(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞培養器の培養面に、
温度応答性ポリマー及び／又は温度応答性ポリマー組成物で被覆された第一被覆領域と、
前記第一被覆領域の端部に設けられた、細胞接着性物質で被覆された２つの第二被覆領域と
を準備する、準備工程と、
細胞を前記第一被覆領域及び前記第二被覆領域に播種し、前記細胞を培養することによって、細胞構造体を調製する、播種培養工程と
を含むことを特徴とする、２つの前記第二被覆領域を結ぶ線の方向への配向性を備える細胞構造体の製造方法であって、
前記温度応答性ポリマーが、カチオン性官能基及びアニオン性官能基を含む、細胞構造体の製造方法。
【請求項２】
前記培養面を、細胞非接着性とする、請求項１に記載の細胞構造体の製造方法。
【請求項３】
前記細胞接着性物質を、ラミニン、コラーゲン、フィブロネクチンからなる群から選択される少なくとも１種とする、請求項１又は２に記載の細胞構造体の製造方法。
【請求項４】
前記第一被覆領域及び前記第二被覆領域が占める領域を、細胞非接着性の壁で囲む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の細胞構造体の製造方法。
【請求項５】
前記第一被覆領域を、所定方向に延びる形状とし、前記第一被覆領域の前記端部を、前記所定方向についての端部とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の細胞構造体の製造方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の細胞構造体の製造方法により製造されたことを特徴とする、細胞構造体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞構造体の製造方法、細胞構造体、細胞培養器に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、患者のＱＯＬの向上を目的として、オーダーメイド医療の実現が望まれている。オーダーメイド医療では、患者自身の細胞を用いて機能障害や機能欠損に陥った組織や臓器の再生を図る、再生医療が主要な役割を担う。
ここで、再生医療は、患者の組織から採取した細胞を、細胞培養器中で培養し、組織を形成させ、その後、その組織を患者に移植するというオペレーションを必要とする。そのため、細胞を培養して、組織等の細胞構造体を形成させる技術や、細胞構造体をそのままの状態で回収する技術が所望されている。
【０００３】
一般的に、生体外に取り出された細胞は、その遺伝子制御に乱れを生じさせる様々なストレスを受けて、脱分化してしまうことが多く、また、細胞を増殖させるために脱分化させることが必要となる場合も多い。これにより、患者から採取した細胞を、単純な培養条件で培養しても、細胞は元の遺伝子発現状態を維持できないことが多いため、細胞構造体、ひいては組織を形成させることができず、また、その細胞の高度な機能を発揮することができないという問題がある。例えば、一般的なポリスチレン製の細胞培養皿で細胞培養を行った場合には、細胞が単層状の構造を形成するに留まり、高度に分化した細胞に見られる構造、例えば、軟骨細胞が生体内に存在している場合の形状であるペレット状の構造と同様の構造を有する細胞構造体を形成させることは困難であり、また、軟骨細胞に特異的な多くの機能が消失されてしまう。
【０００４】
上記問題に関して、例えば、組織の構造を模倣した立体的構造を構築する細胞培養方法、例えば、スフェロイド培養、クラスター培養、ペレット培養、三次元担体培養等の方法が開発されている。立体的な構造を有する細胞外マトリックスを、細胞培養の足場（スキャホールド）として用いることにより、立体的な構造を有する細胞構造体を作製する細胞培養方法が知られている（特許文献１参照）。
また、立体的な構造を有する細胞構造体を作製する手法として、Ｕ字底の低接着性培養皿を用いる手法や、ハンギングドロップ法も開発されている。
【０００５】
近年、特殊な温度応答性ポリマー及び／又は温度応答性ポリマー組成物で被覆した培養面において、細胞を播種・培養することによって、三次元構造を備える細胞構造体を簡便に製造する方法が報告されている（特許文献２参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１０−５２４４５８号公報
【特許文献２】特許第５７４６２４０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、上記スフェロイド培養法等は、直径１０μｍ程度とサイズが小さく、細胞間ネットワークが弱いスフェロイド（多数の細胞の凝集体）しか調製することができないといった問題を有している。
また、上記Ｕ字底の低接着性培養皿を用いる手法や、ハンギングドロップ法では、略真球状のスフェロイドしか得ることができず、敷石形態や紡錘形態といった細胞固有の形態を備えたスフェロイドを得ることができない。
【０００８】
近年開発された上記特殊なポリマー及び／又はポリマー組成物を用いる方法は、得られる細胞構造体の形態を所望のものとするまでには必ずしも至っておらず、この方法に関する諸条件を最適化・好適化する余地を残している。
【０００９】
そこで、本発明は、細胞の凝集様式を制御することにより、所望の形態の細胞構造体を製造することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の要旨は以下の通りである。
本発明の細胞構造体の製造方法は、細胞培養器の培養面に、温度応答性ポリマー及び／又は温度応答性ポリマー組成物で被覆された第一被覆領域と、前記第一被覆領域の端部に設けられた、細胞接着性物質で被覆された２つの第二被覆領域とを準備する、準備工程と、
細胞を前記第一被覆領域及び前記第二被覆領域に播種し、前記細胞を培養することによって、細胞構造体を調製する、播種培養工程と
を含む、２つの前記第二被覆領域を結ぶ線の方向への配向性を備える細胞構造体の製造方法であって、前記温度応答性ポリマーが、カチオン性官能基及びアニオン性官能基を含むことを特徴とする。
【００１１】
本発明の細胞構造体の製造方法では、前記培養面を、細胞非接着性とすることが好ましい。
本発明の細胞構造体の製造方法では、前記細胞接着性物質を、ラミニン、コラーゲン、フィブロネクチンからなる群から選択される少なくとも１種とすることが好ましい。
本発明の細胞構造体の製造方法では、前記第一被覆領域及び前記第二被覆領域が占める領域を、細胞非接着性の壁で囲むことが好ましい。
本発明の細胞構造体の製造方法では、前記第一被覆領域を、所定方向に延びる形状とし、前記第一被覆領域の前記端部を、前記所定方向についての端部とすることが好ましい。
【００１２】
本発明の細胞構造体は、上記いずれかに記載の細胞構造体の製造方法により製造されたことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、細胞の凝集様式を制御して、所望の形態の細胞構造体を製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】（ｉ）〜（ｖｉｉｉ）は、本実施形態における一例の細胞構造体の製造方法の概要について示す図である。
【図２】（ａ）〜（ｃ）は、本実施形態における第一被覆領域と第一被覆領域との配置態様について示す図である。
【図３】準備工程の変形例及びこれに続く播種培養工程の概略を示す図である。
【図４】（ａ）は、試験Ｃにおいて、試験Ｂで準備した第一被覆領域及び第二被覆領域においてＧＦＰ組換えルイスラットのＡＤＳＣを２時間培養した後の様子を、顕微鏡を用いて観察したときの写真を示す図である。（ｂ）は、試験Ｃにおいて、試験Ｂで準備した第一被覆領域及び第二被覆領域においてＧＦＰ組換えルイスラットのＡＤＳＣを２０時間培養した後の様子を、顕微鏡を用いて観察したときの写真を示す図である。（ｃ）は、（ｂ）に示す細胞構造体を倍率を下げて観察したときの写真を示す図である。（ｄ）は、（ｂ）の破線に示す細胞構造体の様子を蛍光顕微鏡を用いて観察したときの写真を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、図面を参照して、本発明の細胞構造体の製造方法、本発明の細胞構造体、本発明の細胞培養器の実施形態について詳細に例示説明する。
【００１７】
本発明の実施形態（以下、「本実施形態」ともいう。）の細胞構造体の製造方法は、
細胞培養器の培養面に、温度応答性ポリマー及び／又は温度応答性ポリマー組成物で被覆された第一被覆領域と、前記第一被覆領域の端部に設けられた、細胞接着性物質で被覆された複数の第二被覆領域とを準備する、準備工程と、
細胞を前記第一被覆領域及び前記第二被覆領域に播種し、前記細胞を培養する、播種培養工程と
を含む。
【００１８】
本実施形態における一例の製造方法は、温度応答性ポリマー及び／又は温度応答性ポリマー組成物を調製する、調製工程と、前述の準備工程と、前述の播種培養工程とを含む。
【００１９】
図１（ｉ）〜（ｖｉｉｉ）に、本実施形態における一例の細胞構造体の製造方法の概要について示す。
【００２０】
以下、本実施形態における一例の細胞構造体の製造方法における各工程の詳細を記載する。
【００２１】
（調製工程）
一例の製造方法では、まず、温度応答性ポリマー及び／又は温度応答性ポリマー組成物を調製する（調製工程）。
【００２２】
本実施形態で用いられる温度応答性ポリマー及び温度応答性ポリマー組成物としては、（Ａ）２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）単位と、アニオン性モノマー単位とを含む温度応答性ポリマー、（Ｂ）Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）単位と、カチオン性モノマー単位と、アニオン性モノマー単位とを含む温度応答性ポリマー、（Ｃ）２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）及び／又はその誘導体の重合体と、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール（トリス）と、核酸、ヘパリン、ヒアルロン酸、デキストラン硫酸、ポリスチレンスルホン酸、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリリン酸、硫酸化多糖類、カードラン及びポリアルギン酸並びにこれらのアルカリ金属塩からなる群から選択される１種以上のアニオン性物質とを含む温度応答性ポリマー組成物等が挙げられる。
ここで、上記（Ａ）としては、例えば、（Ａ−１）ＤＭＡＥＭＡを水存在下で重合する方法により得られる温度応答性ポリマー、（Ａ−２）主としてＤＭＡＥＭＡを含むポリマーブロック（重合鎖α末端）と、主としてＤＭＡＥＭＡとアニオン性モノマーとを含むコポリマーブロック（重合鎖ω末端）とを含む、温度応答性ポリマー等が挙げられる。
本実施形態において、これらは、１種単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００２３】
以下、上記（Ａ−１）の温度応答性ポリマー及びその製造方法について記載する。
【００２４】
（温度応答性ポリマーの製造方法）
（Ａ−１）の温度応答性ポリマーの製造方法は、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）を含む混合物を調製する調製工程と、混合物に紫外線を照射する照射工程とを含み、ここで、調製工程において、混合物は重合禁止剤及び水を更に含み、照射工程において、紫外線は不活性雰囲気下において照射される、ことを特徴とする。
