(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（Ｐ１）で表わされる重合体。
【化１】
0006652808.tif 000033
［ただし、上記式（Ｐ１）中、Ｒ０はカチオン重合開始剤に由来する残基、あるいは官能基を表し、Ｌはリンカーで、Ｌは存在しなくてもよく、ｎは１以上の整数であり、Ｄは近赤外領域に吸収を持つ色素の色素骨格であり、かつ、下記式（ｄ１−１）又は（ｄ１−６）で表わされ、Ｒ１乃至Ｒ４はそれぞれ独立に、水素原子、または、置換もしくは無置換の炭素数１以上４以下の炭化水素基であり、置換を含む場合は、その置換基は、ハロゲン原子、酸素原子、窒素原子から選択される少なくとも１種を含む官能基であり、Ｒ５は、メチル基、エチル基、イソプロピル基、ｎ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｎ−オクチル基、ｎ−ヘプチル基、フェニル基、ブテニル基、ペンチニル基のいずれかであり、
【化２】
0006652808.tif 000034
【化３】
0006652808.tif 000035
上記式（ｄ１−１）又は（ｄ１−６）において、＊はＬに結合すること、あるいは、重合体がＬを含まない場合は、式（Ｐ１）の繰り返し単位の末端の炭素原子に直接結合することを示す。］
【請求項２】
前記式（Ｐ１）が下記式（Ｐ１−１）で表わされる請求項１に記載の重合体。
【化４】
0006652808.tif 000036
【請求項３】
前記Ｌが下記式（ｌ１）乃至（ｌ１３）のいずれかで表わされる構造を有する請求項１又は２に記載の重合体。
【化５】
0006652808.tif 000037
［ただし、上記式（ｌ１）乃至（ｌ１３）において、＊は前記Ｄまたは繰り返し単位の末端の炭素原子と直接結合または間接結合する。］
【請求項４】
前記重合体の分子量が１００００以上１０００００以下である請求項１乃至３のいずれか一項に記載の重合体。
【請求項５】
前記重合体の分子量が１００００以上５００００以下である請求項１乃至４のいずれか一項に記載の重合体。
【請求項６】
前記重合体の分子量が１５０００以上３００００以下である、請求項１乃至５のいずれか一項に記載の重合体。
【請求項７】
前記式（Ｐ１）が下記式（１）で表わされる請求項１乃至６のいずれか一項に記載の重合体。
【化６】
0006652808.tif 000038
【請求項８】
前記Ｒ０が低分子化合物、色素、レポーター分子、標的結合性分子、重合体のいずれかに由来する官能基から選ばれる請求項１乃至７のいずれか一項に記載の重合体。
【請求項９】
請求項１乃至８のいずれか一項に記載の重合体と分散媒とを有する光音響イメージング用造影剤。
【請求項１０】
下記式（Ａ１）で表わされる重合体。
【化７】
0006652808.tif 000039
［ただし、上記式（Ａ１）中、Ｒ０は、カチオン重合開始剤に由来する残基、あるいは官能基を表し、Ｌ１は、リンカーで、Ｌ１は存在しなくてもよく、Ｄ１は、近赤外領域に吸収を持つ色素の色素骨格であり、かつ、下記式（ｄ１−１）又は（ｄ１−６）で表わされ、Ｚ１は、下記式（Ａ２）で示される単位を少なくとも一つ含む構造を表し、
【化８】
0006652808.tif 000040
【化９】
0006652808.tif 000041
【化１０】
0006652808.tif 000042
上記式（Ａ２）中、Ｄ２は、近赤外領域に吸収を持つ色素の色素骨格であり、かつ、上記式（ｄ１−１）又は（ｄ１−６）で表わされ、Ｒ１乃至Ｒ４はそれぞれ独立に、水素原子、または、置換もしくは無置換の炭素数１以上４以下の炭化水素基であり、置換を含む場合は、その置換基は、ハロゲン原子、酸素原子、窒素原子から選択される少なくとも１種を含む官能基であり、
上記式（ｄ１−１）又は（ｄ１−６）において、＊はＬ１または窒素原子に結合すること、あるいは、重合体がＬ１を含まない場合は、式（Ａ２）の繰り返し単位の末端の炭素原子に直接結合することを示す。］
【請求項１１】
前記Ｚ１が、前記式（Ａ２）で表わされる単位を少なくとも１つと、下記式（Ａ３）で表わされる単位を少なくとも１つとを含む構造を表す請求項１０に記載の重合体。
【化１１】
0006652808.tif 000043
［ただし、上記式（Ａ３）中、Ｒ１乃至Ｒ４はそれぞれ独立に、水素原子、または、置換もしくは無置換の炭素数１以上４以下の炭化水素基であり、置換を含む場合は、その置換基は、ハロゲン原子、酸素原子、窒素原子から選択される少なくとも１種を含む官能基であり、Ｒ５は、メチル基、エチル基、イソプロピル基、ｎ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｎ−オクチル基、ｎ−ヘプチル、フェニル基、ブテニル基、ペンチニル基のいずれかである。］
【請求項１２】
前記重合体が、前記式（Ａ２）で表わされる単位と、前記式（Ａ３）で表わされる単位とを有するランダム共重合体である請求項１１に記載の重合体。
【請求項１３】
前記重合体が有する繰り返し単位のうち、前記式（Ａ２）で表わされる単位の割合が６０％以下である、請求項１１または１２に記載の重合体。
【請求項１４】
前記重合体が有する繰り返し単位のうち、前記式（Ａ２）で表わされる単位の割合が０．０１％以上１０％以下である、請求項１１乃至１３のいずれか一項に記載の重合体。
【請求項１５】
前記Ｒ１乃至Ｒ４が水素原子である請求項１０乃至１４のいずれか一項に記載の重合体。
【請求項１６】
前記Ｌ１が下記式（ｌ１）乃至（ｌ１４）のいずれかで表わされる構造を有する請求項１０乃至１５のいずれか一項に記載の重合体。
【化１２】
0006652808.tif 000044
［ただし、上記式（ｌ１）乃至（ｌ１４）において、２つの＊は各々、前記式（Ａ１）におけるＤ１とＺ１に直接結合または間接結合する。上記式（ｌ１４）において、ωは、カチオン重合反応終了末端に由来する残基、あるいは官能基を表す。］
【請求項１７】
前記Ｄ１およびＤ２が、下記式（Ａ４）で表わされる請求項１０乃至１６のいずれか一項に記載の重合体。
【化１３】
0006652808.tif 000045
［ただし、上記式（Ａ４）において、＊はＬ１または前記式（Ａ２）のＮに結合する、または前記重合体がＬ１を含まない場合は、前記式（Ａ１）中のＺ１、に結合することを示す。］
【請求項１８】
前記Ｒ５がエチル基である請求項１１に記載の重合体。
【請求項１９】
前記重合体の分子量が１００００以上２０００００以下である請求項１０乃至１８のいずれか一項に記載の重合体。
【請求項２０】
前記重合体の分子量が１００００以上５００００以下である請求項１０乃至１９のいずれか一項に記載の重合体。
【請求項２１】
前記Ｒ０が低分子化合物、色素、レポーター分子、標的結合性分子、重合体のいずれかに由来する官能基から選ばれる請求項１０乃至２０のいずれか一項に記載の重合体。
【請求項２２】
請求項１０乃至２１のいずれか一項に記載の重合体と分散媒とを有する光音響イメージング用造影剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、重合体、および前記重合体を有する光音響イメージング用造影剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体内部の情報を可視化する装置の１つとして、光音響トモグラフィー（Ｐｈｏｔｏａｃｏｕｓｔｉｃ  ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ、以下ＰＡＴと略すことがある）装置が知られている。ＰＡＴ装置を用いる測定においては、被測定体に光を照射したときに被測定体内部で光を吸収した物質（光吸収体）が発する光音響信号の強度と発生時刻を測定することにより、被測定体内部の物質分布を演算した画像を得ることができる。
【０００３】
ここで、光吸収体としては、生体内で光を吸収して音響波を発するものであればいかなるものをも用いることができる。例えば人体内の血管や悪性腫瘍などを光吸収体とすることが可能である。その他にも、インドシアニングリーン（Ｉｎｄｏｃｙａｎｉｎｅ  Ｇｒｅｅｎ、以下ＩＣＧと略すことがある）などの分子を体内に投与し、造影剤として利用することもできる。ＩＣＧは、人体に照射した際の影響が少なくかつ生体への透過性が高い近赤外波長領域の光をよく吸収することから、ＰＡＴ装置における造影剤（光音響造影剤と略すことがある）として好適に用いることができる。なお、本明細書において、ＩＣＧとは下記式の構造で示される化合物を指す。
【化１】
0006652808.tif 000002
【０００４】
ただし、対イオンはＮａ＋でなくてもよく、Ｈ＋あるいはＫ＋など任意の対イオンを用いることができる。
【０００５】
しかし、ＩＣＧは血中での半減期が数分程度と非常に短いことが知られている。
【０００６】
また、特許文献１では、近赤外色素にポリエチレングリコール（Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）、以下ＰＥＧと略すことがある）を共有結合させた造影剤を用いて腫瘍集積を確認した例が報告されている。近赤外色素をＰＥＧに結合させることで、近赤外色素単独に比べて、血中での半減期を長くすることができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特表２０１２−５２０８５６号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，（２０１４），３５（１７），４８４８−４８６１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
特許文献１に開示された近赤外蛍光色素を結合させたＰＥＧでは、高い腫瘍集積性を示す一方で、血中滞留性も高いため、その腫瘍血中比が低いという課題がある。
【００１０】
そこで本発明では、腫瘍血中比が高い重合体及び重合体を有する光音響イメージング用造影剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は下記式（Ｐ１）で表わされる重合体を提供する。
【化２】
0006652808.tif 000003
上記式（Ｐ１）中、Ｒ０はカチオン重合開始剤に由来する残基、または官能基のいずれかを表し、Ｌはリンカーで、Ｌは存在しなくてもよく、ｎは１以上の整数であり、Ｄは近赤外領域に吸収を持つ色素の色素骨格であり、Ｒ１乃至Ｒ４はそれぞれ独立に、水素原子、または、置換もしくは無置換の炭素数１以上４以下の炭化水素基であり、置換を含む場合は、その置換基は、ハロゲン原子、酸素原子、窒素原子から選択される少なくとも１種を含む官能基であり、Ｒ５は、メチル基、エチル基、イソプロピル基、ｎ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｎ−オクチル基、ｎ−ヘプチル基、フェニル基、ブテニル基、ペンチニル基のいずれかである。
【００１２】
本実施形態に係る重合体の式（Ｐ１）中のＤの一例としては下記式（ｄ１−１）または（ｄ１−６）を挙げることができる。
【化１】
0006652808.tif 000004
【化２】
0006652808.tif 000005
