(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
人工透析液又は注射液である電解液を含む領域部と、
前記領域部を２つの区画に分画し、前記２つの区画をナノポアで連通する分画部材と、
第一の区画に設けられた第一の電極と、
第二の区画に設けられ、前記第一の電極と電気的に接続された第二の電極と、
前記第一の区画の電解液を、前記ナノポアを通して前記第二の区画へ移動させる電解液流発生手段と、
前記第一の電極と、前記第二の電極との間に電圧を印加する印加手段と、
前記ナノポアに流れるイオン電流をモニタリングするモニタリング手段と、を備えることを特徴とする、ＬＡＬ試薬を使用しないエンドトキシン検出装置。
【請求項２】
前記第一の区画近傍に、撹拌手段を更に備える、請求項１に記載のエンドトキシン検出装置。
【請求項３】
前記電解液流発生手段が、電気浸透流を発生させる手段である、請求項１又は２に記載のエンドトキシン検出装置。
【請求項４】
前記ナノポア内部に固定電荷を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載のエンドトキシン検出装置。
【請求項５】
前記分画部材が、キャピラリー、ピペット、漏斗、又は注射針である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のエンドトキシン検出装置。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のエンドトキシン検出装置を備えることを特徴とする、医療溶液製造システム。
【請求項７】
電解液を含む領域部と、
前記領域部を２つの区画に分画し、前記２つの区画をナノポアで連通する分画部材と、
第一の区画に設けられた第一の電極と、
第二の区画に設けられ、前記第一の電極と電気的に接続された第二の電極と、
前記第一の区画の電解液を、前記ナノポアを通して前記第二の区画へ移動させる電解液流発生手段と、
前記第一の電極と、前記第二の電極との間に電圧を印加する印加手段と、
前記ナノポアに流れるイオン電流をモニタリングするモニタリング手段と、を備えるエンドトキシン検出装置を用いて、ＬＡＬ試薬を使用することなくエンドトキシンを検出するエンドトキシンの検出方法。
【請求項８】
前記モニタリング手段で前記イオン電流値の変化を測定してエンドトキシンを検出することを特徴とする、請求項７に記載のエンドトキシンの検出方法。
【請求項９】
前記電解液は、撹拌処理されている、請求項７又は請求項８に記載のエンドトキシンの検出方法。
【請求項１０】
エンドトキシン濃度が既知の参照電解液を用意し、前記ナノポアをエンドトキシンミセルが通過する際のイオン電流値の変化頻度を測定して、前記変化頻度とエンドトキシン濃度との検量線を作成し、エンドトキシン濃度が未知の前記電解液の前記イオン電流の変化頻度を前記検量線と比較することで、前記電解液中のエンドトキシン濃度を測定する、請求項７〜９いずれか一項に記載のエンドトキシンの検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エンドトキシン検出装置、及びエンドトキシンの検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、エンドトキシンを検出する方法として、カブトガニ由来の血球抽出成分から調製された試薬を用い、グラム陰性菌由来のエンドトキシンと試薬とのゲル化形成能力がエンドトキシン濃度に由来することに基づく検出方法（ＬＡＬ法）（特許文献１参照）、上記ＬＡＬ法をベースとして、電気化学的にエンドトキシンを検出する方法（特許文献２、３参照）等が知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開昭５９−４２４５１号公報
【特許文献２】特開２０１８−０７２３３１号公報
【特許文献３】特開２０１７−０３７０４３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、ＬＡＬ試薬を用いた方法は感度が高いものの、ＬＡＬ試薬が高価であり、エンドトキシンの検出に必要なＬＡＬの反応に時間がかかるという問題があった。具体的には、特許文献１に記載の方法は、１時間程度の時間がかかり、特許文献２、３に記載の方法でも、３０分〜１時間を要していた。そのため、高価な試薬を使用することなく、短い時間でエンドトキシンを検出する方法が求められていた。【０００５】
