(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）イオン強度および／またはｐＨの異なる複数の溶媒に、複数のタンパク質と非特異的に相互作用可能なプローブを溶解するステップと、ここで、前記プローブが、
（ａ）１分子中に少なくとも５個の１級アミノ基を有する、重量平均分子量が１，０００〜５００，０００であるカチオン性ポリマーと、
（ｂ）ナフタレンスルホン酸骨格またはベンゾフラザン骨格を有する環境応答性蛍光団と
を含み、かつ、前記蛍光団が、前記カチオン性ポリマー中の前記１級アミノ基の一部に共有結合しているものであり、
（２）前記ステップ（１）で調製された複数のプローブ溶液に、１または複数のタンパク質を含有する分析試料を添加するステップと、その結果、前記分析試料中のタンパク質と前記プローブとが非特異的に相互作用し、
（３）前記ステップ（２）で分析試料を添加した複数のプローブ溶液の蛍光強度を測定するステップと、
（４）前記ステップ（３）により得られた蛍光強度パターンを、参照試料について得られた蛍光強度パターンと比較するステップと
を含む、タンパク質を含有する試料の分析方法。
【請求項２】
前記環境応答性蛍光団が、ダンシル、ジメチルアミノスルホニルベンゾオキサジアゾールおよびそれらの蛍光性誘導体からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記カチオン性ポリマーが、直鎖状または分岐状のポリアミノ酸、ポリアリルアミン、ポリアミドアミンもしくはポリアルキレンイミンである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ポリアミノ酸が、ポリリジンまたはポリオルニチンである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記カチオン性ポリマー中の前記１級アミノ基の１〜５０％に前記環境応答性蛍光団が共有結合している、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記カチオン性ポリマーの前記環境応答性蛍光団が共有結合していない前記１級アミノ基の少なくとも一部に対して、グアニジウム基、アルキル基、アリール基、カルボキシル基およびアミノ酸からなる群から選択される官能基が導入されている、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記ステップ（３）における蛍光強度の測定が、複数の励起波長および蛍光波長について行われる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記ステップ（４）により、前記分析試料に含有されるタンパク質およびその翻訳後修飾の種類ならびに／または量が判定される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記分析試料が細胞培養上清であり、前記ステップ（４）により、培養中の細胞の種類および／または状態および／または濃度が判定される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記培養中の細胞の状態が、細胞の分化度である、請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質およびその翻訳後修飾の種類ならびに／または量を判定する方法、ならびに、培養中の細胞の種類および／または状態および／または濃度を判定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質は、細胞内において、ＤＮＡからｍＲＮＡへの転写、ｍＲＮＡからポリペプチドへの翻訳を経て合成され、その後、種々の化学修飾を受ける。これらは翻訳後修飾（ＰＴＭ）と呼ばれ、リン酸化、アセチル化、ユビキチン化、糖化など、これまでに３００種類以上のＰＴＭが報告されており、一種類のＰＴＭまたは複数のＰＴＭのクロストークにより、タンパク質の活性、局在、相互作用などが調節され、細胞機能が制御されることが知られている。また、近年では、これらのＰＴＭの異常が、がん、心血管疾患、自己免疫疾患など、様々な疾患の病因・病態に直接的に関与していることが明らかにされつつある。そのため、ＰＴＭの解析は、細胞機能の解明のみならず、疾患の発病機構や病態の解明や、さらに、それらに基づく新たな診断方法の確立や新薬開発のために極めて重要である。【０００３】
短時間かつ簡易にＰＴＭを検出するためには、ＰＴＭ特異的抗体が用いられる。これまでに数千種類に及ぶＰＴＭ特異的抗体が市販化されており、ウェスタンブロッティング、フローサイトメトリー、クロマチン免疫沈降などの手法により、様々な生化学的アッセイが行われている。しかし、抗体はタンパク質であるため不安定であり、また、その作製には多大な時間的・経済的コストがかかるという問題がある。加えて、ＰＴＭ特異的抗体は、同一タンパク質における修飾の有無というわずかな差異を区別できることが必要であり、このような高品質な抗体を作製することは極めて困難である。さらに、大多数のＰＴＭ特異的抗体はポリクローナル抗体であるため、ロットごとの品質差が問題になることも多い。こうした事情に鑑み、容易かつ安価に製造でき、安定性が高く、ロット差が小さい化合物を用いた、新しいＰＴＭ検出方法が求められている。【０００４】
上記の諸問題を解決する可能性のある方法として、交差反応型センシング法によるタンパク質の同定法が挙げられる。この方法では、分析対象とするサンプル中の特定の標的タンパク質に特異的に相互作用する抗体のような分子を用いるのではなく、分析対象とするサンプルに含まれる複数のタンパク質に交差反応する分子を用い、複数のタンパク質と交差反応分子との反応パターンを統計的に解析することにより、サンプル中のタンパク質を同定する。そのため、交差反応型センシング法では、標的タンパク質に特異的に相互作用する分子を開発する必要がなく、開発が比較的容易であるという利点がある。【０００５】
２０１０年頃までに、交差反応型センシング法により種類の異なる複数のタンパク質を判別できることが報告されていたが（特許文献１、非特許文献１、非特許文献２）、最近では、同一タンパク質におけるＰＴＭの有無を判別できることも報告されている。例えば、ｐ−スルホナトカリックス誘導体と蛍光色素との複合体を用いて、ヒストンのＮ末端尾部におけるメチル化やアセチル化の有無を判別する方法が報告されている（特許文献２、非特許文献３）。しかし、この方法は、ｐ−スルホナトカリックス誘導体のリジン残基に対する特異的認識能を利用したものであるため、セリンやチロシンのような中性アミノ酸に生じるリン酸化や、グルタミン酸やアスパラギン酸のようなアニオン性アミノ酸に生じるメチル化などの検出には適していない。また、タンパク質のリン酸化部位と特異的に相互作用するペプチドを導入した１，３，５−トリアクリロイルヘキサヒドロ−１，３，５−トリアジンと蛍光色素との複合体を用いて、タンパク質のリン酸化の有無を判別する方法が報告されている（非特許文献４）。しかし、この方法は、ＰＴＭを特異的に認識するペプチドを用いるため、ＰＴＭごとに異なるペプチドを作製する必要があり、広範なＰＴＭの解析に適用するのは困難である。さらに、上記いずれの方法も、ＰＴＭを認識する化合物と、検出のための蛍光色素とを組み合わせて使用するため、検出系の構築が複雑であり、また、検出感度も低い（４〜５μＭ）ため、解析の精度や効率の点で十分なものではなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許8021891号
【特許文献２】米国特許出願公開第2014/0357503号明細書
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】You, C. C. et al., Nat. Nanotechnol., Vol. 2, pp. 318-323 (2007)
【非特許文献２】De, M. et al., Nat. Chem., Vol. 1, pp. 461-465 (2009)
【非特許文献３】Minaker, S. A. et al., J. Am. Chem. Soc., Vol. 134, pp. 11674-11680 (2012)
【非特許文献４】Zamora-Olivares, D. et al., J. Am. Chem. Soc., Vol. 135, pp. 14814-14820 (2013)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、従来技術の諸問題を解消し、タンパク質の種類のみならず、同一タンパク質におけるＰＴＭの有無についても判別することができる、容易かつ高精度な解析方法を提供することを目的としてなされたものである。さらに、本発明は、培養中の細胞の種類および／または状態および／または濃度を、高精度かつ非侵襲的に判別する方法を提供することを目的としてなされたものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、鋭意研究の結果、広範な種類のＰＴＭを高感度に検出できるプローブを得ることに成功した。さらに、前記プローブを用いて、対象タンパク質におけるＰＴＭの有無・種類を高精度で判別し、定量する方法、および、培養中の細胞の種類および／または状態および／または濃度を、細胞培養上清のタンパク質組成の変化に基づいて判定する方法を確立した。【００１０】