上記式（ｄ１−１）又は（ｄ１−６）において＊はＬに結合すること、あるいは、重合体がＬを含まない場合は、式（Ｐ１）の繰り返し単位の末端の炭素原子に直接結合することを示す。
【発明の効果】
【００１３】
本発明に係る重合体によれば、主鎖がポリオキサゾリンまたはその類縁体の構造を有するため、腫瘍に集積し、また時間がたつにつれ血中から排出されるため、腫瘍血中比を大きく、腫瘍を選択的に検出できる造影剤として用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明の実施例における重合体Ｐ６を投与した後、２４時間目の担癌マウスの全身蛍光像である。
【図２】本発明の実施例における重合体Ｐ１、重合体Ｐ２、重合体Ｐ３、重合体Ｐ５、重合体Ｐ６、および重合体Ｐ８をマウスに投与したときの腫瘍集積量および血中濃度を示すグラフである。
【図３】本発明の実施例における重合体Ｐ６と比較例（ＰＥＧ１）の腫瘍血中比を示すグラフである。
【図４】本発明の実施例における重合体Ｐ９を投与した後、２４時間目の担癌マウスの全身蛍光像である。
【図５】本発明の実施例における１１１Ｉｎ標識ＤＯＴＡ−Ｐ１３、１１１Ｉｎ標識ＤＯＴＡ−Ｐ１８、１１１Ｉｎ標識ＤＯＴＡ−Ｐ１９をそれぞれ静脈内投与した後、１、６、２４時間目のマウスから摘出した各臓器の放射活性を示すグラフである。（Ａ）１１１Ｉｎ標識ＤＯＴＡ−Ｐ１９、（Ｂ）１１１Ｉｎ標識ＤＯＴＡ−Ｐ１８、（Ｃ）１１１Ｉｎ標識ＤＯＴＡ−Ｐ１３をそれぞれ表わす。
【図６】本発明の実施例における重合体Ｐ１０−ＩＣＧ、Ｐ１１−ＩＣＧ、Ｐ１２−ＩＣＧ、Ｐ１４−ＩＣＧ、Ｐ２３−ＩＣＧを投与した後、２４時間目の担癌マウスの全身蛍光像である。
【図７】本発明の実施例における重合体Ｐ１０−ＩＣＧ、Ｐ１１−ＩＣＧ、Ｐ１２−ＩＣＧ、Ｐ１４−ＩＣＧ、Ｐ２３−ＩＣＧを投与した後の担癌マウスにおける血中濃度変化を示すグラフである。（Ａ）経時的な血中濃度変化、（Ｂ）重合体の分子量と、血中半減時間のプロットをそれぞれ表わす。
【図８】本発明の実施例における重合体Ｐ３３−ＩＣＧ１、Ｐ３４−ＩＣＧの細胞取り込み実験結果である。
【図９】本発明の実施例における重合体を投与した後、２４時間目の担癌マウスの全身蛍光像である。
【図１０】本発明の実施例における重合体を投与した後、２４時間目の担癌マウスのｉｎ  ｖｉｖｏ光音響画像である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明の実施形態に係る重合体について説明するが、本発明はこれらに限られない。
【００１６】
本実施形態に係る重合体は、ポリオキサゾリンまたはその類縁体を主鎖とし、重合体末端に近赤外色素が結合した構造である。具体的には、下記式（Ｐ１）で表わされる。
【化５】
0006652808.tif 000006
上記式（Ｐ１）中、Ｒ０は特に限定されないが、例えばカチオン重合開始剤に由来する残基、官能基のいずれかを表す。また、上記式（Ｐ１）中、Ｌはリンカーで、Ｌは存在しなくてもよく、ｎは１以上の整数であり、Ｄは近赤外領域に吸収を持つ色素の色素骨格であり、Ｒ１乃至Ｒ４はそれぞれ独立に、水素原子、または、置換もしくは無置換の炭素数１以上４以下の炭化水素基であり、置換を含む場合は、その置換基は、ハロゲン原子、酸素原子、窒素原子から選択される少なくとも１種を含む官能基であり、Ｒ５は、メチル基、エチル基、イソプロピル基、ｎ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｎ−オクチル基、ｎ−ヘプチル基、フェニル基、ブテニル基、ペンチニル基のいずれかである。
【００１７】
本実施形態に係る重合体の式（Ｐ１）中のＤの一例としては下記式（ｄ１）または（ｄ２）を挙げることができる。
【化６】
0006652808.tif 000007
上記式（ｄ１）において、Ｌ１１、Ｌ１２、Ｌ１３、Ｌ１４、Ｌ１５は各々が同一でも異なっていてもよく、ＣＨ又はＣＲ１５を表し、Ｒ１５は、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキル基を表す。Ｌ１１、Ｌ１２、Ｌ１３、Ｌ１４、Ｌ１５は互いに結合して４員環乃至６員環を形成していてもよい。Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４は各々が同一でも異なっていてもよく、水素原子、または、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキル基、−ＲＤ１−ＳＯ３−、−ＲＥ１−ＳＯ３Ｘ１１を表す。ＲＤ１、ＲＥ１は、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキレン基を表す。Ｘ１１は、水素原子、ナトリウム原子、カリウム原子、あるいはアンモニア、トリエチルアミン、リジン、またはアルギニンに由来する陽イオンのいずれかを表す。ＲＡ１は、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキル基、−ＲＣ１−ＳＯ３−、−ＲＧ１−ＳＯ３Ｘ１５、または、−ＲＦ１−ＣＯ２Ｘ１４を表す。Ｘ１４、Ｘ１５は、水素原子、ナトリウム原子、カリウム原子、あるいはアンモニア、トリエチルアミン、リジン、またはアルギニンに由来する陽イオンンのいずれかを表す。ＲＣ１、ＲＦ１、ＲＧ１は、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキレン基を表す。ＲＡ１が、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキル基の場合、ハロゲンイオン、または有機酸イオンが対イオンとして含まれていて良い。ＲＢ１は、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキレン基を表す。Ｚ１１は互いに独立に水素原子、−ＳＯ３Ｘ１２を表わすか、またはＺ１１に結合したインドール環と共にベンズ［ｅ］インドール環、ベンズ［ｆ］インドール環、またはベンズ［ｇ］インドール環からなる環状芳香族環を形成し、さらに該環状芳香族環の水素原子は、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキル基、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルコキシ基、−ＳＯ３Ｘ１３で置換されていてよい。Ｘ１２、Ｘ１３は、水素原子、ナトリウム原子、カリウム原子、あるいはアンモニア、トリエチルアミン、リジン、またはアルギニンに由来する陽イオンのいずれかであり、＊はＬに結合する、または重合体がＬを含まない場合は、式（Ｐ１）における繰り返し単位の末端の炭素原子に結合することを示す。
上記式（ｄ２）において、Ｌ１０１、Ｌ１０２、Ｌ１０３、Ｌ１０４、Ｌ１０５、Ｌ１０６、Ｌ１０７は各々が同一でも異なっていてもよく、ＣＨ又はＣＲ１０５を表し、Ｒ１０５は、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキル基を表す。Ｌ１０１、Ｌ１０２、Ｌ１０３、Ｌ１０４、Ｌ１０５、Ｌ１０６、Ｌ１０７は互いに結合して４員環乃至６員環を形成していてもよい。Ｒ１０１、Ｒ１０２、Ｒ１０３、Ｒ１０４は各々が同一でも異なっていてもよく、水素原子、または、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキル基、−ＲＤ１１−ＳＯ３−、−ＲＥ１１−ＳＯ３Ｘ１０１を表す。ＲＤ１１、ＲＥ１１は、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキレン基を表す。Ｘ１０１は、水素原子、ナトリウム原子、カリウム原子、あるいはアンモニア、トリエチルアミン、リジン、またはアルギニンに由来する陽イオンのいずれかを表す。ＲＡ１１は、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキル基、−ＲＣ１１−ＳＯ３−、−ＲＧ１１−ＳＯ３Ｘ１０５、または、−ＲＦ１１−ＣＯ２Ｘ１０４を表す。Ｘ１０４、Ｘ１０５は、水素原子、ナトリウム原子、カリウム原子、あるいはアンモニア、トリエチルアミン、リジン、またはアルギニンに由来する陽イオンンのいずれかを表す。ＲＣ１１、ＲＦ１１、ＲＧ１１は、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキレン基を表す。ＲＡ１１が、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキル基の場合、ハロゲンイオン、または有機酸イオンが対イオンとして含まれていて良い。ＲＢ１１は、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキレン基を表す。Ｚ１０１は互いに独立に水素原子、−ＳＯ３Ｘ１０２を表わすか、またはＺ１０１に結合したインドール環と共にベンズ［ｅ］インドール環、ベンズ［ｆ］インドール環、またはベンズ［ｇ］インドール環からなる環状芳香族環を形成し、さらに該環状芳香族環の水素原子は、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキル基、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルコキシ基、−ＳＯ３Ｘ１０３で置換されていてよい。Ｘ１０２、Ｘ１０３は、水素原子、ナトリウム原子、カリウム原子、あるいはアンモニア、トリエチルアミン、リジン、またはアルギニンに由来する陽イオンのいずれかであり、＊はＬに結合する、または重合体がＬを含まない場合は、式（Ｐ１）における繰り返し単位の末端の炭素原子に結合することを示す。
【００１８】
【化７】
0006652808.tif 000008