従って、本発明の目的は、高価な試薬を使用することなく、短い時間で、簡便にエンドトキシンを検出する装置、及びエンドトキシンを検出する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
人工透析液又は注射液である電解液を含む領域部と、
前記領域部を２つの区画に分画し、前記２つの区画をナノポアで連通する分画部材と、
第一の区画に設けられた第一の電極と、
第二の区画に設けられ、前記第一の電極と電気的に接続された第二の電極と、
前記第一の区画の電解液を、前記ナノポアを通して前記第二の区画へ移動させる電解液流発生手段と、
前記第一の電極と、前記第二の電極との間に電圧を印加する印加手段と、
前記ナノポアに流れるイオン電流をモニタリングするモニタリング手段と、を備えるＬＡＬ試薬を使用しないエンドトキシン検出装置。
【発明の効果】
【０００７】
本発明は、上記構成を有するため、高価な試薬を使用することなく、短い時間で、簡便にエンドトキシンを検出する装置、及びエンドトキシンを検出する方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】本実施形態のエンドトキシン検出装置の一例を示す概略図である。
【図２】実施例１のエンドトキシン検出装置を説明する概略図である。
【図３】本実施形態のエンドトキシン検出装置を用いた連続測定システムの一例を説明する概略図である。
【図４】本実施形態のエンドトキシン検出装置を医療溶液のラインに適用した一例を説明する概略図である。
【図５Ａ】実施例１で調製したナノピペットの先端のＳＥＭ画像である。
【図５Ｂ】実施例１で調製したガラスピペットを用いてバックグラウンド電流を測定した結果である。
【図６Ａ】実施例１で、エンドトキシン濃度５００ＥＵ／Ｌの電解液を用いて測定した、パルス電流の一例を示す図である。
【図６Ｂ】実施例１で、エンドトキシン濃度１０００ＥＵ／Ｌの電解液を用いて測定した、パルス電流の一例を示す図である。
【図６Ｃ】実施例１で、エンドトキシン濃度５０００ＥＵ／Ｌの電解液を用いて測定した、パルス電流の一例を示す図である。
【図６Ｄ】実施例１で、エンドトキシン濃度１００００ＥＵ／Ｌの電解液を用いて測定した、パルス電流の一例を示す図である。
【図７】実施例１で測定した、エンドトキシン濃度が１００、５００、１０００、５０００及び１００００ＥＵ／Ｌの各溶液の３０ｐＡ以上のパルス数をプロットした図である。
【図８】パルス電流、パルス積分値を説明する図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下、本発明を実施するための形態（以下、「本実施形態」と言う。）について、詳細に説明するが、本発明は以下の記載に限定されるものではなく、その要旨の範囲内で種々変形して実施できる。
【００１０】
［エンドトキシン検出装置］
図１に本実施形態のエンドトキシン検出装置の一例を示す。また、図２〜４に、その他の本実施形態のエンドトキシン検出装置の、例を示す。
エンドトキシン検出装置１は、電解液を含む容器（領域部）２と、上記容器２を２つの区画（例えば、第一の区画２ａ、第二の区画２ｂ等）に分画し、上記２つの区画をナノポア３ａで連通する分画部材３と、第一の区画２ａに設けられた第一の電極４と、第二の区画２ｂに設けられ、上記第一の電極と電気的に接続された第二の電極５と、上記第一の区画２ａの電解液を、上記ナノポア３ａを通して上記第二の区画２ｂへ移動させる電解液流発生手段と、上記第一の電極４と、上記第二の電極５との間に電圧を印加する印加手段６と、電流をモニタリングするモニタリング手段７と、を備える。
エンドトキシン検出装置１において、少なくとも、第一の電極４及び第二の電極５の少なくとも一部と、ナノポア３ａの内径全体とは電解液に満たされている（図１）。
図１のエンドトキシン検出装置は、第一の区画２ａから第二の区画２ｂに向かって、ナノポア３ａを通して電解液が流れる装置の例であるが、第一の区画２ａと第二の区画２ｂとの配置を逆にしてもよい。例えば、図２において、容器２内を第一の区画２ａ、ピペット内を第二の区画２ｂとし、エンドトキシンを含む電解液をピペット内に取り込む方向に流してもよい。
【００１１】
本実施形態のエンドトキシン検出装置は、ナノポア３ａを通して、第一の区画２ａ内のエンドトキシンを含む電解液を、第二の区画２ｂへ移動させることができる。２つの区画間は、ナノポア３ａのみでつながっていることが好ましい（図１、２）。