【００２５】
（Ａ−１）の温度応答性ポリマーの製造方法では、まず、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）を含む混合物を調製する（調製工程）。ここで、混合物は、重合禁止剤及び水を更に含む。
【００２６】
２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）としては、市販品を用いることができる。重合禁止剤としては、メチルヒドロキノン（ＭＥＨＱ）、ヒドロキノン、ｐ−ベンゾキノリン、Ｎ，Ｎ−ジエチルヒドロキシルアミン、Ｎ−ｎｉｔｒｏｓｏ−Ｎ−ｐｈｅｎｙｌｈｙｄｒｏｘｙｌａｍｉｎｅ（Ｃｕｐｆｅｒｒｏｎ）、ｔ−ブチルハイドロキノン、等が挙げられる。また、市販のＤＭＡＥＭＡに含まれるＭＥＨＱ等をそのまま用いてもよい。水としては、超純水が挙げられる。
【００２７】
重合禁止剤の上記混合物に対する重量割合は、０．０１〜１．５％であることが好ましく、０．１〜０．５％であることが更に好ましい。上記範囲とすれば、ラジカル重合反応の暴走を抑制して、制御できない架橋を低減することができ、製造される温度応答性ポリマーの溶媒に対する溶解性を確保することができる。
水の上記混合物に対する重量割合は、１．０〜５０％であることが好ましく、９．０〜３３％であることが更に好ましい。上記範囲とすれば、側鎖の加水分解反応の反応速度と、重合するポリマー鎖の成長反応の反応速度とを、バランスよく調和させることができる。これにより、側鎖が加水分解されたＤＭＡＥＭＡに対する、側鎖が加水分解されていないＤＭＡＥＭＡの割合（共重合割合）が１．０〜２０程度の温度応答性ポリマーを得ることができる。
【００２８】
次いで、（Ａ−１）の温度応答性ポリマーの製造方法では、混合物に紫外線を照射する（照射工程）。ここで、紫外線は、不活性雰囲気下において、照射される。ＤＭＡＥＭＡは、紫外線の照射により、ラジカル重合して、ポリマーとなる。
この工程では、例えば、透明な密封バイアルに、上記混合物を加え、不活性ガスをバブリングすることによってバイアル内を不活性雰囲気とした後に、バイアルの外部から紫外線照射装置を用いて紫外線を照射する。
【００２９】
紫外線の波長としては、２１０〜６００ｎｍであることが好ましく、３６０〜３８０ｎｍであることが更に好ましい。上記範囲とすれば、効率よく重合反応を進行させることができ、所期の共重合割合を有する高分子材料を安定的に得ることができる。また、製造したポリマー材料が着色することを防ぐこともできる。
不活性ガスとしては、窒素、アルゴン、ヘリウム、ネオン等が挙げられる。
【００３０】
反応条件に関して、温度条件としては、１５〜５０℃であることが好ましく、２０〜３０℃であることが更に好ましい。上記範囲とすれば、熱による開始反応を抑制し、光照射による開始反応を優先的に進行させることができる。また、加水分解反応の反応速度をポリマー鎖の成長反応の反応速度に対してバランスのよいものにすることができる。
反応時間としては、７〜２４時間であることが好ましく、１７〜２１時間であることが更に好ましい。上記範囲とすれば、（Ａ−１）の温度応答性ポリマーを高収率で得ることができ、また、光分解反応や不要な架橋反応を抑制しながらラジカル重合を行うことができる。
【００３１】
なお、調製工程において混合物が調製され終えてから、照射工程において紫外線の照射が開始されるまでの時間は、１０分〜１時間であることが好ましい。
【００３２】
混合物を加えたバイアルの内部の気体を置換して、バイアル内を不活性雰囲気とする際には、１０分程度の時間を要する。そのため、上記時間を１０分未満とすると、ラジカル重合に必要となる不活性雰囲気が得られない虞がある。また、混合物中では、ＤＭＡＥＭＡの加水分解反応が、紫外線の照射が開始される前に開始される。そのため、上記時間を１時間超とすると、ラジカル重合反応に不活性なメタクリル酸が混合物中に多数生じてしまう。
【００３３】
（Ａ−１）の温度応答性ポリマーの製造方法では、混合物に水が含まれるため、ＤＭＡＥＭＡのラジカル重合反応と、ポリ２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＰＤＭＡＥＭＡ）の側鎖のエステル結合の加水分解反応とを、拮抗させることができる。
この拮抗により、得られる生成物は、式（Ｉ）で表される繰り返し単位（Ａ）
【化１】
0006800436.tif 000002
、及び式（ＩＩ）で表される繰り返し単位（Ｂ）
【化２】
0006800436.tif 000003
を含むポリマーとなる。
そのため、ポリマーが有するカチオン性官能基、すなわち、ジメチルアミノ基と、ポリマーが有するアニオン性官能基、すなわち、側鎖のエステル結合が加水分解されてできたカルボキシル基の両方を、バランスよく備えることができる。そして、（Ａ−１）の温度応答性ポリマーの製造方法によれば、カチオン性官能基及びアニオン性官能基を有する、ポリ（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート）由来のポリマーを、少ない工程で簡便に製造することができる。
【００３４】
なお、（Ａ−１）の温度応答性ポリマーの製造方法と同一の製造方法ではなくとも、ＤＭＡＥＭＡ、重合禁止剤、及び水が、紫外線照射時に反応系中に共存していれば、本発明の温度応答性ポリマーの製造方法の上記効果と同様の効果を得ることができる。
例えば、ＤＭＡＥＭＡ及び重合禁止剤を含む混合物と、水とを別々に準備し、次いで、混合物と水とに不活性ガスをバブリングし、その後、混合物と水とを不活性雰囲気下で混合すると同時に紫外線を照射するという、温度応答性ポリマーの製造方法も、（Ａ−１）の温度応答性ポリマーに含めることができる。
【００３５】
（温度応答性ポリマー）
（Ａ−１）の温度応答性ポリマーは、上記（Ａ−１）の製造方法により製造される。
【００３６】
ここで、（Ａ−１）の温度応答性ポリマーとしては、数平均分子量（Ｍｎ）が、１０〜５００ｋＤａである分子が好ましい。また、重量平均分子量（Ｍｗ）と数平均分子量（Ｍｎ）との比（Ｍｗ／Ｍｎ）は、１．１〜１０．０である分子が好ましい。
（Ａ−１）の温度応答性ポリマーの分子量は、紫外線の照射時間及び照射強度の条件により、適宜調整することができる。
【００３７】
（Ａ−１）の温度応答性ポリマーによれば、曇点を、例えば室温（２５℃）以下に、低下させることができる。
【００３８】
上記（Ａ−１）の温度応答性ポリマーでは、曇点以上の温度で形成された温度応答性ポリマーの不溶化物が、室温（約２５℃）条件下で再溶解するまでの時間が顕著に遅延する。これは、得られた（Ａ−１）の温度応答性ポリマーは、分子内にカチオン性官能基とアニオン性官能基とが存在するため、高い自己凝集性を有するためであると推定される。
【００３９】
また、この（Ａ−１）の温度応答性ポリマーを用いて、後述するように、培養面にこの温度応答性ポリマーが被覆されている細胞培養器を調製することができる。
【００４０】
更に、（Ａ−１）の温度応答性ポリマーによれば、後述するように、細胞を適切な培養条件で培養することにより、管腔状（チューブ状）、塊状（ペレット状）等の構造を有する細胞構造体を形成させることができる。
【００４１】
（Ａ−１）の温度応答性ポリマーが有する、カチオン性官能基（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ基）の官能基数と、アニオン性官能基（カルボキシル基）の官能基数との比（Ｃ／Ａ比）は、０．５〜３２であることが好ましく、４〜１６であることが更に好ましい。
【００４２】
Ｃ／Ａ比を上記範囲とすれば、曇点を低減させるという上記効果が得られやすい。上記Ｃ／Ａ比を有する温度応答性ポリマーでは、上記温度応答性ポリマー中でカチオン性官能基とアニオン性官能基とが、イオン結合的に分子間及び／又は分子内の凝集に作用して、温度応答性ポリマーの凝集力が強くなった結果であると推測される。
【００４３】
また、Ｃ／Ａ比を上記範囲とすれば、上記温度応答性ポリマー中の正電荷と負電荷とのバランスを特に好適にして、正電荷による細胞傷害性を抑制することができ、また、上記温度応答性ポリマーの親水性と疎水性とのバランスを特に好適にして、細胞の遊走や配向を生じやすくすることができるものと推定される。
【００４４】
以下、上記（Ａ−２）の温度応答性ポリマー及びその製造方法について記載する。
【００４５】
（温度応答性ポリマーの製造方法）
（Ａ−２）の温度応答性ポリマーの製造方法は、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）を含む第一混合物に紫外線を照射する第一重合工程と、第一重合工程における重合物の数平均分子量が所定値以上となった時点で、第一混合物にアニオン性モノマーを添加して第二混合物を調製する添加工程と、第二混合物に紫外線を照射する第二重合工程と、を含むことを特徴とする。
【００４６】
（Ａ−２）の温度応答性ポリマーの製造方法では、まず、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）を含む第一混合物に紫外線を照射する（第一重合工程）。
ここで、第一混合物は、ＤＭＡＥＭＡ以外に、任意選択的に、例えば、他のモノマー、溶媒等を含んでよい。
また、紫外線は、不活性雰囲気下において、照射されてよい。
【００４７】
ＤＭＡＥＭＡとしては、市販品としてよい。
第一混合物に含まれ得る他のモノマーとしては、例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、ポリエチレングリコール側鎖を有するアクリル酸やメタクリル酸のエステル、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリルアミド等が挙げられ、特に、イオンバランスの調整を安定的に行うことを可能にする観点から、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、ポリエチレングリコール側鎖を有するアクリル酸やメタクリル酸のエステル、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドが好ましい。これらは、１種単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。ここで、他のモノマーの使用量のＤＭＡＥＭＡの使用量に対する割合（モル割合）は、０．００１〜１とすることが好ましく、０．０１〜０．５とすることが更に好ましい。
【００４８】
溶媒としては、例えば、トルエン、ベンゼン、クロロホルム、メタノール、エタノール等が挙げられ、特に、ＤＭＡＥＭＡのエステル結合に対して不活性であるため、トルエン、ベンゼンが好ましい。これらは、１種単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００４９】
この工程では、例えば、透明な密封バイアルに、上記第一混合物を加え、不活性ガスをバブリングすることによってバイアル内を不活性雰囲気とした後に、バイアルの外部から紫外線照射装置を用いて紫外線を照射する。
【００５０】
紫外線の波長としては、２１０〜６００ｎｍであることが好ましく、３６０〜３８０ｎｍであることが更に好ましい。上記範囲とすれば、効率よく重合反応を進行させることができ、所期の共重合割合を有する高分子材料を安定的に得ることができる。また、製造したポリマー材料が着色することを防ぐこともできる。