更に（ｄ１）および（ｄ２）は、それぞれ上記（ｄ３）および（ｄ４）で表わすこともできる。上記式（ｄ３）において、Ｒ２０１乃至Ｒ２１２は各々が同一でも異なっていてもよく、水素原子、または、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキル基、−ＳＯ３Ｘ２４を表す。Ｘ２４は、水素原子、ナトリウム原子、カリウム原子、あるいはアンモニア、トリエチルアミン、リジン、またはアルギニンに由来する陽イオンのいずれかを表す。Ｌ２１、Ｌ２２、Ｌ２３、Ｌ２４、Ｌ２５は各々が同一でも異なっていてもよく、ＣＨ又はＣＲ２５を表し、Ｒ２５は、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキル基を表す。Ｌ２１、Ｌ２２、Ｌ２３、Ｌ２４、Ｌ２５は互いに結合して４員環乃至６員環を形成していてもよい。Ｒ２１、Ｒ２２、Ｒ２３、Ｒ２４は各々が同一でも異なっていてもよく、水素原子、または、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキル基、−ＲＤ２−ＳＯ３−、−ＲＥ２−ＳＯ３Ｘ２１を表す。ＲＤ２、ＲＥ２は、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキレン基を表す。Ｘ２１は、水素原子、ナトリウム原子、カリウム原子、あるいはアンモニア、トリエチルアミン、リジン、またはアルギニンに由来する陽イオンのいずれかを表す。ＲＡ２は、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキル基、−ＲＣ２−ＳＯ３−、−ＲＧ２−ＳＯ３Ｘ２５、または、−ＲＦ２−ＣＯ２Ｘ２６を表す。Ｘ２５、Ｘ２６は、水素原子、ナトリウム原子、カリウム原子、あるいはアンモニア、トリエチルアミン、リジン、またはアルギニンに由来する陽イオンのいずれかを表す。ＲＣ２、ＲＦ２、ＲＧ２は、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキレン基を表す。ＲＡ２が、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキル基の場合、塩化物イオン、臭化物イオン、ヨウ化物イオン等のハロゲンイオン、または酢酸イオン、酒石酸イオン、コハク酸イオン等の有機酸イオンが対イオンとして含まれていて良い。ＲＢ２は、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキレン基を表す。＊はＬに結合する、または重合体がＬを含まない場合は、式（Ｐ１）における繰り返し単位の末端の炭素原子に結合することを示す。上記式（ｄ４）において、Ｒ３０１乃至Ｒ３１２は各々が同一でも異なっていてもよく、水素原子、または、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキル基、−ＳＯ３Ｘ３４を表す。Ｘ３４は、水素原子、ナトリウム原子、カリウム原子、あるいはアンモニア、トリエチルアミン、リジン、またはアルギニンに由来する陽イオンのいずれかを表す。Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ３３、Ｌ３４、Ｌ３５、Ｌ３６、Ｌ３７は各々が同一でも異なっていてもよく、ＣＨ又はＣＲ３５を表し、Ｒ３５は、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキル基を表す。Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ３３、Ｌ３４、Ｌ３５、Ｌ３６、Ｌ３７は互いに結合して４員環乃至６員環を形成していてもよい。Ｒ３１、Ｒ３２、Ｒ３３、Ｒ３４は各々が同一でも異なっていてもよく、水素原子、または、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキル基、−ＲＤ３−ＳＯ３−、−ＲＥ３−ＳＯ３Ｘ３１を表す。ＲＤ３、ＲＥ３は、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキレン基を表す。Ｘ３１は、水素原子、ナトリウム原子、カリウム原子、あるいはアンモニア、トリエチルアミン、リジン、またはアルギニンに由来する陽イオンのいずれかを表す。ＲＡ３は、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキル基、−ＲＣ３−ＳＯ３−、−ＲＧ３−ＳＯ３Ｘ３５、または、−ＲＦ３−ＣＯ２Ｘ３６を表す。Ｘ３５、Ｘ３６は、水素原子、ナトリウム原子、カリウム原子、あるいはアンモニア、トリエチルアミン、リジン、またはアルギニンに由来する陽イオンのいずれかを表す。ＲＣ３、ＲＦ３、ＲＧ３は、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキレン基を表す。ＲＡ３が、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキル基の場合、塩化物イオン、臭化物イオン、ヨウ化物イオン等のハロゲンイオン、または酢酸イオン、酒石酸イオン、コハク酸イオン等の有機酸イオンが対イオンとして含まれていて良い。ＲＢ３は、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキレン基を表す。＊はＬに結合する、または重合体がＬを含まない場合は、式（Ｐ１）における繰り返し単位の末端の炭素原子に結合することを示す。
【００１９】
Ｒ０は上述のとおり、カチオン重合開始剤に由来する残基、あるいは官能基のいずれかを表わす。ここで、官能基とは、一般的な官能基全ての他、さらに、低分子化合物、色素、レポーター分子、標的結合性分子、重合体などに由来する基を含む。低分子化合物、色素、レポーター分子、標的結合性分子、重合体などに由来する基とは、それらが、カチオン重合開始剤に由来する残基を介して結合したもの、あるいは、Ｒ０がそのまま、低分子化合物、色素、レポーター分子、標的結合性分子、重合体に置換されたものを含む。また、上記の低分子化合物、色素、レポーター分子、標的結合性分子、重合体などは、結合の過程において、含まれる原子の一部が他の原子に置換等されていてもよい。
本実施形態に係る重合体におけるＲ０としての官能基としてはあらゆる基が含まれ、一例として、アルキル基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、アミノ基、チオール基、アジド基、ジアミン、スクシニミジルエステル基、マレイミド基、スクシンイミド基を挙げることができる。また、Ｒ０としての化合物の例として、低分子化合物、レポーター分子、標的結合性分子、他の重合体等を挙げることができる。低分子化合物の例としてゲフィチニブのような阻害薬が挙げられる。レポーター分子の例として、放射性信号、磁場信号、超音波信号、蛍光信号、光超音波信号などの物理的な信号を発生する分子、治療用薬剤である、放射性ハロゲン、放射性同位元素、常磁性金属イオン、酸化鉄粒子、金ナノ粒子、マイクロバブル、色素、抗癌剤などを挙げられる。色素の例として蛍光性化合物、燐光性化合物、近赤外光吸収性化合物が挙げられる。標的結合性分子の例としては、抗体、抗体フラグメント、一本鎖抗体などの人工抗体、酵素、生物活性ペプチド、グリコペプチド、糖鎖、脂質、分子認識化合物などが挙げられる。Ｒ０としての他の重合体の例としては、ポリエチレングリコールが挙げられるが、重合度は任意であり、エチレングリコールであってもよい。
【００２０】
本実施形態に係る重合体の腫瘍血中比が大きくなる理由について説明する。ここでは、式（Ｐ１）の主鎖としてポリオキサゾリン（以下ＰＯＺと略すことがある）、及びＤで表わされる近赤外色素として、ＩＣＧを有する場合を例に説明する。ＰＯＺとＩＣＧの表面エネルギー評価から、ＩＣＧとＰＯＺは相溶性が低く、ＩＣＧはＰＯＺに被覆されないという傾向が予測される。
【００２１】
一方、従来技術のＩＣＧ結合ＰＥＧについて、ＩＣＧとＰＥＧは相溶性が高く、ＩＣＧはＰＥＧによって有効に被覆される。本実施形態では、ＰＯＺに結合したＩＣＧが、上記の理由によりＰＯＺに被覆されていないため、色素と血中タンパク等が確率的に接触し、異物認識され、肝臓や脾臓に運ばれることで、血中濃度が低下する効果を奏すると考えられる。
【００２２】
また、ＰＯＺはＰＥＧに比較して酸化的分解を受けやすいことが報告されている（非特許文献１）。そのため血中に滞留するプローブは時間が経過するにつれ、酸化的分解により代謝排泄されるため血中濃度が低下する。その結果、腫瘍血液比が高くなる効果を奏すると考えられる。一方で従来技術のＩＣＧ結合ＰＥＧは分解されず長期間血中に滞留するため、腫瘍血中比は低くなる。
【００２３】
なお、以下では、ポリオキサゾリンのモノマーであるオキサゾリンをＯＺと略することがある。
【００２４】
また、上記式（Ｐ１）の例として下記式（ｐ１−１）で表わされる重合体が挙げられる。
【化８】
0006652808.tif 000009
【００２５】
また、上記Ｄの例として、下記式（ｄ１−１）乃至（ｄ１−６）が挙げられる。
【化９】
0006652808.tif 000010
【化１０】
0006652808.tif 000011
【００２６】
上記式（ｄ１−１）乃至（ｄ１−６）において＊はＬに結合すること、あるいは、重合体がＬを含まない場合は、式（Ｐ１）または式（ｐ１−１）の繰り返し単位の末端の炭素原子に直接結合することを示す。
【００２７】
また、Ｌが存在する場合、Ｌの一例として、下記式（ｌ１）乃至（ｌ１４）を含む構造が挙げられる。下記式（ｌ１）乃至（ｌ１４）において、２つの＊は各々、式（Ａ１）におけるＤ１とＺ１に直接結合または間接結合する。式（ｌ１４）において、ωは、カチオン重合反応終了末端に由来する残基、あるいは官能基を表す。下記式（ｌ１）乃至（ｌ１４）は単独で使用しても良く、同一種類または複数種類を繰り返して使用しても良い。ここで、複数種類を繰り返して使用する例としては、下記式（ｌ１−１）が挙げられる。下記式（ｌ１−１）は下記式（ｌ１）、（ｌ２）、（ｌ３）、（ｌ４）、（ｌ５）、（ｌ７）、（ｌ１２）、および、（ｌ１３）を使用している。
【化１１】
0006652808.tif 000012
【化１２】
0006652808.tif 000013
前記の化学構造の中の＊は、前記Ｄまたは繰り返し単位の末端の炭素原子と直接結合または間接結合する。
【００２８】
前記Ｌの形成は、前記のＤに、例えば、アミノ基、水酸基、チオール基、カルボキシル基、エポキシ基、グリシジル基、Ｎ−スクシンイミジルオキシ基、Ｎ−スルホスクシンイミジル基、Ｎ−マレイミドアルキル基、ヨードアセトアミド基、ブロモアセトアミド基、イソチオシアノ基、スルホン酸塩化物基、およびカルボン酸塩化物基等の反応性基を有するものを用い、結合反応を起す組合せで選ばれた前記反応性基の間で結合を生じさせることにより行うことができる。また、前記で生じた結合がシッフ塩基やカルボニル基を含む場合には、それらを還元して結合のさらなる安定化を図ることができる。
【００２９】
また、上記式（Ｐ１）の例として下記式（１）で表わされる重合体が挙げられる。
【化１３】
0006652808.tif 000014
【００３０】
本実施形態に係る重合体は、更に、下記式（Ａ１）で表わすこともできる。
下記式（Ａ１）で表わされる重合体。
【化１４】
0006652808.tif 000015
上記式（Ａ１）中、Ｒ０は、カチオン重合開始剤に由来する残基、あるいは官能基を表し、Ｌ１は、リンカーで、Ｌ１は存在しなくてもよく、Ｄ１は、近赤外領域に吸収を持つ色素の色素骨格であり、Ｚ１は、下記式（Ａ２）で示される単位を少なくとも一つ含む構造を表し、
【化１５】
0006652808.tif 000016
上記式（Ａ２）中、Ｄ２ は、近赤外領域に吸収を持つ色素の色素骨格であり、Ｒ１乃至Ｒ４はそれぞれ独立に、水素原子、または、置換もしくは無置換の炭素数１以上４以下の炭化水素基であり、置換を含む場合は、その置換基は、ハロゲン原子、酸素原子、窒素原子から選択される少なくとも１種を含む官能基である。
【００３１】
更に、本実施形態に係る重合体は、前記（Ａ１）式におけるＺ１が、前記式（Ａ２）で表わされる単位を少なくとも１つと、下記式（Ａ３）で表わされる単位を少なくとも１つとを含む構造で表わされる。
【化１６】
0006652808.tif 000017
上記式（Ａ３）中、Ｒ１乃至Ｒ４はそれぞれ独立に、水素原子、または、置換もしくは無置換の炭素数１以上４以下の炭化水素基であり、置換を含む場合は、その置換基は、ハロゲン原子、酸素原子、窒素原子から選択される少なくとも１種を含む官能基であり、
Ｒ５は、メチル基、エチル基、イソプロピル基、ｎ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｎ−オクチル基、ｎ−ヘプチル、フェニル基、ブテニル基、ペンチニル基のいずれかである。
