(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質の活性が強化された、５’−イノシン酸を生産するコリネバクテリウム属微生物。
【請求項２】
前記５’−イノシン酸を生産するコリネバクテリウム属微生物が、コリネバクテリウム・スタティオニス（Corynebacterium stationis）である、請求項１に記載の５’−イノシン酸を生産するコリネバクテリウム属微生物。
【請求項３】
請求項１に記載のコリネバクテリウム属微生物を培地で培養する段階、及び前記微生物または培地から５’−イノシン酸を回収する段階を含む、５’−イノシン酸の製造方法。
【請求項４】
前記５’−イノシン酸を生産するコリネバクテリウム属微生物が、コリネバクテリウム・スタティオニス（Corynebacterium stationis）である、請求項３に記載の５’−イノシン酸の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＩＭＰ排出タンパク質の活性が強化された５’−イノシン酸を生産するコリネバクテリウム属微生物、これを用いた５’−イノシン酸の製造方法、５’−イノシン酸生産用組成物及び５’−イノシン酸の排出増加方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸系物質の１つである５’−イノシン酸（５’−inosine monophosphate；以下IMP）は、核酸代謝経路の中間物質であって、食品、医薬品及び各種医療的利用などの多方面に利用されている。特に、５’−グアニル酸（５’−guanine monophosphate；以下GMP）と共に食品調味添加剤または食品用として広く利用されている物質である。ＩＭＰは、それ自体で牛肉の味を出すことが知られているが、グルタミン酸一ナトリウム（ＭＳＧ）の風味を強化することが知られて、呈味性核酸系の調味料として脚光を浴びている。
【０００３】
ＩＭＰを製造する方法としては、酵母細胞から抽出したリボ核酸を酵素的に分解する方法（特許文献１）、発酵によって生産されたイノシンを化学的にリン酸化する方法（非特許文献１など）及びＩＭＰを直接的に生産する微生物を培養して、培養液内のＩＭＰを回収する方法などがある。これらの方法の中で、現在最も多く使われている方法は、ＩＭＰを直接生産が可能な微生物を用いた方法である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】日本特許公告第１６１４／１９５７号
【特許文献２】韓国登録特許第１０−０９２４０６５号
【特許文献３】国際公開特許第２００８−０３３００１号
【特許文献４】韓国登録特許第１０−０６２００９２号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Agri. Biol. Chem., 36, 1511 (1972)
【非特許文献２】Pearspm et al (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444
【非特許文献３】Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277
【非特許文献４】Needleman and Wunsch,1970,J. Mol. Biol. 48: 443−453
【非特許文献５】Smith and Waterman, Adv. Appl. Math （1981）2:482
【非特許文献６】Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 （1979）
【非特許文献７】Gribskov et al（1986） Nucl. Acids Res. 14: 6745
【非特許文献８】Sambrook et al., supra, 9.50-9.51, 11.7-11.8
【非特許文献９】van der Rest et al. 1999
【非特許文献１０】Appl. Microbiol. Biothcenol.,1999,52:541-545
【非特許文献１１】Nat. Protoc., 2014 Oct;9(10):2301-16
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
微生物発酵を介して直接ＩＭＰを生産する方法で高収率のＩＭＰを生産するためには、ＩＭＰの排出がスムーズに行われる必要がある。本目的を達成するために発明者らは広範な研究を行い、ＩＭＰ排出能に関与する排出タンパク質に対する研究を行い、排出に関与するタンパク質であるＩｍｐＥ１、ＩｍｐＥ２を究明した。ＩＭＰ排出に関与するタンパク質ＩｍｐＥ１、ＩｍｐＥ２の活性を強化させた場合、ＩＭＰの濃度が上昇することを確認することにより、本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の一つの目的は、ＩＭＰ排出タンパク質の活性が強化された５’−イノシン酸を生産する、コリネバクテリウム属微生物を提供することにある。
本発明の他の目的は、本発明のコリネバクテリウム属微生物を培地で培養する段階を含む、５’−イノシン酸の製造方法を提供することにある。
本発明の別の目的は、本発明のＩＭＰ排出タンパク質の活性が強化されたタンパク質を含む、５’−イノシン酸生産用組成物を提供することにある。
本発明の別の目的は、本発明のＩＭＰ排出タンパク質をコリネバクテリウム属微生物で強化する段階を含む、５’−イノシン酸の排出増加方法を提供することにある。
【発明の効果】
【０００８】
本発明におけるＩＭＰ排出タンパク質の活性が強化された５’−イノシン酸を生産するコリネバクテリウム属微生物を用いて、５’−イノシン酸を製造することができる。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
これを具体的に説明すると、次のとおりである。一方、本発明で開示された各説明及び実施形態は、それぞれの他の説明及び実施形態にも適用できる。すなわち、本発明で開示された様々な要素のすべての組み合わせが本発明のカテゴリに属する。また、下記に記述された具体的な叙述によって、本発明のカテゴリは制限されない。
【００１０】
前記目的を達成するための本発明の一つの様態は、ＩＭＰ排出タンパク質の活性が強化された５’−イノシン酸を生産するコリネバクテリウム属微生物を提供することにある。
本発明において、用語、「５’−イノシン酸排出タンパク質」は、５’−イノシン酸（5’-inosine monophosphate;以下ＩＭＰ）を細胞外に排出するのに関与するタンパク質を意味する。本発明の目的上、前記用語はＩＭＰ排出能を有するタンパク質、５’−イノシン酸排出能を有するタンパク質、５’−イノシン酸排出タンパク質などと混用して使用してもよく、具体的には、ＩｍｐＥで示してもよく、より具体的には、ＩｍｐＥ１、ＩｍｐＥ２で示してもよいが、これに制限されるものではない。また、前記タンパク質は、コリネバクテリウム属由来であってもよく、具体的には、コリネバクテリウム・スタティオニス由来であってもよいが、これに制限されない。例えば、コリネバクテリウム・スタティオニス由来であり、５’−イノシン酸排出能を有するタンパク質として相応する活性を有するタンパク質は、本発明のタンパク質として用いられてもよい。
【００１１】
