(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の薬力学的作用を評価する方法であって、
ＨＧＦが投与された被験体から採取した生体試料中のＡｐｏＡ４タンパク質の発現レベルを測定するステップ、
測定した前記生体試料中のＡｐｏＡ４タンパク質の発現レベルを、ＨＧＦが投与されていない、または、その投与の影響が消失した被験体から採取した前記生体試料中のＡｐｏＡ４タンパク質の発現レベルと比較するステップ、およびＨＧＦが投与されていない、または、その投与の影響が消失した被験体のＡｐｏＡ４タンパク質の発現レベルと比較して、ＨＧＦが投与された被験体のＡｐｏＡ４タンパク質の発現レベルが上昇している場合に、当該投与されたＨＧＦが薬力学的作用をもたらす量で投与されていると判定するステップ
を含み、
ここで、前記生体試料は、血液由来の生体試料である、
ことを特徴とする、
評価方法。
【請求項２】
肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の薬力学的作用を評価する方法であって、
ＨＧＦが投与された被験体から採取した生体試料中のＡｐｏＡ４遺伝子またはＡｐｏＡ４タンパク質の発現レベルを測定するステップ、
測定した前記生体試料中のＡｐｏＡ４遺伝子またはＡｐｏＡ４タンパク質の発現レベルを、ＨＧＦが投与されていない、または、その投与の影響が消失した被験体から採取した前記生体試料中のＡｐｏＡ４遺伝子またはＡｐｏＡ４タンパク質の発現レベルと比較するステップ、および
ＨＧＦが投与されていない、または、その投与の影響が消失した被験体のＡｐｏＡ４遺伝子またはＡｐｏＡ４タンパク質の発現レベルと比較して、ＨＧＦが投与された被験体のＡｐｏＡ４遺伝子またはＡｐｏＡ４タンパク質の発現レベルが上昇している場合に、当該投与されたＨＧＦが薬力学的作用をもたらす量で投与されていると判定するステップ
を含み、
ここで、前記生体試料は、肝臓由来の生体試料である、
ことを特徴とする、
評価方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の評価方法であって、
前記生体試料中のＡｐｏＡ４タンパク質の発現レベルが、イムノアッセイによって測定される、
ことを特徴とする、
評価方法。
【請求項４】
請求項１に記載の評価方法であって、
前記生体試料中のＡｐｏＡ４タンパク質の発現レベルが、イムノアッセイによって測定され、
前記生体試料は、血清または血漿に由来する試料である、
ことを特徴とする、
評価方法。
【請求項５】
請求項２に記載の評価方法であって、
前記生体試料中のＡｐｏＡ４遺伝子の発現レベルが、リアルタイムＰＣＲによって測定される、
ことを特徴とする、
評価方法。
【請求項６】
請求項２または５に記載の評価方法であって、
前記生体試料は、肝細胞または肝組織である、
ことを特徴とする、
評価方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の評価方法であって、
前記被験体は、健常人である、
ことを特徴とする、
評価方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の評価方法であって、
前記被験体は、肝臓疾患を有する被験体である
ことを特徴とする、
評価方法。
【請求項９】
ＨＧＦの薬力学的作用を評価するためのキットであって、
抗ＡｐｏＡ４抗体を含む、
ことを特徴とする、
キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肝細胞増殖因子（以下、ＨＧＦとも称する）のＰＤマーカー、およびその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＨＧＦは、ヒト劇症肝炎患者の血漿から精製された肝実質細胞増殖活性を有する因子であり（特許文献１、および非特許文献１）、抗腫瘍効果、細胞性免疫の増強、創傷治療効果、組織の再生促進効果など、様々な薬理学的効果があることが報告されている（例えば、特許文献２）。【０００３】
薬剤開発の確度を高めるために、薬力学的作用を反映するバイオマーカー（ＰＤマーカー）の開発は重要であり、ＨＧＦについても、これまでに肝臓障害を有する患者に対するＨＧＦの薬効をモニタリングするための指標としてα−フェトプロテインおよび可溶性Ｆａｓが提案されている（特許文献３）。【０００４】
しかし、これらのマーカーは、いずれも肝臓疾患の病態改善が反映される血中マーカーであることから、投与されたＨＧＦが薬力学的作用を示していることを示すものではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開昭６３−２２５２６号公報
【特許文献２】日本国特許第２７４７９７９号
【特許文献３】国際公開ＷＯ２０１２／１４４５３５
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，８１，４１４（１９８８）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、より広範な対象においてＨＧＦの投与によって変動が認められるＰＤマーカーを利用した、ＨＧＦの薬理学的作用を評価する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねる過程で、ＨＧＦ投与によって発現が変動するマーカーの１つとしてアポリポタンパク質Ａ−ＩＶ（ＡｐｏＡ４）を見出した。本発明者らは、ＡｐｏＡ４についてさらなる研究を進めたところ、ＡｐｏＡ４遺伝子が、ＨＧＦとｃ−Ｍｅｔとの相互作用により発現が誘導されること、ＡｐｏＡ４遺伝子発現の誘導が血液中のＡｐｏＡ４タンパク質で検出できること、および正常なヒト肝細胞においてもＨＧＦの暴露によってＡｐｏＡ４遺伝子発現の増加が認められるマーカーであることを見出した。【０００９】
本発明は上記知見に基づくものであり、以下の態様を包含する。
［１］  肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の薬力学的作用を評価する方法であって、
ＨＧＦが投与された被験体から採取した生体試料中のＡｐｏＡ４のレベルを測定するステップを含む、
ことを特徴とする、
評価方法。【００１０】
［２］  ［１］に記載の評価方法であって、
ＨＧＦが投与された被験体から採取した生体試料中のＡｐｏＡ４のレベルを、ＨＧＦが投与されていない、または、その投与の影響が消失した被験体から採取した前記生体試料中のＡｐｏＡ４のレベルと比較するステップをさらに含む、
ことを特徴とする、
評価方法。【００１１】
［３］  ［２］に記載の評価方法であって、
ＨＧＦが投与されていない、または、その投与の影響が消失した被験体のＡｐｏＡ４のレベルと比較して、ＨＧＦが投与された被験体のＡｐｏＡ４のレベルが上昇している場合に、当該投与されたＨＧＦが薬力学的作用をもたらす量で投与されていると判定するステップをさらに含む、
ことを特徴とする、
評価方法。【００１２】
［４］  ［１］〜［３］のいずれかに記載の評価方法であって、
前記「ＡｐｏＡ４のレベル」は、ＡｐｏＡ４タンパク質の発現レベルである、
ことを特徴とする、
評価方法。【００１３】
［５］  ［４］に記載の評価方法であって、
生体由来試料中のＡｐｏＡ４タンパク質の発現レベルが、イムノアッセイによって測定される、
ことを特徴とする、
評価方法。【００１４】
［６］  ［１］〜［５］のいずれかに記載の評価方法であって、
前記生体由来試料は、血清または血漿に由来する試料である、
ことを特徴とする、
評価方法。【００１５】
［７］  ［１］〜［３］のいずれかに記載の評価方法であって、
前記「ＡｐｏＡ４のレベル」は、ＡｐｏＡ４遺伝子の発現レベルである、
ことを特徴とする、
評価方法。【００１６】
［８］  ［７］に記載の評価方法であって、
生体由来試料中のＡｐｏＡ４遺伝子の発現レベルが、リアルタイムＰＣＲによって測定される、
ことを特徴とする、
評価方法。【００１７】
［９］  ［１］〜［３］、[７]または[８]のいずれかに記載の評価方法であって、
前記生体試料は、肝細胞または肝組織である、
ことを特徴とする、
評価方法。【００１８】
［１０］  ［１］〜［９］のいずれかに記載の評価方法であって、
前記被験体は、健常人である、
ことを特徴とする、
評価方法。【００１９】
［１１］  ［１］〜［９］のいずれかに記載の評価方法であって、
前記被験体は、肝臓疾患を有する被験体である
ことを特徴とする、
評価方法。【００２０】