すなわち、本発明は、一実施形態によれば、タンパク質およびその翻訳後修飾の種類ならびに／または量を判別するためのプローブであって、（１）１分子中に少なくとも５個の１級アミノ基を有する、重量平均分子量が１，０００〜５００，０００であるカチオン性ポリマーと、（２）ナフタレンスルホン酸骨格またはベンゾフラザン骨格を有する環境応答性蛍光団とを含み、前記蛍光団が、前記カチオン性ポリマー中の前記１級アミノ基の一部に共有結合しているプローブを提供するものである。【００１１】
また、本発明は、一実施形態によれば、イオン強度および／またはｐＨの異なる複数の溶媒に溶解した上記プローブを、基板上の複数の分離した区画に配置してなる、タンパク質およびその翻訳後修飾の種類ならびに／または量を判別するためのアレイを提供するものである。【００１２】
また、本発明は、一実施形態によれば、（１）イオン強度および／またはｐＨの異なる複数の溶媒に、複数のタンパク質と非特異的に相互作用可能なプローブを溶解するステップと、ここで、前記プローブが、（ａ）１分子中に少なくとも５個の１級アミノ基を有する、重量平均分子量が１，０００〜５００，０００であるカチオン性ポリマーと、（ｂ）ナフタレンスルホン酸骨格またはベンゾフラザン骨格を有する環境応答性蛍光団とを含み、かつ、前記蛍光団が、前記カチオン性ポリマー中の前記１級アミノ基の一部に共有結合しているものであり、（２）前記ステップ（１）で調製された複数のプローブ溶液に、１または複数のタンパク質を含有する分析試料を添加するステップと、その結果、前記分析試料中のタンパク質と前記プローブとが非特異的に相互作用し、（３）前記ステップ（２）で分析試料を添加した複数のプローブ溶液の蛍光強度を測定するステップと、（４）前記ステップ（３）により得られた蛍光強度パターンを、参照試料について得られた蛍光強度パターンと比較するステップとを含む、タンパク質を含有する試料の分析方法を提供するものである。【００１３】
前記環境応答性蛍光団は、ダンシル、ジメチルアミノスルホニルベンゾオキサジアゾールおよびそれらの蛍光性誘導体からなる群から選択されることが好ましい。【００１４】
前記カチオン性ポリマーは、直鎖状または分岐状のポリアミノ酸、ポリアリルアミン、ポリアミドアミンもしくはポリアルキレンイミンであることが好ましい。【００１５】
前記ポリアミノ酸は、ポリリジンまたはポリオルニチンであることが好ましい。【００１６】
前記カチオン性ポリマー中の前記１級アミノ基の１〜５０％に前記環境応答性蛍光団が共有結合していることが好ましい。【００１７】
前記カチオン性ポリマーの前記環境応答性蛍光団が共有結合していない前記１級アミノ基の少なくとも一部に対して、グアニジウム基、アルキル基、アリール基、カルボキシル基およびアミノ酸からなる群から選択される官能基が導入されていてもよい。【００１８】
前記（３）における蛍光強度の測定は、複数の励起波長および蛍光波長について行われることが好ましい。【００１９】
前記ステップ（４）により、前記分析試料に含有されるタンパク質およびその翻訳後修飾の種類ならびに／または量が判定されることが好ましい。【００２０】
前記分析試料が細胞培養上清であり、前記ステップ（４）により、培養中の細胞の種類および／または状態および／または濃度が判定されることが好ましい。【００２１】
前記培養中の細胞の状態は、細胞の分化度であることが好ましい。
【発明の効果】
【００２２】
本発明に係るプローブは、任意のタンパク質に対して相互作用することができ、対象タンパク質の配列やＰＴＭの導入部位によらず、対象タンパク質における種々のＰＴＭの有無を高感度に検出することができる。【００２３】
また、本発明に係るプローブをイオン強度および／またはｐＨの異なる複数の溶媒に溶解して用いることにより、対象タンパク質の種類やＰＴＭの導入状態に応じて「固有の蛍光フィンガープリント」を得ることができる。そのため、本発明に係るタンパク質およびその翻訳後修飾の種類ならびに／または量を判別する方法では、１種類のプローブ分子のみを用いて、広範な種類のタンパク質および／またはＰＴＭについて、容易に解析することが可能となる。さらに、本発明のタンパク質を含有する試料の分析方法により、わずか１種類または数種類のプローブ分子を用いて、培養中の細胞の種類および／または状態および／または濃度を、高精度かつ非侵襲的に判別することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】本発明の一実施形態による翻訳後修飾の種類ならびに／または量を判別する方法の原理を示す模式図である。
【図２】本発明に係るプローブに使用できるカチオン性ポリマーの具体例を示す図である。
【図３】実施例において合成したプローブ（化合物１〜７）の構造式を示す図である。
【図４】ＰＬＬ−Ｄｎｃ（化合物１）のキャラクタリゼーションの結果を示す図である。
【図５】ＰＬＬ−ＤＢＤ（化合物２）のキャラクタリゼーションの結果を示す図である。
【図６】ＰＬＬ（ユニット数：１０）−Ｄｎｃ（化合物３：Ｐ１）のキャラクタリゼーションの結果を示す図である。
【図７】ＰＬＬ（ユニット数：１０）−Ｄｎｃ（化合物３：Ｐ１）およびＰＬＬ（ユニット数：５５）−Ｄｎｃ（化合物４：Ｐ２）のキャラクタリゼーションの結果を示す図である。
【図８】ＰＬＬ（ユニット数：２５８）−Ｄｎｃ（化合物５：Ｐ３）、ポリエチレングリコール−ＰＬＬブロック共重合体−Ｄｎｃ（化合物６：Ｐ４）、およびＰＡＭＡＭデンドリマー−Ｄｎｃ（化合物７：Ｐ５）のキャラクタリゼーションの結果を示す図である。
【図９】６種類の溶媒にＰＬＬ−Ｄｎｃ（化合物１）を溶解させたプローブ溶液に対して、各種アルブミンを添加し、４種類の励起波長／蛍光波長のセットにより蛍光強度を測定して得られた蛍光フィンガープリントを示す図である。
【図１０】図９の結果（溶媒条件：ｐＨ５．５、ｐＨ７．０、ｐＨ８．５）を線形判別分析により解析し、得られた第二判別スコアまでをプロットした図である。
【図１１】６種類の溶媒にＰＬＬ−ＤＢＤ（化合物２）を溶解させたプローブ溶液に対して、各種アルブミンを添加した場合の蛍光強度の変化量を示す図である。
【図１２】図１１の結果（溶媒条件：ｐＨ５．５、ｐＨ７．０、ｐＨ８．５）を線形判別分析により解析し、得られた第二判別スコアまでをプロットした図である。
【図１３】２種類の溶媒にプローブ（化合物３〜７：Ｐ１〜５）を溶解させたプローブ溶液に対して、５種類のヒト血漿タンパク質および３種類の哺乳類由来血清アルブミンを添加した場合の蛍光強度の変化量を示す図である。
【図１４】図１３の結果を線形判別分析により解析し、得られた第二判別スコアまでをプロットした図である。
【図１５】図１３の結果（溶媒条件：ｐＨ５．５）を線形判別分析により解析し、得られた第二判別スコアまでをプロットした図である。
【図１６】図１３の結果（溶媒条件：ｐＨ８．５）を線形判別分析により解析し、得られた第二判別スコアまでをプロットした図である。
【図１７】図１３の結果を階層的クラスター分析により解析して得られたデンドログラムを示す図である。
【図１８】６種類の溶媒にＰＬＬ−Ｄｎｃ（化合物１）を溶解させたプローブ溶液を用いて、翻訳後修飾を有する／有しない各種アルブミンについて得られた蛍光フィンガープリントを線形判別分析により解析し、得られた第三判別スコアまでをプロットした図である。
【図１９】６種類の溶媒にＰＬＬ−Ｄｎｃ（化合物１）を溶解させたプローブ溶液を用いて、翻訳後修飾を有する／有しない各種アルブミンについて得られた蛍光フィンガープリントを階層的クラスター分析により解析して得られたデンドログラムを示す図である。
【図２０】６種類の溶媒にＰＬＬ−Ｄｎｃ（化合物１）を溶解させたプローブ溶液を用いて、翻訳後修飾を有する／有しないタンパク質の混合物について得られた蛍光フィンガープリントを線形判別分析により解析し、得られた第二判別スコアまでをプロットした図である。
【図２１】本発明の一実施形態による培養中の細胞の種類および／または状態および／または濃度を判定する方法の原理を示す模式図である。
【図２２】５種類のプローブ溶液（化合物３〜７：Ｐ１〜５／２０ｍＭ  ＭＯＰＳ（ｐＨ７．４））に対して、異なる培養時間経過後のＡ５４９細胞の培養上清を添加した場合の蛍光強度の変化量を示す図である。
【図２３】図２２の結果を線形判別分析により解析し、得られた第二判別スコアまでをプロットした図である。
【図２４】５種類のプローブ溶液（化合物３〜７：Ｐ１〜５／２０ｍＭ  ＭＯＰＳ（ｐＨ７．４））に対して、４種類の細胞の培養上清を添加した場合の蛍光強度の変化量を示す図である。
