(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍の光線力学診断のための光増感剤、が得られる凍結乾燥物の製造方法であって、以下の連続的工程：
ａ）  ヒペリシンのナトリウム又はカリウム塩の溶液を調整すること；
ｂ）  ポリエチレングリコール又はポリ−Ｎ−ビニルアミドから成る群から選択される錯化剤を溶解すること；
ｃ）  リン酸バッファー又はクエン酸バッファーを含んでなる十分なバッファー系を加えて０．０２２５ｍｇヒペリシン／ｇ溶液の濃度を得ること；および
ｄ）  前記溶液を凍結乾燥して、それぞれの結果として得られる光増感剤中に０．２２５ｍｇのヒペリシンをもたらす凍結乾燥物を得ること、
を含んでなる、方法。
【請求項２】
ポリ−Ｎ−ビニルアミドが、様々な重合度および架橋度のポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ポリビニルピロリドンがＰＶＰ  ｋ１７、ＰＶＰ  ｋ２５またはＰＶＰ  ｋ３０であることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
光線力学診断が膀胱癌の検出のための光線力学診断である、請求項１〜３のいずれか１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規のヒペリシン製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
膀胱癌は尿路で最もよく発症する癌である。膀胱癌は女性よりも男性で３倍多く発症する。これは男性では７番目に最も多く診断される種類の癌である（非特許文献１）。新たに膀胱癌であると診断された患者の約７５〜８５％が筋層非浸潤膀胱腫瘍、すなわち粘膜に限定された腫瘍であることを示す。この場合、腫瘍のステージは上皮内癌（Ｔｉｓ）、ＴａまたはＴ１である（非特許文献２）。筋層非浸潤膀胱腫瘍の場合の再発率は極めて高い。再発の可能性は最初の年で約１５〜６１％、そして５年後までに３１〜７８％である（非特許文献３）。この高い再発率は、一旦罹患した患者の１年間を通じた管理および追跡を必要とする。
【０００３】
筋層非浸潤膀胱癌の最も共通する症状は、血尿である。加えて下部尿路の炎症症状および疼痛も生じる可能性がある。身体的研究（ｐｈｙｓｉｃａｌ  ｓｔｕｄｙ）は、筋層非浸潤膀胱腫瘍の可能性について何の情報も提供しない（非特許文献２）。内視鏡および白色光照射（白色光膀胱鏡検査）での膀胱の視覚的調査および組織サンプルの採取が最初の診断となる。この方法は外方発育腫瘍（ｅｘｏｐｈｙｔｉｃ  ｔｕｍｏｒ）に信頼性が高い。平らな癌腫（特にＴｉｓ）、異常形成、多焦点成長および顕微鏡的病変は検出することが大変難しく、そして白色光膀胱鏡検査では見落されることが多い。
【０００４】
蛍光膀胱検査法（光線力学診断（ＰＤＤ）とも呼ばれる）は筋層非浸潤膀胱癌、特にＴｉｓの検出率を改善し、すなわち再発率を下げる（非特許文献４；５；６）。
【０００５】
光線力学診断（ＰＤＤ）は、好ましくは腫瘍組織に蓄積し、そして正常と腫瘍性組織との間の光学的描写を改善する特定の化合物、いわゆる光増感剤の光活性を使用する。
【０００６】
光線力学診断（ＰＤＤ）の基本原理は、全身的または局所的な光増感剤の適用、そして適切な波長の可視光を用いた照射による光増感剤の活性化を含んでなる２段階法に基づく。
【０００７】
筋層非浸潤膀胱癌の検出における「黄金律」は、白色光膀胱鏡検査である。しかしＴｉｓの疑いでは蛍光膀胱鏡検査の使用が薦められ（非特許文献２）、これにより平均約２０％高くＴｉｓを見出すことができる（非特許文献７）。
【０００８】
