(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
リン酸ジエステル結合で結合しているオリゴヌクレオチドにおいて、
前記オリゴヌクレオチドが式（１）で表される骨格を含む人工核酸のみで構成され、
前記式（１）で表されるＮＨの向き及びメチル基の位置の骨格を有する
オリゴヌクレオチド。
【化１】
0006704196.tif 000055
（式（１）中、Ｂは下記式（２）〜（６）から選択される１種の塩基である。ただし、Ｂで選択される塩基が全て同じになることを除く。ＸはＯ（酸素）またはＳ（硫黄）である。）
【化２】
0006704196.tif 000056
【請求項２】
リン酸ジエステル結合で結合しているオリゴヌクレオチドにおいて、
前記オリゴヌクレオチドは、リボース環又はデオキシリボース環を持つ核酸及び式（１）で表される骨格を含む人工核酸を含み、且つ式（７）又は式（８）で表される結合を含み、
前記式（１）で表されるＮＨの向き及びメチル基の位置の骨格を有する
オリゴヌクレオチド。
【化３】
0006704196.tif 000057
（式（１）中、Ｂは下記式（２）〜（６）から選択される１種の塩基であって、同じであっても異なってもよい。Ｘは、Ｏ（酸素）またはＳ（硫黄）である。）
【化４】
0006704196.tif 000058
【化５】
0006704196.tif 000059
（式（７）及び式（８）中、Ｂは前記式（２）〜（６）から選択される１種の塩基であって、同じであっても異なっていても良い。ＸはＯ（酸素）又はＳ（硫黄）のいずれかである。ＲはＨ（水素）又はＯＨ（水酸基）である。）
【請求項３】
前記式（１）で表される骨格を含む人工核酸がオリゴヌクレオチドの端部に位置する時、端部部分が式（１−ａ）、（１−ｂ）、（７−１）又は（８−１）で表される請求項１又は２に記載のオリゴヌクレオチド。
【化６】
0006704196.tif 000060
（式（１−ａ）、（１−ｂ）、（７−１）及び（８−１）中、Ｙは下記式（１７）又は（１８）から選択される１種である。Ｂ、Ｒ、Ｘは前記と同様である。）
【化７】
0006704196.tif 000061
【請求項４】
前記式（２）〜（６）で表される塩基に加え、前記Ｂが下記式（１９）〜（２６）で表される塩基を含む請求項１〜３の何れか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【化８】
0006704196.tif 000062
（上記式（２３）〜（２６）中、Ｒ1は、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、および下記式（３０）〜（５１）の光機能性分子、あるいは式（３０）〜（５１）の光機能性分子が結合したアルキル基、アルケニル基、およびアルキニル基を表す。）
【化９】
0006704196.tif 000063
【請求項５】
標的とするＤＮＡ又はＲＮＡを選択する工程、
前記標的とするＤＮＡ又はＲＮＡと二重鎖を形成できるオリゴヌクレオチドを設計する工程、
設計したオリゴヌクレオチドを合成する工程、
を含み、
前記設計したオリゴヌクレオチドを合成する工程が、式（１１）で表される化合物を用い、式（１）で表される骨格のみを含むオリゴヌクレオチドを合成する工程である、
オリゴヌクレオチドの製造方法。
【化１０】
0006704196.tif 000064
【化１１】
0006704196.tif 000065
（式（１）および式（１１）中、Ｂは下記式（２）〜（６）から選択される１種の塩基である。ただし、Ｂで選択される塩基が全て同じになることを除く。Ｘは、Ｏ（酸素）またはＳ（硫黄）である。）
【化１２】
0006704196.tif 000066
【請求項６】
前記設計したオリゴヌクレオチドを合成する工程が、
前記式（１１）で表される化合物及び式（１２）で表される化合物、又は式（１３）で表される化合物及び式（１４）で表される化合物を用い、式（７）又は式（８）で表される結合を含むオリゴヌクレオチドを合成する工程である請求項５に記載のオリゴヌクレオチドの製造方法。
【化１３】
0006704196.tif 000067
【化１４】
0006704196.tif 000068
（式（７）及び式（８）中、Ｂは前記式（２）〜（６）から選択される１種の塩基であって、同じであっても異なっていても良い。ＸはＯ（酸素）又はＳ（硫黄）のいずれかである。ＲはＨ（水素）又はＯＨ（水酸基）である。ＤＭＴは式（１１）と同様である。）
【請求項７】
前記設計したオリゴヌクレオチドを合成する工程が、該工程の少なくとも最初及び／又は最後に前記式（１１）又は式（１３）で表される化合物を用いる請求項６に記載のオリゴヌクレオチドの製造方法。
【請求項８】
前記式（２）〜（６）で表される塩基に加え、前記Ｂが下記式（１９）〜（２６）で表される塩基を含む請求項５〜７の何れか一項に記載のオリゴヌクレオチドの製造方法。
【化１５】
0006704196.tif 000069
（上記式（２３）〜（２６）中、Ｒ1は、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、および下記式（３０）〜（５１）の光機能性分子、あるいは式（３０）〜（５１）の光機能性分子が結合したアルキル基、アルケニル基、およびアルキニル基を表す。）
【化１６】
0006704196.tif 000070
【請求項９】
リン酸ジエステル結合で結合しているオリゴヌクレオチドにおいて、
前記オリゴヌクレオチドは、リボース環又はデオキシリボース環を持つ核酸及び式（２７）で表される骨格を含む化合物を含み、且つ式（２８）又は式（２９）で表される結合を含み、
前記式（２７）で表されるＮＨの向き及びメチル基の位置の骨格を有する
オリゴヌクレオチド。
【化１７】
0006704196.tif 000071
（式（２７）中、Ｚは光機能性分子を表す。Ｘは、Ｏ（酸素）またはＳ（硫黄）である。）
【化１８】
0006704196.tif 000072
（式（２８）及び式（２９）中、Ｂは下記式（２）〜（６）、（１９）〜（２６）から選択される１種の塩基であって、同じであっても異なっていても良い。ＸはＯ（酸素）又はＳ（硫黄）のいずれかである。ＲはＨ（水素）又はＯＨ（水酸基）である。Ｚは光機能性分子を表す。）
【化１９】
0006704196.tif 000073
（上記式（２３）〜（２６）中、Ｒ1は、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、および下記式（３０）〜（５１）の光機能性分子、あるいは式（３０）〜（５１）の光機能性分子が結合したアルキル基、アルケニル基、およびアルキニル基を表す。）
【化２０】
0006704196.tif 000074
【請求項１０】
前記Ｚが、上記式（３０）〜（５１）で表される置換基から選択される１種である請求項９に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１１】
前記式（２７）で表される骨格を含む化合物がオリゴヌクレオチドの端部に位置する時、端部部分が式（２８−１）又は式（２９−１）で表される請求項９又は１０に記載のオリゴヌクレオチド。
【化２１】
0006704196.tif 000075
（式（２８−１）及び式（２９−１）中、Ｙは下記式（１７）又は（１８）から選択される１種である。Ｂ、Ｒ、Ｘ及びＺは前記と同様である。）
【化２２】
0006704196.tif 000076
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オリゴヌクレオチドに関し、特に、ＤＮＡ及びＲＮＡを配列特異的に認識する人工核酸を含むオリゴヌクレオチド、並びに光機能性分子を挿入したオリゴヌクレオチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
人工核酸とは、天然核酸に非天然部位を導入又は非天然部位のみで合成した核酸であり、自然界には存在しない、完全に人工的に合成された分子である。そのため、生体内に存在する核酸分解酵素に認識されにくく、分解されにくいという特長をもつ。また、ＤＮＡやＲＮＡと同様にＡ，Ｇ，Ｃ，Ｔなどの塩基を導入することが可能であり、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ型塩基対を形成させ二重鎖を組ませることができる。更に、設計によってはＤＮＡやＲＮＡとハイブリダイズさせることも可能であり、新たなナノデバイスのモチーフとしての利用やアンチセンス法などへの応用が期待されている。
【０００３】
