(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
(i)(a)交差提示XCR1+樹状細胞の表面上の受容体に結合する分子であって、該受容体に対するリガンドまたは受容体に対する抗体もしくは抗体断片である分子と、(b)(a)の分子に結合された抗原含有タンパク質と、(c)Th-1媒介応答を支持し、かつデンジャーシグナルである第1アジュバントとを含む送達システムとして患者に投与され、(a)の分子が受容体に結合すると、(b)のタンパク質が内部移行して樹状細胞中で処理され、該タンパク質中に含有される抗原が樹状細胞の表面上に提示され、それによって患者においてT細胞が活性化される、医薬であり；かつ
(ii)(e)ペプチド結合主要組織適合遺伝子複合体クラスI(MHC-I)提示細胞およびTh-1媒介応答を支持し、かつデンジャーシグナルである第2アジュバント、ならびに(f) (e)および(d)複合体化インターロイキン2(IL-2cx)の組み合わせからなる群より選択される再賦活剤と組み合わせて使用され、該ペプチドが(i)に定義される抗原含有タンパク質に由来しそれによって活性化されたT細胞が再活性化される、医薬であり、
該再賦活剤が、該送達システムの投与後の5日〜12日の時間枠において投与される、
(a)樹状細胞の表面上の受容体に結合する分子と、(b)(a)の分子に結合された抗原含有タンパク質とを含む、細胞性の細胞傷害性免疫応答を誘導するための医薬。
【請求項２】
(x)複合体化インターロイキン2(IL-2cx)が、繰り返し、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13もしくは14回投与され、さらにより好ましくは、複合体化インターロイキン2(IL-2cx)が、1日もしくは2日毎に投与され、かつ／もしくは、5日間〜1ヵ月間、さらにより好ましくは1〜2週間、繰り返し投与され、かつ／または
(xx) 抗原含有タンパク質に由来するペプチドが、アミノ酸8、9もしくは10個の長さを有し、かつ／もしくは、MHC-Iによって、好ましくは対立遺伝子HLA-A2、HLA-A1、HLA-A3、HLA-B7、HLA-B35、HLA-A24、もしくはHLA-A30によって、より好ましくは対立遺伝子HLA-A2によって提示されるペプチドである、
請求項1記載の医薬。
【請求項３】
樹状細胞の表面上の受容体が、ケモカイン(Cモチーフ)受容体1（XCR1）、ネクチン様分子2、c型レクチン（CLEC）、例えばCLEC9Aであり、好ましくは、樹状細胞の表面上の受容体がXCR1である、請求項2記載の医薬。
【請求項４】
前記受容体がケモカイン(Cモチーフ)受容体1（XCR1）であり、かつ、(a)の分子が、抗XCR1抗体もしくはその断片またはケモカイン(Cモチーフ)リガンド1（XCL1）もしくはその機能的に活性なバリアントであり、好ましくは、SEQ ID NO: 7〜10、好ましくはSEQ ID NO: 8〜10、より好ましくはSEQ ID NO: 9または10のいずれか、さらにより好ましくはSEQ ID NO: 10の配列を含むかまたは該配列からなる、請求項1〜3のいずれか一項記載の医薬。
【請求項５】
・  (b)の抗原含有タンパク質が、(a)の分子との融合タンパク質の状態にあり；かつ／または
・  (b)の抗原含有タンパク質の抗原が、免疫原、病原体由来抗原、もしくは腫瘍抗原である、
請求項1〜4のいずれか一項記載の医薬。
【請求項６】
(c)の第1アジュバントおよび第2アジュバントが、独立して、合成または組換えのRIG-Iアゴニスト、TLRリガンド、例えばレシキモド(R848)、ポリICLCまたはポリイノシン:ポリシチジル酸(ポリI:C)、モンタニド（Montanide）、サポニン、リポ多糖(LPS)、およびCpGオリゴデオキシヌクレオチドからなる群より選択され、より好ましくは、RIG-Iアゴニスト、およびTLRリガンド、例えばレシキモド(R848)、ポリICLCまたはポリイノシン:ポリシチジル酸(ポリI:C)より選択される、請求項1〜5のいずれか一項記載の医薬。
【請求項７】
再賦活剤が、ペプチド結合主要組織適合遺伝子複合体クラスI(MHC-I)提示細胞およびTh-1媒介応答を支持し、かつデンジャーシグナルである第2アジュバントであり、
・  該細胞が、好ましくは血液細胞、より好ましくは末梢血単核細胞(PBMC)、さらにより好ましくはIL-2cxとの組み合わせであり、かつ／または
・  該細胞および第2アジュバントが、送達システムの投与後の5日〜9日の時間枠において1回のみ投与される、
請求項1〜6のいずれか一項記載の医薬。
【請求項８】
T細胞が、CD8+ T細胞またはCD4+ T細胞、好ましくはCD8+ T細胞である、請求項1〜7のいずれか一項記載の医薬。
【請求項９】
前記時間枠が、5日〜8日または5日〜9日である、請求項1〜8のいずれか一項記載の医薬。
【請求項１０】
PBMCであるペプチド結合主要組織適合遺伝子複合体クラスI(MHC-I)提示細胞を含む、抗原含有タンパク質に対する細胞性の細胞傷害性免疫応答を延長するための医薬であって、
(i)該医薬が、抗原に対して活性化されたT細胞を有する患者に、Th-1媒介応答を支持し、かつデンジャーシグナルであるアジュバントと組み合わせて投与され、該ペプチドが抗原含有タンパク質に由来しそれによって活性化T細胞が再活性化される、および任意で、該患者に複合体化インターロイキン2(IL-2cx)がさらに投与され、
ペプチド結合主要組織適合遺伝子複合体クラスI(MHC-I)提示細胞およびアジュバントが、T細胞が抗原に対して活性化された後の5日〜12日の時間枠において投与される、
前記医薬。
【請求項１１】
(x)複合体化インターロイキン2(IL-2cx)が投与され、好ましくは、繰り返し、好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13または14回投与され、さらにより好ましくは、複合体化インターロイキン2(IL-2cx)が、1日もしくは2日毎に投与され、かつ／もしくは、5日間〜1ヵ月間、さらにより好ましくは1〜2週間、繰り返し投与され、かつ／または
(xi)抗原含有タンパク質に由来するペプチドが、アミノ酸8、9もしくは10個の長さを有し、かつ／または、MHC-Iによって、好ましくは対立遺伝子HLA-A2、HLA-A1、HLA-A3、HLA-B7、HLA-B35、HLA-A24、もしくはHLA-A30によって、より好ましくは対立遺伝子HLA-A2によって提示されるペプチドである、
請求項10記載の医薬。
【請求項１２】
患者がヒトである、請求項1〜11のいずれか一項記載の医薬。
【請求項１３】
腫瘍および／または感染症を予防的に処置するまたは処置するためのものである、請求項1〜12のいずれか一項記載の医薬。
【請求項１４】
請求項1および4のいずれかに記載される送達システムならびに請求項1または7に記載される再賦活剤を含む、パーツのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、
(i)(a)樹状細胞の表面上の受容体に結合する分子と、(b)(a)の分子に結合された抗原含有タンパク質と、(c)第1アジュバントとを含む送達システムを患者に投与する段階であって、(a)の分子が受容体に結合すると、(b)のタンパク質が内部移行して樹状細胞中で処理され、該タンパク質中に含有される抗原が樹状細胞の表面上に提示され、それによって患者においてT細胞が活性化される、前記段階；ならびに
(ii)(d)複合体化インターロイキン2(IL-2cx)、(e)ペプチド結合主要組織適合遺伝子複合体クラスI(MHC-I)提示細胞および第2アジュバント、ならびに(f)(d)および(e)の組み合わせからなる群より選択される再賦活剤を患者に投与する段階であって、該ペプチドが段階(i)に定義される抗原含有タンパク質に由来しそれによって段階(i)において活性化されたT細胞が再活性化される、前記段階、
を含む細胞性の細胞傷害性免疫応答を誘導する方法における使用のための医薬に関し、
ここで、段階(ii)の再賦活剤は、段階(i)の送達システムの投与後の0時間〜14日の時間枠において投与される。
【背景技術】
【０００２】
免疫系は、多様な機序により、病原体および腫瘍細胞から身体を保護する。適切に機能するために、それは「自己」と「外来」（病原体／腫瘍）とを識別しなければならない。それは、細菌、ウイルス、寄生生物、真菌、および毒素を含む多様な病原体を検出し、それらと戦う。ヒトのような脊椎動物の免疫系は、動的ネットワークにおいて相互作用する多くの種類のタンパク質、細胞、組織、および器官からなる。この複雑な免疫応答の一部として、脊椎動物の免疫系は、特定の病原体をより効率的に認識するため次第に順応する。順応過程は、免疫学的記憶を作り出し、これらの病原体と将来遭遇した際のより有効な防御を可能にする。ワクチン接種は、この獲得免疫の過程に基づく。
【０００３】
樹状細胞（DC）は、免疫系の一部を形成する。それらの主要な機能は、抗原材料をプロセシングし、表面上で免疫系の他の細胞にそれを提示することであり、従って、抗原提示細胞として機能する。
【０００４】
Tヘルパー細胞（エフェクターT細胞またはTh細胞としても公知）も、免疫系の能力の確立および最大化において根底をなす役割を果たすという点で、免疫系の重要なメンバーである。Th細胞は、他の免疫細胞の活性化および指図に関与する。それらは、B細胞抗体クラススイッチの決定、細胞傷害性T細胞の活性化および拡大、ならびにマクロファージのような食細胞の殺菌活性の最大化において不可欠である。Tヘルパー細胞がそのように名付けられているのは、この機能の多様性、および他の細胞への影響における役割のためである。エフェクターT細胞へと発達する増殖性ヘルパーT細胞は、Th1細胞およびTh2細胞（それぞれ1型および2型ヘルパーT細胞としても公知）として公知の二つの主要な細胞のサブタイプへと分化し、Th2細胞は、主として液性免疫系（B細胞の増殖への刺激、B細胞抗体クラススイッチの誘導、および抗体産生の増加）を促進し、Th1細胞は、主として細胞性免疫系（マクロファージおよび細胞傷害性CD8+ T細胞の殺傷効力の最大化）を促進する。侵入する病原体の性質に依って、免疫系はTh1またはTh2の免疫応答を発達させる。Th1免疫応答の場合には、CD8+ T細胞が、細胞傷害性T細胞への分化の強い傾向を示す。同時に、Th1免疫応答のCD8+およびCD4+ヘルパーT細胞は、いずれも、大量のIFN-γ（およびその他のTh1サイトカイン／ケモカイン）を分泌し、マウスにおいては主にIgG2aおよびIgG2bアイソタイプの、ヒトにおいては主にIgGアイソタイプの抗体の生成を誘発する。Th1免疫応答は、ウイルス、（細胞内）細菌および腫瘍から身体を防御するために特に有効である。
【０００５】
生の、弱毒化された、または不活化された病原体成分に向けられた現在入手可能なワクチンおよびアジュバント系は、主として抗体免疫応答を誘発し、有効なTh1細胞傷害性応答を誘発しない（Steinman et al., 2007, Nature 449, 419-26）。誘導された抗体は、病原体の成分に結合することにより、それを生物学的に不活化する（「中和抗体」）。しかしながら、中和抗体が疾患からの防御または疾患の管理のためには十分でなく、現在のワクチン技術が有効でない疾患が多数存在する。これらは、感染症の封じ込めおよび／または根絶のために有効なTh1免疫応答を必要とし得る疾患である。例は、結核、マラリア、リーシュマニア、プリオン病、オルソミクソウイルス、特にインフルエンザ、A型肝炎、B型肝炎、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）およびその他のレンチウイルス、サイトメガロウイルス、ヘルペスウイルス、乳頭腫ウイルス、ブニヤウイルス、カリシウイルス、フィロウイルス、フラビウイルス、特にC型肝炎ウイルス、乳頭腫ウイルス、パラミクソウイルス、多様な呼吸器ウイルス、ならびに封じ込めおよび根絶のために有効なTh1免疫応答、特にTh1細胞傷害性応答を必要とするその他のウイルスである。従って、そのような有効なTh1応答を誘導するワクチン接種方法論の開発は、大いに望ましい。さらに、樹状細胞は最も高い頻度で感染の過程で直接感染されないため、「交差提示」（下記参照）の機序を標的とすることは、ウイルス性、細菌性、寄生生物性、および真菌性の病原体に対するTh1免疫応答の誘導のために最も重要である。Th1免疫応答の発達なしには、多くのウイルス、細菌、寄生生物、または真菌の感染症は、ヒト身体において封じ込めまたは根絶する事ができない。
【０００６】
Th1応答の誘導において主要な役割を果たす細胞が選択的に標的とされ得ることが、WO 2009/065561において見出された。ケモカイン(Cモチーフ)受容体1(XCR1)が、プロフェッショナル抗原提示細胞、特に樹状細胞(DC)の表面上に存在し、これらの細胞中へ物質を選択的に送達するために使用され得ることが見出された。XCR1保有DCへの物質のターゲティングされた送達は、哺乳動物／ヒトにおいて強力なTh1免疫反応の誘導を可能にする。現在のワクチンは、主にTh2抗原提示経路を扱い、主にTh2型(中和)抗体および免疫反応の発生をもたらす。特に、XCR1保有DCへのターゲティングによって、Th1型の液性および細胞性（細胞傷害性）免疫反応が所定の免疫原に対して誘発され得る。NK細胞、CD8+ T細胞、およびTh1CD4+ T細胞がこの反応に関与しているが他のCD4+ T細胞もこのタイプの反応に寄与し得ることが、予想され得る。アジュバントは、単独でまたは免疫原もしくは任意の薬学的化合物と組み合わせて、XCR1保有抗原提示細胞(APC)へ選択的にターゲティングされ得る。
【０００７】
末梢において、免疫系は、一方では無害な外来または自己の抗原と、他方では危険な（ウイルス、細菌、真菌、寄生生物、毒素様）抗原とを識別しなければならない。抗原は、DCによって取り込まれ、ペプチドへ分解される（「処理される」）。結果として生じるペプチドは、MHCクラスIまたはMHCクラスIIのコンテクストにおいてTリンパ球（T細胞）へ「提示」される。T細胞のCD4+サブセットはMHCクラスIIのコンテクストにおいて抗原を認識し、T細胞のCD8+サブセットはMHCクラスIのコンテクストにおいて抗原を認識する。抗原の取り込みと同時に、DCは、「デンジャーシグナル」認識受容体（例えば、トール様受容体、NOD様受容体）の大きなセットを介して、抗原が危険な性質のものであるかどうかまたはそれが無害であるかどうかを感知することができる。「デンジャーシグナル」認識受容体（「パターン認識受容体」とも呼ばれる）によって認識されるパターンは、通常、微生物に特有である分子構造である。これらは、微生物の場合は細胞壁成分（例えば、リポ多糖、ペプチドグリカン）または核酸修飾（例えば、非メチル化CpGモチーフ）、またはウイルスDNAもしくはウイルスRNAに特有である構造的特徴および修飾（例えば、二本鎖RNA）であり得る。さらに、体内においてアポトーシスにより瀕死の状態にある細胞は、「デンジャーシグナル」認識受容体を誘発することができる分子（例えば、高移動度群タンパク質B1、熱ショックタンパク質）を放出する。
【０００８】
危険な抗原の場合、DCは、特定の応答プログラムを活性化する（「成熟」）。抗原はCD4+およびCD8+ T細胞へ提示され、これらは、同時に抗原の危険な性質を示す追加のシグナルをDCから受け取る。結果として、両方のT細胞サブセットが活性化され、長期の寿命を伴って広範囲に拡大し、「エフェクターT細胞」へ発達する。これらは、他のDCもしくはB細胞または免疫系の他の細胞へ「ヘルプ」を提供するCD4+ T細胞であり得るか、またはCD4+細胞傷害性細胞でさえあり得る。CD8+ T細胞サブセット内で、再びヘルパーT細胞が発達するが、CD8+ T細胞の大部分は、IFN-γおよび他の可溶性因子の分泌によってまたは感染した体細胞の殺傷によって侵入病原体を排除することができるエフェクター細胞となる。B細胞へのT細胞ヘルプの結果として、抗原特異的B細胞は、抗原（病原体）へ向けられた抗体を分泌する形質細胞へ分化する。これらの抗体は、多数の機構（例えば、中和、改善された抗原取り込み、オプソニン化、補体結合）によって病原体と戦うのを助ける。
【０００９】
一定の数のエフェクターCD4+およびCD8+ T細胞が、病原体に対する免疫応答の急性期を生き延び、長寿命の「記憶T細胞」となる。記憶T細胞および長寿命の形質細胞は、同じ病原体（抗原）へ再曝露されると、極めて迅速な免疫応答を編成し、免疫系が非常に効果的に病原体（抗原）を排除することを可能にする。同じ病原体への再曝露時のT細胞およびB細胞免疫応答のこの高められた能力は、「免疫」と呼ばれ、免疫を誘導する抗原は「免疫原性」である。
【００１０】
要約すると、免疫系のT細胞の区分はCD4+ T細胞およびCD8+ T細胞を含む。ナイーブ生物において、数百個のみのCD4+またはCD8+T細胞が所定の抗原を認識する。それらが抗原に遭遇していない限り、T細胞はナイーブ状態にあり、エフェクター機能を発揮することができない。APCによって取り込まれ、処理され、そしてMHCのコンテクストにおいて細胞表面上に「提示」される可溶性タンパク質またはポリペプチド抗原により、ナイーブCD4+およびCD8+ T細胞は、APCによってのみ活性化可能である。一次抗原曝露の供給源は、可溶性タンパク質もしくはポリペプチド、または任意のタイプのワクチン、例えば、弱毒化感染因子、所望の抗原性タンパク質もしくはペプチドをコードするウイルスもしくは細菌ベクター、または抗原性タンパク質もしくはペプチドをコードするDNAもしくはRNA発現ベクターであり得る。デンジャーシグナルのコンテクストにおける抗原への一次曝露の結果として、数日以内に「プライミングされた」CD4+およびCD8+ T細胞の集団が存在すると考えられる。
【００１１】
タンパク質抗原がAPC中へターゲティングされると、それはペプチドへ分解され（「処理され」）、これらのペプチドは、MHC-II（古典的提示）およびMHC-I（「交差提示」）のコンテクストにおいてAPCの表面上に提示される。ナイーブCD4+ T細胞はMHC-IIのコンテクストにおいて、ナイーブCD8+ T細胞はMHC-Iのコンテクストにおいて、それらのペプチド-抗原を認識する。それらは活性化され、増殖し、エフェクター機能を獲得する。ペプチドが「デンジャーシグナル」のコンテクストにおいてDCによって提示される場合、拡大されたCD8+ T細胞は細胞傷害性T細胞へ分化する。プロフェッショナルAPCのみが、ナイーブCD8+ T細胞においてこの細胞傷害性機能を誘導することができる（「プライミング」、「一次免疫化」）。いったんCD8+ T細胞がそれらの細胞傷害能を獲得すると、それらは、MHC-Iのコンテクストにおいて同じペプチドを発現する体内の細胞を殺傷できるようになる。従って、それらは、所定の感染因子によって感染された細胞または腫瘍細胞を殺傷する。
【００１２】
抗原提示可能な細胞によって取り込まれる抗原は、MHC-I（「交差提示」）のコンテクストにおいてだけでなく、MHC-II（「古典的提示」）のコンテクストにおいても提示される。従って、デンジャーシグナルを伴う、抗原提示細胞中への抗原送達は、CD8+ T細胞だけでなく、CD4+ T細胞も活性化する。CD4+ T細胞は、TNF-αおよびIFN-γを分泌するTh1 T細胞へ分化し、一部はさらに細胞傷害性T細胞へと発達する。
【００１３】
一次CD8+ T細胞活性化は、可溶性抗原を提供することによって、またはAPC（B細胞、マクロファージ、DC）中への、特にナイーブ宿主のXCR1+ DC中への抗原の直接的もしくは間接的ターゲティングによって、達成され得る。間接的ターゲティングは、APCではないが、インビボでAPCへ、特にXCR1+ DCへ抗原を手渡すことができる細胞に抗原を提供することによって達成される。抗原が「デンジャーシグナル」(例えば、LPS、ポリI:C、CpGなど)と一緒に適用されると、これは一次CD8+ T細胞の細胞傷害性免疫を誘導する。
【００１４】
同様の初期T細胞活性化が、以前に抗原でプライミングされその抗原特異的CD8+ T細胞およびCD4+ T細胞が非活性化記憶状態にある宿主の抗原再チャレンジ（デンジャーシグナルの存在下）によって予想され得る。
【００１５】
同様のT細胞活性化が、宿主によって取り除くことができない低悪性度慢性感染症（例えば、CMV、HCV、HIV）を保有する宿主において予想され得る。
【００１６】
抗原をAPC中へターゲティングすることができる。このターゲティングは、APC上の表面構造体に結合するモノクローナル抗体(mAb)もしくは抗体断片によって、またはAPCの表面上の受容体に結合する任意のリガンドによって、媒介され得る。これらのリガンドは、APC中への抗原の内部移行を可能にする糖部分、ケモカイン、可溶性タンパク質リガンドまたは任意の他の構造体であり得る。DCによって取り込まれた抗原は、MHC-IおよびMHC-IIのコンテクストの両方において提示される。樹状細胞(DC)中への抗原の直接的または間接的ターゲティングは、他の様式の抗原適用と比べて交差提示を実質的に改善する。最良の交差提示および従ってCD8+ T細胞のプライミングは、XCR1+ DC中へ抗原をターゲティングすることによって達成することができる（Bachem et al. 2010, J Exp Med 207, 1273-1281, Bachem et al., 2012, Front Immunol 3, 214; Caminschi et al. 2013, Radford et al. 2013, Kreutz et al. 2013）。
【００１７】
デンジャーシグナル（これは第1アジュバントでもある）のコンテクストにおけるCD8+ T細胞の効率的なプライミング後、これらの細胞傷害性T細胞は、CD8+ T細胞レパートリーのおよそ1%〜5%を示し、顕著な細胞傷害能を示す。例えば、達成された細胞傷害性は、抗原が由来した病原体から宿主を保護し得、この保護レベルは、新たに発達している癌組織に対しても有効であり得る（図2B）。
