(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト由来サイログロブリンをアフィニティー精製し、得られたサイログロブリンを使用して抗サイログロブリン抗体測定免疫反応試薬を製造する方法であって、アフィニティー精製がＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ及びＰｒｏｔｅｉｎ  Ｌから選ばれた１種類又は２種類以上の組み合わせで行われるものであり、アフィニティー精製して得られたサイログロブリンを固相に固定化する工程を有し、かつ、抗サイログロブリン抗体測定免疫反応試薬が、固相に固定化されたサイログロブリンと酵素標識抗ヒトＩｇＧ抗体を有することを特徴とする、免疫反応試薬の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、体外診断薬等に使用される抗サイログロブリン抗体測定免疫反応試薬の製造方法であって、固相に固定化するサイログロブリンを精製することにより、測定再現性及び測定感度を向上させるものである。
【背景技術】
【０００２】
サイログロブリン（以下、Ｔｇ）は分子量約６６万の糖蛋白質で甲状腺ホルモンの合成の場として機能している。このＴｇに対する自己抗体すなわち抗サイログロブリン抗体（以下、ＴｇＡｂ）がバセドウ病や橋本病等の自己免疫性甲状腺疾患に関係することは従来から知られており、ＴｇＡｂの測定は抗マイクロゾーム抗体とともにこれらの疾患の診断、治療の指標として広く用いられている。またＴｇＡｂは甲状腺疾患以外の自己免疫疾患に対して陽性を示すという報告もある。ＴｇＡｂの測定には凝集法を測定原理とした半定量法が行われていたが、感度や特異性の点で十分ではなかった。そこで、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ法）やエンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ法）、化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ法）、化学発光免疫測定法（ＣＬＩＡ法）等の定量法が報告されＴｇＡｂ定量の有用性が明らかとなってきた。
【０００３】
この免疫測定法の測定原理は固相法であり、ヒトＴｇ抗原と抗ヒトＩｇＧ抗体を用いた２ステップサンドイッチ法である。固相に固定化されたＴｇと検体にて第一免疫反応が開始される。一定時間・一定温度でインキュベートした後、洗浄水で未反応の検体成分を除去する（Ｂ／Ｆ分離）。Ｂ／Ｆ分離後、酵素標識抗ヒトＩｇＧ抗体を加えることにより第二免疫反応が開始される。一定時間・一定温度でインキュベートした後、洗浄水で未反応の酵素標識抗体を除去する（Ｂ／Ｆ分離）。この後、固相に結合した酵素活性を測定するために基質を添加し、蛍光物質や発光物質の生成速度もしくは蛍光強度や発光強度を測定することにより、検体中のＴｇＡｂ濃度を知ることができる。
【０００４】
この固相抗原に使用されるＴｇ抗原は、遺伝子組み換え（リコンビナント）蛋白質ではなく、ヒト由来の蛋白質が用いられている。
【０００５】
ヒトＴｇ抗原提供者がＴｇに対する自己抗体（ＴｇＡｂ）を有している場合、免疫反応試薬として作製する以前からＴｇにＴｇＡｂが結合していることとなる。固相抗原の原料として、このＴｇＡｂが結合したＴｇを用いると、本来の測定値よりも高値に測定されてしまう、もしくはバックグラウンド上昇により高感度に測定ができないといった現象が発生する。
【０００６】
更に抗原提供者毎や提供時期毎にＴｇＡｂ保有量が異なる場合、固相抗原の原料としてのＴｇの品質が一定しない。その結果、ロット間差や測定再現性の悪化といった現象が発生する。
【０００７】
以上のことから、ヒト由来Ｔｇを固相抗原の原料とすることに起因して、ＴｇＡｂ測定にて高精度に測定することが妨げられることが問題となっていた。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
