(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
１種以上のヒト凝固因子タンパク質と乳酸ポリマーを含む粉末を製造する方法であって、
ａ）０．１〜２μｍの範囲の粒度ｄ５０を有する乳酸ポリマーと１種以上のヒト凝固因子タンパク質を水中で混合して分散させるステップ、
ｂ）分散液を乾燥させるステップ、
ｃ）分散液からの乾燥材料を圧縮するステップ、
ｄ）分散液からの圧縮された乾燥材料を微粉砕して０．５μｍより大きく５μｍまでの範囲の粒度ｄ５０を有する粉末にするステップ
を含む、方法。
【請求項２】
前記乳酸ポリマーが、ラクチド単位とグリコリド単位から重合されたコポリマーである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記１種以上のヒト凝固因子タンパク質が、第Ｉ因子＝フィブリノゲン、第ＩＩ因子＝プロトロンビン、第ＩＩＩ因子＝組織因子、第Ｖ因子＝プロアクセレリン、第ＶＩＩ因子＝プロコンバーチン、第ＶＩＩＩ因子＝抗血友病因子Ａ、第ＩＸ因子＝抗血友病因子Ｂ、第Ｘ因子＝スチュアート・プロワー因子、第ＸＩ因子＝血漿トロンボプラスチン前駆体、第ＸＩＩ因子＝ハーゲマン因子、第ＸＩＩＩ因子＝フィブリン安定化因子、フォン・ヴィレブランド因子、プレカリクレイン、アンチトロンビンＩＩＩ、ヘパリン補因子ＩＩ、プロテインＣ、プロテインＳ、プロテインＺ、プロテインＺ関連プロテイナーゼインヒビター、プラスミノゲン、α−血漿２−アンチプラスミン、組織プラスミノゲンアクチベーター、ウロキナーゼ、プラスミノゲンアクチベーターインヒビター−１およびプラスミノゲンアクチベーターインヒビター−２またはそれらの任意の組合せの群から選択される、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
前記ヒト凝固因子タンパク質が、ヒト血漿製剤中に含まれる、請求項１から３までのいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
前記ヒト凝固因子タンパク質が、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子またはフォン・ヴィレブランド因子またはそれらの任意の組合せである、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記ヒト血漿製剤が、非生理学的濃度のフォン・ヴィレブランド因子を含む、請求項４または５記載の方法。
【請求項７】
前記ヒト血漿製剤が、０．０５〜５重量％のヒト第ＶＩＩＩ因子と、９５〜９９．９５重量％の他の血漿タンパク質または更なる医薬品賦形剤またはその両方を含む、請求項４または６記載の方法。
【請求項８】
前記ヒト血漿製剤が、水１ｍＬにつき１００ｍｇの濃度で、２５〜１０００ＩＵ／ｍＬのヒト第ＶＩＩＩ因子タンパク質活性を含む、請求項４または７記載の方法。
【請求項９】
ステップａ）において、前記ヒト凝固因子タンパク質を含む前記ヒト血漿製剤と乳酸ポリマーとの比が、３０：７０〜５：９５重量部である、請求項４から８までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
前記ヒト凝固因子タンパク質が、組換え第ＶＩＩＩ因子である、請求項１から３までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
ステップａ）において、ヒト第ＶＩＩＩ因子を含有するヒト血漿製剤と乳酸ポリマーを混合して分散させるために重量基準で５〜５０倍過剰の水を用いる、請求項４から９までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
ステップｂ）において、前記分散液の乾燥を、凍結乾燥または噴霧乾燥によって実施する、請求項１から１１までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
ステップｃ）において、乾燥された分散液の圧縮を、０．２〜２ｋＮの圧縮力で実施する、請求項１から１２までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１４】
０．５〜５μｍの範囲の粒度ｄ５０を有し、ヒト凝固因子タンパク質と乳酸ポリマーを含む、粉末。
【請求項１５】
乾燥、分散または溶解された形態の請求項１４記載の粉末を含む医薬組成物。
【請求項１６】
ヒト凝固因子タンパク質に関連する疾病または遺伝性疾患の治療に適した医薬組成物を製造するための、請求項１から１３までのいずれか１項記載の方法によって得られたか、あるいは請求項１４記載の粉末の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト凝固因子タンパク質と乳酸ポリマーを含む粉末の分野にある。
【背景技術】
【０００２】
欧州特許第１２８３６９９号明細書(EP 1283699B1)には、改善された注入特性を有する注射用懸濁液が記載されている。開示された組成物は、直径１８〜２２ゲージの範囲の針を通して宿主に注射するのに適している。組成物は、活性剤が分散または溶解されているポリ乳酸をベースとする微粒子を開示し得る。前記微粒子の質量中央径は、２０〜１５０μｍの範囲であり得る。
【０００３】
米国特許出願公開第２０１２／０００４３２３号明細書(US2012/0004323A1)は、熱的に不安定な他の生物活性剤およびそのために調製されたインプラントのインプラント加工方法を記載している。この方法は、生体吸収性ポリマーを含む組成物と生物活性剤を混合して混合物を形成し、この混合物を７０℃以下の温度でインプラントに加工することを含む。実施例では、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）ポリマー粒子が凍結状態で粉末に粉砕された。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）が粉末としてポリマー粉末に添加され、ガラス乳鉢と乳棒を用いて混合された。インプラントを製造するために、混合物は打錠機でプレス加工された。混合およびプレス加工は、好ましくは室温でまたはそれよりも低い温度で実施される。インプラントの最小硬度（破壊圧力）は２５ポンドであった。放出試験において、インプラントは２日間でＢＳＡを１００％まで放出する。事前にジクロロメタンのような有機溶媒中に浸漬被覆されたインプラントは、ＢＳＡの放出がはるかに遅く、例えば７日後にわずか５０％しか放出しなかった。
