(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞を培養して糖鎖にシアル酸を含む糖蛋白質を発現させるために用いる培地であって，０．５〜１０ｍＭの濃度のウリジンと，１〜１５ｍＭの濃度のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンとを含有する，培地。
【請求項２】
該ウリジンの濃度が１〜８ｍＭであり，該Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミンの濃度が４〜１２ｍＭである，請求項１に記載の培地。
【請求項３】
該ウリジンの濃度が２〜５ｍＭであり，該Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミンの濃度が５〜１０ｍＭである，請求項１に記載の培地。
【請求項４】
該ウリジンの濃度が約３ｍＭであり，該Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミンの濃度が約８ｍＭである，請求項１に記載の培地。
【請求項５】
Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミンを更に含有するものである，請求項１乃至４のいずれかに記載の培地。
【請求項６】
該Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミンの濃度が０．５〜５ｍＭである，請求項５に記載の培地。
【請求項７】
該Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミンの濃度が１〜３ｍＭである，請求項５に記載の培地。
【請求項８】
該Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミンの濃度が約２ｍＭである，請求項５に記載の培地。
【請求項９】
血清を含まないものである，請求項１乃至８のいずれかに記載の培地。
【請求項１０】
該細胞が，哺乳動物細胞，植物細胞，及び昆虫細胞からなる群から選択されるものである，請求項１乃至９のいずれかに記載の培地。
【請求項１１】
該細胞が，哺乳動物細胞である，請求項１０に記載の培地。
【請求項１２】
該哺乳動物細胞がＣＨＯ細胞である，請求項１１に記載の培地。
【請求項１３】
糖鎖にシアル酸を含む糖蛋白質をコードする外来のＤＮＡにより形質転換された細胞，又は該糖蛋白質をコードする内因性遺伝子を強発現するように改変された細胞を，請求項１乃至１０のいずれかに記載の培地で培養することを含んでなる，該糖蛋白質の製造方法。
【請求項１４】
該糖蛋白質をコードする外来のＤＮＡが，形質転換された該細胞において該糖蛋白質が発現されるように，発現ベクターに組み込まれたものである，請求項１３に記載の製造方法。
【請求項１５】
該糖蛋白質をコードする外来のＤＮＡが，ヒト由来のＤＮＡである請求項１３又は１４に記載の製造方法。
【請求項１６】
糖鎖にシアル酸を含む糖蛋白質をコードする外来のＤＮＡにより形質転換された哺乳動物細胞，又は該糖蛋白質をコードする内因性遺伝子を強発現するように改変された哺乳動物細胞を，請求項１１又は１２に記載の培地で培養することを含んでなる，該糖蛋白質の製造方法。
【請求項１７】
該糖蛋白質をコードする外来のＤＮＡが，形質転換された該哺乳動物細胞において該糖蛋白質が発現されるように，発現ベクターに組み込まれたものである，請求項１６に記載の製造方法。
【請求項１８】
該糖蛋白質をコードする外来のＤＮＡが，ヒト由来のＤＮＡである請求項１６又は１７に記載の製造方法。
【請求項１９】
該哺乳動物細胞が，３６〜３７℃の温度で培養された後，３０〜３５℃の温度で培養されるものである，請求項１５又は１６に記載の製造方法。
【請求項２０】
該哺乳動物細胞が，３６〜３７℃の温度で培養された後，３１〜３３℃の温度で培養されるものである，請求項１５又は１６に記載の製造方法。
【請求項２１】
該哺乳動物細胞が，３６〜３７℃の温度で培養された後，約３２℃の温度で培養されるものである，請求項１５又は１６に記載の製造方法。
【請求項２２】
該糖蛋白質が，α−ガラクトシダーゼＡ，酸性スフィンゴミエリナーゼ，リソソーム酸性リパーゼ，Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ，ヘキソサミニダーゼ，α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ，α−マンノシダーゼ，イズロン酸２−スルファターゼ，グルコセレブロシダーゼ，ガルスルファーゼ，α−Ｌ−イズロニダーゼ，シアリダーゼ，酸性α−グルコシダーゼ等のリソソーム酵素，組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ），血液凝固第ＶＩＩ因子，血液凝固第ＶＩＩＩ因子，血液凝固第ＩＸ因子等の血液凝固因子，インターロイキン６等のリンホカイン，顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ），顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ），マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）等の成長因子，エリスロポエチン，インターフェロン，トロンボモジュリン，卵胞刺激ホルモン，ＤＮａｓｅＩ，甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ），マウス抗体，ヒト化マウス抗体，ヒト・マウスキメラ抗体，ヒト抗体，ＰＤ−１，ＰＤ−１リガンド及び卵胞刺激ホルモンからなる群から選択されるものである，請求項１３乃至２１のいずれかに記載の製造方法。
【請求項２３】
該糖蛋白質が，エリスロポエチン又は卵胞刺激ホルモンである，請求項１３乃至２１のいずれかに記載の製造方法。
【請求項２４】
培養終了後に培養物を回収し，次いで該回収された培養物から該動物細胞を除去することにより，該糖蛋白質を含有する培養上清を調製するステップを更に含むものである，請求項１３乃至２３のいずれかに記載の製造方法。
【請求項２５】
請求項１３乃至２４のいずれかに記載の製造方法であって，該製造方法により製造される糖蛋白質の１分子中に含まれるシアル酸の平均分子数が，ウリジンとＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンの何れも含まない培地で該細胞を培養して製造される糖蛋白質と比較して、少なくとも２０％増加するものである製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は，ウリジンとＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンとを含有する細胞培養用培地，及びかかる培地を用いて糖蛋白質をコードする外来のＤＮＡにより形質転換された細胞を培養することを含んでなる糖蛋白質の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】  糖蛋白質における蛋白質と糖鎖との結合様式には，主なものとして，蛋白質を構成するアスパラギンにＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンが共有結合したＮ−グリコシド結合（Ｎ−グリコシド結合糖鎖），及びセリン又はトレオニンにＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンが共有結合した，又はヒドロキシリンにＤ−ガラクトースが結合したＯ−グリコシド結合（Ｏ−グリコシド結合糖鎖）がある。【０００３】  哺乳動物細胞の中で，糖蛋白質のＮ−グリコシド結合糖鎖は，蛋白質がＲＮＡから翻訳され小胞体内腔を経てゴルジ体に輸送される過程で，各種酵素が関与する複雑な経路を経て蛋白質のアスパラギン残基に付加される。Ｎ−グリコシド結合糖鎖の主なものは，複合型糖鎖と高マンノース型糖鎖である。複合型糖鎖は種々のタイプのものがあるが，非還元末端がシアル酸残基であることを特徴とする。その１例を下記構造式１で示す。【０００４】