なお、図１、２は、わかりやすくするため、ナノポア３ａ等を拡大して記載したものである。
【００１２】
ここで、ナノポア３ａを通して、電解液が流れるエンドトキシン検出装置について説明する。
例えば、第一の区画２ａ内の第一の電極４と、第二の区画２ｂ内の第二の電極５との間に電圧を印加すると、２つの区画をつなぐナノポア３ａを介してイオン電流が流れる。ここでは、第一の電極４を正に、第二の電極５を負としている。
エンドトキシンは水溶液中でミセルを形成する性質がある。例えば、第一の区画２ａ内の電解液中にエンドトキシンがあると、電解液中でミセルを形成する。電解液流発生手段により、第一の区画２ａから第二の区画２ｂに向けて電解液が流れると、該エンドトキシンのミセルは電解液の流れにのって、第一の区画２ａから、ナノポア３ａを通って、第二の区画２ｂに流れる。ここで、電圧を印加している間に、ナノポア３ａ内をミセルが通過すると、ナノポア３ａ内を通過する電解液量がミセルの体積に相当する量だけ減少し、ナノポアの電気抵抗が変化し、パルス電流が発生する。モニタリング手段７により、ナノポアに流れるイオン電流の変化を測定することにより、ナノポア３ａを通過したエンドトキシンのミセルを検出することができる。また、パルス電流の頻度等から、第一の区画２ａの電解液中のエンドトキシン濃度を測定することができる。
【００１３】
上記電解液流発生手段は、電解液を吸引するポンプ等の手段や、電解液を注入する物理的な手段、或いは、電極間に電圧を印加することで、電気泳動流や、電気浸透流を発生する手段であってもよい。電気浸透流を発生させることで、時間当たりのナノポア３aを通過する液量を増加させることができるため、エンドトキシンが希薄な濃度であっても感度を高めることができる。また、エンドトキシンは、一般的にマイナスの電荷に帯電することが知られているが、ガラスなどで第一の区画２ａを形成すると、内壁はマイナスの電荷に帯電し、内壁近傍に電気二重層を形成するが、マイナスに帯電したエンドトキシンは、内壁に吸着することなく、電気浸透流の流れにのって移動できるため、感度の向上が期待できる。
【００１４】
上記容器２としては、分画部材３によって第一の区画２ａと第二の区画２ｂとに分画できるものであれば特に限定されるものではない。
上記容器２は、第一の区画２ａに電解液（例えば、エンドトキシンを含む電解液、エンドトキシンを含む可能性のある試料）等を導入する導入路を有していてもよい。また、第二の区画２ｂは、電解液を導出する導出路を有していてもよい。電解液は、エンドトキシンを個々のミセルとする観点から、測定前（例えば、ナノポアを通過する前）に撹拌されたものであることが好ましい。上記エンドトキシン検出装置は、図３に示すように、第一の区画２ａ内に、攪拌手段１０を備えることが好ましい。攪拌手段１０は、第一の区画内（例えば、第一の電極とナノポアとの間等）に備えられていればよいが（図３、４）、第一の区画に連通する導入路に備えられていてもよい。
上記容器２は、系外からのエンドトキシンの混入や、電解液の揮発を防ぐ観点から、密閉された容器であってもよい。
【００１５】
上記容器２の材料としては、例えば、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート等のプラスチック、ガラス等が挙げられる。例えば、第一の区画と第二の区画とで材料が異なっていてもよく、第一の区画はエンドトキシンが吸着しにくい材料とし、第二の区画はエンドトキシンの有無を検査した電解液中のエンドトキシン濃度を低減させる観点からエンドトキシンを吸着する材料を用いてもよい。
エンドトキシンを吸着する材料としては、正電荷を帯びた材料、ヒスチジンコーティングされた材料、トレミキシンコーティングされた材料、ポリミキシンＢコーティングされた材料、ポリ（γ−メチルＬ−グルタメート）コーティングされた材料等が挙げられる。
エンドトキシンを吸着しにくい材料としては、負電荷を帯びた材料、ボロシリケイト等が挙げられる。
中でも、安定した微小径のナノポアの形成しやすさ、コスト、エンドトキシン及び電気浸透流の関係から、第一の分画２ａは、ガラスからなることが好ましい。
【００１６】
