(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイクロ流体デバイスであって、
（ａ）精製空洞の上流の１つまたは複数のリザーバと、
（ｂ）前記精製空洞の下流の１つまたは複数の廃棄物受容容器と、
（ｃ）前記マイクロ流体デバイスから着脱可能なように構成された前記精製空洞であって、前記精製空洞は、先細形状および中空内部を有するカラムを画定し、前記精製空洞は、
（ｉ）第１の流路を介して、前記精製空洞と減圧発生器との気体連通を可能にする第１のポートと、
（ｉｉ）第２の流路を介して、前記精製空洞と前記１つまたは複数のリザーバとの液体連通を可能にする第２のポートと、
（ｉｉｉ）第３の流路を介して、前記精製空洞と前記１つまたは複数の廃棄物受容容器および減圧発生器の両方との気体連通および液体連通を可能にする第３のポートと
を備える、精製空洞と、
（ｄ）生物学的検体または化学的検体を複合生物学的サンプルから精製するように構成されたフィルタであって、前記第１のポートおよび／または前記第２のポートを通して前記精製空洞に進入し、前記第３のポートを通して前記精製空洞から退出する流体が、前記フィルタを通して流動するように、前記フィルタは、前記第３のポート上に位置し、前記フィルタは、前記精製空洞とは別個の構成要素であり、前記精製空洞の内側に位置する、フィルタと
を備える、マイクロ流体デバイス。
【請求項２】
前記マイクロ流体デバイスは、マイクロ流体カートリッジであり、使い捨てまたは再使用可能のいずれかである、請求項１に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項３】
精製されるべき前記生物学的検体または前記化学的検体は、核酸である、請求項１または請求項２に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項４】
前記フィルタは、シリカを含む、請求項１〜３のうちのいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項５】
前記フィルタは、シリカビーズまたはシリカコーティングされたビーズのいずれかを含むシリカ膜または樹脂を含む、請求項４に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項６】
前記精製空洞は、前記マイクロ流体デバイスにおける前記精製空洞の位置を固定するように構成されたクリップ留め特徴を含む、請求項１〜５のうちのいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項７】
前記減圧発生器は、シリンジポンプ、ダイヤフラムポンプ、または、これらの組み合わせである、請求項１〜６のうちのいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項８】
減圧は、同一の減圧発生器を用いて、前記第１のポートおよび／または前記第３のポートに印加されることができる、請求項１〜７のうちのいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項９】
圧力センサが、前記１つまたは複数の廃棄物受容容器の上流の前記第３の流路内に位置する、請求項１〜８のうちのいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１０】
別の圧力センサが、前記精製空洞と前記減圧発生器との間の前記第１の流路内に位置する、請求項９に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１１】
前記第１のポートおよび前記第２のポートおよび前記第３のポートは、これらの流路内の１つまたは複数のマルチポート弁を用いて、個々に、開放され、閉鎖され、または、大気に通気されることができる、請求項１〜１０のうちのいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１２】
その対応する弁と前記フィルタとの間に前記第３の流路によって封入される死容積は、１μＬ〜１０ｍＬである、請求項１１に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１３】
請求項１〜１２のうちのいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイスを使用して、生物学的検体または化学的検体を複合生物学的サンプルから精製する方法であって、前記方法は、
（ａ）前記精製空洞と第１のリザーバとの間に負圧差を印加することによって、液体サンプルが、前記第２のポートを通して前記精製空洞に進入することを可能にするステップと、
（ｂ）第１の受容容器と前記精製空洞との間に負圧差を印加することによって、前液体サンプルが、前記フィルタを通して前記第１の受容容器の中へ流動することを可能にするステップと、
（ｃ）前記精製空洞と前記１つまたは複数の廃棄物受容容器のうちの１つとの間に負圧差を印加することによって、前記生物学的検体または前記化学的検体を前記フィルタから溶出するステップと
を含む、方法。
【請求項１４】
ステップｃにおける溶出は、
（ｉ）前記精製空洞と第３のリザーバとの間に負圧差を印加することによって、前記第３のリザーバ内に含まれる溶出緩衝剤が、前記第２のポートを通して前記精製空洞に進入することを可能にすることと、
（ｉｉ）前記溶出緩衝剤が、所定のインキュベーション時間の間、前記フィルタと接触することを可能にすることと、
（ｉｉｉ）第２の受容容器と前記精製空洞との間に負圧差を印加することによって、前記溶出緩衝剤が、前記フィルタを通して前記第２の受容容器の中へ流動することを可能にすることと