ポルフィリン前駆体５−アミノレブリン酸（５−ＡＬＡ）およびヘキサアミノレブリン酸（ＨＬＡ）の誘導体は蛍光診断に使用される。両物質はプロドラッグである。プロドラッグを代謝することにより光活性分子が生成され、これがＰＤＤに使用される。膀胱癌腫の兆候でＰＤＤ用の医薬品として認可されている唯一の物質がヘキサアミノレブリン酸である（Ｈｅｘｖｉｘ（登録商標）、Ｃｙｓｖｉｅｗ（登録商標））。
【０００９】
光増感剤および癌細胞の指示書（ｉｎｄｉｃａｔｏｒ）として、特に尿路上皮の筋層非浸潤膀胱腫瘍の検出のためのヒペリシン（１，３，４，６，８，１３−ヘキサヒドロキシ−１０，１１−ジメチルフェナントロ（１，１０，９，８−ｏｐｑｒａ）ペリレン−７，１４−ジオン）の特性は周知である。ヒペリシンはプロドラッグではなく、そして組織で代謝されることはなく、むしろヒペリシンは組織に蓄積されるとすぐに適切な波長の光により直接刺激されることができる。
【００１０】
しかし純粋なヒペリシンは疎水性であり、そして水に不溶性である。この理由により過去の前臨床試験では、水溶性ポリマーのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が、あるいは臨床試験では血清タンパク質が、不溶性のヒペリシンを標的細胞に持ち込むために有効なヒペリシン輸送体／担体として使用された（非特許文献８；９；１０）。
【００１１】
ヒペリシンの溶解度は補助剤のポリビニルピロリドン（“ポビドン”ＰＶＰ）の存在により上昇させることができる（特許文献１）。
【００１２】
２５ｍｇのＰＶＰおよび０．２５ｍｇのヒペリシンからなる製剤は、５７名の患者で臨床試験された（非特許文献１１）。平らな病変（Ｔｉｓおよび異形形成）に関して、Ｔｉｓについては１００％、そして異形形成については８５％の検出率がＰＶＰ−ヒペリシン−支援型ＰＤＤを用いて病変レベルで達成されたが、白色光膀胱鏡検査下ではわずか３３％（Ｔｉｓ）および３１％（異形形成）が検出されただけであった。
【００１３】
病変レベルでの改善された検出は、患者レベルでも明らかである：１６％の患者で、ＰＶＰ−ヒペリシンは白色光膀胱鏡検査で見落とされた支援型ＰＤＤ病変を検出する。ＰＶＰ−ヒペリシン溶液の注入時間（膀胱での滞留時間）は、約６０〜２２０分（平均１１１±３９（ＳＤ）分）であった（非特許文献１１）。
【００１４】
たとえ既知のＰＤＤ実験が良好な結果を達成した時でも、重大な問題が未解決なままである。少なくとも６０分の長い注入時間（すなわち投与した溶液が患者の膀胱内に残っている）は、疼痛や痙攣の頻発に苦しむ筋層非浸潤膀胱癌腫の患者への負担を表す。
【００１５】
本発明の課題は、工業的に製造でき、相応の長期安定性を有する、ヒペリシンの無菌医薬製剤を提供することである。このヒペリシン製剤は、膀胱癌に対する診断薬として、既知の製剤より問題なく使用できるべきである。
【００１６】
上記の課題は、請求項１の特徴を有するヒペリシン製剤によって解決される。
【００１７】
本発明による製剤の好ましく有利な実施形態は従属請求項の対象である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１８】
【特許文献１】国際公開第０１／８９５７６Ａ２号パンフレット
【非特許文献】
【００１９】
【非特許文献１】Ｆｅｒｌａｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．２０１３  Ａｐｒ；４９（６）：１３７４−１４０３
【非特許文献２】Ｂａｂｊｕｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｕｒｏｌｏｇｙ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ，２０１５  Ｅｄｉｔｉｏｎ：Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｏｎ  Ｎｏｎ−Ｍｕｓｃｌｅ−Ｉｎｖａｓｉｖｅ  Ｂｌａｄｄｅｒ  Ｃａｎｃｅｒ（Ｔａ，Ｔ１  ａｎｄ  ＣＩＳ）
