して、還元されたポリペプチドまたはポリペプチド複合体を作製するステップと、
還元されたポリペプチドまたはポリペプチド複合体をジクロロアセトンと接触させて、活性化されたポリペプチドまたはポリペプチド複合体を提供するステップと
を含む方法により、活性化されたポリペプチドまたはポリペプチド複合体を調製するステップをさらに含む、実施形態１９または２０の方法。
【００５３】
２２．実施形態１〜１１のいずれかのポリペプチド−ペイロードコンジュゲートおよび少なくとも１つの薬学的に許容される担体、希釈剤、または緩衝液を含む医薬組成物。
【００５４】
本発明の方法は、修飾されるタンパク質のジスルフィドを還元するステップと、２つの遊離チオール基を含有する還元タンパク質を形成するステップを含む。還元タンパク質を、還元タンパク質上の両方の遊離チオールと反応することができる官能化されたテザー形成化合物（tethering compound）と接触させて、コンジュゲートに好適であるテザー上に少なくとも１つの官能基も保持しながら、遊離チオールを相互につなぐ；または、代わりに、結合される基が、テザー形成基がタンパク質に付加される前にテザー形成基にすでに連結されていてもよい。いくつかの実施形態では、テザー上の官能基はカルボニル基、例えば、遊離チオールが１，３−ジハロケトンと反応することができる場合に得られるケトンである（図１参照）。遊離チオールは、強力に求核性であるため、それらは、ハロゲン化アルキルまたはトシル酸アルキルなどの求電子剤と、脱離基の置換および硫黄−炭素共有結合の形成を含む非可逆反応を介して容易に反応する。官能化されたカルボニル含有テザー形成化合物のいくつかの好適な例としては、１，３−ジクロロアセトンおよび１，３−ジブロモアセトンが挙げられる。これらの試薬は、スルフヒドリルを相互につなぐことによって小さな環状ペプチドにおけるジスルフィド部分の安定化をもたらすのに使用されてきた。例えば、国際公開第２００８／１５７３８０号パンフレット（ジクロロアセトンと還元環状ペンタペプチドとの反応、それに続くカルボニルの還元）を参照。１，３−ジヒドロキシアセトンのスルホン酸エステル（例えば、メシル酸エステル、トリフル酸エステル、フェニルスルホン酸エステル、トシル酸エステルなど）も使用され得る。これらの試薬は、還元タンパク質の遊離チオールに対して十分に反応性であるため、適度に迅速な反応をもたらして、相互につないだ２つのシステイン残基を備えた活性化タンパク質を形成し、ここで遊離チオールのそれぞれは、官能化されたテザー形成基に共有結合される。
【００５５】
還元タンパク質および官能化されたテザー形成化合物は、テザー形成化合物と還元タンパク質の２つの遊離チオールの間の反応を促進するのに好適な条件下で、特に以前はジスルフィド結合で連結された両方の遊離チオールを、今度は直接的ジスルフィド結合に代わってそれらを連結する短いテザーを用いてもう一度相互に結び付けるようにテザー形成化合物の単一分子と反応させるのに有利である濃度および温度の条件下で接触させる。この反応は、図１に例示するように、２個の硫黄原子間に官能化されたテザー［−ＣＨ２Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−］を有する活性化タンパク質を形成する。図１のテザーは、クリーンで効率的なシッフ塩基形成化学反応を介してペイロードを効率的に結合するのに使用できるカルボニルを含む。
【００５６】
本発明のため、少なくとも２つのジスルフィドが還元されコンジュゲートのために使用される。図１に示すように、テザー形成基がコンジュゲート部位として役立つ反応性ケトンを含有する場合、タンパク質は、典型的には、通常同一である２つのテザー形成基で活性化される。２つの活性化テザー形成基は、次いで２つのアミノオキシ基を有する橋かけ試薬との反応により相互に連結される−図３参照。橋かけ基は、次いでペイロードに結合点を与える。
【００５７】