人工核酸としては、以下に示す、ａｃｙｃｌｉｃ  Ｔｈｒｅｏｎｉｎｏｌ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ（ａＴＮＡ）、Ｓｅｒｉｎｏｌ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ（ＳＮＡ）、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ（ＰＮＡ）、Ｇｌｙｃｏｌ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ（ＧＮＡ）、Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ（ＬＮＡ）、等が知られている。ＬＮＡ以外の上記の人工核酸は塩基以外の骨格部分が非環状である。そのため、環状の骨格を持つ化合物と異なり合成が簡単であること、また、天然の核酸と大きく異なる骨格であることから、上記のとおり酵素耐性が高いというメリットがあり、現在盛んに研究が行われている。
【０００４】
【化１】
0006704196.tif 000002
【０００５】
上記人工核酸の中で、ＰＮＡは主鎖に電荷をもっていないことから、ＤＮＡやＲＮＡとの相補性が高く、二重鎖の人工核酸を形成できることが知られている（非特許文献１参照）。しかしながら、ＰＮＡは疎水性が高いため水に溶けにくく、凝集し易いという問題がある。また、ＰＮＡは最大１６〜１７の塩基配列が限界で、ｓｉＲＮＡには使用が難しい等、用途が限定的であるという問題がある。
【０００６】
一方、本発明者らは下記式（ａ）で表すＤ−ａＴＮＡの合成を行い、Ｄ−ａＴＮＡは相補的なＤ−ａＴＮＡとは二重鎖を形成するが、ＤＮＡやＲＮＡとは二重鎖を形成しないことを明らかにしている（非特許文献２、３参照）。
【０００７】
【化２】
0006704196.tif 000003
【０００８】
また、本発明者らは、ＳＮＡは設計の自由度が高く様々な塩基を導入できる上、ＤＮＡやＲＮＡと二重鎖を形成できることを明らかにしている（非特許文献４参照）。しかしながら、ＳＮＡはＤＮＡやＲＮＡと二重鎖を形成するものの、ＳＮＡ／ＤＮＡ、及びＳＮＡ／ＲＮＡ二重鎖は熱安定性が不十分であるという問題がある（非特許文献３参照）。
【０００９】
なお、非特許文献３に記載されているａＴＮＡの特性に着目し、ａＴＮＡをｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）に組み込むことも知られている（非特許文献５参照）。しかしながら、非特許文献５に記載されているｓｉＲＮＡは、３’末端側の相補鎖を形成しない突出した２塩基をａＴＮＡで置換することでｓｉＲＮＡの核酸分解酵素への耐性を高めたものであり、ａＴＮＡがＤＮＡ又はＲＮＡと二重鎖を形成するものではない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｐ．Ｅ．Ｎｉｅｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｂｙ  ｓｔｒａｎｄ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ａ  ｔｈｙｍｉｎｅ−ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ  ｐｏｌｙａｍｉｄｅ”，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１  Ｄｅｃ  ６；２５４（５０３７）：１４９７−５００
【非特許文献２】Ｈ．Ａｓａｎｕｍａ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｕｎｅｘｐｅｃｔｅｄｌｙ  Ｓｔａｂｌｅ  Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｄｕｐｌｅｘ  ｆｒｏｍ  Ｆｌｅｘｉｂｌｅ  Ａｃｙｃｌｉｃ  Ｔｈｒｅｏｎｉｎｏｌ”，Ｊ．ＡＭ．ＣＨＥＭ．ＳＯＣ．，２０１０，１３２，１４７０２−１４７０３
【非特許文献３】Ｈ．Ａｓａｎｕｍａ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｈｉｇｈｌｙ  Ｓｔａｂｌｅ  Ｄｕｐｌｅｘ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｂｙ  Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ａｃｙｃｌｉｃ  Ｔｈｒｅｏｎｉｎｏｌ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ（ａＴＮＡ）  ａｎｄ  Ｓｅｒｉｎｏｌ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ（ＳＮＡ）  ｗｉｔｈ  Ａｃｙｃｌｉｃ  Ｓｃａｆｆｏｌｄｓ”，Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．，２０１３，１９，１４１５１−１４１５８
【非特許文献４】Ｈ．Ｋａｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｈｉｒａｌｉｔｙ  ａｎｄ  Ｈｅｌｉｃｉｔｙ  ｏｆ  Ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ  ｏｆ  Ｓｅｒｉｎｏｌ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ（ＳＮＡ）  ｂｙ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｓｉｇｎ”，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２０１１，５０，１２８５−１２８８
【非特許文献５】Ａｄｅｌｅ  Ａｌａｇｉａ  ｅｔ  ａｌ．，“ＲＮＡ／ａＴＮＡ  Ｃｈｉｍｅｒａｓ：  ＲＮＡｉ  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｏｆ  Ｓｉｎｇｌｅ  ａｎｄ  Ｄｏｕｂｌｅ  Ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＲＮＡｓ”，Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２０１４，１９，１７８７２−１７８９６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、上記従来の問題を解決するためになされた発明であり、鋭意研究を行ったところ、（ｉ）ａＴＮＡの内、Ｄ−ａＴＮＡはＤＮＡ及びＲＮＡと相補鎖を形成しないが、下記式（１）で表される骨格を含む人工核酸（以下、単に「人工核酸」と記載することがある。）が含まれるオリゴヌクレオチド（以下、本発明の人工核酸を「Ｌ−ａＴＮＡモノマー」、本発明の人工核酸のみを含むオリゴヌクレオチドを「Ｌ−ａＴＮＡ」と記載することがある。）を、標的とするＤＮＡ又はＲＮＡに対して二重鎖を形成できるような配列を持つように設計することでＤＮＡ及びＲＮＡと安定的な二重鎖を形成できること、（ｉｉ）前記（ｉ）で設計したオリゴヌクレオチドとＤＮＡ又はＲＮＡの二重鎖は、ＳＮＡとＤＮＡ又はＲＮＡの二重鎖より熱安定性が優れていること、（ｉｉｉ）下記式（１）で表される人工核酸の２’のＮＨ及び３’のメチル基と同様の立体配置を含む下記式（２７）で表される化合物をオリゴヌクレオチド中に導入することで、オリゴヌクレオチドの光機能が向上すること、を新たに見出した。
【００１２】
【化３】
0006704196.tif 000004
【００１３】
（式（１）中、Ｂは下記式（２）〜（６）及び（１９）〜（２６）から選択される１種の塩基であって、同じであっても異なってもよい。Ｘは、Ｏ（酸素）またはＳ（硫黄）である。）
【００１４】
【化４】
0006704196.tif 000005
【００１５】
（上記式（２３）〜（２６）中、Ｒ１は、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、および式（３０）〜（５１）の光機能性分子、あるいは式（３０）〜（５１）の光機能性分子が結合したアルキル基、アルケニル基、およびアルキル基を表す。）
【００１６】
【化５】
0006704196.tif 000006
【００１７】
（上記式（２７）中、Ｚは光機能性分子を表す。Ｘは、Ｏ（酸素）またはＳ（硫黄）である。）
【００１８】
すなわち、本発明の目的は、ＤＮＡ及びＲＮＡを配列特異的に認識する人工核酸を含むオリゴヌクレオチド、及び光機能に優れたオリゴヌクレオチドを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明は、以下に示す、オリゴヌクレオチドに関する。
【００２０】
［１］リン酸ジエステル結合で結合しているオリゴヌクレオチドにおいて、
前記オリゴヌクレオチドが式（１）で表される骨格を含む人工核酸のみで構成されているオリゴヌクレオチド。
【化６】
0006704196.tif 000007
（式（１）中、Ｂは下記式（２）〜（６）から選択される１種の塩基であって、同じであっても異なってもよい。ＸはＯ（酸素）またはＳ（硫黄）である。）
【化７】
0006704196.tif 000008
［２］リン酸ジエステル結合で結合しているオリゴヌクレオチドにおいて、