前記タンパク質は、例えば、配列番号１または配列番号２で記載されたアミノ酸配列で構成されたものであってもよいが、前記タンパク質と同様の活性を有する配列は制限なく含み、当業者は、公知のデータベースであるＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋなどから配列情報を得ることができる。また、前記タンパク質は、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列、またはこれと少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の相同性または同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質であってもよい。また、このような相同性または同一性を有しながら、前記タンパク質に相応する効能を示すアミノ酸配列であれば、一部の配列が欠失、変形、置換、または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質も、本発明のタンパク質として使用できることは自明である。
【００１２】
すなわち、本発明で「特定配列番号で記載されたアミノ酸配列を有するタンパク質」または「特定配列番号のアミノ酸配列からなるタンパク質」と記載されても、該当配列番号のアミノ酸配列からなるタンパク質と同一もしくは相応する活性を有する場合であれば、一部の配列が欠失、変形、置換、保存的置換または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質も、本発明で使用できることは自明である。例えば、前記変異型タンパク質と同一あるいは相応する活性を有する場合であれば、前記アミノ酸配列の前後に、タンパク質の機能を変更しない配列の追加、自然に発生しうる突然変異、そのサイレント突然変異（silent mutation）または保存的置換は除外せず、これらの配列の追加、あるいは突然変異を有する場合でも、本願の範囲内に属することは自明である。
【００１３】
本明細書において、用語、「相同性（homology）」または「同一性（identity）」は、２つの与えられたアミノ酸配列または塩基配列と関連する程度を意味し、パーセンテージで表示されうる。
用語、相同性及び同一性は、多くの場合、相互交換的に用いられる。
保存された（conserved）ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列相同性または同一性は、標準配列アルゴリズムによって決定され、用いられるプログラムによって確立されたデフォルトのギャップペナルティが一緒に利用されてもよい。実質的に、相同性を有するか（homologous）または同一（identical）の配列は、中間または高い厳しい条件（stringent conditions）で、一般的に、配列全体または全長の少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％または９０％以上でハイブリッドしてもよい。ハイブリッド化はポリヌクレオチドでコドンの代わりに縮退コドンを含有するポリヌクレオチドも考慮される。
【００１４】
任意の２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列が相同性、類似性または同一性を有するかどうかは、例えば、非特許文献２と同じデフォルトのパラメータを用いて「ＦＡＳＴＡ」プログラムのような公知のコンピュータアルゴリズムを利用して決定してもよい。または、ＥＭＢＯＳＳパッケージのニードルマンプログラム（EMBOSS：The European Molecular Biology Open Software Suite、非特許文献３）（バージョン５．０．０またはそれ以降のバージョン）で実行されるような、ニードルマン−ウンシュ（Needleman-Wunsch）アルゴリズム（非特許文献４）を使用して決定してもよい。（ＧＣＧプログラムパッケージ（Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387 （1984））、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ（Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 （1990）；Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994、及び[CARILLO ETA／.]（1988） SIAM J Applied Math 48: 1073を含む）。例えば、国立生物工学情報データベースセンターのＢＬＡＳＴ、またはＣｌｕｓｔａｌＷを用いて相同性、類似性または同一性を決定してもよい。
【００１５】
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの相同性、類似性または同一性は、例えば、非特許文献５に公知されたように、例えば、非特許文献４のようなＧＡＰコンピュータープログラムを利用して配列情報を比較することによって決定されてもよい。要約すると、ＧＡＰプログラムは、２つの配列のうち、より短いものからのシンボルの全体数で同様の配列されたシンボル（つまり、ヌクレオチドまたはアミノ酸）の数を割った値として定義する。ＧＡＰプログラムのためのデフォルトパラメータは、（１）一進法の比較マトリックス（同一性のための１及び非同一性のための０の値を含有する）及び非特許文献６に開示されたように、非特許文献７の加重された比較マトリックス（またはＥＤＮＡＦＵＬＬ（ＮＣＢＩ ＮＵＣ４．４のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックス）；（２）各ギャップのための３．０のペナルティ及び各ギャップで各記号のための追加の０．１０ペナルティ（またはギャップ開放ペナルティ１０、ギャップ伸長ペナルティ０．５）；及び（３）末端ギャップのための無ペナルティを含んでもよい。したがって、明細書で使用されるものとして、用語、「相同性」または「同一性」は、配列間の関連性（relevance）を示す。
本明細書において、用語、「活性の強化」は、タンパク質の活性が導入されたり、微生物が有する内在的活性または変形前の活性に比べて活性が向上したことを意味する。前記活性の「導入」は、自然的あるいは人為的に微生物が本来有していなかった特定タンパク質の活性が現れるようになることを意味する。「内在的活性 」は、自然的または人為的な要因による遺伝的変異で微生物の形質が変化する場合、形質の変化前に親菌株が本来に有していた特定タンパク質の活性をいう。
例えば、前記活性の強化は、外来のＩＭＰ排出タンパク質を宿主細胞に導入したり、導入して強化すること、または内在的ＩＭＰ排出タンパク質の活性を増加させることをすべて含んでもよい。
【００１６】
具体的には、本発明で活性の増加は、
１）前記タンパク質をコード（つまり、暗号化）するポリヌクレオチドのコピー数の増加、
２）前記ポリヌクレオチドの発現が増加するように発現調節配列の変形、
３）前記タンパク質の活性が増強されるように染色体上のポリヌクレオチド配列の変形、または
４）その組み合わせによって強化されるように変形する方法
などにより行われてもよいが、これに制限されない。