【非特許文献３】Ｗｉｔｊｅｓ，Ｊ．Ａ．；Ｄｏｕｇｌａｓｓ，Ｊ．Ｎａｔ  Ｃｌｉｎ  Ｐｒａｃｔ  Ｕｒｏｌ．２００７  Ｏｃｔ；４（１０）：５４２−５４９
【非特許文献４】Ｂｕｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｕｒ  Ｕｒｏｌ．２０１３  Ｎｏｖ；６４（５）：８４６−８５４
【非特許文献５】Ｋａｕｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｕｒ  Ｕｒｏｌ．Ａｐｒ  ２０１０；５７（４）：５９５−６０６
【非特許文献６】Ｓｔｅｎｚｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｕｒｏｌ．Ｎｏｖ  ２０１０；１８４（５）：１９０７−１９１３
【非特許文献７】Ｗｉｔｊｅｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｕｒ  Ｕｒｏｌ．２０１０  Ａｐｒ；５７（４）：６０７−６１４
【非特許文献８】Ｄ’Ｈａｌｌｅｗｉｎ，Ｊ．Ｕｒｏｌ．２０００；１６４（２）：３４９−３５１
【非特許文献９】Ｏｌｉｖｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｎｃｏｌ  ２００３；２３（４）：９８３−９９０
【非特許文献１０】Ｐｙｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｕｒｏｌｏｇｙ  ２００２；５９：２１６−２１９
【非特許文献１１】Ｋｕｂｉｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ  Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．２００８；８４（６）：１５６０−１５６３
【発明の概要】
【００２０】
驚くことに、本発明によるヒペリシン製剤はヒペリシンが塩として存在する時のみ、安定な様式で、したがって光線力学的診断での臨床条件下で、成功裏に適用できることが示された。
【００２１】
臨床試験の枠組みの中で、本発明によるヒペリシン製剤は、筋層非浸潤膀胱癌腫が疑われる患者の悪性病変の検出に特に良く適していることが示された。さらに本発明によるヒペリシン製剤は、ＰＤＤの結果に悪影響を及ぼさずに、かなり短い注入時間を可能とし、これは患者の負担が有利に減ることを意味している。
【００２２】
驚くことに、筋層非浸潤膀胱癌腫のＰＤＤについて、３０分から最大５０分の注入時間と組み合わせた、２２．５ｍｇのＰＶＰおよび０．２２５ｍｇのヒペリシンの用量を含む本発明の製剤の適用が最適な用量となることが示された。
【００２３】
本発明による製剤を用いることにより、３０〜５０分の注入時間で、３５％の患者に、白色光膀胱鏡検査で見落とされているＴｉｓ病変を同定することができた。
【００２４】
腫瘍の完全な除去（切除）が、患者の処置の第一の（ｔｈｅ  ｆｉｒｓｔ）重要な段階を表す。腫瘍組織の完全な切除は難しいことが多い。これにより腫瘍物質は見落とされ、そして患者の膀胱に留まる。この理由から、腫瘍組織の縁および境界を完全に検出し、そして取り除くことが特に重要である。
【００２５】
本発明による診断、特に０．２２５ｍｇのヒペリシン含量を含む本発明による製剤（実施例１）を用いた診断の適用は、組織の詳細、特に腫瘍の縁領域に関して、より良い認識可能性（ｒｅｃｏｇｎｉｚａｂｉｌｉｔｙ）を示した。結果として、悪性組織と良性組織との識別が促進され、そして腫瘍を完全に摘出することができる。
