(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
宿主細胞ゲノムの複数（ｎ個）の標的部位に複数（ｎ個）の外来性核酸を組み込むための方法であって、
前記宿主細胞が、真菌細胞、細菌細胞、植物細胞、および昆虫細胞からなる群より選択され、
さらに、ここで、ｎは、少なくとも２であり、該方法は、
（ａ）１つまたはそれを超える単離された宿主細胞を、
（ｉ）該複数の外来性核酸であって、ここで、ｘは、１からｎまで変動する整数であり、各整数ｘに対して、外来性核酸（ＥＳ）ｘの各々が、該宿主細胞ゲノムの該複数（ｎ個）の標的部位から選択される標的部位（ＴＳ）ｘにおいて、相同組換えを介して組み換わることができる外来性核酸；
（ｉｉ）該標的部位（ＴＳ）ｘの各々に対して、（ＴＳ）ｘに断裂を作製することができるヌクレアーゼ（Ｎ）ｘ；
（ｉｉｉ）直鎖状核酸；および
（ｉｖ）１つもしくはそれを超えるさらなる直鎖状核酸
と接触させる工程であり、ここで、前記直鎖状核酸は、該宿主細胞と接触される前記さらなる直鎖状核酸との相同組換えが可能であり、該相同組換えによって、選択マーカーのコード配列を含む環状の染色体外核酸が形成される、工程；
ならびに
（ｂ）該選択マーカーを発現する宿主細胞を選択する工程
を含む、方法。
【請求項２】
前記直鎖状核酸が、前記宿主細胞と接触されるさらなる直鎖状核酸の相同性領域と組み換わることができる相同性領域を含み、２つの該直鎖状核酸の相同組換えによって、前記選択マーカーを発現する前記環状の染色体外核酸が形成される、請求項１に記載の方法であって、
必要に応じて、さらに、該直鎖状核酸が、該選択マーカーの部分的なコード配列、中断されたコード配列および／または不連続のコード配列を含み、該選択マーカーは、該直鎖状核酸から発現され得ず、該環状の染色体外核酸の該形成によって、該選択マーカーの完全なコード配列が形成され、該選択マーカーは、該環状の染色体外核酸から発現され得る、方法。
【請求項３】
工程（ｂ）の前記選択する工程が、視覚的検出法、比色法または蛍光検出法によって前記選択マーカーの発現を検出する工程を含む、請求項１または２のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
ＥＳがＴＳにおいて相同的に組み換えられた宿主細胞を回収する工程をさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法であって、
必要に応じて、さらに、
（ａ）該回収する工程が、前記宿主細胞ゲノムへの選択マーカーの組込みを必要としないか；または
（ｂ）該回収する工程が、スクリーニングされた１０、９、８、７、６、５、４、３もしくは２個の接触された宿主細胞毎またはそれらのクローン集団毎に少なくとも約１回の頻度で行われる、方法。
【請求項５】
（ａ）単一のヌクレアーゼが、（ＴＳ）ｘの各々を切断することができるか；または
（ｂ）ｎ＝３、４、５、６、７、８、９または１０である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
ＥＳが、第１の相同性領域（ＨＲ１）および第２の相同性領域（ＨＲ２）を含み、ここで、ＨＲ１およびＨＲ２は、相同組換えを介して、それぞれ第３の相同性領域（ＨＲ３）および第４の相同性領域（ＨＲ４）と組み換わることができ、ＨＲ３およびＨＲ４は各々、ＴＳに存在する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法であって、
必要に応じて、さらに、
（ａ）Ｎが、ＴＳに一本鎖断裂または二本鎖断裂をもたらすことができるか；または、
（ｂ）ＥＳが、直鎖状である、方法。
【請求項７】
ＥＳが、目的の核酸Ｄをさらに含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法であって、
必要に応じて、さらに、Ｄが、選択マーカー、プロモーター、エピトープタグをコードする核酸配列、目的の遺伝子、レポーター遺伝子、および終止コドンをコードする核酸配列からなる群より選択される、方法。
【請求項８】
前記環状の染色体外核酸が、前記ヌクレアーゼのコード配列をさらに含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法であって、必要に応じて、さらに、該ヌクレアーゼが、ＲＮＡガイドＤＮＡエンドヌクレアーゼであり、必要に応じて、さらに、該ヌクレアーゼが、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼである、方法。
【請求項９】
前記環状の染色体外核酸が、前記ＲＮＡガイドＤＮＡエンドヌクレアーゼによるＴＳの部位特異的な認識および切断を可能にする、ｃｒＲＮＡ活性およびｔｒａｃｒＲＮＡ活性をコードする配列をさらに含む、請求項８に記載の方法であって、
必要に応じて、さらに、該ｃｒＲＮＡ活性および該ｔｒａｃｒＲＮＡ活性が、単一の連続したＲＮＡ分子として発現される、方法。
【請求項１０】
前記ヌクレアーゼが、エンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬ−エフェクターＤＮＡ結合ドメイン−ヌクレアーゼ融合タンパク質（ＴＡＬＥＮ）、トランスポザーゼおよび部位特異的リコンビナーゼからなる群より選択される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法であって、必要に応じて、さらに、
（ａ）該ジンクフィンガーヌクレアーゼが、操作されたジンクフィンガー結合ドメインに融合されたタイプＩＩＳ制限エンドヌクレアーゼの切断ドメインを含む融合タンパク質であり、該タイプＩＩＳ制限エンドヌクレアーゼが、ＨＯエンドヌクレアーゼおよびＦｏｋＩエンドヌクレアーゼからなる群より選択され、該ジンクフィンガー結合ドメインが、３、５または６つのジンクフィンガーを含むか；あるいは、
（ｂ）該エンドヌクレアーゼが、
（ｉ）ＬＡＧＬＩＤＡＤＧホーミングエンドヌクレアーゼ、ＨＮＨホーミングエンドヌクレアーゼ、Ｈｉｓ−Ｃｙｓボックスホーミングエンドヌクレアーゼ、ＧＩＹ−ＹＩＧホーミングエンドヌクレアーゼおよびシアノバクテリアホーミングエンドヌクレアーゼからなる群より選択されるホーミングエンドヌクレアーゼであるか；
（ｉｉ）Ｈ−ＤｒｅＩ、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＳｃｅＶ、Ｉ−ＳｃｅＶＩ、Ｉ−ＳｃｅＶＩＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、Ｉ−ＣｅｕＡＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＶＰ、Ｉ−ＴｌｉＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｐｉ−ＰｓｐＩ、Ｆ−ＳｃｅＩ、Ｆ−ＳｃｅＩＩ、Ｆ−ＳｕｖＩ、Ｆ−ＣｐｈＩ、Ｆ−ＴｅｖＩ、Ｆ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＡｍａＩ、Ｉ−ＡｎｉＩ、Ｉ−ＣｈｕＩ、Ｉ−ＣｍｏｅＩ、Ｉ−ＣｐａＩ、Ｉ−ＣｐａＩＩ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＣｖｕＩ、Ｉ−ＣｖｕＡＩＰ、Ｉ−ＤｄｉＩ、Ｉ−ＤｄｉＩＩ、Ｉ−ＤｉｒＩ、Ｉ−ＤｍｏＩ、Ｉ−ＨｍｕＩ、Ｉ−ＨｍｕＩＩ、Ｉ−ＨｓＮＩＰ、Ｉ−ＬｌａＩ、Ｉ−ＭｓｏＩ、Ｉ−ＮａａＩ、Ｉ−ＮａｎＩ、Ｉ−ＮｃｌＩＰ、Ｉ−ＮｇｒＩＰ、Ｉ−ＮｉｔＩ、Ｉ−ＮｊａＩ、Ｉ−Ｎｓｐ２３６ＩＰ、Ｉ−ＰａｋＩ、Ｉ−ＰｂｏＩＰ、Ｉ−ＰｃｕＩＰ、Ｉ−ＰｃｕＡＩ、Ｉ−ＰｃｕＶＩ、Ｉ−ＰｇｒＩＰ、Ｉ−ＰｏｂＩＰ、Ｉ−ＰｏｒＩ、Ｉ−ＰｏｒＩＩＰ、Ｉ−ＰｂｐＩＰ、Ｉ−ＳｐＢｅｔａＩＰ、Ｉ−ＳｃａＩ、Ｉ−ＳｅｘＩＰ、Ｉ−ＳｎｅＩＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩ、Ｉ−ＳｐｏｍＣＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩＩＰ、Ｉ−ＳｑｕＩＰ、Ｉ−Ｓｓｐ６８０３１、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＪＰ、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＳＴ３Ｐ、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＳＴｅ３ｂＰ、Ｉ−ＴｄｅＩＰ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩＩ、ｉ−ＵａｒＡＰ、ｉ−ＵａｒＨＧＰＡＩＰ、Ｉ−ＵａｒＨＧＰＡ１３Ｐ、Ｉ−ＶｉｎＩＰ、Ｉ−ＺｂｉＩＰ、ＰＩ−ＭｇａＩ、ＰＩ−ＭｔｕＩ、ＰＩ−ＭｔｕＨＩＰ、ＰＩ−ＭｔｕＨＩＩＰ、ＰＩ−ＰｆｕＩ、ＰＩ−ＰｆｕＩＩ、ＰＩ−ＰｋｏＩ、ＰＩ−ＰｋｏＩＩ、ＰＩ−Ｒｍａ４３８１２ＩＰ、ＰＩ−ＳｐＢｅｔａＩＰ、ＰＩ−ＳｃｅＩ、ＰＩ−ＴｆｕＩ、ＰＩ−ＴｆｕＩＩ、ＰＩ−ＴｈｙＩ、ＰＩ−ＴｌｉＩまたはＰＩ−ＴｌｉＩＩからなる群より選択されるか；または
（ｉｉｉ）内在性ゲノム配列に特異的に結合するように改変されており、該改変されたエンドヌクレアーゼは、もはやその野生型エンドヌクレアーゼ認識配列に結合せず、該エンドヌクレアーゼは（ｉ）または（ｉｉ）の野生型エンドヌクレアーゼに由来する、方法。
【請求項１１】
前記宿主細胞が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである真菌細胞である、
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
宿主細胞であって、
（ｉ）該宿主細胞ゲノムの標的部位（ＴＳ）において、相同組換えを介して組み換わることができる、外来性核酸（ＥＳ）；
（ｉｉ）ＴＳにおいて断裂をもたらすことができるヌクレアーゼ（Ｎ）；
（ｉｉｉ）直鎖状核酸として該宿主細胞に導入される核酸；および
（ｉｖ）該宿主細胞内の１つもしくはそれを超えるさらなる直鎖状核酸
を含む、宿主細胞であって、
ここで、前記核酸は、前記さらなる直鎖状核酸との相同組換えが可能であり、該相同組換えによって、選択マーカーのコード配列を含む環状の染色体外核酸が形成される、核酸であり、
必要に応じて、さらに、該直鎖状核酸が、該宿主細胞内のさらなる直鎖状核酸の相同性領域と組み換わることができる相同性領域を含み、
必要に応じて、さらに、該直鎖状核酸が、該選択マーカーの部分的なコード配列、中断されたコード配列および／または不連続のコード配列を含み、該選択マーカーは、該直鎖状核酸から発現され得ず、該環状の染色体外核酸の該形成によって、該選択マーカーの完全なコード配列が形成され、該選択マーカーは、該環状の染色体外核酸から発現され得る、宿主細胞。
【請求項１３】
前記宿主細胞が、
（ｉ）複数の外来性核酸であって、ここで、
ｘは、１からｎまで変動する整数であり、各整数ｘに対して、外来性核酸（ＥＳ）ｘの各々は、該宿主細胞ゲノムの前記複数（ｎ個）の標的部位から選択される標的部位（ＴＳ）ｘにおいて、相同組換えを介して組み換わることができる、外来性核酸；
（ｉｉ）該標的部位（ＴＳ）ｘの各々に対して、（ＴＳ）ｘにおいて断裂をもたらすことができるヌクレアーゼ（Ｎ）ｘ
を含む、請求項１２に記載の宿主細胞。
【請求項１４】
ＥＳが、目的の核酸Ｄをさらに含む、請求項１２または１３に記載の宿主細胞であって、必要に応じて、さらに、Ｄが、選択マーカー、プロモーター、エピトープタグをコードする核酸配列、目的の遺伝子、レポーター遺伝子、および終止コドンをコードする核酸配列からなる群より選択される、宿主細胞。
【請求項１５】
前記環状の染色体外核酸が、前記ヌクレアーゼのコード配列をさらに含む、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の宿主細胞であって、必要に応じて、さらに、該ヌクレアーゼが、ＲＮＡガイドＤＮＡエンドヌクレアーゼであり、必要に応じて、さらに、該ヌクレアーゼが、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼである、宿主細胞。
【請求項１６】
前記環状の染色体外核酸が、前記ＲＮＡガイドＤＮＡエンドヌクレアーゼによるＴＳの部位特異的な認識および切断を可能にする、ｃｒＲＮＡ活性およびｔｒａｃｒＲＮＡ活性をコードする配列をさらに含む、請求項１５に記載の宿主細胞であって、必要に応じて、さらに、該ｃｒＲＮＡ活性および該ｔｒａｃｒＲＮＡ活性が、単一の連続したＲＮＡ分子として発現される、宿主細胞。
【請求項１７】
前記ヌクレアーゼが、エンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬ−エフェクターＤＮＡ結合ドメイン−ヌクレアーゼ融合タンパク質（ＴＡＬＥＮ）、トランスポザーゼおよび部位特異的リコンビナーゼからなる群より選択される、請求項１２〜１６のいずれか１項に記載の宿主細胞であって、必要に応じて、さらに、
（ａ）該ジンクフィンガーヌクレアーゼが、操作されたジンクフィンガー結合ドメインに融合されたタイプＩＩＳ制限エンドヌクレアーゼの切断ドメインを含む融合タンパク質であり、該タイプＩＩＳ制限エンドヌクレアーゼが、ＨＯエンドヌクレアーゼおよびＦｏｋＩエンドヌクレアーゼからなる群より選択され、該ジンクフィンガー結合ドメインが、３、５または６つのジンクフィンガーを含むか；あるいは
（ｂ）該エンドヌクレアーゼが、
（ｉ）ＬＡＧＬＩＤＡＤＧホーミングエンドヌクレアーゼ、ＨＮＨホーミングエンドヌクレアーゼ、Ｈｉｓ−Ｃｙｓボックスホーミングエンドヌクレアーゼ、ＧＩＹ−ＹＩＧホーミングエンドヌクレアーゼおよびシアノバクテリアホーミングエンドヌクレアーゼからなる群より選択されるホーミングエンドヌクレアーゼであるか；
（ｉｉ）Ｈ−ＤｒｅＩ、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＳｃｅＶ、Ｉ−ＳｃｅＶＩ、Ｉ−ＳｃｅＶＩＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、Ｉ−ＣｅｕＡＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＶＰ、Ｉ−ＴｌｉＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｐｉ−ＰｓｐＩ、Ｆ−ＳｃｅＩ、Ｆ−ＳｃｅＩＩ、Ｆ−ＳｕｖＩ、Ｆ−ＣｐｈＩ、Ｆ−ＴｅｖＩ、Ｆ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＡｍａＩ、Ｉ−ＡｎｉＩ、Ｉ−ＣｈｕＩ、Ｉ−ＣｍｏｅＩ、Ｉ−ＣｐａＩ、Ｉ−ＣｐａＩＩ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＣｖｕＩ、Ｉ−ＣｖｕＡＩＰ、Ｉ−ＤｄｉＩ、Ｉ−ＤｄｉＩＩ、Ｉ−ＤｉｒＩ、Ｉ−ＤｍｏＩ、Ｉ−ＨｍｕＩ、Ｉ−ＨｍｕＩＩ、Ｉ−ＨｓＮＩＰ、Ｉ−ＬｌａＩ、Ｉ−ＭｓｏＩ、Ｉ−ＮａａＩ、Ｉ−ＮａｎＩ、Ｉ−ＮｃｌＩＰ、Ｉ−ＮｇｒＩＰ、Ｉ−ＮｉｔＩ、Ｉ−ＮｊａＩ、Ｉ−Ｎｓｐ２３６ＩＰ、Ｉ−ＰａｋＩ、Ｉ−ＰｂｏＩＰ、Ｉ−ＰｃｕＩＰ、Ｉ−ＰｃｕＡＩ、Ｉ−ＰｃｕＶＩ、Ｉ−ＰｇｒＩＰ、Ｉ−ＰｏｂＩＰ、Ｉ−ＰｏｒＩ、Ｉ−ＰｏｒＩＩＰ、Ｉ−ＰｂｐＩＰ、Ｉ−ＳｐＢｅｔａＩＰ、Ｉ−ＳｃａＩ、Ｉ−ＳｅｘＩＰ、Ｉ−ＳｎｅＩＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩ、Ｉ−ＳｐｏｍＣＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩＩＰ、Ｉ−ＳｑｕＩＰ、Ｉ−Ｓｓｐ６８０３１、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＪＰ、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＳＴ３Ｐ、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＳＴｅ３ｂＰ、Ｉ−ＴｄｅＩＰ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩＩ、ｉ−ＵａｒＡＰ、ｉ−ＵａｒＨＧＰＡＩＰ、Ｉ−ＵａｒＨＧＰＡ１３Ｐ、Ｉ−ＶｉｎＩＰ、Ｉ−ＺｂｉＩＰ、ＰＩ−ＭｇａＩ、ＰＩ−ＭｔｕＩ、ＰＩ−ＭｔｕＨＩＰ、ＰＩ−ＭｔｕＨＩＩＰ、ＰＩ−ＰｆｕＩ、ＰＩ−ＰｆｕＩＩ、ＰＩ−ＰｋｏＩ、ＰＩ−ＰｋｏＩＩ、ＰＩ−Ｒｍａ４３８１２ＩＰ、ＰＩ−ＳｐＢｅｔａＩＰ、ＰＩ−ＳｃｅＩ、ＰＩ−ＴｆｕＩ、ＰＩ−ＴｆｕＩＩ、ＰＩ−ＴｈｙＩ、ＰＩ−ＴｌｉＩまたはＰＩ−ＴｌｉＩＩからなる群より選択されるか；または
（ｉｉｉ）内在性ゲノム配列に特異的に結合するように改変されており、該改変されたエンドヌクレアーゼは、もはやその野生型エンドヌクレアーゼ認識配列に結合せず、該エンドヌクレアーゼは（ｉ）または（ｉｉ）の野生型エンドヌクレアーゼに由来する、宿主細胞。
【請求項１８】
細胞培養培地ならびに請求項１２〜１７のいずれか１項に記載の宿主細胞を含む、細胞培養組成物。
【請求項１９】
宿主細胞ゲノムの標的部位に外来性核酸を組み込むための方法であって、
前記宿主細胞が、酵母細胞または細菌細胞であり、
該方法は、
（ａ）１つまたはそれを超える単離された宿主細胞を、
（ｉ）該宿主細胞ゲノムの該標的部位（ＴＳ）において、相同組換えを介して組み換わることができる外来性核酸（ＥＳ）；
（ｉｉ）直鎖状核酸；および
（ｉｉｉ）１つもしくはそれを超えるさらなる直鎖状核酸
と接触させる工程であり、ここで、前記直鎖状核酸は、前記さらなる直鎖状核酸との相同組換えが可能な直鎖状核酸であって、該相同組換えによって、選択マーカーのコード配列およびＴＳにおいて断裂をもたらすことができるヌクレアーゼ（Ｎ）のコード配列を含む環状の染色体外核酸が形成される、工程；
ならびに
（ｂ）該選択マーカーを発現する宿主細胞を選択する工程
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２０１３年１２月１９日に出願された米国仮特許出願第６１／９１８，６２５号および２０１４年２月７日に出願された米国仮特許出願第６１／９３７，４４４号の利益を主張し、当該出願の各々は、その全体が参考として援用される。
１．発明の分野
本明細書中に提供される方法および組成物は、概して、分子生物学および遺伝子操作の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
２．背景
宿主細胞のゲノムに改変を標的化導入する遺伝子操作の技法は、種々の分野において用途が見出されている。基本的には、遺伝子型が表現型にどのように影響するのかを明らかにすることは、挿入または欠失を標的化導入することにより、天然の遺伝子機能を損なうかまたは無効にする能力に依存する。合成生物学の分野において、目的の化合物を産生することができる遺伝的に改変された微生物の作製には、カスタマイズされたＤＮＡ配列を宿主細胞の染色体に挿入することが必要であり；工業規模での生産には、一般に、数十個の遺伝子、例えば、生合成経路全体を単一の宿主ゲノムに導入することが必要である。治療の状況において、正確なゲノムの改変を導入する能力は、単一遺伝子欠陥に起因する疾患、例えば、Ｘ連鎖重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）、血友病Ｂ、ベータサラセミア、嚢胞性線維症、筋ジストロフィおよび鎌状赤血球症に対処する非常に大きな潜在能力を有する。
【０００３】
ゲノム操作の近年の進歩により、様々な細胞型および生物にわたって実質的に任意の遺伝子の操作および／または導入が可能になった。特に、部位特異的なデザイナーヌクレアーゼの出現により、標的化された断裂（ｂｒｅａｋｓ）を宿主細胞のゲノムに導入することによって部位特異的な遺伝子改変、すなわち、ゲノム編集が可能になった。これらのヌクレアーゼとしては、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）およびクラスター化規則性散在短パリンドローム反復（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  ｓｈｏｒｔ  ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  ｒｅｐｅａｔｓ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）ベースのＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ（ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ）が挙げられる。ＺＦＮは、とりわけ、作物において標的遺伝子座を改変するため（Ｗｒｉｇｈｔら、Ｐｌａｎｔ  Ｊ  ４４：６９３−７０５（２００５））、治療用抗体を発現する哺乳動物細胞培養系を改善するため（Ｍａｌｐｈｅｔｔｅｓら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ  １０６（５）：７７４−７８３（２０１０））、およびヒトゲノムを編集してＨＩＶへの耐性を惹起するために（Ｕｒｎｏｖら、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ  １１（９）：６３６−６４６（２０１０））、利用されている。同様に、ＴＡＬＥＮは、作物植物（Ｌｉら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３０：３９０−３９２（２０１２））、ヒト、ウシおよびマウス（Ｘｕら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ−Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ２，ｅ１１２（２０１３））のゲノムをはじめとした種々のゲノムを改変するために利用されている。より最近では、ＣＲＩＳＰＲは、細菌（例えば、Ｊｉａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３１（３）：２３３−２３９（２０１３）；Ｑｉら、Ｃｅｌｌ，５，１１７３−１１８３（２０１３）；酵母（例えば、ＤｉＣａｒｌｏら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，７，４３３６−４３４３（２０１３））；ゼブラフィッシュ（例えば、Ｈｗａｎｇら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３，２２７−２２９（２０１３））；ショウジョウバエ（例えば、Ｇｒａｔｚら、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１９４，１０２９−１０３５（２０１３））；ヒト細胞（例えば、Ｃｏｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ６１２１，８１９−８２３，（２０１３）；Ｍａｌｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，６１２１，８２３−８２６（２０１３）；Ｃｈｏら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３，２３０−２３２（２０１３））；および植物（例えば、Ｊｉａｎｇら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４１（２０）：ｅ１８８（２０１３））；Ｂｅｌｈａｊら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ９（３９）（２０１３））のゲノムを編集するために首尾良く利用されている。
【０００４】
部位特異的ヌクレアーゼは、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）、一本鎖アニーリング（ＳＳＡ）および相同組換え修復（ｈｏｍｏｌｏｇｙ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｒｅｐａｉｒ）（ＨＤＲ）をはじめとした、宿主細胞の細胞ＤＮＡの修復機構を刺激する、染色体ＤＮＡの断裂を誘導する。ヌクレアーゼによって誘導される二本鎖断裂（ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ｂｒｅａｋ）（ＤＳＢ）のＮＨＥＪ媒介性修復は、標的化された部位に小さな欠失または挿入を導入して、例えばフレームシフト変異による遺伝子機能の機能障害または無効をもたらす。別のＤＮＡ分子が関わらない多工程の酵素的プロセスによって、その同じ分子の断裂された末端が再度つなげられる。ＮＨＥＪは、誤りがちで不正確であり、修復中に、断裂部位に不定のサイズの種々の予測不可能な挿入および欠失を有する変異対立遺伝子をもたらす。同様に、ＳＳＡは、ＤＳＢに隣接する配列リピート由来の相補鎖が互いにアニールしたときに生じ、その結果、ＤＳＢは修復されるが、介在配列は欠失する。対照的に、ＨＤＲは、断裂の修復を助ける相同配列を有する別個の未損傷の分子に依存するので、通常、正確に修復された分子をもたらす。その細胞にとって天然のドナー相同配列の主な供給源は、２つある：細胞周期全体にわたって利用可能な相同染色体、および断裂された分子の姉妹染色分体（これは、ＤＮＡが複製された後にだけ利用可能である）。しかしながら、ゲノム操作の技法は、日常的に、ＤＳＢの標的部位と相同な領域を含む外来性ドナーＤＮＡを導入して、標的部位を組み換えることができる。外来性ドナーの中の標的配列に所望の改変を含めることによって、これらの改変は、ＨＤＲを介して元の標的配列に組み込まれ得、その配列を置き換え得る。
【０００５】
ＤＮＡの断裂がヌクレアーゼによって誘導されたとき、宿主細胞の修復経路の選択は、いくつかの因子に依存し、その結果が、所望のゲノム改変の精度を規定し得る。そのような因子としては、宿主細胞のＤＮＡ損傷シグナル伝達経路、断裂の性質、クロマチンリモデリング、特定の修復タンパク質の転写、および細胞周期の後期に存在するサイクリン依存性キナーゼ活性が挙げられる。例えば、Ｂｅｕｃｈｅｒら、ＥＭＢＯ  Ｊ  ２８：３４１３−２７（２００９）；Ｓｏｒｅｎｓｅｎら、Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ７：１９５−２０１（２００５）；Ｊａｚａｙｅｒｉら、Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ８：３７−４５（２００６）；Ｈｕｅｒｔａｓら、Ｎａｔｕｒｅ４５５：６８９−９２（２００８）；Ｍｏｙａｌら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ４１：５２９−４２（２０１１）；およびＣｈｅｒｎｉｋｏｖａら、Ｒａｄｉａｔ  Ｒｅｓ１７４：５５８−６５（２０１０）を参照のこと。切断されたＤＮＡに対して強い相同性を有するドナーＤＮＡが存在する場合、相同組換えによるドナーの組込みのチャンスは、有意に上昇する。例えば、Ｍｏｅｈｌｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９：３０５５−３０６０（２００７）；Ｃｈｅｎら、Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，９，７５３−７５５（２０１１）を参照のこと。しかしながら、切断された標的部位に、相同なドナーＤＮＡがＨＤＲを介して組み込まれる全頻度は、ＮＨＥＪを介した標的部位の非組込み修復（ｎｏｎ−ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ  ｒｅｐａｉｒ）とは対照的に、なおもかなり低い可能性がある。最近の研究は、ＨＤＲ媒介性編集が、一般に低効率事象であり、精度の低いＮＨＥＪが、ＤＳＢに対する修復機構として優勢であり得ることを示唆している。
【０００６】
例えば、Ｍａｌｉら（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３９：８２３−８２６（２０１３））は、ＣＲＩＳＰＲ（ガイドＲＮＡおよびＣａｓ９エンドヌクレアーゼ）および同時に供給される一本鎖ドナーＤＮＡを用いて、ヒトＫ５６２細胞において遺伝子改変を試みたところ、ＡＡＶＳ１遺伝子座におけるＨＤＲ媒介性の遺伝子改変は２．０％の頻度で観察されたのに対し、同じ遺伝子座におけるＮＨＥＪ媒介性の標的化された変異誘発は、３８％の頻度で観察された。Ｌｉら（Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（８）：６８８−９１（２０１３））は、ＣＲＩＳＰＲ（ガイドＲＮＡおよびＣａｓ９エンドヌクレアーゼ）および同時に供給される二本鎖ドナーＤＮＡを用いて、植物Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａにおいて遺伝子置換を試みたところ、ＨＤＲ媒介性の遺伝子置換は９．０％の頻度で観察されたのに対し、ＮＨＥＪ媒介性の標的化された変異誘発は、１４．２％の頻度で観察された。Ｋａｓｓら（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１１０（１４）：５５６４−５５６９（２０１３））は、多様な系統に由来する正常な初代体細胞型においてＨＤＲを調べたところ、マウスの胚性線維芽細胞および成体線維芽細胞、ならびに乳腺上皮、卵巣および新生仔脳に由来する細胞が、Ｉ−ＳｃｅＩエンドヌクレアーゼによって誘導されるＤＳＢにおいておよそ１％（０．６５〜１．７％）の頻度でＨＤＲを起こしたことを観察した。Ｋａｓｓらは、細胞が細胞周期のＳ期およびＧ２期にあるとき、より高いＨＤＲ活性を報告した。Ｌｉら（Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（８）：６８８−９１（２０１３））は、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａにおいて、細胞周期の主要なアクチベーターであるＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ＣＹＣＤ３（サイクリンＤ−タイプ３）の共発現によって異所的な細胞分裂を引き起こすことによってＨＤＲを増加させる可能性を試験した；しかしながら、これは、ＨＤＲの割合をほとんど上昇させなかった（ＣＹＣＤ３なしの９％から１１．１％まで）。ＨＤＲの割合を改善するストラテジーは、拮抗的なＮＨＥＪ修復機構をノックアウトすることも含んだ。例えば、Ｑｉら（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ  ２３：５４７−５５４（２０１３））は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓにおいて、ｋｕ７０変異体に対してＨＤＲ媒介性の遺伝子ターゲティングの５〜１６倍の増加およびｌｉｇ４変異体に対して３〜４倍の増加を報告した。しかしながら、全体的な割合は、約５％以下であると観察され、ほとんどが１％未満だった。さらに、ｋｕ７０またはｌｉｇ４変異は、所望の遺伝子標的化事象が生じた後に、変異植物から削除されなければならなかった。
【０００７】
ほとんどの細胞型においてＨＤＲ媒介性組込みの割合が比較的低いことを考えると、染色体への外来性ＤＮＡの挿入には、通常、所望の組込み事象を起こした形質転換された細胞の富化を可能にする選択マーカーを同時に組み込むことが必要である。しかしながら、これは、下流の適用と適合しない可能性がある外来配列をゲノムに導入するものであり、マーカーの長期間の発現は、悪影響を及ぼすこともある。例えば、ヒト細胞のゲノムにネオマイシン耐性遺伝子を組み込んだ後、Ｇ４１８中での長時間の培養は、細胞の特色を変化させると報告されており、高感度緑色蛍光タンパク質（enhanced  green  flurorescent  protein）（ＥＧＦＰ）および他の蛍光タンパク質の発現は、免疫原性および毒性を引き起こすと報告されている。例えば、Ｂａｒｅｓｅら、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２２：６５９−６６８（２０１１）；Ｍｏｒｒｉｓら、Ｂｌｏｏｄ  １０３：４９２−４９９（２００４）；およびＨａｎａｚｏｎｏら、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ８：１３１３−１３１９（１９９７）を参照のこと。さらに、遺伝的に改変された（ＧＭ）植物における選択マーカー遺伝子の組込みは、他の生物への水平伝播に関する懸念を高め；抗生物質耐性マーカーの場合は、これらのマーカーが抗生物質耐性菌株の増加をもたらし得るという特別な懸念がある。同様の懸念には、除草剤耐性マーカーの組込みおよび新しい非常に強い雑草が誕生する可能性に関するものがある。少なくとも、より後の段階において、組み込まれたマーカー配列を除去することは、時間および大きな労働力を要する。これは、所与の宿主において限られた貯蔵場所（ｃａｃｈｅ）の選択マーカーしか利用可能でない場合、およびさらなる操作工程を可能にするためにマーカーを再利用しなければならない場合に、特に問題となる。したがって、ある特定の適用は、例えば、安全性および／または法規制順守のために、所望の表現型をもたらすのに必要な最低限の外来性配列だけを導入することを保証し、究極的には、全体的にマーカーの組込みの回避を要求し得る。
したがって、宿主細胞ゲノムへの１つまたはそれを超える外来性核酸のＨＤＲ媒介性組込みの効率および／または選択を改善する方法および組成物が必要とされている。さらに、選択マーカーのコード配列の共組込みを必要としないゲノム操作ストラテジーが必要とされている。これらのニーズおよび他のニーズが、本明細書中に提供される組成物および方法によって満たされる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｗｒｉｇｈｔら、Ｐｌａｎｔ  Ｊ  ４４：６９３−７０５（２００５）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
３．要旨
本明細書中に提供される方法および組成物は、相同組換え（ＨＲ）に適格性である宿主細胞を選択するための方法に関する。実施の理論に拘束されるものではないが、細胞集団の中のＨＲ適格性は、宿主細胞に導入される１つまたはそれを超える直鎖状フラグメントを相同的に組み換えて、選択マーカーを発現する環状ベクターを形成することができる宿主細胞を選択することによって選択され得ると考えられている。ここで、この特徴を利用することにより、１つまたはそれを超える外来性核酸を宿主細胞のゲノムに、ＨＲを介して部位特異的に組み込んだ宿主細胞の同定が向上する。いくつかの実施形態において、部位特異的組込みは、意図した組込み部位に断裂をもたらすことができる部位特異的ヌクレアーゼと宿主細胞ゲノムとを接触させることによって増強する。したがって、宿主細胞に、
（ｉ）宿主細胞ゲノムの１つまたはそれを超える標的部位に対する相同領域を有する１つまたはそれを超える外来性核酸；
（ｉｉ）意図した標的部位(複数可)に断裂を選択的にもたらすことができる１つまたはそれを超えるヌクレアーゼ；および
（ｉｉｉ）それ自体によって、または宿主細胞に導入された１つもしくはそれを超えるさらなる直鎖状ＤＮＡフラグメントと、相同的に組み換わることにより、選択マーカーを発現する環状の機能発現ベクターを形成することができる、直鎖状核酸
を導入すること
ならびに選択マーカーの発現について選択すること
によって、１つまたはそれを超える外来性核酸をそれらのそれぞれの標的部位(複数可)に組み込んだ細胞の共選択も達成される。本明細書中に提供される方法および組成物によって提供される所望の組込みを行った宿主細胞を回収する頻度が上昇すれば、別途操作が困難な遺伝子操作または処理が困難な宿主細胞の遺伝子操作が可能になり、より高次の操作デザイン、例えば、多重組込みの効率が改善される。
【００１０】
したがって、１つの態様において、宿主細胞ゲノムの１つまたはそれを超える標的部位に１つまたはそれを超える外来性核酸を組み込むための方法が本明細書中に提供され、その方法は、１つまたはそれを超える宿主細胞を、宿主細胞ゲノムの１つまたはそれを超える標的部位（ＴＳ）において、相同組換えを介して組み換わることができる１つまたはそれを超える外来性核酸（ＥＳ）；および各ＴＳにおいて断裂をもたらすことができる１つまたはそれを超えるヌクレアーゼ（Ｎ）と接触させる工程；ならびに相同組換えに適格性である宿主細胞を選択する工程を含む。いくつかの実施形態において、選択する工程は、外来性核酸が相同的に組み換えられた宿主細胞を選択する工程を含む。いくつかの実施形態において、相同的に組み換えられた核酸は、それ自体との相同組換えまたは１つもしくはそれを超えるさらなる直鎖状核酸との相同組換えが可能な直鎖状核酸である。いくつかの実施形態において、直鎖状核酸(複数可)は、相同組換えの際に環状核酸を形成する。いくつかの実施形態において、相同的に組み換えられた核酸は、選択マーカーをコードする。いくつかの実施形態において、環状核酸を形成する直鎖状核酸の相同組換えによって、選択マーカーのコード配列が形成される。
【００１１】
別の態様において、相同組換えに適格性である宿主細胞を選択する方法が本明細書中に提供され、その方法は、
（ａ）１つまたはそれを超える宿主細胞を、それ自体との相同組換えまたは細胞の集団と接触される１つもしくはそれを超えるさらなる直鎖状核酸との相同組換えが可能な直鎖状核酸と接触させる工程（ここで、前記相同組換えによって、選択マーカーのコード配列を含む環状の染色体外核酸が形成される）；および
（ｂ）選択マーカーを発現する宿主細胞を選択する工程
を含む。
【００１２】
別の態様において、宿主細胞ゲノムの標的部位に外来性核酸を組み込むための方法が本明細書中に提供され、その方法は、
（ａ）１つまたはそれを超える宿主細胞を、
（ｉ）宿主細胞ゲノムの標的部位（ＴＳ）において、相同組換えを介して組み換わることができる外来性核酸（ＥＳ）；
（ｉｉ）ＴＳに断裂をもたらすことができるヌクレアーゼ（Ｎ）；および
（ｉｉｉ）それ自体との相同組換えまたは宿主細胞と接触される１つもしくはそれを超えるさらなる直鎖状核酸との相同組換えが可能な直鎖状核酸（ここで、前記相同組換えによって、選択マーカーのコード配列を含む環状の染色体外核酸が形成される）；
と接触させる工程；
ならびに
（ｂ）選択マーカーを発現する宿主細胞を選択する工程
を含む。
【００１３】
いくつかの実施形態において、直鎖状核酸は、互いとの相同組換えが可能な２つの内部相同性領域を含み、ここで、その内部相同性領域の相同組換えによって、選択マーカーを発現する環状の染色体外核酸が形成される。いくつかの実施形態において、直鎖状核酸は、宿主細胞と接触されるさらなる直鎖状核酸の相同性領域と組み換わることができる相同性領域を含み、２つの直鎖状核酸の相同組換えによって、選択マーカーを発現する環状の染色体外の核酸が形成される。いくつかの実施形態において、直鎖状核酸は、選択マーカーの部分的なコード配列、中断されたコード配列および／または不連続のコード配列を含み、選択マーカーは、直鎖状核酸から発現され得ず、環状の染色体外核酸の前記形成によって、選択マーカーの完全なコード配列が形成され、選択マーカーは、環状の染色体外核酸から発現され得る。
【００１４】
いくつかの実施形態において、接触された宿主細胞(複数可)は、前記選択する工程の前に、少なくとも約１２、２４、３６、４８、７２時間または７２時間より長い期間にわたって培養される。いくつかの実施形態において、接触された細胞は、選択マーカーを発現しない細胞の生存に対して選択する培養条件下で培養される。いくつかの実施形態において、工程（ｂ）という前記選択する工程は、視覚的検出法、比色法または蛍光検出法によって、選択マーカーの発現を検出する工程を含む。いくつかの実施形態において、上記方法は、ＥＳがＴＳにおいて相同的に組み換えられた宿主細胞を回収する工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記回収する工程は、宿主細胞ゲノムへの選択マーカーの組込みを必要としない。いくつかの実施形態において、前記回収する工程は、スクリーニングされた１０、９、８、７、６、５、４、３もしくは２個の接触された宿主細胞毎またはそれらのクローン集団毎に、少なくとも約１回の頻度で行われる。いくつかの実施形態において、上記方法は、選択された宿主細胞から環状の染色体外の（ｅｘｔｒａｃｈｒｏｍａｓｏｍａｌ）核酸を除去する工程をさらに含む。
【００１５】
いくつかの実施形態において、上記方法は、複数（ｎ個）の外来性核酸を宿主細胞ゲノムの複数（ｎ個）の標的部位に組み込む工程を含み、ここで、ｎは、少なくとも２であり、工程（ａ）は、宿主細胞を、前記複数の外来性核酸（ここで、ｘは、１からｎまで変動する整数であり、各整数ｘに対して、外来性核酸（ＥＳ）ｘの各々は、前記宿主細胞ゲノムの前記複数（ｎ個）の標的部位から選択される標的部位（ＴＳ）ｘにおいて、相同組換えを介して組み換わることができる）と接触させる工程を含み；前記標的部位（ＴＳ）ｘの各々に対して、細胞は、（ＴＳ）ｘにおいて断裂をもたらすことができるヌクレアーゼ（Ｎ）ｘとも接触される。いくつかの実施形態において、単一のヌクレアーゼが、（ＴＳ）ｘの各々を切断することができる。いくつかの実施形態において、ｎ＝３、４、５、６、７、８、９または１０である。いくつかの実施形態において、（ＥＳ）ｘは、第１の相同性領域（ＨＲ１）ｘおよび第２の相同性領域（ＨＲ２）ｘを含み、ここで、（ＨＲ１）ｘおよび（ＨＲ２）ｘは、相同組換えを介して、それぞれ第３の相同性領域（ＨＲ３）ｘおよび第４の相同性領域（ＨＲ４）ｘと組み換わることができ、（ＨＲ３）ｘおよび（ＨＲ４）ｘは各々、ＴＳに存在する。いくつかの実施形態において、（Ｎ）ｘは、（ＴＳ）ｘに一本鎖断裂または二本鎖断裂をもたらすことができる。いくつかの実施形態において、（ＥＳ）ｘは、目的の核酸（Ｄ）ｘをさらに含む。いくつかの実施形態において、（Ｄ）ｘは、選択マーカー、プロモーター、エピトープタグをコードする核酸配列、目的の遺伝子、レポーター遺伝子、および終止コドンをコードする核酸配列からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、（ＥＳ）ｘは、直鎖状である。
【００１６】
いくつかの実施形態において、環状の染色体外核酸は、ヌクレアーゼのコード配列をさらに含む。いくつかの実施形態において、ヌクレアーゼは、ＲＮＡガイドＤＮＡエンドヌクレアーゼである。いくつかの実施形態において、ＲＮＡガイドＤＮＡエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼである。いくつかの実施形態において、環状の染色体外核酸は、ＲＮＡガイドＤＮＡエンドヌクレアーゼによるＴＳの部位特異的な認識および切断を可能にする、ｃｒＲＮＡ活性およびｔｒａｃｒＲＮＡ活性をコードする配列をさらに含む。いくつかの実施形態において、ｃｒＲＮＡ活性およびｔｒａｃｒＲＮＡ活性は、単一の連続したＲＮＡ分子として発現される。
【００１７】
いくつかの実施形態において、ヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬ−エフェクターＤＮＡ結合ドメイン−ヌクレアーゼ融合タンパク質（ＴＡＬＥＮ）、トランスポザーゼおよび部位特異的リコンビナーゼからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、ジンクフィンガーヌクレアーゼは、操作されたジンクフィンガー結合ドメインに融合されたタイプＩＩＳ制限エンドヌクレアーゼの切断ドメインを含む融合タンパク質である。いくつかの実施形態において、タイプＩＩＳ制限エンドヌクレアーゼは、ＨＯエンドヌクレアーゼおよびＦｏｋＩエンドヌクレアーゼからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、ジンクフィンガー結合ドメインは、３、５または６つのジンクフィンガーを含む。
【００１８】
いくつかの実施形態において、エンドヌクレアーゼは、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ（配列番号１）ホーミングエンドヌクレアーゼ、ＨＮＨホーミングエンドヌクレアーゼ、Ｈｉｓ−Ｃｙｓボックスホーミングエンドヌクレアーゼ、ＧＩＹ−ＹＩＧ（配列番号２）ホーミングエンドヌクレアーゼおよびシアノバクテリアホーミングエンドヌクレアーゼからなる群より選択されるホーミングエンドヌクレアーゼである。いくつかの実施形態において、エンドヌクレアーゼは、Ｈ−ＤｒｅＩ、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＳｃｅＶ、Ｉ−ＳｃｅＶＩ、Ｉ−ＳｃｅＶＩＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、Ｉ−ＣｅｕＡＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＶＰ、Ｉ−ＴｌｉＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｐｉ−ＰｓｐＩ、Ｆ−ＳｃｅＩ、Ｆ−ＳｃｅＩＩ、Ｆ−ＳｕｖＩ、Ｆ−ＣｐｈＩ、Ｆ−ＴｅｖＩ、Ｆ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＡｍａＩ、Ｉ−ＡｎｉＩ、Ｉ−ＣｈｕＩ、Ｉ−ＣｍｏｅＩ、Ｉ−ＣｐａＩ、Ｉ−ＣｐａＩＩ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＣｖｕＩ、Ｉ−ＣｖｕＡＩＰ、Ｉ−ＤｄｉＩ、Ｉ−ＤｄｉＩＩ、Ｉ−ＤｉｒＩ、Ｉ−ＤｍｏＩ、Ｉ−ＨｍｕＩ、Ｉ−ＨｍｕＩＩ、Ｉ−ＨｓＮＩＰ、Ｉ−ＬｌａＩ、Ｉ−ＭｓｏＩ、Ｉ−ＮａａＩ、Ｉ−ＮａｎＩ、Ｉ−ＮｃｌＩＰ、Ｉ−ＮｇｒＩＰ、Ｉ−ＮｉｔＩ、Ｉ−ＮｊａＩ、Ｉ−Ｎｓｐ２３６ＩＰ、Ｉ−ＰａｋＩ、Ｉ−ＰｂｏＩＰ、Ｉ−ＰｃｕＩＰ、Ｉ−ＰｃｕＡＩ、Ｉ−ＰｃｕＶＩ、Ｉ−ＰｇｒＩＰ、Ｉ−ＰｏｂＩＰ、Ｉ−ＰｏｒＩ、Ｉ−ＰｏｒＩＩＰ、Ｉ−ＰｂｐＩＰ、Ｉ−ＳｐＢｅｔａＩＰ、Ｉ−ＳｃａＩ、Ｉ−ＳｅｘＩＰ、Ｉ−ＳｎｅＩＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩ、Ｉ−ＳｐｏｍＣＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩＩＰ、Ｉ−ＳｑｕＩＰ、Ｉ−Ｓｓｐ６８０３１、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＪＰ、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＳＴ３Ｐ、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＳＴｅ３ｂＰ、Ｉ−ＴｄｅＩＰ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩＩ、ｉ−ＵａｒＡＰ、ｉ−ＵａｒＨＧＰＡＩＰ、Ｉ−ＵａｒＨＧＰＡ１３Ｐ、Ｉ−ＶｉｎＩＰ、Ｉ−ＺｂｉＩＰ、ＰＩ−ＭｇａＩ、ＰＩ−ＭｔｕＩ、ＰＩ−ＭｔｕＨＩＰ  ＰＩ−ＭｔｕＨＩＩＰ、ＰＩ−ＰｆｕＩ、ＰＩ−ＰｆｕＩＩ、ＰＩ−ＰｋｏＩ、ＰＩ−ＰｋｏＩＩ、ＰＩ−Ｒｍａ４３８１２ＩＰ、ＰＩ−ＳｐＢｅｔａＩＰ、ＰＩ−ＳｃｅＩ、ＰＩ−ＴｆｕＩ、ＰＩ−ＴｆｕＩＩ、ＰＩ−ＴｈｙＩ、ＰＩ−ＴｌｉＩまたはＰＩ−ＴｌｉＩＩからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、エンドヌクレアーゼは、内在性ゲノム配列に特異的に結合するように改変され、ここで、その改変されたエンドヌクレアーゼは、もはやその野生型エンドヌクレアーゼ認識配列に結合しない。いくつかの実施形態において、改変されたエンドヌクレアーゼは、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ（配列番号１）ホーミングエンドヌクレアーゼ、ＨＮＨホーミングエンドヌクレアーゼ、Ｈｉｓ−Ｃｙｓボックスホーミングエンドヌクレアーゼ、ＧＩＹ−ＹＩＧ（配列番号２）ホーミングエンドヌクレアーゼおよびシアノバクテリアホーミングエンドヌクレアーゼからなる群より選択されるホーミングエンドヌクレアーゼに由来する。いくつかの実施形態において、改変されたエンドヌクレアーゼは���Ｈ−ＤｒｅＩ、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＳｃｅＶ、Ｉ−ＳｃｅＶＩ、Ｉ−ＳｃｅＶＩＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、Ｉ−ＣｅｕＡＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＶＰ、Ｉ−ＴｌｉＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｐｉ−ＰｓｐＩ、Ｆ−ＳｃｅＩ、Ｆ−ＳｃｅＩＩ、Ｆ−ＳｕｖＩ、Ｆ−ＣｐｈＩ、Ｆ−ＴｅｖＩ、Ｆ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＡｍａＩ、Ｉ−ＡｎｉＩ、Ｉ−ＣｈｕＩ、Ｉ−ＣｍｏｅＩ、Ｉ−ＣｐａＩ、Ｉ−ＣｐａＩＩ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＣｖｕＩ、Ｉ−ＣｖｕＡＩＰ、Ｉ−ＤｄｉＩ、Ｉ−ＤｄｉＩＩ、Ｉ−ＤｉｒＩ、Ｉ−ＤｍｏＩ、Ｉ−ＨｍｕＩ、Ｉ−ＨｍｕＩＩ、Ｉ−ＨｓＮＩＰ、Ｉ−ＬｌａＩ、Ｉ−ＭｓｏＩ、Ｉ−ＮａａＩ、Ｉ−ＮａｎＩ、Ｉ−ＮｃｌＩＰ、Ｉ−ＮｇｒＩＰ、Ｉ−ＮｉｔＩ、Ｉ−ＮｊａＩ、Ｉ−Ｎｓｐ２３６ＩＰ、Ｉ−ＰａｋＩ、Ｉ−ＰｂｏＩＰ、Ｉ−ＰｃｕＩＰ、Ｉ−ＰｃｕＡＩ、Ｉ−ＰｃｕＶＩ、Ｉ−ＰｇｒＩＰ、Ｉ−ＰｏｂＩＰ、Ｉ−ＰｏｒＩ、Ｉ−ＰｏｒＩＩＰ、Ｉ−ＰｂｐＩＰ、Ｉ−ＳｐＢｅｔａＩＰ、Ｉ−ＳｃａＩ、Ｉ−ＳｅｘＩＰ、Ｉ−ＳｎｅＩＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩ、Ｉ−ＳｐｏｍＣＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩＩＰ、Ｉ−ＳｑｕＩＰ、Ｉ−Ｓｓｐ６８０３１、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＪＰ、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＳＴ３Ｐ、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＳＴｅ３ｂＰ、Ｉ−ＴｄｅＩＰ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩＩ、ｉ−ＵａｒＡＰ、ｉ−ＵａｒＨＧＰＡＩＰ、Ｉ−ＵａｒＨＧＰＡ１３Ｐ、Ｉ−ＶｉｎＩＰ、Ｉ−ＺｂｉＩＰ、ＰＩ−ＭｇａＩ、ＰＩ−ＭｔｕＩ、ＰＩ−ＭｔｕＨＩＰ  ＰＩ−ＭｔｕＨＩＩＰ、ＰＩ−ＰｆｕＩ、ＰＩ−ＰｆｕＩＩ、ＰＩ−ＰｋｏＩ、ＰＩ−ＰｋｏＩＩ、ＰＩ−Ｒｍａ４３８１２ＩＰ、ＰＩ−ＳｐＢｅｔａＩＰ、ＰＩ−ＳｃｅＩ、ＰＩ−ＴｆｕＩ、ＰＩ−ＴｆｕＩＩ、ＰＩ−ＴｈｙＩ、ＰＩ−ＴｌｉＩまたはＰＩ−ＴｌｉＩＩからなる群より選択されるエンドヌクレアーゼに由来する。
【００１９】
いくつかの実施形態において、宿主細胞は、原核細胞である。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、真核細胞である。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、真菌細胞、細菌細胞、植物細胞、昆虫細胞、鳥類細胞、魚類細胞および哺乳動物細胞からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、げっ歯類細胞、霊長類細胞およびヒト細胞からなる群より選択される哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、酵母細胞である。いくつかの実施形態において、酵母は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである。
【００２０】
