(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖鎖が切断された抗体又はそのＦｃの製造方法であって、該抗体又はそのＦｃを複数のエンドグリコシダーゼと反応させて該糖鎖を切断することを備える方法であって、
前記複数のエンドグリコシダーゼが、エンドグリコシダーゼＤ及びエンドグリコシダーゼＳを含む方法。
【請求項２】
前記複数のエンドグリコシダーゼが、以下の（ｉＸ）〜（Ｘｉ）のいずれか一つの組み合わせである、請求項１に記載の方法：
（ｉＸ）エンドグリコシダーゼＤとエンドグリコシダーゼＳとエンドグリコシダーゼＬＬ（Ｘ）エンドグリコシダーゼＤとエンドグリコシダーゼＳとエンドグリコシダーゼＨ
（Ｘｉ）エンドグリコシダーゼＤとエンドグリコシダーゼＳとエンドグリコシダーゼＦ１。
【請求項３】
糖鎖が切断された抗体又はそのＦｃが、抗体又はそのＦｃと直接結合するＮ−アセチルグルコサミン以外の糖鎖が切断された抗体又はそのＦｃである、請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項４】
糖鎖が切断された抗体又はそのＦｃが、ＩｇＧ抗体又はそのＦｃの２９７番目のアスパラギンと直接結合するＮ−アセチルグルコサミン以外の糖鎖が切断された抗体又はそのＦｃである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
所望の複数のエンドグリコシダーゼで処理された抗体又はそのＦｃに結合する所望の糖鎖構造を有する対象糖鎖の定量的情報を決定する方法であって、（ａ）前記抗体又はそのＦｃを前記複数のエンドグリコシダーゼと反応させることを備える、反応ステップ、ここで、前記複数のエンドグリコシダーゼが、エンドグリコシダーゼＤ及びエンドグリコシダーゼＳを含み、（ｂ）反応ステップ後の前記抗体又はそのＦｃをプロテアーゼで処理することを備える、プロテアーゼ処理ステップ、（ｃ）前記プロテアーゼ処理ステップにより得られた糖ペプチドのうち、前記対象糖鎖を有する糖ペプチドを測定することを備える、測定ステップ、及び、対象糖鎖を有する糖ペプチドの測定値から前記エンドグリコシダーゼで処理された抗体又はそのＦｃに結合する対象糖鎖の定量的情報を決定することを備える、決定ステップを備える方法。
【請求項６】
前記定量的情報が、前記所望の糖鎖構造を有する糖鎖の量である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
抗体又はＦｃに結合する糖鎖であって、所望の糖鎖構造を有する１種類の糖鎖である対象糖鎖の、複数のエンドグリコシダーゼ処理による、切断量に関する情報を決定する方法であって、
（ａ）前記抗体又はそのＦｃを前記複数のエンドグリコシダーゼと反応させることを備える、反応ステップ、ここで、前記複数のエンドグリコシダーゼが、エンドグリコシダーゼＤ及びエンドグリコシダーゼＳを含み、
（ｂ）エンドグリコシダーゼと反応させた前記抗体又はそのＦｃをプロテアーゼで処理して糖ペプチドを生成させることを備える、プロテアーゼ処理ステップ
（ｃ）エンドグリコシダーゼと反応させていない前記抗体又はそのＦｃをプロテアーゼで処理して糖ペプチドを生成させることを備える、プロテアーゼ処理ステップ、
（ｄ）前記プロテアーゼ処理ステップにおいて、エンドグリコシダーゼと反応させた前記抗体又はそのＦｃをプロテアーゼで処理することにより得られた糖ペプチドであって、前記対象糖鎖が結合した糖ペプチドを定量することを備える、定量ステップ、
（ｅ）前記プロテアーゼ処理ステップにおいて、エンドグリコシダーゼと反応させていない前記抗体又はそのＦｃをプロテアーゼで処理することにより得られた糖ペプチドであって、前記対象糖鎖が結合した糖ペプチドを定量することを備える、定量ステップ、及び、
（ｆ）エンドグリコシダーゼと反応させた前記抗体又はそのＦｃについて前記定量ステップで得られた定量値、及びエンドグリコシダーゼと反応させていない前記抗体又はそのＦｃについて前記定量ステップで得られた定量値から、前記エンドグリコシダーゼ処理による前記対象糖鎖の切断量に関する情報を決定することを備える、決定ステップを備える方法。
【請求項８】
複数のエンドグリコシダーゼ処理による、不均一の糖鎖構造を有する抗体又はそのＦｃに結合する糖鎖であって、所望の糖鎖構造を有する糖鎖である２種類以上の対象糖鎖のそれぞれの切断量に関する情報を決定する方法であって、
（ａ）前記抗体又はそのＦｃを前記複数のエンドグリコシダーゼと反応させることを備える、反応ステップ、ここで、前記複数のエンドグリコシダーゼが、エンドグリコシダーゼＤ及びエンドグリコシダーゼＳを含み、
（ｂ）エンドグリコシダーゼと反応させた前記抗体又はそのＦｃをプロテアーゼで処理して糖ペプチドを生成させることを備える、プロテアーゼ処理ステップ、
（ｃ）エンドグリコシダーゼと反応させていない前記抗体又はそのＦｃをプロテアーゼで処理して糖ペプチドを生成させることを備える、プロテアーゼ処理ステップ、
（ｄ）前記プロテアーゼ処理ステップにおいて、エンドグリコシダーゼと反応させた前記抗体又はそのＦｃをプロテアーゼで処理することにより得られた糖ペプチドであって、前記対象糖鎖が結合した糖ペプチドを定量することを備える、定量ステップ、
（ｅ）前記プロテアーゼ処理ステップにおいて、エンドグリコシダーゼと反応させていない前記抗体又はそのＦｃをプロテアーゼで処理することにより得られた糖ペプチドであって、前記対象糖鎖が結合した糖ペプチドを定量することを備える、定量ステップ、
（ｆ）それぞれの対象糖鎖について、エンドグリコシダーゼと反応させた前記抗体又はそのＦｃについて前記定量ステップ得られた定量値、及びエンドグリコシダーゼと反応させていない前記抗体又はそのＦｃについて前記定量ステップで得られた定量値から、前記エンドグリコシダーゼによるそれぞれの対象糖鎖の切断量に関する情報を決定することを備える、決定ステップを備える方法。
【請求項９】
抗体がカイコにより産生された抗体である、請求項１〜請求項８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
抗体が、非ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、又は、ヒト抗体である請求項１〜請求項９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
所望の均一な糖鎖構造を有する糖鎖が結合した抗体又はそのＦｃを製造する方法であって、
請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載の方法により糖鎖が切断された抗体又はそのＦｃであるアクセプター抗体又はアクセプターＦｃを調製することを備える、アクセプター調製ステップ、及び、
該アクセプター抗体又はアクセプターＦｃと糖鎖ドナーをグライコシンターゼを用いて反応させて、前記所望の均一な糖鎖構造を有する糖鎖が結合された抗体又はそのＦｃを生成させることを備える、抗体生成ステップを備える方法。
【請求項１２】
前記所望の均一な糖鎖構造を有する糖鎖が、高マンノース型糖鎖、または複合型糖鎖である、請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【クロスリファレンス】
【０００１】
本願全体を通して引用される全文献は参照によりそのまま本願に組み込まれる。また、本願は２０１４年４月２５日に出願された日本国特許出願第２０１４−０９１１５７号及び２０１４年１０月３１日に出願された日本国特許出願第２０１４−２２２１９１号からの優先権を主張する。本願が優先権を主張するこれらの出願に記載の内容は全て参照によりそのまま本願に組み込まれる。
【技術分野】
【０００２】
本発明は均一な糖鎖構造を持つ糖タンパク質合成に関するものである。より具体的には、本発明は、新たに開発された抗体の糖鎖リモデリング法のためのアクセプターを調製するための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
いわゆるバイオ医薬品として、エリスロポエチン、あるいはインフリキシマブ、ベバシズマブ、トラスツズマブ、アダリムバブ等に代表されるモノクローナル抗体が認可されているが、いずれもタンパク質に糖鎖が結合した糖タンパク質である。特に癌治療に用いられている抗体はイムノグロブリンクラスがＩｇＧである。癌細胞に発現している抗原に上記ＩｇＧが結合すると様々なカスケードにスィッチが入り、たとえば１）抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）；２）補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）；３）シグナル伝達の変化により抗癌活性を発揮する。
【０００４】
インタクトなＩｇ抗体のＦｃ領域のＣＨ２ドメインに位置する２９７番目のアスパラギン（Ｎ２９７）には不均一なＮ型糖鎖が付加されている。付加される糖鎖は多数の糖鎖構造を持つ二本鎖複合型糖鎖がメインである。この糖鎖は免疫複合体によるエフェクター機能の活性化に必須であり、付加される糖鎖によりその活性が変化することが知られている。たとえば、α１−６結合フコース（以下、「コアフコース」と呼ぶことがある）が欠落すると、ＦｃγＲIIIａを介するＡＤＣＣ活性が高まることが知られている（非特許文献１）。フコース欠損トラスツズマブは、フコースが付加されたトラスツズマブの少なくとも５０倍のＡＤＣＣ活性を有することが報告されており、同様な結果が、リツキシマブ、抗ＣＣＲ４抗体等（非特許文献２）においても報告されている。
【０００５】
一般にバイオ医薬品の生産手段として汎用される大腸菌は糖鎖付加機能がない為、抗体の生産は酵母などにより試みられてきた。しかし、酵母はヒトと同じ糖鎖を付加せず、いわゆる高マンノース型の糖鎖を付加すること、及び酵母が付加する糖鎖に含まれるαＧａｌが抗原性を提示すること等の問題が指摘されている。昆虫細胞を用いる方法も提案されているが、酵母と同様の問題が指摘されている。このため、現在、抗体医薬の多くはヒト型の糖鎖を付加する哺乳動物細胞（ＣＨＯ細胞、ＮＳＯ細胞等）により製造されている。ＣＨＯ細胞等により産生された抗体の糖鎖は、糖鎖転移酵素により生合成されるため、糖鎖構造や糖鎖付加の量が、同じ細胞株であっても継代が異なることで変化することが知られている。このように、ＣＨＯ細胞等で製造された糖タンパク質は、アミノ酸配列レベルでは均一であっても、糖鎖レベルでは不均一となるとの問題があった。また、ヒト血清中ＩｇＧのＦｃに付加している糖鎖構造とＣＨＯで作成したＦｃの糖鎖構造は種類も存在比も全く異なっていることが報告されていた（非特許文献３）。
【０００６】
抗体のＮ結合型糖鎖には、いわゆるｈｉｇｈ  ｍａｎｎｏｓｅ型、２本鎖複合型、及びｃｏｍｐｌｅｘ型が存在し、さらにシアル酸（Ｓｉａ）の有無、結合様式の違い、コアフコースの有無、分岐Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）の有無等の違いがあり、これらの組み合わせで様々な種類の糖鎖が存在し得る。したがって、現在市販されている抗体医薬はいずれも多数の糖鎖構造を含んでおり、その品質維持が問題となっている。また、バイオシミラーの認可においても糖鎖構造の不均一さに基づき同一成分としての認可が困難となっており、例えば、エリスロポエチンはエポエチンカッパ等の異なる成分名で認可される等の措置が取られている。
【０００７】
抗体に付加された糖鎖の長さとそれが活性や安定性に与える影響が検討されており、糖鎖を短縮化した抗体を用いて、糖鎖の長さがＣＨ２ドメインの構造安定化と活性に影響を与えることが示されている（非特許文献４、非特許文献５）。また、医薬品として好ましい糖鎖構造の特性として、例えば、分岐ＧｌｃＮＡｃを含むＮ型糖鎖や、脱コアフコースが知られているが、現在市販されている抗体医薬の多くはこれらの糖鎖を数％程度しか含んでいない。
【０００８】
このように、抗体における糖鎖構造の機能について解析結果から、医薬品として好ましい特性を抗体に付与することができる均質な糖鎖構造を持つ抗体を製造することが望まれている。また、医薬品として十分な品質管理を達成するためにも、均質な糖鎖構造を持つ抗体を製造することが望まれている。
【０００９】
また、ＦｃγＲの遺伝子多形がＡＤＣＣ活性に影響を与えることが報告されている。リツキシマブを投与された患者のうち、ＦｃγＲIIIａの１７６番目のアミノ酸がＶ／Ｖホモ接合体である場合、Ｆ／Ｆホモ接合体と比較して、ＩｇＧ１及びＩｇＧ３との結合力が強いことが報告されている（非特許文献６）。また、ＦｃγＲIIIａの１５８Ｖ／１５８Ｖの相同染色体をもつ患者、及び、ＦｃγＲＩＩａの１３１Ｈ／１３１Ｈの相同染色体を持つ患者は、ＦｃγＲIIIａの１５８Ｆ遺伝子を持つ患者やＦｃγＲＩＩａの１３１Ｒ遺伝子をもつ患者と比較して、リツキシマブへの反応性が高いことが報告されている（非特許文献７）。また、抗イディオタイプ抗体によるワクチン療法においても、ＦｃγＲIIIａの１５８Ｖ／Ｖ遺伝子型は、Ｖ／Ｆ及びＦ／Ｆ遺伝子型と比較して無増悪生存率が高いことが報告されている（非特許文献８）。このように、抗体医薬の効果は患者のＦｃγＲの遺伝子多形に依存することが知られているが、ＦｃγＲ遺伝子多形に応じて最適な効果を奏し得る糖鎖構造に関する報告はない。
【００１０】
このように、好ましい糖鎖構造を解析する上でも、均一の糖鎖構造を有する抗体の製造が必要とされていた。
【００１１】
これまで、抗体への糖鎖付与の制御のための検討が種々行われてきた。例えば、抗体の短縮化がＮ２９７への糖鎖付加や付加される糖鎖構造に与える影響が調べられている（非特許文献９）。また、抗体を産生させる細胞の種類によって付加される糖鎖が異なることが報告されている（非特許文献１０）。
【００１２】
また、分岐ＧｌｃＮＡｃの形成を触媒するβ（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII（ＧｎＴIII）に関する検討が行われており、抗体のＡＤＣＣ活性に対して至適ＧｎＴIII発現量が存在すること（非特許文献１１）、抗体を大量に生産する生産株において、ＧｎＴIIIを共発現させることで分岐ＧｌｃＮＡｃの付加された抗体の割合を高め、共発現させない場合と比較して１０〜２０倍低い濃度で標的細胞を殺傷すること（非特許文献１２）が報告されている。
【００１３】
また、脱コアフコースの方法として、ＦＵＴ８等のα−フコシルトランスフェラーゼをノックアウトする方法が開示されている（非特許文献３）。しかし、この方法はコアフコースのみをコントロールするものであり、糖鎖構造が均一な抗体を取得することはできなかった。また、抗体の糖鎖を切断するエンドグリコシダーゼとして、エンドグリコシダーゼＳ（ＥｎｄｏＳ、Ｅｎｄｏ−Ｓ、ｅｎｄｏ−Ｓ）（非特許文献１３）及びその改変体（非特許文献１４、特許文献１）が報告されている。しかし、これらのエンドグリコシダーゼには糖鎖構造を認識し、特定の構造に対する特異性があることが知られている。このため、ＥｎｄｏＳを用いたとしても、ＣＨＯ細胞で産生させた抗体に付加するあらゆる糖鎖構造を持つ糖鎖を認識し切断することはできず、不純物として未切断の糖鎖が付加された抗体が残存するという問題があった。また、非特許文献１３ではコアフコースを除去する為に、ＣＨＯ細胞から製造されたリツキサンをＥｎｄｏＳで加水分解し、さらにウシからのα−フコシダーゼを２０日反応させアクセプターのＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎ−リツキサンを調製しているが、このような煩雑な方法は工業化には適さないという問題があった。
【００１４】
一方で、抗体以外のタンパク質の糖鎖エンジニアリングに関しては、種々の報告が行われている。非特許文献３には、エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼＭ（エンドグリコシダーゼＭ、Ｅｎｄｏ−Ｍ、ｅｎｄｏ−Ｍ）を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで糖鎖が付加されていないインスリンにフコースが付加されていないＮ−グリカンを結合させたことや、Ｎ−グリコプロテインである単球走化性タンパク質３（ＭＣＰ−３）を合成したことが記載されている。しかし、糖タンパク質として抗体を用いる場合には、Ｆｃドメインの内側に糖鎖が位置することから、他の糖タンパク質とは異なりＥｎｄｏ−Ｍによって完全に糖鎖を切断することは難しいと考えられていた。あるいは、抗体以外のタンパク質の糖鎖エンジニアリング手法としてエンドグリコシダーゼのトランスグリコシレーション反応を利用し、糖タンパク質の糖鎖を還元末端のＧｌｃＮＡｃを残して切断してアクセプタータンパク質を生成させた後、付加する目的糖鎖ドナーを残存ＧｌｃＮＡｃに転移させることにより目的の糖鎖を有する糖タンパク質を製造する方法が報告されている。本方法は、糖鎖ドナーとして均一糖鎖構造を有する糖鎖を用いることにより、任意の均一糖鎖構造を持つ糖タンパク質を合成する方法が開示されている（特許文献２。糖鎖リモデリング法を用いて均一糖鎖構造を有する糖タンパク質を合成するために、少なくとも、エンドグリコシダーゼ（改変Ｅｎｄｏ−Ｍ等）、オキサゾリン誘導体、ドナー基質の３つの技術が必要だと考えられている。既に、これらの技術を用いて、ＲＮａｓｅＢタンパク質に結合するｈｉｇｈ  Ｍａｎを２本鎖複合型に変えた、均一糖鎖構造を持つ糖タンパク質の合成に成功していることが報告されている（非特許文献１５）。