上記分画部材３は、壁状の部材であってもよいし（図１）、上記容器２中に独立した第一の区画２ａを形成する部材（図２）であってもよい。上記独立した第一の区画を形成する部材としては、例えば、キャピラリー、ピペット、漏斗、注射針等が挙げられ、安価で、加工が容易で、微小径のナノポアを形成できる観点から、キャピラリーやピペットが好ましい。
【００１７】
上記分画部材を構成する材料としては、例えば、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート等のプラスチック、ガラス等が挙げられ、試料中のエンドトキシンの有無をより正確に検出する観点から、エンドトキシンが吸着しにくい材料であることが好ましく、ガラスがより好ましい。
【００１８】
上記分画部材の第一の区画２ａ側表面は、第一の区画２ａ全体に電気浸透流を発生させて、エンドトキシンを効率よく検出する観点から、固定電荷を有することが好ましい。
ここで、「固定電荷」とは、表面に固定されて存在する電荷をいうものとし、電解液中の成分が備える電荷は含めないものとする。
上記固定電荷を有する材料としては、ガラス、固定電荷を有する官能基が導入された材料、ヘキサメチルジシラザン等が挙げられる。上記固定電荷としては、正電荷であっても負電荷であってもよい。また、固定電荷を有するように表面を処理してもよい。例えば、シラノール基、カルボキシル基、スルホン酸基、アミノ基、リン酸基等の官能基を導入、又は、付加重合等によって処理してもよいし、修飾反応等で表面に固定電荷を付加処理してもよい。また、固定電荷を有する成分（例えば、窒化ケイ素など）でコーティングしてもよい。中でも、エンドトキシンが吸着しにくいガラスが好ましい。
【００１９】
上記ナノポア３ａの形状は、第一の区画２ａと第二の区画２ｂとを連通する形状であれば、特に限定されず、円筒状等が挙げられる。ナノポア３ａの断面形状は、ナノポア３ａの連通する孔の長さ方向で異なっていてもよいし同じであってもよい。
【００２０】
上記ナノポア３ａの内径は、目的に応じて適宜選択されるが、２０００〜１０ｎｍであることが好ましく、より好ましくは８００〜５０ｎｍ、さらに好ましくは５００〜５０ｎｍ、さらに好ましくは３００〜５０ｎｍである。なお、ナノポアの内径が連通する孔の長さ方向で異なる場合、ナノポアの最も小さい内径を上記の範囲になるよう設計すればよい。
【００２１】
上記ナノポア３ａは、上記分画部材３と同じ材料から構成されていてよく、分画部材３とナノポアとはガラスから構成されていることが好ましい。
また、ナノポア３ａの内部表面は、分画部材３と同じ処理がされてもよい。
低コストで安定して微小径のナノポアの形成できる分画部材３として、先端にナノポアを有するガラスピペット（Sutter Instruments社製）が好ましい。
【００２２】
上記電極の材料としては、金、白金、チタン、アルミニウム、タングステン、銅、鉄、パラジウム等の金属；カーボンナノチューブ、ケッチェンブラック、グラッシーカーボン、グラフェン、フラーレン、カーボンファイバ、カーボンファブリック、カーボンエアロゲル等の炭素材料；ポリアニリン、ポリアセチレン、ポリピロール、ポリ（ｐ−フェニレンビニレン）、ポリチオフェン、ポリ（ｐ−フェニレンスルフィド）等の導電性ポリマー；シリコン、ゲルマニウム、酸化インジウムスズ（ＩＴＯ）、酸化チタン、酸化銅、酸化銀等の半導体；等が挙げられる。中でも、電位の安定性の観点から、銀−塩化銀電極が好ましい。
【００２３】
上記第一の電極及び第二の電極は電気的に接続されている。電気的な接続は、導電性の部材により接続されていれば良く、導電性の材料は特に限定されない。
【００２４】
上記印加手段６としては、例えば、第一の電極４及び第二の電極５間に一定の電圧を連続してかけることができる装置等を用いることができる。
【００２５】
上記モニタリング手段７としては、例えば、ナノポア３ａを通して、第一の電極４及び第二の電極５間に流れるイオン電流を測定できる装置等を用いることができる。上記モニタリング手段は、３０ｐＡ以上のパルス電流を検出できる装置が好ましく、１０ｐＡ以上のパルス電流を検出できる装置がより好ましい。
【００２６】
上記電解液としては、第一の区画と第二の区画とで異なる電解液であってもよいが、エンドトキシンの濃度を除き、同じ組成の電解液であることが好ましい。上記電解液としては、例えば、エンドトキシンを溶解することができる溶液が挙げられ、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、人工透析液、注射液、生理食塩水、医療機器の洗浄液、医薬品の原料液等が挙げられる。中でも、エンドトキシンがミセルを形成しやすい人工透析液、注射液が好ましい。