別の態様において、宿主細胞ゲノムの標的部位（ＴＳ）において、相同組換えを介して組み換わることができる外来性核酸（ＥＳ）；ＴＳにおいて断裂をもたらすことができるヌクレアーゼ（Ｎ）；およびそれ自体との相同組換えまたは宿主細胞内の１つもしくはそれを超えるさらなる直鎖状核酸との相同組換えが可能な直鎖状核酸（ここで、前記相同組換えによって、選択マーカーのコード配列を含む環状の染色体外核酸が形成される）を含む宿主細胞が、本明細書中に提供される。いくつかの実施形態において、直鎖状核酸は、互いとの相同組換えが可能な２つの内部相同性領域を含み、ここで、その内部相同性領域の相同組換えによって、選択マーカーを発現する環状の染色体外核酸が形成される。いくつかの実施形態において、直鎖状核酸は、宿主細胞内のさらなる直鎖状核酸の相同性領域と組み換わることができる相同性領域を含み、ここで、２つの直鎖状核酸の相同組換えによって、選択マーカーを発現する環状の染色体外核酸が形成される。いくつかの実施形態において、直鎖状核酸は、選択マーカーの部分的なコード配列、中断されたコード配列および／または不連続のコード配列を含み、ここで、その選択マーカーは、直鎖状核酸から発現され得ず、環状の染色体外核酸の前記形成によって、選択マーカーの完全なコード配列が形成され、その選択マーカーは、その環状の染色体外核酸から発現され得る。
【００２１】
別の態様において、部位特異的ヌクレアーゼ、または部位特異的ヌクレアーゼのコード配列を含む核酸；および宿主細胞において互いとの相同組換えが可能な２つの内部相同性領域を含む直鎖状核酸（ここで、その内部相同性領域の相同組換えによって、選択マーカーのコード配列を含む環状核酸が形成される）を含む組成物が、本明細書中に提供される。いくつかの実施形態において、直鎖状核酸は、選択マーカーの部分的なコード配列、中断されたコード配列および／または不連続のコード配列を含み、その選択マーカーは、宿主細胞においてその直鎖状核酸から発現され得ず、環状核酸の前記形成によって、選択マーカーの完全なコード配列が形成され、その選択マーカーは、宿主細胞においてその環状核酸から発現され得る。
【００２２】
別の態様において、部位特異的ヌクレアーゼ、または部位特異的ヌクレアーゼのコード配列を含む核酸；ならびに第１の直鎖状核酸および１つまたはそれを超えるさらなる直鎖状核酸（ここで、その第１および第２の直鎖状核酸は、宿主細胞において互いとの相同組換えが可能であり、前記相同組換えによって、選択マーカーのコード配列を含む環状核酸が形成される）を含む組成物が、本明細書中に提供される。いくつかの実施形態において、各直鎖状核酸は、選択マーカーの部分的なコード配列、中断されたコード配列および／または不連続のコード配列を含み、選択マーカーは、宿主細胞において各直鎖状核酸から発現され得ず、環状核酸の前記形成によって、選択マーカーの完全なコード配列が形成され、選択マーカーは、宿主細胞において環状核酸から発現され得る。いくつかの実施形態において、環状核酸は、部位特異的ヌクレアーゼのコード配列をさらに含む。いくつかの実施形態において、部位特異的ヌクレアーゼは、ＲＮＡガイドＤＮＡエンドヌクレアーゼである。いくつかの実施形態において、ＲＮＡガイドＤＮＡエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼである。いくつかの実施形態において、組成物は、ｃｒＲＮＡ活性を有するリボ核酸およびｔｒａｃｒＲＮＡ活性を有するリボ核酸；またはｃｒＲＮＡ活性を有するリボ核酸をコードするデオキシリボ核酸およびｔｒａｃｒＲＮＡ活性を有するリボ核酸をコードするデオキシリボ核酸をさらに含む。いくつかの実施形態において、環状核酸は、ｃｒＲＮＡ活性を有するリボ核酸をコードするデオキシリボ核酸およびｔｒａｃｒＲＮＡ活性を有するリボ核酸をコードするデオキシリボ核酸をさらに含む。いくつかの実施形態において、ｃｒＲＮＡ活性およびｔｒａｃｒＲＮＡ活性をコードするデオキシリボ核酸は、単一の連続したＲＮＡ分子上で前記活性をコードする。他の実施形態において、部位特異的ヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬ−エフェクターＤＮＡ結合ドメイン−ヌクレアーゼ融合タンパク質（ＴＡＬＥＮ）、トランスポザーゼおよび部位特異的リコンビナーゼからなる群より選択される。上述の任意の組成物を含む宿主細胞も本明細書中に提供される。細胞培養培地および本明細書中に記載される任意の宿主細胞を含む細胞培養組成物も本明細書中に提供される。いくつかの実施形態において、細胞培養組成物は、選択マーカーの発現について選択する化合物をさらに含む。
【００２３】
別の態様において、第１の相同性領域（ＨＲ１）および第２の相同性領域（ＨＲ２）を含む直鎖状核酸も本明細書中に提供され、ここで、ＨＲ１およびＨＲ２は、相同組換えを介して互いと組み換わることができ、ＨＲ１とＨＲ２との相同組換えによって、選択マーカーのコード配列を含む環状核酸が形成される。いくつかの実施形態において、ＨＲ１は、選択マーカーの第１の不完全なコード配列を含み、ＨＲ２は、選択マーカーの第２の不完全なコード配列を含み、ＨＲ１とＨＲ２との相同組換えによって、選択マーカーの完全なコード配列が再構成される。いくつかの実施形態において、直鎖状核酸は、本明細書中に記載される部位特異的ヌクレアーゼのコード配列をさらに含む。
【００２４】
部位特異的ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によって媒介される、宿主細胞ゲノムへの１つまたはそれを超えるドナーＤＮＡのゲノム組込みのための方法および組成物も本明細書中に提供される。１つの態様において、宿主細胞ゲノムの１つまたはそれを超える標的部位に１つまたはそれを超える外来性核酸を組み込むための方法が本明細書中に提供され、その方法は、
（ａ）１つまたはそれを超える宿主細胞を、
（ｉ）宿主細胞ゲノムの１つまたはそれを超える標的部位（ＴＳ）において、相同組換えを介して組み換わることができる１つまたはそれを超える外来性ドナー核酸（ＥＳ）；
（ｉｉ）ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）；
（ｉｉｉ）ＲＧＥＮによる１つまたはそれを超えるＴＳの部位特異的な認識および切断を可能にする１つまたはそれを超えるリボ核酸；および
（ｉｖ）それ自体との相同組換えまたは宿主細胞と接触される１つまたはそれを超えるさらなる組換え前の直鎖状核酸との相同組換えが可能な組換え前の直鎖状核酸（ここで、前記相同組換えによって、選択マーカーのコード配列を含む環状の染色体外核酸が形成される）
と接触させる工程；
ならびに
（ｂ）選択マーカーを発現する宿主細胞を選択することにより、宿主細胞ゲノムの１つまたはそれを超える標的部位に１つまたはそれを超える外来性核酸を組み込んだ細胞を選択する工程
を含む。
【００２５】
いくつかの実施形態において、相同組換えによって、環状の染色体外核酸内に選択マーカーの完全なコード配列が形成される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの組換え前の直鎖状核酸は、ＲＮＡガイドＤＮＡエンドヌクレアーゼによるＴＳの部位特異的な認識および切断を可能にする１つまたはそれを超えるリボ核酸をコードする配列を含む。いくつかの実施形態において、その１つまたはそれを超えるリボ核酸は、単一の連続したガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子においてｃｒＲＮＡ活性およびｔｒａｃｒＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの組換え前の直鎖状核酸は、ＲＮＡガイドＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする配列を含む。いくつかの実施形態において、ＲＮＡガイドＤＮＡエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９である。
【００２６】
いくつかの実施形態において、環状の染色体外核酸の形成は、２つまたは３つの組換え前の直鎖状核酸の相同組換えに起因する。いくつかの実施形態において、１つまたはそれを超える組換え前の直鎖状核酸は、１つまたはそれを超える組換え前の核酸を含む１つまたはそれを超える環状核酸のＲＧＥＮ切断によってインビボにおいて生成される。いくつかの実施形態において、複数（ｎ個）の外来性核酸は、宿主細胞ゲノムの複数（ｎ個）の標的部位に組み込まれ、ここで、ｎは、少なくとも２であり、工程（ａ）は、宿主細胞を、
（ｉ）前記複数の外来性核酸（ここで、ｘは、１からｎまで変動する整数であり、各整数ｘに対して、外来性核酸（ＥＳ）ｘの各々は、前記宿主細胞ゲノムの前記複数（ｎ個）の標的部位から選択される標的部位（ＴＳ）ｘにおいて、相同組換えを介して組み換わることができる）；
（ｉｉ）前記標的部位（ＴＳ）ｘの各々に対して、ＲＧＥＮによる（ＴＳ）ｘの部位特異的な認識および切断を可能にするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）ｘ
と接触させる工程を含む。
【００２７】
いくつかの実施形態において、選択マーカーは、薬物耐性マーカー、蛍光タンパク質、または比色法もしくは蛍光検出法によって検出可能なタンパク質である。いくつかの実施形態において、ＥＳは、目的の核酸Ｄをさらに含む。いくつかの実施形態において、Ｄは、選択マーカー、プロモーター、エピトープタグをコードする核酸配列、目的の遺伝子、レポーター遺伝子、および終止コドンをコードする核酸配列からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、真菌細胞、細菌細胞、植物細胞、昆虫細胞、鳥類細胞、魚類細胞および哺乳動物細胞からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、接触された宿主細胞(複数可)は、前記選択する工程の前に、少なくとも約１２、２４、３６、４８、７２時間または７２時間より長い期間にわたって培養される。いくつかの実施形態において、接触された細胞は、選択マーカーを発現しない細胞の生存に対して選択する培養条件下で培養される。いくつかの実施形態において、工程（ｂ）の選択する工程は、視覚的検出法、比色法または蛍光検出法によって選択マーカーの発現を検出する工程を含む。
【００２８】
別の態様において、宿主細胞ゲノムの１つまたはそれを超える標的部位に１つまたはそれを超える外来性核酸を組み込むための組成物が本明細書中に提供され、その組成物は、
（ａ）宿主細胞ゲノムの１つまたはそれを超える標的部位（ＴＳ）において、相同組換えを介して組み換わることができる１つまたはそれを超える外来性ドナー核酸（ＥＳ）；
（ｂ）ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）または前記ＲＧＥＮをコードする核酸；
（ｃ）ＲＧＥＮによる１つもしくはそれを超えるＴＳの部位特異的な認識および切断を可能にする１つもしくはそれを超えるリボ核酸、または前記１つもしくはそれを超えるリボ核酸をコードする１つもしくはそれを超える核酸；および
（ｄ）それ自体とのインビボでの相同組換えまたは組成物中の１つもしくはそれを超えるさらなる組換え前の直鎖状核酸とのインビボでの相同組換えが可能な組換え前の直鎖状核酸（ここで、前記インビボでの相同組換えによって、選択マーカーのコード配列を含む環状の染色体外核酸が形成される）
を含む。
【００２９】
いくつかの実施形態において、前記相同組換えによって、環状の染色体外核酸内に選択マーカーの完全なコード配列が形成される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの組換え前の直鎖状核酸は、ＲＮＡガイドＤＮＡエンドヌクレアーゼによるＴＳの部位特異的な認識および切断を可能にする１つまたはそれを超えるリボ核酸をコードする配列を含む。いくつかの実施形態において、その１つまたはそれを超えるリボ核酸分子は、単一の連続したガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子においてｃｒＲＮＡ活性およびｔｒａｃｒＲＮＡ活性を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの組換え前の直鎖状核酸は、ＲＮＡガイドＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする配列を含む。いくつかの実施形態において、ＲＮＡガイドＤＮＡエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９である。いくつかの実施形態において、組成物は、相同的に組み換わることにより環状の染色体外核酸を形成することができる、２つまたは３つの組換え前の直鎖状核酸を含む。いくつかの実施形態において、１つまたはそれを超える組換え前の直鎖状核酸は、１つまたはそれを超える組換え前の核酸を含む１つまたはそれを超える環状核酸のＲＧＥＮ切断によってインビボにおいて生成される。
【００３０】
いくつかの実施形態において、組成物は、
（ａ）宿主細胞ゲノムの複数（ｎ個）の標的部位に組み込むことができる複数（ｎ個）の外来性核酸（ここで、ｎは、少なくとも２であり、ｘは、１からｎまで変動する整数であり、各整数ｘに対して、外来性核酸（ＥＳ）ｘの各々は、前記宿主細胞ゲノムの前記複数（ｎ個）の標的部位から選択される標的部位（ＴＳ）ｘにおいて、相同組換えを介して組み換わることができる）；ならびに
（ｂ）前記標的部位（ＴＳ）ｘの各々に対して、ＲＧＥＮによる（ＴＳ）ｘの部位特異的な認識および切断を可能にするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）ｘ
を含む。
【００３１】
いくつかの実施形態において、選択マーカーは、薬物耐性マーカー、蛍光タンパク質、または比色法もしくは蛍光検出法によって検出可能なタンパク質である。いくつかの実施形態において、ＥＳは、目的の核酸Ｄをさらに含む。いくつかの実施形態において、Ｄは、選択マーカー、プロモーター、エピトープタグをコードする核酸配列、目的の遺伝子、レポーター遺伝子、および終止コドンをコードする核酸配列からなる群より選択される。
【００３２】
別の態様において、本明細書中に記載される宿主細胞ゲノムの１つまたはそれを超える標的部位への１つまたはそれを超える外来性核酸のＲＧＥＮ媒介性組込みのための任意の組成物を含む宿主細胞が本明細書中に提供される。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、真菌細胞、細菌細胞、植物細胞、昆虫細胞、鳥類細胞、魚類細胞および哺乳動物細胞からなる群より選択される。
４．図面の簡単な説明
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】図１は、部位特異的ヌクレアーゼ（Ｎ）および２つの組換え前の分子（互いと相同組換え（ＨＲ）することにより、選択マーカー（ＧＦＰ）のコード配列を含む環状プラスミドを形成することができる）を使用した、宿主細胞における外来性核酸（Ｄ）のゲノム組込みの例示的な実施形態を提供している。この例では、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のコード配列が、２つの組換え前の分子の間で分割され、それらの２つの分子の間の重複する相同性領域のＨＲの際に、コード配列がインビボにおいて再構成される。選択マーカーの発現のための選択は、その標的部位に外来性核酸を組み込んだ細胞も選択し、選択の後、選択マーカーを含むプラスミドは、除去され得る。ＨＲ１−上流相同性領域；ＨＲ２−下流相同性領域；ＴＳ−標的部位；Ｎ−部位特異的ヌクレアーゼ；Ｄ−目的の核酸。
【００３４】
【図２】図２は、複数の部位特異的ヌクレアーゼおよび２つの組換え前の分子（互いと相同組換えすることにより、選択マーカー（ＧＦＰ）のコード配列を含む環状プラスミドを形成することができる）を使用した、宿主細胞における複数の外来性核酸の同時のゲノム組込みの例示的な実施形態を提供している。この例では、２つの組換え前の分子が、３つの外来性ドナーＤＮＡ（各々が、宿主細胞ゲノムの中のユニークな標的部位に特異的な相同性領域を有する）およびそれらの３つの標的部位において切断することができる１つまたはそれを超えるヌクレアーゼとともに同時に導入される。選択マーカーの発現のための選択は、そのそれぞれの標的部位に各外来性核酸を組み込んだ細胞も選択する。ＨＲ１−上流相同性領域；ＨＲ２−下流相同性領域；ＴＳ−標的部位；Ｎ−部位特異的ヌクレアーゼ；Ｄ−目的の核酸。
【００３５】
【図３】図３は、組換え前の分子のＨＲ媒介性アセンブリおよび外来性ドナーＤＮＡの標的化されたゲノム組込みが可能な細胞を選択するための２つの例示的な実施形態を提供している。図３Ａは、蛍光ベースの選択マーカーを含むプラスミドのＨＲ媒介性形成に基づく選択ストラテジーを表している。宿主細胞を、１つまたはそれを超える外来性ドナーＤＮＡ、１つまたはそれを超える組換え前の分子（ｍｏｌｅｃｌｕｌｅ）（これは、インビボＨＲ媒介性アセンブリの際に、蛍光ベースの選択マーカー（例えば、ＧＦＰ）を含む環状プラスミドを形成する）、および必要に応じて、宿主細胞ゲノムの１つまたはそれを超える標的部位を切断することができる１つまたはそれを超える部位特異的ヌクレアーゼで形質転換する。ＨＲ適格性細胞は、蛍光によって標識され（marked）、フローサイトメトリーなどの標準的な技法を用いて宿主細胞集団から単離され得る。図３Ｂは、薬物ベースの選択マーカーのＨＲ媒介性形成に基づく選択ストラテジーを表している。この実施形態では、ＨＲ適格性細胞は、薬物耐性によって標識され、適切な選択的作用物質を含む培地中で培養されたとき生き残るのに対して、ＨＲに適格性でない薬物感受性細胞は、排除される。いずれかの選択スキームの下で単離された細胞またはクローン細胞集団は、増え、１つまたはそれを超える外来性ドナーＤＮＡの標的化された組込みを有することについて、例えば、ゲノム標的領域のＰＣＲおよび／または配列決定によって確認され得る。
【００３６】
【図４Ａ】図４は、本明細書中に提供されるゲノム組込みの方法において有用な例示的な組換え前の組成物を提供している。本明細書中に記載される任意の組換え前の組成物に対して、それらの組成物は、直鎖状核酸分子として直接、宿主細胞に形質転換され得るか、あるいは、組換え前の分子を含む親環状分子が、宿主細胞に導入され、１つまたはそれを超えるヌクレアーゼによってインビボにおいて切断されることにより、組換え前の分子が遊離され得る。ＨＲ適格性の宿主細胞では、組換え前の直鎖状分子(複数可)が、相同的に組み換わることにより、選択マーカーを含む環状ベクターを形成する。図４Ａは、マーカープラスミドの１ピースインビボアセンブリのための組換え前の分子の２つの例示的な実施形態を表している。（Ｌ）単一の組換え前の直鎖状分子が、選択マーカー（ＧＦＰによって表されている）のインタクトなコード配列の外側の、すなわち、そのインタクトなコード配列を含まない、２つの重複した相同性領域（縦縞の四角によって表されている）を含み得る。（Ｃ）あるいは、単一の組換え前の直鎖状分子が、選択マーカーの部分的なコード配列（それぞれＧＦおよびＦＰ；灰色で陰がつけられた重複部分）を各々が含む２つの重複した相同性領域を含み得る。（Ｒ）両方の実施形態について、単一の組換え前の直鎖状分子とそれ自体とのインビボ相同組換えによって、選択マーカーの完全なコード配列を含む環状プラスミドが形成される。いくつかの実施形態において、単一の組換え前の直鎖状分子は、部位特異的ヌクレアーゼのコード配列をさらに含み得る（示さず）。
【００３７】
【図４Ｂ】図４Ｂは、マーカープラスミドの２ピースインビボアセンブリのための組換え前の分子組成物の２つの例示的な実施形態を表している。２つの組換え前の直鎖状分子は各々、重複していない２つの相同性領域（それぞれ縦縞および横縞の四角によって表されている）を含み得、各相同性領域は、他方の組換え前の分子の相同性領域に相同である。（Ｌ）２つの組換え前の直鎖状分子の一方は、重複していない２つの相同性領域から離れた選択マーカー（ＧＦＰによって表されている）のインタクトなコード配列を含み得る。（Ｃ）あるいは、２つの組換え前の分子の各々は、他方の組換え前の分子上の部分的なマーカーコード配列（それぞれＧＦおよびＦＰ；灰色で陰がつけられた重複部分）に対して相同性を有する選択マーカーの部分的なコード配列を含み得る。（Ｒ）両方の実施形態について、２つの組換え前の直鎖状分子の互いとのインビボ相同組換えによって、選択マーカーの完全なコード配列を含む環状プラスミドが形成される。いくつかの実施形態において、組換え前の直鎖状分子の一方は、部位特異的ヌクレアーゼの完全なコード配列をさらに含み得るか、あるいは、２つの組換え前の分子の各々は、他方の組換え前の分子上の部分的なヌクレアーゼコード配列に対して相同性を有する部分的なヌクレアーゼコード配列を含み得る（示さず）。そのような実施形態は、ヌクレアーゼの発現が、ＨＲ適格性細胞においてのみ望まれる場合、例えば、ＨＲに不適格な細胞におけるヌクレアーゼ媒介性ＮＨＥＪの発生率を低下させるために、有用であり得る。
【００３８】
【図４Ｃ】図４Ｃは、マーカープラスミドの３ピースインビボアセンブリのための組換え前の分子組成物の２つの例示的な実施形態を表している。３つの組換え前の直鎖状分子は各々、重複していない２つの相同性領域（それぞれ、縦縞および横縞の四角；縦縞の四角および菱形で満たされた四角；ならびに横縞の四角および菱形で満たされた四角によって表されている）を含み得、各相同性領域は、他の組換え前の分子のうちの１つにおける相同性領域に相同である。（Ｌ）３つの組換え前の直鎖状分子のうちの１つは、重複していない２つの相同性領域から離れた選択マーカー（ＧＦＰによって表されている）のインタクトなコード配列を含み得る。（Ｃ）あるいは、少なくとも２つの組換え前の分子の各々は、他の１つの組換え前の分子上の部分的なマーカーコード配列に対して相同性を有する選択マーカーの部分的なコード配列を含み得る（それぞれＧＦおよびＦＰ）。（Ｒ）両方の実施形態について、３つの組換え前の直鎖状分子の互いとの相同組換えによって、選択マーカーの完全なコード配列を含む環状プラスミドが形成される。いくつかの実施形態において、２ピースアセンブリにおけるように、組換え前の直鎖状分子の一方は、部位特異的ヌクレアーゼの完全なコード配列をさらに含み得るか、あるいは、少なくとも２つの組換え前の分子の各々は、他の１つの組換え前の分子上の部分的なヌクレアーゼコード配列に対して相同性を有する部分的なヌクレアーゼコード配列を含み得る（示さず）。
【００３９】
【図５】図５は、本明細書中に提供されるゲノム組込みの方法のＲＮＡガイドＤＮＡエンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）に特異的な実施形態において有用な例示的な組換え前の組成物を提供している。図５Ａ：図４Ａに描写された１ピースインビボアセンブリのいくつかの実施形態において、単一の組換え前の分子が、ＲＧＥＮ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９）によるゲノム標的部位の部位特異的な認識および切断を可能にするｃｒＲＮＡ活性およびｔｒａｃｒＲＮＡ活性をコードする１つまたはそれを超える配列（例えば、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）配列）をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、組換え前の分子は、ＲＧＥＮ（例えば、Ｃａｓ９；示さず）のコード配列をさらに含み得る。図５Ｂ：図４Ｂに描写された２ピースインビボアセンブリのいくつかの実施形態において、２つの組換え前の分子の一方が、ｇＲＮＡ配列をさらに含み得る。他の実施形態において、２つの組換え前の分子の一方は、ＲＧＥＮの完全なコード配列をさらに含み得るか、あるいは、２つの組換え前の分子の一方は、他方の組換え前の分子上の部分的なヌクレアーゼコード配列に対して相同性を有する部分的なヌクレアーゼコード配列を含み得る（示さず）。図５Ｃ：３ピースインビボアセンブリのいくつかの実施形態において、３つの組換え前の分子のうちの１つが、ｇＲＮＡ配列をさらに含み得る。他の実施形態において、３つの組換え前の分子のうちの１つは、ＲＧＥＮの完全なコード配列をさらに含み得るか、あるいは、少なくとも２つの組換え前の分子の各々は、他の１つの組換え前の分子上の部分的なヌクレアーゼコード配列に対して相同性を有する部分的なヌクレアーゼコード配列を含み得る（示さず）。
【００４０】
【図６】図６は、ＲＧＥＮ媒介性多重ゲノム組込みにおいて有用な例示的な直鎖状の組換え前の組成物を提供している。図６Ａ：アセンブリに関与する２つの組換え前の分子の一方がｇＲＮＡ配列を含む２ピースインビボアセンブリのいくつかの実施形態において、これらの分子のいくつかは、一度に提供され得（例えば、３つ：ｇＲＮＡ−１、ｇＲＮＡ−２、ｇＲＮＡ−３）、その各々は、異なるゲノム標的部位を標的化するユニークなｇＲＮＡ配列を含む。この実施形態において、他方の組換え前の分子は、選択マーカーの完全なコード配列（Ｌ）、またはｇＲＮＡ含有フラグメントの各々に共通の部分的なコード配列と相同な部分的なマーカーコード配列（Ｃ）を含み得る共通のベクター骨格を表わす。（Ｒ）ＨＲ適格性細胞は、ユニークなｇＲＮＡを含むフラグメントの各々を共通のベクター骨格と組み換えることにより、各々がユニークなｇＲＮＡ配列を含む３つの異なるマーカープラスミドを再構成できる。図６Ｂ：他の実施形態において、２つの組換え前の直鎖状分子の一方は、ＲＧＥＮ（例えば、Ｃａｓ９）の完全なコード配列をさらに含み得る。あるいは、２つの組換え前の分子の各々は、他方の組換え前の分子上の部分的なヌクレアーゼコード配列に対して相同性を有する部分的なヌクレアーゼコード配列を含み得る（示さず）。多重ゲノム組込みは、２ピース、３ピースまたはより高次の組換え前の組成物を、その組成物の１つまたはそれを超える組換え前の分子の中に位置する複数のユニークなｇＲＮＡカセットと組み合わせて用いて行われ得る。
【００４１】
【図７】図７は、実施例１に記載されるようなＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ−９媒介性の多重ドナーＤＮＡ組込みにとって最適なｇＲＮＡ送達様式を決定する際に使用される組成物を表している。（Ｌ）ユニークなｇＲＮＡカセットは、三日月形として表されており、ユニークな薬物選択マーカーは、長方形として表されている。（Ｒ）ｇＲＮＡカセットを、（１）環状ベクター（ここで、３つのユニークなｇＲＮＡカセットの各々を、ユニークな選択マーカーを含むプラスミドにクローニングした）；（２）環状ベクター（ここで、３つのユニークなｇＲＮＡカセットの各々を、同じ選択マーカーを含むプラスミドにクローニングした）；（３）直鎖状の発現カセット（ここで、３つの直鎖状のｇＲＮＡカセットを、選択マーカーを含む環状プラスミドと共に共形質転換した）；および（４）直鎖状の発現カセット（各々が、選択マーカーを含む共形質転換される直鎖状のプラスミドの末端と相同な末端を有し、ゆえに、各ｇＲＮＡおよび共通の選択マーカーを含む環状プラスミドのＨＲ媒介性インビボアセンブリが可能になる）として宿主細胞に導入した。
【００４２】
【図８】図８は、実施例１に記載されるように最適なｇＲＮＡ送達様式を決定する実験の結果を提供している。Ｃａｓ９を発現している宿主細胞（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を、ＲＨＲ２、ＨＯおよびＡＤＨ５オープンリーディングフレームならびに各遺伝子座を標的化するｇＲＮＡ構築物の同時のマーカーレス組込み／欠失のためのドナーＤＮＡで形質転換した。ｇＲＮＡ送達様式は、１）３つの異なる選択マーカーを含む３つのプラスミド、２）同じマーカーを含む３つのプラスミド、３）３つの直鎖状のｇＲＮＡカセットを伴う単一のマーカープラスミド、および４）３つの直鎖状のｇＲＮＡカセットのギャップ修復のためのフランキング配列を含む単一の線状化したマーカープラスミドだった。コロニーを、欠失構築物の外側の上流順方向プライマーおよび各オープンリーディングフレームの代わりに組み込まれた短いリンカー配列に結合する逆方向プライマーを使用するｃＰＣＲによってアッセイした。１１個のコロニーならびにネガティブコントロールとして働く親コロニー（「Ｎ」）を各送達様式についてアッセイした。
【００４３】
【図９】図９は、それぞれＲＨＲ２、ＨＯおよびＡＤＨ５遺伝子座へのドナーＤＮＡのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ−９媒介性の単一の組込みに対する、ｇＲＮＡ発現を選択する利点とは切り離された、マーカーベクターのギャップ修復の利点を決定する実験（実施例２に記載されている）の結果を提供している。Ｃａｓ９を発現している宿主細胞（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を、ＲＨＲ２、ＨＯまたはＡＤＨ５オープンリーディングフレームのマーカーレス欠失のためのドナーＤＮＡならびに各遺伝子座を標的化するｇＲＮＡ構築物で形質転換した。適切なドナーＤＮＡに加えて、直鎖状のｇＲＮＡカセットを、１）閉環状マーカーベクター（Ａ）、または２）同じベクターであるが、線状化され、トランケートされており、ベクターを閉環し、マーカーカセットを再構成するためには、供給されるさらなるフラグメントのギャップ修復が必要であるもの（Ｂ）と共形質転換した。コロニーを、欠失構築物の外側の上流順方向プライマーおよび各オープンリーディングフレームの代わりに組み込まれた短いリンカー配列に結合する逆方向プライマーを使用するＰＣＲによってアッセイした。２３個のコロニーならびにネガティブコントロールとして働く親コロニー（「Ｎ」）を各送達様式についてアッセイした。この実験を３回繰り返した；単一の実験の結果を示す。
【００４４】
【図１０】図１０は、図９において実証された３つのギャップ修復実験の結果の要約を提供している。３つの実験の各々に対して、２３個のコロニーをアッセイした。
【００４５】
【図１１】図１１は、図９において実証された３つのギャップ修復実験のボックスプロットの要約を提供している。
【００４６】
【図１２】図１２は、マーカープラスミドのギャップ修復アセンブリによる増加倍率；図９において実証された３つのギャップ修復実験の要約を提供している。
【００４７】
【図１３】図１３は、それぞれＧａｌ８０、ＨＯおよびＡＤＨ５遺伝子座への３つのドナーＤＮＡのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ−９媒介性の同時組込みに対する、マーカー／ｇＲＮＡベクターの２ピースインビボアセンブリ対３ピースインビボアセンブリの利点を決定する実験の結果を提供している。Ｃａｓ９を発現している宿主細胞（一倍体Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を、Ｇａｌ８０、ＨＯおよびＡＤＨ５オープンリーディングフレームの同時のマーカーレス欠失のためのドナーＤＮＡ、各遺伝子座を標的化するｇＲＮＡ構築物、ならびに２または３ピースマーカー／ｇＲＮＡベクターアセンブリのための組換え前の分子で形質転換した。コロニーを、欠失構築物の外側の上流順方向プライマーおよび各オープンリーディングフレームの代わりに組み込まれた短いリンカー配列に結合する逆方向プライマーを使用するｃＰＣＲによってアッセイした。１１個のコロニーならびにネガティブコントロールとして働く親コロニー（「Ｎ」）を各送達様式についてアッセイした。
【００４８】
【図１４】図１４は、それぞれＧａｌ８０、ＨＯおよびＡＤＨ５遺伝子座への３つのドナーＤＮＡのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ−９媒介性の同時組込みに対する、マーカー／ｇＲＮＡベクターの２ピースインビボアセンブリ対３ピースインビボアセンブリの利点を決定した実験の結果を提供している。二倍体酵母株ＣＡＴ−１（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＣａｓ９を発現している細胞を、Ｇａｌ８０、ＨＯおよびＡＤＨ５オープンリーディングフレームの同時の全対立遺伝子の（ｐａｎ−ａｌｌｅｌｉｃ）マーカーレス欠失のためのドナーＤＮＡ、各遺伝子座を標的化するｇＲＮＡ構築物、ならびに２または３ピースマーカー／ｇＲＮＡベクターアセンブリのいずれかのための組換え前の分子で形質転換した。コロニーを、欠失構築物の外側の上流順方向プライマーおよび各オープンリーディングフレームの代わりに組み込まれた短いリンカー配列に結合する逆方向プライマーを使用するＰＣＲによってアッセイした。この実験は、細胞が、選択的プラスミドを作製するために２または３つの相同組換え事象を用いて、形質転換されたＤＮＡ試薬を処理しなければならない選択スキームを使用した。同時の全対立遺伝子の三重の組込みの割合は、３つの事象が必要とされたとき、ほぼ１０倍高かった。この実験から回収されたコロニーの数もまた、３つの事象が必要とされたとき、およそ１０倍少なかった（示さず）ことから、この選択スキームが、高い割合の三重の組込みに関与したことが示された。
【００４９】
【図１５】図１５は、「異種ブロック（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｙ  ｂｌｏｃｋ）」の状況における、点変異の導入についての概略図を提供している。標的化されているアミノ酸が、四角で囲まれており、隣接する切断部位には、切断部位およびＰＡＭ配列という注釈が付けられている（上のパネル）。サイレントコドン変化の異種ブロックおよびフランキングホモロジー（flanking  homology）の状況において所望の点変異を含むドナーＤＮＡは、６０ｍｅｒのオリゴをアニーリングして伸長することによって（中央のパネル）またはより大きなクローニングされた構築物を用いて、合成的に作製され得る。ドナーＤＮＡの組込みによって、所望の点変異がもたらされる（下のパネル）。
【００５０】
【図１６】図１６は、マーカー／ｇＲＮＡベクターの２ピースインビボアセンブリと組み合わせてＣＲＩＳＰＲを使用して、ドナーＤＮＡ中にコードされている単一の点変異を導入する実験の結果を提供している。候補コロニー（１〜１１）および親ネガティブコントロール（ｃ）を、異種ブロックおよびフランキング配列に対するコロニーＰＣＲによってアッセイした（左のパネルおよび表）。選択された陽性コロニーを、組込み遺伝子座にまたがるより大きなＰＣＲ産物を配列決定することによって確認した。
【００５１】
【図１７】図１７は、マーカー／ｇＲＮＡベクターの２ピースインビボアセンブリと組み合わせてＣＲＩＳＰＲを使用して、ドナーＤＮＡ中にコードされている点変異を多重形式で導入する実験の結果を提供している。ＥＣＭ３８、ＰＧＤ１およびＡＤＨ２の遺伝子座を、３つの点変異の同時導入について標的化した。ドナーＤＮＡを、各標的部位に隣接する５００ｂｐの上流および下流の相同性領域とともにクローニングした。異種ブロックおよびフランキング配列（左のパネルおよび表）に対するコロニーＰＣＲによって候補コロニーを同定した。１０個／１１個のコロニー（９０．９％）が、３つすべての異種ブロックの組込みについて陽性だった。
【００５２】
【図１８】図１８は、マーカー／ｇＲＮＡベクターの２ピースインビボアセンブリと組み合わせてＣＲＩＳＰＲを使用して、ドナーＤＮＡ中にコードされている点変異を多重形式で導入する実験の結果を提供している。ＡＤＨ２、ＰＧＤ１、ＥＣＭ３８、ＳＩＮ４およびＣＹＳ４遺伝子座を、５つの点変異の同時導入について標的化した。この場合、ドナーＤＮＡを、各標的部位に隣接する（flanking）５００ｂｐの上流および下流の相同性領域（homology）とともにクローニングした。異種ブロックおよびフランキング配列（左のパネルおよび表）に対するコロニーＰＣＲによって候補コロニーを同定した。２個／１１個のコロニー（１８．２％）が、５つすべての異種ブロックの組込みについて陽性だった（クローン＃４および９）。
【００５３】
【図１９】図１９は、一倍体ＣＥＮＰＫ２のＧＡＬ８０遺伝子座における短いリンカー配列の組込み（Ａ）、ならびに二倍体工業用株ＣＡＴ−１（Ｂ）および二倍体工業用株ＰＥ−２（Ｃ）におけるＧＡＬ８０遺伝子座の同じ構築物の全対立遺伝子の組込みを実証する実験の結果を提供している。短いリンカー配列の組込み（奇数レーン）ならびに野生型対立遺伝子の存在（偶数レーン）について、各コロニーをアッセイした。各ゲルの最後の２つのレーンは、親（ネガティブ）コントロールである。
【００５４】
【図２０】図２０は、マーカー／ｇＲＮＡベクターの２ピースインビボアセンブリと組み合わせてＣＲＩＳＰＲを使用して、イソプレノイドファルネセンを生成するための１２遺伝子の生合成経路（合計約３０ｋｂ）を多重形式で導入する実験の結果を提供している。Ｇａｌ８０、ＨＯおよびＢＵＤ９遺伝子座を、ファルネセン経路成分のコード配列を含む３つのドナーＤＮＡの同時導入について標的化した（ドナー１：転写制御因子ＧＡＬ４；Ａｒｔｅｍｉｓｉａ  ａｎｎｕａ由来のファルネセンシンターゼ（２コピー）；アセチル−ＣｏＡチオラーゼをコードするＥＲＧ１０；およびＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼをコードするＥＲＧ１３；ドナー２：ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼをコードするｔＨＭＧ１（２コピー）；およびドナー３：メバロン酸キナーゼをコードするＥＲＧ１２；ホスホメバロン酸キナーゼをコードするＥＲＧ８；メバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼをコードするＥＲＧ１９；イソペンテニルピロリン酸イソメラーゼをコードするＩＤＩ１；およびファルネシルピロリン酸シンテターゼをコードするＥＲＧ２０）。ドナーＤＮＡを、各標的部位に隣接する５００ｂｐの上流および下流の相同性領域とともにクローニングした。内部リンカー配列および組込み標的部位に隣接する配列に対するコロニーＰＣＲによって、候補コロニーを同定した。１１個／４７個のコロニー（２３．４％）が、経路全体の組込みについて陽性だった。
【００５５】
【図２１】図２１は、ファルネセン経路を完全に組み込んだときの、ｃＰＣＲによって同定された１１個のクローンについてバッチスクロースプレートモデルアッセイにおいてファルネセン生成を確認する実験の結果を提供している。各ｃＰＣＲ陽性クローンは、約０．１〜１．５ｇ／Ｌファルネセンの範囲の量でファルネセンを生成した。
【００５６】
【図２２】図２２は、高い割合の単一のおよび多重化された対立遺伝子交換を実証する対立遺伝子交換ｃＰＣＲの結果を提供している。
【００５７】
【図２３Ａ】図２３（Ａ）〜（Ｆ）は、ＣＲＩＳＰＲを用いてもたらされた多重化された対立遺伝子交換が、相乗的な表現型を示すことを実証する実験の結果を提供している。（Ａ）ＡＣＥ２のトランケーションは、不完全な細胞分裂および集塊をもたらす。（Ｂ）分泌変異体および細胞周期変異体は、３７℃において成長しない。（Ｃ）細胞周期変異体は、非許容温度においてＧ１で停止する。（Ｄ）ＳＥＣ３−ＧＦＰは、許容温度（２３℃）において正しく芽に局在化するが、分泌変異体では、高温において誤った場所に局在化される。（Ｅ）２つの対立遺伝子は、個々に耐熱性を高め、一緒になると、なおもより高い耐熱性株をもたらす。（Ｆ）いくつかの変異は、エタノール耐性を与えるが、すべての対立遺伝子が一緒になると、なおもさらに高いエタノール抵抗性に関して相乗作用を示す。５つすべての変化が、ＣＲＩＳＰＲを用いて同時に行われた。
【図２３Ｂ】図２３（Ａ）〜（Ｆ）は、ＣＲＩＳＰＲを用いてもたらされた多重化された対立遺伝子交換が、相乗的な表現型を示すことを実証する実験の結果を提供している。（Ａ）ＡＣＥ２のトランケーションは、不完全な細胞分裂および集塊をもたらす。（Ｂ）分泌変異体および細胞周期変異体は、３７℃において成長しない。（Ｃ）細胞周期変異体は、非許容温度においてＧ１で停止する。（Ｄ）ＳＥＣ３−ＧＦＰは、許容温度（２３℃）において正しく芽に局在化するが、分泌変異体では、高温において誤った場所に局在化される。（Ｅ）２つの対立遺伝子は、個々に耐熱性を高め、一緒になると、なおもより高い耐熱性株をもたらす。（Ｆ）いくつかの変異は、エタノール耐性を与えるが、すべての対立遺伝子が一緒になると、なおもさらに高いエタノール抵抗性に関して相乗作用を示す。５つすべての変化が、ＣＲＩＳＰＲを用いて同時に行われた。
【図２３Ｃ】図２３（Ａ）〜（Ｆ）は、ＣＲＩＳＰＲを用いてもたらされた多重化された対立遺伝子交換が、相乗的な表現型を示すことを実証する実験の結果を提供している。（Ａ）ＡＣＥ２のトランケーションは、不完全な細胞分裂および集塊をもたらす。（Ｂ）分泌変異体および細胞周期変異体は、３７℃において成長しない。（Ｃ）細胞周期変異体は、非許容温度においてＧ１で停止する。（Ｄ）ＳＥＣ３−ＧＦＰは、許容温度（２３℃）において正しく芽に局在化するが、分泌変異体では、高温において誤った場所に局在化される。（Ｅ）２つの対立遺伝子は、個々に耐熱性を高め、一緒になると、なおもより高い耐熱性株をもたらす。（Ｆ）いくつかの変異は、エタノール耐性を与えるが、すべての対立遺伝子が一緒になると、なおもさらに高いエタノール抵抗性に関して相乗作用を示す。５つすべての変化が、ＣＲＩＳＰＲを用いて同時に行われた。
【図２３Ｄ】図２３（Ａ）〜（Ｆ）は、ＣＲＩＳＰＲを用いてもたらされた多重化された対立遺伝子交換が、相乗的な表現型を示すことを実証する実験の結果を提供している。（Ａ）ＡＣＥ２のトランケーションは、不完全な細胞分裂および集塊をもたらす。（Ｂ）分泌変異体および細胞周期変異体は、３７℃において成長しない。（Ｃ）細胞周期変異体は、非許容温度においてＧ１で停止する。（Ｄ）ＳＥＣ３−ＧＦＰは、許容温度（２３℃）において正しく芽に局在化するが、分泌変異体では、高温において誤った場所に局在化される。（Ｅ）２つの対立遺伝子は、個々に耐熱性を高め、一緒になると、なおもより高い耐熱性株をもたらす。（Ｆ）いくつかの変異は、エタノール耐性を与えるが、すべての対立遺伝子が一緒になると、なおもさらに高いエタノール抵抗性に関して相乗作用を示す。５つすべての変化が、ＣＲＩＳＰＲを用いて同時に行われた。
【図２３Ｅ】図２３（Ａ）〜（Ｆ）は、ＣＲＩＳＰＲを用いてもたらされた多重化された対立遺伝子交換が、相乗的な表現型を示すことを実証する実験の結果を提供している。（Ａ）ＡＣＥ２のトランケーションは、不完全な細胞分裂および集塊をもたらす。（Ｂ）分泌変異体および細胞周期変異体は、３７℃において成長しない。（Ｃ）細胞周期変異体は、非許容温度においてＧ１で停止する。（Ｄ）ＳＥＣ３−ＧＦＰは、許容温度（２３℃）において正しく芽に局在化するが、分泌変異体では、高温において誤った場所に局在化される。（Ｅ）２つの対立遺伝子は、個々に耐熱性を高め、一緒になると、なおもより高い耐熱性株をもたらす。（Ｆ）いくつかの変異は、エタノール耐性を与えるが、すべての対立遺伝子が一緒になると、なおもさらに高いエタノール抵抗性に関して相乗作用を示す。５つすべての変化が、ＣＲＩＳＰＲを用いて同時に行われた。
【図２３Ｆ】図２３（Ａ）〜（Ｆ）は、ＣＲＩＳＰＲを用いてもたらされた多重化された対立遺伝子交換が、相乗的な表現型を示すことを実証する実験の結果を提供している。（Ａ）ＡＣＥ２のトランケーションは、不完全な細胞分裂および集塊をもたらす。（Ｂ）分泌変異体および細胞周期変異体は、３７℃において成長しない。（Ｃ）細胞周期変異体は、非許容温度においてＧ１で停止する。（Ｄ）ＳＥＣ３−ＧＦＰは、許容温度（２３℃）において正しく芽に局在化するが、分泌変異体では、高温において誤った場所に局在化される。（Ｅ）２つの対立遺伝子は、個々に耐熱性を高め、一緒になると、なおもより高い耐熱性株をもたらす。（Ｆ）いくつかの変異は、エタノール耐性を与えるが、すべての対立遺伝子が一緒になると、なおもさらに高いエタノール抵抗性に関して相乗作用を示す。５つすべての変化が、ＣＲＩＳＰＲを用いて同時に行われた。
【００５８】
【図２４】図２４は、単一の形質転換でのナイーブ酵母株へのムコン酸生合成経路全体の組込みを実証している結果を提供している。（Ａ）ムコン酸生合成経路の概略図。（Ｂ）ムコン酸経路を、合計２８ｋｂの６ピースのドナーＤＮＡを介して３つの別個の遺伝子座に導入した。各ピースは、標的化された遺伝子座（末端）の上流（ＵＳ）または下流（ＤＳ）の相同性の領域を介して、ならびに重複する相同性領域を有するドナーＤＮＡの別のピース（中央）とともに、ゲノムに組み換えた。（Ｃ）この経路の１工程組込みは、この経路のボトルネック：ＡｒｏＹの迅速診断を可能にした。組み込まれた経路を有する株は、約３ｇ／ＬのＰＣＡを産生する（下から２番目の線）。カテコールを供給したとき（下から１番目の線）、これらの株は、利用可能なすべてのカテコールをムコン酸に完全に変換する（下から３番目、４番目および５番目の線）。（Ｄ）ムコン酸経路を、１工程でＫ．ｌａｃｔｉｓにおいて３つの別個の遺伝子座に導入した（１０ｋｂ）。（Ｅ）組み込まれた経路を有するＫ．ｌａｃｔｉｓ株は、約１ｇ／ＬのＰＣＡを産生し（下から１番目の線）、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅと同じ経路のボトルネックを示した。カテコールを供給したとき、これらの株も、利用可能なすべてのカテコールをムコン酸に完全に変換する（下から２番目の線）。
【００５９】
【図２５】図２５は、ＣＲＩＳＰＲ試薬およびドナーＤＮＡによるトランスフェクションの後の、２９３Ｔ細胞における標的化されたゲノム遺伝子座のアンプリコンに対するＲＦＬＰアッセイの結果を提供している。細胞を以下のとおりトランスフェクトした：（２）閉環状「ｇＲＮＡなし」プラスミド＋直鎖状のドナー；（３）開環状「ｇＲＮＡなし」プラスミド；（４）開環状「ｇＲＮＡなし」プラスミド＋ＣＤ４ギャップフラグメント；（６）閉環状ｇＲＮＡプラスミド＋直鎖状のドナー；（８）開環状ｇＲＮＡプラスミド＋完全ギャップ＋直鎖状のドナー。
【発明を実施するための形態】
【００６０】
５．実施形態の詳細な説明
５．１  定義
本明細書中で使用されるとき、ヌクレアーゼ、例えば、ホーミングエンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬ−エフェクターヌクレアーゼまたはＲＮＡガイドＤＮＡエンドヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９）に関して、用語「切断する（ｃｌｅａｖｅｓ）」、「切断」および／または「切断する（ｃｌｅａｖｉｎｇ）」とは、特定の核酸において断裂をもたらす行為のことを指す。当業者が理解するように、その断裂は、平滑末端または粘着末端（すなわち、５’または３’オーバーハング）を残し得る。これらの用語は、一本鎖ＤＮＡ断裂（「ニック」）および二本鎖ＤＮＡ断裂も包含する。
【００６１】
本明細書中で使用されるとき、用語「操作された宿主細胞」とは、遺伝子操作法（すなわち、組換え技術）を用いて親細胞を遺伝的に改変することによって作製された宿主細胞のことを指す。操作された宿主細胞は、親細胞のゲノムに対してヌクレオチド配列の付加、欠失および／または改変を含み得る。
【００６２】
本明細書中で使用されるとき、用語「異種性」とは、通常天然には見出されないもののことを指す。用語「異種性ヌクレオチド配列」とは、所与の細胞に通常天然には見出されないヌクレオチド配列のことを指す。したがって、異種性ヌクレオチド配列は、（ａ）宿主細胞にとって外来のものであり得る（すなわち、その細胞にとって「外来性」であり得る）か；（ｂ）宿主細胞に天然に見出される（すなわち、「内在性」である）が、その細胞に非天然の量（すなわち、宿主細胞に天然に見出される量よりも多いまたは少ない量）で存在し得るか；または（ｃ）宿主細胞に天然に見出されるが、天然の遺伝子座の外側に位置し得る。
【００６３】
本明細書中で使用されるとき、用語「相同性」とは、２つもしくはそれを超える核酸配列の間または２つもしくはそれを超えるアミノ酸配列の間の同一性のことを指す。配列同一性は、パーセンテージ同一性（または類似性または相同性）に関して測定され得る；パーセンテージが高いほど、それらの配列が互いにより同一に近い。核酸配列またはアミノ酸配列のホモログまたはオルソログは、標準的な方法を用いてアラインメントされたとき、比較的高い程度の配列同一性を有する。比較のために配列をアラインメントする方法は、当該分野で周知である。様々なプログラムおよびアラインメントアルゴリズムが、Ｓｍｉｔｈ  ＆  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２，１９８１；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ＆  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３，１９７０；Ｐｅａｒｓｏｎ  ＆  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４，１９８８；Ｈｉｇｇｉｎｓ  ＆  Ｓｈａｒｐ，Ｇｅｎｅ，７３：２３７−４４，１９８８；Ｈｉｇｇｉｎｓ  ＆  Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１−３，１９８９；Ｃｏｒｐｅｔら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：１０８８１−９０，１９８８；Ｈｕａｎｇら、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｐｐｌｓ．Ｂｉｏｓｃ．８，１５５−６５，１９９２；およびＰｅａｒｓｏｎら、Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．２４：３０７−３１，１９９４に記載されている。Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０，１９９０には、配列のアラインメントの方法および相同性の計算に関する詳細な考慮事柄が提示されている。ＮＣＢＩベーシックローカルアラインメントサーチツール（ＢＬＡＳＴ）（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０，１９９０）は、配列解析プログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎおよびｔｂｌａｓｔｘに関連して使用するために、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｂｕｉｌｄｉｎｇ  ３８Ａ，Ｒｏｏｍ  ８Ｎ８０５，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．２０８９４）およびインターネット上をはじめとしたいくつかの供給源から入手可能である。さらなる情報は、ＮＣＢＩのウェブサイトに見出すことができる。
【００６４】
本明細書中で使用されるとき、用語「マーカーレス」とは、選択マーカーの組込みを伴わない、宿主細胞ゲノム内の標的部位へのドナーＤＮＡの組込みのことを指す。いくつかの実施形態において、この用語は、宿主細胞ゲノムへの選択マーカーの組込みに依存する選択スキームを利用しない、そのような宿主細胞の回収のことも指す。例えば、ある特定の実施形態において、エピソームまたは染色体外である選択マーカーは、ゲノム標的部位を切断することができるヌクレアーゼをコードするプラスミドを含む細胞を選択するために利用され得る。その選択マーカーが、宿主細胞のゲノムに組み込まれない限り、そのような使用は、「マーカーレス」であると考えられ得る。
【００６５】
本明細書中で使用されるとき、用語「作動可能に連結された」とは、核酸配列が所望の機能をコードするようなそれらの配列間の機能的な連結のことを指す。例えば、目的の遺伝子、例えば、選択マーカーのコード配列は、連結されたプロモーターおよび／または制御領域が、そのコード配列の発現を機能的に調節するとき、そのプロモーターおよび／または制御配列と作動可能な連結状態にある。また、その用語は、コード配列が、同じ連結されたプロモーターおよび／または制御領域によって調節され得るような、それらのコード配列間の連結のことを指し；コード配列間のそのような連結は、インフレームでまたは同じコードフレームで連結されていることも指し得る。「作動可能に連結された」とは、機能的であるが非コードの配列、例えば、自律増殖（ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓ  ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ）配列または複製起点の連結のことも指す。そのような配列は、それらの正常な機能を発揮できるとき、例えば、宿主細胞内にその配列を有するベクターの複製、伝播および／または分離を可能にするとき、作動可能な連結状態にある。
【００６６】
本明細書中で使用されるとき、用語「選択マーカーを発現している宿主細胞を選択すること」は、選択マーカーを発現している宿主細胞を、形質転換された細胞の集団から富化することも包含する。
【００６７】