臨床検査の分野において、ＴｇＡｂを高精度に測定するために、測定時におけるバックグラウンド上昇の抑制、ロット間差の抑制、測定再現性が同時に求められている。
【０００９】
そこで本発明の目的は、効果的にバックグラウンド上昇を抑制することができ、ロット間差を抑制することができ、かつ測定再現性が良好となる体外診断薬等に使用されるＴｇＡｂ測定免疫反応試薬の製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、前記課題を解決すべく鋭意検討を行なった結果、ヒト由来Ｔｇに結合している抗体を除去することによってＴｇを精製することにより、バックグラウンド上昇の抑制とロット間差の抑制と測定再現性が共に良好であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
即ち本発明は以下のとおりである。
（１）ヒト由来Ｔｇをアフィニティー精製し、得られたＴｇを使用してＴｇＡｂ測定免疫反応試薬を製造することを特徴とする、免疫反応試薬の製造方法。
（２）アフィニティー精製がＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ及びＰｒｏｔｅｉｎ  Ｌから選ばれた１種類又は２種類以上の組み合わせで行われる、（１）に記載の製造方法。
（３）アフィニティー精製して得られたＴｇを固相に固定化する工程を有する、（１）又は（２）に記載の製造方法。
（４）ヒト由来Ｔｇを固相に固定化した後にアフィニティー精製する、（１）又は（２）に記載の製造方法。
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１３】
本発明に用いられるヒト由来Ｔｇは、ヒトから提供されたものである。そのため、Ｔｇに対する自己抗体であるＴｇＡｂが結合している場合がある。
【００１４】
本発明において、ヒト由来Ｔｇに結合している抗体の除去は、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌ等が結合した樹脂や磁気ビーズを用いたアフィニティー精製により行われる。Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌ等の中から１種類を選択して使用してもよく、２種類以上を組み合わせて使用してもよい。このとき先にヒト由来Ｔｇの精製を行い、次いで得られたＴｇの固相への固定化を行う場合には、アフィニティー精製は樹脂と磁気ビーズのいずれも使用することができる。磁性体を含むビーズや微粒子にヒト由来Ｔｇを固定化した後に精製を行う場合には、アフィニティー精製は磁性体を含まない樹脂を使用することができる。磁性体を含まないビーズや微粒子にヒト由来Ｔｇを固定化した後に精製を行う場合には、アフィニティー精製は磁気ビーズを使用することができる。
【００１５】
このようにして精製されたＴｇを用いてＴｇＡｂ測定免疫反応試薬を製造する。この試薬は例えば固相に固定化されたＴｇと酵素標識抗ヒトＩｇＧ抗体を有するものである。この免疫測定試薬の測定原理は固相法であり、ヒトＴｇ抗原と抗ヒトＩｇＧ抗体を用いた２ステップサンドイッチ法である。固相に固定化されたＴｇと検体にて第一免疫反応が開始される。一定時間・一定温度でインキュベートした後、洗浄水で未反応の検体成分を除去する（Ｂ／Ｆ分離）。Ｂ／Ｆ分離後、酵素標識抗ヒトＩｇＧ抗体を加えることにより第二免疫反応が開始される。一定時間・一定温度でインキュベートした後、洗浄水で未反応の酵素標識抗体を除去する（Ｂ／Ｆ分離）。この後、固相に結合した酵素活性を測定するために基質を添加し、蛍光物質や発光物質の生成速度もしくは蛍光強度や発光強度を測定することにより、検体中のＴｇＡｂ濃度を知ることができる。
【００１６】