【化１】
0006652334.tif 000002
【０００５】  哺乳動物細胞，例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）を用いて，組換え糖蛋白質を製造した場合，その蛋白質の糖鎖構造の多くは複合型糖鎖となるので，このような組換え糖蛋白質の糖鎖の非還元末端の多くはシアル酸残基である。組換え糖蛋白質に，非還元末端がシアル酸残基である複合型糖鎖が付加すると，生体内に投与したときに血中での安定性が増すことが知られている（特許文献１）。従って，医薬として血液中で循環してその効果を発揮する組換え糖蛋白質を製造する場合，その血中半滅期を長期化させることにより薬効等を高めることが期待できるので，糖鎖の非還元末端の多くがシアル酸残基となるＣＨＯ細胞を用いた製造法が活用されている。エリスロポエチン，卵巣刺激ホルモン（ＦＳＨ）がその好例である（特許文献２，３）。【０００６】  また，糖蛋白質の糖鎖により多くのシアル酸残基が付加することにより，糖蛋白質の血中半減期をより長期させ得ることが期待できるので，ＣＨＯ細胞等の哺乳動物細胞を用いて，より多くのシアル残基を糖蛋白質に付加させることを目的としたいくつかの方法が報告されている。例えば，糖鎖の末端にシアル酸を付加することのできるシアリルトランスフェラーゼで形質転換をした宿主細胞を用いて，組換え糖蛋白質を製造する方法が報告されている（特許文献４）。また，糖蛋白質をコードする遺伝子により形質転換させた哺乳動物細胞を，段階的に低温で培養することにより，より多くのシアル酸残基が付加した組換え糖蛋白質が得られることが報告されている（特許文献５）。【０００７】  また，糖蛋白質の糖鎖により多くのシアル酸残基を付加させるために用いられる細胞培養用の培地についての報告がいくつかある。例えば，細胞を培養するときに，培地に所定の濃度の酪酸等のアルカン酸又はその塩を添加することにより，その細胞が発現する組換え糖蛋白質に対するシアル酸のモル比が調節できることが報告されている（特許文献６）。また，培地にＭａｎＮＡｃ，アセチル化ＭａｎＮＡｃ，パーアセチル化ＭａｎＮＡｃ又はフェツイン等のシアル酸前駆体を添加することにより，特定のシアル酸付加度を有する組換え糖蛋白質が製造できることが報告されている（特許文献７）。また，培地に単糖類を，例えばグルコース，マンノース及びガラクトースの組合せで添加することにより，組換え糖蛋白質のシアリル化のレベルを上昇させ得ることが報告されている（特許文献８）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】  特開平８−０２７１８１公報
【特許文献２】  特表２００１−５２５３４２公報
【特許文献３】  ＷＯ２００９／１２７８２６
【特許文献４】  特開平５−７１９３４公報
【特許文献５】  特表２００６−５２０１８６公報
【特許文献６】  特表平１１−５０７５２３公報
【特許文献７】  特表２００７−５２２１７９公報
【特許文献８】  特表２００１−５２５３４２公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】  上記背景の下で，本発明の目的の一つは，糖蛋白質をコードする遺伝子で形質転換させた細胞を用いて発現させた糖蛋白質のシアル酸含量を高めることのできる，所定の濃度のウリジンとＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンとを含有する細胞培養用の培地を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】  上記目的に向けた研究において，本発明者らは，エリスロポエチンをコードする遺伝子で形質転換させた哺乳動物細胞（ＣＨＯ細胞）を，ウリジンとＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンとを含有する培地で培養することにより，高度にシアル酸が付加したエリスロポエチンが得られることを見出し，本発明を完成した。すなわち，本発明は以下を提供する。
（１）細胞を培養して糖蛋白質を発現させるために用いる培地であって，０．５〜１０ｍＭの濃度のウリジンと，１〜１５ｍＭの濃度のＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンとを含有する，培地。
（２）該ウリジンの濃度が１〜８ｍＭであり，該Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミンの濃度が４〜１２ｍＭである，上記（１）に記載の培地。
（３）該ウリジンの濃度が２〜５ｍＭであり，該Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミンの濃度が５〜１０ｍＭである，上記（１）に記載の培地。
（４）該ウリジンの濃度が約３ｍＭであり，該Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミンの濃度が約８ｍＭである，上記（１）に記載の培地。
（５）Ｌ−アラニル−Ｌグルタミンを更に含有するものである，上記（１）乃至（４）のいずれかに記載の培地。
（６）該Ｌ−アラニル−Ｌグルタミンの濃度が０．５〜５ｍＭである，上記（５）に記載の培地。
（７）該Ｌ−アラニル−Ｌグルタミンの濃度が１〜３ｍＭである，上記（５）に記載の培地。
（８）該Ｌ−アラニル−Ｌグルタミンの濃度が約２ｍＭである，上記（５）に記載の培地。
（９）血清を含まないものである，上記（１）乃至（８）のいずれかに記載の培地。
（１０）該細胞が，哺乳動物細胞，植物細胞及び昆虫細胞からなる群から選択されるものである，上記（１）乃至（９）のいずれかに記載の培地。
（１１）該細胞が，哺乳動物細胞である，上記（１０）に記載の培地。
（１２）該哺乳動物細胞がＣＨＯ細胞である，上記（１１）に記載の培地。
（１３）糖蛋白質をコードする外来のＤＮＡにより形質転換された細胞，又は内因性遺伝子強発現するように改変された細胞を，上記（１）乃至（１０）のいずれがに記載の培地で培養することを含んでなる，該糖蛋白質の製造方法。
（１４）該糖蛋白質をコードする外来のＤＮＡが，形質転換された該細胞において該糖蛋白質が発現されるように，発現ベクターに組み込まれたものである，上記（１３）に記載の製造方法。
（１５）
該糖蛋白質をコードする外来のＤＮＡが，ヒト由来のＤＮＡである上記（１３）又は（１４）に記載の製造方法。
（１６）糖蛋白質をコードする外来のＤＮＡにより形質転換された哺乳動物細胞，又は内因性遺伝子強発現するように改変された哺乳動物細胞を，上記（１１）又は（１２）に記載の培地で培養することを含んでなる，該糖蛋白質の製造方法。
（１７）該糖蛋白質をコードする外来のＤＮＡが，形質転換された該哺乳動物細胞において該糖蛋白質が発現されるように，発現ベクターに組み込まれたものである，上記（１６）に記載の製造方法。
（１８）該糖蛋白質をコードする外来のＤＮＡが，ヒト由来のＤＮＡである上記（１６）又は（１７）に記載の製造方法。
（１９）該哺乳動物細胞が，３６〜３７℃の温度で培養された後，３０〜３５℃の温度で培養されるものである，上記（１６）乃至（１８）のいずれかに記載の製造方法。
