(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のアミノ酸残基２９２〜５１９と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むインフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）ポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体であって、前記アミノ酸配列がチロシンへの少なくとも２つの点変異を含み、前記２つの点変異は、アミノ酸位置が（ａ）４０３および４３３、（ｂ）４１１および４２２、（ｃ）４０３および４２９、（ｄ）４０３および４３２、（ｅ）４３３および４３５、（ｆ）４０６および４２９、または（ｇ）４０６および４３３であるか、または配列番号１とのアラインメントによりそれらに対応するアミノ酸残基であり、かつ、前記ポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体が、インフルエンザＨＡ三量体ストークの一部を形成し、および／または、インフルエンザＨＡ三量体ストークを有する、または、形成できるタンパク質複合体に折り畳まれる、インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）ポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体。
【請求項２】
配列番号１のアミノ酸残基２９２〜５１９と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列から本質的になる頭部のないインフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）ポリペプチドであって、前記アミノ酸配列がチロシンへの少なくとも２つの点変異を含み、前記２つの点変異は、アミノ酸位置が（ａ）４０３および４３３、（ｂ）４１１および４２２、（ｃ）４０３および４２９、（ｄ）４０３および４３２、（ｅ）４３３および４３５、（ｆ）４０６および４２９、または（ｇ）４０６および４３３であるか、または配列番号１とのアラインメントによりそれらに対応するアミノ酸残基であり、かつ、前記ポリペプチドが、インフルエンザＨＡ三量体ストークの一部を形成し、および／または、インフルエンザＨＡ三量体ストークを有する、または、形成できるタンパク質複合体に折り畳まれる、頭部のないインフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）ポリペプチド。
【請求項３】
前記ポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体が、少なくとも１つのジ−チロシン架橋を含むインフルエンザＨＡ三量体ストークの中にあるか、もしくはそれを含む、請求項１に記載のインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体。
【請求項４】
請求項２に記載の頭部のないインフルエンザＨＡポリペプチドであって、前記ポリペプチドが、少なくとも１つのジ−チロシン架橋を含むインフルエンザＨＡ三量体ストークの中に含まれる、頭部のないインフルエンザＨＡポリペプチド。
【請求項５】
前記少なくとも１つの架橋が、（ａ）残基４０３および４３３；（ｂ）４１１および４２２、（ｃ）４０３および４２９、（ｄ）４０３および４３２、（ｅ）４３３および４３５、（ｆ）４０６および４２９、ならびに（ｇ）４０６および４３３からなる群から選択される対合したチロシン残基の間に位置する、請求項３に記載のインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体、または請求項４に記載の頭部のないインフルエンザＨＡポリペプチド。
【請求項６】
前記ポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体が、ＨＡ−ストーク特異的抗体と結合できる、請求項１に記載のインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体、または請求項２に記載の頭部のないインフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）ポリペプチド。
【請求項７】
前記ポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体が、抗体Ｃ１７９と結合できる、請求項６に記載のインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体。
【請求項８】
前記ポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体が三量体形成ドメインをさらに含み、任意に前記三量体形成ドメインがフォルドンドメインである、請求項１に記載のインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体、または請求項２に記載の頭部のないインフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）ポリペプチド。
【請求項９】
配列番号１のアミノ酸残基２９２〜５１９と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体、または請求項２に記載の頭部のないインフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）ポリペプチド。
【請求項１０】
前記ポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体が、配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、または１１０のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体。
【請求項１１】
請求項２に記載の頭部のないインフルエンザＨＡポリペプチドであって、前記ポリペプチドは、配列番号９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、もしくは１１０のアミノ酸配列を含む、頭部のないインフルエンザＨＡポリペプチド。
【請求項１２】
配列番号９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、および１１０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、インフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体であって、前記ポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体が、インフルエンザＨＡ三量体ストークの一部を形成し、および／または、インフルエンザＨＡ三量体ストークを有する、または、形成できるタンパク質複合体に折り畳まれる、インフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体。
【請求項１３】
請求項１から１２のいずれか１項に記載のインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体をコードする核酸分子。
【請求項１４】
請求項１から１２のいずれか１項に記載のインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体を含む組成物。
【請求項１５】
前記組成物が、アジュバント、担体、免疫刺激剤またはそれらのいずれかの組合せをさらに含む、請求項１４に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本出願は、２０１３年８月３日に出願された米国仮特許出願第６１／８６１，９８９号の利益を主張し、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。
［配列表］
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出されている配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。２０１４年８月１日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、Ａｖａｔａｒ＿００６＿ＷＯ１＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔと命名され、４１４，３１４バイトのサイズである。
［著作権および参照による組み込み］
本特許文献の開示の一部は著作権保護の対象となる素材を含む。著作権の所有者は、特許商標庁の特許ファイルまたは記録に表されているように、特許文献または特許の開示を、何れの者がファクシミリで再生することにも異議はないが、他の場合にはいかなる著作権も全て留保する。
【０００２】
参照による組み込みを認めるそれらの権限のみの目的のために、本明細書に引用される全ての文献のテキストはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
［発明の背景］
米国および世界の全住民は、５０００万人を超える人々が死亡した１９１８年のスペイン（Ｈ１Ｎ１）の大流行と類似した汎発性インフルエンザ大流行の危険にさらされ続けている。同様に、兵器化されたインフルエンザウイルスは細菌戦争による大きな脅威であり続けている。さらに、抗原連続変異により、インフルエンザに対する予防をしようとしている個体は、毎年ワクチン接種することを必要とし、最近の研究により、季節性ワクチン製剤は、ワクチン接種株と循環株との間にミスマッチが存在する場合、わずかな効果しかないことが示されている。
【０００３】
インフルエンザウイルスの株全体において予防を提供する効果的なユニバーサルインフルエンザワクチンの開発は大きな価値がある。インフルエンザＨＡタンパク質の保存されたストークドメインに特異的な抗体は感染に対して予防できるという証拠により、この重要で満たされていない医学的および公衆衛生的必要性に対処するために、さらなるおよびより良好なモノクローナル抗体を同定し、予防ワクチンを開発するための協力が促されている。
【発明の概要】
【０００４】
本発明のいくつかの側面は以下に要約されている。さらなる側面は、本特許出願の発明の詳細な説明、実施例、図面および特許請求の範囲の項に記載されている。
【０００５】
インフルエンザＨＡタンパク質は、インフルエンザウイルス感染に対する予防と相関する有効な中和抗体を誘導することが知られている。ほとんどの既存のインフルエンザウイルスワクチンは、インフルエンザＨＡタンパク質の非常に変わりやすい免疫優勢頭部ドメインに対する抗体の生成に基づいた予防を提供する。しかしながら、頭部ドメインは、多くの場合、株特異的であるので、このようなワクチンは一般に同種インフルエンザ株に対してのみ効果的であり、インフルエンザウイルスの他の形態、たとえば同種ドリフトバリアントおよび異種株に対する予防を提供しない。最近、インフルエンザＨＡのストークドメインが、ストークドメインのより保存された構造および保存されたストークに提示されたエピトープの存在に起因して、インフルエンザウイルス亜型にわたって反応する抗体を誘発できることが示されている。また、ストークドメインの天然の三量体立体構造に特異的に結合する有効な中和抗体（ｎＡｂ）が単離されている。しかしながら、ストークドメインは、非常に不安定になり、非天然立体構造に容易に移行するか、またはＨＡ頭部ドメインを除去すると分解し、ワクチン免疫原としてその状態（たとえば、頭部ドメインを有さない）ではストークドメインの有用性を制限する。その天然の三量体立体構造において安定化されたストークドメインを有するインフルエンザＨＡタンパク質は非常に有益であり得、インフルエンザウイルスの株全体において予防を提供できる候補インフルエンザワクチン免疫原を提供する。同様に、このような安定化されたインフルエンザＨＡタンパク質はまた、抗体、たとえば診断および治療抗体の生成に対しても有用であり得る。
【０００６】
インフルエンザＨＡタンパク質の構造の広範な分析に基づいて、本発明は、インフルエンザＨＡタンパク質のストークドメインをその天然の三量体立体構造に安定化させるか、または「固定する」様々な新規設計戦略および新規構築物を提供する。本発明はまた、様々な操作されたインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体、たとえば１つ以上の標的架橋（たとえばジ−チロシン架橋）、１つ以上のチロシンへの変異（to-tyrosine mutation）、および／または１つ以上の人工的に導入されたプロテアーゼ切断部位／モチーフを含むものも提供する。本発明の操作されたＨＡインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体は、出発点として任意の適切なインフルエンザＨＡポリペプチドまたはタンパク質を使用して作製できる。たとえば、任意のインフルエンザ型、亜型または株由来のインフルエンザＨＡ配列が、ここで記載されている操作された産物を生成するための出発点として使用できる。ここで記載されている態様の多くにおいて、インフルエンザ株プエルトリコ／８／１９３４または「ＰＲ８」（これはインフルエンザＡのＨ１Ｎ１インフルエンザ亜型の株である）を出発点として使用した。野生型ＰＲ８株のアミノ酸配列は図９（配列番号１）に提供されている。しかしながら、任意の他のインフルエンザ型、亜型または株由来の任意の他のインフルエンザＨＡ配列が同様に使用されていてもよい。ここで記載されている操作されたＨＡ産物を生成するための出発点として使用できる他のインフルエンザＨＡ配列の非限定的な例には、限定されないが、図５５、５６、５７、５８、５９および６０に示されているもの、ならびに配列番号８０、８１、８２、８３、８４、８５、１１１、１１２、１１３、１１４および１１５の配列を有するものが含まれる。同様に、インフルエンザＨＡタンパク質をコードするヌクレオチド配列のコドン最適化バージョンが、ここで記載されている操作されたＨＡ産物を生成するための出発点として使用されていてもよい。ＰＲ８インフルエンザ株由来のコドン最適化ＨＡ配列の非限定的な例には、配列番号６３、６４、６５、６６、６７および６８の配列を有するものが含まれる。
【０００７】
いくつかの態様において、本発明は、ストークドメインをその天然の三量体立体構造に安定化させるか、または「固定する」のに役立つそれらのストークドメイン内の１つ以上の標的架橋を含むインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体を提供する。いくつかの態様において、このような標的架橋はジ−チロシン架橋である。いくつかの態様において、本発明は、３つのプロトマーの会合によって形成される三量体ストークドメインを含むインフルエンザＨＡタンパク質複合体を提供し、ストークドメインは、ストークドメインをその天然の三量体立体構造に安定化させる１つ以上の標的架橋、たとえばジ−チロシン架橋を含む。いくつかのこのような態様において、インフルエンザＨＡタンパク質複合体はインフルエンザＨＡ頭部ドメイン内に１つ以上の架橋をさらに含む。いくつかのこのような態様において、インフルエンザＨＡタンパク質複合体はインタクトな頭部ドメインを含まない。ジ−チロシン架橋が使用される態様において、このような架橋は、ＨＡポリペプチド、タンパク質および／もしくはタンパク質複合体に天然に存在する２つのチロシン残基の間、または変異により導入されている２つのチロシン残基の間、またはＨＡポリペプチド、タンパク質および／もしくはタンパク質複合体に天然に存在する第１のチロシン残基と変異により導入されている第２のチロシン残基との間に作製されていてもよい。いくつかの態様において、本発明はまた、ストークドメインをその天然の三量体立体構造に安定化させるためにジ−チロシン架橋の形成に望ましい場所であると決定されている場所においてＨＡストークドメイン内に１つ以上の「チロシンへの」変異を含むインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体を提供する。いくつかの態様において、本発明のインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体（標的架橋（たとえばジ−チロシン架橋）、またはチロシンへの変異、またはそれらの両方を含有しているかどうかに関わらず）は、ＨＡストークドメイン（シグナルペプチドを有するか、または有さない）とＨＡ頭部ドメインの両方、および任意にまた、ＨＡ膜貫通ドメインを含む完全長ＨＡタンパク質である。いくつかの態様において、本発明のインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体は、ＨＡ頭部ドメイン、膜貫通ドメインおよび／またはシグナルペプチドのうちの１つ以上を欠失している。いくつかの態様において、本発明のインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体は、ＨＡストークドメイン、または正常な三量体ストーク立体構造に構築するか、もしくはその一部を形成するのに十分であるＨＡストークドメインの少なくとも一部を含む。したがって、いくつかの態様において、その三量体立体構造に構築するためにＨＡポリペプチドまたはタンパク質の能力を損なわずにある特定のＨＡストークドメインアミノ酸を除去、付加または置換することが可能であり得る。
【０００８】
いくつかの態様において、本発明は、アミノ酸位置４０３、４０６、４１１、４２２、４２９、４３２、４３３および４３５（ここで、このようなアミノ酸番号付けは図９に示される配列（配列番号１）に基づく）のうちの１つ以上において、またはたとえば、ＨＡアミノ酸配列と配列番号１とのアラインメントによって決定される、このようなアミノ酸位置に対応するアミノ酸位置においてチロシンへの変異を含むインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体を提供する。このようなチロシンへの変異の１つ以上を含むインフルエンザＨＡアミノ酸配列の非限定的な例には、配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９および１１０が含まれる。いくつかの態様において、本発明は、以下のアミノ酸位置：３０８、４０３、４０６、４１１、４２２、４２９、４３２、４３３、４３５および４３７（ここで、このようなアミノ酸番号付けは図９に示される配列（配列番号１）に基づく）から選択されるアミノ酸のうちの１つ以上の対合の間に、またはたとえば、ＨＡアミノ酸配列と配列番号１とのアラインメントによって決定される、このようなアミノ酸位置に対応するアミノ酸位置においてジ−チロシン架橋を含む、インフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体を提供する。
【０００９】
いくつかの態様において、本発明は、ＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体の頭部ドメインをタンパク質分解により除去するために使用できる１つ以上の人工的に導入されたプロテアーゼ切断部位を含むインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体を提供する。いくつかの態様において、本発明は、アミノ酸位置４８、６３、２２８、２７８、２８２、２８３、２８６および２９１（ここで、このようなアミノ酸番号付けは配列番号１に示される配列に基づく）の後（たとえば直後）に、またはたとえば、ＨＡアミノ酸配列と配列番号１とのアラインメントによって決定される、このようなアミノ酸位置に対応するアミノ酸位置において挿入された１つ以上の人工的に導入されたプロテアーゼ切断部位を含む、インフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体を提供する。このような人工的に導入されたプロテアーゼ切断部位のうちの１つ以上を含むインフルエンザＨＡアミノ酸配列の非限定的な例には、配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９および３０が含まれる。
【００１０】
いくつかの態様において、本発明は、切断部位の対合の両方での切断によりＨＡ頭部ドメインの除去をもたらすように、人工的に導入されたプロテアーゼ切断部位の少なくとも１つの対合を含む、インフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体を提供する。このような人工的に導入されたプロテアーゼ切断部位の対合を含むインフルエンザＨＡアミノ酸配列の非限定的な例には、配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、２６、２７、２８、２９および３０が含まれる。いくつかのこのような態様において、一対の人工的に導入されたプロテアーゼ切断部位が存在する場合、第１のこのようなプロテアーゼ切断部位はアミノ酸位置４８または６３の後（たとえば直後）に挿入され、第２のこのようなプロテアーゼ切断部位は、アミノ酸位置２２８、２７８、２８２、２８３、２８６または２９１（ここで、このようなアミノ酸番号付けは配列番号１に示される配列に基づく）の後（たとえば直後）に、またはたとえば、ＨＡアミノ酸配列と配列番号１とのアラインメントによって決定される、このようなアミノ酸位置に対応するアミノ酸位置において挿入される。
【００１１】
いくつかの態様において、本発明はまた、たとえば、ここで記載されている人工的に導入されたプロテアーゼ切断部位のうちの１つ以上における切断によって、インタクトなＨＡ頭部ドメイン、たとえば、インフルエンザＨＡ頭部ドメインのタンパク質分解による除去により生成されるものを含まない、インフルエンザＨＡストークドメインポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体を提供する。ＨＡタンパク質は、ストークドメイン配列を含むＮ末端領域、続いて、頭部ドメイン配列を含む中間領域、続いて、さらなるストークドメイン配列を含むＣ末端領域を含むので、インフルエンザＨＡのストークドメイン配列は不連続である。したがって、いくつかの態様において、ＨＡ頭部ドメインのタンパク質分解による切断／除去の結果、２つのストークドメインポリペプチド断片、すなわちＮ末端断片およびＣ末端断片が生成される。いくつかの態様において、本発明は、このようなＮ末端およびＣ末端ストークドメインポリペプチド、および／またはこのようなＮ末端およびＣ末端ストークドメインポリペプチドを含むポリペプチド、タンパク質もしくはタンパク質複合体を提供する。いくつかの態様において、このようなＮ末端およびＣ末端ストークドメインポリペプチドは天然の三量体ストークドメイン立体構造を有するＨＡストークドメインタンパク質複合体に存在する。インフルエンザＨＡのＮ末端ストークドメインポリペプチドの非限定的な例には、配列番号９４および９５が含まれる。インフルエンザＨＡのＣ末端ストークドメインポリペプチドの非限定的な例には、配列番号９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０および１１７が含まれる。インフルエンザＨＡのＮ末端ストークドメインポリペプチドのさらなる非限定的な例は、配列番号１１７のアミノ酸１〜２２８または配列番号１のアミノ酸２２９〜５１９からなるか、それから本質的になるか、またはそれを含むものである。いくつかの態様において、インフルエンザＨＡのＮ末端ストークドメインポリペプチドは、たとえば、配列番号１の位置４０３、４０６、４１１、４２２、４２９、４３２、４３３もしくは４３５、またはそれらに対応する位置（たとえば、配列番号１とのアラインメントによって決定される）のうちの１つ以上において、または配列番号１１７の位置１１２、１１５、１２０、１３１、１３７、１４１、１４２もしくは１４４、またはそれらに対応する位置（たとえば、配列番号１１７とのアラインメントによって決定される）のうちの１つ以上において１つ以上のチロシンへの変異を含む。
【００１２】
いくつかの態様において、本発明は、（ａ）たとえば、上記および本特許明細書の全体にわたるいずれかの場所に記載されているように、１つ以上の標的架橋、たとえば、その天然の三量体立体構造にストークドメインを安定化させるか、もしくは「固定する」のに役立つそれらのストークドメイン内のジ−チロシン架橋、および／またはその天然の三量体立体構造にストークドメインを安定化させるためにジ−チロシン架橋の形成に望ましい場所であると決定されている場所におけるＨＡストークドメイン内の１つ以上の「チロシンへの」変異と、（ｂ）たとえば、上記および本特許明細書の全体にわたるいずれかの場所に記載されているように、ＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体の頭部ドメインをタンパク質分解により除去するために使用できる１つ以上の人工的に導入されたプロテアーゼ切断部位の両方を含む、インフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体を提供する。いくつかの態様において、本発明は、（ａ）１つ以上のチロシンへの変異を含む三量体ストークドメイン、および（ｂ）１つ以上の人工的に導入されたプロテアーゼ認識モチーフを含む頭部ドメインを含む、インフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体を提供する。チロシンへの変異と人工的に導入されたプロテアーゼ切断部位の両方を含むインフルエンザＨＡアミノ酸配列の非限定的な例には、配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６および１７が含まれる。さらに、ここで記載または示されるチロシンへの変異およびプロテアーゼ切断部位挿入のいずれかは、同じＨＡポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体に組み合わされていてもよい。
【００１３】
いくつかの態様において、本発明は、（ａ）３つのプロトマーの会合によって形成される三量体ストークドメインであって、そのストークドメインは、（たとえば、ストークドメインをその天然の三量体立体構造に安定化させるために）１つ以上の人工的に導入された標的架橋、たとえばジ−チロシン架橋を含む、ストークドメイン、および（ｂ）１つ以上の人工的に導入されたプロテアーゼ認識モチーフを含む頭部ドメインを含む、インフルエンザＨＡタンパク質複合体を提供する。
【００１４】
いくつかの態様において、本発明は、頭部のないインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体を作製する方法であって、（ａ）（ｉ）ストークドメインおよび（ｉｉ）１つ以上の人工的に導入されたプロテアーゼ認識モチーフを含有する頭部ドメインを含むインフルエンザＨＡタンパク質を得るか、または発現させること、（ｂ）工程（ａ）において得られたか、または発現された可溶性インフルエンザＨＡタンパク質を、頭部ドメインおよび３つのプロトマーからなる三量体ストークドメインを有するその天然の立体構造に折り畳むことを可能にすること、（ｃ）ストークドメインをその天然の三量体立体構造に安定化させるために１つ以上の標的架橋、たとえばジ−チロシン架橋を三量体ストークドメインに導入すること、ならびに（ｄ）続いて、１つ以上の人工的に導入されたプロテアーゼ認識モチーフにおいて頭部ドメインをタンパク質分解により切断し、それにより頭部のないインフルエンザＨＡタンパク質複合体を産生することを含む、方法を提供する。いくつかのこのような方法において、ストークドメインは１つ以上の「チロシンへの」変異を含み、工程（ｃ）は、１つ以上のジ−チロシン架橋を三量体ストークドメインに導入することを含む。いくつかのこのような方法において、ジ−チロシン架橋、チロシンへの変異、および／または人工的に導入されたプロテアーゼ切断部位／モチーフの場所は、上記および／または本特許明細書全体にわたるいずれかの場所に特定されているものであってもよい。いくつかのこのような方法において、インフルエンザＨＡタンパク質は、限定されないが、哺乳動物細胞または昆虫細胞を含む任意の適切な細胞種類において発現されていてもよい。
【００１５】
いくつかの態様において、本発明は、ここで提示されているこのようなアミノ酸配列と少なくとも約４０％または５０％または６０％または６５％または７０％または７５％または８０％または８５％または９０％または９５％または９８％または９９％の同一性を有する、ここで提示されているインフルエンザＨＡアミノ酸配列またはそれらのいずれかのバリアントもしくは断片のいずれか１つに由来するか、それを含むか、それから本質的になるか、またはそれからなるインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体であって、残基４０３、４０６、４１１、４２２、４２９、４３２、４３３および４３５（ここで、このようなアミノ酸番号付けは図９に示される配列（配列番号１）に基づく）のうちの１つ以上において、またはたとえば、ＨＡアミノ酸配列と配列番号１とのアラインメントによって決定される、このようなアミノ酸位置に対応するアミノ酸位置においてチロシンへの変異を含む、インフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体を提供する。
【００１６】
いくつかの態様において、本発明は、ここで提示されているこのようなアミノ酸配列と少なくとも約４０％または５０％または６０％または６５％または７０％または７５％または８０％または８５％または９０％または９５％または９８％または９９％の同一性を有する、ここで提示されているインフルエンザＨＡアミノ酸配列、またはそれらのいずれかのバリアントもしくは断片のうちのいずれか１つに由来するか、それを含むか、それから本質的になるか、またはそれからなるインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体であって、以下の残基：４８、６３、２２８、２７８、２８２、２８３、２８６および２９１（ここで、このようなアミノ酸番号付けは図９に示される配列（配列番号１）に基づく）のうちの１つ以上の後、たとえば直後に、またはたとえば、ＨＡアミノ酸配列と配列番号１とのアラインメントによって決定される、このようなアミノ酸位置に対応するアミノ酸位置において挿入された人工的に導入されたプロテアーゼ切断部位を含む、インフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体を提供する。
【００１７】
いくつかの態様において、本発明は、ここで提示されているこのようなアミノ酸配列と少なくとも約４０％または５０％または６０％または６５％または７０％または７５％または８０％または８５％または９０％または９５％または９８％または９９％の同一性を有する、ここで提示されているインフルエンザＨＡアミノ酸配列、またはそれらのいずれかのバリアントもしくは断片のうちのいずれか１つに由来するか、それを含むか、それから本質的になるか、またはそれからなるインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体であって、２つの人工的に導入されたプロテアーゼ切断部位を含み、第１のこのような部位は残基４８または６３の直後に導入され、第２のこのような部位は残基２２８、２７８、２８２、２８３、２８６または２９１（ここで、このようなアミノ酸番号付けは図９に示される配列（配列番号１）に基づく）の直後に、またはたとえば、ＨＡアミノ酸配列と配列番号１とのアラインメントによって決定される、このようなアミノ酸位置に対応するアミノ酸位置において導入される、インフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体を提供する。
【００１８】
いくつかの態様において、本発明は、ここで提示されているこのようなアミノ酸配列と少なくとも約４０％または５０％または６０％または６５％または７０％または７５％または８０％または８５％または９０％または９５％または９８％または９９％の同一性を有する、ここで提示されているインフルエンザＨＡアミノ酸配列、またはそれらのいずれかのバリアントもしくは断片のうちのいずれか１つに由来するか、それを含むか、それから本質的になるか、またはそれからなるインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体であって、（ａ）残基３０８、４０３、４０６、４１１、４２２、４２９、４３２、４３３、４３５または４３７のうちの１つ以上におけるチロシン残基（天然に存在するか、チロシンへの変異から生じるかに関わらず）と、（ｂ）以下の残基：４８、６３、２２８、２７８、２８２、２８３、２８６および２９１（ここで、このようなアミノ酸番号付けは図９に示される配列（配列番号１）に基づく）のうちの１つ以上の直後に、またはたとえば、ＨＡアミノ酸配列と配列番号１とのアラインメントによって決定される、このようなアミノ酸位置に対応するアミノ酸位置において挿入された人工的に導入されたプロテアーゼ切断部位の両方を含む、インフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体を提供する。
【００１９】
いくつかの態様において、本発明は、ここで提示されているこのようなアミノ酸配列と少なくとも約４０％または５０％または６０％または６５％または７０％または７５％または８０％または８５％または９０％または９５％または９８％または９９％の同一性を有する、ここで提示されているインフルエンザＨＡアミノ酸配列、またはそれらのいずれかのバリアントもしくは断片のうちのいずれかに由来するか、それを含むか、それから本質的になるか、またはそれからなるインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体であって、（ａ）残基３０８、４０３、４０６、４１１、４２２、４２９、４３２、４３３、４３５または４３７のうちの１つ以上におけるチロシン残基（天然に存在するか、チロシンへの変異から生じるかに関わらず）と、（ｂ）２つの人工的に導入されたプロテアーゼ切断部位の両方を含み、第１のこのような部位は残基４８または６３の直後に導入され、第２のこのような部位は残基２２８、２７８、２８２、２８３、２８６または２９１（ここで、このようなアミノ酸番号付けは図９に示される配列（配列番号１）に基づく）の直後に、またはたとえば、ＨＡアミノ酸配列と配列番号１とのアラインメントによって決定される、このようなアミノ酸位置に対応するアミノ酸位置において導入されるインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体を提供する。
【００２０】
いくつかの態様において、本発明は、配列番号１のアミノ酸残基２２９〜５１９、または配列番号１の２７９〜５１９、または配列番号１の２８３〜５１９、または配列番号１の２８４〜５１９、または配列番号１の２８７〜５１９、または配列番号１の２９２〜５１９、または配列番号９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０もしくは１１７、または配列番号１１７のアミノ酸残基１〜２２８、またはこのようなアミノ酸配列と少なくとも約４０％もしくは約５０％もしくは６０％もしくは６５％もしくは７０％もしくは７５％もしくは８０％もしくは８５％もしくは９０％もしくは９５％もしくは９８％もしくは９９％の同一性を有する配列に由来するか、それを含むか、それから本質的になるか、またはそれからなるインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体であって、残基３０８、４０３、４０６、４１１、４２２、４２９、４３２、４３３、４３５または４３７（ここで、このようなアミノ酸番号付けは図９に示される配列（配列番号１）に基づく）のうちの１つ以上において、またはたとえば、ＨＡアミノ酸配列と配列番号１とのアラインメントによって決定される、このようなアミノ酸位置に対応するアミノ酸位置において、または残基１１２、１１５、１２０、１３１、１３７、１４１、１４２もしくは１４４（ここで、このようなアミノ酸番号付けは図８９に示される配列（配列番号１１７）に基づく）のうちの１つ以上において、またはたとえば、ＨＡアミノ酸配列と配列番号１１７とのアラインメントによって決定される、このようなアミノ酸に対応するアミノ酸位置においてチロシン残基またはチロシンへの変異を含む、インフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体を提供する。
【００２１】
いくつかの態様において、本発明は、残基３０８、４０３、４０６、４１１、４２２、４２９、４３２、４３３、４３５および４３７（ここで、このようなアミノ酸番号付けは図９に示される配列（配列番号１）に基づく）のうちの１つ以上において、またはたとえば、ＨＡアミノ酸配列と配列番号１とのアラインメントによって決定される、このようなアミノ酸位置に対応するアミノ酸位置において配列番号１のアミノ酸残基１〜４７もしくは配列番号１の１〜６２、またはこのようなアミノ酸配列と少なくとも約４０％もしくは５０％もしくは６０％もしくは６５％もしくは７０％もしくは７５％もしくは８０％もしくは８５％もしくは９０％もしくは９５％もしくは９８％もしくは９９％の同一性を有する配列に由来するか、それを含むか、それから本質的になるか、またはそれからなるインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体を提供する。
【００２２】
いくつかの態様において、本発明は、第１および第２のポリペプチドを含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる組成物および／またはインフルエンザＨＡタンパク質複合体であって、（ａ）第１の（Ｃ末端）ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基２２９〜５１９、または配列番号１の２７９〜５１９、または配列番号１の２８３〜５１９、または配列番号１の２８４〜５１９、または配列番号１の２８７〜５１９、または配列番号１の２９２〜５１９、または配列番号９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０もしくは１１７、または配列番号１１７のアミノ酸残基１〜２２８、またはこのようなアミノ酸配列と少なくとも約４０％もしくは５０％もしくは６０％もしくは６５％もしくは７０％もしくは７５％もしくは８０％もしくは８５％もしくは９０％もしくは９５％もしくは９８％もしくは９９％の同一性を有する配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなり、残基３０８、４０３、４０６、４１１、４２２、４２９、４３２、４３３、４３５もしくは４３７（ここで、このようなアミノ酸番号付けは図９に示される配列（配列番号１）に基づく）のうちの１つ以上において、またはたとえば、ＨＡアミノ酸配列と配列番号１とのアラインメントによって決定される、このようなアミノ酸位置に対応するアミノ酸位置において、または残基１１２、１１５、１２０、１３１、１３７、１４１、１４２もしくは１４４（ここで、このようなアミノ酸番号付けは図８９に示される配列（配列番号１１７）に基づく）のうちの１つ以上において、またはたとえば、ＨＡアミノ酸配列と配列番号１１７とのアラインメントによって決定される、このようなアミノ酸位置に対応するアミノ酸位置においてチロシン残基またはチロシンへの変異を含み、（ｂ）第２の（Ｎ末端）ポリペプチドは、たとえば、ＨＡアミノ酸配列と配列番号１とのアラインメントによって決定される、このようなアミノ酸位置に対応するアミノ酸位置において、配列番号１のアミノ酸残基１〜４７もしくは配列番号１の１〜６２（ここで、このようなアミノ酸番号付けは図９に示される配列（配列番号１）に基づく）、またはこのようなアミノ酸配列と少なくとも約４０％もしくは５０％もしくは６０％もしくは６５％もしくは７０％もしくは７５％もしくは８０％もしくは８５％もしくは９０％もしくは９５％もしくは９８％もしくは９９％の同一性を有する配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなるインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体を提供する。
【００２３】
いくつかの態様において、本発明は、配列番号１のアミノ酸残基２２９〜５１９と少なくとも５０、５５、６０、６５もしくは７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなるインフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）ポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体であって、アミノ酸配列は、アミノ酸位置４０３、４０６、４１１、４２２、４２９、４３２、４３３および４３５（ここで、このようなアミノ酸番号付けは図９に示される配列（配列番号１）に基づく）のうちの１つ以上において、またはたとえば、ＨＡアミノ酸配列と配列番号１とのアラインメントによって決定される、このようなアミノ酸位置に対応するアミノ酸位置においてチロシンへの点変異を含む、インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）ポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体を提供する。いくつかの態様において、本発明は、配列番号１１７のアミノ酸残基１〜２２８と少なくとも５０、５５、６０、６５または７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなるインフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）ポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体であって、アミノ酸配列は、アミノ酸位置１１２、１１５、１２０、１３１、１３７、１４１、１４２または１４４（ここで、このようなアミノ酸番号付けは図８９に示される配列（配列番号１１７）に基づく）のうちの１つ以上において、またはたとえば、ＨＡアミノ酸配列と配列番号１１７とのアラインメントによって決定される、このようなアミノ酸位置に対応するアミノ酸位置においてチロシンへの点変異を含む、インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）ポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体を提供する。いくつかのこのような態様において、インフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体は、三量体ストーク立体構造を有するか、または形成できるタンパク質複合体の一部を形成し、および／またはそのタンパク質複合体に折り畳まれ、少なくとも１つのジ−チロシン架橋を含み、少なくとも１つのジ−チロシン架橋の一方または両方のチロシンはチロシンへの変異の１つから生じている。いくつかのこのような態様において、インフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体は、１つ以上の対合したチロシン残基の間に位置する架橋を含み、対合したチロシン残基は、たとえば、ＨＡアミノ酸配列と配列番号１とのアラインメントによって決定される、このようなアミノ酸位置に対応するアミノ酸位置における、残基４０３および４３３；４１１および４２２、４０３および４２９、４０３および４３２、４３３および４３５、ならびに４０６および４３３（ここで、このようなアミノ酸番号付けは図９に示される配列（配列番号１）に基づく）からなる群から選択される。
【００２４】