【図２５】図２４の結果を線形判別分析により解析し、得られた第二判別スコアまでをプロットした図である。
【図２６】５種類のプローブ溶液（化合物３〜７：Ｐ１〜５／２０ｍＭ  ＭＯＰＳ（ｐＨ７．４））に対して、異なる細胞濃度におけるＡ５４９細胞の培養上清を添加した場合の蛍光強度の変化量を示す図である。
【図２７】図２６の結果を線形判別分析により解析し、（ａ）得られた第二判別スコアまでをプロットした図、および（ｂ）得られた第一判別スコアに対して細胞濃度をプロットした図である。
【図２８】５種類のプローブ溶液（化合物３〜７：Ｐ１〜５／２０ｍＭ  ＭＯＰＳ（ｐＨ７．４））に対して、異なる比率で混合したＨｅｐＧ２細胞およびＵＥ７Ｔ−１３細胞の培養上清を添加した場合の蛍光強度の変化量を示す図である。
【図２９】図２６の結果を線形判別分析により解析し、（ａ）得られた第二判別スコアまでをプロットした図、および（ｂ）得られた第一判別スコアに対してＨｅｐＧ２の比率をプロットした図である。
【図３０】５種類のプローブ溶液（化合物３〜７：Ｐ１〜５／２０ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ５．４））に対して、分化誘導を行ったまたは行っていないＵＥ７Ｔ−１３細胞の培養上清を添加した場合の蛍光強度の変化量を示す図である。
【図３１】図３０の結果を線形判別分析により解析し、得られた第二判別スコアまでをプロットした図である。
【図３２】分化誘導を行ったまたは行っていないＵＥ７Ｔ−１３細胞をアリザリンレッドＳによって染色した明視野顕微鏡像である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
以下、本発明を詳細に説明するが、本発明は本明細書中に説明した実施形態に限定されるものではない。
【００２６】
本発明は、第一の実施形態によれば、タンパク質およびその翻訳後修飾の種類ならびに／または量を判別するための、ならびに、培養中の細胞の種類および／または状態および／または濃度を判定するためのプローブであって、（１）１分子中に少なくとも５個の１級アミノ基を有する、重量平均分子量が１，０００〜５００，０００であるカチオン性ポリマーと、（２）ナフタレンスルホン酸骨格またはベンゾフラザン骨格を有する環境応答性蛍光団とを含み、前記蛍光団が、前記カチオン性ポリマーの前記１級アミノ基の一部に共有結合しているプローブである。
【００２７】
本実施形態のプローブが対象とする「タンパク質」は、任意のアミノ酸配列からなる任意のものであってよく、例えば、動物由来、植物由来、微生物由来、ウイルス由来の任意のタンパク質であってよい。本実施形態のプローブが対象とするタンパク質は、以下に限定されないが、例えば、アルブミン、フィブリノーゲン、α１−アンチトリプシン、トランスフェリン、イムノグロブリン、Ｃ反応性タンパク質などの血漿タンパク質；ＥＲＫ、Ａｋｔ、ＭＥＫ、ｐ３８、ペプシン、アミラーゼ、リパーゼなどの酵素；ミオグロビン、ヘモグロビン、コンカナバリン、ラクトグロブリン、ラクトアルブミンなどが挙げられる。また、本実施形態のプローブが対象とするタンパク質は、上記のようなタンパク質の全体であってもよいし、または、そのペプチド断片であってもよい。ペプチド断片のアミノ酸配列は任意のものであってよく、また、その長さも特に限定されない。
【００２８】
本実施形態のプローブが対象とする「翻訳後修飾」とは、ｍＲＮＡから翻訳されたポリペプチドが受ける任意の修飾を意味する。本実施形態のプローブが対象とする翻訳後修飾としては、以下に限定されないが、例えば、リン酸化、糖化、アセチル化、メチル化、アセチル化、アルキル化、グリコシル化、酸化、シトルリン化、ヒドロキシル化、ユビキチン化、ＳＵＭＯ化などが挙げられる。また、本実施形態のプローブが対象とする翻訳後修飾は、対象タンパク質の任意の１以上の位置に導入されたものであってよい。
【００２９】
本実施形態のプローブにおいて使用されるカチオン性ポリマー（１）は、重量平均分子量が１，０００〜５００，０００であり、当該ポリマー１分子中に少なくとも５個の１級アミノ基を有するものであれば、任意のものであってよい。ここで、「ポリマー」とは、同一であっても異なってもよい２以上のモノマーが重合された化合物を意味し、したがって、ホモポリマーであってもよいし、コポリマーであってもよい。また、ポリマーの重合度も特に限定されず、したがって、「ポリマー」にはオリゴマーも含まれる。
【００３０】
本実施形態におけるカチオン性ポリマーの重量平均分子量は、１，０００〜５００，０００であり、好ましくは１，５００〜２００，０００であり、特に好ましくは２，０００〜１００，０００である。
【００３１】
本実施形態におけるカチオン性ポリマーは、当該ポリマー１分子中に少なくとも５個、好ましくは７個以上、特に好ましくは１０個以上の１級アミノ基を有する。
【００３２】
本実施形態における好ましいカチオン性ポリマーは、直鎖状または分岐状のポリアミノ酸、ポリアリルアミン、ポリアミドアミンもしくはポリアルキレンイミンである。本実施形態における好ましいカチオン性ポリマーの例を図２に示す。さらに、これらのカチオン性ポリマーを、ポリエチレングリコールとのコポリマーとしてもよい。
【００３３】
本実施形態におけるポリアミノ酸は、同種類のアミノ酸残基が重合されたものであってもよいし、異なる種類のアミノ酸残基が重合されたものであってもよい。また、ポリアミノ酸を構成するアミノ酸残基は、Ｌ体またはＤ体のいずれであってもよい。ポリアミノ酸の例としては、ポリリジン、ポリオルニチン、リジンとフェニルアラニンのランダムコポリマー、リジンとチロシンのランダムコポリマーなどが挙げられる。本実施形態における好ましいポリアミノ酸は、ポリリジンまたはポリオルニチンである。
【００３４】
本実施形態におけるポリアルキレンイミンの例としては、ポリエチレンイミン、ポリプロピレンイミン、ポリブチレンイミンなどが挙げられる。本実施形態における好ましいポリアルキレンイミンは、ポリエチレンイミンである。
【００３５】
本実施形態のプローブでは、環境応答性蛍光団（２）として、ナフタレンスルホン酸骨格またはベンゾフラザン骨格を有する蛍光団が使用される。ここで、「環境応答性蛍光団」とは、蛍光分子周辺の環境に応じて蛍光特性が変化する蛍光団を意味する。
【００３６】
本実施形態のプローブにおいて使用されるナフタレンスルホン酸骨格を有する環境応答性蛍光団（２）には、例えば、５−ジメチルアミノナフタレン−１−スルホニル（ダンシル）、１−アニリノナフタレン−８−スルホン酸（ＡＮＳ）、Ｎ−メチル−２−アニリノナフタレン−６−スルホン酸（ＭＡＮＳ）、２−ｐ−トルイジニルナフタレン−６−スルホン酸（ＴＮＳ）またはそれらの蛍光性誘導体などが挙げられる。本実施形態における好ましいナフタレンスルホン酸骨格を有する環境応答性蛍光団は、ダンシルまたはその蛍光性誘導体である。
【００３７】
本実施形態のプローブにおいて使用されるベンゾフラザン骨格を有する環境応答性蛍光団（２）には、例えば、４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノスルホニル）−２，１，３−ベンゾキサジアゾール（ＤＢＤ）、７−ニトロ−２，１，３−ベンゾキサジアゾール（ＮＢＤ）、４−（アミノスルホニル）−２，１，３−ベンゾキサジアゾール（ＡＢＤ）、２，１，３−ベンゾキサジアゾール−４−スルホン酸アンモニウム（ＳＢＤ）またはそれらの蛍光性誘導体などが挙げられる。本実施形態における好ましいベンゾフラザン酸骨格を有する環境応答性蛍光団は、ＤＢＤまたはその蛍光性誘導体である。
【００３８】
本実施形態のプローブは、カチオン性ポリマー（１）中の１級アミノ基の一部に環境応答性蛍光団（２）が共有結合により導入されてなる。ここで、「一部」とは、カチオン性ポリマー分子中の１級アミノ基のうちの１〜５０％であることが好ましく、特に好ましくは５〜２０％である。
【００３９】
本実施形態のプローブは、従来公知の化学合成方法や、以下の実施例において記載する化学合成方法およびそれに準ずる化学合成方法により合成することができる。
【００４０】
本実施形態のプローブは、環境応答性蛍光団が導入されていない１級アミノ基の少なくとも一部に対して、グアニジウム基、カルボキシル基、アルキル基、アリール基およびアミノ酸からなる群から選択される官能基が導入されていてもよい。本実施形態におけるアルキル基は、好ましくはＣ１−１０であり、特に好ましくはＣ１−５である。また、アルキル基には、直鎖状および文枝鎖状のいずれの形態のものも含まれる。本実施形態におけるアリール基としては、例えば、フェニル基、インデニル基、ナフチル基、ジフェニルメチル基、トリフェニルメチル基などが挙げられる。本実施形態におけるアミノ酸としては、ロイシン、バリン、イソロイシン、チロシン、トリプトファン、フェニルアラニン、セリン、アスパラギン、グルタミンなどが挙げられる。
【００４１】
