(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｍＵｍＧｍＧｍＧｍＡｍＧＴ＊Ａ＊Ｇ＊Ａ＊Ｔ＊Ｇ＊ｍＡｍＧｍＧｍＵｍＡｍＣ（配列番号１６）を含むオリゴヌクレオチドであって、前記オリゴヌクレオチドの長さが１８ヌクレオチドであり、ｍが２’Ｏメチルであり、＊がホスホロチオエート修飾である、オリゴヌクレオチド。
【請求項２】
５’ＴＧＧＧＡＧＴＡＧＡＴＧＡＧＧＴＡＣ３’（配列番号４）を含むオリゴヌクレオチドであって、前記オリゴヌクレオチドの長さが１８〜１９ヌクレオチドであり、前記オリゴヌクレオチドの５’末端における４〜６ヌクレオチドおよび３’末端における４〜６ヌクレオチドが２’Ｏメチルを含み、４〜１０ヌクレオチドがホスホロチオエート修飾を有する、オリゴヌクレオチド。
【請求項３】
長さが１８ヌクレオチドの、構造
【化４】
0006741673.tif 000016
、を含む化合物またはその塩であって、該化合物が、少なくとも１つのホスホロチオエート修飾を含み、該オリゴヌクレオチドが、Ｒ１および／またはＲ２で示される、３’または５’末端に分子種を、あるいは３’または５’末端の両方に分子種をさらに含む、化合物またはその塩。
【請求項４】
ＴＧＧＧＡＧＴＡＧＡＴＧＡＧＧＴＡＣ（配列番号４）を含む長さが１８〜１９ヌクレオチドのアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む安定な自己集合ナノ構造体であって、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドがコアに会合しており、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドの４〜１０ヌクレオチドがホスホロチオエート修飾を有する、自己集合ナノ構造体。
【請求項５】
ＴＧＧＧＡＧＴＡＧＡＴＧＡＧＧＴＡＣ（配列番号４）を含む長さが１８〜１９ヌクレオチドのアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む安定な自己集合ナノ構造体であって、３’または５’末端における疎水性基が、水中または他の適切な溶媒中で自己会合して、前記ナノ構造体のコアを形成し、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドの４〜１０ヌクレオチドがホスホロチオエート修飾を有する、自己集合ナノ構造体。
【請求項６】
長さが１８ヌクレオチドである、請求項３に記載の化合物。
【請求項７】
配列番号１６のオリゴヌクレオチドである、請求項３に記載の化合物。
【請求項８】
担体を有する組成物に製剤化される、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項９】
前記担体が脂質ベースの担体またはナノ粒子である、請求項８に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
前記オリゴヌクレオチドが、３’または５’末端に分子種を、または３’および５’末端の両方に分子種をさらに含む、請求項１または８に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１１】
前記分子種が、スペーサー、脂質、ステロール、コレステロール、ステアリル、Ｃ１６アルキル鎖、胆汁酸、コール酸、タウロコール酸、デオキシコレート、オレイルリトコール酸、オレオイルコレン酸、糖脂質、リン脂質、スフィンゴ脂質、ステロイドなどのイソプレノイド、ビタミンＥなどのビタミン、飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸、トリグリセリドなどの脂肪酸エステル、ピレン、ポルフィリン、テキサフィリン、アダマンタン、アクリジン、ビオチン、クマリン、フルオレセイン、ローダミン、テキサスレッド、ジゴキシゲニン、ジメトキシトリチル、ｔ−ブチルジメチルシリル、ｔ−ブチルジフェニルシリル、シアニン染料（例えば、Ｃｙ３もしくはＣｙ５）、ヘキスト３３２５８染料、ソラレン、イブプロフェン、親油性部分、葉酸ラジカル、ステロイドラジカル、炭水化物ラジカル、ビタミンＡラジカル、ビタミンＥラジカルまたはビタミンＫラジカルからなる群から選択される、請求項１０に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１２】
前記分子種が、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、メチルホスホネートおよびアミド結合からなる群から選択される結合により前記化合物に直接的に接続しているか、またはリンカーを介して前記化合物に間接的に接続しており；
前記リンカーが、ヌクレオチドリンカー、あるいは脱塩基残基（ｄＳｐａｃｅｒ）、オリゴエチレングリコール、トリエチレングリコール（スペーサー９）、ヘキサエチレングリコール（スペーサー１８）、アルカンジオールまたはブタンジオールからなる群から選択される非ヌクレオチドリンカーである、請求項１０に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１３】
前記オリゴヌクレオチドの５’末端における６ヌクレオチドおよび３’末端における６ヌクレオチドが２’Ｏメチルを含み；
６ヌクレオチド、７ヌクレオチドまたは８ヌクレオチドがホスホロチオエート修飾を有する；および
前記ホスホロチオエート修飾ヌクレオチドが前記オリゴヌクレオチドの中央領域に存在する、請求項２および８から１２のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１４】
前記オリゴヌクレオチドの５’末端から第７、第８、第９、第１０、第１１および第１２番目のヌクレオチドに付随するヌクレオチド間結合がホスホロチオエート修飾されている、請求項１、２および８から１３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１５】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、長さが１８ヌクレオチドである、および／または前記アンチセンスオリゴヌクレオチドがホスホジエステルヌクレオチド間結合を有し；
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが２’Ｏメチル修飾を有する、請求項４に記載のナノ構造体。
【請求項１６】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが１７のヌクレオチド間結合を有し、中央の６つのヌクレオチド間結合がホスホロチオエートであり；前記オリゴヌクレオチドの５’末端における最初の６つのヌクレオチド間結合がホスホジエステルヌクレオチド間結合であり、前記オリゴヌクレオチドの５’末端における最初の６つのヌクレオチドが２’Ｏメチル修飾ヌクレオチドであり、および／または前記オリゴヌクレオチドの３’末端における最後の５つのヌクレオチドが２’Ｏメチル修飾ヌクレオチドである、請求項４または１５に記載のナノ構造体。
【請求項１７】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ｃ（配列番号４）、ｍＵｍＧｍＧｍＧｍＡｍＧｍＵｍＡｍＧｍＡｍＵｍＧｍＡｍＧｍＧｍＵｍＡｍＣ（配列番号１０、Ｏｌｉｇｏ３７４２）、Ｔ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｇ＊Ａ＊Ｇ＊Ｔ＊Ａ＊Ｇ＊Ａ＊Ｔ＊Ｇ＊Ａ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｔ＊Ａ＊Ｃ（配列番号９、Ｏｌｉｇｏ３５００）、ｍＵｍＧｍＧｍＧｍＡｍＧＴ＊Ａ＊Ｇ＊Ａ＊Ｔ＊Ｇ＊ｍＡｍＧｍＧｍＵｍＡｍＣ（配列番号１６、Ｏｌｉｇｏ３５３４）およびｍＵ＊ｍＧ＊ｍＧ＊ｍＧ＊ｍＡ＊ｍＧ＊Ｔ＊Ａ＊Ｇ＊Ａ＊Ｔ＊Ｇ＊ｍＡ＊ｍＧ＊ｍＧ＊ｍＵ＊ｍＡ＊ｍＣ（配列番号１８、Ｏｌｉｇｏ３５０９）からなる群から選択され、−が、ホスホジエステル結合を指し、＊が、ホスホロチオエート結合を指す、請求項１６に記載のナノ構造体。
【請求項１８】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが前記コアの外側に結合されており、
前記ナノ構造体が前記アンチセンスオリゴヌクレオチドの２〜１，０００コピーを含み、
前記ナノ構造体が前記アンチセンスオリゴヌクレオチドと構造的に異なる少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含み、
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドはその５’末端が前記ナノ構造体の外表面に露出しており、
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドはその３’末端が前記ナノ構造体の外表面に露出しており、
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが前記ナノ構造体の表面上に横方向に配置されており、および／または
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが１つまたは１つ超のリンカーを介して前記コアに間接的に結合されている、請求項４、１５および１６のいずれか一項に記載のナノ構造体。
【請求項１９】
前記コアが中実または中空コアであり；
前記中実コアが不活性、常磁性または超常磁性である、請求項４および１５から１６のいずれか一項に記載のナノ構造体。
【請求項２０】
前記コアがポリマーコアであり、前記ポリマーコアが、両親媒性ブロックコポリマー、ポリスチレンなどの疎水性ポリマー、ポリ（乳酸）、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）、ポリ（グリコール酸）、ポリ（カプロラクトン）および他の生体適合性ポリマーから構成されている、請求項４および１３から１８のいずれか一項に記載のナノ構造体。
【請求項２１】
前記コアがリポソームコアである、請求項４および１５から１８のいずれか一項に記載のナノ構造体。
【請求項２２】
請求項３、６および７のいずれか一項に記載の化合物、請求項１、２および８から１４のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドまたは請求項４、５および１５から２１のいずれか一項に記載のナノ構造体を含む組成物であって、前記ナノ構造体と会合している、ＴＮＦ障害を処置するための治療剤をさらに含む、組成物。
【請求項２３】
前記治療剤が前記オリゴヌクレオチドに結合されている、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
ＴＮＦ障害を処置する際に使用するための組成物であって、請求項３、６および７のいずれか一項に記載の化合物、請求項１、２および８から１４のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドまたは請求項４および１５から２１のいずれか一項に記載のナノ構造体を含み、前記組成物は、前記ＴＮＦ障害を処置する有効量で、ＴＮＦ障害を有する対象に投与されることを特徴とする、組成物。
【請求項２５】
前記ＴＮＦ障害が、自己免疫疾患、感染症、移植拒絶または移植片対宿主病、悪性腫瘍、肺障害、腸障害、心臓障害、敗血症、脊椎関節症、代謝障害、貧血、疼痛、肝障害、皮膚障害、爪障害、関節リウマチ、乾癬、乾癬性関節炎と合併した乾癬、潰瘍性大腸炎、クローン病、血管炎、ベーチェット病、強直性脊椎炎、喘息、慢性閉塞性肺障害（ＣＯＰＤ）、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、再狭窄、糖尿病、貧血、疼痛、クローン病関連障害、若年性関節リウマチ（ＪＲＡ）、Ｃ型肝炎ウイルス感染、乾癬性関節炎および慢性尋常性乾癬からなる群から選択される、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
ＴＮＦレベルをｉｎ  ｖｉｖｏで低下させる際に使用するための組成物であって、請求項３、６および７のいずれか一項に記載の化合物、請求項１、２および８から１４のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドまたは請求項４および１５から２１のいずれか一項に記載のナノ構造体を含み、前記組成物は、ＴＮＦレベルをｉｎ  ｖｉｖｏで低下させるための有効量で、対象に投与されることを特徴とする、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本願は、２０１４年１０月６日に出願した米国仮出願第６２／０６０，４２４号による米国特許法第１１９条の優先権を主張する。この出願の内容は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、抗ＴＮＦ核酸化合物、ならびにその使用の方法およびその組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
ＴＮＦ−α（腫瘍壊死因子アルファ）は、様々な疾患をもたらす炎症反応をしばしば促進する活性化マクロファージ／単球およびリンパ球により産生される多面性サイトカインである。ＴＮＦ−αは、マクロファージ、単球およびナチュラルキラー細胞から放出され、細菌および他の微生物感染中ならびに炎症性物質による刺激後に損傷組織への白血球の動員を含む、炎症および免疫反応に重要な役割を果たす。過剰量で存在する場合、ＴＮＦ−αは、組織損傷を引き起こすことが公知であり、炎症性および自己免疫疾患に随伴する病態に関連付けられている。
【０００４】
ＴＮＦ−αは、配列および分子量が異なる２つの別個の膜タンパク質受容体であるＴＮＦ−ＲＩおよびＴＮＦ−ＲＩＩを介して生物学的作用を媒介する。ＴＮＦ−ＲＩは、すべてでないとしても、ほとんどのヒト細胞型において低レベルで存在し、ヒトにおけるＴＮＦ−ＲＩ遺伝子の発現は、感染、インターフェロンおよびホルボールエステルのような、二次メッセンジャーのモジュレーターにより上方制御され得ると報告されている。両ＴＮＦ受容体の細胞外部分は、可溶性の形でも存在し、これは、細胞表面におけるタンパク質分解切断により膜結合形の受容体から生じる。可溶性ＴＮＦ受容体は、溶液中のＴＮＦ−αに結合する能力を保持している。可溶性ＴＮＦ受容体は、健常者の尿および血清中で同定され、いくつかの慢性疾患で、またＴＮＦ−αを誘導する薬剤の接種後に上昇することが示されている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
一部の態様では、本発明は、図７に示す構造を含む化合物またはその塩である。一部の実施形態では、前記化合物の長さは１８ヌクレオチドである。他の実施形態では、前記化合物は、担体を有する組成物に製剤化される。別の実施形態では、前記化合物は、ナトリウム塩である。他の実施形態では、前記化合物は、図８に示す構造である。
【０００６】
一部の実施形態では、前記化合物は、末端のうちの１つに分子種をさらに含む。他の実施形態では、前記化合物は、両末端に分子種をさらに含む。
【０００７】
なお別の実施形態では、前記分子種が、スペーサー、脂質、ステロール、コレステロール、ステアリル、Ｃ１６アルキル鎖、胆汁酸、コール酸、タウロコール酸、デオキシコレート、オレイルリトコール酸、オレオイルコレン酸、糖脂質、リン脂質、スフィンゴ脂質、ステロイドなどのイソプレノイド、ビタミンＥなどのビタミン、飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸、トリグリセリドなどの脂肪酸エステル、ピレン、ポルフィリン、テキサフィリン、アダマンタン、アクリジン、ビオチン、クマリン、フルオレセイン、ローダミン、テキサスレッド、ジゴキシゲニン、ジメトキシトリチル、ｔ−ブチルジメチルシリル、ｔ−ブチルジフェニルシリル、シアニン染料（例えば、Ｃｙ３もしくはＣｙ５７６）、ヘキスト３３２５８染料、ソラレンおよびイブプロフェンからなる群から選択される。
【０００８】
別の実施形態では、前記分子種が、親油性部分、葉酸ラジカル、ステロイドラジカル、炭水化物ラジカル、ビタミンＡラジカル、ビタミンＥラジカルまたはビタミンＫラジカルからなる群から選択される。
【０００９】
別の実施形態では、前記分子種が、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、メチルホスホネートおよびアミド結合からなる群から選択される結合により前記化合物に直接的に接続している。一部の実施形態では、前記分子種がリンカーを介して前記化合物に間接的に接続している。
【００１０】
他の実施形態では、前記リンカーが、脱塩基残基（ｄＳｐａｃｅｒ）、トリエチレングリコール（スペーサー９）またはヘキサエチレングリコール（スペーサー１８）などのオリゴエチレングリコールおよびブタンジオールなどのアルカンジオールからなる群から選択される非ヌクレオチドリンカーである。
【００１１】
本発明の別の態様は、ｍＵｍＧｍＧｍＧｍＡｍＧＴ＊Ａ＊Ｇ＊Ａ＊Ｔ＊Ｇ＊ｍＡｍＧｍＧｍＵｍＡｍＣ（配列番号１６）を含むオリゴヌクレオチドであって、前記オリゴヌクレオチドの長さが１８ヌクレオチドであり、ｍが２’Ｏメチルであり、＊がホスホロチオエート修飾である、オリゴヌクレオチドである。一部の実施形態では、前記オリゴヌクレオチドは、担体を有する組成物に製剤化される。他の実施形態では、前記担体が脂質ベースの担体である。別の実施形態では、前記担体がナノ粒子である。
【００１２】
別の実施形態では、前記オリゴヌクレオチドが３’または５’末端に分子種をさらに含む。一部の実施形態では、前記オリゴヌクレオチドが３’および５’末端の両方に分子種をさらに含む。
【００１３】
他の実施形態では、前記分子種が、スペーサー、脂質、ステロール、コレステロール、ステアリル、Ｃ１６アルキル鎖、胆汁酸、コール酸、タウロコール酸、デオキシコレート、オレイルリトコール酸、オレオイルコレン酸、糖脂質、リン脂質、スフィンゴ脂質、ステロイドなどのイソプレノイド、ビタミンＥなどのビタミン、飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸、トリグリセリドなどの脂肪酸エステル、ピレン、ポルフィリン、テキサフィリン、アダマンタン、アクリジン、ビオチン、クマリン、フルオレセイン、ローダミン、テキサスレッド、ジゴキシゲニン、ジメトキシトリチル、ｔ−ブチルジメチルシリル、ｔ−ブチルジフェニルシリル、シアニン染料（例えば、Ｃｙ３もしくはＣｙ５７６）、ヘキスト３３２５８染料、ソラレンおよびイブプロフェンからなる群から選択される。
【００１４】
一部の実施形態では、前記分子種が、親油性部分、葉酸ラジカル、ステロイドラジカル、炭水化物ラジカル、ビタミンＡラジカル、ビタミンＥラジカルまたはビタミンＫラジカルからなる群から選択される。別の実施形態では、前記分子種が、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、メチルホスホネートおよびアミド結合からなる群から選択される結合により前記化合物に直接的に接続している。なお別の実施形態では、前記分子種がリンカーを介して前記化合物に間接的に接続している。
【００１５】
一部の実施形態では、前記リンカーが、脱塩基残基（ｄＳｐａｃｅｒ）、トリエチレングリコール（スペーサー９）またはヘキサエチレングリコール（スペーサー１８）などのオリゴエチレングリコールおよびブタンジオールなどのアルカンジオールからなる群から選択される非ヌクレオチドリンカーである。
【００１６】
本発明の他の態様は、５’ＴＧＧＧＡＧＴＡＧＡＴＧＡＧＧＴＡＣ３’（配列番号４）を含むオリゴヌクレオチドであって、前記オリゴヌクレオチドの長さが１８〜１９ヌクレオチドであり、前記オリゴヌクレオチドの５’末端における４〜６ヌクレオチドおよび３’末端における４〜６ヌクレオチドが２’Ｏメチルを含み、４〜１０ヌクレオチドがホスホロチオエート修飾を有する、オリゴヌクレオチドである。一部の実施形態では、前記オリゴヌクレオチドの５’末端における６ヌクレオチドおよび３’末端における６ヌクレオチドが２’Ｏメチルを含む。他の実施形態では、６ヌクレオチドがホスホロチオエート修飾を有する。別の実施形態では、７ヌクレオチドがホスホロチオエート修飾を有する。なお別の実施形態では、８ヌクレオチドがホスホロチオエート修飾を有する。
【００１７】
他の実施形態では、前記ホスホロチオエート修飾ヌクレオチドが前記オリゴヌクレオチドの中央領域に存在する。
【００１８】
別の実施形態では、前記オリゴヌクレオチドの５’末端から第７、第８、第９、第１０、第１１および第１２番目のヌクレオチドに付随するヌクレオチド間結合がホスホロチオエート修飾されている。
【００１９】
別の実施形態では、各ヌクレオチドが２’Ｏメチル修飾、またはホスホロチオエートによるヌクレオチド間結合のいずれかを有する。一部の実施形態では、１つのみのヌクレオチドが２’Ｏメチル修飾、およびホスホロチオエートによるヌクレオチド間結合の両方を有する。他の実施形態では、１つのみのヌクレオチドが２’修飾ヌクレオチドを有する。
【００２０】
一部の実施形態では、前記２’修飾が、２’−デオキシ、２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）、２’−ジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）および２’−Ｏ−−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）の群から選択される。
【００２１】
本発明の一態様は、ＴＧＧＧＡＧＴＡＧＡＴＧＡＧＧＴＡＣ（配列番号４）を含む長さが１８〜１９ヌクレオチドのアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む安定な自己集合ナノ構造体であって、３’または５’末端における疎水性基が、水中または他の適切な溶媒中で自己会合して、そのナノ構造体のコアを形成している、自己集合ナノ構造体である。自己集合ナノ構造体は、一般的に、オリゴヌクレオチドが、ＤＮアーゼおよびＲＮアーゼ不含有水または他の適切な溶媒中において５μＭを超える濃度である場合に形成される。一部の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、長さが１８ヌクレオチドである。他の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ホスホジエステルヌクレオチド間結合（internucleotide  linkage）を有する。別の実施形態では、ヌクレオチド間結合の全てよりも少ないもの（less  than  all）がホスホジエステルである。