前記オリゴヌクレオチドは、リボース環又はデオキシリボース環を持つ核酸及び式（１）で表される骨格を含む人工核酸を含み、且つ式（７）又は式（８）で表される結合を含むオリゴヌクレオチド。
【化８】
0006704196.tif 000009
（式（１）中、Ｂは下記式（２）〜（６）から選択される１種の塩基であって、同じであっても異なってもよい。Ｘは、Ｏ（酸素）またはＳ（硫黄）である。）
【化９】
0006704196.tif 000010
【化１０】
0006704196.tif 000011
（式（７）及び式（８）中、Ｂは前記式（２）〜（６）から選択される１種の塩基であって、同じであっても異なっていても良い。ＸはＯ（酸素）又はＳ（硫黄）のいずれかである。ＲはＨ（水素）又はＯＨ（水酸基）である。）
［３］前記式（１）で表される骨格を含む人工核酸がオリゴヌクレオチドの端部に位置する時、端部部分が式（１−ａ）、（１−ｂ）、（７−１）又は（８−１）で表される上記［１］又は［２］に記載のオリゴヌクレオチド。
【化１１】
0006704196.tif 000012
（式（１−ａ）、（１−ｂ）、（７−１）及び（８−１）中、Ｙは下記式（１７）又は（１８）から選択される１種である。Ｂ、Ｒ、Ｘは前記と同様である。）
【化１２】
0006704196.tif 000013
［４］前記式（２）〜（６）で表される塩基に加え、前記Ｂが下記式（１９）〜（２６）で表される塩基を含む上記［１］〜［３］の何れか一に記載のオリゴヌクレオチド。
【化１３】
0006704196.tif 000014
（上記式（２３）〜（２６）中、Ｒ１は、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、および下記式（３０）〜（５１）の光機能性分子、あるいは式（３０）〜（５１）の光機能性分子が結合したアルキル基、アルケニル基、およびアルキニル基を表す。）
【化１４】
0006704196.tif 000015
［５］標的とするＤＮＡ又はＲＮＡを選択する工程、
前記標的とするＤＮＡ又はＲＮＡと二重鎖を形成できるオリゴヌクレオチドを設計する工程、
設計したオリゴヌクレオチドを合成する工程、
を含み、
前記設計したオリゴヌクレオチドを合成する工程が、式（１１）で表される化合物を用い、式（１）で表される骨格のみを含むオリゴヌクレオチドを合成する工程であるオリゴヌクレオチドの製造方法。
【化１５】
0006704196.tif 000016
【化１６】
0006704196.tif 000017
（式（１）中、Ｂは下記式（２）〜（６）から選択される１種の塩基であって、同じであっても異なってもよい。Ｘは、Ｏ（酸素）またはＳ（硫黄）である。）
【化１７】
0006704196.tif 000018
［６］前記設計したオリゴヌクレオチドを合成する工程が、
前記式（１１）で表される化合物及び式（１２）で表される化合物、又は式（１３）で表される化合物及び式（１４）で表される化合物を用い、式（７）又は式（８）で表される結合を含むオリゴヌクレオチドを合成する工程である上記［５］に記載のオリゴヌクレオチドの製造方法。
【化１８】
0006704196.tif 000019
【化１９】
0006704196.tif 000020
（式（７）及び式（８）中、Ｂは前記式（２）〜（６）から選択される１種の塩基であって、同じであっても異なっていても良い。ＸはＯ（酸素）又はＳ（硫黄）のいずれかである。ＲはＨ（水素）又はＯＨ（水酸基）である。ＤＭＴは式（１１）と同様である。）
［７］前記設計したオリゴヌクレオチドを合成する工程が、該工程の少なくとも最初及び／又は最後に前記式（１１）又は式（１３）で表される化合物を用いる上記［６］に記載のオリゴヌクレオチドの製造方法。
［８］前記式（２）〜（６）で表される塩基に加え、前記Ｂが下記式（１９）〜（２６）で表される塩基を含む上記［５］〜［７］の何れか一に記載のオリゴヌクレオチドの製造方法。
【化２０】
0006704196.tif 000021
（上記式（２３）〜（２６）中、Ｒ１は、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、および下記式（３０）〜（５１）の光機能性分子、あるいは式（３０）〜（５１）の光機能性分子が結合したアルキル基、アルケニル基、およびアルキニル基を表す。）
【化２１】
0006704196.tif 000022
［９］リン酸ジエステル結合で結合しているオリゴヌクレオチドにおいて、
前記オリゴヌクレオチドは、リボース環又はデオキシリボース環を持つ核酸及び式（２７）で表される骨格を含む化合物を含み、且つ式（２８）又は式（２９）で表される結合を含むオリゴヌクレオチド。
【化２２】
0006704196.tif 000023
（式（２７）中、Ｚは光機能性分子を表す。Ｘは、Ｏ（酸素）またはＳ（硫黄）である。）
【化２３】
0006704196.tif 000024
（式（２８）及び式（２９）中、Ｂは下記式（２）〜（６）、（１９）〜（２６）から選択される１種の塩基であって、同じであっても異なっていても良い。ＸはＯ（酸素）又はＳ（硫黄）のいずれかである。ＲはＨ（水素）又はＯＨ（水酸基）である。）
【化２４】
0006704196.tif 000025
（上記式（２３）〜（２６）中、Ｒ１は、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、および下記式（３０）〜（５１）の光機能性分子、あるいは式（３０）〜（５１）の光機能性分子が結合したアルキル基、アルケニル基、およびアルキニル基を表す。）
【化２５】
0006704196.tif 000026
［１０］前記Ｚが、上記式（３０）〜（５１）で表される置換基から選択される１種である上記［９］に記載のオリゴヌクレオチド。
［１１］前記式（２７）で表される骨格を含む化合物がオリゴヌクレオチドの端部に位置する時、端部部分が式（２８−１）又は式（２９−１）で表される上記［９］又は［１０］に記載のオリゴヌクレオチド。
【化２６】
0006704196.tif 000027
（式（２８−１）及び式（２９−１）中、Ｙは下記式（１７）又は（１８）から選択される１種である。Ｂ、Ｒ、Ｘは前記と同様である。）
【化２７】
0006704196.tif 000028
【発明の効果】
【００２１】
本発明の式（１）で表される骨格を含む人工核酸を含むオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ又はＲＮＡと二重鎖を形成することができる。また、公知の人工核酸であるＳＮＡと比較して、ＤＮＡ及びＲＮＡとより強い二重鎖を形成することができ、二重鎖を形成した時の熱安定性が向上する。
本発明の式（２７）で表される骨格を含む化合物を含むオリゴヌクレオチドについても、二重鎖を形成した時の熱安定性が向上する。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、本発明のオリゴヌクレオチドの立体構造と、従来の人工核酸を用いたオリゴヌクレオチドの立体構造との違いを説明する図である。
【図２】図２は、実施例１で用いた各種オリゴヌクレオチドの配列及び合成方向を示す図である。
【図３】図３は、実施例１で合成したオリゴヌクレオチドの内、Ｌ−ａＴＮ８ａ／ＤＮ８ｃ、Ｌ−ａＴＮ８ａ／ＲＮ８ｃ、Ｌ−ａＴＮ８ａ／ＤＮ８ｂ、及びＬ−ａＴＮ８ａ／ＲＮ８ｂの組み合わせの融解曲線を示すグラフである。
【図４】図４は、実施例２で合成したオリゴヌクレオチドの配列及び合成方向を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下に、本発明のオリゴヌクレオチドについて詳しく説明する。
【００２４】
本発明のオリゴヌクレオチドは、式（１）で表される骨格を含むことを特徴としており、式（１）で表される骨格のみを含むオリゴヌクレオチドであっても、リボース環又はデオキシリボース環に式（１）で表される骨格が結合しているオリゴヌクレオチドであってもよい。
【００２５】
本発明のオリゴヌクレオチドの長さは特に制限は無く、例えば、３ｍｅｒ以上となるように合成すればよい。また、本発明のオリゴヌクレオチドは、標的とするＤＮＡ又はＲＮＡと二重鎖を形成できることから、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、アンチセンス、遺伝子検査薬などの医薬や診断薬等に用いることができる。医薬や診断薬等の用途に本発明のオリゴヌクレオチドを用いる場合は、１５〜３０ｍｅｒ程度の長さとなるように合成すればよく、用途に応じて長さを適宜調整すればよい。
【００２６】
メッセンジャーＲＮＡに対するアンチセンス核酸として使用する場合は、Ｌ−ａＴＮＡモノマーとＤＮＡの両方を含んだオリゴヌクレオチドが好ましい。なお、本発明においては、リボース環又はデオキシリボース環に式（１）で表される骨格が結合しているオリゴヌクレオチドを「ｉＬ−ａＴＮＡ」と記載することがある。例えば５’末端にｉＬ−ａＴＮＡを連続的に導入したヘッドマーや３’末端に連続的に導入したテイルマー、あるいは配列中にｉＬ−ａＴＮＡとＤＮＡが混在しているミックスマーでも良い。より好ましくは、いわゆるギャップマー構造と言われる、両末端および近傍がｉＬ−ａＴＮＡ、内部が天然のＤＮＡで構成されているオリゴヌクレオチドである。こうした配列設計によりアンチセンス核酸のヌクレアーゼ耐性を向上させることができ、さらに細胞内のＲＮａｓｅ  Ｈによる標的メッセンジャーＲＮＡの切断を促進するので、遺伝子発現を効率的に抑制することが可能となる。オリゴヌクレオチドを構成する各ヌクレオシドをつなぐリン酸ジエステル結合は通常のリン酸ジエステル結合でも良いが、ヌクレアーゼ耐性をさらに向上させるため、リン酸ジエステル結合の一部あるいは全てがチオ化されている方が好ましい。
