(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
肝臓特異的合成プロモーターを含むポリヌクレオチドであって、前記プロモーターが、配列番号１のヌクレオチド配列またはこれと少なくとも９０％同一の配列を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項２】
前記プロモーターがイントロンに作動可能に連結している、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
前記イントロンがＶＨ４由来である、請求項２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
前記プロモーターおよび前記イントロンが一緒に、配列番号２のヌクレオチド配列またはこれと少なくとも９０％同一の配列を構成する、請求項３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
前記プロモーターが目的のポリヌクレオチドに作動可能に連結している、請求項１から４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
前記目的のポリヌクレオチドがポリペプチドまたは機能性核酸をコードする、請求項５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
前記目的のポリヌクレオチドが凝固因子をコードする、請求項６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８】
前記目的のポリヌクレオチドが第ＶＩＩＩ因子をコードする、請求項７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９】
前記目的のポリヌクレオチドがＢドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子をコードする、請求項８に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０】
前記目的のポリヌクレオチドが、配列番号３のヌクレオチド配列またはこれと少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１】
配列番号４のヌクレオチド配列またはこれと少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２】
前記目的のポリヌクレオチドの下流にポリアデニル化部位をさらに含む、請求項１から１１のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３】
請求項１から１２のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１４】
前記ベクターがウイルスベクターである、請求項１３に記載のベクター。
【請求項１５】
前記ベクターがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項１４に記載のベクター。
【請求項１６】
前記ＡＡＶベクターがＡＡＶ８またはＡＡＶ９ベクターである、請求項１５に記載のベクター。
【請求項１７】
請求項１から１２のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドおよび／または請求項１３から１６のいずれか１項に記載のベクターを含む形質転換細胞。
【請求項１８】
請求項１から１２のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項１３から１６のいずれか１項に記載のベクターおよび／または請求項１７の形質転換細胞を含む、ヒトを除く遺伝子導入動物。
【請求項１９】
対象の肝臓で前記ポリペプチドまたは機能性核酸を産生する方法において使用するための、請求項６から１２のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項１３から１６のいずれか１項に記載のベクター、および／または請求項１７の形質転換細胞。
【請求項２０】
対象における血友病Ａまたは後天性第ＶＩＩＩ因子欠乏症を処置する方法において使用するための、請求項８から１２のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項１３から１６のいずれか１項に記載のベクター、および／または請求項１７の形質転換細胞。
【請求項２１】
対象における前記第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドのバイオアベイラビリティを増加させる方法において使用するための、請求項８から１２のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項１３から１６のいずれか１項に記載のベクター、および／または請求項１７の形質転換細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権の陳述
本出願は、その内容全体が引用することにより本明細書の一部をなすものとする、２０１５年２月６日に出願された米国仮出願第６２／１１２，９０１号の利益を主張する。
【０００２】
本発明は、対象の肝臓でポリペプチドおよび機能性核酸を産生するための肝臓特異的合成プロモーターおよび発現構築物に関する。本発明はさらに、第ＶＩＩＩ因子タンパク質のアミノ酸配列に改変を含有する第ＶＩＩＩ因子タンパク質、ならびに該第ＶＩＩＩ因子タンパク質をコードする核酸構築物およびこれらの組成物を使用して出血障害を処置する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）は、第Ｘ因子から第Ｘａ因子への変換を加速させることにより凝固カスケードにおいて重要な役割を果たす。ＦＶＩＩＩ活性の欠乏は出血障害血友病Ａの原因である。血友病Ａの現在の処置は、血漿由来または組換えＦＶＩＩＩタンパク質の静脈内注入である。この処置は出血エピソードの制御に有効であるにもかかわらず、ＦＶＩＩＩの短い半減期（８〜１２時間）により頻回注入が必要なことが、この処置を本質的に高価にしている。遺伝子治療は、この疾患の最終的な治癒に対する魅力的な戦略として現れた。しかしながら、最も有望なウイルスベクターの１つ、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を使用するＦＶＩＩＩ遺伝子の送達の進歩は、ＡＡＶパッケージング能力に近いコード配列ＦＶＩＩＩの大きなサイズのため、凝固因子ＩＸの送達の進歩よりも遅れている。
【発明の概要】
【０００４】
本発明は、ＡＡＶベクターでの使用に適した短い、合成の肝臓特異的プロモーターおよび発現構築物を提供することにより、当技術分野の短所を克服する。本発明は、アミノ酸配列改変を有する追加の糖鎖付加部位を含むＦＶＩＩＩタンパク質、および出血障害の処置におけるその使用方法をさらに提供する。
【０００５】
本発明は、わずか約２００塩基対の長さの肝臓特異的合成プロモーターの開発に部分的に基づく。該プロモーターは、特にＡＡＶベクターを使用して肝臓特異的にポリペプチドおよび機能性核酸を産生するのに使用することができる。ＡＡＶベクターには厳しい長さの制約があり、短いが強力なプロモーターの利用が有効である。
【０００６】
本発明はさらに、重鎖に追加の糖鎖付加部位を含む改変ＦＶＩＩＩタンパク質の開発に部分的に基づく。該改変タンパク質は、本明細書に記載した改変がないＦＶＩＩＩタンパク質と比べて長期の高レベルの活性をもたらす。
【０００７】
一態様では、本発明は、肝臓特異的合成プロモーターを含むポリヌクレオチドに関し、該プロモーターは、配列番号１のヌクレオチド配列またはこれと少なくとも９０％同一の配列を含む。
【０００８】
別の態様では、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、細胞、および／または遺伝子導入動物に関する。
【０００９】
さらなる態様では、本発明は、対象の肝臓でポリペプチドまたは機能性核酸を産生する方法であって、本発明のポリヌクレオチド、ベクターおよび／または形質転換細胞を対象に送達し、これにより対象の肝臓でポリペプチドまたは機能性核酸を産生することを含む方法に関する。
【００１０】
追加の態様では、本発明は、対象における血友病Ａを処置する方法であって、治療有効量の、本発明のポリヌクレオチド、ベクターおよび／または形質転換細胞を対象に送達し、これにより対象における血友病Ａを処置することを含む方法に関する。
【００１１】
別の態様では、本発明は、対象における第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドのバイオアベイラビリティを増加させる方法であって、有効量の、本発明のポリヌクレオチド、ベクターおよび／または形質転換細胞を対象に送達し、これにより対象における第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドのバイオアベイラビリティを増加させることを含む方法に関する。
【００１２】
さらなる態様では、本発明は、重鎖のアミノ酸残基が１つまたは複数の糖鎖付加部位を作製するために改変された、改変ヒト第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドに関する。
【００１３】
追加の態様では、本発明は、本発明の改変ヒト第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびに該ポリヌクレオチドを含むベクター、細胞、および／または遺伝子導入動物に関する。
【００１４】
別の態様では、本発明は、対象の肝臓で第ＶＩＩＩ因子を産生する方法であって、本発明の改変ヒト第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチドを含むベクターおよび／もしくは形質転換細胞を対象に送達し、これにより対象の肝臓で第ＶＩＩＩ因子を産生することを含む方法に関する。
【００１５】
さらなる態様では、本発明は、対象における血友病Ａを処置する方法であって、治療有効量の、本発明の改変ヒト第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクターおよび／または形質転換細胞を対象に送達し、これにより対象における血友病Ａを処置することを含む方法に関する。
【００１６】
追加の態様では、本発明は、対象における第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドのバイオアベイラビリティ増加させる方法であって、有効量の、本発明の改変ヒト第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチドを含むベクターおよび／もしくは形質転換細胞を対象に送達し、これにより対象における第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドのバイオアベイラビリティを増加させることを含む方法に関する。
【００１７】
本発明のこれらの態様およびその他の態様を、以下の本発明の説明においてより詳細に述べる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】ＬＸＰ３．３プロモーターの配列（配列番号１）を示す図である。推定肝臓転写因子およびハウスキーピング転写因子結合部位が下線によって強調されている。
【図２Ａ】ＡＡＶ９−ＴＢＧ−ＬａｃＺまたはＡＡＶ９−Ｌｘｐ３．３−ＬａｃＺをマウスに静脈内注射後の肝臓および心臓におけるＬａｃＺ発現の比較を示す図である。肝臓および心臓薄片のＸ−ｇａｌおよびＨ＆Ｅ二重染色が示されている。
【図２Ｂ】１×１０１１個のベクターゲノム（ｖ．ｇ．）のＡＡＶ９−ＬａｃＺベクターで処置したマウスの様々な組織におけるＬａｃＺ酵素活性の定量的比較を示す図である。ＡＡＶ９−ＬａｃＺベクターは、それぞれ非特異的ＣＭＶプロモーター、肝臓特異的ＴＢＧプロモーター、またはＬＸＰ３．３プロモーターを含有した（図１に例示）。
【図２Ｃ】図２Ｂに示す、ただしより低量（２×１０１０ベクターゲノム（ｖ．ｇ．）のＡＡＶ９−ＬａｃＺベクターで処置したマウスの肝臓におけるＬａｃＺ酵素活性の定量的比較を示す図である。
【図３】異なるＡＡＶベクタープラスミドをトランスフェクトされたＨｕｈ７細胞の上清中の第ＶＩＩＩ因子活性を示す図である。該プラスミドは、イントロンなしでまたはＶＨ４イントロンもしくはキメラＣＩＮイントロンと共に、ヒトＢＤＤ第ＶＩＩＩ因子遺伝子を駆動するＮＢＰプロモーター（１７７ｂｐ）を含有した。
【図４】ＡＡＶ−Ｌｘｐ３．３ｉ−ＢＤＤ−Ｆ８構築物およびＬｘｐ３．３ｉプロモーター−イントロンの配列（配列番号２）を示す図である。ＩＴＲはＡＡＶの１４５ｂｐ逆方向末端反復を表す。
【図５】ヒト肝臓癌Ｈｕｈ７細胞およびマウスＨｅｐａ１−６細胞にける非特異的ＣＭＶプロモーターまたは肝臓特異的ＬＸＰ３．３プロモーターを含有する２つの構築物からのＦＶＩＩＩ発現を示す図である。
【図６】それぞれプロモーターＬＸＰ３．３または弱いプロモーターＴｋＰｒｏを含有する異なるＢＤＤ第ＶＩＩＩ因子（合成ｏｐｔｉ−Ｆ８または野生型ｗｔＦ８）プラスミドをそれぞれトランスフェクトされたＨｕｈ７細胞におけるＦＶＩＩＩ活性を示す図である。
【図７Ａ】高用量（２×１０１１ｖ．ｇ．／マウス）または低用量（４×１０１０ｖ．ｇ．／マウス）のＩＶ注射後の、ＦＶＩＩＩノックアウトマウスにおけるＡＡＶ９−Ｌｘｐ３．３−Ｆ８媒介長期ヒトＦＶＩＩＩ遺伝子発現およびＦＶＩＩＩ活性を示す図である。第ＶＩＩＩ因子活性（正常ヒトレベルのパーセンテージとしての）は、それぞれ注射後２、６、１０および１８週目に測定された。
【図７Ｂ】高用量（２×１０１１ｖ．ｇ．／マウス）または低用量（４×１０１０ｖ．ｇ．／マウス）のＩＶ注射後の、ＦＶＩＩＩノックアウトマウスにおけるＡＡＶ９−Ｌｘｐ３．３−Ｆ８媒介長期ヒトＦＶＩＩＩ遺伝子発現およびヒトＦＶＩＩＩタンパク質濃度を示す図である。第ＶＩＩＩ因子タンパク質は、それぞれ注射後２、６、１０および１８週目にＥＬＩＳＡにより（正常ヒトレベルのパーセンテージとして）測定された。
【図８】改変ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩタンパク質（配列番号３１〜３４）のアミノ酸配列を示す図である。ＳＱはＢＤＤ  第ＶＩＩＩ因子の重鎖および軽鎖の接合部のセリン７４３（Ｓｅｒ  ７４３）およびグルタミン（Ｇｌｎ  １６３８）を表す（配列番号５に基づくナンバリング）。下線を付した文字は重鎖の変異アミノ酸を強調している。
【図９Ａ】ＢＤＤ第ＶＩＩＩ因子または変異体Ｆ８Ｘ１およびＦ８Ｘ２を含有する発現プラスミドをトランスフェクトされたＨｕｈ７細胞におけるヒトＦＶＩＩＩ活性を示す図である（詳細は図８を参照）。
【図９Ｂ】ＦＶＩＩＩノックアウトマウスにおける変異体ヒトＢＤＤ  ＦＶＩＩＩ遺伝子のＡＡＶ８ベクター媒介長期発現を示す図である。ヒト第ＶＩＩＩ因子活性（正常ヒトレベルのパーセンテージとしての）は、５×１０１０ベクターゲノムのＡＡＶ８−ＬＸＰ３．３ｉ−Ｆ８Ｘ１またはＡＡＶ８−ＬＸＰ３．３ｉ−Ｆ８Ｘ２を静脈内注射後の様々な時点で測定された。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明を、これより、本発明の好ましい実施形態が示されている添付図面を参照してより詳細に記載する。しかしながら、本発明は異なる形態で実施することができ、本明細書で述べられている実施形態に限定されると解釈すべきではない。むしろ、これらの実施形態は、本開示が十分かつ完全となり、本発明の範囲を当業者に十分に伝えるように提供される。
【００２０】
文脈が別段のことを指示しない限り、本明細書に記載する本発明の様々な特徴を任意の組み合わせで使用することができることが明確に意図される。さらに、本発明はまた、本発明のいくつかの実施形態において、本明細書で述べる任意の特徴または特徴の組み合わせを除外することができるまたは省略することができることも意図するものである。例示すると、ある複合体が構成要素Ａ、ＢおよびＣを含むことが本明細書で述べられている場合、Ａ、ＢもしくはＣのうちのいずれかまたはそれらの組み合わせを単独でまたは任意の組み合わせで省略して特許請求の範囲から除外する（ｄｉｓｃｌａｉｍｅｄ）ことができることが明確に意図される。
【００２１】
別段の定義がない限り、本明細書で使用する全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者により一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書において本発明の説明で使用する専門用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的とし、本発明を限定することを意図するものではない。
【００２２】
別段の具体的な指示がない限り、本明細書では、ヌクレオチド配列を左から右へ５’から３’方向に一本鎖のみで示す。本明細書では、ヌクレオチドおよびアミノ酸の両方を、特許法施行規則第１．８２２条および確立された用法に従って、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎにより推奨された様式でまたは（アミノ酸に関しては）１文字表記もしくは３文字表記のいずれかにより表す。
【００２３】
別段に指示されている場合を除き、当業者に既知である標準的な方法を、遺伝子のクローニング、核酸の増幅および検出等に使用することができる。そのような技法は当業者に既知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ第２版（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９）、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ他、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．およびＪｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を参照。
【００２４】
Ｉ．定義
本発明の説明および添付した特許請求の範囲で使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が別段のことを明確に指示しない限り複数形も含むことを意図するものである。
【００２５】
本明細書で使用する場合にも、「および／または」は、列挙した関連事項のうちの１つまたは複数の任意の組み合わせおよび全ての可能な組み合わせ、ならびに選択肢（「または」）として解釈した場合には組み合わせの欠如を指し、これらを包含する。
【００２６】
用語「約」は本明細書で使用する場合、例えばポリペプチドの量、用量、時間、温度、酵素活性またはその他の生物学的活性等等の測定可能な値を指す場合に、特定の量の±２０％、±１０％、±５％、±１％、±０．５％または±０．１％のばらつきを包含することを意味する。
【００２７】
移行句「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」は、請求項の範囲が該請求項に列挙した特定の材料または工程、および請求された本発明の「基本的なおよび新規の特徴に実質的に影響を与えないもの」を包含すると解釈することを意味する。Ｉｎ  ｒｅ  Ｈｅｒｚ，５３７  Ｆ．２ｄ  ５４９，５５１−５２，１９０  ＵＳＰＱ  ４６１，４６３（ＣＣＰＡ  １９７６）（原文の強調）を参照。ＭＰＥＰ  §  ２１１１．０３も参照。
【００２８】
用語「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」（および文法的変形）は、本発明のポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列に適用する場合、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの機能が実質的に変更されないように、列挙した配列（例えば配列番号）ならびに、列挙した配列の５’末端および／もしくは３’末端またはＮ末端および／もしくはＣ末端の合計１０個以下（例えば１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個）の追加のヌクレオチドまたはアミノ酸の両方からなるポリヌクレオチドまたはポリペプチドを意味する。合計１０個以下の追加のヌクレオチドまたはアミノ酸は、両方の末端に一緒に追加された追加のヌクレオチドまたはアミノ酸の総数を含む。用語「実質的に変更された」は本発明のポリヌクレオチドに適用する場合、列挙した配列からなるポリヌクレオチドの発現レベルと比較して、少なくとも約５０％以上のコードされたポリペプチドを発現する能力の増減を指す。用語「実質的に変更された」は本発明のポリペプチドに適用する場合、列挙した配列からなるポリペプチドの活性と比較して、少なくとも約５０％以上の凝固刺激活性の増減を指す。
【００２９】
用語「高める（ｅｎｈａｎｃｅ）」または「増加させる（ｉｎｃｒｅａｓｅ）」またはこれらの文法的変形は本明細書で使用する場合、少なくとも約１．２５倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、８倍、１０倍、１２倍または１５倍の特定のパラメータの増加を指す。
【００３０】
用語「阻害する（ｉｎｈｉｂｉｔ）」または「低減する（ｒｅｄｕｃｅ）」またはこれらの文法的変形は本明細書で使用する場合、少なくとも約１５％、２５％、３５％、４０％、５０％、６０％、７５％、８０％、９０％、９５％またはより多くの特定のレベルまたは活性の低下または減少を指す。特定の実施形態では阻害または低減は、ほとんど検出できない活性または本質的に検出不能の活性（多くてもわずかな量、例えば約１０％未満または５％未満）をもたらす。
【００３１】
「有効」量とは本明細書で使用する場合、所望の効果をもたらす量のことである。
【００３２】
「治療上有効」量とは本明細書で使用する場合、対象にある程度の改善または利益をもたらす量のことである。換言すると、「治療有効」量とは、対象における少なくとも１種の臨床症状のある程度の軽減、緩和または低減をもたらすことができる量のことである。ある程度の利益が対象にもたらされる限り、治療効果が完璧であるまたは治癒的である必要はないことを当業者は認識する。
【００３３】
「予防有効」量とは本明細書で使用する場合、対象における疾患、障害および／または臨床症状を予防する（本明細書で定義したように）のに十分な量のことである。ある程度の利益が対象にもたらされる限り、予防レベルが完璧である必要はないことを当業者は認識する。
【００３４】
本発明の方法により出血障害を処置する有効性は、当業者に公知であるように対象の症状および／または臨床パラメータの変化により示された臨床的改善を検出することにより決定することができる。
【００３５】
「処置する（ｔｒｅａｔ）」、「処置すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」または「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、対象の状態の重症度が低減されるまたは少なくとも部分的に改善されるもしくは改変されること、および少なくとも１種の臨床症状のある程度の軽減、緩和または低減が達成されることを意図するものである。
【００３６】
用語「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔ）」、「予防すること（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」または「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」（およびこれらの文法的変形）は、疾患、障害および／または臨床症状の発症前に本発明の方法を実施しない場合に起こることと比べた、発症後の疾患、障害および／または臨床症状の程度または重症度の低下または遅延を指す。血友病Ａに関して、「予防すること」は、予防的処置がない場合に起こる出血エピソードの回数および／または重症度より低い出血エピソードの回数および／または重症度の発生を指す。
【００３７】