［１２］  ＨＧＦの薬力学的作用を評価するためのキットであって、
抗ＡｐｏＡ４抗体を含む、
ことを特徴とする、
キット。【００２１】
以上述べた本発明の一または複数の特徴を任意に組み合わせた発明も、本発明の範囲に含まれることを、当業者であれば理解するであろう。
【発明の効果】
【００２２】
本発明によれば、より広範な対象において、ＨＧＦの投与によって変動が認められるＰＤマーカーとしてＡｐｏＡ４を利用した、ＨＧＦの薬力学的作用を評価する方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は、リコンビナントヒト−ＨＧＦ（ｒｈ−ＨＧＦ）が投与されたマウスの肝臓から抽出したＡｐｏＡ４  ｍＲＮＡに対して行ったリアルタイムＰＣＲの結果を示す。＊＊Ｐ＜０．０１：コントロール群およびｒｈ−ＨＧＦ処置群間の比較（ダネットの多重比較検定;Ｄｕｎｎｅｔｔ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｔｅｓｔ）。
【図２】図２は、ｒｈ−ＨＧＦおよびｃ−Ｍｅｔ阻害剤が投与されたマウスの肝臓から抽出したＡｐｏＡ４  ｍＲＮＡに対して行ったリアルタイムＰＣＲの結果を示す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１：コントロール群およびｒｈ−ＨＧＦ処置群間の比較（ダネットの多重比較検定）。＃Ｐ＜０．０５、＃＃＃Ｐ＜０．００１：ビヒクル処置群およびＰＦ−０４２１７９０３処置群間の比較（対応のないｔ検定；ｕｎｐａｉｒｅｄ  ｔ  ｔｅｓｔ）。
【図３】図３は、ｒｈ−ＨＧＦ、またはｒｈ−ＨＧＦおよびｃ−Ｍｅｔ阻害剤が投与されたマウス由来の血清中のＡｐｏＡ４タンパク質の定量結果を示す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００１：コントロール群およびｒｈ−ＨＧＦ処置群間の比較（ダネットの多重比較検定）。＃Ｐ＜０．０５、＃＃Ｐ＜０．０１、＃＃＃Ｐ＜０．００１：ビヒクル処置群およびＰＦ−０４２１７９０３処置群間の比較（対応のないｔ検定）。
【図４】図４は、ｒｈ−ＨＧＦが投与されたＪｏ２肝不全マウス由来の血清中のＡｐｏＡ４タンパク質の定量結果を示す。＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．０００１：コントロール群およびｒｈ−ＨＧＦ処置群間の比較（ダネットの多重比較検定）。抗−Ｆａｓ  ＭＡｂ：抗−Ｆａｓ／ＣＤ９５モノクローナル抗体。
【図５】図５は、ｒｈ−ＨＧＦで処理されたヒト肝細胞培養物から取得した試料中のＡｐｏＡ４  ｍＲＮＡに対して行ったリアルタイムＰＣＲの結果を示す。＊＊Ｐ＜０．０１：コントロール群およびｒｈ−ＨＧＦ処置群間の比較（ダネットの多重比較検定）。＃Ｐ＜０．０５：ビヒクル処置群およびＰＦ−０４２１７９０３処置群間の比較（対応のないｔ検定）。
【図６】図６は、ｒｈ−ＨＧＦで処理されたヒト肝細胞培養上清中のＡｐｏＡ４タンパク質をウェスタンブロット法によって定量した結果を示す。＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１：コントロール群およびｒｈ−ＨＧＦ処置群間の比較（ダネットの多重比較検定）。＃Ｐ＜０．０５：ビヒクル処置群およびＰＦ−０４２１７９０３処置群間の比較（対応のないｔ検定）。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
以下、本発明の実施の形態を具体的に説明する。
【００２５】
本発明は、ＨＧＦの薬力学的作用を評価する方法に関する。本発明の評価方法は、対象におけるＡｐｏＡ４のレベルが、ＨＧＦ投与によって変動することを新たに見出したことを基礎とする。したがって、本発明の評価方法は、ＨＧＦが投与された被験体から採取した生体試料中のＡｐｏＡ４のレベルを測定するステップを含むことを特徴とする。
【００２６】
本発明に使用されるＨＧＦは、市販のものであってもよいし、組み換え技術によって製造されたものであってもよい。組み換え技術によるＨＧＦの製造は、例えば、ＨＧＦをコードする遺伝子をクローニングし、当該遺伝子を含むベクターを作製し、これを宿主細胞に導入して形質転換させることによって、ＨＧＦを発現する細胞を取得し、これを細胞培養することによって製造することができる。このプロセスに使用される細胞、ベクターの種類、細胞の種類、培養条件等は、当業者の技術的範囲内であり、適宜適切な条件を設定することができる。
【００２７】
本発明において、評価の対象となる被験体は、特に制限されないが、例えば、ＨＧＦ投与の対象となる、肝臓疾患を発症している被験体、肝臓疾患を発症するおそれがある被験体、および健常者が挙げられる。本発明において、肝臓疾患は、任意の肝臓疾患であり得るが、好ましくは、重症肝障害である。被験体は、典型的にはヒトを指すが、ＡｐｏＡ４の発現が認められる動物であれば、例えば他の霊長類、げっ歯類などであってもよい。
【００２８】
ＨＧＦの投与経路は、特に制限されないが、ＨＧＦがタンパク質製剤であることに鑑み、典型的には、静脈内投与である。
【００２９】
本発明において、前記「被験体から採取した生体試料」は、被験体から採取可能なものである限り特に限定されず、例えば組織（動物を構成する基本的な単位である細胞が特定の機能を発揮するように分化し集団を形成したもので、細胞と細胞間質によって構成され、全体としてある機能を果たすもの）、器官（組織が規則正しく組み合わされて作り上げられたもの）または体液とすることができる。組織または器官としては、非限定的に、卵巣、子宮、乳房、甲状腺、脳、食道、舌、肺、膵臓、胃、小腸、十二指腸、大腸、膀胱、腎臓、肝臓、前立腺、胆嚢、咽頭、筋肉、骨および皮膚などが挙げられるがこれらに限定されない。体液としては、非限定的に、血清、血漿または全血などの血液、リンパ液、組織液、髄液、体腔液、消化液、鼻水、涙液、汗および尿などが挙げられるがこれらに限定されない。取得および処理の簡便さから、前記生体試料として血清または血漿を用いることが好ましい。また、前記体液は、対象から採取した体液そのものであっても、採取した体液に通常行われる希釈、濃縮等の処理を行ったものであってもよい。なお、本発明に用いる被験体に由来する生体試料の採取や調製を行なう者は、本発明の工程を行う者と同一人物でもよく、別人物であってもよい。また、本発明に用いる被験体に由来する生体試料は、本発明の実施時に採取または調製されたものでもよく、予め採取または調製され保存されたものであってもよい。
【００３０】
本発明は、一実施形態において、ＨＧＦが投与された被験体から採取した生体試料中のＡｐｏＡ４のレベルを、ＨＧＦが投与されていない、または、その投与の影響が消失した被験体から採取した前記生体試料中のＡｐｏＡ４のレベルと比較するステップをさらに含む。「その投与の影響が消失した被験体」とは、ＨＧＦ投与歴はあるが、ＨＧＦによる薬力学的作用が消失するのに十分な時間が経過している被験体をいう。
【００３１】
本発明は、さらに好ましい実施形態において、ＨＧＦが投与されていない、または、その投与の影響が消失した被験体のＡｐｏＡ４のレベルと比較して、ＨＧＦが投与された被験体のＡｐｏＡ４のレベルが上昇している場合に、当該投与されたＨＧＦが薬理学的作用をもたらす量で投与されていると判定するステップをさらに含む。
【００３２】
本発明において、「薬力学的作用をもたらす量で投与されている」とは、ＨＧＦ投与によって何らかの薬力学的作用が提供されていることを意味し、その作用の大小は必ずしも問題にはされない。例えば、ＨＧＦ投与後にＡｐｏＡ４レベルが大きく上昇した場合も、ＡｐｏＡ４レベルがわずかに上昇したに過ぎない場合も、いずれも「薬力学的作用をもたらす量で投与されている」に該当する。この関連で、「薬力学的作用をもたらす量で投与されている」は、「治療上有効な量で投与されている」と同義ではなく、ＡｐｏＡ４レベルの上昇度に応じて、「治療上有効な量で投与されている」と判定される場合もあれば、「治療上有効な量で投与されている」と判定されない場合もある。
【００３３】
本発明において、ＨＧＦは、ヒト、マウス、ラット、ブタ、その他の動物に由来するＨＧＦを含み得るが、好ましくはヒト由来のＨＧＦである。
【００３４】