によって実施される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ステップａとステップｂとの間に、前記液体サンプルが、所定のインキュベーション時間の間、前記フィルタと接触することを可能にするステップをさらに含む、請求項１３または請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ステップｂとステップｃとの間に、
（ｉ）前記第３の流路と前記精製空洞との間に負圧を印加することによって、所定の時間の間、前記フィルタを清掃し、かつ、乾燥させるステップ、および／または
（ｉｉ）受容リザーバと第２のリザーバとの間に負圧差を印加することによって、前記第２のリザーバ内に位置する洗浄緩衝剤が、前記第２のポートを通して前記精製空洞に進入し、前記フィルタを通して受容容器の中へ流動することを可能にするステップ、および／または
（ｉｉｉ）前記第３の流路と前記精製空洞との間に負圧を印加することによって、気体が、所定の時間の間、前記フィルタを通して流動することを可能にするステップ
のうちの１つまたは複数のステップをさらに含む、請求項１３〜１５のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
圧力差によって、前記第１の流路および前記第２の流路および前記第３の流路内の１つまたは複数のマルチポート弁をトリガすることをさらに含む、請求項１３〜１６のうちのいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（序論）
シリカ表面（固相吸着）に対するＤＮＡおよびＲＮＡの親和性に基づく、原初の核酸精製方法は、Ｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．によって説明された。シリカ表面に対する核酸誘因は、高濃度のカオトロピック塩（典型的には、グアニジンチオシアネートまたはグアニジン塩酸塩）によって助長される。Ｂｏｏｍ法は、カオトロピック塩溶液を使用して、生物学的サンプルを変性させ、それを遠心力を使用してフィルタを通させ、シリカ表面上へのＤＮＡおよびＲＮＡ吸着を助長する。いったん核酸が、フィルタに結合されると、エタノール性緩衝剤を用いた１回またはそれを上回る洗浄が、核酸結合を保ちながら、カオトロピック塩および他の生物学不純物を取り除くために行われる（カオトロピック塩は、下流用途において、大部分の核酸に対して破壊的である）。最終ステップとして、エタノールを取り除いた後（高速スピンを用いて）、核酸は、溶出緩衝剤（水または低塩緩衝剤）を使用して、再水和される必要がある。再水和は、シリカ表面からのＤＮＡおよびＲＮＡの解離を助長し、最終スピンは、精製された核酸が再懸濁される溶液をもたらす。
【背景技術】
【０００２】
液体流駆動力として遠心力または減圧のいずれかを使用する、本プロトコルの変形例も、いずれかに説明されている。しかしながら、これらの方法は全て、かなり煩雑かつ時間がかかり、いくつかのピペット採取ステップおよび液体の流動を制御するための異なる駆動力の連続印加を含み、通常、繰り返される精製プロセス間で収率の高変動をもたらす。
【０００３】
例えば、減圧による精製プロトコルの手動実行では、精製プロセスは、ＮＡが下流用途（ｑＰＣＲ増幅および検出等）のためにさらに利用可能であるように、シリカフィルタを通した５つの異なる液体、すなわち、核酸を含有するサンプル混合物と、フィルタを濯ぎ、任意の量の汚染物質を排除するための洗浄緩衝剤１および洗浄緩衝剤２と、フィルタを乾燥させ、任意の微量の揮発性汚染物質を排除するための空気と、核酸をフィルタから解放するための溶出緩衝剤との流動に対応する、５つの主要ステップから成る。各ステップの終了時、次の液体がピペット採取される前に、ほぼ全く液体がフィルタの隙間内に残されていないことを確実にするために、減圧吸引が、液体の体積がフィルタを通して流動した後でも、１または２分間、維持される。
【０００４】
核酸の収率の再現性は、サンプルおよび緩衝剤とフィルタの接触時間ならびに液体流の大きさおよび分布を再現する可能性に依存し、これは、オペレータの技量に依存する。
【０００５】
したがって、本発明の目的は、個々のオペレータから独立して再現可能な精製結果を提供する、精製デバイスを提供することである。
【０００６】
これは、生物学的検体または化学的検体を複合生物学的サンプルから精製するためのマイクロ流体デバイスおよびそのための方法によって達成される。本マイクロ流体デバイスは、フィルタが埋設されるチャンバと、いくつかのリザーバと、弁とを備える。本デバイスは、自動化された器具によって動作される、外部ポンプとインターフェースがとられることができる。本明細書のデバイスおよび方法は、したがって、古典的核酸精製方法の最初から最後まで自動化された実装を提供する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（説明）
本発明は、生物学的検体または化学的検体を複合生物学的サンプルから精製するためのフィルタを含む封入チャンバを有する、マイクロ流体デバイスであって、該チャンバは、該フィルタに加え、第１の流路を介して、チャンバと減圧発生器の気体連通を可能にする、第１のポートと、第２の流路を介して、チャンバと１つまたはそれを上回るリザーバの液体連通を可能にする、第２のポートと、第３の流路を介して、チャンバと１つまたはそれを上回る受容容器および減圧発生器の両方の気体および液体連通を可能にする、第３のポートとを含む、複数のポートを格納し、第１および／または第２のポートを通してチャンバに進入し、第３のポートを通してチャンバから退出する流体が、フィルタを通して流動するように、フィルタが、第３のポートと第１のポートおよび第２のポートの両方との間に位置する、デバイスに関する。
【０００８】
