(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
a)天然配置にある、少なくとも10の機能性ヒト重鎖V遺伝子;
b)少なくとも1つのヒト重鎖D遺伝子及び少なくとも1つのヒト重鎖J遺伝子;
c)マウスμエンハンサー
d)スイッチμエレメント
e)Cγ1、Cγ2b、及び／又はCγ2aから選択される、CH1エキソンを欠損しているマウスC遺伝子、及び
f)マウス3'エンハンサー領域
を含むベクター。
【請求項２】
前記マウス3'エンハンサー領域が少なくとも42kbのサイズである、請求項1に記載のベクター。
【請求項３】
前記マウス3'エンハンサー領域が、hs3A、hs1.2、hs3B、hs4、hs5、hs6及びhs7から選択される1つ又は複数のエンハンサーエレメントを含む、請求項1又は2に記載のベクター。
【請求項４】
前記マウス3'エンハンサー領域が、エンハンサーエレメントhs3A、hs1.2、hs3B、hs4、hs5、hs6及びhs7を含む、請求項3に記載のベクター。
【請求項５】
10から44の機能性ヒトV遺伝子を含む、請求項1から4のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項６】
選択マーカーを更に含む、請求項1から5のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項７】
酵母人工染色体(YAC)である、請求項1から6のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項８】
請求項1から7のいずれか一項の記載のベクターで形質転換されたトランスジェニックマウス宿主細胞。
【請求項９】
前記細胞がES細胞である、請求項8に記載のトランスジェニックマウス宿主細胞。
【請求項１０】
請求項1から7のいずれか一項に記載のベクター又は請求項8若しくは9に記載の細胞を含むトランスジェニックマウス。
【請求項１１】
1つ又は複数の非機能性内因性免疫グロブリン遺伝子座を含む、請求項10に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項１２】
非機能性内因性ラムダ軽鎖遺伝子座を含む、請求項11に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項１３】
非機能性内因性カッパ軽鎖遺伝子座を含む、請求項11又は12に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項１４】
非機能性内因性重鎖遺伝子座を含む、請求項11から13のいずれか一項に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項１５】
非機能性内因性ラムダ軽鎖遺伝子座、非機能性内因性カッパ軽鎖遺伝子座及び非機能性内因性重鎖遺伝子座を含む、請求項11に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項１６】
HCAbドメイン又はVHドメインの産生における、請求項10から15のいずれか一項に記載のトランスジェニックマウス又は請求項8若しくは9に記載の細胞の使用。
【請求項１７】
ライブラリーの構築における、請求項10から15のいずれか一項に記載のトランスジェニックマウスの使用。
【請求項１８】
前記ライブラリーがナイーブライブラリーである、請求項17に記載のトランスジェニックマウスの使用。
【請求項１９】
請求項10から15のいずれか一項に記載のトランスジェニックマウスを使用してライブラリーを作製する方法。
【請求項２０】
前記ライブラリーがナイーブライブラリーである、請求項19に記載の方法。
【請求項２１】
請求項10から15のいずれか一項に記載のトランスジェニックマウス、又は請求項10から15のいずれか一項に記載のトランスジェニックマウスのex vivo組織若しくは細胞のex vivo免疫を含む、ライブラリーを作製する方法。
【請求項２２】
マウス又はマウス宿主細胞において、請求項1から7のいずれか一項に記載のベクターを導入及び発現させることを含む、HCAbドメイン又はVHドメインを作製する方法。
【請求項２３】
前記マウスが1つ又は複数の非機能性内因性免疫グロブリン遺伝子座を含む、請求項22に記載の方法。
【請求項２４】
前記マウスが非機能性内因性ラムダ軽鎖遺伝子座を含む、請求項23に記載の方法。
【請求項２５】
前記マウスが非機能性内因性カッパ軽鎖遺伝子座を含む、請求項22から24のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記マウスが非機能性内因性重鎖遺伝子座を含む、請求項22から25のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記マウスが非機能性内因性ラムダ軽鎖遺伝子座、非機能性内因性カッパ軽鎖遺伝子座及び非機能性内因性重鎖遺伝子座を含む、請求項22に記載の方法。
【請求項２８】
単離細胞又は単離組織に由来するmRNAからVHドメインをコードする配列をクローニングすることと、クローニングした転写産物からライブラリーを構築することと、VHドメインを単離することとを含む、請求項22から27のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
a)トランスジェニックマウスにおいて請求項1から7のいずれか一項に記載のベクターを発現させる工程と、
b)HCAbを発現する細胞又は組織を単離する工程と、
c)前記単離された細胞又は単離された組織由来のmRNAからVHドメインをコードする配列をクローニングする工程と、
d)クローニングした転写産物からライブラリーを構築する工程と、
e)VHドメインを単離する工程と
を含む、可溶性VH結合ドメインを産生する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マウスにおいて発現させるための核酸構築物に関する。本発明はまた、例えば、軽鎖(L鎖)及び重鎖(H-鎖)遺伝子座の発現が損なわれているマウスにおいて産生される、重鎖のみの抗体(heavy chain-only antibodies)の産生におけるこれらの構築物の使用に関する。本発明はまた、こうした重鎖のみの抗体由来の単一VHドメインの単離及び使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ほとんどの天然抗体又は免疫グロブリン(Ig)は、典型的には、2つの重(H)鎖及び2つの軽(L)鎖を含む。H鎖は可撓性ヒンジドメイン近傍に位置するジスルフィド結合によって相互に連結されており、各H鎖はそのN末端領域に結合されているL鎖ジスルフィドを有し、H2L2ヘテロ四量体を形成する。各L鎖は可変(VL)ドメイン及び定常(CL)ドメインを有するが、各H鎖は可変ドメイン(VH)、第1定常ドメイン(CH1)、ヒンジドメイン及び2又は3つのさらなる定常ドメイン(CH2、CH3、及び任意選択でCH4)を含む。正常な二量体抗体(H2L2)においては、各VHドメイン及びVLドメインの相互作用が抗原結合領域を形成する(CH1ドメインとCLドメインとの間の相互作用によって、重鎖と軽鎖との間の機能的結合が促進することも知られている)。
【０００３】
いくつかの異なるクラスの天然Igが知られている。これらのクラス(又はアイソタイプ)は、それらのH鎖の定常ドメインにおいて異なっており、その結果、Igの機能に影響を及ぼす。哺乳動物において、Igの5つのアイソタイプは、IgA、IgD、IgE、IgG及びIgMである。IgAはCα遺伝子セグメントによってコードされているCHドメインを含み、粘膜免疫において中心的な役割を果たす。分泌型IgAは、1つのJ鎖によって連結されている2つのH2L2ユニットを含有している二量体であり、一般に、ミルク及び初乳等の分泌物中に豊富である。血清IgAは、ヒトにおいてH2L2モノマーとして存在する。IgDは、Cδ遺伝子セグメントによってコードされているCHドメインを含み、単量体であり、抗体産生に関係する細胞であるB細胞上の抗原受容体として機能する。IgEは、Cε遺伝子セグメントによってコードされているCHドメインを有し、また単量体であり、マスト細胞上の高親和性Fcε受容体に結合した場合、サイトカイン及びヒスタミンの放出を誘発するアレルゲンによって架橋され得る(アレルギー応答)。IgGはヒトにおいて4つの異なるサブタイプとして存在し、その全てが単量体であり、Cγ遺伝子セグメントによってコードされているCHドメインを含む。IgGアイソタイプは、成熟抗体に基づく(体液性)免疫応答の大部分を含む。最後に、IgMは、Cμ遺伝子セグメントによってコードされているCHドメインを有し、(IgG、A及びEと同様に)B細胞の表面上及び分泌形態の両方で発現される。分泌型IgMは五量体であり、初期の体液性応答の一部として病原体を排除する際に重要な役割を果たす。
【０００４】
B細胞における正常なIg発現は、順序づけられた連続する遺伝子再配列が関与する。H鎖の可変領域をコードしているエキソンは、VH、多様性(D)セグメント及び連結(JH)セグメントのアセンブリによってin vivoで構築される。L鎖に関する可変領域は、同様のプロセスで、VLセグメント及びJLセグメントのアセンブリによって再編される。再配列されたVDJ領域は、まず、Cμ遺伝子セグメントと共に転写され、IgM H鎖の合成が導かれる。次に、周辺において、スイッチ組換えがVDJエキソンに近接する下流のCH遺伝子セグメント(δ、γ、α又はε)を更にもたらし、Igクラスのスイッチが起こる。L鎖を含まないH鎖Igを発現するB細胞の成熟は、小胞体中のH鎖のシャペロン会合によって阻止される。しかし、CH1がH鎖から欠落している場合、この制御は除外され、H鎖は阻止されることなく細胞表面に移動し分泌され得る。実際、本発明者らは、既に、全く思いがけず、L-/-(κ-/-λ-/-欠損)マウスが、遺伝子操作を更に行わなくても、血清中に様々なH鎖のみの抗体を産生し、この産生は、H鎖転写産物からのCH1エキソンの突発的な欠失の結果、比較的低レベルで起こることを明らかにした。
【０００５】
核脚下目又はラクダ科(ヒトコブラクダ、ラクダ及びラマ)において、ペアの重鎖のみから構成されるIgの主なタイプ(重鎖のみの抗体、HCAb)は、従来のH2L2抗体に加えて、抗原に対する正常な体液性免疫反応の一部として産生される(Padlan, E.A. 1994, Mol. Immunol. 31:169-217)。これらの動物におけるHCAb発現を導く発生プロセスは未知であるが、それらが、(RNA転写物の代替スプライシングによって除かれる)CH1ドメインを欠損している従来の重鎖よりも小さな特定のクラスのVH(VHH)遺伝子及びCγ遺伝子を使用することは知られている。また重鎖抗体は、いくつかの原始的な魚類に存在している。例えば、テンジクザメの新抗原受容体(NAR)及びギンザメの特殊重鎖(COS5)である(Greenbergら, 1996, Eur. J. Immunol. 26:1123-1129, Rastら, 1998, Immunogenetics, 47:234-245)。なおまた、これらの重鎖IgもCH1型ドメインを欠損している。
【０００６】
従来の抗体は、長い間、標的抗原に対するそれらの精巧な選択性、特異性及び有効性に基づき、強力なツールと考えられてきた。実際、これらは、現在、非常に有効な治療薬として十分に確立されており、2012年の販売高は540億ドルで、今後数年間には著しく拡大し続けると予想される。しかし、抗体ベースの次世代の治療薬候補を導き出すため、代わりとなるフォーマット及びより小さなフラグメントの利点を活用することへの需要が高まっている。
【０００７】
VHフラグメント又はVHHフラグメントは、標的特異性及び有効性を保持する免疫グロブリン分子の最小部分であり、安定性、溶解性、技術的及び製造的容易性の観点において最も安定性のある抗体フラグメントである。これにより、特に、局部送達及び局所送達用の製品、純粋なアンタゴニスト並びに二重特異性又は多重特異性製品を開発するのに極めて有利な、非常に好ましい治療薬が得られる。特に、候補医薬品として使用されるラクダ科VHHドメインの可能性が非常に注目されている。しかし、これらはヒトのアミノ酸配列を有していないという事実があり、このことはヒトに投与した場合(特に、疾患適応症が長期投与を必要とする場合)に、抗薬物抗体反応を誘発する可能性があることから、ラクダ科VHHドメインが最適候補薬剤となる上で不利と考えられる重要な特徴の1つとなっている。
【０００８】
そのため、治療薬候補として、ヒトVH(又はVL)ドメインを産生することに大きな関心が寄せられている。従来の抗体に由来するVHドメインはコンパニオンVLドメインを必要とし、その非存在下では、それらの発現は困難であり、多くの場合、不溶性で、標的抗原に対する結合親和性及び特異性が喪失されることが十分に知られている。その結果、パートナードメインの存在下で開発されたドメインを使用して構築されたin vitroディスプレイライブラリーに由来する、単離ヒトVH(又はVL)ドメインには、溶解性及び安定性を高めるための効果的技術が必要である。
【０００９】
本発明は、ノックアウトマウスに、少なくとも10の機能性ヒト及び非操作V遺伝子をそれらの天然配置において含むキメラ核酸構築物を発現させることによって、CH1を有さない様々なHCAbが産生され得るという驚くべき知見(下記の実施例を参照)から得ている。そのゲノムに組み込まれたヒト又はキメラの重鎖遺伝子座を有する本発明のマウスにおけるHCAbの産生は、治療薬の製造において多くの利点をもたらす。こうしたHCAb抗体は完全ヒトVHドメインを含み、これはパートナーVLドメインの非存在下においてin vivoで成熟した。こうしたHCAbに由来するVHドメインは非常に有効であって、可溶性、安定性であり、高レベルで発現させることができる。
【００１０】
先行技術には、免疫グロブリン軽鎖が機能的にサイレンシングされ、H鎖転写産物が自然にCH1エキソンの突発的欠失を受けるマウスにおける重鎖のみの抗体の産生が開示されている(US 12/455,913)。また先行技術には、ラクダ科VHH遺伝子を含む構築物を使用するHCAbの産生も開示されている(例えば、WO 2006/008548を参照)。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】米国特許出願公開第12/455,913号明細書
【特許文献２】国際公開第2006/008548号パンフレット
【特許文献３】国際公開第2003/000737号パンフレット
【特許文献４】国際公開第2004/076618号パンフレット
【特許文献５】国際公開第2004/01095号パンフレット
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Padlan, E.A. 1994, Mol. Immunol. 31:169〜217
【非特許文献２】Greenbergら, 1996, Eur. J. Immunol. 26:1123〜1129
【非特許文献３】Rastら, 1998, Immunogenetics, 47:234〜245
【非特許文献４】Bruschi, C.V.及びGjuracic, K. Yeast Artificial Chromosomes, ENCYCLOPEDIA OF LIFE SCIENCES 2002 Macmillan Publishers Ltd, Nature Publishing Group / www.els.net
【非特許文献５】Ducryら, Bioconjugate Chem. 2010, 21, 5〜13
【非特許文献６】Methods in Molecular Biology, 54巻及び349巻
【非特許文献７】Alasdair MacKenzie, 2006, YAC protocols、第2版
【非特許文献８】Ren, L.ら, Genomics 84 (2004), 686〜695
【非特許文献９】Zou, X.ら, EJI, 1995, 25, 2154〜2162
【非特許文献１０】Zou, X.ら, JI 2003 170, 1354〜1361
【非特許文献１１】Ying, Q.L.ら, Nature, 453, 519〜523, 2008
【非特許文献１２】Nichols, J.ら, Development, 1136, 3215〜3222, 2009
【非特許文献１３】Nagy, K. & Nichols, J., "Derivation of Murine ES Cell Lines", p431〜455 in "Advanced Protocols for Animal Transgenesis. An ISTT Manual.Shirley Pease & Thomas L. Saunders編