【００２６】
この悪性組織と良性組織との間のより良い差別化は、０．５００ｍｇのヒペリシン含量およびわずか１５分の注入時間でも達成される。
【００２７】
Ｔｉｓ病変は、極めて高い再発率および大変高い進行の可能性（すなわち腫瘍の進んだ段階への進行か、または転移の発生）と関連しているので、本発明によるヒペリシン製剤を使用した改善された腫瘍の検出率、したがって完全な除去は、疾患のさらなる進行に対して重要な利点を表す。
【００２８】
特に本発明による製剤を使用した時、本発明による診断に必要な１５分、平均で３０分から長くても５０分の注入時間は、ヘキサアミノレブリン酸を用いたＰＤＤについて使用するどのような注入時間よりもかなり短い。平均３０分の注入時間の後すぐに、上記のヒ
ペリシン製剤を使用して悪性病変を診断できた。この有意に短縮された注入時間は、筋層非浸潤膀胱癌腫の患者に大きな安心を与え、そして必要な暴露時間を続ける（ｒｅｍａｉｎ）確率が上がる。
【００２９】
以下に本発明によるヒペリシン製剤の例を記載する：
有効成分であるヒペリシンナトリウムを含む製剤を生産するための一般的手順：
目的は、光線力学診断の分野において光増感剤として適用するためのヒペリシン含有製剤の生産である。
【００３０】
本発明による製剤は、ヒペリシンの塩、特にＮａヒペリシンから生産される。
【００３１】
出発材料のヒペリシン含量を決定するために、含量の決定に加えて、主に水分含量、そしてヒペリシンナトリウムの場合は、ナトリウムの比率が特定される。
【００３２】
化学−物理特性は、医薬品の製剤に影響を及ぼす可能性がある。
【００３３】
臨床的応用には、本発明による製剤の安定性が必要である。この安定性は最終生成物の組成により保証され、そしてまた同時に製造方法にも関連する。使用するバッファー系により、バルク溶液の十分な安定性も最終生成物の凍結乾燥が起こるまで、生産中に達成することができる。
【００３４】
バッファー系として種々の添加物を使用することができ、それらは好ましくはバルク溶液および再構成した溶液の双方で、５０ｍｌの注射用水で再構成後に生理学的に適合するｐＨおよび２９０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇの浸透圧を達成する。リン酸またはクエン酸バッファー系を主に使用することができる。
【００３５】
バルク溶液を上に挙げた成分から作成した後、対応する量のバルク溶液をバイアルに充填し、そして凍結乾燥する。
【実施例１】
【００３６】
Ｎａヒペリシンから、目的重量の２７．０ｍｇのヒペリシンを含む溶液を生成する。
【００３７】
５．０ｇのヒペリシン溶液を、５６２．５ｍｇのＰＶＰ  ｋ２５に加え、そして完全に溶解する。
【００３８】
この溶液は、リン酸バッファー溶液で定量的に２５０．０ｇにする。この溶液の最終濃度は０．０２２５ｍｇのヒペリシン／ｇ溶液である。
【００３９】
凍結乾燥については、このようにして得たバルク溶液の所定量を、バイアルに充填し、そして対応する凍結（ｌｙｏ）プログラムで最終凍結乾燥物が生成される。
【実施例２】
【００４０】
この手順は実施例１に示したものと同じであるが、Ｎａヒペリシンと錯体形成するためにＰＶＰ  ｋ２５の代わりにＰＶＰ  ｋ１７を使用する。
【実施例３】
【００４１】
この手順は実施例１に示したものと同じであるが、Ｎａヒペリシンと錯体形成するためにＰＶＰ  ｋ２５の代わりにＰＶＰ  ｋ３０を使用する。
【実施例４】
【００４２】
この手順は実施例１，２または３に示したものと同じであるが、リン酸バッファー溶液の代わりにクエン酸バッファー溶液を使用する。
【００４３】
実施例１〜４に記載したように生成されたバルク溶液は、異なるヒペリシン含量で生成することができる。
【００４４】
