(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド（ＰＡＣＡＰ）を有する、汗腺の分泌細胞に局在するＰＡＣ１受容体刺激剤であって、対象への局所投与により、該対象のエクリン汗腺に発現しているＰＡＣ１受容体を刺激する、該対象における汗の分泌促進用であることを特徴とするＰＡＣ１受容体刺激剤。
【請求項２】
請求項１に記載のＰＡＣ１受容体刺激剤を含有することを特徴とする汗分泌促進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、汗分泌促進剤及び該汗分泌促進剤を含有するドライスキンの予防薬又は治療薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
ドライスキン（乾燥肌）は、皮膚のバリア機能が低下することにより、皮膚が乾いた状態である。また、皮膚のバリア機能が低下することにより、外部からの刺激を直接受けやすく、肌荒れや皮膚の痒み等の症状を引き起こしやすい状態である。ドライスキンの主な要因として、アトピー性皮膚炎、加齢、冬の乾燥等が挙げられる。
【０００３】
ドライスキンの治療薬としては、例えば、アブラナ科の抽出物を有効成分とする経口用皮膚保湿剤（特許文献１）、ペクチンを有効成分として含有することを特徴とする肌荒れ防止及び粘膜修復剤（特許文献２）、温熱薬用植物又はそのエキスと尿素とビタミンＡとを含有する浴用剤組成物（特許文献３）等が報告されているが、更なる新規のドライスキンの治療薬の開発が求められる。
【０００４】
また、ドライスキンの治療薬の多くは、皮膚の表面を覆うことにより皮膚の乾燥を防ぎ、ドライスキンの症状を緩和させることを目的としているものが多く、汗分泌を促進することによるドライスキンの治療薬はこれまでに知られていない。
そこで、該分子メカニズムを活性化させることにより汗分泌を促進するドライスキンの治療薬の開発が望まれている。
【０００５】
一方、ＰＡＣＡＰ（Ｐｉｔｕｉｔａｒｙ  Ａｄｅｎｙｌａｔｅ  Ｃｙｃｌａｓｅ−Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ：下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド）は、神経ペプチドの１種であり、２７又は３８アミノ酸残基からなるペプチドである。ＰＡＣＡＰはこれまでに、神経突起誘発剤、抗炎症剤、慢性肺疾患治療剤、眼疾患治療剤としての用途が報告されている（特許文献４〜８、非特許文献１）。しかし、ＰＡＣＡＰが汗分泌の促進に関与していることは報告されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００５−２８１２７１号公報
【特許文献２】特開２００４−０５９４４０号公報
【特許文献３】特開平０９−００２９３９号公報
【特許文献４】特開２００１−２２６２８４号公報
【特許文献５】特開２００４−２２４７７５号公報
【特許文献６】特開２００４−３１５４３６号公報
【特許文献７】特開２００６−３０６７７０号公報
【特許文献８】特開２００９−２６９８１８号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Vaudry D，Falluel-morel A，Bourgault S，Basille M，Bure D et al.，Pituitary Adenylate Cyclase-Activating Polypeptide and Its Receptors：20 years after the Discovery．Pharmacol Rev 2009；61(3)；283-357.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、上記背景技術に鑑みてなされたものであり、その課題は、新規のドライスキンの予防薬又は治療薬を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記の課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、ＰＡＣＡＰが汗分泌促進に関与していることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は、ＰＡＣＡＰ又はその製薬学的に許容される塩を有効成分として含有することを特徴とする汗分泌促進剤を提供するものである。
【００１１】
また、本発明は、上記汗分泌促進剤を含有することを特徴とするドライスキンの予防薬又は治療薬を提供するものである。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、前記問題点や前記課題を解決し、ドライスキンを予防又は治療のために用いることができる汗分泌促進剤を提供することができる。
【００１３】