【非特許文献１４】K. Becker & B. Jerchow "Generation of Transgenic Mice by Pronuclear Microinjection" pp 99-115 in "Advanced Protocols for Animal Transgenesis. An ISTT Manual. Shirley Pease & Thomas L. Saunders編、Springer Protocols 2011
【非特許文献１５】Hamerら, PNAS, 1995, 92(25), 11706〜10
【非特許文献１６】Davies, N.ら, "Human antibody repertoires in transgenic mice: manipulation and transfer of YACs"p59〜76 in "Antibody Engineering. A Practical Approach" McCaffertyら編、IRL Press at Oxford University Press, 1996
【非特許文献１７】Kuby Immunology、第6版; T.J. Kindt, R.A. Goldsby, B.A. Osborne, J Kuby. W.H. Freeman and Company刊, New York, 2007
【非特許文献１８】Antibody Engineering, Benny Lo編, 第8章, p161〜176, 2004
【非特許文献１９】A. Fernandez, D. Munoz & L. Montoliu "Generation of Transgenic Animals by Use of YACs" pp 137-158 in "Advanced Protocols for Animal Transgenesis. An ISTT Manual. Shirley Pease & Thomas L. Saunders編、Springer Protocols 2011
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、マウスを形質転換するための改良された構築物及びヒトVHドメインの産生を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
第1の態様において、本発明は、
a)天然配置にある、少なくとも10の機能性ヒト重鎖V遺伝子;
b)少なくとも1つのヒト重鎖D遺伝子及び少なくとも1つのヒト重鎖J遺伝子;
c)CH1エキソンを欠損しているマウスC遺伝子
を含むベクターに関する。
【００１５】
一実施形態において、ベクターはマウス3'エンハンサー領域又は遺伝子を含む。一実施形態において、前記マウス3'エンハンサー領域又は遺伝子は、少なくとも約42kbのサイズである。一実施形態において、前記マウス3'エンハンサー領域は、エンハンサーエレメントhs3A、hs1.2、hs3B、hs4、hs5、hs6及びhs7から選択される1つ又は複数のエンハンサーを含む。一実施形態において、前記マウス3'エンハンサー領域は、エンハンサーエレメントhs3A、hs1.2、hs3B、hs4、hs5、hs6及びhs7を含む。
【００１６】
本発明はまた、本発明のベクターで形質転換されたマウス宿主細胞に関する。本発明は更に、本発明に記載のベクター又は宿主細胞を含むトランスジェニックマウスに関する。好ましくは、マウスは、いかなる機能性内因性軽鎖又は重鎖を産生しないトリプルノックアウトマウスである。
【００１７】
さらなる態様において、本発明は、本発明のトランスジェニックマウスから産生される、又はトランスジェニックマウスから得ることが可能である重鎖のみの抗体又はVHドメインに関する。
【００１８】
またさらなる態様において、本発明は、マウスにおいて本発明に記載のベクターを導入し発現させることを含む、HCAb、それらのフラグメント、又はそれらから誘導される抗体を作製する方法に関する。例えば、フラグメントはVHドメインである。
【００１９】
別の態様において、本発明は、ヒトVH領域及びCH1領域を欠損しているマウス定常領域を含む、重鎖のみの抗体に関する。別の態様において、本発明は、本発明の方法によって得られる、又は得られる可能性のあるVHドメインに関する。
【００２０】
別の態様において、本発明は、ライブラリー、例えばナイーブライブラリーの構築における本発明のトランスジェニックマウスの使用に関する。
【００２１】
別の態様において、本発明は、本発明のトランスジェニックマウスを使用して、ライブラリー、例えばナイーブライブラリーを作製する方法に関する。
【００２２】
別の態様において、本発明は、本発明のトランスジェニックマウスのex vivo免疫、又は本発明のトランスジェニックマウスの組織若しくは細胞のex vivo免疫を含む、ライブラリーを作製する方法に関する。
【００２３】
最後の態様において、本発明は、本発明の方法によって得られる、又は得られる可能性のあるVHドメインを含む組成物に関する。本組成物は、VHドメインを単独で含むか、又は別のVHドメイン、タンパク質若しくは治療上有効な他の分子と組み合わせて含む。
【００２４】
本発明を、限定するものではない以下の図面において更に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】ヒトBACの図である。
【図２】マウスBACの図である。
【図３】クローン化a1及びa2を含むpYAC3の図である。
【図４】TARクローニングによるBACのYACへの転換の図である。
【図５】BITによる2つのYACの連結を示す図である。L:LYS2;A:ADE2;T:TRP1;U:URA3;K:KANr。
【図６】マウスEμ-Sμ領域の増幅を示す図である。
【図７】CH1を欠失したマウスCγ1フラグメントの増幅の図である。
【図８】pYNOTベクターの図である。
【図９】Hy-HIS3-テロメア(Telomere)YACアームを作製するためのベクターpHKT-Hyの図である。
【図１０】本発明の構築物の図である。YAC1:左から右に、テロメア-酵母TRP1マーカー遺伝子-セントロメア-10のヒトV遺伝子-ヒトD遺伝子-ヒトJ遺伝子-マウスμエンハンサー及びスイッチ-マウスCγ1(CH1Δ)遺伝子-マウス3'エンハンサー-ハイグロマイシン耐性遺伝子-酵母マーカー遺伝子HIS3-テロメア。YAC2:左から右に;テロメア-酵母TRP1マーカー遺伝子-セントロメア-23のヒトV遺伝子-ヒトD遺伝子-ヒトJ遺伝子-マウスμエンハンサー及びスイッチ-マウスCγ1(CH1Δ)遺伝子-マウス3'エンハンサー-ハイグロマイシン耐性遺伝子-酵母マーカー遺伝子HIS3-テロメア。YAC3:左から右に;テロメア-酵母TRP1マーカー遺伝子-セントロメア-23のヒトV遺伝子-ヒトD遺伝子-ヒトJ遺伝子-マウスμエンハンサー及びスイッチ-マウスCγ1(CH1Δ)遺伝子-マウスCγ2b(CH1Δ)遺伝子-マウスCγ2a(CH1Δ)遺伝子-マウス3'エンハンサー-ハイグロマイシン耐性遺伝子-酵母マーカー遺伝子HIS3-テロメア。
【図１１】標的化内因性免疫グロブリン鎖遺伝子座を有する、又は有さないマウス由来のgDNAを使用する遺伝子型決定PCR反応を示す図である。
【図１２】血清中のマウス免疫グロブリンタンパク質のELISAを示す図である。TKOマウスは、血清中にマウス重鎖を有していない。TKOマウスは、血清中にマウス重鎖-軽鎖複合体を有していない。TKOマウスは、血清中にマウス軽鎖を有していない。
【図１３】遺伝子組換え手順の概略図を示す図である。
【図１４】ESクローン内のYAC導入遺伝子の標的化ビルドオンの概略図を示す図である。
【図１５ａ】前核マイクロインジェクション後に生まれた仔由来のゲノムDNAのPCRスクリーニング、及びF0世代からF1世代への生殖細胞系伝達の試験を示す図である。YAC1を示す図である。
【図１５ｂ】前核マイクロインジェクション後に生まれた仔由来のゲノムDNAのPCRスクリーニング、及びF0世代からF1世代への生殖細胞系伝達の試験を示す図である。ゲル電気泳動を示す図である。
【図１５ｃ】前核マイクロインジェクション後に生まれた仔由来のゲノムDNAのPCRスクリーニング、及びF0世代からF1世代への生殖細胞系伝達の試験を示す図である。結果を示す図である。
【図１６】挿入されたYAC導入遺伝子のコピー数の図である。
【図１７】ファージミドベクターの地図を示す図である。
【図１８】再配列されたトランスジェニック遺伝子座から産生された転写産物の例を示す図である。
【図１９ａ】クローン化VH配列の多様性(variability)を示す図である。単一のナイーブトランスジェニックYAC1マウスから単離された転写産物の配列分析。分析された全配列:409。異なるCDR3の数:346。平均のCDR3長:13.24。全てのV遺伝子が利用される。
【図１９ｂ】クローン化VH配列の多様性を示す図である。単一のナイーブトランスジェニックYAC1マウスから単離された転写産物の配列分析。分析された全配列:409。異なるCDR3の数:346。平均のCDR3長:13.24。全てのV遺伝子が利用される。
【図２０】血清中のHCAbを検出するELISAの図である。
【図２１】染色した骨髄細胞を使用するフローサイトメトリーの図である。
【図２２ａ】脾細胞の染色を示すフローサイトメトリーの図である。
【図２２ｂ】脾細胞の染色を示すフローサイトメトリーの図である。
【図２２ｃ】脾細胞の染色を示すフローサイトメトリーの図である。
【図２３】ヘマトキシリン及びエオシンで染色した後の脾臓切片の免疫組織化学を示す図である。
【図２４】免疫に対するHCAb応答を検出するELISAの図である。様々な抗原で免疫したマウス由来の血清を免疫前(事前採血)及び実験終了時に回収した後、標的抗原への結合についてELISAで試験した。
【図２５Ａ】ファージディスプレイ選択方法の概略図を示す図である。
【図２５Ｂ】ファージディスプレイ選択方法の概略図を示す図である。
【図２６】免疫化マウス由来のクローン化VHのファージ選択の前及び後のHIS標識粗VH調製物のELISAを示す図である。
【図２７ａ】免疫したマウス由来の選択前及び選択後ライブラリーの配列を示す図である。選択前のライブラリーサイズ及び配列多様性。ファージライブラリーを4匹の免疫化マウスから構築し、抗原に対して選択する前に、少数のクローン(n=69)をライブラリーの1つからサンプリングし、配列決定した。これらのクローンの間のCDR3長の分布、及び各々のCDR3配列の出現頻度を示す。
【図２７ｂ】免疫したマウス由来の選択前及び選択後ライブラリーの配列を示す図である。4つのフレームワーク領域を有するクローン1(配列番号143、144、145、146、147及びCDR)を示す。
【図２７ｃ】免疫したマウス由来の選択前及び選択後ライブラリーの配列を示す図である。ELISAにおいて高親和性結合をもたらすin vivo体細胞超変異の例を示す。免疫化マウス由来のファージディスプレイを使用して単離した抗原結合性VHファミリーの概要である。
【図２８】選択したVHに対する結合速度論のBIAcore測定を示す図である。
【図２９】受容体に対するリガンド結合のVH介在性阻害の図である。
【図３０】a)及びb)は実験室スケールの培養からのクローン化VHの収量を示す図である。
【図３１】精製した組換え型VHの融解温度の図である。
【図３２】精製したVHのHPLC解析の図である。
【図３３】トリプルKOバックグラウンドでのYAC2を有するトランスジェニックマウスが内因性軽鎖混入のないHCAbを産生することを実証するELISAを示す図である。いずれかの内因性軽鎖の存在(HC-/-、カッパ(Kappa)-/-、ラムダ(Lambda)+/-又はHC-/-、カッパ+/-、ラムダ-/-又はHC-/-、カッパ+/-、ラムダ+/-)によって、軽鎖と対合するHCAbが生じる。
【図３４】3つの異なる抗原で免疫したマウスから単離した、812の抗原結合VHクローンのKabat及びWu変動率（多様性、variability）プロットを示す図である。各々のアミノ酸位置における変動率(%)がプロットされている。各々の示したアミノ酸位置(amino acid position)にて、順に、VH1(16クローン)、VH2(14クローン)、VH3(514クローン)、VH4(163クローン)及びVH6(105クローン)のファミリー配列を表す5本の棒がある。CDR1、CDR2及びCDR3ループを形成する配列は枠で囲まれている。
【図３５】ナイーブライブラリーを示す図である。VH1、2、3、4及び6のライブラリーが113のナイーブYAC1マウスの脾臓から作製された。i.)各々のライブラリーでのクローンの数。ii.)各々のナイーブライブラリー由来のサンプルの配列分析は良好な多様性を示す。iii.)各々のナイーブライブラリー由来の配列サンプル中のCDR3アミノ酸長の頻度。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明をここで更に説明する。以下の節において、本発明の異なる態様をより詳細に定義する。このように定義されたそれぞれの態様は、明確に反対の指示がない限り、任意の他の1つの又は複数の態様と組み合わせることができる。特に、好まれるものとして、又は有利であるとして示した任意の特徴は、好まれるものとして、又は有利であるとして示した任意の他の1つの又は複数の特徴と組み合わせることができる。本発明の実施は、特に明記しない限り、当業者の技術範囲内である、免疫学、分子生物学、化学、生化学及び組換えDNA技術の従来技術を使用することができる。このような技術は本文に全て記述されている。
【００２７】
酵母人工染色体(YAC)は、酵母における非常に大きなDNA挿入物のクローニングに使用することができるベクターである。天然酵母染色体のような挙動にとって必須の3つのシス作用構造要素(自己複製配列(ARS)、セントロメア(CEN)及び2つのテロメア(TEL))を全て含むだけでなく、大きなDNA挿入物を受容するそれらの能力によって、酵母細胞における染色体様の安定性及び伝達の正確性に必要な最小サイズ(150kb)に到達させることができる。YACの構築及び使用は、当技術分野で周知である(例えば、Bruschi, C.V.及びGjuracic, K. Yeast Artificial Chromosomes, ENCYCLOPEDIA OF LIFE SCIENCES 2002 Macmillan Publishers Ltd, Nature Publishing Group / www.els.net)。
【００２８】
本発明者らは、マウスで発現させるための一連の酵母人工染色体(YAC)を調製した(図10)。これらのYACは、トランスジェニックマウスにおいて体細胞組換えを受け、B細胞重鎖のみの抗体レパートリーを生じさせることができるヒト重鎖遺伝子座をコードしている。一連のYACは、YAC2又はYAC3よりも少ないVH遺伝子セグメントを有するYAC1と、利用可能なさらなる免疫グロブリン定常域遺伝子を有するYAC3があり複雑性が増している。本明細書に記載されているように、この一連のYACは、V(N)がマウス定常領域と組み合わされて生殖細胞系列配置において少なくとも10のヒトVHを有するように、追加のVH遺伝子を含むさらなるYAC構築物の基礎を形成することができる。
【００２９】
胚幹細胞への構築物のトランスフェクション、ESクローンの選択及びスクリーニングを補助するため、又は遺伝子組換え中に定義された組み込みを促進するための追加の特徴も、本発明のYAC構築物に含めることができることは、当業者には明白であろう。またYAC以外のベクターを使用することができることも当業者には明白であろう。本明細書に記載されているように、本発明のベクター、ベクター構築物、構築物又は導入遺伝子は、抗原チャレンジへの応答におけるトランスジェニックマウスで選択するクラスの完全機能性、抗原特異的、高親和性のHCAb又はVH結合ドメインを生成するための方法で使用することができる。
【００３０】
本発明の発現ベクターは、ヒト起源及びマウス起源の配列を含むキメラ重鎖遺伝子座を有する。したがって、ベクターは異種重鎖遺伝子座を含む。ベクターは、CH1ドメインをコードしていない重鎖定常領域を含む。ベクターは、げっ歯動物における異種重鎖遺伝子座の発現に使用することができる。げっ歯動物、例えばマウスにおいて発現される場合、遺伝子座は、安定性かつ可溶性のHCAb又はVHドメインを形成することができる。
【００３１】
本発明に記載されている本明細書の様々な態様の一実施形態において、前記ベクターはYACである。しかし、BAC等の当業者に公知の他のベクターも、本発明に従って使用することができる。
【００３２】
第1の態様において、本発明は、
a)天然配置にある、少なくとも10の機能性ヒト重鎖V遺伝子;
b)少なくとも1つのヒト重鎖D遺伝子及び少なくとも1つのヒト重鎖J遺伝子;
