(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリヌクレオチド分析物を膜中の膜貫通ポアに送達する方法であって、
（ａ）官能化微粒子に付着している前記ポリヌクレオチド分析物を用意するステップと、
（ｂ）前記官能化微粒子を前記膜へ送達し、それによって前記ポリヌクレオチド分析物を前記膜貫通ポアに送達し、前記微粒子は、（ｉ）前記膜を含むチャンバーの表面に沿って膜へ進み、および／または膜と平行して進み、または（ｉｉ）膜に沿って進むステップと、
（ｃ）前記ポリヌクレオチド分析物が前記官能化微粒子から剥離し、ポリヌクレオチド結合タンパク質が前記膜貫通ポアを通る前記ポリヌクレオチド分析物の移動を制御するように、前記ポリヌクレオチド分析物を前記膜貫通ポアおよびポリヌクレオチド結合タンパク質と相互作用させるステップと
を含む、前記方法。
【請求項２】
前記膜にカップリングされなかったポリヌクレオチド分析物の濃度と比べて、増加した濃度のポリヌクレオチド分析物を膜中の膜貫通ポアに送達するためのものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記膜貫通ポアに送達される前記ポリヌクレオチド分析物の濃度が、少なくとも約１０倍増加される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
（ａ）前記官能化微粒子を電気化学的勾配、拡散勾配、親水性勾配または疎水性勾配に沿って移動させるステップと、（ｂ）前記官能化微粒子を磁場内で移動させるステップと、（ｃ）前記官能化微粒子を電場内で移動させるステップと、（ｄ）前記官能化微粒子を圧力下で移動させるステップと、または（ｅ）前記官能化微粒子を重力によって移動させるステップとを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、２０以上、３０以上、５０以上、１００以上、５００以上、１，０００以上、５，０００以上、１０，０００以上、１００，０００以上、１０００，０００以上、または５０００，０００以上のポリヌクレオチド分析物が前記官能化微粒子に付着される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記ポリヌクレオチド分析物が、前記膜とカップリングすることができる１つまたは複数のアンカーを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記アンカーが、ポリペプチドアンカーおよび／または疎水性アンカーを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ポリヌクレオチド分析物が前記官能化微粒子に一時的に付着される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ポリヌクレオチド分析物がハイブリダイゼーションによって前記官能化微粒子に付着され、および／または請求項６に依存したときに、前記１つまたは複数のアンカーが、ハイブリダイゼーションによって前記ポリヌクレオチド分析物に連結される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記官能化微粒子が、微粒子が直径５００μｍ以下であり、セラミック、ガラス、シリカ、重合体または金属から形成される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記膜貫通ポアが膜貫通タンパク質ポアである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記膜貫通タンパク質ポアが、スメグマ菌（Mycobacterium smegmatis）ポリン（Ｍｓｐ）、α−ヘモリシン（α−ＨＬ）またはライセニンに由来する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ポリヌクレオチドを特性評価する方法であって、（ａ）請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法を行うステップと、（ｂ）前記ポリヌクレオチドが前記膜貫通ポアを通るように前記ポリヌクレオチドを前記膜貫通ポアと相互作用させるステップと、（ｃ）前記ポリヌクレオチドが前記ポアに対して移動するときに、前記ポリヌクレオチドの１つまたは複数の特性を示す１つまたは複数の測定値を取り、それによって前記ポリヌクレオチドを特性評価するステップとを含む方法。
【請求項１４】
前記官能化微粒子を前記膜から除去するステップをさらに含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
磁場またはフローベースの方法を使用する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
（ａ）第一の官能化微粒子に付着している第一の試料中の第一のポリヌクレオチド分析物を用意するステップと、
（ｂ）前記第一の官能化微粒子を前記膜へ送達し、それによって前記第一のポリヌクレオチド分析物を前記膜貫通ポアに送達するステップと、
（ｃ）前記第一の官能化微粒子を前記膜から除去する、場合により前記第一のポリヌクレオチド分析物を除去するステップと、
（ｄ）第二の官能化微粒子に付着している第二の試料中の第二のポリヌクレオチド分析物を用意するステップと、
（ｅ）前記第二の官能化微粒子を膜へ送達し、それによって前記第二のポリヌクレオチド分析物を前記膜貫通ポアに送達するステップと
を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載の方法であって、
（Ａ）（ｉ）ステップ（ｂ）と（ｃ）の間に、前記第一のポリヌクレオチド分析物を前記膜貫通ポアと相互作用させ、前記第一のポリヌクレオチド分析物の有無または１つもしくは複数の特性を示す１つまたは複数の測定値を相互作用中に取るステップ、および／または（ｉｉ）ステップ（ｅ）後に、前記第二のポリヌクレオチド分析物を前記膜貫通ポアと相互作用させ、前記第二のポリヌクレオチド分析物の有無または１つもしくは複数の特性を示す１つまたは複数の測定値を相互作用中に取るステップをさらに含む、あるいは、
（Ｂ）（ｉ）ステップ（ｂ）と（ｃ）の間に、前記第一のポリヌクレオチドが前記ポアを通って移動するように、前記第一のポリヌクレオチドを前記膜貫通ポアと相互作用させ、前記第一のポリヌクレオチドが前記ポアに対して移動するときに、前記第一のポリヌクレオチドの１つまたは複数の特性を示す１つまたは複数の測定値を取り、それによって前記第一のポリヌクレオチドを特性評価するステップ、および／または（ｉｉ）ステップ（ｅ）後に、前記第二のポリヌクレオチドが前記ポアを通って移動するように、前記第二のポリヌクレオチドを前記膜貫通ポアと相互作用させ、前記第二のポリヌクレオチドが前記ポアを通って移動するときに、前記第二のポリヌクレオチドの１つまたは複数の特性を示す１つまたは複数の測定値を取り、それによって前記第二のポリヌクレオチドを特性評価するステップをさらに含む、
前記方法。
【請求項１８】
膜貫通ポアを使用してポリヌクレオチド分析物の有無または１つもしくは複数の特性を判定する方法であって、（ａ）請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法を行うステップと、（ｂ）前記ポリヌクレオチド分析物を前記膜貫通ポアと相互作用させるステップと、（ｃ）前記ポリヌクレオチド分析物の有無または１つもしくは複数の特性を示す１つまたは複数の測定値を相互作用中に取るステップとを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分析物を膜中の膜貫通ポアに送達する新規方法に関する。方法は、微粒子の使用を含む。
【背景技術】
【０００２】
迅速で安価なポリヌクレオチド（例えばＤＮＡまたはＲＮＡ）シークエンシングおよび同定技術が、現今、広範な用途にわたって必要とされている。既存の技術は、主に、大量のポリヌクレオチドを生産するための増幅技法に頼り、シグナル検出に多量の専門蛍光化学物質を必要とするため、時間がかかり、費用が嵩む。
【０００３】
膜貫通ポア（ナノポア）には、高分子および様々な小分子用の直接的、電気的バイオセンサーとして大きな将来性がある。特に、ナノポアは、最近、将来性のあるＤＮＡシークエンシング技術として注目されている。
【０００４】
電位がナノポア全体に印加されると、ヌクレオチドなどの分析物がバレル内に特定の期間、一時的に存在する場合、電流の流れが変化する。ヌクレオチドのナノポア検出は、電流の既知痕跡および継続時間の変化を知らせる。鎖シークエンシング法では、単一ポリヌクレオチド鎖をポアに通して、ヌクレオチドの正体を得る。鎖シークエンシングは、ポアを通るポリヌクレオチドの移動を制御するためにポリヌクレオチド結合タンパク質の使用を含むことがある。
【０００５】
超低濃度分析物送達は、関連する検出器が存在している膜に分析物をカップリングして果たすことができることが以前に立証されている。これは、検出するのに必要な分析物の量を桁違いに低下させる（国際公開第２０１２／１６４２７０号パンフレット）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者らは、膜中の膜貫通ポアへの分析物の送達効率を、微粒子を使用して増すことが可能であることを驚くべきことに立証した。微粒子は、膜貫通ポアを使用して検出するのに必要な分析物の量を桁違いに低下させる。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
したがって、本発明は、分析物を膜中の膜貫通ポアに送達する方法であって、（ａ）微粒子に付着している分析物を用意するステップと、（ｂ）微粒子を膜へ送達し、それによって分析物を膜貫通ポアに送達するステップとを含む方法を提供する。
【０００８】
本発明は、
ポリヌクレオチド分析物を特性評価する方法であって、（ａ）ポリヌクレオチド分析物で本発明の方法を行うステップと、（ｂ）ポリヌクレオチドがポアを通るようにポリヌクレオチドを膜貫通ポアと接触させるステップと、（ｃ）ポリヌクレオチドがポアに対して移動するときに、ポリヌクレオチドの１つまたは複数の特性を示す１つまたは複数の測定値を取り、それによってポリヌクレオチドを特性評価するステップとを含む方法；
膜貫通ポアを使用して分析物の有無または１つもしくは複数の特性を判定する方法であって、（ａ）本発明の方法を行うステップと、（ｂ）分析物を膜貫通ポアと相互作用させるステップと、（ｃ）相互作用中に、分析物の有無または１つもしくは複数の特性を示す１つまたは複数の測定値を取るステップとを含む方法；および
分析物を膜中の膜貫通ポアに送達するためのキットであって、（ａ）微粒子と、（ｂ）分析物を膜とカップリングすることができる１つまたは複数のアンカーとを含むキット
も提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】ＤＮＡを実施例１でＤｙｎａｂｅａｄ（登録商標）にどのように付着させたかを示す略画表現（ノンスケール）である。二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）試料は、ラムダＤＮＡの断片化によって得（点線で示し、Ａと称する）、Ｙアダプター（Ｂと称する）およびヘアピンアダプター（Ｃと称する）をラムダＤＮＡのいずれかの末端に付着させている。２つの異なるヘリカーゼがｄｓＤＮＡ試料に結合されている。Ｙアダプターに結合するヘリカーゼ（Ｄと称する）は、そのアミノ酸配列中に存在するｈｉｓタグ（６個の連続したヒスチジン）を有さなかった一方、ヘアピンに結合するヘリカーゼ（Ｅと称する）は、そのアミノ酸配列中に存在するｈｉｓタグ（６個の連続したヒスチジン；図ではグレーの四角として示し、Ｆと称する）を有した。Ｈｉｓ−Ｔａｇ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｌｌｄｏｗｎ  Ｄｙｎａｂｅａｄ（登録商標）（Ｇと称する）がｄｓＤＮＡ試料とプレインキュベートされる場合、次いで、ビーズ表面のコバルト（黒い円で示し、Ｈと称する）が酵素上のヒスチジンに結合される。ｄｓＤＮＡ試料は、試料にハイブリダイズされた（Ｉと称する）ＤＮＡ鎖に付着された２つのアンカー（Ｊと称する）も有し、これらはＤＮＡを膜に結合させるために使用される。この図は、単一ｄｓＤＮＡ試料の付着を示しているが、ビーズはコバルトで覆われているため、単一ビーズ上の複数のｄｓＤＮＡ試料を結合する可能性がある。
【図２】ＤＮＡライブラリー試料をＤｙｎａｂｅａｄ（登録商標）とプレインキュベートした場合（レーン４〜７）、またはＤｙｎａｂｅａｄ（登録商標）なしでプレインキュベートした場合（レーン１〜３）に観察された最大スループットに正規化されたスループット（１時間あたりにシークエンシングされるＤＮＡのメガ塩基対）を示す棒グラフである。ｙ軸表示＝最大に正規化されたスループット、およびｘ軸表示＝泳動数。
【図３】ＤＮＡ／ビーズ試料の添加直後のナノポアチップ系の明視野画像を示す図である。わずかなＤｙｎａｂｅａｄ（登録商標）（小さな黒点として見られる）が、膜が形成されたチップの領域で観察された（この領域はウェルの１つで黒い円によって強調されている）。
【図４】ＤＮＡ／ビーズ試料添加の２０分後のナノポアチップ系の明視野画像を示す図である。Ｄｙｎａｂｅａｄ（登録商標）の大きなクラスター（図では白い破線の円によって強調されている）が、膜が形成されたチップの領域で観察された（この領域はウェルの１つで黒い円によって強調されている）。
【図５】様々なＤｙｎａｂｅａｄ（登録商標）を添加する前（Ｘ点）および後（Ｙ点）の飽和チャネルの数（Ｙ軸）のプロットを示す図である。調査した種々のＤｙｎａｂｅａｄ（登録商標）官能化は、１−シラン、２−ストレプトアビジンおよび３−短いビオチン化ＤＮＡ鎖と結合したストレプトアビジンであった。
【図６】もはや活性でなかった単一チャネルＭｓｐＡナノポア（Ｘと称する棒）のパーセンテージ（ｙ軸）、および種々のビーズ（１−シラン、２−ストレプトアビジン、３−短いビオチン化ＤＮＡ鎖と結合したストレプトアビジン、４−コバルトベースのＨｉｓ−ｔａｇ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｕｌｌｄｏｗｎ）をナノポア系に添加したときに飽和したチャネル（Ｙと称する棒）のパーセンテージを示す図である。
【図７】ストレプトアビジン被覆ビーズの存在下（２と称する）またはストレプトアビジン被覆ビーズの不在下（０と称する）の、ポア数（ｙ軸）対オープンポア電流（ｘ軸、ｐＡ）を示すグラフである。
【図８】図８Ａは、アレイチップ上の単一ウェルの側面を示す略画表現である。ＴＯＫフォトレジストでできた柱はＡと称し、ウェルの側面はＢと称し、ウェルの内側および上の緩衝液はＤと称し、ダークグレーとして示し、膜（両親媒性層）はＥと称し、黒い線として示し、ＦはＤＮＡ中の被覆された微粒子を表す。この図は、微粒子が油層の縁に堆積し、次いで、微粒子が油層の縁に沿って転がり、膜の最上部に集まることを示している。  図８Ｂは、アレイチップ（倍率１０×）における同じ単一ウェルの視野画像の上面および側面を示す図である。緩衝液に添加したフルオロフォアおよび前処理（油）に添加した異なる色のフルオロフォアがあり、これらの溶液が系のどこに存在したかを例証した。これらの画像は、共焦点顕微鏡を使用して撮影された画像であることから、図８Ａの略画形態で示された系がアレイチップにおいて生成されることを例証するものである。
【図９】第二のＤＮＡ試料（Ｂ）を磁性微粒子に送達し、検出し、その後、ナノポア系から除去する前に、ＤＮＡ試料（Ａ）をどのように磁性微粒子に送達し、検出し、その後、ナノポア系から除去したかを示す略画図である。（Ａ）は、磁性微粒子が添加されない系を示す。（Ｂ）は、磁性微粒子を使用した試料Ａの送達を示す。（Ｃ）は、試料Ａからの情報の十分なデータコレクションを示す。（Ｄ）は、（試料Ａの被覆された）微粒子の系からの除去を示す。これは、磁性ビーズを磁石に曝露することによって行い、磁性微粒子を膜から除去することによって試料Ａを膜からアンカップリングした。（Ｅ）は、系に今や試料Ａがないことを示す。（Ｆ）は、磁性微粒子を使用した第二の試料Ｂの送達を示す。（Ｇ）は、試料Ｂからの情報の十分なデータコレクションを示す。（Ｈ）は、（試料Ｂの被覆された）微粒子の系からの除去を示す。これは、磁性ビーズを磁石に曝露することによって行い、磁性微粒子を膜から除去することによって試料Ｂを膜からアンカップリングした。上のプロセスは、多数の試料を送達し、検出し、次いで除去するために繰り返すことができる。
【図１０】ＤＮＡを実施例５でＤｙｎａｂｅａｄ（登録商標）にどのように付着させたかを示す略画表現（ノンスケール）である。二本鎖  ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）試料は、ラムダＤＮＡの断片化によって得（点線で示し、Ａと称する）、Ｙアダプター（Ｂと称する）およびヘアピンアダプター（Ｃと称する）をラムダＤＮＡのいずれかの末端に付着させている。Ｙアダプターに結合するヘリカーゼはＤと称する。ヘアピンアダプターにハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドが示され（Ｅと称する）、ビオチン部分（Ｆと称する）を含有した。ＭｙＯｎｅ  Ｃ１  Ｄｙｎａｂｅａｄ（登録商標）（Ｇと称する）をｄｓＤＮＡ試料とプレインキュベートすると、ビーズ表面（黒い円で示し、Ｈと称する）のストレプトアビジンはビオチンに結合した。ｄｓＤＮＡ試料は追加のアンカー（Ｊと称する）も有し、アンカーはＤＮＡ鎖（Ｉと称する）に付着させ、ＤＮＡ鎖はＹアダプターにハイブリダイズした：これをＤＮＡを膜と結合させるために使用した。この図は、単一ｄｓＤＮＡ試料の付着を示しているが、ビーズはストレプトアビジンで覆われているため、単一ビーズ上の複数のｄｓＤＮＡ試料を結合する可能性がある。
【図１１】実施例６に記載されている実験の間の試料ＡおよびＢのカバレッジ深度を示す２つのプロット（ｙ軸＝カバレッジ深度およびｘ軸＝試料１（１と称する領域を参照されたい）および２（２と称する領域を参照されたい）のポリヌクレオチド配列中のＤＮＡ塩基数）を示す図である。カバレッジ深度は、ＤＮＡ配列におけるその位置がマッピングされ、ヘリカーゼによって制御されるＤＮＡの移動において同定された場合の数に関する。セクション（Ａ）は、試料１のみをナノポア系に添加した場合のカバレッジ深度を示し、セクション（Ｂ）は、試料Ａが系から洗浄され、試料Ｂが系に添加されていた場合のカバレッジ深度を示す。試料１のＤＮＡ配列は、試料２のＤＮＡ配列よりはるかに長かった。ビーズ（試料１が付着されている）が系から洗い流され、試料２を有するビーズが添加された後では、試料１のカバレッジ深度は極めて低かった。
【図１２】ナノポアチップ系の同じ領域の２つの顕微鏡画像を示す図である。（Ａ）は、ビーズに付着されている試料Ａの添加後のナノポアチップ系の顕微鏡画像を示す。Ｄｙｎａｂｅａｄ（登録商標）の大きなクラスター（図では白い破線の円によって強調されている）が、膜が形成されたチップの領域で観察された（この領域はウェルの１つで黒い円によって強調されている）。（Ｂ）は、３×１ｍｌ体積の緩衝液を使用してナノポア系が洗い流された後のナノポアチップ系の顕微鏡画像を示す。膜が形成されたチップの領域にビーズは見られなかった。
【図１３Ａ】実施例７において記載されているローインプットプロトコールを示す略図である。
【図１３Ｂ】ＰＣＲベースのローインプットプロトコール（実施例７において言及されている）を示す略図である。
【図１４】実施例８において記載されている配列捕捉ワークフローを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
配列表の説明
配列番号１は、ＭＳ−Ｂ１突然変異体ＭｓｐＡ単量体をコードするコドン最適化ポリヌクレオチド配列を示す。この突然変異体は、シグナル配列を欠き、次の突然変異を含む：Ｄ９０Ｎ、Ｄ９１Ｎ、Ｄ９３Ｎ、Ｄ１１８Ｒ、Ｄ１３４ＲおよびＥ１３９Ｋ。
【００１１】
配列番号２は、ＭｓｐＡ単量体のＭＳ−Ｂ１突然変異体の成熟形態のアミノ酸配列を示す。この突然変異体は、シグナル配列を欠き、次の突然変異を含む：Ｄ９０Ｎ、Ｄ９１Ｎ、Ｄ９３Ｎ、Ｄ１１８Ｒ、Ｄ１３４ＲおよびＥ１３９Ｋ。
【００１２】
配列番号３は、α−ヘモリシン−Ｅ１１１Ｎ／Ｋ１４７Ｎ（α−ＨＬ−ＮＮ；Stoddart et al., PNAS, 2009; 106(19): 7702-7707）の１つの単量体をコードするポリヌクレオチド配列を示す。
【００１３】
配列番号４は、α−ＨＬ−ＮＮの１つの単量体のアミノ酸配列を示す。
【００１４】
配列番号５〜７は、ＭｓｐＢ、ＣおよびＤのアミノ酸配列を示す。
【００１５】
配列番号８は、Ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼをコードするポリヌクレオチド配列を示す。
【００１６】
配列番号９は、Ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列を示す。
【００１７】
配列番号１０は、大腸菌（E. coli）からのｓｂｃＢ遺伝子に由来するコドン最適化ポリヌクレオチド配列を示す。この配列は、大腸菌（E. coli）からのエキソヌクレアーゼＩ酵素（ＥｃｏＥｘｏ  Ｉ）をコードする。
【００１８】
配列番号１１は、大腸菌（E. coli）からのエキソヌクレアーゼＩ酵素（ＥｃｏＥｘｏ  Ｉ）のアミノ酸配列を示す。
【００１９】
配列番号１２は、大腸菌（E. coli）からのｘｔｈＡ遺伝子に由来するコドン最適化ポリヌクレオチド配列を示す。この配列は、大腸菌（E. coli）からのエキソヌクレアーゼＩＩＩ酵素をコードする。
【００２０】
配列番号１３は、大腸菌（E. coli）からのエキソヌクレアーゼＩＩＩ酵素のアミノ酸配列を示す。この酵素は、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の一方の鎖からの５’一リン酸ヌクレオシドの分配性消化（distributive digestion）を３’−５’方向で行う。鎖上での酵素開始は、おおよそ４ヌクレオチドの５’オーバーハングを必要とする。
【００２１】
配列番号１４は、サーマス・サーモフィラス（T. thermophilus）からのｒｅｃＪ遺伝子に由来するコドン最適化ポリヌクレオチド配列を示す。この配列は、サーマス・サーモフィラス（T. thermophilus）からのＲｅｃＪ酵素（ＴｔｈＲｅｃＪ−ｃｄ）をコードする。
【００２２】
配列番号１５は、サーマス・サーモフィラス（T. thermophilus）からのＲｅｃＪ酵素（ＴｔｈＲｅｃＪ−ｃｄ）のアミノ酸配列を示す。この酵素は、ｓｓＤＮＡからの５’一リン酸ヌクレオシドの前進性消化（processive digestion）を５’−３’方向で行う。鎖上での酵素開始は、少なくとも４ヌクレオチドを必要とする。
【００２３】
配列番号１６は、バクテリオファージλ  ｅｘｏ（ｒｅｄＸ）遺伝子に由来するコドン最適化ポリヌクレオチド配列を示す。この配列は、バクテリオファージλエキソヌクレアーゼをコードする。
【００２４】
配列番号１７は、バクテリオファージλエキソヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。この配列は、集合して三量体になる３つの同一のサブユニットの１つである。この酵素は、ｄｓＤＮＡの一方の鎖からのヌクレオチドの５’−３’方向の高前進性消化を行う（http://www.neb.com/nebecomm/products/productM0262.asp）。鎖上での酵素開始は、５’リン酸エステルを有するおおよそ４ヌクレオチドの５’オーバーハングを優先的に必要とする。
【００２５】
配列番号１８は、Ｈｅｌ３０８  Ｍｂｕのアミノ酸配列を示す。
【００２６】
配列番号１９は、Ｈｅｌ３０８  Ｃｓｙのアミノ酸配列を示す。
【００２７】
配列番号２０は、Ｈｅｌ３０８  Ｔｇａのアミノ酸配列を示す。
【００２８】
配列番号２１は、Ｈｅｌ３０８  Ｍｈｕのアミノ酸配列を示す。
【００２９】
配列番号２２は、ＴｒａＩ  Ｅｃｏのアミノ酸配列を示す。
【００３０】
配列番号２３は、ＸＰＤ  Ｍｂｕのアミノ酸配列を示す。
【００３１】
配列番号２４は、Ｄｄａ  １９９３のアミノ酸配列を示す。
【００３２】
配列番号２５は、Ｔｒｗｃ  Ｃｂａのアミノ酸配列を示す。
【００３３】
発明の詳細な説明
開示する生成物および方法の様々な用途を当技術分野における具体的な必要に合わせて調整できることは理解されるはずである。本明細書において用いる用語法が本発明の特定の実施形態の説明を目的にしたものに過ぎず、限定を意図したものでないことも理解されるはずである。
【００３４】
加えて、本明細書および添付の特許請求の範囲において用いる場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈による別段の明白な指図がない限り、複数の言及対象を含む。したがって、例えば、「分析物（an analyte）」への言及は、２つ以上の分析物を含み、「微粒子（a microparticle）」への言及は、２つ以上の微粒子を含み、「ポリヌクレオチド（a polynucleotide）」への言及は、２つ以上のポリヌクレオチドを含み、「アンカー（an anchor）」への言及は、２つ以上のアンカーを指し、「ヘリカーゼ（a helicase）」への言及は、２つ以上のヘリカーゼを含み、「膜貫通ポア（a transmembrane pore）」への言及は、２つ以上のポアを含むなど。
【００３５】
上文であろうと、下文であろうと、本明細書の中で引用するすべての出版物、特許および特許出願は、それら全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【００３６】
発明の方法
本発明は、分析物を膜中の膜貫通ポアに送達する方法を提供する。方法は、微粒子に付着している分析物を用意するステップを含む。方法は、分析物を微粒子に付着させるステップを含んでもよい。微粒子は次いで膜へ送達され、これにより分析物が膜貫通ポアへ送達される。
【００３７】
本発明者らは、ポアへの超低濃度の分析物送達は分析物を微粒子に付着させて果たすことができることを、驚くべきことに立証した。これは、検出するのに必要な分析物の量を数桁下げる。必要とされる分析物の量がどの程度低減するかは、予測することができなかった。特に、本発明者らは驚くべきことに、一本鎖ポリヌクレオチドの捕捉が以前に報告されたものと比べて少なくとも１０桁増加することを報告する。これは、次世代シークエンシングシステムなどの診断装置に関する主要な関心事である試料調製要件に、著しい意味合いを持つ。
【００３８】
本発明の方法は、好ましくは、増加した濃度の分析物を膜中の膜貫通ポアに送達するためのものである。本発明の方法は、好ましくは、増加した濃度の分析物を膜貫通ポアに送達することによる、膜中の膜貫通ポアを使用する分析物の特性評価の改善された方法である。膜貫通ポアに送達された分析物の濃度は、膜にカップリングされなかった分析物と比べて、好ましくは、少なくとも約１０００倍、少なくとも約１００００倍、少なくとも約１０００００倍、少なくとも約１００００００倍、少なくとも約１０００００００倍、少なくとも約１００００００００増加される。
【００３９】
微粒子を使用する送達効率は、分析物が膜ともカップリングされる場合、特に増加される。膜との分析物のカップリングは、様々なナノポア−酵素シークエンシング用途に利点を加えた。鎖シークエンシングにおいて、ポリヌクレオチド分析物が導入される場合、ポアは永続的または一時的に遮断されるようになり、ポリヌクレオチドのシークエンシングを妨げることがある。ポリヌクレオチド分析物の一方の末端が、例えば膜とのカップリングまたは繋留によりポアから離れて局在する場合、この一時的または永続的遮断はもはや観察されないことが驚くべきことに見いだされた。ポリヌクレオチドの一方の末端は、膜とカップリングしてこれを塞ぐことにより、ポア上の分析物濃度を有効に増加させ、したがってシークエンシング系デューティサイクルを増加させるようにも作用する。膜貫通ポアに送達される分析物の濃度は、好ましくは、膜とカップリングされている分析物と比べて少なくとも約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約４５倍、少なくとも約５０倍、または少なくとも約１００倍増加される。
【００４０】
本発明の方法は、好ましくは、特性評価またはシークエンシング用に増加した濃度のポリヌクレオチドを膜中の膜貫通ポアに送達するためのものである。本発明の方法は、好ましくは、増加した濃度の分析物を膜貫通ポアに送達することによる、膜中の膜貫通ポアを使用してポリヌクレオチドを特性評価またはシークエンシングする改善された方法である。膜貫通ポアに送達されるポリヌクレオチドの濃度は、好ましくは、上で論じたいずれかの量ほど増加される。方法は、低濃度で存在する分析物を検出するのにもちろん有利である。分析物が約０．００１ｐＭから約１ｎＭ、例えば約０．０１ｐＭ未満、約０．１ｐＭ未満、約１ｐＭ未満、約１０ｐＭ未満、または約１００ｐＭ未満の濃度で存在する場合、方法は好ましくは、分析物を膜貫通ポアに送達（および場合により、分析物の存在または１つもしくは複数の特性を判定）できるようにする。方法は、低濃度で存在する分析物を検出するのにもちろん有利である。分析物が約０．００１ｐＭから約１ｎＭ、例えば約０．０１ｐＭ未満、約０．１ｐＭ未満、約１ｐＭ未満、約１０ｐＭ未満、または約１００ｐＭ未満の濃度で存在する場合、方法は好ましくは、分析物の存在または１つもしくは複数の特性を判定できるようにする。
