(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
遠心チューブ（４５０）用インサート（１００，２００，３００，５００，６００）であって、
凸型の上面（２１，２２１，３２１）及び１以上の凹部（２４，１２４，２２４，３２４，４２４）をその場に有する外縁（２２，１２２，２２２，３２２，４２２）を備えた、チューブ（４５０）を上部と下部に分割するために、遠心チューブ（４５０）内に適合するようにサイズ化されたディスク（２０，１２０，２２０，４２０）、並びに
インサート（１００，２００，３００，５００，６００）がチューブ（４５０）内に配置された場合、チューブ（４５０）の底に接触する、ディスク（２０，１２０，２２０，４２０）の下面（２６，１２６，４２６）から伸び、且つ前記遠心チューブ（４５０）内の所望の位置に前記ディスク（２０，１２０，２２０，４２０）を保つ支柱（３０，１３０，４３０）、
を備え、
１以上の凹部（２４，１２４，２２４，３２４，４２４）が、チューブ（４５０）の上部と下部との間の流体連通を可能にする、インサート（１００，２００，３００，５００，６００）。
【請求項２】
１以上の凹部（２４，１２４，２２４，３２４，４２４）が、１以上の凹部（２４，１２４，２２４，３２４，４２４）にわたって表面張力を発生させ、遠心力の不在下で液体の流動を制限するようにサイズ化される、請求項１に記載のインサート（１００，２００，３００，５００，６００）。
【請求項３】
上面（２１，２２１，３２１）が、１以上の凹部（２４，１２４，２２４，３２４，４２４）につながる１以上の溝（２８，１２８，２２８，３２８）をさらに備える、請求項１又は請求項２に記載のインサート（１００，２００，３００，５００，６００）。
【請求項４】
ディスク（２０，１２０，２２０，４２０）の上面（２１，２２１，３２１）が把持要素（４０，１４０，３３０，４４０）をさらに備える、請求項１乃至請求項３のいずれか１項に記載のインサート（１００，２００，３００，５００，６００）。
【請求項５】
把持要素（４０，１４０，３３０，４４０）が、ディスク（２０，１２０，２２０，４２０）の上面（２１，２２１，３２１）の中心にある、請求項４に記載のインサート（１００，２００，３００，５００，６００）。
【請求項６】
把持要素（４０，１４０，３３０，４４０）が棒の形態である、請求項４又は請求項５に記載のインサート（１００，２００，３００，５００，６００）。
【請求項７】
１以上の溝（２８，１２８，２２８，３２８）が、ディスク（２０，１２０，２２０，４２０）の中心と１以上の凹部（２４，１２４，２２４，３２４，４２４）とをつないでいる、請求項３乃至請求項６のいずれか１項に記載のインサート（１００，２００，３００，５００，６００）。
【請求項８】
溝（２８，１２８，２２８，３２８）が扇形であり、凹部（２４，１２４，２２４，３２４，４２４）の場所よりもディスク（２０，１２０，２２０，４２０）の中心において狭くなっている、請求項３乃至請求項７のいずれか１項に記載のインサート（１００，２００，３００，５００，６００）。
【請求項９】
ディスク（２０，１２０，２２０，４２０）の下面（２６，１２６，４２６）が凸型である、請求項１乃至請求項８のいずれか１項に記載のインサート（１００，２００，３００，５００，６００）。
【請求項１０】
１以上の凹部（２４，１２４，２２４，３２４，４２４）が半円形又は長円形である、請求項１乃至請求項９のいずれか１項に記載のインサート（１００，２００，３００，５００，６００）。
【請求項１１】
インサート（１００，２００，３００，５００，６００）がポリマーで構成される、請求項１乃至請求項１０のいずれか１項に記載のインサート（１００，２００，３００，５００，６００）。
【請求項１２】
インサート（１００，２００，３００，５００，６００）が、オートクレーブ処理、化学処理、及び／又はエネルギーの照射によって処理されている、請求項１乃至請求項１１のいずれか１項に記載のインサート（１００，２００，３００，５００，６００）。
【請求項１３】
請求項１乃至請求項１２のいずれか１項に記載のインサート（１００，２００，３００，５００，６００）を備える遠心チューブ（４５０）。
【請求項１４】
密度勾配媒体（４６０）をさらに含む、請求項１３に記載の遠心チューブ（４５０）。
【請求項１５】
細胞を分離するための方法であって、
ｉ）一定量の密度勾配媒体（４６０）を遠心チューブ（４５０）に加えるステップ、
ｉｉ）請求項１乃至請求項１２のいずれか１項に記載のインサート（１００，２００，３００，５００，６００）を、支柱（３０，１３０，４３０）がチューブ（４５０）の底に接触するように、密度勾配媒体（４６０）の表面に配置するステップ、
ｉｉｉ）１以上の細胞を含有する液体試料（４６２）をディスク（２０，１２０，２２０，４２０）の上面にわたって分注し、密度勾配媒体（４６０）と試料（４６２）との間に界面を形成するステップ、並びに、
ｉｖ）チューブ（４５０）を遠心分離して、１以上の細胞を試料から分離するステップ、