【００２２】
本発明の別の態様は、ＴＧＧＧＡＧＴＡＧＡＴＧＡＧＧＴＡＣ（配列番号４）を含む長さが１８〜１９ヌクレオチドのアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む安定な自己集合ナノ構造体であって、アンチセンスオリゴヌクレオチドがコアと会合している、自己集合ナノ構造体である。一部の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、長さが１８ヌクレオチドである。他の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ホスホジエステルヌクレオチド間結合を有する。別の実施形態では、ヌクレオチド間結合の全てよりも少ないものがホスホジエステルである。
【００２３】
他の実施形態では、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドがホスホロチオエートによるヌクレオチド間結合を有する。一部の実施形態では、前記ヌクレオチド間結合の全てよりも少ないものがホスホロチオエートである。
【００２４】
一部の実施形態では、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが２’Ｏメチル修飾を有する。他の実施形態では、前記ヌクレオチドの全てよりも少ないものが２’Ｏメチル修飾を含む。
【００２５】
別の実施形態では、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが１７のヌクレオチド間結合を有し、中央の６つのヌクレオチド間結合がホスホロチオエートである。他の実施形態では、前記オリゴヌクレオチドの５’末端における最初の６つのヌクレオチド間結合がホスホジエステルヌクレオチド間結合である。なお別の実施形態では、前記オリゴヌクレオチドの５’末端における最初の６つのヌクレオチドが２’Ｏメチル修飾ヌクレオチドである。
【００２６】
他の実施形態では、前記オリゴヌクレオチドの３’末端における最後の５つのヌクレオチドが２’Ｏメチル修飾ヌクレオチドである。
【００２７】
別の実施形態では、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ｃ（配列番号４）、ｍＵｍＧｍＧｍＧｍＡｍＧｍＵｍＡｍＧｍＡｍＵｍＧｍＡｍＧｍＧｍＵｍＡｍＣ（配列番号１０、Ｏｌｉｇｏ３７４２）、Ｔ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｇ＊Ａ＊Ｇ＊Ｔ＊Ａ＊Ｇ＊Ａ＊Ｔ＊Ｇ＊Ａ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｔ＊Ａ＊Ｃ（配列番号９、Ｏｌｉｇｏ３５００）、ｍＵｍＧｍＧｍＧｍＡｍＧＴ＊Ａ＊Ｇ＊Ａ＊Ｔ＊Ｇ＊ｍＡｍＧｍＧｍＵｍＡｍＣ（配列番号１６、Ｏｌｉｇｏ３５３４）およびｍＵ＊ｍＧ＊ｍＧ＊ｍＧ＊ｍＡ＊ｍＧ＊Ｔ＊Ａ＊Ｇ＊Ａ＊Ｔ＊Ｇ＊ｍＡ＊ｍＧ＊ｍＧ＊ｍＵ＊ｍＡ＊ｍＣ（配列番号１８、Ｏｌｉｇｏ３５０９）からなる群から選択され、−が、ホスホジエステル結合を指し、＊が、ホスホロチオエート結合を指し、ｍが、Ｏメチルを指す。
【００２８】
別の実施形態では、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが前記コアの外側に結合されている。一部の実施形態では、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドの２〜１，０００コピーを含む。
【００２９】
他の実施形態では、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドと構造的に異なる少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む。
【００３０】
一部の実施形態では、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドはその５’末端が前記ナノ構造体の外表面に露出している。他の実施形態では、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドはその３’末端が前記ナノ構造体の外表面に露出している。一部の実施形態では、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが前記ナノ構造体の表面上に横方向に配置されている。
【００３１】
別の実施形態では、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドがリンカーを介して前記コアに間接的に結合されている。一部の実施形態では、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、１つ超のリンカーを介して前記コアに間接的に結合されている。
【００３２】
一部の実施形態では、前記コアが中実または中空コアである。他の実施形態では、前記コアが不活性、常磁性または超常磁性である。別の実施形態では、前記コアが中実コアである。
【００３３】
他の実施形態では、前記中実コアが、金および銀などの貴金属、鉄およびコバルトなどの遷移金属、シリカなどの金属酸化物、ポリマーまたはそれらの組合せから構成されている。別の実施形態では、前記コアがポリマーコアであり、前記ポリマーコアが、両親媒性ブロックコポリマー、ポリスチレンなどの疎水性ポリマー、ポリ（乳酸）、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）、ポリ（グリコール酸）、ポリ（カプロラクトン）および他の生体適合性ポリマーから構成されている。
【００３４】
なお別の実施形態では、前記コアがリポソームコアである。
【００３５】
本発明の別の態様は、化合物、オリゴヌクレオチドまたはナノ構造体の前述の実施形態を含む組成物であって、ナノ構造体に会合している、ＴＮＦ障害を処置するための治療剤をさらに含む組成物である。一部の実施形態では、治療剤は、オリゴヌクレオチドに結合している。
【００３６】
本明細書で述べる組成物および核酸のそれぞれは、様々な担体で製剤化することができる。一部の実施形態では、本発明の化合物は、局所用担体で製剤化する。一部の実施形態では、局所用製剤は、クリーム剤である。他の実施形態では、局所用製剤は、ゲル剤である。
【００３７】
本発明の別の態様は、ＴＮＦ障害を処置するための有効量の化合物、オリゴヌクレオチドまたはナノ構造体の前述の態様を含む組成物を、ＴＮＦ障害を有する対象に投与することを含む、ＴＮＦ障害を処置する方法である。
【００３８】
別の実施形態では、前記ＴＮＦ障害が、自己免疫疾患、感染症、移植拒絶または移植片対宿主病、悪性腫瘍、肺障害、腸障害、心臓障害、敗血症、脊椎関節症、代謝障害、貧血、疼痛、肝障害、皮膚障害、爪障害、関節リウマチ、乾癬、乾癬性関節炎と合併した乾癬、潰瘍性大腸炎、クローン病、血管炎、ベーチェット病、強直性脊椎炎、喘息、慢性閉塞性肺障害（ＣＯＰＤ）、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、再狭窄、糖尿病、貧血、疼痛、クローン病関連障害、若年性関節リウマチ（ＪＲＡ）、Ｃ型肝炎ウイルス感染、乾癬性関節炎および慢性尋常性乾癬からなる群から選択される。
【００３９】
一部の実施形態では、前記自己免疫障害が、関節リウマチ、リウマチ性脊椎炎、変形性関節症、痛風性関節炎、アレルギー、多発性硬化症、自己免疫性糖尿病、自己免疫性ぶどう膜炎および腎炎症候群からなる群から選択される。
【００４０】
別の態様では、本発明はｉｎ  ｖｉｖｏでのＴＮＦレベルを低下させるための有効量の化合物、オリゴヌクレオチドまたはナノ構造体の前述の実施形態を含む組成物を対象に投与することを含む、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＴＮＦレベルを低下させる方法である。
【００４１】
本発明の制限のそれぞれは、本発明の様々な実施形態を包含し得る。したがって、いずれか１つの要素または要素の組合せを含む本発明の制限のそれぞれを本発明の各態様に含めることができることが予想される。本発明は、以下の説明で示すまたは図面で例示する成分の構築および配置の詳細にその適用が限定されない。本発明は、他の実施形態であり得、様々な方法で実施または実行することができる。
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される：
（項目１）
図７に示す構造を含む化合物またはその塩。
（項目２）
長さが１８ヌクレオチドである、項目１に記載の化合物。
（項目３）
担体を有する組成物に製剤化される、項目１に記載の化合物。
（項目４）
ナトリウム塩である、項目１に記載の化合物。
（項目５）
図８に示す構造である、項目１に記載の化合物。
（項目６）
末端のうちの１つに分子種をさらに含む、項目１から５のいずれか一項に記載の化合物。
（項目７）
両末端に分子種をさらに含む、項目１から５のいずれか一項に記載の化合物。
（項目８）
前記分子種が、スペーサー、脂質、ステロール、コレステロール、ステアリル、Ｃ１６アルキル鎖、胆汁酸、コール酸、タウロコール酸、デオキシコレート、オレイルリトコール酸、オレオイルコレン酸、糖脂質、リン脂質、スフィンゴ脂質、ステロイドなどのイソプレノイド、ビタミンＥなどのビタミン、飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸、トリグリセリドなどの脂肪酸エステル、ピレン、ポルフィリン、テキサフィリン、アダマンタン、アクリジン、ビオチン、クマリン、フルオレセイン、ローダミン、テキサスレッド、ジゴキシゲニン、ジメトキシトリチル、ｔ−ブチルジメチルシリル、ｔ−ブチルジフェニルシリル、シアニン染料（例えば、Ｃｙ３もしくはＣｙ５）、ヘキスト３３２５８染料、ソラレンおよびイブプロフェンからなる群から選択される、項目６から７のいずれか一項に記載の化合物。
（項目９）
前記分子種が、親油性部分、葉酸ラジカル、ステロイドラジカル、炭水化物ラジカル、ビタミンＡラジカル、ビタミンＥラジカルまたはビタミンＫラジカルからなる群から選択される、項目６から７のいずれか一項に記載の化合物。
（項目１０）
前記分子種が、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、メチルホスホネートおよびアミド結合からなる群から選択される結合により前記化合物に直接的に接続している、項目６から９のいずれか一項に記載の化合物。
（項目１１）
前記分子種がリンカーを介して前記化合物に間接的に接続している、項目６から９のいずれか一項に記載の化合物。
（項目１２）
前記リンカーが、脱塩基残基（ｄＳｐａｃｅｒ）、トリエチレングリコール（スペーサー９）またはヘキサエチレングリコール（スペーサー１８）などのオリゴエチレングリコールおよびブタンジオールなどのアルカンジオールからなる群から選択される非ヌクレオチドリンカーである、項目１１に記載の化合物。
（項目１３）
ｍＵｍＧｍＧｍＧｍＡｍＧＴ＊Ａ＊Ｇ＊Ａ＊Ｔ＊Ｇ＊ｍＡｍＧｍＧｍＵｍＡｍＣ（配列番号１６）を含むオリゴヌクレオチドであって、前記オリゴヌクレオチドの長さが１８ヌクレオチドであり、ｍが２’Ｏメチルであり、＊がホスホロチオエート修飾である、オリゴヌクレオチド。
（項目１４）
担体を有する組成物に製剤化される、項目１３に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目１５）
前記担体が脂質ベースの担体である、項目１３に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目１６）
前記担体がナノ粒子である、項目１３に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目１７）
３’または５’末端に分子種をさらに含む、項目１３から１６のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目１８）
３’および５’末端の両方に分子種をさらに含む、項目１３から１６のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目１９）
前記分子種が、スペーサー、脂質、ステロール、コレステロール、ステアリル、Ｃ１６アルキル鎖、胆汁酸、コール酸、タウロコール酸、デオキシコレート、オレイルリトコール酸、オレオイルコレン酸、糖脂質、リン脂質、スフィンゴ脂質、ステロイドなどのイソプレノイド、ビタミンＥなどのビタミン、飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸、トリグリセリドなどの脂肪酸エステル、ピレン、ポルフィリン、テキサフィリン、アダマンタン、アクリジン、ビオチン、クマリン、フルオレセイン、ローダミン、テキサスレッド、ジゴキシゲニン、ジメトキシトリチル、ｔ−ブチルジメチルシリル、ｔ−ブチルジフェニルシリル、シアニン染料（例えば、Ｃｙ３もしくはＣｙ５）、ヘキスト３３２５８染料、ソラレンおよびイブプロフェンからなる群から選択される、項目１７から１８のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目２０）
前記分子種が、親油性部分、葉酸ラジカル、ステロイドラジカル、炭水化物ラジカル、ビタミンＡラジカル、ビタミンＥラジカルまたはビタミンＫラジカルからなる群から選択される、項目１７から１８のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目２１）
前記分子種が、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、メチルホスホネートおよびアミド結合からなる群から選択される結合により前記化合物に直接的に接続している、項目１７から１８のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目２２）
前記分子種がリンカーを介して前記化合物に間接的に接続している、項目１７から２０のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目２３）
前記リンカーが、脱塩基残基（ｄＳｐａｃｅｒ）、トリエチレングリコール（スペーサー９）またはヘキサエチレングリコール（スペーサー１８）などのオリゴエチレングリコールおよびブタンジオールなどのアルカンジオールからなる群から選択される非ヌクレオチドリンカーである、項目２２に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目２４）
５’ＴＧＧＧＡＧＴＡＧＡＴＧＡＧＧＴＡＣ３’（配列番号４）を含むオリゴヌクレオチドであって、前記オリゴヌクレオチドの長さが１８〜１９ヌクレオチドであり、前記オリゴヌクレオチドの５’末端における４〜６ヌクレオチドおよび３’末端における４〜６ヌクレオチドが２’Ｏメチルを含み、４〜１０ヌクレオチドがホスホロチオエート修飾を有する、オリゴヌクレオチド。
（項目２５）
前記オリゴヌクレオチドの５’末端における６ヌクレオチドおよび３’末端における６ヌクレオチドが２’Ｏメチルを含む、項目２４に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目２６）
６ヌクレオチドがホスホロチオエート修飾を有する、項目２４または２５に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目２７）
７ヌクレオチドがホスホロチオエート修飾を有する、項目２４または２５に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目２８）
８ヌクレオチドがホスホロチオエート修飾を有する、項目２４または２５に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目２９）
前記ホスホロチオエート修飾ヌクレオチドが前記オリゴヌクレオチドの中央領域に存在する、項目２４から２８のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目３０）
前記オリゴヌクレオチドの５’末端から第７、第８、第９、第１０、第１１および第１２番目のヌクレオチドに付随するヌクレオチド間結合がホスホロチオエート修飾されている、項目２９に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目３１）
各ヌクレオチドが２’Ｏメチル修飾、またはホスホロチオエートによるヌクレオチド間結合のいずれかを有する、項目２４から３０のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目３２）
１つのみのヌクレオチドが２’Ｏメチル修飾、およびホスホロチオエートによるヌクレオチド間結合の両方を有する、項目２４に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目３３）
１つのみのヌクレオチドが２’修飾ヌクレオチドを有する、項目２４に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目３４）
前記２’修飾が、２’−デオキシ、２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）、２’Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）、２’−ジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）および２’−Ｏ−−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）の群から選択される、項目３３に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目３５）
ＴＧＧＧＡＧＴＡＧＡＴＧＡＧＧＴＡＣ（配列番号４）を含む長さが１８〜１９ヌクレオチドのアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む安定な自己集合ナノ構造体であって、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドがコアに会合している、自己集合ナノ構造体。
（項目３６）
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、長さが１８ヌクレオチドである、項目３５に記載のナノ構造体。
（項目３７）
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドがホスホジエステルヌクレオチド間結合を有する、項目３５または３６に記載のナノ構造体。
（項目３８）
前記ヌクレオチド間結合の全てよりも少ないものがホスホジエステルである、項目３７に記載のナノ構造体。
（項目３９）
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドがホスホロチオエートによるヌクレオチド間結合を有する、項目３５または３６に記載のナノ構造体。
（項目４０）
前記ヌクレオチド間結合の全てよりも少ないものがホスホロチオエートである、項目３９に記載のナノ構造体。
（項目４１）
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが２’Ｏメチル修飾を有する、項目３５から４
０のいずれか一項に記載のナノ構造体。
（項目４２）
前記ヌクレオチドの全てよりも少ないものが２’Ｏメチル修飾を含む、項目４１に記載のナノ構造体。
（項目４３）
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが１７のヌクレオチド間結合を有し、中央の６つのヌクレオチド間結合がホスホロチオエートである、項目３６に記載のナノ構造体。
（項目４４）
前記オリゴヌクレオチドの５’末端における最初の６つのヌクレオチド間結合がホスホジエステルヌクレオチド間結合である、項目４３に記載のナノ構造体。
（項目４５）
前記オリゴヌクレオチドの５’末端における最初の６つのヌクレオチドが２’Ｏメチル修飾ヌクレオチドである、項目４４に記載のナノ構造体。
（項目４６）
前記オリゴヌクレオチドの３’末端における最後の５つのヌクレオチドが２’Ｏメチル修飾ヌクレオチドである、項目４４または４５に記載のナノ構造体。
（項目４７）
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ｃ（配列番号４）、ｍＵｍＧｍＧｍＧｍＡｍＧｍＵｍＡｍＧｍＡｍＵｍＧｍＡｍＧｍＧｍＵｍＡｍＣ（配列番号１０、Ｏｌｉｇｏ３７４２）、Ｔ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｇ＊Ａ＊Ｇ＊Ｔ＊Ａ＊Ｇ＊Ａ＊Ｔ＊Ｇ＊Ａ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｔ＊Ａ＊Ｃ（配列番号９、Ｏｌｉｇｏ３５００）、ｍＵｍＧｍＧｍＧｍＡｍＧＴ＊Ａ＊Ｇ＊Ａ＊Ｔ＊Ｇ＊ｍＡｍＧｍＧｍＵｍＡｍＣ（配列番号１６、Ｏｌｉｇｏ３５３４）およびｍＵ＊ｍＧ＊ｍＧ＊ｍＧ＊ｍＡ＊ｍＧ＊Ｔ＊Ａ＊Ｇ＊Ａ＊Ｔ＊Ｇ＊ｍＡ＊ｍＧ＊ｍＧ＊ｍＵ＊ｍＡ＊ｍＣ（配列番号１８、Ｏｌｉｇｏ３５０９）からなる群から選択され、−が、ホスホジエステル結合を指し、＊が、ホスホロチオエート結合を指し、ｍが、Ｏメチルを指す、項目３６に記載のナノ構造体。
（項目４８）
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが前記コアの外側に結合されている、項目３５から４７のいずれか一項に記載のナノ構造体。
（項目４９）
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドの２〜１，０００コピーを含む、項目３５から４７のいずれか一項に記載のナノ構造体。
（項目５０）
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドと構造的に異なる少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む、項目３５から４８のいずれか一項に記載のナノ構造体。
（項目５１）
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドはその５’末端が前記ナノ構造体の外表面に露出している、項目３５から５０のいずれか一項に記載のナノ構造体。
（項目５２）
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドはその３’末端が前記ナノ構造体の外表面に露出している、項目３５から５０のいずれか一項に記載のナノ構造体。