本実施形態に係る重合体は、更に、上記式（Ａ１）中のＺ１が、前記式（Ａ２）で表わされる単位、及び前記式（Ａ３）で表わされる単位と、を有するランダム共重合体で表わすこともできる。
【００３２】
上記式（Ａ１）中のＺ１が、前記式（Ａ２）で表わされる単位を有するための合成方法の例としては、ポリオキサゾリンを加水分解した結果生じるアミノ基に上記Ｄ２を結合させる方法を挙げることができる。ポリオキサゾリンの加水分解方法の例としては、ポリオキサゾリン水溶液に塩酸または水酸化ナトリウム水溶液を加えて加温する方法を挙げることができる。ポリオキサゾリンの加水分解割合は、ポリマー濃度、反応温度、反応時間、塩酸または水酸化ナトリウム水溶液の量等によって適宜調節することが可能である。ポリオキサゾリンの加水分解割合は、プロトンＮＭＲ法や電気伝導度滴定等によって測定することが可能である。
【００３３】
本実施形態に係る重合体の加水分解割合は、任意に調節し使用することが可能であるが、好ましくは、６０％以下である。より好ましくは、２０％以下である。この理由のひとつは、次の通りである。加水分解割合が多くなると、重合体中のアミノ基の割合が多くなる。アミノ基は正電荷を有しやすく、細胞や他の生体物質との相互作用を生じやすい。また、アミノ基は蛋白質などの他の生体物質と結合性の相互作用を生じることがある。つまり、重合体の加水分解割合が多くなることによってアミノ基が多くなり、それゆえ重合体が望まない相互作用を生じる可能性があるため、上述の加水分解割合であることが好ましい。
【００３４】
上記式（Ａ１）中のＺ１が、前記式（Ａ２）で表わされる単位を有するための合成方法の例としては、ポリオキサゾリンを加水分解した結果生じるアミノ基に上記Ｄ２を結合させる方法を挙げることができる。以下では、Ｄ２の例として式（Ａ４）を結合させる方法について説明する。
【化１７】
0006652808.tif 000018
上記式（Ａ４）において、＊はＬ１または前記式（Ａ２）のＮに結合する、または前記重合体がＬ１を含まない場合は、前記式（Ａ１）中のＺ１、に結合することを示す。
具体的には、まず、式（Ａ５）へスクシニミジルエステル基を導入する。
【化１８】
0006652808.tif 000019
【００３５】
次に、加水分解されたポリオキサゾリンと、スクシニミジルエステル基を導入された式（Ａ５）とを反応させることにより、色素を結合させることができる。色素の導入方法はこれに限定されない。別の例としては、加水分解されたポリオキサゾリンへ官能基を導入し、色素と反応させ結合させることができる。更に、ポリオキサゾリンを加水分解した結果生じるアミノ基へ、レポーター分子や標的結合性分子、ポリマーを導入することができる。ここで、レポーター分子とは、放射性信号、磁場信号、超音波信号、蛍光信号、光超音波信号などの物理的な信号を発生する分子や治療用薬剤を意味し、放射性ハロゲン、放射性同位元素、常磁性金属イオン、酸化鉄粒子、金ナノ粒子、マイクロバブル、色素、抗癌剤などが例として挙げられる。色素の例として蛍光性化合物、燐光性化合物が挙げられるが、光超音波信号を発生する分子としては、目的に応じた波長域の光を吸収する性質を有していればよい。レポーター分子を有していることにより、コントラストを強調する造影剤としての利用が可能である。ここで、標的結合性分子とは、腫瘍やその周辺部などに特異的な標的に選択的に結合する物質であり、生体分子や医薬品等の化合物から任意に選択することができる。具体的には、抗体、抗体フラグメント、一本鎖抗体などの人工抗体、酵素、生物活性ペプチド、グリコペプチド、糖鎖、脂質、分子認識化合物などが挙げられる。これらの物質は単独で用いることもできるし、あるいは複数を組み合わせて用いることもできる。標的結合性分子が結合された化合物を用いることで、腫瘍やその周辺部などに特異的な標的の検出を可能にし、動態、局在、薬効、代謝等の追跡を行うことができる。ここで、ポリマーとはポリエチレングリコールのような重合体である。生体内投与における動態の制御に好適に用いることができる。水溶性、疎水性、どちらの性質を有していても良いが、好ましくは水溶性を有するポリマーである。
【００３６】
本実施形態に係る重合体である上記式（Ａ１）中のＺ１が、前記式（Ａ２）で表わされる単位、及び前記式（Ａ３）で表わされる単位とを有するランダム共重合体で表わされる場合、式（Ａ２）の割合は、任意に調節し使用することが可能であるが、好ましくは、６０％以下である。より好ましくは、２０％以下である。更に好ましくは、０．０１％以上１０％以下である。この理由のひとつは、次の通りである。式（Ａ２）の割合、つまり、Ｄ２の割合が多くなると、Ｄ２と細胞や他の生体物質との相互作用が生じ、体内動態に影響を与える可能性があるためである。
【００３７】
また、上記式（Ａ１）の例として下記式（Ａ６）で表わされる重合体が挙げられる。
【化１９】
0006652808.tif 000020
上記式（Ａ６）中、Ｒ０は、カチオン重合開始剤に由来する残基、あるいは官能基を表し、ωは、カチオン重合反応終了末端に由来する残基、あるいは官能基を表し、近赤外領域に吸収を持つ色素の色素骨格であり、Ｒ５は、メチル基、エチル基、イソプロピル基、ｎ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｎ−オクチル基、ｎ−ヘプチル、フェニル基、ブテニル基、ペンチニル基のいずれかである。
【００３８】
また、上記式（Ａ２）としては、下記式（Ａ７）で表わされる単位、上記式（Ａ３）としては、下記式（Ａ８）で表わされる単位が、例として挙げられる。
【化２０】
0006652808.tif 000021
【化２１】
0006652808.tif 000022
上記式（Ａ８）中、Ｒ５は、メチル基、エチル基、イソプロピル基、ｎ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｎ−オクチル基、ｎ−ヘプチル、フェニル基、ブテニル基、ペンチニル基のいずれかである。
【００３９】
（ポリオキサゾリン）
本実施形態に係るＯＺは、４，５−ジヒドロ−１，３−オキサゾール（４，５−ｄｉｈｙｄｒｏ−１，３−ｏｘａｚｏｌｅ）とも表される。本実施形態の主鎖であるＰＯＺは、水溶性の高分子であり、高い生体適合性と低い細胞毒性という性質を有する。また、生体内で分解され代謝されることが期待される。
【００４０】
本実施形態の重合体の重量平均分子量は、１００００以上２０００００以下の範囲であることが好ましく、１００００以上１０００００以下の範囲であることがさらに好ましく、１００００以上５００００以下であることがさらに好ましく、１５０００以上５００００以下であることがさらに好ましく、さらには１５０００以上３００００以下がより好ましい。重量平均分子量が１００００以上であれば、Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ（以下、ＥＰＲと略すことがある）効果により、生体内の正常部位に比べて腫瘍部位により多く集積させることができる。また、重合体の分子量増大に伴い、重合反応の進行が困難になること、および溶液粘性が増大することから重合体の分子量は５００００以下であることが好ましい。このような特徴を有するＰＯＺと色素からなる本実施形態に係る重合体および該重合体を有する光音響用造影剤は、腫瘍部へ集積する一方で、血中濃度は速やかに減少するため腫瘍血液比が高くなる効果を奏する。
なお、本明細書において分子量は重量平均分子量である。平均重量分子量はＧＰＣ法やプロトンＮＭＲ法によって測定することができる。
【００４１】
ＯＺは、分子内イミノエーテル結合を有する５員環の化合物であり、２位の位置に任意の置換基を導入することができる。例えば、メチル基を導入したＭｅＯＺ、エチル基を導入したＥｔＯＺ、イソプロピル基を導入したＩＰＯＺ、ｎ−プロピル基を導入した２−ｎ−ｐｒｏｐｙｌ−２−ｏｘａｚｏｌｉｎｅ、ｎ−ブチル基を導入した２−ｎ−ｂｕｔｙｌ−２−ｏｘａｚｏｌｉｎｅ、ｎ−オクチル基を導入した２−ｎ−ｏｃｔｙｌ−２−ｏｘａｚｏｌｉｎｅ、ｎ−ヘプチル基を導入した２−ｎ−ｈｅｐｔｙｌ−２−ｏｘａｚｏｌｉｎｅ、フェニル基を導入した２−ｐｈｅｎｙｌ−２−ｏｘａｚｏｌｉｎｅ、ブテニル基を導入した２−（ｂｕｔ−３−ｅｎｙｌ）−２−ｏｘａｚｏｌｉｎｅ、ペンチニル基を導入した２−（ｐｅｎｔ−４−ｙｎｙｌ）−２−ｏｘａｚｏｌｉｎｅ等を挙げることができる。本実施形態において最も好ましくはＯＺとして、ＭｅＯＺ、ＥｔＯＺ、ＩＰＯＺが用いられるが、これに限定されない。
【００４２】
ＯＺは、カチオン開環重合反応によりポリマー化しＰＯＺを生成する。重合開始剤（以下、開始剤と略すことがある）としてはカチオン開環重合を開始する任意の物質を用いることができるが、好ましくはｐ−トルエンスルホン酸メチル（Ｍｅｔｈｙｌ  ｐ−ｔｏｌｕｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）、トリフルオロメタンスルホン酸メチル（Ｍｅｔｈｙｌ  ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）を用いることができる。これらの開始剤を用いた場合、重合体の末端はメチル基となる。前述のＯＺは単独または任意の組み合わせで重合させることができる。重合は一般的な反応に基づき実施することができる。例えば、室温での撹拌や、還流装置による加温反応や、マイクロウェーブによる加温反応などであり、このうちマイクロウェーブによる反応は短時間で分散度の小さいＰＯＺを得ることができるため好ましい。マイクロウェーブでは、８０〜２００℃、反応時間は１〜３０分の間で反応をコントロールすることでポリマーの分子量や分散度を調整することができる。マイクロウェーブ装置としては、一般に使用される任意の機器を使用することができ、例えば、Ｄｉｓｃｏｖｅｒ（登録商標）  ＳＰ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＣＥＭ社製）を挙げることができる。
【００４３】
ＰＯＺは、ＯＺの組成、溶液中のＰＯＺ濃度、およびＰＯＺ分子量に依存した下部臨界共溶温度（Ｌｏｗｅｒ  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ、以下ＬＣＳＴと略すことがある）を示す。ＬＣＳＴは曇点とも表される。例えば、ＰＥｔＯＺは、６１から７２℃、ＰＩＰＯＺは３５から３９℃にＬＣＳＴを示すことが報告されている。ＰＯＺはＬＣＳＴ以上の温度において、可逆的な相転移が生じ凝集状態となる。本実施形態に係る重合体および該重合体を有する光音響用造影剤は、生体内に投与した後、血中を循環し腫瘍部へ集積するが、投与された生体より低いＬＣＳＴを示すＰＯＺは生体内において凝集状態となるため好ましくない。つまり本実施形態に係る重合体および該重合体を有する光音響用造影剤は、投与された生体より高いＬＣＳＴを示すことが好ましい。
本実施形態に係る重合体は、前述の通りＬＣＳＴ以上の温度で凝集状態になるが、これに伴い光音響信号が増加する。これは、後述の実施例にて示している通り、最大で３倍にもなることが確認できている。この原因の一つとしては、重合体の吸収した光／熱エネルギーが、周囲の水ではなく、凝集体ポリマー層へ移動することが考えられる。これにより、重合体の吸収したエネルギーから光音響信号への変換効率が高くなると考えられる。つまり、本実施形態に係る重合体が集積した部位を加温することにより、当該部位から生じる光音響信号を増加させる効果が得られる。