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体物質、特に異なる密度の細胞集団を分離するためのデバイス、方法及びキットに関する。本発明は、血液を様々な成分又は細胞集団に分離するのに特に有用である。
【背景技術】
【０００２】
医学及び生物学において、密度勾配は、血液を、赤血球、白血球及び血漿などの異なる分画に分離するために一般に使用される。血液を、規定密度の媒体（例えば、Ｆｉｃｏｌｌ（商標）、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（商標）、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に重層し、その後遠心分離する。遠心分離プロセスに際して、血液成分の示差的移動が起こり、各血液分画の層の形成がもたらされる。赤血球はＦｉｃｏｌｌ層を通って移動し、チューブの底に沈殿するが、白血球はＦｉｃｏｌｌより上で、血漿層より下の界面に移動する。白血球は、名目上は１％未満の抹消血を含むが、この技術は、それらの有効で容易な精製を可能にする。
【０００３】
血液分画の有効な分離のために、密度勾配媒体と血液試料との間の界面は、可能な限り明確で、混合は最小でなければならない。これを成し遂げることは困難であり、熟練した確実な技能及び忍耐が要求される。したがって、遠心分離前の密度勾配媒体上への血液の負荷は非常に時間がかかる。さらにこの界面は壊れやすく、チューブをたたいた場合、界面は容易に混合され、破壊されてしまう可能性がある。
【０００４】
遠心分離後に分離されたバンド又は分画の除去又は収集もまた、分画を崩壊又は破壊せず、密度勾配媒体の過剰な持ち越しを回避するように、オペレーターが注意を払う必要がある技術的に困難な課題を提示する。
【０００５】
これらの問題に対処する方法及びデバイスが開発されてきた。
【０００６】
国際公開第２０１２／１４９６４１号（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．）は、試料中に存在する異なる細胞集団の密度勾配分離を支援する、遠心チューブ用のインサートを記載している。このインサートは、遠心チューブ内に適合するようにサイズ化され、支持体、通常円筒形の支持体により位置決め又は安定化され、それによってチューブを上部と下部とに分割する部材を有する。この部材は、普通凹型の構造であり、２以上の開口を有し、その一方は、インサートが適所に配置された場合、チューブの下端部に近く、液体を底部へと通過させるように機能し、第２の開口は、空気を逃がして圧力を均一にするように機能する。このようなインサートを組み込んだ遠心チューブは、市販品として、すなわち、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．からＳｅｐＭａｔｅ（商標）として利用可能である。
【０００７】
Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから利用可能なＡｃｃｕｓｐｉｎ（商標）チューブは、密度勾配媒体、例えば、リンパ球と他の単核細胞との分離用のＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ（登録商標）などと一緒に使用するために設計されている。Ａｃｃｕｓｐｉｎチューブ（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅから利用可能なＬｅｕｃｏｓｅｐ（商標）チューブとしても公知である）は、多孔質高密度ポリエチレン障壁又はフリットにより分離された２つのチャンバを有する、特別に設計されたポリプロピレン遠心チューブである。密度勾配媒体、例えば、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７を、フリットの下の下部チャンバに加える。血液試料を、上部チャンバに加え、チューブを遠心分離する。遠心分離において、赤血球は、密度勾配媒体を含有するチューブの底部に沈殿し、一方、リンパ球及び単球などの単核細胞は、血漿／Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７の界面に濃密なバンドを形成する。このバンドを、その後デカントにより、又はピペットを用いて除去することができる。赤血球の混入は、チャンバの間の障壁により回避される。
【０００８】
Ｆｌｏａｔｉｅｓ（商標）（ｗｗｗ．Ｂｉｏｆｌｏａｔｉｅｓ．ｃｏｍ）は、小型のオートクレーブ処理可能なポリマーブレンドビーズであり、密度勾配遠心分離による、ヒト全血及び臍帯血試料からの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）のｉｎ  ｖｉｔｒｏ単離用に設計されている。ビーズを、遠心チューブ中の密度勾配媒体の上部に直接充填し、血液試料を穏やかに加える。ビーズの大部分は試料の上部に上昇し、試料はその後チューブの中で遠心分離される。遠心分離後、ＰＢＭＣは血漿−密度勾配媒体の界面近くに層又はバンドを形成し、ビーズ層の間にピペットを挿入することによって収集される。
【０００９】
