(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号５又は配列番号６からなる本発明の特異的なインターロイキン−１５（ＩＬ−１５）アンタゴニストポリペプチドを含む、特異的なＩＬ−１５アンタゴニストポリペプチド。
【請求項２】
免疫グロブリンドメインに融合させた、請求項１記載の特異的なＩＬ−１５アンタゴニストポリペプチド。
【請求項３】
免疫グロブリンドメインが免疫グロブリン定常ドメイン（Ｆｃ領域）である、請求項２記載の特異的なＩＬ−１５アンタゴニストポリペプチド。
【請求項４】
請求項１記載の特異的なインターロイキン−１５（ＩＬ−１５）アンタゴニストポリペプチドをコードしている核酸。
【請求項５】
請求項４記載の核酸を含むベクター。
【請求項６】
請求項４及び／又は請求項５記載の核酸によってトランスフェクトされた、感染した、又は形質転換された宿主細胞。
【請求項７】
請求項１記載の特異的なインターロイキン−１５（ＩＬ−１５）アンタゴニストポリペプチドを含む、医薬組成物。
【請求項８】
患者における免疫応答を抑制するための請求項７記載の医薬組成物。
【請求項９】
患者が自己免疫疾患を患う、請求項８記載の医薬組成物。
【請求項１０】
患者が、急性散在性脳脊髄炎（ＡＤＥＭ）、急性壊死性出血性白質脳炎、アジソン病、無ガンマグロブリン血症、円形脱毛症、アミロイドーシス、強直性脊椎炎、抗ＧＢＭ／抗ＴＢＭ腎炎、抗リン脂質抗体症候群（ＡＰＳ）、自己免疫性血管浮腫、自己免疫性再生不良性貧血、自己免疫性自律神経障害、自己免疫性肝炎、自己免疫性高脂血症、自己免疫性免疫不全症、自己免疫性内耳疾患（ＡＩＥＤ）、自己免疫性心筋炎、自己免疫性膵炎、自己免疫性網膜症、自己免疫性血小板減少性紫斑病（ＡＴＰ）、自己免疫性甲状腺疾患、自己免疫性蕁麻疹、軸索性及び神経性神経障害、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、自己免疫性心筋症、キャッスルマン病、セリアック病、シャーガス病、慢性疲労症候群、慢性炎症性脱髄性多発神経炎（ＣＩＤＰ）、慢性再発性多発性骨髄炎（ＣＲＭＯ）、シャーグ・ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡／良性粘膜類天疱瘡、クローン病、コーガン病、寒冷凝集素症、先天性心ブロック、コクサッキー心筋炎、クレスト病、本態性混合型クリオグロブリン血症、脱髄性神経障害、疱疹状皮膚炎、皮膚筋炎、デビック病（視神経脊髄炎）、円板状ループス、ドレスラー症候群、子宮内膜症、好酸球性筋膜炎、結節性紅斑、実験的アレルギー性脳脊髄炎、エヴァンス症候群、線維筋痛症、線維性肺胞炎、巨細胞性動脈炎（側頭動脈炎）、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、多発血管炎性肉芽腫症（ＧＰＡ）、グレーブス病、ギランバレー症候群、橋本脳炎、橋本甲状腺炎、溶血性貧血、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、妊娠性疱疹、低ガンマグロブリン血症、高ガンマグロブリン血症、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡ腎症、ＩｇＧ４関連硬化症、免疫調節性リポタンパク質、封入体筋炎、炎症性腸疾患、インシュリン依存性糖尿病（１型）、間質性膀胱炎、若年性関節炎、川崎症候群、ランバート・イートン症候群、白血球破壊性血管炎、扁平苔癬、硬化性苔癬、木質性結膜炎、線状ＩｇＡ病（ＬＡＤ）、ループス（ＳＬＥ）、ライム病、メニエール病、顕微鏡的多発血管炎、混合性結合組織病（ＭＣＴＤ）、意義不明の単クローン性γグロブリン血症（ＭＧＵＳ）、モーレン潰瘍、ムッハ・ハーベルマン病、多発性硬化症、重症筋無力症、筋炎、ナルコレプシー、視神経脊髄炎（デビック病）、自己免疫性好中球減少症、眼部瘢痕性類天疱瘡、視神経炎、回帰性リウマチ、ＰＡＮＤＡＳ（連鎖球菌感染性小児自己免疫神経精神障害）、傍腫瘍性小脳変性症、発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）、パリー・ロムベルグ症候群、パーソナージュ・ターナー症候群、毛様体扁平部炎（周辺性ブドウ膜炎）、天疱瘡、末梢神経障害、静脈周囲性脳脊髄炎、悪性貧血、ＰＯＥＭＳ症候群、結節性多発動脈炎、多腺性自己免疫症候群１型、２型及び３型、リウマチ性多発筋痛症、多発性筋炎、心筋梗塞後症候群、心膜切開後症候群、プロゲステロン皮膚炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、乾癬、乾癬性関節炎、特発性肺線維症、壊疽性膿皮症、赤芽球ろう、レイノー現象、反射性交感神経性ジストロフィー、ライター症候群、再発性多発軟骨炎、下肢静止不能症候群、後腹膜線維症、リウマチ熱、関節リウマチ、類肉腫症、シュミット症候群、強膜炎、強皮症、シェーグレン症候���、精子及び精巣自己免疫、全身硬直症候群、亜急性細菌性心内膜炎（ＳＢＥ）、スザック症候群、交感性眼炎、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、トロサ・ハント症候群、横断性脊髄炎、潰瘍性大腸炎、未分化結合組織病（ＵＣＴＤ）、ブドウ膜炎、血管炎、小水疱水疱性皮膚病、白斑、ワルデンストレームマクログロブリン血症（ＷＭ）、並びにウェゲナー肉芽腫症［多発血管炎性肉芽腫症（ＧＰＡ）］からなる群より選択される自己免疫疾患を患う、請求項９記載の医薬組成物。
【請求項１１】
移植片生着を促進するための、及び移植片対宿主疾患の患者を処置するための請求項９記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野：
本発明は、特異的なインターロイキン−１５（ＩＬ−１５）アンタゴニストポリペプチド並びに炎症疾患及び自己免疫疾患の処置のためのその使用に関する。
【０００２】
発明の背景：
ＩＬ−２及びＩＬ−１５は、リンパ球の恒常性及び機能の重要な調節因子であるγｃサイトカインファミリー（ＩＬ−２、４、７、９、１５及び２１）に属する。それらは、リンパ球の増殖及び生存を促進する潜在性を有し、したがって全体的に主に適応免疫応答を増強する。どちらのサイトカインも、それぞれ、２つの受容体サブユニットであるＣＤ１２２及びＣＤ１３２、すなわちβ鎖及び共通のγｃ鎖を共有する。ＩＬ−２は、ＣＤ１２２とＣＤ１３２から構成される二量体受容体又はＣＤ２５とＣＤ１２２とＣＤ１３２から構成される三量体受容体のいずれかへの結合を通してその多面的な活性を発揮する。例えば、ＣＤ２５とＣＤ１２２とＣＤ１３２の複合体は、高い親和性（Ｋａ＝１０１１Ｍ−１）でＩＬ−２に結合し、そして活性化Ｔ細胞及び制御性Ｔ細胞上に存在する（Ｔｒｅｇ；ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋）。ＣＤ２５は、Ｔｒｅｇ細胞において高いレベルで構成的に発現され、それによりそれらは非常に低いバックグラウンドレベルのＩＬ−２を利用することができる。ＩＬ−２とは対照的に、ＩＬ−１５は、細胞間の接触を通して作用する膜結合型サイトカインである。インビボにおける主なＩＬ−１５のシグナル伝達機序は、ヘテロ二量体ＣＤ１２２／ＣＤ１３２受容体へのＩＬ−１５Ｒα（ＣＤ２１５）によるＩＬ−１５のトランス提示である。ＣＤ２５とは異なり、ＩＬ−１５Ｒαは、非常に高い親和性（Ｋａ＝１０１１Ｍ−１）でＩＬ−１５に結合し、これは完全なＩＬ−１５受容体の存在下でもさらに増加せず、すなわち、ＩＬ−１５は、ＣＤ２５に対するＩＬ−２と比較して、ＩＬ−１５Ｒαに対して１００倍高い親和性を有する。ＩＬ−１５Ｒαは、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、Ｂ細胞、ＤＳ、単球、及びマクロファージ上に、並びに、胸腺及びＢＭ間質細胞株に発現される。ＩＬ−２及びＩＬ−１５は、適応免疫系及び自然免疫系の両方において多くの機能を共有する。なぜなら、どちらのサイトカインも、同じＣＤ１２２／ＣＤ１３２受容体ヘテロ二量体を通してシグナルを伝達するからである。どちらのサイトカインも、自然免疫及び適応免疫において中心的な役割を果たす。初期のインビトロにおける実験は、２つのサイトカインの効果において大きな機能的な重複を示したが（活性化リンパ球及びＮＫ細胞の増殖及び細胞毒性の誘導、Ｂ細胞の増殖及び免疫グロブリン合成の共刺激、並びにＴ細胞の化学物質誘引）、追加の実験は、それらがインビボにおいて補完的な作用又はさらには相反的な作用さえ発揮し得ることを示した。マウスにおけるＩＬ−２又はＩＬ−２Ｒαのノックアウトは、活性化Ｔ細胞及びＢ細胞個体群の増加を伴う自己免疫表現型に関連していたが、ＩＬ−１５及びＩＬ−１５Ｒαノックアウトは、ＮＫ細胞、ＮＫ−Ｔ細胞、上皮内リンパ球、及び記憶ＣＤ８Ｔ細胞の特異的異常を生じた。さらに、ＩＬ−２は、活性化により誘発される細胞死を誘発することによって、末梢性トレランスを促進する。ＩＬ−２は、Ｔｒｅｇ細胞の発達及び機能にとって確かに重要であるが、ＩＬ−１５は、ＩＬ−２により媒介される活性化により誘発される細胞死を阻害し、そしてＩＬ−２とは異なり、ＩＬ−１５は、ＣＤ８記憶Ｔ細胞に対する生存因子である。これらの観察と一致して、ＩＬ−２の主な役割は活性化Ｔ細胞の持続的な増殖を制限することであり、一方、ＩＬ−１５は、Ｔ細胞の分裂開始及び記憶Ｔ細胞の生存にとって重要であることが示唆されている。ＩＬ−１５の高い発現レベルは、クローン病、乾癬、白血病、関節リウマチ（ＲＡ）、及び移植片拒絶のような自己免疫疾患及び炎症疾患の発病に関連している。したがって、ＩＬ−１５の調節因子は、治療分野において高い関心を示す。ＩＬ−１５及びＩＬ−１５Ｒα−スシが可動性リンカーによって付着している融合タンパク質（ＲＬＩ及びＩＬＲ）が、リンパ球のサブセットの増殖のための強力なアジュバントとして記載された（Mortier E. et al. J Biol Chem. 2006 Jan 20;281(3):1612-9及び国際公開公報第２００７０４６００６号）。ＩＬ−１５アンタゴニストは、炎症疾患を処置するための潜在的な治療薬であり得、そしていくつかのＩＬ−１５アンタゴニストが先行技術において記載されている。例えば、Ferrari-Lacraz S.等は、免疫グロブリンのＦｃドメインに融合させたＩＬ−１５突然変異体からなるＩＬ−１５アンタゴニストを記載し、そして該アンタゴニストが関節リウマチの処置に有用であり得ることを実証した（Ferrari-Lacraz S. et al. J Immunol. 2004 Nov 1;173(9):5818-26）。しかしながら、先行技術に記載されたＩＬ−１５アンタゴニストはまた、ＩＬ−２のシグナル伝達経路に潜在的に拮抗し、したがって、それらがインビボにおいて注射された場合、有害な副作用（例えばトレランスに関する）を伴う可能性がある。
【０００３】
発明の概要：
本発明は、特異的なインターロイキン−１５（ＩＬ−１５）アンタゴニストポリペプチド並びに炎症疾患及び自己免疫疾患の処置のためのその使用に関する。特に、本発明は特許請求の範囲によって定義される。
【０００４】
発明の詳細な説明：
本発明者らは驚くべきことに、１０１位又は１０８位の少なくとも１つのグルタミン（Ｑ）残基を突然変異させたMortier E. et al. J Biol Chem. 2006 Jan 20;281(3):1612-9及び国際公開公報第２００７０４６００６号に記載のＲＬＩ融合タンパク質が、ＩＬ−１５アンタゴニストとして作用するが、インターロイキン−２のシグナル伝達経路に拮抗しないことを示す。このポリペプチドは、一般的なＩＬ−２Ｒｂ／ｇ受容体に標的化する最初の特異的なＩＬ−１５アンタゴニストであり、したがって、先行技術に記載のＩＬ−１５アンタゴニストを上回る巨大な利点を与える。なぜなら、それはＩＬ−２のシグナル伝達経路に依存する制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）の恒常性に影響を及ぼすことなく、ＩＬ−１５によって媒介されるＮＫ細胞の増殖を阻害することができるからである。
【０００５】
したがって、本発明は、ｉ）配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一率を有するアミノ酸配列を含むＩＬ１５−Ｒαスシ含有ポリペプチド、ｉｉ）リンカー、及びｉｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一率を有するアミノ酸配列を含むＩＬ−１５ポリペプチド（ただし１０８位のグルタミン（Ｑ）残基は突然変異している）を含む、特異的なインターロイキン−１５（ＩＬ−１５）アンタゴニストポリペプチドに関する。