本考察全体を通して、タンパク質は、たとえそれが円または球として示されていても、１０個よりも少ないアミノ酸の小さなポリペプチド、あるいは大きな酵素または２つ以上のサブユニットもしくはポリペプチド鎖の複合体であってよいと理解される。ジスルフィドの２個の硫黄原子は、多重複合体の１つのサブユニット上にあってよいか、またはタンパク質複合体の異なる鎖上にあってよい。本明細書に記載の形質転換に関与するジスルフィドに加えて、タンパク質はまた、還元され得るか、またはタンパク質内でのそれらの位置により還元される可能性のない、他のジスルフィド連結部も含有し得る。本発明の方法は、公知の方法を利用して、タンパク質の全体的形状および機能を維持するために、または相互に連結された２つのサブユニットを複数サブユニット複合体中に保持するために必須である可能性がある「埋め込まれた」ジスルフィドをしばしば還元することなく、折りたたまれたタンパク質の表面付近の溶媒に接触可能なジスルフィド連結部を選択的に還元することができる。
【００５８】
一度、活性化タンパク質が形成されると、ペイロードは、テザーが反応性ケトンを含有する場合、オキシム形成など好適な方法によって結合され得る。図３Ａ〜３Ｃおよび実施例のいくつかにおいて例示するように、ペイロードを含有するビスアミノオキシ化合物は１つのステップで付加され得る；代わりに、官能基を有するアルコキシアミンは、テザーに付加され、官能基は、続くステップにおいてペイロードを結合するために使用され得る。
【００５９】
典型的には、活性化タンパク質は、活性化タンパク質の精製も単離もすることなく、ペイロードを含有するアミノオキシ化合物、またはペイロードを結合するために使用できる基と接触する。実施例は、まずタンパク質上に反応基を導入すること、次いで反応基を用いて細胞毒を結合することを例示する。
【実施例】
【００６０】
下記の実施例では、以下のＨＰＬＣ方法が使用される。
方法Ａ；
溶離液Ａ：水＋０．１％ギ酸、溶離液Ｂ：アセトニトリル＋０．０８％ギ酸
グラジエント：２分間でＢを３から８０％へ−流速１．０ｍｌ／分、カラム：Ｐｒｏｓｗｉｆｔ  Ｍｏｎｏｌｉｔｈ  ４．６×５０ｍｍ、４０℃
方法Ｂ；
溶離液Ａ：水＋０．１％ギ酸、溶離液Ｂ：アセトニトリル＋０．０４％ギ酸
グラジエント：２分間でＢを３から８０％へ−流速１．０ｍｌ／分、カラム：Ｐｒｏｓｗｉｆｔ  Ｍｏｎｏｌｉｔｈ  ４．６×５０ｍｍ、４０℃
方法Ｃ；
溶離液Ａ：水＋３．７５ｍＭ酢酸アンモニウム＋２％アセトニトリル、溶離液Ｂ：アセトニトリル
グラジエント：１．７分間でＢを２から９８％へ−流速１．０ｍｌ／分、カラム：Ａｃｑｕｉｔｙ  ＣＳＨ  ２．１×５０ｍｍ、５０℃
方法Ｄ（ＨＲＭＳ）；
溶離液Ａ：水＋０．０５％ギ酸＋３．７５ｍＭ酢酸アンモニウム、溶離液Ｂ：アセトニトリル＋０．０４％ギ酸
グラジエント：４．４分間でＢを２から９８％へ−流速１．０ｍｌ／分、カラム：Ａｃｑｕｉｔｙ  ＣＳＨ  ２．１×５０ｍｍ、５０℃
【００６１】
アミノオキシ化合物の調製
【００６２】
【化９】
0006721572.tif 000010
ＮＨＳ−ＰＥＧ４−アジド（５０ｍｇ、０．１２９ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（７２μＬ、０．５１５ｍｍｏｌ）を、ジクロロメタン（１．３ｍＬ）中１，７−ビス−Ｂｏｃ−１，４，７−トリアザヘプタン（４７ｍｇ、０．１５５ｍｍｏｌ）に添加した。得られた混合物を室温で１時間撹拌した。塩化ナトリウム飽和水溶液を添加し、混合物をジクロロメタンで２回抽出し、合わせた抽出物を無水硫酸マグネシウムで乾燥した。濾過および濃縮後、残留物をシリカゲルクロマトグラフィー（０〜４０％、ｖ／ｖ、酢酸エチル／ヘプタン）により精製し、標題化合物１（３０ｍｇ、４０％）を得た。ＬＣ−ＭＳ（Ｍ＋１）５７７．４、ｔ＝１．２０分。ＨＲＭＳ：Ｃ２５Ｈ４９Ｎ６Ｏ９（ＭＨ＋）の計算値５７７．３５６１、実測値５７７．３５４８。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 1.44 (br. s., 18 H) 2.63 (t, J=6.28 Hz, 2 H) 3.27 - 3.34 (m, 4 H) 3.40 (t, J=5.04 Hz, 2 H) 3.46 - 3.51 (m, 4 H) 3.54 - 3.72 (m, 14 H) 3.80 (t, J=6.33 Hz, 2 H) 5.11 (br. s., 1 H) 5.18 (br. s., 1 H).