本明細書中で使用されるとき、用語「選択マーカー」とは、本明細書中に記載されるようなマーカーベクターを含む宿主細胞を選択するための案内として機能する遺伝子のことを指す。選択マーカーとしては、蛍光マーカー、発光マーカーおよび薬物選択マーカーなどが挙げられ得るがこれらに限定されない。蛍光マーカーとしては、蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ｄｓＲＦＰ）など）をコードする遺伝子が挙げられ得るがこれらに限定されない。発光マーカーとしては、ルシフェラーゼなどの発光タンパク質をコードする遺伝子が挙げられ得るがこれらに限定されない。本明細書中に提供される方法および組成物とともに使用するのに適した薬物選択マーカーとしては、抗生物質（例えば、アンピシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ハイグロマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコールおよびネオマイシン）に対する耐性遺伝子が挙げられるがこれらに限定されない。いくつかの実施形態において、選択は、ポジティブ選択であり得る；すなわち、そのマーカーを発現している細胞が、集団から単離されることにより、例えば、選択マーカーを含む細胞の富化された集団がもたらされる。他の場合、選択は、ネガティブ選択であり得る；すなわち、集団がそれらの細胞から単離除去されることにより、例えば、選択マーカーを含まない細胞の富化された集団がもたらされる。分離は、使用される選択マーカーにとって適切な任意の好都合な分離法によるものであり得る。例えば、蛍光マーカーが利用されている場合、細胞は、蛍光活性化細胞分取によって分離され得るのに対して、細胞表面マーカーが挿入されている場合、細胞は、アフィニティー分離法、例えば、磁気分離、アフィニティークロマトグラフィ、固体マトリックスに結合した親和性試薬を用いた「パニング」、または他の好都合な技法によって、不均一な集団から分離され得る。
【００６８】
本明細書中で使用されるとき、用語「同時」は、複数の組込みに関して使用されるとき、宿主細胞が、ヌクレアーゼ、例えば、ヌクレアーゼをコードするプラスミド、および宿主細胞ゲノムに組み込まれる１つより多いドナーＤＮＡで共形質転換された時点から始まり、形質転換された宿主細胞またはそのクローン集団が、それぞれの標的遺伝子座におけるドナーＤＮＡの組込みの成功についてスクリーニングされた時点で終わる、期間を包含する。いくつかの実施形態において、「同時」によって包含される期間は、少なくとも、ヌクレアーゼが宿主細胞の染色体(複数可)内のその標的配列に結合してそれを切断するのに必要な時間の量である。いくつかの実施形態において、「同時」によって包含される期間は、宿主細胞がヌクレアーゼ、例えば、ヌクレアーゼをコードするプラスミドおよび１つより多いドナーＤＮＡで共形質転換された時点から始まる、少なくとも６、１２、２４、３６、４８、６０、７２、９６時間または９６時間を超える時間である。
５．２  外来性核酸を組み込む方法
【００６９】
宿主細胞ゲノムの１つまたはそれを超える選択された標的部位に１つまたはそれを超える外来性核酸を組み込む方法が、本明細書中に提供される。ある特定の実施形態において、その方法は、１つまたはそれを超える組込みポリヌクレオチド、すなわち、ゲノム標的部位に組み込まれる外来性核酸を含むドナーＤＮＡ；ゲノム標的部位の近傍またはゲノム標的部位内に二本鎖断裂を引き起こすことができる１つまたはそれを超えるヌクレアーゼ；およびそれ自体との相同組換えまたは宿主細胞と接触される１つもしくはそれを超えるさらなる直鎖状核酸との相同組換えが可能な直鎖状核酸と宿主細胞を接触させる工程を含み、ここで、宿主細胞における直鎖状核酸の前記相同組換えによって、選択マーカーのコード配列を含む環状の染色体外核酸が形成される。いくつかの実施形態において、その後、接触された宿主細胞は、選択的条件下で成長させる。実施の理論に拘束されるものではないが、本明細書中に記載される方法に従って選択されるために、宿主細胞にＨＲを介して発現ベクターを環状化させることは、選択された細胞が、外来性ＤＮＡの、１つまたはそれを超える意図されたＨＲ媒介性ゲノム組込みを首尾良く実行した可能性を高めると考えられている。
【００７０】
特定の態様において、宿主細胞ゲノムの標的部位への外来性核酸のマーカーレス組込みのための方法が、本明細書中に提供され、その方法は、
（ａ）宿主細胞を、
（ｉ）第１の相同性領域（ＨＲ１）および第２の相同性領域（ＨＲ２）を含む外来性核酸（ＥＳ）（ここで、（ＨＲ１）および（ＨＲ２）は、前記標的部位（ＴＳ）において、宿主細胞によって媒介される相同組換えを惹起することができる）；
（ｉｉ）（ＴＳ）において切断することができるヌクレアーゼ（Ｎ）（ここで、前記切断によって、（ＴＳ）において（ＥＳ）の相同組換えがもたらされる）；および
（ｉｉｉ）それ自体との相同組換えまたは宿主細胞と接触される１つもしくはそれを超えるさらなる直鎖状核酸との相同組換えが可能な直鎖状核酸（ここで、前記相同組換えによって、選択マーカーのコード配列を含む環状の染色体外核酸が形成される）
と接触させる工程；
ならびに
（ｂ）その選択マーカーを発現する宿主細胞を選択する工程
を含む。いくつかの実施形態において、その方法は、（ＴＳ）において（ＥＳ）が組み込まれた宿主細胞を回収する工程を含み、ここで、前記回収する工程は、選択マーカーの組込みを必要としない。
【００７１】
図１は、部位特異的ヌクレアーゼ、および宿主細胞によって媒介されるＨＲを介してインビボにおいてアセンブルすることにより環状マーカー発現ベクターを形成することができる組換え前の組成物を使用した外来性核酸のゲノム組込みの例示的な実施形態を提供している。ドナーポリヌクレオチドが、宿主細胞に導入され、ここで、そのポリヌクレオチドは、第１の相同性領域（ＨＲ１）および第２の相同性領域（ＨＲ２）に挟まれた目的の核酸（Ｄ）を含む。ＨＲ１およびＨＲ２は、それぞれ、ゲノム標的部位（ＴＳ）の５’および３’領域と相同性を共有する。部位特異的ヌクレアーゼ（Ｎ）も宿主細胞に導入され、ここで、そのヌクレアーゼは、標的部位内のユニーク配列を認識して切断することができる。この例では、２つの組換え前の直鎖状分子（各々が、互いとの相同組換えが可能な２つの相同性領域を含む）を含む、組換え前の組成物も細胞に導入される。この例では、相同性領域は、各組換え前の分子の５’および３’末端に位置する。各組換え前の分子の一方の相同性領域は、選択マーカーの部分的なコード配列（それぞれＧＦおよびＦＰ）を含み、その２つの相同性領域の間のＨＲにより、選択マーカーの完全で作動可能なコード配列（ＧＦＰ）が、環状化したマーカー発現ベクター上で再構成される。一般に、そのような環状化は、選択マーカーの発現を選択する条件下で細胞を培養することによって、例えば、選択マーカーが薬物耐性マーカーである場合、培養培地に選択的作用物質（selective  agent）（例えば、抗生物質）を補充することによって、または比色法もしくは蛍光検出法によって検出可能なマーカーを発現する細胞をソーティングすることによって、選択される。同時に、ＨＲに適格性である細胞では、部位特異的ヌクレアーゼによる標的部位内の二本鎖断裂の誘導が、切断された標的部位における目的のドナー核酸のＨＲ媒介性組込みを容易にする。選択されるために、宿主細胞がＨＲを介して発現ベクターを環状化することを要件とすることによって、外来性ドナーＤＮＡのＨＲ媒介性組込みも行った細胞の回収も増加する。この回収頻度の上昇は、組換え事象を起こした形質転換体を選択するために、選択マーカーを共組み込みする（co-integrate）必要性を取り除く。例えば、操作された微生物の構築中に、選択マーカーの必要性を無くすことによって、宿主細胞ゲノムを操作するのに必要な時間が大幅に短縮する。さらに、操作ストラテジーは、所与の宿主生物にとって利用可能なマーカーの貯蔵場所が限られていることに起因する、選択マーカーを再使用する必要性によって限定されない。
【００７２】
いくつかの実施形態において、首尾良く組み込まれた外来性核酸を含む形質転換された細胞のマーカーレス回収は、スクリーニングされた１０００、９００、８００、７００、６００、５００、４００、３００、２００もしくは１００個の接触された宿主細胞毎またはそのクローン集団毎に約１個以内の頻度で生じる。特定の実施形態において、首尾良く組み込まれた外来性核酸を含む形質転換された細胞のマーカーレス回収は、スクリーニングされた９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０もしくは１０個の接触した宿主細胞毎またはそのクローン集団毎に約１個以内の頻度で生じる。より特定の実施形態において、首尾良く組み込まれた外来性核酸を含む形質転換された細胞のマーカーレス回収は、スクリーニングされた９、８、７、６、５、４、３もしくは２個の接触した宿主細胞毎またはそのクローン集団毎に約１個以内の頻度で生じる。
【００７３】
選択マーカーを使用せずに、標的部位にまたは標的部位近傍に変更されたゲノムを有する細胞を同定する種々の方法が、利用可能である。いくつかの実施形態において、そのような方法は、標的部位における任意の変化を検出しようとするものであり、その方法としては、ＰＣＲ法、配列決定法、ヌクレアーゼ消化、例えば、制限酵素マッピング、サザンブロットおよびそれらの任意の組み合わせが挙げられるがこれらに限定されない。表現型の読み取り、例えば、予測される機能獲得また機能喪失もまた、意図されるゲノム改変(複数可)をもたらすことについての代用物として使用され得る。
【００７４】
別の態様において、宿主細胞ゲノムに複数の外来性核酸を組み込むための方法が本明細書中に提供され、その方法は、
（ａ）宿主細胞を、
（ｉ）複数の外来性核酸（ここで、外来性核酸（ＥＳ）ｘの各々は、第１の相同性領域（ＨＲ１）ｘおよび第２の相同性領域（ＨＲ２）ｘを含み、（ＨＲ１）ｘおよび（ＨＲ２）ｘは、前記宿主細胞ゲノムの標的部位（ＴＳ）ｘにおいて（ＥＳ）ｘの宿主細胞媒介性の相同組換えを惹起することができる）；
（ｉｉ）前記標的部位（ＴＳ）ｘの各々に対して、（ＴＳ）ｘにおいて切断することができるヌクレアーゼ（Ｎ）ｘ（前記切断によって、（ＴＳ）ｘにおいて（ＥＳ）ｘの相同組換えがもたらされる）；および
（ｉｉｉ）それ自体との相同組換えまたは宿主細胞と接触される１つもしくはそれを超えるさらなる直鎖状核酸との相同組換えが可能な直鎖状核酸（ここで、前記相同組換えによって、選択マーカーのコード配列を含む環状の染色体外核酸が形成される）
と接触させる工程；
ならびに
（ｂ）その選択マーカーを発現する宿主細胞を選択する工程
を含む。いくつかの実施形態において、その方法は、宿主細胞を回収する工程をさらに含み、ここで、選択された外来性核酸（ＥＳ）ｘの各々は、選択された標的配列（ＴＳ）ｘの各々において組み込まれており、
ｘは、１〜ｎの任意の整数であり、ｎは、少なくとも２である。
【００７５】
図２は、複数の部位特異的ヌクレアーゼを使用した複数の外来性核酸の同時のゲノム組込みの例示的な実施形態を提供している。この例において、異なる３つのドナーポリヌクレオチドが、宿主細胞に導入されており、各ポリヌクレオチドは、目的の核酸（Ｄ）ｘを含む外来性核酸（ＥＳ）ｘを含み、ｘ＝１、２または３である。（Ｄ）ｘの各々は、第１の相同性領域（ＨＲ１）ｘおよび第２の相同性領域（ＨＲ２）ｘに挟まれている。（ＨＲ１）ｘおよび（ＨＲ２）ｘは、ゲノムの中の合計３つのユニークな標的部位のうちの選択された標的部位（ＴＳ）ｘの５’および３’領域とそれぞれ相同性を共有している。１つまたはそれを超える部位特異的ヌクレアーゼ（Ｎ）ｘ（例えば、ユニークな認識部位を有する１つもしくはそれを超える（例えば、「ｘ」個の）エンドヌクレアーゼ；または１つもしくはそれを超える（例えば、「ｘ」個の）ガイドＲＮＡを伴うＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ）もまた、宿主細胞に導入され、ここで、ヌクレアーゼ（Ｎ）ｘの各々は、その対応する標的部位（ＴＳ）ｘの中のユニークな配列を認識して切断することができる。この例では、２つの組換え前の直鎖状分子（各々が、互いとの相同組換えが可能な２つの相同性領域を含む）を含む組換え前の組成物も細胞に導入される。この例では、相同性領域は、各組換え前の分子の５’および３’末端に位置する。各組換え前の分子の一方の相同性領域は、選択マーカーの部分的なコード配列（それぞれＧＦおよびＦＰ）を含み、その２つの相同性領域の間のＨＲにより、選択マーカーの完全で作動可能なコード配列（ＧＦＰ）が、環状化したマーカー発現ベクター上で再構成される。そのような環状化は、選択マーカーの発現を選択する条件下で細胞を培養することによって選択される。同時に、ＨＲに適格性である細胞では、標的部位（ＴＳ）ｘの、それに対応する部位特異的ヌクレアーゼ（Ｎ）ｘによる切断が、宿主細胞の内在性の相同組換え機構による（ＴＳ）ｘにおける対応する目的の核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ）（Ｄ）ｘの組込みを容易にする。選択されるために、宿主細胞がＨＲを介して発現ベクターを環状化することを要件とすることによって、外来性ドナーＤＮＡのＨＲ媒介性組込みも行った細胞の回収も増加する。
【００７６】
特定の実施形態において、目的の核酸（Ｄ）ｘを必要に応じて含む外来性核酸（ＥＳ）ｘの各々は、そのそれぞれのゲノム標的部位（ＴＳ）ｘに同時に、すなわち、複数の組込みポリヌクレオチドおよび複数のヌクレアーゼによる宿主細胞の単一の形質転換によって、組み込まれる。いくつかの実施形態において、その方法は、上に記載された方法について列挙された変数に従って、任意の複数の外来性核酸（ＥＳ）ｘ（すなわち、ｘは、１〜ｎの任意の整数であり、ｎは、少なくとも２である）を同時に組み込むのに有用である。いくつかの実施形態において、本明細書中に提供される同時に組み込む方法は、選択された１０個の標的部位（ＴＳ）ｘに最大１０個の外来性核酸（ＥＳ）ｘを同時に組み込むのに有用である（すなわち、ｘは、１〜ｎの任意の整数であり、ｎ＝２、３、４、５、６、７、８、９または１０である）。いくつかの実施形態において、本明細書中に提供される同時に組み込む方法は、選択された２０個の標的部位（ＴＳ）ｘに最大２０個の外来性核酸（ＥＳ）ｘを同時に組み込むのに有用である（すなわち、ｘは、１〜ｎの任意の整数であり、ｎ＝２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０である）。いくつかの実施形態において、ｎ＝２である。いくつかの実施形態において、ｎ＝３である。いくつかの実施形態において、ｎ＝４である。いくつかの実施形態において、ｎ＝５である。いくつかの実施形態において、ｎ＝６である。いくつかの実施形態において、ｎ＝７である。いくつかの実施形態において、ｎ＝８である。いくつかの実施形態において、ｎ＝９である。いくつかの実施形態において、ｎ＝１０である。いくつかの実施形態において、ｎ＝１１である。いくつかの実施形態において、ｎ＝１２である。いくつかの実施形態において、ｎ＝１３である。いくつかの実施形態において、ｎ＝１４である。いくつかの実施形態において、ｎ＝１５である。いくつかの実施形態において、ｎ＝１６である。いくつかの実施形態において、ｎ＝１７である。いくつかの実施形態において、ｎ＝１８である。いくつかの実施形態において、ｎ＝１９である。いくつかの実施形態において、ｎ＝２０である。いくつかの実施形態において、本明細書中に提供される同時に組み込む方法は、２０個を超える外来性核酸を同時に組み込むのに有用である。
【００７７】
単一の標的部位における単一の外来性核酸の組込みと同様に、各外来性核酸をそのそれぞれの標的部位において首尾良く組み込んだ宿主細胞の回収は、本明細書中に記載される１つまたはそれを超える組換え前の直鎖状分子と宿主細胞を接触させずに、選択マーカーの発現について選択したときと比べて、実質的により高い頻度で生じる。いくつかの実施形態において、この組込み頻度の上昇は、複数の組換え事象を同定するために、１つまたはそれを超える選択マーカーの共組込みの必要性を取り除く。いくつかの実施形態において、首尾良く組み込まれた複数の外来性核酸を含む形質転換された細胞のマーカーレス回収は、スクリーニングされた１０００、９００、８００、７００、６００、５００、４００、３００、２００もしくは１００個の接触した宿主細胞毎またはそのクローン集団毎に約１個以内の頻度で生じる。特定の実施形態において、マーカーレス回収は、スクリーニングされた９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０もしくは１０個の接触した宿主細胞毎またはそのクローン集団毎に約１個以内の頻度で生じる。より特定の実施形態において、マーカーレス回収は、スクリーニングされた９、８、７、６、５、４、３もしくは２個の接触した宿主細胞毎またはそのクローン集団毎に約１個以内の頻度で生じる。
５．２．１  環状マーカー発現ベクターのＨＲ媒介性インビボアセンブリ
【００７８】
本明細書中に提供される方法は、ギャップ修復を介した、宿主細胞によって媒介される環状発現ベクターのアセンブリを含む。ギャップ修復は、組換えＤＮＡ分子をインビボにおいてアセンブリするための迅速かつ効率的な方法である。この技法は、細菌（大腸菌；例えば、Ｄａｔｔａら、Ｇｅｎｅ  ３７９：１０９−１１５（２００６）を参照のこと）、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ；例えば、Ｂｅｓｓａら、Ｙｅａｓｔ  ２９：４１９−４２３（２０１２）を参照のこと）、昆虫（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ；例えば、Ｃａｒｒｅｉｒａ−Ｒｏｓａｒｉｏら、Ｊ  Ｖｉｓ  Ｅｘｐ  ７７：ｅ５０３４６（２０１３）を参照のこと）および哺乳動物細胞（ヒト細胞；例えば、Ａｄａｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３７（１７）：５７３７−５７４８（２００９）を参照のこと）をはじめとしたいくつかの生物においてプラスミドをアセンブリするためおよび／または修復するために有効であると記載されている。ギャップ修復は、単一の直鎖状ＤＮＡの２つの相同領域の間、または２つもしくはそれを超える別個の直鎖状ＤＮＡフラグメントの間の相同組換えによって、環状ＤＮＡ分子を生成し得る。通常、アセンブルされた環状化したＤＮＡは、複製配列および選択的マーカーを有するベクターとして作用する。例えば、Ｏｒｒ−Ｗｅａｖｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １０１：２２８−２４５（１９８３）を参照のこと。図４に概要が述べられている技法は、通常、直鎖状の「ギャップのある（ｇａｐｐｅｄ）」ベクターおよび直鎖状ＤＮＡフラグメント（インサート）の共形質転換から始まる（Ｏｒｒ−Ｗｅａｖｅｒら、１９８３）。相同組換えに適格性である細胞では、ベクターとインサートとの間の相同配列の２対のフランキングストレッチの間で組換えが生じ、ギャップが修復されたより大きな環状ベクターがもたらされる。インサートのフランキングホモロジーを提供する単純な方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるものであり、ここで、テイルドプライマー（ｔａｉｌｅｄ  ｐｒｉｍｅｒｓ）が、相同性領域を提供する。
【００７９】
本明細書中に提供される方法および組成物の１つの態様において、宿主細胞を、組換え前のベクター中間体として働く単一の連続した直鎖状の（ギャップのある）核酸と接触させる。本明細書中で使用されるとき、句「単一の核酸」は、複数コピーの同じ核酸分子の実施形態を含む。いくつかの実施形態において、組換え前のベクターは、自己環状化し、互いとの相同組換えが可能な２つの配列特異的組換え領域を含み、組換えに適格性の宿主細胞への導入によって、環状発現ベクターが形成される。いくつかの実施形態において、それらの組換え領域は、組換え前の直鎖状のベクターの末端もしくは末端近傍（例えば、１つの組換え領域が、直鎖状のベクターの各末端に位置し、さらなる配列が、その２つの領域の間に存在する）、末端に対して内部（例えば、各組換え領域は、両端においてさらなる配列によって挟まれる）、またはそれらの組み合わせ（例えば、一方の組換えが、直鎖状のベクターの一方の末端に存在し、他方が、それに対して内部であり、両サイドにおいてさらなる配列によって挟まれる）に位置する。いくつかの実施形態において、第１および第２の組換え領域は、十分な長さの任意のヌクレオチド配列を含み得、互いとの相同組換えを可能にする任意の配列同一性を共有し得る。いくつかの実施形態において、「十分な配列同一性」とは、例えば、少なくとも１５塩基対、少なくとも２０塩基対、少なくとも５０塩基対、少なくとも１００塩基対、少なくとも２５０塩基対、少なくとも５００塩基対の長さまたは５００塩基対を超える長さにわたって、組換え領域の間に少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または１００％の同一性を有する配列のことを指す。配列同一性の程度は、本明細書中に記載されるものを含む任意のコンピュータプログラムおよび関連パラメータ（例えば、デフォルトのパラメータを用いる、ＢＬＡＳＴ２．２．２またはＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８）を用いて決定され得る。組換え領域の間の効果的な相同性の長さに関する考察については、Ｈａｓｔｙら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １１：５５８６−９１（１９９１）を参照のこと。
【００８０】
いくつかの実施形態において、第１および第２の組換え領域は、少なくとも２５％のヌクレオチド配列同一性を共有する。いくつかの実施形態において、第１および第２の組換え領域は、少なくとも３０％のヌクレオチド配列同一性を共有する。いくつかの実施形態において、第１および第２の組換え領域は、少なくとも３５％のヌクレオチド配列同一性を共有する。いくつかの実施形態において、第１および第２の組換え領域は、少なくとも４０％のヌクレオチド配列同一性を共有する。いくつかの実施形態において、第１および第２の組換え領域は、少なくとも４５％のヌクレオチド配列同一性を共有する。いくつかの実施形態において、第１および第２の組換え領域は、少なくとも５０％のヌクレオチド配列同一性を共有する。いくつかの実施形態において、第１および第２の組換え領域は、少なくとも６０％のヌクレオチド配列同一性を共有する。いくつかの実施形態において、第１および第２の組換え領域は、少なくとも６５％のヌクレオチド配列同一性を共有する。いくつかの実施形態において、第１および第２の組換え領域は、少なくとも７０％のヌクレオチド配列同一性を共有する。いくつかの実施形態において、第１および第２の組換え領域は、少なくとも７５％のヌクレオチド配列同一性を共有する。いくつかの実施形態において、第１および第２の組換え領域は、少なくとも８０％のヌクレオチド配列同一性を共有する。いくつかの実施形態において、第１および第２の組換え領域は、少なくとも８５％のヌクレオチド配列同一性を共有する。いくつかの実施形態において、第１および第２の組換え領域は、少なくとも９０％のヌクレオチド配列同一性を共有する。いくつかの実施形態において、第１および第２の組換え領域は、少なくとも９５％のヌクレオチド配列同一性を共有する。いくつかの実施形態において、第１および第２の組換え領域は、少なくとも９９％のヌクレオチド配列同一性を共有する。いくつかの実施形態において、第１および第２の組換え領域は、１００％のヌクレオチド配列同一性を共有する。
【００８１】
ある特定の実施形態において、第１および第２の組換え領域の各々は、約５０〜５，０００ヌクレオチドからなる。ある特定の実施形態において、第１および第２の組換え領域の各々は、約５０〜５，０００ヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態において、第１および第２の組換え領域の各々は、約１００〜２，５００ヌクレオチドからなる。ある特定の実施形態において、第１および第２の組換え領域の各々は、約１００〜１，０００ヌクレオチドからなる。ある特定の実施形態において、第１および第２の組換え領域の各々は、約２５０〜７５０ヌクレオチドからなる。ある特定の実施形態において第１および第２の組換え領域の各々は、約１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、３０００、３１００、３２００、３３００、３４００、３５００、３６００、３７００、３８００、３９００、４０００、４１００、４２００、４３００、４４００、４５００、４６００、４７００、４８００、４９００または５，０００ヌクレオチドからなる。いくつかの実施形態において、第１および第２の組換え領域の各々は、約５００ヌクレオチドからなる。いくつかの実施形態において、第１および第２の組換え領域の各々は、少なくとも１８ヌクレオチド塩基対を含む。いくつかの実施形態において、第１および第２の組換え領域の各々は、１５〜５００ヌクレオチド塩基対からなる。いくつかの実施形態において、第１および第２の組換え領域の各々は、１５〜５００、１５〜４９５、１５〜４９０、１５〜４８５、１５〜４８０、１５〜４７５、１５〜４７０、１５〜４６５、１５〜４６０、１５〜４５５、１５〜４５０、１５〜４４５、１５〜４４０、１５〜４３５、１５〜４３０、１５〜４２５、１５〜４２０、１５〜４１５、１５〜４１０、１５〜４０５、１５〜４００、１５〜３９５、１５〜３９０、１５〜３８５、１５〜３８０、１５〜３７５、１５〜３７０、１５〜３６５、１５〜３６０、１５〜３５５、１５〜３５０、１５〜３４５、１５〜３４０、１５〜３３５、１５〜３３０、１５〜３２５、１５〜３２０、１５〜３１５、１５〜３１０、１５〜３０５、１５〜３００、１５〜２９５、１５〜２９０、１５〜２８５、１５〜２８０、１５〜２７５、１５〜２７０、１５〜２６５、１５〜２６０、１５〜２５５、１５〜２５０、１５〜２４５、１５〜２４０、１５〜２３５、１５〜２３０、１５〜２２５、１５〜２２０、１５〜２１５、１５〜２１０、１５〜２０５、１５〜２００、１５〜１９５、１５〜１９０、１５〜１８５、１５〜１８０、１５〜１７５、１５〜１７０、１５〜１６５、１５〜１６０、１５〜１５５、１５〜１５０、１５〜１４５、１５〜１４０、１５〜１３５、１５〜１３０、１５〜１２５、１５〜１２０、１５〜１１５、１５〜１１０、１５〜１０５、１５〜１００、１５〜９５、１５〜９０、１５〜８５、１５〜８０、１５〜７５、１５〜７０、１５〜６５、１５〜６０、１５〜５５、１５〜５０、１５〜４５、１５〜４０、１５〜３５、１５〜３０、１５〜２５または１５〜２０ヌクレオチド塩基対からなる。いくつかの実施形態において、第１および第２の組換え領域の各々は、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５  ９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９または２００ヌクレオチド塩基対からなる。
【００８２】
本明細書中に提供される方法および組成物の好ましい実施形態において、相同性領域対の各相同性領域は、互いとの相同組換えを可能にするが、アセンブリに関与する組換え前の分子(複数可)の他の領域との相同組換えも宿主細胞のいずれのゲノム領域との相同組換えも可能にしない十分な長さおよび配列同一性のヌクレオチド配列を含む。
【００８３】
いくつかの実施形態において、環状化した発現ベクターは、自己環状化する単一の組換え前の分子から形成されるが、他の実施形態では、環状化した発現ベクターは、２つまたはそれを超える組換え前の直鎖状分子のＨＲ媒介性アセンブリによって形成される。例えば、環状化したベクターは、２つの組換え前の直鎖状分子からアセンブルされ得、ここで、第１の分子は、ギャップのあるベクターであり、第２の分子は、そのギャップのあるベクター上の２つの相同性領域と組み換わることができる２つの別個の相同領域を含むインサートである。ギャップのある直鎖状のベクターおよび直鎖状のインサートの各々に対して、組換え領域は、組換え前の直鎖状のベクターの末端もしくは末端近傍（例えば、１つの組換え領域が、各末端に位置し、さらなる配列が、その２つの領域の間に存在する）、末端に対して内部（例えば、各組換え領域は、両端においてさらなる配列によって挟まれる）、またはそれらの組み合わせ（例えば、一方の組換えが、一方の末端に存在し、他方が、それに対して内部であり、両サイドにおいてさらなる配列によって挟まれる）に位置し得る。なおも他の実施形態において、ギャップのあるベクターを修復するインサート自体が、互いに対する相同領域を含む少なくとも２つの直鎖状核酸からアセンブルされ得る。例えば、環状化したベクターは、異なる３つの組換え前の直鎖状フラグメントから形成され得、ここで、第１の直鎖状の分子は、相同性領域Ａ１およびＢ１を含み、第２の直鎖状の分子は、Ｂ２およびＣ２を含み、第３の直鎖状の分子は、Ｃ３およびＡ３を含み、ＨＲ適格性の宿主細胞における各フラグメントの相同領域の間（すなわち、Ａ１とＡ３、Ｂ１とＢ２およびＣ２とＣ３）の組換えによって、領域Ａ→Ｂ→Ｃを含む環状化した発現ベクターが形成される。
【００８４】
なおも他の実施形態において、環状化したベクターは、ＨＲ適格性の宿主細胞において、少なくとも４、５、６、７、８、９または１０個の異なる組換え前の直鎖状フラグメントから同様の形式でアセンブルされる。実施の理論に拘束されるものではないが、２つより多い組換え前の直鎖状分子からアセンブルされる環状化した発現ベクターを必要とすることによって、相同組換えに特に長けている宿主細胞が選択されると考えられている。したがって、複数の組換え前の分子からの環状発現ベクターのアセンブリは、より高次の組込み事象が望まれるとき、例えば、多重ゲノム組込み（例えば、２つまたはそれを超えるドナー外来性ＤＮＡの多重ゲノム組込み）、または非常に低いＨＲ率を有すると知られているかもしくは疑われている細胞型へのゲノム組込みを行うときに、好ましい場合がある。１つの例において、３つの外来性ドナー核酸を宿主細胞のそれぞれの３つのゲノム標的部位で多重（すなわち、同時）に組み込む場合、宿主細胞は、少なくとも３つの組換え前の直鎖状フラグメントをアセンブル「せざるを得なく」なることにより、環状発現ベクターが形成される。選択マーカーを発現する環状ベクターを形成するように３つのフラグメントを首尾良く組み換え得る細胞だけが、選択を生き残ることができ、すなわち、選択され得、これらの細胞は、３つの外来性ドナー核酸の各々をそれらのそれぞれのゲノム標的部位に首尾良く組み込んだ可能性が高い。いくつかの実施形態において、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０個または１０個を超える外来性ドナー核酸を少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０個または１０個を超えるそれぞれのゲノム標的部位に多重に組込むことが望まれるとき、宿主細胞は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０個または１０個を超える組換え前のフラグメントをアセンブルせざるを得ず、すなわち、組み換えざるを得ず、それにより、宿主細胞において選択マーカーを発現する環状発現ベクターが形成される。いくつかの実施形態において、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０個または１０個を超える組換え前のフラグメントのインビボアセンブリによって、１つより多い選択マーカー（例えば、２つ、３つまたは３つより多い異なる選択マーカー）のコード配列を含む環状発現ベクターが形成される。
【００８５】
好ましい実施形態において、環状化した発現ベクターは、いったんアセンブリされると、選択マーカーのコード配列、および宿主細胞においてマーカーの発現を可能にする好適な制御配列（例えば、プロモーターおよび／またはターミネーター）を含む。選択マーカーには、選択マーカーを含む宿主細胞の選択を可能にするものが含まれるが、他の実施形態は、選択マーカーを含まない細胞の選択を可能にし、それは、選択後に環状化した発現ベクターの除去が望まれる実施形態における用途が見出される（下記で論じられるように）。いくつかの実施形態において、環状発現ベクターのアセンブリの前に、組換え前の直鎖状分子、または多重フラグメントアセンブリの少なくとも１つの組換え前のフラグメントは、選択マーカーのインタクトなコード配列を、ＨＲ媒介性アセンブリに関わる相同性領域とは別個であってその相同性領域から離れて存在する制御配列と作動可能な連結状態で含む。したがって、環状発現ベクターのアセンブリは、選択マーカーのコード配列も変化させないし、発現に必要ないずれの制御配列も変化させない。そのようないくつかの実施形態において、環状化事象だけが、マーカーのコード配列の増殖およびマーカーのコード配列からの持続的な発現を可能にするのに対して、環状化していない直鎖状のベクターは、宿主細胞において増殖され得ず、かつ／または維持され得ない。好ましい実施形態において、環状化した発現ベクターを含まない宿主細胞は、本明細書中に記載される方法において、選択する工程を生き残らず、および／または選択されない。実施の理論に拘束されるものではないが、本明細書中に記載される方法に従って選択されるために、宿主細胞にＨＲを介して発現ベクターを環状化することを要求することによって、選択された細胞が、外来性ＤＮＡの、１つまたはそれを超える意図されたＨＲ媒介性ゲノム組込みも首尾良く実行した可能性が高まると考えられている。
【００８６】
他の実施形態において、選択マーカーをコードする配列および／または発現のために必要なその制御配列は、インタクトではなく、すなわち、任意の単一の組換え前の分子上で作動可能な連結状態ではない。そのようないくつかの実施形態において、発現ベクターが環状化したときだけ、マーカーのコード配列は、その制御エレメントと共に作動可能な連結状態になる。したがって、マーカーをコードする配列およびまたはその必須の制御配列は、構成している組換え前のフラグメント間のＨＲが、選択マーカーのコード配列をその制御配列と作動可能な連結状態で再構成する限り、アセンブリに関与する任意の数のフラグメントに分配された任意の数の重複する相同配列に分けられてもよい。これらの実施形態は、環状化した発現ベクターの形成が、非ＨＲ機構、例えば、非相同末端結合または一本鎖アニーリングを介した、組換え前のフラグメントの接続に起因する宿主細胞の選択を回避するのに特に有用である；選択を生き残るそのような細胞は、偽陽性を表わす。これらの望まれない事象の頻度は、ホスファターゼを使用して組換え前のフラグメント(複数可)上の５’リン酸基を除去することによって低下させることができ、これは、インビトロライゲーションに使用される標準的な方法である。ベクターの再ライゲーションは、組換え前のフラグメント(複数可)をＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼおよびｄＡＴＰで処理することによっても回避され得る；これは、インビボにおいてベクターの再環状化を防ぎ、真の組換えクローンのスクリーニングを容易にするのに特に有効であると報告されている。Ｂｅｓｓａら、Ｙｅａｓｔ  ２９：４１９−４２３（２０１２）を参照のこと。さらに、事前に環状化されたＤＮＡの誤った導入が原因の偽陽性は、エンドヌクレアーゼ消化によって環状ベクターを線状化し、次いでそのフラグメントを単離するのではなく（これは、未消化の環状鋳型を持ち越す可能性がある）、組換え前のフラグメント(複数可)をＰＣＲによってプレップすることによって、回避され得る。それにもかかわらず、実施の理論に拘束されるものではないが、選択プロセスを生き残るために、ＨＲを介して、例えば、少なくとも２つの部分的な配列から、マーカーのコード配列を再構成することを宿主細胞に要求することによって、本明細書中に記載される方法に従って選択された細胞が、外来性ＤＮＡの１つまたはそれを超える意図されたＨＲ媒介性ゲノム組込みも首尾良く行った可能性が高まると考えられている。
【００８７】
本明細書中に提供される方法のいくつかの実施形態において、環状化した発現ベクターは、いったんアセンブルされると、本明細書中に記載される部位特異的ヌクレアーゼのコード配列、および宿主細胞においてそのヌクレアーゼの発現を可能にする好適な制御配列（例えば、プロモーターおよび／またはターミネーター）をさらに含む。いくつかの実施形態において、そのヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ関連ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬ−エフェクターＤＮＡ結合ドメイン−ヌクレアーゼ融合タンパク質（ＴＡＬＥＮ）、トランスポザーゼおよび部位特異的リコンビナーゼからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ関連ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼである。いくつかのそのような実施形態において、環状発現ベクターは、ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼの真正の（ｏｂｌｉｇａｔｅ）ガイド配列をコードする単数または複数の配列、例えば、ｃｒＲＮＡ活性およびｔｒａｃｒＲＮＡ活性をさらに含み、それにより、そのＲＮＡガイドＤＮＡエンドヌクレアーゼによる標的ゲノムＤＮＡの部位特異的な認識および切断が可能になる。いくつかの実施形態において、ｃｒＲＮＡ活性およびｔｒａｃｒＲＮＡ活性は、単一の連続したＲＮＡ分子、すなわち、キメラガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子として、環状発現ベクターから発現される。いくつかの実施形態において、環状発現ベクターは、またヌクレアーゼのコード配列を含まずに、ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼのガイド配列(複数可)（例えば、ｇＲＮＡ）をコードする１つまたはそれを超える配列を含む。いくつかのそのような実施形態において、ＲＮＡガイドヌクレアーゼをコードする１つまたはそれを超える配列は、別個のベクターに供給され得るか、ゲノムに組み込まれ得るか、またはそのヌクレアーゼが、例えば、インビトロにおいて発現され、精製されたタンパク質として細胞に導入され得る。
【００８８】
ヌクレアーゼのコード配列、ならびに／または細胞におけるそのヌクレアーゼの発現および作動可能性に必要なさらなる配列が、環状化した発現ベクターに含められる上述のいずれかの実施形態において、これらの配列は、構成している組換え前のフラグメント間のＨＲが、そのヌクレアーゼのコード配列をその制御配列と作動可能な連結状態で再構成する限り、アセンブリ反応に関与する１つもしくはそれを超える組換え前の直鎖状のフラグメント(複数可)のいずれかにおいてインタクト（すなわち、作動可能な連結状態）であってもよいし、あるいは、アセンブリに関与する任意の数のフラグメントに分配された任意の数の重複する相同配列に分けられてもよい。有益なことに、ヌクレアーゼのコード配列（および／またはそのヌクレアーゼがＲＮＡガイドヌクレアーゼである場合、ガイドＲＮＡ配列をコードする配列）を環状化した発現ベクターにつなげることは、これらの配列の発現が、ＨＲ媒介性組込み事象を助けるのに十分なレベルおよび期間において維持されることを確実にする。本明細書中に記載される方法によると、遺伝子ターゲティングの効率は、意図された組込み部位近傍に導入される標的化されたゲノム二本鎖断裂（ＤＳＢ）と組み合されるとき、改善され得る。例えば、Ｊａｓｉｎ，Ｍ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ  １２（６）：２２４−２２８（１９９６）；およびＵｒｎｏｖら、Ｎａｔｕｒｅ  ４３５（７０４２）：６４６−６５１（２００５）を参照のこと。さらに、ヌクレアーゼのコード配列および／または関連するガイド配列(複数可)を環状化した発現ベクターにつなげることは、これらの配列の発現をもたらすために複数のベクターを宿主細胞に導入する必要性を排除する。さらに、そのようにつなげることによって、所望の組込みを行った宿主細胞の選択後に、ヌクレアーゼと標識された（marked）プラスミドとを同時に除去することが可能になる。したがって、ヌクレアーゼの不必要に長期間の発現が回避され、その結果として、それに伴うあらゆる毒性が回避される（例えば、Ｃｈｏら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ，“Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ  ａｎｄ  ｎｉｃｋａｓｅｓ，”（２０１３）；Ｓａｎｄｅｒら、“Ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ  ａｂｓｔｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｚｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒ  ｎｕｃｌｅａｓｅ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｐｒｏｆｉｌｅｓ  ｒｅｖｅａｌｓ  ａｎ  ｅｘｐａｎｄｅｄ  ｌａｎｄｓｃａｐｅ  ｏｆ  ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ  ｓｉｔｅｓ，”  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４１（１９）：ｅ１８１（２０１３）を参照のこと）。
【００８９】
本明細書中に提供される方法のいくつかの実施形態において、環状化した発現ベクターは、いったんアセンブルされると、下記の５．２．２の項に記載される１つまたはそれを超える外来性ドナー核酸をさらに含む。いくつかのそのような実施形態において、外来性ドナー核酸は、宿主細胞にも導入されたヌクレアーゼ、例えば、環状化した発現ベクターによってもコードされるヌクレアーゼの認識配列に該外来性ドナー核酸を隣接して配置することによって、環状化した発現ベクターから放出され得る。
【００９０】
当業者には明らかであるように、環状化した発現ベクターは、好ましくは、その発現ベクターが、複数ラウンドの宿主細胞分裂の間に複製され、増殖され、分離されることを可能にする、自律増殖配列を含む。その自律増殖配列は、原核生物または真核生物のもののいずれかであり得、複製起点を含む。複製起点は、多量体起点結合タンパク質（multimeric  origin-binding  protein）によって認識され、その起点部位にＤＮＡ複製酵素をアセンブリする際に重要な役割を果たす、複数の短い反復配列を含むユニークなポリヌクレオチドである。本明細書中に提供されるエントリーベクターおよびアセンブリベクターにおいて使用するために好適な複製開始点としては、大腸菌ｏｒｉＣ、ｃｏｌＥ１プラスミド起点、２μおよびＡＲＳ（両方とも、酵母系において有用）、ｓｆｌ、ＳＶ４０  ＥＢＶ  ｏｒｉＰ（哺乳動物系において有用）またはｐＳＣ１０１に見出されるものが挙げられるがこれらに限定されない。発現ベクターの特定の実施形態には、原核生物の自律増殖配列と真核生物の自律増殖配列の両方が含まれる。この配列は、構成している組換え前のフラグメント間のＨＲが、その自律増殖配列を再構成する限り、アセンブリ反応に関与する１つもしくはそれを超える組換え前の直鎖状のフラグメント(複数可)のいずれかにおいてインタクト（すなわち、作動可能な連結状態）であってもよいし、あるいは、アセンブリに関与する任意の数のフラグメントに分配された任意の数の重複する相同配列に分けられてもよい。特定の実施形態において、その自律増殖配列は、インタクトではなく、すなわち、任意の単一の組換え前の分子上で作動可能な連結状態ではない。いくつかのそのような実施形態において、発現ベクターが、組換え前の分子(複数可)の組換えによって環状化したときだけ、自律増殖配列は、作動可能な連結状態になる。これらの実施形態は、環状化した発現ベクターの形成が、例えば、非相同末端結合または一本鎖アニーリングによる、インタクトな自律増殖配列を含む組換え前のフラグメントの非ＨＲ結合に起因する宿主細胞の選択を回避するのに特に有用である；選択を生き残るそのような細胞は、偽陽性を表わす。
【００９１】
当業者には明らかであるように、宿主細胞において環状発現ベクターの形成をもたらす、上に記載された１つまたはそれを超える直鎖状の組換え前のＤＮＡフラグメントの間のインビボ組換えは、起始点として適切な（例えば、同じ）相同性領域を含む組換え前の環状核酸を用いても達成され得る。本明細書中に記載される任意の組換え前の組成物に対して、その組成物は、直鎖状核酸分子として宿主細胞に直接、形質転換され得るか、あるいは、組換え前の分子を含む親環状分子が、宿主細胞に導入され、１つまたはそれを超えるヌクレアーゼによってインビボにおいて切断されることにより、組換え前の分子が遊離され得る。いくつかの実施形態において、マーカーベクターのアセンブリに関与する１つまたはそれを超える直鎖状の組換え前の分子は、切断のための１つまたはそれを超えるゲノム標的部位を標的化する１つまたはそれを超えるヌクレアーゼによって、宿主細胞におけるインビボ切断を介して親環状プラスミドから遊離され得る。
【００９２】
別の態様において、本明細書中に提供される組込み方法の実施において有用な組換え前の発現ベクター中間体を作製する方法が本明細書中に提供される。いくつかの実施形態において、自律増殖配列、第１のプライマー結合配列および第２のプライマー結合配列を含むベースベクターが、少なくとも第１のプライマーおよび第２のプライマーを使用して増幅される。第１のプライマーは、通常、第１の配列特異的組換え配列を有する５’部分およびベースベクターの第１のプライマー結合配列に実質的に相補的な（すなわち、所望の核酸の増幅を可能にするが他の望まれない分子の増幅を可能にしないのに十分な相補性を有する）プライミング部分を有する３’部分を含む。同様に、第２のプライマーは、第２の配列特異的組換え配列を有する５’部分およびベースベクターの第２のプライマー結合配列に実質的に相補的な（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ）プライミング部分を有する３’部分を含む。そのベースベクター（それは、増幅プロセスの開始前に直鎖状または環状のいずれかであり得る）の増幅によって、第１の配列特異的組換え領域を含む第１の末端および第２の配列特異的組換え領域を含む第２の末端を有する直鎖状の発現ベクター中間体が生成される。ある特定の実施形態において、ベースベクターは、プラスミド、特に、当該分野で公知であるような、様々な細菌または酵母に由来する染色体外エレメントに基づくプラスミドである。ある特定の他の実施形態において、ベースベクターは、１つまたはそれを超える選択マーカー、転写開始配列および／または転写終結配列をさらに含む。当業者が認識するように、標的核酸の中に保持されている、遺伝子の発現を制御することを目的としたエレメントは、いったんその環状発現ベクターがインビボにおいてアセンブルされたら、発現されるべき遺伝子(複数可)と機能的にまたは作動可能に会合されるように発現ベクター内に位置されるべきである。そのようなエレメントの特定のポジショニングは、使用されるエレメント、宿主細胞、発現されるべき遺伝子(複数可)、および上に記載されたような他の因子（宿主細胞における所望の組込みの数を含む）に依存する。結果として、本教示に従って作製される特定の発現ベクターの最終的なデザインは、選択できることであって、具体的な適用に依存する。
【００９３】
さらに他の態様は、前述の方法に従って作製される発現ベクター中間体およびそれを含む宿主細胞に関する。なおも別の態様は、本組込み方法の実施において有用な異なる複数の発現ベクター中間体を作製する方法に関する。そのような方法では、２つまたはそれを超える発現ベクター中間体（各々が、異なるインサート核酸との相同組換えを可能にするユニークな配列特異的組換え領域を有する）を生成するために、ベースベクターが増幅される。そのような増幅反応は、異なる発現ベクター中間体を生成するために、好ましくは、別個の反応混合物中で行われる。そのようなハイスループットアプローチの特に好ましい実施形態において、必須の操作は、自動化された様式で行われ、ここで、１つまたはそれを超える工程が、コンピュータによってコントロールされるデバイスによって行われる。
【００９４】
いくつかの実施形態において、本明細書中に提供されるような組換え前の分子を構築するために任意のベクターを使用してよい。特に、当該分野で公知のベクターおよび商業的に入手可能なベクター（およびそれらのバリアントまたは誘導体）は、上に記載されたような組換え領域を含むように操作され得る。そのようなベクターは、例えば、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．、ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｎｏｖａｇｅｎ、ＮＥＢ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ＥｐｉＣｅｎｔｅｒ、ＯｒｉＧｅｎｅｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．およびＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓから入手され得る。特定の目的の一般的なクラスのベクターとしては、原核生物および／または真核生物のクローニングベクター、発現ベクター、融合ベクター、ツーハイブリッドまたは逆ツーハイブリッドベクター、種々の宿主において使用するためのシャトルベクター、変異誘発ベクター、転写ベクター、大きなインサートを受け入れるためのベクターなどが挙げられる。目的の他のベクターとしては、ウイルス起源のベクター（Ｍ１３ベクター、細菌ファージλベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）およびレトロウイルスベクター）、高コピー数、低コピー数および調節可能なコピー数のベクター、単一の宿主において組み合わせて使用するための適合性のレプリコンを有するベクター（ＰＡＣＹＣ１８４およびｐＢＲ３２２）、ならびに真核生物のエピソーム複製ベクター（ｐＣＤＭ８）が挙げられる。他の実施形態において、組換え前の分子は、クローニングされたＤＮＡ（例えば、ＤＮＡ「ライブラリー」）から当該分野で公知の標準的な手順によって、化学合成によって、ｃＤＮＡのクローニングによって、または所望の細胞から精製されたゲノムＤＮＡもしくはそのフラグメントのクローニングによって、またはＰＣＲ増幅およびクローニングによって、得られ得る。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｄ．ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２００１）；Ｇｌｏｖｅｒ，Ｄ．Ｍ．（ｅｄ．），ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，２ｄ．ｅｄ．，ＭＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｔｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｕ．Ｋ．（１９９５）を参照のこと。
５．２．１．１  選択マーカー
【００９５】
好ましい実施形態において、環状化した発現ベクターは、いったんアセンブルされると、選択マーカーのコード配列および宿主細胞においてそのマーカーの発現を可能にする好適な制御配列（例えば、プロモーターおよび／またはターミネーター）を含む。有用な選択マーカーとしては、ポジティブ選択系とネガティブ選択系の両方において機能するものが挙げられる。
【００９６】