【００２７】
本実施形態のエンドトキシン検出装置としては、例えば、図２に示すように、電極４を挿入したナノポア３ａを有するナノガラスピペットと、電極５を挿入した容器（領域部）との組み合わせ、或いは、正電極を有する区画と負電極を有する区画とを備え、両区画がナノポアでつながれた、表面が窒化ケイ素でコーティングされた電極チップ、マイクロ流体デバイス等が挙げられる。
【００２８】
［連続測定システム］
本実施形態の連続測定システムの具体的な一例を図３に示す。図３でも、図１、２と対応する同じものは同じ番号を付与している。
連続測定システムでは、測定する液体を導入する導入路８を備える。導入路８のエンドトキシン検出装置の接続部には、エンドトキシンのミセルの凝集を分解するための手段として、撹拌手段１０が配置される。図３では、撹拌手段１０として、磁気撹拌装置１２により撹拌子１１を回転させる機構を示しているがこれに限られない。
【００２９】
撹拌手段１０は、モーター等で回転する回転子を用いても良いし、超音波撹拌手段等周知の撹拌手段を用いることができる。エンドトキシンは、複数のミセルが凝集する性質があり、凝集を分解して測定すれば、ナノポアを通過させる際に、精度よく測定できる。回転子を用いるものは、剪断応力を直接与えることができ、効率よく凝集を分解することができる。また、超音波等の撹拌手段は、測定する液体と直接接触することがないことから、測定後の測定する液体を利用する際に有利である。
【００３０】
図３では、撹拌手段１０で凝集が分解された、エンドトキシンミセルはエンドトキシン検出装置１で測定が行われる。測定を終えた液体は導出路９から送出され、廃棄、或いは、使用目的に応じて、所望の装置に送られる。
【００３１】
［医療溶液製造システム］
本実施形態の医療溶液製造システムは、上述の本実施形態のエンドトキシン検出装置を備える。医療溶液の製造ラインの中に上記エンドトキシン検出装置を組み込み、連続的又は断続的に医療溶液をエンドトキシン検出装置に流して検査をすることで、医療溶液中のエンドトキシンを検出することができる。
上記医療溶液製造システムとしては、例えば、人工透析液、注射液、生理食塩水、医療機器の洗浄液、医薬品の原料液、等の医療溶液製造システムが挙げられる。
上記医療溶液製造システムにおいて、一部の医療溶液を検査用に上記エンドトキシン検出装置に流してもよいし、全ての医療溶液を流してもよい。また、本実施形態のエンドトキシン検出装置は、導入した電解液に他の試薬を混合することなくそのまま用いるため、検出装置を通した医療溶液を、製造ラインに戻すことができる。
上記医療溶液製造システムは、例えば、検査のための医療溶液の下処理が必要なく、インラインのセンサとしてその場で医療溶液内のエンドトキシンの検査ができるため、簡便に、効率よくエンドトキシンの検査を行うことができる。また、エンドトキシンが検出された際は、その場でシステムを停止することができるため、医療溶液の生産コストを低減することができる。
【００３２】
医療溶液製造システムに適用した際の具体的な例を示す。
図４に本発明を医療溶液、特に、人工透析液のラインに適用した一例を示す。図４でも、図１、２、３と対応する同じものは同じ番号を付与している。
エンドトキシン検出装置１は、人工透析液のライン１３を２つの区画（２ａ、２ｂ）に分画し、ナノポア３ａで連通する分画部材３と、第一の区画に設けられた第一の電極４と、第二の区画に設けられた第二の電極５と、上流側に設けられた撹拌手段１０とを有する。
【００３３】
エンドトキシン検出装置１は、少なくとも、分画部材３、第一の電極４、第二の電極５を一体とし、ラインに取り付け可能なアダプタ型として、所定の時期に交換等行うことで、安価で、メンテナンス容易に構成することができる。回転子等の撹拌手段を用いる場合は、アダプタに組み込むようにしてもよい。
【００３４】
人工透析液のラインに組み込む場合、全量検査のため、人工透析液のラインに直接、組み込んでも良いが、ラインに分岐管を設け、一部の透析液のみを抽出して測定してもよい。分岐管で測定したものは、ラインに戻してもよいし、そのまま、廃棄する形でもよい。
分岐管を用いることで、効率的に、透析液を測定することが可能になる。
【００３５】
［エンドトキシンの検出方法］