いくつかの態様において、ここで記載されているＨＡポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体は、三量体ストーク立体構造に折り畳むことができる。いくつかのこのような態様において、ここで記載されているインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体は、システインへの１つ以上の点変異をさらに含む。いくつかの態様において、ここで記載されているインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体は、三量体ドメイン、たとえばフォルドン（foldon）ドメインをさらに含む。
【００２５】
本発明のインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体の非限定的な例には、限定されないが、配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０および１１７が含まれる。
【００２６】
いくつかの態様において、ここで記載されているインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体は対象におけるインフルエンザＨＡ特異的抗体の産生を誘発できる。いくつかの態様において、ここで記載されているインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体は、インフルエンザＨＡの三量体ストークドメインを認識する抗体と結合できる。
【００２７】
いくつかの態様において、本発明は、ここで記載されているインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体をコードする核酸分子を提供する。
【００２８】
いくつかの態様において、本発明は、限定されないが、ワクチン組成物を含む、ここで記載されているインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体を含む組成物を提供する。いくつかのこのような態様において、このような組成物は、アジュバント、担体、免疫刺激剤、またはそれらのいずれかの組合せをさらに含んでいてもよい。
【００２９】
いくつかの態様において、本発明は、インフルエンザに対して対象をワクチン接種する方法であって、ここで記載されている有効量のインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体を含む組成物を対象に投与することを含む、方法を提供する。
【００３０】
本発明のこれらおよび他の態様は本特許明細書全体にわたって記載されている。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】ＱＮＥ−ｂｎＡｂ複合体（左）、ならびに右側に（ａ）同種ＰＲ８、（ｂ）ドリフト（ＮＬ０９）、（ｃ）１群異種（ＶＮ０４）、および（ｄ）２群異種（ｘ３１）ウイルスの同じｂｎＡｂ中和ＨＡを示す頭部のないユニバーサルワクチン免疫原（ＰＲ８）の略図。
【図２】ストーク三量体を安定化させる頭部のないＨＡにおけるＤＴ架橋の略図。Ａ．ＤＴ結合（黒色の上部）はストーク三量体を立体構造的に固定する。Ｂ．ストーク三量体は立体構造を固定しておらず壊れている。ＱＮＥは喪失している。
【図３】ＨＡバリアント設計：１つのプロトマーにつき２つのアミノ酸置換（黒および白の円）を示す、ストークを上から見下ろした略図。
【図４Ａ】（Ａ）４０５ｎｍにおけるＤＴ特異的蛍光測定またはＷＴ（陰性対照、左）、各々２つのアミノ酸置換を有する４つのＨＡバリアント、および高効率でＤＴ結合を形成するインスリン（陽性対照、右）。（Ｂ）ジチロシン変異体の相対蛍光。データは、エラーバーによって示される標準偏差と共に４つの複製の平均を表す。
【図４Ｂ】（同上）
【図５】ＣＲＣ２６１と結合したＨＡの注釈付き結晶構造。下側の円はＤＴ結合形成についての標的領域を示し、真ん中の円はストークに近接したタンパク質分解による切断についての標的領域を示し、上側の円はストークに近接した切断部位のアクセスを可能にするように頭部をほどくように設計された可変ループタンパク質分解についての標的領域を示す。
【図６】ストークドメインを安定化させるための架橋結合を有さないＷＴおよび頭部のないＨＡタンパク質を発現する細胞の免疫蛍光染色により、安定化されていない頭部のないＨＡタンパク質が最も広範な反応性を示すｍＡｂ、Ｃ１７９の１つと結合しなかったことが実証された。Ａ５４９細胞を、ＷＴ  ＨＡまたはストークドメイン内にいかなる架橋結合も有さない組換えによりスプライシングした頭部のない構築物のいずれかの発現のためのプラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、細胞を固定し、透過処理し、ＨＡタンパク質を、ウサギポリクローナル、ｐＡＢ（一般的発現）（上側パネル）と、ｍＡｂ  Ｃ１７９抗ストーク（立体構造）（下側パネル）一次Ａｂ、続いて抗ウサギＡｌｅｘａ５５５コンジュゲートおよび抗マウスＡｌｅｘａ４８８コンジュゲート二次Ａｂの両方で検出した。
【図７】ＤＴ架橋はＰＲ８ストークにおいて効果的に形成し、Ｃ１７９抗原性は架橋結合の前後で保存される。Ａ．ＷＴ（陰性対照、Ａ）、残基４０３および４２９（Ｂ）、４０６および４３３（Ｃ）、４０３および４３３（Ｄ）、ならびに４０３および４３２（Ｅ）において各々２つのアミノ酸置換（Ｔｙｒへの置換）を有する４つのＨＡバリアント、ならびに高効率でＤＴ結合を形成するインスリン（陽性対照、Ｆ）のｅｘ３２０／ｅｍ４０５ｎｍにおけるＤＴ特異的蛍光測定。Ｂ．捕捉のためのヤギポリクローナル抗ＨＡ抗体（ＢＥＩカタログ番号ＮＲ−３１４８）および検出のためのＣ１７９立体構造Ａｂを使用してサンドイッチＥＬＩＳＡによって測定したときのＤＴ架橋結合前後のバリアント（Ｂ〜Ｅ）とのＣ１７９結合。
【図８】２９３Ｔ細胞にＷＴ  ＮＡおよび示したＨＡプラスミドをトランスフェクトしなかった（−）、またはトランスフェクトした。トランスフェクションの７２時間後、上清中のＶＬＰおよびＷＣＥを、サンドイッチＥＬＩＳＡ（Ａ、ＢＥＩカタログ番号ＮＲ−３１４８ヤギポリクローナル抗ＨＡ捕捉、Ｃ１７９検出）、ウェスタンブロット（Ｂ、左側のパネル；ＰＮＧａｓｅ処理したＷＣＥ）およびＨＡアッセイ（Ｃ）によって分析した。パネルＢ、右側。細胞に上記のように示したようにＨＡおよびＮＡをトランスフェクトした。トランスフェクションの７２時間後、ＶＬＰを３０％スクロース−ＮＴＥクッション上で精製し、総タンパク量についてアッセイし、偽インキュベート（ＷＴ、４８Ｇ）またはＴＥＶプロテアーゼ（ＷＴ＋ＴＥＶ、４８Ｇ＋ＴＥＶ）による消化のいずれかをして、ＰＮＧａｓｅ処理した。切断パーセントをウェスタンブロットによって決定した。
【図９】Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルスのＰＲ８株由来のＨＡタンパク質のアミノ酸配列（配列番号１）。アミノ酸５９〜２９１は、いくつかの態様においてタンパク質分解により除去または破壊されていてもよい、頭部ドメインを含む。アミノ酸１〜５８（または残基１〜１７に位置するシグナルペプチドを有さない１８〜５８）および２９２〜５６６（または膜貫通ドメインおよび細胞質尾部を有さない２９２〜５９２）はストークドメインを含む。ストークドメインは不連続であり、ＨＡタンパク質のＮ末端とＣ末端部分の両方を含む。アミノ酸５２９〜５６５は膜貫通領域および細胞質尾部を含む。ＨＡ細胞外ドメイン（すなわち、外側に露出した／非膜結合部分）は残基１〜５２８（またはシグナルペプチドを有さない１８〜５２８）を含む。
【図１０】Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルスのＰＲ８株由来のＨＡタンパク質をコードするＤＮＡの核酸配列（配列番号２）。
【図１１】位置６３および２７８（下線）において挿入されたＴＥＶプロテアーゼ切断部位、ならびに位置４０３（Ｎ４０３Ｙ）および４３３（Ｄ４３３Ｙ）（下線）においてチロシンへの変異を含む修飾ＰＲ８インフルエンザＨＡタンパク質のアミノ酸配列（配列番号３）。囲まれたＣ末端配列は膜貫通領域を含む。配列番号３のアミノ酸配列は図２８に示される配列番号３１の核酸配列によってコードされる。
【図１２】位置６３および２７８（下線）において挿入されたＴＥＶプロテアーゼ切断部位、ならびに位置４１１（Ｋ４１１Ｙ）および４２２（Ｎ４２２Ｙ）（下線）においてチロシンへの変異を含む修飾ＰＲ８インフルエンザＨＡタンパク質のアミノ酸配列（配列番号４）。囲まれたＣ末端配列は膜貫通領域を含む。配列番号４のアミノ酸配列は図２９に示される配列番号３２の核酸配列によってコードされる。
【図１３】位置６３および２７８（下線）において挿入されたＴＥＶプロテアーゼ切断部位、ならびに位置４０３（Ｎ４０３Ｙ）、４１１（Ｋ４１１Ｙ）、４２２（Ｎ４２２Ｙ）および４３３（Ｄ４３３Ｙ）（下線）においてチロシンへの変異を含む修飾ＰＲ８インフルエンザＨＡタンパク質のアミノ酸配列（配列番号５）。囲まれたＣ末端配列は膜貫通領域を含む。配列番号５のアミノ酸配列は図３０に示される配列番号３３の核酸配列によってコードされる。
【図１４】位置６３および２８２（下線）において挿入されたＴＥＶプロテアーゼ切断部位、ならびに位置４０３（Ｎ４０３Ｙ）および４３３（Ｄ４３３Ｙ）（下線）においてチロシンへの変異を含む修飾ＰＲ８インフルエンザＨＡタンパク質のアミノ酸配列（配列番号６）。囲まれたＣ末端配列は膜貫通領域を含む。配列番号６のアミノ酸配列は図３１に示される配列番号３４の核酸配列によってコードされる。
【図１５】位置６３および２８２（下線）において挿入されたＴＥＶプロテアーゼ切断部位、ならびに位置４１１（Ｋ４１１Ｙ）および４２２（Ｎ４２２Ｙ）（下線）においてチロシンへの変異を含む修飾ＰＲ８インフルエンザＨＡタンパク質のアミノ酸配列（配列番号７）。囲まれたＣ末端配列は膜貫通領域を含む。配列番号７のアミノ酸配列は図３２に示される配列番号３５の核酸配列によってコードされる。
【図１６】位置６３および２２８（下線）において挿入されたＴＥＶプロテアーゼ切断部位、ならびに位置４０３（Ｎ４０３Ｙ）、４１１（Ｋ４１１Ｙ）、４２２（Ｎ４２２Ｙ）および４３３（Ｄ４３３Ｙ）（下線）においてチロシンへの変異を含む修飾ＰＲ８インフルエンザＨＡタンパク質のアミノ酸配列（配列番号８）。囲まれたＣ末端配列は膜貫通領域を含む。配列番号８のアミノ酸配列は図３３に示される配列番号３６の核酸によってコードされる。
【図１７】位置６３および２８３（下線）において挿入されたＴＥＶプロテアーゼ切断部位、ならびに位置４０３（Ｎ４０３Ｙ）および４３３（Ｄ４３３Ｙ）（下線）においてチロシンへの変異を含む修飾ＰＲ８インフルエンザＨＡタンパク質のアミノ酸配列（配列番号９）。囲まれたＣ末端配列は膜貫通領域を含む。配列番号９のアミノ酸配列は図３４に示される配列番号３７の核酸配列によってコードされる。
【図１８】位置６３および２８３（下線）において挿入されたＴＥＶプロテアーゼ切断部位、ならびに位置４１１（Ｋ４１１Ｙ）および４２２（Ｎ４２２Ｙ）（下線）においてチロシンへの変異を含む修飾ＰＲ８インフルエンザＨＡタンパク質のアミノ酸配列（配列番号１０）。囲まれたＣ末端配列は膜貫通領域を含む。配列番号１０のアミノ酸配列は図３５に示される配列番号３８の核酸配列によってコードされる。
【図１９】位置６３および２８３（下線）において挿入されたＴＥＶプロテアーゼ切断部位、ならびに位置４０３（Ｎ４０３Ｙ）、４１１（Ｋ４１１Ｙ）、４２２（Ｎ４２２Ｙ）および４３３（Ｄ４３３Ｙ）（下線）においてチロシンへの変異を含む修飾ＰＲ８インフルエンザＨＡタンパク質のアミノ酸配列（配列番号１１）。囲まれたＣ末端配列は膜貫通領域を含む。配列番号１１のアミノ酸配列は図３６に示される配列番号３９の核酸配列によってコードされる。
【図２０】位置４８および２９１（下線）において挿入されたＴＥＶプロテアーゼ切断部位、ならびに位置４０３（Ｎ４０３Ｙ）および４３３（Ｄ４３３Ｙ）（下線）においてチロシンへの変異を含む修飾ＰＲ８インフルエンザＨＡタンパク質のアミノ酸配列（配列番号１２）。囲まれたＣ末端配列は膜貫通領域を含む。配列番号１２のアミノ酸配列は図４０に示される配列番号４３の核酸配列によってコードされる。
【図２１】位置４８および２９１（下線）において挿入されたＴＥＶプロテアーゼ切断部位、ならびに位置４１１（Ｋ４１１Ｙ）および４２２（Ｎ４２２Ｙ）（下線）においてチロシンへの変異を含む修飾ＰＲ８インフルエンザＨＡタンパク質のアミノ酸配列（配列番号１３）。囲まれたＣ末端配列は膜貫通領域を含む。配列番号１３のアミノ酸配列は図４１に示される配列番号４４の核酸配列によってコードされる。
【図２２】位置４８および２９１（下線）において挿入されたＴＥＶプロテアーゼ切断部位、ならびに位置４０３（Ｎ４０３Ｙ）、４１１（Ｋ４１１Ｙ）、４２２（Ｎ４２２Ｙ）および４３３（Ｄ４３３Ｙ）（下線）においてチロシンへの変異を含む修飾ＰＲ８インフルエンザＨＡタンパク質のアミノ酸配列（配列番号１４）。囲まれたＣ末端配列は膜貫通領域を含む。配列番号１４のアミノ酸配列は図４２に示される配列番号４５の核酸配列によってコードされる。
【図２３】位置４８および２９１（下線）において挿入されたＴＥＶプロテアーゼ切断部位、ならびに位置４０３（Ｎ４０３Ｙ）および４３３（Ｄ４３３Ｙ）（下線）においてチロシンへの変異を含む修飾ＰＲ８インフルエンザＨＡタンパク質のアミノ酸配列（配列番号１５）。囲まれたＣ末端配列は膜貫通領域を含む。配列番号１５のアミノ酸配列は図４３に示される配列番号４６の核酸配列によってコードされる。
【図２４】位置４８および２９１（下線）において挿入されたＴＥＶプロテアーゼ切断部位、ならびに位置４１１（Ｋ４１１Ｙ）および４２２（Ｎ４２２Ｙ）（下線）においてチロシンへの変異を含む修飾ＰＲ８インフルエンザＨＡタンパク質のアミノ酸配列（配列番号１６）。囲まれたＣ末端配列は膜貫通領域を含む。配列番号１６のアミノ酸配列は図４４に示される配列番号４７の核酸配列によってコードされる。
【図２５】位置４８および２９１（下線）において挿入されたＴＥＶプロテアーゼ切断部位、ならびに位置４０３（Ｎ４０３Ｙ）、４１１（Ｋ４１１Ｙ）、４２２（Ｎ４２２Ｙ）および４３３（Ｄ４３３Ｙ）（下線）においてチロシンへの変異を含む修飾ＰＲ８インフルエンザＨＡタンパク質のアミノ酸配列（配列番号１７）。囲まれたＣ末端配列は膜貫通領域を含む。配列番号１７のアミノ酸配列は図４５に示される配列番号４８の核酸配列によってコードされる。
【図２６Ａ】１つの挿入されたプロテアーゼ切断部位を含む修飾ＰＲ８インフルエンザＨＡタンパク質のアミノ酸配列アラインメント、およびインフルエンザウイルスＨ１Ｎ１のＰＲ８株由来の野生型ＰＲ８  ＨＡの配列（配列番号１−図において「ＰＲ８ＨＡ−ＷＴ」として特定される）。下線のアミノ酸残基は配列番号１におけるアミノ酸の置換および／または置きかえによって野生型配列に挿入されたプロテアーゼ切断部位を示す。プロテアーゼ切断部位は以下のアミノ酸残基の直後に挿入される：２９１（配列番号１８および配列番号１９）、４８（配列番号２０）、２８６（配列番号２１）、２７８（配列番号２２）、２８２（配列番号２３）、６３（配列番号２４）または２８３（配列番号２５）。挿入されたプロテアーゼ切断部位はＴＥＶプロテアーゼ認識配列である。アラインメントの囲まれた部分内に示されるＣ末端配列はインフルエンザＨＡタンパク質の膜貫通領域を含む。配列番号１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４および２５のアミノ酸配列は、図４６に示されるようにそれぞれ、配列番号４９、５０、５２、５６、５３、５４、５１および５５の核酸配列によってコードされる。
【図２６Ｂ】（同上）
【図２７Ａ】２つの挿入されたプロテアーゼ切断部位を含む修飾ＰＲ８インフルエンザＨＡタンパク質のアミノ酸配列アラインメント、およびインフルエンザウイルスＨ１Ｎ１のＰＲ８株由来の野生型ＰＲ８  ＨＡの配列（配列番号１−図において「ＰＲ８ＨＡ−ＷＴ」として特定される）。プロテアーゼ切断部位は以下のアミノ酸残基の直後に挿入される：６３および２７８（配列番号２６）、６３および２８２（配列番号２７）、６３および２８３（配列番号２８）、４８および２９１（配列番号２９および３０）。挿入されたプロテアーゼ切断部位はＴＥＶプロテアーゼ認識配列である。下線のアミノ酸残基は、たとえば、頭部ドメインが破壊または除去されている「頭部のない」ＨＡタンパク質の産生を容易にするために、プロテアーゼ（ここで、ＴＥＶプロテアーゼ）により切断されるとＨＡ配列から除去されるプロテアーゼ切断部位の間に位置する配列を示す。アラインメントの囲まれた部分内に示されるＣ末端配列はインフルエンザＨＡタンパク質の膜貫通領域を含む。太字で示されるアミノ酸残基（Ｎ４０３、Ｆ４０６、Ｋ４１１、Ｎ４２２、Ｄ４２９、Ｌ４３２、Ｄ４３３およびＷ４３５）は、チロシンへの変異が、ここで記載されているインフルエンザＨＡストークドメインにおけるジチロシン結合の形成を容易にするように作製されていてもよい位置を示す。配列番号２６、２７、２８、２９および３０のアミノ酸配列は、図４７に示されるようにそれぞれ、配列番号５７、５８、６２、６０および６１の核酸配列によってコードされる。
【図２７Ｂ】（同上）
【図２８】タンパク質における位置６３および２７８においてＴＥＶプロテアーゼ切断部位をコードする挿入された核酸残基（小文字で示す）、ならびにタンパク質における位置４０３（Ｎ４０３Ｙ）および４３３（Ｄ４３３Ｙ）においてコードされたチロシンへの変異（小文字で示す）を含む修飾ＰＲ８インフルエンザＨＡタンパク質をコードする核酸配列（配列番号３１）。囲まれたＣ末端配列はタンパク質の膜貫通領域をコードする核酸配列を含む。
【図２９】タンパク質における位置６３および２７８においてＴＥＶプロテアーゼ切断部位をコードする挿入された核酸残基（小文字で示す）、ならびにタンパク質における位置４１１（Ｋ４１１Ｙ）および４２２（Ｎ４２２Ｙ）においてコードされたチロシンへの変異（小文字で示す）を含む修飾ＰＲ８インフルエンザＨＡタンパク質をコードする核酸配列（配列番号３２）。囲まれたＣ末端配列はタンパク質の膜貫通領域をコードする核酸配列を含む。
【図３０】タンパク質における位置６３および２７８においてＴＥＶプロテアーゼ切断部位をコードする挿入された核酸残基（小文字で示す）、ならびにタンパク質における位置４０３（Ｎ４０３Ｙ）、４１１（Ｋ４１１Ｙ）、４２２（Ｎ４２２Ｙ）および４３３（Ｄ４３３Ｙ）においてコードされたチロシンへの変異（小文字で示す）を含む修飾ＰＲ８インフルエンザＨＡタンパク質をコードする核酸配列（配列番号３３）。囲まれたＣ末端配列はタンパク質の膜貫通領域をコードする核酸配列を含む。
【図３１】タンパク質における位置６３および２８２においてＴＥＶプロテアーゼ切断部位をコードする挿入された核酸残基（小文字で示す）、ならびにタンパク質における位置４０３（Ｎ４０３Ｙ）および４３３（Ｄ４３３Ｙ）においてコードされたチロシンへの変異（小文字で示す）を含む修飾ＰＲ８インフルエンザＨＡタンパク質をコードする核酸配列（配列番号３４）。囲まれたＣ末端配列はタンパク質の膜貫通領域をコードする核酸配列を含む。
【図３２】タンパク質における位置６３および２８２においてＴＥＶプロテアーゼ切断部位をコードする挿入された核酸残基（小文字で示す）、ならびにタンパク質における位置４１１（Ｋ４１１Ｙ）および４２２（Ｎ４２２Ｙ）においてコードされたチロシンへの変異（小文字で示す）を含む修飾ＰＲ８インフルエンザＨＡタンパク質をコードする核酸配列（配列番号３４）。囲まれたＣ末端配列はタンパク質の膜貫通領域をコードする核酸配列を含む。
【図３３】タンパク質における位置６３および２８２においてＴＥＶプロテアーゼ切断部位をコードする挿入された核酸残基（小文字で示す）、ならびにタンパク質における位置４０３（Ｎ４０３Ｙ）、４１１（Ｋ４１１Ｙ）、４２２（Ｎ４２２Ｙ）および４３３（Ｄ４３３Ｙ）においてコードされたチロシンへの変異（小文字で示す）を含む修飾ＰＲ８インフルエンザＨＡタンパク質をコードする核酸配列（配列番号３６）。囲まれたＣ末端配列はタンパク質の膜貫通領域をコードする核酸配列を含む。
【図３４】タンパク質における位置６３および２８３においてＴＥＶプロテアーゼ切断部位をコードする挿入された核酸残基（小文字で示す）、ならびにタンパク質における位置４０３（Ｎ４０３Ｙ）および４３３（Ｄ４３３Ｙ）においてコードされたチロシンへの変異（小文字で示す）を含む修飾ＰＲ８インフルエンザＨＡタンパク質をコードする核酸配列（配列番号３７）。囲まれたＣ末端配列はタンパク質の膜貫通領域をコードする核酸配列を含む。
【図３５】タンパク質における位置６３および２８３においてＴＥＶプロテアーゼ切断部位をコードする挿入された核酸残基（小文字で示す）、ならびにタンパク質における位置４１１（Ｋ４１１Ｙ）および４２２（Ｎ４２２Ｙ）においてコードされたチロシンへの変異（小文字で示す）を含む修飾ＰＲ８インフルエンザＨＡタンパク質をコードする核酸配列（配列番号３８）。囲まれたＣ末端配列はタンパク質の膜貫通領域をコードする核酸配列を含む。
【図３６】タンパク質における位置６３および２８３においてＴＥＶプロテアーゼ切断部位をコードする挿入された核酸残基（小文字で示す）、ならびにタンパク質における位置４０３（Ｎ４０３Ｙ）、４１１（Ｋ４１１Ｙ）、４２２（Ｎ４２２Ｙ）および４３３（Ｄ４３３Ｙ）においてコードされたチロシンへの変異（小文字で示す）を含む修飾ＰＲ８インフルエンザＨＡタンパク質をコードする核酸配列（配列番号３９）。囲まれたＣ末端配列はタンパク質の膜貫通領域をコードする核酸配列を含む。
【図３７】タンパク質における位置６３および２８６においてＴＥＶプロテアーゼ切断部位をコードする挿入された核酸残基（小文字で示す）、ならびにタンパク質における位置４０３（Ｎ４０３Ｙ）および４３３（Ｄ４３３Ｙ）においてコードされたチロシンへの変異（小文字で示す）を含む修飾ＰＲ８インフルエンザＨＡタンパク質をコードする核酸配列（配列番号４０）。囲まれたＣ末端配列はタンパク質の膜貫通領域をコードする核酸配列を含む。
【図３８】タンパク質における位置６３および２８６においてＴＥＶプロテアーゼ切断部位をコードする挿入された核酸残基（小文字で示す）、ならびにタンパク質における位置４１１（Ｋ４１１Ｙ）および位置４２２（Ｎ４２２Ｙ）においてコードされたチロシンへの変異（小文字で示す）を含む修飾ＰＲ８インフルエンザＨＡタンパク質をコードする核酸配列（配列番号４１）。囲まれたＣ末端配列はタンパク質の膜貫通領域をコードする核酸配列を含む。
【図３９】タンパク質における位置６３および２８６においてＴＥＶプロテアーゼ切断部位をコードする挿入された核酸残基（小文字で示す）、ならびにタンパク質における位置４０３（Ｎ４０３Ｙ）、４１１（Ｋ４１１Ｙ）、４２２（Ｎ４２２Ｙ）および４３３（Ｄ４３３Ｙ）においてコードされたチロシンへの変異（小文字で示す）を含む修飾ＰＲ８インフルエンザＨＡタンパク質をコードする核酸配列（配列番号４２）。囲まれたＣ末端配列はタンパク質の膜貫通領域をコードする核酸配列を含む。
【図４０】タンパク質における位置４８および２９１においてＴＥＶプロテアーゼ切断部位をコードする挿入された核酸残基（小文字で示す）、ならびにタンパク質における位置４０３（Ｎ４０３Ｙ）および４３３（Ｄ４３３Ｙ）においてコードされたチロシンへの変異（小文字で示す）を含む修飾ＰＲ８インフルエンザＨＡタンパク質をコードする核酸配列（配列番号４３）。囲まれたＣ末端配列はタンパク質の膜貫通領域をコードする核酸配列を含む。
【図４１】タンパク質における位置４８および２９１においてＴＥＶプロテアーゼ切断部位をコードする挿入された核酸残基（小文字で示す）、ならびにタンパク質における位置４１１（Ｋ４１１Ｙ）および４２２（Ｎ４２２Ｙ）においてコードされたチロシンへの変異（小文字で示す）を含む修飾ＰＲ８インフルエンザＨＡタンパク質をコードする核酸配列（配列番号４４）。囲まれたＣ末端配列はタンパク質の膜貫通領域をコードする核酸配列を含む。
【図４２】タンパク質における位置４８および２９１においてＴＥＶプロテアーゼ切断部位をコードする挿入された核酸残基（小文字で示す）、ならびにタンパク質における位置４０３（Ｎ４０３Ｙ）、４１１（Ｋ４１１Ｙ）、４２２（Ｎ４２２Ｙ）および４３３（Ｄ４３３Ｙ）においてコードされたチロシンへの変異（小文字で示す）を含む修飾ＰＲ８インフルエンザＨＡタンパク質をコードする核酸配列（配列番号４５）。囲まれたＣ末端配列はタンパク質の膜貫通領域をコードする核酸配列を含む。
【図４３】タンパク質における位置４８および２９１においてＴＥＶプロテアーゼ切断部位をコードする挿入された核酸残基（小文字で示す）、ならびにタンパク質における位置４０３（Ｎ４０３Ｙ）および４３３（Ｄ４３３Ｙ）においてコードされたチロシンへの変異（小文字で示す）を含む修飾ＰＲ８インフルエンザＨＡタンパク質をコードする核酸配列（配列番号４６）。囲まれたＣ末端配列はタンパク質の膜貫通領域をコードする核酸配列を含む。
【図４４】タンパク質における位置４８および２９１においてＴＥＶプロテアーゼ切断部位をコードする挿入された核酸残基（小文字で示す）、ならびにタンパク質における位置４１１（Ｋ４１１Ｙ）および４２２（Ｎ４２２Ｙ）においてコードされたチロシンへの変異（小文字で示す）を含む修飾ＰＲ８インフルエンザＨＡタンパク質をコードする核酸配列（配列番号４７）。囲まれたＣ末端配列はタンパク質の膜貫通領域をコードする核酸配列を含む。
【図４５】タンパク質における位置４８および２９１においてＴＥＶプロテアーゼ切断部位をコードする挿入された核酸残基（小文字で示す）、ならびにタンパク質における位置４０３（Ｎ４０３Ｙ）、４１１（Ｋ４１１Ｙ）、４２２（Ｎ４２２Ｙ）および４３３（Ｄ４３３Ｙ）においてコードされたチロシンへの変異（小文字で示す）を含む修飾ＰＲ８インフルエンザＨＡタンパク質をコードする核酸配列（配列番号４８）。囲まれたＣ末端配列はタンパク質の膜貫通領域をコードする核酸配列を含む。
【図４６Ａ】１つの挿入されたプロテアーゼ切断部位を含む修飾ＰＲ８インフルエンザＨＡタンパク質をコードする核酸配列のアラインメント、およびインフルエンザウイルスＨ１Ｎ１のＰＲ８株由来の野生型ＨＡタンパク質の配列（配列番号２−図において「ＲＲ８ＨＡ−ＷＴ」として特定される）。下線の核酸残基は配列番号２の核酸残基の置換および／または置きかえによってＴＥＶプロテアーゼ切断部位をコードする。コードされたタンパク質が以下のアミノ酸残基：２９１（配列番号４９および配列番号５０）、４８（配列番号５２）、２８６（配列番号５６）、２７８（配列番号５３）、２８２（配列番号５４）、６３（配列番号５１）または２８３（配列番号５５）の直後にプロテアーゼ切断部位を有するように核酸残基は核酸配列に挿入される。囲まれたＣ末端配列はタンパク質の膜貫通領域をコードする配列を含む。
【図４６Ｂ】（同上）
【図４６Ｃ】（同上）
【図４６Ｄ】（同上）
【図４６Ｅ】（同上）
【図４６Ｆ】（同上）
【図４７Ａ】２つの挿入されたプロテアーゼ切断部位を含むＰＲ８インフルエンザＨＡタンパク質をコードする核酸配列のアラインメント、およびインフルエンザウイルスＨ１Ｎ１のＰＲ８株由来の野生型ＨＡの配列（配列番号２−図において「ＰＲ８ＨＡ−ＷＴ」として特定される）。下線の核酸残基は配列番号２の核酸残基の置換および／または置きかえによってＴＥＶプロテアーゼ切断部位をコードする。コードされたＨＡタンパク質が以下のアミノ酸残基：６３および２７８（配列番号５７）、６３および２８２（配列番号５８）、６３および２８６（配列番号５９）、４８および２９１（配列番号６０および６１）ならびに６３および２８３（配列番号６２）の直後にプロテアーゼ切断部位を有するように核酸残基は核酸配列に挿入される。囲まれたＣ末端配列はタンパク質の膜貫通領域をコードする配列を含む。囲まれた核酸残基（コードされたＨＡタンパク質におけるアミノ酸位置Ｎ４０３、Ｆ４０６、Ｋ４１１、Ｎ４２２、Ｄ４２９、Ｌ４３２、Ｄ４３３およびＷ４３５に対応する）は、ここで記載されているコードされたインフルエンザＨＡタンパク質のストークドメインにおけるジチロシン結合の形成を容易にするようにチロシンへの変異が作製されていてもよい位置を示す。
【図４７Ｂ】（同上）
【図４７Ｃ】（同上）
【図４７Ｄ】（同上）
【図４７Ｅ】（同上）
【図４８】Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ（ヒト）におけるコードされたＨＡタンパク質の発現のためにコドン最適化したインフルエンザウイルスＨ１Ｎ１のＰＲ８株のＨＡタンパク質をコードする核酸配列（配列番号６３）。
【図４９】Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ（チャイニーズハムスター）におけるコードされたＨＡタンパク質の発現のためにコドン最適化したインフルエンザウイルスＨ１Ｎ１のＰＲ８株のＨＡタンパク質をコードする核酸配列（配列番号６４）。
【図５０】Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ（ベンサミアナタバコ）におけるコードされたＨＡタンパク質の発現のためにコドン最適化したインフルエンザウイルスＨ１Ｎ１のＰＲ８株のＨＡタンパク質をコードする核酸配列（配列番号６５）。
【図５１】Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ（ピキア酵母）におけるコードされたＨＡタンパク質の発現のためにコドン最適化したインフルエンザウイルスＨ１Ｎ１のＰＲ８株のＨＡタンパク質をコードする核酸配列（配列番号６６）。
【図５２】Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（出芽酵母）におけるコードされたＨＡタンパク質の発現のためにコドン最適化したインフルエンザウイルスＨ１Ｎ１のＰＲ８株のＨＡタンパク質をコードする核酸配列（配列番号６７）。
【図５３】Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（ツマジロクサヨトウ）におけるコードされたＨＡタンパク質の発現のためにコドン最適化したインフルエンザウイルスＨ１Ｎ１のＰＲ８株のＨＡタンパク質をコードする核酸配列（配列番号６８）。
【図５４Ａ】インフルエンザウイルスの種々の株由来のＨＡタンパク質の完全長バージョンのアミノ酸配列のアラインメント（ウドーン７２（配列番号７３）、香港６８（配列番号７４）、パナマ９９（配列番号７５）、ウィスコンシン０５（配列番号７６）、上海１３（配列番号７７）、シンガポール５７（配列番号７８）、ベトナム０４（配列番号７９）およびＰＲ８  ３４（配列番号１）、ＵＳＳＲ  ７７（配列番号１１１）、テキサス９１（配列番号１１２）、ＷＳＮ  ３３（配列番号１１３）、サウスカロライナ１９１８（配列番号１１４）およびカリフォルニア０９（配列番号１１５））。囲まれたアミノ酸残基（インフルエンザウイルスＨ１Ｎ１のＰＲ８株由来の野生型ＨＡの配列（配列番号１−図において「ＷＴ−ＰＲ８−３４」として特定される）におけるアミノ酸位置４０３、４０６、４１１、４２２、４２９、４３２、４３３および４３５に対応する）は、チロシン残基への変異がＨＡタンパク質のストーク領域におけるジチロシン結合の形成を容易にするために意図される位置を表す。イタリック体のＣ末端配列はタンパク質の内因性膜貫通領域をコードする配列を含み、これはインフルエンザＨＡタンパク質の可溶性バージョンを生成するように除去または破壊されていてもよい（たとえば、図５５〜６０を参照のこと）。
【図５４Ｂ】（同上）
【図５４Ｃ】（同上）
【図５５】インフルエンザウイルスのＰＲ８株由来のＨＡタンパク質の可溶性バージョンのアミノ酸配列（配列番号８０）。内因性膜貫通領域のアミノ酸５２０〜５６５（図５４における配列番号１のイタリック体のＣ末端配列）は、トロンビン切断ドメイン、Ｔ４フォルドン三量体形成モチーフおよび６ｘＨｉｓタグを含む任意のタグ（下線）（配列番号１１８）に置きかえられている。
【図５６】インフルエンザウイルスの香港６８株由来のＨＡタンパク質の可溶性バージョンのアミノ酸配列（配列番号８１）。内因性膜貫通領域のアミノ酸５２１〜５６６（図５４における配列番号７４のイタリック体のＣ末端配列）は、トロンビン切断ドメイン、Ｔ４フォルドン三量体形成モチーフおよび６ｘＨｉｓタグを含む任意のタグ（下線）（配列番号１１８）に置きかえられている。
【図５７】インフルエンザウイルスのウィスコンシン０５株由来のＨＡタンパク質の可溶性バージョンのアミノ酸配列（配列番号８２）。内因性膜貫通領域のアミノ酸５２１〜５６６（図５４における配列番号７６のイタリック体のＣ末端配列）は、トロンビン切断ドメイン、Ｔ４フォルドン三量体形成モチーフおよび６ｘＨｉｓタグを含む任意のタグ（下線）（配列番号１１８）に置きかえられている。
【図５８】インフルエンザウイルスのベトナム０４株由来のＨＡタンパク質の可溶性バージョンのアミノ酸配列（配列番号８３）。内因性膜貫通領域のアミノ酸５２２〜５６８（図５４における配列番号７９のイタリック体のＣ末端配列）は、トロンビン切断ドメイン、Ｔ４フォルドン三量体形成モチーフおよび６ｘＨｉｓタグを含む任意のタグ（下線）（配列番号１１８）に置きかえられている。
【図５９】インフルエンザウイルスの上海１３株由来のＨＡタンパク質の可溶性バージョンのアミノ酸配列（配列番号８４）。内因性膜貫通領域のアミノ酸５１５〜５６０（図５４における配列番号７７のイタリック体のＣ末端配列）は、トロンビン切断ドメイン、Ｔ４フォルドン三量体形成モチーフおよび６ｘＨｉｓタグを含む任意のタグ（下線）（配列番号１１８）に置きかえられている。
【図６０】インフルエンザウイルスのシンガポール５７株由来のＨＡタンパク質の可溶性バージョンのアミノ酸配列（配列番号８５）。内因性膜貫通領域のアミノ酸５１６〜５６２（図５４における配列番号７８のイタリック体のＣ末端配列）は、トロンビン切断ドメイン、Ｔ４フォルドン三量体形成モチーフおよび６ｘＨｉｓタグを含む任意のタグ（下線）（配列番号１１８）に置きかえられている。
【図６１】位置４０３（Ｎ４０３Ｙ）および４２９（Ｄ４２９Ｙ）（下線）においてチロシンへの変異を含む修飾ＰＲ８インフルエンザＨＡタンパク質のアミノ酸配列（配列番号８６）。
【図６２】位置４０３（Ｎ４０３Ｙ）および４３２（Ｌ４３２Ｙ）（下線）においてチロシンへの変異を含む修飾ＰＲ８インフルエンザＨＡタンパク質のアミノ酸配列（配列番号８７）。
【図６３】位置４０３（Ｎ４０３Ｙ）（下線）において１つのチロシンへの変異を含む修飾ＰＲ８インフルエンザＨＡタンパク質のアミノ酸配列（配列番号８８）。
【図６４】位置４０３（Ｎ４０３Ｙ）および４３３（Ｄ４３３Ｙ）（下線）においてチロシンへの変異を含む修飾ＰＲ８インフルエンザＨＡタンパク質のアミノ酸配列（配列番号８９）。
【図６５】位置４３３（Ｄ４３３Ｙ）および４３５（Ｗ４３５Ｙ）（下線）においてチロシンへの変異を含む修飾ＰＲ８インフルエンザＨＡタンパク質のアミノ酸配列（配列番号９０）。
【図６６】位置４３５（Ｗ４３５Ｙ）（下線）において１つのチロシンへの変異を含む修飾ＰＲ８インフルエンザＨＡタンパク質のアミノ酸配列（配列番号９１）。
【図６７】位置４０６（Ｆ４０６Ｙ）および４３３（Ｄ４３３Ｙ）（下線）においてチロシンへの変異を含む修飾ＰＲ８インフルエンザＨＡタンパク質のアミノ酸配列（配列番号９２）。
【図６８】位置４１１（Ｋ４１１Ｙ）および４２２（Ｎ４２２Ｙ）（下線）においてチロシンへの変異を含む修飾ＰＲ８インフルエンザＨＡタンパク質のアミノ酸配列（配列番号９３）。
【図６９Ａ】１つ以上のチロシンへの変異を含む修飾ＰＲ８インフルエンザＨＡタンパク質のアミノ酸配列アラインメント、およびインフルエンザウイルスＨ１Ｎ１のＰＲ８株由来の野生型ＰＲ８  ＨＡの配列（配列番号１−図において「ＰＲ８ＨＡ−ＷＴ」として特定される）。ジチロシン結合は、ここで記載されている内因性チロシン残基（たとえば、太字で示される配列番号１のＹ３０８およびＹ４３７）とチロシンへの変異を含む残基（たとえば、下線で示される配列番号１のＮ４０３、Ｆ４０６、Ｋ４１１、Ｎ４２２、Ｄ４２９、Ｌ４３２、Ｄ４３３およびＷ４３５）との種々の組合せの間に導入されていてもよい。
【図６９Ｂ】（同上）
【図７０】完全長開始配列（ＰＲ８  ＨＡ、配列番号１）に挿入された２つのプロテアーゼ切断部位（６３Ｇ／２７８Ｓ）においてタンパク質分解後に生成された「頭部のない」インフルエンザＨＡタンパク質を含むタンパク質断片。第１の断片（配列番号９４）はストークドメインのＮ末端部分であり、第２の断片（配列番号９６）はアミノ酸位置１２０および１５０（下線；配列番号１において、それぞれアミノ酸位置４０３および４３３に対応する）において２つのチロシンへの変異を含むストークドメインのＣ末端部分である。
【図７１】完全長開始配列（ＰＲ８  ＨＡ、配列番号１）に挿入された２つのプロテアーゼ切断部位（６３Ｇ／２７８Ｓ）においてタンパク質分解後に生成された「頭部のない」インフルエンザＨＡタンパク質を含むタンパク質断片。第１の断片（配列番号９４）はストークドメインのＮ末端部分であり、第２の断片（配列番号９７）はアミノ酸位置１２８および１３９（下線；配列番号１において、それぞれアミノ酸位置４１１および４２２に対応する）において２つのチロシンへの変異を含むストークドメインのＣ末端部分である。
【図７２】完全長開始配列（ＰＲ８  ＨＡ、配列番号１）に挿入された２つのプロテアーゼ切断部位（６３Ｇ／２７８Ｓ）においてタンパク質分解後に生成された「頭部のない」インフルエンザＨＡタンパク質を含むタンパク質断片。第１の断片（配列番号９４）はストークドメインのＮ末端部分であり、第２の断片（配列番号９８）はアミノ酸位置１２０、１２８、１３９および１５０（下線；配列番号１において、それぞれアミノ酸位置４０３、４１１、４２２および４３３に対応する）において４つのチロシンへの変異を含むストークドメインのＣ末端部分である。
【図７３】完全長開始配列（ＰＲ８  ＨＡ、配列番号１）に挿入された２つのプロテアーゼ切断部位（６３Ｇ／２８２Ｓ）においてタンパク質分解後に生成された「頭部のない」インフルエンザＨＡタンパク質を含むタンパク質断片。第１の断片（配列番号９４）はストークドメインのＮ末端部分であり、第２の断片（配列番号９９）はアミノ酸位置１２２および１５２（下線；配列番号１において、それぞれアミノ酸位置４０３および４３３に対応する）において２つのチロシンへの変異を含むストークドメインのＣ末端部分である。
【図７４】完全長開始配列（ＰＲ８  ＨＡ、配列番号１）に挿入された２つのプロテアーゼ切断部位（６３Ｇ／２８２Ｓ）においてタンパク質分解後に生成された「頭部のない」インフルエンザＨＡタンパク質を含むタンパク質断片。第１の断片（配列番号９４）はストークドメインのＮ末端部分であり、第２の断片（配列番号１００）はアミノ酸位置１３０および１４１（下線；配列番号１において、それぞれアミノ酸位置４１１および４２２に対応する）において２つのチロシンへの変異を含むストークドメインのＣ末端部分である。
【図７５】完全長開始配列（ＰＲ８  ＨＡ、配列番号１）に挿入された２つのプロテアーゼ切断部位（６３Ｇ／２８２Ｓ）においてタンパク質分解後に生成された「頭部のない」インフルエンザＨＡタンパク質を含むタンパク質断片。第１の断片（配列番号９４）はストークドメインのＮ末端部分であり、第２の断片（配列番号１０１）はアミノ酸位置１２２、１３０、１４１および１５２（下線；配列番号１において、それぞれアミノ酸位置４０３、４１１、４２２および４３３に対応する）において４つのチロシンへの変異を含むストークドメインのＣ末端部分である。
【図７６】完全長開始配列（ＰＲ８  ＨＡ、配列番号１）に挿入された２つのプロテアーゼ切断部位（６３Ｇ／２８３Ｇ）においてタンパク質分解後に生成された「頭部のない」インフルエンザＨＡタンパク質を含むタンパク質断片。第１の断片（配列番号９４）はストークドメインのＮ末端部分であり、第２の断片（配列番号１０２）はアミノ酸位置１２１および１５１（下線；配列番号１において、それぞれアミノ酸位置４０３および４３３に対応する）において２つのチロシンへの変異を含むストークドメインのＣ末端部分である。
【図７７】完全長開始配列（ＰＲ８  ＨＡ、配列番号１）に挿入された２つのプロテアーゼ切断部位（６３Ｇ／２８３Ｇ）においてタンパク質分解後に生成された「頭部のない」インフルエンザＨＡタンパク質を含むタンパク質断片。第１の断片（配列番号９４）はストークドメインのＮ末端部分であり、第２の断片（配列番号１０３）はアミノ酸位置１２９および１４０（下線；配列番号１において、それぞれアミノ酸位置４１１および４２２に対応する）において２つのチロシンへの変異を含むストークドメインのＣ末端部分である。
【図７８】完全長開始配列（ＰＲ８  ＨＡ、配列番号１）に挿入された２つのプロテアーゼ切断部位（６３Ｇ／２８３Ｇ）においてタンパク質分解後に生成された「頭部のない」インフルエンザＨＡタンパク質を含むタンパク質断片。第１の断片（配列番号９４）はストークドメインのＮ末端部分であり、第２の断片（配列番号１０４）はアミノ酸位置１２１、１２９、１４０および１５１（下線；配列番号１において、それぞれアミノ酸位置４０３、４１１、４２２および４３３に対応する）において４つのチロシンへの変異を含むストークドメインのＣ末端部分である。
【図７９】完全長開始配列（ＰＲ８  ＨＡ、配列番号１）に挿入された２つのプロテアーゼ切断部位（４８Ｇ／２９１Ｇ）においてタンパク質分解後に生成された「頭部のない」インフルエンザＨＡタンパク質を含むタンパク質断片。第１の断片（配列番号９５）はストークドメインのＮ末端部分であり、第２の断片（配列番号１０５）はアミノ酸位置１１３および１４３（下線；配列番号１において、それぞれアミノ酸位置４０３および４３３に対応する）において２つのチロシンへの変異を含むストークドメインのＣ末端部分である。
【図８０】完全長開始配列（ＰＲ８  ＨＡ、配列番号１）に挿入された２つのプロテアーゼ切断部位（４８Ｇ／２９１Ｇ）においてタンパク質分解後に生成された「頭部のない」インフルエンザＨＡタンパク質を含むタンパク質断片。第１の断片（配列番号９５）はストークドメインのＮ末端部分であり、第２の断片（配列番号１０６）はアミノ酸位置１２１および１３２（下線；配列番号１において、それぞれアミノ酸位置４１１および４２２に対応する）において２つのチロシンへの変異を含むストークドメインのＣ末端部分である。
【図８１】完全長開始配列（ＰＲ８  ＨＡ、配列番号１）に挿入された２つのプロテアーゼ切断部位（４８Ｇ／２９１Ｇ）においてタンパク質分解後に生成された「頭部のない」インフルエンザＨＡタンパク質を含むタンパク質断片。第１の断片（配列番号９５）はストークドメインのＮ末端部分であり、第２の断片（配列番号１０７）はアミノ酸位置１１３、１２１、１３２および１４３（下線；配列番号１において、それぞれアミノ酸位置４０３、４１１、４２２および４３３に対応する）において４つのチロシンへの変異を含むストークドメインのＣ末端部分である。
【図８２】完全長開始配列（ＰＲ８  ＨＡ、配列番号１）に挿入された２つのプロテアーゼ切断部位（４８Ｇ／２９１Ｓ）においてタンパク質分解後に生成された「頭部のない」インフルエンザＨＡタンパク質を含むタンパク質断片。第１の断片（配列番号９５）はストークドメインのＮ末端部分であり、第２の断片（配列番号１０８）はアミノ酸位置１１３および１４３（下線；配列番号１において、それぞれアミノ酸位置４０３および４３３に対応する）において２つのチロシンへの変異を含むストークドメインのＣ末端部分である。
【図８３】完全長開始配列（ＰＲ８  ＨＡ、配列番号１）に挿入された２つのプロテアーゼ切断部位（４８Ｇ／２９１Ｓ）においてタンパク質分解後に生成された「頭部のない」インフルエンザＨＡタンパク質を含むタンパク質断片。第１の断片（配列番号９５）はストークドメインのＮ末端部分であり、第２の断片（配列番号１０９）はアミノ酸位置１２１および１３２（下線；配列番号１において、それぞれアミノ酸位置４１１および４２２に対応する）において２つのチロシンへの変異を含むストークドメインのＣ末端部分である。
【図８４】完全長開始配列（ＰＲ８  ＨＡ、配列番号１）に挿入された２つのプロテアーゼ切断部位（４８Ｇ／２９１Ｓ）においてタンパク質分解後に生成された「頭部のない」インフルエンザＨＡタンパク質を含むタンパク質断片。第１の断片（配列番号９５）はストークドメインのＮ末端部分であり、第２の断片（配列番号１１０）はアミノ酸位置１１３、１２１、１３２および１４３（下線；配列番号１において、それぞれアミノ酸位置４０３、４１１、４２２および４３３に対応する）において４つのチロシンへの変異を含むストークドメインのＣ末端部分である。
【図８５Ａ】２９３Ｔ細胞に、示したＨＡジチロシン変異体（４０３Ｙ、４１１Ｙ−４２２Ｙ、４０３Ｙ−４３３Ｙおよび４３３Ｙ−４３５Ｙ）を発現するための構築物をトランスフェクトし、可溶性ＨＡタンパク質（Ｃ末端フォルドンドメインを有する）をＮｉ2+親和性クロマトグラフィーによってトランスフェクションの７２時間後に上清から精製した。次いで純粋なＨＡタンパク質を必要なＡＲＰペルオキシダーゼ酵素の存在（＋）または非存在（−）下でジチロシン架橋結合条件に供し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを還元し、続いてクマシーブルー染色によって分析した。示されるように矢印は単量体および架橋三量体の移動を示す。
