(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液又は血液生成物（多血小板血漿（PRP）、血小板欠乏血漿（PPP）、多血小板フィブリン（PRF）、自己馴化血漿、血小板懸濁液、血小板溶解物およびそれらの組合せからなる群から選択されるもの）中で組織再形成される凍結乾燥ポリマー組成物であって、該凍結乾燥ポリマー組成物が、約20kDaから108kDaの数平均分子量で脱アセチル化が約80％から約85％のものであるキトサンおよび少なくとも１つの凍結乾燥保護剤であり量が約０．１％〜６％未満となる凍結乾燥保護剤を含み、かつグリセロールリン酸を含まず、注射可能な溶液を形成するものであり、以下の少なくとも１つの特性およびそれらの組合せを示すもの：
ｉ）in situ凝固が達成され、抑制されない；
ｉｉ）移植後の機械的負荷に耐えることができる；
ｉｉｉ）組織欠陥を充填するに際し、血小板媒介クロット退縮が抑制される；
ｉｖ）ポリマーと血液又は血液生成物（多血小板血漿（PRP）、血小板欠乏血漿（PPP）、多血小板フィブリン（PRF）、自己馴化血漿、血小板懸濁液、血小板溶解物およびそれらの組合せからなる群から選択されるもの）との相分離を生じさせることなく良好な混合が得られる；
ｖ）組織修復のための粘性でペースト状の製剤となる；
ｖｉ）in vivoでの適用において生理学的性質に近いものとなる；そして、注射において、
Ｉ）組織への注射時に固化し組織修復のためのインプラントを形成するか、あるいは
ＩＩ）関節への注射時に関節内液と混合する；
ものであることを特徴とする凍結乾燥ポリマー組成物。
【請求項２】
前記の少なくとも１つの凍結乾燥保護剤が、モノサッカリド、ポリオール、ジサッカリド、トリサッカリド、オリゴサッカリド/ポリサッカリド、高分子量賦形剤、アミノ酸、たんぱく質、およびこれらの組合せからなる群から選択されるものである請求項１に記載の凍結乾燥ポリマー組成物。
【請求項３】
前記キトサンが約0.25％w/vから約10％w/vの範囲で存在する請求項１に記載の凍結乾燥ポリマー組成物。
【請求項４】
前記組成物が、クロット活性化剤を更に含有してなる請求項１に記載の凍結乾燥ポリマー組成物。
【請求項５】
前記クロット活性化剤が、塩化カルシウム、グルコン酸カルシウム、酢酸カルシウム、炭酸カルシウム、カルシウムグルビオナート、カルシウムグルセプト、乳酸カルシウム、ラクトビオン酸カルシウム、リン酸カルシウムおよびこれらの組み合わせからなる群から選択されるものである請求項４に記載の凍結乾燥ポリマー組成物。
【請求項６】
凍結乾燥ポリマー組成物の製造を含む注射可能な溶液の製造方法であって、
ａ）キトサンを水と接触させ水性混合物を形成する工程と、
ｂ）該水性混合物を少なくとも１つの凍結乾燥保護剤と接触させる工程と、
ｃ）該水性混合物を少なくとも１つのクロット活性化剤と必要に応じて接触させる工程と、
ｄ）前記のキトサン/水からなる水性混合物に対し、前記の少なくとも１つの凍結乾燥保護剤および前記の適宜の少なくとも１つのクロット活性化剤を、混合させる前又は添加させた後、前記キトサン、前記の少なくとも１つの凍結乾燥保護剤および前記の選択的な少なくとも１つのクロット活性化剤を個々に滅菌する工程と、
ｅ）前記水性混合物を凍結乾燥させる工程と、
ｆ）前記水性混合物を血液又は血液生成物（多血小板血漿（PRP）、血小板欠乏血漿（PPP）、多血小板フィブリン（PRF）、自己馴化血漿、血小板懸濁液、血小板溶解物およびそれらの組合せからなる群から選択されるもの）中で組織再形成させ、注射可能な溶液を形成する工程と、
を具備してなることを特徴とする注射可能な溶液の製造方法。
【請求項７】
前記キトサンが約20kDaから約250kDaの数平均分子量を有する請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記キトサンが約0.25％w/vから約10％w/vの範囲で存在する請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記の少なくとも１つの凍結乾燥保護剤が、モノサッカリド、ポリオール、ジサッカリド、トリサッカリド、オリゴサッカリド/ポリサッカリド、高分子量賦形剤、アミノ酸、たんぱく質、およびこれらの組合せからなる群から選択されるものである請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記の少なくとも１つの凍結乾燥保護剤が約0.1％w/vから約30％w/vの範囲で存在する請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
組織再形成された請求項１−５のいずれか１項に記載の凍結乾燥ポリマー組成物の使用であって、組織修復のためのインプラントの製造における使用。
【請求項１２】
組織再形成された請求項１−５のいずれか１項に記載の凍結乾燥ポリマー組成物の使用であって、関節内注射の製造における使用。
【請求項１３】
前記組織修復が、半月板修復、軟骨修復、回旋腱板修復、骨修復、靭帯/腱修復、上顆炎修復、急性損傷修復、腱障害修復、涙液修復、筋肉修復、口腔/顎顔面外科手術、皮膚修復、創傷管理および潰瘍治療からなる群から選択される請求項１１に記載の凍結乾燥ポリマー組成物の使用。
【請求項１４】
注射可能な溶液であって、約Mn28kDaから約56kDaの範囲の数平均分子量を有するキトサンを1％（w/v）以下の濃度で含むと共に、4％（w/v）以下の濃度の少なくとも１つの凍結乾燥保護剤を含み、かつグリセロールリン酸を含まず、血液又は血液生成物（多血小板血漿（PRP）、血小板欠乏血漿（PPP）、多血小板フィブリン（PRF）、自己馴化血漿、血小板懸濁液、血小板溶解物およびそれらの組合せからなる群から選択されるもの）中で組織再形成されることを特徴とする注射可能な溶液。
【請求項１５】
注射可能な溶液であって、約Mn89kDaから約108kDaの範囲の数平均分子量を有するキトサンを0.56％（w/v）以下の濃度で含むと共に、4％（w/v）以下の濃度の少なくとも１つの凍結乾燥保護剤を含み、かつグリセロールリン酸を含まず、血液又は血液生成物（多血小板血漿（PRP）、血小板欠乏血漿（PPP）、多血小板フィブリン（PRF）、自己馴化血漿、血小板懸濁液、血小板溶解物およびそれらの組合せからなる群から選択されるもの）中で組織再形成されることを特徴とする注射可能な溶液。
【請求項１６】
注射可能な溶液であって、約Mn4kDaから約211kDaの範囲の数平均分子量を有するキトサンを約0.42％（w/v）から約2％（w/v）の濃度で含むと共に、約1％から約10％（w/v）の濃度の少なくとも１つの凍結乾燥保護剤と、塩又は緩衝剤を含み、かつグリセロールリン酸を含まず、血液又は血液生成物（多血小板血漿（PRP）、血小板欠乏血漿（PPP）、多血小板フィブリン（PRF）、自己馴化血漿、血小板懸濁液、血小板溶解物およびそれらの組合せからなる群から選択されるもの）中で組織再形成されることを特徴とする注射可能な溶液。
【請求項１７】
凍結乾燥ポリマー組成物の使用であって、該組成物がキトサンおよび少なくとも１つの凍結乾燥保護剤を含み、ここで、該組成物が多血小板血漿（PRP）、血液生成物およびそれらの組合せの中で組織再形成され、注射可能な溶液を形成することを特徴とする凍結乾燥ポリマー組成物の使用。
【請求項１８】
血液又は血液生成物（多血小板血漿（PRP）、血小板欠乏血漿（PPP）、多血小板フィブリン（PRF）、自己馴化血漿、血小板懸濁液、血小板溶解物およびそれらの組合せからなる群から選択されるもの）中で組織再形成されることを特徴とする凍結乾燥ポリマー組成物であって、該凍結乾燥ポリマー組成物が、約20kDaから108kDaの数平均分子量で脱アセチル化が約80％から約85％のものであるキトサンおよび少なくとも１つの凍結乾燥保護剤であり量が約０．１％〜６％未満となる凍結乾燥保護剤を含み、かつグリセロールリン酸を含まず、注射可能な溶液を形成するものであり、以下の少なくとも１つの特性およびそれらの組合せを示すもの：
ｉ）in situ凝固が達成され、抑制されない；
ｉｉ）移植後の機械的負荷に耐えることができる；
ｉｉｉ）組織欠陥を充填するに際し、血小板媒介クロット退縮が抑制される；
ｉｖ）ポリマーと血液又は血液生成物（多血小板血漿（PRP）、血小板欠乏血漿（PPP）、多血小板フィブリン（PRF）、自己馴化血漿、血小板懸濁液、血小板溶解物およびそれらの組合せからなる群から選択されるもの）との相分離を生じさせることなく良好な混合が得られる；
ｖ）組織修復のための粘性でペースト状の製剤となる；
ｖｉ）in vivoでの適用において生理学的性質に近いものとなる。
【請求項１９】
数平均分子量が約20kDaから108kDaで脱アセチル化が約80％から約85％のキトサンと、少なくとも１つの凍結乾燥保護剤であり量が約０．１％〜６％未満となる凍結乾燥保護剤とを含む凍結乾燥ポリマー組成物であって、該組成物が血液又は血液生成物（多血小板血漿（PRP）、血小板欠乏血漿（PPP）、多血小板フィブリン（PRF）、自己馴化血漿、血小板懸濁液、血小板溶解物およびそれらの組合せからなる群から選択されるもの）中で組織再形成されて注射可能な組成物を形成し、注射において、
Ｉ）組織への注射時に固化し組織修復のためのインプラントを形成するか、あるいは
ＩＩ）関節への注射時に関節内液と混合する；
ものであることを特徴とする凍結乾燥ポリマー組成物。
【請求項２０】
前記の少なくとも１つの凍結乾燥保護剤が、モノサッカリド、ポリオール、ジサッカリド、トリサッカリド、オリゴサッカリド/ポリサッカリド、高分子量賦形剤、アミノ酸、たんぱく質、およびこれらの組合せからなる群から選択されるものである請求項１９に記載の凍結乾燥ポリマー組成物。
【請求項２１】
前記キトサンが約0.25％w/vから約10％w/vの範囲で存在する請求項１９に記載の凍結乾燥ポリマー組成物。
【請求項２２】
前記組成物が、クロット活性化剤を更に含有してなる請求項１９に記載の凍結乾燥ポリマー組成物。
【請求項２３】
前記クロット活性化剤が、塩化カルシウム、グルコン酸カルシウム、酢酸カルシウム、炭酸カルシウム、カルシウムグルビオナート、カルシウムグルセプテート、乳酸カルシウム、ラクトビオン酸カルシウム、リン酸カルシウムおよびこれらの組み合わせからなる群から選択されるものである請求項２２に記載の凍結乾燥ポリマー組成物。
【請求項２４】
前記キトサンが、数平均分子量が約4kDaから約250kDaで脱アセチル化が約80％から約85％のものである請求項１７に記載の凍結乾燥ポリマー組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示はＰＲＰ（ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｒｉｃｈ  ｐｌａｓｍａ（多血小板血漿））又は血液と混合し、組織修復のためのインプラントを形成するための凍結乾燥ポリマー組成物及び／又は治療用関節内注射のための組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
キトサン（CS）は、硬および軟組織を構築するための骨格（スカホールド（ｓｃａｆｆｏｌｄ））として使用されてきた[非特許文献１]。凍結乾燥骨格は純粋なキトサン[非特許文献２]、架橋キトサン（ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｄ  ｃｈｉｔｏｓａｎ）[非特許文献３]、修正されたキトサン[非特許文献４]から、並びにグリコサミノグリカン[非特許文献５]、ポリサッカリド[非特許文献６]、ポリペプチド[非特許文献７]又は合成ポリマー[非特許文献８]とブレンドさせたキトサンから作られてきた。キトサンと、生体活性セラミックス（ｂｉｏａｃｔｉｖｅ  ｃｅｒａｍｉｃｓ）、生体活性ガラス又は生体活性ガラス-セラミックスとを組合せてなる幾つかの凍結乾燥骨格も開発されてきた[非特許文献９]。異なる分子量、脱アセチル化度（ＤＤＡ）および高又は低カルシウム含量のキトサンからなる凍結乾燥骨格が、軟骨修復のためラビットの軟骨大腿骨顆部欠損（ｏｓｔｅｏｃｈｏｎｄｒａｌ  ｆｅｍｏｒａｌ  ｃｏｎｄｙｌａｒ  ｄｅｆｅｃｔｓ）に対しインプラントすることが先に行われてきた[非特許文献１０]。
【０００３】
キトサンは、異なる適用のため、凍結乾燥保護剤（ｌｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔｓ）の存在下で凍結乾燥されてきた。キトサンフィルムの付着させたキトサンスポンジの2層構造を、塩化ナトリウム、グルコース又はスクロースの存在下で凍結乾燥させ、ヒト新生児皮膚線維芽細胞を培養させている[非特許文献１１]。キトサン/ポリ（エチレングリコール）-β-ジカルシウムピロホスフェート骨格をスクロース、グルコース又はフラクトースの存在下で凍結乾燥することもおこなわれてきた[非特許文献１２]。スクロース、マルトース又はトレハロースを含有する凍結乾燥キトサンミクロスフェア（ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ）は鼻内薬物送達のために作られてきた[非特許文献１３]。凍結乾燥キトサンウェハおよびチオール化キトサンベースのキセロゲルは、口腔送達システムとしてグリセロールおよびマンニトールの存在下で凍結乾燥されている[非特許文献１４]。マンニトールは凍結乾燥キトサン/アルギン酸膣挿入のための増量剤として使用されている[特許文献１５]。
【０００４】
凍結乾燥キトサンアセテートを含有する創傷被覆材（ｗｏｕｎｄ  ｄｒｅｓｓｉｎｇｓ）（U.S. Patent No. 7371403, U.S. Patent No. 7482503, U.S. Patent No. 7897832）は戦闘部隊に対し定期的に分配されている。これらの創傷被覆材は前臨床動物モデルにおいて広くテストされてきた[非特許文献１６―２４]。しかし、臨床データはあまり広範のものではない[非特許文献２５―２８]。ブレンドされ、抗菌処理された（ａｎｔｉ−ｍｉｃｒｏｂｉａｌ−ｌｏａｄｅｄ）キトサン凍結乾燥被覆材についても記述されている[非特許文献２９−３１]。
【０００５】
上述の文献の全てにおいて、その骨格/被覆材は、使用/移植（implantation）の時点において固体のままに留まっている。本来は（ｉｎ  ｓｉｔｕ）異なるゲル化アプローチが、異なるゲル化剤（1,2-プロパンジオール、グリセロール、トレハロース又はマンニトール）を含有するキトサン熱硬化性（ｔｈｅｒｍｏｓｅｔｔｉｎｇ）ヒドロゲル調剤について用いられている（U.S Patent Application Publication No. 2009004230）[非特許文献３２−３３]。この場合、凍結乾燥キトサンケーキが、4℃、磁気攪拌のもとで、冷水を添加することにより再形成され、可溶化されている。キトサン（59％DDA-410kDa又は63％DDA-1220kDa）および8％又は10％のトレハロース、同じく10％のマンニトールを含有する調剤について、熱ゲル化特性が凍結乾燥時において保持されるとしている[非特許文献３４]。1.4％(w/v)のキトサンおよび8％のトレハロースを含有し、水中で再形成された凍結乾燥調剤が感熱性を示し、ラットにおいて生体内（in vivo）で3ヶ月までも皮下に居留することが示され、その場合、軽度の炎症が誘起された[非特許文献３５]。
【０００６】
整形外科およびスポーツ医学における多血小板血漿（PRP）の使用が最近、見直されてきた[非特許文献３６−４４]。４つのＰＲＰファミリを有する分類システムが提案されている[非特許文献４５]。最初の２つのファミリは多血小板フィブリン(PRF)、固体フィブリン物質であり、ここで白血球が存在するもの（白血球- PRF）と、欠乏するもの（純粋PRF）とがある。最後の２つのファミリは、白血球を含有するもの（白血球- PRP）、あるいは白血球を欠いたもの（純粋PRP）からなる液状血小板懸濁液であり、これはトロンビン、塩化カルシウム（CaCl2）、グルコン酸カルシウム又は他の活性化剤により活性化されてゲルを形成することができる。血小板溶解物はPRPを使用前に凍結融解することにより製造されており、これは血小板を破壊させ、血小板由来増殖因子を放出させる[非特許文献４６−４８]。
【０００７】
In vitroにおいては、活性化されたPRP放出物は、皮膚、滑膜および腱の線維芽細胞増殖を増大させること[非特許文献４９、５０]、OA(変形性関節症)患者から単離された滑膜線維芽細胞からのヒアルロン酸（HA）および肝細胞増殖因子（HGF）の分泌[非特許文献５１]、細胞増殖、軟骨細胞からのプロテオグリカン（PG）およびコラーゲンの合成を増大させること[非特許文献５２]、並びにアルギン酸ビーズに埋め込まれた軟骨細胞からのプロテオグリカン（PG）およびコラーゲンの合成を増大させること[非特許文献５３]、更に、軟骨細胞におけるシクロオキシジナーゼ-2(COX-2)およびケモキン-レセプター(CXCR4)の発現を減少させること[非特許文献５４]が示されている。PRPは羊の軟骨細胞および間葉系幹細胞の双方の細胞増殖を増大させる[非特許文献５５]。ゼラチンマイクロキャリア上に接種させ、PRPと混合させ、CaCl2で活性化させた軟骨細胞は構造的に安定な構築物を形成させる[非特許文献５６]。ヒトの間葉幹細胞（MSCs）の培地に対し未活性化PRPを補うことにより、Runx、Sox9およびアグリカンの増殖および発現が増加される[非特許文献５７]。多孔質セラミック基板の上面に接種させたウシ軟骨細胞からなる二相構造の培地にPRPを添加することにより軟骨形成が高められる[非特許文献５８]。軟骨細胞、フィブリノゲンおよびPRPからなる移植片は、3週間の培養期間を通して存続を維持した[非特許文献５９]。ヒト軟骨細胞の培養において、PRP がIL-1βの前炎症性作用を抑制した[非特許文献６０、６１]。活性化された血小板溶解物の放出物は、OA軟骨細胞増殖並びにSox9およびアグリカン発現に対し大きい作用を示した[非特許文献６２]。血小板溶解物はヒトの皮質海綿前駆細胞のマイグレーションを増加させ、高密度ペレット培養においてその軟骨細胞分化を誘起させた[非特許文献６３]。血小板溶解物は更にヒトの骨髄間質細胞の軟骨細胞分化を増加させた[非特許文献６４]。