本発明において、ヒトＨＧＦ（ｈＨＧＦ）には、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその変異体が含まれる。ヒトＨＧＦの変異体には、配列番号１に示すアミノ酸配列において、１個または複数個のアミノ酸の付加、欠失または置換を有するアミノ酸配列を有し、かつ、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドと同等またはそれ以上のＨＧＦ活性を有するポリペプチドが含まれる。ここでいう「複数個」は、２〜１５０個、より好ましくは２〜８０個、より好ましくは２〜７０個、より好ましくは２〜６０個、より好ましくは２〜５０個、より好ましくは２〜４０個、より好ましくは２〜３０個、より好ましくは２〜２０個、より好ましくは２〜１０個、またはより好ましくは２〜５個である。前記変異体には、また、配列番号１に示すアミノ酸配列と、少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を示すアミノ酸配列を有し、かつ、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドと同等またはそれ以上のＨＧＦ活性を有するポリペプチドまたは配列番号１に示すアミノ酸配列をコードする遺伝子とストリンジェントな条件でハイブリダイズする遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を有し、かつ、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドと同等またはそれ以上のＨＧＦ活性を有するポリペプチドが含まれる。
【００３５】
本発明において、「ストリンジェントな条件」とは、ポストハイブリダイゼーションの洗浄において、例えば「２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、５０℃」の条件、「２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」の条件、または「１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、３７℃」の条件における洗浄でハイブリダイズしていること、よりストリンジェントな条件としては、例えば「２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」、「０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」、「０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」、または「０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」の条件における洗浄でハイブリダイズしていることが挙げることができる（１×ＳＳＣは１５０  ｍＭ  ＮａＣｌ、１５  ｍＭ  ｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ、ｐＨ  ７．０）。より詳細には、Ｒａｐｉｄ−ｈｙｂ  ｂｕｆｆｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いた方法として、６８℃で３０分以上プレハイブリダイゼーションを行った後、プローブを添加して１時間以上６８℃に保ってハイブリッドを形成させ、その後、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、室温で２０分の洗浄を３回、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、３７℃で２０分の洗浄を３回、最後に、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、５０℃で２０分の洗浄を２回行うことも考えられる。より好ましくは、プレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションの溶液としては、例えば５×ＳＳＣ、７％（Ｗ／Ｖ）ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ、５×デンハルト液（１×デンハルト溶液は０．２％ポリビニールピロリドン、０．２％牛血清アルブミン、及び０．２％フィコールを含む）を含む溶液を用い、プレハイブリダイゼーションを６５℃３０分から１時間、ハイブリダイゼーションを同じ温度で一晩（６〜８時間）行う。その他、例えばＥｘｐｒｅｓｓｈｙｂ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）中、５５℃で３０分以上プレハイブリダイゼーションを行い、標識プローブを添加し、３７〜５５℃で１時間以上インキュベートし、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、室温で２０分の洗浄を３回、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、３７℃で２０分の洗浄を１回行うこともできる。ここで、例えば、プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーションや２度目の洗浄の際の温度を上げることにより、よりストリンジェントな条件とすることができる。例えば、プレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションの温度を６０℃、さらにストリンジェントな条件としては６５℃または６８℃とすることができる。当業者であれば、このようなバッファーの塩濃度、温度等の条件に加えて、その他のプローブ濃度、プローブの長さ、反応時間等の諸条件を加味し、本発明の遺伝子のアイソフォーム、アレリック変異体、及び対応する他種生物由来の遺伝子を得るための条件を設定することができる。ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、『Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄ．』（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ  （１９８９）；特にＳｅｃｔｉｏｎ９．４７−９．５８）、『Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ』（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  （１９８７−１９９７）；特にＳｅｃｔｉｏｎ６．３−６．４）、『ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  １：  Ｃｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ２ｎｄ  ｅｄ．』（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  （１９９５）；条件については特にＳｅｃｔｉｏｎ２．１０）等を参照することができる。
【００３６】
「ＡｐｏＡ４遺伝子」は、アポリポタンパク質Ａ−ＩＶをコードする遺伝子であり、ヒトのほか、マウス、ラット等のげっ歯類などでも発現することが知られている。ヒトＡｐｏＡ４の遺伝子配列およびそれに対応するアミノ酸配列は、それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿０００４８２、およびＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＰ＿０００４７３で登録されている。
【００３７】
本発明において、ヒトＡｐｏＡ４タンパク質は、その変異体を含んでもよい。ヒトＡｐｏＡ４タンパク質の変異体には、配列番号３に示すアミノ酸配列において、１個または複数個のアミノ酸の付加、欠失または置換を有するアミノ酸配列を有し、かつ、配列番号３に示すアミノ酸配列を有するヒトＡｐｏＡ４タンパク質と同等の機能特性を有するポリペプチドをコードするものが含まれる。ここでいう「複数個」は、２〜８０個、より好ましくは２〜６０個、より好ましくは２〜４０個、より好ましくは２〜３５個、より好ましくは２〜３０個、より好ましくは２〜２５個、より好ましくは２〜２０個、より好ましくは２〜１５個、より好ましくは２〜１０個、またはより好ましくは２〜５個である。前記変異体には、また、配列番号３に示すアミノ酸配列と、少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を示すアミノ酸配列を有し、かつ、配列番号３に示すアミノ酸配列を有するヒトＡｐｏＡ４タンパク質と同等の機能特性を有するポリペプチドまたは配列番号３に示すアミノ酸配列をコードする遺伝子（例えば、配列番号２）とストリンジェントな条件でハイブリダイズする遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を有し、かつ、配列番号３に示すアミノ酸配列を有するヒトＡｐｏＡ４タンパク質と同等の機能特性を有するポリペプチドが含まれる。例示的な実施形態において、ヒトＡｐｏＡ４タンパク質の変異体は、配列番号５に示すアミノ酸配列、または配列番号４に示す塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を有している。
