(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞と、ゲル化する細胞外マトリックス成分である生体適合性ハイドロゲルとを含有し、
前記骨芽細胞又は前記骨芽細胞に分化し得る細胞の細胞密度が１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｃｍ３以上、６．４×１０７ｃｅｌｌｓ／ｃｍ３以下である
ことを特徴とする細胞包埋ビーズ。
【請求項２】
さらに、前記骨芽細胞により産生された骨基質及び骨塩を含有する
請求項１に記載の細胞包埋ビーズ。
【請求項３】
前記骨芽細胞に分化し得る細胞が間葉系幹細胞である
請求項１又は２に記載の細胞包埋ビーズ。
【請求項４】
前記細胞外マトリックス成分がＩ型コラーゲンである
請求項１〜３のいずれか一項に記載の細胞包埋ビーズ。
【請求項５】
骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞と、ゲル化する細胞外マトリックス成分である生体適合性ハイドロゲルとを含有する溶液を、撥水性表面を有する支持体に滴下して、前記骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞と、前記生体適合性ハイドロゲルとを含有する液滴を作製し、前記生体適合性ハイドロゲルを硬化させ、細胞包埋硬化ゲル形成体を作製する工程と、
前記細胞包埋硬化ゲル形成体を浮遊培養し、細胞の牽引力により凝集させる工程と、
を備え、
前記凝集工程において、細胞分化誘導剤を添加する
ことを特徴とする細胞包埋ビーズの製造方法。
【請求項６】
骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞と、ゲル化する細胞外マトリックス成分である生体適合性ハイドロゲルとを含有する溶液を、撥水性表面を有する支持体に滴下して、前記骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞と、前記生体適合性ハイドロゲルとを含有する液滴を作製し、前記生体適合性ハイドロゲルを硬化させ、細胞包埋硬化ゲル形成体を作製する工程と、
前記細胞包埋硬化ゲル形成体を浮遊培養し、細胞の牽引力により凝集させる工程と、
を備え、
前記凝集工程において、前記細胞包埋硬化ゲル形成体を浮遊培養し、細胞の牽引力により凝集させて、請求項１〜４のいずれか一項に記載の細胞包埋ビーズを得る
ことを特徴とする細胞包埋ビーズの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞包埋ビーズ及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、骨に関する疾患や事故等による骨折、骨の欠損等の骨の損傷部位を治療するために、再生医療を適用する取り組みが行われている。再生医療における骨の治療においては、自家骨を用いた移植が主な治療法となっていたが、骨の損傷部位が大きいと自家骨を用いることが困難であり、最近では、人工の骨代替材料を用いる治療法の開発が進んでいる。
【０００３】
例えば、人工の骨代替材料として、リン酸カルシウム複合体（例えば、特許文献１参照）やハイドロキシアパタイト（例えば、特許文献２参照）等が挙げられ、これらの骨代替材料を生体親和性、生体吸着性に優れる基材に組み合わせて移植する治療法が行われている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００３−２１０５７０号公報
【特許文献２】特表２００５−５２１４４０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
特許文献１、２では、骨代替材料としてリン酸カルシウム複合体又はハイドロキシアパタイト等のセラミックスを用いており、自家骨を用いた移植と比較すると、骨の再生の効率が圧倒的に低く、比較的小さな骨欠損部位しか修復できないことが問題であった。
【０００６】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、組成が自家骨に類似し、高い骨再生効率を有する細胞包埋ビーズを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、以下の態様を含む。
（１）骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞と、生体適合性ハイドロゲルとを含有することを特徴とする細胞包埋ビーズ。
（２）さらに、前記骨芽細胞により産生された骨基質及び骨塩を含有する（１）に記載の細胞包埋ビーズ。
（３）前記骨芽細胞に分化し得る細胞が間葉系幹細胞である（１）又は（２）に記載の細胞包埋ビーズ。
（４）前記生体適合性ハイドロゲルがゲル化する細胞外マトリックス成分である（１）〜（３）のいずれか一つに記載の細胞包埋ビーズ。
（５）前記細胞外マトリックス成分がＩ型コラーゲンである（４）に記載の細胞包埋ビーズ。
（６）前記骨芽細胞又は前記骨芽細胞に分化し得る細胞の細胞密度が１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｃｍ３以上である（１）〜（５）のいずれか一つに記載の細胞包埋ビーズ。
（７）骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞と、生体適合性ハイドロゲルとを含有する液滴を作製し、前記生体適合性ハイドロゲルを硬化させ、細胞包埋硬化ゲル形成体を作製する工程と、前記細胞包埋硬化ゲル形成体を浮遊培養し、細胞の牽引力により凝集させる工程と、を備えることを特徴とする細胞包埋ビーズの製造方法。
（８）前記細胞包埋硬化ゲル形成体作製工程において、撥水性表面を有する支持体に滴下し、前記液滴を作製する（７）に記載の細胞包埋ビーズの製造方法。