c)CH1エキソンを欠損しているマウスC遺伝子
を含むベクターに関する。
【００３３】
一実施形態において、構築物は、マウス3'エンハンサー領域又は遺伝子を含む。一実施形態において、前記マウス3'エンハンサー領域又は遺伝子は、少なくとも約42kbのサイズである。一実施形態において、前記マウス3'エンハンサー領域は、エンハンサーエレメントhs3A、hs1.2、hs3B、hs4、hs5、hs6及びhs7から選択される1つ又は複数のエンハンサーエレメントを含む。一実施形態において、前記マウス3'エンハンサー領域は、エンハンサーエレメントhs3A、hs1.2、hs3B、hs4、hs5、hs6及びhs7を含む。
【００３４】
一実施形態において、ベクターは2つ以上のマウスC遺伝子を含む。一実施形態において、前記マウスC遺伝子はマウスCγ1遺伝子である。
【００３５】
一実施形態において、ベクターは、マウスμエンハンサー及びスイッチμエレメント又はスイッチγエレメントを含む。したがって、スイッチμエレメント又はスイッチγエレメントは、マウスμエンハンサーの下流に位置し、したがって、これらのエレメントはそれらの天然配置にある。
【００３６】
したがって、一実施形態において、本発明は、
a)実質的に天然配置にある、少なくとも10の機能性ヒト重鎖V遺伝子;
b)少なくとも1つのヒト重鎖D遺伝子及び少なくとも1つのヒト重鎖J遺伝子;
c)マウスμエンハンサー及びスイッチμエレメント又はスイッチγエレメント;
d)CH1エキソンを欠損しているマウスCγ1遺伝子、及び
e)エンハンサーエレメントhs3A、hs1.2、hs3B、hs4、hs5、hs6及びhs7を含む、マウス3'エンハンサー遺伝子
を含むベクターに関する。
【００３７】
a)からe)において示したエレメントは、5'→3'の順である。本発明のベクターはキメラであり、ヒト配列及びマウス配列を含む。ヒト配列はベクターの5'末端に位置し、重鎖V遺伝子、D遺伝子及びJ遺伝子を含む。ヒトJ遺伝子の下流に位置しているベクターの3'領域は、マウス起源の配列を含み、ヒト起源の配列は含まない。
【００３８】
他のところで記述しているように、一実施形態において、ベクターはYACである。
【００３９】
一実施形態において、ベクターは少なくとも約0.5MBのヒト配列を含む。
【００４０】
本発明によれば、ベクターは、実質的に天然配置に少なくとも10の機能性ヒト重鎖V遺伝子を含む。一実施形態において、ベクターは、少なくとも10から全ての機能性ヒトV遺伝子を含んでいてもよい。一実施形態において、V遺伝子の数は10から約44である。一実施形態において、機能性V遺伝子の数は、10から20、10から30、又は10から44である。一実施形態において、機能性V遺伝子の数は、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、28、29、40、41、42、43又は44である。一実施形態において、機能性V遺伝子の数は、10から23である。
【００４１】
一実施形態において、ベクターは、機能性V遺伝子のタンデムリピートを含んでいてもよい。それぞれのタンデムリピートは、実質的に天然配置にある少なくとも10のヒト重鎖V遺伝子を含む。したがって、ベクターは、少なくとも10から数百、例えば、10から約50、10から約100、10から約200以上の機能性V遺伝子を含むことができる。一実施形態において、ベクターは10を超える機能性V遺伝子を含むことができる。それぞれのタンデムリピート内で、少なくとも10の機能性V遺伝子は、実施的にそれらの天然配置にある。
【００４２】
例えば、10又は23の機能性ヒト重鎖V遺伝子をそれぞれ有する本発明に記載のベクターは、図10にYAC 1、Y1C 2及びYAC 3として示してある。しかし、本発明は、図10に示したYACに限定されることはなく、本発明に記載のベクターの他の設計特徴が損なわれることがない限り、さらなる機能性V遺伝子が含まれ得ることは、当業者には理解されよう。
【００４３】
V遺伝子は、ヒト起源であって、機能性のものである。したがって、V遺伝子は遺伝子産物をコードしており、偽遺伝子ではない(偽遺伝子は構築物内に存在し得るが、機能性V遺伝子の数の決定に際してカウントされない)。
【００４４】
更に、本発明のベクター構築物によって、ベクター中に存在する機能性V遺伝子の少なくとも10は、実質的にそれらの天然配置にある。言いかえれば、本発明の構築物は、実質的に再配列されていない天然配置において少なくとも10の機能性ヒトV遺伝子を含む。一実施形態において、本発明の構築物は、再配列されていない天然配置における少なくとも10の機能性ヒトV遺伝子を含む。一実施形態において、天然配置という用語は、遺伝子配列順及び/又はDNA配列を意味する。したがって、一実施形態において、本発明のベクターに含まれているヒトV遺伝子の少なくとも10の機能性ヒトV遺伝子は、それらがヒト生殖細胞系列において見出され得るのと同様の連続配列順になっている。言いかえれば、本発明の構築物は、再配列されていない順で少なくとも10の機能性ヒトV遺伝子を含む。一実施形態において、ベクターは、再編成されていない順で10の機能性ヒトV遺伝子を含む。一実施形態において、ベクターは10を超える機能性ヒトV遺伝子を含み、また、これらの10遺伝子は再配列されていない順になっている。一実施形態において、ベクターは、全部が再配列されていない順である10を超える機能性ヒトV遺伝子を含む。したがって、本発明は、V遺伝子がもはや天然配列順ではなくなるように選択及び組み合わせられる、少なくとも10の異なる機能性ヒトV遺伝子の組み合わせは除外する。
【００４５】
また、天然配列順での少なくとも10のV遺伝子は介在配列を含む。
【００４６】
更に、少なくとも10の機能性ヒトV遺伝子配列及びそれらの介在領域は、実質的にヒト生殖細胞系列で見出され得るものである。例えば、本配列は、ヒト生殖細胞系列で見出され得る配列に対して少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%又は99%の配列同一性を示す。介在領域は、V遺伝子へのアクセスに影響を及ぼし、それらが抗体レパートリーの産生にどのように使用されるかを決定するので重要である。当業者に認識されるように、本発明のベクター構築物を構築する方法の途中で酵母の組換え事象があるため、配列中に小さな差異が生じる可能性がある。
【００４７】
したがって好ましくは、本発明によれば、本発明の構築物において使用される少なくとも10の機能性ヒトV遺伝子は、機能性V遺伝子間で位置する1つ又は複数の介在配列を除去又は改変するための標的操作によって改変されない。このような標的操作は、本発明のベクター構築物を構築する方法の途中での酵母の組換え事象による配列の小さな差異を排除する。したがって、本発明の構築物は、実質的に天然配列の少なくとも10の機能性ヒトV遺伝子を含む。
【００４８】
更に好ましくは、V遺伝子は、残基を改変して溶解性を高めるような操作はされていない。言いかえれば、V遺伝子は天然に存在するものである。
【００４９】
本発明のベクター、例えばYACにおいて使用される機能性ヒトV遺伝子の特定の組み合わせを実施例に示す。しかし、V遺伝子の任意の特定の組み合わせに対する要件はなく、ベクターに含まれる少なくとも10の機能性ヒトV遺伝子が、ヒト生殖細胞系列において見出されるのと同じ配列順である限り、あらゆる機能性ヒトV遺伝子をHCAbの産生的発現に使用することができる。
【００５０】
上記のように、ベクターは、ヒト重鎖D及びヒトJ遺伝子を含んでいる。したがって、少なくとも1つの、好ましくは複数のヒト重鎖D遺伝子、及び少なくとも1つの、好ましくは複数のヒトJ遺伝子が本発明の構築物中に存在する。一実施形態において、構築物は、1〜19、例えば、少なくとも5、少なくとも10、少なくとも15以上のヒト重鎖D遺伝子を含んでいる。一実施形態において、構築物は、少なくとも5、少なくとも10、少なくとも15以上のヒト重鎖J遺伝子を含んでいる。一実施形態において、構築物は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18又は19のヒト重鎖J及びヒトD遺伝子を含んでいる。一実施形態において、本発明の構築物は、全てのヒト重鎖D遺伝子を含んでいる。一実施形態において、本発明の構築物は、全てのヒト重鎖J遺伝子を含んでいる。別の実施形態において、ヒト重鎖D及びヒトJ遺伝子は、実質的にそれらの天然配置にある。一実施形態において、ヒト重鎖D及びヒトJ遺伝子は、それらがヒト生殖細胞系列において見出されるのと同じ配列順である。したがって好ましくは、本発明によれば、本発明の構築物において使用されるD遺伝子及びJ遺伝子は、1つ又は複数の介在配列を除去又は改変する標的操作によって改変されない。
【００５１】
一実施形態において、本発明のベクター構築物はまた、マウスμエンハンサー、IgH遺伝子転写及びVDJ組換えの主要レギュレーター、並びにマウススイッチμエレメントも含んでいる。スイッチエレメントは、クラススイッチにとって不可欠である。
【００５２】
一実施形態において、ベクターは、少なくとも1つ又は複数のマウスC領域遺伝子を更に含む。一実施形態において、C領域遺伝子は、Cγ1、Cγ2b及び/又はCγ2aから選択される。一実施形態において、ベクターは、Cγ1、Cγ2b及びCγ2aを含む。
【００５３】
したがって、本発明のベクター構築物は、CH1エキソンを欠損するマウスCγ1遺伝子を含んでいる。しかしまた、ベクター構築物は、追加のC遺伝子又は領域を含んでいてもよい。
【００５４】
更に、一実施形態において、ベクターはマウス3'エンハンサー領域を含んでいる。好ましくは、これは、約42kbサイズの領域である。一実施形態において、この領域は、エンハンサーエレメントhs3A、hs1.2、hs3B、hs4、並びにエレメントhs5、hs6及びhs7を含有する予測されるインシュレーター領域を含む(Garrettら, 2005; Chatterjeeら, 2011)。実施例において示したように、これは、制御エレメントの存在を示す複数のDNase Iの高感受性(hs)部位を含有する約42kbサイズの領域である。3'エンハンサーは、B細胞発生の際のクラススイッチ組換えプロセスにおいて、及びIgH発現において不可欠であることが示された(Liebersonら, 1995; Vincent-Fabertら, 2010)。ラット3'エンハンサーの747bp領域は、ヒトβ-グロビン遺伝子の転写を測定することによるin vitroアッセイによってエンハンサー活性を有することが同定された(Petterssonら, 1990)。個々のエンハンサーエレメントhs3A、hs1.2、hs3B及びhs4のそれぞれの標的化された欠失を有するマウスは、野生型対照とはクラススイッチにおいて判別不能であった(Cogneら, 1994; Manis ら, 1998; Zhangら, 2007; Vincent-Fabertら, 2009; Bebinら, 2010)。しかし、4つの全てのhsエレメントが組み合わされた欠失は、全てのアイソタイプへのクラススイッチを無くした(Vincent-Fabertら, 2010)。インシュレーター領域は、IgH遺伝子座を、下流に位置するか又は他の場所に位置している非IgH遺伝子から隔離すると予測されている(Chatterjeeら, 2011)。このため、本発明のYAC構築物にフルサイズの3'エンハンサーを含むことで、豊富なかつ相乗的な役割を有する全てのエンハンサーエレメント及びゲノム遺伝子座の残りの部分を保護するためのインシュレーターの供給源を提供する。
【００５５】
ベクターは、マーカー遺伝子、例えば、酵母マーカー遺伝子TRP1、HIS3及び/又はADE2、及び/又はハイグロマイシン耐性遺伝子を更に含んでいてもよい。追加の選択マーカーを含んでいてもよい。
【００５６】
10以上の機能性ヒトV遺伝子を有する本発明に記載のベクター構築物は、実施例に示すように、in vitroで、又はin vivoで作製することができる。in vivoで作製するためには、例えば、図10に示したようにYAC1をマウスES細胞に導入し、V遺伝子の数をES細胞の標的遺伝子ノックインによって伸長させる。簡単に説明すると、追加V遺伝子を有する標的ベクターを、既存の導入遺伝子との相同領域と共に使用し、相同組換え事象を介して導入遺伝子を伸長させる。
【００５７】
ベクター導入遺伝子として本発明のベクターを含有するES細胞は、ベクターDNAをES細胞へトランスフェクションにより直接導入することにより、又は導入遺伝子を有するマウスからES細胞を誘導することにより得ることができる。再誘導したES細胞は、マウスと同じコピー数及び同じゲノム位置で導入遺伝子を有するが、トランスフェクト細胞は、様々なコピー数を有していてもよく、特異的に標的化されない限り、マウスゲノムのいかなる場所にでも組み込まれ得る。
【００５８】
このYAC又は本発明による他のベクターは、マウス細胞又はマウスへ導入し、導入遺伝子としてHCAb又はそれらのフラグメントを産生することができる。したがって、本発明はまた、HCAbを産生する方法における本明細書に記載したベクターの使用に関する。下記に説明したように、可溶性で、凝集せず、実質的にモノマーであるVH結合ドメインは、下記に詳述したようにマウスにおいて産生され得る。本発明はまた、HCAbを産生するマウスの作製における、及び前記マウスからのVHドメインの産生における本明細書に記載のベクターの使用に関する。
【００５９】
別の態様において、本発明は、トランスジェニックマウス、又は本発明のベクターで本明細書に記載したように形質転換され、それによって異種重鎖遺伝子座を発現するトランスジェニックマウス宿主細胞を提供する。したがって、一態様において、本発明は、
a)天然配置にある、少なくとも10の機能性ヒト重鎖V遺伝子;
b)少なくとも1つのヒト重鎖D遺伝子及び少なくとも1つのヒト重鎖J遺伝子;
c)マウスμエンハンサー及びスイッチμエレメント又はスイッチγエレメント;
d)CH1エキソンを欠損しているマウスC遺伝子、並びに
e)マウス3'エンハンサーエレメント
を含む、YAC又は他のベクターで形質転換されたトランスジェニックマウスに関する。
【００６０】
マウス3'エンハンサーエレメントは別記しているとおりである。ベクターの他の特徴も別記している。一実施形態において、前記ベクターはYACである。
【００６１】
一実施形態において、前記マウスC遺伝子はマウスCγ1遺伝子である。一実施形態において、前記マウス3'エンハンサーエレメントは、エンハンサーエレメントhs3A、hs1.2、hs3B、hs4、hs5、hs6及びhs7を含む。したがって、一実施形態において、本発明は、
a)実質的に天然配置にある、少なくとも10の機能性ヒト重鎖V遺伝子;
b)少なくとも1つのヒト重鎖D遺伝子及び少なくとも1つのヒト重鎖J遺伝子;
c)マウスμエンハンサー及びスイッチμエレメント又はスイッチγエレメント;
d)CH1エキソンを欠損しているマウスCγ1遺伝子、並びに
e)エンハンサーエレメントhs3A、hs1.2、hs3B、hs4、hs5、hs6及びhs7を含むマウス3'エンハンサーエレメント
を含む、YACで形質転換されたトランスジェニックマウス又はマウス宿主細胞に関する。
【００６２】
一実施形態において、宿主細胞はマウス宿主細胞である。一実施形態において、トランスジェニックマウスは、内因性抗体遺伝子を発現する能力が低下している。したがって、一実施形態において、マウスは、内因性軽鎖及び/又は重鎖抗体遺伝子を発現する能力が低下している。したがって、マウスは、内因性軽鎖及び/又は重鎖抗体遺伝子の発現を阻止し、非機能性軽鎖及び/又は重鎖が産生されるようなさらなる改変を含んでいてもよい。
【００６３】
一実施形態において、マウスは、非機能性ラムダ軽鎖遺伝子座を含んでいてもよい。したがって、マウスは機能性内因性ラムダ軽鎖を作製しない。一実施形態において、ラムダ軽鎖遺伝子座は、一部若しくは完全に欠失されるか、又は挿入を介して非機能性にされる。例えば、少なくとも定常域遺伝子C1、C2及びC3は欠失され得るか、又は挿入を介して非機能性にされ得る。一実施形態において、遺伝子座は機能的に封止され、それによってマウスは機能性ラムダ軽鎖を作製しなくなる。
【００６４】
更に、マウスは、非機能性カッパ軽鎖遺伝子座を含んでいてもよい。したがって、マウスは機能性内因性カッパ軽鎖を作製しない。一実施形態において、カッパ軽鎖遺伝子座は、一部若しくは完全に欠失されるか、又は挿入を介して非機能性にされる。一実施形態において、遺伝子座は機能的に発現停止され、それによってマウスは機能性カッパ軽鎖を作製しなくなる。
【００６５】
機能的に発現停止された内因性ラムダ及びカッパL鎖遺伝子座を有するマウスは、例えば、その全体が参照によってこれに組み込まれる、WO2003/000737に開示されているようにして作製することができる。
【００６６】
