(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ：
【化１】
0006704422.tif 000015
で表される化合物のマレイン酸塩。
【請求項２】
前記式Ｉで表される化合物とマレイン酸とのモル比が１：０．５〜４である、請求項１に記載の式Ｉで表される化合物のマレイン酸塩。
【請求項３】
前記式Ｉで表される化合物とマレイン酸とのモル比が１：１または１：２である、請求項２に記載の式Ｉで表される化合物のマレイン酸塩。
【請求項４】
前記式Ｉで表される化合物とマレイン酸とのモル比が１：１である、請求項２に記載の式Ｉで表される化合物のマレイン酸塩。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の式Ｉで表される化合物のマレイン酸塩の製造方法であって、
式Ｉで表される化合物の溶液を製造するステップ（１）と、
ステップ（１）で得られた前記式Ｉで表される化合物の溶液とマレイン酸とを混合するステップ（２）と、
ステップ（２）で得られた反応混合物を噴霧乾燥させて、前記式Ｉで表される化合物のマレイン酸塩を得るステップ（３）とを含む、
式Ｉで表される化合物のマレイン酸塩の製造方法。
【請求項６】
前記式Ｉで表される化合物とマレイン酸との使用量のモル比は１：１〜２０である、請求項５に記載の製造方法。
【請求項７】
前記ステップ（１）において、前記式Ｉで表される化合物を有機溶剤に溶解して前記式Ｉで表される化合物の溶液を製造する、請求項５または６に記載の製造方法。
【請求項８】
前記有機溶剤はＤＭＦである、請求項７に記載の製造方法。
【請求項９】
噴霧乾燥前に、前記有機溶剤と相溶する溶剤を加える、請求項７または８に記載の製造方法。
【請求項１０】
前記有機溶剤と相溶する溶剤は水である、請求項９に記載の製造方法。
【請求項１１】
請求項１〜４のいずれかに記載の式Ｉで表される化合物のマレイン酸塩と、薬学的に許容される担体、賦形剤、希釈剤および／または媒体とを含む、医薬組成物。
【請求項１２】
請求項１〜４のいずれかに記載の式Ｉで表される化合物のマレイン酸塩を含む、腫瘍を治療するための医薬組成物。
【請求項１３】
前記腫瘍は非小細胞肺癌または乳癌である、請求項１２に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本願は２０１５年０３月２０日に中華人民共和国国家知的財産局に出願された出願番号が２０１５１０１２５９６２．４である中国特許出願に基づく優先権および利益を主張し、当該出願の全文を引用により本願に組み込む。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、医薬品化学分野に属し、より具体的には、キナゾリン誘導体の塩、その製造方法およびその医薬使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）は、チロシンキナーゼ受容体であり、哺乳類の上皮細胞、線維芽細胞、グリア細胞、ケラチノサイト等の細胞の表面に幅広く分布している。ＥＧＦＲシグナル伝達経路は、細胞の成長、増殖や分化等の生理学的過程に対して重要な役割を果たしている。ＥＧＦＲ等のタンパク質チロシンキナーゼの機能喪失やそれに関連するシグナル伝達経路における重要な因子の活性や細胞局在の異常のいずれも腫瘍、糖尿病、免疫不全や心臓血管疾患の発症を引き起こすことになる。
【０００４】
Ｎ６−（１−アクリロイルアザシクロヘキサン−４−イル）−Ｎ４−（３−クロロ−４−フルオロフェニル）−７−メトキシキナゾリン−４，６−ジアミンは、下記式Ｉで表される構造を有する。
【０００５】
【化１】
0006704422.tif 000002
【０００６】
式Ｉで表されるのは、選択的上皮成長因子受容体阻害剤であり、細胞内ドメインのチロシンキナーゼのリン酸化部位と競合的結合することで、ＡＴＰとリン酸化部位との相互作用をブロックして、チロシンのリン酸化および下流での一連のシグナル伝達を阻害し、さらに腫瘍細胞の成長を阻害することができるものであり、非小細胞肺癌や乳癌等の複数種の悪性腫瘍を治療できる。特許文献１を参照として、その全文が引用により本明細書に組み込まれる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】中国特許出願公開第２０１３１０４５２８８５．４号明細書
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の一態様では、式Ｉで表される化合物のマレイン酸塩を提供し、