【００６３】
Ｎ，Ｎ−ビス（２−アミノエチル）−１−アジド−３，６，９，１２−テトラオキサペンタデカン−１５−アミド二塩酸塩（２）
【００６４】
【化１０】
0006721572.tif 000011
ジオキサン（１３０μＬ、０．５２ｍｍｏｌ）中ＨＣｌ  ４Ｎを１（３０ｍｇ、０．０５２ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（１ｍＬ）中溶液に滴下添加した。得られた混合物を室温で３０分間撹拌し、次いで減圧下で濃縮し、標題化合物Ｎ，Ｎ−ビス（２−アミノエチル）−１−アジド−３，６，９，１２−テトラオキサペンタデカン−１５−アミド二塩酸塩（２、１４ｍｇ、６０％）を得た。ＬＣ−ＭＳ（Ｍ＋１）３７７．３、ｔ＝０．４４分
【００６５】
１−アジド−Ｎ，Ｎ−ビス（１−（（１，３−ジオキソイソインドリン−２−イル）オキシ）−１５−オキソ−３，６，９，１２−テトラオキサ−１６−アザオクタデカン−１８−イル）−３，６，９，１２−テトラオキサペンタデカン−１５−アミド（３）
【００６６】
【化１１】
0006721572.tif 000012
２，５−ジオキソピロリジン−１−イル  １−（（１，３−ジオキソイソインドリン−２−イル）オキシ）−３，６，９，１２−テトラオキサペンタデカン−１５−カルボン酸メチルエステル（３５ｍｇ、０．０６９ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（１７μＬ、０．１２５ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ビス（２−アミノエチル）−１−アジド−３，６，９，１２−テトラオキサペンタデカン−１５−アミド二塩酸塩（２、１４ｍｇ、０．０３１ｍｍｏｌ）のジクロロメタン中溶液に添加した。得られた混合物を室温で１６時間撹拌し、次いで減圧下で濃縮した。標題化合物１−アジド−Ｎ，Ｎ−ビス（１−（（１，３−ジオキソイソインドリン−２−イル）オキシ）−１５−オキソ−３，６，９，１２−テトラオキサ−１６−アザオクタデカン−１８−イル）−３，６，９，１２−テトラオキサペンタデカン−１５−アミド（３、０．０３１ｍｍｏｌ）が得られた。ＬＣ−ＭＳ（Ｍ＋１）１１６３．６、ｔ＝１．１２分。
【００６７】
Ｎ，Ｎ−ビス（１−（アミノオキシ）−１５−オキソ−３，６，９，１２−テトラオキサ−１６−アザオクタデカン−１８−イル）−１−アジド−３，６，９，１２−テトラオキサペンタデカン−１５−アミド（４）
【００６８】
【化１２】
0006721572.tif 000013
ヒドラジン一水和物（６１μＬ、１．２４ｍｍｏｌ）を、１−アジド−Ｎ，Ｎ−ビス（１−（（１，３−ジオキソイソインドリン−２−イル）オキシ）−１５−オキソ−３，６，９，１２−テトラオキサ−１６−アザオクタデカン−１８−イル）−３，６，９，１２−テトラオキサペンタデカン−１５−アミド（３、０．０３１ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（０．６ｍＬ）中溶液に添加した。得られた混合物を室温で１時間撹拌し、次いで減圧下で濃縮した。得られた残留物を分取ＨＰＬＣ（１５〜４０％、ｖ／ｖ、アセトニトリル／（５ｍＭ  ＮＨ４ＯＨ水溶液））により精製し、合わせた溶離物を濃縮して、標題化合物Ｎ，Ｎ−ビス（１−（アミノオキシ）−１５−オキソ−３，６，９，１２−テトラオキサ−１６−アザオクタデカン−１８−イル）−１−アジド−３，６，９，１２−テトラオキサペンタデカン−１５−アミド（４、１３ｍｇ、４６％）を得た。ＬＣ−ＭＳ（Ｍ＋１）９０３．６、ｔ＝０．６５分。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 2.41 - 2.53 (m, 4 H) 2.66 (t, J=6.42 Hz, 2 H) 3.37 - 3.45 (m, 6 H) 3.45 - 3.54 (m, 4 H) 3.56 - 3.71 (m, 44 H) 3.71 - 3.76 (m, 4 H) 3.78 (t, J=6.37 Hz, 2 H) 3.86 (br. s., 4 H).
【００６９】
ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（６−（３−（ピリジン−２−イルジスルファニル）プロパンアミド）ヘキサノイル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル））ジカルバメート（５）
【００７０】
【化１３】
0006721572.tif 000014
スクシンイミジル６−（３−［２−ピリジルジチオ］−プロピオンアミド）ヘキサン酸（５０ｍｇ、０．１１８ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（６５μＬ、０．４７ｍｍｏｌ）を、１，７−ビス−Ｂｏｃ−１，４，７−トリアザヘプタン（４３ｍｇ、０．１４１ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（１．２ｍＬ）中溶液に添加した。得られた混合物を室温で１時間撹拌した。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（８２μＬ、０．４７ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を室温で１６時間撹拌した。塩化ナトリウム飽和水溶液を添加し、次いで混合物をジクロロメタンで２回抽出した。合わせた抽出物を、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。濾過および濃縮後、残留物をシリカゲルクロマトグラフィー（０〜５％、ｖ／ｖ、メタノール／ジクロロメタン）により精製して、ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（６−（３−（ピリジン−２−イルジスルファニル）プロパンアミド）ヘキサノイル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル））ジカルバメート（５、４２ｍｇ、５８％）を無色の固体として得た。ＬＣ−ＭＳ（Ｍ＋１）６１４．３、ｔ＝１．２１分。ＨＲＭＳ：Ｃ２８Ｈ４８Ｎ５Ｏ６Ｓ２（ＭＨ＋）の計算値６１４．３０４６、実測値６１４．３０６５。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 1.31 - 1.74 (m, 24 H) 2.37 (t, J=7.03 Hz, 2 H) 2.64 (t, J=6.72 Hz, 2 H) 3.11 (t, J=6.72 Hz, 2 H) 3.20 - 3.38 (m, 6 H) 3.44 - 3.50 (m, 4 H) 5.20 - 5.34 (m, 2 H) 6.78 (br. s., 1 H) 7.19 (br. s., 1 H) 7.74 (br. s., 2 H) 8.50 (d, J=3.42 Hz, 1 H).