【００１８】
しかしながら、所定の抗原に対して長期的な免疫を確立するかもしくは切迫した感染症からの高レベルの細胞傷害性防御を提供するか、または既に確立された腫瘍に対して高レベルの細胞傷害性を提供しようとする場合、ナイーブCD8+ T細胞の初期プライミングによってまたはCD8+ T細胞の再活性化によって誘導される細胞傷害能は、十分ではない場合がある。これらの状況下では、活性化された抗原特異的CD8+ T細胞のさらなる増幅が必要である。
【００１９】
MHC-Iのコンテクストにおいて発現された抗原を認識した後、CD8+ T細胞は活性化され、様々な細胞表面分子、例えば、CD69、4-1BB、ICOS、CD25、CD40L、OX40をデノボで発現するかまたは強くアップレギュレートし、そしてマウスにおいて最長でおよそ8日間増殖する（時間枠はヒトにおいて多少異なり得る）。その後、最初に活性化されたCD8+ T細胞は、およそ2〜3週間にわたって休止「記憶」状態へと徐々に戻る。同時に、拡大された抗原特異的T細胞集団は強く縮小する。CD8+ T細胞の一部はこの縮小プロセスを生き延び、記憶T細胞となる(Cui et al., 2010, Immunol. Rev. 236, 151-166)。
【００２０】
古典的なワクチン接種スキームは、初期プライミングステップ、続いての1回または複数回の）「ブースティング」へ分割され得る。ブースティングの原理は、初期活性化のダウンモジュレーションを受けたかまたは既に休止状態へ戻った、最初に拡大されたB細胞またはT細胞のデノボ活性化に基づいている。
【００２１】
本発明の根底にある課題は、先行技術の技術と比較して、細胞性の細胞傷害性免疫応答を誘導するための方法におけるおよび／または細胞性の細胞傷害性免疫応答を延長するための方法における、使用のための改善された医薬を提供することである。
【発明の概要】
【００２２】
上記の課題は本発明によって解決される。
【００２３】
一態様において、本発明は、
(i)(a)樹状細胞の表面上の受容体に結合する分子と、(b)(a)の分子に結合された抗原含有タンパク質と、(c)第1アジュバントとを含む送達システムを患者に投与する段階であって、該受容体に(a)の分子が結合すると、(b)のタンパク質が内部移行して樹状細胞中で処理され、該タンパク質中に含有される抗原が樹状細胞の表面上に提示され、それによって患者においてT細胞が活性化される、前記段階；ならびに
(ii)(d)複合体化インターロイキン2(IL-2cx)、(e)ペプチド結合主要組織適合遺伝子複合体クラスI(MHC-I)提示細胞および第2アジュバント、ならびに(f)(d)および(e)の組み合わせからなる群より選択される再賦活剤を患者に投与する段階であって、該ペプチドが段階(i)に定義される抗原含有タンパク質に由来しそれによって段階(i)において活性化されたT細胞が再活性化される、前記段階
を含む、細胞性の細胞傷害性免疫応答を誘導する方法における使用のための医薬であって、
段階(ii)の再賦活剤が、段階(i)の送達システムの投与後の0時間〜14日の時間枠において投与される、前記医薬に関する。
【００２４】
好ましい態様において、医薬は、ヒトにおける使用のためのものである。
【００２５】
患者は、好ましくは哺乳動物患者、より好ましくはヒト患者である。患者は、感染症もしくは腫瘍に罹患していてもよく、または、予防的処置の場合、感染症もしくは腫瘍に罹患していなくてもよいが、それぞれの感染症または腫瘍疾患から保護される。
【００２６】
さらに好ましい態様において、樹状細胞の表面上の受容体は、樹状細胞の表面上のヒト受容体である。
【００２７】
T細胞の強い細胞傷害性を短い時間内で提供する一つの可能性は、抗原によるCD8+ T細胞の初期活性化または再活性化の数日以内に下方調節機構が有効となることを妨げることであろう。CD8+ T細胞応答のこのダウンモジュレーションを防ぐために、本発明者らは、初期活性化または再活性化の短い時間枠内でCD8 T細胞上のT細胞受容体複合体に影響を与える別の刺激および／または適切な成長因子を提供しなければならないと推論した。この概念は、短い時間内でのT細胞受容体を介してのT細胞の度重なる活性化は「活性化誘導細胞死」を生じさせると教示する現在の定説に逆らう（Gorak-Stolinska et al., 2001, J Leukoc Biol 70, 756-766）。
【００２８】
本発明者らの概念を試験するために、Th1応答を支持する第1アジュバント(ポリI:C、LPS、CpG、または等価物)の存在下でXCR1+ DC中へ抗原をターゲティングすることによって、C57BL/6マウスを免疫化した（「プライミングした」）。この一次免疫化のための抗原として、本発明者らは、モデル抗原オボアルブミン(OVA)、またはオボアルブミン由来のペプチド配列（SIINFEKL (SEQ ID NO: 11)）を使用した。このペプチド配列は、標的とされたAPCによるOVAの処理後にC57BL/6マウスのMHC-Iのコンテクストにおいて優先的に提示されることが公知である。この初期免疫化のために、以前に記載されたように(WO 200/065561)、タンパク質OVAまたはペプチドSIINFEKL(SEQ ID NO: 11)を、XCR1に特異的なモノクローナル抗体(mAb)、またはXCR1に結合するケモカインリガンドXCL1のいずれかへ組換え融合した。このプライミングステップ後の様々な時点(3〜20日)で、マウスを抗原へ再曝露した。本発明者らは宿主中へタンパク質またはペプチドを注射しなかった。何故ならば、本発明者らは、いずれの手順も宿主細胞上のMHC-Iのコンテクストにおいて抗原性ペプチドの提示をもたらし、これらは次いで、既に活性化された抗原特異的CD8+ T細胞によって殺傷されるだろうと予想したためであり（図1Aを比較のこと）、これは非常に望ましくない効果である。代わりに、同系脾臓細胞をC57BL/6マウスから単離し、インビトロでペプチドSIINFEKL(SEQ ID NO: 11)と共にインキュベートし（MHC-Iへの「結合」）、洗浄し、以前にプライミングされていたマウスへ静脈内注射した。
【００２９】
予想外に、かつ現在の知識に反して、本発明者らはこのレジメを用いて、CD8+ T細胞を狭い時間枠内で抗原へ再曝露した場合に、抗原特異的CD8+ T細胞の数の増幅を達成することができた。再曝露が非常に早く、第3日においてであった場合、増幅は観察されず、抗原への再曝露を初期CD8+ T細胞活性化の第9日に続いて行った場合は、非常に限定的な増幅が観察された（図3）。プライミングした動物中へのSIINFEKL結合同系脾臓細胞単独の注射は、プライミングされたCD8+ T細胞集団を拡大せず、第2アジュバント(ポリI:C、LPS、CpG、または等価物)を同時適用して「デンジャー」シグナルを提供した場合のみ、所望の効果が達成された。ペプチド結合脾細胞の注射を最適な時点で行った場合、抗原応答性CD8+ T細胞集団は、プライミング後、増幅無しでの0.2 x 106個から、増幅有りでの2 x 106個の細胞へ、およそ10倍拡大した（図4）。これらの拡大されたCD8+ 細胞は、高レベルのエフェクター分子、例えば、グランザイムB、パーフォリン、TNF-αおよびIFN-γ、感染因子のCD8+ T細胞防衛または腫瘍の根絶に関与する分子を発現した。ヒトにおいて、初期T細胞活性化の増幅のための最適な時間枠は、マウスにおける最適な時間枠（初期CD8+ T細胞活性化後およそ5〜8日）とは異なり得る。
【００３０】
様々な増幅時点を比較すると、初期プライミング後5〜8日における抗原での再曝露が、最も高い程度のCD8+ T細胞拡大、およびCD8+ T細胞中における細胞傷害性エフェクター分子（TNF-α、IFN-γ、グランザイムB、パーフォリン）の最も高い発現を提供することが明らかとなった。第5日〜第8日は、休止CD8+ T細胞による抗原の認識後の早い時点であり、従って、T細胞が依然として強く活性化されている時点である。従って、この増幅は古典的なブーストシステムを示さない。代わりに、このタイプの増幅は、T細胞が、ダウンレギュレーションおよび縮小の通常の段階に入る代わりに、それらの初期活性化および拡大期を継続することを可能にするシグナルを提供する。この特定の効果に起因して、本発明者らは、アジュバントと一緒に提供される場合の、この増幅を、「抗原依存的増幅システム」（ADAS）と名付けた。
【００３１】
従って、本発明によれば、「抗原依存的増幅システム」または「ADAS」は、再賦活剤を患者に投与する段階であって、再賦活剤がペプチド結合主要組織適合遺伝子複合体クラスI(MHC-I)提示細胞および第2アジュバントであり、かつ、該ペプチドが本発明の段階(i)に定義される抗原含有タンパク質に由来しそれによって段階(i)において活性化されたT細胞が再活性化される、前記段階に関する、本発明の第2段階(ii)と理解される。任意で、ADASにおける再賦活剤は、複合体化インターロイキン2(IL-2cx)をさらに含む。
【００３２】
ADASの有効性についての細胞要件を調べるために、様々なリンパ球集団（脾細胞、B細胞、T細胞、およびDC）にインビトロでSIINFEKL(SEQ ID NO: 11)を比較のために結合させ、第2アジュバント(ポリI:C、LPS、CpG、または等価物)と一緒にマウスに最適な時間枠内で(第5日)注射した。この実験は、MHC-Iを発現するこれらのリンパ球集団の全てが、初期活性化、拡大、および細胞傷害性エフェクター細胞へのCD8+ T細胞の機能的分化を継続するために必要なシグナルを提供することができたことを明らかにした（図3B）。プライミング単独は第10日に脾臓CD8 T細胞集団内で1%〜5%の抗原特異的CD8+ T細胞を生じさせたが、ADASの適用はこの頻度をおよそ15%〜25%へ上昇させた。
【００３３】
得られた結果から、ADASは、リンパ球細胞またはさらに非リンパ球細胞の表面上に十分に高い密度のペプチド結合MHC-I分子を提供することができる任意のシステムを用いてインビボで機能すると結論付けることができる。インビトロで外部的にMHC-I分子にペプチドを結合させる代わりに、細胞に抗原含有タンパク質全体をインビトロで供給し、細胞が抗原を処理しそしてMHC-Iのコンテクストにおいて抗原性ペプチドを提示することを可能にするシステムを想定することができる。細胞に感染することができるウイルスシステムに細胞をインビトロで曝露し、MHC-Iのコンテクストにおいて多量のペプチドを発現させるシステムを想定することもできる。さらに、MHC-I保有細胞に、所定のタンパク質またはペプチド配列をコードする発現ベクターをトランスフェクトし、再びMHC-Iのコンテクストにおいてペプチドの効率的な提示を生じさせることができる。
【００３４】
APCへ送達された全抗原は、MHC-IのコンテクストにおいてCD8+ T細胞へ提示されるだけでなく、MHC-IIのコンテクストにおいてCD4+ T細胞へも提示されるため、ADASはCD4+ T細胞応答を増幅するためにも使用され得る。この特定の増幅のために、ADASについて使用される細胞は、細胞表面上にMHC-II分子を発現しなければならず、ここに適切なペプチドが結合される。この結合は、好適なペプチドへの外部曝露によって行うことができ、または、MHC-II保有細胞に所定のタンパク質もしくはペプチド配列をコードする発現ベクターをトランスフェクトし、再びMHC-IIのコンテクストにおいてペプチドの効率的な提示を生じさせることができる。
【００３５】
本発明者らは静脈内注射によってADASを適用したが、ペプチド結合細胞の他の適用経路が可能である。これは、皮下、皮内、筋肉内注射、腹腔内、髄腔内、または腫瘍組織中への直接注射によって行うことができる。
【００３６】
従って、本発明の段階(ii)の再賦活剤の投与は、特に、皮下(s.c.)、皮内、静脈内、筋肉内注射、腹腔内、髄腔内、または腫瘍組織中への直接注射より選択される公知の投与方法によって、より好ましくは静脈内または皮下注射によって、行われ得る。
【００３７】
また、本発明の段階(i)の送達システムの投与は、特に、皮下、皮内、静脈内、筋肉内注射、腹腔内、髄腔内、肺内への投与、または腫瘍組織中への直接注射より選択される公知の投与方法によって、より好ましくは静脈内および皮下注射によって、行われ得る。
【００３８】
樹状細胞の表面上の受容体に結合する分子と、(b)(a)の分子に結合された抗原含有タンパク質と、(c)第1アジュバントとを、好ましくは、単一の薬学的調製物として投与する。そのような薬学的調製物は、好ましくは、緩衝化合物のような薬学的に許容される賦形剤をさらに含有し得る液体である。そのような薬学的調製物は好ましくは滅菌されている。
【００３９】
筋肉内投与のための段階(i)の送達システムの用量の体積は、好ましくは最高で約5 mL、例えば、0.3 mL〜3 mL、1 mL〜3 mL、約0.5〜1 mL、または約2 mLである。各用量中の有効成分の量は、処置または予防を提供するために十分であるべきである。異なる態様において、送達される物質の単位用量は、最高で約5μg物質/kg体重、約0.2〜3μg、約0.3〜1.5μg、約0.4〜0.8μg、または約0.6μgであるべきである。代替の態様において、単位用量は、最高で約6μg物質/kg体重、約0.05〜5μg、または約0.1〜4μgであり得る。1用量当たりのタンパク質の代表的な量は、およそ1μg〜およそ1 mg、より好ましくはおよそ5μg〜およそ500μg、さらにより好ましくはおよそ10μg〜およそ250μg、最も好ましくはおよそ25μg〜およそ100μgである。
【００４０】
段階(ii)において投与されるペプチド結合主要組織適合遺伝子複合体クラスI(MHC-I)提示細胞および第2アジュバントを含む再賦活剤の細胞の数は変動し得、典型的に1×106〜400×106個の細胞の範囲内、好ましくは1×106〜200×106個の細胞の範囲内にある。
【００４１】
再賦活剤としての複合体化IL-2は、好ましくは、液剤として、かつ／または、1μg/kg体重〜200μg/kg体重、より好ましくは1μg/kg体重〜50μg/kg体重、さらにより好ましくは1μg/kg体重〜20μg/kg体重の範囲内の投薬量で投与され、ここで、該量は組成物中のIL-2含有量を指す。
【００４２】
本発明者らはXCR1+ DC中への抗原のターゲティング後のADASの効果を試験したが、本発明者らの結果から、インビボでのT細胞受容体誘発によって、CD8+ T細胞および／またはCD4+ T細胞の有意な初期活性化(「プライミング」)または再活性化をもたらす何らかのシステムを、ADASアプローチで増幅することができると結論付けることができる。
【００４３】
リンホカインIL-2は、T細胞およびNK細胞集団を拡大するために過去において使用され、「複合体化」形態で、即ち、高親和性IL-2受容体鎖へのその結合を遮断する抗体に結合された形態で提供される場合、有効であることが示された（CD25、Boyman et al., 2006, Science 311, 1924-1927）。
【００４４】
本発明によれば、「複合体化IL-2」または「IL-2cx」は、高親和性IL-2受容体鎖(CD25)へのその結合を遮断する結合性分子、特に抗体または抗体断片に非共有結合されているIL-2と理解される。好ましい態様において、抗体はヒト化抗体またはヒト抗体である。好ましい態様において、IL-2は、ヒトIL-2である。IL-2は、適切な宿主を使用して、合成的にまたは組換え的に合成され得、より好ましくは、IL-2は組換え的に作製される。
【００４５】
本発明者らは、XCR1+ DC中への抗原のターゲティングによるT細胞活性化の本発明者らのシステムにおいて複合体化IL-2(IL-2cx)を試験した。予想に反して、T細胞応答のプライミング、続いてのIL-2cx単独の適用は、抗原特異的CD8+ T細胞の数を有意には増加させなかった（図4）。第5日のADAS単独の適用は、上述したように、抗原特異的CD8+ T細胞の数を、プライミング単独後のおよそ0.2 x 106個からおよそ2 x 106個へ、従っておよそ10倍増加させた。しかし、非常に驚くべきことに、ADASのコンテクストにおいて適用された場合、IL-2cxは、およそ100〜200 x 106個の抗原特異的CD8+へ、即ちおよそ50〜100倍、抗原特異的CD8+ T細胞の増幅を非常に強く増大させた。この非常に相乗的な効果は、IL-2が複合体化形態で適用された場合に、ADASがIL-2の生物学的効果に好都合な条件を作り出すことを示した。ADASおよびIL-2cxの組み合わせは、今や全ての脾臓免疫細胞の大部分が抗原特異的CD8+ T細胞から構成されたような程度へ、初期プライミングを増幅した。さらに調べると、この大量に拡大されたT細胞集団は、グランザイムBをおよそ60〜70%発現し、これは高い細胞傷害能を示す。
【００４６】
様々な条件下で増幅されたCD8+ T細胞の細胞傷害能力を試験するために、本発明者らは腫瘍モデルを選択し、ここで、高悪性度のOVAトランスフェクト腫瘍株を、同系C57BL/6マウス中へ皮下注射し、実質的なサイズ(およそ20 mm2)へ6日間成長させた。第6日から、マウスの群を未処置のままにしたか、または異なるレジメで処置した。XCR1+DC中へのOVAのターゲティング単独による第6日における腫瘍担持マウスのプライミングは、腫瘍の成長に対してかろうじていくらかの効果を有し（図5）、マウスをプライミングしなかったがIL-2cx単独で処置した場合、同じことが当てはまった。驚くべきことに、第6日におけるマウスのプライミング、続いての連日のIL-2cx単独での処置は、第22日まで腫瘍の成長を有意に減少させ、このことは、インビボでの実質的な殺傷能力の誘導を示している。しかし、腫瘍は第22日あたりでその成長を再開し、このことは、腫瘍塊の全てが除去され得たわけではなかったことを示している。さらに、プライミング後第6日におけるADASの適用は、腫瘍の成長を非常に実質的に減少させたが、これは第18日あたりで再び成長し始めた（図5）。興味深いことに、IL-2cxの連続適用と組み合わせてのプライミング後第6日におけるADASの適用は、実験の終了まで腫瘍のサイズを減少させることにおいて、明らかに最も有効であった（図5）。得られた結果は、APC中への抗原のターゲティング後の所定の時間枠内でのIL-2cx単独の注射は、腫瘍の成長の制御において既に非常に有効であったことを示した。さらに、アウトカムは、ADASもまた、抗原によるCD8+ T細胞の初期活性化後の所定の時間枠内で適用された場合、この抗原を発現する腫瘍に対して強い殺傷活性を誘導したことを示した。悪性腫瘍の成長の制御において最も有効なのは、ADASおよびIL-2cxの組み合わせであった（図5）。この実験において最初にADASを、続いてIL-2cxを適用したが、処置順序は逆にすることもできる。この場合、最初にIL-2cxを、続いて適切な時にADASを適用する。
【００４７】
本発明の方法における使用のための医薬の段階(i)の好ましい態様は、樹状細胞の表面上の受容体としてのXCR1についてのWO 2009/065561に開示されている。WO 2009/065561に開示されるように、抗XCR1抗体もしくはその断片、またはXCL1もしくはその機能的に活性な断片を、好ましくは、樹状細胞の表面上の受容体に結合する分子として用いることができる。XCR1が樹状細胞の表面上の受容体である送達システムに関するWO 2009/065561の開示は、参照により本明細書に組み入れられ、そこに開示される態様は、本発明の使用のための医薬の段階(i)についても適用される。
【００４８】
好適な抗原含有タンパク質は当業者に公知である。
【００４９】
例えば、腫瘍疾患のコンテクストにおける多数の好適な抗原含有タンパク質が公知である。さらに、ワクチンとして好適なペプチドが、例えば、Aranda et al., OncoImmunology 2:12, e26621; December 2013に要約されるように、神経膠腫、肺癌、肉腫、黒色腫、食道扁平上皮癌、胃癌、肝細胞癌、膵臓癌、結腸直腸癌、腎細胞癌、前立腺癌、卵巣癌、婦人科悪性腫瘍、および種々の他の腫瘍を含む固形新生物に対して記載されている。これらの臨床試験において特異的に標的とされる抗原含有タンパク質は、癌-精巣抗原、例えば、NY-ESO-1、TTKプロテインキナーゼ(MOSとしても公知)、リンパ球抗原6複合体、遺伝子座K(LY6K、URLC10として最も知られている)、インスリン様成長因子2 mRNA結合タンパク質3(IGF2BP3、IMP3として最も知られている)、リングフィンガータンパク質(RNF43)、およびミトコンドリア外膜のトランスロカーゼ34(TOMM34)；癌胎児性抗原、例えばグリピカン-3；分化抗原、例えばメランA(MLANA)およびプレメラノソームタンパク質(PMEL、gp100として最も知られている)；腫瘍限定抗原、例えば、SYT-SSX融合物（t(X;18)(p11;q11)染色体転座の結果として滑膜肉腫によって選択的に発現される）；ならびにいわゆる「共有腫瘍関連抗原」（悪性細胞によって過剰発現されるが、1つまたはいくつかの健康な組織によって正常な量で産生される、抗原）、例えば、血管内皮成長因子受容体1(VEGFR1)およびVEGFR2、サバイビン、ウィルムス腫瘍1(WT1)、テロメラーゼ逆転写酵素(TERT)、ならびにp53を包含する。従って、そのようなタンパク質は、腫瘍のコンテクストにおいて好適な抗原含有タンパク質である。癌におけるペプチドワクチンに関するさらなる要約は、Yamada et al., Cancer Sci, 2013, 104(1):15-21である。
【００５０】