本実施形態において、アミノ基への官能基の導入は、従来公知の化学合成方法により行うことができる。アミノ基へのグアニジウム基の導入は、例えば、１Ｈ−ピラゾール−１−カルボキサミジン塩酸塩を用いて行うことができる（Bernatowicz, M. S. et al., J. Org. Chem., 1992, 57 (8), pp. 2497-2502）。アミノ基へのカルボキシル基、アルキル基またはアリール基の導入は、例えば、無水酢酸、無水フタル酸、ナフタレンジカルボン酸無水物などのカルボン酸無水物を用いたアセチル化反応により行うことができる。アミノ基へのアミノ酸の導入は、例えば、アミノ酸のカルボキシル基を脱水縮合させることにより行うことができる。
【００４２】
本実施形態のプローブは、ナフタレンスルホン酸骨格またはベンゾフラザン骨格を有する蛍光団（２）の環境応答性を利用して、カチオン性ポリマー（１）が相互作用するタンパク質およびその翻訳後修飾の種類ならびに／または量を判別することができる。また、本実施形態のプローブは、分析試料中に含まれる１または複数のタンパク質と非特異的に相互作用することにより、分析試料中のタンパク質組成の変化の総和を検出することができる。
【００４３】
本発明は、第二の実施形態によれば、イオン強度および／またはｐＨの異なる複数の溶媒に溶解した上記プローブを、基板上の複数の分離した区画に配置してなる、タンパク質およびその翻訳後修飾の種類ならびに／または量を判別するための、ならびに、培養中の細胞の種類および／または状態および／または濃度を判定するためのアレイである。
【００４４】
本実施形態のプローブが対象とする「タンパク質」および「翻訳後修飾」は、第一の実施形態において定義したものと同様である。
【００４５】
本実施形態のアレイは、イオン強度および／またはｐＨの異なる複数の溶媒に、上記プローブを溶解したものを使用する。溶媒は、例えば２種類以上の異なるイオン強度および／またはｐＨ条件のものを使用することができ、好ましくは３種類以上、特に好ましくは６種類以上の異なるイオン強度および／またはｐＨ条件のものを使用することができる。また、本実施形態のアレイは、１種類のプローブを用いて調製してもよいが、多種類のプローブを用いて調製することがより好ましく、例えば２種類以上、好ましくは３種類以上、特に好ましくは６種類以上のプローブを用いることができる。したがって、例えば、２種類の溶媒と２種類のプローブを用いれば４種類のプローブ溶液が調製され、５種類の溶媒と３種類のプローブを用いれば１５種類のプローブ溶液が調製される。
【００４６】
プローブを溶解するための溶媒は、任意のバッファーおよび／または塩を含む水性溶媒であってよい。バッファーとしては、例えば、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＥＰＰＳ、ＨＥＰＥＳ、Ｔｒｉｓ、リン酸、酢酸、クエン酸、ホウ酸、グリシンなどが挙げられる。塩としては、例えば、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、Ｎａ２ＳＯ４、Ｋ２ＳＯ４、ＭｇＳＯ４、ＮａＩ、ＮａＳＣＮなどが挙げられる。本実施形態において、溶媒のｐＨは、４〜１０であることが好ましく、溶媒のイオン強度は、１０〜５００ｍＭであることが好ましい。また、本実施形態におけるプローブの濃度は、０．１〜１００μｇ／ｍＬであることが好ましい。
【００４７】
本実施形態のアレイは、溶媒に溶解したプローブ溶液を、基板上の複数の分離した区画に配置することにより調製することができる。基板としては、透明なガラスまたはプラスチック製のものを用いることができ、例えば、９６穴プラスチックプレートなどのマルチウェルプレートを使用することができる。
【００４８】
本発明は、第三の実施形態によれば、（１）イオン強度および／またはｐＨの異なる複数の溶媒に、複数のタンパク質と非特異的に相互作用可能なプローブを溶解するステップと、ここで、前記プローブが、（ａ）１分子中に少なくとも５個の１級アミノ基を有する、重量平均分子量が１，０００〜５００，０００であるカチオン性ポリマーと、（ｂ）ナフタレンスルホン酸骨格またはベンゾフラザン骨格を有する環境応答性蛍光団とを含み、かつ、前記蛍光団が、前記カチオン性ポリマー中の前記１級アミノ基の一部に共有結合しているものであり、（２）前記ステップ（１）で調製された複数のプローブ溶液に、１または複数のタンパク質を含有する分析試料を添加するステップと、その結果、前記分析試料中のタンパク質と前記プローブとが非特異的に相互作用し、（３）前記ステップ（２）で分析試料を添加した複数のプローブ溶液の蛍光強度を測定するステップと、（４）前記ステップ（３）により得られた蛍光強度パターンを、参照試料について得られた蛍光強度パターンと比較するステップとを含む、タンパク質を含有する試料の分析方法である。
【００４９】
本実施形態における「タンパク質」、「プローブ」、「ポリマー」、「カチオン性ポリマー」および「環境応答性蛍光団」は、第一の実施形態において定義したものと同様である。
【００５０】
本実施形態の方法では、イオン強度および／またはｐＨの異なる複数の溶媒に、上記プローブを溶解する。ここで、本実施形態のプローブは、複数のタンパク質と非特異的に相互作用可能であり、「複数のタンパク質」には、種類の異なる１以上のタンパク質だけでなく、翻訳後修飾の種類および／または量において異なる同一タンパク質も含まれ得る。また、本実施形態における「溶媒」は、第二の実施形態において定義したものと同様であり、上で記載したようにプローブ溶液を調製することができる。また、上で記載したのと同様に、複数の溶媒と多種類のプローブを用いることができ、溶媒の種類とプローブの種類を増やすことにより、より多次元のデータを得ることができる。例えば、３種類のプローブと２種類の溶媒を用いれば６次元のデータを得ることができ、５種類のプローブと３種類の溶媒を用いれば１５次元のデータを得ることができる。
【００５１】
次いで、複数のプローブ溶液に対し、１または複数のタンパク質を含有する分析試料を添加する。添加されるタンパク質の最終濃度は１ｎＭ〜１ｍＭであってよく、好ましくは５ｎＭ〜１０μＭである。添加する分析試料中のタンパク質濃度が未知の場合には、試料を適宜段階希釈して添加してもよい。ここで、分析試料は、１種類のタンパク質を含有するものであってもよいし、複数種類のタンパク質を含有するものであってもよく、さらに、それらのタンパク質は、１以上の任意の翻訳後修飾を含有してもよい。タンパク質を含有する分析試料としては、例えば、血液、血清、血漿、尿、唾液、細胞破砕液、細胞分泌液などの生体液試料や、細胞培養上清などが挙げられる。本ステップにおいて、プローブは、試料中に含有されるタンパク質に対し、その種類や翻訳後修飾の種類に関係なく、非特異的に相互作用する。
【００５２】
次いで、分析試料を添加した複数のプローブ溶液の蛍光強度を測定する。本実施形態の方法では、励起波長３００〜５００ｎｍ、蛍光波長４００〜７００ｎｍにおいて蛍光強度を測定することができる。また、本実施形態の方法では、各測定対象につき、複数の励起波長／蛍光波長のセット（例えば、励起波長（ｎｍ）／蛍光波長（ｎｍ）：３２０／５２０、３４０／４８０、３４０／５２０、３４０／５４０など）における蛍光強度を測定することが好ましく、例えば２セット、３セット、または４セットの励起波長／蛍光波長により蛍光強度を測定することができる。
【００５３】
上記測定された蛍光強度は、試料中に含まれるタンパク質の種類や翻訳後修飾の導入状態に応じて変化し、さらに、プローブを溶解する溶媒の条件によっても変化する。そのため、本ステップにより、試料に固有の蛍光強度のパターン（蛍光フィンガープリント）を得ることができる。
【００５４】
次いで、分析試料について得られた蛍光強度パターンを、参照試料について得られた蛍光強度パターンと比較する。参照試料についての蛍光強度パターンは、分析試料と並行して蛍光強度の測定を行うことにより取得してもよいし、予め準備された所定の蛍光強度パターンを用いてもよい。蛍光強度パターンの比較は、好ましくは、主成分分析、線形判別分析、階層的クラスター分析などの多変量解析により次元数を圧縮し、蛍光フィンガープリント間の差異を２次元または３次元に圧縮変換して比較することができる。
【００５５】
本実施形態の方法は、蛍光強度のパターンの違いのみに基づいて試料を分析することができる。そのため、本実施形態における参照試料は、その中に含有されるタンパク質の組成が特定されたものであってもよいし、特定されていないものであってもよい。参照試料中のタンパク質組成が特定されている場合には、蛍光強度のパターンの違いに基づいて、分析試料中に含有されるタンパク質およびその翻訳後修飾の種類ならびに／または量を判定することができる。一方、参照試料中のタンパク質組成が特定されていない場合であっても、蛍光強度のパターンの違いに基づいて、タンパク質を含有する分析試料を分析することが可能である。
【００５６】