【０００８】
前臨床モデルにおいて、ラビット軟骨細胞をPRPと混合させ、このPRPをトロンビン/CaCl2で活性化させ、皮下注射を行い2ヵ月後に軟骨結節背側を形成させた[非特許文献６５]。これは同様のアプローチが軟骨修復について使用できることを示唆している[非特許文献６６]。PRPを乗せた凍結乾燥コラーゲン二層骨格[非特許文献６７、６８]およびトロンビン/CaCl2と共にPRPを乗せたポリ乳酸-グリコール酸(PLGA)骨格[非特許文献６９]がラビットの膝蓋骨溝欠陥モデルにおいて治癒を改善するものであった。二相骨格上にPRPを乗せることにより、ミニブタ関節丘における骨軟骨欠損モデルにおいて組織学的スコアの改善につながっている[非特許文献７０]。PRP-増強微小破壊がラット大腿骨内側顆の慢性欠陥モデルにおいて治癒を改善するものであった[非特許文献７１]。ゼラチン-ポリ（エチレングリコール）-チラミン(GPT)共役ヒドロゲルがラット剣状突起欠陥（ｘｙｐｈｏｉｄ  ｄｅｆｅｃｔｓ）の治療を目的として[非特許文献７２]、並びにラビットの膝蓋骨溝欠陥の治療を目的として[非特許文献７３]、自己軟骨細胞およびPRPと併せて骨格として使用されている。微小破壊と併せたPRPのゲルとしての使用が、ヒツジの下顎頭（ｃｏｎｄｙｌａｒ）欠陥モデルにおいて、未活性化PRPの液体注射と比較して、より効果的であった［非特許文献７４］。大人のラビットにおける滑車状骨軟骨欠損モデルにおいて、ヒアルロン酸膜をPRP並びに軟骨断片と併せて使用したとき、良好な治癒が観察された［非特許文献７５］。3-D骨格をPRPから作り、骨髄由来間質細胞を乗せたものが、ラビットにおける滑車状骨軟骨欠損を成功裡に治療することができた[非特許文献７６]。しかし、ヒツジの下顎頭欠陥モデルにおいては、3層生体模倣骨格が、CaCl2で活性化させたPRPをこの骨格上に浸み込ませたときよりも、そのままでより良好なパーホンマンスを示した[非特許文献７７]。PRPで再水和させた脱塩骨基質は、ヤギの距骨における骨軟骨修復を改善することができなかった[非特許文献７８]。更に、PRPは未熟NZWラビットの大腿骨内側顆における治癒の改善をもたらすものではなかった[非特許文献７９]。自己馴化血漿の関節内注射は、ヒツジの下顎頭欠損モデルにおける治癒を改善するものであった[非特許文献８０、８１]。ゼラチンヒドロゲルマイクロスフェア中に埋め込んだPRPの関節内注射がラビットOAモデルで使用されている[非特許文献８２]。PRPの関節内注射は、ブタの炎症性関節炎モデルで、軟骨表現型を回復させ、炎症を減少させるために使用されている[非特許文献８３]。ラビットの半月板欠損モデルにおいて、血小板溶解物を付加させた架橋/凍結乾燥ゼラチンは治癒を改善させるものであった[非特許文献８４]。PRPをヒアルロナン-エステル-ゼラチン骨格に乗せたが、２つの異なるラビット半月板欠損モデルにおいて、修復を改善させることができなかった[非特許文献８５、８６]。
【０００９】
半月板治癒のため、PRPを調査する２つの臨床試験がwww.clinicaltrials.gov(識別子：NCT00961597およびNCT01991353) に投稿されている。
【００１０】
キトサンおよび血液由来物質の組合せが先に他の者により記述されている。以下の３つの論文では、血液由来物質と組合されたキトサンの固体フォーマット（骨格又は創傷被覆材）を製造するために凍結乾燥法が用いられている。Oktayらにおいては、キトサン凍結乾燥固体スポンジに10%CaCl2で活性化させたPRPおよび自己血液（トロビンを含有する）を乗せ、これを炎症反応を誘発した頭蓋欠損部にインプラントしている[非特許文献８７]。Kutluらにおいては、未活性化PRPおよびキトサンを含有する固体骨格を形成するために２つの異なる作製法が使用されている[非特許文献８８]。第１の方法については、キトサンを酢酸に溶解させ、凍結乾燥の前に、これにPRPを増量させながら混合させた。第２の方法については、PRPの量を増加させながら凍結乾燥キトサン骨格上に滴下させた。Rossiら(U.S Patent Application Publication No. 20110280952)においては、血小板溶解物とキトサングルタメート/グリシンとからなる、若しくは血小板溶解物とキトサングルタメート/グリシン/グリセロホスフェートとからなるスポンジ状固体被覆材（包帯）が慢性皮膚創傷への投与のために作られている[非特許文献８９]。これら全ての記述において、キトサン調剤は固体であり、インプラントの直ぐ後において、固体として留まるよう設計されている。Ezodini-Erdanakiらにおいては、固体形態の滅菌キトサン粉体が自己血液の一滴と混合され、ラットモデルにおける脛骨欠損内にインプラントされている[非特許文献９０]。Sandriら(WO 2010064267)においては、キトサングルタメートと、血小板溶解物と混合させたヒドロキシプロピルメチルセルロースとからなる組成物が創傷治療用途のために作られている[非特許文献９１]。Biらにおいては、β-トリカルシウムホスフェート粉末と混合したキトサン/クエン酸/グルコースと、ウシトロンビンおよび10%CaCl2で活性化させたPRPとからなる注射用組成物がヤギの骨欠損モデルで使用されている[非特許文献９２]。
【００１１】
上述の従来技術のいずれにも、凍結乾燥キトサンと濃縮PRPとからなる可溶性調剤であって、生理的存続可能、且つ活性のものについての記述はない。Ezodini-Erdanakiらにおいては、全血が使用されている。Sandriらにおいては、キトサングルタメートベヒクルのpHは5.5で酸性であることが報告されており、血小板溶解物（破断した血小板および血小板由来成長因子を含む）は、製造の間に2倍に稀釈され、調整プロセスは血小板由来成長因子を4℃で2週間貯蔵することを必要としており、これはその活性を破壊する可能性を大きくしている[非特許文献９３]。Biらにおいては、クロット活性剤は、モル浸透圧濃度（オスモル濃度）が〜2500mOsm(生理的〜300mOsmよりも可なり高い)の10%CaCl2と、深刻な凝固障害と関連するウシトロンビンである[非特許文献９４]。
【００１２】
再形成のため、およびPRPにおける同時活性のための安定な凍結乾燥キトサン調剤であって、注射可能な生理的溶液を形成するもの、好ましくはin situでゲル化し容積維持的な組織インプラントを形成するものについての必要性が存在する。更に、収縮することがなく、組織表面に接合するような調剤についての必要性も存在する。全血およびPRPを共に有するポリマーキトサンの液状溶液については、(U.S. Patent No. 8258117; WO 2008064487; WO 2011060555; WO 011060545)において議論されている。しかし、凍結乾燥ポリマーをPRP又は血液中に直接混合させ、組織インプラントを形成させることについては議論されていない。上述の従来技術はいずれも、これらの必要性を満たすものではない。我々の知る限り、PRP中又は血液中での凍結乾燥キトサン調剤の直接的可溶化により、存続可能な(viable)非収縮性in situゲル化インプラントを形成することについて記述した文献は今日まで存在しない。
【００１３】
粘性補給についての研究は主に、種々の形態のヒアルロン酸の使用に向けられてきた[非特許文献９５−９８]。幾つかの研究では、OA又は軟骨疾患の治療のため、PRP関節内注射の使用についての報告がなされている[非特許文献９９−１０７]。今日までおおやけにされた僅かなランダム化比較試験において、CaCl2で活性化された白血球ろ過PRPの単独注射が、初期の膝OA症状を6ヶ月の時点で軽減されることが見出されている[非特許文献１０８]。OA又は軟骨変性に対するPRPの関節内注射の作用を調査する幾つかの臨床試験がwww.clinicaltrials.gov(識別子：NCT01418755, NCT01670578, NCT01270412,  NCT02012530) に投稿されている。
【００１４】
貯蔵安定性のための凍結乾燥保護剤（ｌｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔｓ）を含有し、ＰＲＰを用いた再形成の際に生理的特性を依然として保持する凍結乾燥キトサン調剤が求められている。ＰＲＰ中で迅速、好ましくは完全に、かつ容易に再形成（再水和）されて注射可能な均質なキトサン/ＰＲＰ複合体を形成する調剤が求められている。必要に応じてin situゲル化させるためのクロット活性化剤を含有する調剤が求められている。以下に述べる特性の少なくとも１つを有するキトサン調剤が求められている。その特性とは：１）貯蔵および出荷に適した機械的特性を有する凍結乾燥ケーキであること；２）必要に応じてＰＲＰ、ＰＰＰ、全血又は水中で再形成される、好ましくは完全且つ迅速に再形成されるケーキであること；３）固体キトサン/ＰＲＰハイブリッドインプラントの形成が必要なときに、クロット（ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ）がケーキ成分により抑制されないこと；４）ハイブリッドインプラントがin vivoでの機械的荷重に抗するように固体であり安定であること；５）ハイブリッドインプラントが血小板媒介クロット退縮を抑制し組織欠損を充填するものであること；６）ハイブリッドインプラントが、好ましくはポリマーおよび血液成分の相分離を生じさせることのない均質のものでin vivo応答を改善、好ましくは最適化するものであること；７）混合物が組織修復への適用のため粘性でペースト状のものであること；８）再形成された混合物がin vivoインプラントのための生理学的特性を有するあること。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】U. S. Patent No. 7371403
【特許文献２】U. S. Patent No. 7482503
【特許文献３】U. S. Patent No. 7897832
【特許文献４】U. S. Patent Application Publication No. 2009004230
【特許文献５】U. S Patent Application Publication No. 20110280952
【特許文献６】WO 2010064267
【特許文献７】U. S. Patent No. 8258117
【特許文献８】WO 200806448
【特許文献９】WO 2011060555
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【非特許文献】
【００１６】
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【非特許文献１０９】Nguyen, S., F.M. Winnik, and M.D. Buschmann, Improved reproducibility in the determination of the molecular weight of chitosan by analytical size exclusion chromatography. Carohydrate Polymers, 2009. 75(3): p.523-533
【００１７】
上述の従来技術は、如何なる固化を要することなく効果的な粘性補充を与えるポリマー溶液と混合したＰＲＰについて対応していない。ＰＲＰで再形成された生理的凍結乾燥キトサン調剤は粘性補充を提供し（キトサンの存在により）、ＰＲＰに結合するキトサンにより関節腔への血小板由来因子の緩やかな放出を提供するものと予想される。粘性補充のために設計された凍結乾燥キトサン調剤であって、以下に述べるパフォーマンス基準の少なくとも１つを有するものの開発が求められている。すなわち、１）貯蔵および出荷に適したケーキの良好な機械的特性；２）ケーキの再形成又は再水和が好ましくは完全で、更に好ましくは完全かつ迅速である；３）再形成された混合物が関節内粘性補充のため粘性のものである；４）再形成された混合物が関節内注射に適した生理学的特性を有する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
本発明の１つの形態として、キトサンと、少なくとも１つの凍結乾燥保護剤とを含有する凍結乾燥ポリマー組成物が提供される。好ましくは、この組成物は多血小板血漿（ＰＲＰ）及び／又は血液由来物質内で再形成されて、ｉ) 組織修復のため、少なくとも１つの存続可能なin situ固化非後退インプラントを形成し；ii)治療用関節内注射のための組成物を形成するものである。この少なくとも１つの凍結乾燥保護剤としては、モノサッカリド、ポリオール、ジサッカリド、トリサッカリド、オリゴサッカリド/ポリサッカリド、高分子量賦形剤、アミノ酸、たんぱく質、およびこれらの組合せからなる群から選択することができる。
【００１９】
更なる１つの形態として、血液及び／又は血液由来物質は、PRP、PPP、PRF、自己馴化血漿、血小板懸濁液、血小板溶解物およびこれらの組合せからなる群から選択される。
【００２０】
更なる１つの形態として、少なくとも１つの凍結乾燥保護剤を含有する凍結乾燥キトサン組成物が提供されている。この少なくとも１つの凍結乾燥保護剤としては、モノサッカリド、ポリオール、ジサッカリド、トリサッカリド、オリゴサッカリド/ポリサッカリド、高分子量賦形剤、アミノ酸、たんぱく質およびこれらの組合せからなる群から選択することができる。
【００２１】
好ましくは、上記モノサッカリドは、グルコース、フラクトース、フコース、ガラクトース、マンノース、リボース、キシロースアラビノースおよびこれらの組合せからなる群から選択される。好ましくは、上記ジサッカリドは、ラクトース、マルトース、スクロース、トレハロース、セロビオース、メリビオースおよびこれらの組合せからなる群から選択される。好ましくは、上記トリサッカリドは、マルトトリオース、ラフィノースおよびこれらの組合せから選択される。好ましくは、上記ポリオールは、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、イノシトールおよびこれらの組合せから選択される。好ましくは、上記アミノ酸は、ヒスチジン、グリシン、アルギニン、アラニン、グルタミン酸、リシン、フェニルアラニンおよびこれらの組合せからなる群から選択される。好ましくは、上記オリゴサッカリド/ポリサッカリドは、デキストラン、シクロデキストリン、マルトデキストリン、ヒドロキシエチルデンプン、フィコール、セルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、イヌリンおよびこれらの組合せからなる群から選択される。好ましくは、上記たんぱく質は、ウシ血清アルブミン（BSA）、カゼイン、グロブリン、ラクトアルブミン、乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）、リゾチーム、ミヨグロビン、オボアルブミンおよびこれらの組合せからなる群から選択される。
【００２２】
好ましくは、前記の少なくとも１つの凍結乾燥保護剤は、約0.1％w/vないし約30％w/vの範囲、より好ましくは約0.5％w/vないし約10％w/vの範囲、最も好ましくは約0.5％w/vないし約6％w/vの範囲の量で存在させる。
【００２３】
好ましくは、凍結乾燥キトサン組成物中のキトサンは分子量（molecular weight number）が約20kDaないし約250kDa、より好ましくは約25kDaないし約125kDa、最も好ましくは約30kDaないし約100kDaのものである。好ましくは、凍結乾燥キトサン組成物中のキトサンの濃度は約0.25％w/vないし約10％w/v、より好ましくは約0.25％w/vないし約5％w/v、最も好ましくは約0.25％w/vないし約2.5％w/vの範囲とする。
【００２４】
他の具体例において、凍結乾燥キトサン組成物は必要に応じて、少なくとも１つのクロットアクチベータを含有させる。好ましくは、このクロットアクチベータ(活性化剤)は、塩化カルシウム、グルコン酸カルシウム、酢酸カルシウム、炭酸カルシウム、カルシウムグルビオナート、カルシウムグルセプト、乳酸カルシウム、ラクトビオン酸カルシウム、リン酸カルシウムおよびこれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００２５】