【００１５】
しかし、アクセプタータンパク質として抗体を用いる場合には、上述の通りＮ２９７が立体構造上Ｆｃドメインの内側に存在するためエンドグリコシダーゼが近寄れないという問題があり、また、ＧｌｃＮＡｃにα１−６フコースが付加している場合には、Ｅｎｄｏ−Ｍ等では水解できないという問題から、上述の抗体以外のタンパク質の糖鎖エンジニアリング手法をそのまま適用できないという問題があった。その他、抗体の糖鎖エンジニアリングに関して若干の報告があるものの（非特許文献１６）、目的とする糖鎖のみが付いた均一糖鎖構造を持つ抗体の製品としての生産に利用可能な製造方法に関する報告はこれまでにない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】国際特許公開公報ＷＯ２０１３／１２００６６号
【特許文献２】国際特許公開公報ＷＯ２００７／１３３８５５号
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】Ｓｈｉｎｋａｗａ，  Ｔｏｙｏｈｉｄｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  Ｊａｎ  ２００３；  ２７８：  ３４６６−３４７３
【非特許文献２】Ｎｉｗａ，  Ｒｉｎｐｅｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６４：  ２１２７−２１３３（２００４）
【非特許文献３】Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ，  Ｎ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ  ８７：６１４−６２２（２００４）
【非特許文献４】Ｍｉｍｕｒａ，  Ｙ．，  ｅｔ  ａｌ．，  ＭｏＩ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３７：６９７−７０６（２０００）
【非特許文献５】Ｋｒａｐｐ，  Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  ＭｏＩ  Ｂｉｏｌ  ３２５：９７９−９８９（２００３）
【非特許文献６】Ｗｕ，  Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ，  １００（５）：  ｐ．  １０５９−７０（１９９７）
【非特許文献７】Ｗｅｎｇ，  Ｗ．Ｋ．  ａｎｄ  Ｒ．  Ｌｅｖｙ，  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ，  ２１（２１）：  ｐ．  ３９４０−７（２００３）
【非特許文献８】Ｗｅｎｇ，  Ｗ．Ｋ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ，  ２２（２３）：  ｐ．  ４７１７−２４（２００４）
【非特許文献９】Ｌｕｎｄ，  Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２６７：７２４６−７２５７（２０００）
【非特許文献１０】Ｌｉｆｅｌｙ，  Ｍ．  Ｒ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ５：８１３−８２２（１９９５）
【非特許文献１１】Ｕｍａｎａ，  Ｐ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １７：１７６−１８０（１９９９）
【非特許文献１２】Ｄａｖｉｅｓ，  Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ  ７４：２８８−２９４（２００１）
【非特許文献１３】Ｊ．Ｊ．Ｇｏｏｄｆｅｌｌｏｗ，Ｂ．Ｇ．Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１３４，８０３０−８０３３（２０１２）
【非特許文献１４】Ｗ．Ｈｕａｎｇ，Ｌａｉ−Ｘｉ  Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１３４，１２３０８−１２３１８（２０１２）
【非特許文献１５】Ｗ．Ｈｕａｎｇ，Ｃｉｓｈａｎ  Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１３１，２２１４−２２２３（２００９）
【非特許文献１６】Ｒｏｙ  Ｊｅｆｆｅｒｉｓ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗ  ８：２２６−２３４（２００９）
【発明の概要】
【００１８】
本発明は長年求められていた均一な糖鎖構造を持つ抗体を高純度で製造することを目的とする。一つの側面において、本発明は均一な糖鎖構造を持つ抗体を製造するための糖鎖切断抗体又はそのＦｃ断片（アクセプター）、例えば、２９７番目のアスパラギンに結合する糖鎖のうち、アスパラギンに直接結合するＮ−アセチルグルコサミン以外の糖鎖が切断されたＩｇＧ抗体又はそのＦｃ断片を簡便に調製する方法を提供することを目的とする。特に、本発明は、均一な糖鎖構造を持つ抗体を製造するためのアクセプターであって、コアフコースの付加されていない抗体を簡便に調製する方法を提供することを目的とする。また、ある側面において、本発明は均一なヒト型糖鎖構造を持つ糖タンパク質を製造することを可能とすることにより、真に有効な糖鎖構造に関するスクリーニングを可能とすることを目的とする。このような目的を達成するため、本発明は、複数のエンドグリコシダーゼを組み合わせて抗体又はそのＦｃ断片（例えば、動物（細胞）、酵母、昆虫（細胞）により産生させた抗体又はそのＦｃ断片）を処理することにより、アクセプターを簡便に調製する方法を提供するものである。
【００１９】
従来の動物細胞を用いたタンパク質の製造方法により製造された糖タンパク質は、いわゆるコンセンサス配列Ａｓｎ・Ｘ・Ｓｅｒ／Ｔｈｒを持つタンパク質であっても、Ａｓｎに糖鎖が必ず付加するとは限らず、付加する糖鎖の種類や付加される割合等が様々となることから、糖鎖構造を考慮に入れれば数１００にも及ぶ化合物の混合物となっていた。これに対し、Ｃｈｅｍｏｅｎｚｙｍａｔｉｃな手法が提案されており、均一糖鎖構造を持つ抗体の取得が試みられてきた。従来の手法においては、抗体結合糖鎖は基質特異性よりもむしろその立体的な障壁が効率的な切断を阻害する要因であると考えられてきたことから、複数の酵素を用いた切断効率向上の試みは行われてこなかった。Ｋａｖｉｔｈａ  Ｂａｒｕａｈら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２０１２）４２０：１−７においては、血清中のＩｇＧがモノクローナル抗体の細胞表面のＦｃγレセプターへの結合を阻害することを抑制する目的として、血清中の抗体をエンドグリコシダーゼで処理しており、この中でＥｎｄｏＳとＥｎｄｏＨの２種類のエンドグリコシダーゼを併用しているが、これは、糖鎖切断抗体（アクセプター）の製造を目的としたものではなく、これらによる糖鎖切断効率等の検討もされていない。しかし、本発明者らは、均質なアクセプターを提供するための方法を種々検討した結果、２種類以上の適切なエンドグリコシダーゼの組み合わせを選択して使用することにより、様々な構造を有する糖鎖を極めて効率的に切断することができることを初めて見出した。
【００２０】
よって、一態様において、本発明は、糖鎖が切断された抗体又はそのＦｃ断片（アクセプター）の製造方法であって、該抗体またはそのＦｃと複数のエンドグリコシダーゼとを反応させることを備える方法に関する。例えば、本発明は、タイプの異なる２種類以上のＮ結合型糖鎖が不均一に結合した抗体又はそのＦｃ断片（不均一糖鎖結合抗体又はそのＦｃ断片）からアクセプターを製造する方法であって、当該不均一糖鎖結合抗体又はそのＦｃ断片と複数のエンドグリコシダーゼを反応させることを備える方法に関する。
【００２１】
また、本発明者らは、効率的な糖鎖切断のためのエンドグリコシダーゼの組み合わせを決定する方法について様々な検討を行った。これまで、エンドグリコシダーゼによる抗体結合糖鎖の切断特性の解析は、ＩｇＧのＦｃ領域をエンドグリコシダーゼで処理した後、そのままＬＣ−ＥＳＩ  ＭＳによって検出する方法（Ｇｕｏｚｈａｎｇ  Ｚｏｕ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１３３，１８９７５−１８９９１（２０１１）；Ｓｈｕ−Ｑｕａｎ  Ｆａｎ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８７，１１２７２−１１２８１（２０１２））、インタクトな抗体をエンドグリコシダーゼで処理した後、抗体の重鎖と軽鎖を分離して、重鎖をＬＣ−ＥＳＩ  ＭＳによって検出する方法（Ｗ．Ｈｕａｎｇ，Ｌａｉ−Ｘｉ  Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１３４，１２３０８−１２３１８（２０１２）、ＷＯ２０１３／１２００６）等により行われていた。しかし、この方法では検出しているタンパク質の分子量が大きすぎるため、糖鎖（分子量１６２〜１５００）程度の分子量の差がある分子を正確に定量的に識別することはできなかった。また、その他の方法として、抗体に結合した糖鎖をエンドグリコシダーゼによって切断した後に蛍光標識して、切断された糖鎖を検出する方法が知られていた（Ｋａｖｉｔｈａ  Ｂａｒｕａｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４２０：１−７（２０１２））。この方法は切断された糖鎖を正確に定量的に測定することができるが、抗体に結合（残存）した糖鎖を検出するものではないことから、切断効率の正確な測定には不向きであった。
【００２２】
本発明者らは、より正確な抗体又はそのＦｃ断片への糖鎖結合量の測定方法について鋭意検討した結果、抗体をタンパク質分解酵素で処理して糖ペプチドを生じさせ、当該糖ペプチドを解析することにより、抗体に結合した糖鎖を定量的かつ簡便に解析することができることを見出した。即ち、一態様において本発明は、抗体又はＦｃに結合する所望の糖鎖構造を有する糖鎖（対象糖鎖）の定量的情報を決定する方法であって、（ａ）当該抗体又はそのＦｃをプロテアーゼで処理することを備える、プロテアーゼ処理ステップ、（ｂ）前記プロテアーゼ処理ステップにより得られた糖ペプチドのうち、前記対象糖鎖が結合した糖ペプチドを測定する測定ステップを備える方法に関する。
【００２３】
更に本発明者らは、上記方法により製造した様々な種類の均一な糖鎖構造を持つ抗体について、ＦｃγＲIIIａへの結合を測定した結果、糖鎖構造と結合活性には相関性があり、特定の糖鎖構造が優れた結合活性を示すことを見出した。よって、一態様において本発明は、均一な糖鎖構造を持つ抗体、及び当該抗体を有効成分として含有する、ＡＤＣＣ活性により治療可能な疾患を治療するための医薬組成物に関する。または、本発明は、ＡＤＣＣ活性により治療可能な疾患を治療又は予防するための、均一な糖鎖構造を持つ抗体に関する。
【００２４】
本明細書において、「抗体」とは、特定のタンパク質などの分子（抗原）を認識して結合する働きをもつ、リンパ球のうちＢ細胞の産生する糖タンパク分子であり、物質としては免疫グロブリン（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）（Ｉｇ）と呼ばれ、血漿中のγ（ガンマ）グロブリンにあたる。抗体は定常領域の構造の違いにより、いくつかのクラス（アイソタイプ）に分けられる。哺乳類では、定常領域の構造の違いによりＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥの５種類のクラスに分類されるが、本発明の抗体はこれらのいずれの免疫グロブリンクラスであってもよいが、好ましくは、ＩｇＧである。ヒトの場合、ＩｇＧにはＩｇＧ１〜ＩｇＧ４の４つのサブクラスが、ＩｇＡにはＩｇＡ１とＩｇＡ２の２つのサブクラスがあり、本発明の抗体はこれらのいずれのサブクラスであってもよい。本明細書において「抗体」とは、上述のクラス・サブクラスの総称を意味し、さらに非ヒト抗体（例えば、マウス、ラット、ウサギ等の哺乳動物抗体等）、キメラ抗体（例えば、マウス−ヒトキメラ抗体）、ヒト化抗体、及びヒト型抗体などを含む。また、抗体はモノクローナルであっても、ポリクローナルであってもよい。好ましくは、本明細書における抗体は、高マンノース型、パウチマンノース型、複合型、または混合型でありコアフコースのない、タイプの異なる２種以上のＮ結合型糖鎖が不均一に結合したＩｇＧ抗体である。あるいは、本明細書における抗体は、ＩｇＧ抗体をコードする遺伝子を導入したカイコにより生産されたＩｇＧ抗体であってもよい。例えば、抗体としては、トラスツズマブ及びリツキサンを挙げることができる。
【００２５】
本明細書において抗体の「Ｆｃ断片」又は「Ｆｃ」とは、抗体の定常領域（Ｆｒａｇｍｅｎｔ，  ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｂｌｅ）を意味し、好ましくはジスルフィド結合などにより結合した二量体のＦｃである。
【００２６】
本明細書において、抗体におけるアミノ酸の番号は、ＫａｂａｔらによるＥＵインデックス（Ｋａｂａｔ  ｅｔ．ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，１９９１  Ｆｉｆｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ）により示される番号を意味する。
【００２７】
本明細書において「糖鎖」とは、特にそのように解することが不整合である場合を除き、抗体に結合している糖鎖を意味する。抗体には、通常、糖鎖が結合している（抗体結合糖鎖という。抗体に結合している糖鎖を構成する糖の種類としては、特に限定されるものではないが、例えば、グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチルノイラミン酸、及びキシロースを挙げることができる。ＩｇＧ抗体の場合、２９７番目のアスパラギンにＮ−アセチルグルコサミンを介して糖鎖が結合している（Ｎ−グリコシド結合糖鎖）。また、哺乳動物細胞などで調製されたＩｇＧ抗体の場合、２９７番目のアスパラギンに結合するＮ−アセチルグルコサミンにはフコースが結合しており、コアフコースと呼ばれている。糖鎖の構造はある程度限られており、その中のわずかな構造の違いが識別され、精密に認識されて様々な生命現象が制御されている。抗体結合糖鎖は、様々な構造を有しているが（例えば、生物化学実験法２３−糖タンパク質糖鎖研究法（学会出版センター）高橋禮子編（１９８９年）参照）、いずれの場合も下記に示す基本となる共通のコア構造を有する。抗体と結合する糖鎖の末端（下記の構造における右端）を還元末端、反対側（下記の構造における左端）を非還元末端という。還元末端のＮ−アセチルグルコサミンへのフコースの結合としては、α１，３結合、α１，６結合などがあげられる。
【００２８】
【化１】
0006750148.tif 000002
【００２９】
抗体結合糖鎖には、コア構造の非還元末端にマンノースのみが結合するハイマンノース型；コア構造の非還元末端側にガラクトース−Ｎ−アセチルグルコサミン（以下、Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃと称す。）の枝を並行して１ないしは複数本有し、更にＧａｌ−ＧｌｃＮＡｃの非還元末端側にシアル酸、バイセクティングのＮ−アセチルグルコサミンなどの構造を有するコンプレックス型；コア構造の非還元末端側にハイマンノース型とコンプレックス型の両方の枝を持つハイブリッド型などが含まれる。具体的な抗体結合糖鎖の糖鎖構造の例を図１に示す。本明細書において、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４、Ｍ５、Ｍ６、Ｍ７、Ｍ８、Ｍ９、ＧＮ１、ＧＮ２（＝Ｇ０）、Ｇ１ａ、Ｇ１ｂ、Ｇ２及びＡ２とは、図１に示す糖鎖構造を有する糖鎖又は当該糖鎖が結合した抗体を意味する。なお、図１に示す糖鎖構造にはコアフコースが結合していないが、特にそのように解釈することが不整合な場合を除き、本明細書において、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４、Ｍ５、Ｍ６、Ｍ７、Ｍ８、Ｍ９、ＧＮ１、ＧＮ２（＝Ｇ０）、Ｇ１ａ、Ｇ１ｂ、Ｇ２及びＡ２で示される糖鎖はコアフコースが結合していてもよい。