（２０）該哺乳動物細胞が，３６〜３７℃の温度で培養された後，３１〜３３℃の温度で培養されるものである，上記（１６）乃至（１８）のいずれかに記載の製造方法。
（２１）該哺乳動物細胞が，３６〜３７℃の温度で培養された後，約３２℃の温度で培養されるものである，上記（１６）乃至（１８）のいずれかに記載の製造方法。
（２２）該糖蛋白質が，α−ガラクトシダーゼＡ，酸性スフィンゴミエリナーゼ，リソソーム酸性リパーゼ，Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ，ヘキソサミニダーゼ，α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ，α−マンノシダーゼ，イズロン酸２−スルファターゼ，グルコセレブロシダーゼ，ガルスルファーゼ，α−Ｌ−イズロニダーゼ，シアリダーゼ，酸性α−グルコシダーゼ等のリソソーム酵素，組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ），血液凝固第ＶＩＩ因子，血液凝固第ＶＩＩＩ因子，血液凝固第ＩＸ因子等の血液凝固因子，インターロイキン６等のリンホカイン，顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ），顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ），マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）等の成長因子，エリスロポエチン，インターフェロン，トロンボモジュリン，卵胞刺激ホルモン，ＤＮａｓｅｌ，甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ），マウス抗体，ヒト化マウス抗体，ヒト・マウスキメラ抗体，ヒト抗体，ＰＤ−１，ＰＤ−１リガンド及び卵胞刺激ホルモンからなる群から選択されるものである，上記（１３）乃至（２１）のいずれかに記載の製造方法。
（２３）該糖蛋白質が，エリスロポエチンである，上記（１３）乃至（２１）のいずれかに記載の製造方法。
（２４）該糖蛋白質が糖鎖にシアル酸を含むものである，上記（１３）乃至（２３）のいずれかに記載の製造方法。
（２５）培養終了後に培養物を回収し，次いで該回収された培養物から該動物細胞を除去することにより，該糖蛋白質を含有する培養上清を調製するステップを更に含むものである，上記（１３）乃至（２４）のいずれかに記載の製造方法。
【発明の効果】
【００１１】  本発明によれば，高度にシアル酸が付加された糖蛋白質を製造することができる。高度にシアル酸が付加された糖蛋白質は，例えば，医薬としてヒトの血中に投与したときに一般的に長期の血中半減期を示すので，こうして製造した糖蛋白質は，長期安定性医薬として供給し得る。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は，ヒトエリスロポエチンをコードするＤＮＡを組み込むｐＣｌ−ｎｅｏベクターを示す。
【図２】図２は，ヒトエリスロポエチンをコードするＤＮＡを組み込んだ発現ベクターｐＣｌ−ｎｅｏ（ｈＥＰＯ）を示す。
【図３】図３は，組換えヒトエリスロポエチン発現用細胞を各種培地で培養して得た組換えヒトエリスロポエチンに占める，イソフォーム（ｉｓｏｆｏｒｍ）１型〜３型のそれぞれの比率を示すものである。縦軸はそれらの比率（％）を示す。誤差バーは標準偏差を示す（ｎ＝４）。（１）は基礎培地で培養して得たもの，（２）は８ｍＭのＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンを添加した基礎培地で培養して得たもの，（３）は３ｍＭのウリジンを添加した基礎培地で培養して得たもの，（４）は８ｍＭのＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンと３ｍＭのウリジンを添加した基礎培地で培養して得たものをそれぞれ示す
【図４】図４は，組換えヒトエリスロポエチン発現用細胞を各種培地で培養して得た組換えヒトエリスロポエチンに占める，イソフォーム１型〜３型の比率を合わせた比率を示すものである。縦軸はその比率（％）を示す。誤差バーは標準偏差を示す（ｎ＝４）。（１）は基礎培地で培養して得たもの，（２）は８ｍＭのＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンを添加した基礎培地で培養して得たもの，（３）は３ｍＭのウリジンを添加した基礎培地で培養して得たもの，（４）は８ｍＭのＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンと３ｍＭのウリジンを添加した基礎培地で培養して得たものをそれぞれ示す。
【図５】図５は，ｐＥ−ｎｅｏベクターの構築方法を示す流れ図。
【図６】図６は，ｐＥ−ｈｙｇｒベクターの構築方法を示す流れ図。
【図７】図７は，ヒトＦＳＨα鎖をコードするＤＮＡを組み込んだ発現ベクターｐＥ−Ｎｅｏ（ＦＳＨα）を示す。
【図８】図８は，ヒトＦＳＨβ鎖をコードするＤＮＡを組み込んだ発現ベクターｐＥ−ｈｙｇｒ（ＦＳＨβ）を示す。
【図９】図９は，組換えヒトＦＳＨ発現用細胞を基礎培地で培養して得た組換えヒトＦＳＨのシアル酸含量を１００％としたときの，各種培地で培養して得た組換えヒトＦＳＨのシアル酸含量の相対値（％）を示す。（１）は基礎培地で培養して得たもの，（２）は８ｍＭのＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンを添加した基礎培地で培養して得たもの，（３）は３ｍＭのウリジンを添加した基礎培地で培養して得たもの，（４）は８ｍＭのＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンと３ｍＭのウリジンを添加した基礎培地で培養して得たものをそれぞれ示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】  本発明において，「糖蛋白質」というときは，糖と蛋白質とが共有結合した一群の物質の総称のことをいう。糖と蛋白質との共有結合は，蛋白質を構成するアスパラギン残基にＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンが共有結合したＮ−グリコシド結合（Ｎ−グリコシド結合糖鎖），セリン又はトレオニン残基にＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンが共有結合したＯ−グリコシド結合（Ｏ−グリコシド結合糖鎖）等があるが，本発明における糖蛋白質における糖と蛋白質との共有結合の様式に特に限定はなく，Ｎ−グリコシド結合糖鎖とＯ−グリコシド結合糖鎖のいずれか一方，及び両方を有する糖蛋白質も，本発明における糖蛋白質に含まれる。