【００４４】
本実施形態に係る重合体の主鎖であるＰＯＺには、以下に示す種々の方法で官能基を導入し機能化することができる。例えば、開始剤に由来するα位へ導入できる官能基には、アルキン、アルコール、カルボキシル、アミン、アントラセン等が挙げられる。別の例としてＰＯＺのω位へ導入できる官能基には、アミン、アルケン、カルボキシル、チオール、アジド等が挙げられる。ω位への官能基導入は、保護基を使用することなく進行する反応もあり、簡便であることから好ましい。例えばＰＯＺの重合反応の後に、アミンを官能基として有する色素を求核反応によって導入することにより色素を共有結合させることができる。更にω位への官能基導入の一例としてジアミン（例えばエチレンジアミン）を反応させてアミノ基を導入することができる。具体的に、本実施形態に係る重合体および該重合体を有する光音響用造影剤では、ＰＯＺの重合反応の後に、エチレンジアミンを反応させアミノ基を導入した後、スクシニミジルエステル基を有する色素を反応させることにより、色素を共有結合させているが、色素の導入方法はこれに限定されない。また別の例としては、ＰＯＺの側鎖の２位へ導入できる官能基には、アルケン、アルキン、アミン、アルデヒド、チオール等が挙げられる。アルキンはクリック反応によってアジド−アルキン環状付加させることができる。また、アルケンは、ｔｈｉｏｌ−ｅｎｅクリック反応によってチオール基を有する化合物を付加させることができる。上述の反応によって重合体の主鎖であるＰＯＺにレポーター分子や標的結合性分子を導入することができる。ここで、レポーター分子とは、放射性信号、磁場信号、超音波信号、蛍光信号、光超音波信号などの物理的な信号を発生する分子や治療用薬剤を意味し、放射性ハロゲン、放射性同位元素、常磁性金属イオン、酸化鉄粒子、金ナノ粒子、マイクロバブル、色素、抗癌剤などが例として挙げられる。色素の例として蛍光性化合物、燐光性化合物が挙げられるが、光超音波信号を発生する分子としては、目的に応じた波長域の光を吸収する性質を有していればよい。レポーター分子を有していることにより、コントラストを強調する造影剤としての利用が可能である。ここで、標的結合性分子とは、腫瘍やその周辺部などに特異的な標的に選択的に結合する物質であり、生体分子や医薬品等の化合物から任意に選択することができる。具体的には、抗体、抗体フラグメント、一本鎖抗体などの人工抗体、酵素、生物活性ペプチド、グリコペプチド、糖鎖、脂質、分子認識化合物などが挙げられる。これらの物質は単独で用いることもできるし、あるいは複数を組み合わせて用いることもできる。標的結合性分子が結合された化合物を用いることで、腫瘍やその周辺部などに特異的な標的の検出を可能にし、動態、局在、薬効、代謝等の追跡を行うことができる。
【００４５】
（近赤外色素）
本実施形態に用いられる色素は、蛍光信号、光超音波信号などの物理的な信号を発生する分子である。本実施形態に係る重合体は色素を一つ以上有することで、診断用造影剤として用いることができ、最も好ましくは光音響用造影剤として使用することができる。色素の例としては蛍光色素が挙げられるが、その中でも人体の透過性の比較的高い近赤外波長領域の光を吸収する性質を有する蛍光色素が好ましい。ここで、近赤外波長領域とは、６００ｎｍ以上１３００ｎｍの範囲である。本実施形態における近赤外有機色素としては、例えば、アジン系色素、アクリジン系色素、トリフェニルメタン系色素、キサンテン系色素、ポルフィリン系色素、シアニン系色素、フタロシアニン系色素、スチリル系色素、ピリリウム系色素、アゾ系色素、キノン系色素、テトラサイクリン系色素、フラボン系色素、ポリエン系色素、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）系色素、インジゴイド系色素を挙げることが出来る。別の例としては、インドシアニングリーン（ＩＣＧ）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）７５０などのＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）系色素（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｊａｐａｎ社製）、Ｃｙ（登録商標）系色素（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）、ＩＲ−７８３、ＩＲ−８０６、ＩＲ−８２０（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｊａｐａｎ社製）、ＩＲＤｙｅ  ８００ＣＷ（登録商標）、ＩＲＤｙｅ  ８００ＲＳ（登録商標）（ＬＩ−ＣＯＲ社製）、ＡＤＳ７８０ＷＳ、ＡＤＳ７９５ＷＳ、ＡＤＳ８３０ＷＳ、ＡＤＳ８３２ＷＳ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｄｙｅ  Ｓｏｕｒｃｅ社製）、ＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標）系色素（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、Ｈｉｌｙｔｅ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）系色素（ＡｎａＳｐｅｃ社製）、ＤＹ（登録商標）系色素（Ｄｙｏｍｉｃｓ社製）を挙げることが出来る。アミンのような求核性の官能基を有する色素はＰＯＺと反応し共有結合を形成することができるため好ましい。一般市販の色素へアミンのような官能基を導入しＰＯＺと結合させることもできる。色素は非共有結合、共有結合のいずれか、またはその組み合わせでＰＯＺと結合することができる。体内に投与する場合は色素と主鎖であるＰＯＺが一定時間以上は一体化した状態で存在することが望ましいことから、重合体内で色素とＰＯＺは共有結合で結合していることが望ましい。
【００４６】
（光音響イメージング用造影剤）
本発明に係る光音響イメージング用造影剤は、上記重合体単独であるか、または上記重合体と分散媒とを有する。分散媒として例えば、生理食塩水、注射用蒸留水、リン酸緩衝生理食塩水、ブドウ糖水溶液が挙げられる。また本発明に係る光音響用造影剤は、必要に応じて薬理上許容できる添加物、例えば血管拡張剤などを有していても良い。本発明に係る光音響用造影剤は、上記の分散媒に予め分散させておいてもよいし、キットにしておき、生体内に投与する前に分散媒に分散させて使用してもよい。本発明に係る光音響用造影剤は、ＥＰＲ効果を利用することで、生体内に投与したときに、生体内の正常部位に比べて腫瘍部位により多く集積させることができる。さらに血中濃度は速やかに減少するため腫瘍血液比が高くなる効果を奏する。その結果、造影剤を生体内に投与した後、生体に光を照射して音響波を検出する際に、正常部位よりも腫瘍部位から大きな信号を検出することができる。以上のように本発明に係る光音響用造影剤は腫瘍の造影用として好適に用いることができる。
【００４７】
（光音響イメージング方法）
生体内に投与された本発明に係る光音響イメージング用造影剤を、光音響イメージング装置を用いて検出する方法について説明する。なお、光音響イメージングは、光音響トモグラフィー（断層撮影法）を含む概念である。本発明に係る光音響イメージング用造影剤を検出する方法は以下の（ａ）、（ｂ）の工程を有する。但し、本発明に係る光音響イメージング方法は、以下に示す工程以外の工程を含んでいても良い。
（ａ）本発明に係る光音響用造影剤が投与された検体に６００ｎｍ乃至１３００ｎｍの波長領域の光を照射する工程
（ｂ）前記検体内に存在する前記光音響用造影剤から発生する音響波を検出する工程
【００４８】
また、本発明に係る光音響イメージング用造影剤は、前記（ｂ）で得られた音響波の波長、位相および時間情報等から空間的な光音響信号強度分布を再構成する工程を有していてもよい。なお、前記（ｂ）の工程で得られた光音響信号の波長、位相および時間情報を基に３次元的な画像再構成を行うことができる。画像再構成によって得られるデータは光音響信号の強度分布の位置情報が把握できるものであればどのような形態を取っても構わない。例えば３次元空間上に光音響信号強度が表現されるようなもの構わないし、２次元平面上に光音響信号強度に表現されるようなものでも構わない。また、同一の観察対象に対して異なる撮像方法で情報を取得し、それらの情報と光音響の強度分布の位置的な対応関係を取得することも可能である。上記（ａ）の工程において、経口投与や注射等の方法によって本実施形態に係る重合体を投与された検体を用いることができる。また、上記（ｂ）の工程において、検体に照射する光を発生させる装置、本実施形態に係る重合体から発せられる光音響信号を検出する装置は特に限定されない。上記（ｂ）の工程において検体に光を照射する光源としては、前記検体に対し６００ｎｍ乃至１３００ｎｍの範囲から選択される少なくとも１つの波長のレーザーパルス光を照射させることのできるものであれば限定されない。レーザーパルス光を照射する装置として、例えば、チタンサファイアレーザー（ＬＴ−２２１１−ＰＣ、Ｌｏｔｉｓ社製）、ＯＰＯレーザー（ＬＴ−２２１４ＯＰＯ、Ｌｏｔｉｓ社製）、アレキサンドライトレーザーが挙げられる。音響波を検出する装置は特に制限されず種々のものを用いることが可能である。例えば、市販の光音響イメージング装置（Ｎｅｘｕｓ１２８、Ｅｎｄｒａ  Ｉｎｃ．製）を用いて行うことができる。
【００４９】
本発明に係る光音響イメージング用造影剤を用いたイメージング方法は、上記（ａ）、（ｂ）の工程を経ることで腫瘍あるいは血管などの目的とする部位を造影することができる。
【実施例】
【００５０】
以下、実施例を用いて更に詳細に本発明を説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではない。
【００５１】
（実施例１  Ｈｉｌｙｔｅ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）７５０標識ＰＯＺ）
（重合体の合成）