また、本発明のドライスキンの予防薬又は治療薬は、皮膚の水分保持（保湿）を目的としている従来のドライスキンの予防薬又は治療薬とは異なり、汗分泌促進による皮膚の水分補給を目的とし、ドライスキンの予防又は治療に極めて有効である。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】マウス足底（上）及びヒト足底（下）におけるＰＡＣ１Ｒ免疫陽性反応の結果を示す図である。
【図２】マウス足底におけるＰＡＣ１Ｒ免疫陽性反応を示した図である。ＰＡＣ１Ｒの局在（左下）、ＳＭＡの局在（右下）、ＰＡＣ１Ｒ・ＳＭＡ・ＤＡＰ１の共局在（右上）についてそれぞれ確認した。
【図３】ヒト足底におけるＰＡＣ１Ｒ免疫陽性反応を示した写真の図である。ＰＡＣ１Ｒの局在（左下）、ＳＭＡの局在（右下）、ＰＡＣ１Ｒ・ＳＭＡ・ＤＡＰ１の共局在（右上）についてそれぞれ確認した。
【図４】マウス皮膚におけるＰＡＣＡＰ受容体（ＰＡＣ１Ｒ、ＶＰＡＣ１Ｒ、ＶＰＡＣ２Ｒ）、ＶＩＰ、ＰＡＣＡＰのｍＲＮＡの発現量をＲＴ−ＰＣＲを用いて比較した図である。
【図５】マウス足底から得られた組織抽出物におけるＰＡＣＡＰ受容体（ＰＡＣ１Ｒ、ＶＰＡＣ１Ｒ、ＶＰＡＣ２Ｒ）、ＶＩＰ、ＰＡＣＡＰのｍＲＮＡの発現量をＲＴ−ＰＣＲを用いて比較した図である。
【図６】ＰＡＣＡＰ投与による汗分泌促進効果を評価する際に用いたプロトコールである。
【図７】生理食塩水（Ｓａｌｉｎｅ）（上）、又はＰＡＣＡＰ（１０−６Ｍ）（下）をマウスの足底に局所投与した時における、局所投与前（左）、局所投与してから１２０分後（右）の発汗量を比較した写真の図である。
【図８】ＰＡＣＡＰ投与後の汗分泌量の投与量変化と時間変化を示したグラフである。
【図９】（ａ）ＰＡＣＡＰ投与後の汗分泌量の投与量変化と時間変化を示したグラフである。（ｂ）ＰＡＣＡＰ投与後の汗分泌量が麻酔による影響を受けるか否かの検証結果を示すグラフである。（ｃ）ＰＡＣＡＰによる汗分泌促進効果が局所的か否かの検証結果を示すグラフである。
【図１０】ＰＡＣＡＰ投与による汗分泌促進効果に関与する受容体を評価する際に用いたプロトコールである。
【図１１】（ａ）図１０（i）〜（iv）に記載のプロトコールによる、実験を開始してから１２０分後の発汗量を比較した写真の図である（（i）コントロール、（ii）実験開始１０分後にＰＡＣＡＰを投与、（iii）実験開始直後にＰＡＣＡＰ６−３８を投与し１０分後にＰＡＣＡＰを投与、（iv）実験開始１０分後にＶＩＰを投与）。（ｂ）ＰＡＣＡＰ、ＰＡＣＡＰとＰＡＣＡＰ６−３８、又はＶＩＰ投与後の汗分泌量と時間変化を示したグラフである。
【図１２】ヒト足底の皮膚におけるＰＡＣＡＰ及びＰＡＣ１ＲのｍＲＮＡの発現量をＲＴ−ＰＣＲを用いて比較した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明について説明するが、本発明は、以下の具体的態様に限定されるものではなく、技術的思想の範囲内で任意に変形することができる。
【００１６】
［汗分泌促進剤］
本発明の汗分泌促進剤は、ＰＡＣＡＰ又はその製薬学的に許容される塩を有効成分として含有することを特徴とする。
【００１７】
ＰＡＣＡＰ（Ｐｉｔｕｉｔａｒｙ  Ａｄｅｎｙｌａｔｅ  Ｃｙｃｌａｓｅ−Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ：下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド）は、２７又は３８アミノ酸残基からなる神経ペプチドで、中枢・末梢神経系に強く発現し、精巣、副腎、腸管等の末梢組織にも広く分布する。
ＰＡＣＡＰの受容体には、ＶＩＰ（Ｖａｓｏａｃｔｉｖｅ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ：血管作動性腸管ポリペプチド）に対しても同等の親和性で結合し、ｃＡＭＰの産生を促進させるＶＰＡＣ受容体（ＶＰＡＣ１受容体、ＶＰＡＣ２受容体）と、ＰＡＣＡＰに選択的に結合し、ｃＡＭＰ産生の他にもホスファチジルイノシトール代謝回転やＭＡＰキナーゼを活性化させるＰＡＣ１受容体が存在する。
【００１８】
本発明は、実施例等に示した通り、ＰＡＣＡＰにより、汗分泌が促進されることを初めて見出してなされたものである。
【００１９】
また、本発明の汗分泌促進剤は、「ＰＡＣＡＰ及びその製薬学的に許容される塩よりなる群」に属する１種以上のペプチドを含有することが好ましい。
【００２０】
本発明に用いるＰＡＣＡＰの合成法は、特に限定されないが、公知のペプチド合成法に従って合成することができる。例えば、アジド法、酸クロライド法、酸無水物法、混合酸無水物法、ＤＣＣ法、活性エステル法、カルボイミダゾール法、酸化還元法、ＤＣＣ−ａｄｄｉｔｉｖｅ法等が挙げられる。これらの合成方法は、固相合成及び液相合成の何れにも適用することができる。
【００２１】