（項目５３）
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが前記ナノ構造体の表面上に横方向に配置されている、項目３５から５０のいずれか一項に記載のナノ構造体。
（項目５４）
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドがリンカーを介して前記コアに間接的に結合されている、項目３５から５３のいずれか一項に記載のナノ構造体。
（項目５５）
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、１つ超のリンカーを介して前記コアに間接的に結合されている、項目３５から５４のいずれか一項に記載のナノ構造体。
（項目５６）
前記コアが中実または中空コアである、項目３５から５５のいずれか一項に記載のナノ構造体。
（項目５７）
前記コアが不活性、常磁性または超常磁性である、項目３５から５５のいずれか一項に記載のナノ構造体。
（項目５８）
前記コアが中実コアである、項目３５から５５のいずれか一項に記載のナノ構造体。
（項目５９）
前記中実コアが、金および銀などの貴金属、鉄およびコバルトなどの遷移金属、シリカなどの金属酸化物、ポリマーまたはそれらの組合せから構成されている、項目５８に記載のナノ構造体。
（項目６０）
前記コアがポリマーコアであり、前記ポリマーコアが、両親媒性ブロックコポリマー、ポリスチレンなどの疎水性ポリマー、ポリ（乳酸）、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）、ポリ（グリコール酸）、ポリ（カプロラクトン）および他の生体適合性ポリマーから構成されている、項目５８に記載のナノ構造体。
（項目６１）
前記コアがリポソームコアである、項目３５から５５のいずれか一項に記載のナノ構造体。
（項目６２）
項目１から１２のいずれか一項に記載の化合物、項目１３から３４のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドまたは項目３５から６１のいずれか一項に記載のナノ構造体を含む組成物であって、前記ナノ構造体と会合している、ＴＮＦ障害を処置するための治療剤をさらに含む組成物。
（項目６３）
前記治療剤が前記オリゴヌクレオチドに結合されている、項目６２に記載の組成物。
（項目６４）
ＴＮＦ障害を処置するための方法であって、前記ＴＮＦ障害を処置する有効量の、項目１から１２のいずれか一項に記載の化合物、項目１３から３４のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドまたは項目３５から６１のいずれか一項に記載のナノ構造体を含む組成物を、ＴＮＦ障害を有する対象に投与することを含む、前記ＴＮＦ障害を処置するための方法。
（項目６５）
前記ＴＮＦ障害が、自己免疫疾患、感染症、移植拒絶または移植片対宿主病、悪性腫瘍、肺障害、腸障害、心臓障害、敗血症、脊椎関節症、代謝障害、貧血、疼痛、肝障害、皮膚障害、爪障害、関節リウマチ、乾癬、乾癬性関節炎と合併した乾癬、潰瘍性大腸炎、クローン病、血管炎、ベーチェット病、強直性脊椎炎、喘息、慢性閉塞性肺障害（ＣＯＰＤ）、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、再狭窄、糖尿病、貧血、疼痛、クローン病関連障害、若年性関節リウマチ（ＪＲＡ）、Ｃ型肝炎ウイルス感染、乾癬性関節炎および慢性尋常性乾癬からなる群から選択される、項目６４に記載の方法。
（項目６６）
前記自己免疫障害が、関節リウマチ、リウマチ性脊椎炎、変形性関節症、痛風性関節炎、アレルギー、多発性硬化症、自己免疫性糖尿病、自己免疫性ぶどう膜炎および腎炎症候群からなる群から選択される、項目６５に記載の方法。
（項目６７）
ＴＮＦレベルをｉｎ  ｖｉｖｏで低下させるための有効量の、項目１から１２のいずれか一項に記載の化合物、項目１３から３４のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドまたは項目３５から６１のいずれか一項に記載のナノ構造体を含む組成物を対象に投与することを含む、ＴＮＦレベルをｉｎ  ｖｉｖｏで低下させるための方法。
（項目６８）
ＴＧＧＧＡＧＴＡＧＡＴＧＡＧＧＴＡＣ（配列番号４）を含む長さが１８〜１９ヌクレオチドのアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む安定な自己集合ナノ構造体であって、３’または５’末端における疎水性基が、水中または他の適切な溶媒中で自己会合して、前記ナノ構造体のコアを形成する、自己集合ナノ構造体。
（項目６９）
前記オリゴヌクレオチドが、ＤＮアーゼおよびＲＮアーゼ不含有の水または他の適切な溶媒中において５μＭを上回る濃度にある、項目６８に記載の安定な自己集合ナノ構造体。
（項目７０）
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、長さが１８ヌクレオチドである、項目６８に記載の安定な自己集合ナノ構造体。
（項目７１）
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドがホスホジエステルヌクレオチド間結合を有する、項目６８に記載の安定な自己集合ナノ構造体。
（項目７２）
前記ヌクレオチド間結合の全てよりも少ないものがホスホジエステルである、項目６８に記載の安定な自己集合ナノ構造体。
【００４２】
添付図面は、正確な縮尺率で描画されるものではない。これらの図面において、様々な図で例示されている各同一またはほぼ同一の成分は、同様の数値により表されている。明確さを目的とするため、すべての成分をすべての図面で表示することができるとは限らない。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】図１は、ＴＮＦ発現に対するＯｌｉｇｏ３４９５（スクランブル対照）に対して正規化したＯｌｉｇｏ３４８２、３４８３、３４８４、３４８５、３４８６、３４８７および３４８８を含むいくつかのオリゴヌクレオチドの初代ヒトケラチノサイトにおける阻害活性を示す棒グラフである。
【００４４】
【図２】図２は、ＴＮＦ発現に対するＯｌｉｇｏ３４８５、３４７２、３５０８、３５００、３４９６、３５２６、３６０７、３５３４、３５１４、３５０９、３５１６および３４９５を含むいくつかのオリゴヌクレオチドの初代ヒトケラチノサイトにおける阻害活性を示す棒グラフである。
【００４５】
【図３】図３は、それらのそれぞれの対照と比較したＯｌｉｇｏ３６６０、３７４３、３６６１、３６５７、３６６９および３６５２を含むいくつかのオリゴヌクレオチドの初代ヒトケラチノサイトにおける阻害活性に対する様々な化学的性質の影響を示す棒グラフである。オリゴヌクレオチドは、球状核酸（ＳＮＡ）として製剤化した。
【００４６】
【図４Ａ−Ｂ】図４Ａ〜４Ｂは、刺激ヒトケラチノサイトにおけるＳＮＡによるＴＮＦの遺伝子ノックダウン百分率を示す。図４Ａに、Ｏｌｉｇｏ３６５７およびその対照であるＯｌｉｇｏ３６６１とのＴＮＦ−α  ｍＲＮＡ発現百分率をグラフに示す。図４Ｂは、それぞれ化合物の半阻害濃度（ＩＣ５０）１．８ｎＭおよび＞１００ｎＭを示す。
【００４７】
【図５Ａ−Ｂ】図５Ａ〜５Ｂは、Ｏｌｉｇｏ３６５７修飾ＳＮＡに対するさらなるホスホロチオエート修飾の影響を示す。図５Ａに、ホスホロチオエート含量を増加させた場合のオリゴヌクレオチドの相対ｍＲＮＡ発現の百分率をグラフに示す。図５Ｂは、スクリーニングした各オリゴヌクレオチドの半有効濃度（ＥＣ５０）の表を示す。
【００４８】
【図６Ａ−Ｂ】図６Ａ〜６Ｂは、ＴＮＦ発現に対する中空ＳＮＡの影響を示す。図６Ａに、無処置体に対して正規化したＴＮＦ発現を示すが、図６Ｂは、化合物のＩＣ５０値を示す。
【００４９】
【図７】図７は、遊離酸の形態のＴＮＦアンチセンスオリゴヌクレオチドの構造である。
【００５０】
【図８】図８は、塩の形態のＴＮＦアンチセンスオリゴヌクレオチドの構造である。
【００５１】
【図９】図９は、刺激ヒトケラチノサイトにおけるＳＮＡによるＴＮＦの遺伝子ノックダウン百分率を示す。Ｏｌｉｇｏ６０８１およびその対照であるＯｌｉｇｏ６０９３とのＴＮＦ  ｍＲＮＡ発現の百分率をグラフに示す。示したデータは、ＴＮＦのみにより刺激された細胞（オリゴヌクレオチドなし、１．０に設定）と比較したＴＮＦ  ｍＲＮＡの遺伝子発現である。
【００５２】
【図１０】図１０は、刺激された初代ヒトケラチノサイトにおけるＴＮＦ  ｍＲＮＡ発現の阻害活性に対する様々なヘキサエチレングリコールスペーサー長の影響を示す棒グラフである。Ｏｌｉｇｏ６０８０、６０８１、６０８２および６０９２で処理した細胞の、それらのそれぞれの対照であるＯｌｉｇｏ６０８３、６０９３、６０９４および６０９５（１００に設定）と比較した、ＴＮＦ  ｍＲＮＡ発現の百分率を示す。
【００５３】
【図１１】図１１は、乾癬性ｅｘ  ｖｉｖｏ外植体におけるＬ−ＳＮＡノックダウンＴＮＦを示す棒グラフである。
【００５４】
【図１２Ａ−Ｂ】図１２Ａ〜１２Ｄは、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を含有するマウスにおけるＳ−ＳＮＡ（自己集合ＳＮＡ）型およびＬ−ＳＮＡ（リポソームＳＮＡ）型のＴＮＦアンチセンスオリゴヌクレオチドの臨床的および肉眼的病理スコアの低下を示す。図１２Ａに、疾患の臨床的スコアをビヒクル、ＴＮＢＳ、様々な投与量のＳ−ＳＮＡ型のＯｌｉｇｏ２２７９０１について示す。図１２Ｂに、疾患の臨床的スコアをビヒクル、ＴＮＢＳ、様々な投与量のＬ−ＳＮＡ型のＯｌｉｇｏ２２７９０１について示す。図１２Ｃに、疾患の肉眼的病理スコアをビヒクル、ＴＮＢＳ、様々な投与量のＳ−ＳＮＡ型のＯｌｉｇｏ２２７９０１について示す。図１２Ｄに、疾患の肉眼的病理スコアをビヒクル、ＴＮＢＳ、様々な投与量のＬ−ＳＮＡ型のＯｌｉｇｏ２２７９０１について示す。＊一元配置ＡＮＯＶＡとそれに続く事後チューキー検定を用いた場合、ビヒクル群に対しｐ＜０．０５であることを示す。
【図１２Ｃ】図１２Ａ〜１２Ｄは、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を含有するマウスにおけるＳ−ＳＮＡ（自己集合ＳＮＡ）型およびＬ−ＳＮＡ（リポソームＳＮＡ）型のＴＮＦアンチセンスオリゴヌクレオチドの臨床的および肉眼的病理スコアの低下を示す。図１２Ａに、疾患の臨床的スコアをビヒクル、ＴＮＢＳ、様々な投与量のＳ−ＳＮＡ型のＯｌｉｇｏ２２７９０１について示す。図１２Ｂに、疾患の臨床的スコアをビヒクル、ＴＮＢＳ、様々な投与量のＬ−ＳＮＡ型のＯｌｉｇｏ２２７９０１について示す。図１２Ｃに、疾患の肉眼的病理スコアをビヒクル、ＴＮＢＳ、様々な投与量のＳ−ＳＮＡ型のＯｌｉｇｏ２２７９０１について示す。図１２Ｄに、疾患の肉眼的病理スコアをビヒクル、ＴＮＢＳ、様々な投与量のＬ−ＳＮＡ型のＯｌｉｇｏ２２７９０１について示す。＊一元配置ＡＮＯＶＡとそれに続く事後チューキー検定を用いた場合、ビヒクル群に対しｐ＜０．０５であることを示す。
【図１２Ｄ】図１２Ａ〜１２Ｄは、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を含有するマウスにおけるＳ−ＳＮＡ（自己集合ＳＮＡ）型およびＬ−ＳＮＡ（リポソームＳＮＡ）型のＴＮＦアンチセンスオリゴヌクレオチドの臨床的および肉眼的病理スコアの低下を示す。図１２Ａに、疾患の臨床的スコアをビヒクル、ＴＮＢＳ、様々な投与量のＳ−ＳＮＡ型のＯｌｉｇｏ２２７９０１について示す。図１２Ｂに、疾患の臨床的スコアをビヒクル、ＴＮＢＳ、様々な投与量のＬ−ＳＮＡ型のＯｌｉｇｏ２２７９０１について示す。図１２Ｃに、疾患の肉眼的病理スコアをビヒクル、ＴＮＢＳ、様々な投与量のＳ−ＳＮＡ型のＯｌｉｇｏ２２７９０１について示す。図１２Ｄに、疾患の肉眼的病理スコアをビヒクル、ＴＮＢＳ、様々な投与量のＬ−ＳＮＡ型のＯｌｉｇｏ２２７９０１について示す。＊一元配置ＡＮＯＶＡとそれに続く事後チューキー検定を用いた場合、ビヒクル群に対しｐ＜０．０５であることを示す。
【００５５】
【図１３】図１３は、Ｏｌｉｇｏ６３０７自己集合ＳＮＡの低温ＴＥＭを示す。
【００５６】
【図１４Ａ−Ｂ】図１４Ａ〜１４Ｂは、Ｏｌｉｇｏ６３０７自己集合ＳＮＡの低温ＴＥＭの概略図を示す。個別のＳＮＡ（図１４Ａ）およびＳＮＡの集合（図１４Ｂ）の概略図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５７】
（詳細な説明）
本発明は、一部の態様ではＴＮＦαを低下させるための組成物およびそれらの組成物を用いてＴＮＦ障害を処置する方法に関する。極めて有効なＴＮＦα阻害剤が本発明の態様により特定された。このＴＮＦα阻害剤は、核酸ベースのアンチセンス組成物である。「ＴＮＦ−アルファ」または「ＴＮＦ−α」という用語は、１７ｋＤの分泌型および２６ｋＤの膜会合型として存在するサイトカインを指し、その生物学的活性型は、非共有結合的に結合した１７ｋＤ分子の三量体で構成されている。
【００５８】
本明細書で用いられる「ＴＮＦα阻害剤」は、ＴＮＦα活性を妨げる核酸ベースの薬剤を指す。特に、本発明のＴＮＦαアンチセンス阻害剤またはＴＮＦαアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＴＮＦα遺伝子の発現を低下させる。
【００５９】
本発明のＴＮＦ阻害剤は、アンチセンス核酸である。アンチセンス核酸は、一般的に修飾もしくは非修飾ＲＮＡ、ＤＮＡ、または混合ポリマー核酸を含み、マッチング配列に特異的に結合し、ペプチド合成の調整をもたらすことによって主として機能する。アンチセンス核酸は、ワトソン・クリック塩基対合により標的ＲＮＡに結合し、立体障害またはＲＮアーゼＨ酵素の活性化のいずれかにより、結合配列のリボソームによる翻訳を妨げることによって遺伝子発現をブロックする。アンチセンス分子はまた、ＲＮＡプロセシングまたは核から細胞質内への輸送を妨げることによってタンパク質合成を変化させ得る。
【００６０】
本明細書で用いられる「アンチセンス核酸」または「アンチセンスオリゴヌクレオチド」という用語は、生理的条件下で特定の遺伝子を含むＤＮＡとまたは当該遺伝子のｍＲＮＡ転写物、この場合にはＴＮＦαとハイブリダイズし、それにより、当該遺伝子の転写および／または当該ｍＲＮＡの翻訳を阻害する核酸を記載する。アンチセンス分子は、標的遺伝子または転写物とのハイブリダイゼーションにより標的遺伝子の転写または翻訳を妨げるように設計される。当業者は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの正確な長さおよびその標的とのその相補性の程度が、標的の配列および当該配列を含む特定の塩基を含む、選択される特定の標的に依存することを認識する。
【００６１】
「遺伝子発現の阻害」は、ＴＮＦα遺伝子のような、標的遺伝子からのタンパク質および／またはｍＲＮＡ産物の非存在またはそのレベルの観測可能な低下を指す。「特異性」は、細胞の他の遺伝子に対する明らかな影響を伴わずに標的遺伝子を阻害する能力を指す。阻害による結果は、細胞もしくは生物の外部特性の検査によりまたはＲＮＡ溶液ハイブリダイゼーション、ヌクレアーゼ保護、ノーザンハイブリダイゼーション、逆転写、マイクロアレイによる遺伝子発現モニタリング、抗体結合、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロッティング、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、他のイムノアッセイおよび蛍光活性化細胞解析（ＦＡＣＳ）などの生化学的手法により確認することができる。
【００６２】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＴＮＦα発現を阻害する。アッセイによっては、遺伝子発現の量の定量化により、本発明により処理しなかった細胞と比較して５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％より大きい阻害の程度を決定することが可能になる。例として、阻害の効率は、細胞中の遺伝子産物の量を評価することによって決定することができる。
【００６３】
一部の例において、ＴＮＦα阻害剤は、以下の構造を有する化合物またはその塩およびプロドラッグを含む生物学的同等物である。
【化１】
0006741673.tif 000002
【００６４】
本明細書で用いられる、薬学的に許容される塩およびプロドラッグを含む生物学的に同等な化合物という用語は、目的のアンチセンスオリゴヌクレオチドと同じ一次構造を有するが、目的のアンチセンスオリゴヌクレオチドと同じ種類の生物学的作用を有するように切断または修飾することができる塩の形態または構造を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチドを指す。これは、ヒトを含む動物への投与により、生物学的に活性な代謝物またはその残基を（直接的または間接的に）供給することができる、任意の薬学的に許容される塩、エステル、もしくはそのようなエステルの塩、または任意の他の化合物を包含するものとする。
【００６５】
「薬学的に許容される塩」は、本発明の核酸の生理学的かつ薬学的に許容される塩、すなわち、目的の化合物の所望の生物学的活性を保持し、望ましくない毒性学的作用をそれに与えない塩である。薬学的に許容される塩は、（ａ）ナトリウム、カリウム、アンモニウム、マグネシウム、カルシウムなどの陽イオン、スペルミンおよびスペルミジンなどのポリアミンなどにより形成される塩；（ｂ）無機酸、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸などにより形成される酸付加塩；（ｃ）例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、グルコン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、安息香酸、タンニン酸、パルミチン酸、アルギン酸、ポリグルタミン酸、ナフタレンスルホン酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、ポリガラクツロン酸などのような有機酸により形成される塩；ならびに（ｄ）塩素、臭素およびヨウ素などの陰イオン元素から形成される塩を含むが、これらに限定されない。
【００６６】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの塩の例は、例えば、以下の構造を有するナトリウム塩である化合物である。
【化２】
0006741673.tif 000003
【００６７】
本発明の化合物は、「プロドラッグ」の形態で送達されるように調製することもできる。「プロドラッグ」は、内因性酵素もしくは他の化学物質および／または条件の作用により体内またはその細胞内で活性型（すなわち、薬物）に変換される不活性型で調製される治療剤である。
【００６８】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＴＮＦαアンチセンスオリゴヌクレオチドである。アンチセンスＴＮＦαオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド塩基の配列およびアンチセンスオリゴヌクレオチドが一般的にワトソン・クリック塩基対合によりＴＮＦα標的配列とハイブリダイズして、標的配列内にＲＮＡ：オリゴマーヘテロ二本鎖を形成することを可能にするサブユニット間主鎖を有する化合物を指す。
【００６９】
アンチセンスオリゴヌクレオチドとその標的核酸であるＴＮＦαとの特異的ハイブリダイゼーションは、この核酸、つまりＴＮＦαの正常機能を妨げる。標的核酸と特異的にハイブリダイズする化合物による標的核酸の機能のこの調整は、一般的に「アンチセンス」と呼ばれる。妨げられるＤＮＡの機能は、複製および転写を含む。妨げられるＲＮＡの機能は、例えば、タンパク質翻訳の部位へのＲＮＡの移行、ＲＮＡからのタンパク質の翻訳、１つまたは複数のｍＲＮＡ種を生じるＲＮＡのスプライシング、およびＲＮＡに関与しうるまたはＲＮＡによって促進され得る触媒活性などのすべての必須の機能を含む。標的核酸機能のそのような妨げの全体的な影響は、ＴＮＦαタンパク質の発現の調整である。本発明の状況では、「調整」は、遺伝子の発現の低下または阻害を意味する。
【００７０】
オリゴヌクレオチドが生理的条件下で、３７℃を超える、好ましくは少なくとも４５℃、一般的に５０℃〜８０℃またはそれ超より実質的に高い熱融解点（Ｔｍ）で、ＴＮＦα標的とハイブリダイズする場合、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドと「特異的にハイブリダイズする」。そのようなハイブリダイゼーションは、好ましくは、規定のイオン強度およびｐＨで特定の配列のＴｍより約１０℃、好ましくは約５０℃低いように選択された、厳密ハイブリダイゼーション条件に対応する。所定のイオン強度およびｐＨでは、Ｔｍは、標的配列の５０％が相補的ポリヌクレオチドとハイブリダイズする温度である。
【００７１】
２つの一本鎖ポリヌクレオチドの間に逆平行配置でハイブリダイゼーションが起こる場合、ポリヌクレオチドは、互いに「相補的」として記載される。第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドの鎖の１つの間にハイブリダイゼーションが起こる場合、二本鎖ポリヌクレオチドは、別のポリヌクレオチドと「相補的」であり得る。相補性（１つのポリヌクレオチドが別のものと相補的である程度）は、一般的に受け入れられている塩基対合則に従って、互いに水素結合を形成すると予想される対向する鎖における塩基の割合により定量可能である。アンチセンス化合物と転写物との間に形成されたヘテロ二本鎖構造が所望のＴｍ安定性を有する限り、アンチセンス化合物は、２つの塩基配列が１００％相補的でないとしても、標的転写物の標的領域と相補的であり得る。
【００７２】
特定の核酸を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを同定することは、多段階過程である。この過程は、通常、その機能を調整すべき核酸配列の特定から開始する。これは、例えば、その発現が特定のＴＮＦα障害または疾患状態に関連する細胞遺伝子（または遺伝子から転写されたｍＲＮＡ）であり得る。標的設定過程は、所望の効果、例えば、タンパク質の発現の検出または調整が生じるようにアンチセンス相互作用が起こる、このＴＮＦα遺伝子内の部位または複数の部位の決定も含む。本発明の状況では、好ましい遺伝子内部位は、配列番号３４のヌクレオチド配列２２８３〜２３００、すなわち、ｇｔａｃｃｔｃａ  ｔｃｔａｃｔｃｃｃａ（配列番号３５）を包含する領域である。
【００７３】