【００２７】
ｍｉＲＮＡに対するアンチセンス核酸は、ＲＮａｓｅ  Ｈの基質である必要がないので、全てＬ−ａＴＮＡモノマーで構成されるオリゴヌクレオチドが好ましい。この場合、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合は、通常のリン酸ジエステル結合でも、一部あるいは全てがチオ化されていても良い。
【００２８】
ｓｉＲＮＡにＬ−ａＴＮＡモノマーを導入する場合は、たとえばＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ，２０１４，１５，２５４９−２５５５に記載されている修飾ｓｉＲＮＡに用いられているＳＮＡの代わりにＬ−ａＴＮＡモノマーを用いることができる。
【００２９】
以上のような核酸医薬としての応用においては、細胞への取り込みを促進するために、コレステロールやポリエチレングリコール鎖とコンジュゲートしても良い。さらにＮ−アセチルガラクトサミンといった糖鎖とコンジュゲートすることで、デリバリー性を付与こともできる。
【００３０】
遺伝子診断薬として使用する場合は、例えばＮａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．,１９９６，１４，３０３に記載されているモレキュラービーコンを構成するステム・ループの一部、あるいは全てにＬ−ａＴＮＡモノマーを用いることができる。具体的には、モレキュラービーコンの両末端には蛍光色素と消光色素を導入し、標的ＤＮＡあるいはＲＮＡを認識するループ部位および／あるいはステム部位の一部あるいは全てにＬ−ａＴＮＡモノマーを用いることができる。天然のＤＮＡあるいはＲＮＡを凌駕する二重鎖形成力を持つＬ−ａＴＮＡモノマーを組み込めば、標的ＤＮＡあるいはＲＮＡと強固に二重鎖形成することによる感度上昇が期待できる。またＬ−ａＴＮＡモノマーの導入によるヌクレアーゼ耐性の向上が期待できるので、細胞内のメッセンジャーＲＮＡの蛍光標識にも使用可能である。さらにＡｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．，２００９，４８，７０４４−７０４７およびＡｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．，２０１０，４９，５５０２−５５０６に記載の、ステム部位に蛍光色素と消光色素の対を導入したインステムモレキュラービーコンを構成するＤＮＡの代わりに、本発明のＬ−ａＴＮＡモノマーを用いることができる。Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．記載のモレキュラービーコンと同様に、Ｌ−ａＴＮＡが標的ＤＮＡあるいはＲＮＡと強固に二重鎖形成することによる感度上昇が期待できる。さらにＣｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．，２０１２，１８，１０８６５−１０８７２に記載されている、複数の消光色素を導入したインステムモレキュラービーコンに、Ｌ−ａＴＮＡモノマーをＤＮＡの代わりに用いても良い。
【００３１】
式（１）中に導入するＢの種類は、天然の核酸塩基と相補的水素結合を形成できる化合物であれば、式（２）〜（６）又は（１９）〜（２６）以外でも良い。例えば、ウラシルの５位にフルオレセインなどの蛍光色素や様々な官能基を導入したウラシル誘導体を挙げることが出来る。
【００３２】
図１は、本発明のオリゴヌクレオチドの立体構造と、従来の人工核酸（ＳＮＡとＤ−ａＴＮＡ）用いたオリゴヌクレオチドの立体構造との違いを説明する図で、図１中の点線で囲った部分は、構造の違う部分を示している。また、図１中の矢印は、配列方向を示している。図１（ｃ）は本発明のオリゴヌクレオチドを表しており、２’のＮＨは紙面に対して下側に、３’のメチル基は上側に向いていることが立体構造上の特徴である。一方、図１（ａ）で表されるＳＮＡは、Ｌ−ａＴＮＡの３’のメチル基が無い以外はＬ−ａＴＮＡと同じである。
【００３３】
本発明の図１（ｃ）のＬ−ａＴＮＡは、Ｌ−Ｔｈｒｅｏｎｉｎｏｌを出発原料とした後述の式（１１）のアミダイトモノマーを用い、３’端から１’端方向、すなわち図１（ｃ）で上から下に向って合成した場合に得られる。換言すれば、配列方向と逆の方向に向かって合成する。一方、後述する式（１３）のアミダイトモノマーを用いる場合は、式（１１）とは配列を逆にして合成すればよい。例えば、「３’−ＡＧＣＴ−１’」を合成する場合、式（１１）のアミダイトモノマーを用いる場合は、３’側からＡ→Ｇ→Ｃ→Ｔと合成すればよい。一方、式（１３）のアミダイトモノマーを用いる場合は、１’側からＴ→Ｃ→Ｇ→Ａと合成すればよい。合成後のオリゴヌクレオチドは全く同じである。一方、図１（ｂ）で表されるＬ−ａＴＮＡも、Ｌ−Ｔｈｒｅｏｎｉｎｏｌを出発原料とする同じアミダイトモノマー（式（１１））を用いて、３’側から１’側に向って合成する。しかし配列方向は合成方向と逆の向きになるため、図１（ｂ）で表されるＬ−ａＴＮＡの２’のＮＨの向き及びメチル基の位置が、図１（ｃ）のＬ−ａＴＮＡと異なっている。更に、図１（ｄ）で表されるＤ−ａＴＮＡは、出発原料にＤ−Ｔｈｒｅｏｎｉｎｏｌを用いることで、合成したＤ−ａＴＮＡのメチル基の位置が、図１（ｃ）で表されるＬ−ａＴＮＡの位置と異なっている。後述する実施例及び比較例に示す通り、メチル基や立体構造の違いがＤＮＡ又はＲＮＡとの二重鎖の形成に大きな影響を与え、図１（ａ）で表わされるＳＮＡと図１（ｃ）で表わされるＬ−ａＴＮＡのみが、ＤＮＡ及びＲＮＡと二重鎖を形成することができる。したがって、標的とするＤＮＡ又はＲＮＡに対して二重鎖を形成できる立体構造となるように、オリゴヌクレオチドを合成する必要がある。なお、図１には、相補鎖を形成する配列方向の組み合わせを「逆平行」、配列方向が相補鎖を形成する方向とは逆の配列方向の組み合わせを「平行」と記載してある。
【００３４】
次に本発明のオリゴヌクレオチドの合成方法について説明する。先ず、オリゴヌクレオチドの合成に用いられるモノマーの合成手順を以下に示す。
【化２８】
0006704196.tif 000029
【００３５】
先ず、式（１０−１）で表されるＬ−Ｔｈｒｅｏｎｉｎeを出発原料とし、対応するメチルエステルを、ジャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー誌，１９８１年，４６巻，４７９９−４８００頁に記載の方法で還元してＬ−Ｔｈｒｅｏｎｉｎｏｌを合成した後、その１級水酸基を４，４’―メトキシトリチル基（ＤＭＴ）等の保護基を導入することで、式（１０−２）で表される化合物を得る。次に式（１０−２）で表される化合物を式（１０−３）で表される塩基を含む化合物と反応させ、式（１０−４）で表される化合物を得る。なお、式（１０−３）で表される化合物に含まれるＢａｓｅ（塩基）を以下に示す。式（１０−３）で表される化合物に含まれる塩基は、合成後のオリゴヌクレオチドに含まれる塩基が上記式（２）〜（６）及び（１９）〜（２６）で表される塩基になればよく、合成段階では保護基を含んでいてもよい。保護基は、公知の手法で合成後に除去すればよい。
【００３６】
【化２９】
0006704196.tif 000030
【００３７】
上記式（７０）〜（７３）中、Ｒ1は式（２３）〜（２６）と同様である。なお、Ｒ1のアルキル基、アルケニル基、アルキニル基の具体例としては、未置換の又はハロゲン原子、水酸基、アミノ基、ニトロ基、カルボキシル基等で置換された炭素数１〜２０、好ましくは１〜１０、より好ましくは１〜４のアルキル基、未置換又はハロゲン原子、水酸基、アミノ基、ニトロ基、カルボキシ基等で置換された炭素原子２〜２０、好ましくは２〜１０、より好ましくは２〜４のアルケニル基、未置換又はハロゲン原子、水酸基、アミノ基、ニトロ基、カルボキシ基等で置換された炭素原子２〜２０、好ましくは２〜１０、より好ましくは２〜４のアルキニル基が挙げられる。
【００３８】
そして、式（１０−４）で表される化合物に、トリエチルアミン及び２−シアノエチルジイソプロピルクロロホスホロアミジドを加えることで、式（１１）で表される各種塩基が置換した化合物が得られる。
【００３９】
次に、上記式（１１）で表される化合物を用いて、式（１）で表される骨格を含む人工核酸のみで本発明のオリゴヌクレオチド（Ｌ−ａＴＮＡ）を合成する手順を以下に示す。
【化３０】
0006704196.tif 000031
【００４０】