本明細書で使用する場合、「核酸」、「ヌクレオチド配列」および「ポリヌクレオチド」を互換的に使用し、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、合成（例えば、化学的に合成された）ＤＮＡまたはＲＮＡならびにＲＮＡおよびＤＮＡのキメラを含む、ＲＮＡおよびＤＮＡの両方を包含する。用語ポリヌクレオチド、ヌクレオチド配列または核酸は、鎖の長さに関係なくヌクレオチドの鎖を指す。核酸は、二本鎖または一本鎖であり得る。一本鎖の場合、核酸はセンス鎖またはアンチセンス鎖であり得る。核酸は、オリゴヌクレオチド類似体または誘導体（例えば、イノシンまたはホスホロチオエートヌクレオチド）を使用して合成することができる。そのようなオリゴヌクレオチドは、例えば、塩基対形成能力が変更されたまたはヌクレアーゼ耐性が向上した核酸を調製するのに使用することができる。本発明は、本発明の核酸、ヌクレオチド配列、またはポリヌクレオチドの相補体（完全相補体または部分的相補体のどちらかであり得る）である核酸をさらに提供する。
【００３８】
「単離されたポリヌクレオチド」とは、これが由来する生物の天然に存在するゲノムにおいて、これが直接隣接する（一方は５’末端および一方は３’末端に）ヌクレオチド配列とは直接隣接しないヌクレオチド配列（例えばＤＮＡまたはＲＮＡ）のことである。そのため、一実施形態では単離された核酸は、コード配列に直接隣接する５’非コード（例えばプロモーター）配列の一部または全てを含む。したがって、該用語は、例えば、ベクター、自律複製プラスミドもしくはウイルス、または原核生物もしくは真核生物のゲノムＤＮＡに組み込まれる組換えＤＮＡ、あるいはその他の配列から独立して別個の分子（例えば、ｃＤＮＡまたはＰＣＲもしくは制限エンドヌクレアーゼ処置により産生されたゲノムＤＮＡフラグメント）として存在する組換えＤＮＡを含む。該用語はまた、追加のポリペプチドまたはペプチドコード配列ハイブリッド核酸の一部である組換えＤＮＡも含む。遺伝子を含む単離されたポリヌクレオチドは、そのような遺伝子を含む染色体のフラグメントではなく、むしろ該遺伝子に関連したコード領域および調節領域を含むが、該染色体で天然に見出される追加の遺伝子を含まない。
【００３９】
用語「フラグメント」はポリヌクレオチドに適用する場合、参照核酸または参照ヌクレオチド配列と比べて長さが縮小し、ならびに参照核酸または参照ヌクレオチド配列と同一またはほとんど同一（例えば９０％、９２％、９５％、９８％、９９％同一）の隣接するヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む、該ヌクレオチド配列から本質的になる、および／または該ヌクレオチド配列からなるヌクレオチド配列を意味すると理解される。本発明に係るそのような核酸フラグメントは、これが構成要素となるより大きいポリヌクレオチドに必要に応じて含めることができる。いくつかの実施形態では、そのようなフラグメントは、本発明に係る核酸またはヌクレオチド配列の少なくとも約８個、１０個、１２個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、７５個、１００個、１５０個、２００個もしくはより多くの連続ヌクレオチドの長さを有するオリゴヌクレオチドを含むことができる、該オリゴヌクレオチドから本質的になっていてもよい、および／または該オリゴヌクレオチドからなっていてもよい。
【００４０】
用語「単離された」は、細胞性物質、ウイルス性物質、および／または培養培地（組換えＤＮＡ法により産生する場合）、または化学前駆体もしくはその他の化学物質（化学的に合成する場合）が実質的にない核酸、ヌクレオチド配列またはポリペプチドを指し得る。さらに、「単離されたフラグメント」とは、フラグメントとして天然に存在せず、天然の状態では見出されない核酸、ヌクレオチド配列またはポリペプチドのフラグメントのことである。「単離された」は、調製物が技術的に純粋（均質）であることを意味しないが、意図した目的に使用され得る形態でポリペプチドまたは核酸を提供するには十分に純粋である。
【００４１】
用語「フラグメント」はポリペプチドに適用する場合、参照ポリペプチドまたは参照アミノ酸配列と比べて長さが縮小し、ならびに参照ポリペプチドまたは参照アミノ酸配列と同一またはほとんど同一（例えば９０％、９２％、９５％、９８％、９９％同一）の隣接するアミノ酸のアミノ酸配列を含む、該アミノ酸配列から本質的になる、および／または該アミノ酸配列からなるアミノ酸配列を意味すると理解される。本発明に係るそのようなポリペプチドフラグメントは、これが構成要素となるより大きいポリペプチドに必要に応じて含めることができる。いくつかの実施形態では、そのようなフラグメントは、本発明に係るポリペプチドまたはアミノ酸配列の少なくとも約４個、６個、８個、１０個、１２個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、７５個、１００個、１５０個、２００個もしくはより多くの連続アミノ酸の長さを有するペプチドを含むことができる、該ペプチドから本質的になっていてもよい、および／または該ペプチドからなっていてもよい。
【００４２】
「ベクター」とは、核酸を細胞にクローニングおよび／または移入するための任意の核酸分子のことである。ベクターはレプリコンであってもよい。レプリコンはこれに別のヌクレオチド配列を結合して、結合したヌクレオチド配列の複製を可能にすることができる。「レプリコン」は、インビボでの核酸複製の自律的単位として機能する、すなわち、それ自身の制御下で複製することができる任意の遺伝子エレメント（例えば、プラスミド、ファージ、コスミド、染色体、ウイルスゲノム）であり得る。用語「ベクター」は、インビトロ、エクスビボ、および／またはインビボで細胞に核酸を導入するためのウイルスおよび非ウイルス（例えばプラスミド）核酸分子の両方を含む。当分野で既知の多くのベクターを使用して核酸を操作すること、応答エレメントおよびプロモーターを遺伝子に組み込むこと等ができる。例えば、応答エレメントおよびプロモーターに対応する核酸フラグメントの適切なベクターへの挿入は、適切な核酸フラグメントを相補的な付着末端を有する選択されたベクターにライゲートすることにより達成することができる。また、核酸分子の末端を酵素的に修飾することができ、またはヌクレオチド配列（リンカー）を核酸末端にライゲートすることにより任意の部位を産生することができる。そのようなベクターは、ベクターを含有する細胞および／またはベクターの核酸を細胞ゲノムに取り込んだ細胞の選択をもたらす選択マーカーをコードする配列を含有するように改変することができる。そのようなマーカーは、マーカーによりコードされたタンパク質を取り込み、発現する宿主細胞の同定および／または選択を可能にする。「組換え」ベクターは、１つまたは複数の異種ヌクレオチド配列（すなわち導入遺伝子）、例えば、２つ、３つ、４つ、５つまたはより多くの異種ヌクレオチド配列を含むウイルスベクターまたは非ウイルスベクターを指す。
【００４３】
ウイルスベクターは、細胞および生きている動物対象における幅広い遺伝子送達用途に使用されている。使用することができるウイルスベクターとして、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、アルファウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、エプスタインバーウイルスベクター、およびアデノウイルスベクターが挙げられるがこれらに限定されない。非ウイルスベクターとして、プラスミド、リポソーム、荷電脂質（サイトフェクチン）、核酸−タンパク質複合体、およびバイオポリマーが挙げられる。目的の核酸に加えて、ベクターは１つもしくは複数の調節領域、ならびに／または核酸移入結果（特定の組織への送達、発現期間等）の選択、測定およびモニタリングに有用な選択マーカーも含むことができる。
【００４４】
ベクターは当分野で既知の方法、例えば、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、形質導入、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション（リソソーム融合）、遺伝子銃の使用、または核酸ベクタートランスポーターにより、所望の細胞に導入することができる（例えば、Ｗｕ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：９６３（１９９２）；Ｗｕ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１４６２１（１９８８）；およびＨａｒｔｍｕｔ他、カナダ特許出願第２，０１２，３１１号、１９９０年３月１５日出願を参照）。様々な実施形態では、カチオン性オリゴペプチド（例えば国際特許公開ＷＯ９５／２１９３１）、核酸結合タンパク質に由来するペプチド（例えば国際特許公開ＷＯ９６／２５５０８）、および／またはカチオン性ポリマー（例えば国際特許公開ＷＯ９５／２１９３１）等のその他の分子を、インビボでの核酸の送達を促進するのに使用することができる。裸の核酸としてインビボでベクターを導入することもできる（米国特許第５，６９３，６２２号、米国特許第５，５８９，４６６号および米国特許第５，５８０，８５９号を参照）。受容体媒介核酸送達アプローチも使用することができる（Ｃｕｒｉｅｌ他、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．３：１４７（１９９２）；Ｗｕ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９（１９８７））。
【００４５】
本明細書で使用する場合、用語「タンパク質」および「ポリペプチド」は、別段の指示がない限り互換的に使用され、ペプチドおよびタンパク質の両方を包含する。
【００４６】
「融合タンパク質」とは、天然には融合した状態で見出されない２つ（以上）の異なるポリペプチドをコードする２つの異種ヌクレオチド配列またはそれらのフラグメントが、正しい翻訳リーディングフレームにおいて融合される場合に産生されるポリペプチドのことである。例示的な融合ポリペプチドとして、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、マルトース結合タンパク質、またはレポータータンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質、β−グルクロニダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ等）、赤血球凝集素、ｃ−ｍｙｃ、ＦＬＡＧエピトープ等の全てまたは一部への、本発明のポリペプチド（またはそのフラグメント）の融合が挙げられる。
【００４７】
本明細書で使用する場合、「機能性」ポリペプチドまたは「機能性フラグメント」とは、そのポリペプチドと通常は関連がある少なくとも１種類の生物学的活性（例えば、血管新生活性、タンパク質結合、リガンドまたは受容体結合）を実質的に保持するものである。特定の実施形態では、「機能性」ポリペプチドまたは「機能性フラグメント」は、非改変ペプチドにより保有される活性の全てを実質的に保持する。生物学的活性を「実質的に保持する」とは、ポリペプチドが、天然のポリペプチドの生物学的活性の少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７５％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％またはより多くを保持する（および天然のポリペプチドより高いレベルの活性を有することさえできる）ことを意味する。「非機能性」ポリペプチドとは、ポリペプチドと通常は関連がある、ほとんど検出できない生物学的活性または本質的に検出不能の生物学的活性（例えば、多くてもほんのわずかな量、例えば約１０％未満または５％未満）を示すものである。タンパク質結合および血管新生活性等の生物学的活性は、当分野で公知であり本明細書に記載されたアッセイを使用して測定することができる。
【００４８】
ポリヌクレオチドコード配列の「発現（ｅｘｐｒｅｓｓ）」または「発現（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）」という用語は、該配列が転写され、および任意選択的に翻訳されることを意味する。典型的には、本発明によれば、本発明のコード配列の発現は本発明のポリペプチドの産生をもたらす。発現したポリペプチドまたはフラグメント全体は、精製することなくインタクトな細胞で機能することもできる。
【００４９】
本発明に関連する用語「アデノ随伴ウイルス」（ＡＡＶ）には、ＡＡＶ１型、ＡＡＶ２型、ＡＡＶ３型（３Ａ型および３Ｂ型を含む）、ＡＡＶ４型、ＡＡＶ５型、ＡＡＶ６型、ＡＡＶ７型、ＡＡＶ８型、ＡＡＶ９型、ＡＡＶ１０型、ＡＡＶ１１型、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶならびにヒツジＡＡＶ、ならびに未知のまたは後に発見される任意の他のＡＡＶが含まれるがこれらに限定されない。例えば、ＢＥＲＮＡＲＤ  Ｎ．ＦＩＥＬＤＳ他、ＶＩＲＯＬＯＧＹ、第２巻、第６９章（第４版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）を参照。多くのさらなるＡＡＶの血清型およびクレードも同定されており（例えばＧａｏ他、（２００４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７８：６３８１〜６３８８および表１を参照）、これらも用語「ＡＡＶ」に包含される。
【００５０】
様々なＡＡＶおよび自律性パルボウイルスのゲノム配列ならびにＩＴＲ、Ｒｅｐタンパク質およびカプシドサブユニットの配列は当分野で既知である。そのような配列を、文献にまたはＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）データベース等の公共データベースに見出すことができる。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号ＮＣ００２０７７、ＮＣ００１４０１、ＮＣ００１７２９、ＮＣ００１８６３、ＮＣ００１８２９、ＮＣ００１８６２、ＮＣ０００８８３、ＮＣ００１７０１、ＮＣ００１５１０、ＡＦ０６３４９７、Ｕ８９７９０、ＡＦ０４３３０３、ＡＦ０２８７０５、ＡＦ０２８７０４、Ｊ０２２７５、Ｊ０１９０１、Ｊ０２２７５、Ｘ０１４５７、ＡＦ２８８０６１、ＡＨ００９９６２、ＡＹ０２８２２６、ＡＹ０２８２２３、ＮＣ００１３５８、ＮＣ００１５４０、ＡＦ５１３８５１、ＡＦ５１３８５２、ＡＹ５３０５７９、ＡＹ６３１９６５、ＡＹ６３１９６６を参照し、これらの開示はその全体が本明細書に援用される。また、例えばＳｒｉｖｉｓｔａｖａ他、（１９８３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４５：５５５；Ｃｈｉｏｒｉｎｉ他、（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：６８２３；Ｃｈｉｏｒｉｎｉ他、（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：１３０９；Ｂａｎｔｅｌ−Ｓｃｈａａｌ他、（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：９３９；Ｘｉａｏ他、（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：３９９４；Ｍｕｒａｍａｔｓｕ他、（１９９６）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２２１：２０８；Ｓｈａｄｅ他、（１９８６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５８：９２１；Ｇａｏ他、（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９９：１１８５４；国際特許公開ＷＯ００／２８０６１、ＷＯ９９／６１６０１、ＷＯ９８／１１２４４；米国特許第６，１５６，３０３号も参照し、これらの開示はその全体が本明細書に援用される。また、表１も参照。Ｘｉａｏ，Ｘ．（１９９６）、「Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ（ＡＡＶ）ＤＮＡ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ」、博士論文、ピッツバーグ大学、ピッツバーグ、ペンシルベニア州（その全体が本明細書に援用される）には、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２およびＡＡＶ３の末端反復配列の初期の説明が記載されている。
【００５１】
【表１】
0006800863.tif 000002
【００５２】
「組換えＡＡＶベクターゲノム」または「ｒＡＡＶゲノム」とは、少なくとも１つの逆方向末端反復（例えば、１つの、２つのまたは３つの逆方向末端反復）と、１つまたは複数の異種ヌクレオチド配列とを含むＡＡＶゲノム（すなわちｖＤＮＡ）のことである。ｒＡＡＶベクターは、ウイルスを生成するために１４５塩基の末端反復（ＴＲ）をシスで一般に保持するが、部分的にまたは完全に合成の配列を含む改変ＡＡＶ  ＴＲおよび非ＡＡＶ  ＴＲも、この目的に役立つことができる。全てのその他のウイルス配列が必ずしも必要ではなく、トランスで供給されてもよい（Ｍｕｚｙｃｚｋａ、（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７）。ｒＡＡＶベクターは２つのＴＲ（例えばＡＡＶ  ＴＲ）を任意選択的に含み、これらのＴＲは一般に異種ヌクレオチド配列の５’末端および３’末端にあることができるが、それらに隣接している必要はない。これらのＴＲは互いに同じであり得る、または互いに異なることができる。ベクターゲノムはまた、その３’末端または５’末端に単一のＩＴＲを含有することもできる。
【００５３】
用語「末端反復」または「ＴＲ」には、任意のウイルス末端反復、またはヘアピン構造を形成し逆方向末端反復として機能する（すなわち、例えば複製、ウイルスパッケージング、組み込みおよび／もしくはプロウイルス救済等の所望の機能を媒介する）合成配列が含まれる。ＴＲは、ＡＡＶ  ＴＲまたは非ＡＡＶ  ＴＲであり得る。例えば、その他のパルボウイルス（例えば、イヌパルボウイルス（ＣＰＶ）、マウスパルボウイルス（ＭＶＭ）、ヒトパルボウイルスＢ−１９）の非ＡＡＶ  ＴＲ配列等の非ＡＡＶ  ＴＲ配列またはＳＶ４０複製の開始点としての役割を果たすＳＶ４０ヘアピンをＴＲとして使用することができ、非ＡＡＶ  ＴＲ配列またはＳＶ４０ヘアピンを短縮化、置換、欠失、挿入および／または追加によりさらに改変することができる。さらに、ＴＲは、Ｓａｍｕｌｓｋｉ他に対する米国特許第５，４７８，７４５号に記載されている「二重Ｄ配列」等の部分的なまたは完全な合成であり得る。
【００５４】
「ＡＡＶ末端反復」または「ＡＡＶ  ＴＲ」は、血清型１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０もしくは１１または未知のもしくは後に発見される任意の他のＡＡＶ（例えば表１を参照）が挙げられるがそれらに限定されない任意のＡＡＶ由来であり得る。ＡＡＶ末端反復が所望の機能、例えば複製、ウイルスパッケージング、組み込みおよび／またはプロウイルス救済等を媒介する限り、ＡＡＶ末端反復は、天然の末端反復配列を有する必要はない（例えば、天然のＡＡＶ  ＴＲ配列を挿入、欠失、短縮化および／またはミスセンス変異により変更することができる）。
【００５５】
本明細書では用語「ｒＡＡＶ粒子」および「ｒＡＡＶビリオン」を互換的に使用する。「ｒＡＡＶ粒子」または「ｒＡＡＶビリオン」は、ＡＡＶカプシド内にパッケージングされているｒＡＡＶベクターゲノムを含む。
【００５６】
ＡＡＶカプシド構造は、ＢＥＲＮＡＲＤ  Ｎ．ＦＩＥＬＤＳ他、ＶＩＲＯＬＯＧＹ、第２巻、第６９章および第７０章（第４版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）により詳細に説明されている。
【００５７】
用語「薬物動態特性」は、その通常の慣習的意味を有し、ＦＶＩＩＩタンパク質の吸収、分布、代謝および排出を指す。
【００５８】
「バイオアベイラビリティ」の通常の慣習的意味は、生物学的に活性な薬物の投与量のうちの体循環に到達する画分または量である。本発明の実施形態の文脈では、用語「バイオアベイラビリティ」は通常の慣習的意味を含むが、さらに、ＦＶＩＩＩタンパク質が生物活性である程度を含むようにより広義の意味を有すると理解される。ＦＶＩＩＩの場合には、例えば、「バイオアベイラビリティ」の１つの測定値は、注入後に循環で得られるＦＶＩＩＩタンパク質のプロコアグラント活性である。
【００５９】
「翻訳後改変」は、その通常の慣習的意味を有し、リーダー配列の除去、グルタミン酸残基のγ−カルボキシル化、アスパラギン酸残基のβ−ヒドロキシル化、アスパラギン残基のＮ結合型糖鎖付加、セリンおよび／またはトレオニン残基のＯ結合型糖鎖付加、チロシン残基の硫酸化、セリン残基のリン酸化ならびにこれらの任意の組み合わせを含むがこれらに限定されない。
【００６０】
本明細書で使用する場合、「生物学的活性」は、例えばヒト血漿に由来する標準物質を参照して決定される。ＦＶＩＩＩに関して、標準物質はＭｏｎｏＣＬＡＴＥ−Ｐ（登録商標）（ＣＳＬ  Ｂｅｈｒｉｎｇ）であってもよい。標準物質の生物学的活性は１００％と理解される。
【００６１】
用語「第ＶＩＩＩ因子タンパク質」または「ＦＶＩＩＩタンパク質」は、本明細書で使用する場合、野生型ＦＶＩＩＩタンパク質および天然に存在するまたは人工のタンパク質（例えばＢドメイン欠失タンパク質）を含む。本発明のＦＶＩＩＩタンパク質は、文献で知られているようなＦＶＩＩＩの変異形態をさらに含むことができる。本発明のＦＶＩＩＩタンパク質は、当分野で知られているような、現在既知のまたは後に同定される任意のその他の天然に存在するヒトＦＶＩＩＩタンパク質または人工のヒトＦＶＩＩＩタンパク質、ならびにそれらの誘導体および活性フラグメント／活性ドメインをさらに含む。
【００６２】
多様な哺乳動物種由来のＦＶＩＩＩのアミノ酸配列が、ＧｅｎＢａｎｋ等の配列データベースから入手可能である。ＦＶＩＩＩ配列の例は以下の表に見出される。
【００６３】
【表２】
0006800863.tif 000003
【００６４】
本発明のＦＶＩＩＩタンパク質は、ＦＶＩＩＩの薬理学的に活性な形態をさらに含む。該形態は、シグナルペプチドが除去され、およびプロテアーゼの作用により（または核酸レベルでＢドメインを除去してタンパク質からＢドメインを改変することにより）Ｂドメインが切断されており、機能性ＦＶＩＩＩ凝固因子として折り畳まれたＦＶＩＩＩの２つの非隣接ポリペプチド鎖（軽鎖および重鎖）をもたらす分子形態である。Ｓ７４３とＱ１６３８の間の残基が欠失された頻用ＳＱバージョンを含む、ヒトＦＶＩＩＩのいくつかのＢドメイン欠失形態が知られている。具体的には、糖鎖付加の程度を高める改変を有するＦＶＩＩＩタンパク質が、該広義語に具体的には含まれる。
【００６５】
ヒトＦＶＩＩＩタンパク質のアミノ酸配列は当分野で公知であり、例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＡ５２４８４に見出すことができる。ヒトＦＶＩＩＩタンパク質は２３５１アミノ酸長であり、シグナルペプチド（残基１〜１９）、重鎖（残基２０〜７５９）、Ｂドメイン（残基７６０〜１３３２）、および軽鎖（残基１６６８〜２３５１）から構成される。シグナルペプチドがないアミノ酸配列を以下に開示する（配列番号５）。
【００６６】
用語「半減期」とは、通常の慣習的意味のほか、ＦＶＩＩＩに関する科学文献に見出される通常の慣習的意味を含む広義語のことである。具体的には、注入時に測定される初期値から初期値の半分までの低下にかかる注入後の時間を定義する、ＦＶＩＩＩに関連するパラメータの測定値がこの定義に含まれる。いくつかの実施形態では、ＦＶＩＩＩの半減期は、当分野で公知であるように、および本明細書に記載したように、様々な免疫アッセイにおいてＦＶＩＩＩに対する抗体を使用して血液および／または血液成分で測定することができる。また、半減期は、当分野で公知であるように、および本明細書に記載したように、標準的な凝固アッセイを含む機能的アッセイを使用してＦＶＩＩＩ活性の低下として測定されてもよい。
【００６７】
用語「回復」は本明細書で使用する場合、ＦＶＩＩＩの注入、注射、送達またはさもなければ投与後にＦＶＩＩＩのレベルを測定する目的で、生体試料（例えば、血液または血液産物試料）を除去する最も早い実用的な時間に受容動物またはヒト対象（例えば循環）において検出される、任意の許容される方法により測定されるＦＶＩＩＩの量（ＦＶＩＩＩ抗原レベルまたはＦＶＩＩＩプロテアーゼもしくは凝固活性レベルを含むがこれらに限定されない）を含む。現在の方法論では、ＦＶＩＩＩ回復を測定するための最も早い生体採取時間は典型的には、ＦＶＩＩＩの注入、注射、またはさもなければ送達／投与後、最初の１５分以内であるが、科学技術および／または臨床技術が向上するにつれてより速い採取時間を期待することは当然である。要するに、ＦＶＩＩＩの回復値は、受容動物または患者への注入、注射、またはその他の送達後できるだけ早い時点で受容者（例えば循環）において測定することができる、注入、注射またはさもなければ送達／投与されたＦＶＩＩＩの最大画分となることを本明細書では意味する。