【００１４】  このような糖蛋白質としては，α−ガラクトシダーゼＡ，酸性スフィンゴミエリナーゼ，リソソーム酸性リパーゼ，Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ，ヘキソサミニダーゼ，α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ，α−マンノシダーゼ，イズロン酸２−スルファターゼ，グルコセレプロシダーゼ，ガルスルファーゼ，α−Ｌ−イズロニダーゼ，シアリダーゼ，酸性α−グルコシダーゼ等のリソソーム酵素，組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ），血液凝固第ＶＩＩ因子，血液凝固第ＶＩＩＩ因子，血液凝固第ＩＸ因子等の血液凝固因子，インターロイキン６等のリンホカイン，顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ），顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ），マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）等の成長因子，エリスロポエチン，インターフェロン，トロンボモジュリン，卵胞刺激ホルモン，ＤＮａｓｅｌ，甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）又は各種抗体医薬を含むマウス抗体，ヒト化マウス抗体，ヒト・マウスキメラ抗体，ヒト抗体，ＰＤ−１，ＰＤ−１リガンド，エリスロポエチン及び卵胞刺激ホルモン等が挙げられるが，これらに限定されない。
【００１５】  本発明の糖蛋白質は，好ましくは，その糖鎖にシアル酸を含有するものである。このとき１分子の糖蛋白質に含まれるシアル酸の個数の平均値は，好ましくは１個以上である。
【００１６】  また，本発明において，「糖蛋白質をコードする遺伝子」又は「糖蛋白質をコードする外来のＤＮＡ」というときは，その遺伝子又は外来のＤＮＡの由来に特に限定はないが，好ましくは，ヒト，牛，馬等の家畜及びイヌ，ネコ等の愛玩動物を含む哺乳動物に由来するものであり，最も実用的にはヒトに由来するものである。また，遺伝子又は外来のＤＮＡにコードされる糖蛋白質の発現量を最適化する等の目的で，これら遺伝子又は外来のＤＮＡに変異を導入したものも，糖蛋白質をコードする遺伝子又は糖蛋白質をコードする外来のＤＮＡに含まれる。
【００１７】  また，本発明において，「糖蛋白質」というときは，天然型の糖蛋白質のみならず，天然型の糖蛋白質を構成する１つ又は複数のアミノ酸残基を，置換，欠失，挿入，付加させた天然型の糖蛋白質の類似物をも含まれる。また，複数の天然型の糖蛋白質又はその類似体のドメインを連結させたキメラ蛋白質，天然に存在しない蛋白質等も，それらが糖と蛋白質とが共有結合したものである限り，本発明における糖蛋白質に含まれる。
【００１８】  本発明において，「組換え糖蛋白質」というときは，糖蛋白質をコードする遺伝子又は外来のＤＮＡを強発現させ，その発現状態を維持させるように人工的に作製した細胞を用いて作製した糖蛋白質のことをいう。一般に，強発現させる遺伝子又は外来のＤＮＡは，その遺伝子又は外来のＤＮＡが組み入れられた発現ベクターを使用して，哺乳動物細胞等の宿主細胞を形質転換させて導入するものである。しかしこれに限らず，強発現させる遺伝子は，強発現するように人為的に修正された内因性遺伝子であってもよい。人為的に内因性遺伝子を修正するための手段に関する例としては，内因性遺伝子自体を強発現するように改変する方法があるが，この方法に限定されない。例えば，遺伝子の強発現を引き起こすプロモーターを内因性遺伝子の上流にある内在性プロモーターと置換し，遺伝子の強発現を誘導することもできる。そのような方法はいくつかの特許文献（例えばＷＯ９４／１２６５０，またＷＯ９５／３１５６０）で提示されている。
【００１９】  本発明において，糖蛋白質をコードする遺伝子又は外来のＤＮＡを発現させるための発現ベクターとしては強力な遺伝子発現を誘導する遺伝子制御部位，例えば，サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）由来のプロモーター，ＳＶ４０初期プロモーター（ＳＶ４０エンハンサー／プロモーター），伸長因子１α（ＥＦ−１α）プロモーター，ヒトユビキチンＣプロモーター等の下流に，所望の蛋白質をコードする遺伝子を組み込んだものを用いるのが一般的である。内因性遺伝子自体を強発現するように内在性プロモーターと置換し，遺伝子の強発現を誘導するために用いるプロモーターとしては，例えば，サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）由来のプロモーター，ＳＶ４０初期プロモーター（ＳＶ４０エンハンサー／プロモーター），伸長因子１α（ＥＦ−１α）プロモーター，ヒトユビキチンＣプロモーター等があげられる。
【００２０】  糖蛋白質をコードする遺伝子又は外来のＤＮＡを組み入れた発現ベクターが導入される細胞，又は内因性プロモーターを置換，又は内因性遺伝子自体を改変等することにより，内因性遺伝子を強発現するように改変される細胞としては，通常，哺乳動物細胞が使用されるが，この他，植物細胞，昆虫細胞，又は酵母等を使用することも可能である。すなわち，本発明において，単に「細胞」というときは，広く植物細胞，昆虫細胞，哺乳動物細胞，酵母，及びその他の真核細胞が含まれるが，好ましくは哺乳動物細胞，植物細胞，昆虫細胞及び酵母であり，より好ましくは哺乳動物細胞，植物細胞及び昆虫細胞であり，更に好ましくは哺乳動物細胞である。
【００２１】  哺乳動物細胞の使用に関しては，目的の組換え糖体蛋白質が発現できるものである限り，特別の制限はなく，生体から取り出した臓器，筋組織，皮膚組織，結合組織，神経組織，血液，骨髄等から採取された細胞の初代培養細胞，継代培養細胞，及び継代培養しても形質が安定であるように株化された細胞の何れであってもよい。また，細胞は正常細胞，癌化細胞の何れであってもよい。特に好適に使用できる細胞は，ヒト，マウスあるいはハムスター由来の細胞，特に，チャイニーズハムスター卵巣細胞由来のＣＨＯ細胞，マウス骨髄腫に由来するＮＳ／０細胞，ヒトの繊維芽細胞，及びアフリカミドリザルの腎線維芽細胞に由来するＣＯＳ細胞である。ＣＨＯ細胞を用いて組換え糖蛋白質を発現させた場合，通常，Ｎ−グリコシド結合糖鎖を有する糖蛋白質として，組換え糖蛋白質が得られる。
【００２２】  本発明において，細胞を培養して糖蛋白質を発現させるために用いる培地は，基礎培地にウリジンとＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンとを添加したものである。しかしながら，所望により，基礎培地にウリジンを添加せずにＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンを添加した培地も，本発明における細胞を培養して糖蛋白質を発現させるための培地として使用できる。基礎培地として用いることのできる培地は，細胞を培養して糖蛋白質を発現させて用いることのできるものである限り特に限定はないが，無血清培地を好適に使用し得る。
【００２３】  上記無血清培地の一例は，アミノ酸３〜７００ｍｇ／Ｌ，ビタミン類を０．００１〜５０ｍｇ／Ｌ，単糖類を０．３〜１０ｇ／Ｌ，無機塩を０．１〜１００００ｍｇ／Ｌ，微量元素を０．００１〜０．１ｍｇ／Ｌ，ヌクレオシドを０．１〜５０ｍｇ／Ｌ，脂肪酸を０．００１〜１０ｍｇ／Ｌ，ビオチンを０．０１〜１ｍｇ／Ｌ，ヒドロコルチゾンを０．１〜２０μｇ／Ｌ，インシュリンを０．１〜２０ｍｇ／Ｌ，ビタミンＢ１２を０．１〜１０ｍｇ／Ｌ，プトレッシンを０．０１〜１ｍｇ／Ｌ，ピルビン酸ナトリウムを１０〜５００ｍｇ／Ｌ，及び水溶性鉄化合物を含んでなるものである。所望により，当該培地に，慣用のｐＨ指示薬及び抗生物質を添加してもよいし，チミジン，ヒポキサンチン等を添加してもよい。