前述の問題を克服するために多数の市販の製品が利用可能であるが、コスト効率のよい様式で血液分画の有効な分離を成し遂げるための単純で柔軟性のある手段に対する必要性が依然として存在する。本発明は、新規なインサート、方法、遠心チューブ及びキットの提供によりこの必要性に対処する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開第２０１２／１４９６４１号
【発明の概要】
【００１１】
本発明の第１の態様に従って、遠心チューブ用インサート（１００）であって、凸型の上面（２１）及び１以上の凹部（２４）をその場に有する外縁（２２）を備えた、チューブを上部と下部に分割するために、遠心チューブ内に適合するようにサイズ化されたディスク（２０）、並びにインサート（１００）がチューブ内に配置された場合、チューブの底に接触する、ディスク（２０）の下面（２６）から伸びる支柱（３０）を備えたインサート（１００）を提供する。
【００１２】
一実施形態では、１以上の凹部（２４）は、チューブの上部と下部との間の流体連通を可能にする。
【００１３】
別の実施形態では、１以上の凹部（２４）は、１以上の凹部（２４）にわたって表面張力を発生させ、遠心力の不在下で液体の流動を制限するようにサイズ化する。
【００１４】
別の実施形態では、上面（２１）は、１以上の凹部（２４）につながる１以上の溝（２８）をさらに備える。
【００１５】
一実施形態では、ディスク（２０）の上面（２１）は、把持要素（４０）をさらに備える。
【００１６】
別の実施形態では、把持要素（４０）は、ディスク（２０）の上面（２１）の中心にある。好ましくは、把持要素（４０）は棒の形態である。
【００１７】
別の実施形態では、１以上の溝（ｇｒｏｖｅ）（２８）は、ディスク（２０）の中心と１以上の凹部（２４）とをつないでいる。
【００１８】
一実施形態では、溝（２８）は扇形であり、凹部（２４）の場所よりもディスク（２０）の中心において狭くなっている。
【００１９】
別の実施形態では、ディスク（２０）の下面（２６）は凸型である。
【００２０】
別の実施形態では、１以上の凹部（２４）は半円形又は長円形である。
【００２１】
一実施形態では、インサートはポリマーで構成される。好ましくは、ポリマーは不活性ポリマーである。好ましくは、ポリマーは、例えばオートクレーブ処理、化学処理により、又はγ線などの適切なエネルギーの照射により滅菌可能である。通常、ポリマーはポリエチレン又はポリプロピレンなどのプラスチックポリマーである。しかし、ポリカーボネート、ポリビニル又はアクリレートポリマーなどの他の不活性プラスチックポリマーも使用することができる。
【００２２】
別の実施形態では、インサートは、微生物汚染を最小にするように処理されている。適切な方法の例としては、オートクレーブ処理、殺菌剤又は抗菌剤による化学処理及び／又はγ線などの適切なエネルギーの照射が挙げられる。
【００２３】
本発明の第２の態様に従って、インサートを備える遠心チューブを提供する。遠心チューブは、密度勾配媒体をさらに含有することができる。
【００２４】
本発明の第３の態様に従って、細胞を分離するための方法であって、
ｉ）一定量の密度勾配媒体を遠心チューブに加えるステップ、
ｉｉ）前述のインサートを、支柱がチューブの底に接触するように、密度勾配媒体の表面に配置するステップ、
ｉｉｉ）１以上の細胞を含有する液体試料をディスクの上面にわたって分注し、密度勾配媒体と試料との間に界面を形成するステップ、並びに、
ｉｖ）チューブを遠心分離して、１以上の細胞を試料から分離するステップ、
を含む方法を提供する。
【００２５】
一実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞、赤血球、白血球及び幹細胞からなる群から選択される。
【００２６】
別の実施形態では、試料は全血を含む。
【００２７】
別の実施形態では、本方法は、１以上の細胞を回収するステップをさらに含む。
【００２８】
本発明の第４の態様に従って、前述のインサート及び遠心チューブを含むキットを提供する。好ましくは、このキットは、一定量の密度勾配媒体をさらに含む。
【００２９】
本発明の第５の態様に従って、前述のインサート及び一定量の密度勾配媒体を提供する。
【００３０】
本発明の第６の態様に従って、１以上の細胞を試料から分離するための前述のインサートの使用を提供する。
【００３１】
定義
本明細書で用いる「遠心チューブ用インサート」という用語は、遠心チューブ内に可逆的又は不可逆的に設置又は固定することができる任意のデバイス又は器具を意味することを意図する。
【００３２】
遠心チューブは、遠心分離可能なチューブである。このチューブは、当分野において一般的なコニカル型の下端部を有しても、又は平坦もしくは丸底であってもよい。市販の遠心チューブの例としては、限定する、ものではないが、Ｎｕｎｃ（商標）コニカル滅菌ポリプロピレン遠心チューブ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標））、Ｎａｌｇｅｎｅ（商標）Ｏａｋ  Ｒｉｄｇｅポリカーボネート、ポリプロピレン又はＴｅｆｌｏｎ（商標）チューブ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標））及びＳｔｅｒｉｌｉｎポリプロピレンチューブ（Ｃａｍｌａｂ、ＵＫ）が挙げられる。