【００６８】
用語「糖鎖付加部位」は、その通常の慣習的意味を有する広義語である。本出願の文脈では該用語は、潜在的に糖鎖を受容し得る部位、および糖鎖が実際に結合されているタンパク質内、具体的にはＦＶＩＩＩ内の部位の両方に適用され、オリゴ糖および／または炭水化物のアクセプターとして作用し得る任意のアミノ酸配列を含む。
【００６９】
本明細書で使用する場合、「形質転換」細胞とは、組換えＤＮＡ法を使用して構築されたＦＶＩＩＩタンパク質ベクターを含むがこれに限定されない本発明のＦＶＩＩＩタンパク質をコードする核酸分子で形質転換され、形質導入されおよび／またはトランスフェクトされた細胞のことである。
【００７０】
本明細書で使用する場合、用語「出血障害」は、出血のかたちで現れる細胞起源、生理学的起源または分子起源の先天性、後天性または誘導された任意の欠損を表す。例は、凝固因子欠乏症（例えば、血友病ＡおよびＢ、または凝固因子ＸＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩもしくはＩＸの欠乏）、凝固因子インヒビター、血小板機能不全、血小板減少症、フォンヴィルブランド病、または手術もしくは外傷により誘発される出血である。
【００７１】
出血過多は、血液凝固カスケードが正常に機能する（凝固因子欠乏症がない、または凝固因子のいずれかに対するインヒビターがない）対象においても生じ、血小板機能不全、血小板減少症またはフォンヴィルブランド病により引き起こされることがある。そのような場合、止血系は血友病の場合と同様に欠如し、または異常な必須凝固「化合物」（血小板またはフォンヴィレブランド因子タンパク質など）を有し、大量出血を引き起こすことから、その出血は血友病により引き起こされる出血になぞらえることができる。手術または外傷と関連して広範な組織損傷を経験する対象では、正常な止血機構は差し迫った止血の必要性に圧倒される可能性があり、正常な止血機構にもかかわらず出血を起こす場合がある。十分な止血の達成は、脳、内耳領域および眼等の外科的止血の可能性が限られる器官で出血が生じる場合にも問題となる。同じ問題は、様々な器官（肝臓、肺、腫瘍組織、胃腸管）から生検を採取する過程および腹腔鏡手術において発生し得る。全てのこれらの状況に共通しているのは、外科的手法（縫合、クリップ等）により止血を行う難しさである。これはまた出血が拡散しているケースでもある（出血性胃炎および大量子宮出血）。急性および大量出血は、行われた療法により止血不全が誘発された、抗凝固療法中の対象においても生じ得る。そのような対象は、抗凝固作用が迅速に中和されなければならない場合、外科的介入を必要とすることがある。根治的恥骨後式前立腺摘除術は、前立腺癌が限局している対象に対して一般に行われ術式である。手術は、著しいおよび時折の大量失血をしばしば伴う。前立腺摘除中の少なからぬ失血は、主に複雑な解剖学的位置と関係しており、血管が密集した様々な部位は外科的止血が容易に利用できず、広い範囲からの広汎出血をもたらす可能性がある。また、脳内出血は脳卒中の最も治療困難な形態であり、脳内出血後最初の数時間での高い死亡率および血腫増大と関連している。不十分な止血の場合に問題を引き起こし得る別の状況は、正常な止血機構を有する対象が、血栓塞栓症を予防するための抗凝固療法を受ける場合である。そのような療法として、ヘパリン、プロテオグリカンのその他の形態、ワルファリンまたはビタミンＫ拮抗薬のその他の形態、ならびにアスピリンおよびその他の血小板凝集阻害剤を挙げることができる。
【００７２】
本発明の一実施形態では、出血は血友病と関連している。別の実施形態では、出血は後天性インヒビターを有する血友病と関連している。別の実施形態では、出血は血小板減少症と関連している。別の実施形態では、出血はフォンヴィルブランド病と関連している。別の実施形態では、出血は重度の組織損傷と関連している。別の実施形態では、出血は重度の外傷と関連している。別の実施形態では、出血は手術と関連している。別の実施形態では、出血は腹腔鏡手術と関連している。別の実施形態では、出血は出血性胃炎と関連している。別の実施形態では、出血は多量の子宮出血と関連している。別の実施形態では、出血は機械的止血の可能性が限られる器官で生じている。別の実施形態では、出血は脳、内耳領域または眼で生じている。別の実施形態では、出血は生検を受ける過程と関連している。別の実施形態では、出血は抗凝固療法と関連している。
【００７３】
本発明の「対象」は、出血の制御が必要とされるおよび／もしくは望まれる出血障害もしくは出血状態を有する、または該出血障害もしくは出血状態になりやすい任意の動物を含む。該出血障害または出血状態（血友病Ａおよび後天性ＦＶＩＩＩ欠乏症（例えば、ＦＶＩＩＩに対する自己抗体または血液悪性腫瘍による）等の）は、対象へのＦＶＩＩＩの投与により処置する、改善するまたは予防することができる。そのような対象は一般に、哺乳動物対象（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、霊長類等等の実験動物）、家畜もしくは商業用動物（例えば、ウシ、ウマ、ヤギ、ロバ、ヒツジ等）、または飼育動物（例えばネコ、イヌ、フェレット等）である。特定の実施形態では、対象は霊長類対象、ヒト以外の霊長類対象（例えば、チンパンジー、ヒヒ、サル、ゴリラ等）またはヒトである。本発明の対象は、制御が必要とされるおよび／または望まれる出血障害または出血状態のリスクがあるとわかっているまたは考えられる対象であり得る。また、本発明に係る対象は、制御が必要とされるまたは望まれる出血障害または出血状態のリスクがあると以前にわかっていないまたは疑われていない対象も含み得る。さらなる選択肢として、対象は実験動物および／または疾患の動物モデルであってもよい。
【００７４】
対象は、新生児、若年、熟年および老年対象を含む任意の齢のオスおよび／またはメスを含む。ヒト対象に関して、代表的な実施形態では、対象は乳児（例えば、約１２カ月未満、１０カ月未満、９カ月未満、８カ月未満、７カ月未満、６カ月未満またはより若い）、幼児（例えば、少なくとも約１２、１８もしくは２４カ月および／または約３６、３０もしくは２４カ月未満）、または子供（例えば、少なくとも約１、２、３、４もしくは５歳および／または約１４、１２、１０、８、７、６、５もしくは４歳未満）であってもよい。本発明の実施形態では、対象は、約０カ月齢から３、４、５、６、９、１２、１５、１８、２４、３０、３６、４８もしくは６０カ月齢、約３カ月齢から６、９、１２、１５、１８、２４、３０、３６、４８もしくは６０カ月齢、約６カ月齢から９、１２、１５、１８、２４、３０、３６、４８もしくは６０カ月齢、約９カ月齢から１２、１５、１８、２４、３０、３６、４８もしくは６０カ月齢、約１２カ月齢から１８、２４、３６、４８もしくは６０カ月齢、約１８カ月齢から２４、３０、３６、４８もしくは６０カ月齢、または約２４カ月齢から３０、３６、４８もしくは６０カ月齢のヒト対象である。
【００７５】
プロモーターおよび発現カセット
本発明の一態様は、肝臓特異的合成プロモーターを含むポリヌクレオチドに関し、該プロモーターは、配列番号１のヌクレオチド配列またはこれと少なくとも約９０％同一の配列を含む、該配列から本質的になるまたは該配列からなる。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である。該プロモーターは、短い（約２００塩基対）強力な肝臓特異的プロモーターであり、目的のポリヌクレオチドの肝臓特異的発現に理想的であり、その短い長さおよびＡＡＶベクターの限られた能力のためにＡＡＶベクターで使用するのに特に適している。該プロモーターは、保存された基本プロモーターエレメントおよび転写開始部位を含有するように設計された。基本プロモーターは、肝臓特異的発現のためのいくつかの肝臓特異的転写因子結合部位を有する５’末端で連結される（図１）。プロモーターは、ルシフェラーゼレポーター遺伝子およびヒト肝臓癌細胞株Ｈｕｈ７でのトランスフェクション実験を用いてインビトロで最初に同定され、次いでマウスにおいてインビボで確認されたように、高い活性を示す。
【００７６】
いくつかの実施形態ではプロモーターは、これがイントロン（例えばプロモーターの３’末端で）に作動可能に連結している発現カセットの一部である。これは、プロモーターに連結された目的のポリヌクレオチドの発現レベルを高めるために行われてもよい。任意の適切なイントロン、例えば、キメライントロンＣＩＮ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用することができる。いくつかの実施形態では、イントロンはＶＨ４由来である。いくつかの実施形態では、イントロンは短い非天然エクソンジャンクション配列をさらに含み得る。一実施形態では、プロモーターおよびイントロンは一緒に、配列番号２のヌクレオチド配列、または該配列と少なくとも９０％同一、例えば、配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一の配列を構成する、該配列から本質的になるまたは該配列からなる。
【００７７】
プロモーターは、目的のポリヌクレオチドに作動可能に連結させることができる。いくつかの実施形態では、目的のポリヌクレオチドはポリペプチドまたは機能性核酸をコードする。特定の実施形態では、目的のポリヌクレオチドは、凝固因子、例えばＦＶＩＩＩ、例えばＢドメイン欠失ＦＶＩＩＩをコードする。Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩは、配列番号３のヌクレオチド配列、または配列番号３のヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一、例えば、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一の配列を含む、該配列から本質的になるまたは該配列からなるポリヌクレオチドによりコードされてもよい。一実施形態では、プロモーター、イントロン、およびＢドメイン欠失ＦＶＩＩＩをコードする目的のポリヌクレオチドを含む発現カセットは、配列番号４のヌクレオチド配列、または配列番号４のヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一、例えば、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一の配列を含む、該配列から本質的になるまたは該配列からなる。
【００７８】
本発明の別の態様は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、例えば発現ベクターである。ベクターは、プラスミドベクターおよびウイルスベクターを含むがこれらに限定されない当分野で既知の任意の種類のベクターであってもよい。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターはレトロウイルスまたはレンチウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、ＡＡＶ１型、ＡＡＶ２型、ＡＡＶ３型（３Ａ型および３Ｂ型を含む）、ＡＡＶ４型、ＡＡＶ５型、ＡＡＶ６型、ＡＡＶ７型、ＡＡＶ８型、ＡＡＶ９型、ＡＡＶ１０型、ＡＡＶ１１型、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶおよびヒツジＡＡＶならびに未知のまたは後に発見される任意の他のＡＡＶを含むがこれらに限定されない、任意の既知のＡＡＶ血清型由来のＡＡＶベクターである。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターはＡＡＶ８またはＡＡＶ９である。
【００７９】
本発明のさらなる態様は、本発明のポリヌクレオチドおよび／またはベクターを含む細胞に関する（例えば、単離細胞、形質転換細胞、組換え細胞等）。そのため、本発明の様々な実施形態は、ベクター（例えば発現カセット）を含有する組換え宿主細胞に関する。そのような細胞は、遺伝子導入動物において単離するおよび／また存在することができる。細胞の形質転換を以下でさらに記載する。
【００８０】
本発明の別の態様は、本発明のポリヌクレオチド、ベクターおよび／または形質転換細胞を含む遺伝子導入動物に関する。遺伝子導入動物を以下でさらに記載する。
【００８１】
本発明のポリヌクレオチド、ベクターおよび／または細胞は、医薬組成物に含まれ得る。いくつかの実施形態は、本発明のポリヌクレオチド、ベクターおよび／もしくは細胞、ならびに／または例えば本発明の方法を実行するための試薬および／もしくはキットを使用するための説明書を含むキットに関する。
【００８２】
改変第ＶＩＩＩ因子タンパク質
本発明の一態様は、１つまたは複数の追加の糖鎖付加部位を作製するために重鎖のアミノ酸残基が改変されている、改変哺乳動物第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド（例えばヒトＦＶＩＩＩポリペプチド）に関する。特定の実施形態では、１つまたは複数の追加の糖鎖付加部位は、重鎖のＣ末端、例えば重鎖の最後の１００アミノ酸残基、例えば最後の５０、４０、３０、２０、１０、９、８、７、６または５残基にある。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、少なくとも２つの糖鎖付加部位、例えば２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４もしくまたは１５のまたはより多くの糖鎖付加部位を作製するために改変される。改変には、アミノ酸置換、付加、欠失、またはこれらの任意の組み合わせが含まれ得る。これらの改変は、インビボで発現したときに活性が増加するＦＶＩＩＩタンパク質を産生するように、ＦＶＩＩＩタンパク質のアミノ酸配列に導入される。
【００８３】
「追加の」糖鎖付加部位とは、ＦＶＩＩＩタンパク質中の糖鎖付加部位の数が、非改変（例えば野生型）ＦＶＩＩＩタンパク質（例えば配列番号５）に通常存在する糖鎖付加部位の数より大きいことを意味する。
【００８４】
本発明は、１つまたは複数の（例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５等）追加の糖側鎖を含有するＦＶＩＩＩタンパク質にさらに関する。そのような追加の糖側鎖は、本発明のＦＶＩＩＩタンパク質の１つまたは複数の糖鎖付加部位に存在することができる。また、追加の糖側鎖は、当分野で公知であるような、そのような糖鎖をＦＶＩＩＩ分子に導入する化学的および／または酵素的方法の結果として、ＦＶＩＩＩタンパク質上の部位に存在することができる。「追加の」または「新たな」糖鎖とは、ＦＶＩＩＩタンパク質中の糖鎖の数が、ＦＶＩＩＩの「野生型」形態に通常存在する糖鎖の数より大きいことを意味する。様々な実施形態では、約１から約５０の追加の糖側鎖（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０）を追加することができる。
【００８５】
糖鎖付加部位は、Ｎ結合型糖鎖付加部位、Ｏ結合型糖鎖付加部位、ならびにＮ結合型糖鎖付加部位およびＯ結合型糖鎖付加部位の組み合わせであってもよい。いくつかの実施形態では、追加される糖鎖付加部位にはＮ結合型糖鎖付加部位が含まれ、コンセンサス配列はＮＸＴ／Ｓである（ただし、Ｘがプロリンでないことを条件とする）。他の実施形態では、糖鎖付加部位は、ＣＸＸＧＧＴ／Ｓ−Ｃ（配列番号２４）、ＮＳＴＥ／ＤＡ（配列番号２５）、ＮＩＴＱＳ（配列番号２６）、ＱＳＴＱＳ（配列番号２７）、Ｄ／Ｅ−ＦＴ−Ｒ／Ｋ−Ｖ（配列番号２８）、Ｃ−Ｅ／Ｄ−ＳＮ（配列番号２９）、ＧＧＳＣ−Ｋ／Ｒ（配列番号３０）およびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるコンセンサス配列を含むＯ結合型糖鎖付加部位を含む。
【００８６】
いくつかの実施形態では約１から約１５糖鎖付加部位を、本発明のＦＶＩＩＩタンパク質のアミノ酸配列に追加することができる。様々な実施形態では、約１から約５０糖鎖付加部位（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０）を追加することができる。
【００８７】
本明細書で使用する場合、「糖鎖付加部位（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｓｉｔｅ）」または「糖鎖付加部位（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｓｉｔｅ）」は、糖付加コンセンサス配列（すなわち、糖（単糖、オリゴ糖または多糖）をアミノ酸配列に付加するためのコンセンサス配列として作用する一連のアミノ酸を意味し得、または糖部分が共有結合している実際のアミノ酸残基を意味し得る。糖部分は、単糖（単純な糖分子）、オリゴ糖または多糖であってもよい。
【００８８】
特定の実施形態では、追加のアミノ酸は重鎖を構成するアミノ酸残基のいずれかの間に挿入することができ、および／または該アミノ酸残基のいずれかに代入することができる。さらに、本発明の同じインサートを、ＦＶＩＩＩタンパク質のアミノ酸配列の同じおよび／または異なる位置で複数回導入することができる。また、異なるインサートおよび／または同じインサートを、ＦＶＩＩＩタンパク質のアミノ酸配列全体にわたってアミノ酸残基間の同じおよび／または異なる位置に１回または複数回導入することができる。
【００８９】
いくつかのタンパク質は多くの糖側鎖を支持することができ、Ｎ結合型糖鎖付加部位間の距離はわずか３、４、５または６アミノ酸であってもよい（例えば、Ｌｕｎｄｉｎ他、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．５８１：５６０１（２００７）；Ａｐｗｅｉｌｅｒ他、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １４７３：４（１９９１）を参照。それらの内容全体が参照により本明細書に援用される）。
【００９０】
いくつかの実施形態では、野生型ヒト配列（配列番号５）のアミノ酸残基７３６および７３７は、アミノ酸残基ＸＸ（ＸはＳまたはＴである）により置換される。そのため、残基７３６および７３７はＳＳ、ＳＴ、ＴＳまたはＴＴとなり得る。
【００９１】
いくつかの実施形態では、野生型ヒト配列（配列番号５）のアミノ酸残基７３６〜７４２は、アミノ酸残基ＸＸＹＶＮＲＸＬ（配列番号６）（ＸはＳまたはＴ）により置換される。そのため、残基７３６〜７４２は以下となり得る。
【００９２】
【表３】
0006800863.tif 000004
【００９３】
いくつかの実施形態では、野生型ヒト配列（配列番号５）のアミノ酸残基７３６〜７４２は、アミノ酸残基ＸＸＮＮＸ（配列番号１５）（ＸはＳまたはＴ）により置換される。そのため、残基７３６〜７４０は以下となり得る。
【００９４】
【表４】
0006800863.tif 000005
【００９５】
いくつかの実施形態では、改変ヒト第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドはＢドメインが欠失されたもの、例えば、Ｓ７４３からＧｌｎ１６３８のＳＱ欠失（配列番号５にナンバリングされている）である。
【００９６】
追加の糖鎖付加部位を有する本発明のＦＶＩＩＩタンパク質は、ＰＣＲを使用する部位特異的変異誘発等の組換え方法により産生することができる。また、本発明のＦＶＩＩＩタンパク質は、化学的に合成されて１つまたは複数（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５等）の追加の糖鎖付加部位を有するＦＶＩＩＩタンパク質を調製することができる。
【００９７】
当分野で公知の方法に従っておよび本明細書で教示したように、成熟ＦＶＩＩＩアミノ酸配列の任意のアミノ酸残基を改変すること、ならびに公知の方法に従っておよび本明細書に記載したように、任意の得られたＦＶＩＩＩタンパク質を活性、安定性、回復、半減期等について試験することは、本発明および当業者の技能の範囲内である（例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用されるＥｌｌｉｏｔｔ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：１６８５４（２００４）を参照）。
【００９８】
本発明の実施形態は、ＦＶＩＩＩの活性および／または回復および／または半減期および／または安定性を改善するために糖鎖付加部位が追加された組換えＦＶＩＩＩタンパク質（例えば、Ｘ０、Ｘ１、Ｘ２）に関する。本発明のＦＶＩＩＩタンパク質は、本発明のＦＶＩＩＩタンパク質が投与された対象に対するＦＶＩＩＩタンパク質のバイオアベイラビリティの増加を可能にする改変を含む。いくつかの実施形態ではバイオアベイラビリティの増加は、血漿中のＦＶＩＩＩの濃度が関連濃度となる血液学における標準的な現在の考えを指す。本発明のいくつかの実施形態では、バイオアベイラビリティの増加は、より長期間対象の循環にとどまるＦＶＩＩＩタンパク質の能力を指す。したがって、本発明のいくつかの実施形態では、本明細書に記載したＦＶＩＩＩタンパク質は、インビボでの発現後に活性を増加させたＦＶＩＩＩタンパク質をもたらすように改変され、いくつかの実施形態では、本発明は、本発明のＦＶＩＩＩタンパク質、本発明のポリヌクレオチド、本発明のベクターおよび／または本発明の細胞の有効量を対象に投与することを含む、対象におけるＦＶＩＩＩタンパク質の止血有効性を増加させる方法を提供する。これらの実施形態のいずれかで対象に投与されるＦＶＩＩＩタンパク質は、活性を増加させた本発明のＦＶＩＩＩタンパク質である。
【００９９】
本発明に係るＦＶＩＩＩタンパク質は、当分野で公知のおよび本明細書に記載した方法により産生され、ならびに該方法を特徴とする。これらの方法には、凝固時間の決定（部分トロンボプラスチン時間（ＰＰＴ）アッセイ）、ならびに回復、半減期、およびバイオアベイラビリティを、当分野で公知であるような適切な免疫アッセイおよび／または活性アッセイにより決定するための試験動物へのＦＶＩＩＩタンパク質の投与が含まれる。
【０１００】
本発明の追加の態様は、本発明のＦＶＩＩＩタンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチドおよびＦＶＩＩＩタンパク質を産生するための発現カセットを提供する。
【０１０１】
本発明の別の態様は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、例えば発現ベクターである。ベクターは、プラスミドベクターおよびウイルスベクターを含むがこれらに限定されない、当分野で既知の任意の種類のベクターであり得る。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、ＡＡＶ１型、ＡＡＶ２型、ＡＡＶ３型（３Ａ型および３Ｂ型を含む）、ＡＡＶ４型、ＡＡＶ５型、ＡＡＶ６型、ＡＡＶ７型、ＡＡＶ８型、ＡＡＶ９型、ＡＡＶ１０型、ＡＡＶ１１型、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶおよびヒツジＡＡＶならびに未知のまたは後に発見される任意の他のＡＡＶを含むがこれらに限定されない、任意の既知のＡＡＶ血清型由来のＡＡＶベクターである。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターはＡＡＶ８またはＡＡＶ９である。
【０１０２】
本発明のさらなる態様は、本発明のポリヌクレオチドおよび／またはベクターを含む細胞に関する（例えば、単離細胞、形質転換細胞、組換え細胞等）。そのため、本発明の様々な実施形態は、ベクター（例えば発現カセット）を含有する組換え宿主細胞に関する。そのような細胞は、遺伝子導入動物において単離するおよび／または存在することができる。細胞の形質転換を以下でさらに記載する。
【０１０３】
本発明の別の態様は、本発明のポリヌクレオチド、ベクターおよび／または形質転換細胞を含む遺伝子導入動物に関する。遺伝子導入動物を以下でさらに記載する。
【０１０４】
本発明のＦＶＩＩＩタンパク質、ポリヌクレオチド、ベクターおよび／または細胞は、医薬組成物に含まれ得る。いくつかの実施形態は、本発明のＦＶＩＩＩタンパク質、ポリヌクレオチド、ベクターおよび／もしくは細胞、ならびに／または例えば本発明の方法を実行するための試薬および／もしくはキットを使用するための説明書を含むキットに関する。