更に、マウスは、非機能性重鎖遺伝子座を含んでいてもよい。したがって、マウスは機能性内因性重鎖を作製しない。一実施形態において、重鎖遺伝子座は、一部若しくは完全に欠失されるか、又は挿入を介して非機能性にされる。一実施形態において、遺伝子座は機能的に発現停止され、それによってマウスは機能性重鎖を作製しなくなる。
【００６７】
例えば、WO2004/076618に開示されているように、8つの全ての内因性重鎖定常領域免疫グロブリン遺伝子(μ、δ、γ3、γ1、γ2a、γ2b、ε及びα)はマウスにおいて非存在であるか、又はそれらが非機能性である程度まで部分的に非存在であるか、或いはδ、γ3、γ1、γ2a、γ2b及びεは非存在であり、また隣接する遺伝子μ及びαはそれらが非機能性にされる程度まで部分的に非存在であるか、或いは遺伝子μ、δ、γ3、γ1、γ2a、γ2b、及びεは非存在であり、またαはそれが非機能性にされる程度まで部分的に非存在であり、或いは、δ、γ3、γ1、γ2a、γ2b、ε及びαは非存在であり、またμはそれが非機能性にされる程度まで部分的に非存在である。WO2004/076618は、その全体を参照によってこれに組み入れるものとする。
【００６８】
一部の欠失とは、内因性遺伝子座遺伝子配列が、機能性内因性遺伝子産物が遺伝子座によってコードされない程度に、すなわち、遺伝子座から機能性産物が発現されない程度に、例えば挿入によって、欠失又は破壊されていることを意味する。別の実施形態において、遺伝子座は機能的に発現停止される。
【００６９】
一実施形態において、本発明のベクターを発現するマウスは、非機能性重鎖遺伝子座、非機能性ラムダ軽鎖遺伝子座及び非機能性カッパ軽鎖遺伝子座を含む。したがって、マウスは機能性内在性軽鎖又は重鎖を産生しない。このため、マウスはトリプルノックアウト(TKO)マウスである。
【００７０】
トランスジェニックマウスは、実施例において図示されているような標準技術に従って作製することができる(図13を参照)。トランスジェニックマウスを作製する最も特徴的な2つの経路は、新たに受精した卵母細胞への遺伝物質の前核マイクロインジェクションによるか、又は安定的にトランスフェクトされた胚幹細胞の桑実胚若しくは胚盤胞期胚への導入を介してである。
【００７１】
導入遺伝子を有するES細胞株は、in vitroで作製されるか、又はトランスジェニックマウスの胚から誘導される。新しい特徴は、相同組換え又は挿入ベクターの使用により導入遺伝子へ導入することができる。構築物は、(例えば)リポフェクション、エレクトロポレーション、又は当技術分野で公知の他の方法を使用してES細胞に導入される。選択可能な耐性マーカーを有するクローンを選抜し、成功した組み込みに関してスクリーニングする。構築物及びES細胞は両方とも、所望の構築物の組み込みと、正確に標的化されたESクローンのスクリーニング及び選択の両方を補助する分子的特徴で改変され得る。
【００７２】
導入遺伝子工学は、以下の特徴の1つ又は複数が含まれていてもよく、それらの全ては当技術分野で公知である:
・  選択マーカー:任意の組み合わせで使用することができるBsd、Zeo、Puro、Hyg
・  ネガティブ選択可能マーカー:チミジンキナーゼ(TK)。ネガティブ選択は、1つ又は複数の選択マーカーと組み合わせて使用することができる
・  マーカー及び/又はベクター配列は、loxP、変異体loxP、Frt又は変異体Frt部位と隣接していてもよい。部位の対は同一であっても、異なっていてもよい。更に3つ以上の部位を使用することができる。
・  配列を欠失、逆位又は置き換えるためのレコンビナーゼ(Cre、Flp)の使用
・  例えば、以下のものを介する、定義した配列でのゲノム二本鎖切断の作製:
〇  ジンクフィンガー
〇  TALENs
〇  CRISPR
〇  メガヌクレアーゼ(ホーミングエンドヌクレアーゼ)
【００７３】
標的ビルドオンは、一工程又は複数の工程で達成され得る。配列は相同組換えによって挿入され、選択可能なマーカーはその後のレコンビナーゼを介在した欠失によって除去され得る。或いは、第1の改変工程は、組換え介在型カセット交換を介して配列を導入するために使用することができる、レコンビナーゼ認識部位及び任意選択のネガティブ選択可能マーカー等の特徴を導入し得る。
【００７４】
標的ビルドオンに使用される方策としては、交換ベクター、挿入ベクター又は組換え介在型カセット交換(RMCE)を挙げることができる。DNAは、それぞれ工程で導入及び/又は欠失され得る。導入DNAは、ヒト、細菌、酵母又はウイルス起源のものであってよい。DNAは、導入遺伝子内の任意の位置で導入され得る。導入遺伝子工学は、周囲のゲノム配列を使用することができる。
【００７５】
標的構築は、V遺伝子、D遺伝子及びJ遺伝子が天然のヒトIgH遺伝子座と同じ配列順及び間隔であり、C領域が天然のマウス遺伝子座におけるものと同じである、トランスジェニック遺伝子座を生じる。組換えによって引き起こされた徴少の変化(傷又は小さな欠失等)を含む、多型が生じる可能性がある。
【００７６】
遺伝物質がどのように導入されるかにかかわらず、操作された胚は、妊娠が継続し、候補トランスジェニック仔が生まれる偽妊娠の雌移植体へ移植される。
【００７７】
これらの広範な方法の間の主な違いは、トランスジェニック動物の作製にそれらを使用する前に、ESクローンを広範囲にスクリーニングすることができるということである。更に、導入遺伝子は規定の位置でES細胞に組み込むことができるか、又は無作為に組み込むことができる。対照的に、前核マイクロインジェクションは、その導入後に宿主ゲノムに組み込まれる遺伝物質に依存し、一般に、仔が生まれるまで、導入遺伝子の導入の成功及び機能を確認することはできない。
【００７８】
当技術分野においては、導入遺伝子の組み込みが成功するかどうかを補助し、決定するための多くの方法が知られている。トランスジェニック動物は、構築物のゲノムへのランダムな組み込み、部位特異的な組み込み、又は相同組換えを含む、複数の手段によって作製することができる。薬剤耐性マーカーの使用、レコンビナーゼ、組換え介在性カセット交換、陰性選択技術、及び組換え効率を改善するヌクレアーゼを含む、導入遺伝子の組み込みの作動及び選択の両方、並びに、その後の改変(陽性選択)に使用することができる、様々な手段及び技術がある。これらのほとんどの方法は、一般に、ES細胞の改変において使用されている。しかし、これらの技術のいくつかは、前核インジェクションによって介在される遺伝子組換えの増強に有用性を有し得る。
【００７９】
さらなる精製を使用して、所望のバックグラウンド内のトランスジェニック系統をより効果的に作製することができる。好ましい実施形態において、上述のように、内因性マウス免疫グロブリン発現を発現停止にさせて、創薬のためのHCAbだけを発現させるようにする。遺伝学的に操作されたマウス、例えば、全ての内因性免疫グロブリン遺伝子座(マウス重鎖、マウスカッパ鎖及びマウスラムダ鎖)に対して発現停止されたTKOマウスは、上記のように使用することができる。導入される任意の導入遺伝子のこのTKOバックグラウンドへの移入は、育種(従来の育種、又は方法の効率的なスケーリングを得るためのIVF工程を含む育種)によって行うことができる。しかし、遺伝子組換え手順中に、TKOバックグラウンドを含めることもできる。例えば、マイクロインジェクションについては、卵母細胞はTKOドナーに由来し得る。同様に、本発明者らは、遺伝子組換えで使用するためのTKO胚(以下を参照)からもES細胞を得た。更に、上述のように、YAC1が代替構築物中に存在する共通のコア構造であるので(図10に記載)、YAC1トランスジェニックマウスに由来するES細胞を、YAC2、3、又はコアYAC1設計を有する他のYACS中のものと同じ特徴を持つ導入遺伝子を生じさせるための標的化された付加に使用することができる。様々な遺伝子組換えのオプションを図13にまとめる。
【００８０】
本発明のさらなる態様は、機能性CH1ドメインを欠損するHCAbの産生において本発明のベクターを発現する、本明細書に記載のマウスの使用である。これは、好ましくは、本明細書に記載されているトリプルノックアウトマウスである。一実施形態において、HCAbは、例えば、げっ歯動物及びヒト由来の配列を含む、キメラ抗体であってもよい。別の実施形態において、本発明のマウスは、可溶性VHドメインを産生する方法において使用される。したがって、可溶性VH結合ドメインは、本発明のマウスを使用して産生することができる。
【００８１】
本発明のマウスはまた、ライブラリー、例えば、in vitroディスプレイライブラリーの構築に使用することができる。これは、非限定の実施例において示される。一実施形態において、本発明のマウスは、ナイーブライブラリーの構築に使用される。したがって、本発明は、ライブラリーの構築における本発明のマウスの使用に関する。一実施形態において、ライブラリーはナイーブライブラリーである。一実施形態において、免疫はex vivoである。
【００８２】
また、本明細書に記載のベクターをマウスに導入することを含む、HCAbを産生するマウス細胞又はマウスを作製する方法も提供する。好ましくは、前記マウスは、非機能性重鎖遺伝子座、非機能性ラムダ軽鎖遺伝子座及び非機能性カッパ軽鎖遺伝子座を含む。一実施形態において、前記方法は、前記マウスからナイーブライブラリーを産生することを含む。別の実施形態において、前記マウスは、例えば、ex vivo免疫により免疫化される。
【００８３】
また本発明によって、
(i)本発明のベクター、例えばYACを導入する工程と;
(ii)機能性CH1ドメインを欠損しているHCAb又は抗原結合分子をマウスにおいて形成させる工程と;
(iii)マウス血清からHCAb又は抗原結合分子を得る工程と
を含む、マウスから、HCAb又はそのフラグメント、例えばVHドメインを得る方法も提供する。
【００８４】
好ましくは、前記マウスは、非機能性重鎖遺伝子座、非機能性ラムダ軽鎖遺伝子座及び非機能性カッパ軽鎖遺伝子座を含む。
【００８５】
V遺伝子セグメント、D遺伝子セグメント及びJ遺伝子セグメントは、マウスにおいて発現される場合、VDJコード配列を形成するために組換えすることが可能である。また、異種遺伝子座は、マウスにおいて発現される場合、マウスへ導入されたベクターに定常遺伝子が含まれている任意のクラスの機能性免疫グロブリン分子を形成することができる。抗体のクラスは、構築物中に存在するC遺伝子によって決定される。したがって、抗体アイソタイプは、IgG、IgA、IgD、IgE若しくはIgM、又はそれらの混合物から選択される。好ましくは、アイソタイプはIgGである。IgGは、任意のサブクラスから選択され得る。したがって、本発明は、クラス特異的HCAb及び単一ドメイン抗体、特に可溶性VHドメインの効果的な操作方法を提供する。
【００８６】
また本発明によって、本発明の方法を使用して得られる、又は得られる可能性のある単離されたHCAb産生細胞又はVHドメイン産生細胞が提供される。細胞の選択及び単離は、例えば、機能性CH1ドメインを欠損している抗原特異性HCAbが産生される、B220int/+、シンデカン+脾臓由来形質細胞の同定及び単離に関しては、フローサイトメトリー又は他の細胞単離方法を使用することができる。しかし、当業者には、産生がこれらのタイプのB細胞又は方法に限定されないことは理解されよう。
【００８７】
本発明のこの態様の抗体産生細胞は、二次リンパ器官から単離され得る。例えば、二次リンパ器官は、非脾臓器官であってよく、例えば、消化管関連リンパ系組織(GALT)、気管支関連リンパ系組織(BALT)、鼻関連リンパ系組織(NALT)、喉頭関連リンパ系組織(LALT)、皮膚関連リンパ系組織(SALT)、血管関連リンパ系組織(VALT)、及び/又は結膜関連リンパ系組織(CALT)を含むリンパ節、扁桃及び粘膜関連リンパ系組織(MALT)からなる群のいずれかの器官であってもよい。一実施形態において、抗体産生細胞は腹膜細胞である。一実施形態において、本発明のこの態様の抗体産生細胞は、骨髄から単離され得る。
【００８８】
本発明のマウスは、機能性CH1ドメイン又はVHドメインを欠損しているHCAbを提供する。本発明の抗体は、単離、精製された形態であってよい。抗体は、当技術分野で周知の方法を用いて、単離及び/又は特性決定することができる。特性決定された場合、HCAb又はVHドメインは、当技術分野で周知の組換え方法又は合成方法を使用して製造することができる。適用可能な先行技術の方法については、下記に挙げた参考文献を参照されたい。
【００８９】
本発明によるトランスジェニックマウスは、治療標的に対する単離ヒトVHドメインを産生するために利用され得るHCAbを含む重鎖B細胞のレパートリーを有する。こうしたVHドメインは、多くの方法において単離され得る。例えば、B細胞を含有するリンパ系細胞の個体群は、トランスジェニックマウス由来の様々なリンパ系供給源から抽出することができ、更にin vitroで選択又は刺激した後、標的特異的VHを同定することができる。ライブラリーは、クローンex-vivo転写産物から構築され、限定するものではないが、ファージ及びリボソームディスプレイを含む、様々なin vitroディスプレイプラットフォームを使用して、抗原結合ドメインについて調べることができる。こうしたライブラリーは、ナイーブマウスから、又は特定の標的抗原に反応性のある親和性-成熟免疫レパートリーを含有する免疫動物から構築することができる。
【００９０】
本発明の方法によるHCAbの産生は、細胞表面での発現による、又は分泌(すなわち、細胞からの抗体の放出)による、抗体産生細胞からの発現を含み得る。
【００９１】
HCAb又はVHドメインは、好ましくは、生理学的レベルでマウスにおいて産生され得る。一実施形態において、HCAb又はVHドメインは、野性型よりも高レベルで産生することができる。図20に示したように、導入遺伝子が導入された場合、遊離HCAbがトリプルノックアウトマウスの血清中に産生され得る。
【００９２】
更に、実施例で明らかなように、本発明の方法により産生されるHCAb又はVHドメインは、可溶性であり安定している。
【００９３】
HCAb又はVHドメインは、例えば、抗体をコードしている1つ又は複数の遺伝子を遺伝子操作することによって、溶解性を高めるように改変することができる。
【００９４】
したがって、本発明はまた、本発明のマウスを使用して、可溶性VHドメインを産生する方法に関する。このVHドメインは、可溶性であり、凝集せず、高耐熱性及び親和性を有している。一実施形態において、可溶性VHドメインを産生する方法は、
a)トランスジェニックマウスにおいて本発明のベクターを発現させる工程と、
b)HCAbを発現する細胞又は組織を単離する工程と、
c)単離された細胞又は組織由来のmRNAから得たVHドメインをコードしている配列をクローニングする工程と、
d)クローニングした転写産物からライブラリーを構築する工程と、
e)VHドメインを単離する工程と
を含む。
【００９５】
他の箇所で説明したように、マウスは、好ましくは、任意の機能性内因性軽鎖又は重鎖を産生しないトリブルノックアウトマウスである。
【００９６】
構築されたライブラリーは、ディスプレイ選択技術においてVHドメインの単離に使用することができる。ディスプレイ選択技術としては、ファージディスプレイ、酵母又はリボソームディスプレイが挙げられる。
【００９７】
さらなる工程において、VHドメインは、発現系、例えば、微生物又は哺乳動物の発現系で発現させることができる。
【００９８】
さらなる工程において、VHドメインは親和性についてアッセイすることができる。これは、限定するものではないが、ELISA及びBIAcoreを含む、当技術分野で公知の多数の技術によって実施することができる。更に、細胞表面抗原への結合は、蛍光活性化細胞ソーティング(FACS)によって測定することができる。標的抗原に対する分離されたVHドメインの親和性は、候補VHドメインが治療候補としての開発に更に進める可能性があるか否かを判定する際の重要なパラメーターである。親和性は、一般に、モル(M)単位での解離定数Kd(Kd=[抗体][抗原]/[抗体/抗原複合体])によって測定される。高Kd値は、標的抗原に対する親和性が比較的低い抗体を示す。反対に、低Kdは、多くの場合、ナノモル(nM)以下の範囲であり、高親和性抗体を示す。
【００９９】
標的抗原への結合強度に加えて、所定の標的の機能に影響を及ぼすVHの能力もアッセイすることができる。
【０１００】
一実施形態において、本方法はまた、動物に標的抗原で免疫して、抗原特異的抗体産生を含む免疫応答を誘発する工程も含んでいる。しかしまた、ライブラリーは、ナイーブ動物から構築することもできる。
【０１０１】