したがって、特定の実施形態によれば、分析試料に含有されるタンパク質およびその翻訳後修飾の種類ならびに／または量を判定することができる。この場合には、タンパク質およびその翻訳後修飾の種類ならびに／または量が特定された参照試料を用いることが好ましい。
【００５７】
上記特定の実施形態の概略を図１に示す。図１では、プローブの例として、ポリ−Ｌ−リジンに対してダンシルを導入したプローブ（ＰＬＬ−Ｄｎｃ）およびポリ−Ｌ−リジンに対してジメチルアミノスルホニルベンゾオキサジアゾールを導入したプローブ（ＰＬＬ−ＤＢＤ）を示す。これらのプローブに、タンパク質（例えばＢＳＡ（翻訳後修飾なし）、ＢＳＡ−Ｐｈｏｓ（リン酸化）、ＢＳＡ−Ｍｅ（メチル化））を相互作用させると、プローブの蛍光強度が増加するが、その増加量が翻訳後修飾の種類／量に応じて変化する（図１中段）。さらに、プローブの蛍光強度の変化量は、プローブを溶解する溶媒の条件によっても変化するため、異なる複数の溶媒を用いることにより、対象タンパク質に固有の蛍光強度のパターン（蛍光フィンガープリント）を得ることができる（図１下段）。したがって、タンパク質およびその翻訳後修飾の種類ならびに／または量が特定された参照試料を用いることにより、分析試料中のタンパク質およびその翻訳後修飾の種類ならびに／または量を判定することができる。例えば、ＢＳＡ、ＢＳＡ−ＰｈｏｓおよびＢＳＡ−Ｍｅを参照試料として、分析試料について得られた蛍光フィンガープリントがＢＳＡ−Ｐｈｏｓについて得られた蛍光フィンガープリントの分布と最も確率的に近ければ、分析試料中のＢＳＡがリン酸化されていることが推定または特定される。また、例えば、ＢＳＡとＢＳＡ−Ｐｈｏｓを異なる比率で混合したものを参照試料として、それらについて得られた蛍光フィンガープリントを線形判別分析した結果に基づき検量線を作成して利用することにより、分析試料中のＢＳＡのリン酸化率を定量することができる。
【００５８】
また、特定の実施形態によれば、細胞培養上清を分析試料として用いることにより、培養中の細胞の種類および／または状態および／または濃度を判定することができる。血清を含有した培地中で細胞を培養すると、細胞は、培地中の血清タンパク質を消費する一方、種々のタンパク質を産生し、培地中に分泌する。この細胞の消費および分泌（ＣＯｎｓｕｍｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  ＲＥｌｅａｓｅ：ＣＯＲＥ）プロファイルは、細胞の種類または状態ごとに異なるため、細胞培養上清を分析して得たＣＯＲＥプロファイルに基づいて、細胞の種類／状態／濃度を特定することができる。ここで、従来のメタボローム解析手法では、細胞培養上清中に存在する種々のタンパク質をそれぞれ定量解析して細胞のＣＯＲＥプロファイルを取得する。これに対し、本実施形態の方法では、細胞培養上清中に存在する種々のタンパク質とプローブとの非特異的相互作用の総和を反映した蛍光強度パターン（蛍光フィンガープリント）を取得し、参照試料についての蛍光強度パターンと比較することにより、ＣＯＲＥプロファイルの変化を検出する。
【００５９】
すなわち、特定の実施形態において、参照試料は、例えば、細胞を培養する前の新鮮培地、または、細胞の種類および／または状態および／または濃度が既知の培養から得た細胞培養上清であることが好ましい。
【００６０】
上記特定の実施形態の概略を図２１に示す。図２１では、細胞培養上清を分析試料とした例を示す。本実施形態におけるプローブは、細胞培養上清に含有される種々のタンパク質に対して非特異的に相互作用し、その相互作用の総和が蛍光強度として測定される。この蛍光強度は、培地中に含まれるタンパク質の組成に応じて変化する。したがって、細胞培養上清について得られた蛍光強度パターンを比較することにより、培養中の細胞の種類および／または状態および／または濃度を判定することができる。例えば、新鮮培地、ならびに細胞Ａ、ＢおよびＣの培養上清を参照試料として、分析試料について得られた蛍光フィンガープリントが細胞Ａについて得られた蛍光フィンガープリントの分布と最も確率的に近ければ、分析試料が細胞Ａの培養上清であることが推定または特定される。また、例えば、細胞Ａと細胞Ｂを異なる比率で混合したものを参照試料として、それらについて得られた蛍光フィンガープリントを線形判別分析した結果に基づき検量線を作成して利用することにより、分析試料が由来する培養における細胞Ａと細胞Ｂの混合比率を特定することができる。
【００６１】
さらに、特定の実施形態によれば、前記培養中の細胞の状態は、細胞の分化度であることが好ましい。現状、一般的には、細胞の分化度は、特定の分化マーカータンパク質の発現を定量することにより判定される。これに対し、本実施形態の方法では、複数のタンパク質と非特異的に相互作用するプローブを用いることにより、細胞の分化に伴う細胞培養上清中のタンパク質組成の変化の総和を、蛍光強度パターンの変化として検出する。
【００６２】
すなわち、特定の実施形態において、参照試料は、例えば、未分化細胞の培養から回収した細胞培養上清、分化状態が既知の細胞の培養から回収した細胞培養上清、または、分化誘導から規定の時間経過後に回収した細胞培養上清であることが好ましい。例えば、未分化細胞および分化細胞の培養上清を参照試料として、分析試料について得られた蛍光フィンガープリントが分化細胞について得られた蛍光フィンガープリントの分布と最も確率的に近ければ、分析試料が分化細胞の培養上清であることが推定または特定される。
【００６３】
上記特定の実施形態によれば、分化マーカータンパク質を特定および／または定量する必要なしに、わずか１種類または数種類のプローブを用いて、様々な系統の細胞について分化度を判定することができる。また、分析試料として細胞培養上清を用いるため、非侵襲的に細胞の分化度を判定することができる。そのため、同一の培養について、経時的に分化度を追跡することも可能である。
【００６４】
第二の実施形態におけるアレイ、ならびに、第三の実施形態における方法は、わずか１種類または数種類のプローブを用いて、試料中に含まれる単一タンパク質または複数種類のタンパク質における１種類以上の翻訳後修飾を、容易かつ高効率に判別し定量することを可能とする。また、細胞培養上清を分析試料とした場合には、培養中の細胞の種類および／または状態および／または濃度を、高精度かつ非侵襲的に判別することができる。
【実施例】
【００６５】
以下に実施例を挙げ、本発明についてさらに説明する。なお、これらは本発明を何ら限定するものではない。【００６６】
＜１．プローブの合成＞
以下に示す手順により、ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）に対してダンシル（Ｄｎｃ）を導入したプローブ（化合物１（図３（ａ））および化合物３〜５：Ｐ１〜３（３（ｂ）））、ＰＬＬに対してジメチルアミノスルホニルベンゾオキサジアゾール（ＤＢＤ）を導入したプローブ（化合物２、図３（ａ））、ポリエチレングリコールとＰＬＬのブロック共重合体にＤｎｃを導入したプローブ（化合物６：Ｐ４、図３（ｃ））、およびＰＡＭＡＭデンドリマーにＤｎｃを導入したプローブ（化合物７：Ｐ５、図３（ｄ））を得た。【００６７】
（１−１）ＰＬＬ−Ｄｎｃ（化合物１）の合成
２０ｍｇのポリ−Ｌ−リジン臭化水素酸塩（Ｍｗ：８．２ｋ、ユニット数：３９）（シグマアルドリッチ社製）を５ｍＬのメタノールに溶解し、撹拌しながら、ポリ−Ｌ−リジンのアミノ基に対して５倍量のトリエチルアミンを加え、さらに、２０ｍＭの５−（ジメチルアミノ）ナフタレン−１−スルホニルクロリド（Ｄｎｃ−Ｃｌ）（東京化成工業社製）／ＴＨＦ溶液を０．６７ｍＬ加えた。その後、密栓・遮光して２４時間室温で撹拌した。反応液を透析チューブ（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ６，ＭＷＣＯ：８ｋＤａ、スペクトラム社製）に入れて、順に、１０％メタノール、蒸留水、１ｍＭのＨＣｌ、蒸留水に対して透析した。その後、凍結乾燥を行い、ＰＬＬに対してＤｎｃを導入したプローブ（ＰＬＬ−Ｄｎｃ（化合物１））の粉末を得た。【００６８】
（１−２）ＰＬＬ−ＤＢＤ（化合物２）の合成
Ｄｎｃ−Ｃｌに代えて、４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノスルホニル）−７−フルオロベンゾオキサジアゾール（ＤＢＤ−Ｆ）（東京化成工業社製）を用いた以外は、上記（１）と同様の手順により、ＰＬＬに対してＤＢＤを導入したプローブ（ＰＬＬ−ＤＢＤ（化合物２））の粉末を得た。【００６９】
（１−３）様々なカチオン性高分子にＤｎｃを導入したプローブ（化合物３〜７：Ｐ１〜５）の合成