腫瘍患者または腫瘍に関して予防的に処置される患者において細胞性の細胞傷害性免疫応答を誘導する場合、腫瘍疾患に関与する好適な抗原包含タンパク質が使用され得る。そのようなタンパク質は当技術分野において公知である。例えばTacken and Figdor (Tacken P.J., Figdor C.G.; Targeted antigen delivery and activation of dendritic cells in vivo: Steps towards cost effective vaccines. Semin. Immunol., 2011, 23(1):12-20)に記載されるように、理想的な腫瘍抗原は、共有腫瘍特異的抗原として公知のものである。何故ならば、それらは、様々な組織型の腫瘍細胞において選択的に発現され、MHC発現性正常組織においては発現されないためである。そのようなタイプの抗原の例はMAGE-AまたはNY-ESO-1抗原である。抗原のこのカテゴリー中の様々なメンバーが、腫瘍タイプおよび疾患段階に依存して可変比率で発現される。従って、これらの抗原に基づくワクチンは、標的抗原を発現する腫瘍を保有する患者の選択を必要とする。ワクチン開発について価値があると見なされる腫瘍抗原の別のカテゴリーは、腫瘍中において過剰発現される発癌性タンパク質に由来するものである。真正の非自己腫瘍抗原は、2つの主要な供給源に由来する：HPV感染によって引き起こされる子宮頸癌などの発癌性ウイルス起源の腫瘍の場合はウイルス抗原、および体細胞変異。
【００５１】
感染症に罹患している患者または感染性疾患（または感染症）に関して予防的に処置される患者において細胞性の細胞傷害性免疫応答を誘導する場合、病原体、特に、マラリア、結核、リーシュマニア、またはウイルス、特に、オルトミクソウイルス、インフルエンザウイルス、A型肝炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、慢性C型肝炎ウイルス、レンチウイルス、特にHIウイルス、サイトメガロウイルス、ヘルペスウイルス、乳頭腫ウイルス、ブニヤウイルス、カリシウイルス、フィロウイルス、フラビウイルス、または呼吸器ウイルスより選択されるウイルスより選択される病原体の好適な抗原包含タンパク質が使用され得る。さらにより好ましい態様において、抗原包含タンパク質は、C型肝炎ウイルス、乳頭腫ウイルス、パラミクソウイルス、または呼吸器ウイルスより選択されるウイルスのタンパク質である。
【００５２】
ウイルス、特にRNAウイルスは、典型的に高い突然変異率を示す。しかし、ウイルスポリメラーゼまたは核タンパク質をコードする領域のような、非構造および／または内部タンパク質をコードするゲノムセグメント中に特に見られる保存領域が典型的に存在する。そのような領域は古典的なワクチン接種技術には適しておらず、その理由は、そのような保存タンパク質はウイルス被膜表面上に露出されないためである。対照的に、そのような抗原包含タンパク質および／またはタンパク質中に含まれる抗原は、本発明に従う使用のための医薬において使用され得る。
【００５３】
好ましい態様において、抗原包含タンパク質および／またはウイルスのタンパク質中に含まれる抗原は、保存されている。
【００５４】
さらに好ましい態様において、抗原包含タンパク質は非構造タンパク質であり、かつ／または、抗原は非構造および／もしくは内部タンパク質中に含まれている。
【００５５】
なおさらに好ましい態様において、抗原包含タンパク質は、RNAウイルスのタンパク質である。
【００５６】
「非構造」または「内部」タンパク質は、ウイルス粒子の被膜またはエンベロープの一部ではないタンパク質である。
【００５７】
さらなる態様において、段階(i)におけるタンパク質中に含まれる抗原は、免疫優性である。免疫優性は、ある病原体について多くのpMHC複合体が利用可能であるが、T細胞応答が1つまたは少数の重要抗原に再現性よく集中することを意味し、上記の抗原はそのような重要抗原の1つである。
【００５８】
A型インフルエンザウイルスの好適な抗原含有タンパク質および抗原は、例えばWu et al. (PNAS, 2011, 108(22): 9178-9183)に記載されており、NP(核タンパク質)、塩基性ポリメラーゼ1およびM1を包含する。
【００５９】
段階(ii)は、(d)複合体化インターロイキン2(IL-2cx)、(e)ペプチド結合主要組織適合遺伝子複合体クラスI(MHC-I)提示細胞および第2アジュバント、ならびに(f)(d)および(e)の組み合わせからなる群より選択される再賦活剤を患者に投与することに関し、ここで、該ペプチドは、段階(i)に定義される抗原含有タンパク質に由来しそれによって段階(i)において活性化されたT細胞が再活性化される。
【００６０】
ある態様において、(e)の場合、細胞および第2アジュバントは、段階(i)の送達システムの投与後の0時間〜14日の時間枠において投与される。
【００６１】
一つの好ましい態様において、(e)の場合、細胞および第2アジュバントは、段階(i)の送達システムの投与後の0時間〜14日の時間枠において、1回のみ投与される。
【００６２】
好ましい態様において、(e)の場合、細胞および第2アジュバントは、段階(i)の送達システムの投与後の48時間〜14日の時間枠において投与される。
【００６３】
例えば、細胞および第2アジュバントは、段階(i)の送達システムの投与の48時間、72時間、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日、13日または14日後に投与される。
【００６４】
より好ましい態様において、(e)の場合、細胞および第2アジュバントは、段階(i)の送達システムの投与後の3日〜9日、さらにより好ましくは4日〜8日の時間枠において、例えば4日、5日、6日、7日、8日後に投与される。
【００６５】
別の好ましい態様において、(e)の場合、細胞および第2アジュバントは、段階(i)の送達システムの投与後の0時間〜14日の時間枠において、好ましくは48時間〜14日の時間枠において、1回のみ投与される。
【００６６】
例えば、細胞および第2アジュバントは、段階(i)の送達システムの投与の48時間、72時間、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日、13日または14日後に、1回のみ投与される。
【００６７】
さらに好ましい態様において、(e)の場合、細胞および第2アジュバントは、段階(i)の送達システムの投与後の3日〜9日、さらにより好ましくは4日〜8日の時間枠において、例えば4日、5日、6日、7日、8日後に、1回のみ投与される。
【００６８】
(d)の場合、複合体化インターロイキン2(IL-2cx)は、段階(i)の送達システムの投与後の0時間〜14日の時間枠において投与される。
【００６９】
(d)の場合、複合体化インターロイキン2(IL-2cx)は、段階(i)の送達システムの投与後の0時間〜14日の時間枠において、段階(i)の送達システムの投与後、繰り返し好ましくは投与される。複合体化IL-2のさらなる投与を、段階(i)の送達システムの投与後、14日後に行うことがさらに可能であり；しかし、少なくとも1つの投与は0時間〜14日の時間枠において行われる。
【００７０】
さらに好ましい態様において、(d)の場合、複合体化インターロイキン2(IL-2cx)は、段階(i)の送達システムの投与後の48時間〜9日、さらにより好ましくは3日〜8日の時間枠において、例えば3日、4日、5日、6日、7日、8日後に、好ましくは投与される。
【００７１】
なおさらに好ましい態様において、(d)の場合、複合体化インターロイキン2(IL-2cx)は、段階(i)の送達システムの投与後の48時間〜9日、さらにより好ましくは3日〜8日の時間枠において、例えば3日、4日、5日、6日、7日、8日後に、繰り返し好ましくは投与される。従って、複合体化インターロイキン2(IL-2cx)は、段階(i)の送達システムの投与後の48時間〜9日、さらにより好ましくは3日〜8日の時間枠において、例えば3日、4日、5日、6日、7日、8日後に、1、2、3、4、5、6、7、8、9または10回、好ましくは投与される。例えば、複合体化インターロイキン2(IL-2cx)は毎日または2日毎に投与され得る。例えば、複合体化インターロイキン2(IL-2cx)は、段階(i)の送達システムの投与の48時間、3日、4日、5日、6日、7日および8日後に投与され得る。別の例において、複合体化インターロイキン2(IL-2cx)は、段階(i)の送達システムの投与の48時間、4日、6日、および8日後に投与され得る。
【００７２】
複合体化IL-2のさらなる投与を、段階(i)の送達システムの投与後、例えば14日、好ましくは9または8日である指示される時間の後に行うことがさらに可能であり；しかし、少なくとも1つの投与は、指示される時間枠において行われる。
【００７３】
(f)の場合、複合体化インターロイキン2(IL-2cx)と、ペプチド結合主要組織適合遺伝子複合体クラスI(MHC-I)提示細胞および第2アジュバントとの組み合わせを投与する。好ましい態様において、複合体化インターロイキン2(IL-2cx)は、ペプチド結合主要組織適合遺伝子複合体クラスI(MHC-I)提示細胞および第2アジュバントの投与前に、投与と同時に、または投与後に投与され得る。好ましくは、段階(i)の送達システムの投与後の0時間〜14日の時間枠において、ペプチド結合主要組織適合遺伝子複合体クラスI(MHC-I)提示細胞および第2アジュバントが1回のみ投与され、複合体化インターロイキン2(IL-2cx)が繰り返し投与される。そのような態様において、複合体化IL-2は、ペプチド結合主要組織適合遺伝子複合体クラスI(MHC-I)提示細胞および第2アジュバントの投与前、投与と同時、および／または投与後のいずれにおいても投与され得る。
【００７４】
選択肢(f)について、選択肢(e)および(f)についての態様と同じ好ましい態様が、それぞれ、複合体化IL-2ならびにペプチド結合主要組織適合遺伝子複合体クラスI(MHC-I)提示細胞および第2アジュバントの投与について適用される。
【００７５】
一態様において、(f)の場合、細胞および第2アジュバントは、段階(i)の送達システムの投与後の0時間〜14日の時間枠において、1回のみ投与される。
【００７６】
好ましい態様において、(f)の場合、細胞および第2アジュバントは、段階(i)の送達システムの投与後の48時間〜14日の時間枠において投与される。
【００７７】
例えば、(f)の場合、細胞および第2アジュバントは、段階(i)の送達システムの投与の48時間、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日、13日または14日後に投与される。
【００７８】
より好ましい態様において、(f)の場合、細胞および第2アジュバントは、段階(i)の送達システムの投与後の3日〜9日、さらにより好ましくは4日〜8日の時間枠において、例えば4日、5日、6日、7日、8日後に投与される。
【００７９】
別の好ましい態様において、(f)の場合、細胞および第2アジュバントは、段階(i)の送達システムの投与後の0時間〜14日の時間枠において、1回のみ投与される。
【００８０】
例えば、細胞および第2アジュバントは、段階(i)の送達システムの投与の48時間、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日、13日または14日後に、1回のみ投与される。
【００８１】
さらに好ましい態様において、(f)の場合、細胞および第2アジュバントは、段階(i)の送達システムの投与後の3日〜9日、さらにより好ましくは4日〜8日の時間枠において、例えば4日、5日、6日、7日、8日後に、1回のみ投与される。
【００８２】
(f)の場合、複合体化インターロイキン2(IL-2cx)は、段階(i)の送達システムの投与後の0時間〜14日の時間枠において、段階(i)の送達システムの投与後、繰り返し好ましくは投与される。複合体化IL-2のさらなる投与を、段階(i)の送達システムの投与後、14日後に行うことがさらに可能であり；しかし、少なくとも1つの投与は0時間〜14日の時間枠において行われる。
【００８３】
さらに好ましい態様において、(f)の場合、複合体化インターロイキン2(IL-2cx)は、段階(i)の送達システムの投与後の48時間〜9日、さらにより好ましくは3日〜8日の時間枠において、例えば3日、4日、5日、6日、7日、8日後に、好ましくは投与される。
【００８４】
なおさらに好ましい態様において、(f)の場合、複合体化インターロイキン2(IL-2cx)は、段階(i)の送達システムの投与後の48時間〜9日、さらにより好ましくは3日〜8日の時間枠において、例えば3日、4日、5日、6日、7日、8日後に繰り返し好ましくは投与される。従って、複合体化インターロイキン2(IL-2cx)は、段階(i)の送達システムの投与後の48時間〜9日、さらにより好ましくは3日〜8日の時間枠において、例えば3日、4日、5日、6日、7日、8日後に、1、2、3、4、5、6、7、8、9または10回、好ましくは投与される。例えば、複合体化インターロイキン2(IL-2cx)は毎日または2日毎に投与され得る。例えば、複合体化インターロイキン2(IL-2cx)は、段階(i)の送達システムの投与の48時間、3日、4日、5日、6日、7日および8日後に投与され得る。別の例において、複合体化インターロイキン2(IL-2cx)は、段階(i)の送達システムの投与の48時間、4日、6日、および8日後に投与され得る。
【００８５】
複合体化IL-2のさらなる投与を、段階(i)の送達システムの投与後、例えば14日、好ましくは9または8日である指示される時間の後に行うことがさらに可能であり；しかし、少なくとも1つの投与は、指示される時間枠において行われる。
【００８６】
従って、さらに好ましい態様において、(f)の場合、
(A)細胞および第2アジュバントは、段階(i)の送達システムの投与後の0時間〜14日、好ましくは48時間〜14日の時間枠において、より好ましくは3日〜9日、さらにより好ましくは4日〜8日の時間枠において、例えば4日、5日、6日、7日、8日後に、さらにより好ましくは、段階(i)の送達システムの投与後の48時間〜14日の時間枠において1回のみ、より特には3日〜9日の時間枠において1回のみ、さらにより特には4日〜8日の時間枠において、例えば4日、5日、6日、7日、8日後に1回のみ、投与され、かつ
(B)複合体化インターロイキン2(IL-2cx)は、段階(i)の送達システムの投与後の0時間〜14日、より好ましくは48時間〜9日、さらにより好ましくは3日〜8日の時間枠において、例えば3日、4日、5日、6日、7日、8日後に投与され、最も好ましくは、段階(i)の送達システムの投与後の0時間〜14日、より好ましくは48時間〜9日、さらにより好ましくは3日〜8日の時間枠において、例えば3日、4日、5日、6日、7日、8日後に、繰り返し投与される。
【００８７】
複合体化IL-2のさらなる投与を、段階(i)の送達システムの投与後、14日後に行うことがさらに可能であり；しかし、少なくとも1つの投与は0時間〜14日の時間枠において行われる。
【００８８】
なおさらに好ましい態様において、(f)の場合、複合体化インターロイキン2(IL-2cx)は、段階(i)の送達システムの投与後の48時間〜9日、さらにより好ましくは3日〜8日の時間枠において、例えば3日、4日、5日、6日、7日、8日後に、繰り返し好ましくは投与される。従って、複合体化インターロイキン2(IL-2cx)は、段階(i)の送達システムの投与後の48時間〜9日、さらにより好ましくは3日〜8日の時間枠において、例えば3日、4日、5日、6日、7日、8日後に、1、2、3、4、5、6、7、8、9または10回、好ましくは投与される。例えば、複合体化インターロイキン2(IL-2cx)は毎日または2日毎に投与され得る。例えば、複合体化インターロイキン2(IL-2cx)は、段階(i)の送達システムの投与の48時間、3日、4日、5日、6日、7日および8日後に投与され得る。別の例において、複合体化インターロイキン2(IL-2cx)は、段階(i)の送達システムの投与の48時間、4日、6日、および8日後に投与され得る。
【００８９】
複合体化IL-2のさらなる投与を、段階(i)の送達システムの投与後、例えば14日、好ましくは9または8日である指示される時間の後に行うことがさらに可能であり；しかし、少なくとも1つの投与は、指示される時間枠において行われる。
【００９０】
別の好ましい態様において、(f)の場合、細胞および第2アジュバントは、段階(i)の送達システムの投与後0時間〜14日の時間枠において、1回のみ投与される。
【００９１】
ペプチド結合主要組織適合遺伝子複合体クラスI(MHC-I)提示細胞および第2アジュバントは、好ましくは、単一の薬学的調製物として投与される。そのような薬学的調製物は、好ましくは、緩衝化合物のような薬学的に許容される賦形剤をさらに含有し得る液体である。そのような薬学的調製物は好ましくは滅菌されている。
【００９２】
使用のための医薬の好ましい態様において、
(x)複合体化インターロイキン2(IL-2cx)は、繰り返し、特に1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13もしくは14回投与され、さらにより好ましくは、複合体化インターロイキン2(IL-2cx)は、1日もしくは2日毎に投与され、かつ／もしくは、5日間〜1ヵ月間、さらにより好ましくは1〜2週間、繰り返し投与され、かつ／または
(xx) 抗原含有タンパク質に由来するペプチドは、アミノ酸8、9もしくは10個の長さを有し、かつ／もしくは、MHC-Iによって、好ましくは対立遺伝子HLA-A2、HLA-A1、HLA-A3、HLA-B7、HLA-B35、HLA-A24、もしくはHLA-A30によって、より好ましくは対立遺伝子HLA-A2によって、提示されるペプチドである。
【００９３】
好ましい態様において、複合体化インターロイキン2(IL-2cx)は、繰り返し、特に1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13もしくは14回投与され、さらにより好ましくは、複合体化インターロイキン2(IL-2cx)は、1日もしくは2日毎に投与され、かつ／または、5日間〜1ヵ月間、繰り返し投与される。従って、上述したように、複合体化IL-2のさらなる投与を、14日、もしくは9もしくは8日の時間枠後に行うことが可能である。
【００９４】
上述したように、ペプチド結合主要組織適合遺伝子複合体クラスI(MHC-I)提示細胞および第2アジュバントを、本発明の使用のための医薬の段階(ii)において再賦活剤として好ましくは投与する。さらに、該ペプチドは、段階(i)に定義される抗原含有タンパク質に由来する。「ペプチドは抗原含有タンパク質に由来する」は、該ペプチドの配列が抗原含有タンパク質の配列の一部である（即ち、抗原含有タンパク質配列の部分配列である）こととして理解される。
【００９５】
「ペプチド結合主要組織適合遺伝子複合体クラスI(MHC-I)提示細胞」は、MHC-Iへの結合によって細胞の表面上に所望のペプチドを提示する細胞として理解される。
【００９６】
一態様において、前記結合は、実施例に記載されるように、インビトロで外部的にMHC-I分子にペプチドを結合することによって達成することができる。あるいは、細胞に抗原含有タンパク質全体をインビトロで供給し、細胞が抗原を処理しそしてMHC-Iのコンテクストにおいて抗原性ペプチドを提示することを可能にすることができるか、または細胞に感染することができるウイルスシステムに細胞をインビトロで曝露し、MHC-Iのコンテクストにおいて多量のペプチドを発現させるか、またはMHC-I保有細胞に、所定のタンパク質もしくはペプチド配列をコードする発現ベクターをトランスフェクトし、再びMHC-Iのコンテクストにおいてペプチドの効率的な提示を生じさせることができる。
【００９７】
MHC-Iのコンテクストにおける細胞への結合のためのペプチドを決定するための方法は、当技術分野において公知である。例えば、Wu et al. (PNAS, 2011, 108(22): 9178-9183)に記載される方法が使用され得る。
【００９８】
例えばインビトロで細胞に外部的に結合させることによって、規定のペプチドを結合に適用する場合、ペプチド配列は当技術分野において公知の方法によって選択され得る。インビトロで細胞に外部的に結合させることは、当技術分野において公知の方法によって、例えば、ペプチドの水溶液を提供し、細胞（これは好ましくは緩衝溶液または媒体中にある）へ該溶液を添加し、細胞をペプチドと共にインキュベートし、それぞれのペプチドによるMHC-Iおよび／またはMHC-IIの高飽和を達成し、そして例えば水溶液で細胞を任意で洗浄することによって、行われ得る。
【００９９】
一つの好ましい態様において、抗原含有タンパク質の部分配列である配列を有する一つのペプチドを細胞にインビトロで結合させる。例えば、一種類のそのようなペプチドを含む水溶液を、好ましくは患者の細胞集団である細胞集団へインビトロで添加してもよい。
【０１００】
あるいは、2、3、4、5、6、7、8、9、10種類またはそれ以上の異なるペプチド結合細胞主要組織適合遺伝子複合体クラスI(MHC-I)提示細胞集団の混合物が段階(ii)において使用され得、これらの細胞には異なるペプチドが結合されており、かつ、これらの細胞は、好ましくは患者の細胞である。
【０１０１】
細胞のそのような混合物は、PBMC細胞のような細胞集団と、2、3、4、5、6、7、8、9、10種類またはそれ以上の異なるペプチドの混合物とをインキュベートし、それによってMHC-Iのコンテクストにおいて異なるペプチドが結合した細胞を得ることによって、得られ得る。あるいは、別個の細胞集団、例えば2、3、4、5、6、7、8、9、10種類またはそれ以上の細胞集団を、異なるペプチド、例えば2、3、4、5、6、7、8、9、10種類またはそれ以上の異なるペプチドと共にインビトロでインキュベートしてもよい。それによって、異なるペプチドがそれぞれ結合した、別個の主要組織適合遺伝子複合体クラスI(MHC-I)提示細胞集団がそれによって得られる。異なるペプチド結合細胞主要組織適合遺伝子複合体クラスI(MHC-I)提示細胞集団を段階(ii)において別々に投与してもよく、または異なるペプチド結合細胞主要組織適合遺伝子複合体クラスI(MHC-I)提示細胞集団の混合物を調製してもよく、次いでこれを段階(ii)において投与してもよい。