（９）前記凝集工程において、細胞分化誘導剤を添加する（７）又は（８）に記載の細胞包埋ビーズの製造方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、セラミックスを用いた人工骨移植よりも高い骨再生効率が実現できる。さらに、骨の損傷部位が大きい場合にも、骨組織を再生することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】本実施形態における細胞包埋ビーズの製造方法の一例を示す概略図である。
【図２】実施例１におけるタイムラプス顕微鏡を用いて細胞包埋ビーズを観察した結果を示す画像である。
【図３】実施例１における細胞包埋ビーズのＨＥ染色（Ａ）、Ａｌｉｚａｒｉｎ  ｒｅｄ染色（Ｂ）及びＨｉｆ−１α染色（Ｃ）の結果を示す画像である。
【図４】実施例２における細胞包埋ビーズのＨＥ染色（Ａ）、Ａｌｉｚａｒｉｎ  ｒｅｄ染色（Ｂ）及びＨｉｆ−１α染色（Ｃ）の結果を示す画像である。
【図５】（Ａ）実施例３における細胞包埋ビーズを示す模式図である。（Ｂ）実施例３における位相差蛍光顕微鏡を用いて細胞包埋ビーズを観察した結果を示す画像である。
【図６】試験例１におけるアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性評価試験の結果を示すグラフである。
【図７】試験例２における三次元計測Ｘ線ＣＴ装置を用いてマウス頭蓋骨の透過像及びＣＴ像を撮影した画像である。
【図８】試験例２における三次元計測Ｘ線ＣＴ装置を用いてマウス頭蓋骨の透過像を撮影した画像及び位相差蛍光顕微鏡を用いて撮影したＨＥ染色の結果を示す画像である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、必要に応じて図面を参照しながら、本発明の実施形態について詳細に説明する。
【００１１】
＜細胞包埋ビーズ＞
一実施形態において、本発明は、骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞と、生体適合性ハイドロゲルとを含有する細胞包埋ビーズを提供する。
【００１２】
本実施形態の細胞包埋ビーズによれば、セラミックスを用いた人工骨移植よりも高い骨再生効率が実現できる。さらに、骨の損傷部位が大きい場合にも、本実施形態の細胞包埋ビーズは欠損部位を容易に埋め尽くすことができ、骨組織を再生することが可能となる。
【００１３】
本明細書において、「骨芽細胞」とは、骨基質上に存在し、骨基質の産生およびその石灰化を行う細胞を意味する。骨芽細胞の大きさは、２０〜３０μｍで、立方体または円柱状の形状である。また、骨芽細胞は、骨芽細胞の前駆体細胞である「前骨芽細胞」を含んでいてもよい。この骨芽細胞が増殖、分化し、骨基質の産生およびその石灰化を行うことで、骨折部又は骨欠損部を治癒することができる。
【００１４】
本実施形態の細胞包埋ビーズは、さらに、上記の骨芽細胞により産生された骨基質及び骨塩を含んでいてもよい。
【００１５】
本明細書において、「骨基質」とは、骨を形成する成分のうちタンパク質の成分を意味し、コラーゲン（骨基質全体の約９０％）と、オステオカルシン、オステオネクチン、オステオポンチンなどの非コラーゲン性タンパク質（骨基質全体の約１０％）からなる。骨基質を形成するコラーゲンは、高純度のＩ型コラーゲンである。
本明細書において、「骨塩」とは、骨を形成する成分のうち塩の成分を意味し、主にリン酸カルシウムの結晶であるハイドロキシアパタイトからなる。
骨芽細胞により産生された、上記の骨基質に、上記の骨塩が沈着することにより、骨が形成される。また、本実施形態の細胞包埋ビーズは、骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞、生体適合性ハイドロゲル以外に、骨基質及び骨塩を含有することにより、より自家骨に近しい組成となり、高い骨再生効率を実現できる。
【００１６】
本実施形態において、「骨芽細胞に分化し得る細胞」とは、上記の骨芽細胞に分化することができる未分化細胞を意味する。例えば、胚性幹（ＥＳ）細胞、胚性生殖（ＥＧ）細胞、人工多能性（ｉＰＳ）幹細胞等の万能細胞；間葉系幹細胞（ＭＳＣ）（例えば、骨髄由来間葉系幹細胞等）、造血幹細胞、血管幹細胞、羊膜細胞、臍帯血細胞、骨髄由来細胞、心筋幹細胞、脂肪由来幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞、神経幹細胞等の体性幹細胞等が挙げられる。中でも、間葉系幹細胞であることが好ましい。
細胞の由来として、好ましくは、動物由来細胞であり、より好ましくは脊椎動物由来細胞であり、特に好ましくはヒト由来細胞である。
【００１７】
本明細書において、「間葉系幹細胞」とは、間葉系の組織に存在する幹細胞を意味する。間葉系の組織としては、例えば、骨髄、脂肪、血管内皮、平滑筋、心筋、骨格筋、軟骨、骨、じん帯等が挙げられるが、これらに限定されない。間葉系幹細胞としては、例えば、骨髄、脂肪組織、滑膜組織、筋組織、末梢血、胎盤組織、月経血、臍帯血等に由来する幹細胞が挙げられる。
【００１８】
本実施形態の細胞包埋ビーズは、上記の骨芽細胞又は上記の骨芽細胞に分化し得る細胞のいずれか、又は、その両方を含有していてもよい。
【００１９】
本実施形態において、上記の骨芽細胞又は上記の骨芽細胞に分化し得る細胞の細胞密度が密であることが必要であり、１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｃｍ３以上であり、１×１０７〜４×１０７ｃｅｌｌｓ／ｃｍ３であることが好ましく、１．５×１０７〜３×１０７ｃｅｌｌｓ／ｃｍ３であることがより好ましく、２×１０７〜２．５×１０７ｃｅｌｌｓ／ｃｍ３であることがさらに好ましい。細胞密度が上記範囲内にあることにより、自家骨に近しい細胞密度となり、高い骨再生効率を実現できる。
【００２０】
本明細書において、「生体適合性ハイドロゲル」とは、生体への適合性を有するゲルであって、高分子が化学結合によって網目構造をとり、その網目に多量の水を保有した物質を意味する。より具体的には、天然物由来の高分子や合成高分子の人工素材に架橋を導入してゲル化させたものをいう。
【００２１】