【００４１】
約１０ｎｇ以下、例えば約５ｎｇ以下、約２．５ｎｇ以下、約１．０ｎｇ以下、約０．５ｎｇ以下、約０．１ｎｇ以下、約０．０１ｎｇ以下または約０．００１ｎｇ以下の分析物が存在する場合、方法は好ましくは、分析物を膜貫通ポアに送達（および場合により、分析物の存在または１つもしくは複数の特性を判定）できるようにする。約５．０フェムトモル（ｆｍｏｌ）以下、例えば約４．０ｆｍｏｌ以下、約３．０ｆｍｏｌ以下、約２．０ｆｍｏｌ以下、約１．０ｆｍｏｌ以下、約０．５ｆｍｏｌ以下、約０．１ｆｍｏｌ以下、約０．０１ｆｍｏｌ以下、または約０．００１ｆｍｏｌ以下の分析物が存在する場合、方法は、好ましくは、分析物を膜貫通ポアに送達（および場合により、分析物の存在または１つもしくは複数の特性を判定）できるようにする。
【００４２】
本発明の方法は、ほんの少量の精製ポリヌクレオチドがヒト血液から得られてもよいため、ポリヌクレオチドシークエンシングに特に有利である。方法は好ましくは、約０．００１ｐＭから約１ｎＭ、例えば０．０１ｐＭ未満、０．１ｐＭ未満、１ｐＭ未満、１０ｐＭ未満、または１００ｐＭ未満の濃度で存在するポリヌクレオチドの、膜貫通ポアへの送達を可能にする（および場合により、ポリヌクレオチドの配列の推定、またはポリヌクレオチドのシークエンシングを可能にする）。
【００４３】
１０ｎｇ以下、例えば約５ｎｇ以下、約２．５ｎｇ以下、約１．０ｎｇ以下、約０．５ｎｇ以下、約０．１ｎｇ以下、約０．０１ｎｇ以下、または約０．００１ｎｇ以下のポリヌクレオチドが存在する場合、方法は好ましくは、分析物を膜貫通ポアに送達できるようにする（および場合により、ポリヌクレオチドの配列の推定、またはポリヌクレオチドのシークエンシングを可能にする）。約５．０フェムトモル（ｆｍｏｌ）以下、例えば約４．０ｆｍｏｌ以下、約３．０ｆｍｏｌ以下、約２．０ｆｍｏｌ以下、約１．０ｆｍｏｌ以下、約０．５ｆｍｏｌ以下、約０．１ｆｍｏｌ以下、約０．０１ｆｍｏｌ以下、または約０．００１ｆｍｏｌ以下のポリヌクレオチドが存在する場合、方法は好ましくは、分析物を膜貫通ポアに送達できるようにする（および場合により、ポリヌクレオチドの配列の推定、またはポリヌクレオチドのシークエンシングを可能にする）。
【００４４】
本発明の方法は好ましくは、分析物またはポリヌクレオチドの単一分子の、膜貫通ポアへの送達（および場合により特性評価）を可能にする。
【００４５】
下でより詳細に論じるように、同じまたは類似の分析物の２つ以上のバージョンが、本発明を用いて特性評価されてもよい。これは、ポリヌクレオチドの配列を２回以上調査できるようにするため、ポリヌクレオチドシークエンシングに有利である。これは、シークエンシング効率および精度の向上をもたらす。
【００４６】
ポリヌクレオチドの一方の末端を膜とカップリングする（一時的にでも）ことは、該末端がナノポアベースのシークエンシングプロセスを妨害できないようにされることも意味する。
【００４７】
本発明の方法は、他の利点も有する。本発明で使用される微粒子は、他の分析物を含有する試料から標的分析物を選択または捕捉し、該分析物を膜貫通ポアに送達するように設計することができる。このことは、下でより詳細に論じる。
【００４８】
ナノポア特性評価またはシークエンシングのための試料調製は、微粒子を使用してポリヌクレオチドなどの分析物を精製するステップを概して含む。微粒子は、次いで特性評価またはシークエンシングの前に除去される。微粒子が分析物またはポリヌクレオチドを膜貫通ポアに送達するために使用される場合、試料調製方法は１つ少ないステップを含み、それ故、行うのがより迅速であり、容易である。
【００４９】
分析物
本発明の方法は、分析物を膜中の膜貫通ポアに送達することに関わる。いずれの数の分析物が送達されてもよい。例えば、本発明の方法は、２つ以上の分析物、例えば３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、２０以上、３０以上、５０以上、１００以上、５００以上、１，０００以上、５，０００以上、１０，０００以上、１００，０００以上、１０００，０００以上、または５０００，０００以上の分析物を送達することに関わることがある。２つ以上の分析物は、同じまたは異なる微粒子を使用して送達されてもよい。
【００５０】
２つ以上の分析物が送達される場合、それらは互いに異なっていてもよい。例えば、第一の分析物はタンパク質であってもよく、第二の分析物はポリヌクレオチドであってもよい。あるいは、２つ以上の分析物は異なるポリヌクレオチドであってもよい。２つ以上の分析物は、より長いポリヌクレオチド配列の複数のコピー（ゲノムの複数のコピーなど）のランダム断片化の生成物であってもよく、それ故に、異なっているが重複するポリヌクレオチド断片であってもよい。２つ以上の分析物は、同じ分析物の２つ以上の例であってもよい。２つ以上の分析物は、同一であってもよい。これにより、特に分析物がポリヌクレオチドの場合校正が可能になる。方法が３つ以上の分析物の調査に関わる場合、それらはすべて、同じ分析物の３つ以上の例であってもよく、またはそれらのいくつかが同じ分析物の別の例であってもよい。
【００５１】
本発明の方法は、分析物の１つまたは複数の特性を判定または測定するステップに関わることがある。方法は、分析物の２、３、４または５以上の特性を判定または測定するステップを含むことがある。１つまたは複数の特性は、好ましくは、（ｉ）分析物のサイズ、（ｉｉ）分析物の同一性、（ｉｉｉ）分析物の二次構造、および（ｉｖ）分析物が修飾されているか否かから選択される。｛ｉ｝、｛ｉｉ｝、｛ｉｉｉ｝、｛ｉｖ｝、｛ｉ、ｉｉ｝、｛ｉ、ｉｉｉ｝、｛ｉ、ｉｖ｝、｛ｉｉ、ｉｉｉ｝、｛ｉｉ、ｉｖ｝、｛ｉｉｉ、ｉｖ｝、｛ｉ、ｉｉ、ｉｉｉ｝、｛ｉ、ｉｉ、ｉｖ｝、｛ｉ、ｉｉｉ、ｉｖ｝、｛ｉｉ、ｉｉｉ、ｉｖ｝または｛ｉ、ｉｉ、ｉｉｉ、ｉｖ｝などの、（ｉ）から（ｉｖ）のいずれの組み合わせを本発明に従って測定してもよい。本発明の方法は、好ましくは、ポリヌクレオチドの配列の推定またはポリヌクレオチドのシークエンシングを含む。このことは、下でより詳細に論じる。
【００５２】
分析物は、いずれの物質であってもよい。好適な分析物としては、金属イオン、無機塩類、ポリマー酸または塩基などの重合体、色素、漂白剤、医薬品、診断剤、レクリエーショナルドラッグ、爆薬および環境汚染物質が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５３】
分析物は、細胞から分泌される分析物であってもよい。あるいは、分析物は、本発明が行われうる前に分析物が細胞から抽出されなければならないような、細胞内部に存在する分析物であってもよい。
【００５４】
分析物は、好ましくは、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、またはポリヌクレオチドである。アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質は、天然に存在してもよくまたは天然に存在しなくてもよい。ポリペプチドまたはタンパク質は、その中に合成アミノ酸または修飾アミノ酸を含んでもよい。アミノ酸に対するいくつかの異なるタイプの修飾は、当技術分野において公知である。本発明の目的のために、当技術分野で利用可能ないずれかの方法によって分析物を修飾できることは理解されるはずである。
【００５５】
タンパク質は、酵素、抗体、ホルモン、成長因子、またはサイトカインなどの成長調節タンパク質であってもよい。サイトカインは、インターロイキン、好ましくはＩＦＮ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２またはＩＬ−１３、インターフェロン、好ましくはＩＬ−γ、またはＴＮＦ−αなどの他のサイトカインから選択することができる。タンパク質は、細菌性タンパク質、真菌性タンパク質、ウイルス性タンパク質、または寄生虫由来タンパク質であってもよい。タンパク質はポアと接触される前に、ポリペプチド鎖を形成するためにアンフォールディングされてもよい。
【００５６】
分析物は、最も好ましくは核酸などのポリヌクレオチドである。ポリヌクレオチドは、下でより詳細に論じる。ポリヌクレオチドは、５’末端もしくは３’末端、または鎖に沿った１つもしくは複数の中間点で膜とカップリングしてもよい。ポリヌクレオチドは、下で論じるように一本鎖または二本鎖であってもよい。ポリヌクレオチドは、環状であってもよい。ポリヌクレオチドは、マイクロＲＮＡにハイブリダイズするプローブまたはマイクロＲＮＡそれ自体であるアプタマーであってもよい（Wang, Y. et al, Nature Nanotechnology, 2011, 6, 668-674）。分析物は、タンパク質と結合するポリヌクレオチドであってもよく、タンパク質を特性評価するために、例えばタンパク質の濃度を判定するために使用することができる。
【００５７】
分析物がマイクロＲＮＡにハイブリダイズするプローブである場合、プローブは永続的または一時的に膜とカップリングされてもよい。このことは、下でより詳細に論じる。プローブそれ自体が、膜と直接カップリングするように適合されてもよく、または膜とカップリングするように適合された相補的ポリヌクレオチドにハイブリダイズしてもよい。分析物は、特有の配列または明確に識別できるようにするバーコードを有するプローブにハイブリダイズされたマイクロＲＮＡの複合体であってもよい。
【００５８】
分析物がアプタマーである場合、アプタマーは永続的または一時的に膜とカップリングされてもよい。アプタマーそれ自体が、膜と直接カップリングするように適合されてもよく、または膜とカップリングするように適合された相補的ポリヌクレオチドにハイブリダイズしてもよい。アプタマーは、タンパク質分析物と結合されてもまたは結合されなくてもよく、アプタマーを検出する最終的な目的は、アプタマーが結合するタンパク質分析物の有無または１つもしくは複数の特性を検出することであってもよい。
【００５９】
ポリヌクレオチド
分析物は、好ましくはポリヌクレオチドである。核酸などのポリヌクレオチドは、２つ以上のヌクレオチドを含む高分子である。ポリヌクレオチドまたは核酸は、いずれのヌクレオチドのいずれの組み合わせを含んでもよい。ヌクレオチドは、天然に存在するものであることもあり、または人工的なものであることもある。ポリヌクレオチド中の１つまたは複数のヌクレオチドは、酸化またはメチル化されていることがある。ポリヌクレオチド中の１つまたは複数のヌクレオチドは、損傷されていることがある。例えば、ポリヌクレオチドは、ピリミジン二量体を含むことがある。そのような二量体は概して、紫外線による損傷に関連し、皮膚黒色腫の主原因である。ポリヌクレオチド中の１つまたは複数のヌクレオチドは、例えば標識またはタグで、修飾されていることがある。好適な標識は、下で説明する。ポリヌクレオチドは、１つまたは複数のスペーサーを含むことがある。
【００６０】
ヌクレオチドは、概して核酸塩基、糖および少なくとも１つのリン酸エステル基を概して含有する。核酸塩基および糖は、ヌクレオシドを形成する。
【００６１】
核酸塩基は、概して複素環式である。核酸塩基としては、プリンおよびピリミジン、より具体的にはアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、ウラシル（Ｕ）およびシトシン（Ｃ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６２】
糖は、概してペントース糖である。ヌクレオチド糖としては、リボースおよびデオキシリボースが挙げられるが、これらに限定されない。糖は、好ましくはデオキシリボースである。
【００６３】
ポリヌクレオチドは、好ましくは次のヌクレオシドを含む：デオキシアデノシン（ｄＡ）、デオキシウリジン（ｄＵ）および／またはチミジン（ｄＴ）、デオキシグアノシン（ｄＧ）ならびにデオキシシチジン（ｄＣ）。
【００６４】
ヌクレオチドは、概してリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドである。ヌクレオチドは、概して、一リン酸エステル、二リン酸エステルまたは三リン酸エステルを含有する。ヌクレオチドは、３つより多くのリン酸エステル、例えば４つまたは５つのリン酸エステルを含むことがある。リン酸エステルは、ヌクレオチドの５’側または３’側に付着されていることもある。ヌクレオチドとしては、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）、グアノシン一リン酸（ＧＭＰ）、チミジン一リン酸（ＴＭＰ）、ウリジン一リン酸（ＵＭＰ）、５−メチルシチジン一リン酸、５−ヒドロキシメチルシチジン一リン酸、シチジン一リン酸（ＣＭＰ）、環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）、環状グアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）、デオキシアデノシン一リン酸（ｄＡＭＰ）、デオキシグアノシン一リン酸（ｄＧＭＰ）、デオキシチミジン一リン酸（ｄＴＭＰ）、デオキシウリジン一リン酸（ｄＵＭＰ）、デオキシシチジン一リン酸（ｄＣＭＰ）およびデオキシメチルシチジン一リン酸が挙げられるが、これらに限定されない。ヌクレオチドは、好ましくは、ＡＭＰ、ＴＭＰ、ＧＭＰ、ＣＭＰ、ＵＭＰ、ｄＡＭＰ、ｄＴＭＰ、ｄＧＭＰ、ｄＣＭＰおよびｄＵＭＰから選択される。
【００６５】
ヌクレオチドは、脱塩基性であってもよい（すなわち、核酸塩基を欠く）。ヌクレオチドは、核酸塩基および糖を欠くこともある（すなわち、Ｃ３スペーサーである）。
【００６６】
ポリヌクレオチド中のヌクレオチドは、いずれの様式で互いに付着されていてもよい。ヌクレオチドは、概して、それらの糖およびリン酸基によって核酸の場合のように付着されている。ヌクレオチドは、それらの核酸塩基によってピリミジン二量体の場合のように接続されていることがある。
【００６７】
ポリヌクレオチドは、一本鎖状であることもあり、または二本鎖状であることもある。ポリヌクレオチドの少なくとも一部分は、好ましくは二本鎖状である。
【００６８】
ポリヌクレオチドは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）などの核酸であってもよい。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡの一方の鎖にハイブリダイズされたＲＮＡの一方の鎖を含んでもよい。ポリヌクレオチドは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、グリセロール核酸（ＧＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、またはヌクレオチド側鎖を有する他の合成重合体などの、当技術分野において公知のいずれの合成核酸であってもよい。ＰＮＡ主鎖は、ペプチド結合によって連結された反復Ｎ−（２−アミノエチル）−グリシンユニットからなる。ＧＮＡ主鎖は、ホスホジエステル結合によって連結された反復グリコールユニットからなる。ＴＮＡ主鎖は、ホスホジエステル結合によって一緒に連結された反復トレオース糖からなる。ＬＮＡは、リボース部分の２’酸素と４’炭素を接続する余分な架橋を有する、上で論じたようなリボヌクレオチドから形成される。
【００６９】
ポリヌクレオチドは、最も好ましくはリボ核酸（ＲＮＡ）またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である。
【００７０】
ポリヌクレオチドは、いずれの長さであってもよい。例えば、ポリヌクレオチドは、少なくとも１０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも４００もしくは少なくとも５００ヌクレオチドの長さ、またはヌクレオチド対の長さでありうる。ポリヌクレオチドは、１０００以上のヌクレオチドの長さもしくはヌクレオチド対の長さ、５０００以上のヌクレオチドの長さもしくはヌクレオチド対の長さ、または１０００００以上のヌクレオチドの長さもしくはヌクレオチド対の長さでありうる。
【００７１】
試料
分析物は、任意の好適な試料中に存在してもよい。試料は、生体試料であってもよい。任意の生物または微生物から得られたまたは抽出された少なくとも１つの試料を使用してインビトロで本発明を行ってもよい。生物または微生物は、概して、古細菌性、原核性または真核性であり、五界、すなわち植物界、動物界、菌界、原核生物界および原生生物界の１つに概して属する。任意のウイルスから得られたまたは抽出された少なくとも１つの試料に対して本発明をインビトロで行ってもよい。試料は、好ましくは流体試料である。試料は、患者の体液を概して含む。試料は、尿、リンパ液、唾液、粘液または羊水であってもよいが、好ましくは血液、血漿または血清である。概して、試料は起源がヒトであるが、代替的に、別の哺乳類動物からのもの、例えば、商業飼育動物、例えばウマ、ウシ、ヒツジ、魚、ニワトリもしくはブタからのものであってもよく、または代替的にペット、例えばネコもしくはイヌであってもよい。あるいは、試料は、植物起源のもの、例えば、商品作物、例えば、穀類、マメ科植物、果実または野菜、例えば、コムギ、オオムギ、オートムギ、キャノーラ、トウモロコシ、ダイズ、イネ、ダイオウ、バナナ、リンゴ、トマト、ジャガイモ、ブドウ、タバコ、マメ、レンズマメ、サトウキビ、カカオノキ、ワタから得られた試料であってもよい。
【００７２】
試料は、非生体試料であってもよい。非生体試料は、好ましくは流体試料である。非生体試料の例としては、外科用流体、水、例えば飲用水、海水または河川水、および検査室検査用の試薬が挙げられる。
【００７３】
試料は、本発明で使用される前に、例えば、遠心分離によって、または望ましくない分子もしくは細胞、例えば赤血球を濾過して取り除く膜を通過させることによって、概して処理される。試料は、採取され次第、測定されることがある。試料は、アッセイ前に、好ましくは−７０℃未満で概して保存されることもある。
【００７４】
膜
いずれの膜を本発明に従って使用してもよい。好適な膜は、当技術分野において周知である。膜は、好ましくは両親媒性層である。両親媒性層は、親水性と親油性の両方を有する両親媒性分子、例えばリン脂質から形成される層である。両親媒性分子は、合成のものであってもよく、または天然に存在するものであってもよい。天然に存在しない両親媒性物質、および単層を形成する両親媒性物質は、当技術分野において公知であり、例えば、ブロック共重合体を含む（Gonzalez-Perez et al., Langmuir, 2009, 25, 10447-10450）。ブロック共重合体は、２つ以上の単量体サブユニットが一緒に重合されて単一高分子鎖を作っている高分子材料である。ブロック共重合体は、各単量体サブユニットが一因となる特性を概して有する。しかし、ブロック共重合体は、個々のサブユニットから形成された重合体が有さない固有の特性を有することがある。ブロック共重合体は、単量体サブユニットの１つが疎水性（すなわち親油性）であるが他のサブユニットは水性媒体中にあるとき親水性であるように、工学的に操作することができる。この場合、ブロック共重合体は、両親媒性を有することがあり、生体膜を模倣する構造を形成することがある。ブロック共重合体は、（２つの単量体サブユニットからなる）ジブロックであることがあるが、２つより多くの単量体サブユニットから、両親媒性物質として挙動するより複雑な配置を形成するように、構築されることもある。共重合体は、トリブロック、テトラブロックまたはペンタブロック共重合体であることがある。膜は、好ましくは、トリブロック共重合体膜である。
【００７５】
古細菌双極性テトラエーテル脂質は、脂質が単層膜を形成するように構築されている天然に存在する脂質である。これらの脂質は、厳しい生物環境で生き残る好極限性細菌、好熱菌、好塩菌および好酸菌において一般に見いだされる。それらの安定性は、最終二重層の融合された性質に由来すると考えられている。親水性−疎水性−親水性の一般モチーフを有するトリブロック重合体を生成することによってこれらの生物学的エンティティーを模倣するブロック共重合体材料を構築することは容易である。この材料は、脂質二重層と同様に挙動し、かつ小胞から層状の膜までの範囲の相挙動を包含する、単量体膜を形成しうる。これらのトリブロック共重合体から形成される膜は、生体脂質膜に勝るいくつかの利点を保持する。トリブロック共重合体を合成するので、まさにその構築を注意深く制御して、膜を形成するためにならびにポアおよび他のタンパク質と相互作用するために必要な的確な鎖長および特性を得ることができる。
【００７６】
ブロック共重合体は、脂質副素材として分類されないサブユニットから構築されることもある。例えば、疎水性重合体は、シロキサンまたは他の非炭化水素系単量体から作製されることがある。ブロック共重合体の親水性サブセクションは、低いタンパク質結合特性を有することもでき、この低いタンパク質結合特性によって、未加工の生体試料に曝露されたときに高度に耐性である膜の生成が可能になる。このヘッド基ユニットは、非古典的脂質ヘッド基から誘導されることもある。
【００７７】
トリブロック共重合体膜は、生体脂質膜と比較して増加した機械的および環境安定性、例えば、より高い動作温度またはｐＨ範囲も有する。ブロック共重合体の合成性は、重合体に基づく膜を広範な用途に合わせてカスタマイズするためのプラットフォームをもたらす。
【００７８】
膜は、最も好ましくは、国際出願番号ＰＣＴ／ＧＢ２０１３／０５２７６６またはＰＣＴ／ＧＢ２０１３／０５２７６７において開示されている膜の１つである。
【００７９】
両親媒性分子は、分析物のカップリングを助長するように化学的に修飾されるまたは官能化されることがある。
【００８０】
両親媒性層は、単層であってもよく、または二重層であってもよい。両親媒性層は、概して平面状である。両親媒性層は、湾曲されることがある。両親媒性層は、支持されることがある。両親媒性層は、凹面であってもよい。両親媒性層は、両親媒性層の周辺領域（Ａと称する柱に付着している）が、図８にＥと称して示されている両親媒性層領域より高くなるように、図８に示すように隆起した柱（Ａと称する）から吊るすことができる。これによって、上で記載したように微粒子が膜に沿って進み、移動し、スライドしまたは転がることが可能になりうる。
【００８１】
両親媒性膜は、概して自然移動性であり、本質的に二次元流体としておおよそ１０−８ｃｍ・ｓ−１の脂質拡散速度で動作する。これは、ポアおよびカップリングされた分析物が両親媒性膜内で概して移動することができることを意味する。
【００８２】
膜は、脂質二重層であってもよい。脂質二重層は、細胞膜のモデルであり、ある範囲の実験研究用の優れたプラットフォームとして役立つ。例えば、脂質二重層をシングルチャンネル記録による膜タンパク質のインビトロ調査に使用することができる。あるいは、脂質二重層をバイオセンサーとして使用して、ある範囲の物質の存在を検出することができる。脂質二重層は、いずれの脂質二重層であってもよい。好適な脂質二重層としては、平面状脂質二重層、支持二重層またはリポソームが挙げられるが、これらに限定されない。脂質二重層は、好ましくは平面状脂質二重層である。好適な脂質二重層は、国際出願番号ＰＣＴ／ＧＢ０８／０００５６３（国際公開第２００８／１０２１２１号パンフレットとして公開された）、国際出願番号ＰＣＴ／ＧＢ０８／００４１２７（国際公開第２００９／０７７７３４号パンフレットとして公開された）および国際出願番号ＰＣＴ／ＧＢ２００６／００１０５７（国際公開第２００６／１００４８４号パンフレットとして公開された）に開示されている。
【００８３】
脂質二重層を形成する方法は、当技術分野において公知である。好適な方法は、実施例で開示する。脂質二重層は、脂質単層が水溶液／空気界面に、その界面に対して垂直である開口部のいずれかの側を超えて担持される、モンタル（Montal）およびミューラー（Mueller）の方法（Proc.Natl.Acad.Sci.USA., 1972; 69: 3561-3566）によって、一般に形成される。通常、先ず脂質を有機溶媒に溶解し、次いで溶媒の液滴を開口部のいずれかの側の水性溶液の表面で蒸発させることによって、脂質を水性電解質溶液の表面に付加する。有機溶媒を蒸発させたら、開口部のいずれかの側の溶液／空気界面を、二重層が形成されるまで、開口部を超えて物理的に上下に移動させる。平面状脂質二重層は、膜の開口部を横断して形成されることもあり、または開口を横断して凹所内に形成されることもある。
【００８４】
モンタルおよびミューラーの方法は、タンパク質ポア挿入に好適である良質脂質二重層を形成する、対費用効果の高い、比較的容易な方法であるため、評判がよい。他の一般的な二重層形成方法としては、先端部浸漬（tip-dipping）、二重層の塗装、およびリポソーム二重層のパッチクランプが挙げられる。
【００８５】
先端部浸漬二重層形成は、脂質の単層を担持している試験溶液の表面に開口部表面（例えばピペット先端部）を触れさせることを必要とする。この場合もやはり、有機溶媒に溶解された脂質の液滴を溶液表面で蒸発させることによって先ず脂質単層が溶液／空気界面に作られる。次いで、二重層はラングミュア（Langumur）・シェーファー（Schaefer）法によって形成され、溶液表面に対して開口部を移動させる機械的自動化を必要とする。
【００８６】
塗装される二重層については、有機溶媒に溶解された脂質の液滴が開口部に直接塗布され、その開口部が水性試験溶液に沈められる。脂質溶液は、塗装用刷毛または同等物を使用して開口部全面に薄く塗られる。溶媒が薄くなることで、脂質二重層が形成される結果となる。しかし、二重層からの溶媒の完全除去は困難であり、それ故、この方法によって形成される二重層は、安定性がより低く、電気化学的測定中にノイズをより生じやすい。
【００８７】
パッチクランプは、生体細胞膜の研究に一般に使用される。細胞膜が吸引によってピペットの末端部にクランプされ、膜のパッチがその開口部を覆って付着される。この方法は、リポソームをクランプする（その結果、リポソームが破裂してピペットの開口部全面を封止する脂質二重層を残す）ことによる脂質二重層の生成に適応されている。方法は、安定した巨大な単層状のリポソームと、ガラス表面を有する材料における小開口部の作製とを必要とする。
【００８８】
リポソームは、超音波処理、押出しまたはモザファリ（Mozafari）法（Colas et al.(2007) Micron 38:841-847）によって形成することができる。
【００８９】
好ましい実施形態において、脂質二重層は、国際出願番号ＰＣＴ／ＧＢ０８／００４１２７（国際公開第２００９／０７７７３４号パンフレットとして公開された）に記載されているように形成される。有利なこととして、この方法では脂質二重層が乾燥脂質から形成される。最も好ましい実施形態において、脂質二重層は、国際公開第２００９／０７７７３４号パンフレット（ＰＣＴ／ＧＢ０８／００４１２７）に記載されているように開口を横断して形成される。
【００９０】
脂質二重層は、２つの対向する脂質層から形成される。２つの脂質層は、それらの疎水性テール基が互いに向き合って疎水性の内部を形成するように配置される。脂質の親水性ヘッド基は、その二重層の両面の水性環境に向かって外側に向いている。二重層は、いくつかの脂質相で存在することがあり、そのような脂質相としては、脂質無秩序相（流体層状）、液体秩序相、固体秩序相（層状ゲル相、インターデジティテッドゲル相）および平面状二重層結晶（層状サブゲル相、層状結晶相）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９１】
脂質二重層を形成するいずれの脂質組成物を使用してもよい。脂質組成物は、表面電荷、膜タンパク質を支持する能力、充填密度または機械的特性などの、必要な特性を有する脂質二重層が形成されるように選択される。脂質組成物は、１種または複数種の異なる脂質を含むことができる。例えば、脂質組成物は、１００種以下の脂質を含有することができる。脂質組成物は、好ましくは、１〜１０種の脂質を含有する。脂質組成物は、天然に存在する脂質および／または人工脂質を含むことがある。
【００９２】