【００３３】
本発明に係るインサートは、様々な容積、例えば、２ｍｌ、５ｍｌ、１０ｍｌ、１５ｍｌ及び５０ｍｌなどの遠心チューブと共に使用可能であることは理解されるであろう。
【００３４】
一態様において、本発明に使用される「細胞」は哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞である。本発明に使用可能な哺乳動物細胞の例としては、限定するものではないが、血液細胞、例えば、赤血球、白血球（白血球、リンパ球、顆粒球及び単球を含む）、血小板及び幹細胞（例えば、造血幹細胞）が挙げられる。
【００３５】
「細胞」は骨髄細胞であってもよい。
【００３６】
本明細書で用いる「幹細胞」という用語は、多能性又は複能性幹細胞を含む。幹細胞の例としては、限定するものではないが、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、成体幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞、間葉系幹細胞及び人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）が挙げられる。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】本発明に係るインサートの一実施形態の３次元斜視図を示す。
【図２】図２ａから図２ｃは、図１のインサートの一連の図を表し、図２ａは平面図、図２ｂは前面図、図２ｃは、裏面図を表す。
【図３】図３ａは、本発明に係るインサートの平面図を示す概略図であり、図３ｂは、溝の詳細な差し込みの図である。
【図４】図４ａ、図４ｂ、及び図４ｃは、本発明に係る一部の差し込みの概略図である。特に、図４ａは、インサートのディスク上面にわたる液体の流動を詳細に表し、図４ｂは隆起の高さを表し、図４ｃは溝の深さを表す。
【図５】図５ａは、空の遠心チューブ内に配置された本発明に係るインサートの概略図であり、図５ｂは、遠心分離前の、充填された遠心チューブ内に配置された本発明に係るインサートの概略図であり、図５ｃは、遠心分離後の、充填された遠心チューブ内に配置された本発明に係るインサートの概略図である。
【図６】遠心分離による分離前の、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ密度勾配媒体（下層、５６０ａ、ｂ及びｃ）及び血液／ＰＢＳミックス（上層、５６２ａ、ｂ及びｃ）を負荷された３つの遠心チューブ（５５０ａ、５５０ｂ及び５５０ｃ）の写真である。
【図７】遠心分離及び分離プロセスの後の、図６に示す３つの遠心チューブの写真である。
【図８】図７の各チューブ（Ａは６５０ａ、Ｂは６５０ｂ及びＣは６５０ｃに対応する）に由来する白血球分画のフローサイトメトリー分析の結果を表すグラフであり、文字Ｇは、白血球分画中に存在する顆粒球の部分集団を示し、Ｍは単球の部分集団及びＬはリンパ球の部分集団を示す。ＦＳＣ及びＳＳＣは、それぞれ、前方散乱及び側方散乱を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
本発明に係るインサートの一実施形態を、図１に３次元斜視図で示す。インサート（１００）は、遠心チューブ（図示せず）内に配置されると、上部と下部に該チューブを分割するように、遠心チューブに適合するような寸法及びサイズの直径を有するディスク（２０）で構成される。インサートは、プラスチック、金属又はガラスなどの適切な材料で製造される、１０、１５又は５０ｍｌなどの規格用量の遠心チューブを含む、任意の遠心チューブに適合するサイズであってよい。別の液体に分離されるべき、標的（血液細胞など）を含有する液体を異なる密度の第１の液体に加えた場合に起こる、異なる密度の液体の混合は、遠心分離において標的と第１の液体との不十分な分離につながるので、インサートは、この混合を最小化するように機能する。インサートはまた、遠心分離プロセスの際の標的と第１の液体との分離を容易にする。通常、第１の液体は密度勾配媒体であり、標的を含有する液体は水性血液試料である。
【００３９】
ディスク（２０）は、凸型の上面（２１）を有し、その外縁（２２）又は外周に複数の凹部（２４）を有し、この凹部はどのような形態を取ってもよいが、一般には曲線状の半円形又は長円形である。ディスク（２０）の下面（図示せず）から伸びる支柱（３０）は、インサート（１００）が遠心チューブ（図示せず）内に配置された場合、該チューブの底のより上にディスク（２０）を支持する脚として機能する。支柱（３０）の長さは、インサートが加えられた場合、ディスクの裏面が液体のメニスカスに接触するように、遠心チューブに加えられた液体の容積に依存してサイズ化される。把持要素（４０）は、遠心チューブ内へのインサート（１００）の配置及びそこからの除去を容易にする。インサートは、例えば、オペレーターの指もしくはピンセットなどの適切な道具の使用によって手作業で、又は自動化もしくはロボット手段によって遠心チューブに配置及び／又は遠心チューブから取り外すことができる。