【０００４】
第ＶＩＩＩ因子とフォン・ヴィレブランド因子（ｖＷＦ）の複合体は、異なる生理学的機能を有する第ＶＩＩＩ因子とフォン・ヴィレブランド因子（ｖＷＦ）の２つの分子から成る。第ＶＩＩＩ因子が注射されると、それは第ＶＩＩＩ因子を活性化するフォン・ヴィレブランド因子に血液循環時に結合する。活性化第ＶＩＩＩ因子は、活性化第ＩＸ因子の補因子として作用し、第Ｘ因子からの活性化第Ｘ因子（第Ｘａ因子）の発生を促進する。第Ｘａ因子は、プロトロンビンをトロンビンに活性化させ、これがフィブリノゲンからフィブリンを遊離させることで凝固手順が開始する。
【０００５】
Ｈａｅｍｏｃｔｉｎ（登録商標）は、ヒト血清由来のＢｉｏｔｅｓｔ  ＡＧ，Ｄｒｅｉｅｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙによって製造された市販のヒト第ＶＩＩＩ因子製剤である。Ｐａｕｌ−Ｅｈｒｌｉｃｈ−Ｉｎｓｔｉｔｕｔ，Ｇｅｒｍａｎｙと、ドイツ連邦保健省のウェブサイト(例えばhttp://www.pei.de/SharedDocs/arzneimittel/am-aus-blut/gerinnungsfaktor/16841-00-00.htmlを参照)に情報公開されている。Ｈａｅｍｏｃｔｉｎ（登録商標）は、Ｈａｅｍｏｃｔｉｎ（登録商標）ＳＤＨ  ２５０、５００および１０００（第ＶＩＩＩ因子の国際単位（ＩＵ）を指す）の３つの濃度で現在入手可能である。Ｈａｅｍｏｃｔｉｎ（登録商標）は、第ＶＩＩＩ因子のほかに、注射用担体としてグリシン、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、塩化カルシウムおよび水を含有する。Ｈａｅｍｏｃｔｉｎ（登録商標）は、血友病Ａ（遺伝性第ＶＩＩＩ因子欠乏症）の治療に適応している。この製品は、非生理学的濃度のフォン・ヴィレブランド因子（ｖＷＦ）を含有しているため、フォン・ヴィレブランド病の治療に適応していない。
【０００６】
課題および解決
乳酸ポリマーを用いてヒト凝固因子タンパク質製剤を製造する方法を提供することが課題であった。粉末は、ヒトへの注射用に、好ましくは静脈注射用に水中に懸濁されるのに適しているべきである。提供される粉末は、血液凝固関連の欠乏症または疾病の治療に適しているべきである。この方法は、ナノ構造マトリックス中に１種以上のヒト凝固因子タンパク質を保持し、これらのタンパク質を持続的に放出する粉末を提供する。この方法自体は、凝固因子タンパク質の治療的またはカスケード的な血液凝固活性を、活性の損失なしにまたはごくわずかな損失でもって保持する穏やかな方法であるべきである。
【０００７】
この課題は、
ａ）０．１〜２μｍの範囲の粒度ｄ５０を有する乳酸ポリマーと１種以上のヒト凝固因子タンパク質を水中で混合して分散させるステップ、
ｂ）分散液を乾燥させるステップ、
ｃ）分散液からの乾燥材料を圧縮するステップ、
ｄ）圧縮された乾燥材料分散液を微粉砕して０．５μｍより大きく５μｍまでの範囲の粒度ｄ５０を有する粉末にするステップ
を含む、１種以上のヒト凝固因子タンパク質と乳酸ポリマーを含む粉末を製造する方法によって解決された。
【０００８】
有利な効果
本明細書に開示される方法は、１種以上のヒト凝固因子タンパク質と乳酸ポリマーを含む、水中に懸濁することができる粉末を、含まれるヒト凝固因子タンパク質の予想外の増加した半減期を有する、注射用、好ましくは静脈注射用に適した医薬組成物として提供するものである。
【０００９】
詳細な説明
粒度測定
本明細書に開示される粒度、特にステップａ）およびステップｄ）における粒度の測定は、米国薬局方３６（ＵＳＰ）第４２９章および欧州薬局方７．０（ＥＰ）第２．９．３１章に従って実施されることができる。粒度分布は、レーザー散乱装置（例えば、Ｓｙｍｐａｔｅｃ  ＧｍｂＨ社、ＲＯＤＯＳ乾燥分散ユニットを備えたＨＥＬＯＳ型）を利用して測定される。レーザー回折法は、粒度に依存した強度パターンで粒子があらゆる方向に光を散乱させる現象に基づいている。適切な液体または気体中に適切な濃度で分散された代表的なサンプルは、通常はレーザーからの単色光源のビームを通過する。粒子によって様々な角度で散乱された光は、多素子検出器によって測定され、散乱パターンに関連する数値が、その後の分析のために記録される。次いで、適切な光学モデルと数学的手順を使用して、散乱数値が変換され、体積粒度分布を形成する離散数のサイズクラスに対する全体積の割合（例えば、ｄ５０またはｄ（０．５）は、積算ふるい下分布の５０％に対応する粒径を表す；ｄ９０またはｄ（０．９）は、積算ふるい下分布の９０％に対応する粒径を表す）がもたらされる。好ましくは、粒度分布の測定は、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ（登録商標）ＬＳによって行われることができる。
【００１０】
定義
本発明の意味における「室温」という用語は、２０〜２５℃、約２２℃または２２℃であり得る。
【００１１】
「水」という用語は、好ましくは、脱塩水または純水を意味する。水溶液、例えば生理食塩水またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）の形態における「水」の使用も可能であるが、イオンによる有害作用が生じる可能性があることから、あまり好ましくはない。
【００１２】
方法
１種以上のヒト凝固因子タンパク質と乳酸ポリマーを含む粉末を製造する方法は、ステップａ）〜ｄ）を含む。１種以上のヒト凝固因子タンパク質の生物学的活性を不活性化または低下させ得る有機溶媒の適用は回避される。それゆえ本方法は、好ましくは、１種以上のヒト凝固因子タンパク質の生物学的活性を不活性化または低下させ得る濃度の有機溶媒が添加されないかまたは有機溶媒を全く含まない。
【００１３】
ステップａ）
ステップａ）では、０．１〜２μｍ、０．２〜１．５μｍ、０．３〜１．２μｍ、０．６〜１．０μｍの範囲の粒度ｄ５０を有する乳酸ポリマーとヒト凝固因子タンパク質を水中で混合して分散させる。
【００１４】