脂質は、ヘッド基と、界面部分と、同じであってもまたは異なってもよい２つの疎水性テール基とを概して含む。好適なヘッド基としては、中性ヘッド基、例えばジアシルグリセリド（ＤＧ）およびセラミド（ＣＭ）、双性イオン性ヘッド基、例えばホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）およびスフィンゴミエリン（ＳＭ）、負の電荷を有するヘッド基、例えばホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、リン酸（ＰＡ）およびカルジオリピン（ＣＡ）、ならびに正の電荷を有するヘッド基、例えばトリメチルアンモニウム−プロパン（ＴＡＰ）が挙げられるが、これらに限定されない。好適な界面部分としては、天然に存在する界面部分、例えば、グリセロール系またはセラミド系部分が挙げられるが、これらに限定されない。好適な疎水性テール基としては、飽和炭化水素鎖、例えばラウリン酸（ｎ−ドデカン酸）、ミリスチン酸（ｎ−テトラデカン酸）、パルミチン酸（ｎ−ヘキサデカン酸）、ステアリン酸（ｎ−オクタデカン酸）およびアラキドン酸（ｎ−エイコサン酸）、不飽和炭化水素鎖、例えばオレイン酸（シス−９−オクタデカン酸）、ならびに分岐炭化水素鎖、例えばフィタノイルが挙げられるが、これらに限定されない。不飽和炭化水素鎖の鎖長ならびに不飽和炭化水素鎖中の二重結合の位置および数は、様々でありうる。分岐炭化水素鎖の鎖長ならびに分岐炭化水素鎖中のメチル基などの分枝の位置および数は、様々でありうる。疎水性テール基を界面部分にエーテルまたはエステルとして連結することができる。脂質は、ミコール酸であってもよい。
【００９３】
脂質を化学的に修飾することもできる。脂質のヘッド基またはテール基は、化学的に修飾されることがある。ヘッド基が化学的に修飾されている好適な脂質としては、ＰＥＧ修飾脂質、例えば１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］、官能化ＰＥＧ脂質、例えば１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３ホスホエタノールアミン−Ｎ−［ビオチニル（ポリエチレングリコール）２０００］、ならびにコンジュゲーション用に修飾された脂質、例えば１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−（スクシニル）および１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−（ビオチニル）が挙げられるが、これらに限定されない。テール基が化学的に修飾されている好適な脂質としては、重合性脂質、例えば１，２−ビス（１０，１２−トリコサジイノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、フッ素化脂質、例えば１−パルミトイル−２−（１６−フルオロパルミトイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、重水素化脂質、例えば１，２−ジパルミトイル−Ｄ６２−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、およびエーテル連結脂質、例えば１，２−ジ−Ｏ−フィタニル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンが挙げられるが、これらに限定されない。脂質は、分析物のカップリングを助長するように化学的に修飾されるまたは官能化されることがある。
【００９４】
両親媒性層、例えば脂質組成物は、層の特性に影響を及ぼす１つまたは複数の添加剤を概して含む。好適な添加剤としては、脂肪酸、例えばパルミチン酸、ミリスチン酸およびオレイン酸、脂肪アルコール、例えばパルミチン酸アミコール、ミリスチン酸アルコールおよびオレイン酸アルコール、ステロール、例えばコレステロール、エルゴステロール、ラノステロール、シトステロールおよびスチグマステロール、リゾリン脂質、例えば１−アシル−２−ヒドロキシ−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、ならびにセラミドが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９５】
別の好ましい実施形態において、膜は固体層である。固体層は、有機材料と無機材料両方から形成することができ、そのような材料としては、マイクロエレクトロニクス材料、絶縁材料、例えばＳｉ３Ｎ４、Ａｌ２Ｏ３およびＳｉＯ、有機および無機重合体、例えば、ポリアミド、プラスチック、例えばＴｅｆｌｏｎ（登録商標）またはエラストマー、例えば二成分付加硬化シリコーンゴム、およびガラスが挙げられるが、これらに限定されない。固体層は、グラフェンから形成されることがある。好適なグラフェン層は、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０１０６３７（国際公開第２００９／０３５６４７号パンフレットとして公開された）に開示されている。Yusko et al., Nature Nanotechnology, 2011; 6: 253-260および米国特許出願公開第２０１３／００４８４９９号明細書は、微粒子を使用しない固体層における膜貫通ポアへのタンパク質の送達を記載している。本発明の方法は、これらの文献に開示された方法における送達を改善するために使用することができる。
【００９６】
方法は、（ｉ）ポアを含む人工両親媒性層、（ｉｉ）ポアを含む単離された天然に存在する脂質二重層、または（ｉｉｉ）ポアが挿入された細胞を使用して、概して行われる。方法は、人工トリブロック共重合体層などの人工両親媒性層を使用して、概して行われる。層は、他の膜貫通および／または膜内タンパク質ならびに他の分子をポアに加えて含むことがある。好適な装置および条件は、下で論じる。本発明の方法は、概してインビトロで行われる。
【００９７】
膜貫通ポア
膜貫通ポアは、ある程度膜を交差する構造である。膜貫通ポアは、印加された電位によって駆動される水和イオンが膜を横断して流れるまたは膜内を流れることを可能にする。膜貫通ポアは、概して膜全体を交差しており、したがって、水和イオンは、膜の一方の面から膜の他方の面に流れることがある。しかし、膜貫通ポアが膜を交差している必要はない。膜貫通ポアは、一方の末端が閉じられていることがある。例えば、ポアは、膜内のウェル、ギャップ、チャネル、溝またはスリットであることがあり、水和イオンは、それに沿って流れることもあり、またはその中に流入することもある。
【００９８】
いずれの膜貫通ポアを本発明において使用してもよい。ポアは、生物学的なものであってもよく、または人工的なものであってもよい。好適なポアとしては、タンパク質ポア、ポリヌクレオチドポアおよび固体ポアが挙げられるが、これらに限定されない。ポアは、ＤＮＡ折り紙ポア（Langecker et al., Science, 2012; 338: 932-936）であってもよい。
【００９９】
膜貫通ポアは、好ましくは膜貫通タンパク質ポアである。膜貫通タンパク質ポアは、分析物などの水和イオンが膜の一方の面から膜の他方の面に流れることを可能にする、ポリペプチドまたはポリペプチドのコレクションである。本発明において、膜貫通タンパク質ポアは、印加された電位によって駆動される水和イオンが膜の一方の面から他方に流れることを可能にするポアを形成することができる。膜貫通タンパク質ポアは、好ましくは、ヌクレオチドなどの分析物がトリブロック共重合体膜などの膜の一方の面から他方に流れることを可能にする。膜貫通タンパク質ポアは、ＤＮＡまたはＲＮＡなどのポリヌクレオチドをポアを通って、移動させる。
【０１００】
膜貫通タンパク質ポアは、単量体であってもよく、またはオリゴマーであってもよい。ポアは、好ましくは、いくつかの反復サブユニット、例えば、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５または少なくとも１６個サブユニットで構成される。ポアは、好ましくは、六量体、七量体、八量体または九量体ポアである。ポアは、ホモオリゴマーであってもよく、またはヘテロオリゴマーであってもよい。
【０１０１】
膜貫通タンパク質ポアは、概してバレルまたはチャネルを含み、それを通ってイオンが流れることがある。ポアのサブユニットは、概して中心軸を包囲し、鎖を膜貫通βバレルもしくはチャネルまたは膜貫通αヘリックスバンドルもしくはチャネルにもたらす。
【０１０２】
膜貫通タンパク質ポアのバレルまたはチャネルは、ヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたは核酸などの分析物との相互作用を助長するアミノ酸を概して含む。これらのアミノ酸は、好ましくは、バレルまたはチャネルの狭窄部付近に位置する。膜貫通タンパク質ポアは、正電荷を有する１つまたは複数のアミノ酸、例えば、アルギニン、リシン、もしくはヒスチジンまたは芳香族アミノ酸、例えばチロシンもしくはトリプトファンを概して含む。これらのアミノ酸は、ポアとヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたは核酸との相互作用を概して助長する。
【０１０３】
本発明に従って使用するための膜貫通タンパク質ポアは、βバレルポアまたはαヘリックスバンドルポアに由来しうる。βバレルポアは、β鎖から形成されるバレルまたはチャネルを含む。好適なβバレルポアとしては、β−毒素、例えばα−ヘモリシン、炭疽毒素およびロイコシジン、ならびに外膜タンパク質／細菌のポリン、例えば、スメグマ菌（Mycobacterium smegmatis）ポリン（Ｍｓｐ）、例えばＭｓｐＡ、ＭｓｐＢ、ＭｓｐＣまたはＭｓｐＤ、ＣｓｇＧ、外膜ポリンＦ（ＯｍｐＦ）、外膜ポリンＧ（ＯｍｐＧ）、外膜ホスホリパーゼＡおよびナイセリア（Neisseria）オートトランスポーターリポタンパク質（ＮａｌＰ）ならびに他のポア、例えばライセニンが挙げられるが、これらに限定されない。αヘリックスバンドルポアは、αヘリックスから形成されるバレルまたはチャネルを含む。好適なαヘリックスバンドルポアとしては、内膜タンパク質およびα外膜タンパク質、例えば、ＷＺＡおよびＣｌｙＡ毒素が挙げられるが、これらに限定されない。膜貫通ポアは、ライセニンに由来しうる。ＣｓｇＧに由来する好適なポアは、国際出願第ＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０６９９６５号明細書に開示されている。ライセニンに由来する好適なポアは、国際出願番号ＰＣＴ／ＧＢ２０１３／０５０６６７（国際公開第２０１３／１５３３５９号パンフレットとして公開された）に開示されている。膜貫通ポアは、Ｍｓｐに由来することもあり、またはα−ヘモリシン（α−ＨＬ）に由来することもある。野生型α−ヘモリシンポアは、７つの同一の単量体またはサブユニットで形成されている（すなわち、このポアは七量体である）。α−ヘモリシン−ＮＮの１つの単量体またはサブユニットの配列は、配列番号４で示される。
【０１０４】
膜貫通タンパク質ポアは、好ましくはＭｓｐに、好ましくはＭｓｐＡに由来する。そのようなポアは、オリゴマー性となり、Ｍｓｐに由来する７、８、９または１０個の単量体を概して含む。ポアは、同一の単量体を含むＭｓｐに由来するホモオリゴマー性ポアであることがある。あるいは、ポアは、他と異なる少なくとも１つの単量体を含むＭｓｐに由来するヘテロオリゴマー性ポアであることがある。好ましくは、ポアは、ＭｓｐＡまたはそのホモログもしくはパラログに由来する。
【０１０５】
Ｍｓｐに由来する単量体は、配列番号２で示される配列またはその変異体を概して含む。配列番号２は、ＭｓｐＡ単量体のＭＳ−（Ｂ１）８突然変異体である。これは、次の突然変異：Ｄ９０Ｎ、Ｄ９１Ｎ、Ｄ９３Ｎ、Ｄ１１８Ｒ、Ｄ１３４ＲおよびＥ１３９Ｋを含む。配列番号２の変異体は、配列番号２のものとは異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドであって、ポアを形成するその能力を保持するポリペプチドである。ポアを形成する変異体の能力は、当技術分野において公知の任意の方法を用いてアッセイすることができる。例えば、変異体を両親媒性層に他の適切なサブユニットとともに挿入してもよく、オリゴマー化してポアを形成するその能力を判定してもよい。両親媒性層などの膜にサブユニットを挿入する方法は、当技術分野において公知である。例えば、サブユニットを精製形態でトリブロック共重合体膜を含有する溶液に懸濁させてもよく、その結果、サブユニットは膜に分散し、膜と結合することによって挿入され、集合して機能性状態になる。あるいは、M.A. Holden, H. Bayley. J. Am. Chem.Soc.2005, 127, 6502-6503および国際出願番号ＰＣＴ／ＧＢ２００６／００１０５７（国際公開第２００６／１００４８４号パンフレットとして公開された）に記載されている「ピックアンドプレース」法を用いて、サブユニットを膜に直接挿入してもよい。
【０１０６】
配列番号２のアミノ酸配列の全長にわたって、変異体は、好ましくは、アミノ酸同一性に基づきその配列と少なくとも５０％相同であることになる。より好ましくは、変異体は、アミノ酸同一性に基づき、配列全体にわたって配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％およびより好ましくは少なくとも９５％、９７％または９９％相同であることがある。１００以上、例えば１２５、１５０、１７５または２００以上の連続するアミノ酸のストレッチにわたって、少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、９０％または９５％アミノ酸同一性（「確かな相同性」）があることがある。
【０１０７】
当技術分野における標準的な方法を用いて相同性を決定してもよい。例えば、ＵＷＧＣＧ  Ｐａｃｋａｇｅは、相同性を計算するために使用することができ、例えばそのデフォルト設定で使用される、ＢＥＳＴＦＩＴプラグラムを提供している（Devereux et al (1984) Nucleic Acids Research 12, p387-395）。例えば、Altschul S. F. (1993) J Mol Evol 36:290-300；Altschul, S.F et al (1990) J Mol Biol 215:403-10に記載されているように、ＰＩＬＥＵＰおよびＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いて、相同性を計算し、または配列を並べる（例えば、等価の残基または対応する配列を（通常はそれらのデフォルト設定で）同定する）ことができる。ＢＬＡＳＴ解析を行うためのソフトウェアは、米国国立生物工学情報センター（National Center for Biotechnology Information）（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）から公的に入手できる。
【０１０８】
配列番号２は、ＭｓｐＡ単量体のＭＳ−（Ｂ１）８突然変異体である。変異体は、ＭｓｐＡと比較してＭｓｐＢ、ＣまたはＤ単量体における突然変異のいずれかを含むことがある。ＭｓｐＢ、ＣおよびＤの成熟形態は、配列番号５〜７で示される。詳細には、変異体は、ＭｓｐＢ中に存在する次の置換を含むことがある：Ａ１３８Ｐ。変異体は、ＭｓｐＣ中に存在する次の置換の１つまたは複数を含むことがある：Ａ９６Ｇ、Ｎ１０２ＥおよびＡ１３８Ｐ。変異体は、ＭｓｐＤ中に存在する次の突然変異の１つまたは複数を含むことがある：Ｇ１の欠失、Ｌ２Ｖ、Ｅ５Ｑ、Ｌ８Ｖ、Ｄ１３Ｇ、Ｗ２１Ａ、Ｄ２２Ｅ、Ｋ４７Ｔ、Ｉ４９Ｈ、Ｉ６８Ｖ、Ｄ９１Ｇ、Ａ９６Ｑ、Ｎ１０２Ｄ、Ｓ１０３Ｔ、Ｖ１０４Ｉ、Ｓ１３６ＫおよびＧ１４１Ａ。変異体は、ＭｓｐＢ、ＣおよびＤからの突然変異および置換の１つまたは複数の組み合わせを含むことがある。変異体は、好ましくは、突然変異Ｌ８８Ｎを含む。配列番号２の変異体は、ＭＳ−Ｂ１のすべての突然変異に加えて突然変異Ｌ８８Ｎを有し、ＭＳ−（Ｂ２）８と呼ばれる。本発明において使用されるポアは、好ましくはＭＳ−（Ｂ２）８である。配列番号２の変異体は、好ましくは、１つまたは複数のＤ５６Ｎ、Ｄ５６Ｆ、Ｅ５９Ｒ、Ｇ７５Ｓ、Ｇ７７Ｓ、Ａ９６ＤおよびＱ１２６Ｒを含む。配列番号２の変異体は、ＭＳ−Ｂ１のすべての突然変異に加えて突然変異Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｑ１２６Ｒを有し、ＭＳ−Ｂ２Ｃと呼ばれる。本発明において使用されるポアは、好ましくはＭＳ−（Ｂ２）８またはＭＳ−（Ｂ２Ｃ）８である。配列番号２の変異体は、好ましくはＮ９３Ｄを含む。変異体は、より好ましくは突然変異Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｎ９３Ｄ／Ｑ１２６Ｒを含む。
【０１０９】
上で論じたものに加えて、アミノ酸置換、例えば１、２、３、４、５、１０、２０または３０以下の置換を、配列番号２のアミノ酸配列に加えてもよい。保存的置換は、アミノ酸を、類似の化学構造、類似の化学的特性または類似の側鎖体積の他のアミノ酸で置き換える。導入されるアミノ酸は、それらが置き換えるアミノ酸と類似の極性、親水性、疎水性、塩基性、酸性、中性または電荷を有しうる。あるいは、保存的置換は、既存の芳香族または脂肪族アミノ酸の代わりに、芳香族または脂肪族である別のアミノ酸を導入することがある。
【０１１０】
膜貫通タンパク質ポアなどの、本明細書に記載するタンパク質のいずれも、それらの同定または精製を支援するように、例えば、ヒスチジン残基（ｈｉｓタグ）、アスパラギン酸残基（ａｓｐタグ）、ストレプトアビジンタグ、ｆｌａｇタグ、ＳＵＭＯタグ、ＧＳＴタグもしくはＭＢＰタグの付加によって、または細胞からのそれらの分泌を促進するためのシグナル配列の付加（ポリペプチドがそのような配列を天然に含有しない場合）によって、修飾されることがある。遺伝子タグを導入することの代替法は、タグをポアまたは構築物上のネイティブ位置または工学的に操作された位置に化学反応させることである。この方法の例は、ポアの外側に工学的に操作されたシステインにゲルシフト試薬を反応させることであろう。この方法は、ヘモリシンヘテロオリゴマーを分離する方法として立証されている（Chem Biol.1997 Jul; 4(7):497-505）。
【０１１１】
ポアは、顕現標識で標識されることがある。顕現標識は、ポアを検出できるようにするいずれの好適な標識であってもよい。好適な標識としては、蛍光分子、放射性同位元素、例えば、１２５Ｉ、３５Ｓ、酵素、抗体、抗原、ポリヌクレオチドおよびリガンド、例えばビオチンが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１２】
膜貫通タンパク質ポアなどの、本明細書に記載するタンパク質のいずれも、合成的に作製してもよく、または組み換え手段によって作製してもよい。例えば、ポアをインビトロ翻訳および転写（ＩＶＴＴ）によって合成してもよい。ポアのアミノ酸配列は、天然に存在しないアミノ酸を含むように修飾されることもあり、またはタンパク質の安定性を増すように修飾されることもある。タンパク質が合成手段によって生産される場合、そのようなアミノ酸を生産中に導入してもよい。合成または組み換え生産のいずれかの後にポアを改変してもよい。
【０１１３】
膜貫通タンパク質ポアなどの、本明細書に記載するタンパク質のいずれも、当技術分野において公知の標準的な方法を用いて生成することができる。ポアまたは構築物をコードするポリヌクレオチド配列は、当技術分野における標準的方法を用いて誘導され、複製されることがある。ポアまたは構築物をコードするポリヌクレオチド配列は、当技術分野における標準技法を用いて細菌宿主細胞において発現されることがある。ポアは、組み換え発現ベクターからのポリペプチドのインサイチュー発現によって細胞において生産されることがある。発現ベクターは、ポリペプチドの発現を制御するための誘導性プロモーターを場合により有する。これらの方法は、Sambrook, J. and Russell, D. (2001).Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition.Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NYに記載されている。
【０１１４】
ポアは、タンパク質生産生物からの任意のタンパク質液体クロマトグラフィーシステムによる精製後、または組み換え発現後、大規模に生産されることがある。典型的なタンパク質液体クロマトグラフィーシステムとしては、ＦＰＬＣ、ＡＫＴＡシステム、Ｂｉｏ−Ｃａｄシステム、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＢｉｏＬｏｇｉｃシステムおよびＧｉｌｓｏｎ  ＨＰＬＣシステムが挙げられる。
【０１１５】
微粒子
微粒子は、分析物を送達するために使用される。いずれの数の微粒子も、本発明の方法において使用することができる。例えば、本発明の方法は、単一の微粒子または２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、５０、１００、１，０００、５，０００、１０，０００、１００，０００、５００，０００もしくは１，０００，０００もしくはこれ以上の微粒子を使用してもよい。２つ以上の微粒子が使用される場合、微粒子は同じであってもよい。あるいは、異なる微粒子の混合物が使用されてもよい。
【０１１６】
各微粒子は、１つの分析物が付着されてもよい。あるいは、各微粒子は、２つ以上の分析物、例えば３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、２０以上、３０以上、５０以上、１００以上、５００以上、１，０００以上、５，０００以上、１０，０００以上、１００，０００以上、１０００，０００以上、または５０００，０００以上の分析物が付着されてもよい。微粒子は、分析物で実質的にまたは完全に被覆または覆われてもよい。微粒子は、その表面上の実質的に全てまたは全てに分析物が付着されてもよい。微粒子は、アダプターによってポリヌクレオチドなどの分析物に付着することができる。アダプターは、Ｙアダプターまたはヘアピンアダプターであってもよい（以下を参照されたい）。
【０１１７】
分析物、すなわち、分析物の１つの例は、２つ以上の微粒子に付着されてもよい。分析物、すなわち、分析物の１つの例は、上で論じたいずれの数の微粒子にも付着されうる。
【０１１８】
微粒子は、サイズが概してミクロン（μｍ）で測定される微視的粒子である。微粒子は、ミクロスフェアまたはマイクロビーズとしても公知である。微粒子は、ナノ粒子であってもよい。ナノ粒子は、サイズが概してナノメートル（ｎｍ）で測定される微視的粒子である。
【０１１９】
微粒子は、約０．００１μｍから約５００μｍの粒径を概して有する。例えば、ナノ粒子は、約０．０１μｍから約２００μｍまたは約０．１μｍから約１００μｍの粒径を有してもよい。より多くの場合、微粒子は、約０．５μｍから約１００μｍまたは例えば約１μｍから約５０μｍの粒径を有する。微粒子は、約１ｎｍから約１０００ｎｍ、例えば約１０ｎｍから約５００ｎｍ、約２０ｎｍから約２００ｎｍまたは約３０ｎｍから約１００ｎｍの粒径を有してもよい。
【０１２０】
微粒子は、球形または非球形であってもよい。球形微粒子は、ミクロスフェアと呼ばれることがある。非球形粒子は、例えば板状、針状、不整形または管状であってもよい。用語「粒径」は本明細書で使用されるとき、粒子が球形であれば粒子の直径を意味し、または粒子が非球形であれば体積ベースの粒径を意味する。体積ベースの粒径は、問題の非球形粒子と同じ体積を有する球体の直径である。
【０１２１】
２つ以上の微粒子が方法で使用される場合、微粒子の平均粒径は、約０．５μｍから約５００μｍなどの上で論じたサイズのいずれであってもよい。２つ以上の微粒子の集団は、好ましくは、１０％以下、例えば５％以下または２％以下の変動係数（標準偏差対平均の比）を有する。
【０１２２】
任意の方法が、微粒子のサイズを判定するために使用されうる。好適な方法としては、フローサイトメトリー（例えば、Chandler et al., J Thromb Haemost. 2011 Jun;9（6）:1216-24を参照されたい）が挙げられるが、これに限定されない。
【０１２３】
微粒子は、任意の材料から形成することができる。微粒子は、好ましくは、セラミック、ガラス、シリカ、重合体または金属から形成される。重合体は、ポリヒドロキシアルカノエート、デキストラン、ポリラクチド、アガロース、セルロース、デンプンもしくはキトサンなどの天然重合体、またはポリウレタン、ポリスチレン、ポリ（塩化ビニル）、シランもしくはメタクリレートなどの合成重合体であってもよい。好適な微粒子は当技術分野において公知であり、市販されている。セラミックおよびガラスのミクロスフェアは、３Ｍ（登録商標）から市販されている。シリカおよび重合体の微粒子は、ＥＰＲＵＩ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ＆Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ  Ｃｏ．Ｌｔｄから市販されている。微粒子は、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．およびＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからも市販されている。
【０１２４】
微粒子は、固体であってもよい。微粒子は、中空であってもよい。微粒子は、重合体繊維から形成されてもよい。
【０１２５】
分析物がポリヌクレオチドである場合、微粒子は、ポリヌクレオチドを抽出および単離するために使用されるキットに由来してもよい。
【０１２６】
微粒子の表面は、分析物と相互作用および付着することができる。表面は、官能化することなく分析物と天然に相互作用することができる。微粒子の表面は、分析物の付着を容易にするために概して官能化される。好適な官能化は、当技術分野において公知である。例えば、微粒子の表面は、ポリヒスチジンタグ（ヘキサヒスチジンタグ、６×Ｈｉｓタグ、Ｈｉｓ６タグまたはＨｉｓタグ（登録商標））、Ｎｉ−ＮＴＡ、ストレプトアビジン、ビオチン、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド（ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＧＮＡ、ＴＮＡまたはＬＮＡなど）、カルボキシ基、第四級アミン基、チオール基、アジド基、アルキン基、ＤＩＢＯ、脂質、ＦＬＡＧタグ（ＦＬＡＧオクタペプチド、ポリヌクレオチド結合タンパク質（下で論じられたもののいずれかを含む）、ペプチド、タンパク質、抗体または抗体断片によって官能化することができる。抗体断片は、下でより詳細に論じる。微粒子は、付着に関して、下で論じるリンカーまたは基のいずれかによって官能化することもできる。
【０１２７】
微粒子は、分析物と特異的に結合する分子または基によって官能化することができる。この場合、微粒子に付着され、膜貫通ポアに送達されることになる分析物は、標的分析物と呼ばれることがある。これにより、他の分析物を含有する試料から微粒子が標的分析物を選択または捕捉することが可能になる。分子または基が、優先的なまたは高い親和性では標的分析物と結合するならば、分子または基は標的分析物と特異的に結合するが、低い親和性のみでは他のまたは異なる分析物と結合しない。分子または基は、１×１０−６Ｍ以下、より好ましくは１×１０−７Ｍ以下、５×１０−８Ｍ以下、より好ましくは１×１０−８Ｍ以下、またはより好ましくは５×１０−９Ｍ以下のＫｄで結合するならば、優先的なまたは高い親和性で結合する。分子または基は、１×１０−６Ｍ以上、より好ましくは１×１０−５Ｍ以上、より好ましくは１×１０−４Ｍ以上、より好ましくは１×１０−３Ｍ以上、さらにより好ましくは１×１０−２Ｍ以上のＫｄで結合するならば、低い親和性で結合する。
【０１２８】
好ましくは、分子または基は、他の分析物に対する親和性より大きい、少なくとも１０倍、例えば少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも１０００または少なくとも１０，０００倍の親和性で標的分析物と結合する。親和性は、蛍光および放射性同位元素を利用するものなど、公知の結合アッセイを用いて測定することができる。競合的結合アッセイも当技術分野において公知である。ペプチドまたはタンパク質とポリヌクレオチドとの結合強度は、Hornblower et al., Nature Methods. 4: 315-317.（2007）に記載されているナノポア力分光法を用いて測定することができる。
【０１２９】