【００４０】
溝（２８）はディスク（２０）の中心と凹部（２４）とをつないでいる。溝（２８）の目的は、ディスク（２０）の凸型上面（２１）に注がれる液体を、この液体が、チューブの下部に存在する密度勾配媒体などの第１の液体の上に層をなすように凹部（２４）に、分離プロセスを損なう崩壊又は混合が最小になるように流すことである。
【００４１】
図２ａ、２ｂ及び２ｃは、それぞれ、図１のインサート（２００）の平面図、前面図及び底部平面図である。図２ａは、インサート（２００）の上部平面図を提供し、ディスク（１２０）の中心の把持要素（１４０）からディスク（１２０）の外縁（１２２）又は周縁の凹部（１２４）へと連続する溝又は流路（１２８）の配置を示す。インサート（２００）の把持要素（１４０）及び支柱（１３０）、図２ｂの前面図に示す。インサート（２００）の裏面図である図２ｃは、ディスク（１２０）の凹型の下面（１２６）及び中心支柱（１３０）を示す。
【００４２】
本発明に係るインサート（３００）の一実施形態のディスク（２２０）の概略上部平面図を図３ａに示す。実施例において、ディスク（２２０）は、その上面（２２１）の中心（２２９）から外縁（２２２）の凹部（２２４）へ放射状に伸びる扇形の溝を有し、溝（２２８）は外縁よりディスクの中心において狭くなっている。ディスク（２２０）の直径（Ｄ）は、インサートが意図される遠心チューブのサイズ又は容積に依存して変動し、例えば、５０ｍｌの遠心チューブ用のインサートは通常およそ直径２６ｍｍのディスクを有する。このようなインサートに対して、曲線状の凹部は幅（Ｗ）およそ４ｍｍであり、深さ（Ｄ）およそ１ｍｍを有する（図３ｂ）。
【００４３】
図４ａ、ｂ及びｃは、本発明の一実施形態のディスクの部分的概略図を示す。図４ａは、ディスクの上面（３２１）にわたる（矢印の流れの方向により例示される）液体の流れを表す。ディスクの凸型上面の上部に注がれた液体は、扇形の溝（３２８）を進み、溝の長さを凹部（３２４）へと下に流れ、その後ディスク表面から下に流れる。溝（３２８）の深さは、この溝が把持要素（３３０）とぶつかるディスクの中心から増加していき、外縁（３２２）において最大になる。図４ｂは、ディスクの外縁（３２２）の浸水しない周縁の隆起の高さ（Ｈ）を示す詳細の概略であり、５０ｍｌの遠心チューブ用インサートの高さはおよそ１ｍｍである。図４ｃは、溝（３２８）の深さ（Ｄ）を示し、上記インサート用にはおよそ１ｍｍである。深さＤ及び高さＨは、インサートが設計されたチューブの容積に依存して変動する。
【００４４】
図５ａ、ｂ及びｃは、空の遠心チューブ内（図５ａ）、遠心分離前の、充填された遠心チューブ内（図５ｂ）及び遠心分離後の、充填された遠心チューブ内（図５ｃ）に配置された本発明に係るインサートの概略図である。
【００４５】
図５ａは、中空内部（４５２）又は内壁（４５３）により画成されたチャンバを封入する蓋（４５１）を有する、従来の遠心チューブ（４５０）内に配置された本発明に係るインサート（５００）を示す。図５ａの遠心チューブ（４５０）は液体を全く包含していない。チューブの外壁（４５４）及び内壁（４５３）は両方とも不活性材料、例えば、プラスチック、ガラス又は金属で製造されている。遠心チューブ（４５０）は、様々な液体容積、例えば、５ｍｌ、１０ｍｌ、１５及び５０ｍｌに適合するように設計することができ、この壁には、チャンバ（４５２）内に存在する容積を示すように印（４５５）が付けられている。
【００４６】
インサート（５００）は、チューブ（４５０）内への配置を可能にする把持要素（４４０）を有するディスク（４２０）及びチューブの底より上にディスクを支持する支柱（４３０）を備える。液体が、凹部（４２４）以外を通ってチューブの上部からチューブの下部へと通過不可であるように、外縁（４２２）がチューブ（４５０）の内壁（４５３）に接触するようにディスクをサイズ化して、液体不浸透性障壁を提示する。ディスクの外縁に存在する凹部（４２４）は、遠心力の不在下ではディスクを越える液体の流れを制限するように設計する。
【００４７】
図５ｂは、遠心分離及び液体試料（４６２）から密度勾配媒体への細胞の分離前の、２種の液体（４６０及び４６２）、密度勾配媒体（４６０）及び細胞を含有する液体試料（４６２）を充填した図５ａのチューブ（４５０）を例示している。図５ｂに示すチューブを調製するために、所定容積の密度勾配媒体（４６０）をチューブの下部（Ａ）に注ぎ、次いで、インサートのディスク（４２０）の下面（４２６）が支柱（４３０）によりチューブの底より上に支持された場合、液体（４６０）のメニスカスがインサートのディスク（４２０）の下面（４２６）と流体連通するようにインサート（５００）を挿入する。したがって、支柱（４３０）の長さは、遠心チューブの下部（Ａ）に存在可能な液体（４６０）又は密度勾配媒体の特定量を規定するスペーサーとして機能する。支柱（４３０）の長さが、遠心分離及び分離プロセスに使用される液体又は密度勾配媒体（４６０）の所望の容積並びに遠心チューブの内部容積に依存して変動することは理解されるであろう。通常５０ｍｌの遠心チューブに対して、支柱（４３０）の長さは、ディスク（４２０）がチューブ（４５０）の１５ｍｌの印に位置するようにサイズ化される。