【０１０５】
本発明の方法
本発明のさらなる態様は、ポリペプチドまたは機能性核酸を例えば肝臓特異的に産生するための、本発明のプロモーターおよび発現カセットの使用に関する。そのため、一態様は、対象の肝臓でポリペプチドまたは機能性核酸を産生する方法であって、本発明のポリヌクレオチド、ベクターおよび／または形質転換細胞を対象に送達し、これにより対象の肝臓でポリペプチドまたは機能性核酸を産生することを含む方法に関する。ポリヌクレオチド、ベクターおよび／または形質転換細胞は、ポリペプチドまたは機能性核酸を産生するように目的のポリヌクレオチドの発現が生じる条件下で送達される。そのような条件は当分野で公知であり、以下でさらに記載される。
【０１０６】
本発明の別の態様は、本発明のプロモーターおよび発現カセットを使用して対象における血友病Ａまたは後天性第ＶＩＩＩ因子欠乏症を処置する方法であって、治療有効量の、本発明のポリヌクレオチド、ベクターおよび／または形質転換細胞を対象に送達し、これにより対象における血友病Ａを処置することを含む方法に関する。いくつかの実施形態では、目的のポリヌクレオチドは、上記したＦＶＩＩＩポリペプチドをコードする。
【０１０７】
本発明のさらなる態様は、本発明のプロモーターおよび発現カセットを使用して対象におけるＦＶＩＩＩポリペプチドのバイオアベイラビリティを増加させる方法であって、有効量の、本発明のポリヌクレオチド、ベクターおよび／または形質転換細胞を対象に送達し、これにより対象におけるＦＶＩＩＩポリペプチドのバイオアベイラビリティを増加させることを含む方法に関する。この態様では、目的のポリヌクレオチドは、上記したＦＶＩＩＩポリペプチドをコードする。
【０１０８】
本発明の改変ＦＶＩＩＩタンパク質は、それを必要とする対象（例えばヒト患者）に有効量のＦＶＩＩＩタンパク質を投与することにより出血障害を処置する方法において使用することができる。そのため、本発明はまた、それを必要とする対象に、有効量の、本発明のＦＶＩＩＩタンパク質、ポリヌクレオチド、ベクターおよび／または細胞を投与することを含む、出血障害を処置する方法も提供する。
【０１０９】
本発明の一態様は、対象の肝臓で第ＶＩＩＩ因子を産生する方法本発明の改変ヒト第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ベクターおよび／または形質転換細胞を対象に送達し、これにより対象の肝臓で第ＶＩＩＩ因子を産生することを含む方法に関する。
【０１１０】
本発明の別の態様は、対象における血友病Ａまたは後天性第ＶＩＩＩ因子欠乏症を処置する方法であって、治療有効量の、本発明の改変ヒト第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクターおよび／または形質転換細胞を対象に送達し、これにより対象における血友病Ａまたは後天性第ＶＩＩＩ因子欠乏症を処置することを含む方法に関する。
【０１１１】
本発明のさらなる態様は、対象における第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドのバイオアベイラビリティを増加させる方法であって、有効量の、本発明の改変ヒト第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ベクターおよび／または形質転換細胞を対象に送達し、これにより対象における第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドのバイオアベイラビリティを増加させることを含む方法に関する。
【０１１２】
本発明の方法に従って処置することができる出血障害として、血友病Ａおよび後天性ＦＶＩＩＩ欠乏症等の、ＦＶＩＩＩで処置することができるいずれかの障害が挙げられる。本発明のＦＶＩＩＩタンパク質および／または本発明のＦＶＩＩＩタンパク質をコードするポリヌクレオチドを、対象（例えば、それを必要とする対象）に投与するまたは送達するためのそのような処置プロトコルおよび投与レジメンは、当分野で公知である。
【０１１３】
本発明の実施形態では、本発明のＦＶＩＩＩタンパク質をコードするベクター（例えば、ウイルスベクターまたはその他の核酸ベクター）の投与量は、ＦＶＩＩＩタンパク質の治療血漿濃度が達成されるような量であり得る。ＦＶＩＩＩタンパク質の治療濃度は、平均１００％で測定される健康な個体の正常レベルの１％超、故に、正常なヒト血漿１ｍＬ中のＦＶＩＩＩの１国際単位（ＩＵ）超であるとみなされる。当業者は、特定の対象および特定の状態に対する最適用量を決定することができる。
【０１１４】
計画的介入と関連した処置について、本発明のＦＶＩＩＩタンパク質は、典型的には介入を行う前の約２４時間以内、およびその後７日以上にもわたって投与される。凝固剤としての投与は、本明細書に記載した様々な経路によることができる。
【０１１５】
医薬組成物は、予防的および／または治療的処置のための非経口投与を主に対象としている。好ましくは、医薬組成物は非経口的に、すなわち静脈内、皮下もしくは筋肉内に投与される、または持続もしくはパルス注入により投与されてもよい。また、医薬組成物は、経口、皮下、静脈内、脳内、鼻腔内、経皮、腹腔内、筋肉内に、肺内、膣内、直腸、眼内を含むがこれらに限定されない様々な方法で、または任意のその他の許容される方法で投与するために処方することができる。
【０１１６】
非経口投与のための組成物は、薬学的に許容される担体、好ましくは水性担体と共に（例えば、該担体に溶解された）本発明のＦＶＩＩＩタンパク質を含む。水、緩衝水、０．４％生理食塩水、０．３％グリシン等等の様々な水性担体を使用することができる。本発明のＦＶＩＩＩタンパク質はまた、安定性および貯蔵を延長する、メチオニンおよびスクロース等の組成物と処方することもできる。本発明のＦＶＩＩＩタンパク質はまた、傷害の部位に送達するまたは該部位を標的とするためにリポソーム調製物中に処方することもできる。リポソーム調製物は、例えば、米国特許第４，８３７，０２８号、米国特許第４，５０１，７２８号および米国特許第４，９７５，２８２号に一般に記載されている。組成物は、従来の公知の滅菌法により滅菌することができる。得られた水溶液は使用のためにパッケージングする、または無菌条件下で濾過し凍結乾燥することができ、凍結乾燥調製物は投与前に滅菌水溶液と組み合わされる。組成物は、ｐＨ調整剤および緩衝剤、張度調節剤等等の、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム等の、生理学的条件に近づけるのに必要な薬学的に許容される補助物質を含有してもよい。組成物はまた、防腐剤、等張化剤、非イオン界面活性剤もしくは洗浄剤、抗酸化剤および／またはその他の種々の添加剤も含有することができる。
【０１１７】
これらの製剤におけるＦＶＩＩＩタンパク質の濃度は大きく異なり得（すなわち、通常は約１重量％または少なくとも約１重量％のところ、約０．５重量％未満から約１５または２０重量％まで）、選択された特定の投与様式に従って主に流量、粘度等により選択される。そのため、１つの非限定例として、静脈内注入用の典型的な医薬組成物は、滅菌リンゲル溶液２５０ｍｌおよびＦＶＩＩＩタンパク質１０ｍｇを含有するように構成され得る。非経口投与可能な組成物を調製する実際の方法は、当業者に既知または明らかであり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第２１版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、イーストン、ペンシルベニア州（２００５）により詳細に記載されている。
【０１１８】
本発明のＦＶＩＩＩタンパク質および／または本発明のＦＶＩＩＩタンパク質をコードする核酸分子を含む組成物は、予防的および／または治療的処置のために投与することができる。治療的適用では、組成物は、疾患およびその合併症を治癒する、軽減するまたは部分的に停止させるのに十分な量で、上記した疾患に既に罹患している対象に投与される。これを達成するのに適した量は、「治療有効量」として定義される。当業者に理解されるように、この目的に有効な量は、疾患または傷害の重症度ならびに対象の体重および全般的状態に依存する。
【０１１９】
予防的適用では、本発明のＦＶＩＩＩポリペプチドを含有する組成物は、疾患状態もしくは傷害になりやすいまたはさもなければ疾患状態もしくは傷害のリスクがある対象に投与されて、対象自身の凝固能力を高める。そのような量は「予防有効量」であると定義される。予防的適用では、正確な量はこの場合も対象の健康状態および体重に依存する。
【０１２０】
組成物の単回または複数回投与は、担当医師により選択されている服用レベルおよびパターンで実行され得る。毎日維持レベルを必要とする外来対象には、ＦＶＩＩＩタンパク質は、例えば携帯ポンプシステムを使用して持続注入により投与することができる。
【０１２１】
本発明のＦＶＩＩＩタンパク質は、徐放または持続放出製剤に処方することもできる。徐放または持続放出組成物を処方する方法は当分野で既知であり、該方法として、該ポリペプチドを含有する固体疎水性粒子の半透性マトリックスが挙げられるがこれに限定されない。
【０１２２】
例えば局所適用等の、本発明のＦＶＩＩＩタンパク質の局所送達は、例えば、スプレー、灌流、ダブルバルーンカテーテル、人工血管もしくは血管ステントに組み込まれるステント、バルーンカテーテルを被覆するのに使用されるハイドロゲル、またはその他の十分に確立された方法によって実行することができる。いずれにしても、医薬組成物は、対象を効果的に処置するのに十分なＦＶＩＩＩタンパク質の量を提供するべきである。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、目的のポリヌクレオチド（例えばＦＶＩＩＩタンパク質）はＡＡＶベクターを使用して対象に送達される。そのため、本発明はまた、目的のポリヌクレオチドを含むＡＡＶウイルス粒子（すなわちビリオン）も提供し、ウイルス粒子はベクターゲノムをパッケージングし（すなわちカプシド形成し）、任意選択的にＡＡＶベクターゲノムをパッケージングする。
【０１２４】
特定の実施形態では、ビリオンは、目的の異種ポリヌクレオチド、例えば細胞に送達するための異種ポリヌクレオチドを含む組換えベクターである。そのため、本発明は、インビトロでの、エクスビボでのおよびインビボでのポリヌクレオチドの細胞への送達に有用である。代表的な実施形態では、本発明の組換えベクターを有利に用いて、ポリヌクレオチドを動物（例えば哺乳動物）細胞へ送達または移入させることができる。
【０１２５】
本発明のウイルスベクターにより、任意の異種ヌクレオチド配列を送達することができる。目的のポリヌクレオチドとして、ポリペプチドをコードし、任意選択的に治療用（例えば医学的用途のまたは獣医学的用途の）ポリペプチドおよび／または免疫原性（例えばワクチン用の）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが挙げられる。
【０１２６】
治療用ポリペプチドとして、嚢胞性線維症膜貫通調節タンパク質（ＣＦＴＲ）、ジストロフィン（ジストロフィンのミニ遺伝子またはマイクロ遺伝子のタンパク質産物等、例えば、Ｖｉｎｃｅｎｔ他、（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ５：１３０、米国特許公開第２００３０１７１３１号、Ｗａｎｇ他、（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：１３７１４〜９［ミニジストロフィン］、Ｈａｒｐｅｒ他、（２００２）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．８：２５３〜６１［マイクロジストロフィン］を参照）；ミニアグリン、ラミニン−α２、サルコグリカン（α、β、γまたはδ）、フクチン関連タンパク質、ミオスタチンプロペプチド、フォリスタチン、ドミナントネガティブミオスタチン、血管新生因子（例えばＶＥＧＦ、アンジオポエチン−１またはアンジオポエチン−２）、抗アポトーシス因子（例えばヘムオキシゲナーゼ−１、ＴＧＦ−β、プロアポトーシスシグナルの阻害因子、例えばカスパーゼ、プロテアーゼ、キナーゼ、細胞死受容体［例えばＣＤ−０９５］、チトクロムＣ放出の調節因子、ミトコンドリアの開孔および膨張の阻害因子）；アクチビンＩＩ型可溶性受容体、抗炎症性ポリペプチド、例えばＩカッパＢ優性変異体、サルコスパン、ユートロフィン、ミニユートロフィン、ミオスタチンまたはミオスタチンプロペプチドに対する抗体または抗体フラグメント、細胞周期調節因子、Ｒｈｏキナーゼ調節因子、例えば改変された細菌Ｃ３外酵素であるＣｅｔｈｒｉｎ［ＢｉｏＡｘｏｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．、サンローラン、ケベック州、カナダから入手可能］、ＢＣＬ−ｘＬ、ＢＣＬ２、ＸＩＡＰ、ＦＬＩＣＥｃ−ｓ、ドミナントネガティブカスパーゼ−８、ドミナントネガティブカスパーゼ−９、ＳＰＩ−６（例えば米国特許出願第２００７００２６０７６号を参照）、転写因子ＰＧＣ−α１、Ｐｉｎｃｈ遺伝子、ＩＬＫ遺伝子およびチモシンβ４遺伝子）、凝固因子（例えば、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子等）、エリスロポエチン、アンジオスタチン、エンドスタチン、カタラーゼ、チロシンヒドロキシラーゼ、細胞内のおよび／または細胞外のスーパーオキシドジスムターゼ、レプチン、ＬＤＬ受容体、ネプリライシン、リポタンパク質リパーゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ、β−グロビン、α−グロビン、スペクトリン、α１−抗トリプシン、メチルシトシン結合タンパク質２、アデノシンデアミナーゼ、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、β−グルコセレブロシダーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、リソソームヘキソサミニダーゼＡ、分枝鎖ケト酸デヒドロゲナーゼ、ＲＰ６５タンパク質、サイトカイン（例えばα−インターフェロン、β−インターフェロン、インターフェロン−γ、インターロイキン１〜１４、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、リンフォトキシン等）、ペプチド増殖因子、神経栄養因子およびホルモン（例えばソマトトロピン、インスリン、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２等のインスリン様増殖因子、ＧＬＰ−１、血小板由来増殖因子、表皮増殖因子、線維芽細胞増殖因子、神経増殖因子、神経栄養因子−３および神経栄養因子−４、脳由来神経栄養因子、グリア由来増殖因子、形��転換増殖因子−αおよび形質転換増殖因子−β等）、骨形態形成タンパク質（ＲＡＮＫＬおよびＶＥＧＦを含む）、リソソームタンパク質、グルタミン酸受容体、リンフォカイン、可溶性ＣＤ４、Ｆｃ受容体、Ｔ細胞受容体、ＡｐｏＥ、ＡｐｏＣ、タンパク質ホスファターゼ阻害因子１の阻害因子１（Ｉ−１）、ホスホランバン、ｓｅｒｃａ２ａ、リソソーム酸α−グルコシダーゼ、α−ガラクトシダーゼＡ、Ｂａｒｋｃｔ、β２−アドレナリン受容体、β２−アドレナリン受容体キナーゼ（ＢＡＲＫ）、ホスホイノシチド−３キナーゼ（ＰＩ３キナーゼ）、カルサルシン、受容体（例えば腫瘍壊死増殖因子−α可溶性受容体）、抗炎症性因子、例えばＩＲＡＰ、Ｐｉｍ−１、ＰＧＣ−１α、ＳＯＤ−１、ＳＯＤ−２、ＥＣＦ−ＳＯＤ、カリクレイン、チモシン−β４、低酸素誘導転写因子［ＨＩＦ］、血管新生因子、Ｓ１００Ａ１、パルブアルブミン、アデニリルシクラーゼ６型、Ｇタンパク質共役受容体キナーゼ２型ノックダウンをもたらす分子、例えば短縮型の構成的に活性なｂＡＲＫｃｔ；ホスホランバン阻害分子またはドミナントネガティブ分子、例えばホスホランバンＳ１６Ｅ、モノクローナル抗体（単鎖モノクローナル抗体を含む）または自殺遺伝子産物（例えばチミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、ジフテリア毒素および腫瘍壊死因子、例えばＴＮＦ−α）、ならびにそれを必要とする対象で治療効果を有する任意の他のポリペプチドが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１２７】
ポリペプチドをコードする異種ヌクレオチド配列として、レポーターポリペプチドをコードするもの（例えば酵素）が挙げられる。レポーターポリペプチドは当分野で既知であり、該レポーターポリペプチドとして、蛍光タンパク質（例えば、ＥＧＦＰ、ＧＦＰ、ＲＦＰ、ＢＦＰ、ＹＦＰまたはｄｓＲＥＤ２）、ルシフェラーゼ（例えば、ガウシア、ウミシイタケまたはホタル由来）等の検出可能な産物を産生する酵素、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、アルカリホスファターゼ、およびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、または直接検出することができるタンパク質が挙げられるがこれらに限定されない。事実上いずれのタンパク質も、例えばタンパク質に対する特異抗体を使用することにより直接検出することができる。真核細胞の正の選択または負の選択のいずれかに適した追加のマーカー（および関連抗生物質）は、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ（２００１）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク州、ならびにＡｕｓｕｂｅｌ他（１９９２）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（定期的更新を含む）に開示されている。
【０１２８】
また、異種核酸は、機能性ＲＮＡ、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム（例えば、米国特許第５，８７７，０２２号に記載されている）、スプライソソーム媒介トランス−スプライシングをもたらすＲＮＡ（Ｐｕｔｔａｒａｊｕ他、（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：２４６、米国特許第６，０１３，４８７号、米国特許第６，０８３，７０２号を参照）、遺伝子サイレンシングを媒介する低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含む干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）（Ｓｈａｒｐ他、（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８７：２４３１を参照）、マイクロＲＮＡまたは「ガイド」ＲＮＡ（Ｇｏｒｍａｎ他、（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：４９２９、Ｙｕａｎ他に対する米国特許第５，８６９，２４８号）等のその他の非翻訳「機能性」ＲＮＡ等をコードすることができる。例示的な非翻訳ＲＮＡとして、（例えば、腫瘍を治療するためのおよび／もしくは化学療法による損傷を予防するための心臓への投与のための）多剤耐性（ＭＤＲ）遺伝子産物に対するＲＮＡｉまたはアンチセンスＲＮＡ、ミオスタチン（デュシェンヌ型のもしくはベッカー型の筋ジストロフィー）に対するＲＮＡｉまたはアンチセンスＲＮＡ、ＶＥＧＦまたは（腫瘍を処置するための）本明細書に具体的に記載した腫瘍免疫原が挙げられるがこれに限定されない腫瘍免疫原に対するＲＮＡｉまたはアンチセンスＲＮＡ、変異ジストロフィン（デュシェンヌ型のもしくはベッカー型の筋ジストロフィー）を標的とするＲＮＡｉまたはアンチセンスオリゴヌクレオチド、（Ｂ型肝炎感染を防止および／もしくは処置するための）Ｂ型肝炎表面抗原遺伝子に対するＲＮＡｉまたはアンチセンスＲＮＡ、（ＨＩＶを予防および／もしくは処置するための）ＨＩＶｔａｔ遺伝子および／またはＨＩＶｒｅｖ遺伝子に対するＲＮＡｉまたはアンチセンスＲＮＡ、ならびに／または（病原体から対象を保護するための）病原体由来の任意の他の免疫原または（疾患を予防するまたは処置するための）欠陥遺伝子産物に対するＲＮＡｉまたはアンチセンスＲＮＡが挙げられる。上記した標的または任意の他の標的に対するＲＮＡｉまたはアンチセンスＲＮＡを研究試薬として用いることもできる。
【０１２９】
当分野で知られているように、アンチセンス核酸（例えばＤＮＡまたはＲＮＡ）配列および阻害性ＲＮＡ（例えばマイクロＲＡＮおよびＲＮＡｉ、例えばｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ）配列を使用して、ジストロフィン遺伝子の欠如から生じる筋ジストロフィーを有する患者で「エクソンスキッピング」を誘発することができる。そのため、異種核酸は、適切なエクソンスキッピングを誘発するアンチセンス核酸または阻害性ＲＮＡをコードすることができる。エクソンスキッピングのための特定のアプローチはジストロフィン遺伝子の根本的な欠如の性質に依存し、多くのそのような戦略が当分野で既知であることを当業者は認識する。例示的なアンチセンス核酸配列および阻害性ＲＮＡ配列は、１つまたは複数のジストロフィンエクソン（例えばエクソン１９または２３）の上流の分岐点および／または下流のドナースプライス部位および／または内部スプライシングエンハンサー配列を標的とする。例えば、特定の実施形態では、異種核酸は、ジストロフィン遺伝子のエクソン１９または２３の上流の分岐点および下流のスプライスドナー部位に対するアンチセンス核酸または阻害性ＲＮＡをコードする。そのような配列を、改変Ｕ７ｓｎＲＮＡとアンチセンス核酸または阻害性ＲＮＡとを送達するＡＡＶベクターに組み込むことができる（例えばＧｏｙｅｎｖａｌｌｅ他、（２００４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０６：１７９６〜１７９９を参照）。別の戦略として、改変Ｕ１ｓｎＲＮＡを、ジストロフィンエクソン（例えばエクソン１９または２３）の上流のおよび下流のスプライス部位に相補的なｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡと共にＡＡＶベクターに組み込むことができる（例えばＤｅｎｔｉ他、（２００６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０３：３７５８〜３７６３を参照）。さらに、アンチセンス核酸および阻害性ＲＮＡは、エクソン１９、４３、４５または５３中のスプライシングエンハンサー配列を標的とすることができる（例えば米国特許第６，６５３，４６７号、米国特許第６，７２７，３５５号および米国特許第６，６５３，４６６号を参照）。
【０１３０】
リボザイムとは、部位特異的な方法で核酸を切断するＲＮＡ−タンパク質複合体のことである。リボザイムは、エンドヌクレアーゼ活性を保持する特定の触媒ドメインを有する（Ｋｉｍ他、（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：８７８８、Ｇｅｒｌａｃｈ他、（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ  ３２８：８０２、ＦｏｒｓｔｅｒおよびＳｙｍｏｎｓ、（１９８７）Ｃｅｌｌ  ４９：２１１）。例えば、多くのリボザイムは、高度に特異的なリン酸エステル転移反応を促進し、オリゴヌクレオチド基質のいくつかのリン酸エステルのうちの１つのみを切断することが多い（ＭｉｃｈｅｌおよびＷｅｓｔｈｏｆ、（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１６：５８５、Ｒｅｉｎｈｏｌｄ−ＨｕｒｅｋおよびＳｈｕｂ、（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ  ３５７：１７３）。この特異性は、化学反応前に基質が特異的な塩基対形成相互作用を介してリボザイムの内部ガイド配列（「ＩＧＳ」）に結合するという要求に起因している。
【０１３１】