好ましくは、ヒト凝固因子タンパク質は、ヒト血漿製剤に含まれる。好ましくは、ヒト凝固因子タンパク質を含むヒト血漿製剤と乳酸ポリマーとの比は、３０：７０〜１：９９重量部、２０：８０〜２：９８重量部、１５：８５〜５：９５重量部である。（Ｈａｅｍｏｃｔｉｎ（登録商標）の形態の）ヒト血漿製剤に含まれる第ＶＩＩＩ因子とポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）、ラクチド／グリコリド比５０：５０の最適値は、約１０：９０重量部あった。この比でまたはこの比の近傍で、ステップｂ）における混合物の最適な均一性（ＥＤＸ分析によって測定）およびステップｄ）からの粉末の半減期の最適値（第ＶＩＩＩ因子についてのＢＩＯＰＨＥＮ（登録商標）発色アッセイによって測定）が見出された（実施例を参照）。
【００１５】
ステップｂ）
ステップｂ）では、ステップａ）からの分散液を乾燥させて乾燥材料を得る。乾燥ステップは、好ましくは４５℃以下、４０℃以下、３０℃以下または２０℃〜３０℃の温度で噴霧乾燥することによって行うことができる。最も好ましくは、乾燥ステップは、凍結乾燥によって行うことができる。得られる中間生成物は、不規則な粉末の形態を有していてよい。このステップのＥＤＸ分析は、ヒト凝固因子タンパク質と乳酸ポリマーが互いに水中で混合されて分散され、次いで凍結乾燥によって乾燥される場合、有利な均一分布を示す。
【００１６】
ステップｃ）
ステップｃ）では、ステップｂ）からの分散液から得られた乾燥材料を圧縮する。圧縮は、好ましくは、１種以上のヒト凝固因子タンパク質の不活性化が起きる可能性を回避するかまたは低下させるために打錠機において比較的低い圧力で行う。分散液からの乾燥材料の圧縮は、０．１〜２ｋＮまたは０．２〜１．８ｋＮ、０．３〜１．０ｋＮ、０．４〜０．６ｋＮ（７８．５４ｍｍ２の横断面積）の圧縮力で実施することができる。この圧縮ステップは、高負荷量でヒト凝固因子タンパク質が付着する、高い内表面を有する三次元乳酸ポリマー構造を作製するために必須であると考えられる。それゆえ重要なポイントは、ステップａ）で定義されるナノスケール粒度を有する乳酸ポリマーの使用であると考えられる。
【００１７】
ヒト凝固因子タンパク質と乳酸ポリマーの複数成分の圧縮ステップによって引き起こされるものと想定される相互作用は、アミドＩバンドの波長範囲、波数域１５００，０００〜１７００，０００［ｃｍ−１］の減衰全反射赤外分光法（ＡＴＲ−ＩＲ）による分析によって明らかになる。ヒト凝固因子タンパク質のみと乳酸ポリマーのみの単独成分では、圧縮された成分と比較して、明らかに異なる吸収スペクトルを示す（実施例を参照）。
【００１８】
ステップｄ）
ステップｄ）では、乾燥圧縮された分散液を、０．５μｍより大きく５μｍまで、０．６〜３μｍ、０．８〜２．０μｍ、０．９〜１．５μｍの範囲の粒度ｄ５０を有する粉末に微粉砕する。好ましくは、粒子は規則的な球形であってもよい。粒度が相当程度低い場合、粉末を水中に懸濁させることが可能であり、この場合、粒子の非経口的適用、好ましくは静脈内注射のために適したものになるかまたは簡単に利用できるようになる。
【００１９】
ヒト凝固因子タンパク質
１種以上のヒト凝固因子タンパク質は、第Ｉ因子＝フィブリノゲン、第ＩＩ因子＝プロトロンビン、第ＩＩＩ因子＝組織因子、第Ｖ因子＝プロアクセレリン、第ＶＩＩ因子＝プロコンバーチン、第ＶＩＩＩ因子＝抗血友病因子Ａ、第ＩＸ因子＝抗血友病因子Ｂ、第Ｘ因子＝スチュアート・プロワー因子、第ＸＩ因子＝血漿トロンボプラスチン前駆体、第ＸＩＩ因子＝ハーゲマン因子、第ＸＩＩＩ因子＝フィブリン安定化因子、フォン・ヴィレブランド因子、プレカリクレイン、アンチトロンビンＩＩＩ、ヘパリン補因子ＩＩ、プロテインＣ、プロテインＳ、プロテインＺ、プロテインＺ関連プロテイナーゼインヒビター、プラスミノゲン、α−血漿２−アンチプラスミン(alpha-plasma 2-antoplasmin)、組織プラスミノゲンアクチベーター、ウロキナーゼ、プラスミノゲンアクチベーターインヒビター−１およびプラスミノゲンアクチベーターインヒビター−２またはそれらの任意の組合せの群から選択することができる。
【００２０】
ヒト凝固因子タンパク質は、天然起源のもの、ヒト血漿から単離されたもの、または組換えＤＮＡ技術によって製造された組換えヒト凝固因子タンパク質であってもよい。
【００２１】
ヒト血漿から単離された天然起源のヒト凝固因子タンパク質の例は、Ｂｉｏｔｅｓｔ  ＡＧ，Ｇｅｒｍａｎｙによって製造された、それぞれＨａｅｍｏｃｔｉｎ（登録商標）ＳＤＨ  ２５０、５００および１０００（この番号は第ＶＩＩＩ因子の国際単位（ＩＵ）を指す）の市販製品Ｈａｅｍｏｃｔｉｎ（登録商標）である。他のメーカーからの類似の製品も同様に市販されている可能性がある。
【００２２】
組換えヒト凝固因子タンパク質の例は、市販製品Ａｄｖａｔｅ（登録商標）およびＡｄｖａｔｅ（登録商標）２５０のそれぞれ（Ｂａｘｔｅｒ  Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ  ＧｍｂＨ、Ｇｅｒｍａｎｙによって流通される）である。
【００２３】
好ましくは、ヒト凝固因子タンパク質は、ヒト血漿製剤に含まれ得る。
【００２４】
好ましくは、ヒト血漿製剤中に含まれるヒト凝固因子タンパク質は、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）、第ＩＸ因子またはフォン・ヴィレブランド因子（ｖＷＦ）またはそれらの任意の組合せであってもよい。好ましくは、ヒト血漿製剤中のｖＷＦ／ＦＶＩＩＩの比は、０．１〜０．５、０．２〜０．４ＩＵ（国際単位）のｖＷＦ／１ＩＵのＦＶＩＩＩであってもよい。
【００２５】
好ましくは、ヒト血漿製剤は、非生理学的濃度のフォン・ヴィレブランド因子を含んでいてもよい。非生理学的濃度は、フォン・ヴィレブランド病の治療に適応していない濃度であり得る。国際単位（ＩＵ）における非生理学的濃度は、規定濃度または平均濃度の少なくとも２分の１、３分の１、１０分の１、２０分の１、５０分の１もしくは１００分の１であり得るか、または健康なヒトの血漿中のフォン・ヴィレブランド因子の規定濃度または平均濃度の範囲外であり得る。
【００２６】
好ましくは、ヒト血漿製剤は、０．０５〜５重量％のヒト第ＶＩＩＩ因子と、９５〜９９．９５重量％の他の血漿タンパク質または更なる医薬品賦形剤またはその両方を含む。そのような濃度は、生理学的または治療的に有効な濃度として定義することができる。
【００２７】