【００７１】
中間体Ｎ，Ｎ−ビス（２−アミノエチル）−６−（３−（ピリジン−２−イルジスルファニル）プロパンアミド）ヘキサンアミド二塩酸塩（６）の調製
【００７２】
【化１４】
0006721572.tif 000015
ジオキサン（１７１μＬ、０．６８ｍｍｏｌ）中ＨＣｌ  ４Ｎをジ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（６−（３−（ピリジン−２−イルジスルファニル）プロパンアミド）ヘキサノイル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル））ジカルバメート（５、４２ｍｇ、０．０６８ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（０．７ｍＬ）中溶液に添加した。得られた混合物を室温で３０分間撹拌し、次いで減圧下で濃縮し、標題化合物Ｎ，Ｎ−ビス（２−アミノエチル）−６−（３−（ピリジン−２−イルジスルファニル）プロパンアミド）ヘキサンアミド二塩酸塩（６、０．０６８ｍｍｏｌ）を得た。ＬＣ−ＭＳ（Ｍ＋１）４１４．２、ｔ＝０．５２分。
【００７３】
１−（（１，３−ジオキソイソインドリン−２−イル）オキシ）−Ｎ−（１−（（１，３−ジオキソイソインドリン−２−イル）オキシ）−１５−オキソ−１９−（６−（３−（ピリジン−２−イルジスルファニル）プロパンアミド）ヘキサノイル）−３，６，９，１２−テトラオキサ−１６，１９−ジアザヘニコサン−２１−イル）−３，６，９，１２−テトラオキサペンタデカン−１５−アミド（７）
【００７４】
【化１５】
0006721572.tif 000016
２，５−ジオキソピロリジン−１−イル  １−（（１，３−ジオキソイソインドリン−２−イル）オキシ）−３，６，９，１２−テトラオキサペンタデカン−１５−カルボン酸メチルエステル（７６ｍｇ、０．１５０ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（３８μＬ、０．２７２ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ビス（２−アミノエチル）−６−（３−（ピリジン−２−イルジスルファニル）プロパンアミド）ヘキサンアミド二塩酸塩（６、０．０６８ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（１．４ｍＬ）中溶液に添加した。得られた混合物を室温で１６時間撹拌した。塩化ナトリウム飽和水溶液を添加し、混合物をジクロロメタンで２回抽出した。合わせた抽出物を無水硫酸マグネシウムで乾燥した。濾過および濃縮後、残留物をシリカゲルクロマトグラフィー（０〜１０％、ｖ／ｖ、メタノール／ジクロロメタン）により精製して、１−（（１，３−ジオキソイソインドリン−２−イル）オキシ）−Ｎ−（１−（（１，３−ジオキソイソインドリン−２−イル）オキシ）−１５−オキソ−１９−（６−（３−（ピリジン−２−イルジスルファニル）プロパンアミド）ヘキサノイル）−３，６，９，１２−テトラオキサ−１６，１９−ジアザヘニコサン−２１−イル）−３，６，９，１２−テトラオキサペンタデカン−１５−アミド（７、４７ｍｇ、５８％）を透明な油状物として得た。ＬＣ−ＭＳ（Ｍ＋１）１２００．４、ｔ＝１．１３分。ＨＲＭＳ：Ｃ５６Ｎ７８Ｈ７Ｏ１８Ｓ２（ＭＨ＋）の計算値１２００．４８４５、実測値１２００．４９４３。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 1.31 - 1.74 (m, 6 H) 2.40 (t, J=7.21 Hz, 2 H) 2.43 - 2.57 (m, 4 H) 2.66 (t, J=6.72 Hz, 2 H) 3.12 (t, J=6.97 Hz, 2 H) 3.29 (q, J=6.44 Hz, 2 H) 3.35 - 3.55 (m, 9 H) 3.55 - 3.67 (m, 19 H) 3.67 - 3.80 (m, 8 H) 3.88 (td, J=4.43, 2.26 Hz, 4 H) 4.33 - 4.44 (m, 4 H) 6.96 (br. s., 1 H) 6.99 - 7.10 (m, 1 H) 7.24 (br. s., 2 H) 7.73 - 7.83 (m, 6 H) 7.83 - 7.91 (m, 4 H) 8.51 (d, J=4.77 Hz, 1 H).