【０００９】
【化２】
0006704422.tif 000003
【００１０】
ここで、マレイン酸と式Ｉで表される化合物とのモル比は、前記塩を製造する際のマレイン酸の使用量により決定される。例えば、前記マレイン酸塩において、式Ｉで表される化合物とマレイン酸とのモル比は１：０．５〜４であってもよい。
【００１１】
本発明の別の態様では、式Ｉで表される化合物の溶液を製造するステップ（１）と、ステップ（１）で得られた前記式Ｉで表される化合物の溶液とマレイン酸とを接触させるステップ（２）と、ステップ（２）で得られた反応混合物を噴霧乾燥させて、前記式Ｉで表される化合物のマレイン酸塩を得るステップ（３）とを含む、式Ｉで表される化合物のマレイン酸塩の製造方法を提供する。
【００１２】
また、本発明の別の態様では、前記式Ｉで表される化合物のマレイン酸塩と薬学的に許容される担体、賦形剤、希釈剤および／または媒体とを含む医薬組成物を提供する。
【００１３】
さらに、本発明の別の態様では、式Ｉで表される化合物のマレイン酸塩またはその医薬組成物の腫瘍治療薬の製造における使用を提供する。
【００１４】
さらに、本発明の別の態様では、式Ｉで表される化合物のマレイン酸塩またはその医薬組成物を、必要な対象に投与するステップを含む腫瘍の治療方法を提供する。
【００１５】
さらに、本発明の別の態様では、腫瘍を治療するための式Ｉで表される化合物のマレイン酸塩またはその医薬組成物を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、それぞれ開示された実施形態を全体的に理解するために、具体的な詳細を含んで説明したが、当業者は、これらの詳細の一部または複数の部分を用いずに他の方法、部品、材料などを用いても、これらの実施形態を実現することができると理解すべきである。
【００１７】
本明細書および添付の特許請求の範囲の全てにわたって、特に断らない限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」のような用語、およびその英語の変形(例えば「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」や「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」など)は、いずれも開放（オープンエンド）式の、包含式の意味、すなわち「・・・を含むがこれらに限定されない」として解釈されるべきである。
【００１８】
本明細書にわたって記載された「一実施形態」または「実施形態」、あるいは「別の実施形態において」または「いくつかの実施形態において」とは、少なくとも１つの実施形態に、当該実施形態に記載の関連する具体的な参照要素、構造、または特徴を含むことを意味する。したがって、明細書の全体にわたって異なる位置に記載の「一実施形態において」、「実施形態において（実施形態では）」、「他の実施形態において」または「いくつかの実施形態において」という語句は、必ずしも同じ実施形態を指すことではない。また、具体的な要素、構造または特徴は、任意の適切な方式で１つ以上の実施形態の中に組み合せられてもよい。
【００１９】
本願の明細書および添付の特許請求の範囲に用いられた単数形の冠詞「一」、「１つ（の）」、「１個（の）」(英語の「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」などに相当する)は、特に断らない限り、複数の対象（オブジェクト）が含まれていると理解すべきである。したがって、例えば、かかる「触媒」が含まれる反応には、１種の触媒、または２種以上の触媒が含まれている。また、用語「または」などは、特に断らない限り、通常「および/または」の意味を含んで用いられる。
【００２０】
本発明の一態様では、式Ｉで表される化合物のマレイン酸塩を提供し、
【００２１】
【化３】
0006704422.tif 000004
【００２２】
ここで、マレイン酸と式Ｉで表される化合物とのモル比は、前記塩を製造する際のマレイン酸の使用量により決定される。例えば、前記マレイン酸塩において、式Ｉで表される化合物とマレイン酸とのモル比は１：０．５〜４であってもよい。
【００２３】
本発明のいくつかの実施形態において、前記マレイン酸塩の中、式Ｉで表される化合物とマレイン酸とのモル比は１：１である。本発明の別のいくつかの実施形態において、前記マレイン酸塩の中、式Ｉで表される化合物とマレイン酸とのモル比は１：２である。
【００２４】