【００３０】
本明細書において「不均一の糖鎖構造を有する抗体」とは、２種類以上の異なる構造の糖鎖が不均一に結合した抗体を意味する。このような不均一糖鎖結合抗体は、結合する糖鎖が不均一であれば、前述の「抗体」の定義に含まれるいかなる抗体であってもよい。
【００３１】
本明細書において、「均一の糖鎖構造を持つ抗体」又は「均一糖鎖抗体」とは、同義であり、結合している糖鎖構造が同一である抗体を意味する。均一の糖鎖構造を持つ抗体には糖鎖結合部位が２箇所あり、両方に糖鎖が結合したｆｕｌｌｙ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ型、片方に糖鎖が結合したｈｅｍｉ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ型と糖鎖が結合していないａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ型が存在し（Ｓｈｉｙｉ  Ｗａｎｇら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ１２１７（２０１０）６４９６−６５０２）、均一（ｈｏｍｏ）とは、２箇所の糖鎖が同じ糖鎖構造であることを意味する。このような糖鎖構造としては、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４、Ｍ５、Ｍ６、Ｍ７、Ｍ８、Ｍ９、ＧＮ１、ＧＮ２（＝Ｇ０）、Ｇ１ａ、Ｇ１ｂ、Ｇ２及びＡ２を挙げることができ、好ましくは、均一の糖鎖構造を持つ抗体は、Ａ２、Ｇ２、Ｇ０、Ｇ１ａ、Ｇ１ｂ、及びＭ３から選択される１種類の糖鎖が結合した均一糖鎖構造を持つ単離された抗体であり、最も好ましくは、均一の糖鎖構造を持つ抗体は、Ａ２、Ｇ２、又はＧ０の糖鎖が結合した均一糖鎖構造を持つ抗体である。また、均一の糖鎖構造を持つ抗体として、好ましくは、Ａ２、Ｇ２、又はＧ０の糖鎖が結合した均一糖鎖構造を持つトラスツズマブである。また、本発明における抗体としては、実質的に均一の糖鎖構造を持つ抗体からなる複数の抗体（ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）を含む。ここで、実質的に均一の糖鎖構造を持つとは、該複数の抗体の糖鎖構造の８０％以上（好ましくは、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．５％以上、９９．９％以上）が同一の糖鎖構造であることを意味する。
【００３２】
別の態様において、本発明は、複数の（１を超える分子の）抗体を含有する組成物であって、当該抗体が実質的に同一の糖鎖構造を有する組成物に関する。当該組成物において、抗体はｆｕｌｌｙ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ型とｈｅｍｉ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ型のいずれでもよく、好ましくは、ｆｕｌｌｙ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ型である。実質的に同一の糖鎖構造を有するとは、他の糖鎖構造がまったく存在しないことを必要とするものではなく、目的（例えば、医薬品としての利用など）を達成するために影響を与えない程度の他の糖鎖構造が混入していることを除外するものではない。よって、実質的に同一の糖鎖構造を有するとは、例えば、当該組成物に含まれる目的の抗体に結合する糖鎖のうち、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、９９．９９％の糖鎖が同一であることを含んでいてもよい。
【００３３】
本明細書において、「アクセプター」とは、抗体又はそのＦｃ断片に結合していた糖鎖の一部が切断された抗体又はそのＦｃ断片、あるいは、抗体又はそのＦｃ断片に直接結合するＮ−アセチルグルコサミン以外の糖鎖が切断された抗体又はそのＦｃ断片（Ｎ−アセチルグルコサミンのみが結合した抗体又はそのＦｃ断片）を意味する。特に、抗体がＩｇＧの場合、アクセプターは、２９７番目のアスパラギンに結合する糖鎖のうち、アスパラギンに直接結合するＮ−アセチルグルコサミン以外の糖鎖が切断された抗体、又は、２９７番目のアスパラギンにＮ−アセチルグルコサミンのみが付加された抗体を意味する。ここで、「Ｎ−アセチルグルコサミンのみ」とは、糖鎖の主構造上の糖が結合していないことを意味し、通常、コアフコースの結合の有無は問わない。よって、特に、そのように解釈することが不整合である場合を除き、「アクセプター」は、抗体又はそのＦｃ断片に直接結合するＮ−アセチルグルコサミンにコアフコースが結合していてもよい。好ましくは、アクセプターは、抗体又はそのＦｃ断片に直接結合するＮ−アセチルグルコサミンにコアフコースが結合していない。
【００３４】
本発明において、「エンドグリコシダーゼ」とは、グリコシド結合を内側から加水分解する酵素を意味する。すなわち、エンドグリコシダーゼは糖鎖をその内部において切断する酵素を意味する。エンドグリコシダーゼは抗体の糖鎖を切断することができる酵素であれば特に限定されない。好ましくは、本発明のエンドグリコシダーゼは、ＥＣ３．２．１．９６に分類されるエンドグリコシダーゼである。本発明のエンドグリコシダーゼは、エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼＤ（エンドグリコシダーゼＤ、Ｅｎｄｏ−Ｄ、ｅｎｄｏ−Ｄ）、エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼＨ（エンドグリコシダーゼＨ、Ｅｎｄｏ−Ｈ、ｅｎｄｏ−Ｈ）、エンドグリコシダーゼＳ（ＥｎｄｏＳ、Ｅｎｄｏ−Ｓ、ｅｎｄｏ−Ｓ）、エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼＭ（エンドグリコシダーゼＭ、Ｅｎｄｏ−Ｍ、ｅｎｄｏ−Ｍ）、エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼＬＬ（エンドグリコシダーゼＬＬ、ＥｎｄｏＬＬ、Ｅｎｄｏ−ＬＬ、ｅｎｄｏ−ＬＬ）、エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼＦ１（エンドグリコシダーゼＦ１、Ｅｎｄｏ−Ｆ１、ｅｎｄｏ−Ｆ１）、エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼＦ２（エンドグリコシダーゼＦ２、Ｅｎｄｏ−Ｆ２、ｅｎｄｏ−Ｆ２）、及びエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼＦ３（エンドグリコシダーゼＦ３、Ｅｎｄｏ−Ｆ３、ｅｎｄｏ−Ｆ３）を含む。
【００３５】
「ＡＤＣＣ」とは、抗体に覆われた標的が、結合抗体のＦｃ部分を認識するＦｃ受容体を有する細胞により傷害される機構を意味する。「ＡＤＣＣ活性」とは、標的に結合した際にＡＤＣＣによる細胞障害を引き起こす抗体の持つ能力（活性）を意味する。ＡＤＣＣ活性は、主には抗体のＦｃ領域とＦｃ受容体との結合活性に依存すると考えられている。
【００３６】
「Ｆｃ受容体」とは、抗体のＦｃ領域に特異的な受容体であり、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ−Ａ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩ−Ｂ２（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩ−Ｂ１（ＣＤ３２）、ＦｃγＲIIIａ（ＣＤ１６ａ）、ＦｃγＲIIIｂ（ＣＤ１６ｂ）、ＦｃεＲＩ、及びＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）を含む。Ｆｃ受容体は、そのリガンドとなる抗体の種類が知られており、ＦｃγＲＩは、ＩｇＧ３、ＩｇＧ１、及びＩｇＧ４と結合し、ＦｃγＲＩＩは、ＩｇＧ３、ＩｇＧ１、及びＩｇＧ２と結合し、ＦｃγＲIIIは、ＩｇＧ１及びＩｇＧ３とほとんどのＡＤＣＣは細胞表面にＦｃ受容体としてＦｃγＲIIIを有するナチュラルキラー細胞により媒介されることが知られていることから、好ましくは、ＦｃγＲIIIである。また、上述のとおり、ＦｃγＲIIIａには、複数のバリアントが存在することが知られているが、本明細書におけるＦｃγＲIIIａはこれらのバリアントのいずれであっても良いが、好ましくは、１５８番目のアミノ酸がバリンであるＦｃγＲIIIａ（ＦｃγＲIIIａ−Ｖ１５８）である。
【００３７】
「ＡＤＣＣ活性により治療可能な疾患」とは、標的に対して抗体が結合し、抗体により被覆された標的細胞をナチュラルキラー細胞等の細胞傷害性細胞が破壊することが治療に利用できる疾患であれば特に限定されるものではなく、利用する抗体の標的に応じて適宜選択することができる。このような疾患としては、例えば、原虫、細菌又はウイルス感染症、がん、寄生虫感染などが挙げられる。抗体がトラスツズマブの場合、対象疾患は、乳癌又は胃癌である。
【００３８】
また別の態様において、本発明は、前記抗体を有効成分として含有する医薬組成物に関する。医薬組成物は、その種類が特に限定されるものではなく、剤型としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、懸濁剤、座剤、軟膏、クリーム剤、ゲル剤、貼付剤、吸入剤、注射剤等が挙げられる。これらの製剤は常法に従って調製することができる。また、液体製剤にあっては、用時、水又は他の適当な溶媒に溶解又は懸濁する形であってもよい。また錠剤、顆粒剤は周知の方法でコーティングしてもよい。注射剤の場合には、本発明の化合物を水に溶解させて調製されるが、必要に応じて生理食塩水或いはブドウ糖溶液に溶解させてもよく、また緩衝剤や保存剤を添加してもよい。経口投与用又は非経口投与用の任意の製剤形態で提供される。例えば、顆粒剤、細粒剤、散剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤又は液剤等の形態の経口投与用医薬組成物、静脈内投与用、筋肉内投与用、若しくは皮下投与用などの注射剤、点滴剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤、点鼻剤、吸入剤、坐剤などの形態の非経口投与用医薬組成物として調製することができる。注射剤や点滴剤などは、凍結乾燥形態などの粉末状の剤形として調製し、用時に生理食塩水などの適宜の水性媒体に溶解して用いることもできる。
【発明の効果】
【００３９】
本発明の製造方法によれば、アクセプター抗体を効率的に調製することができる。また、本発明の方法によれば、効率的に糖鎖を切断することができるエンドグリコシダーゼの組み合わせが得られることから、効率的かつ低コストでアクセプター抗体を製造する事ができる。また、本発明の均一糖鎖構造を有する抗体は、Ｆｃ受容体との結合能力に優れることから、ＡＤＣＣ活性により治療可能な疾患に対する優れた治療薬を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】糖鎖構造の例を示す模式図である。各略号が示す糖は次のとおりである。ＧｌｃＮＡｃ：Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｍａｎ：マンノース、Ｇａｌ：ガラクトース、Ｓｉａ：シアル酸。
【図２】プラスミドＥｎｄｏＬＬ／ｐＧＥＸ−６Ｐ−１の模式図である。
【図３】エンドグリコシダーゼ未処理、またはＥｎｄｏＳ、ＥｎｄｏＬＬおよびＥｎｄｏ−Ｄによるトリプルダイジェスチョン処理後のカイコ絹糸腺産生マウスＩｇＧ１のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。
【図４】各種エンドグリコシダーゼによる加水分解反応を行ったカイコ絹糸腺産生マウスＩｇＧ１のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。
【図５】カイコ絹糸腺から産生されたマウスＩｇＧ１の糖ペプチド断片（Ｂｚ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ（Ｇｌｙｃａｎ）−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ）のＭＳスペクトルを示す。縦軸は強度比、横軸はｍ／ｚ値を示す。「Ｍ２」、「Ｍ３」及び「Ｍ４」は、それぞれ、パウチマンノース型Ｍ２、Ｍ３及びＭ４の糖鎖が結合した、ｍ／ｚ＝１９９２．１９、２１５４．２８、及び２３１６．３６を示す。「ＧＮ１」及び「ＧＮ２」は、それぞれ、複合型ＧＮ１及びＧＮ２の糖鎖が結合した、ｍ／ｚ＝２３５７．３９及び２５６０．５１を示す。「Ｍ５」、「Ｍ６」、「Ｍ７」、「Ｍ８」及び「Ｍ９」は、それぞれ、ハイマンノース型Ｍ５、Ｍ６、Ｍ７、Ｍ８及びＭ９の糖鎖が結合した、ｍ／ｚ＝２４７８．４４、２６４０．５３、２８０２．６３、２９６４．７２及び３１２６．８４を示す。
【図６Ａ】種々のエンド酵素（Ｅｎｄｏ−Ｍ，ＥｎｄｏＬＬ，Ｅｎｄｏ−Ｈ，Ｅｎｄｏ−Ｄ，ＥｎｄｏＳ）処理又は未処理のカイコ絹糸腺産生マウスＩｇＧ１の糖ペプチド断片（Ｂｚ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ（Ｇｌｙｃａｎ）−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ）のＭＳスペクトルを示す。
【図６Ｂ】種々のエンド酵素、又はその組み合わせ（Ｅｎｄｏ−Ｄ＋ＥｎｄｏＳ，Ｅｎｄｏ−Ｄ，ＥｎｄｏＳ）処理又は未処理のカイコ絹糸腺産生マウスＩｇＧ１の糖ペプチド断片（Ｂｚ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ（Ｇｌｙｃａｎ）−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ）のＭＳスペクトルを示す。
【図６Ｃ】種々のエンド酵素、又はその組み合わせ（Ｅｎｄｏ−Ｍ＋Ｅｎｄｏ−Ｄ，Ｅｎｄｏ−Ｍ＋ＥｎｄｏＳ，Ｅｎｄｏ−Ｄ＋Ｅｎｄｏ−Ｈ，ＥｎｄｏＳ＋Ｅｎｄｏ−Ｈ，Ｅｎｄｏ−Ｄ＋ＥｎｄｏＬＬ，ＥｎｄｏＳ＋ＥｎｄｏＬＬ）処理又は未処理のカイコ絹糸腺産生マウスＩｇＧ１の糖ペプチド断片（Ｂｚ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ（Ｇｌｙｃａｎ）−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ）のＭＳスペクトルを示す。
【図６Ｄ】種々のエンド酵素、又はその組み合わせ（Ｅｎｄｏ−Ｆ１，Ｅｎｄｏ−Ｆ２，Ｅｎｄｏ−Ｆ３，Ｅｎｄｏ−Ｆ１＋Ｅｎｄｏ−Ｆ２，Ｅｎｄｏ−Ｆ１＋Ｅｎｄｏ−Ｆ３，Ｅｎｄｏ−Ｆ２＋Ｅｎｄｏ−Ｆ３）処理又は未処理のカイコ絹糸腺産生マウスＩｇＧ１の糖ペプチド断片（Ｂｚ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ（Ｇｌｙｃａｎ）−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ）のＭＳスペクトルを示す。
【図７Ａ】種々のエンド酵素、又はその組み合わせ（ＥｎｄｏＳ，Ｅｎｄｏ−Ｈ，Ｅｎｄｏ−Ｍ，ＥｎｄｏＬＬ，Ｅｎｄｏ−Ｄ，及びＥｎｄｏ−Ｄ＋ＥｎｄｏＳ）処理又は未処理のカイコ絹糸腺産生マウスＩｇＧ１  １０μｇ当たりの各糖鎖構造の抗体結合糖鎖の量（ｐｍｏｌ）を示すグラフである。黒色の棒グラフは、エンドグリコシターゼ処理前の各糖鎖構造の糖鎖量を示し、灰色の棒グラフは各エンドガグリコシダーゼ処理後の各糖鎖構造の糖鎖量を示す。縦軸は、ｐｍｏｌ／１０μｇＩｇＧ１を示し、横軸は糖鎖構造を示す。表内のパーセンテージは、残存する糖鎖量を示す。
【図７Ｂ】種々のエンド酵素、又はその組み合わせ（ＥｎｄｏＳ＋ＥｎｄｏＬＬ，Ｅｎｄｏ−Ｄ＋ＥｎｄｏＬＬ，Ｅｎｄｏ−Ｄ＋Ｅｎｄｏ−Ｈ，ＥｎｄｏＳ＋Ｅｎｄｏ−Ｈ，ＥｎｄｏＳ＋Ｅｎｄｏ−Ｍ，Ｅｎｄｏ−Ｄ＋Ｅｎｄｏ−Ｍ，Ｅｎｄｏ−Ｆ１，及びＥｎｄｏ−Ｆ２）処理又は未処理のカイコ絹糸腺産生マウスＩｇＧ１  １０μｇ当たりの各糖鎖構造の抗体結合糖鎖の量（ｐｍｏｌ）を示すグラフである。黒色の棒グラフは、エンドグリコシターゼ処理前の各糖鎖構造の糖鎖量を示し、灰色の棒グラフはエンドグリコシダーゼ処理後の各糖鎖構造の糖鎖量を示す。縦軸は、ｐｍｏｌ／１０μｇＩｇＧ１を示し、横軸は糖鎖構造を示す。表内のパーセンテージは、残存する糖鎖量を示す。