いくつかの実施形態において、所望の細胞の選択は、選択マーカーによってコードされる薬物耐性について選択することに基づく（図３Ｂ）。ポジティブ選択系は、形質転換された細胞の成長を容易にするものである。ポジティブ選択系は、条件的ポジティブ選択系または非条件的ポジティブ選択系に分けられ得る。条件的ポジティブ選択系は、形質転換されていない細胞にとっては毒性である特定の基質に対する耐性を付与するかまたは形質転換された細胞の成長および／もしくは分化を促すタンパク質、通常は酵素をコードする遺伝子からなる。条件的ポジティブ選択系では、その基質は、いくつかの方法のうちの１つにおいて作用し得る。基質は、抗生物質、除草剤、薬物アナログもしくは代謝産物アナログまたは炭素供給前駆体であり得る。各場合において、その遺伝子は、形質転換された細胞の選択的な成長および増殖を促すための、基質に対して特異性を有する酵素をコードする。その基質は、形質転換されていない細胞にとって毒性または無毒性であり得る。タンパク質合成を阻害することによってカナマイシン耐性を付与するｎｐｔＩＩ遺伝子は、形質転換されていない細胞にとって毒性である系の古典的な例である。ホスホマンノースイソメラーゼをコードするｍａｎＡ遺伝子は、選択基質が毒性でない条件的ポジティブ選択系の例である。この系では、基質であるマンノースは、形質転換されていない細胞に対して炭素源として作用することができないが、ｍａｎＡで形質転換された細胞の成長を容易にする。非条件的ポジティブ選択系は、外部の基質を必要としないが、形質転換された細胞の選択的な成長および分化を容易にする。植物における例は、内因的に植物ホルモンのレベルを改変することによって苗条（shoot）の発達を増強するｉｐｔ遺伝子である。
【００９７】
ネガティブ選択系は、形質転換された細胞の死をもたらす。これらは、条件的選択系および非条件的選択系として記載され得る主要な選択マーカー系である。選択系が、基質依存的でないとき、その選択系は、非条件的ネガティブ選択系である。一例は、特定の細胞型を取り除くリボヌクレアーゼなどの毒性タンパク質の発現である。その毒性遺伝子の作用に、基質が毒性を発現することが必要であるとき、その系は、条件的ネガティブ選択系である。これらには、シトシンデアミナーゼをコードする細菌のｃｏｄＡ遺伝子、細菌のシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ遺伝子、細菌のハロアルカンデハロゲナーゼ遺伝子またはＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓのアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子が挙げられる。これらの各々は、無毒性作用物質（non-toxic  agent）を毒性作用物質に変換して、形質転換された細胞の死をもたらす。ｃｏｄａ遺伝子は、葉緑体の形質転換のための効果的なドミナントネガティブ選択マーカーであることも示されている。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍのａｕｘ２およびｔｍｓ２遺伝子は、ポジティブ選択系においても使用できる点において、興味深い。ポジティブ選択は、環状発現ベクターを首尾良く組み換えた（かつ推定的に、１つまたはそれを超える意図されたＨＲ媒介性ゲノム組込みを行った）細胞を富化するために利用することができ、ネガティブ選択は、いったん所望のゲノム組込みが確認されたら、同じ集団から発現ベクターを除去する（「取り除く」）ために使用できるので、ポジティブ−ネガティブ選択系の組み合わせは、本明細書中に提供される組込み方法にとって特に有用である。
【００９８】
多種多様の選択マーカーが、当該分野で公知である（例えば、Ｋａｕｆｉｎａｎ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１８５：４８７（１９９０）；Ｋａｕｆｍａｎ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１８５：５３７（１９９０）；Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ  ａｎｄ  Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ，Ｇｅｎｅ，１０３：５３（１９９１）；Ｒｏｍａｎｏｓら、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２：Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐａｇｅｓ  １２３−１６７（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  １９９５）；Ｍａｒｋｉｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５４：３５９（１９９６）；Ｐｆｅｉｆｅｒら、Ｇｅｎｅ，１８８：１８３（１９９７）；Ｔｕｃｋｅｒ  ａｎｄ  Ｂｕｒｋｅ，Ｇｅｎｅ，１９９：２５（１９９７）；Ｈａｓｈｉｄａ−Ｏｋａｄｏら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，４２５：１１７（１９９８）を参照のこと）。いくつかの実施形態において、選択マーカーは、薬物耐性マーカーである。薬物耐性マーカーは、それがなければ細胞を殺滅する外来性薬物をその細胞が解毒することを可能にする。薬物耐性マーカーの実例としては、抗生物質（例えば、アンピシリン、テトラサイクリン、カナマイシン、ブレオマイシン、ストレプトマイシン、ハイグロマイシン、ネオマイシン、ＺｅｏｃｉｎＴＭなど）に対する耐性を付与するものが挙げられるがこれらに限定されない。他の選択マーカーとしては、ブレオマイシン耐性遺伝子、メタロチオネイン遺伝子、ハイグロマイシンＢ−ホスホトランスフェラーゼ遺伝子、ＡＵＲＩ遺伝子、アデノシンデアミナーゼ遺伝子、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ遺伝子、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子、チミジンキナーゼ遺伝子、キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子などが挙げられる。
【００９９】
ｐＢＲおよびｐＵＣ由来のプラスミドは、選択マーカーとして細菌の薬物耐性マーカーであるＡＭＰｒまたはＢＬＡ遺伝子を含む（Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ，Ｊ．Ｇ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７５：３７３７（１９７８）を参照のこと）。ＢＬＡ遺伝子は、ベータ−ラクタマーゼとして機能し、ベータ−ラクタム抗生物質、例えば、狭域セファロスポリン、セファマイシンおよびカルバペネム（エルタペネム）、セファマンドールおよびセフォペラゾン、ならびにテモシリンを除くすべての抗グラム陰性菌ペニシリンに対する菌耐性に関与する、酵素Ｔｅｍ−１をコードする。
【０１００】
他の有用な選択マーカーとしては、ＮＡＴ１、ＰＡＴ、ＡＵＲ１−Ｃ、ＰＤＲ４、ＳＭＲ１、ＣＡＴ、マウスｄｈｆｒ、ＨＰＨ、ＤＳＤＡ、ＫＡＮＲおよびＳＨ  ＢＬＥ遺伝子が挙げられるがこれらに限定されない。Ｓ．ｎｏｕｒｓｅｉのＮＡＴ１遺伝子は、ノウルセオトリシン（ｎｏｕｒｓｅｏｔｈｒｉｃｉｎ）Ｎ−アセチルトランスフェラーゼをコードし、ノウルセオトリシンに対する耐性を付与する。Ｓ．ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ  Ｔｕ９４由来のＰＡＴ遺伝子は、ホスフィノトリシンＮ−アセチルトランスフェラーゼをコードし、ビアラホス（ｂｉａｌｏｐｈｏｓ）に対する耐性を付与する。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＡＵＲ１−Ｃ遺伝子は、出芽酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにとって毒性である、Ａｕｅｒｏｂａｓｉｄｉｕｍ  ｐｕｌｌｕｌａｎｓによって産生される抗真菌性（ａｎｔｉｆｕｎｃａｌ）抗生物質であるオーレオバシジン（Ａｕｅｒｏｂａｓｉｄｉｎ）Ａ（ＡｂＡ）に対する耐性を付与する。ＰＤＲ４遺伝子は、セルレニン（ｃｅｒｕｌｅｎｉｎ）に対する耐性を付与する。ＳＭＲ１遺伝子は、スルホメツロンメチルに対する耐性を付与する。Ｔｎ９トランスポゾン由来のＣＡＴコード配列は、クロラムフェニコールに対する耐性を付与する。マウスｄｈｆｒ遺伝子は、メトトレキサートに対する耐性を付与する。Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａのＨＰＨ遺伝子は、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼをコードし、ハイグロマイシンＢに対する耐性を付与する。大腸菌のＤＳＤＡ遺伝子は、Ｄ−セリンデアミナーゼをコードし、唯一の窒素源としてＤ−セリンを含むプレート上で酵母が成長することを可能にする。Ｔｎ９０３トランスポゾンのＫＡＮＲ遺伝子は、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼをコードし、Ｇ４１８に対する耐性を付与する。Ｓｔｒｅｐｔｏａｌｌｏｔｅｉｃｈｕｓ  ｈｉｎｄｕｓｔａｎｕｓ由来のＳＨ  ＢＬＥ遺伝子は、ゼオシン結合タンパク質をコードし、ゼオシン（ブレオマイシン）に対する耐性を付与する。
【０１０１】
他の実施形態において、選択マーカーは、栄養素要求性マーカーである。栄養素要求性マーカーは、必須成分（通常、アミノ酸）を欠く培地中で成長している間、細胞がその必須成分を合成することを可能にする。選択的栄養素要求性遺伝子配列としては、例えば、ヒスチジノールの存在下のヒスチジン非含有培地中での成長を可能にするｈｉｓＤが挙げられる。いくつかの実施形態において、選択マーカーは、宿主株における栄養の栄養素要求性（nutritional  auxotrophy）をレスキューする。そのような実施形態では、宿主株は、栄養素要求性の表現型を引き起こす、その宿主のアミノ酸生合成経路の１つもしくはそれを超える遺伝子（例えば、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ１、ＭＥＴ１５およびＴＲＰ１など）に機能的破壊を含むか、または栄養素要求性の表現型を引き起こすその宿主のヌクレオチド生合成経路の１つもしくはそれを超える遺伝子（例えば、ＡＤＥ２およびＵＲＡ３など）に機能的破壊を含む。特定の実施形態において、宿主細胞は、ＵＲＡ３遺伝子に機能的破壊を含む。栄養素要求性の表現型を引き起こす宿主細胞における機能的破壊は、点変異、部分的もしくは完全な遺伝子欠失、またはヌクレオチドの付加もしくは置換であり得る。アミノ酸またはヌクレオチドの生合成経路内の機能的破壊によって、宿主株は、原栄養性の野生型細胞とは対照的に１つまたはそれを超える栄養分の補充がない培地中では最適な成長ができない栄養素要求性変異体になる。次いで、宿主株における機能的に破壊された生合成遺伝子は、栄養素要求性遺伝子マーカーとして機能し得、その栄養素要求性遺伝子マーカーは、後で、例えば、破壊された生合成遺伝子の機能的なコピーを含む１つまたはそれを超えるプラスミドを導入すると、レスキューされ得る。
【０１０２】
酵母において、ＵＲＡ３、ＴＲＰ１およびＬＹＳ２遺伝子を選択マーカーとして利用することは、ポジティブ選択とネガティブ選択の両方が可能であるので、顕著な利点がある。ポジティブ選択は、ＵＲＡ３、ＴＲＰ１およびＬＹＳ２変異の栄養素要求性の補完によって行われるのに対して、ネガティブ選択は、原栄養菌株の成長を妨げるがそれぞれＵＲＡ３、ＴＲＰ１およびＬＹＳ２変異体の成長を可能にする、それぞれ特異的阻害剤である５−フルオロ−オロチン酸（ＦＯＡ）、５−フルオロアントラニル酸およびａ−アミノアジピン酸（ａＡＡ）に基づく。ＵＲＡ３遺伝子は、ウラシルの生合成に必要な酵素であるオロチジン−５’リン酸デカルボキシラーゼをコードする。ＦＯＡは、デカルボキシラーゼの作用によって毒性化合物である５−フルオロウラシルに変換されるとみられるので、Ｕｒａ３−（またはｕｒａ５−）細胞は、すべてのＵＲＡ３＋細胞を殺滅するがｕｒａ３−細胞を殺滅しないＦＯＡを含む培地上で選択され得る。ＦＯＡ培地上でのネガティブ選択は、高度に識別的であり、通常、１０−２個未満のＦＯＡ耐性コロニーが、Ｕｒａ＋である。ＦＯＡ選択手順を用いることにより、より重要なことには、ＵＲＡ３含有プラスミドを有しない細胞を選択するために、変異による一倍体株においてｕｒａ３マーカーを生成することができる。ＴＲＰ１遺伝子は、トリプトファン生合成における３番目のステップを触媒するホスホリボシルアントラニル酸イソメラーゼをコードする。５−フルオロアントラニル酸を用いる対抗選択は、アントラニル酸をトリプトファンに変換するために必要な酵素を欠くがゆえに５−フルオロアントラニル酸（ｆｌｕｒｏａｎｔｈｒａｎｉｌｉｃ  ａｃｉｄ）に耐性である株による代謝拮抗を含む。ＬＹＳ２遺伝子は、リジンの生合成に必要な酵素であるアミノアジピン酸レダクターゼをコードする。Ｌｙｓ２−およびｌｙｓ５−変異体は、通常の窒素源を欠くがリジンおよびａＡＡを含む培地上で成長するが、正常な株は、成長しない。明らかに、ｌｙｓ２およびｌｙｓ５変異は、高レベルのａＡＡによって形成されるリジン生合成の毒性中間体の蓄積を引き起こすが、これらの変異体は、なおもａＡＡを窒素源として使用することができる。ＦＯＡ選択手順と同様に、ＬＹＳ２含有プラスミドは、ｌｙｓ２宿主から都合よく除去され得る。他の実施形態において、選択マーカーは、栄養素要求性（ａｕｘｏｔｏｐｈｉｃ）変異をレスキューするマーカー以外のマーカーである。
【０１０３】
本明細書中に記載される任意の方法および組成物に対して、レポーター遺伝子（例えば、形質転換されたコロニーのブルー／ホワイト選択を容易にするためのｌａｃＺレポーター遺伝子）または蛍光タンパク質（例えば、緑色、赤色および黄色蛍光タンパク質）を選択マーカー遺伝子として使用することにより、１つまたはそれを超える組換え前のフラグメントから環状発現ベクターを首尾良くアセンブルできるＨＲ適格性の宿主細胞の選択を容易にすることができる（図３Ａを参照のこと）。これらの実施形態では、形質転換された細胞を、選択的化合物、例えば、抗生物質を含む培地中で成長させるのではなく、それらの細胞を、レポーターの発現を可能にするのに十分な条件下で成長させ、そのレポーターの視覚的検出、比色検出または蛍光検出を介して、選択を行うことができる。宿主細胞の薬物非含有での選択圧のない細胞維持は、いくつかの利点を提供し得る。例えば、選択薬および他の選択圧の因子は、しばしば、変異原性であるか、またはそうでない場合は、細胞の生理機能に干渉し、細胞ベースのアッセイの結果をゆがめる。例えば、選択薬は、アポトーシスに対する感受性を低下させ得（Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３６（３７）：１１１６９−１１１７８（１９９７））、ＤＮＡ修復および薬物代謝を増大し得（Ｄｅｆｆｉｅら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４８（１３）：３５９５−３６０２（１９８８））、細胞のｐＨを上昇させ得（Ｔｈｉｅｂａｕｔら、Ｊ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．３８（５）：６８５−６９０（１９９０）；Ｒｏｅｐｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．３２（４１）：１１０４２−１１０５６（１９９３）；Ｓｉｍｏｎら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．９１（３）：１１２８−１１３２（１９９４））、リソソームおよびエンドソームのｐＨを低下させ得（Ｓｃｈｉｎｄｌｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．３５（９）：２８１１−２８１７（１９９６）；Ａｌｔａｎら、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１８７（１０）：１５８３−１５９８（１９９８））、原形質膜電位を低下させ得（Ｒｏｅｐｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．３２（４１）：１１０４２−１１０５６（１９９３））、塩化物（Ｇｉｌｌら、Ｃｅｌｌ．７１（１）：２３−３２（１９９２））およびＡＴＰ（Ａｂｒａｈａｍら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．９０（１）：３１２−３１６（１９９３））に対する原形質膜コンダクタンスを上昇させ得、小胞輸送の速度を高め得る（Ａｌｔａｎら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．９６（８）：４４３２−４４３７（１９９９））。したがって、本明細書中に提供される方法は、選択圧によって引き起こされるアーチファクトがないスクリーニングを可能にする、薬物を用いない選択によって実施され得る。
【０１０４】
フローサイトメトリーセルソーターを使用することにより、蛍光マーカー、またはフルオロフォア（ｆｌｕｏｒｐｈｏｒｅｓ）に結合し、かつマーカータンパク質に対する親和性を有するタンパク質（例えば、抗体）の発現が陽性である細胞を単離することができる。いくつかの実施形態において、複数ラウンドのソーティングが行われ得る。１つの実施形態において、フローサイトメトリーセルソーターは、ＦＡＣＳ装置である。ハイスループットスクリーニングに適合したものを含む他の蛍光プレートリーダーも使用することができる。ＭＡＣＳ（磁気細胞ソーティング）を使用することによってもまた、例えば、磁気ビーズに結合され、かつマーカータンパク質に対する親和性を有するタンパク質を有する宿主細胞を選択することができる。これは、選択マーカーが、例えば、膜タンパク質、膜貫通タンパク質、膜アンカータンパク質、細胞表面抗原または細胞表面レセプター（例えば、サイトカインレセプター、免疫グロブリンレセプターファミリーメンバー、リガンド開口型（ｌｉｇａｎｄ−ｇａｔｅｄ）イオンチャネル、タンパク質キナーゼレセプター、Ｇタンパク質共役レセプター（ＧＰＣＲ）、核ホルモンレセプターおよび他のレセプター；ＣＤ１４（単球）、ＣＤ５６（ナチュラルキラー細胞）、ＣＤ３３５（ＮＫｐ４６、ナチュラルキラー細胞）、ＣＤ４（Ｔヘルパー細胞）、ＣＤ８（細胞傷害性Ｔ細胞）、ＣＤ１ｃ（ＢＤＣＡ−１、血液樹状細胞サブセット）、ＣＤ３０３（ＢＤＣＡ−２）、ＣＤ３０４（ＢＤＣＡ−４、血液樹状細胞サブセット）、ＮＫｐ８０（ナチュラルキラー細胞、ガンマ／デルタＴ細胞、エフェクター／メモリーＴ細胞）、「６Ｂ１１」（Ｖａ２４／Ｖｂ１１；インバリアントナチュラルキラーＴ細胞）、ＣＤ１３７（活性化Ｔ細胞）、ＣＤ２５（制御性Ｔ細胞）、またはＣＤ１３８（形質細胞）枯渇、ＣＤ４枯渇、ＣＤ８枯渇、ＣＤ１９枯渇、ＣＤ２５枯渇、ＣＤ４５ＲＡ枯渇、ＣＤ４５ＲＯ枯渇）をコードする場合、特に有用である。したがって、いくつかの実施形態において、選択マーカーは、抗体、例えば、フルオロフォアに結合した抗体、または比色もしくは他の視覚的読み取りによって容易に検出可能であり得る、宿主細胞表面上にディスプレイされたタンパク質を含む。
５．２．１．２  細胞培養
【０１０５】
本明細書中に記載される方法のいくつかの実施形態では、１つまたはそれを超える組換え前のフラグメントで形質転換された宿主細胞を、環状化した発現ベクターからの選択マーカーの発現にとって十分な期間にわたって培養する。
【０１０６】
選択マーカーが薬物耐性マーカーであるいくつかの実施形態において、培養は、選択培地中での該マーカーを発現している細胞の生存を支持し得る量のマーカータンパク質を産生するのに十分な期間にわたって行われる。好ましい実施形態において、これらの条件は、選択マーカーを発現していない細胞の生存に対して選択するものである。当業者に公知である種々の化合物または処理を用いて、細胞に対して選択圧が適用され得る。理論に限定されるものではないが、選択圧は、成長、細胞周期の進行または生存能に対して最適以下であるかまたは有害である条件に宿主細胞を曝すことによって、適用され得、これらの条件に抵抗性である（tolerant）または耐性である（resistant）細胞は、これらの条件に抵抗性でないまたは耐性でない細胞と比べて選択される。選択圧を発揮するかまたは適用するために使用され得る条件としては、抗生物質、薬物、変異原、細胞成長または生物学的基本要素の合成を遅らせるかまたは停止する化合物、ＲＮＡ、ＤＮＡまたはタンパク質の合成を中断する化合物、細胞成長培地または細胞培養培地からの細胞成長および生存能に必要な栄養分、アミノ酸、炭水化物または化合物の欠乏または制限、細胞成長に対して最適以下である条件下、例えば、最適以下の温度、大気条件（例えば、％二酸化炭素、酸素または窒素または湿度）または枯渇培地（ｄｅｐｒｉｖｅｄ  ｍｅｄｉａ）条件下での細胞の成長または維持などの処理が挙げられるがこれらに限定されない。使用される選択圧のレベルは、当業者によって決定され得る。これは、例えば、殺滅曲線（ｋｉｌｌ  ｃｕｒｖｅ）実験を行うことによって、行われ得、その実験では、コントロール細胞および耐性マーカーまたは耐性遺伝子を含む細胞を、選択圧のレベル、用量、濃度または処理を高めながら、所望の時間範囲（例えば、１〜２４時間、１〜３日間、３〜５日間、４〜７日間、５〜１４日間、１〜３週間、２〜６週間）にわたって陰性細胞だけまたは陰性細胞を優先的に選択する範囲で、試験する。使用され得る選択圧の正確なレベル、濃度、用量または処理は、使用される細胞、所望の特性自体、選択圧に対して耐性または抵抗性を付与するマーカー、因子または遺伝子、ならびに選択される細胞において望まれる所望の特性のレベルに依存し、当業者は、これらの考慮すべき事柄に基づいて適切な範囲を決定する方法を容易に認識する。
【０１０７】
培養は、細胞培養プレート、フラスコまたは発酵槽を含むがこれらに限定されない好適な容器内の好適な培養培地中で行われ得る。いくつかの実施形態において、培養培地は、同化できる炭素源、窒素源およびリン酸源を含む水性培地である。そのような培地は、適切な塩、ミネラル、金属および他の栄養分も含み得る。いくつかの実施形態において、好適な培地には、選択剤に加えて、１つまたはそれを超えるさらなる作用物質（例えば、誘導物質（例えば、遺伝子産物をコードする１つまたはそれを超えるヌクレオチド配列が誘導性プロモーターの調節下にあるとき）、リプレッサー（例えば、遺伝子産物をコードする１つまたはそれを超えるヌクレオチド配列が抑制性プロモーターの調節下にあるとき））が補充される。細胞培養物の維持および成長のための材料および方法は、微生物学または発酵科学の分野の当業者に周知である（例えば、Ｂａｉｌｅｙら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ，ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８６を参照のこと）。宿主細胞、発酵およびプロセスに関する具体的な要求に応じて、適切な培養培地、ｐＨ、温度および好気的条件、微好気的条件または嫌気性条件に対する要件が考慮されなければない。いくつかの実施形態において、培養は、所望の細胞密度に達するまで、形質転換された集団が複数回の倍加を起こすのに十分な期間にわたって、行われる。いくつかの実施形態において、培養は、宿主細胞集団が、培養を行っている発酵槽または発酵容器において０．０１〜４００の細胞密度（ＯＤ６００）に達するのに十分な期間にわたって行われる。いくつかの実施形態において、培養は、少なくとも０．０１のＯＤ６００に達するまで行われる。いくつかの実施形態において、培養は、少なくとも０．１のＯＤ６００に達するまで行われる。いくつかの実施形態において、培養は、少なくとも１．０のＯＤ６００に達するまで行われる。いくつかの実施形態において、培養は、少なくとも１０のＯＤ６００に達するまで行われる。いくつかの実施形態において、培養は、少なくとも１００のＯＤ６００に達するまで行われる。いくつかの実施形態において、培養は、０．０１〜１００のＯＤ６００に達するまで行われる。いくつかの実施形態において、培養は、０．１〜１０のＯＤ６００に達するまで行われる。いくつかの実施形態において、培養は、１〜１００のＯＤ６００に達するまで行われる。他の実施形態において、培養は、少なくとも１２、２４、３６、４８、６０、７２、８４、９６時間または９６時間より長い期間にわたって行われる。いくつかの実施形態において、培養は、３〜２０日間の期間にわたって行われる。いくつかの実施形態において、培養は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０日間または２０日間より長い期間にわたって行われる。
【０１０８】
本明細書中に記載される方法のいくつかの実施形態において、上記方法は、例えば、選択された宿主細胞が所望のゲノム組込み(複数可)を含むと同定された後、環状化した発現ベクター、すなわち、プラスミドをその宿主細胞から除去する工程をさらに含む。プラスミドベースの系は、一般に、その細胞内に外来ＤＮＡを維持するために、プラスミドに対する選択圧を要求する。例えば、酵母細胞は、通常、各有糸分裂後に、細胞に含まれるプラスミドの１０％を失うので、酵母におけるほとんどのプラスミドは、比較的不安定である。したがって、いくつかの実施形態において、選択された細胞から選択的マーカーをコードするプラスミドを除去することは、そのプラスミドが集団から効果的に希釈されるのに十分な有糸分裂を、選択された細胞が起こすのを可能にすることによって達成され得る。あるいは、プラスミドが存在しないことについて選択することによって、例えば、対抗選択マーカー（counter-selectable  marker）（例えば、ＵＲＡ３など）に対して選択することによって、または同一のコロニーを選択培地と非選択培地の両方にプレーティングし、次いで、選択培地上では成長しないが非選択培地上で成長するコロニーを選択することによって、プラスミドを含まない細胞が選択され得る。
５．２．２．外来性ドナー核酸
【０１０９】
有益なことに、組込みポリヌクレオチド、すなわち、ドナーＤＮＡは、宿主細胞ゲノムの選択された標的部位への１つまたはそれを超える外来性核酸構築物の組込みを容易にする。好ましい実施形態において、組込みポリヌクレオチドは、第１の相同性領域（ＨＲ１）ｘおよび第２の相同性領域（ＨＲ２）ｘ、ならびに必要に応じて、（ＨＲ１）ｘと（ＨＲ２）ｘとの間に位置する目的の核酸を含む外来性核酸（ＥＳ）ｘを含む。いくつかの実施形態において、組込みポリヌクレオチドは、直鎖状ＤＮＡ分子である。他の実施形態において、組込みポリヌクレオチドは、環状ＤＮＡ分子である。いくつかの実施形態において、組込みポリヌクレオチドは、一本鎖ＤＮＡ分子、すなわち、オリゴヌクレオチドである。他の実施形態において、組込みポリヌクレオチドは、二本鎖ＤＮＡ分子である。
【０１１０】
組込みポリヌクレオチドは、当業者には明らかな任意の技法によって作製され得る。ある特定の実施形態において、組込みポリヌクレオチドは、当該分野で周知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）および分子クローニング法を用いて作製される。例えば、ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｅｄ．ＨＡ  Ｅｒｌｉｃｈ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ；ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｅｄ．ＨＡ  Ｅｒｌｉｃｈ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）；米国特許第８，１１０，３６０号を参照のこと。
５．２．２．１  ゲノム組込み配列
【０１１１】
好ましい実施形態において、組込みポリヌクレオチドは、第１の相同性領域（ＨＲ１）ｘおよび第２の相同性領域（ＨＲ２）ｘを含む外来性核酸（ＥＳ）ｘを含み、ここで、（ＨＲ１）ｘおよび（ＨＲ２）ｘは、宿主細胞ゲノム内の選択された標的部位（ＴＳ）ｘにおいて、宿主細胞によって媒介される相同組換えを惹起することができる。相同組換えによってゲノムに外来性核酸を組み込むために、組込みポリヌクレオチドは、好ましくは、一方の末端に（ＨＲ１）ｘを、他方の末端に（ＨＲ２）ｘを含む。いくつかの実施形態において、（ＨＲ１）ｘは、選択されたゲノム標的部位（ＴＳ）ｘの５’領域と相同であり、（ＨＲ２）ｘは、選択された標的部位（ＴＳ）ｘの３’領域と相同である。いくつかの実施形態において、（ＨＲ１）ｘは、選択されたゲノム標的部位（ＴＳ）ｘの５’領域と約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％相同である。いくつかの実施形態において、（ＨＲ２）ｘは、選択された標的部位（ＴＳ）ｘの３’領域と約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％相同である。
【０１１２】
ある特定の実施形態において、（ＨＲ１）ｘは、目的の核酸（Ｄ）ｘに対して５’に位置する。いくつかの実施形態において、（ＨＲ１）ｘは、（Ｄ）ｘの５’末端のすぐ隣に位置する。いくつかの実施形態において、（ＨＲ１）ｘは、（Ｄ）ｘの５’に対して上流に位置する。ある特定の実施形態において、（ＨＲ２）ｘは、目的の核酸（Ｄ）ｘに対して３’に位置する。いくつかの実施形態において、（ＨＲ２）ｘは、（Ｄ）ｘの３’末端のすぐ隣に位置する。いくつかの実施形態において、（ＨＲ２）ｘは、（Ｄ）ｘの３’に対して下流に位置する。
【０１１３】
特定のゲノム遺伝子座における組込みポリヌクレオチドの組込みに影響し得る特性としては、ゲノム組込み配列の長さ、切除可能な核酸構築物の全体の長さ、およびゲノム組込み遺伝子座のヌクレオチド配列または位置が挙げられるがこれらに限定されない。例えば、ゲノム組込み配列の一方の鎖と宿主細胞ゲノムにおける特定の遺伝子座の一方の鎖との間の有効なヘテロ二重鎖形成は、ゲノム組込み配列の長さに依存し得る。ゲノム組込み配列の長さについての有効な範囲は、５０〜５，０００ヌクレオチドである。ゲノム組込み配列とゲノム遺伝子座との間で相同である有効な長さに関する考察については、Ｈａｓｔｙら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １１：５５８６−９１（１９９１）を参照のこと。
【０１１４】
いくつかの実施形態において、（ＨＲ１）ｘおよび（ＨＲ２）ｘは、任意の酵母ゲノム遺伝子座において外来性核酸（ＥＳ）ｘのゲノム組込みを可能にする十分な長さおよび配列同一性の任意のヌクレオチド配列を含み得る。ある特定の実施形態において、（ＨＲ１）ｘおよび（ＨＲ２）ｘの各々は、独立して、約５０〜５，０００ヌクレオチドからなる。ある特定の実施形態において、（ＨＲ１）ｘおよび（ＨＲ２）ｘの各々は、独立して、約１００〜２，５００ヌクレオチドからなる。ある特定の実施形態において、（ＨＲ１）ｘおよび（ＨＲ２）ｘの各々は、独立して、約１００〜１，０００ヌクレオチドからなる。ある特定の実施形態において、（ＨＲ１）ｘおよび（ＨＲ２）ｘの各々は、独立して、約２５０〜７５０ヌクレオチドからなる。ある特定の実施形態において、（ＨＲ１）ｘおよび（ＨＲ２）ｘの各々は、独立して、約１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、３０００、３１００、３２００、３３００、３４００、３５００、３６００、３７００、３８００、３９００、４０００、４１００、４２００、４３００、４４００、４５００、４６００、４７００、４８００、４９００または５，０００ヌクレオチドからなる。いくつかの実施形態において、（ＨＲ１）ｘおよび（ＨＲ２）ｘの各々は、独立して、約５００ヌクレオチドからなる。
５．２．２．２  目的の核酸
【０１１５】
いくつかの実施形態において、組込みポリヌクレオチドは、目的の核酸（Ｄ）ｘをさらに含む。目的の核酸は、当業者によって有用であるとみなされた任意のＤＮＡセグメントであり得る。例えば、そのＤＮＡセグメントは、宿主ゲノムに「ノックイン」され得る目的の遺伝子を含み得る。他の実施形態において、そのＤＮＡセグメントは、宿主細胞ゲノムの標的部位に当該構築物が組み込まれたときに標的遺伝子を特異的に破壊することができる「ノックアウト」構築物として機能し、それにより、破壊された遺伝子は機能性でなくなる。目的の核酸（Ｄ）ｘの有用な例としては、タンパク質コード配列、レポーター遺伝子、蛍光マーカーコード配列、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、転写活性化因子、転写抑制因子、転写活性化因子結合部位、転写抑制因子結合部位、イントロン、エキソン、ポリＡテイル、マルチクローニングサイト（multiple  cloning  site）、核局在化シグナル、ｍＲＮＡ安定化シグナル、組込み遺伝子座、エピトープタグコード配列、分解シグナルまたは他の任意の天然に存在するＤＮＡ分子もしくは合成ＤＮＡ分子が挙げられるがこれらに限定されない。いくつかの実施形態において、（Ｄ）ｘは、天然起源であり得る。あるいは、（Ｄ）ｘは、インビトロにおいて作製された、完全に合成起源であり得る。さらに、（Ｄ）ｘは、単離された天然に存在するＤＮＡ分子の任意の組み合わせ、または単離された天然に存在するＤＮＡ分子と合成ＤＮＡ分子との任意の組み合わせを含み得る。例えば、（Ｄ）ｘは、タンパク質コード配列に作動可能に連結された異種性プロモーター、ポリＡテイルに連結されたタンパク質コード配列、エピトープタグコード配列とインフレームで連結されたタンパク質コード配列などを含み得る。目的の核酸（Ｄ）ｘは、クローニングされたＤＮＡ（例えば、ＤＮＡ「ライブラリー」）から、化学合成によって、ｃＤＮＡクローニングによって、または所望の細胞から精製されたゲノムＤＮＡもしくはそのフラグメントのクローニングによって、またはＰＣＲ増幅およびクローニングによって、当該分野で公知の標準的な手順によって得てもよい。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｄ．ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２００１）；Ｇｌｏｖｅｒ，Ｄ．Ｍ．（ｅｄ．），ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，２ｄ．ｅｄ．，ＭＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｔｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｕ．Ｋ．（１９９５）を参照のこと。
【０１１６】
特定の実施形態において、目的の核酸（Ｄ）ｘは、選択マーカーをコードする核酸を含まない。これらの実施形態において、本明細書中に記載される方法によって提供される高効率の組込みは、選択培地上での形質転換された細胞の成長を必要とせずに、組込み事象のスクリーニングおよび同定を可能にする。しかしながら、それでもなお選択培地上での成長が望まれる他の実施形態では、目的の核酸（Ｄ）ｘは、宿主ゲノムへの外来性核酸の組込みを選択するために使用され得る選択マーカーを含み得る。
【０１１７】
目的の核酸（Ｄ）ｘは、約３００ヌクレオチドから最大約１００万ヌクレオチド塩基対までの範囲のサイズを含む任意のサイズであり得る。目的のそのような核酸は、１つまたはそれを超える遺伝子および／またはそれらの関連する制御領域を含み得る。目的の（ｏｆ  ｉｎｔｅｒｓｔ）これらの核酸は、任意の供給源、例えば、ゲノム供給源またはｃＤＮＡライブラリー（組織特異的なｃＤＮＡライブラリー、正規化されたｃＤＮＡライブラリーおよびサブトラクティブｃＤＮＡライブラリーを含む）に由来し得る。ゲノム供給源としては、ウイルス（例えば、ＨＩＶおよび肝炎ウイルス）および細胞性病原体などの病原生物を含む様々な生物のゲノム（またはそのフラグメント）が挙げられる。さらに、目的の核酸は、任意の植物または任意の動物を含む任意の生物から得ることができ、それらは、真核生物または原核生物であり得る。ある特定の実施形態において、目的の核酸は、疾患関連遺伝子である遺伝子、すなわち、存在、非存在、発現、発現の欠如、発現レベルの変更、または疾患と相関するかもしくは疾患を引き起こす変化した形態の存在をコードする。
【０１１８】
いくつかの実施形態において、目的の核酸は、宿主細胞の標的化された対立遺伝子の点変異をコードし、その点変異は、標的化された対立遺伝子へのミスセンスＳＮＰの導入（すなわち、「対立遺伝子交換（ａｌｌｅｌｅ  ｓｗａｐ）」）のために利用され得る。いくつかのそのような実施形態において、対立遺伝子交換に向けたヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９およびｇＲＮＡ）の標的部位の選択は、欠失またはＯＲＦへの組込みよりも制約がかなり大きい。好ましい実施形態において、ヌクレアーゼ切断部位は、ゲノム内において唯一であるべきであり、組換えによって、ドナーＤＮＡのフランキング配列ではなく変異配列が取り込まれるように、可能な限り、標的化されたヌクレオチドの近くであるべきである。これは、切断部位を修復する組換えには、所望のＳＮＰの取り込み（incorporation）が必要でなく、それを含む可能性は、切断部位からの距離につれて減少すると予想されるからである。さらに、最適な効率のために、ドナーＤＮＡは、それがヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９およびｇＲＮＡ）に対する標的ではないようにデザインされるべきである。したがって、ドナーＤＮＡが切断を免れるため、および同時に、組換え事象が所望のＳＮＰを含むチャンスを改善するために、異種ブロックアプローチが利用され得、このアプローチでは、標的部位と点変異との間のコドンにサイレント変異を作製し、所望のＳＮＰを取り除く組換え事象の潜在性を減少させる。ドナーＤＮＡは、中央の「異種ブロック」を取り囲むフランキングホモロジーを有してデザインされ得る。その異種ブロックは、ヌクレアーゼ標的部位を取り囲む配列にサイレント変異を導入するものであり、いくつかの目的にかなうものである。まず、異種ブロックは、ドナーＤＮＡが切断されないように、ヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９）の認識にとって不可欠な塩基を除去する。さらに、異種ブロックの組込みによって、ＰＣＲによって候補クローンを同定する新規のプライマー結合部位が提供される。図１５は、「異種ブロック」の状況における、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によって媒介される点変異の導入についての概略図を提供している。標的化されているアミノ酸が、四角で囲まれており、隣接する切断部位には、切断部位およびＰＡＭ配列という注釈が付けられている（上のパネル）。サイレントコドン変化の異種ブロックおよびフランキングホモロジーの状況において所望の点変異を含むドナーＤＮＡは、６０ｍｅｒのオリゴをアニーリングして伸長することによって（中央のパネル）またはより大きなクローニングされた構築物を用いて、合成的に作製され得る。ドナーＤＮＡの組込みによって、所望の点変異がもたらされる（下のパネル）。
５．２．３．ヌクレアーゼ
【０１１９】
本明細書中に記載される方法のいくつかの実施形態において、宿主細胞ゲノムは、選択された標的部位内の指定の領域を切断することができる、すなわち、断裂をもたらすことができる１つまたはそれを超えるヌクレアーゼと接触する。いくつかの実施形態において、断裂は、一本鎖断裂であり、つまり、標的部位のＤＮＡ鎖の両方ではなく一方の鎖が切断される（すなわち、「ニック」が入る）。いくつかの実施形態において、断裂は、二本鎖断裂である。いくつかの実施形態において、断裂誘導物質（break  inducing  agent）は、特異的なポリヌクレオチド認識配列を認識し、および／またはそれに結合して、その認識配列においてまたはその認識配列近傍において断裂をもたらす任意の作用物質である。断裂誘導物質の例としては、エンドヌクレアーゼ、部位特異的リコンビナーゼ、トランスポザーゼ、トポイソメラーゼおよびジンクフィンガーヌクレアーゼが挙げられるがこれらに限定されず、それらの改変された誘導体、バリアントおよびフラグメントも含む。
【０１２０】
いくつかの実施形態において、１つまたはそれを超えるヌクレアーゼの各々は、選択された標的部位（ＴＳ）ｘ内の指定の領域に断裂を引き起こすことができる。いくつかの実施形態において、ヌクレアーゼは、（ＨＲ１）ｘおよび（ＨＲ２）ｘとそれぞれ相同性を共有する（ＴＳ）ｘの５’領域と３’領域との間に位置する領域において断裂を引き起こすことができる。他の実施形態において、ヌクレアーゼは、（ＴＳ）ｘの５’および３’領域の上流または下流に位置する領域において断裂を引き起こすことができる。
【０１２１】
認識配列は、断裂誘導物質によって特異的に認識および／または結合される任意のポリヌクレオチド配列である。認識部位配列の長さは、変動し得、例えば、少なくとも１０、１２、１４、１６、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０ヌクレオチド長またはそれを超える長さの配列を含む。
【０１２２】
いくつかの実施形態において、認識配列は、パリンドロームであり、つまり、一方の鎖における配列が、相補鎖において逆方向に同じ配列を読む。いくつかの実施形態において、ニック／切断部位は、認識配列内に存在する。他の実施形態において、ニック／切断部位は、認識配列の外側に存在する。いくつかの実施形態において、切断は、平滑末端をもたらす。他の実施形態において、切断は、一本鎖オーバーハング、すなわち、「粘着末端」をもたらし、それは、５’オーバーハングまたは３’オーバーハングであり得る。
【０１２３】
いくつかの実施形態において、選択された標的部位内の認識配列は、宿主細胞ゲノムにとって内在性であり得るか、または外来性であり得る。認識部位が、内在性配列であるとき、それは、天然に存在する断裂誘導物質、すなわち天然の断裂誘導物質によって認識される認識配列であり得る。あるいは、内在性の認識部位は、内在性の認識配列を特異的に認識して断裂をもたらすようにデザインされたまたは選択された、改変されたまたは操作された断裂誘導物質によって認識および／または結合され得る。いくつかの実施形態において、改変された断裂誘導物質は、天然に存在する天然の断裂誘導物質に由来する。他の実施形態において、改変された断裂誘導物質は、人工的に作製されるかまたは合成される。そのような改変されたまたは操作された断裂誘導物質を選択するための方法は、当該分野で公知である。例えば、タンパク質(複数可)のアミノ酸配列バリアントは、そのＤＮＡにおける変異によって調製され得る。変異誘発およびヌクレオチド配列の変更のための方法としては、例えば、Ｋｕｎｋｅｌ，（１９８５）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８２：４８８−９２；Ｋｕｎｋｅｌら（１９８７）Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １５４：３６７−８２；米国特許第４，８７３，１９２号；Ｗａｌｋｅｒ  ａｎｄ  Ｇａａｓｔｒａ，ｅｄｓ．（１９８３）Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＭａｃＭｉｌｌａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）およびそれらの中で引用された参考文献が挙げられる。タンパク質の生物学的活性に影響する可能性が低いアミノ酸置換に関する指針は、例えば、Ｄａｙｈｏｆｆら（１９７８）Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｎａｔｌ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｒｅｓ  Ｆｏｕｎｄ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）のモデルに見出される。保存的置換（例えば、１つのアミノ酸を、同様の特性を有する別のアミノ酸と交換すること）が、好ましいことがある。保存的な欠失、挿入およびアミノ酸置換は、タンパク質の特色に根本的な変化をもたらすとは予想されず、任意の置換、欠失、挿入またはそれらの組み合わせの影響は、日常的なスクリーニングアッセイによって評価され得る。二本鎖断裂誘導活性に対するアッセイは、公知であり、一般に、認識部位を含むＤＮＡ基質に対するその作用物質の全体的な活性および特異性を測定する。
５．２．３．１  クラスター化規則性散在短パリンドローム反復（ＣＲＩＳＰＲ）
【０１２４】
本明細書中に提供される方法のいくつかの実施形態において、ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ由来ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼである。ＣＲＩＳＰＲは、タイプＩＩ原核生物ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化規則性散在短パリンドローム反復）適応免疫系に基づくゲノム編集ツールである。真正細菌および古細菌におけるＣＲＩＳＰＲシステムは、小さいＲＮＡおよびＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）エンドヌクレアーゼを用いて、侵入してきた外来ＤＮＡを標的化し、切断する。例えば、Ｂｈａｙａら、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ  ４５：２７３−２９７（２０１１）；Ｔｅｒｎｓら、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １４（３）：３２１−３２７（２０１１）；およびＷｉｅｄｅｎｈｅｆｔら、Ｎａｔｕｒｅ  ４８２（７３８５）：３３１−３３８を参照のこと。細菌では、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、スペーサーと呼ばれる外来性ＤＮＡのセグメント（約３０ｂｐ長）によって分断された一連のリピートから構成される。リピート−スペーサーアレイは、長い前駆体として転写され、リピート配列内でプロセシングされることにより、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼによって切断される標的配列（プロトスペーサーとしても知られる）を特定する小さいｃｒＲＮＡを生成する。次いで、ＣＲＩＳＰＲスペーサーを用いることにより、ＲＮＡまたはＤＮＡレベルにおいて、外来性の遺伝的エレメントが認識され、サイレンシングされる。標的領域の３’末端におけるすぐ下流の配列モチーフが、切断にとって必須であり、それは、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）として知られている。そのＰＡＭは、標的ＤＮＡに存在するが、それを標的としているｃｒＲＮＡには存在しない。
【０１２５】
最も単純なＣＲＩＳＰＲシステムの１つは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｎｅｓ由来のタイプＩＩ  ＣＲＩＳＰＲシステムである。ＲＮＡにガイドされる外来ＤＮＡ切断のためには、ＣＲＩＳＰＲ関連Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ、および２つの小さなＲＮＡ、すなわち標的相補性（ｔａｒｇｅｔ−ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ）ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）；およびトランス作用性ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）があれば十分である。タイプＩＩ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの顕著な特徴のタンパク質であるＣａｓ９タンパク質は、ＲｕｖＣヌクレアーゼおよびＨＮＨヌクレアーゼに相同な２つのヌクレアーゼドメインを含む大きなモノマーＤＮＡヌクレアーゼである。Ｃａｓ９は、ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体によって、ＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ）配列モチーフに隣接したＤＮＡ標的配列にガイドされる。成熟したｃｒＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡと塩基対形成して、Ｃａｓ９を標的ＤＮＡに向ける２−ＲＮＡ構造を形成する。ｃｒＲＮＡガイド配列に相補的な部位では、Ｃａｓ９  ＨＮＨヌクレアーゼドメインが、相補鎖を切断するのに対し、Ｃａｓ９  ＲｕｖＣ様ドメインが、非相補鎖を切断して、標的ＤＮＡに二本鎖断裂をもたらす。例えば、Ｄｅｌｔｃｈｅｖａら、Ｎａｔｕｒｅ  ４７（７３４０）：６０２−６０７（２０１１）を参照のこと。
【０１２６】
最近の研究は、ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体を模倣する単一のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）キメラを、ゲノム編集ツールとしてＣａｓ９とともに使用することにより、Ｃａｓ９をガイドして部位特異的ＤＮＡ二本鎖断裂をインビトロにおいて導入することができることを示している。標的ゲノム内の切断の特異性は、天然のｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体を模倣するキメラガイドＲＮＡ分子（ｇＲＮＡ）のスペーサー様部分によって決定される。したがって、機能的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムにおける構成要素の最小数は２：Ｃａｓ９およびｓｇＲＮＡである。その５’末端に配置されたｓｇＲＮＡガイド配列は、ＤＮＡ標的特異性を付与する。ゆえに、このガイド配列を改変することによって、種々の標的特異性を有するｓｇＲＮＡを作製することが可能である。ガイド配列のカノニカルな長さは、２０ｂｐである。その結果として、ＤＮＡ標的もまた、２０ｂｐであり、その後に、コンセンサスＮＧＧを伴うＰＡＭ配列が続く。この改変されたＣＲＩＳＰＲシステムの使用は、インビトロ（例えば、Ｊｉｎｅｋら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３７（６０９６）：８１６−８２１（２０１２）を参照のこと）、哺乳動物細胞株（例えば、Ｍａｌｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３９（６１２１）：８２３−８２６（２０１３），Ｊｉｎｅｋら、Ｅｌｉｆｅ  ２：ｅ００４１７（２０１３）；Ｃｏｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３９（６１２１）：８１９−８２３（２０１３）；およびＣｈｏら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３１（３）：２３０−２３２（２０１３）を参照のこと）、細菌（例えば、Ｊｉａｎｇら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３１（３）：２３３−２３９（２０１３）；およびＧａｓｉｕｎａｓら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０９（３９）：Ｅ２５７９−Ｅ２５８６．（２０１２）を参照のこと）、酵母（例えば、ＤｉＣａｒｌｏら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ  ４１（７）：４３３６−４３４３（２０１３）を参照のこと）、ゼブラフィッシュ（例えば、Ｈｗａｎｇら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３１（３）：２２７−２２９（２０１３）；およびＣｈａｎｇら、Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ  ２３（４）：４６５−４７２（２０１３）を参照のこと）、マウス（例えば、Ｗａｎｇら、Ｃｅｌｌ  １５３（４）：９１０−９１８（２０１３を参照のこと）および植物（例えば、Ｂｅｌｈａｊら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ９：３９（２０１３）を参照のこと）において実証されている。
【０１２７】
Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、（１）異種性宿主内での高発現のためのコドン最適化；（２）適切な区画化のための核局在化シグナル（ＮＬＳ）への融合；および（３）ヌクレアーゼを鎖特異的ニッカーゼに変換するためのＨＮＨまたはＲｕｖＣドメインのいずれかの部位特異的変異誘発によって改変され得る。ＲｕｖＣまたはＨＮＨモチーフいずれかにおけるＣａｓ９の部位特異的変異誘発は、鎖切断特異性を示し、それにより、野生型エンドヌクレアーゼに加えて２つの鎖特異的ニッカーゼが提供され、ＤＮＡの標的化された一本鎖断裂が可能になった。例えば、Ｊｉｎｅｋら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３７（６０９６）：８１６−８２１（２０１２）およびＧａｓｉｕｎａｓら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０９（３９）：Ｅ２５７９−Ｅ２５８６．（２０１２）を参照のこと。ジンクフィンガーヌクレアーゼおよびＴＡＬＥＮについて報告されたように、一本鎖だけを断裂するニッカーゼとして機能するようにこのヌクレアーゼを改変することにより、オフターゲット切断による毒性が低下し、非ＨＲ機構、例えば、ＮＨＥＪによる断裂修復の割合も低下し得る。例えば、Ｊｉｎｅｋら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３７（６０９６）：８１６−８２１（２０１２）を参照のこと。
【０１２８】
当該分野で公知のいずれのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムも、本明細書中に提供される方法および組成物におけるヌクレアーゼとしての用途が見出されている。非常に多様なＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、コアエレメントの内容および配列に基づいて、３つの主なタイプに分類され、それらはさらに１０のサブタイプに細分される（例えば、Ｍａｋａｒｏｖａら、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ９：４６７−７７（２０１１）を参照のこと）。外来核酸のｃｒＲＮＡ媒介性サイレンシングに関わる核タンパク質複合体の構造的な構成および機能は、異なるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタイプの間で異なる（Ｗｉｅｄｅｎｈｅｆｔら、Ｎａｔｕｒｅ  ４８２：３３１−３３８（２０１２）を参照のこと）。タイプｌ−Ｅシステムでは、大腸菌によって例証されるように、ｃｒＲＮＡが、Ｃａｓｃａｄｅ（抗ウイルス防御のためのＣＲＩＳＰＲ関連複合体（ＣＲＩＳＰＲ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｆｏｒ  ａｎｔｉｖｉｒａｌ  ｄｅｆｅｎｃｅ））と呼ばれるマルチサブユニットエフェクター複合体に取り込まれ（Ｂｒｏｕｎｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２１：９６０−４（２００８））、その複合体が、標的ＤＮＡに結合し、シグネチャーＣａｓ３タンパク質による分解を引き起こす（Ｓｉｎｋｕｎａｓら、ＥＭＢＯ  Ｊ  ３０：１３３５＾２（２０１１）；Ｂｅｌｏｇｌａｚｏｖａら、ＥＭＢＯ  Ｊ  ３０：６１６−２７（２０１１））。Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓおよびＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓのタイプＩＩＩ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムでは、Ｃａｓ  ＲＡＭＰモジュール（Ｃｍｒ）およびｃｒＲＮＡ複合体が、インビトロにおいて合成ＲＮＡを認識し、切断する（Ｈａｌｅら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ４５：２９２−３０２（２０１２）；Ｚｈａｎｇら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ，４５：３０３−１３（２０１２））一方で、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、インビボにおいてＤＮＡを標的化する（Ｍａｒｒａｆｆｉｎｉ  ＆  Ｓｏｎｔｈｅｉｍｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ．３２２：１８４３−５（２００８））。タイプＩＩ  ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムによるＤＮＡサイレンシング、より詳細には、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＤＧＣＣ７７１０のＣＲＩＳＰＲ３／Ｃａｓシステムに関わるＲＮＰ複合体（Ｈｏｒｖａｔｈ  ＆  Ｂａｒｒａｎｇｏｕ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２７：１６７−７０（２０１０））は、４つのｃａｓ遺伝子：ｃａｓ９、ｃａｓｌ、ｃａｓ２およびｃｓｎ２からなり、これらは、１２個のリピート−スペーサー単位の上流に位置する。Ｃａｓ９（以前はｃａｓ５またはｃｓｎｌという名称だった）は、タイプＩＩシステムのシグネチャー遺伝子である（Ｍａｋａｒｏｖａら、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ９：４６７−７７（２０１１））。
【０１２９】
本明細書中に提供される方法および組成物における用途が見出されるＣＲＩＳＰＲシステムには、国際公開番号ＷＯ２０１３／１４２５７８Ａ１およびＷＯ２０１３／０９８２４４Ａ１（これらの内容は、その全体が本明細書に援用される）に記載されているものも含まれる。
５．２．３．２  転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）
【０１３０】
本明細書中に提供される方法のいくつかの実施形態において、１つまたはそれを超える上記ヌクレアーゼは、ＴＡＬ−エフェクターＤＮＡ結合ドメイン−ヌクレアーゼ融合タンパク質（ＴＡＬＥＮ）である。Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属の植物病原菌のＴＡＬエフェクターは、宿主ＤＮＡに結合し、エフェクター特異的宿主遺伝子を活性化することによって、病気において重要な役割を果たし、すなわち、防御を引き起こす。例えば、Ｇｕら（２００５）Ｎａｔｕｒｅ  ４３５：１１２２−５；Ｙａｎｇら（２００６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０３：１０５０３−８；Ｋａｙら（２００７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１８：６４８−５１；Ｓｕｇｉｏら（２００７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０４：１０７２０−５；Ｒｏｍｅｒら（２００７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１８：６４５−８；Ｂｏｃｈら（２００９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２６（５９５９）：１５０９−１２；およびＭｏｓｃｏｕ  ａｎｄ  Ｂｏｇｄａｎｏｖｅ，（２００９）３２６（５９５９）：１５０１を参照のこと。ＴＡＬエフェクターは、１つまたはそれを超えるタンデム反復ドメインを介して配列特異的様式でＤＮＡと相互作用するＤＮＡ結合ドメインを含む。その反復配列は、通常、３４アミノ酸を含み、その反復は、通常、互いに９１〜１００％相同である。その反復の多型が、通常１２および１３位に位置し、１２および１３位の反復可変二残基（diresidue）の同一性とＴＡＬ−エフェクターの標的配列における連続したヌクレオチドの同一性との間に１対１の対応が存在すると見られる。
【０１３１】
ＴＡＬ−エフェクターＤＮＡ結合ドメインは、所望の標的配列に結合するように操作され得、ヌクレアーゼドメイン、例えば、タイプＩＩ制限エンドヌクレアーゼに由来するヌクレアーゼドメイン、通常、ＦｏｋＩなどのタイプＩＩ制限エンドヌクレアーゼ由来の非特異的な切断ドメインに融合され得る（例えば、Ｋｉｍら（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：１１５６−１１６０を参照のこと）。他の有用なエンドヌクレアーゼとしては、例えば、ＨｈａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｎｏｄ、ＢｂｖＣＩ、ＥｃｏＲＩ、ＢｇｌＩおよびＡｌｗＩが挙げられ得る。したがって、好ましい実施形態において、ＴＡＬＥＮが、特異的ヌクレオチド配列内のまたは特異的ヌクレオチド配列に隣接した標的ＤＮＡを切断するように、ＴＡＬＥＮは、組み合わさってその標的ＤＮＡ配列内の特異的ヌクレオチド配列に結合する複数のＴＡＬエフェクター反復配列を含むＴＡＬエフェクタードメインを含む。本明細書中に提供される方法にとって有用なＴＡＬＥＮとしては、ＷＯ１０／０７９４３０および米国特許出願公開番号２０１１／０１４５９４０に記載されているものが挙げられる。
【０１３２】
いくつかの実施形態において、標的ＤＮＡ内の特異的ヌクレオチド配列に結合するＴＡＬエフェクタードメインは、１０個またはそれを超えるＤＮＡ結合リピート、好ましくは、１５個またはそれを超えるＤＮＡ結合リピートを含み得る。いくつかの実施形態において、各ＤＮＡ結合リピートは、標的ＤＮＡ配列における塩基対の認識を決定する反復可変二残基（ＲＶＤ）を含み、ここで、各ＤＮＡ結合リピートは、標的ＤＮＡ配列における１塩基対の認識に関与し、ＲＶＤは、Ｃを認識するためのＨＤ；Ｔを認識するためのＮＧ；Ａを認識するためのＮＩ；ＧまたはＡを認識するためのＮＮ；ＡまたはＣまたはＧまたはＴを認識するためのＮＳ；ＣまたはＴを認識するためのＮ＊（ここで、＊は、このＲＶＤの２番目の位置におけるギャップを表す）；Ｔを認識するためのＨＧ；Ｔを認識するためのＨ＊（ここで、＊は、このＲＶＤの２番目の位置におけるギャップを表す）；Ｔを認識するためのＩＧ；Ｇを認識するためのＮＫ；Ｃを認識するためのＨＡ；Ｃを認識するためのＮＤ；Ｃを認識するためのＨＩ；Ｇを認識するためのＨＮ；Ｇを認識するためのＮＡ；ＧまたはＡを認識するためのＳＮ；およびＴを認識するためのＹＧのうちの１つまたはそれを超えるものを含む。
【０１３３】
本明細書中に提供される方法のいくつかの実施形態において、１つまたはそれを超える上記ヌクレアーゼは、部位特異的リコンビナーゼである。リコンビナーゼとも称される部位特異的リコンビナーゼは、その適合性の組換え部位間の保存的な部位特異的組換えを触媒するポリペプチドであり、それには、天然のポリペプチドならびに活性を保持する誘導体、バリアントおよび／またはフラグメント、ならびに活性を保持するリコンビナーゼをコードする天然のポリヌクレオチド、誘導体、バリアントおよび／またはフラグメントが含まれる。部位特異的リコンビナーゼおよびそれらの認識部位の概説については、Ｓａｕｅｒ（１９９４）Ｃｕｒｒ  Ｏｐ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ５：５２１−７；およびＳａｄｏｗｓｋｉ，（１９９３）ＦＡＳＥＢ  ７：７６０−７を参照のこと。いくつかの実施形態において、リコンビナーゼは、セリンリコンビナーゼまたはチロシンリコンビナーゼである。いくつかの実施形態において、リコンビナーゼは、インテグラーゼファミリーまたはレゾルバーゼ（Ｒｅｓｏｌｖａｓｅ）ファミリーに由来する。いくつかの実施形態において、リコンビナーゼは、ＦＬＰ、Ｃｒｅ、ラムダインテグラーゼおよびＲからなる群より選択されるインテグラーゼである。インテグラーゼファミリーの他のメンバーについては、例えば、Ｅｓｐｏｓｉｔｏら（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２５：３６０５−１４およびＡｂｒｅｍｓｋｉら（１９９２）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  ５：８７−９１を参照のこと。リコンビナーゼおよびバリアントの動態、補因子の相互作用および要件、発現、最適条件ならびに／または認識部位特異性を改変するための方法ならびにリコンビナーゼおよびバリアントの活性についてスクリーニングするための方法は、公知であり、例えば、Ｍｉｌｌｅｒら（１９８０）Ｃｅｌｌ  ２０：７２１−９；Ｌａｎｇｅ−Ｇｕｓｔａｆｓｏｎ  ａｎｄ  Ｎａｓｈ，（１９８４）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２５９：１２７２４−３２；Ｃｈｒｉｓｔら（１９９８）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２８８：８２５−３６；Ｌｏｒｂａｃｈら（２０００）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２９６：１１７５−８１；Ｖｅｒｇｕｎｓｔら（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９０：９７９−８２；Ｄｏｒｇａｉら（１９９５）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２５２：１７８−８８；Ｄｏｒｇａｉら（１９９８）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２７７：１０５９−７０；Ｙａｇｕら（１９９５）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２５２：１６３−７；Ｓｃｌｉｍｅｎｔｅら（２００１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２９：５０４４−５１；Ｓａｎｔｏｒｏ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚｅ，（２００２）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９９：４１８５−９０；Ｂｕｃｈｈｏｌｚ  ａｎｄ  Ｓｔｅｗａｒｔ，（２００１）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １９：１０４７−５２；Ｖｏｚｉｙａｎｏｖら（２００２）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３０：１６５６−６３；Ｖｏｚｉｙａｎｏｖら（２００３）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３２６：６５−７６；Ｋｌｉｐｐｅｌら（１９８８）ＥＭＢＯ  Ｊ  ７：３９８３−９；Ａｒｎｏｌｄら（１９９９）ＥＭＢＯ  Ｊ  １８：１４０７−１４；ＷＯ０３／０８０４５；ＷＯ９９／２５８���０；およびＷＯ９９／２５８４１を参照のこと。認識部位は、約３０ヌクレオチドの最小部位から数百ヌクレオチドに及ぶ。天然に存在する部位およびバリアントを含む、リコンビナーゼについての任意の認識部位を用いることができる。バリアント認識部位は、公知である。例えば、Ｈｏｅｓｓら（１９８６）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １４：２２８７−３００；Ａｌｂｅｒｔら（１９９５）Ｐｌａｎｔ  Ｊ  ７：６４９−５９；Ｔｈｏｍｓｏｎら（２００３）Ｇｅｎｅｓｉｓ  ３６：１６２−７；Ｈｕａｎｇら（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １９：４４３−８；Ｓｉｅｂｌｅｒ  ａｎｄ  Ｂｏｄｅ，（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３６：１７４０−７；Ｓｃｈｌａｋｅ  ａｎｄ  Ｂｏｄｅ，（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３：１２７４６−５１；Ｔｈｙｇａｒａｊａｎら（２００１）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２１：３９２６−３４；Ｕｍｌａｕｆ  ａｎｄ  Ｃｏｘ，（１９８８）ＥＭＢＯ  Ｊ  ７：１８４５−５２；Ｌｅｅ  ａｎｄ  Ｓａｉｔｏ，（１９９８）Ｇｅｎｅ  ２１６：５５−６５；ＷＯ０１／２３５４５；ＷＯ９９／２５８２１；ＷＯ９９／２５８５１；ＷＯ０１／１１０５８；ＷＯ０１／０７５７２および米国特許第５，８８８，７３２号を参照のこと。
【０１３４】
本明細書中に提供される方法のいくつかの実施形態において、１つまたはそれを超える上記ヌクレアーゼは、トランスポザーゼである。トランスポザーゼは、ゲノム内の１つの位置から別の位置へのトランスポゾンの転位を媒介するポリペプチドである。トランスポザーゼは、通常、二本鎖断裂を誘導してトランスポゾンを切り取り、末端近くの反復を認識し、切り取られたトランスポゾンの末端をつなぎ合わせ、いくつかの系では、転位の間に末端をつなぎ合わせるために他のタンパク質も必要とされる。トランスポゾンおよびトランスポザーゼの例としては、トウモロコシ由来のＡｃ／Ｄｓ、Ｄｔ／ｒｄｔ、Ｍｕ−Ｍ１／ＭｎおよびＳｐｍ（Ｅｎ）／ｄＳｐｍエレメント、キンギョソウ由来のＴａｍエレメント、バクテリオファージ由来のＭｕトランスポゾン、細菌のトランスポゾン（Ｔｎ）および挿入配列（ＩＳ）、酵母のＴｙエレメント（レトロトランスポゾン）、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ由来のＴａ１エレメント（レトロトランスポゾン）、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ由来のＰエレメントトランスポゾン（Ｇｌｏｏｒら（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５３：１１１０−１１１７）、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ由来のＣｏｐｉａ、ＭａｒｉｎｅｒおよびＭｉｎｏｓエレメント、イエバエ由来のＨｅｒｍｅｓエレメント、Ｔｒｉｃｈｐｌｕｓｉａ  ｎｉ由来のＰｉｇｇｙＢａｃｋエレメント、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ由来のＴｃ１エレメント、ならびにマウス由来のＩＡＰエレメント（レトロトランスポゾン）が挙げられるがこれらに限定されない。
５．２．３．３  ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）
【０１３５】
本明細書中に提供される方法のいくつかの実施形態において、１つまたはそれを超える上記ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）である。ＺＦＮは、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインおよび断裂誘導物質ドメインを含む操作された断裂誘導物質である。操作されたＺＦＮは、二量体化したときに活性になる２つのジンクフィンガーアレイ（ＺＦＡ）からなり、その各々は、非特異的なエンドヌクレアーゼの単一のサブユニット（例えば、ＦｏｋＩ酵素由来のヌクレアーゼドメイン）に融合している。通常、単一のＺＦＡは、３または４つジンクフィンガードメインからなり、その各々は、特定のヌクレオチドトリプレット（ＧＧＣ、ＧＡＴなど）を認識するようにデザインされている。したがって、２つの「３フィンガー」ＺＦＡから構成されたＺＦＮは、１８塩基対の標的部位を認識することができ；１８塩基対の認識配列は、ヒトおよび植物のゲノムなどの大きなゲノムの中でさえも、通常唯一の配列である。２つのＦｏｋＩヌクレアーゼモノマーの共局在化および二量体化を誘導することによって、ＺＦＮは、標的化された遺伝子座においてＤＮＡに断裂をもたらす機能的な部位特異的エンドヌクレアーゼを生成する。
【０１３６】
有用なジンクフィンガーヌクレアーゼとしては、公知のものおよび本明細書中に記載される１つまたはそれを超える標的部位（ＴＳ）に対して特異性を有するように操作されたものが挙げられる。ジンクフィンガードメインは、例えば、宿主細胞ゲノムの標的部位内の、選択されたポリヌクレオチド認識配列に特異的に結合するポリペプチドをデザインするのに適している。ＺＦＮは、非特異的なエンドヌクレアーゼドメイン、例えば、タイプＩＩｓエンドヌクレアーゼ（例えば、ＨＯまたはＦｏｋＩ）由来のヌクレアーゼドメインに連結された操作されたＤＮＡ結合ジンクフィンガードメインからなる。あるいは、操作されたジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインは、他の断裂誘導物質またはＤＮＡニッキング／切断活性を保持するその誘導体に融合され得る。例えば、このタイプの融合を用いることにより、断裂誘導物質を異なる標的部位に向けること、ニックもしくは切断部位の位置を変更すること、その誘導物質をより短い標的部位に向けること、またはその誘導物質をより長い標的部位に向けることができる。いくつかの例において、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインは、部位特異的リコンビナーゼ、トランスポザーゼ、またはＤＮＡニッキングおよび／もしくは切断活性を保持するそれらの誘導体に融合される。転写活性化因子ドメイン、転写抑制因子ドメインおよびメチラーゼを含むさらなる機能性が、ジンクフィンガー結合ドメインに融合され得る。いくつかの実施形態において、ヌクレアーゼドメインの二量体化が、切断活性に必要である。
【０１３７】
各ジンクフィンガーは、標的ＤＮＡの中の３つの連続した塩基対を認識する。例えば、３フィンガードメインは、連続した９ヌクレオチドの配列を認識するので、このヌクレアーゼの二量体化の要件によって、２セットのジンクフィンガートリプレットを用いることにより、１８ヌクレオチドの認識配列に結合する。有用なデザイナージンクフィンガーモジュールとしては、様々なＧＮＮおよびＡＮＮトリプレットを認識するもの（Ｄｒｅｉｅｒら（２００１）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７６：２９４６６−７８；Ｄｒｅｉｅｒら（２０００）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３０３：４８９−５０２；Ｌｉｕら（２００２）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７：３８５０−６）、ならびに様々なＣＮＮまたはＴＮＮトリプレットを認識するもの（Ｄｒｅｉｅｒら（２００５）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８０：３５５８８−９７；Ｊａｍｉｅｓｏｎら（２００３）Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  ２：３６１−８）が挙げられる。Ｄｕｒａｉら（２００５）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３３：５９７８−９０；Ｓｅｇａｌ，（２００２）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２６：７６−８３；Ｐｏｒｔｅｕｓ  ａｎｄ  Ｃａｒｒｏｌｌ，（２００５）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２３：９６７−７３；Ｐａｂｏら（２００１）Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ７０：３１３−４０；Ｗｏｌｆｅら（２０００）Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｂｉｏｍｏｌ  Ｓｔｒｕｃｔ  ２９：１８３−２１２；Ｓｅｇａｌ  ａｎｄ  Ｂａｒｂａｓ，（２００１）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １２：６３２−７；Ｓｅｇａｌら（２００３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４２：２１３７−４８；Ｂｅｅｒｌｉ  ａｎｄ  Ｂａｒｂａｓ，（２００２）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２０：１３５−４１；Ｃａｒｒｏｌｌら（２００６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  １：１３２９；Ｏｒｄｉｚら（２００２）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９９：１３２９０−５；Ｇｕａｎら（２００２）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９９：１３２９６−３０１；ＷＯ２００２０９９０８４；ＷＯ００／４２２１９；ＷＯ０２／４２４５９；ＷＯ２００３０６２４５５；ＵＳ２００３００５９７６７；米国特許出願公開番号２００３／０１０８８８０；米国特許第６，１４０，４６６号、同第６，５１１，８０８号および同第６，４５３，２４２号も参照のこと。有用なジンクフィンガーヌクレアーゼとしては、ＷＯ０３／０８０８０９；ＷＯ０５／０１４７９１；ＷＯ０５／０８４１９０；ＷＯ０８／０２１２０７；ＷＯ０９／０４２１８６；ＷＯ０９／０５４９８５；およびＷＯ１０／０６５１２３に記載されているものも挙げられる。
５．２．３．４  エンドヌクレアーゼ
【０１３８】
本明細書中に提供される方法のいくつかの実施形態において、１つまたはそれを超える上記ヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼである。エンドヌクレアーゼは、ポリヌクレオチド鎖内のホスホジエステル結合を切断する酵素であり、それには、塩基を損傷せずに特定の部位においてＤＮＡを切断する制限エンドヌクレアーゼが含まれる。制限エンドヌクレアーゼには、タイプＩ、タイプＩＩ、タイプＩＩＩおよびタイプＩＶエンドヌクレアーゼが含まれ、それらはさらにサブタイプを含む。制限エンドヌクレアーゼは、例えば、ＲＥＢＡＳＥデータベース（ｒｅｂａｓｅ．ｎｅｂ．ｃｏｍのウェブページ；Ｒｏｂｅｒｔｓら（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３１：４１８−２０）、Ｒｏｂｅｒｔｓら（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３１：１８０５−１２およびＢｅｌｆｏｒｔら（２００２）Ｍｏｂｉｌｅ  ＤＮＡ  ＩＩ，ｐｐ．７６１−７８３，Ｅｄｓ．Ｃｒａｉｇｉｅら、ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃにさらに記載され、分類されている。
【０１３９】
本明細書中で使用されるとき、エンドヌクレアーゼには、制限エンドヌクレアーゼのような、特定の認識配列に結合して切断するホーミングエンドヌクレアーゼも含まれる。しかしながら、ホーミングエンドヌクレアーゼの認識部位は、通常、より長く、例えば、約１８ｂｐまたはそれより長い。メガヌクレアーゼとしても知られるホーミングエンドヌクレアーゼは、保存配列モチーフに基づいて、以下のファミリー：ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ（配列番号１）ホーミングエンドヌクレアーゼ、ＨＮＨホーミングエンドヌクレアーゼ、Ｈｉｓ−Ｃｙｓボックスホーミングエンドヌクレアーゼ、ＧＩＹ−ＹＩＧ（配列番号２）ホーミングエンドヌクレアーゼおよびシアノバクテリアホーミングエンドヌクレアーゼに分類されている。例えば、Ｓｔｏｄｄａｒｄ，Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  ３８（１）：４９−９５（２００６）を参照のこと。これらのファミリーは、保存されたヌクレアーゼ活性部位コアモチーフおよび触媒機構、生物学的分布およびゲノム分布、ならびに非ホーミングヌクレアーゼ系とのより広い関係性が大きく異なる。例えば、Ｇｕｈａｎ  ａｎｄ  Ｍｕｎｉｙａｐｐａ（２００３）Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３８：１９９−２４８；Ｌｕｃａｓら（２００１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２９：９６０−９；Ｊｕｒｉｃａ  ａｎｄ  Ｓｔｏｄｄａｒｄ，（１９９９）Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ  ５５：１３０４−２６；Ｓｔｏｄｄａｒｄ，（２００６）Ｑ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  ３８：４９−９５；およびＭｏｕｒｅら（２００２）Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ  ９：７６４を参照のこと。これらのファミリー由来の有用な特定のホーミングエンドヌクレアーゼの例としては、Ｉ−ＣｒｅＩ（Ｒｏｃｈａｉｘら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：９７５−９８４（１９８５）を参照のこと）、Ｉ−ＭｓｏＩ（Ｌｕｃａｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２９：９６０−９６９（２００１）を参照のこと）、Ｉ−ＳｃｅＩ（Ｆｏｕｒｙら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４４０：３２５−３３１（１９９８）を参照のこと）、Ｉ−ＳｃｅＩＶ（Ｍｏｒａｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：４０６９−４０７６（１９９２）を参照のこと）、Ｈ−ＤｒｅＩ（Ｃｈｅｖａｌｉｅｒら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  １０：８９５−９０５（２００２）を参照のこと）、Ｉ−ＨｍｕＩ（Ｇｏｏｄｒｉｃｈ−Ｂｌａｉｒら、Ｃｅｌｌ  ６３：４１７−４２４（１９９０）；Ｇｏｏｄｒｉｃｈ−Ｂｌａｉｒら、Ｃｅｌｌ  ８４：２１１−２２１（１９９６）を参照のこと）、Ｉ−ＰｐｏＩ（Ｍｕｓｃａｒｅｌｌａら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０：３３８６−３３９６（１９９０）を参照のこと）、Ｉ−ＤｉｒＩ（Ｊｏｈａｎｓｅｎら、Ｃｅｌｌ  ７６：７２５−７３４（１９９４）；Ｊｏｈａｎｓｅｎ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２１：４４０５（１９９３）を参照のこと）、Ｉ−ＮｊａＩ（Ｅｌｄｅら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５９：２８１−２８８（１９９９）；Ｄｅ  Ｊｏｎｃｋｈｅｅｒｅら、Ｊ．Ｅｕｋａｒｙｏｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４１：４５７−４６３（１９９４）を参照のこと）、Ｉ−���ａｎＩ（Ｅｌｄｅら、Ｓ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５９：２８１−２８８（１９９９）；Ｄｅ  Ｊｏｎｃｋｈｅｅｒｅら、Ｊ．Ｅｕｋａｒｙｏｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４１：４５７−４６３（１９９４））を参照のこと）、Ｉ−ＮｉｔＩ（Ｄｅ  Ｊｏｎｃｋｈｅｅｒｅら、Ｊ．Ｅｕｋａｒｙｏｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４１：４５７−４６３（１９９４）；Ｅｌｄｅら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５９：２８１−２８８（１９９９）を参照のこと）、Ｉ−ＴｅｖＩ（Ｃｈｕら、Ｃｅｌｌ  ４５：１５７−１６６（１９８６）を参照のこと）、Ｉ−ＴｅｖＩＩ（Ｔｏｍａｓｃｈｅｗｓｋｉら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：３６３２−３６３３（１９８７）を参照のこと）、Ｉ−ＴｅｖＩＩＩ（Ｅｄｄｙら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．５：１０３２−１０４１（１９９１）を参照のこと）、Ｆ−ＴｅｖＩ（Ｆｕｊｉｓａｗａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：７４７３−７４８１（１９８５）を参照のこと）、Ｆ−ＴｅｖＩＩ（Ｋａｄｙｒｏｖら、Ｄｏｋｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３３９：１４５−１４７（１９９４）；Ｋａｌｉｍａｎ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：４２７７（１９９０）を参照のこと）、Ｆ−ＣｐｈＩ（Ｚｅｎｇら、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．１９：２１８−２２２（２００９）を参照のこと）、ＰＩ−ＭｇａＩ（Ｓａｖｅｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２９：４３１０−４３１８（２００１）を参照のこと）、Ｉ−ＣｓｍＩ（Ｃｏｌｌｅａｕｘら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２２３：２８８−２９６（１９９０）を参照のこと）、Ｉ−ＣｅｕＩ（Ｔｕｒｍｅｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１８：２９３−３１１（１９９１））を参照のこと）およびＰＩ−ＳｃｅＩ（Ｈｉｒａｔａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：６７２６−６７３３（１９９０）を参照のこと）が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１４０】
本明細書中に記載される方法のいくつかの実施形態において、ホーミングエンドヌクレアーゼの天然に存在するバリアントおよび／または操作された誘導体が使用される。動態、補因子相互作用、発現、最適条件および／または認識部位特異性を改変するための方法、ならびに活性についてスクリーニングするための方法は、公知である。例えば、Ｅｐｉｎａｔら（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３１：２９５２−６２；Ｃｈｅｖａｌｉｅｒら（２００２）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  １０：８９５−９０５；Ｇｉｍｂｌｅら（２００３）Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３３４：９９３−１００８；Ｓｅｌｉｇｍａｎら（２００２）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３０：３８７０−９；Ｓｕｓｓｍａｎら（２００４）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３４２：３１−４１；Ｒｏｓｅｎら（２００６）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３４：４７９１−８００；Ｃｈａｍｅｓら（２００５）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３３：ｅ１７８；Ｓｍｉｔｈら（２００６）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３４：ｅ１４９；Ｇｒｕｅｎら（２００２）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３０：ｅ２９；Ｃｈｅｎ  ａｎｄ  Ｚｈａｏ，（２００５）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３３：ｅ１５４；ＷＯ２００５１０５９８９；ＷＯ２００３０７８６１９；ＷＯ２００６０９７８５４；ＷＯ２００６０９７８５３；ＷＯ２００６０９７７８４；およびＷＯ２００４０３１３４６を参照のこと。有用なホーミングエンドヌクレアーゼには、ＷＯ０４／０６７７３６；ＷＯ０４／０６７７５３；ＷＯ０６／０９７７８４；ＷＯ０６／０９７８５３；ＷＯ０６／０９７８５４；ＷＯ０７／０３４２６２；ＷＯ０７／０４９０９５；ＷＯ０７／０４９１５６；ＷＯ０７／０５７７８１；ＷＯ０７／０６０４９５；ＷＯ０８／１５２５２４；ＷＯ０９／００１１５９；ＷＯ０９／０９５７４２；ＷＯ０９／０９５７９３；ＷＯ１０／００１１８９；ＷＯ１０／０１５８９９；およびＷＯ１０／０４６７８６に記載されているものも含まれる。
【０１４１】
任意のホーミングエンドヌクレアーゼを、二本鎖断裂誘導物質として使用することができ、それらとしては、Ｈ−ＤｒｅＩ、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＳｃｅＶ、Ｉ−ＳｃｅＶＩ、Ｉ−ＳｃｅＶＩＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、Ｉ−ＣｅｕＡＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＶＰ、Ｉ−ＴｌｉＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｐｉ−ＰｓｐＩ、Ｆ−ＳｃｅＩ、Ｆ−ＳｃｅＩＩ、Ｆ−ＳｕｖＩ、Ｆ−ＣｐｈＩ、Ｆ−ＴｅｖＩ、Ｆ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＡｍａＩ、Ｉ−ＡｎｉＩ、Ｉ−ＣｈｕＩ、Ｉ−ＣｍｏｅＩ、Ｉ−ＣｐａＩ、Ｉ−ＣｐａＩＩ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＣｖｕＩ、Ｉ−ＣｖｕＡＩＰ、Ｉ−ＤｄｉＩ、Ｉ−ＤｄｉＩＩ、Ｉ−ＤｉｒＩ、Ｉ−ＤｍｏＩ、Ｉ−ＨｍｕＩ、Ｉ−ＨｍｕＩＩ、Ｉ−ＨｓＮＩＰ、Ｉ−ＬｌａＩ、Ｉ−ＭｓｏＩ、Ｉ−ＮａａＩ、Ｉ−ＮａｎＩ、Ｉ−ＮｃｌＩＰ、Ｉ−ＮｇｒＩＰ、Ｉ−ＮｉｔＩ、Ｉ−ＮｊａＩ、Ｉ−Ｎｓｐ２３６ＩＰ、Ｉ−ＰａｋＩ、Ｉ−ＰｂｏＩＰ、Ｉ−ＰｃｕＩＰ、Ｉ−ＰｃｕＡＩ、Ｉ−ＰｃｕＶＩ、Ｉ−ＰｇｒＩＰ、Ｉ−ＰｏｂＩＰ、Ｉ−ＰｏｒＩ、Ｉ−ＰｏｒＩＩＰ、Ｉ−ＰｂｐＩＰ、Ｉ−ＳｐＢｅｔａＩＰ、Ｉ−ＳｃａＩ、Ｉ−ＳｅｘＩＰ、Ｉ−ＳｎｅＩＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩ、Ｉ−ＳｐｏｍＣＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩＩＰ、Ｉ−ＳｑｕＩＰ、Ｉ−Ｓｓｐ６８０３１、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＪＰ、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＳＴ３Ｐ、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＳＴｅ３ｂＰ、Ｉ−ＴｄｅＩＰ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩＩ、Ｉ−ＵａｒＡＰ、Ｉ−ＵａｒＨＧＰＡＩＰ、Ｉ−ＵａｒＨＧＰＡ１３Ｐ、Ｉ−ＶｉｎＩＰ、Ｉ−ＺｂｉＩＰ、ＰＩ−ＭｇａＩ、ＰＩ−ＭｔｕＩ、ＰＩ−ＭｔｕＨＩＰ  ＰＩ−ＭｔｕＨＩＩＰ、ＰＩ−ＰｆｕＩ、ＰＩ−ＰｆｕＩＩ、ＰＩ−ＰｋｏＩ、ＰＩ−ＰｋｏＩＩ、ＰＩ−Ｒｍａ４３８１２ＩＰ、ＰＩ−ＳｐＢｅｔａＩＰ、ＰＩ−ＳｃｅＩ、ＰＩ−ＴｆｕＩ、ＰＩ−ＴｆｕＩＩ、ＰＩ−ＴｈｙＩ、ＰＩ−ＴｌｉＩもしくはＰＩ−ＴｌｉＩＩ、またはそれらの任意のバリアントもしくは誘導体が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１４２】
いくつかの実施形態において、エンドヌクレアーゼは、天然または内在性の認識配列に結合する。他の実施形態において、エンドヌクレアーゼは、非天然または外来性の認識配列に結合して天然または内在性の認識配列には結合しない改変されたエンドヌクレアーゼである。
５．２．３．５  ゲノム標的部位
【０１４３】
本明細書中に提供される方法では、ゲノム標的部位近傍またはゲノム標的部位内に二本鎖断裂を引き起こすことができるヌクレアーゼが宿主細胞に導入され、それによって、その切断部位またはその切断部位近傍における相同組換えの頻度が大幅に上昇する。好ましい実施形態において、ヌクレアーゼの認識配列は、宿主細胞ゲノムの中の標的部位にのみ存在し、それによって、そのヌクレアーゼによるあらゆるオフターゲットのゲノムの結合および切断が最小限になる。
【０１４４】
いくつかの実施形態において、ゲノム標的部位は、宿主細胞にとって内在性であり、例えば、天然の遺伝子座である。いくつかの実施形態において、天然のゲノム標的部位は、本明細書中に提供される組込みの方法において使用されるヌクレアーゼのタイプに従って選択される。
【０１４５】
使用されるヌクレアーゼが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ由来のＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼである場合、最適な標的部位は、使用される特定のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓエンドヌクレアーゼの標的認識に対する要件に従って選択され得る。例えば、Ｃａｓ９の標的認識は、標的ＤＮＡの中の「プロトスペーサー」配列とｃｒＲＮＡの中の残りのスペーサー配列との間に相補性が検出されると生じる。正しいプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）が３’末端にも存在する場合だけ、Ｃａｓ９は、そのＤＮＡを切断する。異なるタイプＩＩシステムは、異なるＰＡＭ要件を有する。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓシステムは、ＮＧＧ配列を必要とし、ここで、Ｎは、任意のヌクレオチドであり得る。Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓタイプＩＩシステムは、それぞれＮＧＧＮＧおよびＮＮＡＧＡＡＷを必要とする一方で、異なるＳ．ｍｕｔａｎｓシステムは、ＮＧＧまたはＮＡＡＲを許容する。バイオインフォマティクス解析によって、新しいＰＡＭを同定するのに役立ち得、ＣＲＩＳＰＲが標的化可能な配列のセットを拡大し得る、種々の細菌におけるＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の広範囲なデータベースが生成された。例えば、Ｒｈｏら、ＰＬｏＳ  Ｇｅｎｅｔ．８，ｅ１００２４４１（２０１２）；およびＤ．Ｔ．Ｐｒｉｄｅら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．２１，１２６（２０１１）を参照のこと。Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓでは、Ｃａｓ９は、プロトスペーサーの３ｂｐ上流に、平滑末端化された二本鎖断裂をもたらし、これは、Ｃａｓ９タンパク質における２つの触媒ドメイン：そのＤＮＡの相補鎖を切断するＨＮＨドメインおよび非相補鎖を切断するＲｕｖＣ様ドメインによって媒介されるプロセスである。
【０１４６】
使用されるヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼである場合、最適な標的部位は、いくつかの公的に入手可能なオンライン情報源を用いて選択され得る。例えば、Ｒｅｙｏｎら、ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １２：８３（２０１１）（これは、その全体が参照により本明細書に援用される）を参照のこと。例えば、オリゴマー化プール工学（Ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｚｅｄ  Ｐｏｏｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）（ＯＰＥＮ）は、高い特異性およびインビボ機能性を有するジンクフィンガーアレイを操作するための、高度にロバストで公的に入手可能なプロトコルであり、植物、ゼブラフィッシュならびにヒトの体性幹細胞および多能性幹細胞において効率的に機能するＺＦＮを作製するために首尾良く使用されている。ＯＰＥＮは、選択ベースの方法であり、この方法では、予め構築され、ランダム化された候補ＺＦＡのプールをスクリーニングすることにより、所望の標的配列に対して高い親和性および特異性を有するものが同定される。ＺＦＮＧｅｎｏｍｅは、ＯＰＥＮによって作製されたＺＦＮの潜在的な標的部位を同定するためおよび可視化するためのＧＢｒｏｗｓｅベースのツールである。ＺＦＮＧｅｎｏｍｅは、配列決定され、注釈がつけられたモデル生物のゲノムにおける潜在的なＺＦＮ標的部位の大要を提供する。ＺＦＮＧｅｎｏｍｅは、現在、７つのモデル生物；Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ、Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、Ｄ．ｒｅｒｉｏ、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓおよびＨ．ｓａｐｉｅｎｓの完全に配列決定されたゲノム内にマッピングされた合計１１６０万個を超える潜在的なＺＦＮ標的部位を含んでいる。３つの植物種；Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ（ダイズ）、Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ（イネ）、Ｚｅａ  ｍａｙｓ（トウモロコシ）および３つの動物種、Ｔｒｉｂｏｌｉｕｍ  ｃａｓｔａｎｅｕｍ（コクヌストモドキ）、Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ（マウス）、Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ（ドブネズミ）を含むさらなるモデル生物が、近い将来、追加される。ＺＦＮＧｅｎｏｍｅは、潜在的なＺＦＮ標的部位の各々に関する情報（その染色体の場所および転写開始部位(複数可)に対する位置を含む）を提供する。ユーザーは、いくつかの異なる基準（例えば、遺伝子ＩＤ、転写物ＩＤ、標的部位配列）を用いてＺＦＮＧｅｎｏｍｅに問い合わせることができる。
【０１４７】
使用されるヌクレアーゼが、ＴＡＬ−エフェクターヌクレアーゼである場合、いくつかの実施形態において、最適な標的部位は、Ｓａｎｊａｎａら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，７：１７１−１９２（２０１２）（その全体が参照により本明細書に援用される）に記載されている方法に従って選択され得る。手短に言えば、ＴＡＬＥＮは、二量体として機能し、左ＴＡＬＥＮおよび右ＴＡＬＥＮと称されるＴＡＬＥＮ対は、ＤＮＡの逆鎖上の配列を標的化する。ＴＡＬＥＮは、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインとモノマーのＦｏｋＩ触媒ドメインとの融合物として操作される。ＦｏｋＩの二量体化を容易にするために、左および右ＴＡＬＥＮ標的部位は、およそ１４〜２０塩基の間隔が空くように選択される。ゆえに、各々が２０ｂｐの配列を標的化するＴＡＬＥＮ対の場合、最適な標的部位は、５’−ＴＮ１９Ｎ１４−２０Ｎ１９Ａ−３’の形態をとるべきであり、ここで、左ＴＡＬＥＮが、５’−ＴＮ１９−３’を標的化し、右ＴＡＬＥＮが、５’−Ｎ１９Ａ−３’のアンチセンス鎖を標的化する（Ｎ＝Ａ、Ｇ、ＴまたはＣ）。
【０１４８】
本明細書中に提供される方法の他の実施形態において、ゲノム標的部位は、宿主細胞にとって外来性である。例えば、１つまたはそれを超えるゲノム標的部位は、本明細書中に記載される組込みの方法を行う前に、従来の方法、例えば、遺伝子ターゲティングを用いて、宿主細胞ゲノムへと操作され得る。いくつかの実施形態において、複数コピーの同じ標的配列が、宿主細胞ゲノムの異なる遺伝子座へと操作され、それにより、その標的配列を特異的に認識する単一のヌクレアーゼのみを使用して、同時の複数の組込み事象が促進される。他の実施形態において、複数の異なる標的配列が、宿主細胞ゲノムの異なる遺伝子座へと操作される。いくつかの実施形態において、操作された標的部位は、それが行われなければ宿主細胞の天然のゲノムに表われない標的配列を含む。例えば、ホーミングエンドヌクレアーゼは、通常、イントロンまたはインテインの中に埋もれている大きな認識部位（１２〜４０ｂｐ）を標的化し、したがって、それらの認識部位は、極めて稀であり、これらの部位は、哺乳動物のサイズのゲノムには全く存在しないかまたはほんのわずかしか存在しない。したがって、いくつかの実施形態において、その外来性のゲノム標的部位が、ホーミングエンドヌクレアーゼの認識配列である。いくつかの実施形態において、ホーミングヌクレアーゼは、Ｈ−ＤｒｅＩ、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＳｃｅＶ、Ｉ−ＳｃｅＶＩ、Ｉ−ＳｃｅＶＩＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、Ｉ−ＣｅｕＡＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＶＰ、Ｉ−ＴｌｉＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｐｉ−ＰｓｐＩ、Ｆ−ＳｃｅＩ、Ｆ−ＳｃｅＩＩ、Ｆ−ＳｕｖＩ、Ｆ−ＣｐｈＩ、Ｆ−ＴｅｖＩ、Ｆ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＡｍａＩ、Ｉ−ＡｎｉＩ、Ｉ−ＣｈｕＩ、Ｉ−ＣｍｏｅＩ、Ｉ−ＣｐａＩ、Ｉ−ＣｐａＩＩ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＣｖｕＩ、Ｉ−ＣｖｕＡＩＰ、Ｉ−ＤｄｉＩ、Ｉ−ＤｄｉＩＩ、Ｉ−ＤｉｒＩ、Ｉ−ＤｍｏＩ、Ｉ−ＨｍｕＩ、Ｉ−ＨｍｕＩＩ、Ｉ−ＨｓＮＩＰ、Ｉ−ＬｌａＩ、Ｉ−ＭｓｏＩ、Ｉ−ＮａａＩ、Ｉ−ＮａｎＩ、Ｉ−ＮｃｌＩＰ、Ｉ−ＮｇｒＩＰ、Ｉ−ＮｉｔＩ、Ｉ−ＮｊａＩ、Ｉ−Ｎｓｐ２３６ＩＰ、Ｉ−ＰａｋＩ、Ｉ−ＰｂｏＩＰ、Ｉ−ＰｃｕＩＰ、Ｉ−ＰｃｕＡＩ、Ｉ−ＰｃｕＶＩ、Ｉ−ＰｇｒＩＰ、Ｉ−ＰｏｂＩＰ、Ｉ−ＰｏｒＩ、Ｉ−ＰｏｒＩＩＰ、Ｉ−ＰｂｐＩＰ、Ｉ−ＳｐＢｅｔａＩＰ、Ｉ−ＳｃａＩ、Ｉ−ＳｅｘＩＰ、Ｉ−ＳｎｅＩＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩ、Ｉ−ＳｐｏｍＣＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩＩＰ、Ｉ−ＳｑｕＩＰ、Ｉ−Ｓｓｐ６８０３１、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＪＰ、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＳＴ３Ｐ、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＳＴｅ３ｂＰ、Ｉ−ＴｄｅＩＰ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩＩ、Ｉ−ＵａｒＡＰ、Ｉ−ＵａｒＨＧＰＡＩＰ、Ｉ−ＵａｒＨＧＰＡ１３Ｐ、Ｉ−ＶｉｎＩＰ、Ｉ−ＺｂｉＩＰ、ＰＩ−ＭｇａＩ、ＰＩ−ＭｔｕＩ、ＰＩ−ＭｔｕＨＩＰ  ＰＩ−ＭｔｕＨＩＩＰ、ＰＩ−ＰｆｕＩ、ＰＩ−ＰｆｕＩＩ、ＰＩ−ＰｋｏＩ、ＰＩ−ＰｋｏＩＩ、ＰＩ−Ｒｍａ４３８１２ＩＰ、ＰＩ−ＳｐＢｅｔａＩＰ、ＰＩ−ＳｃｅＩ、ＰＩ−ＴｆｕＩ、ＰＩ−���ｆｕＩＩ、ＰＩ−ＴｈｙＩ、ＰＩ−ＴｌｉＩもしくはＰＩ−ＴｌｉＩＩまたはそれらの任意のバリアントもしくは誘導体からなる群より選択される。特定の実施形態において、外来性のゲノム標的部位は、Ｉ−ＳｃｅＩ、ＶＤＥ（ＰＩ−ＳｃｅＩ）、Ｆ−ＣｐｈＩ、ＰＩ−ＭｇａＩまたはＰＩ−ＭｔｕＩＩの認識配列であり、これらの各々は、下記に提供される。