リボザイム触媒反応は、核酸に関わる配列特異的切断／連結反応の一部として主に観察されている（Ｊｏｙｃｅ、（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３３８：２１７）。例えば、米国特許第５，３５４，８５５号では、ある種のリボザイムが、配列特異性が既知のリボヌクレアーゼの配列特異性よりも高くてＤＮＡ制限酵素の配列特異性に近いエンドヌクレアーゼとして作用することができることが報告されている。そのため、核酸発現の配列特異性リボザイム媒介阻害は治療用途に特に適し得る（Ｓｃａｎｌｏｎ他、（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：１０５９１、Ｓａｒｖｅｒ他（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：１２２２、Ｓｉｏｕｄ他、（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２３：８３１）。
【０１３２】
マイクロＲＮＡ（ｍｉｒ）とは、ｍＲＮＡの安定性を制御することにより多重遺伝子の発現を調節することができる天然の細胞ＲＮＡ分子のことである。特定のマイクロＲＮＡの過剰発現または減少を使用して機能不全を処置することができ、多くの病状および疾患の動物モデルで有効であることが分かっている（例えばＣｏｕｚｉｎ、（２００８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１９：１７８２〜４を参照）。遺伝的疾患および後天性疾患を処置するために、またはある種の組織の機能性を高め増殖を促進するために、キメラＡＡＶを使用してマイクロＲＮＡを細胞、組織および対象中に送達することができる。例えば、ｍｉｒ−１、ｍｉｒ−１３３、ｍｉｒ−２０６および／またはｍｉｒ−２０８を使用して心疾患および骨格筋疾患を処置することができる（例えばＣｈｅｎ他、（２００６）Ｇｅｎｅｔ．３８：２２８〜３３、ｖａｎ  Ｒｏｏｉｊ他、（２００８）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．２４：１５９〜６６を参照）。マイクロＲＮＡを使用して、遺伝子送達後に免疫系を調節することもできる（Ｂｒｏｗｎ他、（２００７）Ｂｌｏｏｄ  １１０：４１４４〜５２）。
【０１３３】
用語「アンチセンスオリゴヌクレオチド」（「アンチセンスＲＮＡ」を含む）は本明細書で使用する場合、特定のＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列に相補的であり特異的にハイブリダイズする核酸を指す。アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびそれをコードする核酸を、従来の技法に従って産生することができる。例えば、Ｔｕｌｌｉｓに対する米国特許第５，０２３，２４３号、Ｐｅｄｅｒｓｏｎに対する米国特許第５，１４９，７９７号を参照。
【０１３４】
配列相同性の程度が、アンチセンスヌクレオチド配列のその標的（上記で定義した）への特異的ハイブリダイズおよびタンパク質産物の産生の（例えば少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％またはより多くの）低減に十分である限り、アンチセンスオリゴヌクレオチドが標的配列に完全に相補的であることは必要ではないことを当業者は認識する。
【０１３５】
ハイブリダイゼーションの特異性を決定するために、低ストリンジェンシー条件下で、中間ストリンジェンシー条件下で、さらにはストリンジェントな条件下で、そのようなオリゴヌクレオチドの標的配列へのハイブリダイゼーションを実行することができる。低ストリンジェンシーの、中間ストリンジェンシーのおよびストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を実現するための適切な条件は本明細書に記載した通りである。
【０１３６】
換言すると、特定の実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的配列の相補体と少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％のまたはより高い配列同一性を有し、タンパク質産物（上記で定義した）の産生を低減する。いくつかの実施形態では、アンチセンス配列は、標的配列と比較して１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個のミスマッチを含有する。
【０１３７】
核酸配列のパーセント同一性を決定する方法を、本明細書の他の箇所により詳細に記載する。
【０１３８】
アンチセンスオリゴヌクレオチドが目的の標的に特異的にハイブリダイズし、タンパク質産物（上記で定義した）の産生を低減する限り、アンチセンスオリゴヌクレオチドの長さは重要ではなく、常法に従って決定することができる。一般に、アンチセンスヌクレオチドは、少なくとも約８、１０もしくは１２もしくは１５のヌクレオチド長であり、かつ／または約２０未満、３０未満、４０未満、５０未満、６０未満、７０未満、８０未満、１００未満もしくは１５０未満のヌクレオチド長である。
【０１３９】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、タンパク質産物（例えばｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ）の産生の低減に有用な別のアプローチである。ＲＮＡｉとは、目的の標的配列に対応する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が細胞または生物に取り込まれ、対応するｍＲＮＡが分解する転写後遺伝子サイレンシング機構のことである。ＲＮＡｉにより遺伝子サイレンシングが実現される機構は、Ｓｈａｒｐ他、（２００１）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １５：４８５〜４９０およびＨａｍｍｏｎｄ他、（２００１）Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｇｅｎ．２：１１０〜１１９）に概説されている。ＲＮＡｉの効果が複数回の細胞分裂にわたって持続した後に遺伝子発現が回復する。したがって、ＲＮＡｉは、ＲＮＡレベルで、標的化したノックアウトまたは「ノックダウン」を行う強力な方法である。ＲＮＡｉは、ヒト胚腎細胞およびＨｅＬａ細胞を含むヒト細胞での成功が証明されている（例えばＥｌｂａｓｈｉｒ他、Ｎａｔｕｒｅ（２００１）４１１：４９４〜８を参照）。
【０１４０】
哺乳動物細胞でＲＮＡｉを使用する初期の試みにより、ｄｓＲＮＡ分子に応じたＰＫＲを含む抗ウイルス防御機構が得られた（例えばＧｉｌ他、（２０００）Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ５：１０７を参照）。その後、「短干渉ＲＮＡ」（ｓｉＲＮＡ）として既知である約２１個のヌクレオチドの短い合成ｄｓＲＮＡが、抗ウイルス応答を誘発することなく哺乳動物細胞でサイレンシングを媒介することができることが証明されている（例えばＥｌｂａｓｈｉｒ他、Ｎａｔｕｒｅ（２００１）４１１：４９４〜８、Ｃａｐｌｅｎ他、（２００１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：９７４２を参照）。
【０１４１】
ＲＮＡｉ分子（ｓｉＲＮＡ分子を含む）は短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ；Ｐａｄｄｉｓｏｎ他、（２００２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９９：１４４３〜１４４８を参照）であり得、ＲＮａｓｅＩＩＩ様酵素であるＤｉｃｅｒの作用により細胞内で２０〜２５ｍｅｒのｓｉＲＮＡ分子にプロセシングされると考えられる。ｓｈＲＮＡは一般に、ループアウトする短スペーサー配列により２つの逆方向反復配列が分離されているステム−ループ構造を有する。３〜２３のヌクレオオチド長の範囲のループを有するｓｈＲＮＡが報告されている。ループ配列は一般に重要ではない。例示的なループ構造として以下のモチーフが挙げられる：ＡＵＧ、ＣＣＣ、ＵＵＣＧ、ＣＣＡＣＣ、ＣＴＣＧＡＧ、ＡＡＧＣＵＵ、ＣＣＡＣＡＣＣおよびＵＵＣＡＡＧＡＧＡ。
【０１４２】
ＲＮＡｉは、センス領域とアンチセンス領域との間でのｄｓＲＮＡ形成時に「ダンベル」型の構造を形成するために、両側に２つのループ領域を有するセンス領域およびアンチセンス領域を含む環状分子をさらに含むことができる。この分子をインビトロまたはインビボでプロセシングして、ｄｓＲＮＡ部分、例えばｓｉＲＮＡを遊離させることができる。
【０１４３】
国際特許公開ＷＯ０１／７７３５０には、真核細胞中で異種配列のセンス転写産物およびアンチセンス転写産物の両方を生成するための双方向性転写用のベクターが記載されている。この技法を用いて、本発明に係る使用のためのＲＮＡｉを産生することができる。
【０１４４】
Ｓｈｉｎａｇａｗａ他、（２００３）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１７：１３４０には、ＣＭＶプロモーター（ｐｏｌ  ＩＩプロモーター）由来の長ｄｓＲＮＡを発現させる方法が報告されており、この方法を組織特異的ｐｏｌ  ＩＩプロモーターに適用することもできる。同様に、Ｘｉａ他、（２００２）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０：１００６のアプローチはポリ（Ａ）尾部付加を回避し、組織特異的プロモーターに関連して使用され得る。
【０１４５】
ＲＮＡｉを生成する方法として、化学合成、インビトロ転写、（インビトロまたはインビボでの）Ｄｉｃｅｒによる長ｄｓＲＮＡの消化、送達ベクターからのインビボでの発現、およびＰＣＲ由来ＲＮＡｉ発現カセットからのインビボでの発現が挙げられる（例えばＡｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．，オースティン  テキサス州からのＴｅｃｈＮｏｔｅｓ  １０（３）“Ｆｉｖｅ  Ｗａｙｓ  ｔｏ  Ｐｒｏｄｕｃｅ  ｓｉＲＮＡｓ”を参照；ｗｗｗ．ａｍｂｉｏｎ．ｃｏｍで入手可能）。
【０１４６】
ｓｉＲＮＡ分子を設計するためのガイドラインが入手可能である（例えばＡｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．，オースティン  テキサス州からの文献を参照；ｗｗｗ．ａｍｂｉｏｎ．ｃｏｍで入手可能）。特定の実施形態では、ｓｉＲＮＡ配列は約３０〜５０％のＧ／Ｃ含有量を有する。さらに、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩをＲＮＡの転写に使用する場合、４個のＴ残基またはＡ残基よりも大きい長ストレッチを一般に避ける。例えば、Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ｗｗｗ．ｊｕｒａ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ）を介してＡｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．（ｗｗｗ．ａｍｂｉｏｎ．ｃｏｍ）から、またはＤｈａｒｍａｃｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．（ｗｗｗ．ｄｈａｒｍａｃｏｎ．ｃｏｍ）から、オンラインｓｉＲＮＡターゲットファインダー（Ｏｎｌｉｎｅ  ｓｉＲＮＡ  ｔａｒｇｅｔ  ｆｉｎｄｅｒ）が入手可能である。
【０１４７】
ＲＮＡｉ分子のアンチセンス領域は標的配列に完全に相補的であり得るが、該アンチセンス領域が標的配列（上記に定義した）に特異的にハイブリダイズしてタンパク質産物の産生を（例えば少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％またはより多く）低減する限り、標的配列に完全に相補的である必要はない。いくつかの実施形態では、上記で定義したように、そのようなオリゴヌクレオチドの標的配列へのハイブリダイゼーションを低ストリンジェンシー条件下で、中間ストリンジェンシー条件下で、さらにはストリンジェントな条件下で実行することができる。
【０１４８】
その他の実施形態では、ＲＮＡｉのアンチセンス領域は、標的配列の相補体と少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％のまたはより高い配列同一性を有し、タンパク質産物の産生を（例えば少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％またはより多く）低減する。いくつかの実施形態では、アンチセンス領域は、標的配列と比較して１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個のミスマッチを含有する。ミスマッチは、ｄｓＲＮＡの中心部分よりも端部で一般に許容される。
【０１４９】
特定の実施形態では、ＲＮＡｉは、２つの別々のセンス分子とアンチセン分子との間の分子間複合体化により形成される。ＲＮＡｉは、２つの別々の鎖の間の分子間塩基対合により形成される二本鎖領域を含む。その他の実施形態では、ＲＮＡｉは、典型的には逆方向反復として、センス領域およびアンチセンス領域の両方を含む単一の核酸分子内の分子間塩基対合により形成されたｄｓ領域を含む（例えばｓｈＲＮＡもしくはその他のステムループ構造、または環状ＲＮＡｉ分子）。ＲＮＡｉは、センス領域とアンチセンス領域との間にスペーサー領域をさらに含むことができる。
【０１５０】
一般に、ＲＮＡｉ分子は高選択的である。必要に応じて、当業者は、例えばＢＬＡＳＴ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴで入手可能）を使用して、その他の既知の配列との実質的な配列相同性を有しないＲＮＡｉ配列を同定すべく関連するデータベースを検索することにより、標的以外の核酸の発現を妨げる可能性がある候補ＲＮＡｉを容易に除くことができる。
【０１５１】
ＲＮＡｉの産生用キットは市販されており、例えばＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．およびＡｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．から市販されている。
【０１５２】
組換えウイルスベクターはまた、宿主染色体の遺伝子座と相同性を共有し該遺伝子座と組み換わる異種ヌクレオチド配列を含むこともできる。このアプローチを用いて、宿主細胞での遺伝子欠損を修正することができる。
【０１５３】
本発明はまた、例えばワクチン接種のための、免疫原性ポリペプチドを発現する組換えウイルスベクターも提供する。異種核酸は、当分野で既知の目的の任意の免疫原をコードすることができ、該免疫原して、ヒト免疫不全ウイルス、インフルエンザウイルス、ｇａｇタンパク質、腫瘍抗原、癌抗原、細菌性抗原、ウイルス抗原等からの免疫原が挙げられるがこれらに限定されない。また、免疫原は、ウイルスカプシド中に存在する（例えばウイルスカプシド中に組み込まれる）ことができる、または（例えば共有結合改変により）ウイルスカプシドに繋がれ得る。
【０１５４】
パルボウイルスのワクチンとしての使用は当分野で既知である（例えばＭｉｙａｍｕｒａ他、（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：８５０７、Ｙｏｕｎｇ他に対する米国特許第５，９１６，５６３号、Ｍａｚｚａｒａ他に対する米国特許第５，９０５，０４０号、米国特許第５，８８２，６５２号、Ｓａｍｕｌｓｋｉ他に対する米国特許第５，８６３，５４１号、これらの開示はその全体が参照により本明細書に援用される）。抗原がウイルスカプシド中に存在することができる。また、組換えベクターゲノムに導入した異種核酸から抗原を発現させることができる。
【０１５５】
免疫原性ポリペプチドまたは免疫原は、疾患に対して対象を防御するのに適した任意のポリペプチドであり得、該疾患として、微生物による疾患、細菌による疾患、原虫による疾患、寄生虫による疾患、真菌による疾患およびウイルスによる疾患が挙げられるがこれらに限定されない。例えば、免疫原は、オルソミクソウイルス免疫原（例えばインフルエンザウイルス免疫原、例えばインフルエンザウイルス赤血球凝集素（ＨＡ）表面タンパク質もしくはインフルエンザウイルス核タンパク質遺伝子、またはウマインフルエンザウイルス免疫原）、またはレンチウイルス免疫原（例えばウマ伝染性貧血ウイルス免疫原、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）免疫原またはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）免疫原、例えばＨＩＶもしくはＳＩＶのエンベロープＧＰ１６０タンパク質、ＨＩＶもしくはＳＩＶのマトリックス／カプシドタンパク質、ならびにＨＩＶもしくはＳＩＶのｇａｇ遺伝子産物、ｐｏｌ遺伝子産物およびｅｎｖ遺伝子産物）であり得る。免疫原はまた、アレナウイルス免疫原（例えばラッサ熱ウイルス免疫原、例えばラッサ熱ウイルスのヌクレオカプシドタンパク質遺伝子およびラッサ熱エンベロープ糖タンパク質遺伝子）、ポックスウイルス免疫原（例えばワクシニア、例えばワクシニアのＬ１遺伝子またはＬ８遺伝子）、フラビウイルス免疫原（例えば黄熱病ウイルス免疫原または日本脳炎ウイルス免疫原）、フィロウイルス免疫原（例えばエボラウイルス免疫原またはマールブルグウイルス免疫原、例えばＮＰ遺伝子およびＧＰ遺伝子）、ブニヤウイルス免疫原（例えばＲＶＦＶウイルス、ＣＣＨＦウイルスおよびＳＦＳウイルス）、またはコロナウイルス免疫原（例えば感染性ヒトコロナウイルス免疫原、例えばヒトコロナウイルスのエンベロープ糖タンパク質遺伝子またはブタ伝染性胃腸炎ウイルス免疫原またはトリ伝染性気管支炎ウイルス免疫原または重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）免疫原、例えばＳ［Ｓ１もしくはＳ２］タンパク質、Ｍタンパク質、Ｅタンパク質またはＮタンパク質またはそれらの免疫原性フラグメント）であることもできる。免疫原はさらに、ポリオ免疫原、ヘルペス免疫原（例えばＣＭＶ免疫原、ＥＢＶ免疫原、ＨＳＶ免疫原）、流行性耳下腺炎免疫原、麻疹免疫原、風疹免疫原、ジフテリア毒素もしくはその他のジフテリア免疫原、百日咳抗原、肝炎（例えばＡ型肝炎、Ｂ型肝炎もしくはＣ型肝炎）免疫原または当分野で既知の任意の他のワクチン免疫原であり得る。
【０１５６】
また、免疫原は、任意の腫瘍細胞抗原または癌細胞抗原であり得る。任意選択的に、腫瘍抗原または癌抗抗原を癌細胞の表面上で発現させる。例示的な癌細胞抗原および腫瘍細胞抗原がＳ．Ａ．Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ、（１９９９）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １０：２８１）に記載されている。例示的な癌抗原および腫瘍抗原として、ＢＲＣＡ１遺伝子産物、ＢＲＣＡ２遺伝子産物、ｇｐ１００、チロシナーゼ、ＧＡＧＥ−１／２、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＣＤＫ−４、β−カテニン、ＭＵＭ−１、カスパーゼ−８、ＫＩＡＡ０２０５、ＨＰＶＥ、ＳＡＲＴ−１、ＰＲＡＭＥ、ｐ１５、ＭＡＲＴ−１（Ｃｏｕｌｉｅ他、（１９９１）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８０：３５）を含むメラノーマ腫瘍抗原（Ｋａｗａｋａｍｉ他、（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：３５１５、Ｋａｗａｋａｍｉ他、（１９９４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１８０：３４７、Ｋａｗａｋａｍｉ他、（１９９４）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５４：３１２４）、ｇｐ１００（Ｗｉｃｋ他、（１９８８）Ｊ．Ｃｕｔａｎ．Ｐａｔｈｏｌ．４：２０１）ならびにＭＡＧＥ抗原（ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−２およびＭＡＧＥ−３）（Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｂｒｕｇｇｅｎ他、（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５４：１６４３）、ＣＥＡ、ＴＲＰ−１；ＴＲＰ−２；Ｐ−１５およびチロシナーゼ（Ｂｒｉｃｈａｒｄ他、（１９９３）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７８：４８９）；ＨＥＲ−２／ｎｅｕ遺伝子産物（米国特許第４，９６８，６０３号）；ＣＡ１２５；ＨＥ４；ＬＫ２６；ＦＢ５（エンドシアリン）；ＴＡＧ７２；ＡＦＰ；ＣＡ１９−９；ＮＳＥ；ＤＵ−ＰＡＮ−２；ＣＡ５０；Ｓｐａｎ−１；ＣＡ７２−４；ＨＣＧ；ＳＴＮ（シアリルＴｎ抗原）；ｃ−ｅｒｂＢ−２タンパク質；ＰＳＡ；Ｌ−ＣａｎＡｇ；エストロゲン受容体；乳脂肪グロブリン；ｐ５３腫瘍サプレッサータンパク質（Ｌｅｖｉｎｅ、（１９９３）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：６２３）；ムチン抗原（国際特許公開ＷＯ９０／０５１４２）；テロメラーゼ；核マトリックスタンパク質；前立腺酸性ホスファターゼ；パピローマウイルス抗原；ならびに以下の癌に関連する抗原：メラノーマ、腺がん、胸腺腫、肉腫、肺癌、肝臓癌、結腸癌、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、白血病、子宮癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頚部癌、膀胱癌、腎臓癌、膵臓癌、脳癌、腎臓癌、胃癌、食道癌、頭頚部癌およびその他（例えばＲｏｓｅｎｂｅｒｇ、（１９９６）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．４７：４８１〜９１を参照）が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１５７】
また、異種ヌクレオチド配列は、望ましくはインビトロ、エクスビボでまたはインビボで細胞中において産生される任意のポリペプチドをコードすることができる。例えば、ウイルスベクターを培養細胞に導入し、発現したタンパク質産物を培養細胞から単離することができる。
【０１５８】
目的の異種ポリヌクレオチドを適切な制御配列と作動可能に結合させることができることを当業者は理解する。例えば、異種核酸を、発現制御エレメント、例えば転写／翻訳制御シグナル、複製開始点、ポリアデニル化シグナル、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、プロモーター、エンハンサー等と作動可能に結合させることができる。
【０１５９】
所望のレベルおよび組織特異的発現に応じて様々なプロモーター／エンハンサーエレメントを使用することができることを当業者はさらに認識する。所望の発現パターンに応じて、プロモーター／エンハンサーは構成的であり得る、または誘導性であり得る。プロモーター／エンハンサーは生来または外来性であり得、天然配列または合成配列であり得る。外来性とは、転写開始領域が、該転写開始領域が導入されている野生型宿主において見出されないことを意図するものである。
【０１６０】
プロモーター／エンハンサーエレメントは、標的細胞もしくは処置する対象に対して生来であり得、および／または異種核酸配列に対して生来であり得る。プロモーター／エンハンサーエレメントは一般に、目的の標的細胞中で機能することができるように選択される。代表的な実施形態では、プロモーター／エンハンサーエレメントは哺乳動物のプロモーター／エンハンサーエレメントである。プロモーター／エンハンサー（ｅｎｈａｎｃｅ）エレメントは構成的または誘導性であり得る。
【０１６１】
誘導性発現制御エレメントは一般に、異種核酸配列の発現に対する調節をもたらすことが望ましい用途で使用される。遺伝子送達用の誘導性プロモーター／エンハンサーエレメントは、組織特異的なまたは組織優先的なプロモーター／エンハンサーエレメントであり得、該エレメントには、（心臓、骨格および／または平滑筋を含む）筋肉に特異的なまたは優先的な、（脳特異的を含む）神経組織に特異的なまたは優先的な、（網膜特異的および角膜特異的を含む）眼、肝臓に特異的なまたは優先的な、骨髄に特異的なまたは優先的な、膵臓に特異的なまたは優先的な、脾臓に特異的なまたは優先的な、および肺に特異的なまたは優先的なプロモーター／エンハンサーエレメントが含まれる。その他の誘導性プロモーター／エンハンサーエレメントとして、ホルモン誘導性エレメントおよび金属誘導性エレメントが挙げられる。例示的な誘導性プロモーター／エンハンサーエレメントとして、Ｔｅｔオン／オフエレメント、ＲＵ４８６−誘導性プロモーター、エクジソン誘導性プロモーター、ラパマイシン誘導性プロモーターおよびメタロチオネインプロモーターが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１６２】