紫外線の照射強度としては、０．０１〜５０ｍＷ／ｃｍ２であることが好ましく、０．１〜５ｍＷ／ｃｍ２であることが更に好ましい。上記範囲とすれば、無用な化学結合の切断等による分解を抑制しつつ、安定的に、適切な速度（時間）で重合反応を進行させることができる。
不活性ガスとしては、窒素、アルゴン、ヘリウム、ネオン等が挙げられる。
【００５１】
温度条件としては、１０〜４０℃あることが好ましく、２０〜３０℃あることが更に好ましい。上記範囲とすれば、通常の実験室の室温において反応を行うことができ、また、光とは別の手段（加熱等）により反応を抑制することが可能となる。
反応時間としては、１０分〜４８時間であることが好ましく、６０分〜２４時間であることが更に好ましい。
【００５２】
この工程において、ＤＭＡＥＭＡは、紫外線の照射により、ラジカル重合して、ポリマー（ポリ（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート）（ＰＤＭＡＥＭＡ））となり、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレートを含むホモポリマーブロックが形成される。他のモノマーも用いた場合には、ＤＭＡＥＭＡと他のモノマーとを含むポリマーブロックが形成される。
【００５３】
次いで、（Ａ−２）の温度応答性ポリマーの製造方法では、第一重合工程における重合物（具体的には、ポリマー化した２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート）の数平均分子量が所定値以上となった時点で、第一混合物にアニオン性モノマーを添加して第二混合物を調製する（添加工程）。
ここで、第二混合物は、第一重合工程後の第一混合物、及びアニオン性モノマー以外に、例えば、他のモノマー、前述の第一混合物に含まれ得る溶媒（トルエン、ベンゼン、メタノール等）等を含んでよい。
また、アニオン性モノマーは、不活性雰囲気下において、添加されてよい。
【００５４】
アニオン性モノマーとしては、例えば、アクリル酸、メタクリル酸、側鎖にカルボキシル基、スルホン酸基、リン酸基を有するビニル誘導体等が挙げられ、特に、化学的安定性の観点から、アクリル酸、メタクリル酸が好ましい。
これらは、１種単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００５５】
第二混合物に含まれ得る他のモノマーとしては、例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、ポリエチレングリコール側鎖を有するアクリル酸やメタクリル酸のエステル、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリルアミド等が挙げられ、特に、電気的に中性であり、且つ親水性である、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミドが好ましい。これらは、１種単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。ここで、他のモノマーの使用量のＤＭＡＥＭＡの使用量に対する割合（モル）は、０．０１〜１０とすることが好ましく、０．１〜５とすることが更に好ましい。
【００５６】
この工程では、例えば、バイアルに不活性ガスをフローさせることによってバイアル内を不活性雰囲気に保ちながら、上記第二混合物を添加する。
【００５７】
数平均分子量の所定値は、曇点低減の効果を十分に得る観点から、好適には５，０００であり、更に好適には２０，０００であり、特に好適には１００，０００である。
なお、第一重合工程後の第一混合物中におけるポリマー化したＰＤＭＡＥＭＡの数平均分子量は、所定の時点で重合系から少量の反応混合物を採取して、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）や光散乱法（ＳＬＳ）等の当業者に周知の方法により、測定することができる。
【００５８】
この工程において、重合中のＤＭＡＥＭＡを含むホモポリマーに加えて、アニオン性モノマーも重合系に含められることとなり、バイアル内の重合系が、ＤＭＡＥＭＡの単独重合系から、ＤＭＡＥＭＡとアニオン性モノマーとの共重合系に、変わることとなる。
【００５９】
そして、（Ａ−２）の温度応答性ポリマーの製造方法では、第二混合物に紫外線を照射する（第二重合工程）。
ここで、紫外線は、不活性雰囲気下において、照射されてよい。
【００６０】
この工程では、例えば、第二混合物を添加した後のバイアルの外部から紫外線照射装置を用いて紫外線を照射する。
【００６１】
第二重合工程における、紫外線の波長、紫外線の照射強度、用いる不活性ガス、反応温度、反応時間等の諸条件は、第一重合工程における条件と同様としてよい。
【００６２】
この工程において、ＤＭＡＥＭＡとアニオン性モノマーとが、紫外線の照射により、ラジカル重合して、第一重合工程において形成したＤＭＡＥＭＡを含むホモポリマーブロックの重合鎖α末端に連続する形態で、ＤＭＡＥＭＡとアニオン性モノマーとを含むコポリマーブロックが形成される。他のモノマーも用いた場合には、ＤＭＡＥＭＡとアニオン性モノマーと他のモノマーとを含むコポリマーブロックが形成される。
【００６３】
上記の通り、ＤＭＡＥＭＡを含むホモポリマーブロックと、ＤＭＡＥＭＡとアニオン性モノマーとのコポリマーブロックとを含む温度応答性ポリマーが得られる。
【００６４】
なお、（Ａ−２）の製造方法では、当業者に理解される通り、種々の分子量及び分子構造を有するポリマーの混合物が生成するところ、ＤＭＡＥＭＡを含むホモポリマーブロックと、ＤＭＡＥＭＡとアニオン性モノマーとのコポリマーブロックとを含む温度応答性ポリマーを主成分として得る観点から、第一重合工程、添加工程、及び第二重合工程に亘って、同一の条件下で重合を行うことが好ましい。
【００６５】
（温度応答性ポリマー）
（Ａ−２）の温度応答性ポリマーは、上記（Ａ−２）の製造方法により製造される。
【００６６】
（Ａ−２）の温度応答性ポリマーは、主として２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレートを含み、任意選択的にジメチルアクリルアミド、ポリエチレングリコール側鎖を有するアクリル酸やメタクリル酸等の親水性モノマー等の他のモノマー単位を含むポリマーブロック（重合鎖α末端）と、主として２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレートとアニオン性モノマー（重合鎖ω末端）とを含み、任意選択的に他のモノマー単位を含むコポリマーブロックとを含む。
好適には、（Ａ−２）の温度応答性ポリマーは、ＤＭＡＥＭＡのホモポリマーブロックと、ＤＭＡＥＭＡとアニオン性モノマーとのコポリマーブロックとを含み、更に好適には、これらブロックからなる。
【００６７】
ここで、（Ａ−２）の温度応答性ポリマーとしては、重合鎖α末端のポリマーブロック（例えば、ＤＭＡＥＭＡのホモポリマーブロック）の数平均分子量が５０００Ｄａ以上であることが好ましく、２００００Ｄａ以上であることが更に好ましい。
【００６８】
（Ａ−２）の温度応答性ポリマーとしては、数平均分子量（Ｍｎ）が、１０〜５００ｋＤａである分子が好ましい。また、重量平均分子量（Ｍｗ）と数平均分子量（Ｍｎ）との比（Ｍｗ／Ｍｎ）は、１．１〜１０．０である分子が好ましい。
温度応答性ポリマーの分子量は、紫外線の照射時間及び照射強度の条件により、適宜調整することができる。
【００６９】
（Ａ−２）の温度応答性ポリマーによれば、曇点を、例えば室温（２５℃）以下に、低下させることができる。
【００７０】
上記（Ａ−２）の温度応答性ポリマーでは、曇点以上の温度で形成された温度応答性ポリマーの不溶化物が、室温（約２５℃）条件下で再溶解するまでの時間が顕著に遅延する。これは、得られた温度応答性ポリマーは、分子内にカチオン性官能基とアニオン性官能基とが存在するため、高い自己凝集性を有するためであると推定される。
【００７１】
特に、（Ａ−２）の温度応答性ポリマーは、重合鎖α末端に、高分子量（例えば、５０００Ｄａ以上）を有するＤＭＡＥＭＡのホモポリマーブロックを備えるため、ＤＭＡＥＭＡの側鎖の温度依存的なグロビュール転移が生じやすく、曇点を効果的に低減することが可能となると考えられる。
【００７２】
また、この温度応答性ポリマーを用いて、後述するように、培養面にこの温度応答性ポリマーを被覆してなる細胞培養器を調製することができる。
【００７３】
更に、（Ａ−２）の温度応答性ポリマーによれば、後述するように、細胞を適切な培養条件で培養することにより、管腔状（チューブ状）や塊状（ペレット状）等の構造を有する細胞構造体を形成させることができる。
【００７４】
（Ａ−２）の温度応答性ポリマーが有する、カチオン性官能基（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ基）の官能基数と、アニオン性官能基（カルボキシル基）の官能基数との比（Ｃ／Ａ比）は、０．５〜３２であることが好ましく、４〜１６であることが更に好ましい。
【００７５】
Ｃ／Ａ比を上記範囲とすれば、曇点を低減させるという上記効果が得られやすい。上記Ｃ／Ａ比を有する温度応答性ポリマーでは、上記温度応答性ポリマー中でカチオン性官能基とアニオン性官能基とが、イオン結合的に分子間及び／又は分子内の凝集に作用して、温度応答性ポリマーの凝集力が強くなった結果であると推測される。
【００７６】
また、Ｃ／Ａ比を上記範囲とすれば、上記温度応答性ポリマー中の正電荷と負電荷とのバランスを特に好適にして、正電荷による細胞傷害性を抑制することができ、また、上記温度応答性ポリマーの親水性と疎水性とのバランスを特に好適にして、細胞の遊走や配向を生じやすくすることができるものと推定される。
【００７７】
以下、上記（Ｂ）の温度応答性ポリマー及びその製造方法について記載する。
【００７８】
（温度応答性ポリマーの製造方法）
（Ｂ）の温度応答性ポリマーの製造方法は、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）（以下、「モノマー（Ａ）」ともいう。）と、カチオン性モノマー（以下、「モノマー（Ｂ）」ともいう。）と、アニオン性モノマー（以下、「モノマー（Ｃ）」ともいう。）とを重合させるものである。任意選択的に、上記３種類のモノマーにこれら以外の他のモノマーを加えて重合させてよい。
【００７９】
Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）としては、市販品としてよい。
【００８０】
カチオン性モノマーとしては、カチオン性官能基を有するモノマーが挙げられ、カチオン性官能基としては、第１級〜第４級アミノ基等のアミノ基、グアニジン基等が挙げられ、特に、化学的安定性、低細胞傷害性、滅菌安定性、強陽電荷性の観点から、第３級アミノ基が好ましい。
より具体的には、カチオン性モノマーとしては、生理活性物質を担持したり、アルカリ性条件下においたりしても、安定性が高いものが好ましく、例えば、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピル）−（メタ）アクリルアミド、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピル）−（メタ）アクリレート、アミノスチレン、２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル）−（メタ）アクリルアミド、２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル）−（メタ）アクリレート等が挙げられる。