【図７Ｃ】種々のエンド酵素、又はその組み合わせ（Ｅｎｄｏ−Ｆ３，Ｅｎｄｏ−Ｆ１＋Ｅｎｄｏ−Ｆ２，Ｅｎｄｏ−Ｆ１＋Ｅｎｄｏ−Ｆ３，及びＥｎｄｏ−Ｆ２＋Ｅｎｄｏ−Ｆ３）処理又は未処理のカイコ絹糸腺産生マウスＩｇＧ１  １０μｇ当たりの各糖鎖構造の抗体結合糖鎖の量（ｐｍｏｌ）を示すグラフである。黒色の棒グラフは、エンドグリコトシターゼ処理前の各糖鎖構造の糖鎖量を示し、灰色の棒グラフはエンドグリコシダーゼ処理後の各糖鎖構造の糖鎖量を示す。縦軸は、ｐｍｏｌ／１０μｇＩｇＧ１を示し、横軸は糖鎖構造を示す。表内のパーセンテージは、残存する糖鎖量を示す。
【図８】エンドグリコシダーゼ未処理、またはＥｎｄｏＳ、ＥｎｄｏＬＬおよびＥｎｄｏ−Ｄによるトリプルダイジェスチョン処理を行ったカイコ絹糸腺産生マウストラスツズマブのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。
【図９】エンドグリコシダーゼ各種による加水分解反応を行ったカイコ絹糸腺産生トラスツズマブのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。
【図１０】カイコ絹糸腺から産生されるトラスツズマブの糖ペプチド（Ｂｚ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ（Ｇｌｙｃａｎ）−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ）のＭＳスペクトルを示す。
【図１１】種々のエンド酵素又はその組み合わせ（ＥｎｄｏＳ，Ｅｎｄｏ−Ｄ，Ｅｎｄｏ−Ｈ，Ｅｎｄｏ−Ｍ，及びＥｎｄｏ−Ｄ＋ＥｎｄｏＳ）処理又は未処理のカイコ絹糸腺産生トラスツズマブのＭＳスペクトルを示す。
【図１２】種々のエンド酵素又はその組み合わせ（ＥｎｄｏＳ，Ｅｎｄｏ−Ｄ，Ｅｎｄｏ−Ｈ，Ｅｎｄｏ−Ｍ，及びＥｎｄｏ−Ｄ＋ＥｎｄｏＳ）処理又は未処理のカイコ絹糸腺産生トラスツズマブ１０μｇ当たりの各糖鎖構造の抗体結合糖鎖の量（ｐｍｏｌ）を示すグラフである。黒色の棒グラフは、エンドグリコシターゼ処理前の各糖鎖構造の糖鎖量を示し、灰色の棒グラフはエンドグリコシダーゼ処理後の各糖鎖構造の糖鎖量を示す。縦軸は、ｐｍｏｌ／１０μｇＩｇＧ１を示し、横軸は糖鎖構造を示す。表内のパーセンテージは、残存する糖鎖量を示す。
【図１３】糖鎖を改変したカイコ絹糸腺産生トラスツズマブのＳＤＳ−ＰＡＧＥ像の写真である。
【図１４】ＡＫＴＡ−ＦＰＬＣシステムで分離精製したカイコ絹糸腺産生トラスツズマブのＳＤＳ−ＰＡＧＥ像の写真である。
【図１５】カイコ絹糸腺産生したトラスツズマブにＡ２糖鎖を付加させた糖鎖改変抗体の精製のクロマトグラムを示す。縦軸は、ＵＶ吸収強度を示す。点線は、塩のグラジェントを示す。
【図１６】カイコ絹糸腺産生したトラスツズマブにＡ２糖鎖を付加させた糖鎖改変抗体の精製前と精製後のＨＰＬＣプロファイルを示す。
【図１７】精製後の糖鎖改変抗体（Ａ２体、Ｇ２体、Ｇ０体、Ｍ３体）とカイコ絹糸腺産生トラスツズマブ由来の糖ペプチドのＭＳスペクトルを示す。
【図１８】糖鎖改変抗体（Ａ２体、Ｇ２体、Ｇ０体、及びＭ３体）、糖鎖改変していない抗体（Ｉｎｔａｃｔ体）、糖鎖切断した抗体（ａｇｌｙｃｏｎ体）、並びに、ＣＨＯ細胞で作成されたトラスツズマブ（ＣＨＯ体）とＦｃγＲIIIａ−Ｖ１５８との結合試験の結果を示すグラフである。（縦軸：ＯＤ４５０ｎｍ、横軸：タンパク濃度（μｇ／ｍｌ））
【図１９】糖鎖改変抗体（Ａ２体、Ｇ２体、Ｇ０体、及びＭ３体）並びに改変していない抗体（Ｉｎｔａｃｔ体）、糖鎖切断した抗体（ａｇｌｙｃｏｎ体）、ＣＨＯ細胞で作成されたトラスツズマブ（ＣＨＯ体）のＳＫＢＲ−３をターゲット細胞とした時のＡＤＣＣリポーター試験の結果を示すグラフである。(縦軸：ルシフェラーゼ活性：発光量（ＲＬＵ）、横軸：タンパク濃度(μｇ／ｍｌ))
【図２０】糖鎖改変抗体（Ａ２体、Ｇ２体、Ｇ０体、及びＭ３体）並びに改変していない抗体（Ｉｎｔａｃｔ体）、糖鎖切断した抗体（ａｇｌｙｃｏｎ体）、ＣＨＯ細胞で作成されたトラスツズマブ（ＣＨＯ体）のＢＴ−４７４をターゲット細胞とした時のＡＤＣＣリポーター試験の結果を示すグラフである。(縦軸：ルシフェラーゼ活性：発光量（ＲＬＵ）、横軸：タンパク濃度(μｇ／ｍｌ))
【発明を実施するための形態】
【００４１】
＜抗体の製造方法＞
抗体は、当業者周知の遺伝子組換え技術により作製することができる。すなわち、抗体遺伝子を挿入した抗体発現ベクターを、カイコ、酵母等へ導入することにより取得することができる。例えば、抗体は次の方法で得ることができる。抗体の重鎖および軽鎖のｃＤＮＡを単離し、ＢｍＮＰＶポリヘドリンの５’非翻訳領域配列（特開２００８−１２５３６６）を含むプライマーを用いたＰＣＲを行うことにより、重鎖および軽鎖ｃＤＮＡの５′末端にＢｍＮＰＶポリヘドリンの５’非翻訳領域配列を付加する。得られた抗体の重鎖ｃＤＮＡを、カイコ形質転換用ベクターｐＭＳＧ３．１ＭＧ（特開２０１２−１８２９９５）のＮｒｕＩサイトに挿入し、次いで、Ｅｃｏ４７IIIサイトに軽鎖ｃＤＮＡを挿入して、抗体ｃＤＮＡをカイコに組み込むためのプラスミドベクターを完成させる。
【００４２】
得られたプラスミドベクターをＰｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）で精製した後、ヘルパープラスミドであるｐＨＡ３ＰＩＧ（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８，８１−８４（２０００））とプラスミド量が１：１になるように混合し、さらにエタノール沈殿を行った後、ＤＮＡ濃度が１０〜１０００μｇ／ｍｌなるようにインジェクションバッファー（０．５ｍＭリン酸バッファーｐＨ７．０，５ｍＭ  ＫＣｌ）に溶解する。このベクター混合液を、産卵後２〜８時間の前胚盤葉期のカイコ卵（カイコ胚）に、一つの卵あたり約１〜２００ｎｌの液量で微量注入する。ベクターＤＮＡを微量注入した卵を約２５℃でインキュベートし、孵化したカイコを飼育し、得られた生殖可能な成虫を交配し、Ｆ１世代の卵塊を得る。産卵日から３〜１０日目のＦ１卵塊のうち、眼や神経系から緑色蛍光を発するトランスジェニックカイコの卵を選択して孵化させ、抗体ｃＤＮＡが組み込まれたトランスジェニックカイコを樹立する。
【００４３】
得られたトランスジェニックカイコを、ＢｍＮＰＶ由来のトランスアクチベーターであるＩＥ１遺伝子を発現するカイコ（特開２０１２−１８２９９５）と交配し、得られたＦ２世代のカイコから、抗体ｃＤＮＡとＩＥ１遺伝子の両方を有するカイコを選別し、これらのカイコを飼育して繭を作らせる。抗体ｃＤＮＡとＩＥ１遺伝子を有するカイコの繭を、抽出バッファー（ＰＢＳ，０．１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，０．５Ｍ  ＮａＣｌ）に浸漬し、３０分間室温で撹拌して繭抽出液を調製する。抽出液を０．４５μｍのフィルターで濾過し、プロテインＧカラム（ＰｒｏｔｅｉｎＧ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ，ＧＥヘルスケア）に供する。０．１Ｍグリシン（ｐＨ２．７）で溶出させ、溶液に１Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ９．０）を加えて中和し、最後にＰＢＳに対して透析する。
【００４４】
また、抗体のＦｃ断片は、当業者周知の様々な方法で調製することができ、例えば、上述の方法により得られた抗体をパパイン処理することにより、得ることができる。
【００４５】
＜抗体結合糖鎖の定量方法＞
一態様において、本発明は、抗体又はそのＦｃ断片に結合する所望の糖鎖構造を有する糖鎖（対象糖鎖）の定量的情報を決定する方法であって、（ａ）当該抗体又はそのＦｃ断片をプロテアーゼで処理することを備える、プロテアーゼ処理ステップ、及び、（ｂ）前記プロテアーゼ処理ステップにより得られた糖ペプチドのうち、前記対象糖鎖が結合した糖ペプチドを測定することを備える、測定ステップを備える方法に関する。
【００４６】
本発明の方法は、特に、エンドグリコシダーゼによる糖鎖切断後に残存する抗体結合糖鎖の定量的な情報を得る目的で用いることができる。すなわち、本発明は、所望のエンドグリコシダーゼで処理された抗体又はそのＦｃ断片に結合する所望の糖鎖構造を有する糖鎖（対象糖鎖）の定量的情報を決定する方法であって、（ａ）前記抗体又はそのＦｃ断片をエンドグリコシダーゼと反応させることを備える、反応ステップ、（ｂ）反応ステップ後の前記抗体又はそのＦｃ断片をプロテアーゼで処理することを備える、プロテアーゼ処理ステップ、（ｃ）前記プロテアーゼ処理ステップにより得られた糖ペプチドのうち、前記対象糖鎖が結合した糖ペプチドを測定することを備える、測定ステップ、及び、対象糖鎖を有する糖ペプチドの測定値から前記エンドグリコシダーゼで処理された抗体又はそのＦｃに結合する対象糖鎖の定量的情報を決定することを備える、決定ステップを備える方法に関する。
【００４７】
前記抗体結合糖鎖の定量方法において、「対象糖鎖」とは、抗体又はそのＦｃ断片に結合する所望の糖鎖構造を有する糖鎖であって、その定量的情報を取得する対象となる糖鎖を意味する。対象糖鎖は、１種類でもよいし、２種類以上でもよい。対象糖鎖が２種類以上の場合、異なる構造の糖鎖を同時に又は別々に測定してその定量的情報を決定することができる。また、前記抗体結合糖鎖の定量方法において、「定量的情報」とは、抗体に結合（又はエンドグリコシダーゼにより切断されずに残存）している糖鎖の量に関する情報を意味する。「定量的情報」は、量の指標となり得る情報であれば特に制限されず、（絶対的な）量を意味してもよいし、閾値やコントロールに基づく数値や割合などの相対的な数値、又は段階的評価（多い〜少ないに関する）を意味してもよい。「定量的情報」は通常、１種類の対象糖鎖に関する量に関する情報を意味するが、対象糖鎖が２種類以上の場合には、それぞれの糖鎖に関する定量的情報であってもよいし、当該２種類以上の全ての糖鎖に関する定量的情報であってもよい（例えば、総抗体結合糖鎖量等）。
【００４８】
前記「プロテアーゼ処理ステップ」で用いるプロテアーゼとしては、抗体を切断可能でかつ抗体に結合する糖鎖構造に影響を与えないプロテアーゼであれば特に限定されない。例えば、プロテアーゼとしては、トリプシンを挙げることができる。プロテアーゼによる処理は、使用するプロテアーゼの種類、至適条件（ｐＨ、温度など）に応じて、当業者周知の方法により適宜行うことができる。また、抗体又はそのＦｃ断片エンドグリコシダーゼと反応させる「反応ステップ」は、使用するエンドグリコシダーゼの種類、至適条件（ｐＨ、温度など）に応じて、当業者周知の方法により適宜行うことができる。たとえば、エンドグリコシダーゼによる処理は、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０〜８．０）中の抗体又はそのＦｃ断片にエンドグリコシダーゼを加え、３７℃で１〜３０時間静置することで行うことができる。「反応ステップ」では、１種類のエンドグリコシダーゼを使用することもできるし、２種類以上のエンドグリコシダーゼを組み合わせて使用することもできる。また、前記「測定ステップ」における糖ペプチドの測定は、後述の方法により行うことができる。
【００４９】
また、抗体又はそのＦｃ断片に結合する所望の糖鎖構造を有する糖鎖（対象糖鎖）の定量的情報の決定は、定量的情報の性質及び測定ステップで用いる測定方法に応じて、測定ステップにより得られた測定値を基にして定量的情報を決定することにより行うことができる。例えば、定量的情報の決定は、測定ステップにより得られた測定値（蛍光強度等の測定値そのもの、又は、測定の結果算出された糖鎖結合抗体量）をそのまま定量的情報として決定することにより行うことができる。あるいは、定量的情報の決定は、測定ステップにより得られた測定値を基にして、適宜計算、あるいは評価又は分類することにより行うことができる。例えば、定量的情報の決定は、使用した総抗体量に占める、対象糖鎖結合抗体量の割合として決定してもよいし、対象糖鎖結合抗体量が特定の閾値を超える／越えない量であるか否かとして決定してもよい。あるいは、定量的情報の決定は、コントロール抗体又はそのＦｃ断片における糖鎖結合量に対する評価抗体の糖鎖結合量の割合や、コントロール抗体又はそのＦｃ断片における糖鎖結合量と、評価抗体の糖鎖結合量との差としてもよい。
【００５０】
対象糖鎖を有する糖ペプチドは、前記エンドグリコシダーゼで処理された抗体又はそのＦｃに由来することから、当該抗体又はそのＦｃに結合する糖鎖をそのまま有する。よって、対象糖鎖を有する糖ペプチドの量は、対象糖鎖を有する前記エンドグリコシダーゼで処理された抗体又はそのＦｃの量を反映している。対象糖鎖を有する糖ペプチドの測定値から前記エンドグリコシダーゼで処理された抗体又はそのＦｃに結合する対象糖鎖の定量的情報を決定することを備える、決定ステップは、対象糖鎖を有する糖ペプチドの測定値をそのまま前記エンドグリコシダーゼで処理された抗体又はそのＦｃに結合する対象糖鎖の定量的情報としてもよいし、対象糖鎖を有する糖ペプチドの測定値を基に、前記エンドグリコシダーゼで処理された抗体又はそのＦｃに結合する対象糖鎖の定量的情報を計算により求めてもよい。例えば、対象糖鎖を有する糖ペプチドの測定値が量である場合、当該量はそのまま前記エンドグリコシダーゼで処理された抗体又はそのＦｃに結合する対象糖鎖の量として決定することができる。
【００５１】
＜抗体結合糖鎖の切断量に関する情報の決定方法＞
一態様において、本発明はエンドグリコシダーゼによる抗体結合糖鎖の切断量に関する情報を決定する方法に関する。具体的には、本発明は、
抗体又はＦｃに結合する糖鎖であって、所望の糖鎖構造を有する１種類の糖鎖である対象糖鎖の、エンドグリコシダーゼ処理による、切断量に関する情報を決定する方法であって、
（ａ）前記抗体又はそのＦｃをエンドグリコシダーゼと反応させることを備える、反応ステップ、
（ｂ）エンドグリコシダーゼと反応させた前記抗体又はそのＦｃをプロテアーゼで処理して糖ペプチドを生成させることを備える、プロテアーゼ処理ステップ
（ｃ）エンドグリコシダーゼと反応させていない前記抗体又はそのＦｃをプロテアーゼで処理して糖ペプチドを生成させることを備える、プロテアーゼ処理ステップ、
（ｄ）前記プロテアーゼ処理ステップにおいて、エンドグリコシダーゼと反応させた前記抗体又はそのＦｃをプロテアーゼで処理することにより得られた糖ペプチドであって、前記対象糖鎖が結合した糖ペプチドを定量することを備える、定量ステップ、
（ｅ）前記プロテアーゼ処理ステップにおいて、エンドグリコシダーゼと反応させていない前記抗体又はそのＦｃをプロテアーゼで処理することにより得られた糖ペプチドであって、前記対象糖鎖が結合した糖ペプチドを定量することを備える、定量ステップ、及び、
（ｆ）エンドグリコシダーゼと反応させた前記抗体又はそのＦｃについて前記定量ステップで得られた定量値、及びエンドグリコシダーゼと反応させていない前記抗体又はそのＦｃについて前記定量ステップで得られた定量値から、前記エンドグリコシダーゼ処理による前記対象糖鎖の切断量に関する情報を決定することを備える、決定ステップを備える方法に関する。
【００５２】
別の態様において、本発明の抗体結合糖鎖の切断量に関する情報の決定方法は、不均一の糖鎖構造を有する抗体における２種類以上の対象糖鎖に関する切断量に関する情報を決定する方法であってもよい。よって、本発明は、
エンドグリコシダーゼ処理による、不均一の糖鎖構造を有する抗体又はそのＦｃに結合する糖鎖であって、所望の糖鎖構造を有する糖鎖である２種類以上の対象糖鎖のそれぞれの切断量に関する情報を決定する方法であって、
（ａ）前記抗体又はそのＦｃをエンドグリコシダーゼと反応させることを備える、反応ステップ、
（ｂ）エンドグリコシダーゼと反応させた前記抗体又はそのＦｃをプロテアーゼで処理して糖ペプチドを生成させることを備える、プロテアーゼ処理ステップ、
（ｃ）エンドグリコシダーゼと反応させていない前記抗体又はそのＦｃをプロテアーゼで処理して糖ペプチドを生成させることを備える、プロテアーゼ処理ステップ、
（ｄ）前記プロテアーゼ処理ステップにおいて、エンドグリコシダーゼと反応させた前記抗体又はそのＦｃをプロテアーゼで処理することにより得られた糖ペプチドであって、前記対象糖鎖が結合した糖ペプチドを定量することを備える、定量ステップ、
（ｅ）前記プロテアーゼ処理ステップにおいて、エンドグリコシダーゼと反応させていない前記抗体又はそのＦｃをプロテアーゼで処理することにより得られた糖ペプチドであって、前記対象糖鎖が結合した糖ペプチドを定量することを備える、定量ステップ、