先ず、核酸合成装置を用いた公知の合成手順により、式（１１）で表される化合物を（ｂ）に示す方向に合成することでＬ−ａＴＮＡを合成する。このようにして合成した化合物（ｂ）は、化合物（ｅ）と全く同じものである。つまり１’から３’方向に向かって１’−Ｂ１−Ｂ２−Ｂ３−３’という配列の化合物（ｅ）を合成する場合、式（１１）のモノマーを使用して、Ｂ３，Ｂ２，Ｂ１の順に合成すれば良い。得られる化合物（ｂ）、すなわち３’−Ｂ３−Ｂ２−Ｂ１−１’は、化合物（ｅ）と全く同じものであり、目的とする式（１）で表される骨格を含む人工核酸のみから構成されたオリゴヌクレオチドが合成できる。
【００４１】
次に、式（１）で表される骨格を含む人工核酸とリボース環又はデオキシリボース環を持つ核酸を結合させたオリゴヌクレオチドを、式（１１）のモノマーを用いて合成する手順を以下に示す。
【００４２】
【化３１】
0006704196.tif 000032
【００４３】
上記式（１１）で表される化合物と、市販されているデオキシリボース環の３’末端の水酸基がＤＭＴ等の保護基で保護された式（１２）で表される化合物を用い、核酸合成装置を用いた公知の合成手順により、矢印の方向に合成することで、（ｆ）及び（ｇ）に示すオリゴヌクレオチドを合成する。この状態では、（ｆ）及び（ｇ）中の点線で囲った部分のＮＨ及びメチル基は上記（e）あるいは式（１）と同様の立体構造である。こうすることで、ＮＨとメチル基の立体構造は図１（ｃ）に示す立体構造と同様であることから、天然のリボース環、デオキシリボース環を含むオリゴヌクレオチド中に人工核酸を組み込んでも、二重鎖を形成することができる。なおＲ’について、ＤＮＡ用のアミダイトモノマーの場合は、上記のＲ’の例示の中からＨを用いればよい。また、ＲＮＡ用のアミダイトモノマーの場合は−ＯＨ基に保護基が必要となることから、上記のＲ’の例示の中から、保護基の付いた置換基を用いればよい。以下の式（１４）の場合も同様である。
【００４４】
上記は、デオキシリボース環の３’側がＤＭＴで保護されたモノマーと式（１１）で表される化合物を用いた合成手順を示しているが、通常のＤＮＡあるいはＲＮＡ合成に用いられる５’側の水酸基がＤＭＴで保護されたモノマーと、３’側の２級水酸基が保護された式（１３）で表される化合物を用いても合成可能である。
【００４５】
【化３２】
0006704196.tif 000033
化合物（１５）と化合物（ｆ）、化合物（１６）と化合物（ｇ）は同じものである。
【００４６】
上記式（１）で表される骨格を含む人工核酸が、オリゴヌクレオチドの端部に位置する時は、端部部分は以下の式（１−ａ）、（１−ｂ）、（７−１）又は式（８−１）で表すことができる。
【００４７】
【化３３】
0006704196.tif 000034
【００４８】
（式（１−ａ）、（１−ｂ）、（７−１）及び（８−１）中、Ｙは下記式（１７）又は（１８）から選択される１種である。Ｂ、Ｒ、Ｘは前記と同様である。）
【化３４】
0006704196.tif 000035
【００４９】
上記Ｙについて、後述する実施例のとおり、人工核酸のみ、或いは、人工核酸及びリボース環又はデオキシリボース環を持つ核酸を用いてオリゴヌクレオチドを化学合成する場合、Ｙは通常“−Ｈ”になる。一方、酵素を用いて２つのオリゴヌクレオチドを繋げる場合、Ｙが“−ＰＯ32-”となる。例えば、式（１１）で表されるモノマーを使うと３’端から１’端に向かって合成することになり、１’端に−ＰＯ32-を導入する場合は、グレンリサーチ社から販売されているＣｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ  ＩＩ（ケミカル  ホスホリレーション  リエージェントII）を使用すればよい。また、式（１３）で表されるＬ−ａＴＮＡモノマーを使用する場合は、１’端から３’端に向かって合成することになり、上記と同じ試薬を使用し、３’末端に−ＰＯ32-を導入すればよい。
【００５０】
一方、式（１１）で表されるモノマーを使って３’末端にリン酸を導入する場合は、合成の最初にリン酸を導入する必要がある。この場合、あらかじめ末端がリン酸化されている固相担体を使用すればよい。具体的には、グレンリサーチ社から販売されている、３’−Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ＣＰＧ（３‘−ホスフェートＣＰＧ）を使用すればよい。また、式（１３）で表されるＬ−ａＴＮＡモノマーを使って１’末端にリン酸を導入する場合にも、３’−Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ＣＰＧを使用すればよい。
【００５１】
本発明のオリゴヌクレオチドは、標的とするＤＮＡ又はＲＮＡと二重鎖を形成できる範囲内であれば、各種変更をしてもよい。例えば、骨格中に色素を導入してもよい。また、ＬＮＡ、ＰＮＡ、ＳＮＡ等の人工核酸、又はメトキシエチル（ＭＯＥ）化、Ｏ−メチル化したＤＮＡ／ＲＮＡなどの人工核酸を、オリゴヌクレオチド中に含んでいてもよい。更に、ペプチド、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、糖鎖、コレステロール、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）などとの複合体としてもよい。
【００５２】
また、本発明のオリゴヌクレオチドは、標的とするＤＮＡ又はＲＮＡと完全に相補的な配列である必要は無く、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列のものであってもよい。ストリンジェントな条件下とは、一般的なハイブリダイズ条件をいい、例えば、ｐＨが５から８の間で塩化ナトリウム水溶液の濃度が１０−１０００ｍＭなど、本発明のオリゴヌクレオチドを標的とする核酸とハイブリダイズしたことを電圧や電流等の変化により検出できる条件である。
【００５３】
本発明のオリゴヌクレオチドは、従来のＳＮＡを用いた場合と比較して、二重鎖を形成する際の熱安定性を高めることができる。したがって、組み込む人工核酸の数を調整することで、熱安定性の調整を行うことができる。
【００５４】
本発明のオリゴヌクレオチドは、（１）標的とするＤＮＡ又はＲＮＡの５’から３’方向に対する配列が、Ｌ−ａＴＮＡでは１’から３’方向に相補的な配列を持つ場合、及び（２）標的とするＤＮＡ又はＲＮＡの５’から３’方向に対する配列が、リボース環又はデオキシリボース環と人工核酸を含むオリゴヌクレオチドでは３’から５’方向に相補的な配列を持つ場合に、本発明のオリゴヌクレオチドは標的とするＤＮＡ又はＲＮＡと二重鎖を形成することができる。したがって、本発明のオリゴヌクレオチドは、先ず、上記（１）及び（２）となるようにオリゴヌクレオチドの設計を行い、次いで、式（１１）で表される化合物のみ、あるいは式（１１）で表される化合物と式（１２）で表される化合物、または式（１３）で表される化合物と式（１４）で表される化合物のモノマーを組み合わせて合成を行えばよい。なお、後述する実施例では、二重鎖を形成できる配列の方向を「逆平行」と記載し、二重鎖を形成できない配列の方向、すなわち逆方向の配列を「平行」と記載している。
【００５５】
ところで、本発明者らは、（１）非環状リンカーのＤ−トレオニノールを“足場”に用いて光機能分子を導入した人工ヌクレオチド“トレオニノールヌクレオチド”（Ｔｈｒｅｏｎｉｎｏｌ−Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ：ＴＮ）を、核酸配列中に任意の数導入できること、（２）二重鎖の不安定化や配列特異性を損なわずに二重鎖内にＴＮをインターカレートできること、（３）ＴＮに光機能性分子を組み込むことで、可視光照射（λ＞４５０ｎｍ）で平面構造のｔｒａｎｓ体に異性化し、紫外光（４００ｎｍ＞λ＞３００ｎｍ）照射で非平面構造のｃｉｓ体に異性化するので、可視光照射で二重鎖を形成し紫外光照射では解離させることができる、つまり核酸の二重鎖形成と解離を光制御できること、を発表している。（Ｋａｍｉｙａ，  Ｙ．；  Ａｓａｎｕｍａ，  Ｈ．  Ａｃｃｏｕｎｔｓ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ２０１４，  ４７，  １６６３−１６７２、及び、Ａｓａｎｕｍａ，  Ｈ．；  Ｋａｓｈｉｄａ，  Ｈ．；  Ｋａｍｉｙａ，  Ｙ．，  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｃｏｒｄｓ，  ２０１４，  １４，  １０５５−１０６９、参照。）
【００５６】
後述する実施例のとおり、本発明の式（１）で表される骨格を含む人工核酸を含むオリゴヌクレオチドは、２’のＮＨ及び３’のメチル基の立体配置の違いにより、従来の人工核酸と比較してＤＮＡ及びＲＮＡとより強い二重鎖を形成することができ、二重鎖を形成した時の熱安定性が向上する。そのため、上記ＴＮに代え、式（１）の２’のＮＨ及び３’のメチル基の立体配置と同様の下記式（２７）で表される化合物を、核酸配列中に下記式（２８）又は（２９）で表される結合を含むように導入することで、核酸の光制御能をより向上することができる。
【００５７】
【化３５】