【００２４】  無血清培地として，ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（ＤＭＥＭとＦ１２の混合培地）を基本培地として用いてもよく，この培地は当業者に周知である。更にまた，無血清培地として，炭酸水素ナトリウム，Ｌ−グルタミン，Ｄ−グルコース，インスリン，ナトリウムセレナイト，ジアミノブタン，ヒドロコルチゾン，硫酸鉄（ＩＩ），アスパラギン，アスパラギン酸，セリン及びポリビニルアルコールよりなるものである，ＤＭＥＭ（ＨＧ）ＨＡＭ改良型（Ｒ５）培地を使用してもよい。更には市販の無血清培地，例えば，ＣＤ  ＯｐｔｉＣＨＯＴＭ培地，ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ  ＩＩ培地又はＣＤ  ＣＨＯ培地（ライフテクノロジーズ社），ＩＳ  ＣＨＯ−ＶＴＭ培地（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社），ＥＸ−ＣＥＬＬＴＭ３０２培地又はＥＸ−ＣＥＬＬＴＭ３２５−ＰＦ培地（ＳＡＦＣ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）等を基本培地として使用することもできる。
【００２５】  基礎培地として血清（牛胎仔血清：ＦＢＳ）含有培地を用いる場合，培地中の血清の濃度は，好ましくは５〜２０％（Ｖ／Ｖ）であり，より好ましくは８〜１２％（Ｖ／Ｖ）である。
【００２６】  本発明において，基礎培地に添加されるウリジンは，その塩でもあってよい。基礎培地に添加されるウリジンの量は，使用する細胞，発現ベクター及び発現させるべき糖蛋白質の種類によって適宜調整されるが，基礎培地中における濃度が，好ましくは０．５〜１０ｍＭ，より好ましくは１〜８ｍＭ，更に好ましくは２〜５ｍＭ，更により好ましくは２．５〜３．５ｍＭ，特に好ましくは３ｍＭとなるように添加される。また，基礎培地に添加されるＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンは，その塩でもあってよく，また，基礎培地に添加されるＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンの量は，使用する細胞，発現ベクター及び発現させるべき糖蛋白質の種類によって適宜調整されるが，基礎培地中における濃度が，好ましくは１〜１５ｍＭ，より好ましくは４〜１２ｍＭ，更に好ましくは５〜１０ｍＭ，更により好ましくは５〜８ｍＭ，特に好ましくは８ｍＭとなるように添加される。
【００２７】  また，基礎培地には，ウリジンとＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンに加えて，Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミン又はその塩を更に添加してもよい。基礎培地に添加されるＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンの量は，使用する細胞，発現ベクター及び発現させるべき糖蛋白質の種類によって適宜調整されるが，基礎培地中における濃度が，好ましくは０．５〜５ｍＭ，より好ましくは１〜３ｍＭ，更に好ましくは１．５〜２．５ｍＭ，特に好ましくは２ｍＭとなるように添加される。
【００２８】  本発明において，糖蛋白質をコードする遺伝子又は外来のＤＮＡにより形質転換された哺乳動物細胞，若しくは内因性遺伝子を強発現するように内在性プロモーターが置換された哺乳動物細胞を培養して糖蛋白質を発現させることにより，組換え糖蛋白質を製造する場合，その培養温度は，使用する哺乳動物細胞，発現ベクター及び発現させるべき糖蛋白質の種類によって適宜調整されるが，好ましくは３０〜３７℃，より好ましくは３６〜３７℃の温度である。また，培養温度は，細胞の培養期間中一定でもよいが，段階的に下げることもできる。培養期間中に培養温度を段階的に下げる場合，培養温度は，例えば，培養開始時に３６〜３７℃に設定され，次いで培養期間の途中で，好ましくは３０〜３５℃に，より好ましくは３１〜３３℃に，例えば３２℃に下げられる。組換え糖蛋白質は，概ね、細胞から培地中に分泌されるので、培養終了後に培養物を回収し，次いで該回収された培養物から該動物細胞を除去することにより，組換え糖蛋白質を含有する培養上清を得ることができる。この培養上清からカラムクロマトグラフィー等の手法により組換え糖蛋白質を精製することができる。
【実施例】
【００２９】  以下，実施例を参照して本発明を更に詳細に説明するが，本発明が実施例に限定されることは意図しない。【００３０】〔ヒトエリスロポエチン用発現ベクターの構築〕
プライマーセット，プライマーＥＰＯ−５’（配列番号１）及びプライマーＥＰＯ−３’（配列番号２），を用いて，ヒト胎児肝臓由来のｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）からＰＣＲでヒトエリスロポエチンのｃＤＮＡを増幅した。【００３１】  配列番号１の配列において，ヌクレオチド３〜８はＥｃｏＲＩ部位に対応し，ヌクレオチド９〜２８はコード領域の最初の２０個のヌクレオチドに対応する。【００３２】  配列番号２の配列において，そのヌクレオチド１２〜１７はＢｇＩＩＩ部位に対応し，ヌクレオチド１８〜３０はｃＤＮＡのヌクレオチド７７４〜７６２に対応する。【００３３】  ＰＣＲ反応は，変性ステップを９５℃で１分，アニールステップを６０℃で１分，伸長ステップを７２℃で２分を１サイクルとして，３０サイクル行った。増幅したｃＤＮＡをＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで切断した後，ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター（ｐＢＳ：Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）のマルチクローニングサイトのＥｃｏＲＩからＨｉｎｄＩＩＩサイトの間へサブクローニングした。得られたベクターを制限酵素ＢｇＩＩＩで切断した後，修飾酵素Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化し，続いて，制限酵素ＥｃｏＲＩ消化によりヒトエリスロポエチン遺伝子断片を切り出した。得られたヒトエリスロポエチン遺伝子の断片のヌクレオチド配列及びこれがコードするアミノ酸配列を，配列番号３及び配列番号４にそれぞれ示す。配列番号３において，塩基９〜５８７がアミノ酸をコードする領域に対応し，塩基３〜８はＥｃｏＲＩ切断部位，塩基７７５〜７８０はＢｇＩＩＩ切断部位に対応する。得られたヒトエリスロポエチン遺伝子の断片を，ｐＣＩ−ｎｅｏベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社）（図１）のＥｃｏＲＩ部位とＳｍａＩ部位の間へＤＮＡｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（タカラバイオ社）を用いてライゲーションし，得られた図２に示す組換えベクターを，ヒトエリスロポエチン用発現ベクターとして用いたｐＣＩ−ｎｅｏ（ｈＥＰＯ）とした（図２）。【００３４】〔組換えヒトエリスロポエチン発現用細胞の樹立〕
ＣＨＯ細胞（ＣＨＯ−Ｋ１）を理化学研究所より入手した。１Ｘ１０７個のＣＨＯ細胞を，Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用い，上記ヒトエリスロポエチン発現ベクター２０μｇにより，慣用の方法で形質転換し，次いで，１０％の牛胎仔血清（ＦＢＳ）とＧ４１８（ＳＩＧＭＡ社）を０．８  ｍｇ／ｍＬ含むＨａｍ−Ｆ１２培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で選択培養して，ネオマイシンに耐性の安定した形質転換体を得た。次に，細胞を無血清培地に馴化させるために，Ｌ−グルタミンを４ｍＭ，ヒポキサンチンを１０ｍｇ／Ｌ，チミジンを４ｍｇ／Ｌ，Ｇ４１８を１２０ｍｇ／Ｌ添加した市販の血清不含ＥＸ−ＣＥＬＬ３０２ＴＭ培地（ＪＲＨ社）中に細胞を移し，細胞の増殖が安定するまで連続的に培養した。得られた細胞を，１０％のＦＢＳと１０％のＤＭＳＯを含むＨａｍ−Ｆ１２培地に懸濁させ，液体窒素中に保存し，種細胞とした。【００３５】〔組換えヒトエリスロポエチン発現用細胞の培養〕