好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒトＴＮＦα、例えば、以下に示す配列番号３４のヌクレオチド配列を標的とするように設計される。ヒトＴＮＦα  ｃＤＮＡ配列は、Nedwin  G.  E.ら（Nucleic  Acids  Res.、１９８５年、１３巻、６３６１〜６３７３頁）により公表され、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｘ０２９１０に開示されている。
【００７４】
【化３−１】
0006741673.tif 000004
【化３−２】
0006741673.tif 000005
【００７５】
本明細書で述べるナノ構造体は、安定な自己集合ナノ構造体であり得る。例えば、ナノ構造体は、ＴＧＧＧＡＧＴＡＧＡＴＧＡＧＧＴＡＣ（配列番号４）を含む長さが１８〜１９ヌクレオチドのアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、３’または５’末端における疎水性基が自己会合して、水中または適切な溶媒中でナノ構造体のコアを形成し得る、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。本明細書で用いられる疎水性基は、コレステロール、コレステリルもしくは修飾コレステリル残基、アダマンチン、ジヒドロテステロン、長鎖アルキル、長鎖アルケニル、長鎖アルキニル、オレイルリトコール（olely-lithocholic）、コレン、オレオイル−コレン、パルミチル、ヘプタデシル、ミリスチル（myrisityl）、胆汁酸、コール酸もしくはタウロコール酸、デオキシコレート、オレイルリトコール酸、オレオイルコレン酸、糖脂質、リン脂質、スフィンゴ脂質、ステロイドなどのイソプレノイド、ビタミンＥなどのビタミン、飽和もしくは不飽和のいずれかの脂肪酸、トリグリセリドなどの脂肪酸エステル、ピレン、ポルフィリン、テキサフィリン、アダマンタン、アクリジン、ビオチン、クマリン、フルオレセイン、ローダミン、テキサスレッド、ジゴキシゲニン、ジメトキシトリチル、ｔ−ブチルジメチルシリル、ｔ−ブチルジフェニルシリル、シアニン染料（例えば、Ｃｙ３もしくはＣｙ５）、ヘキスト３３２５８染料、ソラレンまたはイブプロフェンを含み得る。
【００７６】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、一般的に１５〜２０塩基の長さを有し、これは、一般的に哺乳類ゲノムにおける１つの相補的配列を有するのに十分に長い。さらに、長さが少なくとも１２、一般的に少なくとも１５ヌクレオチドの長さを有するアンチセンス化合物は、それらの標的ｍＲＮＡと十分にハイブリダイズする。したがって、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、一般的に８〜１００ヌクレオチドのサイズ範囲にあり、より好ましくは長さが１２〜５０ヌクレオチドである。本発明の一部の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、長さが１８〜１９ヌクレオチドであり、ＴＧＧＧＡＧＴＡＧＡＴＧＡＧＧＴＡＣ（配列番号４）を含む。配列番号４を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの５’および／または３’末端にさらなるヌクレオチドを含み得る。しかし、配列番号４を含み、長さが１８ヌクレオチドに制限されているアンチセンスオリゴヌクレオチドは、その分子の５’または３’末端にさらなるヌクレオチドを有さない。他の非ヌクレオチド分子は、それらのオリゴヌクレオチドの５’および／または３’末端に共有結合または非共有結合により結合させ得る。
【００７７】
一部の例において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、以下のオリゴヌクレオチド：Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ｃ（配列番号４）、ｍＵｍＧｍＧｍＧｍＡｍＧｍＵｍＡｍＧｍＡｍＵｍＧｍＡｍＧｍＧｍＵｍＡｍＣ（配列番号１０、Ｏｌｉｇｏ３７４２）、Ｔ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｇ＊Ａ＊Ｇ＊Ｔ＊Ａ＊Ｇ＊Ａ＊Ｔ＊Ｇ＊Ａ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｔ＊Ａ＊Ｃ（配列番号９、Ｏｌｉｇｏ３５００）、ｍＵｍＧｍＧｍＧｍＡｍＧＴ＊Ａ＊Ｇ＊Ａ＊Ｔ＊Ｇ＊ｍＡｍＧｍＧｍＵｍＡｍＣ（配列番号１６、Ｏｌｉｇｏ３５３４）およびｍＵ＊ｍＧ＊ｍＧ＊ｍＧ＊ｍＡ＊ｍＧ＊Ｔ＊Ａ＊Ｇ＊Ａ＊Ｔ＊Ｇ＊ｍＡ＊ｍＧ＊ｍＧ＊ｍＵ＊ｍＡ＊ｍＣ（配列番号１８、Ｏｌｉｇｏ３５０９）の１つであり、−は、ホスホジエステル結合を指し、＊は、ホスホロチオエート結合を指し、ｍは、Ｏメチルを指す。
【００７８】
「核酸」および「オリゴヌクレオチド」という用語は、互換的に用いられ、リン酸基に、および置換ピリミジン（例えば、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）もしくはウラシル（Ｕ））または置換プリン（例えば、アデニン（Ａ）もしくはグアニン（Ｇ））のいずれかである、交換可能な有機塩基に結合された複数のヌクレオチド（すなわち、糖（例えば、リボースまたはデオキシリボース）を含む分子）を意味する。本明細書で用いられる「核酸」および「オリゴヌクレオチド」という用語は、オリゴリボヌクレオチドおよびオリゴデオキシリボヌクレオチドを指す。「核酸」および「オリゴヌクレオチド」という用語は、ポリヌクレオシド（すなわち、ポリヌクレオチドからリン酸を除いたもの）およびあらゆる他の有機塩基含有ポリマーも含むものとする。核酸分子は、好ましくは合成分子である（例えば、核酸合成により生成された）。オリゴヌクレオチドは、アンチセンス効果をもたらすのに有用な任意のサイズであり得る。一部の実施形態では、それらは、長さが１８〜２３ヌクレオチドである。他の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、長さが１８ヌクレオチドである。
【００７９】
「核酸」および「オリゴヌクレオチド」という用語はまた、例えば、塩基および／または糖などにおける、置換または修飾を有する核酸またはオリゴヌクレオチドを包含し得る。例えば、それらは、２’位におけるヒドロキシル基以外および５’位におけるリン酸基またはヒドロキシ基以外の低分子量有機基に共有結合している主鎖糖を有する核酸を含む。したがって、修飾核酸は、２’−Ｏ−アルキル化リボース基を含み得る。さらに、修飾核酸は、リボースの代わりにアラビノースまたは２’−フルオロアラビノースなどの糖を含み得る。したがって、核酸は、主鎖組成が不均質であり、それにより、ペプチド−核酸（核酸塩基を含むアミノ酸主鎖を有する）のような連結したポリマー単位のあらゆる可能な組合せを含有し得る。他の例は、下文でより詳細に述べる。
【００８０】
オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、ＥＮＡまたはそれらの任意の化学修飾もしくは天然修飾を含むハイブリッドであり得る。化学修飾および天然修飾は、当技術分野で周知である。そのような修飾は、例えば、標的鎖への結合を増大させる（すなわち、それらの融解温度を上昇させる）ように、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド−標的複合体の同定を補助するように、細胞浸透を増加させるように、オリゴヌクレオチドの構造または活性を分解しまたは妨げるヌクレアーゼおよび他の酵素に対して安定させるように、標的に配列特異的に結合したならば中断の状態（終結事象）をもたらすように、ならびにオリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改善するように設計された修飾を含む。
【００８１】
修飾は、例えば、（ａ）末端修飾、例えば、５’末端修飾（リン酸化、脱リン酸化、コンジュゲーション、反転結合（inverted  linkage）など）、３’末端修飾（コンジュゲーション、ＤＮＡヌクレオチド、反転結合など）、（ｂ）塩基修飾、例えば、修飾塩基、安定化塩基、不安定化塩基、またはパートナーのより広範なレパートリーと塩基対形成する塩基、または共役塩基（conjugated  base）による置き換え、（ｃ）糖修飾（例えば、２’位または４’位における）または糖の置き換え、ならびに（ｄ）ホスホジエステル結合の修飾または置き換えを含む、ヌクレオシド間結合修飾を含むが、これらに限定されない。そのような修飾が翻訳を妨げる（すなわち、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳アッセイにおいて、修飾の欠如している場合と比べて翻訳の５０％、６０％、７０％、８０％または９０％またはそれ超の減少をもたらす）限りは、修飾は、本明細書で述べる方法および組成物について最適でない可能性がある。
【００８２】
修飾ヌクレオシド間結合の非限定的な例は、正常３’−５’  結合を有する、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルならびに３’−アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含む他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’−アミノホスホルアミデートおよびアミノアルキルホスホルアミデートを含むホスホルアミデート、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、ならびにボラノホスフェート、これらの２’−５’  結合類似体、ならびにヌクレオシド単位の隣接対が結合している極性が３’−５’から５’−３’に、または２’−５’から５’−２’に反転しているものを含む。様々な塩、混合塩および遊離酸型も含まれる。
【００８３】
リン原子をその中に含まない修飾ヌクレオシド間結合は、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子およびアルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、または１もしくは複数の短鎖ヘテロ原子もしくはヘテロ環式ヌクレオシド間結合により形成されるヌクレオシド間結合を有する。これらは、モルホリノ結合を有するもの（ヌクレオシドの糖部分から一部分は形成された）；シロキサン主鎖；スルフィド、スルホキシドおよびスルホン主鎖；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル主鎖；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル主鎖；アルケン含有主鎖；スルファメート主鎖；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ主鎖；スルホネートおよびスルホンアミド主鎖；アミド主鎖；ならびに混合Ｎ、Ｏ、ＳおよびＣＨ２成分部分を有するその他のものを含む。
【００８４】
置換糖部分は、２’位における以下のもの：Ｈ（デオキシリボース）；ＯＨ（リボース）；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−もしくはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−もしくはＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−もしくはＮ−アルキニル；またはＯ−アルキル−Ｏ−アルキルの１つを含むが、これらに限定されず、アルキル、アルケニルおよびアルキニルは、置換または非置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキルまたはＣ２〜Ｃ１０アルケニルおよびアルキニルであり得る。
【００８５】
化学的にまたは天然で修飾されたオリゴヌクレオチドは、例えば、糖の２’位において修飾されている少なくとも１つのヌクレオチド、最も好ましくは２’−Ｏ−アルキル、２’−Ｏ−アルキル−Ｏ−アルキルもしくは２’−フルオロ修飾ヌクレオチドまたは末端キャップを含み得る。他の実施形態では、ＲＮＡ修飾は、ＲＮＡの３’末端におけるピリミジンのリボース、脱塩基残基または反転塩基上の２’−フルオロ、２’−アミノおよび２’−Ｏ−メチル修飾を含む。
【００８６】
本発明により有用なオリゴヌクレオチドは、単一修飾ヌクレオシドを含み得る。他の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも２個の修飾ヌクレオシド、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個またはそれ超、最大オリゴヌクレオチドの全長までのヌクレオシドを含み得る。
【００８７】
ヌクレオシドまたは核酸塩基は、天然プリン塩基アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）ならびにピリミジン塩基チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）を含む。修飾ヌクレオシドは、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、ヌブラリン、イソグアニシン、ツベルシジン、２−（ハロ）アデニン、２−（アルキル）アデニン、２−（プロピル）アデニン、２（アミノ）アデニン、２−（アミノアルキル（aminoalkyll））アデニン、２（アミノプロピル）アデニン、２（メチルチオ）Ｎ６（イソペンテニル）アデニン、６（アルキル）アデニン、６（メチル）アデニン、７（デアザ）アデニン、８（アルケニル）アデニン、８−（アルキル）アデニン、８（アルキニル）アデニン、８（アミノ）アデニン、８−（ハロ）アデニン、８−（ヒドロキシル）アデニン、８（チオアルキル）アデニン、８−（チオール）アデニン、Ｎ６−（イソペンチル）アデニン、Ｎ６（メチル）アデニン、Ｎ６，Ｎ６（ジメチル）アデニン、２−（アルキル）グアニン、２（プロピル）グアニン、６−（アルキル）グアニン、６（メチル）グアニン、７（アルキル）グアニン、７（メチル）グアニン、７（デアザ）グアニン、８（アルキル）グアニン、８−（アルケニル）グアニン、８（アルキニル）グアニン、８−（アミノ）グアニン、８（ハロ）グアニン、８−（ヒドロキシル）グアニン、８（チオアルキル）グアニン、８−（チオール）グアニン、Ｎ（メチル）グアニン、２−（チオ）シトシン、３（デアザ）５（アザ）シトシン、３−（アルキル）シトシン、３（メチル）シトシン、５−（アルキル）シトシン、５−（アルキニル）シトシン、５（ハロ）シトシン、５（メチル）シトシン、５（プロピニル）シトシン、５（プロピニル）シトシン、５（トリフルオロメチル）シトシン、６−（アゾ）シトシン、Ｎ４（アセチル）シトシン、３（３アミノ−３カルボキシプロピル）ウラシル、２−（チオ）ウラシル、５（メチル）２（チオ）ウラシル、５（メチルアミノメチル）−２（チオ）ウラシル、４−（チオ）ウラシル、５（メチル）４（チオ）ウラシル、５（メチルアミノメチル）−４（チオ）ウラシル、５（メチル）２，４（ジチオ）ウラシル、５（メチルアミノメチル）−２，４（ジチオ）ウラシル、５（２−アミノプロピル）ウラシル、５−（アルキル）ウラシル、５−（アルキニル）ウラシル、５−（アリルアミノ）ウラシル、５（アミノアリル）ウラシル、５（アミノアルキル）ウラシル、５（グアニジニウムアルキル）ウラシル、５（１，３−ジアゾール−１−アルキル）ウラシル、５−（シアノアルキル）ウラシル、５−（ジアルキルアミノアルキル）ウラシル、５（ジメチルアミノアルキル）ウラシル、５−（ハロ）ウラシル、５−（メトキシ）ウラシル、ウラシル−５オキシ酢酸、５（メトキシカルボニルメチル）−２−（チオ）ウラシル、５（メトキシカルボニル−メチル）ウラシル、５（プロピニル）ウラシル、５（プロピニル）ウラシル、５（トリフルオロメチル）ウラシル、６（アゾ）ウラシル、ジヒドロウラシル、Ｎ３（メチル）ウラシル、５−ウラシル（すなわち、プソイドウラシル）、２（チオ）プソイドウラシル、４（チオ）プソイドウラシル、２，４−（ジチオ）プソイドウラシル、５−（���ルキル）プソイドウラシル、５−（メチル）プソイドウラシル、５−（アルキル）−２−（チオ）プソイドウラシル、５−（メチル）−２−（チオ）プソイドウラシル、５−（アルキル）−４（チオ）プソイドウラシル、５−（メチル）−４（チオ）プソイドウラシル、５−（アルキル）−２，４（ジチオ）プソイドウラシル、５−（メチル）−２，４（ジチオ）プソイドウラシル、１置換プソイドウラシル、１置換２（チオ）プソイドウラシル、１置換４（チオ）プソイドウラシル、１置換２，４−（ジチオ）プソイドウラシル、１（アミノカルボニルエチレニル）−プソイドウラシル、１（アミノカルボニルエチレニル）−２（チオ）プソイドウラシル、１（アミノカルボニルエチレニル）−４（チオ）プソイドウラシル、１（アミノカルボニルエチレニル）−２，４−（ジチオ）プソイドウラシル、１（アミノアルキルアミノカルボニルエチレニル（arninoalkylarninocarbonylethylenyl））−プソイドウラシル、１（アミノアルキルアミノカルボニルエチレニル）−２（チオ）プソイドウラシル、１（アミノアルキルアミノカルボニルエチレニル）−４（チオ）プソイドウラシル、１（アミノアルキルアミノカルボニルエチレニル）−２，４−（ジチオ）プソイドウラシル、１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェノキサジン−１−イル、１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェノキサジン−１−イル、１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェンチアジン−１−イル、１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェンチアジン−１−イル、７−置換１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェノキサジン−１−イル、７−置換１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェノキサジン−１−イル、７−置換１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェンチアジン−１−イル、７−置換１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェンチアジン−１−イル、７−（アミノアルキルヒドロキシ（arninoalkylhydroxy））−１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェノキサジン−１−イル、７−（アミノアルキルヒドロキシ）−１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェノキサジン−１−イル、７−（アミノアルキルヒドロキシ）−１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェンチアジン−１−イル、７−（アミノアルキルヒドロキシ）−１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェンチアジン−１−イル、７−（グアニジニウムアルキルヒドロキシ）−１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェノキサジン−１−イル、７−（グアニジニウムアルキルヒドロキシ）−１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェノキサジン−１−イル、７−（グアニジニウムアルキル−ヒドロキシ）−１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェンチアジン−１−イル、７−（グアニジニウムアルキルヒドロキシ）−１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェンチアジン−１−イル、１，３，５−（トリアザ）−２，６−（ジオキサ）−ナフタレン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、ヌブラリン、ツベルシジン、イソグアニシン、イノシニル、２−アザ−イノシニル、７−デアザ−イノシニル、ニトロイミダゾリル、ニトロピラゾリル、ニトロベンゾイミダゾリル、ニトロインダゾリル、アミノインドリル、ピロロピリミジニル、３−（メチル）イソカルボスチリリル、５−（メチル）イソカルボスチリリル、３−（メチル）−７−（プロピニル）イソカルボスチリリル、７−（アザ）インドリル、６−（メチル）−７−（アザ）インドリル、イミジゾピリジニル、９−（メチル）−イミジゾピリジニル、ピロロピリジニル、イソカルボスチリリル、７−（プロピニル）イソカルボスチリリル、プロピニル−７−（アザ）インドリル、２，４，５−（トリメチル）フェニル、４−（メチル）インドリル、４，６−（ジメチル）インドリル、フェニル、ナフタレニル（napthalenyl）、アントラセニル、フェナントラセニル、ピレニル、スチルベニル、テトラセニル、ペンタセニル、ジイルオロトリル、４−（イルオロ）−６−（メチル）ベンゾイミダゾール、４−（メチル）ベンゾイミダゾール、６−（アゾ）チミン、２−ピリジノン、５ニトロインドール、３ニトロピロール、６−（アザ）ピリミジン、２（アミノ）プリン、２，６−（ジアミノ）プリン、５置換ピリミジン、Ｎ２−置換プリン、Ｎ６−置換プリン、Ｏ６−置換プリン、置換１，２，４−トリアゾール、ピロロ−ピリミジン−２−オン−３−イル、６−フェニル−ピロロ−ピリミジン−２−オン−３−イル、パラ−置換−６−フェニル−ピロロ−ピリミジン−２−オン−３−イル、オルト−置換−６−フェニル−ピロロ−ピリミジン−２−オン−３−イル、ビス−オルト−置換−６−フェニル−ピロロ−ピリミジン−２−オン−３−イル、パラ−（アミノアルキルヒドロキシ）−６−フェニル−ピロロ−ピリミジン−２−オン−３−イル、オルト−（アミノアルキルヒドロキシ）−６−フェニル−ピロロ−ピリミジン−２−オン−３−イル、ビス−オルト−（アミノアルキルヒドロキシ）−６−フェニル−ピロロ−ピリミジン−２−オン−３−イル、ピリドピリミジンー３−イル、２−オキソ−７−アミノ−ピリドピリミジン−３−イル、２−オキソ−ピリドピリミジン−３−イルまたはそれらの任意のＯ−アルキル化もしくはＮ−アルキル化誘導体などの他の合成および天然核酸塩基を含む。