ヒペリシンのストック溶液（ヒペリシンナトリウムから生成）から、以下の希釈物をさらに処置する前に生成することができる：
−所定量の溶媒を０．４ｇの実施例１で述べたヒペリシン溶液に加えて均一化する。この場合、次の工程でわずか１８７．５ｍｇのＰＶＰ（異なる種類のＰＶＰが可能である）が錯体形成のために加えられる。最終的なバルク溶液では、このようにして終濃度０．００７５ｍｇヒペリシン／ｇ溶液に達する。
−所定量の溶媒を０．２ｇの実施例１で述べたヒペリシン溶液に加えて均一化する。この場合、次の工程でわずか６２．５ｍｇのＰＶＰ（異なる種類のＰＶＰが可能である）が錯体形成のためにそれに加えられる。最終的なバルク溶液では、このようにして終濃度０．００２５ｍｇヒペリシン／ｇ溶液に達する。
【００４５】
臨床試験では、実施例１によるヒペリシン製剤が２２．５ｍｇのＰＶＰおよび０．２２５ｍｇのヒペリシンの用量で平均して３０〜３５分間、最長で５０分間、患者の膀胱に注入された。次いで膀胱鏡検査を最初に白色光下で、そして次に蛍光下で行った。疑わしい病変は摘出され、そして組織検査により分類された。
【００４６】
全部で２０名の患者で、Ｔｉｓ病変を検出し、そして組織学的に確認できた。この場合、本発明によるヒペリシン製剤を使用したＰＤＤは、３５％の患者でＴｉｓの検出に決定的な優位性を示す。本発明によるヒペリシン製剤を使用するＰＤＤ無しでは、Ｔｉｓ病変はこれらの患者で検出されないままであった。
【００４７】
参考文献：
Ｂａｂｊｕｋ，Ｍ．；Ｂｏｅｈｌｅ，Ａ．；Ｂｕｒｇｅｒ，Ｍ．；Ｃｏｍｐｅｒａｔ，Ｅ．；Ｋａａｓｉｎｅｎ，Ｅ．；Ｐａｌｏｕ，Ｊ．；Ｒｏｕｐｒeｔ，Ｍ．；ｖａｎ  Ｒｈｉｊｎ，Ｂ．Ｗ．Ｇ．；Ｓｈａｒｉａｔ，Ｓ．；Ｓｙｌｖｅｓｔｅｒ，Ｓ．；ａｎｄ  Ｚｉｇｅｕｎｅｒ，Ｒ．Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｕｒｏｌｏｇｙ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ，２０１５  Ｅｄｉｔｉｏｎ：Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｏｎ
Ｎｏｎ−Ｍｕｓｃｌｅ−Ｉｎｖａｓｉｖｅ  Ｂｌａｄｄｅｒ  Ｃａｎｃｅｒ（Ｔａ，Ｔ１  ａｎｄ  ＣＩＳ）
Ｂｕｒｇｅｒ，Ｍ．；Ｇｒｏｓｓｍａｎ，Ｈ．Ｂ．；Ｄｒｏｌｌｅｒ，Ｍ．；Ｓｃｈｍｉｄｂａｕｅｒ，Ｊ．；Ｈｅｒｍａｎｎ，Ｇ．；Ｄｒ．Ｇｏｅｓｃｕ，Ｏ．；Ｒａｙ，Ｅ．；Ｆｒａｄｅｔ，Ｙ．；Ｋａｒｌ，Ａ．；Ｂｕｒｇｕｅｓ，Ｊ．Ｐ．；Ｗｉｔｊｅｓ，Ｊ．Ａ．；Ｓｔｅｎｚｌ，Ａ．；Ｊｉｃｈｌｉｎｓｋｉ，Ｐ．；Ｊｏｃｈａｍ，Ｄ．Ｐｈｏｔｏｄｙｎａｍｉｃ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  Ｎｏｎ−Ｍｕｓｃｌｅ−Ｉｎｖａｓｉｖｅ  Ｂｌａｄｄｅｒ  Ｃａｎｃｅｒ  ｗｉｔｈ  Ｈｅｘａｍｉｎｏｌｅｖｕｌｉｎａｔｅ  Ｃｙｓｔｏｓｃｏｐｙ：Ａ  Ｍｅｔａ−Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ  Ｂａｓｅｄ  ｏｎ  Ｒａｗ  Ｄａｔａ．Ｅｕｒ  Ｕｒｏｌ．２０１３  Ｎｏｖ；６４（５）：８４６−８５４
Ｄ’Ｈａｌｌｅｗｉｎ，Ｍ．Ａ．；ｄｅ  Ｗｉｔｔｅ，Ｐ．Ａ．；Ｗａｅｌｋｅｎｓ，Ｅ．；Ｍｅｒｌｅｖｅｄｅ，Ｗ．；Ｂａｅｒｔ，Ｌ．Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｆｌａｔ  Ｂｌａｄｄｅｒ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ  Ｉｎ  Ｓｉｔｕ