本明細書に開示される発明はまた、本明細書に開示されるマイクロ流体デバイスを使用して、生物学的検体または化学的検体を複合生物学的サンプルから精製する方法であって、（ａ）流路内の弁が、第１のポートおよび第２のポートに対して開放され、第３のポートに対して閉鎖される間、チャンバと第１のリザーバとの間に負圧差を印加することによって、液体サンプルが、第２のポートを通してチャンバに進入することを可能にするステップと、（ｂ）流路内の弁が、第１のポートに対して閉鎖され、第２のポートに対して大気圧に通気され、第３のポートに対して開放される間、該第１の受容容器とチャンバとの間に負圧差を印加することによって、サンプルが、フィルタを通して第１の受容容器の中に流動することを可能にするステップと、（ｃ）流路内の弁が、第１のポートおよび第２のポートに対して開放され、第３のポートに対して閉鎖される間、チャンバと受容容器のうちの１つとの間に負圧差を印加することによって、検体をフィルタから溶出するステップとを含む、方法に関する。
本発明は、例えば、以下を提供する。
（項目１）
生物学的検体または化学的検体を複合生物学的サンプルから精製するためのフィルタを含む封入チャンバを有する、マイクロ流体デバイスであって、前記チャンバは、前記フィルタに加え、
ａ．第１の流路を介して、前記チャンバと減圧発生器の気体連通を可能にする、第１のポートと、
ｂ．第２の流路を介して、前記チャンバと１つまたはそれを上回るリザーバの液体連通を可能にする、第２のポートと、
ｃ．第３の流路を介して、前記チャンバと１つまたはそれを上回る受容容器および減圧発生器の両方の気体および液体連通を可能にする、第３のポートと、
を含む、複数のポートを格納し、
ｄ．前記第１および／または第２のポートを通して前記チャンバに進入し、前記第３のポートを通して前記チャンバから退出する流体が、フィルタを通して流動するように、フィルタが、前記第３のポートと前記第１のポートおよび第２のポートの両方との間に位置する、デバイス。
（項目２）
前記デバイスは、マイクロ流体カートリッジであって、使い捨てまたは再使用可能のいずれかである、項目１に記載のデバイス。
（項目３）
前記精製されるべき検体は、核酸である、項目１または２に記載のデバイス。
（項目４）
前記フィルタは、シリカ、好ましくは、シリカビーズまたはシリカコーティングされたビーズのいずれかを含む、シリカ膜または樹脂である、項目１から３に記載のデバイス。
（項目５）
前記フィルタは、精製空洞内に統合され、固定リングによって固定される、項目１から４に記載のデバイス。
（項目６）
前記精製空洞は、前記デバイス内に位置付けられ、それによって、前記フィルタを固定する、別個の部品である、項目１から４に記載のデバイス。
（項目７）
前記減圧発生器は、シリンジポンプ、ダイヤフラムポンプ、またはそれらの組み合わせである、項目１から６に記載のデバイス。
（項目８）
減圧は、同一減圧発生器を用いて、前記第１のポートおよび／または第３のポートに印加されることができる、項目１から７に記載のデバイス。
（項目９）
圧力センサが、前記受容容器の上流の前記第３の流路内に位置する、項目１から８に記載のデバイス。
（項目１０）
別の圧力センサが、前記減圧発生器の下流の前記第１の流路内に位置する、項目９に記載のデバイス。
（項目１１）
前記ポートは、それらの流路内の１つまたはそれを上回るマルチポート弁を用いて、個々に、開放、閉鎖、または大気に通気されることができる、項目１から１０に記載のデバイス。
（項目１２）
その対応する弁と前記フィルタとの間に前記第３の流体経路によって封入される死容積は、１μＬ〜１０ｍＬである、項目１１に記載のデバイス。
（項目１３）
項目１から１２に記載のマイクロ流体デバイスを使用して、生物学的検体または化学的検体を複合生物学的サンプルから精製する方法であって、
（ａ）前記流路内の弁が、前記第１のポートおよび第２のポートに対して開放され、前記第３のポートに対して閉鎖される間、前記チャンバと前記第１のリザーバとの間に負圧差を印加することによって、液体サンプルが、前記第２のポートを通して前記チャンバに進入することを可能にするステップと、
（ｂ）前記流路内の弁が、前記第１のポートに対して閉鎖され、前記第２のポートに対して大気圧に通気され、前記第３のポートに対して開放される間、前記第１の受容容器と前記チャンバとの間に負圧差を印加することによって、前記サンプルが、前記フィルタを通して第１の受容容器の中に流動することを可能にするステップと、
（ｃ）前記流路内の弁が、前記第１のポートおよび第２のポートに対して開放され、前記第３のポートに対して閉鎖される間、前記チャンバと前記受容容器のうちの１つとの間に負圧差を印加することによって、前記検体を前記フィルタから溶出するステップと、
を含む、方法。
（項目１４）
ステップｃにおける溶出は、
ｉ）前記流路内の弁が、前記第１のポートおよび第２のポートに対して開放され、前記第３のポートに対して閉鎖される間、前記チャンバと前記第３のリザーバとの間に負圧差を印加することによって、第３のリザーバ内に含まれる溶出緩衝剤が、前記第２のポートを通して前記チャンバに進入することを可能にするステップと、
ｉｉ）前記流路内の弁が、前記第１のポートおよび第２のポートに対して開放され、前記第３のポートに対して閉鎖される間、前記溶出緩衝剤が、所定のインキュベーション時間の間、前記フィルタと接触することを可能にするステップと、
ｉｉｉ）前記流路内の弁が、前記第１のポートに対して閉鎖され、前記第２のポートに対して大気圧に通気され、前記第３のポートに対して開放される間、前記第２の受容容器と前記チャンバとの間に負圧差を印加することによって、前記溶出緩衝剤が、前記フィルタを通して第２の受容容器の中に流動することを可能にするステップと、
によって実施される、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