他の形態として、本発明は好ましくは以下に記載するような一般的特性の少なくとも1つ、より好ましくはそれ以上、最も好ましくはそれら全てを有する凍結乾燥キトサン組成物を提供するものである。すなわち、１）出荷のための良好な機械的特性を有する均質固体凍結乾燥ケーキ（ケーキ外観で評価して）；２）必要に応じて、ＰＲＰ、乏血小板血漿 (ＰＰＰ)、血液又は水の少なくとも１つにおいて、急速で完全な再形成を示すもの、すなわち、好ましくは5分未満、より好ましくは2分未満で（再形成時での外観(肉眼)検査で評価して）。
【００２６】
凍結乾燥キトサン組成物をＰＲＰ又は血液と混合させるため、この組成物は以下の特性の少なくとも１つ、より好ましくはそれ以上、最も好ましくはそれら全てを有するものとする。すなわち、３）固体インプラントを形成する必要がある場合に、その混合物がクロットを抑制するものでないこと（1具体例においては、トロンボエラストグラフィー（ｔｈｒｏｍｂｏｅｌａｓｔｏｇｒａｐｈｙ）で評価した）；４）凝固した混合物（好ましくはインプラント）が機械的に安定であること（1具体例においては、マニュアル破砕試験で評価した）；５）凝固した混合物（好ましくはインプラント）が、血液又はＰＲＰ単独で生じるクロット退縮を抑制すること（1具体例においては、液体発現測定で評価した）；６）そのポリマーおよび血液成分の相分離を生じさせることなく良好な混合が達成されること（1具体例においては、組織像で評価した）；７）その混合物が再形成前において、組織修復への適用のため、粘性、ペースト状であるか、あるいは関節内粘性補充の場合に粘性懸濁液であること（1具体例においては、流れ易さ試験で評価した）；８）その混合物が近生理学的特性を有すること、すなわち、in vivoインプラント又は関節内注射の後において、好ましくは約165mOsmないし約660mOsm、より好ましくは約195mOsmないし約550mOsm、最も好ましくは約330mOsmを示し、更にpHが好ましくは約6.4ないし約7.9、より好ましくは約6.9ないし約7.9、最も好ましくは約7.4を示すこと（1具体例においては、モル浸透圧測定およびpH測定で評価した）。
【００２７】
他の形態として、本発明はキトサンを含有する凍結乾燥ポリマー組成物の製造方法を提供するものであり、その方法は以下の工程からなる：
a) キトサンを水と接触させ水性混合物を形成する工程、
b)該水性混合物を少なくとも１つの凍結乾燥保護剤と接触させる工程、
c) 該水性混合物を少なくとも１つのクロットアクチベータと必要に応じて接触させる工程、
d) 上記のキトサン/水からなる水性混合物に対し、上記の少なくとも１つの凍結乾燥保護剤および上記の適宜の少なくとも１つのクロットアクチベータを、混合させる前又は添加させた後、上記キトサン、上記の少なくとも１つの凍結乾燥保護剤および上記の選択的な少なくとも１つのクロットアクチベータを個々に滅菌する工程、
e) 上記の少なくとも１つの凍結乾燥保護剤および上記の選択的な少なくとも１つのクロットアクチベータを含有してなる上記水性混合物を凍結乾燥させる工程。
【００２８】
この方法の１つの形態として、凍結乾燥ポリマー/キトサン組成物中のキトサンは分子量（molecular weight number）が約20kDaないし約250kDa、より好ましくは約25kDaないし約125kDa、最も好ましくは約30kDaないし約100kDaのものである。好ましくは、凍結乾燥キトサン組成物中のキトサンの濃度は約10％未満、より好ましくは約5％未満、最も好ましくは約2.5％未満とする。
【００２９】
他の形態として、上記の少なくとも１つの凍結乾燥保護剤は、モノサッカリド、ポリオール、ジサッカリド、トリサッカリド、オリゴサッカリド/ポリサッカリド、高分子量賦形剤、アミノ酸、たんぱく質、およびこれらの組合せからなる群から選択することができる。
【００３０】
好ましくは、上記モノサッカリドは、グルコース、フラクトース、フコース、ガラクトース、マンノース、リボース、キシロース、アラビノースおよびこれらの組合せからなる群から選択される。好ましくは、上記ジサッカリドは、ラクトース、マルトース、スクロース、トレハロース、セロビオース、メリビオースおよびこれらの組合せからなる群から選択される。好ましくは、上記トリサッカリドは、マルトトリオース、ラフィノースおよびこれらの組合せから選択される。好ましくは、上記ポリオールは、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、イノシトールおよびこれらの組合せから選択される。好ましくは、上記アミノ酸は、ヒスチジン、グリシン、アルギニン、アラニン、グルタミン酸、リシン、フェニルアラニンおよびこれらの組合せからなる群から選択される。好ましくは、上記オリゴサッカリド/ポリサッカリドは、デキストラン、シクロデキストリン、マルトデキストリン、ヒドロキシエチルデンプン、フィコール、セルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、イヌリンおよびこれらの組合せからなる群から選択される。好ましくは、上記たんぱく質は、ウシ血清アルブミン（BSA）、カゼイン、グロブリン、ラクトアルブミン、乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）、リゾチーム、ミヨグロビン、オボアルブミンおよびこれらの組合せからなる群から選択される。
【００３１】
好ましくは、前記の少なくとも１つの凍結乾燥保護剤は、約0.5％ないし約30％の範囲、より好ましくは約0.5％ないし約10％の範囲、最も好ましくは約0.5％ないし約6％w/vの範囲の量で存在させる。
【００３２】
上記の任意の少なくとも１つのクロットアクチベータは、好ましくは、塩化カルシウム、グルコン酸カルシウム、酢酸カルシウム、炭酸カルシウム、カルシウムグルビオナート、カルシウムグルセプト、乳酸カルシウム、ラクトビオン酸カルシウム、リン酸カルシウムおよびこれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００３３】
他の具体例において、凍結乾燥のため、異なる滅菌キトサン調剤を作ることができる。変異型としては、種々の実施例に記載してあるように、キトサンの重量平均分子量（Mw）、数平均分子量（Mn）、デアセチル化度（DDA）、濃度およびプロトン化レベルである。他の変異型としては、混合法、上記の少なくとも１つのクロットアクチベータ（好ましくは金属塩、より好ましくは金属ハロゲン化物、最も好ましくはCaCl2）濃度および添加法、凍結乾燥保護剤濃度（好ましくは、トレハロース、マンニトールおよびスクロースからなる群から選択されるもの）、塩濃度（好ましくは、金属塩、より好ましくは金属ハロゲン化物、最も好ましくはNaCl）および緩衝液濃度（好ましくはヒスチジン）などである。1具体例として、画像化を目的としてトレーサが添加される。好ましくは、フィルター滅菌ローダミン-キトサントレーサがケーキに添加される。好ましくは、画像化のため0.01％（トレーサvol /溶液vol）の最終割合で添加される。
【００３４】
他の形態において、凍結乾燥キトサン組成物は、血液中又はPRP、PPP、PRF、自己馴化血漿、血小板懸濁液、血小板溶解物およびこれらの組合せからなる群から選択される血液生成物中で再形成することができる。好ましくは、再形成された凍結乾燥キトサン組成物は、組織修復のためのインプラントを作るのに使用される。好ましくは、この組織修復は、半月板修復、軟骨修復、骨修復、回旋腱板修復、上顆炎修復、靭帯/腱修復、急性損傷修復、腱障害修復、涙液修復、筋肉修復、口腔/顎顔面外科手術、皮膚修復、創傷管理、潰瘍治療およびこれらの組合せからなる群から選択されるものである。
【００３５】
他の形態において、PRPおよびPPPは凍結乾燥されたケーキの性能特性をテストするのに使用される。好ましい具体例において、抗クロット処理全血は遠心分離される。すなわち、好ましくは、約160ｇで約10分間、好ましくは室温で遠心分離され、その結果、上清が形成される。この上清は最初の約2mmの赤血球と共に集められ、PRP（チューブ内の底1.5mL、白血球- PRP、更に僅かな赤血球を含む）およびPPP（透明な血漿）を分離するため再び好ましくは室温で約400ｇで約10分間遠心分離される。
【００３６】
他の具体例において、ケーキの再形成をテストするため、約1mLのPRP又はPPP（透明なので視覚評価に好ましい）が凍結乾燥ケーキを収容した各バイアル中にピペッティング(ピペットによる操作)される。混合が行われる。好ましくは、３つの0.39gのステンレス鋼ボールの存在下（又は不存在下）で10秒間の激しい旋回又は振動により行われる。1具体例において、この凍結乾燥ケーキが約3ないし約5分間内で再可溶化される。再形成された混合物のpHおよび浸透圧モル濃度も記録され、これらが生理的に近いか否かの判定がなされている。
【００３７】
他の具体例においては、ケーキのパーフォーマンスをテストするため、約1mLのPRPが凍結乾燥ケーキを収容した各バイアル中にピペッティングされる。調剤は３つの0.39gのステンレス鋼ボールの存在下又は不存在下で10秒間の激しい旋回（振り）又は振動により混合されている。
【００３８】
他の具体例においては、調剤のクロット特性をトロンボエラストグラフィ（TEG）によりテストされる。この混合物は固体インプラントを形成する必要がある場合には凝固を抑制しないものである。
【００３９】
他の具体例においては、ハイブリッドクロット（hybrid clot）ボリューム保持は、クロット退縮時に発生するハイブリッドクロットからの液体発現を測定することにより評価される。凝固した混合物（インプラント）は、組織欠損を完全に満たすため、血液又はPRP単独で発生するクロット退縮を大きく抑制すべきものである。
【００４０】
ハイブリッドクロット中のキトサン分散は組織像により評価される。上記ポリマーおよび血液成分の相分離を生じさせることなく良好な混合を達成させ、それによりタイムリーな生物分解性を確保し、in situ生理学的応答に有益なものとする。
【００４１】
上記調剤のペース状特性は流れ易さ試験で評価することができる。好ましくは、上記混合物は適度の取扱い特性を有するものとし、これは好ましくは、組織修復への適用において粘性のペース状であり、あるいは関節内粘性補充の場合は粘性懸濁液とする。
【００４２】
上記調剤の機械的特性は破砕試験で評価することができる。好ましくは、上記の凝固した混合物（インプラント）は機械学的に安定であり、移植部位への充填に耐えるものとする。
【００４３】
上記調剤の取扱い特性は、半月版欠損モデルおよび軟骨欠損モデルでのex vivoでテストすることができる。好ましくは、上記混合物は、手術室の装置を以って組織欠損部へ容易に送出されるようにする。
【００４４】
上記凍結乾燥調剤のin vivoクレアリング（clearing）は、ラビットの軟骨欠損モデルおよび皮下移植ラビットモデルで評価することができる。好ましくは、上記混合物は、慢性炎症のような有害な影響を誘起させることのないタイムリーな様式で生物分解性を示しクレアされるようなものとすべきである。より好ましくは、キトサン/PRPからなるハイブリッドインプラントは、創傷治癒事象（ｗｏｕｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇ  ｅｖｅｎｔｓ）を調節させるため、in vivoでPRPよりも長く留置されるべきである。
【００４５】
ハイブリッドキトサン/PRPインプラントは、半月版欠損部および急性並びに慢性軟骨欠損部へin vivoで注射することができ、それにより治癒メカニズムを調節し、修復を改善することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１Ａ】種々の凍結乾燥キトサンケーキおよび実施例１でのそれらの試験を示す図である。
【図１Ｂ】種々の凍結乾燥キトサンケーキおよび実施例１でのそれらの試験を示す図である。
【図２Ａ】凍結乾燥キトサンケーキおよび実施例２でのそれらの試験を示す図である。
【図２Ｂ】凍結乾燥キトサンケーキおよび実施例２でのそれらの試験を示す図である。
【図３Ａ】実施例３の凍結乾燥調剤および溶液で作られたハイブリッドクロット（clots）を示す図である。
【図３Ｂ】実施例３の凍結乾燥調剤および溶液で作られたハイブリッドクロット（clots）を示す図である。
【図４Ａ】実施例４の凍結乾燥キトサンケーキおよびハイブリッドクロット（clots）を示す図である。
【図４Ｂ】実施例４の凍結乾燥キトサンケーキおよびハイブリッドクロット（clots）を示す図である。
【図５Ａ】実施例５の種々のキトサン調剤の変化の流れテストおよびTEGを示す図である。
【図５Ｂ】実施例５の種々のキトサン調剤の変化の流れテストおよびTEGを示す図である。
【図６Ａ】実施例６の種々の凍結乾燥キトサンケーキおよびハイブリッドクロットを示す図である。
【図６Ｂ】実施例６の種々のテスト条件下での種々の調剤のTEGテストおよび液体発現テストを示す図である。
【図６Ｃ】実施例６のキトサン調剤の流れテストおよびex vivoインプラントを示す図である。
【図６Ｄ】実施例６のハイブリッドクロットの機械強度テストを示す図である。
【図７Ａ】実施例７のハイブリッドクロットを示す図である。
【図７Ｂ】実施例７の種々のテストにおけるハイブリッドクロットを示す図である。
【図７Ｃ】実施例７のＮＺＷラビットに注射した凍結乾燥キトサン/PRPインプラントの日1における組織学的結果を示す図である。
【図７Ｄ】実施例７のＮＺＷラビットに注射した凍結乾燥キトサン/PRPインプラントの日3における組織学的結果を示す図である。
【図７Ｅ】実施例７のＮＺＷラビットに注射した凍結乾燥キトサン/PRPインプラントの肉眼的結果を示す図である。
【図８Ａ】実施例８の種々の凍結乾燥キトサンケーキのケーキ外観および可溶性を示す図である。
【図８Ｂ】実施例８の種々の凍結乾燥キトサンケーキの液体発現テストを示す図である。
【図８Ｃ】実施例８の種々の凍結乾燥キトサンケーキのTEGテストおよびクロット組織を示す図である。
【図８Ｄ】実施例８の外科的半月板欠損に対するキトサン/PRPハイブリッドの適用を示す図である。
【図８Ｅ】実施例８の半月板欠損に対するキトサン/PRPハイブリッドのインプラント後の1日目および21日目における結果を示す図である。
【図９Ａ】実施例９の慢性軟骨欠損に対するキトサン/PRPインプラントの移植を示す図である。
【図９Ｂ】実施例９の慢性軟骨欠損に対するキトサン/PRPハイブリッドの移植後の21日目における結果を示す図である。
【図面の詳細な説明】
【００４７】
図１Ａを参照すると、白色矢線は、旋回方法（図1A1）を使用し、ステンレス鋼ビーズ（図1A2）で混合することにより凍結乾燥キトサンケーキをPRPで再形成した後の未溶解キトサン粒子を指している。PRPハイブリッドクロット中のキトサン分散は全ての調剤について均質ではなかった（図1A3および図1A4は調剤#４の結果を示している）。図1A3中の四角を高倍率に拡大することにより1A4が得られ、そこにはキトサン集塊が示されている。調剤#４：0.56%（w/v）CS 80.6%DDA Mw 380kDaで7%（w/v）のトレハロースおよび45mMのCaCl2を伴う。  
【００４８】
図１Ｂを参照すると、ハイブリッドクロット（調剤#２、３、４、５、６）からの液体発現は、PRP単独よりも小さい（図1B1）。凍結乾燥キトサン/ PRPインプラント（調剤#３）が、ラビット軟骨修復モデルにおける10日間のポスト処置でマイクロドリルホールの頂部に検出された（図1B2）。調剤#２：0.67%（w/v）CS 80.6%DDA Mw 341kDaで、201 mMのNaCl（液体CaCl2による活性化ポスト再形成）を伴う。調剤#３：0.56%（w/v）CS 80.6%DDA Mw 389kDaで6.3%（w/v）のスクロースおよび45mMのCaCl2を伴う。調剤#４：0.56%（w/v）CS 80.6%DDA Mw 380kDaで7%（w/v）のトレハロースおよび45mMのCaCl2を伴う。調剤#５：0.56%（w/v）CS 80.6%DDA Mw 400kDaで5.2%（w/v）のスクロースおよび45mMのCaCl2並びに33mMのヒスチジンを伴う。調剤#６：0.56%（w/v）CS 80.6%DDA Mw 391kDaで5.8%（w/v）のトレハロースおよび45mMのCaCl2並びに33mMのヒスチジンを伴う。  
【００４９】
図２Ａを参照すると、調剤#１（図２Ａ１）および調剤#１４（図２A２）で得られた凍結乾燥キトサンケーキが描かれている。ハイブリッドクロット中のキトサン分散体はこれら調剤（図2A3および図2A4は調剤#１を示している）のいずれにおいても均質ではなかった。図２Ａ３中の四角を高倍率に拡大することにより図２Ａ４が得られ、そこにはキトサンの存在が示され、この図２Ａ３中の四角形の上の領域にはキトサンの存在は認められなかった。調剤#１：0.56%（w/v）CS 80.6%DDA Mn 151kDaで42.2mMのCaCl2を伴い、調剤#１４：0.56%（w/v）CS 80.6%DDA Mn 148kDaで10%（w/v）のトレハロースおよび42.2mMのCaCl2を伴う。
【００５０】