様々な免疫プロトコルを使用し、トランスジェニック動物内でのHCAb応答を作動させることができる。最も一般に使用されている手順は、タンパク質ベースの標的をアジュバントと共に投与することによる。標的は、多くの場合、精製形態であるが、粗製の抗原調製物も使用することができる。また細胞は、所望の標的が自然に、又は遺伝子操作の結果として細胞により発現される、抗原の供給源としても使用することができる。またDNAは、免疫原の供給源として使用することもできる。この場合、分子又はサイトカインアジュバントと組み合わせた発現プラスミドは、多くの場合、タンパク質免疫原を生じさせるin vivoトランスフェクションで使用される。免疫中及び免疫後、HCAb応答は、(例えば)血清-ELISA又はELISpot技術を適用することによって、モニターすることができる。
【０１０２】
ライブラリー系の検出方法に加えて、ハイブリドーマ技術を使用し、ex-vivo B細胞(リンパ球個体群内のもの、又は事前選択されたもの)をパートナーミエローマ細胞と融合させ、所望の結合特性についてスクリーニングすることが可能な、HCAbを産生するモノクローナルハイブリドーマを作製することができる。次いで、VH配列をハイブリドーマからクローニングし、所望の最終フォーマットに変換することができる。
【０１０３】
したがって、別の態様において、本発明はまた、
a)トランスジェニックマウスにおいて本発明のベクターを発現させる工程と、
b)HCAbを発現する細胞又は組織を単離する工程と、
c)ハイブリドーマを前記細胞から産生させる工程と、
d)VHドメインを単離する工程と
を含む、可溶性VHドメインを産生する方法に関する。
【０１０４】
更に、本発明により、本明細書で定義されているHCAb産生細胞又はVHドメイン産生細胞をB細胞腫瘍系細胞と融合させることによって得られるハイブリドーマが提供される。本発明のある特定の実施形態において、ハイブリドーマの形成に使用される抗体産生細胞は、非脾臓二次リンパ器官細胞である(上記を参照されたい)。モノクローナル抗体を産生するための単一クローンハイブリドーマを作製及び選択する公知の方法は、本発明における使用に適合し得る。
【０１０５】
また本発明により、本明細書に記載されている方法によって得られる、又は得ることが可能なHCAb、それから誘導される抗体又はそれらのフラグメントが提供される。したがって、本発明は、本発明のベクターを発現するマウスから得られる、又は誘導される、マウスにおいて作製されたHCAb、又はそれらのフラグメントを提供する。一実施形態において、本発明のマウス、好ましくはトランスジェニックTKOマウスから誘導されるフラグメントは、VHドメインである。
【０１０６】
HCAb又はVHドメインは、抗原に特異的であり得る。HCAb又はVHドメインは、1つ又は複数の特性を有する二価抗体又は多価抗体であるように操作することができる。
【０１０７】
HCAbは、モノクローナル抗体、IgG様抗体又はIgM様抗体であってよい。本発明の方法及びマウスによって産生されるHCAb又はVHドメインは、診断用、予後用又は治療用の造影剤として使用することができる。HCAb又はVHドメインは、更に又は或いは、細胞内結合剤又はアブザイムとして使用することができる。
【０１０８】
また、本明細書に記載のHCAb又はVHドメイン、及び任意選択で医薬として許容可能な担体を含む医薬品、医薬製剤又は組成物も提供する。医薬品は、典型的には、患者への投与前に、公知の方法を使用して処方される。したがって、本発明は、本発明の方法によって得られる、又は得ることが可能なVHドメインを含む組成物に関する。本組成物は、VHドメインを単独で含むか、又は別のVHドメイン、タンパク質若しくは他の治療上有効な分子と組み合わせて含む。非限定的な例を以下に挙げる。
【０１０９】
一実施形態において、コンジュゲーションは、抗体薬剤コンジュゲート(ADC)を形成するための毒性成分(ペイロード)であってもよく、又はヒトVHドメインの結合を利用する目的で放射性免疫複合体を形成するための放射性核種であってもよく、細胞外若しくは細胞内の場所に毒性成分を送達するためのin vivoにおけるその標的抗原であってもよい。したがって、VHドメインは、標的細胞(がん細胞であってもよい)に毒性ペイロードを誘導し、そこで、ペイロードはその細胞毒性活性を発揮し、細胞を死滅させることができる。毒性成分は、VHドメインに直接融合させることができる。別の例において、毒性成分は、直接的に、又はリンカーを介して、VHドメインに化学的にカップリングさせることができる。リンカーは、ペプチド、オリゴペプチド又はポリペプチドを含んでいてもよく、それらはいずれも、天然又は非天然のアミノ酸を含み得る。別の例において、リンカーは合成リンカーを含んでいてもよい。リンカーは、切断することができるか、又は切断できなくてもよい。典型的には、リンカーは、リシン残基のアミノ基を介して、又はシステイン残基のチオール基によって、抗原結合分子に結合される。多くのリンカーが当業者には知られているが、これらは、例えば、Ducryら, Bioconjugate Chem. 2010, 21, 5-13、及びWO 2004/01095に開示されている。両参考文献は、参照により本明細書に組み入れられるものとする。別の実施形態において、VHドメインは、Fc領域又はその一部と融合される。
【０１１０】
本組成物の一実施形態において、少なくとも2つのVHドメインは、当技術分野で公知の方法によって、ラインで共に融合されるか、結合されるか、又はコンジュゲートされる。VHドメインは、同一標的抗原又は異なる抗原に結合し得る。
【０１１１】
したがって、本VHドメインは、疾患の処置において医薬品として使用することができる。したがって、本発明は、本発明のVHドメインを、それを必要とする患者に投与することを含む、疾患症状を処置する方法に関する。
【０１１２】
本発明に記載の抗体を使用する処置に感受性である疾患としては、限定するものではないが、創傷治癒、新生物、メラノーマ、肺、結腸直腸、骨肉腫、直腸、卵巣、肉腫、子宮頸部、食道、乳房、膵臓、膀胱、頭頸部及び他の固形腫瘍を含む細胞増殖性疾患;骨髄増殖性疾患、例えば、白血病、非ホジキンリンパ腫、白血球減少症、血小板減少症、血管新生障害、カポジ肉腫;アレルギー、炎症性腸疾患、関節炎、乾癬及び気道炎症、喘息、免疫障害及び臓器移植拒絶を含む、自己免疫疾患/炎症性疾患;高血圧、浮腫、アンギナ、アテローム性動脈硬化、血栓症、敗血症、ショック、再潅流障害及び虚血を含む、心臓血管及び血管障害;中枢神経系疾患、アルツハイマー病、脳損傷、筋萎縮性側索硬化症及び疼痛を含む、神経疾患;発達障害;糖尿病、骨粗鬆症、及び肥満、AIDS及び腎臓疾患を含む、代謝障害;ウイルス感染、細菌感染、真菌感染及び寄生虫感染、胎盤関連の病理学的症状並びに他の病理学的状態を含む、感染症が挙げられる。適切な投与経路は、当業者には公知である。
【０１１３】
更に、本発明は、ヒトVH領域及びマウス定常領域を含む、機能性CH1ドメインを欠損しているHCAbに関する。
【０１１４】
本発明は、1つ又は複数の図面を参照し本明細書において前述したベクター構築物を含む。一態様において、本発明は図10に示したベクターに関する。
【０１１５】
当業者は多くの他の有効な代替案に気づくことは疑いない。本発明は、記載した実施形態に限定されるものではなく、当業者には明白で、添付の特許請求の範囲の趣旨及び範囲内にある変更を包含することは理解されよう。
【０１１６】
本明細書で言及されている全ての文書及び刊行物は、参照によりその全体を本明細書に組み入れるものとする。
【０１１７】
本明細書で使用されている「及び/又は」とは、2つの明示された特徴又は構成要素のそれぞれが、他の特徴又は構成要素を有するか否かの具体的な開示として解釈されるべきである。例えば、「A及び/又はB」とは、(i)A、(ii)B、並びに(iii)A及びBのそれぞれの具体的な開示として、それぞれが本明細書に個別に記載されているかのように解釈されるべきである。
【０１１８】
文脈が別段の指示をしない限り、上記で説明した特徴の記載及び定義は、本発明のいかなる特定の態様又は実施形態にも限定されるものではなく、記載されている全ての態様及び実施形態に等しく適用される。
【０１１９】
本発明を以下の非限定の実施例において更に説明する。
【実施例】
【０１２０】
(実施例1)
YACの構築
1.1  材料
ベクター:
pYAC3 (Bruschi, ICGEB, Yeast Molecular Genetics Group, Trieste, ITALYから入手)
pYNOT (URA3をLEU2マーカーで置き換えることによりpYAC3から誘導したもの。Bruschi, ICGEB, Yeast Molecular Genetics Group, Trieste, ITALYから入手)
pHTK (LEU2をHIS3マーカーで置き換えることによりpYNOTから誘導したもの)
pHKT-Hy (pHKTに挿入されたハイグロマイシン(Hy)耐性遺伝子)
pYES1L (Invitrogen社)
【０１２１】
酵母菌株:YLBW1 (Hamerら, 1995)、AB1380 (Markie, 2006)。
【０１２２】
1.2 BACのYACへの変換
BAC(円形状の細菌人工染色体)は、約150kbp〜350kbpのサイズのDNAセグメントの操作(例えば、配列決定及びクローニング)を促進する、当技術分野で周知の手段である(Methods in Molecular Biology, 54巻及び349巻)。ヒト又はマウスの重鎖免疫グロブリン遺伝子座に由来するDNAを含有するBACは多数存在し、当技術分野で周知である。このようなBACの例(図1及び図2にも記載)としては、限定するものではないが、以下のものが挙げられる:
ヒト:
・  RP11-1065N8
・  RP11-659B19
・  RP11-141I7
・  RP11-72N10
・  RP11-683L4
・  RP11-12F16
マウス:
・  RP23-354L16
・  RP24-72M1
【０１２３】
また、BACを使用して、オーバーラップする(相補的)配列を含む複数のDNAセグメントの連続的な分子結合を促進し、より大きなDNA分子を作製できることは、当技術分野で周知である。これを達成するこうした方法の1つである、BIT(架橋誘導性転座(bridge induced translocation))は、BACを、まず酵母人工染色体(YAC)として酵母がオーバーラップしない直鎖状にまず変換しなければならないことが要件であった。
【０１２４】
形質転換関連組換え(TAR)クローニングによるBAC変換
BAC変換及びYAC操作は、栄養要求性マーカー、酵母選択、培地、酵母形質転換、YACスクリーニング、YAC移入、YAC改変及び増幅に関する処方及び方法が詳細に記載されている、例えば、YACプロトコル(Methods in Molecular Biology, 54巻及び349巻)において当技術分野で開示されており、十分に確立されている技術である。
【０１２５】
簡単に説明すると、その後の結合用のBACから保持されている非オーバーラップ配列に隣接する2つのアンカー配列、アンカー配列1(a1)及びアンカー2(a2)を、pYAC3(http://genome-www.stanford.edu/vectordb/vector_descrip/COMPLETE/PYAC3.SEQ.html)ベクターにクローニングするPCRプライマーの末端の操作制限部位(SalI及びSphI)を用いてPCRにより増幅した(図3)。こうしたアンカー配列に関する設計の必要条件は、当技術分野で周知である(例えば、Alasdair MacKenzie, 2006, YAC protocols、第2版)。制限酵素で消化したa1及びa2をpYAC3へ逐次クローニングした(図3)。pYAC3-a1-a2ベクターは、続いて、2つのYACアーム、a1-URA3-テロメア及びa2-セントロメア-TRP1-テロメアを作製するSphI及びBamHIで消化した。元のBACを有する酵母をこれらの2つのYACアームで形質転換し、トリプトファンを含みウラシルを含まない酵母培地にプレーティングし、3日間、30℃でインキュベートした。YACアームとアンカーの位置のBACとの間の相同組換えにより、変換されたYACが作製された(図4)。形質転換体は、連結のPCRによって、及びサイズについてはパルスフィールドゲル電気泳動(PFGE)によって、正しく変換された産物についてスクリーニングされた。連結される隣接のDNA配列を含む非オーバーラップYACは、引き続きBITによって構築された。
【０１２６】
BITによる2つの非オーバーラップYACの連結
カナマイシン耐性遺伝子KANRカセットを、それぞれの末端にFRT部位と結合用の2つのYAC末端に特異的なYAC相同配列の65bpフラグメントを付加することにより構築した(図5)。このカセットを、連結しようとする2つのYACを含有する酵母に形質転換した。更に、カナマイシン耐性クローンはPCR及びサザンブロットによって特性決定し、連結が成功したことを確認した。次いで、KANR遺伝子を、FLPレコンビナーゼを使用してポップアウトした。連結領域のDNAを配列決定し、連結部位のFRT配列を含有するDNA「scar」の存在を確認した。YAC操作のそれぞれの工程では、PFGEを適用してYACのサイズを確認した。元のヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座からの隣接配列を含むYACの逐次連結を使用して、それぞれ、ヒトC-遺伝子、D-遺伝子及びJ-遺伝子、並びに数が増え続けるV-遺伝子を有する多数のYAC構築物を作製した。
【０１２７】
1.3  マウスエレメントを有するC領域構築物
YAC構築物から作動される免疫応答の効率を強化するため、その後、それらをそれぞれ、ヒトC領域遺伝子をマウス重鎖定常領域エレメントで置き換えるよう改変した。
【０１２８】
オーバーラップするDNAフラグメントを取り込み、効率的に再結合させる酵母の能力を利用し(Gibsonら, 2008)、複数のオーバーラップするフラグメントを使用して、マウスμエンハンサー、マウスμスイッチ及びマウス定常1遺伝子(後者はCH1ドメインが欠失)を最後のヒトJ遺伝子の3'末端に付加し、単一定常遺伝子を有するYAC構築物を作製した。次に、同様の手法を採用し、CH1ドメインが全て欠失している複数のマウス定常遺伝子Cγ1、Cγ2b及びCγ2aを含むYAC構築物を作製した。
【０１２９】
1.3.1  単一マウスC遺伝子を有するYAC
酵母形質転換用のDNAフラグメントの調製
マウスμエンハンサー及びスイッチμエレメント
フォワードプライマー:GACATTCTGCCATTGTGATTACTACTACTACTACGGTATGGACGTCTGGGGGCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGGTAAGAAT(配列番号1)。このプライマーの最初の69bpは、ヒトJ6由来のものである(ID: J00256、http://www.imgt.org/IMGTlect/?query=201+J00256)。このプライマーの最後の24bpは、マウス配列3'からJ4に相補的である。リバースプライマー:TTGAGGACCAGAGAGGGATAAAAGAGAAATG (配列番号2)、このプライマーは、領域5'からマウスIGHμ  CH1に相補的なリバースである(図6)。テンプレートとしてBAC RP23-354L16を使用する2つのプライマーによるPCRを行い、マウスμエンハンサー及びヒトJ6領域に相同な一末端を有するμスイッチ領域をカバーする5.8kbのフラグメントを作製した。
【０１３０】
CH1が欠失されたマウスCγ1遺伝子
フォワードプライマー:AGAGGACGTATAGGGAGGAGGGGTTC (配列番号3);リバースプライマー:AACACCTTCAGCGATGCAGAC (配列番号4)。テンプレートとしてBAC RP23-354L16を使用するこれらの2つのプライマーを含む7.8kbのPCR産物は、CH1エキソン以外のマウスCγ1転写領域全体をカバーする(図7)。
【０１３１】
非オーバーラップEμ、Cγ1及びYACアームフラグメントを架橋するリンカー