【０００６】
本明細書において使用する「特異的なインターロイキン−１５（ＩＬ−１５）アンタゴニストポリペプチド」という表現は、ＩＬ−２のシグナル伝達経路に拮抗することなく、ＩＬ−１５のシグナル伝達経路を阻害することができるポリペプチドを指す。
【０００７】
本発明によると、第二のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一率を有する第一のアミノ酸配列とは、第一の配列が、第二のアミノ酸配列に対して８０；８１；８２；８３；８４；８５；８６；８７；８８；８９；９０；９１；９２；９３；９４；９５；９６；９７；９８；９９又は１００％の同一率を有することを意味する。
【０００８】
配列同一性は、同一率（又は類似率又は相同率）に換算して頻繁に測定され；比率が高くなればなるほど、２つの配列は類似している。比較のための配列のアラインメント法は当技術分野において周知である。様々なプログラム及びアラインメントアルゴリズムがSmith and Waterman, Adv. Appl. Math., 2:482, 1981; Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol., 48:443, 1970; Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85:2444, 1988; Higgins and Sharp, Gene, 73:237-244, 1988; Higgins and Sharp, CABIOS, 5:151-153, 1989; Corpet et al. Nuc. Acids Res., 16:10881-10890, 1988; Huang et al., Comp. Appls Biosci., 8:155-165, 1992；及びPearson et al., Meth. Mol. Biol., 24:307-31, 1994に記載されている。Altschul et al., Nat. Genet., 6:119-129, 1994は、配列アラインメント法及び相同性の計算についての詳細な考察を提示する。例えば、アラインメントツールのＡＬＩＧＮ（Myers and Miller, CABIOS 4:11-17, 1989）又はＬＦＡＳＴＡ（Pearson and Lipman, 1988）を使用して配列比較（インターネットプログラム（登録商標）1996、W. R. Pearson及びバージニア大学、ｆａｓｔａ２０ｕ６３バージョン２．０ｕ６３、発売日１９９６年１２月）を行なうことができる。ＡＬＩＧＮは、全配列を互いに比較するが、ＬＦＡＳＴＡは局所的な類似領域を比較する。これらのアラインメントツール及びそれらのそれぞれのチュートリアルは、例えば、インターネットのＮＣＳＡウェブサイトで入手することができる。あるいは、約３０アミノ酸より大きなアミノ酸配列の比較のために、デフォールトパラメーター（ギャップ存在コスト１１、及び残基ごとのギャップコスト１）に設定されたデフォールトＢＬＯＳＵＭ６２マトリクスを使用してＢｌａｓｔ２配列関数を使用してもよい。短いペプチド（約３０アミノ酸より少ない）をアラインさせる場合、アラインメントは、デフォールトパラメーター（オープンギャップ９、エクステンションギャップ１のペナルティー）に設定されたＰＡＭ３０マトリクスを使用して、Ｂｌａｓｔ２配列関数を使用して実施されるべきである。ＢＬＡＳＴ配列比較システムは、例えば、ＮＣＢＩウェブサイトから入手することができる；Altschul et al., J. Mol. Biol., 215:403-410, 1990; Gish. & States, Nature Genet., 3:266-272, 1993; Madden et al. Meth. Enzymol., 266:131-141, 1996; Altschul et al., Nucleic Acids Res., 25:3389-3402, 1997；及びZhang & Madden, Genome Res., 7:649-656, 1997も参照されたい。
【０００９】
本発明によると、ＩＬ１５−Ｒαスシ含有ポリペプチド、リンカー、及びＩＬ−１５ポリペプチドはインフレームで融合し、ここでＩＬ−１５Ｒαスシ含有ポリペプチドのＣ末端は、リンカーのＮ末端に融合し、そしてリンカーのＣ末端は、ＩＬ−１５ポリペプチドのＮ末端に融合している。
【００１０】
本明細書において使用する「リンカー」という用語は当技術分野におけるその一般的な意味を有し、そして該タンパク質が適切な二次構造及び三次構造を確実に形成するのに十分な長さのアミノ酸配列を指す。
【００１１】
いくつかの実施態様では、リンカーは、少なくとも１つ、しかし３０個未満のアミノ酸を含むペプチドリンカー、例えば、２〜３０アミノ酸、好ましくは１０〜３０アミノ酸、より好ましくは１５〜３０アミノ酸、さらにより好ましくは１９〜２７アミノ酸、最も好ましくは２０〜２６アミノ酸のペプチドリンカーである。いくつかの実施態様では、該リンカーは、２；３；４；５；６；７；８；９；１０；１１；１２；１３；１４；１５；１６；１７；１８；１９；２０；２１；２２；２３；２４；２５；２６；２７；２８；２９；３０個のアミノ酸残基を有する。典型的には、リンカーは、該化合物が適切なコンフォメーション（すなわち、ＩＬ−１５Ｒβ／γシグナル伝達経路を通した適切なシグナル伝達活性を可能とするコンフォメーション）をとることを可能とするものである。最も適切なリンカー配列は、（１）可動性の伸長されたコンフォメーションをとり、（２）融合タンパク質の機能的ドメインと相互作用する可能性のある規則的な二次構造を発生させる傾向を示さず、そして（３）機能的タンパク質ドメインとの相互作用を促進する可能性のある疎水性又は荷電特徴を最小限有するだろう。可動性タンパク質領域における典型的な表面アミノ酸としては、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、及びＳｅｒ（すなわち、Ｇ、Ｎ、又はＳ）が挙げられる。実質的に、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、及びＳｅｒを含有しているアミノ酸配列のあらゆる並べ替えが、リンカー配列に対する上記の基準を満たすことが予想されるだろう。他の中性に近いアミノ酸、例えばＴｈｒ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ（すなわち、Ｔ、Ａ、Ｌ、Ｑ）もリンカー配列に使用され得る。リンカー配列の長さは、融合タンパク質の生物学的活性に有意な影響を及ぼすことなく変更され得る。治療目的で使用される場合、リンカーは好ましくは、非免疫原性である。例示的なリンカー配列は、米国特許第５，０７３，６２７号及び第５，１０８，９１０号に記載されている。
【００１２】
いくつかの実施態様では、本発明のリンカーは、配列番号２又は配列番号３のアミノ酸配列からなる。
【００１３】
本明細書において使用する突然変異という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、そして置換、欠失又は挿入を指す。「置換」という用語は、特定の位置における特定のアミノ酸残基が除去され、そして別のアミノ酸残基が同位置に挿入されることを意味する。「欠失」という用語は、特定のアミノ酸残基が除去されることを意味する。「挿入」という用語は、１つ以上のアミノ酸残基が、特定のアミノ酸残基の前又は後に挿入され、より具体的には、１つ以上、好ましくは１つ又はいくつかのアミノ酸残基が、特定のアミノ酸残基のカルボキシル基又はアミノ基に結合されることを意味する。
【００１４】
いくつかの実施態様では、１０８位のグルタミン（Ｑ）残基は、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、リジン（Ｋ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）、システイン（Ｃ）、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、プロリン（Ｐ）、メチオニン（Ｍ）、及びトリプトファン（Ｗ）からなる群より選択されるアミノ酸残基によって置換されている。いくつかの実施態様では、１０８位のグルタミン（Ｑ）残基はアスパラギン酸（Ｄ）残基によって置換されている。
【００１５】
いくつかの実施態様では、ＩＬ−１５ポリペプチドの１０１位のグルタミン（Ｑ）残基も突然変異している。いくつかの実施態様では、１０１位のグルタミン（Ｑ）残基は、アスパラギン酸（Ｄ）残基、リジン（Ｋ）、及びトリプトファン（Ｗ）からなる群より選択されるアミノ酸残基によって置換されている。いくつかの実施態様では、１０１位のグルタミン（Ｑ）残基は、アスパラギン酸（Ｄ）残基によって置換されている。
【００１６】
いくつかの実施態様では、１０１位及び１０８位の両方のグルタミン（Ｑ）残基が置換されている。いくつかの実施態様では、１０１位及び１０８位の両方のグルタミン（Ｑ）残基がアスパラギン酸（Ｄ）残基によって置換されている。
【００１７】
いくつかの実施態様では、本発明の特異的なインターロイキン−１５（ＩＬ−１５）アンタゴニストポリペプチドは、配列番号５又は配列番号６のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一率を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様では、本発明の特異的なインターロイキン−１５（ＩＬ−１５）アンタゴニストポリペプチドは、配列番号５又は配列番号６からなる。
【００１８】
いくつかの実施態様では、本発明の特異的なインターロイキン−１５（ＩＬ−１５）アンタゴニストポリペプチドは免疫グロブリンドメインに融合し、よってイムノアドヘシンを形成する。本明細書において使用する「イムノアドヘシン」という用語は、本発明の特異的なインターロイキン−１５（ＩＬ−１５）アンタゴニストポリペプチドの結合特異性と、免疫グロブリン定常ドメインのエフェクター機能を組み合わせた、抗体様分子を示す。いくつかの実施態様では、イムノアドヘシン内の免疫グロブリン定常ドメイン配列は、任意の免疫グロブリン、例えばＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３、又はＩｇＧ−４サブタイプ、ＩｇＡ（ＩｇＡ−１及びＩｇＡ−２を含む）、ＩｇＥ、ＩｇＤ、又はＩｇＭから得ることができる。いくつかの実施態様では、免疫グロブリン配列は、免疫グロブリン定常ドメイン（Ｆｃ領域）である。イムノアドヘシンは、ヒト抗体の価値ある化学的及び生物学的特性の多くを有し得る。イムノアドヘシンは、適切なヒト免疫グロブリンヒンジ及び定常ドメイン（Ｆｃ）配列に連結させた所望の特異性を有するヒトタンパク質配列から構築され得るので、関心対象の結合特異性は、全てヒト成分を使用して達成することができる。このようなイムノアドヘシンは、患者にとって最低限の免疫原性であり、そして慢性使用又は反復使用に対して安全である。当業者は、最も適切なＦｃドメインを容易に選択することができる（Chan AC, Carter PJ. Therapeutic antibodies for autoimmunity and inflammation. Nat Rev Immunol. 2010 May;10(5):301-16. doi: 10.1038/nri2761. Review）。いくつかの実施態様では、Ｆｃ領域は、補体との結合及び／又はＦｃ受容体への結合を阻害する突然変異を含むか又は含まない（Zheng et al, Transplantation. 2006 Jan 15;81(1):109-16）。いくつかの実施態様では、Ｆｃ領域は、天然配列のＦｃ領域である。いくつかの実施態様では、Ｆｃ領域は変異Ｆｃ領域である。いくつかの実施態様では、Ｆｃ領域は、機能的Ｆｃ領域である。本明細書において使用する「Ｆｃ領域」という用語は、天然配列のＦｃ領域及び変異Ｆｃ領域を含む、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は変化し得るが、ヒトＩｇＧ重鎖のＦｃ領域は通常、Ｃｙｓ２２６位のアミノ酸残基から、又はＰｒｏ２３０から、そのカルボキシル末端までにおよぶと定義される。いくつかの実施態様では、イムノアドヘシンの接着部分及び免疫グロブリン配列部分は、最小限のリンカーによって連結されている。