【００７５】
ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（６−（３−（フェニルジスルファニル）プロパンアミド）ヘキサノイル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル））ジカルバメート（８）
【００７６】
【化１６】
0006721572.tif 000017
チオフェノール（１０１μＬ、０．９８ｍｍｏｌ）をジ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（６−（３−（ピリジン−２−イルジスルファニル）プロパンアミド）ヘキサノイル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル））ジカルバメート（５、６０ｍｇ、０．０９８ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（０．９８ｍＬ）中溶液に添加した。得られた混合物を室温で３０分間撹拌し、混合物を減圧下で濃縮した。残留物をシリカゲルクロマトグラフィー（（１０〜１００％、ｖ／ｖ、酢酸エチル／ヘプタン）により精製して、ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（６−（３−（フェニルジスルファニル）プロパンアミド）ヘキサノイル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル））ジカルバメート（８、３５ｍｇ、５８％）を透明な油状物として得た。ＬＣ−ＭＳ（Ｍ＋１）６１３．２、ｔ＝１．３８分。ＨＲＭＳ：Ｃ２９Ｈ４９Ｎ４Ｏ６Ｓ２（ＭＨ＋）の計算値６１３．３０９４、実測値６１３．３０９７。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 1.29 - 1.55 (m, 22 H) 1.55 - 1.78 (m, 2 H) 2.35 (t, J=7.20 Hz, 2 H) 2.56 (t, J=7.01 Hz, 2 H) 3.03 (t, J=7.01 Hz, 2 H) 3.16 - 3.36 (m, 6 H) 3.37 - 3.53 (m, 4 H) 7.14 - 7.30 (m, 1 H) 7.30 - 7.41 (m, 2 H) 7.47 - 7.59 (m, 2 H).
【００７７】
中間体Ｎ，Ｎ−ビス（２−アミノエチル）−６−（３−（フェニルジスルファニル）プロパンアミド）ヘキサンアミド二塩酸塩（９）の調製
【００７８】
【化１７】
0006721572.tif 000018
ジオキサン（１４３μＬ、０．５７ｍｍｏｌ）中ＨＣｌ  ４Ｎをジ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（６−（３−（フェニルジスルファニル）プロパンアミド）ヘキサノイル）アザンジイル）ビス（エタン−２，１−ジイル））ジカルバメート（８、３５ｍｇ、０．０５７ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（０．６ｍＬ）中溶液に添加した。得られた混合物を室温で３０分間撹拌し、混合物を減圧下で濃縮し、Ｎ，Ｎ−ビス（２−アミノエチル）−６−（３−（フェニルジスルファニル）プロパンアミド）ヘキサンアミド二塩酸塩（９、０．０５７ｍｍｏｌ）を得た。ＬＣ−ＭＳ（Ｍ＋１）４１３．２、ｔ＝０．６７分。
【００７９】
１−（（１，３−ジオキソイソインドリン−２−イル）オキシ）−Ｎ−（１−（（１，３−ジオキソイソインドリン−２−イル）オキシ）−１５−オキソ−１９−（６−（３−（フェニルジスルファニル）プロパンアミド）ヘキサノイル）−３，６，９，１２−テトラオキサ−１６，１９−ジアザヘニコサン−２１−イル）−３，６，９，１２−テトラオキサペンタデカン−１５−アミド（１０）
【００８０】
【化１８】
0006721572.tif 000019