ステップａとｂとの間に、前記流路内の弁が、前記第１のポートおよび第２のポートに対して開放され、前記第３のポートに対して閉鎖される間、前記サンプルが、所定のインキュベーション時間の間、前記フィルタと接触することを可能にするステップをさらに含む、項目１３または１４に記載の方法。
（項目１６）
ステップｂとｃとの間に、
（ｉ）前記流路内の弁が、前記第１のポートに対して閉鎖され、前記第２のポートに対して大気圧に通気され、前記第３のポートに対して開放される間、前記第３の流路と前記チャンバとの間に負圧を印加することによって、所定の時間の間、前記フィルタを清掃し、かつ乾燥させるステップ、および／または
（ｉｉ）前記流路内の弁が、前記第２のポートおよび第３のポートに対して開放され、前記第１のポートに対して閉鎖される間、受容リザーバと第２のリザーバとの間に負圧差を印加することによって、第２のリザーバ内に位置する洗浄緩衝剤が、前記第２のポートを通して前記チャンバに進入し、前記フィルタを通して受容容器の中に流動することを可能にするステップ、および／または
ｉｉｉ）前記流路内の弁が、前記第１のポートに対して閉鎖され、前記第２のポートに対して大気圧に通気され、前記第３のポートに対して開放される間、前記第３の流路と前記チャンバとの間に負圧を印加することによって、気体が、所定の時間の間、前記フィルタを通して流動することを可能にするステップ、
のうちの１つまたはそれを上回るステップをさらに含む、項目１３から１５に記載の方法。
（項目１７）
前記弁のうちの１つまたはそれを上回るものは、前記圧力差によってトリガされる、項目１３から１６に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、プラスチック本体（２）と、固定リング（１０）によって圧縮され、定位置に保持される膜フィルタ（３）とから成る、手動精製のための市販のキットからの精製カラム（１）を示す。プラスチック本体は、液体入口（４）と、液体出口（５）とを備える。
【図２Ａ】図２Ａは、統合された精製空洞（１０１）と、固定リング（１０）によって定位置に保持された膜フィルタ（３）とを伴う、マイクロ流体デバイス（１００）の一部を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、統合される精製空洞（１０１）と、固定リング（１０）によって定位置に保持された膜フィルタ（３）とを伴う、マイクロ流体デバイス（１００）の回転された図を示す。精製空洞（１０１）に接続される、気体ポート（１０２）、液体入口ポート（１０３）、および出口ポート（１０４）もまた、示される。
【図２Ｃ】図２Ｃは、別個の精製空洞（２００）を示す。
【図２Ｄ】図２Ｄは、マイクロ流体デバイス（１００）内に組み立てられた精製空洞（２００）を示す。クリップ留め特徴（２０１）が、精製空洞（２００）を定位置に保持し、適切な圧縮を膜フィルタ（３）に印加する。気体ポート（２０３）、液体入口ポート（２０４）、および出口ポート（２０５）もまた、示される。
【図２Ｅ】図２Ｅは、液体の装填（ステップ１）および洗浄／溶出（ステップ２）の間のポート構成および流動方向を図示する。実線矢印は、液体流動を示し、点線矢印は、気体流動を示し、Ｘは、弁によって閉鎖されるポートを示す。
【図３】図３−１１は、表１に詳述されるステップ毎のポート／弁構成を示す、詳細な流体図である。本発明のデバイスは、図に示される要素のそれぞれを備え得るが、必ずしもそうである必要はないことを理解されたい。説明および／または請求項は、不可欠な要素を示す。該要素に加え、１つまたはそれを上回るさらなる随意の要素が、相互から独立して選定されてもよい。随意の要素は、以下に示される。１：減圧発生器１（例えば、シリンジポンプ）；２：減圧発生器２（随意、例えば、ダイヤフラムポンプ）；３−７：弁（例えば、マルチポート弁）；８および９：圧力センサ（随意）；１０：チャンバ；１１：固定リング（随意）；１２：フィルタ；１３：廃棄物受容容器（随意）；１４：溶出物受容容器；１５：サンプルリザーバ；１６−１７：リザーバ（随意）；１８：溶出緩衝剤リザーバ。
【図４】図３−１１は、表１に詳述されるステップ毎のポート／弁構成を示す、詳細な流体図である。本発明のデバイスは、図に示される要素のそれぞれを備え得るが、必ずしもそうである必要はないことを理解されたい。説明および／または請求項は、不可欠な要素を示す。該要素に加え、１つまたはそれを上回るさらなる随意の要素が、相互から独立して選定されてもよい。随意の要素は、以下に示される。１：減圧発生器１（例えば、シリンジポンプ）；２：減圧発生器２（随意、例えば、ダイヤフラムポンプ）；３−７：弁（例えば、マルチポート弁）；８および９：圧力センサ（随意）；１０：チャンバ；１１：固定リング（随意）；１２：フィルタ；１３：廃棄物受容容器（随意）；１４：溶出物受容容器；１５：サンプルリザーバ；１６−１７：リザーバ（随意）；１８：溶出緩衝剤リザーバ。
【図５】図３−１１は、表１に詳述されるステップ毎のポート／弁構成を示す、詳細な流体図である。本発明のデバイスは、図に示される要素のそれぞれを備え得るが、必ずしもそうである必要はないことを理解されたい。説明および／または請求項は、不可欠な要素を示す。該要素に加え、１つまたはそれを上回るさらなる随意の要素が、相互から独立して選定されてもよい。随意の要素は、以下に示される。１：減圧発生器１（例えば、シリンジポンプ）；２：減圧発生器２（随意、例えば、ダイヤフラムポンプ）；３−７：弁（例えば、マルチポート弁）；８および９：圧力センサ（随意）；１０：チャンバ；１１：固定リング（随意）；１２：フィルタ；１３：廃棄物受容容器（随意）；１４：溶出物受容容器；１５：サンプルリザーバ；１６−１７：リザーバ（随意）；１８：溶出緩衝剤リザーバ。