【００１９】
本発明によると、本発明の特異的なインターロイキン−１５（ＩＬ−１５）アンタゴニストポリペプチドは、慣用的な自動ペプチド合成法によって又は組換え発現によって生成される。タンパク質を設計及び製造するための一般的な原則は、当業者には周知である。本発明の特異的なインターロイキン−１５（ＩＬ−１５）アンタゴニストポリペプチドは、慣用的な技術に従って溶液中又は固体支持体上で合成され得る。様々な自動合成装置が市販され、そしてStewart and Young; Tam et al., 1983; Merrifield, 1986 and Barany and Merrifield, Gross and Meienhofer, 1979に記載のような公知のプロトコールに従って使用され得る。本発明の特異的なインターロイキン−１５（ＩＬ−１５）アンタゴニストポリペプチドはまた、アプライドバイオシステムズ社製のモデル４３３Ａなどの例示的なペプチド合成装置を使用して固相技術によって合成され得る。自動ペプチド合成を通して又は組換え法を通して生成されたあらゆる所与のタンパク質の純度は、逆相ＨＰＬＣ分析を使用して決定され得る。各ペプチドの化学的信憑性は、当業者には周知である任意の方法によって確立され得る。自動ペプチド合成の代替選択肢として、組換えＤＮＡ技術を使用し得、この技術では、選択されたタンパク質をコードするヌクレオチド配列を発現ベクターに挿入し、適切な宿主細胞に形質転換又はトランスフェクトし、そして本明細書において以下に記載のような発現に適した条件下で培養する。組換え法は、より長いポリペプチドを生成するのに特に好ましい。様々な発現ベクター／宿主系が、ペプチド又はタンパク質をコードする配列を含有及び発現させるのに使用され得る。これらとしては、微生物、例えば組換えバクテリオファージ、プラスミド又はコスミドＤＮＡ発現ベクターを用いて形質転換された細菌；酵母発現ベクターを用いて形質転換された酵母（Giga-Hama et al., 1999）；ウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルス、Ghosh et al., 2002参照）を用いて感染させた昆虫細胞系；ウイルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）を用いてトランスフェクトされた又は細菌発現ベクター（例えばＴｉ又はｐＢＲ３２２プラスミド；例えばBabe et al., 2000参照）を用いて形質転換された植物細胞系；又は動物細胞系が挙げられるがこれらに限定されない。当業者は、哺乳動物によるタンパク質の発現を最適化させるための様々な技術を知っている。例えば、Kaufman, 2000; Colosimo et al., 2000を参照されたい。組換えタンパク質生成において有用である哺乳動物細胞としては、ＶＥＲＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、ＣＯＳ細胞（例えばＣＯＳ−７）、Ｗ１３８、ＢＨＫ、ＨｅｐＧ２、３Ｔ３、ＲＩＮ、ＭＤＣＫ、Ａ５４９、ＰＣ１２、Ｋ５６２、及び２９３細胞が挙げられるがこれらに限定されない。細菌、酵母及び他の無脊椎動物におけるペプチド基質又は融合ポリペプチドの組換え発現のための例示的なプロトコールは当業者には公知であり、そして本明細書において以下に簡潔に記載されている。組換えタンパク質の発現のための哺乳動物宿主系もまた当業者には周知である。宿主細胞株は、発現タンパク質をプロセシングする、又はタンパク質の活性を与える際に有���であろう特定の翻訳後修飾を生じる、特定の能力のために選択され得る。ポリペプチドのこのような修飾としては、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化、及びアシル化が挙げられるがこれらに限定されない。「プレプロ」形のタンパク質を切断する翻訳後プロセシングもまた、正しい挿入、フォールディング及び／又は機能にとって重要であり得る。ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、２９３、ＷＩ３８などの様々な宿主細胞が、このような翻訳後活性のための特定の細胞機構及び特徴的な機序を有し、そして導入された外来タンパク質の正しい修飾及びプロセシングを確実とするために選択され得る。
【００２０】
いくつかの実施態様では、本発明の特異的なインターロイキン−１５（ＩＬ−１５）アンタゴニストポリペプチドは、それらの治療効力を改善させるために修飾されることが考えられる。治療用化合物のこのような修飾は、毒性を低下させるか、循環時間を延長させるか、又は体内分布を改変するために使用され得る。例えば、潜在的に重要である治療用化合物の毒性は、体内分布を改変させる様々な薬物担体ビヒクルと組み合わせることによって有意に減少させることができる。薬物の寿命を改善するための戦略は、水溶性ポリマーの使用である。様々な水溶性ポリマーが、体内分布を改変し、細胞による取り込み形態を改善し、生理学的バリアを通る透過性を変化させ；そして体内からの消失速度を改変させることが示された。標的化効果又は持続的放出効果のいずれかを達成するために、末端基として、骨格の一部として、又はポリマー鎖上の釣り下がった基として薬物部分を含有する水溶性ポリマーが合成されている。例えば、ＰＥＧ化は、広範なポリペプチドの修飾のための十分に確立されかつ検証されたアプローチである。利点としては、とりわけ、（ａ）ポリマーが糸球体ろ過限界値を超えるまで分子の見かけのサイズを増加させる結果として、腎クリアランスを回避するために、及び／又は細胞による消失機序の回避を通して、インビボにおいて顕著に改善された循環半減期；（ｂ）ＰＥＧの付着した分子の低下した抗原性及び免疫原性；（ｃ）改善された薬物動態；（ｄ）タンパク質分解に対するコンジュゲートタンパク質の増強された抵抗性；並びに（ｅ）ＰＥＧ化ポリペプチドの改善された熱的安定性及び力学的安定性が挙げられる。
【００２１】
本発明の別の目的は、本発明の特異的なインターロイキン−１５（ＩＬ−１５）アンタゴニストポリペプチドをコードしている単離されたか、合成の、又は組換えの核酸に関する。
【００２２】
本明細書において使用する「核酸」という用語は当技術分野におけるその一般的な意味を有し、そしてＤＮＡ分子又はＲＮＡ分子を指す。しかしながら、該用語は、４−アセチルシトシン、８−ヒドロキシ−Ｎ６−メチルアデノシン、アジリジニルシトシン、プソイドイソシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシル、５−カルボキシメチル−アミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルアデニン、１−メチルプソイドウラシル、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−メチルアデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノ−メチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルクエオシン、５’−メトキシカルボニルメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、オキシブトキソシン、プソイドウラシル、クエオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、−ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、プソイドウラシル、クエオシン、２−チオシトシン、及び２，６−ジアミノプリンなどであるがこれらに限定されない、公知のＤＮＡ及びＲＮＡの塩基類似体のいずれかを含む配列も含む。
【００２３】
いくつかの実施態様では、本発明の核酸は、プラスミド、コスミド、エピソーム、人工染色体、ファージ、又はウイルスベクターなどの任意の適切なベクターに含められ得る、ＤＮＡ分子又はＲＮＡ分子である。「ベクター」、「クローニングベクター」及び「発現ベクター」という用語はビヒクルであって、これによってＤＮＡ配列又はＲＮＡ配列（例えば外来遺伝子）を宿主細胞に導入し、よって宿主を形質転換し、そして導入された配列の発現（例えば転写及び翻訳）を促進することができるビヒクルを意味する。
【００２４】
よって、本発明の別の目的は、本発明の核酸を含むベクターに関する。
【００２５】
このようなベクターは、被験者に投与されると前記ポリペプチドの発現を引き起こすか又は指令する、プロモーター、エンハンサー、終結因子などの調節因子を含み得る。ベクターはさらに、１つ又はいくつかの複製起点及び／又は選択マーカーを含み得る。プロモーター領域は、コード配列に対して同質であっても異種であってもよく、そしてインビボにおける使用を含む、任意の適切な宿主細胞において、遍在的な、構成的な、調節された、及び／又は組織特異的な発現をもたらし得る。プロモーターの例としては、細菌プロモーター（Ｔ７、ｐＴＡＣ、Ｔｒｐプロモーターなど）、ウイルスプロモーター（ＬＴＲ、ＴＫ、ＣＭＶ−ＩＥなど）、哺乳動物遺伝子プロモーター（アルブミン、ＰＧＫなど）などが挙げられる。プラスミドの例としては、複製起点を含む複製プラスミド、又は例えばｐＵＣ、ｐｃＤＮＡ、ｐＢＲなどの組み込み型プラスミドが挙げられる。ウイルスベクターの例としては、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、及びＡＡＶベクターが挙げられる。このような組換えウイルスは、パッケージング細胞のトランスフェクトによって、又はヘルパープラスミド若しくはウイルスを用いての一過性トランスフェクションによってなどの、当技術分野において公知である技術によって生成され得る。ウイルスパッケージング細胞の典型例としては、ＰＡ３１７細胞、ＰｓｉＣＲＩＰ細胞、ＧＰｅｎｖ＋細胞、２９３細胞などが挙げられる。このような複製欠損組換えウイルスを生成するための詳細なプロトコールは、例えば、国際公開公報第９５／１４７８５号、国際公開公報第９６／２２３７８号、米国特許第５，８８２，８７７号、米国特許第６，０１３，５１６号、米国特許第４，８６１，７１９号、米国特許第５，２７８，０５６号、及び国際公開公報第９４／１９４７８号に見られ得る。
【００２６】
本発明の別の目的は、本発明に記載の核酸分子及び／又はベクターによってトランスフェクトされたか、感染したか、又は形質転換された宿主細胞に関する。「形質転換」という用語は、宿主細胞への「外来」（すなわち外因性又は細胞外）遺伝子、ＤＮＡ配列又はＲＮＡ配列の導入を意味し、よって宿主細胞は導入された遺伝子又は配列を発現して、導入された遺伝子又は配列によってコードされる所望の物質、典型的にはタンパク質又は酵素を生成するだろう。導入されたＤＮＡ又はＲＮＡを受け取りそして発現する宿主細胞は「形質転換」されている。
【００２７】
