(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリオキサゾリンポリマー、前記ポリオキサゾリンポリマーに連結する認識部分、任意選択による精製部分、及び加水分解性部分を含む遊離可能なリンカーを介して前記ポリオキサゾリンポリマーに連結する複数の薬剤を含む、ポリマー複合体であって、前記ポリマー複合体は、下記の一般式
Ｒ１−｛［Ｎ（ＣＯＸ）ＣＨ２ＣＨ２］ｏ−［Ｎ（ＣＯＲ２）ＣＨ２−ＣＨ２）］ｎ−［Ｎ（ＣＯＹ）ＣＨ２−ＣＨ２）］ｍ｝ａ−Ｒ２０
を有し、式中、
Ｒ１は、開始基であり、
Ｒ２は、非置換アルキル基、置換アルキル基、非置換アルケニル基、置換アルケニル基、非置換アラルキル基、置換アラルキル基、非置換ヘテロシクリルアルキル基、置換ヘテロシクリルアルキル基から、各繰り返し単位について独立に選択され、
各繰り返し単位のＸは、第１のペンダント部分であり、少なくとも１個の第１のペンダント部分が、薬剤又は精製部分を含み、前記ポリマー骨格に前記薬剤又は前記精製部分を連結し、
各繰り返し単位のＹは、第２のペンダント部分であり、前記第２のペンダント部分の各々が、任意選択的に前記薬剤又は前記精製部分を含み、前記ポリマー骨格に前記薬剤又は前記精製部分を連結し、
但し、前記薬剤を含む前記第１のペンダント部分及び前記第２のペンダント部分の各々は、以下の構造：
【化１】
0006704900.tif 000050
を有し、前記精製部分を含む前記第１のペンダント部分及び前記第２のペンダント部分の各々は、以下の構造：
【化２】
0006704900.tif 000051
Ｒ３は、−Ｒ５−又は−Ｃ（Ｏ）−Ｒ５−であり、式中、Ｒ５は、存在しないか、又は長さが１〜１０個の炭素の置換若しくは非置換アルキルであり、
前記第１のペンダント部分又は前記第２のペンダント部分が精製部分を含むとき、Ｒ４は、−Ｒ６−Ｒ７−Ｒ８−であり、加水分解性部分を欠いており、式中、
Ｒ６は、置換若しくは非置換アルキル、置換若しくは非置換アラルキル、又はポリマーであり、
Ｒ７は、連結基であり、
Ｒ８は、存在しない；
前記第１のペンダント部分又は前記第２のペンダント部分が薬剤を含むとき、Ｒ４は、−Ｒ６−Ｒ７−Ｒ８−であり、少なくとも１つの加水分解性部分を含み、
Ｒ６は、Ｕ１−（ｐｏｌ）ｂ−Ｕ２−（［ＮＲ１６−Ｃ（Ｒ１３）（Ｒ１４）−Ｃ（Ｏ）］ｃ）−ＮＲ１７−Ａｒ−（ＣＨ２）ｓであり、任意選択的に、加水分解性部分を含み、
Ｒ７は、連結基であり、任意選択的に、加水分解性基又は加水分解性部分の一部分を含み、
Ｒ８は、存在しないが、但し、Ｒ６又はＲ７の少なくとも１つは、加水分解性部分を含み、
Ｕ１は、任意の連結基を表し、
ｐｏｌは、ポリマー部分を表し、
Ｕ２は、任意の連結基を表し、
Ｒ１７、Ｒ１６、及びＲ１３は各々独立して、Ｈまたは置換若しくは非置換Ｃ１−Ｃ５アルキルであり、
Ｒ１４は、天然型アミノ酸または非天然型アミノ酸上の側鎖基であり、
Ａｒは、アリール基を表し、
ｂは、１〜１５の整数であり、
ｃは、１〜１０の整数であり、
ｓは、０〜４の整数であり、
Ｒ２０は、前記認識部分を含み、前記ポリマー骨格に前記認識部分を連結する、認識薬剤連結部分であり、
ａは、ランダムコポリマーを示すｒａｎ、又はブロックコポリマーを示すｂｌｏｃｋであり、
ｎは、０〜１０００の整数であり、
ｏ及びｍは各々、０〜５０から独立して選択される整数であるが、
但し、ｏ及びｍの両方が、各々０であることはなく、薬物対抗体の比率は、２以上であり、
前記精製部分は、ビオチンであり、前記認識部分は、抗体又は抗体断片である、
ポリマー複合体。
【請求項２】
前記認識部分は、抗体である、請求項１に記載のポリマー複合体。
【請求項３】
前記抗体は、前記ポリオキサゾリンポリマーへの前記抗体の部位特異的複合化のための結合残基を含む、請求項２に記載のポリマー複合体。
【請求項４】
前記結合残基は、非天然のものである、請求項３に記載のポリマー複合体。
【請求項５】
前記結合残基は、セレノシステイン残基又はシステイン残基である、請求項３に記載のポリマー複合体。
【請求項６】
前記認識部分及び前記ポリオキサゾリンポリマーは、１：１の比率で存在する、請求項１に記載のポリマー複合体。
【請求項７】
前記抗体は、一本鎖のＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、又はＩｇＤ抗体である、請求項２に記載のポリマー複合体。
【請求項８】
前記薬剤は、細胞毒性剤である、請求項１に記載のポリマー複合体。
【請求項９】
ｎ、ｏ、及びｍの合計は、少なくとも３０であり、５００以下である、請求項１に記載のポリマー複合体。
【請求項１０】
少なくとも１個の第１のペンダント部分又は第２のペンダント部分は、薬剤又は精製部分に連結しない、請求項１に記載のポリマー複合体。
【請求項１１】
前記加水分解性部分は、カルボン酸エステル、炭酸エステル、カルバメート、二硫化物、硫化物、及びアミドからなる群から選択される、請求項１に記載のポリマー複合体。
【請求項１２】
前記薬剤を含む前記第１のペンダント部分及び第２のペンダント部分の各々における前記加水分解可能なリンカーは、前記加水分解性部分を含む生体安定加水分解性リンカーである、請求項１に記載のポリマー複合体。
【請求項１３】
【化３】
0006704900.tif 000052
は、
【化４】
0006704900.tif 000053
である、請求項１に記載のポリマー複合体。
【請求項１４】
Ｒ７は、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−である、請求項１に記載のポリマー複合体。
【請求項１５】
Ｕ１は、置換若しくは非置換Ｃ１−Ｃ１０アルキルであるか、又は存在せず、Ｕ２は、−（ＣＨ２）ｔ−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、若しくは−ＮＨ−によって表されるか、又は存在せず、ｐｏｌは、ポリエチレングリコールポリマーであり、Ａｒは、ベンゼンであり、ｔは、１〜１０の整数である、請求項１４に記載のポリマー複合体。
【請求項１６】
Ｒ７は、−Ｒａ−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｒｂ−、−Ｒａ−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｒｂ−、−Ｒａ−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｒｂ−、−Ｒａ−Ｓ−Ｓ−Ｒｂ−、又はＲａ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｒｂ−であり、Ｒａ及びＲｂは各々独立して、存在しないか、又は置換若しくは非置換アルキルである、請求項１に記載のポリマー複合体。
【請求項１７】
Ｒ３は、−（ＣＨ２）３−又はＣ（Ｏ）−（ＣＨ２）３であり、Ｒ４は、
【化５】
0006704900.tif 000054
である、請求項１に記載のポリマー複合体。
【請求項１８】
Ｒ３は、−（ＣＨ２）３−又はＣ（Ｏ）−（ＣＨ２）３であり、Ｒ４は、
【化６】
0006704900.tif 000055
である、請求項１に記載のポリマー複合体。
【請求項１９】
【化７】
0006704900.tif 000056
は、
【化８】
0006704900.tif 000057
である、請求項１に記載のポリマー複合体。
【請求項２０】
Ｒ３は、−（ＣＨ２）３−又はＣ（Ｏ）−（ＣＨ２）３であり、Ｒ４は、
【化９】
0006704900.tif 000058
である、請求項１に記載のポリマー複合体。
【請求項２１】
Ｒ２０は、Ｒ２１−Ｚ−Ｒ２２であり、
式中、
Ｒ２１は、−Ｓ−、−Ｏ−、又は−Ｎ−からなる群から選択され、
Ｚは、連結基であり、
Ｒ２２は、前記認識部分を含む部分である、
請求項１に記載のポリマー複合体。
【請求項２２】
Ｚは、−（ＣＨ２）ｒ−であり、ｒは、１〜１０の整数である、請求項２１に記載のポリマー複合体。
【請求項２３】
Ｒ２０は、−Ｒ２１−（ＣＨ２）ｒ１−Ｒ２３−Ｒ２４−（ＣＨ２）ｒ２−Ｒ２２であり、
式中、
Ｒ２１は、−Ｓ−、−Ｏ−、又は−Ｎ−からなる群から選択され、
Ｒ２２は、前記認識部分を含む部分であり、
Ｒ２３は、−Ｃ（Ｏ）−、又は−Ｎ−Ｒ２５−であり、
Ｒ２４は、−Ｏ−、又は−Ｎ−Ｒ２６−であり、
Ｒ２５及びＲ２６は各々独立して、Ｈ又は置換若しくは非置換アルキル基であり、
ｒ１及びｒ２は各々独立して、０〜１０の整数である、
請求項１に記載のポリマー複合体。
【請求項２４】
Ｒ２２は、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−Ｓ−Ａｂ、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−Ｓｅ−Ａｂ、
【化１０】
0006704900.tif 000059
であり、Ａｂは、抗体を表す、請求項２３に記載のポリマー複合体。
【請求項２５】
Ｒ２０は、−Ｒ２１−（ＣＨ２）ｒ１−Ｒ２３−Ｒ２４−（ＣＨ２）ｒ２−Ｒ２７−Ｒ２８−（ＣＨ２）ｒ３−Ｒ２２であり、
式中、
Ｒ２１は、−Ｓ−、−Ｏ−、又は−Ｎ−からなる群から選択され、
Ｒ２２は、前記認識部分を含む部分であり、
Ｒ２３は、−Ｃ（Ｏ）−、又は−Ｎ−Ｒ２５−であり、
Ｒ２４は、−Ｏ−、又は−Ｎ−Ｒ２６−であり、
Ｒ２７は、存在しないか、又はＮ−Ｒ２９若しくはＣ（Ｏ）−であり、
Ｒ２８は、存在しないか、又は−Ｃ（Ｏ）−若しくはＮ−Ｒ３０であり、
Ｒ２５、Ｒ２６、Ｒ２９、及びＲ３０は各々独立して、Ｈ又は置換若しくは非置換アルキル基であり、
ｒ１、ｒ２、及びｒ３は各々独立して、０〜１０の整数である、
請求項１に記載のポリマー複合体。
【請求項２６】
Ｒ２２は、−Ｓ−Ａｂ、−Ｓｅ−Ａｂ、
【化１１】
0006704900.tif 000060
からなる群から選択され、Ａｂは、抗体を表す、請求項２５に記載のポリマー複合体。
【請求項２７】
ｍ＝０である、請求項１に記載のポリマー複合体。
【請求項２８】
以下の構造
【化１２】
0006704900.tif 000061
0006704900.tif 000062
を有し、式中、
ｑは、１〜１０の整数であり、
ｂ及びｄは各々独立して、１〜３０の整数であり、
ｏ１は、１〜５の整数であり、
ｏ２は、１〜４５の整数であり、
Ａｇｅｎｔは、前記薬剤を表し、
ＰＭは、前記精製部分を表す、
請求項１に記載のポリマー複合体。
【請求項２９】
ｏは、１〜２０の整数であり、ｍは、０であるか、又は１〜５０の整数であり、ｎは、２０〜５００の整数である、請求項１に記載のポリマー複合体。
【請求項３０】
以下の構造のポリマー複合体であって、
【化１３】
0006704900.tif 000063
0006704900.tif 000064
式中、
ｏ１、ｏ２、及びｍの合計は、５０以下であり、
ｏ１は、１〜５の整数であり、
ｏ２は、１〜４５の整数であり、
Ａｇｅｎｔは、薬剤を表し、
Ａｂは、抗体を表し、
ＢＲは、前記抗体上の結合残基を表し、
ＰＭは、精製部分を表す、
ポリマー複合体。
【請求項３１】
前記抗体は、一本鎖のＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、又はＩｇＤ抗体である、請求項３０に記載のポリマー複合体。
【請求項３２】
ｏ１は、２以下であり、ｏ２は、１０以下であり、ｍは、１０以下であり、ｎは、５００以下である、請求項３０に記載のポリマー複合体。
【請求項３３】
前記薬剤は、細胞毒性剤である、請求項３２に記載のポリマー複合体。
【請求項３４】
複合体が、５〜２０の薬物対抗体の比率を有する、請求項１、２８又は３０のいずれか一項に記載のポリマー複合体。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
小分子医薬品は、限定されないが、癌を含む様々な疾患の治療において標準である。そのような小分子医薬品は、通常、液体、丸薬、カプセル等の形態で経口投与されるか、または注射液もしくは静脈内製剤の形態で非経口投与される。非常に多くの病態の治療において有効である一方で、多くの困難が残っている。これらには、薬物送達の速度を制御することと、化合物の送達を所望の作用部位に向けることと、循環血液中の化合物の半減期を最大化することと、が含まれるが、これらに限定されない。例えば、多くの化合物が作用部位に到達する前の新陳代謝に起因して、減少した有効性及び治療効果を呈する。さらに、多くの化合物が、水性溶媒に比較的不溶性であり、投与のために複雑な製剤の使用を必要とする。いくつかの事例において、これは、たとえこれらの化合物が前臨床試験において有効であったとしても、臨床でこれらの有用性を制限し得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００２】
薬物送達の分野における１つの目標は、所望の作用部位に化合物を優先的に送達することである。さらに、付加的な目標は、化合物が作用部位に達したら、少なくとも部分的に化合物の送達を制御することである。さらに、付加的な目標は、生体内に送達されたとき、化合物を安定化させ、生体内で化合物の半減期を延ばし、化合物、特に、水性溶媒に不溶性である化合物の可溶性において補助をする送達システムを用いて、前述の目標のうちの１つ以上を達成することである。
【０００３】
当分野における不十分な点に対処するために、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）が研究されている。多くの研究及び開発が、ＡＤＣが、動物モデル及びヒトにおける癌細胞を標的とした破壊の提供に有効であることを示している（Ｐ．Ｄ．Ｓｅｎｔｅｒ  ａｎｄ  Ｅ．Ｌ．Ｓｉｅｖｅｒｓ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３０，６３１−６３７（２０１２）、Ｃ＆ＥＮ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｄｒｕｇ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ，Ｊｕｎｅ  １８，２０１２，ｐａｇｅｓ  １２−１８、Ｊ．Ｄ．Ｔｈｏｍａｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，２３，２００７−２０１３（２０１２）、及びこれら内の参考文献）。この概念は長年論じられているが、この概念の実現には、実現させるために数十年かかった。最初の「武装抗体」は、２０１１年まで承認されなかった（Ｐ．Ｄ．Ｓｅｎｔｅｒ  ａｎｄ  Ｅ．Ｌ．Ｓｉｅｖｅｒｓ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３０，６３１−６３７（２０１２））。その最も一般的な形態において薬物または（本明細書で「作用剤」と称される）他の化合物の１〜４個の分子は、腫瘤内、または腫瘍細胞内へ作用剤を放出するように設計されたリンカー化学を使用して抗体にカップリングされる。この手法の１つの制約は、特により効能が低い毒素が使用されるときか、または腫瘍細胞表面上に存在する低減された抗原密度が存在するとき、不適当な毒素が抗体に結合して、特定の腫瘍を殺し得ることである。また、抗体上への毒素結合点の数の増加は、抗体結合能力を損ない得、癌細胞を殺すその能力を減少させ得る。さらに、この手法は、可溶化するのが困難な化合物では、問題があり得る。最後に、いくつかの毒素は、抗体に結合したとき、非常に疎水性であるため、毒素が抗体の結合領域から独立した標的組織外によって取り込まれ、したがって、これらの有効治療能力を限定する。
【０００４】
別の手法は、酸化デキストランから誘導されたポリアセタール等の生分解性ポリマーを使用することである（Ｙｕｒｏｋｏｖｅｔｓｋｉｙら、米国特許第８，６８５，３８３号）。そのような手法において、ポリマーＡＤＣは、ポリマー骨格に連結する作用剤の複数の複製を含み得、ポリマー自体は抗体に連結する。１超の薬物対抗体の比率（ＤＡＲ）は、非標的ポリマー薬物複合体単独と比較したとき、改善された細胞毒性の結果を可能にする。上記ポリアセタール等の生分解性ポリマーは、分解の利点を有し、したがって、体内への蓄積を回避する。しかしながら、これらは、調製の間、または注入後体内でのいずれかで、所望されるよりも早い分解の欠点も有する。この手法は、循環の間の細胞毒性剤の時期尚早な放出をもたらし得、したがって、細胞毒性剤が標的細胞上の抗原に達する前に、その有効性を制限する。次に、上記のポリアセタールを含む多くのそのようなポリマーは、生体に由来し、これは、危険な不純物の除去に関する製造の困難をもたらし得、これは、対象に投与されたとき、有害反応の危険性を増加させ得る。
【０００５】
付加的な手法は、抗体を（ポリマーＡＤＣと称される）生体適合性ポリマーに結合させることである。単純な手法は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の線状ポリマーを抗体と薬物との間に結合させることである。これは、Ｒｉｇｇｓ−Ｓａｕｔｈｉｅｒらによって実施され（米国第２０１４／００８８０２１号）、ここでは、２ｋＤａまたは２０ｋＤａのいずれかの１つの線状ヘテロ二官能性ＰＥＧが、まず、マレイミド化学によってＨＥＲ２抗体上の１個のチオールに結合される。次いで、ＰＥＧ抗体複合体は、エステル連結によって１個の細胞毒性小分子にカップリングされる。この手法は、エステル連結が生体内で安定せず、それが標的細胞上の抗原に達する前に、加水分解して、血中に細胞毒性剤を放出するため重大な欠点を有し得る。この研究における生体内での有効性研究は、２ｋＤａまたは２０ｋＤａポリマーのいずれかが使用されたとき、ポリマーＡＤＣの能動的標的指向性を示すことができなかった。示された有効性は、恐らく、ＰＥＧ部分に起因する細胞毒性剤の薬物動態の半減期延長に起因した。さらに、ＰＥＧポリマーＡＤＣは、薬物単独と比較したとき、細胞毒性アッセイにおいて生物活性を失った。このシナリオにおける薬物対抗体の比率（ＤＡＲ）は、１つだけであり、非ポリマーＡＤＣ手法を超える利点を提供しない。線状ＰＥＧポリマー上での薬物または抗体のいずれかの複数の複製の武装は、この手法では達成することができない。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
前述のことを考慮して、本分野は、ＡＤＣ、具体的には、上述の制約に対処するポリマーＡＤＣを必要としている。本出願は、合成品製造のものであるポリマーＡＤＣを提供することによってこれらの問題に対する解決策を提供し、標的抗体上への作用剤の増加した積載（より高いＤＡＲ値）を提供し、生体内で複合体のより長い半減期を提供し、標的作用剤（すなわち、抗体）の結合活性を実質的に阻害しない。さらに、本開示のポリマーＡＤＣ複合体は、容易に構築され、これらは、送達される化合物の改善された可溶性を提供することができる。最後に、本開示のポリマーＡＤＣ複合体は、ポリマーＡＤＣ複合体が標的細胞上の抗原に到達し、吸収されるまで薬物を放出せず、ここで、作用剤は、ポリマーからの開裂の後に放出される。本出願において、ＨＢＬ−２、ＭＥＣ−１、及びラモス細胞株（ヒトＢ細胞リンパ腫誘導細胞株）が例として使用される。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１Ａ】ＨＢＬ−２及びＭＥＣ−１細胞を用いたＲ１１  ＰＯＺビオチンのフローサイトメトリープロットを示す。
【図１Ｂ】ＨＢＬ−２及びＭＥＣ−１細胞を用いたＲ１１  ＰＯＺビオチンのフローサイトメトリープロットを示す。
【図２】精製前、精製の間、及び精製後の、ＣＤ７９ｂのＰＯＺ  ＭＭＡＥ複合体のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。
【図３】ＥＬＩＳＡアッセイによる、ＲＯＲ１抗原への生来の抗体及びポリオキサゾリン複合化Ｒ１１抗体の結合を示す。
【図４】ラモス細胞の生存率への、ＭＭＡＥ及びデアセチルコルヒチン（ＤＣ）のＣＤ７９ｂ  ＰＯＺ薬物複合体の濃度の影響を示す。
【図５】ＭＥＣ−１細胞の生存率における、ＭＭＡＥ及びデアセチルコルヒチン（ＤＣ）のＣＤ７９ｂ  ＰＯＺ薬物複合体の濃度の影響を示す。
【図６】ＨＢＬ−２及びＭＥＣ−１細胞の生存率への、ＭＭＡＥのＲ１１ＰＯＺ  薬物複合体の濃度の影響を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明の要約
本開示において、ポリマー複合体、及びヒト疾患を治療するためのそのようなポリマーの使用を説明する。一実施形態において、ポリマー複合体は、ポリマーＡＤＣのである。一実施形態において、ポリマー複合体は、生体安定である。別の実施形態において、全てまたはある特定のリンカーは、生体安定である。ポリマーＡＤＣは、多くのポリマー結合作用剤を含有するように設計される（高ＤＡＲ）。これらのポリマーＡＤＣは、（限定されないが、抗体等の）認識部分とポリマーとの間の単一の結合点または複数の結合点も有してもよく、結合点（単数または複数）は、認識部分の結合部位とは遠く離れていてもよい。ある特定の実施形態において、単一の認識部分は、本明細書に記載される２つ以上のポリマーＡＤＣを結合させ得る。記載されるポリマーＡＤＣは、従来のＡＤＣと比較して改善された薬物動態及び可溶性を有する。さらに、これらのポリマーＡＤＣは、調製の間、または送達の間に分解されない利点を有する。さらに、ポリマーＡＤＣのポリマー部分は、合成物質であり、生物学的不純物を含まない。作用剤とポリマーとの間のリンカーは、腫瘍細胞等の作用部位の所望の部位でかつ所望の条件下で、毒素の放出を提供するように適合され得る。本発明のポリマーＡＤＣの付加的特徴は、限定されないが、ビオチン等の精製部分がポリマー骨格上に結合して、複雑な複合体の容易な精製を提供できることである。
【０００９】
定義
本明細書において使用する場合、用語「作用剤」は、治療または診断用途を有する任意の分子を指し、作用剤は、ポリマー上の官能基、またはポリマーと結合した連結基と連結を形成し得、作用剤には、（限定されないが、薬物等の）治療剤、診断剤、または有機小分子が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、作用剤は、癌の治療に有用である。
【００１０】
本明細書において使用する場合、用語「連結する」、「連結した」、「連結」、または「リンカー」は、本明細書に記載されるポリマーもしくは作用剤、またはこれらの構成成分に関して使用されるとき、通常化学反応の結果として形成される基または結合を指す。ある特定の実施形態において、特定の連結は、共有結合的連結である。ある特定の実施形態において、特定の連結は、加水分解性である。
【００１１】
本明細書において使用する場合、用語「加水分解性リンカー」または「遊離可能な加水分解性リンカー」は、加水分解性リンカーを含む本開示の複合体が対象に投与された後、対象内の特定の生理的条件下で、対象の生体内で開裂可能な化学連結を指す。さらなる実施形態において、加水分解性リンカーは、生体安定でもよい。加水分解性リンカーは、本明細書で論じられるように加水分解性部分を含んでもよく、ある特定の状況で、加水分解性リンカーは、２つ以上の加水分解性リンカーを含んでもよい。一実施形態において、加水分解性リンカーは、限定されないが、腫瘍細胞等の作用部位への送達の際に開裂可能である。一実施形態において、加水分解性リンカーは、限定されないが、腫瘍細胞等の細胞によって（例えば、エンドサイトーシスによって）吸収されるときにのみ開裂可能である。一実施形態において、加水分解性リンカーは、リソソームまたはエンドソーム内で開裂可能である。一実施形態において、加水分解性リンカーは、化学反応によって開裂される。この実施形態の態様において、開裂は、限定されないが、二硫化物等の容易に還元される基の還元、または自壊性反応による。一実施形態において、加水分解性リンカーは、対象内に自然に存在するか、または存在するように誘発される物質によって開裂される。この実施形態の態様において、そのような物質は、酵素またはポリペプチドである。したがって、一実施形態において、加水分解性リンカーは、酵素反応によって開裂される。一実施形態において、加水分解性リンカーは、前述のものの組み合わせによって開裂される。一実施形態において、加水分解性リンカー内に含まれる加水分解性部分は、同じ条件下、及び同じ機構によって開裂される。
【００１２】
本明細書において使用する場合、用語「生体安定」は、ヒト対象を含む対象に投与されたとき、ポリマーまたはポリマー複合体が（限定されないが、腫瘍細胞等の）作用部位に到達するまで、開裂に耐性があるポリマーまたはポリマー複合体（限定されないが、これら内に含まれる加水分解性リンカー等の任意のリンカーもしくは連結を含む）を指す。「開裂に耐性があるに耐性がある」は、少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、または９９％以上のポリマーまたはポリマー複合体が、ポリマーが作用部位に到達するまで開裂されないことを意味する。一実施形態において、生体安定ポリマーまたはポリマー複合体は、８０％超、９０％、９５％、９８％、９９％以上のポリマーまたはポリマー複合体が血流中で開裂されないような、対象の血流中での開裂への耐性を示す。用語、生体安定」は、ヒト対象を含む対象に投与されたとき、連結のリンカーが（限定されないが、腫瘍細胞等の）作用部位に配置されるまで、リンカーまたは連結が開裂に耐性があるような、限定されないが、加水分解性リンカー等のリンカーまたは連結も指す。したがって、一実施形態において、生体安定リンカーまたは連結は、８０％超、９０％、９５％、９８％、９９％以上のリンカーまたは連結が血流中で開裂しないような、対象の血流中での開裂への耐性を示す。
【００１３】