図２Ｂを参照すると、凍結乾燥キトサン/PRPハイブリッドの凝固は2%（w/v）の凍結乾燥保護剤（図２Ｂ１に示す調剤#１０）の存在下では正常であったが、8%（w/v）又は10%（w/v）の凍結乾燥保護剤（図２Ｂ２および図２Ｂ３にそれぞれ示す調剤#１３および#１４）の存在下では抑制された。調剤#１０：0.56%（w/v）CS 80.6%DDA Mn 162kDaで2%（w/v）のトレハロースおよび42.2mMのCaCl2を伴う。調剤#１３：0.56%(w/v)CS 80.6%DDAで8%（w/v）のトレハロースおよび42.2mMのCaCl2を伴う。調剤#１４：0.56%(w/v)CS 80.6%DDA Mn 148kDaで10%（w/v）のトレハロースおよび42.2mMのCaCl2を伴う。
【００５１】
図３Ａおよび３Ｂを参照すると、キトサン集塊は、ガラス管内に作られた凍結乾燥ハイブリッドクロット全体に亘って分散せず（図３Ａ１および３Ａ２にそれぞれ示した調剤#１および２）、半月板欠損中にも分散していない（図３Ｂ１および３Ｂ２にそれぞれ示した調剤#１および２）。溶液で作られたハイブリッドクロットは、ガラス管内に作られたもの（図３Ａ３および３Ａ４にそれぞれ示した液体調剤#３および４）で作られたものでも、半月板欠損中に作られたもの（図３Ｂ３および３Ｂ４にそれぞれ示した液体調剤#３および４）でも均質であった。図３Ａ１ないし３Ａ４中の白色破線はガラス管内のハイブリッドクロットの底縁を表わしている。図３Ｂ１ないし３Ｂ４中の白色破線は半月板欠損の境界を表わしている。ローダミン-キトサントレーサはエピ蛍光下では白く見える。調剤#１：0.56%（w/v）CS 80.6%DDA Mn 159kDaで130mMのNaClおよび42.2mMのCaCl2を伴う。調剤#２：0.56%（w/v）CS 80.6%DDA Mn 162kDaで2%（w/v）のトレハロースおよび42.2mMのCaCl2を伴う。液体調剤#３：0.56%（w/v）CS 80.6%DDA Mn 163kDaで42mMのNaClおよび45mMのCaCl2を伴う、PRPとの混合後のもの。液体調剤#４：0.56%（w/v）CS 80.6%DDA Mn 145kDaで2%（w/v）のトレハロースおよび45mMのCaCl2を伴う、PRPとの混合後のもの。
【００５２】
図４Ａを参照すると、凍結乾燥キトサンケーキを調剤#６（図４Ａ１）および調剤#１０（図４Ａ２）を用いて得た。調剤#６：0.56%（w/v）CS 80.6%DDA Mn 183kDaで6%（w/v）のトレハロース、3.8mMのヒスチジンおよび42.2mMのCaCl2を伴う。調剤#１０：0.56%（w/v）CS 80.6%DDA Mn 167kDaで6%（w/v）のマンニト−ル、3.8mMのヒスチジンおよび42.2mMのCaCl2を伴う。
【００５３】
図４Ｂを参照すると、ハイブリッドクロット中のキトサン分散体は、凍結乾燥ケーキを作るのに中程度のMnのキトサンを使用したとき（図４Ｂ３および４Ｂ４に示した調剤#１８： CS 82.5%DDA Mn 38kDaのもの）は均質であったが、高いMnのキトサンを使用したとき（図４Ｂ１および４Ｂ２に示した調剤#３： CS 80.6%DDA Mn 131kDaのもの）あるいは低いMnのキトサンを使用したとき（図４Ｂ５および４Ｂ６に示した調剤#２３： CS 84.4%DDA Mn 11kDaのもの）は均質でなかった。これらの図において、ローダミン-キトサントレーサはエピ蛍光下では白く見える。調剤#３：0.56%（w/v）CS 80.6%DDA Mn 131kDaで2%（w/v）のトレハロースおよび42.2mMのCaCl2を伴う。調剤#１８：0.56%（w/v）CS 82.5%DDA Mn 38kDaで2%（w/v）のマンにトール、3.8 mMのヒスチジンおよび42.2mMのCaCl2を伴う。調剤#２３：0.56%（w/v）CS 84.4%DDA Mn 11kDaで2%（w/v）のトレハロースおよび42.2mMのCaCl2を伴うもの。
【００５４】
図５Ａを参照すると、キトサン濃度を0.56%（w/v）から1%（w/v）に増加させたり、キトサンMnを32kDaから56kDaに増加させることにより、傾斜したプラスチックプレート上での流れテストによれば、凍結乾燥調剤のペースト状特性が改善される（図５Ａ２に対し図５Ａ１を、図５Ａ３に対し図５Ａ１を比較する）。図５Ａ１ないし図５Ａ４中の黒の矢線は、キトサンなしのPRPの流れ易さを指摘するものである。図５Ａ１ないし図５Ａ4中の黒の円は、異なるキトサン-PRP調剤の流れ易さを指摘するものである。
【００５５】
図５Ｂを参照すると、0.56%（w/v）キトサンMn 32kDaを含む調剤は、PRP単独対照と同様の1-相様式で凝固した（図５Ｂ１）。キトサンMn又は濃度を増加させることにより、TEGトレーシングが示すように2-相凝固メカニズムが誘起された（図5B2ないし図5B4）。調剤#１：0.56%（w/v）CS 81.2%DDA Mn 32kDaで2%（w/v）のトレハロースおよび42.2mMのCaCl2を伴う。調剤#２：0.56%（w/v）CS 81.2%DDA Mn 32kDaで6%（w/v）のトレハロースおよび42.2mMのCaCl2を伴う。調剤#３：0.56%（w/v）CS 81.2%DDA Mn 32kDaで2%（w/v）のマンニトールおよび42.2mMのCaCl2を伴う。調剤#４：0.56%（w/v）CS 81.2%DDA Mn 32kDaで6%（w/v）のマンニトールおよび42.2mMのCaCl2を伴う。調剤#５：1%（w/v）CS 81.2%DDA Mn 32kDaで2%（w/v）のトレハロースおよび42.2mMのCaCl2を伴う。調剤#６：1%（w/v）CS 81.2%DDA Mn 32kDaで6%（w/v）のトレハロースおよび42.2mMのCaCl2を伴う。調剤#７：1%（w/v）CS 81.2%DDA Mn 32kDaで2%（w/v）のマンニトールおよび42.2mMのCaCl2を伴う。調剤#８：1%（w/v）CS 81.2%DDA Mn 32kDaで6%（w/v）のマンニトールおよび42.2mMのCaCl2を伴う。調剤#１３：0.56%（w/v）CS 80.1%DDA Mn 56kDaで2%（w/v）のトレハロースおよび42.2mMのCaCl2を伴う。調剤#１４：0.56%（w/v）CS 80.1%DDA Mn 56kDaで6%（w/v）のトレハロースおよび42.2mMのCaCl2を伴う。調剤#１５：0.56%（w/v）CS 80.1%DDA Mn 56kDaで2%（w/v）のマンニトールおよび42.2mMのCaCl2を伴う。調剤#１６：0.56%（w/v）CS 80.1%DDA Mn 56kDaで6%（w/v）のマンニトールおよび42.2mMのCaCl2を伴う。調剤#１７：1%（w/v）CS 80.1%DDA Mn 56kDaで2%（w/v）のトレハロースおよび42.2mMのCaCl2を伴う。調剤#１８：1%（w/v）CS 80.1%DDA Mn 56kDaで6%（w/v）のトレハロースおよび42.2mMのCaCl2を伴う。調剤#１９：1%（w/v）CS 80.1%DDA Mn 56kDaで2%（w/v）のマンニトールおよび42.2mMのCaCl2を伴う。調剤#２０：1%（w/v）CS 80.1%DDA Mn 56kDaで6%（w/v）のマンニトールおよび42.2mMのCaCl2を伴う。
【００５６】
図６Ａを参照すると、凍結乾燥キトサンケーキを調剤#９（図６Ａ１）および調剤#１１０（図６Ａ２）を用いて得た。ハイブリッドクロット中のキトサン分散体は、キトサンMn 28kDa（図６Ａ３）、あるいはキトサンMn 56kDa（図６Ａ４）が使用されたときでも、いずれもおおよそ均質であることが判明した（図６Ａ３および６Ａ４に示した調剤#１２および#１６）。調剤#９：1%（w/v）CS 80.5%DDA Mn 28kDaで2%（w/v）のトレハロースおよび42.2mMのCaCl2を伴う。調剤#１１：1%（w/v）CS 80.5%DDA Mn 28kDaで2%（w/v）のマンニトールおよび42.2mMのCaCl2を伴う。調剤#１２：1%（w/v）CS 80.5%DDA Mn 28kDaで6%（w/v）のマンニトールおよび42.2mMのCaCl2を伴う。調剤#１６：1%（w/v）CS 81.8%DDA Mn 56kDaで6%（w/v）のマンニトールおよび42.2mMのCaCl2を伴う。
【００５７】
図６Ｂを参照すると、TEGトレーシングによる2-相凝固メカニズムが示されている（図６Ｂ１および６Ｂ２）。ハイブリッドクロットからの液体発現は、凍結乾燥キトサン/PRPの場合は殆んど存在せず（0％液体発現）、これに対し、PRP単独の場合は約80％容積減少が認められた（図６Ｂ３）。調剤#９：1%（w/v）CS 80.5%DDA Mn 28kDaで2%（w/v）のトレハロースおよび42.2mMのCaCl2を伴う。調剤#１０：1%（w/v）CS 80.5%DDA Mn 28kDaで6%（w/v）のトレハロースおよび42.2mMのCaCl2を伴う。調剤#１１：1%（w/v）CS 80.5%DDA Mn 28kDaで2%（w/v）のマンニトールおよび42.2mMのCaCl2を伴う。調剤#１２：1%（w/v）CS 80.5%DDA Mn 28kDaで6%（w/v）のマンニトールおよび42.2mMのCaCl2を伴う。調剤#１３：1%（w/v）CS 80.1%DDA Mn 56kDaで2%（w/v）のマンニトールおよび42.2mMのCaCl2を伴う。調剤#１４：1%（w/v）CS 80.1%DDA Mn 56kDaで6%（w/v）のマンニトールおよび42.2mMのCaCl2を伴う。調剤#１５：1%（w/v）CS 81.8%DDA Mn 56kDaで2%（w/v）のマンニトールおよび42.2mMのCaCl2を伴う。調剤#１６：1%（w/v）CS 81.8%DDA Mn 56kDaで6%（w/v）のマンニトールおよび42.2mMのCaCl2を伴う。
【００５８】
図６Ｃを参照すると、全ての調剤（#１ないし#１６）はPRPと比較してペースト状であった（図６Ｃ１中の調剤#９ないし#１６）。図６Ｃ１中の黒の矢線は、キトサンなしのPRPの流れ易さを指摘するものである。図６Ｃ１中の黒の円は、異なるキトサン-PRP調剤の流れ易さを指摘するものである。ハイブリッドクロットは、20ゲージ針を備えた注射器を用いてブタの関節に生じた軟骨欠損に対しex vivoで送出させ、そこで凝固させた（図６Ｃ２中の調剤#９、１０，１１，１２，１５および１６）。調剤#９：1%（w/v）CS 80.5%DDA Mn 28kDaで2%（w/v）のトレハロースおよび42.2mMのCaCl2を伴う。調剤#１０：1%（w/v）CS 80.5%DDA Mn 28kDaで6%（w/v）のトレハロースおよび42.2mMのCaCl2を伴う。調剤#１１：1%（w/v）CS 80.5%DDA Mn 28kDaで2%（w/v）のマンニトールおよび42.2mMのCaCl2を伴う。調剤#１２：1%（w/v）CS 80.5%DDA Mn 28kDaで6%（w/v）のマンニトールおよび42.2mMのCaCl2を伴う。調剤#１３：1%（w/v）CS 80.1%DDA Mn 56kDaで2%（w/v）のマンニトールおよび42.2mMのCaCl2を伴う。調剤#１４：1%（w/v）CS 80.1%DDA Mn 56kDaで6%（w/v）のマンニトールおよび42.2mMのCaCl2を伴う。調剤#１５：1%（w/v）CS 81.8%DDA Mn 56kDaで2%（w/v）のマンニトールおよび42.2mMのCaCl2を伴う。調剤#１６：1%（w/v）CS 81.8%DDA Mn 56kDaで6%（w/v）のマンニトールおよび42.2mMのCaCl2を伴う。
【００５９】
図６Ｄを参照すると、2%（w/v）の凍結乾燥保護剤を含有するハイブリッドクロット（図６Ｄ１および図６Ｄ２中の調剤#３）は、6%（w/v）の凍結乾燥保護剤を用いて作られたハイブリッドクロット（図６Ｄ３および図６Ｄ４中の調剤#４）と比較して機械的強度がより高かった。調剤#３：1%（w/v）CS 81.2%DDA Mn 32kDaで2%（w/v）のマンニトールおよび42.2mMのCaCl2を伴う。調剤#４：1%（w/v）CS 81.2%DDA Mn 32kDaで6%（w/v）のマンニトールおよび42.2mMのCaCl2を伴う。図７Ａを参照すると、ハイブリッドクロットを、ステンレス鋼ビーズの助けなしで（図７Ａ１ないし７Ａ４）、あるいは３つの0.39gのステンレス鋼ビーズを用いて（図７Ａ５ないし７Ａ８）形成させた。調剤#１５：0.56%（w/v）CS 80.6%DDA Mn 41kDaで2%（w/v）のマンニトールおよび42.2mMのCaCl2を伴う。調剤#１９：1%（w/v）CS 80.6%DDA Mn 41kDaで2%（w/v）のマンニトールおよび42.2mMのCaCl2を伴う。調剤#２３：0.56%（w/v）CS 80.6%DDA Mn 89kDaで2%（w/v）のマンニトールおよび42.2mMのCaCl2を伴う。調剤#２７：1%（w/v）CS 80.6%DDA Mn 108kDaで2%（w/v）のマンニトールおよび42.2mMのCaCl2を伴う。
【００６０】
図７Ｂを参照すると、ステンレス鋼ビーズを用いて又は用いずに再形成された調剤について、並びに2人の異なるドナーからのPRP対照についての破砕テスト、％液体発現、流れ易さおよび最大広さについての結果が図７Ｂに示されている。調剤#１５：0.56%（w/v）CS 80.6%DDA Mn 41kDaで2%（w/v）のマンニトールおよび42.2mMのCaCl2を伴う。調剤#１９：1%（w/v）CS 80.6%DDA Mn 41kDaで2%（w/v）のマンニトールおよび42.2mMのCaCl2を伴う。調剤#２３：0.56%（w/v）CS 80.6%DDA Mn 89kDaで2%（w/v）のマンニトールおよび42.2mMのCaCl2を伴う。調剤#２７：1%（w/v）CS 80.6%DDA Mn 108kDaで2%（w/v）のマンニトールおよび42.2mMのCaCl2を伴う。
【００６１】
図７Ｃを参照すると、NZWラビットの背中に注射された皮下用凍結乾燥キトサン/PRPインプラントは、注射後1日目でこのインプラントに向けての白血球走化性を示した（図７Ｃ１、７Ｃ２、７Ｃ３および７Ｃ４）。PRP単独対照は注射後1日目での白血球の引き付けは可なり小さかった（図７Ｃ５および７Ｃ６）。調剤#１３：0.56%（w/v）CS 80.6%DDA Mn 41kDaで2%（w/v）のトレハロースおよび42.2mMのCaCl2を伴う。調剤#１４：0.56%（w/v）CS 80.6%DDA Mn 41kDaで6%（w/v）のトレハロースおよび42.2mMのCaCl2を伴う。
【００６２】
図７Ｄを参照すると、NZWラビットの背中に注射された皮下用凍結乾燥キトサン/PRPインプラントは、注射後３日目でこのインプラントに向けての白血球走化性を示した（図７Ｄ１、７Ｄ２、７Ｄ３および７Ｄ４）。PRP単独対照は注射後３日目での白血球の引き付けは可なり小さかった（図７Ｄ５および７Ｄ６）。調剤#１３：0.56%（w/v）CS 80.6%DDA Mn 41kDaで2%（w/v）のトレハロースおよび42.2mMのCaCl2を伴う。調剤#１４：0.56%（w/v）CS 80.6%DDA Mn 41kDaで6%（w/v）のトレハロースおよび42.2mMのCaCl2を伴う。
【００６３】
図７Ｅを参照すると、凍結乾燥キトサン/PRPハイブリッドはインプラント後少なくとも14日間in vivoにて保持された（図７Ｅ１、７Ｅ２および７Ｅ３）が、カルシウム再沈着（ｒｅｃａｌｃｉｆｉｅｄ）されたPRP対照はインプラント後わずか3日存在するに過ぎなかった（図７Ｅ４は、１日目でのPRP対照を示している）。調剤#１３：0.56%（w/v）CS 80.6%DDA Mn 41kDaで2%（w/v）のトレハロースおよび42.2mMのCaCl2を伴う。調剤#１４：0.56%（w/v）CS 80.6%DDA Mn 41kDaで6%（w/v）のトレハロースおよび42.2mMのCaCl2を伴う。
【００６４】
図８Ａを参照すると、凍結乾燥キトサンケーキが、CS Mn 43kDaおよび85%DDA（図８Ａ１）およびCS Mn 36kDaおよび80%DDA（図８Ａ２）、更に1%（w/v）CS濃度および1%（w/v）トレハロース濃度を以って得られた。これら凍結乾燥キトサンケーキは混合したとき完全に可溶性のものであった（図８Ａ３および８Ａ４）。
【００６５】
図８Ｂを参照すると、キトサン/PRPハイブリッドは液体を発現しなかったが、PRP単独対照は血清中にそれらの重量の80％を超えて発現した（図８Ｂ１、８Ｂ２、８Ｂ３および８Ｂ４）。
【００６６】
図８Ｃを参照すると、キトサン/PRPハイブリッドは、トロンボエラストグラフィーで測定したところ、クロット形成時間およびクロット最大広さを減少させていた（図８Ｃ１および８Ｃ２）。ハイブリッドクロット中のCS分散は均質であった（図８Ｃ３および８Ｃ４）。
【００６７】
図８Ｄを参照すると、外科用メスを使用してヒツジの内側半月板の前方部分に外科的欠損を生じさせた（図８Ｄ１）。この欠損を10mmの長さまで長くした（図８Ｄ２）。この欠損を粗く擦った（ラスピング；rasping）（図８Ｄ３）。この欠損を締め付けることなく縫合し、18ゲージ針を事前に配置し、上記半月板の周縁から裂目まで穿孔チャンネルを形成させた（図８Ｄ４および８Ｄ５）。この穿孔チャンネルを介して、キトサン/PRPハイブリッドを上記半月板裂目に送出させた（図８Ｄ６）。
【００６８】
図８Ｅを参照すると、キトサン/PRPハイブリッドを上記裂目部に外科手術後少なくとも24時間居留させた（図８Ｅ１および８Ｅ２）。外科手術後21日目において、キトサン/PRPハイブリッドで処置した上記半月板裂目部のエッジ部は良好に並列されていた（図８Ｅ３および８Ｅ４）。