前記１）ポリヌクレオチドのコピー数の増加は、特にこれに制限されないが、ベクターに作動可能に連結された形態で実行されるか、宿主細胞内の染色体内に挿入されることによって実行されてもよい。また、コピー数の増加の一様態として、タンパク質の活性を示す外来ポリヌクレオチドまたは前記ポリヌクレオチドのコドン最適化された変異型ポリヌクレオチドを宿主細胞内に導入して行ってもよい。前記外来ポリヌクレオチドは、前記タンパク質と同一／類似の活性を示す限り、その由来や配列に制限なく用いてもよい。前記導入は、公知の形質転換方法を当業者が適宜選択して行ってもよく、宿主細胞内で前記導入されたポリヌクレオチドが発現されることによりタンパク質が生成され、その活性が増加されうる。前記コピー数の増加は、ポリヌクレオチドがタンデム（tandem）形態で連続的に存在してもよく、この場合、互いに異なるＩＭＰ排出タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列が交差的、順次的、同じ配列が反復的に存在することができ、タンデム形態で連続的に存在する場合、互いにオーバーラップが生じることがあるが、これに制限されない。具体的には、本発明は、配列番号３、配列番号４または配列番号５で記載されたポリヌクレオチド配列のコピー数が増加したものであってもよい。
【００１７】
次に、２）ポリヌクレオチドの発現が増加するように発現調節配列の変形は特にこれに制限されないが、前記発現調節配列の活性をさらに強化するように核酸配列を欠失、挿入、非保存的または保存的置換またはこれらの組み合わせで配列上の変異を誘導して行うか、さらに強い活性を有する核酸配列に交替することによって行ってもよい。前記発現調節配列は、特にこれに制限されないが、プロモーター、オペレーター配列、リボソーム結合部位をコードする配列、転写及び解読の終結を調節する配列などを含んでもよい。具体的には、ポリヌクレオチド発現単位の上部には、本来のプロモーターの代わりに強力な異種プロモーターが連結されてもよいが、前記強力なプロモーターの例としては、ＣＪ７プロモーター、ｌｙｓＣＰ１プロモーター、ＥＦ−Ｔｕプロモーター、ｇｒｏＥＬプロモーター、ａｃｅＡあるいはａｃｅＢプロモーターなどがある。前記プロモーターとポリヌクレオチドが作動可能に連結され、前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドの発現率を向上させることができるが、これに限定されない。
【００１８】
また、３）染色体上のポリヌクレオチド配列の変形は、特にこれに制限されないが、前記ポリヌクレオチド配列の活性をより強化するように核酸配列を欠失、挿入、非保存的または保存的置換、またはこれらの組み合わせで発現調節配列上の変異を誘導して行うか、さらに強い活性を有するように改良されたポリヌクレオチド配列に交替することによって行ってもよい。
【００１９】
最後に、４）前記１）〜３）の組み合わせによって強化されるように変形する方法は、前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドのコピー数の増加、その発現が増加するように発現調節配列の変形、染色体上の前記ポリヌクレオチド配列の変形及び前記タンパク質の活性を示す外来ポリヌクレオチドまたはそのコドン最適化された変異型ポリヌクレオチドの変形のうち１以上の方法を一緒に適用して行ってもよい。
【００２０】
また、本発明の配列番号１、または配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、コドン縮退性（codon degeneracy）によって前記配列番号１または２アミノ酸配列からなるタンパク質またはそれと相同性を有するタンパク質に翻訳されうるポリヌクレオチドも含まれることは自明である。例えば、配列番号３、配列番号４または配列番号５に記載されたポリヌクレオチド配列で構成されたものであってもよい。また、公知の遺伝子配列から調製されうるプローブ、例えば、前記塩基配列の全体または一部に対する相補配列と厳格な条件下（ストリンジェントな条件下）でハイブリッド化し、配列番号１または２のアミノ酸配列からなるタンパク質の活性を有するタンパク質をコードする配列であれば、制限なく含まれてもよい。前記「厳しい条件（ストリンジェントな条件）」とは、ポリヌクレオチド間の特異的ハイブリッド化を可能にする条件を意味する。これらの条件は、文献（例えば、J. Sambrook et al., 同上）に具体的に記載されている。例えば、相同性が高い遺伝子同士、４０％以上、具体的には、９０％以上、より具体的には、９５％以上、さらに具体的には、９７％以上、特に具体的には、９９％以上の相同性を有する遺伝子同士でハイブリッド化し、それより相同性が低い遺伝子同士はハイブリッド化しない条件、または通常のサザンハイブリッド化の洗浄条件である６０℃、１×ＳＳＣ 、０．１％ＳＤＳ、具体的には、６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、より具体的には、６８℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度及び温度で、１回、具体的には、２回〜３回洗浄する条件が挙げられる。
【００２１】
ハイブリッド化は、たとえハイブリッド化の厳密度に応じて塩基間のミスマッチ（mismatch）が可能であっても、２つの核酸が相補的配列を有することを要求する。用語「相補的」は、互いにハイブリッド化が可能なヌクレオチド塩基間の関係を記述するために使用される。例えば、ＤＮＡに関して、アデノシンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。したがって、本発明は、また、実質的に類似の核酸配列だけでなく、全体配列に相補的な単離された核酸断片を含みうる。
具体的には、相同性を有するポリヌクレオチドは、５５℃のＴｍ値でハイブリッド化段階を含むハイブリッド化条件を用い、上述した条件を用いて探知することができる。また、前記Ｔｍ値は、６０℃、６３℃または６５℃であってもよいが、これに制限されるものではなく、その目的に応じて当業者によって適切に調節されうる。
ポリヌクレオチドをハイブリッド化する適切な厳密度は、ポリヌクレオチドの長さ及び相補性の程度に依存し、変数は当該技術分野でよく知られている（非特許文献８参照）。
【００２２】
本明細書で使用する用語、「ベクター」は、適切な宿主内で目的のタンパク質を発現できるように、適切な調節配列に作動可能に連結された前記目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列を含有するＤＮＡ製造物を意味する。前記調節配列は、転写を開始しうるプロモーター、このような転写を調節するための任意のオペレーター配列、適合したｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、及び転写及び解読の終結を調節する配列を含んでもよい。ベクターは、適当な宿主細胞内に形質転換された後、宿主ゲノムとは無関係に複製または機能することができ、ゲノムそのものに統合されてもよい。
【００２３】
本発明で用いられるベクターは、宿主細胞内で発現可能なものであれば、特に限定されず、当業界に知られている任意のベクターを用いてもよい。通常用いられるベクターの例としては、天然の状態であるか、組換えされた状態のプラスミド、コスミド、ウイルス及びバクテリオファージが挙げられる。例えば、ファージベクターまたはコスミドベクターとして、ｐＷＥ１５、Ｍ１３、ＭＢＬ３、ＭＢＬ4、ＩＸＩＩ、ＡＳＨＩＩ、ＡＰＩＩ、ｔ１０、ｔ１１、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、及びＣｈａｒｏｎ２１Ａなどを用いてもよく、プラスミドベクターとして、ｐＢＲ系、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ系、ｐＧＥＭ系、ｐＴＺ系、ｐＣＬ系とｐＥＴ系などを用いてもよい。具体的には、ｐＤＺ、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＣＬ、ｐＥＣＣＧ１１７、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＷ１１８、ｐＣＣ１ＢＡＣベクターなどを用いてもよいが、これに制限されない。