【００４８】
血液細胞などの細胞を含有する液体試料（４６２）は、ディスク（４２０）の上面に慎重に注がれ、チューブの上部（Ｂ）においてディスクの上に層を形成する。その後キャップ（４５１）を元に戻し、チューブを遠心分離器に移す。
【００４９】
図５ｃは、遠心分離後の図５ｂのチューブの概略図である。チューブ（４５０）中に存在する液体は、密度に基づき４つの分画、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧに分離される。分画Ｄは主に血漿を含有し、分画ＥはＦｉｃｏｌｌであり、分画Ｆは大部分が赤血球からなり、分画Ｇは白血球を含有する。ここで細胞の標的集団を、チューブから様々な分画を慎重にピペットにより収集できる、例えば、白血球が必要な場合、分画Ｄが最初に取り出され、その後分画Ｇが収集される。又は、赤血球が標的である場合、分画Ｄ及びＧを廃棄し、インサート（５００）及び残りの分画を、かき乱さないように慎重に取り外し、分画Ｆを収集する。
【実施例】
【００５０】
本発明を、これから以下の実施例を参照しながら記載する。
【００５１】
本発明に係るインサートを、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ密度勾配媒体上への負荷を支援するその能力、並びにＢｌｏｏｄ−Ｆｉｃｏｌｌ界面において、遠心力の下で血液分画を混合せずに分離させるその能力に関して試験した。
【００５２】
２５ｍｌの血液を、２％のヒト血清を含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２倍に希釈した。１５ｍｌのＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅを、３×５０ｍｌの遠心チューブに加えた。２つのチューブは従来の遠心チューブ（図６の５５０ａ及び５５０ｃ）であり、１つのチューブは（図６の５５０ｂ）Ａｃｃｕｓｐｉｎ（商標）チューブ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）であった。Ａｃｃｕｓｐｉｎ（商標）チューブは、多孔質高密度ポリエチレン障壁又はフリットにより分離された２つのチャンバを有する、遠心分離により全血及び骨髄からのリンパ球と他の単核細胞との分離を支援するように特別に設計されたポリプロピレン遠心チューブである。
【００５３】
２５ｍｌの血液／ＰＢＳミックス（５６２ａ、５６２ｂ）を、チューブ５５０ａ及びｂ両方のＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ層の表面上にピペットにより慎重に加えた。本発明に係るインサート（６００）を、第３のチューブ（５５０ｃ）に加えた。２５ｍｌの血液／ＰＢＳミックス（５６２ｃ）を、チューブ５５０ｃのインサートの中心上部にピペットにより加え、血液ミックスが溝を流れ落ちて、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ層の上に層を形成するようにした。
【００５４】
図６は、遠心分離による分離前の、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ密度勾配媒体（下層、５６０ａ、ｂ及びｃ）及び血液／ＰＢＳミックス（上層、５６２ａ、ｂ及びｃ）を負荷された３つのチューブ（５５０ａ、５５０ｂ及び５５０ｃ）の写真である。見てわかるように、チューブ５５０ａ及び５５０ｃの２つは、従来の遠心チューブ（チューブ５５０ｃは、本発明に係るインサート６００を含む）であり、チューブ５５０ｂはＡｃｃｕｓｐｉｎ（商標）チューブ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）である。
【００５５】
３つのチューブはすべて、４００ｇにおいて３０分間、連続して遠心分離した。
【００５６】
図７は、遠心分離及び分離プロセス後の図６と同じ３つのチューブを示す。赤血球は、チューブ（６５０ａ、ｂ及びｃ）のＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ層（６６５ａ、ｂ及びｃ）の底にペレット化され（６６４ａ、ｂ及びｃ）、白血球（６６６ａ、ｂ及びｃ）は、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（６６５ａ、ｂ及びｃ）及び血漿６６７（ａ、ｂ及びｃ）層の界面に分離された。
【００５７】
その後、各チューブからの白血球分画を、ピペットを用いて収集し、ヌクレオカウンター（ｎｕｃｌｅｏｃｏｕｎｔｅｒ）（ＮＣ１００、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を使用して計数した。１０6細胞を、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）により分析し、それらの集団構成を決定した。
【００５８】