標的分析物がポリヌクレオチドである場合、微粒子は、標的ポリヌクレオチド分析物に特異的にハイブリダイズする、または標的ポリヌクレオチド分析物の部分もしくは領域に相補的である部分もしくは領域を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド（上で論じたもののいずれかなど）によって官能化されてもよい。これにより、他のポリヌクレオチドなどの他の分析物を含有する試料から、微粒子が標的ポリヌクレオチド分析物を選択または捕捉することが可能になる。オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、優先的なまたは高い親和性で標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズするならば、標的ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするが、低い親和性のみでは他のポリヌクレオチドに実質的にハイブリダイズしない、ハイブリダイズしない。オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、他の配列に対するＴｍより大きい、少なくとも２℃、例えば少なくとも３℃、少なくとも４℃、少なくとも５℃、少なくとも６℃、少なくとも７℃、少なくとも８℃、少なくとも９℃または少なくとも１０℃である融解温度（Ｔｍ）で標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズするならば、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは特異的にハイブリダイズする。より好ましくは、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、他の核酸に対するＴｍより大きい、少なくとも２℃、例えば少なくとも３℃、少なくとも４℃、少なくとも５℃、少なくとも６℃、少なくとも７℃、少なくとも８℃、少なくとも９℃、少なくとも１０℃、少なくとも２０℃、少なくとも３０℃または少なくとも４０℃であるＴｍで標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする。好ましくは、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドとは１ヌクレオチド以上、例えば１、２、３、４または５ヌクレオチド以上異なる配列に対するＴｍより大きい、少なくとも２℃、例えば少なくとも３℃、少なくとも４℃、少なくとも５℃、少なくとも６℃、少なくとも７℃、少なくとも８℃、少なくとも９℃、少なくとも１０℃、少なくとも２０℃、少なくとも３０℃または少なくとも４０℃であるＴｍで標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする。オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、少なくとも９０℃、例えば少なくとも９２℃または少なくとも９５℃のＴｍで標的ポリヌクレオチドに概してハイブリダイズする。Ｔｍは、ＤＮＡマイクロアレイの使用を含む公知の技法を用いて実験的に測定することができ、またはインターネット上で利用できるものなど、公的に入手できるＴｍ計算機を用いて計算することができる。
【０１３０】
ハイブリダイゼーションを可能にする条件は、当技術分野において周知である（例えば、Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning: a laboratory manual, 3rd edition, Cold Spring Harbour Laboratory Press；およびCurrent Protocols in Molecular Biology, Chapter 2, Ausubel et al., Eds., Greene Publishing and Wiley-lnterscience, New York（1995））。ハイブリダイゼーションは、低ストリンジェンシー条件下、例えば、３０から３５％ホルムアミド、１Ｍ  ＮａＣｌおよび１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）の緩衝液の存在下、３７℃、その後の１×（０．１６５０Ｍ  Ｎａ＋）から２×（０．３３Ｍ  Ｎａ＋）ＳＳＣ（標準的なクエン酸ナトリウム）、５０℃、２０回洗浄で行われてもよい。ハイブリダイゼーションは、中程度のストリンジェンシー条件下、例えば、４０から４５％ホルムアミド、１Ｍ  ＮａＣｌ、および１％ＳＤＳの緩衝液の存在下、３７℃、その後の０．５×（０．０８２５Ｍ  Ｎａ＋）から１×（０．１６５０Ｍ  Ｎａ＋）ＳＳＣ、５５℃、洗浄で行われてもよい。ハイブリダイゼーションは、高ストリンジェンシー条件下、例えば５０％ホルムアミド、１Ｍ  ＮａＣｌ、１％ＳＤＳの緩衝液の存在下、３７℃、その後の０．１×（０．０１６５Ｍ  Ｎａ＋）ＳＳＣ、６０℃、洗浄で行われてもよい。
【０１３１】
オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドの部分または領域に実質的に相補的である部分または領域を含んでもよい。したがって、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの領域または部分は、標的ポリヌクレオチド中の部分または領域と比較して、５、１０、１５、２０、２１、２２、３０、４０または５０ヌクレオチドの領域にわたって１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上の不一致を有することがある。
【０１３２】
領域の部分は、概して、５０ヌクレオチド以下、例えば４０ヌクレオチド以下、３０ヌクレオチド以下、２０ヌクレオチド以下、１０ヌクレオチド以下または５ヌクレオチド以下である。
【０１３３】
微粒子は、好ましくは常磁性または磁性である。微粒子は、好ましくは、常磁性もしくは超常磁性材料、または鉄などの常磁性もしくは超常磁性金属を含む。任意の好適な磁性微粒子が使用されうる。例えば、例えばＣｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃおよびＮＥＢから市販されている磁性ビーズが使用されうる。いくつかの実施形態において、微粒子は、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）などの金属キレート基などの有機基が付着している磁性粒子を含む。有機成分は、例えば、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−Ｃ−Ｏ−Ｃ−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ、−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ２−Ｉ、−Ｓ（＝Ｏ）２−および−Ｓ−から選択される基を含んでもよい。有機成分は、ＮＴＡ（ニトリロ三酢酸）などの金属キレート基を含んでもよい。通常、金、鉄、ニッケルまたはコバルトなどの金属も、金属キレート基に付着される。この種類の磁性ビーズは、Ｈｉｓタグタンパク質を捕捉するために一般に使用されるが、本発明に使用するためにも好適である。
【０１３４】
微粒子は、最も好ましくは、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから市販されているＨｉｓタグＤｙｎａｂｅａｄ（登録商標）、ＩＢＡ製Ｍａｇ  Ｓｔｒｅｐビーズ、ＮＥＢ製ストレプトアビジン磁性ビーズ、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ製Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ（ＳＰＲＩ）ビーズもしくはＡｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰビーズ、またはＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）ＭｙＯｎｅ（商標）ストレプトアビジンＣ１（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）である。
【０１３５】
他の方法
本発明は、分析物を膜中の膜貫通ポアに送達する方法であって、
（ａ）固体担体に付着している分析物を用意するステップと、
（ｂ）固体担体を膜へ送達し、それによって分析物を膜貫通ポアに送達するステップと
を含む方法も提供する。
【０１３６】
方法は、好ましくは、固体担体を膜に近接または隣接して置き、固体担体を膜へ移動できるようにするステップを含む。方法は、好ましくは、固体担体を膜に近接または隣接して置き、固体担体を膜へ移動させるステップを含む。固体担体は、膜と接触させることができる。固体担体は、膜と接触させなくてもよい。
【０１３７】
固体担体は、任意の固体担体であってもよい。好適な例としては、プローブ、プレート、カラム、ピンおよびディップスティックが挙げられるが、これらに限定されない。プローブは、M.A. Holden, H. Bayley. J. Am. Chem. Soc. 2005, 127, 6502-6503、および国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２００６／００１０５７号明細書（国際公開第２００６／１００４８４号パンフレットとして公開された）において論じられているもののいずれであってもよい。
【０１３８】
分析物、試料、ポア、膜、装置、官能化、付着、送達、カップリング、アンカップリング、除去、洗浄および特性評価など、上および下で論じた実施形態のいずれも、この方法に同等に当てはまる。
【０１３９】
本発明は、分析物を膜中の膜貫通ポアに送達するためのキットであって、（ａ）固体担体と、（ｂ）分析物を膜とカップリングすることができる１つまたは複数のアンカーとを含むキットも提供する。下で論じるキット実施形態のいずれも、このキットに同等に当てはまる。
【０１４０】
付着
分析物および微粒子は、いずれの様式で付着されてもよい。例えば、分析物は、下で論じるカップリング方法のいずれかを用いて微粒子に付着されてもよい。分析物は、下で論じる任意の方法を用いて微粒子に特異的に付着されてもよい。
【０１４１】
分析物は、微粒子に非特異的に付着されてもよい。分析物は、微粒子に吸着されてもよい。分析物が微粒子の外面および／または微粒子内の内面に薄膜として付着される場合、分析物は微粒子に吸着される。
【０１４２】
分析物は、１カ所で微粒子に付着されてもよい。例えば２つ以上のリンカーが使用される場合、分析物は、２カ所以上、例えば３、４、５、６、７、８、９、１０カ所以上で微粒子に付着されてもよい。
【０１４３】
タンパク質分析物は、システイン、トレオニン、セリン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸およびグルタミンなどの天然に存在するそのアミノ酸を介して付着されてもよい。天然に存在するアミノ酸は、付着を容易にするために修飾されてもよい。例えば、天然に存在するアミノ酸は、アシル化、リン酸化、グリコシル化またはファルネシル化によって修飾することができる。他の好適な修飾は、当技術分野において公知である。天然に存在するアミノ酸に対する修飾は、翻訳後修飾であってもよい。タンパク質分析物は、その配列に導入されたアミノ酸を介して付着されてもよい。そのようなアミノ酸は、好ましくは置換によって導入される。導入されるアミノ酸は、システインまたは付着を容易にする非天然アミノ酸であってもよい。好適な非天然アミノ酸としては、４−アジド−Ｌ−フェニルアラニン（Faz）、およびLiu C. C. and Schultz P. G., Annu. Rev. Biochem., 2010, 79, 413−444の図1に含まれる１−７１のアミノ酸のいずれか１つが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４４】
分析物は、リンカー分子を介して微粒子に付着されてもよい。分析物は、１つまたは複数、例えば２つまたは３つのリンカーを使用して微粒子に付着することができる。リンカーは、必要な距離にわたって続く任意の分子を含むことができる。リンカーは、炭素１個（ホスゲン型リンカー）から多数のオングストロームまで長さが変化できる。リンカーとしての使用に好適である直鎖状分子の例としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリペプチド、多糖、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリセロール核酸（ＧＮＡ）、飽和および不飽和炭化水素、ポリアミドが挙げられるが、これらに限定されない。これらのリンカーは不活性であってもよく、または反応性であってもよく、特にこれらのリンカーは規定の位置で化学的に切断可能であってもよく、またはそれ自体がフルオロフォアもしくはリガンドで修飾されてもよい。リンカーは、好ましくはジチオスレイトール（ＤＴＴ）に抵抗性である。好ましい柔軟なペプチドリンカーは、２から２０個、例えば４、６、８、１０または１６個のセリンおよび／またはグリシンアミノ酸のストレッチである。より好ましい柔軟なリンカーとしては、（ＳＧ）１、（ＳＧ）２、（ＳＧ）３、（ＳＧ）４、（ＳＧ）５、（ＳＧ）８、（ＳＧ）１０、（ＳＧ）１５または（ＳＧ）２０が挙げられ、ここでＳはセリンであり、Ｇはグリシンである。好ましい剛性リンカーは、２から３０個、例えば４、６、８、１６または２４個のプロリンアミノ酸のストレッチである。より好ましい剛性リンカーとしては、（Ｐ）１２が挙げられ、ここでＰはプロリンである。
【０１４５】
分析物は、１つもしくは複数の化学的クロスリンカーまたは１つもしくは複数のペプチドリンカーを使用して微粒子に付着されてもよい。好適な化学的クロスリンカーは、当技術分野において周知である。好適な化学的クロスリンカーとしては、次の官能基：マレイミド、活性エステル、スクシンイミド、アジド、アルキン（ジベンゾシクロオクチノール（ＤＩＢＯまたはＤＢＣＯ）、ジフルオロシクロアルキンおよび直鎖アルキンなど）、ホスフィン（無痕跡および無痕跡でないシュタウディンガーライゲーションにおいて使用されるものなど）、ハロアセチル（ヨードアセトアミドなど）、ホスゲン型試薬、スルホニルクロリド試薬、イソチオシアネート、ハロゲン化アシル、ヒドラジン、ジスルフィド、ビニルスルホン、アジリジンおよび光反応性試薬（アリールアジド、ジアジリジンなど）を含むものが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４６】
アミノ酸と官能基との反応は、システイン／マレイミドなど、自発的であってもよく、またはアジドおよび直鎖アルキンを接続するためのＣｕ（Ｉ）など、外部試薬を必要としてもよい。
【０１４７】
好ましいクロスリンカーとしては、２，５−ジオキソピロリジン−１−イル３−（ピリジン−２−イルジスルファニル）プロパノエート、２，５−ジオキソピロリジン−１−イル４−（ピリジン−２−イルジスルファニル）ブタノエート、２，５−ジオキソピロリジン−１−イル８−（ピリジン−２−イルジスルファニル）オクタノエート、ジ−マレイミドＰＥＧ  １ｋ、ジ−マレイミドＰＥＧ  ３．４ｋ、ジ−マレイミドＰＥＧ  ５ｋ、ジ−マレイミドＰＥＧ  １０ｋ、ビス（マレイミド）エタン（ＢＭＯＥ）、ビス−マレイミドヘキサン（ＢＭＨ）、１，４−ビス−マレイミドブタン（ＢＭＢ）、１，４ビス−マレイミジル−２，３−ジヒドロキシブタン（ＢＭＤＢ）、ＢＭ［ＰＥＯ］２（１，８−ビス−マレイミドジエチレングリコール）、ＢＭ［ＰＥＯ］３（１，１１−ビス−マレイミドトリエチレングリコール）、トリス［２−マレイミドエチル］アミン（ＴＭＥＡ）、ＤＴＭＥジチオビスマレイミドエタン、ビス−マレイミド  ＰＥＧ３、ビス−マレイミド  ＰＥＧ１１、ＤＢＣＯ−マレイミド、ＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−マレイミド、ＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−ＮＨ２、ＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−ＮＨＳ、ＤＢＣＯ−ＮＨＳ、ＤＢＣＯ−ＰＥＧ−ＤＢＣＯ  ２．８ｋＤａ、ＤＢＣＯ−ＰＥＧ−ＤＢＣＯ  ４．０ｋＤａ、ＤＢＣＯ−１５原子−ＤＢＣＯ、ＤＢＣＯ−２６原子−ＤＢＣＯ、ＤＢＣＯ−３５原子−ＤＢＣＯ、ＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−Ｓ−Ｓ−ＰＥＧ３−ビオチン、ＤＢＣＯ−Ｓ−Ｓ−ＰＥＧ３−ビオチンおよびＤＢＣＯ−Ｓ−Ｓ−ＰＥＧ１１−ビオチンが挙げられる。最も好ましいクロスリンカーは、スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）およびマレイミド−ＰＥＧ（２ｋＤａ）−マレイミド（アルファ，オメガ−ビス−マレイミドポリ（エチレングリコール））である。
【０１４８】
リンカーは標識されることがある。好適な標識としては、蛍光分子（Ｃｙ３、ＦＡＭ／ＦＩＴＣまたはＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５５５など）、放射性同位元素、例えば１２５Ｉ、３５Ｓ、酵素、抗体、抗原、ポリヌクレオチドおよびビオチンなどのリガンドが挙げられるが、これらに限定されない。そのような標識は、リンカーの量を定量できるようにする。標識は、ビオチンなどの切断可能な精製タグ、またはタンパク質それ自体には存在しないがトリプシン消化によって放出されるペプチドなどの、同定方法において現れる特定の配列でもあってもよい。
【０１４９】
分析物または微粒子のそれ自体への架橋は、非常に過剰な分析物および／または微粒子の中でリンカーの濃度を保つことにより防ぐことができる。あるいは、２つのリンカーが使用される「鍵と鍵穴」配置が使用されてもよい。各リンカーの一方の末端のみが一緒に反応してより長いリンカーを形成し、リンカーの他方の末端はそれぞれ構築物（すなわち、分析物または微粒子）の異なる部分と反応することができる。
【０１５０】
微粒子への分析物の付着は、永続的または安定性であることがある（すなわち、分析物は、本発明の方法において微粒子から剥離するようにならない）。好ましい永続的または安定な付着は、共有結合性付着である。
【０１５１】
付着は、好ましくは一時的であり、すなわち、分析物は、例えばポアに送達されるとまたはポアと相互作用するときに、本発明の方法中に微粒子から剥離しうる。好ましい一時的付着はハイブリダイゼーションによる。２つの相補的ポリヌクレオチドは、分析物を微粒子に付着させるために使用されることがある。あるいは、他方のポリヌクレオチドの部分もしくは領域に特異的にハイブリダイズする、または他方のポリヌクレオチドの部分もしくは領域に相補的である部分または領域をそれぞれ含む２つのポリヌクレオチドが使用されることがある。一方のポリヌクレオチドは、分析物に付着されることがあり、他方は微粒子に付着されることがある。分析物および微粒子は、次いで２つのポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションによって付着されることがある。ポリヌクレオチドは、上で論じたもののいずれであってもよい。あるいは、分析物がポリヌクレオチドである場合、ポリヌクレオチド分析物の部分または領域に特異的にハイブリダイズする、またはポリヌクレオチド分析物の部分もしくは領域に相補的である部分または領域を含むポリヌクレオチドが、微粒子に付着されることがある。
【０１５２】
このことは、カップリングに関して下でより詳細に論じる。他の好ましい一時的付着としては、ポリヒスチジンタグ（ヘキサヒスチジンタグ、６×Ｈｉｓタグ、Ｈｉｓ６タグまたはＨｉｓタグ（登録商標））、Ｎｉ−ＮＴＡまたはストレプトアビジン−ビオチンを使用する付着が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５３】
下で論じるように、ヘリカーゼなどのポリヌクレオチド結合タンパク質は、ポアを通るポリヌクレオチド分析物の移動を制御するために使用されることがある。好ましい実施形態において、ポリヌクレオチド分析物は、これと結合しているポリヌクレオチド結合タンパク質が備えられ（すなわち、ポリヌクレオチド分析物は、ポリヌクレオチド結合タンパク質を含む）、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド結合タンパク質を介して微粒子に付着される。ポリヌクレオチド結合タンパク質は、上で論じた方法のいずれかを用いて微粒子に付着されることがある。ポリヌクレオチド結合タンパク質は、下で論じるタンパク質のいずれであってもよい。ポリヌクレオチド結合タンパク質は、好ましくはヘリカーゼに由来する。
【０１５４】
送達
方法は、微粒子を膜へ送達するステップを含む。微粒子は、分析物を膜中の膜貫通ポアに送達する。微粒子は、いずれの様式で膜へ送達されてもよい。方法は、好ましくは、微粒子を膜に近接または隣接して置き、微粒子を膜へ移動させるステップを含む。微粒子は、膜から任意の距離、例えば膜から約５００μｍ以内、膜から約２００μｍ以内、膜から約１００μｍ以内、膜から約５０μｍ以内または膜から約３０μｍ以内に置かれてもよい。
【０１５５】
微粒子は膜へ移動する。微粒子は、概して膜に移動する。微粒子は膜と接触してもよい。微粒子は膜と接触しなくてもよい。例えば、微粒子は、分析物で実質的にもしくは完全に被覆されている場合、またはその表面の実質的にすべてもしくはすべてが分析物に付着されている場合、膜と接触しない可能性がある。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドなどの分析物は、微粒子の粒径より大きいまたは長いことがある。分析物は、微粒子と膜とのクッションとして作用することがある。微粒子は、分析物をポアに送達するのに膜の十分近くに移動する。当業者は、分析物がポアに送達されるように系を設計することができる。
【０１５６】
微粒子は、いずれの様式で膜へ移動してもよい。方法は、好ましくは、微粒子を電気化学的勾配、拡散勾配、親水性勾配または疎水性勾配に沿って移動させるステップを含む。勾配は、１点から別の点に移るときに観察される特性の程度における増減である。当業者は、上で言及した勾配のいずれかの生成方法、および微粒子を勾配に沿って移動させる方法を理解するであろう。例えば、荷電微粒子は、概して電気化学的勾配に沿って移動することになる。微粒子は、概して膜の方へ拡散することになる。微粒子は、概して、圧力勾配に沿って溶液中を流れることになる。親水性または疎水性微粒子は、概して、親水性または疎水性勾配に沿って移動することになる。分析物、および１つまたは複数のアンカーなどの任意の関連分子は、微粒子の電荷および／または親水性／疎水性に影響を及ぼすことがある。
【０１５７】
方法は、好ましくは微粒子を磁場内で移動させるステップを含む。方法は、好ましくは、微粒子を膜に送達するために磁場を使用するステップを含む。磁性微粒子は、上で論じている。磁場を生成するための好適な方法は公知であり、磁性材料または電磁石が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５８】
方法は、好ましくは微粒子を電場内で移動させるステップを含む。方法は、好ましくは、微粒子を膜に送達するために電場を使用するステップを含む。荷電微粒子は、当技術分野において公知であり、上で論じられている。電場を生成するための好適な方法も公知である。
【０１５９】
方法は、好ましくは微粒子を圧力下で移動させるステップを含む。方法は、好ましくは、微粒子を膜に送達するために圧力または流れを使用するステップを含む。圧力は、物理的圧力または浸透圧であってもよい。そのような圧力を生成するための好適な方法は公知である。
【０１６０】
方法は、好ましくは微粒子を重力場内でまたは重力によって移動させるステップを含む。方法は、好ましくは、微粒子を膜に送達するために重力を使用するステップを含む。溶液中の膜の上に置かれた高密度微粒子は、重力の影響下で膜へ移動することになる。方法は、微粒子が表面に沿って膜へ進み、移動し、スライドしまたは転がることを可能にするステップを含むことがある。表面は、概して、膜を含むチャンバーの垂直壁（壁は膜の平面にほぼ垂直である）から約４５°から約６９°の角度で傾斜している。表面は、概して、膜の平面と比較して約２１°、２２°、２３°、２４°、２５°、２６°、２７°、２８°、２９°、３０°、３１°、３２°、３３°、３４°、３５°、３６°、３７°、３８°、３９°、４０°、４１°、４２°、４３°、４４°から約４５°の角度で膜の方へ傾斜している。好ましい実施形態において、傾斜面は、膜を含むチャンバーの１つまたは複数の表面を、シリコン油、ＡＲ２０またはヘキサデカンなどの好適な前処理法で前処理して形成される。本発明の方法において使用するためのチャンバーを含む好適な装置は、下で論じる。
【０１６１】
微粒子が膜と接触する場合、方法は、微粒子が膜に沿って進み、移動し、スライドしまたは転がることを可能にするステップを含むことがある。微粒子が膜と接触しない場合、方法は、微粒子が膜と平行して進み、移動し、スライドしまたは転がることを可能にするステップを含むことがある。
【０１６２】
カップリング
分析物は、好ましくは、膜とカップリングすることができる１つまたは複数のアンカーを含む。方法は、好ましくは、１つまたは複数のアンカーを使用して分析物を膜とカップリングするステップをさらに含む。
【０１６３】
アンカーは、分析物とカップリング（または結合）する基、および膜とカップリング（または結合）する基を含む。各アンカーは、分析物および／または膜と共有結合でカップリング（または結合）することがある。
【０１６４】
分析物は、２、３、４以上のアンカーなど、任意の数のアンカーを使用して膜とカップリングしてもよい。例えば、分析物は、各々のアンカーが分析物および膜の両方と別々にカップリング（または結合）する、２つのアンカーを使用して膜とカップリングしてもよい。
【０１６５】
１つまたは複数のアンカーは、１つまたは複数のポリヌクレオチド結合タンパク質を含んでもよい。各アンカーは、１つまたは複数のポリヌクレオチド結合タンパク質を含んでもよい。ポリヌクレオチド結合タンパク質は、下で論じられるもののいずれであってもよい。
【０１６６】
膜が、両親媒性層、例えば、トリブロック共重合体膜である場合、１つまたは複数のアンカーは、好ましくは、膜中に存在するポリペプチドアンカー、および／または膜中に存在する疎水性アンカーを含む。疎水性アンカーは、好ましくは、脂質、脂肪酸、ステロール、カーボンナノチューブ、ポリペプチド、タンパク質またはアミノ酸、例えばコレステロール、パルミチン酸エステルまたはトコフェロールである。好ましい実施形態において、１つまたは複数のアンカーはポアではない。
【０１６７】
膜の成分、例えば、両親媒性分子、共重合体または脂質は、１つまたは複数のアンカーを形成するように化学的に修飾されるまたは官能化されることがある。好適な化学的修飾、および膜の成分を官能化する好適な方法の例は、下でより詳細に論じる。膜成分の任意の比率、例えば、少なくとも０．０１％、少なくとも０．１％、少なくとも１％、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％または１００％を官能化してもよい。
【０１６８】
分析物は、膜と直接カップリングされることもある。分析物を膜とカップリングするために使用される１つまたは複数のアンカーは、好ましくはリンカーを含む。１つまたは複数のアンカーは、１つまたは複数、例えば２、３、４以上のリンカーを含むことがある。１つのリンカーを使用して、１つより多く、例えば２、３、４以上の分析物を膜とカップリングしてもよい。
【０１６９】
好ましいリンカーとしては、重合体、例えばポリヌクレオチド、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、多糖類およびポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。これらのリンカーは、直鎖状であってもよく、分岐状であってもよく、または環状であってもよい。例えば、リンカーは、環状ポリヌクレオチドであることがある。分析物は、それ自体がポリヌクレオチドであるならば、環状ポリヌクレオチドリンカーにおける相補配列にハイブリダイズすることがある。
【０１７０】
１つもしくは複数のアンカーまたは１つもしくは複数のリンカーは、切断または破壊することができる成分、例えば、制限部位または光解離性基を含むことがある。
【０１７１】
官能化されたリンカー、およびそれらが分子をカップリングできる方法は、当技術分野において公知である。例えば、マレイミド基で官能化されたリンカーは、タンパク質中のシステイン残基と反応して、該システイン残基に付着することになる。本発明に関して、タンパク質は、膜中に存在することもあり、分析物それ自体であることもあり、または分析物とカップリング（または結合）するために使用されることもある。このことは、下でより詳細に論じる。
【０１７２】
分析物の架橋は、「鍵と鍵穴」配置を用いて回避することができる。各リンカーの１つの末端のみが一緒に反応してより長いリンカーを形成することがあり、リンカーの他の末端は、各々、分析物または膜とそれぞれ反応する。そのようなリンカーは、国際出願番号ＰＣＴ／ＧＢ１０／０００１３２（国際公開第２０１０／０８６６０２号パンフレットとして公開された）に記載されている。
【０１７３】
下で論じるシークエンシング実施形態ではリンカーの使用が好ましい。ポリヌクレオチド分析物が、ポアと相互作用しているときにはアンカップリングしないという意味で永続的に膜と直接カップリングされている場合には、膜とポアの間の距離のためシークエンシング実行をポリヌクレオチドの末端まで継続することができないので、一部の配列データが失われることになる。リンカーを使用する場合には、ポリヌクレオチド分析物を完了まで処理することができる。
【０１７４】
カップリングは、永続的または安定性であることがある。言い換えれば、カップリングは、分析物が、ポアと相互作用すると、膜とカップリングされたままであるようなカップリングであることがある。