本明細書において使用する場合、用語「アルキル」は、単独で、または置換基の一部として使用されるかに関わらず、１〜２０個の炭素原子を含む直鎖炭化水素基を含む。したがって、この語句は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル等の直鎖アルキル基を含む。この語句は、例として提供される、−ＣＨ（ＣＨ３）２、−ＣＨ（ＣＨ３）（ＣＨ２ＣＨ３）、−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ３）２、−Ｃ（ＣＨ３）３、−Ｃ（ＣＨ２ＣＨ３）３、−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２，−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）（ＣＨ２ＣＨ３）、−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ３）２、−ＣＨ２Ｃ（ＣＨ３）３、−ＣＨ２Ｃ（ＣＨ２ＣＨ３）３、−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ（ＣＨ３）（ＣＨ２ＣＨ３）、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）（ＣＨ２ＣＨ３）、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ３）２、−ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（ＣＨ３）３、−ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（ＣＨ２ＣＨ３）３、−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ（ＣＨ３）２、−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ３）ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ（ＣＨ３）（ＣＨ２ＣＨ３）、及び他のものを含むがこれらに限定されない、直鎖アルキル基の分岐鎖異性体も含む。この語句は、上で定義されるように、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、及びシクロオクチル等の環状アルキル基、ならびに分岐鎖及び分岐鎖アルキル基で置換されたそのような環も含む。この語句は、上で定義されるように、限定されないが、アダマンチルノルボルニル、及びビシクロ［２．２．２］オクチル等の多環式アルキル基、ならびに直鎖及び分岐鎖アルキル基で置換されたそのような環も含む。
【００１４】
本明細書において使用する場合、用語「アルケニル」は、単独で、または置換基の一部として使用されるかに関わらず、任意の２個の隣接した炭素原子間に少なくとも１つの二重結合を有するアルキル基を含む。
【００１５】
本明細書において使用する場合、用語「アルキニル」は、単独で、または置換基の一部として使用されるかに関わらず、任意の２個の隣接した炭素原子間に少なくとも１つの三重結合を有するアルキル基を含む。
【００１６】
本明細書において使用する場合、用語「非置換アルキル」、「非置換アルケニル」、及び「非置換アルキニル」は、ヘテロ原子を含まないアルキル基、アルケニル基、及びアルキニル基を指す。
【００１７】
本明細書において使用する場合、用語「置換アルキル」、「置換アルケニル」、及び「非置換アルキニル」は、上に定義されるように、炭素（複数可）または水素（複数可）との１つ以上の結合が、限定されないが、アルコキシ基ならびにアリールオキシ基等の基の中の酸素原子、アルキル及びアリール硫化物基、スルホン基、スルホニル基、ならびにスルホキシド基等の基の中の硫黄原子、トリアルキルシリル基、ジアルキルアリールシリル基、アルキルジアリールシリル基、ならびにトリアリールシリル基中等の基の中のケイ素原子、ならびに様々な他の基内の他のヘテロ原子等の、非水素または非炭素原子との結合によって置き換えられた、アルキルアルケニル及びアルキニル基を指す。
【００１８】
本明細書において使用する場合、用語「非置換アラルキル」は、上に定義されるように、非置換または置換アルキルまたはアルケニル基の水素または炭素結合が、上に定義されるように、置換または非置換アリール基との結合に置き換えられた非置換アルキルまたはアルケニル基を指す。例えば、メチル（ＣＨ３）は、非置換アルキル基である。メチル基の水素原子がフェニル基との結合に置き換えられたば場合、例えば、メチルの炭素が、ベンゼンの炭素と結合した場合には、その化合物は、非置換アラルキル基（すなわち、ベンジル基）である。
【００１９】
本明細書において使用する場合、用語「置換アラルキル」は、置換アリール基が非置換アリール基に関して有したものと同じ意味を、非置換アラルキル基に関して有する。しかしながら、置換アラルキル基は、その基のアルキルの部分の炭素または水素結合が、非炭素または非水素原子との結合によって置き換えられた基も含む。
【００２０】
本明細書において使用する場合、用語「非置換アリール」は、ヘテロ原子を含まない、限定されないが、フェニル、ナフチル、アントラセニル、ビフェニル、及びジフェニル基等の、環部分の中に６〜１２個の炭素原子を有する単環式または二環式芳香族炭化水素基を指す。語句「非置換アリール」はナフタレン等の縮合環を含む基を含むが、トリル等のアリール基は以下に記載されるように、置換アリール基であるとみなされるため、「非置換アリール」は、環員のうちの１つと結合したアルキルまたはハロ基等の他の基を有するアリール基を含まない。しかしながら、非置換アリール基は、親化合物中の１個以上の炭素原子（複数可）、酸素原子（複数可）、窒素原子（複数可）、及び／または硫黄原子（複数可）と結合し得る。
【００２１】
本明細書において使用する場合、用語「置換アリール基」は、置換アルキル基が非置換アルキル基に関して有したものと同じ意味を、非置換アリール基に関して有する。しかしながら、置換アリール基は、芳香族炭素のうちの１つが、限定されないが、置換アルキルに関して上に記載される原子等の、非炭素または非水素原子のうちの１つと結合しているアリール基も含み、かつ、アリール基の１個以上の芳香族炭素が本明細書で定義される置換及び／または非置換アルキル、アルケニル、もしくはアルキニル基と結合しているアリール基も含む。これは、アリール基の２個の炭素原子が、アルキルまたはアルケニルの２つの原子と結合し、縮合環系（例えば、ジヒドロナフチルまたはテトラヒドロナフチル）を画定するために分類する結合配列を含む。したがって、語句「置換アリール」は、数ある中でも、トリル、及びヒドロキシフェニルを含むが、これらに限定されない。
【００２２】
本明細書において使用する場合、用語「非置換ヘテロシクリル」は、３つ以上の環員であって、これらのうちの１つ以上が、限定されないが、Ｎ、Ｏ、及びＳ等のヘテロ原子である、３つ以上の環員を含む単環式、二環式、及び多環式環状化合物を含む、芳香族及び非芳香族環状化合物の両方を指す。語句「非置換ヘテロシクリル」は、ベンズイミダゾリル等の縮合複素環を含むが、２−メチルベンズイミダゾリル等の化合物は、以下に定義されるように「置換ヘテロシクリル」基であるため、「非置換ヘテロシクリル」は、環員のうちの１つと結合したアルキルまたはハロ基等の他の基を有するヘテロシクリル基を含まない。ヘテロシクリル基の例には、１〜４個の窒素原子を含む不飽和３〜８員環、１〜４個の窒素原子を含む縮合不飽和複素環式基、１〜２個の酸素原子及び１〜３個の窒素原子を含む不飽和３〜８員環、１〜２個の酸素原子及び１〜３個の窒素原子そのようなを含む飽和３〜８員環、１〜２個の酸素原子及び１〜３個の窒素原子を含む不飽和縮合複素環式基、１〜３個の硫黄原子及び１〜３個の窒素原子を含む不飽和３〜８員環、１〜２個の硫黄原子及び１〜３個の窒素原子を含む飽和３〜８員環、１〜２個の硫黄原子を含む飽和及び不飽和３〜８員環、１〜２個の硫黄原子及び１〜３個の窒素原子を含む不飽和縮合複素環、酸素原子を含む不飽和３〜８員環、１〜２個の酸素原子を含む不飽和縮合複素環、１個の酸素原子及び１〜２個の硫黄原子を含む不飽和３〜８員環、１〜２個の酸素原子及び１〜２個の硫黄原子を含む飽和３〜８員環、１〜２個の硫黄原子を含む不飽和縮合環、ならびに１個の酸素原子及び１〜２個の酸素原子を含む不飽和縮合複素環が含まれるが、これらに限定されない。ヘテロシクリル基は、環中の１個以上のＳ原子が１個または２個の酸素原子（スルホキシド及びスルホン）と二重結合している上述のものも含む。
【００２３】
本明細書において使用する場合、用語「置換ヘテロシクリル」は、置換アルキル基が非置換アルキル基に関して有したものと同じ意味を、非置換ヘテロシクリル基に関して有する。しかしながら、置換ヘテロシクリル基は、炭素のうちの１つが、限定されないが、置換アルキル及び置換アリール基に関して上述される原子等の非炭素または非水素原子のうちの１個と結合しているヘテロシクリル基も含み、かつ、ヘテロシクリル基の１個以上の炭素が、本明細書に定義されるように、置換及び／もしくは非置換アルキル、アルケニル、またはアリール基と結合しているヘテロシクリル基も含む。これは、縮合環系を画定するための、ヘテロシクリル基の２個の炭素原子がアルキル、アルケニル、またはアルキニル基の２個の原子と結合している結合配列を含む。例には、数ある中でも、２−メチルベンズイミダゾリル、５−メチルベンズイミダゾリル、５−クロロベンズチアゾリル、１−メチルピペラジニル、及び２−クロロピリジルが含まれるが、これらに限定されない。
【００２４】
本明細書において使用する場合、用語「非置換ヘテロシルアルキル（ｕｎｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ  ｈｅｔｅｒｏｃｙｌａｌｋｙｌ）」は、上に定義されるように、非置換アルキルまたはアルケニル基の水素または炭素結合が、上に定義されるように、置換または非置換ヘテロシクリル基との結合に置き換えられた非置換アルキルまたはアルケニル基を指す。例えば、メチル（ＣＨ３）は、非置換アルキル基である。メチル基の水素原子がヘテロシクリル基との結合に置き換えられた場合、例えば、メチルの炭素がピリジンの炭素２（ピリジンのＮと結合している炭素のうちの１つ）、またはピリジンの炭素３もしくは４と結合した場合には、化合物は、非置換ヘテロシクリルアルキル基である。
【００２５】
本明細書において使用する場合、用語「置換ヘテロシルアルキル」は、置換アリール基が非置換アリール基に関して有したものと同じ意味を、非置換ヘテロシクリルアルキル基に関して有する。しかしながら、置換ヘテロシクリルアルキル基は、非水素原子が限定されないが、ピペリジニルアルキル基のピペリジン環中の窒素原子等のヘテロシクリルアルキル基のヘテロシクリル基中のヘテロ原子に結合している基も含む。
【００２６】
簡単にするために、化学的部分は、全体にわたって、当業者に明らかな適切な構造的状況下で、１価の化学的部分（例えば、アルキル、アリール等）または多価の部分であり得ると定義及び称される。例えば、「アルキル」部分は、１価のラジカル（例えば、ＣＨ３−ＣＨ２−）と称され得るか、または他の事例において、２価の連結部分は、「アルキル」であり得、この場合、当業者は、アルキルが２価のラジカル（例えば、−ＣＨ２−ＣＨ２−）であり、これは、用語「アルキレン」と同等であることを理解するであろう。同様に、２価の部分が必要であり、かつ「アルコキシ」、「アルキルアミノ」、「アリールオキシ」、「アルキルチオ」、「アリール」、「ヘテロアリ（ｈｅｔｅｒｏａｒｙ）」、「複素環式」、「アルキル」、「アルケニル」、「アルキニル」、「脂肪族」、または「シクロアルキル」と述べられる状況において、当業者は、これらの用語が対応する２価の部分を指すことを理解するであろう。
【００２７】
本明細書において使用する場合、用語「治療」、「治療する」、及び「治療すること」は、疾患もしくは病態の症状、態様、もしくは特性を取り除くか、または低減するために、そのような疾患もしくは病態の症状、態様、もしくは特性の発症後、開始される（複合体または薬学的組成物の投与等の）一連の行動を指す。そのような治療は、有用であることが絶対的である必要はない。
【００２８】
本明細書において使用する場合、用語「治療を必要とする」は、患者が必要とするか、または治療から恩恵を受ける、介護人によって下された判断を指す。この判断は、介護人の専門知識の分野おける様々な要因に基づいて下されるが、これは、本開示の方法または化合物によって治療可能な疾患または病態の結果として、患者が病気であるか、または病気になるという知識を含む。
【００２９】
本明細書において使用する場合、用語「予防を必要とする」は、患者が必要とするか、または予防から恩恵を受ける、介護人によって下された判断を指す。この判断は、介護人の専門知識の分野おける様々な要因に基づいて下されるが、これは、本開示の方法または化合物によって予防可能な疾患または病態の結果として、患者が病気になるか、または病気になり得る知識を含む。
【００３０】
本明細書において使用する場合、用語「個人」、「対象」、または「患者」は、ネズミ、ラット、他のげっ歯類、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウマ、または霊長類等の哺乳動物、及びヒトを含む、あらゆる動物を指す。この用語は、オスもしくはメスまたは両方を指定し得るか、あるいはオスもしくはメスを考慮しない場合がある。
【００３１】
本明細書において使用する場合、用語「治療有効量」は、疾患または病態の任意の症状、態様、または特性への任意の検出可能な好影響を有し得る、単独または薬学的組成物の一部としてのいずれかでの複合体の量を指す。そのような効果は、有益であることが絶対的である必要はない。
【００３２】
ポリオキサゾリンポリマー
ポリオキサゾリン（ＰＯＺ）は、２−置換−２−オキサゾリンモノマーから調製されたポリマーである。これらのポリマーは、水溶性であり、哺乳類のモデル系において非毒性であると報告されている。ＰＯＺは一般に、適切な化学量論量の２−アルキル−２−オキサゾリンを、メチルトリフレート（ＣＨ３−ＯＳＯ２−ＣＦ３）等の求電子性開始剤、またはトリフリン酸もしくはｐ−トルエンスルホン酸等の強酸と反応させ、続いて、限定されないが、水酸化物、チオール、またはアミン等の求核試薬で停止させることによって調製される。生成されたポリマーは、開始基が左端の基によって示され、末端基が右端の基によって示され、２−アルキル−２−オキサゾリン構成成分が真ん中にある、省略表現で便利に記載される。したがって、この省略表現説明が本明細書で使用されるとき、指定されない限り、記号表示の左側が「開始剤端」を示し、記号表示の右側が「末端」を示すことが意図される。
【００３３】
例えば、２−アルキル−２−オキサゾリンが２−メチル−２−オキサゾリンであるとき、メチルトリフレートが開始剤として使用され、水酸化物が停止剤として使用され、以下のＰＯＺが生成される。
ＣＨ３−［Ｎ（ＣＯＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２］ｎ−ＯＨ
上記のポリマーは、省略表現表記法でＭ−ＰＭＯＺ−ＯＨと便利に記載され、この中で、メチル開始剤は左端のＭによって示され、ＰＭＯＺはポリメチルオキサゾリンを表し、繰り返し単位のメチルはＰＭＯＺのＭによって示され、末端ヒドロキシルは−ＯＨによって示される。
【００３４】
別の一般的に使用されるモノマーは、２−エチル−２−オキサゾリンであり、これは、メチルトリフレートでの開始及び水酸化物での停止で、以下のＰＯＺポリマーを提供する。
ＣＨ３−［Ｎ（ＣＯＣＨ２ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２］ｎ−ＯＨ
上記のポリマーは、省略表現表記法でＭ−ＰＥＯＺ−ＯＨと便利に記載され、この中で、メチル開始剤は左端のＭによって示され、ＰＥＯＺはポリメチルオキサゾリンを表し、繰り返し単位のエチルはＰＥＯＺのＥによって示され、末端ヒドロキシルは−ＯＨによって示される。
【００３５】
よく特徴づけられたポリマーの重合度、ｎは、おおよそ３〜１０００超の範囲にわたり得る。
【００３６】
重合プロセスは、求電子剤を用いた開始がオキサゾリニウムカチオンを生成し、次いでこれが連鎖反応で追加のモノマー単位と反応して、成長する「生きた」カチオンを生成するため、生きたカチオン重合と称される。
【化１】
0006704900.tif 000002
【００３７】
当業者は、現実には、環状形態が確実に最も重要であるが、生きたカチオンが（メチルトリフレートで開始された２−メチル−２−オキサゾリンの重合の場合）以下の非環状形態で表され得ると仮定することにより、停止の生成物を予測することができる。
ＣＨ３−［Ｎ（ＣＯＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２］ｎ−Ｎ（ＣＯＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２＋
本考察において、我々は、このカチオンをＭ−ＰＭＯＺ＋と表す。上で述べたように、このＰＯＺカチオンは、水酸化物、チオール、またはアミン等の求核試薬と反応させることにより、「停止」され得る。
【００３８】
オキサゾリン重合は、機能的求電子剤を用いても開始することができる。例えば、求電子性開始剤のエチル３−ブロモプロピオネートが、２−エチル−２−オキサゾリン重合を開始するために使用されている。水酸化物を用いた停止は、以下のポリマーを提供する。
ＨＯ２Ｃ−ＣＨ２ＣＨ２−［Ｎ（ＣＯＣＨ２ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２］ｎ−ＯＨ
官能基を有するポリオキサゾリンを調製するためのさらに別の手段は、２位に官能基を有するオキサゾリンモノマーで、２−エチル−２−オキサゾリン等のモノマーを共重合することである（Ｆ．Ｃ．Ｇａｅｒｔｎｅｒ，Ｒ．Ｌｕｘｅｎｈｏｆｅｒ，Ｂ．Ｂｌｅｃｈｅｒｔ，Ｒ．Ｊｏｒｄａｎ  ａｎｄ  Ｍ．Ｅｓｓｌｅｒ，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，２００７，１１９，２９１−３００）。例えば、Ｊｏｒｄａｎ及びその同僚は、アセチレンを用いてオキサゾリンを調製し、２位のアルデヒド、カルボン酸、及びアミンを保護した。これらの官能性モノマーの２−エチル−２−オキサゾリンとの共重合で、複数のペンダントまたは側鎖官能基を有するランダムコポリマーが得られる。例えば、２−エチル−２−オキサゾリンと２−ペンチニル−２−オキサゾリンとの重合のメチルトリフレートを用いた開始、続いてピペラジン（ＮＨＣ４Ｈ８ＮＨ）を用いた停止で、以下のランダムコポリマーが得られる。
ＣＨ３−｛［Ｎ（ＣＯＣＨ２ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２］ｎ−［Ｎ（ＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−ＣＣＨ）ＣＨ２ＣＨ２］ｍ｝ｒａｎ−ＮＣ４Ｈ８ＮＨ
下付き文字「ｒａｎ」は、ポリマーがランダムコポリマーであることを示す。ｎの値が、典型的におおよそ２０〜３０である一方で、ｍは、おおよそ２〜５である。
【００３９】
ペンダント官能基及び末端官能基を有するこれらのコポリマーは、ペンダント及び末端官能基が「化学的直交性」官能基であり得るという点で有用である。化学的直交性官能基は、互いに反応しないが、他の官能基と選択的に反応する官能基である。例えば、上記の分子は、２個の官能基、末端二級アミン及びペンダントアセチレンを有する。アセチレンは、アミンとは反応しないが、例えば、アジド基（−Ｎ３）とは反応する。同様に、アミンは、アセチレンまたはアジドとは反応しないが、例えば、イソチオシアネート基（−ＮＣＳ）とは反応する。Ｊｏｒｄａｎは、このコポリマーを使用して、アジド官能化ＲＧＤペプチドをアセチレン基と、及びイソチオシアネート官能化金属キレート剤をアミンとカップリングしている。ＲＧＤペプチドは、腫瘍を標的にすることで知られており、診断放射性核種または治療放射性核種は、キレート基と結合することができる。最終複合体は、腫瘍を撮像または治療するために使用することができる（Ｒ．Ｌｕｘｅｎｈｏｆｅｒ，Ｍ．Ｌｏｐｅｚ−Ｇａｒｃｉａ，Ａ．Ｆｒａｎｎｋ，Ｈ．Ｋｅｓｓｌｅｒ  ａｎｄ  Ｒ．Ｊｏｒｄａｎ，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，ＰＭＳＥ  Ｐｒｅｐｒ．２００６，９５，２８３−２８４）。
【００４０】
上述のピペラジンまたはピペリジン末端ポリオキサゾリンを含む、従来技術のポリオキサゾリンポリマーの使用を妨げる１つの問題は、これらの精製が困難であることである。この困難は、停止の間に存在する汚染水が、水による求核攻撃及び二級アミン不純物の結果的形成をもたらすために起こる（Ｏ．Ｎｕｙｋｅｎ，Ｇ．Ｍａｉｅｒ，Ａ．Ｇｒｏｓｓ，Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．１９７，８３−９５，１９９６）。ピペラジン及びピペリジン停止からの生成物が常に三級アミンを含有するため、イオン交換クロマトグラフィーを、汚染二級アミンを除去するために使用することができない。
【００４１】
上に例示されるペンダントポリオキサゾリンのさらに別の制約は、これらの化合物が単一の末端官能基を有することである。結果として、この構造配置は、末端に結合することができる薬物または標的部分の数を制限し、治療、診断、及び標的用途のためのそのような化合物の効果的な使用は、これらの部分の複数回の充填を必要とし得る。本開示のポリマーは、２個の化学的反応性基及び直交官能基の各々の複数の複製を提供することにより、この制限を回避する。
【００４２】
ポリオキサゾリンポリマー抗体複合体
いくつかのポリオキサゾリンポリマーが、本発明で使用され得る。そのようなポリマーは、米国特許第８，１１０，６５１号、同第８１０１，７０６号、及び同第８，３８３，０９３号、ならびにＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０６３０８８号に記載される（これらの各々は、そのような教示のために参照により本明細書に組み込まれる）。一実施形態において、記載されるＡＤＣにおける使用のためのポリオキサゾリンポリマーは、２種以上の、限定されないが、細胞毒性剤等の作用剤を運搬する。一実施形態において、記載されるＡＤＣにおける使用のためのポリオキサゾリンポリマーは、５種以上の、限定されないが、細胞毒性剤等の作用剤を運搬する。別の実施形態において、記載されるＡＤＣにおける使用のためのポリオキサゾリンポリマーは、８種以上の、限定されないが、細胞毒性剤等の作用剤を運搬する。一実施形態において、記載されるＡＤＣにおける使用のためのポリオキサゾリンポリマーは、１０種以上の、限定されないが、細胞毒性剤等の作用剤を運搬する。前述の実施形態の各々において、作用剤は同じでもよいか、または作用剤（複数可）は異なってもよい（例えば、癌の成長を抑制するように経路内で順次作用する２つの細胞毒性化合物）。一実施形態において、作用剤は同じである。代表的な作用剤が本明細書に記載される。一実施形態において、ポリオキサゾリンポリマーは、記載されるように、３種以上、５種以上、８種以上、２０種以上、または４０種以上の、限定されないが、細胞毒性剤等の作用剤を運搬するヘテロ官能性ポリマーでもよい。
【００４３】
一実施形態において、ポリオキサゾリン抗体複合体は、認識部分に連結するポリオキサゾリンを含み、認識部分は、結合残基を含み、ポリオキサゾリンは、複数の作用剤を含み、ポリオキサゾリンは、結合残基で認識作用剤に連結する。ポリオキサゾリン抗体複合体及び薬学的に許容される担体を含む組成物も、提供される。
【００４４】
一実施形態において、認識部分は、限定されないが、一本鎖の抗体等の抗体または抗体断片である。さらなる実施形態において、認識部分は、限定されないが、一本鎖の抗体等の抗体または抗体断片であり、結合残基は、理論結合残基であり、ポリオキサゾリンポリマー及び抗体は、１：１の比率で理論結合残基に結合する。さらなる実施形態において、認識部分は、限定されないが、一本鎖の抗体等の抗体または抗体断片であり、結合残基は、セレノシステイン残基であり、ポリオキサゾリンポリマー及び抗体は、１：１の比率でセレノシステイン残基に結合する。さらなる実施形態において、認識部分は、一本鎖の抗体であり、結合残基は、セレノシステイン残基であり、ポリオキサゾリンポリマー及び一本鎖の抗体は、１：１の比率でセレノシステイン残基に結合する。ある特定の実施形態において、複数のポリオキサゾリンポリマーは、記載されるように、単一の認識部分に結合してもよい。ある特定の実施形態において、２個、４個、６個、８個、または１０個のポリオキサゾリンポリマーが、異なる位置で単一の認識部分に結合する。ある特定の実施形態において、２個、３個、４個、または５個のポリオキサゾリンポリマーが、異なる位置で単一の認識部分に結合する。
【００４５】
一実施形態において、ポリオキサゾリン複合体は、以下の一般構造によって表され、
Ｒ１−｛［Ｎ（ＣＯＸ）ＣＨ２ＣＨ２］ｏ−［Ｎ（ＣＯＲ２）ＣＨ２−ＣＨ２）］ｎ−［Ｎ（ＣＯＹ）ＣＨ２−ＣＨ２）］ｍ｝ａ−Ｒ２０
式中、
Ｒ１は、開始基であり、
Ｒ２は、非反応性ペンダント部分である。
各繰り返し単位のＸは、第１のペンダント部分であり、少なくとも１個の第１のペンダント部分が、作用剤または精製部分を含み、ポリマー骨格に作用剤または精製部分を連結し、
各繰り返し単位のＹは、第２のペンダント部分であり、各第２のペンダント部分が、任意選択的に作用剤または精製部分を含み、ポリマー骨格に作用剤または精製部分を連結し、
Ｒ２０は、認識部分を含む認識作用剤連結部分であり、ポリマー骨格に認識部分を連結し、
ａは、ランダムコポリマーを示すｒａｎ、またはブロックコポリマーを示すｂｌｏｃｋであり、
ｎは、０〜１０００の整数であり、
ｏ及びｍは各々、０〜５０から独立して選択される整数であるが、
但し、ｏ及びｍの両方が各々０であることはなく、ｎ、ｏ、及びｍの合計が、少なくとも３０であり、少なくとも１種の作用剤が存在することを条件とする。
【００４６】
記載されるポリマー複合体中、作用剤は独立して、１種類以上の作用剤がポリマー複合体中に存在するように、各繰り返し単位について選択されてもよい。同様に、精製部分は独立して、１種類以上の精製部分がポリマー複合体中に存在するように、各繰り返し単位について選択されてもよい。ある特定の実施形態において、わずか１種類の作用剤及び１種類の精製部分が存在する。ある特定の実施形態において、２種類の作用剤及び１種類の精製部分が存在する。本明細書で論じられるように、ある特定の実施形態において、（第１のペンダント部分及び第２のペンダント部分の一部分を含み得る）作用剤及び／または精製部分は、独立して合成され、ポリマー複合体と連結することができ、連結したそのようなペンダント部分の数は、ペンダント部分のモル比によって制御することができ、それにより単一の反応で複数の種類の作用剤及び／または精製部分の追加を可能にする。他の組み合わせもまた、本開示の範囲内である。
【００４７】