本発明の別の態様では、式Ｉで表される化合物の溶液を製造するステップ（１）と、ステップ（１）で得られた前記式Ｉで表される化合物の溶液とマレイン酸とを混合するステップ（２）と、ステップ（２）で得られた反応混合物を噴霧乾燥させて、前記式Ｉで表される化合物のマレイン酸塩を得るステップ（３）とを含む、式Ｉで表される化合物のマレイン酸塩の製造方法を提供する。
【００２５】
いくつかの実施形態において、前記製造方法には、式Ｉで表される化合物とマレイン酸との使用量のモル比は１：１〜２０、好ましくは１：１〜１５、最も好ましくは１：１〜１０である。
【００２６】
前記製造方法のステップ（１）において、式Ｉで表される化合物を有機溶剤に溶解して式Ｉで表される化合物の溶液を製造してもよい。前記有機溶剤は、式Ｉで表される化合物を溶解可能な全ての有機溶剤であればよく、例えばＤＭＦが挙げられる。
【００２７】
前記製造方法のステップ（２）において、ステップ（１）で得られた式Ｉで表される化合物の溶液とマレイン酸またはマレイン酸の溶液を混合し、さらに、必要に応じて反応混合物を適切な温度、例えば６０〜１００℃、好ましくは８０℃に加熱してもよい。いくつかの実施形態において、マレイン酸の溶液はマレイン酸と有機溶剤を混合して得られたマレイン酸の有機溶液である。本発明のいくつかの実施形態において、前記有機溶剤は例えばＤＭＦである。
【００２８】
いくつかの実施形態において、噴霧乾燥前に、ステップ（１）および／または（２）における有機溶剤と相溶する溶剤、例えば水を加えてもよい。
【００２９】
また、本発明の別の態様では、式Ｉで表される化合物のマレイン酸塩と薬学的に許容される担体、賦形剤、希釈剤および／または媒体を含む医薬組成物を提供する。
【００３０】
本明細書に記載の用語「医薬組成物」とは、本発明の化合物と、医薬分野で通常許容される、生物学的活性化合物を生体（例えば、ヒト）に送達できる担体、賦形剤、希釈剤および／または媒体とを用いて製造された製剤である。医薬組成物の目的は、本発明に係る化合物の生体への投与を容易にすることである。
【００３１】
本明細書に記載の用語「薬学的に許容される担体」とは、生体に対して顕著な刺激作用がなく、且つ活性化合物の生物学的活性や性能を損なうことのない担体や希釈剤を意味する。「薬学的に許容される賦形剤および／または媒体」とは、活性成分とともに投与され且つ生体への活性成分の送達に役立つ不活性物質である。「薬学的に許容される担体、賦形剤、希釈剤および／または媒体」は、ヒトや家畜に利用可能な任意の担体、賦形剤、媒体、流動促進剤、甘味剤、希釈剤、防腐剤、染料／着色剤、矯味剤、界面活性剤、湿潤剤、分散剤、崩壊剤、懸濁促進剤、安定剤、等張剤、溶剤または乳化剤等が挙げられるが、これらに制限されない。前記賦形剤の非限定的な例としては、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、各種の糖および各種の澱粉、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油、並びにポリエチレングリコール等が挙げられる。
【００３２】
本発明に係る式Ｉで表される化合物のマレイン酸塩は、純粋な形または適切な医薬組成物の形で投与できる。本発明に係る医薬組成物は、本発明に係る式Ｉで表される化合物のマレイン酸塩と適切な薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤とを組み合わせて製造でき、かつ固体、半固体、液体または気体の製剤、例えば錠剤、丸剤、カプセル剤、粉剤、顆粒剤、クリーム剤、乳剤、懸濁剤、液剤、座薬、注射剤、吸入剤、ゲル剤、マイクロスフェアおよびエアゾール等として調製できる。
【００３３】
本発明に係る式Ｉで表される化合物のマレイン酸塩またはその医薬組成物の代表的な投与経路は、経口投与、直腸投与、経粘膜投与、経腸投与、または局所投与、経皮投与、吸入投与、非経口投与、舌下投与、膣内投与、鼻腔内投与、眼内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、皮下投与、静脈内投与が挙げられる。好ましい投与経路は、経口投与である。
【００３４】
本発明に係る医薬組成物は、例えば通常の混合法、溶解法、造粒法、糖衣錠製法、粉砕法、乳化法、凍結乾燥法等の当業者に公知の法によって製造できる。
【００３５】