本実施形態のエンドトキシンの検出方法は、上述の本実施形態のエンドトキシン検出装置を用いて、上記モニタリング手段７でイオン電流値の変化を測定してエンドトキシンを検出する。
エンドトキシンを含まない電解液が流れる際に発生するイオン電流（バックグラウンドイオン電流）に対し、エンドトキシンのミセルがナノポアを通過すると、イオン電流値が変化する（図６Ａ〜６Ｄ、図８）。イオン電流値の変化は、主にパルス電流として現れる。パルス電流の大きさから、エンドトキシンのミセルの大きさがわかる。また、パルス電流の頻度から、エンドトキシンのミセルの濃度がわかる。
なお、イオン電流のベース値は、例えば、電解液の種類、ナノポアの内径等により調整することができる。
【００３６】
上記パルス電流とは、横軸を時間（ｍｓ）、縦軸をイオン電流値（ｐＡ）とするグラフにおいて、パルス前後の５０ｍｓ（合計１００ｍｓ）のイオン電流値の平均をベース値とし、該ベース値とパルス電流値のピークトップとの差が有意なものをいうものとする（図８）。また、有意なものとは、ベース値の上限値と下限値との差に対して、１．５倍以上変化したパルス電流値であることが好ましく、より好ましくは１．８倍以上、さらに好ましくは２倍以上のものであり、そのようなパルス電流をミセルがナノポアを通過したものと判断する。具体的なパルス電流値としては、３０ｐＡ以上であることが好ましく、より好ましくは、５０ｐＡ以上のものである。
なお、図６Ｃの最右図のように、パルス電流が連続的に発生、或いは、何らかの理由で、時間軸方向に広がりを持つものが発生する場合がある。このような場合、前後のパルス電流のピークトップの間隔が５０ｍｓない場合、一つのパルス電流とみなしている。
【００３７】
また、横軸を時間（ｍｓ）、縦軸をイオン電流値（ｐＡ）とするグラフ中の各パルスにおいて、エンドトキシンのミセルの体積を見積もる場合には、上記ベース値とパルスの波形とに囲まれる面積（図８の斜線部、本明細書において「パルス積分値」と称する）から、エンドトキシンのミセルの体積を見積もることができる。
上記パルス電流は、パルス積分値が２００ｐＡ・ｍｓ以上であることが好ましく、より好ましくは３００ｐＡ・ｍｓ以上、さらに好ましくは４００ｐＡ・ｍｓ以上である。パルスの頻度とパルス積分値とを併せて測定することにより、エンドトキシンの濃度を一層正確に測定することができる。
【００３８】
ナノポアに流れる電解液の流量は、エンドトキシンが検出される流量であればよく、５〜０．１μＬ／分であることが好ましく、より好ましくは１〜０．１μＬ／分、さらに好ましくは０．６〜０．１μＬ／分である。
【００３９】
第一の電極４及び第二の電極５間に印加する電圧としては、エンドトキシンが検出しやすいイオン電流が得られる、３．０〜０．１Ｖが好ましく、より好ましくは２．０〜０．５Ｖ、さらに好ましくは１．０〜０．５Ｖである。
【００４０】
検出する時間は、特に限定されず４分以内としてもよいし、連続的に検出し続けてもよい。例えば、エンドトキシンの存在が検出できた時点で、検出を止めてもよい。
【００４１】
エンドトキシンを含む電解液は、エンドトキシンのミセルの大きさが均一化することで、濃度が一層正確に測定することができるように、事前に撹拌混合することが好ましい。撹拌混合としては、２０００〜３０００ｒｐｍで２０〜４０分の混合が好ましい。
【００４２】
エンドトキシンの検出は、第一の区画２ａに電解液を導入し、第二の区画２ｂから電解液を排出しながら行ってもよい。
【００４３】
本実施形態のエンドトキシンの検出方法によれば、エンドトキシン濃度が既知の参照電解液のパルス頻度（イオン電流値の変化頻度）を測定し、例えば、縦軸をパルス頻度、横軸をエンドトキシン濃度とする検量線を作成し（図７）、エンドトキシン濃度が未知の試料のパルス頻度と照らし合わせることで、試料中のエンドトキシン濃度を測定することができる。
【実施例】
【００４４】
以下に、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。【００４５】
（使用した試薬、材料等）
・標準エンドトキシン：ＵＳＰ−ＲＳＥ、生化学工業製
・リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）：ダルベッコリン酸緩衝生理食塩末（富士フィルム和光純薬）を注射用水（大塚製薬）に溶かして調製した。
・エンドトキシン溶液：注射用水（大塚製薬）に標準エンドトキシンを溶解した。なお、エンドトキシン液の調製は、大気からのエンドトキシン混入を防ぐため、クリーンベンチ内で行った。