非生理学的濃度のフォン・ヴィレブランド因子と、生理学的または治療的に有効な濃度のヒト第ＶＩＩＩ因子（０．３ＵのＶＷＦ／１ＵのＦＶＩＩＩ）を含む適切なヒト血漿製剤は、Ｂｉｏｔｅｓｔ  ＡＧ，Ｇｅｒｍａｎｙによって製造された市販製品Ｈａｅｍｏｃｔｉｎ（登録商標）ＳＤＨ  ２５０、５００および１０００（この番号は第ＶＩＩＩ因子の国際単位（ＩＵ）を指す）であってもよい。
【００２８】
好ましくは、適切なヒト血漿製剤は、水１ｍＬにつき１００ｍｇの濃度で、２５〜１０００ＩＵ／ｍＬ、１００〜８００ＩＵ／ｍＬ、１００〜３００ＩＵ／ｍＬ、１５０〜２５０ＩＵ／ｍＬのヒト第ＶＩＩＩ因子タンパク質活性を含んでいてもよい。
【００２９】
ヒト凝固因子タンパク質は、組換えＤＮＡ技術、例えば組換え第ＶＩＩＩ因子によって製造された組換えタンパク質であってもよい。適切な組換え第ＶＩＩＩ因子製剤は、水１ｍＬにつき１００ｍｇの濃度で、５００〜１０００ＩＵ／ｍＬ、６００〜９００ＩＵ／ｍＬまたは７００〜８００ＩＵ／ｍｌのヒト第ＶＩＩＩ因子タンパク質活性の範囲であり得る。
【００３０】
乳酸ポリマー
「乳酸ポリマー」（ポリ乳酸）という用語は、重合したモノマー単位、好ましくは少なくとも１０重量％、少なくとも２０重量％、少なくとも３０重量％、少なくとも４０重量％、少なくとも５０重量％、少なくとも６０重量％、少なくとも７０重量％もしくは１００重量％までの重合した乳酸もしくはラクチド単位を含むポリマーまたはコポリマーを意味するものとする。乳酸ポリマーは、０．１〜２μｍ、０．２〜０．１５μｍ、０．５〜１．２μｍ、０．６〜１．０μｍの範囲の粒度ｄ５０を有し得る。
【００３１】
必要な範囲の粒度を有する乳酸ポリマー製品は、市販されている。
【００３２】
明確な粉末形態ではないか、または必要に応じてより高いｄ５０値を有する粉末粒子から成る乳酸ポリマー製品は、粉砕または高圧均質化のような慣用の方法によって当業者により適切な粒度に適合され得る。高圧均質化は、好ましくは高圧均質化装置を用いて行われる。ポリマー溶液を形成するために、乳酸ポリマーは、塩化メチレンまたは酢酸エチルのような少容量の有機溶媒に溶解してよい。次いで、過剰の水をポリマー溶液に添加してエマルジョンを形成することができ、これを加圧下で均質化してよい。次いで、有機溶媒を真空によってエマルジョンから除去することで、微細なポリマー粒子分散液を得ることができる。引き続き、必要な範囲内の乳酸ポリマー粒子を、乾燥ステップにおいて水を除去することによりポリマー粒子分散液から得ることができる。
【００３３】
ラクチドは、乳酸の環状ジエステルである。ラクチドという用語は、Ｌ−ラクチド、Ｄ−ラクチド、Ｄ，Ｌ−ラクチドまたはメソ−ラクチドを意味するものとする。乳酸またはラクチドのそれぞれと重合され得る適切なコモノマーは、グリコリド、イプシロン−カプロラクトン、トリメチレンカーボネートまたはジオキソナンである。乳酸ポリマーまたはコポリマーはまた、乳酸ポリマーもしくはコポリマーから選択されたＡブロックと、ポリエチレングリコールポリマーから選択されたＢブロックを含有するＡＢ−もしくはＡＢＡ−ブロックコポリマーを含み得る。
【００３４】
１種以上の乳酸ポリマーは、好ましくは、モノマー成分から合成された乳酸ポリマーもしくはコポリマー、またはａ）〜ｌ）から成る群から選択されたモノマー成分の混合物から選択され得る：
ａ）Ｄ−およびＬ−ラクチド、
ｂ）Ｌ−ラクチドおよびグリコリド、
ｃ）Ｄ，Ｌ−ラクチドおよびグリコリド、
ｄ）Ｌ−ラクチドおよびイプシロン−カプロラクトン、
ｅ）Ｌ−ラクチドおよびジオキサノン、
ｆ）Ｌ−ラクチドおよびトリメチレンカーボネート、
ｇ）Ｌ−ラクチド、Ｄ−ラクチド、メソ−ラクチドまたはＤ，Ｌ−ラクチド、
ｈ）Ｌ−ラクチド、
ｉ）ＤＬ−ラクチド、
ｊ）Ｌ−ラクチド、Ｄ−ラクチド、メソ−ラクチドまたはＤＬ−ラクチドとイプシロンカプロラクトンの統計的に分布したモノマー単位、
ｋ）Ｌ−ラクチド、Ｄ−ラクチド、メソ−ラクチドまたはＤＬ−ラクチドとジオキソナンの統計的に分布したモノマー単位、
ｌ）Ｌ−ラクチド、Ｄ−ラクチド、メソ−ラクチドまたはＤＬ−ラクチドとトリメチレンカーボネートの統計的に分布したモノマー単位。
【００３５】
これらの種類の「乳酸ポリマー」は、生分解性ポリマーであり、例えば欧州特許第１４６８０３５号明細書（EP1468035）、米国特許第６７０６８５４号明細書（US6706854）、国際公開第２００７／００９９１９号（WO2007/009919A2）、欧州特許出願公開第１９０７０２３号明細書（EP1907023A）、欧州特許出願公開第２２６３７０７号明細書（EP2263707A）、欧州特許第２１４７０３６号明細書（EP2147036）、欧州特許第０４２７１８５号明細書（EP0427185）または米国特許第５６１０２６６号明細書（US5610266）から当該技術分野において周知である。
【００３６】
好ましくは、乳酸ポリマーは、ラクチド単位とグリコリド単位から重合されたコポリマー（ラクチド−グリコリドコポリマー＝ＰＬＧＡ）である。
【００３７】
好ましくは、生体吸収性ポリエステルは、好ましくは０．１〜２．０［ｄＬ／ｇ］、０．１２〜１．２［ｄＬ／ｇ］、０．１４〜１．０［ｄＬ／ｇ］、０．１６〜０．４４［ｄＬ／ｇ］、０．１６〜０．２４［ｄＬ／ｇ］の固有粘度（ＩＶ）を有するポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）コポリマーである。
【００３８】
好ましい生体吸収性ポリエステルは、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）コポリマー中での重合したＤ，Ｌ−ラクチド：グリコリド単位の割合が８０：２０〜２０：８０重量部もしくはモル（モル比）、７０：３０〜３０：７０重量部もしくはモル、６０：４０〜４０：６０重量部もしくはモル、または８０：２０〜６０：４０重量部もしくはモルであり、それによってＤ，Ｌ−ラクチド：グリコリドの量が合計して約１００％となるポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）コポリマーである。
【００３９】
好ましい生体吸収性ポリエステルは、ＲＥＳＯＭＥＲ（登録商標）ＲＧ  ５０３またはＲＥＳＯＭＥＲ（登録商標）ＲＧ  ５０３  Ｈタイプのものであり、これらは４５：５５〜５５：４５、好ましくは５０：５０のＤ，Ｌ−ラクチド：グリコリド比（モル比）と、０．２８〜０．４８［ｄＬ／ｇ］または０．３〜０．４６［ｄＬ／ｇ］の範囲の固有粘度ＩＶを有するポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）コポリマーである。