本発明において固相に固定化されたＴｇは、ビーズや微粒子などの固相担体に固定化したＴｇで、抗原抗体反応を行う溶液に不溶性のものを指すが、固相に直接Ｔｇが結合していなくても、アビジン−酵素複合体を結合するためのビオチンを結合したＴｇで可溶性のものも含まれる。
【００１７】
固相担体としては、ビーズや微粒子を使用することできる。特に微粒子が好ましく、ガラス、金属、セラミツクス等の無機物であってもよく、また高分子ポリマー等の有機物であってもよい。またそれらの微粒子は磁性体を含むものであってもよい。微粒子の粒子径は０．１から５０μｍが好ましく、さらには１から１０μｍが好ましい。
【００１８】
酵素標識抗ヒトＩｇＧ抗体は、酵素を結合した抗ヒトＩｇＧ抗体で、抗原抗体反応を行う溶液に可溶性のものを指すが、酵素を直接抗体に結合していなくても、アビジン−酵素複合体を結合するためのビオチンを結合した抗体で可溶性のものも含まれる。
【００１９】
本発明における抗ヒトＩｇＧ抗体はポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよく、抗体を産生する実際上任意の動物種、例えばウサギ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウマ、マウスまたはラットなど由来の抗体が使用できる。抗体の形態には完全抗体や、それを酵素処理や化学処理により切断したＦ（ａｂ’）２やＦａｂ’等のような抗体断片であってもよい。
【００２０】
酵素としては特に限定されるものではないが、例えばアルカリ性ホスファターゼ、パーオキシダーゼ等があげられる。
【００２１】
本発明では、免疫反応試薬製造時に蛋白質を共存させてもよく、それらは特に限定されるものではないが、例えばウシ血清アルブミン、コラーゲンペプチド、カゼイン、カゼインナトリウム、スキムミルク等を使用することができる。０．１〜２０％（重量／容量）の濃度範囲とすることが好ましく、特に１〜１０％（重量／容量）の濃度範囲とすることが好ましい。また糖、緩衝液や塩類を共存させてもよく、それらは特に限定されるものではないが、糖であれば例えばスクロース、マンニトール、トレハロースやイノシトール等を使用することができる。緩衝液としては、例えばＴｒｉｓ、ＭＯＰＳＯ、ＭＯＰＳやＭＥＳ等を使用することができ、塩類としては、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、塩化亜鉛等を使用することができる。なお、これら以外にも、必要に応じて他の試薬成分等を共存させることもできる。
【００２２】
このようにして、ヒト由来Ｔｇを精製することにより、Ｔｇ提供者由来の自己抗体（ＴｇＡｂ）を除去し、その後に精製Ｔｇを固相に固定化し、これを固相抗原とするＴｇＡｂ測定免疫反応試薬を製造することができる。また、ヒト由来Ｔｇを固相に固定化し、その後に精製することにより、Ｔｇ提供者由来の自己抗体（ＴｇＡｂ）を除去し、これを固相抗原とするＴｇＡｂ測定免疫反応試薬を製造することができる。
【発明の効果】
【００２３】
本発明によれば、効果的にバックグラウンド上昇を抑制することができ、ロット間差を抑制することができ、かつ測定再現性が良好となる体外診断薬等に使用されるＴｇＡｂ測定免疫反応試薬を得ることが可能となる。例えば、本発明で得られたＴｇＡｂ測定免疫反応試薬は精度よく測定することができるので、本発明によって高精度なＴｇＡｂ測定も実現できる。
【実施例】
【００２４】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は本実施例により限定されるものではない。免疫測定装置として全自動エンザイムイムノアッセイ装置（ＡＩＡ−ＣＬ２４００、東ソー社製）と免疫測定用試薬として当該装置用免疫反応試薬を用い、２ステップサンドイッチ法により各測定を行った。なお、各免疫反応試薬は後述したようにして調製した。
【００２５】
（実施例１）