天然物由来の高分子としては、ゲル化する細胞外マトリックス成分等が挙げられる。ゲル化する細胞外マトリックス成分としては、例えば、コラーゲン（Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、Ｖ型、ＸＩ型など）、マウスＥＨＳ腫瘍抽出物（ＩＶ型コラーゲン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカンなどを含む）より再構成された基底膜成分（商品名：マトリゲル）、フィブリン、グリコサミノグリカン、ヒアルロン酸、プロテオグリカンなどを例示することができる。その他天然物由来の高分子として、ゼラチン、寒天、アガロースなどを使用することもできる。それぞれのゲル化に至適な塩等の成分、その濃度、ｐＨなどを選択しハイドロゲルを作製することが可能である。また、これらの原料を組み合わせてもよい。
【００２２】
また、合成高分子としては、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、メチルセルロース、ポリエチレンオキシド、ｐｏｌｙ（ＩＩ−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ）／ｐｏｌｙｃａｐｒｏｌａｃｔｏｎｅなどが挙げられる。また、これらの高分子を２種以上用いてハイドロゲルを作製することも可能である。
【００２３】
中でも、生体適合性ハイドロゲルは、天然物由来の高分子であることが好ましく、ゲル化する細胞外マトリックス成分であることがより好ましく、Ｉ型コラーゲンであることがさらに好ましい。Ｉ型コラーゲンを含有することにより、より自家骨に近しい組成となり、高い骨再生効率を実現できる。
【００２４】
＜細胞包埋ビーズの製造方法＞
一実施形態において、本発明は、骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞と、生体適合性ハイドロゲルとを含有する液滴を作製し、前記生体適合性ハイドロゲルを硬化させ、細胞包埋硬化ゲル形成体を作製する工程と、前記細胞包埋硬化ゲル形成体を浮遊培養し、細胞の牽引力により凝集させる工程と、を備える細胞包埋ビーズの製造方法を提供する。
【００２５】
本実施形態の製造方法によれば、自家骨に類似し、高い骨再生効率を有する細胞包埋ビーズを得ることができる。また、本実施形態の製造方法によれば、骨の欠損部位の大きさに合わせて、ビーズのサイズを調整することができる。
【００２６】
図１は、本実施形態における細胞包埋ビーズの製造方法の一例を示す概略図である。図１を参照しながら、本実施形態における細胞包埋ビーズの製造方法について、以下に詳細を説明する。
【００２７】
［細胞包埋硬化ゲル形成体作製工程］
まず、骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞１を、生体適合性ハイドロゲル２を含む溶液に懸濁し、目的に合わせた大きさの液滴を作製する。
【００２８】
本実施形態の製造方法において、骨芽細胞は上述のとおりである。また、骨芽細胞に分化し得る細胞は、上述したものと同様のものが挙げられる。中でも、間葉系幹細胞であることが好ましい。
細胞の由来として、好ましくは、動物由来細胞であり、より好ましくは脊椎動物由来細胞であり、特に好ましくはヒト由来細胞である。
【００２９】
また、上記の骨芽細胞又は上記の骨芽細胞に分化し得る細胞のいずれか、又は、その両方を組み合わせて使用していてもよい。
【００３０】
本実施形態の製造方法において、生体適合性ハイドロゲルとは、上述したものと同様のものが挙げられる。中でも、生体適合性ハイドロゲルは、天然物由来の高分子であることが好ましく、ゲル化する細胞外マトリックス成分であることがより好ましく、Ｉ型コラーゲンであることがさらに好ましい。Ｉ型コラーゲンを使用することにより、より自家骨に近しい組成となり、高い骨再生効率を実現できる。
【００３１】
生体適合性ハイドロゲルを含む溶液は、Ｈａｍ’ｓ  Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅｓ  Ｆ−１０又はＨａｍ’ｓ  Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅｓ  Ｆ−１２等の無血清培地や、生体適合性ハイドロゲル再構成用の緩衝液（例えば、水酸化ナトリウム、炭酸水水素ナトリウム、ＨＥＰＥＳ−Ｂｕｆｆｅｒからなる緩衝液等）等を含んでいてもよい。
【００３２】
液滴の作製方法は、特別な限定はなく、公知の方法に従って当業者が決定できる。例えば、油性成分からなる溶液中に、上記の骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞と、生体適合性ハイドロゲルとを含有する懸濁液を滴下し、液滴を作製する方法や、図１及び後述の実施例のように、撥水性表面を有する支持体３に上記の懸濁液を滴下し、液滴を作製する方法などが挙げられる。
【００３３】
本明細書において、「撥水性」とは、水をはじく性質を意味し、水接触角が典型的には９０°以上、好ましくは１００°以上、より好ましくは１０５°以上である。また、水接触角が１５０°を超える超撥水状態も含む。
支持体の表面に、撥水処理又は撥水性を有する材質を重ね合せることにより、撥水性表面を有する支持体を得ることができる。
撥水処理としては、特別な限定はなく、例えばアルキル基、アルケニル基、アルコキシ基又はアルケニルオキシ基等の低極性の官能基や、一つ以上の水素原子がフッ素原子で置換されたアルキル基又はアルコキシ基等の疎水性の官能基を基板表面に導入する方法が挙げられる。また、撥水性を有する材質としては、特別な限定はなく、例えばポリプロピレン、ポリエチレン、ポリスルフォン等の疎水性高分子；ポリ塩化ビニリデン、ポリフッ化ビニリデン、フッ素化カーボン、ポリテトラフルオロエチレン等の塩素又はフッ素含有高分子等が挙げられる。
【００３４】