本発明の核酸分子を使用して、適切な発現系において本発明の特異的なインターロイキン−１５（ＩＬ−１５）アンタゴニストポリペプチドを生成し得る。「発現系」という用語は、例えばベクターによって担持されそして宿主細胞に導入された外来ＤＮＡによってコードされるタンパク質の発現のために適した条件下の宿主細胞及び適格なベクターを意味する。一般的な発現系としては、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞及びプラスミドベクター、昆虫宿主細胞及びバキュロウイルスベクター、並びに哺乳動物宿主細胞及びベクターが挙げられる。宿主細胞の他の例としては、原核細胞（例えば細菌）及び真核細胞（例えば酵母細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞など）が挙げられるがこれらに限定されない。具体例としては、Ｅ．ｃｏｌｉ、クリイベロマイセス（Kluyveromyces）又はサッカロマイセス（Saccharomyces）酵母、哺乳動物細胞株（例えばＶｅｒｏ細胞、ＣＨＯ細胞、３Ｔ３細胞、ＣＯＳ細胞など）並びに初代又は樹立された哺乳動物細胞培養液（例えば、リンパ芽球、線維芽細胞、胚細胞、上皮細胞、神経細胞、脂肪細胞などから生成）が挙げられる。本発明による発現ベクターの構築、及び宿主細胞の形質転換は、慣用的な分子生物学技術を使用して実施され得る。本発明の特異的なインターロイキン−１５（ＩＬ−１５）アンタゴニストポリペプチドは、例えば、本発明に従って遺伝子的に形質転換された細胞を培養し、そして該細胞によって発現されたポリペプチドを培養液から回収することによって得ることができる。それらは、次いで、必要であれば、例えば分画沈降法、特に硫酸アンモニウム沈降法、電気泳動法、ゲルろ過、アフィニティクロマトグラフィーなどによる、当業者にはそれ自体が公知である慣用的な手順によって精製され得る。特に、組換えタンパク質を調製しそして精製するための慣用的な方法が、本発明に記載のポリペプチドを生成するために使用され得る。したがって、本発明はまた、本発明の特異的なインターロイキン−１５（ＩＬ−１５）アンタゴニストポリペプチドを発現している組換え宿主細胞を生成するための方法に関し、該方法は、（ｉ）インビトロ又はエクスビボにおいて上記のような組換え核酸又はベクターを適格な宿主細胞に導入し、（ｉｉ）インビトロ又はエクスビボにおいて得られた組換え宿主細胞を培養し、そして（ｉｉｉ）場合により、本発明のポリペプチドを発現及び／又は分泌する細胞を選択することからなる工程を含む。このような組換え宿主細胞は、本発明のポリペプチド及び融合タンパク質の生成のために使用され得る。本発明はさらに、本発明の特異的なインターロイキン−１５（ＩＬ−１５）アンタゴニストポリペプチドを生成する方法に関し、該方法は、（ｉ）本発明に記載の形質転換された宿主細胞を、該ポリペプチド又は融合タンパク質の発現を可能とするに適した条件下で培養し；そして（ｉｉ）発現されたポリペプチド又は融合タンパク質を回収することからなる工程を含む。
【００２８】
本発明の特異的なインターロイキン−１５（ＩＬ−１５）アンタゴニストポリペプチドは、自己免疫疾患及び炎症疾患の処置をはじめとする治療目的に特に適している。
【００２９】
したがって、本発明のさらなる目的は、薬物としての使用のための本発明の特異的なインターロイキン−１５（ＩＬ−１５）アンタゴニストポリペプチドに関する。
【００３０】
本発明のさらなる目的は、ある用量の本発明の特異的なインターロイキン−１５（ＩＬ−１５）アンタゴニストポリペプチドを投与し、これによりＩＬ−１５依存性免疫応答を調節することによって、患者における免疫応答を抑制する方法に関する。
【００３１】
特に、本発明の方法は、自己免疫疾患を患っている患者を処置するのに適している。自己免疫疾患の例としては、急性散在性脳脊髄炎（ＡＤＥＭ）、急性壊死性出血性白質脳炎、アジソン病、無ガンマグロブリン血症、円形脱毛症、アミロイドーシス、強直性脊椎炎、抗ＧＢＭ／抗ＴＢＭ腎炎、抗リン脂質抗体症候群（ＡＰＳ）、自己免疫性血管浮腫、自己免疫性再生不良性貧血、自己免疫性自律神経障害、自己免疫性肝炎、自己免疫性高脂血症、自己免疫性免疫不全症、自己免疫性内耳疾患（ＡＩＥＤ）、自己免疫性心筋炎、自己免疫性膵炎、自己免疫性網膜症、自己免疫性血小板減少性紫斑病（ＡＴＰ）、自己免疫性甲状腺疾患、自己免疫性蕁麻疹、軸索性及び神経性神経障害、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、自己免疫性心筋症、キャッスルマン病、セリアック病、シャーガス病、慢性疲労症候群、慢性炎症性脱髄性多発神経炎（ＣＩＤＰ）、慢性再発性多発性骨髄炎（ＣＲＭＯ）、シャーグ・ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡／良性粘膜類天疱瘡、クローン病、コーガン症候群、寒冷凝集素症、先天性心ブロック、コクサッキー心筋炎、クレスト病、本態性混合型クリオグロブリン血症、脱髄性神経障害、疱疹状皮膚炎、皮膚筋炎、デビック病（視神経脊髄炎）、円板状ループス、ドレスラー症候群、子宮内膜症、好酸球性筋膜炎、結節性紅斑、実験的アレルギー性脳脊髄炎、エヴァンス症候群、線維筋痛症、線維性肺胞炎、巨細胞性動脈炎（側頭動脈炎）、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、多発血管炎性肉芽腫症（ＧＰＡ）、グレーブス病、ギランバレー症候群、橋本脳炎、橋本甲状腺炎、溶血性貧血、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、妊娠性疱疹、低ガンマグロブリン血症、高ガンマグロブリン血症、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡ腎症、ＩｇＧ４関連硬化症、免疫調節性リポタンパク質、封入体筋炎、炎症性腸疾患、インシュリン依存性糖尿病（１型）、間質性膀胱炎、若年性関節炎、川崎症候群、ランバート・イートン症候群、白血球破壊性血管炎、扁平苔癬、硬化性苔癬、木質性結膜炎、線状ＩｇＡ病（ＬＡＤ）、ループス（ＳＬＥ）、ライム病、メニエール病、顕微鏡的多発血管炎、混合性結合組織病（ＭＣＴＤ）、意義不明の単クローン性γグロブリン血症（ＭＧＵＳ）、モーレン潰瘍、ムッハ・ハーベルマン病、多発性硬化症、重症筋無力症、筋炎、ナルコレプシー、視神経脊髄炎（デビック病）、自己免疫性好中球減少症、眼部瘢痕性類天疱瘡、視神経炎、回帰性リウマチ、ＰＡＮＤＡＳ（連鎖球菌感染性小児自己免疫神経精神障害）、傍腫瘍性小脳変性症、発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）、パリー・ロムベルグ症候群、パーソナージュ・ターナー症候群、毛様体扁平部炎（周辺性ブドウ膜炎）、天疱瘡、末梢神経障害、静脈周囲性脳脊髄炎、悪性貧血、ＰＯＥＭＳ症候群、結節性多発動脈炎、多腺性自己免疫症候群１型、２型及び３型、リウマチ性多発筋痛症、多発性筋炎、心筋梗塞後症候群、心膜切開後症候群、プロゲステロン皮膚炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、乾癬、乾癬性関節炎、特発性肺線維症、壊疽性膿皮症、赤芽球ろう、レイノー現象、反射性交感神経性ジストロフィー、ライター症候群、再発性多発軟骨炎、下肢静止不能症候群、後���膜線維症、リウマチ熱、関節リウマチ、類肉腫症、シュミット症候群、強膜炎、強皮症、シェーグレン症候群、精子及び精巣自己免疫、全身硬直症候群、亜急性細菌性心内膜炎（ＳＢＥ）、スザック症候群、交感性眼炎、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、トロサ・ハント症候群、横断性脊髄炎、潰瘍性大腸炎、未分化結合組織病（ＵＣＴＤ）、ブドウ膜炎、血管炎、小水疱水疱性皮膚病、白斑、ワルデンストレームマクログロブリン血症（ＷＭ）、並びにウェゲナー肉芽腫症［多発血管炎性肉芽腫症（ＧＰＡ）］が挙げられるがこれらに限定されない。
【００３２】
より特定すると、本発明の方法は、以下：（１）リウマチ疾患、例えば関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、強皮症、混合結合組織疾患、皮膚筋炎、多発性筋炎、ライター症候群、又はベーチェット病、（２）２型糖尿病、（３）甲状腺の自己免疫疾患、例えば橋本甲状腺炎又はグレーブス病、（４）中枢神経系の自己免疫疾患、例えば多発性硬化症、重症筋無力症、又は脳脊髄炎、（５）様々な天疱瘡、例えば尋常性天疱瘡、増殖性天疱瘡、落葉性天疱瘡、シニアー・アッシャー症候群、又はブラジル天疱瘡、（６）乾癬、及び（７）炎症性腸疾患（例えば潰瘍性大腸炎又はクローン病）が挙げられるがこれらに限定されない、自己免疫疾患を患っている患者を処置するのに特に適している。
【００３３】
本発明の特異的なインターロイキン−１５（ＩＬ−１５）アンタゴニストポリペプチドの投与はまた、後天性免疫不全症候群（エイズ）の処置にも有用であり得る。
【００３４】
本発明の特異的なインターロイキン−１５（ＩＬ−１５）アンタゴニストポリペプチドの別の用途としては、後期のＨＴＬＶ（ヒトＴリンパ球向性ウイルス）１型により誘発された成人Ｔ細胞白血病−リンパ腫の処置が挙げられる。Burton et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 91:4935（1994）を参照されたい。
【００３５】
いくつかの実施態様では、本発明の方法は、臓器移植片、組織移植片、又は細胞移植片などの生物学的材料の移植片を受けた患者を処置するために使用される。例えば、本発明の特異的なインターロイキン−１５（ＩＬ−１５）アンタゴニストポリペプチドは、移植片生着（同種移植片又は異種移植片）を促進するのに特に適し得る。典型的には、被験者は、心臓、腎臓、肺、肝臓、膵臓、膵島、脳組織、胃、大腸、小腸、角膜、皮膚、気管、骨、骨髄、筋肉、又は膀胱からなる群より選択される移植片を移植されていてもよい。本発明の方法はまた、レシピエント被験者による、ドナー組織移植片、細胞移植片、又は臓器移植片の拒絶に関連した免疫応答を予防又は抑制するのに特に適している。移植片関連疾患又は障害としては、骨髄移植に関連しているなどの移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）、並びに、例えば皮膚、筋肉、神経、膵島、臓器、肝臓の実質細胞の移植片をはじめとする、臓器、組織又は細胞の移植片（例えば組織又は細胞の同種移植片又は異種移植片）の移植の拒絶から生じた又は関連した免疫障害が挙げられる。したがって、本発明の方法は、宿主対移植片疾患（ＨＶＧＤ）及び移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）の予防に有用である。本発明の特異的なインターロイキン−１５（ＩＬ−１５）アンタゴニストポリペプチドは、移植前、移植の最中、及び／又は移植後に被験者に投与され得る（例えば、移植の少なくとも１日前、移植の少なくとも１日後、及び／又は移植手術それ自体の最中）。いくつかの実施態様では、本発明の特異的なインターロイキン−１５（ＩＬ−１５）アンタゴニストポリペプチドは、移植前及び／又は移植後に周期的に被験者に投与されてもよい。
【００３６】
典型的には、本発明の特異的なインターロイキン−１５（ＩＬ−１５）アンタゴニストポリペプチドは典型的には治療有効量で投与される。「治療有効量」によって、任意の医学的処置に適用可能な妥当なベネフィット／リスク比で疾患を治療及び／又は予防するのに十分な本発明の融合タンパク質又はアンタゴニスト量を意味する。本発明の化合物及び組成物の１日総使用量は、妥当な医学的判断の範囲内で担当の医師によって決定されるであろうことが理解されるだろう。任意の特定の患者に対する具体的な治療有効用量レベルは、処置される疾患及び疾患の重症度；使用される具体的な化合物の活性；使用される具体的な組成、患者の年齢、体重、全般的な健康状態、性別、及び食事；使用される具体的な化合物の投与時刻、投与経路、及び排泄速度；処置期間；使用される具体的なポリペプチドと組み合わせて又は同時に使用される薬物；並びに医学分野において周知である同様な要因をはじめとする、様々な要因に依存するだろう。例えば、所望の治療効果を達成するのに必要とされるよりも低いレベルで化合物の用量を開始し、そして所望の効果が達成されるまで次第に投与量を増加させることは、当技術分野の技能の範囲内において周知である。しかしながら、製品の１日投与量は、１日あたり成人１人あたり０．０１〜１，０００mgまでの幅広い範囲にわたり変更され得る。好ましくは、該組成物は、処置しようとする患者への症候による投与量の調整のために、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、１５．０、２５．０、５０．０、１００、２５０及び５００mgの活性成分を含有している。医薬品は典型的には、約０．０１mg〜約５００mgの活性成分、好ましくは１mg〜約１００mgの活性成分を含有している。薬物の有効量は通常、０．０００２mg/kg（体重）/日〜約２０mg/kg（体重）/日、特に約０．００１mg/kg（体重）/日〜７mg/kg（体重）/日の投与量レベルで供給される。
【００３７】