【００２４】
本発明で用いてもよいベクターは特に制限されるものではなく、公知の発現ベクターを用いてもよい。また、細胞内の染色体挿入用ベクター介して、染色体内に目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを挿入することができる。前記ポリヌクレオチドの染色体内への挿入は、当業界で知られている任意の方法、例えば、相同組換えによって行われてもよいが、これに限定されない。前記染色体が挿入されたかどうかを確認するための選別マーカー（selection marker）をさらに含んでもよい。選別マーカーは、ベクターで形質転換された細胞を選別、すなわち目的核酸分子が挿入されたかどうかを確認するためのものであり、薬物耐性、栄養要求性、細胞毒性剤に対する耐性または表面タンパク質の発現のような選択可能の表現型を付与するマーカーが使用されてもよい。選択制（selective agent）が処理された環境では、選別マーカーを発現する細胞のみの生存、または他の表現形質を示すので、形質転換された細胞を選別することができる。
【００２５】
本明細書において、用語、「形質転換」は、標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを宿主細胞内に導入して、宿主細胞内で前記ポリヌクレオチドがコードするタンパク質が発現できるようにすることを意味する。形質転換されたポリヌクレオチドは宿主細胞内で発現することさえできれば、宿主細胞の染色体内に挿入され位置するか、染色体外に位置するかに関係なく、これらをすべて含んでもよい。また、前記ポリヌクレオチドは、標的タンパク質をコードするＤＮＡ及びＲＮＡを含む。前記ポリヌクレオチドは、宿主細胞内に導入されて発現できるものであれば、あらゆる形態で導入されるものであっても構わない。例えば、前記ポリヌクレオチドは、それ自体で発現されるのに必要なすべての要素を含む遺伝子構造体である発現カセット（expression cassette）の形態で宿主細胞に導入されてもよい。前記発現カセットは、通常、前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されているプロモーター（promoter）、転写終結シグナル、リボソーム結合部位、及び翻訳終結シグナルを含んでもよい。前記発現カセットは、それ自体の複製が可能な発現ベクターの形態であってもよい。また、前記ポリヌクレオチドは、それ自体の形態で宿主細胞に導入されて宿主細胞で発現に必要な配列と作動可能に連結されているものであってもよく、これに限定されない。前記形質転換する方法は、核酸を細胞内に導入するあらゆる方法も含まれ、宿主細胞に応じて当分野で公知のように、適切な標準技術を選択して行なってもよい。例えば、電気穿孔法（electroporation）、リン酸カルシウム（ＣａＰＯ４）沈殿、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）沈殿、微細注入法（microinjection）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法、ＤＥＡＥデキストラン法、陽イオンリポソーム法、及び酢酸リチウムＤＭＳＯ法などがあるが、これに制限されない。
【００２６】
また、前記で用語、「作動可能に連結された」ものとは、本発明の目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドの転写を開始及び媒介するようにするプロモーター配列と前記プリヌクレオチド配列が機能的に連結されていることを意味する。
作動可能な連結は、当業界に公知の遺伝子組み換え技術を用いて製造してもよく、
部位特異的ＤＮＡ切断及び連結は、当業界の切断及び連結酵素などを用いて製作してもよいが、これに制限されない。
本明細書において、用語、「５’−イノシン酸を生産するコリネバクテリウム属（the genus Corynebacterium）微生物」とは、天然型または変異を介して５’−イノシン酸生産能を有しているコリネバクテリウム属微生物を意味する。具体的には、本発明で５’−イノシン酸生産能を有するコリネバクテリウム属微生物とは、天然型菌株それ自体または外部５’−イノシン酸の生産メカニズムと関連された遺伝子が挿入されたり、内在的遺伝子の活性を強化させたり弱化させて向上された５’−イノシン酸の生産能を有するようになったコリネバクテリウム属微生物であってもよい。より具体的には、形質変化前の親菌株または非変形微生物より、５’−イノシン酸生産能が向上された微生物であってもよい。
【００２７】
本発明において、「コリネバクテリウム属微生物」は、具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum ）、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）、ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavum）、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス（Corynebacterium thermoaminogenes）、コリネバクテリウム・エフィシエンス（Corynebacterium efficiens）、コリネバクテリウム・スタティオニス（Corynebacterium stationis）などであるが、必ずこれに限定されるものではない。より具体的には、本発明において、コリネバクテリウム属微生物はコリネバクテリウム・スタティオニス（Corynebacterium stationis）であってもよい。具体的な例を挙げて、５’−イノシン酸を細胞外に排出する機能を有するタンパク質の活性を強化して５’−イノシン酸の生産能が向上されたコリネバクテリウム・スタティオニス（Corynebacterium stationis）であってもよいが、これに制限されない。
【００２８】
本発明のもう一つの様態として、前記ＩＭＰ排出タンパク質の活性が強化されたコリネバクテリウム属微生物を培地で培養する段階を含む、５’−イノシン酸の製造方法を提供する。
具体的には、本発明の方法は、前記微生物または培地から５’−イノシン酸を回収する段階をさらに含んでもよい。
前記方法において、前記微生物を培養する段階は、特に制限されないが、公知の回分式培養方法、連続式培養方法、流加式培養方法などにより行われてもよい。このとき、培養条件は、特に制限されないが、塩基性化合物（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムまたはアンモニア）または酸性化合物（例えば、リン酸または硫酸）を用いて適正ｐＨ（例えば、ｐＨ５〜９、具体的には、ｐＨ６〜８、最も具体的には、ｐＨ６．８）を調節してもよく、酸素または酸素含有ガス混合物を培養物に導入させて好気性条件を維持してもよい。培養温度は２０〜４５℃、具体的には、２５〜４０℃を維持してもよく、約１０〜１６０時間培養してもよいが、これに制限されるものではない。前記培養によって生産された５’−イノシン酸は、培地中に分泌されるか細胞内に残留しうる。