（ｆ）それぞれの対象糖鎖について、エンドグリコシダーゼと反応させた前記抗体又はそのＦｃについて前記定量ステップ得られた定量値、及びエンドグリコシダーゼと反応させていない前記抗体又はそのＦｃについて前記定量ステップで得られた定量値から、前記エンドグリコシダーゼによるそれぞれの対象糖鎖の切断量に関する情報を決定することを備える、決定ステップを備える方法。
を含む。
【００５３】
前記抗体結合糖鎖の切断量に関する情報の決定方法において、「エンドグリコシダーゼによる抗体結合糖鎖の切断量に関する情報」とは、抗体結合糖鎖のエンドグリコシダーゼにより切断された量の指標となり得る情報であれば特に限定されず、（絶対的な）切断量を意味してもよいし、閾値やコントロールに基づく数値や割合などの相対的な数値、又は段階的評価（多い〜少ないに関する）を意味してもよい。対象糖鎖が２種類以上の場合には、「定量的情報」はそれぞれの糖鎖に関する定量的情報であってもよいし、当該２種類以上の全ての糖鎖に関する定量的情報であってもよい（例えば、総切断量等）。あるいは、「定量的情報」は、２種類以上の糖鎖構造を有する糖鎖について、それぞれの糖鎖の切断量に関する定量的情報の集合である「糖鎖切断パターン」としてもよい。
【００５４】
上述の「抗体結合糖鎖の定量方法」における「プロテアーゼ処理ステップ」、「反応ステップ」、及び「測定ステップ」に関する説明は、そのまま「抗体結合糖鎖の切断量に関する情報の決定方法」にも適用される。なお、「抗体結合糖鎖の切断量に関する情報の決定方法」における、エンドグリコシダーゼと反応させていない前記抗体又はそのＦｃの「プロテアーゼ処理ステップ」及び／又は「測定ステップ」とエンドグリコシダーゼと反応させていない前記抗体又はそのＦｃの「プロテアーゼ処理ステップ」及び／又は「測定ステップ」は同時に行っても良いし、異なるタイミングで別々に行っても良い。また、上述の「抗体結合糖鎖の定量方法」は、エンドグリコシダーゼと反応させていない前記抗体又はそのＦｃの「プロテアーゼ処理ステップ」及び／又は「測定ステップ」を含んでいなくても良く、その代わりに、既に得られている「エンドグリコシダーゼと反応させていない前記抗体又はそのＦｃについて前記定量ステップで得られた定量値」を決定ステップにおいて用いても良い。
【００５５】
また、抗体又はそのＦｃ断片に結合する所望の糖鎖構造を有する糖鎖（対象糖鎖）のエンドグリコシダーゼによる切断量に関する情報の決定は、切断量に関する情報の性質及び測定ステップで用いる測定方法に応じて、測定ステップにより得られた測定値を基にして切断量を算出することにより決定することができる。例えば、切断量に関する情報の決定は、測定ステップにより得られた測定値（蛍光強度等の測定値そのもの、又は、測定の結果算出された糖鎖結合抗体量）を基に、エンドグリコシダーゼ処理／未処理の割合又は差（（エンドグリコシダーゼ未処理群で得られた測定値）−（エンドグリコシダーゼ処理群で得られた測定値））として計算して決定することができる。あるいは、切断量に関する情報の決定は、測定ステップにより得られた測定値を基にして、評価又は分類することにより行うことができる。例えば、切断量に関する情報の決定は、対象糖鎖切断のエンドグリコシダーゼ処理／未処理の割合又は差が特定の閾値を超える／越えない量であるか否かとして決定してもよい。
【００５６】
特に、２種類以上の糖鎖構造を有する糖鎖を対象糖鎖とする場合、各々の糖鎖構造を有する糖鎖について、エンドグリコシダーゼ処理／未処理の割合又は差（（エンドグリコシダーゼ未処理群で得られた測定値）−（エンドグリコシダーゼ処理群で得られた測定値））を計算し、これらの情報の集合としてエンドグリコシダーゼによる切断量に関する情報（切断パターン）を決定することができる。
【００５７】
＜アクセプターの調製に用いるエンドグリコシダーゼの組み合わせの決定方法＞
更なる態様において、本発明は、アクセプターの調製方法に使用するための、２種類以上のエンドグリコシダーゼの組み合わせを決定する方法に関する。具体的には、本発明は、  抗体に結合した糖鎖を切断するために使用するのに適した２種類以上のエンドグリコシダーゼの組み合わせを決定する方法であって、
上述の抗体結合糖鎖の切断量に関する情報の決定方法を用いて不均一の糖鎖構造を有する抗体又はそのＦｃに結合する糖鎖であって、所望の糖鎖構造を有する２種類以上の対象糖鎖のエンドグリコシダーゼによる切断量に関する情報を決定するステップ、
得られた対象糖鎖のエンドグリコシダーゼによる切断量に関する情報から、相補的な糖鎖切断を示す２種類以上のエンドグリコシダーゼの組み合わせを選択するステップ、及び、
選択された２種類以上のエンドグリコシダーゼを前記抗体に結合した糖鎖を切断するために使用するのに適したエンドグリコシダーゼの組み合わせとして決定するステップを備える方法に関する。
【００５８】
アクセプターの調製に用いるエンドグリコシダーゼの組み合わせの決定方法において、「相補的な糖鎖切断を示す２種類以上のエンドグリコシダーゼの組み合わせを選択するステップ」は、ある１種類以上の糖鎖構造を有する糖鎖（「候補切断糖鎖」という）の切断量が多く、別の１種類以上の糖鎖構造を有する糖鎖（「候補非切断糖鎖」という）の切断量が少ない候補エンドグリコシダーゼに対し、候補非切断糖鎖の切断量が多いエンドグリコシダーゼを相補的エンドグリコシダーゼとして選択し、該候補エンドグリコシダーゼと該相補的エンドグリコシダーゼとの組み合わせを「相補的な糖鎖切断を示す２種類以上のエンドグリコシダーゼの組み合わせ」として選択することにより行うことができる。また、「選択された２種類以上のエンドグリコシダーゼを前記抗体に結合した糖鎖を切断するために使用するのに適したエンドグリコシダーゼの組み合わせとして決定するステップ」は、前記候補エンドグリコシダーゼと相補的エンドグリコシダーゼの組み合わせを前記抗体に結合した糖鎖を切断するために使用するのに適した組み合わせとして決定することにより行うことができる。エンドグリコシダーゼの選択及び組み合わせの決定において、候補エンドグリコシダーゼとして複数のエンドグリコシダーゼを選択するか、あるいは、相補的エンドグリコシダーゼとして複数のエンドグリコシダーゼを選択することにより、３種類以上のエンドグリコシダーゼの組み合わせを決定することもできる。また、候補エンドグリコシダーゼと相補的エンドグリコシダーゼの組み合わせとして、２通り以上の組み合わせを決定してもよい。最初に選択する候補エンドグリコシダーゼは、所望のエンドグリコシダーゼを選択することができるが、好ましくは、抗体結合糖鎖の切断量が多いエンドグリコシダーゼである。エンドグリコシダーゼによる抗体結合糖鎖の切断量は、上述の抗体結合糖鎖の切断量に関する情報の決定方法に記載された方法により決定することができる。
【００５９】
あるいは、「相補的な糖鎖切断を示す２種類以上のエンドグリコシダーゼの組み合わせを選択するステップ」は、各々のエンドグリコシダーゼについて得られた複数の糖鎖構造に関する糖鎖切断パターンを比較し、糖鎖切断パターンが相補的となるようなエンドグリコシダーゼの組み合わせを決定することにより行ってもよい。
【００６０】
また、アクセプターの調製に用いるエンドグリコシダーゼの組み合わせの決定方法は、更に、相補的な糖鎖切断を示す２種類以上のエンドグリコシダーゼの２通り以上の組み合わせを決定し、その後、当該エンドグリコシダーゼの２通り以上の組み合わせのそれぞれをエンドグリコシダーゼとして用いて上述の「抗体結合糖鎖の切断量に関する情報の決定方法」を行うことで、当該エンドグリコシダーゼの２通り以上の組み合わせのそれぞれについて所望の種類の糖鎖構造を持つ糖鎖の糖鎖切断量に関する情報を決定し、決定された踏査切断料に関する情報を比較することにより、アクセプターの調製に用いるエンドグリコシダーゼの組み合わせを決定してもよい。すなわち、前記方法は、更に、前記相補的な糖鎖切断を示す２種類以上のエンドグリコシダーゼによる対象糖鎖の糖鎖切断量に関する情報を決定するステップ（本ステップは、必要に応じて、前記相補的な糖鎖切断を示す２種類以上のエンドグリコシダーゼを用いた反応ステップ、プロテアーゼ処理ステップ、及び／又は定量ステップを含む）、及び、前記相補的な糖鎖切断を示す２種類以上のエンドグリコシダーゼの２通り以上の組み合わせのうち、対象糖鎖の糖鎖切断量が多い組み合わせをアクセプターの調製に用いるエンドグリコシダーゼの組み合わせとして決定するステップを備える方法であってもよい。ここで、「対象糖鎖の糖鎖切断量が多い」とは、１種類以上の対象糖鎖の総切断量又は全ての結合糖鎖の総切断量が多いことを意味する。
【００６１】
より具体的には、本発明のアクセプターの調製に用いるエンドグリコシダーゼの組み合わせの決定方法は、次の方法であってもよい。抗体に結合した糖鎖を切断するために使用するのに適した２種類以上のエンドグリコシダーゼの組み合わせを決定する方法であって、
上述の抗体結合糖鎖の切断量に関する情報の決定方法を用いて不均一の糖鎖構造を有する抗体又はそのＦｃに結合する糖鎖であって、所望の糖鎖構造を有する２種類以上の対象糖鎖のエンドグリコシダーゼによる切断量に関する情報を決定するステップ、
得られた対象糖鎖のエンドグリコシダーゼによる切断量に関する情報から、相補的な糖鎖切断を示す２種類以上のエンドグリコシダーゼの２通り以上の組み合わせを選択するステップ、及び、
選択された２種類以上のエンドグリコシダーゼの２通り以上の組み合わせのそれぞれについて、上述の抗体結合糖鎖の切断量に関する情報の決定方法を用いて対象糖鎖の切断量に関する情報を決定するステップ、及び、
前記対象糖鎖の切断量に関する情報を比較することにより、抗体に結合した糖鎖を切断するために使用するのに適した２種類以上のエンドグリコシダーゼの組み合わせを決定するステップを備える方法であってもよい。
【００６２】
上述において「対象糖鎖の切断量に関する情報」は、切断パターンとすることもできるし、１種類以上の対象糖鎖の総切断量又は全ての結合糖鎖の総切断量とすることもできる。この場合、抗体に結合した糖鎖を切断するために使用するのに適した２種類以上のエンドグリコシダーゼの組み合わせを決定するステップは、例えば、本方法を行った２種類以上のエンドグリコシダーゼの組み合わせのそれぞれから得られた、全ての糖鎖の総切断量、エンドグリコシダーゼ未処理抗体又はそのＦｃ断片において結合量の多い（１種類以上の）糖鎖の総切断量、あるいは、目的とする特定の（１種類以上の）標的糖鎖の総切断量を比較し、前記総切断量が多い組み合わせ、エンドグリコシダーゼ未処理抗体又はそのＦｃ断片において結合量の多い（１種類以上の）糖鎖の総切断量が多い組み合わせ、あるいは、目的とする特定の（１種類以上の）標的糖鎖の総切断量が多い組み合わせを抗体に結合した糖鎖を切断するために使用するのに適した２種類以上のエンドグリコシダーゼの組み合わせとして決定することにより行うことができる。
【００６３】
特に、前記決定ステップが総切断量を指標とする場合、本発明の方法は、更に、前記相補的な糖鎖切断を示す２種類以上のエンドグリコシダーゼによる全ての糖鎖の／１種類以上の対象糖鎖の／エンドグリコシダーゼ未処理抗体又はそのＦｃ断片において結合量の多い（１種類以上の）糖鎖の切断量に関する情報を決定するステップ、及び、前記相補的な糖鎖切断を示す２種類以上のエンドグリコシダーゼによる総切断量が多い２種類以上のエンドグリコシダーゼの組み合わせを前記抗体に結合した糖鎖を切断するためのエンドグリコシダーゼの組み合わせとして決定するステップを備えることができる。
【００６４】
＜糖ペプチドの測定方法＞
前記プロテアーゼ処理ステップにより得られた糖ペプチドのうち、各糖鎖構造を有する糖ペプチドを定量する定量ステップは、マススペクトルにより行うことができる。
【００６５】
抗体結合糖鎖の組成は、トリフルオロ酢酸等で、糖鎖の酸加水分解を行うことにより、中性糖またはアミノ糖を遊離し、その組成比を分析することもできる。具体的な方法として、Ｄｉｏｎｅｘ社製糖組成分析装置（ＢｉｏＬＣ）を用いる方法が挙げられる。ＢｉｏＬＣはＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ（ｈｉｇｈ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ａｎｉｏｎ−ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−ｐｕｌｓｅｄ  ａｍｐｅｒｏｍｅｔｒｉｃｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）法［ジャーナル・オブ・リキッド・クロマトグラフィー（Ｊ．Ｌｉｑ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．），６，１５７７（１９８３）］によって糖組成を分析する装置である。また、２−アミノピリジンによる蛍光標識化法でも組成比を分析することができる。具体的には、公知の方法［アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．），５５（１），２８３−２８４（１９９１）］に従って酸加水分解した試料を２−アミノピリジル化で蛍光ラベル化し、ＨＰＬＣ分析して組成比を算出することができる。
【００６６】
また、抗体の糖鎖の構造解析は、２次元糖鎖マップ法［アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），１７１，７３（１９８８）、生物化学実験法２３−糖タンパク質糖鎖研究法（学会出版センター）高橋禮子編（１９８９年）］により行うこともできる。２次元糖鎖マップ法は、例えば、Ｘ軸には逆相クロマトグラフィー糖鎖の保持時間または溶出位置を、Ｙ軸には順相クロマトグラフィーによる糖鎖の保持時間または溶出位置を、それぞれプロットし、既知糖鎖のそれらの結果と比較することにより、糖鎖構造を推定する方法である。
【００６７】
具体的には、抗体をヒドラジン分解して、抗体から糖鎖を遊離し、２−アミノピリジン（以下、ＰＡと略記する）による糖鎖の蛍光標識［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），９５，１９７（１９８４）］を行った後、ゲルろ過により糖鎖を過剰のＰＡ化試薬などと分離し、逆相クロマトグラフィーを行う。次いで、分取した糖鎖の各ピークについて順相クロマトグラフィーを行う。これらの結果をもとに、２次元糖鎖マップ上にプロットし、糖鎖スタンダード（ＴａＫａＲａ社製）、文献［アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），１７１，７３（１９８８）］とのスポットの比較より糖鎖構造を推定することができる。さらに各糖鎖のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳなどの質量分析を行い、２次元糖鎖マップ法により推定される構造を確
認することができる。
【００６８】
＜アクセプターの調製方法＞
別の態様において、本発明は、抗体に結合した糖鎖を切断してアクセプターを製造する方法に関する。具体的には、本発明は、糖鎖が切断された抗体（例えば、ＩｇＧ抗体の場合、２９７番目のアスパラギンに結合する糖鎖のうち、Ｎ−アセチルグルコサミン以外の糖鎖が切断された抗体）の製造方法であって、抗体と複数のエンドグリコシダーゼとを反応させることを備える方法に関する。ここで、複数のエンドグリコシダーゼは、エンドグリコシダーゼＤ，エンドグリコシダーゼＨ，エンドグリコシダーゼＳ、エンドグリコシダーゼＭ、エンドグリコシダーゼＬＬ、エンドグリコシダーゼＦ１、エンドグリコシダーゼＦ２、及びエンドグリコシダーゼＦ３からなる群から選択される２種類以上のエンドグリコシダーゼであってもよい。
【００６９】
本発明の方法において用いる２種類以上のエンドグリコシダーゼの組み合わせは、エンドグリコシダーゼの所望の組み合わせを含むことができる。例えば、複数のエンドグリコシダーゼが、ＥＣ３．２．１．９６に分類される基質特異性の異なるエンドグリコシダーゼの組み合わせとすることができる。好ましくは、エンドグリコシダーゼの組み合わせは後述の方法によって決定される組み合わせである。例えば、本発明の方法において用いる２種類以上のエンドグリコシダーゼの組み合わせとしては、以下の組み合わせを挙げることができる：
（ｉ）エンドグリコシダーゼＤとエンドグリコシダーゼＳ
（ｉｉ）エンドグリコシダーゼＳとエンドグリコシダーゼＬＬ
（ｉｉｉ）エンドグリコシダーゼＤとエンドグリコシダーゼＬＬ
（ｉｖ）エンドグリコシダーゼＤとエンドグリコシダーゼＨ
（ｖ）エンドグリコシダーゼＳとエンドグリコシダーゼＨ
（ｖｉ）エンドグリコシダーゼＦ１とエンドグリコシダーゼＦ２
（ｖｉｉ）エンドグリコシダーゼＦ１とエンドグリコシダーゼＦ３