【図６】図３−１１は、表１に詳述されるステップ毎のポート／弁構成を示す、詳細な流体図である。本発明のデバイスは、図に示される要素のそれぞれを備え得るが、必ずしもそうである必要はないことを理解されたい。説明および／または請求項は、不可欠な要素を示す。該要素に加え、１つまたはそれを上回るさらなる随意の要素が、相互から独立して選定されてもよい。随意の要素は、以下に示される。１：減圧発生器１（例えば、シリンジポンプ）；２：減圧発生器２（随意、例えば、ダイヤフラムポンプ）；３−７：弁（例えば、マルチポート弁）；８および９：圧力センサ（随意）；１０：チャンバ；１１：固定リング（随意）；１２：フィルタ；１３：廃棄物受容容器（随意）；１４：溶出物受容容器；１５：サンプルリザーバ；１６−１７：リザーバ（随意）；１８：溶出緩衝剤リザーバ。
【図７】図３−１１は、表１に詳述されるステップ毎のポート／弁構成を示す、詳細な流体図である。本発明のデバイスは、図に示される要素のそれぞれを備え得るが、必ずしもそうである必要はないことを理解されたい。説明および／または請求項は、不可欠な要素を示す。該要素に加え、１つまたはそれを上回るさらなる随意の要素が、相互から独立して選定されてもよい。随意の要素は、以下に示される。１：減圧発生器１（例えば、シリンジポンプ）；２：減圧発生器２（随意、例えば、ダイヤフラムポンプ）；３−７：弁（例えば、マルチポート弁）；８および９：圧力センサ（随意）；１０：チャンバ；１１：固定リング（随意）；１２：フィルタ；１３：廃棄物受容容器（随意）；１４：溶出物受容容器；１５：サンプルリザーバ；１６−１７：リザーバ（随意）；１８：溶出緩衝剤リザーバ。
【図８】図３−１１は、表１に詳述されるステップ毎のポート／弁構成を示す、詳細な流体図である。本発明のデバイスは、図に示される要素のそれぞれを備え得るが、必ずしもそうである必要はないことを理解されたい。説明および／または請求項は、不可欠な要素を示す。該要素に加え、１つまたはそれを上回るさらなる随意の要素が、相互から独立して選定されてもよい。随意の要素は、以下に示される。１：減圧発生器１（例えば、シリンジポンプ）；２：減圧発生器２（随意、例えば、ダイヤフラムポンプ）；３−７：弁（例えば、マルチポート弁）；８および９：圧力センサ（随意）；１０：チャンバ；１１：固定リング（随意）；１２：フィルタ；１３：廃棄物受容容器（随意）；１４：溶出物受容容器；１５：サンプルリザーバ；１６−１７：リザーバ（随意）；１８：溶出緩衝剤リザーバ。
【図９】図３−１１は、表１に詳述されるステップ毎のポート／弁構成を示す、詳細な流体図である。本発明のデバイスは、図に示される要素のそれぞれを備え得るが、必ずしもそうである必要はないことを理解されたい。説明および／または請求項は、不可欠な要素を示す。該要素に加え、１つまたはそれを上回るさらなる随意の要素が、相互から独立して選定されてもよい。随意の要素は、以下に示される。１：減圧発生器１（例えば、シリンジポンプ）；２：減圧発生器２（随意、例えば、ダイヤフラムポンプ）；３−７：弁（例えば、マルチポート弁）；８および９：圧力センサ（随意）；１０：チャンバ；１１：固定リング（随意）；１２：フィルタ；１３：廃棄物受容容器（随意）；１４：溶出物受容容器；１５：サンプルリザーバ；１６−１７：リザーバ（随意）；１８：溶出緩衝剤リザーバ。
【図１０】図３−１１は、表１に詳述されるステップ毎のポート／弁構成を示す、詳細な流体図である。本発明のデバイスは、図に示される要素のそれぞれを備え得るが、必ずしもそうである必要はないことを理解されたい。説明および／または請求項は、不可欠な要素を示す。該要素に加え、１つまたはそれを上回るさらなる随意の要素が、相互から独立して選定されてもよい。随意の要素は、以下に示される。１：減圧発生器１（例えば、シリンジポンプ）；２：減圧発生器２（随意、例えば、ダイヤフラムポンプ）；３−７：弁（例えば、マルチポート弁）；８および９：圧力センサ（随意）；１０：チャンバ；１１：固定リング（随意）；１２：フィルタ；１３：廃棄物受容容器（随意）；１４：溶出物受容容器；１５：サンプルリザーバ；１６−１７：リザーバ（随意）；１８：溶出緩衝剤リザーバ。
【図１１】図３−１１は、表１に詳述されるステップ毎のポート／弁構成を示す、詳細な流体図である。本発明のデバイスは、図に示される要素のそれぞれを備え得るが、必ずしもそうである必要はないことを理解されたい。説明および／または請求項は、不可欠な要素を示す。該要素に加え、１つまたはそれを上回るさらなる随意の要素が、相互から独立して選定されてもよい。随意の要素は、以下に示される。１：減圧発生器１（例えば、シリンジポンプ）；２：減圧発生器２（随意、例えば、ダイヤフラムポンプ）；３−７：弁（例えば、マルチポート弁）；８および９：圧力センサ（随意）；１０：チャンバ；１１：固定リング（随意）；１２：フィルタ；１３：廃棄物受容容器（随意）；１４：溶出物受容容器；１５：サンプルリザーバ；１６−１７：リザーバ（随意）；１８：溶出緩衝剤リザーバ。
【図１２】記載なし
【発明を実施するための形態】
【００１０】
（詳細な説明）
精製は、原則として、クロマトグラフィにおいて広く知られた任意の効果（例えば、移動、親和性、カチオン交換、アニオン交換、サイズ排除、逆相、および順相）に基づくことができ、その選択肢は、主に、精製されるべき検体に依存する。しかしながら、サイズ排除は、恒久的結合が、本技法の場合、達成されることができないため、他の技法より好ましくない。後者のものに関しては、精製されるべき検体は、媒体に選択的に結合される一方、理想的には、サンプルの他の成分は、結合せずに、媒体を通して通過するという条件が見出され得る。
【００１１】
本発明のマイクロ流体デバイスは、フィルタを含む、封入チャンバを備える。本明細書のフィルタは、サンプルの異なる成分と異なって相互作用する、媒体を指す。従来のクロマトグラフィでは、そのような媒体は、通常、定常相と呼ばれるであろう。異なる相互作用（パーティション化とも呼ばれる）は、サンプルが該媒体を通して好適な緩衝剤（クロマトグラフィでは、通常、移動相と呼ばれる）中で移動される場合、異なる滞留時間、したがって、精製効果を生じさせるであろう。