好ましい実施形態において、本発明に係る医薬組成物は経口投与に適した形である。経口投与には、活性化合物と当該分野でよく知られている薬学的に許容される担体、賦形剤、希釈剤および／または媒体とを混合して該医薬組成物を製造できる。これらの担体、賦形剤、希釈剤および／または媒体を利用して、本発明に係る医薬組成物を錠剤、丸剤、トローチ剤、コート剤、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ、懸濁剤等に製造して、患者へ経口投与することができる。通常の混合法、充填法や打錠法によって経口固形組成物を製造できる。
【００３６】
前記投与において、式Ｉで表される化合物のマレイン酸塩の１日投与量は、好ましくは０．０１〜２００ｍｇ／ｋｇ体重である。
【００３７】
また、本発明の別の態様では、式Ｉで表される化合物のマレイン酸塩またはその医薬組成物の腫瘍治療薬の製造における使用を提供する。
【００３８】
さらに、本発明の別の態様では、式Ｉで表される化合物のマレイン酸塩またはその医薬組成物を、必要な対象に投与するステップを含む腫瘍の治療方法を提供する。
【００３９】
さらに、本発明の別の態様では、腫瘍を治療するための式Ｉで表される化合物のマレイン酸塩またはその医薬組成物を提供する。
【００４０】
いくつかの実施形態において、前記腫瘍は非小細胞肺癌や乳癌を含むが、これらに制限されない。
【実施例】
【００４１】
実施例１  式Ｉで表される化合物の製造
ステップ１：  ４−クロロ−７−フルオロ−６−ニトロキナゾリン
【００４２】
【化４】
0006704422.tif 000005
【００４３】
７−フルオロ−６−ニトロキナゾリン−４（３Ｈ）−オン（２．０ｇ、９．６ｍｍｏｌ）と１滴のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを塩化チオニル（６ｍＬ）において一晩還流し、次に反応混合物を減圧濃縮させた。残渣にトルエンを加え、再び減圧濃縮させて、残留した塩化チオニルを除去し、表題化合物（２ｇ、９２％）を得た。
１Ｈ  ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３）：  δ  ９．１８  （１Ｈ，  ｓ），  ９．０５  （１Ｈ，  ｄ，  Ｊ  ＝  ７．６  Ｈｚ），  ７．９５  （１Ｈ，  ｄ，  Ｊ  ＝  １０．４）。
【００４４】
ステップ２：  ３−クロロ−Ｎ−（３，４−ジメトキシベンジル）−４−フルオロアニリン
【００４５】
【化５】
0006704422.tif 000006
【００４６】
３−クロロ−４−フルオロアニリン（２．９ｇ、２０ｍｍｏｌ）および３，４−ジメトキシベンゼンホルムアルデヒド（３．３ｇ、２０ｍｍｏｌ）を１，２−ジクロロエタン（３０ｍＬ）に加え、室温で１時間撹拌した。次に、トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム（１０ｇ、５０ｍｍｏｌ）を加えて、反応混合液を室温で一晩撹拌した。反応混合液を水１００ｍＬに投入してジクロロメタンで抽出した。有機相を分離して、飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、有機相を減圧濃縮させて表題化合物（５．５ｇ、９３％）を得た。
１Ｈ  ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３）：  δ  ６．９４−６．８２  （４Ｈ，  ｍ），  ６．６３−６．６１  （１Ｈ，  ｍ），  ６．４５−６．４１  （１Ｈ，  ｍ），  ４．１８  （２Ｈ，  ｓ），  ３．９８  （１Ｈ，  ｂｒ），  ３．８７  （３Ｈ，  ｓ），  ３．８６  （３Ｈ，  ｓ）。
【００４７】
ステップ３：  Ｎ−（３−クロロ−４−フルオロフェニル）−Ｎ−（３，４−ジメトキシベンジル）−７−フルオロ−６−ニトロキナゾリン−４−アミン
【００４８】
【化６】
0006704422.tif 000007
【００４９】
４−クロロ−７−フルオロ−６−ニトロキナゾリン（２．１ｇ、９．２ｍｍｏｌ）および３−クロロ−Ｎ−（３，４−ジメトキシベンジル）−４−フルオロアニリン（２．７ｇ、９．２ｍｍｏｌ）を、アセトニトリル（２０ｍＬ）に加えて３時間還流した。冷却後、炭酸ナトリウム溶液を加えて中和し、酢酸エチルで抽出して有機相を分離し、飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧濃縮させて表題化合物（３．６ｇ、８０％）を得た。
【００５０】
ステップ４：  Ｎ−（３−クロロ−４−フルオロフェニル）−Ｎ−（３，４−ジメトキシベンジル）−７−メトキシ−６−ニトロキナゾリン−４−アミン