【０１７５】
カップリングは、一時的であることがある。言い換えれば、カップリングは、分析物が、ポアと相互作用すると、膜から分離されうるようなカップリングであることがある。アプタマー検出およびポリヌクレオチドシークエンシングなどの特定の用途には、カップリングの一時的性質が好ましい。永続的または安定性リンカーが、ポリヌクレオチドの５’または３’末端のいずれかに直接付着され、リンカーが、膜と膜貫通ポアのチャネルとの間の距離より短い場合には、シークエンシング実行をポリヌクレオチドの末端まで継続することができないので、一部の配列データが失われることになる。カップリングが一時的である場合には、カップリングされた末端から無作為に膜がなくなると、ポリヌクレオチドを完了まで処理することができる。永続的／安定性または一時的連結を形成する化学基は、下でより詳細に論じる。コレステロールまたは脂肪アシル鎖を使用して、分析物が両親媒性層またはトリブロック共重合体膜と一時的にカップリングされることがある。６〜３０個の炭素原子の長さを有する任意の脂肪アシル鎖、例えば、ヘキサデカン酸を使用してもよい。
【０１７６】
好ましい実施形態において、核酸などのポリヌクレオチド分析物は、トリブロック共重合体膜または脂質二重層などの両親媒性層とカップリングされる。核酸の合成脂質二重層へのカップリングは、様々な異なる繋留戦略を用いて以前に行われている。これらのことを下の表３に要約する。
【０１７７】
【表１】
0006721581.tif 000002
【０１７８】
合成ポリヌクレオチド分析物および／またはリンカーは、コレステロール、トコフェロール、パルミチン酸エステル、チオール、脂質およびビオチン基などの好適なアンカー基の直接付加に容易に適合する修飾ホスホラミダイトを合成反応において使用して、官能化されることがある。これらの様々な付着化学によって、ポリヌクレオチドへの付着の一連の選択肢が得られる。様々な修飾基各々がわずかに異なる方法でポリヌクレオチドにカップリングし、カップリングは必ずしも永続的であるとは限らないため、膜への分析物の滞留に異なる時間が費やされる。一時的カップリングの利点は、上で論じている。
【０１７９】
リンカーとのまたは官能化膜とのポリヌクレオチドのカップリングは、相補的反応性基またはアンカー基をポリヌクレオチドに付加することができるという条件で、いくつかの他の手段によって果たすこともできる。ポリヌクレオチドのいずれかの末端への反応性基の付加は、以前に報告されている。Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼおよびＡＴＰγＳを使用して、チオール基をｓｓＤＮＡまたはｄｓＤＮＡの５’に付加することができる（Grant, G. P. and P. Z. Qin (2007)."A facile method for attaching nitroxide spin labels at the 5' terminus of nucleic acids." Nucleic Acids Res 35(10): e77）。Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼおよびγ−［２−アジドエチル］−ＡＴＰまたはγ−［６−アジドヘキシル］−ＡＴＰを使用して、アジド基をｓｓＤＮＡまたはｄｓＤＮＡの５’リン酸エステルに付加することができる。チオールまたはクリックケミストリー使用して、チオール、ヨードアセトアミドＯＰＳＳもしくはマレイミド基（チオールに対して反応性）またはＤＩＢＯ（ジベンゾシクロオクチン）もしくはアルキン基（アジドに対して反応性）のいずれかを含有するテザーをポリヌクレオチド分析物に共有結合で付着させることができる。ターミナルトランスフェラーゼを使用して、ビオチン、チオールおよびフルオロフォアなどの化学基のより多様な選択物を付加して、ｓｓＤＮＡの３’に修飾オリゴヌクレオチドを組み込むことができる（Kumar, A., P. Tchen, et al.(1988). "Nonradioactive labeling of synthetic oligonucleotide probes with terminal deoxynucleotidyl transferase." Anal Biochem 169(2): 376-82）。ストレプトアビジン／ビオチンおよび／またはストレプトアビジン／デスチオビオチンカップリングを任意の他の分析物に使用してもよい。下の例は、ポリヌクレオチドが、ストレプトアビジン／ビオチンおよびストレプトアビジン／デスチオビオチンを使用して膜とどのようにカップリングされうるかを説明するものである。ターミナルトランスフェラーゼと好適に修飾されたヌクレオチド（例えばコレステロールまたはパルミチン酸エステル）を使用してアンカーがポリヌクレオチドに直接付加されうることも可能でありうる。
【０１８０】
１つまたは複数のアンカーは、好ましくは、分析物をハイブリダイゼーションによって膜とカップリングする。ハイブリダイゼーションは、１つまたは複数のアンカーのいずれの部分に存在してもよく、例えば、１つもしくは複数のアンカーと分析物の間、１つもしくは複数のアンカー内、または１つもしくは複数のアンカーと膜の間に存在してもよい。１つまたは複数のアンカーのハイブリダイゼーションによって、上で論じたような一時的手法でのカップリングが可能になる。例えば、リンカーは、一緒にハイブリダイズされている２つ以上のポリヌクレオチド、例えば、３、４または５つのポリヌクレオチドを含むことがある。分析物がポリヌクレオチドである場合、１つまたは複数のアンカーは、ポリヌクレオチド分析物にハイブリダイズされることがある。１つまたは複数のアンカーは、ポリヌクレオチド分析物に直接、ポリヌクレオチド分析物に付着されているＹアダプターおよび／もしくはリーダー配列に直接、または（下でより詳細に論じるように）ポリヌクレオチド分析物に付着されているヘアピンループアダプターに直接ハイブリダイズすることがある。あるいは、１つまたは複数のアンカーは、ポリヌクレオチド分析物にハイブリダイズされる１つまたは複数、例えば２つまたは３つの中間ポリヌクレオチド（または「スプリント」）、ポリヌクレオチド分析物に付着されているＹアダプターおよび／もしくはリーダー配列、または（下でより詳細に論じるように）ポリヌクレオチド分析物に付着されているヘアピンループアダプターにハイブリダイズされることがある。
【０１８１】
１つまたは複数のアンカーは、一本鎖ポリヌクレオチドを含むこともあり、または二本鎖ポリヌクレオチドを含むこともある。アンカーの一部分は一本鎖または二本鎖ポリヌクレオチド分析物にライゲートされていることがある。Ｔ４  ＲＮＡリガーゼＩを使用する短いｓｓＤＮＡ片のライゲーションは報告されている（Troutt, A. B., M. G. McHeyzer-Williams, et al.(1992)."Ligation-anchored PCR: a simple amplification technique with single-sided specificity."Proc Natl Acad Sci U S A 89(20): 9823-5）。あるいは、一本鎖または二本鎖ポリヌクレオチド分析物のいずれかを二本鎖ポリヌクレオチドにライゲートし、次いで、２本の鎖を熱変性または化学変性によって分離することができる。二本鎖ポリヌクレオチドに対しては、その二重鎖の末端の一方もしくは両方に一本鎖ポリヌクレオチドの一部分を付加すること、または一方もしくは両方の末端に二本鎖ポリヌクレオチドを付加することが可能である。一本鎖ポリヌクレオチドの二本鎖ポリヌクレオチドへの付加については、この付加を、一本鎖ポリヌクレオチドの他の領域へのライゲーションの場合と同様にＴ４  ＲＮＡリガーゼＩを使用して果たすことができる。次に、二本鎖ポリヌクレオチドの二本鎖ポリヌクレオチド分析物への付加については、ライゲーションは、分析物および付加されたポリヌクレオチドそれぞれに関する相補的３’ｄＡ／ｄＴテールを（多くの試料調製用途に鎖状体または二量体形成を防止するために常例的に行われているように）用いる、「平滑末端型」であることもあり、または分析物の制限消化および適合性アダプターのライゲーションによって生成される「突出末端」の使用であることもある。次いで、二重鎖が融解されると、各一本鎖は、一本鎖ポリヌクレオチドが５’末端、３’末端でのライゲーションもしくは修飾に使用された場合には５’もしくは３’修飾、または二本鎖ポリヌクレオチドがライゲーションに使用された場合には両方の修飾、いずれかを有することになる。
【０１８２】
ポリヌクレオチド分析物が合成鎖である場合、ポリヌクレオチドの化学合成中に１つまたは複数のアンカーを組み込むことができる。例えば、ポリヌクレオチドを、反応性基が付着されているプライマーを使用して合成することができる。
【０１８３】
アデニル化ポリヌクレオチドは、アデノシン一リン酸をポリヌクレオチドの５’リン酸エステルに付着させるライゲーション反応における中間体である。この中間体を生成するために、ＮＥＢからの５’ＤＮＡアデニル化キットなどの様々なキットを利用できる。反応中に修飾ヌクレオチド三リン酸をＡＴＰで置換することによって、その際、ポリヌクレオチドの５’に反応性基（例えばチオール、アミン、ビオチン、アジドなど）の付加が可能でありうる。５’ＤＮＡアデニル化キットと好適に修飾されたヌクレオチド（例えばコレステロールまたはパルミチン酸エステル）を使用してアンカーがポリヌクレオチドに直接付加されうることも可能でありうる。
【０１８４】
ゲノムＤＮＡのセクションを増幅するための一般的な技法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の使用である。ここで、２つの合成オリゴヌクレオチドプライマーを使用して、ＤＮＡの同じセクションのいくつかのコピーを生成することができ、この場合、各コピーについて、二重鎖における各鎖の５’は合成ポリヌクレオチドとなる。ポリメラーゼを利用することにより、単一または複数のヌクレオチドを一本鎖または二本鎖ＤＮＡの３’末端に付加することができる。使用することができるポリメラーゼの例としては、ターミナルトランスフェラーゼ、クレノウおよび大腸菌（E. coli）ポリ（Ａ）ポリメラーゼが挙げられるが、これらに限定されない）。反応中に修飾ヌクレオチド三リン酸をＡＴＰで置換することによって、その際、コレステロール、チオール、アミン、アジド、ビオチンまたは脂質などのアンカーを二本鎖ポリヌクレオチドに組み込むことができる。したがって、増幅されたポリヌクレオチドの各コピーは、アンカーを含有することになる。
【０１８５】
理想的には、分析物は、該分析物を官能化する必要なく、膜とカップリングされる。これは、１つもしくは複数のアンカー、例えばポリヌクレオチド結合タンパク質または化学基を膜とカップリングし、１つもしくは複数のアンカーを分析物と相互作用させることによって、または膜を官能化することによって、果たすことができる。１つまたは複数のアンカーを本明細書に記載する方法のいずれかによって膜とカップリングしてもよい。特に、１つまたは複数のアンカーは、１つまたは複数のリンカー、例えばマレイミド官能化リンカーを含むことがある。
【０１８６】
この実施形態において、分析物は、概してＲＮＡ、ＤＮＡ、ＰＮＡ、ＴＮＡまたはＬＮＡであり、二本鎖または一本鎖であってもよい。この実施形態は、ゲノムＤＮＡ分析物に特に適している。
【０１８７】
１つまたは複数のアンカーは、一本鎖もしくは二本鎖ポリヌクレオチド、分析物内の特異的ヌクレオチド配列、または分析物内の修飾ヌクレオチドのパターン、またはポリヌクレオチド上に存在する任意の他のリガンドとカップリング、結合または相互作用する任意の基を含むことができる。
【０１８８】
アンカーに使用するために好適な結合タンパク質としては、下に列挙するものを含めて、大腸菌（E. coli）一本鎖結合タンパク質、Ｐ５一本鎖結合タンパク質、Ｔ４  ｇｐ３２一本鎖結合タンパク質、ＴＯＰＯ  Ｖ  ｄｓＤＮＡ結合領域、ヒトヒストンタンパク質、大腸菌（E. coli）ＨＵ  ＤＮＡ結合タンパク質、および他の古細菌性、原核性または真核性一本鎖または二本鎖ポリヌクレオチド（または核酸）結合タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８９】
特異的ヌクレオチド配列は、転写因子、リボソーム、エンドヌクレアーゼ、トポイソメラーゼまたは複製開始因子によって認識される配列であることがある。修飾ヌクレオチドのパターンは、メチル化または損傷のパターンであることがある。
【０１９０】
１つまたは複数のアンカーは、ポリヌクレオチド分析物とカップリングする、結合する、それにインターカレートする、または、それと相互作用する任意の基を含むことができる。この基は、静電相互作用、水素結合相互作用、またはファンデルワールス相互作用によって、ポリヌクレオチド分析物にインターカレートすることもあり、またはポリヌクレオチドと相互作用することもある。そのような基としては、リシン単量体、ポリリシン（ｓｓＤＮＡまたはｄｓＤＮＡと相互作用することになる）、臭化エチジウム（ｄｓＤＮＡにインターカレートすることになる）、ユニバーサル塩基またはユニバーサルヌクレオチド（任意のポリヌクレオチド分析物とハイブリダイズすることができる）およびオスミウム錯体（メチル化塩基と反応することができる）が挙げられる。したがって、ポリヌクレオチド分析物を膜と、その膜に付着している１つまたは複数のユニバーサルヌクレオチドを使用してカップリングしてもよい。１つまたは複数のリンカーを使用して各ユニバーサルヌクレオチドを膜とカップリングしてもよい。ユニバーサルヌクレオチドは、好ましくは、次の核酸塩基のうちの１つを含む：ヒポキサンチン、４−ニトロインドール、５−ニトロインドール、６−ニトロインドール、ホルミルインドール、３−ニトロピロール、ニトロイミダゾール、４−ニトロピラゾール、４−ニトロベンゾイミダゾール、５−ニトロインダゾール、４−アミノベンゾイミダゾールまたはフェニル（Ｃ６−芳香族環）。ユニバーサルヌクレオチドは、より好ましくは、次のヌクレオシドのうちの１つを含む：２’−デオキシイノシン、イノシン、７−デアザ−２’−デオキシイノシン、７−デアザ−イノシン、２−アザ−デオキシイノシン、２−アザ−イノシン、２−Ｏ’−メチルイノシン、４−ニトロインドール２’−デオキシリボヌクレオシド、４−ニトロインドールリボヌクレオシド、５−ニトロインドール２’−デオキシリボヌクレオシド、５−ニトロインドールリボヌクレオシド、６−ニトロインドール２’−デオキシリボヌクレオシド、６−ニトロインドールリボヌクレオシド、３−ニトロピロール２’−デオキシリボヌクレオシド、３−ニトロピロールリボヌクレオシド、ヒポキサンチンの非環状糖類似体、ニトロイミダゾール２’−デオキシリボヌクレオシド、ニトロイミダゾールリボヌクレオシド、４−ニトロピラゾール２’−デオキシリボヌクレオシド、４−ニトロピラゾールリボヌクレオシド、４−ニトロベンゾイミダゾール２’−デオキシリボヌクレオシド、４−ニトロベンゾイミダゾールリボヌクレオシド、５−ニトロインダゾール２’−デオキシリボヌクレオシド、５−ニトロインダゾールリボヌクレオシド、４−アミノベンゾイミダゾール２’−デオキシリボヌクレオシド、４−アミノベンゾイミダゾールリボヌクレオシド、フェニルＣ−リボヌクレオシド、フェニルＣ−２’−デオキシリボシルヌクレオシド、２’−デオキシネブラリン、２’−デオキシイソグアノシン、Ｋ−２’−デオキシリボース、Ｐ−２’−デオキシリボースおよびピロリジン。ユニバーサルヌクレオチドは、より好ましくは、２’−デオキシイノシンを含む。ユニバーサルヌクレオチドは、より好ましくは、ＩＭＰまたはｄＩＭＰである。ユニバーサルヌクレオチドは、最も好ましくは、ｄＰＭＰ（２’−デオキシ−Ｐ−ヌクレオシド一リン酸）またはｄＫＭＰ（Ｎ６−メトキシ−２，６−ジアミノプリン一リン酸）である。
【０１９１】
１つまたは複数のアンカーをフーグスティーン（Hoogsteen）水素結合（２つの核酸塩基が水素結合によって一緒に保持される）または逆フーグスティーン水素結合（一方の核酸塩基が他方の核酸塩基に対して１８０°回転される）によってポリヌクレオチド分析物とカップリング（または結合）してもよい。例えば、１つまたは複数のアンカーは、ポリヌクレオチド分析物とフーグスティーン水素結合または逆フーグスティーン水素結合を形成する、１つもしくは複数のヌクレオチド、１つもしくは複数のオリゴヌクレオチドまたは１つもしくは複数のポリヌクレオチドを含むことがある。これらのタイプの水素結合は、第３のポリヌクレオチド鎖を二本鎖ヘリックスの周りに巻きつかせ、三重鎖を形成させる。１つまたは複数のアンカーは、二本鎖二重鎖と三重鎖を形成することによって、二本鎖ポリヌクレオチド分析物とカップリング（または結合）することがある。
【０１９２】
この実施形態において、膜成分の少なくとも１％、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％または１００％は官能化されることがある。
【０１９３】
１つまたは複数のアンカーがタンパク質を含む場合、例えば、タンパク質が、膜と適合性である外部疎水性領域を既に有するならば、アンカーは、さらなる官能化なしに直接膜内に係留することができるであろう。そのようなタンパク質の例としては、膜貫通タンパク質、膜内タンパク質および膜タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、タンパク質は、膜と適合性である遺伝子融合された疎水性領域とともに発現されることがある。そのような疎水性タンパク質領域は、当技術分野において公知である。
【０１９４】
１つまたは複数のアンカーは、好ましくは、膜への送達の前に分析物と混合されるが、１つまたは複数のアンカーを膜と接触させ、その後、分析物と接触させてもよい。
【０１９５】
別の態様において、分析物は、上記の方法を用いて、特異的結合基が該分析物を認識できるように官能化されることがある。具体的には、分析物は、リガンド、例えば、ビオチン（ストレプトアビジンと結合させるため）、アミロース（マルトース結合タンパク質もしくは融合タンパク質と結合させるため）、Ｎｉ−ＮＴＡ（ポリヒスチジンもしくはポリヒスチジンタグ付きタンパク質と結合させるため）、またはペプチド（例えば抗原）で官能化されることがある。
【０１９６】
好ましい実施形態によると、ポアを優先的に通り抜けるリーダー配列に分析物を付着させる場合、１つまたは複数のアンカーを使用してポリヌクレオチド分析物を膜とカップリングすることがある。リーダー配列は、下でより詳細に論じる。好ましくは、ポリヌクレオチド分析物は、ポアを優先的に通り抜けるリーダー配列に付着（例えばライゲート）される。そのようなリーダー配列は、ホモ重合体型ポリヌクレオチドまたは脱塩基領域を含むことがある。リーダー配列は、１つまたは複数のアンカーに直接、または１つもしくは複数の中間ポリヌクレオチド（もしくはスプリント）を介して、ハイブリダイズするように概して設計される。そのような場合、１つまたは複数のアンカーは、リーダー配列内の配列または１つもしくは複数の中間ポリヌクレオチド（もしくはスプリント）内の配列に相補的であるポリヌクレオチド配列を概して含む。そのような場合、１つまたは複数のスプリントは、リーダー配列内の配列に相補的であるポリヌクレオチド配列を概して含む。
【０１９７】
両親媒性層など、ポリヌクレオチドを膜とカップリングするための上で論じた方法のいずれも、もちろん他の分析物と膜の組み合わせに当てはまりうる。いくつかの実施形態において、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、トリブロック共重合体層または脂質二重層などの両親媒性層とカップリングされる。そのような分析物の化学的付着のための様々な方法論が利用できる。化学的付着に使用される分子の例は、ＥＤＣ（１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩）である。市販のキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｐｉｅｒｃｅ、部品番号２２９８０）を使用して反応性基をポリヌクレオチドの５’に付加することもできる。好適な方法としては、ヒスチジン残基およびＮｉ−ＮＴＡを使用する一時的親和性付着はもちろん、反応性システイン、リシンまたは非天然アミノ酸による、より強い共有結合性付着も挙げられるが、これらに限定されない。
【０１９８】
分析物特性評価
本発明は、膜貫通ポアを使用して分析物の有無または１つもしくは複数の特性を判定することにさらに関わることがある。これは、（ｉ）分析物を膜貫通ポアと相互作用させるステップ、および（ｉｉ）相互作用中に、分析物の有無または１つもしくは複数の特性を示す１つまたは複数の測定値を取るステップを概して含む。
【０１９９】
様々な異なるタイプの測定を行ってもよい。この測定は、限定ではいが、電気的測定および光学的測定を含む。可能な電気的測定としては、電流測定、インピーダンス測定、トンネル効果測定（Ivanov AP et al., Nano Lett.2011 Jan 12; 11(1):279-85）、およびＦＥＴ測定（国際出願ＷＯ２００５／１２４８８８）が挙げられる。光学的測定は電気的測定と組み合わされることがある（Soni GV et al., Rev Sci Instrum.2010 Jan; 81(1):014301）。測定は、膜貫通電流測定、例えば、ポアを通って流れるイオン電流の測定であってもよい。
【０２００】
電気的測定は、Stoddart D et al., Proc Natl Acad Sci, 12;106(19):7702-7、Lieberman KR et al, J Am Chem Soc.2010;132(50):17961-72、および国際出願ＷＯ２０００／２８３１２に記載されているような、標準的なシングルチャンネル記録装置を使用して行ってもよい。あるいは、電気的測定は、例えば、国際出願ＷＯ２００９／０７７７３４および国際出願ＷＯ２０１１／０６７５５９に記載されているような、マルチチャンネルシステムを使用して行ってもよい。
【０２０１】
方法は、好ましくは、膜を横断して印加される電位を用いて行われる。印加される電位は、電圧電位であってもよい。あるいは、印加される電位は、化学的電位であってもよい。この方法の例は、両親媒性層などの膜を横断する塩勾配の使用である。塩勾配は、Holden et al., J Am Chem Soc.2007 Jul 11; 129(27):8650-5に開示されている。場合によっては、ポリヌクレオチド分析物がポアに対して移動するときにポアを通過する電流を用いて、ポリヌクレオチドの配列を推定または判定する。これは鎖シークエンシングである。
【０２０２】
方法は、好ましくは、（ｉ）分析物をポアと相互作用させるステップと、（ｉｉ）相互作用中にポアを通過する電流を測定し、それによって分析物の有無または１つもしくは複数の特性を判定するステップとを含む。
【０２０３】
電流が分析物に特異的な様式でポアを通って流れるならば（すなわち、分析物に関連する特有の電流がポアを通って流れながら検出されるならば）、分析物は存在する。電流が分析物に特異的な様式でポアを通って流れないならば、分析物は存在しない。同様に、分析物の特性は、相互作用中にポアを通って流れる電流を用いて判定することができる。
【０２０４】
したがって、本発明は、分析物のナノポア検知を含む。本発明は、分析物がポアを通過する電流に与える異なる影響に基づき、類似の構造の分析物を識別するために使用することができる。本発明は、試料中の特定の分析物の濃度を測定するために使用することもできる。
【０２０５】
本発明は、バルク検出用途で多数または数千のポアを使用するセンサーにおいて使用することもできる。
【０２０６】
分析物とポアとの相互作用中、分析物は、その分析物に特異的な様式でポアを通って流れる電流に影響を及ぼす。例えば、特定の分析物は、ポアを通って流れる電流を特定の平均期間および特定の程度低減することになる。言い換えれば、ポアを通って流れる電流は、特定の分析物に特有である。対照実験を、ポアを通って流れる電流に特定の分析物が与える影響を判定するために行ってもよい。試料中の特定の分析物を同定し、特定の分析物が試料中に存在するかどうかを判定し、または各分析物の特性を判定するために、試験試料での本発明の方法の実施結果は、次いで、そのような対照実験から得られるものと比較することができる。ポアを通って流れる電流が、特定の分析物を示す様式で影響を受ける頻度は、試料中の分析物の濃度を判定するために使用することができる。
【０２０７】
アンカップリング
本発明の方法は、分析物を膜からアンカップリングするステップを含むことがある。複数の分析物が、本発明の方法を用いて送達されている場合、分析物の少なくとも１０％が好ましくは膜からアンカップリングされる。例えば、分析物の少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％が、膜からアンカップリングされてもよい。好ましくは、分析物のすべてが膜からアンカップリングされる。膜からアンカップリングされる分析物の量は、ポアを使用して判定することができる。
【０２０８】
分析物は、任意の公知の方法を用いて膜からアンカップリングすることができる。分析物は、好ましくは、ポアを使用して膜からアンカップリングされない。分析物は、好ましくは、電圧または印加電位を用いて膜からアンカップリングされない。
【０２０９】
方法は、好ましくは、１つまたは複数のアンカーを膜から除去することにより、分析物を膜からアンカップリングするステップをさらに含む。方法は、より好ましくは、１つまたは複数のアンカーが膜に対して有するより高い親和性を１つまたは複数のアンカーに対して有する作用物質と、１つまたは複数のアンカーを接触させるステップを含む。分子の特異的結合能力を判定するための競合的結合アッセイまたは免疫放射線測定アッセイに関する様々なプロトコールは、当技術分野において周知である（例えばMaddox et al, J. Exp. Med. 158, 1211-1226, 1993を参照されたい）。作用物質は１つまたは複数のアンカーを膜から除去し、それによって分析物をアンカップリングする。作用物質、好ましくは糖である。１つまたは複数のアンカーが膜に対して有するより高い親和性で、１つまたは複数のアンカーと結合する任意の糖を使用してもよい。糖は、下で論じるようにシクロデキストリンまたはその誘導体であってもよい。
【０２１０】
１つまたは複数のアンカーは、好ましくは、コレステロールなどの疎水性アンカーを含み、作用物質は、好ましくは、シクロデキストリンもしくはその誘導体、または脂質である。シクロデキストリンまたはその誘導体は、Eliseev, A. V., and Schneider, H-J.（1994）J. Am. Chem. Soc. 116, 6081-6088に開示されているもののいずれであってもよい。作用物質は、より好ましくは、ヘプタキス−６−アミノ−β−シクロデキストリン（ａｍ７−βＣＤ）、６−モノデオキシ−６−モノアミノ−β−シクロデキストリン（ａｍ１−βＣＤ）またはヘプタキス−（６−デオキシ−６−グアニジノ）−シクロデキストリン（ｇｕ７−βＣＤ）である。本明細書において開示されている脂質のいずれも、使用することができる。
【０２１１】
１つまたは複数のアンカーは、好ましくは、ストレプトアビジン、ビオチンまたはデスチオビオチンを含み、作用物質は、好ましくは、ビオチン、デスチオビオチンまたはストレプトアビジンである。ビオチンおよびデスチオビオチンの両方は、ストレプトアビジンが膜と結合するより高い親和性でストレプトアビジンと結合し、逆もまた同様である。ビオチンは、ストレプトアビジンに対してデスチオビオチンより強い親和性を有する。したがって、ストレプトアビジンを含むアンカーは、ビオチンまたはデスチオビオチンを使用して膜から除去することができ、逆もまた同様である。
【０２１２】
１つまたは複数のアンカーは、好ましくはタンパク質を含み、作用物質は、好ましくは、タンパク質と特異的に結合する抗体またはその断片である。抗体が、優先的なまたは高い親和性でタンパク質と結合するならば、抗体はタンパク質と特異的に結合するが、低親和性のみでは他のまたは異なるタンパク質と結合しない。抗体は、１×１０−６Ｍ以下、より好ましくは１×１０−７Ｍ以下、５×１０−８Ｍ以下、より好ましくは１×１０−８Ｍ以下、またはより好ましくは５×１０−９Ｍ以下のＫｄで結合するならば、優先的なまたは高い親和性で結合する。抗体は、１×１０−６Ｍ以上、より好ましくは１×１０−５Ｍ以上、より好ましくは１×１０−４Ｍ以上、より好ましくは１×１０−３Ｍ以上、さらにより好ましくは１×１０−２Ｍ以上のＫｄで結合するならば、低い親和性で結合する。任意の方法が、結合または特異的結合を検出するために使用されることもある。タンパク質に対する抗体の結合を定量的に測定する方法は、当技術分野において周知である。抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であってもよい。抗体の好適な断片としては、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）およびＦ（ａｂ’）２断片、ならびに一本鎖鎖抗体が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、抗体またはその断片は、キメラ抗体もしくはその断片、ＣＤＲ移植抗体もしくはその断片、またはヒト化抗体もしくはその断片であってもよい。