（１）各種ポリオキサゾリン（ＰＯＺ）は、開始剤として、ｐ−トルエンスルホン酸メチル（Ｍｅｔｈｙｌ  ｐ−ｔｏｌｕｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）を用い、モノマーとして２−エチル−２−オキサゾリン（ＥｔＯＺ）、または２−イソプロピル−２−オキサゾリン（ＩＰＯＺ）、またはＥｔＯＺおよびＩＰＯＺを用い、反応溶媒としてアセトニトリルを用いて合成された。開始剤とモノマーの反応開始時の物質量に基づく混合割合は表１に示した。ＰＯＺの重合反応は、マイクロウェーブ装置Ｄｉｓｃｏｖｅｒ（登録商標）ＳＰ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＣＥＭ社製）を用いて、１４０℃、１４分間の条件で加温することにより実施した。色素として、Ｈｉｌｙｔｅ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）７５０ａｍｉｎｅ（ＡｎａＳｐｅｃ社製）をジメチルスルホキシド（ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ、以下ＤＭＳＯと略すことがある）へ溶解させた溶液を、重合反応後のＰＯＺ溶液と混和し、１４０℃、１分間の条件で前述のマイクロウェーブ装置を用いて加温することで色素とＰＯＺの結合体（以下、重合体と略すことがある）を得た。反応後の溶液を減圧下で溶媒留去し、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（Ｎ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ、以下ＤＭＦと略すことがある）へ溶解させＳｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）樹脂を充填したカラムにより精製した。続いて、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｕｎｉｔｓ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を用いて限外濾過により精製した。ＰＯＺと色素の結合は電気泳動により確認した。
【００５２】
【表１】
0006652808.tif 000023
【００５３】
（分子量評価）
作製した重合体Ｐ１からＰ８の分子量をＧｅｌ  Ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（以下、ＧＰＣと略すことがある）システム（株式会社島津製作所）により評価した。具体的には、システムコントローラとしてＣＢＭ−２０Ａ、分析用送液ユニットとしてＬＣ−２０ＡＤ、オンライン脱気ユニットとしてＤＧＵ−２０Ａ３、カラムオーブンとしてＣＴＯ−２０ＡＣ、示差屈折率検出器としてＲＩＤ−１０Ａ、ＵＶ−ＶＩＳ検出器としてＳＰＤ−２０Ａ、ＬＣワークステーション、ＧＰＣソフトウェアから構成されるＧＰＣシステムを用いた。分析用カラムとしてＰＬｇｅｌ  ＭＩＸＥＤ−Ｅを用い、溶離液としてＤＭＦを用いた。標準分子量物質としてポリエチレングリコール（Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）、以下ＰＥＧと略すことがある）を用いてキャリブレーションを実施した。流速０．５ｍｌ／ｍｉｎで色素とＰＯＺの結合体のＤＭＦ溶液をカラムへ流し、溶出時間から分子量を算出した（表１）。表１においてモノマー／開始剤比は、開始剤の物質量に対する反応時のモノマーの仕込み物質量の割合を表す。モノマーの仕込み割合の増加に伴って分子量が増加した。
【００５４】
（温度応答性評価）
作製した重合体Ｐ１からＰ８を純水に溶解させた。重合体Ｐ１からＰ８の相転移温度を調べるためにＺｅｔａｓｉｚｅｒ  ｎａｎｏ−ＺＳを用いて任意の温度での粒径を評価し、粒径が増大し溶液が濁った温度を相転移温度とした。Ｐ１からＰ３は７５℃以上でも相転移が確認できなかった。それぞれの相転移温度を表２にまとめた。重合体の分子量とモノマーの組成によって相転移温度が変化した。分子量の増加およびＩＰＯＺの割合が増加するに伴い、相転移温度が低くなる傾向が確認された。
【００５５】
【表２】
0006652808.tif 000024
【００５６】
（光音響評価）
音響波の測定、具体的には光音響信号強度の測定は、パルスレーザー光をＰＢＳ中に分散したサンプルに照射し、サンプルから発生した光音響信号の強度を圧電素子を用いて検出し、高速プリアンプで増幅後、デジタルオシロスコープで取得した。具体的な条件は以下の通りである。光源として、チタンサファイアレーザー（ＬＴ−２２１１−ＰＣ、Ｌｏｔｉｓ社製）を用いた。波長は７００〜１０００ｎｍで可変であり、測定時はサンプルの吸収極大値付近の波長を選択した。エネルギー密度はおよそ１０から２０ｍＪ／ｃｍ２、パルス幅は約２０ナノ秒、パルス繰返し周波数は１０Ｈｚの条件とした。光音響信号を検出する圧電素子には、エレメント径１．２７ｃｍ、中心帯域１ＭＨｚの非収束型超音波トランスデューサー（Ｖ３０３、Ｐａｎａｍｅｔｒｉｃｓ−ＮＤＴ製）。測定容器としては、ポリスチレン製キュベットで、光路長０．１ｃｍ、サンプル容量は約２００μｌであった。水を満たしたガラス容器に前記の測定容器と圧電素子とを浸け、その間隔を２．５ｃｍとした。光音響信号強度を増幅する高速プリアンプは増幅度＋３０ｄＢの超音波プリアンプ（Ｍｏｄｅｌ５６８２、オリンパス製）を用いた。増幅された信号をデジタルオシロスコープ（ＤＰＯ４１０４、テクトロニクス製）に入力した。ガラス容器の外からパルスレーザー光を前記ポリスチレン製キュベットに照射した。この際に生じる散乱光の一部をフォトダイオードで検出し、デジタルオシロスコープにトリガー信号として入力した。デジタルオシロスコープを３２回平均表示モードとし、レーザーパルス照射３２回平均の光音響信号強度の測定を行った。測定したＰ１からＰ８の光音響信号強度は、レーザー強度と、測定した重合体溶液中の色素濃度で規格化し表２にまとめた。
【００５７】
（腫瘍集積性評価および血中濃度評価）
本発明の実施例において腫瘍塊への重合体の移行量の評価は腫瘍移植モデルマウスを用いて行った。マウスには雌の非近交系ＢＡＬＢ／ｃ  ｓｌｃ−ｎｕ／ｎｕマウス（購入時６週齢）（日本エスエルシー社）を用いた。マウスに担癌させる前の１週間、標準的な食餌、床敷きを用い、自由に食餌および飲料水を摂取できる環境下でマウスを順応させた。前記マウスに、１０６個のマウス直腸がん細胞株（Ｃｏｌｏｎ２６）を皮下移植し、腫瘍塊サイズが５〜１０ｍｍになるまで飼育した。腫瘍移植マウスへ本発明の重合体を色素量で１３ｎｍｏｌ投与し、投与１日後における腫瘍移植マウスの蛍光イメージングを実施した。蛍光イメージングはＩＶＩＳ（登録商標）Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍを用いて行った。本発明の重合体Ｐ６を腫瘍移植マウスに投与し、１日後に全身蛍光像を撮像した結果が図１である。腫瘍へ集積した重合体Ｐ６からの強い蛍光を観察した。
【００５８】
本発明の重合体の腫瘍集積性を確認するために、前記腫瘍移植マウスに対して、重合体Ｐ１、重合体Ｐ２、重合体Ｐ３、重合体Ｐ５、重合体Ｐ６、および重合体Ｐ８を尾静脈より投与した。投与量は色素量として１３ｎｍｏｌとした。投与１日後にマウスを炭酸ガスで安楽死させた後、腫瘍組織を摘出した。腫瘍組織にＴｒｉｔｏｎ（登録商標）−Ｘ１００水溶液を添加してホモジネートし後に、ＤＭＳＯを加えて色素を抽出し色素抽出溶液を作製した。一方で、何も投与していない腫瘍移植マウスからも癌組織を摘出し、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００水溶液を添加して腫瘍ホモジネート溶液を調製した。次いで、既知濃度の重合体Ｐ１、重合体Ｐ２、重合体Ｐ３、重合体Ｐ５、重合体Ｐ６、および重合体Ｐ８を、前記腫瘍ホモジネート溶液で種々の濃度へ希釈し、この希釈溶液に対し、ＤＭＳＯを加えて色素を抽出した検量用標準液を調製した。ＩＶＩＳ（登録商標）Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ  ２００Ｓｅｒｉｅｓ（ＸＥＮＯＧＥＮ社製）を用いて、色素抽出溶液および検量用標準液の蛍光強度を測定することで腫瘍組織中の色素量を定量した。腫瘍組織の単位重量あたりの、投与量に対する腫瘍組織への色素移行率（腫瘍集積量とも呼ぶ、％ｉｎｊｅｃｔｅｄ  ｄｏｓｅ：％ＩＤと略す）を算出した。
【００５９】
前記腫瘍集積性評価において、１日後にマウスを炭酸ガスで安楽死させる直前に、尾静脈から血液を採取した。採取した血液にＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００水溶液を添加して、次いでＤＭＳＯを加えて色素を抽出し色素抽出血液溶液を作製した。一方で、既知濃度の重合体Ｐ１、重合体Ｐ２、重合体Ｐ３、重合体Ｐ５、重合体Ｐ６、および重合体Ｐ８を、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００水溶液で種々の濃度に希釈し、希釈した溶液と、同量の未投与マウスから採取した血液とを混合した。次いで、この血液との混合溶液に対し、更にＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００水溶液およびＤＭＳＯを添加して検量用標準血液溶液を作製した。ＩＶＩＳ（登録商標）Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ  ２００Ｓｅｒｉｅｓ（ＸＥＮＯＧＥＮ社製）を用いて、色素抽出血液溶液および検量用標準血液溶液の蛍光強度を測定することで血液中の色素量（％ＩＤ／ｇ）を定量した。
算出した腫瘍集積量と血液中の色素量を、投与した重合体の重量平均分子量に対してプロットした（図２）。重合体の分子量の増加に伴い、腫瘍集積量の増加を確認した。
【００６０】
（比較例１  ＩＣＧ標識ポリエチレングリコール）
（ポリエチレングリコールと色素の結合体の合成）
モノアミン直鎖状ＰＥＧ  ＭＥ−２００ＥＡ（日油社製，Ｍｗ２００００）を５０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．０）で溶解させＮＨ２濃度を０．６２５ｍＭとした。一方で、ＩＣＧ−Ｓｕｌｆｏ−ＯＳｕ（Ｄｏｊｉｎｄｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．製））１ｍｇ（１．２５μｍｏｌ）をＤＭＳＯ１００μｌで溶解させた。ＰＥＧの炭酸緩衝液（４００μｌ）に、ＩＣＧ−Ｓｕｌｆｏ−ＯＳｕのＤＭＳＯ溶液２０μｌを加え、ＩＣＧ−Ｓｕｌｆｏ−ＯＳｕとＰＥＧの反応比１で反応させた。遮光下、室温で２４時間回転撹拌した後、０．２２μｍシリンジフィルターで反応溶液をろ過し、ＰＥＧと色素の結合体（以下、ＰＥＧ１と略す）を得た。
【００６１】
前述の本発明の重合体と同じ方法で、ＰＥＧ１の腫瘍集積量と血液中の色素量を定量した。本発明の重合体Ｐ６と、ＰＥＧ１について腫瘍集積量を血液の色素量で除した値（以下、腫瘍血液比、またはＴ／Ｂと略す）を算出した（図３）。重合体Ｐ６はＰＥＧ１に対して有意に高い腫瘍血液比を示した。ここで有意差検定は、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔにより行いＰ＜０．０５を有意差ありと判定した。
【００６２】
（実施例２  ＩＣＧ標識ＰＯＺ）
（重合体の合成）