カチオン性高分子には、分子量の異なるＰＬＬ（ユニット数：１０、５５、２５８）（アラマンダポリマーズ社製）、ポリエチレングリコールとＰＬＬのブロック共重合体（ポリエチレングリコールのユニット数：１０４、ＰＬＬのユニット数：５２）（アラマンダポリマーズ社製）、およびＰＡＭＡＭデンドリマー（エチレンジアミンコア、４．０世代）（シグマアルドリッチ社製）を用いた。４ｍｇ／ｍＬのカチオン性高分子／ＭｅＯＨ溶液に、カチオン性高分子のアミノ基に対して５倍量のトリエチルアミンを撹拌しながら加え、さらに、カチオン性高分子のアミノ基に対して０．１５倍量のダンシルクロリド（ＴＨＦ溶液）を加えた。それ以外は、上記（１）と同様の手順により、Ｄｎｃを導入したプローブ（化合物３〜７：Ｐ１〜５）を得た。【００７０】
＜２．プローブのキャラクタリゼーション＞
化合物１〜７について、タンパク質を相互作用させ、その蛍光特性を評価した。タンパク質には、様々の動物由来のアルブミン（ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ウサギ血清アルブミン（ＲＳＡ）（いずれもシグマアルドリッチ社製）、およびウマ血清アルブミン（ＥＳＡ）（ロックランドイムノケミカルズ社製）ならびにヒト血漿由来α１−アンチトリプシン（Ａｎｔ）（シグマアルドリッチ社製）を使用した。【００７１】
（２−１）ＰＬＬ−Ｄｎｃ（化合物１）のキャラクタリゼーション
化合物１を、５μｇ／ｍＬになるように、１８ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ５．５）に溶解させた。得られたプローブ溶液２ｍＬを１ｃｍ光路長の石英セルに入れ、２．５ｍｇ／ｍＬのＥＳＡ水溶液を滴下した。滴下するごとによく撹拌し、室温で３分間静置し、励起波長３４０ｎｍ、蛍光波長４００〜６５０ｎｍで蛍光スペクトルを測定した。【００７２】
結果を図４（ａ）に示す。ＰＬＬ−Ｄｎｃ（化合物１）は、ＥＳＡの不在下では微弱な蛍光しか発しないが、ＥＳＡを加えると蛍光を発し、ＥＳＡの濃度増加にしたがって蛍光強度が顕著に増加することが示された。【００７３】
さらに、化合物１を、以下の３種類の溶媒：（１）１８ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ５．５）、（２）１８ｍＭのＥＰＰＳ（ｐＨ８．５）、または（３）１８ｍＭのＭＥＳ＋２５ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ５．５）に溶解させたプローブ溶液（５μｇ／ｍＬ）を調製した。各プローブ溶液に、ＢＳＡ、ＨＳＡ、ＲＳＡまたはＥＳＡの水溶液（２．５ｍｇ／ｍＬ）を滴下し、上記と同様の手順により、励起波長３４０ｎｍ、蛍光波長５１０ｎｍにおける蛍光強度を測定した。【００７４】
結果を図４（ｂ）〜（ｄ）に示す。図４（ｂ）は上記（１）のプローブ溶液、図４（ｃ）は上記（２）のプローブ溶液、図４（ｄ）は上記（３）のプローブ溶液での測定結果を示す。縦軸（ΔＦ．Ｉ．）はタンパク質を添加する前後の蛍光強度の変化量を示す。ＰＬＬ−Ｄｎｃ（化合物１）は、ＢＳＡ、ＨＳＡ、ＲＳＡまたはＥＳＡのいずれに対しても相互作用して蛍光を発した。また、蛍光強度の増加量は、溶媒条件に応じて大きく変化した。なお、図４（ｄ）では、ＢＳＡとＨＳＡによる蛍光強度の増加量がほぼ同一であり、両者のグラフの曲線が重複している。この結果から、ＰＬＬ−Ｄｎｃ（化合物１）が、高いＳ／Ｎ比でタンパク質を検出・識別できるｔｕｒｎ−ｏｎ型蛍光プローブとして使用できる可能性が示唆された。【００７５】
（２−２）ＰＬＬ−ＤＢＤ（化合物２）のキャラクタリゼーション
化合物２を、５μｇ／ｍＬになるように、１８ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ５．５）に溶解させたプローブ溶液を調製した。上記（２−１）と同様の手順により、ＥＳＡを添加し、励起波長４４０ｎｍにおける蛍光スペクトル（５００〜７００ｎｍ）および蛍光強度（５６０ｎｍ）を測定した。【００７６】
結果を図５に示す。図５（ｂ）の縦軸（ΔＦ．Ｉ．）は、タンパク質を添加する前後の蛍光強度の変化量を示す。ＰＬＬ−ＤＢＤ（化合物２）も、タンパク質の不在下では微弱な蛍光しか発しないが、ＥＳＡを加えると蛍光を発し（図５（ａ））、ＥＳＡの濃度増加にしたがって蛍光強度が顕著に増加するものであることが示された（図５（ｂ））。この結果から、ＰＬＬ−ＤＢＤ（化合物２）も、ＰＬＬ−Ｄｎｃ（化合物１）と同様に、高いＳ／Ｎ比でタンパク質を検出できるｔｕｒｎ−ｏｎ型蛍光プローブとして使用できる可能性が示唆された。【００７７】
（２−３）様々なカチオン性高分子にＤｎｃを導入したプローブ（化合物３〜７：Ｐ１〜５）のキャラクタリゼーション
化合物３〜７（Ｐ１〜５）を、１μｇ／ｍＬになるように、１８ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ５．５）または１８ｍＭのＥＰＰＳ（ｐＨ８．５）に溶解させたプローブ溶液を調製した。各プローブ溶液について、上記（２−１）と同様の手順により、ＨＳＡまたはＡｎｔを添加し、励起波長３４０ｎｍにおける蛍光スペクトル（４８０〜６７５ｎｍ）および蛍光強度（５１０ｎｍ）を測定した。【００７８】
化合物３（Ｐ１）／ｐＨ５．５の結果を図６および図７（ａ）、化合物４（Ｐ２）／ｐＨ５．５の結果を図７（ｂ）、化合物５（Ｐ３）／ｐＨ５．５の結果を図８（ａ）、化合物６（Ｐ４）／ｐＨ５．５の結果を図８（ｂ）、化合物７（Ｐ５）／ｐＨ５．５の結果を図８（ｃ）、化合物５（Ｐ３）／ｐＨ８．５の結果を図８（ｄ）、化合物６（Ｐ４）／ｐＨ８．５の結果を図８（ｅ）に示す。図７の縦軸（ΔＦ．Ｉ．）および図８の縦軸（Ｉ−Ｉ０）は、タンパク質を添加する前後の蛍光強度の変化量を示す。化合物３〜７（Ｐ１〜５）も、ＰＬＬ−Ｄｎｃ（化合物１）やＰＬＬ−ＤＢＤ（化合物２）と同様に、高いＳ／Ｎ比でタンパク質を検出できるｔｕｒｎ−ｏｎ型蛍光プローブとして使用できる可能性が示唆された。【００７９】
＜３．異なるタンパク質の識別＞
続いて、化合物１〜７のプローブを用いて、異なるタンパク質を識別することができるかどうかを試験した。
（３−１）ＰＬＬ−Ｄｎｃ（化合物１）によるアルブミンの識別
化合物１を、以下の６種類の溶媒に溶解させ、プローブ溶液（５μｇ／ｍＬ）を調製した：（１）１８ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ５．５）、（２）１８ｍＭのＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）、（３）１８ｍＭのＥＰＰＳ（ｐＨ８．５）、（４）１８ｍＭのＭＥＳ＋２５ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ５．５）、（５）１８ｍＭのＭＯＰＳ＋２５ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．０）、（６）１８ｍＭのＥＰＰＳ＋２５ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ８．５）。各プローブ溶液について、上記（２−１）と同様の手順により、２０μｇ／ｍＬのＢＳＡ、ＨＳＡ、ＲＳＡ、ＥＳＡ、卵白アルブミン（ＯＶＡ）（シグマアルドリッチ社製）、またはウシ由来ラクトアルブミン（ＢＬＡ）（シグマアルドリッチ社製）の水溶液を添加し、混合した。３０℃で１０分間インキュベートした後、以下の４セットの励起波長（ｎｍ）／蛍光波長（ｎｍ）にて蛍光強度を測定した：（Ｃｈ１）３２０／５２０、（Ｃｈ２）３４０／４８０、（Ｃｈ３）３４０／５２０、（Ｃｈ４）３４０／５４０。各タンパク質につき、６回の反復測定を行った。【００８０】
表１．アルブミンの特性
【表１】
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【００８１】
結果を図９に示す。ＰＬＬ−Ｄｎｃ（化合物１）の蛍光特性は、相互作用するアルブミンの種類や溶媒条件に応じて異なる変化を示し、異なるアルブミンごとに固有の蛍光フィンガープリントが得られた。【００８２】
また、（１）〜（３）のプローブ溶液における蛍光強度（Ｃｈ１）により得られた蛍光フィンガープリントを線形判別分析により解析し、得られた第二判別スコアまでをプロットした結果を図１０に示す。各アルブミンのクラスターは、それぞれ重なることなく分布した。さらに、この結果をジャックナイフ法により解析したところ、１００％の精度で各アルブミンを識別できることが確認された。以上の結果から、ＰＬＬ−Ｄｎｃ（化合物１）の１種類のプローブを用いて、その溶媒条件を変えることのみで、アルブミンのホモログを識別できることが確認された。【００８３】
（３−２）ＰＬＬ−ＤＢＤ（化合物２）によるアルブミンの識別
化合物１に代えて化合物２を用いた以外は、上記（３−１）と同様にして蛍光フィンガープリントを取得し、線形判別分析により解析した。【００８４】
測定結果を図１１に示す。図１１の縦軸（ΔＩ）はタンパク質を添加する前後の蛍光強度（Ｃｈ１）の増加量を示し、各アルブミンにつき６本のカラムは、それぞれ左から順にプローブ溶液（１）〜（６）に対応する。この結果から、ＰＬＬ−ＤＢＤ（化合物２）を用いても、異なるアルブミンごとに固有の蛍光フィンガープリントが得られることが示された。【００８５】