【００３８】
前記生体試料中のＡｐｏＡ４レベルの測定は、ＡｐｏＡ４を定量的に検出できる方法であれば特に制限されない。したがって、ＡｐｏＡ４タンパク質の発現レベルを測定することによってもよいし、ＡｐｏＡ４遺伝子の発現レベル（すなわちＡｐｏＡ４  ｍＲＮＡ）を測定することによってもよい。ＡｐｏＡ４タンパク質は、ＨＧＦ投与による変動を血液中のタンパク質で確認することができるため、簡便さの点で、血清または血漿中のＡｐｏＡ４タンパク質の量を測定することが有利であり得る。
【００３９】
ＡｐｏＡ４タンパク質の発現レベルの測定方法は、ＡｐｏＡ４タンパク質を特異的に検出し、測定できる方法であれば特に制限はなく、通常用いられる測定方法を適用することができる。そのような方法として、これに限定されるものではないが、ＡｐｏＡ４タンパク質に結合する抗体を用いる方法、イオン交換クロマトグラフィー、質量分析、ＬＣ／ＭＳ、ＬＣ／ＭＳに質量分析計を直列に結合したＬＣ／ＭＳ／ＭＳ等のＡｐｏＡ４タンパク質またはその断片を測定する方法等を挙げることができる。
【００４０】
本発明において、ＡｐｏＡ４タンパク質の検出に用いる装置には特に制限はなく、ＡｐｏＡ４タンパク質の測定の方法に応じて適宜選択することができる。具体的には例えば、ＨＰＬＣ機器、質量分析機器（マススペクトロメトリー）、液体クロマトグラフィーと質量分析機器を接続したＬＣ／ＭＳ機器、ＬＣ／ＭＳ機器に質量分析計を直列に結合したＬＣ／ＭＳ／ＭＳ機器、電気泳動機器（キャピラリー電気泳動装置等）、全自動あるいは半自動酵素免疫測定機器、セルウォッシャー、全自動あるいは半自動化学発光免疫測定機器、発光測定装置、全自動あるいは半自動電気化学発光免疫測定機器、光学測定装置、プレートリーダー、ＣＣＤカメラ、全自動あるいは半自動蛍光免疫測定機器、蛍光測定装置、全自動あるいは半自動放射免疫測定機器、液体シンチレーションカウンター、クールターカウンター、表面プラズモン測定装置、ブロッティング装置、デンシトメーター等を挙げることができる。
【００４１】
本発明の一実施形態において、ＡｐｏＡ４タンパク質の発現レベルの測定には、ＡｐｏＡ４タンパク質に結合する抗体（本明細書中、「抗ＡｐｏＡ４抗体」とも称する）を用いる方法、例えば抗ＡｐｏＡ４抗体を用いるイムノアッセイを使用することが好ましい。抗ＡｐｏＡ４抗体は、ＡｐｏＡ４を認識して結合可能な抗体であれば特に制限されない。
【００４２】
抗ＡｐｏＡ４抗体は、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体のいずれも公知の方法に従って作製することができる。モノクローナル抗体は、例えば、ＡｐｏＡ４またはＡｐｏＡ４フラグメントで免疫した非ヒト哺乳動物から抗体産生細胞を単離し、これを骨髄腫細胞等と融合させてハイブリドーマを作製し、このハイブリドーマが産生した抗体を精製することによって得ることができる。また、ポリクローナル抗体は、ＡｐｏＡ４タンパク質またはＡｐｏＡ４フラグメントで免疫した動物の血清から得ることができる。ＡｐｏＡ４フラグメントはＡｐｏＡ４タンパク質の部分ペプチドであり、抗ＡｐｏＡ４フラグメント抗体は、ＡｐｏＡ４タンパク質を認識する。また、免疫原としては、例えば、ヒトやサルなどの霊長類、ラットやマウスなどのげっ歯類などのＡｐｏＡ４タンパク質またはＡｐｏＡ４フラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４３】
なお、本明細書において「抗体」とは、天然に存在するか、遺伝子組換え技術によって産生される、全長の免疫グロブリン分子、または抗体フラグメントのような免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な断片をいう。これらの抗体は、慣用技術を用いて作製することができ、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよい。抗体フラグメントとしては、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖなどが挙げられる。
【００４４】
本発明において使用する抗ＡｐｏＡ４抗体は、ＡｐｏＡ４タンパク質に特異的に結合する抗体であることが好ましい。「特異的な結合」とは、非特異的な相互作用に比して、より高い結合親和性でＡｐｏＡ４タンパク質と結合する抗体を指す。本発明の一実施形態では、「特異的な結合」は、例えばＡｐｏＡ４タンパク質に対して少なくとも約１０−４Ｍ、または少なくとも約１０−５Ｍ、または少なくとも約１０−６Ｍ、または少なくとも約１０−７Ｍ、または少なくとも約１０−８Ｍ、または少なくとも約１０−９Ｍ、または少なくとも約１０−１０Ｍ、または少なくとも約１０−１１Ｍ、または少なくとも約１０−１２Ｍ、またはそれ以上のＫｄを持つ抗体によって示されうる。別の実施形態では、「特異的な結合」は、ＡｐｏＡ４のポリペプチドとは異なる他のポリペプチドに実質的に結合することなく、ＡｐｏＡ４に結合することを意味する。
【００４５】
イムノアッセイは、検出可能に標識した抗ＡｐｏＡ４抗体、または、検出可能に標識した抗ＡｐｏＡ４抗体に対する抗体（二次抗体）を用いる。抗体の標識法により、エンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡまたはＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）、蛍光偏光イムノアッセイ（ＦＰＩＡ）、化学発光イムノアッセイ（ＣＬＩＡ）、電気化学発光イムノアッセイ（ＥＣＬＩＡ）等に分類され、これらのいずれも本発明の方法に用いることができる。
【００４６】
ＥＬＩＳＡ法では、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等の酵素、ＲＩＡ法では、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、３Ｈ等の放射性物質、ＦＰＩＡ法では、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ダンシルクロリド、フィコエリスリン、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、近赤外蛍光材料等の蛍光物質、ＣＬＩＡ法では、ルシフェラーゼ、βガラクトシダーゼ等の酵素と各酵素で発光物質に変化する発光基質、ルシフェリン、エクオリン等の発光物質で標識した抗体を用いることができる。その他、金コロイド、量子ドットなどのナノ粒子で標識した抗体を検出することもできる。
【００４７】
また、イムノアッセイでは、抗ＡｐｏＡ４抗体をビオチンで標識し、酵素等で標識したアビジンまたはストレプトアビジンを結合させて、ＡｐｏＡ４タンパク質を検出、測定することもできる。
【００４８】
イムノアッセイの中でも、酵素標識を用いるＥＬＩＳＡ法は、簡便且つ迅速に標的を測定することができて好ましい。
【００４９】
ＥＬＩＳＡ法では、例えばサンドイッチ法を用いることができる。固相担体に抗ＡｐｏＡ４抗体を固定し、適宜処理した生体試料を添加して反応させた後、さらに酵素で標識した別のエピトープを認識する抗ＡｐｏＡ４抗体を添加して反応させる。
【００５０】
洗浄後、酵素基質と反応、発色させ、吸光度を測定することにより、ＡｐｏＡ４タンパク質の発現レベルを求めることができる。また、固相担体に固定した抗ＡｐｏＡ４抗体と生体試料中のＡｐｏＡ４タンパク質を反応させた後、非標識抗ＡｐｏＡ４抗体（一次抗体）を添加し、この非標識抗体に対する抗体（二次抗体）を酵素標識してさらに添加してもよい。 
【００５１】