図８は、図７の各チューブ（Ａは６５０ａ、Ｂは６５０ｂ及びＣは６５０ｃに対応する）に由来する白血球分画のフローサイトメトリー分析の結果を表すグラフであり、文字Ｇは、白血球分画中に存在する顆粒球の部分集団を示し、Ｍは単球の部分集団及びＬはリンパ球の部分集団を示す。これらの図は、白血球集団中に存在する部分集団（顆粒球、単球及びリンパ球）それぞれの百分率も示している。下記の表１は、各チューブの白血球の回収及び細胞生存率を示している。
【００５９】
【表１】
0006652967.tif 000002
表から明らかな通り、従来のＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ層形成又はＡｃｃｕｓｐｉｎ（商標）チューブを使用して収集された白血球において、細胞総数、細胞生存率又は細胞集団に関して、本発明に係るインサートを使用した場合と比較して認識可能な差は存在しない。
【００６０】
本発明の好ましい例示的実施形態を説明してきたが、当業者は、本発明が記載の実施形態以外の実施形態により実践可能であり、記載の実施形態は単なる例示目的で提示されており、本発明を限定するものでは決してないことを理解すると思われる。本発明は、下記の特許請求の範囲によってのみ限定される。
［実施態様１］
遠心チューブ（４５０）用インサート（１００，２００，３００，５００，６００）であって、
凸型の上面（２１，２２１，３２１）及び１以上の凹部（２４，１２４，２２４，３２４，４２４）をその場に有する外縁（２２，１２２，２２２，３２２，４２２）を備えた、チューブ（４５０）を上部と下部に分割するために、遠心チューブ（４５０）内に適合するようにサイズ化されたディスク（２０，１２０，２２０，４２０）、並びに
インサート（１００，２００，３００，５００，６００）がチューブ（４５０）内に配置された場合、チューブ（４５０）の底に接触する、ディスク（２０，１２０，２２０，４２０）の下面（２６，１２６，４２６）から伸びる支柱（３０，１３０，４３０）、
を備えたインサート（１００，２００，３００，５００，６００）。
［実施態様２］
１以上の凹部（２４，１２４，２２４，３２４，４２４）が、チューブ（４５０）の上部と下部との間の流体連通を可能にする、実施態様１に記載のインサート（１００，２００，３００，５００，６００）。
［実施態様３］
１以上の凹部（２４，１２４，２２４，３２４，４２４）が、１以上の凹部（２４，１２４，２２４，３２４，４２４）にわたって表面張力を発生させ、遠心力の不在下で液体の流動を制限するようにサイズ化される、実施態様１又は実施態様２のいずれかに記載のインサート（１００，２００，３００，５００，６００）。
［実施態様４］
上面（２１，２２１，３２１）が、１以上の凹部（２４，１２４，２２４，３２４，４２４）につながる１以上の溝（２８，１２８，２２８，３２８）をさらに備える、実施態様１乃至実施態様３のいずれか１項に記載のインサート（１００，２００，３００，５００，６００）。
［実施態様５］
ディスク（２０，１２０，２２０，４２０）の上面（２１，２２１，３２１）が把持要素（４０，１４０，３３０，４４０）をさらに備える、実施態様１乃至実施態様４のいずれか１項に記載のインサート（１００，２００，３００，５００，６００）。
［実施態様６］
把持要素（４０，１４０，３３０，４４０）が、ディスク（２０，１２０，２２０，４２０）の上面（２１，２２１，３２１）の中心にある、実施態様５に記載のインサート（１００，２００，３００，５００，６００）。
［実施態様７］
把持要素（４０，１４０，３３０，４４０）が棒の形態である、実施態様５又は実施態様６のいずれかに記載のインサート（１００，２００，３００，５００，６００）。
［実施態様８］
１以上の溝（２８，１２８，２２８，３２８）が、ディスク（２０，１２０，２２０，４２０）の中心と１以上の凹部（２４，１２４，２２４，３２４，４２４）とをつないでいる、実施態様４乃至実施態様７のいずれか１項に記載のインサート（１００，２００，３００，５００，６００）。
［実施態様９］
溝（２８，１２８，２２８，３２８）が扇形であり、凹部（２４，１２４，２２４，３２４，４２４）の場所よりもディスク（２０，１２０，２２０，４２０）の中心において狭くなっている、実施態様４乃至実施態様８のいずれか１項に記載のインサート（１００，２００，３００，５００，６００）。
［実施態様１０］
ディスク（２０，１２０，２２０，４２０）の下面（２６，１２６，４２６）が凸型である、実施態様１乃至実施態様９のいずれか１項に記載のインサート（１００，２００，３００，５００，６００）。
［実施態様１１］
１以上の凹部（２４，１２４，２２４，３２４，４２４）が半円形又は長円形である、実施態様１乃至実施態様１０のいずれか１項に記載のインサート（１００，２００，３００，５００，６００）。
［実施態様１２］
インサート（１００，２００，３００，５００，６００）がポリマーで構成される、実施態様１乃至実施態様１１のいずれか１項に記載のインサート（１００，２００，３００，５００，６００）。
［実施態様１３］