（ｖｉｉｉ）エンドグリコシダーゼＦ２とエンドグリコシダーゼＦ３
（ｉＸ）エンドグリコシダーゼＤとエンドグリコシダーゼＳとエンドグリコシダーゼＬＬ
（Ｘ）エンドグリコシダーゼＤとエンドグリコシダーゼＳとエンドグリコシダーゼＨ
（Ｘｉ）エンドグリコシダーゼＤとエンドグリコシダーゼＳとエンドグリコシダーゼＦ１
【００７０】
一態様において、本発明は、タイプの異なる２種類以上のＮ結合型糖鎖が不均一に結合した抗体（不均一糖鎖結合抗体）又はそのＦｃ断片から、アクセプター（好ましくは、Ｎ−アセチルグルコサミンのみが付加された抗体（例えば、ＩｇＧ抗体なら２９７番目のアスパラギンにＮ−アセチルグルコサミンのみが付加された抗体）又はそのＦｃ断片）を製造する方法であって、当該不均一糖鎖結合抗体（例えば、ＩｇＧ抗体）又はそのＦｃ断片と複数のエンドグリコシダーゼを反応させることを備える方法であって、当該複数のエンドグリコシダーゼが上述のアクセプターの調製に用いるエンドグリコシダーゼの組み合わせの決定方法により決定されたエンドグリコシダーゼである方法に関する。すなわち、本発明は、アクセプター（好ましくは、Ｎ−アセチルグルコサミン以外の糖鎖が切断された抗体又はそのＦｃ断片）の製造方法であって、抗体と上述の方法により決定された複数のエンドグリコシダーゼとを反応させることを備える方法に関する。
【００７１】
抗体の糖鎖エンジニアリングの重要な課題として、ＣＨＯ細胞で抗体を作成した場合、８０％以上がコアフコースを含んでおり、エンドグリコシダーゼで消化してもアクセプターが作製できないという問題があった。この問題を解決するため、好ましくは、酵母またはカイコにより産生された抗体を原料として用いて、上述の方法を適用することにより、より簡便かつ安価にコアフコースの結合していないアクセプター（例えば、２９７番目のアスパラギンにＮ−アセチルグルコサミンのみが付加されたＩｇＧ抗体又はそのＦｃ断片ｎ）を製造することができる。即ち、本発明は、均一な糖鎖構造を持つ糖タンパク質生産用のアクセプターの製造方法であって、酵母又はカイコにより産生された抗体又はそのＦｃ断片と複数のエンドグリコシダーゼとを反応させることを備える方法に関する。特に、本発明によれば、複数のエンドグリコシダーゼを用いて、酵母又はカイコ特有のハイマンノース型糖鎖付加抗体又はそのＦｃ断片から、アクセプターを調製することができる。
【００７２】
＜均一糖鎖結合抗体の製造方法＞
更に本発明は、前記方法により調製されたアクセプターを用いた均一糖鎖抗体又はそのＦｃ断片の調製方法を提供する。すなわち、本発明は、所望の均一な糖鎖構造を有する糖鎖が結合した抗体（均一糖鎖結合抗体）又はそのＦｃ断片を製造する方法であって、
上述の方法によりアクセプターを調製する、アクセプター調製ステップ、及び、
該アクセプターと糖鎖ドナーとをグライコシンターゼを用いて反応させて、前記所望の均一な糖鎖構造を有する糖鎖が結合された抗体又はそのＦｃ断片を生成させる抗体生成ステップを備える方法に関する。
【００７３】
あるいは、本発明は、上述の方法により調製されたアクセプター（下記式中のＧｌｃＮＡｃ−抗体）と、均一な糖鎖（Ａ−ＧｌｃＮＡｃ−ＯＨ）をオキサゾリンで誘導させた糖鎖ドナー（下記式中のＡ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｏｘａ）とを、グライコシンターゼを用いて酵素的糖鎖転移反応（下記式）を行い、当該均一な糖鎖が導入された抗体又はそのＦｃ断片（下記式中のＡ−ＧｌｃＮＡｃ−抗体）を製造する方法に関する。ここでは、「抗体」の用語は抗体のＦｃ断片を含む。
式：
Ａ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｏｘａ＋ＧｌｃＮＡｃ−抗体→Ａ−ＧｌｃＮＡｃ−抗体＋Ｈ２Ｏ
（式中、Ａは糖質を示す、ＧｌｃＮＡｃ−ＯｘａとはＧｌｃＮＡｃのオキサゾリン誘導体を示す。）
【００７４】
前記均一糖鎖結合抗体に結合する糖鎖は、所望の糖鎖構造であることができ、例えば、高マンノース型糖鎖（Ｍ３、Ｍ４、Ｍ５、Ｍ６、Ｍ７、Ｍ８、Ｍ９のいずれか）、または複合型糖鎖（Ａ２、Ｇ２、Ｇ１ａ、Ｇ１ｂ、Ｇ０（＝ＧＮ２）のいずれか）であってもよい。
【００７５】
前記抗体生成ステップは、当業者周知の方法で行うことができ、例えば、酸補足材存在下、糖鎖ドナーに脱水縮合材を添加した後に、アクセプター抗体を添加してグライコシンターゼを作用させることにより行うことができる。
【００７６】
本発明の医薬組成物は、経口投与形態、又は注射剤、点滴剤等の非経口投与形態で用いることができる。本化合物を哺乳動物等に投与する場合、錠剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤等として経口投与してもよいし、又は、注射剤、点滴剤として非経口的に投与してもよい。
【００７７】
本発明の医薬組成物は、通常の薬学的に許容される担体を用いて、常法により製剤化することができる。経口用固形製剤を調製する場合は、主薬に賦形剤、更に必要に応じて、結合剤、崩壊剤、滑沢剤等を加えた後、常法により溶剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等とする。注射剤を調製する場合には、主薬に必要によりｐＨ調整剤、緩衝剤、安定化剤、可溶化剤等を添加し、常法により皮下又は静脈内用注射剤とすることができる。
【００７８】
別の態様において、本発明は、それを必要とする患者に有効量の本発明の抗体を投与することを備える、ＡＤＣＣ活性により治療可能な疾患の治療方法又は予防方法に関する。あるいは、本発明は、ＡＤＣＣ活性により治療可能な疾患の治療薬又は予防薬を製造するための、本発明の抗体の使用に関する。例えば、本発明の抗体を治療又は予防目的で使用する場合、本発明の抗体を、経口投与形態、又は注射剤、点滴剤等の非経口投与形態で投与することができる。本発明の抗体を哺乳動物等に投与する場合の投与量は、症状、年齢、性別、体重、投与形態等により異なるが、例えば成人に経口的に投与する場合には、通常１日量は０．１〜１０００ｍｇとすることができ、１日１〜５回投与することができる。
【００７９】
以下、本発明をより詳細に説明するため実施例を示すが、本発明はこれに限定されるものではない。
【実施例】
【００８０】
＜実施例１＞ＥｎｄｏＬＬの調製
（１）ＥｎｄｏＬＬのＤＮＡのクローニング
既知のエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの部分アミノ酸配列と相同性の高いアミノ酸配列をもつタンパク質を産生するラクトコッカス・ラクティスの該アミノ酸配列をＮＣＢＩ  ｂｌａｓｔｐにて検索し、相当するゲノム配列を元にプライマーを設計した。以下にセンス、アンチセンスのプライマー配列を記す。
【００８１】
ＥｎｄｏＬＬ−１２Ｆ（センスプライマー）
５’  ｔｔｇｇａｇｇａｔｔｔｔａｔｇａａａａａａｔｃｇ  ３’  （配列番号３）
ＥｎｄｏＬＬ  ｓｔｏｐＲ（アンチセンスプライマー）
５’  ｔｃａｇｃｔａｔｔｔｔｔｔｔｇｔｃｃｔａａｔａｃｔｔｇ  ３’  （配列番号４）
【００８２】
農業生物資源研究所（茨城県つくば市観音台２丁目１−２）に寄託されているラクトコッカス・ラクティス（受託番号ＭＡＦＦ５１６０３２）から抽出したｇＤＮＡをテンプレートにして上記プライマーでＰＣＲを行い、増幅された２．８ｋｂｐｓの断片を０．８％アガロースゲル電気泳動にて分離して切り出した後、Ｗｉｚａｒｄ  ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−ｕｐ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて精製した。このＤＮＡ断片をテンプレートとしてさらに以下のセンス、アンチセンスのプライマーでＰＣＲを行った。
【００８３】
６Ｐ１−ＥｎｄｏＬＬ−Ｆ（センスプライマー）
５’  ｇｇｇｃｃｃｃｔｇｇｇａｔｃｃａａａａａａｔｃｇａａａａａａ  ３’  （配列番号５）
６Ｐ１−ＥｎｄｏＬＬ−Ｒ（アンチセンスプライマー）
５’  ａｔｇｃｇｇｃｃｇｃｔｃｇａｇｔｔａｇｃｔａｔｔｔｔｔｔｔｇ  ３’  （配列番号６）
【００８４】
増幅された２．８ｋｂｐｓの断片を０．８％アガロースゲル電気泳動にて分離して切り出した後、Ｗｉｚａｒｄ  ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−ｕｐ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて精製した。この断片とＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩで切断した線状のｐＧＥＸ−６Ｐ−１ベクターでＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）にてプラスミドＥｎｄｏＬＬ／ｐＧＥＸ−６Ｐ−１を構築した（図２）。
作成されたＥｎｄｏＬＬは、自動塩基配列決定機（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製３７３０ｘ１  ＤＮＡ  ａｎａｌｙｚｅｒ）を用いて配列決定を行い、その核酸配列を配列番号１に示す。
【００８５】
（２）ＥｎｄｏＬＬの大腸菌での発現
宿主としては大腸菌ＢＬ−２１（ＤＥ３）株を用いた。形質転換はＩｎｏｕｅ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ，  ９６，  ２３−２８（１９９０）の方法に従った。選抜はカルベニシリンを５０μｇ／ｍｌとなるよう添加したＬＢ寒天培地上で行い、生育したコロニーをカルベニシリンを５０μｇ／ｍｌとなるよう添加したＬＢ液体培地に植菌して３７℃で培養して、ＯＤ６００が０．８に達した時点で培養液を急冷しＩＰＴＧを終濃度５０μｇ／ｍｌとなるよう加えた。培養液は２０℃で一晩回転振盪培養を行った後に集菌した。
【００８６】
集金した菌体をＮＥＴＮ緩衝液（５０ｍＭトリス緩衝液  ｐＨ８．０、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％  ＮＰ−４０）に懸濁し、ＱＳｏｎｉｃａ社  Ｑ１２５（ワケンビーテック）にて超音波破砕した。破砕液を遠心分離し分離上清にＧＳＴ−Ａｃｃｅｐｔ（ナカライテスク）ゲルを加え、４℃で２時間回転振盪培養してアフィニティークロマトグラフィーによりＧＳＴ融合ＥｎｄｏＬＬを回収した。ＧＳＴ融合ＥｎｄｏＬＬが吸着したゲルをＮＥＴＮ緩衝液で洗浄した後、ＮＥＴ緩衝液（５０ｍＭトリス緩衝液  ｐＨ８．０、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）でさらに洗浄した。ＮＥＴ緩衝液を等量加えた洗浄後のゲルにＴｕｒｂｏ３Ｃ  ｐｒｏｔｅａｓｅを添加して４℃で一晩回転振盪培養し、樹脂に吸着させたまま酵素消化を行った。酵素消化後の上清を回収して精製ＥｎｄｏＬＬとした。
【００８７】
得られたＥｎｄｏＬＬをコードする核酸配列を配列番号１に、アミノ酸配列を配列番号２に示す。
【００８８】
＜実施例２＞マウスＩｇＧ１のカイコ絹糸腺による産生
（１）ベクターの作製
マウスハイブリドーマｃＤＮＡより、マウスＩｇＧ１の重鎖および軽鎖のｃＤＮＡを単離した。次に、ＢｍＮＰＶポリヘドリンの５′非翻訳領域配列（特開２００８−１２５３６６）を含むプライマーを用いたＰＣＲを行うことにより、重鎖および軽鎖ｃＤＮＡの５′末端にＢｍＮＰＶポリヘドリンの５′非翻訳領域配列を付加した。得られたマウスＩｇＧ１の重鎖ｃＤＮＡを、カイコ形質転換用ベクターｐＭＳＧ３．１ＭＧ（特開２０１２−１８２９９５）のＮｒｕＩサイトに挿入し、次いで、Ｅｃｏ４７IIIサイトに軽鎖ｃＤＮＡを挿入して、マウスＩｇＧ１ｃＤＮＡをカイコに組み込むためのプラスミドベクターを完成させた。
（２）トランスジェニックカイコの作製
上記のプラスミドベクターをＰｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）で精製した後、ヘルパープラスミドであるｐＨＡ３ＰＩＧ（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８，８１−８４（２０００））とプラスミド量が１：１になるように混合し、さらにエタノール沈殿を行った後、ＤＮＡ濃度が２００μｇ／ｍｌなるようにインジェクションバッファー（０．５ｍＭリン酸バッファーｐＨ７．０，５ｍＭ  ＫＣｌ）に溶解した。このベクター混合液を、産卵後２〜８時間の前胚盤葉期のカイコ卵（カイコ胚）に、一つの卵あたり約１５〜２０ｎｌの液量で微量注入した。
ベクターＤＮＡを微量注入した卵を２５℃でインキュベートし、孵化したカイコを飼育した。得られた生殖可能な成虫を交配し、Ｆ１世代の卵塊を得た。産卵日から５〜６日目のＦ１卵塊を蛍光実体顕微鏡で観察することにより、眼や神経系から緑色蛍光を発するトランスジェニックカイコの卵をスクリーニングした。緑色蛍光を発する卵から孵化したカイコを飼育して、マウスＩｇＧ１ｃＤＮＡが組み込まれたトランスジェニックカイコを樹立した。
上記のトランスジェニックカイコを、ＢｍＮＰＶ由来のトランスアクチベーターであるＩＥ１遺伝子を発現するカイコ（特開２０１２−１８２９９５）と交配した。ＩＥ１遺伝子から合成されるＩＥ１タンパク質は、ｐＭＳＧ３．１ＭＧに含まれるＢｍＮＰＶ由来のｈｒ３エンハンサーや、セリシン１プロモーターに作用し、中部絹糸腺における組換えタンパク質の発現量を増加させることが知られている（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｅｎｇ．  １０６，８６０−８７０（２０１０））。交配して得られたＦ２世代のカイコから、マウスＩｇＧ１ｃＤＮＡとＩＥ１遺伝子の両方を有するカイコを選別し、これらのカイコを飼育して繭を作らせた。
（３）マウスＩｇＧ１の精製
マウスＩｇＧ１ｃＤＮＡとＩＥ１遺伝子を有するカイコの繭を、抽出バッファー（ＰＢＳ，０．１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，０．５Ｍ  ＮａＣｌ）に浸漬し、３０分間室温で撹拌して繭抽出液を調製した。抽出液を０．４５μｍのフィルターで濾過し、プロテインＧカラム（ＰｒｏｔｅｉｎＧ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ，ＧＥヘルスケア）に供した。カラムからのＩｇＧ１の溶出には、０．１Ｍグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ２．７）を使用した。溶出したＩｇＧ１溶液に１Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ９．０）を加えて中和し、最後にＰＢＳに対して透析した。
【００８９】
＜実施例３＞ＥｎｄｏＳ、ＥｎｄｏＬＬおよびＥｎｄｏＤの同時加水分解によるカイコ絹糸腺産生マウスＩｇＧ１アクセプターの調製とＳＤＳ−ＰＡＧＥによる確認
カイコ絹糸腺から産生されるマウスＩｇＧ１（１ｍｇ）とＥｎｄｏＳ（２μｇ）、ＥｎｄｏＬＬ（２μｇ）およびＲｅｍｏｖｅ−ｉＴ  Ｅｎｄｏ−Ｄ（（ＮＥＢ社）１５０ユニット）を５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）中に加え、総量５００μｌとして３７℃で１７時間静置した。この反応液に５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したＡｂ−Ｃａｐｃｈｅｒ  ＥｘＴｒａ（プロテノバ社）７５μｌを加えて室温で３時間回転振盪し、ゲル担体に抗体を吸着させた。４５０μｌのＰＢＳで５分間洗浄する作業を計３回行った担体に１５０μｌの０．１Ｍグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ２．７）を加え室温で５分間振盪し、溶出させ、溶出液に１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）を２．５μｌ加えて中和した。この溶出作業を計３回行い、その溶出液をまとめてアミコンウルトラ−０．５（ＮＭＷＬ３０ｋＤａ）で濃縮しＰＢＳに置換した。得られた９６５μｇのマウスＩｇＧ１アクセプターのうち０．５μｇを同時加水分解前のマウスＩｇＧ１同量と並べて１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて泳動して分子量を確認した。
【００９０】
アクセプターは糖鎖が切断されたために低分子側にシフトし、また切れ残った糖鎖がほとんど無いことが確認された（図３）。
【００９１】
＜実施例４＞エンドグリコシダーゼによるマウスＩｇＧ１の加水分解のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる確認