【０２１３】
方法は、１つまたは複数のアンカーを、膜とカップリングするその能力を低減する作用物質と接触させるステップを含むことがある。例えば、作用物質は、１つまたは複数のアンカーの構造および／または疎水性に干渉し、それによって膜とカップリングするその能力を低減しうる。１つまたは複数のアンカーは、好ましくはコレステロールを含み、作用物質は、好ましくはコレステロールデヒドロゲナーゼである。１つまたは複数のアンカーは、好ましくは脂質を含み、作用物質は、好ましくはホスホリパーゼである。１つまたは複数のアンカーは、好ましくはタンパク質を含み、作用物質は、好ましくはプロテイナーゼまたは尿素である。好適なアンカーおよび作用物質の他の組み合わせは、当業者には明らかであろう。
【０２１４】
方法は、分析物を１つまたは複数のアンカーから分離することによって、分析物を膜からアンカップリングするステップを含むことがある。これは、いずれの様式でも行うことができる。例えば、リンカーは、リンカーを含む１つまたは複数のアンカーにおいて切断されうる。この実施形態は、ハイブリダイゼーションによる結合を伴う１つまたは複数のアンカーに特に適用可能である。そのようなアンカーは、上で論じている。
【０２１５】
方法は、分析物および１つまたは複数のアンカーを、１つまたは複数のアンカーへの結合に関して分析物と競合する作用物質と接触させることによって、分析物を膜からアンカップリングするステップを含むことがある。競合的結合を判定および測定する方法は、当技術分野において公知である。作用物質は、好ましくは、１つまたは複数のアンカーへのハイブリダイゼーションに関して分析物と競合するポリヌクレオチドである。例えば、ハイブリダイゼーションを伴う１つまたは複数のアンカーを使用して、分析物が膜とカップリングされる場合、分析物は、ハイブリダイゼーションの部位に同様にハイブリダイズするポリヌクレオチドと１つまたは複数のアンカーを接触させることによって、アンカップリングすることができる。ポリヌクレオチド作用物質は、概して、分析物および１つまたは複数のアンカーの濃度より高い濃度で添加される。あるいは、ポリヌクレオチド作用物質は、１つまたは複数のアンカーに分析物より強くハイブリダイズしてもよい。
【０２１６】
方法は、（ｉ）分析物および１つまたは複数のアンカーを、尿素、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ストレプトアビジンもしくはビオチン、ＵＶ光、酵素、または結合剤と接触させるステップと、（ｉｉ）分析物および１つまたは複数のアンカーを加熱するステップと、あるいは（ｉｉｉ）ｐＨを変えるステップとを含むことがある。尿素、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）またはジチオスレイトール（ＤＴＴ）は、アンカーを破壊し、分析物を膜から分離することができる。アンカーがストレプトアビジン−ビオチン結合を含む場合、ストレプトアビジン作用物質は、ビオチンへの結合に関して競合することになる。アンカーがストレプトアビジン−デスチオビオチン結合を含む場合、ビオチン作用物質は、ストレプトアビジンへの結合に関して競合することになる。ＵＶ光は、光解離性基を破壊するために使用することができる。酵素および結合剤は、アンカーを切断、破壊または解すために使用することができる。好ましい酵素としては、エキソヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼまたはヘリカーゼが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい結合剤としては、酵素、抗体もしくはその断片または一本鎖結合タンパク質（ＳＳＢ）が挙げられるが、これらに限定されない。下で論じる酵素または上で論じた抗体のいずれを使用してもよい。熱およびｐＨは、ハイブリダイゼーションおよび他の結合を破壊するために使用することができる。
【０２１７】
分析物を１つまたは複数のアンカーから分離することによって、分析物が膜からアンカップリングされる場合、１つまたは複数のアンカーは膜に残存するであろう。残存する１つまたは複数のアンカーは、膜に送達された別の分析物をカップリングするために使用されることもある。例えば、第二の分析物が、膜に残存する１つまたは複数のアンカーにハイブリダイズするポリヌクレオチドとともに送達されることもある。あるいは、第二の分析物を、第一の分析物（すなわち、他の１つまたは複数のアンカー）から分離されたものとは別の１つまたは複数のアンカーを使用して、膜とカップリングしてもよい。別の１つまたは複数のアンカーは、第一の分析物を膜とカップリングするために使用される同じタイプのアンカーであってもよく、または異なるタイプのアンカーであってもよい。
【０２１８】
方法は、微粒子を膜から除去することによって、分析物を膜からアンカップリングするステップを好ましくはさらに含む。微粒子を膜から除去する方法は、下で論じる。微粒子との分析物の付着強度が、膜との分析物のカップリング強度より大きい場合、微粒子の除去は、分析物を膜からアンカップリングすることになる。付着およびカップリングの強度は、下で論じるように測定することができる。微粒子を使用する分析物のアンカップリングは、分析物の全ての例を系から除去するのに役立つことがあるため、別の微粒子が第二の分析物（第一の分析物と同じであってもよく、または異なってもよい）を膜貫通ポアに送達するために使用されることがある。
【０２１９】
除去または洗浄
方法は、微粒子を膜から除去するステップを好ましくはさらに含む。複数の微粒子が使用される場合、微粒子の少なくとも１０％が除去されてもよく、例えば微粒子の少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％が除去されてもよい。方法は、より好ましくは、微粒子の全てを膜から除去するするステップをさらに含む。これは、任意の方法で行うことができる。微粒子は、磁場を用いて膜から除去されてもよい。あるいはまたはさらに、微粒子は、フローベースの方法を用いて膜から除去されてもよい。例えば、膜は緩衝液で洗浄することができる。好適な緩衝液は、下で論じる。
【０２２０】
方法は、好ましくは、
（ａ）第一の微粒子に付着している第一の試料中の第一の分析物を用意するステップと、
（ｂ）第一の微粒子を膜へ送達し、それによって第一の分析物を膜貫通ポアに送達するステップと、
（ｃ）第一の微粒子を膜から除去するステップと、
（ｄ）第二の微粒子に付着している第二の試料中の第二の分析物を用意するステップと、
（ｅ）第二の微粒子を膜へ送達し、それによって第二の分析物を膜貫通ポアに送達するステップと
を含む。
【０２２１】
第一の分析物は、第二の分析物と同じであってもよい。２つの分析物がポリヌクレオチドである場合、これにより、校正が可能になる。第一の分析物は、例えばタイプ（例えばタンパク質およびポリヌクレオチド）および／または同一性（例えば２つの異なるポリヌクレオチド）において、第二の分析物と異なってもよい。２つの試料は同じであってもよく、または異なってもよい。
【０２２２】
１つの実施形態において、方法は、（ｉ）ステップ（ｂ）と（ｃ）の間に、第一の分析物を膜貫通ポアと相互作用させ、第一の分析物の有無または１つもしくは複数の特性を示す１つまたは複数の測定値を相互作用中に取るステップ、および／または（ｉｉ）ステップ（ｅ）後に、第二の分析物を膜貫通ポアと相互作用させ、第二の分析物の有無または１つもしくは複数の特性を示す１つまたは複数の測定値を相互作用中に取るステップを好ましくはさらに含む。
【０２２３】
別の実施形態において、第一および第二の分析物はポリヌクレオチドであり、方法は、（ｉ）ステップ（ｂ）と（ｃ）の間に、第一のポリヌクレオチドがポアを通って移動するように、第一のポリヌクレオチドを膜貫通ポアと相互作用させ、第一のポリヌクレオチドがポアに対して移動するときに、第一のポリヌクレオチドの１つまたは複数の特性を示す１つまたは複数の測定値を取り、それによって第一のポリヌクレオチドを特性評価するステップ、および／または（ｉｉ）ステップ（ｅ）後に、第二のポリヌクレオチドがポアを通って移動するように、第二のポリヌクレオチドを膜貫通ポアと相互作用させ、第二のポリヌクレオチドがポアに対して移動するときに、第二のポリヌクレオチドの１つまたは複数の特性を示す１つまたは複数の測定値を取り、それによって第二のポリヌクレオチドを特性評価するステップをさらに含む。
【０２２４】
除去方法におけるステップ（ｃ）は、好ましくは、微粒子および第一の分析物を除去するステップを含む。
【０２２５】
ポリヌクレオチド特性評価
本発明の方法は、好ましくは、ポリヌクレオチドを特性評価するステップを含む。ポリヌクレオチドは、本発明を用いて膜貫通ポアに送達され、ポアは、ポリヌクレオチドを特性評価するために使用される。
【０２２６】
送達後、方法は、（ｉ）ポリヌクレオチドがポアを通って移動するように、ポリヌクレオチドを膜貫通ポアと相互作用させるステップと、（ｉｉ）ポリヌクレオチドがポアに対して移動するときに、ポリヌクレオチドの１つまたは複数の特性を示す１つまたは複数の測定値を取り、それによってポリヌクレオチドを特性評価するステップとを含む。
【０２２７】
任意の数のポリヌクレオチドを調査することができる。例えば、本発明の方法は、２つ以上のポリヌクレオチド、例えば３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、２０以上、３０以上、５０以上、１００以上、５００以上、１，０００以上、５，０００以上、１０，０００以上、１００，０００以上、１０００，０００以上、または５０００，０００以上のポリヌクレオチドを特性評価することに関わることがある。２つ以上のポリヌクレオチドは、同じまたは異なる微粒子を使用して送達されてもよい。
【０２２８】
２つ以上のポリヌクレオチドが特性評価される場合、それらは互いに異なっていてもよい。２つ以上のポリヌクレオチドは、同じポリヌクレオチドの２つ以上の例であってもよい。これにより、校正が可能になる。
【０２２９】
ポリヌクレオチドは、天然に存在するものであることもあり、または人工的なものであることもある。例えば、方法を用いて、２つ以上の製造されたオリゴヌクレオチドの配列を検証してもよい。方法は、概してインビトロで行われる。
【０２３０】
方法は、各ポリヌクレオチドの２、３、４または５以上の特性を測定するステップを含むことがある。１つまたは複数の特性は、好ましくは、（ｉ）ポリヌクレオチドの長さ、（ｉｉ）ポリヌクレオチドの同一性、（ｉｉｉ）ポリヌクレオチドの配列、（ｉｖ）ポリヌクレオチドの二次構造、および（ｖ）ポリヌクレオチドが修飾されているか否かから選択される。｛ｉ｝、｛ｉｉ｝、｛ｉｉｉ｝、｛ｉｖ｝、｛ｖ｝、｛ｉ、ｉｉ｝、｛ｉ、ｉｉｉ｝、｛ｉ、ｉｖ｝、｛ｉ、ｖ｝、｛ｉｉ、ｉｉｉ｝、｛ｉｉ、ｉｖ｝、｛ｉｉ、ｖ｝、｛ｉｉｉ、ｉｖ｝、｛ｉｉｉ、ｖ｝、｛ｉｖ、ｖ｝、｛ｉ、ｉｉ、ｉｉｉ｝、｛ｉ、ｉｉ、ｉｖ｝、｛ｉ、ｉｉ、ｖ｝、｛ｉ、ｉｉｉ、ｉｖ｝、｛ｉ、ｉｉｉ、ｖ｝、｛ｉ、ｉｖ、ｖ｝、｛ｉｉ、ｉｉｉ、ｉｖ｝、｛ｉｉ、ｉｉｉ、ｖ｝、｛ｉｉ、ｉｖ、ｖ｝、｛ｉｉｉ、ｉｖ、ｖ｝、｛ｉ、ｉｉ、ｉｉｉ、ｉｖ｝、｛ｉ、ｉｉ、ｉｉｉ、ｖ｝、｛ｉ、ｉｉ、ｉｖ、ｖ｝、｛ｉ、ｉｉｉ、ｉｖ、ｖ｝、｛ｉｉ、ｉｉｉ、ｉｖ、ｖ｝または｛ｉ、ｉｉ、ｉｉｉ、ｉｖ、ｖ｝などの、（ｉ）〜（ｖ）のいずれの組み合わせを、本発明に従って測定してもよい。
【０２３１】
（ｉ）については、ポリヌクレオチドの長さは、例えば、ポリヌクレオチドとポアとの相互作用数、またはポリヌクレオチドとポアとの相互作用の継続時間を判定することによって測定することができる。
【０２３２】
（ｉｉ）については、ポリヌクレオチドの同一性は、いくつかの方法で測定することができる。ポリヌクレオチドの同一性は、ポリヌクレオチドの配列測定とともに測定されることもあり、またはポリヌクレオチドの配列測定なしで測定されることもある。前者は容易であり、ポリヌクレオチドをシークエンシングし、それによって同定する。後者は、いくつかの方法で行うことができる。例えば、ポリヌクレオチド内の特定のモチーフの存在が（ポリヌクレオチドの残存配列を測定せずに）測定されることがある。あるいは、方法の中で特定の電気および／または光シグナルを測定することによって、ポリヌクレオチドを特定の源に由来すると同定することができる。
【０２３３】
（ｉｉｉ）については、ポリヌクレオチドの配列を以前に記載されているように判定することができる。好適なシークエンシング方法、特に電気的測定を用いるものは、Stoddart D et al., Proc Natl Acad Sci, 12;106(19):7702-7、Lieberman KR et al, J Am Chem Soc.2010;132(50):17961-72、および国際出願ＷＯ２０００／２８３１２に記載されている。
【０２３４】
（ｉｖ）については、二次構造を様々な方法で測定することができる。例えば、方法が電気的測定を含む場合、滞留時間の変化、またはポアを通って、流れる電流の変化を利用して、二次構造が測定されることがある。これによって、一本鎖ポリヌクレオチド領域と二本鎖ポリヌクレオチド領域を区別することが可能になる。
【０２３５】
（ｖ）については、任意の修飾の存在または不在を測定することができる。方法は、ポリヌクレオチドがメチル化によって、酸化によって、損傷によって、１つもしくは複数のタンパク質で、または１つもしくは複数の標識、タグもしくはスペーサーで修飾されているか否かを判定するステップを好ましくは含む。特異的修飾は、ポアとの特異的相互作用をもたらすことになり、下で説明する方法を用いてそのような特異的相互作用を測定することができる。例えば、メチルシトシンとシトシンとを、各ヌクレオチドとのその相互作用中にポアを通って、流れる電流に基づいて区別してもよい。
【０２３６】
ポアが膜内に存在する膜／ポア系の調査に適しているいずれの装置を使用して方法を行ってもよい。膜貫通ポア検知に適しているいずれの装置を使用して方法を行ってもよい。例えば、装置は、水溶液を含むチャンバーと、該チャンバーを２区画に分ける遮断壁とを備えている。遮断壁は、ポアを含有する膜を形成する開口部を概して有する。あるいは、遮断壁は、ポアが存在する膜を形成する。
【０２３７】
国際出願番号ＰＣＴ／ＧＢ０８／０００５６２（国際公開第２００８／１０２１２０号パンフレット）に記載されている装置を使用して方法を行ってもよい。
【０２３８】
方法は、ポリヌクレオチドがポアに対して移動するときポアを通過する電流を測定するステップを含むことがある。したがって、装置は、電位を印加することができ、膜およびポアを横断する電気シグナルを測定することができる電気回路も含むことがある。方法をパッチクランプまたは電圧クランプを用いて行ってもよい。方法は、好ましくは電圧クランプの使用を含む。
【０２３９】
本発明の方法は、ポリヌクレオチドがポアに対して移動するときポアを通過する電流を測定するステップを含むことがある。膜貫通タンパク質ポアを通るイオン電流の測定に好適な条件は、当技術分野において公知であり、実施例において開示する。方法は、概して、電圧を膜およびポアを横断して印加して行われる。使用される電圧は、概して、＋５Ｖ〜−５Ｖ、例えば、＋４Ｖ〜−４Ｖ、＋３Ｖ〜−３Ｖ、または＋２Ｖ〜−２Ｖである。使用される電圧は、概して、−６００ｍＶ〜＋６００ｍＶまたは−４００ｍＶ〜＋４００ｍＶである。使用される電圧は、好ましくは、−４００ｍＶ、−３００ｍＶ、−２００ｍＶ、−１５０ｍＶ、−１００ｍＶ、−５０ｍＶ、−２０ｍＶおよび０ｍＶから選択される下限と＋１０ｍＶ、＋２０ｍＶ、＋５０ｍＶ、＋１００ｍＶ、＋１５０ｍＶ、＋２００ｍＶ、＋３００ｍＶおよび＋４００ｍＶから独立して選択される上限とを有する範囲である。使用される電圧は、より好ましくは、１００ｍＶ〜２４０ｍＶの範囲、最も好ましくは１２０ｍＶ〜２２０ｍＶの範囲である。増加した印加電位を使用することによって、ポアによる異なるヌクレオチド間の識別を増すことが可能である。
【０２４０】
方法は、金属塩、例えばアルカリ金属塩、ハロゲン化物塩、例えば塩化物塩、例えばアルカリ金属塩化物塩などの、任意の電荷担体の存在下で概して行われる。電荷担体としては、イオン性液体または有機塩、例えば塩化テトラメチルアンモニウム、塩化トリメチルフェニルアンモニウム、塩化フェニルトリメチルアンモニウムまたは塩化１−エチル−３−メチルイミダゾリウムを挙げることができる。上で論じた例示的装置において、塩は、チャンバー内の水溶液中に存在する。塩化カリウム（ＫＣｌ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化セシウム（ＣｓＣｌ）、またはフェロシアン化カリウムとフェリシアン化カリウムの混合物が概して使用される。ＫＣｌ、ＮａＣｌ、およびフェロシアン化カリウムとフェリシアン化カリウムの混合物が好ましい。電荷担体は、膜に対して非対称であることがある。例えば、電荷担体のタイプおよび／または濃度は膜の両側で異なることがある。
【０２４１】
塩濃度は、飽和時のものでありうる。塩濃度は、３Ｍ以下でありうるが、通常は０．１〜２．５Ｍ、０．３〜１．９Ｍ、０．５〜１．８Ｍ、０．７〜１．７Ｍ、０．９〜１．６Ｍ、または１Ｍ〜１．４Ｍである。塩濃度は、好ましくは、１５０ｍＭ〜１Ｍである。方法は、好ましくは、少なくとも０．３Ｍ、例えば、少なくとも０．４Ｍ、少なくとも０．５Ｍ、少なくとも０．６Ｍ、少なくとも０．８Ｍ、少なくとも１．０Ｍ、少なくとも１．５Ｍ、少なくとも２．０Ｍ、少なくとも２．５Ｍ、または少なくとも３．０Ｍの塩濃度を用いて行われる。高い塩濃度は、高いシグナル対ノイズ比をもたらし、ヌクレオチドの存在を示す電流を、正常電流変動のバックグラウンドと対照して同定することを可能にする。
【０２４２】
方法は、緩衝液の存在下で概して行われる。上で論じた例示的装置において、緩衝液は、チャンバー内の水溶液中に存在する。いずれの緩衝液を本発明の方法において使用してもよい。通常は、緩衝液はリン酸緩衝液である。他の好適な緩衝液は、ＨＥＰＥＳおよびＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液である。方法は、４．０〜１２．０、４．５〜１０．０、５．０〜９．０、５．５〜８．８、６．０〜８．７、または７．０〜８．８、または７．５〜８．５のｐＨで概して行われる。使用されるｐＨは、好ましくは約７．５である。
【０２４３】
方法は、０℃〜１００℃、１５℃〜９５℃、１６℃〜９０℃、１７℃〜８５℃、１８℃〜８０℃、１９℃〜７０℃、または２０℃〜６０℃で行われることがある。方法は、概して室温で行われる。方法は、場合により、酵素機能を支援する温度、例えば、約３７℃で行われる。
【０２４４】
送達後、方法は、好ましくは、ａ）ポリヌクレオチドがポアを通って移動し、ポリヌクレオチド結合タンパク質がポアを通るポリヌクレオチドの移動を制御するように、ポリヌクレオチドをポアおよびポリヌクレオチド結合タンパク質と相互作用させるステップと、ｂ）ポリヌクレオチドがポアに対して移動するときに、ポリヌクレオチドの１つまたは複数の特性を示す、ポアを通過する電流を測定し、それによってポリヌクレオチドを特性評価するステップとを含む。
【０２４５】
ポリヌクレオチド結合タンパク質は、ポリヌクレオチドと結合することができ、かつポアを通る、その移動を制御することができる、いずれのタンパク質であってもよい。当技術分野においてタンパク質がポリヌクレオチドと結合するか否かを判定することは容易である。タンパク質は、概して、ポリヌクレオチドと相互作用し、ポリヌクレオチドの少なくとも１つの特性を修飾する。タンパク質は、ポリヌクレオチドを切断して個々のヌクレオチドまたはより短いヌクレオチド鎖、例えばジもしくはトリヌクレオチドを形成することによって、ポリヌクレオチドを修飾することがある。その部分は、ポリヌクレオチドを配向させることによって、または特定の位置に移動させること、すなわち、その移動を制御することによって、ポリヌクレオチドを修飾することがある。
【０２４６】
ポリヌクレオチド結合タンパク質は、好ましくはポリヌクレオチドハンドリング酵素に由来する。ポリヌクレオチドハンドリング酵素は、ポリヌクレオチドと相互作用してポリヌクレオチドの少なくとも１つの特性を修飾することができるポリペプチドである。この酵素は、ポリヌクレオチドを切断して個々のヌクレオチドまたはより短いヌクレオチド鎖、例えばジもしくはトリヌクレオチドを形成することによって、ポリヌクレオチドを修飾することがある。この酵素は、ポリヌクレオチドを配向させることによって、または特定の位置に移動させることによって、ポリヌクレオチドを修飾することがある。ポリヌクレオチドハンドリング酵素は、ポリヌクレオチドに結合することができ、かつポアを通る、その移動を制御することができるのであれば、酵素活性を示す必要はない。例えば、酵素は、その酵素活性を除去するように修飾されることもあり、または酵素として作用することを妨げる条件下で使用されることもある。そのような条件は、下でより詳細に論じる。
【０２４７】
ポリヌクレオチドハンドリング酵素は、好ましくは核酸分解酵素に由来する。酵素の構築物に使用されるポリヌクレオチドハンドリング酵素は、より好ましくは、酵素分類（ＥＣ）群３．１．１１、３．１．１３、３．１．１４、３．１．１５、３．１．１６、３．１．２１、３．１．２２、３．１．２５、３．１．２６、３．１．２７、３．１．３０および３．１．３１のいずれかのメンバーに由来する。酵素は、国際出願番号ＰＣＴ／ＧＢ１０／０００１３３（国際公開第２０１０／０８６６０３号パンフレットとして公開された）に開示されているもののいずれかであってもよい。
【０２４８】
好ましい酵素は、ポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、トランスロカーゼ、およびトポイソメラーゼ、例えばジャイレースである。好適な酵素としては、大腸菌（E. coli）からのエキソヌクレアーゼＩ（配列番号１１）、大腸菌（E. coli）からのエキソヌクレアーゼＩＩＩ酵素（配列番号１３）、サーマス・サーモフィラス（T. thermophilus）からのＲｅｃＪ（配列番号１５）、およびバクテリオファージλエキソヌクレアーゼ（配列番号１７）、ＴａｔＤエキソヌクレアーゼならびにこれらの変異体が挙げられるが、それらに限定されない。配列番号１５で示される配列またはその変異体を含む３つのサブユニットは相互作用して三量体エキソヌクレアーゼを形成する。ポリメラーゼは、ＰｙｒｏＰｈａｇｅ（登録商標）３１７３  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｌｕｃｉｇｅｎ（登録商標）Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから市販されている）、ＳＤポリメラーゼ（Ｂｉｏｒｏｎ（登録商標）から市販されている）、またはそれらの変異体であることがある。酵素は、好ましくはＰｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼ（配列番号９）またはその変異体である。トポイソメラーゼは、好ましくは、部分分類（ＥＣ）群５．９９．１．２および５．９９．１．３のいずれかのメンバーである。
【０２４９】
酵素は、最も好ましくはヘリカーゼに由来する。ヘリカーゼは、Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼ、ＲｅｃＤヘリカーゼ、例えばＴｒａＩヘリカーゼもしくはＴｒｗＣヘリカーゼ、ＸＰＤヘリカーゼ、またはＤｄａヘリカーゼであってもよく、あるいはこれらのヘリカーゼに由来してもよい。ヘリカーゼは、Ｈｅｌ３０８  Ｍｂｕ（配列番号１８）、Ｈｅｌ３０８  Ｃｓｙ（配列番号１９）、Ｈｅｌ３０８  Ｔｇａ（配列番号２０）、Ｈｅｌ３０８  Ｍｈｕ（配列番号２１）、ＴｒａＩ  Ｅｃｏ（配列番号２２）、ＸＰＤ  Ｍｂｕ（配列番号２３）もしくはその変異体であってよくまたはそれらに由来しうる。
【０２５０】
ヘリカーゼは、国際出願番号ＰＣＴ／ＧＢ２０１２／０５２５７９（国際公開第２０１３／０５７４９５号パンフレットとして公開された）、ＰＣＴ／ＧＢ２０１２／０５３２７４（国際公開第２０１３／０９８５６２号パンフレットとして公開された）、ＰＣＴ／ＧＢ２０１２／０５３２７３（国際公開第２０１３０９８５６１号パンフレットとして公開された）、ＰＣＴ／ＧＢ２０１３／０５１９２５（国際公開第２０１４／０１３２６０号パンフレットとして公開された）、ＰＣＴ／ＧＢ２０１３／０５１９２４（国際公開第２０１４／０１３２５９号パンフレットとして公開された）、ＰＣＴ／ＧＢ２０１３／０５１９２８（国際公開第２０１４／０１３２６２号パンフレットとして公開された）、およびＰＣＴ／ＧＢ２０１４／０５２７３６（国際公開第２０１５／０５５９８１号パンフレットとして公開された）に開示されている、ヘリカーゼ、修飾ヘリカーゼまたはヘリカーゼ構築物のいずれであってもよい。
【０２５１】
ヘリカーゼは、配列番号２５（Ｔｒｗｃ  Ｃｂａ）で示される配列もしくはその変異体、配列番号１８（Ｈｅｌ３０８  Ｍｂｕ）で示される配列もしくはその変異体、または配列番号２４（Ｄｄａ）で示される配列もしくはその変異体を好ましくは含む。変異体は、膜貫通ポアについて下で論じる点のいずれかにおいてネイティブ配列と異なることがある。配列番号２４の好ましい変異体は、（ａ）Ｅ９４ＣおよびＡ３６０Ｃ、または（ｂ）Ｅ９４Ｃ、Ａ３６０Ｃ、Ｃ１０９ＡおよびＣ１３６Ａ、次いで場合により（ΔＭ１）Ｇ１（すなわち、Ｍ１の欠失および次いで付加Ｇ１）を含む。これは、Ｍ１Ｇと呼ばれることもある。上で論じた変異体のいずれも、Ｍ１Ｇをさらに含むことができる。
【０２５２】
任意の数のヘリカーゼを本発明に従って使用してもよい。例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上のヘリカーゼを使用してもよい。いくつかの実施形態において、異なる数のヘリカーゼを使用してもよい。
【０２５３】
本発明の方法は、好ましくは、ポリヌクレオチドを２つ以上のヘリカーゼと接触させるステップを含む。その２つ以上のヘリカーゼは、概して同じヘリカーゼである。２つ以上のヘリカーゼは、異なるヘリカーゼであってもよい。
【０２５４】
２つ以上のヘリカーゼは、上で言及したヘリカーゼの任意の組み合わせであってもよい。２つ以上のヘリカーゼは、２つ以上のＤｄａヘリカーゼであってもよい。２つ以上のヘリカーゼは、１つまたは複数のＤｄａヘリカーゼおよび１つまたは複数のＴｒｗＣヘリカーゼであってもよい。２つ以上のヘリカーゼは、同じヘリカーゼの異なる変異体であってもよい。
【０２５５】
２つ以上のヘリカーゼは、好ましくは、互いに付着されている。２つ以上のヘリカーゼは、より好ましくは、互いに共有結合で付着されている。ヘリカーゼはいずれの順序で、およびいずれの方法を用いて付着させてもよい。本発明において使用するための好ましいヘリカーゼ構築物は、国際出願番号ＰＣＴ／ＧＢ２０１３／０５１９２５（国際公開第２０１４／０１３２６０号パンフレットとして公開された）、ＰＣＴ／ＧＢ２０１３／０５１９２４（国際公開第２０１４／０１３２５９号パンフレットとして公開された）、ＰＣＴ／ＧＢ２０１３／０５１９２８（国際公開第２０１４／０１３２６２号パンフレットとして公開された）およびＰＣＴ／ＧＢ２０１４／０５２７３６に記載されている。
【０２５６】
配列番号９、１１、１３、１５、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５の変異体は、配列番号９、１１、１３、１５、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５のものとは異なるアミノ酸配列を有する酵素であって、ポリヌクレオチド結合能力を保持する酵素である。この能力は、当技術分野において公知の任意の方法を用いて測定することができる。例えば、変異体をポリヌクレオチドと接触させることができ、ポリヌクレオチドと結合するおよびポリヌクレオチドに沿って移動するその能力を測定することができる。変異体は、ポリヌクレオチドの結合を助長するならびに／または高い塩濃度および／もしくは室温でその活性を助長する修飾を含むことがある。変異体は、ポリヌクレオチドに結合する（すなわち、ポリヌクレオチド結合能力を保持する）が、ヘリカーゼとして機能しない（すなわち、移動を助長するためのすべての必要成分、例えばＡＴＰおよびＭｇ２＋が備わっているときにポリヌクレオチドに沿って移動しない）ように修飾されることがある。そのような修飾は、当技術分野において公知である。例えば、ヘリカーゼ中のＭｇ２＋結合ドメインの修飾は、ヘリカーゼとして機能しない変異体を概してもたらす。これらのタイプの変異体は、分子ブレーキとして作用することがある（以下を参照されたい）。
【０２５７】