一実施形態において、ｏ及びｍのうちの１つは、０であり、ｏまたはｍの他方は、３、５、８、１０、１５、２０、３０、４０以上〜最大５０であり、ｏ、ｍ、及びｎの合計は、２０〜１０００、３０〜５００、３０〜２５０、または３０〜１００である。一実施形態において、ｏ及びｍのうちの１つは、０であり、ｏまたはｍの他方は、５以上〜２０以下であり、ｏ、ｍ、及びｎの合計は、２０〜１０００、３０〜５００、３０〜２５０、または３０〜１００である。一実施形態において、ｏ及びｍのうちの１つは、０であり、ｏまたはｍの他方は、５以上〜１５以下であり、ｏ、ｍ、及びｎの合計は、２０〜１０００、３０〜５００、３０〜２５０、または３０〜１００である。一実施形態において、ｏ及びｍのうちの１つは、０であり、ｏまたはｍの他方は、５以上〜１０以下であり、ｏ、ｍ、及びｎの合計は、２０〜１０００、３０〜５００、３０〜２５０、または３０〜１００である。一実施形態において、前述のいずれかのうち、ｍは、０であるよりもむしろ１〜５０、１〜３０、１〜２０、１〜１５、１〜１０、または１〜５であり得る。一実施形態において、前述のいずれかのうち、ｍは０であるよりもむしろ１〜５０、１〜３０、１〜２０、１〜１５、１〜１０、または１〜５であり得、第２のペンダント部分の全てまたは一部分は、作用剤または精製部分を有しない。
【００４８】
一実施形態において、１〜１０個、１〜４個、または１〜２個の精製部分が存在する。本明細書で論じられるように、そのような精製部分は、Ｘ及び／またはＹ中に含まれてもよい。精製部分は同じでもよいか、または精製部分は異なってもよい。一実施形態において、２〜２０種、２〜１５種、２〜１０種、または２〜７種の作用剤が存在する。一実施形態において、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、または１０種の作用剤が存在する。一実施形態において、最大４０種の作用剤が存在する。本明細書で論じられるように、そのような作用剤は、Ｘ及び／またはＹ中に含まれてもよい。作用剤は、同じでもよいか、または作用剤は異なってもよい。本明細書に開示されるある特定の構造において、複合体中に存在する精製部分の数は、ｏ１の記号表示によって示され、複合体中に存在する作用剤の数は、ｏ２の記号表示によって示される。
【００４９】
複合体に連結する作用剤及び／または精製部分の数は、ｏ及びｍの合計以下である。例えば、ｏ及びｍの合計が１５である場合、ポリマーに連結する作用剤及び／または精製部分の最大数は、１５である。ある特定の実施形態において、複合体に連結する作用剤及び／精製部分の数は、ｏ及びｍの合計未満であり、ある特定の実施形態において、遊離第１のペンダント部分及び／または第２のペンダント部分が存在することを意味する。したがって、全てのペンダント部分が、作用剤及び／または精製部分を含む必要があるとは限らない。ある特定の実施形態において、複合体は、２〜４０、２〜２０、５〜２０、１０〜２０、または２０〜４０のＤＡＲを有する。ある特定の実施形態において、複合体は、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０のＤＡＲを有する。
【００５０】
第１のペンダント部分及び第２のペンダント部分の性質は、異なり得るが、但し、基が作用剤及び／または精製部分、ならびにポリマーとの連結のための構造を有することを条件とする。第１のペンダント部分及び第２のペンダント部分の代表的な構造が、本明細書に記載される。一実施形態において、第１のペンダント部分及び第２のペンダント部分は各々、官能基（すなわち、第１の官能基及び第２の官能基）を含む。官能基は、本明細書に記載されるように、ポリマーへの作用剤及び／または精製部分との連結に関与する。一実施形態において、第１の官能基及び第２の官能基は、互いに対して化学的直交性であり、ポリマーへの作用剤及び／または精製部分への異なる反応化学の使用を可能にする。第１の官能基及び第２の官能基には、アルキン、アミン、オキシアミン、アルデヒド、ケトン、アセタール、ケタール、マレイミド、エステル、カルボン酸、（限定されないが、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル（ＮＨＳ）及び１−ベンゾトリアジネイル（ｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｉｎｅｙｌ）活性エステル等の）活性カルボン酸、活性炭酸塩、クロロホルメート、アルコール、アジド、ビニルスルホン、またはオルトピリジル二硫酸塩（ＯＰＳＳ）が含まれるが、これらに限定されない。さらに、第１のペンダント部分及び第２のペンダント部分は、限定されないが、非置換もしくは置換アルキル、非置換もしくは置換アルケニル、非置換もしくは置換アラルキル、または非置換もしくは置換ヘテロシクリルアルキル基等の、官能基をポリマー骨格に連結する追加の基を含んでもよい。ある特定の実施形態において、第１の官能基及び／または第２の官能基は、アルキンである。ある特定の実施形態において、第１のペンダント部分及び／または第２のペンダント部分のうちの少なくとも１つは、作用剤または精製部分に連結しない。
【００５１】
ある特定の実施形態において、ポリマー複合体は、生体安定ポリマー複合体である。ある特定の実施形態において、第１のペンダント部分及び／または第２のペンダント部分は、生体安定である。ある特定の実施形態において、第１のペンダント部分及び／または第２のペンダント部分は、加水分解性部分を含む加水分解性リンカーを含み、加水分解性リンカー及び加水分解性部分は、生体安定である。
【００５２】
Ｒ２は、非反応性ペンダント部分である。そのため、Ｒ２は、官能基を有さず、一実施形態において、Ｒ２は独立して、非置換もしくは置換アルキル、非置換もしくは置換アルケニル、非置換もしくは置換アラルキル、または非置換もしくは置換ヘテロシクリルアルキル基から、各繰り返し単位について選択される。別の実施形態において、Ｒ２は、長さが１〜１０個または１〜５個の炭素の非置換または置換アルキルである。
【００５３】
例となる開始基には、水素、アルキル、置換アルキル、アラルキル、または置換アラルキル基が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、開始基は、メチル基である。一実施形態において、Ｒ１基は、官能基を有さないように選択される。追加の例となる開始基は、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０７８１５９号に開示され、これは、そのような教示のために参照により本明細書に組み込まれる。
【００５４】
一実施形態において、ポリマー複合体は、以下の一般構造によって表され得、
【化２】
0006704900.tif 000003
式中、作用剤は、本明細書に記載される任意の作用剤であり、Ｘは、第１のペンダント部分を表し、Ｙは、第２のペンダント部分を表す。前述の一実施形態において、ｏは、３〜１５であり、ｍは、１〜４５であり、ｎ、ｍ、及びｏの合計は、３０〜５００（またはその中もしくは本明細書に記載される任意の部分範囲）である。この実施形態において、第２のペンダント部分Ｙは、作用剤または精製部分への結合を有さずに示される。さらに、この実施形態における非反応性ペンダント基は、簡単にするためにエチルとして示され、Ｒ２に関して記載されるあらゆる基が存在し得ることが理解される。ペンダント部分が上記のＹ等の作用剤または精製部分に連結しないとき、ペンダント部分は、アルキン（及び本明細書に記載される他の基）でもよい。例えば、Ｙがアルキンであるとき、ポリマー複合体は、以下の構造を有し得る。
【化３】
0006704900.tif 000004
【００５５】
一実施形態において、ポリマー複合体は、以下の一般構造によって表され得、
【化４】
0006704900.tif 000005
式中、作用剤は、本明細書に記載される任意の作用剤であり、ＰＭは、精製部分を表し、Ｘは、第１のペンダント部分を表し、Ｙは、第２のペンダント部分を表す。前述の一実施形態において、ｏ１は、１〜４であり、３〜１５であり、ｍは、１〜４５であり、ｎ、ｍ、及びｏの合計は、３０〜５００（またはその中もしくは本明細書に記載される任意の部分範囲）である。この実施形態において、第２のペンダント部分Ｙは、作用剤または精製部分への結合を有さずに示される。さらに、この実施形態における非反応性ペンダント基は、簡単にするためにエチルとして示され、Ｒ２に関して記載されるあらゆる基が存在し得ることが理解される。ペンダント部分が上記のＹ等の作用剤または精製部分に連結しないとき、ペンダント部分は、アルキン（及び本明細書に記載される他の基）でもよい。例えば、Ｙがアルキンであるとき、ポリマー複合体は、以下の構造を有し得る。
【化５】
0006704900.tif 000006
【００５６】
作用剤及び精製部分の数は、実施例に記載されるように、中間体の調整によって複合体の合成の間に制御され得る。一実施形態において、作用剤及び（存在する場合）精製部分の追加のための反応化学は、同じである。別の実施形態において、反応化学は異なる。例えば、反応化学が同じであり、２個の精製部分及び６種の作用剤が最終複合体中に所望される場合、複合反応の間に、精製部分を含む２モル当量のペンダント部分、及び作用剤を含む６モル当量のペンダント部分が反応混合物に添加され、所望の構造が得られる。作用剤及び精製部分が存在するとき、ペンダント連結部分の性質は、同じであり得るか、または異なり得る。換言すると、第１のペンダントリンカーの性質は、本明細書に記載されるように、同じであり得るか、または異なり得る。さらに、本明細書に記載されるように、Ｘ及びＹペンダント連結部分の性質は、存在する反応性基が直交官能基を提供し、異なる反応化学を介した作用剤と精製部分との結合を可能にし得るようなものであり得る。
【００５７】
当分野で既知の任意の精製部分が、本明細書に記載されるポリマー複合体に使用されてもよい。一実施形態において、精製部分は、ビオチンである。一実施形態において、１〜３個のビオチン分子が、本複合体中に存在する。一実施形態において、２個のビオチン分子が存在する。
【００５８】
一実施形態において、作用剤は、遊離可能な加水分解性連結によって、ポリ（オキサゾリン）ポリマーに連結する（すなわち、第１のペンダント部分及び／または第２のペンダント部分が加水分解性リンカーである）。そのような場合、第１のペンダント部分及び／または第２のペンダント部分は、少なくとも１個の加水分解性部分を含み、対象にポリ（オキサゾリン）ポリマー複合体が投与された後、連結が開裂されることを可能にする。第１のペンダント部分及び／または第２のペンダント部分は、単一の加水分解性部分、または２個以上の加水分解性部分を含んでもよい。加水分解性部分は、酵素によって、または化学反応によって開裂可能であり得る。実施例において、２個以上の加水分解性部分が存在する場合、１個の加水分解性部分は、酵素によって開裂可能であり得、１個の加水分解性部分は、化学反応によって開裂可能であり得るか、または全部が、同じ機構によって開裂可能であり得る。一実施形態において、第１のペンダント部分及び／または第２のペンダント部分は、１個の加水分解性部分を含む。別の実施形態において、第１のペンダント部分及び／または第２のペンダント部分は、２個の加水分解性部分を含む。別の実施形態において、第１のペンダント部分及び／または第２のペンダント部分は、２個の加水分解性部分を含み、１個のそのような部分は、酵素によって開裂可能である。
【００５９】
一実施形態において、精製部分は、安定リンカー（連結は、作用部位ですら開裂しない）、または加水分解性リンカーによって、ポリ（オキサゾリン）ポリマーに連結する。そのため、作用剤及び精製部分が各々、同じ反応化学によってポリマーに連結するとき（すなわち、第１のペンダント部分が同じ反応化学を使用して、作用剤及び精製部分の両方を連結させるために使用されるとき）、第１のペンダント部分の一部分は、加水分解性部分を含んでもよく、第１のペンダント部分の一部分は、安定した連結を含んでもよい。別の実施形態において、精製部分は、本明細書に記載されるように、遊離可能な加水分解性連結によってポリオキサゾリンポリマーに連結する。加水分解性リンカーは、ある特定の実施形態において、生体安定でもよい。そのため、作用剤及び精製部分が各々、同じ反応化学によってポリマーに連結するとき、（すなわち、第１のペンダント部分が同じ反応化学を使用して、作用剤及び精製部分の両方を連結させるために使用されるとき）、作用剤及び精製部分の全ての連結は、加水分解性部分を含む。しかしながら、加水分解性部分の性質は、所望により作用剤と精製部分との間で異なってもよい。
【００６０】
いくつかの酵素が、加水分解性部分を開裂するために使用され得る。一実施形態において、開裂に関与する酵素は、血中または血漿中に存在しない。一実施形態において、開裂に関与する酵素は、限定されないが、リソソームまたはエンドソーム等の細胞内区画内に存在する。特定の実施形態において、酵素は、限定されないが、カテプシン等のペプチダーゼである。代表的なカテプシンは、カテプシンＢである。特定の実施形態において、加水分解性連結及び加水分解性部分は、作用剤及び／または精製部分が血流中に著しい量まで放出されないように、血中または血漿中で生体安定である。一実施形態において、酵素によって開裂された加水分解性部分は、アミド結合であり、そのようなアミド結合は、アミノ酸配列内に含まれ得る。
【００６１】
例となる加水分解性部分には、カルボン酸エステル（−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−）、炭酸エステル（−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−）、カルバメート（−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−）、二硫化物（−Ｓ−Ｓ−）、硫化物（−Ｓ−）、アセタール（−ＣＨ（ＯＲ’）（ＯＲ’’））、ヘミアセタール（−ＣＨ（ＯＲ’）（ＯＨ））、リン酸塩（−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−（Ｏ）−）、ホスホン酸塩（−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）−（Ｏ）−）及びアミド（−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−）が含まれるが、これらに限定されず、他の加水分解性部分は、本明細書で論じられ、式中、Ｒ’及びＲ’’は、Ｈまたは置換もしくは非置換アルキルである。特定の実施形態において、加水分解性部分は、エステルである。別の特定の実施形態において、加水分解性部分は、アミドである。さらに、遊離可能な加水分解性連結は、天然型アミノ酸、非天然型アミノ酸、または１個以上の天然型アミノ酸及び／もしくは非天然型アミノ酸に連結するポリマー中に含まれ得る。
【００６２】
一実施形態において、遊離可能な加水分解性連結は、Ｒ３またはＲ４基のうちの１個の中に加水分解性部分を含む、ジ−置換トリアゾールである。一実施形態において、加水分解性部分は、Ｒ４基の中にある。特定の実施形態において、ジ−置換トリアゾールは、以下の構造を有する。
【化６】
0006704900.tif 000007
別の実施形態において、ジ−置換トリアゾールは、以下の構造を有する。
【化７】
0006704900.tif 000008
前述の構造の各々中、
Ｒ３は、ポリマー鎖にトリアゾール部分を連結するリンカーである。一実施形態において、Ｒ３は、ポリマー鎖上の官能基によって（少なくとも部分的に）画定される。一実施形態において、Ｒ３は、−Ｒ５−または−Ｃ（Ｏ）−Ｒ５−であり、式中、Ｒ５は、存在しないか、または長さが１〜１０個の炭素の置換もしくは非置換アルキルである。一実施形態において、Ｒ５は、長さが１〜１０個の炭素の非置換アルキルである。一実施形態において、Ｒ５は、長さが１〜５個の炭素の非置換アルキルである。
Ｒ４は、トリアゾール部分と作用剤との間に連結を形成する。Ｒ基の性質は、異なってもよいが、但し、連結機能が遊離可能な様式で達成される（すなわち、連結が加水分解性部分を含む）ことを条件とする。一実施形態において、Ｒ４は、アルキル部分を含む。別の実施形態において、Ｒ４は、ポリマー部分を含む。別の実施形態において、Ｒ４は、１個以上のアミノ酸を含む。別の実施形態において、Ｒ４は、ポリマー部分及び１個以上のアミノ酸を含み、ここで、加水分解性部分は、アミノ酸部分中のアミド結合である。好適なポリマーは、当分野で既知であるか、または本明細書に記載される任意の水溶性ポリマーを含む。一実施形態において、水溶性ポリマーは、−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｓ−によって表されるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーであり、式中、ｓは、１〜１５、１〜１０、または１〜５の整数である。ｓの特定の値には、２、３、４、及び５が含まれるが、これらに限定されない。
【００６３】
一実施形態において、Ｒ４は、−Ｒ６−Ｒ７−Ｒ８−であり、式中、
Ｒ６は、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換アラルキル、ポリマー、または（以下に記載される）Ｕ１−（ｐｏｌ）ｂ−Ｕ２−（［ＮＲ１６−Ｃ（Ｒ１３）（Ｒ１４）−Ｃ（Ｏ）］ｃ）−ＮＲ１７−Ａｒ−（ＣＨ２）ｓであり、任意選択的に加水分解性部分を含み、
Ｒ７は、連結基であり、任意選択的に加水分解性部分または加水分解性部分の一部分を含み、
Ｒ８は、存在しないか、またはＯ、Ｓ、ＣＲｃ、またはＮＲｃであり、Ｒｃは、Ｈまたは置換もしくは非置換アルキルであるが、但し、Ｒ６及びＲ７のうちの少なくとも１つが、加水分解性部分を含むことを条件とする。
【００６４】
一実施形態において、２個以上の加水分解性部分は、Ｒ４中に存在する。一実施形態において、単一の加水分解性部分は、Ｒ４中に存在する。一実施形態において、結合したＲ７及びＲ８が、加水分解性部分を形成する。一実施形態において、Ｒ７は、加水分解性部分を含む。一実施形態において、Ｒ６は、加水分解性部分を含む。一実施形態において、加水分解性部分は、Ｒ６及びＲ７の両方に存在する。そのような加水分解性部分は、同じ機構によって、または異なる機構によって開裂可能であり得る。
【００６５】
前述の一実施形態において、Ｒ６は、直鎖の置換もしくは非置換Ｃ１−Ｃ１６アルキル、または分岐鎖の置換もしくは非置換Ｃ１−Ｃ１６アルキルである。前述の一実施形態において、Ｒ６は、直鎖の置換もしくは非置換Ｃ１−Ｃ５アルキル、または分岐鎖の置換もしくは非置換Ｃ１−Ｃ５アルキルである。一実施形態において、Ｒ６は、−（ＣＨ２）ｐ−であり、式中、ｐは、１〜１６、１〜１０、または１〜５である。
【００６６】
別の実施形態において、Ｒ６は、ポリマーである。好適なポリマーは、当分野で既知であるか、または本明細書に記載される任意の水溶性ポリマーを含む。一実施形態において、水溶性ポリマーは、−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｂ−によって表されるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーであり、式中、ｂは、１〜３０、１〜１５、１〜１０、または１〜５の整数である。ｂの特定の値には、２、３、４、及び５が含まれるが、これらに限定されない。別の実施形態において、ポリマーは、アミノ酸ポリマーである。好適なアミノ酸ポリマーとしては、長さが１〜１０個のアミノ酸のポリ−グリシンポリマー及びポリ−アラニンポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。ＰＥＧまたはアミノ酸ポリマーを含むそのようなポリマーは、連結から得られた追加の末端基を含み得る。
【００６７】
別の実施形態において、Ｒ６は、アミノ酸部分に連結する（各々が上述のとおりである）直鎖の置換もしくは非置換、分岐鎖の置換もしくは非置換アルキル、またはポリマーを含む（ポリマーがアミノ酸ポリマーである場合、２個のアミノ酸部分が結合される）。アミノ酸部分は、１〜６個のアミノ酸、１〜４個のアミノ酸、または１〜２個のアミノ酸を含み得る。好適なアミノ酸は、天然型アミノ酸、非天然型アミノ酸、または前述のものの組み合わせを含む。ある特定の実施形態において、アミノ酸は、バリン、シトルリン、リジン、及びフェニルアラニンでもよい。ある特定の実施形態において、アミノ酸部分は、バリン及びシトルリンまたはリジン及びフェニルアラニンである。
【００６８】
一実施形態において、Ｒ７は、−Ｒａ−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｒｂ−、−Ｒａ−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｒｂ−、−Ｒａ−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｒｂ−、−Ｒａ−ＣＨ（ＯＨ）−Ｒｂ−、−Ｒａ−Ｓ−Ｓ−Ｒｂ−、−Ｒａ−Ｓ−Ｒｂ−、−Ｒａ−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ１１）−Ｒｂ−（式中、Ｒ１１は、Ｈまたは置換もしくは非置換Ｃ１−Ｃ５アルキルである）、あるいは−Ｒａ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｒｂ−であり、式中、Ｒａ及びＲｂは各々独立して、存在しないか、または置換もしくは非置換アルキルである。別の実施形態において、Ｒａ及びＲｂは各々独立して、存在しないか、またはＣ１−Ｃ１６置換もしくは非置換アルキルである。別の実施形態において、Ｒａ及びＲｂは各々独立して、存在しないか、またはＣ１−Ｃ５置換もしくは非置換アルキルである。別の実施形態において、Ｒａ及びＲｂは各々、存在しない。
【００６９】
ある特定の実施形態において、Ｒ７は、−Ｒａ−Ｃ（Ｏ）−Ｒｂ−、−Ｒａ−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｒｂ−であり、Ｒａ及びＲｂは各々、存在せず、Ｒ８はＯであり、Ｒ７は−Ｒａ−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｒｂ−または−Ｒａ−Ｃ（Ｏ）−Ｒｂであり、Ｒａ及びＲｂは各々、存在せず、Ｒ８はＮＨであり、Ｒ７は、−Ｒａ−Ｓ−Ｓ−Ｒｂ−、−Ｒａ−Ｓ−Ｒｂ−であり、Ｒａ及びＲｂは各々、存在せず、Ｒ８は、存在しない。
【００７０】
ある特定の実施形態において、Ｒ７は、−Ｒａ−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｒｂ−、−Ｒａ−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｒｂ−であり、Ｒａ及びＲｂは各々、存在せず、Ｒ８は、存在しない。
【００７１】
一実施形態において、Ｒ６は、Ｕ１−（ｐｏｌ）ｂ−Ｕ２−（［ＮＲ１６−Ｃ（Ｒ１３）（Ｒ１４）−Ｃ（Ｏ）］ｃ）−ＮＲ１７−Ａｒ−（ＣＨ２）ｓによって表され、式中、
Ｕ１は、任意の連結基を表し、
ｐｏｌは、ポリマー部分を表し、
Ｕ２は、任意の連結基を表し、
Ｒ１７、Ｒ１６、及びＲ１３は各々独立して、Ｈまたは置換もしくは非置換Ｃ１−Ｃ５アルキルであり、
Ｒ１４は、天然型アミノ酸または非天然型アミノ酸上の側鎖基であり、
Ａｒは、アリール基を表し、
ｂは、１〜１５の整数であり、
ｃは、１〜１０の整数であり、
ｓは、０〜４の整数である。
【００７２】
好適なポリマーは、当分野で既知であるか、または本明細書に記載される任意の水溶性ポリマーを含む。一実施形態において、水溶性ポリマーは、−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｂ−によって表されるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーであり、式中、ｓは、１〜１５、１〜１０、または１〜５の整数である。ｓの特定の値には、２、３、４、及び５が含まれるが、これらに限定されない。別の実施形態において、ポリマーは、アミノ酸ポリマーである。好適なアミノ酸ポリマーとしては、長さが１〜１０個のアミノ酸のポリ−グリシンポリマー及びポリ−アラニンポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７３】
ある特定の実施形態において、Ｕ１は、長さが１〜１０個、１〜８個、１〜５個、または１〜３個の炭素の置換もしくは非置換アルキルである。一実施形態において、Ｕ１は、長さが１〜５個の炭素の非置換アルキルである。ある特定の実施形態において、Ｕ１は、存在しない。
【００７４】
ある特定の実施形態において、Ｕ２は、−（ＣＨ２）ｔ−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、または−ＮＨ−によって表される。ある特定の実施形態において、Ｕ２は、存在しない。前述のものにおいて、ｔは、１〜１０、１〜８、１〜５、または１〜３である。
【００７５】
ある特定の実施形態において、Ｒ１６及びＲ１３は各々、Ｈである。
【００７６】
ある特定の実施形態において、Ｒ１４は、バリン、シトルリン、リジン、またはフェニルアラニンからの側鎖を表す。ある特定の実施形態において、ｃは、２と等しく、Ｒ１４は、バリン及びシトルリンまたはリジン及びフェニルアラニンからの側鎖である。ある特定の実施形態において、加水分解性部分は、基、−（［ＮＲ１６−Ｃ（Ｒ１３）（Ｒ１４）−Ｃ（Ｏ）］ｃ）−内のアミド結合である。
【００７７】
Ａｒ基は、単環を含んでもよいか、または多環式でもよい。ある特定の実施形態において、Ａｒ基は、ベンゼン、ピリジン、ピラジン、イミダゾール、ピラゾール、オキサゾール、チオフェン、ナフタレン、アントラセン、及びフェナントレンからなる群から選択される。ある特定の実施形態において、Ａｒ基は、ベンゼンである。
【００７８】
ある特定の実施形態において、ｓは、１である。
【００７９】