酵素基質は、酵素がペルオキシダーゼの場合、３，３’−ジアミノベンジン（３，３’−ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ；ＤＡＢ）、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジン（３，３’，５，５’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ；ＴＭＢ）、ｏ−フェニレンジアミン（ｏ−ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ；ＯＰＤ）等を用いることができ、アルカリホスファターゼの場合、ｐ−ニトロフェニルホスフェート（ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ；ＮＰＰ）等を用いることができる。
【００５２】
また、上記イムノアッセイの中で、微量のタンパク質を簡便に検出できる方法として凝集法も好ましい。凝集法としては、例えば、抗体にラテックス粒子を結合させたラテックス凝集法が挙げられる。
【００５３】
ラテックス粒子に抗ＡｐｏＡ４抗体を結合させて生体試料に混合すると、ＡｐｏＡ４タンパク質が存在すれば、抗体結合ラテックス粒子が凝集する。そこで、試料に近赤外光を照射して、吸光度の測定（比濁法）または散乱光の測定（比朧法）により凝集塊を定量し、抗原の濃度を求めることができる。
【００５４】
ＡｐｏＡ４遺伝子の発現レベルの測定は、ＡｐｏＡ４  ｍＲＮＡを定量的に検出できる方法であれば特に制限されず、例えば、ＡｐｏＡ４  ｍＲＮＡに特異的なプライマーを用いたＰＣＲ法、ＲＴ−ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法などの核酸増幅法を用いることができる。例えば、リアルタイムＰＣＲは、具体的には、以下のように行うことができる。すなわち、組織からトータルＲＮＡを常法に従って取得し、逆転写酵素と適当なプライマーを用いてｃＤＮＡを作製する。作製したｃＤＮＡをもとに、ＡｐｏＡ４遺伝子に特異的なプライマーと、ＤＮＡポリメラーゼを用いることでＡｐｏＡ４遺伝子を特異的に増幅させることができる。ＡｐｏＡ４遺伝子は、増幅させる際に適当な蛍光色素を取り込ませることで、特定の機器（ＰＲＩＳＭ  ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ７９００ＨＴ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ＳｙｓｔｅｍもしくはＶｉｉＡ（商標）７  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）など）を用いて増幅曲線をモニターすることができる。内部標準遺伝子（Ｈｐｒｔなど）によりＡｐｏＡ４の補正を行うことで、組織におけるＡｐｏＡ４  ｍＲＮＡの量を定量的に測定することができる。
【００５５】
別の態様において、本発明は、ＨＧＦの薬力学的作用を評価するためのキットに関する。本発明に係るキットは、ＡｐｏＡ４のレベルを測定するための手段を含んでおり、一実施形態において、そのような手段は、抗ＡｐｏＡ４抗体、ＡｐｏＡ４アプタマー、ＡｐｏＡ４タンパク質、その断片若しくはそれらを同位体標識したもの、またはＡｐｏＡ４遺伝子配列に相補的な部分配列からなるプライマー，プローブ若しくはそれらを色素で標識したものである。本発明のキットの好ましい実施形態において、抗ＡｐｏＡ４抗体は、ＡｐｏＡ４に特異的に結合する抗体であり、ＡｐｏＡ４アプタマーは、ＡｐｏＡ４タンパク質に特異的に結合するアプタマーである。
【００５６】
本発明のキットは、ＡｐｏＡ４タンパク質と、抗ＡｐｏＡ４抗体との抗原抗体反応を利用するイムノアッセイによって、生体試料中のＡｐｏＡ４タンパク質の量を測定するために必要な試薬および装置をさらに含んでもよい。
【００５７】
本発明のキットは、一実施形態において、サンドイッチＥＬＩＳＡ法によってＡｐｏＡ４タンパク質の量を測定するためのものであり、マイクロタイタープレート；捕捉用の抗ＡｐｏＡ４抗体；アルカリホスファターゼまたはペルオキシダーゼで標識した抗ＡｐｏＡ４抗体；および、アルカリホスファターゼ基質（ＮＰＰ等）またはペルオキシダーゼの基質（ＤＡＢ、ＴＭＢ、マイクロタイタープレートＯＰＤ等）、を含む。捕捉抗体と標識抗体は、異なるエピトープを認識する。このようなキットの場合、まず、マイクロタイタープレートに捕捉抗体を固定し、ここに適宜処理し希釈した生体試料を添加した後インキュベートし、試料を除去して洗浄する。次に、標識抗体を添加した後インキュベートし、基質を加えて発色させる。マイクロタイタープレートリーダー等を用いて発色を測定することにより、ＡｐｏＡ４タンパク質の量を求めることができる。
【００５８】
本発明のキットは、別の実施形態において、二次抗体を使用したサンドイッチＥＬＩＳＡ法によりＡｐｏＡ４タンパク質の量を測定するためのものであり、マイクロタイタープレート；捕捉用の抗ＡｐｏＡ４抗体；一次抗体として、抗ＡｐｏＡ４抗体；二次抗体として、アルカリホスファターゼまたはペルオキシダーゼで標識した、一次抗体の抗ＡｐｏＡ４抗体に対する抗体；および、アルカリホスファターゼ（ＮＰＰ等）またはペルオキシダーゼの基質（ＤＡＢ、ＴＭＢ、ＯＰＤ等）、を含む。捕捉抗体と一次抗体は、異なるエピトープを認識する。このようなキットでは、まず、マイクロタイタープレートに捕捉抗体を固定し、ここに適宜処理し希釈した生体試料を添加した後インキュベートし、試料を除去して洗浄する。続いて、一次抗体を添加してインキュベートおよび洗浄を行い、さらに酵素標識した二次抗体を添加してインキュベートを行った後、基質を加えて発色させる。マイクロタイタープレートリーダー等を用いて発色を測定することにより、ＡｐｏＡ４タンパク質の量を求めることができる。二次抗体を用いることにより、反応が増幅され検出感度を高めることができる。
【００５９】
本発明のキットは、さらに、必要な緩衝液、酵素反応停止液、マイクロプレートリーダー、製品説明書等を含むことも好ましい。
【００６０】
標識抗体は、酵素標識した抗体に限定されず、放射性物質（１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、３Ｈ等）、蛍光物質（フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ダンシルクロリド、フィコエリスリン、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、近赤外蛍光材料等）、発光物質（ルシフェラーゼ、ルシフェリン、エクオリン等）、ナノ粒子（金コロイド、量子ドット）等で標識した抗体であってもよい。また標識抗体としてビオチン化抗体を用い、キットに標識したアビジンまたはストレプトアビジンを加えることもできる。
【００６１】
本発明のキットは、ＡｐｏＡ４と、ＡｐｏＡ４アプタマーとの反応を利用するアッセイによって、生体試料中のＡｐｏＡ４の量を測定するために必要な試薬および装置をさらに含んでもよい。
【００６２】
なお、本明細書において用いられる用語は、特定の実施形態を説明するために用いられるのであり、発明を限定する意図ではない。
【００６３】
また、本明細書において用いられる「含む」との用語は、文脈上明らかに異なる理解をすべき場合を除き、記述された事項（部材、ステップ、要素、数字など）が存在することを意図するものであり、それ以外の事項（部材、ステップ、要素、数字など）が存在することを排除しない。
【００６４】
異なる定義が無い限り、ここに用いられるすべての用語（技術用語および科学用語を含む。）は、本発明が属する技術の当業者によって広く理解されるのと同じ意味を有する。ここに用いられる用語は、異なる定義が明示されていない限り、本明細書および関連技術分野における意味と整合的な意味を有するものとして解釈されるべきであり、理想化され、または、過度に形式的な意味において解釈されるべきではない。
【００６５】
第一の、第二のなどの用語が種々の要素を表現するために用いられる場合があるが、これらの要素はそれらの用語によって限定されるべきではないことが理解される。これらの用語は一つの要素を他の要素と区別するためのみに用いられているのであり、例えば、第一の要素を第二の要素と記し、同様に、第二の要素は第一の要素と記すことは、本発明の範囲を逸脱することなく可能である。
【００６６】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、しかしながら、本発明はいろいろな形態により具現化することができ、ここに記載される実施例に限定されるものとして解釈されてはならない。