【００６９】
図９Ａを参照すると、NZWラビットの骨滑車上に、4mmＸ4mmの軟骨単独欠損を生じさせた（図９Ａ１）。膝を閉じ、この欠損部を1ヶ月をかけて慢性期まで発展させた（図９Ａ２）。上記欠損部を創面切除し、直径0.9mmの４つのミクロドリル孔を、軟骨下骨を通って4mmまでの深さまで貫通させた。キトサン/PRPインプラント（CS Mn 40kDaおよび80%DDA で、1%（w/v）CS濃度および2%（w/v）トレハロース濃度のもの）を上記のミクロドリル孔欠損部の頂部に注射することにより１つの膝部を処置した（図９Ａ４）。反対側の膝を、対照としてのカルシウム再沈着PRPを上記のミクロドリル孔欠損部の頂部に注射することにより治療した（図９Ａ３）。
【００７０】
図９Ｂを参照すると、上記欠損部の巨視的外観の評価（図９Ｂ１および９Ｂ２）および組織学的評価（図９Ｂ３および９Ｂ４）を、治癒の21日後におこなった。図９Ｂ１および９Ｂ２中の黒い破線による四角は慢性軟骨欠損の境界を示している。
【発明の詳細な説明】
【００７１】
好ましい具体例において、１つの手順として、室温のキトサンを15mL のFalcon管内に計量し、ddH2Oおよび１NのHClを各管に添加した。キトサンの濃度は0.42%〜2%（w/v）とした。HClの濃度は12〜57mMとした。これらの管をローテータ上に置き、完全な溶解を確保するため一晩室温で攪拌させた。
【００７２】
キトサン溶液の滅菌のため、２つの滅菌方法を用いた：１）Mn>100kDaのキトサンについては10分間、オートクレーブにかける；又は２）Mn〈100kDaのキトサンについてはろ過である。
【００７３】
層流フードのもとで、フィルター滅菌した270mM CaCl2をキトサン溶液に添加し、最終濃度を45mM又は42.2mMとした。フィルター滅菌した15％（w/v）トレハロース、マンニトール又はオートクレーブした20％（w/v）スクロース、トレハロースを必要に応じて添加し、0ないし10％（w/v）の範囲の凍結乾燥保護剤濃度を得た。必要に応じてオートクレーブした5M NaClを添加し、130ないし201mMの最終濃度を達成させた。必要に応じてフィルター滅菌したヒスチジンを添加し、3.8、33又は39mMの最終濃度を達成させた。フィルター滅菌したローダミン-キトサントレーサを添加し、画像化の目的のため最終比、0.01%（トレーサ量/溶液量）を得た。
【００７４】
振り混ぜにより、均質な溶液が達成されるまで十分に混合させたのち、1mLの一定分量を、凍結乾燥のため3mL又は10mLのガラス瓶（バイアル）に分配した。このとき、滅菌を保持させるため、このバイアルの頂部に膜を用いた。あるいは、より小さい300μLの一定分量を、凍結乾燥のため2mLのガラス瓶（バイアル）に分配した。この凍結乾燥サイクルは以下のものからなる。すなわち、１）1時間をかけて−40℃まで傾斜凍結を行い、ついで−40℃の等温で2時間おこなう；２）−40℃で48時間；３）12時間をかけて30℃まで傾斜加熱を行い、ついで300または100ミリトールで30℃の等温加熱を6時間行う、である。ケーキは凍結乾燥後、肉眼で評価した。上記基準１のとおり、凍結乾燥したケーキは均質並びに固体であって、貯蔵および出荷のため良好な機械的特性を表わすものでなければならない。
【００７５】
抗凝固全血を、ラビット、ヒツジおよびヒトドナーから採血し、真空採血管内に収容した。この抗凝固剤はクエン酸デキストロース（血中、13mMのクエン酸三ナトリウム二水和物；7mMのクエン酸；24 mMのデキストロース）又はクエン酸ナトリウム（血中、12.9mMのクエン酸三ナトリウム二水和物）であった。
【００７６】
抗凝固全血を収容した真空採血管を、ACE E-Z PRPTM遠心分離機内で、160Gで10分間、室温で遠心分離した。上澄液を最初の約2mmの赤血球と共に集め、多血小板血漿（管底中の1.5mLで白血球-PRPとして分類され、微量の赤血球を含む）および貧血小板血漿（透明な血小板）を分離するため再び室温、400ｇで10分間遠心分離を行った。
【００７７】
ケーキ再形成およびキトサン溶解度をテストするため、1mLのPRP又はPPP（赤血球を含むPRPに対して、透明のなので視覚評価に好ましい）をピペットで、凍結乾燥ケーキを収容した各ガラス瓶内に入れた。混合は激しい旋回又は振動により３つのステンレス鋼ボール（各0.39g）の存在下又は不存在下で10秒間おこなった。ケーキの溶解性の容易性を記録した。上記基準２のとおり、ケーキは必要に応じて、PRP、PPP、血液又は水の中で迅速かつ容易に再形成されるものでなければならない。再形成された混合物のpH およびモル浸透圧濃度も記録し、これらが生理学的なものに近いか否かを判定した。上記基準８のとおり、再形成された混合物は、in vivoインプラント又は関節内注射のため近生理学的特性を有するものでなければならない。
【００７８】
ケーキの性能をテストするため、1mLのPRPをピペットで、凍結乾燥ケーキを収容した各ガラス瓶内に入れた。混合は激しい旋回又は振動により３つのステンレス鋼ボール（各0.39g）の存在下又は不存在下で10秒間おこなった。
【００７９】
凝固特性は各調剤360μLを、再形成直後のTEGコップ内に充填し、TEGトレーシング（tracings）を1時間記録することにより測定した。上記基準３のとおり、凝固はin situゲル化が要求されているときは抑制されてはならない。
【００８０】
各調剤の機械的特性は手動による破砕テストで評価した。凝固1時間後、各ハイブリッドクロット（hybrid clot）を手動破砕に供し、機械的強度は0（弱い）ないし4+（強い）のスケールで記録した。上記基準４のとおり、キトサン/PRPハイブリッドインプラントは機械的に安定でインプラント部位での充填（loading）に耐えるものでなければならない。
【００８１】
ハイブリッドクロットのボリュウム保持は、再形成された調剤を37℃でガラス管内に分配することにより評価した。60分後、ハイブリッドクロットからの液体発現を重量測定により定量した。上記基準５のとおり、キトサン/PRPハイブリッドインプラントは、血小板媒介収縮を受けずに組織欠損部を満たすことができるものでなければならない。
【００８２】
ハイブリッドクロット内でのキトサン分散対集合を、組織像で評価した。例えば、ローダミン-キトサントレーサを含んだハイブリッドクロットを、10％中性緩衝ホルマリン（NBF）中で固定し、厚いカミソリ刃部をエピフルオレセンス（ｅｐｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）顕微鏡で観察した。ハイブリッドクロットを10％NBF（中性緩衝ホルマリン）中で固定し、5μmのパラフィン断面をサフラニンO/Fast グリーン染色（Safranin O/Fast Green staining）のため集めた。上記基準６のとおり、上記ポリマーおよび血液成分の相分離なしに良好な混合が達成され、最良のin vivo応答とタイムリーな生分解性が確保されるものではならない。
【００８３】
調剤のペースト状特性を、流れ易さ（流れ）テストで評価した。この流れ易さは各調剤の30μLの液滴を、再形成の直後に或る角度（38度）に固定したプラスチックの硬質片上に置き、一定時間で写真を撮ることにより評価した。上記基準７のとおり、この混合物は適当な取扱い特性、つまり、組織修復への用途のためには粘性でペースト状であること、関節内粘性補充の場合は粘性懸濁液でなければならない。
【００８４】
調剤の取扱い特性は、半月板欠損モデルにおいてex vivoでテストした。例えば、真直ぐな剃刀刃を使用し、ブタ半月板から〜0.5mmの断面をとり、この半月板の大腿骨（上部）表面に向けて水平フラップを形成させた。4mmの生検パンチ（punch）を使用し、この半月板の脛骨（底部）表面に向けて部分的厚みの欠損を形成させた。この半月板を高湿度のプラスチックフィルム内に包み、この実験の開始前少なくとも30分間37℃で配置させた。PRPで再形成した凍結乾燥キトサン調剤を、20ゲージ針を装着した注射器を使用して上記の部分的厚みの半月板欠損部に注射し、上記フラップを直ちに閉じた。上記半月板を、湿ったプラスチックフィルムを用いて直ちに再度包み閉じ、37℃で1時間置いた。上記半月板を10％NBF内に固定し、厚いカミソリ刃部をエピフルオレセンス顕微鏡で観察した。パラフィン断面をサフラニンO/Fast グリーンで染色した。
【００８５】
調剤の取扱い特性を、軟骨欠損モデルにおいてex vivoでテストした。生検パンチ（8mm径）およびフラットな手術用ブレードを使用してブタ関節丘および骨滑車内に軟骨欠損を形成させた。上記関節部をこの実験の開始前少なくとも30分間37℃で湿ったチャンバー内に置いた。PRP中に再形成させた凍結乾燥キトサン調剤を、20ゲージ針を装着した注射器を使用して、上記軟骨欠損部に注射した。上記関節部を湿ったチャンバー内で直ちに封止し、37℃で1時間置いた。ついで、この関節部を、クロットがin situで発生したか否かを判定するため検査した。
【００８６】
他の実施例において、凍結乾燥調剤のin vivo切開をテストするため、3.5mm X 4.5mmの軟骨欠損を、2匹の19月齢のNZWラビットの骨滑車内に左右相称（ｂｉ−ｌａｔｅｒａｌｌｙ）に形成させた。0.9mmのドリルビットを用い、４つのマイクロドリルホールを軟骨下骨を通って約4mmの深さまで貫通させた。自己PRPを手術直前に抽出したラビットの血液から用意した。この欠損の形成後、凍結乾燥キトサンケーキを、ビーズ混合法を使用して1mLのPRPで再形成させ、インプラント（1懸滴）を上記欠損部上に送出させ、膝を閉じる前〜5分間 in situで固化させた。反対側の膝上にて、凍結乾燥キトサンを、再形成および送出の直前に採血した1mLの新鮮な血液と混合させた。インプラント在留を10日目および21日目に評価した。
【００８７】
他の実施例において、幾つかの異なるキトサン調剤の同時テストを許容にする第2のラビットモデルを使用してin vivo生分解性をテストした。自己PRPを、手術直前に抽出したラビットの血液から用意した。各凍結乾燥ケーキを、ビーズ混合法を使用せずに300μLのPRP中で再形成させ、SubQ針を備えた注射器を用いてラビットの背中に皮下注射した。対照はキトサンを含まないカルシウム再沈着（ｒｅｃａｌｃｉｆｉｅｄ）させたPRPであった。インプラント在居性および細胞補充は、注射後1、3、7および14日目に評価した。
【００８８】
他の実施例において、ヒツジ半月板修復モデルを使用して、ハイブリッドインプラント保持および半月板組織修復に対するインプラントの作用についてテストした。凍結乾燥キトサンのハイブリッドインプラント、クロット活性化剤、凍結乾燥保護剤および自己PRPを、手術により作られた半月板欠損部に注射した。インプラント保持は１日目に評価し、組織修復は手術後21日目に評価した。
【００８９】
他の実施例において、慢性軟骨修復モデルをラビットに発生させ、それを骨軟骨修復に対するハイブリッドインプラントの作用をテストするのに使用した。NZWラビットの骨滑車に外科的欠損を形成させ、慢性ステージまで進行させた。この外科的欠損を凍結乾燥キトサン、クロット活性化剤、凍結乾燥保護剤および自己PRPからなるハイブリッドインプラントで治療した。治癒は手術後21日目に評価した。
実施例１
１−キトサン調剤の調製
【００９０】
凍結乾燥保護剤又は緩衝剤（バッファ）なしの調剤：
重量平均分子量Mw 500kDaのキトサン（特許文献１０９に記載されているGPCにより測定）および80.6% DDAをHCl中に、室温で一晩溶解させ、最終キトサン濃度、0.56%又は0.67%（w/v）のものを得た。これら溶液を10分間、オートクレーブ処理し、氷上で冷却した。オートクレーブ処理後のキトサンMwは319-403kDaであった。凍結乾燥のため個々の10mLバイアル（ガラス瓶）に分配する前にオートクレーブ処理した5MのNaClおよびフィルター滅菌した270mMのCaCl２を必要に応じて添加した。
【００９１】
凍結乾燥保護剤およびバッファを伴う調剤：
キトサン（Mw 500kDa、80.6% DDA）をHCl中に、室温で一晩溶解させ、最終キトサン濃度、0.56%又は0.67%（w/v）のものを得た。オートクレーブ処理した20%（w/v）スクロース又は20%（w/v）トレハロースを必要に応じて添加した。これら溶液を10分間、オートクレーブ処理し、氷上で冷却した。オートクレーブ処理後のキトサンMwは342-421kDaであった。凍結乾燥のため個々の10mLバイアルに分配する前にフィルター滅菌した270mMのCaCl２および在庫（stock）L-ヒスチジン200mMを必要に応じて添加した。
【００９２】
表1および2の通り、HCl濃度を調節し、全ての調剤が理論的目標のpH 6.6を有するものとした。ケーキ内の全体的モノマー含量とマッチするようにヒスチジンバッファ濃度を調節した。凍結乾燥保護剤の濃度を調整し全ての調剤が理論的モル浸透圧濃度（オスモル濃度）350mOsmを有するものとした。
２−凍結乾燥サイクル
【００９３】
凍結乾燥サイクルは：１）1時間をかけて−40℃まで傾斜凍結を行い、ついで−40℃の等温で2時間おこなう；２）−40℃で48時間；３）12時間をかけて30℃まで傾斜加熱を行い、ついで300ミリトールで30℃の等温加熱を6時間行う。
【００９４】
表１．クロット活性化剤（CaCl２）を含有する調剤であって、PRPで直接再形成される。
[表１]
0006721514.tif 000002
１最終ハイブリッド：キトサン(0.56%)-HCl(12mM)-NaCl(130mM)- CaCl２(45mM)-PRP
２最終ハイブリッド：キトサン(0.56%)-HCl(12mM)-スクロース (184mM)-CaCl２(45mM)-PRP
3最終ハイブリッド：キトサン(0.56%)-HCl(12mM)-トレハロース(185mM)-CaCl２(45mM)-PRP
4最終ハイブリッド：キトサン(0.56%)-HCl(12mM)-スクロース (152mM)-ヒスチジン(33mM)-CaCl２(45mM)-PRP
5最終ハイブリッド：キトサン(0.56%)-HCl(12mM)-トレハロース(183mM)-ヒスチジン(33mM)-CaCl２(45mM)-PRP
【００９５】
表２．PRPで直接再形成した後、CaCl２で活性化される調剤。
[表２]
0006721514.tif 000003
１最終ハイブリッド：キトサン(0.56%)-HCl(12mM)-NaCl(167mM)-CaCl２(45mM)-PRP
２最終ハイブリッド：キトサン(0.56%)-HCl(12mM)-スクロース (244mM)-CaCl２(45mM)-PRP
3最終ハイブリッド：キトサン(0.56%)-HCl(12mM)-トレハロース(247mM)-CaCl２(45mM)-PRP
4最終ハイブリッド：キトサン(0.56%)-HCl(12mM)-スクロース (208mM)-ヒスチジン(39mM)-CaCl２(45mM)-PRP
5最終ハイブリッド：キトサン(0.56%)-HCl(12mM)-トレハロース(209mM)-ヒスチジン(39mM)-CaCl２(45mM)-PRP
３−ケーキ外観
【００９６】
ケーキ外観は、−（収縮、シート状又はひび割れ）ないし３＋（均質の固体状の分厚い形）で点数づけされた。２＋又は３＋の点数のケーキは許容し得るものと思われた。
【００９７】
NaClを含有する調剤は不均一な表面を有し、調剤#１は凍結乾燥の間に可なり収縮した。ヒスチジンバッファ（33ないし39mM）を含有する調剤はひび割れし、不均一な表面を有していた。
【００９８】
CaCl２を伴い又は伴わずにスクロース又はトレハロース含有する調剤は平滑な均一の白色表面を有し、頂部で僅かな凹みがあった。凍結乾燥保護剤の存在は機械的に安定なケーキを得るのを助けた。
４−ラビットPRPの単離
【００９９】
全血をNZWラビットから抽出し、酸性クエン酸デキストロース（ACD）抗凝固剤と混合した（1.5mLのACDに対し8.5mLの血液）。
【０１００】
上記血液をACE E-Z PRPTM遠心分離機内で、160ｇで10分間、室温で遠心分離した。
【０１０１】
血漿および軟膜を含有する上澄液並びに最初の1−2mmの赤血球層を、10mLの注射器に取着した2.5インチ（18ゲージ）鈍針を用いて除去した。
【０１０２】
多血小板血漿（PRP）を貧血小板血漿（PPP）から分離するため、血漿および軟膜を更に室温、400ｇで10分間遠心分離した。
５−ケーキ再形成
【０１０３】
ケーキを1mLのPRP単独で再形成し（調剤#３ないし６）、又は1mLのPRPで再形成しこれを200μLの3％（w/v）CaCl２で活性化した（調剤#２、７および８）。
【０１０４】
２つの異なる混合方法をテストした。すなわち、上記バイアルを10秒間渦巻きを生じさせ、針を備えた注射器で2度吸引吐出を行うか、あるいは３つの0.39gのステンレス鋼ビーズを用い10秒間混合させた。
【０１０５】
テストした双方の混合方法において、未溶解のキトサン粒子が再形成後に観察された（図１Ａ１および１Ａ２）。
６−液体発現
【０１０６】
PRP中で再形成した調剤を37℃でガラス管内に分配した。60分後、液体発現およびハイブリッドクロットからの容積損失を重量測定により定量した。
【０１０７】
テストした全ての調剤にクロットが生じた。クロット活性化剤を凍結乾燥ケーキに直接添加することができる。
【０１０８】
全てのハイブリッドクロットは、PRP単独よりも少ない液体を発現した（図１Ｂ１）。
