(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つのヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）連結（Ｊ）領域遺伝子、Ｉｇ定常領域遺伝子、及びラット３’エンハンサーを含むキメラポリヌクレオチドであって、前記ラット３’エンハンサーが配列番号１として記載される配列を含むキメラポリヌクレオチド。
【請求項２】
少なくとも１つのヒトＩｇ可変（Ｖ）領域遺伝子及び／又はヒトＩｇ多様性（Ｄ）領域遺伝子を更に含む、請求項１に記載のキメラポリヌクレオチド。
【請求項３】
前記定常領域遺伝子が、ヒト定常領域遺伝子及びラット定常領域遺伝子からなる群から選択される、請求項１又は２に記載のキメラポリヌクレオチド。
【請求項４】
前記定常領域遺伝子が、ラット定常領域遺伝子を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載のキメラポリヌクレオチド。
【請求項５】
前記定常領域遺伝子が、Ｃμ及びＣγからなる群から選択される定常領域遺伝子を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載のキメラポリヌクレオチド。
【請求項６】
細菌人工染色体（ＢＡＣ）アナベル（配列番号１０）に少なくとも９０％同一である人工Ｉｇ遺伝子座を含む核酸を含み、ここで、前記人工Ｉｇ遺伝子座が、機能性であり、再配置され得て、又は前記人工Ｉｇ遺伝子座が、再配置されかつ重鎖可変ドメインをコードする完全なエクソンを形成するＶ−Ｄ−Ｊ領域を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載のキメラポリヌクレオチド。
【請求項７】
前記ヒトＩｇ  Ｖ領域が、ＢＡＣ６−ＶＨ３−１１及び／又はＢＡＣ３から単離可能な少なくとも１つのヒトＶ領域遺伝子を含む、請求項２〜６のいずれか１項に記載のキメラポリヌクレオチド。
【請求項８】
核酸配列（ａ）及び（ｂ）：
（ａ）ＢＡＣ６−ＶＨ３−１１及び／又はＢＡＣ３から単離可能な自然構成のヒトＶ領域遺伝子を含むヒトＩｇ可変領域；及び
（ｂ）前記細菌人工染色体（ＢＡＣ）アナベル（配列番号１０）から単離可能な自然構成のヒトＪ領域遺伝子を含むヒトＩｇ連結領域
を５’から３’の順に含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載のキメラポリヌクレオチド。
【請求項９】
核酸配列（ａ）〜（ｅ）：
（ａ）ヒトＩｇ可変領域；
（ｂ）ヒトＩｇ多様性領域；
（ｃ）ヒトＩｇ連結領域；
（ｄ）Ｉｇ定常領域；及び
（ｅ）配列番号１として記載される配列を含むラット３’エンハンサー
を５’から３’の順に含む、請求項２〜８のいずれか１項に記載のキメラポリヌクレオチド。
【請求項１０】
配列番号２として記載される核酸配列に少なくとも９０％同一である核酸配列を含み、ここで、前記核酸が、人工Ｉｇ遺伝子座を含み、前記人工Ｉｇ遺伝子座が、機能性であり、再配置され得て、又は前記人工Ｉｇ遺伝子座が、再配置されかつ重鎖可変ドメインをコードする完全なエクソンを形成するＶ−Ｄ−Ｊ領域を含む、請求項９に記載のキメラポリヌクレオチド。
【請求項１１】
配列番号１１として記載される核酸配列に少なくとも９０％同一である核酸配列を含み、ここで、前記核酸が、人工Ｉｇ遺伝子座を含み、前記人工Ｉｇ遺伝子座が、機能性であり、再配置され得て、又は前記人工Ｉｇ遺伝子座が、再配置されかつ重鎖可変ドメインをコードする完全なエクソンを形成するＶ−Ｄ−Ｊ領域を含む、請求項９に記載のキメラポリヌクレオチド。
【請求項１２】
前記Ｖ−Ｄ−Ｊ領域が、再配置され、重鎖可変ドメインをコードする完全なエクソンを形成する、請求項２〜１１のいずれか１項に記載のキメラポリヌクレオチド。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載のキメラポリヌクレオチドを含む、げっ歯類細胞。
【請求項１４】
Ｖ、Ｊ、及び定常領域遺伝子と、配列番号６及び配列番号７からなる群から選択される核酸配列に少なくとも９０％同一である核酸配列とを含む、機能性免疫グロブリンをコードするポリヌクレオチドを含む、請求項１３に記載のげっ歯類細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１２年１２月１４日に出願された米国仮特許出願第６１／７３７，３７１号に対する優先権を主張する。本出願は、その全体が参照により本明細書に明確に組み込まれる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、げっ歯類におけるヒトイディオタイプを有する免疫グロブリンの産生に有用なポリヌクレオチド、特にキメラポリヌクレオチドに関する。本発明は更に、そのようなポリヌクレオチドを含むげっ歯類細胞に関する。
【０００３】
配列表への参照
２０１２年１２月１２日に作成された「１８９３１４−ＵＳ ＳＴ２５．ｔｘｔ」という名称のｔｘｔファイル（サイズ３ＭＢ）として、配列表が本特許文書において提供される。このファイルの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００４】
ヒトモノクローナル抗体は、ＩｇＧとして従来のサイズ、単鎖、又はドメインモジュールのいずれかとして、治療的用途において非常に有益であることが証明されている１、２。その成功にも関わらず、利用可能なヒト材料の特異性選択及びその後の個別の産物の修飾、又は利用が限られたトランスジェニック動物、主にマウスの免疫化のいずれかに依存する、それらの産生において大きな欠点が依然として存在する３。トランスジェニックマウス、ならびにウシなどの大型のトランスジェニック動物の使用に対して標的抗原の制約が広く存在し、新たな特異性の開発は企業によって管理される４〜７。
【０００５】
トランスジェニックマウスにおけるヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子のＤＮＡ再配置及び発現は、重鎖遺伝子を生殖系列構成内に安定的に挿入することによって、２０年以上前に新規に開発された８。ヒト抗体レパートリはこれらの初期動物において得られたものの、より高い発現レベル及びヒトＩｇの排他的な産生につながる主要な改良は、２つの新たな計画、すなわち、胚幹（ＥＳ）細胞における遺伝子ノックアウト９、及び人工染色体上における遺伝子座伸長１０を組み合わせた。
【０００６】
ＥＳ細胞における遺伝子標的法による内因性Ｉｇ遺伝子のサイレンシングは、それらのＩｇＨ及びＩｇ遺伝子座を再配置する能力を有さない、又は完全機能性ＩｇＨ、Ｉｇ、又はＩｇ産物を産生しない、いくつかの不活性マウス系列を産生した（３に要約）。より最近になって、Ｉｇ遺伝子における部位特異的二本鎖切断を生成するためのジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）が設計され、欠失及び非相同ＤＮＡ修復によって遺伝子攪乱を可能とした。ＺＦＮプラスミドの受精卵への注入は、ＩｇＨ及びＩｇＬ攪乱を有するＩｇサイレンシングされたラット及びウサギを産生した１１〜１３。
【０００７】
抗体の効率的発現は、免疫グロブリン遺伝子座内の様々な位置における機能性制御要素を必要とする。エンハンサー配列は、ヌクレアーゼ消化及び分解に対する過敏性によって、多くの活性遺伝子の近くで特定されている。過敏部位はプロモーター配列に先行し得、それらの活性の強度はＤＮＡ配列と相関した。レポーター遺伝子への連結は、エンハンサー機能が存在する場合に転写の上昇を示した（Ｍｕｎｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，，１６６，３３１５［２００１］）。ＩｇＨ遺伝子座において、２つの重要な転写又は発現制御、すなわち、遺伝子座の末端でＥμ及び３’Ｅが特定されている（Ｐｅｔｔｅｒｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４４，１６５［１９９０］）。マウスにおいて、全３’制御領域（ｈｓ３ａ、ｈｓ１，２、ｈｓ３ｂ、及びｈｓ４を含む）の除去は、正常な初期Ｂ細胞発達を可能にするが、クラススイッチ組み換えを無効にし（Ｖｉｎｃｅｎｔ−Ｆａｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１１６，１８９５［２０１０］）、体細胞超変異の最適化を阻止する可能性がある（Ｐｒｕｚｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，１，［２０１１］）。
【０００８】
最適なアイソタイプ発現を達成する制御機能は、トランスジェニックヒトＩｇＨ遺伝子が使用されている際に特に望ましい。しかしながら、いくつかの研究室において、典型的にｈｓ１，２要素のみを提供する不完全な３’Ｅ領域を有するトランス遺伝子構築物は、内因性ＩｇＨ遺伝子座がノックアウトされたときでさえもトランスジェニックマウスにおける期待はずれの発現レベルにつながった。これは、遺伝子操作されたマウス由来の抗原特異的完全ヒトＩｇＧの生成が、これまで非効率的であった１つの理由であり得る。（Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８，８５６［１９９４］、Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６３，６８９８［１９９９］、Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  Ｒｅｖ．１８，４２１［１９９９］、Ｐｒｕｚｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，１，［２０１１］）。
【０００９】
ラットにおいて、３’Ｅ領域は、十分に分析されていない。マウス及びラット配列の比較は、ｈｓ４、すなわち、追加の重要な制御配列を更に下流に有する、非常に重要な第４のＥ要素の特定を可能にしない（Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８６，２９３０３［２０１１］）。これは、この領域がラット内には存在せず、おそらくマウス内でほど重要ではないことを意味し得るか、又は分析されたラットゲノム配列内に不在であった可能性もある。
【００１０】
幅広い範囲の疾患区域におけるヒトの治療のために有用な、トランスジェニック動物を使用する、ヒトイディオタイプを有する免疫グロブリン又は抗体の最適な産生のための方法及び材料が依然必要とされる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
トランスジェニック動物の作成における使用のためのキメラ免疫グロブリン鎖、特にキメラ重鎖をコードする核酸配列を含む、新規のポリヌクレオチドが本明細書に開示される。３’エンハンサーを欠くトランス遺伝子座は、欠陥的アイソタイプスイッチ及び低ＩｇＧ発現につながるため、本発明のポリヌクレオチドは、少なくとも一部は３’エンハンサーの包含による最適な発現を有利に提供する。したがって、好適な実施形態において、本発明は、ラット３’エンハンサー配列、Ｉｇ定常領域遺伝子、及び少なくとも１つのヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）連結（Ｊ）領域遺伝子を含む、キメラポリヌクレオチドを提供する。好適な一実施形態において、ラット３’エンハンサー配列は、配列番号１として記載される配列、又はその一部を含む。
【００１２】
本明細書に説明されるキメラポリヌクレオチドは、少なくとも１つのヒト可変（Ｖ）遺伝子、少なくとも１つの多様性（Ｄ）遺伝子、又はこれらの組み合わせを更に含み得る。一実施形態において、キメラポリヌクレオチドの定常領域遺伝子は、ヒト定常領域遺伝子及びラット定常領域遺伝子からなる群から選択される。好適な一実施形態において、定常領域遺伝子は、ラット定常領域遺伝子である。別の好適な実施形態において、定常領域遺伝子は、Ｃμ及びＣγからなる群から選択される。
【００１３】
一実施形態において、キメラポリヌクレオチドは、本明細書に開示される細菌人工染色体（ＢＡＣ）アナベル（例えば、配列番号１０）、又はその一部に実質的に相同な核酸配列を含み、ＢＡＣ６−ＶＨ３−１１及びＢＡＣ３から単離可能な少なくとも１つのヒト可変Ｉｇ遺伝子を任意で更に含み得る。好適な一実施形態において、本明細書で企図されるキメラポリヌクレオチドは、核酸配列（ａ）及び（ｂ）、すなわち（ａ）ＢＡＣ６−ＶＨ３−１１及び／又はＢＡＣ３から単離可能な自然構成のヒトＶ領域遺伝子を含むヒトＩｇ可変領域と、（ｂ）細菌人工染色体（ＢＡＣ）アナベルから単離可能な自然構成のヒトＪ領域遺伝子を含むヒトＩｇ連結領域と、を５’から３’の順に含む。別の実施形態において、本明細書に開示されるキメラポリヌクレオチドのヒトＩｇ可変領域、ヒトＩｇ多様性領域、ヒトＩｇ連結領域、Ｉｇ定常領域、及びラット３’エンハンサー領域のうちのそれぞれは、図１ａに示される相対位置にある。別の実施形態において、開示されるキメラポリヌクレオチドは、配列番号２として記載される配列、又はその一部を含む、あるいはそれと実質的に相同な配列を有する。別の実施形態において、開示されるキメラポリヌクレオチドは、配列番号１１として記載される配列、又はその一部を含む、あるいはそれと実質的に相同な配列を有する。更なる一実施形態において、開示されるキメラポリヌクレオチドは再配置されたＶ−Ｄ−Ｊ領域を含み、該再配置されたＶ−Ｄ−Ｊ領域は重鎖可変ドメインエクソンをコードする。
【００１４】
ヒトカッパ軽鎖遺伝子をコードするポリヌクレオチドもまた、本明細書に開示される。一実施形態において、本明細書に開示されるポリヌクレオチドは、ＲＰ１１−１１５６Ｄ９（配列番号３として記載）及びＲＰ１１−１１３４Ｅ２４（配列番号４として記載）からなる群から選択される核酸配列を含む、あるいはそれと実質的に相同な核酸配列を有する。別の実施形態において、単離されたポリヌクレオチドは、核酸配列（ａ）及び（ｂ）、すなわち（ａ）細菌人工染色体（ＢＡＣ）ＲＰ１１−１５６Ｄ９及び／又はＲＰ１１−１１３４Ｅ２４から単離可能な自然構成のヒトＶ領域遺伝子を含むヒトＩｇ可変領域と、（ｂ）細菌人工染色体（ＢＡＣ）ＲＰ１１−１１３４Ｅ２４及び／又はＲＰ１１−３４４Ｆ１７（配列番号５として記載）から単離可能な自然構成のヒトＪ領域遺伝子を含むヒトＩｇ連結領域と、を５’から３’順に含む。好適な一実施形態において、ヒトＩｇ可変領域、ヒトＩｇ連結領域、及びヒトＩｇ定常領域のうちのそれぞれは、図１ｂに示される相対位置にある。別の実施形態において、開示されるキメラポリヌクレオチドは、配列番号６として記載される配列、又はその一部を含む、あるいはそれと実質的に相同な配列を有する。