【００５１】
【化７】
0006704422.tif 000008
【００５２】
金属ナトリウム（１１３ｍｇ、５．０ｍｍｏｌ）を無水メタノール（２０ｍＬ）に加え、室温で１０分間撹拌し、次にＮ−（３−クロロ−４−フルオロフェニル）−Ｎ−（３，４−ジメトキシベンジル）−７−フルオロ−６−ニトロキナゾリン−４−アミン（２．４ｇ、５．０ｍｍｏｌ）を加えて、混合液を４０℃で６時間撹拌した。冷却後、混合液を水１００ｍＬに投入して、酢酸エチルで抽出し、有機相を飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧濃縮させて表題化合物（２．３５ｇ、９４％）を得た。
１Ｈ  ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３）：  δ  ８．８５  （１Ｈ，  ｓ），  ７．５７  （１Ｈ，  ｓ），  ７．３５  （１Ｈ，  ｓ），  ７．２３−７．１９  （２Ｈ，  ｍ），  ７．００−６．９６  （１Ｈ，  ｍ），  ６．８４−６．７８  （２Ｈ，  ｍ），  ５．３５  （２Ｈ，  ｓ），  ４．０５  （３Ｈ，  ｓ），  ３．８８  （３Ｈ，  ｓ），  ３．８３  （３Ｈ，  ｓ）。
【００５３】
ステップ５：  Ｎ４−（３−クロロ−４−フルオロフェニル）−Ｎ４−（３，４−ジメトキシベンジル）−７−メトキシキナゾリン−４，６−ジアミン
【００５４】
【化８】
0006704422.tif 000009
【００５５】
Ｎ−（３−クロロ−４−フルオロフェニル）−Ｎ−（３，４−ジメトキシベンジル）−７−メトキシ−６−ニトロキナゾリン−４−アミン（２．３５ｇ、４．７ｍｍｏｌ）およびラネーニッケル（約０．５ｇ）を、テトラヒドロフラン（１００ｍＬ）に加え、水素ガスで置換し、水素雰囲気下（１ａｔｍ）、室温で一晩撹拌した。濾過して、濾液を減圧濃縮させて表題化合物（２ｇ、９０％）を得た。
【００５６】
ステップ６：  ｔｅｒｔ−ブチル−４−｛｛４−［（３−クロロ−４−フルオロフェニル）（３，４−ジメトキシベンジル）アミノ］−７−メトキシキナゾリン−６−イル｝アミノ｝ピペリジン−１−カルボキシレート
【００５７】
【化９】
0006704422.tif 000010
【００５８】
Ｎ４−（３−クロロ−４−フルオロフェニル）−Ｎ４−（３，４−ジメトキシベンジル）−７−メトキシキナゾリン−４，６−ジアミン（４６９ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）およびｔｅｒｔ−ブチル−４−オキソピペリジン−１−カルボキシレート（２３９ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ）の酢酸（１０ｍＬ）溶液とを室温下で２時間撹拌し、次に、トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム（２５４ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ）を一括して加えた。半時間反応した後、水を緩やかに加えて反応をクエンチさせ、酢酸エチルで抽出した。得られた有機相を順に水、５％ＮａＨＣＯ３水溶液および飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥して減圧濃縮させた。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより分離して表題化合物（４０４ｍｇ、６２％）を得た。
【００５９】
ステップ７：  Ｎ６−（ピペリジン−４−イル）−Ｎ４−（３−クロロ−４−フルオロフェニル）−７−メトキシキナゾリン−４，６−ジアミン
【００６０】
【化１０】
0006704422.tif 000011
【００６１】
ｔｅｒｔ−ブチル−４−｛｛４−［（３−クロロ−４−フルオロフェニル）（３，４−ジメトキシベンジル）アミノ］−７−メトキシキナゾリン−６−イル｝アミノ｝ピペリジン−１−カルボキシレート（０．４ｇ、０．６１ｍｍｏｌ）のトリフルオロ酢酸（８ｍＬ）溶液を７０℃で６時間撹拌した。反応終了後、冷却して減圧濃縮させ、残留物を酢酸エチルでスラリーに調製し、濾過して表題化合物であるトリフルオロ酢酸塩（０．２６ｇ、８３％）を得た。
【００６２】
ステップ８：  Ｎ６−（１−アクリロイルピペリジン−４−イル）−Ｎ４−（３−クロロ−４−フルオロフェニル）−７−メトキシキナゾリン−４，６−ジアミン
【００６３】
【化１１】