【図８５Ｂ−Ｃ】（Ｂ）ジチロシン架橋の形成を確認するために、Ａに記載されているように得た、精製し、架橋したおよび架橋していない試料を、ＤＴ−特異的蛍光：励起波長：３２０ｎｍ、発光波長：４０５ｎｍについて分析した。（Ｃ）２０μｇ／ｍｌの８Ｄ４での直接捕捉ＥＬＩＳＡによる架橋結合前後の広域中和ＶH１−６９ストーク特異的ｍＡｂ  ８Ｄ４との可溶性４０３Ｙ−４３３Ｙ  ＨＡ変異体の結合。
【図８６Ａ】（Ａ）２９３Ｔ細胞に、ＨＡ（ＷＴおよび示した挿入変異体）およびＮＡを発現するためのプラスミドをトランスフェクトした。ウイルス様粒子を、球状頭部抗体、ＰＹ−１０２を有するトランスフェクトした細胞上清から直接捕捉ＥＬＩＳＡによって分析した。
【図８６Ｃ】（Ｂ）５０μｇ／ｍｌ（上清中のＨＡの存在について正規化した）での直接捕捉ＥＬＩＳＡによる広域中和ＶH１−６９ストーク特異的ｍＡｂとの単一挿入ＨＡ変異体（位置６３、２７８および２８６において挿入）の結合。（Ｃ）Ａに記載されているように得たＶＬＰを３０％スクロース−ＮＴＥクッション上で精製した。次いで１０ｕｇの総タンパク質を、製造業者の指示書に従ってＴＥＶプロテアーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）の存在（＋）または非存在（−）下で切断緩衝液中でインキュベートした。抗ＨＡ２抗体を使用したウェスタンブロットによって切断効率をモニターした。矢印は切断産物を示す。
【図８７Ａ】（Ａ）２９３Ｔ細胞に、ＨＡ（ＷＴおよび示した二重挿入変異体）およびＮＡを発現するためのプラスミドをトランスフェクトした。ウイルス様粒子を、球状頭部抗体、ＰＹ−１０２を有するトランスフェクトした細胞上清から直接捕捉ＥＬＩＳＡによって分析した。
【図８７Ｂ】（Ｂ）５０μｇ／ｍｌ（上清中のＨＡの存在について正規化した）での直接捕捉ＥＬＩＳＡによる２つの広域中和ＶH１−６９ストーク特異的ｍＡｂとの二重挿入ＨＡ変異体（位置６３＋２７８および６３＋２８６において挿入）の結合。
【図８８】野生型ＰＲ８  ＨＡアミノ酸配列（配列番号１）の位置２９１において挿入されたプロテアーゼ切断部位におけるタンパク質分解後に生成したインフルエンザＨＡ  Ｃ末端断片のアミノ酸配列。配列番号１０８の配列は、位置１１３および１４３（下線；配列番号１のそれぞれ位置４０３および４３３に対応する）においてチロシンへの変異を含む。配列番号１０９の配列は位置１２１および１３２（下線；配列番号１のそれぞれ位置４１１および４２２に対応する）においてチロシンへの変異を含む。配列番号１１０の配列は、位置１１３、１２１、１３２および１４３（下線；配列番号１のそれぞれ位置４０３、４１１、４２２および４３３に対応する）においてチロシンへの変異を含む。Ｃ末端膜貫通領域は各配列において下線を引かれている。
【図８９】インフルエンザＨＡタンパク質Ｃ末端断片のアミノ酸配列（配列番号１１７）。この断片は、野生型ＰＲ８  ＨＡアミノ酸配列（配列番号１）の位置２９１において挿入されたプロテアーゼ切断部位におけるタンパク質分解後に生成される。下線のアミノ酸残基Ｎ１１２、Ｆ１１５、Ｋ１２０、Ｎ１３１、Ｄ１３７、Ｌ１４１、Ｄ１４２およびＷ１４４は、チロシンへの変異がジ−チロシン結合の形成を容易にするために作製されていてもよい配列番号１１７における位置を示す。下線の残基は、配列番号１のそれぞれ位置Ｎ４０３、Ｆ４０６、Ｋ４１１、Ｎ４２２、Ｄ４２９、Ｌ４３２、Ｄ４３３およびＷ４３５に対応する。Ｃ末端膜貫通領域は下線を引かれている。いくつかの態様において、膜貫通領域は存在しない（すなわち、断片は、最後の４６アミノ酸残基（配列番号１１７の２２９〜２７４）を含有しないが、配列番号１１７の残基１〜２２８を含有する）。位置１７および１４６におけるチロシン残基（太字のイタリック体で示される）はジチロシン結合の形成に使用されていてもよい内因性チロシン残基である。これらの内因性残基は配列番号１のそれぞれ位置３０８および４３７におけるチロシン残基に対応する。
【発明の詳細な説明】
【００３２】
本発明は、インフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体（たとえば、その天然立体構造を有し、インタクトな頭部ドメインを含んでいてもよいか、または含んでいなくてもよいストークドメインを含むもの）、このようなポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体を作製する方法、このようなポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体を含む組成物（たとえば、医薬組成物およびワクチン組成物）、ならびにたとえばワクチン接種方法、治療方法および他の方法においてこのようなポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体を使用する方法を部分的に提供する。いくつかの態様において、インフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体は、たとえばインフルエンザワクチンにおいて免疫原として有用であってもよい。
【００３３】
定義および略語
本明細書に使用される「約」および「およそ」という用語は、数値に関して使用される場合、述べられている値の＋または−２０％以内を意味する。
【００３４】
ここで使用される「ＨＡ」という略語は、ヘマグルチニンタンパク質を指す。ここで使用される「Ａｂ」という略語は、抗体を指す。ここで使用される「ｂｎＡｂｓ」という略語は、広域中和抗体を指す。ここで使用される「ＱＮＥ」という略語は、四次中和エピトープ（quaternary neutralizing epitope）を指す。ここで使用される「ＤＴ」という略語は、ジ−チロシンを指す。ここで使用される「完全長」という語句は、インフルエンザＨＡタンパク質またはポリペプチドに関して使用される場合、野生型インフルエンザＨＡタンパク質と同じ長さであるＨＡタンパク質またはポリペプチドであることを要しない。むしろこの用語は、少なくともストークドメインと頭部ドメインの両方を含むインフルエンザＨＡタンパク質またはポリペプチドを指すために使用される。このようなストークおよび頭部ドメインは、野生型インフルエンザＨＡタンパク質またはポリペプチドに見出されるものと同じ長さであってもよいか、または同じ長さでなくてもよい。たとえば、野生型インフルエンザＨＡタンパク質またはポリペプチドに見出される膜貫通ドメインを欠いているインフルエンザＨＡタンパク質またはポリペプチドは、それがストークドメインおよび頭部ドメインを有する場合、ここで「完全長」ＨＡタンパク質またはポリペプチドとさらに称されていてもよい。いくつかの態様において、「完全長」という語句は、インフルエンザＨＡタンパク質またはポリペプチドに関して使用される場合、ストークおよび頭部ドメインに加えて、膜貫通ドメインも含むインフルエンザＨＡタンパク質またはポリペプチドを指していてもよい。ここで使用される「可溶性」という語句は、インフルエンザＨＡタンパク質またはポリペプチドに関して使用される場合、膜貫通ドメインを含まないインフルエンザＨＡタンパク質またはポリペプチドを指す。このような可溶性ＨＡタンパク質またはポリペプチドは、ストークドメインおよび頭部ドメイン、または頭部ドメインが存在しないストークドメインのいずれかを含んでいてもよい。
【００３５】
ここで使用される「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は、他に述べられていない限り、交換可能に使用される。ここで使用される「タンパク質複合体」という用語は、２つ以上のタンパク質またはタンパク質サブユニットの集合、たとえば２つ以上の単量体を指す。他に述べられていない限り、タンパク質および／またはポリペプチドに関するここでの全ての説明はタンパク質複合体に同様に適用され、逆もまた同様である。
【００３６】
ここで使用される「安定化された」および「固定された」という用語は、たとえば、インフルエンザＨＡタンパク質、ポリペプチドまたはタンパク質複合体のストークドメインをその天然の三量体立体構造に安定化させるか、または固定する際の架橋結合の効果に関して交換可能に使用される。これらの用語は１００％の安定性を必要としない。むしろこれらの用語は、改良されたか、または増加した安定性の程度を示す。たとえば、いくつかの態様において、「安定化された」という用語が、その天然の三量体立体構造における架橋されたストークドメインに関して使用される場合、この用語は、ストークドメインの天然の三量体立体構造が、このような架橋結合の前に有していたか、または有していないものより大きな安定性を有することを示す。安定性および相対的安定性は、たとえば、ストークドメインの天然の三量体立体構造の半減期に基づいて本出願の他の項に記載されている種々の手段で測定されていてもよい。安定性の改良または増加は、意図する用途に有用または有意である任意の程度であってもよい。たとえば、いくつかの態様において、安定性は、約１０％、２５％、５０％、１００％、２００％（すなわち２倍）、３００％（すなわち３倍）、４００％（すなわち４倍）、５００％（すなわち５倍）、１０００％（すなわち１０倍）またはそれ以上増加していてもよい。
【００３７】
ここで使用される「ステム」および「ストーク」という用語は、インフルエンザＨＡタンパク質またはポリペプチドのストークドメインまたはその一部を指すように交換可能に使用される。
【００３８】
ここで使用される「操作された」という用語は、本発明のインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体に関して使用される場合、これらのポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体の野生型バージョンと比較して、たとえば、限定されないが、野生型ポリペプチド、タンパク質および／もしくはタンパク質複合体（たとえば膜貫通ドメインまたは頭部ドメイン）の特定の部分もしくはドメインの除去もしくは破壊の手段による、または１つ以上の点変異の導入（たとえばジ−チロシン結合の形成を容易にするために導入されたもの）による、または野生型ポリペプチド、タンパク質および／もしくはタンパク質複合体に通常存在しない１つ以上のプロテアーゼ認識モチーフの導入の手段による、またはその野生型形態と比較してポリペプチド、タンパク質および／もしくはタンパク質複合体の任意の他の修飾による、いくつかの手段で改変されているインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体を概して指す。
【００３９】
他の定義および略語が本明細書全体にわたって見られる。
【００４０】
インフルエンザおよびインフルエンザウイルス
一般に「インフル（flu）」として知られているインフルエンザは、インフルエンザウイルスである、オルトミクソウイルス科のＲＮＡウイルスによって引き起こされるトリおよび哺乳動物の感染疾患である。インフルエンザは季節的流行として世界中に広がり、１年に約３００万〜５００万人の重症疾患の症例および１年に約２５０，０００〜５００，０００人の死、いくつかの大流行の年には数百万人に増加する死をもたらす。２０世紀において、３回のインフルエンザ大流行が発生し、各々はヒトにおけるウイルスの新規株の出現によって引き起こされ、何千万人もの人々を殺した。多くの場合、既存のインフルウイルスが別の動物種からヒトに伝播する場合、または既存のヒト株が、通常トリまたはブタに感染するウイルスから新規遺伝子を取得する場合に新規インフルエンザ株が出現する。
【００４１】
３種の異なる種類のインフルエンザウイルス、Ａ型、Ｂ型およびＣ型と、これらの型に含まれる種々の亜型および株が存在する。
【００４２】
インフルエンザＡ型ウイルスは３種のインフルエンザ型の中で最も悪性のヒト病原体であり、最も重症の疾患を引き起こす。インフルエンザＡウイルスは、限定されないが、Ｈ１Ｎ１（１９１８年にスペイン風邪および２００９年豚インフルを引き起こした）、Ｈ２Ｎ２（１９５７年にアジア風邪を引き起こした）、Ｈ３Ｎ２（１９６８年にホンコン風邪を引き起こした）、Ｈ５Ｎ１（２００４年に鳥インフルを引き起こした）、Ｈ７Ｎ７、Ｈ１Ｎ２（ヒト、ブタおよびトリに固有である）、Ｈ９Ｎ２、Ｈ７Ｎ２、Ｈ７Ｎ３、Ｈ１０Ｎ７およびＨ７Ｎ９を含む、異なる亜型または血清型に細分され得る。野生の水鳥は多種多様のインフルエンザＡについての自然宿主である。しかしながら、家禽、たとえばシチメンチョウおよびニワトリもまた、鳥インフルエンザにより重病および死に至る可能性があり、いくつかの鳥インフルエンザＡウイルスもまた、野生のトリにおいて重大疾患および死を引き起こす可能性がある。
【００４３】
インフルエンザＢ型はほとんどヒトだけに感染し、インフルエンザＡよりも一般的ではない。インフルエンザＢ感染に感受性があることが知られている唯一の他の動物はアシカおよびフェレットである。インフルエンザＢ型はＡ型より２〜３倍遅い速度で変異するので、遺伝的多様性は少なく、１つのみのインフルエンザＢ血清型が知られているだけである。抗原的多様性のこの欠如の結果として、インフルエンザＢに対する免疫度は通常、若年時に獲得される。しかしながら、インフルエンザＢは、持続免疫が可能ではないほど頻繁に変異する。
【００４４】
インフルエンザＣ型ウイルスは、ヒト、イヌおよびブタに感染し、時々、重病と局所的流行の両方を引き起こす。しかしながら、インフルエンザＣは他の種類より一般的ではなく、通常、軽度の疾患を引き起こすだけである。
【００４５】
インフルエンザウイルスＡ、ＢおよびＣは、それらの全体構造が非常に類似している。それらの各々は、２つの主な種類の糖タンパク質を含有するウイルスエンベロープ、ならびにウイルスＲＮＡゲノムおよび他のウイルスタンパク質を含有する中心コアを含む。ヘマグルチニン（「ＨＡ」）およびノイラミニダーゼ（「ＮＡ」）は２つの大きなエンベロープ糖タンパク質である。ＨＡは、標的細胞とのウイルスの結合およびウイルスゲノムの標的細胞内への侵入を媒介するレクチンである。種々のインフルエンザＡ亜型は、ＨＡおよびＮＡタンパク質に対するそれらの抗体反応に基づいて分類される。たとえば、「Ｈ７Ｎ２ウイルス」はＨＡ７タンパク質およびＮＡ２タンパク質を有するインフルエンザＡ亜型を示す。同様に、「Ｈ５Ｎ１」ウイルスはＨＡ５タンパク質およびＮＡ１タンパク質を有する。現在、約１７種の公知のＨＡ亜型および約１０種の公知のＮＡ亜型が存在する。ＨＡとＮＡタンパク質の多くの異なる組合せが可能である。インフルエンザＡ亜型Ｈ１Ｎ１、Ｈ１Ｎ２およびＨ３Ｎ２が現在、ヒト個体群において一般的に循環している主な型である。トリとヒトの両方に感染することが知られている鳥インフルエンザＡウイルスのいくつかの目立った亜型−たとえばＨ５Ｎ１、Ｈ７Ｎ２、Ｈ７Ｎ７、Ｈ７Ｎ３およびＨ７Ｎ７亜型も存在する。
【００４６】
インフルエンザＡ型において、所望の場合、種々の異なる手段で種々の異なるインフルエンザ亜型をグループ分けできる。たとえば、インフルエンザＡ型亜型は、それらのＨＡタンパク質に基づいて異なる抗原群および抗原サブグループに頻繁に分類またはグループ分けされる。このようなグループ分けは抗原性および異なるサブグループ間のＨＡ配列同一性の程度に関連する。同じ抗原性群または抗原性サブグループのインフルエンザ亜型は、他の抗原性群のものよりも抗原性およびＨＡ配列に関して互いにより類似している。抗原性群１は、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３およびＨ１６インフルエンザＡ亜型からなる。抗原性群２は、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ１４、Ｈ７、Ｈ１０およびＨ１５インフルエンザＡ亜型からなる。抗原性群１において、３種の抗原性サブグループが存在し、それらはここで抗原性サブグループ１Ａ、１Ｂおよび１Ｃと称される。抗原性サブグループ１Ａは、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ５およびＨ６インフルエンザＡ亜型からなる。抗原性サブグループ１Ｂは、Ｈ１１、Ｈ１３およびＨ１６インフルエンザＡ亜型からなる。抗原性サブグループ１Ｃは、Ｈ８、Ｈ９およびＨ１２インフルエンザＡ亜型からなる。
【００４７】
ここでいくつかの態様において、本発明のＨＡポリペプチド、タンパク質およびタンパク質複合体は、Ａ、ＢまたはＣ型を含む任意のインフルエンザ型由来のＨＡ配列から生成される。ここでいくつかの態様において、本発明のＨＡポリペプチド、タンパク質およびタンパク質複合体は、インフルエンザＡ型由来のＨＡ配列から生成される。ここでいくつかの態様において、本発明のＨＡポリペプチド、タンパク質およびタンパク質複合体は、インフルエンザＡ型、抗原性群１由来のＨＡ配列から生成される。ここでいくつかの態様において、本発明のＨＡポリペプチド、タンパク質およびタンパク質複合体は、インフルエンザＡ型、抗原性群１Ａ由来のＨＡ配列から生成される。
【００４８】
ここでいくつかの態様において、本発明のＨＡポリペプチド、タンパク質およびタンパク質複合体は、対象をワクチン接種し、Ａ、ＢまたはＣ型を含むいずれかのインフルエンザ型に対する防御を提供するために使用できる。ここでいくつかの態様において、本発明のＨＡポリペプチド、タンパク質およびタンパク質複合体は、対象をワクチン接種し、インフルエンザＡ型に対する防御を提供するために使用できる。ここでいくつかの態様において、本発明のＨＡポリペプチド、タンパク質およびタンパク質複合体は、対象をワクチン接種し、インフルエンザＡ型、抗原性群１に対する防御を提供するために使用できる。ここでいくつかの態様において、本発明のＨＡポリペプチド、タンパク質およびタンパク質複合体は、対象をワクチン接種し、インフルエンザＡ型、抗原性群１Ａに対する防御を提供するために使用できる。ここでいくつかの態様において、本発明のＨＡポリペプチド、タンパク質およびタンパク質複合体は、対象をワクチン接種し、インフルエンザ亜型Ｈ１に対する防御を提供するために使用できる。ここでいくつかの態様において、本発明のＨＡポリペプチド、タンパク質およびタンパク質複合体は、対象をワクチン接種し、インフルエンザ亜型Ｈ１およびＨ２に対する防御を提供するために使用できる。ここでいくつかの態様において、本発明のＨＡポリペプチド、タンパク質およびタンパク質複合体は、対象をワクチン接種し、インフルエンザ亜型Ｈ１、Ｈ２およびＨ５に対する防御を提供するために使用できる。ここでいくつかの態様において、本発明のＨＡポリペプチド、タンパク質およびタンパク質複合体は、対象をワクチン接種し、インフルエンザ亜型Ｈ１、Ｈ２、Ｈ５およびＨ６に対する防御を提供するために使用できる。
【００４９】
以下の表ＡおよびＢは、Ｈ１Ｎ１株ＰＲ８のＨＡタンパク質またはＨＡタンパク質の特定の断片と、抗原性群１および２由来のいくつかを含む、他のインフルエンザ亜型および株由来の対応するタンパク質または断片との間の配列同一性のいくつかの例を提供する。
【００５０】
【表Ａ】
0006704849.tif 000002
【００５１】
【表Ｂ】
0006704849.tif 000003
【００５２】
上記の表に示される配列同一性に加えて、ＰＲ８（配列番号１）と、インフルエンザＨＡタンパク質のタンパク質分解による切断後に存在しているＣ末端断片にわたるＨ６、Ｈ９、Ｈ１１およびＨ１３亜型の配列との間の同一性パーセントは、それぞれ６８．２％、５４．７％、５６．２％および５０．５％であることを見出した。
【００５３】
インフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質およびタンパク質複合体
いくつかの態様において、本発明は、操作されたインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体、そのようなポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体を含む組成物、ならびにそのようなポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体を使用する方法を提供する。そのようなタンパク質は、出発点として任意の適切なインフルエンザウイルスＨＡタンパク質を使用して作製できる。たとえば、本発明のタンパク質は、出発点として任意の適切なインフルエンザ型（たとえばＡ、ＢまたはＣ）、インフルエンザウイルスの亜型（限定されないが、Ｈ１Ｎ１、Ｈ１Ｎ２およびＨ３Ｎ２亜型を含む）または株（たとえばＨ１Ｎ１  Ａ／プエルトリコ／８／１９３４（「ＰＲ８」）株（配列番号１））由来のインフルエンザＨＡタンパク質を使用して作製できる。ここで記載されているインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体の重要な性質の１つは、それらが、非常に変わりやすい頭部ドメインと異なるＨＡタンパク質の三量体ストークドメインを含むことであり、そのＨＡタンパク質の三量体ストークドメインは、インフルエンザ型、亜型および株の間でより保存されている。したがって、インフルエンザウイルスの同種の型、亜型および株に対する（すなわち、ここで記載されているインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体を作製するための出発点として使用される同じ型、亜型および／または株のインフルエンザウイルスに対する）ワクチン免疫原として有用であることに加えて、本発明のＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体はまた、インフルエンザウイルスの異種の型、亜型および株に対する（すなわち、操作されたＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体を作製するための出発点として使用されるものと異なる型、亜型および／または株のインフルエンザウイルスに対する）ワクチン免疫原として有用であってもよい。
【００５４】
いくつかの態様において、本発明は、インフルエンザＨＡタンパク質のストークドメインをその天然の三量体立体構造に安定化させるためのアプローチであって、架橋され得るか、またはされるべきであるインフルエンザＨＡタンパク質内の特定の場所を提供すること、およびこのような架橋の形成を容易にできるＨＡタンパク質の変異型を提供することを含む、アプローチを提供する。このような架橋および変異は、（たとえば、野生型ＨＡタンパク質の文脈においてまたは任意の人口の変異もしくは他の人口の修飾を含まないＨＡタンパク質の文脈において）単独で使用されていてもよいか、または１つ以上の他の人口の変異、修飾、架橋もしくは安定化戦略と組み合わせて使用されていてもよい。したがって、たとえば、ここで記載されているアプローチは、付加されるフォルドン三量体形成ドメイン、安定化抗体（たとえば、６Ｆ１２、Ｃ１７９、ＣＲ６２６１、Ｆ１０、Ａ６６およびＤ８）、および／または他の部分的もしくは潜在的な安定化修飾もしくは変異の使用と共に使用されていてもよい。
【００５５】
本発明者らは、インフルエンザＨＡタンパク質の構造の広範な分析を実施し、種々の新規設計戦略および新規の操作されたインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体を開発した。本発明はまた、このようなインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体を作製し、使用するための方法を提供する。いくつかの態様において、本発明はインフルエンザＨＡタンパク質のアミノ酸配列内の特定の場所を提供し、その場所においてまたはその場所の間で、ＨＡタンパク質のストークドメインをその天然の三量体立体構造に「固定」するために標的架橋を作製できる。いくつかの態様において、標的架橋はジ−チロシン架橋である。ジ−チロシン架橋が使用される場合、本発明は、既存のチロシン残基を含むか、またはジ−チロシン架橋を作製できるようにチロシン残基へ変異され得るか、もしくはされるかのいずれかである特定のアミノ酸残基（またはアミノ酸残基の対合）を提供する。
【００５６】
ここで記載されている操作されたインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体は、ＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体が、ストークドメイン、あるいは天然の三量体立体構造を有するストークドメインに折り畳むことができるか、もしくはその一部を形成でき、および／または１つ以上の抗ストーク抗体と結合できるストークドメインの一部を有するという条件で、任意の適切なインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体、たとえば野生型（ＷＴ）インフルエンザＨＡタンパク質もしくはポリペプチド、またはインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／もしくはタンパク質複合体の変異体、ホモログ、誘導体、類似体、オルソログもしくは任意の他の誘導体の配列に基づいて作製できる。適切なインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体のアミノ酸配列、ならびにこのようなインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体をコードする核酸配列は当該分野において公知であり、任意のこのようなアミノ酸または核酸配列が使用されていてもよい。さらに、いくつかの適切なインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体のアミノ酸配列、ならびにこのようなインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体をコードする核酸配列がここで提供される。任意の適切なインフルエンザウイルスＨＡタンパク質が、ここで記載されている可溶性インフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体を作製するための出発点として使用され得るが、このようなＨＡタンパク質は、ストークドメイン、または天然の三量体立体構造に折り畳むことができ、および／もしくは１つ以上の抗ストーク抗体、たとえば中和抗ストーク抗体と結合できるストークドメインの一部を少なくとも含むべきである。いくつかの態様において、出発点として使用されるＨＡタンパク質は、頭部ドメインおよびストークドメイン、ならびに任意にまた、膜貫通ドメインを含む完全長野生型ＨＡタンパク質である。いくつかの態様において、使用されるＨＡタンパク質は膜貫通ドメインを欠くか、または機能的もしくはインタクトな膜貫通ドメインを欠く。いくつかの態様において、ＨＡタンパク質はＴ４フォルドン三量体形成モチーフを含む。いくつかの態様において、ここで記載されているインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体を作製するための出発点として使用されるＨＡタンパク質は、（ａ）ストークドメイン、または天然の三量体立体構造に折り畳むことができ、および／もしくは１つ以上の中和抗ストーク抗体と結合できるストークドメインの一部を含み、（ｂ）Ｔ４フォルドン三量体形成モチーフを含み、（ｃ）機能的またはインタクトな膜貫通ドメインを欠く。
【００５７】
本特許明細書全体にわたって、参照が、特定のアミノ酸残基の番号（たとえばアミノ酸残基４０３および４２２など）を参照することによってインフルエンザＨＡタンパク質におけるそれらのアミノ酸残基または特定のアミノ酸領域に対してなされる場合、他に記載されない限り、その番号付けは、図９および配列番号１（これはインフルエンザ株ＰＲ８（インフルエンザＡ型−Ｈ１Ｎ１亜型）由来の野生型ＨＡタンパク質のアミノ酸配列である）における、ここで提供されるＨＡアミノ酸配列に基づく。しかしながら、たとえば、（たとえば、図２６および２７ならびにここでの他の図面および配列の多くに示されるように）配列番号１と比較して付加または除去される追加のアミノ酸残基が存在する場合、異なるＨＡ配列が異なる番号付け方式を有していてもよいことは留意されるべきであり、当業者は理解するであろう。このように、特定のアミノ酸残基がそれらの番号で称される場合、その説明は、所与のアミノ酸配列の開始から数えて正確にその番号付けした位置にある唯一のアミノ酸に限定されず、むしろ、たとえその残基が同じ正確な番号付けした位置になくても、たとえば、ＨＡ配列が配列番号１より短いか、もしくは長い場合、または配列番号１と比較して挿入もしくは欠失を有する場合、任意および全てのＨＡ配列における等価／対応するアミノ酸残基が意図されることは理解される。当業者は、たとえば、所与のＨＡ配列を配列番号と並べることによって、ここで挙げられている特定の番号付けした残基のいずれかと対応する／等価のアミノ酸位置がどれであるかを容易に決定できる。したがって、インフルエンザＨＡタンパク質の特定のアミノ酸残基が参照される態様において、本発明は、これらの正確な番号付けされたアミノ酸位置のみに特定のアミノ酸特性（たとえば、チロシン残基、変異またはプロテアーゼ認識部位の挿入などの存在）を有する配列に限定されないことは理解される。むしろ、特定のアミノ酸特性は、配列番号１のＰＲ８インフルエンザＨＡタンパク質について挙げられている番号付けされた位置と等価である／対応する任意のインフルエンザＨＡタンパク質における任意の位置にあってもよい。この説明は、参照が、特定の核酸残基の番号を参照することによりインフルエンザＨＡタンパク質をコードするヌクレオチド配列におけるそれらの核酸残基または特定の核酸領域に対してなされている場合に同様に当てはまる。したがって、他に記載されない限り、番号付けは、図１０および配列番号２における、ここで提供されるヌクレオチド配列に基づく。
【００５８】
いくつかの態様において、本発明のインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体は、限定されないが、（たとえば、完全長形態（配列番号１）または可溶性形態（配列番号８０；もしくはそのアミノ酸残基１〜５１９の）Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルスのＰＲ８株のアミノ酸配列、（たとえば、完全長形態（配列番号７３）またはそのアミノ酸残基１〜５２０を含む可溶性形態の）Ｈ３Ｎ２インフルエンザウイルスのウドーン７２株のアミノ酸配列、（たとえば、完全長形態（配列番号７４）または可溶性形態（配列番号８１；もしくはそのアミノ酸残基１〜５２０）の）Ｈ３Ｎ２インフルエンザウイルスの香港６８株のアミノ酸配列、（たとえば、完全長形態（配列番号７５）またはそのアミノ酸残基１〜５２０を含む可溶性形態の）Ｈ３Ｎ２インフルエンザウイルスのパナマ９９株のアミノ酸配列、（たとえば、完全長形態（配列番号７６）または可溶性形態（配列番号８２；もしくはそのアミノ酸残基１〜５２０）の）Ｈ３Ｎ２インフルエンザウイルスのウィスコンシン０５株のアミノ酸配列、（たとえば、完全長形態（配列番号７７）または可溶性形態（配列番号８４；もしくはそのアミノ酸残基１〜５１４）の）Ｈ７Ｎ９インフルエンザウイルスの上海１３株のアミノ酸配列、（たとえば、完全長形態（配列番号７８）または可溶性形態（配列番号８５；もしくはそのアミノ酸残基１〜５１５）の）Ｈ２Ｎ２インフルエンザウイルスのシンガポール５７株のアミノ酸配列、（たとえば、完全形態（配列番号７９）または可溶性形態（配列番号８３；もしくはそのアミノ酸残基１〜５２１）の）Ｈ５Ｎ１インフルエンザウイルスのベトナム０４株のアミノ酸配列、（たとえば、完全長形態（配列番号１１１）またはそのアミノ酸残基１〜５１９を含む可溶性形態の）Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルスのＵＳＳＲ  ７７株のアミノ酸配列、（たとえば、完全長形態（配列番号１１２）またはそのアミノ酸残基１〜５１９を含む可溶性形態の）Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルスのテキサス９１株のアミノ酸配列、（たとえば、完全長形態（配列番号１１３）またはそのアミノ酸残基１〜５１８を含む可溶性形態の）Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルスのＷＳＮ  ３３株のアミノ酸配列、（たとえば、完全長形態（配列番号１１４）またはアミノ酸１〜５１９を含む可溶性形態の）Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルスのサウスカロライナ１９１８株のアミノ酸配列、（たとえば、完全長形態（配列番号１１５）またはアミノ酸１〜５１９を含む可溶性形態の）Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルスのカリフォルニア０９株のアミノ酸配列、あるいはそれらのいずれかの断片を含む、当該分野において公知の任意の適切なインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体配列のアミノ酸配列に由来していてもよい（またはそれを含んでいてもよいか、それから本質的になっていてもよいか、もしくはそれからなっていてもよい）。いくつかの態様において、本発明のインフルエンザＨＡタンパク質およびポリペプチドは、任意の公知のインフルエンザＨＡ配列または任意の公知のインフルエンザ群、亜群、科、亜科、型、亜型、属、種、株および／もしくはクレード、またはそれらのいずれか��断片由来のＨＡ配列と少なくとも約４０％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列に由来していてもよい（またはそれを含んでいてもよいか、それから本質的になっていてもよいか、またはそれからなっていてもよい）。さらに、多数の特定のアミノ酸およびヌクレオチド分子ならびにここで提供される配列（配列番号１〜１１０を含む）に加えて、本発明はまた、いずれかのこのような分子および配列と少なくとも約４０％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸およびヌクレオチド分子ならびに配列を提供し、包含する。したがって、特定の配列または特定の配列番号（たとえば配列番号１〜１１０）を参照している、ここでのあらゆる態様に関して、本発明はまた、このような特定の配列または配列番号と少なくとも約４０％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸およびヌクレオチド分子ならびに配列を含むこのような態様の変形も含む。
【００５９】
いくつかの態様において、本発明は、ストークドメイン（たとえば、その天然の三量体立体構造を有するか、または形成できる）を含み、頭部ドメインを含まない、操作されたインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体を提供する。このようなポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体は、「頭部のない」インフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体と称されていてもよい。
【００６０】
いくつかの態様において、本発明は、その天然の三量体立体構造を有するストークドメインおよび頭部ドメインを含む、インフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体を提供する。このようなタンパク質は、「頭部のある（head-on）」インフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体と称されていてもよい。いくつかの態様において、このようなポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体はまた、頭部ドメインのタンパク質分解による破壊および／または除去のために使用できる１つ以上の操作されたプロテアーゼ認識モチーフを含んでいてもよい。いくつかの態様において、このような頭部のあるインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体は、たとえば、ここで記載されているように、「頭部のない」インフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体の産生における中間体として有用であってもよい。
【００６１】
「頭部のない」ＨＡバリアントは様々な方法によって得ることができるか、または生成できる。たとえば、いくつかの態様において、頭部のないＨＡバリアントは、ＨＡ頭部ドメインの全てまたは一部の除去によって、たとえば、頭部ドメインのタンパク質分解による除去によって、または別の他の適切な手段によって得ることができる。他の態様において、頭部のないＨＡバリアントはストークドメインのみをコードするヌクレオチド配列の発現によって得ることができる。いくつかの態様において、「頭部のない」ＨＡバリアントは、タンパク質に挿入されるプロテアーゼ認識モチーフにおける完全長インフルエンザＨＡタンパク質のタンパク質分解による切断によって生成でき、それにより切断後に、頭部ドメイン配列が切り取られ、ストークドメインを含む少なくとも２つのタンパク質断片が残る。図２７は、プロテアーゼ切断モチーフの例を示し、プロテアーゼ処理後に切り取られる頭部ドメインの介在配列を示す。したがって、いくつかの態様において、たとえば図２７に示されるように、「頭部のない」インフルエンザＨＡバリアントは、ストークドメインを含む、少なくとも２つのタンパク質断片、たとえばＮ末端断片およびＣ末端断片を含む。いくつかの態様において、「頭部のない」インフルエンザタンパク質の１つ以上の断片は１つ以上のチロシンへの変異および／または１つ以上のジチロシン架橋を含む。このような変異および／または架橋は典型的に、「頭部のない」ＨＡタンパク質のＣ末端断片に存在する。（たとえば配列番号９６〜１１０および１１７を参照のこと）。図７０〜８４および８９はいくつかのこのようなＨＡペプチドの例を示す。いくつかの態様において、このようなペプチド（たとえば、配列番号９６〜１１０および１１７）は、頭部ドメインを含む、より大きなＨＡ分子内に含まれていてもよいか、またはそれらは「頭部のない」ＨＡタンパク質に存在していてもよい。いくつかの態様において、いくつかのこのようなペプチドは、三量体ストークドメインにあるか、または三量体ストークドメインを形成できるＨＡタンパク質複合体を形成するために会合していてもよい。いくつかの態様において、インフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体は、配列番号１０８、１０９、１１０のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、インフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体は、配列番号９４および配列番号９６のアミノ酸配列、または配列番号９４および配列番号９７のアミノ酸配列、または配列番号９４および配列番号９８のアミノ酸配列、または配列番号９４および配列番号９９のアミノ酸配列、または配列番号９４および配列番号１００のアミノ酸配列、または配列番号９４および配列番号１０１のアミノ酸配列、または配列番号９４および配列番号１０２のアミノ酸配列、または配列番号９４および配列番号１０３のアミノ酸配列、または配列番号９４および配列番号１０４のアミノ酸配列、または配列番号９５および配列番号１０６のアミノ酸配列、または配列番号９５および配列番号１０７のアミノ酸配列、または配列番号９５および配列番号１０８のアミノ酸配列、または配列番号９５および配列番号１０９のアミノ酸配列、または配列番号９５および配列番号１１０のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、インフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体は、配列番号９４または配列番号９５を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなるＮ末端ＨＡペプチド、および配列番号９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９もしくは１１０を含むか、それから本質的になるか、もしくはそれからなるＣ末端ＨＡペプチド、または配列番号１のアミノ酸残基２２９〜５１９を含むか、それから本質的になるか、もしくはそれからなるＣ末端ＨＡペプチド（ここで、そのアミノ酸配列は、アミノ酸位置４０３、４０６、４１１、４２２、４２９、４３２、４３３もしくは４３５の１つ以上においてチロシンへの点変異を含む）、または配列番号１１７のアミノ酸残基１〜２２８を含むか、それから本質的になるか、もしくはそれからなるＣ末端ＨＡペプチド（ここで、そのアミノ酸配列は、アミノ酸位置１１２、１１５、１２０、１３１、１３７、１４１、１４２または１４４の１つ以上においてチロシンへの点変異を含む）を含む。
【００６２】
ＰＲ８  ＨＡアミノ酸配列（配列番号１）のアミノ酸残基１〜５８（または残基１〜１７に位置するシグナルペプチドを有さない１８〜５８）および２９２〜５６６（または膜貫通ドメインおよび細胞質尾部を有さない２９２〜５２９）はインフルエンザＨＡストークドメイン配列を表すことに留意されるべきである。ストークドメインは不連続であり、ＨＡタンパク質のＮ末端とＣ末端部分の両方を含む。ここで提供されるアミノ酸配列は、存在していてもよいか、もしくは部分的に存在していてもよいさらなるドメインを含んでいてもよいか、またはいくつかの態様において存在していないが、他の態様において、たとえば頭部ドメイン（たとえばＰＲ８  ＨＡアミノ酸配列（配列番号１）のアミノ酸残基５９〜２９１）、ならびに／または膜貫通および細胞質領域（たとえばＰＲ８  ＨＡアミノ酸配列（配列番号１）のアミノ酸残基５２９または５３０〜５６５）、ならびに／またはシグナルペプチド（たとえばＰＲ８  ＨＡアミノ酸配列（配列番号１）のアミノ酸残基１〜１７）、ならびに／または１つ以上の任意の外因性（非ＨＡ）配列、たとえばエピトープタグ、フォルドンドメインなどを含んでいてもよい。たとえば、いくつかの態様において、任意のフォルドン三量体形成ドメイン、トロンビン切断部位、６ｘＨｉｓ−タグ（配列番号１１８）および／または連鎖球菌タグが存在していてもよい。いくつかの態様において、これらのさらなる配列は存在していなくてもよいか、修飾されていてもよいか、再配列されていてもよいか、または置きかえられていてもよい。たとえば、いくつかの態様において、異なる三量体形成ドメインが使用されていてもよいか、または異なるエピトープタグが使用されていてもよい。いくつかの態様において、これらのさらなる配列は存在していなくてもよいか、修飾されていてもよいか、再配列されていてもよいか、またはたとえば異なる膜貫通もしくは細胞質ドメインと置きかえられていてもよい。
【００６３】
いくつかの態様において、本発明は、ここで提示されるインフルエンザＨＡアミノ酸配列のいずれか１つ、またはここで提示されるこのようなアミノ酸配列と少なくとも約４０％もしくは５０％もしくは６０％もしくは６５％もしくは７０％もしくは７５％もしくは８０％もしくは８５％もしくは９０％もしくは９５％もしくは９８％もしくは９９％の同一性を有するそれらの任意のバリアントもしくは断片に由来するか、それを含むか、それから本質的になるか、またはそれからなるインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体であって、残基３０８、４０３、４０６、４３７、４１１、４２２、４２９、４３２、４３３および４３５のうちの１つ以上においてチロシン残基（天然に存在するか、チロシンへの変異から生じるかに関わらず）を含む、インフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体を提供する。
【００６４】