本発明のさらなる目的は、場合により薬学的に許容される担体又は賦形剤と共に本発明の特異的なインターロイキン−１５（ＩＬ−１５）アンタゴニストポリペプチドを含む、医薬組成物に関する。「薬学的に」又は「薬学的に許容される」は、哺乳動物、特にヒトに適宜投与された場合に、有害反応、アレルギー反応、又は他の望ましくない反応を生じない分子実体及び組成物を指す。薬学的に許容される担体又は賦形剤は、任意の種類の無毒性固体、半固体、又は液体充填剤、希釈剤、封入材料、又は製剤化助剤を指す。経口、舌下、皮下、筋肉内、静脈内、経皮、局所、又は直腸投与用の本発明の医薬組成物において、活性成分は単独で又は別の活性成分と組み合わせて、単位投与剤形で、慣用的な薬学的支持体との混合物として、動物及びヒトへと投与することができる。適切な単位投与剤形としては、経口経路剤形、例えば錠剤、ゲルカプセル剤、散剤、顆粒剤、及び経口用懸濁剤又は液剤、舌下及び頬側投与剤形、エアゾール剤、埋込剤、皮下、経皮、局所、腹腔内、筋肉内、静脈内、皮下、経皮、くも膜下腔内、及び鼻腔内投与剤形、及び直腸投与剤形を含む。好ましくは、医薬組成物は、注射することのできる製剤にとって薬学的に許容可能であるビヒクルを含有する。これらは特に、等張の無菌食塩水溶液（リン酸一ナトリウム若しくはリン酸二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、若しくは塩化マグネシウムなど、又はこのような塩の混合物）、又は、場合に応じて滅菌水若しくは生理食塩水を投与すると注射液の構成が可能となる乾燥させた、特に凍結乾燥させた組成物であり得る。注射用途に適した剤形としては、無菌水溶液又は分散液；ゴマ油、ピーナッツ油、又は水性プロピレングリコールを含む製剤；及び無菌注射溶液又は分散液の即時調製のための無菌粉末が挙げられる。全ての場合において、剤形は無菌でなければならず、そしてシリンジが容易に扱える程度に流動性でなければならない。それは、製造及び保存の条件下で安定でなければならず、そして細菌及び真菌などの微生物の汚染作用から防腐されていなければならない。遊離塩基又は薬理学的に許容される塩として本発明の化合物を含む溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合された水中で調製され得る。分散液はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、及びその混合物中、並びに油中において調製されてもよい。通常の保存及び使用条件下において、これらの調製物は、微生物の増殖を防ぐための保存剤を含有する。本発明の特異的なインターロイキン−１５（ＩＬ−１５）アンタゴニストポリペプチドは、中性すなわち塩の形態の組成物へと製剤化されてもよい。薬学的に許容される塩としては、酸付加塩（これはタンパク質の遊離アミノ基を用いて形成される）が挙げられ、これは、例えば塩酸若しくはリン酸などの無機酸、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などのような有機酸を用いて形成される。遊離カルボキシル基を用いて形成される塩はまた、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、又は水酸化鉄などの無機塩基、及びイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどのような有機塩基から誘導され得る。担体はまた、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、適切なその混合物、及び植物油を含有している、溶媒又は分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用によって、分散液の場合には必要とされる粒径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持され得る。微生物の作用の防御は、様々な抗細菌剤及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらされ得る。多くの場合、等張剤、例えば、糖又は塩化ナトリウムを含めることが好ましいであろう。注射用組成物の延長吸収は、該組成物に、吸収を遅延する物質、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを使用することによってもたらされ得る。無菌注射液は、必要量の活性ポリペプチドを、適切な溶媒中に、必要であれば上記に列挙されたいくつかの他の成分と共に取り込み、その後、滅菌ろ過することによって調製される。一般的には、分散液は、様々な滅菌された活性成分を、基本分散媒体と上記に列挙された成分の中からの必要とされる他の成分とを含有する無菌ビヒクルに取り込むことによって調製される。無菌注射液の調製のための無菌粉末の場合、好ましい調製法は真空乾燥技術及び凍結乾燥技術であり、これにより、事前に滅菌ろ過されたその溶液から活性成分と任意の追加の所望の成分の粉末が生じる。製剤化されると、液剤は、投与製剤に適合した様式で、治療的に有効な量で投与されるだろう。製剤は、上記の種類の注射液などの様々な投与剤形で容易に投与されるが、薬物放出カプセルなども使用され得る。水溶液での非経口投与のために、例えば、液剤は、必要であれば適切に緩衝化されるべきであり、そして液体希釈剤はまず、十分な食塩水又はブドウ糖を用いて等張とされるべきである。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下、及び腹腔内投与に特に適している。これに関連して、使用され得る無菌水性媒体は、本開示に鑑みて当業者には公知であろう。例えば、１回投与量を１mlの等張ＮａＣｌ溶液に溶かし、そして１０００mlの皮下点滴療法用の液体に加え得るか又は提案された注入部位に注射し得る。投与量の幾分の変更が、処置される被験者の容態に応じて必然的に行なわれるだろう。投与責任者は、いずれの事象においても、個々の被験者に対する適切な用量を決定するだろう。本発明の特異的なインターロイキン−１５（ＩＬ−１５）アンタゴニストポリペプチドは、治療用混合物内において、１回の用量あたり、約０．０００１〜１．０mg、又は約０．００１〜０．１mg、又は約０．１〜１．０、又はさらには約１０mgなどを含むように製剤化され得る。複数回の用量を投与してもよい。静脈内又は筋肉内注射などの、非経口投与用に製剤化された本発明の化合物の他に、他の薬学的に許容される剤形としては、例えば、経口投与用の錠剤又は他の固形剤；リポソーム製剤；徐放性カプセル剤；及び現在使用されるあらゆる他の剤形が挙げられる。
【００３８】
本発明は、以下の図面及び実施例によってさらに説明されるだろう。しかしながら、これらの実施例及び図面は、いずれにしても、本発明の範囲を制限するものと解釈されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】細胞増殖に対する突然変異ＲＬＩ又は突然変異ＩＬ−１５の効果。Ｋｉｔ−２２５細胞（Ａ）、ＴＦ−１β細胞（Ｂ）及びＮＫ−９２細胞（Ｃ）を、漸増濃度のＩＬ−１５（■）、ＲＬＩ（●）、ＲＬＩ １０１−１０８（▲）、ＲＬＩ ６５−６９−１０１−１０８（◇）、ＲＬＩ ６５（▽）と共に７２時間培養した。Ｋｉｔ−２２５細胞（Ｄ）及びＮＫ−９２細胞（Ｅ）を、漸増濃度のＩＬ−１５（■）、ＩＬ−１５ １０１(○)又はＩＬ−１５ １０８（△）と共に７２時間培養した。細胞増殖はアラマーブルー（登録商標）アッセイによって定量された。
【図２】ＲＬＩにより誘発された細胞増殖に対する突然変異ＲＬＩの効果。Ｋｉｔ−２２５細胞（Ａ）、ＴＦ−１β細胞（Ｂ）及びＮＫ−９２細胞（Ｃ）を、一定濃度のＲＬＩ（Ｋｉｔ−２２５及びＴＦ−１βについては４０pM；ＮＫ−９２については１０pM）及び漸増濃度のＲＬＩ １０１−１０８（■）、ＲＬＩ ６５−６９−１０１−１０８（○）又はＲＬＩ ６５（●）と共に７２時間培養した。細胞増殖はアラマーブルー（登録商標）アッセイによって定量された。
【図３】ＩＬ−１５により誘発された細胞増殖に対する突然変異ＲＬＩの効果。Ｋｉｔ−２２５細胞（Ａ）、ＴＦ−１β細胞（Ｂ）及びＮＫ−９２細胞（Ｃ）を、一定濃度のＩＬ−１５（Ｋｉｔ−２２５については８０pM、ＴＦ−１β及びＮＫ−９２については４０pM）及び漸増濃度のＲＬＩ １０１−１０８（■）、ＲＬＩ ６５−６９−１０１−１０８（○）又はＲＬＩ ６５（●）と共に７２時間培養した。細胞増殖はアラマーブルー（登録商標）アッセイによって定量された。
【図４】ＩＬ−１５又はＩＬ−２により誘発された細胞増殖に対する突然変異ＩＬ−１５の効果。Ｋｉｔ−２２５細胞（左パネル）及びＮＫ−９２細胞（右パネル）を、一定濃度のＩＬ−１５（Ａ）又はＩＬ−２（Ｂ）（Ｋｉｔ−２２５については８０pM及びＮＫ−９２については４０pM）及び漸増濃度のＲＬＩ １０１−１０８（■）、ＩＬ−１５ １０１（●）又はＩＬ−１５ １０８（○）と共に７２時間培養した。細胞増殖はアラマーブルー（登録商標）アッセイによって定量された。
【図５】ＩＬ−２Ｒα遮断抗体の存在下におけるＩＬ−２により誘発された細胞増殖に対する突然変異ＲＬＩの効果。Ｋｉｔ−２２５細胞（Ａ）又はＮＫ−９２細胞（Ｂ）を、一定濃度のＩＬ−２（それぞれ５００又は８０pM）、３３Ｂ３．１遮断抗体（５nM）及び漸増濃度のＲＬＩ １０１−１０８（■）又はＲＬＩ ６５−６９−１０１−１０８（○）と共に７２時間培養した。細胞増殖はアラマーブルー（登録商標）アッセイによって定量された。
【図６】ＩＬ−１５又はＩＬ−２によるＮＫ−９２細胞の簡潔な刺激前の、突然変異ＲＬＩの効果。ＮＫ−９２細胞を、ＩＬ−１５（Ａ）又はＩＬ−２（Ｂ）（４０pM）を用いて３０分間かけて刺激する前に、２００nMの突然変異ＲＬＩと共に３０分間インキュベートした。次いで、細胞を、２４時間培養し、そして細胞増殖をアラマーブルー（登録商標）アッセイによって定量した。
【図７】ＩＬ−１５又はＩＬ−２によるＮＫ−９２細胞の簡潔な刺激後の、突然変異ＲＬＩの効果。ＮＫ−９２細胞を、１nMのＩＬ−１５（Ａ）又はＩＬ−２（Ｂ）と共に３０分間インキュベートした。２回洗浄した後、細胞を、一定濃度の突然変異ＲＬＩ（２００nM）と共に２４時間培養した。細胞増殖はアラマーブルー（登録商標）アッセイによって定量された。
【図８】ＮＫ−９２細胞の代謝活性の伝搬に対する、突然変異ＲＬＩの効果。ＮＫ−９２細胞を、ＩＬ−１５（Ａ）又はＩＬ−２（Ｂ）（１nM）を用いて３０分間かけて刺激した。２回洗浄した後、刺激された細胞を、突然変異ＲＬＩ（５０nM）の存在下においてサイトカインを飢餓させたＮＫ−９２細胞と共に２４時間培養した。細胞増殖はアラマーブルー（登録商標）アッセイによって定量された。
【図９】ＮＫ及びＣＤ４Ｔ−ｒｅｇの恒常性に対する突然変異ＲＬＩのインビボにおける効果。ＰＢＳ又は突然変異ＲＬＩを、毎日３日間注射した（注射１回につき２μg）。マウスを１日後に屠殺した。脾臓及び骨髄を回収し、そして細胞を単離した。ＮＫ細胞は、ＮＫ１．１＋ＣＤ３−として同定され、そしてＴ−ｒｅｇ細胞はＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋であった。
【図１０】ＩＬ−１５のアンタゴニスト特性に対するＱ１０１位又はＱ１０８位における異なる突然変異の予測される効果に基づいた分子モデリング。
【図１１Ａ−Ｃ】固定されたＣＤ１２２鎖（Ａ及びＣ）又はＦｃ−ＩＬ−１５Ｒα鎖（Ｂ及びＤ）に対する、漸増濃度（３．１、６．２、１２．５、２５、５０及び１００nM）の示された分子の結合（会合相及び解離相）のＳＰＲセンサーグラム。（Ｅ）固定されたＣＤ１２２鎖に対して漸増濃度の野生型ＲＬＩ又はＲＬＩＱ１０８Ｄが結合し、続いてＣＤ１３２鎖が順次結合するＳＰＲセンサーグラム。
【図１１Ｄ−Ｅ】固定されたＣＤ１２２鎖（Ａ及びＣ）又はＦｃ−ＩＬ−１５Ｒα鎖（Ｂ及びＤ）に対する、漸増濃度（３．１、６．２、１２．５、２５、５０及び１００nM）の示された分子の結合（会合相及び解離相）のＳＰＲセンサーグラム。（Ｅ）固定されたＣＤ１２２鎖に対して漸増濃度の野生型ＲＬＩ又はＲＬＩＱ１０８Ｄが結合し、続いてＣＤ１３２鎖が順次結合するＳＰＲセンサーグラム。
【図１２Ａ】（Ａ）遮断性ＴＵ−２７又は非遮断性ＣＦ−１抗ＣＤ１２２ｍＡｂによって判明した、ＲＬＩＱ１０８Ｄ又はＲＬＩＮ６５Ｋにより前処置されたＮＫ−９２細胞の表面上におけるＣＤ１２２発現のフローサイトメトリー分析。（Ｂ）ＮＫ−９２細胞に結合する示された分子と、放射性ヨウ素化された野生型ＲＬＩ（１nM）との競合試験。
【図１２Ｂ】（Ａ）遮断性ＴＵ−２７又は非遮断性ＣＦ−１抗ＣＤ１２２ｍＡｂによって判明した、ＲＬＩＱ１０８Ｄ又はＲＬＩＮ６５Ｋにより前処置されたＮＫ−９２細胞の表面上におけるＣＤ１２２発現のフローサイトメトリー分析。（Ｂ）ＮＫ−９２細胞に結合する示された分子と、放射性ヨウ素化された野生型ＲＬＩ（１nM）との競合試験。
【図１３Ａ】漸増濃度の示された分子と共に培養した（Ａ）Ｋｉｔ２２５細胞又は（Ｂ）ＮＫ−９２細胞の増殖アッセイ。