ＰＡＣＡＰの製薬学的に許容される塩としては、例えば、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属との塩；カルシウム、マグネシウム等のアルカリ土類金属との塩；アルミニウム塩；アンモニウム塩等の無機塩基との塩；トリメチルアミン、ピリジン、ピコリン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ−ジベンジルエチレンジアミン等の有機塩基との塩；塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸等の無機酸との塩、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、フマール酸、シュウ酸、酒石酸、乳酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸等の有機酸との塩；タンニン酸、カルボキシメチルセルロース、ポリ乳酸、ポリグリコール酸等の重合酸との塩；等を挙げることができる。
【００２２】
更に、本発明の汗分泌促進剤は、ＰＡＣＡＰ誘導体又はその製薬学的に許容される塩を含有することができる。
ＰＡＣＡＰ誘導体とは、例えば、ＰＡＣＡＰのポリペプチド構造中における一部のアミノ酸が削除若しくは置換されたもの、又は、ＰＡＣＡＰのポリペプチド構造中に他のアミノ酸が挿入された汗分泌促進作用を有するものを言う。
【００２３】
ＰＡＣＡＰ誘導体の製薬学的に許容される塩、合成法等は、前記したＰＡＣＡＰのものと同様のものが使用又は適用できる。
ＰＡＣＡＰ若しくはＰＡＣＡＰ誘導体又はそれらの塩は、単離されたものや精製されたものが好ましく、抽出したものや合成したものが好ましい。
【００２４】
汗分泌促進剤中のＰＡＣＡＰ若しくはＰＡＣＡＰ誘導体又はそれらの製薬学的に許容される塩の含有量は、汗分泌を促進することができれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。ＰＡＣＡＰ若しくはＰＡＣＡＰ誘導体又はそれらの製薬学的に許容される塩の合計量が、汗分泌促進剤全体に対して、１０−１２ｍｏｌ／Ｌ〜１０−４ｍｏｌ／Ｌ含有されていることが好ましく、１０−１１ｍｏｌ／Ｌ〜１０−５ｍｏｌ／Ｌ含有されていることが更に好ましく、１０−１０ｍｏｌ／Ｌ〜１０−６ｍｏｌ／Ｌ含有されていることが特に好ましい。
【００２５】
前記ＰＡＣＡＰ、ＰＡＣＡＰ誘導体、及びそれらの製薬学的に許容される塩は、何れか１つを汗分泌促進剤に含有させてもよいし、２種以上を併用してもよい。２種以上併用する場合の、前記汗分泌促進剤中の各々の化合物の含有比については、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００２６】
また、本発明の汗分泌促進剤は、ＰＡＣＡＰ、ＰＡＣＡＰ誘導体、及びそれらの製薬学的に許容される塩に加えて、「その他の成分」を含有することができる。
【００２７】
前記汗分泌促進剤における、上記「その他の成分」としては、特に制限はなく、本発明の効果を損なわない範囲内で、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、薬学的に許容され得る担体等が挙げられる。
かかる担体としては、特に制限はなく、例えば、後述する剤型等に応じて適宜選択することができる。また、前記汗分泌促進剤中の前記「その他の成分」の含有量としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００２８】
［ドライスキン予防薬又は治療薬］
本発明のドライスキン予防薬又は治療薬は、前記汗分泌促進剤を含有する。
【００２９】
本発明のドライスキン予防薬又は治療薬全体に対する、前記汗分泌促進剤の含有量は、特に制限がなく、目的に応じて適宜選択することができるが、自然免疫活性化剤全体を１００質量部としたときに、汗分泌促進剤が、０．００１〜１００質量部であることが好ましく、より好ましくは０．０１〜９９質量部、特に好ましくは０．１〜９５質量部、更に好ましくは１〜９０質量部である。
【００３０】
本発明のドライスキン予防薬又は治療薬の剤型としては、特に制限はなく、例えば、後述するような所望の投与方法に応じて適宜選択することができる。
具体的には、例えば、経口固形剤（錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等）、経口液剤（内服液剤、シロップ剤、エリキシル剤等）、注射剤（溶剤、懸濁剤等）、軟膏剤、貼付剤、ゲル剤、クリーム剤、外用散剤、スプレー剤、吸入散布剤等が挙げられる。
【００３１】
前記経口固形剤としては、例えば、前記汗分泌促進剤に、賦形剤、更には必要に応じて、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味・矯臭剤等の添加剤を加え、常法により製造することができる。
前記賦形剤としては、例えば、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、微結晶セルロース、珪酸等が挙げられる。