一実施形態において、Ｒ６は、Ｕ１−（ｐｏｌ）ｂ−Ｕ２−（［ＮＲ１６−Ｃ（Ｒ１３）（Ｒ１４）−Ｃ（Ｏ）］ｃ）−ＮＲ１７−Ａｒ−（ＣＨ２）ｓであり、Ｒ７は、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−であり、Ｒ８は、存在しない。一実施形態において、Ｒ６は、Ｕ１−（ｐｏｌ）ｂ−Ｕ２−（［ＮＲ１６−Ｃ（Ｒ１３）（Ｒ１４）−Ｃ（Ｏ）］ｃ）−ＮＲ１７−Ａｒ−（ＣＨ２）ｓであり、Ｒ７は、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−であり、Ｒ８は、存在せず、Ｕ１は、置換もしくは非置換Ｃ１−Ｃ１０アルキルであるか、または存在せず、Ｕ２は、−（ＣＨ２）ｔ−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、もしくは−ＮＨ−であるか、または存在せず、ｐｏｌは、ポリエチレングリコールポリマーであり、Ａｒは、ベンゼンである。一実施形態において、Ｒ６は、Ｕ１−（ｐｏｌ）ｂ−Ｕ２−（［ＮＲ１６−Ｃ（Ｒ１３）（Ｒ１４）−Ｃ（Ｏ）］ｃ）−ＮＲ１７−Ａｒ−（ＣＨ２）ｓであり、Ｒ７は、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−であり、Ｒ８は、存在せず、Ｕ１は、置換もしくは非置換Ｃ１−Ｃ１０アルキルであるか、または存在せず、Ｕ２は、−（ＣＨ２）ｔ−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、もしくは−ＮＨ−であるか、または存在せず、ｐｏｌは、ポリエチレングリコールポリマーであり、Ａｒはベンゼンであり、ｂは４であり、ｃは２であり、ｓは１である。
【００８０】
さらに、精製部分が複合体上に存在するとき、Ｒ３及びＲ４部分は、加水分解性部分を有さない。
【００８１】
一実施形態において、Ｒ３及びＲ４部分は、加水分解性部分を有さず、Ｒ４は、Ｕ３−（ｐｏｌ）ｂ−Ｕ４によって表され、式中、
Ｕ３は、任意の連結基を表し、
ｐｏｌは、ポリマー部分を表し、
Ｕ４は、任意の連結基を表し、
ｂは、１〜１５の整数である。
【００８２】
好適なポリマーは、当分野で既知であるか、または本明細書に記載される任意の水溶性ポリマーを含む。一実施形態において、水溶性ポリマーは、−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｂ−によって表されるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーであり、式中、ｓは、１〜１５、１〜１０、または１〜５の整数である。ｓの特定の値には、２、３、４、及び５が含まれるが、これらに限定されない。別の実施形態において、ポリマーは、アミノ酸ポリマーである。好適なアミノ酸ポリマーとしては、長さが１〜１０個のアミノ酸のポリ−グリシンポリマー及びポリ−アラニンポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８３】
ある特定の実施形態において、Ｕ３は、長さが１〜１０個、１〜８個、１〜５個、または１〜３個の炭素の置換もしくは非置換アルキルである。一実施形態において、Ｕ３は、長さが１〜５個の炭素の非置換アルキルである。ある特定の実施形態において、Ｕ３は、存在しない。
【００８４】
ある特定の実施形態において、Ｕ４は、−Ｃ（Ｏ）−または−ＮＨ−によって表される。ある特定の実施形態において、Ｕ４は、存在しない。
【００８５】
ある特定の実施形態において、Ｒ８は、存在しない。
【００８６】
ある特定の実施形態において、Ｒ３は、−（ＣＨ２）３−または−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）３−であり、Ｒ４は−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−、または−ＣＨ２（ＣＨ２）−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−である。
【００８７】
特定の実施形態において、Ｒ３は、−（ＣＨ２）３−または−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）３であり、Ｒ４は、
【化８】
0006704900.tif 000009
である。
特定の実施形態において、Ｒ３は、−（ＣＨ２）３−または−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）３であり、Ｒ４は、
【化９】
0006704900.tif 000010
である。
特定の実施形態において、Ｒ３は、−（ＣＨ２）３−または−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）３であり、Ｒ４は、
【化１０】
0006704900.tif 000011
である。
別の実施形態において、遊離可能な加水分解性連結は、構造、Ｒ９−Ｙ−Ｒ１０を有し、式中、Ｙは、加水分解性部分であり、Ｒ９及びＲ１０は各々、ポリマー複合体及び作用剤それぞれにＹを連結する基である。Ｒ９及びＲ１０は、同じまたは異なっていてもよい。一実施形態において、Ｒ９及びＲ１０は各々独立して、存在しないか、または置換もしくは非置換アルキルである。別の実施形態において、Ｒ９及びＲ１０は各々独立して、存在しないか、またはＣ１−Ｃ１６置換もしくは非置換アルキルである。一実施形態において、Ｒ９及びＲ１０は各々、存在しない。
【００８８】
前述の一実施形態において、連結基は、−Ｒ９−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｒ１０−、−Ｒ９−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｒ１０−、−Ｒ９−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＲ１８−Ｒ１０−（式中、Ｒ１８はａはＨまたは置換もしくは非置換Ｃ１−Ｃ５アルキルである）、−Ｒ９−ＣＨ（ＯＨ）−Ｏ−Ｒ１０−、Ｒ９−ＣＨ（ＯＲ１２）−Ｏ−Ｒ１０−（式中、Ｒ１２はＨまたは置換もしくは非置換Ｃ１−Ｃ５アルキルである）、−Ｒ９−Ｓ−Ｓ−Ｒ１０−、−Ｒ９−Ｓ−Ｒ１０−、−Ｒ９−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ１２）−Ｏ−Ｒ１０−（式中、Ｒ１２はＨまたは置換もしくは非置換Ｃ１−Ｃ５アルキルである）、−Ｒ９−Ｃ（Ｏ）−ＮＲ１８−Ｒ１０−（式中、Ｒ１８は、ａはＨまたは置換もしくは非置換Ｃ１−Ｃ５アルキルである）、あるいは−Ｒ９−［ＮＲ１８−Ｃ（Ｒ１３）（Ｒ１４）−Ｃ（Ｏ）］ｃ−Ｒ１０−（式中、Ｒ１８はａはＨまたは置換もしくは非置換Ｃ１−Ｃ５アルキルであり、Ｒ１３は、ＨまたはＣ１−Ｃ５アルキルであり、Ｒ１４は、天然型アミノ酸または非天然型アミノ酸上の側鎖基であり、ｃは１〜１０である）である。
【００８９】
一実施形態において、加水分解性部分の開裂の速度は、遊離可能な加水分解性連結の性質によって制御される。前述のものの各々において、遊離可能な加水分解性連結の加水分解性部分は、作用剤を放出するように開裂され得る。一実施形態において、遊離可能な加水分解性連結の加水分解性部分は、対象に投与された後、対象内の生理的条件下で化学的に開裂される。一実施形態において、遊離可能な加水分解性連結の加水分解性部分は、対象に投与された後、対象内の生理的条件下で、対象中に自然に存在するか、存在するように誘発された物質によって開裂される。一実施形態において、そのような物質は、酵素またはポリペプチドである。一実施形態において、遊離可能な加水分解性連結の加水分解性部分は、前述のものの組み合わせによって開裂される。
【００９０】
一実施形態において、ポリマーＡＤＣは、以下の一般構造によって表され得、
【化１１】
0006704900.tif 000012
0006704900.tif 000013
式中、作用剤は、本明細書に記載されるか、または当分野で既知の任意の作用剤であり、ＰＭは、本明細書に記載されるか、または当分野で既知の任意の精製部分であり、ｑは、１〜１０の整数であり、ｂ及びｄは独立して、１〜３０の整数であり、残りの変数は、本明細書で定義されるとおりである。
【００９１】
前述の一実施形態において、ｏは、３〜１５であり、ｍ及びｏの合計は、１〜５０であり、ｎは、１〜１０００または１〜５００である。ある特定の実施形態において、ｍは０である。別の実施形態において、ｏ１、ｏ２、及びｍの合計は、５０以下であり、ｏ１は、１〜５の整数であり、ｏ２は、３〜４５の整数であり、ｍは、１〜５０の整数であり、ｎは、１〜１０００または１〜５００である。
【００９２】
一実施形態において、Ｒ２０は、ポリマーに認識部分を連結する役目をする連結基である。一実施形態において、Ｒ２０は、認識部分上で結合残基と反応する、反応性基を含む。一実施形態において、反応性基は、特異的に、かつ１：１の比率で認識部分上の化学量論的結合残基と反応する。特定の態様において、認識部分は、限定されないが、一本鎖の抗体等の抗体であり、化学量論的結合残基は、本明細書に記載されるセレノシステイン部分であり、反応性基は、マレイミド基である。特定の態様において、認識部分は、限定されないが、一本鎖の抗体等の抗体であり、化学量論的結合残基は、本明細書に記載されるセレノシステイン部分であり、反応性基は、ヨードアセトイミド基である。一態様において、Ｒ２０は、認識部分とポリオキサゾリンポリマーとの隔たりを提供するためのスペーサを組み込む。一態様において、Ｒ２０は、本開示のポリオキサゾリンポリマーを停止求核試薬と反応させ、任意選択的にこの構造をさらなる化学反応に供することによって形成することができる。
【００９３】
特定の実施形態において、Ｒ２０は、以下の構造によって表され得、
Ｒ２１−Ｚ−Ｒ２２、式中、
Ｒ２１は、Ｓ、Ｏ、またはＮからなる群から選択され、
Ｚは、連結基であり、
Ｒ２２は、認識部分を含む部分である。
【００９４】
一実施形態において、Ｚは、−（ＣＨ２）ｒ−によって表され、式中、ｒは１〜１０である。
【００９５】
別の実施形態において、Ｚは、−（ＣＨ２）ｒ１−Ｒ２３−Ｒ２４−（ＣＨ２）ｒ２−によって表され、式中、Ｒ２３は、存在しないか、または−Ｃ（Ｏ）−、もしくは−Ｎ−Ｒ２５−であり、Ｒ２５は、Ｈまたは置換もしくは非置換アルキル基であり、Ｒ２４は、存在しないか、または−Ｏ−、もしくは−Ｎ−Ｒ２６−であり、Ｒ２６は、Ｈまたは置換もしくは非置換アルキル基であり、ｒ１及びｒ２は各々独立して、０〜１０の整数である。
【００９６】
前述のものの一態様において、Ｒ２３は、−Ｃ（Ｏ）−である。一態様において、Ｒ２４は、−Ｏ−または−ＮＨ−である。一態様において、ｒ１は、１〜４の整数であり、ｒ２は、０〜４の整数である。一態様において、Ｒ２３は、−Ｃ（Ｏ）−であり、Ｒ２４は、−Ｏ−であり、ｒ１は２であり、ｒ２は０である。一態様において、Ｒ２３は、−Ｃ（Ｏ）−であり、Ｒ２４は、−ＮＨ−であり、ｒ１は２であり、ｒ２は２である。
【００９７】
前述のものの一態様において、式中、Ｚは、−（ＣＨ２）ｒ１−Ｒ２３−Ｒ２４−（ＣＨ２）ｒ２−によって表され、Ｒ２２は、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−Ｓ−Ａｂ、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−Ｓｅ−Ａｂ、
【化１２】
0006704900.tif 000014
であり、Ａｂは、及び抗体を表す。
別の実施形態において、Ｚは、−（ＣＨ２）ｒ１−Ｒ２３−Ｒ２４−（ＣＨ２）ｒ２−Ｒ２７−Ｒ２８−（ＣＨ２）ｒ３−によって表され、式中、Ｒ２３は、存在しないか、またはＣ＝Ｏ、もしくはＮ−Ｒ２５であり、Ｒ２５は、Ｈまたは置換もしくは非置換アルキル基であり、Ｒ２４は、存在しないか、またはＯ、もしくはＮ−Ｒ２６であり、Ｒ２６は、Ｈまたは置換もしくは非置換アルキル基であり、Ｒ２７は、存在しないか、またはＮ−Ｒ２９であり、Ｒ２９は、Ｈまたは置換もしくは非置換アルキル基、または−Ｃ（Ｏ）−であり、Ｒ２８は、存在しないか、または−Ｃ（Ｏ）−もしくはＮ−Ｒ３０であり、Ｒ３０は、Ｈまたは置換もしくは非置換アルキル基であり、ｒ１、ｒ２、及びｒ３は各々独立して、０〜１０の整数である。
【００９８】
前述のものの一態様において、Ｒ２３は、−Ｃ（Ｏ）−である。一態様において、Ｒ２４は、−Ｏ−または−ＮＨ−である。一態様において、ｒ１は、１〜４の整数であり、ｒ２は、０〜４の整数であり、ｒ３は、０〜４の整数である。一態様において、Ｒ２３は、−Ｃ（Ｏ）−であり、Ｒ２４は、−ＮＨ−であり、Ｒ２７は、−ＮＨ−であり、Ｒ２８は、−Ｃ（Ｏ）−であり、ｒ１は２であり、ｒ２は２であり、ｒ３は１である。
【００９９】
前述のものの一態様において、式中、Ｚは、−（ＣＨ２）ｒ１−Ｒ２３−Ｒ２４−（ＣＨ２）ｒ２−Ｒ２７−Ｒ２８−（ＣＨ２）ｒ３−によって表され、Ｒ２２は、Ｓ−ＡｂまたはＳｅ−Ａｂであり、Ａｂは、及び抗体を表す。
【０１００】
一態様において、Ｒ２２は、認識部分のポリマーへの連結に使用される、反応性基の全てまたは一部分を含む。代表的な連結基には、認識部分に連結する、ヨードアセトアミド、ブロモアセトアミド、クロロアセトアミド、マレイミド、またはアクリルアミド基が含まれるが、これらに限定されない。一態様において、Ｒ２２は、認識部分に連結するマレイミド基またはヨードアセトアミド基である。別の実施形態において、Ｒ２２のそのような部分を有さない
【０１０１】
さらなる態様において、認識部分は、抗体であり、結合残基は、システイン残基である。さらなる態様において、認識部分は、ＳＣ抗体であり、結合残基は、システイン残基である。
【０１０２】
さらなる態様において、認識部分は、抗体であり、結合残基は、セレノシステイン残基であり、ポリオキサゾリンポリマー及び抗体は、１：１の比率でセレノシステイン残基に結合する。
【０１０３】
さらなる態様において、認識部分は、ＳＣ抗体であり、結合残基は、セレノシステイン残基であり、ポリオキサゾリンポリマー及びＳＣ抗体は、１：１の比率でセレノシステイン残基に結合する。
【０１０４】
そのような態様において、Ｒ２２基は、以下の構造によって表され得る。代表的な反応性基及び結合残基の構造が示される一方で、本出願の本開示は、開示される例に限定されるべきではない。マレイミドが抗体をポリマーに結合させるために使用される反応性基であるとき、Ｒ２２は、以下の構造を有し得る。
【化１３】
0006704900.tif 000015
【０１０５】
ヨードアセトアミドが抗体をポリマーに結合させるために使用される反応性基であるとき、Ｒ２２は、以下の構造を有し得る。
【化１４】
0006704900.tif 000016
【０１０６】
そのため、代表的なＲ２０基には、（以下の構造中のセレン、Ｓｅが、硫黄、Ｓまたは他の結合残基に置き換えられるという理解のもとで）以下が含まれるが、これらに限定されない。
【化１５】
0006704900.tif 000017
0006704900.tif 000018
【０１０７】
一実施形態において、本開示は、以下の複合体を提供し、式中、ｏ１、ｏ２の合計は、５０以下であり、ｏ１は、１〜５の整数であり、ｏ２は、１〜４５の整数であり、ｍは、１〜５０の整数であり、ａは、ランダムコポリマーまたはブロックコポリマーを表し、作用剤は、作用剤を表し、ＢＲは、抗体上の結合残基を表し、Ａｂは、抗体を表し、ＰＭは、精製部分を表す。
【化１６】
0006704900.tif 000019
0006704900.tif 000020
0006704900.tif 000021
0006704900.tif 000022
【０１０８】
一実施形態において、Ａｂは、ＳＣ抗体を表す。一実施形態において、Ａｂは、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、またはＩｇＤ抗体を表す。Ａｂという用語は、本明細書に記載されるか、または当分野で既知の抗体のうちのいずれかを表し得る。一実施形態において、ＢＲは、セレノシステインを表す。一実施形態において、ＢＲは、硫黄を表す。ＢＲという用語は、記載される抗体上に存在し得る任意の結合残基を表し得る。一実施形態において、作用剤は、（限定されないが、デアセチルコルヒチン等の）コルヒチン、または（限定されないが、モノメチルオーリスタチンＥ、モノメチルオーリスタチンＦ、もしくはデスメチル−オーリスタチンＦ等の）オーリスタチンである。作用剤は、本明細書に記載されるか、または当分野で既知の任意の作用剤でもよい。
【０１０９】
ポリオキサゾリンポリマーの合成方法
一実施形態において、本開示のポリマーは、官能基を含む適切な２−置換−２−オキサゾリンの共重合によって調製される。例えば、単純２−アルキル−２−オキサゾリンに加えて、アルキン基及びアセタール基を有する水溶性コポリマーの調製は、以下のオキサゾリンモノマーを使用して合成することができる。
【化１７】
0006704900.tif 000023
【０１１０】
重合は、限定されないが、メチルトリフレート、メチルトシレート、ｐ−トルエンスルホン酸、またはトリフリン酸等の求電子剤によって開始される。共重合は、本明細書で論じられる求核試薬によって停止することができる。末端官能基が所望される場合、限定されないが、メチルチオールアセテート等の官能化停止剤が使用され得る。非反応性停止末端については、アルキルメルカプタン等の求核試薬が使用され得る。同様に、停止ヒドロキシル基も、多くの試薬に対して非反応性であり、したがって、この用途に有用であり得る。重合のために好ましい溶媒は、クロロベンゼンまたはアセトニトリルである。好ましい温度範囲は、約４０℃〜約１２０℃である。重合のために必要な時間は、温度、所望の分子量、及び溶媒に左右され、約１時間〜約１００時間の範囲にわたり得る。ある特定の実施形態において、実質的に重合反応を完了させるのに必要な時間に重合反応を制限することが望ましい。一実施形態において、重合反応の進捗は、ＭＡＬＤＩ及び／またはＧＰＣを使用して監視される。
【０１１１】
重合は、いくつかの手段で行われ得る。一実施形態において、適切なオキサゾリン構成成分の混合物を、好ましい溶媒中で、撹拌しながら開始剤と反応させてもよい。この反応で、オキサゾリン構成成分が互いに対して同じように反応性であるとき、ランダムコポリマーを、またはオキサゾリン構成成分のうちの１つ以上が互いに対してより低い反応性であるとき、ブロックコポリマーが得られる。代替実施形態において、ポリマーは、わずか１つのオキサゾリン構成成分を使用して、好ましい溶媒中で適切な開始剤を用いて重合を開始することにより、ブロック中でも合成され得る。反応は、反応が実質的に完了したことを判定するために、ＭＡＬＤＩまたはＧＰＣを用いて監視してもよい。第１のブロックの重合が完了したとき、第２のオキサゾリン構成成分が、ポリマー鎖の末端で初期の生きたカチオンを用いて重合を再開始するために添加され、重合反応の監視が、記載されるように実施されてもよい。溶媒は、第１の重合反応と同じ、または異なってもよく、反応温度及び他の変数もまた、望みどおりに調節されてもよい。第２のブロックの重合が完了したら、第３のオキサゾリン構成成分が、ポリマー鎖の末端で生きたカチオンを用いて重合を再開始するために添加され、重合反応の監視が、記載されるように実施されてもよい。溶媒は、第１の重合反応または第２の重合反応と同じ、または異なってもよく、反応温度及び他の変数もまた、所望のとおりに調節されてもよい。第３の重合工程が完了したとき、重合は、停止剤の添加によって停止されてもよい。オキサゾリン構成成分は、官能基を含んでもよいか、または官能基を有さなくてもよい。逐次重合は、任意の順序で行うことができる。別の実施形態において、オキサゾリンモノマーのうちの２つのランダム共重合と、続いて第３のブロックの連続重合も、ランダム構成及びブロック構成の両方を有するポリマーを生成するために、行われ得る。一実施形態において、オキサゾリンモノマーのうちの１つは、官能基を有さない。
【０１１２】
所望の重合プロセスが完了したら、ポリマーを、例えば、エチルエーテル中で数回沈殿させ、真空下で乾燥させる。ポリマーは、限定されないが、ＭＡＬＤＩ、ＮＭＲ、及びＧＰＣ等の標準的技法によってさらに特徴づけられてもよい。
【０１１３】
ポリエチレングリコールに関する研究は、標的分子の変更において、２０，０００Ｄａ以上の分子量（ＭＷ）、及び１．１未満の分子量分布、または多分散度（ＰＤ）のポリマーの利用が必要であることを示している。上記の範囲内のＭＷ及びＰＤが、ＰＯＺ鎖に関して、従来の技法では達成できないことを示す多数の研究が存在する。当分野で知られているように、ＰＤ値は、ＭＷと共に変化し、一般に、分子量が増加するに従い、ＰＤ値も増加する。一般に、成長しているＰＯＺ鎖の分子量がおおよそ５，０００Ｄａに達したとき、多分散度が明らかに上昇すると考えられている。限定されないが、連鎖移動を含む副反応の重要性が高まり始める。上述の従来技術は、高ＭＷのＰＯＺ鎖を生成するために使用されるとき、許容できないＰＤ値を有するＰＯＺ誘導体を生成する。本開示のポリオキサゾリン誘導体は、低ＰＤ値を有するポリオキサゾリン誘導体と、限定されないが、連鎖移動等の不必要な副反応によって生成される、より少ない量の不純物と、を生じる新規の方法を使用して製造されたポリオキサゾリン鎖を使用して、生成され得る。一実施形態において、ポリオキサゾリン鎖は、限定されないが、連鎖移動等の不必要な副反応を最小化し、低ＰＤ値を有する上昇した純度のＰＯＺ誘導体の生成を可能にするために製造される。したがって、本開示のＰＯＺ誘導体は、薬学的用途における使用に好適な、上昇した純度及び低ＰＤ値で精製され得る。そのような方法は、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０７８１５９号に記載され、これは、そのような教示のために参照により本明細書に組み込まれる。
【０１１４】
一実施形態において、作用剤は、クリック化学を使用してポリオキサゾリンポリマーに連結する。クリック化学手法は、アルキン基とアジド基との間の反応を伴う。一態様において、クリック化学反応は、作用剤に対するアジドエステルの反応、及びポリオキサゾリンポリマーに対するアルキンの反応を伴う。この態様の特定の実施形態において、アジドエステル基が、作用剤に対する、限定されないが、ヒドロキシル基等の化学基との好適な化学反応によって形成される。例となる反応は、ハロ酸からのハライドをアジ化ナトリウムで置換して、アジド酸を形成し、続いて、（ここでロチゴチンと例示される）作用剤上のヒドロキシル基でアジド酸をエステル化することによる、アジドエステルの調製である。
【化１８】
0006704900.tif 000024
【０１１５】
次いで、アジドエステルは、ポリオキサゾリンポリマー上に存在するアルキン官能基に連結する。特定の実施形態において、アルキン官能基は、ポリオキサゾリンポリマー上のペンダントの位置に存在するアセチレン官能基である。
【０１１６】
上記の方法が使用されてもよい一方で、加水分解性部分の形成の他の手法も使用されてもよい。例えば、エステル加水分解性部分を含む連結は、ポリオキサゾリンポリマー上にアジド官能基を、例えば、ポリオキサゾリンポリマー上にペンダント基を作製することによって、アセチレンエステル等の作用剤上にアルキン基を作製することによって、及びアジド基とアルキン基とを反応させて、加水分解性部分（この場合、エステル結合）を含む遊離可能な加水分解性連結を形成することによっても、形成され得る。
【０１１７】
別の手法において、カルボン酸基は、ポリオキサゾリンポリマー上でのペンダント基等の、ポリオキサゾリンポリマー上で生成され得、作用剤上でアルコールまたはフェノール基を直接エステル化することによってカルボン酸基を反応させて、加水分解性部分（この場合、エステル結合）を含む遊離可能な加水分解性連結を形成する。一実施形態において、ポリオキサゾリンポリマー上のカルボン酸基は、重合反応にカルボキシル化モノマーを含めることにより、ポリオキサゾリンポリマー上のペンダント位置で生成される。
【０１１８】
本開示のポリオキサゾリンポリマー複合体の調製において、ポリオキサゾリンポリマー上の作用剤の数は、ポリオキサゾリンポリマー上に存在する反応性基の数によって制御され、一実施形態において、反応性基は、ポリオキサゾリンポリマー上のペンダント位置に存在する。ペンダント位置の反応性基に関して、ポリマー上に存在する反応性基の数は、重合で使用される不活性な側鎖（例えば、アルキル）を有するモノマー単位に対する、作用剤または連結基との連結を形成し得る官能化側鎖（例えば、アセチレン）を有するモノマー単位（例えば、モノマーオキサゾリン）の比率によって制御される。さらに、官能化側鎖を有するモノマー単位の所与の比率について、ポリマー長さが制御され得、所与のポリマー複合体上に積載された作用剤の数のさらなる制御を提供する。したがって、特定のポリマー複合体と結合した作用剤の数を、制御することができる。上述のとおり、連結基の性質、ポリマーの大きさ、及び投与経路は、ポリマーからの作用剤の放出動態に対する制御を可能にする。
【０１１９】
認識部分
本開示のＡＤＣは、認識部分を含む。本開示で使用される場合、用語「認識部分」は、限定されないが、タンパク質が結合した作用剤の放出に触媒作用を及ぼすエンドソームと縮合し得る、細胞質内への内部移行が起きるタンパク質を含む特定のエピトープ／抗原／細胞表面マーカを認識し、これと結合する分子を指す。例となる認識部分には、抗体、抗体の断片、一本鎖の抗体、ポリペプチド、またはペプチド模倣物等が含まれるが、これらに限定されない。認識部分は、ＡＤＣを特定の細胞、組織、または場所に向けることに加えて、ある特定の治療効果（すなわち、標的細胞または経路に対する抗増殖（すなわち、細胞分裂阻止及び／または細胞毒性）活性）があり得る。認識部分は、ＡＤＣのポリマー部分に連結するための少なくとも１個の化学的反応性基を含むか、または含むように操作されてもよい。一態様において、反応性基は、セレノシステイン部分である。
【０１２０】
特定の実施形態において、認識部分は、抗体である。
【０１２１】
本明細書で使用される場合、用語、抗体は、１つ以上の非共有結合の相互作用がポリペプチド鎖含有分子構造と抗原／エピトープとの間の複合体を安定化させる、標的細胞上の抗原／エピトープに結合し、標的細胞上の抗原／エピトープを認識する特定の形状を有する、任意のポリペプチド鎖含有分子構造を意味する。一実施形態において、抗体分子は、免疫グロブリンである。したがって、用語、抗体は、全ての源（例えば、ヒト、げっ歯類、ウサギ、ウシ、ヒツジ、ブタ、イヌ、他の哺乳動物等）からの、全ての種類の免疫グロブリン（ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ等）を含む。抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体でもよく、一態様において、抗体は、モノクローナル抗体である。抗体を産生させ、モノクローナル抗体を生成する方法は、当業者に既知である。抗体または抗原結合断片もまた、遺伝子工学によって生成され得る。