【００４０】
好ましい生体吸収性ポリエステルは、ＲＥＳＯＭＥＲ（登録商標）ＲＧ  ５０２またはＲＥＳＯＭＥＲ（登録商標）ＲＧ  ５０２  Ｈタイプのものであり、これらは４５：５５〜５５：４５、好ましくは５０：５０のＤ，Ｌ−ラクチド：グリコリド比（モル比）と、０．１６〜０．４４［ｄＬ／ｇ］または０．１６〜０．２４［ｄＬ／ｇ］の範囲の固有粘度ＩＶを有するポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）コポリマーである。
【００４１】
生体吸収性ポリエステルは、約３０〜６０℃、３５〜５５℃のガラス転移温度Ｔｇを特徴とし得る。ガラス転移温度は、好ましくは、米国薬局方３６（ＵＳＰ）第＜８９１＞章、欧州薬局方７．０（ＥＰ）第２．２．３４章およびＤＩＮ  ５３７６５：１９９４−０３（Ｄ）に従って測定することができる。
【００４２】
「生体吸収性ポリエステル」における「生体吸収性」という用語は、好ましくは乳酸系ポリマーであるポリエステルが、ヒトの体内または動物の体内への移植または注射後に体液と接触してゆっくりとした加水分解反応においてオリゴマーに分解されることを意味する。乳酸またはグリコール酸のような加水分解最終生成物は、二酸化炭素と水に代謝される。「生体吸収性ポリエステル」という用語の代わりに頻繁に使用される他の交換可能な表現は、「吸収性ポリエステル」、「生分解性ポリエステル」または「吸着性ポリエステル」である。
【００４３】
粉末
本出願は、開示される方法から得られるかまたは得られた、ヒト凝固因子タンパク質と乳酸ポリマーを含み、０．５μｍより大きく５μｍまで、０．６〜３μｍ、０．８〜２．０μｍ、０．９〜１．５μｍの範囲の粒度ｄ５０を有する粉末を含む。
【００４４】
医薬組成物
本出願はまた、開示された粉末を含む、乾燥、分散または溶解された形態の医薬組成物を開示する。医薬組成物はさらに、分散もしくは溶解された形態のための担体液体としての水および／または医薬的に許容される賦形剤、例えば塩、緩衝剤または安定剤を含むことができる。本出願は、ヒト凝固因子タンパク質にまつわる疾病または遺伝性疾患の治療に適した医薬組成物を製造するための粉末の使用を含む。
【００４５】
実施例
材料：
【表１】
0006750153.tif 000002
【００４６】
【表２】
0006750153.tif 000003
【００４７】
【表３】
0006750153.tif 000004
【００４８】
【表４】
0006750153.tif 000005
【００４９】
【表５】
0006750153.tif 000006
【００５０】
方法：
活性測定および動態(kinetics)のための二成分混合物
原則として、種々の配合成分の母液または分散液を調製し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７．４［欧州薬局方のモノグラフ「４．０１．０３  Ｂｕｆｆｅｒ  ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ」］中で、適切な量で混合して（１：１ｖ／ｖ混合）、基準（例えば１００ＩＵの活性を有するＨａｅｍｏｃｔｉｎ（登録商標））、プラセボ（分散液１．５ｍＬにつき１０ｍｇのＰＬＧＡ上澄み（ＲＥＳＯＭＥＲ（登録商標）５０３  Ｈ）、酢酸エチル（水溶性画分）および異なる作業混合物（例えば二成分混合物と呼ばれる２つの成分の混合物）を、活性試験の定量範囲内の活性レベルを有するものとして得た。通常、約１ＩＵ／ｍＬ（ＩＵ＝国際単位）の活性が目標として意図され、定義によれば、これは健康なヒトにおける所望のＦＶＩＩＩ活性レベルである。すべてのサンプル調製は、汚染を回避するために無菌条件下で行った。
【００５１】
活性アッセイ二成分混合物
血液第ＶＩＩＩ因子活性の測定は、ＣｏａＣｈｒｏｍ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａからの市販のＢＩＯＰＨＥＮ（登録商標）発色アッセイキット第ＶＩＩＩ：Ｃ因子を用いて行った（アッセイ原理を要約すれば：トロンビンによって活性化されると、第ＶＩＩＩ：Ｃ因子が、第ＩＸａ因子、リン脂質およびカルシウムと酵素複合体を形成し、これが第Ｘ因子を第Ｘａ因子に活性化する。第Ｘａ因子は、基質を切断して、ｐＮＡ／パラ−ニトロアニリンを放出する。生成されたｐＮＡの量は、第Ｘａ因子活性に正比例する）。Ｈａｅｍｏｃｔｉｎ（登録商標）と、可能な製剤アプローチの成分のほかに製剤アプローチのために使用される溶媒との二成分混合物を、活性アッセイのサンプルとして試験した。すべてのサンプルを、約１ｍｇ／ｍＬの最終的に予想されるタンパク質濃度および約１００ＩＵ／ｍＬの予想される活性で調製した。
【００５２】
活性アッセイの調製ステップとして、各キット試薬Ｒ１−３を２．５ｍＬの細胞培養水で再構成し、次いでボルテックスで混合し、室温（１８〜２５℃）で３０分間インキュベートする。その後、試薬は、試験のために３７℃でプレインキュベートしなければならない。
【００５３】
次のステップとして、キャリブレーション血漿の活性基準線について調製した。それゆえ、凍結乾燥血漿を１ｍＬの細胞培養水で再構成し、次いでボルテックスで混合し、さらに室温で３０分間インキュベートした。キャリブレーション血漿は、そのとき約７０％の活性を含んでいた。キャリブレーション血漿は、活性２００％で開始し、１：４０の内部アッセイ希釈液を含むキャリブレーションラインに用いられるべきである。それゆえ、血漿を１：１４に希釈し（１００μＬのキャリブレーター血漿を１３００μＬのＴｒｉｓ−ＢＳＡ緩衝液（Ｒ４＋）に加えた；式２００×血漿の濃度／１００に基づく）、同時にすべてのサンプルを１：４０に希釈した。したがって、活性２００％で開始して、以下のキャリブレーションラインを調製する：
【表６】
0006750153.tif 000007
【００５４】
５０μＬ／ウェルの各濃度を９６ウェルプレートに３回適用した；５０μＬのＴｒｉｓ−ＢＳＡ緩衝液Ｒ４＋の追加の３つのウェルをバックグラウンド参照として使用した。
【００５５】
試験サンプルの調製を参照すると、それらのすべてをアッセイ性能の前に０．２〜２ＩＵ／ｍＬの濃度に希釈した。したがって、Ｈａｅｍｏｃｔｉｎ（登録商標）サンプルを、Ｔｒｉｓ−ＢＳＡ緩衝液中で主として１：１００に希釈した（予想される活性１ＩＵ／ｍＬ）。さらに、各サンプルを内部アッセイ希釈のためにさらに追加的に１：４０に希釈した（血漿キャリブレーターを用いたキャリブレーションライン参照）。再度、１ウェルにつき５０μＬを３回、９６ウェルプレートに加えた。