前記結合剤としては、例えば、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロース、エチルセルロース、シェラック、リン酸カルシウム、ポリビニルピロリドン等が挙げられる。
前記崩壊剤としては、例えば、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、乳糖等が挙げられる。
前記滑沢剤としては、例えば、精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ砂、ポリエチレングリコール等が挙げられる。
前記着色剤としては、例えば、酸化チタン、酸化鉄等が挙げられる。
前記矯味・矯臭剤としては、例えば、白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸等が挙げられる。
【００３２】
前記経口液剤としては、例えば、前記汗分泌促進剤に、矯味・矯臭剤、緩衝剤、安定化剤等の添加剤を加え、常法により製造することができる。
前記矯味・矯臭剤としては、例えば、白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸等が挙げられる。前記緩衝剤としては、例えば、クエン酸ナトリウム等が挙げられる。前記安定化剤としては、例えば、トラガント、アラビアゴム、ゼラチン等が挙げられる。
【００３３】
前記注射剤としては、例えば、前記汗分泌促進剤に、ｐＨ調節剤、緩衝剤、安定化剤、等張化剤、局所麻酔剤等を添加し、常法により皮下用、筋肉内用、静脈内用等の注射剤を製造することができる。
前記ｐＨ調節剤及び前記緩衝剤としては、例えば、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム等が挙げられる。前記安定化剤としては、例えば、ピロ亜硫酸ナトリウム、ＥＤＴＡ、チオグリコール酸、チオ乳酸等が挙げられる。前記等張化剤としては、例えば、塩化ナトリウム、ブドウ糖等が挙げられる。前記局所麻酔剤としては、例えば、塩酸プロカイン、塩酸リドカイン等が挙げられる。
【００３４】
前記軟膏剤としては、例えば、前記汗分泌促進剤に、公知の基剤、安定剤、湿潤剤、保存剤等を配合し、常法により混合し、製造することができる。
前記基剤としては、例えば、流動パラフィン、白色ワセリン、サラシミツロウ、オクチルドデシルアルコール、パラフィン等が挙げられる。前記保存剤としては、例えば、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル等が挙げられる。
【００３５】
前記貼付剤としては、例えば、公知の支持体に前記軟膏剤としてのクリーム剤、ゲル剤、ペースト剤等を、常法により塗布し、製造することができる。前記支持体としては、例えば、綿、スフ、化学繊維からなる織布、不織布、軟質塩化ビニル、ポリエチレン、ポリウレタン等のフィルム、発泡体シート等が挙げられる。
【００３６】
本発明のドライスキン予防薬又は治療薬は、例えば、汗分泌促進機構の活性化を必要とする個体（例えば、健康維持や汗分泌を必要とする個体；癌や生活習慣病の予防や治療を必要とする個体；細菌、真菌、ウイルス等に感染した個体；等）に投与することにより使用することができる。
【００３７】
本発明のドライスキン予防薬又は治療薬の投与対象動物としては、特に制限はないが、例えば、ヒト；マウス；ラット；サル；ウマ；ウシ、ブタ、ヤギ、ニワトリ等の家畜；ネコ、イヌ等のペット；等が挙げられる。
【００３８】
また、前記ドライスキン予防薬又は治療薬の投与方法としては、特に制限はなく、例えば、前記汗分泌促進剤の剤型等に応じ、適宜選択することができ、経口投与、腹腔内投与、血液中への注射、腸内への注入等が挙げられる。
また、前記ドライスキン予防薬又は治療薬の投与量としては、特に制限はなく、投与対象である個体の年齢、体重、所望の効果の程度等に応じて適宜選択することができるが、例えば、成人への１日の投与量は、有効成分の量として、１ｍｇ〜３０ｇが好ましく、１０ｍｇ〜１０ｇがより好ましく、１００ｍｇ〜３ｇが特に好ましい。
また、前記ドライスキン予防薬又は治療薬の投与時期としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、予防的に投与されてもよいし、治療的に投与されてもよい。
【実施例】
【００３９】
以下、実施例及び試験例に基づき本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例等の具体的範囲に限定されるものではない。「％」は、特に断りのない限り「質量％」を示す。
【００４０】
［実験動物］
マウス（野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、雄）は三共ラボサービス社から購入し、１５〜１９週齢の雄マウスを使用した。動物実験に関するすべての実験手法は昭和大学の動物実験委員会からの承認済である。