【０１２２】
一態様において、本開示の抗体は、ヒト対象等の対象における免疫反応の誘発の可能性を低減するように改良される。したがって、用語、抗体は、ヒトに投与されたとき、大した免疫反応を生成しないヒト化ヒト抗体、キメラヒト抗体、または異種ヒト抗体を含む。あるいは、ヒト変数可変領域を含む一本鎖の抗体（以下に記載されるｓｃ−Ｆｖ）が、生成され得る。したがって、用語、抗体は、（本明細書でＳＣ抗体またはｓｃ−Ｆｖ断片とも称される）一本鎖の抗体を含み得る。
【０１２３】
全体的免疫グロブリン構造に加えて、抗原／エピトープ結合部位を含む免疫グロブリン断片が使用されてもよい。したがって、用語抗体は、免疫グロブリン断片を含む。そのような断片には、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、または他の断片が含まれるが、これらに限定されない。そのような抗体断片は、ペプシン、パパイン、または他のプロテアーゼ開裂によって、免疫グロブリン全体から生成されてもよい。そのような断片はまた、組み換え免疫グロブリン技法を利用して設計されてもよい。例えば、本発明における使用のためのＳＣ抗体「Ｆｖ」免疫グロブリンは、ペプチドリンカー（例えば、ポリ−グリシンまたはアルファヘリックスまたはベータシートモチーフを形成しない別の配列）を介して、可変重鎖領域に可変軽鎖領域を連結することにより、生成され得る。
【０１２４】
用語、抗体は、機能的同等物も含む。用語、「機能的同等物」には、相同配列を有する抗体、キメラ抗体、人工抗体、及び改良抗体が含まれる。当業者は、「抗体断片」と称される分子グループ及び「機能的同等物」と称されるグループにおいて、重複が存在することを理解するであろう。機能的同等物を生成する方法は、当業者に既知である。人工抗体には、ｓｃＦｖ断片、二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体、及び分子認識単位（ｍｒｕ）が含まれ、これらの各々が、抗原結合能力を有する。一本鎖の抗体中、抗体のＶＨ及びＶＬ領域が、柔軟性ペプチドによって連結される。典型的に、このリンカーペプチドは、約１５個のアミノ酸残基の長さである。リンカーがより小さい、例えば、５個のアミノ酸である場合、二重特異性抗体が形成され、これは、２価のｓｃＦｖ二量体である。リンカーが３個未満のアミノ酸残基に還元された場合、三重特異性抗体及び四重特異性抗体と呼ばれる三量体構造及び四量体構造が形成される。抗体の最小結合単位は、ＣＤＲ、典型的には、別個に使用することができる十分な特定の認識及び結合を有する重鎖のＣＤＲ２である。そのような断片は、ｍｒｕと呼ばれる。いくつかのそのようなｍｒｕは、短いリンカーペプチドに一緒に連結され得、したがって、単一のｍｒｕより高い親和性を有する人工結合タンパク質を形成する。
【０１２５】
機能的同等物には、抗体への任意の種類の分子の共有結合によって改良された抗体を含む、改良抗体も含まれる。例えば、改良抗体には、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護基／ブロック基による誘導体化、タンパク質分解開裂、細胞リガンドまたは他のタンパク質への連結によって改良された抗体が含まれる。これらの改良は、限定されないが、特定の化学開裂、アセチル化、及びホルミル化を含む既知の技法によって実施されてもよい。
【０１２６】
機能的同等物は、異なる骨格内の異なる鎖上の異なるＣＤＲを入れ替えることにより生成することができる。したがって、例えば、抗体の異なるクラスが、異なる重鎖の置換であって、それによって、例えば、ｌｇＧ１−４、ＩｇＭ、ｌｇＡ１−２、ＩｇＤ、ＩｇＥ抗体型及びアイソタイプが生成され得る、異なる重鎖の置換によって、所与の組のＣＤＲに関して可能である。同様に、本発明の範囲内の人工抗体は、完全に合成物質の骨格内に所与の組のＣＤＲを埋め込むことにより、生成することができる。機能的同等物は、当分野で既知の多岐にわたる方法を使用して、特定の組のＣＤＲに隣接する可変領域配列及び／または不変領域配列内での変異、欠失、及び／または挿入により容易に生成することができる。ＣＤＲは、エピトープ認識及び抗体結合に最も重要である。しかしながら、変更が、抗体がその同族のエピトープを認識し結合する能力を妨げずに、ＣＤＲを含む残基に加えられてもよい。例えば、エピトープ認識に影響を与えないが、エピトープに対する抗体の結合親和性を上昇させる変更が、加えられてもよい。したがって、好ましくは上昇した親和性を有する前述のものの改良版が、本発明の範囲内に含まれる。いくつかの研究が、一次抗体配列の知識に基づいて、結合及び発現のレベル等のその特性への、抗体の配列における様々な位置に１つ以上のアミノ酸変更を導入することの影響を調査している（Ｙａｎｇ，Ｗ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２５４：３９２−４０３、Ｒａｄｅｒ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５：８９１０−８９１５、Ｖａｕｇｈａｎ，Ｔ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１６：５３５−５３９）。これらの研究で、一次抗体の同等物が、オリゴヌクレオチド媒介部位特異的変異誘発、カセット変異誘発、エラープローンＰＣＲ、ＤＮＡシャッフリング、または大腸菌の突然変異誘発株等の方法を使用して、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、または骨格領域内の重鎖及び軽鎖遺伝子の配列を変更することにより、生成されている（Ｖａｕｇｈａｎ，Ｔ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１６：５３５−５３９、Ａｄｅｙ，Ｎ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｃｈａｐｔｅｒ  １６，ｐｐ．２７７−２９１，“Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”，Ｅｄｓ．内Ｋａｙ，Ｂ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）。一次抗体の配列変更のこれらの方法は、抗体の改善された親和性をもたらしている（Ｇｒａｍ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：３５７６−３５８０、Ｂｏｄｅｒ，Ｅ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７：１０７０１−１０７０５、Ｄａｖｉｅｓ，Ｊ．ａｎｄ  Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，Ｌ，１９９６，Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｇｙ，２：１６９−１７９、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２５６：７７−８８、Ｓｈｏｒｔ，Ｍ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２��７：１６３６５−１６３７０、Ｆｕｒｕｋａｗａ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６：２７６２２−２７６２８）。
【０１２７】
一実施形態において、そのようなアミノ酸置換は、（１）タンパク質分解に対する感受性を低減し、（２）酸化に対する感受性を低減し、（３）タンパク質複合体を形成するための結合親和性を変化させ、（４）そのような抗体の他の物理化学的特性または機能的特性を付与または変更するものである。そのような機能的同等物には、天然型ペプチド配列からの配列の様々な突然変異体が含まれ得る。例えば、単一または複数のアミノ酸置換（好ましくは、保存的アミノ酸置換）が、天然型配列内で（好ましくは、分子間接触を形成する領域（複数可）外のポリペプチドの部分内で）行なわれてもよい。保存的アミノ酸置換は、親配列の構造的特性を実質的に変えるべきではない（例えば、置換アミノ酸は、親配列内に生じる螺旋を破壊するか、または親配列を特徴づける他の種類の二次構造を崩壊させる傾向があるべきではない）。当分野で認められているポリペプチド二次構造及び三次構造の例は、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８４））、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｃ．Ｂｒａｎｄｅｎ  ａｎｄ  Ｊ．Ｔｏｏｚｅ，ｅｄｓ．，Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９９１））、ａｎｄ  Ｔｈｏｒｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｎａｔｕｒｅ，３５４：１０５に記載され、これらは各々、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１２８】
さらに、前述の抗体のうちのいずれかは、１個以上の非古典的アミノ酸を含むように改良されてもよい。一実施形態において、非古典的アミノ酸は、（例えば、そのような教示のために参照に組み込まれるＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２００９  Ｄｅｃ  ２２；４８（５０）：１２０４７−５７に記載される）セレノシステイン残基である。一実施形態において、非古典的アミノ酸は、抗原／エピトープ結合との干渉を最小化するために、抗体のＣ末端に配置される。
【０１２９】
特定の実施形態において、認識部分は、抗体である。さらなる特定の実施形態において、認識部分は、一本鎖の抗体である。ヒト疾患の予防、診断、及び治療における抗体、具体的にはモノクローナル抗体及びＳＣ抗体の使用は、増加している。２０個超のモノクローナル抗体が、食品医薬品局によって承認されており、さらに多くが、臨床開発の様々な段階にある。さらに、ＡＤＣは、抗体構成成分の特異性、及び化学的構成成分／作用剤、例えば、小分子または作用剤含有ポリマーの作用を活用するためにも、研究されている。例えば、抗体分子が特異性及び親和性を提供する一方で、小分子は、撮像能力または細胞毒性を提供する。
【０１３０】
一実施形態において、認識部分は、抗体が一本鎖の抗体か他の形態かにかかわらず、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体（ＲＯＲ）に結合する（Ｆｒｏｎｔ．Ｏｎｃｏｌ．，１８  Ａｐｒｉｌ  ２０１２｜ｄｏｉ：１０．３３８９／ｆｏｎｃ．２０１２．０００３４で再考察されている）。受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）は、分化、移動、増殖、及び生存等の通常の細胞プロセスの重要な制御因子として知られているが、受容体チロシンキナーゼは、多くの種類のヒト癌の成長及び進行における決定的役割も有する。その結果、ＲＴＫ及びこれらのリガンドは、癌の治療介入の魅力的な分子標的となっている。これらの受容体は、通常、発生の間に高レベルで発現し、骨格及び神経系器官形成において重要な役割を果たすが、次いで、成体組織では、抑圧されるようになる。ＲＴＫのＲＯＲファミリーは、２つの進化的に保存されたタンパク質、ＲＯＲ１及びＲＯＲ２からなり、遺伝子発現プロファイリングは、ＲＯＲ１及びＲＯＲ２を様々な癌において過剰発現するシグネチャー遺伝子のうちの１つと識別した。例えば、ＲＯＲ１は、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病、Ｂ細胞急性リンパ球性白血病、及び外套細胞白血病を含む様々な造血器癌で過剰発現することが見出されている一方で、ＲＯＲ２は、様々な肉腫及び癌腫で過剰発現することが見出されている。
【０１３１】
ＲＯＲ２は、正常な骨及び軟骨発達の過程において、Ｗｎｔ５Ａ糖タンパク質とのＲＯＲ２の関係による非標準のＷｎｔ信号を送ることによって活性化される膜結合型ＲＴＫである。ＲＯＲ２発現は、哺乳動物における口蓋発達の間の細胞の移動を媒介するために必要であり、ＲＯＲ２遺伝子における変異は、短指症Ｂ型及び常染色体劣性ルビノー症候群等の疾患を引き起こすことが示されている。ＲＯＲ２は、ある特定の細胞株において腫瘍形成促進性（ｐｒｏ−ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃ）の効果があることが報告されている。ＲＯＲ２は、様々な肉腫及び癌腫において、過剰発現することが見出されている。
【０１３２】
癌腫は、最も一般的な種類のヒト癌であり、上皮細胞の細胞学的外観、組織学的構築、または細胞特性を発症した細胞から発生する。癌腫は、完全に異種の実体であり、様々な発癌プロモーターの多岐にわたる強度及び能力を反映する。亜型としては、腺癌、扁平上皮細胞癌、未分化癌、大細胞癌腫及び小細胞癌腫、ならびにこれらの混合物が挙げられる。癌腫は、例えば、肺癌、胸部の腺管癌、前立腺の腺癌、結腸及び直腸の腺癌または扁平上皮細胞癌等の癌腫が起こる部位によっても分類される。肉腫は、間葉細胞から生じ、全ヒト悪性腫瘍のおおよそ１％を占める６０個を超える腫瘍型の異種群である。大部分の肉腫が、局所的侵攻性の増殖及び転移の傾向を示す。
【０１３３】
セレノシステイン複合化
化合物に抗体を結合させるいくつかの従来の方法が知られている。例えば、リジン（Ｌｙｓ）残基のε−アミノ基またはシステイン（Ｃｙｓ）残基のチオール基が、作用剤上で適切な置換基を用いた複合反応で使用されてもよい。しかしながら、これらの手法を使用して生成されたＡＤＣは、単一の種の分子ではなく、むしろ抗体／作用剤化学量論の範囲及び結合点を有する分子の混合物である。さらに、生成されたＡＤＣは、実質的なバッチ間の変動を特徴とする。複合化のそのようなランダムパターンは、多くの場合、抗原／抗体結合反応を損ない得る。抗体への化学的構成成分／作用剤の部位特異的複合化は、定義された化学量論、低減したバッチ変動、及び抗原／抗体結合反応を保護する能力を提供する。部位特異的複合化の目標は、抗体分子の構造及び／または機能に著しく影響を与えることなく、抗体内へ固有の化学反応性を導入することである。
【０１３４】
セレノシステイン型は、近年、抗体と化学的構成成分との間に操作された界面を提供することによって抗体への化学的構成成分の部位特異的複合化を提供するために、使用されている。セレノシステインは、所望の場所への化学的構成成分の標的を定めた配置を提供し、１：１化学量論を提供する。このプロセスは、Ｈｏｆｅｒ及びその同僚によって説明されている（ＰＮＡＳ，１０５（３４），１２４５１−１２４５６，２００８；Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４８（５０），１２０４７−１２０５７，２００９、前述のものの各々は、そのような教示のために参照により本明細書に組み込まれる）。セレノシステイン界面技術は、抗体または抗体断片の生物学的特性に影響を与えずに、抗体分子全部及び抗体断片の両方と一緒に使用されている。他の部位特異的抗体複合化法と比較して、セレノシステイン界面法は、（ａ）例えば、Ｃ末端の抗体構造の若干の改良を伴い、これは、構造または機能を妨げず、（ｂ）単純かつ効果的なカップリング化学を利用し、（ｃ）抗体及び化学的構成成分の１：１化学量論をもたらす。
【０１３５】
作用剤
作用剤は、疾患もしくは病態の治療、または疾患もしくは病態の診断に有用な任意の作用剤でもよい。ある特定の実施形態において、作用剤は、診断剤または治療剤である。ある特定の実施形態において、治療剤は、有機小分子である。さらに、作用剤は、治療または診断用途を有する任意の分子でもよく、作用剤は、限定されないが、ＰＯＺポリマー等の本開示のポリマー上の官能基、または本開示のポリマーに連結する連結基と連結を形成し得る。
【０１３６】
本開示を用いて使用するための作用剤には、既知の任意の作用剤が含まれ得る。一実施形態において、本作用剤は、癌を治療するのに有用である。一実施形態において、本作用剤は、細胞毒性剤である。一実施形態において、本作用剤は、微小管阻害剤、ＤＮＡ損傷剤、またはポリメラーゼＩＩ阻害剤である。微小管阻害剤は、チューブリンを結合させ、微小管を不安定化させ、Ｇ２／Ｍ期細胞周期を止めさせる。オーリスタチン及びマイタンシノイドは、微小管阻害剤の２つのクラスである。ＤＮＡ損傷剤には、アントラサイクリン、カリケアマイシン、デュオカルマイシン、及びピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）が含まれる。これらの薬物の全ては、ＤＮＡの副溝を結合し、ＤＮＡ台切断、アルキル化、または架橋を引き起こすことによって機能する。
【０１３７】
本開示の複合体中で有用な作用剤のクラスには、（限定されないが、モノメチルオーリスタチンＥ、モノメチルオーリスタチンＦ、デスメチル−オーリスタチンＦ等の）オーリスタチン、（限定されないが、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、バルルビシン、及びミトキサントロン等の）アントラサイクリン、（限定されないが、カリケアマイシン及びＮ−アセチル−γカリケアマイシン１，２−ジメチルヒドラジンジクロリド等の）カリケアマイシン、（限定されないが、ＤＭ１、ＤＭ４、及びアンソミトシン（ａｎｓｏｍｉｔｏｃｉｎ）等の）マイタンシノイド、（限定されないが、アビーマイシン（ａｂｂｅｙｍｙｃｉｎ）、チカマイシン、ＤＣ−８１、マゼスラマイシン、ネオトラマイシンＡ及びＢ、ポロスラマイシンプロトラカルシン、シバノマイシン（ＤＣ−１０２）シビロマイシン、ならびにトママイシン等の）ピロロベンゾジアゼピン、（限定されないが、ＳＪＧ−１３６、ＳＧ２２８５、ＤＲＧ−１６、及びＥＬＢ−２１等の）ピロロベンゾジアゼピンの二量体、（限定されないが、コルヒチン、デアセチルコルヒチン等の）コルヒチン、（限定されないが、ドルスタチン１０、１５、及び１６等の）ドラスタチン、（限定されないが、チューブリシン、Ａ、Ｂ、Ｄ、及びＭ等の）チューブリシン類、マイタンシノール、（限定されないが、デュオカルマイシンＡ、Ｂ１、Ｂ２、Ｃ１、Ｃ２、Ｄ、ＳＡ、及びＣＣ−１０６５、ならびにアドゼレシン、ビゼレシン、及びカルゼルシン等の）デュオカルマイシン、ネモルビシン及び他のドキソルビシン類似体、ならびに（限定されないが、クリプトフィシン１、８、２４、５２、５５、２９６及び３０９等の）クリプトフィシン、（限定されないが、エピチロンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、ＢＭＳ２４７５５０、及びＢＭＳ３１０７０５等の）エピチロン、ならびに（限定されないが、サフラシンＡ及びＢ等の）サフラシンが含まれるが、これらに限定されない。前述のものの誘導体及び類似体もまた、本開示の範囲内に含まれる。
【０１３８】
薬学的組成物
ポリマーＡＤＣを含む本開示のポリマー複合体は、ヒト用途及び獣医用途の両方のために製剤化することができ、ポリマーＡＤＣ及び薬学的に許容される担体を含んでもよい。一般に、薬学的組成物は、限定されないが、滅菌水、生理的食塩水、緩衝食塩水、またはデキストロース溶液を含む、滅菌した生体適合性担体等の１種以上の不活性作用剤に加えて、本開示のポリマーＡＤＣを含む。薬学的組成物は、単独で、または他の化学療法化合物、ホルモン、ワクチン、及び／もしくは放射線治療を含む他の治療レジメンと組み合わせて、のいずれかで投与されてもよい。「と組み合わせて」は、追加のレジメンが一緒に送達するために同時に投与されなければならないか、または配合されなければならないことを意味しないが、送達のこれらの方法は、本発明の範囲内である。一般に、各々は、投与量で、かつそのレジメンのために決定された時間スケジュールで投与される。さらに、本発明は、生物学的利用能を改善し得るか、新陳代謝を低減もしくは変更し得るか、排泄を抑制し得るか、または体内での分配を変更し得る作用剤と組み合わせた、本開示のポリマーＡＤＣの送達を包含する。あるいは、または加えて、本開示のポリマーＡＤＣは、治療される疾患もしくは障害の症状もしくは原因、または患者が患う任意の他の病気の症状もしくは原因に対処する１つ以上の他の化合物と一緒に投与されてもよい。本発明の薬学的組成物は、治療を必要とするあらゆる対象（例えば、あらゆる動物）の治療のために使用することができるが、本発明の薬学的組成物は、最も好ましくは、ヒトの治療で使用される。
【０１３９】
本発明の薬学的組成物は、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、皮下、脳室内、経皮、直腸内、膣内、腹腔内、（粉末、軟膏、もしくは滴薬による）局所的、口腔を含む様々な経路により、または経口もしくは経鼻の噴霧剤もしくはエアロゾル剤として、ヒト及び他の動物に投与することができる。一般に、投与の最も適切な経路は、化合物の性質（例えば、消化管の環境内でのその安定性）、患者の状態（例えば、患者が経口投与に耐えることができるかどうか）を含む様々な要因に左右される。現在、静脈内経路が、本開示のポリマーＡＤＣを送達するために最も一般的に使用される。しかしながら、本開示は、薬物送達の科学において起こり得る進歩を考慮した、任意の適切な経路による本開示ポリマーＡＤＣの送達を含む。
【０１４０】
治療の方法
ある特定の実施形態において、本開示のポリマー複合体は、癌細胞または腫瘤等の特定の細胞または組織を標的としてもよい。この実施形態の一態様において、ポリマーＡＤＣが、ポリマーに結合した抗体によって結合され得る（限定されないが、細胞表面受容体等の）抗原を発現する特定の細胞または組織を標的にするために使用することができる。
【０１４１】
一実施形態において、病態または病状を治療する方法が開示される。そのような方法は、標的細胞上の選択された抗原と結合し、細胞に作用剤を送達する、対象へのある量の本開示の（ポリマーＡＤＣ複合体を含む）ポリマー複合体を対象に投与するステップを含む。一実施形態において、作用剤は、細胞毒性剤である。一実施形態において、本作用剤は、微小管阻害剤、ＤＮＡ損傷剤、またはポリメラーゼＩＩ阻害剤である。
【０１４２】
本開示のポリマー複合体上の抗体によって認識される抗原を発現する細胞の成長を抑制するための方法が、提供される。そのような方法は、標的細胞上の選択された抗原と結合し、細胞に作用剤を送達する、対象へのある量の本開示の（ポリマーＡＤＣ複合体を含む）ポリマー複合体を対象に投与するステップを含む。一実施形態において、作用剤は、細胞毒性剤である。一実施形態において、本作用剤は、微小管阻害剤、ＤＮＡ損傷剤、またはポリメラーゼＩＩ阻害剤である。選択された細胞集団の成長を抑制するための方法は、試験管内、生体内、または生体外で実施され得る。本明細書において使用する場合、「成長を抑制する」は、短期間にわたってか、または長期間にわたってかにかかわらず、細胞の成長を遅くすること、細胞生存率を減少させること、細胞の死を引き起こすこと、細胞を溶解し、細胞の死を誘発すること、を意味する。
【０１４３】
結果として、本開示は、薬剤として説明される抗ポリマーＡＤＣ複合体の使用を含む。
【０１４４】
記載される方法において、ポリマー複合体は、本明細書に記載されるように、単独で、または薬学的組成物の一部として投与されてもよい。一実施形態において、対象は、そのような治療の必要があると判定される。さらなる実施形態において、ポリマー複合体は、治療有効量で投与される。本明細書に開示される方法において、対象は哺乳動物であり得る。ある特定の実施形態において、対象はヒトである。
【０１４５】
一実施形態において、病態は癌である。本開示のポリマーＡＤＣは、（限定されないが）扁平上皮細胞癌；白血病、急性リンパ球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫を含むリンパ系の造血器腫瘍；急性ならびに慢性骨髄性白血病及び前骨髄球性白血病を含む骨髄細胞系の造血器腫瘍；線維肉腫及び横紋筋肉腫を含む間葉由来の腫瘍；黒色腫、精上皮腫、奇形癌、神経芽細胞腫、及び神経膠腫を含む他の腫瘍；星状細胞腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、及び神経鞘腫を含む中枢神経系及び末梢神経系の腫瘍；線維肉腫、横紋筋肉腫、及び骨肉腫を含む間葉由来の腫瘍；ならびに黒色腫、色素性乾皮症、角化棘細胞腫、精上皮腫、濾胞性甲状腺癌、及び奇形癌を含む他の腫瘍を含む、膀胱、胸部、結腸、腎臓、肝臓、肺、卵巣、膵臓、胃、子宮頸部、甲状腺、及び皮膚の癌腫を含む癌腫を含む様々な癌の治療または予防に有用である。治療される癌の性質は、ポリマー複合体と結合する抗体の性質によって決定され得る。
【０１４６】
ＲＯＲ１及び／またはＲＯＲ２陽性細胞の成長を抑制することを必要とする患者に、ＲＯＲ１及び／またはＲＯＲ２と結合し、ＲＯＲ１及び／またはＲＯＲ２陽性細胞に作用剤を送達する本開示のポリマーＡＤＣを投与することによって、ＲＯＲ１及び／またはＲＯＲ２陽性細胞の成長を抑制するための方法が提供される。一実施形態において、作用剤は、細胞毒性剤である。選択された細胞集団の成長を抑制するための方法は、試験管内、生体内、または生体外で実施され得る。本明細書において使用する場合、「成長を抑制する」は、短期間にわたってか、または長期間にわたってかにかかわらず、細胞の成長を遅くすること、細胞生存率を減少させること、細胞の死を引き起こすこと、細胞を溶解し、細胞の死を誘発すること、を意味する。結果として、本開示は、薬剤として説明される抗ポリマーＡＤＣ複合体の使用を含む。
【０１４７】
臨床治療の生体内での使用に関して、ポリマー複合体は、滅菌状態及び内毒素レベルの試験済み溶液として供給される。本開示のポリマー複合体の投与の好適なプロトコルの例は、任意の好適な経路によって、毎日、週２回、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間以上で週１回である。投与の経路、賦形剤、希釈剤、投与量、時間等に関する特定の臨床プロトコル臨床プロトコルは、臨床的状況が正当な根拠を与えるとき、当業者のうちの１人によって決定され得る。