【表１】
0006652489.tif 000002
５．２．３．６  送達
【０１４９】
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載される方法にとって有用な１つまたはそれを超えるヌクレアーゼは、精製されたタンパク質として宿主細胞に提供され、例えば、送達される。他の実施形態において、１つまたはそれを超えるヌクレアーゼは、そのヌクレアーゼをコードする核酸を含むポリヌクレオチド(複数可)を介して提供される。他の実施形態において、１つまたはそれを超えるヌクレアーゼは、宿主細胞の核において直接翻訳され得る、精製されたＲＮＡとして宿主細胞に導入される。
【０１５０】
ある特定の実施形態において、上に記載されたような組込みポリヌクレオチド（ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｔｉｄｅ）、ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドもしくは精製されたヌクレアーゼタンパク質またはそれらの任意の組み合わせが、外来性のタンパク質および／または核酸を細胞に導入する当該分野で公知の任意の従来の技法を用いて宿主細胞に導入され得る。そのような方法としては、溶液からの細胞による当該分子の直接的な取り込み、または例えばリポソームもしくは免疫リポソームを使用するリポフェクションを介した促進された取り込み；粒子媒介性のトランスフェクションなどが挙げられるがこれらに限定されない。例えば、米国特許第５，２７２，０６５号；Ｇｏｅｄｄｅｌら、ｅｄｓ，１９９０，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，ＣＡ；Ｋｒｉｅｇｅｒ，１９９０，Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ−−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ；およびＡｕｓｕｂｅｌら、ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ＮＹを参照のこと。細胞を形質転換するための特定の方法は、当該分野で周知である。Ｈｉｎｎｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７５：１２９２−３（１９７８）；Ｃｒｅｇｇら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３３７６−３３８５（１９８５）を参照のこと。例示的な技法としては、スフェロプラスト法（ｓｐｈｅｒｏｐｌａｓｔｉｎｇ）、エレクトロポレーション、ＰＥＧ１０００によって媒介される形質転換、および酢酸リチウムまたは塩化リチウムによって媒介される形質転換が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１５１】
いくつかの実施形態では、微粒子銃を用いて、組込みポリヌクレオチド、ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド、精製されたヌクレアーゼタンパク質またはそれらの任意の組み合わせが、宿主細胞、特に、従来の技法を用いて形質転換しにくい／トランスフェクトしにくい宿主細胞、例えば、植物に導入される。微粒子銃は、形質転換反応物を微視的金粒子に結合し、次いで、圧縮ガスを用いてそれらの粒子を標的細胞に発射することによって働く。
【０１５２】
いくつかの実施形態において、ヌクレアーゼをコードする核酸を含むポリヌクレオチドは、宿主細胞内でヌクレアーゼの発現を可能にする発現ベクターである。好適な発現ベクターとしては、大腸菌、酵母または哺乳動物細胞において遺伝子を発現する際に使用するための公知のものが挙げられるがこれらに限定されない。大腸菌発現ベクターの例としては、ｐＳＣＭ５２５、ｐＤＩＣ７３、ｐＳＣＭ３５１およびｐＳＣＭ３５３が挙げられるがこれらに限定されない。酵母発現ベクターの例としては、ｐＰＥＸ７およびｐＰＥＸ４０８が挙げられるがこれらに限定されない。好適な発現ベクターの他の例としては、ＣＥＮ．ＡＲＳ配列および酵母選択マーカーを含む酵母−大腸菌ｐＲＳシリーズのシャトルベクター；ならびに２μプラスミドが挙げられる。いくつかの実施形態において、ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドは、天然に存在するポリヌクレオチド配列と比べて宿主細胞における使用頻度がより高いコドンに置換するように改変され得る。例えば、ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドは、天然に存在するポリヌクレオチド配列と比べてＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける使用頻度がより高いコドンに置換するように改変され得る。
【０１５３】
ジンクフィンガーヌクレアーゼおよびＴＡＬ−エフェクターヌクレアーゼの場合のように、ヌクレアーゼが各モノマーの別個の発現を必要とするヘテロ二量体として機能するいくつかの実施形態では、ヘテロ二量体の各モノマーは、同じ発現プラスミドから発現されてもよいし、異なるプラスミドから発現されてもよい。複数のヌクレアーゼが細胞に導入されることにより、異なる標的部位に二本鎖断裂がもたらされる実施形態では、それらのヌクレアーゼは、単一のプラスミド上でコードされてもよいし、別々のプラスミド上でコードされてもよい。
【０１５４】
ある特定の実施形態において、ヌクレアーゼ発現ベクターは、その発現ベクターを含む宿主細胞の選択を可能にする選択マーカーをさらに含む。そのような選択は、ヌクレアーゼが出現するのに十分な量の発現に必要な期間にわたって、例えば、１２、２４、３６、４８、６０、７２、８４、９６時間または９６時間を超える期間にわたって宿主細胞内にそのベクターを保持することに役立ち得、その後、その宿主細胞を、その発現ベクターがもはや保持されない条件下で成長させ得る。ある特定の実施形態において、選択マーカーは、ＵＲＡ３、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、ゼオシン耐性およびホスフィノトリシンＮ−アセチルトランスフェラーゼからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、ヌクレアーゼ発現ベクターベクターは、１つまたはそれを超えるドナー核酸分子の組込みの後は発現ベクターを含まない宿主細胞の選択を可能にする対抗選択マーカーを含み得る。使用されるヌクレアーゼ発現ベクターは、選択マーカーを有しない一過性ベクターでもあり得るか、または選択されないベクターである。特定の実施形態において、一過性のヌクレアーゼ発現ベクターを含む宿主細胞の子孫は、時間とともにそのベクターを失う。
【０１５５】
ある特定の実施形態において、発現ベクターは、ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された転写終結配列およびプロモーターをさらに含む。いくつかの実施形態において、プロモーターは、構成的プロモーターである。いくつかの実施形態において、プロモーターは、誘導性プロモーターである。酵母細胞において使用するために適したプロモーターの実例としては、Ｋ．ｌａｃｔｉｓのＴＥＦ１遺伝子のプロモーター、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＰＧＫ１遺伝子のプロモーター、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＴＤＨ３遺伝子のプロモーター、抑制性プロモーター、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＣＴＲ３遺伝子のプロモーター、および誘導性プロモーター、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのガラクトース誘導性プロモーター（例えば、ＧＡＬ１、ＧＡＬ７およびＧＡＬ１０遺伝子のプロモーター）が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１５６】
いくつかの実施形態において、核局在化配列（ＮＬＳ）を含むさらなるヌクレオチド配列が、ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列の５’に連結される。ＮＬＳは、より大きなヌクレアーゼ（＞２５ｋＤ）の核局在化を促進し得る。いくつかの実施形態において、核局在化配列は、ＳＶ４０核局在化配列である。いくつかの実施形態において、核局在化配列は、酵母核局在化配列である。
【０１５７】
ヌクレアーゼ発現ベクターは、当業者に明らかな任意の技法によって作製され得る。ある特定の実施形態において、そのベクターは、当該分野で周知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）および分子クローニング法を用いて作製される。例えば、ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｅｄ．ＨＡ  Ｅｒｌｉｃｈ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹを参照のこと。
５．３  宿主細胞
【０１５８】
別の態様において、本明細書中に記載される１つまたはそれを超える外来性核酸をゲノム的に組み込むいずれかの方法によって作製された改変された宿主細胞が本明細書中に提供される。好適な宿主細胞としては、目的の核酸または「ドナーＤＮＡ」を染色体またはエピソームの遺伝子座に組み込むことが望まれる任意の細胞が挙げられる。いくつかの実施形態において、その細胞は、相同組換えを行う能力を有する生物の細胞である。いくつかの例証的な実施形態は、酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）において実証されるが、本明細書中に提供されるゲノム改変の方法は、機能的な組換え系を有するすべての生物学的生物において、その組換え系が酵母ほどの能力がなかったとしても、実施され得ると考えられる。機能的な相同組換え系を有する他の細胞または細胞型としては、細菌、例えば、枯草菌および大腸菌（これは、ＲｅｃＥ  ＲｅｃＴ組換え能がある；Ｍｕｙｒｅｒｓら、ＥＭＢＯ  ｒｅｐ．１：２３９−２４３，２０００）；原生動物（例えば、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ）；他の酵母（例えば、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）；糸状菌（例えば、Ａｓｈｂｙａ  ｇｏｓｓｙｐｉｉ）；植物、例えば、蘚類のＰｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ（Ｓｃｈａｅｆｅｒ  ａｎｄ  Ｚｒｙｄ，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．１１：１１９５−１２０６，１９９７）；ならびに動物細胞、例えば、哺乳動物細胞およびニワトリＤＴ４０細胞（Ｄｉｅｋｅｎら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１２：１７４−１８２，１９９６）が挙げられる。
【０１５９】
いくつかの実施形態において、宿主細胞は、原核細胞である。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、真核細胞である。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、真菌細胞、細菌細胞、植物細胞、昆虫細胞、鳥類細胞、魚類細胞および哺乳動物細胞からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、哺乳動物細胞は、げっ歯類細胞、霊長類細胞およびヒト細胞からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、細胞は、真菌細胞（例えば、酵母細胞）、細菌細胞、植物細胞または動物細胞（例えば、ニワトリ細胞）である。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＯＳ−７細胞、マウス線維芽細胞、マウス胚性癌腫細胞またはマウス胚性幹細胞である。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、昆虫細胞である。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、Ｓ２細胞、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ細胞、Ｓ１２細胞、５Ｂ１−４細胞、Ｔｎ５細胞またはＳｆ９細胞である。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、単細胞の真核生物細胞である。
【０１６０】
特定の実施形態において、宿主細胞は、酵母細胞である。有用な酵母宿主細胞としては、微生物寄託所（例えば、ＩＦＯ、ＡＴＣＣなど）に寄託された酵母細胞が挙げられ、それらの酵母宿主細胞は、とりわけ、Ａｃｉｃｕｌｏｃｏｎｉｄｉｕｍ、Ａｍｂｒｏｓｉｏｚｙｍａ、Ａｒｔｈｒｏａｓｃｕｓ、Ａｒｘｉｏｚｙｍａ、Ａｓｈｂｙａ、Ｂａｂｊｅｖｉａ、Ｂｅｎｓｉｎｇｔｏｎｉａ、Ｂｏｔｒｙｏａｓｃｕｓ、Ｂｏｔｒｙｏｚｙｍａ、Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ、Ｂｕｌｌｅｒａ、Ｂｕｌｌｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｃｉｔｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃｌａｖｉｓｐｏｒａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｙｓｔｏｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ、Ｄｅｋｋａｒａ、Ｄｉｐｏｄａｓｃｏｐｓｉｓ、Ｄｉｐｏｄａｓｃｕｓ、Ｅｅｎｉｅｌｌａ、Ｅｎｄｏｍｙｃｏｐｓｅｌｌａ、Ｅｒｅｍａｓｃｕｓ、Ｅｒｅｍｏｔｈｅｃｉｕｍ、Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｆｅｌｌｏｍｙｃｅｓ、Ｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｇａｌａｃｔｏｍｙｃｅｓ、Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ、Ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｅｌｌａ、Ｈａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｈａｓｅｇａｗａｅａ、Ｈｏｌｔｅｒｍａｎｎｉａ、Ｈｏｒｍｏａｓｃｕｓ、Ｈｙｐｈｏｐｉｃｈｉａ、Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ、Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ、Ｋｌｏｅｃｋｅｒａｓｐｏｒａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｋｏｎｄｏａ、Ｋｕｒａｉｓｈｉａ、Ｋｕｒｔｚｍａｎｏｍｙｃｅｓ、Ｌｅｕｃｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ、Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ、Ｌｏｄｄｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ、Ｍｅｔｓｃｈｎｉｋｏｗｉａ、Ｍｒａｋｉａ、Ｍｙｘｏｚｙｍａ、Ｎａｄｓｏｎｉａ、Ｎａｋａｚａｗａｅａ、Ｎｅｍａｔｏｓｐｏｒａ、Ｏｇａｔａｅａ、Ｏｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ、Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ、Ｐｈａｃｈｙｔｉｃｈｏｓｐｏｒａ、Ｐｈａｆｆｉａ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｄｅｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ、Ｓａｉｔｏｅｌｌａ、Ｓａｋａｇｕｃｈｉａ、Ｓａｔｕｒｎｏｓｐｏｒａ、Ｓｃｈｉｚｏｂｌａｓｔｏｓｐｏｒｉｏｎ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ、Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ、Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ、Ｓｐｏｒｏｐａｃｈｙｄｅｒｍｉａ、Ｓｔｅｐｈａｎｏａｓｃｕｓ、Ｓｔｅｒｉｇｍａｔｏｍｙｃｅｓ、Ｓｔｅｒｉｇｍａｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ、Ｓｙｍｂｉｏｔａｐｈｒｉｎａ、Ｓｙｍｐｏｄｉｏｍｙｃｅｓ、Ｓｙｍｐｏｄｉｏｍｙｃｏｐｓｉｓ、Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｅｌｌａ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ、Ｔｒｉｇｏｎｏｐｓｉｓ、Ｔｓｕｃｈｉｙａｅａ、Ｕｄｅｎｉｏｍｙｃｅｓ、Ｗａｌｔｏｍｙｃｅｓ、Ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉａ、Ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉｅｌｌａ、Ｗｉｌｌｉｏｐｓｉｓ、Ｙａｍａｄａｚｙｍａ、Ｙａｒｒｏｗｉａ、Ｚｙｇｏａｓｃｕｓ、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、ＺｙｇｏｗｉｌｌｉｏｐｓｉｓおよびＺｙｇｏｚｙｍａ属に属する。
【０１６１】
いくつかの実施形態において、酵母宿主細胞は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ細胞、Ｄｅｋｋｅｒａ  ｂｒｕｘｅｌｌｅｎｓｉｓ細胞、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ細胞、Ａｒｘｕｌａ  ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓ細胞またはＨａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ（現在はＰｉｃｈｉａ  ａｎｇｕｓｔａとして知られる）細胞である。特定の実施形態において、酵母宿主細胞は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞である。いくつかの実施形態において、酵母宿主細胞は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ細胞またはＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ（以前はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓと呼ばれていた）細胞である。いくつかの実施形態において、酵母宿主細胞は、Ｃａｎｄｉｄａ属に属する細胞、例えば、Ｃａｎｄｉｄａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｋｒｕｓｅｉ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｐｓｅｕｄｏｔｒｏｐｉｃａｌｉｓまたはＣａｎｄｉｄａ  ｕｔｉｌｉｓである。別の特定の実施形態において、酵母宿主細胞は、Ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓ細胞である。
【０１６２】
特定の実施形態において、酵母宿主細胞は、パン酵母細胞、ＣＢＳ７９５９細胞、ＣＢＳ７９６０細胞、ＣＢＳ７９６１細胞、ＣＢＳ７９６２細胞、ＣＢＳ７９６３細胞、ＣＢＳ７９６４細胞、ＩＺ−１９０４細胞、ＴＡ細胞、ＢＧ−１細胞、ＣＲ−１細胞、ＳＡ−１細胞、Ｍ−２６細胞、Ｙ−９０４細胞、ＰＥ−２細胞、ＰＥ−５細胞、ＶＲ−１細胞、ＢＲ−１細胞、ＢＲ−２細胞、ＭＥ−２細胞、ＶＲ−２細胞、ＭＡ−３細胞、ＭＡ−４細胞、ＣＡＴ−１細胞、ＣＢ−１細胞、ＮＲ−１細胞、ＢＴ−１細胞およびＡＬ−１細胞からなる群より選択されるＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞である。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、ＰＥ−２細胞、ＣＡＴ−１細胞、ＶＲ−１細胞、ＢＧ−１細胞、ＣＲ−１細胞およびＳＡ−１細胞からなる群より選択されるＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞である。特定の実施形態において、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ宿主細胞は、ＰＥ−２細胞である。別の特定の実施形態において、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ宿主細胞は、ＣＡＴ−１細胞である。別の特定の実施形態において、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ宿主細胞は、ＢＧ−１細胞である。
【０１６３】
いくつかの実施形態において、酵母宿主細胞は、工業発酵、例えば、バイオエタノール発酵に適した細胞である。特定の実施形態において、その細胞は、工業発酵環境のストレス条件として認識されている、高溶媒濃度、高温、幅広い基質利用、栄養制限、浸透ストレス（ｏｓｍｏｔｉｃ  ｓｔｒｅｓｓ  ｄｕｅ）、酸性度、亜硫酸塩および細菌汚染、またはそれらの組み合わせの下で生存するように慣らされている。
５．４  適用
５．４．１．遺伝子治療および細胞治療
【０１６４】
本明細書中に記載される方法および組成物は、例えば、被験体に由来する細胞集団においてエキソビボで遺伝的欠陥を訂正しようとする治療への適用において利点を提供する。例えば、Ｓｃｈｗａｎｋら（Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  １３：６５３−６５８（２０１３））は、最近、ヒトＣＦ患者の培養された腸管幹細胞における相同組換えによってＣＦＴＲ遺伝子座を訂正するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集システムの利用を報告した。訂正された対立遺伝子は、クローン的に拡大されたオルガノイドにおいて測定されたとき、発現され、完全に機能的だったので、この報告は、単一遺伝子に遺伝的欠陥を有する患者由来の初代成体幹細胞における相同組換えによる遺伝子訂正に対する概念証明を提供する。しかしながら、培養された幹細胞におけるＣＦＴＲ遺伝子座の訂正には、ドナーＤＮＡとともにピューロマイシン耐性カセットのゲノム組込みに続くピューロマイシンにおける選択が必要だった。ヒト細胞ゲノムへのネオマイシン耐性遺伝子の組込みに続くＧ４１８における長時間の培養は、その細胞の特色に変化をもたらすことが報告され、高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）および他の蛍光タンパク質の発現は、免疫原性および毒性を引き起こすと報告された。例えば、Ｂａｒｅｓｅら、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２２：６５９−６６８（２０１１）；Ｍｏｒｒｉｓら、Ｂｌｏｏｄ  １０３：４９２−４９９（２００４）；およびＨａｎａｚｏｎｏら、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ８：１３１３−１３１９（１９９７）を参照のこと。したがって、本明細書中に提供される方法および組成物を用いることにより、選択マーカーの組込みの必要無しに、初代成体幹細胞における相同組換えによって遺伝子訂正を行うことができる。
【０１６５】
遺伝性疾患のＨＲ媒介性訂正の別の報告では、Ｗｕら（Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  １３：６５９−６６２（２０１３）は、白内障の原因であるＣｒｙｇｃ遺伝子に優性変異を有するマウスを、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡおよび変異対立遺伝子を標的化する単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を接合子に共注入すること（coinjection）によってレスキューすることができたことを実証した。訂正は、外部から供給されたオリゴヌクレオチドまたは内在性のＷＴ対立遺伝子に基づく相同組換え修復（ＨＤＲ）を介して生じ、得られたマウスは、生殖能力があり、訂正された対立遺伝子を子孫に伝えることができた。しかしながら、ＨＤＲ媒介性修復の割合は、ＮＨＥＪによる修復または非修復の発生率よりもかなり低かった（Ｗｕらの表１を参照のこと）。したがって、本明細書中に提供される方法および組成物を使用することにより、ＨＲ媒介性遺伝子改変を選択する有用な選択機構を提供することによって遺伝子訂正の効率を改善することができる。
５．４．２．代謝経路を操作するための方法
【０１６６】
本明細書中に記載される方法および組成物は、例えば、バイオマスをバイオ燃料、医薬品またはバイオマテリアルに変換することに対して最適化された生合成経路を含む、組換え生物を構築するための特定の利点を提供する。機能的な非天然の生物学的経路が、抗マラリア薬アルテミシニンに対する前駆体（例えば、Ｍａｒｔｉｎら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２１：７９６−８０２（２００３）を参照のこと；脂肪酸由来の（ｄｅｒｉｖｅｓ）燃料および化学物質（例えば、脂肪酸エステル、脂肪アルコールおよびろう；例えば、Ｓｔｅｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ４６３：５５９−５６２（２０１０）を参照のこと；ハロゲン化メチル由来の燃料および化学物質（例えば、Ｂａｙｅｒら、Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  １３１：６５０８−６５１５（２００９）を参照のこと；コレステロール低下薬をもたらすポリケチドシンターゼ（例えば、Ｍａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２６：５８９−５９２（２００９）を参照のこと；およびポリケチド（例えば、Ｋｏｄｕｍａｌ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０１：１５５７３−１５５７８（２００４）を参照のこと）を生成するために微生物宿主において首尾良く構築された。
【０１６７】
従来、代謝工学、特に生合成経路の構築は、１つずつの連続的な形式で進んできており、経路成分は、１回につき宿主細胞ゲノムの単一の遺伝子座に導入、すなわち、組み込まれてきた。本明細書中に提供される組込みの方法を利用することにより、新しい代謝経路、すなわち、宿主細胞が内因的に産生しない代謝産物を生成する代謝経路の酵素をコードする１つまたはそれを超える異種性ヌクレオチド配列を含むように宿主細胞、例えば、微生物細胞を操作するために通常必要な時間を短縮することができる。他の特定の実施形態では、本明細書中に提供される組込みの方法を用いることにより、宿主細胞にとって内在性の代謝経路、すなわち、宿主細胞が内因的に産生する代謝産物を生成する代謝経路の酵素をコードする１つまたはそれを超える異種性ヌクレオチド配列を含むように宿主細胞を効率的に操作することができる。１つの例において、デザインストラテジーは、宿主細胞の３つの天然の遺伝子を相補的な外来性経路で置き換えようとし得る。現在の技術水準を用いたこれらの３つの内在性遺伝子座の改変には、３つの別個の形質転換が必要である。対照的に、本明細書中に提供される同時の複数の組込みの方法は、３つすべての組込みを単一の形質転換において行うことを可能にし、ゆえに、必要とされる操作の回数が３倍減少する。さらに、その方法は、１つの宿主細胞シャーシ（ｃｈａｓｓｉｓ）の中の複数の部位に組み込まれた最適化された経路成分を含むＤＮＡアセンブリを、第２の宿主細胞シャーシの中の類似部位に移すこと（ｐｏｒｔｉｎｇ）を可能にする。所望の遺伝子型を操作するのに必要な回数を減少させることによって、代謝経路の構築のペースが実質的に上昇する。
５．４．２．１  イソプレノイド経路の操作
【０１６８】
いくつかの実施形態において、本明細書中に提供される方法は、操作された宿主細胞の生成物プロファイルを改変するために生合成経路の１つまたはそれを超える構成要素を同時に導入するかまたは置き換えるために使用され得る。いくつかの実施形態において、生合成経路は、イソプレノイド経路である。
【０１６９】
テルペンは、多くの生物において産生される炭化水素の大きなクラスである。テルペンが、化学的に改変されたとき（例えば、炭素骨格の酸化または再配列によって）、得られる化合物は、一般に、テルペノイドと称され、それは、イソプレノイドとしても知られる。イソプレノイドは、多くの重要な生物学的役割を、例えば、電子伝達鎖におけるキノンとして、膜の構成要素として、タンパク質のプレニル化を介した細胞内標的化および制御において、カロテノイド、クロロフィルを含む光合成色素として、ホルモンおよび補因子として、ならびに様々なモノテルペン、セスキテルペンおよびジテルペンとともに植物防御化合物として、果たす。それらは、抗生物質、ホルモン、抗がん薬、殺虫剤および化学物質として工業的に有用である。
【０１７０】
テルペンは、イソプレン（Ｃ５Ｈ８）の単位を連結することによって得られ、存在するイソプレン単位の数によって分類される。ヘミテルペンは、単一のイソプレン単位からなる。イソプレン自体は、唯一のヘミテルペンであると考えられている。モノテルペンは、２つのイソプレン単位から構成されており、分子式Ｃ１０Ｈ１６を有する。モノテルペンの例は、ゲラニオール、リモネンおよびテルピネオールである。セスキテルペンは、３つのイソプレン単位から構成されており、分子式Ｃ１５Ｈ２４を有する。セスキテルペンの例は、ファルネセンおよびファルネソールである。ジテルペンは、４つのイソプレン単位から作られており、分子式Ｃ２０Ｈ３２を有する。ジテルペンの例は、カフェストール、カーウェオール、センブレンおよびタキサジエンである。セスタテルペンは、５つのイソプレン単位から構成されており、分子式Ｃ２５Ｈ４０を有する。セスタテルペンの例は、ゲラニルファルネソールである。トリテルペンは、６つのイソプレン単位からなり、分子式Ｃ３０Ｈ４８を有する。テトラテルペンは、８つのイソプレン単位を含み、分子式Ｃ４０Ｈ６４を有する。生物学的に重要なテトラテルペンとしては、非環式リコピン、単環式ガンマ−カロテン、ならびに二環式アルファ−およびベータ−カロテンが挙げられる。ポリテルペンは、多くのイソプレン単位の長鎖からなる。天然ゴムは、二重結合がｃｉｓであるポリイソプレンからなる。
【０１７１】
テルペンは、イソペンテニルピロリン酸（イソペンテニル二リン酸またはＩＰＰ）とその異性体であるジメチルアリルピロリン酸（ジメチルアリル二リン酸またはＤＭＡＰＰ）の縮合によって生合成される。ＩＰＰおよびＤＭＡＰＰを生成する２つの経路、すなわち、真核生物のメバロン酸依存的（ＭＥＶ）経路（図３）および原核生物のメバロン酸非依存的経路またはデオキシキシルロース−５−リン酸（ＤＸＰ）経路が知られている。植物は、ＭＥＶ経路とＤＸＰ経路の両方を用いる。ＩＰＰおよびＤＭＡＰＰは、プレニル二リン酸（ｐｒｅｎｙｌ  ｄｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ）シンターゼ（例えば、それぞれＧＰＰシンターゼ、ＦＰＰシンターゼおよびＧＧＰＰシンターゼ）の作用によって、ポリプレニル二リン酸（例えば、ゲラニル二リン酸（ｇｅｒａｎｙｌ  ｄｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ）またはＧＰＰ、ファルネシル二リン酸またはＦＰＰおよびゲラニルゲラニル二リン酸またはＧＧＰＰ）に次々に縮合される。それらのポリプレニル二リン酸中間体は、テルペンシンターゼによって、より複雑なイソプレノイド構造に変換される。
【０１７２】
テルペンシンターゼは、複数の生成物を形成する大きな遺伝子ファミリーに分けられている。テルペンシンターゼの例としては、ＧＰＰをモノテルペンに変換するモノテルペンシンターゼ；ＧＧＰＰをジテルペンに変換するジテルペンシンターゼ；およびＦＰＰをセスキテルペンに変換するセスキテルペンシンターゼが挙げられる。セスキテルペンシンターゼの例は、ＦＰＰをファルネセンに変換するファルネセンシンターゼである。テルペンシンターゼは、代謝の分岐点において働き、細胞によって産生されるイソプレノイドのタイプを規定するので、イソプレノイドへの経路の流れの制御において重要である。さらに、テルペンシンターゼは、そのようなテルペンの高収率生成の鍵を握っている。したがって、異種性イソプレノイドの生成について操作された宿主における経路の流れを改善する１つのストラテジーは、テルペンシンターゼをコードする複数コピーの核酸を導入することである。例えば、ＭＥＶ経路を含む操作された微生物において、ファルネセンなどのセスキテルペンの生成が望まれる場合、セスキテルペンシンターゼ、例えば、ファルネセンシンターゼが、その経路の終末酵素として使用され、ファルネセン生成のために最適化された株の作出に向けて、複数コピーのファルネセンシンターゼ遺伝子が宿主細胞に導入され得る。
【０１７３】
いずれのイソプレノイドの生合成も、プレニル二リン酸シンターゼおよびテルペンシンターゼの上流の同じ経路成分に依存するので、これらの経路成分は、いったん宿主「プラットフォーム」株に操作されたら、任意のセスキテルペンの生成に向けて利用することができ、そのセスキテルペンが何であるかは、宿主細胞に導入された特定のセスキテルペンシンターゼによって規定され得る。さらに、異なるイソプレン単位を有するテルペン、例えば、セスキテルペンの代わりにモノテルペンの生成が望まれる場合、プレニル二リン酸シンターゼとテルペンシンターゼの両方が、その経路の上流の成分をなおも利用しつつ、異なるテルペンを生成するように置き換えられ得る。
【０１７４】
したがって、本明細書中に提供される方法および組成物は、イソプレノイド産生経路、例えば、ＭＥＶ経路を含む宿主細胞を、所望のイソプレノイドを生成するように効率的に改変するために使用され得る。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、ＭＥＶ経路を含み、本明細書中に提供される複数の同時の組込みの方法は、宿主細胞のテルペン生成物プロファイルを定義する、複数コピーのプレニル二リン酸シンターゼおよび／またはテルペンシンターゼを同時に導入するために使用され得る。いくつかの実施形態において、プレニル二リン酸シンターゼは、ＧＰＰシンターゼであり、テルペンシンターゼは、モノテルペンシンターゼである。いくつかの実施形態において、プレニル二リン酸シンターゼは、ＦＰＰシンターゼであり、テルペンシンターゼは、セスキテルペンシンターゼである。いくつかの実施形態において、プレニル二リン酸シンターゼは、ＧＧＰＰシンターゼであり、テルペンシンターゼは、ジテルペンシンターゼである。他の実施形態において、宿主細胞は、ＭＥＶ経路を含み、第１のタイプのテルペン、例えば、ファルネセンの生成のためのプレニル二リン酸シンターゼおよび／またはテルペンシンターゼならびに本明細書中に提供される複数の同時の組込みの方法を用いることにより、１コピーまたはそれを超えるコピー数のプレニル二リン酸シンターゼおよび／またはテルペンシンターゼを同時に置き換えて、第２のタイプのテルペン、例えば、アモルファジエンを生成することができる。これらの実施形態は、下記の実施例３および４において例証される。本明細書中に提供される方法は、複数コピーの経路成分を使用する任意の生合成経路の構築および／または改変に向けて同様に利用することができ、その生成物プロファイルが複数コピーの単一経路成分の追加または交換によって容易に改変され得る宿主細胞を操作するために特に有用である。
【実施例】
【０１７５】
６．実施例
６．１  実施例１：ＣＲＩＳＰＲを使用し、欠失構築物の組込みを介して３つの遺伝子を同時に欠失させるための複数のｇＲＮＡ送達形式の比較
この実施例は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいてＲＨＲ２、ＨＯおよびＡＤＨ５のＯＲＦを（短いリンカー配列の組込みによって）同時に欠失させるためのＣＲＩＳＰＲの使用を実証する結果を提供する。手短に言えば、ＲＨＲ２、ＨＯおよびＡＤＨ５のＯＲＦに含まれるユニーク配列を標的化するキメラｇＲＮＡを作製し、それらをＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓのタイプＩＩ細菌ＣＲＩＳＰＲシステム由来のＣａｓ９タンパク質を発現している宿主細胞において様々な配置で形質転換した。形質転換されたコロニーを、コロニーＰＣＲ（ｃＰＣＲ）によって、短いリンカー配列による１つ、２つまたは３つのＯＲＦの置き換えについてスクリーニングした。
６．１．１．Ｃａｓ９ｐの構成的発現
【０１７６】
野生型Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株（ＣＥＮ．ＰＫ２、Ｍａｔ  ａ、ｕｒａ３−、ＴＲＰ１＋、ｌｅｕ２−、ＭＡＬ２−８Ｃ、ＳＵＣ２）を、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９ｐの構成的発現に対する宿主として使用した。中強度のＦＢＡ１プロモーター（配列番号３）の調節下にあるＣａｓ９に対する酵母コドン最適化コード配列を含む構築物のゲノム組込みを、ＧＲＥ３遺伝子座に対して標的化した。
６．１．２．ＲＨＲ２、ＨＯおよびＡＤＨ５のＯＲＦにおけるＣＲＩＳＰＲ標的部位の選択
【０１７７】
標的化されるＯＲＦ内のＣＲＩＳＰＲ標的候補を、ＰＡＭ配列Ｎ（１９）ＮＧＧの存在に基づいて同定した。そのＮＧＧ配列は、ＰＡＭ配列と称され、ＰＡＭ配列の前にある８塩基対のＤＮＡが、特異性を強制するために特に重要である（Ｆｕら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３１（９）：８２２−８２６（２０１３）；Ｒａｎら、Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ  ８（１１）：２２８１−２３０８（２０１３））。次いで、候補部位を、ゲノム内の標的配列のユニークさに基づいてランク付けし、オフターゲット切断のリスクを最小限にするために、ゲノム内の他の部位と最も低い類似性を有する部位を選択した。標的部位を表２に示す。
【０１７８】
【表２】
0006652489.tif 000003
６．１．３．ｇＲＮＡの送達様式
【０１７９】
Ｃａｓ９ｐは、一般的な構造ＲＮＡおよび特異的な標的化ＲＮＡとの会合によって切断部位に標的化される。この研究では現在の標準的な「キメラ」配置を採用し、標的化ＲＮＡと構造ＲＮＡとが融合されることにより、単一のガイドＲＮＡ、すなわちｇＲＮＡが形成される（Ｒａｎ，Ｈｓｕら、２０１３）。そのｇＲＮＡ構築物(複数可)の発現は、ＳＵＰ４ターミネーターとともにＳＮＲ５２ポリメラーゼＩＩＩプロモーターによって駆動された（ＤｉＣａｒｌｏ，Ｎｏｒｖｉｌｌｅら、２０１３）。ＲＨＲ２、ＨＯおよびＡＤＨ５遺伝子座を標的化するｇＲＮＡ構築物に対する配列は、それぞれ配列番号７、８および９として本明細書中に提供される。上記の５．２．１の項に記載されたようなおよび図７に示されているようないくつかのｇＲＮＡ送達様式を使用した。ｐＲＳ４ＸＸシリーズ２μベクター（Ｓｉｋｏｒｓｋｉ  ａｎｄ  Ｈｉｅｔｅｒ  １９８９）からのｇＲＮＡカセットの発現を、１）Ｃａｓ９を発現する酵母株への形質転換の前に、完成した環状プラスミド（図７．１および７．２）を作製する標準的なクローニング方法、または２）線状化ベクター骨格とともに、Ｃａｓ９を発現する酵母株に直接ｇＲＮＡカセットを形質転換することによって（Ｏｒｒ−Ｗｅａｖｅｒ，Ｓｚｏｓｔａｋら、１９８３）、インビボにおけるギャップ修復によって、そのカセットを環状化プラスミドにアセンブルすることによって達成した（図７．４）。ｇＲＮＡカセットの末端と直鎖状ベクター骨格（配列番号１０）との間の相同性の領域（約５００ｂｐ）は、インビボにおいて環状ｇＲＮＡプラスミドのアセンブリを容易にする。あるいは、３）形質転換された細胞を選択するためにＮａｔＡ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｎｏｕｒｓｅｉ由来のノウルセオトリシンアセチルトランスフェラーゼ）選択マーカー（配列番号１１）を有する閉環状プラスミドと共に共形質転換された直鎖状カセットから直接、ｇＲＮＡを発現させた（図７．３）。最後に、第３の方法の変法として、４）ＮａｔＡマーカーについての中央のコード配列を失うようにＮａｔＡマーカー内部でＰＣＲすることによって線状化したベクター（配列番号１２）と直鎖状カセットを共形質転換し；完全なＮａｔＡ発現カセットを有する閉環状プラスミドを再形成するためにギャップ修復によって組み換わることができる重複する相補的なＮａｔＡ  ＯＲＦフラグメント（配列番号１３）も共形質転換した（図９Ｂ；下記の実施例２において論じる）。
【０１８０】
環状ｇＲＮＡプラスミド（送達様式１）を作製するために、ＣＲＩＳＰＲシード配列およびカセットに対して２０ｂｐの上流／下流のホモロジーを含むアニールしたオリゴヌクレオチドを、大腸菌において、線状化した骨格にギャップ修復し（Ｍａｎｄｅｃｋｉ  １９８６）、正しいクローンを同定し、完成したプラスミドを宿主株に形質転換した。線状化したベクターに対して約５００ｂｐのフランキングホモロジーを有する完全長の直鎖状ｇＲＮＡカセットを調製するために（送達様式２、３および４）、ＰＣＲアセンブリ法を用いた。一般的なｇＲＮＡカセットを鋳型として使用し、カセットの半分を、ユニークなＣＲＩＳＰＲシード配列を含む２２塩基対の中央の重複を形成するプライマーを用いて増幅した。次いで、その２つのカセットの半分を、第２のＰＣＲ反応においてアセンブルすることにより、完全長ｇＲＮＡ発現カセットを生成した。１０μｌの未精製のＰＣＲアセンブリ（ＤＮＡマーカーラダーとの比較によって決定されたとき、通常２０〜６０ｎｇ／μｌ濃度）および１５０ｎｇの線状化した２μベクターを形質転換ごとに使用した。
６．１．４．直鎖状のドナーＤＮＡの作製
【０１８１】
直鎖状のドナーＤＮＡは、中央のリンカー（ＣＧＣＴＣＧＴＣＣＡＡＣＧＣＣＧＧＣＧＧＡＣＣＴ）を挟む、各ＯＲＦを標的化する５００ｂｐの上流相同性領域および下流相同性領域を含み、それらを、米国特許第８，２２１，９８２号に記載されているポリヌクレオチドアセンブリの方法によって作製した。ＲＨＲ２、ＨＯおよびＡＤＨ５遺伝子座に組み込むためのドナーＤＮＡ配列は、それぞれ配列番号１４、１５および１６として本明細書中に提供される。
６．１．５．ＣＲＩＳＰＲを用いた、ＯＲＦの同時の欠失および短いリンカー配列の組込み
【０１８２】
ドナーＤＮＡ（約１μｇ）および適切なｇＲＮＡ試薬を、最適化されたＬｉＡｃ法（Ｇｉｅｔｚ  ａｎｄ  Ｗｏｏｄｓ  ２００２）を用いるが、３０℃で細胞を３０分間インキュベートした後、４２℃での熱ショックを行うことを追加して、Ｃａｓ９を発現する各株に共形質転換した。細胞を非選択的ＹＰＤ（酵母エキスペプトンデキストロース）培地中で一晩回復させた後、ｇＲＮＡまたはマーカープラスミドを維持するために、選択的抗生物質含有培地（ノウルセオトリシン、１００μｇ／ｍｌ）にプレーティングした。５’組込み隣接部（flank）の上流および組み込まれたリンカー配列に結合するプライマー（表３）を使用するコロニーＰＣＲ（ｃＰＣＲ）が、標的化された組込み事象を示す結果である正しいアンプリコンを生成した場合、マーカーレス組込みを陽性とスコア付した。
【０１８３】
【表３−１】
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【表３−２】
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６．１．６．結果および考察
【０１８４】
ギャップ修復送達様式：４つのｇＲＮＡ送達様式を、短いリンカー配列の組込みによるＲＨＲ２、ＨＯおよびＡＨＤ５オープンリーディングフレームの同時欠失の効率について評価した。三重の組込みを評価するためのコロニーＰＣＲの結果を図８に示し、割合を表４に要約する。
【０１８５】
【表４】
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【０１８６】
第１のｇＲＮＡ送達様式において、３つのｇＲＮＡ（それぞれＲＨＲ２、ＨＯおよびＡＤＨ５を標的化する）の各々を、ユニークなマーカーを有するプラスミドに供給し（ＮａｔＡ、ＵＲＡ３カセットおよびＨＩＳ３カセット；図７．１を参照のこと）、細胞を３つすべてのプラスミドで形質転換し、各マーカーの発現について三重に選択した。非常に高い効率（９１％）の三重の欠失（組込みを介して）が観察された（図８、パネル１）。これらの高頻度は、おそらく、それらのカセットを有するプラスミドに対する三重の選択による３つすべてのｇＲＮＡの持続的な発現に起因する。対照的に、ｇＲＮＡを、同じマーカー（ＮａｔＡ；図７．２を参照のこと）を有する３つのプラスミドに供給した第２の様式は、いかなる三重の欠失も生成しなかった（図８、パネル２）。代わりに、３つのプラスミドのうち１つだけを維持する選択要件と一致する単一欠失が優勢だった。第３の様式では、形質転換された細胞を選択するために含められたＮａｔＡ標識された（NatA  marked）プラスミドとともに、ｇＲＮＡを直鎖状のカセットとして供給した（図７．３を参照のこと）。三重の欠失は、観察されず、いずれの欠失事象も非常に低い割合で観察された（図８、パネル３）。この送達様式は、ｇＲＮＡ構築物の一過性の発現をもたらすと予想され、これは、持続的な発現よりも劣るとみられる。調べた第４の送達様式は、ＮａｔＡマーカーを有する線状化したベクターへの、３つのｇＲＮＡカセットのギャップ修復を必要とする（図７．４を参照のこと）。本発明者らは、コロニーの６４％が三重に欠失していたことを観察した（図８、パネル４）。この送達様式は、第１の様式のように３つすべてのｇＲＮＡの持続的な発現を強制しないので、これは、驚くべき結果である。実際に、第２の様式の結果は、３つの類似の標識されたｇＲＮＡプラスミドの共形質転換が、効果的でないことを明らかに示し、第３の様式の結果は、直鎖状のカセットからのｇＲＮＡの一過性の発現もまた機能的でないことを示す。したがって、ｇＲＮＡカセットの送達様式として、ギャップ修復に関連するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ−９媒介性ゲノム組込み事象に予想外の有益な利点が存在する。
６．２  実施例２：ギャップ修復を介したＨＲ適格性細胞の選択
【０１８７】
この実施例は、ヌクレアーゼ媒介性組込み事象の効率を改善するために、ｇＲＮＡ発現を選択する利点とは無関係のギャップ修復の利点を実証する。
【０１８８】
ギャップ修復が、ＣＲＩＳＰＲ（または任意の部位特異的ヌクレアーゼ）によって操作されたクローンの回収を改善し得る１つの機構は、相同組換え（ＨＲ）能がある細胞についてのさらなる選択を強制することによるものである。相同組換え能は、非同調細胞集団において大きく異なり得（例えば、Ｂｒａｎｚｅｉ  ａｎｄ  Ｆｏｉａｎｉ，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ  ９（４）：２９７−３０８（２００８）を参照のこと）、選択マーカーを有するプラスミドのギャップ修復を達成し得る細胞の選択によって、特に相同組換え能がある集団が選択され得る。これは、実施例１において論じられた第４のｇＲＮＡ送達様式の驚くべき成功を説明し得る（図７．４および８．４）。上記ｇＲＮＡのうちの少なくとも１つの持続的な発現の効果から、選択機構としてのギャップ修復の効果を切り離すために、本発明者らは、適切なドナーＤＮＡおよび直鎖状のｇＲＮＡカセット（上記の実施例１に記載されたもの）および２つのマーカーベクターのうちの１つの共形質転換による、ＲＨＲ２、ＨＯおよびＡＤＨ５遺伝子座のそれぞれの単一欠失の割合を評価した。第１のマーカーベクターは、閉環状であり、すなわち、形質転換された細胞におけるＮａｔＡマーカーの発現にギャップ修復は必要ない（図９Ａ）。第２のマーカーは、ＮａｔＡマーカーの中央部が失われるように線状化されていたが、重複するフラグメントのギャップ修復によって補完されることにより、完全なＮａｔＡ発現カセットを有する機能的な閉環状マーカーベクターをもたらすことができた（図９Ｂ）。両方の場合において、ｇＲＮＡの発現は、単に一過性である。３つの独立した実験にわたって、マーカープラスミドがギャップ修復を要求したとき、本発明者らは、単一遺伝子座欠失（組込み）の割合が最大８倍（平均約３〜５倍の範囲）改善したことに注目した（図９、割合は図１０〜１２に纏めた）。
【０１８９】
これらの結果は、ギャップ修復が、相同組換え能がある細胞のさらなる選択として機能することができ、ゆえに、ヌクレアーゼによって支援される操作、特に、標的化されたドナーＤＮＡの組込みを最も成功させることができるという仮説を支持する。本発明者らは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅが、特にＨＲの能力が高いことに注目し、ＮＨＥＪおよび他の不完全な修復方法を好む細胞（例えば、哺乳動物細胞）において、本発明者らは、ギャップ修復が、１つまたはそれを超える標的化された組込みを有する細胞の回収率の上昇に特に有効であり得ることを提唱する。
６．３  実施例３：マルチピースギャップ修復を介したＨＲ適格性細胞の選択の向上
【０１９０】
この実施例は、ベクターをさらに断片化することによってマーカーベクターのギャップ修復の複雑さを高めることによって、ヌクレアーゼによって支援される操作の効率をさらに高めることができることを実証する。
【０１９１】
Ｃａｓ９を発現している一倍体酵母細胞（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を、実施例１に記載されたように、Ｇａｌ８０、ＨＯおよびＡＤＨ５オープンリーディングフレームを同時にマーカーレス欠失させるためのドナーＤＮＡ、各遺伝子座を標的化するｇＲＮＡ構築物、ならびに線状化したベクター骨格で形質転換したが、この形質転換に、ベクター骨格を２つのピースに断片化し、その各ピースが互い（４７ｂｐ）ならびにｇＲＮＡカセット（約５００ｂｐ）と重複した相同領域を含むという形質転換を付け加えた。これにより、ｇＲＮＡカセットを組み込む環状ＮａｔＡマーカープラスミドのギャップ修復を介した３ピースインビボアセンブリが可能になった。ＮａｔＡマーカーＯＲＦは、２つの骨格フラグメントのうちの一方に含まれたのに対して、ＮａｔＡ発現を駆動するプロモーター（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ  Ｔｅｆ１プロモーター）は、もう一方に含まれ、ゆえに、ＮａｔＡ発現は、それらのフラグメントのＨＲ媒介性アセンブリのときにのみ可能になる。Ｇａｌ８０、ＨＯおよびＡＤＨ５遺伝子座の各々をそれぞれ標的化するドナーＤＮＡの配列；各遺伝子座を標的化するｇＲＮＡ構築物；ならびに２ピースおよび３ピースインビボアセンブリのいずれかのためのマーカープラスミドフラグメントは、配列番号２１〜２９として本明細書中に提供される。