液体窒素中に保存した上記種細胞を，３７℃恒温槽ですばやく解凍し，ＣＤ  ＯｐｔｉＣＨＯＴＭ培地（ライフテクノロジース社）に，２ｍＭ  ＧｌｕｔａＭＡＸ（ライフテクノロジーズ社）及び１ＸＨＴサプリメント（ライフテクノロジーズ社）を添加した培地（基礎培地）に懸濁した後，遠心して細胞を沈殿させて回収した。回収した細胞を基礎培地で懸濁して細胞懸濁液とし，生細胞数を測定した。生細胞の密度が２×１０５個／ｍＬとなるように細胞懸濁液を基礎培地で希釈した。細胞懸濁液を１２０ｍＬずつ培養容器に分注して４群とし，５％  ＣＯ２存在下，３７℃で５日間培養した。このときの培養は，Ｂｉｏ  Ｊｒ．８（１００ｍＬ×８連培養装置，ＡｂｌｅＢｉｏｔｔ社）を用いて行い，また培養期間中は，培地のｐＨを６．９に維持するとともに，培養液中の溶存酸素濃度（ＤＯ）を４０％に維持した。またこのとき，各群（第１群〜第４群）に，表１に示す濃度のウリジンとＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンとを，それぞれ添加した。各群とも培養は４回実施した。【００３６】
【表１】
0006652334.tif 000003
【００３７】〔組換えヒトエリスロポエチンの精製〕
上記培養の５日目に，１０ｍＬの培養液を遠心管に回収し，３０００ｒｐｍで１０分間遠心した後，上清を回収し，回収した培養上清を純水で１．５倍に希釈した。次いで，２０ｍＭ  トリス緩衝液（ｐＨ  ７．５）で予め平衡化したマルチモーダル陰イオン交換樹脂ＣａｐｔｏＴＭ  ａｄｈｅｒｅカラム（カラム体積：１ｍＬ，ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）に，この希釈した培養上清を７．５ｍＬ負荷した。カラム体積５倍容の２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ  ７．５）でカラムを洗浄した後，２００ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭ  トリス緩衝液（ｐＨ  ７．５）で，樹脂に吸着させた組換えヒトエリスロポエチンを溶出させて，溶出画分を得た。この溶出画分をＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−４遠心式フィルターユニット（分画分子量：３ｋＤａ，ミリポア社）を用いて，液量が１００μＬとなるまで濃縮した。【００３８】〔組換えヒトエリスロポエチンの分析〕
各群の濃縮液を，キャピラリー電気泳動システム（Ｐ／ＡＣＥＴＭシステムＭＤＱ，ベックマンコールタール社）に装着したＢａｒｅ  Ｆｕｓｅｄ−Ｓｉｌｉｃａ  Ｃａｐｉｌｌａｒｙ（５０μｍ  ＩＤ，３７５μｍＯＤ，全長５０ｃｍ，ベックマンコールタール社）を用いて，キャピラリー電気泳動した。このとき，電気泳動バファーとして，１０ｍＭ  塩化ナトリウム，５００ｍＭ  酢酸ナトリウム，７Ｍ  尿素及び２．５ｍＭ  プトレシンを含有する１０ｍＭ  トリス緩衝液（ｐＨ４．５）を用い，２４μＡの一定電流で５０分間電気泳動をした。また，ＵＶ検出器を用いて２１４ｎｍの波長をモニターし，電気泳動された組換えヒトエリスロポエチンを検出した。【００３９】〔組換えヒトエリスロポエチンの分析結果〕
上記キャピラリー電気泳動で検出された等電点の異なるイソフォームの中で，最も等電点の低いイソフォームを１型とし，等電点が低い順に，２型，３型とした。検出された全てのイソフォームに占める１型，２型及び３型の比率を算出し，各群で比較した。各群における１型，２型及び３型の比率を図３に示す。基礎培地で細胞を培養して得た第１群の組換えヒトエリスロポエチンでは，１型，２型及び３型の比率が，それぞれ約０．７％，約５％及び約１５％であった（図３）。【００４０】  これに対し，基礎培地に８ｍＭのＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンのみを添加した培地で細胞を培養して得た第２群では，１型，２型及び３型の比率が，それぞれ約１．２％，約７％及び約２０．７％であった（図３）。組換えヒトエリスロポエチンのイソフォームの等電点は，組換えヒトエリスロポエチン１分子当たり付加されるシアル酸の分子数が増加することにより，低下する。従って，上記の結果は，基礎培地に８ｍＭのＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンを添加して得た第２群では，組換えヒトエリスロポエチン１分子当たり付加されるシアル酸の分子数が，基礎培地で得たものに比較して，増加することを示すものである。【００４１】  これに対して，基礎培地に３ｍＭのウリジンのみを添加した培地で細胞を培養して得た第３群の組換えヒトエリスロポエチンでは，基礎培地で細胞を培養して得た第１群のものと比較して，１型，２型及び３型の比率が，それぞれ約０．３％，約３．５％及び約１３％と著しく低下した（図３）。この結果は，基礎培地に３ｍＭのウリジンを添加して得た第３群では，組換えヒトエリスロポエチン１分子当たり付加されるシアル酸の分子数が，基礎培地で得たものに比較して，減少することを示すものである。【００４２】  また，基礎培地に８ｍＭのＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンと３ｍＭのウリジンを添加した培地で細胞を培養して得た第４群では，１型，２型及び３型の比率が，それぞれ約１．１％，約７％及び約２１．５％であった（図３）。１型，２型及び３型の比率を合わせた比率を，第４群と第２群で比較すると，第４群が第２群を上回っており，８ｍＭのＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンを３ｍＭのウリジンと組み合わせて培地に添加することにより，組換えヒトエリスロポエチン１分子当たり付加されるシアル酸の分子数を更に増加させ得ることが示された（図４）。このようなＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンとウリジンの相乗効果は，３ｍＭのウリジンのみを培地に添加した第３群では，組換えヒトエリスロポエチン１分子当たり付加されるシアル酸の分子数が，基礎培地で得たものに比較して，滅少したことを考慮すると驚くべきことである。【００４３】〔その他の検討〕
上記の分析結果から，培地に８ｍＭのＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンを添加して，又は培地に８ｍＭのＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンと３ｍＭのウリジンを添加して，組換えヒトエリスロポエチン遺伝子を導入した細胞を培養することにより，組換えヒトエリスロポエチン１分子当たり付加されるシアル酸の分子数を増加させ得ることがわかった。組換えヒトエリスロポエチン１分子当たり付加されるシアル酸の分子数は，これらの培地を用いて細胞を培養する方法と，他の方法，例えば，細胞の培養期間中に培養温度を段階的に下げる等の方法と組み合わせることにより，更に増加させることができると考えられる。【００４４】〔ヒトＦＳＨ発現用ベクターの構築〕