２，５−ジオキソピロリジン−１−イル  １−（（１，３−ジオキソイソインドリン−２−イル）オキシ）−３，６，９，１２−テトラオキサペンタデカン−１５−カルボン酸メチルエステル（８７ｍｇ、０．１７１ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（３９μＬ、０．２８５ｍｍｏｌ）を、Ｎ，Ｎ−ビス（２−アミノエチル）−６−（３−（フェニルジスルファニル）プロパンアミド）ヘキサンアミド二塩酸塩（９、０．０５７ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（０．６ｍＬ）中溶液に添加した。得られた混合物を室温で１時間撹拌した。塩化ナトリウム飽和水溶液を添加し、混合物をジクロロメタンで２回抽出した。合わせた抽出物を無水硫酸マグネシウムで乾燥した。濾過および濃縮後、残留物をシリカゲルクロマトグラフィー（０〜１０％、ｖ／ｖ、メタノール／ジクロロメタン）により精製し、１−（（１，３−ジオキソイソインドリン−２−イル）オキシ）−Ｎ−（１−（（１，３−ジオキソイソインドリン−２−イル）オキシ）−１５−オキソ−１９−（６−（３−（フェニルジスルファニル）プロパンアミド）ヘキサノイル）−３，６，９，１２−テトラオキサ−１６，１９−ジアザヘニコサン−２１−イル）−３，６，９，１２−テトラオキサペンタデカン−１５−アミド（１０、４５ｍｇ、６６％）を透明な油状物として得た。ＬＣ−ＭＳ（Ｍ＋１）１１９９．３、ｔ＝１．２５分。ＨＲＭＳ：Ｃ５７Ｈ７９Ｎ６Ｏ１８Ｓ２（ＭＨ＋）の計算値１１９９．４８９２、実測値１１９９．４９５５。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 1.32 - 1.44 (m, 2 H) 1.44 - 1.60 (m, 4 H) 2.41 (t, J=7.40 Hz, 2 H) 2.49 (d, J=4.89 Hz, 4 H) 2.60 (br. s., 2 H) 3.04 (t, J=7.09 Hz, 2 H) 3.25 (d, J=4.40 Hz, 2 H) 3.44 (d, J=6.85 Hz, 6 H) 3.52 (br. s., 3 H) 3.56 - 3.78 (m, 27 H) 3.88 (td, J=4.31, 2.75 Hz, 4 H) 4.30 - 4.45 (m, 4 H) 7.18 - 7.38 (m, 3 H) 7.55 (dd, J=6.91, 1.65 Hz, 2 H) 7.71 - 7.82 (m, 4 H) 7.82 - 7.91 (m, 4 H)
【００８１】
中間体１−（アミノオキシ）−Ｎ−（１−（アミノオキシ）−１５−オキソ−１９−（６−（３−（フェニルジスルファニル）プロパンアミド）ヘキサノイル）−３，６，９，１２−テトラオキサ−１６，１９−ジアザヘニコサン−２１−イル）−３，６，９，１２−テトラオキサペンタデカン−１５−アミド（１１）の調製
【００８２】
【化１９】
0006721572.tif 000020
ヒドラジン一水和物（７４μＬ、１．５０１ｍｍｏｌ）を、１−（（１，３−ジオキソイソインドリン−２−イル）オキシ）−Ｎ−（１−（（１，３−ジオキソイソインドリン−２−イル）オキシ）−１５−オキソ−１９−（６−（３−（フェニルジスルファニル）プロパンアミド）ヘキサノイル）−３，６，９，１２−テトラオキサ−１６，１９−ジアザヘニコサン−２１−イル）−３，６，９，１２−テトラオキサペンタデカン−１５−アミド（１０、４５ｍｇ、０．０３８ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（０．７５ｍＬ）中溶液に添加した。得られた混合物を室温で３０分間撹拌し、次いで減圧下で濃縮した。残留物を分取ＨＰＬＣ（１５〜４０％、ｖ／ｖ、アセトニトリル／（５ｍＭ  ＮＨ４ＯＨ水溶液））により精製した。濃縮後、１−（アミノオキシ）−Ｎ−（１−（アミノオキシ）−１５−オキソ−１９−（６−（３−（フェニルジスルファニル）プロパンアミド）ヘキサノイル）−３，６，９，１２−テトラオキサ−１６，１９−ジアザヘニコサン−２１−イル）−３，６，９，１２−テトラオキサペンタデカン−１５−アミド（１１、１２ｍｇ、３４％）を得た。ＬＣ−ＭＳ（（Ｍ／２）＋１）４７０．６、ｔ＝１．１５分。
【００８３】
生体直交性（bioorthogonal）官能基（複数可）を有するコンジュゲートの調製
ＩｇＧからのＦｃの調製