【０１０２】
異なるペプチドを用いる場合、特に、2、3、4、5、6、7、8、9、10種類またはそれ以上の異なるペプチドを用いる場合、そのようなペプチドは同じまたは異なる抗原含有タンパク質に由来し得る。好ましい態様において、1つの腫瘍抗原に由来する2、3、4、5、6、7、8、9、10種類またはそれ以上の異なるペプチドを使用してもよい。これは、各ペプチドの配列が腫瘍抗原の部分配列であることを意味する。そのような異なるペプチドの配列は、重複していても重複していなくてもよい。さらなる態様において、2、3、4、5、6、7、8、9、10種類またはそれ以上の異なる腫瘍抗原に由来する2、3、4、5、6、7、8、9、10種類またはそれ以上の異なるペプチドを使用してもよい。そのような態様において、異なる腫瘍抗原は、同じまたは異なる腫瘍に関連しており、好ましくは同じ腫瘍に関連している。
【０１０３】
好ましくは、アミノ酸8、9または10個の長さのペプチド配列が選択される。何故ならば、MHC-Iによって提示されるペプチドが典型的にこの長さのものであるためである。
【０１０４】
Wu et al.においてさらに記載されるように、HLA対立遺伝子は非常に多型性に富む。従って、結合されるペプチドは、好ましくは、頻度の高いHLA対立遺伝子によって提示されるペプチドである。従って、ヒトにおいて、最も頻度の高い対立遺伝子HLA-A2によって提示されるペプチドが特に好ましい。あるいは、白人起源に関連する対立遺伝子であるHLA-A1、-A3、-B7、-B35によって提示されるペプチドが使用され得る。HLA-A24はアジア人に対し使用され得、HLA-A30はアフリカ人に対し使用され得る。
【０１０５】
いくつかの好適な腫瘍関連ペプチドが、Speiser and Romero (Seminars in Immunology 22 (2010) 144-154)およびその中の参考文献に記載されている。それらの大部分は、HLA-A2拘束性のもの、例えば、以下に由来するペプチドである：メラノサイト分化抗原についての、Melan-A/MART-1、gp100エピトープの1つ、およびチロシナーゼ；前立腺についての前立腺表面抗原およびPSAP；粘膜腫瘍についての癌胎児性抗原およびMUC-1；乳癌についてのHER-2/neu；腎細胞癌についてのG250；顆粒球において通常発現され、骨髄性白血病細胞において過剰発現される、2つの骨髄性白血病関連抗原によって共有されるPR1、PR3および好中球エラスターゼ；様々な腫瘍タイプについての共有腫瘍特異的抗原MAGE-AおよびNY-ESO-1；ならびに過剰発現されるタンパク質サバイビンおよびテロメラーゼ。好適なA型インフルエンザ由来ペプチドがWu et al (前記)に記載されている。
【０１０６】
従って、さらなる態様において、抗原含有タンパク質に由来するペプチドは、MHC-Iによって、好ましくは対立遺伝子HLA-A2、HLA-A1、HLA-A3、HLA-B7、HLA-B35、HLA-A24、またはHLA-A30によって、より好ましくは対立遺伝子HLA-A2によって提示されるペプチドである。そのようなペプチドを同定するための方法は、Wu et al. (前記)に記載および要約されている。例えば、Wu et al. (前記)の系統的同定アプローチ、またはそこに記載される好適なアルゴリズムを使用することができる。
【０１０７】
従って、さらなる態様において、抗原含有タンパク質に由来するペプチドは、アミノ酸8、9または10個の長さを有し、かつ、MHC-Iによって、好ましくは対立遺伝子HLA-A2、HLA-A1、HLA-A3、HLA-B7、HLA-B35、HLA-A24、またはHLA-A30によって、より好ましくは対立遺伝子HLA-A2によって提示されるペプチドである。
【０１０８】
使用のための医薬のさらに好ましい態様において、樹状細胞の表面上の受容体は、交差提示樹状細胞の表面上の受容体である。
【０１０９】
交差提示樹状細胞は、MHC-Iのコンテクストにおいてペプチドを提示するために特に適している。交差提示DCは、可溶性のまたはターゲティングされたタンパク質を取り込み、それを処理し、そしてMHC-Iのコンテクストにおいてそれを提示することができる。従来のDCの全てが抗原交差提示をすることができる。定量的に最適な抗原交差提示は、マウスにおいてはXCR1+ DCによって、ヒトにおいてはBDCA3+ DC集団内のXCR1+ DCによって行われる。従って、XCR1+ DCは好ましいマウス交差提示DCであり、BDCA3+ DC集団内のXCR1+ DCは好ましいヒト交差提示DCである。
【０１１０】
使用のための医薬のさらに好ましい態様において、樹状細胞の表面上の受容体は、ケモカイン(Cモチーフ)受容体1(XCR1)、ネクチン様分子2、c型レクチン(CLEC)、例えばCLEC9Aである。
【０１１１】
C型レクチンは、それらの炭水化物認識ドメイン(CRD)において一次および二次構造相同性を共有するCa++依存性グリカン結合タンパク質である。これらのタンパク質は、C型レクチンフォールドを有し、これは、炭水化物に結合しない多くのタンパク質にも存在する非常に可変性のタンパク質配列を有するフォールドである。
【０１１２】
ヒト受容体CLEC9Aの配列は、例えば、Caminschi et al., 2008, Blood 112, 3264-3273に記載されている。CLEC9Aに結合する好適な分子は、例えば、特異的モノクローナル抗CLEC9A抗体である。
【０１１３】
ヒト受容体ネクチン様分子2は、Takai et al., 2003, Cancer Sci 94, 655-667に記載されている。ネクチン様分子2に結合する好適な分子は、例えば、特異的抗ネクチン様分子2モノクローナル抗体である。
【０１１４】
送達システムは、免疫系において、Th1応答に、任意でさらにTh2応答に影響を与えるために特に適している。
【０１１５】
XCR1はケモカイン受容体であり、現在のところ、ケモカイン受容体の「C」サブファミリの唯一のメンバーである。それはGPR5またはCCXCR1としても公知である。オーファンGタンパク質共役型受容体として以前にクローニングされたGPR5は、最初にヒトにおいて、次いでマウスにおいて、XCL1についての単一特異的受容体として認識され、従ってXCR1と呼ばれた。
【０１１６】
XCR1の天然のリガンドは、ATAC、リンホタクチンまたはSCM-1としても公知であるXCL1である。それはケモカインのCファミリーの唯一のメンバーである。活性化により誘導されT細胞に由来しケモカインに関連するサイトカイン（activation-induced, T cell-derived, and chemokine-related cytokine：ATAC)は、ヒトにおいてクローニングされ(Muller et al., 1995, Eur. J. Immunol. 25, 1744-48)、独立して、マウスにおいてリンホタクチン(Kelner et al., 1994, Science 266, 1395-99)、ヒトにおいてSCM-1(Yoshida et al., 1995, FEBS Lett. 360, 155-9)としてクローニングされた。ケモカインの命名法により、ATAC／リンホタクチン／SCM-1は、現在、「XCL1」と名付けられている。XCL1は、主として、活性化されたCD8+ T細胞、Th1 CD4+ T細胞、およびNK細胞により分泌される。ヒトにおいて、全長タンパク質の28位および29位のアミノ酸アスパラギン酸およびリジンがそれぞれヒスチジンおよびアルギニンに交換された、XCL2と名付けられたXCL1のバリアントが、記載されており(Yoshida et al., 1996, FEBS Lett. 395, 82-8)、それも、本発明のために使用され得る。生物活性型のXCL1を作製するための例示的な方法は、WO 2009/065561の実施例8に記載される。その他の生物活性型のXCL1、例えば、他の種のものを作製するためにも、類似した方法が使用され得る。
【０１１７】
さらにより好ましい態様において、樹状細胞の表面上の受容体はXCR1である。
【０１１８】
ヒトXCR1のアミノ酸配列は公知である(NCBI; アクセッションNP_001019815)：
0006698541.tif 000002
【０１１９】
使用のための医薬のさらに好ましい態様において、(a)の分子は、受容体に対するリガンドまたは受容体に対する抗体もしくは抗体断片である。さらにより好ましい態様において、受容体はケモカイン(Cモチーフ)受容体1(XCR1)であり、(a)の分子は、抗XCR1抗体もしくはその断片またはケモカイン(Cモチーフ)リガンド1(XCL1)もしくはその機能的活性バリアントであり、特に、SEQ ID NO: 7〜10、好ましくはSEQ ID NO: 8〜10、より好ましくはSEQ ID NO: 9または10のいずれか、特にSEQ ID NO: 10の配列を含むかまたは該配列からなる。
【０１２０】
いくつかの種のXCL1(ATAC)のアミノ酸配列(ヒト: SEQ ID NO: 1, GenBankアクセッションP47992；マウス: SEQ ID NO: 2, GenBankアクセッションP47993；およびラット SEQ ID NO: 3, GenBankアクセッションP51672を含む)が公知であり、SEQ ID NO: 1〜3として示される(下記を参照のこと)。さらに、ウイルスケモカイン様タンパク質であるK4.1 HHV8(SEQ ID NO:4, GenBankアクセッションAAB62672.1)(下記を参照のこと)と呼ばれる特異的なXCLR1アゴニストも公知である。これらの天然に存在するXCR1リガンドまたはその他の天然に存在するXCR1リガンドのうちの任意のものが使用され得る。
【０１２１】
あるいは、任意の天然に存在するXCL1の機能的に活性なバリアントが使用されてもよい。バリアントという用語には、断片、1つまたは複数のアミノ酸の付加、欠失、および／または置換に由来するバリアント、ならびに、融合タンパク質のような、任意の天然に存在するXCL1またはその一部分を含む分子、特に、タンパク質が包含される。融合タンパク質のXCL1部分には、アミノ酸残基がC末端に隣接していてもよいし、N末端に隣接していてもよいし、またはC末端およびN末端に隣接していてもよい。
【０１２２】
機能的に活性な断片は、1つまたは複数のアミノ酸欠失により、任意の天然に存在するXCR1リガンド、特にXCL1、特にSEQ ID NO:1〜4のものに由来することを特徴とする。欠失は、C末端、N末端、および／または内部にあり得る。好ましくは、断片は、多くても1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、または60個、より好ましくは多くても1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、または30個、さらに好ましくは多くても1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、または15個、さらに好ましくは多くても1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個、最も好ましくは1、2、3、4、または5個のアミノ酸欠失により得られる。本発明の機能的に活性な断片は、XCR1と結合して(b)のタンパク質の内部移行を媒介する能力を含む、それが由来するリガンドにより示されるものに類似している生物学的活性を有することを特徴とする。天然に存在するXCR1リガンド、特にXCL1、特にSEQ ID NO:1〜4のものの断片は、断片の活性（結合および内部移行）が、配列改変のないXCL1の活性の少なくとも10％、好ましくは少なくとも25％、より好ましくは少なくとも50％、さらにより好ましくは少なくとも70％、さらにより好ましくは少なくとも80％、特に少なくとも90％、特に少なくとも95％、最も好ましくは少なくとも99％となる場合、本発明の状況において機能的に活性である。これらの断片は、約18〜50アミノ酸長のような短い長さを含む、任意の所望の長さで設計され入手され得る。
【０１２３】
天然に存在するXCR1リガンド、特にXCL1、特にSEQ ID NO:1〜4のものの機能的に活性な断片は、その他の構造的特色も特徴とし得る。従って、本発明の一つの好ましい態様において、機能的に活性な断片は、SEQ ID NO:1〜4のいずれかのXCR1リガンドのアミノ酸の少なくとも60％、好ましくは少なくとも70％、より好ましくは少なくとも80％、さらにより好ましくは少なくとも90％、さらにより好ましくは少なくとも95％、最も好ましくは99％からなる。上に定義されたような機能的に活性な断片は、1つまたは複数のアミノ酸欠失によりペプチドに由来するかもしれない。欠失は、C末端、N末端、および／または内部にあり得る。SEQ ID NO:1〜4の上記の配列アラインメントは、保存されていると考えられる天然に存在するリガンドのドメインを示している。本発明の好ましい態様において、これらのドメインは断片において維持されるべきである。
【０１２４】
保存されたドメインには、1〜2位（V/S G）、13〜27位
0006698541.tif 000003
、35〜51位
0006698541.tif 000004
のプロセシングされたN末端（プロセシングされたN末端は、SEQ ID NO: 1〜3についてはプロセシングされていないN末端のアミノ酸22から開始し、SEQ ID NO: 4についてはアミノ酸27から開始する）のアミノ酸、ならびに11位および48位のシステイン残基の間のジスルフィド架橋が含まれる（上記アラインメントも参照のこと）。SEQ ID NO: 1〜4の配列のコンセンサス配列は、同一アミノ酸のみを考慮した場合には、
0006698541.tif 000005
であり、同一アミノ酸および多数派アミノ酸（即ち、配列四つのうち三つに存在するアミノ酸；代替アミノ酸はスラッシュの後にリストされる）を考慮した場合には、
0006698541.tif 000006
である。SEQ ID NO: 1〜3の配列のコンセンサス配列は、同一アミノ酸のみを考慮した場合には、
0006698541.tif 000007
であり、同一アミノ酸および多数派アミノ酸（即ち、配列三つのうち二つに存在するアミノ酸；代替アミノ酸はスラッシュの後にリストされる）を考慮した場合には、
0006698541.tif 000008
である。
【０１２５】
従って、本発明における使用のための好ましい送達システムにおいて、XCL1の機能的に活性なバリアント、好ましくは機能的に活性な断片は、SEQ ID NO: 7〜10のいずれか、好ましくはSEQ ID NO: 8〜10のいずれか、より好ましくはSEQ ID NO: 9または10のいずれか、特にSEQ ID NO: 10の配列を含むか、またはこれらからなる。
【０１２６】
本発明のさらに好ましい態様において、XCR1リガンドが、SEQ ID NO:1〜4のいずれかのXCR1リガンドの機能的に活性なバリアントであり、該バリアントが、SEQ ID NO:1〜4のいずれかのXCR1リガンドとの少なくとも50％の配列同一性を有する、上に定義されたようなXCL1バリアントを使用する。より好ましい態様において、機能的に活性なバリアントは、SEQ ID NO:1〜4のいずれかの抗原との少なくとも60％、好ましくは少なくとも70％、より好ましくは少なくとも80％、さらに好ましくは少なくとも90％、さらに好ましくは少なくとも95％、最も好ましくは99％の配列同一性を有する。
【０１２７】
配列同一性の割合は、例えば、配列アラインメントにより決定され得る。比較のための配列のアラインメントの方法は、当技術分野において周知である。様々なプログラムおよびアラインメントアルゴリズムが、例えばSmith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482, 1981またはPearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85: 2444-2448, 1988に記載されている。
【０１２８】
NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410, 1990)は、配列分析プログラムblastp、blastn、blastx、tblastn、およびtblastxに関連した使用のため、National Center for Biotechnology Information（NCBI,Bethesda,MD）を含むいくつかの供給元から、そしてインターネット上で入手可能である。SEQ ID NO:1〜4の配列のいずれかの抗原のバリアントは、典型的には、デフォルトパラメーターに設定されたNCBI Blast 2.0、gapped blastpを使用して特徴決定される。少なくとも35アミノ酸のアミノ酸配列の比較のためには、Blast 2 sequences機能が、デフォルトパラメーター（11のgap existence costおよび1のper residue gap cost）に設定されたデフォルトBLOSUM62マトリックスを使用して利用される。短いペプチド（約35アミノ酸未満）を整列化する場合には、アラインメントは、デフォルトパラメーター（open gap 9、extension gap 1 penalties）に設定されたPAM30マトリックスを利用して、Blast 2 sequences機能を使用して実施される。15アミノ酸以下のような、そのような短いウィンドウで配列同一性を決定する方法は、National Center for Biotechnology Information（Bethesda,Maryland）により維持されているウェブサイト（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）に記載されている。
【０１２９】
あるいは、複数の配列のアラインメントは、ClustalVアラインメントアルゴリズム（Higgins et al., 1992, Comput. Appl. Biosci. 8, 189-91）を利用して、DNAStar（Madison,WI,USA）のMegAlign Sofwareを使用して実施され得る。上記のアラインメントにおいては、このソフトウェアが使用され、以下のデフォルトパラメーターに設定された：gap penalty 10、gap length penalty 10。極めて低い相同性のため、アラインメントにSEQ ID NO:4を含めるのには、手動の調整が必要であった。
【０１３０】
機能的に活性なバリアントは、天然に存在するXCR1リガンドの配列改変により入手され、ここで、配列改変を有するXCR1リガンドは、未改変のXCR1リガンドの機能を保持しており、例えば、XCR1と結合して段階(i)における(b)のタンパク質の内部移行を媒介する能力を含む、天然に存在するXCR1リガンドにより示されるものに類似している生物学的活性を有する。そのような配列改変には、保存的置換、欠失、変異、および挿入が含まれ得るが、これらに限定はされない。機能的に活性なバリアントのこれらの特徴は、例えば、上に詳述されたようにして査定され得る。
【０１３１】
さらにより好ましい態様において、使用のためのXCL1の機能的に活性なバリアントは、保存的置換により、SEQ ID NO:1〜4の配列のいずれかの天然に存在するXCR1リガンドに由来する。保存的置換とは、側鎖および化学的特性が関連しているアミノ酸ファミリーの内部で起こるものである。そのようなファミリーの例は、塩基性側鎖を含むアミノ酸、酸性側鎖を有するアミノ酸、無極性脂肪族側鎖を有するアミノ酸、無極性芳香族側鎖を有するアミノ酸、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸、小さな側鎖を有するアミノ酸、大きい側鎖を有するアミノ酸等である。一態様において、1個の保存的置換がペプチドに含まれる。別の態様において、2個以下の保存的置換がペプチドに含まれる。さらなる態様において、3個以下の保存的置換がペプチドに含まれる。
【０１３２】
保存的アミノ酸置換の例には、以下にリストされたものが含まれるが、これらに限定はされない。
0006698541.tif 000009
【０１３３】
本発明に従う使用のための好適なモノクローナル抗XCR1抗体は、例えば、WO 2009/065561に開示されるmAb 6F8、またはMARX10(Bachem et al., 2012, Front Immunol 3, 214)である。
【０１３４】