Eμ及びCγ1フラグメントに対するリンカー1:TCATGCCCCTAGAGTTGGCTGAAGGGCCAGATCCACCTACTCTAGAGGCATCTCTCCCTGTCTGTGAAGGCTTCCAAAGTCACGTTCCTGTGGCTAGAAGGCAGCTCCATAGCCCTGCTGCAGTTTCGTCCTGTATACCAGGTTCACCTACTACCATATCTAGCCCTGCCTGCCTTAAGAGTAGCAACAAGGAAATAGCAGGGTGTAGAGGGATCTCCTGTCTGACAGGAGGCAAGAAGACAGATTCTTACCCCTCCATTTCTCTTTTATCCCTCTCTGGTCCTCAGAAGAGGACGTATAGGGAGGAGGGGTTCACTAGAGGTGAGGCTCAAGCCATTAGCCTGCCTAAACCAACCAGGCTGGACAGCCATCACCAGGAAATGGATCTCAGCCCAGAAGATCGAAAGTTGTTCTTCTCCCTTCTGGAGATTTCTATGTCCTTTACACTCATTGGTTAATATCCTGGGTTGGATTCCCACACATCTTGACAAACAGAGACAATTGAGTATCACCAGCCAAAAGTCATACCCAAAAACAGCCTGGCAT(配列番号5)。リンカー1を作製するため、PCR1(313bp、プライマー1 F): TCATGCCCCTAGAGTTGGCTG;  プライマー1 R: GAACCCCTCCTCCCTATACGTCCTCTTTGAGGACCAGAGAGGGATAAAAGAGAAATG (配列番号6))、及びPCR2(258bp、プライマー2 F: AGAGGACGTATAGGGAGGAGGGGTTC(配列番号7);  プライマー2 R: ATGCCAGGCTGTTTTTGGGTA(配列番号8)を、テンプレートとしてBAC RP23-354L16を使用して合成した。オーバーラップする配列を含むPCR1及びPCR2は、プライマー1 F及びプライマー2 Rを使用する融合PCRによってリンカー1に構築された。
【０１３２】
Cγ1及びYACアームフラグメントに対するリンカー2:
TACATCTTTTTTCCTCTCTGTCTGCATCGCTGAAGGTGTTTCGTCGCCGCACTTATGACT GTCTTCTTTA TCATGCAACT(配列番号9)
【０１３３】
YACアーム
LEU2遺伝子マーカーを有する5.7kbのYACアームは、PshAI及びBamHI制限酵素を用いて、pYNOTベクター(図8、URA3をLEU2マーカーで置き換えることによりpYAC3から得たもの)を消化することによって作製した。
【０１３４】
酵母相同組換えによるヒトC領域のマウスC領域による置き換え
酵母スフェロプラスト形質転換(Sanchez and Lanzer, 2006)を使用し、5つのフラグメント(マウスEμ、マウスCγ1、YACアーム、リンカー1及びリンカー2)を、ヒトC領域を含むYACを有する酵母YLBW1株へ導入した。形質転換体は、トリプトファン及びロイシン欠失培地で選択した。ヒトJ6でオーバーラップする配列間の相同組換えによって、ヒト遺伝子がマウスEμ及びCγ1で置き換えられた。この新しいYACは、PCR及び連結部位の配列決定により特性決定された。
【０１３５】
3'エンハンサーの付加
42kbの3'エンハンサーフラグメントのBAC-YACベクターへのクローニング
マウス3'エンハンサーは、42kbの領域3'から最後の定常遺伝子Cαに散在されているエレメントhs3A、hs1.2、hs3B、hs4、hs5、hs6及びhs7を含有している。Cγ1遺伝子の3'部位に全エンハンサーを付加するため、エンハンサーエレメントの全てをカバーする42kbのMfeIフラグメントを、invitrogen社によって提供されている説明書に従って、BAC-YACベクターpYES1L(Invitrogen社)へサブクローニングした。構築物は、PCR、PFGE及び配列決定によって完全に特性決定された。MfeI消化によって、その後の酵母形質転換用のベクターから42kbのフラグメントが切り離された。
【０１３６】
ハイグロマイシン-HIS3 YACアームの調製
YACベクター(pHKT-Hy、図9)は、ハイグロマイシン(Hy)耐性遺伝子をpHKT(LEU2をHIS3マーカーで置き換えることによりpYNOTから誘導したもの)中へ挿入することによって構築した。SpeI及びBamHIを用いるこのベクターのダブル消化によって、Hy-HIS3-テロメアを含有する6.2kbのYACアームフラグメントが作製された。
【０１３７】
3'エンハンサーフラグメントをマウスCγ1遺伝子及びHy-HIS3 YACアームに架橋するリンカー
マウスCγ1及び42kb 3'エンハンサーに対するリンカー1(626bp)
ACGGCTCAGGAGGAAAAGGCACTCTGTGTGGAGCTCTTCAGTGGGTATGAAATGGTGATGGAGAAGCCCAGGTGCACTGAAAATCCAGGAGCTGAATTTGATCACCAGGACGCATATGGTAGAGAGGAAAATGAATTGATTCCCAAATGTTCTCCTCTATGTGTGCACCGTGGCATGTGCATGCACACAATTACACATAAACACATTCAACATAAATACAACACACATATACACGCTGCACACACATACACACACAGAACACACACCACACACACACACCACACACAATCACACACATATTCCACACAGTACACCACAAACATCTATACACACCACACACACACAGACACACACACACACACATTCATACACAGCACAACACAAACATCTATACACAACACACACACAATACACATAGTCACACGCATATTCACTCACACACATATTCACCCACACACAATCATACATAGACACATTCAACATAAACACAACACCACACACACACACACTTGCACACACAAATGTAATGATTTTTTTAAGGACTACATCTTTTTTCCTCTCTGTCTGCATCGCTGAAGGTGTTCAATTGCCAAAATCACAGGTGAGCCCAGATGCATACCCGGGAC(配列番号10)。リンカー1を作製するため、PCR1(604bp、プライマー1 F: ACGGCTCAGGAGGAAAAGGCAC (配列番号11);プライマー1 R: TCACCTGTGATTTTGGCAATTGAACACCTTCAGCGATGCAGAC (配列番号12))を、テンプレートとしてBAC RP23-354L16を使用して合成した。次いで、PCR1は、プライマー1 F及びプライマーR: GTCCCGGGTATGCATCTGGGCTCACCTGTGATTTTGGCAATTG (配列番号13)により626bpまで延長した。
【０１３８】
42kb 3'エンハンサー及びHy-HIS3 YACアームに対するリンカー2(766bp)
GAGGTACAGGGGGCTCATGGGTTTATAAGTTCAGGTTTATACCAAGGTTTCGGGGGGTAGCCTGAGGCTCATGTACCTTCTTGTGGTAGCCCCCAGGTTCTGTGCATGGTACTGCTCAGTTACTGGCATGGCTTCTGGGAAGGCTGGGCTCCCACGTCCCCTGTGGACACATGGTTACGCCAAGAACAGAACTACAAAGTTAGGAGTTACCATTCCCACCTGCACCTGTATCTCCAGTACCTGGGTTTCTAAGACGTAGTGAGTCCTCTTGCCAACCAGGGTCTGCCACAATGGTCAGGCACAGCTGTGGGCCGGTCAGCCCCATCAGGTCACACCAGCAGGTCCCAGGAGCACAGAGCTTAAATGCCCCCTAGTGTCCCTAGTGAGGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGGTAAGTGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGGTTATGGCCCTTGCGTGCCTTGAATTACTTCCACCTGGCTGCAGTACGTGATTCTTGATCCCGAGCTTCGGGTTGGAAGTGGGTGGGAGAGTTCGAGGCCTTGCGC(配列番号14)。リンカー2を作製するため、PCR1(379bp、プライマー1 F: GAGGTACAGGGGGCTCATGGGT (配列番号15);プライマー1 R:AGCCTCACTAGGGACACTAGGGGGCATTTAAGC (配列番号16))及びPCR2(387bp、プライマー2 F:CCCTAGTGTCCCTAGTGAGGCTCCGGTGCCCGT (配列番号17);プライマー2 R:GCGCAAGGCCTCGAACTCTC (配列番号18)を、テンプレートとしてBAC RP23-354L16及びBAC RP24-72M1をそれぞれ使用して合成した。オーバーラップする配列を有するPCR1及びPCR2は、プライマー1 F及びプライマー2 Rを使用する融合PCRによって、構築されリンカー2が作製された。
【０１３９】
酵母形質転換
4つのフラグメント(3'エンハンサー、Hy-HIS3-テロメアYACアーム、リンカー1及びリンカー2)は、酵母スフェロプラスト形質転換によって、3'エンハンサー付加用のYACを含有する酵母YLBW1株に導入された。形質転換体は、トリプトファン及びヒスチジン欠失培地上で選択した。オーバーラップするフラグメント間の相同組換えによって、3'エンハンサー及びYACを選択するためのHy-HIS3-テロメアアームが付加され、Crescendo YAC1又はYAC2が作製された(図10)。この新しいYACは、PCR及び連結部位の配列決定により特性決定された。この新しいYACのサイズは、PFGE及びサザンブロッティングによって確認した。
【０１４０】
1.3.2  複数の定常遺伝子を有するYAC
マウスCγ1遺伝子を含有するYACに加えて、複数の定常遺伝子-全てがCH1ドメインを欠失しているマウス定常遺伝子Cγ1、Cγ2b及びCγ2aを含むように他のYACが設計された(図10)。
【０１４１】
CH1が欠失したCγ2b及びCγ2aを含有する45kbのフラグメントの作製。
下記に挙げたプライマーを使用し、7つのオーバーラップするPCRフラグメントを、テンプレートとしてRP24-72M1を使用して増幅させた。フラグメント3は、Cγ2b(CH1欠失)との融合PCRによって合成された。フラグメント6は、Cγ2a(CH1欠失)との融合PCRによって合成された。
【０１４２】
7つのPCRに対して使用したプライマー:
フラグメント1:45k-1 8057bp
フォワード:GGTTGGATTCTATCTTCGCATGG(配列番号19)
リバース:TGGGTCCTGTCTTTCTACCTTTG (配列番号20)
フラグメント2:45k-2 8304bp
フォワード:GCTCCTTGCTGGGTCTTAATGTT(配列番号21)
リバース:TTAGAACCGTGTCTTCTACAATTGA(配列番号22)
フラグメント3:45k-3 1.3kb CH1Δ
45k-3-左
フォワード:GGGTAGGAGGTTGTTGGTTA(配列番号23)
リバース:CCCGCTGGGCTCTGCAAGAGAGGAGAATGTGTGA(配列番号24)
45K-3-右
フォワード:CTCTCTTGCAGAGCCCAGCGGGCCCATTTCA(配列番号25)
リバース:GCTTGTTTTTATATCGAGCTTGC(配列番号26)
フラグメント4:45k-4 8412bp
フォワード:TCAGTCTCACTTGCCTGGTCGT(配列番号27)
リバース:CTTTGTAGCACATGCGTCATCC(配列番号28)
フラグメント5:45k-5 9012bp
フォワード:TGAAGGCATGAAGGAGTTGAGC(配列番号29)
リバース:ACAACCCCCTATCCTACACATT(配列番号30)
フラグメント6:45k-6 2274b CH1Δ
45k-6-左
フォワード:GGGTCCTGGCAACATTAGCG(配列番号31)
リバース:CACTCTGGGCTCTGCAAGAAAGGAGGATGTGTGA(配列番号32)
45k-6-右
フォワード:CTTTCTTGCAGAGCCCAGAGTGCCCATAACAC(配列番号33)
リバース:TGGTGTTCAGCAGGCTAATTTG(配列番号34)
フラグメント7:45k-7 9968bp
フォワード:CAGGCCCCACTTCTTTACCTAA(配列番号35)
リバース:TTGTTAGTTCATCACAGGGCAATTC(配列番号36)
7つのPCR産物並びに末端のフラグメント1及びフラグメント7に対するオーバーラップ配列を含む線状化BAC-YACベクターを相同組換えのため酵母に形質転換した。45kb-YACは、連結のPCR、PFGE及び配列決定によって確認された。PmeI制限酵素は、環状YACから45kbフラグメントを切り離す。
【０１４３】
CH1が欠失したCγ1、Cγ2b及びCγ2aを含有する58kbフラグメントの作製。
マウスμエンハンサー及びスイッチμフラグメント、CH1が欠失したCγ1フラグメント及びリンカー1(1.3.1)、Cγ2b及びCγ2aを含有する45kb PmeI制限フラグメント、並びに末端の5'のμエンハンサーフラグメント及び3'の45kbフラグメントに対するオーバーラップ配列を有する線状化BAC-YACベクターを、相同組換え用の酵母に形質転換した。58kb-YACは、連結のPCR、PFGE及び配列決定によって確認された。PmeI制限酵素は、環状YACから58kbフラグメントを切り離す。
【０１４４】
複数の定常遺伝子を有するYACに関する酵母形質転換
1つがCγ1-Cγ2b-Cγ2aを含む58kb、もう1つが、58kbフラグメントの3'末端に対するオーバーラップ配列を有するYACアームである2つのフラグメントを、スフェロプラスト形質転換によって、Cγ1-Cγ2b-Cγ2a遺伝子を付加するために設計されたYACを含有する酵母に導入した。形質転換体は、YACアームに含まれている栄養要求性マーカーに基づき、アミノ酸欠失培地で選択された。オーバーラップフラグメント間の相同組換えによって、Cγ1-Cγ2b-Cγ2aフラグメント及び新規YACアームが、選択したYACに付加された。この新しいYACは、PCR及び連結部位の配列決定によって特性決定された。この新しいYACのサイズは、PFGE及びサザンブロッティングによって確認した。次に、42kbのマウス3'エンハンサーが(上述のようにして)付加され、Crescendo YAC3が作製された(図10)。
【０１４５】
(実施例2)
ノックアウトマウスの作製
マウス重鎖遺伝子座(WO2004/076618及びRen, L.ら, Genomics 84 (2004), 686-695)、マウスラムダ遺伝子座(Zou, X.ら, EJI, 1995, 25, 2154-2162及びWO2003/000737)並びにカッパ遺伝子座(Zou, X.ら, JI 2003 170, 1354-1361及びWO2003/000737)を発現停止させるために使用される方法は、既に開示されている。簡単に説明すると、マウス重鎖定常領域及びマウスラムダ鎖遺伝子座の大規模な欠失により、これらの2つの免疫グロブリン鎖の発現停止が生じた。カッパ軽鎖は、ネオマイシン耐性カセットの標的挿入を介して発現停止された。
【０１４６】
a)重鎖及び軽鎖KOマウスの交雑育種
内因性軽鎖(カッパ及びラムダ)の二重発現停止を有するマウスは、従来の育種によって作製した(Zou, X.ら, JI 2003 170, 1354-1361)。これらの軽鎖KOマウスを重鎖KOマウスと共に更に飼育し、トリプルノックアウト(TKO)系を得るための交配用トリプルヘテロ接合動物を得た。この系は繁殖力があることが判明し、純粋な育種系統として維持されている。
【０１４７】
b)交雑育種による後代の遺伝子型決定
プライマーは、内因性重鎖、カッパ軽鎖及びラムダ軽鎖領域のそれぞれについて、野生型と発現停止された遺伝子座との間の識別ができるように設計した。ゲノムDNAは、仔から得た尾部又は耳の生検から抽出し、PCR反応内の鋳型DNAに使用した。gDNAは、十分に開示されている方法を使用して(例えば、メーカーの使用説明書に従い、Viagen Direct PCR溶解試薬(尾部)cat no 102-Tを使用して)抽出した。以下のプライマー(Sigma社から購入したもの)をPCR反応において使用した。
【０１４８】
【表１】
0006641379.tif 000002
【０１４９】
【表２】
0006641379.tif 000003
【０１５０】
【表３】
0006641379.tif 000004
【０１５１】
これらのプライマーは、様々なDNAポリメラーゼ酵素及びバッファーと共に使用することができ、サイクル条件は特定の酵素に適合させることができる。一例として、Fermentas DreamTaq-Ready Mix (#K1081)は、以下のように使用することができる;
【０１５２】
【表４】
0006641379.tif 000005
【０１５３】
1ulのテンプレートを反応に使用した。陽性対照及び水の対照は、遺伝子型同定されるサンプル中に常に含まれていた。以下のサイクル条件を特にこの酵素に対して使用した;
【０１５４】
【化１】
0006641379.tif 000006
【０１５５】
PCR反応後、産物は、1%アガロースゲルでの電気泳動後にDNA染色を使用して可視化した。図11は、wt、重鎖KO、軽鎖KO又はTKO遺伝子型を有する2匹の動物から抽出したゲノムDNAの代表的な遺伝子型決定実験の結果を示す。
【０１５６】
c)TKOマウスにおける内因性免疫グロブリン発現の欠失