いくつかの態様において、本発明は、ここで提示されるインフルエンザＨＡアミノ酸配列のいずれか１つ、またはここで提示されるこのようなアミノ酸配列と少なくとも約４０％もしくは５０％もしくは６０％もしくは６５％もしくは７０％もしくは７５％もしくは８０％もしくは８５％もしくは９０％もしくは９５％もしくは９８％もしくは９９％の同一性を有するそれらの任意のバリアントもしくは断片に由来するか、それを含むか、それから本質的になるか、またはそれからなるインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体であって、以下の残基：４８、６３、２２８、２７８、２８２、２８３、２８６および２９１のうちの１つ以上の直後に挿入された人工的に導入されたプロテアーゼ切断部位を含む、インフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体を提供する。
【００６５】
いくつかの態様において、本発明は、ここで提示されるインフルエンザＨＡアミノ酸配列のいずれか１つ、またはここで提示されるこのようなアミノ酸配列と少なくとも約４０％もしくは５０％もしくは６０％もしくは６５％もしくは７０％もしくは７５％もしくは８０％もしくは８５％もしくは９０％もしくは９５％もしくは９８％もしくは９９％の同一性を有するそれらの任意のバリアントもしくは断片に由来するか、それを含むか、それから本質的になるか、またはそれからなるインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体であって、２つの人工的に導入されたプロテアーゼ切断部位を含み、第１のこのような部位が残基４８または６３の直後に導入され、第２のこのような部位が残基２２８、２７８、２８２、２８３、２８６または２９１の直後に導入される、インフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体を提供する。
【００６６】
いくつかの態様において、本発明は、ここで提示されるインフルエンザＨＡアミノ酸配列のいずれか１つ、またはここで提示されるこのようなアミノ酸配列と少なくとも約４０％もしくは５０％もしくは６０％もしくは６５％もしくは７０％もしくは７５％もしくは８０％もしくは８５％もしくは９０％もしくは９５％もしくは９８％もしくは９９％の同一性を有するそれらの任意のバリアントもしくは断片に由来するか、それを含むか、それから本質的になるか、またはそれからなるインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体であって、（ａ）残基３０８、４０３、４０６、４３７、４１１、４２２、４２９、４３２、４３３および４３５のうちの１つ以上においてチロシン残基（天然に存在するか、チロシンへの変異から生じるかに関わらず）と、（ｂ）以下の残基：４８、６３、２２８、２７８、２８２、２８３、２８６および２９１のうちの１つ以上の直後に挿入された人工的に導入されたプロテアーゼ切断部位の両方を含む、インフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体を提供する。
【００６７】
いくつかの態様において、本発明は、ここで提示されるインフルエンザＨＡアミノ酸配列のいずれか１つ、またはここで提示されるこのようなアミノ酸配列と少なくとも約４０％もしくは５０％もしくは６０％もしくは６５％もしくは７０％もしくは７５％もしくは８０％もしくは８５％もしくは９０％もしくは９５％もしくは９８％もしくは９９％の同一性を有するそれらの任意のバリアントもしくは断片に由来するか、それを含むか、それから本質的になるか、またはそれからなるインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／タンパク質複合体であって、（ａ）残基３０８、４０３、４０６、４３７、４１１、４２２、４２９、４３２、４３３および４３５のうちの１つ以上においてチロシン残基（天然に存在するか、チロシンへの変異から生じるかに関わらず）と、（ｂ）２つの人工的に導入されたプロテアーゼ切断部位の両方を含み、第１のこのような部位は残基４８または６３の直後に導入され、第２のこのような部位は残基２２８、２７８、２８２、２８３、２８６または２９１の直後に導入される、インフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／タンパク質複合体を提供する。
【００６８】
いくつかの態様において、本発明は、配列番号１のアミノ酸残基２２９〜５１９、もしくは配列番号１の２７９〜５１９、もしくは配列番号１の２８３〜５１９、もしくは配列番号１の２８４〜５１９、もしくは配列番号１の２８７〜５１９、もしくは配列番号１の２９２〜５１９、またはこのようなアミノ酸配列と少なくとも約４０％もしくは５０％もしくは６０％もしくは６５％もしくは７０％もしくは７５％もしくは８０％もしくは８５％もしくは９０％もしくは９５％もしくは９８％もしくは９９％の同一性を有する配列に由来するか、それを含むか、それから本質的になるか、またはそれからなるインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体であって、残基３０８、４０３、４０６、４３７、４１１、４２２、４２９、４３２、４３３および４３５のうちの１つ以上においてチロシン残基（天然に存在するか、チロシンへの変異から生じるかに関わらず）を含む、インフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体を提供する。
【００６９】
いくつかの態様において、本発明は、配列番号１のアミノ酸残基１〜４７、もしくは配列番号１の１〜６２、またはこのようなアミノ酸配列と少なくとも約４０％もしくは５０％もしくは６０％もしくは６５％もしくは７０％もしくは７５％もしくは８０％もしくは８５％もしくは９０％もしくは９５％もしくは９８％もしくは９９％の同一性を有する配列に由来するか、それを含むか、それから本質的になるか、またはそれからなるインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体を提供する。
【００７０】
いくつかの態様において、本発明は、第１および第２のペプチドを含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる組成物および／またはインフルエンザＨＡタンパク質複合体であって、（ａ）第１のペプチドが、配列番号１のアミノ酸残基２２９〜５１９、もしくは配列番号１の２７９〜５１９、もしくは配列番号１の２８３〜５１９、もしくは配列番号１の２８４〜５１９、もしくは配列番号１の２８７〜５１９、もしくは配列番号１の２９２〜５１９、またはこのようなアミノ酸配列と少なくとも約４０％もしくは５０％もしくは６０％もしくは６５％もしくは７０％もしくは７５％もしくは８０％もしくは８５％もしくは９０％もしくは９５％もしくは９８％もしくは９９％の同一性を有する配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなり、インフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体は、残基３０８、４０３、４０６、４３７、４１１、４２２、４２９、４３２、４３３および４３５のうちの１つ以上においてチロシン残基（天然に存在するか、チロシンへの変異から生じるかに関わらず）を含み、（ｂ）第２のペプチドが、配列番号１のアミノ酸残基１〜４７、もしくは配列番号１の１〜６２、またはこのようなアミノ酸配列と少なくとも約４０％もしくは５０％もしくは６０％もしくは６５％もしくは７０％もしくは７５％もしくは８０％もしくは８５％もしくは９０％もしくは９５％もしくは９８％もしくは９９％の同一性を有する配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる、組成物および／またはインフルエンザＨＡタンパク質複合体を提供する。
【００７１】
いくつかの態様において、本発明は、１つ以上の人工的に導入された架橋を含むインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体であって、インフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体における以下のアミノ酸残基の少なくとも１つが、インフルエンザＨＡタンパク質における別のアミノ酸残基と人工的に架橋される、インフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体を提供する：Ｙ３０８、Ｎ４０３、Ｆ４０６、Ｙ４３７、Ｋ４１１、Ｎ４２２、Ｄ４２９、Ｌ４３２、Ｄ４３３およびＷ４３５。いくつかの態様において、示した位置がチロシンではない場合、その残基はチロシンに変異される。いくつかのこのような態様において、架橋はジ−チロシン架橋である。
【００７２】
いくつかの態様において、本発明は、１つ以上の人工的に導入された架橋を含むインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体であって、このような人工的に導入された架橋は、以下のアミノ酸残基：Ｙ３０８、Ｎ４０３、Ｆ４０６、Ｋ４１１、Ｙ４３７、Ｎ４２２、Ｄ４２９、Ｌ４３２、Ｄ４３３およびＷ４３５のうちの２つとつながる、インフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体を提供する。いくつかのこのような態様において、示した位置がチロシンではない場合、その残基はチロシンに変異される。いくつかのこのような態様において、架橋はジ−チロシン架橋である。
【００７３】
いくつかの態様において、本発明は、以下の対合したアミノ残基の１つ以上のアミノ酸残基が人工的に導入された架橋によって互いに架橋される、インフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体を提供する：３０８／４０３、３０８／４３５、４０３／４３７、４０３／４２９、４０３／４３２、４０３／４３３、４０６／４２９、４０６／４３３、４１１／４２２、４２２／４３３、４３３／４３５および４３７／４３５。いくつかのこのような態様において、示した位置がチロシンではない場合、その残基はチロシンに変異される。いくつかのこのような態様において、架橋はジ−チロシン架橋である。
【００７４】
いくつかの態様において、本発明は、インフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体、たとえば、架橋がストークドメインを天然の三量体立体構造または抗ストーク抗体、たとえば中和もしくは広域中和抗ストーク抗体と結合できる他の立体構造に安定化させるか、または安定化できるストークドメインにおける任意の適切な位置での１つ以上の架橋の標的導入を意図する。このような安定化は、たとえば、相互作用を安定化させるか、またはストーク単量体もしくはストークプロトマー内で折り畳むか（分子内架橋）、および／または１つ以上のストーク単量体もしくはストークプロトマーの間で相互作用するか（分子間架橋）、またはこのような架橋のいずれかの組合せである、架橋を導入することによって達成されていてもよい。いくつかのこのような態様において、架橋はジ−チロシン架橋である。たとえば、いくつかの態様において、分子間ジ−チロシン架橋は、位置４０３および４３３、４１１および４２２または４３３および４３５におけるチロシン残基の間に形成されていてもよい。同様に、いくつかの態様において、分子間ジ−チロシン架橋は、残基４０３におけるチロシンと別のチロシン残基との間、および／または残基４３３におけるチロシンと、別の残基、たとえば特にジ−チロシン架橋についての可能性のある部位としてここで記載されている他の残基、たとえば残基３０８、４０３、４０６、４１１、４２２、４２９、４３２、４３３、４３５または４３７に位置するチロシン（天然であるか、変異されているかに関わらず）のいずれかとの間に形成されていてもよい。
【００７５】
いくつかの態様において、本発明は、以下の領域：おおよその位置２９８〜おおよそ３１８のアミノ酸残基、おおよその位置３９３〜おおよその位置４１３のアミノ酸残基、おおよその位置３９６〜おおよその位置４１６のアミノ酸残基、おおよその位置４０１〜おおよその位置４２１のアミノ酸残基、おおよその位置４１２〜おおよその位置４３２のアミノ酸残基、おおよその位置４１９〜おおよその位置４３９のアミノ酸残基、おおよその位置４２２〜おおよその位置４４２のアミノ酸残基、おおよその位置４２３〜おおよその位置４４３のアミノ酸残基、おおよその位置４２５〜おおよその位置４４５のアミノ酸残基およびおおよそ４２７〜おおよそ４４７のアミノ酸残基のうちの２つの間に人工的に導入された架橋を含むインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体を提供する。いくつかのこのような態様において、架橋はジ−チロシン架橋である。
【００７６】
本発明のインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体が１つ以上のジ−チロシン架橋を含む態様において、ジ−チロシン架橋は２つの内因性チロシン残基の間、「チロシンへの」変異から生じている２つのチロシン残基の間、または「チロシンへの」変異から生じているチロシン残基と内因性チロシン残基との間に導入されていてもよい。いくつかの態様において、１つより多いジ−チロシン架橋がインフルエンザＨＡタンパク質またはポリペプチドに導入される。
【００７７】
本発明のインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体が１つ以上のジ−チロシン架橋を含む態様において、「チロシンへの」変異が導入され得るアミノ酸位置の非限定的な例には、Ｎ４０３、Ｆ４０６、Ｋ４１１、Ｎ４２２、Ｄ４２９、Ｌ４３２、Ｄ４３３、Ｗ４３５またはそれらのいずれかの組合せが含まれる。
【００７８】
本発明のインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体が１つ以上のジ−チロシン架橋を含む態様において、ジ−チロシン架橋を形成するために使用され得る既存または内因性のチロシン残基の非限定的な例には、Ｙ３０８およびＹ４３７またはそれらのいずれかの組合せが含まれる。
【００７９】
本発明のインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体が１つ以上のジ−チロシン架橋を含む態様において、残基の対合（その間にジ−チロシン架橋が導入され得る）の非限定的な例には、４０３／４２９、４０３／４３２、４０３／４３３、４０６／４２９、４０６／４３３、４１１／４２２および４３３／４３５またはそれらのいずれかの組合せが含まれる。
【００８０】
本発明のインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体が１つ以上のジ−チロシン架橋を含む態様において、チロシン置換および／またはジ−チロシン架橋のためにアミノ酸が選択されてもよいインフルエンザＨＡタンパク質の領域または二次構造の非限定的な例には、ストークドメイン（たとえば、アミノ酸残基１（シグナルペプチドを有する）または１８（シグナルペプチドを有さない）〜５８、および２９２〜５２９（膜貫通および細胞質ドメインを有さない）または５６６（膜貫通ドメインを有する）が含まれる。いくつかの態様において、本発明のインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体のストークドメインの下流領域（配列番号１のアミノ酸残基１８〜４６、３３４〜３４３、３４４〜３９０および４４９〜５０３を含む）、および／または頭部ドメイン（たとえば配列番号１のアミノ酸残基５９〜２９１）はまた、１つ以上のジ−チロシン架橋および／または１つ以上のチロシンへの変異を含んでいてもよい。
【００８１】
チロシン置換および／または架橋のために１つ以上のアミノ酸が選択されてもよいインフルエンザＨＡタンパク質の他の領域の非限定的な例には、おおよその位置２９８からおおよその位置３１３までのアミノ酸残基、おおよその位置３９３からおおよその位置４１３までのアミノ酸残基、おおよその位置３９６からおおよその位置４１６までのアミノ酸残基、おおよその位置４０１からおおよその位置４２１までのアミノ酸残基、おおよその位置４１２からおおよその位置４３２までのアミノ酸残基、おおよその位置４１９からおおよその位置４３９までのアミノ酸残基、おおよその位置４２２からおおよその位置４４２までのアミノ酸残基、おおよその位置４２３からおおよその位置４４３までのアミノ酸残基、おおよその位置４２５からおおよその位置４４５までのアミノ酸残基、およびおおよその位置４２７からおおよその位置４４７までのアミノ酸残基が含まれる。
【００８２】
いくつかの態様において、本発明は、配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９または１１０のアミノ酸配列（それらの各々は、ＨＡタンパク質の頭部ドメインのタンパク質分解による切断を容易にするために１つ以上のプロテアーゼ認識配列、ならびに／またはジ−チロシン架橋を容易にするため、およびインフルエンザＨＡタンパク質のストークドメインの特定の立体構造、たとえばその天然の三量体立体構造での「固定」を容易にするために１つ以上の「チロシンへの」変異を含むインフルエンザＨＡアミノ酸配列の変異体である）、またはそれらのいずれかの断片、たとえば、インフルエンザＨＡタンパク質のアミノ酸ストークドメインを含む断片、もしくはタンパク質分解により生成されていてもよい、および／もしくは機能的インフルエンザＨＡタンパク質に構築されていてもよいか、もしくはその一部を形成していてもよいインフルエンザＨＡタンパク質の任意の他の断片に由来するか、それを含むか、それから本質的になるか、またはそれからなるインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体を提供する。いくつかの態様において、本発明は、配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９もしくは１１０、またはそれらのいずれかの断片と少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列に由来するか、それを含むか、それから本質的になるか、またはそれからなるインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体を提供する。
【００８３】
ジ−チロシン架橋を標的としてもよいインフルエンザＨＡタンパク質またはポリペプチドにおけるアミノ酸位置の非限定的な例には、位置Ｙ３０８（既存／内因性Ｔｙｒ残基）およびＮ４０３Ｙ（Ｔｙｒへの置換）、位置Ｙ３０８（既存／内因性Ｔｙｒ残基）およびＷ４３５Ｙ（Ｔｙｒへの置換）、位置Ｎ４０３Ｙ（Ｔｙｒへの置換）およびＹ４３７（既存／内因性Ｔｙｒ残基）、位置Ｎ４０３Ｙ（Ｔｙｒへの置換）およびＤ４２９Ｙ（Ｔｙｒへの置換）、位置Ｎ４０３Ｙ（Ｔｙｒへの置換）およびＬ４３２Ｙ（Ｔｙｒへの置換）、位置Ｎ４０３Ｙ（Ｔｙｒへの置換）およびＤ４３３Ｙ（Ｔｙｒへの置換）、位置Ｎ４０６Ｙ（Ｔｙｒへの置換）およびＤ４２９Ｙ（Ｔｙｒへの置換）、位置Ｎ４０６Ｙ（Ｔｙｒへの置換）およびＤ４３３Ｙ（Ｔｙｒへの置換）、位置Ｄ４３３Ｙ（Ｔｙｒへの置換）およびＷ４３５Ｙ（Ｔｙｒへの置換）、位置Ｋ４１１Ｙ（Ｔｙｒへの置換）およびＷ４２２Ｙ（Ｔｙｒへの置換）および位置Ｙ４３７（既存／内因性Ｔｙｒ残基）およびＷ４３５Ｙ（Ｔｙｒへの置換）が含まれる。いくつかの態様において、本発明のインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体は上記のジ−チロシン架橋のうちの１つを含む。いくつかの態様において、本発明のインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体は上記のジ−チロシン架橋（たとえば、配列番号５、８、１１、１４および１７）のうちの２つを含む。いくつかの態様において、本発明のインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体は、上記のジ−チロシン架橋のうちの３つを含む。いくつかの態様において、本発明のインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体は、上記のジ−チロシン架橋のうちの４つを含む。いくつかの態様において、本発明のインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体は、上記のジ−チロシン架橋のうちの５つ以上を含む。いくつかの態様において、本発明のインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体は、上記のジ−チロシン架橋のうちのいずれかの組合せまたは１つ以上を含む。
【００８４】
１つより多いジ−チロシン架橋を有するように設計されたインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体の非限定的な例には、２つの「チロシンへの」変異体を有するインフルエンザＨＡタンパク質（ここで、各々のこのようなチロシン残基は、異なる内因性／既存のチロシン残基と架橋を形成する）、または４つの「チロシンへの」変異、たとえば配列番号５、８、１１、１４および１７により示されるようにＮ４０３Ｙ／Ｋ４１１Ｙ／Ｎ４２２Ｙ／Ｄ４３３Ｙを有するインフルエンザＨＡタンパク質（ここで、位置４０３におけるチロシンは位置４１１におけるチロシンと対合するように設計され、位置４２２におけるチロシンは位置４３３におけるチロシンと対合するように設計され、それにより２つのジ−チロシン架橋の形成によってＨＡタンパク質のストークドメインを安定化させる）が含まれる。
【００８５】
同じタンパク質複合体内（たとえば三量体を形成するように配列される単量体）の第１のＨＡポリペプチドと第２のＨＡポリペプチドとの間の結合が分子間結合の例である。本発明は、分子間相互作用を安定化させるように設計された架橋を含む例示的なインフルエンザＨＡタンパク質およびポリペプチド、ならびにこのような配列に由来し、このような配列に存在する特定の「チロシンへの」変異を含むインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体を提供する。たとえば、１つの単量体における１つの導入されたチロシンは、隣接する単量体上の他の導入されたチロシンと対合するように設計される。
【００８６】
いくつかの態様において、ＨＡポリペプチドは分子内で架橋される（たとえば、架橋の両方のチロシンが同じＨＡポリペプチド内に位置する）。本発明は、限定されないが、配列番号＿を含む分子内相互作用を安定化させるように設計された架橋を含む例示的なインフルエンザＨＡタンパク質およびポリペプチド、ならびにこのような配列に由来し、このような配列に存在する特定の「チロシンへの」変異を含むインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体を提供する。
【００８７】
いくつかの態様（上記のものの全て、およびここで挙げられている特定のアミノ酸配列のいずれかを有するインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体に関するもの、ならびにここで提供される特定のアミノ酸配列と１００％未満の同一性を有するこのようなインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体のバリアントまたは断片に関するものを含む）において、本発明のインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体は、１つ以上の所望の特性、たとえば、（１）ストークドメインの天然の三量体立体構造を形成でき、（２）架橋結合により天然の三量体立体構造に「固定した」ストークドメインを有することができ、（３）インフルエンザＨＡストーク特異的抗体と結合でき、（４）中和抗体と結合でき、（５）広域中和抗体と結合でき、（６）６Ｆ１２、Ｃ１７９、ＣＲ６２６１、Ｆ１０、Ａ６６およびＤ８からなる群から選択される抗体と結合でき、（７）Ｂ細胞受容体と結合できおよび／もしくは活性化でき、（８）動物において抗体反応を誘発でき、（９）動物において防御抗体反応を誘発でき、（１０）動物において中和抗体の産生を誘発でき、（１１）動物において広域中和抗体の産生を誘発でき、（１２）動物において四次中和エピトープ（ＱＮＥ）を認識する抗体の産生を誘発でき、ならびに／または（１３）動物において防御免疫反応を誘発できる、特性を有するべきである。いくつかの態様において、ここで記載されているインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体は、動物において１つ以上のインフルエンザウイルス株に対する防御免疫反応を誘発でき、ならびに／または動物において同種と異種の両方のインフルエンザウイルス株に対する防御免疫反応を誘発できる。
【００８８】
他に示されない限り、特定のインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質およびタンパク質複合体に関連するここでの全ての説明は、それらの全てのホモログ、オルソログ、類似体、誘導体、変異形態、断片、キメラ、融合タンパク質など、たとえば、特定の所望の特性または性質を有するもの（たとえば、天然の三量体立体構造に折り畳むことができるストークドメインもしくはストークドメインの一部を有するもの、または限定されないが、１種以上の抗ＨＡ抗体、たとえばインフルエンザＨＡストークドメインに特異的な抗体と結合できるか、もしくはその産生を誘発できるものを含む所望の機能的特性を有するもの）に同様に関連する。
【００８９】
同様に、特定のポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体ポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体（たとえば、特定のアミノ酸配列を有するものまたは特定のインフルエンザ型、亜型もしくは株由来のもの）に関連するここでの全ての説明は、（たとえば異なるインフルエンザ型、亜型または株で）天然に存在していてもよいこのようなポリペプチド、タンパク質および／もしくはタンパク質複合体の他の関連する形態に同様に関連するか、またはそれらは、ここで提供されるが、いくらかの手段、たとえば組換え手段、化学手段、もしくは任意の他の手段によって人工的に変えられている特定の配列に関連する。ここで記載されているインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体は、当該分野において公知の任意の適切なインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体のヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列を有していてもよいか、または由来していてもよい。いくつかの態様において、本発明のインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体は、任意のこのようなタンパク質、またはその断片（たとえば、種々の態様において、当業者に公知である任意の適切な方法を使用して、たとえば、当該分野において公知であるコンピューターホモロジープログラムを使用して並べられる場合、ここで記載されているか、または当該分野において公知である任意の特定のインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体のアミノ酸または核酸配列と少なくとも約５０％または５５％または６０％または６５％または７０％または７５％または８０％または８５％または９０％または９５％または９８％または９９％の同一性を有するもの）と実質的に同種であるタンパク質を含む、ここで記載されているか、または当該分野において公知である特定のインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体の誘導体および／または類似体であってもよいか、または由来していてもよいか、あるいは高ストリンジェンシー、中ストリンジェンシーまたは低ストリンジェンシー条件下で本発明のタンパク質のコード核酸配列とハイブリダイズできる核酸をコードするものであってもよいか、または由来していてもよい。
【００９０】
いくつかの態様において、本発明は、ここで記載されているインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体の断片、たとえば、少なくとも約１０アミノ酸、２０アミノ酸、５０アミノ酸、１００アミノ酸、２００アミノ酸または５００アミノ酸を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなるものを提供する。
【００９１】
いくつかの態様において、ここで記載されているか、または当該分野において公知である特定のインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体内の１つ以上のアミノ酸残基は、欠失していてもよいか、付加されていてもよいか、または別のアミノ酸と置換されていてもよい。このような変異が導入されている態様において、インフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体は、部分的アミノ酸配列を決定するためにマイクロシークエンシングされていてもよい。他の態様において、インフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体をコードする核酸分子は、変異の導入を特定および／または確認するために配列決定されていてもよい。
【００９２】
いくつかの態様において、１つ以上のアミノ酸残基が、同様の極性を有し、機能的等価物として作用できる別のアミノ酸により置換されていてもよく、その結果、サイレント変異が生じる。いくつかの態様において、配列内のアミノ酸に対する置換は、たとえば保存的置換を生成するために、アミノ酸が属するクラスの他のメンバーから選択されていてもよい。たとえば、非極性（疎水性）アミノ酸には、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンが含まれる。極性中性アミノ酸には、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンが含まれる。正電荷（塩基性）のアミノ酸には、アルギニン、リシンおよびヒスチジンが含まれる。負電荷（酸性）のアミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれる。このような置換は保存的置換であると一般に理解されている。
【００９３】
いくつかの態様において、人工、合成または非古典的アミノ酸または化学的アミノ酸類似体が、本発明のインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体を作製するために使用されていてもよい。非古典的アミノ酸には、限定されないが、共通のアミノ酸のＤ−異性体、フルオロ−アミノ酸および「デザイナー」アミノ酸、たとえばβ−メチルアミノ酸、Ｃγ−メチルアミノ酸、Ｎγ−メチルアミノ酸および一般的なアミノ酸類似体が含まれる。非古典的アミノ酸のさらなる非限定的な例には、限定されないが、α−アミノカプリル酸、Ａｃｐａ；（Ｓ）−２−アミノエチル−Ｌ−システイン／ＨＣｌ、Ａｅｃｙｓ；アミノフェニルアセテート、Ａｆａ；６−アミノヘキサン酸、Ａｈｘ；γ−アミノイソ酪酸およびα−アミノイソ酪酸、Ａｉｂａ；アロイソロイシン、Ａｉｌｅ；Ｌ−アリルグリシン、Ａｌｇ；２−アミノ酪酸、４−アミノ酪酸およびα−アミノ酪酸、Ａｂａ；ｐ−アミノフェニルアラニン、Ａｐｈｅ；ｂ−アラニン、Ｂａｌ；ｐ−ブロモフェニルアラニン、Ｂｒｐｈｅ；シクロヘキシルアラニン、Ｃｈａ；シトルリン、Ｃｉｔ；β−クロロアラニン、Ｃｌａｌａ；シクロロイシン、Ｃｌｅ；ｐ−クロロフェニルアラニン、Ｃｌｐｈｅ；システイン酸、Ｃｙａ；２，４−ジアミノ酪酸、Ｄａｂ；３−アミノプロピオン酸および２，３−ジアミノプロピオン酸、Ｄａｐ；３，４−デヒドロプロリン、Ｄｈｐ；３，４−ジヒドロキシルフェニルアラニン、Ｄｈｐｈｅ；ｐ−フルロフェニルアラニン、Ｆｐｈｅ；Ｄ−グルコサミン酸（D-glucoseaminic acid）、Ｇａａ；ホモアルギニン、Ｈａｇ；δ−ヒドロキシリシン／ＨＣｌ、Ｈｌｙｓ；ＤＬ−β−ヒドロキシノルバリン、Ｈｎｖｌ；ホモグルタミン、Ｈｏｇ；ホモフェニルアラニン、Ｈｏｐｈ；ホモセリン、Ｈｏｓ；ヒドロキシプロリン、Ｈｐｒ；ｐ−ヨードフェニルアラニン、Ｉｐｈｅ；イソセリン、Ｉｓｅ；α−メチルロイシン、Ｍｌｅ；ＤＬ−メチオニン−Ｓ−メチルスルホニウムクロライド（DL-methionine-S-methylsulfoniumchloide）、Ｍｓｍｅｔ；３−（１−ナフチル）アラニン、１Ｎａｌａ；３−（２−ナフチル）アラニン、２Ｎａｌａ；ノルロイシン、Ｎｌｅ；Ｎ−メチルアラニン、Ｎｍａｌａ；ノルバリン、Ｎｖａ；Ｏ−ベンジルセリン、Ｏｂｓｅｒ；Ｏ−ベンジルチロシン、Ｏｂｔｙｒ；Ｏ−エチルチロシン、Ｏｅｔｙｒ；Ｏ−メチルセリン、Ｏｍｓｅｒ；Ｏ−メチルスレオニン、Ｏｍｔｈｒ；Ｏ−メチルチロシン、Ｏｍｔｙｒ；オルニチン、Ｏｒｎ；フェニルグリシン；ペニシラミン、Ｐｅｎ；ピログルタミン酸、Ｐｇａ；ピペコリン酸、Ｐｉｐ；サルコシン、Ｓａｒ；ｔ−ブチルグリシン；ｔ−ブチルアラニン；３，３，３−トリフルオロアラニン（3,3,3-trifluroalanine）、Ｔｆａ；６−ヒドロキシドーパ、Ｔｈｐｈｅ；Ｌ−ビニルグリシン、Ｖｉｇ；（−）−（２Ｒ）−２−アミノ−３−（２−アミノエチルスルホニル）プロパン酸ジヒドロキソクロライド（dihydroxochloride）、Ａａｓｐａ；（２Ｓ）−２−アミノ−９−ヒドロキシ−４，７−ジオキサノナン酸、Ａｈｄｎａ；（２Ｓ）−２−アミノ−６−ヒドロキシ−４−オキサヘキサン酸、Ａｈｏｈａ；（−）−（２Ｒ）−２−アミノ−３−（２−ヒドロキシエチルスルホニル）プロパン酸、��ｈｓｏｐａ；（−）−（２Ｒ）−２−アミノ−３−（２−ヒドロキシエチルスルファニル）プロパン酸、Ａｈｓｐａ；（２Ｓ）−２−アミノ−１２−ヒドロキシ−４，７，１０−トリオキサドデカン酸、Ａｈｔｄａ；（２Ｓ）−２，９−ジアミノ−４，７−ジオキサノナン酸、Ｄａｄｎａ；（２Ｓ）−２，１２−ジアミノ−４，７，１０−トリオキサドデカン酸、Ｄａｔｄａ；（Ｓ）−５，５−ジフルオロノルロイシン、Ｄｆｎｌ；（Ｓ）−４，４−ジフルオロノルバリン、Ｄｆｎｖ；（３Ｒ）−１−１−ジオキソ−［１，４］チアジアン（thiaziane）−３−カルボン酸、Ｄｔｃａ；（Ｓ）−４，４，５，５，６，６，６−ヘプタフルオロノルロイシン、Ｈｆｎｌ；（Ｓ）−５，５，６，６，６−ペンタフルオロノルロイシン、Ｐｆｎｌ；（Ｓ）−４，４，５，５，５−ペンタフルオロノルバリン、Ｐｆｎｖ；および（３Ｒ）−１，４−チアジナン−３−カルボン酸、Ｔｃａが含まれる。さらに、アミノ酸はＤ（右旋性）またはＬ（左旋性）であってもよい。古典的および非古典的アミノ酸の概説に関しては、Ｓａｎｄｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８（Ｓａｎｄｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８．Ｎｅｗ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｄｅｓｃｒｉｐｔｏｒｓ  ｒｅｌｅｖａｎｔ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ．Ａ  ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ８７  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４１（１４）：ｐｐ．２４８１−９１）を参照のこと。
【００９４】
核酸
ここで記載されている特定のインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体を提供することに加えて、本発明はまた、このようなインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体をコードする核酸、ならびにこのような核酸を含む組成物およびベクターを提供する。このような核酸は、当該分野において公知の任意の適切な方法を使用して得ることができるか、または作製できる。たとえば、インフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体をコードする核酸分子は、クローンＤＮＡから得ることができるか、または化学合成によって作製できる。いくつかの態様において、核酸は、当業者に公知の方法、たとえばランダム−またはポリＡ−プライム逆転写のいずれかによって調製されたＲＮＡを逆転写することによって得ることができる。起源が何であれ、本発明のインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体をコードする核酸分子は、任意の適切なベクター、たとえば、核酸分子の増殖に使用されるベクターまたは核酸分子の発現に使用されるベクター内にクローニングされていてもよい。核酸は、必要な場合、種々の制限酵素を使用して特定の部位で切断されていてもよい。発現を必要とする態様において、核酸は、所望の細胞種類、たとえば哺乳動物細胞または昆虫細胞における発現を誘導するのに適したプロモーターに作動可能に連結されていてもよく、任意の適切な発現ベクター、たとえば哺乳動物または昆虫発現ベクター内に組み込まれていてもよい。本発明のインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体をコードする核酸分子は、その核酸分子から発現されるタンパク質の発現レベルを向上させるために当該分野において公知の方法によって最適化された。たとえば、コドン最適化は種間のコドン使用頻度の変化を最小化または排除するために使用されていてもよい。いくつかの態様において、本発明のインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体は、ヒト（たとえば、配列番号６３および図４８を参照のこと）、Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ（たとえば、配列番号６４および図４９を参照のこと）、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ（たとえば、配列番号６５および図５０を参照のこと）、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ（たとえば、配列番号６６および図５１を参照のこと）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（たとえば、配列番号６７および図５２を参照のこと）またはＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（たとえば、配列番号６８および図５３を参照のこと）における発現のためにコドン最適化されている核酸分子に由来する。
【００９５】
いくつかの態様において、本発明は、配列番号３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１もしくは６２（これらの各々は、ＨＡタンパク質の頭部ドメインのタンパク質分解による切断を容易にするために１つ以上のプロテアーゼ認識配列、ならびに／またはジ−チロシン架橋結合を容易にするため、およびインフルエンザＨＡタンパク質のストークドメインの特定の立体構造、たとえばその天然の三量体立体構造での「固定」を容易にするために１つ以上の「チロシンへの」変異を含むインフルエンザＨＡアミノ酸配列の変異体をコードする）の核酸配列、またはそれらの任意の断片、たとえば、インフルエンザＨＡタンパク質のストークドメインをコードする断片に由来するか、それを含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる核酸を提供する。
【００９６】
さらに、当業者は、たとえば、変異される特定のアミノ酸残基をコードするヌクレオチドコドンを位置付け、必要に応じてそのコドンにおけるヌクレオチドを変異させて、チロシンをコードするコドンを生じることによって、ここで記載されている特定の「チロシンへの」変異のいずれか１つ以上を含む核酸分子を容易に想起できるか、または作製できる。
【００９７】
架橋結合
いくつかの態様において、本発明のインフルエンザＨＡポリペプチドおよび／またはタンパク質は、所望の立体構造的構造、たとえばストークドメインの天然の三量体立体構造を有するタンパク質複合体に構築され、その立体構造を安定化させるために架橋される。架橋され得るインフルエンザＨＡタンパク質、およびこのような架橋結合を容易にするように設計される特定のインフルエンザＨＡ変異体の特定の領域の詳細は本出願の他の項に記載されている。いくつかの態様において、架橋はインフルエンザＨＡタンパク質の三次および／または四次構造を安定化させるために使用されていてもよい。いくつかの態様において、架橋結合は分子内および／または分子間架橋結合であってもよい。いくつかの態様において、使用される架橋は標的架橋である。いくつかの態様において、使用される架橋は生理的条件下で安定である。いくつかの態様において、使用される架橋は、たとえば発現の間および／または貯蔵（たとえば高濃度のインフルエンザＨＡタンパク質を含む組成物の貯蔵）の間、インフルエンザＨＡタンパク質の凝集体形成を導かない。いくつかの態様において、このような架橋の導入は、免疫原、たとえばワクチン免疫原としての本発明のインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質およびタンパク質の有効性を向上させることができる。いくつかの態様において、このような架橋の導入は、インフルエンザＨＡタンパク質内のエピトープ、たとえばストークドメイン内のエピトープを安定化させることができ、それによりエピトープが特定の抗体によって認識されることができ、抗体の産生を誘発でき、および／または抗体が結合するとＢ細胞受容体を活性化できる。
【００９８】
いくつかの態様において、標的架橋結合が使用されていてもよい。標的架橋はインフルエンザＨＡタンパク質またはタンパク質複合体内の特定の位置において形成するように作製され得るものである。いくつかの戦略が、インフルエンザＨＡタンパク質またはポリペプチドにおける特定の場所、たとえばここで記載されている特定の場所に架橋を標的化するために使用されていてもよい。本発明は、架橋すると、インフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体を、中和抗体と結合できるか、もしくはその産生を誘発でき、ならびに／または動物における中和抗体反応を生成できる立体構造に安定化させることができるか、または安定化させるかもしれないインフルエンザＨＡタンパク質内の残基対を提供する。標的架橋は、特定のアミノ酸側鎖の物理的および／または化学的特性を利用することによって、たとえば特定のアミノ酸配列または三次元構造を認識する酵素反応を使用することによって、または折り畳まれたタンパク質もしくはタンパク質複合体において架橋を形成する能力を有する非天然アミノ酸を組み込むことによって、ここで特定されている場所または位置の１つ以上に導入されていてもよい。
【００９９】
架橋または修飾は、所望の結果、たとえばストークドメインのその天然の三量体立体構造での安定化を達成するために、インフルエンザＨＡタンパク質またはポリペプチド、たとえばストークドメインの構造における特定の部位に標的化されていてもよい。本発明は、インフルエンザＨＡタンパク質またはポリペプチドにおける任意の適切な位置、好ましくは、架橋または修飾がストークドメインをその天然の三量体立体構造に安定化させるか、またはストークドメインの天然の三量体立体構造の向上した安定化を提供する場所において１つ以上の架橋および／または他の安定化修飾の標的導入を意図する。本発明は、ジ−チロシン架橋結合についてここで記載されている任意のインフルエンザＨＡタンパク質アミノ酸残基、残基対合、二次構造または他の領域もまた、限定されないが、アミノ酸位置Ｙ３０８、Ｎ４０３、Ｎ４０６、Ｋ４１１、Ｗ４２２、Ｄ４２９、Ｌ４３２、Ｄ４３３、Ｗ４３５およびＹ４３７またはそれらの任意の組合せ；残基対合３０８／４０３、３０８／４３５、４０３／４３７、４０３／４２９、４０３／４３２、４０３／４３３、４０６／４２９、４０６／４３３、４１１／４２２、４３３／４３５および４３７／４３５またはそれらの任意の組合せ；たとえばＨＡタンパク質ストークドメインまたは頭部ドメインを含む領域または二次構造；および膜貫通ドメインまたはストークドメインの下流領域を含むインフルエンザＨＡタンパク質の他の領域を含む、他の標的架橋もしくは結合または他の修飾の形成に使用されていてもよいことを意図する。