【００２９】
また、用いられる培養用培地は、炭素供給源としては、糖及び炭水化物（例えば、グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、糖蜜、でん粉及びセルロース）、油脂及び脂肪 （例えば、大豆油、ヒマワリ油、ピーナッツ油及びココナッツ油）、脂肪酸（例えば、パルミチン酸、ステアリン酸及びリノール酸）、アルコール（例えば、グリセロール及びエタノール）及び有機酸（例えば、酢酸）などを個別に用いたり、または混合して用いてもよいが、これに制限されない。窒素供給源としては、窒素含有有機化合物（例えば、ペプトン、酵母抽出液、肉汁、麦芽抽出液、トウモロコシ浸漬液、大豆粕粉及びウレア）、または無機化合物（例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸アンモニウム）などを個別に用いたり、または混合して用いてもよいが、これに制限されない。リン供給源としては、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、これに相応するナトリウム含有塩などを個別に用いたり、または混合して用いてもよいが、これに制限されない。また、培地には他の金属塩（例えば、硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄）、アミノ酸及びビタミンのような必須成長促進物質を含んでもよい。
【００３０】
本発明の前記培養段階で生産された５’−イノシン酸を回収する方法は、培養方法によって当該分野で公知の適切な方法を用いて培養液から目的とする５’−イノシン酸を収集してもよい。例えば、遠心分離、ろ過、陰イオン交換クロマトグラフィー、結晶化及びＨＰＬＣなどが用いられてもよく、当該分野で公知の適切な方法を用いて培地または微生物から目的とする５’−イノシン酸を回収してもよい。
また、前記回収段階は、精製工程を含んでもよく、当該分野で公知の適切な方法を用いて行ってもよい。したがって、前記回収された５’−イノシン酸は、精製された形態または５’−イノシン酸を含有した微生物発酵液であってもよい。
【００３１】
本発明は、もう一つの様態として、本発明の配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質またはこれをコードするポリヌクレオチドを含む５’−イノシン酸生産用組成物を提供する。
本発明の組成物は、さらに、前記ポリヌクレオチドを作動させることができる構成を制限なく含んでもよい。また、本発明の組成物で、前記ポリヌクレオチドは、導入された宿主細胞で作動可能に連結された遺伝子を発現させうるようにベクター内に含まれた形態であってもよい。
【００３２】
また、前記組成物は、５’−イノシン酸生産用組成物に通常使用される任意の適切な賦形剤をさらに含んでもよい。これらの賦形剤としては、例えば、保存剤、湿潤剤、分散剤、懸濁化剤、緩衝剤、安定化剤、または等張化剤などであってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明は、もう一つの様態として、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質の、コリネバクテリウム属微生物の５’−イノシン酸の生産増加のための用途を提供する。
本発明は、もう一つの様態として、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコリネバクテリウム属微生物で強化する段階を含む、５’−イノシン酸の排出増加方法を提供する。
本発明は、もう一つの様態として、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質の、コリネバクテリウム属微生物の５’−イノシン酸の排出増加のための用途を提供する。
前記用語、「配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質」、「強化」及び「コリネバクテリウム属微生物」は、前述した通りである。
【００３３】
以下、本発明を実施例により詳細に説明する。しかし、これらの実施例は、本発明を例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例により制限されるものではなく、本発明が属する技術分野で通常の知識を有する者にとって明らかであろう。
【００３４】
実施例１：ゲノミックＤＮＡライブラリの製作
ＩＭＰ排出に関与するコリネバクテリウム属の膜タンパク質を同定するためにコリネバクテリウム・スタティオニス（Corynebacterium stationis）ＡＴＣＣ６８７２のゲノミックＤＮＡライブラリを製作した。
以後、コリネバクテリウム属野生型の菌株は、ＩＭＰを生産できないか、ＩＭＰを生産しても、非常に極微量が生産されるだけなので、ＩＭＰ生産能を確認するために、ＩＭＰ生産能を有するＡＴＣＣ６８７２由来のＣＪＩ０３２３菌株を作製した。製作されたＣＪＩ０３２３菌株に前記ＡＴＣＣ６８７２のゲノミックＤＮＡライブラリを形質転換し、ＩＭＰ排出に関与する野生型の膜タンパク質のスクリーニングを行った。具体的な実験は、以下の通りである。
【００３５】
実施例１−１：ＩＭＰ生産株であるＣＪＩ０３２３菌株の選別
ＡＴＣＣ６８７２由来のＩＭＰ生産株を製作するために、ＡＴＣＣ６８７２をリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．０）、またはクエン酸緩衝液（ｐＨ５．５）に１０７〜１０８細胞／ｍｌで懸濁させた。ここにＵＶ処理して突然変異を誘発させた。２回にかけて０．８５％食塩水で洗浄して希釈した後、１．７％寒天を含有した最小培地に耐性を付与しようとする物質を適正濃度に含有した培地に塗抹した後、コロニーを得た。それぞれのコロニーを、栄養培地で培養し、種培地で２４時間培養した。発酵培地で３〜４日間培養した後、培養液に蓄積されたＩＭＰ生産量が最も優れたコロニーを選別した。高濃度ＩＭＰ生産株を製作するために、アデニン要求性、グアニン漏出型、リゾチーム感受性、３,４−デヒドロプロリン耐性、ストレプトマイシン耐性、アゼチジンカルボン酸耐性、チアプロリン耐性、アザセリン耐性、スルファグアニジン耐性、ノルバリン耐性、トリメトプリム耐性を付与するために、前記過程をそれぞれの物質に対して順次行い、前記物質に対する耐性が付与されてＩＭＰ生産能の優れたＣＪＩ０３２３を最終選別した。下記の表１にＡＴＣＣ６８７２に比べたＣＪＩ０３２３の耐性程度を比較して示した。
【００３６】
【表１】
0006652687.tif 000002
【００３７】
−最小培地：ブドウ糖２％、硫酸ナトリウム０．３％、リン酸第１カリウム０．１％、リン酸第二カリウム０．３％、硫酸マグネシウム０．３％、塩化カルシウム１０ｍｇ／ｌ、硫酸鉄１０ｍｇ／ｌ、硫酸亜鉛１ｍｇ／ｌ、塩化マンガン３．６ｍｇ／ｌ、Ｌ−システイン２０ｍｇ／ｌ、パントテン酸カルシウム１０ｍｇ／ｌ、チアミン塩酸塩５ｍｇ／ｌ、ビオチン３０μｇ／Ｌ、アデニン２０ｍｇ／ｌ、グアニン２０ｍｇ／ｌ、ｐＨ７．３
−栄養培地：ペプトン１％、肉汁１％、塩化ナトリウム０．２５%、酵母エキス１％、寒天２%、ｐＨ７．２
−種培地：ブドウ糖１％、ペプトン１％、肉汁１％、酵母エキス１％、塩化ナトリウム０．２５％、アデニン１００ｍｇ／ｌ、グアニン１００ｍｇ／ｌ、ｐＨ７．５