TKOマウスのヌル表現型は、マウス重鎖、重鎖/軽鎖複合体及び軽鎖に特異的な酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)を用いて確認した。簡単に説明すると、免疫吸着プレート(例えば、Nunc Maxisorb 96Fウェルプレート  カタログ番号443404)を、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で希釈した捕捉抗体の5ug/ml溶液でコーティングした。PBS/0.05% Tween、PBSで洗浄し、粉乳の3%溶液でブロッキングした後、血清希釈液(3%粉乳/PBS中)をプレートにアプライした。非結合のタンパク質を洗浄した後、結合タンパク質を適切なビオチン化-検出抗体溶液で検出し、予め決定した最適希釈液を使用し、続いてニュートラアビジン-HRPで可視化を行った。様々な市販の抗体をこれらのELISAに使用することができる。Table 1(表5)は、こうした抗体の例を示す。
【０１５７】
【表５】
0006641379.tif 000007
【０１５８】
図12に示すように、TKOマウスは、検出可能な内因性免疫グロブリン鎖が欠損していることが示された。2匹の野性型マウス及び2匹のTKOマウスのそれぞれからの血清サンプルをアッセイした。
【０１５９】
d)ES細胞の単離及び培養
胚幹細胞の単離は開示されている(Ying, Q.L.ら, Nature, 453, 519-523, 2008, Nichols, J.ら, Development, 1136, 3215-3222, 2009, Nagy, K. & Nichols, J., "Derivation of Murine ES Cell Lines", p431 - 455 in "Advanced Protocols for Animal Transgenesis. An ISTT Manual. Shirley Pease & Thomas L. Saunders編)。この2i法は、FGF/Erkシグナル伝達系を遮断し、ES細胞を未分化状態に維持する小分子阻害剤を利用する。更に、これらの阻害剤を含有する培地で初期の胚をインキュベートすると胚の細胞内塊が胚盤葉系統に分化し、分化誘導内胚葉の発生が阻害される。これによって、ES細胞株をより容易に得ることができる豊富な外胚葉区画が提供される。
【０１６０】
ES細胞株はTKO胚から誘導した。初期段階TKO胚は、胚盤胞期に達するまで、参照した方法で定義されているように、凍結保存から解凍し培養した。次いで、これらを更に2日間培養した後、外胚葉を遊離させたが、これは、抗マウス血清及び補体を使用し、栄養外胚葉を除去することによって行った。次いで、外胚葉を増殖させた後、トリプシン溶液中で分解し、得られたES細胞株を増殖させた。ES細胞株及びクローンの増殖用培地は十分に開示されている。本事例の場合、ES株は、2i培地で維持されるか、又はLIF及び血清を補充した培地上で分離した。
【０１６１】
(実施例3)
遺伝子導入
a)前核マイクロインジェクション
トランスジェニック動物を作製するDNAの前核マイクロインジェクション技術は十分に開示されている(例えば、K. Becker & B. Jerchow "Generation of Transgenic Mice by Pronuclear Microinjection" pp 99-115 in "Advanced Protocols for Animal Transgenesis. An ISTT Manual. Shirley Pease & Thomas L. Saunders編、Springer Protocols 2011を参照されたい)。簡単に説明すると、受精卵母細胞は、繁殖用雄と交配した過剰排卵雌マウスから単離する。過剰排卵にするため、雌に、妊娠雌馬血清ゴナゴトロピン(PMSG)5 I.U.を含有するPBS 100ulを2日前に腹腔内注射する。46〜48時間後、PBS 100ul中のヒト絨毛膜性腺刺激ホルモン(hCG)5 I.U.を投与し(腹腔内)、雌を繁殖用雄と交尾させる。翌朝、卵丘複合体を、ヒアルロニダーゼ溶液で消化することによって遊離させ、回収卵管及び卵母細胞から採取する。マイクロインジェクション用の受精卵母体の産生には、様々な系統のマウスを首尾よく使用することができる。
【０１６２】
C57Bl6×CBA F2野性型(wt)マウスを使用し、上記の手順を採用し、精製YAC DNAを導入した。遺伝子組換えの概説において示したように(図13)、TKOマウスを使用する場合、同様の手順を採用する。マイクロインジェクションに向けてのこれらの精製を容易にするため、YACを、いわゆる「window」と呼ばれる株の酵母に形質転換した(Hamerら, PNAS, 1995, 92(25), 11706-10)。「window」株の酵母は、ゲル電気泳動に供した場合、パッセンジャーYACが酵母内因性染色体を欠くサイズで移動するよう、内因性染色体の方策上の分裂により作製された一連の宿主酵母である。或いは、酵母染色体を分割する適切なプライマー及びPCR方法を使用して、適切な「window」を新たに作製した。したがって、マイクロインジェクション用のYACは、パルスフィールドゲル電気泳動(PFGE)、続いて第2のゲル電気泳動溶出法を使用し、精製した。この手順は、"Generation of Transgenic Animals by Use of YACs" pp 137-158 in "Advanced Protocols for Animal Transgenesis. An ISTT Manual. Shirley Pease & Thomas L. Saunders編、Springer Protocols 2011に、A. Fernandez, D. Munoz & L. Montoliuによって述べられている。受精した卵母細胞の回収後、精製したYAC DNA溶液を、プル式ガラスマイクロインジェクション針を使用して前核に注入した。全ての作業は、加熱したステージを備えた顕微鏡下でマイクロマニピュレーターを使用して行われ、除振台にマウントした。マイクロインジェクション後、卵母細胞を24時間まで回復させ、次いで、偽妊娠代理母の卵管に移植した。偽妊娠の雌は、移植日の24時間前に精管を切除した繁殖用の雄と雌を交配させることにより得た。仔は、通常、19〜21日後に分娩された。YACのマイクロインジェクションは、それらのサイズに基づいた、要件の厳しい方法であり、挿入効率は、より小さいBAC又はプラスミドで確認される効率よりも低い。Table 2(表6)に、2つの関連するYAC構築物で実施したマイクロインジェクションプロジェクトから得られた統計をまとめている。
【０１６３】
【表６】
0006641379.tif 000008
【０１６４】
b. ES細胞
YAC構築物をES細胞に導入するのには様々な経路がある(下記に記載)。どの経路を選択するかにかかわらず、導入遺伝子の組み込みに成功したESクローンを取得することが目的である。前核マイクロインジェクション技術に関するES介在性遺伝子組換えの利点は、トランスジェニック系統の作製にそれらを使用する前にESクローンを完全に特性決定することができるということである。ESクローンに対して実施される特性決定は、前核インジェクション由来のF0動物及びF1動物をスクリーニングするのに使用したものと本質的に同じである(下記を参照)。またin situハイブリダイゼーションを適用して、組み込みの染色体を決定することもできる。これは、ES細胞がTKOよりもむしろwtである場合に、特に望ましい可能性がある。内因性マウス免疫グロブリン遺伝子座を欠損する染色体上に組み込まれたYACを有するESクローンのみが、トランスジェニック系統の作製に選択され得る。この事前選択によって、TKOバックグラウンドへの戻し交配を効果的に妨げる結合遺伝子座が存在しないことが確実になる。
【０１６５】
今後、ES細胞のB細胞系統へのin vitro分化をサポートする方法の開発は、遺伝子組換え前に、導入したトランスジェニック遺伝子座の機能試験を可能にし得る。しかし、現在、これは技術的に実現可能ではない。
【０１６６】
i)精製YACのトランスフェクション
YACは、前述したように、本質的に精製することができる(上記「マイクロインジェクション用のYACの調製」を参照)。精製YACは、例えば、リポフェクションを使用して(例えば、Invitrogen社リポフェクタミン試薬と共に)ES細胞に導入し、その後、ES細胞はハイグロマイシンを使用する選択に供する(YAC設計により指示されているように、代替の選択的試薬を使用することができる)。クローンが選抜及びスクリーニングされ、適切なクローンを使用してトランスジェニック系統が作製される。様々な特徴が構築物及び/又は標的化ES細胞に導入され、トランスフェクトされたESクローンの誘導を促進することができる(下記を参照)。
【０１６７】
ii)スフェロプラスト融解法
YACをES細胞に導入する別法は、スフェロプラスト融合による。この方法は、大きな構築物の操作が最小限に抑えられ、それによって、剪断によって構築物に損傷が生じる可能性を制限するという利点を提供する。スフェロプラスト融合技術は開示されている(Davies, N.ら, "Human antibody repertoires in transgenic mice: manipulation and transfer of YACs"p59-76 in "Antibody Engineering. A Practical Approach" Ed. McCaffertyら, IRL Press at Oxford University Press, 1996)。簡単に説明すると、酵母スフェロプラストは、酵母細胞壁のチモリアーゼ消化によって作製される。分解したES細胞をスフェロプラストと混合し、ポリエチレングリコール溶液を添加することによって融合が行われる。培地中に再懸濁した後、ES細胞を洗浄し、下記のように、選択培養、クローニング、スクリーニングに供する。
【０１６８】
iii)Tg/TKO ES細胞の標的ビルドオン
YAC1導入遺伝子(後続の全てのYAC構築物に共通のコア構造を含有する)にさらなる特徴を加える代替方法は、ES細胞株内に位置しているYAC1導入遺伝子の標的伸長を実施することである(図14)。YAC1導入遺伝子を有するES細胞株は、in vitroで作製するか、又はYAC1トランスジェニックマウスの胚に由来する。新しい特徴は、本明細書の他の箇所に記載されているような相同組換えによって、又は挿入ベクターの使用によって、導入遺伝子に導入され得る。
【０１６９】
(実施例4)
初代の特性決定及びスクリーニング
a)導入遺伝子の存在及び生殖細胞系伝達
マイクロインジェクションを行った卵母細胞移入後の全ての仔について、それらのゲノムDNA内のYACの存在をチェックした。ES細胞由来のトランスジェニック仔では、毛色遺伝学もまた適切な胚盤胞ドナー動物の選択と組み合わせて利用され、キメラ仔は、その毛色から容易に同定され得る。以下のスクリーニングの例は、前核マイクロインジェクション遺伝子組換えに由来する同腹仔を使用する。しかし、ESクローンを遺伝子組換えの前に同様の分析に供し、得られた同腹仔を確証的な結果についてスクリーニングすることができる。
【０１７０】
YAC導入遺伝子の試験は、尾部又は耳の生検からgDNAを精製し、PCR反応を使用してYAC領域を試験することを含む。gDNAの単離及びPCRの方法は既に記載している(上記参照)。YACのそれぞれの末端領域を標的とするPCR反応を実施し、次いで、両領域の陽性組み込みを有するいずれかのサンプルを、YAC導入遺伝子の様々な内部領域を増幅するように設計したさらなるプライマーを用いてスクリーニングした。これらのスクリーニングに使用したPCRプライマーをTable 3(表7)に記載する。次いで、PCRの陽性結果をもたらすいずれかの初代マウス(F0)を交配させ、導入遺伝子の生殖細胞系伝達をチェックし、PCRスクリーニング結果がフラグメントではなく無処置のYACの存在に起因することも確認した。後者の場合、最も可能性の高いシナリオは、フラグメントが異なる染色体上に位置し、このように、F1後代の中でそれらの独立した分離によって同定されるということであった。初代及びその生殖細胞系伝達のスクリーニングの一例を図15に示す。
【０１７１】
【表７Ａ】
0006641379.tif 000009
【０１７２】
【表７Ｂ】
0006641379.tif 000010
【０１７３】
【表７Ｃ】
0006641379.tif 000011
【０１７４】
【表７Ｄ】
0006641379.tif 000012
【０１７５】
b)YAC導入遺伝子のフィンガープリント分析
全ての場合において、トランスジェニック遺伝子座は、ヒトゲノムDNA配列を有していた。したがって、ヒト配列中に存在する繰り返しモチーフであるヒトDNA AluエレメントG15N2(Genbank X55929.1)の存在をスクリーニングすることができる。制限酵素で消化したヒトgDNAの所定領域は、Aluプローブを使用するサザンブロット分析で特性吸収帯パターンを生じる。したがって、YACのAluフィンガープリントを、トランスジェニック動物から抽出したgDNAから得られたものと比較し、導入遺伝子の構造上の完全性の指標を得る。完全なYAC導入遺伝子では、酵母内に存在するYACと同様のフィンガープリントが得られることが予想される。
【０１７６】
Aluプローブは、以下のプライマーを使用し、クローン配列(Genbank X55929.1)又はgDNAから調製する:
【０１７７】
【表８】
0006641379.tif 000013
【０１７８】
以下がサイクル条件である;
【０１７９】
【化２】
0006641379.tif 000014
【０１８０】
プローブは、放射性又は非放射性の方法のいずれかを使用して標識する(例えば、DIGプローブ合成キット(Roche社、カタログ番号11636090910)を使用し、PCR工程中に、DIG-dUTP残基に付加する)。次いで、プローブ化サザンブロットの化学発光性検出は、アルカリホスファターゼ標識抗ジゴキシゲニン抗体、続いて適切な基質の付加によって行う(例えば、CDP-Star発光基質、Sigma社C0712)。
【０１８１】
c)導入遺伝子のコピー数
YACの複数のコピーがトランスジェニックマウス(又は選択したESクローン)のゲノム内に存在している可能性がある。これは、異なる組み込み部位で、又は単一染色体の位置での繰り返し方式のいずれかで起こり得る。独立して分離される組み込み部位の数は、遺伝学上の遺伝パターンの研究及びメンデル遺伝学の適用から推論することができる。例えば、単一の組み込み部位は、後代に50%の遺伝パターンをもたらすが、2つの組み込み部位は、3:1のトランスジェニック:非トランスジェニック遺伝をもたらす。
【０１８２】
Q-PCR系の手法を用いて、YAC領域由来のアンプリコンの相対量とハウスキーパー遺伝子のPCR反応物とを比較した。コピー数評価は、基準のアンプリコン及び導入遺伝子アンプリコンが独自の色素を使用して記録される多重反応を使用して試みた。例えば、ハウスキーパー二倍体遺伝子(例えば、マウストランスフェリンレセプター;Invitrogen社、カタログ番号4458366)及びYAC領域(例えば、導入遺伝子のヒトJ領域;Taqmanコピー数アッセイid Hs03892805_cn、又はハイグロマイシン選択遺伝子;アッセイid Mr00661678)に特異的なアッセイを使用するTaqManプローブ技術(又は適切な代替技術)を使用した。
【０１８３】
これらの反応に関して、Q-PCRは、市販の試薬(例えば、Taqman Genotyping Master Mix 400rxns、カタログ番号4371355)を使用し、メーカーが推奨する条件に基づいた条件を用いてセットアップし、それぞれのアンプリコンに対するCT値を同一PCR反応内で測定した。コピー数分析の一例を図16に示す。本実施例において、マウス由来のDNAのQ-PCR分析によって、YAC2(単一コピー組み込み体)についてはヘテロ接合体であり、又はYAC2導入遺伝子(2つのコピー)についてはホモ接合体であることが示される。
【０１８４】
(実施例5)
TKOへの育種
a)従来の育種
野生型バックグラウンドで作製したトランスジェニックマウスをTKO系統と戻し交配し、導入遺伝子をこの所望のバックグラウンドに移した。これは、それぞれの育種スケジュールごとに選択される、慎重に遺伝子型が同定された後代との連続する育種工程を使用する従来の育種によって行った。
【０１８５】
b)戻し交配組み込みIVF