【実施例】
【００６７】
［実施例１］ｒｈ−ＨＧＦを投与した健常マウスの肝組織を用いた遺伝子発現解析
目的：
ｒｈ−ＨＧＦが生物活性をもたらす標的臓器、肝臓を材料として、ｒｈ−ＨＧＦによって影響を受ける分子を同定し、その中からＰＤマーカーの同定を試みた。分子同定には、マイクロアレイならびにリアルタイムＰＣＲ法を用いた。【００６８】
実験：
ｒｈ−ＨＧＦの投与と採材
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞で組み換え発現させた肝細胞増殖因子アクチベーターを用いて、ＣＨＯ細胞で組み換え発現させたヒトＨＧＦを活性化して、ｒｈ−ＨＧＦを得た。ＢＡＬＢ／ｃＡｎＮＣｒｌＣｒｌｊ雄性６週齢マウス（日本チャールスリバー）に、ダルベツコリン酸緩衝生理食塩水（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ‘ｓ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ：ＰＢＳ）（Ｗａｋｏ，♯０４５−２９７９５）またはｒｈ−ＨＧＦ（１．５ｍｇ／ｋｇ）を静脈内投与した。ＰＢＳ投与直後、ｒｈ−ＨＧＦの投与後８および２４時間に、３％イソフルラン吸入麻酔下にて腹部下大静脈より採血を行い、頚椎脱臼法によりマウスを安楽死させた。安楽死後、肝臓組織を採取し、ＲＮＡ  ｌａｔｅｒ（Ａｍｂｉｏｎ，  ＃ＡＭ７０２１）に浸漬させた。下記表は、本実験に用いた試験群を示す。【００６９】
【表１】
0006800208.tif 000002
【００７０】
肝臓由来Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡの抽出
採材した肝臓からＴＲＩＺＯＬ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  ＃１５５９６−０１８）、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ，  ＃７４１０４）、およびＲＮａｓｅ−Ｆｒｅｅ  ＤＮａｓｅ  ｓｅｔ（ＱＩＡＧＥＮ，  ＃７９２５４）を用いてｔｏｔａｌ  ＲＮＡを精製した。ＲＮＡ濃度を吸光度により測定した後、ＲＮＡ  ６０００  Ｎａｎｏ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  ＃５０６７−１５１１）を用いて、２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にてクオリティチェックを実施した。【００７１】
ＤＮＡマイクロアレイ解析
ＤＮＡマイクロアレイは、ＳｕｒｅＰｒｉｎｔ  Ｇ３  ｍｏｕｓｅ  ＧＥ  ８×６０Ｋ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  ＃Ｇ４８５２Ａ）を使用した。得られたデータのうち、３群全てでシグナル値が１００以上となっている遺伝子を対象とし、群１に対して群２または群３で２倍以上のシグナル値が増加したものを一時抽出した。その中から、可溶性タンパク質として存在しうると思われうる分子として、Ｇｅｎｅ  Ｏｎｔｏｌｏｇｙ  ａｎｎｏｔａｔｉｏｎで「Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ」あるいは「Ｐｌａｓｍａ  ｍｅｍｂｒａｎｅ」の情報を有するものを抽出した。このようにして、ｒｈ−ＨＧＦ投与によって発現が強く誘導される分子をＰＤマーカー候補として選んだ。【００７２】
結果１：
上記の分子選出法によって、ＡｐｏＡ４分子を抽出した（表２）。ＡｐｏＡ４分子は、アポリポタンパク質を構成するアポタンパク質として血中に存在する分子である。ＡｐｏＡ４分子は、ＰＢＳのみを投与されたマウス（群１）では発現が低く、ｒｈ−ＨＧＦを投与すると発現増強が見られた。【００７３】
【表２】
0006800208.tif 000003
【００７４】
リアルタイムＰＣＲによるＡｐｏＡ４  ｍＲＮＡ発現誘導の確定
ＤＮＡマイクロアレイで用いたサンプルと同じＲＮＡについて、Ｈｉｇｈ−Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｗｉｔｈ  ＲＮａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  ＃４３７４９６６）を使用して逆転写し、ｃＤＮＡを作製した。得られたｃＤＮＡを鋳型として、ＡｐｏＡ４  ｍＲＮＡ発現量をリアルタイムＰＣＲ法で検討した。検討にあたっては、Ｈｐｒｔ  ｍＲＮＡを内部コントロールとした。ＰＣＲ反応は、ＴａｑＭａｎ  Ｆａｓｔ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  ＃４４４４５５７）とＴａｑＭａｎ  Ａｓｓａｙ（ＡｐｏＡ４：  Ｍｍ００４３１８１４＿ｍ１，  Ｈｐｒｔ：  Ｍｍ０３０２４０７５＿ｍ１，  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、ＶｉｉＡ７リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、ＰＣＲの増幅反応を実施した。増幅反応は、９５℃で２０秒インキュベートした後、９５℃で１秒、６０℃で２０秒の反応を４０サイクル繰り返した。ＡｐｏＡ４  ｍＲＮＡの発現値をサンプルごとにＨｐｒｔ  ｍＲＮＡ発現値で標準化することで、サンプル間の補正を実施した。【００７５】
統計解析：
ＡｐｏＡ４  ｍＲＮＡ定量の結果について、コントロールとｒｈ−ＨＧＦ投与群との間で、ダネットの多重比較検定を実施した（図１）。【００７６】
結果２：
ＤＮＡマイクロアレイの結果得られたＡｐｏＡ４について、そのｍＲＮＡをリアルタイムＰＣＲ法で定量し確定した。ハウスキーピング遺伝子のＨｐｒｔ  ｍＲＮＡを内部コントロールとしたＡｐｏＡ４  ｍＲＮＡ定量の結果、その挙動はＤＮＡマイクロアレイで見られたシグナル値の変動と相関しており、ｒｈ−ＨＧＦ投与によって強く発現が増強されていることが確認された（図１）。【００７７】
［実施例２］ｒｈ−ＨＧＦ投与によるＡｐｏＡ４誘導とｃ−Ｍｅｔ阻害剤によるキャンセル効果
目的：
ｒｈ−ＨＧＦの生物活性は、その受容体ｃ−Ｍｅｔを介してもたらされる。即ち、ＡｐｏＡ４がｒｈ−ＨＧＦのＰＤマーカーであることの妥当性は、その発現誘導がｃ−Ｍｅｔに依存していることを明らかにすることによって担保できる。そこで、ｃ−Ｍｅｔの特異的阻害剤を投与した健常マウスを用いて、ｒｈ−ＨＧＦ投与によるＡｐｏＡ４発現誘導のキャンセル効果を検討した。検討は肝臓由来ｍＲＮＡおよび血清中タンパク質を対象とした。【００７８】
実験：
ｃ−Ｍｅｔ阻害剤の投与と実験群
ＢＡＬＢ／ｃＡｎＮＣｒｌＣｒｌｊ雄性６週齢マウス（日本チャールスリバー）にｃ−Ｍｅｔ阻害剤ＰＦ−０４２１７９０３（５０  ｍｇ／ｋｇ）（Ｓｅｌｌｅｃｋ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ＃Ｓ１０９４，  ｌｏｔ．  ０５）または媒体（５％  ＤＭＳＯ，１０％  Ｔｗｅｅｎ８０，６．７ｍｍｏｌ／Ｌ塩酸水）を１０ｍＬ／ｋｇの用量で経口投与し、１時間後にｒｈ−ＨＧＦ（０．５，  １．５，  ５．０，  １５ｍｇ／ｋｇ）またはＰＢＳを静脈内投与した。ｒｈ−ＨＧＦまたはＰＢＳの投与後２４時間、３％イソフルラン吸入麻酔下にて腹部下大静脈より採血を行い、頚椎脱臼法によりマウスを安楽死させた。安楽死後、肝臓組織を採取し、ＲＮＡ  ｌａｔｅｒ（Ａｍｂｉｏｎ，＃ＡＭ７０２１）に浸漬させた。採取した血液から血清を回収した。下記表は、本実験で用いた試験群を示す。【００７９】
【表３】
0006800208.tif 000004
【００８０】
肝臓由来Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡの抽出
採材した肝臓からＴＲＩＺＯＬ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  ＃１５５９６−０１８）、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ，  ＃７４１０４）、およびＲＮａｓｅ−Ｆｒｅｅ  ＤＮａｓｅ  ｓｅｔ（ＱＩＡＧＥＮ，  ＃７９２５４）を用いてｔｏｔａｌ  ＲＮＡを精製し、ＲＮＡ濃度を吸光度により測定した。【００８１】