これらの中で、特に、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピル）アクリルアミドは、高い陽電荷強度を有することから、アニオン性物質の担持を容易にするため、好ましい。
また、アミノスチレンは、高い陽電荷強度を有することから、アニオン性物質の担持を容易にすると共に、分子内の芳香環が水溶液中において他の物質の疎水性構造と相互作用することから、担持可能なアニオン性物質のバリエーションを広げるため、好ましい。
更に、２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル）−メタクリルアミドは、中性域のｐＨで微弱な陽電荷を有し、且つ、水への溶解性が温度に影響されないことから、一度担持したアニオン性物質の放出を容易にするため、好ましい。
これらは、１種単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００８１】
アニオン性モノマーとしては、アニオン性官能基を有するモノマーが挙げられ、アニオン性官能基としては、カルボン酸基、スルホン酸基、硫酸基、リン酸基、ボロン酸基等が挙げられ、特に、化学的安定性、細胞親和性、高い精製度の観点から、カルボン酸基、スルホン酸基、リン酸基が好ましい。
より具体的には、アクリル酸、メタクリル酸、ビニル安息香酸、等が挙げられ、特に、化学的安定性、細胞親和性の観点から、メタクリル酸、ビニル安息香酸が好ましい。
これらは、１種単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００８２】
他のモノマーとしては、例えば、ジメチルアクリルアミド、ポリエチレングリコール側鎖を有するアクリル酸やメタクリル酸等の中性の親水性モノマー等が挙げられる。
これらは、１種単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
他のモノマーは、電荷以外の親水性・疎水性のバランスの調整に使用可能であり、バリエーションを広げることが可能となる。
【００８３】
ここで、（Ｂ）の温度応答性ポリマーの製造方法におけるＮＩＰＡＭの使用量、カチオン性モノマーの使用量、他のモノマーの使用量それぞれの、モノマー（Ａ）〜（Ｃ）の合計の使用量に対する割合（モル）は、モノマーの重合反応における反応性を考慮して、所望のモノマー成分の割合を得られるよう、当業者が適宜調整することができる。
【００８４】
ここで、重合方法としては、ラジカル重合、イオン重合等が挙げられる。
ラジカル重合としては、リビングラジカル重合が好ましく、リビングラジカル重合としては、可逆的付加開裂連鎖移動（ＲＡＦＴ）重合、原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）、イニファーター重合等が挙げられ、イニファーター重合が好ましい。
イオン重合としては、リビングアニオン重合が好ましい。
【００８５】
（Ｂ）の温度応答性ポリマーの製造方法の一例は、ラジカル重合を用いる方法である。
この製造方法の一例は、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）を含む第一混合物に紫外線を照射する第一重合工程と、第一混合物に、カチオン性モノマーとアニオン性モノマーとを添加して第二混合物を調製する添加工程と、第二混合物に紫外線を照射する第二重合工程と、を含む。
【００８６】
この製造方法の一例では、まず、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）を含む第一混合物に紫外線を照射する（第一重合工程）。
ここで、第一混合物は、ＤＭＡＥＭＡ以外に、任意選択的に、例えば、他のモノマー、溶媒、連鎖移動剤、安定剤、界面活性剤等を含んでよい。
また、紫外線は、不活性雰囲気下において、照射されてよい。
【００８７】
この工程では、例えば、透明な密封バイアルに、上記第一混合物を加え、不活性ガスをバブリングすることによってバイアル内を不活性雰囲気とした後に、バイアルの外部から紫外線照射装置を用いて紫外線を照射する。
【００８８】
溶媒としては、例えば、ベンゼン、トルエン、クロロホルム、メタノール、水、等が挙げられ、特に、溶解力の点、及び重合に不活性である点から、ベンゼン、トルエンが好ましい。これらは、１種単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００８９】
この工程では、例えば、透明な密封バイアルに、上記第一混合物を加え、不活性ガスをバブリングすることによってバイアル内を不活性雰囲気とした後に、バイアルの外部から紫外線照射装置を用いて紫外線を照射する。
【００９０】
紫外線の波長としては、２１０〜６００ｎｍであることが好ましく、３６０〜３８０ｎｍであることが更に好ましい。上記範囲とすれば、効率よく重合反応を進行させることができ、所期の共重合割合を有する高分子材料を安定的に得ることができる。また、製造したポリマー材料が着色することを防ぐこともできる。
紫外線の照射強度としては、０．０１〜５０ｍＷ／ｃｍ２であることが好ましく、０．１〜５ｍＷ／ｃｍ２であることが更に好ましい。
不活性ガスとしては、窒素、アルゴン、ヘリウム、ネオン等が挙げられる。
【００９１】
温度条件としては、１０〜４０℃あることが好ましく、２０〜３０℃あることが更に好ましい。上記範囲とすれば、通常の実験室の室温において重合反応を行うことを可能とすることができ、また、光照射という手段とは別の加熱という手段での反応制御を可能とすることもできる。
反応時間としては、反応時間としては、１０分〜４８時間であることが好ましく、６０分〜２４時間であることが更に好ましい。
【００９２】
この工程において、ＮＩＰＡＭは、紫外線の照射により、ラジカル重合して、ポリマー（ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（ＰＮＩＰＡＭ））となり、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドを含むホモポリマーブロックが形成される。他のモノマーも用いた場合には、ＮＩＰＡＭと他のモノマーとを含むポリマーブロックが形成される。
【００９３】
次いで、（Ｂ）の温度応答性ポリマーの製造方法では、第一重合工程後の第一混合物にカチオン性モノマーとアニオン性モノマーとを添加して第二混合物を調製する（添加工程）。
ここで、第二混合物は、第一重合工程後の第一混合物、カチオン性モノマー、及びアニオン性モノマー以外に、例えば、他のモノマー、溶媒、連鎖移動剤、安定剤、界面活性剤等を含んでよい。
また、カチオン性モノマーとアニオン性モノマーとは、不活性雰囲気下において、添加されてよい。
【００９４】
この工程では、例えば、バイアルに不活性ガスをフローさせることによってバイアル内を不活性雰囲気に保ちながら、上記カチオン性モノマーとアニオン性モノマーとを添加する。
【００９５】
この工程において、重合中のＮＩＰＡＭを含むホモポリマーに加えて、カチオン性モノマー及びアニオン性モノマーも重合系に含められることとなり、バイアル内の重合系が、ＮＩＰＡＭの単独重合系から、ＮＩＰＡＭとカチオン性モノマーとアニオン性モノマーとの共重合系に、変わることとなる。
【００９６】
そして、（Ｂ）の温度応答性ポリマーの製造方法では、第二混合物に紫外線を照射する（第二重合工程）。
ここで、紫外線は、不活性雰囲気下において、照射されてよい。
【００９７】
この工程では、例えば、カチオン性モノマーとアニオン性モノマーとを添加した後のバイアルの外部から紫外線照射装置を用いて紫外線を照射する。
【００９８】
紫外線の波長としては、２１０〜６００ｎｍであることが好ましく、３６０〜３８０ｎｍであることが更に好ましい。上記範囲とすれば、効率よく重合反応を進行させることができ、所期の共重合割合を有する高分子材料を安定的に得ることができる。また、製造したポリマー材料が着色することを防ぐこともできる。
紫外線の照射強度としては、０．０１〜５０ｍＷ／ｃｍ２であることが好ましく、０．１〜５ｍＷ／ｃｍ２であることが更に好ましい。
不活性ガスとしては、窒素、アルゴン、ヘリウム、ネオン等が挙げられる。
【００９９】
温度条件としては、１０〜４０℃あることが好ましく、２０〜３０℃あることが更に好ましい。上記範囲とすれば、通常の実験室の室温において重合反応を行うことを可能とすることができ、また、光照射という手段とは別の加熱という手段での反応制御を可能とすることもできる。
反応時間としては、反応時間としては、１０分〜４８時間であることが好ましく、６０分〜２４時間であることが更に好ましい。
【０１００】
この工程において、ＮＩＰＡＭとカチオン性モノマーとアニオン性モノマーとが、紫外線の照射により、ラジカル重合して、第一重合工程において形成したＮＩＰＡＭを含むホモポリマーブロックの重合鎖α末端に連続する形態で、ＮＩＰＡＭとカチオン性モノマーとアニオン性モノマーとを含むコポリマーブロックが形成される。他のモノマーも用いた場合には、ＮＩＰＡＭと他のモノマーとを含むポリマーブロック、及び／又は、ＮＩＰＡＭとカチオン性モノマーとアニオン性モノマーと他のモノマーとを含むコポリマーブロックが形成される。
【０１０１】
上記の通り、ＮＩＰＡＭを含むホモポリマーブロックと、ＮＩＰＡＭとカチオン性モノマーとアニオン性モノマーとのコポリマーブロックとを含む温度応答性ポリマーが得られる。
【０１０２】
なお、この一例の製造方法では、効率的な反応を実現する観点から、第一重合工程、添加工程、及び第二重合工程に亘って紫外線を照射することが好ましい。
【０１０３】
（Ｂ）の温度応答性ポリマーの製造方法の別の例は、ラジカル重合を用いる方法であり、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）と、カチオン性モノマーと、アニオン性モノマーと、任意選択的に他のモノマーを含む混合物に紫外線を照射する。
ここで、上記混合物は、例えば、溶媒、連鎖移動剤、安定剤、界面活性剤等を含んでよい。
また、紫外線は、不活性雰囲気下において、照射されてよい。
他の条件については、前述の一例の製造方法と同様としてよい。
【０１０４】
更には、イニファーター重合を用いる場合、イニファーターとして、ベンジル−（Ｎ，Ｎ−ジエチル）ジチオカルバメートを、溶媒として、トルエン等を用いてよく、近紫外線の照射によりリビング重合を行ってよい。ここで、１番目のモノマーによる重合後、単離操作を経て、２番目のモノマーによる重合を行うことによって、ブロック共重合体を得ることができる。
【０１０５】
更には、イオン重合を用いる場合、触媒として、ＮａＯＨ粉末を、溶媒として、精製に用いられる再沈殿用溶媒と共に非プロトン系溶媒を用いてよい。１番目のモノマーによる重合後、再沈殿操作（この操作後もω末端にイオン種が残る）を経て、２番目のモノマーによる重合を行うことによって、ブロック共重合体を得ることができる。
【０１０６】
（温度応答性ポリマー）
（Ｂ）の温度応答性ポリマーは、上記（Ｂ）の製造方法により製造される。
【０１０７】
（Ｂ）の温度応答性ポリマーは、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）単位と、カチオン性モノマー単位と、アニオン性モノマー単位とを含み、任意選択的に、他のモノマー単位を含む。本ポリマーは、前述の一例、別の例の製造方法により製造することができる。