【００８８】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、キメラオリゴヌクレオチドであり得る。本発明のキメラアンチセンス化合物は、上述のような２つまたはそれ超のオリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドおよび／またはオリゴヌクレオチド模倣体の複合構造体として形成することができる。そのような化合物は、当技術分野でハイブリッドまたはギャップマーとも呼ばれている。特に、ギャップマーは、少なくとも３つの別個の部分を有するオリゴヌクレオチドであり、それらの部分のうちの２つは、類似しており、すなわち、１つまたは複数の主鎖修飾を含んでおり、異なる、すなわち、主鎖修飾を含まない領域を取り囲んでいる。
【００８９】
オリゴヌクレオチドは、１つまたは両方の末端に、すなわち、３’および／または５’末端に分子種を含み得る。本明細書で用いられる分子種は、天然ヌクレオチドまたは非天然ヌクレオチドでない任意の化合物を指す。分子種は、スペーサー、脂質、ステロール、コレステロール部分などの脂質部分、コール酸、チオエーテル、例えば、ヘキシル−Ｓ−トリチルチオール、チオコレステロール、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオールもしくはウンデシル残基、リン脂質、例えば、ジヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールもしくはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート、ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖、またはアダマンタン酢酸、パルミチル部分、オクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分、ステアリル、Ｃ１６アルキル鎖、胆汁酸、コール酸、タウロコール酸、デオキシコレート、オレイルリトコール酸、オレオイルコレン酸、糖脂質、リン脂質、スフィンゴ脂質、ステロイドなどのイソプレノイド、ビタミンＥなどのビタミン、飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸、トリグリセリドなどの脂肪酸エステル、ピレン、ポルフィリン、テキサフィリン、アダマンタン、アクリジン、ビオチン、クマリン、フルオレセイン、ローダミン、テキサスレッド、ジゴキシゲニン、ジメトキシトリチル、ｔ−ブチルジメチルシリル、ｔ−ブチルジフェニルシリル、シアニン染料（例えば、Ｃｙ３もしくはＣｙ５７６）、ヘキスト３３２５８染料、ソラレンまたはイブプロフェンを含むが、これらに限定されない。
【００９０】
分子種は、オリゴヌクレオチドの様々な位置に付着させることができる。上述のように、分子種は、オリゴヌクレオチドの３’−末端または５’−末端に結合させることができ、３’−または５’−エキソヌクレアーゼに対するオリゴマーの安定性を増大させる目的も果たす。あるいは、分子種は、内部ヌクレオチドまたは分枝上のヌクレオチドに結合させることができる。分子種は、ヌクレオチドの２’位に付着させることができる。分子種は、ヌクレオチドのヘテロ環塩基にも結合させることができる。
【００９１】
分子種は、リンカー部分によりオリゴヌクレオチドに接続させることができる。任意選択でリンカー部分は、非ヌクレオチドリンカー部分である。非ヌクレオチドリンカーは、例えば、脱塩基残基（ｄＳｐａｃｅｒ）、トリエチレングリコールもしくはヘキサエチレングリコールなどのオリゴエチレングリコール、またはブタンジオールなどのアルカンジオールである。スペーサー単位は、好ましくはホスホジエステルまたはホスホロチオエート結合により結合されている。リンカー単位は、分子中に１回だけ出現し得るまたは例えば、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、メチルホスホネートまたはアミド結合を介して数回組み込まれ得る。
【００９２】
本発明のオリゴヌクレオチド（ヌクレオチドを分子種に接続するリンカーから分離した）は、非ヌクレオチドリンカー、とりわけ脱塩基リンカー（ｄＳｐａｃｅｒ）、トリエチレングリコール単位またはヘキサエチレングリコール単位も含有し得る。さらなる好ましいリンカーは、Ｃ３、Ｃ６、Ｃ１２アミノリンカーなどのアルキルアミノリンカー、およびまたＣ３またはＣ６チオールリンカーなどのアルキルチオールリンカーである。
【００９３】
ＴＮＦαは、様々なＴＮＦα関連障害に役割を果たす。本明細書で用いられるＴＮＦα障害は、ＴＮＦα活性が対象における特定の生理的機能に有害である障害を指す。本明細書で用いられる「ＴＮＦα活性が有害である障害」という用語は、障害に罹っている対象において発現するＴＮＦαのレベルが障害の病態生理にまたは障害の悪化もしくは維持に寄与する因子としての役割を果たす疾患および他の障害を含むものとする。したがって、ＴＮＦα活性が有害である障害は、ＴＮＦα活性の阻害が障害の少なくとも１つの症状および／または進行もしくは悪化を軽減すると期待される障害である。そのような障害は、例えば、それぞれＴＮＦαメッセージまたはタンパク質を検出するためのＴＮＦαプローブまたは抗ＴＮＦα抗体を用いて検出することができる、障害に罹っている対象の生体液中のＴＮＦαの濃度の増加（例えば、対象の血清、血漿、滑液などの中のＴＮＦαの濃度の増加）により証明することができる。
【００９４】
ＴＮＦα障害は、敗血症、感染、自己免疫疾患、がん、移植拒絶反応および移植片対宿主病、移植拒絶反応、悪性腫瘍、肺障害、腸障害、心臓障害、敗血症、脊椎関節症、代謝障害、貧血、疼痛、肝障害、皮膚障害、爪障害、関節リウマチ、乾癬、乾癬性関節炎を伴う乾癬、潰瘍性大腸炎、クローン病、血管炎、ベーチェット病、強直性脊椎炎、喘息、慢性閉塞性肺障害（chronic  obstructive  pulmonary  disorder；ＣＯＰＤ）、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、再狭窄、糖尿病、貧血、疼痛、クローン病関連障害、若年性関節リウマチ（ＪＲＡ）、Ｃ型肝炎ウイルス感染、乾癬性関節炎および慢性尋常性乾癬を含むが、これらに限定されない。
【００９５】
これらの疾患のいくつかにおいてＴＮＦαにより果たされる生物学的役割を以下に述べる。これらの疾患におけるＴＮＦα発現を阻害することは、障害に対する治療処置となる。ＴＮＦαは、敗血症に役割を果たす。生物学的作用は、低血圧、心筋抑制、血管漏出症候群、臓器壊死、有毒二次メディエーターの放出の刺激および凝固カスケードの活性化を含む。
【００９６】
ＴＮＦαは、例えば、関節リウマチにおける組織炎症を活性化し、関節破壊をもたらすことにより自己免疫疾患に関連付けられ、また膵島細胞の死を促進し、糖尿病におけるインスリン抵抗性を媒介することに、多発性硬化症におけるオリゴデンドロサイトに対する細胞傷害性を媒介することおよび炎症性プラークの誘導に、ならびにクローン病の発現に関連付けられている。
【００９７】
様々な感染症で認められる生物学的影響は、ＴＮＦαに起因する。例えば、ＴＮＦαは、マラリアにおける脳炎症ならびに毛細血管血栓症および梗塞の媒介に、髄膜炎における脳炎症の媒介、血液脳関門の破綻の誘発、敗血症ショック症候群の誘発および静脈梗塞の活性化に、ならびに後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）における悪液質の誘発、ウイルス増殖の刺激および中枢神経系損傷の媒介に関連付けられている。
【００９８】
ＴＮＦαはまた、同種移植片拒絶および移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の重要なメディエーターとして、およびＴ細胞受容体ＣＤ３複合体に対するラット抗体ＯＫＴ３を用いて腎移植の拒絶を阻害する場合に認められた有害反応の媒介に関与するとされている。
【００９９】
ＴＮＦαは、悪性腫瘍における悪液質の誘発、腫瘍成長の刺激、転移能の増強および細胞傷害性の媒介に関連付けられている。
【０１００】
肺障害もＴＮＦαに関連付けられる。例えば、ＴＮＦαは、成人呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）における、白血球内皮活性化の刺激、肺細胞に対する細胞傷害性の誘導および血管漏出症候群の誘発を含む役割を果たす。本発明の組成物は、成人呼吸促迫症候群、ショック肺、慢性肺炎症性疾患、肺サルコイドーシス、肺線維症、ケイ肺病、特発性間質性肺疾患および慢性閉塞性気道障害を含む、様々な肺障害を処置するために用いることができる。慢性閉塞性気道障害の例は、喘息および慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を含む。
【０１０１】
クローン病を含む炎症性腸障害もＴＮＦと関連する。クローン病に関連する障害の例は、膀胱、膣および皮膚における瘻孔；腸閉塞；膿瘍；栄養欠乏；コルチコステロイドの使用による合併症；関節の炎症；結節性紅斑；壊疽性膿皮症；および眼の病変を含む。
【０１０２】
ＴＮＦαは、心臓の虚血を含む、心臓または冠動脈障害に役割を果たす。ＴＮＦα活性が有害である心臓障害は、障害に罹っている対象におけるＴＮＦαの存在が、障害の病態生理に関与すること、または心血管障害、例えば再狭窄を含む障害の悪化に寄与する因子であることのいずれかが示されたまたは疑われる冠動脈および心血管疾患を含むものとする。これらの障害は、心血管系、例えば、心臓、血管および／または血液に関わる任意の疾患、障害または状態を指す。心血管障害の例は、冠動脈疾患、狭心症、心筋梗塞、心臓停止によりもたらされた心血管組織の損傷、心臓バイパスによりもたらされた心血管組織の損傷、心原性ショック、および高血圧、アテローム動脈硬化症、冠動脈れん縮、冠動脈疾患、弁膜症、不整脈、および心筋症を含むが、これらに限定されない。
【０１０３】
脊椎関節症などの炎症性疾患もＴＮＦαにより悪化する。脊椎関節症は、脊椎の関節を侵すいくつかの疾患のうちのいずれか１つを指し、そのような疾患は、共通の臨床的、放射線学的および組織学的特徴を共有する。
【０１０４】
糖尿病および肥満などの代謝障害は、ＴＮＦαに関連付けられている。代謝障害という用語は、身体が生理機能を遂行するために必要な物質をどのように保有するかに影響を及ぼす疾患または障害を指す。糖尿病の例は、１型糖尿病、２型糖尿病、糖尿病性神経障害、末梢神経障害、糖尿病性網膜症、糖尿病性潰瘍形成、網膜症潰瘍形成、糖尿病性大血管障害および肥満を含む。
【０１０５】
ＴＮＦαは、貧血の発現に関連付けられている。貧血は、循環赤血球の数が異常に低いことまたは血液中のヘモグロビンの濃度が低いことである。関節リウマチに関連する貧血の例は、例えば、慢性疾患の貧血、鉄欠乏性貧血および自己免疫性溶血性貧血を含む。
【０１０６】
ＴＮＦαは、多種の疼痛症候群にも関連付けられている。本明細書で用いられる「疼痛」という用語は、神経障害性疼痛および術後疼痛、慢性腰痛、群発頭痛、帯状疱疹性神経痛、幻肢痛、中枢性疼痛、歯痛、オピオイド耐性疼痛、内臓痛、術後痛、骨損傷痛、陣痛および分娩時の疼痛、日焼けを含む、熱傷に起因する疼痛、産後の疼痛、片頭痛、狭心症痛および膀胱炎を含む尿生殖路関連痛などの急性および慢性疼痛を含むすべての種類の疼痛を指す。当用語は、侵害受容性疼痛または侵害受容も含む。
【０１０７】
肝障害もＴＮＦαに関連する。肝障害は、障害に罹っている対象におけるＴＮＦαの存在が、障害の病態生理に関与していること、または障害の悪化に寄与する因子であることが示されたまたは疑われる肝臓の疾患および他の障害または肝細胞損傷もしくは胆管障害に関連する状態を含む。肝障害は、アルコール性肝硬変、α１アンチトリプシン欠損、自己免疫性肝硬変、特発性肝硬変、劇症肝炎、Ｂ型およびＣ型肝炎ならびに脂肪性肝炎を含む、肝細胞損傷に関連する障害を含む。胆管障害の例は、嚢胞性線維症、原発性胆汁性肝硬変、硬化性胆管炎および胆管閉塞を含む。
【０１０８】
ＴＮＦαは、皮膚および爪障害に関連付けられている。皮膚障害は、炎症を伴う皮膚の、創傷以外の異常を指す。皮膚障害の例は、乾癬、尋常性天疱瘡、強皮症、アトピー性皮膚炎、サルコイドーシス、結節性紅斑、化膿性汗腺炎、扁平苔癬、スイート症候群および白斑を含むが、これらに限定されない。
【０１０９】
ＴＮＦαは、血管の炎症によって特徴付けられる障害の群である、血管炎に関連付けられている。ＴＮＦα活性が有害である血管炎の例は、ベーチェット病、巨細胞動脈炎、リウマチ性多発筋痛および高安病もしくは動脈炎などの大血管疾患、古典的結節性多発性動脈炎および川崎病などの中血管疾患またはベーチェット症候群、ウェグナー肉芽腫症、顕微鏡的多発性血管炎、過敏性血管炎、小血管血管炎、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、アレルギー性肉芽腫症および血管炎などの小血管疾患、ならびに孤立性中枢神経系血管炎および閉塞性血栓性血管炎を含むが、これらに限定されない。
【０１１０】
ＴＮＦα活性が有害である様々な他の障害は、若年性動脈炎、子宮内膜症、前立腺炎、脈絡膜血管新生、坐骨神経痛、シェーグレン症候群、ぶどう膜炎、滲出型黄斑変性、骨粗鬆症、骨関節炎、炎症性骨障害、骨吸収疾患、凝固障害、熱傷、再灌流傷害、ケロイド形成、瘢痕組織形成、発熱、歯周病、肥満、放射線毒性、加齢性悪液質、アルツハイマー病、脳浮腫、炎症性脳損傷、がん、慢性疲労症候群、皮膚筋炎、スティーヴンズ・ジョンソン症候群およびヤーリッシュ・ヘルクスハイマー反応などの薬物反応、脊髄内および／または周囲浮腫、家族性周期熱、フェルティ症候群、線維症、糸球体腎炎（例えば、溶連菌感染後糸球体腎炎またはＩｇＡ腎症）、プロテーゼの緩み、顕微鏡的多発性血管炎、混合性結合組織障害、多発性骨髄腫、がんおよび悪液質、多臓器障害、骨髄異形成症候群、睾丸炎骨溶解、急性、慢性を含む、膵炎および膵膿瘍、多発性筋炎、進行性腎不全、偽性痛風、壊疽性膿皮症、再発性多発性軟骨炎、リウマチ性心疾患、サルコイドーシス、硬化性胆管炎、脳卒中、胸腹部大動脈瘤修復（ＴＡＡＡ）、ＴＮＦ受容体関連周期性症候群（ＴＲＡＰＳ）、黄熱ワクチン接種に関連する症状、耳に関連する炎症性疾患、慢性耳炎症、コレステリン腫を伴うまたは伴わない慢性中耳炎、小児耳炎、筋炎、卵巣がん、結腸直腸がん、誘発性炎症症候群（例えば、ＩＬ−２投与後の症候群）に関連する療法、ならびに再灌流傷害に関連する障害を含むが、これらに限定されない。
【０１１１】
オリゴヌクレオチドは、ＴＮＦα障害の処置のために単独または別の治療剤と共に投与することができる。本発明のＴＮＦα阻害剤と併用することができる治療剤の非限定的な例は、以下のもの：非ステロイド抗炎症薬（複数可）（ＮＳＡＩＤ）；サイトカイン抑制性抗炎症薬（複数可）（ＣＳＡＩＤ）；ＣＤＰ−５７１／ＢＡＹ−１０−３３５６（ヒト化抗ＴＮＦα抗体；Ｃｅｌｌｔｅｃｈ／Ｂａｙｅｒ）；ｃＡ２／インフリキシマブ（キメラ抗ＴＮＦα抗体；Ｃｅｎｔｏｃｏｒ）；７５ｋｄ  ＴＮＦＲ−ＩｇＧ／エタネルセプト（７５ｋＤ  ＴＮＦ受容体−ＩｇＧ融合タンパク質；Ｉｍｍｕｎｅｘ）；５５ｋｄ  ＴＮＦ−ＩｇＧ（５５ｋＤ  ＴＮＦ受容体−ＩｇＧ融合タンパク質；Ｈｏｆｆｍａｎｎ−ＬａＲｏｃｈｅ）；ＩＤＥＣ−ＣＥ９／ＳＢ２１０３９６（非枯渇霊長類化抗ＣＤ４抗体；ＩＤＥＣ／ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）；ＤＡＢ４８６−ＩＬ−２および／またはＤＡＢ３８９−ＩＬ−２（ＩＬ−２融合タンパク質；Ｓｅｒａｇｅｎ）；抗Ｔａｃ（ヒト化抗ＩＬ−２Ｒα；Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｌａｂｓ／Ｒｏｃｈｅ）；ＩＬ−４（抗炎症性サイトカイン；ＤＮＡＸ／Ｓｃｈｅｒｉｎｇ）；ＩＬ−１０（ＳＣＨ５２０００；組換えＩＬ−１０、抗炎症性サイトカイン；ＤＮＡＸ／Ｓｃｈｅｒｉｎｇ）；ＩＬ−４；ＩＬ−１０および／またはＩＬ−４アゴニスト（例えば、アゴニスト抗体）；ＩＬ−１  ＲＡ（ＩＬ−１受容体アンタゴニスト；Ｓｙｎｅｒｇｅｎ／Ａｍｇｅｎ）；アナキンラ（Ｋｉｎｅｒｅｔ／Ａｍｇｅｎ）；ＴＮＦ−ｂｐ／ｓ−ＴＮＦ（可溶性ＴＮＦ結合タンパク質）；Ｒ９７３４０１（ホスホジエステラーゼＩＶ型阻害剤；ＭＫ−９６６（ＣＯＸ−２阻害剤；Ｉｌｏｐｒｏｓｔ）；メトトレキセート；サリドマイドおよびサリドマイド関連薬物（例えば、Ｃｅｌｇｅｎ）；レフルノミド（抗炎症性およびサイトカイン阻害剤；トラネキサム酸（プラスミノーゲン活性化の阻害剤；Ｔ−６１４（サイトカイン阻害剤）；プロスタグランジンＥ１；テニダップ（非ステロイド抗炎症薬）；ナプロキセン（非ステロイド抗炎症薬）；メロキシカム（非ステロイド抗炎症薬）；イブプロフェン（非ステロイド抗炎症薬）；ピロキシカム（非ステロイド抗炎症薬）；ジクロフェナク（非ステロイド抗炎症薬）；インドメタシン（非ステロイド抗炎症薬）；スルファサラジン；アザチオプリン；ＩＣＥ阻害剤（インターロイキン−１ベータ変換酵素の阻害剤）；ｚａｐ−７０および／またはＩｃｋ阻害剤（チロシンキナーゼｚａｐ−７０またはＩｃｋの阻害剤）；ＶＥＧＦ阻害剤および／またはＶＥＧＦ−Ｒ阻害剤（血管内皮細胞増殖因子または血管内皮細胞増殖因子受容体の阻害剤；血管形成の阻害剤）；コルチコステロイド抗炎症薬（例えば、ＳＢ２０３５８０）；ＴＮＦコンベルターゼ阻害剤；抗ＩＬ−１２抗体；抗ＩＬ−１８抗体；インターロイキン−１１；インターロイキン−１３；インターロイキン−１７阻害剤；金；ペニシラミン；クロロキン；ヒドロキシクロロキン；クロラムブシル；シクロスポリン；シクロホスファミド；全リンパ節照射；抗胸腺細胞グロブリン；抗ＣＤ４抗体；ＣＤ５毒素；経口投与ペプチドおよびコラーゲン；ロベンザリット二ナトリウム；サイトカイン調節薬（ＣＲＡ）ＨＰ２２８およびＨＰ４６６（Ｈｏｕｇｈｔｅｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）；ＩＣＡＭ−１アンチセンスホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチド（ＩＳＩＳ２３０２；Ｉｓｉｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）；可溶性補体受容体１（ＴＰ１０；Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）；プレドニゾン；オルゴテイン；ポリ硫酸化グリコサミノグリカン；ミノサイクリン；抗ＩＬ２Ｒ抗体；海産および植物脂質（魚および植物種子脂肪酸）；オーラノフィン；フェニルブタゾン；メクロフェナム酸：フルフェナム酸；静脈内免疫グロブリン；ジロートン；アザリビン；ミコフェノール酸（ＲＳ−６１４４３）；タクロリムス（ＦＫ−５０６）；シロリムス（ラパマイシン）；アミプリロース（テラフェクチン）；クラドリビン（２−クロロデオキシアデノシン）；メトトレキセート；抗ウイルス薬；および免疫調節薬を含む。
【０１１２】
本発明の予防および／または治療プロトコールの毒性および有効性は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に対して致死的な用量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療上有効な用量）を決定するための細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手順により判断することができる。毒性および治療効果との間の用量比は、治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０比として表すことができる。大きい治療指数を示す予防および／または治療剤が好ましい。毒性副作用を示す予防および／または治療剤を用いることができるが、未感染細胞の生じ得る損傷を最小限にし、それにより、副作用を低減するために罹患組織の部位にそのような薬剤をターゲティングする送達システムを設計するように注意を払うべきである。
【０１１３】
細胞培養アッセイおよび動物試験から得られたデータは、ヒトに用いる予防および／または治療剤の一連の用量を処方するために用いることができる。そのような薬剤の用量は、好ましくは毒性をほとんどまたは全く有さないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にある。用量は、用いられる剤形および用いられる投与経路によってこの範囲内で変化し得る。本発明の方法に用いるあらゆる薬剤について、治療有効用量は、最初に細胞培養アッセイから推定することができる。細胞培養において決定されたようにＩＣ５０（すなわち、症状の半阻害を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成する用量を動物モデルにおいて処方することができる。そのような情報は、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定するために用いることができる。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーにより測定することができる。いくつかの試験で、アンチセンスオリゴヌクレオチドの最適用量が検討された。
【０１１４】
ある特定の実施形態では、医薬組成物は、例えば、少なくとも約０．１％の活性化合物を含み得る。他の実施形態では、活性化合物は、約２％〜約７５％の間の重量単位、または例えば、約２５％〜約６０％の間、およびそれにおいて導き出せるあらゆる範囲を含み得る。
【０１１５】
本明細書で述べる化合物の対象の用量は、一般的に約０．１μｇ〜１０，０００ｍｇの範囲、より一般的に約１μｇ／日〜８０００ｍｇの範囲、最も一般的に約１０μｇ〜１００μｇの範囲である。対象の体重に関して述べると、一般的な用量範囲は、１回の投与につき約１マイクログラム／ｋｇ／体重、約５マイクログラム／ｋｇ／体重、約１０マイクログラム／ｋｇ／体重、約５０マイクログラム／ｋｇ／体重、約１００マイクログラム／ｋｇ／体重、約２００マイクログラム／ｋｇ／体重、約３５０マイクログラム／ｋｇ／体重、約５００マイクログラム／ｋｇ／体重、約１ミリグラム／ｋｇ／体重、約５ミリグラム／ｋｇ／体重、約１０ミリグラム／ｋｇ／体重、約５０ミリグラム／ｋｇ／体重、約１００ミリグラム／ｋｇ／体重、約２００ミリグラム／ｋｇ／体重、約３５０ミリグラム／ｋｇ／体重、約５００ミリグラム／ｋｇ／体重から約１０００ｍｇ／ｋｇ／体重またはそれ超、およびそれにおいて導き出せるあらゆる範囲にある。本明細書で列挙した数から導き出せる範囲の非限定的な例において、約５ｍｇ／ｋｇ／体重〜約１００ｍｇ／ｋｇ／体重、約５マイクログラム／ｋｇ／体重〜約５００ミリグラム／ｋｇ／体重などの範囲を上述の数に基づいて投与することができる。絶対量は、併用療法、投与の数ならびに年齢、健康状態、体格および体重を含む個々の患者パラメーターを含む様々な因子に依存する。これらは、当業者に周知の因子であり、せいぜい通常の実験により対応することができる。最大用量、すなわち、妥当な医学的判断による最高安全用量を用いることが一般的に好ましい。