支持体の材質としては、特別な限定はなく、例えば、樹脂（例えばポリエステル樹脂、ポリスチレン樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ＡＢＳ樹脂（Ａｃｒｙｌｏｎｉｔｒｉｌｅ Ｂｕｔａｄｉｅｎｅ Ｓｔｙｒｅｎｅ樹脂）、ナイロン樹脂、アクリル樹脂、フッ素樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリオレフィン樹脂、ポリウレタン樹脂、ポリ塩化ビニリデン、メチルペンテン樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂、ピーク樹脂、エポキシ樹脂及び塩化ビニル樹脂等）、金属（例えば金、銀、銅、アルミニウム、タングステン、モリブデン、クロム、白金、チタン、ニッケル等）、合金（例えばステンレス、ハステロイ、インコネル、モネル、ジュラルミン等）、ガラス（例えばガラス、石英ガラス、溶融石英、合成石英、アルミナ、サファイア、セラミクス、フォルステライト及び感光性ガラス等）、半導体材料、シリコン、ゴム（例えば天然及び合成ゴム）等が挙げられる。また、これらの材質のうち、複数の材質を組み合わせてもよい。
【００３５】
続いて、作製した液滴を２０分以上６０分未満（好ましくは、３０分）、２５℃以上４０℃未満（好ましくは、３７℃）で静置し、生体適合性ゲルを硬化させる。ダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ：ＤＭＥＭ）等の基本培地により、表面を洗浄し、細胞包埋硬化ゲル形成体を回収する。
【００３６】
［凝集工程］
続いて、回収した細胞包埋硬化ゲル形成体を７日以上２０日以下、好ましくは１４日以上１８日以下、２５℃以上４０℃未満（好ましくは、３７℃）で浮遊培養する。
【００３７】
使用する培地は、特別な限定はなく、細胞の生存増殖に必要な成分（無機塩、炭水化物、ホルモン、必須アミノ酸、非必須アミノ酸、ビタミン）等を含む基本培地であればよい。例えば、ＤＭＥＭ、Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ）、ＲＰＭＩ−１６４０、Ｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｅａｇｌｅ（ＢＭＥ）、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ：Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  Ｆ−１２（ＤＭＥＭ／Ｆ−１２）、Ｇｌａｓｇｏｗ  Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｌａｓｇｏｗ ＭＥＭ）等が挙げられる。
【００３８】
使用する細胞が骨芽細胞に分化し得る細胞である場合、培地中に細胞分化誘導剤を添加することが好ましい。
【００３９】
細胞分化誘導剤としては、骨芽細胞への分化を誘導できるものであれば特別な限定はない。例えば、グルココルチコイド、β−グリセロホスフェート、アスコルビン酸等が挙げられ、これらを組み合わせて使用してもよい。
【００４０】
本明細書において「グルココルチコイド」とは、副腎皮質ホルモンであり、糖質代謝に関係するステロイドホルモンの総称を意味する。グルココルチコイドは、骨髄細胞が骨芽細胞に分化誘導するための成分として知られている（例えば、参考文献１：「Ｍａｎｉａｔｏｐｏｕｌｏｓ，Ｃ  ｅｔ  ａｌ：Ｂｏｎｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｂｙ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｏｂｔａｉｎｅｄ  ｆｒｏｍ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｏｆ  ｙｏｕｎｇ  ａｄｕｌｔ  ｒａｔｓ．Ｃｅｌｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓ，２５４：３１７−３３０，１９８８．」参照）。グルココルチコイドは、糖質コルチコイドとも称される。より具体的な物質としては、デキサメサゾン、ベタメタゾン、プレドニソロン、プレドニソン、コルチゾン、コルチゾル、コルチコステロン等が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、デキサメサゾンが使用される。天然のグルココルチコイドと同様な作用を有する化学合成物質も含むことができる。これらの代表的なグルココルチコイドは、β−グリセロホスフェートおよびアスコルビン酸とともに、骨芽細胞に分化し得る細胞に使用すると、骨芽細胞へと分化誘導する活性が有する因子を産生されることから、本実施形態において、いずれも培地中に含ませることができる。グルココルチコイドは、培地中、０．１ｎＭ〜１０ｍＭの濃度で含ませることができ、好ましくは、１０〜１００ｎＭの濃度である。
【００４１】
本明細書において「β−グリセロホスフェート」とは、グリセロリン酸（Ｃ３Ｈ５（ＯＨ）２ＯＰＯ３Ｈ２）のうちリン酸基がβ位に結合したものの塩の総称を意味する。塩としては、例えばカルシウム塩、ナトリウム塩等を挙げることができる。β−グリセロホスフェートは、骨髄細胞が骨芽細胞に分化誘導するための成分としても知られている（例えば、参考文献１参照）。β−グリセロホスフェートは、グルココルチコイドおよびアスコルビン酸とともに、骨芽細胞に分化し得る細胞に使用すると、骨芽細胞へと分化誘導する活性を有する因子が産生されることから、本実施形態において、いずれも培地中に含ませることができる。β−グリセロホスフェートは、培地中に、０．１ｍＭ〜１Ｍの濃度で含ませることができ、好ましくは、１０ｍＭの濃度である。
【００４２】