【図１３Ｂ】漸増濃度の示された分子と共に培養した（Ａ）Ｋｉｔ２２５細胞又は（Ｂ）ＮＫ−９２細胞の増殖アッセイ。
【図１４Ａ】（Ａ）ＲＬＩＱ１０８Ｄ又はＲＬＩＮ６５Ｋの非存在下又は存在下における野生型ＲＬＩにより誘発されるＳｔａｔ５及びＳｔａｔ３リン酸化のフローサイトメトリー分析。アイソタイプ対照が示されている。（Ｂ）一定濃度の野生型ＲＬＩ（４０pM）及び漸増濃度のＲＬＩＱ１０８Ｄ又はＲＬＩＮ６５Ｋと共に培養されたＫｉｔ２２５細胞、ＮＫ−９２細胞及びＴＦ−１β細胞の増殖アッセイ。
【図１４Ｂ】（Ａ）ＲＬＩＱ１０８Ｄ又はＲＬＩＮ６５Ｋの非存在下又は存在下における野生型ＲＬＩにより誘発されるＳｔａｔ５及びＳｔａｔ３リン酸化のフローサイトメトリー分析。アイソタイプ対照が示されている。（Ｂ）一定濃度の野生型ＲＬＩ（４０pM）及び漸増濃度のＲＬＩＱ１０８Ｄ又はＲＬＩＮ６５Ｋと共に培養されたＫｉｔ２２５細胞、ＮＫ−９２細胞及びＴＦ−１β細胞の増殖アッセイ。
【図１５Ａ】（Ａ）５０nMのＲＬＩＱ１０８Ｄ又はＩＬ−１５Ｑ１０８Ｄの存在下又は非存在下においてＩＬ−１５（２５pM）のローディングされた又はローディングされていない安定にトランスフェクトされたＩＬ−１５Ｒを提示するＨｅＬａ細胞と共に１時間共培養した後の、Ｋｉｔ２２５応答細胞内のｐ−Ｓｔａｔ５発現の分析。数字は、示されたゲート内の細胞のパーセンテージを示す。（Ｂ）ＲＬＩＱ１０８Ｄ（１００nM）の存在下においてＩＬ−１５Ｒを提示するＨｅＬａ細胞上にローディングされた漸増濃度のＩＬ−１５に応答した、ｐ−Ｓｔａｔ５陽性Ｋｉｔ２２５応答細胞のパーセンテージ。
【図１５Ｂ】（Ａ）５０nMのＲＬＩＱ１０８Ｄ又はＩＬ−１５Ｑ１０８Ｄの存在下又は非存在下においてＩＬ−１５（２５pM）のローディングされた又はローディングされていない安定にトランスフェクトされたＩＬ−１５Ｒを提示するＨｅＬａ細胞と共に１時間共培養した後の、Ｋｉｔ２２５応答細胞内のｐ−Ｓｔａｔ５発現の分析。数字は、示されたゲート内の細胞のパーセンテージを示す。（Ｂ）ＲＬＩＱ１０８Ｄ（１００nM）の存在下においてＩＬ−１５Ｒを提示するＨｅＬａ細胞上にローディングされた漸増濃度のＩＬ−１５に応答した、ｐ−Ｓｔａｔ５陽性Ｋｉｔ２２５応答細胞のパーセンテージ。
【図１６】（Ａ）一定濃度のＩＬ−２（１nM）及び漸増濃度のＲＬＩＱ１０８Ｄと共に培養されたＴＦ−１β細胞の増殖アッセイ。（Ｂ）ＣＤ８Ｔ細胞を、ＲＬＩＱ１０８Ｄ（５０nM）の存在下又は非存在下において５nMの示されたサイトカインを用いて刺激した。（Ｃ）ヒトＰＢＭＣの増殖を、フローサイトメトリーによって評価した。単離されたＰＢＭＣをＶＰＤ−４５０によって標識し、そして１００nMのＲＬＩＱ１０８Ｄの存在下又は非存在下において漸増濃度のＩＬ−１５又は（Ｄ）ＩＬ−２と共に培養した。ＣＤ８Ｔ細胞はＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞として同定された。
【図１７】（Ａ）示されているように処置されたマウスの脾臓ＮＫｐ４６＋ＣＤ３−ＮＫ細胞及び（Ｂ）ＣＤ８Ｔ細胞内のｐ−Ｓｔａｔ５の分析（１条件あたりｎ＝５）。
【図１８Ａ−Ｆ】ＩＬ−２Ｒαは、ＲＬＩＱ１０８ＤによるＩＬ−２シグナル伝達の阻害を損なう。（Ａ）アルファスクリーン技術によって明らかとなった、ＲＬＩＱ１０８Ｄを用いて１時間処置されたか（白色の棒グラフ）又は処置されていない（黒色の棒グラフ）Ｋｉｔ２２５細胞内のＩＬ−１５及びＩＬ−２により誘発されるＳｔａｔ５のリン酸化の阻害アッセイ。（Ｂ）一定濃度のＩＬ−２（８０pM）及び漸増濃度のＲＬＩＱ１０８Ｄ又はＲＬＩＮ６５Ｋと共に培養したＫｉｔ２２５細胞の増殖アッセイ。（Ｃ）一定濃度のＩＬ−２（８０pM）及び３３Ｂ３．１抗ＣＤ２５ｍＡｂ（６６nM）並びに漸増濃度のＲＬＩＱ１０８Ｄ又はＲＬＩＮ６５Ｋと共に培養したＫｉｔ２２５細胞の増殖アッセイ。（Ｄ）一定濃度のＩＬ−１５（４０pM）並びに漸増濃度のＲＬＩＱ１０８Ｄ及び／又はＩＬ−１５Ｑ１０８Ｄと共に培養したＫｉｔ２２５細胞の増殖アッセイ。（Ｅ）ヒトＰＢＭＣからのＮＫ細胞の増殖をフローサイトメトリーによって評価した。単離されたＶＰＤ−４５０で標識されたＰＢＭＣを、一定濃度のＩＬ−１５又は（Ｆ）ＩＬ−２と共に３３Ｂ３．１抗ＣＤ２５ｍＡｂ及び漸増濃度のＲＬＩＱ１０８Ｄの存在下又は非存在下において、培養した。ＮＫ細胞は、ＣＤ３−ＮＫｐ４６＋細胞として同定された。（Ｇ）ＩＬ−２により誘発されるＣＤ４Ｔ細胞の増殖を、ＲＬＩＱ１０８Ｄの存在下又は非存在下においてＣＤ２５の発現に対するＶＰＤ−４５０の希釈度によって評価した。（Ｈ）ＩＬ−２により誘発されるＣＤ２５−Ｔ細胞又は（Ｉ）ＣＤ２５＋ＣＤ４＋ＣＤ３＋Ｔ細胞の増殖を、１００nMのＲＬＩＱ１０８Ｄの存在下又は非存在下においてＣＤ２５の発現に対するＶＰＤ−４５０の希釈度によって評価した。
【図１８Ｇ−Ｉ】ＩＬ−２Ｒαは、ＲＬＩＱ１０８ＤによるＩＬ−２シグナル伝達の阻害を損なう。（Ａ）アルファスクリーン技術によって明らかとなった、ＲＬＩＱ１０８Ｄを用いて１時間処置されたか（白色の棒グラフ）又は処置されていない（黒色の棒グラフ）Ｋｉｔ２２５細胞内のＩＬ−１５及びＩＬ−２により誘発されるＳｔａｔ５のリン酸化の阻害アッセイ。（Ｂ）一定濃度のＩＬ−２（８０pM）及び漸増濃度のＲＬＩＱ１０８Ｄ又はＲＬＩＮ６５Ｋと共に培養したＫｉｔ２２５細胞の増殖アッセイ。（Ｃ）一定濃度のＩＬ−２（８０pM）及び３３Ｂ３．１抗ＣＤ２５ｍＡｂ（６６nM）並びに漸増濃度のＲＬＩＱ１０８Ｄ又はＲＬＩＮ６５Ｋと共に培養したＫｉｔ２２５細胞の増殖アッセイ。（Ｄ）一定濃度のＩＬ−１５（４０pM）並びに漸増濃度のＲＬＩＱ１０８Ｄ及び／又はＩＬ−１５Ｑ１０８Ｄと共に培養したＫｉｔ２２５細胞の増殖アッセイ。（Ｅ）ヒトＰＢＭＣからのＮＫ細胞の増殖をフローサイトメトリーによって評価した。単離されたＶＰＤ−４５０で標識されたＰＢＭＣを、一定濃度のＩＬ−１５又は（Ｆ）ＩＬ−２と共に３３Ｂ３．１抗ＣＤ２５ｍＡｂ及び漸増濃度のＲＬＩＱ１０８Ｄの存在下又は非存在下において、培養した。ＮＫ細胞は、ＣＤ３−ＮＫｐ４６＋細胞として同定された。（Ｇ）ＩＬ−２により誘発されるＣＤ４Ｔ細胞の増殖を、ＲＬＩＱ１０８Ｄの存在下又は非存在下においてＣＤ２５の発現に対するＶＰＤ−４５０の希釈度によって評価した。（Ｈ）ＩＬ−２により誘発されるＣＤ２５−Ｔ細胞又は（Ｉ）ＣＤ２５＋ＣＤ４＋ＣＤ３＋Ｔ細胞の増殖を、１００nMのＲＬＩＱ１０８Ｄの存在下又は非存在下においてＣＤ２５の発現に対するＶＰＤ−４５０の希釈度によって評価した。
【図１９】（Ａ）マウスを、ポリ（Ｉ：Ｃ）の投与前にＲＬＩＱ１０８Ｄを用いて処置したか又は処置しなかった。マウスの血中のＮＫ細胞を、ＩＦＮγ及びＣＤ６９の発現についてフローサイトメトリーによって分析した。（Ｂ）示されたように処置されたマウスの血中のＣＤ８Ｔ細胞及び（Ｃ）ＣＤ４Ｔ細胞上でのＣＤ６９の発現の分析。
【図２０Ａ−Ｃ】（Ａ）ヒトＰＢＭＣ由来の全ＣＤ４Ｔ細胞の中のＦｏｘＰ３＋ＣＤ２５＋ＣＤ４Ｔ細胞のパーセンテージをフローサイトメトリーによって分析した。（Ｂ）ＲＬＩＱ１０８Ｄの存在下又は非存在下において示された濃度のＩＬ−２を用いて刺激されたヒトＰＢＭＣの中のＣＤ８Ｔ細胞に対する増殖性ＣＤ４制御性Ｔ細胞の比率。（Ｃ）示されたように処置されたマウスの脾臓ＣＤ４４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞又は（Ｄ）ＣＤ３−ＮＫｐ４６＋ＮＫ細胞を、フローサイトメトリーによって分析した。（Ｅ）示されたように処置されたマウスの示された成熟段階における脾臓ＮＫ細胞の数。（Ｆ）脾臓ＦｏｘＰ３＋ＣＤ２５＋ＣＤ４Ｔ細胞をフローサイトメトリー及び（Ｇ）リンパ球ゲートの中のＮＫ細胞に対するＣＤ４制御性Ｔ細胞の比率を示すグラフによって分析した。
【図２０Ｄ−Ｇ】（Ａ）ヒトＰＢＭＣ由来の全ＣＤ４Ｔ細胞の中のＦｏｘＰ３＋ＣＤ２５＋ＣＤ４Ｔ細胞のパーセンテージをフローサイトメトリーによって分析した。（Ｂ）ＲＬＩＱ１０８Ｄの存在下又は非存在下において示された濃度のＩＬ−２を用いて刺激されたヒトＰＢＭＣの中のＣＤ８Ｔ細胞に対する増殖性ＣＤ４制御性Ｔ細胞の比率。（Ｃ）示されたように処置されたマウスの脾臓ＣＤ４４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞又は（Ｄ）ＣＤ３−ＮＫｐ４６＋ＮＫ細胞を、フローサイトメトリーによって分析した。（Ｅ）示されたように処置されたマウスの示された成熟段階における脾臓ＮＫ細胞の数。（Ｆ）脾臓ＦｏｘＰ３＋ＣＤ２５＋ＣＤ４Ｔ細胞をフローサイトメトリー及び（Ｇ）リンパ球ゲートの中のＮＫ細胞に対するＣＤ４制御性Ｔ細胞の比率を示すグラフによって分析した。
【図２１】（Ａ）２０週令のマウスをＲＬＩＱ１０８Ｄを用いて処置し、そして脾臓ＦｏｘＰ３＋ＣＤ２５＋ＣＤ４Ｔ細胞を分析した。（Ｂ）Ｂａｌｂ／ｃマウスの皮膚をＤＢＡ／２レシピエントマウスに移植した。マウス（１条件あたりｎ＝１０）を１０μgのＲＬＩＱ１０８Ｄを用いて１日１回処置し、そして移植片生着をモニタリングした。
【００４０】
実施例１：
材料及び方法
細胞培養液
D.Cantrell博士（ダンディー大学、スコットランド、イギリス）から入手した非接着性Ｋｉｔ−２２５ヒトＴリンパ腫細胞株を、６％の熱により失活させたウシ胎児血清、２mMのグルタミン、及び５ng/mLのヒトｒＩＬ−２を含有しているＲＰＭＩ−１６４０培地（ギブコ−インビトロジェン社）中で培養した。B.Azzarone博士（ギュスタブ・ルシー研究所、ヴィルジェイフ、フランス）によって親切にも提供された非接着性ＴＦ−１βヒト赤白血病細胞株を、１０％の熱により失活させたウシ胎児血清、２mMのグルタミン、１ng/mLのＧＭ−ＣＳＦ、及び２５０μg/mLのジェネテシンを含有しているＲＰＭＩ １６４０培地中で培養した。Henri Vie（インセルムＵ８９２、ナント、フランス）によって親切にも提供されたＮＫ−９２細胞株を、１０％の熱により失活させたウシ胎児血清、２mMのグルタミン、及び５ng/mLのヒトｒＩＬ−２を含有しているＲＰＭＩ−１６４０培地（ギブコ−インビトロジェン社）中で培養した。
【００４１】
増殖アッセイ
サイトカインに対するＫｉｔ−２２５細胞、ＴＦ−１β細胞及びＮＫ−９２細胞の増殖応答を、アラマーブルー（登録商標）アッセイ（ＡｂＤセロテック社、キッドリントン、イギリス）によって定量した。簡潔に言えば、細胞を、Ｋｉｔ−２２５については２４時間又はＴＦ−１β及びＮＫ−９２については５時間かけて、サイトカインを含まない培養培地中で飢餓させた。細胞を１００μl中に１×１０４個の細胞で播種し、そして漸増濃度の試験タンパク質の補充された培地中で、又は一定濃度のヒトｒＩＬ−１５、ヒトｒＩＬ−２若しくはＲＬＩ及び漸増濃度の試験アンタゴニストの補充された培地中で４８時間培養した。細胞を、１ウェルあたり１０μLのアラマーブルーで６時間かけてパルス標識した。細胞増殖を、Ｅｎｓｐｉｒｅプレートリーダー（パーキンエルマー社、ホプキントンＭＡ州、アメリカ）を使用して５５０／５９０nmの蛍光を測定することによって評価した。
【００４２】
サイトカインによる短時間の刺激
サイトカインによる短時間の刺激に対するＫｉｔ−２２５細胞、ＴＦ−１β細胞及びＮＫ−９２細胞の増殖応答を、アラマーブルー（登録商標）アッセイによって定量した。簡潔に言えば、細胞を、２４時間、サイトカインを含まない培養培地中で飢餓させた。それらを１mLあたり２×１０５個の細胞で、４０pM又は１nMのヒトｒＩＬ−１５又はｒＩＬ−２と共に３０分間インキュベートし、２回洗浄し、そして一定濃度の試験タンパク質の補充された培地中で２４時間培養した。細胞代謝活性を先に記載されているようにアラマーブルーによってアッセイした。２回目のセットの実験において、３０分間のサイトカインによる刺激を、３０分後以降に、試験タンパク質と接触させた細胞上で実現した。
【００４３】
生存シグナルの伝搬
細胞代謝活性の伝搬を、アラマーブルー（登録商標）アッセイによって検出した。簡潔に言えば、細胞を、サイトカインを含まない培養培地中で２４時間の間に飢餓させた。細胞を、１mLあたり２×１０５個の細胞で１nMのヒトｒＩＬ−１５又はｒＩＬ−２と共に３０分間インキュベートし、２回洗浄し、そして２×１０４個のこれらの活性化細胞を、アンタゴニストの存在下で飢餓させた２×１０４個の細胞と共に２４時間培養した。細胞生存率を、先に記載されている通りにアラマーブルーによって評価した。
【００４４】
ＮＫ個体群及びＴ−ｒｅｇ個体群に対する突然変異ＲＬＩのインビボにおける効果