【００１５】
本発明の１つ以上のポリヌクレオチドを含む、げっ歯類細胞もまた、本明細書に開示される。例えば、好適にはキメラ重鎖をコードする核酸配列、例えば、ラット３’エンハンサー配列、Ｉｇ定常領域遺伝子、及び少なくとも１つのヒトＪ領域遺伝子をコードする核酸配列を含み、任意でＲＰ１１−１１５６Ｄ９、ＲＰ１１−１１３４Ｅ２４、及びこれらの部分からなる群から選択される核酸配列に実質的に相同な核酸配列を含む、本明細書に開示されるポリヌクレオチドを含むげっ歯類細胞が本明細書に提供される。本明細書で企図されるげっ歯類細胞は、例えば、図１ｂに示される配列（配列番号６として記載）、図１ｃに示される配列（配列番号７として記載）、及びこれらの部分からなる群から選択される核酸配列を含む、又はこれと実質的に相同な核酸配列を有する、機能性軽鎖をコードするポリヌクレオチドを更に含み得る。一実施形態において、ポリヌクレオチドのうちの１つ以上は、げっ歯類細胞ゲノムに統合される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】統合されたヒトＩｇ遺伝子座。（ａ）キメラヒト−ラットＩｇＨ領域は、２２の異なる潜在的機能性ヒトＶＨセグメントを有する、３つの重複ＢＡＣを含む。ＢＡＣ６−３は、ＶＨ６−１を介して、Ｃ領域ＢＡＣ  Ｈｕ−ラットアナベルと１１．３ｋｂ重複する、ＢＡＣ３に１０．６ｋｂの重複を提供するために、ＶＨ３−１１で伸長されている。後者はキメラであり、全てのヒトＤ及びＪＨセグメントを含み、完全エンハンサー配列を有するラットＣ領域が続く。（ｂ）１２のＶｋ及び全てのＪｋを有するヒトＩｇｋ  ＢＡＣは、Ｖｋ領域において約１４ｋｂ、及びＣｋ領域において約４０ｋｂの重複を提供して、ＫＤＥを含む。（ｃ）３’エンハンサーを含む、１７のＶｌ及び全てのＪ−Ｃｌを有するヒトＩｇｌ領域は、ＹＡＣ３３由来である。
【図２ａ】生後３ヶ月のラットからのリンパ球ゲート骨髄及び脾臓細胞のフローサイトメトリー分析。ＩｇＭ及びＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）の表面染色は、ＨＣ１４及び野生型ラットの骨髄及び脾臓において、類似した数の未熟及び成熟Ｂ細胞を露呈した一方で、ＪＫＯ／ＪＫＯ動物はＢ細胞発達を示さなかった。部位（ＳＳＣ）散乱に対する前方（ＦＳＣ）のプロットは、サイズ及び形状に関して、同等数のリンパ球（ゲート）集団を示した。細胞数（×１０２）に対してプロットされた抗ＩｇＧ（Ｇ１、Ｇ２ａ、Ｇ２ｂ、Ｇ２ｃアイソタイプ）での脾臓細胞の表面染色は、野生型と比較して、ＨＣ１４ラットにおいてほぼ正常数のＩｇＧ＋発現体を露呈した。骨髄において、Ａはプロ／プレＢ細胞（ＣＤ４５Ｒ＋ＩｇＭ−）を指し、Ｂは未熟Ｂ細胞（ＣＤ４５Ｒ＋ＩｇＭ＋）を指す。脾臓において、Ａは移行Ｂ細胞（ＣＤ４５Ｒ＋ＩｇＭ−）を指し、Ｂは濾胞Ｂ細胞（ＣＤ４５Ｒ＋ＩｇＭ＋）を指し、Ｃは辺縁帯Ｂ細胞（ＣＤ４５ＲｌｏｗＩｇＭ＋）を指す。
【図２ｂ】生後３ヶ月のラットからのリンパ球ゲート骨髄及び脾臓細胞のフローサイトメトリー分析。ＩｇＭ及びＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）の表面染色は、ＨＣ１４及び野生型ラットの骨髄及び脾臓において、類似した数の未熟及び成熟Ｂ細胞を露呈した一方で、ＪＫＯ／ＪＫＯ動物はＢ細胞発達を示さなかった。部位（ＳＳＣ）散乱に対する前方（ＦＳＣ）のプロットは、サイズ及び形状に関して、同等数のリンパ球（ゲート）集団を示した。細胞数（×１０２）に対してプロットされた抗ＩｇＧ（Ｇ１、Ｇ２ａ、Ｇ２ｂ、Ｇ２ｃアイソタイプ）での脾臓細胞の表面染色は、野生型と比較して、ＨＣ１４ラットにおいてほぼ正常数のＩｇＧ＋発現体を露呈した。骨髄において、Ａはプロ／プレＢ細胞（ＣＤ４５Ｒ＋ＩｇＭ−）を指し、Ｂは未熟Ｂ細胞（ＣＤ４５Ｒ＋ＩｇＭ＋）を指す。脾臓において、Ａは移行Ｂ細胞（ＣＤ４５Ｒ＋ＩｇＭ−）を指し、Ｂは濾胞Ｂ細胞（ＣＤ４５Ｒ＋ＩｇＭ＋）を指し、Ｃは辺縁帯Ｂ細胞（ＣＤ４５ＲｌｏｗＩｇＭ＋）を指す。
【図２ｃ】生後３ヶ月のラットからのリンパ球ゲート骨髄及び脾臓細胞のフローサイトメトリー分析。ＩｇＭ及びＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）の表面染色は、ＨＣ１４及び野生型ラットの骨髄及び脾臓において、類似した数の未熟及び成熟Ｂ細胞を露呈した一方で、ＪＫＯ／ＪＫＯ動物はＢ細胞発達を示さなかった。部位（ＳＳＣ）散乱に対する前方（ＦＳＣ）のプロットは、サイズ及び形状に関して、同等数のリンパ球（ゲート）集団を示した。細胞数（×１０２）に対してプロットされた抗ＩｇＧ（Ｇ１、Ｇ２ａ、Ｇ２ｂ、Ｇ２ｃアイソタイプ）での脾臓細胞の表面染色は、野生型と比較して、ＨＣ１４ラットにおいてほぼ正常数のＩｇＧ＋発現体を露呈した。骨髄において、Ａはプロ／プレＢ細胞（ＣＤ４５Ｒ＋ＩｇＭ−）を指し、Ｂは未熟Ｂ細胞（ＣＤ４５Ｒ＋ＩｇＭ＋）を指す。脾臓において、Ａは移行Ｂ細胞（ＣＤ４５Ｒ＋ＩｇＭ−）を指し、Ｂは濾胞Ｂ細胞（ＣＤ４５Ｒ＋ＩｇＭ＋）を指し、Ｃは辺縁帯Ｂ細胞（ＣＤ４５ＲｌｏｗＩｇＭ＋）を指す。
【図２ｄ】生後３ヶ月のラットからのリンパ球ゲート骨髄及び脾臓細胞のフローサイトメトリー分析。ＩｇＭ及びＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）の表面染色は、ＨＣ１４及び野生型ラットの骨髄及び脾臓において、類似した数の未熟及び成熟Ｂ細胞を露呈した一方で、ＪＫＯ／ＪＫＯ動物はＢ細胞発達を示さなかった。部位（ＳＳＣ）散乱に対する前方（ＦＳＣ）のプロットは、サイズ及び形状に関して、同等数のリンパ球（ゲート）集団を示した。細胞数（×１０２）に対してプロットされた抗ＩｇＧ（Ｇ１、Ｇ２ａ、Ｇ２ｂ、Ｇ２ｃアイソタイプ）での脾臓細胞の表面染色は、野生型と比較して、ＨＣ１４ラットにおいてほぼ正常数のＩｇＧ＋発現体を露呈した。骨髄において、Ａはプロ／プレＢ細胞（ＣＤ４５Ｒ＋ＩｇＭ−）を指し、Ｂは未熟Ｂ細胞（ＣＤ４５Ｒ＋ＩｇＭ＋）を指す。脾臓において、Ａは移行Ｂ細胞（ＣＤ４５Ｒ＋ＩｇＭ−）を指し、Ｂは濾胞Ｂ細胞（ＣＤ４５Ｒ＋ＩｇＭ＋）を指し、Ｃは辺縁帯Ｂ細胞（ＣＤ４５ＲｌｏｗＩｇＭ＋）を指す。
【図３】ＰＢＬからのＩｇＨ及びＩｇＬ転写物における突然変異変化。固有（ＶＨＤＪＨ）及びＶＬは、Ｖ群特異的プライマーによる増幅、すなわち、ユニバーサルγＣＨ２リバースプライマーと組み合わされるＩＧＨＶ１、２、３、４、及び６と、リバースＣλプライマーと組み合わされるＩＧＬＶ２、３、及び４と、リバースＣκプライマーと組み合わされるＩＧＫＶ１、３、４、及び５と、に由来した（補足表１）。変異トランススイッチ産物を、ヒトＶＨ−ラットＣγ２ａ（４）及びヒトＶＨ−ラットＣγ２ｃ（２）について特定した。
【図４】ヒトイディオタイプでのラットＩｇの精製、ならびにヒト及び正常ラットＩｇレベルに対する比較。ＯｍｎｉＲａｔ血清、及びヒト又はラット野生型対照血清、それぞれ１００μｌを、ＩｇＭ／Ｇ精製のために使用した。（ａ）ＩｇＭを抗ＩｇＭマトリックスで捕捉し、野生型ラットにおいて１４μｇ、ならびにＯｍｎｉＲａｔ［ＨＣ１４（ａ）及びＨＣ１４（ｃ）］において３０μｇ及び１０μｇを特定した。（ｂ）ＯｍｎｉＲａｔについて最大約３ｍｇ／ｍｌの収率（プロテインＡ：ＨＣ１４（ａ）１０００μｇ／ｍｌ、ＨＣ１４（ｂ）３５０μｇ／ｍｌ、野生型ラット３５０μｇ／ｍｌ、プロテインＧ：ＨＣ１４（ａ）２９７０μｇ／ｍｌ、ＨＣ１４（ｂ）２８０μｇ／ｍｌ、野生型ラット１０１０μｇ／ｍｌ）で、プロテインＡ及びプロテインＧカラム上でＩｇＧを精製した。（ｃ）抗Ｉｇκ及び抗Ｉｇλマトリックス上で、それぞれヒトＩｇκ及び（ｄ）ヒトＩｇλを精製した。野生型ラット血清（図示せず）を使用して、精製産物は得られなかった。精製Ｉｇ、約３μｇ（ナノドロップによって決定される濃度）を、４〜１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で還元条件下で分離させた。個別のＯｍｎｉＲａｔ（８５３１、８３２２、８１９９、８４８６、８０５５）、ヒト、及び野生型ラット血清における、（ｅ）ヒトＩｇκ及び（ｆ）ヒトＩｇλレベルのＥＬＩＳＡ滴定による比較。血清希釈（１：１０、１：１００、１：１，０００、１：１０，０００）を、４９２ｎｍでの吸着によって測定された結合に対してプロットした。一致する名称／番号は、同一のラットからの試料を指す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
組み換え又は人工免疫グロブリン鎖、あるいは遺伝子座をコードするキメラポリヌクレオチドが、本明細書に提供される。上述のように、本明細書に開示されるキメラポリヌクレオチドは、ヒトＩｇ遺伝子を含むようにげっ歯類を形質転換すること、ならびにそのようなげっ歯類を使用して、ヒトイディオタイプを有する免疫グロブリン又は抗体の産生をするのに、有用である。
【００１８】
ポリヌクレオチド
免疫グロブリンは、免疫グロブリン遺伝子によって実質的にコードされた、１つ以上のポリペプチドからなるタンパク質を指す。認識されているヒト免疫グロブリン遺伝子は、カッパ、ラムダ、アルファ（ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）、ガンマ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、デルタ、エプシロン、及びミュ定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子を含む。完全長の免疫グロブリン「軽鎖」（約２５Ｋｄ、又は２１４アミノ酸）は、一般的に、ＮＨ２末端に１つ以上の可変領域遺伝子（複数可）及び１つ以上の連結領域遺伝子（複数可）を含むエクソンによってコードされた可変ドメイン（約１１０アミノ酸）、ならびにＣＯＯＨ末端でカッパ又はラムダ定常領域遺伝子によってコードされた定常ドメインを含む。完全長の免疫グロブリン「重鎖」（約５０Ｋｄ、又は４４６アミノ酸）は、同様に、（１）１つ以上の可変領域遺伝子、１つ以上の多様性領域遺伝子、及び１つ以上の連結領域遺伝子を含むエクソンによってコードされた可変ドメイン（約１１６アミノ酸）、ならびに（２）１つ以上の定常領域遺伝子、例えば、アルファ、ガンマ、デルタ、エプシロン、又はミュ（約３３０アミノ酸をコードする）を含む、前述の定常ドメインのうちの１つを含む。免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子は、抗体階級、すなわち、アイソタイプ（例えば、ＩｇＭ又はＩｇＧ１）をコードする。
【００１９】
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、少なくとも１つの、及び好適には２つの重（Ｈ）鎖可変ドメイン（本明細書ではＶＨと省略）、ならびに少なくとも１つの、及び好適には２つの軽（Ｌ）鎖可変ドメイン（本明細書ではＶＬと省略）を含むタンパク質を指す。当業者は、免疫鎖の可変ドメインが、可変ドメインをコードする完全なエクソンを形成するために、まず体細胞組み換えを受けなくてはならない遺伝子セグメントにおいて、コードされることを認識するであろう。可変ドメインを形成するための再配置を受ける、３つの型の領域又は遺伝子セグメント、すなわち、可変遺伝子を含む可変領域と、多様性遺伝子を含む多様性領域（免疫グロブリン重鎖の場合）と、連結遺伝子を含む連結領域と、がある。ＶＨ及びＶＬドメインは更に、「骨格領域」（「ＦＲ」）と呼ばれる、より保存された領域とともに散在した「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）と呼ばれる、超可変性の領域に細分され得る。ＦＲ及びＣＤＲの程度は、正確に定義されている（これにより本明細書に参照によって組み込まれる、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２、及びＣｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−１７を参照されたい）。各ＶＨ及びＶＬドメインは、一般的に、アミノ末端からカルボキシ末端まで、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順に配置された３つのＣＤＲ及び４つのＦＲで構成される。抗体の抗原結合断片（又は単に「抗体部分」又は「断片」）は、本明細書で使用される場合、抗原（例えば、ＣＤ３）に特異的に結合する能力を保持する完全長の抗体の１つ以上の断片を指す。
【００２０】
抗体の「抗原結合断片」という用語内に網羅される結合断片の例は、（ｉ）Ｆａｂ断片、すなわち、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、及びＣＨ１ドメインからなる一価の断片、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ′）２断片、すなわち、ジスルフィド架橋によってヒンジ領域で結合した２つのＦａｂ断片を含む二価の断片、（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ３４１：５４４−４６）、（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、を含む。更に、Ｆｖ断片の２つのドメイン、すなわち、ＶＬ及びＶＨは別個の遺伝子によってコードされるものの、それらは、組み換え方法を使用して、それらがＶＬ及びＶＨ領域対が一価の分子を形成する単一タンパク質鎖（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖとして既知）、例えば、Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４２：４２３−２６、及びＨｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：５８７９−８３を参照されたい）として作成されることを可能にする、合成リンカーによって連結され得る。そのような単鎖抗体はまた、抗体の「抗原結合断片」という用語内に網羅されることが意図される。これらの抗体断片は、当業者に既知の従来技術を使用して得られ、断片は、無傷抗体がされるのと同一の方法で、実用性についてスクリーニングされる。
【００２１】