本明細書において「アスコルビン酸」とは、白色、結晶性の水溶性ビタミンを意味し、多くの植物体とくに柑橘類に含まれる物質である。ビタミンＣとも称される。アスコルビン酸は、骨髄細胞が骨芽細胞に分化誘導するための成分としても知られている（例えば、参考文献１参照）。アスコルビン酸は、アスコルビン酸およびその誘導体を含むことができる。アスコルビン酸としては、例えば、Ｌ−アスコルビン酸、Ｌ−アスコルビン酸ナトリウム、Ｌ−アスコルビン酸パルミチン酸エステル、Ｌ−アスコルビン酸ステアリン酸エステル、Ｌ−アスコルビン酸２−グルコシド、アスコルビン酸リン酸エステルマグネシウム、アスコルビン酸グルコシド等が挙げられるが、これらに限定されない。天然のアスコルビン酸と同様な作用を有する化学合成物質も含むことができる。これらの代表的なアスコルビン酸は、グルココルチコイド、β−グリセロホスフェートとともに、骨芽細胞に分化し得る細胞に使用すると、骨芽細胞へと分化誘導する活性を有する因子が産生されることから、本実施形態において、いずれも培地中に含ませることができる。アスコルビン酸は、培地中に、０．１μｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌの濃度で含ませることができ、好ましくは、１０〜５０μｇ／ｍｌの濃度である。
【００４３】
細胞包埋硬化ゲル形成体４を上記条件において浮遊培養することにより、細胞の牽引力により凝集させ、上記の細胞密度の細胞包埋ビーズ６を得ることができる。また、上記条件において浮遊培養により、骨芽細胞が骨基質及び骨塩を産生することができ、より自家骨に近しい組成となる。
【００４４】
＜細胞包埋ビーズの投与量＞
本実施形態の細胞包埋ビーズの投与量は、被検動物（ヒト又は非ヒト動物を含む各種哺乳動物、好ましくはヒト）の年齢、性別、体重、症状、治療方法、投与方法、処理時間等を勘案して適宜調節される。
投与回数としては、１か月平均当たり、１回〜数回投与することが好ましい。
投与形態としては、例えば、皮下注射、鼻腔内的、または外科的に当業者に公知の方法が挙げられ、外科的方法が好ましい。
注射剤は、非水性の希釈剤（例えば、ポレングリコール、オリーブ油等の植物油、エタノール等のアルコール類など）、懸濁剤、又は乳濁剤として調製することもできる。このような注射剤の無菌化は、フィルターによる濾過滅菌、殺菌剤等の配合により行うことができる。注射剤は、用事調製の形態として製造することができる。即ち、使用前に注射用蒸留水又は他の溶媒に懸濁して使用することができる。
【００４５】
＜医薬組成物＞
本発明の医薬組成物は、治療的に有効量の細胞包埋ビーズ、及び薬学的に許容されうる担体又は希釈剤を含む。薬学的に許容されうる担体又は希釈剤は、賦形剤、稀釈剤、増量剤、崩壊剤、安定剤、保存剤、緩衝剤、乳化剤、着色剤、粘稠剤、溶解補助剤、添加剤等が挙げられる。これら担体の１種以上を用いることにより、注射剤、液剤、懸濁剤又は乳剤等の形態の医薬組成物を調製することができる。
また、担体としてコロイド分散系を用いることもできる。コロイド分散系は、細胞包埋ビーズの生体内安定性を高める効果や、特定の骨組織、又は細胞へ、細胞包埋ビーズの移行性を高める効果が期待される。コロイド分散系としては、ポリエチレングリコール、高分子複合体、高分子凝集体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、水中油系の乳化剤、ミセル、混合ミセル、リポソームを包含する脂質を挙げることができ、特定の骨組織、又は細胞へ、細胞包埋ビーズを効率的に輸送する効果のある、リポソームや人工膜の小胞が好ましい。
【００４６】
本発明の医薬組成物における製剤化の例としては、水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、又は懸濁液剤の注射剤の形で非経口的に使用されるものが挙げられる。更には、薬理学上許容される担体又は希釈剤、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤等と適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化されたものが挙げられる。
【００４７】
注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えばＤ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート８０（ＴＭ）、ＨＣＯ−５０と併用してもよい。
【００４８】
溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールと併用してもよい。また、緩衝剤、例えばリン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、無痛化剤、例えば、塩酸プロカイン、安定剤、例えばベンジルアルコール、フェノール、酸化防止剤と配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填させる。
【００４９】
＜骨再生方法＞
また、本発明の一側面は、骨に関する疾患や事故等による骨折、骨の欠損等の骨の損傷部位の治療のための細胞包埋ビーズを提供する。
また、本発明の一側面は、骨に関する疾患や事故等による骨折、骨の欠損等の骨の損傷部位の治療のための細胞包埋ビーズの製造方法を提供する。
また、本発明の一側面は、治療的に有効量の細胞包埋ビーズを含む医薬組成物を提供する。
また、本発明の一側面は、前記医薬組成物を含む、骨再生治療剤を提供する。
また、本発明の一側面は、前記医薬組成物を含む、骨再生治療剤を製造するための上記細胞包埋ビーズの使用を提供する。
また、本発明の一側面は、上記細胞包埋ビーズの有効量を、治療を必要とする患者に投与することを含む、骨に関する疾患や事故等による骨折、骨の欠損等の骨の損傷部位の治療方法を提供する。
【００５０】
本明細書において、再生可能な骨組織としては、特別な限定はなく、例えば、頭頂骨、歯槽骨、側頭骨、蝶形骨、上顎骨、下顎骨、上腕骨、りょう骨、尺骨、手骨、鎖骨、胸骨、肋骨、寛骨、仙骨、尾骨、髄、大腿骨、膝蓋骨、腓骨、脛骨、足骨等が挙げられる。
また、適用可能な骨組織の疾患としては、骨の変性、壊死、損傷などを伴う任意の疾患であって、例えば変形性関節症、骨軟骨損傷、難治性骨折、骨壊死、軟骨損傷、半月損傷、靭帯損傷、腱損傷、軟骨変性、半月変性、椎間板変性、靭帯変性、腱変性、骨腫瘍、先天性骨系統疾患等が挙げられ、これらに限定されない。
【００５１】
治療対象としては、特別な限定はなく、ヒト又は非ヒト動物を含む哺乳動物が挙げられ、ヒトが好ましい。
【実施例】
【００５２】