−発酵培地：グルタミン酸ナトリウム０．１％、塩化アンモニウム１％、硫酸マグネシウム１．２％、塩化カルシウム０．０１％、硫酸鉄２０ｍｇ／ｌ、硫酸マンガン２０ｍｇ／ｌ、硫酸亜鉛２０ｍｇ／ｌ、硫酸銅５ｍｇ／ｌ、Ｌ−システイン２３ｍｇ／ｌ、アラニン２４ｍｇ／ｌ、ニコチン酸８ｍｇ／ｌ、ビオチン４５μｇ／ｌ、チアミン塩酸５ｍｇ／ｌ、アデニン３０ｍｇ／ｌ、リン酸（８５％）１．９％、ブドウ糖２．５５％、果糖１．４５％になるように添加して用いた。
【００３８】
実施例１−２：ＣＪＩ０３２３の発酵力価の実験
種培地２ｍｌを直径１８ｍｍの試験管に分注して加圧殺菌した後、ＡＴＣＣ６８７２及びＣＪＩ０３２３をそれぞれ接種し、３０℃の温度で２４時間振とう培養して種培養液として用いた。発酵培地２９ｍｌを２５０ｍｌの振とう用三角フラスコに分注して１２１℃の温度で１５分間加圧殺菌した後、種培養液２ｍｌを接種して３日間培養した。培養条件は、回転数１７０ｒｐｍ、温度３０℃、ｐＨ７．５に調節した。
培養終了後、ＨＰＬＣ（SHIMAZDU LC20A）を用いた方法によりＩＭＰの生産量を測定し、培養結果は以下の表２の通りである。
【００３９】
【表２】
0006652687.tif 000003
【００４０】
実施例１−３：排出タンパク質の発掘
１．７％の寒天を添加した最小培地内にさらにＩＭＰを添加してＣＪＩ０３２３菌株の生育低下（growth inhibition）を示すスクリーニング条件を確立した。ＡＴＣＣ６８７２ゲノミックライブラリプラスミドをＣＪＩ０３２３菌株に電気穿孔法で形質転換させて（非特許文献９）、過量のＩＭＰが添加された培地条件で生育低下が解除されるコロニーを選別した。選別されたコロニーからプラスミドを獲得し、シーケンスの技法により塩基配列を分析した。このことから、過量のＩＭＰ添加条件で生育低下を解除させるのに関与する膜タンパク質の１種を同定した。
前記の１種のコリネバクテリウム膜タンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列、及び配列番号５の塩基配列（NCBI GenBank：NZ_CP014279、WP_066795121、MFS transporter）と確認された。前記膜タンパク質は、ＭＦＳトランスポーターとして知られているが、明確な機能が確認されておらず、さらにＩＭＰ排出に関する機能は知られていない。本発明では、これをＩｍｐＥ２（ＷＴ）と命名した。
【００４１】
実施例２：ＩｍｐＥ１、ＩｍｐＥ２の同定
実施例２−１：ｉｍｐＥ１、ｉｍｐＥ２の確認
前記膜タンパク質ＩｍｐＥ２の機能を調べるため、ＮＣＢＩから配列番号５の遺伝子構造を確認した（NCBI GenBank：NZ_CP014279、WP_066795121、MFS transporter）。配列番号５（ｉｍｐＥ２）はＯＲＦの開始部分の７ｂｐがｉｍｐＥ２の上流に位置した遺伝子（NCBI GenBank：NZ_CP014279、WP_066795119、transcriptional regulator）とオーバーラップされることを確認した。ｉｍｐＥ２ の上流に位置した該当遺伝子及び遺伝子からコードされるタンパク質は、まだ機能が確認されなかったので、本発明でこれをＩｍｐＥ１（ＷＴ）と命名した（配列番号１のアミノ酸配列及び配列番号４の塩基配列）。
【００４２】
実施例２−２：ｉｍｐＥ１またはｉｍｐＥ２欠損ベクターの製作
実施例１と２−１を介して同定したＩＭＰによる生育低下を解除させるのに関与するＩｍｐＥ１またはＩｍｐＥ２をＩＭＰ生産菌株で欠損させた場合、ＩＭＰの排出能が減少するのかを確認するために、各遺伝子の欠損ベクターを製作した。
ベクターを製作するための遺伝子断片は、ＡＴＣＣ６８７２ゲノミックＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを介して獲得した。
具体的には、前記ｉｍｐＥ１のＰＣＲは、配列番号６、７のプライマー及び配列番号８、９のプライマーを、ｉｍｐＥ２のＰＣＲは、配列番号１０、１１のプライマー及び配列番号１２、１３のプライマーを用いた（表３）。
【００４３】
【表３】
0006652687.tif 000004
【００４４】
この時用いたプライマーは、米国国立衛生研究所ジェンバンク（NIH GenBank）に登録されているコリネバクテリウム・スタティオニス（Corynebacterium stationis、ＡＴＣＣ６８７２）遺伝子（NCBI Genbank：NZ_CP014279）及び周辺塩基配列に対する情報に基づいて製作した。
ＰＣＲ条件は、９４℃で５分間変性した後、９４℃で３０秒の変性、５２℃で３分のアニーリング、７２℃で１分重合を２５回繰り返した後、７２℃で５分間重合反応を行った。配列番号６と７のプライマー、配列番号８と９のプライマーを用いて増幅されたｉｍｐＥ１遺伝子の二つの断片を鋳型として、オーバーラップポリメラーゼ連鎖反応を行い、１．８ｋｂｐのポリヌクレオチド鋳型を得た。得られた遺伝子の断片を制限酵素ＸｂａＩで切断した。Ｔ４リガーゼを用いて前記遺伝子断片をＸｂａＩ制限酵素で切断した線状のｐＤＺ（特許文献２及び３）のベクターにクローニングしてｐＤＺ−△ｉｍｐＥ１を製作した。また、配列番号１０と１１のプライマーを用いて増幅されたｉｍｐＥ２遺伝子断片と配列番号１２と１３のプライマーを用いて増幅されたｉｍｐＥ２遺伝子の二つの断片を鋳型として、オーバーラップポリメラーゼ連鎖反応を行い、１．７ｋｂｐのポリヌクレオチド鋳型を得た。得られた遺伝子の断片を制限酵素ＸｂａＩ、ｓｐｅＩで切断した。Ｔ４リガーゼを用いて前記遺伝子断片をＸｂａＩ制限酵素で切断した線状のｐＤＺベクターにクローニングして、ｐＤＺ−△ｉｍｐＥ２を製作した。
【００４５】
実施例２−３：ｉｍｐＥ１、ｉｍｐＥ２統合欠損ベクターの製作
前記ＩＭＰによる生育低下を解除させるのに関与するタンパク質をコードする遺伝子ｉｍｐＥ１とｉｍｐＥ２はオーバーラップされているので、二つの遺伝子は同時に調節されるべく必要性がある。したがって、ｉｍｐＥ１とｉｍｐＥ２の両方が欠損したベクターを製作した。
ｉｍｐＥ１とｉｍｐＥ２ＰＣＲは、配列番号６と１４のプライマー及び配列番号１５と１３のプライマーを用いた。この時用いたプライマーは、米国国立衛生研究所ジェンバンク（NIH GenBank）に登録されているコリネバクテリウム・スタティオニス（ＡＴＣＣ６８７２）遺伝子（NCBI Genbank：NZ_CP014279）及び周辺塩基配列に対する情報に基づいて製作した。配列番号６と１４のプライマーを用いて増幅されたｉｍｐＥ１遺伝子断片と配列番号１５と１３のプライマーを用いて増幅されたｉｍｐＥ２遺伝子の二つの断片を鋳型として、オーバーラップポリメラーゼ連鎖反応を行い、２．０ｋｂｐのポリヌクレオチド鋳型を得た。得られた遺伝子の断片を、それぞれＸｂａＩ、ｓｐｅＩで切断した。Ｔ４リガーゼを用いて前記遺伝子断片をＸｂａＩ制限酵素で切断した線状のｐＤＺベクターにクローニングして、ｐＤＺ−△ｉｍｐＥ１Ｅ２を製作した。
【００４６】
実施例２−４：ｉｍｐＥ１、ｉｍｐＥ２欠損菌株の製作
実施例２−２で製作した２種と実施例２−３で製作した１種のプラスミドをそれぞれＣＪＩ０３２３に電気穿孔法で形質転換した後（非特許文献１０による形質転換法利用）、相同性配列の組換えによって染色体上にベクターが挿入された菌株をカナマイシン（kanamycin）２５ｍｇ／Ｌを含有した培地から選別した。選別された１次菌株は再び２次交差（cross−over）を行った。最終的に形質転換された菌株の遺伝子が欠損されたかどうかは、配列番号６、９及び配列番号１０、１３及び配列番号６、１３のプライマー対を用いてＰＣＲを行うことにより確認した。