ｐＥＦ／ｍｙｃ／ｎｕｃベクター（インビトロジェン社）を，ＫｐｎＩとＮｃｏＩで消化し，ＥＦ−１αプロモーター及びその第一イントロンを含む領域を切り出し，これをＴ４  ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化処理した。ｐＣＩ−ｎｅｏベクター（インビトロジェン社）を，ＢｇＩＩＩ及びＥｃｏＲＩで消化して，ＣＭＶのエンハンサー／プロモーター及びイントロンを含む領域を切除した後に，Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化処理した。これに，上記のＥＦ−１αプロモーター及びその第一イントロンを含む領域を挿入して，ｐＥ−ｎｅｏベクターを構築した（図５）。【００４５】  ｐＥ−ｎｅｏベクターを，ＳｆｉＩ及びＢｓｔＸＩで消化し，ネオマイシン耐性遺伝子を含む約１ｋｂｐの領域を切除した（図６）。ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｙｇｒｏ（＋）ベクター（インビトロジェン社）を鋳型にしてプライマーＨｙｇ−Ｓｆｉ（配列番号５）及びプライマーＨｙｇ−ＢｓｔＸ（配列番号６）を用いて，ＰＣＲ反応によりハイグロマイシン遺伝子を増幅した（図６）。増幅したハイグロマイシン遺伝子を，ＳｆｉＩ及びＢｓｔＸＩで消化し，上記のｐＥ−ｎｅｏベクターに挿入して，ｐＥ−ｈｙｇｒベクターを構築した（図６）。【００４６】  ヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリー（タカラバイオ）を鋳型にして，プライマーＨＣＧ−Ａ−Ｆ（配列番号７）及びプライマーＨＣＧ−Ａ−Ｒ（配列番号８）を用いて一次ＰＣＲ反応を行った。さらに得られたＰＣＲ産物を鋳型に，一次反応プライマーＨＣＧ−Ａ−Ｆよりやや３’側下流の位置の配列を持つプライマーＨＣＧＡ−ＯＲＦ−Ｆ（配列番号９），及び一次反応プライマーＨＣＧ−Ａ−Ｒよりやや５’側上流の位置の配列を持つプライマ−ＨＣＧＡ−ＯＲＦ−Ｒ（配列番号１０）を用いて二次ＰＣＲ反応を行いヒトＦＳＨα鎖のｃＤＮＡを増幅した。また，同様に，ヒト脳下垂体ｃＤＮＡライブラリー（タカラバイオ）を鋳型にして，１次プライマーＦＳＨ−Ｆ（配列番号１１）及びプライマーＦＳＨ−Ｒ（配列番号１２）と２次プライマーＦＳＨ−Ｆ２（配列番号１３）及びプライマーＦＳＨ−Ｒ２（配列番号１４）を用いて，ＰＣＲ反応によりヒトＦＳＨβ鎖のｃＤＮＡを増幅した。【００４７】  ヒトＦＳＨα鎖の１次ＰＣＲ反応は，ヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリー１００ｎｇを鋳型に，（９５℃／１０秒，５５℃／１０秒，７２℃／１０秒）を１サイクルとして４０サイクルさせた。２次ＰＣＲ反応は，１次ＰＣＲ反応の反応液１μＬを鋳型に，（９５℃／１０秒，６０℃／１０秒，７２℃／１０秒）を１サイクルとして３０サイクル反応させた。また，ヒトＦＳＨβ鎖の１次ＰＣＲ反応は，ヒト脳下垂体ｃＤＮＡライブラリー１０ｎｇを鋳型に，（９８℃／２秒，６０℃／１０，７２℃／１０秒）を１サイクルとして４０サイクル反応させた。２次ＰＣＲ反応は，１次ＰＣＲ反応の反応液１μＬを鋳型に，（９８℃／２秒，６０℃／１０秒，７２℃／１０秒）を１サイクルとして３０サイクル反応させた。【００４８】  増幅させたヒトＦＳＨα鎖ｃＤＮＡを，ＥｃｏＲＩで切断した後，ＥｃｏＲＩで消化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（−）（ｐＢＳ：Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）のＥｃｏＲＩサイトへ挿入した。得られたプラスミドＤＮＡをＸｂａＩとＥｃｏＲＶで消化し，ヒトＦＳＨα鎖ｃＤＮＡを切り出し，これをＸｂａＩとＳｍａＩで消化したｐＥ−ｎｅｏベクターに挿入し，ヒトＦＳＨα鎖発現用ベクターｐＥ−ｎｅｏ（ＦＳＨα）とした（図７）。【００４９】  増幅させたヒトＦＳＨβ鎖ｃＤＮＡを，ＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩで切断した後，ＥｃｏＲＩとＮｏｔＩで消化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（−）に挿入した。得られたプラスミドＤＮＡを，ＥｃｏＲＩで消化し，Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼによる平滑末端化処理をした後に，ＮｏｔＩで消化し，ヒトＦＳＨβ鎖ｃＤＮＡを切り出した。ｐＥ−ｈｙｇｒベクターをＸｂａＩで消化し，Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼによる平滑末端化処理をした後に，ＮｏｔＩで消化した。このｐＥ−ｈｙｇｒベクターに，ヒトＦＳＨβ鎖ｃＤＮＡを挿入し，ヒトＦＳＨβ鎖発現用ベクターｐＥ−ｈｙｇｒ（ＦＳＨβ）とした（図８）。【００５０】〔組換えヒトＦＳＨ発現用細胞の作製〕
ＣＨＯ細胞（ＣＨＯ−Ｋ１：Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎより購入）に，Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて，前記発現用ベクターｐＥ−ｎｅｏ（ＦＳＨα）及びｐＥ−ｈｙｇｒ（ＦＳＨβ）を下記の方法でトランスフェクトした。すなわち，予めトランスフェクション前日にコンフルエントに近い細胞密度となるように３．５ｃｍ培養皿にＣＨＯ−Ｋ１細胞を播種し，一晩５％炭酸ガス通気下３７℃で培養した。翌日，細胞をＰＢＳ（−）で２回洗浄した後，１ｍＬの血清を含まないＤ−ＭＥＭ／Ｆ１２培地（インビトジェン社）を培養皿に添加した。次いで，培養皿にＯｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ培地（インビトロジェン社）で２０倍に希釈したＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００溶液と，１３．２μｇ／ｍＬのｐＥ−ｎｅｏ（ＦＳＨα）と６．６μｇ／ｍＬのｐＥ−ｈｙｇｒ（ＦＳＨβ）とを含有するプラスミドＤＮＡ溶液の等量混液を２００μＬ添加し，３７℃で５時間，トランスフェクションした。【００５１】  トランスフェクション後，培地を５％ＦＣＳを含むＤ−ＭＥＭ／Ｆ１２（Ｄ−ＭＥＭ／Ｆ１２／５％ＦＣＳ）培地に交換して５％炭酸ガス通気下３７℃で２日間，細胞を培養した。その後，０．６ｍｇ／ｍｌ  Ｇ４１８及び０．４ｍｇ／ｍｌハイグロマイシンＢを含む培地（Ｄ−ＭＥＭ／Ｆ１２／５％ＦＣＳ培地）に交換して５％炭酸ガス通気下３７℃で選択培養を行った。選択培地中で増殖する細胞を数代継代し，組換え体細胞を得た。【００５２】  次に，限界希釈法にて９６穴プレートに１穴あたり１個以下の細胞が播種される条件で組換え体細胞を播種し，１０日間ほど培養し，単一コロニーを形成させた。単一コロニーを形成した穴の培養上清を採取しＥＬＩＳＡにてヒトＦＳＨ発現量を調べ，ヒトＦＳＨの高発現株を選択した。【００５３】  選択した細胞株を，無血清浮遊細胞へ馴化させるため，Ｌ−グルタミンを４ｍＭ，ヒポキサンチンを１０ｍｇ／Ｌ，チミジンを４ｍｇ／Ｌ，Ｇ４１８を１２０ｍｇ／Ｌ，ハイグロマイシンＢを８０ｍｇ／Ｌ添加した市販の無血清培地ＥＸ−ＣＥＬＬ３０２培地（ＪＲＨ社）で細胞の増殖が安定するまで継代培養を行った。更に，培地をＩＳ  ＣＨＯ−Ｖ−ＧＳ培地に切り換えて，細胞の増殖速度が安定するまで培養を継続し，これを１０％のＦＣＳと１０％ＤＭＳＯを添加したＩＳ  ＣＨＯ−Ｖ−ＧＳ培地に懸濁させて液体窒素中に保存し，種細胞とした。【００５４】〔組換えヒトＦＳＨ発現用細胞の培養〕