以下に実施例を挙げて本発明を更に詳述するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００５３】
［実施例１］ヒト間葉系幹細胞包埋ビーズの作製
（１）細胞包埋硬化ゲル形成体作製工程
培養ディッシュ上のヒト間葉系幹細胞（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ：ＭＳＣ）（ＬＯＮＺＡ製）をトリプシン処理して剥がし、１５ｍＬチューブに移した後、１，０００ｒｐｍ、１８０秒間遠心分離した。上澄みを吸い上げ、新たに培地を１０ｍＬ加えてペレットを懸濁し、細胞数カウントを行ったところ、２×１０５ｃｅｌｌｓ／１０ｍＬであった。
【００５４】
再度、１，０００ｒｐｍ、１８０秒間遠心分離をした。上澄みを吸い上げ、残ったペレットに、コラーゲン溶液（コラーゲン  Ｔｙｐｅ１（新田ゼラチン社製）：ハム培地：コラーゲン再構成緩衝液＝８：１：１）を２００μＬ加え、懸濁した。
【００５５】
培養ディッシュの蓋の裏面に、懸濁液を２μＬずつ滴下した。３７℃で３０分間インキュベートし、細胞包埋硬化ゲル形成体を作製した。
【００５６】
（２）凝集工程
オリゴデンドロサイト用培地（Ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ  Ｍｅｄｉｕｍ：ＯＭ）を２ｍＬ加え、細胞包埋硬化ゲル形成体を培養ディッシュの蓋の裏面から剥がした。培地ごと細胞包埋硬化ゲル形成体を培養ディッシュに入れ、骨芽細胞分化培地（ＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ社製）、デキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ社製）、β−グリセロホスフェート（Ｓｉｇｍａ社製）、アスコルビン酸（ＷＡＫＯ社製））を添加し、１４日間浮遊培養した。なお、２日おきに培地を交換した。
【００５７】
（３）観察結果
タイムラプス顕微鏡（ＢＺ−Ｘ７００  ＫＥＹＥＮＣＥ社製）を用いて、培養開始から１８時間の細胞包埋ビーズの観察した結果を図２に示す。細胞包埋ビーズは、細胞の牽引力により、平均直径２ｍｍから０．５ｍｍまで凝集することが確かめられた。
【００５８】
（４）細胞包埋ビーズの染色
（細胞包埋ビーズの凍結切片の作製）
細胞包埋ビーズをリン酸緩衝生理食塩水（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ：ＰＢＳ）で洗浄し、パラホルムアルデヒドで固定した。続いて、固定液を回収し、１０％、２０％、３０％スクロース溶液にそれぞれ２時間ずつ浸し、液を置換した。続いて、細胞包埋ビーズを３０％スクロース溶液ごと切片作製用容器に流し込み、スクロース溶液のみ回収した。続いて、凍結組織切片作製用包埋剤（Ｏｐｔｉｍａｌ  Ｃｕｔｔｉｎｇ  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄ：Ｏ．Ｃ．Ｔ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄ）を静かに流し込み、細胞包埋ビーズを封入した。続いて、液体窒素の中に、切片作製用容器を入れ、細胞包埋ビーズを凍結させた。予め−２２℃に冷却したミクロトームを用いて、細胞包埋ビーズを微小の厚さにカットした。カットされた切片をスライドガラスに垂直に押し当て、転写した。
【００５９】
（ヘマトキシリン・エオジン（Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ−Ｅｏｓｉｎ：ＨＥ）染色）
得られたスライドガラスにキシレンを１ｍＬ滴下し６０分間静置した後、溶液を除去した。続いて、１００％エタノールを１ｍＬ滴下し５分間静置した後、溶液を除去した。続いて、１００％エタノールを１ｍＬ滴下し、同じ操作をもう一度繰り返した。続いて、９０％エタノール溶液を１ｍＬ滴下し５分間静置した後、溶液を除去した。続いて、７０％エタノール溶液を１ｍＬ滴下し５分間静置した後、溶液を除去した。続いて、マイヤー・ヘマトキシリン染色液を１ｍＬ滴下し３分間静置した後、溶液を除去した。続いて、流水に１３分間浸し、洗い流した。続いて、エマシンＹを１ｍＬ滴下し４分間静置した後、溶液を除去した。続いて、９０％エタノール溶液を１ｍＬ滴下し３０秒間静置した後、溶液を除去した。続いて、９０％エタノール溶液を１ｍＬ滴下し１分間静置した後、溶液を除去した。続いて、１００％エタノールを１ｍＬ滴下し１分間静置した後、溶液を除去した。続いて、１００％エタノールを１ｍＬ滴下し５分間静置した後、溶液を除去した。続いて、１００％エタノールを１ｍＬ滴下し、同じ操作をもう一度繰り返した。続いて、キシレンを１ｍＬ滴下し５分間静置した後、溶液を除去した。最後に、キシレンを１ｍＬ滴下し、同じ操作をもう一度繰り返した。スライドガラスが乾いたら、マウントクイック（封入剤）を少量垂らし、気泡が入らないようにマイクロカバーガラスをゆっくりかぶせ、封入した。位相差蛍光顕微鏡（オリンパス社製、ＩＸ−７１）で観察した結果を図３に示す。
【００６０】
（Ａｌｉｚａｒｉｎ  ｒｅｄ染色）
得られたスライドガラスにＰＢＳを１ｍＬ滴下し、洗浄した。続いて、Ａｌｉｚａｒｉｎ  ｒｅｄ  Ｓ（Ｓｉｇｍａ社製）をスライドガラスに１ｍＬ滴下し、５分間静置した。続いて、ＰＢＳで３回洗浄した。スライドガラスが乾いたら、マウントクイック（封入剤）を少量垂らし、気泡が入らないようにマイクロカバーガラスをゆっくりかぶせ、封入した。位相差蛍光顕微鏡（オリンパス社製、ＩＸ−７１）で観察した結果を図３に示す。
【００６１】
（低酸素誘導因子−１α（Ｈｙｐｏｘｉａ Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｆａｃｔｏｒ−１α：Ｈｉｆ−１α）染色）