選別された菌株は、ＣＪＩ０３２３＿△ｉｍｐＥ１、ＣＪＩ０３２３＿△ｉｍｐＥ２、ＣＪＩ０３２３＿△ｉｍｐＥ１Ｅ２と命名し、前記菌株のＩＭＰの生産能を評価した。
種培地２ｍｌを直径１８ｍｍの試験管に分注して加圧殺菌した後、ＣＪＩ０３２３、ＣＪＩ０３２３＿△ｉｍｐＥ１、ＣＪＩ０３２３＿△ｉｍｐＥ２、ＣＪＩ０３２３＿△ｉｍｐＥ１Ｅ２を接種し、３０℃の温度で２４時間振とう培養して種培養液として用いた。発酵培地２９ｍｌを２５０ｍｌの振とう用三角フラスコに分注して１２１℃の温度で１５分間加圧殺菌した後、種培養液２ｍｌを接種して３日間培養した。培養条件は、回転数１７０ｒｐｍ、温度３０℃、ｐＨ７．５に調節した。
培養終了後、ＨＰＬＣ（SHIMAZDU LC20A）を用いた方法によりＩＭＰの生産量を測定し、培養結果は以下の表４の通りである。
【００４７】
【表４】
0006652687.tif 000005
【００４８】
この時、親菌株であるコリネバクテリウム・スタティオニスＣＪＩ０３２３と培地内のＩＭＰ蓄積量を比較した結果、前記表４に示すようにＣＪＩ０３２３＿△ｉｍｐＥ１、ＣＪＩ０３２３＿△ｉｍｐＥ２、ＣＪＩ０３２３＿△ｉｍｐＥ１Ｅ２菌株が同一の条件下で親菌株に比べてＩＭＰの濃度が約８ｇ／Ｌ減少したことを確認し、ＩｍｐＥ１、ＩｍｐＥ２がＩＭＰの排出に関与するタンパク質であることを確認した。
【００４９】
実施例３：野生型ｉｍｐＥ１、ｉｍｐＥ２の強化
コリネバクテリウム属野生型の菌株は、ＩＭＰを生産できないか、ＩＭＰを生産しても非常に極微量が生産されるだけなので、ＩＭＰ生産能を有するＣＪＩ０３２３菌株でＩｍｐＥタンパク質を欠損した後、野生型のＩｍｐＥタンパク質を導入することにより復元し、また、ＩｍｐＥタンパク質の活性を強化することにより野生型ＩｍｐＥタンパク質強化によるＩＭＰ排出能の増加を確認した。前記タンパク質の活性強化は、強化の方法の一つである「コピー数の増加」の方法及びプロモーター強化の方法を用いた。
【００５０】
実施例３−１：野生型ｉｍｐＥ１、ｉｍｐＥ２統合導入ベクターの製作
ＩｍｐＥが野生型に導入された菌株を製作するために、まず、ベクターを製作するための遺伝子断片をＡＴＣＣ６８７２ゲノミックＤＮＡを鋳型とし、ＰＣＲを介して獲得した。野生型ｉｍｐＥ１とｉｍｐＥ２のＰＣＲは、配列番号６と１３のプライマーを用いた。配列番号６と１３のプライマーを用いて増幅された野生型ｉｍｐＥ１−ｉｍｐＥ２遺伝子全体の断片はＸｂａＩ、ＳｐｅＩ制限酵素で処理し、ｐＤＺベクターのＸｂａＩ制限酵素の位置にクローニングして、ｐＤＺ−ｉｍｐＥ１Ｅ２（ＷＴ）を作製した。
【００５１】
実施例３−２：野生型のｉｍｐＥ１強化ベクターの製作
ＩｍｐＥ１強化ベクターを製作するために、まず、ベクターを製作するための遺伝子断片をＡＴＣＣ６８７２ゲノミックＤＮＡを鋳型とし、ＰＣＲを介して獲得した。ｉｍｐＥ１を強化するためにプロモーター部位と思われるｉｍｐＥ１上流の約３７０ｂｐを含む配列番号１６と１７のプライマーを用いて増幅した。増幅されたｉｍｐＥ１遺伝子断片をＸｂａＩの制限酵素で処理し、ｐＤＺベクターのＸｂａＩ制限酵素の位置にクローニングして、ｐＤＺ−ｉｍｐＥ１（ＷＴ）２−１を作製した。その後、２コピーベクター製作のために、ｉｍｐＥ１は配列番号１８と１９のプライマー対でＰＣＲを行った。確保された各ＤＮＡ断片は、ＤＮＡ制限酵素であるＮｏｔＩで切断し、同じＤＮＡ制限酵素で切断したｐＤＺ−ｉｍｐＥ１（ＷＴ）２−１にクローニングした。製造されたベクターは、ｐＤＺ−ｉｍｐＥ１（ＷＴ）２×と命名した。
【００５２】
実施例３−３：野生型ｉｍｐＥ１、ｉｍｐＥ２統合強化ベクターの製作
ｉｍｐＥ１とｉｍｐＥ２が統合強化された菌株を製作するために、野生型ｉｍｐＥ１とｉｍｐＥ２の統合遺伝子を配列番号１６と２０のプライマーを用い、ＰＣＲを介して増幅した。増幅された遺伝子断片をＸｂａＩの制限酵素で処理し、ｐＤＺベクターのＸｂａＩ制限酵素の位置にクローニングして、ｐＤＺ−ｉｍｐＥ１Ｅ２（ＷＴ）２−１を作製した。その後、２コピーベクターの製作のために、ｉｍｐＥ１Ｅ２は配列番号１８と２１のプライマー対でＰＣＲを行った。確保された各ＤＮＡ断片は、ＤＮＡ制限酵素であるＮｏｔＩで切断し、同じＤＮＡ制限酵素で切断したｐＤＺ−ｉｍｐＥ１Ｅ２（ＷＴ）２−１にクローニングした。製造されたベクターは、ｐＤＺ−ｉｍｐＥ１Ｅ２（ＷＴ）２×と命名した。
【００５３】
【表５】
0006652687.tif 000006
【００５４】
実施例３−４：野生型ｉｍｐＥ１、ｉｍｐＥ２の導入／強化菌株の評価
実施例３−１で製作したｐＤＺ−ｉｍｐＥ１Ｅ２（ＷＴ）を、実施例２で製作したＣＪＩ０３２３＿△ｉｍｐＥ１Ｅ２菌株に電気穿孔法で形質転換した後、（非特許文献１０による形質転換法利用）、相同性配列の組換えによって染色体上にベクターが挿入された菌株はカナマイシン（kanamycin）２５ｍｇ／Ｌを含有した培地から選別した。選別された１次菌株は再び２次交差（cross−over）を行った。最終的に形質転換された菌株の遺伝子が導入されたかどうかは、配列番号６、１３のプライマー対を用いてＰＣＲを行うことにより確認した。その後に製作された菌株ＣＪＩ０３２３＿△ｉｍｐＥ１Ｅ２＿ｉｍｐＥ１Ｅ２（ＷＴ）を評価して、ＣＪＩ０３２３菌株にｉｍｐＥ１及びｉｍｐＥ２の野生型が導入された場合のＩＭＰ生産能を確認した。
また、ＣＪＩ０３２３＿△ｉｍｐＥ１Ｅ２＿ｉｍｐＥ１Ｅ２（ＷＴ）菌株に電気穿孔法でｐＤＺ−ｉｍｐＥ１（ＷＴ）２×、ｐＤＺ−ｉｍｐＥ１Ｅ２（ＷＴ）２×ベクターを形質転換して、相同性配列の組換えによって染色体上にベクターが挿入された菌株はカナマイシン（kanamycin）２５ｍｇ／Ｌを含有した培地から選別した。選別された１次菌株は再び２次交差（cross−over）を行った。最終的に形質転換された菌株の遺伝子が強化されたかどうかは、配列番号１６、１９及び配列番号１６、２１のプライマー対を用いてＰＣＲを行うことにより確認した。ＣＪＩ０３２３＿△ｉｍｐＥ１Ｅ２＿ｉｍｐＥ１Ｅ２（ＷＴ）、ＣＪＩ０３２３＿△ｉｍｐＥ１Ｅ２＿ｉｍｐＥ１Ｅ２（ＷＴ）＿ｉｍｐＥ１（ＷＴ）２×及びＣＪＩ０３２３＿△ｉｍｐＥ１Ｅ２＿ｉｍｐＥ１Ｅ２（ＷＴ）＿ｉｍｐＥ１Ｅ２（ＷＴ）２×を実施例２−４と同様の方法で培養し、菌株を獲得して、前記菌株のＩＭＰ生産能を評価した。培養終了後、ＨＰＬＣを用いた方法によりＩＭＰの生産量を測定し、培養結果は以下の表６の通りである。
【００５５】
【表６】
0006652687.tif 000007
【００５６】
この時、培地内ＩＭＰ蓄積量を親菌株であるコリネバクテリウム・スタティオニスＣＪＩ０３２３＿△ｉｍｐＥ１Ｅ２＿ｉｍｐＥ１Ｅ２（ＷＴ）と比較した結果、前記の表６に示すように、同じ条件下でＩｍｐＥ１またはＩｍｐＥ１とＩｍｐＥ２活性が同時に強化された菌株は親菌株に比べてＩＭＰの濃度が最大２８％増加したことを確認した。ＩＭＰを生産しないか、または生産しても極微量のみを生産するコリネバクテリウム属微生物において、ＩｍｐＥタンパク質の活性の増加に起因するＩＭＰ生産量の増加は、非常に意味のあるものと解釈できる。
前記製作されたＣＪＩ０３２３及びＣＪＩ０３２３＿△ｉｍｐＥ１Ｅ２＿ｉｍｐＥ１Ｅ２（ＷＴ）＿ｉｍｐＥ１Ｅ２（ＷＴ）２×（ＣＪＩ２２３６）は、それぞれコリネバクテリウム・スタティオニスＣＮ０１−０３２３及びコリネバクテリウム・スタティオニスＣＮ０１−２２３６と命名し、ブダペスト条約下の国際寄託機関である韓国微生物保存センター（Korean CultureCenter of Microorganisms、KCCM）にそれぞれ２０１７年１１月７日付で寄託して寄託番号ＫＣＣＭ１２１５１Ｐを、２０１７年１０月２５日付で寄託して寄託番号ＫＣＣＭ１２１３７Ｐを与えられた。