開始剤として、ｐ−トルエンスルホン酸メチル（Ｍｅｔｈｙｌ  ｐ−ｔｏｌｕｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）を用い、モノマーとしてＥｔＯＺを用い、モノマー：開始剤比＝４００：１で混合し反応溶媒としてアセトニトリルを用いて合成された。重合反応は、前述のマイクロウェーブ装置を用いて、１４０℃、１４分間の条件で加温することにより実施した。続いて、エチレンジアミン（Ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ）を重合反応後のＰＯＺ溶液と混和し、１４０℃、７分間の条件で前述のマイクロウェーブ装置を用いて加温した。反応後の溶液を減圧下で溶媒留去し、メタノール（Ｍｅｔｈａｎｏｌ）へ溶解させ、Ｐｒｅ−ｔｒｅａｔｅｄ  ＲＣ  Ｔｕｂｉｎｇ（ＭＷＣＯ：３．５ｋＤ，Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を用いてメタノールに対して透析することで精製し、アミノ基が導入されたＰＯＺを得た。次に、透析後の溶液を減圧下で溶媒留去し、５０ｍＭホウ酸緩衝液（Ｂｏｒａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ）  ｐＨ８．５へ溶解させ、ＤＭＳＯへ溶解させたＩＣＧ−ｓｕｌｆｏ−ＯＳｕ（Ｄｏｊｉｎｄｏ社製）と混和し、室温で２４時間、遮光下で反応させた。反応後の溶液を前述のＰｒｅ−ｔｒｅａｔｅｄ  ＲＣ  Ｔｕｂｉｎｇを用いてメタノールに対して透析することで精製し、ＩＣＧ標識ＰＯＺ（以下、Ｐ９と呼ぶ）を得た。ＰＯＺとＩＣＧの結合は電気泳動により確認した。
【００６３】
（分子量評価）
本発明の重合体Ｐ９の分子量を前述のＧＰＣシステムにより評価した。分析用カラムとしてＰＬｇｅｌ  ＭＩＸＥＤ−Ｅを用い、溶離液としてＤＭＦを用いた。標準分子量物質としてポリエチレングリコール（Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）、以下ＰＥＧと略すことがある）を用いてキャリブレーションを実施した。流速０．５ｍｌ／ｍｉｎで色素とＰＯＺの結合体のＤＭＦ溶液をカラムへ流し、溶出時間から分子量を算出した結果、Ｐ９の重量平均分子量は１４０００であった。
【００６４】
（腫瘍集積性評価および血中濃度評価）
前述の方法で準備した腫瘍移植マウスへ本発明の重合体Ｐ９を７．５ｎｍｏｌ投与し、投与１日後における腫瘍移植マウスの蛍光イメージングを前述の方法と同様に実施した。本発明の重合体Ｐ９を腫瘍移植マウスに投与し、１日後に全身蛍光像を撮像した結果が図４である。腫瘍へ集積したＰ９からの強い蛍光を観察した。更に前述の方法で本発明の重合体Ｐ９の腫瘍集積量と血液中の色素量を定量した。その結果、腫瘍集積量は、１０．８±２．１％ＩＤ／ｇ、血液中の色素量は、５．５±１．０％ＩＤ／ｇとなり、高い腫瘍集積性を確認した。また、腫瘍血液比は２．０±０．１となり、重合体Ｐ９はＰＥＧ１に対して有意に高い腫瘍血液比を示した。ここで有意差検定は、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔにより行いＰ＜０．０５を有意差ありと判定した。
【００６５】
（参考例  ＰＯＺの体内動態評価）
（重合体の合成）
開始剤として、ｐ−トルエンスルホン酸メチル（Ｍｅｔｈｙｌ  ｐ−ｔｏｌｕｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）を用い、モノマーとしてＥｔＯＺ、またはＩＰＯＺ、または２−ｎ−ｐｒｏｐｙｌ−２−ｏｘａｚｏｌｉｎｅ（以下、ＮＰＯＺと略すことがある）、またはこれらの組み合わせを用い、表３に示す種々のモノマー／開始剤割合で混合し反応溶媒としてアセトニトリルを用いて合成した。重合反応は、前述のマイクロウェーブ装置を用いて、１４０℃、１４分間の条件で加温することにより実施した。続いて、エチレンジアミン（Ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ）を重合反応後のＰＯＺ溶液と混和し、１４０℃、７分間の条件で前述のマイクロウェーブ装置を用いて加温した。加温後の溶液を減圧下で溶媒留去し、メタノール（Ｍｅｔｈａｎｏｌ）へ溶解させ、Ｐｒｅ−ｔｒｅａｔｅｄ  ＲＣＴｕｂｉｎｇ（ＭＷＣＯ：３．５ｋＤ，Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を用いてメタノールに対して透析することで精製し、アミノ基が導入されたＰＯＺを得た。得られた重合体の分子量を前述のＧＰＣシステムにより評価し、その結果を表３にまとめた。
【００６６】
作製した重合体をＰｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）に溶解させ、前述の通り相転移温度を調べた。それぞれの相転移温度を表３にまとめた。モノマーがＥｔＯＺの場合は７０℃以上でも相転移が確認できなかった。一方で、モノマーがＮＰＯＺの場合は、ＩＰＯＺと比較して相転移温度が低くなる傾向が確認された。モノマーがＮＰＯＺとＩＰＯＺの組み合わせの場合は、ＮＰＯＺの割合が高くなるにつれて相転移温度が低くなる傾向が確認された。
【００６７】
【表３】
0006652808.tif 000025
【００６８】
次に、作製した重合体の体内動態評価のために放射性標識を実施した。具体的には、まず重合体Ｐ１３、Ｐ１８、Ｐ１９とＳ−２−（４−Ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｏｂｅｎｚｙｌ）−１，４，７，１０−ｔｅｔｒａａｚａｃｙｃｌｏｄｏｄｅｃａｎｅ  ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ（ｐ−ＳＣＮ−Ｂｎ−ＤＯＴＡとも呼ぶ、Ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｃｓ社製）とをメタノール中で、重合体：ｐ−ＳＣＮ−Ｂｎ−ＤＯＴＡ＝１：５の割合で混合し室温で１．５日間反応させ、重合体に金属キレート部位を導入した。以後、金属キレート部位を導入した重合体Ｐ１３、Ｐ１８、Ｐ１９を、ＤＯＴＡ−Ｐ１３、ＤＯＴＡ−Ｐ１８、ＤＯＴＡ−Ｐ１９と呼ぶ。未反応のｐ−ＳＣＮ−Ｂｎ−ＤＯＴＡを除去するために、ＰＤ−１０カラム（ＧＥヘルスケアジャパン社製）を用いたゲルろ過、およびＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｕｎｉｔｓを用いた限外濾過により精製した。
【００６９】
金属キレート部位を導入した重合体の相転移温度は、導入前後で大きく変化しないことを確認した。
【００７０】
ＤＯＴＡ−Ｐ１３またはＤＯＴＡ−Ｐ１８は、１１１ＩｎＣｌ３と酢酸緩衝液中で混和し、室温で１０分間反応させることで、１１１Ｉｎ標識されたＤＯＴＡ−Ｐ１３（以下、１１１Ｉｎ標識ＤＯＴＡ−Ｐ１３と呼ぶことがある）または１１１Ｉｎ標識されたＤＯＴＡ−Ｐ１８（以下、１１１Ｉｎ標識ＤＯＴＡ−Ｐ１８と呼ぶことがある）を得た。ＤＯＴＡ−Ｐ１９は、１１１ＩｎＣｌ３と酢酸緩衝液中で混和し、氷上で１０分間反応させ、１１１Ｉｎ標識されたＤＯＴＡ−Ｐ１９（以下、１１１Ｉｎ標識ＤＯＴＡ−Ｐ１９と呼ぶことがある）を得た。得られた各重合体の放射化学的収率および放射化学的純度を表４にまとめた。放射活性は、ＮａＩｗｅｌｌ型シンチレーションカウンター  １４７０ＷＩＺＡＲＤ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）により測定した。
【００７１】
【表４】
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【００７２】
上述の通り作製した１１１Ｉｎ標識ＤＯＴＡ−Ｐ１３、１１１Ｉｎ標識ＤＯＴＡ−Ｐ１８、または１１１Ｉｎ標識ＤＯＴＡ−Ｐ１９をマウス尾静脈より投与し（それぞれマウス一匹あたり０．６μＣｉ、２６．７μＭ（ポリマー濃度）、１５０μＬ  ＰＢＳ）、１，６，２４時間後に安楽死させ、マウス組織を摘出しその重量と放射活性を測定した。測定した各臓器の放射活性を臓器重量と投与サンプルの放射活性で規格化し図５にまとめた。被検体であるマウスの体温よりも相転移温度が低い１１１Ｉｎ標識ＤＯＴＡ−Ｐ１９は、投与１時間後から肝臓や脾臓へ集積し、血中から速やかにクリアランスされた（図５（Ａ））。肝臓や脾臓には比較的大きな分子がマクロファージに貪食されて集積することが知られており、１１１Ｉｎ標識ＤＯＴＡ−Ｐ１９はマウス体内で重合体が凝集したため、これらの臓器に集積したと考えられる。次に、被検体であるマウスの体温と同じくらいの相転移温度である１１１Ｉｎ標識ＤＯＴＡ−Ｐ１８は、肝臓や腎臓に集積し、投与１時間後でも血液中に存在した（図５（Ｂ））。最後に、被検体であるマウスの体温より充分高い相転移温度である１１１Ｉｎ標識ＤＯＴＡ−Ｐ１３は、顕著な臓器集積は示さず、１１１Ｉｎ標識ＤＯＴＡ−Ｐ１８、および１１１Ｉｎ標識ＤＯＴＡ−Ｐ１９よりも長く血液中に存在した（図５（Ｃ））。
【００７３】
次に、ヒト前立腺癌細胞ＰＣ−３を担癌したマウスに１１１Ｉｎ標識ＤＯＴＡ−Ｐ１３、１１１Ｉｎ標識ＤＯＴＡ−Ｐ１８、または１１１Ｉｎ標識ＤＯＴＡ−Ｐ１９を腫瘍内投与し（それぞれマウス一匹あたり０．６μＣｉ、２０００μＭ（ポリマー濃度）、５μＬＰＢＳ）、１日後に安楽死させ腫瘍を摘出しその放射活性を測定し、投与サンプルの放射活性で規格化した。その結果、腫瘍における滞留は、１１１Ｉｎ標識ＤＯＴＡ−Ｐ１９が最も多く（５８．８％ＩＤ±１４．１）、次いで１１１Ｉｎ標識ＤＯＴＡ−Ｐ１８（１３．１％ＩＤ±３．５）、１１１Ｉｎ標識ＤＯＴＡ−Ｐ１３（３．３％ＩＤ±０．６）の順であった。これは、相転移温度が被検体よりも低いと、凝集して拡散しにくくなるためこのような順番になったと考えられる。
【００７４】
腫瘍を明確に造影するためには、重合体（造影剤）の腫瘍集積量を増やし、血中濃度を下げることが好ましい。ＥＰＲ効果により重合体を腫瘍へ集積させる場合には、重合体を血管から腫瘍間質へ漏出させる必要がある。そのため、投与後一定時間は、重合体が血中に滞留していることが好ましい。上記参考例の実験から、相転移温度が被検体よりも高い重合体を用いると、投与後一定時間は重合体が血中に存在することが示された。つまり、腫瘍をより明確に造影するためには、相転移温度が被検体よりも高い重合体（本例ではＥｔＯＺ）を用いることがより好ましいことが示された。
【００７５】
（実施例３  分子量の異なるＰＯＺの体内動態評価）
（重合体の合成）
上記実施例２と同じ方法で重合体を合成した。重合体の反応条件ならびに分子量を表５にまとめた。
【００７６】
【表５】
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【００７７】
得られた重合体（Ｐ２３）および上記実施例２で合成したＰ１０、Ｐ１１、Ｐ１２、Ｐ１４（各０．５μｍｏｌ）のそれぞれに対して、下式（ｄ１−１−１）で表わされる色素（１μｍｏｌ）と、１−ｅｔｈｙｌ−３−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）  ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（１μｍｏｌ）と、Ｎ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−４−ａｍｉｎｏｐｙｒｉｄｉｎｅ（１μｍｏｌ）とを、クロロホルム（１ｍＬ）中にて混和し、遮光下にて２４時間反応させた。未反応の色素は、Ｐｒｅ−ｔｒｅａｔｅｄ  ＲＣ  Ｔｕｂｉｎｇ（ＭＷＣＯ：３．５ｋＤ）を用いてメタノールに対して透析することで精製した。上述の方法で得られた色素の結合したＰ１０、Ｐ１１、Ｐ１２、Ｐ１４、Ｐ２３を以降ではそれぞれ、Ｐ１０−ＩＣＧ、Ｐ１１−ＩＣＧ、Ｐ１２−ＩＣＧ、Ｐ１４−ＩＣＧ、Ｐ２３−ＩＣＧと呼ぶ。ＰＯＺと色素の結合は電気泳動により確認した。Ｐ１０−ＩＣＧ、Ｐ１１−ＩＣＧ、Ｐ１２−ＩＣＧ、Ｐ１４−ＩＣＧ、および、Ｐ２３−ＩＣＧの純度は、いずれも９９％以上の高い値で得られた。