リアルタイムＰＣＲ法によるＡｐｏａ４  ｍＲＮＡの定量
リアルタイムＰＣＲ法によるＡｐｏＡ４  ｍＲＮＡの定量は、実施例１に準じて行った。【００８２】
統計解析：
ＡｐｏＡ４  ｍＲＮＡ定量の結果について、コントロールとｒｈ−ＨＧＦ投与群との間で、ダネットの多重比較検定を実施した。さらに、ＡｐｏＡ４  ｍＲＮＡが統計的に有意に増加したｒｈ−ＨＧＦ処置群について、ビヒクルとｃ−Ｍｅｔ阻害剤処置群との間で対応のないｔ検定を実施した（図２）。【００８３】
結果１：
ＡｐｏＡ４  ｍＲＮＡはｒｈ−ＨＧＦ投与により肝臓で顕著に発現が誘導・亢進することが再度確認された。更に、その誘導は、ｃ−Ｍｅｔ阻害剤を投与することで顕著に阻害されたことから、ｒｈ−ＨＧＦ投与に伴うＡｐｏＡ４  ｍＲＮＡの発現増強は、ｃ−Ｍｅｔ依存性であることが確認できた（図２）。【００８４】
血清ＡｐｏＡ４タンパク質の定量
上記血清をもちいて、ウェスタンブロット法によってＡｐｏＡ４タンパク質を定量した。ＰＢＳ（−）（Ｗａｋｏ）で２００倍希釈した血清に１／４容の泳動バッファー液（３１３ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８），１０％  ＳＤＳ，３０％  Ｇｌｙｃｅｒｏｌ，０．２ｍｇ／ｍＬ  Ｂｒｏｍｏ−ｐｈｅｎｏｌ  ｂｌｕｅ，２５％  ２−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈｎｏｌ）を添加し（血清の最終希釈度は２５０倍となる）、９５℃、３分加熱処理した。その内１２．５μＬをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ニトロセルロースフィルター（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ，  ＢＡ８５）にブロッティングした。フィルターをブロッキング液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，５％  ｓｋｉｍ−ｍｉｌｋ，０．０１％  Ｔｗｅｅｎ２０，０．１％  ＮａＮ３）に浸し、室温で１時間振とうしてからブロッキング液を廃棄し、ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ−ＩＶ抗体（ＧｅｎｅＴｅｘ，  ＃ＧＴＸ８８５３３）を０．４２μｇ／ｍＬ濃度で添加した反応溶液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，５％  ｓｋｉｍ−ｍｉｌｋ，４％  ＰＥＧ６０００，０．２％  ＥＤＴＡ／３Ｎａ，０．０１％  Ｔｗｅｅｎ２０，０．２％  Ｐｒｏｃｌｉｎ１５０）に浸し、室温下で２時間振とうした。洗浄液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，０．０１％  Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄した後、二次抗体のＨＲＰ標識ｒａｂｂｉｔ  ａｎｔｉ−ｇｏａｔ  ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を１／２０００濃度で添加した上記反応溶液に浸し、室温で１時間振とうした。上記洗浄液で３回洗浄した後、化学発光溶液ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｄｕｒａ  Ｅｘｔｅｎｄｅｄ  Ｄｕｒａｔｉｏｎ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を加えて発光させ、ＬＡＳ−４０００（ＦＵＪＩＦＩＬＭ）でＡｐｏＡ４タンパク質を検出した。【００８５】
統計解析：
血清ＡｐｏＡ４  タンパク質定量の結果について、コントロールとｒｈ−ＨＧＦ投与群との間で、ダネットの多重比較検定を実施した。さらに、ＡｐｏＡ４  タンパク質が統計的に有意に増加したｒｈ−ＨＧＦ処置群について、ビヒクル処置群とｃ−Ｍｅｔ阻害剤処置群との間で対応のないｔ検定を実施した（図３）。【００８６】
結果２：
ｒｈ−ＨＧＦ投与によるＡｐｏＡ４タンパク質の発現誘導は、血清中のタンパク質として検出することが可能だった。更に、その誘導は、ｃ−Ｍｅｔ阻害剤を投与することで阻害されたことから、ｒｈ−ＨＧＦ投与に伴うＡｐｏＡ４  タンパク質の発現増強は、ｃ−Ｍｅｔ依存性であることが確認できた（図３）。【００８７】
［実施例３］実験的肝障害時でのｒｈ−ＨＧＦ投与によるＡｐｏＡ４タンパク質の産生増強効果の検証
目的：
これまでの結果から、マウスＡｐｏＡ４タンパク質は血中で測定可能なＨＧＦのＰＤマーカーと考えられた。健常マウスの肝ｍＲＮＡならびに血中において、ＡｐｏＡ４タンパク質はＨＧＦのＰＤマーカーとしての挙動をしめしたが、肝障害時においてもＨＧＦのＰＤマーカーとしての挙動を示すか否かについて、実験的肝障害マウス（Ｊｏ２肝不全モデル）を用いて検証した。Ｊｏ２肝不全モデルは、抗Ｆａｓモノクローナル抗体（Ａｎｔｉ−Ｆａｓ  ＭＡｂ）投与によって直接に肝細胞のアポトーシスを惹起することに起因した重症度の高い肝障害モデルである。【００８８】
実験：
Ｊｏ２肝不全モデルの作製
ＢＡＬＢ／ｃＡｎＮＣｒｌＣｒｌｊ雄性６週齢マウス（日本チャールスリバー）に、抗Ｆａｓモノクローナル抗体（クローン名：Ｊｏ２、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，  ＃５５４２５４，  ｌｏｔ＃３２６９６３４）０．２３ｍｇ／ｋｇを単回尾静脈内投与し、急性肝不全モデルを作製した。このモデルに対し、ＰＢＳに溶解したｒｈ−ＨＧＦを０．１５，  １．５，  １５  ｍｇ／ｋｇで、抗Ｆａｓモノクローナル抗体投与の１時間前に尾静脈内投与した。コントロール群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）には、ＰＢＳを尾静脈内投与した。【００８９】
肝障害の重症度評価
抗Ｆａｓモノクローナル抗体投与５時間後に３％イソフルラン吸入麻酔下にてマウスを保定し、顎骨後ろに位置する静脈より血液を採取し、コアグチェックＸＳ（Ｒｏｃｈｅ−ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，  ＃ＥＳ３５０００９）およびＰＴテストストリップ（Ｒｏｃｈｅ−ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，  ＃ＥＳ３５００５４）を用いてプロトロンビン時間（Ｐｒｏｔｈｒｏｍｂｉｎ  ｔｉｍｅ：ＰＴ）を測定した。プロトロンビン時間測定後、腹部下大静脈より採血を行った後、頚椎脱臼法により安楽死させた。血清中のＡｓｐａｒｔａｔｅ  Ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＡＳＴ）、Ａｌａｎｉｎｅ  ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ（ＡＬＴ）の測定は、それぞれＬタイプワコー  ＡＳＴ・Ｊ２（Ｗａｋｏ）のキットおよびＬタイプワコー  ＡＬＴ・Ｊ２（Ｗａｋｏ）のキットおよび自動分析装置（Ｈｉｔａｃｈｉ  ７１８０  Ａｕｔｏｍａｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ，  Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｈｉｇｈ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて行った。【００９０】
血清ＡｐｏＡ４タンパク質の定量
血清ＡｐｏＡ４タンパク質の定量は、実施例２に準じて行った。【００９１】
統計解析：
ＰＴ、ＡＳＴ、ＡＬＴおよび血清ＡｐｏＡ４タンパク質の測定の結果について、コントロールとｒｈ−ＨＧＦ投与群との間でダネットの多重比較検定を実施した（図４）。【００９２】
結果：
Ｊｏ２肝不全マウスにおいて、コントロールでは顕著な血中ＡＳＴ、ＡＬＴの上昇とＰＴの延長を認める一方、それらはｒｈ−ＨＧＦ投与によって強く阻害された。その時、血中ＡｐｏＡ４タンパク質の値は、ｒｈ−ＨＧＦの投与によって上昇し、１．５，５，１５  ｍｇ／ｋｇでは統計学的に有意な上昇を示した。以上から、ＨＧＦによる肝障害阻止効果を反映してＡｐｏＡ４タンパク質の上昇がみられることが判明した（図４）。【００９３】
［実施例４］ヒト初代培養肝細胞を用いたＡｐｏＡ４タンパク質のＰＤマーカーとしての検証