抗体は、それぞれ重免疫グロブリン鎖及び軽免疫グロブリン鎖を形成する、重鎖及び／又は軽鎖定常ドメインを更に含み得る。一実施形態において、抗体は、２つの重免疫グロブリン鎖及び２つの軽免疫グロブリン鎖の四量体であり、重免疫グロブリン鎖及び軽免疫グロブリン鎖は、例えば、ジスルフィド結合によって相互結合される。重鎖定常ドメインは、３つの遺伝子セグメント、すなわち、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３で構成される。軽鎖定常ドメインは、１つの遺伝子、すなわち、ＣＬで構成される。重鎖及び／又は軽鎖の可変ドメインは、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常ドメインは、典型的に、免疫系の様々な細胞（例えば、効果細胞）及び古典的相補系の第１の構成要素（Ｃ１ｑ）を含む、宿主組織又は因子に対する抗体の結合を媒介する。
【００２２】
人工免疫グロブリン遺伝子座又は人工免疫グロブリン鎖をコードするポリヌクレオチドは、複数の免疫グロブリン領域を含む組み換えポリヌクレオチド、例えば、Ｖ遺伝子を含む可変（Ｖ）領域又は遺伝子セグメント、Ｊ遺伝子を含む連結（Ｊ）遺伝子領域又は遺伝子セグメント、重鎖遺伝子座の場合にＤ遺伝子を含む多様性（Ｄ）領域又は遺伝子セグメント、及び／又は少なくとも１つのＣ遺伝子を含む少なくとも１つの定常（Ｃ）領域を意味する。好適には、可変ドメインの各領域、例えば、Ｖ、Ｄ、又はＪ領域は、同一の型の少なくとも２つの遺伝子を含む、又はそれらに広がる。例えば、可変領域は、本明細書で使用される場合、少なくとも２つの可変遺伝子、少なくとも２つの連結遺伝子を含む連結領域、及び多様性遺伝子を含む多様性領域を含む。定常領域は、１つの定常遺伝子、例えば、κ遺伝子又はλ遺伝子のみ、あるいは複数の遺伝子、例えば、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３を含み得る。
【００２３】
「エンハンサー配列」又は「エンハンサー」は、本明細書で使用される場合、ヌクレアーゼ消化及び分解に対する過敏性によって、多くの活性遺伝子の近くで特定されている配列を指す。過敏部位は、プロモーター配列に先行し得、それらの活性の強度は、ＤＮＡ配列と相関した。レポーター遺伝子への連結は、エンハンサー機能が存在する場合に転写の上昇を示した（Ｍｕｎｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，，１６６，３３１５［２００１］．）。ＩｇＨ遺伝子座において、２つの重要な転写又は発現制御、すなわち、Ｅμ及び３’Ｅが遺伝子座の末端で特定されている（Ｐｅｔｔｅｒｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４４，１６５［１９９０］）。マウスにおいて、全３’制御領域（ｈｓ３ａ、ｈｓ１，２、ｈｓ３ｂ、及びｈｓ４を含む）の除去は、正常な初期Ｂ細胞発達を可能にするが、クラススイッチ組み換えを無効にし（Ｖｉｎｃｅｎｔ−Ｆａｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１１６，１８９５［２０１０］）、体細胞超変異の最適化を阻止する可能性がある（Ｐｒｕｚｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，１，［２０１１］）。最適なアイソタイプ発現を達成する制御機能は、トランスジェニックヒトＩｇＨ遺伝子が使用されている際に特に望ましい。通常ｈｓ１，２要素のみを提供する不完全な３’Ｅ領域を有するトランス遺伝子構築物は、内因性ＩｇＨ遺伝子座がノックアウトされたときでさえもトランスジェニックマウスにおける期待はずれの発現レベルにつながった。結果として、過去２０年間に産生された構築物から単離されている抗原特異的完全ヒトＩｇＧは、ほんのわずかである（Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８，８５６［１９９４］、Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６３，６８９８［１９９９］、Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  Ｒｅｖ．１８，４２１［１９９９］、Ｐｒｕｚｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，１，［２０１１］）。ラットＩｇＨ遺伝子座において、３’Ｅ領域は、十分に分析されていない。マウス及びラット配列の比較は、ｈｓ４、すなわち、追加の重要な制御配列を更に下流に有する、非常に重要な第４の要素の特定を可能にしなかった（Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８６，２９３０３［２０１１］）。この３’エンハンサーを欠くキメラポリヌクレオチドは欠陥的アイソタイプスイッチ及びＩｇＧ発現につながるため、本発明のポリヌクレオチドは、少なくとも一部はラット３’エンハンサーの包含による最適な発現を有利に提供する。一実施形態において、ラット３’エンハンサーは、配列番号１として記載される配列、又はその一部を含む、あるいはそれと実質的に相同な配列を有する。
【００２４】
本明細書で使用される場合、第２の配列（例えば、配列番号１、配列番号２など）の一部、例えば、全体より少ない部分を含む、又はそれに実質的に相同な配列を有するポリヌクレオチドは、好適に、第２の配列の生物活性を保持する（例えば、３’エンハンサーの生物活性を保持して、免疫グロブリンの最適な発現及び／又はアイソタイプスイッチを提供する、再配置して、ヒト化キメラ重鎖を提供することができる、など）。一実施形態において、配列番号１の一部を含む、又はそれと実質的に相同な配列を含む核酸は、少なくとも８ｋＢ、好適には少なくとも１０ｋＢの、配列番号１と実質的に相同な連続核酸を含む。
【００２５】
「人工Ｉｇ遺伝子座」は、本明細書で使用される場合、再配置されない、部分的に再配置された、あるいは再配置されたポリヌクレオチド（例えば、重鎖の場合Ｖ、Ｄ、及び／又はＪ領域、あるいは軽鎖の場合Ｖ、及び／又はＪ領域、ならびに任意で重鎖及び軽鎖のいずれか、又は両方の定常領域を含む配列）を指し得る。人工Ｉｇ遺伝子座は、人工Ｉｇ軽鎖遺伝子座及び人工Ｉｇ重鎖遺伝子座を含む。一実施形態において、本発明の人工免疫グロブリン遺伝子座は、機能性であり、再配置及び免疫グロブリン鎖のレパートリを産生することができる。好適な一実施形態において、本明細書に開示されるポリヌクレオチドの可変ドメイン又はその部分は、自然構成、すなわち、ヒトＩｇ遺伝子セグメントの自然発生配列の遺伝子、ヒトＩｇ遺伝子セグメントの自然発生配列の縮退形態、ならびにヒトＩｇ遺伝子セグメントの自然発生配列によってコードされた、ポリペプチドに実質的に同一なポリペプチド配列をコードする合成配列を含む。別の好適な実施形態において、ポリヌクレオチドは、ヒトにおいて見られる自然構成の可変ドメイン又はその部分を含む。例えば、本明細書に開示される、人工Ｉｇ重鎖をコードするポリヌクレオチドは、自然構成で、少なくとも２つのヒトＶ遺伝子、少なくとも２つのＤ遺伝子、少なくとも２つのＪ遺伝子、又はこれらの組み合わせを含み得る。
【００２６】
好適な一実施形態において、人工Ｉｇ遺伝子座は、非ヒトＣ領域遺伝子を含み、非ヒトＣ領域を有するキメラ免疫グロブリンを含む、免疫グロブリンのレパートリを産生することができる。一実施形態において、人工Ｉｇ遺伝子座はヒトＣ領域遺伝子を含み、ヒトＣ領域を有する免疫グロブリンを含む、免疫グロブリンのレパートリを産生することができる。一実施形態において、人工Ｉｇ遺伝子座は「人工定常領域遺伝子」を含み、これにより、ヒト由来のヌクレオチド配列及び非ヒト定常領域遺伝子を含む定常領域遺伝子を意味する。例えば、例示的な人工Ｃ定常領域遺伝子は、ヒトＩｇＧ  ＣＨ１ドメイン、ならびにラットＩｇＧ  ＣＨ２及びＣＨ３ドメインをコードする定常領域遺伝子である。
【００２７】
好適な一実施形態において、人工Ｉｇ遺伝子座は、ｈｓ１，２、ｈｓ３ａ、ｈｓ３ｂ、及びｈｓ３ｂの下流の配列（５００〜２５００ｎｔ）を含む３’エンハンサー配列を含む。トランスジェニック動物において、Ｃアルファから３’ｈｓ３ｂまで、完全な約３０ｋｂの３’Ｅ領域を含む人工遺伝子座は、高レベルのＩｇＧ発現、広範な超変異、ならびに高（ｐＭ）親和性の多数の抗原特異的融合細胞腫につながる。しかしながら、より短いエンハンサー配列は、Ｉｇ発現を低減する。
【００２８】
好適な一実施形態において、人工Ｉｇ遺伝子座は、図１ａに示される３’エンハンサー配列を含む。この配列は、ラットＩｇ重鎖遺伝子座に由来し、カラファ（Ｃａｌａｐｈａ）から３’ｈｓ３ｂまで、約３０ｋｂの３’領域を含む。ラット３’エンハンサー配列の配列は、配列番号１として記載される。別の実施形態において、人工Ｉｇ遺伝子座は、配列番号１として記載される配列を含む、又はそれと実質的に相同な配列を含む。
【００２９】
いくつかの実施形態において、人工Ｉｇ重鎖遺伝子座は、結果として得られる免疫グロブリンが典型的な免疫グロブリン、すなわちシャペロン結合を回避することを可能にする、ＣＨ１又は等価の配列を欠く。そのような人工遺伝子座は、機能性Ｉｇ軽鎖遺伝子座を欠くために、機能性Ｉｇ軽鎖を発現しない、トランスジェニック動物において重鎖のみ抗体の産生を提供する。そのような人工Ｉｇ重鎖遺伝子座は、本明細書で企図される方法において、機能性Ｉｇ軽鎖遺伝子座を欠き、人工Ｉｇ重鎖遺伝子座を含み、重鎖のみ抗体を産生することができる、トランスジェニック動物を産生するために使用される。あるいは、人工Ｉｇ遺伝子座は、ＣＨ１又は等価の領域を攪乱し、重鎖のみ抗体の産生を提供する人工Ｉｇ重鎖遺伝子座を生成するように、ｉｎ  ｓｉｔｕで操作され得る。軽鎖欠損マウスにおける重鎖のみ抗体の産生に関しては、例えば、Ｚｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＥＭ，２０４：３２７１−３２８３，２００７を参照されたい。
【００３０】
「ヒトイディオタイプ」は、免疫グロブリンＶ遺伝子セグメントによってコードされたヒト抗体上に存在する、ポリペプチド配列を意味する。「ヒトイディオタイプ」という用語は、本明細書で使用される場合、ヒト抗体の自然発生配列、ならびに自然発生ヒト抗体に見られるポリペプチド実質的に同一な合成配列の両方を含む。「実質的に」は、アミノ酸配列同一性の程度が少なくとも約８５％〜９５％であることを意味する。好適には、アミノ酸配列同一性の程度は、９０％より大きい、又は好適には９５％より大きい。
【００３１】
「キメラ抗体」又は「キメラ免疫グロブリン」は、ヒト免疫グロブリンポリペプチド配列（又はヒトＩｇ遺伝子セグメントによってコードされたポリペプチド配列）の一部、及び非ヒト免疫グロブリンポリペプチド配列の一部を含む免疫グロブリン分子を意味する。本発明のキメラ免疫グロブリン分子は、非ヒトＦｃ領域又は人工Ｆｃ領域、ならびにヒトイディオタイプを有する免疫グロブリンである。そのような免疫グロブリンは、キメラ免疫グロブリン分子を産生するように操作された本発明の動物から、単離され得る。
【００３２】
「人工Ｆｃ領域」は、人工定常領域遺伝子によってコードされたＦｃ領域を意味する。
【００３３】
「Ｉｇ遺伝子セグメント」という用語は、本明細書で使用される場合、非ヒト動物及びヒトの生殖系列内に存在し、再配置されたＩｇ遺伝子を形成するためにＢ細胞内に集められる、Ｉｇ分子の様々な部分をコードするＤＮＡの領域を指す。したがって、Ｉｇ遺伝子セグメントは、本明細書で使用される場合、Ｖ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、Ｊ遺伝子セグメント、及びＣ遺伝子セグメントを含む。
【００３４】
「ヒトＩｇ遺伝子セグメント」という用語は、本明細書で使用される場合、ヒトＩｇ遺伝子セグメントの自然発生配列の遺伝子、ヒトＩｇ遺伝子セグメントの自然発生配列の縮退形態、ならびにヒトＩｇ遺伝子セグメントの自然発生配列によってコードされた、ポリペプチドに実質的に同一なポリペプチド配列をコードする合成配列の両方を含む。「実質的に」は、アミノ酸配列同一性の程度が少なくとも約８５％〜９５％であることを意味する。好適には、アミノ酸配列同一性の程度は、９０％より大きい、又は好適には９５％より大きい。
【００３５】
本発明に関するポリヌクレオチドは、ＤＮＡ又はＲＮＡを含み得、完全に又は部分的に合成であり得る。本明細書に提示されるヌクレオチド配列への言及は、特定の配列を有するＤＮＡ分子を網羅し、別段文脈が要求しない限り、ＵがＴに置換される特定の配列を有するＲＮＡ分子を網羅する。
【００３６】
２つの配列間の「相同性」又は「配列同一性」の計算（これらの用語は、本明細書で互換的に使用される）は、以下のように実行される。配列を、最適な比較の目的のために整列させる（例えば、間隙が、最適な整列のための第１の及び第２のアミノ酸又は核酸配列の、１つ又は両方の中に導入され得、非相同配列が、比較の目的のために無視され得る）。好適な一実施形態において、比較の目的のために整列させた参照配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、好適には少なくとも４０％、より好適には少なくとも５０％、更により好適には少なくとも６０％、及び更により好適には少なくとも７０％、８０％、９０％、１００％である。その後、対応するアミノ酸位置又はヌクレオチド位置において、アミノ酸残基又はヌクレオチドが、比較される。第１の配列における位置が、第２の配列における対応する位置と、同一のアミノ酸残基又はヌクレオチドによって占有される際、分子は、その位置で同一である（本明細書で使用される場合、アミノ酸又は核酸の「同一性」は、アミノ酸又は核酸の「相同性」と等価である）。２つの配列間の同一性パーセントは、その配列によって共有される同一の位置の数の関数であり、２つの配列の最適な整列のために導入される必要がある、間隙の数及び各間隙の長さ、を考慮する。
【００３７】