【００５６】
すべてのサンプル、対照およびキャリブレーションラインを９６ウェルプレートに適用した後、以下のアッセイステップを実施した：
・  ５０μＬのＲ１を加えるステップ（キット試薬１、ヒト第Ｘ因子およびフィブリン重合阻害剤、３７℃でプレインキュベート済み）
・  ５０μＬのＲ２を加えるステップ（キット試薬２、第ＩＸａ因子、トロンビン、リン脂質およびカルシウム、３７℃でプレインキュベート済み）３７℃で５分間インキュベーション
・  ５０μＬのＲ３を加えるステップ（キット試薬３、第Ｘａ因子特異的発色基質、３７℃でプレインキュベート済み）５０μＬの酢酸２０％を３７℃で正確に５分間インキュベーション
【００５７】
吸光度の測定は、マルチプレートリーダーによって４０５ｎｍで２時間以内に行われるべきである。
【００５８】
データ分析のために、Ｔｒｉｓ−ＢＳＡ緩衝液（Ｒ４＋）の吸光度を、キャリブレーションシリーズを含むすべてのサンプルから差し引いて、平均値を計算した。キャリブレーションラインの調製後、サンプルのＦＶＩＩＩ：Ｃ活性は、キャリブレーションラインの式を使用して計算することができた。
【００５９】
最終結果を得るために、アッセイ前の希釈ステップ（１：１００および１：４０）を、以下の計算を用いて考慮に入れなければならなかった：
活性［％］×１００／４０
【００６０】
得られる値は、サンプルの活性を示す。
【００６１】
血液因子／ＰＬＧＡ製剤およびＨａｅｍｏｃｔｉｎ（登録商標）対照の凍結乾燥
２−プロパノールで洗浄しなければならなかったガラスビーカーに、約４５０ｍｇの予め緩めた血液因子製品（例えばＨａｅｍｏｃｔｉｎ（登録商標））を移し、その後に約４．０９ｇのＰＬＧＡ（ＬＳＢ  ５０５０  ＤＬＧ  ２Ａ、ｄ５０＝７４１ｎｍ）を加える。約７０ｍＬの細胞培養用の水を加え、穏やかに手動で旋回させた後、得られた懸濁液を３０ｍＬのビーズ瓶に定量充填しなければならず（最大５ｍＬ、最大液面高さにより適切な凍結乾燥プロセスを保証する）、続けて凍結乾燥処理を行った。
【００６２】
対照として、１バイアルのＨａｅｍｏｃｔｉｎ（登録商標）ＳＤＨ  １０００を、５ｍＬの細胞培養用の水に溶解し、Ｈａｅｍｏｃｔｉｎ（登録商標）／ＰＬＧＡ（ＬＳＢ  ５０５０  ＤＬＧ  ２Ａ、ｄ５０＝７４１ｎｍ）製剤と同じ手順で凍結乾燥した。
【００６３】
【表７】
0006750153.tif 000008
【００６４】
調製した凍結乾燥製剤の最終的な保管は、ブチルゴム栓とアルミニウムキャップシールで密閉した、同じ３０ｍＬのガラス瓶中で＋２℃〜＋８℃にて行われるべきである。
【００６５】
エネルギー分散型Ｘ線分光法（ＥＤＸ）分析（Ｈａｅｍｏｃｔｉｎ（登録商標）製剤）
ＥＤＸ測定は、特定のＥＤＸユニットを含む走査型電子顕微鏡を用いて行った。
【００６６】
Ｈａｎｄｉ−Ｐｒｅｓｓから得られた錠剤を、自己接着性グラファイトパッドを含むアルミニウムサンプルプレート上に直接固定し、薄い炭素層で所定の時間スチーム処理した。その後、表面を測定したが、切断面については、ＥＤＸ分析中のアーチファクトまたはシャドーイング効果を回避するために、ミクロトームを用いて錠剤を切断した。
【００６７】
凍結乾燥血液因子製品／ＰＬＧＡ製剤の錠剤化
錠剤化する前に、最終的な錠剤の微生物汚染を回避するために、成分と接触するシングルパンチ打錠機のすべての装置部分を２−プロパノールで洗浄しなければならなかった。その後、凍結乾燥物として、約２００ｍｇの製剤９０％を、供給位置（サイクルにおける最も低い位置）の下部パンチに手で（ヘラを使用して）充填し、錠剤に圧縮すべきである。
【００６８】
上部パンチの送り／圧縮深さ設定を、約１．２５に調節して、低圧縮錠剤を製造した；上部パンチの設定を、約２．００に調節して、強圧縮錠剤を製造した。錠剤圧縮のために適用した圧力は、０．４〜０．６ｋＮの範囲であった。
【００６９】
改善された凍結乾燥製剤９０％の粉砕
最終的な粉砕製品の微生物汚染を回避するために、ミリングプロセスの前に、粉砕ボウルおよび粉砕ボールを完全に洗浄し、オートクレーブ処理した。試験材料のボウル中への充填ステップのほかにサンプリング（最終粉砕製品／分析サンプル）も無菌条件下で行われるべきである。
【００７０】
少なくとも約２ｇの調製された血液因子／ＰＬＧＡ（ＬＳＢ  ５０５０  ＤＬＧ  ２Ａ、ｄ５０＝７４１ｎｍ）錠剤を、無菌粉砕ボウル中に充填し、安全面のためにＰＥ袋に包装した。いったん閉じたら、粉砕ボウルは滅菌作業台の外側に移すことができた。「すぐに使用できる」粉砕ボウルを装置中に組み込んだ後、粉砕プロセスを、表８に記載しているように行うことができた。
【００７１】
【表８】
0006750153.tif 000009
【００７２】
最終的に、得られた粉砕調製物の含水量は、カールフィッシャー滴定より測定して≦３％であるべきである。
【００７３】
粒度分布の測定
粒度分布の決定は、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ（登録商標）ＬＳによって行った。表９は、サンプル測定に用いた装置設定の概要を示す。
【００７４】
【表９】
0006750153.tif 000010
【００７５】
ＴＲＩＳ緩衝液ｐＨ７．９、細胞培養用の水および／またはＴｗｅｅｎ（登録商標）２０（１０％ｗ／ｗ）を、バックグラウンド参照および懸濁培地としてこのプロジェクト中に使用した。サンプル（スパチュラ点）は、測定前に好ましい懸濁培地中に懸濁させなければならない。必要に応じて、サンプルの部分的に短い超音波処理を、旋回および反転に加えて行った。
【００７６】
錠剤および粉砕されたサンプルの活性アッセイ動態
錠剤または粉砕サンプルとしての血液第ＶＩＩＩ因子活性の測定は、ＣｏａＣｈｒｏｍ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａからの市販のＢＩＯＰＨＥＮ（登録商標）発色アッセイキット第ＶＩＩＩ：Ｃ因子を用いて実施した。未粉砕の錠剤は、異なる量のポリマーならびに組換えＦＶＩＩＩ（Ａｄｖａｔｅ（登録商標））およびｖＷＦを含むかまたは含まないＨａｅｍｏｃｔｉｎ（登録商標）でできているのに対して、粉砕されたサンプルは、ポリマーおよびＨａｅｍｏｃｔｉｎ（登録商標）のみを含有していた。各々の錠剤または粉砕されたサンプルを３回製造し、活性アッセイ用のサンプルとして使用した。