好適には、（Ｂ）の温度応答性ポリマーは、主としてＮ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）単位を含み、任意選択的に他のモノマー単位を含むポリマーブロック（重合鎖α末端）と、主としてカチオン性モノマー単位と、アニオン性モノマー単位とを含み、任意選択的に他のモノマー単位を含むコポリマーブロックとを含む。更に好適には、（Ｂ）の温度応答性ポリマーは、ＮＩＰＡＭのホモポリマーブロックと、ＮＩＰＡＭとカチオン性モノマーとアニオン性モノマーとのコポリマーブロックとを含み、特に好適には、これらブロックからなる。本ポリマーは、前述の一例の製造方法により製造することができる。
【０１０８】
従来の温度応答性ポリマーのうちの１つ（特開２０１４−１６２８６５号公報参照）では、ポリマーに温度応答性を与えるＤＭＡＥＭＡが、同時に、（アニオン性モノマーと共に）細胞構造体の形成に必要となるカチオン性モノマーであり、また、温度応答性に関わるＤＭＡＥＭＡは、ポリマーブロックとして重合鎖α末端に含まれている。
かかる温度応答性ポリマーでは、重合鎖α末端に必ずカチオン性モノマーが存在することから、重合鎖中におけるカチオン性サイトの位置の調整の自由度が高くはなく、また、カチオン性モノマーが主としてＤＭＡＥＭＡに限られることから、カチオン性サイトの陽電荷強度の調整や、温度応答性ポリマー水溶液のｐＨの調整も必ずしも容易とは言えなかった。
そして、上記温度応答性ポリマーを、例えば、温度応答性ポリマーを薬物送達（ＤＤＳ）に用いた場合、担持可能な薬剤の種類や量が限られる可能性があった。ＤＤＳの手法としては、例えば、細胞培養器に薬剤を担持させた温度応答性ポリマーを塗布して、塗布後の細胞培養器で細胞や組織を培養することによって、被覆物から細胞・組織に対して薬剤を徐放するといった手法等が挙げられる。ここで、上記従来の温度応答性ポリマーでは、陽電荷強度が小さいＤＭＡＥＭＡを含むため、アニオン性物質の薬剤の担持は必ずしも容易とは言えず、担持可能な薬剤の種類や量が限られる可能性があった。
【０１０９】
一方、（Ｂ）の温度応答性ポリマーでは、ポリマーに温度応答性を与えるＮＩＰＡＭは中性のモノマーであり、（アニオン性モノマーと共に）細胞構造体の形成に必要となるカチオン性モノマーはＮＩＰＡＭとは異なるモノマーである。
（Ｂ）の温度応答性ポリマーでは、重合鎖α末端に必ずしもカチオン性モノマーが存在する必要はなく、重合鎖中におけるカチオン性サイトの位置を自由に調整することが可能であり、また、広範なカチオン性モノマーを用いることができるため、カチオン性サイトの陽電荷強度や温度応答性ポリマー水溶液のｐＨを容易に調整することが可能である。
（Ｂ）の温度応答性ポリマーによれば、例えば、温度応答性ポリマーを薬物送達（ＤＤＳ）に用いた場合、担持可能な薬剤の種類を拡大しつつ、その量を増加させることが可能となり、ひいては、温度応答性ポリマーの応用範囲を拡大することができる。
【０１１０】
（Ｂ）の温度応答性ポリマーでは、ＮＩＰＡＭ単位の、ＮＩＰＡＭ単位、カチオン性モノマー単位、アニオン性モノマー単位の合計に対する割合（モル）が、０．６〜０．９であることが好ましく、０．７〜０．９であることが更に好ましく、０．９であることが特に好ましい。
他のモノマーも用いた場合には、他のモノマー単位の、ＮＩＰＡＭ単位、カチオン性モノマー単位、アニオン性モノマー単位の合計に対する割合（モル）が、０．００１〜０．２であることが好ましく、０．０１〜０．１であることが更に好ましい。
【０１１１】
（Ｂ）の温度応答性ポリマーとしては、重合鎖α末端のポリマーブロック（例えば、ＮＩＰＡＭのホモポリマーブロック）の数平均分子量が５０００Ｄａ以上であることが好ましく、２００００Ｄａ以上であることが更に好ましい。
【０１１２】
（Ｂ）の温度応答性ポリマーとしては、数平均分子量（Ｍｎ）が、１０〜５００ｋＤａである分子が好ましい。また、重量平均分子量（Ｍｗ）と数平均分子量（Ｍｎ）との比（Ｍｗ／Ｍｎ）は、１．１〜１０．０である分子が好ましい。
温度応答性ポリマーの分子量は、重合条件により、適宜調整することができる。
【０１１３】
（Ｂ）の温度応答性ポリマーによれば、曇点を、例えば室温（２５℃）以下に、低下させることができる。
【０１１４】
上記温度応答性ポリマーでは、曇点以上の温度で形成された温度応答性ポリマーの不溶化物が、室温（約２５℃）条件下で再溶解するまでの時間が顕著に遅延する。これは、得られた温度応答性ポリマーは、分子内にカチオン性官能基とアニオン性官能基とが存在するため、高い自己凝集性を有するためであると推定される。
【０１１５】
特に、前述の（Ｂ）の温度応答性ポリマーは、重合鎖α末端に、高分子量を有するＮＩＰＡＭのホモポリマーブロックを備えるため、ＮＩＰＡＭの側鎖の温度依存的なグロビュール転移が生じやすく、曇点を効果的に低減することが可能となると考えられる。
【０１１６】
また、この温度応答性ポリマーを用いて、後述するように、培養面にこの温度応答性ポリマーを被覆してなる細胞培養器を調製することができる。
【０１１７】
更に、（Ｂ）の温度応答性ポリマーによれば、後述するように、細胞を適切な培養条件で培養することにより、管腔状（チューブ状）や塊状（ペレット状）等の構造を有する細胞構造体を形成させることができる。
【０１１８】
（Ｂ）の温度応答性ポリマーが有する、カチオン性官能基の官能基数と、アニオン性官能基の官能基数との比（Ｃ／Ａ比）は、０．５〜３２であることが好ましく、４〜１６であることが更に好ましい。
【０１１９】
Ｃ／Ａ比を上記範囲とすれば、曇点を低減させるという上記効果が得られやすい。上記Ｃ／Ａ比を有する温度応答性ポリマーでは、上記温度応答性ポリマー中でカチオン性官能基とアニオン性官能基とが、イオン結合的に分子間及び／又は分子内の凝集に作用して、温度応答性ポリマーの凝集力が強くなった結果であると推測される。
【０１２０】
また、Ｃ／Ａ比を上記範囲とすれば、上記温度応答性ポリマー中の正電荷と負電荷とのバランスを特に好適にして、正電荷による細胞傷害性を抑制することができ、また、上記温度応答性ポリマーの親水性と疎水性とのバランスを特に好適にして、細胞の遊走や配向を生じやすくすることができるものと推定される。
【０１２１】
以下、上記（Ｃ）の温度応答性ポリマー及びその製造方法について記載する。
【０１２２】
（温度応答性ポリマー組成物の製造方法）
（Ｃ）の温度応答性ポリマー組成物の製造方法は、まず、混合型温度応答性ポリマー組成物を調製する（混合物調製工程）。具体的には、（Ｃ１）２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）及び／又はその誘導体の重合体と、（Ｃ２）２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール（トリス）と、（Ｃ３）核酸、ヘパリン、ヒアルロン酸、デキストラン硫酸、ポリスチレンスルホン酸、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリリン酸、硫酸化多糖類、カードラン及びポリアルギン酸並びにこれらのアルカリ金属塩からなる群から選択される一種以上のアニオン性物質とを混合する。なお、（Ｃ２）トリスは任意選択的な成分である。
【０１２３】
（温度応答性ポリマー組成物）
（Ｃ）の温度応答性ポリマー組成物は、上記の通り、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又はその誘導体の重合体と、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオールと、核酸、ヘパリン、ヒアルロン酸、デキストラン硫酸、ポリスチレンスルホン酸、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリリン酸、硫酸化多糖類、カードラン及びポリアルギン酸並びにこれらのアルカリ金属塩からなる群から選択される一種以上のアニオン性物質とを含む。
【０１２４】
（Ｃ１）のＤＭＡＥＭＡ及び／又はその誘導体の重合体は、温度応答性ポリマーであり、その曇点は３２℃である。（Ｃ２）のトリスは、曇点の若干の低下、及び／又は曇点よりも高温で形成されたポリマーが、曇点以下に冷却された際に再溶解する速度を低減させる役割を果たし、また、疎水化されたポリマー層中でも親水性を維持しながら、アミノ基に由来する陽電荷により細胞に刺激を与える役割を果たすと推定される。（Ｃ３）のアニオン性物質は、培養する細胞の遊走や配向を可能にする役割や細胞傷害性を抑制する役割を果たすと推定される。
【０１２５】
この混合型温度応答性ポリマー組成物によれば、曇点を室温（２５℃）以下に低減させることができる。
上記組成物では、ＤＭＡＥＭＡ及び／又はその誘導体の重合体の側鎖とトリスとが、互いに相互作用（例えば、架橋する作用）して、上記重合体が凝集しやすくなっていると推定される。
【０１２６】
ここで、上記（Ｃ１）について、ＤＭＡＥＭＡ及び／又はその誘導体の重合体としては、数平均分子量（Ｍｎ）が、１０〜５００ｋＤａである分子が好ましい。また、重量平均分子量（Ｍｗ）と数平均分子量（Ｍｎ）との比（Ｍｗ／Ｍｎ）は、１．１〜６．０である分子が好ましい。
【０１２７】
また、（Ｃ１）のＤＭＡＥＭＡの誘導体としては、例えば、メタクリレートのメチル基の水素原子をハロゲン置換した誘導体、メタクリレートのメチル基を低級アルキル基で置換した誘導体、ジメチルアミノ基のメチル基の水素原子をハロゲン置換した誘導体、ジメチルアミノ基のメチル基を低級アルキル基で置換した誘導体が挙げられる。
【０１２８】
上記（Ｃ２）について、トリスは、純度９９．９％以上の純物質であるか、又は、トリス水溶液を、アルカリ性物質の添加等により、使用時に中性又は塩基性とすることが好ましい。トリスは、塩酸塩の状態で市販されているところ、これを用いた場合には、トリス水溶液のｐＨが下がるため、組成物の曇点が７０℃程度にまで上昇してしまう。そのため、トリス塩酸塩は好ましくない。
【０１２９】
上記（Ｃ３）に列挙したアニオン性物質のうち、核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、その他１本鎖、２本鎖、オリゴ体、ヘアピンなどの人工核酸等が挙げられる。
【０１３０】
また、上記（Ｃ３）に列挙したアニオン性物質は、ある程度の大きさ、例えば１〜５，０００ｋＤａの分子量（Ｍ）を有していることが好ましい。
分子量を上記範囲とすれば、アニオン性物質は、カチオン性物質とイオン結合して、カチオン性物質を、長時間捕捉する役割を果たすことができ、安定したイオン複合体微粒子を形成させることがでる。また、一般的にカチオン性物質が有する、細胞の細胞膜表面に対する静電的相互作用に起因する細胞傷害性を緩和することもできる。
【０１３１】
（Ｃ３）に列挙したアニオン性物質の他にも、例えば、カチオン性ポリマーであるポリ（４−アミノスチレン）の４−位のアミノ基に対してシュウ酸などのジカルボン酸を脱水縮合させることによって、アニオン性官能基を導入した、実質的にアニオン性物質として機能するポリマー誘導体も、用いることができる。
【０１３２】
なお、上記（Ｃ３）に列挙したアニオン性物質は、二種以上含まれていてもよい。
【０１３３】
ここで、（Ｃ１）２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）及び／又はその誘導体の重合体に対する、（Ｃ２）２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール（トリス）の割合（（Ｃ２）／（Ｃ１））が、１．０以下とした混合型温度応答性ポリマー組成物を用いることが好ましい。