ＰＢＳ又は突然変異ＲＬＩを毎日３日間（注射１回あたり２μg）注射した。マウスを１日後に屠殺した。脾臓及び骨髄を回収し、そして細胞を単離した。フローサイトメトリーによって、ＮＫ細胞はＮＫ１．１＋ＣＤ３−細胞として同定され、そしてＴ−ｒｅｇ細胞はＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋であった。
【００４５】
結果
トランス提示を通して作用するＩＬ−１５を阻害するために、本発明者らは、ＩＬ−１５単独よりも高い親和性でＣＤ１２２に結合する融合分子（ＲＬＩ）を作製し、そしてＣＤ１３２界面において突然変異させた（ＲＬＩＱ１０８Ｄ）。結果として、突然変異ＲＬＩはＣＤ１２２鎖に効率的に結合するが、応答細胞内のシグナルを伝達できない。本発明者らは、Ｋｉｔ−２２５細胞、ＴＦ−１ｂ細胞及びＮＫ−９２細胞が野生型ＩＬ−１５及びＲＬＩの両方に応答して増殖するが、突然変異ＲＬＩに応答した増殖シグナルは全く検出されなかったことを観察した（図１）。次いで、本発明者らは、突然変異ＲＬＩが、ＣＤ１２２／ＣＤ１３２二量体受容体に直接標的化する野生型ＲＬＩ依存性増殖を阻害することができるかどうかを試験した。本発明者らは、突然変異ＲＬＩが、ＲＬＩ依存性細胞増殖を効率的に阻害し、２nMでＩＣ５０に到達することを発見した（図２）。驚くべきことに、本発明者らは、突然変異ＲＬＩがＩＬ−１５依存性増殖を効率的に消失させたことを観察したが（図３）、ＩＬ−２依存性増殖に対する阻害は全く観察されなかった（図４）。本発明者らは、突然変異ＲＬＩは、ＣＤ２５が遮断された場合にのみ（３３Ｂ３．１遮断抗体）ＩＬ−２依存性シグナルを阻害することができたことを発見した（図５）。突然変異ＲＬＩがＩＬ−１５シグナルを阻害する効力を確認するために、本発明者らは細胞をサイトカインと共に３０分間インキュベートすることによって「パルス刺激」アッセイを評価し、次いで、結合していないサイトカインを除去するために洗浄した後、細胞を、サイトカイン非含有培地中に２４時間かけて再懸濁した。本発明者らは、突然変異ＲＬＩがＩＬ−１５に対する細胞応答を効率的に減少させたが、ＩＬ−２に対する細胞応答は減少させなかったことを観察した（図７及び８）。最後に、本発明者らは、突然変異ＲＬＩがマウスにおけるＮＫ個体群及びＴ−ｒｅｇ個体群に影響を及ぼし得るかどうかを調べた。その目的のために、本発明者らは突然変異ＲＬＩ又はＰＢＳを毎日３日間注射した（注射１回あたり２μg）。１日後、マウスを屠殺し、そしてＮＫ及びＴ−ｒｅｇを脾臓及び骨髄から単離した。本発明者らは、ＮＫ個体群が、脾臓への突然変異ＲＬＩの注射後に減少したことを観察した。一方でＴ−ｒｅｇ個体群は未変化のままであった。骨髄には全く差は観察されなかった（図９）。
【００４６】
実施例２：
材料及び方法：
細胞株
非接着性Ｋｉｔ２２５ヒトＴリンパ腫細胞株を、６％の熱で失活させたウシ胎児血清、２mMのグルタミン、及び５ng/mLのヒトｒＩＬ−２を含有しているＲＰＭＩ−１６４０培地（ギブコ−インビトロジェン社）中で培養した。Henri Vie（ＣＲＣＮＡ、ナント、フランス）によって親切にも提供されたＮＫ−９２細胞株を、１０％の熱により失活させたヒト血清、２mMのグルタミン、及び５ng/mLのヒトｒＩＬ−２を含有しているＲＰＭＩ−１６４０培地（ギブコ−インビトロジェン社）中で培養した。非接着性ＴＦ−１βヒト赤白血病細胞株を、１０％の熱により失活させたウシ胎児血清、２mMのグルタミン、１ng/mLのＧＭ−ＣＳＦ、及び２５０μg/mLのジェネテシンを含有しているＲＰＭＩ １６４０培地中で培養した。
【００４７】
健康なドナー血液試料を、フランス血液バンク（Etablissement Francais du Sang（ＥＦＳ））から回収した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をフィコール勾配で単離した。全ての細胞株を３７℃の加湿した５％ＣＯ２の雰囲気で維持した。
【００４８】
表面プラズモン共鳴試験
ＳＰＲ実験を、ビアコア３０００バイオセンサー（ビアコア社、ウプサラ、スウェーデン）を用いて実施した。組換えタンパク質（ｈＣＤ１２２、ｈＣＤ１３２、Ｆｃ−ＩＬ−１５Ｒα）をＣＭ５センサーチップに共有結合により連結させ、そして漸増濃度のリガンド（ＩＬ−１５、ＩＬ−１５Ｑ１０８Ｄ、ＲＬＩ、ＲＬＩＱ１０８Ｄ、ＲＬＩＮ６５Ｋ）の結合をモニタリングした。センサーグラムの分析を、ＢＩＡｌｏｇｕｅ動態評価ソフトウェアを使用して実施した。
【００４９】
アルファスクリーンシュアファイアアッセイ
Ｋｉｔ２２５細胞を、ＩＬ−２を含まない無血清培地中で１２時間かけて飢餓させ、そして２×１０５個の細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレートに播種した。Ｋｉｔ２２５細胞を、ＲＬＩＱ１０８Ｄと共に３０分間インキュベートし、次いで４０pMのＩＬ−１５又はＩＬ−２を用いて１時間かけて刺激した。Ｓｔａｔ５リン酸化をｐ−Ｓｔａｔ５アルファスクリーンシュアファイアキット（パーキンエルマーライフサイエンシーズ社）を使用して測定した。刺激後、細胞を溶解した。次いで、４μlの溶解液を３８４ウェルの白色Ｏｐｔｉプレート（パーキンエルマーライフサイエンシーズ社）に移し、そしてＳｔａｔ５リン酸化を製造業者の説明書に従って測定した。未処置の状態から得られたＳｔａｔ５リン酸化値を、リガンドの存在下において特定のＳｔａｔ５リン酸化値について得られた数値から差し引いた。
【００５０】
増殖アッセイ
サイトカインに対するＫｉｔ２２５細胞の増殖応答をアラマーブルーアッセイ（ＡｂＤセロテック社、キッドリントン、イギリス）によって定量した。簡潔に言えば、細胞を、サイトカイン非含有培養培地中で一晩かけてＫｉｔ２２５細胞について飢餓させた。細胞を、１００μl中に１０４個の細胞で播種し、そして一定濃度のヒトｒＩＬ−１５、ヒトｒＩＬ−２、又はＲＬＩ、及び漸増濃度のＲＬＩＱ１０８Ｄアンタゴニストの補充された培地中で７２時間培養した。細胞を、１ウェルあたり１０μLのアラマーブルーで６時間かけてパルス標識した。細胞増殖を、Ｅｎｓｐｉｒｅプレートリーダー（パーキンエルマー社、ホプキントンＭＡ州、アメリカ）を使用して５５０／５９０nmでの蛍光を測定することによって評価した。
【００５１】
フローサイトメトリー
ｈ／ｍＣＤ３、ｈ／ｍＣＤ８、ｈ／ｍＣＤ４、ｈ／ｍＮＫｐ４６、ｍＮＫ１．１、ｍＣＤ２７、ｍＣＤ１１ｂ、ｍＣＤ４４、ｈ／ｍＣＤ１３２、ｍＣＤ１２２、ｈ／ｍＣＤ２５、ｈＩＬ−１５Ｒαの細胞表面発現を、市販の抗体を使用して実施した。染色前に、Ｆｃ受容体を、ＰＢＳ中１％ヒト血清を用いて４℃で１５分間かけて遮断した。細胞を、細胞表面染色のために抗体と共に４℃で３０分間インキュベートした。Ｓｔａｔ５及びＳｔａｔ３のリン酸化の分析を、Ｌｙｓｅ／Ｆｉｘ緩衝液及びＰｅｒｍ緩衝液ＩＩＩ（ＢＤバイオサイエンシーズ社）を使用して製造業者のプロトコールに従って実施した。ＦｏｘＰ３染色を、Ｆｏｘｐ３キット（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）に概略が示されたプロトコールに従って実施した。試料を、８カラーのＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＩＩサイトメーター（ＢＤバイオサイエンス社）で取得した。分析を、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア９．９（ベックマン・コールター社）を使用して実施した。
【００５２】
ＲＬＩＱ１０８ＤによるＩＬ−１５のトランス提示の阻害を研究するために、ＩＬ−１５Ｒαの安定にトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞株を、ＩＬ−１５と共に３７℃で１時間インキュベートすることにより、ＩＬ−１５をＩＬ−１５Ｒαと結合させ、そしてこれを洗浄して可溶性ＩＬ−１５を除去した。飢餓させたＫｉｔ２２５をＲＬＩＱ１０８Ｄと共に１時間インキュベートし、次いで、提示しているＨｅＬａ細胞と共に１時間共培養した。細胞を固定し、そして細胞内ｐ−Ｓｔａｔ５発現の分析のために透過性処理を行なった。
【００５３】
ヒトＰＢＭＣの増殖アッセイのために、細胞をフィコール勾配で単離した。次いで、細胞をＰＢＳ中で洗浄し、そして１０×１０６個のＰＢＭＣを、１Ｍの最終濃度のＢＤ Ｈｏｒｉｚｏｎ（商標）色素４５０（ＶＰＤ−４５０、ＢＤバイオサイエンシーズ社）と共に３７℃で１０分間インキュベートした。反応をＰＢＳによる１０倍希釈によって停止し、そして細胞を完全培地Ｒ１０（１mMのピルビン酸ナトリウム、１mMの非必須アミノ酸、１００IU/mLのペニシリン／ストレプトマイシン、２mMのＬ−グルタミン、及び１０％ＦＢＳの補充されたＲＰＭＩ １６４０培地）中で洗浄した。ＰＢＭＣを、９６ウェル丸底プレート中の完全培地Ｒ１０に１×１０６個の細胞/mLで播種し、そして示された濃度のサイトカイン及び変異体で３７℃でインキュベートした。
【００５４】
インビボモデル
Ｃ５７ＢＬ／６マウス、Ｂａｌｂ／ｃマウス、及びＤＢＡ／２マウスはＪａｎｖｉｅｒ研究所から購入した。全てのマウスは通常、６才令から１２週令を使用した。全ての動物実験は、動物実験の地域における倫理委員会（ペイ・ド・ラ・ロワール、フランス）によって承認され、そして欧州連合ガイドライン（承認番号第Ｂ４４−２７８）に従って実施された。
【００５５】
インビボにおけるＳｔａｔ５リン酸化アッセイのために、１０μgのＲＬＩＱ１０８Ｄ又はＰＢＳを、２μgのＩＬ−２を用いての３０分間かけての腹腔内刺激のさらに３０分前にＣ５７ＢＬ／６マウスに腹腔内投与した。マウスを屠殺し、続いて単離された脾臓細胞を固定した。脾臓からの細胞懸濁液を、機械的に引き裂くことによって調製し、その後、表現型分析のために染色した。膜におけるＮＫｐ４６及びＣＤ８の染色を、細胞透過処理及び細胞内ｐ−Ｓｔａｔ５染色の前に実施した。
【００５６】
ポリ（Ｉ：Ｃ）による活性化のために、マウスを、１０μgのＲＬＩＱ１０８Ｄを用いて一晩かけて前処置したか又はしなかった。次いで、マウスを、１０μgのＲＬＩＱ１０８Ｄと一緒に又はその非存在下で２５μg/gのポリ（Ｉ：Ｃ）を用いて活性化し、そして血中のＮＫ細胞及びＣＤ８Ｔ細胞の活性化について試験した。６時間後の表面のＣＤ６９の発現及び細胞内ＩＦＮγをフローサイトメトリーによって分析した。
【００５７】
移植片の実験を、性別の一致した動物を使用して実施した。マウスを、７５mg/kgのケタミンと１５mg/kgのキシラジンの混合物を用いて麻酔した。皮膚移植を、Ｂａｌｂ／ｃ（Ｈ−２ｄ）ドナーマウスの尾皮膚の全層を用いて、ＤＢＡ／２（Ｈ−２ｄ）レシピエントマウスの右側腹部に対して実施した。皮膚移植片を、最初の５日間、絆創膏を用いて固定した。マウスを２つの群に分類した：未処置群とＲＬＩＱ１０８Ｄにより処置された群。マウスを、１日１回のＲＬＩＱ１０８Ｄの腹腔内投与用量（１０μg/マウス）を用いて処置した。次いで、移植片生着を、１日１回の目視による検査によって追跡した。全ての処置は、皮膚移植日の前日に開始された。拒絶は、移植された皮膚組織の８０％超の減少として定義された。
【００５８】
結果：
ＲＬＩＱ１０８Ｄ：ＣＤ１２２に対する高まった親和性及びＣＤ１３２の動員障害を有するＩＬ−１５とＩＬ−１５Ｒαの融合分子。