２つの配列間の配列の比較、及び配列同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成され得る。好適な一実施形態において、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｇｃｇ．ｃｏｍでオンラインから入手可能）内のＧＡＰプログラム内に組み込まれる、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４−５３）アルゴリズムを使用して、Ｂｌｏｓｓｕｍ６２マトリックス又はＰＡＭ２５０マトリックスのいずれか、ならびに１６、１４、１２、１０、８、６、又は４の間隙重量及び１、２、３、４、５、又は６の長さ重量を使用して、決定される。更に別の好適な実施形態において、２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｇｃｇ．ｃｏｍでオンラインから入手可能）内のＧＡＰプログラムを使用して、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックス、ならびに４０、５０、６０、６０、７０、又は８０の間隙重量、及び１、２、３、４、５、又は６の長さ重量を使用して、決定される。特に好適な一組のパラメータ（及び、施術者が、分子が本発明の配列同一性又は相同性の限界内にあるかどうかを決定するために、どのパラメータが適用されるべきか不確かである場合に使用されるべきもの）は、１２の間隙ペナルティ、４の間隙伸長ペナルティ、及び５のフレームシフト間隙ペナルティを有する、Ｂｌｏｓｓｕｍ６２スコアマトリックスである。２つのアミノ酸又はヌクレオチド配列間の同一性パーセントはまた、ＡＬＩＧＮプログラム（ｖｅｒｓｉｏｎ２．０）に組み込まれている、Ｍｅｙｅｒｓ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒ  （（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ４：１１−１７）のアルゴリズムを使用して、ＰＡＭ１２０重量残基表、１２の間隙長さペナルティ、及び４の間隙ペナルティを使用して、決定され得る。
【００３８】
人工Ｉｇ遺伝子座
本発明は、人工Ｉｇ遺伝子座、ならびにヒトイディオタイプを有する免疫グロブリンを産生することができるトランスジェニック動物の作成における、それらの使用に更に向けられる。各人工Ｉｇ遺伝子座は、少なくとも１つのＶ領域遺伝子セグメント、１つ以上のＪ遺伝子セグメント、重鎖遺伝子座の場合に１つ以上のＤ遺伝子セグメント、及び１つ以上の定常領域遺伝子を含む、複数の免疫グロブリン遺伝子セグメントを含む。本発明において、Ｖ遺伝子セグメントのうちの少なくとも１つは、生殖系列又は超変異ヒトＶ領域アミノ酸配列をコードする。したがって、そのようなトランスジェニック動物は、ヒトイディオタイプを有する抗体を含む、免疫グロブリン分子の多様化されたレパートリを産生する能力を有する。重鎖遺伝子座において、ヒト又は非ヒト由来Ｄ遺伝子セグメントが、人工Ｉｇ遺伝子座に含まれ得る。そのような遺伝子座における遺伝子セグメントは、再配置されていない構成（又は「生殖系列構成」）において、あるいは部分的に又は完全に再配置された構成において、互いに対して並置される。人工Ｉｇ遺伝子座は、対象動物において（遺伝子セグメントが完全に再配置されていない場合）遺伝子再配置を受ける能力を有し、それによりヒトイディオタイプを有する免疫グロブリンの多様化されたレパートリを産生する。
【００３９】
プロモーター、エンハンサー、スイッチ領域、組み換え信号、及び同様物などの制御要素は、ヒト又は非ヒト起源であり得る。必要とされるのは、要素が、人工遺伝子座を機能性にするために、関係する動物種において動作可能であることである。好適な制御要素は、本明細書により詳細に記載される。
【００４０】
一態様において、本発明は、宿主動物において遺伝子再配置を受けることができる人工重鎖遺伝子座を含み、それによりヒトイディオタイプを有する重鎖の多様化されたレパートリを産生する、トランスジェニック構築物を提供する。トランス遺伝子の人工重鎖遺伝子座は、少なくとも１つのヒトＶ遺伝子セグメントを有するＶ領域を含む。好適には、Ｖ領域は、少なくとも約５〜１００のヒト重鎖Ｖ（又は「ＶＨ」）遺伝子セグメントを含む。前述のように、ヒトＶＨセグメントは、ヒトＶＨ遺伝子セグメントの自然発生配列、ヒトＶＨ遺伝子セグメントの自然発生配列の縮退形態、ならびにヒト重鎖Ｖドメインポリペプチドに実質的に（すなわち、少なくとも約８５％〜９５％）同一のポリペプチド配列をコードする合成配列を網羅する。
【００４１】
好適な一実施形態において、人工重鎖遺伝子座は、少なくとも１つの、又はいくつかのラット定常領域遺伝子、例えば、Ｃδ、Ｃμ、及びＣγ（任意のＣγ亜階級を含む）を含む。
【００４２】
別の好適な実施形態において、人工重鎖遺伝子座は、人工定常領域遺伝子を含む。好適な一実施形態において、そのような人工定常領域遺伝子は、ヒトＣＨ１ドメイン及びラットＣＨ２ＣＨ３ドメイン、又はヒトＣＨ１及びラットＣＨ２、ＣＨ３、及びＣＨ４ドメインをコードする。ヒトＣＨ１ドメインを有するハイブリッド重鎖は、完全なヒト軽鎖と効果的に対合する。
【００４３】
好適な一実施形態において、人工Ｉｇ遺伝子座は、ｈｓ１，２、ｈｓ３ａ、ｈｓ３ｂ、及びラットＣアルファと３’ｈｓ３ｂとの間の配列を含む３’エンハンサー配列を含む。
【００４４】
別の好適な実施形態において、人工重鎖遺伝子座は、ＣＨ１ドメインを欠く人工定常領域遺伝子を含む。好適な一実施形態において、そのような人工定常領域遺伝子は、短縮型ＩｇＭ、及び／又はＣＨ１ドメインを欠くがＣＨ２及びＣＨ３、あるいはＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、及びＣＨ４ドメインを含む、ＩｇＧをコードする。ＣＨ１ドメインを欠く重鎖は、Ｉｇ軽鎖と効果的に対合することができず、重鎖のみの抗体を形成する。
【００４５】
別の態様において、本発明は、宿主動物において遺伝子再配置を受けることができる人工軽鎖遺伝子座を含み、それによりヒトイディオタイプを有する軽鎖の多様化されたレパートリを産生する、トランスジェニック構築物提供する。トランス遺伝子の人工軽鎖遺伝子座は、少なくとも１つのヒトＶ遺伝子セグメント、例えば、少なくとも１つのヒトＶＬ遺伝子及び／又は少なくとも１つの再配置されたヒトＶＪセグメントを有する、Ｖ領域を有するＶ領域を含む。好適には、Ｖ領域は、少なくとも約５〜１００のヒト軽鎖Ｖ（又は「ＶＬ」）遺伝子セグメントを含む。一貫して、ヒトＶＬセグメントは、ヒトＶＬ遺伝子セグメントの自然発生配列、ヒトＶＬ遺伝子セグメントの自然発生配列の縮退形態、ならびにヒト軽鎖Ｖドメインポリペプチドに実質的に（すなわち、少なくとも約８５％〜９５％）同一のポリペプチド配列をコードする合成配列を網羅する。一実施形態において、人工軽鎖Ｉｇ遺伝子座は、少なくとも１つのラットＣ遺伝子（例えば、ラットＣλ又はＣκ）を有するＣ領域を有する。
【００４６】
本発明の別の態様は、人工Ｉｇ遺伝子座を含むトランスジェニックベクターを作成する方法に向けられる。そのような方法は、Ｉｇ遺伝子座又はその断片を単離することと、ヒトＶ領域要素をコードする配列を含む１つ又はいくつかのＤＮＡ断片と、それを結合させることと、を伴う。Ｉｇ遺伝子セグメント（複数可）は、遺伝子座が、対象動物において効果的な遺伝子再配置を受ける能力を保持するような方法での結紮又は相同組み換えによって、人工Ｉｇ遺伝子座又はその一部内に挿入される。
【００４７】
好適には、非ヒトＩｇ遺伝子座が、そのゲノムＤＮＡから調製された、プラスミド、コスミド、ＹＡＣ、又はＢＡＣ、及び同様物のライブラリをスクリーニングすることによって単離される。ＹＡＣクローンは、最大２メガ塩基対のＤＮＡ断片を持ち得るため、動物重鎖遺伝子座の全体又はその大部分は、１つのＹＡＣクローン内で単離される、又はＹＡＣクローン内に含まれるように再構築され得る。ＢＡＣクローンは、より小さいサイズ（約５０〜５００ｋｂ）のＤＮＡ断片を持つことができる。しかしながら、Ｉｇ遺伝子座の重複断片を含む複数のＢＡＣクローンは、別個に変更され、その後、動物レシピエント細胞内に共に挿入され得、重複断片はレシピエント動物細胞内で再結合して、連続Ｉｇ遺伝子座を生成する。
【００４８】
ヒトＩｇ遺伝子セグメントは、ＤＮＡ断片の結紮、又は相同組み換えによるＤＮＡ断片の挿入を含む様々な方法によって、ベクター（例えば、ＢＡＣクローン）上のＩｇ遺伝子座内に統合され得る。ヒトＩｇ遺伝子セグメントの統合は、ヒトＩｇ遺伝子セグメントが、トランス遺伝子内の宿主動物配列に動作可能に結合して、機能性ヒト化Ｉｇ遺伝子座、すなわち、ヒトイディオタイプを有する抗体の多様化されたレパートリの産生につながる、遺伝子再配置をすることができるＩｇ遺伝子座を産生するような方法で行われる。相同組み換えは、細菌、酵母、及び高頻度の相同組み換え事象を有する他の細胞内で実行され得る。操作されたＹＡＣ及びＢＡＣは、から容易に単離され、トランスジェニック動物の作成において使用され得る。
【００４９】
ヒトイディオタイプを有する抗体を産生することができる人工Ｉｇ遺伝子座を含む、げっ歯類卵母細胞及びトランスジェニック動物
一態様において、本発明は、ヒトイディオタイプを有する免疫グロブリンを産生することができるトランスジェニック動物、ならびにそれを作成する方法を提供する。
【００５０】
使用されるトランスジェニック動物は、げっ歯類（例えば、ラット、ハムスター、マウス、及びモルモット）から選択される。
【００５１】
本発明におけるヒト化抗体産生のために使用されるトランスジェニック動物は、内因性Ｉｇ遺伝子座における生殖系列突然変異を持つ。好適な一実施形態において、トランスジェニック動物は、変異内因性Ｉｇ重鎖及び／又は内因性Ｉｇ軽鎖遺伝子についてホモ連結性である。更に、これらの動物は、機能性であり、トランスジェニック動物において免疫グロブリン分子のレパートリを産生することができる、少なくとも１つの人工Ｉｇ遺伝子座を持つ。本明細書で使用される人工Ｉｇ遺伝子座は、少なくとも１つのヒトＶ遺伝子セグメントを含む。
【００５２】
好適な一実施形態において、トランスジェニック動物は、それぞれが機能性であり、トランスジェニック動物において、ヒトイディオタイプを有する抗体を含む免疫グロブリン分子のレパートリを産生することができる、少なくとも１つの人工Ｉｇ重鎖遺伝子座、及び少なくとも１つの人工Ｉｇ軽鎖遺伝子座を持つ。一実施形態において、少なくとも１つの非ヒトＣ遺伝子を含む人工遺伝子座が使用され、ヒトイディオタイプ及び非ヒト定常領域を有するキメラ抗体を産生することができる動物が提供される。一実施形態において、少なくとも１つのヒトＣ遺伝子を含む人工遺伝子座が使用され、ヒトイディオタイプ及びヒト定常領域を有する抗体を産生することができる動物が提供される。
【００５３】
別の好適な実施形態において、トランスジェニック動物は、少なくとも１つの人工Ｉｇ重鎖遺伝子座を持ち、機能性Ｉｇ軽鎖遺伝子座を欠く。そのような動物は、重鎖のみ抗体の産生における使用を見いだす。
【００５４】
そのようなトランスジェニック動物の産生は、１つ以上の人工重鎖Ｉｇ遺伝子座及び１つ以上の人工軽鎖Ｉｇ遺伝子座を、メガヌクレアーゼの作用によって非活性化されている、又はされるであろう、少なくとも１つの内因性Ｉｇ遺伝子座を有する、トランスジェニック動物のゲノムに統合することを伴う。好適には、トランスジェニック動物は、内因性Ｉｇ重鎖及び／又は内因性Ｉｇ軽鎖についてホモ欠損であるため、内因性免疫グロブリンを産生することができない。染色体位置に関わらず、本発明の人工Ｉｇ遺伝子座は遺伝子再配置を受け、それにより免疫グロブリン分子の多様化されたレパートリを産生する能力を有する。遺伝子再配置を受ける能力を有するＩｇ遺伝子座はまた、本明細書において「機能性」Ｉｇ遺伝子座として言及され、機能性Ｉｇ遺伝子座によって生成される多様性を有する抗体はまた、本明細書において「機能性」抗体又は抗体の「機能性」レパートリとして言及される。
【００５５】
そのようなトランスジェニック動物を生成するために使用される人工遺伝子座は、それぞれ、少なくとも１つのＶ領域遺伝子セグメント、１つ以上のＪ遺伝子セグメント、重鎖遺伝子座の場合に１つ以上のＤ遺伝子セグメント、及び１つ以上の定常領域遺伝子を含む複数の免疫グロブリン遺伝子セグメントを含む。本発明において、Ｖ遺伝子セグメントのうちの少なくとも１つは、生殖系列又は超変異ヒトＶ領域アミノ酸配列をコードする。したがって、そのようなトランスジェニック動物は、ヒトイディオタイプを有する抗体を含む、免疫グロブリン分子の多様化されたレパートリを産生する能力を有する。
【００５６】
一実施形態において、使用される人工遺伝子座は、少なくとも１つの非ヒトＣ領域遺伝子セグメントを含む。したがって、そのようなトランスジェニック動物は、ヒトイディオタイプを有するキメラ抗体を含む、免疫グロブリン分子の多様化されたレパートリを産生する能力を有する。
【００５７】
一実施形態において、使用される人工遺伝子座は、少なくとも１つのヒトＣ領域遺伝子セグメントを含む。したがって、そのようなトランスジェニック動物は、ヒトイディオタイプ及びヒト定常領域を有する抗体を含む、免疫グロブリン分子の多様化されたレパートリを産生する能力を有する。
【００５８】
一実施形態において、使用される人工遺伝子座は、少なくとも１つの人工定常領域遺伝子を含む。例えば、例示的な人工Ｃ定常領域遺伝子は、ヒトＩｇＧ  ＣＨ１ドメイン、ならびにラットＩｇＧ  ＣＨ２及びＣＨ３ドメインをコードする定常領域遺伝子である。したがって、そのようなトランスジェニック動物は、ヒトイディオタイプ、ならびにヒト及び非ヒト構成要素を含む人工定常領域を有する抗体を含む、免疫グロブリン分子の多様化されたレパートリを産生する能力を有する。
【００５９】
人工Ｉｇ遺伝子座を含むトランスジェニックベクターが、レシピエント細胞又は細胞内に導入され、その後、不規則な統合又は標的化された統合によってレシピエント細胞又は細胞のゲノムに統合される。
【００６０】
不規則な統合について、人工Ｉｇ遺伝子座を含むトランスジェニックベクターが、標準トランスジェニック技術によってレシピエント細胞内に導入され得る。例えば、トランスジェニックベクターは、受精卵母細胞の前核に直接注入され得る。トランスジェニックベクターはまた、卵母細胞の受精前の、精子のトランスジェニックベクターとの共インキュベーションによって導入され得る。トランスジェニック動物は、受精卵母細胞から発達し得る。トランスジェニックベクターを導入するための別の方法は、胚幹細胞又は他の多分化能細胞（例えば、始原生殖細胞）を遺伝子移入し、その後、遺伝子組み換え細胞を発達する胚に注入することによってである。あるいは、トランスジェニックベクター（裸、又は促進試薬との組み合わせ）は、発達する胚に直接注入され得る。最終的に、キメラトランスジェニック動物が、トランスジェニック動物の少なくともいくつかの体細胞のゲノム内に統合された、人工Ｉｇトランス遺伝子を含む胚から産生される。別の実施形態において、トランスジェニックベクターが細胞のゲノム内に導入され、動物は核移植クローニングによる遺伝子移入細胞から得られる。
【００６１】