【０１００】
いくつかの態様において、本発明のインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質およびタンパク質複合体はストークドメインにおける架橋を含み、このような架橋はストークドメインのみに位置する必要はない。いくつかの態様において、架橋は、所望の場合、「頭部のある」ポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体における頭部ドメインを含む、インフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体全体のどこに位置していてもよい。好ましくは、他の領域（たとえばストークドメインの外側）における架橋を含むインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体は、１つ以上の所望の特性、たとえば、（１）ストークドメインの天然の三量体立体構造を形成でき、（２）架橋結合によって天然の三量体立体構造に「固定した」ストークドメインを有することができ、（３）インフルエンザＨＡストーク特異的抗体と結合でき、（４）中和抗体と結合でき、（５）広域中和抗体と結合でき、（６）６Ｆ１２、Ｃ１７９、ＣＲ６２６１、Ｆ１０、Ａ６６およびＤ８からなる群から選択される抗体と結合でき、（７）Ｂ細胞受容体と結合でき、および／もしくは活性化でき、（８）動物における抗体反応を誘発でき、（９）動物における防御抗体反応を誘発でき、（１０）動物における中和抗体の産生を誘発でき、（１１）動物における広域中和抗体の産生を誘発でき、（１２）動物における四次中和エピトープ（ＱＮＥ）を認識する抗体の産生を誘発でき、ならびに／または（１３）動物における防御免疫反応を誘発できる特性を保有する。
【０１０１】
様々な長さのスペーサーアームを有する架橋を有するもの、ならびに精製するための蛍光および官能基を有するおよび有さないものを含む、分子内および分子間でタンパク質を架橋結合する様々な方法は当該分野において公知である。このような方法には、限定されないが、ヘテロ二官能性架橋剤（たとえばスクシンイミジルアセチルチオアセテート（ＳＡＴＡ）、トランス−４−（マレイミジルメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）およびスクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ））、ホモ二官能性架橋剤（たとえばスクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート）、光反応性架橋剤（たとえば４−アジド−２，３，５，６−テトラフルオロ安息香酸、ＳＴＰエステル、ナトリウム塩（ＡＴＦＢ、ＳＴＰエステル）、４−アジド−２，３，５，６−テトラフルオロ安息香酸、スクシンイミジルエステル（ＡＴＦＢ、ＳＥ）、４−アジド−２，３，５，６−テトラフルオロベンジルアミン、塩酸塩、ベンゾフェノン−４−イソチオシアネート、ベンゾフェノン−４−マレイミド、４−ベンゾイル安息香酸、スクシンイミジルエステル、Ｎ−（（２−ピリジルジチオ）エチル）−４−アジドサリチルアミド（ＰＥＡＳ；ＡＥＴ）、チオール反応性架橋剤（たとえばマレイミドおよびヨードアセトアミド）、アミン反応性架橋剤（たとえばグルタルアルデヒド、ビス（イミドエステル）、ビス（スクシンイミジルエステル）、ジイソシアネートおよび二酸塩化物）の使用が含まれる。チオール基は非常に反応性があり、アミン基と比べてほとんどのタンパク質において比較的まれであるので、チオール反応性架橋結合がいくつかの態様において使用されていてもよい。チオール基がインフルエンザＨＡタンパク質の構造の適切な部位において欠失しているか、または存在しない場合、それらはいくつかのチオール化法のうちの１つを使用して導入されていてもよい。たとえば、スクシンイミジルトランス−４−（マレイミジルメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレートがアミン部位においてチオール反応基を導入するために使用されていてもよい。
【０１０２】
いくつかの酸化架橋、たとえばジスルフィド結合（これは自然に形成し、ｐＨおよび酸化還元感受性である）およびジ−チロシン結合（これは生理的条件下で非常に安定であり、不可逆的である）が公知である。
【０１０３】
いくつかの態様において、架橋はインフルエンザＨＡタンパク質の三次構造を安定化させる。いくつかの態様において、架橋はインフルエンザＨＡタンパク質の四次構造を安定化させる。いくつかの態様において、架橋はインフルエンザＨＡタンパク質の三次と四次構造の両方を安定化させる。
【０１０４】
いくつかの態様において、本発明のインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体は熱安定である架橋を有する。いくつかの態様において、本発明のインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体は有毒でない架橋を有する。いくつかの態様において、本発明のインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体は、標的架橋、または非標的架橋、または可逆的架橋、または不可逆的架橋、またはホモ二官能性架橋結合剤の使用によって形成される架橋、またはヘテロ二官能性架橋結合剤の使用によって形成される架橋、またはアミン基と反応する試薬の使用によって形成される架橋、またはチオール基と反応する試薬の使用によって形成される架橋、または光反応性である試薬の使用によって形成される架橋、またはアミノ酸残基の間に形成される架橋、またはタンパク質もしくはタンパク質複合体の構造内に組み込まれた変異アミノ酸残基の間に形成される架橋、または酸化架橋、またはジ−チロシン結合、またはグルタルアルデヒド架橋、またはそれらのいずれかの組合せである架橋を有する。いくつかの態様において、本発明のインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体はグルタルアルデヒド架橋を有さない。
【０１０５】
いくつかの態様において、本発明のインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体は人工的に導入されたジスルフィド結合を１つも有さないか、またはそれがこのようなジスルフィド結合を有する場合、さらなる人工的に導入された架橋も有する。いくつかの態様において、本発明のインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体は人工的に導入されたジスルフィド結合を１つも有さないが、天然に存在するジスルフィド結合を有していてもよい。システイン側鎖が点変異によって操作される場合、ジスルフィド結合は人工的に導入されていてもよい。しかしながら、ジスルフィド結合は、ｐＨ感受性であり、特定の酸化還元条件下で溶解することが知られており、したがって、たとえばｉｎ  ｖｉｖｏで免疫原として使用される、ジスルフィド架橋により操作されたタンパク質および／またはタンパク質複合体の予防および／または治療有用性は損なわれる場合がある。さらに、望まれないジスルフィド結合は、多くの場合、凝集体形成を媒介する遊離スルフヒドリル基を有するタンパク質間に形成され（たとえば、Ｈａｒｒｉｓ  ＲＪ  ｅｔ  ａｌ．２００４，Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ  ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  ｓｃａｌｅ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ  Ｒｅｓ  ６１（３）：１３７−１５４；Ｃｏｓｔａｎｔｉｎｏ  ＆  Ｐｉｋａｌ（Ｅｄｓ．），２００４．Ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，ｅｄｉｔｏｒｓ  Ｃｏｓｔａｎｔｉｎｏ  ＆  Ｐｅｋａｌ．Ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ．Ｓｅｒｉｅｓ：Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｓｐｅｃｔｓ  ＩＩ，４５３−４５４ページを参照のこと；Ｔｒａｃｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，米国特許第６，４６５，４２５号を参照のこと）、これはまた、ＨＩＶ  ｇｐ１２０およびｇｐ４１に関する問題としても報告されている（Ｊｅｆｆｓ  ｅｔ  ａｌ．２００４．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ  ｅｎｖｅｌｏｐｅ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｉｓｏｌａｔｅｓ  ｏｆ  ＨＩＶ−１．Ｖａｃｃｉｎｅ  ２２：１０３２−１０４６；Ｓｃｈｕｌｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００２．Ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ  ａｎｄ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ａ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃａｌｌｙ  ｍａｔｕｒｅ，ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ−ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １  ｇｐ１４０  ｅｎｖｅｌｏｐｅ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７６：７７６０−７７７６を参照のこと）。したがって、多くの態様において、ジスルフィド結合が使用されないか、または架橋の唯一の方法として使用されないことが好ましい。
【０１０６】
インフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体の構造および／または免疫原性が架橋により損なわれるか、または変化する場合、その全体の構造および機能を維持することは、架橋結合反応についてのアミノ酸側鎖の利用可能性を制御することによって、またはさらなる架橋もしくは他の安定化修飾を導入することによって達成され得る。たとえば、ＤＴ架橋結合の場合、反応に利用可能であるが、複合体の構造の歪みを生じ、インフルエンザＨＡタンパク質の免疫原性／抗原性を損なうチロシル側鎖はこのような残基を別のアミノ酸、たとえばフェニルアラニンなどに変異させることによって除去されていてもよい。さらに、点変異は、結合の形成が最も有益な結果を引き起こすように、アミノ酸側鎖が架橋結合剤または互いと反応する位置に導入されていてもよい。これらの位置はまた、ここで記載されているように特定されていてもよい。
【０１０７】
選択された残基において反応性側鎖が既に存在していない場合、点変異は、たとえば、反応性側鎖が存在し、反応に利用可能となるように、このような点変異を、その発現を誘導する核酸のｃＤＮＡに導入する分子生物学的方法を使用して導入されていてもよい。
【０１０８】
使用されていてもよい架橋には、限定されないが、アミンおよび／またはチオール基と反応するホモおよびヘテロ二官能性架橋結合剤、光反応性架橋試薬の使用から得られる可逆的架橋、インフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体の構造に組み込まれる非古典的アミノ酸の間に形成していてもよい任意の架橋、任意の酸化架橋、たとえば、限定されないが、ジ−チロシン架橋／結合、ヘテロ二官能性架橋剤（たとえばスクシンイミジルアセチルチオアセテート（ＳＡＴＡ）、トランス−４−（マレイミジルメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）およびスクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ））、ホモ二官能性架橋剤（たとえばスクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート）、光反応性架橋剤（たとえば４−アジド−２，３，５，６−テトラフルオロ安息香酸、ＳＴＰエステル、ナトリウム塩（ＡＴＦＢ、ＳＴＰエステル）、４−アジド−２，３，５，６−テトラフルオロ安息香酸、スクシンイミジルエステル（ＡＴＦＢ、ＳＥ）、４−アジド−２，３，５，６−テトラフルオロベンジルアミン、塩酸塩、ベンゾフェノン−４−イソチオシアネート、ベンゾフェノン−４−マレイミド、４−ベンゾイル安息香酸、スクシンイミジルエステル、Ｎ−（（２−ピリジルジチオ）エチル）−４−アジドサリチルアミド（ＰＥＡＳ；ＡＥＴ）、チオール反応性架橋剤（たとえばマレイミドおよびヨードアセトアミド）、アミン反応性架橋剤（たとえばグルタルアルデヒド、ビス（イミドエステル）、ビス（スクシンイミジルエステル）、ジイソシアネートおよび二酸塩化物）が含まれる。
【０１０９】
本発明はまた、タンパク質間相互作用および／または所望のタンパク質もしくはペプチド立体構造、たとえばインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体のストークドメインの天然の三量体立体構造を安定化させるための「架橋」として標的非共有結合チロシン−スタッキング相互作用の導入を意図する。架橋は、限定されないが、インフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／もしくはタンパク質複合体内の導入／操作されたチロシンの芳香族側鎖と、内因性チロシン、フェニルアラニン、ヒスチジンもしくはトリプトファンとの間、またはインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／もしくはタンパク質複合体内の導入／操作されたチロシンの芳香族側鎖と、第２の導入／操作されたチロシンとの間のＴ字形、サンドイッチまたは平行移動πスタッキング相互作用を含む標的πスタッキング相互作用を含む。
【０１１０】
本出願の文脈において使用されるような不可逆的架橋には、生理的に関連する条件下で顕著に溶解しないものが含まれる。使用される架橋の種類は、発現の間または本発明のインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／もしくはタンパク質複合体が高濃度で貯蔵されている場合、凝集体形成を導くべきではないことが好ましい。ジスルフィド結合は不可逆的架橋ではない。むしろそれらは可逆的架橋であり、生理的に関連する条件下で溶解していてもよく、ならびに／またはタンパク質発現および／もしくは産生の間、もしくは高濃度で貯蔵されている場合、凝集体形成を導いていてもよい。
【０１１１】
いくつかの態様において、架橋は、所望の立体構造安定化および／または所望の免疫原特性（たとえば、ストークドメインをその天然の三量体立体構造に維持し、および／または広域中和抗体と結合する能力）を達成するために、ここで記載されているインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体の特定の領域に標的化されていてもよい。あるいは、ここで特定されている場所において架橋を有するタンパク質は、たとえば、化学的、物理的および／または機能的特徴に基づいて所望の修飾を有するおよび有さない架橋および非架橋タンパク質の混合物から単離されていてもよい。このような特徴には、たとえば、三量体形成、天然の三量体立体構造を有するストークドメインの存在および／または任意の所望の抗原性、免疫原性もしくは生化学的特徴が含まれていてもよい。
【０１１２】
あるいは、いくつかの態様において、架橋は標的化されていなくてもよく、所望の架橋もしくは特性を有するタンパク質は、非標的架橋結合系を使用して作製された修飾および非修飾タンパク質の混合物から単離されていてもよい。
【０１１３】
所望の架橋を有するインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体が、架橋および非架橋タンパク質の混合物から単離される態様において、このような単離または分離は、限定されないが、分子量、分子体積、クロマトグラフィー特性、電気泳動における移動度、抗原性および生化学的特徴、蛍光特徴、溶解度、抗体との結合、構造特徴、免疫学的特徴または任意の他の適切な特徴を含む１つ以上の特徴に基づいて実施されていてもよい。
【０１１４】
ここで記載されている特定の架橋結合の位置に加えて、インフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体内のさらなる位置は、さらなる架橋が作製され得る位置、たとえば反応性側鎖が、インフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体のいずれかの場所で反応性側鎖との結合を形成できる位置において特定されていてもよい。いくつかの態様において、このようなさらなる位置は、たとえば、タンパク質、ポリペプチドまたはタンパク質複合体の免疫原性／抗原性を維持または改良するために選択されていてもよい。いくつかの態様において、架橋されるこのようなさらなる位置は対で選択されていてもよい。
【０１１５】
ジ−チロシン（ＤＴ）架橋
いくつかの態様において、本発明は、ジ−チロシン（ＤＴ）架橋を含むインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体、ならびにこのようなＤＴ架橋したインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体を作製する方法を提供する。
【０１１６】
ジ−チロシン架橋結合は１つ以上の共有炭素間結合をタンパク質またはタンパク質複合体内に導入する。これは、それらの構造的および機能的完全性を維持しながら、分子内および／または分子間ポリペプチドジ−チロシン結合の導入によって、タンパク質、タンパク質複合体および立体構造を安定化させるための方法を提供する（Ｍａｒｓｈａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第７，０３７，８９４号および同第７，４４５，９１２号（これらの内容は参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと）。最小限変化し、ゼロ長のＤＴ架橋は生理的条件下で加水分解せず、液体クロマトグラフィー／質量分析（ＬＣ／ＭＳ）によってタンパク質の構造的完全性を維持することが実証されている。ジ−チロシン架橋は、それらの特定の特徴を利用するために開発されたタンパク質の文脈において（たとえば、Ｅｌｖｉｎ  ＣＭ  ｅｔ  ａｌ．２００５，Ｎａｔｕｒｅ  ４３７：９９９−１００２；Ｔｅｎｏｖｕｏ  Ｊ  ＆  Ｐａｕｎｉｏ  Ｋ  １９７９，Ａｒｃｈ  Ｏｒａｌ  Ｂｉｏｌ．；２４（８）：５９１−４）、および非特異的タンパク質酸化の結果として（Ｇｉｕｌｉｖｉ  ｅｔ  ａｌ．２００３，Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  ２５（３−４）：２２７−３２）の両方で、それらがｉｎ  ｖｉｖｏで自然に形成されるので、また、それらが最も一般的な食品のいくつかに大量に存在するので、安全であることが知られている：ＤＴ結合は、たとえば、混合およびベーキングの間のパン生地においてグルテンサブユニットを含む四次タンパク質構造である、小麦グルテンの構造を形成する（Ｔｉｌｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．２００１，Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ  ４９，２６２７）。ジ−チロシン結合はｉｎ  ｖｉｔｒｏで自然発生的に形成しない。むしろ、酵素架橋反応はタンパク質構造および機能を保存するための最適条件下で実施される。したがって、（ジスルフィド結合と異なり）非特異的結合／凝集は生じないので、ＤＴ安定化免疫原の大規模製造が、より経済的に実現可能になり得る。
【０１１７】
チロシル側鎖は、多くの酸化還元酵素、および多くの場合、長寿命で比較的低い反応性を有するチロシルラジカルに関与する酵素特異的反応の触媒に存在する。最適条件下で、ラジカル形成はチロシル側鎖に特異的である。近接して、チロシル側鎖はラジカルカップリングを受け、共有炭素間結合を形成する。反応しないチロシルラジカルはラジカル化していないチロシル側鎖に戻る（Ｍａｌｅｎｃｉｋ  ＆  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，２００３．Ｄｉ−ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ａｓ  ａ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ｏｆ  ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｓｔｒｅｓｓ  ａｎｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｂｅ．Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  ２５：２３３−２４７）。したがって、チロシル側鎖は、単一の折り畳まれたポリペプチド鎖内、または複合体内の近接して相互作用するタンパク質ドメイン上のいずれかでＤＴ結合を形成するように近接して位置付けされなければならない。約５〜８ÅのＣα−Ｃα分離は結合形成の必須条件であるので（Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８．Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｂｙ  ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｇｌｙｃｉｎｅ−ｇｌｙｃｉｎｅ−ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３７，４３９７−４４０６；Ｍａｒｓｈａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．２００６，米国特許第７，０３７，８９４号）、また、これらの結合の形成において原子が加えられないので、得られる「ステープル」は「ゼロ長」およびタンパク質構造に対して非破壊的である。
【０１１８】
架橋されるチロシン残基は、架橋されるタンパク質の一次構造で天然に存在していてもよいか、または制御された点変異によって加えられてもよい。ＤＴ結合を形成するために、チロシル側鎖を有するタンパク質がＤＴ結合の形成を導く反応条件に供されていてもよい。ＤＴ結合形成反応は酸化架橋結合反応であるので、このような条件は、酸化反応条件であるか、または酸化反応条件になる。いくつかの態様において、ＤＴ架橋結合反応条件は、別様で修飾されていないか、または検出可能に修飾されていないタンパク質を生じる。このような条件は、Ｈ2Ｏ2の形成を触媒する酵素、たとえばペルオキシダーゼの使用により得られていてもよい。ＤＴ結合形成は、約３２０ｎｍの励起波長を用いる分光測光法によってモニターされていてもよく、約４００ｎｍの波長にて蛍光測定されていてもよく（たとえば、図４Ａを参照のこと）、一方、チロシル蛍光の喪失も、標準的な手段によってモニターされる。チロシル蛍光の喪失がＤＴ結合形成ともはや化学量論的ではない場合、反応は当業者に公知である任意の方法によって、たとえば還元剤の付加およびその後の試料の冷却（氷上）または凍結などによって停止されていてもよい。ＤＴ架橋結合を実施する方法のさらなる詳細は当該分野において公知であり、たとえば、Ｍａｒｓｈａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．２００６、米国特許第７，０３７，８９４号（その内容は参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【０１１９】
タンパク質操作におけるジ−チロシン架橋結合の主要な利点には、（ｉ）（タンパク質および複合体の一次、二次、三次および／または四次構造に基づいて）架橋結合するための特定の残基を標的する能力、（ｉｉ）最小の構造的修飾、（ｉｉｉ）反応の特異性（チロシンは特定の架橋条件下で架橋を形成することが知られている唯一のアミノ酸である）；（ｉｖ）連結の安定性、（ｖ）架橋のゼロ長（原子は加えられていない）、および（ｖｉ）架橋結合化学の拡張性が含まれる。
【０１２０】
いくつかの態様において、標的ＤＴ架橋は、ここで挙げられているインフルエンザＨＡタンパク質における特定の場所の１つ以上に導入されていてもよい。他の態様において、インフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体内のさらなる位置が特定されていてもよく、その位置においてＤＴ架橋が作製されていてもよい。いくつかの態様において、ジ−チロシン結合または架橋は、ＤＴ結合がたとえばそれらの近接性に起因して形成する、または形成することが予想されるインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体の構造内の特定の残基の対合に標的化される。いくつかの態様において、チロシル側鎖は架橋されるアミノ酸残基において既に存在する。いくつかの場合、天然に存在するチロシン残基はジ−チロシン結合形成に必要な対合したチロシン残基のいずれか１つまたは両方を構成していてもよい。しかしながら、他の場合、本発明のインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体は、１つ以上のチロシン残基を加えるように、または１つ以上の非チロシン残基をチロシン残基に置換するように変異されるか、または操作される。このような変異はここで「チロシンへの」変異と称され、ジ−チロシン架橋／結合を形成することが望ましい場所に導入されていてもよい。いくつかの態様において、本発明は、インフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体をコードする核酸配列においてチロシンへの点変異を導入することによってチロシル側鎖が所望の架橋結合位置に導入される変異インフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体を提供する。あるいは、いくつかの態様において、インフルエンザＨＡタンパク質、ポリペプチドもしくはタンパク質複合体、またはそれらの部分は、所望の架橋結合位置においてチロシル側鎖を有するチロシン残基またはアミノ酸を含むように合成されていてもよい。反対に、いくつかの態様において、本発明は、インフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質もしくはタンパク質複合体をコードする核酸配列においてチロシンからの点変異を導入することによってチロシル側鎖が望ましくない架橋結合位置において除去されている変異インフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／もしくはタンパク質複合体を提供するか、またはインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質もしくはタンパク質複合体は、架橋結合が望まれない位置におけるチロシン残基もしくはチロシル側鎖を有するアミノ酸を排除するように合成されていてもよい。たとえば、チロシル側鎖の少なくとも１つは、別の側鎖、たとえばフェニルアラニン側鎖と置きかえられていてもよい（たとえば、Ｍａｒｓｈａｌｌ  ＣＰ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第７，０３７，８９４号（その内容は参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと）。したがって、本発明のインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質およびタンパク質複合体は、「チロシンへの」または「チロシンからの」点変異を含んでいてもよい。このような変異は、当該分野において公知である任意の適切な変異誘発法を使用して本発明のインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体をコードする核酸配列を変化させることによって作製できる。あるいは、変異インフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体は、当該分野において公知である任意の他の適切な方法によって合成、精製および／または産生されていてもよい。
【０１２１】
いくつかの態様において、本発明は、インフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体における、たとえば架橋が、ストークドメインを天然の三量体立体構造または抗ストーク抗体、たとえば中和もしくは広域中和抗ストーク抗体と結合できる他の立体構造に安定化させるか、または安定化させることができる、ストークドメインにおける任意の適切な位置における１つ以上のジ−チロシン架橋の標的導入を意図する。このような安定化は、たとえば、ストーク単量体内の相互作用もしくは折り畳み（分子内架橋結合）および／またはストーク三量体を含む１つ以上のストーク単量体の間の相互作用（分子間架橋結合）を安定化させる架橋、または分子内および／もしくは分子間架橋のいずれかの組合せを導入することによって達成されていてもよい。
【０１２２】
タンパク質分解による切断
本発明のいくつかの態様において、本発明のインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体（および／またはそれらの合成における中間体）は、たとえば、頭部ドメインのタンパク質分解による除去を容易にするために使用され得る１つ以上のプロテアーゼ認識モチーフを含む。当該分野において公知である任意の適切なプロテアーゼ認識モチーフが使用されていてもよい。このような操作されたプロテアーゼ認識部位は、それらが、頭部ドメインの破壊および／または除去に有用であるが、好ましくはストークドメイン（および／またはストークドメインにおける中和エピトープの立体構造）の天然の三量体立体構造を破壊しないインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体における任意の適切な場所に配置されていてもよい。このような場所は、限定されないが、機能的アッセイ、抗体結合アッセイ、抗原アッセイ、構造アッセイなどにおいて操作されたプロテアーゼ認識部位を導入している効果を試験することを含む、当該分野において公知である方法を使用して決定されていてもよい。いくつかの態様において、このような操作されたプロテアーゼ認識モチーフは可変ループ領域内に位置していてもよい。なぜならこのような領域はインフルエンザＨＡタンパク質の構造および／または機能を顕著に変化させずにアミノ酸配列の変化を許容することが知られているからである。本発明のインフルエンザＨＡタンパク質は、インフルエンザＨＡタンパク質配列内にプロテアーゼ認識配列を生成するために、たとえば、プロテアーゼ認識部位（たとえば、配列番号１８、１９、２１、２３および２５を参照のこと）を含むか、その一部を含む１つ以上のアミノ酸を挿入することによって、またはインフルエンザＨＡタンパク質由来の１つ以上のアミノ酸を、プロテアーゼ認識部位（たとえば、配列番号２４を参照のこと）を含むか、もしくはその一部を含む異なるアミノ酸と置換することによって、またはアミノ酸（たとえば、配列番号２０および２２を参照のこと）の挿入および置換の組合せを実施することによって１つ以上のプロテアーゼ認識配列を導入するように操作されていてもよい。操作されたプロテアーゼ認識部位は典型的に約２０までのアミノ酸残基からなる。いくつかの態様において、ここで記載されているインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体は、以下の一番目の頭部を除去した部位：アミノ酸残基５３〜６７、アミノ酸残基６０〜７６、アミノ酸残基２６９〜２７７、およびアミノ酸残基２７７〜２９０のうちの１つ以上において操作されたプロテアーゼ認識モチーフを含み、また、以下の二番目の頭部を除去した部位：アミノ酸残基１４２〜１４６、およびアミノ酸残基１５５〜１６４のうちの１つ以上において操作されたプロテアーゼ認識モチーフを任意に含んでいてもよい。いくつかの態様において、本発明のインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体は、インフルエンザＨＡタンパク質の以下の領域：アミノ酸残基４０〜６８、アミノ酸残基６０〜７６、アミノ酸残基７７〜１１４、アミノ酸残基１２０〜１４１、アミノ酸残基１４２〜１４６、アミノ酸残基１４８〜１７８、アミノ酸残基１８２〜１８８、アミノ酸残基１９５〜２０１、アミノ酸残基２０９〜２４２、アミノ酸残基２５０〜２５５、アミノ酸残基２６０〜２８５、アミノ酸残基２７７〜２９０、およびアミノ酸残基２８６〜３２０のうちの１つにおいてアミノ酸残基位置において開始するプロテアーゼ認識配列を含む。いくつかの態様において、このようなプロテアーゼ認識モチーフは、インフルエンザＨＡ頭部ドメインにおけるＳａ、Ｃａ、ＳｂおよびＣｂ抗原部位のうちの１つ以上におけるタンパク質分解による切断を可能にすることができる。いくつかの態様において、プロテアーゼ認識モチーフは、位置４８、６３、２７８、２８２、２８６または２９１におけるアミノ酸の直後でインフルエンザＨＡタンパク質内に挿入される。いくつかの態様において、プロテアーゼ認識モチーフは、インフルエンザＨＡタンパク質の以下の領域：アミノ酸残基３８〜５８、アミノ酸残基５３〜７３、アミノ酸残基２６８〜２８８、アミノ酸残基２７２〜２９２、アミノ酸残基２７６〜２９６およびアミノ酸残基２８１〜３０１のうちの１つ以上においてインフルエンザＨＡタンパク質内に挿入される。いくつかの態様において、プロテアーゼ認識モチーフは、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ認識配列（たとえば、ＬＥＶＬＦＱＧＰ（配列番号６９））もしくはＴＥＶ認識配列（たとえば、ＥＮＬＹＦＱＧ（配列番号７０）またはＥＮＬＹＦＱＳ（配列番号７１））、またはそれらのいずれかの組合せを含んでいてもよい。このようなプロテアーゼ認識部位をコードするヌクレオチド配列は、当該分野において公知である標準的な分子生物学的手法を使用して本発明のインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体をコードする核酸内に操作されていてもよい。
【０１２３】
インフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質およびタンパク質複合体の作製および分析
いくつかの態様において、本発明は、本発明のインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質およびタンパク質複合体を作製する方法を提供する。本発明のインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質およびタンパク質複合体は、当該分野において公知である任意の適切な手段によって作製できる。いくつかの態様において、本発明のインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体は、組換え手段によって作製できる。いくつかの態様において、本発明のインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／もしくはタンパク質複合体、またはそれらのいずれかの部分は、化学合成手段によって作製できる。たとえば、ここで記載されているタンパク質またはタンパク質複合体の一部に対応するペプチドは、ペプチドシンセサイザーの使用によって合成できる。
【０１２４】
組換え産生方法
本発明のインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質およびタンパク質複合体が組換え手段によって作製される態様において、本発明のインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質およびタンパク質複合体をコードする核酸は、限定されないが、哺乳動物細胞、トリ細胞（たとえばＥＢ６６アヒル細胞）および昆虫細胞（たとえばバキュロウイルス発現系を使用したＳＦ９またはＨｉ５細胞）を含む、任意の適切な細胞種類において発現できる。核酸分子からポリペプチドおよびタンパク質を発現する方法は慣用であり、当該分野において周知であり、当該分野において公知である任意の適切な方法、ベクター、系および細胞種類を使用できる。たとえば、典型的に、本発明のインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体をコードする核酸配列は、適切なプロモーターを含有する適切な発現構築物内に置かれ、次いでそれは発現のために細胞に送達される。
【０１２５】
キメラ／融合タンパク質およびオリゴマー形成ドメイン
いくつかの態様において、キメラタンパク質／融合タンパク質を産生するため、たとえば、ここで記載されているインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体の分析および／または単離および／または精製を容易にするために、ここで記載されているインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体にキメラドメインを付加することが好適であってもよい。いくつかの態様において、本発明のインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質およびタンパク質複合体は、リーダー配列、前駆体ポリペプチド配列、分泌シグナル、局在化シグナル、エピトープタグ、プロテアーゼ切断部位などを含んでいてもよい。使用され得るエピトープタグには、限定されないが、ＦＬＡＧタグ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）タグ、ヘマグルチニンＡ（ＨＡ）タグ、ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、ルシフェラーゼタグ、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）タグ、ｃ−Ｍｙｃタグ、プロテインＡタグ、プロテインＧタグ、ストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐ）タグなどが含まれる。
【０１２６】
いくつかの態様において、ここで記載されているインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／もしくはタンパク質複合体の構築を容易にするため、ならびに／またはストークドメインの天然の三量体立体構造での安定化を容易にするために、ならびに／またはインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／もしくはタンパク質複合体の他の構造的性質を安定化させるためにオリゴマー形成ドメインを付加することが好適であってもよい。いくつかの態様において、オリゴマー形成ドメインは、限定されないが、Ｔ４フォルドンモチーフを含む、三量体モチーフである。限定されないが、Ｈａｂａｚｅｔｔｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００９（Ｈａｂａｚｅｔｔｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００９．ＮＭＲ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａ  Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ  Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｉｌｙ  Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｐａｔｈｗａｙ  ｏｆ  ａ  Ｓｍａｌｌ  Ｔｒｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  Ｄｏｍａｉｎ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．），Ｋａｍｍｅｒｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００５（Ｋａｍｍｅｒｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００５．Ａ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ｔｒｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｍｏｔｉｆ  ｃｏｎｔｒｏｌｓ  ｔｈｅ  ｔｏｐｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｓｈｏｒｔ  ｃｏｉｌｅｄ  ｃｏｉｌｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０２（３９）：１３８９１−１３８９６），Ｉｎｎａｍｏｒａｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００６（Ｉｎｎａｍｏｒａｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００６．Ａｎ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃ１ｑ−ｇｌｏｂｕｌａｒ  ｄｏｍａｉｎ．Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌ  １８（６）：７６１−７７０）、およびＳｃｈｅｌｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００７（Ｓｃｈｅｌｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００７．Ｔｈｅ  ｒｅｏｖｉｒｕｓ  σ−１  ａｓｐａｒｔｉｃ  ａｃｉｄ  ｓａｎｄｗｉｃｈ：Ａ  ｔｒｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｍｏｔｉｆ  ｐｏｉｓｅｄ  ｆｏｒ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ｃｈａｎｇｅ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８２（１５）：１１５８２−１１５８９）に記載されているものを含む、これらの目的のために使用できる天然のタンパク質において様々な三量体形成ドメインが存在する。三量体タンパク質複合体の安定化はまた、ＧＣＮ４およびＴ４フィブリニチン（fibrinitin）モチーフを使用して達成できる（Ｐａｎｃｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２００５．Ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｍｉｍｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ｖｉｒｕｓ  Ｔｙｐｅ  １  Ｖｉｒａｌ  Ｓｐｉｋｅｓ  Ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｂｙ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｖｅ  Ｔｒｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  Ｄｏｍａｉｎ  ｗｉｔｈ  ａ  Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  Ｔｒｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  Ｍｏｔｉｆ：Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｇａｎｄ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７９（１５）：９９５４−９９６９；Ｇｕｔｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００４．Ｖｅｒｙ  ｆａｓｔ  ｆｏｌｄｉｎｇ  ａｎｄ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｔｒｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｄｏｍａｉｎ  ｆｒｏｍ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  Ｔ４  ｆｉｂｒｉｔｉｎ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．ｖ���３７  ｐｐ．９０５−１５；Ｐａｐａｎｉｋｏｌｏｐｏｕｌｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００８．Ｃｒｅａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄ  ｎａｎｏｒｏｄｓ  ｆｒｏｍ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｎａｔｕｒａｌ  ｔｒｉｍｅｒｉｃ  ｆｉｂｒｏｕｓ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｆｉｂｒｉｔｉｎ  ｔｒｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｍｏｔｉｆ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ４７４：１５−３３）。異種オリゴマー形成モチーフが、本発明のタンパク質のタンパク質間相互作用を安定化させるために当業者に公知である任意の組換え法によって導入されていてもよい。