【０１４８】
キット
本開示は、本開示のポリマー複合体、包装材料、及び対象に疾患または病態、限定されないがそのような癌の治療のために前述のものを投与するための使用説明書から本質的になるか、またはこれらからなる、含むキットを提供する。
【実施例】
【０１４９】
材料の調製
本開示の教示を例示するために、ポリオキサゾリン−ＡＤＣ複合体の調製を提供し、これらの複合体の生物活性を説明する。使用される略称は、以下のとおりである。ＤＣ、デアセチルコルヒチン；ＭＭＡＥ、オーリスタチン；ＰＯＺ、プロピオン酸で停止したポリオキサゾリン；ＶＣ、バリン−シトリン；Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、フェニルアラニン及びリジン；ＰＡＢ、ｐ−アミノベンジルアルコール；ＤＣＭ、ジクロロメタン；ＴＥＡ、トリメチルアミン；ＤＭＡＰ、ジメチルアミノピリジン；ＤＩＰＥＡ、ジイソプロピルエチルアミン；ＡＣＮ、アセトニトリル；ＮＰＣ、ニトロフェニルカーボネート、ＰＥＧ、ポリエチレングリコール；Ｎ３、アジドまたはアジド。
【０１５０】
材料
コルヒチンは、Ｓｉｇｍａから購入した。ジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカーボネート、４−（ジメチルアミノ）ピリジン（ＤＭＡＰ）、トリエチルアミン（ＴＥＡ）、メタノール中の０．５Ｎのナトリウムメトキシド、トリフルロ酢酸（ｔｒｉｆｌｕｒｏａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）（ＴＦＡ）、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、Ｎ−Ｂｏｃ−エチレンジアミン（Ｂｏｃ−ＥＤＡ）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）、Ｆｍｏｃクロリド（Ｆｍｏｃ−Ｃｌ）、Ｎ−（２−アミノエチル）マレイミドＴＦＡ塩、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（ＨＯＢＴ）、ヨウ化銅（Ｉ）、及びピペリジンは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。Ｎ３−ＰＥＧ４−ＶＣ−ＰＡＢ−ＰＮＰ、Ｎ３−ＰＥＧ４−ＶＣ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ、及びＮ３−ＰＥＧ４−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（Ｔｒｔ）−ＰＡＢ−ＮＰＣは、Ｃｏｎｃｏｒｔｉｓから購入した。ジエチルエーテル、ジクロロメタン（ＤＣＭ）、及びアセトニトリル（ＡＣＮ）は、ＥＭＤから購入した。ビオチン−ＰＥＧ３−アジドは、Ｃｈｅｍｐｅｐから購入した。Ｌ（＋）−アスコルビン酸ナトリウム塩及び硫酸銅５水和物（ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ）は、Ｆｌｕｋａから購入した。Ｄｏｗｅｘ（登録商標）Ｍ４１９５は、Ｓｕｐｅｌｃｏから購入した。ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、テトラヒドラフラン（ＴＨＦ）、ジクロロメタン（ＤＣＭ）、アセトニトリル（ＡＣＮ）、無水硫酸ナトリウム、無水硫酸マグネシウム、及びシリカゲル６０（７０−２３０メッシュ）は、ＥＭＤから購入した。スクシンイミジルヨードアセテートは、ＣｏｖａＣｈｅｍから購入した。ビオチン−ＰＥＧ３−アジドは、Ｃｈｅｍｐｅｐから購入した。
【０１５１】
実施例１．
ＰＯＺ  １０ｐマレイミド５Ｋの調製
１０個のペンダントアルキン基を有し、カルボン酸（ＰＯＺ  １０ｐ酸５Ｋ）で停止したＭＷ５，０００のＰＯＺを、米国特許第８，１１０，６５１号及び同第８，１０１，７０６号に記載される手順に従って合成した（これらの各々は、そのような教示のために参照により本明細書に組み込まれる）。ＰＯＺ  １０ｐ酸５Ｋは、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ）質量分析（ＭＳ）によって決定した、５，５００ｇ／ｍｏｌのＭｎ及び１．０１のＰＤＩを有した。ＡＫＴＡクロマトグラフィー（ＤＥＡＥカラム）によるポリマーの末端基分析は、ポリマーが９９．８％の酸末端基を有したことを示した。１Ｈ  ＮＭＲスペクトルは、その構造に準拠し、ポリマー中の２−ペンチニル−２−オキサゾリン及び２−エチル−２−オキサゾリン単位の比率は、１０：４０であったことを示した。
【化１９】
0006704900.tif 000025
【０１５２】
スクシンイミジル誘導体として活性化されたＰＯＺ酸（ＰＯＺ  １０ｐ  ＳＰＡ  ５Ｋ）を、米国特許第７，９４３，１４１号に記載される手順に従って合成した。１Ｈ  ＮＭＲスペクトルは、その構造に準拠し、スクシンイミジルエステルへの酸基の定量的変換を示した。
【化２０】
0006704900.tif 000026
【０１５３】
Ｎ−（２−アミノエチル）マレイミドトリフルオロアセテート塩（０．０７９４ｇ、３．１２５×１０−４ｍｏｌ、１．２５当量）を、２５ｍＬ丸底フラスコ内で、１５ｍＬのジクロロメタンに溶解した。０．０８７１ｍＬのトリエチルアミン（０．０６３２ｇ、６．２５×１０−４ｍｏｌ、２．５当量）を、フラスコ内へ添加した。次いで、１．３７５ｇのＰＯＺ  １０ｐ  ＳＰＡ  ５Ｋ（２．５×１０−４ｍｏｌ、１当量）をフラスコ内へ添加し、アルゴン下で２０時間、室温で溶液を撹拌した。この時間の最後に、溶液を乾燥状態まで回転蒸発させた。残基を１００ｍＬの脱イオン水、１０重量％の塩化ナトリウムに溶解し、ジクロロメタン（３×２５ｍＬ）中に抽出した。ジクロロメタン相を分離し、２５ｍＬの１０重量％の塩化ナトリウム溶液で洗浄した。ジクロロメタン相を再び分離し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、１５ｍＬに濃縮し、２２５ｍＬのジエチルエーテル中で析出させた。ポリマーを、ガラス焼結フリットをとおして濾過し、高真空下で一晩乾燥させ、１．００ｇの生成物を得た（収率：７２％）。１Ｈ  ＮＭＲ（Ｖａｒｉａｎ、１０ｍｇ／ｍＬのＣＤＣｌ３、δ）は、１．１２ｐｐｍ（ｓ、３Ｈ、ＣＨ３ＣＨ２ＣＯ−）、２．３１ｐｐｍ（小さいｓ）及び２．４１ｐｐｍ（大きいｓ）（総面積２Ｈ、ＣＨ３ＣＨ２ＣＯ−）、ならびに３．４７ｐｐｍ（ｓ、４Ｈ、−ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−）で通常の骨格ピークを示した。ペンダント基のピークは、１．８４ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＣ≡Ｈ）、及び２．００ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＣ≡Ｈ）で出現した。末端−ＣＨ２ＳＣＨ２ＣＨ２ＣＯＮＨ−のピークは、２．７０〜２．８２ｐｐｍで出現した。マレイミドの窒素に結合した−ＣＨ２基及びマレイミドの−ＣＨ基は、それぞれ３．６８ｐｐｍ及び６．７２ｐｐｍで出現した。ポリマー中の２−ペンチニル−２−オキサゾリン及び２−エチル−２−オキサゾリン単位の比率は、１０．２：４０であった。ＰＯＺ  １０ｐマレイミド５Ｋは、ＭＡＬＤＩからの６，４００ｇ／ｍｏｌのＭｎ及び１．０２のＰＤＩを有した。
【０１５４】
ＰＯＺ  ２ｐマレイミド５Ｋの調製
ＰＯＺ  ２ｐ酸５Ｋを、米国特許第８，１１０，６５１号及び同第８，１０１，７０６号に記載される手順に従って合成した。ＰＯＺ  ２ｐ酸５Ｋは、ＭＡＬＤＩからの５，２００ｇ／ｍｏｌのＭｎ及び１．０２のＰＤＩを有した。ＡＫＴＡ（ＤＥＡＥカラム）によるポリマーの末端基分析は、ポリマーが９８．６％の酸末端基を有したことを示した。１Ｈ  ＮＭＲは、ポリマー中の２−ペンチニル−２−オキサゾリン及び２−エチル−２−オキサゾリン単位の比率は、１．９：４８であったことを示した。
【化２１】
0006704900.tif 000027
【０１５５】
ＰＯＺ  ２ｐ  ＳＰＡ  ５Ｋを、米国特許第７，９４３，１４１号に記載される手順に従って合成した。１Ｈ  ＮＭＲスペクトルは、その構造に準拠し、ＮＨＳエステルへの酸基の定量的変換を示した。
【化２２】
0006704900.tif 000028
【０１５６】
０．３１ｇのＮ−（２−アミノエチル）マレイミドトリフルオロアセテート塩（１．２×１０−３ｍｏｌ、１．２５当量）を、１００ｍＬ丸底フラスコ内で、５０ｍＬのジクロロメタンに溶解した。トリエチルアミン（０．２４ｇ、２．４×１０−３ｍｏｌ、２．５当量）を、フラスコ内へ添加した。次いで、ＰＯＺ  ２ｐ  ＳＰＡ  ５Ｋ（５．０ｇ、９．６×１０−４ｍｏｌ、１当量）を、フラスコ内へ添加した。溶液をアルゴン下で２４時間、室温で撹拌した。溶液を、１０重量％のＮａＣｌ（０．１ＮのＨＣｌ）溶液（３×５０ｍＬ）で洗浄した。ジクロロメタン相を分離し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、５０ｍＬに濃縮し、７５０ｍＬのジエチルエーテル中で析出させた。ポリマーを、ガラス焼結フリットをとおして濾過し、高真空下で一晩乾燥させ、４．５３ｇの生成物を得た（収率：９０％）。１Ｈ  ＮＭＲ（Ｖａｒｉａｎ、１０ｍｇ／ｍＬのＣＤＣｌ３、δ）は、１．１３ｐｐｍ（ｓ、３Ｈ、ＣＨ３ＣＨ２ＣＯ−）、２．２９ｐｐｍ（小さいｓ）及び２．４１ｐｐｍ（大きいｓ）（総面積２Ｈ、ＣＨ３ＣＨ２ＣＯ−）、ならびに３．４７ｐｐｍ（ｓ、４Ｈ、−ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−）で通常の骨格ピークを示した。ペンダント基のピークは、１．８４ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＣ≡Ｈ）、及び２．００ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＣ≡Ｈ）で出現した。末端−ＣＨ２ＳＣＨ２ＣＨ２ＣＯＮＨ−ピークは、２．６８〜２．８２ｐｐｍで出現した。マレイミドの窒素に結合した−ＣＨ２基及びマレイミドの−ＣＨ基は、それぞれ３．６７ｐｐｍ及び６．７２ｐｐｍで出現した。ポリマー中の２−ペンチニル−２−オキサゾリン及び２−エチル−２−オキサゾリン単位の比率は、１．９：４８であった。ＰＯＺ  ２ｐマレイミド５Ｋは、ＭＡＬＤＩからの４，８５０ｇ／ｍｏｌのＭｎ及び１．０２のＰＤＩを有した。
【０１５７】
実施例２．ペンダントペンチン基を用いたＰＯＺへのアジド毒素のカップリング
この反応は、米国特許第８，１０１，７０６号に記載されるように実施され、これは、そのような教示のために参照により本明細書に組み込まれる。
【０１５８】
実施例３．デアセチルコルヒチンＴＦＡ（３）の合成
【化２３】
0006704900.tif 000029
【０１５９】
ステップ１．Ｎ−Ｂｏｃ−コルヒチン（１）の合成
デアセチルコルヒチン（ＤＣ）を、Ｌ．Ｌｅｂｅａｉｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｙｎ．Ｃｏｍｍ．，２７（２），２９３−２９６（１９９７）に従って合成した。アセトニトリル（ＡＣＮ）（２０ｍＬ）中のコルヒチン（２．００ｇｍ、４．７６ｍｍｏｌ）の溶液を、乾燥状態まで蒸発させた。次いで、ＡＣＮ（２０ｍＬ）をこの固形物に添加した。トリエチルアミン（ＴＥＡ）（０．７４ｍＬ、５．３４ｍｍｏｌ）及びジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）（０．６５ｇｍ、５．３３ｍｍｏｌ）を、溶液に添加し、続いて、ジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカーボネート（６．２３ｍＬ、２７．１ｍｍｏｌ）を添加した。溶液を、アルゴン雰囲気下で一晩、８０℃で撹拌させた。室温に冷ました後、溶液を、回転蒸発装置上で乾燥状態まで蒸発させた。粗残留物をエチルアセテートに溶解し、移動相としてエチルアセテートを使用して、Ｂｉｏｔａｇｅ  Ｉｓｏｌｅｒａシステム上でシリカゲルクロマトグラフィーによって精製した。生成物画分を回転蒸発装置上で乾燥状態まで蒸発させ、１．４７ｇｍの固形物を得た（１．収率：５９％）。ＨＰＬＣにより、純度は、９９％超であった。ＣＤＣｌ３中の化合物１の１Ｈ−ＮＭＲ：７．５７３ｐｐｍ、ｓ、１Ｈ；７．１９８ｐｐｍ、ｄ、１Ｈ；６．７５８ｐｐｍ、ｄ、１Ｈ；６．５２４ｐｐｍ、ｓ、１Ｈ；５．１３９ｐｐｍ、ｍ、１Ｈ；３．９６６ｐｐｍ、ｓ、３Ｈ；３．９３０ｐｐｍ、ｓ、３Ｈ；３．８９４ｐｐｍ、ｍ、３Ｈ；３．６５７ｐｐｍ、ｓ、３Ｈ；２．４９７〜２．６７２ｐｐｍ、ｍ、３Ｈ；２．２７７ｐｐｍ、ｓ、３Ｈ；１．９６１ｐｐｍ、ｍ、１Ｈ；１．５５８ｐｐｍ、ｓ、９Ｈ。
【０１６０】
ステップ２．Ｎ−Ｂｏｃ−デアセチルコルヒチン（２）及びデアセチルコルヒチン・ＴＦＡ（３）の合成
Ｎ−Ｂｏｃ−コルヒチン（１、１．４７ｇｍ、２．９４ｍｍｏｌ）をメタノール（３５ｍＬ）に溶解し、これを、アルゴン雰囲気下で０℃に冷却させた。撹拌している溶液に、メタノール中の０．５Ｎのナトリウムメトキシド（２３．６ｍＬ、１１．７８ｍｍｏｌ）を滴加した。溶液を、０℃で撹拌させた。６５分の反応の後に、ＮＨ４Ｃｌ（０．６３ｇｍ、１１．７８ｍｍｏｌ）を、反応混合物を中和するために０℃で添加した。５分の撹拌の後に、明澄な溶液を、回転蒸発装置上で乾燥状態まで蒸発させた。残留物をＤＣＭ（３０ｍＬ）と一緒に撹拌し、次いで濾過して、固形の塩を除去した。塩をさらなるＤＣＭ（１０ｍＬ）ですすぎ、同じ濾液内へと濾過した。ＤＣＭ中の粗Ｎ−Ｂｏｃ−デアセチルコルヒチン（２）のこの濾液に、ＴＦＡ（４ｍＬ）を添加した。溶液を、アルゴン下で、室温で撹拌させた。２．５時間の反応の後に、トルエン（３５ｍＬ）を反応混合物に添加し、続いて、乾燥状態まで乾燥させた（０トルへの勾配）。粗残留物をＤＣＭ（１０ｍＬ）に溶解し、移動相としてＤＣＭ−メタノール（９：１ｖ／ｖ）を使用して、Ｂｉｏｔａｇｅ上のシリカゲルカラム上で精製した。溶出を２４７ｎｍで監視した。画分（ＴＬＣによりＲｆ＝０．３４）を含有する生成物を、回転蒸発により乾燥状態近くまで蒸発させ、真空で一晩さらに乾燥させ、１．２ｇｍの黄色い固形物を得た（３、収率：８７％）。ＨＰＬＣにより、純度は、９９％超であった。ＤＭＳＯ−ｄ６中の３の１Ｈ−ＮＭＲ：８．４４７ｐｐｍ、ｓ、３Ｈ；７．１０５〜７．１８９ｐｐｍ、ｍ、３Ｈ；６．８２３ｐｐｍ、ｓ、１Ｈ；３．９１０ｐｐｍ、ｓ、３Ｈ；３．８４４ｐｐｍ、ｓ、３Ｈ；３．８１３ｐｐｍ、ｍ、１Ｈ；３．７８０ｐｐｍ、ｓ、３Ｈ；２．６５５ｐｐｍ、ｍ、１Ｈ；２．２６７ｐｐｍ、ｍ、２Ｈ；１．９２９ｐｐｍ、ｍ、１Ｈ。
【０１６１】
実施例４．Ｎ−（Ｎ３−ＰＥＧ４−ＶＣ−ＰＡＢＣ）−デアセチルコルヒチン（４）の合成
【化２４】
0006704900.tif 000030
【０１６２】
デアセチルコルヒチンＴＦＡ（３、０．３０ｇｍ、０．６４ｍｍｏｌ）を無水ＤＣＭ（２０ｍＬ）に溶解し、アルゴン雰囲気下で撹拌した。黄色い溶液にＮ３−ＰＥＧ４−ＶＣ−ＰＡＢ−ＰＮＰ（０．６６ｇｍ、０．７６ｍｍｏｌ）を添加し、続いて、ＴＥＡ（０．２７ｍＬ、１．９１ｍｍｏｌ）、ＡＣＮ（５ｍＬ）、及びＤＭＦ（５ｍＬ）を添加した。次いで、ＤＩＰＥＡ（０．４４ｍＬ、２．５５ｍｍｏｌ）を反応混合物に添加した。２日の反応の後に、反応混合物の逆相ＨＰＬＣ分析は、９７％の転化を示した。反応混合物を、真空下で、３７℃で乾燥状態まで蒸発させた。粗残留物をエチルアセテート−メタノール（１０ｍＬ、１０：１ｖ／ｖ）に溶解し、移動相Ａとしてエチルアセテートを、及び移動相Ｂとしてメタノールを使用して、Ｂｉｏｔａｇｅ上のシリカゲルカラムによって精製した。溶出を２４７ｎｍで監視した。生成物含有画分を回転蒸発により乾燥状態近くまで蒸発させ、真空で一晩さらに乾燥させ、０．５６ｇｍの黄色い固形物を得た（４、収率：８４％）。ＤＭＳＯ−ｄ６中の化合物４の１Ｈ−ＮＭＲ：９．９８５ｐｐｍ、ｓ、１Ｈ；８．１１２ｐｐｍ、ｍ、２Ｈ；７．８６８ｐｐｍ、ｄ、１Ｈ；７．５７６ｐｐｍ、ｄ  ２Ｈ；７．２３４ｐｐｍ、ｄ、３Ｈ；７．１１５ｐｐｍ、ｄ、１Ｈ；７．０３２ｐｐｍ、ｄ、１Ｈ；６．７６８ｐｐｍ、ｓ、１Ｈ；５．９７７ｐｐｍ、ｔ、不十分な分解、１Ｈ；５．４１１ｐｐｍ、ｓ、ＮＨ２−；４．９０３ｐｐｍ、ｑ、２Ｈ；４．３７９ｐｐｍ、ｍ、１Ｈ；４．２３０ｐｐｍ、ｍ、１Ｈ；４．１４７ｐｐｍ、ｍ、１Ｈ；３．８７９ｐｐｍ、ｓ、３Ｈ；３．８３３ｐｐｍ、ｓ、３Ｈ；３．７８９ｐｐｍ、ｓ、３Ｈ；３．５９２ｐｐｍ、ｓ、３Ｈ；３．５３１ｐｐｍ、ｍ、−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−；３．３１６ｐｐｍ、ｔ、２Ｈ；３．０２０ｐｐｍ、ｍ、１Ｈ；２．９４９ｐｐｍ、ｍ、１Ｈ；２．５６８ｐｐｍ、ｍ、１Ｈ；２．３７５ｐｐｍ、ｍ、１Ｈ；２．１８４ｐｐｍ、ｍ、１Ｈ；１．８２９ｐｐｍ、ｍ、１Ｈ；１．６８６ｐｐｍ、ｍ、１Ｈ；１．５９２ｐｐｍ、ｍ、１Ｈ；１．４３３ｐｐｍ、ｍ、１Ｈ；１．３６９ｐｐｍ、ｍ、１Ｈ；０．８６０ｐｐｍ、ｄ、３Ｈ；０．８２７ｐｐｍ、ｄ、３Ｈ。
【０１６３】
実施例５．Ｎ−（Ｎ３−ＰＥＧ４−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（Ｔｒｔ）−ＰＡＢＣ）−デアセチルコチシン（Ｄｅａｃｅｔｙｌｃｏｃｈｉｃｉｎｅ）５の合成
【化２５】
0006704900.tif 000031
【０１６４】
デアセチルコルヒチン・ＴＦＡ（３、０．１８ｇｍ、０．３９ｍｍｏｌ、１．０当量）及びＮ３−ＰＥＧ４−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（Ｔｒｔ）−ＰＡＢ−ＮＰＣ（０．５０ｇｍ、０．４６ｍｍｏｌ、１．２当量）を、無水ＤＭＦ（５ｍＬ）に溶解した。ＴＥＡ（１６２μＬ、１．１６ｍｍｏｌ、３．０当量）及びＤＩＰＥＡ（２０２μＬ、１．１６ｍｍｏｌ、３．０当量）を、反応混合物に添加した。黄色い溶液を、アルゴン雰囲気下で一晩、室温で撹拌させた。反応混合物を、真空下で、３７℃で乾燥状態まで蒸発させた。粗生成物をエチルアセテートに溶解し、移動相Ａとしてエチルアセテートを、及び移動相Ｂとしてメタノールを使用して、Ｂｉｏｔａｇｅ上のシリカゲルカラムによって精製した。溶出を３１７ｎｍで監視した。生成物含有画分を回転蒸発により乾燥状態近くまで蒸発させ、真空で一晩さらに乾燥させ、０．４７ｇｍの黄色い固形物を得た（５、収率：７９％）。純度９８％（ＨＰＬＣ）。化合物５（Ｖａｒｉａｎ、１０ｍｇ／ｍＬのＤＭＳＯ−ｄ６、δ）の１Ｈ  ＮＭＲ：９．９９２ｐｐｍ、ｓ、１Ｈ；８．１１２ｐｐｍ、ｍ、２Ｈ；８．０２０ｐｐｍ、ｄ、１Ｈ；７．５６６ｐｐｍ、ｄ、２Ｈ；７．３８１ｐｐｍ、ｄ、６Ｈ；７．２２６〜７．２７１ｐｐｍ、ｍ、１４Ｈ；７．１０５〜７．２０９ｐｐｍ、ｍ、４Ｈ；７．０３９ｐｐｍ、ｄ、１Ｈ；６．７６６ｐｐｍ、ｓ、１Ｈ；４．８９１ｐｐｍ、ｄｄ、２Ｈ；４．５５７ｐｐｍ、ｔ、１Ｈ、不十分な分解；４．０８０ｐｐｍ、ｍ、１Ｈ；３．８７０ｐｐｍ、ｓ、３Ｈ；３．８２８ｐｐｍ、ｓ、３Ｈ；３．７８４ｐｐｍ、ｓ、３Ｈ；３．５２７ｐｐｍ、ｍ、−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−；３．５１９ｐｐｍ、ｓ、３Ｈ；２．９９６ｐｐｍ、ｄｄ、１Ｈ；２．７４２ｐｐｍ、７、１Ｈ；２．５７５ｐｐｍ、ｍ、１Ｈ；１．２〜２．３ｐｐｍ、複数のピーク。
【０１６５】
実施例６．ＰＯＺ  １０ｐ−ＥＤＡ−Ｂｏｃ  ２０Ｋ（７）の合成
【化２６】
0006704900.tif 000032
【０１６６】
ペンダントＰＯＺ  １０ｐ酸２０Ｋ（１０ｇｍ、０．５２ｍｍｏｌ、１．０当量）及びＮＨＳ（０．０７８ｇｍ、０．６７ｍｍｏｌ、１．３当量）を、無水ＡＣＮ（２００ｍＬ）に溶解した。溶液を、回転蒸発により乾燥状態まで蒸発させた。残留物を無水ＤＣＭ（１００ｍＬ）に溶解し、続いて、ＤＣＣ（０．１３８ｇｍ、０．６７ｍｍｏｌ、１．３当量）を添加した。溶液を、アルゴン雰囲気下で一晩撹拌させた。反応混合物を、ジエチルエーテル（１６００ｍＬ）内へ緩徐に添加することより析出した。析出物を濾過し、真空下で一晩乾燥させ、８．８ｇｍの白い粉末（６）を得た。６上のスクシンイミジル基の置換は、イオン交換クロマトグラフィーによって決定された、９８％である。化合物６（Ｖａｒｉａｎ、１０ｍｇ／ｍＬのＣＤＣｌ３、δ）の１Ｈ  ＮＭＲは、１．１２ｐｐｍ（ｓ、３Ｈ、ＣＨ３ＣＨ２ＣＯ−）、２．３１ｐｐｍ（小さいｓ）及び２．４１ｐｐｍ（大きいｓ）（総面積２Ｈ、ＣＨ３ＣＨ２ＣＯ−）、及び３．４７ｐｐｍ（ｓ、４Ｈ、−ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−）で通常の骨格ピークを示した。ペンダント基ピークは、１．８４ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＣ≡Ｈ）、及び２．００ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＣ≡Ｈ）で出現した。末端スクシンイミジル基ピークは、２．８６ｐｐｍ（ｓ、４Ｈ）で出現した。
【０１６７】
無水ＤＣＭ（１００ｍＬ）中のＢＯＣ−ＥＤＡ（０．１０ｇｍ、０．６２ｍｍｏｌ、２．１当量）及びＴＥＡ（０．１７ｍＬ、１．２ｍｍｏｌ、４．１当量）の溶液に、化合物６（５．６ｇｍ、０．２９ｍｍｏｌ、１当量）を添加した。溶液をアルゴン雰囲気下で一晩、室温で撹拌した。次いで、反応混合物を、ジエチルエーテル（８００ｍＬ）内へ緩徐に添加することにより析出した。析出物を濾過し、真空で一晩乾燥させ、５．０ｇｍの白い粉末（７）を得た。７上でのＢｏｃ−ＥＤＡの置換は、イオン交換クロマトグラフィーによって決定された、９１％である。化合物７（Ｖａｒｉａｎ、１０ｍｇ／ｍＬのＣＤＣｌ３、δ）の１Ｈ  ＮＭＲは、１．１２ｐｐｍ（ｓ、３Ｈ、ＣＨ３ＣＨ２ＣＯ−）、２．３１ｐｐｍ（小さいｓ）及び２．４１ｐｐｍ（大きいｓ）（総面積２Ｈ、ＣＨ３ＣＨ２ＣＯ−）、及び３．４５ｐｐｍ（ｓ、４Ｈ、−ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−）で通常の骨格ピークを示した。ペンダント基ピークは、１．８４ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＣ≡Ｈ）、及び１．９４ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＣ≡Ｈ）で出現した。末端−Ｏ−Ｃ（ＣＨ３）３基ピークは、１．４３ｐｐｍ（ｓ、９Ｈ）で出現した。
【０１６８】
実施例７．ＰＯＺ  ２０Ｋペンダント［（ビオチン）２（ＰＥＧ４−ＶＣ−ＰＡＢＣ−デアセチルコルヒチン）６］ａ−ヨードアセトアミド（１１）の合成
【化２７】
0006704900.tif 000033
0006704900.tif 000034
0006704900.tif 000035
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0006704900.tif 000037
【０１６９】
アジド−ＰＥＧ３−ビオチン（９８ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ、２．１当量）及びＰＯＺ  １０ｐ−ＥＤＡ−ＢＯＣ  ２０Ｋ（７、２．０００ｇｍ、０．１０ｍｍｏｌ、１．０当量）を、脱イオン水（２５ｍＬ）に溶解した。溶液を、緩徐なアルゴン流で１５分間スパージした。次いで、Ｌ（＋）−アスコルビン酸ナトリウム塩（４４ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ、２．１当量）をフラスコに添加し、続いて、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ（５５ｍｇ、０．２２ｍｏｌ、２．１当量）をすぐに添加した。溶液をアルゴン雰囲気下で一晩、室温で撹拌した。反応混合物の逆相ＨＰＬＣ分析は、反応が完了していることを示した。溶液を、Ｄｏｗｅｘ（登録商標）Ｍ４１９５媒体（２０ｇｍ）が充填されたカラムを通過させて、銅を除去した。カラムを、追加の脱イオン水（１７５ｍＬ）を用いて溶出させた。ＮａＣｌ（３０ｇｍ）を溶離液（２００ｍＬ）に溶解した。溶液をＤＣＭ（３×１００ｍＬ）で抽出した。ＤＣＭ溶液を、無水硫酸マグネシウム（１．５ｇｍ）及び硫酸ナトリウム（１００ｇｍ）上で乾燥させた。混合物を、ガラスフリットをとおして濾過した。濾液を回転蒸発により乾燥状態近くまで濃縮し、真空で一晩さらに乾燥させ、これにより、１．７ｇｍの白い固形物（８）を得た。化合物８（Ｖａｒｉａｎ、１０ｍｇ／ｍＬのＤＭＳＯ−ｄ６、δ）の１Ｈ  ＮＭＲは、０．９５ｐｐｍ（複数可）及び０．９７（複数可）（１個のＣＨ３ＣＨ２ＣＯ−当たり総面積３Ｈ）、２．２８ｐｐｍ（大きいｓ）及び２．３３ｐｐｍ（小さいｓ）（１個のＣＨ３ＣＨ２ＣＯ−当たり総面積２Ｈ）、ならびに３．３５ｐｐｍ（大きいｓ）及び３．４４（小さいｓ）（１個の−ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−当たり総面積４Ｈ）で通常のＰＯＺ骨格ピークを示した。残りのペンダント基ピークは、１．６５ｐｐｍ（ｍ、１個の−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＣ≡Ｈ当たり２Ｈ）、及び２．７５ｐｐｍ（ｍ、１個のＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＣ≡Ｈ当たり１Ｈ）で出現した。ＰＯＺ末端基ピークは、１．３７ｐｐｍ（ｓ、９Ｈ、−Ｏ−Ｃ（ＣＨ３）３）、６．７７ｐｐｍ（ｔ、不十分な分解、１Ｈ、−ＮＨ−Ｂｏｃ）、７．９２ｐｐｍ（ｔ、不十分な分解、１Ｈ、−ＣＯＮＨ−）で出現した。ペンダントビオチン関連ピークは、３．７９ｐｐｍ（ｔ、不十分な分解、１個のトリアゾール−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−当たり２Ｈ）、４．１２ｐｐｍ（ｍ、ビオチン上の１個の−ＣＯＮＨＣＨ（ＣＨ２Ｓ−当たり１Ｈ）−）及び４．３０ｐｐｍ（ｍ、ビオチン上の１個の−ＣＯＮＨＣＨ当たり１Ｈ）、４．４５ｐｐｍ（ｔ、不十分な分解、１個のトリアゾール−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−当たり２Ｈ）、６．３４ｐｐｍ（複数可）及び６．４０ｐｐｍ（複数可）（１個の−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−当たり２Ｈ）、７．８１ｐｐｍ（ｍ、１個のトリアゾール環＝ＣＨ−Ｎ当たり１Ｈ、１個の−ＣＯＮＨ−当たり１Ｈ）。