７−クロット均質性
【０１０９】
ハイブリッドクロットを10%NBF内で固定し、パラフィン断面をサフラニンO/Fast グリーンで染色し、該クロット内でのキトサンの分散を評価した。
【０１１０】
キトサン集塊は、上記調剤のいずれについてもハイブリッドクロット全体に亘って分散していなかった（図１Ａ３および１Ａ４）。
８−in vivo軟骨修復モデル
【０１１１】
２つの調剤（#３および#４）をラビット軟骨修復モデルにおいてin vivoでテストした。
【０１１２】
3.5mm X 4.5mmの軟骨欠損を、2匹の19月齢のNZWラビットの骨滑車内に左右相称に形成させた。４つのマイクロドリルホールを軟骨下骨貫通により形成させ、0.9mmのドリルビットを〜4mmの深さまで貫通させた。
【０１１３】
４−ラビットPRPの単離の上記項目に記載したように、自己PRPを手術直前に抽出したラビットの血液から用意した。この欠損の形成後、凍結乾燥キトサンケーキを、ビーズ混合法を使用して1mLのPRPで再形成させ、インプラント（1懸滴）を上記欠損部上に送出させ、膝を閉じる前〜5分間 in situで固化させた。
【０１１４】
反対側の膝上にて、凍結乾燥キトサンを、再形成および送出の直前に採血した1mLの新鮮な血液と混合させた。
【０１１５】
手術後10日目で、凍結乾燥キトサン/PRPハイブリッドインプラントを、マイクロドリルホールの表面で、炎症性浸潤と共に観察した（図1Ｂ２）。ハイブリッドインプラントは手術後21日目までにクリアされた。
【０１１６】
表３．10の異なる調剤のパーフォーマンス。
[表３]
0006721514.tif 000004
【０１１７】
実施例１においては、貯蔵および出荷のため機械的に安定なケーキを得るために凍結乾燥保護剤が必要であるが、ケーキに緩衝剤を添加すると表面にひび割れを誘起する。上記クロット活性化剤は凍結乾燥ケーキに直接添加し、in situでの上記キトサン/PRP混合物の凝固を誘導してもよい。しかし、高分子キトサンで作られた凍結乾燥ケーキはPRP中では容易、かつ完全に溶解しなかった。凍結乾燥キトサン/PRPハイブリッドは急性ラビット軟骨欠損モデルへのインプラントの際に慢性炎症を誘起させることはなく、生体内（in vivo）で21日までにクリアにされた。 
実施例２
１−キトサン調剤の調製
【０１１８】
数平均分子量Mn 211kDaのキトサン（非特許文献１０９に記載されているGPCにより測定）および80.6% DDAをHCl中に、室温で一晩溶解させ、最終キトサン濃度、0.56%又は0.42%（w/v）のものを得た。これら溶液を10分間、オートクレーブ処理し、氷上で冷却した。オートクレーブ処理後のキトサンMnは112-160kDaであった。オートクレーブ処理した20%（w/v）スクロース、20%（w/v）トレハロースおよび5MのNaClおよびフィルター滅菌した270mMのCaCl2を必要に応じて添加した。凍結乾燥のため個々の10mLバイアル（ガラス瓶）に分配する前にフィルター滅菌ローダミン-キトサントレーサ（Mn 143kDa, 80.0% DDA）を添加した。
【０１１９】
表４の通り、HCl濃度を調節し、全ての調剤が理論的目標のpH 6.45を有するものとした。NaCl濃度を調節し、全ての調剤が理論的モル浸透圧濃度（オスモル濃度）350mOsmを有するものとした。凍結乾燥保護剤の濃度を1ないし10%（w/v）の範囲に調整した。
２−凍結乾燥サイクル
【０１２０】
凍結乾燥サイクルは：１）1時間をかけて−40℃まで傾斜凍結を行い、ついで−40℃の等温で2時間おこなう；２）−40℃で48時間；３）12時間をかけて30℃まで傾斜加熱を行い、ついで100ミリトールで30℃の等温加熱を6時間行う。
【０１２１】
表４．クロット活性化剤（CaCl２）を含有する調剤であって、PRPで直接再形成される。
[表４]
0006721514.tif 000005
0006721514.tif 000006
0006721514.tif 000007
３−ケーキ外観
【０１２２】
キトサンのみを含有する調剤はシート状であった（図２Ａ１）。NaClのみを含有する調剤は凍結乾燥の間に可なり収縮した。
【０１２３】
2%（w/v）以上のスクロース又はトレハロースを含有する調剤は、より嵩高であり、機械的安定なクロットを得るには凍結乾燥保護剤が必要なことが確認された。ケーキは、凍結乾燥保護剤濃度を増加させたとき最も嵩高となった（図２Ａ２）。
４−ラビットPRPの単離
【０１２４】
全血をArcottクロスヒツジから抽出し、酸性クエン酸デキストロース（ACD）抗凝固剤と混合した（1.5mLのACDに対し8.5mLの血液）。
【０１２５】
上記血液をACE E-Z PRPTM遠心分離機内で、160ｇで10分間、室温で遠心分離した。
【０１２６】
血漿および軟膜を含有する上澄液並びに最初の1−2mmの赤血球層を、10mLの注射器に取着した2.5インチ（18ゲージ）鈍針を用いて除去した。
【０１２７】
多血小板血漿（PRP）を貧血小板血漿（PPP）から分離するため、血漿および軟膜を更に室温、400ｇで10分間遠心分離した。
５−ケーキ再形成
【０１２８】
ケーキを1mLのPRPで再形成し、３つの0.39gのスチールビーズ（ｓｔｅｅｌ  ｂｅaｄｓ）を用いて10秒間混合した。各ケーキをテストするため、2つの異なるヒツジドナーを使用した。
【０１２９】
未溶解のキトサン粒子が再形成後に観察された。
６−トロンボエラストグラフィ（TEG）
【０１３０】
各調剤360μLを、混合直後にTEGカップ内に充填し、TEGトレーシング（tracings）を1時間記録した。
【０１３１】
キトサンのみを含有する調剤は再現的にクロットを生じさせるものではなかった。
【０１３２】
クロティング（clotting）はNaClのみを含有する調剤については抑制された。
【０１３３】
2%（w/v）のスクロース又はトレハロースを含有する調剤は、正常に凝固し、クロット反応時間（R）は9-18分の範囲であり、最大広さ（MA）は55mmないし75mmの範囲であった（図２Ｂ１）。
【０１３４】
8%（w/v）のスクロース又はトレハロースを含有する調剤については、８つのケースのうち、３つのケースにおいてクロティングが抑制された。他の５つのケースについて、14mmないし20mmの範囲の減少した最大広さ（MA）が観察された（図２Ｂ２）。
【０１３５】
10%（w/v）のスクロース又はトレハロースを含有する調剤については、８つのケースのうち、５つのケースにおいてクロティングが抑制された（図２Ｂ３）。他の３つのケースについて、9mmないし24mmの範囲の減少した最大広さ（MA）が観察された。
６−液体発現
【０１３６】
PRP中で再形成した調剤を37℃でガラス管内に分配した。60分後、液体発現およびハイブリッドクロットからの容積損失を重量測定により定量した。
【０１３７】
テストした全てのハイブリッドクロットは、PRP単独よりも少ない液体を発現した。
７−クロット均質性
【０１３８】
ハイブリッドクロットを10%NBF内で固定し、厚いカミソリ刃部をエピフルオレセンス顕微鏡で観察し、クロット内のキトサンの分散を評価した。
【０１３９】
キトサン集塊はスクロース又はトレハロースを含有するハイブリッドクロット全体に亘って分散することはなかった（図２Ａ３および図２Ａ４）。分散は凍結乾燥保護剤のない調剤において良好であった。
【０１４０】
表５．28の異なる調剤のパーフォーマンス。
[表５]
0006721514.tif 000008
【０１４１】
実施例２において、凍結乾燥保護剤の濃度増加は、ケーキの機械的安定性を改善させるが、キトサン/ PRP混合物の凝固も抑制するものである。高分子量キトサンを含有する凍結乾燥ケーキは、PRP内で容易かつ完全に溶解することはない。
実施例３
１−キトサン調剤の調製
【０１４２】
キトサン（Mn 211kDa、80.6% DDA）をHCl中に、室温で一晩溶解させ、最終キトサン濃度、0.56%（w/v）のものを得た。これら溶液を10分間、オートクレーブ処理し、氷上で冷却した。オートクレーブ処理後のキトサンMnは151および162kDaであった。オートクレーブ処理した20%（w/v）トレハロースおよび5MのNaCl並びにフィルター滅菌した270mMのCaCl2を必要に応じて添加した。凍結乾燥のため個々の10mLバイアルに分配する前にフィルター滅菌ローダミン-キトサントレーサ（Mn 143kDa, 80.0% DDA）を添加した。
【０１４３】
表６の通り、HCl濃度を調節し、全ての調剤が理論的目標のpH 6.45を有するものとした。NaCl濃度を調節し、これら調剤が理論的モル浸透圧濃度（オスモル濃度）350mOsmを有するものとした。凍結乾燥保護剤の濃度を調剤#２について2%（w/v）に設定した。
【０１４４】
凍結乾燥サイクルは、実施例２の章２-凍結乾燥サイクルに記載したものと同じであった。
【０１４５】
表６．クロット活性化剤（CaCl２）を含有し、PRPで直接再形成される凍結乾燥調剤。
[表６]
0006721514.tif 000009
１最終ハイブリッド：キトサン(0.56%)-HCl(14mM)-NaCl(130mM)- CaCl２(42.2mM)-PRP
２最終ハイブリッド：キトサン(0.56%)-HCl(12mM)-トレハロース (48mM)-CaCl２(42.2mM)-PRP
２−ヒトPRPの単離
【０１４６】
全血をヒトドナーから採血し、3.8%（w/v）のクエン酸三ナトリウム二水和物溶液と混合した（1mLのクエン酸ナトリウムに対し9mLの血液）。
【０１４７】
上記血液をACE E-Z PRPTM遠心分離機内で、160ｇで10分間、室温で遠心分離した。
【０１４８】
血漿および軟膜を含有する上澄液並びに最初の1−2mmの赤血球層を、10mLの注射器に取着した2.5インチ（18ゲージ）鈍針を用いて除去した。
【０１４９】
多血小板血漿（PRP）を貧血小板血漿（PPP）から分離するため、血漿および軟膜を更に室温、400ｇで10分間遠心分離した。
３−ケーキ外観
【０１５０】
NaClのみを含有する調剤は凍結乾燥の間に可なり収縮した。
【０１５１】
2%（w/v）のトレハロースを含有する調剤は機械的に安定であり、パーフォーマンス基準１に適合するものであった。
４−ケーキ再形成
【０１５２】
ケーキを1mLのPRPで再形成し、３つの0.39gのステンレス鋼ビーズを用い10秒間混合を行った。
【０１５３】
未溶解のキトサン粒子が再形成後に観察された。
５−液体調剤の製造と混合
【０１５４】
凍結乾燥調剤と並行して液体キトサン調剤もテストのため用意した（表７）。これら溶液を10分間、オートクレーブ処理し、氷上で冷却した。オートクレーブ処理後のキトサンMnは145kDa および163kDaであった。
【０１５５】
400μLの液体キトサン調剤を800μLのPRPと混合し、240μLの3％（w/v）CaCl２で活性化させた。
【０１５６】
表７． PRPと混合され、クロット活性化剤（CaCl２）で活性化される液体調剤。
[表７]
0006721514.tif 000010
１最終ハイブリッド：キトサン(0.56%)-HCl(14mM)-NaCl(42mM)- CaCl２(45mM)-PRP
２最終ハイブリッド：キトサン(0.56%)-HCl(14mM)-トレハロース (48mM)-CaCl２(45mM)-PRP
６−クロット均質性
【０１５７】
再形成した凍結乾燥調剤および液体調剤を37℃でガラス管内に分配し、1時間凝固させた。
【０１５８】
ハイブリッドクロットを10％NBF中で固定し、厚いカミソリ刃部をエピフルオレセンス顕微鏡で観察し、クロット中のキトサン分散を評価した。
【０１５９】
キトサン集塊は、凍結乾燥ハイブリッドクロット全体に亘って分散していなかった（図３Ａ１および３Ａ２）。
【０１６０】
液体溶液で作られたハイブリッドクロット内においては、キトサンは良好に分散した（図３Ａ３および３Ａ４）。
（７−半月板欠損内のex vivoインプランティーション（移植））
【０１６１】
真直ぐな剃刀刃を使用し、ブタ半月板から〜0.5mmの断面をとり、この半月板の大腿骨（上部）表面に向けて水平フラップを形成させた。
【０１６２】
4mmの生検パンチ（punch）を使用し、この半月板の脛骨（底部）表面に向けて部分的厚みの欠損を形成させた。
【０１６３】
この半月板を高湿度のプラスチックフィルム内に包み、この実験の開始前少なくとも30分間37℃で配置させた。
【０１６４】
再形成した凍結乾燥調剤および液体調剤を、20ゲージ針を装着した注射器を使用して上記の部分的厚みの半月板欠損部に注射し、上記フラップを直ちに閉じた。
【０１６５】
上記半月板を、湿ったプラスチックフィルムを用いて直ちに再度包み、閉じ、37℃で1時間置いた。
【０１６６】
凍結乾燥キトサン/ PRPおよび液体調剤を、これらがin situで凝固した半月板欠損部内にex vivoで成功裡にインプラントした。
【０１６７】
ブタの半月板を10％NBF内に固定し、厚いカミソリ刃部をエピフルオレセンス顕微鏡で観察し、クロット内のキトサンの分散を評価した。
【０１６８】
凍結乾燥調剤については、キトサンは凝結し、上記半月板欠損部全体に分散しなかった（図３Ｂ１および３Ｂ２）。
【０１６９】
液体調剤については、キトサンは上記半月板欠損部内に良好に分散した（図３Ｂ３および３Ｂ４）。
【０１７０】
表８．２つの異なる凍結乾燥調剤のパーフォーマンス。
[表８]
0006721514.tif 000011
【０１７１】
実施例３において、キトサンの液体調剤はPRPと容易に混合できるが、PRP中における凍結乾燥キトサンの再形成は、より困難である。高分子量のキトサンを含有する凍結乾燥ケーキはPRP中では容易かつ完全に溶解しなかったが、標準的手術室装置を使用して半月板欠損モデルにおいてex vivoで依然としてインプラントすることがでるであろう。
実施例４
１−キトサン調剤の調製
【０１７２】
キトサンMn〉100 kDaを有する調剤：
キトサン（Mn 211kDa、80.6% DDAおよびMn 105kDa、81.2% DDA）をHCl中に、室温で一晩溶解させ、最終キトサン濃度、0.56%（w/v）のものを得た。これら溶液を10分間、オートクレーブ処理し、氷上で冷却した。フィルター滅菌した15%（w/v）トレハロース、15%（w/v）マンニトール、270mMのCaCl2、在庫L-ヒスチジンバッファー55mM pH6.5(10mLの0.017%w/v L-ヒスチジンおよび10mLのHCl 30mMを混合することにより作った)およびオートクレーブ処理した5MのNaClを必要に応じて添加した。凍結乾燥のため個々の3mLバイアルに分配する前にフィルター滅菌ローダミン-キトサントレーサ（Mn 110kDa, 80.2% DDA）を添加した。
【０１７３】
キトサンMn〈100 kDaを有する調剤：
キトサン（Mn 38kDa、82.5% DDA、およびMn 11kDa、84.4% DDAおよびMn 4kDa、80.2% DDA）をHCl中に、室温で一晩溶解させ、最終キトサン濃度、0.56%（w/v）のものを得た。これら溶液をフィルター滅菌した。フィルター滅菌した15%（w/v）トレハロース、15%（w/v）マンニトール、270mMのCaCl2、5MのNaClおよび在庫L-ヒスチジンバッファー55mM pH6.5(10mLの0.017%w/v L-ヒスチジンおよび10mLのHCl 30mMを混合することにより作った)を必要に応じて添加した。凍結乾燥のため個々の3mLバイアルに分配する前にフィルター滅菌ローダミン-キトサントレーサ（Mn 40kDa, 80.0% DDA又はMn 10kDa, 81.9% DDA）を添加した。
【０１７４】
表９の通り、HCl濃度を調節し、全ての調剤がHCl：グルコサミン比が0.6となるようにした。NaCl濃度を調節し、調剤が理論的モル浸透圧濃度（オスモル濃度）350mOsmを有するものとした。より低い濃度のヒスチジン（先の実施例における33-39mMに対し3.8mM）を選択し、ケーキの割れを防止した。凍結乾燥保護剤の濃度を2%又は6%（w/v）に設定した。これは安定なケーキを提供するに十分なものであるが、凝固を妨げないものである。
【０１７５】
凍結乾燥サイクルは実施例２の章２−凍結乾燥サイクルに記載したものと同じとした。
【０１７６】
表９．クロット活性化剤（CaCl２）を含有し、PRPで直接再形成される凍結乾燥調剤。
[表９]
0006721514.tif 000012
２−ケーキ外観
【０１７７】
凍結乾燥保護剤なしの調剤は凍結乾燥の間に可なり収縮した。
【０１７８】
3.8mMの濃度で使用したヒスチジンバッファーは、33-39mMのより高い濃度の実施例１で見られたようなケーキの割れを誘起することはなかった。
【０１７９】
濃度を増大させた凍結乾燥保護剤を使用したとき、ケーキは最も嵩高となった。マンニトールを含有するケーキは、トレハロースを含有するケーキよりも、より嵩高であった（図４Ａ１および４Ａ２）。
３−ケーキ再形成
【０１８０】
前記実施例３の章２−ヒトPRPの単離のところで記載したのと同様にして、ヒトPRPおよびPPPを抽出した。
【０１８１】
ケーキを1mLのPRP又は1mLのPPPで再形成し、３つの0.39gのステンレス鋼ビーズを用い10秒間混合を行った。
【０１８２】
中間および低いMnのキトサンは、より高いMnのキトサンよりも良好に溶解した。これは特に凍結乾燥保護剤が存在したときにそうであった。
４−液体発現
【０１８３】