好適な一実施形態において、人工Ｉｇ遺伝子座を含むトランス遺伝子は、レシピエント細胞（受精卵母細胞又は発生中の胚など）のゲノム内にランダムに統合される。好適な一実施形態において、内因性Ｉｇ重鎖及び／又はＩｇ軽鎖についてホモ欠損であり、したがって内因性免疫グロブリンを産生することができず、トランスジェニック免疫グロブリンを産生することができる子孫が得られる。
【００６２】
標的化された統合のために、トランスジェニックベクターが、胚幹細胞、他の多分化能細胞、又は既に分化した体細胞などの適切なレシピエント細胞内に導入され得る。後に、トランス遺伝子が動物ゲノム内に統合されている細胞は、標準的な方法によって選択され得る。その後、選択された細胞は、除核された核移植ユニット細胞、例えば、卵母細胞又は胚幹細胞、すなわち、全能であり、機能性新生児を形成することができる細胞と融合され得る。融合は、確立された従来技術に従って実行される。例えば、Ｃｉｂｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９８）２８０：１２５６、Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００３）３０１：１１７９を参照されたい。卵母細胞の除核及び核移植はまた、注入ピペットを使用して顕微鏡手術によって実行され得る。（例えば、Ｗａｋａｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９９８）３９４：３６９を参照されたい）。その後、結果として生じる細胞は適切な培地内で培養され、トランスジェニック動物を生成するために同期レシピエントに移される。あるいは、選択された遺伝子組み換え細胞は、その後、キメラ動物に発達する、発達する胚内に注入され得る。
【００６３】
一実施形態において、メガヌクレアーゼが、二本鎖ＤＮＡ開裂を通した、標的部位での相同組み換えの頻度を増加させるために使用される。特異的部位内への統合のために、部位特異的メガヌクレアーゼが使用され得る。一実施形態において、内因性Ｉｇ遺伝子座を標的化するメガヌクレアーゼが、相同組み換え、ならびに内因性Ｉｇ遺伝子座又はその一部の、人工Ｉｇ遺伝子座又はその一部との置換の頻度を増加させるために使用される。一実施形態において、トランスジェニック動物は、機能性Ｉｇ軽鎖遺伝子座を欠き、人工Ｉｇ重鎖遺伝子座を含む。
【００６４】
ヒトイディオタイプを有する免疫グロブリン
ヒトイディオタイプを有する免疫グロブリンを産生することができるトランスジェニック動物が作成されると、抗原に対する免疫グロブリン及び抗体調製物を、その抗原を有する動物を免疫化することによって、容易に得ることができる。「ポリクローナル抗血清組成物」は、本明細書で使用される場合、親和性精製ポリクローナル抗体調製物を含む。
【００６５】
様々な抗原が、トランスジェニック動物を免疫化するために使用され得る。そのような抗原は、微生物、例えば、ウイルス及び単細胞生物（細菌及び菌類など）、微生物の生きた、弱毒化された、又は死んだ断片、あるいは微生物から単離された抗原性分子を含むが、これに限定されない。
【００６６】
動物の免疫化における使用のために好適な細菌性抗原は、莢膜多糖類５及び８型などの黄色ブドウ球菌、ならびにアルファ毒素、付着因子結合タンパク質、コラーゲン結合タンパク質、及びフィブロネクチン結合タンパク質などの毒性因子の組み換え体からの精製抗原を含む。好適な細菌性抗原はまた、黄色ブドウ球菌の弱毒化体、緑膿菌、エンテロコッカス、エンテロバクター、及び肺炎桿菌、又はこれらの細菌細胞からの培養上清を含む。免疫化において使用され得る他の細菌性抗原は、精製リポ多糖体（ＬＰＳ）、莢膜抗原、莢膜多糖類、及び／又は外膜タンパク質の組み換え体、フィブロネクチン結合タンパク質、黄色ブドウ球菌からの内毒素及び外毒素、エンテロコッカス、エンテロバクター、及び肺炎桿菌を含む。
【００６７】
菌類に対する抗体の生成のための好適な抗原は、カンジダアルビカンス、カンジダパラプローシス、カンジダトロピカリス、クリプトコッカスネオフォルマンスを含むが、これに限定されない、菌類又はそれらの外膜タンパク質の弱毒体を含む。
【００６８】
ウイルスに対する抗体を生成するための免疫化における使用のための好適な抗原は、呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）（特にＦタンパク質）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ＥＢＶ、及びＨＳＶを含むが、これに限定されない、ウイルスのエンベロープタンパク質及び弱毒体を含む。
【００６９】
癌に特異的な抗体は、単離された腫瘍細胞又は腫瘍細胞株、ならびにＨｅｒ−２−ｎｅｕ抗原（乳癌の治療のために有用な抗体）、ＣＤ２０、ＣＤ２２、及びＣＤ５３抗原（Ｂ細胞リンパ腫の治療のために有用な抗体）、前立腺特異的膜抗原（ＰＭＳＡ）（前立腺癌の治療のために有用な抗体）、ならびに１７−１Ａ分子（結腸癌の治療のために有用な抗体）を含むが、これに限定されない、腫瘍に関連する抗原で、トランスジェニック動物を免疫化することによって生成され得る。
【００７０】
抗原は、補助剤の有無に関わらず、任意の従来の方法でトランスジェニック動物に投与され得、所定の計画に従って投与され得る。
【００７１】
モノクローナル抗体を作成するために、脾臓細胞を免疫化トランスジェニック動物から単離し、融合細胞腫の産生のための形質転換細胞株との細胞融合おいて使用するか、又は抗体をコードするｃＤＮＡを標準的な分子生物学技術によってクローンし、遺伝子移入細胞において発現するか、のいずれかである。モノクローナル抗体を作成するための手順は、当該技術分野において十分に確立されている。例えば、本明細書に参照によって組み込まれる、欧州特許出願第０  ５８３  ９８０Ａ１号（「Ｍｅｔｈｏｄ  Ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｒｏｍ  Ｒａｂｂｉｔｓ」）、米国特許第４，９７７，０８１号（「Ｓｔａｂｌｅ  Ｒａｂｂｉｔ−Ｍｏｕｓｅ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  Ａｎｄ  Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｔｈｅｒｅｏｆ」）、国際公開第９７／１６５３７号（「Ｓｔａｂｌｅ  Ｃｈｉｃｋｅｎ  Ｂ−ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ  Ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  Ｕｓｅ  Ｔｈｅｒｅｏｆ」）、及び欧州特許第０  ４９１  ０５７Ｂ１号（「Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｗｈｉｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｅｓ  Ａｖｉａｎ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇ」）を参照されたい。クローンｃＤＮＡ分子からのモノクローナル抗体のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの産生は、Ａｎｄｒｉｓ−Ｗｉｄｈｏｐｆ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈｉｃｋｅｎ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｂｙ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ」，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ２４２：１５９（２０００）によって、及びＢｕｒｔｏｎ，Ｄ．Ｒ．，「Ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ」，Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１：８７（１９９５）によって記載されている。
【００７２】
ヒトイディオタイプを有するキメラモノクローナル抗体が生成された時点で、そのようなキメラ抗体は標準的な分子生物学技術を使用して、完全ヒト抗体に容易に変換され得る。完全ヒトモノクローナル抗体は、ヒトにおいて免疫原性ではなく、ヒト対象の治療的処置における使用のために適切である。
【００７３】
本発明の抗体は、重鎖のみ抗体を含む。
一実施形態において、機能性Ｉｇ軽鎖遺伝子座を欠き、人工重鎖遺伝子座を含むトランスジェニック動物が、抗原に特異的に結合する重鎖のみ抗体を産生するために、抗原で免疫化される。
【００７４】
一実施形態において、本発明は、そのような動物から得られるモノクローナル抗体を産生する細胞、ならびにそれから得られる核酸を提供する。それに由来する融合細胞腫もまた、提供される。完全ヒト重鎖のみ抗体、ならびにそれに由来するコーディング核酸もまた、提供される。
【００７５】
重鎖のみ抗体についての教示は、当該技術分野に見いだされる。例えば、ＰＣＴ公開国際公開第０２０８５９４４号、国際公開第０２０８５９４５号、国際公開第２００６００８５４８号、及び国際公開第２００７０９６７７９号を参照されたい。米国第５，８４０，５２６号、米国第５，８７４，５４１号、米国第６，００５，０７９号、米国第６，７６５，０８７号、米国第５，８００，９８８号、欧州特許第１５８９１０７号、国際公開第９７３４１０３号、及び米国第６，０１５，６９５号もまた、参照されたい。
【００７６】
医薬的組成物
本発明の更なる実施形態において、精製モノクローナル又はポリクローナル抗体は、医薬的組成物を提供するために、患者への投与のために好適な適切な医薬的担体で混加される。
【００７７】
本発明の医薬的組成物で治療される患者は、好適には哺乳類、より好適にはヒトであるが、獣医学的使用もまた企図される。
【００７８】
本医薬的組成物において用いられ得る、医薬的に許容可能な担体は、任意及び全ての溶媒、分散媒体、等張剤、及び同様物であり得る。あらゆる従来の媒体、薬剤、希釈剤、又は担体は、レシピエント又はその中に含まれる抗体の治療的有効性にとって有害である場合を除いて、本発明の医薬的組成物におけるその使用は、適切である。
【００７９】
担体は、液体、半固体、例えば、ペースト又は固体担体であり得る。担体の例は、油、水、生理食塩水溶液、アルコール、糖、ゲル、脂質、リポソーム、樹脂、多孔性マトリックス、結合剤、充填剤、被覆、防腐剤、及び同様物、又はこれらの組み合わせを含む。
【００８０】
治療の方法
本発明の更なる一態様において、そのような疾患の治療に望ましい本発明の精製抗体組成物を投与することによって、脊椎動物、好適には哺乳類、好適には霊長類における、ヒト対象が特に好適な実施形態である、疾患を治療するための方法が提供される。
【００８１】
抗体組成物は、ヒト体組織において、疾患を引き起こす、又はそれに寄与する、あるいは不所望又は異常な免疫反応を誘導する抗原性実体に結合し、中和又は調節するために使用され得る。「抗原性実体」は、本明細書において、タンパク質を含む、任意の可溶性又は細胞表面結合分子、ならびに少なくとも抗体に結合することができ、好適には免疫反応を誘導することもできる、細胞又は感染症を引き起こす生物又は薬剤を網羅するように定義される。
【００８２】
単独療法としての、又は化学療法との組み合わせでの、感染因子に対する抗体組成物の投与は、感染粒子の除去につながる。抗体の単一投与は、感染粒子の数を１０〜１００倍、より一般的には１０００倍超、減少させる。同様に、単独療法として、又は化学療法と組み合わせで用いられる、悪性疾患を有する患者における抗体療法は、悪性細胞の数を一般的に１０〜１００倍、又は１０００倍超、低減する。治療法は、感染粒子、悪性細胞などの完全な除去を確保するために長時間反復され得る。いくつかの例において、抗体調製物での治療法は、検出可能な量の感染粒子又は不所望の細胞の不在で長期間継続されるであろう。
【００８３】
同様に、免疫反応の調節のための抗体療法の使用は、治療的抗体の単一又は複数の投与からなり得る。治療法は、いずれの疾患症状も不在で長期間継続され得る。
【００８４】
対象治療は、感染症又は悪性腫瘍を阻害するのに十分な用量での化学療法と併用して用いられ得る。自己免疫疾患患者又は移植レシピエントにおいて、抗体療法は、免疫反応を阻害するために十分な用量での免疫抑制治療法と併用して用いられ得る。
【実施例】
【００８５】
ヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子座のためのマウストランスジェニックにおいて、完全ヒト抗体の送達における最適に満たない効率は、ヒト膜ＩｇＨ鎖の定常領域とマウス細胞信号機構との間の不完全な相互作用が原因とされている。この問題を未然に防ぐために、我々は、ここで、キメラヒト／ラットＩｇＨ遺伝子座［２２のヒトＶＨを含み、全てのヒトＤ及びＪＨセグメントは自然構成にあるが、ラットＣＨ遺伝子座に結合する］を持つヒト化ラット系統（ＯｍｎｉＲａｔ（商標））を、完全ヒト軽鎖遺伝子座［Ｊκ−Ｃκに結合する１２つのＶκ及びＪλ−Ｃλに結合する１６のＶλ］とともに説明する。内因性ラットＩｇ遺伝子座を、デザイナージンクフィンガーヌクレアーゼによってサイレンシングした。免疫化に続いて、ＯｍｎｉＲａｔは、高親和性血清ＩｇＧを産出することにおいて、正常なラットと同程度に効率的に機能する。正常なラットからの従来の抗体の産出と同様に、ナノモル未満の抗原親和性を有する完全ヒト可変領域を含み、広範な体細胞突然変異を持つモノクローナル抗体は、容易に得ることができる。
【００８６】
材料及び方法
ＹＡＣ及びＢＡＣ上での修飾ヒトＩｇ遺伝子座の構築
ａ）ＩｇＨ遺伝子座
ヒトＩｇＨＶ遺伝子を２つのＢＡＣ、すなわち、ＶＨ４−３９からＶＨ３−２３まで広がる真正領域を含むＢＡＣ６−ＶＨ３−１１に続いて、ＶＨ３−１１（商業的に入手可能なＢＡＣクローン３０５４Ｍ１７  ＣＩＴＢから修飾）及びＶＨ３−１１からＶＨ６−１まで広がる真正領域を含むＢＡＣ３（８１１Ｌ１６  ＲＰＣＩ−１１）によって網羅した。アナベルと呼ばれるＢＡＣを、ヒトＶＨ６−１−Ｄ−ＪＨ領域の直下流のラットＣＨ領域遺伝子を連結することによって構築した（図１）。ヒト又はラットＩｇＨ遺伝子座の部分を含む全てのＢＡＣクローンは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した。
【００８７】
ＢＡＣ６−ＶＨ３−１１及びアナベルの両方を、まず出芽酵母内で環状ＹＡＣ（ｃＹＡＣ）として構築し、更に大腸菌内でＢＡＣとして確認し維持した。構築の詳細は、ｗｗｗ．ｒａｔｌｔｄ．ｎｅｔで閲覧することができる。