【００４１】
［実験で用いたヒトのサンプル］
ヒトの皮膚試料（平均年齢４５．３±１４才、男２人、女４人）は、足底の良性腫瘍を摘出するために外科手術を行った患者から得られた。すべての患者からインフォームドコンセントを行い、本実験への参加に対して同意を得た。摘出された皮膚の正常箇所を実験に用いた。本実験は昭和大学医学部の倫理委員会からの承認済である。
【００４２】
［全ＲＮＡ抽出とＲＴ−ＰＣＲ］
全ＲＮＡ抽出及びＲＴ−ＰＣＲは公知の手法を用いた。全ＲＮＡはＱＩＡＧＥＮ  ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて、試料粉から抽出した。全ＲＮＡ試料をまず、ＲＮａｓｅフリーＤＮａｓｅ（Stratagene社）で処理し、AffinityScript QPCR cDNA Synthesis Kit（Stratagene社）を用いて２０μＬの反応混合液中でｃＤＮＡを合成した。ＲＴ−ＰＣＲはｃＤＮＡを含む反応混合液中で行い、プライマーセット及びEmerald Amp PCR Master Mix（宝酒造社）、及びS1000 thermal cycler（BIO RAD社）を用いた。そして、電気泳動を１％ＴＡＥバッファー下で１００Ｖ、２５分行った。ゲルは臭化エチジウムで染色し、染色されたバンドはChemiDoc XRS+（BIO RAD社）を用いて可視化した。
【００４３】
［和田・高垣法による汗分泌の評価］
汗が分泌された汗腺は和田・高垣法（ヨードデンプン反応を利用したミラー法の変法）を用いて可視化した。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（ｎ＝１０）を体重１ｇ当たり１０μＬのペントバルビタール（共立製薬社）を用いて麻酔した後、マウスの足に１０％のポビドン・ヨード液（ハウゾウメディカル社）を塗布した。乾燥後、５０％のコーンスターチ液（和光純薬工業社）を含むひまし油で塗布した。５μＬのＰＡＣＡＰ（濃度：０、１×１０−１０、１×１０−８、１×１０−６（ｍｏｌ／Ｌ））を図６ａ及びｂに記載のプロトコールに基づいて肉趾に皮下注射した。別の実験では、生理食塩水又は１×１０−５ｍｏｌ／ＬのＰＡＣＡＰ６−３８を１×１０−６ｍｏｌ／ＬのＰＡＣＡＰ又はＶＩＰを投与する１０分前に注射した（図１０）。写真中の黒点は発汗していることを示し、黒点の数を数えることにより定量解析を行った。
【００４４】
［免疫組織化学］
マウスをペントバルビタールナトリウム（１ｋｇ当たり５０ｍｇの割合で腹腔内投与）で麻酔し、生理食塩水で経心灌流し、その後４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を含む５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．２）を灌流した。肉趾を回収し、４％ＰＦＡを添加し、４℃で一晩置いた。２０％スクロースを含む０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．２）に４℃下で浸した後、肉趾をＯ．Ｃ．Ｔ．コンパウンド（サクラファインテックジャパン社）中に包埋し、凍結させた。凍結させた切片をミクロトーンで５μｍの厚さにカットした。
実験で用いるヒトの組織は、Ｏ．Ｃ．Ｔ．コンパウンド（サクラファインテックジャパン社）中に包埋し、液体窒素で凍結させた。凍結させた切片をミクロトーンで５μｍの厚さにカットした。ヒトのサンプルには、免疫染色３０分前に４％ＰＦＡを添加した。
【００４５】
[[単免疫染色（single immunostaining）]]
組織切片を含む顕微鏡スライドをリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．２）で洗浄した。切片をクエン酸（１０ｍＭ、ｐＨ６．０）下で、８５℃で２０分処理した。内在性ペルオキシダーゼの反応を止めるために０．３％過酸化水素を含むＰＢＳで処理した後、切片を５％正常ウマ血清（ＮＨＳ）含有ＰＢＳで非特異的結合を阻止するために６０分処理した。その後、切片をウサギ抗ＰＡＣ１Ｒポリクローナル抗体（１：４００、本発明者らにより作製）の存在下で、４℃で一晩インキュベートした。その後、切片をＰＢＳで洗浄し、ビオチン化したヤギ抗ウサギＩｇＧ（１：２００、Santa Cruz Biotechnology社）の存在下で、室温で２時間インキュベートし、アビジン−ビオチン複合体溶液（Vector社）により反応させ、色原体としてジアミノベンジジン（Vector社）を用いた。核をヘマトキシリンで対比染色した。単免疫染色は、顕微鏡（ＡＸ７０、オリンパス社）を用いて検出した。
【００４６】
[[二重染色（double immunostaining）]]