【０１２７】
いくつかの態様において、１つより多いさらなるドメインおよび／またはタグを、ここで記載されているインフルエンザポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体に付加することが好適であってもよく、適切なキメラおよび／またはオリゴマー形成ドメインの任意の組合せが、所望のインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体を作製するために付加されていてもよい。いくつかの態様において、膜貫通領域の全てまたは一部がさらなるドメインによって置きかえられるように、さらなるドメインは、たとえば膜貫通領域内の１つ以上のアミノ酸の挿入および／または置換によって、インフルエンザＨＡタンパク質の膜貫通領域においてまたは内で操作される。いくつかの態様において、さらなるドメインはトロンビン切断部位、Ｔ４フォルドンモチーフおよびヒスチジンタグ（たとえば６ｘＨｉｓタグ（配列番号１１８））を含む。いくつかの態様において、さらなるドメインは、ＣＧＴＴＣＴＣＴＧＧＴＴＣＣＧＣＧＴＧＧＴＴＣＴＣＣＧＧＧＴＴＣＴＧＧＴＴＡＣＡＴＣＣＣＧＧＡＡＧＣＴＣＣＧＣＧＴＧＡＣＧＧＴＣＡＧＧＣＴＴＡＣＧＴＴＣＧＴＡＡＡＧＡＣＧＧＴＧＡＡＴＧＧＧＴＴＣＴＧＣＴＧＴＣＴＡＣＣＴＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＴＧＡ（配列番号７２）を含む核酸によってコードされる。いくつかの態様において、インフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体は、アミノ酸配列ＲＳＬＶＰＲＧＳＰＧＳＧＹＩＰＥＡＰＲＤＧＱＡＹＶＲＫＤＧＥＷＶＬＬＳＴＦＬＨＨＨＨＨＨ（配列番号１１６）を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になるタグを含む。
【０１２８】
キメラインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体は当業者に公知である任意の方法によって作製でき、別のタンパク質または他のタンパク質のドメインまたはモチーフのアミノ酸配列と、ペプチド結合を介してそのアミノまたはカルボキシ末端において結合される、たとえば、本発明の１つまたは複数のインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／もしくはタンパク質複合体、ならびに／またはそれらのいずれかの断片、誘導体もしくは類似体（たとえば、本発明のポリペプチド、タンパク質もしくはタンパク質複合体の少なくとも１つのドメイン、またはそれらの少なくとも６および好ましくは少なくとも１０アミノ酸からなる）を含んでいてもよい。いくつかの態様において、このようなキメラタンパク質は、限定されないが、キメラタンパク質をコードする核酸（たとえば、インフレームで第２のコード配列と結合される第１のコード配列を含む）の組換え発現；適切なコードフレームにおける所望のアミノ酸配列をコードする適切な核酸配列の互いとのライゲーション、およびキメラ産物の発現を含む、当業者に公知である任意の方法によって産生できる。
【０１２９】
翻訳後修飾
いくつかの態様において、ここで記載されているインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質およびタンパク質複合体は、翻訳後修飾を付加もしくは除去することによって、化学修飾もしくは付加物を付加もしくは除去することによって、および／または当業者に公知である任意の他の修飾を導入することによって変化されていてもよい。翻訳または合成の間または後に、たとえば、グリコシル化（または脱グリコシル化）、アセチル化（または脱アセチル化）、リン酸化（または脱リン酸化）、アミド化（または脱アミド化）、ペグ化、公知の保護／遮断基による誘導体化、タンパク質分解による切断によって、または当該分野において公知である任意の他の手段によって修飾されるインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質およびタンパク質複合体は本発明の範囲内に含まれる。たとえば、いくつかの態様において、インフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体は、臭化シアン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、Ｖ８プロテアーゼ、ＮａＢＨ４、アセチル化、ホルミル化、酸化、還元による化学的切断、ツニカマイシンの存在下での代謝合成などに供されていてもよい。いくつかの態様において、このような翻訳後修飾は、本発明のインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体を、より免疫原性、より安定、ならびに／または中和および広域中和抗体とより結合できるか、もしくはその産生をより誘発できるようにするために使用されていてもよい。
【０１３０】
所望の立体構造のインフルエンザＨＡタンパク質の取得
いくつかの態様において、本発明のインフルエンザＨＡポリペプチドおよび／またはタンパク質は、所望の立体構造的構造、たとえばストークドメインの天然の三量体構造を有するタンパク質複合体に構築され、その構造を安定化させるために架橋される。本出願のいずれかの場所に記載されているように、インフルエンザＨＡタンパク質は３つの単量体から形成される三量体を含む。いくつかの態様において、酵素架橋結合反応の前および／または間、インフルエンザＨＡタンパク質は、たとえば架橋結合が実施されている間、所望の立体構造で得られていてもよい（および／または維持されていてもよい）。いくつかの態様において、インフルエンザＨＡタンパク質は、ほとんどまたは実質的に全てのインフルエンザＨＡ分子が天然の三量体立体構造に存在するストークドメインを有するように、産生および／または単離されていてもよい。たとえば、ＨＡタンパク質が頭部ドメインを含んだままの形態で発現されるか、または得られる場合、ストークドメインは典型的にその天然の三量体ストーク立体構造であると想定される。いくつかの態様において、所望の立体構造のインフルエンザＨＡ分子は、所望の立体構造であるいくつかのもの（たとえば天然のストークドメインの構造）および他の構造であるいくつかのもの（たとえば単量体および／または二量体構造のストークドメイン）を含むインフルエンザＨＡタンパク質分子の混合集団から分離されていてもよい。いくつかの態様において、インフルエンザＨＡタンパク質は細胞内で（たとえば、その膜結合または可溶性形態として）発現され、その正常な立体構造（たとえば、その天然の三量体立体構造のストークドメインを有する）に自然に構築される。いくつかの態様において、インフルエンザＨＡタンパク質のストークドメインをその天然の三量体形態に保持するためにさらなる安定化は必要とされなくてもよい。いくつかの態様において、発現され、構築された／折り畳まれたインフルエンザＨＡタンパク質は、ストークドメインの天然の三量体立体構造の形成および／または維持に好適な特定の条件下、または特定の組成物中に維持されていてもよい。インフルエンザＨＡタンパク質は、限定されないが、標準的なタンパク質精製法、たとえばイオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーおよび／または親和性クロマトグラフィー法を含む、当該分野において公知である任意の適切な方法を使用して所望の立体構造で得られていてもよく、および／または単離されていてもよく、および／または維持されていてもよい。いくつかの態様において、インフルエンザＨＡタンパク質は、インフルエンザＨＡタンパク質と結合し、それをその所望の立体構造に安定化させる分子（限定されないが、抗体、小分子、ペプチドおよび／またはペプチド模倣体を含む）の存在下で発現されていてもよいか、その分子と共発現されていてもよいか、またはその分子と接触されていてもよい。その天然の三量体立体構造におけるストークドメインと結合する抗体の非限定的な例には、６Ｆ１２、Ｃ１７９、ＣＲ６２６１、Ｆ１０、Ａ６６およびＤ８が含まれる。本発明のＨＡポリペプチド、タンパク質およびタンパク質複合体を特徴付けるか、または安定化させるために使用できる他の抗体には、限定されないが、１８Ａ３、１８Ｃ１１、１８Ｅ７、１８Ｅ１２、１８Ｈ９、１６Ｂ５、１０Ａ１４、５Ｋ２４、ＦＩ６ｖ３、６Ｋ１４、６Ｊ２４、８Ｄ４、ＶH１−６９重鎖系統の抗インフルエンザヒト抗体、およびＶH３−３０重鎖系統の抗インフルエンザヒト抗体が含まれる。いくつかの態様において、インフルエンザＨＡタンパク質は、タンパク質が存在する媒体／緩衝液のイオン強度を制御することによって（たとえば、高または低イオン強度媒体を使用することによって）、その所望の立体構造で得られていてもよいか、単離されていてもよいか、または維持されていてもよい。いくつかの態様において、インフルエンザＨＡタンパク質は、所望の立体構造の保存に好適な１つ以上の温度で得られていてもよいか、単離されていてもよいか、または維持されていてもよい。いくつかの態様において、インフルエンザＨＡタンパク質は、所望の立体構造が喪失する程度を減少させる時間にわたって得られていてもよいか、単離されていてもよいか、または維持されていてもよい。
【０１３１】
いくつかの態様において、分析は、所望の立体構造、たとえばストークドメインの天然の三量体立体構造がインフルエンザＨＡタンパク質において形成および／または維持されていることを確認するために実施されていてもよい。このような分析は、架橋結合の前、架橋結合プロセスの間、架橋結合プロセスの後、またはこのような段階のいずれかの組合せにおいて実施されていてもよい。このような分析は、機能的分析、結晶学的分析などを含む、タンパク質またはタンパク質複合体の３次元構造を評価するための当該分野において公知である任意の適切な方法を含んでいてもよい。いくつかの態様において、このような分析は、特定の抗体、たとえばここでのいずれかの場所に記載されている、ストークドメインの天然の三量体立体構造に特異的であるものおよび／またはストークドメインにおける抗原部位もしくはインフルエンザＨＡタンパク質におけるいずれかの場所と結合することが知られているもの（限定されないが、６Ｆ１２、Ｃ１７９、ＣＲ６２６１、Ｆ１０、Ａ６６およびＤ８抗体を含む）とのインフルエンザＨＡタンパク質の結合の評価を含んでいてもよい。
【０１３２】
タンパク質精製
いくつかの態様において、本発明のインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質およびタンパク質複合体を作製する方法は、製造プロセスにおける１つ以上の工程の前、間または後に、インフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体を精製することを含んでいてもよい。たとえば、いくつかの態様において、本発明のインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体は、全ての製造工程の完了後に精製されていてもよい。いくつかの態様において、本発明のインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体は、架橋結合プロセスを開始する前またはプロセスにおける中間の方法の工程の１つ以上の後、たとえば、インフルエンザＨＡポリペプチドもしくはタンパク質の発現後、タンパク質複合体の構築後、所望の立体構造でのインフルエンザＨＡタンパク質の取得後、架橋結合反応を実施している間もしくは後、または頭部ドメインの除去後に精製されていてもよい。本発明のインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体は、当該分野において公知である任意の適切な方法を使用して単離または精製されていてもよい。このような方法には、限定されないが、クロマトグラフィー（たとえば、イオン交換、親和性および／またはサイズカラムクロマトグラフィー）、硫安分画、遠心分離、溶解度差または当業者に公知であるタンパク質を精製するための任意の他の手法が含まれる。具体的な態様において、十分に架橋されなかったもの、または頭部ドメインが十分に除去されなかったものから、本発明の好適なインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体を分離することが必要であってもよい。これは、当該分野において公知である任意の適切なシステムを使用して行うことができる。たとえば、天然の三量体立体構造におけるストークドメインを有するインフルエンザＨＡタンパク質は、抗体に基づいた分離方法を使用して、天然の三量体立体構造ではないストークドメインを有するものから分離できる。本発明のインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体は、それらを産生するために使用される任意の供給源から精製されていてもよい。たとえば、本発明のインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体は、昆虫、原核生物、真核生物、単細胞、多細胞、動物、植物、真菌、脊椎動物、哺乳動物、ヒト、ブタ、ウシ、ネコ、ウマ、イヌ、トリもしくは組織培養細胞を含む供給源、または任意の他の供給源から精製されていてもよい。純度は変化していてもよいが、種々の態様において、本発明の精製されたインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体は、それらが最終組成物中に総タンパク質の約１０％、２０％、５０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％もしくは９９．９％超を含む形態で提供される。いくつかの態様において、本発明のインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体は、限定されないが、クロマトグラフィー、グリセロール勾配、親和性クロマトグラフィー、遠心分離、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーおよび親和性クロマトグラフィーを含む標準的な方法によって、または当業者に公知であるタンパク質を精製するための任意の他の標準的な手法によって、他のタンパク質または任意の他の望ましくない産物（たとえば非架橋産物または頭部ドメインの除去が不十分または不完全である産物）から単離および精製されていてもよい。単離されるインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／もしくはタンパク質複合体は、高もしくは低イオン媒体中で発現されていてもよいか、または高もしくは低イオン緩衝液もしくは溶液中で単離されていてもよい。本発明のインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体はまた、所望の立体構造の保存に好適な１つ以上の温度で単離されていてもよい。それらはまた、沈殿が所望の立体構造を喪失する程度を減少させる時間にわたって単離されていてもよい。タンパク質の沈殿が１つ以上の所望の立体構造（たとえばストークドメインの天然の三量体立体構造および／もしくは中和抗体と好適に結合する構造、または他の所望の特性）を保持する程度は、たとえば、限定されないが、生化学的、生物物理学的、免疫学的およびウイルス学的分析を含む、当該分野において公知である任意の適切な方法によってアッセイされていてもよい。このようなアッセイには、たとえば、限定されないが、免疫沈降、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）または酵素結合免疫吸着スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）アッセイ、結晶学的分析（抗体による共結晶化を含む）、沈殿、分析超遠心分離、動的光散乱（ＤＬＳ）、電子顕微鏡法（ＥＭ）、ｃｒｙｏ−ＥＭ断層撮影法、熱量測定法、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、円偏光二色性分析、および小角ｘ線散乱、中和アッセイ、抗体依存性細胞毒性アッセイ、および／またはｉｎ  ｖｉｖｏでのウイルス学的チャレンジ試験が含まれる。
【０１３３】
本発明のインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体の収率は、当該分野において公知である任意の手段によって、たとえば、出発材料の量と比較して、または産生方法の任意の先行する工程に存在する材料の量と比較して、最終の操作されたタンパク質（たとえば架橋インフルエンザＨＡタンパク質）の量を比較することによって決定できる。タンパク質濃度は、標準的な手段、たとえばブラッドフォードまたはローリータンパク質アッセイなどによって決定できる。ブラッドフォードアッセイは還元剤および変性剤と適合する（Ｂｒａｄｆｏｒｄ，Ｍ，１９７６．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２：２４８）。ローリーアッセイは洗浄剤と良好な相溶性を有し、反応はタンパク質濃度および読み取り値に対して十分に線形である（Ｌｏｗｒｙ，Ｏ  Ｊ，１９５１．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９３：２６５）。
【０１３４】
例示的な産生方法
いくつかの態様において、本発明は、ここで記載されている「頭部のない」インフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体を作製する方法を提供する。いくつかの態様において、「頭部のない」インフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体を作製する方法は、（ａ）（ｉ）ストークドメインと頭部ドメインの両方、および（ｉｉ）その頭部ドメインにおける、または近接した１つ以上の操作されたプロテアーゼ認識モチーフを有するインフルエンザＨＡタンパク質を発現させること、（ｂ）工程（ａ）において発現された可溶性インフルエンザＨＡタンパク質を、三量体ストークドメインおよび頭部ドメインを有するその天然の立体構造に折り畳むことを可能にすること、（ｃ）１つ以上の架橋を三量体ストークドメインに導入することであって、架橋はストークドメインをその天然の三量体立体構造に安定化させる、導入すること、ならびに（ｄ）続いて、頭部ドメインをタンパク質分解により破壊または除去し、それにより頭部のないインフルエンザＨＡタンパク質を産生することを含む。いくつかのこのような態様において、架橋は標的架橋、たとえばジ−チロシン架橋である。いくつかの態様において、方法はまた、工程（ｃ）における１つ以上の架橋の導入が、ストークの立体構造をその天然の三量体立体構造に安定化させることができ、および／またはストークを、１つ以上の広域中和抗ストーク抗体の結合を可能にする構造に安定化させることができる、ＨＡタンパク質における１つ以上の領域を最初（少なくとも工程（ｃ）の前）に特定することも含む。いくつかの態様において、「頭部のない」インフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体を作製する方法は、（ａ）（ｉ）ストークドメインと頭部ドメインの両方、（ｉｉ）１つ以上の「そのストークドメイン内のチロシンへの変異」、および（ｉｉｉ）その頭部ドメイン内またはそれに近接した１つ以上の操作されたプロテアーゼ認識モチーフを有するインフルエンザＨＡタンパク質を発現させること、（ｂ）インフルエンザＨＡタンパク質を、三量体ストークドメインおよび頭部ドメインを有するその天然の立体構造に折り畳むことを可能にすること、（ｃ）１つ以上のジ−チロシン架橋を三量体ストークドメインに導入することであって、ジ−チロシン架橋は生理的条件下で安定であり、ストークドメインをその天然の三量体立体構造に安定化させる、導入すること、ならびに（ｄ）続いて、頭部ドメインをタンパク質分解により除去し、それにより可溶性の頭部のないインフルエンザＨＡタンパク質を産生することを含む。いくつかの態様において、方法はまた、工程（ｃ）における１つ以上のＤＴ架橋の導入が、ストークの立体構造をその天然の三量体立体構造に安定化させることができ、および／またはストークを、１つ以上の広域中和抗ストーク抗体の結合を可能にする立体構造に安定化させることができる、ＨＡタンパク質における１つ以上の領域を最初（少なくとも工程（ｃ）の前）に特定することも含む。このような方法において、可溶性インフルエンザＨＡタンパク質は典型的に、上記および本出願の他の項におけるように、頭部ドメインのタンパク質分解による除去を容易にするために使用できる１つ以上のプロテアーゼ認識モチーフを含む。
【０１３５】
いくつかの態様において、ここで記載されている「頭部のない」インフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体を作製する方法は、インフルエンザＨＡタンパク質の頭部ドメインが十分に破壊または除去されていることを確認するために、タンパク質分解による切断の工程の開始または完了後に分析を実施することをさらに含んでいてもよい。いくつかのこのような態様において、この分析は、たとえば、ＳＤＳ  ＰＡＧＥゲル移動度シフトアッセイ実施すること、または頭部特異的抗体を使用することを含んでいてもよい。
【０１３６】
いくつかの態様において、本発明は、ここで記載されている「頭部のある」インフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体を作製する方法を提供する。いくつかの態様において、「頭部のある」インフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体を作製する方法は、（ａ）ストークドメインおよび頭部ドメインを含むインフルエンザＨＡタンパク質を発現させること、（ｂ）発現させたインフルエンザＨＡタンパク質を、三量体ストークドメインを有するその天然の立体構造に折り畳むことを可能にすること、ならびに（ｃ）１つ以上の生理的に安定な架橋を、三量体ストークドメインおよび任意にまた、頭部ドメインにおけるＨＡタンパク質に導入し、それにより架橋ストークドメインを有する操作された「頭部のある」インフルエンザＨＡタンパク質を産生することを含む。いくつかのこのような態様において、架橋は標的架橋、たとえばジ−チロシン架橋である。いくつかの態様において、「頭部のない」インフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体を作製する方法は、（ａ）そのストークドメインおよび任意にまた頭部ドメイン内の標的位置において１つ以上の「チロシンへの」変異を有するインフルエンザＨＡタンパク質を発現させること、（ｂ）インフルエンザＨＡタンパク質を、三量体ストークドメインおよび頭部ドメインを有するその天然の立体構造に折り畳むことを可能にすること、ならびに（ｃ）ストークドメインおよび任意にまた、頭部ドメインにおける架橋チロシン残基に対するＤＴ架橋結合反応を実施し、それによりＤＴ−架橋ストークドメインを有する操作された「頭部のある」インフルエンザＨＡタンパク質を産生することを含む。このような方法において、インフルエンザＨＡタンパク質は、所望の場合、「頭部のない」インフルエンザＨＡタンパク質を生成するために、「頭部のある」タンパク質の頭部ドメインの後のタンパク質分解による除去を容易にするために使用できる１つ以上のプロテアーゼ認識モチーフを含んでいてもよい。
【０１３７】
インフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体の特性
いくつかの態様において、ここで記載されているように特に架橋されているものを含む、本発明のインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体は、特定の構造的、物理的、機能的および／または生物学的特性を有する。このような特性には、以下のうちの１つ以上、または以下のうちのいずれかの組合せが含まれていてもよい：頭部ドメインの存在または非存在、ストークドメインのその天然の三量体立体構造での存在；（架橋されていないインフルエンザＨＡタンパク質と比較して）ストークドメインの天然の三量体立体構造の改良された安定性；（架橋されていないインフルエンザＨＡタンパク質と比較して）インフルエンザＨＡタンパク質の改良された半減期；（架橋されていないインフルエンザＨＡタンパク質と比較して）改良された熱安定性；（架橋されていないインフルエンザＨＡタンパク質と比較して）長期間の保存可能期間；（架橋されていないインフルエンザＨＡタンパク質と比較して）対象の身体内の長期間の半減期；凝集体を形成せずに溶液中で保存される能力（高濃度で溶液中に存在する場合を含む）；（架橋されていないインフルエンザＨＡタンパク質と比較して）溶液中での凝集の低下；抗体との結合；中和抗体との結合；広域中和抗体との結合；ストーク特異的抗体との結合；立体構造的に特異的な抗体との結合；ストークドメインエピトープを認識する抗体との結合；６Ｆ１２、Ｃ１７９、ＣＲ６２６１、Ｆ１０、Ａ６６およびＤ８からなる群から選択される抗体との結合；Ｂ細胞受容体との結合；Ｂ細胞受容体の活性化；ｉｎ  ｖｉｖｏでの抗体反応の誘発；ｉｎ  ｖｉｖｏでの防御抗体反応の誘発；ｉｎ  ｖｉｖｏでの中和抗体の産生の誘発；ｉｎ  ｖｉｖｏでの広域中和抗体の産生の誘発；ｉｎ  ｖｉｖｏでの四次中和エピトープ（ＱＮＥ）を認識する抗体の産生の誘発；ｉｎ  ｖｉｖｏでの防御免疫反応の誘発；および／またはｉｎ  ｖｉｖｏでの体液性免疫反応の誘発。抗体分子と結合する場合、いくつかの態様において、本発明のインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体は、高い特異性および／または高い親和性で抗体（たとえばストーク特異的抗体および／または６Ｆ１２、Ｃ１７９、ＣＲ６２６１、Ｆ１０、Ａ６６およびＤ８）と結合する。
【０１３８】
特性についてのアッセイ
いくつかの態様において、本発明のインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／もしくはタンパク質複合体、またはそれらの製造におけるいずれかの中間体は、それらが、所望の特性、たとえば所望の構造的、物理的、機能的および／または生物学的特性、たとえば上記または本特許明細書のいずれかの場所で特定されているそれらの特性を有することを確認するために分析されていてもよい。たとえば、いくつかの態様において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏアッセイは、インフルエンザＨＡタンパク質の立体構造的構造、安定性（たとえば熱安定性）、半減期（たとえば対象の身体内）、溶液中の凝集、抗体（たとえば中和抗体、広域中和抗体；ストーク特異的抗体；ストークドメインエピトープを認識する抗体、立体構造的に特異的な抗体、６Ｆ１２、Ｃ１７９、ＣＲ６２６１、Ｆ１０、Ａ６６およびＤａ）との結合、Ｂ細胞受容体との結合、Ｂ細胞受容体の活性化、抗原性、免疫原性、抗体反応を誘発する能力、防御抗体／免疫反応を誘発する能力、中和抗体の産生を誘発する能力、または広域中和抗体の産生を誘発する能力を評価するために実施されていてもよい。本発明のインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体がｉｎ  ｖｉｖｏで動物において試験される態様において、動物は、限定されないが、哺乳動物（たとえば齧歯動物種（たとえばマウスまたはラット）、ウサギ、フェレット、ブタ種、ウシ種、ウマ種、ヒツジ種、または霊長類種（たとえばヒトまたは非ヒト霊長類）、またはトリ種（たとえばニワトリ））を含む任意の適切な動物種であってもよい。
【０１３９】
タンパク質の立体構造的構造を評価するためのアッセイは当該分野において周知であり、限定されないが、結晶学的分析（たとえばＸ線結晶学または電子線結晶学）、沈降分析、分析超遠心、電子顕微鏡法（ＥＭ）、低温電子顕微鏡法（ｃｒｙｏ−ＥＭ）、ｃｒｙｏ−ＥＭ断層撮影法、核磁気共鳴（ＮＭＲ）、小角ｘ線散乱、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）アッセイなどを含む、任意の適切なアッセイが使用されていてもよい。
【０１４０】
タンパク質の安定性を評価するためのアッセイは当該分野において周知であり、限定されないが、変性および非変性電気泳動、等温滴定熱量計、ならびにタンパク質がインキュベートされ、種々のタンパク質濃度、温度、ｐＨまたは酸化還元条件で経時的に分析される経時的実験を含む、任意の適切なアッセイが使用されていてもよい。タンパク質はまた、タンパク質分解に対する感受性についても分析されていてもよい。
【０１４１】
タンパク質の抗体との結合を評価するためのアッセイは当該分野において周知であり、限定されないが、免疫沈降アッセイ、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、酵素免疫スポットアッセイ（ＥＬＩＳＰＯＴ）、結晶学的分析（抗体による同時結晶化を含む）、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイ、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）アッセイなどを含む、任意の適切なアッセイが使用されていてもよい。
【０１４２】
中和活性を評価するためのアッセイは当該分野において周知であり、任意の適切なアッセイが使用されていてもよい。たとえば、アッセイは、本発明のインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／タンパク質複合体による動物のワクチン接種／免疫化によって生成された抗体または抗血清の中和活性を決定するために実施されていてもよい。当該分野において公知である中和アッセイには、限定されないが、Ｄｅｙ  ｅｔ  ａｌ．２００７（Ｄｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ｖｉｒｕｓ  Ｔｙｐｅ  １  Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ  ａｎｄ  Ｔｒｉｍｅｒｉｃ  ｇｐ１２０  Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＣＤ４−Ｂｏｕｎｄ  Ｓｔａｔｅ：Ａｎｔｉｇｅｎｉｃｉｔｙ，Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ，ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８１（１１）：５５７９−５５９３）およびＢｅｄｄｏｗｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００６（Ｂｅｄｄｏｗｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ａ  ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｓｔｕｄｙ  ｉｎ  ｒａｂｂｉｔｓ  ｏｆ  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ−ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃａｌｌｙ  ｃｌｅａｖｅｄ，ｓｏｌｕｂｌｅ  ｔｒｉｍｅｒｉｃ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １  ｇｐ１４０，ｔｒｉｍｅｒｉｃ  ｃｌｅａｖａｇｅ−ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ  ｇｐ１４０  ａｎｄ  ｍｏｍｏｍｅｒｉｃ  ｇｐ１２０．Ｖｉｒｏｌ  ３６０：３２９−３４０）に記載されているものが含まれる。
【０１４３】
ワクチン免疫原が免疫反応を誘発できるかどうか、および／または防御免疫を提供できるかどうかを評価するためのアッセイは当該分野において周知であり、任意の適切なアッセイが使用されていてもよい。たとえば、アッセイは、本発明のインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体による動物のワクチン接種／免疫化が、インフルエンザウイルスによる感染に対する免疫反応および／または防御免疫を提供するかどうかを決定するために実施されていてもよい。いくつかの態様において、比較が、感染またはセロコンバージョンまたはウイルス負荷のそれらの比率に関してプラセボと試験ワクチン接種した群の間でなされていてもよい。
【０１４４】
タンパク質の薬物動態および生体内分布を評価するためのアッセイもまた、当該分野において周知であり、本発明のインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体のそれらの特性を評価するために任意の適切なアッセイが使用されていてもよい。
【０１４５】
組成物
いくつかの態様において、本発明は、ここで記載されているインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体のいずれかを含む組成物を提供する。いくつかの態様において、このような組成物は、免疫原性組成物、ワクチン組成物および／または治療組成物であってもよい。いくつかの態様において、このような組成物は対象に投与されていてもよい。いくつかの態様において、ここで記載されているインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体は、ウイルス様粒子または「ＶＬＰ」に存在していてもよい。
【０１４６】
いくつかの態様において、本発明のインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体は、１種以上の追加の有効性成分、たとえば１種以上の追加のワクチン免疫原または治療剤を含む組成物中に提供されていてもよい。いくつかの態様において、本発明のインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体は、限定されないが、薬学的に許容される担体、アジュバント、湿潤もしくは乳化剤、ｐＨ緩衝剤、防腐剤および／または組成物の意図する使用に適した任意の他の成分を含む、１種以上の他の成分を含む組成物中に提供されていてもよい。このような組成物は、液剤、懸濁剤、エマルションなどの形態を取っていてもよい。「薬学的に許容される担体」という用語は、種々の希釈剤、賦形剤および／またはビヒクルを含み、それらの中に、またはそれらと一緒に本発明のインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体が提供されていてもよい。「薬学的に許容される担体」という用語は、限定されないが、ヒトおよび／もしくは他の動物対象への送達に安全であり、ならびに／または連邦もしくは州政府の規制機関により承認され、ならびに／または米国薬局方および／もしくは他の一般的に認められている薬局方に記載され、ならびに／またはヒトおよび／もしくは他の動物における使用のために１つ以上の一般的に認められている機関から特定もしくは個別の承認を受けていることが知られている担体を含む。このような薬学的に許容される担体には、限定されないが、水、水溶液（たとえば食塩水、緩衝液など）、有機溶媒（たとえば特定のアルコールおよび石油、動物、植物または合成起源のものを含む油、たとえばピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油）などが含まれる。いくつかの態様において、本発明の組成物はまた、１種以上のアジュバントを含む。例示的なアジュバントには、限定されないが、無機または有機アジュバント、油性アジュバント、ビロソーム、リポソーム、リポ多糖（ＬＰＳ）、抗原についての分子ケージ（たとえば免疫刺激複合体（「ＩＳＣＯＭＳ」））、流入領域リンパ節に輸送される安定なケージ状構造を形成するＡｇ修飾サポニン／コレステロールミセル）、細菌細胞壁の成分、取り込まれた核酸（たとえば二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）および非メチル化ＣｐＧジヌクレオチド含有ＤＮＡ）、ＡＵＭ、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウムおよびスクアレンが含まれる。いくつかの態様において、ビロソームはアジュバントとして使用される。本発明に従って使用できるさらなる市販のアジュバントには、限定されないが、Ｒｉｂｉアジュバント系（ＲＡＳ、２％スクアレン中の無毒化（detoxified）エンドトキシン（ＭＰＬ）およびマイコバクテリア細胞壁成分を含有する水中油エマルション（Ｓｉｇｍａ  Ｍ６５３６））、ＴｉｔｅｒＭａｘ（安定な代謝可能な油中水アジュバント（ＣｙｔＲｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  １５０  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｐａｒｋｗａｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｐａｒｋ／Ａｔｌａｎｔａ  Ｎｏｒｃｒｏｓｓ、Ｇｅｏｒｇｉａ  ３００９２））、Ｓｙｎｔｅｘ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ（ＳＡＦ、Ｔｗｅ���ｎ８０およびプルロニックポリオキシエチレン（polyoxyethlene）／ポリオキシプロピレンブロックコポリマーＬ１２１により安定化される水中油エマルション（Ｃｈｉｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、ＣＡ））、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、ＡＬＵＭ−水酸化アルミニウム、Ａｌ（ＯＨ）３（Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌとして利用可能、Ａｃｃｕｒａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ＆  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏ、Ｗｅｓｔｂｕｒｙ、ＮＹ）、ＳｕｐｅｒＣａｒｒｉｅｒ（Ｓｙｎｔｅｘ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３４０１  Ｈｉｌｌｖｉｅｗ  Ａｖｅ．Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ  １０８５０  Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ  ９４３０３）、Ｅｌｖａｘ  ４０Ｗ１，２（エチレン−酢酸ビニル共重合体（ＤｕＰｏｎｔ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ））、抗原と共沈したＬ−チロシン（多くの化学会社から入手可能である）；Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（マニド−オレエート（manide-oleate）、ＩＳＡ  Ｓｅｐｐｉｃ  Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ、ＮＪ））、ＡｄｊｕＰｒｉｍｅ（炭水化物ポリマー）、ニトロセルロース吸着タンパク質、Ｇｅｒｂｕアジュバント（Ｃ−Ｃ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｏｗａｙ、ＣＡ）などが含まれる。
【０１４７】
いくつかの態様において、本発明の組成物は、本発明の「有効量」のインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体を含む。「有効量」は所望の最終結果を達成するのに必要とされる量である。所望の最終結果の例には、限定されないが、体液性免疫反応の生成、中和抗体反応の生成、広域中和抗体反応の生成、および防御免疫の生成が含まれる。所望の最終結果を達成するのに有効である本発明のインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体の量は、限定されないが、予防またはいくつかの他の治療効果が求められているインフルエンザウイルスの型、亜型および株、意図する対象の種（たとえばヒトか、いくつかの他の動物種かに関わらず）、意図する対象の年齢および／または性別、計画された投与経路、計画された投薬レジメン、任意の継続中のインフルエンザ感染の重症度（たとえば治療的使用の場合）などを含む、様々な要因に依存する。有効量（これは有効量の範囲であってもよい）は、いかなる過度の実験も必要とせずに標準的な手法によって、たとえば、意図する対象の種または任意の適切な動物モデル種においてｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏアッセイを使用して決定できる。適切なアッセイには、限定されないが、用量反応曲線からの外挿ならびに／またはｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび／もしくはｉｎ  ｖｉｖｏモデル系から導出された他のデータを含むものが含まれる。いくつかの態様において、有効量は特定の状況に基づいて医師または獣医師の判断に従って決定されていてもよい。