【００１２】
本明細書に開示されるデバイスにおいて使用されるフィルタは、生物学的検体または化学的検体を複合生物学的サンプルから精製するために好適である。検体は、精製されるべき物質である。複合生物学的サンプルは、精製されるべき検体の他に、タンパク質、核酸、ホルモン、脂質、塩等の可変サイズおよび化学的性質の多くの異なる成分を含む、サンプルである。好ましいサンプルは、細胞溶解物である。
【００１３】
好ましい実施形態では、フィルタは、シリカから作製されるか、または少なくともそれを含む。例えば、フィルタは、シリカビーズまたはシリカコーティングされたビーズのいずれかを含む、シリカ膜または樹脂の形態であってもよい。シリカ表面は、核酸、特に、ＤＮＡを分離または精製するために有用である。シリカは、ある塩およびｐＨ条件下でＤＮＡ分子を吸着することが知られており、シリカ吸着は、ＤＮＡを精製するために重要な技法となっている。
【００１４】
本発明の一実施形態では、フィルタ要素は、精製空洞内に統合され、固定リングによって固定される。好ましい実施形態では、精製膜フィルタが、マイクロ流体デバイスの本体の一部である、空洞内に挿入され、膜フィルタは、それを圧縮する固定リングによって定位置に保持される（図２ＡおよびＤ）。
【００１５】
代替実施形態では、精製空洞は、マイクロ流体デバイスの中に組み立てられ、膜フィルタを定位置に保つための固定リングの必要性を排除する、別個の部品である。精製空洞自体が、膜の適切な圧縮を用いて空洞および膜フィルタを定位置に固定する、クリップ留め特徴を提供する（図２ＢおよびＣ）。
【００１６】
好ましくは、クリップ留め特徴によって定位置に保持される、別個の空洞は、固定リングを備える空洞と比較して、以下のいくつかの利点を有する。
【００１７】
膜フィルタの再現可能な圧縮が、クリップ留め特徴によって達成される。これは、再現可能な圧縮を保証し、膜フィルタを通して再現可能な液体流、したがって、精製核酸または他の精製検体の再現可能な収率をもたらす。
【００１８】
マイクロ流体デバイスの中への精製空洞の正確な位置付けは、好ましくは、圧縮量を制御する必要なく、これは、設計によって与えられ、そのクリップ留め特徴によって保証される。これは、製造を促進する。
【００１９】
精製空洞は、固定リングの必要性を排除し、サンプルの汚染の低減をもたらす。固定リングは、流体経路を妨害し、液体の残余物を集め、緩衝剤の間に汚染を生じさせ、最終精製溶出物中にある量の汚染物質をもたらし、ＰＣＲ等の下流分析を阻害し得る。着脱可能精製空洞は、その壁上に平滑遷移をもたらし、壁にくっつき得る汚染物質の量を、典型的には、５〜１０分の１まで低減させる。
【００２０】
検体は、核酸であることが好ましい。用語「核酸」は、処理済みおよび未処理形態におけるｍＲＮＡ（伝令ＲＮＡ）、ｔＲＮＡ（転移ＲＮＡ）、ｈｎ−ＲＮＡ（ヘテロ核ＲＮＡ）、ｒＲＮＡ（リボソームＲＮＡ）、ＬＮＡ（架橋型核酸）、ｍｔＲＮＡ（ミトコンドリアＲＮＡ）、ｎＲＮＡ（核ＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）、ｓｎＲＮＡ（小核ＲＮＡ）、ｓＮｏ．ＲＮＡ（小核小体ＲＮＡ）、ｓｃａＲＮＡ（低分子カハール体特異的ＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ（二本鎖ＲＮＡ）、リボザイム、リボスイッチ、ウイルスＲＮＡ、ｄｓＤＮＡ（二本鎖ＤＮＡ）、ｓｓＤＮＡ（一本鎖ＤＮＡ）、プラスミドＤＮＡ、コスミドＤＮＡ、染色体ＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、ｍｔＤＮＡ（ミトコンドリアＤＮＡ）、ｎＤＮＡ（核ＤＮＡ）、ｓｎＤＮＡ（小核ＤＮＡ）、または同等物、ならびにあらゆる他の考えられる核酸を含む。
【００２１】
チャンバは、該フィルタに加え、第１の流路を介して、チャンバと減圧発生器の気体連通を可能にする、第１のポートと、第２の流路を介して、チャンバと１つまたはそれを上回るリザーバの液体連通を可能にする、第２のポートと、第３の流路を介して、チャンバと１つまたはそれを上回る受容容器および減圧発生器の両方の気体ならびに液体連通を可能にする、第３のポートとを含む、複数のポートを格納する。
【００２２】
減圧発生器は、チャンバの上流に位置する。１つまたはそれを上回るリザーバもまた、チャンバの上流に位置するが、減圧発生器以外の別の流路内に位置する。１つまたはそれを上回る受容容器は、チャンバの下流に位置する。受容容器のさらに下流には、第３の流路の減圧発生器が、位置する。
【００２３】
リザーバは、通常、少なくとも、精製されるべきサンプルを含む、リザーバと、随意に、１つまたはそれを上回る洗浄緩衝剤および／または溶出緩衝剤および／または再生緩衝剤を含む、１つまたはそれを上回るリザーバとを備える。１つまたはそれを上回る容器は、通常、検体を受容するための少なくとも１つの容器と、随意に、他の液体、例えば、洗浄緩衝剤および／または再生緩衝剤を通る流動を受容するための１つまたはそれを上回る容器とを備える。
【００２４】
フィルタが、第１および／または第２のポートを通してチャンバに進入し、第３のポートを通してチャンバから退出する流体が、フィルタを通して流動するように、第３のポートと第１のポートおよび第２のポートの両方との間に位置する。最も便宜的には、フィルタは、チャンバの断面全体を横断して拡張する。しかしながら、媒体がチャンバの全高を充填する必要はない。好ましくは、フィルタは、直接、第３のポート上に設置される。
【００２５】