抗XCR1抗体もしくはその機能的に活性な断片は、一つの好ましい態様において、段階(i)において受容体としてのXCR1に結合する分子として使用され得る。抗XCR1抗体またはその機能的に活性な断片は、XCR1へ特異的に結合することができる。抗体の機能的に活性な断片は、XCL1の機能的に活性な断片（上記参照）と同様に定義され、即ち、機能的に活性な断片は、（a）C末端欠失、N末端欠失、および／または内部欠失のような1つまたは複数のアミノ酸欠失により任意の抗XCR1抗体に由来することを特徴とし、かつ（b）XCL1との結合能を含む、それが由来する抗XCR1抗体により示されるものに類似している生物学的活性を有することを特徴とする。天然に存在する抗体は、外来物質を同定し中和するために免疫系により使用されるタンパク質である。天然に存在する抗体は、各々、二つの大きい重鎖および二つの小さな軽鎖を有し、異なる抗原に結合することができる。本発明には、例えば、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、およびヒト化抗体が含まれ、Fab断片、Fab、Fab'、F(ab')2'、Fv、またはFab発現ライブラリーの産物も含まれる。抗体もしくは抗体成分は、その生物学的半減期を延ばすためにさらに修飾されてもよいし、またはそれらをターゲティングにさらに適したものにするためその他の方式で修飾されてもよい。XCR1に対して作製された抗体は、XCR1もしくはその断片を動物に直接注射することにより、またはXCR1もしくはその断片を動物、好ましくは非ヒトに投与することにより入手され得る。このようにして入手された抗体は、次いで、XCR1に結合するであろう。モノクローナル抗体の作製のためには、連続細胞系培養物、例えば、ハイブリドーマ細胞系により産生された抗体を提供する、当技術分野において公知の任意の技術が使用され得る。好適なモノクローナル抗体の作製は、WO 2009/065561にも詳述される。単鎖抗体の作製のための記載されている技術（米国特許第4,946,778号）は、XCR1に対する単鎖抗体を作製するために適合し得る。また、トランスジェニックのマウスまたはその他の哺乳動物のようなその他の生物が、XCR1に対するヒト化抗体を発現させるために使用されてもよい。
【０１３５】
使用のための医薬のさらに好ましい態様において、
・  (b)の抗原含有タンパク質は、(a)の分子との融合タンパク質にあり；かつ／または
・  (b)の抗原含有タンパク質の抗原は、免疫原、病原体由来抗原、もしくは腫瘍抗原である。
【０１３６】
従って、一つの好ましい態様において、(b)の抗原含有タンパク質は、(a)の分子との融合タンパク質にある。そのような融合タンパク質は、例えば、合成的にまたは組換え的に、好ましくは組換え的に合成され得る。そのような融合タンパク質は、樹状細胞への効率的なターゲティングを可能にする。例えば、抗体MARX10とOVAとの融合タンパク質、およびXCL1とOVAとの融合タンパク質が、実施例において成功裏に使用された。
【０１３７】
免疫原とは、免疫応答を刺激する抗原である。抗原は、免疫系内で、T細胞上（T細胞受容体）およびB細胞上（B細胞受容体）の特異的な受容体により認識される物質であり、通常、タンパク質または多糖である。これには、細菌、ウイルス、およびその他の微生物の一部分（被膜、莢膜、細胞壁、鞭毛、線毛、および毒素）が含まれる。一般に、脂質および核酸は、タンパク質および多糖と組み合わせられた場合にのみ、抗原性である。非微生物性の外因性（非自己）抗原には、花粉、卵白、ならびに移植された組織および器官に由来する、または輸血された血球の表面上のタンパク質が含まれ得る。
【０１３８】
抗原は、内因性または外因性に分類され得る。本発明の好ましい抗原は外因性抗原である。
【０１３９】
好ましくはウイルス、細菌および／または真核生物性寄生生物の、病原体由来抗原を使用する場合、医薬は、好ましくは、そのような病原体での感染症に対して細胞性の細胞傷害性免疫応答を誘導することにおいて使用するためのものである。
【０１４０】
腫瘍抗原を使用する場合、医薬は、好ましくは、そのような腫瘍に対して細胞性の細胞傷害性免疫応答を誘導することにおいて使用するためのものである。
【０１４１】
樹状細胞は、MHCクラスI分子を介して外因性抗原を提示することができ、この過程は「交差提示」として公知である。
【０１４２】
使用のための医薬のさらに好ましい態様において、(c)の第1アジュバントおよび第2アジュバントは、独立して、Th-1媒介応答を支持するアジュバントであり、好ましくは、それらは、合成もしくは組換えのRIG-Iアゴニスト、TLRリガンド、例えばポリICLCおよびレシキモド(R848)、モンタニド（Montanide）、例えばISA51、ISA720、サポニン、例えばQuil-A、ISCOM、QS-21、AS02およびAS01、ポリイノシン:ポリシチジル酸(ポリI:C)、リポ多糖(LPS)、ならびにCpGオリゴデオキシヌクレオチドからなる群より独立して選択され、より好ましくは、RIG-Iアゴニスト、およびTLRリガンド、例えばレシキモド(R848)、ポリICLCおよびポリイノシン:ポリシチジル酸(ポリI:C)より選択される。
【０１４３】
(c)の第1アジュバントおよび第2アジュバントを両方とも使用する場合、それらは同じであってもよく、またはそれらは互いに異なっていてもよい。
【０１４４】
ポリICLCは、ポリ-L-リジンおよびカルボキシメチルセルロースで安定化されたポリICからなり、Th1応答を支持することにおいて強力である。
【０１４５】
R848は、マウスにおいてはTLR7についての、ヒトにおいてはTLR7およびTLR8についての選択的リガンドであり、NLRパイリンドメイン含有3(NLRP3)インフラマソームを活性化する。
【０１４６】
ポリICLCおよびR848については、Tacken and Figdor (前記)およびそこに引用される参考文献を参照されたい。
【０１４７】
モンタニド、例えばISA51およびISA720は、Speiser and Romeroおよびそこに引用される参考文献に開示されるように、乳化剤としてスクアレンおよびマンニドモノオレアートを含有する油中水型乳剤である。
【０１４８】
サポニン、例えばQuil-A、ISCOM、QS-21、AS02およびAS01は、Speiser and Romeroおよびそこに引用される参考文献に開示されるように、植物から単離されたトリテルペン配糖体である。
【０１４９】
アジュバントは、単独で与えられた場合は直接的な効果をたとえあったとしてもほとんど有さないが、他の薬剤の効果を改変する薬剤である。薬理学において、アジュバントは、単独では薬理学的効果をほとんど有さないかまたは有さないが、同時に与えられると他の薬物の効能または効力を増加させ得る薬物である。免疫学において、アジュバントは、それ自体ではいかなる特異的抗原性効果も有さないが、免疫系を刺激し得、ワクチンに対する応答を増加させる薬剤である。本発明において使用されるアジュバントは好ましくはTh1応答を支持する。Th-1応答（または1型T細胞応答）を支持するまたは誘導するアジュバントは、DCにおいてIL-12を誘導することができかつ応答性抗原反応性CD8+およびCD4+ T細胞によるIL-2、IFN-γおよびTNF-αの分泌、ならびに抗原反応性細胞傷害性CD8+およびCD4+ T細胞による細胞傷害性分子グランザイムBおよびパーフォリンの産生をもたらすアジュバントと理解される。Th1応答を支持する好適な好ましい第1および第2のアジュバントは当技術分野において公知であり、例えば、Tacken and Figdor、およびSpeiser and Romeroに記載されている（Tacken P.J., Figdor C.G.; Targeted antigen delivery and activation of dendritic cells in vivo: Steps towards cost effective vaccines. Semin. Immunol. (2011), doi:10.1016/j.smim.2011.01.001; Speiser D.E. and Romero P., Seminars in Immunology 22 (2010) 144-154）。
【０１５０】
樹状細胞(DC)は、「デンジャーシグナル」認識受容体（例えば、トール様受容体、NOD様受容体）の大きなセットを介して、抗原が危険な性質のものであるかどうかまたはそれが無害であるかどうかを感知することができる。「デンジャーシグナル」認識受容体（「パターン認識受容体」とも呼ばれる）によって認識されるパターンは、通常、微生物に特有である分子構造である。これらは、微生物の場合は細胞壁成分（例えば、リポ多糖、ペプチドグリカン）または核酸修飾（例えば、非メチル化CpGモチーフ）、またはウイルスDNAもしくはウイルスRNAに特有である構造的特徴および修飾（例えば、二本鎖RNA）であり得る。さらに、体内においてアポトーシスにより瀕死の状態にある細胞は、「デンジャーシグナル」認識受容体を誘発することができる分子（例えば、高移動度群タンパク質B1（High Mobility Group Protein B1）、熱ショックタンパク質）を放出する。そのようなデンジャーシグナルは、本発明の第1および第2のアジュバントが好まれる。
【０１５１】
使用のための医薬のさらに好ましい態様において、再賦活剤は、好ましくはIL-2cxと組み合わせた、ペプチド結合主要組織適合遺伝子複合体クラスI(MHC-I)提示細胞および第2アジュバントであり、ここで、細胞は血液細胞、特に末梢血単核細胞(PBMC)である。
【０１５２】
使用のための医薬のさらに好ましい態様において、T細胞は、CD8+ T細胞またはCD4+ T細胞、好ましくはCD8+ T細胞である。
【０１５３】
特に、CD8+ T細胞の再活性化は、強力でありかつ増強された細胞傷害性免疫応答を得るために特に有利である。
【０１５４】
使用のための医薬のさらに好ましい態様において、時間枠は、72時間〜12日、72時間〜9日、特に5日〜8日、5日〜9日または5日〜12日である。
【０１５５】
一つの好ましい態様において、方法の段階(i)および(ii)を1回のみ行う。
【０１５６】
しかしながら、免疫系が再び落ち着いた場合、同じ送達システムおよび同じ再賦活剤を用いて方法の段階を繰り返すことが可能である。これは、典型的に、上述のように本発明に従って細胞性の細胞傷害性免疫応答を誘導した後、少なくとも1ヵ月後、好ましくは少なくとも2ヵ月後に当てはまる。
【０１５７】
従って、別の好ましい態様において、段階(i)に従って同じ送達システムおよび段階(ii)に従って同じ再賦活剤を用いる方法の段階を、本発明の方法の段階を行った後、少なくとも1、2、または3ヵ月後に、繰り返す。
【０１５８】
あるいは、方法の段階を、段階(i)に従って異なる送達システムを用いて繰り返してもよく、好ましくは、該異なる送達システムは、異なる抗原含有タンパク質(b)、および任意で、樹状細胞の表面上の受容体に結合する異なる分子(a)を含む。そのような態様においては、免疫系が再び落ち着くまで待つ必要はない。従って、方法は、最初の送達システムを用いて初めて本発明の方法の段階を行った例えば7または14日後に、異なる送達システムを用いて繰り返してもよい。そのような態様において、同じまたは異なる再賦活剤を段階(ii)において使用してもよい。
【０１５９】
別の態様において、本発明は、
(i)抗原に対して活性化されたT細胞を有する患者に、ペプチド結合主要組織適合遺伝子複合体クラスI(MHC-I)提示細胞および第2アジュバントを投与する段階であって、該ペプチドが抗原含有タンパク質に由来しそれによって活性化T細胞を再活性化し、任意で、複合体化インターロイキン2(IL-2cx)がさらに投与される、前記段階
を含む、抗原含有タンパク質に対する細胞性の細胞傷害性免疫応答を延長する方法における使用のための医薬であって、
段階(i)の再賦活剤が、T細胞が抗原に対して活性化された後の0時間〜14日の時間枠において投与される、前記医薬に関する。
【０１６０】
「細胞性の細胞傷害性免疫応答」は、所定の抗原に対して誘発され得るTh1型の液性および細胞性の（細胞傷害性）免疫反応と理解される。これは、主にTh2抗原提示経路を扱いかつ主にTh2型(中和)抗体および免疫反応の発生をもたらす古典的なワクチンに対する応答とは対照的である。
【０１６１】
「延長された」細胞性の細胞傷害性免疫応答は、本発明の使用のための医薬の段階(i)の送達システムによって得られる細胞性の細胞傷害性免疫応答と比較して、より長い間生じる細胞性の細胞傷害性免疫応答と理解される。例えば、応答は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14日、またはそれ以上延長され得る。
【０１６２】
この態様について、適用可能な場合、上述の本発明の使用のための医薬についての態様と同じ好ましい態様が適用される。
【０１６３】
ある態様において、細胞および第2アジュバントを、T細胞が抗原に対して活性化された後の0時間〜14日の時間枠において投与する。
【０１６４】
一つの好ましい態様において、細胞および第2アジュバントを、T細胞が抗原に対して活性化された後の0時間〜14日の時間枠において、1回のみ投与する。
【０１６５】
さらに好ましい態様において、細胞および第2アジュバントを、T細胞が抗原に対して活性化された後の48時間〜14日の時間枠において投与する。
【０１６６】
例えば、細胞および第2アジュバントを、T細胞が抗原に対して活性化された48時間、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日、13日または14日後に投与する。
【０１６７】
より好ましい態様において、細胞および第2アジュバントを、T細胞が抗原に対して活性化された後の5日〜9日、5日〜12日または3日〜9日、さらにより好ましくは4日〜8日または5日〜12日の時間枠において、例えば4日、5日、6日、7日、8日後に投与する。
【０１６８】
別の好ましい態様において、細胞および第2アジュバントを、T細胞が抗原に対して活性化された後の0時間〜14日の時間枠において、1回のみ投与する。
【０１６９】
さらに好ましい態様において、細胞および第2アジュバントを、T細胞が抗原に対して活性化された後の48時間〜14日の時間枠において、1回のみ投与する。
【０１７０】
例えば、細胞および第2アジュバントを、T細胞が抗原に対して活性化された48時間、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日、13日または14日後に、1回のみ投与する。
【０１７１】
さらに好ましい態様において、細胞および第2アジュバントを、T細胞が抗原に対して活性化された後の5日〜9日、5日〜12日または3日〜9日、さらにより好ましくは4日〜8日または5日〜12日の時間枠において、例えば4日、5日、6日、7日、8日後に、1回のみ投与する。
【０１７２】
一つの好ましい態様において、複合体化インターロイキン2(IL-2cx)と、ペプチド結合主要組織適合遺伝子複合体クラスI(MHC-I)提示細胞および第2アジュバントとの組み合わせを、投与する。より好ましい態様において、複合体化インターロイキン2(IL-2cx)を、ペプチド結合主要組織適合遺伝子複合体クラスI(MHC-I)提示細胞および第2アジュバントの投与前に、投与と同時に、または投与後に投与してもよい。好ましくは、T細胞が抗原に対して活性化された後の0時間〜14日の時間枠において、ペプチド結合主要組織適合遺伝子複合体クラスI(MHC-I)提示細胞および第2アジュバントが1回のみ投与され、複合体化インターロイキン2(IL-2cx)が繰り返し投与される。そのような態様において、複合体化IL-2が、ペプチド結合主要組織適合遺伝子複合体クラスI(MHC-I)提示細胞および第2アジュバントの投与前、投与と同時、および／または投与後のいずれにおいても投与され得る。
【０１７３】
組み合わせについて、細胞単独の投与についての態様と同じ好ましい態様が、ペプチド結合主要組織適合遺伝子複合体クラスI(MHC-I)提示細胞および第2アジュバントの投与について適用される。
【０１７４】
一態様において、組み合わせの場合、細胞および第2アジュバントを、T細胞が抗原に対して活性化された後の0時間〜14日の時間枠において、1回のみ投与する。
【０１７５】
好ましい態様において、組み合わせの場合、細胞および第2アジュバントを、T細胞が抗原に対して活性化された後の48時間〜14日の時間枠において投与する。
【０１７６】
例えば、組み合わせの場合、細胞および第2アジュバントを、T細胞が抗原に対して活性化された48時間、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日、13日または14日後に投与する。
【０１７７】
より好ましい態様において、組み合わせの場合、細胞および第2アジュバントを、T細胞が抗原に対して活性化された後の3日〜9日、さらにより好ましくは4日〜8日の時間枠において、例えば4日、5日、6日、7日、8日後に投与する。
【０１７８】
別の好ましい態様において、組み合わせの場合、細胞および第2アジュバントを、T細胞が抗原に対して活性化された後の0時間〜14日の時間枠において、1回のみ投与する。
【０１７９】
例えば、細胞および第2アジュバントを、T細胞が抗原に対して活性化された48時間、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日、13日または14日後に、1回のみ投与する。
【０１８０】
さらに好ましい態様において、組み合わせの場合、細胞および第2アジュバントを、T細胞が抗原に対して活性化された後の3日〜9日、さらにより好ましくは4日〜8日の時間枠において、例えば4日、5日、6日、7日、8日後に、1回のみ投与する。
【０１８１】
組み合わせの場合、複合体化インターロイキン2(IL-2cx)を、T細胞が抗原に対して活性化された後の0時間〜14日の時間枠において、T細胞が抗原に対して活性化された後、繰り返し好ましくは投与する。複合体化IL-2のさらなる投与を、T細胞が抗原に対して活性化された後、14日後に行うことがさらに可能であり；しかし、少なくとも1つの投与は0時間〜14日の時間枠において行われる。
【０１８２】
さらに好ましい態様において、組み合わせの場合、複合体化インターロイキン2(IL-2cx)を、T細胞が抗原に対して活性化された後の48時間〜9日、さらにより好ましくは3日〜8日の時間枠において、例えば3日、4日、5日、6日、7日、8日後に、好ましくは投与する。
【０１８３】
なおさらに好ましい態様において、組み合わせの場合、複合体化インターロイキン2(IL-2cx)は、T細胞が抗原に対して活性化された後の48時間〜9日、さらにより好ましくは3日〜8日の時間枠において、例えば3日、4日、5日、6日、7日、8日後に、繰り返し好ましくは投与される。従って、複合体化インターロイキン2(IL-2cx)は、T細胞が抗原に対して活性化された後の48時間〜9日、さらにより好ましくは3日〜8日の時間枠において、例えば3日、4日、5日、6日、7日、8日後に、1、2、3、4、5、6、7、8、9または10回、好ましくは投与される。例えば、複合体化インターロイキン2(IL-2cx)は毎日または2日毎に投与され得る。例えば、複合体化インターロイキン2(IL-2cx)は、T細胞が抗原に対して活性化された48時間、3日、4日、5日、6日、7日および8日後に投与され得る。別の例において、複合体化インターロイキン2(IL-2cx)は、T細胞が抗原に対して活性化された48時間、4日、6日、および8日後に投与され得る。
【０１８４】
複合体化IL-2のさらなる投与を、段階(i)の送達システムの投与後、例えば14日、好ましくは9または8日である指示される時間の後に行うことがさらに可能であり；しかし、少なくとも1つの投与は、指示される時間枠において行われる。
【０１８５】
従って、さらに好ましい態様において、組み合わせの場合、
(A)細胞および第2アジュバントは、T細胞が抗原に対して活性化された後の0時間〜14日、好ましくは48時間〜14日の時間枠において、より好ましくは3日〜9日、さらにより好ましくは4日〜8日の時間枠において、例えば4日、5日、6日、7日、8日後に、さらにより好ましくは、T細胞が抗原に対して活性化された後の48時間〜14日の時間枠において1回のみ、より特には3日〜9日の時間枠において1回のみ、さらにより特には4日〜8日の時間枠において、例えば4日、5日、6日、7日、8日後に1回のみ、投与され、かつ
(B)複合体化インターロイキン2(IL-2cx)は、T細胞が抗原に対して活性化された後の0時間〜14日、より好ましくは48時間〜9日、さらにより好ましくは3日〜8日の時間枠において、例えば3日、4日、5日、6日、7日、8日後に投与され、最も好ましくは、T細胞が抗原に対して活性化された後の0時間〜14日、より好ましくは48時間〜9日、さらにより好ましくは3日〜8日の時間枠において、例えば3日、4日、5日、6日、7日、8日後に、繰り返し投与される。
【０１８６】
組み合わせの場合、複合体化IL-2のさらなる投与を、T細胞が抗原に対して活性化された後、14日後に行うことがさらに可能であり；しかし、少なくとも1つの投与は0時間〜14日の時間枠において行われる。
【０１８７】
なおさらに好ましい態様において、組み合わせの場合、複合体化インターロイキン2(IL-2cx)は、T細胞が抗原に対して活性化された後の48時間〜9日、さらにより好ましくは3日〜8日の時間枠において、例えば3日、4日、5日、6日、7日、8日後に、繰り返し好ましくは投与される。従って、複合体化インターロイキン2(IL-2cx)は、T細胞が抗原に対して活性化された後の48時間〜9日、さらにより好ましくは3日〜8日の時間枠において、例えば3日、4日、5日、6日、7日、8日後に、1、2、3、4、5、6、7、8、9または10回、好ましくは投与される。例えば、複合体化インターロイキン2(IL-2cx)は毎日または2日毎に投与され得る。例えば、複合体化インターロイキン2(IL-2cx)は、T細胞が抗原に対して活性化された48時間、3日、4日、5日、6日、7日および8日後に投与され得る。別の例において、複合体化インターロイキン2(IL-2cx)は、T細胞が抗原に対して活性化された0時間、48時間、4日、6日、および8日後に投与され得る。
【０１８８】
複合体化IL-2のさらなる投与を、T細胞が抗原に対して活性化された後、例えば14日、好ましくは9または8日である指示される時間の後に行うことがさらに可能であり；しかし、少なくとも1つの投与は、指示される時間枠において行われる。
【０１８９】
別の好ましい態様において、組み合わせの場合、細胞および第2アジュバントを、T細胞が抗原に対して活性化された後の0時間〜14、好ましくは48時間〜14日の時間枠において、1回のみ投与する。
【０１９０】