切片をＰＢＳ（ｐＨ７．２）で洗浄し、クエン酸（１０ｍＭ、ｐＨ６．０）下で、８５℃で２０分処理した。その後、切片を５％正常ウマ血清（ＮＨＳ）含有ＰＢＳで６０分処理した。そして切片を、一次抗体としてウサギ抗ＰＡＣ１Ｒポリクローナル抗体（１：４００、本発明者らにより作製）及びマウス抗平滑筋アクチン（ＳＭＡ）モノクローナル抗体（１：４００、R&D SYSTEMS社）の存在下で一晩インキュベートした。その後切片をＰＢＳで洗浄し、Ａｌｅｘａ５４６抗ウサギＩｇＧ抗体（１：４００、Life Technologies社）とＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８抗マウスＩｇＧ抗体（１：４００、Life Technologies社）で可視化した。そして、対比染色のために、核を４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）塩酸塩（dihydrochloride）（１：１００００、Roche社）で染色した。画像はApoTome（Zeiss社、図２）及びニコンＡ１共焦点顕微鏡（ニコン社、図３）を用いて取得した。
【００４７】
［統計解析］
データは平均値±ＳＥＭで示す。Tukey-Kramer HSD検定を用いて実験結果を評価した。ｐ＜０．０５の場合、統計学的に有意であると判断した。
【００４８】
試験例１
＜汗腺における発現量の比較＞
汗腺は、ヒトでは大きく分けてエクリン汗腺とアポクリン汗腺がある一方、マウスにはエクリン汗腺のみが存在する。汗腺は、腺房部、腺房部を覆う筋上皮細胞及び導管部からなり、腺房部で汗が生成され、その汗は導管部を通り汗として分泌される。また、汗分泌は交感神経により調節されている。
【００４９】
まず、ＰＡＣＡＰ受容体の局在を調べるために蛍光免疫染色を用い、マウスの足底の７μｍ凍結切片及びヒトの足底の５μｍ凍結切片を使用し一次抗体としてＰＡＣＡＰの受容体の一つであるＰＡＣ１受容体抗体（本発明者らにより作製）、筋上皮細胞マーカーであるＳＭＡ抗体（R&D SYSTEMS，Minneapolis，USA，１：４００）を、二次抗体としてＡｌｅｘａ５４６標識抗ウサギＩｇＧ（life technologies，Carlsbad，CA，１：４００）、Ａｌｅｘａ４８８標識抗マウスＩｇＧ（life technologies，１：４００）を用い、ＤＡＰＩ（Roche，Mannheim，Germany，１：１００００）による核染色後に蛍光共焦点顕微鏡Ａ１（Nikon，Tokyo，Japan）を用いてＰＡＣ１受容体の陽性反応を観察した。結果を図１〜３に示す。
【００５０】
ＲＴ−ＰＣＲ（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction）法ではマウスの皮膚からＲＮＡを抽出し、逆転写反応によりｃＤＮＡを作製した。ＰＡＣＡＰ、ＶＩＰ、ＰＡＣ１受容体（「ＰＡＣ１Ｒ」と略記する場合がある）、ＶＰＡＣ１受容体（「ＶＰＡＣ１Ｒ」と略記する場合がある）、ＶＰＡＣ２受容体（「ＶＰＡＣ２Ｒ」と略記する場合がある）に対するプライマーを用いてＰＣＲを行った。結果を図４に示す。
【００５１】
蛍光免疫染色の観察結果より、汗腺にはＰＡＣ１Ｒ陽性細胞が認められた（図１〜３）。マウスの汗腺の切片をＰＡＣ１Ｒ（赤）及び平滑筋アクチン（ＳＭＡ、緑）で二重染色した結果、多くのＰＡＣ１Ｒ陽性細胞が分泌細胞で確認されたが、ＳＭＡとＰＡＣ１Ｒの染色は重複しなかった（図２）。
また、免疫組織染色によって、ヒトとマウスの足底の汗腺でのＰＡＣＡＰ及びＰＡＣ１Ｒの局在は同様のものであることがわかった。免疫組織染色によって、エクリン腺の分泌細胞でＰＡＣ１Ｒの強い染色が見られ、導管でも染色が見られ、マウスでも同様の結果が得られた（図１）。ヒト汗腺をＰＡＣ１Ｒ（赤）及びＳＭＡ（緑）を用いて二重染色した結果、多くのＰＡＣ１Ｒ陽性細胞が分泌細胞で確認された（図３）。
以上の結果は、ＰＡＣＡＰの汗分泌における役割はヒトと齧歯動物とでは類似していることが示唆された。
【００５２】
ＲＴ−ＰＣＲにより、マウスの皮膚において、ＰＡＣＡＰ、ＶＩＰ、ＰＡＣ１Ｒ、ＶＰＡＣ１Ｒ、ＶＰＡＣ２ＲのｍＲＮＡの発現が認められた（図４）。
【００５３】
更にマウスの足底から得られた組織抽出物にＰＡＣＡＰ及びその受容体が発現しているかどうかをＲＴ−ＰＣＲを用いて調べた。ＰＡＣＡＰ、ＶＩＰ、ＰＡＣ１Ｒ、ＶＰＡＣ１Ｒ及びＶＰＡＣ２ＲのｍＲＮＡ転写産物は肉趾の皮膚で検出された（図５）。ＶＩＰ及びＰＡＣ１ＲのｍＲＮＡ発現量は多かった一方、ＰＡＣＡＰ，ＶＰＡＣ１Ｒ及びＶＰＡＣ２ＲのｍＲＮＡ発現量はＶＩＰ及びＰＡＣ１Ｒに比べ少なかった。
【００５４】
試験例２
＜ＰＡＣＡＰによる汗分泌促進＞
次に生理食塩水（生食、vehicle）、ＰＡＣＡＰ３８（ペプチド研究所、大阪）（以下、単に「ＰＡＣＡＰ」と略記する場合がある）を図６ａに示すプロトコールに従って、ペントバルタール腹腔内麻酔下（１０倍希釈、１０μＬ／体重１ｇ）のマウスの足底（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、雄、１８〜２０週齢）に、濃度を１０−１０〜１０−６Ｍ（ｍｏｌ／Ｌ）と変化させて、体重１ｇあたり５μＬの量を局所注射した。汗の発現量は和田・高垣法（Ｍｉｎｏｒ変法）を用い測定した。