PRP中で再形成した調剤を37℃でガラス管内に分配した。60分後、ハイブリッドクロットからの液体発現を重量測定により定量した。
【０１８４】
これら全てのハイブリッドクロットは、PRP単独よりも少ない液体を発現した。
５−クロット均質性
【０１８５】
ハイブリッドクロットを10%NBF内で固定し、厚いカミソリ刃部をエピフルオレセンス顕微鏡で観察し、クロット内のキトサンの分散を評価した。
【０１８６】
キトサンは高いMnのキトサンで作られた殆んどのハイブリッドクロットにおいて凝固した（図４Ｂ１および図４Ｂ２）。
【０１８７】
中間のMnのキトサンを使用したときに、殆んどのハイブリッドクロットにおいてキトサンの分散は良好であった（図４Ｂ３および図４Ｂ４）。
【０１８８】
最も低いMnのキトサンを使用したとき、PRP中に存在する赤血球がこのクロットの底部に向けて沈降し、クロット表面にキトサンの帯域を残した（図４Ｂ５および図４Ｂ６）。
６−半月板欠損内のex vivoインプランティーション（移植）
【０１８９】
前記実施例３の章７−半月板欠損内のex vivoインプラントのところで記載したのと同様にして、凍結乾燥キトサン/ PRP調剤を、これらがin situで凝固した半月板欠損部内に、ex vivoで成功裡にインプラントすることができた。
【０１９０】
表１０．30の異なる調剤のパーフォーマンス。
[表１０]
0006721514.tif 000013
【０１９１】
実施例４において、キトサンの分子量を減少させることにより、PRP中のケーキ溶解度が改善されたが、中間の分子量（Mn 38kDa）のキトサンのみが、何らの相分離（より低い分子量で生じる）又は凝集（より高い分子量で生じる）を生じさせることなく均質なキトサン/ PRPハイブリッドクロットを生じさせた。
実施例５
１−キトサン調剤の調製
【０１９２】
中間Mnのキトサン（Mn 56kDa、80.1% DDAおよびMn 32kDa、81.2% DDA）をHCl中に、室温で一晩溶解させ、最終キトサン濃度、0.56%、1%又は2%（w/v）のものを得た。これら溶液をフィルター滅菌した。フィルター滅菌した15%（w/v）トレハロース、15%（w/v）マンニトールおよび270mMのCaCl2を必要に応じて添加した。凍結乾燥のため個々の3mLバイアルに分配する前にフィルター滅菌ローダミン-キトサントレーサ（Mn 40kDa, 80.0% DDA）を添加した。
【０１９３】
表１１の通り、HCl濃度を調節し、全ての調剤がHCl：グルコサミン比が0.6となるようにした。凍結乾燥保護剤の濃度を2%又は6%（w/v）に設定した。これは安定なケーキを提供するに十分なものであるが、凝固を妨げないものである。
【０１９４】
凍結乾燥サイクルは実施例２の章２−凍結乾燥サイクルに記載したものと同じとした。
【０１９５】
表１１．クロット活性化剤（CaCl２）を含有し、PRPで直接再形成される凍結乾燥調剤。
[表１１]
0006721514.tif 000014
0006721514.tif 000015
２−ケーキ外観
【０１９６】
濃度を増大させた凍結乾燥保護剤を使用したとき、ケーキは最も嵩高となった。マンニトールを含有するケーキは、トレハロースを含有するケーキよりも、より嵩高であった。
３−ケーキ再形成
【０１９７】
前記実施例３の章２−ヒトPRPの単離のところで記載したのと同様にして、2人の異なるヒトドナーからヒトPRPおよびPPPを抽出した。
【０１９８】
ケーキを1mLのPRP又は1mLのPPPで再形成し、３つの0.39gのステンレス鋼ビーズを用い10秒間混合を行った。
【０１９９】
2%（w/v）のキトサンを含有する調剤は良く溶解することはなかった。
【０２００】
より低いMnのキトサン（32kDa）を含有するケーキは、0.56%および1%（w/v）の双方のキトサン濃度において、より高いMnのキトサンを含有するケーキと比較して、より容易に再形成することができた。
４−トロンボエラストグラフィ（TEG）
【０２０１】
各調剤360μLを、混合直後にTEGカップ内に充填し、TEGトレーシングを1時間記録した。
【０２０２】
0.56%（w/v）のキトサンMn 32kDaを含有する調剤は、PRP単独の対照と同様に、1-相様式でクロットを生じさせた（図５Ｂ１）。
【０２０３】
キトサンのMn又は濃度を増加させることにより、TEGトレーシングから明らかなように2-相凝固メカニズムが誘起された（図５Ｂ２および５Ｂ３）。
【０２０４】
全ての場合において、6%（w/v）の凍結乾燥保護剤を添加することにより、2%（w/v）の凍結乾燥保護剤を添加した場合（51-84mmの範囲のMA）と比較して、より低い最大広さ（24-61mmの範囲のMA）を有する、より柔らかなクロットが与えられた。
５−流れ易さテスト
【０２０５】
流れ易さは、各調剤の30μLの液滴を、再形成の直後に或る角度（38度）に固定したプラスチックの硬質片上に置き、一定時間で写真を撮ることにより評価した。
【０２０６】
キトサンの濃度を増加させることにより、調剤のペースト状特性が改善された（図５Ａ１と５Ａ２を比較）。キトサンのMnを増加させることにより、調剤のペースト状特性が改善された（図５Ａ１と５Ａ３を比較）。
【０２０７】
表１２．２４の異なる調剤のパーフォーマンス。
[表１２]
0006721514.tif 000016
【０２０８】
実施例５において、キトサンの濃度又はキトサンのMnを増加させることにより、調剤のペースト状特性を改善させることができる。中間の分子量のキトサンを含有する凍結乾燥ケーキは、キトサンの濃度が2%（w/v）未満であれば、PRP中で容易に再形成させることができる。
実施例６
１−キトサン調剤の調製
【０２０９】
５つの異なる中間Mnのキトサン（Mn 56kDa、80.1% DDA；Mn 56kDa、81.8% DDA；Mn 32kDa、81.2% DDA；Mn 30kDa、81.0% DDAおよびMn 28kDa、80.5% DDA）をHCl中に、室温で一晩溶解させ、最終キトサン濃度、1%（w/v）のものを得た。これら溶液をフィルター滅菌した。フィルター滅菌した15%（w/v）トレハロース、15%（w/v）マンニトールおよび270mMのCaCl2を必要に応じて添加した。凍結乾燥のため個々の3mLバイアルに分配する前にフィルター滅菌したローダミン-キトサントレーサ（Mn 40kDa, 80.0% DDA又はMn 110kDa, 80.2% DDA）を添加した。
【０２１０】
表１３の通り、HCl濃度を調節し、全ての調剤がHCl：グルコサミン比が0.6となるようにした。凍結乾燥保護剤の濃度を2%又は6%（w/v）に設定した。これは安定なケーキを提供するに十分なものであるが、凝固を妨げないものである。
【０２１１】
凍結乾燥サイクルは実施例２の章２−凍結乾燥サイクルに記載したものと同じとした。
【０２１２】
表１３．クロット活性化剤（CaCl２）を含有し、PRPで直接再形成された調剤。
[表１３]
0006721514.tif 000017
0006721514.tif 000018
２−ケーキ外観
【０２１３】
濃度を増大させた凍結乾燥保護剤を使用したとき、ケーキは最も嵩高となった。マンニトールを含有するケーキは、トレハロースを含有するケーキよりも、より嵩高であった（図６Ａ１および６Ａ２）。
３−ケーキ再形成
【０２１４】
前記実施例３の章２−ヒトPRPの単離のところで記載したのと同様にして、ヒトPRPおよびPPPを抽出した。
【０２１５】
ケーキを1mLのPRP又は1mLのPPPで再形成し、３つの0.39gのステンレス鋼ビーズを用い10秒間混合を行った。
【０２１６】
全ての調剤は良く溶解し、パーフォーマンス基準２に適合した。
４−トロンボエラストグラフィ（TEG）
【０２１７】
各調剤360μLを、混合直後にTEGカップ内に充填し、TEGトレーシングを1時間記録した。
【０２１８】
全ての調剤において、TEGトレーシングから明らかなように2-相凝固メカニズムが誘起された（図６Ｂ１および６Ｂ２）。
【０２１９】
全ての場合において、6%（w/v）の凍結乾燥保護剤を添加することにより、2%（w/v）の凍結乾燥保護剤を添加した場合（68-79mmの範囲のMA）と比較して、より低い最大広さ（37-67mmの範囲のMA）を有する、より柔らかなクロットが与えられた。
５−流れ易さテスト
【０２２０】
流れ易さは、各調剤の30μLの液滴を、再形成の直後に或る角度（38度）に固定したプラスチックの硬質片上に置き、一定時間で写真を撮ることにより評価した。
【０２２１】
PRP単独と比較して、全ての調剤はペースト状特性を有していた（図６Ｃ１）。
６−液体発現
【０２２２】
PRP中で再形成した調剤を37℃でガラス管内に分配した。60分後、ハイブリッドクロットからの液体発現を重量測定により定量した。
【０２２３】
これら全てのハイブリッドクロットは、PRP単独よりも少ない液体を発現した（図６Ｂ３）。
７−クロット均質性
【０２２４】
ハイブリッドクロットを10%NBF内で固定し、厚いカミソリ刃部をエピフルオレセンス顕微鏡で観察し、クロット内のキトサンの分散を評価した。
【０２２５】
全ての調剤において、ハイブリッドクロット全体に亘ってキトサンは分散した（図６Ａ３および図６Ａ４）。
８−破砕テスト
【０２２６】
クロット化（clotting）1時間後、各ハイブリッドクロットを破砕テストに供し、機械的強度を記録した。
【０２２７】
０＝クロットは、分解させることなく取り扱うことはできなかった。
【０２２８】
＋＝クロットは容易に破壊され、破砕された外観は多数の断片からなっていた（5を超える断片）。
【０２２９】
＋＋＝クロットは比較的硬く、破砕された外観は多数の断片からなっていた（3ないし5の断片）。
【０２３０】
＋＋＋＝クロットは硬く、かつ弾性を有し、破砕された外観は２−３の断片からなっていた。
【０２３１】
＋＋＋＋＝クロットは硬く、かつ弾性を有し、破砕された外観は２つの断片からなるもの（時折、依然として結合されている）、あるいはクロットの中央に孔があるのみであった。
【０２３２】
6%（w/v）の凍結乾燥保護剤を加えることにより、2%（w/v）の凍結乾燥保護剤のものと比較して、クロットの機械的強度は減少した（図６Ｄ３および図６Ｄ４に対し、図６Ｄ１および図６Ｄ２を比較する）。
９−軟骨欠損内のex vivoインプランテーション（移植）
【０２３３】
生検パンチ（8mm径）およびフラットな手術用ブレードを使用してブタ関節丘および骨滑車内に軟骨欠損を形成させた。
【０２３４】
上記関節部をこの実験の開始前少なくとも30分間37℃で湿ったチャンバー内に置いた。
【０２３５】
再形成させた凍結乾燥キトサン/PRP調剤を上記軟骨欠損部に注射した。
【０２３６】
これら関節を直ちに湿ったチャンバー内で封止し、37℃で1時間置いた。
【０２３７】
凍結乾燥キトサン/PRP調剤を、20ゲージ針を装着した注射器を使用して軟骨欠損部にex vivoで成功裡にインプラントしたところ、それらはin situで凝固した（図６Ｃ２）。
【０２３８】
表１４．１６の異なる調剤のパーフォーマンス。
[表１４]
0006721514.tif 000019
【０２３９】
実施例６において、同様のMnを有するキトサンパウダーの異なるバッチを使用して、同等のパーフォーマンス特性を有するケーキを作ることができる。凍結乾燥保護剤の高い濃度を有するキトサンケーキは望ましくないようなソフトなキトサン/PRPハイブリッドを生じさせる。
実施例７
１−キトサン調剤の調製
【０２４０】
４つの異なるMnのキトサン（Mn 10kDa、80.6% DDA；Mn 41kDa、80.6% DDA；Mn 89kDa、80.6% DDAおよびMn 108kDa、80.6% DDA）をHCl中に、室温で一晩溶解させ、最終キトサン濃度、0.56%（w/v）、1%（w/v）および2%（w/v）のものを得た。この後者の濃度はMn 10kDaのキトサンについてのみ作られた。これら溶液をフィルター滅菌した。フィルター滅菌した15%（w/v）トレハロース、15%（w/v）マンニトールおよび270mMのCaCl2を必要に応じて添加した。凍結乾燥のため個々の3mL又は2mLのバイアルに分配する前にフィルター滅菌したローダミン-キトサントレーサ（Mn 10kDa, 81.9% DDA、Mn 40kDa, 80.0% DDA又はMn 110kDa, 80.2% DDA）を添加した。
【０２４１】
表１５の通り、HCl濃度を調節し、全ての調剤がHCl：グルコサミン比が0.6となるようにした。凍結乾燥保護剤の濃度を2%、4%又は6%（w/v）に設定した。これは安定なケーキを提供するに十分なものであるが、凝固を妨げないものである。
【０２４２】
凍結乾燥サイクルは実施例２の章２−凍結乾燥サイクルに記載したものと同じとした。
【０２４３】
表１５． CaCl２を含有し、PRPで直接再形成された調剤。
[表１５]
0006721514.tif 000020
0006721514.tif 000021
２−ケーキ外観
【０２４４】
濃度を増大させた凍結乾燥保護剤を使用したとき、ケーキは最も嵩高となった。マンニトールを含有するケーキは、トレハロースを含有するケーキよりも、より嵩高であった。
３−ケーキ再形成
【０２４５】
前記実施例３の章２−ヒトPRPの単離のところで記載したのと同様にして、ヒトPRPおよびPPPを抽出した。
【０２４６】
ケーキを1mLのPRP又は1mLのPPPで再形成し、ステンレス鋼ビーズを用いずに手で10秒間混合を行った。これら調剤の４つ（#１５、#１９、#２３、#２７）については、３つの0.39gのステンレス鋼ビーズを用いて同様にケーキの再形成をおこない、先に得られた結果と比較した。
【０２４７】
キトサンMn 10kDa 0.56%（w/v）および1%（w/v）で作られた調剤は完全に溶解した。キトサンMn 10kDa 2%（w/vol）およびキトサンMn 41kDa 0.56%（w/vol）および1%（w/vol）で作られた調剤は、良好に溶解した。キトサンMn 89kDaおよび108kDaで作られた調剤は、より濃く取り扱いがより困難であった。
４−トロンボエラストグラフィ（TEG）
【０２４８】
各調剤360μLを、混合直後にTEGカップ内に充填し、TEGトレーシングを1時間記録した。
【０２４９】
Mn 10kDa 0.56%（w/v）のキトサンを含有する調剤は、１相凝固トレーシングを誘起させた。キトサンの濃度およびMnを増加させることにより、TEGトレーシングから明らかなように2-相凝固メカニズムが誘起された。
【０２５０】
クロット反応時間は、Mn 10kDaのキトサンを含有する調剤については長く、Mn 108kDaのキトサンを含有する調剤については短く、Mn 40kDaの調剤はその中間であった。
【０２５１】
2%（w/v）の凍結乾燥保護剤を含むハイブリッドクロットについては、4%又は6%（w/v）凍結乾燥保護剤を含有するハイブリッドクロットと比較して、最大広さがより大きかった。
５−流れ易さテスト
【０２５２】
流れ易さは、各調剤の30μLの液滴を、再形成の直後に或る角度（38度）に固定したプラスチックの硬質片上に置き、一定時間で写真を撮ることにより評価した。
【０２５３】
Mn 10kDa 0.56%（w/vol）および1%（w/vol）のキトサンを含有する調剤は流れ易いものであった。
【０２５４】
PRP単独と比較して、他の全ての調剤はペースト状特性を有していた。
６−液体発現
【０２５５】
PRP中で再形成した調剤を37℃でガラス管内に分配した。60分後、ハイブリッドクロットからの液体発現を重量測定により定量した。
【０２５６】
これら全てのハイブリッドクロットは、PRP単独よりも少ない液体を発現した（図６Ｂ３）。
７−クロット均質性
【０２５７】
Mn 89kDaおよび108kDaのキトサンで作られた殆んどのハイブリッドクロットにおいて、大きいキトサン集塊が観察された（図７Ａ３、７Ａ４、７Ａ７および図７Ａ８）。Mn 41kDaのキトサンを使用したとき、殆んどのハイブリッドクロット内においてキトサンは良く分散した（図７Ａ１、７Ａ２、７Ａ５および図７Ａ６）。Mn 10 kDaのキトサンを使用したとき、PRP中に存在する赤血球がこのクロットの底部に向けて沈降し、クロット表面にキトサンの帯域を残した。
８−破砕テスト
【０２５８】
クロット化（clotting）1時間後、各ハイブリッドクロットを破砕テストに供し、機械的強度を記録した。
【０２５９】
０＝クロットは、分解させることなく取り扱うことはできなかった。
【０２６０】
＋＝クロットは容易に破壊され、破砕された外観は多数の断片からなっていた（5を超える断片）。
【０２６１】
＋＋＝クロットは比較的硬く、破砕された外観は多数の断片からなっていた（3ないし5の断片）。
【０２６２】
＋＋＋＝クロットは硬く、かつ弾性を有し、破砕された外観は２−３の断片からなっていた。
【０２６３】
＋＋＋＋＝クロットは硬く、かつ弾性を有し、破砕された外観は２つの断片からなるもの（時折、依然として結合されている）、あるいはクロットの中央に孔があるのみであった。
【０２６４】
6%（w/v）の凍結乾燥保護剤を加えることにより、クロットの機械的強度は減少した。
９−軟骨欠損内のex vivoインプランテーション（移植）
【０２６５】
生検パンチ（8mm径）およびフラットな手術用ブレードを使用してブタ関節丘、骨滑車および脛骨プラトーに軟骨欠損を形成させた。
【０２６６】
上記関節部をこの実験の開始前少なくとも30分間37℃で湿ったチャンバー内に置いた。
【０２６７】