本発明者らはXCR1+ DC中への抗原のターゲティング後のADASの効果を試験したが、本発明者らの結果から、インビボでのT細胞受容体誘発によってCD8+ T細胞および／またはCD4+ T細胞の有意な初期活性化(「プライミング」)または再活性化をもたらす何らかのシステムをADASアプローチで増幅することができると結論付けることができる。T細胞集団は最初にインビトロでも活性化され、その後インビボで養子移入され得、その結果、次いでADASが、インビボでT細胞エフェクター応答を増幅するために使用され得る。
【０１９１】
従って、一態様において、抗原に対して活性化されたT細胞は、送達システムを使用する段階(i)における使用のための医薬の状態で、上述したような方法を行うことによって得ることができる。
【０１９２】
別の好ましい態様において、抗原に対して活性化されたT細胞は、インビトロで得ることができる。この目的のために、処置される患者から好ましくは得られる未選択のT細胞を抗原または抗原含有タンパク質およびAPCと共培養し、抗原応答性T細胞を、例えばIFN-γ分泌アッセイによって選択し、そして成長因子を用いて拡大する。あるいは、抗原特異的T細胞を、適切な四量体またはそのアナログを使用して選別し、APCの存在下で抗原へ曝露し、そして成長因子を用いて拡大する。
【０１９３】
使用のための医薬の好ましい態様において、MHC-I提示細胞は、血液細胞、特に末梢血単核細胞(PBMC)である。
【０１９４】
MHC-I提示細胞は、好ましくは、処置される患者から得られた細胞である。そのような細胞を得るための方法は当業者に公知である。例えば、血液が採取され得、次いでPBMC細胞が単離され得る。
【０１９５】
使用のための医薬のさらに好ましい態様において、複合体化インターロイキン2(IL-2cx)が投与され、好ましくは、繰り返し、特に1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13もしくは14回投与され、さらにより好ましくは、複合体化インターロイキン2(IL-2cx)が、1日もしくは2日毎に投与され、かつ／または、5日間〜1ヵ月間、さらにより好ましくは1〜2週間、繰り返し投与される。
【０１９６】
使用のための医薬のさらに好ましい態様において、抗原含有タンパク質に由来するペプチドは、アミノ酸8、9もしくは10個の長さを有し、かつ／または、MHC-Iによって、好ましくは対立遺伝子HLA-A2、HLA-A1、HLA-A3、HLA-B7、HLA-B35、HLA-A24、もしくはHLA-A30によって、より好ましくは対立遺伝子HLA-A2によって提示されるペプチドである。
【０１９７】
使用のための医薬のさらに好ましい態様において、患者は、哺乳動物、特にヒトである。
【０１９８】
使用のための医薬のさらに好ましい態様において、細胞性の細胞傷害性免疫応答を誘導する方法は、腫瘍および／または感染症の予防的処置または処置のためのものである。
【０１９９】
使用のための医薬は、感染症から保護するために提供され得る（「予防的処置」）。あるいは、そのような医薬は、治療目的のために使用され得る。病原体に対して十分なTh1免疫応答を開始することができない場合のある感染個体には、細胞性細胞傷害応答を誘導および／または延長するよう設計された医薬が投与され得、従って、感染症を封じ込めるまたは根絶することができるようになるであろう（「処置する」）。例は、マラリア、結核、リーシュマニア、プリオン病、オルトミクソウイルス、特にインフルエンザ、A型肝炎、B型肝炎、慢性C型肝炎、HIVおよび他のレンチウイルス、サイトメガロウイルス、ヘルペスウイルス、乳頭腫ウイルス、ブニヤウイルス、カリシウイルス、フィロウイルス、フラビウイルス、特にC型肝炎ウイルス、乳頭腫ウイルス、パラミクソウイルス、様々な呼吸器ウイルスおよび他のウイルス、または本明細書において特定される任意の他の感染症であろう。
【０２００】
ワクチンは、公知の抗原性成分を有する腫瘍（例えば、黒色腫、前立腺癌）の発生から健康な個体を保護するためにも使用され得る（「腫瘍の予防的処置」）。あるいは、使用のための医薬は、既に腫瘍を発症した患者を治療するために使用され得る。そのような腫瘍の例は、ヒトウイルスにより誘発された腫瘍、特に、乳頭腫ウイルスにより誘発された腫瘍、HCVにより誘発された腫瘍、B型肝炎ウイルスにより誘発された腫瘍、およびその他の慢性感染時に腫瘍を誘発するウイルスであろう。さらに、処置される好適な腫瘍は、自然発生性の固形腫瘍（例えば、黒色腫、前立腺癌、乳癌、消化管の腺癌、肺癌）、および白血病である。
【０２０１】
病原体または感染因子は、宿主に対して疾患または疾病を引き起こす生物学的因子、特に、生存している微生物である。病原体は、本発明によると、好ましくはウイルス、細菌、および／または真核生物性寄生生物を意味する。病原体由来抗原は、病原体に由来する抗原である。
【０２０２】
抗原の交差提示も、体内の腫瘍の根絶のために中心的に重要である。抗腫瘍免疫応答を誘発するためには、腫瘍細胞および腫瘍抗原がDCにより取り込まれ、処理され、提示されなければならない。大部分の腫瘍の排除は、有効な細胞傷害性Th1 T細胞応答を必要とするため、腫瘍抗原の交差提示は不可欠である。従って、有効な抗腫瘍応答のため、交差提示DCは卓越した役割を果たす。実施例5に示されるように、本発明の使用のための医薬は、腫瘍モデルにおいて驚くべき有利な効果を示した。
【０２０３】
一態様において、使用のための医薬は、(a)樹状細胞の表面上の受容体に結合する分子、および(b)(a)の分子に結合された抗原含有タンパク質を含み、好ましくはこれらからなる。
【０２０４】
別の態様において、使用のための医薬は、(a)樹状細胞の表面上の受容体に結合する分子と、(b)(a)の分子に結合された抗原含有タンパク質と、(c)第1アジュバントとを含み、好ましくはこれらからなる。
【０２０５】
さらに別の態様において、使用のための医薬は、(A)(a)樹状細胞の表面上の受容体に結合する分子、(b)(a)の分子に結合された抗原含有タンパク質、および(c)第1アジュバント、ならびに(B)(d)複合体化インターロイキン2(IL-2cx)、(e)ペプチド結合主要組織適合遺伝子複合体クラスI(MHC-I)提示細胞および第2アジュバント、または(f)(d)および(e)の組み合わせ、を含み、好ましくはこれらからなり、ここで該ペプチドは(A)に定義される抗原含有タンパク質に由来する。
【０２０６】
別の態様において、本発明は、上記に定義される送達システムおよび上記に定義される再賦活剤を含む、好ましくはこれらからなる、パーツのキットに関する。
【０２０７】
さらに別の態様において、本発明は、(A)複合体化インターロイキン2(IL-2cx)、ならびに(B)ペプチド結合主要組織適合遺伝子複合体クラスI(MHC-I)提示細胞および第2アジュバントを含む、好ましくはこれらからなる、パーツのキットに関する。
【０２０８】
なおさらなる態様において、本発明は、
(ii)抗原に対して活性化されたT細胞を有する患者に、ペプチド結合主要組織適合遺伝子複合体クラスI(MHC-I)提示細胞および第2アジュバントを投与する段階であって、該ペプチドが抗原含有タンパク質に由来しそれによって活性化T細胞を再活性化し、任意で、複合体化インターロイキン2(IL-2cx)がさらに投与される、前記段階
を含む、抗原含有タンパク質に対する細胞性の細胞傷害性免疫応答を延長する方法であって、
段階(i)の再賦活剤が、T細胞が抗原に対して活性化された後の0時間〜14日の時間枠において投与される、前記方法に関する。
【０２０９】
なおさらなる態様において、本発明は、
(i)(a)樹状細胞の表面上の受容体に結合する分子と、(b)(a)の分子に結合された抗原含有タンパク質と、(c)第1アジュバントとを含む送達システムを患者に投与する段階であって、該受容体に(a)の分子が結合すると、(b)のタンパク質が内部移行して樹状細胞中で処理され、該タンパク質中に含有される抗原が樹状細胞の表面上に提示され、それによって患者においてT細胞が活性化される、前記段階；ならびに
(ii)(d)複合体化インターロイキン2(IL-2cx)、(e)ペプチド結合主要組織適合遺伝子複合体クラスI(MHC-I)提示細胞および第2アジュバント、ならびに(f)(d)および(e)の組み合わせからなる群より選択される再賦活剤を患者に投与する段階であって、該ペプチドが、段階(i)に定義される抗原含有タンパク質に由来しそれによって段階(i)において活性化されたT細胞が再活性化される、前記段階
を含む、細胞性の細胞傷害性免疫応答を誘導する方法であって、
段階(ii)の再賦活剤が、段階(i)の送達システムの投与後の0時間〜14日の時間枠において投与される、前記方法に関する。
【０２１０】
本発明の方法および本発明のパーツのキットについて、本発明の使用のための医薬についての態様と同じ態様が適用される。
[本発明1001]
(i)(a)樹状細胞の表面上の受容体に結合する分子と、(b)(a)の分子に結合された抗原含有タンパク質と、(c)第1アジュバントとを含む送達システムを患者に投与する段階であって、(a)の分子が受容体に結合すると、(b)のタンパク質が内部移行して樹状細胞中で処理され、該タンパク質中に含有される抗原が樹状細胞の表面上に提示され、それによって患者においてT細胞が活性化される、前記段階；ならびに
(ii)(d)複合体化インターロイキン2(IL-2cx)、(e)ペプチド結合主要組織適合遺伝子複合体クラスI(MHC-I)提示細胞および第2アジュバント、ならびに(f)(d)および(e)の組み合わせからなる群より選択される再賦活剤を患者に投与する段階であって、該ペプチドが段階(i)に定義される抗原含有タンパク質に由来しそれによって段階(i)において活性化されたT細胞が再活性化される、前記段階
を含む細胞性の細胞傷害性免疫応答を誘導する方法における使用のための医薬であって、
段階(ii)の再賦活剤が、段階(i)の送達システムの投与後の0時間〜14日の時間枠において投与される、前記医薬。
[本発明1002]
(x)複合体化インターロイキン2(IL-2cx)が、繰り返し、特に1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13もしくは14回投与され、さらにより好ましくは、複合体化インターロイキン2(IL-2cx)が、1日もしくは2日毎に投与され、かつ／もしくは、5日間〜1ヵ月間、さらにより好ましくは1〜2週間、繰り返し投与され、かつ／または
(xx) 抗原含有タンパク質に由来するペプチドが、アミノ酸8、9もしくは10個の長さを有し、かつ／もしくは、MHC-Iによって、好ましくは対立遺伝子HLA-A2、HLA-A1、HLA-A3、HLA-B7、HLA-B35、HLA-A24、もしくはHLA-A30によって、より好ましくは対立遺伝子HLA-A2によって提示されるペプチドである、
本発明1001の使用ための医薬。
[本発明1003]
樹状細胞の表面上の受容体が、交差提示樹状細胞の表面上の受容体である、本発明1001または1002の使用のための医薬。
[本発明1004]
樹状細胞の表面上の受容体が、ケモカイン(Cモチーフ)受容体1（XCR1）、ネクチン様分子2、c型レクチン（CLEC）、例えばCLEC9Aであり、好ましくは、樹状細胞の表面上の受容体がXCR1である、本発明1002または1003の使用のための医薬。
[本発明1005]
(a)の分子が、前記受容体に対するリガンドまたは受容体に対する抗体もしくは抗体断片であり、特に、該受容体がケモカイン(Cモチーフ)受容体1（XCR1）であり、かつ、(a)の分子が、抗XCR1抗体もしくはその断片またはケモカイン(Cモチーフ)リガンド1（XCL1）もしくはその機能的に活性なバリアントであり、特に、SEQ ID NO: 7〜10、好ましくはSEQ ID NO: 8〜10、より好ましくはSEQ ID NO: 9または10のいずれか、特にSEQ ID NO: 10の配列を含むかまたは該配列からなる、本発明1001〜1004のいずれかの使用のための医薬。
[本発明1006]
・  (b)の抗原含有タンパク質が、(a)の分子との融合タンパク質の状態にあり；かつ／または
・  (b)の抗原含有タンパク質の抗原が、免疫原、病原体由来抗原、もしくは腫瘍抗原である、
本発明1001〜1005のいずれかの使用のための医薬。
[本発明1007]
(c)の第1アジュバントおよび第2アジュバントが、独立してTh-1媒介応答を支持するアジュバントであり、好ましくは、それらが、独立して合成または組換えのRIG-Iアゴニスト、TLRリガンド、例えばレシキモド(R848)、ポリICLCまたはポリイノシン:ポリシチジル酸(ポリI:C)、モンタニド（Montanide）、サポニン、リポ多糖(LPS)、およびCpGオリゴデオキシヌクレオチドからなる群より選択され、より好ましくは、RIG-Iアゴニスト、およびTLRリガンド、例えばレシキモド(R848)、ポリICLCまたはポリイノシン:ポリシチジル酸(ポリI:C)より選択される、本発明1001〜1006のいずれかの使用のための医薬。
[本発明1008]
再賦活剤が、ペプチド結合主要組織適合遺伝子複合体クラスI(MHC-I)提示細胞および第2アジュバントであり、
・  該細胞が、好ましくは血液細胞、特に末梢血単核細胞(PBMC)、より好ましくはIL-2cxとの組み合わせであり、かつ／または
・  該細胞および第2アジュバントが、段階(i)の送達システムの投与後の0時間〜14日の時間枠において1回のみ投与される、
本発明1001〜1007のいずれかの使用のための医薬。
[本発明1009]
T細胞が、CD8+ T細胞またはCD4+ T細胞、好ましくはCD8+ T細胞である、本発明1001〜1008のいずれかの使用のための医薬。
[本発明1010]
前記時間枠が、72時間〜12日、好ましくは72時間〜9日、より好ましくは5日〜8日、5日〜9日または5日〜12日である、本発明1001〜1009のいずれかの使用のための医薬。
[本発明1011]
(i)抗原に対して活性化されたT細胞を有する患者に、ペプチド結合主要組織適合遺伝子複合体クラスI(MHC-I)提示細胞および第2アジュバントを投与する段階であって、該ペプチドが抗原含有タンパク質に由来しそれによって活性化T細胞が再活性化される、前記段階、および任意で、複合体化インターロイキン2(IL-2cx)をさらに投与する段階
を含む抗原含有タンパク質に対する細胞性の細胞傷害性免疫応答を延長する方法における使用のための医薬であって、
段階(i)の再賦活剤が、T細胞が抗原に対して活性化された後の0時間〜14日の時間枠において投与され、好ましくは、段階(i)の再賦活剤が、T細胞が抗原に対して活性化された後の0時間〜14日の時間枠において1回のみ投与される、前記医薬。
[本発明1012]
(x)MHC-I提示細胞が、血液細胞、特に末梢血単核細胞(PBMC)であり、かつ／または
(xi)複合体化インターロイキン2(IL-2cx)が投与され、好ましくは、繰り返し、特に1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13または14回投与され、さらにより好ましくは、複合体化インターロイキン2(IL-2cx)が、1日もしくは2日毎に投与され、かつ／もしくは、5日間〜1ヵ月間、さらにより好ましくは1〜2週間、繰り返し投与され、かつ／または
(xii)抗原含有タンパク質に由来するペプチドが、アミノ酸8、9もしくは10個の長さを有し、かつ／または、MHC-Iによって、好ましくは対立遺伝子HLA-A2、HLA-A1、HLA-A3、HLA-B7、HLA-B35、HLA-A24、もしくはHLA-A30によって、より好ましくは対立遺伝子HLA-A2によって提示されるペプチドである、
本発明1011の使用ための医薬。
[本発明1013]
患者がヒトである、本発明1001〜1012のいずれかの使用のための医薬。
[本発明1014]
細胞性の細胞傷害性免疫応答を誘導する方法が、腫瘍および／または感染症を予防的に処置するまたは処置するためのものである、本発明1001〜1013のいずれかの使用のための医薬。
[本発明1015]
本発明1001および1005のいずれかの送達システムならびに本発明1001または1008の再賦活剤を含む、パーツのキット。
【図面の簡単な説明】
【０２１１】
【図１】XCR1+ DC中への抗原のターゲティンク後の細胞傷害活性の誘導を示す。
【図２】誘導された細胞傷害活性による感染症からのまたは癌細胞の播種からの保護を示す。
【図３】抗原性ペプチドSIINFEKL(SEQ ID NO: 11)が結合した同系リンパ球の注射によって得られたCD8+ T細胞の細胞傷害性の増幅を示す。
【図４】ペプチド結合細胞および複合体化IL-2の同時適用による細胞傷害性CD8+ T細胞の高相乗的増幅を示す。
【図５】定着腫瘍の処置における抗原ターゲティンクならびにペプチド結合細胞および複合体化IL-2の同時適用の相乗効果を示す。
【図６】ワクチン接種の様々な様式を使用したプライミング後の細胞傷害性CD8+ T細胞の低い頻度は、ADASで強く増幅され得ることを示す。(A)C57BL/6動物に、第0日に、200μgの可溶性のターゲティンクされていないオボアルブミン(OVA)、または5μgのmAb MARX10-OVA、DEC-205-OVA、33D1-OVA、MOPC21-OVAを注射した；全ての場合において、10μg ポリI:Cをアジュバントとして同時注射した。第5日に血液サンプルを採取し、SIINFEKL特異的CD8+ T細胞の頻度を、特異的四量体を使用してフローサイトメトリーによって測定した。(B)第5日に、OVA由来ペプチドSIINFEKLに対する免疫応答を、ADAS手順（アジュバントとしての50μg ポリI:Cに加えた10×106個のSIINFEKL結合同系脾細胞の注射）で増幅した。第10日に、動物を犠牲にし、SIINFEKL特異的CD8+ T細胞の頻度を、四量体を使用して脾臓中において測定した。(C)C57BL/6 Batf3-KO動物を、(A)に記載のように免疫化し、(B)に記載されるようにADAS処置し、そして第10日にSIINFEKL特異的CD8+ T細胞の頻度を脾臓中において測定した。
【図７】(A)R9-SIINFEKLポリペプチドはMHC-I溝に外部的に結合しない：C57BL/6脾細胞を、5×106細胞/mlの密度で1μMのSIINFEKLペプチドと共に37℃、5% CO2で2時間、RPMI1640完全培養培地中において、または2×106細胞/mlの密度で1μMのR9-SIINFEKLポリペプチドと共に4時間インキュベートした。細胞を2回洗浄し、抗-SIINFEKL-H2Kb mAb(クローン25-D1.16)で染色し、MHC-I溝へのペプチド結合の効率を決定した。さらに、細胞を、異なる脾臓細胞集団を同定するために様々な系統マーカーで共染色し、フローサイトメトリーによって分析した。(B)プライマリー細胞の細胞質画分中へ抗原を輸送し、従って誘導されたペプチドのMHC-Iへの結合を可能にするために、R9-SIINFEKLを使用することができる：C57BL/6脾細胞を、上記のように、2×106細胞の密度で様々な濃度（1〜30μM）のR9-SIINFEKLポリペプチドと共に7時間インキュベートした。その後、細胞を2回洗浄し、MHC-I溝へのペプチド結合の効率を決定するためにmAb 25-D1.16で染色し、系統マーカーで共染色し、フローサイトメトリーによって分析した。30μMポリペプチドで有意な細胞死が観察された(示さず)。(C)R9-SIINFEKL結合プライマリー細胞をADASのために使用することができる：C57BL/6マウスに、第0日に、10×106個のR9-SIINFEKL結合(5μM、7時間)脾細胞を、または比較のために10×106個のSIINFEKL結合(2μM、2時間)脾細胞を、または2μgのMARX10-OVA(全て10μgポリI:Cと共に)をプライミングのために静脈内注射し、CD8+ T細胞の頻度および細胞傷害能(グランザイムB、KLRG1、示さず)を第5日に測定した。あるいは、C57BL/6マウスを2μg MARX10-OVAおよび10μg ポリI:Cでプライミングし、SIINFEKL結合(2μM、2時間)脾細胞および50μgポリI:Cを用いる静脈内注射によって第5日にADASへ供した（陽性対照）。並行して、C57BL/6マウスを、第0日に、2μg MARX10-OVA、または2μg 33D1-OVA、または2μg 1D3-OVA、または200μgのターゲティンクされていないOVA(全て10μgポリI:Cと一緒に)で静脈内プライミングし、R9-SIINFEKL結合(5μM、7時間)同系脾細胞および50μgポリI:Cの静脈内注射によってADASへ供した。SIINFEKL特異的CD8+ T細胞のADAS誘導拡大を、特異的四量体を使用してフローサイトメトリーによって第10日に測定した。全てのCD8+ T細胞が、細胞傷害性を示すマーカー(グランザイムB、KLRG1、示さず)を示した。
【図８】抗原の投与はプライミングステップにおいてアジュバントの適用から分離することができる：(A)C57BL/6マウスに、1つの溶液中に混合された、2μg MARX10-OVAおよびアジュバントとしての10μg ポリI:Cを、第0日に静脈内注射した。あるいは、マウスに、第-1日に10μgのポリI:Cを、第0日に2μg MARX10-OVAを注射した。あるいは、マウスに、第0日に2μg MARX10-OVAを、第1日に10μg ポリI:Cを注射した。各実験群において、血液サンプルを第5日に採取し、SIINFEKL特異的CD8+ T細胞の頻度を、特異的四量体を使用してフローサイトメトリーによって測定した。(B)(A)に記載のマウスを、ADAS増幅手順（SIINFEKLが外部的に結合した脾細胞および50μgのポリI:Cの静脈内注射）へ供し、脾臓中におけるSIINFEKL特異的CD8+ T細胞の頻度をフローサイトメトリーによって測定した。抗原の投与は、ADAS手順においてアジュバントの適用から分離することができる。