【００５５】
具体的には、ＰＡＣＡＰ局所注射前に足底に１０％ポビドンヨード液を塗布し、十分乾燥させた後に可溶性デンプンとヒマシ油との混合液を薄く塗り、発汗開始に伴い汗孔に一致してヨードデンプン反応が起こり、極微小な黒色の着色点が現れる。
これによりＰＡＣＡＰ投与前、投与後６０分、９０分、１２０分とデジタルカメラで足底を撮影し、黒点の数を数え測定した。発汗の黒点数が多い程、汗分泌が促進されたことを示す。
【００５６】
生理食塩水及びＰＡＣＡＰ（１０−６Ｍ）を投与前、投与後１２０分の発汗の黒点を撮影した結果を図７に示した。図７（上）は生理食塩水（Ｓａｌｉｎｅ）を投与した場合であり、図７（下）はＰＡＣＡＰを投与した場合である。図７中の矢印は、発汗の黒点の一部を指している。
生理食塩水投与と比較して、ＰＡＣＡＰ１０−６Ｍ投与では、１２０分後に発汗が観察された。
【００５７】
また、ＰＡＣＡＰ投与後の汗分泌量の変化を、ＰＡＣＡＰ投与前、投与後６０分、９０分、１２０分の黒点の数を数えて結果を図８、図９ａに示した。
生理食塩水投与群（saline又はvehicle）と比較してＰＡＣＡＰ１０−６Ｍ投与群では、１２０分後に発汗量が有意に増加した（図８、図９ａ）。一方、ＰＡＣＡＰ１０−１０Ｍ又はＰＡＣＡＰ１０−８Ｍを投与した場合、統計学的に有意に発汗の増加は認められなかった。ＰＡＣＡＰ効果による汗分泌は、用量依存性の傾向で、促進された。
【００５８】
ピロカルピン（非選択性のムスカリン受容体アゴニスト）をマウスの肉趾に注射すると、発汗（functional sweet gland）は１５分後に確認された（図示せず）。一方、ＰＡＣＡＰの場合は１２０分後に発汗が確認された。
そこで、ＰＡＣＡＰの効果は麻酔によって影響を受けるか否かを確認するため、ＰＡＣＡＰ又はコントロールを、図６ｂに示すプロトコールに従って、麻酔してから６０分後にマウスの肉趾に注射した。
【００５９】
結果を図９ｂに示す。１×１０−６ｍｏｌ／Ｌ（Ｍ）のＰＡＣＡＰを注射したマウスでは、ＰＡＣＡＰを注射してから６０分後（麻酔してから１２０分後）には、汗の分泌は増加せず（図９ｂ左）、ＰＡＣＡＰを注射してから９０分後（麻酔してから１５０分後）に汗の分泌量が大きく増えた（図９ｂ右）。この結果は、ＰＡＣＡＰによる汗分泌の効果はゆっくりであり、麻酔が切れたときから効果が出てきたものと示唆された。
【００６０】
また、ＰＡＣＡＰの効果は局所的なものか、全体に効果を及ぼすものかを検証するために、ＰＡＣＡＰを投与した側と投与していない側での汗の分泌量の違いを検証した。
検証結果を図９ｃに示す。汗の分泌量は、ＰＡＣＡＰ注射をした側（injected side）でのみ大きく増加し、反対側の足の皮膚（non-injected side）では汗の分泌量は増加しなかった（図９ｃ）。この結果は、ＰＡＣＡＰはマウスの肉趾に存在する受容体と局所的に反応することにより、汗の分泌が促進されたことが示唆される。更に意外なことに、ＰＡＣＡＰノックアウトマウスではピロカルピン投与後通常の汗の分泌が確認された（図示せず）。
これらの結果から、ＰＡＣＡＰはアセチルコリン受容体依存性経路を介して汗分泌に関与していることが示唆された。
【００６１】
試験例３
＜ＰＡＣＡＰによる汗分泌促進に関与する受容体の探索＞
次に、どの受容体がＰＡＣＡＰによる効果に関与しているかを調べるために、ＰＡＣ１Ｒのアンタゴニスト（ＰＡＣＡＰ６−３８）とＶＰＡＣ１Ｒ及びＶＰＡＣ２Ｒのアンタゴニスト（ＶＩＰ）を用いて、図１０に示すプロトコールに従って検証を行った。
【００６２】
結果を図１１に示す。（ii）１×１０−６ｍｏｌ／ＬのＰＡＣＡＰのみを注射した場合、実験を開始してから１２０分及び１５０分後に汗の分泌量が大きく増加していた。一方、（iii）実験開始直後にＰＡＣＡＰ６−３８、１０分後にＰＡＣＡＰを投与した場合、汗の分泌量は有意に増加しなかった。（iv）実験開始１０分後にＶＩＰを投与した場合も、汗の分泌量は有意に増加しなかった。
これらの結果から、ＰＡＣＡＰの局所投与により汗分泌が促進され、その効果は汗腺に発現しているＰＡＣ１Ｒを介して発揮されていることが示唆された。
【００６３】
試験例４
＜ヒトにおけるＰＡＣＡＰ及びＰＡＣ１Ｒの発現＞
ヒトの足底の皮膚における、ＰＡＣＡＰとＰＡＣ１ＲのｍＲＮＡ発現量の個体間での違いを立証するために、ＲＴ−ＰＣＴを行った。ＰＡＣＡＰのｍＲＮＡの発現量は、脳と比較して、足底の皮膚（plantar dermis）ではかなり少なかった（図１２）。一方、ＰＡＣ１Ｒの発現量は、足底の皮膚と脳では大きな違いは見られなかった。２つのヒトのサンプルを比較しても、ＰＡＣＡＰとＰＡＣ１Ｒそれぞれ発現量に違いはなかった。以上の結果は、ヒトの個体間で発現量に大きな違いはなかったことを示唆している。
【００６４】
＜考察＞