【０１１６】
本発明の分子の複数回の投与も企図される。一部の例において、本発明の分子を別の治療剤、例えば、抗炎症薬と共に投与する場合、本分子もしくは他の薬剤のいずれかの治療量以下の用量、または両方の治療量以下の用量をＴＮＦα障害を有するもしくは発現するリスクのある対象の処置に用いる。２つのクラスの薬物を一緒に使用する場合、望ましい治療結果をもたらすために他の薬剤を治療量以下の用量で投与することができる。本明細書で用いられる「治療量以下の用量」は、他の薬剤の非存在下で投与した場合に対象における治療結果をもたらす用量より少ない用量を指す。したがって、治療剤の治療量以下の用量は、本発明の分子の投与の非存在下で対象における所望の治療結果をもたらさないものである。ＴＮＦα障害を処置するのに有用な薬剤の治療用量は、医療分野で周知である。これらの用量は、Remington's  Pharmaceutical  Sciencesなどの参考文献；ならびに感染症、がんおよび自己免疫疾患の処置のための指針として医療専門家が依拠している多くの他の医学文献に広範囲に記載されている。オリゴヌクレオチドの治療用量も当技術分野で記載されている。
【０１１７】
投与計画は、１日数回、毎日、１日おき、毎週、隔週、それらの間の任意の回数またはより低頻度であり得る。本明細書で用いられる「隔週投与」という用語は、物質（例えば、抗ＴＮＦα核酸）を２週間ごとに１回対象に投与する時間的経過を指す。オリゴヌクレオチドは、例えば、７〜２０日ごと、１１〜１７日ごと、または１３〜１５日ごとに投与することができる。
【０１１８】
オリゴヌクレオチドは、有効量で投与する。本明細書で述べる疾患の処置における本発明の化合物の有効量は、用いられる特定の化合物、化合物の送達の方法およびそれが単独で使用されるかまたは併用されるかによって異なり得る。どの特定の適用例についての有効量も、処置される疾患、投与される特定の化合物、対象の体格または疾患もしくは状態の重症度のような因子によって異なり得る。当業者は、過度の実験を必要とすることなく、本発明の特定の分子の有効量を経験的に決定することができる。本明細書で示した教示と合わせて考え、様々な活性化合物の中から選択し、有効性、相対生物学的利用能、患者体重、有害副作用の重症度および好ましい投与方法などの因子を検討することによって、実質的な毒性をもたらさず、それにもかかわらず、特定の対象を処置するのに完全に有効である効果的な予防または処置処置計画を計画することができる。
【０１１９】
本明細書で述べるオリゴヌクレオチドは、本明細書でより詳細に述べるように、本発明の検出および処置方法に単独で、または検出または細胞傷害性薬剤などの他の分子とのコンジュゲートとして用いることができる。
【０１２０】
オリゴヌクレオチドは、例えば、検出可能標識にカップリングまたはコンジュゲートすることができる。検出可能標識は、その存在を直接的または間接的に確認することができる、部分である。一般的に、標識の検出は、標識によるエネルギーの放出を必要とする。標識は、特定の波長の光子または他の原子粒子（例えば、放射能、発光、光学または電子密度など）を放出および／または吸収するその能力によって直接的に検出することができる。標識は、それ自体特定の波長の光を放出または吸収し得る別の部分（例えば、ＦＬＡＧエピトープなどのエピトープタグ、西洋ワサビペルオキシダーゼなどの酵素タグなど）に結合する、それを動員する、また場合によって、切断するその能力によって間接的に検出することができる。間接的検出の例は、基質を可視生成物に切断する第１の酵素標識の使用である。標識は、そのように限定されないが、化学物質、ペプチドまたは核酸分子性によるものであり得る。他の検出可能標識は、Ｐ３２もしくはＨ３などの放射性同位体、蛍光色素、光学もしくは電子密度マーカーなどの発光マーカー、またはＦＬＡＧエピトープもしくはＨＡエピトープ、ビオチン、アビジンなどのエピトープタグ、および西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼなどの酵素タグを含む。標識は、その合成中または後にオリゴヌクレオチドに結合させることができる。当業者に公知の多くの異なる標識および標識化の方法が存在する。本発明に用いることができる標識の種類の例は、酵素、放射性同位体、蛍光化合物、コロイド金属、化学発光化合物および生物発光化合物を含む。当業者は、本明細書で述べるオリゴヌクレオチドに対する他の適切な標識について知り、または通常の実験を用いて、上記のものを確認することができる。さらに、本発明のオリゴヌクレオチドへのこれらの標識のカップリングまたはコンジュゲーションは、当業者に一般的である標準的技術を用いて実施することができる。
【０１２１】
検出可能標識へのオリゴヌクレオチドのコンジュゲーションは、とりわけ、診断アッセイにおけるそのような薬剤の使用を促進する。検出可能標識の別のカテゴリーは、例えば、磁気共鳴画像化法（ＭＲＩ）：Ｇｄ（ＤＯＴＡ）；核医学用：２０１Ｔｌ、ガンマ線放出放射性核種９９ｍＴｃ；陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）：陽電子放出同位体、（１８）Ｆ−フルオロデオキシグルコース（（１８）ＦＤＧ）、（１８）Ｆ−フッ化物、銅−６４、ガドジアミド、および２０３ＰｂなどのＰｂ（ＩＩ）の放射性同位体；１１１Ｉｎなどの診断および画像化標識（一般的にｉｎ  ｖｉｖｏ検出可能標識と呼ばれる）を含む。そのような場合、オリゴヌクレオチドがアンチセンス効果をもたらすので、オリゴヌクレオチドの使用を観測することが可能となる。
【０１２２】
本明細書で述べるコンジュゲーションまたは修飾は、通常の化学反応を用いるものであり、その化学反応は、本発明の一部を構成せず、またその化学反応は、化学の分野の技術者に周知のものである。保護基ならびにモノおよびヘテロ二官能性リンカーなどの公知のリンカーの使用は、文献に十分に記録されており、ここで繰り返さない。
【０１２３】
本明細書で用いられる「コンジュゲートされた」は、２つの実体が任意の物理化学的手段により互いに安定に結合していることを意味する。付着の本質が、どちらの実体の有効性も実質的に損なわないというものであることは、重要である。これらのパラメーターを念頭において、当業者に公知の任意の共有または非共有結合を用いることができる。一部の実施形態では、共有結合が好ましい。非共有結合性コンジュゲーションは、疎水性相互作用、イオン相互作用、ビオチン−アビジンおよびビオチン−ストレプトアビジン錯形成などの高アフィニティー相互作用ならびに他のアフィニティー相互作用を含む。付着のそのような手段および方法は、当業者に周知である。標識および他のアッセイ構成要素の性質によって、様々な方法を用いて標識を検出することができる。
【０１２４】
本発明の医薬組成物は、薬学的に許容される担体中に溶解または分散した、有効量の１つまたは複数の薬剤を含む。「薬学的にまたは薬理学的に許容される」という語句は、必要に応じて、例えば、ヒトなどの動物に投与した場合に有害、アレルギーまたは他の不都合な反応をもたらさない分子実体および組成物を指す。さらに、動物（例えば、ヒト）投与について、調製物がＦＤＡ  Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓにより要求されている、無菌性、発熱原性、一般安全性および純度基準を満たすべきであることは、理解される。化合物は、一般的にヒトへの投与に適している。この用語は、ヒトへの投与の前に化合物または組成物のさらなる操作が必要でないように、化合物または組成物が非毒性であり、十分に純粋であることを要求している。
【０１２５】
本明細書で用いられる「薬学的に許容される担体」は、当業者に公知であるように、ありとあらゆる溶媒、分散媒体、コーティング、界面活性剤、抗酸化剤、保存剤（例えば、抗菌剤、抗真菌剤）、等張剤、吸収遅延剤、塩、保存剤、薬物、薬物安定剤、ゲル剤、結合剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、甘味料、着香料、染料、この種の材料およびそれらの組合せを含む（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Remington's  Pharmaceutical  Sciences（１９９０年）を参照のこと）。通常のいかなる担体も有効成分と不適合である場合を除いて、治療用または医薬組成物におけるその使用が企図される。
【０１２６】
薬剤は、それを固体、液体またはエアゾールの形態で投与すべきであるか、またそれが注射のような投与経路のため無菌である必要があるかによって、異なる種類の担体を含み得る。本発明は、静脈内に、皮内に、動脈内に、病巣内に、腫瘍内に、頭蓋内に、関節内に、前立腺内に、胸膜内に、気管内に、鼻腔内に、硝子体内に、膣内に、直腸内に、局所に、腫瘍内に、筋肉内に、腹腔内に、皮下に、結膜下に、小胞体内に、粘膜に、心膜内に、臍帯内に、眼内に、経口で、局所に、局所的に、吸入（例えば、エアゾール吸入）、注射、注入、持続注入、標的細胞を直接浸す局所的環流、カテーテルにより、洗浄により、クリーム剤で、脂質組成物（例えば、リポソーム）で、または当業者に公知であるような他の方法もしくは前述のもののいずれかの組合せにより投与することができる（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Remington's  Pharmaceutical  Sciencesを参照のこと）。特定の実施形態では、腹腔内注射が企図される。
【０１２７】
いずれの場合にも、組成物は、１つまたは複数の成分の酸化を遅らせるための様々な抗酸化剤を含み得る。さらに、微生物の作用の防止は、パラべン（例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン）、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールまたはそれらの組合せを含むが、これらに限定されない、様々な抗菌および抗真菌剤などの防腐剤によってもたらされ得る。
【０１２８】
薬剤は、遊離塩基、中性または塩の形で組成物に製剤化することができる。薬学的に許容される塩は、酸付加塩、例えば、タンパク質性組成物の遊離アミノ基により形成されるもの、または例えば塩酸もしくはリン酸などの無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸もしくはマンデル酸のような有機酸により形成されるものを含む。遊離カルボキシル基により形成される塩も、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムもしくは水酸化第二鉄などの無機塩基、またはイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジンもしくはプロカインのような有機塩基から得ることができる。
【０１２９】
組成物が液体の形である実施形態では、担体は、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、脂質（例えば、トリグリセリド、植物油、リポソーム）およびそれらの組合せを含むが、これらに限定されない溶媒または分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用により、例えば、液体ポリオールもしくは脂質などの担体における分散による必要な粒径の維持により、例えば、ヒドロキシルプロピルセルロースなどの界面活性剤の使用により、またはそのような方法の組合せにより、維持することができる。多くの場合に、例えば、糖、塩化ナトリウムまたはそれらの組合せなどの等張剤を含めることが好ましい。
【０１３０】
本発明の化合物は、組織に直接投与することができる。直接組織投与は、直接的な注射により達成することができる。化合物は、１回投与することができ、または代わりに複数回の投与で投与することができる。複数回投与する場合、化合物を異なる経路により投与することができる。例えば、最初の（または最初の数回の）投与を罹患組織中に直接行うことができ、一方、後の投与は、全身的であってよい。
【０１３１】
本発明の製剤は、通常薬学的に許容される濃度の塩、緩衝剤、保存剤、適合性担体、アジュバントおよび任意選択で他の治療用成分を含み得る、薬学的に許容される溶液で投与する。
【０１３２】
本発明の方法によれば、化合物は、医薬組成物で投与することができる。一般的に、医薬組成物は、本発明の化合物および薬学的に許容される担体を含む。本明細書で用いられる薬学的に許容される担体は、有効成分の生物学的活性の有効性を妨げない非毒性材料を意味する。
【０１３３】
薬学的に許容される担体は、希釈剤、増量剤、塩、緩衝剤、安定剤、可溶化剤および当技術分野で周知の他の材料を含む。そのような調製物は、塩、緩衝剤、保存剤、適合性担体および任意選択で他の治療剤を通常含み得る。医薬に用いる場合、塩は、薬学的に許容されるべきであるが、薬学的に許容されない塩は、その薬学的に許容される塩を調製するために好都合に用いることができ、本発明の範囲から除外されない。そのような薬理学的および薬学的に許容される塩は、以下の酸：塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、クエン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸などから調製されるものを含むが、これらに限定されない。また、薬学的に許容される塩は、ナトリウム、カリウムまたはカルシウム塩などのアルカリ金属またはアルカリ土類金属酸化物として調製することができる。
【０１３４】
本発明の化合物は、錠剤、カプセル剤、散剤、粒剤、軟膏剤、水剤、デポ剤、吸入剤および注射剤などの固体、半固体、液体または気体の形態の調製物に、経口、非経口または外科的投与のための通常の方法で製剤化することができる。本発明はまた、インプラントなどによる、局所的な投与用に製剤化されている医薬組成物を含む。
【０１３５】
経口投与に適する組成物は、それぞれ所定の量の活性薬剤を含む、カプセル剤、錠剤、ロゼンジ剤などの不連続単位として提供することができる。他の組成物は、シロップ剤、エリキシル剤またはエマルジョンなどの水性液体または非水性液体中懸濁液を含む。
【０１３６】
経口投与用に、活性化合物を当技術分野で周知の薬学的に許容される担体と混ぜ合わせることによって、化合物を容易に製剤化することができる。そのような担体は、本発明の化合物が、処置を受ける対象による経口摂取用の錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー（slurries）、懸濁液などとして製剤化されることを可能にする。経口使用のための医薬調製物は、所望の場合、錠剤または糖衣錠コアを得るために適切な補助剤を加えた後に任意選択で得られた混合物を粉砕し、粒剤の混合物を処理して、固体賦形剤として得ることができる。適切な賦形剤は、とりわけ、ラクトース、スクロース、マンニトールもしくはソルビトールを含む、糖などの増量剤；例えば、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムなどのセルロース調製物、および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）である。所望の場合、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはアルギン酸ナトリウムなどのその塩などの崩壊剤を加えることができる。任意選択で経口製剤は、生理食塩水または内部酸性条件を中和するための緩衝液で製剤化することもでき、あるいは担体を用いずに投与することができる。
【０１３７】
糖衣錠コアは、適切なコーティングを施す。この目的のために、濃縮糖溶液を用いることができ、これは、任意選択でアラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコールおよび／または二酸化チタン、ラッカー溶液ならびに適切な有機溶媒または溶媒混合物を含み得る。識別のためまたは活性化合物の用量の異なる配合を明らかにするために染料または顔料を錠剤または糖衣錠コーティングに加えることができる。
【０１３８】
経口で用いることができる医薬調製物は、ゼラチンから作製されたプッシュフィット型カプセル剤、ならびにゼラチンおよびグリセロールまたはソルビトールなどの可塑剤から作製された軟質密封カプセル剤を含む。プッシュフィット型カプセル剤は、ラクトースなどの増量剤、デンプンなどの結合剤、および／またはタルクもしくはステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤、および任意選択で安定剤と混合された有効成分を含み得る。軟カプセル剤では、活性化合物は、脂肪油、流動パラフィンまたは液体ポリエチレングリコールなどの適切な液体に溶解または懸濁することができる。さらに、安定剤を加えることができる。経口投与用に製剤化されたマイクロスフェアも用いることができる。そのようなマイクロスフェアは、当技術分野で明確に定義される。経口投与用のすべての製剤は、そのような投与に適する用量のものであるべきである。
【０１３９】
口腔投与のために、組成物は、通常の方法で製剤化した錠剤またはロゼンジ剤の形をとり得る。
【０１４０】
吸入による投与のために、本発明による使用のための化合物は、適切な高圧ガス、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適切なガスの使用により、加圧パックまたは噴霧器からエアゾール噴霧放出の形で好都合に送達することができる。加圧エアゾールの場合、投薬単位は、定量を送達するための弁を備えることにより決定することができる。化合物およびラクトースまたはデンプンなどの適切な粉末基剤の粉末混合物を含む、吸入器または吹込器に用いる例えば、ゼラチンのカプセルおよびカートリッジを製剤化することができる。エアゾール送達システムを調製する技術は、当業者に周知である。一般的に、そのようなシステムは、活性薬剤の生物学的特性を著しく損なわない成分を用いるべきである（例えば、Remington's  Pharmaceutical  Sciences中のSciarraおよびCutie、「Aerosols」を参照のこと）。当業者は、過度の実験に頼ることなくエアゾールを生産するための様々なパラメーターおよび条件を容易に決定することができる。
【０１４１】
化合物は、全身的に送達することが望ましい場合、注射、例えば、ボーラス注射または持続注入による非経口投与用に製剤化することができる。注射用製剤は、単位剤形で、例えば、添加保存剤を含む、アンプル入りまたは複数回投与容器入りで提供することができる。組成物は、油性または水性ビヒクル中懸濁剤、液剤またはエマルジョンのような形をとり、懸濁化、安定化および／または分散剤などの製剤化薬剤を含有し得る。
【０１４２】
非経口投与用の調製物は、無菌の水性または非水性溶液、懸濁剤およびエマルジョンを含む。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルである。水性担体は、生理食塩水および緩衝媒体を含む、水、アルコール性／水性溶液、エマルジョンまたは懸濁液を含む。非経口投与用ビヒクルは、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸リンゲル液または不揮発性油を含む。静脈内投与用ビヒクルは、補給液および栄養補給剤、電解質補給液（リンゲルデキストロースに基づくものなど）などを含む。例えば、抗微生物剤、抗酸化剤、キレート化剤および不活性ガスなどの保存剤および他の添加剤も存在し得る。低用量は、静脈内投与などの他の形態の投与に起因する。適用した初回用量で対象の反応が不十分である場合、患者の耐容能が許容する程度までのより高用量（または異なる、より局所的な送達経路による効果的により高用量）を用いることができる。化合物の適切な全身レベルを達成するために１日当たり複数回投与が企図される。
【０１４３】
本発明の組成物は、皮膚または体腔への投与用の局所組成物に製剤化することができる。適切な局所用ビヒクルおよびビヒクル成分は、化粧品および医薬品技術分野で周知であり、水のようなビヒクル（またはビヒクル成分）；アルコール（とりわけエタノールなどの皮膚から容易に蒸発することができる低級アルコール）、グリコール（プロピレングリコール、ブチレングリコールおよびグリセリンなど）、脂肪族アルコール（ラノリンなど）などの有機溶媒；水および有機溶媒の混合物（水およびアルコール）ならびにアルコールおよびグリセリンなどの有機溶媒の混合物（任意選択で水も含む）；脂肪酸、アシルグリセロール（鉱油および天然または合成由来の脂肪などの油を含む）、ホスホグリセリド、スフィンゴ脂質およびワックスなどの脂質ベースの材料；コラーゲンおよびゼラチンなどのタンパク質ベースの材料；シクロメチコン、デメチコノールおよびジメチコンコポリオール（Ｄｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇ）などのシリコーンベースの材料（不揮発性および揮発性）；ワセリンおよびスクアランなどの炭化水素ベースの材料；陰イオン、陽イオンおよび両性界面活性剤ならびに石けん；マイクロスポンジおよびポリマーマトリックスなどの持続放出ビヒクル；安定化および懸濁化剤；乳化剤；ならびに皮膚への投与に適する他のビヒクルおよびビヒクル成分、ならびに上記または当技術分野で公知の別の局所用ビヒクル成分の混合物を含む。ビヒクルは、保存剤、抗酸化剤、皮膚浸透促進剤、持続放出材料などの、適用製剤の安定性または有効性を改善するように構成された成分をさらに含み得る。そのようなビヒクルおよびビヒクル成分の例は、当技術分野で周知であり、Martindale  -  The  Extra  Pharmacopoeia（Pharmaceutical  Press、London、１９９３年）およびMartin（編）、Remington's  Pharmaceutical  Sciencesのような参考文献に記載されている。
【０１４４】