なお、割合（（Ｃ２）／（Ｃ１））は、重量割合であるものとする。
【０１３４】
上記割合の混合型温度応答性ポリマー組成物を用いた場合、後述の培養工程で、細胞構造体を形成しやすくすることができる。
この組成物によれば、上記組成物の親水性と疎水性とのバランスを更に好適にすることができる。そして、この好適なバランスが、培養面への細胞の接着性を好適に調整し、細胞の遊走や配向を活性化していると推定される。
【０１３５】
また、上記割合（（Ｃ２）／（Ｃ１））は、０．１以上あることが好ましい。
上記割合を０．１以上とすることにより、曇点を低減させるという上記効果が得られやすい。また、細胞構造体を形成しやすくするという上記効果が得られやすい。
【０１３６】
上記と同様の理由により、上記割合（（Ｃ２）／（Ｃ１））は、０．１〜０．５であることが更に好ましい。
【０１３７】
ここで、混合型温度応答性ポリマー組成物中のＣ／Ａ比（正電荷／負電荷）が、０．５〜１６であることが好ましい。
なお、本願明細書では、Ｃ／Ａ比とは、組成物中に含まれる物質が有する正電荷の、組成物中に含まれる物質が有する負電荷に対する割合を指す。具体的には、Ｃ／Ａ比は、（Ｃ１）ＤＭＡＥＭＡ及び／又はその誘導体の重合体のモル数をＮ１、（Ｃ３）アニオン性物質のモル数をＮ３としたときに、｛（重合体１分子当たりの正電荷）×Ｎ１｝／｛（アニオン性物質１分子当たりの負電荷）×Ｎ３｝という式で表される。
またなお、本願明細書では、アニオン性物質をＤＮＡとした場合、アニオン性物質１分子当たりの負電荷数は、ＤＮＡの塩基対の数（ｂｐ数）×２で計算し、分子量（Ｄａ）は、ｂｐ数×６６０（ＡＴペア及びＣＧペアの平均分子量）で計算するものとする。
【０１３８】
Ｃ／Ａ比を０．５〜１６とすることにより、管状細胞構造体を形成させやすくするという上記効果が得られやすくなる。
上記組成物中の正電荷と負電荷とのバランスを好適にして、正電荷による細胞傷害性を抑制することができると推定される。また、上記組成物の親水性と疎水性とのバランスを更に好適にして、細胞の遊走や配向を生じやすくすることができると推定される。
【０１３９】
上記と同様の理由により、上記Ｃ／Ａ比は、２〜１０とすることが更に好ましく、特にＣ／Ａ比は８付近であることが最も好ましい。
【０１４０】
（準備工程）
一例の製造方法では、次いで、細胞培養器の培養面に、温度応答性ポリマー及び／又は温度応答性ポリマー組成物で被覆された第一被覆領域と、第一被覆領域の端部に設けられた、細胞接着性物質で被覆された複数の第二被覆領域とを準備する（準備工程）（図１（ｉ）〜（ｉｉｉ）参照）。
【０１４１】
ここで、第一被覆領域及び第二被覆領域以外の培養面は、細胞接着性としても、細胞非接着性としてもよいが、所望の形状の細胞構造体を得られやすくする観点から、細胞非接着性とすることが好ましい。
細胞非接着性の培養面の調製方法は、特に限定されることなく、例えば、細胞非接着性の培養面を備える細胞培養器、例えば、ＳＵＭＩＬＯＮ社製のＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ（登録商標）を用いてもよく、細胞非接着性のシートや中敷き等を用いてもよく、未処理のポリスチレン製の培養面を備える細胞培養器を用いてもよい。
【０１４２】
ここで、図１に示すように、第一被覆領域及び第二被覆領域は、細胞培養器の壁との接触を抑制して、細胞構造体の形状を整える観点から、非被覆領域（培養面に特に被覆が施されていない領域）に取り囲まれるように設けられることが好ましい（図１（ｉｉ）、（ｉｉｉ）参照）。
【０１４３】
第一被覆領域の面積は、特に限定されないが、例えば、Φ３５ｍｍの細胞培養器の培養面を用いて、１〜３０ｍｍサイズの細胞構造体を製造する場合、１〜７５０ｍｍ２としてよく、好ましくは１０〜７００ｍｍ２である。
【０１４４】
第一被覆領域の形状は、特に限定されることなく、平面視で、円形（円、楕円等）、矩形（正方形、長方形、三角形等）、線形としてよく、矩形は角が丸みを帯びていてもよい。
中でも、上記形状は、細胞の凝集様式を制御する観点から、所定方向に延びる形状、より具体的には、長軸方向及び短軸方向が存在する形状、外輪郭線上の任意の２点間の距離に最大及び最小が存在する形状が好ましく、長方形が更に好ましい。
【０１４５】
第一被覆領域の形状が矩形である場合、そのアスペクト比（長辺長：短辺長）としては、１〜５０としてよく、５〜５０が好ましく、より好ましくは１０〜５０である。
【０１４６】
第一被覆領域の形状が長方形である場合、細胞構造体の形状を制御する観点から、その幅は０．１〜５０ｍｍであることが好ましく、より好ましくは０．１〜３０ｍｍであり、その長さは０．１〜１５０ｍｍであることが好ましく、より好ましくは０．１〜１００ｍｍである。
【０１４７】
第一被覆領域表面のゼータ電位としては、０〜５０ｍＶが好ましく、より好ましくは０〜３５ｍＶ、更に好ましくは１０〜２５ｍＶである。ゼータ電位が０ｍＶ以上であることにより、負に帯電する細胞が接着しやすくなる。また、ゼータ電位が５０ｍＶ以下であることにより、細胞毒性を軽減することができる。
また、ゼータ電位を上記範囲とすることにより、細胞を適切な培養条件で培養するだけで、塊状（ペレット状）の構造を有する細胞構造体を一層簡便に作製させることができる。これは、表面ゼータ電位を上記範囲とすることによって、第一被覆領域表面に細胞毒性を惹起しない微弱な陽電荷を与えることができ、また、播種した細胞の速やかな接着を確保し、細胞の活性の向上及び細胞外マトリックスの分泌を促進し、更には、細胞遊走を適度に抑制して、細胞間の結合を強くすることができることによるものと推測される。
なお、ゼータ電位とは、ポリスチレンラテックスをヒドロキシプロピルセルロースで被覆した粒子（ゼータ電位：−５〜＋５ｍＶ）を標準のモニター粒子として、ゼータ電位計（例えば、型番「ＥＬＳＺ」、大塚電子社製等）で測定した、Ｓｍｏｌｕｃｈｏｗｓｋｉ式により算出される値をいう。
【０１４８】
第一被覆領域表面に対する水の接触角としては、本発明の効果を高める観点から、５０〜９０°が好ましく、より好ましくは６０〜８０°、更に好ましくは６２〜７８°である。
なお、第一被覆領域に対する水の接触角とは、被覆領域内の任意の数点において、ＪＩＳ  Ｒ  ３２５７に準拠して測定される接触角の平均値をいう。
【０１４９】
第二被覆領域に被覆される細胞接着性物質としては、ラミニン、コラーゲン、フィブロネクチン、ペプチド、カチオン性ポリマー、ポリスチレン等が挙げられる。上記ペプチドとしては、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸の配列を有するペプチド、アルギニン残基が８個以上連続する配列を有するペプチド等が挙げられる。上記カチオン性ポリマーとしては、アミノスチレン等が挙げられる。これらの中でも、細胞接着性が高い、ラミニン、コラーゲン、フィブロネクチンが好ましい。
また、上記列挙の細胞接着性物質を含む試薬も好適に用いることができ、かかる試薬としては、血清等が挙げられる。
上記細胞接着性物質は、１種単独で用いてもよく、複数種を併用してもよい。
【０１５０】
第二被覆領域の面積は、特に限定されないが、例えば、Φ３５ｍｍの細胞培養器の培養面を用いて、１〜３０ｍｍサイズの細胞構造体を製造する場合、０．１〜７５ｍｍ２としてよく、好ましくは０．１〜１０ｍｍ２である。
【０１５１】
第二被覆領域の形状は、特に限定されることなく、平面視で、円形（円、楕円等）、矩形（正方形、長方形、三角形等）としてよく、矩形は角が丸みを帯びていてもよい。
中でも、上記形状は、細胞が凝集する際に第二被覆領域に接着した細胞にかかる力を緩和する観点から、円形が好ましい。
【０１５２】
第二被覆領域の形状が円形である場合、細胞構造体の形状を制御する観点から、その直径は０．１〜５０ｍｍであることが好ましく、より好ましくは０．１〜１０ｍｍである。
【０１５３】
上記第二被覆領域の面積（Ｓ２）の上記第一被覆領域の面積（Ｓ１）に対する割合（Ｓ２／Ｓ１）は、特に限定されないが、細胞の凝集様式を制御しやすくする観点から、０．００１〜１．０であることが好ましく、より好ましくは０．０１〜０．５である。
【０１５４】
本実施形態では、第一被覆領域と第二被覆領域とは、互いに重なり合っていてもよく、互いの外輪郭線が接していてもよく、互いの最短距離で０．１〜１０ｍｍだけ離間していてもよい。
なお、第一被覆領域の培養面における位置、及び第二被覆領域の培養面における位置は、それぞれの重心の位置としてよい。
【０１５５】
本実施形態では、第二被覆領域は第一被覆領域の端部に設けられていればよく、ここで、端部とは、第一被覆領域の外輪郭線から内側へ０．０１〜１ｍｍの領域をいう。
【０１５６】
本実施形態では、第一被覆領域の端部に設けられる第二被覆領域の数は、複数であれば特に限定されることなく、３以上、４以上等としてもよい。なお、複数の第二被覆領域間において、被覆される細胞接着性物質は、同じであってもよく、異なっていてもよい。
【０１５７】
図２（ａ）〜（ｃ）に、本実施形態における第一被覆領域と第一被覆領域との配置態様について示す。
図２（ａ）（ｉ）及び図１（ｉ）〜（ｖｉｉｉ）に示す例では、第一被覆領域を平面視で円形とし、第二被覆領域を、円形の第一被覆領域の両端部に、第一被覆領域と重ねながら、配置している。
本実施形態では、円形の第一被覆領域の端部に、第二被覆領域を、第一被覆領域と重ねながら、３箇所配置してもよく（図２（ａ）（ｉｉ）参照）、４箇所配置してもよい（図２（ａ）（ｉｉｉ）参照）。
また、本実施形態では、図２（ｂ）に示すように、角が丸みを帯びた長方形の第一被覆領域の両端部に、第二被覆領域を、第一被覆領域と重ねながら、配置してもよい。
更に、本実施形態では、図２（ｃ）に示すように、所望の形状の第一被覆領域の複数（図では５箇所）の端部に、第二被覆領域を、第一被覆領域と重ねながら、配置してもよい。
【０１５８】
なお、図１に示す一例の細胞構造体の製造方法では、準備工程を、細胞培養器（図１（ｉ）参照）の培養面の中央部分に、平面視で円形の形状を描きながら、上記温度応答性ポリマー及び／又は上記温度応答性ポリマー組成物を塗布し（図１（ｉｉ）参照）、塗布部分を乾燥する（図１（ｉｉｉ）参照）ことによって、第一被覆領域を設け、その後、この円形の第一被覆領域の中心を通る直線上に位置し、第一被覆領域の端部に位置する２箇所に、平面視で円形の形状を描きながら、細胞接着性物質を塗布し（図１（ｉｉ）参照）、塗布部分を乾燥する（図１（ｉｉｉ）参照）ことによって、第二被覆領域を設けている。
【０１５９】
上記準備工程は、例えば、温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物を、溶媒に溶解して、温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物を含む溶液（温度応答性ポリマー溶液）としてから、細胞培養器の培養面上に塗布し、乾燥させて被覆細胞培養器を準備する工程（準備工程Ｉ）としてもよく、また、温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物を含む水溶液（温度応答性ポリマー水溶液）を温度応答性ポリマーの曇点以下に冷却し、冷却した温度応答性ポリマー水溶液を細胞培養器の培養面上に流延させ、曇点超の温度まで加熱して、被覆細胞培養器を準備する工程（準備工程ＩＩ）としてもよい。
【０１６０】