０．６１ｍＬのＴｒｉｓ  ０．１Ｍ  ｐＨ８．０およびＬｙｓ−Ｃ（１００μＬの０．１ｍｇ／ｍＬ水中溶液）をＩｇＧ（０．６３９ｍＬの７８．２６ｍｇ／ｍＬ  ＰＢＳ中溶液  ｐＨ７．４、０．３３６μｍｏｌ）に順に添加した。得られた混合物を３７℃で４５分間インキュベートした。セファロースビーズに固定化したプロテインＡを混合物に添加し、続いてＰＢＳ緩衝液で３回洗浄し、Ｌｙｓ−ＣおよびＦａｂ断片を除去した。次いで、Ｆｃを、グリシン０．１Ｍ  ｐＨ２．５を２回添加し、Ｔｒｉｓ  １Ｍ  ｐＨ８．０へ溶出することにより解離した。溶出したＦｃは、Ａｍｉｃｏｎ  １０Ｋ  ＭＷＣＯ遠心濾過機を使用してＰＢＳ  ｐＨ７．４に緩衝液交換し、Ｆｃ（７００μＬ、１９．６ｍｇ／ｍＬ、１３．７ｍｇ、７７％）を得た。ＬＣＭＳ  ＥＳＩ（ＰＮＧａｓｅ  Ｆによる脱グリコシル化後）：５０４１０。
【００８４】
１２の調製
【００８５】
【化２０】
0006721572.tif 000021
９００μＬのＴｒｉｓ  ０．２５Ｍ  ｐＨ７．４およびＤＭＳＯ（１２０μＬ、０．０１９ｍｍｏｌ）中１，３−ジクロロアセトンをＦｃ（１０ｍｇ、０．１８９μｍｏｌ）の５１０μＬ  ＰＢＳ  ｐＨ７．４中溶液に４℃で順に添加した。混合物を４℃で１０分間かき混ぜ、次いで水中ＴＣＥＰ．ＨＣｌ（１８０μＬ、１．８８７μｍｏｌ）を滴下添加した。混合物を４℃で２０時間かき混ぜた。混合物をＺｅｂａ  ７Ｋ  ＭＷＣＯ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｃｕｔ  Ｏｆｆ：分画分子量）スピンカラムに３回通し、１２（１．８ｍＬ、５．３５ｍｇ／ｍＬ、９．６３ｍｇ、９６％）を得た。ＬＣＭＳ  ＥＳＩ（ＰＮＧａｓｅ  Ｆによる脱グリコシル化後）：５０５２１。
【００８６】
修飾抗Ｈｅｒ２  ＩｇＧ（１３）の調製
【００８７】
【化２１】
0006721572.tif 000022
ＤＭＳＯ（９．７２μＬ、１．５３μｍｏｌ）中１，３−ジクロロアセトンを抗Ｈｅｒ２  ＩｇＧ（１．５ｍｇ、０．０１０μｍｏｌ）の８２μＬのＴｒｉｓ（０．２５Ｍ、ｐＨ７．４）中溶液に４℃で添加した。混合物を４℃で１０分間かき混ぜ、次いで水中ＴＣＥＰ．ＨＣｌ（１４．６２μＬ、０．１５３μｍｏｌ）を滴下添加した。得られた混合物を４℃で２０時間かき混ぜ、次いでＺｅｂａ  ７Ｋ  ＭＷＣＯスピンカラムに連続して３回通し、修飾抗Ｈｅｒ２  ＩｇＧ  １３（１１０μＬ、１１．６ｍｇ／ｍＬ、１．２７ｍｇ、８５％）を得た。ＬＣＭＳ  ＥＳＩ（ＰＮＧａｓｅ  Ｆによる脱グリコシル化後）：１４５４０１。
【００８８】
［実施例１］
Ｆｃ−アジドコンジュゲート（１４）の調製
【００８９】
【化２２】
0006721572.tif 000023
０．４ｍＬのＰＢＳ  ｐＨ７．４、Ｎ，Ｎ−ビス（１−（アミノオキシ）−１５−オキソ−３，６，９，１２−テトラオキサ−１６−アザオクタデカン−１８−イル）−１−アジド−３，６，９，１２−テトラオキサペンタデカン−１５−アミド（４、５２μＬの３０ｍｇ／ｍＬ  ＤＭＳＯ中溶液、１．５５ｍｇ、１．７１７μｍｏｌ）、およびＤＭＳＯ中３，５−ジアミノ安息香酸（１３０μＬ、０．１７２ｍｍｏｌ）を１２（９．１ｍｇ、０．１７２μｍｏｌ）の１．７ｍＬのＰＢＳ（ｐＨ７．４）中溶液に室温で順に添加した。混合物を２０℃で１６時間かき混ぜ、次いで洗浄緩衝液としてＰＢＳ用いてＡｍｉｃｏｎ  ｕｌｔｒａ  １０Ｋ  ＭＷＣＯ遠心濾過機を使用して濃縮し、標題化合物１４（３１０μＬ、２７ｍｇ／ｍＬ、８．３７ｍｇ、９０％）を得た。ＬＣＭＳ  ＥＳＩ（ＰＮＧａｓｅ  Ｆによる脱グリコシル化後）：５１３８８。Ｆｃおよび１２と共に反応生成物のＳＤＳ−ＰＡＧＥについては図４を参照。
【００９０】
［実施例２］
ジアジド官能基を有する抗Ｈｅｒ２  ＩｇＧの調製（１５）
【００９１】
【化２３】
0006721572.tif 000024
Ｎ，Ｎ−ビス（１−（アミノオキシ）−１５−オキソ−３，６，９，１２−テトラオキサ−１６−アザオクタデカン−１８−イル）−１−アジド−３，６，９，１２−テトラオキサペンタデカン−１５−アミド（４、１．８１μＬの３０ｍｇ／ｍＬ  ＤＭＳＯ中溶液、５４μｇ、０．０６０μｍｏｌ）、およびＤＭＳＯ中３，５−ジアミノ安息香酸（２．２８μＬ、３．００μｍｏｌ）を３８μＬのＰＢＳ（ｐＨ７．４）中修飾抗Ｈｅｒ２  ＩｇＧ（１３、４４１μｇ、０．００３μｍｏｌ）に室温で順に添加した。得られた混合物を２０℃で１６時間かき混ぜ、次いでＺｅｂａ  ７Ｋ  ＭＷＣＯスピンカラムに連続して３回通し、標題化合物（１５、１２５μＬ、３．０５ｍｇ／ｍＬ、３８０μｇ、８５％）を得た。ＬＣＭＳ  ＥＳＩ（ＰＮＧａｓｅ  Ｆによる脱グリコシル化後）：１４７１３２。抗体単独（ＴＢＳ）および本明細書に含まれない別のＴＢＳコンジュゲートと共に、この生成物のＳＤＳ−ＰＡＧＥについては図５を参照。