適切なビヒクルの選択は、特定の物理的形態および製剤が達成すべき送達の方法に依存する。適切な形態の例は、液体（例えば、溶解型のストロンチウム陽イオンを含む、うがい剤および洗口薬ならびに懸濁剤、エマルジョンなど）；ゲル剤、フォーム、ペースト剤、クリーム剤、軟膏剤、「スティック」（リップスティックまたは腋の下脱臭スティックのような）、散剤などの固体および半固体；リポソームまたは他の送達小胞を含有する製剤；直腸および膣坐剤、クリーム剤、フォーム、ゲル剤または軟膏剤；ならびにその他の形態を含む。一般的な送達方法は、手指を用いる適用；布、ティッシュー、スワブ、スティックまたはブラシなどの物理的アプリケーターを用いる適用（例えば、適用直前に製剤でアプリケーターを浸漬することにより、または皮膚に、処理済みまたはあらかじめ湿らせた包帯、ワイプ、ウォッシュクロスもしくはスティックなどの、製剤を既に含有する調製済みアプリケーターを適用もしくは接着することにより達成される）；噴霧（ミスト、エアゾールまたはフォーム噴霧を含む）；点滴器適用（例えば、点耳剤を用いるような）；ふりかけること（sprinkling）（適切な粉末形態の製剤を用いるような）；および浸漬を含む。
【０１４５】
局所製剤は、直腸および膣投与用の製剤も含む。直腸投与用の製剤は、例えば、ココアバターを含む適切な基剤を含む坐剤として提供することができる。膣投与に適する製剤は、当技術分野で適切であることが公知であるような担体を有効成分に加えて含有する錠剤、ペッサリー、タンポン、クリーム剤、ゲル剤、ペースト剤、フォームまたは噴霧製剤として提供することができる。
【０１４６】
さらに他の実施形態では、送達ビヒクルは、哺乳類レシピエントへのインプラントに適する生体適合性微粒子またはインプラントである。他の送達システムは、長期徐放、遅延放出または持続放出送達システムを含み得る。そのようなシステムは、化合物の反復投与を回避し、対象および医師の利便性を増大させ得る。多くの種類の放出送達システムが利用可能であり、当業者に公知である。それらは、ポリ（ラクチド−グリコリド）、コポリオキサレート、ポリカプロラクトン、ポリエステルアミド、ポリオルトエステル、ポリヒドロキシ酪酸およびポリ酸無水物などのポリマーベースのシステムを含む。
【０１４７】
一部の実施形態では、本発明のアンチセンス核酸を安定な自己集合ナノ構造体として製剤化する。このナノ構造体は、コアに会合しているＴＮＦαアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。コアは、中実コアまたはリポソームコアのように中空コアであり得る。中実コアは、中空の中心部を有さない球形の材料である。本明細書で用いられる、球という用語は、一般的な形状を指し、完全な球または円形の形状を意味せずまたはそれに限定されない。これには、不完全なものも含まれる。
【０１４８】
中実コアは、貴金属（金、銀）、遷移金属（鉄、コバルト）および金属酸化物（シリカ）を含むが、これらに限定されない当業者に公知の様々な材料から構築することができる。さらに、これらの中実コアは、不活性、常磁性または超常磁性であり得る。これらの中実コアは、述べる材料の純粋組成物から、または任意の数の材料の混合物の組合せで、もしくは材料の層状組成物としてのいずれかで構築することができる。さらに、中実コアは、両親媒性ブロックコポリマー、ポリスチレンなどの疎水性ポリマー、ポリ乳酸、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）、ポリグリコール酸、ポリカプロラクトンおよび当業者に公知の生体適合性ポリマーなどのポリマーコアから構成され得る。
【０１４９】
コアは、代わりになるべきものとして、シェル材料の中心領域に少なくとも多少の空間を有する、中空コアであり得る。中空コアは、リポソームコアを含む。本明細書で用いられるリポソームコアは、脂質二重層を形成する脂質またはリン脂質の成分により形成された中心に位置するコアコンパートメントを指す。「リポソーム」は、様々なサイズおよび構造の人工的な自己閉鎖小胞構造体であり、１層または数層の膜が水性コアを封入している。最も一般的にはリポソーム膜は、親水性頭基が水性環境の方向に配向し、脂質鎖が親油性コアに埋め込まれている、脂質二重層膜から形成される。リポソームは、ブロックコポリマーまたはポリペプチドのような、ポリマーなどの他の両親媒性モノマーおよびポリマー分子からも形成することができる。ユニラメラ（unilamellar）小胞は、水性空間を取り囲む単一の膜により定義されるリポソームである。これと対照的に、オリゴ（oligo-）またはマルチラメラ（multilamellar）小胞は、数層の膜から構成されている。一般的に、膜は、厚さが約４ｎｍであり、天然または合成由来のリン脂質などの両親媒性脂質から構成されている。任意選択で、膜特性は、ステロールまたはコール酸誘導体などの他の脂質の取込みにより修飾することができる。
【０１５０】
脂質二重層は、脂質分子の２つの層から構成されている。層における各脂質分子は、隣接する脂質二重層と実質的に平行に配向し、二重層を形成する２つの層は、それらの分子の極性末端が水性相に露出し、非極性末端が互いに隣接している。リポソームコアの中心の水性領域は、空である、あるいは水、水性エマルジョン、オリゴヌクレオチドまたは他の治療もしくは診断薬により完全または部分的に満たされている。
【０１５１】
「脂質」は、脂肪、脂質、水に不溶性である、原形質のアルコール−エーテル可溶性構成成分を包含する一般用語として、その通常の意味を指す。脂質は通常、親水性部分および疎水性部分からなる。水中では、脂質は、自己集合して、親水性部分（頭基）が水性相の方向に配向しており、親油性部分（アシル鎖）が二重層コアに埋め込まれている、二重層膜を形成し得る。脂質は、２つの親水性部分（ボラアンフィフィル（bola  amphiphiles））も含み得る。その場合、膜は、単一脂質層から形成することができ、二重層ではない。現在の文脈における脂質の一般的な例は、脂肪、脂肪油、精油、ワックス、ステロイド、ステロール、リン脂質、糖脂質、スルホ脂質、アミノ脂質、クロモ脂質および脂肪酸である。この用語は、天然および合成脂質の両方を包含する。本発明に関連する好ましい脂質は、ステロイドおよびステロール、とりわけコレステロール、ホスファチジル、ホスファチジルコリンおよびホスファチジルエタノールアミンを含む、リン脂質ならびにスフィンゴミエリンである。脂肪酸が存在する場合、それらは、最大６つの二重結合を含有する、長さが約１２〜２４炭素鎖であり得る。脂肪酸は、グリセロールに由来し得る、主鎖に結合している。１つの脂質内の脂肪酸は、異なることがあり得る（不斉）。または１つの脂肪酸鎖のみ、例えば、リゾレシチンが存在し得る。とりわけ非陽イオン脂質が、卵黄、ウシ心臓、脳、肝臓またはダイズから精製されたレシチン（ホスファチジルコリン）などの天然源に由来する場合、混合製剤も可能である。
【０１５２】
リポソームコアは、スフィンゴシン、スフィンゴシンホスフェート、メチル化スフィンゴシンおよびスフィンガニン、セラミド、セラミドホスフェート、１−０アシルセラミド、ジヒドロセラミド、２−ヒドロキシセラミド、スフィンゴミエリン、グリコシル化スフィンゴ脂質、スルファチド、ガングリオシド、ホスホスフィンゴ脂質、ならびに様々な長さおよび飽和状態のフィトスフィンゴシンおよびそれらの誘導体などのスフィンゴ脂質、ホスファチジルコリン、リソホスファチジルコリン、ホスファチジン酸、リソホスファチジン酸、環状ＬＰＡ、ホスファチジルエタノールアミン、リソホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、リソホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、リソホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、イノシトールホスフェート、ＬＰＩ、カルジオリピン、リソカルジオリピン、ビス（モノアシルグリセロ）ホスフェート、（ジアシルグリセロ）ホスフェート、エーテル脂質、ジフィタニルエーテル脂質、ならびに様々な長さおよび飽和状態のプラスマロゲンおよびそれらの誘導体などのリン脂質、コレステロール、デスモステロール、スチグマステロール、ラノステロール、ラトステロール、ジオスゲニン、シトスタノール、チモステロール、チモステノール、１４−デメチル−ラノステロール、コレステロール硫酸、ＤＨＥＡ、ＤＨＥＡ硫酸、１４−デメチル−１４−デヒドロラノステロール、シトスタノール、カンペステロール、エーテルアニオン脂質、エーテルカチオン脂質、ランタニドキレート化脂質、Ａ環置換オキシステロール、Ｂ環置換オキシステロール、Ｄ環置換オキシステロール、側鎖置換オキシステロール、二重置換オキシステロール、コレスタン酸誘導体、フッ素化ステロール、蛍光ステロール、スルホン化ステロール、リン酸化ステロール、ならびに異なる長さ、飽和状態の多価不飽和ステロールおよびそれらの誘導体などのステロールを含むが、これらに限定されない、当業者に公知の１つまたは複数の脂質から構築することができる。
【０１５３】
オリゴヌクレオチドは、コアの外側、コアの壁の内側および／またはコアの中心に配置することができる。コア上に配置されているオリゴヌクレオチドは、一般的にコアにカップリングされていると呼ばれる。カップリングされた状態は、直接または間接であり得る。一部の実施形態では、少なくとも２５、５０、７５、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００もしくは１，０００個のオリゴヌクレオチドまたはそのいずれかの範囲の組合せがコアの外側に存在する。一部の実施形態では、１〜１０００、１０〜５００、５０〜２５０または５０〜３００個のオリゴヌクレオチドが表面上に存在する。
【０１５４】
オリゴヌクレオチドシェルのオリゴヌクレオチドは、様々な方向に配向している可能性がある。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、半径方向に外向きに配向している。これらのオリゴヌクレオチドの配向は、コアに対して５’遠位／３’終端もしくはコアに対して３’遠位／５’終端であり、またはコアの周りに横方向に配向することがあり得る。一実施形態では、１つまたは複数の異なるオリゴヌクレオチドが単一ＳＮＡの同じ表面上に存在する。すべての場合に、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドが表面上に存在するが、最大１０，０００個が存在し得る。
【０１５５】
オリゴヌクレオチドは、直接的にまたはリンカーを介して間接的にのいずれかで、コアにもしくは互いにおよび／または活性薬剤のような他の分子に結合し得る。オリゴヌクレオチドは、５’末端または３’末端を介してリンカーにコンジュゲートさせることができる。例えば、［配列、５’−３’］−リンカーまたはリンカー−［配列、５’−３’］であり得る。ナノ構造体のオリゴヌクレオチドの一部またはすべては、共有または非共有結合により、直接的または間接的のいずれかで互いに結合し得る。別のオリゴヌクレオチドへの１つのオリゴヌクレオチドの結合は、リポソームコアへの当オリゴヌクレオチドの結合に加えてのものまたはそれに代わるものであり得る。
【０１５６】
オリゴヌクレオチドシェルは、様々な鎖長のアルカンチオール、環状ジチオール、リポ酸または当業者に公知の他のチオールリンカーなどの、１つまたは複数のチオールを含むあらゆる化学構造を含むが、これらに限定されない、１つまたは複数のリンカー分子を介してコアの表面に固定することができる。
【０１５７】
リポソームコアを含有する一実施形態では、オリゴヌクレオチドシェルは、トコフェロール、スフィンゴシン、スフィンゴシンホスフェート、メチル化スフィンゴシンおよびスフィンガニン、セラミド、セラミドホスフェート、１−０アシルセラミド、ジヒドロセラミド、２−ヒドロキシセラミド、スフィンゴミエリン、グリコシル化スフィンゴ脂質、スルファチド、ガングリオシド、ホスホスフィンゴ脂質、ならびに様々な長さおよび飽和状態のフィトスフィンゴシンおよびそれらの誘導体などのスフィンゴ脂質、ホスファチジルコリン、リソホスファチジルコリン、ホスファチジン酸、リソホスファチジン酸、環状ＬＰＡ、ホスファチジルエタノールアミン、リソホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、リソホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、リソホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、イノシトールホスフェート、ＬＰＩ、カルジオリピン、リソカルジオリピン、ビス（モノアシルグリセロ）ホスフェート、（ジアシルグリセロ）ホスフェート、エーテル脂質、ジフィタニルエーテル脂質、ならびに様々な長さおよび飽和状態のプラスマロゲンおよびそれらの誘導体などのリン脂質、コレステロール、デスモステロール、スチグマステロール、ラノステロール、ラトステロール、ジオスゲニン、シトスタノール、チモステロール、チモステノール、１４−デメチル−ラノステロール、コレステロール硫酸、ＤＨＥＡ、ＤＨＥＡ硫酸、１４−デメチル−１４−デヒドロラノステロール、シトスタノール、カンペステロール、エーテルアニオン脂質、エーテルカチオン脂質、ランタニドキレート化脂質、Ａ環置換オキシステロール、Ｂ環置換オキシステロール、Ｄ環置換オキシステロール、側鎖置換オキシステロール、二重置換オキシステロール、コレスタン酸誘導体、フッ素化ステロール、蛍光ステロール、スルホン化ステロール、リン酸化ステロール、ならびに異なる長さ、飽和状態の多価不飽和ステロールおよびそれらの誘導体などのステロールを含むが、これらに限定されない、１つまたは複数のリンカー分子とのコンジュゲーションによりリポソームコアの表面に固定することができる。
【０１５８】
オリゴヌクレオチドは、コア（リポソームコア）内に埋め込むことによってコアと会合させることもできる。またはそれを、間接的に（すなわち、リンカーのような他の分子を介して非共有結合によりもしくは共有結合により）または直接的に（すなわち、共有結合により）のいずれかで、付着または結合させることができる。
【０１５９】
本発明はまた、構成要素のいずれか１つまたは集合を指す、物品を含む。一部の実施形態では、物品は、キットである。物品は、１つまたは複数の容器中に本発明の医薬用または診断用化合物を含む。物品は、本発明の化合物の使用を奨励するまたは記述する指示またはラベルを含み得る。
【０１６０】
本明細書で用いられる「奨励」は、ＴＮＦα障害の処置に関連する本発明の組成物に関連する、教育、病院および他の臨床指示の方法、医薬品販売、ならびにあらゆる形の書面、口述による伝達および電子通信を含む任意の広告または他の販売促進活動を含む医薬品産業活動を含む業務を実施するすべての方法を含む。
【０１６１】
「指示」は、奨励の構成要素を規定し、一般的に本発明の組成物の包装に関するまたは関連する書面による指示を含み得る。指示はまた、あらゆる方法で行われる口述または電子指示を含み得る。
【０１６２】
したがって、本明細書で述べる薬剤は、一部の実施形態では、治療、診断または研究応用におけるそれらの使用を促進するための医薬または診断または研究キットに結集することができる。キットは、本発明の構成要素および使用説明書を収容する１つまたは複数の容器を含み得る。具体的には、そのようなキットは、本明細書で述べる１つまたは複数の薬剤、ならびにこれらの薬剤の意図される治療応用および適正な投与を記述した指示書を含み得る。ある特定の実施形態では、キット中の薬剤は、医薬製剤中に存在し、薬剤の特定の応用および投与の方法に適する用量であり得る。
【０１６３】
キットは、医師による本明細書で述べる方法の使用を促進するように設計することができ、多くの形をとり得る。キットの組成のそれぞれは、該当する場合、液体の形態で（例えば、溶液で）または固体の形態で（例えば、乾燥粉末）用意することができる。ある特定の場合に、組成物の一部は、例えば、キットと共に供給され得るまたはされ得ない、適切な溶媒または他の種（例えば、水もしくは細胞培養培地）の添加により、構成可能または別の状態に処理可能（例えば、活性型に）であり得る。本明細書で用いられる「指示」は、指示および／または奨励の構成要素を規定し得るものであり、一般的に本発明の包装に関するまたは関連する書面による指示を含む。指示はまた、使用者が、指示がキットに関連するものであることを明確に認識するようなあらゆる方法、例えば、視聴覚（例えば、ビデオテープ、ＤＶＤなど）、インターネットおよび／またはウエブベースの通信などにより与えられる口述または電子的指示を含み得る。書面による指示は、医薬品または生物製剤の製造、使用または販売を規制する政府機関により規定された形であり得る。その指示は、ヒト投与のための製造、使用または販売の当機関による承認も反映し得る。
【０１６４】
キットは、１つまたは複数の容器に入れた本明細書で述べる任意の１つまたは複数の構成要素を含有し得る。例として、一実施形態では、キットは、キットの１つまたは複数の構成要素を混合することおよび／または単離し、試料を混合し、対象に適用することに関する指示を含み得る。キットは、本明細書に記載する薬剤を収容する容器を含み得る。薬剤は、無菌的に調製し、注射器に包装し、冷凍して出荷され得る。あるいは、それをバイアルまたは貯蔵用の他の容器に収容することができる。第２の容器は、無菌的に調製された他の薬剤を有し得る。あるいは、キットは、事前に混合した活性薬剤を含み、注射器、バイアル、管または他の容器で出荷され得る。
【０１６５】
キットは、パウチ内に付属品が緩やかに詰め込まれているブリスターパウチ、収縮ラップパウチ、真空シーラブルパウチ、シーラブル熱成型トレー、または類似のパウチもしくはトレー形態、１つもしくは複数の管、容器、ボックスまたはバッグなどの様々な形態を有し得る。キットは、付属品を加えた後に滅菌することができ、それにより、容器中の個々の付属品の包装を別途解くことができる。キットは、放射線滅菌、熱滅菌または当技術分野で公知の他の滅菌法などの任意の適切な滅菌技術を用いて滅菌することができる。キットは、特定の応用に応じて、例えば、容器、細胞培地、塩、緩衝液、試薬、注射器、針、消毒剤を塗布または除去するためのガーゼなどの布、使い捨て手袋、投与前の薬剤の支持体などの他の構成要素も含み得る。
【０１６６】
キットの組成は、任意の適切な形態、例えば、液状の溶液または乾燥粉末として供給することができる。供給された組成物が乾燥粉末である場合、粉末は、供給されることもある、適切な溶媒を加えることによって再構成することができる。液体の形態の組成物が適する実施形態では、液体の形態のものは、濃縮するか、またはそのまま使用することができる。溶媒は、化合物および使用または投与方法に依存する。薬物組成物の適切な溶媒は、周知であり、文献で閲覧可能である。溶媒は、化合物および使用または投与方法に依存する。
【０１６７】
キットは、一連の実施形態では、それぞれの容器が方法に用いられる別個の要素の１つを含む、バイアル、管などの１つまたは複数の容器手段を厳重に閉じ込められた状態で入れるために区分化された運搬手段を含み得る。例えば、容器の１つは、アッセイの陽性対照を含み得る。さらに、キットは、他の構成要素、例えば、アッセイに有用な緩衝液用の容器を含み得る。
【０１６８】
本発明はまた、最終包装およびラベル表示された医薬品を包含する。この製造品は、密閉されているガラスバイアルまたは他の容器などの適切な器または容器に入れた適切な単位剤形を含む。非経口投与に適する剤形の場合、有効成分は、無菌であり、粒子状物質不含有の溶液として投与に適している。換言すると、本発明は、非経口用の溶液および凍結乾燥粉末の両方を包含し、それぞれが無菌であり、後者は、注射前の再構成に適している。あるいは、単位剤形は、経口、経皮、局所または粘膜送達に適する固体であり得る。
【０１６９】
好ましい実施形態では、単位剤形は、静脈内、筋肉内または皮下送達に適する。したがって、本発明は、好ましくは無菌で、各送達経路に適する、溶液を包含する。
【０１７０】
あらゆる医薬品と同様に、包装材料および容器は、貯蔵および出荷中の製品の安定性を保護するように設計されている。さらに、本発明の製品は、ＴＮＦα疾患もしくは障害をどのようにして適切に防止または処置するかを医師、技師または患者に助言する使用説明書または他の情報資料を含む。換言すると、この製造品は、実際の用量、モニタリング手順および他のモニタリング情報を含むが、これらに限定されない投与計画を示すまたは提案する指示手段を含む。
【０１７１】
より具体的には、本発明は、ボックス、ビン、管、バイアル、容器、噴霧器、吹込器、静注（ｉ．ｖ．）バッグ、封筒などの包装材料；および前記包装材料内に含有される医薬品の少なくとも１つの単位剤形を含む製造品を提供する。本発明はまた、ボックス、ビン、管、バイアル、容器、噴霧器、吹込器、静注（ｉ．ｖ．）バッグ、封筒などの包装材料；および前記包装材料内に含有される各医薬品の少なくとも１つの単位剤形を含む製造品を提供する。本発明はさらに、ボックス、ビン、管、バイアル、容器、噴霧器、吹込器、静注（ｉ．ｖ．）バッグ、封筒などの包装材料；および前記包装材料内に含有される各医薬品の少なくとも１つの単位剤形を含む製造品を提供する。本発明はさらに、製剤の注射のための、好ましくは無菌の形で包装された針または注射器、および／または包装されたアルコールパッドを含む製造品を提供する。
【０１７２】
本発明は、以下の説明に示すまたは図面に例示した成分の構築および配置の詳細にその適用が限定されない。本発明は、他の実施形態および様々な方法で実施または実行する能力がある。また、本明細書で用いる表現法および用語は、記述の目的のためであり、限定的であると見なすべきでない。本明細書における「を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「を有する」、または「を含有する」、「を含む（ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ）」およびそれらの変形形態の使用は、その後に列挙する項目およびその同等物ならびにさらなる項目を包含することを意味する。
【０１７３】
当業者は、単に通常の実験を用いて、本明細書で述べる本発明の特定の実施形態の多くの同等物を認識するまたは確認することができる。そのような同等物は、以下の特許請求の範囲により包含されるものとする。
【０１７４】
本明細書で開示した、特許文書を含む、すべての参考文献は、それらの全体が参照により組み込まれる。
【実施例】
【０１７５】
（実施例１）
阻害性オリゴヌクレオチド配列
オリゴヌクレオチドは、標準ホスホルアミダイト化学反応（Ｇｌｅｎ  ＲｅｓｅａｒｃｈおよびＣｈｅｍＧｅｎｅｓからの試薬）を用いてＭｅｒＭａｄｅ４８（Ｂｉｏａｕｔｏｍａｔｉｏｎ）で合成した。配列のうちの３つは、ヒトＴＮＦ  ｍＲＮＡの開始コドンに対して標的化した（Ｏｌｉｇｏ３４８２、３４８３および３４８４）。３つの追加の配列を、Ｓｆｏｌｄを用いて作製した（Ｏｌｉｇｏ３４８５、３４８６および３４８７）。１つの配列Ｏｌｉｇｏ３４８８をヒト化した。最後に、スクランブル対照を作製した（Ｏｌｉｇｏ３４９５）。それぞれの配列を表１に列挙する。
【０１７６】
【表１】
0006741673.tif 000006
【０１７７】