標的細胞において異種核酸配列が転写され、次いで翻訳される実施形態では、挿入されたタンパク質コード配列の効率的な翻訳のために、特異的な開始シグナルを一般に用いる。ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列を含むことができるこれらの外因性翻訳制御配列は様々な起源であり得、すなわち天然および合成のどちらでもあることができる。
【０１６３】
本発明は、本発明のウイルスベクターを産生する方法をさらに提供する。代表的な実施形態では、本発明は、組換えウイルスベクターを産生する方法であって、細胞にインビトロで、（ａ）（ｉ）目的のポリヌクレオチドおよび（ｉｉ）ＡＡＶテンプレートのウイルス粒子へのカプシド形成に十分なパッケージングシグナル配列（例えば、ＡＡＶ末端反復等の１つまたは複数の（例えば２つの）末端反復）を含むテンプレートと、（ｂ）テンプレートの複製およびウイルス粒子へのカプシド形成に十分なＡＡＶ配列（例えば、ＡＡＶｒｅｐ配列およびＡＡＶｃａｐ配列）とを提供することを含む方法を提供する。カプシド内にパッケージングされたテンプレートを含む組換えウイルス粒子が細胞中で産生されるような条件下で、テンプレート配列およびＡＡＶ複製配列およびカプシド配列が提供される。本方法は、細胞からウイルス粒子を回収する工程をさらに含むことができる。培地からかつ／または細胞を溶解させることにより、ウイルス粒子を回収することができる。
【０１６４】
一つの例示的な実施形態では、本発明は、ＡＡＶカプシドを含むｒＡＡＶ粒子を産生する方法であって、細胞にインビトロで、ＡＡＶカプシドをコードする核酸、ＡＡＶｒｅｐコード配列、目的のポリヌクレオチドを含むＡＡＶベクターゲノムおよび増殖性ＡＡＶ感染を生じさせるヘルパー機能を提供すること、ならびにＡＡＶカプシドを含むＡＡＶ粒子の組み立てを可能にし、ＡＡＶベクターゲノムをカプシド形成することを含む方法を提供する。
【０１６５】
細胞は典型的には、ＡＡＶウイルス複製を許容する細胞である。哺乳動物細胞等の当分野で既知の任意の適切な細胞を用いることができる。複製欠陥性ヘルパーウイルス、例えば２９３細胞またはその他のＥ１ａトランス相補性細胞から欠失した機能を提供するトランス相補性パッケージング細胞株も適している。
【０１６６】
当分野で既知の任意の方法により、ＡＡＶ複製配列およびカプシド配列を供給することができる。最新のプロトコルにより、単一のプラスミド上でＡＡＶｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子が典型的には発現される。ＡＡＶ複製配列およびパッケージング配列を共に供給する必要はないが、そのようにすることが便利な場合がある。ＡＡＶｒｅｐ配列および／またはＡＡＶｃａｐ配列を、任意のウイルスベクターまたは非ウイルスベクターにより供給することができる。例えば、ｒｅｐ／ｃａｐ配列を、ハイブリッドアデノウイルスベクターまたはハイブリッドヘルペスウイルスベクターにより供給することができる（例えば、欠失アデノウイルスベクターのＥａ１領域またはＥ３領域に挿入することができる）。ＥＢＶベクターを用いてＡＡＶｃａｐ遺伝子およびＡＡＶｒｅｐ遺伝子を発現させることもできる。この方法の１つの利点は、ＥＢＶベクターがエピソームであるが、連続的な細胞分裂を通して高コピー数を維持することができる（すなわち、ＥＢＶベースの核エピソームと命名した染色体外エレメントとして細胞に安定的に組み込まれる）ことである。
【０１６７】
さらなる代替として、ｒｅｐ／ｃａｐ配列は細胞内で安定的に保有され得る（エピソームであり得る、または組み込まれ得る）。
【０１６８】
典型的には、ＡＡＶｒｅｐ／ｃａｐ配列がＡＡＶパッケージング配列（例えばＡＡＶ  ＩＴＲ）に隣接せず、これらの配列の救済および／またはパッケージングを防止することができる。
【０１６９】
当分野で既知の任意の方法を使用して、テンプレート（例えばｒＡＡＶベクターゲノム）を細胞に供給することができる。例えば、非ウイルス（例えばプラスミド）ベクターまたはウイルスベクターにより、テンプレートを供給することができる。特定の実施形態では、テンプレートは、ヘルペスウイルスベクターまたはアデノウイルスベクターにより供給される（例えば、欠失アデノウイルスのＥ１ａ領域またはＥ３領域に挿入される）。別の例示として、ＡＡＶ  ＩＴＲに隣接するレポーター遺伝子を保有するバキュロウイルスベクターがＰａｌｏｍｂｏ他、（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：５０２５に記載されている。ＥＢＶベクターを用いて、ｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子に関して上記に記載したようにテンプレートを送達することもできる。
【０１７０】
別の代表的な実施形態では、ｒＡＡＶウイルスを複製することによりテンプレートが供給される。さらに他の実施形態では、ＡＡＶプロウイルスが細胞の染色体に安定的に組み込まれる。
【０１７１】
最大のウイルス力価を得るために、増殖性ＡＡＶ感染に必須のヘルパーウイルス機能（例えばアデノウイルスまたはヘルペスウイルス）が細胞に概して供給される。ＡＡＶ複製に必要なヘルパーウイルス配列は当分野で既知である。典型的には、これらの配列は、ヘルパーアデノウイルスベクターまたはヘルパーヘルペスウイルスベクターにより供給される。また、別の非ウイルスベクターまたはウイルスベクターにより、例えばＦｅｒｒａｒｉ他、（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．３：１２９５ならびに米国特許第６，０４０，１８３号および米国特許第６，０９３，５７０号に記載されているように効率的なＡＡＶ産生に必要である全てのヘルパー遺伝子を保有する非感染性のアデノウイルスミニプラスミドとして、アデノウイルス配列またはヘルペスウイルス配列を供給することができる。
【０１７２】
さらに、染色体に組み込まれた、または安定的な染色体外エレメントとして維持されたヘルパー遺伝子を有するパッケージング細胞により、ヘルパーウイルス機能を提供することができる。代表的な実施形態では、ヘルパーウイルス配列をＡＡＶビリオン中にパッケージングすることはできず、例えばＡＡＶ  ＩＴＲに隣接していない。
【０１７３】
ＡＡＶ複製配列およびカプシド配列ならびにヘルパーウイルス配列（例えばアデノウイルス配列）を単一のヘルパー構築物上に供給することが有利であり得ることを当業者は認識する。このヘルパー構築物は非ウイルス構築物またはウイルス構築物であり得るが、任意選択的に、ＡＡＶｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子を含むハイブリッドアデノウイルスまたはハイブリッドヘルペスウイルスであり得る。
【０１７４】
一つの特定の実施形態では、単一のアデノウイルスヘルパーベクターによりＡＡＶｒｅｐ／ｃａｐ配列およびアデノウイルスヘルパー配列が供給される。このベクターはｒＡＡＶテンプレートをさらに含有する。ＡＡＶｒｅｐ／ｃａｐ配列および／またはｒＡＡＶテンプレートを、アデノウイルスの欠失領域（例えばＥ１ａ領域またはＥ３領域）に挿入することができる。
【０１７５】
さらなる実施形態では、単一のアデノウイルスヘルパーベクターによりＡＡＶｒｅｐ／ｃａｐ配列およびアデノウイルスヘルパー配列が供給される。ｒＡＡＶテンプレートはプラスミドテンプレートとして供給される。
【０１７６】
別の例示的な実施形態では、単一のアデノウイルスヘルパーベクターによりＡＡＶｒｅｐ／ｃａｐ配列およびアデノウイルスヘルパー配列が供給され、ｒＡＡＶテンプレートはプロウイルスとして細胞に組み込まれる。また、染色体外エレメントとして（例えば「ＥＢＶベースの核エピソーム」として、Ｍａｒｇｏｌｓｋｉ、（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎ．１５８：６７を参照）細胞内に維持されるＥＢＶベクターによりｒＡＡＶテンプレートが供給される。
【０１７７】
さらに例示的な実施形態では、単一のアデノウイルスヘルパーによりＡＡＶｒｅｐ／ｃａｐ配列およびアデノウイルスヘルパー配列が供給される。ｒＡＡＶテンプレートは別々の複製ウイルスベクターとして供給される。例えば、ｒＡＡＶ粒子によりまたは別の組換えアデノウイルス粒子によりｒＡＡＶテンプレートを供給することができる。
【０１７８】
上述の方法によれば、ハイブリッドアデノウイルスベクターは、アデノウイルスの複製およびパッケージングに十分なアデノウイルスの５’シス配列および３’シス配列（すなわち、アデノウイルスの末端反復およびＰＡＣ配列）を典型的には含む。ＡＡＶｒｅｐ／ｃａｐ配列および存在する場合にはｒＡＡＶテンプレートはアデノウイルスバックボーンに埋め込まれており、５’シス配列および３’シス配列に隣接しており、そのため、これらの配列をアデノウイルスカプシド中にパッケージングすることができる。上記に記載したように、代表的な実施形態では、アデノウイルスヘルパー配列およびＡＡＶｒｅｐ／ｃａｐ配列はＡＡＶパッケージング配列（例えばＡＡＶ  ＩＴＲ）に隣接しておらず、そのため、これらの配列はＡＡＶビリオン中にパッケージングされない。
【０１７９】
ＡＡＶパッケージング法において、ヘルペスウイルスをヘルパーウイルスとして使用することもできる。ＡＡＶｒｅｐタンパク質をコードするハイブリッドヘルペスウイルスは、よりスケーラブルなＡＡＶベクター産生スキームを有利に促進することができる。ＡＡＶ−２ｒｅｐ遺伝子およびＡＡＶ−２ｃａｐ遺伝子を発現するハイブリッド単純ヘルペスウイルスＩ型（ＨＳＶ−１）が記載されている（Ｃｏｎｗａｙ他、（１９９９）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ６：９８６およびＷＯ００／１７３７７、これらの開示はその全体が本明細書に援用される）。
【０１８０】
さらなる代替として、Ｕｒａｂｅ他、（２００２）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １３：１９３５〜４３に記載されているようにｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子およびｒＡＡＶテンプレートの送達にバキュロウイルスベクターを使用して、本発明のウイルスベクターを昆虫細胞中で産生することができる。
【０１８１】
ＡＡＶを産生するその他の方法は、安定的に形質転換されたパッケージング細胞を使用する（例えば米国特許第５，６５８，７８５号を参照）。
【０１８２】
当分野で既知の任意の方法により、ヘルパーウイルスの夾雑がないＡＡＶベクターストックを得ることができる。例えば、ＡＡＶおよびヘルパーウイルスをサイズに基づいて容易に区別することができる。ＡＡＶをヘパリン基質に対する親和性に基づいてヘルパーウイルスから分離することもできる（Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎ他、（１９９９）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ６：９７３）。代表的な実施形態では、いかなる夾雑ヘルパーウイルスも複製能を有しないように、欠失した複製欠損ヘルパーウイルスを使用する。さらなる代替として、アデノウイルスの初期遺伝子発現のみがＡＡＶウイルスのパッケージングの媒介に必要であることから、後期遺伝子発現を欠いているアデノウイルスヘルパーを用いることができる。後期遺伝子発現が不完全なアデノウイルス変異体は当分野で既知である（例えばｔｓ１００Ｋアデノウイルス変異体およびｔｓ１４９アデノウイルス変異体）。
【０１８３】
本発明のパッケージング法を用いて、ウイルス粒子の高力価ストックを産生することができる。特定の実施形態では、ウイルスストックは、少なくとも約１０５形質導入単位（ｔｕ）／ｍｌ、少なくとも約１０６ｔｕ／ｍｌ、少なくとも約１０７ｔｕ／ｍｌ、少なくとも約１０８ｔｕ／ｍｌ、少なくとも約１０９ｔｕ／ｍｌまたは少なくとも約１０１０ｔｕ／ｍｌの力価を有する。
【０１８４】
特定の実施形態では、本発明は、薬学的に許容される担体中の本発明のウイルスベクターと、任意選択的にその他の薬剤、医薬品、安定化剤、緩衝剤、担体、アジュバント、希釈剤等とを含む医薬組成物を提供する。注射では、担体は典型的には液体となる。その他の投与の方法では、担体は固体でもよいし液体でもよい。吸入投与では、担体は呼吸に適し、好ましくは固体または液体粒子形態となる。
【０１８５】
「薬学的に許容される」とは、毒性ではないまたはそれ以外の望ましくはないものではない材料を意味し、すなわち、任意の望ましくない生物学的影響を引き起こすことなく材料を対象に投与することができる。
【０１８６】
本発明の一態様は、目的のポリヌクレオチドをインビトロで細胞へ移入する方法である。特定の標的細胞に適した標準的な形質導入法により、感染の適切な多重度でウイルスベクターを細胞に導入することができる。投与するウイルスベクターまたはカプシドの力価は、標的細胞の型および数、ならびに具体的なウイルスベクターまたはカプシドに応じて異なることができ、過度の実験を行うことなく当業者により決定され得る。特定の実施形態では、少なくとも約１０３感染単位を、より好ましくは少なくとも約１０５感染単位を細胞に導入する。
【０１８７】
ウイルスベクターを導入することができる細胞は、神経細胞（末梢神経系、中枢神経系、特に脳細胞、例えば神経細胞、希突起神経膠細胞、グリア細胞、星状膠細胞を含む）、肺細胞、眼の細胞（網膜細胞、網膜色素上皮および角膜細胞を含む）、上皮細胞（例えば腸上皮細胞および呼吸上皮細胞）、骨格筋細胞（筋芽細胞、筋管および筋繊維を含む）、横隔膜筋細胞、樹状細胞、膵臓細胞（島細胞を含む）、肝細胞、消化管の細胞（平滑筋細胞、上皮細胞を含む）、心臓細胞（心筋細胞を含む）、骨細胞（例えば骨髄幹細胞）、造血幹細胞、脾臓細胞、角化細胞、線維芽細胞、内皮細胞、前立腺細胞、関節細胞（例えば軟骨、半月板、滑膜および骨髄を含む）、生殖細胞等が挙げられるがこれらに限定されない任意の種類であり得る。また、細胞は任意の前駆細胞であり得る。さらにまた、細胞は幹細胞（例えば神経幹細胞、肝幹細胞）であり得る。さらにまた、細胞は癌細胞または腫瘍細胞（上記に記載している癌および腫瘍）であり得る。さらに、上記に示したように、細胞は任意の種類の起源由来であり得る。
【０１８８】
改変細胞を対象に投与する目的で、ウイルスベクターをインビトロで細胞に導入することができる。特定の実施形態では、対象から細胞を取り出し、細胞にウイルスベクターを導入し、次いで細胞を対象内に戻す。エクスビボでの処置のために対象から細胞を取り出し、続いて対象内に戻す方法は当分野で既知である（例えば米国特許第５，３９９，３４６号を参照）。または、組換えウイルスベクターを、別の対象由来の細胞に、培養細胞に、または任意のその他の適切な供給源由来の細胞に導入し、それを必要とする対象に該細胞を投与する。
【０１８９】
エクスビボでの遺伝子治療に適した細胞は上記に記載した通りである。対象に投与する細胞の投与量は、対象の年齢、状態および種、細胞型、細胞により発現される核酸、投与の様式等に応じて異なることができる。典型的には、薬学的に許容される担体中、投与１回当たり少なくとも約１０２〜約１０８個のまたは約１０３〜１０６個の細胞を投与することができる。特定の実施形態では、ウイルスベクターにより形質導入された細胞を有効量で、薬学的に許容される担体と共に対象に投与する。
【０１９０】
いくつかの実施形態では、ウイルスベクターにより形質導入されている細胞を投与して、送達されたポリペプチド（例えば導入遺伝子として発現される、またはカプシド中で発現される）に対する免疫応答を誘発することができる。典型的には、有効量のポリペプチドを発現する量の細胞を、薬学的に許容される担体と共に投与する。任意選択的に、投与量は防御免疫応答（上記で定義した）を引き起こすのに十分である。免疫原性ポリペプチドを投与する利点が該投与の任意の不利益を上回る限り、付与される防御の程度が完全である必要はない、または持続性である必要はない。
【０１９１】
本発明のさらなる態様は、本発明のウイルスベクターを対象に投与する方法である。特定の実施形態では、本方法は、目的のポリヌクレオチドを動物対象に送達する方法を含み、該方法は、有効量の、本発明に係るウイルスベクターを動物対象に投与することを含む。当分野で既知の任意の手段により、それを必要とするヒト対象または動物に本発明のウイルスベクターを投与することができる。任意選択的に、薬学的に許容される担体中のウイルスベクターを有効な用量で送達する。
【０１９２】
さらに、本発明のウイルスベクターを（例えばワクチンとして）対象に投与して、免疫原性応答を誘発することができる。典型的には、本発明のワクチンは、有効量のウイルスを薬学的に許容される担体と共に含む。任意選択的に、投与量は防御免疫応答（上記で定義した）を引き起こすのに十分である。免疫原性ポリペプチドを投与する利点が該投与の任意の不利益を上回る限り、付与される防御の程度が完全である必要はない、または持続性である必要はない。対象および免疫原は上記に記載した通りである。
【０１９３】
対象に投与するウイルスベクターの投与量を、投与の様式、処置する疾患または状態、個々の対象の状態、具体的なウイルスベクターおよび送達する核酸によって決めることができ、定常的な方法で決定することができる。治療効果を達成する例示的な用量は、少なくとも約１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０３、１０１４、１０１５形質導入単位またはより多くであり、好ましくは約１０７または１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３または１０１４形質導入単位であり、さらにより好ましくは約１０１２形質導入単位である。
【０１９４】
特定の実施形態では、複数回の投与（例えば２回、３回、４回またはより多くの投与）を用いて、様々な間隔の期間にわたり、例えば日毎に、週毎に、月毎に、年毎に等で所望のレベルの遺伝子発現を達成することができる。
【０１９５】
投与の例示的な様式として、経口、直腸、経粘膜、局所、鼻腔内、（例えばエアロゾルを介する）吸入、口腔（例えば舌下）、膣、髄腔内、眼内、経皮、子宮内（または卵内）、非経口（例えば静脈内、皮下、皮内、筋肉内［骨格筋、横隔膜筋および／または心筋への投与等］、皮内、胸腔内、脳内および関節内）、局所（例えば皮膚表面と気道表面を含む粘膜表面との両方、および経皮投与）、リンパ管内等、ならびに組織または器官への（例えば肝臓、骨格筋、心筋、横隔膜筋または脳への）直接注入が挙げられる。腫瘍（例えば腫瘍またはリンパ節の内部または近傍）に投与することもできる。いずれの場合であっても、最も適切な経路を、処置する状態の性質および重症度、ならびに使用する具体的なベクターの性質によって決めることができる。
【０１９６】
ウイルスベクターを含むデポー剤を送達することにより、これらの組織のいずれかへの送達を達成することもでき、デポー剤は、組織に埋め込むことができ、または該組織を、ウイルスベクターを含むフィルムまたはその他のマトリックスと接触させることができる。そのような埋め込み可能なマトリックスまたは基質の例が米国特許第７，２０１，８９８号）に記載されている。
【０１９７】
本発明を使用して、組織または器官の障害を処置することができる。また、本発明を実行して、核酸を組織または器官に送達することができ、本発明は、通常は血液中を循環するタンパク質産物（例えば酵素）もしくは非翻訳ＲＮＡ（例えばＲＮＡｉ、マイクロＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ）の産生用の、または疾患（例えば代謝障害、例えば糖尿病（例えばインスリン）、血友病（例えば第ＩＸ因子もしくは第ＶＩＩＩ因子）またはリソソーム蓄積障害（例えばゴーシェ病［グルコセレブロシダーゼ］、ポンペ病［リソソーム酸性α−グルコシダーゼ］またはファブリー病［α−ガラクトシダーゼＡ］またはグリコーゲン蓄積障害（例えばポンペ病［リソソーム酸性αグルコシダーゼ］）を処置するためのその他の組織への全身的送達用のプラットフォームとして使用される。代謝障害の処置に適したその他のタンパク質は上記に記載されている。
【０１９８】
注射剤を、溶液または懸濁液、注射前に溶液または懸濁液に適した固形状として、またはエマルションとしてのいずれかの従来の形態で調製することができる。また、ウイルスベクターを例えばデポー剤または徐放性製剤で全身的な様式ではなくて局所に投与することができる。さらに、（例えば米国特許第７，２０１，８９８号に記載されているように）ウイルスベクターを、例えば骨移植代替物、縫合糸、ステント等の外科的に埋め込み可能なマトリックスに乾燥して送達することができる。
【０１９９】
経口投与に適した医薬組成物を、それぞれ所定の量の本発明の組成物を含有するカプセル、カシェ剤、ロゼンジ剤もしくはタブレット等の個別の単位で；粉末または顆粒として；水性のもしくは非水性の液体の溶液もしくは懸濁液として；または水中油型のもしくは油中水型のエマルションとして提供することができる。本発明のウイルスベクターと動物の腸内において消化酵素による分解に耐えることが可能な担体との複合体化により、経口送達を行うことができる。そのような担体の例として、当分野で既知であるようにプラスチックカプセルまたはタブレットが挙げられる。そのような製剤を薬学の任意の適切な方法により調製し、該方法は、組成物と、（上記で述べた１種または複数の副成分を含有することができる）好適な担体とを結合させる工程を含む。一般に、組成物と液体の担体もしくは微粉化した固体の担体またはその両方とを均一にかつ密接に混合し、次いで、必要な場合には得られた混合物を成形することにより、本発明の実施形態に係る医薬組成物を調製する。例えば、組成物と任意選択的に１種または複数の副成分とを含有する粉末または顆粒を圧縮するまたは成型することにより、タブレットを調製することができる。結合剤、潤滑剤、不活性希釈剤および／または界面活性剤／分散剤と任意選択的に混合した、粉末または顆粒等の易流動形態の組成物を適切な機械中で圧縮することにより、圧縮タブレットを調製する。不活性な液体結合剤で湿らせた粉末状化合物を適切な機械中で成型することにより、成型タブレットを作製する。
【０２００】
頬側（舌下）投与に適した医薬組成物として、通常はスクロースおよびアラビアゴムまたはトラガントである風味付け基剤中に本発明の組成物を含むロゼンジ剤；ならびにゼラチンおよびグリセリンまたはスクロースおよびアカシアゴム等の不活性基剤中に組成物を含むパステル剤が挙げられる。
【０２０１】
非経口投与に適した医薬組成物は、本発明の組成物の無菌の水性注射液および非水性注射液を構成することができ、これらの調製液は、対象の受容者の血液と任意選択的に等張である。これらの調製液は、組成物と対象の受容者の血液とを等張にする抗酸化剤、緩衝剤、静菌薬および溶液を含有することができる。水性のおよび非水性の無菌の懸濁液、溶液およびエマルションは、懸濁剤および増粘剤を含むことができる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油等の植物油、オレイン酸エチル等の注射可能な有機エステルである。水性担体として、水、アルコール性／水性の溶液、食塩水および緩衝媒体を含むエマルションまたは懸濁液が挙げられる。非経口媒体として、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース（Ｒｉｎｇｅｒ’ｓ  ｄｅｘｔｒｏｓｅ）、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸化リンゲル（ｌａｃｔａｔｅｄ  Ｒｉｎｇｅｒ’ｓ）または不揮発性油が挙げられる。静脈内媒体として、流体および栄養補充液、電解質補充液（例えばリンゲルデキストロースをベースとするもの）等が挙げられる。例えば抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤および不活性ガス等の、防腐剤およびその他の添加剤が存在することもできる。
【０２０２】
組成物は、単位／用量のまたは複数回用量の容器中の状態で、例えば密封したアンプルおよびバイアル中の状態で存在することができ、使用直前に無菌の液体担体、例えば食塩水または注射用水の添加のみを必要とするフリーズドライした（凍結乾燥した）状態で貯蔵され得る。
【０２０３】