【００５７】
実施例３−５：野生型ｉｍｐＥ１またはｉｍｐＥ２のプロモーター強化ベクターの製作
各遺伝子のプロモーターを強化されたプロモーターに交替するベクターを製作するための遺伝子断片は、ＡＴＣＣ６８７２ゲノミックＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを介して獲得した。
前記強化されたプロモーターは、コリネバクテリウム・スタティオニスで強く発現されると報告されているＰｃｊ７（特許文献４）プロモーターを用いた。
ｉｍｐＥ１のＰＣＲは、配列番号２２と１３のプライマー、２４と２５のプライマーを用いて増幅したそれぞれの遺伝子断片をＸｂａＩ、ＮｄｅＩの制限酵素で処理し、ｐＤＺベクターのＸｂａＩ制限酵素の位置にクローニングした。Ｐｃｊ７遺伝子断片を増幅するためにＡＴＣＣ６８７２ゲノミックＤＮＡを鋳型として配列番号３０と３１のプライマーでＰＣＲを行い、得られた断片をＮｄｅＩで処理して、前記作製したベクターをＮｄｅＩで処理してｐＤＺ−Ｐｃｊ７＿ｉｍｐＥ１（ＷＴ）ベクターを製作した。
ｉｍｐＥ２のＰＣＲは、配列番号２６と２７のプライマー、２８と２９のプライマーを用いて増幅したそれぞれの遺伝子断片をＸｂａＩ、ＮｄｅＩの制限酵素で処理し、ｐＤＺベクターのＸｂａＩ制限酵素の位置にクローニングした。前記得られたＰｃｊ７遺伝子断片と製作したベクターをＮｄｅＩで処理し、ｐＤＺ−Ｐｃｊ７＿ｉｍｐＥ２（ＷＴ）ベクターを作製した。
【００５８】
【表７】
0006652687.tif 000008
【００５９】
実施例３−６：野生型ｉｍｐＥ１、ｉｍｐＥ２プロモーター交換菌株の評価
実施例４−１で製作した２種のプラスミドをそれぞれ実施例３−３で製作したＣＪＩ０３２３＿△ｉｍｐＥ１Ｅ２＿ｉｍｐＥ１Ｅ２（ＷＴ）菌株に電気穿孔法で形質転換した後（非特許文献１０による形質転換法利用）、相同性配列の組換えによって染色体上にベクターが挿入された菌株は、カナマイシン（kanamycin）２５ｍｇ／Ｌを含有した培地から選別した。選別された１次菌株は再び２次交差（cross−over）を行った。最終的に形質転換された菌株の遺伝子が強化されたかどうかは、配列番号２２、２５及び配列番号２６、２７のプライマー対を用いてＰＣＲを行うことにより確認した。前記製作された２種の菌株は、ＣＪＩ０３２３＿△ｉｍｐＥ１Ｅ２＿ｉｍｐＥ１Ｅ２（ＷＴ）＿Ｐｃｊ７／ｉｍｐＥ１（ＷＴ）、ＣＪＩ０３２３＿△ｉｍｐＥ１Ｅ２＿ｉｍｐＥ１Ｅ２（ＷＴ）＿Ｐｃｊ７／ｉｍｐＥ２（ＷＴ）と命名した。また、製作したＣＪＩ０３２３＿△ｉｍｐＥ１Ｅ２＿ｉｍｐＥ１Ｅ２（ＷＴ）＿Ｐｃｊ７／ｉｍｐＥ１（ＷＴ）菌株を基にしてｐＤＺ−Ｐｃｊ７＿ｉｍｐＥ２（ＷＴ）を形質転換した後、相同性配列の組換えによって染色体上にベクターが挿入された菌株は、カナマイシン（kanamycin）２５ｍｇ／Ｌを含有した培地から選別した。選別された１次菌株は再び２次交差（cross−over）を行った。最終的に形質転換された菌株の遺伝子が強化されたかどうかは、配列番号２６、２９のプライマー対を用いてＰＣＲを行うことにより確認した。前記製作された菌株は、ＣＪＩ０３２３＿△ｉｍｐＥ１Ｅ２＿ｉｍｐＥ１Ｅ２（ＷＴ）＿Ｐｃｊ７／ｉｍｐＥ１（ＷＴ）＿Ｐｃｊ７／ｉｍｐＥ２（ＷＴ）と命名した。以後、前記製作された菌株ＣＪＩ０３２３＿△ｉｍｐＥ１Ｅ２＿ｉｍｐＥ１Ｅ２（ＷＴ）＿Ｐｃｊ７／ｉｍｐＥ１（ＷＴ）、ＣＪＩ０３２３＿△ｉｍｐＥ１Ｅ２＿ｉｍｐＥ１Ｅ２（ＷＴ）＿Ｐｃｊ７／ｉｍｐＥ２（ＷＴ）、及びＣＪＩ０３２３＿△ｉｍｐＥ１Ｅ２＿ｉｍｐＥ１Ｅ２（ＷＴ）＿Ｐｃｊ７／ｉｍｐＥ１（ＷＴ）＿Ｐｃｊ７／ｉｍｐＥ２（ＷＴ ）を実施例２−４と同様の方法でそれぞれ培養し、ＩＭＰ生産能を評価した。
培養終了後、ＨＰＬＣを用いた方法によりＩＭＰの生産量を測定し、培養結果は以下の表８のとおりである。
【００６０】
【表８】
0006652687.tif 000009
【００６１】
この時、培地内のＩＭＰ蓄積量を親菌株であるコリネバクテリウム・スタティオニスＣＪＩ０３２３＿△ｉｍｐＥ１Ｅ２＿ｉｍｐＥ１Ｅ２（ＷＴ）と比較した結果、前記の表８に示すように、同じ条件下でＩｍｐＥ１及び／またはＩｍｐＥ２の活性が強化された菌株は、親菌株に比べてＩＭＰの濃度が最大２８％増加したことを確認した。
前記製作したＣＪＩ０３２３＿△ｉｍｐＥ１Ｅ２＿ｉｍｐＥ１Ｅ２（ＷＴ）＿Ｐｃｊ７／ｉｍｐＥ１（ＷＴ）及びＣＪＩ０３２３＿△ｉｍｐＥ１Ｅ２＿ｉｍｐＥ１Ｅ２（ＷＴ）＿Ｐｃｊ７／ｉｍｐＥ２（ＷＴ）菌株は、ブダペスト条約下の国際寄託機関である韓国微生物保存センター（Korean Culture Center of Microorganisms、KCCM）に２０１８年１１月２日付で寄託し、それぞれ寄託番号ＫＣＣＭ１２３５７Ｐ及びＫＣＣＭ１２３５８Ｐを与えられた。
【００６２】
実施例４：ＩＭＰ生産株基盤ｉｍｐＥ１、ｉｍｐＥ２の強化
実施例４−１：ＩＭＰ生産株基盤ｉｍｐＥ１、ｉｍｐＥ２強化菌株の製作
ＩＭＰ生産菌株でｉｍｐＥ１、ｉｍｐＥ２の強化効果を確認するために、ＡＴＣＣ６８７２からＩＭＰの分解経路に該当するアデニロコハク酸シンテターゼ（adenylosuccinate synthetase）及びＩＭＰデヒドロゲナーゼ（IMP dehydrogenase）の活性が弱化された菌株を作製した。前記二つの酵素をコードする遺伝子ｐｕｒＡ及びｇｕａＢの各塩基配列から１番目の塩基をａからｔに変更して開始コドンを変更した。ＡＴＣＣ６８７２から前記二つの遺伝子の発現が弱化された菌株は、ＣＪＩ９０８８と命名した。製造されたＣＪＩ９０８８菌株に前記実施例３−３で製作したｐＤＺ−ｉｍｐＥ１（ＷＴ）２×及びｐＤＺ−ｉｍｐＥ１Ｅ２（ＷＴ）２×ベクターを電気穿孔法で形質転換し、相同性配列の組換えによって染色体上にベクターが挿入された菌株をカナマイシン（kanamycin）２５ｍｇ／Ｌを含有した培地から選別した。選別された１次菌株は再び２次交差（cross−over）を行った。最終的に形質転換された菌株の遺伝子が導入されたかどうかは、配列番号６、１３のプライマー対を用いてＰＣＲを行うことにより確認した。
製作されたＣＪＩ９０８８及びＣＪＩ９０８８＿ｉｍｐＥ１（ＷＴ）２×、 ＣＪＩ９０８８＿ｉｍｐＥ１Ｅ２（ＷＴ）２×菌株のＩＭＰ生産能を評価した。培養終了後、ＨＰＬＣを用いた方法によりＩＭＰの生産量を測定し、培養結果は以下の表９の通りである。
【００６３】
【表９】
0006652687.tif 000010
【００６４】
培地内の蓄積されたＩＭＰを確認した結果、親菌株であるＣＪＩ９０８８に比べてＩＭＰ生産能が最大６７％増加したことを確認した。このことから、本発明の５’−イノシン酸を排出するタンパク質（ＩｍｐＥ）の活性を強化することにより、ＩＭＰ生産量が増加できることを確認した。
以上の説明から、本発明が属する技術分野の当業者は、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更せず、他の具体的な形態で実施されうることを理解できるだろう。これに関連し、以上で記述した実施例はすべての面で例示的なものであり、限定的なものではないものと理解しなければならない。本発明の範囲は、前記詳細な説明より、後述する特許請求の範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導き出されるすべての変更または変形された形態が本発明の範囲に含まれるものと解釈されるべきである。     
【配列表】
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