次いでオリゴヌクレオチドを、逆相高速液体クロマトグラフィー（Ａｇｌｉｅｎｔ）を用いて精製した。オリゴヌクレオチド生成物の同一性は、マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析により確認した。
【０１７８】
合成されたオリゴヌクレオチドを最初にＴＮＦ発現についてスクリーニングした。初代ヒトケラチノサイトを９６ウェルプレートに蒔いた。翌日、細胞にＯｐｔｉｍｅｍ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）においてリポフェクタミン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて２μＭのアンチセンス鎖を２４時間トランスフェクトした。インキュベーション期間の後、細胞をＰＢＳで洗浄し、それらのｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成し、ＲＴ−ＰＣＲを用いてＴＮＦおよびＧＡＰＤＨレベルを決定した（図１）。オリゴヌクレオチド３４８２、３４８５および３４８７は、ＴＮＦ発現レベルを低下させるのに特に有効であった。
【０１７９】
追加の一連の修飾配列において同じ実験条件を実施した。手短に述べると、初代ヒトケラチノサイトを９６ウェルプレートに蒔いた。翌日、細胞にＯｐｔｉｍｅｍ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）においてリポフェクタミン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて２μＭのアンチセンス鎖を２４時間トランスフェクトした。インキュベーション期間の後、細胞をＰＢＳで洗浄し、それらのｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成し、ＲＴ−ＰＣＲを用いてＴＮＦおよびＧＡＰＤＨレベルを精査した（図２）。表２で見られる通り、各配列をそれぞれの対照（イタリック体）と対にした。
【０１８０】
【表２】
0006741673.tif 000007
【０１８１】
（実施例２）
球状核酸（ＳＮＡ）によるＴＮＦの阻害
各種ＳＮＡの化学的性質をそれぞれのオリゴヌクレオチド対照と比較した。抗ＴＮＦアンチセンス鎖を含有するＳＮＡを調製した。０．１９６９ｇのＨＡｕＣｌ４・３Ｈ２Ｏの４９０ｍＬ沸騰水溶液を１０ｍＬの水中０．５７０ｇのクエン酸三ナトリウムにより還元することによって、１３±１ｎｍの直径の金ナノ粒子を調製した。次いで粒子溶液を、０．４５μｍ酢酸セルロース膜に通して濾過して、あらゆる凝集ナノ粒子を除去した。ナノ粒子濃度は、調製した際、１１ｎＭであった。
【０１８２】
次いで金ナノ粒子をそのまま用いて、抗ＴＮＦおよび対照ＳＮＡを調製した。ＳＮＡの合成は、チオール化５ｋＤａ直鎖状ポリエチレングリコールを合成したままの金ナノ粒子に５μＭの最終濃度となるように加えることにより開始した。混合した後、溶液を３７℃で１．５時間放置し、その時点で、オリゴヌクレオチドを溶液に５μＭの最終濃度で加えた。温度を維持しながら、塩化ナトリウム溶液を官能基付与混合物に１時間にわたって２等分割量で加えて、ＮａＣｌの濃度を１５０ｍＭに上昇させた。当混合物を３７℃で一夜放置した。翌日、２１，０００×ｇで遠心分離して粒子を沈殿させ、上清を除去し、粒子を無菌ＰＢＳ中に再懸濁した。この工程を３回繰返して、粒子に付着しなかった過剰のＰＥＧおよびオリゴヌクレオチドを除去した。金コアからオリゴヌクレオチドを遊離させる、つまりナノ粒子をＫＣＮにより酸化的に溶解させることによって、ナノ粒子１個当たりのオリゴヌクレオチドの数を測定した。最後に、遊離したオリゴヌクレオチドの数を、製造業者の指示に従って蛍光ベースのアッセイ（Ｏｌｉｇｒｅｅｎ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により測定した。
【０１８３】
初代ヒトケラチノサイトを９６ウェルプレートに蒔いた。翌日、細胞に５μＭのオリゴヌクレオチド濃度でＴＮＦまたは対照ＳＮＡをトランスフェクトした。処置は、一夜継続した。翌日、細胞を洗浄し、ｍＲＮＡを収集し、ｃＤＮＡを調製し、ＴＮＦおよびＧＡＰＤＨの発現を精査した。結果を図３に示す。表３で見られる通り、各配列をそれぞれの対照（イタリック体）と対にした。
【０１８４】
【表３】
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【０１８５】
ヒトケラチノサイトを９６ウェル組織培養プレートで平板培養し、一夜付着させた。次の日、それらを、Ｏｌｉｇｏ３６６１修飾ＳＮＡまたはＯｌｉｇｏ３６５７（配列番号２２）ＳＮＡによる処理の前に５０ｎｇ／ｍＬヒト組換えＴＮＦで４時間処理した。処理は、一夜継続した。翌日、細胞を洗浄し、ｍＲＮＡを収集し、ｃＤＮＡを調製し、ＴＮＦおよびＧＡＰＤＨの発現を精査し、遺伝子ノックダウンの百分率を計算した（図４）。
【０１８６】
Ｏｌｉｇｏ３６５７修飾ＳＮＡに対するさらなるホスホロチオエート修飾の影響を検討した。ホスホロチオエート含量を増加させたオリゴヌクレオチドのファミリーを前述の金ナノ粒子を用いて調製した。粒子をヒトケラチノサイトに一夜トランスフェクトした。翌日、細胞を洗浄し、ｍＲＮＡを収集し、ｃＤＮＡを調製し、ＴＮＦおよびＧＡＰＤＨの発現を精査し、遺伝子ノックダウンの百分率を計算した（図５）。表４における配列を解析した。
【０１８７】
【表４】
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【０１８８】
ＴＮＦ発現に対する中空ＳＮＡの影響を検討した。トコフェロールホスホルアミダイトを含有するオリゴヌクレオチドを調製した（ＣｈｅｍＧｅｎｅｓからの試薬）。ジオレオイルホスファチジル−コリン（ＤＯＰＣ）からなるリポソーム足場は、脂質を７５ｍｇ／ｍＬでＤＣＭに溶解し、次いで溶液を窒素の気流中で乾燥し、凍結乾燥することにより調製した。残留物をＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）および１５０ｍＭ  ＮａＣｌに４０ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解し、３０分間放置した後、液体窒素を用いて３つの凍結／解凍サイクルにかけた。次いで当溶液を、１００、５０および３０ｎｍの直径を有する細孔を含有するポリカーボネート膜に通して押し出した。得られた溶液は、直径が約４０ｎｍのリポソームを含有していた。ＳＮＡ中への官能基付与は、リポソーム溶液にトコフェロール修飾オリゴヌクレオチドを加えることによって起こった。次いで材料を接線流濾過により濃縮し、上述のようにヒトケラチノサイトに加えた。調製された配列は、表５に示す通りである。
【０１８９】
【表５】
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【０１９０】
（実施例３）
ＴＮＦ  ｍＲＮＡを標的とするアンチセンスＳＮＡの阻害効果
ｍＲＮＡ発現に対するＴＮＦ  ｍＲＮＡを標的とするアンチセンスＳＮＡの阻害効果を非標的対照ＳＮＡと比較した。化合物６０８１からなる、抗ＴＮＦアンチセンス鎖を含有するＳＮＡを調製した。
【０１９１】
すべてのオリゴヌクレオチドを、標準ＵｎｉＬｉｎｋｅｒ（ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ）を用いて１マイクロモルスケールで合成した。ＤＮＡ、ＲＮＡ、２’−Ｏ−Ｍｅモノマーおよびヘキサエチレングリコールスペーサーは、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手した。コレステロールモディファイアは、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈから入手した。結合は、標準ホスホジエステル、または硫化剤として１：１ルチジン：ＡＣＮ中０．２Ｍフェニルアセチルジスルフィド（ＰＡＤＳ）を用いて作製したホスホロチオエートのいずれかであった。合成は、５’→３’方向にＤＭＴ−ｏｆｆで実施した。合成後、水酸化アンモニウムおよびエタノールの４：１混合物を用いて５５℃で１６時間処理してオリゴヌクレオチドを支持体から切断し、脱保護した。オリゴヌクレオチドをイオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法により精製した。ＩＤＴ  Ｏｌｉｇｏ分析装置を用いて分子量および吸光係数を推定した。オリゴヌクレオチド分子量の確認は、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）を用いて実施した。オリゴヌクレオチド濃度は、ＩＤＴ  Ｏｌｉｇｏ分析装置からの計算吸光係数とともにマイクロプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ）で２６０ｎｍでのＵＶ吸光度により決定した。
【０１９２】
次いでオリゴヌクレオチドを用いて、抗ＴＮＦおよび対照ＳＮＡを調製した。合成は、オリゴヌクレオチドをＰＢＳ中１００μＭに希釈することにより開始した。次いでオリゴヌクレオチドを遮光して４℃で一夜貯蔵した。オリゴヌクレオチドの疎水性コレステロール尾部に対する極性溶媒の静電的反発により、コレステロールコアを有し、オリゴヌクレオチドが外側に延びた構造化ミセル構造が形成される。
【０１９３】
初代ヒトケラチノサイトを９６ウェルプレートで平板培養した。翌日、細胞に、１０００、３３３．３、１００、３３．３、１０、３．３、１、０．３３、０．１、０．０３および０．０１ｎＭのオリゴヌクレオチド濃度のＯｌｉｇｏ  ＩＤ６０８１またはＯｌｉｇｏ  ＩＤ６０９３  ＳＮＡをトランスフェクトする前に５０ｎｇ／ｍＬヒト組換えＴＮＦで４時間処理した。処理は、一夜継続した。翌日、細胞を洗浄し、ｍＲＮＡを収集し、ｃＤＮＡを調製し、ＴＮＦおよびＧＡＰＤＨの発現を精査し、遺伝子発現の百分率を計算した（図９）。
【０１９４】
Ｏｌｉｇｏ  ＩＤ６０８１  ＳＮＡのアンチセンス活性に対するヘキサエチレングリコール（ＨＥＧ）の鎖長の変化の影響を検討した。ＨＥＧスペーサー長を増加させたオリゴヌクレオチドを調製し、自己集合ＳＮＡとして製剤化した。初代ヒトケラチノサイトを９６ウェルプレートで平板培養した。翌日、細胞を、１００、１０、１および０．１ｎＭのオリゴヌクレオチド濃度のＯｌｉｇｏ  ＩＤ６０８０、６０８１、６０８２、６０９２、６０８３、６０９３、６０９４または６０９５  ＳＮＡを用いてトランスフェクトする前に５０ｎｇ／ｍＬヒト組換えＴＮＦで４時間処理した。処理は、一夜継続した。翌日、細胞を洗浄し、ｍＲＮＡを収集し、ｃＤＮＡを調製し、ＴＮＦおよびＧＡＰＤＨの発現を精査し、遺伝子発現の百分率を計算した（図１０）。
【０１９５】
【表６】
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【０１９６】
（実施例４）
ヒト乾癬性皮膚におけるｅｘ  ｖｉｖｏ活性の試験
オリゴヌクレオチドは、標準固相ホスホルアミダイト法を用いてＭｅｒｍａｄｅ４８（Ｂｉｏａｕｔｏｍａｔｉｏｎ）により合成した。塩基および試薬は、Ｇｌｅｎ  ＲｅｓｅａｒｃｈおよびＣｈｅｍｇｅｎｅｓから購入した。すべてのオリゴヌクレオチドを逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により精製し、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）分析を用いて分子量を測定した。合成オリゴヌクレオチドを表７に列挙する。
【０１９７】
リポソームは、５０ｎｍの細孔を有する４７ｍｍの直径のポリカーボネート膜（Ｓｔｅｒｌｉｔｅｃｈ）を用いて、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、１０Ｍリン酸、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ７．４、ｈｙｃｌｏｎｅ）中で水和した１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）の押出しにより合成した。リポソームの直径は、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いた動的光散乱法を用いて測定した。脂質濃度は、リン脂質アッセイキット（Ｓｉｇｍａ）を決定した。
【０１９８】
Ｌ−ＳＮＡは、オリゴヌクレオチドとリポソームとを１００：１モル比で混合し、混合物を室温で４時間インキュベートすることにより合成した。Ｌ−ＳＮＡを未反応材料から単離し、３０ｋＤ分子量カットオフ修飾ポリエーテルスルホン（ｍＰＥＳ）中空繊維フィルターモジュールを備えたＭｉｎｉＫｒｏｓ  Ｐｉｌｏｔ  ｉ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｓ）を用いた接線流濾過（ＴＦＦ）を用いて濃縮した。Ｌ−ＳＮＡを含有する保持液を、リン脂質アッセイキット（Ｓｉｇｍａ）を用いて脂質濃度について分析した。Ｌ−ＳＮＡを９０％メタノールで希釈し、リポソームを溶解して、表面官能基化オリゴヌクレオチドを放出させ、その濃度をＣａｒｙ  ＵＶ／ｖｉｓ分光光度計（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いて測定した。ナノ粒子にコンジュゲートしたオリゴヌクレオチドの平均数は、オリゴヌクレオチドの濃度をリポソームの濃度で割ることによって計算した。Ｌ−ＳＮＡの直径は、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いた動的光散乱法を用いて測定した。
【０１９９】
ヒト乾癬性ｅｘ  ｖｉｖｏ皮膚培養に対し、Ｏｌｉｇｏ４８３１．１を含有するＬ−ＳＮＡを適用することによる遺伝子調節効果を検討した。実験群を表８に列挙する。
【０２００】
４つの直径３ｍｍの皮膚生検材料を、軽度から中等度の尋常性乾癬を有する５例の患者の乾癬プラークから採取した。正確な表示を期し、また患者の特定の反応と対照して、各複製試料を異なる患者から採取した。外植片を以下の方法で培養した。Ｃｏｒｎｉｎｇ  １２ウェル細胞培養フィルターインサートの中心に穴をパンチした。生検材料がフィルターに埋め込まれるように外植片の真皮（底部）部分をフィルターの穴に押し込んだ。表皮は、内側チャンバー中で曝露し、真皮は、外側チャンバー中で曝露した。真皮がウェル中の培地と接触し、表皮が空気に曝露するようにこれらのフィルターを１ｍｌ細胞培養培地（ＤＭＥＭ、１％ＦＢＳ、１．２５μｇ／ｍＬアムホテリシンＢ、５０μｇ／ｍＬゲンタマイシン、０．１Ｕ／ｍＬペニシリン／ストレプトマイシン）中に浸した。培養物を以下のように処理した。２μＬの各化合物をピペットを用いて各生検材料の上部（角質層）のＰＢＳに加えた。生検材料を３７℃で１６時間インキュベートした。
【０２０１】
試料は、３ｍｍの直径のジルコニアボールベアリングを満たした２ｍＬスクリューギャップバイアル中３００μＬのＲＬＴ緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ）中でボールベアリングホモジナイザーを用いて直ちにホモジナイズした。ホモジナイズした試料を直ちに急速冷凍し、−８０℃で貯蔵した。溶解物をＱｉａｇｅｎ  ９６ウェルＲＮｅａｓｙプレート抽出キットを用いて処理した。ｈＴＮＦおよびｈＧＡＰＤＨ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）に対するプローブおよびプライマーを用いてＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）でＲＴＰＣＲを実施し、ＴＮＦ遺伝子発現を測定した（図１１）。
【０２０２】
【表７】
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【０２０３】
【表８】
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【０２０４】
（実施例５）
ＴＮＢＳ誘発性炎症性腸疾患（ＩＢＤ）マウスモデルにおける抗ＴＮＦ  ＳＮＡおよびＬ−ＳＮＡの有効性の試験
Ｏｌｉｇｏ２２７９０１の効果（表９）をＴＮＢＳ誘発性ＩＢＤマウスモデルにおいて評価した。その３’末端にコレステロールを有するＯｌｉｇｏ２２７９０１を合成した（ＣｈｅｍＧｅｎｅｓからの試薬）。本発明者らは、実施例６において、このオリゴヌクレオチドの自己集合ＳＮＡ構造体の形成を、低温ＥＭを用いて示す。さらに、５０ｎｍＤＯＰＣリポソーム溶液にオリゴヌクレオチドを加えることにより、Ｌ−ＳＮＡ型のＯｌｉｇｏ２２７９０１を調製した。動物に用いるためにＳ−ＳＮＡおよびＬ−ＳＮＡを重炭酸溶液中でｐＨ９．５にした。
【０２０５】
ＴＮＢＳ誘発性結腸炎の試験を６〜７週齢のＢａｌｂ／ｃマウスにおいて実施した。結腸炎の誘発のために、８０％エタノールに溶解した１０ｍｇのＴＮＢＳを試験０日目に動物の直腸内に投与した。対照マウスは、ビヒクルのみで処置したマウスおよび無処置ナイーブマウスからなっていた。
【０２０６】
ＴＮＢＳ誘発性結腸炎試験におけるＯｌｉｇｏ２２７９０１のＳ−ＳＮＡおよびＬ−ＳＮＡの治療効果を検討するために、結腸炎の誘発後１、２、３および４日目に（合計４回投与）強制経口投与により１００μｇ／投与／マウス〜３００μｇ／投与／マウスにて化合物でマウスを処置した。マウスを臨床スコア所見について７日まで毎日モニターし、肉眼的病理解析のために７日目に安楽死させた。
【０２０７】
対照マウスおよび処置マウスの臨床スコアは、体重、便の硬さおよび直腸からの出血ならびに被毛および腹部に認められたあらゆる異常などのパラメーターを考慮することによって割り当てた。
【０２０８】
安楽死の後に動物から摘出した結腸の肉眼的病理スコアを、試験の最終日に対照マウスおよび処置マウスに割り当てた。０〜５の肉眼的病理スコアを、異常は検出されず（スコア０）；１つの位置における浮腫および発赤（スコア１）；複数の位置における浮腫および発赤（スコア２）；１つの潰瘍（スコア３）；複数の潰瘍または重度潰瘍（スコア４）；ならびに複数の位置における浮腫および発赤かつ１または複数の潰瘍（スコア５）という所見に基づいて割り当てた。
【０２０９】
試験の結果を図１２に示す。群の統計的有意性は、一元配置ＡＮＯＶＡとそれに続く事後チューキー検定を用いて計算した。ＴＮＢＳのみの群における臨床スコアおよび肉眼的病理スコアの増加は、ＴＮＢＳの直腸投与がナイーブマウスを除く群のすべてにおける結腸炎疾患を定着させたことを示唆している。関連ビヒクル群と比較して平均臨床スコアの有意な低下が、０日目のＴＮＢＳによる結腸炎の誘発後、１日目〜４日目に合計４回の２００μｇ／投与の量でＳ−ＳＮＡ型のＯｌｉｇｏ２２７９０１で処置した群について認められた。１日目から４日目まで４回のＳ−ＳＮＡ（２００μｇ／投与および３００μｇ／投与）およびＬ−ＳＮＡ（２００μｇ／投与）の投与にて処置した動物は、ビヒクル群と比較して肉眼的病理スコアの有意な低下を示した。全体的に見て、結果は、Ｓ−ＳＮＡの経口投与が、より低い臨床スコア、より低い病理スコアおよびより高い動物生存率を反映して、疾患症状に対し正の効果を有していたことを示唆するものである。
【０２１０】
【表９】
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【０２１１】
（実施例６）
自己集合ＳＮＡの低温ＴＥＭ
ＣｒｙｏＴＥＭ撮像をＯｌｉｇｏ６３０７自己集合球状核酸（Ｓ−ＳＮＡ）（表１０）の溶液について実施した。Ｓ−ＳＮＡは、２．４ｍＭオリゴヌクレオチド溶液を用いてリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、１０Ｍリン酸、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ７．４、Ｈｙｃｌｏｎｅ）中で調製した。試料は、４００メッシュ銅グリッド上穴あき炭素フィルムにより支持されたガラス状氷中に保存した。各試料は、試料懸濁液の３μｌ滴を清浄グリッドに加え、濾紙で吸取り、液体エタン中で直ちにガラス化を進めることにより調製した。グリッドは、撮像のために電子顕微鏡に移すまで液体窒素中で貯蔵した。
【０２１２】
電子顕微鏡法は、ＦＥＩ  Ｅａｇｌｅ  ４Ｋｘ４ｋＣＣＤカメラを装着した１２０ｋｅＶで操作するＦＥＩ  Ｔｅｃｎａｉ  Ｔ１２電子顕微鏡を用いて実施した。ガラス状氷グリッドを−１７０℃未満の温度に維持する低温ステージを用いて電子顕微鏡中に移した。１１００００ｘ（０．１０ｎｍ／ピクセル）の公称倍率の高倍率像が得られた。像は、−５μｍ〜−３μｍの公称アンダーフォーカスおよび１０〜４０ｅ−／Ａ２の電子線量で取得した。
【０２１３】
試料は、視野全域にわたり主として多くの小さな約３ｎｍの丸い粒子からなっていた（図１３）。これらの丸い粒子は、Ｓ−ＳＮＡ粒子の疎水性コアからなるコレステロール分子のクラスターの直径に対応する。小さな約３ｎｍの丸い粒子は、３〜５ｎｍのギャップにより均等な間隔で存在し、これは、疎水性コアの周りに球状の配向で配列したオリゴヌクレオチドコロナに対応しているようである（図１４Ａ）。オリゴヌクレオチドコロナまたはシェルは、約１３ｎｍのＳ−ＳＮＡの流体力学的半径を規定し、電子密度が高い疎水性コア間の間隔が均等になる（図１４Ｂ）。
【０２１４】
【表１０】
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【図１】
0006741673.tif 000017
【図２】
0006741673.tif 000018
【図３】
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【図４Ａ−Ｂ】
0006741673.tif 000020
【図５Ａ−Ｂ】
0006741673.tif 000021
【図６Ａ−Ｂ】
0006741673.tif 000022
【図７】
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【図８】
0006741673.tif 000024
【図９】
0006741673.tif 000025
【図１０】
0006741673.tif 000026
【図１１】
0006741673.tif 000027
【図１２Ａ−Ｂ】
0006741673.tif 000028
【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
0006741673.tif 000030
【図１３】
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【図１４Ａ−Ｂ】
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【配列表】
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