配列番号９、１１、１３、１５、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５のアミノ酸配列の全長にわたって、変異体は、好ましくは、アミノ酸同一性に基づきその配列と少なくとも５０％相同であることになる。より好ましくは、変異体ポリペプチドは、アミノ酸同一性に基づき、配列全体にわたって配列番号９、１１、１３、１５、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５のアミノ酸配列と少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、９７％または９９％相同であることがある。２００以上、例えば２３０、２５０、２７０、２８０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１０００以上の連続するアミノ酸のストレッチにわたって、少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、９０％または９５％のアミノ酸同一性（「確かな相同性（hard homology）」）があることがある。相同性は、上で記載したように判定される。変異体は、下の配列番号２および４に関しては、上で論じた点のいずれかにおいて野生型配列とは異なることがある。酵素は、ポアに共有結合で付着されることがある。任意の方法が、酵素をポアに共有結合で付着させるために使用されることがある。
【０２５８】
好ましい分子ブレーキは、ＴｒｗＣ  Ｃｂａ−Ｑ５９４Ａ（突然変異Ｑ５９４Ａを有する配列番号２５）である。この変異体は、ヘリカーゼとして機能しない（すなわち、ポリヌクレオチドと結合するが、移動を助長するためのすべての必要成分、例えばＡＴＰおよびＭｇ２＋が備わっているときにポリヌクレオチドに沿って移動しない）。
【０２５９】
鎖シークエンシングにおいてポリヌクレオチドは、印加電位によってまたは逆らって、ポアを通って移行される。二本鎖ポリヌクレオチドにおいて漸進性または進行性に作用するエキソヌクレーゼは、残存する一本鎖を通すために印加電位下でポアのシス側で、または逆電位下でトランス側で使用することができる。同様に、二本鎖ＤＮＡを巻き戻すヘリカーゼも、同じように使用することができる。ポリメラーゼも使用することができる。印加電位に逆らった鎖移行を必要とするシークエンシング用途の可能性もあるが、ＤＮＡを逆電位または無電位下で酵素によって最初に「捕らえ」なければならない。結合後に次いで切り替えられた電位により、鎖はシスからトランスへポアを通過し、電流の流れによって延長された立体構造で保持されることになる。一本鎖ＤＮＡエキソヌクレーゼまたは一本鎖ＤＮＡ依存性ポリメラーゼは、印加電位に逆らって、制御された段階的様式でトランスからシスにポアを通って移行されたばかりの一本鎖を引き戻すための分子モーターとして作用することができる。
【０２６０】
いずれかのヘリカーゼが該方法において使用されることもある。ヘリカーゼは、ポアに対して２つのモードで機能しうる。第一に、方法は好ましくは、印加電圧から生じた場によってポリヌクレオチドをポアを通って移動させるようにヘリカーゼを使用して行われる。このモードでは、ポリヌクレオチドの５’末端がポア中で最初に捕捉され、ヘリカーゼは、ポリヌクレオチドが最終的に膜のトランス側に移行するまで場によってポアを通過するように、ポリヌクレオチドをポア中に移動させる。あるいは、方法は好ましくは、印加電圧から生じた場に逆らってヘリカーゼがポリヌクレオチドをポアを通って移動させるように行われる。このモードではポリヌクレオチドの３’末端がポア中で最初に捕捉され、ヘリカーゼは、ポリヌクレオチドが最終的に膜のシス側に押し戻されるまで印加された場に逆らってポアから引き出されるように、ポリヌクレオチドをポアを通って移動させる。
【０２６１】
方法は、反対方向で行われることもある。ポリヌクレオチドの３’末端は、ポア中で最初に捕捉されてもよく、ヘリカーゼは、ポリヌクレオチドが最終的に膜のトランス側に移行するまで場によってポアを通過するように、ポリヌクレオチドをポア中に移動させてもよい。
【０２６２】
ヘリカーゼに助長するための必要成分が備わっていない場合、またはヘリカーゼが、移動を妨害もしくは防止するように修飾されている場合、ヘリカーゼはポリヌクレオチドと結合し、印加された場によってポリヌクレオチドがポア中に引き入れられるときにポリヌクレオチドの移動を遅速させるブレーキとして作用することができる。不活性モードでは、ポリヌクレオチドが３’または５’下流のいずれで捕捉されるかは問題にならず、ブレーキとして作用する酵素によってポリヌクレオチドをトランス側へポアに引き入れる印加された場が問題になる。不活性モードの場合、ヘリカーゼによるポリヌクレオチドの移動制御は、漸減、スライドおよび制動をはじめとするいくつかの方法で説明することができる。ヘリカーゼ活性を欠くヘリカーゼ変異体も、このようにして使用することができる。
【０２６３】
ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド結合タンパク質およびポアとはいずれの順序でも接触することができる。ポリヌクレオチドをヘリカーゼなどのポリヌクレオチド結合タンパク質、およびポアと接触させるとき、ポリヌクレオチドは、先ずタンパク質と複合体を形成することが好ましい。電圧がポアを横断して印加される場合、ポリヌクレオチド／タンパク質複合体は、次いで、ポアと複合体を形成し、ポアを通るポリヌクレオチドの移動を制御する。
【０２６４】
ポリヌクレオチド結合タンパク質を使用する方法におけるいずれのステップも、遊離ヌクレオチドまたは遊離ヌクレオチド類似体と、ポリヌクレオチド結合タンパク質の作用を助長する酵素補因子との存在下で、概して行われる。遊離ヌクレオチドは、上で論じた個々のヌクレオチドのいずれか１つまたは複数であってもよい。遊離ヌクレオチドとしては、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、グアノシン一リン酸（ＧＭＰ）、グアノシン二リン酸（ＧＤＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、チミジン一リン酸（ＴＭＰ）、チミジン二リン酸（ＴＤＰ）、チミジン三リン酸（ＴＴＰ）、ウリジン一リン酸（ＵＭＰ）、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）、ウリジン三リン酸（ＵＴＰ）、シチジン一リン酸（ＣＭＰ）、シチジン二リン酸（ＣＤＰ）、シチジン三リン酸（ＣＴＰ）、環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）、環状グアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）、デオキシアデノシン一リン酸（ｄＡＭＰ）、デオキシアデノシン二リン酸（ｄＡＤＰ）、デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシグアノシン一リン酸（ｄＧＭＰ）、デオキシグアノシン二リン酸（ｄＧＤＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、デオキシチミジン一リン酸（ｄＴＭＰ）、デオキシチミジン二リン酸（ｄＴＤＰ）、デオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）、デオキシウリジン一リン酸（ｄＵＭＰ）、デオキシウリジン二リン酸（ｄＵＤＰ）、デオキシウリジン三リン酸（ｄＵＴＰ）、デオキシシチジン一リン酸（ｄＣＭＰ）、デオキシシチジン二リン酸（ｄＣＤＰ）およびデオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）が挙げられるが、これらに限定されない。遊離ヌクレオチドは、好ましくは、ＡＭＰ、ＴＭＰ、ＧＭＰ、ＣＭＰ、ＵＭＰ、ｄＡＭＰ、ｄＴＭＰ、ｄＧＭＰまたはｄＣＭＰから選択される。遊離ヌクレオチドは、好ましくはアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）である。酵素補因子は、構築物を機能させる因子である。酵素補因子は、好ましくは二価金属カチオンである。二価金属カチオンは、好ましくは、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃａ２＋またはＣｏ２＋である。酵素補因子は、最も好ましくはＭｇ２＋である。
【０２６５】
ヘリカーゼおよび分子ブレーキ
好ましい実施形態において、方法は、
（ａ）ポリヌクレオチド分析物に１つまたは複数のヘリカーゼおよび１つまたは複数の分子ブレーキを付着させた、微粒子に付着しているポリヌクレオチド分析物を用意するステップと、
（ｂ）微粒子を膜へ送達し、それによってポリヌクレオチドを膜貫通ポアに送達するステップと、
（ｃ）１つまたは複数のヘリカーゼと１つまたは複数の分子ブレーキを一緒にし、両方がポアを通るポリヌクレオチドの移動を制御するように、ポアを横断して電位を印加するステップと、
（ｄ）ポリヌクレオチドがポアに対して移動するときに、ポリヌクレオチドの１つまたは複数の特性を示す１つまたは複数の測定値を取り、それによってポリヌクレオチドを特性評価するステップと
を含む。
【０２６６】
このタイプの方法は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１４／０５２７３７号明細書に詳細に論じられている。
【０２６７】
１つまたは複数のヘリカーゼは、上で論じたもののいずれであってもよい。１つまたは複数の分子ブレーキは、ポリヌクレオチドと結合してそのポリヌクレオチドのポアを通る、移動を遅速させるいずれの化合物または分子であってもよい。１つまたは複数の分子ブレーキは、ポリヌクレオチドと結合する１つまたは複数の化合物を好ましくは含む。１つまたは複数の化合物は、好ましくは、１つまたは複数の大環状分子である。好適な大環状分子としては、シクロデキストリン、カリックスアレーン、環状ペプチド、クラウンエーテル、ククルビツリル、ピラーアレーン、これらの誘導体またはそれら組み合わせが挙げられるが、それらに限定されない。シクロデキストリンまたはその誘導体は、Eliseev, A. V., and Schneider, H-J. (1994) J. Am. Chem.Soc.116, 6081-6088に開示されているもののいずれであってもよい。この作用物質は、より好ましくは、ヘプタキス−６−アミノ−β−シクロデキストリン（ａｍ７−βＣＤ）、６−モノデオキシ−６−モノアミノ−β−シクロデキストリン（ａｍ１−βＣＤ）またはヘプタキス−（６−デオキシ−６−グアニジノ）−シクロデキストリン（ｇｕ７−βＣＤ）である。
【０２６８】
ポリヌクレオチド分析物中のスペーサー
１つまたは複数のヘリカーゼは、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１４／０５０１７５号明細書において論じされているように、１つまたは複数のスペーサーで停止させてもよい。国際出願に開示されている１つまたは複数のヘリカーゼおよび１つまたは複数のスペーサーのいずれの配置を本発明において使用してもよい。
【０２６９】
二本鎖ポリヌクレオチド
ポリヌクレオチド分析物が二本鎖である場合、方法は、好ましくは、ポリヌクレオチドの一方の末端にヘアピンアダプターを有するポリヌクレオチドを用意するステップと、ポリヌクレオチドの二本鎖を分離して一本鎖ポリヌクレオチド構築物を形成するステップとをさらに含む。次いで、一本鎖ポリヌクレオチド構築物を本発明に従って、ポアと接触させてもよい。このようにして二本鎖構築物上の両方の鎖を連結し、調べることにより、特性評価の効率および精度が増す。
【０２７０】
好適なヘアピンアダプターは当技術分野において公知の方法を用いて設計することができる。ヘアピンループは、いずれの長さであってもよい。ヘアピンループは、概して１１０ヌクレオチド以下、例えば、１００ヌクレオチド以下、９０ヌクレオチド以下、８０ヌクレオチド以下、７０ヌクレオチド以下、６０ヌクレオチド以下、５０ヌクレオチド以下、４０ヌクレオチド以下、３０ヌクレオチド以下、２０ヌクレオチド以下、または１０ヌクレオチド以下の長さである。ヘアピンループは、好ましくは、約１〜１１０、２〜１００、５〜８０、または６〜５０ヌクレオチドの長さである。ループがアダプターの差次的選択性に関与する場合、５０〜１１０ヌクレオチドなどの、より長いヘアピンループ長が好ましい。同様に、ループが、下で論じるような選択可能結合に関与しない場合、１〜５ヌクレオチドなどの、より短いヘアピンループ長が好ましい。
【０２７１】
ヘアピンアダプターは、ポリヌクレオチドのいずれかの末端、すなわち、５’または３’末端に提供されることがある。ヘアピンアダプターは、当技術分野において公知の任意の方法を用いてポリヌクレオチドにライゲートされることがある。ヘアピンアダプターは、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、大腸菌（E. coli）ＤＮＡリガーゼ、Ｔａｑ  ＤＮＡリガーゼ、Ｔｍａ  ＤＮＡリガーゼおよび９ｏＮ  ＤＮＡリガーゼなどのリガーゼを使用してライゲートされることがある。
【０２７２】
当技術分野において公知のいずれの方法を用いてポリヌクレオチドの２本の鎖を分離してもよい。例えば、ポリヌクレオチド結合タンパク質によって、または脱ハイブリダイゼーションに有利に働く条件を用いて、それらの鎖を分離してもよい（脱ハイブリダイゼーションに有利に働く条件の例としては、高温、高ｐＨ、ならびに水素結合または塩基対合を破壊することができる作用物質、例えばホルムアミドおよび尿素の添加が挙げられるが、これらに限定されない）。
【０２７３】
ヘアピンアダプターは、選択可能結合部分を好ましくは含む。これによって、ポリヌクレオチドを精製または単離することが可能になる。選択可能結合部分は、その結合特性に基づいて選択することができる部分である。したがって、選択可能結合部分は、好ましくは、表面と特異的に結合する部分である。選択可能結合部分は、本発明において使用される任意の他の部分よりはるかに大きい程度に表面と結合する場合、その表面に特異的に結合する。好ましい実施形態において、部分は、本発明で使用される他の部分が結合しない表面と結合する。
【０２７４】
好適な選択的結合部分は、当技術分野において公知である。好ましい選択的結合部分としては、ビオチン、ポリヌクレオチド配列、抗体、抗体断片、例えばＦａｂおよびＳｃＳｖ、抗原、ポリヌクレオチド結合タンパク質、ポリヒスチジンテールおよびＧＳＴタグが挙げられるが、これらに限定されない。最も好ましい選択的結合部分は、ビオチンおよび選択可能ポリヌクレオチド配列である。ビオチンは、アビジンで被覆された表面と特異的に結合する。選択可能ポリヌクレオチド配列は、相同配列で被覆された表面と特異的に結合（すなわちハイブリダイズ）する。あるいは、選択可能ポリヌクレオチド配列は、ポリヌクレオチド結合タンパク質で被覆された表面と特異的に結合する。
【０２７５】
ヘアピンアダプターおよび／または選択可能結合部分は、切る、切れ目を入れる、切断するまたは加水分解することができる領域を含みうる。そのような領域は、ポリヌクレオチドを該ポリヌクレオチドが結合している表面から精製または単離後に除去することを可能にするように設計することができる。好適な領域は、当技術分野において公知である。好適な領域としては、ＲＮＡ領域、デスチオビオチンおよびストレプトアビジンを含む領域、ジスルフィド結合ならびに光切断性領域が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２７６】
リーダー配列
ポリヌクレオチド分析物に、ポアを優先的に通り抜けるリーダー配列を備えさせてもよい。リーダー配列は、本発明の方法を助長する。リーダー配列は、膜貫通ポアを優先的に通り抜けるように、およびそれによってポリヌクレオチド分析物のポアを通る、移動を助長するように設計される。リーダー配列を使用して、ポリヌクレオチドを上で論じたような１つまたは複数のアンカーに連結させることもできる。
【０２７７】
リーダー配列は、重合体を概して含む。重合体は、好ましくは負電荷を有する。重合体は、好ましくは、ポリヌクレオチド、例えばＤＮＡもしくはＲＮＡ、修飾ポリヌクレオチド（例えば脱塩基ＤＮＡ）、ＰＮＡ、ＬＮＡ、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリペプチドである。リーダーは、好ましくはポリヌクレオチドを含み、より好ましくは一本鎖ポリヌクレオチドを含む。リーダー配列は、上で論じたポリヌクレオチドのいずれかを含むことができる。一本鎖リーダー配列は、最も好ましくは、ＤＮＡの１本の鎖、例えば、ポリｄＴセクションを含む。リーダー配列は、好ましくは１つまたは複数のスペーサーを含む。
【０２７８】
リーダー配列は、任意の長さでありうるが、概して１０〜１５０ヌクレオチドの長さ、例えば２０〜１５０ヌクレオチドの長さである。リーダーの長さは、方法に使用される膜貫通ポアに概して依存する。
【０２７９】
二重カップリング
本発明の方法は、二本鎖ポリヌクレオチドの二重カップリングを含むことがある。方法は、好ましくは、
（ａ）ポリヌクレオチドが、一方の末端にＹアダプターおよび他方の末端にヘアピンループアダプターを有し、Ｙアダプターが、ポリヌクレオチドを膜とカップリングするための１つまたは複数の第一のアンカーを含み、ヘアピンループアダプターがポリヌクレオチドを膜とカップリングするための１つまたは複数の第二のアンカーを含み、ならびにヘアピンループアダプターの膜とのカップリング強度が、Ｙアダプターの膜とのカップリング強度より大きい、微粒子に付着している二本鎖ポリヌクレオチドを用意するステップと、
（ｂ）微粒子を膜へ送達し、それによってポリヌクレオチドを膜貫通ポアに送達するステップと、
（ｃ）ポリヌクレオチドの少なくとも一方の鎖がポアを通って移動するように、ポリヌクレオチドをポアと相互作用させるステップと、
（ｄ）ポリヌクレオチドの少なくとも一方の鎖がポアに対して移動するときに、ポリヌクレオチドの少なくとも一方の鎖の１つまたは複数の特性を示す１つまたは複数の測定値を取り、それによってポリヌクレオチドを特性評価するステップと
を含む。好ましい実施形態において、ポリヌクレオチドの両方の鎖がポアを通って移動する。
【０２８０】
このタイプの方法は、国際出願番号ＰＣＴ／ＧＢ２０１５／０５０９９１において詳細に論じられている。
【０２８１】
二本鎖ポリヌクレオチドは、一方の末端にＹアダプターおよび他方の末端にヘアピンループアダプターが備わっている。Ｙアダプターおよび／またはヘアピンアダプターは、概してポリヌクレオチドアダプターである。それらのアダプターを上で論じたポリヌクレオチドのいずれから形成してもよい。
【０２８２】
Ｙアダプターは、概して、（ａ）二本鎖領域および他方の末端に（ｂ）一本鎖領域または相補的でない領域を含む。Ｙアダプターは、一本鎖領域を含む場合、オーバーハングを有すると記述されることがある。Ｙアダプター内の非相補領域の存在はこのアダプターをＹ形にする。２本の鎖が、通常、二本鎖部分とは異なり互いにハイブリダイズしないからである。Ｙアダプターは、１つまたは複数の第一のアンカーを含む。アンカーは、上でより詳細に論じている。
【０２８３】
Ｙアダプターは、ポアを優先的に通り抜けるリーダー配列を好ましくは含む。リーダー配列は、上で論じている。
【０２８４】
ヘアピンアダプターは、上で論じたような選択可能結合部分を好ましくは含む。ヘアピンアダプターおよび／または選択可能結合部分は、上で論じたような、切る、切り目を入れる、切断するまたは加水分解することができる領域を含むことがある。
【０２８５】
当技術分野において公知のいずれの方法を用いてＹアダプターおよび／またはヘアピンアダプターをポリヌクレオチドにライゲートしてもよい。リガーゼ、例えば、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、大腸菌（E. coli）ＤＮＡリガーゼ、Ｔａｑ  ＤＮＡリガーゼ、Ｔｍａ  ＤＮＡリガーゼおよび９ＯＮ  ＤＮＡリガーゼを使用して、アダプターの一方または両方をライゲートしてもよい。あるいは、アダプターは、下で論じる本発明の方法を用いてポリヌクレオチドに付加することができる。
【０２８６】
好ましい実施形態において、方法は、二本鎖ポリヌクレオチドが一方の末端にＹアダプターおよび他方の末端にヘアピンループアダプターを含むように、二本鎖ポリヌクレオチドを修飾するステップを含む。いずれの様式の修飾も使用することができる。方法は、好ましくは、本発明に従って二本鎖ポリヌクレオチドを修飾するステップを含む。このことは、下でより詳細に論じる。修飾および特性評価の方法は、任意の方法で組み合わせることができる。
【０２８７】
ヘアピンアダプターの膜とのカップリング（または結合）強度は、Ｙアダプターの膜とのカップリング（または結合）強度より大きい。この強度は任意の方法で測定することができる。カップリング（または結合）強度を測定する好適な方法は、英国出願第１４０６１４７．７号および１４０７８１．８号の実施例に開示されている。
【０２８８】
ヘアピンループアダプターのカップリング（または結合）強度は、好ましくは、ヘアピンループアダプターのカップリング（または結合）強度の少なくとも１．５倍、例えば、アンカーアダプターのカップリング（または結合）強度の少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５、または少なくとも１０倍である。膜に対するヘアピンループアダプターの親和定数（Ｋｄ）は、好ましくは、Ｙアダプターの親和定数の少なくとも１．５倍、例えば、Ｙアダプターのカップリング強度の少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５、または少なくとも１０倍である。
【０２８９】
ヘアピンループアダプターがＹアダプターより強く膜とカップリング（または結合）する方法はいくつかある。例えば、ヘアピンループアダプターは、Ｙアダプターより多くのアンカーを含むことがある。例えば、ヘアピンループアダプターは、２個、３個以上の第二のアンカーを含むことがあり、これに対してＹアダプターは、１個の第一のアンカーを含むことがある。
【０２９０】
１つまたは複数の第二のアンカーの膜とのカップリング（または結合）強度は、１つまたは複数の第一のアンカーの膜とのカップリング（または結合）強度より大きいことがある。１つまたは複数の第二のアンカーのヘアピンループアダプターとのカップリング（または結合）強度は、１つまたは複数の第一のアンカーのＹアダプターとのカップリング（または結合）強度より大きいことがある。１つまたは複数の第一のアンカーおよび１つまたは複数の第二のアンカーは、それらのそれぞれのアダプターにハイブリダイゼーションによって付着されることがあり、このハイブリダイゼーション強度は、１つまたは複数の第一のアンカーにおけるより１つまたは複数の第二のアンカーにおけるほうが大きい。これらの実施形態のいずれの組み合わせを本発明において使用してもよい。当技術分野における公知の技法を用いてカップリング（または結合）強度を測定してもよい。
【０２９１】
１つまたは複数の第二のアンカーは、膜とカップリング（または結合）する１つまたは複数の第一のアンカー中の１つまたは複数の基より大きい強度で膜とカップリング（または結合）する１つまたは複数の基を好ましくは含む。好ましい実施形態において、ヘアピンループアダプター／１つまたは複数の第二のアンカーは、コレステロールを使用して膜とカップリング（または結合）し、Ｙアダプター／１つまたは複数の第一のアンカーは、パルミチン酸エステルを使用して膜とカップリング（または結合）する。コレステロールは、パルミチン酸エステルより強くトリブロック共重合体膜および脂質膜と結合する。代替実施形態において、ヘアピンループアダプター／１つまたは複数の第二のアンカーは、パルミチン酸エステルなどのモノアシル種を使用して膜とカップリング（または結合）し、Ｙアダプター／１つまたは複数の第一のアンカーは、ジパルミトイルホスファチジルコリンなどのジアシル種を使用して膜とカップリング（または結合）する。
【０２９２】
ヘアピンループおよびリーダー配列の付加
二本鎖ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドをＭｕＡトランスポサーゼおよび二本鎖ＭｕＡ基質の集団と接触させることによって、Ｙアダプターおよびヘアピンアダプターを備えさせてもよく、集団中の基質の比率はリーダー配列を含むＹアダプターであり、集団中の基質の比率はヘアピンループアダプターである。トランスポサーゼは、二本鎖ポリヌクレオチド分析物を断片化し、ＭｕＡ基質をそれらの断片の一方または両方の末端にライゲートする。これは、リーダー配列を一方の末端に含み、ヘアピンループを他方に含む、複数の修飾二本鎖ポリヌクレオチドを生成する。次いで、本発明の方法を用いてそれらの修飾二本鎖ポリヌクレオチドを調査してもよい。
【０２９３】
これらのＭｕＡベースの方法は、（国際公開第２０１５／０２２５４４号パンフレット）として公開されたＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＧＢ２０１４／０５２５０５に開示されている。それらは、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＧＢ２０１５／０５０９９１においても詳細に論じられている。
【０２９４】
修飾ポリヌクレオチド分析物
本発明に従って送達および特性評価する前に、ポリメラーゼが、ポリヌクレオチド分析物をテンプレートとして使用して修飾ポリヌクレオチド分析物を形成する条件下で、ポリヌクレオチド分析物は、ポリヌクレオチド分析物をポリメラーゼおよび遊離ヌクレオチドの集団と接触させることによって修飾されることがあり、ポリメラーゼは、修飾ポリヌクレオチド分析物を形成するときに、ポリヌクレオチド分析物中のヌクレオチド種の１つまたは複数を異なるヌクレオチド種と置き換える。次いで、修飾ポリヌクレオチド分析物は、微粒子に付着され、膜へ送達されてもよい。このタイプの修飾は、国際出願番号ＰＣＴ／ＧＢ２０１５／０５０４８３に記載されている。上で論じたポリメラーゼのいずれかを使用してもよい。ポリメラーゼは、好ましくは、クレノウまたは９〇Ｎｏｒｔｈである。
【０２９５】
他の特性評価方法
別の実施形態において、膜貫通ポアに送達後、ポリヌクレオチド分析物は、ポリメラーゼがヌクレオチドをポリヌクレオチドに組み込むときに放出される標識種を検出することによって特性評価される。ポリメラーゼは、ポリヌクレオチド分析物をテンプレートとして使用する。各標識種は、各ヌクレオチドに対して特異的である。ポリヌクレオチド分析物は、膜貫通ポアに送達され、次いで、ヌクレオチドがポリメラーゼによってポリヌクレオチドに付加されるときにリン酸標識種が連続的に放出されるように、ポリメラーゼおよび標識されたヌクレオチドと接触させる。リン酸種は、各ヌクレオチドに特異的な標識を含有する。ポリメラーゼは、上で論じたもののいずれであってもよい。リン酸標識種はポアを使用し、それによってポリヌクレオチド分析物を特性評価する。このタイプの方法は、欧州出願番号１３１８７１４９．３（欧州特許出願公開第ＥＰ  ２６８２４６０号明細書として公開された）に開示されている。上で論じた実施形態のいずれも、この方法に同等に当てはまる。
【０２９６】
キット
本発明は、分析物を膜中の膜貫通ポアに送達するためのキットであって、（ａ）微粒子と、（ｂ）分析物を膜とカップリングすることができる１つまたは複数のアンカーとを含むキットも提供する。微粒子および１つまたは複数のアンカーは、本発明の方法に関して上で論じたもののいずれであってもよい。キットがポリヌクレオチドをポアに送達するためのものである場合、微粒子は、好ましくは、ポリヌクレオチドを抽出および／または精製するためのキットの一部である。
【０２９７】
キットは、好ましくは、膜貫通ポアを優先的に通り抜けるようことができるヘアピンループおよび／またはリーダー配列をさらに含む。キットはＹアダプターを含むことがある。キットは、好ましくは、ポリヌクレオチド結合タンパク質をさらに含む。好ましいヘアピンループ、リーダー配列、Ｙアダプターおよびポリヌクレオチド結合タンパク質は、上で論じている。
【０２９８】
発明の方法に関して上で論じた実施形態のいずれも、キットに同等に当てはまる。キットは、膜の成分、例えば、両親媒性層またはトリブロック共重合体膜の成分をさらに含むことがある。キットは、膜貫通タンパク質ポアをさらに含むことがある。
【０２９９】
本発明のキットは、上述の実施形態のいずれかを実施できるようにする１つまたは複数の他の試薬または器具をさらに含むことがある。キットは、磁石または電磁石を含むことがある。そのような試薬または器具としては、次のものの１つまたは複数が挙げられる：好適な緩衝液（水溶液）、対象から試料を得るための手段（例えば、容器、もしくは針を備えている器具）、ポリヌクレオチドを増幅および／もしくは発現させるための手段、上で定義した通りの膜、または電圧もしくはパッチクランプ装置。試薬は、流体試料が該試薬を再懸濁するように、乾燥状態でキット内に存在することがある。キットは、場合により、キットを本発明の方法で使用できるようにする説明書、またはその方法をどの生物に使用してもよいのかに関する詳説も含むことがある。
【０３００】
以下の実施例は、本発明を例証するものである。
実施例
【実施例１】
【０３０１】