また、（１）〜（３）のプローブ溶液における蛍光強度（Ｃｈ１）により得られた蛍光フィンガープリントを線形判別分析により解析し、得られた第二判別スコアまでをプロットした結果を図１２に示す。各アルブミンのクラスターは、それぞれ重なることなく分布した。さらに、この結果をジャックナイフ法により解析したところ、１００％の精度で各アルブミンを識別できることが確認された。以上の結果から、ＰＬＬ−ＤＢＤ（化合物２）も、ＰＬＬ−Ｄｎｃ（化合物１）と同様に、１種類のプローブを用いて、その溶媒条件を変えることのみで、アルブミンのホモログを識別できることが確認された。【００８６】
（３−３）様々なカチオン性高分子にＤｎｃを導入したプローブ（化合物３〜７：Ｐ１〜５）による異なるタンパク質の識別
化合物３〜７（Ｐ１〜５）の５種類のプローブを、（１）１８ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ５．５）または（２）１８ｍＭのＥＰＰＳ（ｐＨ８．５）に溶解させ、プローブ溶液を調製した。解析対象のタンパク質としては、以下の８種類の血漿タンパク質：ＢＳＡ、ＥＳＡ、ＲＳＡ、ＨＳＡ、Ａｎｔ、ヒトフィブリノーゲン（Ｆｉｂ）（シグマアルドリッチ社製）、ヒトイムノグロブリンＧ（ＩｇＧ）（シグマアルドリッチ社製）、およびヒトトランスフェリン（Ｔｒａ）（シグマアルドリッチ社製）を用いた。励起波長３４０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍの蛍光強度を測定した（各タンパク質につき６回反復）。得られた蛍光フィンガープリントを、線形判別分析により解析した。【００８７】
測定結果（２溶媒条件×５プローブ）を図１３に示す。縦軸（ΔＦ．Ｉ．）は、タンパク質を添加する前後の蛍光強度の変化量を示す。また、前記測定結果を線形判別分析により解析した結果を図１４に示す。各タンパク質のクラスターは、それぞれ重なることなく分布した。さらに、この結果をジャックナイフ法により解析したところ、１００％の精度で各タンパク質を識別できることが確認された。また、マハラノビス距離に基づく盲検によっても、１００％の精度で各タンパク質を識別することができた。【００８８】
また、上記測定結果を、ｐＨ５．５またはｐＨ８．５の溶媒条件ごとに、それぞれ線形判別分析により解析し、得られた第二判別スコアまでをプロットした結果を図１５および１６に示す。溶媒条件ｐＨ５．５において得られた測定結果では、各タンパク質のクラスターはそれぞれ重なることなく分布し、ジャックナイフ法によっても１００％の精度で各タンパク質を識別できた。一方、溶媒条件ｐＨ８．５において得られた測定結果では、ＦｉｂのクラスターとＢＳＡのクラスターが完全には分離しなかったが、ジャックナイフ法による解析では、１００％の精度で各タンパク質を識別することができた。【００８９】
さらに、図１３の測定結果（２溶媒条件×５プローブ）を、ウォード法による階層的クラスター分析により解析した結果を図１７に示す。各タンパク質が極めて良好にクラスター化できることが示された。【００９０】
以上の結果から、化合物１〜７のいずれのプローブも、異なるタンパク質を良好に識別できるものであることが示された。【００９１】
＜４．異なる翻訳後修飾を有する同一タンパク質の識別＞
ＰＬＬ−Ｄｎｃ（化合物１）を用いて、同一タンパク質における翻訳後修飾の種類および／または有無を識別することができるかどうかを試験した。
（４−１）アルブミンにおける翻訳後修飾の有無の識別
上記表１の各種アルブミンおよび翻訳後修飾を有する下記表２のアルブミンについて、上記（３−１）と同様にして蛍光フィンガープリントを取得し、線形判別分析およびウォード法による階層的クラスター分析により解析した。【００９２】
表２．翻訳後修飾を有するアルブミン
【表２】
0006741259.tif 000003
【００９３】
線形判別分析の結果を図１８に、階層的クラスター分析の結果を図１９に示す。この結果から、ＰＬＬ−Ｄｎｃ（化合物１）により、同一タンパク質における様々な種類の翻訳後修飾の有無および種類を識別できることが示された。【００９４】
（４−２）翻訳後修飾が導入されたアルブミンの定量
ＨＳＡ／ＨＳＡ−Ｇｌｃの混合物（濃度：０〜３０μｇ／ｍＬ）およびＢＳＡ／ＢＳＡ−ＰＳの混合物（濃度：０〜９μｇ／ｍＬ）について、上記（３−１）と同様にして蛍光フィンガープリントを取得し、線形判別分析により解析した。【００９５】
ＨＳＡ／ＨＳＡ−Ｇｌｃの混合物について解析した結果を図２０（ａ）に、ＢＳＡ／ＢＳＡ−ＰＳの混合物について解析した結果を図２０（ｂ）に示す。ＨＳＡ／ＨＳＡ−Ｇｌｃの混合物については１５μｇ／ｍＬ（約２５０ｎＭ）、ＢＳＡ／ＢＳＡ−ＰＳの混合物については３μｇ／ｍＬ（約５０ｎＭ）の低濃度においても翻訳後修飾の有無を良好に識別することができた。また、いずれの場合も、異なる濃度のサンプルをすべて良好に識別することができた。【００９６】
（４−３）活性型／不活性型の細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ１）の定量
翻訳後修飾を有しない不活性型ＥＲＫ１（ＥＲＫ１−ｉｎ）およびＴ２０２とＹ２０４がリン酸化された活性型ＥＲＫ１（ＥＲＫ１−ａｃ）の混合物（濃度：０〜０．６μｇ／ｍＬ）について、プローブ溶液の濃度を１μｇ／ｍＬとした以外は、上記（３−１）と同様の手順により蛍光フィンガープリントを取得し、線形判別分析により解析した。【００９７】
結果を図２０（ｃ）に示す。低濃度（０．６μｇ／ｍＬ、約８ｎＭ）であっても活性型ＥＲＫ１と不活性型ＥＲＫ１を良好に識別することができ、また、濃度の違いについても明確に識別することができた。以上の結果から、ＰＬＬ−Ｄｎｃ（化合物１）が、単に翻訳後修飾の有無を識別できるだけでなく、翻訳後修飾の定量を高感度に行えるものであることが示された。【００９８】
このように、１級アミノ基を有するカチオン性ポリマーに、ナフタレンスルホン酸骨格またはベンゾフラザン骨格を有する環境応答性蛍光団が導入されてなるプローブは、イオン強度および／またはｐＨの異なる複数の溶媒に溶解して用いることにより、１種類またはごく数種類のプローブのみの使用によって多種多様な翻訳後修飾を高感度かつ高精度に識別・定量でき、翻訳後修飾の解析に有用であることが示された。【００９９】
＜５．培養細胞によって変化した培地中タンパク質組成の識別＞
（５−１）ヒト肺胞基底上皮腺癌細胞（Ａ５４９）による培地中のタンパク質組成の変化の検出
１０％のＦＢＳ（ＧＥ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）および１％のｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ  ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ  ｎｅｏｍｙｃｉｎ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  ｍｉｘｔｕｒｅ（ＰＳＮ）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を添加したＤ−ＭＥＭ （高グルコース、Ｌ−グルタミン、フェノールレッド含有）（和光純薬工業株式会社製）に懸濁したＡ５４９細胞（ＪＣＲＢ細胞バンクより分譲）を、１．２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度で各ウェルにつき５００μＬずつ、２４ウェルプレート（ＡＧＣテクノガラス）に播種した。３７℃、５％ＣＯ２環境下で４８時間培養した後、培地を除去し、２００μＬのリン酸生理食塩水（ＰＢＳ）（和光純薬工業株式会社製）で２回洗浄し、１％ＦＢＳを含有した１×ＣＤ  ＣＨＯ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）３００μＬをウェルに加えた。３７℃、５％ＣＯ２環境下で１６〜４８時間培養した後、培地を採取し、３０００ｇで１０分間遠心分離し、培養上清を回収した。また、細胞を加えずに上記と同条件にてインキュベートして得た培地を対照とした。【０１００】
化合物３〜７（Ｐ１〜５）の５種類のプローブを、２０ｍＭのＭＯＰＳ（ｐＨ７．４）に溶解させ、プローブ溶液（２．１μｇ／ｍＬ）を調製した。各プローブ溶液を、９６ウェルマイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）に１９０μＬ／ウェルずつ分注し、各ウェルに上で得られた培養上清を１０μＬ添加し、混合した。３０℃で１０分間インキュベートした後、以下の２セットの励起波長（ｎｍ）／蛍光波長（ｎｍ）にて蛍光強度を測定した：（Ｃｈ１）３２０／５６０、（Ｃｈ２）３４０／４８０。各タンパク質につき、６回の反復測定を行った。【０１０１】