【００８８】
ＹＡＣとは異なり、ＢＡＣプラスミド調製物は、大量の所望のＤＮＡを産出する。線状ＹＡＣをｃＹＡＣに変換するため、あるいはＢＡＣとして大腸菌内でもまた維持され得る、重複する末端を有するＤＮＡ断片を出芽酵母内で単一のｃＹＡＣに組み立てるために、２つの自己複製出芽酵母／大腸菌シャトルベクター、すなわちｐＢｅｌｏ−ＣＥＮ−ＵＲＡ及びｐＢｅｌｏ−ＣＥＮ−ＨＹＧを構築した。簡潔には、出芽酵母ＣＥＮ４をＡｖｒＩＩ断片としてｐＹＡＣ−ＲＣ３９から切り取り、Ｓｐｅｌ−線状化ｐＡＰ５９９４０に結紮した。結果として生じるプラスミドは、出芽酵母ＵＲＡ３とハイグロマイシン耐性発現カセット（ＨｙｇＲ）との間の中でクローン化したＣＥＮ４を含む。このプラスミドから、ＵＲＡ３を含むＡｐａＬＩ−ＢａｍＨＩ断片を、これに続いてＣＥＮ４を含むＣＥＮ４又はＰｍｌＩ−ＳｐｈＩ断片を、これに続いてＨｙｇＲを切り取り、ＡｐａＬＩ及びＢａｍＨＩ、又はＨｐａＩ及びＳｐｈＩで二重消化されたｐＢＡＣＢｅｌｏ１１（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）に結紮して、ｐＢｅｌｏ−ＣＥＮ−ＵＲＡ及びｐＢｅｌｏ−ＣＥＮ−ＨＹＧを産出した。
【００８９】
ＢＡＣ６−ＶＨ３−１１を構築するために、まず２つの断片、すなわち１１５ｋｂのＮｏｔＩ−ＰｍｅＩ及び１１０ｋｂのＲｓｒＩＩ−ＳｇｒＡＩを、ＢＡＣクローン３０５４Ｍ１７  ＣＩＴＢから切り取った。前者の断片の３’末端は、後者の５’末端と２２ｋｂ重複する。ＮｏｔＩ−ＰｍｅＩ断片を、ｐＹＡＣ−ＲＣからの出芽酵母ＣＥＮ４及びＴＲＰ１／ＡＲＳ１を含むＮｏｔＩ−ＢａｍＨＩ  ＹＡＣアームに結紮し、ＲｓｒＩＩ−ＳｇｒＡＩ断片を、同様にｐＹＡＣ−ＲＣからの出芽酵母ＵＲＡ３を含むＳｇｒＡＩ−ＢａｍＨＩ  ＹＡＣアームに結紮した。その後、結紮混合物を、スフェロプラスト形質転換４１を介して出芽酵母ＡＢ１３８０細胞に形質転換し、ＵＲＡ＋ＴＲＰ＋酵母クローンを選択した。ヒトＶＨ４−３９からＶＨ３−２３までの線状領域を含む、ＹＡＣ６と呼ばれるクローンを、サザンブロット分析によって確認した。ＹＡＣ６を、ＶＨ３−２３の１０．６ｋｂの断片３’の付加、及びｃＹＡＣへの変換によって、更に伸長させた。１０．６ｋｂの伸長はヒトＶＨ３−１１を含み、それはまたＢＡＣ３の５’末端で生じる。ＹＡＣ６の修飾のために、ｐＢｅｌｏＨＹＧ−ＹＡＣ６＋ＢＡＣ３（５’）を構築した。簡潔には、重複する末端を有する３つの断片を、ＰＣＲによって調製した：１）ＶＨ４−３９の上流の配列と一致する５’の尾及びＹＡＣ６におけるＶＨ３−２３の下流と一致する３’の尾を有する、ＨｐａＩ部位に隣接する出芽酵母ＴＲＰ１−ＡＲＳ１を含む「スタッフ（ｓｔｕｆｆ）」断片（長オリゴ５６１及び５６２、ならびに鋳型としてｐＹＡＣ−ＲＣを使用）、２）上述のように、ＶＨ３−２３の下流の配列と一致する５’の尾を有する１０．６ｋｂの伸長断片、及びその３’末端の固有ＡｓｃＩ部位（長オリゴ５７０及び４１２、ならびに鋳型としてヒトゲノムＤＮＡを使用、３）１０．６伸長断片の３’末端と一致する相同尾と下流で連結したＣＥＮ４を有するｐＢｅｌｏ−ＣＥＮ−ＨＹＧベクター、及び上述のようにＶＨ４−３９の上流の配列と一致する尾と上流で連結したＨｙｇＲ（長オリゴ４１４及び５６６、ならびに鋳型としてｐＢｅｌｏ−ＣＥＮ−ＨＹＧを使用）。その後、３つのＰＣＲ断片を、スフェロプラスト形質転換に関連する相同組み換えを介して、出芽酵母においてＨｙｇＲ及びＴＲＰ＋を付与する小さいｃＹＡＣに組み立て、このｃＹＡＣを、更にＢＡＣｐＢｅｌｏＨＹＧ−ＹＡＣ６＋ＢＡＣ３（５’）に変換した。最後に、ＨｐａＩ消化ｐＢｅｌｏＨＹＧ−ＹＡＣ６＋ＢＡＣ３（５’）を使用して、ＹＡＣ６を持つ酵母細胞を形質転換し、相同組み換えを通して、ＨｙｇＲのみを付与するｃＹＡＣ  ＢＡＣ６−ＶＨ３−１１を生成した。形質転換を介して（下記を参照）、このｃＹＡＣをＢＡＣとして大腸菌内に導入した。ＢＡＣ６−ＶＨ３−１１内のヒトＶＨ遺伝子を、約１８２ｋｂのＡｓｉＳＩ（ＨｙｇＲ内で自然発生）−ＡｓｃＩ断片として切り取り、ＢＡＣ３内のＶＨ遺伝子を約１７３ｋｂのＮｏｔＩ断片として切り取った（図１上部）。
【００９０】
Ｃ領域のＶＨ重複での組み立てのために、ヒトＶＨ６−１−Ｄ−ＪＨ領域は、ラットＣが後続する、最後のＪＨの直下流でラットゲノム配列と連結して、ｃＹＡＣ／ＢＡＣを産出しなくてはならなかった。これを達成するために、５つの重複する制限及びＰＣＲ断片、すなわち、ヒトＶＨ６−１の６．１ｋｂの断片５’（オリゴ３８３及び３８４、ならびに鋳型としてヒトゲノムＤＮＡを使用）と、ＢＡＣ１（ＲＰ１１６４５Ｅ６）から切り取ったヒトＶＨ６−１−Ｄ−ＪＨ領域を含む約７８ｋｂのＰｖｕＩ−ＰａｃＩ断片と、最後のＪＨの直下流のラットゲノム配列でヒトＪＨ６に連結し、ラットμコード配列の部分を含む８．７ｋｂの断片（オリゴ４８８及び３４６、ならびに鋳型としてラットゲノムＤＮＡを使用）と、ＢＡＣ  Ｍ５（ＣＨ２３０−４０８Ｍ５）から切り取った真正ラットμ、δ、及びγ２ｃ領域を含む約５２ｋｂのＮｏｔＩ−ＰｍｅＩ断片と、ラットγ２ｃ領域の３’末端と一致する相同尾と下流で連結したＵＲＡ３、及び前述のようにヒトＶＨ６−１の５’領域と一致する尾と上流で連結したＣＥＮ４を有するｐＢｅｌｏ−ＣＥＮ−ＵＲＡベクター（長オリゴ３８５及び５５０、ならびに鋳型としてｐＢｅｌｏ−ＣＥＮ−ＵＲＡを使用）と、を調製した。出芽酵母内での相同組み換えを介した正確な組み立てをＰＣＲによって分析し、正確なクローンからの精製ｃＹＡＣを大腸菌中でＢＡＣに変換した。
【００９１】
真正ラットμ、δ、及びγ２ｃ領域が後続する、ヒトＶＨ６−１−Ｄ−ＪＨを含む上記のｃＹＡＣ／ＢＡＣのアナベル部分の組み立て、ならびにＰＣＲ断片を使用した。５つの重複断片は、上述のようにヒトＶＨ６−１５’末端で６．１ｋｂの断片と、最後のＪＨの下流に、直後にラットゲノム配列が続くヒトＶＨ６−１−Ｄ−ＪＨを含み、ラットＣμの部分を含む約８３ｋｂのＳｐｅＩ断片と、ラットγ１の５’末端でラットμの３’末端に連結する５．２ｋｂの断片（オリゴ４９０及び５３４、ならびに鋳型としてラットゲノムＤＮＡを使用）と、真正ラットγ１、γ２ｂ、ε、α、及びＢＡＣ  Ｉ８から切り取った３’Ｅ  ＩｇＨエンハンサー領域（ＣＨ２３０−１６２Ｉ０８）を含む約１１８ｋｂのＮｏｔＩ−ＳｇｒＡＩ断片と、上述のようにラット３’Ｅの３’末端と一致する相同尾と下流で連結したＵＲＡ３、及びヒトＶＨ６−１の５’末端と一致する尾と上流で連結したＣＥＮ４を有するｐＢｅｌｏ−ＣＥＮ−ＵＲＡベクターと、を含んだ。ＢＡＣ３及びアナベルの両方におけるヒトＶＨ６−１領域間に１０．３ｋｂの重複がある。アナベルにおける出芽酵母ＵＲＡ３と共にラットＣＨ領域が続くヒトＶＨ６−１−Ｄ−ＪＨを、単一の約１８３ｋｂのＮｏｔＩ断片として切り取ることができる（図１上部を参照されたい）。
【００９２】
ＢＡＣ６−ＶＨ３−１１、ＢＡＣ３及びアナベルを、それらの真正性について、制限分析及び部分配列によって広範に確認した。
【００９３】
ｂ）ＩｇＬ遺伝子座
約４１０ｋｂのＹＡＣ上のヒトＩｇλ遺伝子座を、コスミドを含む３ＣλとのＶλ  ＹＡＣの組み換え組み立てによって得た２５。再配置及び発現を、完全ヒトＩｇλ  ＹＡＣの１つの複製を含む、ＥＳ細胞由来のトランスジェニックマウスにおいて検証した３８。このＩｇλ  ＹＡＣを、Ｖλ３−２７の領域５’のうちの約１００ｋｂを除去する環状ＹＡＣの生成によって短縮した。ベクターｐＹＡＣ−ＲＣを、ＣｌａＩ及びＢＳｐｅＩで消化して、ＵＲＡ３を除去し、ＨＹＧを含むｐＡＰ５９９からのＣｌａＩ／ＮｇｏＭＩＶ断片と結紮した。ベクターからの酵母セントロメア及びハイグロマイシンマーカー遺伝子を含む領域のＰＣＲ（ｐＹＡＣ−ＲＣ−ＨＹＧ）を、Ｖλ３−２７の領域５’に相同な５’末端を有するプライマー（プライマー２７６）と共に、ＹＡＣアーム内のＡＤＥ２マーカー遺伝子（プライマー２７５）内で実行した。ＰＣＲ断片（３．８ｋｂ）を、高効率酢酸リチウム形質転換法４２、及びＹＰＤプレートを含むハイグロマイシンの選択を使用して、Ｉｇλ  ＹＡＣ内に統合した。ＤＮＡを、クローン（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  ＭａｓｔｅｒＰｕｒｅ  Ｙｅａｓｔ  ＤＮＡ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ）から調製し、以下のオリゴ、すなわち、２４３＋２７８及びＨＹＧ末端Ｒ＋２３８を使用して、ＰＣＲによる正確な接合について分析した。栓を作成し４３、酵母染色体をＰＦＧＥ（０．８％アガロース（ＰＦＣ）（Ｂｉｏｒａｄ）ゲル［６Ｖ／ｃｍ、６０秒で１０時間及び１０秒で１０時間のパルス時間、８℃）によって除去し、環状酵母人工染色体をアガロースブロック内に捕捉させた４４。ブロックを除去し、ＮｒｕＩで消化した。簡潔には、１×最終濃度で過剰の制限酵素バッファーとともに、１時間氷上で、ブロックをプレインキュベートした。過剰なバッファーを、栓を被覆するために十分なだけ残して除去し、制限酵素を１００Ｕ／ｍｌの最終濃度まで添加し、３７℃で４〜５時間チューブインキュベートした。線状化ＹＡＣを、ＰＦＧＥによってブロックから追い出し、ゲルからストリップとして切り取し、以下に記載するように精製した。
【００９４】
ヒトＩｇκ遺伝子座のために、３つのＢＡＣ（ＲＰ１１−３４４Ｆ１７、ＲＰ１１−１１３４Ｅ２４、及びＲＰ１１−１５６Ｄ９、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を選択し、これらは５’Ｖκ１−１７から３’ＫＤＥまで３００ｋｂ以上の領域を網羅した４５。消化及び配列分析において、３つの重複断片：Ｖκ１−１７からＶκ３−７まで（約１４ｋｂの重複を有する１５０ｋｂのＮｏｔＩ）、Ｖκ３−７からＣκの３’まで（約４０ｋｂの重複を有する１５８ｋｂのＮｏｔＩ）、及びＣκからＫＤＥの３’まで（４０ｋｂの重複を有する５５ｋｂのＰａｃＩ）を特定した。重複する領域は、卵母細胞に共注入される際に、一般的に連結体統合を好む２４。
【００９５】
ゲル分析及びＤＮＡ精製
精製ＹＡＣ及びＢＡＣ  ＤＮＡを、従来の０．７％アガロースゲル上で制限消化及び分離によって分析した４６。５０〜２００ｋｂのより大きい断片を、ＰＦＧＥ（Ｂｉｏｒａｄ  Ｃｈｅｆ  Ｍａｐｐｅｒ（商標））によって８０℃で、０．５％のＴＢＥ中の０．８％のＰＦＣアガラオスを使用して８０℃で、２〜２０秒スイッチ時間で１６時間、６Ｖ／ｃｍ、１０ｍＡで分離した。精製は、結果として生じる断片の、配列分析から得られた予期されるサイズとの直接比較を可能にした。変更物をＰＣＲ及び配列によって分析した。
【００９６】
消化後の線状ＹＡＣ、環状ＹＡＣ、及びＢＡＣ断片を、Ｅｌｕｔｒａｐ（商標）（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｅｌｌ）４７を使用する電気溶出によって、従来通りに流れる０．８％アガロースゲルから、又はパルスフィールドゲル電気泳動（ＰＦＧＥ）から切断されたストリップから精製した。ＤＮＡ濃度は、約１００μｌの量において、通常数ｎｇ／μｌであった。最大約２００ｋｂの断片について、ＤＮＡを析出し、マイクロ注入バッファー（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１００ｍＭのＥＤＴＡ  ｐＨ８、及び１００ｍＭのＮａＣｌ、しかしスペルミン／スペルミジンはなし）内で所望の濃度に再溶解させた。
【００９７】
酵母からの環状ＹＡＣの精製を、Ｎｕｃｌｅｏｂｏｎｄ  ＡＸシリカ系アニオン交換樹脂（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して実行した。簡潔には、ザイモリアーゼ又はライティカーゼを使用してスフェロプラストを作成し、ペレット化した２０。その後、細胞は、アルカリ細胞溶解、ＡＸ１００カラムへの結合、及びＮｕｃｌｅｏｂｏｎｄ法に記載される低複製プラスミドのための溶出を受けた。汚染酵母染色体ＤＮＡを、Ｐｌａｍｉｄ−Ｓａｆｅ（商標）ＡＴＰ依存デオキシリボヌクレアーゼ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してハイドライズし、ＳｕｒｅＣｌｅａｎ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）を使用して最終洗浄化段階を続けた。その後、ＤＨ１０エレクトロコンピテント細胞のアリコート（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を環状ＹＡＣで形質転換して、ＢＡＣ群体を得た。マイクロ注入のために、挿入ＤＮＡ（１５０〜２００ｋｂ）を、セファロース４Ｂ−ＣＬを伴う濾過段階を使用して、ＢＡＣベクターＤＮＡ（約１０ｋｂ）から分離した４８。
【００９８】
ラット及び交配の誘導
組み換え免疫グロブリン遺伝子座をコードする精製ＤＮＡを、マイクロ注入バッファー内で１０ｍＭのスペルミン及び１０ｍＭのスペミジンと共に再懸濁した。ＤＮＡを、０．５〜３ｎｇ／μｌの様々な濃度で受精卵母細胞に注入した。
【００９９】
ラット免疫グロブリン遺伝子に特異的なＺＦＮをコードするプラスミドＤＮＡ又はｍＲＮＡを、０．５〜１０ｎｇ／μｌの様々な濃度で受精卵母細胞内に注入した。
【０１００】
マイクロ注入を、Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ施設で実行した。異系交配ＳＤ／Ｈｓｄ（野生型）系統動物を、国際実験動物ケア評価認証協会（ＡＡＡＬＡＣ）によって認証された動物施設内で、承認済動物ケア手順の下、標準的なマイクロ単離機ケージ内で保管した。ラットを、適宜食事及び水へのアクセスを有する状態で、１４〜１０時間明／暗周期で維持した。異系交配ＳＤ／Ｈｓｄ雄との交配前に、生後４〜５週間のＳＤ／Ｈｓｄ雌ラットに、２０〜２５ＩＵのＰＭＳＧ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を、続けて４８時間後に２０〜２５ＩＵのｈＣＧ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を注入した。単細胞段階の受精胚を、後続するマイクロ注入のために回収した。操作された胚を、出産を行せるために、擬妊娠したＳＤ／Ｈｓｄ雌ラットに移した。
【０１０１】
複数特性ヒトＩｇラット（ラットＪ  ＫＯ、κＫＯ、及びλＫＯと組み合わされる、ヒトＩｇＨ、Ｉｇκ、及びＩｇλ）、ならびに対照としての野生型を、生後１０〜１８週間の時点で分析した。動物を、特定の無病原体条件下で、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒで交配した。