上記準備工程Ｉにおける温度応答性ポリマー溶液における溶媒としては、例えば、水；生理食塩水；緩衝液；メタノール、エタノール、ｎ−プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、１−ブタノール、イソブチルアルコール、２−ブタノール、ｔ−ブチルアルコール、１−ペンタノール、２−ペンタノール、３−ペンタノール、２−メチル−１−ブタノール、３−メチル−１−ブタノール、２−メチル−２−ブタノール、３−メチル−２−ブタノール、２，２−ジメチル−１−プロパノール、１−ペンタノール、２−ペンタノール、３−ペンタノール、２−メチル−１−ブタノール、３−メチル−１−ブタノール、２−メチル−２−ブタノール、３−メチル−２−ブタノール、２，２−ジメチル−１−プロパノール、１−ヘキサノール、２−メチル−２−ペンタノール、アリルアルコール、ベンジルアルコール、サリチルアルコール等のアルコール；アセトン、エチルメチルケトン、ジエチルケトン、メチルプロピルケトン、メチルイソブチルケトン、メチルビニルケトン、シクロヘキサノン、２−メチルシクロペンタノン、アセトフェノン、ベンゾフェノン、イソホロン等のケトン；酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸イソプロピル、酢酸ｎ−ブチル、酢酸イソブチル、酢酸ｓｅｃ−ブチル、酢酸ｔｅｒｔ−ブチル、酢酸ビニル、ギ酸メチル、ギ酸エチル、ギ酸プロピル、上記アルコールとリン酸のエステル、上記アルコールと炭酸のエステル等のエステル；クロロホルム；ベンゼン；トルエン；ジエチルエーテル；ジクロロメタン；等が挙げられる。
中でも、培養面に均一に被覆しやすく、また、温度応答性ポリマーの溶解性に優れるという観点から、メタノール、エタノール、ｎ−プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、２−ブタノール、ｔ−ブチルアルコール、アリルアルコール等のアルコール；アセトン、エチルメチルケトン、ジエチルケトン、メチルビニルケトン等のケトン；酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸イソプロピル、酢酸ｔｅｒｔ−ブチル、酢酸ビニル等のエステル；クロロホルム；ベンゼン；トルエン；ジエチルエーテル；ジクロロメタンが好ましい。また、短時間で乾燥させることができ、培養面に一層均一に塗布しやすいという観点から、沸点が低い有機溶媒（例えば、炭素数１〜４の低級アルコール、炭素数３〜５の低級ケトン、及び炭素数１〜４のアルキル基を有する酢酸アルキルエステルからなる群より選ばれる少なくとも１種、特に、水より沸点が低い、炭素数１〜４の低級アルコール、炭素数３〜５の低級ケトン、及び炭素数１〜４のアルキル基を有する酢酸アルキルエステルからなる群より選ばれる少なくとも１種）がさらに好ましく、コスト、操作性にも優れる観点から、メタノール、エタノールが特に好ましい。
上記溶媒は、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
溶媒は、温度応答性ポリマーの溶解性に優れるため、曇点以上の温度（例えば、室温や３７℃など）にしても、温度応答性ポリマーが不溶化して沈殿しにくい。そのため、温度応答性ポリマーを塗布する際に、温度応答性ポリマー溶液の温度管理をする手間が省け、簡易に被覆細胞培養器を準備することができる。
【０１６１】
上記準備工程Ｉにおいて、温度応答性ポリマー溶液には、細胞が自己凝集しやすくなるという観点から、親水性分子が含まれることが好ましい。親水性分子としては、温度応答性ポリマーのＣ／Ａ比に影響しない非イオン性かつ親水性であるもの、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ジメチルアクリルアミド（ＤＭＡＡ）、グリセリン、ＴｒｉｔｏｎＸ、ポリプロピレングリコール等が挙げられる。
【０１６２】
上記準備工程Ｉにおいて、温度応答性ポリマー溶液中の温度応答性ポリマーの含有量は、温度応答性ポリマーが培養面に均一に被覆されやすくなるという観点から、温度応答性ポリマー溶液（１００重量％）に対して、０．０００７５〜０．０１５重量％であることが好ましく、０．００１〜０．０１重量％であることがより好ましい。
【０１６３】
上記準備工程Ｉにおいて、温度応答性ポリマー溶液中の親水性分子の含有量は、細胞が自己凝集しやすくなるという観点から、温度応答性ポリマー（１００重量％）に対して、０．００００１〜０．０００１５重量％であることが好ましく、０．００００３〜０．０００１重量％であることがより好ましい。
【０１６４】
上記準備工程Ｉにおいて、温度応答性ポリマー溶液は、温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物が培養面に均一に被覆されやすくなるという観点から、水が含まれないことが好ましく、温度応答性ポリマー溶液（１００重量％）中の水の重量割合が０．５重量％以下であることがより好ましく、０．１重量％以下であることがさらに好ましい。
なお、水の重量割合は、ガスクロマトグラフィー、カールフィッシャー法など当業者に周知の方法により測定可能である。
【０１６５】
上記準備工程Ｉにおいて、温度応答性ポリマー溶液は、培養面の全面に塗布してもよいし、培養面の一部に塗布してもよい。中でも、簡易に細胞構造体が得られるという観点から、培養面の全面に塗布することが好ましい。
【０１６６】
上記準備工程Ｉにおいて、塗布した温度応答性ポリマー溶液を乾燥させる条件としては、培養面に温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物を均一に被覆する観点から、大気圧下、温度１０〜７０℃、時間１〜３，０００分が好ましい。塗布した温度応答性ポリマー溶液を、素早く乾燥させることにより、培養面上に温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物が偏ることなく、均一に被覆されやすくなる。
塗布した温度応答性ポリマー溶液は、例えば、細胞培養器を３７℃のインキュベーター中で静置することによって乾燥させてもよい。
【０１６７】
上記準備工程ＩＩにおいて、温度応答性ポリマー又は温度応答性ポリマー組成物を溶解する溶媒としては、例えば、水；生理食塩水；リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、トリス緩衝液等の緩衝液；等が挙げられる。
【０１６８】
上記準備工程ＩＩにおいて、温度応答性ポリマー水溶液を冷却する方法としては、例えば、温度応答性ポリマー水溶液を約４℃の冷蔵庫に入れて曇点以下の温度まで冷却する方法等が挙げられる。
【０１６９】
上記準備工程ＩＩにおいて、温度応答性ポリマー水溶液を培養面上に流延させる方法としては、例えば、曇点以下の温度を有する温度応答性ポリマー水溶液を、細胞培養器の培養面を傾けることによって伸ばす方法、スパチュラを用いて温度応答性ポリマー水溶液を延ばす方法等が挙げられる。
【０１７０】
上記準備工程ＩＩにおいて、流延した温度応答性ポリマー水溶液を曇点超まで加熱する方法としては、例えば、流延工程後の細胞培養器を３７℃のインキュベーター中で静置する方法等が挙げられる。
【０１７１】
本実施形態の細胞培養方法では、準備工程において、第一被覆領域及び第二被覆領域が占める領域を、細胞非接着性の壁で囲むことが好ましく、具体的には、下記の変形例が挙げられる。
なお、細胞非接着性とは、付着細胞が接着しない又は接着しにくいことをいう。
かかる態様によれば、後述の播種培養工程において、播種される細胞と凹部の壁面との接着を抑制して、細胞の凝集様式を制御することが容易となり、所望の配向性を有する細胞構造体をより精密に製造することが可能となる。
【０１７２】
図３に、準備工程の変形例及びこれに続く播種培養工程の概略を示す。
準備工程の変形例では、細胞培養器の培養面に、図１における第一被覆領域及び第二被覆領域の形状をなすような平面視形状（大サイズの円、及びその端部２箇所に配置された小サイズの円）の凹部を彫り込む（図３参照）。
そして、この変形例の準備工程では、彫り込んだ凹部の底面のみに温度応答性ポリマー及び／又は上記温度応答性ポリマー組成物、並びに細胞接着性物質を配置し、凹部の底面以外の面、すわわち、凹部の壁面の表面には、上記ポリマー及び／又は上記ポリマー組成物、並びに細胞接着性物質を配置していない（図３（ｉ）参照）。
かかる変形例によれば、所望の配向性を有する細胞構造体をより精密に製造することができる（図３（ｉｉ）参照）。
【０１７３】
（播種培養工程）
本実施形態における一例の製造方法では、次いで、細胞を第一被覆領域及び第二被覆領域に播種し、細胞を培養することによって、細胞構造体を調製する（播種培養工程）。
【０１７４】
図１に示す例では、播種培養工程を、細胞培養器に細胞及び細胞培養用培地を加え（図１（ｉｖ）参照）、その後、この細胞培養器を一般的な３７℃の細胞インキュベーターに入れ（図１（ｖ）参照）、培地交換により新たな細胞培養用培地を加え（図１（ｖｉ）参照）、細胞培養器を更に細胞インキュベーターに入れる（図１（ｖｉｉ）、（ｖｉｉｉ）参照）ことによって、行っている。
【０１７５】
本実施形態の細胞培養方法に用いることが可能な細胞としては、ＡＤＳＣ、心筋細胞、心筋線維芽細胞、神経細胞、神経芽細胞、線維芽細胞、軟骨細胞、血管内皮細胞、血管間質細胞、平滑筋細胞等が挙げられる。
上記細胞は、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
【０１７６】
播種培養工程において細胞を播種する際の細胞密度は、０．３×１０４個／ｃｍ２以上とすることが好ましく、より好ましくは１．０×１０４個／ｃｍ２以上であり、また、培養中の細胞同士の接触による増殖停止等の、細胞周期に関する問題を生じにくくするため、５．０×１０４個／ｃｍ２以下とすることが好ましく、より好ましくは４．５×１０４個／ｃｍ２以下である。
【０１７７】
播種後の第一被覆領域においては、９０〜１００％コンフルエントが好ましく、より好ましくは９５〜１００％コンフルエント、さらに好ましくは９９〜１００％コンフルエントである。
上記範囲であると、各細胞がそれぞれコロニーを形成せずに、均質分散した状態を維持して凝集して細胞構造体を形成することができる。また、細胞の密度が高いと、播種した細胞が増殖しにくくなり、細胞が増殖する前に塊状の細胞構造体を形成することができる。また、播種した細胞は、増殖する際の性質が変化する場合があるが、細胞が増殖しにくいと、播種時と同じ性質の細胞を含む細胞構造体を形成することができる。
【０１７８】
培養条件は、使用する細胞種や実験目的に基づいて、当業者は適切に定めることができ適宜定めてよく、例えば、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気等としてよい。
【０１７９】
ここで、播種培養工程において生じる現象を、図１を参照しながら、以下に記載する。
この工程においては、まず、播種された細胞が、第一被覆領域及び第二被覆領域上に、沈降する。このとき、第一被覆領域及び第二被覆領域上に沈降した細胞は、被覆領域上に接着して、生存する一方、非被覆領域上に沈降した細胞は、非被覆領域上に接着することなく、死滅する（図１（ｖ）参照）。
次いで、培地交換により、培養面に接着しなかった細胞が細胞培養器から除去される（図１（ｖｉ）参照）。
そして、第一被覆領域及び第二被覆領域に接着した細胞を更に培養すると、第一被覆領域と非被覆領域との境界付近に位置する細胞が、該細胞よりも第一被覆領域の中央部分側に位置する細胞をも伴いながら、中央部分に向かって凝集し始める（図１（ｖｉｉ）参照）。言い換えると、接着していた細胞が、第一被覆領域から遠ざかるように剥離し、第一被覆領域の中央部分に向かって反り返る。