目的：
マウスを用いた実施例を通じて、血中ＡｐｏＡ４タンパク質がＨＧＦのＰＤマーカーであることを確認した。実際に、ヒトにおいてもＡｐｏＡ４タンパク質が、ＨＧＦのＰＤマーカーとなりうるのか否かについて、ヒト初代培養肝細胞を用いて検証した。【００９４】
実験： 
ヒト初代培養肝細胞とｒｈ−ＨＧＦによる処理
２４ウェルプレートに播種したヒト初代培養肝細胞（３．８×１０５細胞／ウェル，  Ｂｉｏｐｒｅｄｉｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，  ＃ＨＥＰ２２０−ＭＷ２４）をＩｎｃｕｂａｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍ（製品名：Ｂｉｏｐｒｅｄｉｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，  ＃ＭＩＬ２１４）で３日培養したのち、ｃ−Ｍｅｔ阻害剤ＰＦ−０４２１７９０３（終濃度１００  ｎｍｏｌ／Ｌ）（Ｓｅｌｌｅｃｋ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，  ＃Ｓ１０９４，  ｌｏｔ．  ０５）または媒体（ビヒクル：ＤＭＳＯ）を添加し、１時間後にｒｈ−ＨＧＦ（終濃度１００，  ３００，  １０００  ｎｇ／ｍＬ）またはコントロール群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）には、（Ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍ）を添加した。【００９５】
ヒトＡｐｏＡ４  ｍＲＮＡの定量
ｒｈ−ＨＧＦ添加２４時間後の肝細胞からＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ，  ＃７４１０４）およびＲＮａｓｅ−Ｆｒｅｅ  ＤＮａｓｅ  ｓｅｔ（ＱＩＡＧＥＮ，  ＃７９２５４）を用いてｔｏｔａｌ  ＲＮＡを精製し、ＲＮＡ濃度を吸光度により測定した。精製したｔｏｔａｌ  ＲＮＡをＨｉｇｈ−Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｗｉｔｈ  ＲＮａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  ＃４３７４９６６）を使用して逆転写しｃＤＮＡを作製した。得られたｃＤＮＡを鋳型として、ＡｐｏＡ４  ｍＲＮＡ発現量をリアルタイムＰＣＲ法で検討した。検討にあたっては、１８Ｓ  ｒＲＮＡを内部コントロールとした。ＰＣＲ反応は、ＴａｑＭａｎ  Ｆａｓｔ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  ＃４４４４５５７）とＴａｑＭａｎ  Ａｓｓａｙ（ＡｐｏＡ４：  Ｈｓ００１６６６３６＿ｍ１，  １８Ｓ  ｒＲＮＡ：  Ｈｓ９９９９９９０１＿ｓ１，  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、ＶｉｉＡ７リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、ＰＣＲの増幅反応を実施した。増幅反応は、９５℃で２０秒インキュベートした後、９５℃で１秒、６０℃で２０秒の反応を４０サイクル繰り返した。ＡｐｏＡ４  ｍＲＮＡの発現値をサンプルごとに１８Ｓ  ｒＲＮＡ発現値で標準化することで、サンプル間の補正を実施した。【００９６】
統計解析：
ＡｐｏＡ４  ｍＲＮＡ定量の結果について、コントロールとｒｈ−ＨＧＦ投与群との間で、ダネットの多重比較検定を実施した。ＡｐｏＡ４  ｍＲＮＡが統計的に有意に増加したｒｈ−ＨＧＦ処置群について、ビヒクル処置群とｃ−Ｍｅｔ阻害剤処置群との間で対応のないｔ検定を実施した（図５）。【００９７】
結果：
ヒト初代培養肝細胞をｒｈ−ＨＧＦに暴露することによって、ヒトＡｐｏＡ４  ｍＲＮＡの発現が強力に増強された。また、その増強効果は、特異的ｃ−Ｍｅｔ阻害剤によって阻害されたことから、ＡｐｏＡ４はヒト肝細胞においてもｃ−Ｍｅｔ介在性にｒｈ−ＨＧＦ生物活性を反映したＰＤマーカーであることが強く示唆された。従って、ＡｐｏＡ４はヒトにおいてもｒｈ−ＨＧＦのＰＤマーカーとなることが示唆された（図５）。【００９８】
ヒトＡｐｏＡ４タンパク質の定量
ｒｈ−ＨＧＦ添加２４時間後の肝細胞培養上清（ｍＲＮＡ調製用の細胞と同一物の培養上清）をもちいて、ウェスタンブロット法によってＡｐｏＡ４タンパク質を定量した。ＰＢＳ（Ｗａｋｏ）で４倍希釈した培養上清に１／４容の泳動バッファー液（３１３  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８），１０％  ＳＤＳ，３０％  Ｇｌｙｃｅｒｏｌ，０．２  ｍｇ／ｍＬ  Ｂｒｏｍｏ−ｐｈｅｎｏｌ  ｂｌｕｅ，２５％  ２−Ｍｅｒｃｕｐｔｏｅｔｈｎｏｌ）を添加し（培養上清の最終希釈度は２０倍となる）、９５℃、３分加熱処理した。その内  １０μＬをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ニトロセルロースフィルター（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ，  ＢＡ８５）にブロッティングした。フィルターをブロッキング液（５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１５０  ｍＭ  ＮａＣｌ，５％  ｓｋｉｍ−ｍｉｌｋ，０．０１％  Ｔｗｅｅｎ２０，０．１％  ＮａＮ３）に浸し、室温で１時間振とうしてからブロッキング液を廃棄し、ｒａｂｂｉｔ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ４抗体（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ，  １７９９６−１−ＡＰ）を０．０６７  μｇ／ｍＬ濃度で添加した反応溶液（５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１５０  ｍＭ  ＮａＣｌ，５％  ｓｋｉｍ−ｍｉｌｋ，４％  ＰＥＧ６０００，０．２％  ＥＤＴＡ／３Ｎａ，０．０１％  Ｔｗｅｅｎ２０，０．２％  Ｐｒｏｃｌｉｎ１５０）に浸し、室温下で２時間振とうした。洗浄液（５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１５０  ｍＭ  ＮａＣｌ，０．０１％  Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄した後、二次抗体のＨＲＰ標識ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ）を１／２０００濃度で添加した上記反応溶液に浸し、室温で１時間振とうした。上記洗浄液で３回洗浄した後、化学発光溶液ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｄｕｒａ  Ｅｘｔｅｎｄｅｄ  Ｄｕｒａｔｉｏｎ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を加えて発光させ、ＬＡＳ−４０００（ＦＵＪＩＦＩＬＭ）でＡｐｏＡ４タンパク質を検出した。【００９９】
統計解析：
ＡｐｏＡ４タンパク質の定量結果について、コントロールとｒｈ-ＨＧＦ投与群との間で、ダネットの多重比較検定を実施した。で、ＡｐｏＡ４タンパク質が統計的に有意に増加したｒｈ−ＨＧＦ処置群について、ビヒクル処置群とｃ−Ｍｅｔ阻害剤処置群との間で対応のないｔ検定を実施した（図６）。【０１００】
結果２：
ヒト初代培養肝細胞をｒｈ−ＨＧＦに暴露することによって、ヒトＡｐｏＡ４タンパク質の細胞外への放出が強力に増強された。また、その増強効果は、特異的ｃ−Ｍｅｔ阻害剤によって阻害されたことから、ＡｐｏＡ４タンパク質はヒト肝細胞においてもｃ−Ｍｅｔ介在性にｒｈ−ＨＧＦ生物活性を反映したＰＤマーカーであることが強く示唆された。従って、ＡｐｏＡ４タンパク質はヒトにおいてもｒｈ−ＨＧＦのＰＤマーカーとなることが示唆された（図６）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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