得られたスライドガラスにＰＢＳを１ｍＬ滴下し５分静置した後、溶液を除去した（洗浄）。続いて、ＰＢＳを１ｍＬ滴下し、同じ操作をもう一度行い、洗浄した。続いて、１％ＢＳＡ含有溶液を２００μＬ滴下し、３０分間静置し、ブロッキングを行った。続いて、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ：Ｄ−ＰＢＳ）で１００倍に希釈したウサギＨｉｆ−１α抗体（Ｓｉｇｍａ社製）を一次抗体としてスライドガラスに１ｍＬ滴下し、４℃で一晩インキュベートした。続いて、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）を１ｍＬ滴下し１０分間静置した後、溶液を除去した（洗浄）。同じ操作を２回繰り返して、洗浄を行った。Ｄ−ＰＢＳで２０μｇ／ｍＬに希釈したＡｌｅｚａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（ライフテクノロジー社製）を二次抗体として、スライドガラスに２００μＬ滴下し、アルミホイルで覆い、２時間常温でインキュベートした。続いて、ＰＢＳ−Ｔを１ｍＬ滴下し１０分間静置した後、溶液を除去した（洗浄）。同じ操作を２回繰り返し、洗浄を行った。続いて、ＰＢＳで１００倍希釈したＤＡＰＩ（４’，６−Ｄｉａｍｉｄｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ）溶液をスライドガラスに２００μＬ滴下し、９分間インキュベーションすることで、核染色を行った。続いて、ＰＢＳを１ｍＬ滴下し５分静置した後、溶液を除去した（洗浄）。続いて、ＰＢＳを１ｍＬ滴下し、同じ操作をもう一度行い、洗浄した。スライドガラスが乾いたら、マウントクイック（封入剤）を少量垂らし、気泡が入らないようにマイクロカバーガラスをゆっくりかぶせ、封入した。位相差蛍光顕微鏡（オリンパス社製、ＩＸ−７１）で観察した結果を図３に示す。
【００６２】
（結果と考察）
ＨＥ染色では、細胞質がピンク色に染色するが、ピンク色に染色していない部分が数か所存在した。染色されていない部分には、骨基質又は骨塩が産生していると推察できる。また、Ａｌｉｚａｒｉｎ  ｒｅｄ染色では、濃い赤色に染まっている部分にカルシウムが蓄積されていることが確認された。また、Ｈｉｆ−１α染色では、染色されている箇所が少ないため、低酸素状態に陥っていないことが確認された。
以上のことから、細胞包埋ビーズ内のＭＳＣは骨基質又は骨塩を産生しており、骨芽細胞に分化していることが示唆された。
【００６３】
［実施例２］ヒト骨芽細胞包埋ビーズの作製
（１）細胞包埋硬化ゲル形成体作製工程
ヒト間葉系幹細胞の代わりにヒト骨芽細胞を使用した以外は、実施例１の（１）と同様の方法により、細胞包埋硬化ゲル形成体を作製した。
【００６４】
（２）凝集工程
骨芽細胞分化培地の代わりに骨芽細胞増殖培地（ＯＳＭ（登録商標）  Ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ  Ｇｒｏｗｔｈ  ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ（登録商標））（ＬＯＮＺＡ社製）を使用した以外は、実施例１の（２）と同様の方法により、１４日間浮遊培養した。
【００６５】
（３）細胞包埋ビーズの染色
Ｈｉｆ−１α染色にて一次抗体が３μｇ／ｍＬとなるようにＤ−ＰＢＳで希釈し、２００μＬ滴下したこと、またＤＡＰＩ溶液での核染色後、ＰＢＳで３回洗浄したこと以外は、実施例１の（４）と同様の方法により、細胞包埋ビーズの凍結切片を作製し、ＨＥ染色、Ａｌｉｚａｒｉｎ  ｒｅｄ染色及びＨｉｆ−１α染色を行った。位相差蛍光顕微鏡（オリンパス社製、ＩＸ−７１）で観察した結果を図４に示す。
【００６６】
図４から、骨芽細胞包埋ビーズは、骨基質又は骨塩を産生しており、低酸素状態に陥っていないことが確認された。
【００６７】
［実施例３］
ヒト間葉系幹細胞を用いて、実施例１と同様の方法により、２，０００ｃｅｌｌｓ／２μＬ／個の細胞包埋ビーズを作製した。細胞非接着Ｕ底９６ウェルプレート内に、骨芽細胞分化培地を添加し、１４日間培養した。培養開始から３日後、７日後及び１４日後の細胞包埋ビーズの模式図及び位相差蛍光顕微鏡像を図５（Ａ）及び（Ｂ）に示す。図５から、細胞包埋ビーズが凝集していることが確かめられた。
【００６８】
［比較例１］
ヒト間葉系幹細胞を用いて、２，０００ｃｅｌｌｓ／個のスフェロイドを調製した。細胞非接着Ｕ底９６ウェルプレート内に、骨芽細胞分化培地を添加し、１４日間培養した。
【００６９】
［試験例１］アルカリホスファターゼ（Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ：ＡＬＰ）活性評価試験
（１）試薬の調製
（基質溶解液の調製）
０．２Ｍ炭酸ナトリウム溶液（ＷＡＫＯ社製）２２ｍＬ、０．２Ｍ炭酸水素ナトリウム溶液（ＷＡＫＯ社製）２８ｍＬ、水５０ｍＬを混合し、０．１Ｍ炭酸・重炭酸バッファー（ｐＨ９．８）を１００ｍＬ調製した。続いて、塩化マグネシウム六水和物（ＷＡＫＯ社製）４０．６６ｍｇを０．１Ｍ炭酸・重炭酸バッファー（ｐＨ９．８）に溶解し、基質溶解液を調製した。
【００７０】
（標準液の調製）
ｐ−ニトロフェノール（ＷＡＫＯ社製）０．０１３９ｇを、１ｍＬの水に溶解し、１００ｍＭ  ｐ−ニトロフェノール溶液を調製した。この溶液を遮光して、室温で保存し、実験ごとに２ｍＭに希釈して使用した。
【００７１】
（基質緩衝液の調製）
ｐ−ニトロフェニルリン酸二ナトリウム六水和物（ＷＡＫＯ社製）０．０２ｇを８ｍＬの水に溶解し、１０ｍＭ  ｐ−ニトロフェニルリン酸二ナトリウム溶液を調製した。
【００７２】
（コラゲナーゼ溶液の調製）
前灌流緩衝液（ＮａＣｌ  ８ｇ、ＫＣｌ  ０．４ｇ、ＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ  ０．０７８ｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ  ０．１５１ｇ、ＨＥＰＥＳ  ２．３８ｇ、Ｐｈｅｎｏｌ  Ｒｅｄ  ０．００６ｇ、ＥＧＴＡ  ０．１９ｇ、ＮａＨＣＯ３  ０．３５ｇ、Ｇｌｕｃｏｓｅ  ０．９ｇを 蒸留水９００ｍＬに添加し、溶けるまで撹拌したものに１Ｎ  ＮａＯＨ溶液を用いてｐＨ７．２に調整した溶液）１ｍＬに、コラゲナーゼ（ＷＡＫＯ社製）５０ｍｇ、大豆由来トリプシンインヒビター（ＷＡＫＯ社製）１０ｍｇを溶解し、５０ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼ溶液を調製した。