【０１４８】
本発明のインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質およびタンパク質複合体の使用
いくつかの態様において、本発明のインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質およびタンパク質複合体は、研究手段として、診断手段として、治療剤として、抗体試薬もしくは治療抗体の産生のための標的として、および／またはワクチン組成物のワクチンもしくは成分として有用であってもよい。たとえば、いくつかの態様において、本発明のインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質およびタンパク質複合体は、動物対象、たとえばヒトを含む哺乳動物対象におけるワクチン免疫原として有用である。本発明のインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質およびタンパク質複合体のこれらおよび他の使用はより完全に以下に記載されている。当業者は、本発明のインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質およびタンパク質複合体が、様々な他の適用にも有用であってもよく、全てのこのような適用および使用は本発明の範囲内に含まれることを意図することを理解する。
【０１４９】
インフルエンザＨＡ抗体を研究するための手段
一態様において、本発明のインフルエンザポリペプチド、タンパク質およびタンパク質複合体は、たとえばＥＬＩＳＡアッセイ、Ｂｉａｃｏｒｅ／ＳＰＲ結合アッセイ、および／または当該分野において公知である抗体結合についての任意の他のアッセイにおいて、抗ＨＡ抗体の結合および／または力価をアッセイおよび／または測定するための検体として有用であってもよい。たとえば、本発明のインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質およびタンパク質複合体は、抗ＨＡ抗体の有効性を分析および／または比較するために使用されていてもよい。
【０１５０】
抗体を生成するための手段
本発明のインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質およびタンパク質複合体（インフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質およびタンパク質複合体を製造する間に産生された任意の中間体および／またはバリアントを含む）はまた、治療抗体および／または研究手段として、もしくは任意の他の所望の用途のために使用できる抗体の生成に有用であってもよい。たとえば、本発明のインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質およびタンパク質複合体は、研究手段として、および／または治療として使用するためのインフルエンザＨＡタンパク質に対する抗体を得るための免疫化のために使用されていてもよい。いくつかの態様において、本発明のインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質およびタンパク質複合体は、抗体を生成するために、非ヒト動物、たとえば限定されないが、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、非ヒト霊長類などを含む脊椎動物を免疫化するために使用されていてもよい。モノクローナルもしくはポリクローナルであってもよいこのような抗体および／またはこのような抗体を産生する細胞は後で動物から得られていてもよい。たとえば、いくつかの態様において、本発明のインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質およびタンパク質複合体は、マウスを免疫化するため、ならびにモノクローナル抗体および／またはこのようなモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを産生し、得るために使用されていてもよい。このような方法は、ハイブリドーマ産生のための標準的な方法を含む、マウスモノクローナル抗体を産生するための当該分野において公知である標準的な方法を使用して実施されていてもよい。いくつかの態様において、本発明のインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質およびタンパク質複合体は、たとえば、限定されないが、ＣＤＲグラフト法、ファージディスプレイ法、トランスジェニックマウス法（たとえば完全ヒト抗体、たとえばＸｅｎｏｍｏｕｓｅの産生を可能にするように遺伝子組換えされているマウスを使用する）を含む、キメラ、ヒト化および完全ヒト抗体を産生するための、現在当該分野において公知である方法ならびに／または当該分野において公知である任意の他の適切な方法のいずれかを使用して、キメラ（たとえば部分的にヒト）、ヒト化もしくは完全にヒト抗体を産生するために使用されていてもよい。このような系を使用して作製される本発明のインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質およびタンパク質複合体に対する抗体は、好ましくは、本発明自体のインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質およびタンパク質複合体を含む、１つの抗原またはいくつかの抗原のセットを抗原的に使用して特徴付けられていてもよい。このような抗体のさらなる特徴付けは、限定されないが、ＥＬＩＳＡに基づいた方法、ＳＰＲに基づいた方法、生化学的方法（たとえば、限定されないが、等電点決定）を含む、当業者に公知である任意の標準的な方法、ならびにたとえば前臨床および臨床研究において抗体の生体内分布、安全性および有効性を研究するために当該分野において公知である方法によって実施されていてもよい。
【０１５１】
対象への投与
いくつかの態様において、本発明は、本発明のインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体（またはこのようなインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体を含む組成物）を対象に投与することを含む方法を提供する。このような方法は、インフルエンザウイルスを有する個体を処置するための方法（すなわち治療的方法）および／または将来のインフルエンザウイルス感染に対して個体を防御するための方法（すなわち予防的方法）を含んでいてもよい。
【０１５２】
（たとえば処置方法またはワクチン接種方法の過程において）本発明のインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／もしくはタンパク質複合体、またはこのようなインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／もしくはタンパク質複合体を含む組成物が投与され得る対象には、特に、インフルエンザウイルス感染に対して感受性があるか、またはインフルエンザウイルス感染の研究のためのモデル動物系を提供できるものを含む、任意および全ての動物種が含まれる。いくつかの態様において、対象は哺乳動物種である。いくつかの態様において、対象はトリ種である。哺乳動物対象には、限定されないが、ヒト、非ヒト霊長類、齧歯動物、ウサギおよびフェレットが含まれる。トリ対象には、限定されないが、ニワトリ、たとえば養鶏場のニワトリが含まれる。いくつかの態様において、本発明のインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／もしくはタンパク質複合体、またはこのようなインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／もしくはタンパク質複合体を含む組成物が投与される対象は、たとえば、対象の年齢および／または受けている医学的状態に起因して、インフルエンザを有するか、またはインフルエンザ感染の危険性があるかのいずれかである。いくつかの態様において、対象は免疫不全である。いくつかの態様において、対象は、心臓疾患、肺疾患、糖尿病、腎疾患、認知症、脳卒中および／またはリウマチ疾患を有する。いくつかの態様において、対象は、約５０歳超、約５５歳超、約６０歳超、約６５歳超、約７０歳超、約７５歳超、約８０歳超、約８５歳超、または約９０歳超であるヒトである。いくつかの態様において、対象は、約１ヶ月齢未満、約２ヶ月齢未満、約３ヶ月齢未満、約４ヶ月齢未満、約５ヶ月齢未満、約６ヶ月齢未満、約７ヶ月齢未満、約８ヶ月齢未満、約９ヶ月齢未満、約１０ヶ月齢未満、約１１ヶ月齢未満、約１２ヶ月齢未満、約１３ヶ月齢未満、約１４ヶ月齢未満、約１５ヶ月齢未満、約１６ヶ月齢未満、約１７ヶ月齢未満、約１８ヶ月齢未満、約１９ヶ月齢未満、約２０ヶ月齢未満、約２１ヶ月齢未満、約２２ヶ月齢未満、約２３ヶ月齢未満、または約２４ヶ月齢未満のヒトである。
【０１５３】
種々の送達系が当該分野において知られており、任意の適切な送達系が、本発明の組成物を対象に投与するために使用されていてもよい。このような送達系には、限定されないが、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外および経口送達系が含まれる。本発明の組成物は、任意の簡便な経路によって、たとえば注入またはボーラス注射によって、上皮または皮膚粘膜層（たとえば、口腔粘膜、直腸および腸粘膜など）を介する吸収によって投与されていてもよく、他の生物活性剤と一緒に投与されていてもよい。投与は全身または局所であってもよい。たとえば、吸入具または噴霧器、および噴霧剤を有する製剤の使用によって肺内投与も利用されていてもよい。
【０１５４】
いくつかの態様において、本発明の医薬組成物を、インフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体が、所望の結果を生じるのに最も効果的であり得る組織に局所的に投与することが好適であってもよい。これは、たとえば、局所注入、注射、カテーテルを使用する送達によって、またはインプラント、たとえば多孔質、非多孔質もしくはゼラチン様インプラントまたは１つ以上の膜（たとえばシアラスティック（sialastic）膜）を含むインプラントまたは繊維からもしくは繊維を通してタンパク質もしくはタンパク質複合体が局所的に放出されていてもよい繊維によって達成されていてもよい。いくつかの態様において、制御放出系が使用されていてもよい。いくつかの態様において、ポンプが使用されていてもよい（Ｌａｎｇｅｒ，ｓｕｐｒａ；Ｓｅｆｔｏｎ，１９８７．ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１；Ｂｕｃｈｗａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８０．Ｓｕｒｇｅｒｙ  ８８：５０７；Ｓａｕｄｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９．Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：５７４を参照のこと）。いくつかの態様において、インフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体の放出を促進および／または制御するためにポリマー材料が使用されていてもよい（Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，Ｌａｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｗｉｓｅ（ｅｄｓ．），１９７４．ＣＲＣ  Ｐｒｅｓ．，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，１９８４．Ｄｒｕｇ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，Ｓｍｏｌｅｎ  ａｎｄ  Ｂａｌｌ（ｅｄｓ．），Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｒａｎｇｅｒ  ＆  Ｐｅｐｐａｓ，１９８３  Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３：６１を参照のこと；Ｌｅｖｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８：１９０；Ｄｕｒｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ，１９８９．Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５：３５１；Ｈｏｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ  ７１：１０５も参照のこと）。いくつかの態様において、制御放出系は、インフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体が送達される組織／器官に近接して配置されていてもよい（たとえば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，１９８４．Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，ｓｕｐｒａ，ｖｏｌ．２：１１５−１３８を参照のこと）。本発明と併せて使用されていてもよいいくつかの適切な制御放出系は、Ｌａｎｇｅｒ，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ；ｖｏｌ．２４９：ｐｐ．５２７−１５３３に記載されている。
【０１５５】
いくつかの態様において、本発明のインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体の投与は、１種以上の免疫刺激剤の投与と併せて実施されていてもよい。このような免疫刺激剤の非限定的な例には、免疫刺激、免疫増強および炎症作用を有する種々のサイトカイン、リンホカインおよびケモカイン、たとえばインターロイキン（たとえば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３）；成長因子（たとえば、顆粒球マクロファージ（ＧＭ）−コロニー刺激因子（ＣＳＦ））；および他の免疫刺激剤、たとえばマクロファージ炎症因子、Ｆｌｔ３リガンド、Ｂ７．１；Ｂ７．２が含まれる。免疫刺激剤はインフルエンザＨＡタンパク質もしくはポリペプチドと同じ製剤で投与されていてもよいか、または別々に投与されていてもよい。
【０１５６】
いくつかの態様において、本発明のインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／もしくはタンパク質複合体、またはそれらを含む組成物は、様々な異なるインフルエンザウイルスワクチン接種法またはレジメンで対象に投与されていてもよい。いくつかのこのような態様において、単一用量の投与が好ましい。しかしながら、他の態様において、所望の予防効果を達成するために、追加投薬量が同じまたは異なる経路によって投与されていてもよい。新生児および幼児において、たとえば、複数回投与が十分なレベルの免疫を誘発するために必要とされていてもよい。必要に応じてインフルエンザウイルス感染に対する十分なレベルの防御を維持するために、投与は小児期を通じて周期的に継続していてもよい。同様に、特にインフルエンザウイルス感染に感受性がある成人、たとえば高齢者および免疫不全の個体などは、防御免疫反応を確立および／または維持するために複数の免疫化を必要としていてもよい。誘発された免疫のレベルは、たとえば、中和分泌および血清抗体の量を測定することによってモニターされていてもよく、必要に応じて所望のレベルの防御を誘発し、維持するために投薬量が調節されるか、またはワクチン接種が繰り返される。
【０１５７】
いくつかの態様において、投薬レジメンは単回投与／免疫化を含んでいてもよい。他の態様において、投薬レジメンは複数回投与／免疫化を含んでいてもよい。たとえば、ワクチンは一次免疫、続いて１回以上の追加免疫として与えられていてもよい。本発明のいくつかの態様において、このような「プライムブースト」ワクチン接種レジメンが使用されていてもよい。たとえば、いくつかのこのようなプライムブーストレジメンにおいて、ここで記載されているインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体を含む組成物が、時間間隔を空けて複数の機会（たとえば、２回、３回またはさらにそれより多い機会）で個体に投与されていてもよく、最初の投与は「プライミング」投与であり、その後の投与は「追加免疫」投与である。他のこのようなプライムブーストレジメンにおいて、ここで記載されているインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体を含む組成物は、「プライミング」投与としてインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体をコードするウイルスまたはＤＮＡベクターを含む組成物を個体へ最初に投与した後に個体に投与されていてもよく、ここで記載されているインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体を含む組成物の１回以上の後の「追加免疫」投与が行われる。追加免疫は一次免疫と同じおよび／または異なる経路を介して送達されていてもよい。追加免疫は一般に、一次免疫または以前に投与された追加免疫後の一定の期間の後に投与される。たとえば、追加免疫は、一次免疫の約２週間以上の後、与えられていてもよく、および／または２回目の追加免疫が、１回目の追加免疫の約２週間以上の後、与えられていてもよい。追加免疫は、対象の生涯全体を通してある期間、たとえば約２週間以上、繰り返して与えられていてもよい。追加免疫は、一次免疫後または以前の追加免疫後、たとえば、約２週、約３週、約４週、約１ヶ月、約２ヶ月、約３ヶ月、約４ヶ月、約５ヶ月、約６ヶ月、約７ヶ月、約８ヶ月、約９ヶ月、約１０ヶ月、約１１ヶ月、約１年、約１年半、約２年、約２年半、約３年、約３年半、約４年、約４年半、約５年、またはそれ以上、間隔を空けていてもよい。
【０１５８】
好ましい単位投薬製剤は、本発明のインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質および／またはタンパク質複合体の用量もしくは単位（たとえば有効量）またはそれらの適切な割合を含有するものである。このような成分に加えて、本発明の製剤は、一般に当業者に使用される他の薬剤を含んでいてもよい。本発明により提供される医薬組成物は、便宜上、慣用の製薬手法を使用して調製された好ましい単位投薬製剤中に存在していてもよい。このような手法には、有効成分と医薬担体または賦形剤または他の成分を会合させる工程が含まれる。一般に、製剤は有効成分を液体担体と均一および密接に会合させることによって調製される。非経口投与に適した製剤には、酸化防止剤、緩衝液、静菌薬および製剤を意図する受容者の血液と等張にする溶質を含有していてもよい水性および非水性滅菌注射溶液、ならびに懸濁剤および増粘剤を含んでいてもよい水性および非水性滅菌懸濁剤が含まれる。製剤は、単位用量または複数回用量容器、たとえば密閉アンプルおよびバイアル中に存在していてもよく、使用直前に、滅菌液体担体、たとえば注射用水の添加のみを必要とするフリーズドライ（凍結乾燥）状態で保存されていてもよい。即時の注射溶液および懸濁剤は、一般に当業者により使用される滅菌粉末、顆粒および錠剤から調製されていてもよい。
【０１５９】
キット
本発明は、本発明のインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質もしくはタンパク質複合体、またはこのようなポリペプチド、タンパク質もしくはタンパク質複合体を含有する組成物を含むキットをさらに提供する。本発明の方法および組成物の使用を容易にするために、ここで記載されている成分および／または組成物のいずれか、ならびに実験もしくは治療もしくはワクチン目的に有用な追加の構成成分がキットの形態で充填されていてもよい。典型的に、キットは、上記構成成分に加えて、たとえば、構成成分、パッケージング材料、容器および／または送達装置を使用するための指示書を含んでいてもよい追加材料を含有する。
【０１６０】
本発明の種々の態様はまた、以下の非限定的な例によってさらに記載されていてもよい：
［実施例］
本出願の例の項における角括弧／丸括弧の番号は、ここでの参考文献のリストとして提供される番号付けされた参考文献に対する引用である。
【０１６１】
例１
米国および世界の全住民は汎発性インフルエンザ発生の危険にさらされ続けており、兵器化されたインフルエンザウイルスは細菌戦争／テロリズムによる大きな脅威であり続けている［２３、２４］。ＨＡの免疫優勢頭部の代わりに、保存されたストークＱＮＥに対してＡｂ反応を誘発できるインフルエンザウイルスＨＡに基づいたワクチン免疫原は、同種（Ｈ１Ｎ１）、ならびに同種ドリフトバリアント、群１異種（Ｈ５Ｎ１）、および群２異種チャレンジ（Ｈ３Ｎ２）から防御できる広域中和抗体を生じさせることが予想される。したがって、単一のユニバーサル免疫原は、季節性、汎発性および兵器化されたインフルエンザウイルスに対する防御免疫反応を誘発できる。インフルエンザウイルスが全住民に対して与える商業的および公衆衛生への影響により、今日の米国における生命保険会社が１９１８年のスペイン風邪大流行の再発の可能性に対して資本を保持する必要があるという事実が強調される（Ｏｌｉｖｅｒ，Ｗｙｍａｎ，＆  ＣＯ，２０１２  ＆  ［２５］）。ここで記載されているアプローチは、大量のワクチン産物を貯蔵でき、各々の新たな脅威に対処するために必要とされる製造の際の時間の増加に由来する現実の脅威を取り除く広域防御インフルエンザワクチンを提供する可能性を有する。
【０１６２】
現在のインフルエンザウイルスワクチンは、大部分が、同種ウイルス株に対して防御し、季節ごとに循環している株に対して適合するように新たな三価ワクチンカクテルを必要とする。防御は主にヘマグルチニン（ＨＡ）に対する高い親和性抗体に起因しており、多くの場合、ＨＡタンパク質の非常に変わりやすい免疫優勢頭部ドメインに対する免疫反応に主に焦点を当てることに起因して株特異的である。しかしながら、ＨＡストークはインフルエンザ株において高度に保存され、重要な証拠により、現在、ストークの保存された領域に対する良好な反応がより広域の防御を提供することが示唆されている［１〜４］。ＨＡをコードするＤＮＡによる免疫化は主にストーク特異的Ａｂ反応を誘発し、エレクトロポレーションによる、ＨＡ  ＤＮＡを用いたワクチン接種による限定された異種亜型の（heterosubtypic）防御を示すデータが、最近、記載された［５］。さらに、「頭部のない」ＨＡタンパク質に基づいた免疫原（「頭部のないＨＡ」、可変頭部ドメインが除去されているＨＡ構築物）によるワクチン接種の結果、顕著に向上した異種亜型の結合活性を伴うＡｂ反応の誘導が生じる［１、６］。ＨＡをコードするウイルスまたはＤＮＡベクターのプライムブーストの組合せ、その後の頭部のないタンパク質のブーストは、長期間の防御を生じる広域異種特異的反応を生成する見込みを保持する。しかしながら、異種チャレンジに対する良好な防御は現在、依然としてとらえどころのないままである［７〜１０］。
【０１６３】
同様の抗体反応を誘発できる免疫原を逆行分析するために、広域中和抗体（「ｂｎＡｂ」）の特定および特徴付けに対して大きな注目が集められている［９、１１］。多くのこれらのｂｎＡｂが記載されており、最も有効なものは、同じ複合体のプロトマー上ではなく、インフルエンザＨＡ三量体の保存されたストーク上に存在する保存された複合体／構造特異的エピトープに結合する［７、１２、１３］。これらのヒトＡｂの単離により、広域防御ワクチンが、実際に、達成可能な目標であることが証明されている（「プロトマー」は三量体のサブユニットであり、それ自体はＨＡ１／ＨＡ２ヘテロ二量体である）。したがって、これらの三量体／複合体特異的エピトープは四次中和エピトープ（ＱＮＥ）と呼ばれ、それらはインフルエンザウイルスの脆弱性の鍵となる部位を表すと考えられる。なぜなら、それらは有効な四次ｂｎＡｂを誘発する可能性を有するからである［１４、１５］。インタクトな三量体ストークのみが広域防御ＱＮＥを示す（図２を参照のこと）。その三量体の天然構造に固定され、有効で広域の防御四次ｂｎＡｂに結合する頭部のない構築物は、ユニバーサルインフルエンザ免疫原を提供でき、ワクチン接種した対象において有効なｂｎＡｂを誘発できる。
【０１６４】
最近、頭部のないインフルエンザヘマグルチニン（「頭部のないＨＡ」）免疫原は、広域に交差反応性であるインフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）の高度に保存されているストーク領域に焦点を当てられている抗体（「Ａｂ」）反応を誘発することが示されている。このことによりまた、ストーク領域に対する最も有効で広域の中和／防御Ａｂ（ｂｎＡｂ）が三量体特異的であり（すなわちストークの四次構造を認識する）、それらの対応する四次エピトープは、インフルエンザＨＡの頭部が除去されている場合、表示されないことが明らかになる。頭部ドメインの非存在下で、ストーク三量体は分解するようである。本発明は、頭部がタンパク質分解により除去される前に、たとえば標的架橋の導入によって、ストーク領域の三量体立体構造が安定化されるか、または「立体構造的に固定される」、頭部のないＨＡ免疫原を提供する。この頭部のないＨＡ免疫原は、四次ｂｎＡｂとの結合を保持するはずであり、インフルエンザ免疫原として四次中和エピトープ（「ＱＮＥ」）を提示する。このような立体構造的に固定された頭部のないＨＡ三量体は、単一のワクチン接種レジメンからのインフルエンザウイルスに対する広域防御の念願の目標を可能にすることができる。
【０１６５】
最小限に修飾されたジチロシン（「ＤＴ」）安定化手法は、タンパク質および複合体を天然立体構造に固定するように、安全で標的化され、ゼロ長で不可逆的なＤＴ結合を酵素的に導入する。この手法の適用はタンパク質構造を完全に保存し、ＤＴ結合が自然発生的に形成しないので、凝集を回避する。結合は、非常に近い構造的近接性でＴｙｒ側鎖間のみで形成し、タンパク質が完全に折り畳まれ、その天然状態になった後に導入される。標的ＤＴ架橋結合により、広域防御を最大化するためにＱＮＥを立体構造的に固定することによって改良されたインフルエンザワクチン免疫原の設計が可能となる。
【０１６６】
この例に記載されている方法は３つの工程を含む。第１の工程は、ストーク領域内の標的位置における「Ｔｙｒへ」の置換により可溶性の完全長インフルエンザＨＡを発現することを含む。第２の工程は、安定化ＤＴ架橋の導入を含む。そして第３の工程は、免疫反応をＤＴ−頭部のないＨＡ  ＱＮＥに焦点を当てるためにインフルエンザＨＡの頭部ドメインをタンパク質分解により除去することを含む。
【０１６７】
組換え可溶性ＨＩＶ  Ｅｎｖ三量体を使用した予備研究により、ＤＴ架橋結合が、Ｅｎｖ免疫原をその天然の三量体立体構造に立体構造的に固定するために使用でき、それにより、インフル四次抗ストークｂｎＡｂと類似している、最も有効なＨＩＶ四次ｂｎＡｂとの結合を改良することが実証され、このアプローチの実現可能性が実証されている。ＨＩＶ  Ｅｎｖおよび頭部のないインフルエンザウイルスは、両方が、組換えにより発現される場合、不安定な三量体であり、両方において、鍵となるＱＮＥは天然の三量体複合体においてのみ存在するという点で非常に類似している。他の予備研究において、標的ＤＴ結合はインフルエンザＨＡストーク内に首尾良く導入されている。
【０１６８】
その天然の三量体立体構造における組換えＰＲ８  ＨＡ構築物のＤＴ架橋を実施して、鍵となるｂｎＡｂとの結合を確認でき、続いてストーク三量体のＤＴ固定された天然の抗原立体構造を維持しながら、「頭部」ドメインを、タンパク質分解による切断部位を操作することによって除去できる。得られた頭部のないＨＡ免疫原は、それがＣ５７ＢＬ／６マウスモデルにおいて広域防御を誘発することを確認するために試験できる。有効性についての前臨床試験は高度に予測されたフェレット致死チャレンジモデルにおいて実施できる。安全性についての前臨床試験はウサギにおいて実施できる。
【０１６９】
標的ＤＴ架橋結合
天然の可溶性および組換えＨＡ三量体を生成し、三量体のストークにおける三量体形成相互作用を共有結合により架橋するために標的ジチロシン（ＤＴ）「ステープル」を適用することによって、ＤＴ安定化ＨＡ三量体が、抗原プロファイルを完全に保存した状態で操作される。ＨＡストーク領域における三量体の共有結合安定化はストークの四次構造を安定にするように操作され、これにより、ストークのＱＮＥを保存しながら、後の頭部のタンパク質分解による除去が可能となる。ＤＴ結合は、タンパク質／複合体が完全に折り畳まれた後、複合体を安定化させるために導入され、それにより、タンパク質の構造的機能的完全性を維持しながら、天然構造を固定する［１６〜１８］。これらの安全で不可逆的なゼロ長の架橋は、非常に近い構造的近接性でＴｙｒ残基の間のみに形成し、タンパク質の構造を歪めない。それらはどれもジスルフィド結合で観察されるような非特異的凝集体形成を引き起こさない［１７、１９−２２］。標的ＤＴ架橋結合手法は可溶性ＨＡ三量体をその正確に折り畳まれた構造に共有結合により安定化させるために適用されていてもよく、次いでそれが実際に鍵となるＱＮＥを提示しているかどうかを決定できる。その後、免疫優勢頭部は、アミノ酸変化に対する可変ループ許容度およびＨＡのトランスポゾンに基づいた突然変異分析から集めた情報を使用して、配列特異的プロテアーゼ切断部位を導入することによって除去できる。頭部のないＨＡ上でのＱＮＥの提示は、ドリフトバリアントおよび異種ウイルスを用いた致死チャレンジ研究における防御の広さにより改良すると予想される。ＨＩＶにおける本発明者らの以前の研究は、高度にグリコシル化された多量体（たとえばＨＩＶ  Ｅｎｖ）が、関連する四次構造および抗原性を維持しながら、切断されたＥｎｖ三量体内の種々の位置におけるＤＴ架橋によって一緒に効果的に固定され得ることを示している。
【０１７０】
インフルエンザウイルスＨＡ三量体複合体の立体構造的固定
ＨＩＶエンベロープスパイクは、その基部における十分に特徴付けられた相互作用およびスパイクの先端における相互作用を介して三量体形成される［３３、３４］。スパイクの先端における三量体形成相互作用を安定化させるために、チロシン置換基を導入し、タンパク質を発現させ、精製し、ＤＴ架橋した。蛍光により、７つのバリアントは、任意の最適化前に、ＤＴ特異的励起（３２０ｎｍ）および発光（４０５ｎｍ）波長を使用して定量して平均８０％＋の効率で分子間三量体形成架橋を形成することを特定した。立体構造的および三量体特異的ｂｎＡｂに結合するこれらの構築物の能力をアッセイした。ＤＴ架橋結合は、プロトマーと三量体の両方に結合する、抗ＣＤ４結合部位ｂｎＡｂ  ｂ１２、および優先的に三量体と結合するが、単量体にも結合する抗Ｖ２  ｂｎＡｂ  ＰＧ９の結合を十分に保存する。さらに、立体構造的固定はまた、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて非中和ｍＡｂ、たとえばｂ６およびｂ１３との結合を顕著に減少させる。ＤＴ結合の位置はＤＴ−Ｅｎｖ三量体のトリプシン断片のＭＳ／ＭＳによって確認した。より重要なことには、立体構造的に固定したＨＩＶ  Ｅｎｖ三量体は、ＷＴプロトマーと比較して、非常に広域に中和し、有効な抗ＨＩＶ  Ｅｎｖ  ｂｎＡｂ、ＰＧ１６のうちの１つと顕著に良好に結合することが見出され；ＰＧ１６エピトープは天然／機能的ＨＩＶエンベロープ三量体上にのみ存在する［２８］。改良されたＰＧ１６結合は、β−シートとしてＰＧ１６が結合する重複しているエピトープのα−ヘリカル配座異性体と結合する、不十分な中和抗Ｖ２ｍＡｂ、ＣＨ５８との結合の際の顕著な減少と相関する。このＤＴ固定された可溶性ＨＩＶ  Ｅｎｖ三量体を用いた次の工程は、それを動物免疫原性実験において試験することである。
【０１７１】
インフルエンザＨＡにおいて、ＣＲ６２６１  ｂｎＡｂとの複合体におけるＨＡタンパク質の三量体構造を分析した。可能なＨＡバリアントの５つの例（Ｎ４０３Ｙ＿Ｄ４２９Ｙ；Ｎ４０３Ｙ＿Ｌ４３２Ｙ；Ｎ４０３Ｙ＿Ｄ４３３Ｙ；Ｎ４０６Ｙ＿Ｄ４２９Ｙ；およびＮ４０６Ｙ＿Ｄ４３３Ｙ）を最初に特定し、２つの点変異を有する各々は、分子間結合を形成し、ＣＲ６２６１四次エピトープを変化させずに膜遠位／頭部近位端（図３の設計の概略図を参照のこと）においてストーク三量体を安定化させることが予測された。これらのバリアントのうちの４つをコードする発現ベクターを生成し、バリアントを発現させ、架橋結合条件に供した。蛍光分光分析を使用して、ＤＴ結合がそれらのモル濃度に正比例して強力に蛍光を発するＤＴ特異的励起および発光波長を使用して、これらのバリアントがＤＴ結合を形成したかどうかを決定した。野生型ＨＡではなく、全ての４つのバリアントは効果的にＤＴ結合を形成した（図４）。陽性対照（インスリン）およびＤＴ標準との比較に基づいて、７０％超の架橋効率が任意の最適化前にこれらの構造の４つ全てに関して推定される［３５］。
【０１７２】
立体構造的に固定したＨＡからのＨＡ頭部の除去
ＤＴ固定したＨＡ三量体からのＨＡ頭部ドメインのタンパク質分解による除去は、基質特異的プロテアーゼ（たとえばＴＥＶ）のためのＨＡ１頭部ドメイン内に認識モチーフを操作することを必要とする。トランスポゾンに基づいた突然変異誘発スクリーニングを使用して、ＰＲ８  ＨＡ１球状頭部内の４つの領域は、操作されたＴＥＶプロテアーゼ部位とほぼ同じ大きさの外来配列の挿入を許容することが特定されている。さらなる最適化を用いずに、これらの領域のうちの２つ（アミノ酸残基１２８および２２３に位置する）は、ＰＲ８球状頭部における４つの主要な抗原部位のうちの３つ（Ｓａ、ＣａおよびＳｂ部位）のタンパク質分解による切断を可能にする［３６］。残りのＣｂ部位も除去される。ＨＡ１におけるこれらの部位に挿入を有するウイルスは融合可能なままであるので、ＨＡ複合体は機能的にインタクトなままである。次いでタンパク質分解反応が実施される。
【０１７３】
これらのデータにより、ストークにおけるＨＡ三量体を一緒に固定し、続いて免疫優勢頭部ドメインを除去するアプローチは、頭部のないＨＡのワクチン関連ＱＮＥを保存し、免疫原を抗原的に有益な構造に固定することが実証される。同様に、このことにより、ここで記載されているＤＴ固定した頭部のない三量体はｉｎ  ｖｉｖｏで広域防御抗体反応を誘導すると予想されることが示唆される。
【０１７４】
インフルエンザウイルスＨＡ三量体複合体の立体構造的固定
実験設計。ＷＴ  ＨＡおよび上記のバリアントの可溶性形態（たとえば、膜貫通ドメインを欠き、Ｔ４フォルドン三量体形成モチーフを保有している）は、分泌タンパク質としてＳＦ９またはＨｉ５細胞において発現され、十分に確立された方法によって精製される［３７〜３８］。Ｔｙｒへの置換およびＤＴ架橋の抗原効果は、抗ＨＡストーク広域中和ｍＡｂのパネル（たとえば６Ｆ１２、Ｃ１７９、ＣＲ６２６１、Ｆ１０、Ａ６６およびＤ８）を使用してＥＬＩＳＡにおいて決定される。なぜなら、Ｔｙｒへの置換によって引き起こされる構造変化は、これらの抗体のいくつかとの結合を減少または増加させることができるからである。方法：完全曲線結合アッセイは、ＷＴ  ＨＡを非架橋および架橋ＨＡバリアントと比較する。結合の変化を、結合曲線の非線形回帰分析（Ｇｒａｐｈｐａｄソフトウェア）を使用して決定して、各ｍＡｂを有する各構築物についてＥＣ５０値を算出し、比較する。分子間結合形成は、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおけるゲルシフトにより確認され（ウェスタンブロット／クマシー；ＤＴ結合は減少しない）；ＤＴ架橋結合は上記のように蛍光分光分析によって定量される。このような方法は、分子間ＤＴ結合を形成し、操作されたインフルエンザ免疫原を架橋結合した後、野生型ＰＲ８  ＨＡと同等の鍵となる抗ストーク四次ｂｎＡｂとの結合を保持するＨＡバリアントを産生するために使用できる。
【０１７５】
立体構造的に固定したＨＡからのＨＡ頭部のタンパク質分解による除去
ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ認識配列（ＬＥＶＬＦＱＧＰ（配列番号６９）（ＱとＧ残基との間の切断）および／またはＴＥＶ認識配列（ＥＮＬＹＦＱＧ（配列番号７０）（ＱとＧ残基との間の切断）およびＥＮＬＹＦＱＳ（配列番号７１）（ＧとＳ残基との間の切断））を規定された（たとえばアミノ酸残基１２８および２２３）またはさらなる位置に挿入して、発現され、精製され、完全に折り畳まれ、ＤＴ安定化された可溶性ＨＡ前駆体であるバキュロウイルスからＨＡの球状頭部の大部分を除去できる。抗原確認後、アミノ酸分析および質量分析を実施して架橋分子を生化学的に特徴付けることができる。
【０１７６】
頭部ドメインのタンパク質分解は、標準的な生化学手順によって実施でき、完全なＤＴ−ＨＡ三量体（２２５ｋＤ）に対応する分子量から頭部のない三量体（１３５ｋＤａ）の分子量までＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気移動シフトによってアッセイできる（クマシー染色、ウェスタンブロット）。ＤＴ架橋ＨＡストークからの頭部の除去は、たとえばウェスタンブロットおよびＥＬＩＳＡにおいて頭部特異的Ａｂにより確認できる。同じｂｎＡｂおよび上記のアッセイを使用して、ＤＴ−頭部のないＨＡの大部分の関連ＱＮＥの保存を確認できる。
【０１７７】
アミノ酸分析を実施して、アミノ酸側鎖に対するあらゆる非特異的変化を評価し、ＤＴ結合の存在を確認できる（ＤＴ部分自体は特異的に検出できる）。ＤＴ−頭部なしにおけるＤＴ結合の位置を特定するために、脱グリコシル化トリプシン消化のＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析は、たとえば、Ｍｉｃｈｒｏｍ  Ｐａｒａｄｉｇｍ  ＨＰＬＣおよびＶａｃｕｕｍ  Ｓｐｒａｙイオン化源を備えたＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＬＴＱ質量分析計で実施できる。
【０１７８】
生化学的特徴付けを実施して、野生型可溶性ＰＲ８  ＨＡ三量体と等しい鍵となる抗ストーク四次ｂｎＡｂとの結合を保持しているＤＴ安定化した頭部のないＨＡのバリアントを特定できる。必要な場合、最初に頭部を解体するためにさらなる切断部位を操作していてもよく、それによりタンパク質分解による切断の効率を改良する。同様に、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎおよび／またはＴＥＶプロテアーゼおよびそれらの切断部位を上記のように使用していてもよい。
【０１７９】
ドリフトおよび異種ウイルスによるチャレンジに対する防御試験
ＰＲ８  ＨＡバリアントは、ｍｇ定量で発現させ、ＤＴ架橋し、タンパク質分解し、精製し、抗原的に特徴付けることができる。ＰＲ８、ＮＬ０９およびＶＮ０４  ＨＡＬＯ／ＰＲ８＿６＋２変異ウイルス調製物を作製できる。チャレンジウイルスの各々についてＬＤ５０を確立するために、各ウイルスについて公表されたＬＤ５０付近で各群について示されるウイルスの１０倍希釈物を使用して、各ウイルスについて４Ｃ５７ＢＬ／６マウス（雌、６〜８週齢（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の４つの群に接種できる。５ＸのＬＤ５０用量の同種（ＰＲ８）チャレンジから動物の８０％＋を防御する精製したＤＴ固定した頭部のないＨＡ三量体免疫原の最適用量を確立するために、５Ｃ５７ＢＬ／６マウス（雌、６〜８週齢（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の４つの群を、一定量のＰｏｌｙ  Ｉ／Ｃアジュバント（１０μｇ）と共に様々な量の精製したＤＴ−頭部のないＨＡ免疫原の連続注射からなるプライムブースト戦略により免疫化できる。簡潔に述べると、各群は、アジュバントとしてＰｏｌｙ  Ｉ／Ｃと共に製剤化した０μｇ、２．５μｇ、５μｇおよび１０μｇのＤＴ固定した頭部のない三量体により免疫化できる。３週間後、各々等量のアジュバント免疫原によりマウスを追加免疫できる。追加免疫の３週間後、それらを、５ＸＬＤ５０用量の同種（ＰＲ８）インフルエンザウイルスにより鼻腔内でチャレンジできる。マウスは、適切な時間、たとえば１４日、罹患率および死亡率についてモニターでき、評価できる。それらの初期体重の２５％超を損失したマウスは屠殺し、死亡とスコア付けできる。生存は２５％未満の体重損失として定義できる。ドリフトバリアントおよび群１異種チャレンジに対する防御について免疫化マウスを試験するために、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの３つの群は１０μｇのＰｏｌｙ  Ｉ／Ｃアジュバントのみ（「アジュバントのみ」対照群）により免疫化でき、残りの３つの群は上記に特定した最適用量のアジュバントＤＴ−頭部のないＨＡ免疫原により上記のスケジュールに従って免疫化できる（「ＤＴ固定した頭部のない三量体」群）。
【０１８０】
最後の免疫化の２週間後、アジュバントのみの１つの群および最適用量のＤＴ固定した頭部のない三量体により免疫化した１つの群の各々は、致死量の同種ウイルス（ＰＲ８  Ｈ１Ｎ１）、マウスに適合させた新規ブタ流行性ドリフトバリアント（ＮＬ／０９、Ｈ１Ｎ１）により、および異種亜型の群１インフルエンザウイルス（ＶＮ０４  ＨＡＬＯ／ＰＲ８＿６＋２変異Ｈ５Ｎ１）により鼻腔内でチャレンジできる（表１）。マウスは、１０日間、罹患率および死亡率についてモニターでき、評価でき、上記のようにスコア付けできる。
【０１８１】
【表１】
0006704849.tif 000004
【０１８２】
統計的考察：予測因子（アジュバントのみ対アジュバント＋ＨＤ頭部のない免疫原）と結果（死対生存）の両方が二分されるという事実を考慮して、ワクチンが効果を有さない帰無仮説をフィッシャーの正確確率検定により試験できる。９５％信頼水準（ｐ＜．０５）において効果を検出するのに必要な１群当たりの動物の最小数（全ての群において等しい数）を算出するために、検出力を８０％に設定でき、５０％の仮定効果量を使用できる（対照群において８０％の致死率、ワクチン接種した群において３０％の致死率）。したがって、各検体および対照群は最低で１５匹の動物を使用すべきである。
【０１８３】
全ての方法は、たとえばＳｔｅｅｌ  ｅｔ  ａｌ．２０１０［１］に記載されている標準的な手段に従って実施できる。たとえば、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて抗原（ＰＲ８  ＨＡ）は、その天然構造の提示を最適化するために、α−フォルドンｍＡｂ（たとえば７４５５０、Ｆｉｂｒｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．）またはαストークｍＡｂと共に非四次エピトープに固定できる。血清中の抗原特異的Ｉｇは標識したα−マウスＡｂを使用して検出できる。
【０１８４】
ＤＴ−頭部なしは、ドリフトウイルス（群Ｄ：ＮＬ０９、Ｈ１Ｎ１）および／または異種株（群Ｆ：Ｈ５Ｎ１）に対する防御を首尾よく誘導することが予想される。必要な場合、免疫原は異なる／さらなるアジュバントにより再製剤化でき、および／または試験用量を増加でき、免疫原用量較正試験を反復できる。さらに、必要な場合、プライムブーストレジメンが、精製したＤＴ−頭部のないＨＡ抗原による第３の追加免疫を含むように変更されていてもよい。最終チャレンジ研究に使用される動物の数は、同種対ドリフトおよび異種チャレンジから許容可能な信頼水準を達成するように変更／増加されていてもよい。
【０１８５】
例１についての参考文献
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2.  Pica, N. et al. Hemagglutinin stalk antibodies elicited by the 2009 pandemic influenza virus as a mechanism for the extinction of seasonal H1N1 viruses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 2573-2578 (2012).