【０１０２】
ＰＣＲ及びＲＴ−ＰＣＲ
トランスジェニックラットを、Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｄ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）を使用して、尾又は耳クリップＤＮＡからのＰＣＲによって特定した。ＩｇＨ  ＰＣＲに対して、以下の条件下で、１ｋｂ未満のＧｏＴａｑ  Ｇｒｅｅｎ  Ｍａｓｔｅｒ混合物（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用した：９４℃で２分間、３２×（９４℃で３０秒間、５４〜６７０℃（プライマー及び特定のアニーリング温度については、補足表１を参照されたい）で３０秒間、７２℃で１分間）７２℃で２分間。ＩｇＨ  ＰＣＲに対して、以下の条件下で、１ｋｂ未満のＫＯＤポリメラーゼ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を使用した：９５℃で２分間、３２×（９５℃で２０秒間、５６〜６２０℃（補足表１）で２０秒間、７０℃で９０秒間）、７０℃で２分間。全て１ｋｂ未満であるＩｇκ及びＩｇλ  ＰＣＲに対して、７２℃で５０秒間の延長を除いては、以上の条件を使用した。
【０１０３】
ＲＮＡを、ＲｉｂｏＰｕｒｅ  Ｂｌｏｏｄ  Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を使用して血液から抽出し、脾臓、骨髄、又はリンパ節からのＲＮＡの抽出は、ＲＮＡＳｐｉｎ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用した。オリゴｄＴ及びＰｒｏｍｅｇａ逆転写酵素を４２℃で１時間使用して、ｃＤＮＡを作成した。ＧＡＰＤＨ  ＰＣＲ反応（オリゴ４２９〜４３０）が、濃度を決定した。
【０１０４】
ラットμＣＨ２又はラットγＣＨ２プライマーを有するＶＨリーダープライマーを使用して、ＲＴ−ＰＣＲを設定した（補足表１）。ＧｏＴａｑ  Ｇｒｅｅｎ  Ｍａｓｔｅｒ混合物での増幅は、９４℃で２分間、３４×（９４℃で３０秒間、５５〜６５℃で３０秒間、７２℃で５０〜６０秒間）、７２℃で２分間であった。期待されたサイズのＰＣＲ産物を、ゲル又はＱｕｉｃｋＣｌｅａｎ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）によって精製し、直接配列するか、又はｐＧｅｍＴ（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローン化するかのいずれかにした。
【０１０５】
タンパク質精製
ＩｇＭを、手順に記載される通り、抗ＩｇＭ親和性マトリックス（ＢＡＣ  Ｂ．Ｖ．，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ＃２８９０．０５）上で精製した。同様に、ヒトＩｇκ及びＩｇλを、手順に従って、抗Ｌ鎖親和性マトリックス（ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ  ａｎｔｉ−Ｉｇκ＃０８３３及びａｎｔｉ−Ｉｇλ＃０８４９）上で精製した。
【０１０６】
ラットＩｇＧ精製２９に対して、プロテインＡ及びプロテインＧアガロースを使用した（Ｉｎｎｏｖａ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ，＃８５１−００２４及び＃８９５−００２４）。血清を樹脂でインキュベートし、緩やかな混合の下、０．１Ｍの燐酸ナトリウムを、プロテインＧに対してはｐＨ７で、プロテインＡに対してｐＨ８で、結合を促進した。ポリプレップカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を、混合物で充填し、ｐＨ７．４のＰＢＳで十分に洗浄した。溶出バッファーはｐＨ２．５の０．１Ｍのクエン酸ナトリウムで、中和バッファーはｐＨ９の１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌであった。
【０１０７】
電気泳動を４〜１５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ上に実行し、クマシーブリリアントブルーを染色に使用した。ＭＷ標準は、ＨｙｐｅｒＰａｇｅ  Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍａｒｋｅｒ（＃ＢＩＯ−３３０６６，Ｂｉｏｌｉｎｅ）であった。
【０１０８】
フローサイトメトリー分析及びＦＩＳＨ
細胞懸濁液を洗浄し、ＰＢＳ−１％  ＢＳＡ−０．１％Ａｚｉｄｅ中５×１０５細胞／１００μｌに調整した。抗Ｂ細胞ＣＤ４５Ｒ（ラットＢ２２０）−ＰＥ−複合ｍＡｂ  （Ｈｉｓ２４，ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）又は抗ＩｇＤ−ＰＥ−複合ｍＡｂ（ＭＡＲＤ−３，Ａｂｄ  Ｓｅｒｏｔｅｃ）と共に、マウス抗ラットＩｇＭ  ＦＩＴＣラベルｍＡｂ（ＭＡＲＭ４，Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用して、異なるＢ細胞サブセットを特定した。ＦＡＣＳ  ＣａｎｔｏＩＩフローサイトメーター及びＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｐｏｎｔ  ｄｅ  Ｃｌａｉｘ，Ｆｒａｎｃｅ）を分析のために使用した。
【０１０９】
記載されるように、精製ＩｇＨ及びＩｇＬ  Ｃ領域ＢＡＣを使用して、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕ交雑を固定血リンパ球上で実行した４９。
【０１１０】
免疫化、細胞融合及び親和性測定
免疫化を、ＣＦＡ中１２５μｇのＰＧ、ＣＦＡ中１５０μｇのｈＧＨＲ、ＣＦＡ中２００μｇのＴａｕ／ＫＬＨ、ＣＦＡ中１５０μｇのＨＥＬ、ＣＦＡ中１５０  μｇのＯＶＡで、尾の付け根で実行し、記載されるように、２２日後に内側腸骨リンパ節細胞をマウスＰ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３骨髄腫細胞と融合した５０。複数の免疫化のために、タンパク質、すなわち、１２５μｇのＰＧ又はＨＥＬ、あるいはＧＥＲＢＵ補助剤（ｗｗｗ．Ｇｅｒｂｕ．ｃｏｍ）中１００μｇのｈＧＨＲ又はＣＤ１４を、以下のように腹膜内に投与した：補助剤なしで０日目、１４日目、２８日目、及び４１日目、続けて４日後にＰ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３細胞との脾臓細胞融合４９。
【０１１１】
記載されるように、抗原が直接固定化された状態で、Ｂｉａｃｏｒｅ２０００を使用して、表面プラズモン共鳴によって、結合反応速度を分析した２３。
【０１１２】
【表１−１】
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【０１１３】
【表１−２】
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【０１１４】
【表１−３】
0006705650.tif 000004
【０１１５】
【表１−４】
0006705650.tif 000005
【０１１６】
【表１−５】
0006705650.tif 000006
【０１１７】
【表１−６】
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【０１１８】
【表２−１】
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【０１１９】
【表２−２】
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【０１２０】
【表２−３】
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【０１２１】
結果
ヒトＩｇＨ及びＩｇＬ遺伝子座
ヒトＩｇ遺伝子座の構築は、ＹＡＣ及びＢＡＣ１６、１９、２４〜２６を使用して大きいＤＮＡセグメントを組み立てるための確立した技術を用いた。大腸菌における複数のＢＡＣ修飾は、スイッチ配列及びエンハンサーなどの反復領域をまれに欠失させたため、出芽酵母内に、環状ＹＡＣ（ｃＹＡＣ）として重複する末端を有する配列を組み立て、その後、そのようなｃＹＡＣをＢＡＣに変換するための方法を開発した。ＹＡＣの利点は、それらの大きなサイズ、酵母宿主における相同変更物の容易さ及び配列安定性を含み、一方大腸菌内に伝搬されるＢＡＣは容易な調製及び大きな収率の利点を提供する。更に、詳細な制限マッピング及び配列分析は、ＹＡＣにおいてよりもＢＡＣにおいてより良好に達成され得る。
【０１２２】
配列分析及び消化は、対象の遺伝子クラスターを特定し、広領域にわたるＤＮＡ再配置及びスイッチを確保するための遺伝子座統合性及び機能性を確保した。ヒトＩｇＨ（ラットＣ遺伝子が後続する、ヒトＶＨ、Ｄ、及びＪＨセグメント）、Ｉｇκ、及びＩｇλ遺伝子座のレイアウトを、図１ａ〜ｃに図示する。既に示したように、重複する領域は、卵母細胞２４に共注入される際に、一般的に連結体統合を好み得る。これにより、１７３ｋｂのＮｏｔＩ断片であるＢＡＣ３、及び１９３ｋｂのＮｏｔＩ断片であるＢＡＣ３−１Ｎ１２Ｍ５Ｉ８（Ｈｕ−ラットアナベル）と共に、１８２ｋｂのＡｓｉＳＩ−ＡｓｃＩ断片であるＢＡＣ６−ＶＨ３−１１の挿入は、ラットゲノムにおける完全機能性トランスジェニックＩｇＨ遺伝子座の再構成につながった。同様に、ヒトＩｇκ遺伝子座を、相同重複によって統合した。ヒトＩｇλ遺伝子座を、約３００ｋｂのＹＡＣとしてインタクトに単離し、またラット染色体内に完全に挿入した。統合の成功を、注入された遺伝子座のほとんどの５’末端からほとんどの３’末端までのＶ（Ｄ）Ｊ−Ｃ組み換えが、を示す転写物分析によって特定した。複数の複製を、ｑＰＣＲ（図示せず）によって特定し、おそらく頭尾統合が生じたと考えられる。すべての場合において、単一部位統合を有するトランスジェニック動物を交配によって生成した。
【０１２３】
ホモ連結性に対する交配
卵母細胞内へのＤＮＡマイクロ注入によるトランスジェニックラットの誘導、それらの交配及び免疫化は、マウスに対して同等である。しかしながら、遺伝子ノックアウトを得るためのＺＦＮ技術は、近年ようやく報告されている１１、１３。ＺＦＮ  ＫＯ技術を使用する、ＪＨ欠失によるラットＩｇＨ遺伝子座のサイレンシングは、説明されており１２、ラットＩｇＬ遺伝子座のサイレンシング、Ｃκの標的化、及びＪ−Ｃλ遺伝子の欠失を説明する原稿は準備中である。我々は、統合されたヒトＩｇ遺伝子座及びサイレンシングされた内因性Ｉｇ産生を有する複数の創始者を導き出し、選択、異種交配された完全なトランス遺伝子座統合を有するＰＣＲ及びＦＩＳＨによって全てを分析した（表２）。いくつかの創始者ラットは、低いトランス遺伝子座複製数を持ち、Ｃμ及びＣα産物のｑＰＣＲ（図示せず）によって決定されるように、ＯｍｎｉＲａｔにおけるラットＣ遺伝子ＢＡＣは、５つの複製内におそらく完全に統合されると考えられる。ＦＩＳＨによる多くの系列における単一位置挿入の特定は、ＢＡＣ混合物の拡散又は複数の統合が稀であること、及び達成されたホモ連結性への交配の利点を確認した。
【０１２４】
【表３】
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【０１２５】
個別のヒトトランス遺伝子座、すなわち、ＩｇＨ、Ｉｇκ、及びＩｇλを持つラットを、Ｉｇ遺伝子座ＫＯラットのホモ連結性に異種交配することに成功した。これは、２２の機能性ＶＨを含む４００ｋｂ以上のヒトＶＨ−Ｄ−ＪＨ領域、及び約１１６ｋｂのラットＣ領域を有する高効率な新しい複数特性系列（ＯｍｎｉＲａｔ（商標））を産生した。ＤＮＡ再配置、発現レベル、クラススイッチ、及び超変異は、異なる創始者間で非常に類似し、野生型ラットと同等であった。これは、おそらくいくつかのＣ及びを収容し、真正構成において３’Ｅ（エンハンサー対照）領域を有する関連するラット定常領域の結果であろう。
【０１２６】
ノックアウトバックグラウンドにおけるＢ細胞発達
導入されたヒトＩｇ遺伝子座が、正常Ｂ細胞発達を再構成することができるかどうかを評価するために、フローサイトメトリー分析を実行した。ＪＫＯ／ＪＫＯラット１２におけるＢ細胞発達の欠如、ならびにκＫＯ／κＫＯ及びλＫＯ／λＫＯ動物において対応するＩｇＬ発現がないことを既に示した、脾臓及び骨髄リンパ球（図２）における特定の分化段階を分析した（データ図示せず）。最も顕著であったのは、骨髄及び脾臓において類似した数のＢ２２０（ＣＤ４５Ｒ）＋  リンパ球を有する野生型動物と比較した、ＯｍｎｉＲａｔにおけるＢ細胞発達の完全な回復であった。大きな割合のＣＤ４５Ｒ＋Ｂ細胞におけるＩｇＭ発現は、完全に再構成された免疫系を示した。脾臓細胞のサイズ及び形状分離は、ＯｍｎｉＲａｔと野生型動物との間で区別不可能であったため、ラットＣ領域を有するヒトイディオタイプを発現するトランスジェニックラットにおいて、復元することに成功した。更に、小さなｓＩｇＧ＋リンパ球集団がＯｍｎｉＲａｔ内に存在した（図２右）。
【０１２７】
他のＯｍｎｉＲａｔリンパ球組織の分析は、それらが野生型対照から区別不可能であり、例えば、Ｔ細胞サブセットが完全に保持される（データ図示せず）ことを示し、これは更に最適な免疫作用が完全に復元されているという概念を支持する。
【０１２８】
多様なヒトＨ鎖及びＬ鎖転写物
機能性内因性Ｉｇ遺伝子座を有するトランスジェニックラットからの血液リンパ球又は脾臓細胞を使用して、広範な転写分析を実行した。Ｃμ又はＣγリバースプライマーに対してフォワードである特異的ヒトＶＨ群からのＲＴ−ＰＣＲは、ヒトＶＨＤＪＨ使用を示した。Ｌ鎖分析群のために、特異的ヒトＶκ又はＶλフォワードプライマーをＣμ又はＣγリバースプライマーと共に使用した。結果（表３）は、Ｄセグメント及び全てのＪＨセグメントの多様な使用との組み合わせでの、機能性２７であると見なされる、全ての統合されたヒトＶＨ遺伝子の使用を示した。
【０１２９】
【表４】
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【０１３０】