即時注射用の溶液および懸濁液を、上記した種類の無菌の粉末、顆粒およびタブレットから調製することができる。例えば、密封した容器中における単位剤形の形態で、本発明の注射可能な安定した無菌の組成物を提供することができる。組成物を凍結乾燥した形態で提供することができ、該組成物を適切な薬学的に許容される担体と再構成して対象への注射に適した液体組成物を形成することができる。単位剤形は、約１μｇ〜約１０グラムの本発明の組成物であり得る。組成物が実質的に水不溶性である場合、十分な量の生理的に許容される乳化剤が、水性担体中で組成物を乳化させるのに十分な量で含有され得る。そのような有用な乳化剤の一つはホスファチジルコリンである。
【０２０４】
直腸投与に適した医薬組成物が単位用量の座薬として存在することができる。組成物と例えばカカオ脂等の１種または複数の従来の固体担体とを混合し、次いで得られた混合物を成形することにより、この座薬を調製することができる。
【０２０５】
皮膚への局所投与に適した本発明の医薬組成物は、軟膏、クリーム、ローション、ペースト、ゲル、スプレー、エアロゾルおよび／またはオイルの形態を取ることができる。使用することができる担体として、ワセリン、ラノリン、ポリエチレングリコール、アルコール、経皮エンハンサーおよびこれらの２種以上の組み合わせが挙げられるがこれらに限定されない。いくつかの実施形態では、例えば本発明の医薬組成物と皮膚を通過可能な親油性試薬（例えばＤＭＳＯ）とを混合することにより、局所送達を行うことができる。
【０２０６】
経皮投与に適した医薬組成物は、長時間にわたり対象の表皮に密接させた状態で保つのに適した個別パッチの形態であり得る。経皮投与に適した組成物をイオン導入（例えばＰｈａｒｍ．Ｒｅｓ．３：３１８（１９８６）を参照）により送達することもでき、該組成物は任意選択的に緩衝した本発明の組成物の水溶液の形態を典型的にはとる。適切な製剤は、クエン酸塩緩衝液もしくはビス／トリス緩衝剤（ｐＨ６）またはエタノール／水を含むことができ、０．１〜０．２Ｍの活性成分を含有することができる。
【０２０７】
任意の適切な手段により、例えば、対象が吸入する、ウイルスベクターから構成される呼吸用粒子のエアロゾル懸濁液を投与することにより、本明細書中に開示したウイルスベクターを対象の肺に投与することができる。吸入用粒子は液体または固体であり得る。当業者に既知であるように、任意の適切な手段により、例えば圧力駆動式のエアロゾル噴霧器または超音波噴霧器により、ウイルスベクターを含む液体粒子のエアロゾルを産生することができる。例えば米国特許第４，５０１，７２９号を参照。ウイルスベクターを含む固体粒子のエアロゾルも同様に、製薬分野で既知の技法により、任意の固体粒子の薬剤エアロゾル発生器により産生することができる。
【０２０８】
本発明の第ＶＩＩＩ因子タンパク質の産生
多くの発現ベクターを使用して遺伝子改変細胞を作製することができる。いくつかの発現ベクターは、選択された高発現細胞に好都合な様々な条件下で、トランスフェクトされた細胞の増幅後に大量の組換えタンパク質を発現するように設計される。いくつかの発現ベクターは、淘汰圧下で増幅を必要とすることなく大量の組換えタンパク質を発現するように設計される。本発明は、当分野で標準的な方法に従った遺伝子改変細胞の産生を含み、任意の特異的発現ベクターまたは発現系の使用に依存しない。
【０２０９】
大量のＦＶＩＩＩタンパク質を産生する遺伝子改変細胞を作製するために、細胞は、該タンパク質をコードするポリヌクレオチド（例えばｃＤＮＡ）を含有する発現ベクターをトランスフェクトされる。いくつかの実施形態では、ＦＶＩＩＩタンパク質は、ＦＶＩＩＩタンパク質の適切な翻訳後修飾を特定の細胞系で生じさせる選択されたコトランスフェクト酵素と共に発現される。
【０２１０】
細胞は様々な供給源から選択することができるが、さもなければ、ＦＶＩＩＩタンパク質をコードする核酸分子（例えばｃＤＮＡ）を含有する発現ベクターをトランスフェクトすることができる細胞である。
【０２１１】
本発明の実践は、別段の指示がない限り、当業者の技能の範囲内である分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、および免疫学の従来の技法を用いる。そのような技法は文献で十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版（１９８９）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｖｏｌ．ＩおよびＩＩ（Ｄ．Ｎ  Ｇｌｏｖｅｒ編、１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８４）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８４）；Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、１９８６）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、１９８６）；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ、Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；シリーズ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）、特にＶｏｌ．１５４および１５５（それぞれ、ＷｕおよびＧｒｏｓｓｍａｎ、ならびにＷｕ編）；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｈ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編、１９８７、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、ＭａｙｅｒおよびＷａｌｋｅｒ編（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９８７）；Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、第２版、１９８７（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ-Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．）；ならびにＨａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ  Ｉ〜ＩＶ  （Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編、１９８６）を参照。本明細書で引用する全ての特許、特許出願、および刊行物は、その全体が参照により本明細書に援用される。
【０２１２】
遺伝子操作法
遺伝子操作によるクローン化遺伝子、組換えＤＮＡ、ベクター、形質転換細胞、タンパク質およびタンパク質フラグメントの産生は公知である。例えば、Ｂｅｌｌ他の米国特許第４，７６１，３７１号、Ｃｏｌ．６、３行目〜Ｃｏｌ．９、６５行目；Ｃｌａｒｋ他の米国特許第４，８７７，７２９号、Ｃｏｌ．４、３８行目〜Ｃｏｌ．７、６行目；Ｓｃｈｉｌｌｉｎｇの米国特許第４，９１２，０３８号、Ｃｏｌ．３、２６行目〜Ｃｏｌ．１４、１２行目；およびＷａｌｌｎｅｒの米国特許第４，８７９，２２４号、Ｃｏｌ．６、８行目〜Ｃｏｌ．８、５９行目を参照。
【０２１３】
ベクターは複製可能なＤＮＡ構築物である。ベクターは、ＦＶＩＩＩタンパク質をコードする核酸を増幅するおよび／またはＦＶＩＩＩタンパク質をコードする核酸を発現するために本明細書で使用される。発現ベクターは、ＦＶＩＩＩタンパク質をコードするヌクレオチド配列が適切な制御配列に作動可能に連結している複製可能な核酸構築物である。制御配列は、該ヌクレオチド配列の発現をもたらして適切な宿主細胞でＦＶＩＩＩタンパク質を産生することができる。そのような制御配列の必要性は、選択される宿主細胞および選択される形質転換方法に応じて異なる。一般に、制御配列として、転写プロモーター、転写を制御する任意選択のオペレーター配列、適切なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、ならびに転写および翻訳の終結を制御する配列が挙げられる。
【０２１４】
ベクターは、プラスミド、ウイルス（例えば、ＡＡＶ、アデノウイルス、サイトメガロウイルス）、ファージ、および組み込み可能なＤＮＡフラグメント（すなわち、組換えにより宿主細胞ゲノムに組み込み可能なフラグメント）を含む。ベクターは、宿主細胞ゲノムとは独立に複製および機能することができ（例えば一過性発現により）、または宿主細胞ゲノム自体に組み込むことができる（例えば安定的組み込み）。発現ベクターは、発現される核酸分子に作動可能に連結し、宿主細胞および／または生物において作動可能なプロモーターおよびＲＮＡ結合部位を含有することができる。
【０２１５】
ＤＮＡ領域またはヌクレオチド配列は、これらが互いに機能的に関連している場合、作動可能に連結され、または作動可能に結合される。例えば、プロモーターは、これがコード配列の転写を制御するならば、コード配列に作動可能に連結しており、またはリボソーム結合部位は、これがコード配列の翻訳を可能にするように位置しているならば、コード配列に作動可能に連結している。
【０２１６】
適切な宿主細胞として、原核生物細胞、酵母細胞、または哺乳動物細胞および昆虫細胞等の高等真核細胞が挙げられる。多細胞生物に由来する細胞は、組換えＦＶＩＩＩタンパク質合成に特に適した宿主であり、哺乳動物細胞が特に好ましい。細胞培養におけるそのような細胞の増殖は常法になっている（Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、ＫｒｕｓｅおよびＰａｔｔｅｒｓｏｎ編（１９７３））。有用な宿主細胞株の例は、ＶＥＲＯおよびＨｅＬ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、ならびにＷＩ１３８、ＨＥＫ  ２９３、ＢＨＫ、ＣＯＳ−７、ＣＶおよびＭＤＣＫ細胞株である。そのような細胞に対する発現ベクターは、通常、（必要な場合には）複製起点、発現されるＦＶＩＩＩタンパク質をコードするヌクレオチド配列から上流に位置し、リボソーム結合部位と共に該配列と作動可能に結合されるプロモーター、ＲＮＡスプライス部位（イントロン含有ゲノムＤＮＡが使用される場合）、ポリアデニル化部位および転写終結配列を含む。一実施形態では、発現は、その全体が参照により本明細書に援用される米国特許第５，８８８，８０９号の発現系を使用して、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞で実行することができる。
【０２１７】
脊椎動物細胞の形質転換に使用される発現ベクターにおける転写および翻訳制御配列は、ウイルス供給源により提供されることが多い。非限定例として、ポリオーマ、アデノウイルス２およびサルウイルス４０（ＳＶ４０）に由来するプロモーターが挙げられる。例えば、米国特許第４，５９９，３０８号を参照。
【０２１８】
複製起点は、ＳＶ４０もしくはその他のウイルス（例えば、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶまたはＢＰＶ）供給源に由来し得るような外因性起点を含むベクターの構築によりもたらされ得、または宿主細胞染色体複製機構によりもたらされ得る。ベクターが宿主細胞染色体に組み込まれる場合、後者で十分であることが多い。
【０２１９】
ウイルス複製起点を含有するベクターを使用するよりむしろ、選択マーカーとＦＶＩＩＩタンパク質をコードする核酸分子で同時形質転換する方法により哺乳動物細胞を形質転換することができる。適切な選択マーカーの非限定例は、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）またはチミジンキナーゼである。この方法は、その全体が参照により本明細書に援用される米国特許第４，３９９，２１６号にさらに記載されている。
【０２２０】
組換え脊椎動物細胞培養におけるＦＶＩＩＩタンパク質の合成への適合に適したその他の方法として、Ｇｅｔｈｉｎｇ他、Ｎａｔｕｒｅ  ２９３：６２０（１９８１）；Ｍａｎｔｅｉ他、Ｎａｔｕｒｅ  ２８１：４０；ならびにＬｅｖｉｎｓｏｎ他、ＥＰＯ出願第１１７，０６０Ａ号およびＥＰＯ出願第１１７，０５８Ａ号に記載されているものが挙げられ、それらの各々の内容全体は参照により本明細書に援用される。
【０２２１】
昆虫細胞（例えば培養ヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄ）細胞）等の宿主細胞およびバキュロウイルス発現ベクター（例えば、オートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）ＭＮＰＶ、イラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ）ＭＮＰＶ、ラキプルシア・オウ（Ｒａｃｈｉｐｌｕｓｉａ  ｏｕ）ＭＮＰＶ、またはガレリア・オウ（Ｇａｌｌｅｒｉａ  ｏｕ）ＭＮＰＶ）に由来するベクター）等の発現ベクターが、Ｓｍｉｔｈ他の米国特許第４，７４５，０５１号および米国特許第４，８７９，２３６号に記載されているように、本発明を実行するのに用いられてもよい。一般に、バキュロウイルス発現ベクターは、ポリへドリン転写開始シグナルからＡＴＧ開始部位わたる位置で、およびバキュロウイルスポリへドリンプロモーターの転写制御下でポリへドリン遺伝子に挿入される、発現されるヌクレオチド配列を含有するバキュロウイルスゲノムを含む。
【０２２２】
原核生物宿主細胞として、グラム陰性またはグラム陽性生物、例えばそれぞれ、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）（Ｅ．ｃｏｌｉ）または桿菌が挙げられる。高等真核細胞として、本明細書に記載した哺乳動物起源の確立された細胞株が挙げられる。例示的な細菌宿主細胞は、大腸菌Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７，３２５）、大腸菌Ｂ、大腸菌Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ３１，５３７）および大腸菌２９４（ＡＴＣＣ３１，４４６）である。幅広い適切な原核生物および微生物ベクターが利用可能である。大腸菌は、典型的にはｐＢＲ３２２を使用して形質転換される。組換え微生物発現ベクターにおいて最も一般的に使用されるプロモーターとして、ベータラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）およびラクトースプロモーター系（Ｃｈａｎｇ他、Ｎａｔｕｒｅ  ２７５：６１５（１９７８）；およびＧｏｅｄｄｅｌ他、Ｎａｔｕｒｅ  ２８１：５４４（１９７９））、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（Ｇｏｅｄｄｅｌ他Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．８：４０５７（１９８０）およびＥＰＯ出願公開第３６，７７６号）ならびにｔａｃプロモーター（Ｄｅ  Ｂｏｅｒ他Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：２１（１９８３））が挙げられる。プロモーターおよびシャイン−ダルガノ配列（原核生物宿主発現のための）は、ＦＶＩＩＩタンパク質をコードする核酸に作動可能に連結される。すなわち、これらは、ＤＮＡからのＦＶＩＩＩメッセンジャーＲＮＡの転写を促進するように配置される。
【０２２３】
酵母培養物等の真核微生物も、タンパク質コードベクターで形質転換することができる（例えば米国特許第４，７４５，０５７号を参照）。出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）は、下等真核宿主微生物の中で最も一般的に使用されるが、多くのその他の株が一般的に利用可能である。酵母ベクターは、２ミクロン酵母プラスミド由来の複製起点または自己複製配列（ＡＲＳ）、プロモーター、ＦＶＩＩＩタンパク質をコードする核酸、ポリアデニル化および転写終結のための配列、ならびに選択遺伝子を含有し得る。例示的なプラスミドはＹＲｐ７である（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ他、Ｎａｔｕｒｅ  ２８２：３９（１９７９）；Ｋｉｎｇｓｍａｎ他、Ｇｅｎｅ  ７：１４１（１９７９）；Ｔｓｃｈｅｍｐｅｒ他、Ｇｅｎｅ  １０：１５７（１９８０））。酵母ベクターにおける適切なプロモーター配列（ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）として、メタロチオネイン、３−ホスホグリセレートキナーゼに対するプロモーターが挙げられる（Ｈｉｔｚｅｍａｎ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：２０７３（１９８０）またはその他の解糖酵素（Ｈｅｓｓ他、Ｊ．Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｇ．７：１４９（１９６８）；およびＨｏｌｌａｎｄ他、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １７：４９００（１９７８））。酵母発現での使用に適切なベクターおよびプロモーターは、Ｒ．  Ｈｉｔｚｅｍａｎ他、ＥＰＯ公開番号第７３，６５７号にさらに記載されている。
【０２２４】
本発明のクローン化コード配列は、マウス、ラット、イヌ、オポッサム、ウサギ、ネコ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ウシ、モルモット、オポッサム、カモノハシおよびヒトを含む任意の種の起源のＦＶＩＩＩをコードし得るが、好ましくはヒト起源のＦＶＩＩＩタンパク質をコードする。本明細書に開示したタンパク質をコードする核酸とハイブリダイズできるＦＶＩＩＩをコードする核酸も包含される。そのような配列のハイブリダイゼーションは、標準的なインサイチュハイブリダイゼーションアッセイにおいて、本明細書に開示したＦＶＩＩＩタンパク質をコードする核酸に対して、低下したストリンジェンシー条件またはストリンジェントな条件（例えば、０．３Ｍ  ＮａＣｌ、０．０３Ｍクエン酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ、６０℃または７０℃の洗浄ストリンジェンシーにより代表されるストリンジェントな条件）下で実行することができる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版、１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙを参照）。
【０２２５】
本発明に従って産生されたＦＶＩＩＩタンパク質は、既知の方法により遺伝子導入動物において発現することができる。例えば、その全体が参照により本明細書に援用される米国特許第６，３４４，５９６号を参照。手短かに言うと、遺伝子導入動物として、家畜（例えば、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ウサギ等）、齧歯類（マウス、ラットおよびモルモットなど）および飼育動物（例えばネコおよびイヌ）が挙げられ得るがこれらに限定されない。ブタ、ヒツジ、ヤギおよびウシ等の家畜動物が、いくつかの実施形態では特に好ましい。
【０２２６】
本発明の遺伝子導入動物は、ポリヌクレオチドが成熟動物の生殖系列細胞のＤＮＡに安定的に組み込まれ、通常のメンデルの様式で遺伝されるような方法で、本発明のヒトＦＶＩＩＩタンパク質をコードする適切なポリヌクレオチドを単一細胞胚に導入することにより産生される。本発明の遺伝子導入動物は、体液および／または組織でＦＶＩＩＩタンパク質を産生する表現型を有する。ＦＶＩＩＩタンパク質は、これらの体液および／または組織から取り除かれ、例えば治療用途のために処理される。（その内容全体が参照により本明細書に援用される、例えば、Ｃｌａｒｋ他、“Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉ-ｈｅｍｏｐｈｉｌｉｃ  ｆａｃｔｏｒ  ＩＸ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｉｌｋ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｓｈｅｅｐ”Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７：４８７-４９２（１９８９）；Ｖａｎ  Ｃｏｔｔ他、“Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉｃ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｌｉｖｅｓｔｏｃｋ：ａｂｕｎｄａｎｃｅ  ｃａｎ  ｅｎａｂｌｅ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｔｈｅｒａｐｉｅｓ  ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ”Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ  １０（４）：７０-７７（２００４）を参照）。
【０２２７】
ＤＮＡ分子は、マイクロインジェクション、リン酸カルシウム媒介沈殿、リポソーム融合、または全能性もしくは多能性幹細胞のレトロウイルス感染を含むがこれらに限定されない様々な手段により、胚に導入することができる。形質転換細胞は、次いで胚導入され、その中に組み込まれて遺伝子導入動物を形成することができる。遺伝子導入動物を作製する方法は、例えば、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ａｎｉｍａｌ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｂｙ  Ｌ．Ｍ．Ｈｏｕｄｅｂｉｎｅ，Ｈａｒｗｏｏｄ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９７に記載されている。遺伝子導入動物はまた、例えばＣａｍｐｂｅｌｌ他、Ｎａｔｕｒｅ  ３８０：６４−６６（１９９６）およびＷｉｌｍｕｔ他、Ｎａｔｕｒｅ  ３８５：８１０−８１３（１９９７）に記載されているように核移植または胚細胞株もしくは成体細胞株を使用するクローニングの方法を使用して生成することもできる。さらに、ＤＮＡの細胞質注射を利用する技法が米国特許第５，５２３，２２２号に記載されているように使用されてもよい。
【０２２８】
ＦＶＩＩＩ産生遺伝子導入動物は、ＦＶＩＩＩコード配列を含むキメラ構築物を導入することにより得ることができる。遺伝子導入動物を得るための方法は公知である。例えば、Ｈｏｇａｎ他、ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＮＧ  ＴＨＥ  ＭＯＵＳＥ  ＥＭＢＲＹＯ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ  １９８６）；Ｋｒｉｍｐｅｎｆｏｒｔ他、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：８８（１９９１）；Ｐａｌｍｉｔｅｒ他、Ｃｅｌｌ  ４１：３４３（１９８５）、Ｋｒａｅｍｅｒ他、ＧＥＮＥＴＩＣ  ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＴＨＥ  ＥＡＲＬＹ  ＭＡＭＭＡＬＩＡＮ  ＥＭＢＲＹＯ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９８５）；Ｈａｍｍｅｒ他、Ｎａｔｕｒｅ  ３１５：６８０（１９８５）；Ｗａｇｎｅｒ他、米国特許第５，１７５，３８５号；Ｋｒｉｍｐｅｎｆｏｒｔ他、米国特許第５，１７５，３８４号、Ｊａｎｎｅ他、Ａｎｎ．Ｍｅｄ．２４：２７３（１９９２）、Ｂｒｅｍ他、Ｃｈｉｍ．Ｏｇｇｉ．１１：２１（１９９３）、Ｃｌａｒｋ他、米国特許第５，４７６，９９５を参照。全てはその全体が参照により本明細書に援用される。
【０２２９】