デバイスは、マイクロ流体カートリッジであることが好ましい。カートリッジは、好適なインターフェースを通してより大きいユニットによって作動されることができる、消耗構成要素を意味する。通常、ユニットは、コストがかかり、および／または耐久性のある要素、もしくは清掃が容易である要素と、プロセスの制御を自動化するための一式のソフトウェアコードとを含む。ユニットは、代替として、精製ユニットの上流または下流で他のプロセスを行うためのさらなる要素を備えてもよい。
【００２６】
一実施形態では、デバイスは、使い捨てであって、デバイスが、単回使用のために設計され、その後、廃棄されることを意味する。別の実施形態では、デバイスは、再使用可能であって、通常、各使用後、デバイスの再生を必要とする。
【００２７】
デバイスはさらに、弁を備えてもよく、理想的には、減圧発生器は、別個である。減圧発生器は、チャンバの圧力を減圧化し、それによって、相対負圧を発生させる。ポート構成（すなわち、開放または閉鎖）に応じて、流体は、リザーバのうちの１つからチャンバの中に、および／またはチャンバから受容容器のうちの１つの中に吸引される。好ましい実施形態では、減圧発生器は、シリンジポンプまたはダイヤフラムポンプである。さらなる好ましい実施形態では、減圧は、同一減圧発生器を用いて、第１のポートおよび／または第３のポートに印加されることができる。
【００２８】
公知のマイクロ流体デバイスは、システム内に圧力を追跡するための手段を含まない。本発明は、好ましくは、１つまたはそれを上回る圧力センサを含む。圧力センサが、好ましくは、受容容器の上流の第３の流路内に位置する。別の圧力センサが、好ましくは、減圧発生器の下流の第１の流路内に位置する。前述の圧力センサは、フィルタの流体状態を示す、フィルタによって生じる圧力降下を判定するために使用されてもよい。それによって、（ｉ）方法ステップが完了したとき（したがって、時間および緩衝剤を最小限にする）（例えば、乾燥ステップの間、フィルタが完全に乾燥されたとき、有利には、各液体の流動後および次の液体の流動前に生じる、パージステップの間のフィルタから液体残物が十分にパージされたとき）と、（ｉｉ）液体がフィルタを通して完全に流れたかどうか（サンプルの密度および粘度に起因して液体流に対する増加抵抗が存在する場合、システムが吸引圧力の「適時」増加を印加することを可能にする）と、（ｉｉｉ）フィルタが詰まっているかどうかと、（ｉｖ）精製方法のための制御としての所定の閾値と比較され得る、各液体がフィルタを通して流動するために要求される時間とを判定してもよい。
【００２９】
前述のように、本明細書に開示されるデバイスは、チャンバと連通するための３つのポート、すなわち、第１のポート（気体出口ポート）と、第２のポート（液体入口ポート）と、第３のポート（液体／気体出口ポート）とを有する。各ポートは、個別の流路内に位置する弁を用いて、個々に、開放、閉鎖、または大気に通気されることができる。便宜的には、マルチポート弁が、使用され、所望に応じて、２つまたは３つのポートが、同一マルチポート弁を用いて作動される。その対応する弁とフィルタとの間に第３の流路によって封入される死容積は、１μＬ〜１０ｍＬであることが好ましい。液体の制御流動（フィルタの完全湿潤のための無流動状況を含む）は、減圧を適切なポートに印加することによって、および各ステップにおいて適切な弁を開閉することによって、達成される。これは、生物学的サンプルタイプから独立して、本デバイスに公知のデバイスより高い再現性を授ける。
【００３０】
例えば、減圧による精製プロトコルの手動実行を伴う従来の精製キットでは、精製プロセスは、下流用途（ｑＰＣ増幅および検出等）のためにさらに利用可能にするために、フィルタを通して５つの異なる液体の流動に対応する５つの主要ステップ、すなわち、核酸を含有するサンプル混合物の装填と、フィルタを濯ぎ、任意の量の汚染物質を排除するための洗浄緩衝剤１および洗浄緩衝剤２を用いた洗浄と、フィルタの空気乾燥および任意の微量の揮発性汚染物質の排除と、核酸をフィルタから解放するための溶出とから成る。各ステップの終了時、減圧吸引は、次の液体がピペット採取される前に、ほぼ全く液体がフィルタ隙間内に残っていないことを確実にするために、液体の体積がフィルタを通して流動した後でも、１または２分間、維持され、本動作は、「パージ」と称される。
【００３１】
同一効果を達成するために、自動化されたプロトコルは、基本的に、同一ステップを含み、これは、全ステップを自動化するためのソフトウェアを使用して、圧力源（例えば、シリンジまたは回転式ポンプ）、一式の弁、一式のマイクロ流体チャネル、およびマイクロコントローラを用いて、各ポートを適切なリザーバに接続し、適切な圧力差を常に印加することによって達成される。
【００３２】
本明細書に開示されるマイクロ流体デバイスは、特に、１つまたはそれを上回る検体が他の成分から分離されるべき方法、すなわち、精製方法において使用されるために好適である。したがって、本発明の別の目的は、本明細書に説明されるマイクロ流体デバイスを使用して、生物学的検体または化学的検体を複合生物学的サンプルから精製する方法であって、（ａ）流路内の弁が、第１のポートおよび第２のポートに対して開放され、第３のポートに対して閉鎖される間、チャンバと第１のリザーバとの間に負圧差を印加することによって、液体サンプルが、第２のポートを通してチャンバに進入することを可能にするステップと、（ｂ）流路内の弁が、第１のポートに対して閉鎖され、第２のポートに対して大気圧に通気され、第３のポートに対して開放される間、該第１の受容容器とチャンバとの間に負圧差を印加することによって、サンプルが、フィルタを通して第１の受容容器の中に流動することを可能にするステップと、（ｃ）流路内の弁が、第１のポートおよび第２のポートに対して開放され、第３のポートに対して閉鎖される間、チャンバと受容容器のうちの１つとの間に負圧差を印加することによって、検体をフィルタから溶出するステップとをこの順序で含む、方法である。