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例２
組換え可溶性タンパク質免疫原は天然および兵器化された病原体に対する攻撃において有意な機会を表す。近年、多くの病原体に対する広域中和抗体（ｂｎＡｂ）が記載されており、それらの多くはタンパク質複合体により表示される四次構造（多くの場合、それら自体は不安定である）のみに結合する。したがって、タンパク質に基づいたワクチン免疫原は病原体自体によって提示されるため、それらを同じ天然の四次構造に「固定」するための差し迫った必要性が存在している。
【０１８６】
この例は、（ｉ）得られるＴｙｒ残基が近い構造的近接性であると予測される位置において部位特異的突然変異誘発法を実施すること、（ｉｉ）変異タンパク質を発現させ、精製すること、および（ｉｉｉ）続いて、完全に折り畳まれたタンパク質複合体を酵素的に架橋／固定することを含むシステムを使用して作製された頭部のないヘマグルチニンに基づいたユニバーサルインフルワクチンに関する。ＤＴ架橋結合は標的化され、ゼロ長のＤＴ結合は不可逆的であり、自然発生的に形成せず、最も重要なことには、ＤＴ結合の導入はタンパク質構造および機能を保存する。なぜなら、そのＤＴ架橋結合はタンパク質が完全に折り畳まれると生じるからである。
【０１８７】
現在、ユニバーサルインフルエンザワクチン免疫原は利用可能ではない。しかしながら、最近、膜貫通ドメインにおいて三量体形成された頭部のないＨＡ構築物は、高度に保存されたストークに対するＡｂ反応に焦点を合わせ、実際に、広域防御反応を誘発することが記載された。しかしながら、フォルドンモチーフによって三量体形成された可溶性の頭部のないＨＡはミスフォールドし、鍵となる四次中和エピトープ（ＱＮＥ）を提示せず、不十分な防御反応を誘発する。本発明は、（ｉ）可溶性ＨＡ構築物をその天然の三量体立体構造でＤＴ架橋結合すること、ならびに（ｉｉ）可変ループおよび頭部の基部においてタンパク質分解による切断部位を操作し、切断することによって「頭部」ドメインを除去することを含む代替のシステムを提供する。ＨＡ可溶性ステムのサブユニット（膜貫通ドメインを欠く）の間の相互作用は、ＨＡ三量体の構造的完全性を維持しながら、ジチロシン架橋によって固定され得る。結晶構造に基づいて、ｂｎＡｂ結合部位を回避しながら、ステムにおいて、かつ近い構造的近接性でＴｙｒ側鎖を有する構築物を作製できる。これらの構築物は発現でき、得られたタンパク質をＨｉｓタグ親和性クロマトグラフィーによって精製した。試験を実施して、ＤＴ特異的蛍光をスクリーニングすること、およびゲルシフト分析（たとえばウェスタンブロット）によって構築物が分子間ＤＴ架橋を形成するかどうかを決定できる。
【０１８８】
抗ステムｂｎＡｂのパネルを使用して、ＤＴ架橋したＨＡ三量体の機能保存は抗ステムｂｎＡｂを使用してＥＬＩＳＡによって測定できる。熱力学的安定化をアッセイして、生物物理学的に架橋結合した後、ＤＴ結合の位置および構築物の構造的完全性を確認できる。構築物は有益な抗原および／または生化学的プロファイルに基づいて選択できる。四次抗ステムｂｎＡｂ、たとえば６Ｆ１２、Ｃ１７９、ＣＲ６２６１、Ｆ１０、Ａ６６およびＤ８との結合は完全に維持されることが予想される。
【０１８９】
タンパク質分解による切断部位は天然のＤＴ安定化ＨＡ三量体の頭部を解体し除去するように操作できる。１または２つのプロテアーゼについて４つ以上の切断部位を有する完全に折り畳まれたＨＡ構築物を設計し、生成し、発現し、ＤＴ架橋し、次いでプロテアーゼによる消化前にＨｉｓタグ親和性クロマトグラフィーによって精製して、頭部を除去できる。抗原および生化学的および生物物理学的分析を実施して、タンパク質分解による消化後、ＤＴ−頭部のないＨＡにおけるＱＮＥの保存／完全性を確認でき、免疫原性分析をマウスにおいて実施できる。
【０１９０】
季節性および汎発性インフルエンザウイルスは、急速な遺伝的浮動および再集合により免疫学的監視を回避するそれらの能力に起因してヒトの健康に深刻な脅威となり続けている。米国のみにおいて、インフルエンザは、全体として個人および経済界にとって深刻な経済的負担となりながら、毎年、数十万人もの入院および平均３０，０００人の死の原因となる季節的流行を引き起こす［１〜３］。世界的流行は、ほとんどまたは全く免疫がない人々に感染するウイルスの毒性株が出現する場合に発生し、地球全体に急速に拡散し、ヒトの健康に対して最も深刻な脅威の１つを表す。１９１８年のスペイン風邪（Ｈ１Ｎ１）大流行は推定５０００万人の死を引き起こし；１９５７年のアジアインフルエンザ（Ｈ２Ｎ２）大流行および１９６８年の香港（Ｈ３Ｎ２）大流行の各々は数百万人の死を引き起こした［６］。インフルエンザウイルスは急速に接近し、エアロゾルにより容易に感染するので、遺伝子操作の可能性は、兵器化、細菌戦争およびバイオテロの巨大な脅威を表す［７、８］。ワクチンが感染を制御するために防御を提供することについて最も有望である。
【０１９１】
循環株と適合する場合、非常に効果的であるが、現在のインフルエンザウイルスワクチンはほとんど同種ウイルス株に対して防御する。防御は、インフルエンザの各株に特異的である、ヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質の非常に可変性の免疫優勢頭部ドメインに対する高い親和性抗体に主に起因する。したがって、新たな三価ワクチンカクテルが、毎年、循環中の蔓延しているインフルエンザ株に合わせられなければならない。従来、卵に基づいたインフルエンザワクチン製造は、季節の開始の９カ月前に株が選択されることを必要とする。不幸にも、循環株の予測は、多くの場合、不正確であり、不十分に適合し、したがって不十分な防御であるワクチンを生じる［９〜１１］。多数の開発プログラムがこの問題に対処するために進行中であり、それらの多くは進行した段階であるが、ここで提案されているアプローチは、１つ以上のプログラムが安全性および有効性のハードルを越える可能性を有し、季節性と汎発性インフルエンザの両方について真に長期間の広域防御ワクチン産物を可能にする。
【０１９２】
ＨＡのステムは多数のインフルエンザ株において高度に保存され、現在の重要な証拠により、主にＨＡステムからなる「頭部のない」ＨＡによるワクチン接種の結果、顕著に向上した異種亜型結合活性および致死チャレンジに対する広域防御を伴う抗体反応の誘導が生じることが示唆される［１２〜１５、１６、１７］。このように、頭部のないＨＡはインフルエンザの全ての株に対して防御できるユニバーサルワクチン免疫原として大いに有望である［１６］［１７］。興味深いことに、ＨＡをコードするＤＮＡによる免疫化は主にストーク特異的Ａｂ反応を生成することが観察されており、エレクトロポレーションによる、ＨＡ  ＤＮＡを用いたワクチン接種による異種亜型防御を示しているデータが最近記載された［５０］。ＨＡをコードする発現ベクターのプライムブーストの組合せ、その後の可溶性の頭部のないタンパク質のブーストは、長期間の防御を生じる広域異種亜型反応を生成するのに有望である。
【０１９３】
本発明は、鍵となる四次中和エピトープ（ＱＮＥ）を提示するその正確に折り畳まれた立体構造で共有結合的に安定化された可溶性の「頭部のない」ＨＡ三量体を提供する。標的ジチロシン架橋結合手法が完全長ＨＡ三量体を安定化させるために使用され、続いて頭部が、アミノ酸変化についての可変ループ許容度を使用する、配列／基質特異的プロテアーゼを使用して除去される。
【０１９４】
ジチロシン（ＤＴ）架橋結合は、タンパク質の構造的および機能的完全性を維持しながら、ゼロ長の架橋を酵素的に導入することによってタンパク質の折り畳み、複合体および立体構造を安定化させるための方法を提供する［２０、２１］。ジチロシン結合はタンパク質構造に対する立体構造的安定性および剛性を提供し、多くの異なる自然環境において示されている。ＤＴ架橋は、それらの特定の特徴を利用するために開発されたタンパク質と［２２〜２４］、タンパク質酸化の結果として［２５］の両方の文脈において、ｉｎ  ｖｉｖｏで天然に形成する。ＤＴ結合は麦グルテン（タンパク質の四次構造はグルテニンサブユニットを含む）の構造を形成し、最も一般的な食品のいくつかに大量に存在する［２６］。他のアミノ酸は架橋を形成しないか、またはチロシン側鎖自体が非常に離れて位置している場合、酸化していてもよいが、反応が穏やかな条件下で実施される場合、変形し、それにより特に準最適条件下で反応の効率が制限される。ＤＴ架橋は正常な生理的条件下で加水分解されず、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで自然発生的に形成しない。ＤＴ架橋結合のこれらの性質は従来のＳ−Ｓ化学より重要な利点を提供する；すなわち、自然発生的および／または望ましくないタンパク質産物は形成せず、非特異的結合／凝集は成熟およびプロセシングにおいて発生しない。反応は非常に制御され得るので、大規模高収率プロセスの開発は比較的容易であり得、ＤＴ安定化免疫原の大規模製造をより経済的に実現可能にする。
【０１９５】
ＤＴ架橋結合の重要な性質の１つはチロシン側鎖の構造的近接性に大きく依存しているので、そのチロシン側鎖はタンパク質またはタンパク質複合体の構造内で操作されなければならない。炭素は結合の形成に付加されないので、得られる「ステープル」は全体のタンパク質の折り畳みに対して非破壊的であり、決定的に、タンパク質構造内の特定の部位は高い特異性で標的化され得る。必要なチロシンはタンパク質の一次構造内に存在していてもよいか、または「チロシンへの」点変異によって付加されていてもよく、一方、望ましくないＤＴ結合を形成するＴｙｒ残基はバックグラウンドを減少させるように（たとえばＰｈｅへ）変異されていてもよい。
【０１９６】
タンパク質免疫原は、時々、いくつかのポリペプチドサブユニットからなるアミノ酸ポリペプチドの折り畳まれた鎖である。自然発生的なアンフォールディング、立体構造的移行および解離の割合はタンパク質の機能的半減期を決定する。隣接していないアミノ酸側鎖の間の共有非ペプチド結合は、アンフォールディングの割合、およびそれによりタンパク質またはタンパク質複合体の半減期に劇的に影響を与え得る。少なくとも２つの異なる化学物質が、それらの立体構造および／または遅延されたアンフォールディングを安定化させるために、ｉｎ  ｖｉｖｏでタンパク質における共有結合架橋を達成するために開発されている：それらはジスルフィド結合およびジチロシン（ＤＴ）結合である。
【０１９７】
共有結合が特定の場所に標的化される方向付けられたＤＴ架橋結合アプローチの１つの主要な利点は、エピトープの二次、三次および／または四次構造の特定の３−Ｄ配列を増強できることであり、それにより望ましくない立体構造的移行を防ぎ、タンパク質免疫原の抗原特性に有害な影響を与えずに高程度の熱力学的安定化および立体構造的固定を提供する可能性を有する。
【０１９８】
ジスルフィド結合は多様な機能の多くの真核生物タンパク質において見出されている。分子内Ｓ−Ｓ架橋は、多くの場合、タンパク質ドメインを安定化させるのに必須であり、分子間Ｓ−Ｓ結合はタンパク質複合体の四次構造に対して安定性を提供する。これらの結合は自然発生的に形成できるので、さらなる製造および精製プロセスを必要としないが、遊離スルフヒドリルにより媒介される凝集体形成に起因して製造収率も減少させる。さらに、それらはタンパク質がＥＲ／ゴルジ装置に折り畳まれると形成されるので、それらはＱＮＥ提示および免疫原防御の広さに影響を与える構造歪みを導き得る。
【０１９９】
ＤＴ架橋結合によって生成されるＣ−Ｃ結合は、免疫化およびワクチン接種のプロセスに使用されるものを含む、本発明に従って使用される可能性がある、実質的にほとんどの生理学的および／または操作条件下で安定である。ＤＴ結合は「ゼロ長」、すなわち原子は付加されていない。架橋結合触媒は単に２つのチロシンの間の結合形成を開始するだけであり、産物内に組み込まれない。したがって、タンパク質の望ましくない化学修飾は起こらない。ＤＴ架橋結合はまた、非常に特異的であり、反応が穏やかな条件下で実施される場合、チロシン以外のアミノ酸が架橋を形成するか、または修飾されていることは示されていない。さらに、チロシン側鎖の間に厳密な距離の要件があり、２つが非常に近接している場合にのみ結合が形成する。さらに、ＤＴ架橋は自然発生的に形成せず、上記のように近接したＴｙｒ残基の間のみに形成する。したがって、タンパク質を架橋するＤＴは、それを既存の天然／機能的構造に固定する。頭部のないＨＡ設計の文脈において、このことにより、（ｉ）たとえば点変異を導入することによって抗原的／免疫原性的に有益な構造において頭部のないように操作でき、次いで（ｉｉ）ＤＴ架橋結合によってそれをこの好ましい構造に固定できる。
【０２００】
重要な生物学的機能を有するジチロシン結合（ＤＴ結合）は、恐らくジスルフィド結合が不適切である環境において、いくつかの種のタンパク質において特定されている。特定のＤＴ結合は、たとえば、線虫（Caenorhabditis elegans）のクチクリン（cuticlin）タンパク質［２７］、タケノコの細胞壁タンパク質［２８］、および羊皮（parchment）コラーゲン［２９］に示されている。これら全ての場合、タンパク質の機能性の原因となる構造的硬直性に起因してＤＴ架橋を特異的に配置するようにタンパク質は開発される。このような結合の重要性はまた、たとえば、酵母において、代謝経路が、特殊化されたタンパク質内でＤＴ結合の形成を導くことが示されている事実によって証明される［３０］。
【０２０１】
さらに、原子レベル構造の非存在下でのＤＴ結合の明確な蛍光特性に起因して、それらの形成は、従来の９６−および３８４−ウェル蛍光プレートリーダーを使用して容易にアッセイできる。このことはまた、架橋結合条件の最適化を簡単および効率的にする。
【０２０２】
この方法は、（ａ）ＷＴ  ＨＡのものと等価のストーク特異的抗原プロファイルを保持するＤＴ安定化完全長ＨＡ分子を生成すること、（ｂ）ＷＴ  ＨＡと同じ「ストーク特異的」抗原プロファイルを保持しながら、タンパク質分解による切断によって完全に折り畳まれたＤＴ−ＨＡから頭部ドメインを除去することを含む。免疫原性は動物研究において確認されていてもよい。
【０２０３】
この例は、出発点としてインフルエンザのＨ１Ｎ１  Ａ／プエルトリコ／８／１９３４（「ＰＲ８」）株由来のＨＡを利用する。マウスにおけるインフルエンザウイルス研究の大多数は、実験室に適合したＰＲ８またはＡ／ＷＳＮ／１９３３（Ｈ１Ｎ１）［ＷＳＮ］インフルエンザウイルスを利用する。免疫原性およびチャレンジ研究は、同種および異種Ｈ１Ｎ１  ＰＲ８およびＨ３Ｎ２  Ｘ３１チャレンジを用いてＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて実施できる。Ｘ３１はＰＲ８のバックグラウンドにおいてＡ／香港／１／１９６８（Ｈ３Ｎ２）のＨＡおよびＮＡ遺伝子を保有する再集合体ウイルスである［３５］。
【０２０４】
ジチロシン結合により、ＨＡ三量体を形成し、安定化させることができるＨＡ構築物を特定するために、三量体ＨＡ結晶構造を分析し（ｐｄｂファイル３ＧＢＮ）、近接する残基は四次中和抗体の結合部位から離れたｔｙｒ置換のために選択される（図５を参照のこと）。「ｔｙｒへの」点変異（２Ｔ−ＨＡ）のコンピュータ設計が完了すると、野生型ＨＡ（ＰＲ８）およびｔｙｒへの置換変異体の細胞外ドメインをコードするｃＤＮＡを生成でき、標準的な分子生物学手法を使用してバキュロウイルス移入ベクター（ｐＡｃＧＰ６７Ａ）内にクローニングできる。ＷＴおよび２Ｔ−ＨＡタンパク質はＳＦ９またはＨｉ５細胞において発現でき、分泌されたＨＡは、レクチンに基づいた糖親和性カラムおよびＭｏｎｏＱアニオン交換カラム上で精製できる。精製後、分泌されたＨＡ三量体は、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム上でサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって単量体および高分子量凝集体から単離できる。
【０２０５】
設計した２Ｔ−ＨＡ構築物が分子間ＤＴ架橋を形成するか否かを評価するために、精製されたタンパク質は、還元ＳＤＳ−ＰＡＧ（ウェスタンブロットおよびクマシー染色）におけるゲルシフトによって、およびＤＴ特異的蛍光についてＤＴ架橋条件への曝露前後に分析できる。５０％超の効率でＤＴ架橋を形成できる構築物は、さらなる特徴付けのために進められていてもよい。ＨＩＶ  ｅｎｖ三量体を用いた予備研究に基づいて、大幅なプロセス最適化を用いずに８０％超の架橋結合効率が達成可能であると考えられる。ＤＴ架橋ＨＡ三量体（ＤＴ−ＨＡ）の生化学的および生物物理学的分析を実施して、１〜３０日の時間経過にわたって３７℃の正常なヒト血清において、それらの熱安定性を、非架橋ＨＡのものと比較できる。三量体ＤＴ−ＨＡおよび対照（非架橋）三量体ＨＡは、ウェスタンブロットによって保持された三量体の存在について毎日分析できる。同様に、６０日、２５℃の時間経過で、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の精製された三量体ＤＴ−ＨＡおよび対照（非架橋）三量体ＨＡをＳＥＣによって毎週分析できる。三量体および単量体画分における全物質の比率は標準的なピーク積分ソフトウェアを使用して定量でき、ＤＴ−ＨＡおよび対照試料における三量体対単量体の比が決定できる。ＤＴ−ＨＡ構築物が還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおけるそれらの安定性に基づいて特定できることを考慮して、ＤＴ架橋三量体の１００％が上記の実験条件下で三量体を保持するのに対して、不安定な非架橋ＨＡ三量体は時間経過の期間を通して単量体サブユニットに解離することが予想される。
【０２０６】
他の架橋結合方法論よりもＤＴ架橋結合手法の中心的な利点は、ワクチン免疫原候補の抗原プロファイルを破壊せずに共有結合分子間架橋を形成する能力である。「ｔｙｒへの」変異とＤＴ架橋結合の両方の効果は、抗ＨＡステム広域中和ｍＡｂのパネル（たとえば６Ｆ１２、Ｃ１７９、ＣＲ６２６１、Ｆ１０、Ａ６６およびＤ８）を使用してＥＬＩＳＡによって決定できる。完全曲線結合アッセイを使用して、ＷＴ  ＨＡ三量体を２Ｔ−ＨＡ変異三量体（非架橋）およびＤＴ−ＨＡ三量対（架橋）と比較できる。ｔｙｒへの変異の導入後およびＤＴ架橋結合後の結合の変化は結合曲線の非線形回帰分析を使用して決定して、各ｍＡｂを有する各構築物についてＥＣ５０値を算出し、比較できる。ｔｙｒへの変異の位置は上記の抗ステムｂｎＡｂの結合に関与するアミノ酸に対して遠位であってもよく、重なっていなくてもよい。チロシン置換によって引き起こされる構造変化は、これらの抗体のいくつかとの結合を減少させていてもよいか、または増加させていてもよい可能性がある。しかしながら、ＨＩＶを使用する予備研究により、ＤＴ架橋結合はタンパク質候補の抗原プロファイルを完全に保存し、同様の程度の抗原保存がインフルエンザＨＡのＤＴ架橋後に予想されることが示唆される。
【０２０７】
架橋タンパク質全体を通してアミノ酸側鎖に対する非特異的変化を評価するために、比較アミノ酸分析（ＡＡＡ）を非架橋（対照）および架橋構築物で実施できる。アミノ酸分析も使用してＤＴ結合の存在を確認できる。なぜなら、ジチロシン架橋は、ＡＡＡについての試料を調製するために使用される酸加水分解でさえも耐性があり、ジチロシン自体は分析において特異的に検出できるからである。ＤＴ−ＨＡにおけるジチロシン結合の位置を直接特定するために、脱グリコシル化トリプシン消化物の質量分析を、たとえば、Ｍｉｃｈｒｏｍ  Ｐａｒａｄｉｇｍ  ＨＰＬＣおよびＭｉｃｈｒｏｍ  Ｖａｃｕｕｍ  Ｓｐｒａｙイオン化源を備えたＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＬＴＱ質量分析計でＬＣ−ＭＳ／ＭＳを実施することによって使用できる。まとめると、これらの研究を使用して、三量体形成ＤＴ結合を形成できるＨＡ構築物を特定し、特徴付けることができる。このような構築物は、免疫優勢ＨＡ頭部ドメインを除去する前でさえ、ストーク特異的ＱＮＥを安定に提示する改良されたＨＡ免疫源を提供できる。
【０２０８】
以前に報告された組換え頭部のないＨＡ構築物はＨＡステムの完全に天然の四次構造を保持しないので、これらの構築物は公知の四次特異的ｂｎＡｂに結合しない。上記のＤＴ−ＨＡ構築物のバキュロウイルス発現および精製後、広域防御構造依存性抗体との結合を保持する安定な頭部のないＨＡを生成するために、頭部ドメインは、折り畳み後およびＤＴ架橋結合後、タンパク質分解により除去できる。ＨＡの球状頭部ドメインのタンパク質分解による除去を可能にするために、プロテアーゼ切断部位はＨＡ１に導入されていてもよい。頭部の除去部位は、たとえば、標準的な分子生物学的手法により位置６０〜７６（Ｎ末端部位）および２７７〜２９０（ｃ末端部位）に導入されていてもよい［１９］。ＨＡの結晶構造は、これらの位置が溶媒に曝露され、ＨＡ１可変ループドメイン（ＡＡ位置１４２〜１４６および１５５〜１６４）内へのさらなる切断部位の導入により効果的なタンパク質分解を妨げ得る構造的拘束を除去することによってプロテアーゼにさらに接近可能になり得ることを示す［３７］。必要な場合、頭部を解体することを使用して、プロテアーゼ基質への接近をさらに改良できる。ＨＡ可変ループ内への切断部位の導入は、これらの部位がアミノ酸置換についての高い許容度があるので、ＨＡ三量体の全体の構造を変化させないことが予想される。実際に、これらのアミノ酸位置（たとえば１４２〜１４６および１５５〜１６４）の全ては１９６８年から１９９９年に収集された感染ウイルス単離株において変化している［３８］。可変ループにおけるＨＡ１の切断を実施して頭部の球状構造を不安定化させることができ、主な頭部除去部位における完全な曝露および効果的な切断を可能にする（５３〜６７および２６９〜２７７）。ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）認識配列（ＬＥＶＬＦＱＧＰ（配列番号６９））およびＴＥＶ（Ｔｏｂａｃｃｏ  Ｅｔｃｈ  Ｖｉｒｕｓプロテアーゼ）認識配列ＥＮＬＹＦＱＧ（配列番号７０）およびＥＮＬＹＦＱＳ（配列番号７１））を使用／導入できる。ＴＥＶ切断は、ｐＨ７．０にて１５０〜５００ｍＭ  ＮａＣｌおよび１４ｍＭ  β−メルカプトエタノールを有する２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液中で１：５０〜２００ｗ／ｗの基質対酵素の比にて実施できる。ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ切断は、ｐＨ７．０にて１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡおよび１ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）を有する５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液中で実施できる。頭部の除去は、電気移動シフトにより完全長ＤＴ−ＨＡ三量体に対応する分子量（約２２５ｋＤａ）からＳＤＳ−ＰＡＧＥにより頭部のない三量体の分子量（約１３５ｋＤａ）までアッセイでき、続いてクマシー染色およびウェスタンブロットが実施できる。頭部特異的検出Ａｂを使用して、ウェスタンブロットおよびＥＬＩＳＡによってＤＴ架橋ＨＡステムから頭部の除去を確認できる。ＨＡ頭部除去が不完全な場合、Ｐｒｅｓｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼの位置およびＴＥＶ部位は交換されていてもよいか、または単一種類の部位のみが全ての所望の切断位置において導入されていてもよい。
【０２０９】
ＤＴ−頭部のない構築物の免疫原性を試験するために、マウス免疫原性研究を実施できる。ＢＡＬＢ／ｃマウス（６〜８週齢）はイソフルラン３〜５％により麻酔でき、続いて３週間間隔を空けた２回の筋肉内注射によりプライムブーストレジーム／スケジュールにおいて免疫化でき、１回目は３７．５μｇのｐＧａｇ−ＥＧＦＰおよび７５μｇのｐＤＺ＿ＰＲ８＿ＨＡを含むＤＮＡ、続いてエレクトロポレーションパルス（プライム）であり、２回目は２５μｇのＷＴ  ＨＡ、フォルドン／ＧＣＮ４−安定化ＨＡ三量体またはＤＴ−頭部のないタンパク質（ブースト）である。タンパク質（ブースト）免疫原はＡｌｕｍ（リン酸アルミニウム、３００μｇ／用量）により製剤化できる。２回目の注射（ブースト）から２週間後、血清を回収でき、予備免疫血清およびアジュバントのみの対照に対する抗ＨＡ反応についてアッセイできる。各群についての抗ＨＡ  ＩｇＧおよびＩｇＭ力価全体はＥＬＩＳＡにより決定できる。１０個の異なる精製した群１および群２のＨＡに対する抗血清の異種亜型反応性はウェスタンブロットおよびＥＬＩＳＡにより決定できる。各群由来の免疫原は抗ＨＡ抗体反応を誘発することが予想される。各群由来の抗血清の異種亜型中和能を調べるために、異種インフルエンザウイルスのパネル（ＨＫ／６８  Ｈ３、Ｂｒｉｓ／０７  Ｈ３、Ｎｅｔｈ／０３  Ｈ７、Ｃａｌ／０９  Ｈ１、Ｓｉｎｇ／５７  Ｈ２、Ｖｉｅｔ／０４  Ｈ５、ＨＫ／９７  Ｈ６、ＨＫ／９９  Ｈ９）を中和するこれらの血清の能力を試験できる。抗血清は２倍に連続希釈でき、等体積のウイルスと混合でき、３７℃にて２時間インキュベートできる。ウイルス−血清混合物はトリプシンを含有する無血清培地中の標的細胞（ＭＤＣＫ）に加えることができ、培地を置きかえる前に３時間インキュベートできる。細胞は、ウイルス−血清混合物への曝露の３〜５日後、細胞変性効果についてモニターできる。
【０２１０】
この免疫原設計および開発プロセスの主な目的は、ｂｎＡｂを誘発でき、異種インフルエンザチャレンジに対して防御できるＤＴ−頭部のない免疫原を生成することである。インフルエンザ感染に対して防御反応を誘発するＤＴ−頭部なしの能力を直接調べるために、２０匹のＢＡＬＢ／ｃマウスの３つの群は、免疫化なし／予備免疫化した、およびアジュバントのみで免疫化した対照（群４および５、各々２０匹のマウス）と比較して、ＷＴ  ＨＡ、フォルドン／ＧＣＮ４頭部なし、またはＤＴ−頭部なしにより免疫化でき、致死量の同種（ＰＲ８）または異種（Ｘ３１）ウイルスにより鼻腔内でチャレンジでき（各々１０匹のマウス）、２週間後、２回目の免疫化（ブースト）を行う。マウスはチャレンジ前にケタミン（７５ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（１５ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射により麻酔でき、体重は毎日モニターできる。２０％未満の体重損失を生存についてのサロゲートとして使用できる。各免疫原（ＷＴ  ＨＡ、フォルドン／ＧＣＮ４頭部なし、ＤＴ−頭部なし）は、ＰＲ８チャレンジに対してある程度の防御を提供することが予想される。しかしながら、ＤＴ−頭部のない免疫原による免疫化は、異種インフルエンザチャレンジに対して顕著に改良された防御を提供し、この防御は、その三量体形態で天然のＨＡステム上に提示される保存されたＱＮＥを認識するｂｎＡｂの力価と相関することが予想される。
【０２１１】
バキュロウイルス発現ベクター系（ＢＥＶＳ）は、このシステムが十分に確立され、適切な産生／精製プロトコルが十分に記載され、立証されているので、組換えＨＡ抗原を製造するために使用できる［１０］。一般に、このようなプロトコルは、遠心分離、洗浄剤により媒介されるタンパク質可溶化、続いて２回のクロマトグラフ（ＩＥおよびＨＩＣカラム）工程を含む精製によって感染細胞を収集することを含む［１０］。単量体頭部と比較した三量体ストークのＭＷの大きさの差、およびプロセシングに使用される酵素に起因して、ゲル濾過も使用できる。ＩＥクロマトグラフィーも使用できる。
【０２１２】
ＤＴ結合の形成を触媒するペルオキシダーゼおよび架橋結合後にＨＡ頭部を切断するプロテアーゼである、２つの酵素がここで記載されているプロセスに使用される。両方とも市販されている。
【０２１３】
完成した免疫原の精製は従来のゲル電気泳動およびＨＰＬＣによって確認できる。架橋結合は、変性条件下でのゲル電気泳動、蛍光測定およびアミノ酸分析の組合せによって評価できる。免疫原性は上記の選択された抗体のパネルに対するプロファイリングによって評価できる。ＨＰＬＣに基づいたアッセイを使用して、タンパク質糖組成物を特定し、測定できる。
【０２１４】
ＤＴ−頭部のないＨＡは技術仕様および他の事項に基づいて選択されるアジュバントと共に製剤化できる。様々な賦形剤および安定化剤／防腐剤と共に製剤化されたアジュバントＨＡは凍結乾燥でき、再水和後、生物物理学的（動的光散乱）および抗原的に試験できる。室温、４℃および−２０℃での貯蔵の効果を試験して、長期間の貯蔵条件、安定性および有効性を決定できる。
【０２１５】
動物有効性研究（たとえばフェレットで実施した）を実施でき、急性および長期間の動物安全性研究を実施できる。フェレットはヒトインフルエンザウイルスに感受性があり、ヒトにおいて見られるインフルエンザの症状のいくつかを発症し；さらにそれらは臨床パラメーター（たとえば温度、心拍および呼吸数）をモニターするのに十分大きく、血清学的および抗原的特性化における使用のために比較的多量の血清を得ることができる。
【０２１６】
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例３
頭部のないＨＡの操作における従来の試みは、球状頭部領域が組換えにより切り出されたＨＡタンパク質を発現させることを含んでいた。このような従来の頭部のないＨＡ構築物は当該分野においてかなりの反響を引き起こした。なぜならそれらは改良された交差反応性Ａｂ反応を誘発したからである。しかしながら、これらのＡｂは交差防御せず、同種チャレンジに対して防御しただけであった。これらの従来の組換え頭部のない構築物は交差防御の立体構造的ストークＡｂの現在のレパートリーと結合せず、このことは、インタクトな球状頭部の非存在下で少なくともある程度のストークミスフォールディングを示唆している。これらの従来の観察は、最も広域に交差反応する抗ストークＡｂの１つであるＣ１７９を使用して、免疫蛍光分析によって確認された（図６を参照のこと）。ＤＴに基づいた立体構造的固定の適用は、頭部のタンパク質分解による除去の前にストーク三量体をその天然の立体構造に一緒に保持することによってこの欠点を回避し、それにより決定的なストークＱＮＥに対するＡｂ反応に焦点を当てるＤＴ固定された頭部のないＨＡ免疫原を生じる。
【０２１７】
例４
ＤＴ架橋をＰＲ８  ＨＡストークドメイン内に導入すると、ＤＴ架橋ＨＡ三量体は天然の抗原性を維持した。ｃｒ６２６１  ｂｎＡｂ（ｐｄｂファイル：３ＧＢＮ）との複合体における１９１８  Ｈ１Ｎ１  ＨＡ三量体、およびＰＲ８  ＨＡ（ｐｄｂファイル：１ＲＵ７）の結晶構造に基づいて、ＤＴ架橋形成を可能にするためにチロシンへの置換をＨＡストークドメイン内に首尾良く操作した。そのＤＴ架橋形成は、球状頭部がタンパク質分解により除去されると、四次抗原を維持するはずである。続いて２９３Ｔ細胞にチロシンへの変異体の分泌バリアントをトランスフェクトし、トランスフェクトした細胞上清中で４０５ｎｍ蛍光にて測定してＤＴ結合の形成を決定した。４０５ｎｍ蛍光（ＤＴ結合に非常に特異的である）の大きな増加により、いくつかのチロシンへの変異体において強固な架橋結合が実証される（図７Ａ）。陽性対照（インスリン）およびＤＴ標準との比較に基づいて、７０％超の架橋結合効率を、任意の最適化前に、これらの構築物のうちの４つについて確認した。図７Ｂに示されるように、Ｃ１７９  Ａｂ結合は架橋結合反応の前後で変化していない。これらのデータにより、ＰＲ８  ＨＡストークが架橋できること、および最も広域の交差反応性立体構造的ｍＡｂの１つである、Ｃ１７９（２）が結合する鍵となる四次ストークペプチドが維持されることが示される。
【０２１８】
標的プロテアーゼ切断部位もまた、首尾良く導入し、ＰＲ８  ＨＡ頭部ドメインを切断するために使用した。ＰＲ８  ＨＡ構造の広範な分析およびトランスポゾンに基づいた変異誘発研究により、タンパク質分解による切断部位の挿入を許容できる球状頭部領域内の複数の位置が明らかになった。特定した２０＋の可能な部位の中から、挿入を可能にする２つの構築物を生成した。１つの部位は球状頭部ドメイン（「４８Ｇ」）の基部に位置するのに対して、他の残基はタンパク質（「１２８Ｓ」）の可変ループに近接する。両方の挿入は全細胞抽出物のウェスタンブロットによって示されるように十分に発現し（図６Ｂ、左）、Ｃ１７９  ＥＬＩＳＡによるトランスフェクト細胞上清中での検出のために十分な量のウイルス様粒子（ＶＬＰ）を形成する（図８Ａ）。生成した２つの構築物のうち、４８Ｇ挿入は、少なくともプロテアーゼに接近可能であり、さらに、頭部の基部に近接したその位置に起因して頭部ドメインを最も完全に除去することが予測される。４８Ｇ部位が十分に接近可能であることを実証するために、ＴＥＶプロテアーゼ切断を、陰性対照としてＷＴ  ＨＡを使用してＨＡ  ４８Ｇタンパク質で実施した。図８Ｂの右側に示されるように、ＨＡ  ４８Ｇタンパク質のＴＥＶプロテアーゼ切断により、ＨＡの第１の４８ＡＡ（６．５ｋＤａ）の除去が生じるが、ＷＴ  ＨＡタンパク質において切断は生じない。さらに、ＨＡ  ４８Ｇはまた、トランスフェクト細胞上清から直接アッセイされる場合、血球凝集活性も維持し、それはその機能的立体構造に折り畳まれたままであることが示唆される（図８Ｃ）。
【０２１９】
例５
導入：立体構造的に固定された頭部のないＨＡを設計する際に、１９１８  ＨＡ：ｃｒ６２６１複合体（ＰＤＢ：３ＧＢＮ）およびＰＲ８  ＨＡ（ＰＤＢ：１ＲＵ７）の原子構造を分析して、１）ストークｂｎＡｂ結合を維持するためにｃｒ６２６１エピトープから十分な距離でストークにおいてジチロシン（ＤＴ）架橋を可能にし、２）頭部を除去するために使用できるプロテアーゼ切断部位の挿入を可能にする位置を特定した。
【０２２０】
ＰＲ８  ＨＡ三量体はＨＡストークにおけるいくつかの場所においてＤＴ架橋を使用してそれらの天然の三量体立体構造に首尾良く固定し；これらのＤＴ固定したＨＡは天然のストーク抗原性を維持する
いくつかのチロシン変異を、三量体が高い効率でそれらの天然の融合前状態に固定できるようにＰＲ８  ＨＡのストーク内に操作した。図８５Ａは、ＤＴ架橋結合後の三量体状態への明確なシフトを実証しており（還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）；図８５Ｂは、ジ−チロシン結合が４０５ｎｍにおける特異的な蛍光によって形成していることを確認している。架橋種の濃度測定により、三量体状態への８０％超の変換が実証される。最も重要なことには、８Ｄ４、ストーク特異的ｂｎＡｂの結合が完全に維持される（図８５Ｃ）。結晶学的分析により、８Ｄ４がｃｒ６２６１と同じエピトープに結合することが示されている。これらのデータにより、ＰＲ８  ＨＡが、鍵となるＶH１−６９四次ストークエピトープの天然の立体構造を維持しながら、そのストークにおいて架橋され得ることが確認される。
【０２２１】
複数のＣおよびＮ末端ＴＥＶプロテアーゼ認識部位を個々におよび組み合わせてＰＲ８  ＨＡの頭部内に首尾良く操作した
ＨＡの機能を破壊せずにＴＥＶプロテアーゼ切断部位が挿入され得るＰＲ８  ＨＡの頭部内の領域を特定した。構造に基づいた設計に関して、ＰＲ８  ＨＡおよびＴＥＶプロテアーゼ認識部位の構造データを合わせ、切断部位挿入を以下の基準に基づいてＨＡの頭部の領域内に特異的に標的化した：ｉ）免疫優勢頭部の除去を最大化するためにストーク先端への近接性；ｉｉ）構造摂動を最小化するためにＨＡの二次構造とＴＥＶ切断部位との間の類似性；ｉｉｉ）トランスポゾンに基づいた突然変異誘発スクリーニングからのデータによるトランスポゾン変異誘発スクリーニングに基づいた挿入に対する許容度として特定される領域（Ｈｅａｔｏｎ  ａｎｄ  Ｐａｌｅｓｅ  ＰＮＡＳ  Ｖｏｌ．１１０，Ｎｏ．５０；ｐｐ．２０２４８−５３）。
【０２２２】
合計で、約５０の挿入部位を個々にスクリーニングし、ＨＡ（ＷＴまたは挿入を有する）およびＮＡのみを発現することによってＶＬＰ内に組み込まれるそれらの能力についてアッセイした。このアッセイは、発現、細胞表面蓄積、膜マイクロドメイン局在および粒子形成を含む、ＨＡの機能的属性のいくつかを包含するので、完全長ＨＡタンパク質を用いて実施した。このアプローチは、ＴＥＶ挿入が、ＶＬＰ形成アッセイにおいてＷＴ  ＨＡの機能を維持する、いくつかのＣ末端（たとえば位置２７８、２８２、２８３、２８６および２９１において）および２Ｎ末端（位置４８および６３）を特定した（図８６Ａ）。これらのいくつかはまた、ストークｂｎＡｂ結合および切断を効果的に維持する（図８６ＢおよびＣ）。２つのＣ末端挿入（位置２７８および２８６）および１つのＮ末端挿入（位置６３）を組み合わせてさらなる分析および試験のために優先させた。第２のＮ末端挿入（位置４８）は、特定の抗ストークＶH１−６９ｂｎＡｂ（たとえば１８Ａ３）と十分に結合するが、他とあまり結合せず、したがって、それにもかかわらず、位置６３における挿入に対する妥当な代替を提供する。
【０２２３】
優先させた挿入部位のいくつかを種々の組合せ（たとえば６３〜２７８および６３〜２８６）で試験し、挿入の組合せの両方もまた、効果的なＶＬＰ形成を維持し（図８７Ａ）、ストークｂｎＡｂに十分に結合する（図８７Ｂ）ことを示した。
【０２２４】
いずれは、両方の構成成分（チロシンへの変異およびタンパク質分解による切断部位挿入）は単一のＨＡ分子内に導入できる。次いでＤＴ架橋結合はＨＡのストークをその三量体の融合前構造に固定するように適用でき、この後、頭部をタンパク質分解により除去して、完全に天然の頭部のないＨＡを生成できる。
【０２２５】
上述の発明は、明確さおよび理解の目的のために詳しく記載されているが、当業者は、本開示を読んで、本発明の真の範囲から逸脱せずに形態および詳細の様々な変更を行うことができることは明らかである。本発明はまた、以下の特許請求の範囲の観点からさらに定義されていてもよい。
以下に、当初の特許請求の範囲に記載していた発明を付記する。
［１］
配列番号１のアミノ酸残基２２９〜５１９と少なくとも６５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むインフルエンザヘマグルチン（ＨＡ）ポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体であって、前記アミノ酸配列が、アミノ酸位置４０３、４０６、４１１、４２２、４２９、４３２、４３３および４３５またはそれらに対応するアミノ酸残基のうちの１つ以上においてチロシンへの点変異を含む、インフルエンザヘマグルチン（ＨＡ）ポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体。
［２］
前記アミノ酸配列が、アミノ酸位置４０３、４０６、４１１、４２２、４２９、４３２、４３３および４３５またはそれらに対応するアミノ酸残基のうちの２つ以上においてチロシンへの点変異を含む、［１］に記載のインフルエンザヘマグルチン（ＨＡ）ポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体。
［３］
配列番号１のアミノ酸残基２２９〜５１９と少なくとも６５％の配列同一性を有するアミノ酸配列から本質的になるインフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）ポリペプチドであって、前記アミノ酸配列が、アミノ酸位置４０３、４０６、４１１、４２２、４２９、４３２、４３３および４３５またはそれらに対応するアミノ酸残基のうちの１つ以上においてチロシンへの点変異を含む、インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）ポリペプチド。
［４］
前記ポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体が、三量体ストーク立体構造に折り畳まれ、少なくとも１つのジ−チロシン架橋を含み、前記少なくとも１つのジ−チロシン架橋の一方または両方のチロシンがチロシンへの点変異から生じている、［１］に記載のインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体。
［５］
前記ポリペプチドが、三量体ストーク立体構造に折り畳まれるインフルエンザＨＡタンパク質複合体により構成され、前記インフルエンザＨＡタンパク質複合体が少なくとも１つのジ−チロシン架橋を含み、前記少なくとも１つのジ−チロシン架橋の一方または両方のチロシンがチロシンへの点変異から生じている、［３］に記載のインフルエンザＨＡポリペプチド。
［６］
前記架橋が１つ以上の対合したチロシン残基の間に位置し、前記対合したチロシン残基が、残基４０３および４３３；４１１および４２２、４０３および４２９、４０３および４３２、４３３および４３５、ならびに４０６および４３３からなる群から選択される、［４］に記載のインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体。
［７］
前記架橋が１つ以上の対合したチロシン残基の間に位置し、前記対合したチロシン残基が、残基４０３および４３３；４１１および４２２、４０３および４２９、４０３および４３２、４３３および４３５、ならびに４０６および４３３からなる群から選択される、［５］に記載のインフルエンザＨＡタンパク質複合体。
［８］
前記インフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体が、配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０もしくは１１７のアミノ酸配列、またはこれらの配列のいずれかと６５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、［１］に記載のインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体。
［９］
前記ポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体が、ＨＡ−ストーク特異的抗体と結合できる、［１］に記載のインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体。
［１０］
前記ポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体が、抗体Ｃ１７９と結合できる、［９］に記載のインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体。
［１１］
前記ポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体が、三量体ストーク立体構造に折り畳むことができる、［１］に記載のインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体。
［１２］
前記ポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体が、三量体形成ドメインをさらに含む、［１］に記載のインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体。
［１３］
前記三量体形成ドメインがフォルドンドメインである、［１２］に記載のインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体。
［１４］
［１］に記載のインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体をコードする核酸分子。
［１５］
［１］に記載のインフルエンザＨＡポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体を含む組成物。
［１６］
前記組成物がワクチン組成物である、［１６］に記載の組成物。
［１７］
前記組成物が、アジュバント、担体、免疫刺激剤またはそれらのいずれかの組合せをさらに含む、［１７］に記載の組成物。
［１８］
［２］に記載のインフルエンザＨＡポリペプチドを含む組成物。
［１９］
［２］に記載のインフルエンザＨＡポリペプチド、および配列番号９４または配列番号９５と少なくとも６５％の配列同一性を有するアミノ酸配列から本質的になるインフルエンザＨＡポリペプチドを含む組成物。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６Ａ】
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【図４６Ｂ】
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【図４６Ｃ】
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【図４６Ｄ】
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【図４６Ｅ】
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【図４６Ｆ】
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【図４７Ａ】
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【図４７Ｂ】
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【図４７Ｃ】
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【図４７Ｄ】
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【図４７Ｅ】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４Ａ】
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【図５４Ｂ】
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【図５４Ｃ】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６９Ａ】
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【図６９Ｂ】
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【図７０】
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【図７１】
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【図７２】
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【図７３】
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【図７４】
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【図７５】
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【図７６】
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【図７７】
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【図７８】
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【図７９】
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【図８０】
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【図８１】
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【図８２】
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【図８３】
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【図８４】
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【図８５Ａ】
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【図８５Ｂ−Ｃ】
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【図８６Ａ】
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【図８６Ｃ】
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【図８７Ａ】
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【図８７Ｂ】
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【図８８】
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【図８９】
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【配列表】
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