ヒトＴｇ抗原をＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇ樹脂にてアフィニティー精製を行い、精製Ｔｇを得た。得られたＴｇを磁性微粒子（２．５μｍ）に固定化し、Ｔｇ固定化磁性微粒子を得た。このＴｇ固定化磁性微粒子をウシ血清、コラーゲンペプチド、スクロース、塩化ナトリウムを含むＴｒｉｓ緩衝液に加えて凍結乾燥を行った。一方、アルカリ性ホスファターゼ標識抗ヒトＩｇＧ抗体をコラーゲンペプチド、トレハロース、塩化マグネシウム、塩化亜鉛を含むＴｒｉｓ緩衝液に加えて凍結乾燥を行った。
【００２６】
前記自動免疫測定装置で試薬に対して０濃度サンプル、血漿及び血清を測定し、アルカリ性ホスファターゼの基質である化学発光基質の発光強度を測定した。各サンプルは５回ずつ測定し、その平均値を測定値とした。０濃度サンプルの測定値と２ＳＤを元に、低濃度検出限界（ＭＤＣ）を算出した。血漿及び血清サンプルに関しては、その測定値を元に、濃度及び測定再現性を算出した。結果を表１に示す。
【００２７】
（実施例２）
ロットの異なるヒトＴｇ抗原を使用した以外は、実施例１と同様の方法でＴｇを精製および試薬の調製を行った。前記自動免疫測定装置で試薬に対して、実施例１と同様の方法でサンプル測定を行った。結果を表１に示す。
【００２８】
（比較例１）
ＴｇをＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇ樹脂にてアフィニティー精製を行わなかった以外は、実施例１と同一ロットのＴｇを用い、実施例１と同様の方法で試薬の調製を行った。前記自動免疫測定装置で試薬に対して、実施例１と同様の方法でサンプル測定を行った。結果を表１に示す。
【００２９】
（比較例２）
実施例２と同一ロットのＴｇを用い、ＴｇをＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇ樹脂にてアフィニティー精製を行わなかった以外は、実施例１と同様の方法で試薬の調製を行った。前記自動免疫測定装置で試薬に対して、実施例１と同様の方法でサンプル測定を行った。結果を表１に示す。
【００３０】
【表１】
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０濃度サンプル品の発光強度（Ｃｏｕｎｔ／ｓｅｃ．）は、比較例１の９２２に対して実施例１は１３６と、約８００低減させる結果があり、低濃度検出限界（ＭＤＣ）も０．３６８（ＩＵ／ｍＬ）から０．０３３（ＩＵ／ｍＬ）と１０倍以上良好となる結果であった。また、比較例２の５６７に対して実施例２は１６４と、約４００低減させる結果があり、低濃度検出限界（ＭＤＣ）も０．２４３（ＩＵ／ｍＬ）から０．１０８（ＩＵ／ｍＬ）と２倍以上良好となる結果であった。さらに、比較例１と比較例２にておいては差が４００以上ありロット間差が確認されたが、実施例１と実施例２にておいては差が３０弱であり、ロット間差を抑制していることがわかる。
【００３１】
血漿及び血清サンプルの測定濃度の実施例１と実施例２の比較では、血漿サンプルで３８．８（ＩＵ／ｍＬ）と３７．０（ＩＵ／ｍＬ）、血清サンプルＡで５１１．９（ＩＵ／ｍＬ）と４８９．７（ＩＵ／ｍＬ）、血清サンプルＢで１，４２１．３（ＩＵ／ｍＬ）と１，４４３．５（ＩＵ／ｍＬ）であり、全てにおいて測定値の差は５％以内に収まっており、ロット間差を抑制していることがわかる。
【００３２】
血漿及び血清サンプルの測定再現性については、比較例１ではそれぞれ６．７％、４．８％、３．１％であるが、実施例１ではそれぞれ４．６％、１．３％、３．０％と全てのサンプルにおいて向上している結果であった。また、比較例２ではそれぞれ６．２％、２．５％、４．６％であるが、実施例２ではそれぞれ３．５％、２．３％、４．１％と全てのサンプルにおいて向上している結果であった。
【００３３】
以上の結果から、ヒト由来Ｔｇを精製してＴｇ提供者由来の自己抗体（ＴｇＡｂ）を除去することにより、免疫反応試薬の性能が向上したことを示している。