測定結果（２波長セット×５プローブ）を図２２に示す。縦軸（Ｉ−Ｉ０）は、試料（培地または培養上清）を添加する前後の蛍光強度の変化量を示す。また、前記測定結果を線形判別分析により解析し、得られた第二判別スコアまでをプロットした結果を図２３に示す。培地（Ｂｌａｎｋ）については、時間経過に伴う蛍光フィンガープリントの変化は見られないのに対し、Ａ５４９の培養上清については、培養時間の経過に伴って蛍光フィンガープリントが変化し、培養時間ごとに異なる固有の蛍光フィンガープリントが得られることが確認された。【０１０２】
（５−２）培地中のタンパク質組成の変化に基づく細胞の種類の識別
Ａ５４９、ヒト肝癌由来細胞（ＨｅｐＧ２）（ＪＣＲＢ細胞バンクより分譲）、ヒト骨肉腫細胞（ＭＧ６３）（ＪＣＲＢ細胞バンクより分譲）およびヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ＵＥ７Ｔ−１３）（ＪＣＲＢ細胞バンクより分譲）について、上記（５−１）と同様の手順により、培養４８時間後の各細胞の培養上清を回収し、それらについての蛍光フィンガープリント（２波長セット×５プローブ）を取得し、得られた蛍光フィンガープリントを線形判別分析により解析した。また、細胞を加えずに上記と同条件にてインキュベートして得た培地を対照とした。【０１０３】
得られた蛍光フィンガープリントを図２４に、線形判別分析により解析した結果を図２５に示す。各細胞のクラスターは、それぞれ重なることなく分布した。さらにこの結果をジャックナイフ法により解析したところ、１００％の精度で各細胞を識別できることが確認された。また、マハラノビス距離に基づく盲検によっても、９０％の精度で各細胞を識別することができた。以上の結果から、化合物３〜７（Ｐ１〜５）のプローブを用いて細胞培養上清を分析することにより、細胞の種類を識別できることが示された。【０１０４】
（５−３）培地中のタンパク質組成の変化に基づく細胞の濃度の識別
０、０．４×１０５、０．８×１０５、および１．２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度におけるＡ５４９細胞の培養について、上記（５−１）と同様の手順により、培養４８時間後の培養上清を回収し、それらについての蛍光フィンガープリント（２波長セット×５プローブ）を取得した。さらに、得られた蛍光フィンガープリント（２波長セット×２プローブ（化合物３および４））を線形判別分析により解析した。【０１０５】
得られた蛍光フィンガープリントを図２６に、線形判別分析により解析した結果を図２７に示す。各細胞濃度のクラスターは、それぞれ重なることなく分布した（図２７（ａ））。さらにこの結果をジャックナイフ法により解析したところ、１００％の精度で各細胞濃度を識別できることが確認された。また、マハラノビス距離に基づく盲検によっても８８％の精度で各細胞濃度を識別することができた。また、線形判別分析により得られた第一判別スコアを、細胞濃度に対してプロットした結果、第一判別スコアと細胞濃度との間には高い線形相関が観察された（ｒ＝−０．９９）（図２７（ｂ））。以上の結果から、化合物３〜７（Ｐ１〜５）のプローブを用いて細胞培養上清を分析することにより、細胞の濃度を定量できることが示された。【０１０６】
（５−４）培地中のタンパク質組成の変化に基づく複数種類の細胞の混合比率の識別
ＨｅｐＧ２およびＵＥ７Ｔ−１３の混合培養物（合計濃度：１．２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）について、上記（５−１）と同様の手順により、培養４８時間後の培養上清を回収し、それらについての蛍光フィンガープリント（２波長セット×５プローブ）を取得した。さらに、得られた蛍光フィンガープリント（２波長セット（化合物３、５、７についてはＣｈ１のみ）×５プローブ）を線形判別分析により解析した。【０１０７】
得られた蛍光フィンガープリントを図２８に、線形判別分析により解析した結果を図２９に示す。各混合培養物のクラスターは、それぞれ重なることなく分布した（図２９（ａ））。さらにこの結果をジャックナイフ法により解析したところ、９７％の精度で各混合培養物を識別できることが確認された。また、マハラノビス距離に基づく盲検によっても９５％の精度で各混合培養物を識別することができた。また、線形判別分析により得られた第一判別スコアを、混合培養物におけるＨｅｐＧ２の比率に対してプロットした結果、第一判別スコアと混合培養物におけるＨｅｐＧ２の比率との間には高い線形相関が観察された（ｒ＝０．９９）（図２９（ｂ））。以上の結果から、化合物３〜７（Ｐ１〜５）のプローブを用いて細胞培養上清を分析することにより、複数種類の細胞の混合培養物における細胞の混合比率を定量できることが示された。【０１０８】
（５−５）培地中のタンパク質組成の変化に基づく細胞の分化度の識別
ヒト骨髄由来間葉系幹細胞であるＵＥ７Ｔ−１３について、以下の手順により骨芽細胞への分化誘導を行った。上記（５−１）と同様にして、ＵＥ７Ｔ−１３を１０％のＦＢＳおよび１％のＰＳＮを添加したＤ−ＭＥＭに懸濁し、１．２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度で各ウェルにつき４００μＬずつ、２４ウェルプレートに播種した。３７℃、５％ＣＯ２環境下で２４時間培養し、細胞を十分に接着させた後、培地を除去し、４００μＬの新鮮な上記Ｄ−ＭＥＭに交換した。さらに２４時間培養した後、培地を除去し、分化誘導培地（０．１μＭのデキサメタゾン（シグマアルドリッチ社製）、１０ｍＭのβ−グリセロリン酸（シグマアルドリッチ社製）、０．２ｍＭのアスコルビン酸（シグマアルドリッチ社製）／Ｄ−ＭＥＭ（１０％ＦＢＳ、１％ＰＳＮ））に交換し、分化誘導を行った。７２時間ごとに、新鮮な分化誘導培地に交換した。分化誘導開始後０時間（分化誘導１日目）、７２時間（４日目）、１６８時間（８日目）、２６４時間（１２日目）の時点で、上記（５−１）と同様にして培養上清を回収し、それらについての蛍光フィンガープリント（２波長セット×５プローブ、プローブ溶媒：２０ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ５．４））を取得し、得られた蛍光フィンガープリント（２波長セット×４プローブ（化合物３および５〜７））を線形判別分析により解析した。また、分化誘導培地に代えてＤ−ＭＥＭ（１０％ＦＢＳ、１％ＰＳＮ）を用いた非分化誘導培養から回収した培養上清を対照とした。【０１０９】
得られた蛍光フィンガープリントを図３０に、線形判別分析により解析した結果を図３１に示す。図中、「ｄ」は分化誘導開始後の培養日数を示し、「Ｄ」は分化誘導培養、「Ｕ」は非分化誘導培養を示す。分化誘導開始後７２時間の時点で、分化誘導培養／非分化誘導培養のクラスターが重なることなく分布した（図３１、ｄ４／Ｄ、ｄ４／Ｕ）。さらにこの結果をジャックナイフ法により解析したところ、１００％の精度で各培養条件／時点における細胞を識別できることが確認された。また、マハラノビス距離に基づく盲検によっても９７％の精度で各培養条件／時点における細胞を識別することができた。【０１１０】
一方、上記と同様にして調製したＵＥ７Ｔ−１３の分化誘導培養／非分化誘導培養について、アリザリンレッドＳ染色による分化度の評価を行った。アリザリンレッドＳ染色は、ＵＥ７Ｔ−１３が骨芽細胞に分化した結果として生じる石灰化を検出する。アリザリンレッドＳ染色は、以下の手順により行った。分化誘導開始後、７２時間、１６８時間、２６４時間の時点で、培地を除去し、２００μＬのＰＢＳで２回洗浄後、４℃の２００μＬの４％パラホルムアルデヒドを添加し、３７℃、５％ＣＯ２環境下で１５分インキュベートした。３００μＬの滅菌水で３回洗浄後、−２０℃の３００μＬのメタノールを加え、３７℃、５％ＣＯ２環境下で１０分インキュベートした。２００μＬの滅菌水で１回洗浄後、０．１ｍｇ／ｍＬのアリザリンレッドＳ（シグマアルドリッチ社製）水溶液（ＫＯＨ水溶液によりｐＨ６．４に調製）を２００μＬ加え、３７℃、５％ＣＯ２環境下で１５分インキュベートした。２００μＬの滅菌水で２回洗浄後、１００μＬの滅菌水を加え、明視野顕微鏡で観察した。【０１１１】
結果を図３２に示す。分化誘導４日目および８日目の時点では石灰化を検出することができず、分化誘導１２日目の時点で初めて石灰化が検出された。以上の結果から、化合物３〜７（Ｐ１〜５）のプローブを用いて細胞培養上清を分析することにより、アリザリンレッドＳ染色では検出できない初期の分化状態についても検出でき、ごくわずかな分化度の違いを識別できることが示された。
【図１】
0006741259.tif 000004
【図２】
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【図３】
0006741259.tif 000006
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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