【００７７】
アッセイ性能のために、洗浄したピルスプリッターを使用して錠剤を断片に切断し、それぞれ最終的に予測されるタンパク質活性が１ＩＵ／ｍＬになるように秤量した。各々の錠剤片を１ｍＬまたは２ｍＬの欠乏血漿で満たし、３７℃、６００ｒｐｍで加熱式サーモシェーカーにおいて７日間（７ｄ）までインキュベートした。
【００７８】
インキュベーション中の血漿の汚染を回避するために、無菌条件下ですべての作業ステップを行った。欠乏血漿を、使用前に濾過した（孔径０．２μｍ）。
【００７９】
各々のアッセイ性能については、Ｈａｅｍｏｃｔｉｎ（登録商標）の新鮮なバイアルを使用した。
【００８０】
キャリブレーションカーブについては、ＥＤＱＭからの標準ヒト凝固第ＶＩＩＩ因子濃縮物ＢＲＰを使用した。それゆえ、凍結乾燥ＢＲＰ濃縮物を１ｍＬの細胞培養水で再構成して１０．４ＩＵ／ｍＬの濃度を得た。
【００８１】
【表１０】
0006750153.tif 000011
【００８２】
活性アッセイ動態の開始活性のために、場合によっては、試験サンプルおよび対照の内部アッセイ希釈液が、ＢＩＯＰＨＥＮ（登録商標）発色アッセイキット第ＶＩＩＩ：Ｃ因子の検出範囲に準拠するために必要であった。
【００８３】
１：４０の内部アッセイ希釈を含むために、各々の試験サンプル、対照およびキャリブレーションラインのサンプルをさらに希釈し、すなわち、５μＬのサンプルを１９５μＬのＴｒｉｓ−ＢＳＡ緩衝液（Ｒ４＋）に添加した。したがって、１９５μＬのＴｒｉｓ−ＢＳＡ緩衝液（Ｒ４＋）中で５μＬの欠乏血漿を、バックグラウンド参照として役立てた。
【００８４】
活性アッセイは、「活性アッセイ二成分混合物」の箇所に記載されているように行った。
【００８５】
ＡＴＲ−ＩＲ分光法（減衰全反射赤外分光法）
少量の乾燥サンプルを、規定のオーム抵抗（２００Ω）で担体結晶（ダイヤモンド）上に押し付け、続けて、ＡＴＲユニットを追加で備えたＮｉｃｏｌｅｔ  ＦＴ−ＩＲ分光計を用いて４０００〜４００ｃｍ−１の全スペクトルを測定した。その後、使用した物質および／またはステップ間の相互作用の説明のために、特異的バンドアミドＩ（１７００〜１５００ｃｍ−１）を詳細に考慮し、すなわち、３３．３３３ｃｍ−１の波数範囲を有する６つの間隔領域を分析点として固定した。
【００８６】
ＰＬＧＡ（ＬＳＢ  ５０５０  ＤＬＧ  ２Ａ、ｄ５０＝７４１ｎｍ）単独では、特異的バンドアミドＩ（１７００〜１５００ｃｍ−１）において、ほとんどシグナルが示されない。しかしながら、バックグラウンドノイズは、製剤９０スペクトルから減じた。
【００８７】
Ｈａｅｍｏｃｔｉｎ（登録商標）単独、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）単独およびフォン・ヴィレブランド因子（ｖＷＦ）単独では、特異的バンドアミドＩ（１７００〜１５００ｃｍ−１）において有意なシグナルが示され、これを参照スペクトルとして使用して、相応の製剤（全製剤９０／１０）からのものと比較した。
【００８８】
製剤９０（ＰＬＧＡ（ＬＳＢ  ５０５０  ＤＬＧ  ２Ａ、ｄ５０＝７４１ｎｍ）＋Ｈａｅｍｏｃｔｉｎ（登録商標）、９０／１０）、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）の製剤およびフォン・ヴィレブランド因子（ｖＷＦ）の製剤では、特異的バンドアミドＩ（１７００〜１５００ｃｍ−１）において有意なシグナルが示され、これはＨａｅｍｏｃｔｉｎ（登録商標）単独とは異なる。
【００８９】
表１６〜１８において得られるサンプル値は、総（１００％）測定アミドＩピーク面積に対する各間隔領域の百分率を示す。
【００９０】
結果：
活性アッセイおよび動態
Ｈａｅｍｏｃｔｉｎ（登録商標）と、可能な製剤アプローチの可能な成分との適合性を分析するために、Ｈａｅｍｏｃｔｉｎ（登録商標）、ＲＥＳＯＭＥＲ（登録商標）（懸濁液の水相）、酢酸エチル（エマルジョンの水相）の二成分混合物を、活性アッセイで試験した。
【００９１】
表１１は、アッセイ手順の変更により、予想されたとおり活性８０％の範囲の正常血漿の活性が生じ、アッセイ手順に明確な間違いがないことが確認されたことを示す。この結果は一般に、試験された製剤成分（例えばＲＥＳＯＭＥＲ（登録商標）５０３Ｈの水性上澄み）のいずれも、活性アッセイにおいて有意なバックグラウンドシグナルを生まないことを示した。そのうえ、Ｈａｅｍｏｃｔｉｎ（登録商標）とこれらの成分との混合物の結果は、Ｈａｅｍｏｃｔｉｎ（登録商標）単独と比較して高い活性傾向にあることを示す（例えばＲＥＳＯＭＥＲ（登録商標）５０３Ｈ＋Ｈａｅｍｏｃｔｉｎ（登録商標））。さらに、酢酸エチルの存在が、ほぼゼロとなる活性の有意な低下につながった。
【００９２】
【表１１】
0006750153.tif 000012
【００９３】
最初の適合性試験の後、異なるＨａｅｍｏｃｔｉｎ（登録商標）／ポリマー比を用いて錠剤を製造した。ポリマーと混合および調製されるＨａｅｍｏｃｔｉｎ（登録商標）の最適比を見出すために、これらの錠剤の第ＶＩＩＩ活性について試験した。最適比は、Ｈａｅｍｏｃｔｉｎ（登録商標）の持続放出によってＦＶＩＩＩ活性の延長された半減期を可能にし、同時に７日間の期間にわたって活性に影響を与えるのに十分速い放出を保証するべきである。
【００９４】
表１２は、７０〜９８％のポリマーのポリマー割合が、必要に応じてＨａｅｍｏｃｔｉｎ（登録商標）活性に影響を及ぼし、ここで、９０％のポリマー含有率が最適であることを示す。
【００９５】
【表１２】
0006750153.tif 000013
【００９６】
製剤をさらに最適化し、静脈内投与に適した粒子製剤（粒径≦１μｍ）を製造するために、製剤９０％を用いて以下のプロセスステップを実施し、さらには「製剤９０」と記載する。
【００９７】
ステップａ）：ポリマーとＨａｅｍｏｃｔｉｎ（登録商標）との９０／１０混合物の懸濁液を水中で調製して、異なる製剤バッチ間の偏差の減少を保証する均質な混合物を達成した。
ステップｂ）：懸濁液をさらに凍結乾燥して、ＦＶＩＩＩ活性を妨害するであろう水を再び除去した。
ステップｃ）：凍結乾燥粉末を圧縮して、Ｈａｅｍｏｃｔｉｎ（登録商標）成分をポリマーに付着させた。
ステップｄ）：このプロセスの最終ステップとして、静脈内投与に適しており、かつＨａｅｍｏｃｔｉｎ（登録商標）をポリマーにさらに付着させるために、錠剤を約１μｍの粒度に粉砕する。