0006704422.tif 000012
【００６４】
Ｎ６−（ピペリジン−４−イル）−Ｎ４−（３−クロロ−４−フルオロフェニル）−７−メトキシキナゾリン−４，６−ジアミンモノトリフルオロ酢酸塩（２５８ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（２０２ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（１０ｍＬ）溶液を室温で３０分間撹拌した。０℃まで冷却した後、塩化アクリロイル（５４ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン溶液（２ｍＬ）を滴下し、滴下終了後、３０分間引き続き反応させた。反応終了後、５％ＮａＨＣＯ３溶液を緩やかに加えて反応をクエンチさせ、酢酸エチルで抽出した。得られた有機相を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させて減圧濃縮させ、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより分離して目的生成物（１５０ｍｇ、６６％）を得た。
１Ｈ  ＮＭＲ  （ＤＭＳＯ−ｄ６）：  δ  ９．２４  （１Ｈ，  ｓ），  ８．３３  （１Ｈ，  ｓ），  ８．０９−８．０８  （１Ｈ，  ｍ），  ７．７７−７．７４  （１Ｈ，  ｍ），  ７．４２−７．４０  （１Ｈ，  ｍ），  ７．２３  （１Ｈ，  ｓ），  ７．０６  （１Ｈ，  ｓ），  ６．８５−６．８１  （１Ｈ，  ｍ），  ６．１０−６．０６  （１Ｈ，  ｍ），  ５．６６−５．６４  （１Ｈ，  ｍ），  ５．３２−５．２９  （１Ｈ，  ｍ），  ４．４１−４．３８  （１Ｈ，  ｍ），  ４．０９−４．０６  （１Ｈ，  ｍ），  ３．９３  （３Ｈ，  ｓ），  ３．７９−３．７８  （１Ｈ，  ｍ），  ３．３５−３．３４  （１Ｈ，  ｍ），  ２．８７−２．８４  （１Ｈ，  ｍ），  ２．０３−２．０１  （２Ｈ，  ｍ），  １．４４−１．４１  （２Ｈ，  ｍ）。
【００６５】
実施例２  式Ｉで表される化合物のマレイン酸塩の製造
【００６６】
室温で、式Ｉで表される化合物５ｇをＤＭＦ  １００ｍＬに溶解して、絶えずに撹拌して均一にし、マレイン酸６．３ｇを加えた後、８０℃まで昇温して２時間反応させ、次に、この温度で水１００ｍｌを加えて直接噴霧乾燥させ、黄色固体粉末４．０ｇを得、ＸＲＤパターンにより、式Ｉで表される化合物の非晶質マレイン酸塩（１：１）であった。
【００６７】
実施例３  式Ｉで表される化合物のクエン酸塩、蓚酸塩および酢酸塩の製造
【００６８】
実施例２と同様な方法によって、式Ｉで表される化合物のクエン酸塩、蓚酸塩および酢酸塩をそれぞれ製造した。
【００６９】
実施例４  生物学的利用能実験
研究方法：体重７．４〜９．４ｋｇのビーグル犬１５匹をランダムに５群に分け、５ｍｇ／ｋｇ体重の式Ｉで表される化合物およびそのマレイン酸塩、クエン酸塩、蓚酸塩、酢酸塩（式Ｉで表される化合物の量で換算）のＣＭＣ−Ｎａ（カルボキシメチルセルロースナトリウム）懸濁液をそれぞれ経口投与し、投与前と投与後（０．２５、０．５、１、２、４、６、８、１２、２４、４８時間の時点）に採血し、ＬＣ−ＭＳ法によって犬血漿サンプルにおける式Ｉで表される化合物の濃度をそれぞれ測定して生物学的利用能を計算した。
【００７０】
検出方法：
クロマトグラフィー条件は、移動相Ａ：メタノール、移動相Ｂ：０．１％（ｖ／ｖ）のギ酸水溶液、アイソクラティック溶離方式：  Ａ：Ｂ＝５２：４８、流速：０．２ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度：３５℃、クロマトグラフィーカラム：ＳＨＩＭＡＤＺＵ  Ｓｈｉｍ−ｐａｃｋ  ＶＰ−ＯＤＳ  Ｃ１８（５．０μｍ、１５０ｍｍ×２．０ｍｍ  Ｉ．Ｄ．島津社製）である。
【００７１】
質量スペクトル条件は、イオン源：ＥＳＩイオン化源、ＳＩＭ方式走査、湾曲型脱溶媒装置（ＣＤＬ）温度：２５０℃、加熱ブロック（ｂｌｏｃｋ）温度：２００℃、ＣＤＬ  電圧：２５Ｖ、検出電圧：＋１．６０ｋＶ、噴霧ガス流速：１．５Ｌ／ｍｉｎ、乾燥ガス流速：２．０Ｌ／ｍｉｎである。
【００７２】
【表１】
0006704422.tif 000013
【００７３】
実施例５  インビトロ活性試験
１．インビトロ酵素学的検出方法
【００７４】
ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ（Ｔ７９０Ｍ、Ｌ８５８Ｒ）、ＨＥＲ２キナーゼは、昆虫発現系で発現させて精製して得られ、または市販品として購入して得られる。
【００７５】
Ｃｉｓｂｉｏ社の均一時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）法を用いて、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ（Ｔ７９０Ｍ、Ｌ８５８Ｒ）、ＨＥＲ２のキナーゼ活性検出用プラットフォームを作成し、化合物の活性測定を行った。当該化合物について、１００％ＤＭＳＯを用い、それぞれ１００ｎＭ（ＥＧＦＲとＨＥＲ２）、１μＭ（ＥＧＦＲ−Ｔ７９０Ｍ／Ｌ８５８Ｒ）から始めて３倍段階希釈を行い、各濃度のもの４μＬを取って反応緩衝液（５０ｍＭの４−ヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）（ｐＨ７．０）、０．０２％のＮａＮ３、０．０１％の牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．１ｍＭのオルトバナジン酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ  Ｏｒｔｈｏｖａｎａｄａｔｅ）、５ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｎＭのＳＥＢ（Ｃｉｓｂｉｏ社製、商品番号：６１ＳＥＢＡＬＢ）、１ｍＭのＤＴＴ）９６μＬに加え、得られた混合物２．５μＬを取って３８４ウェルプレート（ＯｐｔｉＰｌａｔｅ−３８４、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）に加え、次に２．５μＬのキナーゼを加えて遠心分離して均一混合し、その後、５μＬのＡＴＰおよびＴＫ基質−ビオチン（Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ−ｂｉｏｔｉｎ）を加えて反応を開始させた。３８４ウェルプレートをインキュベータに入れて２３℃で一定時間反応させた後、Ｅｕ３＋−Ｃｒｙｐｔａｔｅで標識されたＴＫ−Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ５μＬ、ストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）−ＸＬ６６５  ５μＬを加えて反応を停止した。インキュベータにおいて１時間インキュベートした後、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）から蛍光値を読み取った。この化合物のＩＣ５０値は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５．０ソフトウェアを用いて算出した。
【００７６】
２．Ａｎｃｈｏｒａｇｅ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ細胞増殖試験（足場非依存性細胞増殖試験）
ヒト非小細胞肺癌細胞ＮＣＩ−Ｈ１９７５、ヒト乳癌細胞系ＢＴ４７４を細胞インキュベータ（３７℃、５％ＣＯ２）においてＲＰＩＭ−１６４０、またはＤＭＥＭ培地及び１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）で培養した。化合物の検出中、底層基質濃度を０．６％としており、細胞を０．３％の低融点寒天で再懸濁した後、１ウェルあたりに１０，０００個の細胞（１００μＬ）を加えるように９６ウェルプレートに播種した。化合物について１０ｍＭから始めて３倍段階希釈を行い、各濃度のもの２μＬを取って培地９８μＬに加え、次に、得られた混合物５．３μＬを取って細胞培養液（ＤＭＳＯ最終濃度０．１％、ｖ／ｖ）に加え、１週間（７日間）処理後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ（Ｒ）（Ｐｒｏｍｅｇａ）試薬２０μＬを加えて、３７℃で４時間インキュベートし、Ｅｎｖｉｓｏｎ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）において蛍光信号を読み取り、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５．０を用いて化合物による細胞増殖阻害のＩＣ５０を算出した。
【００７７】
【表２】
0006704422.tif 000014