【００９２】
［実施例３］
フェニルジスルフィドを有する抗Ｈｅｒ２  ＩｇＧ（１６）の調製
【００９３】
【化２４】
0006721572.tif 000025
１−（アミノオキシ）−Ｎ−（１−（アミノオキシ）−１５−オキソ−１９−（６−（３−（フェニルジスルファニル）プロパンアミド）ヘキサノイル）−３，６，９，１２−テトラオキサ−１６，１９−ジアザヘニコサン−２１−イル）−３，６，９，１２−テトラオキサペンタデカン−１５−アミド（１１、８．４４μＬの３０ｍｇ／ｍＬ  ＤＭＳＯ中溶液、２５３μｇ、０．２６９μｍｏｌ）およびＤＭＳＯ中３，５−ジアミノ安息香酸（５．１２μＬ、６．７４μｍｏｌ）を１３５μＬのＰＢＳ（ｐＨ７．４）中修飾抗Ｈｅｒ２  ＩｇＧ（１３、２ｍｇ、０．０１３μｍｏｌ）に室温で添加した。混合物を２０℃で１６時間かき混ぜ、次いでＺｅｂａ  ７Ｋ  ＭＷＣＯスピンカラムに連続して３回通し、標題化合物１６（１５０μＬ、９．２４ｍｇ／ｍＬ、１．４ｍｇ、６９％）を得た。ＬＣＭＳ  ＥＳＩ（ＰＮＧａｓｅ  Ｆによる脱グリコシル化後）：１４７２０４。
【００９４】
細胞毒ペイロードを有するコンジュゲートの調製
【００９５】
［実施例５］
抗Ｈｅｒ２  ＩｇＧ−ジＭＭＡＦ  １７の調製
【００９６】
【化２５】
0006721572.tif 000026
ＴＣＥＰ．ＨＣｌの水中溶液（０．８８μＬ、０．０９２μｍｏｌ）を、７５μＬのＰＢＳ（ｐＨ７．４）中−フェニルジスルフィド１６を有する抗Ｈｅｒ２  ＩｇＧ（０．６９ｍｇ、０．００４６μｍｏｌ）に室温で滴下添加した。得られた混合物を２０℃で２０分間かき混ぜ、次いでＺｅｂａ  ７Ｋ  ＭＷＣＯスピンカラム（ＰＢＳ  ０．１Ｍ＋ＥＤＴＡ  １０ｍＭ、ｐＨ７．４であらかじめ平衡化した）に連続して３回通した。（Ｓ）−２−（（２Ｒ，３Ｓ）−３−（（Ｒ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｒ）−２−（（Ｓ）−２−（６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）−Ｎ−メチルヘキサンアミド）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルへプタノイル）ピロリジン−３−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパンアミド）−３−フェニルプロパン酸（ＤＭＳＯ中４．２７μＬ、０．０９２μｍｏｌ、２０ｍｇ／ｍＬ）を次いで添加し、混合物を２０℃で１６時間かき混ぜた。混合物をＺｅｂａ  ７Ｋ  ＭＷＣＯスピンカラムに連続して３回通し、標題化合物１７（１００μＬ、４．９３ｍｇ／ｍＬ、４９３μｇ、７０％）を得た。ＬＣＭＳ  ＥＳＩ（ＰＮＧａｓｅ  Ｆによる脱グリコシル化後）：１４６９８７（ピーク強度より１０％、抗Ｈｅｒ２  ＩｇＧリンカー、＋０  ＭＭＡＦ）、１４８８３９（ピーク強度より９０％、抗Ｈｅｒ２  ＩｇＧ−ジＭＭＡＦ、＋２  ＭＭＡＦ）。最終生成物の平均ＤＡＲは、ＥＳＩ−ＭＳピークに基づいて１．８と予測される。前駆体および抗Ｈｅｒ２  ＩｇＧと共に、この生成物のＳＤＳ−ＰＡＧＥについては図６を参照。
【００９７】
ＳＤＳ  ＰＡＧＥのための還元試料の調製（還元ゲル手順）：タンパク質（５μｇ、０．０００１７μｍｏｌ）のＰＢＳ溶液にＴＣＥＰ  ＨＣｌ溶液（１μｌ、０．５Ｍ、０．５μｍｏｌ）を添加した。得られた混合物を３７℃で３０分間インキュベートした。
【図１】
0006721572.tif 000031
【図２】
0006721572.tif 000032
【図３Ａ】
0006721572.tif 000033
【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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