いくつかの実施形態では、ｃｉｓ作用調節領域が使用され得る。ｃｉｓ作用調節領域は、乳汁が合成される生理学的条件下、プロモーターがその他の組織より乳腺組織で活性となる乳腺組織で「活性」となる。そのようなプロモーターとして、乳清酸性タンパク質（ＷＡＰ）、短いおよび長いα、βおよびκカゼイン、α−ラクトアルブミンおよびβ−ラクトグロブリン（「ＢＬＧ」）プロモーターが挙げられるがこれらに限定されない。発現されたタンパク質のその他の体液、特に血液および尿への分泌を指示するシグナル配列も、本発明に従って使用することができる。そのような配列の例として、ＦＶＩＩＩ、タンパク質Ｃおよび組織型プラスミノーゲン活性化因子のシグナルペプチドを含む、分泌凝固因子のシグナルペプチドが挙げられる。
【０２３０】
上で論じたプロモーターに加えて、転写を調節する有用な配列は、エンハンサー、スプライスシグナル、転写終結シグナル、ポリアデニル化部位、緩衝配列、ＲＮＡプロセシング配列および導入遺伝子発現を調節するその他の配列である。
【０２３１】
好ましくは、発現系または発現構築物は、所望の組換えタンパク質をコードするヌクレオチド配列の下流の３’非翻訳領域を含む。この領域は、導入遺伝子の発現を増加させることができる。この点で有用な３’非翻訳領域は、ポリＡシグナルをもたらす配列である。
【０２３２】
適切な異種３’非翻訳配列は、例えば、ＳＶ４０スモールＴ抗原、カゼイン３’非翻訳領域、または当分野で公知のその他の３’非翻訳配列に由来し得る。リボソーム結合部位もＦＶＩＩＩの発現の効率性を高めるのに重要である。同様に、ＦＶＩＩＩの翻訳後修飾を調節する配列は、本発明において有用である。
【０２３３】
本発明を説明してきたが、本発明を以下の実施例でより詳細に説明することができ、実施例は例示目的のみで本明細書に記載されており、本発明を限定すること意図するものではない。
【実施例】
【０２３４】
［実施例１］
肝臓特異的合成プロモーター
本発明者らは、保存された基本プロモーターエレメントおよび転写開始部位を含有するいくつかの人工プロモーターを設計し、完全合成した。基本プロモーターは、その５’末端で肝臓特異的発現のためのいくつかの肝臓特異的転写因子結合部位と連結される。ＬＸＰ３．３と名付けたプロモーター（図１）（配列番号１）を、ヒト肝臓癌細胞株Ｈｕｈ７においてルシフェラーゼレポーター遺伝子およびトランスフェクション実験を用いてインビトロで最初にスクリーニングされたその小さいサイズ（２００ｂｐ）および高い活性により選択する。
【０２３５】
ＬＸＰ３．３プロモーターを、次いで、肝臓、心臓および筋肉等に広い組織向性を有するＡＡＶ９ベクターにパッケージングされたＬａｃＺレポーター遺伝子を用いてさらに試験した。並行して、インビボ実験を行ってプロモーター活性および肝臓特異性を、小型および大型動物モデルにおいて最も強力な肝臓特異的プロモーターのうちの１つとして以前に報告された強力な肝臓特異的プロモーターチロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）と比較した。ＬＸＰ３．３−ＬａｃＺまたはＴＢＧ−ＬａｃＺ発現カセットを含有するＡＡＶ９ベクターを、２種類の異なる用量でＣ５６／Ｂ６マウスに尾静脈を介して注射した。図２Ａに示すように、肝臓および心臓のＸ−ｇａｌ染色は、両方のプロモーターについて強い肝臓発現、および心臓発現の欠如を示した。組織ホモジネートの定量分析は、これらの２種類のプロモーターが、肝臓（図２Ｂ）に対してほとんど同一のＬａｃＺ発現レベルおよび組織特異性を達成したが、ＬＸＰ３．３プロモーターはサイズがわずか２００ｂｐであり、一方ＴＢＧは６８１ｂｐであったことを示した。具体的には、定量的ＬａｃＺ酵素活性分析は、肝臓における遺伝子発現が、ＬＸＰ３．３およびＴＢＧプロモーターに関して心臓より３００倍超高いことを示した。さらに、肝臓特異的プロモーターにより得られるＬａｃＺ酵素活性は、ユビキタスＣＭＶプロモーターにより得られる活性より肝臓で５００倍高かった（図２Ｃ）。一方、ＣＭＶプロモーターは、肝臓特異的プロモーターのほぼ１３倍高いＬａｃＺ発現を心臓で達成した（図２Ｂ）。結果は、合成プロモーターＬＸＰ３．３が肝臓において高度に活性であり、特異的であることを示した。
【０２３６】
［実施例２］
合成プロモーターイントロンカセット
完全合成プロモーターＬＸＰ３．３をその３’末端で、短い非天然エクソンジャンクション配列を有するＶＨ４の小さいイントロンに連結させた。このイントロンは、ＢＤＤヒトＦＶＩＩＩ遺伝子を駆動する弱いプロモーターを使用したインビトロでのトランスフェクション実験により、最初に試験した。ＶＨ４イントロンの追加は、イントロンのないプロモーターよりはるかに高い遺伝子発現を生じさせ、また、一般的に使用されるキメライントロンＣＩＮ（Ｐｒｏｍｅｇａ）より高い発現も生じさせた（図３）。結果的に、本発明者らは、ＬＸＰ３．３プロモーターおよびＶＨ４イントロンを人工エクソンジャンクション配列と組み合わせ、これをＬＸＰ３．３Ｉと名付けた（配列番号２）。ＦＶＩＩＩ発現の駆動におけるその活性を試験するために、本発明者らはプロモーターＬＸＰ３．３Ｉを、完全合成ヒトＢＤＤ欠失ＦＶＩＩＩ遺伝子（配列番号３）とこれに続く小さいポリアデニル化部位の上流に挿入した。遺伝子発現カセット（配列番号４）全体を、その後、ベクターＤＮＡ複製およびベクターゲノムパッケージングのために、２つのＡＡＶ逆方向末端反復配列を有するＡＡＶベクタープラスミド骨格にクローニングした（図４）。
【０２３７】
インビトロでのプロモーター活性を比較するために、一般的に使用される強力な組み合わせであるＳＶ４０イントロンに連結したユビキタスＣＭＶプロモーターを使用して、ＦＶＩＩＩ発現カセット中のＬＸＰ３．３Ｉを置換した。プラスミドをヒト肝臓癌細胞株Ｈｕｈ７にトランスフェクション後、ＦＶＩＩＩ活性を発色キットを用いて測定した。図５のトランスフェクション実験に示すように、ＬＸＰ３．３ＩはＣＭＶプロモーターより高いＦＶＩＩＩ活性を細胞培養培地で生じさせた。さらに、本発明者らはまた、トランスフェクション実験において完全合成ヒトＢＤＤ欠失ＦＶＩＩＩ遺伝子を天然ヒトＤＮＡ配列のＢＤＤ  ＦＶＩＩＩ遺伝子と比較した。同じＬＸＰ３．３Ｉにより駆動される場合、同じＦＶＩＩＩアミノ酸配列をコードするが異なる選択のコドンを使用した２つの遺伝子は、ヒト細胞においてＦＶＩＩＩ活性の有意な差を示さなかった（図６）。しかしながら、異なる肝臓特異的プロモーターを使用した場合、天然コドンを有するＢＤＤＦＶＩＩＩ遺伝子は、ＬＸＰ３．３Ｉにより駆動される同じ遺伝子と比較するとより低い発現を示し、これは主に、より高い遺伝子発現をもたらすＬＸＰ３．３Ｉプロモーターによるものであることを示唆した。
【０２３８】
本発明者らは次に、一般的に使用されるＦＶＩＩＩ遺伝子ノックアウト血友病Ａマウスモデルにおいてインビボでの遺伝子発現活性を試験した。ＬＸＰ３．３Ｉ−ｈＦ８遺伝子発現カセットをＡＡＶ９カプシドにパッケージングし、ＦＶＩＩＩ  ＫＯマウスの尾静脈に注射した。２種類の異なる用量のベクターを使用して（マウス１匹当たり２×１０１１および４×１０１０ベクターゲノム）インビボでの発現を調べた。図７Ａに示すように、高レベルおよび長期の遺伝子発現は、ベクター投与後、これらの２種類の用量で１年を超えて達成された。ＦＶＩＩＩ活性に関する発色アッセイに加えて、ＥＬＩＳＡアッセイも使用して血漿に分泌されるＦＶＩＩＩタンパク質の量を調べた（図７Ｂ）。結果は、完全長野生型ヒトＦＶＩＩＩタンパク質の参照標準と比べて、ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩタンパク質濃度は、同じ完全長ヒトＦＶＩＩＩに対するＦＶＩＩＩ活性の発色アッセイにより得られた読み取りデータより約５０％低いことを示した。ＦＶＩＩＩ活性読み取りデータより低いＥＬＩＳＡ読み取りデータというこの食い違いは、野生型ＦＶＩＩＩのほぼ半分の長さを含む、ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩにおける長いＢドメインの欠如による可能性が高い。ＥＬＩＳＡキットは、Ｂドメインを含む野生型完全長ＦＶＩＩＩに対してポリクローナル抗体を使用したため、Ｂドメインを欠くＢＤＤ  ＦＶＩＩＩは抗体結合部位がより少なく、したがってＥＬＩＳＡ読み取りデータがより低かったことが予想される。これらの結果は、発色アッセイおよびＥＬＩＳＡアッセイは両方とも、血友病ＡマウスにおけるＦＶＩＩＩ発現の一致した測定値を生成したことを示した。部分トロンボプラスチン時間（ＰＴＴ）アッセイも数時点で行った。結果は、他の２つのアッセイの結果と概ね一致した。
【０２３９】
［実施例３］
第ＶＩＩＩ因子重鎖変異
以前の文献は、ＦＶＩＩＩの重鎖が限定因子であることを示した。重鎖は、軽鎖よりプロセシングの有効性がはるかに低くおよび／またははるかに不安定であり、その正確な機構ははっきりしないままである。例えば、重鎖および軽鎖遺伝子を２つの別個のベクターから別々に発現させた場合、凝固活性のために同様のタンパク質濃度を得るには、軽鎖遺伝子より重鎖遺伝子のはるかに高いコピー数を必要とした。結果的に、本発明者らは、Ｃ末端領域に変異を導入することにより、具体的には新たな糖鎖付加部位を導入することにより、ＦＶＩＩＩ重鎖翻訳後プロセシング効率性を高めることにした。その理由は、糖鎖付加は、翻訳後プロセシングにおける役割および細胞膜結合および分泌タンパク質の安定性が公知であるためである。本発明者らは、糖鎖付加を重鎖のＣ末端に導入することを選択した。その論理的根拠は、この末端領域が、ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩタンパク質のＸ線結晶構造分析により示されたように不定形であることから、したがって明確な構造がない柔軟な領域であることであった。そのため、その領域の変異はＦＶＩＩＩタンパク質の機能構造を妨げない可能性が高い。その論理的根拠により、本発明者らは７３４位および７３５位の２個の天然アスパラギンを利用し、隣接するアミノ酸７３６および７３７をトレオニンに変異させた（ＮＮＡＩからＮＮＴＴ）。変異はアミノ酸配列の変化を最小化し、糖鎖付加の程度を最大化し、Ｘ０と名付けた変異体ＦＶＩＩＩに２つの新規の糖鎖付加部位（ＮＮＴおよびＮＴＴ）をもたらした（図８）。
【０２４０】
変異体Ｘ０の２つの新たな糖鎖付加部位に加えて、本発明者らは、重鎖のＮ末端のアミノ酸７３８〜７４２のペプチド（ＥＰＲＳＦ）を、アミノ酸２３７から２４２から単離した天然糖鎖付加配列（ＹＶＮＲＳＬ）により置換することによって、ＮＮＴＴ部位のすぐ隣りに別の糖鎖付加部位を追加した。この天然糖鎖付加部位（ＮＲＳ）は、重鎖において最も効果的に糖鎖付加される部位のうちの１つであることから選択され（Ｍｅｄｚｉｈｒａｄｓｚｋｙ他、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６９：３９８６（１９９７））、Ｘ１と名付けた変異体ＦＶＩＩＩが生成された（図８）。
【０２４１】
また、本発明者らは、７３８〜７４０位のアミノ酸ＥＰＲを変異体Ｘ０のＮＮＴと置換し、変異体Ｘ２において２つ多い糖鎖付加部位をもたらした（図８）。
【０２４２】
［実施例４］
第ＶＩＩＩ因子重鎖のＣ末端の変異はインビトロでのＦＶＩＩＩ活性を高めた
本発明者らは次に、変異体構築物のＦＶＩＩＩ活性をその野生型ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩ対応物と対照比較した。プラスミドのトランスフェクションは、内因性ＦＶＩＩＩ発現はないが肝臓特異的プロモーター対照遺伝子発現に適したヒト肝臓癌細胞株Ｈｕｈ７で実行した。図９Ａに示すように、変異Ｘ１およびＸ２は、その親遺伝子と比べてインビトロでのＦＶＩＩＩ活性を２倍超にした。
【０２４３】
［実施例５］
血友病Ａマウスモデルにおけるインビボでの変異体ＦＶＩＩＩの長期および高レベルの遺伝子発現
ＦＶＩＩＩ変異体Ｘ１およびＸ２が、インビトロでのトランスフェクション実験で有意に高いＦＶＩＩＩ活性を示したことから、本発明者らは次に、ＦＶＩＩＩ  ＫＯマウスにおいてインビボでの遺伝子発現およびＦＶＩＩＩ活性を調べた。Ｘ１およびＸ２遺伝子は、同じＬＸＰ３．３Ｉプロモーターの転写制御下にあり、ＡＡＶ８ベクター粒子にパッケージングされた。初期の実験に基づき、５×１０１０ｖ．ｇ．／マウスの標準的なベクター用量を選択し、２から３カ月齢の血友病Ａマウスの尾静脈を介して静脈内に注射した。血漿試料を、一般的に使用される方法である後眼窩出血法により採取した。図９Ｂに示すように、変異体Ｘ１およびＸ２は両方とも、それらの野生型親ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩ遺伝子より高い発現を達成した（図７Ａ、低用量と比べて）。長期の遺伝子発現をモニターするために、本発明者らは、Ｘ１またはＸ２変異体のいずれかで処置した血友病Ａマウスを観察用に２４週間維持した。親ｗｔ  ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩベクターで処置した血友病Ａマウス（図７Ａ）と同様に、変異体ＦＶＩＩＩベクターで処置したマウスも、血漿中のヒトＦＶＩＩＩ活性を著しく低下させることなく長期のおよび安定した遺伝子発現を示した。様々な時点でのインヒビター試験は、インヒビター形成がないことを明らかにした。
【０２４４】
本発明の趣旨から逸脱することなく、多くのおよび様々な改変を行うことができることを当業者は理解する。したがって、本発明の形態は例示のみであり、本発明の範囲を限定することを意図するものではないことが明確に理解すべきである
【０２４５】
本明細書で引用する全ての刊行物、特許出願、特許、特許公報、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）データベース受託番号により同定された配列およびその他の参照は、参照が提示された文および／または段落に関する教示のために、その全体が参照により援用される。
【０２４６】
前述は、本発明の例示であり、本発明を限定すると解釈してはならない。本発明は、本明細書に含まれる特許請求の範囲の同等物と共に、以下の特許請求の範囲により規定される。
【０２４７】
配列：
配列番号１  ＬＸＰ３．３プロモーター−２００ｂｐ
配列番号２  （ＬＸＰ３．３プロモーターおよびＶＨ４イントロンを含有するＬＸＰ３．３Ｉ−２８８ｂｐ
配列番号３  合成ヒトＢドメイン欠失第ＦＶＩＩＩ因子コード配列−４３７４ｂｐ
配列番号４  ＡＡＶベクター中のヒト第ＦＶＩＩＩ因子遺伝子発現カセット、左逆方向反復から右逆方向末端反復−５０４５ｂｐ
配列番号５  シグナルペプチドがないヒト第ＦＶＩＩＩ因子野生型タンパク質配列−２３３３ａａ
出願時の特許請求の範囲は以下の通りである。
［請求項１］
肝臓特異的合成プロモーターを含むポリヌクレオチドであって、前記プロモーターが、配列番号１のヌクレオチド配列またはこれと少なくとも９０％同一の配列を含む、ポリヌクレオチド。
［請求項２］
前記プロモーターがイントロンに作動可能に連結している、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
［請求項３］
前記イントロンがＶＨ４由来である、請求項２に記載のポリヌクレオチド。
［請求項４］
前記プロモーターおよび前記イントロンが一緒に、配列番号２のヌクレオチド配列またはこれと少なくとも９０％同一の配列を構成する、請求項３に記載のポリヌクレオチド。
［請求項５］
前記プロモーターが目的のポリヌクレオチドに作動可能に連結している、請求項１から４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
［請求項６］
前記目的のポリヌクレオチドがポリペプチドまたは機能性核酸をコードする、請求項５に記載のポリヌクレオチド。
［請求項７］
前記目的のポリヌクレオチドが凝固因子をコードする、請求項６に記載のポリヌクレオチド。
［請求項８］
前記目的のポリヌクレオチドが第ＶＩＩＩ因子をコードする、請求項７に記載のポリヌクレオチド。
［請求項９］
前記目的のポリヌクレオチドがＢドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子をコードする、請求項８に記載のポリヌクレオチド。
［請求項１０］
前記目的のポリヌクレオチドが、配列番号３のヌクレオチド配列またはこれと少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項９に記載のポリヌクレオチド。
［請求項１１］
配列番号４のヌクレオチド配列またはこれと少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項９に記載のポリヌクレオチド。
［請求項１２］
前記目的のポリヌクレオチドの下流にポリアデニル化部位をさらに含む、請求項１から１１のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
［請求項１３］
請求項１から１２のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
［請求項１４］
前記ベクターがウイルスベクターである、請求項１３に記載のベクター。
［請求項１５］
前記ベクターがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項１４に記載のベクター。
［請求項１６］
前記ＡＡＶベクターがＡＡＶ８またはＡＡＶ９ベクターである、請求項１５に記載のベクター。
［請求項１７］
請求項１から１２のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドおよび／または請求項１３から１６のいずれか１項に記載のベクターを含む形質転換細胞。
［請求項１８］
請求項１から１２のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項１３から１６のいずれか１項に記載のベクターおよび／または請求項１７の形質転換細胞を含む遺伝子導入動物。
［請求項１９］
対象の肝臓で前記ポリペプチドまたは機能性核酸を産生する方法であって、請求項６から１２のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項１３から１６のいずれか１項に記載のベクター、および／または請求項１７の形質転換細胞を前記対象に送達し、これにより前記対象の肝臓でポリペプチドまたは機能性核酸を産生することを含む方法。
［請求項２０］
対象における血友病Ａまたは後天性第ＶＩＩＩ因子欠乏症を処置する方法であって、治療有効量の、請求項８から１２のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項１３から１６のいずれか１項に記載のベクター、および／または請求項１７の形質転換細胞を前記対象に送達し、これにより前記対象における血友病Ａを処置することを含む方法。
［請求項２１］
対象における前記第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドのバイオアベイラビリティを増加させる方法であって、有効量の、請求項８から１２のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項１３から１６のいずれか１項に記載のベクター、および／または請求項１７の形質転換細胞を前記対象に送達し、これにより前記対象における第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドのバイオアベイラビリティを増加させることを含む方法。
［請求項２２］
重鎖のアミノ酸残基が１つまたは複数の糖鎖付加部位を作製するために改変された、改変哺乳動物第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド。
［請求項２３］
前記１つまたは複数の糖鎖付加部位が重鎖のＣ末端にある、請求項２２に記載の改変第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド。
［請求項２４］
ヒト第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドである、請求項２２または２３に記載の改変第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド。
［請求項２５］
野生型ヒト配列（配列番号５）のアミノ酸残基７３６および７３７がアミノ酸残基ＸＸ（ＸはＳまたはＴである）により置換されている、請求項２４に記載の改変第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド。
［請求項２６］
野生型ヒト配列（配列番号５）のアミノ酸残７３６から７４２が、アミノ酸残基ＸＸＹＶＮＲＸＬ（ＸはＳまたはＴである）により置換されている、請求項２４に記載の改変第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド。
［請求項２７］
野生型ヒト配列（配列番号５）のアミノ酸残基７３６から７４０が、アミノ酸残基ＸＸＮＮＸ（ＸはＳまたはＴである）により置換されている、請求項２４に記載の改変第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド。
［請求項２８］
Ｂドメイン欠失をさらに含む、請求項２２から２７のいずれか１項に記載の改変第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド。
［請求項２９］
請求項２２から２８のいずれか１項に記載の改変第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
［請求項３０］
プロモーターに作動可能に連結している、請求項２９に記載のポリヌクレオチド。
［請求項３１］
前記プロモーターが請求項１から４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含む、請求項３０に記載のポリヌクレオチド。
［請求項３２］
請求項２９から３１のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
［請求項３３］
前記ベクターがウイルスベクターである、請求項３２に記載のベクター。
［請求項３４］
前記ベクターがＡＡＶベクターである、請求項３３に記載のベクター。
［請求項３５］
前記ＡＡＶベクターがＡＡＶ８またはＡＡＶ９ベクターである、請求項３４に記載のベクター。
［請求項３６］
請求項２９から３１のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドおよび／または請求項３２から３５のいずれか１項に記載のベクターを含む形質転換細胞。
［請求項３７］
請求項２９から３１のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項３２から３５のいずれか１項に記載のベクター、および／または請求項３６に記載の形質転換細胞を含む遺伝子導入動物。
［請求項３８］
対象の肝臓で第ＶＩＩＩ因子を産生する方法であって、請求項２９から３１のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項３２から３５のいずれか１項に記載のベクター、および／または請求項３６に記載の形質転換細胞を前記対象に送達し、これにより前記対象の肝臓で第ＶＩＩＩ因子を産生することを含む方法。
［請求項３９］
対象における血友病Ａまたは後天性第ＶＩＩＩ因子欠乏症を処置する方法であって、治療有効量の、請求項２２から２８のいずれか１項に記載の改変ヒト第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド、請求項２９から３１のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項３２から３５のいずれか１項に記載のベクター、および／または請求項３６に記載の形質転換細胞を前記対象に送達し、これにより前記対象における血友病Ａを処置することを含む方法。
［請求項４０］
対象における前記第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドのバイオアベイラビリティを増加させる方法であって、有効量の、請求項２９から３１のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項３２から３５のいずれか１項に記載のベクターおよび／または請求項３６に記載の形質転換細胞を前記対象に送達し、これにより前記対象における第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドのバイオアベイラビリティを増加させることを含む方法。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【配列表】
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