ＩＬ−２及びＩＬ−１５依存性エフェクター機能を阻害するために、本発明者らは、ＣＤ１２２に対する高まった親和性及びＣＤ１３２の動員障害を組み合わせることによってＣＤ１２２／ＣＤ１３２二量体を標的化する独創的なアプローチを開発した。一方で、本発明者らは、ＩＬ−１５をＩＬ−１５Ｒαと共有結合により連結させると（ＲＬＩ融合分子）、可溶性ＣＤ１２２に対するＩＬ−１５の低い親和性（Ｋｄ＝２５nM）（図１１Ａ）は１４倍増加することを発見した。他方で、ＩＬ−１５におけるＱ１０８残基をＤへと突然変異することにより、ＣＤ１３２鎖へのその結合は消失することが示された。この突然変異はＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα複合体の形成に影響を及ぼさない。なぜなら、ＩＬ−１５Ｑ１０８Ｄムテインは、野生型ＩＬ−１５と同じような親和性で、固定されたＦｃ−ＩＬ−１５Ｒαに結合したからである（図１１Ｂ）。したがって、本発明者らは、可溶性ＩＬ−１５Ｒαスシドメインに共有結合により連結させたＩＬ−１５Ｑ１０８Ｄムテイン間の融合分子であるＲＬＩＱ１０８Ｄを作製した。対照として、ＩＬ−１５部分にＮ６５Ｋ突然変異を導入することによって、ＣＤ１２２の動員が消失したＲＬＩＮ６５Ｋが作製された。表面プラズモン共鳴分析により、予想された通り、ＲＬＩＱ１０８ＤはＣＤ１２２鎖に対して野生型ＲＬＩと同じような親和性を保持し（図１１Ａ及び１１Ｃ）、固定されたＦｃ−ＩＬ−１５Ｒαへの結合は全く観察されなかった（図１１Ｄ）ことが示された。これに対して、ＲＬＩＮ６５ＫはＣＤ１２２に結合することができなかった（図１１Ｃ）。さらに、ＲＬＩ／ＣＤ１２２複合体への可溶性ＣＤ１３２の結合は、ＲＬＩにＱ１０８Ｄ置換を導入すると（ＲＬＩＱ１０８Ｄ）完全に消失した（図１１Ｅ）。細胞膜にアンカーされた受容体（ＣＤ１２２、ＣＤ１３２、ＩＬ−１５Ｒα及びＩＬ−２Ｒα（ＣＤ２５）を発現しているＫｉｔ−２２５細胞及びＮＫ−９２細胞を使用）の状況では、ＴＵ−２７（ＣＤ１２２へのＩＬ−２及びＩＬ−１５の結合を遮断する抗ＣＤ１２２ｍＡｂ）の結合はＲＬＩＱ１０８Ｄによって有意に阻害され、一方、ＲＬＩＮ６５Ｋは全く影響を及ぼさなかった。対照として、非遮断性ＣＦ−１抗ＣＤ１２２ｍＡｂの結合は、ＲＬＩＱ１０８Ｄ又はＲＬＩＮ６５Ｋのいずれによっても影響を受けなかった（図１２Ａ）。したがって、ＲＬＩＱ１０８Ｄは、ＮＫ−９２細胞上のＣＤ１２２／ＣＤ１３２二量体受容体への放射性ヨウ素化された野生型ＲＬＩの結合に競合したが、しかしながら、ＣＤ１３２の動員がないために、野生型ＲＬＩ（２nM）と比べて１０倍高いＩＣ５０（２０nM）であった（図１２Ｂ）。したがって、ＲＬＩＱ１０８Ｄは、ＣＤ１２２に対する高まった親和性とＣＤ１３２の動員障害を組み合わせた、独創的なＩＬ−１５由来分子である。
【００５９】
ＲＬＩＱ１０８Ｄは、それらの共通のＣＤ１２２／ＣＤ１３２二量体受容体を通してＩＬ−１５及びＩＬ−２のシグナル伝達の両方を阻害する。
分子の生物学的活性に関して、予想された通り、野生型ＲＬＩは、ＣＤ１２２／ＣＤ１３２二量体を通して作用することによって、Ｋｉｔ２２５及びＮＫ−９２の増殖を誘導し（ＥＣ５０＝５０pM）、一方、ＲＬＩＱ１０８Ｄ、ＲＬＩＮ６５Ｋ、及びＩＬ−１５Ｑ１０８Ｄは不活性であり（図１３Ａ及び図１３Ｂ）、このことから、ＣＤ１２２鎖及びＣＤ１３２鎖の両方の動員の必要性が確認された。結合試験から予想されるように、ＲＬＩＱ１０８Ｄは、５nMのＩＣ５０で、野生型ＲＬＩにより誘発されるＳｔａｔ３及びＳｔａｔ５のリン酸化の両方（図１４Ａ）並びにＫｉｔ２２５細胞、ＮＫ−９２細胞及びＴＦ−１β細胞の増殖を効率的に阻害した（図１４Ｂ）。ＲＬＩＮ６５Ｋの阻害活性は全く観察されず（図１４Ａ及び図１４Ｂ）、このことから、ＣＤ１２２の動員ではなく、ＣＤ１３２の動員を標的化することに関心が高まった。
【００６０】
さらに、ＩＬ−１５ＲαによりトランスフェクトされたＨｅｌａ細胞によるＫｉｔ２２５細胞上のＣＤ１２２／ＣＤ１３２へのＩＬ−１５のトランス提示は、ＲＬＩＱ１０８Ｄによって有意に消失し、このことにより、細胞間相互作用の最中でさえＩＬ−１５のシグナル伝達を阻害するその効力が判明した（図１５Ａ及び１５Ｂ）。これとは対照的に、そして最も重要なことには、ＩＬ−１５Ｑ１０８Ｄはこのような阻害作用を発揮することができず（図１５Ａ）、これにより、ＣＤ１２２／１３２二量体を標的化しそして阻害作用を発揮することに対して、ＩＬ−１５Ｑ１０８Ｄより高まったＲＬＩＱ１０８Ｄの親和性の重要性が強調される。
【００６１】
ＣＤ１２２／ＣＤ１３２二量体受容体を通してのＩＬ−２のシグナル伝達に対するＲＬＩＱ１０８Ｄの有効性を試験するために、本発明者らはＣＤ１２２及びＣＤ１３２を発現するがＩＬ−２Ｒαを発現しないＴＦ−１β細胞を使用した。ＲＬＩＱ１０８Ｄは、３nMのＩＣ５０で、ＩＬ−２依存性のＴＦ−１β細胞増殖を効率的に阻害した（図１６Ａ）。次いで、本発明者らは、ヒト初代細胞へと本発明者らの分析を展開させた。ＶＰＤ−４５０により標識されたＰＢＭＣを、ＲＬＩＱ１０８Ｄの存在下においてＩＬ−１５又はＩＬ−２を用いて刺激した。本発明者らは、ＩＬ−１５及びＩＬ−２に応答したＣＤ８Ｔ細胞増殖が、ＲＬＩＱ１０８Ｄによって両方共に阻害されたことを発見した（図１６Ｂ〜Ｄ）。
【００６２】
ＲＬＩＱ１０８Ｄの阻害有効性がさらにインビボにおいて確認された。ＲＬＩＱ１０８Ｄが、野生型ＲＬＩの注射前にマウスに投与されると、脾臓ＮＫ細胞及びＣＤ８Ｔ細胞内のＳｔａｔ５リン酸レベルは、未処置マウスのＮＫ細胞と比較して減少したことが判明した（図１７Ａ及び１７Ｂ）。したがって、ＣＤ１２２／ＣＤ１３２二量体受容体を通したＩＬ−２及びＩＬ−１５のシグナル伝達は、インビトロ及びインビボにおいてＲＬＩＱ１０８Ｄによって効率的に阻害された。
【００６３】
ＩＬ−２Ｒαは、そのＩＬ−２Ｒα／ＣＤ１２２／ＣＤ１３２三量体受容体を通して、ＲＬＩＱ１０８ＤによるＩＬ−２シグナル伝達の阻害を障害する。
ＩＬ−２Ｒα鎖及びＩＬ−１５Ｒα鎖がＲＬＩＱ１０８Ｄの遮断効果に影響を及ぼし得るかどうかという疑問に取り組むために、本発明者らは、それらの特異的な三量体受容体（ＩＬ−２に対するＩＬ−２Ｒα／ＣＤ１２２／ＣＤ１３２、及びＩＬ−１５に対するＩＬ−１５Ｒα／ＣＤ１２２／ＣＤ１３２；シス提示）を通して、外来性ＩＬ−２及びＩＬ−１５に応答するＫｉｔ２２５細胞、ＮＫ−９２細胞、及びＴＦ−１β細胞を再び利用した。驚くべきことに、Ｋｉｔ２２５細胞においてＩＬ−１５により誘発されたＳｔａｔ５リン酸化はＲＬＩＱ１０８Ｄによって阻害されたが、ＩＬ−２により誘発されたＳｔａｔ５リン酸化は阻害されなかった（図１８Ａ）。したがって、ＲＬＩＱ１０８Ｄは、ＩＬ−２により誘発された細胞増殖には影響を及ぼさないままであった（図１８Ｂ）。興味深いことに、ＩＬ−２により誘発された細胞増殖に対するＲＬＩＱ１０８Ｄの阻害活性は、ＣＤ２５に結合するＩＬ−２を遮断する抗体（３３Ｂ３．１）を加えた場合に顕現し、このことはＩＬ−２Ｒαの存在がＲＬＩＱ１０８Ｄの阻害作用を妨げたことを示唆する（図１８Ｃ）。両方のアッセイにおいて、ＲＬＩＮ６５Ｋは不活性であった（図１８Ｂ及び１８Ｃ）。
【００６４】
ＲＬＩＱ１０８Ｄは、ＲＬＩにより誘発された増殖よりも６倍高い、３０nMのＩＣ５０で、ＩＬ−１５により誘発された細胞増殖を阻害した。さらに、本発明者らは、ＩＬ−１５Ｑ１０８ＤによるＩＬ−１５Ｒαの遮断は、ＲＬＩＱ１０８Ｄの阻害活性を増強したことを発見した（図１８Ｄ）。このことは、ＲＬＩＱ１０８Ｄの阻害活性が、三量体受容体の状況においては僅かに損なわれ、それ故、ＩＬ−１５Ｒαの存在はその阻害作用に影響を及ぼし得ることを示す。
【００６５】
本発明者らは、ヒト初代細胞へと本発明者らの分析を展開させた。ＩＬ−１５により誘発されるＮＫ細胞増殖は、５nMのＩＣ５０で、ＲＬＩＱ１０８Ｄの存在下において完全に消失した（図１８Ｅ）。これに対して、ＩＬ−２により誘発されるＮＫ細胞増殖はＲＬＩＱ１０８Ｄによってほんの部分的にしか阻害されず、実験間で高い程度のばらつきがあった。しかしながら、遮断性抗ＣＤ２５ ３３Ｂ３．１ｍＡｂが培養液に添加されると、ＲＬＩＱ１０８ＤによるＩＬ−２により誘発されるＮＫ細胞増殖の阻害は完全に有効であり、ＩＬ−１５により誘発される増殖阻害と同じようなＩＣ５０であった（図１８Ｆ）。これらの結果は、ＩＬ−２ＲαによるＲＬＩＱ１０８Ｄの作用の障害を確認する。以前に観察されたものに従って、ＲＬＩＱ１０８Ｄは、ＩＬ−２により誘発されるＣＤ４ＣＤ２５−Ｔ細胞の増殖を阻害したが、ＣＤ２５を発現している従来のＣＤ４Ｔ細胞の増殖は阻害しなかった（図１８Ｇ−Ｉ）。要するに、これらの結果は、ＲＬＩＱ１０８Ｄは三量体の受容体の状況においてはあまり有効ではなく、それ故、ＩＬ−１５Ｒαの存在もまた、ＩＬ−２Ｒαのように劇的ではないけれども、その阻害作用に影響を及ぼし得ることを示す。
【００６６】
ＲＬＩＱ１０８ＤによるＣＤ１２２／ＣＤ１３２二量体受容体の阻害は、細胞の活性化を制限し、そしてトレランスを促進する。
ＩＬ−１５及びＩＬ−１５Ｒαは、炎症中に誘導される。炎症に関連した細胞活性化を阻害するＲＬＩＱ１０８Ｄの効力をさらに記載するために、ポリ（Ｉ：Ｃ）をマウスに投与した。ポリ（Ｉ：Ｃ）により刺激されたマウス由来のＮＫ細胞によるＩＦＮγ発現は、細胞表面におけるＣＤ６９の発現に影響を及ぼすことなく、ＲＬＩＱ１０８Ｄによって有意に損なわれた（図１９Ａ）。しかしながら、ＣＤ６９の発現は、ＲＬＩＱ１０８Ｄをポリ（Ｉ：Ｃ）と一緒に注射した場合、ＣＤ８及びＣＤ４Ｔ細胞上において減少した（図１９Ｂ及び図１９Ｃ）。したがって、インビボにおけるＴＬＲによる刺激は、ＮＫ細胞及びＴ細胞の活性化を支えるためにＣＤ１２２／ＣＤ１３２二量体受容体を必要とし、そしてこれはＲＬＩＱ１０８Ｄによって阻害される。
【００６７】
ＩＬ−１５ＲはＣＤ１２２及びＣＤ１３２とは独立して幅広く発現されているが、ＩＬ−２Ｒαの発現は主にＣＤ４制御性Ｔ細胞（Ｔ−ｒｅｇ）及び活性化Ｔ細胞に限定されている。本発明者らの観察によると、ヒトＰＢＭＣ由来のＦｏｘＰ３＋陽性細胞におけるＩＬ−２によるＣＤ４Ｔ細胞の増強は、ＲＬＩＱ１０８Ｄによって影響を受けなかった（図２０Ａ）。正味の結果として、ＲＬＩＱ１０８Ｄによる処置は、Ｔ−ｒｅｇとＣＤ８Ｔ細胞の比をＴ−ｒｅｇの方にシフトさせ（図２０Ｂ）、このことはトレランスの促進におけるその潜在性を強調する。
【００６８】
インビボにおいてＲＬＩＱ１０８Ｄの有効性を評価するために、ＲＬＩＱ１０８ＤをＩＬ−２と一緒にマウスに投与した。予想された通り、ＩＬ−２の注射により、ＣＤ４４＋ＣＤ８Ｔ細胞及びＮＫ細胞は増加し、これはＲＬＩＱ１０８Ｄによって完全に消失した（図２０Ｃ及び図２０Ｄ）。さらに、ＮＫ細胞の成熟を研究することによって、本発明者らは、ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ２７−成熟ＮＫ細胞個体群が劇的に減少したことを発見した（図２０Ｅ）。興味深いことに、ＣＤ４Ｔ−ｒｅｇ個体群は、ＩＬ−２と一緒に注射された場合、ＲＬＩＱ１０８Ｄによって阻害されず、さらには促進され（図２０Ｆ）、これにより野生型マウスにおいてＮＫ細胞よりもＴ−ｒｅｇ細胞の方へとバランスが傾き（図２０Ｇ）、これはヒトＰＢＭＣを用いて得られた結果を確認する。興味深いことに、多量のＴ−ｒｅｇ細胞が加齢マウス内に認められ、そしてＲＬＩＱ１０８Ｄの注射それ自体が脾臓Ｔ−ｒｅｇ個体群を有意に増強させた（図２１Ａ）。
【００６９】
制御性Ｔ細胞は、Ｔ細胞活性化を阻害することによって同種移植片拒絶を予防することができた。したがって、本発明者らは、Ｂａｌｂ／ｃマウスの皮膚がＤＢＡ／２レシピエントに移植された移植モデルを使用して、単独で細胞活性化よりもトレランスを支持するＲＬＩＱ１０８Ｄが、潜在的な治療的利点を提示し得るかどうか疑問に思った。本発明者らは、全ての未処置マウスは、１４日目までに同種皮膚移植片を拒絶したことを発見した。しかしながら、移植後にＲＬＩＱ１０８Ｄを用いて１日１回処置することにより、移植片生着率は上昇し（図２１Ｂ）、このことはＲＬＩＱ１０８Ｄがトレランスを支持し得るという考えを支持する。
【００７０】
配列：
【化１】
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【００７１】
参考文献：
本出願全体を通して、様々な参考文献が、本発明が属する技術分野の最新技術を記載する。これらの参考文献の開示は、本開示への参照により本明細書に組み入れられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ−Ｃ】
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【図１１Ｄ−Ｅ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ−Ｆ】
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【図１８Ｇ−Ｉ】
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【図１９】
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【図２０Ａ−Ｃ】
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【図２０Ｄ−Ｇ】
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【図２１】
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【配列表】
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