・Ａｇ／ＡｇＣｌ線：直径０．３ｍｍのＡｇ線（９９．９９％、田中貴金属工業製）を、０．１Ｍ  ＨＣｌ中でＡｇＣｌを電解析出させて作製した。【００４６】
（ナノピペットの調製）
ガラスナノピペットは、Ｓｕｔｔｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ製のＣＯ2レーザープラー（Ｍｏｄｅｌ  Ｐ−２０００）で、Ｓｕｔｔｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ製のボロシリケイト管（外径１．０ｍｍ、内径０．５ｍｍ、ＢＦ１００−５０−７．５）を引いて作製した。レーザープラーのプログラムのパラメータは、ｈｅａｔ＝３００、ｆｉｌａｍｅｎｔ＝３、ｖｅｌｏｃｉｔｙ＝３０、ｄｅｌａｙ＝１５０、ｐｕｌｌ＝５０とした。
作製したガラスナノピペットの先端径の評価は、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ、日本電子製、ＪＳＭ−７１００Ｆ）で行った。
ナノピペット先端のＳＥＭ像を図５Ａに示す。６本のガラスピペットについて、ＳＥＭでポアの直径を測定したところ、平均が２６０ｎｍ、標準偏差が１８ｎｍだった。ナノポア径のばらつきが少ないナノピペットが得られたことを確認した。
また、ガラスナノピペット内部にエンドトキシンフリーのＰＢＳを充填し、ガラスナノピペット内外部にＡｇ／ＡｇＣｌ線を挿入し、１Ｖの電圧を印加して、バックグラウンド電流を測定した。イオン電流測定及び電圧制御には、Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ製のパッチクランプ増幅器（ＭｕｌｔｉＣｌａｍｐ  ７００Ｂ）を用いた。
１本目のガラスナノピペットでは、８．５７０±０．００９ｎＡの一定の電流が流れ、３本のガラスピペットを用いての測定した平均は８．５７２ｎＡ、標準偏差は６．２２８ｐＡであった（図５Ｂ）。
この結果から、エンドトキシンフリーのＰＢＳではパルス電流が観測されないことが示された。
電気浸透流の流速を測定したところ、０．５μＬ／分であった。【００４７】
（実施例１）
エンドトキシンフリーのＰＢＳ２ｍＬをポリスチレン製の容器（第二の区画）に入れ、エンドトキシン溶液を充填したガラスナノピペット（第一の区画）の先端を、上記容器のＰＢＳに浸した（図２）。
ピペットに充填するエンドトキシン溶液には、エンドトキシン濃度が０、１００、５００、１０００、５０００及び１００００ＥＵ／Ｌの各溶液を使用した。また、ナノピペット内壁面のエンドトキシン汚染を考慮して、測定毎に新しいガラスナノピペットを用いた。濃度ごとに３回ずつ、繰り返し計測を行った。なお、ガラスナノピペットには、上記で作製したガラスピペットを用いた。
上記ガラスナノピペット内部及び上記容器の両方にＡｇ／ＡｇＣｌ線を挿入し、上記容器内のＡｇ／ＡｇＣｌ線に対してナノピペット内部のＡｇ／ＡｇＣｌ線が＋１Ｖになるように電圧を印加した。ナノピペット先端を上記容器のＰＢＳ中に浸漬してから４分間イオン電流値を測定した。イオン電流測定及び電圧制御には、Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ製のパッチクランプ増幅器（ＭｕｌｔｉＣｌａｍｐ  ７００Ｂ）を用いた。
電気浸透流の流速を測定したところ、０．５μＬ／分であった。【００４８】
−結果−
エンドトキシン濃度０ＥＵ／Ｌの電解液を４分間流して得られるバックグラウンドイオン電流は８ｎＡであった。
エンドトキシン濃度５００ＥＵ／Ｌ以上のエンドトキシン溶液で５０ｐＡ以上のパルスが現れたが、０および１００ＥＵ／Ｌのエンドトキシン溶液では現れなかった。これは１００ＥＵ／Ｌ以下では、エンドトキシン溶液中のミセル濃度が低く、ナノポアに対して電気抵抗に影響を与えるほど十分な大きさのミセルが形成できなかった可能性が考えられる。例えば、ナノポア内の電荷量、電解液の種類、電圧、ナノポア径、流速等を変えること、測定時間を変えること等で測定できる可能性がある。
各エンドトキシン濃度で現れた一部のパルス形状を図６Ａ〜６Ｄに示す。
濃度別に見たピーク電流値の大きさは、５００−１０００ＥＵ／Ｌでは５０ｐＡ程度、５０００ＥＵ／Ｌでは５０−１００ｐＡ程度、１００００ＥＵ／Ｌでは５０−２００ｐＡ程度だった。ナノポアを通過するミセルが大きいほど、イオン流の阻害が大きくなり、大きなパルス電流が現れることから、エンドトキシン濃度が高くなるとミセルは大きくなっていることがわかる。