カイコ絹糸腺から産生されるマウスＩｇＧ１（４μｇ）およびＥｎｄｏＳ、ＥｎｄｏＬＬ、Ｒｅｍｏｖｅ−ｉＴ  Ｅｎｄｏ−Ｄ、Ｅｎｄｏ−Ｈ（ＮＥＢ）またはＥｎｄｏ−Ｍ（東京化成）単体（１μｇ）を緩衝液中に加え、総量２０μｌとして３７℃で６時間静置した。緩衝液はＥｎｄｏＳ、ＥｎｄｏＬＬまたはＲｅｍｏｖｅ−ｉＴ  Ｅｎｄｏ−Ｄの場合、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）を、Ｅｎｄｏ−Ｈの場合５０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）を、Ｅｎｄｏ−Ｍの場合、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）を用いた。反応後のマウスＩｇＧ１（０．５μｇ）を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて泳動して分子量を確認した。
【００９２】
エンドグリコシダーゼを酵素は単体で加水分解を行った場合はどの酵素についても切れ残りが存在することが確認された（図４）。一方、コントロールとして並べたＥｎｄｏＳ、ＥｎｄｏＬＬおよびＥｎｄｏＤの同時加水分解産物は切れ残りがなく全てが低分子側にシフトしていた。
【００９３】
＜実施例５＞マウスＩｇＧ１糖ペプチドＧｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ（Ｇｌｙｃａｎ）−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ａｒｇの解析
カイコ絹糸腺から産生されるマウスＩｇＧ１（１５μｇ）を１００ｍＭ炭酸水素アンモニウム水溶液（３０μＬ）に溶かし、１．０％（ｗ／ｖ）ＲａｐｉＧｅｓｔ水溶液（３μＬ）、を加え、９０℃で１５分間加熱し、室温で３０分間静置する。この溶液にシークエンスグレードのトリプシン（０．２５ｍｇ／ｍｌ，５μＬ）を加え、３７℃で１２時間反応させる。反応溶液を９０℃３０分間、加熱する事により酵素を失活させ、Ｇ−２５カラム（０．８×６ｃｍ，３ｍＬ）で脱塩し、濃縮する。これにＤＭＦ（５μＬ）を加え、６０℃５分間、加熱し、２００ｍＭ無水安息香酸−メタノール溶液（１００μＬ）を加え、超音波洗浄機を用いて３０分間超音波しながら反応を行い、０．５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（６０μＬ）を加え、室温にて３０分間撹拌した。その後、水（２００μＬ）を加え、ＥｔＯＡｃ（４００μＬ）にて３回洗浄した後に減圧濃縮を行った。この反応物をＧ−２５カラム（０．８×６ｃｍ，３ｍＬ）で脱塩し、Ｃ１８  Ｓｐｉｎカラム（１０ｍｇ）にロードし、水（２ｍＬ）で十分洗浄した後に、２５％アセトニトリル水溶液（６５０μＬ）、５０％アセトニトリル水溶液  （６５０μＬ）で回収し、減圧濃縮を行った。この試料に水（２０μＬ）、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ（ｗｅｔ５０μＬ）、エタノール（１００μＬ）、ｎ−ブタノール（４００μＬ）の順番で加え、室温で１時間、撹拌する。その後、溶液をエンプティカラムに移してｎ−ブタノール：エタノール：水＝８：２：１（ｖ／ｖ／ｖ）（２ｍＬ）で洗浄し、エタノール：水＝１：２（ｖ／ｖ）（２ｍＬ）でマウスＩｇＧ１糖ペプチドを回収し、減圧濃縮した。
【００９４】
この試料を水（１０μＬ）に溶かし、ＭＡＬＤＩターゲットプレート上に０．５μＬ添加し、ＤＨＢＡ溶液（１０ｍｇ／ｍｌ  ｏｆ  ５０％アセトニトリル水溶液）（１μＬ）と混合し、乾固させた。島津製作所製ＭＡＬＤＩ−ＱＩＴ−ＴＯＦ  ＭＳ装置（ＡＸＩＭＡ−Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）を用いてｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｍｏｄｅでＭＳ測定を行った。
【００９５】
結果を図５に示す。ＭＳ測定により、Ｂｚ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ａｒｇにパウチマンノース型Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４の糖鎖が結合したｍ／ｚ＝１９９２．１９、２１５４．２８、２３１６．３６と複合型ＧＮ１、ＧＮ２の糖鎖が結合したｍ／ｚ＝２３５７．３９、２５６０．５１とハイマンノース型Ｍ５、Ｍ６、Ｍ７、Ｍ８、Ｍ９の糖鎖が結合したｍ／ｚ＝２４７８．４４、２６４０．５３、２８０２．６３、２９６４．７２、３１２６．８４を検出した。
【００９６】
＜実施例６＞カイコ絹糸腺産生マウスＩｇＧ１のエンド酵素による消化の解析
種々のエンド酵素（Ｅｎｄｏ−Ｍ，ＥｎｄｏＬＬ，Ｅｎｄｏ−Ｈ，Ｅｎｄｏ−Ｄ，ＥｎｄｏＳ，Ｅｎｄｏ−Ｄ＋ＥｎｄｏＳ，  Ｅｎｄｏ−Ｍ＋Ｅｎｄｏ−Ｄ，Ｅｎｄｏ−Ｍ＋ＥｎｄｏＳ，Ｅｎｄｏ−Ｄ＋Ｅｎｄｏ−Ｈ，ＥｎｄｏＳ＋Ｅｎｄｏ−Ｈ，Ｅｎｄｏ−Ｄ＋ＥｎｄｏＬＬ，ＥｎｄｏＳ＋ＥｎｄｏＬＬ，Ｅｎｄｏ−Ｆ１，Ｅｎｄｏ−Ｆ２，Ｅｎｄｏ−Ｆ３，Ｅｎｄｏ−Ｆ１＋Ｅｎｄｏ−Ｆ２，Ｅｎｄｏ−Ｆ１＋Ｅｎｄｏ−Ｆ３，Ｅｎｄｏ−Ｆ２＋Ｅｎｄｏ−Ｆ３）によって処理が施されたカイコ絹糸腺産生マウスＩｇＧ１（１５μｇ）をそれぞれ１００ｍＭ炭酸水素アンモニウム水溶液（３０μＬ）に溶かし、１．０％（ｗ／ｖ）ＲａｐｉＧｅｓｔ水溶液（３μＬ）、を加え、９０℃で１５分間加熱し、室温で３０分間静置する。この溶液にシークエンスグレードのトリプシン（０．２５ｍｇ／ｍｌ，５μＬ）を加え、３７℃で１２時間反応させる。反応溶液を９０℃３０分間、加熱する事により酵素を失活させ、Ｇ−２５カラム（０．８×６ｃｍ，３ｍＬ）で脱塩し、濃縮する。これにＤＭＦ（５μＬ）を加え、６０℃５分間、加熱し、２００ｍＭ無水安息香酸−メタノール溶液（１００μＬ）を加え、超音波洗浄機を用いて３０分間室温で超音波しながら反応を行い、０．５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（６０μＬ）を加え、室温にて３０分間撹拌した。その後、水（２００μＬ）を加え、ＥｔＯＡｃ（４００μＬ）にて３回洗浄した後に減圧濃縮を行った。この反応物をＧ−２５カラム（０．８×６ｃｍ，３ｍＬ）で脱塩し、Ｃ１８  Ｓｐｉｎカラム（１０ｍｇ）にロードし、水（２ｍＬ）で十分洗浄した後に、２５％アセトニトリル水溶液（６５０μＬ）、５０％アセトニトリル水溶液  （６５０μＬ）で回収し、減圧濃縮を行った。この試料に水（２０μＬ）、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ（ｗｅｔ５０μＬ）、エタノール（１００μＬ）、ｎ−ブタノール（４００μＬ）の順番で加え、室温で１時間、撹拌する。その後、溶液をエンプティカラムに移してｎ−ブタノール：エタノール：水＝８：２：１（ｖ／ｖ／ｖ）（２ｍＬ）で洗浄し、エタノール：水＝１：２（ｖ／ｖ）（２ｍＬ）でマウスＩｇＧ１糖ペプチドを回収し、減圧濃縮した。
【００９７】
この試料を水（１０μＬ）に溶かし、ＭＡＬＤＩターゲットプレート上に０．５μＬ添加し、ＤＨＢＡ溶液（１０ｍｇ／ｍｌ  ｏｆ  ５０％アセトニトリル水溶液）（１μＬ）と混合し、乾固させた。島津製作所製ＭＡＬＤＩ−ＱＩＴ−ＴＯＦ  ＭＳ装置（ＡＸＩＭＡ−Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）を用いてｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｍｏｄｅでＭＳ測定を行った。
【００９８】
ＭＳ測定では、Ｂｚ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ａｒｇにパウチマンノース型Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４の糖鎖が結合したｍ／ｚ＝１９９２．１９、２１５４．２８、２３１６．３６と複合型ＧＮ１、ＧＮ２の糖鎖が結合したｍ／ｚ＝２３５７．３９、２５６０．５１とハイマンノース型Ｍ５、Ｍ６、Ｍ７、Ｍ８、Ｍ９の糖鎖が結合したｍ／ｚ＝２４７８．４４、２６４０．５３、２８０２．６３、２９６４．７２、３１２６．８を検出した。
【００９９】
結果を図６Ａ〜図６Ｄに示す。また、各エンドグリコシダーゼ処理により得られた各糖鎖の強度比をエンドグリコシダーゼ処理していない抗体の糖鎖の強度比と重ね合わせて棒グラフを作成し、当該エンドグリコシダーゼによりどの糖鎖が切断できたかを分析した。分析の結果を図７Ａ〜図７Ｃに示す。
【０１００】
＜実施例７＞トラスツズマブのカイコ絹糸腺による産生
５′末端にＢｍＮＰＶポリヘドリンの５′非翻訳領域配列を付加したトラスツズマブ重鎖および軽鎖の遺伝子を人工合成した。これら合成遺伝子を、実施例２に記載した方法によりカイコ形質転換用ベクターｐＭＳＧ３．１ＭＧに挿入した後、カイコ卵に微量注入することにより、トラスツズマブ遺伝子が組み込まれたトランスジェニックカイコを作製した。さらに、ＩＥ１遺伝子を発現するカイコと交配して、トラスツズマブ遺伝子とＩＥ１遺伝子の両方を有するカイコを作製し、これらのカイコを飼育して繭を作らせた。得られた繭から、実施例２に記載した方法により、カイコ絹糸腺で産生されたトラスツズマブを精製した。
【０１０１】
＜実施例８＞ＥｎｄｏＳ、ＥｎｄｏＬＬおよびＥｎｄｏＤの同時加水分解によるカイコ絹糸腺産生トラスツズマブアクセプターの調製
カイコ絹糸腺から産生されるトラスツズマブ（５００μｇ）とＥｎｄｏＳ（１μｇ）、ＥｎｄｏＬＬ（１μｇ）およびＲｅｍｏｖｅ−ｉＴ  Ｅｎｄｏ−Ｄ（（ＮＥＢ社）１００ユニット）を５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）中に加え、総量２００μｌとして３７℃で２２時間静置した。この反応液に５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したＡｂ−Ｃａｐｃｈｅｒ  ＥｘＴｒａ（プロテノバ社）１０μｌを加えて室温で３０分回転振盪し、ゲル担体に抗体を吸着させた。５００μｌのＰＢＳで室温、５分間洗浄した担体に１００μｌの０．１Ｍグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ２．７）を加え、溶出させ、溶出液に１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）を０．３μｌ加えて中和した。この溶出作業を計２回行い、溶出液をまとめてアミコンウルトラ−０．５（ＮＭＷＬ３０ｋＤａ）で濃縮しながらＰＢＳにバッファー置換した。得られた４３８μｇのトラスツズマブアクセプターのうち０．５μｇを同時加水分解前のマウスＩｇＧ１同量と並べて１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて泳動した。
【０１０２】
アクセプターは糖鎖が切断されたために低分子側にシフトし、また切れ残りは無いことが確認できた（図８）。
【０１０３】
＜実施例９＞エンドグリコシダーゼ各種を単体で用いたカイコ絹糸腺産生トラスツズマブの加水分解
カイコ絹糸腺から産生されるトラスツズマブ（４μｇ）とＥｎｄｏＳ、ＥｎｄｏＬＬ、Ｒｅｍｏｖｅ−ｉＴ  Ｅｎｄｏ−Ｄ（ＮＥＢ）、Ｅｎｄｏ−Ｈ（ＮＥＢ）またはＥｎｄｏ−Ｍ（東京化成）のいずれか単体（１μｇ）、またはカイコ絹糸腺から産生されるトラスツズマブ（４μｇ）とＲｅｍｏｖｅ−ｉＴ  Ｅｎｄｏ−Ｄ（１μｇ）およびＥｎｄｏＳ（１μｇ）を緩衝液中に加え、総量２０μｌとして３７℃で６時間静置した。緩衝液はＥｎｄｏＳ、ＥｎｄｏＬＬ、Ｒｅｍｏｖｅ−ｉＴ  Ｅｎｄｏ−ＤまたはＥｎｄｏＳとＲｅｍｏｖｅ−ｉＴ  Ｅｎｄｏ−Ｄの同時加水分解の場合、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）を、Ｅｎｄｏ−Ｈの場合５０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）を、Ｅｎｄｏ−Ｍの場合、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）を用いた。反応後のトラスツズマブ（０．５μｇ）を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて泳動した。
【０１０４】
結果を図９に示す。酵素を単体で用いた加水分解ではいずれも切れ残りが存在すると確認された。一方、コントロールとして並べたＥｎｄｏＳ、ＥｎｄｏＬＬおよびＲｅｍｏｖｅ−ｉＴ  Ｅｎｄｏ−Ｄの同時加水分解産物では切れ残りは無く、全てが低分子側にシフトしていた。ＥｎｄｏＳおよびＲｅｍｏｖｅ−ｉＴ  Ｅｎｄｏ−Ｄのダブルダイジェスチョンでも見かけ上切れ残りは確認されなかった。
【０１０５】
＜実施例１０＞
カイコ絹糸腺から産生されるトラスツズマブ糖ペプチドＧｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ（Ｇｌｙｃａｎ）−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ａｒｇの解析
カイコ絹糸腺から産生されるトラスツズマブ（２０μｇ）を１００ｍＭ炭酸水素アンモニウム水溶液（５０μＬ）に溶かし、１．０％（ｗ／ｖ）ＲａｐｉＧｅｓｔ水溶液（５μＬ）、を加え、９０℃で１５分間加熱し、室温で３０分間静置する。この溶液にシークエンスグレードのトリプシン（０．２５ｍｇ／ｍｌ，５μＬ）を加え、３７℃で３０時間反応させる。反応溶液を９０℃３０分間、加熱する事により酵素を失活させ、Ｇ−２５カラム（０．８×６ｃｍ，３ｍＬ）で脱塩し、濃縮する。これに水（２０μＬ）とピリジン（１０μＬ）を加え、２００ｍＭ安息香酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ジメチルホルムアミド溶液（２０μＬ）を加え、５７℃で１２時間反応を行い、０．５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（６０μＬ）を加え、室温にて３０分間撹拌した。その後、水（２００μＬ）を加え、ＥｔＯＡｃ（４００μＬ）にて３回洗浄した後に減圧濃縮を行った。この反応物をＧ−２５カラム（０．８×６ｃｍ，３ｍＬ）で脱塩し、Ｃ１８  Ｓｐｉｎカラム（１０ｍｇ）にロードし、水（２ｍＬ）で十分洗浄した後に、２５％アセトニトリル水溶液（６５０μＬ）、５０％アセトニトリル水溶液  （６５０μＬ）で回収し、減圧濃縮を行った。この試料に水（２０μＬ）、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ（ｗｅｔ５０μＬ）、エタノール（１００μＬ）、ｎ−ブタノール（４００μＬ）の順番で加え、室温で１時間、撹拌する。その後、溶液をエンプティカラムに移してｎ−ブタノール：エタノール：水＝８：２：１（ｖ／ｖ／ｖ）（２ｍＬ）で洗浄し、エタノール：水＝１：２（ｖ／ｖ）（２ｍＬ）でトラスツズマブ糖ペプチドを回収し、減圧濃縮した。
【０１０６】
この試料を水（１０μＬ）に溶かし、ＭＡＬＤＩターゲットプレート上に０．５μＬ添加し、ＤＨＢＡ溶液（１０ｍｇ／ｍｌ  ｏｆ  ５０％アセトニトリル水溶液）（１μＬ）と混合し、乾固させた。島津製作所製ＭＡＬＤＩ−ＱＩＴ−ＴＯＦ  ＭＳ装置（ＡＸＩＭＡ−Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）を用いてｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｍｏｄｅでＭＳ測定を行った。
【０１０７】
結果を図１０に示す。ＭＳ測定では、Ｂｚ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ａｒｇにパウチマンノース型Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４の糖鎖が結合したｍ／ｚ＝２０２５．４０、２１８６．４６、２３４８．５６と複合型ＧＮ１、ＧＮ２の糖鎖が結合したｍ／ｚ＝２３８９．５８、２５９２．７４とハイマンノース型Ｍ５、Ｍ６、Ｍ７、Ｍ８、Ｍ９の糖鎖が結合したｍ／ｚ＝２５１０．６５、２６７２．７９、２８３４．０９、２９９７．０６、３１５８．５４が検出できた。
【０１０８】
＜実施例１１＞
カイコ絹糸腺産生トラスツズマブのエンド酵素による消化の解析