【図９】ADASと複合体化IL-15の投与とを組み合わせることによる細胞傷害性CD8+ T細胞の高相乗的増幅：C57BL/6動物を、第0日に2μg MARX10-OVAおよび10μg ポリI:Cでプライミングし、特異的四量体およびフローサイトメトリーを使用して第5日（プライミング）における脾臓中のSIINFEKL特異的CD8+ T細胞の総数について分析した。一部のプライミングした動物を第5日にADAS（10×106個のSIINFEKL結合脾細胞および50μg ポリI:Cの注射）のみに供し、一部にはADASを受けさせかつ第6日、第7日、および第8日にIL-2cxを腹腔内注射し（実施例4および5に記載した通り）、他のマウスに第5日にADASを受けさせかつ第6日、第7日、および第8日に複合体化IL-15(IL-15cx)を腹腔内注射した。全てのADAS処置群において、SIINFEKL特異的細胞傷害性CD8+ T細胞の総数を第9日に測定した。マウス1匹についてのIL-15cxの用量を、2μg IL 15(Peprotech # 210-15)を9.3μg sIL-15R-Fc(R&D, #551-MR-100)と共に37℃で20分間インキュベートすることによって作製し、PBSを500μlまで添加し、溶液を腹腔内注射した。
【図１０】ADASは抗原特異的様式で休止記憶CD8+ T細胞を増幅することができる：C57BL/6マウスに、第-1日に2,000または10,000個のOT-I T細胞を養子移入し、第0日にMARX10-OVAおよび10μg ポリI:Cでプライミングした。ADAS（10×106個のSIINFEKL結合脾細胞および50μg ポリI:Cの注射）を第5日に全ての動物において行い、第10日および第40日に(A)OT-I T細胞および(B)内因性のThy 1.1陰性SIIFEKL特異的CD8+ T細胞の頻度について動物を分析した。別の群のマウスを第69日に再びADASへ供し、第74日に(A)OT-I T細胞および(B)内因性SIINFEKL特異的CD8+ T細胞の頻度について分析した。
【図１１】ADASによるインビトロ活性化抗原特異的CD8+ T細胞のインビボ増幅：脾細胞をOT-Iマウスから単離し、完全培地中において1.4 nMのSIINFEKLペプチドと共に3日間培養した。その後、細胞をPBSで洗浄し、5×105個のOT-I T細胞(フローサイトメトリーによって決定)をナイーブC57BL/6マウス中へ養子移入し、動物を移入後の様々な時点でADASによって処置した。ADASを養子移入後第5日に行った場合の、移入されたCD8+ T細胞の頻度に対する効果を示す。全てのCD8+ T細胞のうちの養子移入されたCD8+ T細胞の割合を、フローサイトメトリーを使用して第9日に血液中において測定した。血液中の頻度はこれらの実験において動物の脾臓中の頻度に対応する。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【０２１２】
実施例1
XCR1+ DC中への抗原のターゲティンク後の細胞傷害活性の誘導(図1)
モデル抗原OVAを、XCR1特異的mAb MARX10(Bachem, A. et al. Front Immunol 3 (2012) 214)へ組換え融合したか、またはXCR1受容体へ特異的に結合するケモカインリガンドXCL1(Hartung, E. et al. J Immunol 194 (2015) 1069-1079)へ組換え融合した。MARX10-OVAまたはXCL1-OVAを低レベルでナイーブC57BL/6マウス中へ静脈内注射した場合、抗原はXCR1+ DC中へターゲティンクされた。この抗原プライミングがアジュバント(3μg LPS、CpG、または10μg ポリI:C)の存在下で生じた場合、実質的な細胞傷害活性が誘導された(アジュバントとしてポリI:Cを用いたデータを示す)。この細胞傷害活性を、第6日にプライミングした動物へ標的細胞（脾臓リンパ球）を静脈内注射することによって試験し、これらには、OVA由来ペプチドである、SIINFEKL(SEQ ID NO: 11)が前もってインビトロで結合されていた。標的細胞を、結合後にフルオロフォアCFSEで高程度に標識し、一方、非結合対照脾臓リンパ球をCFSEで低程度に標識した。図1Aに示されるように、OVA+アジュバントでのプライミング動物は、細胞傷害活性を生じさせ、これはほぼ全てのSIINFEKL結合標的細胞を排除した。図1Bは、XCR1+ DCへターゲティンクされた様々な量の抗原で得られた用量応答曲線を示す。同一の結果が、XCR1+ DC中への免疫原性ペプチドのターゲティンクのためにMARX10-SIINFEKLまたはXCL1-SIINFEKLを使用した後に得られた。
【０２１３】
実施例2
誘導された細胞傷害活性による感染症からのまたは癌細胞の播種からの保護(図2)
C57BL/6マウスを、MARX10-OVA(2μgのOVAを含有)およびアジュバント(10μgのポリI:C)でプライミングしたか、または未処置のままにした。5日後、全てのマウスに、1×106 CFU (= 5x LD50)の、組換え操作によりペプチド配列SIINFEKL(SEQ ID NO: 11)が入れられたL.モノサイトゲネス（L. monocytogenes）株を感染させた（Foulds et al., 2002, J. Immunol. 168, 1528-1532）。全ての未処置マウスは3〜4日以内に死滅したが、抗原性プライミングによる誘導レベルの細胞傷害性は、疾患から全ての動物を完全に保護した（図2A）。
【０２１４】
C57BL/6マウスを、MARX10-OVAまたはXCL1-OVA(各々0.16μgのOVAを含有)およびアジュバント(3μg LPS)で静脈内プライミングし、対照動物にPBSを注射した。7日後、全ての動物に、OVAを発現するように操作された悪性同系腫瘍株である5×105個のEG.7細胞(Moore, M.W. et al. Cell 54 (1988) 777-785)を注射した。PBS処置動物は全て14日後に強い腫瘍成長を示したが、免疫化された動物はいずれも注射部位またはその他の箇所でいかなる腫瘍組織も有さず、このことは、誘導レベルの細胞傷害性が腫瘍播種から動物を保護したことを示している（図2B）。
【０２１５】
実施例3
抗原性ペプチドSIINFEKL(SEQ ID NO: 11)が結合した同系リンパ球の注射によって得られたCD8+ T細胞の細胞傷害性の増幅(図3)
C57BL/6マウスを、第-20日、第-15日、第-10日、第-7日、第-5日、または第-3日に、MARX10-OVA(2μg OVAを含有)およびアジュバント(ポリI、CpG、またはLPS；10μg ポリI:Cを用いたデータを示す)でプライミングした。第0日に、プライミングした動物に、10×106個の、注射前にインビトロでSIINFEKL(SEQ ID NO: 11)を結合させた脾細胞（「抗原依存的増幅システム」、ADAS）を静脈内注射した(図3A)。ペプチド結合細胞と一緒にアジュバントを注射し(様々な量のLPSまたはポリI:C)、50μgのポリI:Cを用いたデータを示す。第10日に動物を犠牲にし、SIINFEKL特異的CD8+ T細胞の総数を、SIINFEKL特異的四量体およびフローサイトメトリーを使用して脾臓中において測定した（図3A）。結果は、抗原特異的CD8+ T細胞の増幅のために使用したシステムが、最初の抗原刺激後5日〜9日の狭い時間枠において有効であったことを実証した（図3A）。
【０２１６】
C57BL/6マウスをMARX10-OVA(2μg OVAを含有)およびアジュバント(10μg ポリI:C)でプライミングした。5日後、注射前にインビトロでSIINFEKL(SEQ ID NO: 11)を結合させた10×106個の脾臓リンパ球、または精製T細胞、樹状細胞、またはB細胞を、プライミングした動物中へ静脈内注射した。ペプチド結合細胞と一緒にアジュバントを注射した(50μg ポリI:C)。MARX10-OVAでのプライミング後第10日に、動物を犠牲にし、SIINFEKL特異的CD8+ T細胞の総数を、SIINFEKL特異的四量体およびフローサイトメトリーを使用して脾臓中において測定した。結果は、細胞傷害性CD8+ T細胞応答の増幅が、細胞表面上にMHC-Iを発現する様々な細胞集団で達成できることを示した。増幅された細胞は、高レベルのエフェクター分子(TNF-α、IFN-γ、グランザイムB)を発現した。
【０２１７】
実施例4
ペプチド結合細胞および複合体化IL-2の同時適用による細胞傷害性CD8+ T細胞の高相乗的増幅(図4)
C57BL/6マウスをMARX10-OVA (2μg OVAを含有)およびアジュバント(10μg ポリI:C)でプライミングした。ある群のプライミングした動物に、プライミング後第1日、第2日、および第3日に、IL-2(2μg)および抗-IL-2 mAb JES6-5H4(10μg、Sander, B. J Immunol Methods 166 (1993) 201-214)を4℃で一晩インキュベートすることによって得られた複合体化IL-2(IL-2cx)を注射し、第6日に犠牲にした（「プライミング+IL-2cx」）。別の群のマウスに、SIINFEKL結合脾細胞(10×106)およびアジュバント(50μg ポリI:C)を第5日に注射し、第10日に犠牲にした（「プライミング+ADAS」）。別の群のマウスに、SIINFEKL結合脾細胞(10×106)およびアジュバント(50μg ポリI:C)を第5日に、ならびにIL-2cxを第6日、第7日、第8日、および第9日に注射し、第10日に犠牲にした（「プライミング+ADAS+IL-2cx」）。各実験の終了時に、SIINFEKL特異的CD8+ T細胞の総数を、SIINFEKL特異的四量体およびフローサイトメトリーを使用して脾臓中において測定した。実験は、抗原特異的細胞傷害性CD8+ T細胞の増幅におけるADASおよびIL-2cxの高い相乗効果を明らかにした。
【０２１８】
実施例5
定着腫瘍の処置における抗原ターゲティンクならびにペプチド結合細胞および複合体化IL-2の同時適用の相乗効果(図5)
C57BL/6マウスに、OVAを発現するように操作された悪性同系腫瘍株である5×105個のEG.7細胞(Moore, M.W. et al. Cell 54 (1988) 777-785)を皮下注射した。腫瘍注射後第6日に、マウスをMARX10-OVA(2μg OVAを含有)およびアジュバント(10μg ポリI:C)でプライミングし、ある群を未処置のままにした。プライミングの6日後（第11日）、ある群のマウスにSIINFEKL結合脾細胞(10×106)およびアジュバント(50μg ポリI:C)を注射した（「プライミング+ADAS」）。別のプライミングした群のマウスに、第12日、第13日、第14日、第15日、第16日、第17日、第18日、第19日、第21日、および第23日にIL-2cxのみを注射した（「プライミング+IL-2cx」）。別のプライミングした群のマウスに、SIINFEKL結合脾細胞(10×106)およびアジュバント(50μg ポリI:C)を第11日に、ならびにIL-2cxを第12日、第13日、第14日、第15日、第16日、第17日、第18日、第19日、第21日、および第23日に注射した（「プライミング+ADAS+IL-2cx」）。第25日に全てのマウスを犠牲にした（腫瘍が直径1 cmを超えたため、一部の対照動物をより早く犠牲にしなければならなかった）。全てのデータは、各処置群（n=6）における腫瘍の平均サイズ(mm2)を示す。結果は、ターゲティンクされたOVAを用いる腫瘍注射マウスのプライミング単独は、有効ではなかったことを実証している。対照的に、IL-2cxまたはADASのいずれか単独は、プライミングしたマウスにおいておよそ7〜10日間腫瘍塊を強く減少させることによって有効であったが、その後腫瘍の成長を防ぐことができなかった。ADASおよびIL-2cxの組み合わせをプライミングした動物へ適用した場合、腫瘍塊は強く減少し、腫瘍は実験の終了時まで完全に抑制された（一部のマウスは腫瘍組織を完全に退けた）。
【０２１９】
実施例6
様々な様式の免疫化は低頻度のプライミングした抗原特異的CD8+ T細胞を生じさせる。これらはADAS手順を用いて概して強く拡大させそしてキラーCD8+ T細胞へ分化させることができる。
MAb MARX10(Bachem et al., Front Immunol 3 (2012) 214, EP2641915A1)は、XCR1+ DCについての系統マーカーであるXCR1を認識し、Mab DEC-205(NLDC-145, Kraal et al., 1986, Biolegendから入手)は、マウスXCR1+ DC上に発現されるCD205分子を認識し、mAb 33D1(Nussenzweig et al., PNAS 79 (1982) 161-165, ATCCから入手)は、SIRPα+ DC上のDCIR2分子を認識し、mAb 1D3はB細胞上のCD19を認識し(Krop et al. Eur J Immunol 26 (1996) 238-242, ATCCから入手)、mAb MOPC-21(Potter et al., J Natl Cancer Inst 26 (1961) 1109-1137, Biolegendから入手)はマウスにおけるいずれの分子も認識せず、従ってIgG1アイソタイプ対照として使用される。XCL1は、XCR1についてのケモカインリガンドであり、マウスおよびヒトにおけるXCR1+ DCへの抗原のターゲティンクのために使用され得る(Hartung et al. J Immunol 194 (2015) 1069-1079)。
【０２２０】
mAb DEC-205、33D1、1D3、MOPC-21の重鎖および軽鎖の抗原結合性領域を、質量分析によって同定し、mAb MARX10について以前に記載されたように(Hartung et al., J Immunol 194 (2015) 1069-1079)、標準組換え技術によってmAb DEC-205の骨格上へグラフト化した。この骨格は、Fc受容体への結合を最小限にするように以前に修飾されていた。次いで、mAb MARX10について以前に記載されたように(Hartung et al., J Immunol 194 (2015) 1069-1079)、抗体の各々へC末端融合タンパク質としてOVAを収容するような方法で、全ての構築物を修飾した。以前に記載されたように(Hartung et al., J Immunol 194 (2015) 1069-1079)、XCL1-OVAを作製した。
【０２２１】
C57BL/6動物に、第0日に、多量(200μg)の可溶性のターゲティンクされていないOVA、または5μgのmAb MARX10-OVA、DEC-205-OVA、33D1-OVA、MOPC21-OVAを注射し；全ての場合において、10μg ポリI:Cをアジュバントとして同時注射した。第5日に、血液サンプルを採取し、OVA特異的CD8+ T細胞の頻度を、SIINFEKLが結合しかつSIINFEKL特異的CD8+ T細胞に結合することができるH-2Kb四量体を使用してフローサイトメトリーによって測定した。図6Aに示されるように、抗原適用の全ての様式（ターゲティンクされていない様式か、またはXCR1+ DC、SIRPα+ DCもしくはB細胞へターゲティンクされた様式のいずれか）が、SIINFEKL特異的CD8+ T細胞の初期拡大(「プライミング」)を誘導し、血液中の全てのCD8+ T細胞中のおよそ2〜3%の頻度を生じさせた。第5日に、OVA由来ペプチドSIINFEKLに対する免疫応答を、ADAS手順（50μg ポリI:Cに加えた10×106個のSIINFEKL結合同系脾細胞の注射）で増幅した。第10日に、動物を犠牲にし、SIINFEKL特異的CD8+ T細胞の頻度を脾臓中において測定した。さらに、細胞傷害性を示すいくつかのマーカーを測定した(KLRG1、パーフォリン、グランザイムB；データを示さず)。全ての場合において、ADAS手順は、SIINFEKL特異的CD8+ T細胞の初期頻度をおよそ10倍増幅し（図6B）、細胞傷害性T細胞を示す表現型を誘導した（示さず）。
【０２２２】
並行して、C57BL/6バックグランド上のBatf3-KO動物（XCR1+ DCを欠いている動物、Hildner et al. Science 322 (2008) 1097-1100）を、上記のように、ターゲティンクされていないまたはターゲティンクされたOVA試薬でプライミングした。第5日に、Batf3-KO動物をまた、上記のように、ADAS手順によって処置した。第10日に、全ての動物を犠牲にし、SIINFEKL特異的CD8+ T細胞の頻度を脾臓中において測定した。プライミング、続いてのADASは、全てのC57BL/6動物において高頻度のSIINFEKL特異的CD8+ T細胞をもたらしたが（図6B）、実質的なSIINFEKL特異的応答は、Batf3-KO動物のいずれにおいてもADAS後に観察することができなかった（図6C）。
【０２２３】
いくつかの結論がこれらの実験から得ることができる。高レベルのターゲティンクされていないタンパク質を使用する免疫化は、Th1アジュバントと一緒に適用された場合、本発明者らおよび他の人によって以前に(Hartung et al., J Immunol 194 (2015) 1069-1079)実証されたように、抗原特異的細胞傷害性CD8+ T細胞の初期頻度を生じさせる。DC中への抗原のターゲティンクは、この一次免疫化を遥かにより有効にする。何故ならば、同じ効果を達成するために少量のみの抗原が必要であるためである(Hartung et al, 2015, Caminschi et al. Front Immunol 3 (2012) 13)。驚くべきことに、B細胞への抗原のターゲティンクでさえ（この場合、B細胞上に特異的に発現される表面分子、CD19を介して）、DCへの抗原のターゲティンクと同様に有効であった。この効果は、B細胞からDCへの抗原の輸送(Allan et al. Immunity 25 (2006) 153-162)によって、またはDC上のFc受容体へのターゲティンク抗体の「非特異的」結合によって説明することができる。後者の効果は、マウス免疫系におけるいかなる抗原も認識しないアイソタイプ対照抗体であるMOPC-21を使用する場合、プライミングの効率を担う可能性が最も高い。これらの結果は、表面受容体Siglec-1を介しての辺縁帯メタロフィリックマクロファージへの抗原のターゲティンクもまた低頻度の細胞傷害性CD8+ T細胞の生成をもたらしたが、Batf3-KO動物においてはもたらさなかった以前の結果と完全に適合する（Backer et al. Proc Natl Acad Sci USA 107 (2010) 216-221）。Baf3-KO動物を用いる本発明者らの実験は、ナイーブT細胞のプライミングはDCによって生じなければならないという一般的な仮定と一致している。特に、これらの実験は、XCR1+ DCがこの初期CD8+ T細胞プライミングのために必要であることを示している。従って、XCR1+ DC中への抗原のターゲティンクは、良好な一次CD8+ T細胞応答（「プライミング」）を達成するために、タンパク質抗原、抗原をコードする核酸、または抗原をコードするウイルスシステムをターゲティンクする最も有効な方法であることを約束する。
【０２２４】
まとめると、これらの結果は、従来のDCである皮膚DCもしくは他のDC、例えば単球由来DC、pDCへの、マクロファージへの、または他の細胞への、抗体を使用した抗原ターゲティンクまたは受容体リガンドを使用したターゲティンク（例えば、XCL1-OVA）は、ターゲティンクされていない抗原の適用と比較して、初期細胞傷害応答の誘導について遥かにより効率的であることを示している。タンパク質抗原を用いる全ての種類のプライミング（例えば、これらに限定されないが、抗原担体としてリポソーム、ナノ粒子、および他のシステムを用いることによるもの(Saroja et al. Int J Pharm Investig 1 (2011) 64-74）が、タンパク質がTh1アジュバントのコンテクストにおいて適用される限り同様の結果をもたらすであろうことが、予想され得る。細胞傷害性CD8+ T細胞の同様に低い初期頻度が、非タンパク質免疫化、例えば、これらに限定されないが、ターゲティンクされたまたはターゲティンクされていない様々なシステムを使用する体内へのDNAもしくはDNAベースのワクチンまたはRNAもしくはRNAベースのワクチンの適用または注射によって誘導され得ることも、文献において十分に記録されている（Saroja et al. Int J Pharm Investg 1 (2011) 64-74, Koup et al. Cold Spring Harb Perspect Med 1 (2011) a007252, Ulmer et al. Vaccine 30 (2012) 4414-4418, Kramps et al. Wiley Interdiscip Rev RNA 4 (2013) 737-749）。CD8+ T細胞の同様のプライミングが、ウイルスシステムまたは弱毒化ウイルスで達成され得る（Draper et al. Nat Rev Microbiol 8 (2010) 62-73）。RNAもしくはDNAベースの調製物または非複製ウイルスシステムもしくは弱毒化ウイルスの注射または適用は、追加のTh1アジュバントを必ずしも必要とせず、その理由は、これらの薬剤は自己アジュバント化されており；即ち、これらの薬剤はまた、それら自体、Th1アジュバントを示すためである。
【０２２５】
体内へのワクチン送達の本質的に全ての方法において、初期CD8+細胞傷害応答が比較的弱いことが明らかである。そのような弱い応答は、多くの場合において、感染症を予防する、感染症を処置する、または癌組織を根絶するためには不十分である。従って、初期プライミングを強力に増幅することができるシステムについての必要性が存在する。
【０２２６】