液体窒素中に保存した上記種細胞を，３７℃恒温槽ですばやく解凍し，ＣＤ  ＯｐｔｉＣＨＯＴＭ培地（ライフテクノロジーズ社）に，２ｍＭ  ＧｌｕｔａＭＡＸ（ライフテクノロジーズ社）及び１ＸＨＴサプリメント（ライフテクノロジーズ社）を添加した培地（基礎培地）に懸濁した後，遠心して細胞を沈殿させて回収した。回収した細胞を基礎培地で懸濁して細胞懸濁液とし，生細胞数を測定した。生細胞の密度が２×１０５個／ｍＬとなるように細胞懸濁液を基礎培地で希釈した。細胞懸濁液を１２０ｍＬずつ培養容器に分注して４群とし，５％ＣＯ２存在下，３７℃で５日間培養した。このときの培養は，Ｂｉｏ  Ｊｒ．８（１００ｍＬ×８連培養装置，ＡｂｌｅＢｉｏｔｔ社）を用いて行い，また培養期間中は，培地のｐＨを６．９に維持するとともに，培養液中の溶存酸素濃度（ＤＯ）を４０％に維持した。またこのとき，各群（第１〜４群）に，表２に示す濃度のウリジンとＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンとを，それぞれ添加した。各群とも培養は２回実施した。【００５５】
【表２】
0006652334.tif 000004
【００５６】〔組換えヒトＦＳＨの精製〕
上記培養の５日目に，１０ｍＬの培養液を遠心管に回収し，３０００ｒｐｍで１０分間遠心した後，上清を回収した。次いで，ＰＢＳ（ｐＨ  ７．４）で予め平衡化したＦＳＨアフィニティー樹脂ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔＴＭ  ＦＳＨ（カラム体積，１ｍＬ；ライフテクノロジーズ）に，培養上清を２０ｍＬ負荷した。カラム体積５倍容のＰＢＳ（ｐＨ７．４）でカラムを洗浄した後，２ＭのＭｇＣｌ２を含む２０ｍＭ  トリス緩衝液（ｐＨ７．４）で，樹脂に吸着させた組換えヒトＦＳＨを溶出させて，溶出画分を得た。この溶出画分をＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−４遠心式フィルターユニット（分画分子量：３ｋＤａ）を用いて，水で希釈／濃縮を実施した。最終的に液量が１００μＬとなるまで濃縮し，各群（１〜４群）の各々について精製組換えヒトＦＳＨ濃縮液を得た。精製組換えヒトＦＳＨ濃縮液の組換えヒトＦＳＨの濃度を１ｍｇ／ｍＬに調整した。【００５７】〔シアル酸含量測定〕
各群の精製組換えヒトＦＳＨ濃縮液（５０μＬ）を，３７℃で３０分間，０．３Ｍ水酸化ナトリウムでアルカリ処理し，次いで，８０℃で６０分間，０．０５Ｍ塩酸で処理をすることにより，組換えヒトＦＳＨを構成する糖鎖を単糖にまで加水分解した。次いで，蛍光試薬（９．６ｍＭ  １，２−ジアミノ−４，５−メチレンジオキシベンゼン，２４ｍＭハイドロサルファイトナトリウム，及び１Ｍ  ２−メルカプトエタノールを含む水溶液）を添加して，５０℃で１５０分間加熱し，加水分解して得られた糖を蛍光ラベルし，この反応溶液をサンプル溶液とした。このとき，標準品としてシアル酸を同様に処理し，蛍光ラベルされたシアル酸の標準品を得た。この標準品を，逆相カラムとしてＣＯＳＭＯＳＩＬ  ５Ｃ１８−ＰＡＱを用いてＨＰＬＣ分析し，シアル酸のピークが得られる溶出時間を測定した。次いで，サンプル溶液をＨＰＬＣ分析し，シアル酸に対応するピークの面積を求めた。【００５８】  基礎培地で細胞を培養した第１群で得られたピーク面積を１００％として，第２群〜第３群のピーク面積の相対値（％）を求めた（図９）。その結果，基礎培地に８ｍＭのＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンを添加した培地で細胞を培養した第２群では，ピーク面積はほぼ１００％であった。一方，３ｍＭのウリジンを添加した培地で細胞を培養した第３群では，ピーク面積は約１１２％となり，基礎培地で細胞を培養して得た組換えヒトＦＳＨと比較して，３ｍＭのウリジンを添加した培地で細胞を培養して得た組換えヒトＦＳＨでは，１分子中に含まれるシアル酸の平均分子数が，ほぼ１０％増加することが分かった。また，基礎培地に８ｍＭのＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンと３ｍＭのウリジンを添加した培地で細胞を培養した第３群では，ピーク面積は約１２１％となり，基礎培地で細胞を培養して得た組換えヒトＦＳＨと比較して，８ｍＭのＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンと３ｍＭのウリジンを添加した培地で細胞を培養して得た組換えヒトＦＳＨでは，１分子中に含まれるシアル酸の平均分子数が，ほぼ２０％増加することが分かった。【００５９】  組換えヒトエリスロポエチンの場合，３ｍＭのウリジンのみを培地に添加した第３群では，組換えヒトエリスロポエチン１分子当たり付加されるシアル酸の分子数が，基礎培地で培養して得たものに比較して減少したが，組換えヒトＦＳＨの場合，３ｍＭのウリジンのみを培地に添加した第３群では，基礎培地で得たものに比較して，組換えヒトＦＳＨ１分子当たり付加されるシアル酸の分子数は増加した。その一方で，８ｍＭのＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンのみを培地に添加した第２群では，組換えヒトＦＳＨ１分子当たり付加されるシアル酸の分子数は，基礎培地で培養して得たものと同等であった。【００６０】  しかしながら，８ｍＭのＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンと３ｍＭのウリジンとを含む培地で細胞を培養して得た組換えヒトエリスロポエチンと組換えヒトＦＳＨは，ともに基礎培地で得たものに比較して，シアル酸含量が多く，この２つの成分を培地に加えた培地で細胞を培養して組換え糖蛋白質を製造することによって，組換え糖蛋白質の種類に関わらず，１分子当たりに付加されるシアル酸の分子数を増加させることができること���示された。【００６１】〔その他の検討〕
上記の分析結果から，培地に８ｍＭのＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンと３ｍＭのウリジンを添加して，所望の糖蛋白質をコードする遺伝子又は外来のＤＮＡを導入した細胞を培養することにより，組換え糖蛋白質１分子当たり付加されるシアル酸の分子数を増加させ得ることがわかった。組換え糖蛋白質１分子当たり付加されるシアル酸の分子数は，これらの培地を用いて細胞を培養する方法と，他の方法，例えば，細胞の培養期間中に培養温度を段階的に下げる等の方法と組み合わせることにより，更に増加させることができると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００６２】  本発明によれば，糖蛋白質を活性成分として含んでなる，生体内に投与したときに長期の血中半減期を示す，長期安定性医薬を提供することができる。
【配列表フリーテキスト】
【００６３】
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Ｒ産物
配列番号５：プライマーＨｙｇ−Ｓｆｉ，合成配列
配列番号６：プライマーＨｙｇ−ＢｓｔＸ，合成配列
配列番号７：プライマーＨＣＧ−Ａ−Ｆ，合成配列
配列番号８：プライマーＨＣＧ−Ａ−Ｒ，合成配列
配列番号９：プライマーＨＣＧＡ−ＯＲＦ−Ｆ，合成配列
配列番号１０：プライマーＨＣＧＡ−ＯＲＦ−Ｒ，合成配列
配列番号１１：プライマーＦＳＨ−Ｆ，合成配列
配列番号１２：プライマーＦＳＨ−Ｒ，合成配列
配列番号１３：プライマーＦＳＨ−Ｆ２，合成配列
配列番号１４：プライマーＦＳＨ−Ｒ２，合成配列
【配列表】
１１９５Ｐ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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