0006704196.tif 000036
（式（２７）中、Ｚは光機能性分子を表す。Ｘは、Ｏ（酸素）またはＳ（硫黄）である。）
【化３６】
0006704196.tif 000037
（式（２８）及び式（２９）中、Ｂ、Ｘ及びＲは上記と同様である。）
【００５８】
なお、本発明において「光機能性分子」とは、３００ｎｍより長波長側に吸収を持つ機能性色素（分子）を意味し、アゾベンゼン、蛍光色素、消光色素等が挙げられる。例えば、Ｚで表される光機能性分子として、以下の式（３０）〜（５１）で表される置換基が挙げられる。
【００５９】
【化３７】
0006704196.tif 000038
【００６０】
式（２７）で表される化合物を導入したオリゴヌクレオチドを用いて相補鎖を形成した場合、式（２７）で表される化合物は二重鎖を形成せず、ＤＮＡ又はＲＮＡが形成する二重鎖の間に導入される。オリゴヌクレオチド中への式（２７）で表される化合物の導入は、後述する実施例に示すとおり、（ｉ）二重鎖の片方の鎖のみに式（２７）で表される化合物を導入（ｗｅｄｇｅ型）、（ｉｉ）二重鎖の相対する位置に式（２７）で表される化合物を導入（ｄｉｍｅｒ型）、（ｉｉｉ）二重鎖の相対する位置に式（２７）で表される化合物を塊で導入（ｃｌｕｓｔｅｒ型）、等が挙げられるが、式（２７）で表される化合物を導入したオリゴヌクレオチドが二重鎖を形成できれば導入方法は特に制限は無い。なお、上記のとおり、式（２７）で表される化合物は二重鎖形成には寄与しないことから、オリゴヌクレオチド中の割合が５０％程度までとすることが好ましい。
【００６１】
また、式（２７）で表される化合物は、オリゴヌクレオチドの端部に導入してもよい。前記式（２７）で表される骨格を含む化合物がオリゴヌクレオチドの端部に位置する時、端部部分は式（２８−１）又は式（２９−１）で表される。なお、式中のＹ、Ｂ、Ｒ、Ｘは、式（７−１）及び（８−１）と同様である。式（２７）で表される化合物のオリゴヌクレオチド中への導入は、人工核酸と同様の手順で合成を行えばよい。
【００６２】
【化３８】
0006704196.tif 000039
【００６３】
ところで、オリゴヌクレオチド合成の原料として用いられる式（１３）で表されるアミダイトモノマー、及び式（２７）で表される骨格を含む化合物をオリゴヌクレオチド中に導入するためのアミダイトモノマーは、何れも新規の化合物である。以下の式（６０−１）及び（６０−２）で表される化合物は、本発明のオリゴヌクレオチドを合成するための原料として有用である。式（６０−１）で表される化合物は後述する実施例３、式（６０−２）で表される化合物は後述する実施例４の合成方法により合成することができる。
【００６４】
【化３９】
0006704196.tif 000040
【００６５】
上記式中、Ｚは、上記式（３０）〜（５１）、Ｂは（６６）〜（７３）で表される置換基から選択される１種である。
【００６６】
以下に実施例を掲げ、本発明を具体的に説明するが、この実施例は単に本発明の説明のため、その具体的な態様の参考のために提供されているものである。これらの例示は本発明の特定の具体的な態様を説明するためのものであるが、本願で開示する発明の範囲を限定したり、あるいは制限することを表すものではない。
【実施例】
【００６７】
＜実施例１＞
以下に示す手順により、２種類のＬ−ａＴＮＡモノマーのみを含むオリゴヌクレオチドの合成を行った。
［アミダイトモノマーの合成］
先ず、以下に示す手順により、各種塩基を有するアミダイトモノマーを合成した。
【化４０】
0006704196.tif 000041
【００６８】
Ｌ−Ｔｈｒｅｏｎｉｎｏｌに保護基ＤＭＴを置換した式１−１で表される化合物は、「アンゲヴァンテ・ケミー・インターナショナル・エディション（Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  ｃｈｅｍｉｅ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｅｄｉｔｉｏｎ）誌、２０１０年、４９巻、５５０２−５５０６頁」に記載の方法により合成した。
式１−２（Ｔ）で表される化合物は市販品を用いた。また、式１−２（BzＡ）で表される化合物は、「ジャーナルオブペプチドサイエンス（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）誌、２００１年、７巻、４０２−４１２頁」に記載の方法で合成した。式１−２（BzＣ）で表される化合物は、「ヌクレクイックアシッズリサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）誌、１９９８年、２６巻、２７３５−２７３９頁」に記載の方法で合成した。式１−２（iBuＧ）で表される化合物は、「ジャーナルオブケミカルソサエティパーキントランザクションズ１（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  １）誌、２０００年、１巻、１９−２６頁」に記載の方法で合成した。
【００６９】
二口フラスコに式１−１で表される化合物（１．４８ｇ、３．６ｍｍｏｌ）と式１−２（Ｔ）で表される化合物（０．８０ｇ、４．３ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（２．８ｍｌ）を入れ、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）約３０ｍｌに溶解させた。次にトリアジン系縮合剤（ＤＭＴ−ＭＭ；１．６０ｇ、５．８ｍｍｏｌ）を加え、２時間室温で攪拌し反応させた。反応終了後、クロロホルム７０ｍｌを加え、飽和重曹水及び飽和食塩水で分液した。有機層をエバポレーションした後、真空乾燥した。これをシリカゲルカラムトグラフィー（展開溶媒組成：クロロホルム：メタノール＝３０：１）で精製後、クロロホルム２０ｍｌに溶解させ、ヘキサン：ジエチルエーテル＝１：１溶液１００ｍＬに滴下し再沈殿し、濾過により式１−３（Ｔ）で表される化合物（１．８５ｇ：３．２２ｍｍｏｌ、収率８７％）を得た。同様の手法で合成を行い、式１−３（BzＡ）で表される化合物を収率７５％、式１−３（BzＣ）で表される化合物を収率８３％、及び式１−３（iBuＧ）で表される化合物を収率９１％で得た。
【００７０】
ナスフラスコに式１−３（Ｔ）で表される化合物（１．５ｇ、２．６ｍｍｏｌ）を入れ、窒素置換した後、脱水ジクロロメタン約２０ｍｌに溶解させトリエチルアミン１．９ｍＬを加えた。続いて氷浴上で２−シアノエチルジイソプロピルクロロホスホロアミジド（１．２ｍｌ、５．４ｍｍｏｌ）をゆっくり滴下し、攪拌した。約２０分反応させた後、酢酸エチル約６０ｍｌを加え、飽和重曹水及び飽和食塩水で分液を行った。有機層をエバポレーションした後、シリカゲルカラムトグラフィー（展開溶媒組成：ヘキサン：酢酸エチル：トリエチルアミン＝２０：９０：３）で精製し、式１−４（Ｔ）で表される化合物（１．３７ｇ：１．７７ｍｍｏｌ、収率６８％）を得た。同様の手法で合成を行い、式１−４（BzＡ）で表される化合物を収率５７％、式１−４（BzＣ）で表される化合物を収率５２％、及び式１−４（iBuＧ）で表される化合物を収率６８％で得た。
【００７１】
［Ｌ−ａＴＮＡモノマーのみを含むオリゴヌクレオチドの合成］
次に、合成した式１−４（Ｔ）、式１−４（BzＡ）、式１−４（BzＣ）、及び式１−４（iBuＧ）で表される化合物を用い、「米国化学会誌（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ）、２０１０年、１３２巻、１４７０２−１４７０３頁」に記載の方法により、本発明のオリゴヌクレオチドの合成を行った。図２に、合成した“Ｌ−ａＴＮ８ａ”及び“Ｌ−ａＴＮ８ｂ”の配列及び合成方向を示す。
【００７２】
〔Ｌ−ａＴＮＡモノマーのみを含むオリゴヌクレオチドの二重鎖安定性評価〕
次に、合成した“Ｌ−ａＴＮ８ａ”及び“Ｌ−ａＴＮ８ｂ”と、当該配列に対応する図２に示すＤＮＡ（ＤＮ８ａ、ＤＮ８ｂ、ＤＮ８ｃ、ＤＮ８ｄ）及びＲＮＡ（ＲＮ８ａ、ＲＮ８ｂ、ＲＮ８ｃ、ＲＮ８ｄ）とで組合せを形成し、当該組合せの融解温度を調べることでＬ−ａＴＮＡの二重鎖安定性評価を行った。なお、上記ＤＮＡ及びＲＮＡはＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社から購入し、比較対象であるＤ−ａＴＮＡ（Ｄ−ａＴＮ８ａ、Ｄ−ａＴＮ８ｂ）は非特許文献２（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ誌、２０１０年、１３２巻、１４７０２頁−１４７０３頁）、ＳＮＡ配列（ＳＮ８ｃ、ＳＮ８ｄ）は非特許文献４（Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ誌、２０１１年、５０巻、１２８５頁−１２８８頁）に記載さている方法で合成した。
【００７３】
［融解温度の測定］