【０１７０】
５０ｍＬ丸底フラスコ中のＮ−（Ｎ３−ＰＥＧ４−ＶＣ−ＰＡＢＣ）−デアセチルコルヒチン（４、０．１５ｇｍ、０．１５ｍｍｏｌ、７．５当量）に、無水ＴＨＦ（１０ｍＬ）を添加した。次いで、ＰＯＺ  ２０Ｋペンダントビオチン２−ＥＤＡ−Ｂｏｃ（８、０．４０ｇｍ、０．０２０ｍｍｏｌ、１当量）を溶液に溶解した。溶液を緩徐なアルゴン流下で１０分間撹拌させた。次いで、ＣｕＩ（２３ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ、６．０当量）を添加し、続いて、ＴＥＡ（１７μＬ、０．１２ｍｍｏｌ、６．０当量）をすぐに添加した。ＤＭＦ（１ｍＬ）を反応混合物内へ添加した。緑色を帯びた溶液を、アルゴン雰囲気下で一晩、４０℃で撹拌した。反応混合物の逆相ＨＰＬＣ分析は、一晩の撹拌後、反応が完了していることを示した。反応混合物を濾過し、濾液を回転蒸発によって乾燥状態近くまで濃縮した。残留物ＤＭＦを、真空下でさらに蒸発させた。残留物に、２０ｍＬのメタノールを添加した。明澄な緑色の溶液を、Ｄｏｗｅｘ（登録商標）Ｍ４１９５媒体（２０ｍＬ）が充填されたカラムを通過させることにより精製して、銅を除去した。カラムを、追加のメタノール（８０ｍＬ）を用いて溶出させた。溶離液（１００ｍＬ）を回転蒸発により乾燥状態まで濃縮させた。残留物をＤＣＭ（１０ｍＬ）に溶解し、これをジエチルエーテル（１５０ｍＬ）内へ緩徐に添加することにより、析出させた。析出物を濾過し、次いで、真空で一晩乾燥させ、０．４９ｇｍの琥珀色の粉末（９）を得た。化合物９（Ｖａｒｉａｎ、１０ｍｇ／ｍＬのＤＭＳＯ−ｄ６、δ）の１Ｈ  ＮＭＲは、０．９５ｐｐｍ（複数可）及び０．９７（複数可）（１個のＣＨ３ＣＨ２ＣＯ−当たり総面積３Ｈ）、２．２８ｐｐｍ（大きいｓ）及び２．３３ｐｐｍ（小さいｓ）（１個のＣＨ３ＣＨ２ＣＯ−当たり総面積２Ｈ）、ならびに３．３５ｐｐｍ（大きいｓ）及び３．４４（小さいｓ）（１個の−ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−当たり総面積４Ｈ）で通常のＰＯＺ骨格ピークを示した。ＰＯＺ末端基ピークは、１．３７ｐｐｍ（ｓ、９Ｈ、−Ｏ−Ｃ（ＣＨ３）３）、６．７７ｐｐｍ（ｔ、不十分な分解、１Ｈ、−ＮＨ−Ｂｏｃ）、７．８２ｐｐｍ（ｔ、不十分な分解、１Ｈ、−ＣＯＮＨ−）で出現した。ペンダントビオチン関連ピークは、３．７９ｐｐｍ（ｔ、不十分な分解、１個のトリアゾール−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−当たり２Ｈ）、４．１２ｐｐｍ（ｍ、ビオチン上の１個の−ＣＯＮＨＣＨ（ＣＨ２Ｓ−）−当たり１Ｈ）及び４．３０ｐｐｍ（ｍ、ビチオン上の１個の−ＣＯＮＨＣＨ当たり１Ｈ）、４．４６ｐｐｍ（ｔ、不十分な分解、１個のトリアゾール−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−当たり２Ｈ）、６．３４ｐｐｍ（複数可）及び６．４０ｐｐｍ（複数可）（１個の−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−当たり２Ｈ）、７．８１ｐｐｍ（ｍ、１個のトリアゾール環＝ＣＨ−Ｎ当たり１Ｈ、１個の−ＣＯＮＨ−当たり１Ｈ）を含む。ペンダントＰＥＧ４−ＶＣ−ＰＡＢＣ−デアセチルコルヒチンピークのうちのいくつか（以下のＨの数は、１個のペンダントＰＥＧ４−ＶＣ−ＰＡＢＣ−デアセチルコルヒチン当たりを示す）は、０．８２７ｐｐｍ、ｄ、３Ｈ；０．８６０ｐｐｍ、ｄ、３Ｈ；１．３７ｐｐｍ、ｍ、１Ｈ；１．４３ｐｐｍ、ｍ、１Ｈ；１．５９ｐｐｍ、ｍ、１Ｈ；１．���９ｐｐｍ、ｍ、１Ｈ；１．８３ｐｐｍ、ｍ、１Ｈ；２．５８ｐｐｍ、ｍ、１Ｈ；２．９５ｐｐｍ、ｍ、１Ｈ；３．０２ｐｐｍ、ｍ、１Ｈ；３．５３ｐｐｍ、ｍ、−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−；３．５９ｐｐｍ、ｓ、３Ｈ；３．７９ｐｐｍ、ｓ、３Ｈ；３．８３ｐｐｍ、ｓ、３Ｈ；３．８８ｐｐｍ、ｓ、３Ｈ；４．１５ｐｐｍ、ｍ、１Ｈ；４．２３ｐｐｍ、ｍ、１Ｈ；４．３８ｐｐｍ、ｍ、１Ｈ；４．４５ｐｐｍ、ｔ、２Ｈ；４．９０ｐｐｍ、ｑ、２Ｈ；５．４１ｐｐｍ、ｓ、ＮＨ２−；５．９８ｐｐｍ、ｔ、不十分な分解、１Ｈ；６．７７ｐｐｍ、ｓ、１Ｈ；７．０３ｐｐｍ、ｄ、１Ｈ；７．１２ｐｐｍ、ｄ、１Ｈ；７．２３ｐｐｍ、ｄ、３Ｈ；７．５８ｐｐｍ、ｄ  ２Ｈ；７．８２ｐｐｍ、ｔ、１Ｈ；７．８７ｐｐｍ、ｄ、１Ｈ；８．１１ｐｐｍ、ｍ、２Ｈ；９．９８ｐｐｍ、ｓ、１Ｈを含む。
【０１７１】
ＰＯＺ  ２０Ｋペンダント［（ビオチン）２（ＰＥＧ４−ＶＣ−ＰＡＢＣ−デアセチルコルヒチン）６］ａ−ＥＤＡ−ＢＯＣ（９、０．４８０ｇｍ）を、ＤＣＭ（３．２ｍＬ）に溶解し、続いて、ＴＦＡ（３．２ｍＬ）を添加した。溶液を、アルゴン下で３時間、室温で撹拌させた。次いで、混合物を回転蒸発により２８℃で乾燥状態まで蒸発させた。残留物は、溶解ＤＣＭ（３０ｍＬ）であった。溶液を、１５％のブライン（２×２０ｍＬ）によって洗浄した。相分離後、ＤＣＭ溶液を１５％のブライン（４０ｍＬ、ｐＨは１ＮのＮａＯＨによって１２に調節した）で洗浄した。相分離後、ＤＣＭ溶液を回収し、無水硫酸ナトリウム（２０ｇｍ）上で乾燥させた。混合物を、ガラスフリットをとおして濾過した。濾液を乾燥状態まで蒸発させた。残留物をＤＣＭ（７ｍＬ）に溶解し、次いで、ジエチルエーテル（１５０ｍＬ）中で析出させた。析出物を濾過し、真空で一晩乾燥させ、０．１３ｇｍの白い粉末（１０）を得た。化合物１０（Ｖａｒｉａｎ、１０ｍｇ／ｍＬのＤＭＳＯ−ｄ６、δ）の１Ｈ  ＮＭＲは、０．９５ｐｐｍ（複数可）及び０．９７（複数可）（１個のＣＨ３ＣＨ２ＣＯ−当たり総面積３Ｈ）、２．２８ｐｐｍ（大きいｓ）及び２．３３ｐｐｍ（小さいｓ）（１個のＣＨ３ＣＨ２ＣＯ−当たり総面積２Ｈ）、ならびに３．３５ｐｐｍ（大きいｓ）及び３．４４（小さいｓ）（１個の−ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−当たり総面積４Ｈ）で通常のＰＯＺ骨格ピークを示した。ＰＯＺ末端Ｂｏｃ基の１．３７ｐｐｍピークは、大幅に低減され、これは、末端Ｂｏｃ基の除去を示した。末端アミドＮＨは、７．８２ｐｐｍ（ｔ、不十分な分解、１Ｈ、−ＣＯＮＨ−）で出現した。ペンダントビオチン関連ピークのうちのいくつかは、３．７９ｐｐｍ（ｔ、不十分な分解、１個のトリアゾール−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−当たり２Ｈ）、４．１２ｐｐｍ（ｍ、ビチオン上の１個の−ＣＯＮＨＣＨ（ＣＨ２Ｓ−）−当たり１Ｈ）及び４．３０ｐｐｍ（ｍ、ビチオン上の１個の−ＣＯＮＨＣＨ当たり１Ｈ）、４．４６ｐｐｍ（ｔ、不十分な分解、１個のトリアゾール−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−当たり２Ｈ）、６．３４ｐｐｍ（複数可）（１個の−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−当たり２Ｈ）及び６．４０ｐｐｍ（複数可）、７．８１ｐｐｍ（ｍ、１個のトリアゾール環＝ＣＨ−Ｎ当たり１Ｈ、１個の−ＣＯＮＨ−当たり１Ｈ）を含む。ペンダントＰＥＧ４−ＶＣ−ＰＡＢＣ−デアセチルコルヒチンピークのうちのいくつか（以下のＨの数は、１個のペンダントＰＥＧ４−ＶＣ−ＰＡＢＣ−デアセチルコルヒチン当たりを示す）は、０．８２７ｐｐｍ、ｄ、３Ｈ；０．８６０ｐｐｍ、ｄ、３Ｈ；１．３７ｐｐｍ、ｍ、１Ｈ；１．４３ｐｐｍ、ｍ、１Ｈ；１．５９ｐｐｍ、ｍ、１Ｈ；１．６９ｐｐｍ、ｍ、１Ｈ；１．８３ｐｐｍ、ｍ、１Ｈ；２．５８ｐｐｍ、ｍ、１Ｈ；２．９５ｐｐｍ、ｍ、１Ｈ；３．０２ｐｐｍ、ｍ、１Ｈ；３．５３ｐｐｍ、ｍ、−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−；３．５９ｐｐｍ、ｓ、３Ｈ；３．７９ｐｐｍ、ｓ、３Ｈ；３．８３ｐｐｍ、ｓ、３Ｈ；３．８８ｐｐｍ、ｓ、３Ｈ；４．１５ｐｐｍ、ｍ、１Ｈ；４．２３ｐｐｍ、ｍ、１Ｈ；４．３８ｐｐｍ、ｍ、１Ｈ；４．４５ｐｐｍ、ｔ、２Ｈ；４．９０ｐｐｍ、ｑ、２Ｈ；５．４１ｐｐｍ、ｓ、ＮＨ２−���５．９８ｐｐｍ、ｔ、不十分な分解、１Ｈ；６．７７ｐｐｍ、ｓ、１Ｈ；７．０３ｐｐｍ、ｄ、１Ｈ；７．１２ｐｐｍ、ｄ、１Ｈ；７．２３ｐｐｍ、ｄ、３Ｈ；７．５８ｐｐｍ、ｄ  ２Ｈ；７．８２ｐｐｍ、ｔ、１Ｈ；７．８７ｐｐｍ、ｄ、１Ｈ；８．１１ｐｐｍ、ｍ、２Ｈ；９．９８ｐｐｍ、ｓ、１Ｈを含む。
【０１７２】
ＰＯＺペンダント［（ビオチン）２（ＰＥＧ４−ＶＣ−ＰＡＢＣ−デアセチルコルヒチン）６］ａ−ＥＤＡ  ２０Ｋ（１０、０．１１ｇｍ、０．００４２ｍｍｏｌ、１当量）を、ＡＣＮ（５ｍＬ）に溶解し、次いで、これを回転蒸発により乾燥状態まで蒸発させた。残留物をＤＣＭ（５ｍＬ）に溶解した。スクシンイミジルヨードアセテート（２．５ｍｇ、０．００８３ｍｍｏｌ、２当量）を添加し、続いて、ＴＥＡ（４．６μＬ、０．０３３ｍｍｏｌ、８当量）を添加した。溶液を、アルゴン雰囲気下で、暗中で撹拌させた。一晩の反応後、溶液を８０ｍＬのジエチルエーテル中で析出させた。析出物を濾過し、ジエチルエーテル（５ｍＬ）によってすすぎ、真空で乾燥させ、これにより９９ｍｇの白い粉末（１１）を得た。１１のヨードアセトアミド置換は、３−メルカプトプロピオン酸との反応後、イオン交換クロマトグラフィーによって決定された、８１％であった。
【０１７３】
実施例８．ＰＯＺ  １０ｐ−ＥＤＡ−Ｆｍｏｃ  ２０Ｋ（１３）の合成
【化２８】
0006704900.tif 000038
【０１７４】
ＰＯＺ  １０ｐ−ＥＤＡ−ＢＯＣ  ２０Ｋ（７、１．０ｇｍ）をＤＣＭ（６ｍＬ）に溶解し、続いて、ＴＦＡ（６ｍＬ）を添加した。溶液を、アルゴン雰囲気下で２時間、室温で撹拌した。次いで、混合物を２８℃で乾燥状態まで蒸発させた。残留物は、溶解脱イオン水（１０ｍＬ）であり、溶液のｐＨを１ＮのＮａＯＨによって１１に調節した。ＮａＣｌを溶液添加し、１５％のブラインを作製し、これを、ＤＣＭ（４×３０ｍＬ）によって抽出した。相分離後、ＤＣＭ相を回収し、無水ＭｇＳＯ４（１ｇｍ）及びＮａ２ＳＯ４（９０ｇｍ）上で乾燥させた。濾過して固形物を取り除いた後、濾液を乾燥状態まで蒸発させた。残留物をＤＣＭ（１０ｍＬ）に溶解し、これを、ジエチルエーテル（２００ｍＬ）中に添加して、ポリマーを析出した。析出物を濾過し、真空で一晩乾燥させ、０．８６ｇｍの白い粉末（１２）を得た。化合物１２（Ｖａｒｉａｎ、１０ｍｇ／ｍＬのＤＭＳＯ−ｄ６、δ）の１Ｈ  ＮＭＲは、０．９５ｐｐｍ（複数可）及び０．９７（複数可）（１個のＣＨ３ＣＨ２ＣＯ−当たり総面積３Ｈ）、２．２８ｐｐｍ（大きいｓ）及び２．３３ｐｐｍ（小さいｓ）（１個のＣＨ３ＣＨ２ＣＯ−当たり総面積２Ｈ）、ならびに３．３５ｐｐｍ（大きいｓ）及び３．４４（小さいｓ）（１個の−ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−当たり総面積４Ｈ）で通常のＰＯＺ骨格ピークを示した。ペンダント基ピークは、１．６４ｐｐｍ（ｍ、１個の−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＣ≡Ｈ当たり２Ｈ）、及び２．７７ｐｐｍ（ｍ、１個のＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＣ≡Ｈ当たり１Ｈ）で出現した。ＰＯＺ末端Ｂｏｃ基（１．３７ｐｐｍ）は、消失し、これは、末端Ｂｏｃ基の完全な除去を示した。
【０１７５】
１０ｍＬのＡＣＮ（１０ｍＬ）中のＰＯＺ  １０ｐ−ＥＤＡ  ２０Ｋ（１２、０．４２ｇｍ、０．０２２ｍｍｏｌ、１当量）の溶液を、回転蒸発により乾燥状態まで蒸発させた。残留物をＤＣＭ（６ｍＬ）に溶解した。ＤＩＰＥＡ（１５μＬ、０．０８７ｍｍｏｌ、４当量）及びＦｍｏｃクロリド（１２ｍｇ、０．０４４ｍｍｏｌ、２当量）を添加した。アルゴン下での一晩の撹拌後、溶液を乾燥状態まで蒸発させた。残留物を脱イオン水（１０ｍＬ）に溶解し、続いて、ＮａＣｌ（１ｇｍ）を溶解した。水溶液をジエチルエーテル（１５ｍＬ）によって洗浄し、続いて、ＤＣＭ（３×１５ｍＬ）で残りの水溶液を抽出した。ＤＣＭ溶液を、Ｎａ２ＳＯ４（２０ｇｍ）上で乾燥させ、次いで、濾過して、固形物を除去した。濾液を回転蒸発により約４ｍＬまで濃縮させ、次いで、ジエチルエーテル（８０ｍＬ）中で析出させた。析出物を濾過によって回収し、真空で一晩乾燥させ、０．３６ｇｍの白い粉末（１３）を得た。ＣＤＣｌ３中のＮＭＲは、Ｆｍｏｃへの転化を示した。化合物１３（Ｖａｒｉａｎ、１０ｍｇ／ｍＬのＣＤＣｌ３、δ）の１Ｈ  ＮＭＲは、１．１２ｐｐｍ（ｓ、３Ｈ、ＣＨ３ＣＨ２ＣＯ−）、２．３１ｐｐｍ（小さいｓ）及び２．４１ｐｐｍ（大きいｓ）（総面積２Ｈ、ＣＨ３ＣＨ２ＣＯ−）、ならびに３．４５ｐｐｍ（ｓ、４Ｈ、−ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−）で通常の骨格ピークを示した。ペンダント基ピークは、１．８４ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＣ≡Ｈ）、及び２．０３ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＣ≡Ｈ）で出現した。Ｆｍｏｃ基ピークは、４．２０ｐｐｍ（ｔ、１Ｈ）、４．３７ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ）、７．３１ｐｐｍ（ｔ、２Ｈ）、７．４０ｐｐｍ（ｔ、２Ｈ）、７．５９ｐｐｍ（ｄ、２Ｈ）、及び７．７６ｐｐｍ（ｄ、２Ｈ）で出現した。
【０１７６】
実施例９．ＰＯＺ  ２０Ｋペンダント［（ビオチン）２（ＰＥＧ４−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＰＡＢＣ−デアセチルコルヒチン）５］ａ−ヨードアセトアミド（１７）の合成
【化２９】
0006704900.tif 000039
0006704900.tif 000040
0006704900.tif 000041
0006704900.tif 000042
0006704900.tif 000043
【０１７７】
１００ｍＬ丸底フラスコ中のＮ３−ＰＥＧ４−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（Ｔｒｔ）−ＰＡＢＣ−カーボネート−デアセチルコルヒチン（５、１９３ｍｇ、０．１４５ｍｍｏｌ、６当量）及びＰＯＺ  １０ｐ−ＥＤＡ−Ｆｍｏｃ２０Ｋ（１３、４７０ｍｇ、０．０２４２ｍｍｏｌ、１当量）に、ビオチン−ＰＥＧ３−アジド（２２ｍｇ、０．０４８ｍｍｏｌ、２．０当量）を添加し、これを、１ｍＬのＤＭＦに事前溶解した。ＤＭＦ（１ｍＬ）を使用してすすぎ、残留物ビオチン−ＰＥＧ３−アジドを反応混合物に移した。次いで、無水ＴＨＦ（１５ｍＬ）を添加した。溶液を、アルゴン下で１５分間撹拌した。次いで、ＣｕＩ（２９ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ、６．４当量）を添加し、続いて、ＴＥＡ（２２μＬ、０．１５ｍｍｏｌ、６．４当量）をすぐに添加した。緑色を帯びた溶液を、アルゴン下で一晩、５０℃で撹拌した。反応混合物を、０．２μｍフィルタをとおして濾過し、濾液を回転蒸発により乾燥状態まで蒸発させた。ＤＭＦを真空下で蒸発させた。メタノール（１０ｍＬ）を添加して、残留物を溶解した。明澄な緑色の溶液を、Ｄｏｗｅｘ（登録商標）Ｍ４１９５溶媒（９ｇｍ）が充填されたカラムを通過させて、銅を除去した。カラムを、追加のメタノール（９０ｍＬ）を用いて溶出させた。溶離液を乾燥状態まで濃縮させた。残留物をＤＣＭ（１２ｍＬ）に溶解した。ＤＣＭ溶液を、ジエチルエーテル（２００ｍＬ）内へ緩徐に添加することにより析出した。析出物を濾過し、次いで、真空で乾燥させ、０．６４ｇｍの琥珀色の粉末（１４）を得た。化合物１４（Ｖａｒｉａｎ、１０ｍｇ／ｍＬのＤＭＳＯ−ｄ６、δ）の１Ｈ  ＮＭＲは、０．９５ｐｐｍ（複数可）及び０．９７（複数可）（１個のＣＨ３ＣＨ２ＣＯ−当たり総面積３Ｈ）、２．２７ｐｐｍ（大きいｓ）及び２．３２ｐｐｍ（小さいｓ）（１個のＣＨ３ＣＨ２ＣＯ−当たり総面積２Ｈ）、ならびに３．３５ｐｐｍ（大きいｓ）及び３．４４（小さいｓ）（１個の−ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−当たり総面積４Ｈ）で通常のＰＯＺ骨格ピークを示した。Ｆｍｏｃ基ピークは、４．１２ｐｐｍ（ｍ、１Ｈ）、４．３０ｐｐｍ（ｍ、２Ｈ）で出現した。ペンダントビオチン関連ピークのうちのいくつかは、３．７９ｐｐｍ（ｔ、不十分な分解、１個のトリアゾール−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−当たり２Ｈ）、４．１２ｐｐｍ（ｍ、ビチオン上の１個の−ＣＯＮＨＣＨ（ＣＨ２Ｓ−）−当たり１Ｈ）及び４．３０ｐｐｍ（ｍ、ビチオン上の１個の−ＣＯＮＨＣＨ当たり１Ｈ）、４．４４ｐｐｍ（ｔ、不十分な分解、１個のトリアゾール−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−当たり２Ｈ）、６．３４ｐｐｍ（複数可）（１個の−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−当たり２Ｈ）及び６．４０ｐｐｍ（複数可）、７．８１ｐｐｍ（ｍ、１個のトリアゾール環＝ＣＨ−Ｎ当たり１Ｈ、１個の−ＣＯＮＨ−当たり１Ｈ）を含む。ペンダントＰＥＧ４−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（Ｔｒｔ）−ＰＡＢＣ−デアセチルコルヒチン関連ピークのうちのいくつか（以下のＨの数は、１個のペンダントＰＥＧ４−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（Ｔｒｔ）−ＰＡＢＣ−デアセチルコルヒチン当たりを示す）は、３．５２ｐｐｍ、ｓ、３Ｈ；３．７８ｐｐｍ、ｓ、３Ｈ；３．８２ｐｐｍ、ｓ、３Ｈ；３．８７ｐｐｍ、ｓ、３Ｈ；４．１２ｐｐｍ、ｍ、１Ｈ；４．４��ｐｐｍ（ｔ、不十分な分解、１個のトリアゾール−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−当たり２Ｈ）；４．５３ｐｐｍ、ｔ、１Ｈ、不十分な分解；４．９１ｐｐｍ、ｓ、２Ｈ；６．７６ｐｐｍ、ｓ、１Ｈ；７．０２ｐｐｍ、ｄ、１Ｈ；７．１１〜７．２１ｐｐｍ、ｍ、４Ｈ；７．３７ｐｐｍ（ｄ、Ｔｒｔ基から）；７．５６ｐｐｍ、ｄ２Ｈ；７．８０ｐｐｍ（ｍ、１個のトリアゾール環＝ＣＨ−Ｎ当たり１Ｈ）；８．０３ｐｐｍ、ｄ、１Ｈ；８．１１ｐｐｍ、ｍ、２Ｈ；９．９９ｐｐｍ、ｓ、１Ｈである。
【０１７８】
ＰＯＺ  ２０Ｋペンダント［（ビオチン）２（ＰＥＧ４−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（Ｔｒｔ）−ＰＡＢＣ−デアセチルコルヒチン）５］ａ−Ｆｍｏｃ（１４、０．４４ｇｍ）を、Ａｒ下で無水ＤＭＦ（４ｍＬ）に溶解した。ピペリジン（０．２０ｍＬ）を溶液に添加した。溶液を、アルゴン雰囲気下で１時間撹拌させた。次いで、溶液を真空下で、４０℃で乾燥状態まで蒸発させた。残留物をＤＣＭ（４ｍＬ）に溶解し、続いて、ジエチルエーテル（８０ｍＬ）中で析出させた。析出物をジエチルエーテル（５ｍＬ）によって洗浄し、次いで、真空で乾燥させ、０．４２ｇｍの粉末を得た。乾燥粉末をＤＣＭ（１５ｍＬ）に溶解し、次いで分液漏斗中で７％のブライン（３０ｍＬ）によって洗浄した。相分離後、ＤＣＭ溶液を、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。濾過して、Ｎａ２ＳＯ４を除去した後に、濾液を約７ｍＬまで濃縮させ、これを、ジエチルエーテル（１５０ｍＬ）中で析出させた。析出物を濾過によって除去し、ジエチルエーテル（１０ｍＬ）ですすぎ、次いで、真空で一晩乾燥させ、０．３７ｇｍの粉末（１５）を得た。化合物１５（Ｖａｒｉａｎ、１０ｍｇ／ｍＬのＤＭＳＯ−ｄ６、δ）の１Ｈ  ＮＭＲは、０．９５ｐｐｍ（複数可）及び０．９７（複数可）（１個のＣＨ３ＣＨ２ＣＯ−当たり総面積３Ｈ）、２．２７ｐｐｍ（大きいｓ）及び２．３２ｐｐｍ（小さいｓ）（１個のＣＨ３ＣＨ２ＣＯ−当たり総面積２Ｈ）、ならびに３．３５ｐｐｍ（大きいｓ）及び３．４４（小さいｓ）（１個の−ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−当たり総面積４Ｈ）で通常のＰＯＺ骨格ピークを示した。ペンダントビオチン関連ピークのうちのいくつかは、４．４４ｐｐｍ（ｔ、不十分な分解、１個のトリアゾール−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−当たり２Ｈ）、６．３４ｐｐｍ（複数可）及び６．４０ｐｐｍ（複数可）（１個の−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−当たり２Ｈ）、７．８１ｐｐｍ（ｍ、１個のトリアゾール環＝ＣＨ−Ｎ当たり１Ｈ、１個の−ＣＯＮＨ−当たり１Ｈ）を含む。ペンダントＰＥＧ４−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（Ｔｒｔ）−ＰＡＢＣ−デアセチルコルヒチン関連ピークのうちのいくつか（以下のＨの数は、１個のペンダントＰＥＧ４−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（Ｔｒｔ）−ＰＡＢＣ−デアセチルコルヒチン当たりを示す）は、３．４４ｐｐｍ、ｓ、ＰＥＧ４−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−；３．５２ｐｐｍ、ｓ、３Ｈ；３．７８ｐｐｍ、ｓ、３Ｈ；３．８２ｐｐｍ、ｓ、３Ｈ；３．８６ｐｐｍ、ｓ、３Ｈ；４．１３ｐｐｍ、ｍ、１Ｈ；４．４４ｐｐｍ（ｔ、不十分な分解、１個のトリアゾール−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−当たり２Ｈ）；４．５６ｐｐｍ、ｔ、１Ｈ、不十分な分解；４．９１ｐｐｍ、ｍ、２Ｈ；６．７６ｐｐｍ、ｓ、１Ｈ；７．０３ｐｐｍ、ｄ、１Ｈ；７．１４〜７．２６ｐｐｍ、ｍ、Ａｒ；７．３７ｐｐｍ（ｄ、Ｔｒｔ基）；７．５６ｐｐｍ、ｄ  ２Ｈ；７．８０ｐｐｍ（ｍ、１個のトリアゾール環＝ＣＨ−Ｎ当たり１Ｈ）；８．０３ｐｐｍ、ｄ、１Ｈ；８．１１ｐｐｍ、ｍ、２Ｈ；９．９９ｐｐｍ、ｓ、１Ｈである。
【０１７９】
ＰＯＺ  ２０Ｋペンダント［（ビオチン）２（ＰＥＧ４−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（Ｔｒｔ）−ＰＡＢＣ−デアセチルコルヒチン）５］ａ−ＥＤＡ（１５、０．３６ｇｍ、ＭＷ２６６８５Ｄａ、０．０１３ｍｍｏｌ、１当量）を、ＡＣＮ（５ｍＬ）に溶解し、次いで、これを、回転蒸発により乾燥状態まで蒸発させた。残留物を無水ＤＣＭ（５ｍＬ）に溶解し、アルゴン雰囲気下で保護した。スクシンイミジルヨードアセテート（１２ｍｇ、０．０４０ｍｍｏｌ、３．０当量）を添加し、続いて、ＴＥＡ（１１μＬ、０．０８０ｍｍｏｌ、６当量）を添加した。暗中での一晩の撹拌後、溶液を、ジエチルエーテル（１５０ｍＬ）中で析出させた。溶液を濾過し、ジエチルエーテル（１０ｍＬ）によってすすぎ、真空で乾燥させ、０．３６ｇｍの白い粉末（１６）を得た。
【０１８０】
ＰＯＺ  ２０Ｋペンダント［（ビオチン）２（ＰＥＧ４−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（Ｔｒｔ）−ＰＡＢＣ−デアセチルコルヒチン）５］ａ−ヨードアセトアミド（１６、０．１６ｇｍ）を、ＤＣＭ（２ｍＬ）に溶解し、続いて、ＴＦＡ（０．１０ｍＬ）を添加した。溶液を、暗中アルゴン下で一晩、室温で撹拌させた。次いで、混合物を回転蒸発により２８℃で乾燥状態まで蒸発させた。溶液をＤＣＭ（４ｍＬ）に溶解し、次いで、ジエチルエーテル（８０ｍＬ）中で析出させた。析出物を濾過し、大量のエチルエーテルで洗浄し、真空で乾燥させた。乾燥粉末（０．１５ｇｍ）を、脱イオン水（２０ｍＬ）に溶解した。溶液を、ＰＬＢＣ膜（４４．５ｍｍ、ＮＭＷＬ３０００）を用いて、ａｍｉｃｏｎ限外濾過装置を使用して、限外濾過によって５ｍＬまで濃縮させた。濃縮溶液を脱イオン水によって５０ｍＬに希釈し、これを再び５ｍＬまで濃縮させた。濃縮溶液を３０ｍＬに希釈し、続いて、５ｍＬまで濃縮させた。濃縮溶液を５０ｍＬバイアルに移した。限外濾過装置を脱イオン水（１０ｍＬ）ですすぎ、５０ｍＬバイアルに移した。溶液を凍結乾燥器で凍結乾燥させ、０．１５ｇｍの白い粉末（１７）を得た。化合物１７（Ｖａｒｉａｎ、１０ｍｇ／ｍＬのＤＭＳＯ−ｄ６、δ）の１Ｈ  ＮＭＲは、０．９５ｐｐｍ（複数可）及び０．９７（複数可）（１個のＣＨ３ＣＨ２ＣＯ−当たり総面積３Ｈ）、２．２７ｐｐｍ（大きいｓ）及び２．３２ｐｐｍ（小さいｓ）（１個のＣＨ３ＣＨ２ＣＯ−当たり総面積２Ｈ）、ならびに３．３５ｐｐｍ（大きいｓ）及び３．４４（小さいｓ）（１個の−ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−当たり総面積４Ｈ）で通常のＰＯＺ骨格ピークを示した。ＰＯＺ末端ヨードアセトアミド（−ＣＯＣＨ２Ｉ）ピークは、３．６２ｐｐｍ（ｓ、２Ｈ）で出現した。ペンダントビオチン関連ピークは、４．４４ｐｐｍ（ｔ、不十分な分解、１個のトリアゾール−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−当たり２Ｈ）、６．３４ｐｐｍ（複数可）及び６．４０ｐｐｍ（複数可）（１個の−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−当たり２Ｈ）、７．８１ｐｐｍ（ｍ、１個のトリアゾール環＝ＣＨ−Ｎ当たり１Ｈ、１個の−ＣＯＮＨ−当たり１Ｈ）を含む。ペンダントＰＥＧ４−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＰＡＢＣ−デアセチルコルヒチン関連ピークのうちのいくつか（以下のＨの数は、１個のペンダントＰＥＧ４−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＰＡＢＣ−デアセチルコルヒチン当たりを示す）は、３．４６ｐｐｍ、ｓ、ＰＥＧ４−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−；３．５２ｐｐｍ、ｓ、３Ｈ；３．７９ｐｐｍ、ｓ、３Ｈ；３．８３ｐｐｍ、ｓ、３Ｈ；３．８７ｐｐｍ、ｓ、３Ｈ；４．１３ｐｐｍ、ｍ、１Ｈ；４．４４ｐｐｍ（ｔ、不十分な分解、１個のトリアゾール−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−当たり２Ｈ）；４．５６ｐｐｍ、ｔ、１Ｈ、不十分な分解；４．９２ｐｐｍ、ｍ、２Ｈ；６．７６ｐｐｍ、ｓ、１Ｈ；７．０４ｐｐｍ、ｄ、１Ｈ；７．１３ｐｐｍ、ｍ、Ａｒ；７．２３ｐｐｍ、ｍ、Ａｒ；７．５７ｐｐｍ、ｄ  ２Ｈ；７．６４ｐｐｍ、ｍ、Ａｒ；７．８０ｐｐｍ（ｍ、１個のトリアゾール環＝ＣＨ−Ｎ）当たり１Ｈ；８．０５ｐｐｍ、ｄ、１Ｈ；８．１１ｐｐｍ、ｍ、１Ｈ；１０．０ｐｐｍ、ｓ、１Ｈを含む。