【０１９２】
Ｇａｌ８０、ＨＯおよびＡＤＨ５遺伝子座に対する標的部位をそれぞれ表５に示す。
【０１９３】
【表５】
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【０１９４】
細胞を、実施例１に記載されたように形質転換して培養し、選択の際に出現したコロニーを、欠失構築物の外側に結合する上流順方向プライマーおよび各オープンリーディングフレームの代わりに組み込まれた短いリンカー配列に結合する逆方向プライマーを使用するｃＰＣＲによって各遺伝子座における欠失構築物の組込みについてアッセイした。１１個のコロニーならびにネガティブコントロールとして働く親コロニー（「Ｎ」）を各送達様式についてアッセイした。
【０１９５】
【表６】
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【０１９６】
図１３に示されているように、３つすべての遺伝子座における同時の三重の組込みの割合は、マーカーベクターをアセンブリするために３つのＨＲ事象が必要とされたとき、２つのＨＲ事象だけが必要とされるときと比べて、実質的に高かった。特に、マーカーベクターの２ピースインビボアセンブリでは、６個／１１個のコロニーが、Ｇａｌ８０遺伝子座に組込みを有し、１０個／１１個が、ＨＯ遺伝子座に組込みを有し、７個／１１個のコロニーが、ＡＤＨ５遺伝子座に組込みを有し、５個／１１個のコロニー（４５．４％）が、３つすべての遺伝子座に組込みを有した。それに比べて、マーカーベクターの３ピースインビボアセンブリでは、９個／１１個のコロニーが、Ｇａｌ８０遺伝子座に組込みを有し、１０個／１１個が、ＨＯ遺伝子座に組込みを有し、１０個／１１個のコロニーが、ＡＤＨ５遺伝子座に組込みを有し、９個／１１個のコロニー（８１．８％）が、３つすべての遺伝子座に組込みを有した。したがって、２ピースギャップ修復の代わりに、マーカーベクターの３ピースギャップ修復を必要とすることは、三重の組込みの割合をほぼ２倍改善した。
【０１９７】
多重組込みの割合のこの改善が、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの二倍体株でも見出され得るかを決定するために、二倍体酵母株ＣＡＴ−１のＣａｓ９を発現している細胞を、同様に、Ｇａｌ８０、ＨＯおよびＡＤＨ５オープンリーディングフレームの同時の全対立遺伝子のマーカーレス欠失のためのドナーＤＮＡ、各遺伝子座を標的化するｇＲＮＡ構築物、ならびに２つまたは３つの重複したピースに断片化された選択的ＤＮＡで形質転換した。コロニーを、欠失構築物の外側の上流順方向プライマーおよび各オープンリーディングフレームの代わりに組み込まれた短いリンカー配列に結合する逆方向プライマー（表６）を使用するｃＰＣＲによってアッセイした。
【０１９８】
図１４に示されているように、二倍体株の３つすべての遺伝子座における同時の三重の組込みの割合もまた、マーカーベクターをアセンブルするために３つのＨＲ事象が必要とされたとき、実質的により高かった。特に、マーカーベクターの２ピースインビボアセンブリでは、３個／２４個のコロニーが、Ｇａｌ８０遺伝子座に組込みを有し、７個／２４個が、ＨＯ遺伝子座に組込みを有し、２個／２４個のコロニーが、ＡＤＨ５遺伝子座に組込みを有し、１個／２４個のコロニー（４．２％）が、３つすべての遺伝子座に組込みを有した。それに比べて、マーカーベクターの３ピースインビボアセンブリでは、３個／８個のコロニーが、Ｇａｌ８０遺伝子座に組込みを有し、５個／８個が、ＨＯ遺伝子座に組込みを有し、３個／８個のコロニーが、ＡＤＨ５遺伝子座に組込みを有し、３個／８個のコロニー（３７．５％）が、３つすべての遺伝子座に組込みを有した。したがって、２ピースギャップ修復の代わりに、マーカーベクターの３ピースギャップ修復を必要とすることは、二倍体株において、三重の組込みの割合をほぼ１０倍改善した。この実験から回収されたコロニーの数もまた、３つの事象が必要とされたとき、およそ１０倍少なかった（データ示さず）ことから、マーカーベクターのより高次のアセンブリが必要とされることにより、その集団の最もＨＲ適格性の細胞だけが選択されることが示唆された。
６．４  実施例４：ギャップ修復と組み合わせてＣＲＩＳＰＲを用いた単一および多重の点変異の導入
【０１９９】
この実施例は、正確な点変異または点変異に対する訂正を導入するための、実施例１に記載されたような最適化されたプロトコル（様式４：マーカーベクター骨格へのｇＲＮＡカセット(複数可)のインビボＨＲ媒介性取り込み）の適用を実証する。
【０２００】
現在、単一遺伝子座における点変異の導入は、冗長なプロセスである。Ｄｅｌｉｔｔｏ  Ｐｅｒｆｅｔｔｏ法は、点変異のマーカーレス導入を可能にするが、標的化された部位に近接して誘導性メガヌクレアーゼを含む標識されたカセットの組込みを必要とする（Ｓｔｏｒｉｃｉら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １００（２５）：１４９９４−９（２００３））。あるいは、ＵＲＡ３マーカーを有する複雑な組込みカセットがデザインされ、標的部位に組み込まれ得、その後の５−ＦＯＡ対抗選択によるＵＲＡ３のループアウトにより、点変異を含んだ遺伝子座が再構成される。これらの方法の両方が、必須の遺伝子にとって問題があり、少なくとも２回の遺伝子操作を必要とし、多重化に適していない。
【０２０１】
ＣＲＩＳＰＲによって点変異（すなわち、ミスセンスＳＮＰ）を導入するためには、考慮すべき事柄がいくつかある。第１に、切断に対して標的化される部位は、ゲノムの中でユニークであることに加えて、所望のＳＮＰの部位に可能な限り近くであるべきである（図１５）。これは、切断部位を修復する組換えが、所望のＳＮＰの取り込みを必要とせず、切断部位からの距離につれてそれを含む可能性が低くなると予想されるからである。第２に、最適な効率のために、ドナーＤＮＡは、それがＣＲＩＳＰＲの標的にならないようにデザインされるべきである。実際に、この問題は、ＤｉＣａｒｌｏらによって引用されており、それにより、ＤｉＣａｒｌｏらの実験において観察されたＣＲＩＳＰＲによる低い割合のＳＮＰ組込みが説明された（ＤｉＣａｒｌｏら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，７，４３３６−４３４３（２０１３）））。切断を免れるためには、所望のＳＮＰは、ドナーＤＮＡの中のＣＲＩＳＰＲ標的部位を破壊する必要があるが、これは、ほとんどの遺伝子座において満たすことが不可能な要件である。ドナーＤＮＡに切断を免れさせるため、および同時に、組換え事象が所望のＳＮＰを含むチャンスを改善するために、異種ブロックアプローチが採用され、ここで、標的部位と点変異との間のコドンにサイレント変異が作製され、所望のＳＮＰを取り除く組換え事象の潜在性を減少させた（図１５）。さらに、その異種ブロックの組込みは、ＰＣＲによって候補クローンを同定するための新規のプライマー結合部位を提供する。
【０２０２】
原理証明として、変異誘発を起こした酵母細胞（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の変異対立遺伝子を、上に記載されたアプローチを用いて、対応する野生型対立遺伝子での置き換えについて標的化した。その変異誘発した株は、実施例１に記載されたような中強度のＦＢＡ１プロモーターの調節下においてＣａｓ９を構成的に発現するようにさせられていた。次いで、そのＣａｓ９ｐを発現する株を、ＴＲＳ３１、ＣＵＥ５、ＥＣＭ３８、ＰＧＤ１、ＳＭＣ６、ＮＴＯ１およびＤＧＡ１オープンリーディングフレームの各々を標的化するドナーＤＮＡ（単一の組込み事象に対して１つずつ）ならびに各遺伝子座を標的化するｇＲＮＡ構築物（その各々が直鎖状のＮａｔＡマーカープラスミド骨格と相同な重複を含む）で形質転換したところ、ギャップ修復を介した環状プラスミドのインビボアセンブリが可能だった。実施例１に記載されたように、細胞を形質転換して培養し、次いで、７つの遺伝子座の各々において点変異（復帰変異対立遺伝子（reversion  allele））の導入について評価した。候補コロニーおよび親ネガティブコントロール（ｃ）を、異種ブロックおよびフランキング配列に対するコロニーＰＣＲによってアッセイし、選択された陽性コロニーを、組込み遺伝子座にまたがるより大きなＰＣＲ産物を配列決定することによって確認した。
【０２０３】
【表７−１】
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【表７−２】
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【０２０４】
ＴＲＳ３１、ＣＵＥ５、ＥＣＭ３８、ＰＧＤ１、ＳＭＣ６、ＮＴＯ１、ＤＧＡ１、ＡＤＨ２、ＳＩＮ４およびＣＹＳ４遺伝子座の各々をそれぞれ標的化するドナーＤＮＡの配列；各遺伝子座の標的配列、ならびに各遺伝子座を標的化するｇＲＮＡ構築物は、配列番号６７〜９６として本明細書中に提供される。
【０２０５】
図１６に示されているように、高い割合の異種ブロック組込みが、各遺伝子座において観察され（３６．４％〜９０．９％の範囲）、所望の変異にまたがるＰＣＲフラグメントのその後の配列決定から、クローンの大部分が所望の対立遺伝子を含んだことが明らかになった。
【０２０６】
点変異の多重導入の実行可能性を決定するために、３つの遺伝子座（ＥＣＭ３８、ＰＧＤ１およびＡＤＨ２）を、複数のｇＲＮＡに対して最適化された送達様式を用いて異種ブロック組込み（対立遺伝子交換）のために同時に標的化した。図１７に示されているように、高い割合の三重の異種ブロック組込みが、ＰＣＲアッセイによって観察された（９０．９〜１００％）。より高次の多重組込みが実行可能であるかを決定するために、５つの遺伝子座（ＡＤＨ２、ＰＧＤ１、ＥＣＭ３８、ＳＩＮ４およびＣＹＳ４）を類似の形式で同時に標的化した。図１８に示されているように、同時の五重の異種ブロック組込みが、ｃＰＣＲアッセイによって、２個／１１個のコロニー（１８．２％）において確認された。
【０２０７】
第２の原理証明として、１１個の異なる変異対立遺伝子をナイーブＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株に導入し、得られた株を、これらのＳＮＰによって与えられる表現型について試験した。調べた対立遺伝子は、より速い沈降をもたらす、工業発酵に関連する１つの対立遺伝子（ＡＣＥ２  Ｓ３７２＊）（Ｏｕｄ，Ｇｕａｄａｌｕｐｅ−Ｍｅｄｉｎａら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １１０（４５）：Ｅ４２２３−４２３１，２０１３）、細胞分裂および分泌経路に必須の遺伝子における一連の温度感受性対立遺伝子（ＳＥＣ１  Ｇ４４３Ｅ、ＳＥＣ６  Ｌ６３３Ｐ、ＭＹＯ２  Ｅ５１１Ｋ、ＣＤＣ２８  Ｒ２８３Ｑ）（Ｌｏｒｉｎｃｚ  ａｎｄ  Ｒｅｅｄ，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ６（１１）：４０９９−４１０３，１９８６；Ｒｏｕｍａｎｉｅ，Ｗｕら、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １７０（４）：５８３−５９４，２００５）ならびに高温成長の改善に関する別の対（ＮＣＳ２  Ｈ７１ＬおよびＥＮＤ３  Ｓ２５８Ｎ）（Ｓｉｎｈａ，Ｄａｖｉｄら、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １８０（３）：１６６１−１６７０，２００８；Ｙａｎｇ，Ｆｏｕｌｑｕｉｅ−Ｍｏｒｅｎｏら、ＰＬｏＳ  Ｇｅｎｅｔ  ９（８）：ｅ１００３６９３，２０１３）であった。さらに、高エタノール濃度に対する耐性に関連する一連の５つの対立遺伝子を試験した（ＳＰＴ１５  Ｆ１７７Ｓ、ＳＰＴ１５  Ｙ１９５Ｈ、ＳＰＴ１５  Ｋ２１８Ｒ、ＰＲＯ１  Ｄ１５４ＮおよびＰＵＴ１欠失）（Ｔａｋａｇｉ，Ｔａｋａｏｋａら、Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ７１（１２）：８６５６−８６６２，２００５；Ａｌｐｅｒ，Ｍｏｘｌｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１４（５８０５）：１５６５−１５６８，２００６）。
【０２０８】
ほとんどの個別の対立遺伝子の導入に対しては、高い割合の異種ブロック組込み（＞９０％）が観察され（図２２）、所望の変異にまたがるＰＣＲフラグメントのその後の配列決定から、これらの変化が確認された。温度感受性変異体を許容温度および制限温度においてアッセイすることにより、それらの意図された表現型を確認した。ＡＣＥ２のトランケーションによって引き起こされた分裂中の細胞の不完全な分離は、明視野顕微鏡法によって著しい細胞集塊であることが確認された（図２３Ａ）。ＣＤＣ２８、ＭＹＯ２およびＳＥＣ１の温度感受性対立遺伝子は、予想どおりに３７℃で成長させず（図２３Ｂ）、ＣＤＣ２８対立遺伝子株は、成長のＧ１期で停止した（図２３Ｃ）。ＳＥＣ１およびＳＥＣ６変異体において制限温度での分泌欠陥を実証するために、エクソシスト複合体の構成要素ＳＥＣ３を、その内在性遺伝子座においてカルボキシ末端でＧＦＰタグ化することにより（これもＣＲＩＳＰＲを使用して）、分泌活性のレポーターとして機能させた。ＳＥＣ３は、正常には野生型細胞の芽に局在するが、その局在化は、両方の分泌変異体において明らかに乱される（図２３Ｄ）。
【０２０９】
多くの場合、表現型は、複数の対立遺伝子の相乗作用から生じるが、上記のような株の操作は、なおもより時間のかかるものであり、しばしば試みられていない。最適化された多重方法をこの問題に適用した。ナイーブＣＥＮＰＫ２は、高温成長のための１つの対立遺伝子（ＭＫＴ１  Ｄ３０Ｇ）を有し（Ｙａｎｇ，Ｆｏｕｌｑｕｉｅ−Ｍｏｒｅｎｏら、２０１３）、２つのさらなる変異が、ＮＣＳ２およびＥＮＤ３に導入された。一連の温度において一晩成長したとき、個々の対立遺伝子はいずれも影響を及ぼさなかった。しかしながら、一工程で組み込まれた両方のさらなる対立遺伝子を含む株は、４２．７℃までの温度を生き残った（図２３Ｅ）。
【０２１０】
エタノール耐性対立遺伝子もまた、相乗効果を与えた。野生型ＣＥＮＰＫ２は、この実験において最大１７．５％のエタノールに抵抗性であった（図２３Ｆ）。ＳＰＴ１５における変異は、耐性を２０％のエタノールにまで高めた（図２３Ｆ）。これらの対立遺伝子の相互作用を調べるために、３つの遺伝子座に対する５つの標的化された変化をナイーブ株に同時に導入した（ＳＰＴ１５における３つの変異、ＰＲＯ１  Ｄ１５４ＮおよびＰＵＴ１の欠失）。ＳＰＴ１５における３つの変異を、２つのｇＲＮＡを使用して、その３つの対立遺伝子を含む遺伝子の約１５０ｂｐを切り取ることによって、単一のドナーＤＮＡに導入した。コロニーＰＣＲによって評価し、配列決定によって確認したとき、得られたクローンの２７％が５つすべての改変を含んだ（図２２）。得られた株は、２２．５％エタノールまでの、最も高いエタノール抵抗性を有した（図２３Ｆ）。これらの結果が実証するように、多重化されたＣＲＩＳＰＲは、原因となる対立遺伝子の組み合わせに関する仮説の迅速な評価を可能にする。
【０２１１】
これらの結果は、本明細書中に提供されるＣＲＩＳＰＲ媒介性ゲノム組込みのために最適化された方法および組成物を用いて、正確な点変異または復帰変異が高効率かつ高多重度で達成され得ることを実証する。
６．５  実施例５：二倍体細胞の二対立遺伝子操作
【０２１２】
この実施例は、二倍体酵母株において同時に二対立遺伝子を組み込むための、実施例１に記載されたような最適化されたプロトコル（様式４：マーカーベクター骨格へのｇＲＮＡカセット(複数可)のインビボＨＲ媒介性取り込み）の適用を実証する。
【０２１３】
二倍体の工業用ＳＣ株は、高度にヘテロ接合性であり、多くがマッピングされていないが、発酵にとって有益な形質を有する。しかしながら、これらの株は、標準的な方法では操作しにくく、遺伝子を欠失させるためまたは二対立遺伝子操作を導入するために、２つの逐次的組込み工程および異なるマーカーを必要とする。したがって、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＣＡＴ−１およびＰＥ−２二倍体工業用株におけるＧＡＬ８０遺伝子座のＣＲＩＳＰＲ媒介性の二対立遺伝子欠失の有効性を、実施例１の最適化されたプロトコルを用いて試験した。Ｇａｌ８０遺伝子座を標的化するドナー配列およびｇＲＮＡ配列は、実施例３に記載されている。
【０２１４】
図１９に示されているように、ドナーＤＮＡ、およびＧａｌ８０遺伝子座を標的化し、共形質転換される直鎖状のＮａｔＡマーカーベクター骨格に対して相同な末端を有する直鎖状のｇＲＮＡカセットで形質転換されたＣａｓ９を発現する株のｃＰＣＲから、ＣＡＴ−１二倍体細胞において１００％（図１９Ｂ）およびＰＥ−２二倍体細胞において９０％（図１９Ｃ）という二対立遺伝子ドナー組込みの割合が明らかになった。これらの割合は、一倍体ＣＥＮＰＫ２株における同じ欠失が得られた割合に匹敵する（１００％；図１９Ａ）。これらの結果は、二倍体宿主細胞を操作する場合の、本明細書中に提供されるＣＲＩＳＰＲ媒介性ゲノム組込みに対する最適化された方法および組成物の有効性を実証する。
６．６  実施例６：完全な生合成経路の多重組込み
【０２１５】
この実施例は、ナイーブ酵母株の生合成経路全体に同時に組み込むための、実施例１に記載されたような最適化されたプロトコルの適用（様式４：マーカーベクター骨格へのｇＲＮＡカセット(複数可)のインビボでのＨＲ媒介性取り込み）を実証する。
【０２１６】
通常、代謝経路の操作は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなどの扱いやすい宿主でさえも、時間のかかるものである。遺伝子のカセットの組込みが、薬物選択マーカーのいかなる組込みも必要とせずに、並行して実施できた場合、このタイムテーブルは、大きく改善される。ゆえに、ＣＲＩＳＰＲ媒介性組込みに対する最適化されたプロトコルを、合計およそ３０ｋｂのＤＮＡであり、ファルネセンを生成するための機能的な経路をコードする（米国特許第８，４１５，１３６号を参照のこと）１２個の遺伝子カセットのＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅへの同時組込みに適用した。遺伝子カセットは、米国特許第８，２２１，９８２号および同第８，３３２，１６０号に記載されているポリヌクレオチドアセンブリの方法を用いて、デザインし、クローニングした。その経路を、１２個の遺伝子：アセチル−ＣｏＡチオラーゼをコードするＥＲＧ１０；ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼをコードするＥＲＧ１３；ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼをコードするｔＨＭＧ１（２コピー）；メバロン酸キナーゼをコードするＥＲＧ１２；ホスホメバロン酸キナーゼをコードするＥＲＧ８；メバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼをコードするＥＲＧ１９；イソペンテニルピロリン酸イソメラーゼをコードするＩＤＩ１；Ａｒｔｅｍｉｓｉａ  ａｎｎｕａ由来のファルネセンシンターゼ（２コピー）；ファルネシルピロリン酸シンテターゼをコードするＥＲＧ２０；および転写制御因子ＧＡＬ４の組込みのために３つのドナー構築物に分けた。それらの３つの構築物を、ナイーブＣＥＮＰＫ２  Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるＧａｌ８０、ＨＯおよびＢＵＤ９遺伝子座への組込みのために標的化し、ここで、中強度のＦＢＡ１プロモーター（配列番号３）の調節下のＣａｓ９をＧＲＥ３遺伝子座に標的化した。３つすべての構築物の同時のマーカーレス組込みを、実施例１に記載された最適化されたギャップ修復方法を用いて試み、組込み標的遺伝子座の５’隣接部および各ドナー構築物内の内部のリンカー配列に結合するｃＰＣＲプライマー対によって、クローンをアッセイした。
【０２１７】
図２０に示されているように、スクリーニングした４７個のクローンのうち、１１個のクローン（２３．４％）が、ファルネセン経路全体を構成する３０ｋｂの組込みについて陽性だった（クローン２２、２４、２９〜３２、４１〜４３、４５および４６）。４８番目のクローンは、親ネガティブコントロールである。続いて、すべての三重陽性候補を、各標的遺伝子座の３’隣接部におけるｃＰＣＲによって同様にアッセイし、両方の隣接部において組込みが陽性だったことを確認した。続いて、その１１個のｃＰＣＲ陽性クローンを、バッチスクロースプレートモデルアッセイにおいてファルネセン生成について試験した。図２１に示されているように、１１個すべてのクローンが、０．１〜およそ１．５ｇ／Ｌの量の範囲の量でファルネセンを生成した。まとめると、これらの結果は、本明細書中に提供されるＣＲＩＳＰＲ媒介性ゲノム組込みに対して最適化された方法および組成物の、迅速かつ多重の代謝操作に対する有効性を実証する。多重操作のために最適化されたプロトコルを適用することにより、複雑な経路を操作するためのタイムラインを大幅に短縮することができる。例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株において３つの点変異を同時に導入するには、およそ６週間の作業（各対立遺伝子を導入するために１週間、各マーカーを再利用するために１週間、合計３サイクル）が必要であるのに対して、本明細書中に提供される最適化された方法を用いたときは１週間で済む。節約される時間の量は、並行して標的化される遺伝子座の数に合わせて調整する（scale）ので、ここで実証された基本的なファルネセン経路を導入するためのタイムラインは、同様に６倍圧縮される。
【０２１８】
さらなる概念証明として、ムコン酸への新規経路をコードする３つの遺伝子座にわたって分布している２４ｋｂのＤＮＡを含む１１個の遺伝子カセットの多重組込みを、一倍体ＣＥＮＰＫ２において試みた（図２４）。ムコン酸は、ナイロン−６，６、ポリウレタンおよびポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）をはじめとしたバイオプラスチックの生成について大きな潜在性を有する前駆体分子である。現在、ムコン酸は、石油由来の供給材料から有機合成を介して得られているが、再生可能供給源が望ましい。ムコン酸の生合成は、芳香族アミノ酸（シキミ酸）生合成経路の過剰発現によって達成される。以前には、ムコン酸の高レベル生成（３６．８ｇ／Ｌ、フェドバッチ発酵）が、大腸菌において達成された（Ｎｉｕ，Ｄｒａｔｈｓら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｐｒｏｇ  １８（２）：２０１−２１１，２００２）。しかしながら、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを用いたより低いｐＨでの発酵が、そのプロセスの下流の処理および工業化を促進する。原理証明の取り組みにおいて、最大１４１ｍｇ／Ｌの力価が、操作されたＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株での振盪フラスコ実験において観察された（Ｃｕｒｒａｎ，Ｌｅａｖｉｔｔら、Ｍｅｔａｂ  Ｅｎｇ  １５：５５−６６，２０１３）。このＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける最初の試みとは対照的に、本実験では、天然のＡＲＯ１遺伝子ではなく、大腸菌のシキミ酸経路遺伝子ＡＲＯＦ、ＡＲＯＢおよびＡＲＯＤを使用した。操作された経路を図２４Ａに示す。
【０２１９】
組込みのために、その経路を、ＣＥＮＰＫにおいてＧＡＬ８０、ＨＯおよびＡＲＯ１遺伝子座を標的化する３つに分離した構築物（インビボでの相同組換えによる再構成のために内部重複を有する）に分けた（図２４Ｂ）。ＨＯを中立の遺伝子座として選択し、ＧＡＬ８０を、ガラクトースオペロンのグルコース抑制を無くすために選択し、操作された経路を通る流れを強制するためにＡＲＯ１遺伝子座を欠失させた。ＡＲＯ１の欠失は、それらの株を、芳香族アミノ酸に対する栄養素要求性にもして、バイオマス生産段階（富栄養培地中）と生産段階（最少培地中）との間で単純な切替え機構をもたらす。最適化されたギャップ修復方法を用いて、３つすべての構築物の同時のマーカーレス組込みを試み、ＰＣＲによってクローンをアッセイしたところ、４．２％という割合の三重の組込みが明らかになった（ｎ＝４８）。これらの３つの構築物の組込みが９つの組換え事象（遺伝子座あたり２つのフランキングおよび１つの内部事象）を必要とすることは、注目に値する。観察された割合は、多重欠失について見られた割合よりも低いが、完全な生合成経路の導入によって、適応度に欠陥がもたらされると予想され、これは、正しく組み込まれた株の回収率を制限し得る。
【０２２０】
ムコン酸および中間体の生成を、９６ウェル振盪プレートアッセイにおいて試験し、ＨＰＬＣによって解析した。１工程で組み込まれた株は、高力価のＰＣＡ（約３ｇ／Ｌ）を示したことから、ＰＣＡをカテコールに変換するＡｒｏＹにおけるボトルネックが示された（図２４Ａ）。下流経路の機能性を確かめるために、最大１ｇ／Ｌのカテコールを、生成培地のウェルに直接供給したところ、カテコールからｃｉｓ−ｔｒａｎｓムコン酸への定量的変換が、操作された株では観察されたが、親株では観察されなかったことから、経路デザインにおける単一の欠陥がＡｒｏＹにあることが明確に特定された。
【０２２１】
最適化されたギャップ修復方法方法の有効性を第２の工業的に妥当な酵母において試験するために、６つの遺伝子を含むよりコンパクトなバージョンのムコン酸経路をＫ．ｌａｃｔｉｓにおいて組み込む試みを行った。その経路を、ＤＩＴ１、ＡＤＨ１およびＮＤＴ８０遺伝子座を標的化する３つの組込み構築物に分けた。Ｃａｓ９をＧＡＬ８０遺伝子座にインテグレートし、ＹＫＵ８０を欠失させて非相同末端結合の作用を最小限にすることによって、ナイーブＫ．ｌａｃｔｉｓ株（ＡＴＣＣ８５８５）を調製した（Ｋｏｏｉｓｔｒａ，Ｈｏｏｙｋａａｓら、Ｙｅａｓｔ  ２１（９）：７８１−７９２，２００４；Ｗｅｓｏｌｏｗｓｋｉ−Ｌｏｕｖｅｌ，ＦＥＭＳ  Ｙｅａｓｔ  Ｒｅｓ  １１（６）：５０９−５１３，２０１１）。３つすべての構築物のマーカーレス組込みを、同じギャップ修復方法を用いるが、ｐＫＤ１安定性エレメントを含むプラスミド骨格を用いる、１工程で達成した（Ｃｈｅｎ，Ｗｅｓｏｌｏｗｓｋｉ−Ｌｏｕｖｅｌら、Ｊ  Ｂａｓｉｃ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ２８（４）：２１１−２２０，１９８８）。ＰＣＲによってアッセイしたとき、三重の組込みは、２．１％の割合で生じた（ｎ＝４８）。ＣＥＮＰＫの結果と同様に、高力価のＰＣＡ（１ｇ／Ｌ）が観察されたが、ムコン酸の生成は観察されなかった（図２４Ｅ）。カテコール供給実験によって、ＡＲＯＹの機能における同じ欠陥が確認された。ＡＲＯ１は、このＫ．ｌａｃｔｉｓ株において欠失されておらず、この矛盾が、観察されたより低力価のＰＣＡを説明し得ることは、注目に値する。それにもかかわらず、これらの結果は、１ヶ月未満で、２つの工業的に妥当な酵母株においてムコン酸生成をプロトタイプとし（ｐｒｏｔｏｔｙｐｅ）、制限している酵素を同定する能力を実証するものであり、これは、迅速なデザイン反復を促進し、２つの有望な宿主のサンプリングを可能にしたワークフローである。
６．７  実施例７：哺乳動物細胞における組込みの改善
【０２２２】
この実施例は、哺乳動物宿主細胞において組込みの割合の改善を達成するための、実施例１に記載されたような最適化されたプロトコル（様式４：マーカーベクター骨格へのｇＲＮＡカセット(複数可)のインビボＨＲ媒介性取り込み）の適用を実証する。
【０２２３】
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに対して上に記載されたｇＲＮＡに対するギャップ修復送達方法が、哺乳動物細胞においても組込みの割合を改善し得るかどうかを試験するために、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞におけるトランスフェクション実験のために一連の試薬を作製した。概要としては、ＣＤ４エピトープタグの５’部分に２Ａ−リンカーを介して融合されたＣａｓ９発現カセットを含む線状化したプラスミド骨格、ＡＡＶＳ１遺伝子座を標的化するｇＲＮＡカセットを含むフラグメント、ならびに後の診断を目的とする（ギャップ修復状態）ＥｃｏＲＩ部位を挟む上流および下流のホモロジーを含む、相同組換えによってその遺伝子座を修復するためのドナーＤＮＡフラグメントで細胞を共トランスフェクトした。このトランスフェクションを、閉環状プラスミドに含められたＣａｓ９−２Ａ−ＣＤ４発現カセットおよびｇＲＮＡカセットを用いたコントロール反応（ポジティブコントロール）と比較した。さらに、ｇＲＮＡを含まないプラスミドをネガティブコントロールとして使用することにより、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９の非存在下において、ドナーＤＮＡの相同組込みが測定可能な割合で生じたかどうかを評価した。トランスフェクションの後、ＣＤ４＋細胞（トランスフェクトされた細胞）を、抗体が結合した磁気ビーズを用いて単離し、細胞を溶出し、ゲノムＤＮＡ調製物において使用した。組込み部位を包含する領域のＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩで消化することにより、標的部位にドナーＤＮＡをインテグレートしていた細胞の画分を決定した。
【０２２４】
材料および方法
【０２２５】
Ｃａｓ９ヌクレアーゼおよび関連するｇＲＮＡの発現。ＬｉｆｅＴｅｃｈ／ＧｅｎｅＡｒｔ  ＣＲＩＳＰＲ  Ｎｕｃｌｅａｓｅ  ｗｉｔｈ  ＣＤ４  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  ｋｉｔ（Ａ２１１７５）を使用した。製造業者の指示に従って、ＡＡＶＳ１領域の内側の配列（ＡＡＶＳ１、ＭａｌｉらからのＴ２ｇＲＮＡ）をコードする二本鎖オリゴヌクレオチド（オリゴＣＵＴ１２１６およびＣＵＴ１２１７をアニーリングすることによって調製される）を、提供された線状化したベクターにライゲートすることにより、ｐＡＭ３４７３（配列番号９８）を作製した。そのプラスミドをマキシプレップした（Ｑｉａｇｅｎ）。
【０２２６】
ギャップ修復の試験に適したバージョンのｐＡＭ３４７３の作製。ｐＡＭ３４７３プラスミドをＢｓｔ１１０７ＩおよびＮｈｅＩで消化することにより、ｇＲＮＡカセット全体ＣＤ４  ＯＲＦの一部を除去した。その骨格をＣＩＰ（アルカリホスファターゼ）処理し、ゲル精製した。ユニークなＣｌａＩおよびＸｍａＩ部位を含み、直鎖状のベクターに適合したオーバーハングを有するマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）二本鎖オリゴを、ＣＵＴ１２１４（配列番号１０３）オリゴおよびＣＵＴ１２１５（配列番号１０４）オリゴをアニーリングすることによって調製した。その二本鎖オリゴを精製された骨格にライゲートすることにより、ｐＡＭ３４７２（配列番号９７）を作製した。そのプラスミドをマキシプレップした（Ｑｉａｇｅｎ）。使用する前に、そのプラスミドをＣｌａＩおよびＮｈｅＩで消化することによって線状化し、エタノール沈殿によって精製／濃縮した。
【０２２７】
ＣＤ４エピトープだけを含む（およびｇＲＮＡを含まない）コントロールプラスミドの作製。ｐＡＭ３４７３（配列番号９８）をＢｓｔ１１０７ＩおよびＰａｃＩで消化し、その骨格をＣＩＰ処理し、ゲル精製した。ｇＲＮＡカセットを含まない骨格を再環状化するようにデザインされた二本鎖オリゴを、ＣＵＴ１２５４（配列番号１１３）オリゴおよびＣＵＴ１２５５（配列番号１１４）オリゴをアニーリングすることによって調製し、ベクター骨格にライゲートすることにより、ｐＡＭ１５０６８（配列番号１０２；以前は「Ａ２」として知られた）を作製した。
【０２２８】
線状化したｐＡＭ３４７２へのＡＡＶＳ１  ｇＲＮＡカセットのギャップ修復のためのフラグメントの調製。プライマーＣＵＴ１２２０（配列番号１０７）およびＣＵＴ１２２１（配列番号１０８）を使用して、ｐＡＭ３４７３からの２８５０ｂｐのフラグメントを増幅した。その生成物を、ギャップ修復（大腸菌）によってＲＹＳＥ０９アクセプターベクターにサブクローニングし、その構築物を、ｐＡＭ３５１５（配列番号１００）を作製するために、配列決定することによって検証した。トランスフェクションの前に、フランキングプライマーＲＹＳＥ０（配列番号１１７）およびＲＹＳＥ１９（配列番号１１８）を使用するＰｈｕｓｉｏｎ  ＰＣＲ増幅によって直鎖状のフラグメントを調製し、そのＰＣＲ産物を、Ａｍｐｕｒｅビーズ（Ａｘｙｇｅｎ）を用いて精製した。トランスフェクションの前に、フランキングプライマーＲＹＳＥ０およびＲＹＳＥ１９を使用するＰｈｕｓｉｏｎ  ＰＣＲ増幅によって直鎖状のフラグメントを調製し、そのＰＣＲ産物を、Ａｍｐｕｒｅビーズ（Ａｘｙｇｅｎ）を用いて精製した。
【０２２９】
線状化したｐＡＭ３４７２へのＣＤ４のみのコントロールフラグメントのギャップ修復のためのフラグメントの調製。プライマーＣＵＴ１２２０（配列番号１０７）およびＣＵＴ１２５２（配列番号１１１）をＰｈｕｓｉｏｎ  ＰＣＲ反応において使用し、ｐＡＭ３４７３を鋳型として使用して、ＣＤ４  ＯＲＦの３’末端を含む上流フラグメントを増幅し、プライマーＣＵＴ１２５３（配列番号１１２）およびＣＵＴ１２２１（配列番号１０８）を使用して、ｇＲＮＡカセットの下流のフランキングホモロジーを含む下流のフラグメントを増幅した。これらの２つのフラグメントをゲル精製し、第２の融合ＰＣＲ反応において使用し、プライマーＲＹＳＥ０およびＲＹＳＥ１９を約２ｋｂの生成物の増幅のために使用した。その生成物をギャップ修復（大腸菌）によってＲＹＳＥ０９アクセプターベクターにサブクローニングし、その構築物を、ｐＡＭ３５１６（配列番号１０１）を作製するために、配列決定することによって検証した。トランスフェクションの前に、フランキングプライマーＲＹＳＥ０およびＲＹＳＥ１９を使用するＰｈｕｓｉｏｎ  ＰＣＲ  ＰＣＲ増幅によってこの鋳型から直鎖状のフラグメントを調製し、そのＰＣＲ産物を、Ａｍｐｕｒｅビーズ（Ａｘｙｇｅｎ）を用いて精製した。
【０２３０】
ＡＡＶＳ１標的遺伝子座にＥｃｏＲＩ部位を導入するためのドナーＤＮＡの調製。プライマーＣＵＴ１２２６（配列番号１１９）およびＣＵＴ１２２３（配列番号１２０）を使用し、Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼを用いて、ヒトゲノムＤＮＡ（ＨＥＫ−２９３細胞由来）からのその３’末端に合成ＥｃｏＲＩ部位を含む約５７０ｂｐの上流フラグメントを増幅した。プライマーＣＵＴ１２２４（配列番号１０９）およびＣＵＴ１２２７（配列番号１１０）を使用して、同じヒトゲノム鋳型からのその５’末端にＥｃｏＲＩ部位を含む約５４０ｂｐの下流フラグメントを増幅した。それらのフラグメントを、フランキングプライマーＲＹＳＥ０およびＲＹＳＥ１９とともにＰｈｕｓｉｏｎポリメラーゼを使用する融合ＰＣＲによってアセンブルし、約１１００ｂｐのフラグメントを、ギャップ修復（大腸菌）によって、線状化したＲＹＳＥ０９ベクターにサブクローニングした。その構築物を、ｐＡＭ３５１４（配列番号９９）を作製するために、配列決定することによって検証した。トランスフェクションの前に、フランキングプライマーＲＹＳＥ０およびＲＹＳＥ１９を使用するＰｈｕｓｉｏｎ  ＰＣＲ増幅によってこの鋳型から直鎖状のフラグメントを調製し、そのＰＣＲ産物を、Ａｍｐｕｒｅビーズ（Ａｘｙｇｅｎ）を用いて精製した。
【０２３１】
トランスフェクション実験。製造業者の指示に従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００を使用して（ＬＦ３０００に対して１．５倍のＤＮＡという比で）、７０％コンフルエントの接着性２９３Ｔ細胞をＤＮＡでトランスフェクトした。表８は、各トランスフェクション（２つ組で行われた）に使用されたＤＮＡ構築物およびＤＮＡの量を提供している。
【表８】
0006652489.tif 000011
【０２３２】
４８時間後、ＴｒｙｐｌＥ試薬（ＬｉｆｅＴｅｃｈ）を用いて細胞を回収し、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  ＣＤ４  Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＬｉｆｅＴｅｃｈ）を用いてＣＤ４＋細胞を精製した。結合した細胞を、製造業者の指示に従ってビーズから溶出し、製造業者の指示に従ってＰｒｅｐｇｅｍ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ（Ｚｙｇｅｍ）を使用してゲノムＤＮＡを調製した。
【０２３３】
ＥｃｏＲＩ部位の組込みについてのＲＦＬＰアッセイ。意図されるゲノム組込みの状況のドナーＤＮＡだけが生成物をもたらすように、ＥｃｏＲＩ組込み部位を包含するプライマーセット（ＣＵＴ１２９７（配列番号１１６）およびＣＵＴ１２９４（配列番号１１５））および「外側」プライマーとともにＰｈｕｓｉｏｎポリメラーゼを用いて増幅されたＰＣＲフラグメント（９２０ｂｐ）に対して、ＲＦＬＰアッセイを行った。フラグメントを、Ａｍｐｕｒｅビーズ（Ａｘｙｇｅｎ）を用いて精製し、ＥｃｏＲＩで消化した。相同組換えによって組み込まれたＥｃｏＲＩ部位を有するＰＣＲ産物は、３４８ｂｐおよび５７２ｂｐのフラグメントをもたらした。組み込まれたＥｃｏＲＩ部位を有する鋳型の割合は、デンシトメトリー（Ｉｍａｇｅ  Ｊ）によって、式：消化バンド密度（３４８ｂｐ＋５７２ｂｐの密度）／総密度（３４８ｂｐ＋５７２ｂｐ＋９２０ｂｐの密度）を用いて算出された。
【０２３４】
結果
【０２３５】
ギャップ修復を要求することによって、相同組込みの割合が高まり得るかどうかを試験するために、本発明者らは、プラスミドと直鎖状ＤＮＡとのいくつかの異なる組み合わせ（表８および図２５）でトランスフェクトしたＨＥＫ−２９３Ｔ細胞において、ＥｃｏＲＩ部位のドナーＤＮＡ挿入の割合を比較した。ＥｃｏＲＩドナーＤＮＡが、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９による標的化切断の非存在下において、いくらか測定可能なレベルでＡＡＶＳ１遺伝子座にインテグレートし得るかを評価するために、Ｃａｓ９−２Ａ−ＣＤ４  ＯＲＦを含むがｇＲＮＡカセットを含まないプラスミドｐＡＭ１５０６８、および直鎖状のドナーＤＮＡ（ｐＡＭ３５１４のＰＣＲ産物）で細胞をトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を、ダイナビーズを用いて精製し、ゲノム鋳型を調製し、組込み部位にまたがるＰＣＲ産物を消化したところ、消化産物は生成されなかったことから、ＥｃｏＲＩ部位の組込みの割合は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９の非存在下において、測定可能でないことが示された（図２５、トランスフェクション２）。完全なＣＤ４  ＯＲＦを欠く線状化したｐＡＭ３４７２プラスミドがそれ自体に対してＣＤ４＋表現型を付与できないことを確認するために、この直鎖状のフラグメントだけを用いてトランスフェクションを行った。これらの精製された細胞から調製された鋳型からＰＣＲ産物が得られなかったことから、ＰＣＲ反応に対する鋳型として作用するためには、トランスフェクトされた細胞のダイナビーズとの会合が不十分であることが示された（図２５、トランスフェクション３）。ギャップ修復が、ＣＤ４  ＯＲＦを再構成できることを確認するために、線状化したｐＡＭ３４７２プラスミドを、ＣＤ４ギャップ修復フラグメント（ｐＡＭ３５１６のＰＣＲ産物）と共トランスフェクトしたところ、これらのトランスフェクションから精製された細胞由来の鋳型は、９２０ｂｐのバンドをもたらしたが、ｇＲＮＡが存在しなかったので、消化産物をもたらさなかった（図２５、トランスフェクション４）。次に、ＡＡＶＳ１  ｇＲＮＡを含むトランスフェクションを調べた。ＡＡＶＳ１  ｇＲＮＡを伴うＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムの機能についてのベースラインを確立するために、本発明者らは、Ｃａｓ９の発現カセット、ＣＤ４およびｇＲＮＡを含む閉環状プラスミド（ｐＡＭ３４７３）ならびに直鎖状のドナーＤＮＡ構築物（ｐＡＭ３５１４のＰＣＲ産物）を共トランスフェクトした。そのＰＣＲ産物のＥｃｏＲＩ消化は、５７２および３４８ｂｐの脱落産物を示したことから、全ＰＣＲ産物のわずかしか消化されなかったことが示された（図２５、トランスフェクション６）。Ｉｍａｇｅ  Ｊソフトウェアを用いたバンド密度の定量から、全鋳型の２２．５％がＥｃｏＲＩ部位を含んだことが明らかになった。ギャップ修復がこの割合を改善し得るかどうかを評価するために、本発明者らは、線状化したｐＡＭ３４７２ベクターならびにＣＤ４の欠損部分およびｇＲＮＡカセットを含むギャップ修復フラグメント（ｐＡＭ３５１５のＰＣＲ産物）を閉環状ベクターの代わりに用いた（図２５、トランスフェクション８）。デンシトメトリープロセスを繰り返したところ、本発明者らは、全鋳型の４７．５％がＥｃｏＲＩ部位を含んだことを観察した。これは、閉環状プラスミドに対して観察された割合（トランスフェクション６）に対して２．１％倍の改善に相当するので、哺乳動物細胞において、ゲノム組込みに対する改善されたギャップ修復方法の有効性が確認された。
【０２３６】
本明細書において引用されたすべての刊行物、特許および特許出願は、各個別の刊行物または特許出願が具体的かつ個別に参照により援用されると示されたかのように、本明細書中に参照により援用される。前述の発明は、理解を明確にする目的で例証および例示のためにいくらか詳細に記載されてきたが、本発明の教示に照らして、ある特定の変更および改変が、添付の特許請求の範囲の精神または範囲から逸脱することなく本発明に対して行われ得ることは、当業者には容易に明らかである。
例えば、本発明は、以下の項目を提供する。
（項目１）
相同組換えに適格性である宿主細胞を選択する方法であって、該方法は、
（ａ）１つまたはそれを超える宿主細胞を、それ自体との相同組換えまたは細胞の集団と接触される１つもしくはそれを超えるさらなる直鎖状核酸との相同組換えが可能な直鎖状核酸と接触させる工程であって、ここで、該相同組換えによって、選択マーカーのコード配列を含む環状の染色体外核酸が形成される、工程；および
（ｂ）該選択マーカーを発現する宿主細胞を選択する工程
を含む、方法。
（項目２）
宿主細胞ゲノムの標的部位に外来性核酸を組み込むための方法であって、該方法は、
（ａ）１つまたはそれを超える宿主細胞を、
（ｉ）該宿主細胞ゲノムの標的部位（ＴＳ）において、相同組換えを介して組み換わることができる外来性核酸（ＥＳ）；
（ｉｉ）ＴＳに断裂を作製することができるヌクレアーゼ（Ｎ）；および
（ｉｉｉ）それ自体との相同組換えまたは該宿主細胞と接触される１つもしくはそれを超えるさらなる直鎖状核酸との相同組換えが可能な直鎖状核酸であって、ここで、該相同組換えによって、選択マーカーのコード配列を含む環状の染色体外核酸が形成される、直鎖状核酸
と接触させる工程；
ならびに
（ｂ）該選択マーカーを発現する宿主細胞を選択する工程
を含む、方法。
（項目３）
前記直鎖状核酸が、互いとの相同組換えが可能な２つの内部相同性領域を含み、ここで、該内部相同性領域の相同組換えによって、前記選択マーカーを発現する前記環状の染色体外核酸が形成される、項目１または２に記載の方法。
（項目４）
前記直鎖状核酸が、前記宿主細胞と接触されるさらなる直鎖状核酸の相同性領域と組み換わることができる相同性領域を含み、２つの該直鎖状核酸の相同組換えによって、前記選択マーカーを発現する前記環状の染色体外核酸が形成される、項目１または２に記載の方法。
（項目５）
前記直鎖状核酸が、前記選択マーカーの部分的なコード配列、中断されたコード配列および／または不連続のコード配列を含み、該選択マーカーは、該直鎖状核酸から発現され得ず、前記環状の染色体外核酸の前記形成によって、該選択マーカーの完全なコード配列が形成され、該選択マーカーは、該環状の染色体外核酸から発現され得る、項目１〜４のいずれか１項に記載の方法。
（項目６）
接触される前記宿主細胞(複数可)が、前記選択する工程の前に、少なくとも約１２、２４、３６、４８、７２時間または７２時間より長い期間にわたって培養される、項目１〜５のいずれか１項に記載の方法。
（項目７）
接触される前記細胞が、前記選択マーカーを発現しない細胞の生存に対して選択する培養条件下で培養される、項目１〜６のいずれか１項に記載の方法。
（項目８）
工程（ｂ）という前記選択する工程が、視覚的検出法、比色法または蛍光検出法によって前記選択マーカーの発現を検出する工程を含む、項目１〜７のいずれか１項に記載の方法。
（項目９）
ＥＳがＴＳにおいて相同的に組み換えられた宿主細胞を回収する工程をさらに含む、項目２〜８のいずれか１項に記載の方法。
（項目１０）
前記回収する工程が、前記宿主細胞ゲノムへの選択マーカーの組込みを必要としない、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記回収する工程が、スクリーニングされた１０、９、８、７、６、５、４、３もしくは２個の接触された宿主細胞毎またはそれらのクローン集団毎に少なくとも約１回の頻度で行われる、項目９に記載の方法。
（項目１２）
選択された前記宿主細胞から前記環状の染色体外核酸を除去する工程をさらに含む、項目２〜１１のいずれか１項に記載の方法。
（項目１３）
複数（ｎ個）の外来性核酸が、前記宿主細胞ゲノムの複数（ｎ個）の標的部位に組み込まれ、ここで、ｎは、少なくとも２であり、工程（ａ）は、前記宿主細胞を
（ｉ）該複数の外来性核酸であって、ここで、
ｘは、１からｎまで変動する整数であり、各整数ｘに対して、外来性核酸（ＥＳ）ｘの各々は、該宿主細胞ゲノムの該複数（ｎ個）の標的部位から選択される標的部位（ＴＳ）ｘにおいて、相同組換えを介して組み換わることができる、外来性核酸；
（ｉｉ）該標的部位（ＴＳ）ｘの各々に対して、（ＴＳ）ｘにおいて断裂をもたらすことができるヌクレアーゼ（Ｎ）ｘ
と接触させる工程を含む、項目２〜１２のいずれか１項に記載の方法。
（項目１４）
単一のヌクレアーゼが、（ＴＳ）ｘの各々を切断することができる、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
ｎ＝３、４、５、６、７、８、９または１０である、項目１３または１４に記載の方法。
（項目１６）
ＥＳが、第１の相同性領域（ＨＲ１）および第２の相同性領域（ＨＲ２）を含み、ここで、ＨＲ１およびＨＲ２は、相同組換えを介して、それぞれ第３の相同性領域（ＨＲ３）および第４の相同性領域（ＨＲ４）と組み換わることができ、ＨＲ３およびＨＲ４は各々、ＴＳに存在する、項目２〜１５のいずれか１項に記載の方法。
（項目１７）
Ｎが、ＴＳに一本鎖断裂または二本鎖断裂をもたらすことができる、項目２〜１６のいずれか１項に記載の方法。
（項目１８）
ＥＳが、目的の核酸Ｄをさらに含む、項目２〜１７のいずれか１項に記載の方法。
（項目１９）
Ｄが、選択マーカー、プロモーター、エピトープタグをコードする核酸配列、目的の遺伝子、レポーター遺伝子、および終止コドンをコードする核酸配列からなる群より選択される、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
ＥＳが、直鎖状である、項目２〜１９のいずれか１項に記載の方法。
（項目２１）
前記環状の染色体外核酸が、前記ヌクレアーゼのコード配列をさらに含む、項目２〜２０のいずれか１項に記載の方法。
（項目２２）
前記ヌクレアーゼが、ＲＮＡガイドＤＮＡエンドヌクレアーゼである、項目２〜２１のいずれか１項に記載の方法。
（項目２３）
前記ＲＮＡガイドＤＮＡエンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼである、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記環状の染色体外核酸が、前記ＲＮＡガイドＤＮＡエンドヌクレアーゼによるＴＳの部位特異的な認識および切断を可能にする、ｃｒＲＮＡ活性およびｔｒａｃｒＲＮＡ活性をコードする配列をさらに含む、項目２２または２３に記載の方法。
（項目２５）
前記ｃｒＲＮＡ活性および前記ｔｒａｃｒＲＮＡ活性が、単一の連続したＲＮＡ分子として発現される、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
前記ヌクレアーゼが、エンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬ−エフェクターＤＮＡ結合ドメイン−ヌクレアーゼ融合タンパク質（ＴＡＬＥＮ）、トランスポザーゼおよび部位特異的リコンビナーゼからなる群より選択される、項目２〜２１のいずれか１項に記載の方法。
（項目２７）
前記ジンクフィンガーヌクレアーゼが、操作されたジンクフィンガー結合ドメインに融合されたタイプＩＩＳ制限エンドヌクレアーゼの切断ドメインを含む融合タンパク質である、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
前記タイプＩＩＳ制限エンドヌクレアーゼが、ＨＯエンドヌクレアーゼおよびＦｏｋＩエンドヌクレアーゼからなる群より選択される、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
前記ジンクフィンガー結合ドメインが、３、５または６つのジンクフィンガーを含む、項目２７に記載の方法。
（項目３０）
前記エンドヌクレアーゼが、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧホーミングエンドヌクレアーゼ、ＨＮＨホーミングエンドヌクレアーゼ、Ｈｉｓ−Ｃｙｓボックスホーミングエンドヌクレアーゼ、ＧＩＹ−ＹＩＧホーミングエンドヌクレアーゼおよびシアノバクテリアホーミングエンドヌクレアーゼからなる群より選択されるホーミングエンドヌクレアーゼである、項目２６に記載の方法。
（項目３１）
前記エンドヌクレアーゼが、Ｈ−ＤｒｅＩ、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＳｃｅＶ、Ｉ−ＳｃｅＶＩ、Ｉ−ＳｃｅＶＩＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、Ｉ−ＣｅｕＡＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＶＰ、Ｉ−ＴｌｉＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｐｉ−ＰｓｐＩ、Ｆ−ＳｃｅＩ、Ｆ−ＳｃｅＩＩ、Ｆ−ＳｕｖＩ、Ｆ−ＣｐｈＩ、Ｆ−ＴｅｖＩ、Ｆ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＡｍａＩ、Ｉ−ＡｎｉＩ、Ｉ−ＣｈｕＩ、Ｉ−ＣｍｏｅＩ、Ｉ−ＣｐａＩ、Ｉ−ＣｐａＩＩ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＣｖｕＩ、Ｉ−ＣｖｕＡＩＰ、Ｉ−ＤｄｉＩ、Ｉ−ＤｄｉＩＩ、Ｉ−ＤｉｒＩ、Ｉ−ＤｍｏＩ、Ｉ−ＨｍｕＩ、Ｉ−ＨｍｕＩＩ、Ｉ−ＨｓＮＩＰ、Ｉ−ＬｌａＩ、Ｉ−ＭｓｏＩ、Ｉ−ＮａａＩ、Ｉ−ＮａｎＩ、Ｉ−ＮｃｌＩＰ、Ｉ−ＮｇｒＩＰ、Ｉ−ＮｉｔＩ、Ｉ−ＮｊａＩ、Ｉ−Ｎｓｐ２３６ＩＰ、Ｉ−ＰａｋＩ、Ｉ−ＰｂｏＩＰ、Ｉ−ＰｃｕＩＰ、Ｉ−ＰｃｕＡＩ、Ｉ−ＰｃｕＶＩ、Ｉ−ＰｇｒＩＰ、Ｉ−ＰｏｂＩＰ、Ｉ−ＰｏｒＩ、Ｉ−ＰｏｒＩＩＰ、Ｉ−ＰｂｐＩＰ、Ｉ−ＳｐＢｅｔａＩＰ、Ｉ−ＳｃａＩ、Ｉ−ＳｅｘＩＰ、Ｉ−ＳｎｅＩＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩ、Ｉ−ＳｐｏｍＣＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩＩＰ、Ｉ−ＳｑｕＩＰ、Ｉ−Ｓｓｐ６８０３１、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＪＰ、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＳＴ３Ｐ、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＳＴｅ３ｂＰ、Ｉ−ＴｄｅＩＰ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩＩ、ｉ−ＵａｒＡＰ、ｉ−ＵａｒＨＧＰＡＩＰ、Ｉ−ＵａｒＨＧＰＡ１３Ｐ、Ｉ−ＶｉｎＩＰ、Ｉ−ＺｂｉＩＰ、ＰＩ−ＭｇａＩ、ＰＩ−ＭｔｕＩ、ＰＩ−ＭｔｕＨＩＰ  ＰＩ−ＭｔｕＨＩＩＰ、ＰＩ−ＰｆｕＩ、ＰＩ−ＰｆｕＩＩ、ＰＩ−ＰｋｏＩ、ＰＩ−ＰｋｏＩＩ、ＰＩ−Ｒｍａ４３８１２ＩＰ、ＰＩ−ＳｐＢｅｔａＩＰ、ＰＩ−ＳｃｅＩ、ＰＩ−ＴｆｕＩ、ＰＩ−ＴｆｕＩＩ、ＰＩ−ＴｈｙＩ、ＰＩ−ＴｌｉＩまたはＰＩ−ＴｌｉＩＩからなる群より選択される、項目２６に記載の方法。