本発明者らの実験において、本発明者らは、初期CD8+細胞傷害応答（プライミング）が、感染症または腫瘍を取り除くためには不十分である全ての場合において、ADAS手順を使用してそれを増幅することができることを実証する。
【０２２７】
さらに、腫瘍組織または死細胞を用いた患者の免疫化は、CD8+ T細胞コンパートメントのプライミングをもたらし(de Gruijl et al. Cancer Immunol Immunother 57 (2008) 1569-1577)、従って、これらの細胞をADAS手順の影響を受けやすくするだろう。
【０２２８】
あるいは、一次CD8+ T細胞活性化は、患者から既存の腫瘍または病原体特異的CD8+ T細胞を単離し、それらをインビトロで活性化および拡大し、そしてそれらを患者中へ注射して戻すことによって、達成され得る。これらの養子移入された（再注入された）CD8+ T細胞は、ADAS手順によって再活性化されかつさらに拡大され、そして細胞傷害性T細胞へ分化する。
【０２２９】
ADAS増幅は、全ての場合において、複合体化IL-2（実施例4、5）または複合体化IL-15（実施例9を参照のこと）のその後の注射によって、相乗的にさらに増大させることができる。
【０２３０】
本発明者らの実験において、本発明者らはアジュバントとしてポリI:Cを使用した。同様の結果が、全てのタイプのTh1アジュバント、例えば、これらに限定されないが、ポリI:C、RIG-Iアゴニスト、およびTLR8アゴニストを用いて達成されるであろう。
【０２３１】
実施例7
ADASについてのプライマリー細胞の細胞質画分中への抗原の送達は抗原由来ペプチドのMHC-Iへの有効な結合をもたらす
本発明者らは、様々なプライマリー細胞（例えば、B細胞、T細胞、DC、脾細胞）のMHC-Iへの抗原由来ペプチド（例えば、SIINFEKL）の外部的結合が、ADASのために使用できることを実証した。本発明者らは、同じ手順が、上述したように、タンパク質全体をプライマリー細胞中へ導入するかまたはあるタンパク質を細胞内部で発現させる様々な方法でも機能するだろうと予想した。
【０２３２】
この概念をさらに説明するために、本発明者らは、プライマリー細胞中へ抗原含有タンパク質（ポリペプチド）を輸送するために9個のアルギニン残基のストレッチを細胞透過性ペプチド(CPP、Milletti 2012, Bechara et al., 2013)として使用した。この37アミノ酸のポリペプチド（R9-SIINFEKLと名付けた）の全配列は、
0006698541.tif 000010
である。
【０２３３】
R9-SIINFNEKLは、誘導される抗原性ペプチド(SIINFEKL)がMHC-Iのコンテクストにおいて細胞表面上に提示される前に、プロテアソームによる細胞内プロセシングを必要とする。従って、このシステムは、プライマリー細胞中へタンパク質全体を導入するためのモデルとしての役割を果たし得、該タンパク質は次いでプロテアソームによって断片へ処理され、これらの一部は、次いでMHC-Iのコンテクストにおいて細胞表面上に提示される。
【０２３４】
このポリペプチドは、MHC-Iの溝の中へ直接、外部的に結合することができない。この点を証明するために、本発明者らは、C57BL/6マウスの脾細胞を1μMのポリペプチドR9-SIINFEKLと共に37℃で4時間完全培地中でインキュベートした。並行して、脾細胞を、1μMのペプチドSIINFEKL（これは直接MHC-Iへ外部的に結合することができる）と共に2時間のみインキュベートした。インキュベーション後、細胞を洗浄し、MHC-I H2KbのコンテクストにおいてSIINFEKLを認識するmAb 25-D1.16(Porgador et al. Immunity 6 (1997)715-726)を使用してフローサイトメトリーによって分析した。脾細胞とSIINFEKLとのインキュベーションは、予想通りに（何故ならばSIINFEKLはMHC-Iへ外部的に結合するため）、マクロファージ、B細胞、T細胞、pDC、およびDCに強いシグナルを与えたが、R9-SIINFEKLポリペプチドではシグナルは得られなかった（図7A）。この実験は、R9-ポリペプチドがMHC-I溝中へ直接収まって抗原として役立つことができないことを直接実証した。
【０２３５】
次の段階において、脾細胞を、R9-SIINFEKLポリペプチドの漸増濃度(1〜30μM)で、7時間インキュベートした。インキュベーションおよび洗浄後、SIINFEKL結合MHC-Iの量を、mAb 25-D1.16で染色することによって測定した。図7Bに示されるように、全ての試験されたプライマリー脾臓細胞は、用量依存的シグナルを示した。直接測定しなかったが、MHC-IIも同様の様式で結合されたと仮定することができる。この実験は、ポリペプチドは、いったんCPPによってプライマリー細胞の細胞質画分中へ輸送されると、処理されそしてMHC-I（およびMHC-II）のコンテクストにおいて提示されることを実証した。
【０２３６】
この実験から、同じ手順が、タンパク質全体（これもまたMHC-I（およびMHC-II）のコンテクストにおいて提示される前に処理されなければならない）でも機能すると推定することができる。実際に、SIINFEKLのMHC-Iへの同様の結合が、9個のアルギニン残基のストレッチが標準組換え技術を使用してN末端に融合されたOVA全体で実証された。その実験において、OVAは、mAb 25-D1.16(Mitsui et al. J Invest Dermatol 126 (2006) 1804-1812)での染色によって決定されたように、正しく処理され、MHC-Iのコンテクストにおいて提示された。従って、本発明者らの実験は文献と一致しており、CPP原理を使用した細胞中への未処理ポリペプチドまたはタンパク質の導入は、この細胞のMHC-I（およびMHC-II）に効果的に結合されることを実証している。
【０２３７】
この実験から、タンパク質および未処理ペプチドのプライマリー細胞への任意のタイプの内部的結合が、この材料由来のペプチドの有効なMHC-I提示をもたらすと推定することができる。
【０２３８】
プライマリー細胞のそのような内部的結合は、細胞中へペプチドまたはタンパク質を導入する他の方法を用いて、例えば、これらに限定されないが、エレクトロポレーションによって、または様々な方法、例えば、これらに限定されないが、トランスフェクション、リポフェクション、形質導入、注入、バリスティックインジェクション、感染によって、ペプチドおよびタンパク質をコードする核酸を導入することによって、同様に達成することができた。
【０２３９】
本発明者らは、次いで、R9-SIINFEKLを使用して内部的に結合されたプライマリー細胞の生物学的効力を試験した。この目的のために、C57BL/6マウスからの脾細胞を、R9-SIINFEKLと共に5μMで7時間インキュベートし、洗浄した。次いで、それらを、ナイーブC57BL/6動物中へ第0日に静脈内注射し、SIINFEKL結合脾細胞の静脈内注射と、またはMARX10-OVAの静脈内注射と比較した。全ての調製物をアジュバントとしてのポリI:Cと一緒に適用した。図7Cに見られるように、全ての抗原性送達方法が、特異的四量体および表現型分析（グランザイムB、KLRG1の発現）によって評価されたように、低頻度のSIINFEKL特異的細胞傷害性CD8+ T細胞を誘導し、MARX10-OVAが最も効率的な抗原送達方法であった。
【０２４０】
次の段階において、R9-SIINFEKL結合脾細胞をADAS手順におけるそれらの能力について評価した。この実験において、MARX10-OVAによるプライミングおよびSIINFEKL結合脾細胞でのADASは陽性対照として役立ち、およそ20%のSIINFEKL特異的細胞傷害性CD8+ T細胞をもたらした（図7C）。R9-SIINFEKL結合脾細胞は、SIIFEKL結合脾細胞として、MARX10-OVA、33D1-OVA、1D3-OVAまたは多量のターゲティンクされていないOVAでのプライミング後、ADAS手順において同様に有効であった（図7Aも比較のこと）。この実験は、抗原のプライマリー細胞への任意のタイプの有効な内部的結合が、ADASについて効率的であることを実証した。この結合は、未処理ポリペプチド、タンパク質全体を用いて、またはペプチドもしくはタンパク質をコードする核酸を用いて、または感染因子、すなわち所望のポリペプチドまたはタンパク質をコードするように組換え改変されたウイルスもしくは細菌ベクターシステムを使用して、行うことができる。
【０２４１】
実施例8
Th1アジュバントの適用はプライミングステップおよびADAS手順の両方において抗原の適用から時間的に分離され得る
宿主の免疫化を達成するために、抗原は抗原と一緒に適用されなければならないと、現在、一般的に仮定されている。従って、抗原は通常アジュバントと混合され、一緒に適用される。アジュバントは、最適な結果を達成するために、理想的にはさらには抗原へ物理的に連結されるべきであると、現在、一般的に仮定されている。従って、プライミングおよびADAS手順におけるアジュバント送達からの抗原投与の分離が良好かつさらにはより良い免疫応答をもたらすことを本発明者らが理解したことは、非常に驚くべきことであった。
【０２４２】
C57BL/6マウスに、1つの溶液中に混合された、アジュバントとしての10μg ポリI:C に加えた2μg MARX10-OVAを、第0日に静脈内注射した。あるいは、マウスに、第-1日に10μg ポリI:Cを、第0日に2μg MARX10-OVAを注射した。あるいは、マウスに、第0日に2μg MARX10-OVAを、第1日に10μg ポリI:Cを注射した。各実験群において、血液サンプルを第5日に採取し、SIINFEKL特異的CD8+ T細胞の頻度をフローサイトメトリーによって測定した。図8Aに見られるように、第0日における抗原およびアジュバントの同時投与は、全てのCD8+ T細胞のうちのおよそ2%のプライミング頻度を与えた。対照的に、抗原の1日前におけるアジュバントの適用は効果がないようであった。非常に驚くべきことに、第0日における抗原の投与および第1日におけるアジュバントの適用は最も有効であり、第5日において全てのCD8+ T細胞のうちのおよそ4%の頻度を与えた。
【０２４３】
全ての実験群をADAS手順（SIINFEKLが外部的に結合した脾細胞および50μgのポリI:Cの静脈内注射）によって処置した場合、抗原およびアジュバントの同時適用の群は、およそ15%のSIINFEKL特異的細胞傷害性CD8+ T細胞を有した。明らかに、最良の結果は、アジュバントが抗原の1日後に適用された群で達成された（およそ30%のSIINFEKL特異的CD8+ T細胞)）。興味深いことに、ポリI:Cが抗原の1日前に適用された群においてさえ、低レベルのSIINFEKL特異的T細胞が存在し（およそ5%）、このことは、一定のプライミングがこの群においてさえ達成されたこと（これは次いで、ADAS手順において達成された増幅によって測定可能となった）を示している。
【０２４４】
これらの実験は、抗原およびアジュバントの適用が、プライミング手順において時間的に分離可能であることを明確に実証している。実際に、結果は、抗原の投与後しばらくしてからのアジュバントの適用が、これらの成分の同時適用よりも有利であることを示している。本発明者らの結果は、アジュバントの適用が抗原の適用の数日後であってさえ有効であろうことを示している。正確な時間枠はヒトにおいて決定することができないが、1〜2日、恐らくは3日以内と推定すべきである。
【０２４５】
実施例9
ADASと複合体化IL-15の投与とを組み合わせることによる細胞傷害性CD8+ T細胞の高相乗的増幅
本発明者らは、第0日におけるMARX10-OVA(2μg)およびポリI:C(10μg)を用いたプライミング後の第1日、第2日、および第3日における複合体化IL-2（IL-2cx＝その高親和性受容体CD25へのIL-2の結合を遮断する抗体と複合体化されたマウスIL-2）の注射が、第6日におけるプライミングされたCD8+ T細胞の数を実質的に上昇させなかったことを実証した。しかし、動物を、第0日にMARX10-OVA(2μg)およびポリI:C(10μg)でプライミングし、第5日にADAS（SIINFEKLが結合した10×106個の脾細胞および50μg ポリI:Cの注射）へ供した場合、第6日、第7日、第8日および第9日にIL-2cxを注射することによって、第10日における脾臓中のSIINFEKL特異的CD8+ T細胞の数は劇的に上昇した（実施例4および図4）。
【０２４６】
ADAS無しでは、第6日、第7日、第8日および第9日におけるIL-2cxの注射は、脾臓中のSIINFEKL特異的CD8+ T細胞の数を実質的に上昇させず(示さず)、しかし全身腫瘍組織量の減少において有効であった。明らかに、ADAS手順は、プライミングされたCD8+ T細胞がIL-2cxの作用に対して非常に敏感となり、これが細胞傷害性CD8+ T細胞の強い拡大を生じさせるような様式で、プライミングされたCD8+ T細胞を再活性化する。しかし、このIL-2cxに対する非常に高められた感受性をもたらす正確な分子機構は不明のままである。
【０２４７】
C57BL/6動物を、第0日に2μg MARX10-OVAおよび10μg ポリI:Cでプライミングし、第5日にADAS（10×106個のSIINFEKL結合脾細胞および50μg ポリI:Cの注射）へ供した。上記のように、ADAS手順は、SIINFEKL特異的CD8+ T細胞のレベルを、第5日におけるおよそ200,000個からADAS後の第10日におけるおよそ2×106個の細胞へ上昇させた（図9）。次いで、ADAS処置動物に、第6日、第7日、および第8日に、複合体化IL-15(IL-15cx)を、または比較のためにIL-2cx(上述した通り)を注射した。第9日に、SIINFEKL特異的CD8+ T細胞の総数を、フローサイトメトリーを使用して脾臓中において測定した。図9に見られるように、IL-15cxの繰り返し注射は、ADAS手順後のSIINFEKL特異的CD8+ T細胞の数を強力に増幅することにおいて、IL-2cxの繰り返し注射と同様に有効であった。IL-15cxは、この効果を達成するために、IL-2cxと同様に、静脈内、皮下、腹腔内、または腫瘍中へ注射することができた。IL-15cxの注射はまた、グランザイムBの細胞レベルおよびKLRG1の発現を増加させ、このことは細胞傷害性を増大させたことを示している（示さず）。
【０２４８】
驚くべきことに、この実験はこのように、IL-15cxが、IL-2cxの作用と同様に、ADAS再活性化抗原特異的CD8+ T細胞のレベルを強力に増幅することができたことを明らかにした。この実験から、IL-2cxの注射が細胞傷害性免疫応答の増大に有利であった全ての場合において（上述した通り）、IL-15cxも有効であろうことが推定され得る。
【０２４９】
実施例10
抗原特異的様式で記憶CD8+ T細胞を再活性化および拡大するためにADAS手順を使用することができる
第0日に2μgのMARX10-OVAおよび10μgのポリI:Cでプライミングしたナイーブ動物を用いて、本発明者らは、マウスにおいて、ADASは第3日に行った場合は応答の増幅についてあまり効果がないが、その後に有効となり、少なくとも第20日まで引き続いてある程度有効であり（実施例3および図3）、第4日から第9日の間が最も有効であることを実証することができた。
【０２５０】
これらの実験において、新たに活性化されたナイーブ抗原特異的CD8+ T細胞を増幅するためにADASを使用した。ADASがCD8+ T細胞の一次活性化後の一定の時間ウィンドウにおいてのみ最適に機能するという事実は、これらのT細胞が、ADAS増幅に敏感であるためには特定の活性化段階になければならないことを示していた。
【０２５１】
従って、本発明者らは、新たに活性化されたCD8+ T細胞と比較して明らかに異なる活性化状態を有する休止記憶CD8+ T細胞に対してもADASを行うことができるかどうか疑問に思った。この目的のために、C57BL/6マウスに、第-1日に、H-2Kbのコンテクストにおいて提示されたSIINFEKLに特異的なT細胞受容体を保有する2,000または10,000個のOT-I CD8+ T細胞を養子移入した。これらの移入されたOT-I T細胞は、それらと内因性T細胞とを識別することを可能にする遺伝マーカーThy1.1(CD90.1)を保有した(Dorner et al., 2009を比較のこと)。第0日に、動物を10μg ポリI:Cに加えたMARX10-OVAでプライミングした。ADAS（10×106個のSIINFEKL結合脾細胞および50μg ポリI:Cの注射）を第5日に行い、これによって、養子移入された動物の両方の群について、第10日における脾臓中の全てのCD8+ T細胞のうちのOT-I T細胞の30%の頻度が生じた（図10A）。同じ実験群からの動物を第40日に分析した場合、予想通りに、それらのOT-I CD8+ T細胞の頻度は1〜2%へ減少していた（図10A）。第69日に、別のADAS増幅を行い（10×106個のSIINFEKL結合脾細胞および50μg ポリI:Cの注射）、OT-I T細胞の頻度を5日後（第74日）に脾臓中において測定した。ADAS増幅によって、OT-I T細胞の頻度は、脾臓中の全てのCD8+ T細胞のうちの30〜60%へ再び上昇した。
【０２５２】
OT-I T細胞が養子移入された全ての動物において、本発明者らは内因性CD8+ T細胞の応答も分析した。何故ならば、これらは、Thy 1.1マーカーについてはCD8+ T細胞陰性と同定され得るが、SIINFEKL-四量体で染色されるためである。図10Bに見られるように、内因性の、SIINFEKL反応性CD8+ T細胞は、OT-I T細胞と同様の挙動を示した。特に、ADAS手順は、内因性SIINFEKL特異的記憶T細胞を大いに増幅することができ、これらのT細胞は、細胞傷害性CD8+ T細胞に典型的な全ての表現型マーカー（グランザイムB陽性、KLRG1-発現、データを示さず）を保有した。
【０２５３】
これらの実験は、ADAS手順が、抗原特異的様式で休止記憶CD8+ T細胞を再活性化しそして大量に拡大することができ、その結果、それらが再びCD8+細胞傷害性エフェクターとなることを明らかにした。ADAS手順は、IL-2cxおよびIL-15cxに対して応答性であるT細胞の状態を生じさせるため、両方のサイトカイン調製物は、ADASに対する記憶CD8+ T細胞の応答をさらに強く増大させるであろう。
【０２５４】
要約すると、ADASは、活性化後のある特定の時間ウィンドウにおいて、新たに活性化されたナイーブCD8+ T細胞を抗原特異的様式で増幅するだけでなく、休止記憶CD8+ T細胞も増幅することができる。
【０２５５】
実施例11
ADASはインビトロで活性化され養子移入されたCD8+ T細胞でも有効である
養子T細胞療法において、抗原特異的CD8+ T細胞（例えば、CMV抗原もしくは任意の他の病原性抗原へ向けられたT細胞、または定義された腫瘍抗原へ向けられたT細胞）は、患者のPBMCから濃縮される。これは、例えば、磁気細胞選別と組み合わせて、この病原体(例えば、CMV)または腫瘍由来の抗原性ペプチドまたはタンパク質でのPBMCのインビトロ刺激後にIFN-γ分泌捕獲を使用して行われる。次いで、濃縮された抗原特異的CD8+ T細胞を、全抗原、または、より頻繁には、ペプチド抗原の添加によってさらに刺激し、次いで、インビトロで拡大させる。拡大後、所望の治療効果（病原体または腫瘍の排除）を達成するために、活性化CD8+ T細胞を次いで患者に再注入する。現在、再注入されたCD8+ T細胞はインビボで短い寿命を有し、IFN-γを分泌するそれらの能力は限定的であり、それらの細胞傷害能は最適以下である。本発明者らは、養子T細胞療法のこの欠点が、ADAS手順を用いて非常に実質的に改善され得ることを見出した。
【０２５６】
OT-Iマウスの脾細胞を、アジュバント無しで、3日間、ペプチドSIINFEKLを用いてインビトロで活性化した。しかし、CD8+ T細胞のこの活性化は、Th1アジュバントの存在下でも行うことができた。培養後、細胞（この時点で97% OT-I CD8+ T細胞から構成された）を第0日に同系C57BL/6マウス中へ移入した。ADAS（10×106個のSIIFEKL結合脾細胞および50μg ポリI:Cの静脈内注射）を第0日、第1日、第2日、第3日、第4日、第5日、または第6日のいずれかにおいて適用した。第1日、第2日または第3日におけるADASは、宿主動物中の養子移入されたCD8+ T細胞の頻度に対して有意な効果を有さなかった。しかし、移入されたCD8+ T細胞の明らかな増幅が、第4日に適用されたADASで観察され、最適な増幅が第5日におけるADASで見られた（図11）。同時に、移入されたCD8+ T細胞のエフェクター細胞への成熟を示す、表面マーカーKLRG1の発現が、第1日におけるADASでの30〜40%から第5日および第6日における80〜90%へ上昇した。これらのデータは、ADAS手順が、インビトロで活性化されそして養子移入された抗原特異的CD8+ T細胞の集団を強力に増幅することができると結論付けることを可能にする。同時に、ADASは、細胞傷害性エフェクター細胞へのこれらのCD8+ T細胞のさらなる分化を誘導する。マウスにおける実験による、ヒトにおける正確な予測は可能でないため、ADASについての最適な時点はヒトにおいて異なり得る。従って、養子移入されたCD8+ T細胞に対する最適なADAS効果のための期間は、例えば12日または14日までより延長され得る。ADASは0時間〜14日という養子移入後の短い時間枠内で有効であるだけでなく、養子移入されたCD8+ T細胞が長い期間の後に記憶状態へ戻った場合も有効であることが予想され得る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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