図２に示すオリゴヌクレオチドの中から、Ｌ−ａＴＮ８ａと逆平行であるＤＮ８ｃ、ＲＮ８ｃ、及びＬ−ａＴＮ８ａと平行方向であるＤＮ８ｂ、ＲＮ８ｂを選択し、Ｌ−ａＴＮ８ａ／ＤＮ８ｃ、Ｌ−ａＴＮ８ａ／ＲＮ８ｃ、Ｌ−ａＴＮ８ａ／ＤＮ８ｂ、及びＬ−ａＴＮ８ａ／ＲＮ８ｂの組み合わせを形成した。測定試料は、前記組み合わせたオリゴヌクレオチドが２μＭ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．０）となるように調整した。融解温度測定には島津製作所製Ｔｍ解析システムを用い、相対吸光度による融解曲線を測定した。
【００７４】
図３は、測定した融解曲線を示すグラフである。図３から明らかなように、Ｌ−ａＴＮ８ａ／ＤＮ８ｃはシグモイド型の曲線が得られ、融解温度は２８．４℃と算出された。従って、Ｌ−ａＴＮＡは相補配列を持つＤＮＡと逆平行型二重鎖を形成することがわかった。また、同様にＬ−ａＴＮ８ａ／ＲＮ８ｃの融解温度は４１．０℃であり、Ｌ−ａＴＮＡは相補的なＲＮＡとも逆平行型二重鎖を形成した。一方、Ｌ−ａＴＮ８ａ／ＤＮ８ｂ及びＬ−ａＴＮ／ＲＮ８ｂの組み合わせは融解温度を示さなかったことから、Ｌ−ａＴＮＡは相補的ＤＮＡやＲＮＡと平行型二重鎖を形成しないことがわかった。
【００７５】
更に図３に示す組み合わせに加え、比較のため、下記表１の示すオリゴヌクレオチドの組み合わせについても、上記と同様の手順で融解温度を調べた。なお、表１中、「融解温度」欄の“−”は二重鎖を形成しないことを表す。
【００７６】
【表１】
0006704196.tif 000042
【００７７】
上記表１から明らかなように、Ｌ−ａＴＮ８ａ／ＤＮ８ｃと同様の配列を持つＳＮＡ／ＤＮＡ二重鎖（ＳＮ８ｄ／ＤＮ８ｃ）の融解温度は２３．５℃で、Ｌ−ａＴＮ８ａ／ＤＮ８ｃと比較し約５℃不安定であった。また、ＳＮＡ／ＲＮＡ二重鎖（ＳＮ８ｄ／ＲＮ８ｃ）の融解温度は３５．０℃で、Ｌ−ａＴＮ８ａ／ＲＮ８ｃより融解温度が６℃低いことが分かった。更にＤ−ａＴＮＡについても同様の測定を行ったところ、Ｄ−ａＴＮＡはＤＮＡ、ＲＮＡのいずれとも二重鎖を形成しないことを確認した。以上のことから、Ｌ−ａＴＮＡは相補的なＤＮＡ及びＲＮＡと二重鎖を形成可能であり、その安定性はＳＮＡよりも高いことが明らかとなった。
【００７８】
＜実施例２＞
次に、実施例１と同様の手順で１５ｍｅｒのＬ−ａＴＮＡを合成し、二重鎖安定性評価を行った。図４は、合成した“Ｌ−ａＴＮ１５ａ”、及び対応するＤＮＡ、ＲＮＡ、ＳＮＡの配列及び合成方向を示している。また、表２はオリゴヌクレオチドの組み合わせと融解温度を示している。
【００７９】
【表２】
0006704196.tif 000043
【００８０】
表２から明らかなように、１５ｍｅｒの配列を持つＬ−ａＴＮＡについても相補配列を持つＤＮＡ及びＲＮＡとの融解曲線において融解温度が算出された。その結果、Ｌ−ａＴＮＡはこれらと極めて安定な逆平行型二重鎖を形成し、その融解温度はＳＮＡよりも高いことが明らかとなった。すなわち、Ｌ−ａＴＮＡは１５ｍｅｒの配列であってもＤＮＡ、ＲＮＡと安定な二重鎖を形成可能であることが分かった。
【００８１】
更に、Ｌ−ａＴＮ８ａ／ＤＮ８ｃの融解温度が２８．４℃であるのに対して、配列を長くしたＬ−ａＴＮ１５ａ／ＤＮ１５ｃの融解温度は４３．７℃と高くなっていた。同様に、Ｌ−ａＴＮ８ａ／ＲＮ８ｃの融解温度が４１．０℃であるのに対して、配列を長くしたＬ−ａＴＮ１５ａ／ＲＮ１５ｃの融解温度は５１．５℃と高くなっていた。これは、Ｌ−ａＴＮＡが長くなるほど、ＤＮＡ又はＲＮＡと水素結合する分子数が多くなったためである。したがって、例えば、核酸中に式（１）で表わされる骨格を組み込む際にも、組み込む骨格の数に応じて融解温度の調整をすることができる。
【００８２】
［ｉＬ−Ｔｈｒｅｏｎｉｎｏｌ−ａｚｏｂｅｎｚｅｎｅ導入オリゴヌクレオチドの合成］
＜実施例３＞
上記実施例１及び２に示すとおり、式（１）で表される骨格を含む人工核酸を含むオリゴヌクレオチドは熱安定性が向上したことから、式（１）の２’のＮＨ及び３’のメチル基の立体配置と同様の骨格に、塩基に代え光機能性分子を導入した化合物を含むオリゴヌクレオチドを合成し、オリゴヌクレオチドの光制御について調べた。なお、式（１）の２’のＮＨ及び３’のメチル基と同様の立体配置となるようにＬ−Ｔｈｒｅｏｎｉｎｏｌ−ａｚｏｂｅｎｚｅｎｅをＤＮＡ又はＲＮＡに導入したオリゴヌクレオチドには、“ｉ”を付してある。
【００８３】
［ｉＬ−Ｔｈｒｅｏｎｉｎｏｌ−ａｚｏｂｅｎｚｅｎｅ導入オリゴヌクレオチドに対応するアミダイトモノマーの合成］
アミダイトモノマーは、以下のスキームに従い合成した。
【００８４】
【化４１】
0006704196.tif 000044
【００８５】
（ａ）ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）保護
Ｌ−Ｔｈｒｅｏｎｉｎｏｌ  ｍｅｔｈｙｌ  ｅｓｔｅｒ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ化合物２−１  １３ｇ（７６．６ｍｍｏｌ）をフラスコに入れ、ＭｅＯＨ  １００ｍｌに溶かし、Ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ  １４ｍｌを加えた。氷浴上でＥｔｈｙｌ  Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔａｔｅ  １２ｍｌ（１０１ｍｍｏｌ）を滴下し、３０ｍｉｎ撹拌した後、室温で１ｈ撹拌した。アセトン１００ｍｌ＋ジエチルエーテル１００ｍｌに懸濁させ、氷浴で冷やし、ろ過により固体を除去して減圧濃縮・真空乾燥し、アセトニトリル共沸を行い、化合物２−２（２４ｇ、収率ｑｕａｎｔ．）を得た。
【００８６】
（ｂ）ＤＭＴ保護、（ｃ）還元反応
二口フラスコに化合物２−２  ２４ｇ（７６．６ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ  １．８５ｇ（１５．１ｍｍｏｌ）を入れて窒素置換し、ｄｒｙ  ｐｙｒｉｄｉｎｅ  ６０ｍｌ、ＤＩＰＥＡ  １５ｍｌを加え溶かした。ＤＭＴ−Ｃｌ  ２５ｇ（７３．８ｍｍｏｌ）を加えて６５℃で終夜撹拌した。その後減圧濃縮し、酢酸エチル２００ｍｌを加え、蒸留水、２％クエン酸水溶液、飽和重曹水、飽和食塩水で順次有機層を洗い、減圧濃縮・真空乾燥した。得られた化合物２−３を含む粘性液体をＴＨＦ  ５０ｍｌに溶かした。別の容器にＬｉＣｌ  ３．２ｇ（７５．５ｍｍｏｌ）をとり、ＭｅＯＨ  １０ｍｌに溶かして冷やしてから氷浴上で反応容器に加えた。これを５回繰り返した（計３７７ｍｍｏｌ）。別の容器でＮａＢＨ４  ２．２ｇ（５８．２ｍｍｏｌ）をとり、ＭｅＯＨ  １０ｍｌ程度で溶かし、室温で反応容器に加えた。反応溶液が高温になった場合は氷浴で適度に冷やした。これを７回繰り返した（計４０７ｍｍｏｌ）。２ｈ反応させた後、飽和重曹水１５０ｍｌと水１５０ｍｌを加えて５ｍｉｎ撹拌した。クロロホルムで分液抽出し、有機層を回収して硫酸マグネシウムで乾燥、ろ過した後、減圧濃縮・真空乾燥した。これをシリカゲルクロマトグラフィー（酢エチ／ＴＥＡ３％→クロロホルム：メタノール＝３０：１／ＴＥＡ３％→クロロホルム：メタノール＝２０：１／ＴＥＡ３％）で精製した。アセトニトリル及びジエチルエーテルで共沸し、減圧濃縮・真空乾燥し化合物２−４（７．８９ｇ：１９．４ｍｍｏｌ，収率２５％）を得た。
【００８７】
（ｄ）Ａｚｏｂｅｎｚｅｎｅとの縮合
フラスコに化合物２−４（１．００ｇ，２．５ｍｍｏｌ）、４−フェニルアゾ安息香酸（０．７０ｇ，３．１ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（１．５ｍｌ）を入れ、ＤＭＦ約１０ｍｌに溶解させた。次にＤＭＴ−ＭＭ（１．０５ｇ，３．８ｍｍｏｌ）を加え、１時間室温で攪拌し反応させた。反応終了後、クロロホルム１０ｍｌを加え３０ｍｉｎ撹拌した後、過剰量の酢酸エチルを加え、飽和重曹水及び飽和食塩水で分液抽出した。有機層を減圧濃縮、真空乾燥し、シリカゲルカラムトグラフィー（展開溶媒：ヘキサン・酢酸エチル）で精製し、化合物２−５（１．０３ｇ：１．７ｍｍｏｌ，収率６８％）を得た。
【００８８】
（ｅ）アミダイト化
二口フラスコに化合物２−５（０．９０ｇ，１．５ｍｍｏｌ）を入れ、窒素置換した後、脱水ジクロロメタン約１０ｍｌに溶解させトリエチルアミン１．２ｍｌを加えた。続いて氷浴上で２−シアノエチルジイソプロピルクロロホスホロアミジト（０．７ｍｌ，２．２ｍｍｏｌ）を滴下し、攪拌した。約２０分反応させた後、酢酸エチル約６０ｍｌを加え、飽和重曹水及び飽和食塩水で分液を行った。有機層を減圧濃縮した後、シリカゲルカラムトグラフィー（展開溶媒：ヘキサン・酢酸エチル  トリエチルアミン３％）で精製し、化合物２−６（０．６３ｇ：０．７７ｍｍｏｌ，収率５１％）を得た。
【００８９】
［ｉＬ−Ｔｈｒｅｏｎｉｎｏｌ−ａｚｏｂｅｎｚｅｎｅ導入オリゴヌクレオチドの二重鎖安定性評価］
ｉＬ−Ｔｈｒｅｏｎｉｎｏｌ−ａｚｏｂｅｎｚｅｎｅ（ＸｉＬＴ）導入オリゴヌクレオチドは、ネイチャー・プロトコルズ誌（Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）、２００７年、第２巻、２０３−２１２頁に記載の方法により合成した。次いで、合成したオリゴヌクレオチドの融解温度を測定し、二重鎖安定性を評価した。合成したｉＬ−Ｔｈｒｅｏｎｉｎｏｌ−ａｚｏｂｅｎｚｅｎｅ導入オリゴヌクレオチドの配列（Ｘ−１Ａ，Ｘ−１１１Ａ，Ｘ−３Ａ，Ｘ−１Ｂ，Ｘ−１１１Ｂ，Ｘ−３Ｂ；Ｘ＝ＸｉＬＴ）を以下に示す。配列中のＸには、式（ＸｉＬＴ）で表わされる化合物が含まれている。