ＪＫＯ／ＪＫＯバックグラウンドにおけるクラススイッチ及び超変異（図３）の分析は、これらの必須かつ非常に所望な機構が、ＯｍｎｉＲａｔにおいて完全に動作することを示した。ＰＢＬからのＩｇＧスイッチ産物の増幅は、約８０％の多数の細胞における、ならびにほぼ等しい数のγ１及びγ２ｂのＨ鎖における、突然変異の広範な比率（２ａａ未満の変更）を露呈した。少数パーセントのトランススイッチ配列、すなわち、γ１ａ及び２ｃもまた特定され（図３）、これはトランス遺伝子座が同様に活性であるが、内因性ＩｇＨ遺伝子座としてヒト（ＶＨ−Ｄ−ＪＨ）を提供するという見解２８を支持する。変異ヒトＩｇγ及びＩｇκのＬ鎖配列の数は、約３０％であるため、ＩｇＧのＨ鎖よりかなり少ない。理由は、ＩｇＧ＋又は分化した血漿細胞からではなくむしろ、全ての産生細胞からのＬ鎖の一般的な増幅である。
【０１３１】
血清中のＩｇレベル
抗体産生についての明確な情報を獲得するために、我々は、ＯｍｎｉＲａｔ及び正常野生型動物からの血清Ｉｇの質及び量を比較した。還元条件下で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離されたＩｇＭ及びＩｇＧの精製（図４）は、期待されたサイズ、すなわち、μＨ鎖については約７５ｋＤａ、及びγＨ鎖については約５５ｋＤａ、Ｌ鎖については約２５ｋＤａを示し、これはＯｍｎｉＲａｔと野生型動物との間で区別不可能であるようだった。いくつかのＯｍｎｉＲａｔ及び野生型動物の両方について、血清からのＩｇ収率を、ＩｇＭについて１００〜３００μｇ／ｍｌ、及びＩｇＧについて１〜３ｍｇ／ｍｌであるように決定した。しかしながら、プロテインＡ又はＧ上のラットＩｇＧ精製が準最適であると考えられる２９ために、ラットＩｇレベルは過小評価され得る。これらの若い（生後約３ヶ月）ラットが無病原体施設に保管され、免疫化されていないことを考慮に入れると、これは、開放的な施設で飼育されるラットについて報告される、０．５〜１ｍｇ／ｍｌのＩｇＭレベル、及び数ｍｇ／ｍｌのＩｇＧレベルに比較しても劣らない３０、３１。興味深いことに、モノクローナルについて実証されるように、我々は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上でのラットＩｇＧアイソタイプの階級特異的可動性を可視化することができた２９。ＩｇＧ分離（図４ｂ）において、明らかな下方γＨ鎖バンドは野生型においては可視であったが、ＯｍｎｉＲａｔのＩｇにおいては可視でなかった。このバンドは、ＯｍｎｉＲａｔ（ＨＣ１４）トランス遺伝子座内に存在しない、γ２ａのＨ鎖が原因とされている。ＩｇＧレベルはＯｍｎｉＲａｔと野生型動物との間で類似しているため、我々は、クラススイッチも同様に効率的であると仮定する。ＯｍｎｉＲａｔにおけるＣγ２ａの欠如が限定的ではない理由は、トランスジェニック遺伝子座のいくつかの複製が、スイッチ産物のレベルを優遇して増加させることであり得る。抗Ｌ鎖で捕捉することによる、ヒトＩ及びＩｇλの精製もまた成功し（図４ｃ及びｄ）、予期されたＨ鎖及びＬ鎖バンドは期待されたサイズであった。ＩｇＭ／Ｇ力価の確認もまた、野生型及びＯｍｎｉＲａｔのアイソタイプ分布を決定し、比較可能な量のＩｇＧ１及びＩｇＧ２ｂ（図示せず）を特定する、ＥＬＩＳＡによって得た。
【０１３２】
固相におけるヒトＩｇのＬ鎖力価の直接比較（図４ｅ及びｆ）は、ＯｍｎｉＲａｔにおいて、ヒト血清中よりも５〜１０倍低いレベルを露呈した。しかしながら、成人からのヒト対照血清は、１０代までの子どもにおけるよりも時折１０倍以上高いＩｇレベルを含み得３２、これは若いラットにおけるヒトＩｇκ及びＩｇλ力価と類似するため、これは期待されていた。興味深いことに、野生型ラットはほとんど内因性Ｉｇλを産生しない一方で、トランスジェニックラットは、ヒトＬ鎖、Ｉｇκ、及びＩｇλの両方の型を効率的に発現することができる。
【０１３３】
完全ヒト抗原特異的ＩｇＧ
急速一免疫化計画を使用してリンパ節を採取するか、あるいはブースター免疫化及び脾臓細胞を使用するかのいずれかで、いくつかの細胞融合を実行した（表２）。例えば、ヒトプログラニュリン（ＰＧ）での一免疫化、及びその２２日後の骨髄腫融合の後、かなりの数の安定融合細胞腫が得られた。ここで、ＳＤ対照及びＯｍｎｉＲａｔ融合細胞腫クローンにおいて、それぞれ約３，５２０及び約１，６００ウェル内で細胞成長を観察した。バイオセンサー測定によって特徴付けられる、抗プログラニュリン特異的ＩｇＧを、１４８のＯｍｎｉＲａｔクローンによって産生した。混合したウェルを除外するための限定的な希釈、及び反復親和性測定は、ＯｍｎｉＲａｔクローンがそれらの抗原特異性を保持することを露呈した。ＳＤ及びＯｍｎｉＲａｔクローンからの抗体の結合及び解離比率の比較は、０．３〜７４ｎＭ間の類似した親和性を示した（表４、データ図示せず）。ヒト成長ホルモン受容体（ｈＧＨＲ）、キーホールリンペットヘモシアニン結合ＴＡＵ受容体（ＴＡＵ／ＫＬＨ）、鶏卵リゾチーム（ＨＥＬ）、又はオボアルブミン（ＯＶＡ）での単一免疫化、これに続くリンパ節融合もまた、しばしば野生型に類似した数で、多くの高親和性ヒト抗体を産生した。
【０１３４】
更に、ヒトＰＧ、ｈＧＨＲ、ヒトＣＤ１４、及びＨＥＬでの従来のブースター免疫化は、ＩｇＧのヒトイディオタイプとの高親和性（ｐＭ範囲）につながった。ＯｍｎｉＲａｔは、野生型ラットと同様、かつそれと同程度に顕著な、常に抗原特異的血清ＩｇＧの期待される４〜５ログの力価増加を示した（表４ａ）。結果は動物によって異なり得るものの、同様に高親和性を有する抗原特異的抗体を産生する、比較可能な数の融合細胞腫が野生型動物（ＳＤ及び他の系統）ならびにＯｍｎｉＲａｔから得られた。それらの多様なヒトＶＨ−Ｄ−ＪＨ、ヒトＶκ−Ｊκ又はＶλ−Ｊλ特徴及び親和性を示す、リンパ節及び脾臓細胞融合クローンを産生する個別ＩｇＧの要約が、表４ｂに示される。免疫化及び融合結果は、１ｎＭをはるかに下回る親和性（バイオセンサー分析によって決定）が、ＰＧ、ＣＤ１４、Ｔａｕ、ＨＥＬ、及びＯＶＡ抗原で免疫化されたＯｍｎｉＲａｔから頻繁に得られたことを示した。要約すると、ＯｍｎｉＲａｔからの抗原特異的融合細胞腫は、単一免疫化の後でさえも、ナノモル未満の親和性を有する多数のｍＡｂを産出する野生型動物からと同程度に容易に生成され得る。
【０１３５】
【表５−１】
0006705650.tif 000013
【０１３６】
【表５−２】
0006705650.tif 000014
【０１３７】
考察
新規ＩｇＨ遺伝子座を組み立てるための、ヒト及びラット遺伝子の組み合わせは、ヒトイディオタイプを有する抗体の、非常に効率的な正常に近い発現につながった。更に、ヒトＩｇκ及びＩｇλ遺伝子座の統合は、完全ヒト特異性を有するキメラＩｇが容易に産生されること、ならびにヒトＬ鎖とラットＣ領域の結合が有害ではないことを露呈した。ラットＩｇＨ遺伝子座の部分を使用することの利点は、本質的には多様なヒトＶＨＤ  ＪＨ領域のみが移植されて、種特異的Ｃ領域及びエンハンサー対照要素がそれらの自然構成で保持されることである。更に、ラットＦｃ領域を有する抗体の発現は、正常Ｂ細胞受容体組み立て、ならびに非常に効率的な免疫反応の開始のために必須である、下流信号経路の最適な活性化を可能にする。特に、抗原投与に対する免疫反応の質は、多くの受容体に関連する信号及び修飾構成要素の結合作用に依存する（ｗｗｗ．ｂｉｏｃａｒｔａ．ｃｏｍ／ｐａｔｈｆｉｌｅｓ／ｈ ｂｃｒｐａｔｈｗａｙ．ａｓｐを参照されたい）。
【０１３８】
ＹＡＣ及びＢＡＣ、ならびにこれら２つの間の交換を使用するアプローチは、重複する相同性によって大領域の構築物を作成する際に、統合性を確認するための速度及び能力の両方の利点を有する。いくつかの創始者ラットは、低いトランス遺伝子座複製数を持ち、Ｃμ及びＣα産物のｑＰＣＲ（図示せず）によって決定されるように、ＯｍｎｉＲａｔにおけるラットＣ遺伝子ＢＡＣは、５つの複製内におそらく完全に統合されると考えられる。ＦＩＳＨによる多くの系列における単一位置挿入の特定（表１ｄを参照されたい）は、ＢＡＣ混合物の拡散又は複数の統合が稀であること、及び達成されたホモ連結性への交配の利点を確認した。ＤＮＡ再配置のために必須である完全機能性を維持するように、広範な重複する領域が統合するのかどうかについて、ほとんど知られていなかった。以前、重複する統合は報告されていたが、はるかにより小さな領域（１００ｋｂ未満）についてであり２４、３３、我々の発見は、相同性による、又は縦一列での所望の統合が頻繁な事象であることを示す。時間と労力を要する、大きなＹＡＣの幹細胞への統合、ならびにそこからの後続する動物誘導が実行されなくてよいため、これはトランスジェニック技術を実質的に容易にする１８、１９。更に、同様にＤＮＡ注入を介して実行されるＺＦＮ技術１１、１２は、容易にＩｇ  ＫＯ系統を産生し、遺伝子攪乱及び置換のために選択される将来の技術であり得る。ＯｍｎｉＲａｔにおけるサイレンシングされた内因性Ｉｇ遺伝子発現は、ヒト−ラットＩｇＨ及びヒトＩｇＬ遺伝子座を含み、干渉する、又は不所望なラットＩｇが混合産物を生じ得ないという利点を有する。興味深いことに、依然野生型Ｉｇを産生するＯｍｎｉＲａｔにおける免疫化及び融合細胞腫生成は、不完全なＩｇ  ＫＯにも関わらず、多くの産物が完全ヒト、ヒト−ラットＩｇＨ及びヒトＩｇであることを露呈した。ここで、広範な数の野生型Ｖ遺伝子にも関わらず、導入されたヒト遺伝子が容易に増幅したため、効率的な発現競合者であることを示すことは注目に値した。これは、内因性遺伝子座と優遇して競合する、全ての我々の統合されたトランス遺伝子の一般的に良好な発現レベルについての見解と一致する。以前、ヒト抗体レパートリを発現するマウスにおいて、野生型Ｉｇが発表された際にヒト産物の発現がほとんど見られなかった８、１８ため、Ｉｇ  ＫＯは必須であった。
【０１３９】
系統特異的シス作用配列が高レベル発現のために必要とされるため、Ｉｇ  ＫＯマウス内での完全ヒトＩｇ遺伝子座の産生でさえも準最適である可能性がある。マウスにおいて、Ｃαの下流のエンハンサー領域は、クラススイッチ組み換えにおいて不可欠な役割を果たし３４、その領域内の要素はおそらく超変異を促進し得ると考えられる２３。これは、高頻度の免疫反応及び多様な融合細胞腫の生成が、大きな完全ヒト遺伝子座を持つマウスにおいてでさえも困難であり得る理由であり得る３５、３６。キメラヒト−ラットＩｇＨ遺伝子座が、ＯｍｎｉＲａｔにおける野生型に近い分化及び発現レベルを促進するため、内因性ラットＣ領域、及び実際にはＣα約３０ｋｂのエンハンサー配列３’が、発現するための最適な遺伝子座対照及び成熟ヒトＶＨ遺伝子を提供していることが結論付けられ得る。別の領域、すなわちその３’対照モチーフクラスターを有するＣδ２６は、ＩｇＤのサイレンシング又は欠如が免疫作用を低減するようではなかった３７及びその中の参照文献ため、キメラＣ領域ＢＡＣから除去されている。通常、成熟ＩｇＭ＋ＩｇＤ＋Ｂ細胞は、抗原接触時にＩｇＤを下方制御し、これがクラススイッチ組み換えを開始する３７。したがって、スイッチは、ＩｇＤ制御なしで増加され得、これは、Ｃδ領域がトランスジェニック構築物内に保持される際に、ＩｇＧ転写物及び血清レベルがより有意に低いという我々の発見によって支持される（データ図示せず）。
【０１４０】
我々は、様々なｍＡｂにおいて、野生型対照において産生されたものと比較可能である、配列及びエピトープにおける多様性を有する免疫化は、脾臓及びリンパ節融合を介して単離され得ることを発見したため、ＯｍｎｉＲａｔにおける特異的ＩｇＧの産生は、特に有望である。Ｖ遺伝子、Ｄ及びＪ多様性は、期待された通りであり、ほぼ全てのセグメントが予期された通り生産的に使用されることが発見された２７。これは、いくつかの前駆Ｂ細胞からのクローン増殖が多様性をほとんど産生しなかった、完全ヒトトランス遺伝子座を持つマウスに対して著しく対照的であった２３。移植されたＶ遺伝子の数は、ヒトにおいて使用されるものの約半分であるため、我々は、ＯｍｎｉＲａｔを野生型動物と比較する際に、制限された免疫反応及び限定された多様性を発見することを予測した。しかしながら、これはその限りではなく、１０００以上のクローン（配列が提供され得る）におけるＣＤＲ３多様性の比較は、ＯｍｎｉＲａｔにおいて、野生型動物においてと同一の広範な接合差を露呈した。それらの少数の同一の遺伝子セグメントの組み合わせは、ＶＨからＤ及び／又はＤからＪＨ接合でのＮ配列の付加又は欠失によって、及び同様に超変異によって、更に多様化された。したがって、ラットＣ領域配列は、ヒトＶＨＤＪＨのＤＮＡ再配置及び発現を制御することにおいて非常に効率的であることが明らかである。広範な多様性はまた、マウスにおいて既に示されているものに類似して、導入されたヒトＩｇκ及びＩｇλ遺伝子座について見られた２２、２３、３８。したがって、マウスからのヒト抗体の産生における実質的に低減した効率７は、ＯｍｎｉＲａｔにおいて克服されており、これは高親和性抗体を時折ではなくむしろ大量に産出するためのクラススイッチ及び超変異によって、再配置されたＨ鎖を確実かつ広範に多様化する。抗原特異的ｍＡｂにおいて印象的に利用される、トランスジェニックＩｇＧの収率及び超変異のレベルは、クローン多様化及び産生レベルがＯｍｎｉＲａｔと野生型動物との間で類似することを示した。ナノモル未満の範囲における高親和性特異性の定期的な生成は、異なる単一免疫化によってでさえも達成され、この場合もやはり、野生型動物に比較しても劣らない。ヒト遺伝子座のみからヒト抗体レパートリを産生するトランスジェニックマウスにおいては、結果は示されていない１８。
【０１４１】
要約すると、ヒト抗体産生を最大化するために、抗体特異性のためにヒト遺伝子を使用するが、分化及び高発現の制御のためにげっ歯類遺伝子を使用するＩｇＨ遺伝子座は、必須であると見なされるべきである。Ｌ鎖の柔軟性は、それが野生型  Ｉｇが存在するときでさえも高効率なヒトＩｇＨ／ＩｇＬ組み立てを可能にするため、追加の利点である。治療的用途にとって、キメラＨ鎖は、特異性を妥協することなく、Ｃ遺伝子置換によって完全ヒトＡｂに容易に変換され得る。
【０１４２】
本明細書で参照される全ての特許及び特許出版物は、これにより参照によって組み込まれる。
【０１４３】
当業者は、前述の記載を閲読した後、特定の修正及び改良に気付くであろう。全てのそのような修正及び改良は、簡潔性及び可読性のために本明細書において削除されているが、適切に以下の特許請求の範囲の範囲内にあることが理解されるべきである。
【０１４４】
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【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図２ｄ】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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