【００９８】
プロセスステップ１の箇所で述べた均質性を、ＥＤＸ（エネルギー分散型Ｘ線分光法）により分析した。ＥＤＸ分析の結果、サンプル中の以下のイオンとそれらの分布が、特定の色で表される：
・  赤色：酸素
・  黒色／灰色：炭素
・  緑色：ナトリウム
・  青色：塩化物
【００９９】
一般にＨａｅｍｏｃｔｉｎ（登録商標）中に存在する低い割合のＦＶＩＩＩタンパク質に加えて、Ｈａｅｍｏｃｔｉｎ（登録商標）中の残りの成分は、アミノ酸、塩および安定剤の混合物である。それゆえ、Ｈａｅｍｏｃｔｉｎ（登録商標）ＥＤＸの結果で観察されることができ、純粋なＰＬＧＡ（ＬＳＢ  ５０５０  ＤＬＧ  ２Ａ、ｄ５０＝７４１ｎｍ）では入手できないナトリウム（緑色）および塩化物（青色）の検出に主な焦点を当てた。
【０１００】
製剤混合物の均質性を達成するためのいくつかの試みにおいて、調製されたＰＬＧＡ（ＬＳＢ  ５０５０  ＤＬＧ  ２Ａ、ｄ５０＝７４１ｎｍ）（９０％）／Ｈａｅｍｏｃｔｉｎ（登録商標）（１０％）製剤の最良の均質性が、水中での製剤懸濁液の凍結乾燥プロセス後に検出可能であった。Ｈａｅｍｏｃｔｉｎ（登録商標）（緑色および青色）は、ＥＤＸ試験サンプルにおいて均一に分布している。
【０１０１】
ＰＬＧＡを、ふるい分したＨａｅｍｏｃｔｉｎ（登録商標）と混合することによる製剤製造プロセスに基づく良好な均質性を達成することはできなかった。Ｈａｅｍｏｃｔｉｎ（登録商標）のより明るいスポットは、ＰＬＧＡ（ＬＳＢ  ５０５０  ＤＬＧ  ２Ａ、ｄ５０＝７４１ｎｍ）の赤色シグナルのバックグラウンドにおいて観察された。
【０１０２】
さらに、粒度および分布の測定を行った。改善された製剤（ＰＬＧＡ（ＬＳＢ  ５０５０  ＤＬＧ  ２Ａ、ｄ５０＝７４１ｎｍ）（９０％）／Ｈａｅｍｏｃｔｉｎ（登録商標）（１０％））錠剤（低圧縮、粉砕条件２）の粉砕混合物について最良の粒度分布（約１μｍのｄ５０）が示される。
【０１０３】
１０％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０中での超音波処理（１分）後の粉砕製剤（ＰＬＧＡ（ＬＳＢ  ５０５０  ＤＬＧ  ２Ａ、ｄ５０＝７４１ｎｍ）（９０％）／Ｈａｅｍｏｃｔｉｎ（１０％）、低圧縮錠剤、粉砕条件２）の粒度分布は、ｄ１０：０．５７４μｍ／ｄ５０：１．２５２μｍ／ｄ９０：１１．８９μｍであった。
【０１０４】
表１３は、適用されたプロセスステップがＨａｅｍｏｃｔｉｎ（登録商標）の活性に及ぼす影響を示す。ＡＵＣ値は、異なるプロセス条件に起因してＦＶＩＩＩ活性の低下を示し、緩和された粉砕条件が好ましいものであることを指し示す。第ＶＩＩＩ因子活性のこの部分的な低下は、表１５に示される用量調節によって等しくされる。
【０１０５】
さらに、表１３は、７日間の動態期間における活性の挙動を示し、低圧で圧縮され、かつ緩和された条件下で粉砕された９０／１０製剤（ＰＬＧＡ（ＬＳＢ  ５０５０  ＤＬＧ  ２Ａ、ｄ５０＝７４１ｎｍ）（９０％）／Ｈａｅｍｏｃｔｉｎ（登録商標）（１０％）＝「製剤９０」）について２日目（７７％）および７日目（５５％）のＦＶＩＩＩ活性の改善された半減期を明示する。さらに、すべてのプロセスステップは、Ｈａｅｍｏｃｔｉｎ（登録商標）対照と比較して７日目に残った活性に好ましい影響を及ぼす。
【０１０６】
【表１３】
0006750153.tif 000014
【０１０７】
表１４には、ＰＬＧＡ（ＬＳＢ  ５０５０  ＤＬＧ  ２Ａ、ｄ５０＝７４１ｎｍ）を用いたＦＶＩＩＩの乾燥圧縮が、Ａｄｖａｔｅ（登録商標）単独と比較して２日目の動態の組換え第ＶＩＩＩ因子（Ａｄｖａｔｅ（登録商標））の改善されたＦＶＩＩＩ活性をさらにもたらしたことが示される。２日目の製剤９０／Ｈａｅｍｏｃｔｉｎ（登録商標）について１００％を超える活性の増加は、Ｈａｅｍｏｃｔｉｎ（登録商標）または正確には錠剤からのＦＶＩＩＩの持続放出によって説明することができる。
【０１０８】
【表１４】
0006750153.tif 000015
【０１０９】
表１３は、好ましい製造プロセスとして低圧錠剤化および緩和された粉砕条件と一緒に凍結乾燥プロセスを行うことを指し示しており、このプロセスは、追加のプロセス反復および活性動態によってさらに検証した。
【０１１０】
ここでは、適用されたプロセス条件によって引き起こされる活性低下を考慮に入れながら、開始活性として１ＩＵ／ｍＬまで用量を調節して動態を実施した。結果を表１５に示す。
【０１１１】
この用量調節は、７日間にわたってＦＶＩＩＩ活性に及ぼす製剤の効果を変化させなかった。
【０１１２】
【表１５】
0006750153.tif 000016
【０１１３】
再び、製剤９０サンプルは、２日目および７日目の動態について、より高いＦＶＩＩＩ活性を示した。
【０１１４】
製剤９０の有望なｉｎ  ｖｉｔｒｏ結果はまた、表１５における有意に増大した曲線下面積（ＡＵＣ値）によって示される、マウスでの４８時間のｉｎ  ｖｉｖｏ試験によっても確認することができた。
【０１１５】
ＡＴＲ−ＩＲ分光法
少量の乾燥サンプルを、規定のオーム抵抗（２００Ω）で担体結晶（ダイヤモンド）上に押し付け、続けて、ＡＴＲユニットを追加で備えたＮｉｃｏｌｅｔ  ＦＴ−ＩＲ分光計を用いて４０００〜４００ｃｍ−１の全スペクトルを測定した。その後、使用した物質および／またはステップ間の相互作用の説明のために、特異的バンドアミドＩ（１７００〜１５００ｃｍ−１）を詳細に考慮し、すなわち、３３．３３３ｃｍ−１の波数範囲を有する６つの間隔領域を分析点として固定した。得られるサンプル値は、総測定アミドＩピーク面積に対する各間隔領域の割合を示す。
【０１１６】
【表１６】
0006750153.tif 000017
【０１１７】
【表１７】
0006750153.tif 000018
【０１１８】
【表１８】
0006750153.tif 000019
【０１１９】
表１６〜１８は、製剤（製剤９０％）に依存するコンフォメーション／アグリゲーション−３つの血液因子（ＦＶＩＩＩ、ＦＩＸおよびｖＷＦ）のすべての変化を示す。これらの変化は、１６００ｃｍ−１付近のアミドＩバンドの高エネルギー領域の最も感度の高い部分への間隔領域の有意なシフトのほかに、このアミドＩ領域へのより大きな寄与ももたらす。対照的に、ＰＬＧＡ（ＬＳＢ  ５０５０  ＤＬＧ  ２Ａ、ｄ５０＝７４１ｎｍ）単独では、この領域にシグナルは示されない。