【化２２】
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【００７８】
（腫瘍集積性評価および血中濃度評価）
前述の方法で準備した腫瘍移植マウスへＰ１０−ＩＣＧ、Ｐ１１−ＩＣＧ、Ｐ１２−ＩＣＧ、Ｐ１４−ＩＣＧ、Ｐ２３−ＩＣＧを１３ｎｍｏｌ投与し、投与１日後における腫瘍移植マウスの蛍光イメージングを前述の方法と同様に実施した。本発明の実施例におけるＰ１０−ＩＣＧ、Ｐ１１−ＩＣＧ、Ｐ１２−ＩＣＧ、Ｐ１４−ＩＣＧ、Ｐ２３−ＩＣＧを腫瘍移植マウスに投与し、１日後に全身蛍光像を撮像した結果が図６である。いずれも腫瘍へ集積し、強い蛍光を観察できた。更に前述の方法で本発明の実施例におけるＰ１０−ＩＣＧ、Ｐ１１−ＩＣＧ、Ｐ１２−ＩＣＧ、Ｐ１４−ＩＣＧ、Ｐ２３−ＩＣＧの腫瘍集積量と血液中の色素量を定量し、その結果を表６にまとめた。腫瘍集積量は、分子量の増加に伴い概ね増加する傾向にあった。また、腫瘍血液比はいずれも３以上となり、比較例１で合成したＰＥＧ１に対して有意に高い腫瘍血液比を示した。ここで有意差検定は、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔにより行いＰ＜０．０５を有意差ありと判定した。
【表６】
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【００７９】
次に、本発明の実施形におけるＰ１０−ＩＣＧ、Ｐ１１−ＩＣＧ、Ｐ１２−ＩＣＧ、Ｐ１４−ＩＣＧ、Ｐ２３−ＩＣＧを腫瘍移植マウスに投与し、投与後５、１５、３０分、１、３、６、２４時間目にマウスの尾静脈より採血し、上述の方法に従い血液に含まれる本発明の色素の結合した重合体を定量し経時変化を調べた（図７Ａ）。Ｇｒａｐｈｐａｄ  ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ社製）を用いてｔｗｏ  ｐｈａｓｅ  ｄｅｃａｙモデルで血中半減時間を算出し、各重合体の分子量に対してプロットした（図７Ｂ）。図７Ａの結果より、分子量が増加するに伴い、血中濃度の低下が緩やかになることが示された。このことは、図７Ｂに示した通り、分子量に対して血中半減時間が増加したことからも支持される。
【００８０】
（実施例４  ポリマー凝集による光音響信号の増加）
（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ光音響信号測定）
実施例１で作製したＰ４乃至Ｐ８について、上述の光音響信号強度の測定と同じ方法で、測定時の水槽内の水の温度を、３７℃、４７℃、５７℃と変化させて、光音響信号の変化について調べ、結果を表７にまとめた。相転移温度が７０℃以上のＰ５、Ｐ６では、５７℃まで加温しても最大で１．３倍程度しか光音響信号は増加しなかった。これは水温の上昇による熱膨張係数の増加、および、それに伴うグリューナイゼン係数の増加による光音響信号の増加と考えられる。一方でＰ４は５７℃で、Ｐ７は３７℃以上で、Ｐ８は４７℃以上で光音響信号が、１．５倍以上増加した。このことから、相転移温度以上の温度で凝集することにより光音響信号が増加する効果が得られることが分かった。この原因の一つとしては、吸収した光エネルギーが、周囲の水では無く、凝集体ポリマー層へ移動することが考えられる。これにより、重合体の吸収したエネルギーから光音響信号への変換効率が高くなる効果が考えられる。
【表７】
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【００８１】
（実施例５  オキサゾリン側鎖加水分解体）
（加水分解反応）
本発明の実施形態において、オキサゾリンの２位の側鎖を加水分解することによって官能基導入することも可能である。具体的には、加水分解等によって２級アミンに変換することができる。加水分解反応は塩酸（以下ＨＣｌと略すことがある）または水酸化ナトリウム（以下ＮａＯＨと略すことがある）を用いて、以下に示す方法で行った。エチルオキサゾリンポリマー（重量平均分子量２５０００、または５００００、または２０００００）とＨＣｌまたはＮａＯＨを表８に示した割合で水中で混合し、種々の温度で加温した。ＮａＯＨと反応させた溶液は、反応後ＨＣｌで中和し、Ｐｒｅ−ｔｒｅａｔｅｄ  ＲＣ  Ｔｕｂｉｎｇ（ＭＷＣＯ：３．５ｋＤ）を用いて透析精製した。透析外液は、１回目が水、２回目が水：メタノール＝１：１、３回目がメタノールとして３回の透析を行った。一方で、ＨＣｌと反応させた溶液は、反応後ＮａＯＨで中和し、一晩凍結乾燥した後、クロロホルムに溶解させＣｅｌｉｔｅ（登録商標）ろ過で回収した。加水分解割合は、ＮＭＲおよび電気伝導度によって測定した。電気伝導度は、０．０１Ｍの塩酸に１Ｍの水酸化ナトリウムを５μＬずつ添加していくことで滴定直線を作成し、これを基に測定溶液中のアミノ基量（加水分解割合に対応する）を算出した。加水分解割合は、ＮＭＲで算出した場合と電気伝導度で算出した場合で概ね一致する傾向が見られた。ＮａＯＨを用いて加水分解した場合にはＮａＯＨの量および反応時間が増加すると加水分解割合が増加する傾向が見られた。一方で、ＮａＯＨの添加割合がポリマー側鎖の１０倍になるように調製した場合では、ＮａＯＨの添加割合がポリマー側鎖の１倍になるように調製した場合よりも加水分解割合が低下した。これは、重合体濃度が高くないことが原因であると考えられる。次に、ＨＣｌを用いて加水分解した場合にも、ＮａＯＨの場合と同様に反応時間とＨＣｌの添加割合が増加すると加水分解割合が増加した。このように、様々な濃度のポリマーおよびＮａＯＨまたはＨＣｌを用いて、種々の条件で加温することで期待する加水分解割合のＰＯＺを調製することができる。
【表８】
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【００８２】
（側鎖色素標識反応）
前述の表８の重合体いくつかについて、加水分解された側鎖への色素標識を行った。具体的には、表９に示す割合で各重合体に対して、ＩＣＧ−ｓｕｌｆｏ−ＯＳｕを、クロロホルム中にて混和し、遮光下にて２４時間反応させた。別の色素標識方法としては、式（ｄ１−１−１）で表わされる色素および、１−ｅｔｈｙｌ−３−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）  ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅおよび、Ｎ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−４−ａｍｉｎｏｐｙｒｉｄｉｎｅとを、クロロホルム中にて混和し、遮光下にて２４時間反応させた。いずれの色素標識反応の場合も未反応の色素は、Ｐｒｅ−ｔｒｅａｔｅｄ  ＲＣ  Ｔｕｂｉｎｇ（ＭＷＣＯ：３．５ｋＤ）を用いてメタノールに対して透析することで精製した。上述の方法で得られた色素の結合した重合体を、以降では表９に示した通り、重合体の番号とＩＣＧの組み合わせで呼称する。同じ重合体でＩＣＧ結合数が異なる場合は末尾に数字を付して判別する。ＩＣＧの結合数は、重合体重量と吸光度から算出した。重合体とＩＣＧの結合は電気泳動により確認し、いずれの重合体も９０％以上の純度で得られた。
【００８３】
（細胞取り込み評価）
前述のＰ３３−ＩＣＧ１、および、Ｐ３４−ＩＣＧについて、細胞への取り込み評価を行った。２４ｗｅｌｌ細胞培養プレートへＣｏｌｏｎ２６細胞（１０５個／ｗｅｌｌ）をまき、ＣＯ２インキュベーター内で一日培養した。新しい培地（４００μＬ）へ交換後、Ｐ３３−ＩＣＧ１、または、Ｐ３４−ＩＣＧ、または、ＩＣＧ、または、前述の比較例１のＰＥＧ１（各色素濃度１０μＭ、１００μＬ）をそれぞれｗｅｌｌへ添加し、ＣＯ２インキュベーター内で２４時間培養した。培養後のｗｅｌｌ内の溶液を捨て、ＰＢＳ（１ｍＬ）で２回洗浄し、細胞をトリプシン／エチレンジアミン四酢酸溶液で剥がして回収し、ｗｅｌｌあたりの細胞数を計測した。回収した細胞溶液に、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（終濃度１％）と、ＤＭＳＯ（終濃度９０％）を加えて、蛍光強度を測定した。その結果を図８に示した。Ｐ３３−ＩＣＧ１、および、Ｐ３４−ＩＣＧはＰＥＧ１に比較して有意に高く、Ｃｏｌｏｎ２６細胞に取り込まれたが、ＩＣＧよりは低かった。また、ＩＣＧ結合数と側鎖加水分解割合の高いＰ３４−ＩＣＧの方がＣｏｌｏｎ２６細胞に多く取り込まれた。
【００８４】
（腫瘍集積性評価および血中濃度評価）
前述の方法で準備した腫瘍移植マウスへ、表９に記載の重合体をそれぞれ１３ｎｍｏｌ投与し、投与１日後における腫瘍移植マウスの蛍光イメージングを前述の方法と同様に実施した。本発明の重合体を腫瘍移植マウスに投与し、１日後に全身蛍光像を撮像した結果が図９である。いずれも腫瘍への集積を確認することができ、Ｐ３３−ＩＣＧ１、Ｐ３３−ＩＣＧ２、Ｐ３７−ＩＣＧ１、Ｐ３７−ＩＣＧ２、Ｐ３７−ＩＣＧ３、Ｐ４２−ＩＣＧは、腫瘍周囲とのコントラストは高かった。また、ＩＣＧ結合数が多くなると肝臓からの蛍光が強くなる傾向がみられた。更に前述の方法で本発明の重合体の腫瘍集積量と血液中の色素量を定量し、その結果を表９にまとめた。腫瘍集積量は、マウスの全身蛍光像において腫瘍周囲とのコントラストが高かった重合体の方が高い値となる傾向がみられた。加水分解割合が高くなると、腫瘍集積性が低下する傾向がみられた。また、腫瘍血液比はいずれも２以上となり、比較例１で合成したＰＥＧ１に対して有意に高い腫瘍血液比を示した。ここで有意差検定は、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔにより行いＰ＜０．０５を有意差ありと判定した。
【表９】
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【００８５】
（実施例６  担癌マウスモデルでの光音響信号測定）
（ｉｎ  ｖｉｖｏ光音響腫瘍イメージング）
本発明の実施例においてｉｎ  ｖｉｖｏ光音響腫瘍イメージングは、光音響イメージング装置（Ｎｅｘｕｓ１２８，Ｅｎｄｒａ．Ｉｎｃ．製）を用いて実施した。前述の腫瘍集積性評価と同様に作製した担癌マウスを、麻酔で眠らせた後、イメージング装置に固定した。本発明の重合体Ｐ２３−ＩＣＧおよびＰ３７−ＩＣＧ３（各５２ｎｍｏｌ）を投与する前、および、投与２４時間後において、光音響信号を測定し、それぞれの３次元再構成データを得た。得られた３次元再構成データを用いてＯｓｉｒｉＸ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｏｆｔｗａｒｅにより光音響信号画像を描出した（図１０）。本発明の重合体Ｐ２３−ＩＣＧおよびＰ３７−ＩＣＧ３を投与した担癌マウスにおいて、投与２４時間後において腫瘍の位置および形状が明瞭に描出されたことから、本発明の重合体の光音響用腫瘍造影剤としての有用性が示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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