【００３３】
ステップａにおける圧力は、第１の流路内に位置する減圧発生器によって発生されてもよい。ステップｂにおける圧力は、第３の流路内に位置する減圧発生器によって発生されてもよい。
【００３４】
ステップｃにおける溶出は、
ｉ）流路内の弁が、第１のポートおよび第２のポートに対して開放され、第３のポートに対して閉鎖される間、チャンバと第３のリザーバとの間に負圧差を印加することによって、第３のリザーバ内に含有される溶出緩衝剤が、第２のポートを通してチャンバに進入することを可能にするステップ（圧力は、第１の流路内に位置する減圧発生器によって発生されてもよい）と、
ｉｉ）流路内の弁が、第１のポートおよび第２のポートに対して開放され、第３のポートに対して閉鎖される間、溶出緩衝剤が、所定の時間の間、フィルタと接触することを可能にするステップ（本ステップは、所望の検体を解放するために、フィルタの十分な湿潤を可能にする）と、
ｉｉｉ）流路内の弁が、第１のポートに対して閉鎖され、第２のポートに対して大気圧に通気され、第３のポートに対して開放される間、該第２の受容容器とチャンバとの間に負圧差を印加することによって、溶出緩衝剤（解放された検体を含有する）が、フィルタを通して第２の受容容器の中に流動することを可能にするステップ（圧力は、第３の流路の減圧発生器によって発生されてもよい）と、
によって、詳細に実施されてもよい。
【００３５】
好ましくは、本方法はさらに、ステップａとｂとの間に、流路内の弁が、第１のポートおよび第２のポートに対して開放され、および第３のポートに対して閉鎖されたままである間、サンプルが、所定の時間の間、フィルタと接触することを可能にするステップを含む。
【００３６】
本方法は、随意に、ステップｂとｃとの間に、
（ｉ）流路内の弁が、第１のポートに対して閉鎖され、第２のポートに対して大気圧に通気され、第３のポートに対して開放される間、第３の流路とチャンバとの間に負圧を印加することによって、所定の時間の間、フィルタを清掃し、かつ乾燥させるステップ（該負圧差は、第３の流路内に位置する減圧発生器によって発生される）、および／または
（ｉｉ）流体経路内の弁が、第２のポートおよび第３のポートに対して開放され、第１のポートに対して閉鎖される間、該受容リザーバと該第２のリザーバとの間に負圧差を印加することによって、第２のリザーバ内に位置する洗浄緩衝剤が、第２のポートを通してチャンバに進入し、フィルタを通して受容容器の中に流動することを可能にするステップ（圧力は、第３の流路内に位置する減圧発生器によって発生されてもよい）、および／または
ｉｉｉ）流路内の弁が、第１のポートに対して閉鎖され、第２のポートに対して大気圧に通気され、第３のポートに対して開放される間、第３の流路とチャンバとの間に負圧を印加することによって、気体が、所定の時間の間、フィルタを通して流動することを可能にするステップ（気体は、液体を移動させ、フィルタを乾燥させ、圧力は、第３の流路内に位置する減圧発生器によって発生されてもよい）、
のうちの１つまたはそれを上回るものを含んでもよい。
【００３７】
好ましくは、圧力差が、１つまたはそれを上回る弁が切り替えられるべきであって、したがって、次の方法ステップが行われるべきときを判定するために判定される。フィルタを横断する圧力降下は、弁が次の方法ステップを行うために作動されることができることを示す。
【００３８】
さらに、フィルタを乾燥させるために流動する気体は、第１の圧力センサと第２の圧力センサとの間の圧力差の一次導関数の値が所定の閾値を下回る場合のみ印加されることが好ましい。
【００３９】
表１は、自動手段によって精製プロセスのために行われるべき方法ステップの一実施例を詳述する。図面に示される流体の図は、該ステップ毎のポート／弁構成を示す。
【表１−１】
0006800144.tif 000002
【表１−２】
0006800144.tif 000003
【００４０】
本発明は、全体的自動化が達成されることができ、精製プロセスが完了されるために手動操作が必要とされず、したがって、再現可能な結果を達成するという利点を有する。さらに、精製デバイス／プロセスは、他の上流または下流デバイス／プロセス（例えば、溶解、増幅、および検出）にリンクされることができる。先行技術とは対照的に、液体は、第３のポートが閉鎖される間、第１のポートに印加される減圧を用いて、チャンバの中およびフィルタ上に移動される。これは、所定のインキュベーション時間の間のフィルタの事前湿潤を可能にする間、フィルタを通る流動を防止する。液体は、そのポートの弁を開放した後、第３のポートに印加される減圧を用いて、フィルタを通して移動される。まとめると、公知の方法と比較して、等しいか、またはより高い核酸収率が得られる。
【図１】
0006800144.tif 000004
【図２Ａ】
0006800144.tif 000005
【図２Ｂ】
0006800144.tif 000006
【図２Ｃ】
0006800144.tif 000007
【図２Ｄ】
0006800144.tif 000008
【図２Ｅ】
0006800144.tif 000009
【図３】
0006800144.tif 000010
【図４】
0006800144.tif 000011
【図５】
0006800144.tif 000012
【図６】
0006800144.tif 000013
【図７】
0006800144.tif 000014
【図８】
0006800144.tif 000015
【図９】
0006800144.tif 000016
【図１０】
0006800144.tif 000017
【図１１】
0006800144.tif 000018
【図１２】
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