（項目３２）
前記エンドヌクレアーゼが、内在性ゲノム配列に特異的に結合するように改変されており、該改変されたエンドヌクレアーゼは、もはやその野生型エンドヌクレアーゼ認識配列に結合しない、項目２６に記載の方法。
（項目３３）
前記改変されたエンドヌクレアーゼが、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧホーミングエンドヌクレアーゼ、ＨＮＨホーミングエンドヌクレアーゼ、Ｈｉｓ−Ｃｙｓボックスホーミングエンドヌクレアーゼ、ＧＩＹ−ＹＩＧホーミングエンドヌクレアーゼおよびシアノバクテリアホーミングエンドヌクレアーゼからなる群より選択されるホーミングエンドヌクレアーゼに由来する、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
前記改変されたエンドヌクレアーゼが、Ｈ−ＤｒｅＩ、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＳｃｅＶ、Ｉ−ＳｃｅＶＩ、Ｉ−ＳｃｅＶＩＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、Ｉ−ＣｅｕＡＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＶＰ、Ｉ−ＴｌｉＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｐｉ−ＰｓｐＩ、Ｆ−ＳｃｅＩ、Ｆ−ＳｃｅＩＩ、Ｆ−ＳｕｖＩ、Ｆ−ＣｐｈＩ、Ｆ−ＴｅｖＩ、Ｆ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＡｍａＩ、Ｉ−ＡｎｉＩ、Ｉ−ＣｈｕＩ、Ｉ−ＣｍｏｅＩ、Ｉ−ＣｐａＩ、Ｉ−ＣｐａＩＩ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＣｖｕＩ、Ｉ−ＣｖｕＡＩＰ、Ｉ−ＤｄｉＩ、Ｉ−ＤｄｉＩＩ、Ｉ−ＤｉｒＩ、Ｉ−ＤｍｏＩ、Ｉ−ＨｍｕＩ、Ｉ−ＨｍｕＩＩ、Ｉ−ＨｓＮＩＰ、Ｉ−ＬｌａＩ、Ｉ−ＭｓｏＩ、Ｉ−ＮａａＩ、Ｉ−ＮａｎＩ、Ｉ−ＮｃｌＩＰ、Ｉ−ＮｇｒＩＰ、Ｉ−ＮｉｔＩ、Ｉ−ＮｊａＩ、Ｉ−Ｎｓｐ２３６ＩＰ、Ｉ−ＰａｋＩ、Ｉ−ＰｂｏＩＰ、Ｉ−ＰｃｕＩＰ、Ｉ−ＰｃｕＡＩ、Ｉ−ＰｃｕＶＩ、Ｉ−ＰｇｒＩＰ、Ｉ−ＰｏｂＩＰ、Ｉ−ＰｏｒＩ、Ｉ−ＰｏｒＩＩＰ、Ｉ−ＰｂｐＩＰ、Ｉ−ＳｐＢｅｔａＩＰ、Ｉ−ＳｃａＩ、Ｉ−ＳｅｘＩＰ、Ｉ−ＳｎｅＩＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩ、Ｉ−ＳｐｏｍＣＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩＩＰ、Ｉ−ＳｑｕＩＰ、Ｉ−Ｓｓｐ６８０３１、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＪＰ、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＳＴ３Ｐ、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＳＴｅ３ｂＰ、Ｉ−ＴｄｅＩＰ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩＩ、ｉ−ＵａｒＡＰ、ｉ−ＵａｒＨＧＰＡＩＰ、Ｉ−ＵａｒＨＧＰＡ１３Ｐ、Ｉ−ＶｉｎＩＰ、Ｉ−ＺｂｉＩＰ、ＰＩ−ＭｇａＩ、ＰＩ−ＭｔｕＩ、ＰＩ−ＭｔｕＨＩＰ
ＰＩ−ＭｔｕＨＩＩＰ、ＰＩ−ＰｆｕＩ、ＰＩ−ＰｆｕＩＩ、ＰＩ−ＰｋｏＩ、ＰＩ−ＰｋｏＩＩ、ＰＩ−Ｒｍａ４３８１２ＩＰ、ＰＩ−ＳｐＢｅｔａＩＰ、ＰＩ−ＳｃｅＩ、ＰＩ−ＴｆｕＩ、ＰＩ−ＴｆｕＩＩ、ＰＩ−ＴｈｙＩ、ＰＩ−ＴｌｉＩまたはＰＩ−ＴｌｉＩＩからなる群より選択されるエンドヌクレアーゼに由来する、項目３２に記載の方法。
（項目３５）
前記宿主細胞が、原核細胞である、項目１〜３４のいずれか１項に記載の方法。
（項目３６）
前記宿主細胞が、真核細胞である、項目１〜３４のいずれか１項に記載の方法。
（項目３７）
前記宿主細胞が、真菌細胞、細菌細胞、植物細胞、昆虫細胞、鳥類細胞、魚類細胞および哺乳動物細胞からなる群より選択される、項目１〜３４のいずれか１項に記載の方法。
（項目３８）
前記宿主細胞が、げっ歯類細胞、霊長類細胞およびヒト細胞からなる群より選択される哺乳動物細胞である、項目１〜３４のいずれか１項に記載の方法。
（項目３９）
前記宿主細胞が、ヒト細胞である、項目１〜３４のいずれか１項に記載の方法。
（項目４０）
前記宿主細胞が、酵母細胞である、項目１〜３４のいずれか１項に記載の方法。
（項目４１）
前記酵母が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである、項目４０に記載の方法。
（項目４２）
宿主細胞であって、（ｉ）該宿主細胞ゲノムの標的部位（ＴＳ）において、相同組換えを介して組み換わることができる、外来性核酸（ＥＳ）；
（ｉｉ）ＴＳにおいて断裂をもたらすことができるヌクレアーゼ（Ｎ）；および
（ｉｉｉ）それ自体との相同組換えまたは該宿主細胞内の１つもしくはそれを超えるさらなる直鎖状核酸との相同組換えが可能な直鎖状核酸であって、該相同組換えによって、選択マーカーのコード配列を含む環状の染色体外核酸が形成される、直鎖状核酸
を含む、宿主細胞。
（項目４３）
前記直鎖状核酸が、互いとの相同組換えが可能な２つの内部相同性領域を含み、ここで、該内部相同性領域の相同組換えによって、前記選択マーカーを発現する前記環状の染色体外核酸が形成される、項目４２に記載の宿主細胞。
（項目４４）
前記直鎖状核酸が、前記宿主細胞内のさらなる直鎖状核酸の相同性領域と組み換わることができる相同性領域を含み、２つの該直鎖状核酸の相同組換えによって、前記選択マーカーを発現する前記環状の染色体外核酸が形成される、項目４２に記載の宿主細胞。
（項目４５）
前記直鎖状核酸が、前記選択マーカーの部分的なコード配列、中断されたコード配列および／または不連続のコード配列を含み、該選択マーカーは、該直鎖状核酸から発現され得ず、前記環状の染色体外核酸の前記形成によって、該選択マーカーの完全なコード配列が形成され、該選択マーカーは、該環状の染色体外核酸から発現され得る、項目４２〜４４のいずれか１項に記載の宿主細胞。
（項目４６）
前記宿主細胞が、
（ｉ）複数の外来性核酸であって、ここで、
ｘは、１からｎまで変動する整数であり、各整数ｘに対して、外来性核酸（ＥＳ）ｘの各々は、該宿主細胞ゲノムの前記複数（ｎ個）の標的部位から選択される標的部位（ＴＳ）ｘにおいて、相同組換えを介して組み換わることができる、外来性核酸；
（ｉｉ）該標的部位（ＴＳ）ｘの各々に対して、（ＴＳ）ｘにおいて断裂をもたらすことができるヌクレアーゼ（Ｎ）ｘ
を含む、項目４２〜４５のいずれか１項に記載の宿主細胞。
（項目４７）
ＥＳが、第１の相同性領域（ＨＲ１）および第２の相同性領域（ＨＲ２）を含み、ここで、ＨＲ１およびＨＲ２は、相同組換えを介して、それぞれ第３の相同性領域（ＨＲ３）および第４の相同性領域（ＨＲ４）と組み換わることができ、ＨＲ３およびＨＲ４は各々、ＴＳに存在する、項目４２〜４６のいずれか１項に記載の宿主細胞。
（項目４８）
Ｎが、ＴＳに一本鎖断裂または二本鎖断裂をもたらすことができる、項目４２〜４１のいずれか１項に記載の宿主細胞。
（項目４９）
ＥＳが、目的の核酸Ｄをさらに含む、項目４２〜４８のいずれか１項に記載の宿主細胞。
（項目５０）
Ｄが、選択マーカー、プロモーター、エピトープタグをコードする核酸配列、目的の遺伝子、レポーター遺伝子、および終止コドンをコードする核酸配列からなる群より選択される、項目４９に記載の宿主細胞。
（項目５１）
ＥＳが、直鎖状である、項目４２〜５０のいずれか１項に記載の宿主細胞。
（項目５２）
前記環状の染色体外核酸が、前記ヌクレアーゼのコード配列をさらに含む、項目４２〜５１のいずれか１項に記載の宿主細胞。
（項目５３）
前記ヌクレアーゼが、ＲＮＡガイドＤＮＡエンドヌクレアーゼである、項目４２〜５２のいずれか１項に記載の宿主細胞。
（項目５４）
前記ＲＮＡガイドＤＮＡエンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼである、項目５３に記載の宿主細胞。
（項目５５）
前記環状の染色体外核酸が、前記ＲＮＡガイドＤＮＡエンドヌクレアーゼによるＴＳの部位特異的な認識および切断を可能にする、ｃｒＲＮＡ活性およびｔｒａｃｒＲＮＡ活性をコードする配列をさらに含む、項目５３または５４に記載の宿主細胞。
（項目５６）
前記ｃｒＲＮＡ活性および前記ｔｒａｃｒＲＮＡ活性が、単一の連続したＲＮＡ分子として発現される、項目５５に記載の宿主細胞。
（項目５７）
前記ヌクレアーゼが、エンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬ−エフェクターＤＮＡ結合ドメイン−ヌクレアーゼ融合タンパク質（ＴＡＬＥＮ）、トランスポザーゼおよび部位特異的リコンビナーゼからなる群より選択される、項目４２〜５６のいずれか１項に記載の宿主細胞。
（項目５８）
前記ジンクフィンガーヌクレアーゼが、操作されたジンクフィンガー結合ドメインに融合されたタイプＩＩＳ制限エンドヌクレアーゼの切断ドメインを含む融合タンパク質である、項目５７に記載の宿主細胞。
（項目５９）
前記タイプＩＩＳ制限エンドヌクレアーゼが、ＨＯエンドヌクレアーゼおよびＦｏｋＩエンドヌクレアーゼからなる群より選択される、項目５８に記載の宿主細胞。
（項目６０）
前記ジンクフィンガー結合ドメインが、３、５または６つのジンクフィンガーを含む、項目５８に記載の宿主細胞。
（項目６１）
前記エンドヌクレアーゼが、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧホーミングエンドヌクレアーゼ、ＨＮＨホーミングエンドヌクレアーゼ、Ｈｉｓ−Ｃｙｓボックスホーミングエンドヌクレアーゼ、ＧＩＹ−ＹＩＧホーミングエンドヌクレアーゼおよびシアノバクテリアホーミングエンドヌクレアーゼからなる群より選択されるホーミングエンドヌクレアーゼである、項目５８に記載の宿主細胞。
（項目６２）
前記エンドヌクレアーゼが、Ｈ−ＤｒｅＩ、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＳｃｅＶ、Ｉ−ＳｃｅＶＩ、Ｉ−ＳｃｅＶＩＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、Ｉ−ＣｅｕＡＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＶＰ、Ｉ−ＴｌｉＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｐｉ−ＰｓｐＩ、Ｆ−ＳｃｅＩ、Ｆ−ＳｃｅＩＩ、Ｆ−ＳｕｖＩ、Ｆ−ＣｐｈＩ、Ｆ−ＴｅｖＩ、Ｆ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＡｍａＩ、Ｉ−ＡｎｉＩ、Ｉ−ＣｈｕＩ、Ｉ−ＣｍｏｅＩ、Ｉ−ＣｐａＩ、Ｉ−ＣｐａＩＩ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＣｖｕＩ、Ｉ−ＣｖｕＡＩＰ、Ｉ−ＤｄｉＩ、Ｉ−ＤｄｉＩＩ、Ｉ−ＤｉｒＩ、Ｉ−ＤｍｏＩ、Ｉ−ＨｍｕＩ、Ｉ−ＨｍｕＩＩ、Ｉ−ＨｓＮＩＰ、Ｉ−ＬｌａＩ、Ｉ−ＭｓｏＩ、Ｉ−ＮａａＩ、Ｉ−ＮａｎＩ、Ｉ−ＮｃｌＩＰ、Ｉ−ＮｇｒＩＰ、Ｉ−ＮｉｔＩ、Ｉ−ＮｊａＩ、Ｉ−Ｎｓｐ２３６ＩＰ、Ｉ−ＰａｋＩ、Ｉ−ＰｂｏＩＰ、Ｉ−ＰｃｕＩＰ、Ｉ−ＰｃｕＡＩ、Ｉ−ＰｃｕＶＩ、Ｉ−ＰｇｒＩＰ、Ｉ−ＰｏｂＩＰ、Ｉ−ＰｏｒＩ、Ｉ−ＰｏｒＩＩＰ、Ｉ−ＰｂｐＩＰ、Ｉ−ＳｐＢｅｔａＩＰ、Ｉ−ＳｃａＩ、Ｉ−ＳｅｘＩＰ、Ｉ−ＳｎｅＩＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩ、Ｉ−ＳｐｏｍＣＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩＩＰ、Ｉ−ＳｑｕＩＰ、Ｉ−Ｓｓｐ６８０３１、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＪＰ、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＳＴ３Ｐ、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＳＴｅ３ｂＰ、Ｉ−ＴｄｅＩＰ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩＩ、ｉ−ＵａｒＡＰ、ｉ−ＵａｒＨＧＰＡＩＰ、Ｉ−ＵａｒＨＧＰＡ１３Ｐ、Ｉ−ＶｉｎＩＰ、Ｉ−ＺｂｉＩＰ、ＰＩ−ＭｇａＩ、ＰＩ−ＭｔｕＩ、ＰＩ−ＭｔｕＨＩＰ  ＰＩ−ＭｔｕＨＩＩＰ、ＰＩ−ＰｆｕＩ、ＰＩ−ＰｆｕＩＩ、ＰＩ−ＰｋｏＩ、ＰＩ−ＰｋｏＩＩ、ＰＩ−Ｒｍａ４３８１２ＩＰ、ＰＩ−ＳｐＢｅｔａＩＰ、ＰＩ−ＳｃｅＩ、ＰＩ−ＴｆｕＩ、ＰＩ−ＴｆｕＩＩ、ＰＩ−ＴｈｙＩ、ＰＩ−ＴｌｉＩまたはＰＩ−ＴｌｉＩＩからなる群より選択される、項目５８に記載の宿主細胞。
（項目６３）
前記エンドヌクレアーゼが、内在性ゲノム配列に特異的に結合するように改変されており、該改変されたエンドヌクレアーゼは、もはやその野生型エンドヌクレアーゼ認識配列に結合しない、項目５８に記載の宿主細胞。
（項目６４）
前記改変されたエンドヌクレアーゼが、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧホーミングエンドヌクレアーゼ、ＨＮＨホーミングエンドヌクレアーゼ、Ｈｉｓ−Ｃｙｓボックスホーミングエンドヌクレアーゼ、ＧＩＹ−ＹＩＧホーミングエンドヌクレアーゼおよびシアノバクテリアホーミングエンドヌクレアーゼからなる群より選択されるホーミングエンドヌクレアーゼに由来する、項目６３に記載の宿主細胞。
（項目６５）
前記改変されたエンドヌクレアーゼが、Ｈ−ＤｒｅＩ、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＳｃｅＶ、Ｉ−ＳｃｅＶＩ、Ｉ−ＳｃｅＶＩＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、Ｉ−ＣｅｕＡＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＶＰ、Ｉ−ＴｌｉＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｐｉ−ＰｓｐＩ、Ｆ−ＳｃｅＩ、Ｆ−ＳｃｅＩＩ、Ｆ−ＳｕｖＩ、Ｆ−ＣｐｈＩ、Ｆ−ＴｅｖＩ、Ｆ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＡｍａＩ、Ｉ−ＡｎｉＩ、Ｉ−ＣｈｕＩ、Ｉ−ＣｍｏｅＩ、Ｉ−ＣｐａＩ、Ｉ−ＣｐａＩＩ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＣｖｕＩ、Ｉ−ＣｖｕＡＩＰ、Ｉ−ＤｄｉＩ、Ｉ−ＤｄｉＩＩ、Ｉ−ＤｉｒＩ、Ｉ−ＤｍｏＩ、Ｉ−ＨｍｕＩ、Ｉ−ＨｍｕＩＩ、Ｉ−ＨｓＮＩＰ、Ｉ−ＬｌａＩ、Ｉ−ＭｓｏＩ、Ｉ−ＮａａＩ、Ｉ−ＮａｎＩ、Ｉ−ＮｃｌＩＰ、Ｉ−ＮｇｒＩＰ、Ｉ−ＮｉｔＩ、Ｉ−ＮｊａＩ、Ｉ−Ｎｓｐ２３６ＩＰ、Ｉ−ＰａｋＩ、Ｉ−ＰｂｏＩＰ、Ｉ−ＰｃｕＩＰ、Ｉ−ＰｃｕＡＩ、Ｉ−ＰｃｕＶＩ、Ｉ−ＰｇｒＩＰ、Ｉ−ＰｏｂＩＰ、Ｉ−ＰｏｒＩ、Ｉ−ＰｏｒＩＩＰ、Ｉ−ＰｂｐＩＰ、Ｉ−ＳｐＢｅｔａＩＰ、Ｉ−ＳｃａＩ、Ｉ−ＳｅｘＩＰ、Ｉ−ＳｎｅＩＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩ、Ｉ−ＳｐｏｍＣＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩＩＰ、Ｉ−ＳｑｕＩＰ、Ｉ−Ｓｓｐ６８０３１、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＪＰ、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＳＴ３Ｐ、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＳＴｅ３ｂＰ、Ｉ−ＴｄｅＩＰ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩＩ、ｉ−ＵａｒＡＰ、ｉ−ＵａｒＨＧＰＡＩＰ、Ｉ−ＵａｒＨＧＰＡ１３Ｐ、Ｉ−ＶｉｎＩＰ、Ｉ−ＺｂｉＩＰ、ＰＩ−ＭｇａＩ、ＰＩ−ＭｔｕＩ、ＰＩ−ＭｔｕＨＩＰ
ＰＩ−ＭｔｕＨＩＩＰ、ＰＩ−ＰｆｕＩ、ＰＩ−ＰｆｕＩＩ、ＰＩ−ＰｋｏＩ、ＰＩ−ＰｋｏＩＩ、ＰＩ−Ｒｍａ４３８１２ＩＰ、ＰＩ−ＳｐＢｅｔａＩＰ、ＰＩ−ＳｃｅＩ、ＰＩ−ＴｆｕＩ、ＰＩ−ＴｆｕＩＩ、ＰＩ−ＴｈｙＩ、ＰＩ−ＴｌｉＩまたはＰＩ−ＴｌｉＩＩからなる群より選択されるエンドヌクレアーゼに由来する、項目６３に記載の宿主細胞。
（項目６６）
（ａ）部位特異的ヌクレアーゼ、または部位特異的ヌクレアーゼのコード配列を含む核酸；および
（ｂ）宿主細胞において互いとの相同組換えが可能な２つの内部相同性領域を含む直鎖状核酸であって、ここで、該内部相同性領域の相同組換えによって、選択マーカーのコード配列を含む環状核酸が形成される、直鎖状核酸
を含む、組成物。
（項目６７）
前記直鎖状核酸が、前記選択マーカーの部分的なコード配列、中断されたコード配列および／または不連続のコード配列を含み、該選択マーカーは、宿主細胞において該直鎖状核酸から発現され得ず、前記環状核酸の前記形成によって、該選択マーカーの完全なコード配列が形成され、該選択マーカーは、該宿主細胞において該環状核酸から発現され得る、項目６６に記載の組成物。
（項目６８）
（ａ）部位特異的ヌクレアーゼ、または部位特異的ヌクレアーゼのコード配列を含む核酸；ならびに
（ｂ）第１の直鎖状核酸および１つまたはそれを超えるさらなる直鎖状核酸であって、ここで、該第１および第２の直鎖状核酸は、宿主細胞において互いとの相同組換えが可能であり、該相同組換えによって、選択マーカーのコード配列を含む環状核酸が形成される、第１の直鎖状核酸および１つまたはそれを超えるさらなる直鎖状核酸
を含む、組成物。
（項目６９）
各直鎖状核酸が、前記選択マーカーの部分的なコード配列、中断されたコード配列および／または不連続のコード配列を含み、該選択マーカーは、宿主細胞において各直鎖状核酸から発現され得ず、前記環状核酸の前記形成によって、該選択マーカーの完全なコード配列が形成され、該選択マーカーは、宿主細胞において該環状核酸から発現され得る、項目６８に記載の組成物。
（項目７０）
前記環状核酸が、部位特異的ヌクレアーゼのコード配列をさらに含む、項目６６〜６９のいずれか１項に記載の組成物。
（項目７１）
前記部位特異的ヌクレアーゼが、ＲＮＡガイドＤＮＡエンドヌクレアーゼである、項目６６〜７０のいずれか１項に記載の組成物。
（項目７２）
前記ＲＮＡガイドＤＮＡエンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼである、項目７１に記載の組成物。
（項目７３）
（ｉ）ｃｒＲＮＡ活性を有するリボ核酸およびｔｒａｃｒＲＮＡ活性を有するリボ核酸；または
（ｉｉ）ｃｒＲＮＡ活性を有するリボ核酸をコードするデオキシリボ核酸およびｔｒａｃｒＲＮＡ活性を有するリボ核酸をコードするデオキシリボ核酸
をさらに含む、項目７１または７２に記載の組成物。
（項目７４）
前記環状核酸が、ｃｒＲＮＡ活性を有するリボ核酸をコードするデオキシリボ核酸およびｔｒａｃｒＲＮＡ活性を有するリボ核酸をコードするデオキシリボ核酸をさらに含む、項目７２または７３に記載の組成物。
（項目７５）
前記ｃｒＲＮＡ活性および前記ｔｒａｃｒＲＮＡ活性をコードする前記デオキシリボ核酸が、単一の連続したＲＮＡ分子上で該活性をコードする、項目７３または７４に記載の組成物。
（項目７６）
前記部位特異的ヌクレアーゼが、エンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬ−エフェクターＤＮＡ結合ドメイン−ヌクレアーゼ融合タンパク質（ＴＡＬＥＮ）、トランスポザーゼおよび部位特異的リコンビナーゼからなる群より選択される、項目６６〜７０のいずれか１項に記載の組成物。
（項目７７）
前記ジンクフィンガーヌクレアーゼが、操作されたジンクフィンガー結合ドメインに融合されたタイプＩＩＳ制限エンドヌクレアーゼの切断ドメインを含む融合タンパク質である、項目７６に記載の組成物。
（項目７８）
前記タイプＩＩＳ制限エンドヌクレアーゼが、ＨＯエンドヌクレアーゼおよびＦｏｋＩエンドヌクレアーゼからなる群より選択される、項目７７に記載の組成物。
（項目７９）
前記ジンクフィンガー結合ドメインが、３、５または６つのジンクフィンガーを含む、項目７７に記載の組成物。
（項目８０）
前記エンドヌクレアーゼが、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧホーミングエンドヌクレアーゼ、ＨＮＨホーミングエンドヌクレアーゼ、Ｈｉｓ−Ｃｙｓボックスホーミングエンドヌクレアーゼ、ＧＩＹ−ＹＩＧホーミングエンドヌクレアーゼおよびシアノバクテリアホーミングエンドヌクレアーゼからなる群より選択されるホーミングエンドヌクレアーゼである、項目７６に記載の組成物。
（項目８１）
前記エンドヌクレアーゼが、Ｈ−ＤｒｅＩ、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＳｃｅＶ、Ｉ−ＳｃｅＶＩ、Ｉ−ＳｃｅＶＩＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、Ｉ−ＣｅｕＡＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＶＰ、Ｉ−ＴｌｉＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｐｉ−ＰｓｐＩ、Ｆ−ＳｃｅＩ、Ｆ−ＳｃｅＩＩ、Ｆ−ＳｕｖＩ、Ｆ−ＣｐｈＩ、Ｆ−ＴｅｖＩ、Ｆ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＡｍａＩ、Ｉ−ＡｎｉＩ、Ｉ−ＣｈｕＩ、Ｉ−ＣｍｏｅＩ、Ｉ−ＣｐａＩ、Ｉ−ＣｐａＩＩ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＣｖｕＩ、Ｉ−ＣｖｕＡＩＰ、Ｉ−ＤｄｉＩ、Ｉ−ＤｄｉＩＩ、Ｉ−ＤｉｒＩ、Ｉ−ＤｍｏＩ、Ｉ−ＨｍｕＩ、Ｉ−ＨｍｕＩＩ、Ｉ−ＨｓＮＩＰ、Ｉ−ＬｌａＩ、Ｉ−ＭｓｏＩ、Ｉ−ＮａａＩ、Ｉ−ＮａｎＩ、Ｉ−ＮｃｌＩＰ、Ｉ−ＮｇｒＩＰ、Ｉ−ＮｉｔＩ、Ｉ−ＮｊａＩ、Ｉ−Ｎｓｐ２３６ＩＰ、Ｉ−ＰａｋＩ、Ｉ−ＰｂｏＩＰ、Ｉ−ＰｃｕＩＰ、Ｉ−ＰｃｕＡＩ、Ｉ−ＰｃｕＶＩ、Ｉ−ＰｇｒＩＰ、Ｉ−ＰｏｂＩＰ、Ｉ−ＰｏｒＩ、Ｉ−ＰｏｒＩＩＰ、Ｉ−ＰｂｐＩＰ、Ｉ−ＳｐＢｅｔａＩＰ、Ｉ−ＳｃａＩ、Ｉ−ＳｅｘＩＰ、Ｉ−ＳｎｅＩＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩ、Ｉ−ＳｐｏｍＣＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩＩＰ、Ｉ−ＳｑｕＩＰ、Ｉ−Ｓｓｐ６８０３１、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＪＰ、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＳＴ３Ｐ、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＳＴｅ３ｂＰ、Ｉ−ＴｄｅＩＰ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩＩ、ｉ−ＵａｒＡＰ、ｉ−ＵａｒＨＧＰＡＩＰ、Ｉ−ＵａｒＨＧＰＡ１３Ｐ、Ｉ−ＶｉｎＩＰ、Ｉ−ＺｂｉＩＰ、ＰＩ−ＭｇａＩ、ＰＩ−ＭｔｕＩ、ＰＩ−ＭｔｕＨＩＰ  ＰＩ−ＭｔｕＨＩＩＰ、ＰＩ−ＰｆｕＩ、ＰＩ−ＰｆｕＩＩ、ＰＩ−ＰｋｏＩ、ＰＩ−ＰｋｏＩＩ、ＰＩ−Ｒｍａ４３８１２ＩＰ、ＰＩ−ＳｐＢｅｔａＩＰ、ＰＩ−ＳｃｅＩ、ＰＩ−ＴｆｕＩ、ＰＩ−ＴｆｕＩＩ、ＰＩ−ＴｈｙＩ、ＰＩ−ＴｌｉＩまたはＰＩ−ＴｌｉＩＩからなる群より選択される、項目７６に記載の組成物。
（項目８２）
前記エンドヌクレアーゼが、内在性ゲノム配列に特異的に結合するように改変されており、該改変されたエンドヌクレアーゼは、もはやその野生型エンドヌクレアーゼ認識配列に結合しない、項目７６に記載の組成物。
（項目８３）
前記改変されたエンドヌクレアーゼが、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧホーミングエンドヌクレアーゼ、ＨＮＨホーミングエンドヌクレアーゼ、Ｈｉｓ−Ｃｙｓボックスホーミングエンドヌクレアーゼ、ＧＩＹ−ＹＩＧホーミングエンドヌクレアーゼおよびシアノバクテリアホーミングエンドヌクレアーゼからなる群より選択されるホーミングエンドヌクレアーゼに由来する、項目７７に記載の組成物。
（項目８４）
前記改変されたエンドヌクレアーゼが、Ｈ−ＤｒｅＩ、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＳｃｅＶ、Ｉ−ＳｃｅＶＩ、Ｉ−ＳｃｅＶＩＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、Ｉ−ＣｅｕＡＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＶＰ、Ｉ−ＴｌｉＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｐｉ−ＰｓｐＩ、Ｆ−ＳｃｅＩ、Ｆ−ＳｃｅＩＩ、Ｆ−ＳｕｖＩ、Ｆ−ＣｐｈＩ、Ｆ−ＴｅｖＩ、Ｆ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＡｍａＩ、Ｉ−ＡｎｉＩ、Ｉ−ＣｈｕＩ、Ｉ−ＣｍｏｅＩ、Ｉ−ＣｐａＩ、Ｉ−ＣｐａＩＩ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＣｖｕＩ、Ｉ−ＣｖｕＡＩＰ、Ｉ−ＤｄｉＩ、Ｉ−ＤｄｉＩＩ、Ｉ−ＤｉｒＩ、Ｉ−ＤｍｏＩ、Ｉ−ＨｍｕＩ、Ｉ−ＨｍｕＩＩ、Ｉ−ＨｓＮＩＰ、Ｉ−ＬｌａＩ、Ｉ−ＭｓｏＩ、Ｉ−ＮａａＩ、Ｉ−ＮａｎＩ、Ｉ−ＮｃｌＩＰ、Ｉ−ＮｇｒＩＰ、Ｉ−ＮｉｔＩ、Ｉ−ＮｊａＩ、Ｉ−Ｎｓｐ２３６ＩＰ、Ｉ−ＰａｋＩ、Ｉ−ＰｂｏＩＰ、Ｉ−ＰｃｕＩＰ、Ｉ−ＰｃｕＡＩ、Ｉ−ＰｃｕＶＩ、Ｉ−ＰｇｒＩＰ、Ｉ−ＰｏｂＩＰ、Ｉ−ＰｏｒＩ、Ｉ−ＰｏｒＩＩＰ、Ｉ−ＰｂｐＩＰ、Ｉ−ＳｐＢｅｔａＩＰ、Ｉ−ＳｃａＩ、Ｉ−ＳｅｘＩＰ、Ｉ−ＳｎｅＩＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩ、Ｉ−ＳｐｏｍＣＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩＩＰ、Ｉ−ＳｑｕＩＰ、Ｉ−Ｓｓｐ６８０３１、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＪＰ、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＳＴ３Ｐ、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＳＴｅ３ｂＰ、Ｉ−ＴｄｅＩＰ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩＩ、ｉ−ＵａｒＡＰ、ｉ−ＵａｒＨＧＰＡＩＰ、Ｉ−ＵａｒＨＧＰＡ１３Ｐ、Ｉ−ＶｉｎＩＰ、Ｉ−ＺｂｉＩＰ、ＰＩ−ＭｇａＩ、ＰＩ−ＭｔｕＩ、ＰＩ−ＭｔｕＨＩＰ
ＰＩ−ＭｔｕＨＩＩＰ、ＰＩ−ＰｆｕＩ、ＰＩ−ＰｆｕＩＩ、ＰＩ−ＰｋｏＩ、ＰＩ−ＰｋｏＩＩ、ＰＩ−Ｒｍａ４３８１２ＩＰ、ＰＩ−ＳｐＢｅｔａＩＰ、ＰＩ−ＳｃｅＩ、ＰＩ−ＴｆｕＩ、ＰＩ−ＴｆｕＩＩ、ＰＩ−ＴｈｙＩ、ＰＩ−ＴｌｉＩまたはＰＩ−ＴｌｉＩＩからなる群より選択されるエンドヌクレアーゼに由来する、項目７７に記載の組成物。
（項目８５）
項目６６〜８４のいずれか１項に記載の組成物を含む、宿主細胞。
（項目８６）
前記宿主細胞が、原核細胞である、項目４２〜６５および８５のいずれか１項に記載の宿主細胞。
（項目８７）
前記宿主細胞が、真核細胞である、項目４２〜６５および８５のいずれか１項に記載の宿主細胞。
（項目８８）
前記宿主細胞が、真菌細胞、細菌細胞、植物細胞、昆虫細胞、鳥類細胞、魚類細胞および哺乳動物細胞からなる群より選択される、項目４２〜６５および８５のいずれか１項に記載の宿主細胞。
（項目８９）
前記宿主細胞が、げっ歯類細胞、霊長類細胞およびヒト細胞からなる群から選択される哺乳動物細胞である、項目４２〜６５および８５のいずれか１項に記載の宿主細胞。
（項目９０）
前記宿主細胞が、ヒト細胞である、項目４２〜６５および８５のいずれか１項に記載の宿主細胞。
（項目９１）
前記宿主細胞が、酵母細胞である、項目４２〜６５および８５のいずれか１項に記載の宿主細胞。
（項目９２）
前記酵母が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである、項目９１に記載の宿主細胞。
（項目９３）
細胞培養培地ならびに項目４２〜６５および８５〜９２のいずれか１項に記載の宿主細胞を含む、細胞培養組成物。
（項目９４）
前記選択マーカーの発現について選択する化合物をさらに含む、項目９３に記載の細胞培養組成物。
（項目９５）
宿主細胞ゲノムの標的部位に外来性核酸を組み込むための方法であって、該方法は、
（ａ）１つまたはそれを超える宿主細胞を、
（ｉ）該宿主細胞ゲノムの該標的部位（ＴＳ）において、相同組換えを介して組み換わることができる外来性核酸（ＥＳ）；および
（ｉｉ）それ自体との相同組換えまたは該宿主細胞と接触される１つもしくはそれを超えるさらなる直鎖状核酸との相同組換えが可能な直鎖状核酸であって、ここで、該相同組換えによって、選択マーカーのコード配列およびＴＳにおいて断裂をもたらすことができるヌクレアーゼ（Ｎ）のコード配列を含む環状の染色体外核酸が形成される、直鎖状核酸
と接触させる工程；
ならびに
（ｂ）該選択マーカーを発現する宿主細胞を選択する工程
を含む、方法。
（項目９６）
前記ヌクレアーゼが、ＣＲＩＳＰＲ関連ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬ−エフェクターＤＮＡ結合ドメイン−ヌクレアーゼ融合タンパク質（ＴＡＬＥＮ）、トランスポザーゼおよび部位特異的リコンビナーゼからなる群より選択される、項目９５に記載の方法。
（項目９７）
前記ヌクレアーゼが、ＣＲＩＳＰＲ関連ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼであり、前記環状の染色体外核酸が、前記ＲＮＡガイドＤＮＡエンドヌクレアーゼによるＴＳの部位特異的な認識および切断を可能にするｃｒＲＮＡ活性およびｔｒａｃｒＲＮＡ活性をコードする配列をさらに含む、項目９６に記載の方法。
（項目９８）
宿主細胞であって、（ｉ）該宿主細胞ゲノムの標的部位（ＴＳ）において、相同組換えを介して組み換わることができる外来性核酸（ＥＳ）；および
（ｉｉ）それ自体との相同組換えまたは該宿主細胞と接触される１つもしくはそれを超えるさらなる直鎖状核酸との相同組換えが可能な直鎖状核酸であって、ここで、該相同組換えによって、選択マーカーのコード配列およびＴＳにおいて断裂をもたらすことができるヌクレアーゼ（Ｎ）のコード配列を含む環状の染色体外核酸が形成される、直鎖状核酸
を含む、宿主細胞。
（項目９９）
前記ヌクレアーゼが、ＣＲＩＳＰＲ関連ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬ−エフェクターＤＮＡ結合ドメイン−ヌクレアーゼ融合タンパク質（ＴＡＬＥＮ）、トランスポザーゼおよび部位特異的リコンビナーゼからなる群より選択される、項目９８に記載の宿主細胞。
（項目１００）
前記ヌクレアーゼが、ＣＲＩＳＰＲ関連ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼであり、前記環状の染色体外核酸が、前記ＲＮＡガイドＤＮＡエンドヌクレアーゼによるＴＳの部位特異的な認識および切断を可能にするｃｒＲＮＡ活性およびｔｒａｃｒＲＮＡ活性をコードする配列をさらに含む、項目９９に記載の宿主細胞。
（項目１０１）
第１の相同性領域（ＨＲ１）および第２の相同性領域（ＨＲ２）を含む直鎖状核酸であって、ここで、ＨＲ１およびＨＲ２は、相同組換えを介して互いと組み換わることができ、ＨＲ１とＨＲ２との相同組換えによって、選択マーカーのコード配列を含む環状核酸が形成される、直鎖状核酸。
（項目１０２）
ＨＲ１が、前記選択マーカーの第１の不完全なコード配列を含み、ＨＲ２が、該選択マーカーの第２の不完全なコード配列を含み、ＨＲ１とＨＲ２との相同組換えによって、該選択マーカーの完全なコード配列が再構成される、項目１０１に記載の直鎖状核酸。
（項目１０３）
部位特異的ヌクレアーゼのコード配列をさらに含む、項目１０１または１０２に記載の直鎖状核酸。
（項目１０４）
前記部位特異的ヌクレアーゼが、ＲＮＡガイドＤＮＡエンドヌクレアーゼである、項目１０３に記載の直鎖状核酸。
（項目１０５）
前記ＲＮＡガイドＤＮＡエンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼである、項目１０４に記載の直鎖状核酸。
（項目１０６）
前記環状核酸が、ｃｒＲＮＡ活性およびｔｒａｃｒＲＮＡ活性をコードする配列をさらに含む、項目１０１〜１０５のいずれか１項に記載の直鎖状核酸。
（項目１０７）
前記ｃｒＲＮＡ活性および前記ｔｒａｃｒＲＮＡ活性をコードする配列が、単一の連続したＲＮＡ分子上で該活性をコードする、１０６に記載の直鎖状核酸。
（項目１０８）
前記部位特異的ヌクレアーゼが、エンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬ−エフェクターＤＮＡ結合ドメイン−ヌクレアーゼ融合タンパク質（ＴＡＬＥＮ）、トランスポザーゼおよび部位特異的リコンビナーゼからなる群より選択される、項目１０３に記載の直鎖状核酸。
（項目１０９）
前記ジンクフィンガーヌクレアーゼが、操作されたジンクフィンガー結合ドメインに融合されたタイプＩＩＳ制限エンドヌクレアーゼの切断ドメインを含む融合タンパク質である、項目１０８に記載の直鎖状核酸。
（項目１１０）
前記タイプＩＩＳ制限エンドヌクレアーゼが、ＨＯエンドヌクレアーゼおよびＦｏｋＩエンドヌクレアーゼからなる群より選択される、項目１０９に記載の直鎖状核酸。
（項目１１１）
前記ジンクフィンガー結合ドメインが、３、５または６つのジンクフィンガーを含む、項目１０９に記載の直鎖状核酸。
（項目１１２）
前記エンドヌクレアーゼが、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧホーミングエンドヌクレアーゼ、ＨＮＨホーミングエンドヌクレアーゼ、Ｈｉｓ−Ｃｙｓボックスホーミングエンドヌクレアーゼ、ＧＩＹ−ＹＩＧホーミングエンドヌクレアーゼおよびシアノバクテリアホーミングエンドヌクレアーゼからなる群より選択されるホーミングエンドヌクレアーゼである、項目１０８に記載の直鎖状核酸。
（項目１１３）
前記エンドヌクレアーゼが、Ｈ−ＤｒｅＩ、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＳｃｅＶ、Ｉ−ＳｃｅＶＩ、Ｉ−ＳｃｅＶＩＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、Ｉ−ＣｅｕＡＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＶＰ、Ｉ−ＴｌｉＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｐｉ−ＰｓｐＩ、Ｆ−ＳｃｅＩ、Ｆ−ＳｃｅＩＩ、Ｆ−ＳｕｖＩ、Ｆ−ＣｐｈＩ、Ｆ−ＴｅｖＩ、Ｆ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＡｍａＩ、Ｉ−ＡｎｉＩ、Ｉ−ＣｈｕＩ、Ｉ−ＣｍｏｅＩ、Ｉ−ＣｐａＩ、Ｉ−ＣｐａＩＩ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＣｖｕＩ、Ｉ−ＣｖｕＡＩＰ、Ｉ−ＤｄｉＩ、Ｉ−ＤｄｉＩＩ、Ｉ−ＤｉｒＩ、Ｉ−ＤｍｏＩ、Ｉ−ＨｍｕＩ、Ｉ−ＨｍｕＩＩ、Ｉ−ＨｓＮＩＰ、Ｉ−ＬｌａＩ、Ｉ−ＭｓｏＩ、Ｉ−ＮａａＩ、Ｉ−ＮａｎＩ、Ｉ−ＮｃｌＩＰ、Ｉ−ＮｇｒＩＰ、Ｉ−ＮｉｔＩ、Ｉ−ＮｊａＩ、Ｉ−Ｎｓｐ２３６ＩＰ、Ｉ−ＰａｋＩ、Ｉ−ＰｂｏＩＰ、Ｉ−ＰｃｕＩＰ、Ｉ−ＰｃｕＡＩ、Ｉ−ＰｃｕＶＩ、Ｉ−ＰｇｒＩＰ、Ｉ−ＰｏｂＩＰ、Ｉ−ＰｏｒＩ、Ｉ−ＰｏｒＩＩＰ、Ｉ−ＰｂｐＩＰ、Ｉ−ＳｐＢｅｔａＩＰ、Ｉ−ＳｃａＩ、Ｉ−ＳｅｘＩＰ、Ｉ−ＳｎｅＩＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩ、Ｉ−ＳｐｏｍＣＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩＩＰ、Ｉ−ＳｑｕＩＰ、Ｉ−Ｓｓｐ６８０３１、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＪＰ、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＳＴ３Ｐ、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＳＴｅ３ｂＰ、Ｉ−ＴｄｅＩＰ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩＩ、ｉ−ＵａｒＡＰ、ｉ−ＵａｒＨＧＰＡＩＰ、Ｉ−ＵａｒＨＧＰＡ１３Ｐ、Ｉ−ＶｉｎＩＰ、Ｉ−ＺｂｉＩＰ、ＰＩ−ＭｇａＩ、ＰＩ−ＭｔｕＩ、ＰＩ−ＭｔｕＨＩＰ  ＰＩ−ＭｔｕＨＩＩＰ、ＰＩ−ＰｆｕＩ、ＰＩ−ＰｆｕＩＩ、ＰＩ−ＰｋｏＩ、ＰＩ−ＰｋｏＩＩ、ＰＩ−Ｒｍａ４３８１２ＩＰ、ＰＩ−ＳｐＢｅｔａＩＰ、ＰＩ−ＳｃｅＩ、ＰＩ−ＴｆｕＩ、ＰＩ−ＴｆｕＩＩ、ＰＩ−ＴｈｙＩ、ＰＩ−ＴｌｉＩまたはＰＩ−ＴｌｉＩＩからなる群より選択される、項目１０８に記載の直鎖状核酸。
（項目１１４）
前記エンドヌクレアーゼが、内在性ゲノム配列に特異的に結合するように改変されており、該改変されたエンドヌクレアーゼは、もはやその野生型エンドヌクレアーゼ認識配列に結合しない、項目１０８に記載の直鎖状核酸。
（項目１１５）
前記改変されたエンドヌクレアーゼが、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧホーミングエンドヌクレアーゼ、ＨＮＨホーミングエンドヌクレアーゼ、Ｈｉｓ−Ｃｙｓボックスホーミングエンドヌクレアーゼ、ＧＩＹ−ＹＩＧホーミングエンドヌクレアーゼおよびシアノバクテリアホーミングエンドヌクレアーゼからなる群より選択されるホーミングエンドヌクレアーゼに由来する、項目１１４に記載の直鎖状核酸。
（項目１１６）
前記改変されたエンドヌクレアーゼが、Ｈ−ＤｒｅＩ、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＳｃｅＶ、Ｉ−ＳｃｅＶＩ、Ｉ−ＳｃｅＶＩＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、Ｉ−ＣｅｕＡＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＶＰ、Ｉ−ＴｌｉＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｐｉ−ＰｓｐＩ、Ｆ−ＳｃｅＩ、Ｆ−ＳｃｅＩＩ、Ｆ−ＳｕｖＩ、Ｆ−ＣｐｈＩ、Ｆ−ＴｅｖＩ、Ｆ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＡｍａＩ、Ｉ−ＡｎｉＩ、Ｉ−ＣｈｕＩ、Ｉ−ＣｍｏｅＩ、Ｉ−ＣｐａＩ、Ｉ−ＣｐａＩＩ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＣｖｕＩ、Ｉ−ＣｖｕＡＩＰ、Ｉ−ＤｄｉＩ、Ｉ−ＤｄｉＩＩ、Ｉ−ＤｉｒＩ、Ｉ−ＤｍｏＩ、Ｉ−ＨｍｕＩ、Ｉ−ＨｍｕＩＩ、Ｉ−ＨｓＮＩＰ、Ｉ−ＬｌａＩ、Ｉ−ＭｓｏＩ、Ｉ−ＮａａＩ、Ｉ−ＮａｎＩ、Ｉ−ＮｃｌＩＰ、Ｉ−ＮｇｒＩＰ、Ｉ−ＮｉｔＩ、Ｉ−ＮｊａＩ、Ｉ−Ｎｓｐ２３６ＩＰ、Ｉ−ＰａｋＩ、Ｉ−ＰｂｏＩＰ、Ｉ−ＰｃｕＩＰ、Ｉ−ＰｃｕＡＩ、Ｉ−ＰｃｕＶＩ、Ｉ−ＰｇｒＩＰ、Ｉ−ＰｏｂＩＰ、Ｉ−ＰｏｒＩ、Ｉ−ＰｏｒＩＩＰ、Ｉ−ＰｂｐＩＰ、Ｉ−ＳｐＢｅｔａＩＰ、Ｉ−ＳｃａＩ、Ｉ−ＳｅｘＩＰ、Ｉ−ＳｎｅＩＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩ、Ｉ−ＳｐｏｍＣＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩＩＰ、Ｉ−ＳｑｕＩＰ、Ｉ−Ｓｓｐ６８０３１、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＪＰ、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＳＴ３Ｐ、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＳＴｅ３ｂＰ、Ｉ−ＴｄｅＩＰ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩＩ、ｉ−ＵａｒＡＰ、ｉ−ＵａｒＨＧＰＡＩＰ、Ｉ−ＵａｒＨＧＰＡ１３Ｐ、Ｉ−ＶｉｎＩＰ、Ｉ−ＺｂｉＩＰ、ＰＩ−ＭｇａＩ、ＰＩ−ＭｔｕＩ、ＰＩ−ＭｔｕＨＩＰ
ＰＩ−ＭｔｕＨＩＩＰ、ＰＩ−ＰｆｕＩ、ＰＩ−ＰｆｕＩＩ、ＰＩ−ＰｋｏＩ、ＰＩ−ＰｋｏＩＩ、ＰＩ−Ｒｍａ４３８１２ＩＰ、ＰＩ−ＳｐＢｅｔａＩＰ、ＰＩ−ＳｃｅＩ、ＰＩ−ＴｆｕＩ、ＰＩ−ＴｆｕＩＩ、ＰＩ−ＴｈｙＩ、ＰＩ−ＴｌｉＩまたはＰＩ−ＴｌｉＩＩからなる群より選択されるエンドヌクレアーゼに由来する、項目１１４に記載の直鎖状核酸。
（項目１１７）
宿主細胞ゲノムの１つまたはそれを超える標的部位に１つまたはそれを超える外来性核酸を組み込むための方法であって、該方法は、
（ａ）１つまたはそれを超える宿主細胞を、
（ｉ）該宿主細胞ゲノムの１つまたはそれを超える標的部位（ＴＳ）において、相同組換えを介して組み換わることができる１つまたはそれを超える外来性ドナー核酸（ＥＳ）；（ｉｉ）ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）；
（ｉｉｉ）該ＲＧＥＮによる該１つまたはそれを超えるＴＳの部位特異的な認識および切断を可能にする１つまたはそれを超えるリボ核酸；および
（ｉｖ）それ自体との相同組換えまたは該宿主細胞と接触された１つまたはそれを超えるさらなる組換え前の直鎖状核酸との相同組換えが可能な組換え前の直鎖状核酸であって、ここで、該相同組換えによって、選択マーカーのコード配列を含む環状の染色体外核酸が形成される、組換え前の直鎖状核酸
と接触させる工程；
ならびに
（ｂ）該選択マーカーを発現する宿主細胞を選択することにより、宿主細胞ゲノムの該１つまたはそれを超える標的部位に該１つまたはそれを超える外来性核酸を組み込んだ細胞を選択する工程
を含む、方法。
（項目１１８）
前記相同組換えによって、前記環状の染色体外核酸内に前記選択マーカーの完全なコード配列が形成される、項目１１７に記載の方法。
（項目１１９）
少なくとも１つの組換え前の直鎖状核酸が、前記ＲＮＡガイドＤＮＡエンドヌクレアーゼによるＴＳの部位特異的な認識および切断を可能にする前記１つまたはそれを超えるリボ核酸をコードする配列を含む、項目１１７または１１８に記載の方法。
（項目１２０）
前記１つまたはそれを超えるリボ核酸が、単一の連続したガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子においてｃｒＲＮＡ活性およびｔｒａｃｒＲＮＡを含む、項目１１９に記載の方法。
（項目１２１）
少なくとも１つの組換え前の直鎖状核酸が、前記ＲＮＡガイドＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする配列を含む、項目１１７〜１２０のいずれか１項に記載の方法。
（項目１２２）
前記ＲＮＡガイドＤＮＡエンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ９である、項目１１７〜１２１のいずれか１項の項目に記載の方法。
（項目１２３）
前記環状の染色体外核酸の形成が、２つまたは３つの組換え前の直鎖状核酸の相同組換えに起因する、項目１１７〜１２２のいずれか１項に記載の方法。
（項目１２４）
前記１つまたはそれを超える組換え前の直鎖状核酸が、該１つまたはそれを超える組換え前の核酸を含む１つまたはそれを超える環状核酸のＲＧＥＮ切断によってインビボにおいて生成される、項目１１７〜１２３のいずれか１項に記載の方法。
（項目１２５）
複数（ｎ個）の外来性核酸が、前記宿主細胞ゲノムの複数（ｎ個）の標的部位に組み込まれ、ここで、ｎは、少なくとも２であり、工程（ａ）は、前記宿主細胞を、
（ｉ）該複数の外来性核酸であって、ここで、
ｘは、１からｎまで変動する整数であり、各整数ｘに対して、外来性核酸（ＥＳ）ｘの各々は、該宿主細胞ゲノムの該複数（ｎ個）の標的部位から選択される標的部位（ＴＳ）ｘにおいて、相同組換えを介して組み換わることができる、外来性核酸；
（ｉｉ）該標的部位（ＴＳ）ｘの各々に対して、前記ＲＧＥＮによる（ＴＳ）ｘの部位特異的な認識および切断を可能にするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）ｘ
と接触させる工程を含む、項目１１７〜１２４のいずれか１項に記載の方法。
（項目１２６）
前記選択マーカーが、薬物耐性マーカー、蛍光タンパク質、または比色法もしくは蛍光検出法によって検出可能なタンパク質である、項目１１７〜１２５のいずれか１項に記載の方法。
（項目１２７）
ＥＳが、目的の核酸Ｄをさらに含む、項目１１７〜１２６のいずれか１項に記載の方法。
（項目１２８）
Ｄが、選択マーカー、プロモーター、エピトープタグをコードする核酸配列、目的の遺伝子、レポーター遺伝子、および終止コドンをコードする核酸配列からなる群より選択される、項目１２７に記載の方法。
（項目１２９）
前記宿主細胞が、真菌細胞、細菌細胞、植物細胞、昆虫細胞、鳥類細胞、魚類細胞および哺乳動物細胞からなる群より選択される、項目１１７〜１２８のいずれか１項に記載の方法。
（項目１３０）
接触された前記宿主細胞(複数可)が、前記選択する工程の前に、少なくとも約１２、２４、３６、４８、７２時間または７２時間より長い期間にわたって培養される、項目１１７〜１２９のいずれか１項に記載の方法。
（項目１３１）
接触された前記細胞が、前記選択マーカーを発現しない細胞の生存に対して選択する培養条件下で培養される、項目１１７〜１３０のいずれか１項に記載の方法。
（項目１３２）
工程（ｂ）という前記選択する工程が、視覚的検出法、比色法または蛍光検出法によって前記選択マーカーの発現を検出する工程を含む、項目１１７〜１３０のいずれか１項に記載の方法。
（項目１３３）
宿主細胞ゲノムの１つまたはそれを超える標的部位に１つまたはそれを超える外来性核酸を組み込むための組成物であって、該組成物は、
（ａ）宿主細胞ゲノムの１つまたはそれを超える標的部位（ＴＳ）において、相同組換えを介して組み換わることができる１つまたはそれを超える外来性ドナー核酸（ＥＳ）；
（ｂ）ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）または該ＲＧＥＮをコードする核酸；
（ｃ）該ＲＧＥＮによる該１つもしくはそれを超えるＴＳの部位特異的な認識および切断を可能にする１つもしくはそれを超えるリボ核酸、または該１つもしくはそれを超えるリボ核酸をコードする１つもしくはそれを超える核酸；および
（ｄ）それ自体とのインビボでの相同組換えまたは該組成物中の１つもしくはそれを超えるさらなる組換え前の直鎖状核酸とのインビボでの相同組換えが可能な組換え前の直鎖状核酸であって、ここで、該インビボでの相同組換えによって、選択マーカーのコード配列を含む環状の染色体外核酸が形成される、組換え前の直鎖状核酸
を含む、組成物。
（項目１３４）
前記相同組換えによって、前記環状の染色体外核酸内に前記選択マーカーの完全なコード配列が形成される、項目１３３に記載の組成物。
（項目１３５）
少なくとも１つの組換え前の直鎖状核酸が、前記ＲＮＡガイドＤＮＡエンドヌクレアーゼによるＴＳの部位特異的な認識および切断を可能にする前記１つまたはそれを超えるリボ核酸をコードする配列を含む、項目１３３〜１３４のいずれか１項に記載の組成物。
（項目１３６）
前記１つまたはそれを超えるリボ核酸分子が、単一の連続したガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子においてｃｒＲＮＡ活性およびｔｒａｃｒＲＮＡ活性を含む、項目１３５に記載の組成物。
（項目１３７）
少なくとも１つの組換え前の直鎖状核酸が、前記ＲＮＡガイドＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする配列を含む、項目１３３〜１３６のいずれか１項に記載の組成物。
（項目１３８）
前記ＲＮＡガイドＤＮＡエンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ９である、項目１３３〜１３７のいずれか１項に記載の組成物。
（項目１３９）
前記組成物が、相同的に組み換わることにより前記環状の染色体外核酸を形成することができる、２つまたは３つの組換え前の直鎖状核酸を含む、項目１３３〜１３８のいずれか１項に記載の組成物。
（項目１４０）
前記１つまたはそれを超える組換え前の直鎖状核酸が、該１つまたはそれを超える組換え前の核酸を含む１つまたはそれを超える環状核酸のＲＧＥＮ切断によってインビボにおいて生成される、項目１３３〜１３９のいずれか１項に記載の組成物。
（項目１４１）
前記組成物が、
（ａ）前記宿主細胞ゲノムの複数（ｎ個）の標的部位に組み込むことができる複数（ｎ個）の外来性核酸であって、ここで、ｎは、少なくとも２であり、ｘは、１からｎまで変動する整数であり、各整数ｘに対して、外来性核酸（ＥＳ）ｘの各々は、該宿主細胞ゲノムの該複数（ｎ個）の標的部位から選択される標的部位（ＴＳ）ｘにおいて、相同組換えを介して組み換わることができる、外来性核酸；ならびに
（ｂ）該標的部位（ＴＳ）ｘの各々に対して、前記ＲＧＥＮによる（ＴＳ）ｘの部位特異的な認識および切断を可能にするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）ｘ
を含む、項目１３３〜１４０のいずれか１項に記載の組成物。
（項目１４２）
前記選択マーカーが、薬物耐性マーカー、蛍光タンパク質、または比色法もしくは蛍光検出法によって検出可能なタンパク質である、項目１３３〜１４１のいずれか１項に記載の組成物。
（項目１４３）
ＥＳが、目的の核酸Ｄをさらに含む、項目１３３〜１４２のいずれか１項に記載の組成物。
（項目１４４）
Ｄが、選択マーカー、プロモーター、エピトープタグをコードする核酸配列、目的の遺伝子、レポーター遺伝子、および終止コドンをコードする核酸配列からなる群より選択される、項目１４３に記載の組成物。
（項目１４５）
項目１３３〜１４４のいずれか１項に記載の組成物を含む、宿主細胞。
（項目１４６）
前記宿主細胞が、真菌細胞、細菌細胞、植物細胞、昆虫細胞、鳥類細胞、魚類細胞および哺乳動物細胞からなる群より選択される、項目１４５に記載の宿主細胞。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２３Ｄ】
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【図２３Ｅ】
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【図２３Ｆ】
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【図２４】
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【図２５】
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【配列表】
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