５００ＥＵ／Ｌで観測される全ての２０ｐＡ以上のパルス電流値について、ピーク前後のベース値のブレに対するピークの大きさを測定したところ、全てのパルス電流で２倍以上であった。また、２０ｐＡ以上のパルス電流について、パルス積分値を測定したところ、全てのパルス電流で４００ｐＡ・ｍｓ以上であった。
１０００ＥＵ／Ｌで観測される全ての２０ｐＡ以上のパルス電流値について、ピーク前後のベース値のブレに対するピークの大きさを測定したところ、２倍以上であった。また、２０ｐＡ以上のパルス電流について、パルス積分値を測定したところ、全てのパルス電流で３００ｐＡ・ｍｓ以上であった。
５０００ＥＵ／Ｌで観測される全ての２０ｐＡ以上のパルス電流値について、ピーク前後のベース値のブレに対するピークの大きさを測定したところ、２倍以上であった。また、５０ｐＡ以上のパルス電流について、パルス積分値を測定したところ、全てのパルス電流で４００ｐＡ・ｍｓ以上であった。
１００００ＥＵ／Ｌで観測される全ての５０ｐＡ以上のパルス電流値について、ピーク前後のベース値のブレに対するピークの大きさを測定したところ、２倍以上であった。また、５０ｐＡ以上のパルス電流について、パルス積分値を測定したところ、全てのパルス電流で４００ｐＡ・ｍｓ以上であった。
図７に４分間のイオン電流測定中に現れた５０ｐＡ以上のパルス数をエンドトキシン濃度に対してプロットした検量線を示す。エラーバーは標準偏差（Ｎ＝３）を表す。５００ＥＵ／Ｌから１００００ＥＵ／Ｌの範囲で、エンドトキシン濃度の上昇とともに、パルスの現れる頻度が上昇した。これは、エンドトキシン濃度が増加するとともに、単位時間あたりにナノポアを通過するエンドトキシンのミセルの個数が増加することを示している。パルス１回につき１つのミセルが通過したと仮定すると、ミセル１つ当たりに含まれるエンドトキシン量は、５００ＥＵ／Ｌで０．１５ｐｇ、１０００ＥＵ／Ｌで０．１３ｐｇ、５０００ＥＵ／Ｌで０．２１ｐｇ、１００００ＥＵ／Ｌで０．２５ｐｇと算出できる。よって、エンドトキシン濃度の上昇とともにミセル１つ当たりに含まれるエンドトキシン量は増加し、エンドトキシン濃度とミセルの個数は比例関係ではなく、頭打ちになる非線形的な関係であるといえる。図７で得られた検量線と比較することで、未知試料中のエンドトキシン含有の有無、及びエンドトキシン濃度の測定ができる。
なお、本実施例における検出限界は、パルスが１つでも現れたエンドトキシン濃度とし、５００ＥＵ／Ｌと算出された。
【産業上の利用可能性】
【００４９】
本発明のエンドトキシン検出装置及びエンドトキシンの検出方法によれば、高価な試薬を使用することなく、短い時間でエンドトキシンを検出することができる。また、他の試薬との反応させることなく、フローの系で直接エンドトキシンを検出できるため、透析液、注射液等のラインに組み込むことができる。
【符号の説明】
【００５０】
１  エンドトキシン検出装置
２  容器（領域部）
２ａ  第一の区画
２ｂ  第二の区画
３  分画部材
３ａ  ナノポア
４  第一の電極
５  第二の電極
６  印加手段
７  モニタリング手段
８  導入路
９  導出路
１０  撹拌手段
１１  撹拌子
１２  磁気撹拌装置
１３  ライン
【要約】
発明の目的は、高価な試薬を使用することなく、短い時間で、簡便にエンドトキシンを検出する装置、及びエンドトキシンを検出する方法を提供することにある。本発明のエンドトキシン検出装置は、電解液を含む領域部と、前記領域部を２つの区画に分画し、前記２つの区画をナノポアで連通する分画部材と、第一の区画に設けられた第一の電極と、第二の区画に設けられ、前記第一の電極と電気的に接続された第二の電極と、前記第一の区画の電解液を、前記ナノポアを通して前記第二の区画へ移動させる電解液流発生手段と、前記第一の電極と、前記第二の電極との間に電圧を印加する印加手段と、電流をモニタリングするモニタリング手段と、を備えることを特徴とする。【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７】
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【図８】
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