種々のエンド酵素（Ｅｎｄｏ−Ｍ，Ｅｎｄｏ−Ｈ，Ｅｎｄｏ−Ｄ，ＥｎｄｏＳ，Ｅｎｄｏ−Ｄ＋ＥｎｄｏＳ）によって処理が施されたカイコ絹糸腺産生トラスツズマブ（２０μｇ）をそれぞれ１００ｍＭ炭酸水素アンモニウム水溶液（５０μＬ）に溶かし、１．０％（ｗ／ｖ）ＲａｐｉＧｅｓｔ水溶液（５μＬ）、を加え、９０℃で１５分間加熱し、室温で３０分間静置する。この溶液にシークエンスグレードのトリプシン（０．２５ｍｇ／ｍｌ，５μＬ）を加え、３７℃で３０時間反応させる。反応溶液を９０℃３０分間、加熱する事により酵素を失活させ、Ｇ−２５カラム（０．８×６ｃｍ，３ｍＬ）で脱塩し、濃縮する。これに水（２０μＬ）とピリジン（１０μＬ）を加え、２００ｍＭ安息香酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ジメチルホルムアミド溶液（２０μＬ）を加え、５７℃で１２時間反応を行い、０．５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（６０μＬ）を加え、室温にて３０分間撹拌した。その後、水（２００μＬ）を加え、ＥｔＯＡｃ（４００μＬ）にて３回洗浄した後に減圧濃縮を行った。この反応物をＧ−２５カラム（０．８×６ｃｍ，３ｍＬ）で脱塩し、Ｃ１８  Ｓｐｉｎカラム（１０ｍｇ）にロードし、水（２ｍＬ）で十分洗浄した後に、２５％アセトニトリル水溶液（６５０μＬ）、５０％アセトニトリル水溶液（６５０μＬ）で回収し、減圧濃縮を行った。この試料に水（２０μＬ）、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ（ｗｅｔ５０μＬ）、エタノール（１００μＬ）、ｎ−ブタノール（４００μＬ）の順番で加え、室温で１時間、撹拌する。その後、溶液をエンプティカラムに移してｎ−ブタノール：エタノール：水＝８：２：１（ｖ／ｖ／ｖ）（２ｍＬ）で洗浄し、エタノール：水＝１：２（ｖ／ｖ）（２ｍＬ）でトラスツズマブ糖ペプチドを回収し、減圧濃縮した。
【０１０９】
この試料を水（１０μＬ）に溶かし、ＭＡＬＤＩターゲットプレート上に０．５μＬ添加し、ＤＨＢＡ溶液（１０ｍｇ／ｍｌ  ｏｆ  ５０％アセトニトリル水溶液）（１μＬ）と混合し、乾固させた。島津製作所製ＭＡＬＤＩ−ＱＩＴ−ＴＯＦ  ＭＳ装置（ＡＸＩＭＡ−Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）を用いてｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｍｏｄｅでＭＳ測定を行った。
【０１１０】
ＭＳ測定では、Ｂｚ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ａｒｇにパウチマンノース型Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４の糖鎖が結合したｍ／ｚ＝２０２５．４０、２１８６．４６、２３４８．５６と複合型ＧＮ１、ＧＮ２の糖鎖が結合したｍ／ｚ＝２３８９．５８、２５９２．７４とハイマンノース型Ｍ５、Ｍ６、Ｍ７、Ｍ８、Ｍ９の糖鎖が結合したｍ／ｚ＝２５１０．６５、２６７２．７９、２８３４．０９、２９９７．０６、３１５８．５４が検出できた。
【０１１１】
結果を図１１に示す。また、各エンドグリコシダーゼ処理により得られた各糖鎖の強度比をエンドグリコシダーゼ処理していない抗体の糖鎖の強度比と重ね合わせて棒グラフを作成し、当該エンドグリコシダーゼによりどの糖鎖が切断できたかを分析した。分析の結果を図１２に示す。
【０１１２】
＜実施例１２＞
カイコ絹糸腺産生トラスツズマブの糖鎖改変
実施例８で調製したカイコ絹糸腺産生トラスツズマブアクセプター（２ｍｇ）、糖供与体として糖オキサゾリン（１．８７５μｍｏｌ、Ａ２またはＧ２またはＧ０またはＭ３）および糖転移酵素としてＧＳＴ−ＥｎｄｏＳ  Ｄ２３３Ｑ（２００μｇ）を５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）中に加え、総量５００μｌとして３７℃で３時間静置した。この反応液に同緩衝液で平衡化したＣＯＳＭＯＧＥＬ  ＧＳＴ−Ａｃｃｅｐｔ（ナカライテスク社）をベッドボリューム５０μｌ加えて室温で３０分回転振盪を行いＧＳＴ−ＥｎｄｏＳ  Ｄ２３３Ｑを吸着させた。このゲル担体を除いた液に同じく５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したＡｂ−Ｃａｐｃｈｅｒ  ＥｘＴｒａ（プロテノバ社）ベッドボリューム３０μｌを加えて室温で１時間回転振盪し、ゲル担体に抗体を吸着させた。ゲル担体は５００μｌのＮＥＴＮバッファー（５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭＥＤＴＡおよび０．１％（ｗ／ｗ）ＮＰ−４０）で５分間回転振盪して洗浄する作業を２回行った後、５００μｌのＰＢＳでリンスした。洗浄した担体に１０ベッドボリュームの０．１Ｍグリシン塩酸（ｐＨ２．７）を加え室温で１５分間回転振盪し、フロースルーに１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）を１／３０ボリューム加えて中和した。中和した溶出液はビバスピン−５００（ＮＭＷＬ３０ｋＤａ）（ザルトリウス社）で濃縮した後ＰＢＳに溶液置換した。得られた１．３ｍｇの糖鎖改変抗体のうち１μｇを１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけたところ、糖オキサゾリン４種ともに糖受容体に転移されたために高分子側にシフトしたことが確認された（図１３及び図１４）。
【０１１３】
＜実施例１３＞
糖鎖改変した抗体の精製とＨＰＬＣ分析
カイコ絹糸腺から産生したトラスツズマブを糖鎖改変した抗体（Ａ２体、Ｇ２体、Ｇ０体、Ｍ３体）（５００μｇ）を４℃条件下で設置したＡＫＴＡ−ＦＰＬＣシステムを用いて、ＭｏｎｏＳカラム（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製、４．６×１００ｍｍ）を使用して、流速１．３５ｍｌ／ｍｉｎで２０ｍＭ酢酸ナトリウム水溶液（ｐＨ４．１５）と２０ｍＭ酢酸ナトリウム＋５００ｍＭ塩化ナトリウム水溶液の２液によるステップワイズのグラジェント溶出により、分離し、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５−１０ｋ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）の限外濾過フィルターを用いて濃縮した。分離精製の確認は、ＨＰＬＣシステム（島津社製）を用いたＰｒｏｐａｃ  ＷＣＸ−１０（４．０×２５０ｍｍ）と２８０ｎｍのＵＶ検出を使用して、流速１．０ｍｌ／ｍｉｎで１０ｍＭ酢酸ナトリウム水溶液（ｐＨ４．１５）と１０ｍＭ酢酸ナトリウム＋１０００ｍＭ塩化ナトリウム水溶液の２液によるグラジェント溶出により行った。その結果、糖鎖改変した抗体（Ａ２体、Ｇ２体、Ｇ０体、Ｍ３体）をすべて分離精製できている事を確認した（代表的な例として、Ａ２体のデータを図１５及び図１６に示す）。
【０１１４】
＜実施例１４＞
糖鎖改変した抗体のＭＳ分析
精製した糖鎖改変した抗体（Ａ２体、Ｇ２体、Ｇ０体、Ｍ３体）（２０μｇ）をそれぞれ１００ｍＭ炭酸水素アンモニウム水溶液（５０μＬ）に溶かし、１．０％（ｗ／ｖ）ＲａｐｉＧｅｓｔ水溶液（５μＬ）、を加え、９０℃で１５分間加熱し、室温で３０分間静置する。この溶液にシークエンスグレードのトリプシン（０．２５ｍｇ／ｍｌ，５μＬ）を加え、３７℃で３０時間反応させる。反応溶液を９０℃３０分間、加熱する事により酵素を失活させ、Ｇ−２５カラム（０．８×６ｃｍ，３ｍＬ）で脱塩し、濃縮する。これに水（２０μＬ）とピリジン（１０μＬ）を加え、２００ｍＭ安息香酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ジメチルホルムアミド溶液（２０μＬ）を加え、５７℃で１２時間反応を行い、０．５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（６０μＬ）を加え、室温にて３０分間撹拌した。その後、水（２００μＬ）を加え、ＥｔＯＡｃ（４００μＬ）にて３回洗浄した後に減圧濃縮を行った。この反応物をＧ−２５カラム（０．８×６ｃｍ，３ｍＬ）で脱塩し、Ｃ１８  Ｓｐｉｎカラム（１０ｍｇ）にロードし、水（２ｍＬ）で十分洗浄した後に、２５％アセトニトリル水溶液（６５０μＬ）、５０％アセトニトリル水溶液  （６５０μＬ）で回収し、減圧濃縮を行った。この試料に水（２０μＬ）、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ（ｗｅｔ５０μＬ）、エタノール（１００μＬ）、ｎ−ブタノール（４００μＬ）の順番で加え、室温で１時間、撹拌する。その後、溶液をエンプティカラムに移してｎ−ブタノール：エタノール：水＝８：２：１（ｖ／ｖ／ｖ）（２ｍＬ）で洗浄し、エタノール：水＝１：２（ｖ／ｖ）（２ｍＬ）でトラスツズマブ糖ペプチドを回収し、減圧濃縮した。
【０１１５】
この試料を水（１０μＬ）に溶かし、ＭＡＬＤＩターゲットプレート上に０．５μＬ添加し、ＤＨＢＡ溶液（１０ｍｇ／ｍｌ  ｏｆ  ５０％アセトニトリル水溶液）（１μＬ）と混合し、乾固させた。島津製作所製ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ装置（ＡＸＩＭＡ−ＴＯＦ２）を用いてＬｉｎｅａｒモードのｐｏｓｉｔｉｖｅでＭＳ測定を行った。
【０１１６】
精製後のトラスツズマブ−Ａ２のＭＳ測定では、Ｂｚ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ａｒｇにシアル酸含有複合型糖鎖のＡ２糖鎖が結合したｍ／ｚ＝３４９８．７とＭＳ測定上でシアル酸が１つ切断されたフラグメントイオンｍ／ｚ＝３２０７．７が検出された。精製後のトラスツズマブ−Ｇ２のＭＳ測定では、Ｂｚ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ａｒｇに複合型糖鎖のＧ２糖鎖が結合したｍ／ｚ＝２９１６．７が検出された。精製後のトラスツズマブ−Ｇ０のＭＳ測定では、Ｂｚ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ａｒｇに複合型糖鎖のＧ０（ＧＮ２）糖鎖が結合したｍ／ｚ＝２５９２．７が検出された。精製後のトラスツズマブ−Ｍ３のＭＳ測定では、Ｂｚ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ａｒｇに複合型糖鎖のＭ３糖鎖が結合したｍ／ｚ＝２１８６．５が検出された（図１７）。この結果より、均一の糖鎖（Ａ２体、Ｇ２体、Ｇ０体、Ｍ３体）を持った糖鎖改変抗体が調製できている事を確認した。
【０１１７】
＜実施例１５＞
糖鎖改変した抗体とＦｃγＲIIIａ−Ｖ１５８の結合試験
ＬＧ．Ｐｒｅｓｔａらの報告（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２００１）２７６，６５９１−６６０４）を参考にして、糖鎖改変したトラスツズマブ（Ａ２体、Ｇ２体、Ｇ０体、Ｍ３体）のＦｃγＲIIIａ−Ｖ１５８に対する結合試験を行った。ヒト型ＦｃγＲIIIａ−Ｖ１５８溶液（ｎｏｖｏｐｒｏｔｅｉｎ社製、１０μｇ／ｍｌ  ｏｆ  ＰＢＳ、１００μｌ）をＥＬＩＳＡ用マイクロプレート（Ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｆｉｔｉｃ社製）に加えて４℃で一晩固定化した後に、０．１４Ｍ食塩、１％ＢＳＡ、及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）でブロッキングを行った。各ステップ間に０．１４Ｍ食塩及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で５回洗浄を行った。次に、精製した糖鎖改変したトラスツズマブ（Ａ２体、Ｇ２体、Ｇ０体、及びＭ３体）、改変していないトラスツズマブ（Ｉｎｔａｃｔ体）、ＰＮＧａｓｅＦを用いて糖鎖切断した抗体（ａｇｌｙｃｏｎ体）、並びに、ＣＨＯ細胞で作成されたトラスツズマブ（ＣＨＯ体、Ｆ．Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ社製）をそれぞれ０．１４Ｍ食塩、１％ＢＳＡ及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で希釈した。各希釈溶液（１００μｌ）は、ヒト型ＦｃγＲIIIａ−Ｖ１５８を固定化したプレートウェルに加えて、２７℃で２時間結合させた。プレートから抗体溶液を取り除き、十分に洗浄した後、プレートに結合している抗体の量をＨＲＰコンジュゲートｐｒｏｔｅｉｎＧ（Ｂｉｏ−ｒａｄ社製）を用いて検出した。発色試薬としてＴＭＢ溶液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を反応させ、０．１８Ｍ硫酸水溶液でクエンチした後にプレートリーダーで４５０ｎｍの波長を検出した。
【０１１８】
結果を図１８に示す。この結果より、抗体の糖鎖の有無又は種類がＦｃγＲIIIａ−Ｖ１５８に対する結合に大きく関与している事が分かった。また、糖鎖改変したフコースが無いトラスツズマブは、ＣＨＯ細胞で作成されたトラスツズマブ（ＣＨＯ体）よりも強くＦｃγＲIIIａ−Ｖ１５８に対して結合する事が分かった。更に、またフコースの有無以外の糖鎖変化も、ＦｃγＲIIIａ−Ｖ１５８に対する結合活性への影響が大きい事が分かった。特に、Ｇ２又はＡ２の糖付加体による結合活性は、フコースが結合していないＩｎｔａｃｔと比較しても優れており、これらの結合活性は単にフコースが存在しないことによるものではなく、これらの糖鎖構造そのものがヒト型ＦｃγＲIIIａ−Ｖ１５８との結合活性に直接寄与していることが示された。
【０１１９】
＜実施例１６＞
糖鎖改変した抗体のＡＤＣＣリポーター試験
Ｐｒｏｍｅｇａ社製のＡＤＣＣｒｅｐｏｒｔｅｒＢｉｏａｓｓａｙキットを用いて糖鎖改変したトラスツズマブ（Ａ２体、Ｇ２体、Ｇ０体、Ｍ３体）に対する抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を測定した。
ターゲット細胞には、Ｈｅｒ２レセプターが高発現のヒト乳癌細胞（ＳＫＢＲ−３）とヌードマウス可移植性ヒト乳癌細胞（ＢＴ−４７４）を、エフェクタ細胞としてＦｃ−γ受容体IIIａのＶ１５８バリアントを安定に発現し、ホタルルシフェラーゼの発現を駆動するＮＦＡＴ応答配列を安定に保持する遺伝子組換えＪｕｒｋａｔ細胞を用いて行った。
ＳＫＢＲ−３細胞とＢＴ−４７４細胞は、１０％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ培地で培養し、９６穴プレートに１ウェル当たり１，５００個の細胞を継代した。これを１００μＬの無血清ＲＰＭＩ１６４０培地で洗浄し、５０μＬのＡＤＣＣアッセイ培地(ＲＰＭＩ１６４０＋ＭＥＭ−ＮＥＡＡ（必須アミノ酸）＋４％Ｓｕｐｅｒ−ｌｏｗ  ＩｇＧ  ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ社製）)に交換し、一晩培養した。次に、精製した糖鎖改変したトラスツズマブ（Ａ２体、Ｇ２体、Ｇ０体、Ｍ３体）並びに改変していないトラスツズマブ（Ｉｎｔａｃｔ体）、ＰＮＧａｓｅＦを用いて糖鎖切断した抗体（ａｇｌｙｃｏｎ体）、ＣＨＯ細胞で作成されたトラスツズマブ（ＣＨＯ体、Ｆ．Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ社製）をＡＤＣＣアッセイ培地で希釈した様々な濃度溶液（２５μｌ）をターゲット細胞が入ったウェルに加えて、３７℃で３０分静置した。エフェクタ細胞：ターゲット細胞の比率を５０：１にする為にＪｕｒｋａｔ  ＡＤＣＣリポーター細胞をＡＤＣＣアッセイ培地で懸濁した溶液（２５μｌ）を１ウェル当たり７５，０００個になるように加えて、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータ内で２０時間静置した。その後、培養液に等量のＢｉｏ−Ｇｌｏルシフェラーゼ反応液（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を加えて１５分間室温で反応させた後にルシフェラーゼの化学発光を検出した。その結果を図１９及び図２０に示す。
【０１２０】
解析の結果、コアフコースの無い糖鎖を持つ抗体はＣＨＯ細胞で作成されたトラスツズマブ（ＣＨＯ体）よりも非常に高いＡＤＣＣを示した。非還元末端にマンノースを持つ抗体と複合型の糖鎖を持つ抗体を比べると複合型糖鎖を持つ抗体の方が強いＡＤＣＣを示した。ＳＫＢＲ−３とＢＴ−４７４とで微妙にＡＤＣＣの活性の応答に違いが出ている事が分かった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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