Ａｆｔｅｒ  Ｉｎｔｒａｖｅｓｉｃａｌ  Ｉｎｓｔｉｌｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｙｐｅｒｉｃｉｎ．Ｊ．Ｕｒｏｌ．２０００；１６４（２）：３４９−３５１
Ｄ’Ｈａｌｌｅｗｉｎ，Ｍ．Ａ．；Ｋａｍｕｈａｂｗａ，Ａ．Ｒ．；Ｒｏｓｋａｍｓ，
Ｔ．；ｄｅ  Ｗｉｔｔｅ，Ｐ．Ａ．Ｍ．；Ｂａｅｒｔ，Ｌ．Ｈｙｐｅｒｉｃｉｎ−Ｂａｓｅｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  Ｂｌａｄｄｅｒ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ．ＢＪＵ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ２００２；８９：７６０−７６３
Ｄ’Ｈａｌｌｅｗｉｎ，Ｍ．Ａ．；Ｂｅｚｄｅｔｎａｙａ，Ｌ．；Ｇｕｉｌｌｅｍｉｎ，Ｆ．Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｌａｄｄｅｒ  Ｃａｎｃｅｒ：Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ．Ｅｕｒ  Ｕｒｏｌ．２００２；４２（５）：４１７−４２５
Ｆｅｒｌａｙ，Ｊ．；Ｓｔｅｌｉａｒｏｖａ−Ｆｏｕｃｈｅｒ，Ｅ．；Ｌｏｒｔｅｔ−Ｔｉｅｕｌｅｎｔ，Ｊ．；Ｒｏｓｓｏ，Ｓ．；Ｃｏｅｂｅｒｇｈ，Ｊ．Ｗ．；Ｃｏｍｂｅｒ，Ｈ．；Ｆｏｒｍａｎ，Ｄ．；Ｂｒａｙ，Ｆ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｍｏｒｔａｌｉｔｙ  Ｐａｔｔｅｒｎｓ  ｉｎ  Ｅｕｒｏｐｅ：Ｅｓｔｉｍａｔｅｓ  ｆｏｒ  ４０  Ｃｏｕｎｔｒｉｅｓ  ｉｎ  ２０１２．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．２０１３  Ａｐｒ；４９（６）：１３７４−１４０３
Ｋａｕｓｃｈ，Ｉ．；Ｓｏｍｍｅｒａｕｅｒ，Ｍ．；Ｍｏｎｔｏｒｓｉ，Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．：Ｐｈｏｔｏｄｙｎａｍｉｃ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｉｎ  Ｎｏｎ−Ｍｕｓｃｌｅ−Ｉｎｖａｓｉｖｅ  Ｂｌａｄｄｅｒ  Ｃａｎｃｅｒ：Ａ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｒｅｖｉｅｗ  ａｎｄ  Ｃｕｍｕｌａｔｉｖｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  Ｓｔｕｄｉｅｓ．Ｅｕｒ  Ｕｒｏｌ．Ａｐｒ  ２０１０；５７（４）：５９５−６０６
Ｋｕｂｉｎ，Ａ．；Ｍｅｉｓｓｎｅｒ，Ｐ．；Ｗｉｅｒｒａｎｉ，Ｆ．；Ｂｕｒｎｅｒ，Ｕ．；Ｂｏｄｅｎｔｅｉｃｈ，Ａ．；Ｐｙｔｅｌ，Ａ．；
Ｓｃｈｍｅｌｌｅｒ，Ｎ．Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  Ｂｌａｄｄｅｒ  Ｃａｎｃｅｒ  ｗｉｔｈ  Ｎｅｗ  Ｗａｔｅｒ  Ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｈｙｐｅｒｉｃｉｎ  Ｂｏｕｎｄ  ｔｏ  Ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ：ＰＶＰ−Ｈｙｐｅｒｉｃｉｎ．Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ  Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．２００８；８４（６）：１５６０−１５６３