【００９０】
0006704196.tif 000045
【００９１】
【化４２】
0006704196.tif 000046
【００９２】
また、比較のため、上記配列中のＸの位置に、上記式（ＸｉＬＴ）で表される化合物に代え、下記式（ＸＳ）で表されるＳｅｒｉｎｏｌ−ａｚｏｂｅｎｚｅｎｅ及び下記式（ＸＤＴ）で表されるＤ−Ｔｈｒｅｏｎｉｎｏｌ−ａｚｏｂｅｎｚｅｎｅを同じ位置に導入した配列も合成した。ＸＤＴはネイチャー・プロトコルズ誌（Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）、２００７年、第２巻、２０３−２１２頁に記載されている方法、ＸsはＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ，２０１５，１６，１２９８−１３０１に記載された方法に準じて合成した。
【００９３】
【化４３】
0006704196.tif 000047
【００９４】
二重鎖安定性の評価は、実施例１と同様の手順で行った。
【００９５】
まず、Ｘを付加的に導入（ｗｅｄｇｅ型）したＤＮＡで比較した結果を下記表３に示す。Ｘ−１Ａ／Ｓ０配列の二重鎖の融解温度を測定した結果、従来のＸＤＴ導入オリゴヌクレオチドに対し、ＸｉＬＴ導入オリゴヌクレオチドは可視光照射後の融解温度が安定化（５０．２℃）し、紫外光照射後の融解温度が低下（３９．９℃）した。その結果、従来のＸＤＴ導入オリゴヌクレオチドに比べ４℃程度も高い光制御能を示した（−１０．３℃）。同様に、１１１Ａ／Ｓ０においても５℃近く光制御能が向上した。また、ＸＳ導入オリゴヌクレオチドと比べても明らかに高い光制御能を有していることが示された。以上のように、アゾベンゼンをオリゴヌクレオチドに付加的に導入する場合、ＸｉＬＴはＸＳ及びＸＤＴに比べてｔｒａｎｓ体で二重鎖をより安定化、ｃｉｓ体でより不安定化させるため、高い光制御能を付与できることが明らかとなった。
【００９６】
【表３】
0006704196.tif 000048
【００９７】
次に、ｄｉｍｅｒ型で導入した場合を比較した結果を下記表４に示す。Ｘ−１Ａ／Ｘ−１ＢではＸｉＬＴの方がＸＤＴに比べ可視光照射後の融解温度が若干低下（５０．８℃）したものの、紫外光照射後の融解温度がそれ以上に低下（３８．２℃）し、光制御能としては高い値となった。Ｘ−１１１Ａ／Ｘ−１１１Ｂでも同様の傾向が見られた。
【００９８】
【表４】
0006704196.tif 000049
【００９９】
次に、ｃｌｕｓｔｅｒ型で導入した場合を比較した結果を下記表５に示す。ｄｉｍｅｒ型と同様、ＸｉＬＴの方がＸＤＴに比べ可視光照射後の融解温度が若干低下（５４．３℃）したものの、紫外光照射後の融解温度がそれ以上に低下（３９．６℃）し、光制御能としては高い値（−１４．７℃）となった。従って、アゾベンゼンをｄｉｍｅｒ型またはｃｌｕｓｔｅｒ型で導入する場合、ＸｉＬＴはＸＳ及びＸＤＴに比べてｃｉｓ体で二重鎖を不安定化する効果により、高い光制御能を付与できることが示された。
以上のように、アゾベンゼンをオリゴヌクレオチドに導入する場合、ＸＳやＸＤＴではなく、ＸｉＬＴで導入すると最も高い光制御能を示すことが明らかとなった。また、ｉＬ−Ｔｈｒｅｏｎｉｎｏｌは、付加的に色素を導入するのに最も適したリンカーであることが示された。
【０１００】
【表５】
0006704196.tif 000050
【０１０１】
＜実施例４＞
実施例１及び２は、式（１１）で表されるアミダイトモノマーのみを用いてオリゴヌクレオチドを合成したが、次に、式（１３）で表されるアミダイトモノマーと核酸を用いてオリゴヌクレオチドの合成を行った。
【０１０２】
［ｉＬ−ａＴＮＡ導入オリゴヌクレオチドに対応するアミダイトモノマーの合成］
各核酸塩基を有するアミダイトモノマーは、以下の手順に従い合成した。
【０１０３】
【化４４】
0006704196.tif 000051
【０１０４】
化合物３−１は実施例３に記載の方法により合成した。また、化合物３−２（ＢｚＡ），３−２（ＢｚＣ）及び３−２（ｉＢｕＧ）はそれぞれジャーナルオブペプチドサイエンス（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）誌２００１年７巻４０２−４１２頁、ヌレクイックアシッズリサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）誌１９９８年２６巻２７３５−２７３９頁及びジャーナルオブケミカルソサエティパーキントランザクションズ１（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  １）誌２０００年１巻１９−２６頁にそれぞれ記載の方法で合成した。フラスコに化合物３−１（１．６３ｇ，４．０ｍｍｏｌ）と化合物３−２（ＢｚＣ）（１．３１ｇ，４．８ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（２．８ｍｌ）を入れ、ＤＭＦ約３０ｍｌに溶解させた。次にＤＭＴ−ＭＭ（１．６０ｇ，５．８ｍｍｏｌ）を加え、２時間室温で攪拌し反応させた。反応終了後、クロロホルム３０ｍｌを加え３０ｍｉｎ撹拌した。クロロホルムで希釈し、飽和重曹水及び飽和食塩水で分液した。有機層を減圧濃縮、真空乾燥した。これをシリカゲルカラムトグラフィー（展開溶媒組成：クロロホルム：メタノール＝３０：１）で精製後、クロロホルム２０ｍｌに溶解させ、ジエチルエーテル１００ｍＬに滴下し再沈殿し、濾過により化合物３−３（ＢｚＣ）（１．２７ｇ：１．９１ｍｍｏｌ，収率４８％）を得た。同様の手法で化合物３−３（ＢｚＡ），３−３（Ｔ）及び３−３（ｉＢｕＧ）をそれぞれ収率４５％、９３％及び６０％で得た。
【０１０５】
ナスフラスコに化合物３−３（Ｔ）（０．８０ｇ，１．２ｍｍｏｌ）を入れ、窒素置換した後、脱水ジクロロメタン約１０ｍｌに溶解させトリエチルアミン０．８２ｍＬを加えた。続いて氷浴上で２−シアノエチルジイソプロピルクロロホスホロアミジト（０．５０ｍｌ，２．４ｍｍｏｌ）を滴下し、攪拌した。約２０分反応させた後、酢酸エチル約６０ｍｌを加え、飽和重曹水及び飽和食塩水で分液を行った。有機層をエバポレーションした後、シリカゲルカラムトグラフィー（展開溶媒組成：ヘキサン：酢酸エチル：トリエチルアミン＝２０：９０：３）で精製し、化合物３−４（Ｔ）（０．７４ｇ：０．９１ｍｍｏｌ，収率７６％）を得た。同様の手法で化合物３−４（ＢｚＡ），３−４（ＢｚＣ）及び３−４（ｉＢｕＧ）をそれぞれ収率３７％、６７％及び７２％で得た。
【０１０６】
ｉＬ−ａＴＮＡを含むオリゴマヌクレオチドの合成は米国化学会誌（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ）２０１０年１３２巻１４７０２−１４７０３頁記載の方法により行った。
【０１０７】
［ｉＬ−ａＴＮＡ導入オリゴヌクレオチドの二重鎖安定性の評価］
ｉＬ−ａＴＮＡ導入オリゴヌクレオチドの融解温度を測定し、ＲＮＡとの二重鎖安定性を評価した。合成したｉＬ−ａＴＮＡ導入オリゴヌクレオチドの配列（Ｌｃ６４７３−ｉＬ１−１，Ｌｃ６４７３−ｉＬ２−２，Ｌｃ６４７３−ｉＬ３−３）を以下に示す。また、比較のため、以下に示すＳＮＡを同じ位置に導入した配列（Ｌｃ６４７３−Ｓ１−１，Ｌｃ６４７３−Ｓ２−２，Ｌｃ６４７３−Ｓ３−３）も合成した。
【０１０８】
0006704196.tif 000052
【０１０９】
0006704196.tif 000053
【０１１０】
［融解温度の測定］
溶融温度の測定は、実施例１と同様の手順で行った。
【０１１１】
融解温度を測定した結果を下記表６に示す。ＳＮＡでは導入数の増加に伴い二重鎖が不安定化していたが、ｉＬ−ａＴＮＡ導入オリゴヌクレオチドの場合、導入に伴う融解温度の減少が抑制された（ｉＬ１−１：＋０．２℃、ｉＬ２−２：＋０．２℃、ｉＬ３−３：＋１．７℃）。これは設計通り、ｉＬ−ａＴＮＡ導入オリゴヌクレオチドの１’のメチル基が適切な剛直性を誘発し、ＳＮＡに比べ二重鎖形成時のエントロピーロスが減少したためであると考えられる。以上の結果からオリゴヌクレオチドに人工核酸を導入する場合、ｉＬ−ａＴＮＡはＳＮＡに比べ二重鎖を不安定化しにくいことが明らかとなった。
【０１１２】
【表６】
0006704196.tif 000054
【産業上の利用可能性】
【０１１３】
本発明の人工核酸を含むオリゴヌクレオチドは、標的となるＤＮＡ又はＲＮＡを配列特異的に認識して二重鎖を形成でき、更に、従来の人工核酸を用いたオリゴヌクレオチドより熱安定性が向上する。したがって、医薬や診断薬等の用途に適用できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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