インサート（１００，２００，３００，５００，６００）が、微生物汚染を最小にするように処理されている、実施態様１乃至実施態様１２のいずれか１項に記載のインサート（１００，２００，３００，５００，６００）。
［実施態様１４］
実施態様１乃至実施態様１３のいずれか１項に記載のインサート（１００，２００，３００，５００，６００）を備える遠心チューブ（４５０）。
［実施態様１５］
密度勾配媒体（４６０）をさらに含む、実施態様１４に記載の遠心チューブ（４５０）。
［実施態様１６］
細胞を分離するための方法であって、
ｉ）一定量の密度勾配媒体（４６０）を遠心チューブ（４５０）に加えるステップ、
ｉｉ）実施態様１乃至実施態様１３のいずれか１項に記載のインサート（１００，２００，３００，５００，６００）を、支柱（３０，１３０，４３０）がチューブ（４５０）の底に接触するように、密度勾配媒体（４６０）の表面に配置するステップ、
ｉｉｉ）１以上の細胞を含有する液体試料（４６２）をディスク（２０，１２０，２２０，４２０）の上面にわたって分注し、密度勾配媒体（４６０）と試料（４６２）との間に界面を形成するステップ、並びに、
ｉｖ）チューブ（４５０）を遠心分離して、１以上の細胞を試料から分離するステップ、
を含む方法。
［実施態様１７］
細胞が、哺乳動物細胞、赤血球（６６４ａ，６６４ｂ，６６４ｃ）、白血球（６６６ａ，６６６ｂ，６６６ｃ）及び幹細胞からなる群から選択される、実施態様１６に記載の方法。
［実施態様１８］
試料が全血を含む、実施態様１６又は実施態様１７のいずれかに記載の方法。
［実施態様１９］
１以上の細胞を回収するステップをさらに含む、実施態様１６乃至実施態様１８のいずれか１項に記載の方法。
［実施態様２０］
実施態様１乃至実施態様１３のいずれか１項に記載のインサート（１００，２００，３００，５００，６００）及び遠心チューブ（４５０）を含むキット。
［実施態様２１］
一定量の密度勾配媒体（４６０）をさらに含む、実施態様２０に記載のキット。
［実施態様２２］
実施態様１乃至実施態様１３のいずれか１項に記載のインサート（１００，２００，３００，５００，６００）及び一定量の密度勾配媒体（４６０）を含むキット。
［実施態様２３］
実施態様２０乃至実施態様２２のいずれか１項に記載のキットの、１以上の細胞を試料から分離するための使用。
【符号の説明】
【００６１】
２０  ディスク
２１  ディスクの上面
２２  外縁
２４  凹部
２６  ディスクの下面
２８  溝、流路
３０  支柱
４０  把持要素
１００  インサート
１２０  ディスク
１２２  外縁
１２４  凹部
１２６  ディスクの下面
１２８  溝、流路
１３０  支柱
１４０  把持要素
２００  インサート
２２０  ディスク
２２１  ディスクの上面
２２２  外縁
２２４  凹部
２２８  溝
２２９  ディスクの中心
３００  インサート
３２１  ディスクの上面
３２２  外縁
３２４  凹部
３２８  溝
３３０  把持要素
４２０  ディスク
４２２  外縁
４２４  凹部
４２６  ディスクの下面
４３０  支柱
４４０  把持要素
４５０  遠心チューブ
４５１  キャップ、蓋
４５２  中空内部、チャンバ
４５３  内壁
４５４  外壁
４５５  容積を示す印
４６０  密度勾配媒体、液体
４６２  液体試料
５００  インサート
５５０ａ  従来の遠心チューブ
５５０ｂ  Ａｃｃｕｓｐｉｎ（商標）チューブ
５５０ｃ  従来の遠心チューブ、第３のチューブ
５６０ａ  Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ層
５６０ｂ  Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ層
５６０ｃ  Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ層
５６２ａ  血液／ＰＢＳミックス
５６２ｂ  血液／ＰＢＳミックス
５６２ｃ  血液／ＰＢＳミックス
６００  インサート
６５０ａ  チューブ
６５０ｂ  チューブ
６５０ｃ  チューブ
６６６ａ  白血球
６６６ｂ  白血球
６６６ｃ  白血球
６６４ａ  赤血球
６６４ｂ  赤血球
６６４ｃ  赤血球
６６５ａ  Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ層
６６５ｂ  Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ層
６６５ｃ  Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ層
６６７ａ  血漿
６６７ｂ  血漿
６６７ｃ  血漿
【図１】
0006652967.tif 000003
【図２】
0006652967.tif 000004
【図３】
0006652967.tif 000005
【図４】
0006652967.tif 000006
【図５】
0006652967.tif 000007
【図６】
0006652967.tif 000008
【図７】
0006652967.tif 000009
【図８】
0006652967.tif 000010