この例は、ＤＮＡと結合されたヘリカーゼをｈｉｓ−ｔａｇ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｕｌｌｄｏｗｎ  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に付着させ、次いでビーズをナノポア系に添加して、ヘリカーゼによって制御されるＤＮＡの移動を検出するための試料調製手順を説明するものである。図１は、ＤＮＡをどのようにビーズに付着させたかの略画表現を示す。ＤＮＡは、アンカーを付着させたＤＮＡ鎖にもハイブリダイズした（アンカーを有する１個のＤＮＡをＹアダプターにハイブリダイズし、アンカーを有する第二のＤＮＡをヘアピンアダプターにハイブリダイズした（図１を参照されたい））。これは、ＤＮＡを膜中のナノポアに送達するのを支援した。ＤＮＡをナノポアに送達するためにビーズを使用した実験は、同じ濃度のＤＮＡをナノポア系に添加した対照と比較して、濃度の増大をもたらすことが観察された。
【０３０２】
材料および方法
１．１  Ｈｉｓ−ｔａｇ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｌｌｄｏｗｎ  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）の洗浄処理
溶液全体にわたってＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）を十分に再懸濁させるために、ｈｉｓ−ｔａｇ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｕｌｌｄｏｗｎ  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）を含有するストック試料をボルテックスした。ビーズ溶液試料（１０μＬ）をストック溶液から除去し、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌｏｗ−Ｂｉｎｄチューブ（１．５ｍＬ）に添加した。チューブを磁気ラックに入れ、ビーズのすべてが磁石にくっついたら上清を除去した。緩衝液を磁性ビーズ試料（５００μＬの５００ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ８．０、２５ｍＭリン酸カリウム緩衝液）に添加し、ボルテックスすることによりビーズを再懸濁させた。次いで、チューブを磁気ラックに置き、ビーズが磁石にくっついたら上清を除去した。緩衝液洗浄および上清除去ステップをさらに２回繰り返し、その結果、ビーズは緩衝液（５００ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ８．０、２５ｍＭリン酸カリウム緩衝液）を使用して合計３回洗浄した。次いで、ビーズを（１０μＬの５００ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ８．０、および２５ｍＭリン酸カリウム緩衝液）に再懸濁させた。これを、別名、洗浄ビーズストック溶液とした。溶液全体にわたってＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）を十分に再懸濁させるために、使用前にビーズストック溶液をボルテックスした。
【０３０３】
１．２  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）へのＤＮＡ（ヘリカーゼが事前結合している）の付着
ＤＮＡライブラリー（断片化し、次いでＹアダプター（ヘリカーゼがリーダーに付着した）およびヘアピンアダプター（異なるｈｉｓタグ付けヘリカーゼがヘアピンに付着した）に付着させ、最後に、アンカーが付着したＤＮＡの二本鎖にハイブリダイズした二本鎖ラムダＤＮＡを含有する（図１を参照されたい））を洗浄Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）に添加し（下の表５を参照されたい）、試料を室温で少なくとも１時間インキュベートした。この試料を、別名ＤＮＡ／ビーズ試料２とした。
【０３０４】
【表２】
0006721581.tif 000003
【０３０５】
１．３  電気生理学
実験を始める前に、ＤＮＡ／ビーズ試料２（０．５２μＬ）を緩衝液（１４５．５μＬ、２５ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ８．０、５００ｍＭ  ＫＣｌ）および燃料ミックス（４μＬのＭｇＣｌ２（７５ｍＭ）およびＡＴＰ（７５ｍＭ））に添加した。
【０３０６】
緩衝液（２５ｍＭリン酸カリウム緩衝液、１５０ｍＭフェロシアン化カリウム（ＩＩ）、および１５０ｍＭフェリシアン化カリウム（ＩＩＩ）、ｐＨ８．０）中のブロック共重合体に挿入された単一ＭｓｐＡナノポアから電気的測定値を得た。ブロック共重合体に挿入された単一ポアを得た後に、次いで緩衝液（２ｍＬ、２５ｍＭリン酸カリウム緩衝液、１５０ｍＭフェロシアン化カリウム（ＩＩ）、１５０ｍＭフェリシアン化カリウム（ＩＩＩ）、ｐＨ８．０）をその系に流して一切の過剰ＭｓｐＡナノポアを除去した。
【０３０７】
過剰な緩衝液（５００ｍＭ  ＫＣｌ、２５ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ８．０）を、試料を添加する前にナノポア系に流した。ＤＮＡ／ビーズ試料２および燃料プレミックス（合計１５５μＬ）を、次いでその単一ナノポア実験系に流した。実験を−１２０ｍＶで実行し、ヘリカーゼによって制御されるＤＮＡの移動をモニターした。
【０３０８】
上で記載したように、同じ濃度のＤＮＡライブラリー（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）と結合されていない）をナノポア系に添加し、ヘリカーゼによって制御されるＤＮＡの移動をモニターした類似の対照実験も行った。
【０３０９】
結果
対照反応（ＤＮＡがビーズと結合されなかった）およびＤＮＡ／ビーズ試料２の両方について、ヘリカーゼによって制御されるＤＮＡの移動が観察された。図２は、７つの異なるナノポア実験を示す（１〜３はビーズなしの対照反応であり、４〜７はＤＮＡ／ビーズ試料２であった）。対照実験が２つのアンカーを有するＤＮＡを使用した一方、ビーズ実験は、ナノポアへのＤＮＡの送達を助けるためにビーズおよび２つのアンカーの両方を使用した。図２に示されているスループット値は、試験した泳動（泳動４）で観察された最大スループットと比べて正規化した。ビーズと結合されなかったＤＮＡライブラリーは、３つの実験すべてにおいて約１５の正規化スループット値を観察した。一方、ＤＮＡ／ビーズ試料２は、約９０の正規化スループット値をもたらした。したがって、ＤＮＡライブラリーをＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）とプレインキュベートした場合、正規化スループットの大幅な増加が観察された。これは、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）がナノポア系へのＤＮＡの直接送達を支援し、対照と比較して濃度の増大をもたらすことを意味した。
【実施例２】
【０３１０】
この例は、ＭｓｐＡナノポアが存在する膜にＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）がＤＮＡを直接送達することをどのように観察したかを示すナノポアチップアレイの画像の撮影の仕方を説明するものである。系を経時的に撮影した画像は、ビーズがナノポアが挿入された膜表面に集中することが観察されたことを示した。
【０３１１】
材料および方法
２．１  ＤＮＡが付着したＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）の調製
Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）を実施例１．１に記載されているように洗浄し、ＤＮＡを実施例１．２に記載されているようにビーズに付着させた。
【０３１２】
２．２  チップの撮像
対物レンズが２０×の顕微鏡を使用して、ナノポアチップ系の一連の明視野画像を捕捉した。
【０３１３】
結果
図３および４は、ナノポアチップ系を撮影した２つの明視野画像を示す。図３は、ＤＮＡ／ビーズ試料を添加した直後のチップを示す。ナノポア挿入用の膜が位置するチップウェルの上にわずかな小さな黒いビーズが見えた（ビーズのいくつかが図では黒い矢印で強調されている）。図４は、ＤＮＡ／ビーズ試料を添加した２０分後のナノポアチップ系の同じ領域を示す。ビーズの大きなクラスターが、ナノポア挿入用の膜が位置するチップウェルの上で観察された（これらのビーズクラスターのいくつかが、図ではクラスターの周りの白い破線の円によって強調されている）。図８Ａは、ビーズがどのように膜に集中しえたかの略画表現を示す。したがって、ビーズがＤＮＡ試料をナノポア付近に送達しながら各膜の中心に局在していることは、チップを撮影した画像から明らかであった。
【実施例３】
【０３１４】
この例は、ナノポアチップアレイ実験で形成された膜の安定性にどう影響を及ぼすかを見るために、異なるタイプのビーズをどのように試験したかを説明するものである。試験したビーズはいずれも膜に著しい損傷をもたらさなかった。したがって、これらのビーズは、ナノポア系へのＤＮＡの送達の増大に使用されうる。
【０３１５】
材料および方法
２．１  様々な表面被覆によるＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）の調製
次の官能化（１−シラン、２−ストレプトアビジン、３−短いビオチン化ＤＮＡ鎖と結合したストレプトアビジン、４−コバルトベースのＨｉｓ−ｔａｇ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｕｌｌｄｏｗｎ））を有するＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）を試験して、それらが膜にどんな影響を与えたかを判定した。Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）は異なる保存液中に提供された。ストックバイアルを１０秒間ボルテックスし、次いで保存液中のビーズ試料（３０μＬ）をエッペンドルフに添加した。エッペンドルフを磁石の隣りに置き、次いで上清を除去ことによってビーズを保存液から分離した。緩衝液（５００μＬ、２５ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ８．０、５００ｍＭ  ＫＣｌ）を次いでチューブに添加し、試料を１０秒間ボルテックスした。次いで、緩衝液およびビーズを分離し、洗浄緩衝液を捨てた。次いで、ビーズを緩衝液（３０μＬ、２５ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ８．０、５００ｍＭ  ＫＣｌ）に再懸濁させ、次いでビーズを希釈した（４μＬストックビーズを、ランダム配列ＤＮＡの短い鎖も含有する１５０μＬの緩衝液（２５ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ８．０、５００ｍＭ  ＫＣｌ）に）。
【０３１６】
２．２  膜の安定性を判定するための電気的試験
ブロック共重合体が膜を形成するいくつかのウェル、および緩衝液（２５ｍＭリン酸カリウム緩衝液、１５０ｍＭフェロシアン化カリウム（ＩＩ）、および１５０ｍＭフェリシアン化カリウム（ＩＩＩ）、ｐＨ８．０）中の膜に挿入された個々のＭｓｐＡナノポアを有するアレイチップで、電気的測定値を得た。ブロック共重合体に単一ポアを得た後、次いで緩衝液（３ｍＬ、２５ｍＭリン酸カリウム緩衝液、１５０ｍＭフェロシアン化カリウム（ＩＩ）、１５０ｍＭフェリシアン化カリウム（ＩＩＩ）、ｐＨ８．０）をその系に流して一切の過剰ＭｓｐＡナノポアを除去した。ビーズ溶液の添加前に、緩衝液（３ｍＬ、２５ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ８．０、５００ｍＭ  ＫＣｌ）を系に流し、次いで１８０ｍＶの電位を印加し、系（ビーズの添加前の）をモニターした。次いで、緩衝液（ランダム配列ＤＮＡの短い鎖と混合した）中の種々のＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）試料を、単一ナノポア実験チップ系に流し、１８０ｍＶの電位を印加した。鎖がナノポアを通って移行しながら特徴的な電流シグナルを生成したときに、単一ＭｓｐＡナノポアの同定を支援するために、ランダムＤＮＡ配列の短い鎖を添加した。
【０３１７】
結果
飽和し使用することができない個々のチャネル数を、ビーズを添加する前後にカウントした。図５の点Ｘは、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）を種々のＤｙｎａｂｅａｄ官能化（１＊＝シラン、２＊＝ストレプトアビジンおよび３＊＝短いビオチン化ＤＮＡ鎖と結合したストレプトアビジン）のために添加する前の飽和チャネル数を示す。図５の点Ｙは、種々のＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）（１＝シラン、２＝ストレプトアビジンおよび３＝短いビオチン化ＤＮＡ鎖と結合したストレプトアビジン）を添加した後の飽和チャネル数を示す。飽和チャネル数の比較的わずかな増加が、ストレプトアビジン官能化ビーズおよびビオチン化ＤＮＡの短い鎖と結合したストレプトアビジン官能化ビーズについて観察された。しかし、ビーズをシランで被覆した場合、飽和チャネル数のやや大きな増加が観察された。
【０３１８】
図６は、もはや活性でなかった単一チャネルＭｓｐＡナノポアのパーセンテージ、およびビーズ（１−シラン、２−ストレプトアビジン、３−短いビオチン化ＤＮＡ鎖を有するストレプトアビジン、４−コバルトベースのｈｉｓ−ｔａｇ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｕｌｌｄｏｗｎ）をナノポア系に添加したときに飽和したチャネルのパーセンテージを示す。種々の被覆ビーズのすべてが、シランを除いて、ＭｓｐＡナノポアの２０％未満の喪失（もはや活性なナノポアでない）および１０％未満のチャネル飽和をもたらした。シランは、ＭｓｐＡナノポアの５０％未満の喪失、および３０％前後のチャネル飽和をもたらした。ビーズを添加した後に飽和したチャネルのパーセンテージが、もはや活性でないＭｓｐＡナノポアのパーセンテージより低かったことから、ＭｓｐＡナノポアの低減が膜破裂のみによるものであったとは考えにくかった。
【０３１９】
図７は、オープンポア電流がストレプトアビジン被覆ビーズの添加によって影響を及ぼされなかったことを示す。線０はビーズの存在がないことに対応し、線２はストレプトアビジン被覆ビーズの存在に対応し、両方とも１８０ｍＶの印加電位で  ３５０ｐＡ前後のオープンポア電流をもたらした。
【０３２０】
図５〜７に示されたデータから、試験した磁性ビーズ官能化（１−シラン、２−ストレプトアビジン、３−短いビオチン化ＤＮＡ鎖と結合したストレプトアビジン、４−コバルトベースのｈｉｓ−ｔａｇ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｌｌｄｏｗｎ））のいずれも、ＤＮＡをナノポアに送達するために使用することができた。
【実施例４】
【０３２１】
この例は、いくつかの異なる試料を、磁性微粒子を使用してどのように膜貫通タンパク質ポアに送達したかを説明するものである。試料Ａは、磁性微粒子を使用して膜貫通タンパク質ポア（ＭｓｐＡ）に送達した。次いで、ナノポア系を使用してこの試料を検出した。次いで、試料Ａを、膜表面から磁石を使用して除去した。微粒子への試料Ａの付着強度は、膜との試料Ａのカップリング強度より大きく、したがって、微粒子の除去は試料Ａを膜からアンカップリングした。試料Ａを除去したら、次いで試料Ｂを磁性微粒子を使用してナノポアに送達した。この試料もナノポア系によって検出し、その後、磁石を使用して除去した。複数の試料を、ナノポア系においてこのプロセスを用いて試験した。
【０３２２】
材料および方法
４．１  ビーズの調製および試料の付着
磁性ビーズを、上の実施例１、ステップ１．１に記載されたプロセスに類似したプロセスで洗浄した。試料ＡおよびＢを、実施例１、ステップ１．２に記載されたプロセスに類似したプロセスで磁性微粒子に付着させた。
【０３２３】
４．２  電気生理学
試料ＡまたはＢのいずれかが付着した微粒子を、実施例１、ステップ１．３に記載されているように緩衝液および燃料ミックスに希釈した。単一ＭｓｐＡナノポアを実施例１、ステップ１．３．に記載されているように調製した。
【０３２４】
試料Ａをナノポア系に添加し、ヘリカーゼによって制御されるＤＮＡの移動をモニターした。試料Ａに関する十分なデータを回収した後、次いで磁石をナノポア系の上に１０分間置いた。これは、磁性微粒子を磁石の方へ、膜中の膜貫通タンパク質ポアから離れて付着させた。試料Ａを系から除去した後、次いで、試料Ｂが付着した磁性微粒子をナノポア系に流し、ヘリカーゼによって制御されるＤＮＡの移動をモニターした。試料Ｂに関する十分なデータを回収した後、次いで磁石をナノポア系の上に１０分間置いた。これは、試料Ｂが付着した磁性微粒子を、磁石の方へ、膜中の膜貫通タンパク質ポアから離れて付着させた。これは、試料Ｂをナノポア系から除去し、今後の試料の検出に利用できるようにした。
【０３２５】
結果
この例は、磁性微粒子を使用して、いくつかの異なる試料をナノポア系に送達し、検出し、次いでその後、ナノポア系から除去することが可能であったことを示した。これは、微粒子との試料ＡおよびＢの付着強度が膜との試料ＡおよびＢのカップリング強度より大きく、したがって、微粒子の除去が試料ＡおよびＢを膜からアンカップリングし、それらをナノポア系から除去したために可能であった。図９は、上の４．２に記載されているステップの略画表現を示す。
【実施例５】
【０３２６】
この例は、ＤＮＡ分子をＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）ＭｙＯｎｅ（商標）ストレプトアビジンＣ１（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  製品番号６５００１）に付着させ、次いでビーズをナノポア系に添加して、ヘリカーゼによって制御されるＤＮＡの移動を検出するための試料調製手順を説明するものである。ＤＮＡは、「アンカー」オリゴヌクレオチドにハイブリダイズした。すなわち、１つのオリゴはＹアダプターにハイブリダイズし、ＤＮＡを膜中のナノポアに送達するのを支援し、ヘアピンアダプターにハイブリダイズした第二のオリゴは、磁性ビーズとのＤＮＡ分子の結合を容易にするビオチン部分を含有した（図１０を参照されたい）。
【０３２７】
材料および方法
ＭｙＯｎｅ  Ｃ１  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）の洗浄処理
溶液全体にわたってＤｙｎａｂｅａｄ（登録商標）を十分に再懸濁させるために、ＭｙＯｎｅ  Ｃ１  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）を含有するストック試料をボルテックスした。ビーズ溶液試料（１μＬ）をストック溶液から除去し、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ＤＮＡ  ＬｏＢｉｎｄチューブ（１．５ｍＬ）に添加した。チューブを磁気ラックに入れ、ビーズのすべてが磁石にくっついたら上清を除去した。結合緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ  Ｋｉｔ、カタログ番号６０１０１の一部として提供された）を磁性ビーズ試料（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）ｋｉｌｏｂａｓｅＢＩＮＤＥＲ（商標）キット）に添加し（４０μＬ）、ボルテックスすることによりビーズを再懸濁させた。次いで、チューブを磁気ラックに置き、ビーズが磁石にくっついたら上清を除去した。緩衝液洗浄および上清除去ステップをさらに２回繰り返し、その結果、ビーズは緩衝液を使用して合計３回洗浄した。これを、別名、洗浄ビーズストック溶液とした。溶液全体にわたってＤｙｎａｂｅａｄ（登録商標）を十分に再懸濁させるために、使用前にビーズストック溶液をボルテックスした。
【０３２８】
Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）へのＤＮＡ（ヘリカーゼが事前結合している）の付着
ＤＮＡライブラリー（断片化し、次いでＹアダプター（ヘリカーゼがリーダーに付着した）およびヘアピンアダプターに付着させ、次いで２つのアンカーオリゴヌクレオチドにハイブリダイズした二本鎖ラムダＤＮＡを含有する（図１０に示すように））を洗浄Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）に添加し（下の表６を参照されたい）、試料を室温で１５分間インキュベートした（混合しながら）。１５分後、試料を磁気ラックに入れてビーズをペレット化した。上清を除去し、ビーズを８０μＬ洗浄緩衝液（２Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）ｋｉｌｏｂａｓｅＢＩＮＤＥＲ（商標）キット）で洗浄した。洗浄緩衝液を除去し、洗浄ステップを繰り返した。最後に、洗浄およびペレット化したビーズを１２μＬ  ５００ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ８．０、２５ｍＭリン酸カリウム緩衝液に再懸濁させた。この試料は、ＤＮＡ／ビーズ試料３であった。
【０３２９】
【表３】
0006721581.tif 000004
【０３３０】
電気生理学
実験を始める前に、ＤＮＡ／ビーズ試料３（３μＬ）を緩衝液（１４３μＬ、２５ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ８．０、５００ｍＭ  ＫＣｌ）および燃料ミックス（４μＬのＭｇＣｌ２（７５ｍＭ）およびＡＴＰ（７５ｍＭ））に添加した。
【０３３１】
緩衝液（２５ｍＭリン酸カリウム緩衝液、１５０ｍＭ  フェロシアン化カリウム（ＩＩ）、および１５０ｍＭフェリシアン化カリウム（ＩＩＩ）、ｐＨ８．０）中のブロック共重合体に挿入された単一ＭｓｐＡナノポアから電気的測定値を得た。ブロック共重合体に挿入された単一ポアを得た後に、次いで緩衝液（２ｍＬ、２５ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液、１５０ｍＭフェロシアン化カリウム（ＩＩ）、１５０ｍＭフェリシアン化カリウム（ＩＩＩ）、ｐＨ８．０）をその系に流して一切の過剰ＭｓｐＡナノポアを除去した。
【０３３２】
過剰な緩衝液（５００ｍＭ  ＫＣｌ、２５ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ８．０）を、試料を添加する前にナノポア系に流した。ＤＮＡ／ビーズ試料３および燃料プレミックス（合計１５５μＬ）を、次いでその単一ナノポア実験系に流した。実験を−１２０ｍＶで実行し、ヘリカーゼによって制御されるＤＮＡの移動をモニターした。
【０３３３】
結果
ＤＮＡ／ビーズ試料３について、ヘリカーゼによって制御されるＤＮＡの移動が観察された。Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）ＭｙＯｎｅ（商標）ストレプトアビジンＣ１（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製品番号６５００１）とプレインキュベートしたＤＮＡライブラリーは、Ｈｉｓタグ付けビーズを使用して実施例１で観察されたものと類似した濃度の増大を示した。これは、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）がナノポア系へのＤＮＡの直接送達を支援することを意味した。
【実施例６】
【０３３４】
この例は、緩衝液フラッシュを使用してフローセルからビーズを物理的に除去することによって、ビーズに付着した試料がナノポアチップアレイからどのように除去されうるかを示す。
【０３３５】
材料および方法
２つの別々の生物由来のＤＮＡ試料を個々に調製し、実施例１に記載されているようにＨｉｓ−ｔａｇ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｕｌｌｄｏｗｎ磁性ビーズに付着させた（１．１および１．２を参照されたい）。第一の生物から調製された試料（試料Ａ）を、実施例１．３に記載されているようにナノポア系に添加し、第一の生物由来のＤＮＡのヘリカーゼによって制御されるＤＮＡの移動を１時間モニターした。次いで、ビーズを系から洗い流すために、ナノポアアレイ系を３×１ｍｌ体積の緩衝液を使用して洗い流した。次いで、第二の生物から調製された試料（試料Ｂ）を、実施例１．３に記載されているようにナノポア系に添加し、第二の生物由来のＤＮＡのヘリカーゼによって制御されるＤＮＡの移動を１時間モニターした。ヘリカーゼによって制御されるＤＮＡの移動を、２つのゲノムからなる参照にマッピングした（図１１を参照されたい）。図１１（Ａ）は、試料Ａのみが系に存在した場合の実験の被覆深度を示し、図１１（Ｂ）は、緩衝液を系をから洗い流し、試料Ｂを添加した後の第二時限の実験に関する被覆深度を示す。マッピングは、単純な緩衝液フラッシュがナノポア系から試料Ａのほとんどを除去したことを示した。系から除去される、試料Ａが付着したビーズの数を増やすために、さらなるフラッシュを系で行うことができた。図１２は、試料Ａを添加し、３×１ｍｌ緩衝液を洗い流した後のナノポア系の同じ領域の拡大画像を示す（図１２Ａ）。図１２Ａは、膜が形成されるナノポア系の領域にビーズが集中したことを示し、図１２Ｂは、緩衝液フラッシュ後にビーズが系から除去されたことを示す。
【実施例７】
【０３３６】
この例は、ＰＣＲを必要とすることなくローインプット試料（＜１００ｎｇ出発材料）のスループットを最大化するために、ワークフローをどう改善することができるかを示す。
【０３３７】
材料および方法：
図１３Ａは、新たなローインプットプロトコールの略図を示す。このプロトコールでは、鎖を依然としてビーズと結合させながら、ライブラリーを分析のためにナノポア系にロードした。
【０３３８】
対照的に、図１３Ｂは、ＰＣＲベースのローインプットプロトコールの略図を示す。ＰＣＲベースのプロトコールの最終ステップは長々しい。すなわち、ユーザーは、分析のためにナノポア系にロードする前に、調製されたシークエンシングライブラリーをストレプトアビジンビーズを使用してきれいにし、ビーズからライブラリーを溶出する必要がある。
【０３３９】
結果：
新たなローインプットプロトコールでは、重力を使用してビーズを膜表面に引っ張り、膜上のＤＮＡ分子の局所濃度を上昇させる。これは、系の感度を１桁以上改善し、本発明者らがインプット要件を１μｇから０．０２５μｇ（２５ｎｇ）に下げることを可能にした。ＰＣＲステップの省略は、増幅バイアスが排除され、実験室時間が節約されたことを意味した。ＰＣＲなしのプロトコールはより長い断片と適合可能であり、より長い読み取りをもたらす。さらに、後成的修飾が保存される。約８ｋｂに剪断されたゲノムＤＮＡで使用する場合、新たなローインプットプロトコールからの２Ｄ読み取り長分布は、インプットＤＮＡの断片長分布と類似していた。これは、ビーズローディングがいずれの目立った断片長バイアスも導入しないことを示すものである。
【実施例８】
【０３４０】
この例は、配列捕捉がシークエンシング前に目的とする遺伝子座をいかに濃縮させ、したがってシークエンシングランのより効率的な使用を可能にするかを示す。
【０３４１】
材料および方法：
配列捕捉は、目的とする領域に特異的なプローブにライブラリー断片をハイブリダイズすることによって、ライブラリー調製中に行った（図１４を参照されたい）。Ａｇｉｌｅｎｔによって合成され１塩基間隔でタイル表示された１２０ｎｔオリゴからなる、ラムダファージゲノムに特異的なカスタムプローブセットを設計した。ラムダゲノムＤＮＡを、ゲノムが等モル比で混合された大腸菌（E. coli）ＤＮＡと混合した。ゲノムＤＮＡを、フラグメンターゼを使用して約２ｋｂに断片化した。ＰＣＲ伸長時間をより長い断片に合わせて調整し、配列捕捉をＡｇｉｌｅｎｔの標準的なＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔプロトコールに従って行った。次いで、得られたライブラリーをナノポア系を使用して分析した。
【０３４２】
結果：
ラムダＤＮＡは出発ＤＮＡの約１％を構成したが、捕捉後、本発明者らは標的において読み取りの７０％を得た。
【０３４３】
配列捕捉は、ゲノム全体の分析が望まれない場合、またはゲノムがシーケンサーのスループットには大きすぎる場合に有用である。目的とする領域は、ＰＣＲによる濃縮に現実的である領域より全体として長いことがあり、またはあまりに多くのＰＣＲが必要とされることがある。配列捕捉は、シークエンシングおよびデータ分析の際のお金と時間を節約する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【配列表】
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