【０１８１】
実施例１０．ＰＯＺ  ２０Ｋペンダント［（ＰＥＧ４−ＶＣ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＥ）９］ａ−マレイミド（１９）
【化３０】
0006704900.tif 000044
【０１８２】
ガラスバイアル中のＮ３−ＰＥＧ４−ＶＣ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＥ（７２ｍｇ、０．０４９ｍｍｏｌ、９当量）に、ＴＨＦ（４ｍＬ）を添加した。次いで、ポリ［（ＥＯＺ）ｎ−ｃｏ−（ＰｔｙｎＯＺ）１０］−酸２０Ｋ（１０６ｍｇ、０．００５４４ｍｍｏｌ、１当量）を、溶液内に添加した。溶液を、アルゴン下で１０分間、撹拌した。次いで、ＣｕＩ（９ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ、９当量）を混合物に添加し、続いて、ＴＥＡ（７μＬ、０．０５ｍｍｏｌ、９当量）をすぐに添加した。溶液を、アルゴン下で一晩、４５℃で撹拌した。緑色を帯びた混合物を、逆相ＨＰＬＣによって分析し、これは、残留物Ｎ３−ＰＥＧ４−ＶＣ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＥが反応混合物中に残っていないことから、反応は完了したことを示す。溶液を、回転蒸発により乾燥状態まで蒸発させた。２ｍＭのＨＣｌ（４ｍＬ）及びＡＣＮ（４ｍＬ）を、添加して、残基を溶解し、これを、Ｄｏｗｅｘ  Ｍ４１９５媒体（２ｍＬ）が充填されたカラムをとおして精製して、銅を除去した。カラムを、１：１ｖ／ｖの２ｍＭのＨＣｌ及びＡＣＮ（１０ｍＬ）によって溶出させた。ＡＣＮを、回転蒸発によって蒸発させた。ＮａＣｌを残りの水溶液に添加して、１５％のブラインを作製した。溶液を、ＤＣＭ（３×３０ｍＬ）で抽出した。相分離後、ＤＣＭ溶液を約２０ｍＬまで濃縮させ、無水硫酸ナトリウム（１０ｇｍ）上で乾燥させた。混合物を、ガラスフリットをとおして濾過し、濾液を約４ｍＬまで濃縮させた。次いで、溶液をジエチルエーテル（８０ｍＬ）中で析出させた。析出物を濾過によって回収し、真空で乾燥させ、１０８ｍｇの白い粉末１８を得た。化合物１８（Ｖａｒｉａｎ、１０ｍｇ／ｍＬのＤＭＳＯ−ｄ６、δ）の１Ｈ  ＮＭＲは、０．９５ｐｐｍ（複数可）及び０．９７（複数可）（１個のＣＨ３ＣＨ２ＣＯ−当たり総面積３Ｈ）、２．２７ｐｐｍ（大きいｓ）及び２．３２ｐｐｍ（小さいｓ）（１個のＣＨ３ＣＨ２ＣＯ−当たり総面積２Ｈ）、ならびに３．３５ｐｐｍ（大きいｓ）及び３．４７（小さいｓ）（１個の−ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−当たり総面積４Ｈ）で通常のＰＯＺ骨格ピークを示した。ペンダントＰＥＧ４−ＶＣ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＥ関連ピークのうちのいくつか（以下のＨの数は、１個のペンダントＰＥＧ４−ＶＣ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＥ当たりを示す）は、０．７０〜０．９５ｐｐｍ、ｍ、２４Ｈ、−ＣＨ３；３．５０ｐｐｍ、ｓ、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）３−；３．７９ｐｐｍ、ｔ、不十分な分解、１個のトリアゾール−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−当たり２Ｈ）；３．９９ｐｐｍ、ｍ、２Ｈ；４．２３ｐｐｍ、ｍ、２Ｈ；４．４５ｐｐｍ（主要ピーク、ｔ、不十分な分解、１個のトリアゾール−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−当たり２Ｈ）；５．０４ｐｐｍ、ｍ、２Ｈ；５．４１ｐｐｍ、ｓ、２Ｈ；６．０４ｐｐｍ、ｓ、１Ｈ；７．１７ｐｐｍ、ｍ、１Ｈ、ＭＭＡＥ上のＡｒ；７．２７ｐｐｍ、ｄ、２Ｈ、ＰＡＢのＡｒ；７．３１ｐｐｍ、ｍ、４Ｈ、ＭＭＡＥ上のＡｒ；７．５９ｐｐｍ、ｄ、２Ｈ、ＰＡＢのＡｒ；７．８２ｐｐｍ（ｍ、１個のトリアゾール環＝ＣＨ−Ｎ当たり１Ｈ）；８．１３ｐｐｍ、ｄ、１Ｈ；１０．０３ｐｐｍ、ｓ、１Ｈを含む。
【０１８３】
ＰＯＺ  ２０Ｋペンダント−（ＰＥＧ４−ＶＣ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＥ）９−酸（１８、９３ｍｇ、０．００２９ｍｍｏｌ、１．０当量）を無水ＡＣＮ（２ｍＬ）に溶解し、続いて、ＨＯＢＴ（０．４ｍｇ、０．００２ｍｍｏｌ、０．８当量）及びＮ−（２−アミノエチル）マレイミドＴＦＡ塩（１ｍｇ、０．００４ｍｍｏｌ、１．３当量）を添加した。溶液を、回転蒸発により乾燥状態まで蒸発させた。残留物を無水ＤＣＭ（３ｍＬ）に溶解し、続いて、ＴＥＡ（０．６μＬ、０．００４ｍｍｏｌ、１．５当量）及びＤＣＣ（０．７ｍｇ、３．５１０１×１０−６ｍｏｌ、１．２当量）を添加した。溶液を、アルゴン雰囲気下で一晩撹拌させた。混合物を濾過し、小さいシリカゲルカラム（１０ｍＬ）上に充填し続いて、ＤＣＭを用いて溶出させた。溶離液（３０ｍＬ）を、回転蒸発によって１ｍＬまで濃縮させた。溶液をエチルエーテル（１５ｍＬ）内へ添加し、析出させた。濾過によって回収された析出物、及び真空で乾燥させ、３０ｍｇの白い粉末（１９）を得た。化合物１９（Ｖａｒｉａｎ、１０ｍｇ／ｍＬのＤＭＳＯ−ｄ６、δ）の１Ｈ  ＮＭＲは、０．９５ｐｐｍ（複数可）及び０．９７（複数可）（１個のＣＨ３ＣＨ２ＣＯ−当たり総面積３Ｈ）、２．２７ｐｐｍ（大きいｓ）及び２．３２ｐｐｍ（小さいｓ）（１個のＣＨ３ＣＨ２ＣＯ−当たり総面積２Ｈ）、ならびに３．３５ｐｐｍ（大きいｓ）及び３．４７（小さいｓ）（１個の−ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−当たり総面積４Ｈ）で通常のＰＯＺ骨格ピークを示した。ＰＯＺ末端マレイミド基ピークは、７．００ｐｐｍ（ｓ、２Ｈ）で出現した。ペンダントＰＥＧ４−ＶＣ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＥ関連ピークのうちのいくつか（以下のＨの数は、１個のペンダントＰＥＧ４−ＶＣ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＥ当たりを示す）は、０．７０〜０．９５ｐｐｍ、ｍ、２４Ｈ、−ＣＨ３；３．５０ｐｐｍ、ｓ、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）３−；３．７９ｐｐｍ、ｔ、不十分な分解、１個のトリアゾール−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−当たり２Ｈ）；３．９９ｐｐｍ、ｍ、２Ｈ；４．２３ｐｐｍ、ｍ、２Ｈ；４．４５ｐｐｍ（主要ピーク、ｔ、不十分な分解、１個のトリアゾール−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−当たり２Ｈ）；５．０４ｐｐｍ、ｍ、２Ｈ；５．４１ｐｐｍ、ｓ、２Ｈ；６．０４ｐｐｍ、ｓ、１Ｈ；７．１７ｐｐｍ、ｍ、１Ｈ、ＭＭＡＥ上のＡｒ；７．２７ｐｐｍ、ｄ、２Ｈ、ＰＡＢのＡｒ；７．３１ｐｐｍ、ｍ、４Ｈ、ＭＭＡＥ上のＡｒ；７．５９ｐｐｍ、ｄ、２Ｈ、ＰＡＢのＡｒ；７．８２ｐｐｍ（ｍ、１個の当たり１Ｈトリアゾール環＝ＣＨ−Ｎ）；８．１３ｐｐｍ、ｄ、１Ｈ；１０．０３ｐｐｍ、ｓ、１Ｈを含む。
【０１８４】
実施例１１．ＰＯＺ  ２０Ｋペンダント［（ビオチン）２（ＰＥＧ４−ＶＣ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＥ）５］ａ−ヨードアセトアミド（２２）
反応スキーム：
【化３１】
0006704900.tif 000045
0006704900.tif 000046
0006704900.tif 000047
0006704900.tif 000048
【０１８５】
５０ｍＬ丸底フラスコ中のＮ３−ＰＥＧ４−ＶＣ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＥ（１３２ｍｇ、０．０９４４ｍｍｏｌ、６．０当量）及びＰＯＺ  １０ｐ−ＥＤＡ−Ｂｏｃ  ２０Ｋ（７、３０５ｍｇ、０．０１５７ｍｍｏｌ、１当量）に、ビオチン−ＰＥＧ３−アジド（１４ｍｇ、０．０３２ｍｍｏｌ、２当量、０．６ｍＬのＤＭＦ中に溶解）を添加し、続いて、９ｍＬの無水ＴＨＦ（９ｍＬ）を添加した。溶液を、アルゴン下で保護し、室温で１５分間撹拌した。次いで、ＣｕＩ（１９ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ、６．８当量）を添加し、続いて、ＴＥＡ（５２μＬ、０．３７ｍｍｏｌ、２４当量）をすぐに添加した。緑色を帯びた溶液を、アルゴン下で一晩、５０℃で撹拌した。溶液を、０．２μｍシリンジフィルタをとおして濾過し、濾液を乾燥状態まで蒸発させた。ＤＭＦを真空下で蒸発させた。メタノール（１０ｍＬ）を残留固形物に添加した。メタノール溶液を、Ｄｏｗｅｘ（登録商標）Ｍ４１９５媒体（５ｇｍ）が充填されたカラムを通過させて、銅イオンを除去した。溶離液を乾燥状態まで濃縮させ、ＤＣＭ（６ｍＬ）に溶解した。明澄な溶液を、撹拌しながら、ジエチルエーテル（１５０ｍＬ）中で析出させた。析出物を、濾過によって回収し、真空で乾燥させ、４００ｍｇの琥珀色の粉末（２０）を得た。化合物２０（Ｖａｒｉａｎ、１０ｍｇ／ｍＬのＤＭＳＯ−ｄ６、δ）の１Ｈ  ＮＭＲは、０．９５ｐｐｍ（複数可）及び０．９７（複数可）（１個のＣＨ３ＣＨ２ＣＯ−当たり総面積３Ｈ）、２．２７ｐｐｍ（大きいｓ）及び２．３２ｐｐｍ（小さいｓ）（１個のＣＨ３ＣＨ２ＣＯ−当たり総面積２Ｈ）、ならびに３．３５ｐｐｍ（大きいｓ）及び３．４７（小さいｓ）（１個の−ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−当たり総面積４Ｈ）で通常のＰＯＺ骨格ピークを示した。ＰＯＺ末端Ｂｏｃ基ピークは、１．３７ｐｐｍ（ｓ、９Ｈ）で出現した。ペンダントビオチン関連ピークのうちのいくつかは、３．７９ｐｐｍ（ｔ、不十分な分解、１個のトリアゾール−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−当たり２Ｈ）、４．１２ｐｐｍ（ｍ、ビチオン上の１個の−ＣＯＮＨＣＨ（ＣＨ２Ｓ−）−当たり１Ｈ）及び４．３０ｐｐｍ（ｍ、ビチオン上の１個の−ＣＯＮＨＣＨ当たり１Ｈ）、４．４５ｐｐｍ（ｔ、不十分な分解、１個のトリアゾール−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−当たり２Ｈ）、６．３４ｐｐｍ（複数可）（１個の−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−当たり２Ｈ）及び６．４０ｐｐｍ（複数可）、７．８１ｐｐｍ（ｍ、１個のトリアゾール環＝ＣＨ−Ｎ当たり１Ｈ、１個の−ＣＯＮＨ−当たり１Ｈ）を含む。ペンダントＰＥＧ４−ＶＣ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＥ関連ピークのうちのいくつか（以下のＨの数は、１個のペンダントＰＥＧ４−ＶＣ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＥ当たりを示す）は、０．７０〜０．９５ｐｐｍ、ｍ、−ＣＨ３；３．５０ｐｐｍ、ｓ、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）３−；３．７９ｐｐｍ、ｔ、不十分な分解、１個のトリアゾール−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−当たり２Ｈ）；３．９９ｐｐｍ、ｍ、２Ｈ；４．２３ｐｐｍ、ｍ、２Ｈ；４．４５ｐｐｍ（主要ピーク、ｔ、不十分な分解、１個のトリアゾール−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−当たり２Ｈ）；５．０４ｐｐｍ、ｍ、２Ｈ；５．４０ｐｐｍ、ｓ、２Ｈ；５．９０ｐｐｍ、ｓ、１Ｈ；７．１６ｐｐｍ、ｍ、１Ｈ、ＭＭＡＥ上のＡｒ；７．２７ｐｐｍ、ｄ、２Ｈ、ＰＡＢのＡｒ；７．３１ｐｐｍ、ｍ、４Ｈ、ＭＭＡＥ上のＡｒ；７．５８ｐｐｍ、ｄ、２Ｈ、ＰＡＢのＡｒ；７．８２ｐｐｍ（ｍ、１個のトリアゾール環＝ＣＨ−Ｎ当たり１Ｈ）；８．１３ｐｐｍ、ｄ、１Ｈ；９．９８ｐｐｍ、ｓ、１Ｈを含む。
【０１８６】
化合物２０（３９０ｇｍ）を無水ＤＣＭ（２ｍＬ）に溶解し、続いて、ＴＦＡ（２ｍＬ）を添加した。溶液を、アルゴン下で３時間、室温で撹拌した。次いで、混合物を乾燥状態まで蒸発させた。残留固形物をＡＣＮ（５ｍＬ）に溶解し、続いて、脱イオン水（１５ｍＬ）と混合した。次いで、ＡＣＮを回転蒸発によって蒸発させた。残りの溶液のｐＨを１ＮのＮａＯＨによって１１に調節し、続いて、溶液内へ塩化ナトリウム（１．５ｇｍ）を溶解した。水溶液を、ＤＣＭ（３×３０ｍＬ）で抽出した。ＤＣＭ相を回収し、無水ＭｇＳＯ４（１．５ｇｍ）及びＮａ２ＳＯ４（２０ｇｍ）上で乾燥させた。混合物を濾過して、固形物を除去し、濾液を回転蒸発により乾燥状態まで蒸発させた。残留物を、一晩真空で乾燥させ、２８９ｍｇの固形物（２１）を得た。化合物２１（Ｖａｒｉａｎ、１０ｍｇ／ｍＬのＤＭＳＯ−ｄ６、δ）の１Ｈ  ＮＭＲは、１．３７ｐｐｍでの単一のピークの出現によって示されるように、末端Ｂｏｃ基の完全な開裂を示した。化合物２１（Ｖａｒｉａｎ、１０ｍｇ／ｍＬのＤＭＳＯ−ｄ６、δ）の１Ｈ  ＮＭＲは、１．３７ｐｐｍでの単一のピークの出現によって示されるように、末端Ｂｏｃ基の完全な開裂を示した。
【０１８７】
化合物２１（１５０ｍｇ、５．８６×１０−３ｍｍｏｌ、１当量）をクロロホルム（６ｍＬ）に溶解し、次いで、これを回転蒸発により乾燥状態まで蒸発させた。残留物をＤＣＭ（６ｍＬ）に溶解し、アルゴン雰囲気下で保護した。スクシンイミジルヨードアセテート（３．４ｍｇ、１．２×１０−２ｍｍｏｌ、２．０当量）を添加し、続いて、ＴＥＡ（６．５μＬ、４．７×１０−２ｍｍｏｌ、８当量）を添加した。溶液を、暗中で一晩撹拌させた。次いで、溶液を、撹拌しながら、８０ｍＬのジエチルエーテル内へ緩徐に添加して、生成物を析出した。析出物を濾過し、ジエチルエーテル（５ｍＬ）ですすぎ、真空で乾燥させて、１４０ｍｇの白い粉末を得た。固形物を、５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４（７ｍＬ、ｐＨ４．６）に溶解した。次いで、溶液を、Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ（３−１２ｍＬ、２，０００ＭＷＣＯ）透析カセットで、脱イオン水（３×１Ｌ）に対して一晩透析した。溶液を、回転蒸発により乾燥状態まで蒸発させた。残留物をクロロホルム（５ｍＬ）に溶解し、蒸発させた。残留物を、クロロホルム（５ｍＬ）に再溶解させ、乾燥状態まで蒸発させた。次いで、残留物をＤＣＭ（６ｍＬ）に溶解し、次いで、撹拌しながらジエチルエーテル（８０ｍＬ）中で析出させた。析出物を濾過し、ジエチルエーテル（５ｍＬ）ですすぎ、真空で乾燥させて、１１８ｍｇの白い粉末（２２）を得た。２２の逆相ＨＰＬＣ分析は、９９％超の純度を示した。２２のヨードアセトアミド置換は、３−メルカプトプロピオン酸との反応後、イオン交換クロマトグラフィーによって決定された、６７％であった。
【０１８８】
実施例１２．抗体へのＰＯＺ（ビオチン）１０マレイミドの複合化
５、１０、及び２０ｋＤａのＰＯＺ（ビオチン）１０−マレイミド試薬を、Ｒ１１ｓｃ−Ｆｖ−ＦＣ特異的ＲＯＲ１抗体と結合させた。典型的な複合化条件は、１００ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．２）に溶解した、抗体４μＭ、ＰＯＺ−ビオチン１００μＭ、ＤＴＴ０．１ｍＭであり、室温で１時間撹拌した。次いで、タンパク質Ａ分離カラムを使用して、１００ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）の洗浄緩衝液及び溶出緩衝液を用いて、抗体及びＰＯＺ抗体複合体から非複合ＰＯＺポリマーを分離する。次いで、ポリマー骨格に連結したビチオンがアビジンに対して強い親和性を有する、モノマーアビジンフロースルーキットを用いて、複合化抗体を非複合抗体から分離した。次いで、異なる分子量のＰＯＺ複合体を、ＨＢＬ−２（ＲＯＲ＋）及びＭＥＣ−１（ＲＯＲ−）細胞と一緒に培養した。図１は、ＰＯＺポリマーの大きさが、抗体上の単一の部位に結合するとき、抗原（ＨＢＬ−２）を発現する細胞に選択的に結合するその能力を変えないようであることを示し、ポリマー複合体は、抗原（ＭＥＣ−１）を発現しない細胞には、ほとんど結合を示さない。
【０１８９】
ＰＯＺ−ＡＤＣ結合活性は、ＥＬＩＳＡによっても検証することができる。９６個のウェルプレートの各ウェルを、ｈＲＯＲ１ＥＣＤ抗原でコーティングし、ＴＢＳ中で１時間、３７℃で培養する。１５０μＬの３％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ／ＴＢＳを用いて、３７℃で１時間ブロックした後、ＰＯＺポリマーが結合しているか、または結合していないＲ１１ｓｃ−Ｆｖ−ＦＣ特異的ＲＯＲ１抗体を添加し、３７℃で２時間培養する。この実験で使用したＰＯＺ分子は、上述のＰＯＺ  １０ｐマレイミドポリマーである。各ウェルの洗浄、断片特異的二次抗体の希釈後、ＨＲＰ活性で安定化した抗ヒトロバＩｇＧＦｃγを添加した。水での洗浄後、２，２′−アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリ）−６−スルホン酸を使用して、比色検出を行う。吸光度を、マイクロプレートリーダを使用して、４０５ｎｍで測定する。吸光度対ＲＯＲ１抗体濃度のプロット（図２）を、作製して、生来の抗体対ポリマーＡＤＣ複合化抗体の結合効率を描く。このプロットは、生来の抗体及びポリマーＡＤＣ複合化抗体が、類似した様式でｈＲＯＲ１  ＥＣＤ抗原を結合させることを示し、ＰＯＺポリマーが抗原結合の妨げにならないという結論につながった。
【０１９０】
実施例１３．抗体へのＰＯＺ  ２０Ｋペンダント［（ビオチン）２（ＰＥＧ４−ＶＣ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＥ）１］ｒ−ヨードアセトアミド及びＰＯＺ  ２０Ｋペンダント［（ビオチン）２（ＰＥＧ４−ＶＣ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＥ）５］ｒ−ヨードアセトアミドの複合化
ＰＯＺ  ２０Ｋペンダント［（ビオチン）２（ＰＥＧ４−ＶＣ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＥ）１］ａ−ヨードアセトアミド及びＰＯＺ  ２０Ｋペンダント［（ビオチン）２（ＰＥＧ４−ＶＣ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＥ）５］ａ−ヨードアセトアミドを、Ｒ１１  ｓｃ−Ｆｖ−Ｆｃ特定のＲＯＲ１抗体、Ｒ１２  ｓｃ−Ｆｖ−Ｆｃ特定のＲＯＲ２抗体、及びＣＤ７９ｂ抗体と結合させた。複合化及び精製条件は、上に説明している。タンパク質Ａ分離カラムを使用して、１００ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）の洗浄緩衝液及び溶出緩衝液を用いて、生来の抗体及びＰＯＺ抗体複合体から非複合ＰＯＺポリマーを分離する。次いで、ポリマー骨格上のビチオンがアビジンに対して強い親和性を有する、モノマーアビジンフロースルーキットを用いて、ＰＯＺ複合化抗体を非複合抗体から分離した。図３のＣＤ−７９ｂ  ＰＯＺ  ｖａｌ−ｃｉｔ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＥ複合体のＳＤＳ  ＰＡＧＥパターン（クマシー染料）は、複合化及び精製の各ステップを示す。次いで、精製したＰＯＺ抗体複合体を、ＨＢＬ−２（ＲＯＲ＋）、ＭＥＣ−１（ＲＯＲ−）、及びラモス細胞と一緒に培養した。フローサイトメトリーは、ラモス細胞への、かつＭＥＣ−１細胞（データは示さず）にではない、全てのＰＯＺ複合体の高い細胞表面結合を示した。レーン割り当ては、以下に示す。
【表１】
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【０１９１】
実施例１４．抗体へのＰＯＺ  ２０Ｋペンダント［（ビオチン）２（ＰＥＧ４−ＶＣ−ＰＡＢＣ−デアセチルコルヒチン）６］ａ−ヨードアセトアミド及びＰＯＺ  ２０Ｋペンダント［（ビオチン）２（ＰＥＧ４−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＰＡＢＣ−デアセチルコルヒチン）５］ａ−ヨードアセトアミドの複合化
ＰＯＺ（ビオチン）２（Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＤＣ）６ヨードアセトアミド及びＰＯＺ（ビオチン）２（Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＰＡＢ−ＤＣ）５ヨードアセトアミドを、Ｒ１１、Ｒ１２  ｓｃ−Ｆｖ−ＦＣ特異的ＲＯＲ１及びＲＯＲ２抗体、ならびにＣＤ７９ｂ抗体に結合させた。典型的な複合化及び精製条件は、上に説明している。結合及び精製の各ステップの間のＣＤ−７９ｂ  ＰＯＺ（ｐｈｅ−ｌｙｓ−ＰＡＢ−ＤＣ）５複合体のＳＤＳ  ＰＡＧＥパターン（クマシー染料）は、複合化及び精製が起こったことを示す。次いで、純粋ＰＯＺ抗体複合体を、ＨＢＬ−２（ＲＯＲ＋）、ＭＥＣ−１（ＲＯＲ−）、及びラモス細胞と一緒に培養した。フローサイトメトリーデータは、ＨＢＬ−２及びラモス細胞へ、及びＭＥＣ−１細胞へではない全てのＰＯＺ複合体の高い細胞表面結合を示す。
【０１９２】
実施例１５．ＰＯＺ  ２０Ｋペンダント（ＰＥＧ４−ＶＣ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＥ）１、ＰＯＺ  ２０Ｋペンダント（ＰＥＧ４−ＶＣ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＥ）５、ＰＯＺ（ＰＥＧ４−ＶＣ−ＰＡＢＣ−デアセチルコルヒチン）６、及びＰＯＺ  ２０Ｋペンダント（ＰＥＧ４−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＰＡＢＣ−デアセチルコルヒチン）５のＣＤ７９ｂ複合体の能力
ラモス及びＭＥＣ−１細胞を、細胞毒性アッセイで９６時間、ＣＤ７９ｂ−複合化ＰＯＺ薬物複合体の異なる濃度を用いて培養した。図４は、試験管内における、ラモス細胞の生存率（％）への、ＣＤ７９ｂ−ＰＯＺ複合体の濃度上昇の影響を示す。このデータは、１個のＭＭＡＥ分子が結合したＰＯＺ  Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ複合体が、約２０ｎＭのＩＣ５０を有したことを示す。平均５個のＭＭＡＥ分子を有する複合体と比較したとき、ＩＣ５０は、おおよそ１ｌｏｇ〜約２ｎＭまで低減された。このデータは、１つのＰＯＺ複合体当たりのＭＭＡＥ分子の数の増加が、ＩＣ５０を１０倍に増加させ、すなわち、より大きい薬物抗体比（ＤＡＲ）が、ポリマーＡＤＣの活性及び能力を改善することを示す。ＣＤ−７９ｂ複合体の両方がラモス細胞への高い細胞表面結合を有したにもかかわらず、ＤＣのＰＯＺ  ｖａｌ−ｃｉｔ−ＰＡＢ複合体は、約２００ｎＭのＩＣ５０を有し、ＤＣのＰＯＺ  Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＰＡＢ複合体は、活性が低減した。これは、デアセチルコルヒチン（ＤＣ）が、本ラモス細胞研究において、ＭＭＡＥほど効能がないことを示唆する。さらに、Ｖａｌ−Ｃｉｔリンカーは、細胞内放出により堪能であるようであり、これは、細胞内放出が因子である一部の用途にとって魅力的なものにし得る。図５は、ＭＥＣ−１細胞の生存率（％）への、ＣＤ７９ｂ−ＰＯＺ複合体の濃度の影響を示す。このデータは、ＭＭＡＥのＰＯＺ  ｖａｌ−ｃｉｔ−ＰＡＢ複合体が、３００ｎＭ超のＩＣ５０を有し、細胞毒性剤としてのＤＣを有さない複合体は、活性がなかったことを示す。全てのこれらの複合体は、予期されたように、ＣＤ７９ｂ抗体に対する抗原の低い濃度に起因して、ＭＥＣ−１細胞への低い細胞表面結合を有した。
【０１９３】
実施例１６．ＰＯＺ  ２０Ｋペンダント（ＰＥＧ４−ＶＣ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＥ）５のＲ１１複合体の能力
ＨＢＬ−２及びＭＥＣ−１細胞を、細胞毒性アッセイで９６時間、ＰＯＺ−ＭＭＡＥと複合化したＲ１１の異なる濃度を用いて培養した。図６は、試験管内における、ＨＢＬ−２（ＲＯＲ＋）及びＭＥＣ−１（ＲＯＲ−）細胞の生存率（％）への、Ｒ１１−ＰＯＺ−（ＰＥＧ４−ＶＣ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＥ）５複合体の濃度の影響を示す。このデータは、この化合物が、ＨＢＬ−２細胞に対して、約２００ｎＭのＩＣ５０を有し、ＭＥＣ−１細胞に対しては活性がないことを示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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