一方で、第二被覆領域に接着した細胞は、第二被覆領域から剥離することなく、当初の位置に接着し続ける（図１（ｖｉｉ）参照）。
最終的に、第一被覆領域に接着していた細胞は、第二被覆領域に接着し続ける２つの細胞集団の間を繋げるように、第一被覆領域の中央部分で、直線状の構造を有する細胞構造体を形成する（図１（ｖｉｉｉ）参照）。
【０１８０】
ここで、播種培養工程において得られた細胞構造体のうち、第一被覆領域に接着していた細胞により形成される部分においては、細胞が、直線状の構造の延在方向に沿って引き伸ばされた形状をなし、２つの第二被覆領域を結ぶ線の方向に沿う方向への配向性を備える。
【０１８１】
こうして得られた細胞構造体を複数用いて、適宜、編み込んだり、連結させたりすることによって、所望の形状の細胞構造体を作製することも可能である。
【０１８２】
また、得られた細胞構造体は、バイアビリティの観点から、可能な限り形成直後に実験等に用いることが好ましく、２４時間以内に使用することが更に好ましい。
【０１８３】
本実施形態の細胞構造体の製造方法によれば、単層構造で栄養と酸素とを十分に供給されていた細胞が短時間内に凝集して細胞構造体を形成するため、該細胞構造体の内部の細胞が酸欠で壊死する等といった従来技術における問題が生じにくい。特に、酸素供給の必要性が特に高い心筋細胞からなる細胞構造体の培養に有用である。
【０１８４】
生体内の環境における細胞構造体を試験管内において得ることは、実験技術の観点から、極めて重要な意味を有するところ、本実施形態の細胞構造体の製造方法によれば、細胞の配向性を生体内におけるものと同様に揃える（例えば、心筋細胞の場合、所定方向への紡錘形態）ことが可能となる。
【０１８５】
例えば、心筋細胞に関する創薬試験では、不整脈惹起等の心毒性の有無を検出するため、培養心筋細胞の心電波形を評価することが行われており、ここでは、測定精度（ＳＮ比）を高める観点から、細胞からの電気信号を可能な限り大きくすることが望まれる。
本実施形態の細胞構造体の製造方法によれば、前述の通り、大きなサイズの細胞構造体を、生来の配向性を備えた状態で得ることができるため、生体内で生きている心筋細胞を模倣した検体を得ることができる。このため、心筋細胞に関する創薬試験の精度を高めることが可能となる。
【実施例】
【０１８６】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明は下記の実施例に何ら限定されるものではない。
【０１８７】
下記の試験において、市販の試薬は、特に断りのない限り更に精製することなく用いた。
【０１８８】
（実施例１）
（試験Ａ）温度応答性ポリマーの調製
容量５０ｍＬの軟質ガラス製の透明なバイアル瓶に、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）１０．０ｇ、及び水５，０００μＬを加えて、磁気撹拌器を用いて撹拌した。そして、この混合物（液体）に対してＧ１グレードの高純度（純度：９９．９９９９５％）の窒素ガスを１０分間パージ（流速：２．０Ｌ／分）することにより、この混合物を脱酸素した。なお、用いたＤＭＡＥＭＡには、重合禁止剤であるメチルヒドロキノン（ＭＥＨＱ）が０．５重量％含まれていた。
その後、この反応物に対して、丸型ブラック蛍光灯（ＮＥＣ社製、型番：ＦＣＬ２０ＢＬ、１８Ｗ）を用いて、２２時間紫外線照射することにより、上記反応物を重合させた。反応物は、５時間後に粘性を帯び１５時間後に固化して、重合体が反応生成物として得られた。この反応生成物を２−プロパノールに溶解させ、溶液を透析チューブに移した。そして、透析を７２時間行い、反応生成物を精製した。
反応生成物を含む溶液を、セルロース混合エステル製の０．２μｍフィルター（東洋濾紙社製、型番：２５ＡＳ０２０）で濾過し、得られた濾液を凍結乾燥させることにより、分子内イオン複合体型の温度応答性ポリマーが得られた（収量：６．８ｇ、転化率：６８％）。このポリマーの数平均分子量（Ｍｎ）を、ＧＰＣ（島津社製、型番：ＬＣ−１０ｖｐシリーズ）を用いて、ポリエチレングリコール（Ｓｈｏｄｅｘ社製、ＴＳＫシリーズ）を標準物質として測定し、Ｍｎ＝１００，０００（Ｍｗ／Ｍｎ＝１０．０）と決定した。
【０１８９】
温度応答性ポリマーの核磁気共鳴スペクトル（ＮＭＲ）を、核磁気共鳴装置（Ｖａｒｉａｎ社製、型番：Ｇｅｍｉｎｉ３００）を用いて、重水（Ｄ２Ｏ）を標準物質として測定した。下記には、実施例ポリマー１に共通する代表的なピークを示す。
1H-NMR (in D2O) δ 0.8-1.2 (br, 3H, -CH2-C(CH3)-), 1.6-2.0 (br, 2H, -CH2-C(CH3)-), 2.2-2.4 (br, 6H, -N(CH3)2), 2.5-2.7 (br, 1.9H,-CH2-N(CH3)2), 4.0-4.2 (br, 1.9H, -O-CH2-).
ここで、α位に結合したメチル基（δ 0.8-1.2）のプロトン数（ＤＭＡＥＭＡユニットの場合もメタクリル酸ユニットの場合も３個）Ａと、側鎖のエステル結合の酸素に結合しているエチル基（δ 4.0-4.2）のメチルプロトン数（ＤＭＡＥＭＡユニットの場合は２個で、メタクリル酸ユニットの場合は０個）Ｂとから、ＤＭＡＥＭＡの側鎖が有するアミノ基の官能基数と、メタアクリル酸の側鎖のカルボキシル基の官能基数との比を算出した。
その結果、得られたポリマー１の場合９４：６となった。これは、カチオン性ポリマーとアニオン性ポリマーとを含む２成分混合系におけるイオン複合体で言うＣ／Ａ比に換算すると、Ｃ／Ａ比＝１５．６となる。
【０１９０】
更に、得られた温度応答性ポリマーの３％水溶液を調製し、この水溶液の６６０ｎｍにおける吸光度を、２０℃〜４０℃の間で測定したところ、約３２℃であった。
【０１９１】
（試験Ｂ）第一被覆領域及び第二被覆領域の準備
細胞培養器として、Φ３５ｍｍプレート（ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ（登録商標）、ＳＵＭＩＬＯＮ社製）（細胞低吸着性プレート）を用いた。
上記プレートの培養面上の６箇所に、室温条件下において、前述の試験Ａで調製したポリマーの水溶液（濃度：１５ｎｇ／μＬ）を４．０μＬずつスポットして、その後、この水溶液を３７℃で３０分間乾燥させて、それぞれ円形の第一被覆領域（面積４．５ｍｍ２）を準備した。
乾燥後、６箇所の円形の第一被覆領域のうちの一つにおいて、第一被覆領域の中心を通る直線上に位置し、第一被覆領域の端部に位置する２箇所に、第一被覆領域と重なり合うように、フィブロネクチン溶液（ヒト血漿由来）（濃度：２００ｎｇ／μＬ）（ＢＤバイオサイエンス社製、ロット番号３３５３５６３）を０．２μＬずつスポットして、その後、この溶液を３７℃で５分間乾燥させて、それぞれ円形の第二被覆領域（面積０．８ｍｍ２）を準備した（図４（ａ）参照）。
【０１９２】
第一被覆領域の表面のゼータ電位を、ゼータ電位計（大塚電子社製、型番：ＥＬＳＺ）及び平板試料用セルユニットを用いて測定した。測定では、セルとしては、石英セルを用い、標準のモニター粒子としては、ポリスチレンラテックス（粒子径：約５００ｎｍ）をヒドロキシプロピルセルロース（Ｍｗ＝３０，０００）で被覆した粒子（ゼータ電位：−５ｍＶ〜＋５ｍＶ）を用い、溶媒として、１０ｍＭの塩化ナトリウム水溶液をｐＨ＝７、３７℃の条件下で用いた。ゼータ電位は、Ｓｍｏｌｕｃｈｏｗｓｋｉ式により算出した。
その結果、温度応答性ポリマーにより被覆された第一被覆領域の表面のゼータ電位は、＋２０ｍＶであった。なお、当業者に周知の通り、上記ゼータ電位の測定値は、±１０％程度のバラツキを有するものである。
【０１９３】
細胞培養プレートの第一被覆領域に対する水の接触角を、ＪＩＳ  Ｒ３２５７に準拠して、接触角計（商品名：ＤＭｓ−４００、協和界面科学社製）を用いて測定したところ、７０°±１０°であった。
【０１９４】
（試験Ｃ）細胞の播種・培養
上記試験Ｂで準備した細胞培養器を用いた。
ＧＦＰ組換えルイスラットの脂肪組織由来間葉系幹細胞（ＡＤＳＣ（Ａｄｉｐｏｓｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌ））を、培地（ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）＋１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）；ＤＭＥＭ：ギブコ社製、型番１１９６５；ＦＢＳ：バイオロジカルインダストリー社製、ロット番号７１５９２９）中に浮遊させて、細胞懸濁液を調製した。
上記プレートに、室温条件下で、細胞密度２．５×１０５個／ｃｍ２）となるように、細胞懸濁液を加えた（９５％コンフルエント）。
そして、この細胞を、３７℃、５％ＣＯ２の細胞培養インキュベーター中で２時間培養した。
培養開始から２時間後、前述の培地で培地交換を行い、死滅した細胞を除去した。
図４（ａ）に、試験Ｃにおいて、試験Ｂで準備した第一被覆領域及び第二被覆領域においてＧＦＰ組換えルイスラットのＡＤＳＣを２時間培養した後の様子を、顕微鏡を用いて観察したときの写真を示す。
そして、細胞を、３７℃、５％ＣＯ２の細胞培養インキュベーター中で更に１８時間培養した。
更なる１８時間の培養中、第一被覆領域に接着していた細胞は、中央部分に向かって凝集し、一方、第二被覆領域に接着した細胞は、当初の位置に接着し続けた。播種された細胞の成熟による細胞間のネットワークの結合力が、細胞の第一被覆領域に対する接着力を上回るようになり、細胞の凝集現象が生じた。このとき、長軸方向への凝集・収縮は制限される一方、短軸方向への凝集・収縮が優先された。最終的に、第二被覆領域に接着し続ける２つの細胞集団と、これらの細胞集団の間を連結するスティック状の細胞集団とからなる、直線状の構造を有する細胞構造体が形成した。
図４（ｂ）に、試験Ｃにおいて、試験Ｂで準備した第一被覆領域及び第二被覆領域においてＧＦＰ組換えルイスラットのＡＤＳＣを２０時間培養した後の様子を、顕微鏡を用いて観察したときの写真を示す。
【０１９５】
なお、図４（ｃ）に、図４（ｂ）に示す細胞構造体を倍率を下げて観察したときの写真を示す。
【０１９６】
図４（ｄ）に、図４（ｂ）の破線に示す細胞構造体の様子を蛍光顕微鏡を用いて観察したときの写真を示す。
試験Ｃにおいて得られた細胞構造体のうちスティック状の細胞集団においては、細胞が細胞構造体の延在方向に沿って伸びる形状をなし、第二被覆領域に接着し続ける２つの細胞集団を結ぶ線の方向に沿う方向への配向性を備えることがわかった。
【０１９７】
（実施例２）
用いる細胞接着性物質を、フィブロネクチン溶液から、ラミニン（濃度：５０ｎｇ／μＬ）（ニッピ社製）に代えて、前述の実施例１の試験Ｂと同様の試験を行った。
そして、用いる細胞を、ＧＦＰ組換えルイスラットのＡＤＳＣから、心筋細胞（生後１日目の新生ルイス系ラットから定法に従って分離）に代えて、前述の実施例１の試験Ｃと同様の試験を行った。
この場合においても、前述の図４に示す細胞構造体と同様の構造を備える細胞構造体が得られた。
【０１９８】
【表１】
0006800436.tif 000004
【産業上の利用可能性】
【０１９９】
本発明によれば、細胞の凝集様式を制御して、所望の形態の細胞構造体を製造することができる。
【図１】
0006800436.tif 000005
【図２】
0006800436.tif 000006
【図３】
0006800436.tif 000007
【図４】
0006800436.tif 000008