本試験例等により、in vivoで汗の分泌を促進するという、汗腺でのＰＡＣＡＰの役割を証明した。ＰＡＣＡＰ及びその受容体がマウスの皮膚で発現していることを確かめ、ＰＡＣＡＰの投与によりＰＡＣ１Ｒを介した汗の分泌が誘導されることがわかった。ＰＡＣ１Ｒ陽性細胞の多くはマウス及びヒト汗腺の分泌細胞で観察された。これらの結果は、発汗においてＰＡＣＡＰが重要な役割を担っていることを示し、発汗障害に関する病態生理学の理解が重要であることも示している。そして、本試験例等により初めて、エクリン腺でのＰＡＣＡＰによる汗分泌が促進されたことを示した。
【００６５】
汗分泌におけるＰＡＣＡＰの効果を検証し、ＰＡＣＡＰを皮下注射された野生型マウスで、用量依存的に汗の分泌が促進された。既に知られているが、ムスカリン受容体を介したアセチルコリン刺激により発汗が促進される。ピロカルピンをマウスの肉趾に投与したとき、５分で汗の分泌（functional sweat gland）が検出された（図示せず）。一方で、ＰＡＣＡＰを投与した場合は、１２０分後に観察された（図９ｄ）。このデータは、ＰＡＣＡＰはムスカリン受容体を間接的に刺激している、又は汗腺での他の発汗作用経路若しくはメカニズムに関与していることを示唆している。
これまでの研究でアクアポリン−５（ＡＱＰ５）が唾液腺、粘膜下腺、汗腺における分泌に関与していることが報告されている。ＡＱＰ５はイソプロテレノール投与後に、顎下腺及び耳下腺の腺房細胞の頂端膜で速やかにかつ瞬間的に、ｃＡＭＰシグナル経路を介したＰＫＡによりリン酸化される。一方で、ピロカルピン投与ではリン酸化されない。したがって、ＡＱＰ５はＰＡＣＡＰによる汗分泌に関与している可能性が考えられる。
【００６６】
健康なヒトにin vivoでＰＡＣＡＰを静脈注射すると、ＶＰＡＣ１Ｒを介して１５分後に（３０分後がピーク）、血管拡張、紅潮及び浮腫が誘導されることが報告されている。また、他には、ラットにＰＡＣＡＰを静脈注射したとき、３つの主な唾液腺において、唾液分泌の促進が見られたことが報告されている。本発明の結果を考慮すると、ＰＡＣＡＰは様々な外分泌や皮膚での血管拡張に重要な役割を有していることが示唆される。そして、ＰＡＣＡＰが相反する機能を示すのは、ＰＡＣＡＰの作用は受容体のサブタイプによって大きく影響を受け、他の栄養に関する因子やシグナル伝達分子が存在することを強く示唆している。
【００６７】
エクリン腺に関するこれまでの研究では、ＶＩＰはｃＡＭＰ濃度が上昇することにより、汗分泌を刺激し、アセチルコリンを介した、及びアゴニストを介した汗分泌の両方の相乗剤として役割を担うことが示唆されている。一方で、ＰＡＣＡＰ投与で、ヒト汗腺におけるＡＣの細胞内局在が変化し、アデニル酸シクラーゼ、ｃＡＭＰ及びカテコールアミン分泌を刺激するＶＩＰより非常に強い変化が見られた。本発明者らにより、ＶＩＰ投与により汗分泌が促進されなかったことが立証された（図１１）。ＰＡＣＡＰはｃＡＭＰを介した、エクリン腺においてＶＩＰよりも重要な役割を担っている可能性がある。
【００６８】
汗腺におけるＰＡＣＡＰ受容体の局在、及び汗分泌における役割はこれまでに立証されていなかった。本発明により、ＰＡＣ１Ｒの陽性細胞の多くはマウス及びヒトの汗腺の分泌細胞に存在していることがわかった（図１）。汗分泌には、分泌細胞を囲む筋上皮細胞の収縮が必要であるが、ＰＡＣ１Ｒの陽性細胞は筋上皮細胞において重要ではない。このデータは、ＰＡＣＡＰは分泌細胞の周りの筋上皮細胞による汗分泌の促進には関与しておらず、分泌細胞の分泌活性自体を促進していることを示唆している。
【００６９】
まとめると、ＰＡＣＡＰの局所投与は汗分泌を促進し、その効果は汗腺の分泌細胞に発現しているＰＡＣ１Ｒを介していることが考えられる。ＰＡＣＡＰは健康人及び臨床的障害を有する患者についても汗分泌を促進するか検討する必要がある。ＰＡＣＡＰ及びその受容体は新規の治療方法を提供し、臨床的障害がある場合の発汗の新たな機構の解明を提供できる可能性がある。
【００７０】
＜実施例の総括＞
本発明により（特に試験例２から）、ＰＡＣＡＰが汗分泌を促進していることが分かった。
本発明により（特に試験例１から）、ＰＡＣＡＰは、何らかのＰＡＣＡＰ受容体を活性化することにより、汗分泌促進を誘導することが明らかになり、試験例３からＰＡＣ１Ｒを介して汗分泌促進を誘導することが示唆された。また、汗腺にはＰＡＣＡＰのレセプターが存在することが確認された。更にＰＡＣＡＰの製薬学的に許容される塩、ＰＡＣＡＰ誘導体又はその製薬学的に許容される塩についてもＰＡＣＡＰ受容体を活性化することにより汗分泌促進が誘導される可能性が示唆された。
【産業上の利用可能性】
【００７１】
本発明の汗分泌促進剤は、ドライスキンの症状改善のための医薬として利用できるほか、ドライスキンケア用化粧品や機能性食品等として広く利用可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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