再形成させた凍結乾燥キトサン/PRP調剤を上記軟骨欠損部に注射した。
【０２６８】
これら関節を直ちに湿ったチャンバー内で封止し、37℃で1時間置いた。
【０２６９】
凍結乾燥キトサン/PRP調剤を、20ゲージ針を装着した注射器を使用して軟骨欠損部にex vivoで成功裡にインプラントしたところ、それらはin situで凝固した。
１０−凍結乾燥調剤の再形成；ビーズ無しで、又はビーズで混合して
【０２７０】
ハイブリッドクロットの組織学的外観は、凍結乾燥ケーキがステンレス鋼ビーズの助けなしで再形成されたものでも、３つの0.39gのステンレス鋼ビーズを用いて混合して再形成されたものでも同様であった（図７Ａ１、７Ａ２、７Ａ３および図７Ａ４を図７Ａ５、７Ａ６、７Ａ７および図７Ａ８と比較する）。
【０２７１】
凍結乾燥調剤のパーフォーマンス特性は、ステンレス鋼ビーズの助けなしで作られたハイブリッドクロットでも、３つの0.39gのステンレス鋼ビーズを用いて混合して作られたハイブリッドクロットでも同様であった（図７Ｂの表参照）。
１１−PRPで再形成された調剤のオスモル濃度
【０２７２】
マンニトールを含有する凍結乾燥キトサン調剤は、トレハロースを含有する凍結乾燥調剤よりも高いオスモル濃度を有していた。凍結乾燥保護剤の濃度の増加に伴ってオスモル濃度は増加する。2%（w/vol）のトレハロースを含有する調剤はオスモル濃度が443-495mOsmの範囲である。2%（w/vol）のマンニトールを含有する調剤はオスモル濃度が526-582mOsmの範囲である。4%（w/vol）のトレハロースを含有する調剤はオスモル濃度が516-564mOsmの範囲である。4%（w/vol）のマンニトールを含有する調剤はオスモル濃度が608-665mOsmの範囲である。6%（w/vol）のトレハロースを含有する調剤はオスモル濃度が595-631mOsmの範囲である。6%（w/vol）のマンニトールを含有する調剤はオスモル濃度が759-823mOsmの範囲である。
１２−凍結乾燥キトサン調剤の皮下インプランティーション
【０２７３】
低および高浸透度を有する幾つかの調剤を、ラビット皮下インプラントモデルにおいて、in vivoでテストした（表１６）。
【０２７４】
表１６． ラビット皮下インプラントモデルにおいて、in vivoでテストした調剤。
[表１６
0006721514.tif 000022
0006721514.tif 000023
１ソース（源）キトサンのDDAは、Mn 41.89および108kDaに解重合させた。
２6%のトレハロースを含有する1%CS（Mn 108kDa）の調剤を含有するケーキは入手できなかったので、調剤#２７が選択された。
３ヒトPRP内での再形成の後に得られたpHおよびオスモル濃度。
【０２７５】
NZWラビットの背中の毛を剃り、皮膚をBaxedin（登録商標）で3回通すことにより消毒し、ついで3回、プロビオジンおよびイソプロパノール70％を交互に3回通した。
【０２７６】
実施例１の章４−ラビットPRPの単離に記載したように、手術直前に抽出したラビット血液から自己PRPを用意した。各300μLの凍結乾燥キトサンケーキを混合用ビーズの助けなしで300μLのPRPで再形成させた。
【０２７７】
SubQ針を備えた1cc注射器を用いてラビットの背中の皮下に各インプランを150μL送出させた。
【０２７８】
対照PRPは、注射の前に42.2mMのCaCl２でカルシウム再沈着させた。
【０２７９】
注射部位は各動物に対し組織的に変化させ、部位依存的結果が生じるのを回避した。
【０２８０】
これら動物は、注射後1日目（図７Ｃ１ないし７Ｃ６）、3日目（図７Ｄ１ないし７Ｄ６）、7日目および14日目（図７Ｅ２および７Ｅ３）に安楽死（ｅｕｔｈａｎｉｚｅｄ）させた。
【０２８１】
1日目では、キトサンインプラントはほぼそのままの状態に見えた。幾つかの例において、PRP中の赤血球がインプラト内に見えた。白血球はインプラトに引き寄せられ、インプラントの周縁の殆んどで見ることができた（図７Ｃ１、７Ｃ２、７Ｃ３および７Ｃ４）。
【０２８２】
３日目までに、キトサン/PRPインプラントは部分的に劣化し、血液細胞がインプラントを侵襲していた（図７Ｄ１、７Ｄ２、７Ｄ３および７Ｄ４）。
【０２８３】
白血球の補充が1日目と比較して３日目で増加するという時間的作用が見られた（図７Ｄ１ないし７Ｄ４と図７Ｃ１ないし７Ｃ４との比較）
【０２８４】
キトサン/PRPハイブリッドは注射後１４日目までin vivoにて在居していた（図７Ｅ１、７Ｅ２および７Ｅ３）。
【０２８５】
カルシウム再沈着の対照PRPは、注射後３日目まで見ることができるに過ぎなく（図７Ｅ４は１日目での対照PRPを示している）、多くの細胞補充を誘起させることはできなかった（図７Ｃ５、７Ｃ６、図７Ｄ５、７Ｄ６および図７Ｅ４）。
【０２８６】
表１７． 40の異なる調剤のパーフォーマンス。
[表１７]
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【０２８７】
実施例７において、PRPでの凍結乾燥キトサンケーキの再形成のためには、ステンレス鋼ビーズを用いての混合は必要としない。凍結乾燥保護剤を高濃度で含有する調剤はオスモル濃度が高く、生体内（in vivo）でのインプランティーションの際、より多くの白血球を引き寄せるものとなる。キトサン/PRPハイブリッドも、、生体内（in vivo）でのPRPのみのカルシウム再沈着（ｒｅｃａｌｃｉｆｉｅｄ）対照PRPよりも、より長く在居した。８つの特定の調剤（#１３、#１５、#１７、#１９、#３５〜#３８）は、予め規定されたパーフォーマンス特性の全てに適合するものであった。
実施例８
１−キトサン調剤の調製
【０２８８】
２つの異なるキトサン（Mn 43kDa、85% DDA；Mn 36kDa、80% DDA）をHCl中に、室温で一晩溶解させ、最終キトサン濃度、1%（w/v）のものを得た。これら溶液をフィルター滅菌した。フィルター滅菌した15%（w/v）トレハロースおよび270mMのCaCl2を必要に応じて添加した。凍結乾燥のため個々の3mLのバイアルに分配する前にフィルター滅菌したローダミン-キトサントレーサ（Mn 40kDa, 80.0% DDA）をバイアルの幾つかに添加した。
【０２８９】
表１８の通り、HCl濃度を調節し、全ての調剤がHCl：グルコサミン比が0.6となるようにした。オスモル濃度を生理的なものに近づけるため、凍結乾燥保護剤の濃度を1%（w/v）に設定した。これは安定なケーキを提供するに十分なものであるが、凝固を妨げないものである。
【０２９０】
凍結乾燥サイクルは実施例２の章２−凍結乾燥サイクルに記載したものと同じとした。
【０２９１】
表１８． CaCl２を含有し、PRPで直接再形成された調剤。
[表１８]
0006721514.tif 000025
２−ケーキ外観
【０２９２】
ケーキは何らの崩れも無く、平滑な表面と、良好な外観を有していた。凍結乾燥したとき、ガラス瓶中の全てのケーキにおいて若干の後退があった（図８Ａ１および図８Ａ２）。
３−ケーキ再形成
【０２９３】
前記実施例３の章２−ヒトPRPの単離のところで記載したのと同様にして、ヒトPRPおよびPPPを抽出した。
【０２９４】
ケーキを1mLのPRP又は1mLのPPPで再形成し、ステンレス鋼ビーズを用いずに手で10秒間混合を行った。
【０２９５】
これら調剤は良好な溶解性を有し、完全に溶解した（図８Ａ３および図８Ａ４）。
４−トロンボエラストグラフィ（TEG）
【０２９６】
各調剤360μLを、混合直後にTEGカップ内に充填し、TEGトレーシングを1時間記録した。
【０２９７】
クロット反応時間および最大広さは、対照PRPと比較して、キトサン/PRP調剤は、より小さいものであった（図８Ｃ１および８Ｃ２）。
５−流れ易さテスト
【０２９８】
流れ易さは、各調剤の30μLの液滴を、再形成の直後に或る角度（38度）に固定したプラスチックの硬質片上に置き、一定時間で写真を撮ることにより評価した。
【０２９９】
対照PRPと比較して、これら調剤はペースト状特性を有していた。
６−液体発現
【０３００】
PRP中で再形成した調剤を37℃でガラス管内に分配した。60分後、ハイブリッドクロットからの液体発現を重量測定により定量した。
【０３０１】
これらハイブリッドクロットは液体を発現しなかったが、対照PRPは血清中でその重量の80％を超える液体を発現した（図８Ｂ１、８Ｂ２、８Ｂ３および８Ｂ４）。
７−クロット均質性
【０３０２】
ハイブリッドクロットを10%NBF内で固定し、エピフルオレセンス顕微鏡を用いてキトサンの分散を観察した。
【０３０３】
ハイブリッドクロット内においてキトサンは良好に分散した（図８Ｃ３および図８Ｃ４）。
８−破砕テスト
【０３０４】
クロット化（clotting）1時間後、実施例７の章８−破砕テストに記載したようにして、各ハイブリッドクロットを破砕テストに供し、機械的強度を記録した。
【０３０５】
ハイブリッドクロットは良好な機械強度を有していた。
１１−PRPで再形成された調剤のオスモル濃度
【０３０６】
Mn 43kDa, 85%DDAのキトサンを含有する調剤は再形成の際、457mOsmのオスモル濃度を有していた。Mn 36kDa, 80%DDAのキトサンを含有する調剤は再形成の際、444mOsmのオスモル濃度を有していた。
１２−半月板欠損内へのin vivoインプランティーション
【０３０７】
２つの上述の調剤およびPRP単独対照のものをヒツジ半月板修復モデルでテストした。
【０３０８】
手術の朝、実施例２の章４−ヒツジPRP単離に記載したようにしてヒツジの血液からPRPを抽出した。
【０３０９】
内側大腿脛骨関節腔にアクセスするため、1.5cm長の関節切開を形成し、半月板の前方1/3にアクセスするため水平切開を内側関節包に作った。
【０３１０】
#11外科用メスを使用して、莢膜とフリーボーダー（莢膜に近い所）との間の長さの1/3の所に10mmの裂目を形成し刺し傷を作った（図８Ｄ１）。これをメニスカスプッシュナイフ（ｍｅｎｉｓｃｕｓ  ｐｕｓｈ  ｋｎｉｆｅ）により長くした（図８Ｄ２）。
【０３１１】
この裂目および滑膜を粗く擦り、フープ状歪を与える周囲の線維を混乱させることなくFDキトサン/PRPインプラントが付着するための3Dスペースをつくった（図８Ｄ３）。
【０３１２】
半月板裂目の周りに水平マットレスパターンで、２つの3-0ポリプロピレン縫合糸を置いた（図８Ｄ４）。
【０３１３】
２つの18ゲージ針（〜2mm離して）を配置させて、２つの穿孔チャンネルを、半月板の周囲から上記裂目にかけて形成させた（図８Ｄ５）。
【０３１４】
キトサンケーキは1mLの自己PRPを用いて再形成させ、10秒間激しく混合させた。
【０３１５】
このキトサン/PRP混合物は、1cc注射器を使用して吸引させた。
【０３１６】
このキトサン/PRPハイブリッド物質は、18ゲージ針を引き抜きながら、上記チャンネルおよび裂目に向けて吐出させた（図８Ｄ６）。
【０３１７】
上記縫合糸を、送出5分後に、半月板裂目のエッジ部に逆らう十分な張力をかけて締め付けた。
【０３１８】
関節包を縫合し、この手法を、研究設計通りに他の膝でも繰り返した。
【０３１９】
注射直前に、42.4mMのCaCl２を用いて、PRP単独の対照をカルシウム再沈着させた。
【０３２０】
これら動物は注射手術後1日目および21日目に安楽死させた。
【０３２１】
１日目において、キトサン/PRPは上記裂目内で在居していた（図８Ｅ１および８Ｅ２）。
【０３２２】
２１日目において、キトサン/PRPで処置した裂目のエッジ部は良好に並置されていた（図８Ｅ３および８Ｅ４）。
【０３２３】
実施例８は、標準の外科手術用器具を用いて、in vivoでキトサン/PRP調剤を半月板欠損部に注入することができることを示すと共に、キトサン/PRPハイブリッドは半月板裂目に在居させることができ、キトサン/PRPハイブリッドで処置した裂目は治療の21日後に良好に並置されたエッジ部がもたらされることを示している。
実施例９
１−キトサン調剤の調製
【０３２４】
キトサン（Mn 40kDa、80% DDA）をHCl中に、室温で一晩溶解させ、最終キトサン濃度、1%（w/v）のものを得た。この溶液をフィルター滅菌した。フィルター滅菌した15%（w/v）トレハロースおよび270mMのCaCl2を必要に応じて添加した。凍結乾燥のため個々の2mLのバイアルに分配する前にフィルター滅菌したローダミン-キトサントレーサ（Mn 40kDa, 80.0% DDA）を上記バイアルに添加した。
【０３２５】
表１９の通り、HCl濃度を調節し、これらの調剤がHCl：グルコサミン比が0.6となるようにした。凍結乾燥保護剤の濃度を2%（w/v）に設定した。
【０３２６】
凍結乾燥サイクルは実施例２の章２−凍結乾燥サイクルに記載したものと同じとした。
【０３２７】
表１９． CaCl２を含有し、PRPで直接再形成された調剤。
[表１９]
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８−in vivo慢性軟骨修復モデル
【０３２８】
4mm X 4mmの軟骨のみの欠損を、3匹の9月齢のNZWラビットの骨滑車内に左右相称に形成させた（図９Ａ１）。縫合した膝および上記欠損部を1ヶ月間で慢性段階に発展させた（図９Ａ２）。
【０３２９】
上記膝を再び開き、欠損部を創面切除（ｄｅｂｒｉｄｅｄ）し、４つのマイクロドリルホールを0.9mmのドリルビットを用いて軟骨下骨を通って〜4mmの深さまで貫通させた。
【０３３０】
上記実施例１の４−ラビットPRPの単離の上記項目に記載したように、自己PRPを手術直前に抽出したラビットの血液から用意した。この欠損の形成後、凍結乾燥キトサンケーキを、300μLのPRPを用いて再形成させ、10秒間、激しく混合させ、インプラント（1懸滴）を上記欠損部上に送出させ、膝を閉じる前〜5分間 in situで固化させた（図９Ａ４）。
【０３３１】
カルシウム再沈着させたPRPを、対照として反対側の膝に送出させた（図９Ａ３）。
【０３３２】
手術後21日目において、治療部および対照側の修復組織は異なる外観を有していた（図９Ｂ１および９Ｂ２）。
【０３３３】
増大した細胞補充および拡大した骨再形成が、キトサン/PRPにより治療した膝に認められ（図９Ｂ４）、これは対照の膝には欠けていた（図９Ｂ３）。
【０３３４】
実施例９は、キトサン/PRPハイブリッドインプラントを慢性軟骨欠損へin vivoで送出させることができ、そこでこのインプラントは細胞補給および骨の再形成を刺激することができることを提供するものであり、これらは改善された修復に以前から付随する特徴である。
【０３３５】
上述のことに基づいて、我々は、どのキトサン組成物が我々の予定しているパーフォーマンス特性の少なくとも１つ、或る場合には２以上、更に或る場合にはその全てを満たすことができるか否かを判定することができた。適応できた基準としては以下のものが含まれる。すなわち、１）貯蔵および出荷においてケーキが機械的に安定であること（図６Ａ１および６Ａ２）；２）PRP中で迅速、容易かつ完全に再形成すること（図６Ａ１および６Ａ２）；３）in situでの凝固が達成され、抑制されないこと（図６Ｂ１および６Ｂ２）；４）キトサン/PRPハイブリッドインプラントがインプランティーション後の機械的充填の耐えることができること（図６Ｄ１および６Ｄ２）；５）組織欠損部を満たすため、血小板媒介のクロット退縮が抑制されること（図６Ｂ３）；６）ポリマーおよび血液成分の相分離を生じさせることなく良好な混合がなされること（図６Ａ３および６Ａ４）；７）組織修復への適用のため粘性でペースト状の調剤であること（図６Ｃ１）；および８）in vivoでの用途のため、生理学的特性に近いものであること（実施例７）である。キトサン/PRPハイブリッドは、３日以内に一掃されたカルシウム再沈着されたPRP単独のものとは対照的に、in vivoでの組織修復を成功裡に刺激するため、少なくとも１４日間在居するものである（図７Ｃ、７Ｄおよび７Ｅ）。更に、キトサン/PRPハイブリッドは、半月板欠損の治療（図８Ｄおよび８Ｅ）、急性軟骨欠損の治療（図１Ｂ）、慢性軟骨欠損の治療（図９Ａおよび９Ｂ）のため動物モデルにおいてin vivoで使用された。組織インプランティーションおよびin situゲル化の好ましい態様の実施例は：１）分子量が約Mn 28ないし約56 kDaの範囲のキトサンで、凍結乾燥保護剤の濃度が約1%（w/v）以下ないし約4%（w/v）以下の範囲のもの；又は２）分子量が約Mn 89ないし約108 kDaの範囲のキトサンで、凍結乾燥保護剤の濃度が約0.56%（w/v）以下ないし約4%（w/v）以下の範囲のものである。上記の所定の基準の幾つかを満たした他のテストされた調剤は、キトサンが約Mn 4ないし約211 kDaの範囲の分子量を有し、濃度が約0.42%ないし約2%（w/v）のもの、凍結乾燥保護剤（スクロース、トレハロース、マンニトール）の濃度が約1%（w/v）ないし約10%（w/v）のもの、塩（NaCl）又はバッファー（ヒスチジン）を含むものであった。
【０３３６】
本願の請求項の範囲は、各実施例にて提示された好ましい具体例により制限されるべきではなく、発明の詳細な説明全体として整合する最も広範な解釈で理解されるべきである。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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