Ｏｌｉｖｏ，Ｍ．；Ｌａｕ，Ｗ．；Ｍａｎｉｖａｓａｇｅｒ，Ｖ．；Ｔａｎ，Ｐ．Ｈ．；Ｓｏｏ，Ｋ．Ｃ．；Ｃｈｅｎｇ，Ｃ．Ｍａｃｒｏｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｂｌａｄｄｅｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｕｓｉｎｇ  Ｈｙｐｅｒｉｃｉｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｃｙｓｔｏｓｃｏｐｙ  ａｎｄ  Ｌａｓｅｒ  Ｃｏｎｆｏｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｎｃｏｌ  ２００３；２３（４）：９８３−９９０
Ｐｙｔｅｌ，Ａ．；Ｓｃｈｍｅｌｌｅｒ，Ｎ．Ｎｅｗ  Ａｓｐｅｃｔ  ｏｆ  Ｐｈｏｔｏｄｙｎａｍｉｃ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ＢｌａｄｄｅｒＴｕｍｏｒｓ：Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｃｙｔｏｌｏｇｙ．Ｕｒｏｌｏｇｙ  ２００２；５９：２１６−２１９
Ｓｔｅｎｚｌ，Ａ．；Ｂｕｒｇｅｒ，Ｍ．；Ｆｒａｄｅｔ，Ｙ．；Ｍｙｎｄｅｒｓｅ，Ｌ．Ａ．；Ｓｏｌｏｗａｙ，Ｍ．Ｓ．；Ｗｉｔｊｅｓ，Ｊ．Ａ．；Ｋｒｉｅｇｍａｉｒ，Ｍ．；Ｋａｒｌ，Ａ．；Ｓｈｅｎ，Ｙ．；Ｇｒｏｓｓｍａｎ，Ｈ．Ｂ．Ｈｅｘａｍｉｎｏｌｅｖｕｌｉｎａｔｅ  Ｇｕｉｄｅｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｃｙｓｔｏｓｃｏｐｙ  Ｒｅｄｕｃｅｓ  Ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ  ｉｎ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｎｏｎｍｕｓｃｌｅ  Ｉｎｖａｓｉｖｅ  Ｂｌａｄｄｅｒ  Ｃａｎｃｅｒ．Ｊ  Ｕｒｏｌ．Ｎｏｖ  ２０１０；１８４（５）：１９０７−１９１３
Ｗｉｔｊｅｓ，Ｊ．Ａ．；Ｄｏｕｇｌａｓｓ，Ｊ．Ｔｈｅ  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｈｅｘａｍｉｎｏｌｅｖｕｌｉｎａｔｅ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｃｙｓｔｏｓｃｏｐｙ  ｉｎ  Ｂｌａｄｄｅｒ  Ｃａｎｃｅｒ．Ｎａｔ  Ｃｌｉｎ  Ｐｒａｃｔ  Ｕｒｏｌ．２００７  Ｏｃｔ；４（１０）：５４２−５４９
Ｗｉｔｊｅｓ，Ｊ．Ａ．；Ｒｅｄｏｒｔａ，Ｊ．Ｐ．；Ｊａｃｑｍｉｎ，Ｄ．；Ｓｏｆｒａｓ，Ｆ．；Ｍａｌｍｓｔｒｏｅｍ，Ｐ．Ｕ．；Ｒｉｅｄｌ，Ｃ．；Ｊｏｃｈａｍ，Ｄ．；Ｃｏｎｔｉ，Ｇ．；Ｍｏｎｔｏｒｓｉ，Ｆ．；Ａｒｅｎｔｓｅｎ，Ｈ．Ｃ．；Ｚａａｋ，Ｄ．；Ｍｏｓｔａｆｉｄ，Ａ．Ｈ．；Ｂａｂｊｕｋ，Ｍ．Ｈｅｘａｍｉｎｏｌｅｖｕ
ｌｉｎａｔｅ−Ｇｕｉｄｅｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｃｙｓｔｏｓｃｏｐｙ  ｉｎ
ｔｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｆｏｌｌｏｗ−Ｕｐ  ｏｆ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ
ｗｉｔｈ  Ｎｏｎ−Ｍｕｓｃｌｅ−Ｉｎｖａｓｉｖｅ  Ｂｌａｄｄｅｒ  Ｃａｎｃｅｒ：Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ．Ｅｕｒ  Ｕｒｏｌ．２０１０  Ａｐｒ；５７（４）：６０７−６１４