【００７３】
（２）細胞の破砕及び細胞抽出液の調製
培養開始から３日後、７日後、１４日後の実施例３の細胞包埋ビーズ及び比較例１のスフェロイドをそれぞれ培養液ごと吸い上げ、チューブに移した。１，０００ｒｐｍ、３分間遠心分離し、上澄みを除去した。続いて、０．１％トライトンＸ−１００を含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ溶液（ｐＨ７．６）を４００μＬ加え、１０分間静置した。続いて、３７℃に温めた５０ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼ溶液を１００μＬ加えた。ビーズが溶け切ったら、−８０℃で凍結し、室温で溶解するという操作を２セット繰り返した。続いて、ジルコニアビーズ入りのバイオマッシャーに、試料を移し、ボルテックスミキサーで３分間撹拌した。続いて、１，３００ｒｐｍで５分間遠心分離した。
【００７４】
（３）ＡＬＰ反応
（２）の遠心分離で得られた上澄みを２０μＬずつ取って、９６ウェルプレートに添加した。スタンダード列として、列の一番端のウェルに標準液を４０μＬ加え、同じ列のその他のウェルに水を２０μＬずつ加え、端から順にピペッティングしながら２０μＬずつ移し替えてゆき、１倍、２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍、６４倍、１２８倍の希釈系列を作製した。続いて、全てのウェルに基質緩衝液を１００μＬずつ加えた。３７℃で６０分間インキュベートした。
【００７５】
（４）解析
プレートリーダーを用いて１分間撹拌した後、４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。結果を図６に示す。
【００７６】
（５）結果と考察
培養開始から１４日後において、比較例１では、培養開始から７日後と値がほとんど変わらないのに対し、実施例３では、ＡＬＰ活性が向上していた。また全体を通して、実施例１のほうが、比較例１よりも、ＡＬＰ活性が高かった。
以上から、細胞包埋ビーズの形態で培養したほうが、スフェロイド状で培養するよりも、骨芽細胞への分化誘導効率が高いことが示唆された。
【００７７】
［試験例２］移植により再生した骨の欠損部の評価試験
（１）頭蓋骨欠損モデルマウスへの移植
頭蓋骨欠損モデルマウスに、欠損部を覆い隠すように実施例１で作製した細胞包埋ビーズを移植した。コントロールとして、何も移植しないマウスを用意した。また、比較例２として、β−リン酸三カルシウム（β−ＴＣＰ）パウダーを移植したマウスを用意した。移植から１か月後に、μＣＴでの観察及びＨＥ染色による組織学的評価を行った。
【００７８】
（２）μＣＴでの撮影
イソフルランを用いて、移植から１か月後のマウスに吸引麻酔を行った。マウス固定具を用いて、マウスの頭蓋骨の固定を行った。三次元計測Ｘ線ＣＴ装置（ヤマト科学（株）社製、ＴＤＭ１０００Ｈ−ＩＩ（２Ｋ））を用いて、透過像及びＣＴ像を撮影した。ＩｍａｇｅＪにより解析し、三次元画像を作製した。透過像及びＣＴ像を図７に示す。
【００７９】
（３）切片の作製
移植から１か月後のマウスの頭蓋骨を切り出した。続いて、２０％ホルマリンに１日間浸漬し、組織を固定した。続いて、２０％ＥＤＴＡ溶液に５日間浸漬し、脱灰（骨の石灰化部を溶かす処理）した。７０％エタノール溶液で一晩浸漬し、９０％エタノール溶液で３０分間浸漬し、１００％エタノールで１時間の浸漬を２回行い、エタノールへの置換を行った。続いて、エタノール：２−ブタノールの体積比が１：１の溶液に３０分間浸漬し、１００％２−ブタノールに１時間の浸漬を２回行い、ブタノールへの置換を行った。続いて、２−ブタノール：パラフィンの体積比が１：１の溶液に３０分間浸漬し、１００％パラフィンに１時間の浸漬を２回行い、さらに、一晩浸漬しパラフィンに置換した。ミクロトームを用いて、切片を作製した。乾燥機を用いて、乾燥した。
【００８０】
（４）ＨＥ染色
実施例１の（４）と同様の方法により、ＨＥ染色を行った。位相差蛍光顕微鏡（オリンパス社製、ＩＸ−７１）で観察した結果を図８に示す。図８のＨＥ染色の画像において、黒三角の矢印は骨欠損部を示している。
【００８１】
図７から、比較例２のβ−ＴＣＰパウダーを移植したマウスでは、コントロールと同様に骨の欠損部が埋まっておらず、新生骨の形成が見られなかった。これに対し、実施例１の細胞包埋ビーズを移植したマウスでは、半分以上の骨の欠損部が新生骨により埋まっており、骨再生能を確認することができた。
【００８２】
図８から、コントロールの何も移植していないマウスでは、骨の欠損部が修復せず、肉芽組織も形成されていなかった。これに対し、比較例２のβ−ＴＣＰパウダーを移植したマウス及び実施例１の細胞包埋ビーズを移植したマウスでは、骨の欠損部の修復が見られた。また、比較例２のβ−ＴＣＰパウダーを移植したマウスでは、β−ＴＣＰパウダーが吸収又は分解されて、骨修復初期過程にみられる肉芽組織が形成されていた。さらに、実施例１の細胞包埋ビーズを移植したマウスでは、肉芽組織に加えて、新生骨が形成されており、再生骨は生体と同等の厚みを有していた。
以上のことから、本発明の細胞包埋ビーズは、組織学的な観点から骨再生に有用であることが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【００８３】
本発明によれば、セラミックスを用いた人工骨移植よりも高い骨再生効率が実現できる。さらに、骨の損傷部位が大きい場合にも、骨組織を再生することが可能となる。
【符号の説明】
【００８４】
１…骨芽細胞又は骨芽細胞に分化し得る細胞、２…生体適合性ハイドロゲル、３…撥水性表面を有する支持体、４…細胞包埋硬化ゲル形成体、５…培地、６…細胞包埋ビーズ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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