TKOバックグラウンドへのトランスジェニック系統の実施には、完了するまで、それぞれ一巡の育種に9〜12週間を要する時間のかかる手順である。しかし、IVF方略を使用し、慎重なスケジューリングを行うことにより、戻し交配を完了してTg/wtのTKO系統との最初の交配から約15週間以内にTg/TKO仔のかなり大きい同齢集団(cohort)を得ることができる程の規模まで育種を拡大した。Table 5(表9)は、こうしたIVF-促進育種プログラムから得たデータを含んでいる。同様のIVF工程を使用して、既にTKOバックグラウンドで得られているトランスジェニック系統を(例えば、TKO/ES細胞から、又は前核マイクロインジェクションからTKO卵母細胞へ)速やかに展開させることができる。
【０１８６】
トランスジェニックドナーの雄マウスに由来する精子との受精用に大量の卵母細胞が得られるようにTKOマウスを使用することが可能な条件を決定した。簡単に説明すると、8〜12週齢の雌マウスをホルモンで処理し、過剰排卵を誘導した(実施例3を参照)。卵母細胞を繁殖用トランスジェニック雄由来の精子と受精させ、受精した卵母細胞を、4〜24時間以内に偽妊娠雌へ移植するか、又は後の移植用に凍結保存するかのいずれかを行った。
【０１８７】
【表９】
0006641379.tif 000015
【０１８８】
(実施例6)
導入遺伝子使用の評価
B細胞発生中に、免疫グロブリン遺伝子座の体細胞組換えが起こり、抗体レパートリーが生じる(例えば、概説については、Kuby Immunology、第6版; T.J. Kindt, R.A. Goldsby, B.A. Osborne, J Kuby. W.H. Freeman and Company刊, New York, 2007を参照)。重鎖については、この方法はV-D-J領域の組換えを含む。これらの遺伝子セグメントのあいまいな連結によって、ナイーブレパートリーの利用され得る潜在的な多様性が増す。スプライシングされたVDJ遺伝子フラグメントによりVHドメインが生じ、これを、定常域遺伝子によってコードされている別のドメインに連結させる。再配列されたgDNAによってB細胞内にRNA転写物が生じ、これらが翻訳され、膜発現及びHcAb分子の分泌の両方が起こる。したがって、YAC導入遺伝子転写産物の機能的活性を探索する場合、B細胞及び血清タンパク質の両方をアッセイした。
【０１８９】
以下のセクションでは、導入された導入遺伝子が機能性であるかどうかを判断するために使用することができる、様々な分子、タンパク質及び細胞のアッセイのいくつかを記載する。
【０１９０】
a)分子の分析;転写産物-RT-PCR、クローニング及び配列決定
リンパサンプル(例えば、血液サンプル、脾臓)をトランスジェニック動物から取得した。RNAは、市販試薬(例えば、RNeasy Qiagenキット、カタログ番号74106)を使用してリンパサンプルから単離し、Supercript III酵素(Gibco社)と共に適切なプライマー(下記に詳細)又はoligodTプライマー(Gibco社)を使用して逆転写した。関連する全てのバッファー及び条件は、メーカーにより推奨されたものであった。このようにして得られたcDNAは、VHドメインに特異的なプライマーを使用するか(いくつかは、以後のライブラリー作製に適用-以下を参照)、又はVHリーダー及び定常領域に関するプライマー(Table 6(表10))を用いて、VH領域を増幅するPCR反応に使用した。
【０１９１】
【表１０Ａ】
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【０１９２】
【表１０Ｂ】
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【０１９３】
以下の実施例において、PCR反応は、プルーフリーダー酵素(例えば、Phusion高正確性DNAポリメラーゼ、カタログ番号F530S)及び「タッチ-ダウン」PCRサイクル条件を使用した。
実施例タッチダウンプログラム;
【０１９４】
【化３】
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【０１９５】
PCR産物を精製し、市販のクローニングベクター(例えば、pJET1.2, Fermentas K1231)にクローニングするか、又は、NcoI及びXhoIで消化した後、ファージミドベクターへクローニングするか、又は、PCR系クローニング方法を使用し、ファージミドベクターに組み込んだ(ファージミドベクターの詳細については、図17及び後記を参照)。
【０１９６】
クローンを配列決定し、導入遺伝子由来の転写産物が存在するかどうかを決定するため分析した。トランスジェニック動物からクローニングされた転写産物の例を図18に示す。トランスジェニック動物内のVHレパートリーの利用可能な多様性もまた、こうした配列分析から推定することができる(ただし、バイアスが、例えば、サンプリングのプロセス又は特定のPCR増幅工程の包含から生じる可能性がある)。図19に示した例では、VHは、個々のナイーブトランスジェニックマウスからクローニングされた。トランスジェニック動物は、クローニング工程でポリメラーゼ鎖増幅を使用したにもかかわらず、多様なB細胞レパートリーを有し、複製配列はほとんど確認されないことが明らかである。広範囲のCDR3の長さがこの単一のマウス分析から明らかであった。配列を生殖細胞系列VH配列と比較し、変異性プロットを構築した。ナイーブマウス由来のVHは、ほとんどが生殖細胞系列であり、CDR3領域外ではほとんど変異はなかった。上記で概説した従来のクローニング及び配列決定に加えて、VHレパートリーは、例えば、次世代配列決定を使用して分析することで、トランスジェニック動物のトランスクリプトームを調べることができる。
【０１９７】
b)タンパク質分析-血清ELISA
サンドイッチELISA技術は既に開示されている(TKOマウスの特性決定を参照)。適切な抗体の対を捕捉及び検出に使用し、導入遺伝子によってコードされているタンパク質をトランスジェニックマウスの血清で検出した。サンドイッチELISAに使用した試薬は、市販されている。ELISAを使用して血清内のHcAbを検出した、トランスジェニックマウスの分析を図20に示す。
【０１９８】
また本発明者らは、ヒトVH遺伝子を利用するHCAb産生のトランスジェニックプラットフォームの性能に関するトリプルノックアウトバックグラウンドの重要性を検討した。これを実施するため、本発明者らはELISAを使用し、内因性重鎖遺伝子はノックアウトされたが、様々な内因性免疫グロブリン軽鎖遺伝子ノックアウトバックグラウンドを有するマウスの血清中のHCAb及び重鎖/軽鎖複合体の存在を探索した(図33を参照)。捕捉抗体については、ヒト、ウシ、ウマ、ウサギ及びラット血清タンパク質に対して最小交差反応性を有するポリクローナルヤギ抗マウスIgG(H+L)(Jackson社、カタログ番号415-005-166)を使用した。この抗体は、アッセイで使用した検出抗体(ビオチン-ラット抗マウスIg、カッパ軽鎖、クローン87.1、BD Pharmingen  カタログ番号559750、ビオチン-ラット抗マウスIg、ラムダ1、ラムダ2及びラムダ3軽鎖、クローンR26-46、BD Pharmingen  カタログ番号553433、並びにビオチン-SP-結合型affini-Pureヤギ抗マウスIgG、Fcγフラグメント特異的、Jackson社  カタログ番号115-065-008)と直接結合できなかったので選択した。したがって、測定されたいかなるシグナルも、サンドイッチELISAにおいて、検出抗体の捕捉重鎖タンパク質への結合に起因するが、捕捉抗体への結合には起因しない可能性がある。簡単に説明すると、ELISAに関して、マウス血清中の抗体を、コーティングした抗マウスIgG抗体を介して捕捉した。洗浄後、捕捉された重鎖タンパク質又は複合型軽鎖を、ビオチン化抗マウスIgG重鎖特異的抗体、又はビオチン化抗マウスカッパ軽鎖Ab又はビオチン化抗マウスラムダ鎖Abのいずれかを使用して検出した。検出抗体は、検出抗体のビオチンタグに結合するニュートラアビジン-HRP複合体によって比色反応が起きる、TMB基質を使用して可視化した。既に示したように(図12を参照)、導入遺伝子を欠損しているTKOマウスは、その血清中に抗体を有していなかった。しかし、YAC2導入遺伝子が存在する場合、HcAbは、内因性免疫グロブリン軽鎖遺伝子バックグラウンドにかかわらず、全ての場合において確認することができた。機能性の内因性カッパ遺伝子座が存在する場合、カッパ軽鎖は捕捉された重鎖上で検出することができ、このことは、内因性カッパ軽鎖と複合体形成されたトランスジェニックHcAbが存在することを示唆している。同様に、機能するラムダ遺伝子座が存在する場合、ラムダ軽鎖は捕捉された重鎖と会合させて検出することができ、このことは、内因性ラムダ軽鎖タンパク質と複合体形成されたトランスジェニックHcAbが存在することを示唆している。内因性カッパ及び内因性ラムダの両軽鎖遺伝子座が存在する場合、マウスにおいては、ラムダ再配列がカッパ軽鎖タンパク質の産生の成功により妨げられることが普通であるので、カッパ鎖が優先的に使用された。したがって、この場合、ラムダ軽鎖は、トランスジェニックキメラHCAbと関連付けて検出することはより困難であった。これらのELISAの結果から、Hcのみの抗体を単独で産生することができるトランスジェニックマウスの提供には、いかなる内因性免疫グロブリンタンパク質も産生することはできない、トリプルノックアウトバックグラウンドを有することが必要であることは明らかである。
【０１９９】
(実施例7)
細胞分析-フローサイトメトリー
B細胞発生経路は、特定の発生段階に関連した、十分に特徴づけられた様々な試薬及びマーカーを用いるフローサイトメトリーを使用してモニタリングすることができる。例えば、初期のプレB細胞は、c-kit及びIL7Rを発現し、細胞が成熟した表面Ig-陽性B細胞に進行するにつれて、例えばCD43、CD19、B220等の他のマーカーが獲得されるか(例えば、CD19、B220)、又は獲得されダウンレギュレートされる(例えば、CD43)(図21を参照)。更に、B細胞レパートリー内では、マーカーを使用して、B-2 B細胞(CD23+、CD5-)を他のB細胞サブセットと区別することができる。前者は、後天性の体液性免疫反応に関与し得る(図22を参照)。
【０２００】
フローサイトメトリー分析については、単一細胞懸濁液をリンパ系組織(例えば、骨髄、脾臓)から調製し、次いで、(例えば、Fcフラグメント(Rockland社)で)ブロッキングし、表面マーカー又はアイソタイプの対照に対して抗体を含むFACSバッファー(PBS/1%BSA/0.01%NaN2)で染色した。ビオチン結合抗体を、適切なストレプトアビジンコンジュゲート(例えば、PE-Cy7ストレプトアビジン)を使用し検出した。染色後、細胞を3.7%ホルムアルデヒド溶液で固定し、適切な電圧及び補正設定を使用して、フローサイトメーター(例えば、FACSCalibur又はLSRII装置)により分析した。データは、フリーウェアプログラムのFlowJo & WinMDIを含む、様々なソフトウェアパッケージを使用して分析した(図21及び図22を参照)。フローサイトメトリー分析前の染色用試薬については、当技術分野で公知である(例えば、http://www.bd.com/uk/products/main.aspを参照。)
【０２０１】
(実施例8)
脾臓の免疫組織化学
脾臓は、赤脾髄区域及び白脾髄区域を含む組織化構造を有し、後者はB細胞及びT細胞が豊富な領域を含有している。ホルムアルデヒド固定パラフィン包埋組織から得た組織切片のヘマトキシリン及びエオシン染色を使用してこの構造を明らかにし、野性型マウス、トリプルKOマウス及びTg/TKOマウスに関する比較画像を示す(図23)。これらから、TKOマウスでは構造が損傷されており、卵胞の数は少なく、卵胞周辺の辺縁領域がないことが明らかである。これらの特徴は、TKOマウスにおいてB細胞が存在しないことと一致している。またTgマウスに関する画像が示すように、構造は回復され、卵胞は密集度がより高く、明白な辺縁領域によって囲まれている。
【０２０２】
(実施例9)
VHドメインの産生
標的特異的VHドメインは、免疫化トランスジェニックマウス又はナイーブトランスジェニックマウス由来のRNAを用いて作製されたディスプレイライブラリーを使用し単離した。
【０２０３】
a)免疫
異なる標的抗原の選択は、当技術分野で周知の多数の免疫プロトコルの中の1つを使用し、トランスジェニックマウスに投与した。血清ELISAの例を図24に示す。サンドイッチELISAは、上記で概説したのと同様である。簡単に説明すると、吸着プレートを抗原でコーティングし、洗浄及びブロッキングした後、動物由来の血清の希釈液を添加した。抗原コーティングプレートに結合している全てのHCAbは、ビオチン化抗Fc Ab、次いでニュートラアビジン-HRPとインキュベーションし、基質を添加した後に検出した。
【０２０４】
b)ナイーブライブラリー
それぞれのVHファミリーの大きなライブラリーを、YAC1トランスジェニックマウス由来の113の脾臓を使用して構築した。上記のように、それぞれの脾臓を個別に処理し、個々のRNAのアリコートを異なるVHファミリーライブラリー構築に使用した。このライブラリーの特性の概要を図35のナイーブライブラリーに示す。ライブラリーは約3.81×1010クローンからなっており、各ファミリーからの配列決定のサンプルはクローン多様性が高いことを示し、ほとんどのクローンはサンプル内で1回のみ単離される。
【０２０５】
cDNAライブラリーの構築及び使用
ディスプレイライブラリーをナイーブトランスジェニック動物及び免疫化トランスジェニック動物の両方から構築した。簡単に説明すると、リンパ系組織をRNAまで収集し、次いで機械的にホモジナイズし、溶解させた。或いは、新鮮なリンパ系組織、血液、又はハイブリドーマを含むB細胞の別の供給源をRNAの供給源として使用することができる。RNAの抽出後、(全RNA又はメッセンジャーRNAのいずれかの)cDNAを作製した。次いで、PCRを使用してVH配列を増幅させ、ファージミドベクターへのクローニングができるように適切なアダプターを加えた。VHのクローニングには、多くの手法を使用することができる。本件の場合、導入遺伝子内に存在するリーダー配列用の縮重プライマーを、J/H連結用の縮重プライマーと共に使用した。別法は、ターミナルデオキシトランスフェラーゼを用いて、リーダー配列の代わりに使用するための反復デオキシリボヌクレオチドベーステール又はアンカーを付加することによる。増幅後、VH産物をNcoI及びXhoIで消化し、ベクターに連結するか、又は、プライマーとして使用し、PCR系の手法を使用してファージミドベクターに組み込んだ。ファージミドベクターをインハウスで構築した(図17を参照)。追加の適応配列(adaption sequence)を有するプライマーは、前のセクションに記載している(分子の分析;転写産物-RT-PCR、クローニング及び配列決定を参照)。
【０２０６】
次いで、このようにして構築されたライブラリーを、ファージディスプレイ選択で使用した(図25の方法概略図を参照)。限定するものではないが、可溶性選択、オフレートバイアス選択又はオンレートバイアス選択、及び競合選択を含む、この技術の変更形も使用することができる。
【０２０７】
それぞれの選択方法からのアウトプットをELISAによってスクリーニングし、ファージ選択の前後のいくつかのライブラリースクリーニングの例を図26に示した。この場合、VHライブラリーは免疫化マウスからクローニングし、免疫抗原で選択する前と後の両方でELISAによってライブラリーをスクリーニングした。免疫原に特異的なVH抗体を、公開された方法(Antibody Engineering, Benny Lo編, 第8章, p161-176, 2004)に従って、大腸菌のペリプラズムから精製したVHを使用するELISAによって同定した。ex-vivoではライブラリーが低頻度で免疫原バインダーを含有していたことが明白である。これは、トランスジェニックマウス内の、応答性及びナイーブ両方のB細胞のマイニング(mining)と一致している。ファージ選択後、抗原結合性VHを濃縮した(図26)。実際、図27に示すように、事前選択ライブラリーの多様性が高いのは明らかであり、ファージディスプレイによる1ラウンドのストリンジェントな選択後、抗原結合性VHは、CDR3多様性によってグループ化した場合、50の配列ファミリーに属していることが分かった。更に、体細胞超変異の証拠は、CDR1配列、CDR2配列及びCDR3配列並びに多数の同胞配列の試験から明白であり、おそらく、胚中心内でのin vivo体細胞超変異の結果、単離された(図27a)i)を参照)。体細胞超変異が抗原に対する親和性を増加させることは、抗原への結合も示す、4つの同胞配列の選択パネルで実証されている(図27a)i)を参照)。VHの配列多様化につながる体細胞超変異のさらなる証拠は、図34-Kabat及びWuの抗原バインダーに示している。この場合、3つの抗原の1つに結合されている105のVHを分析し、生殖細胞系列の配列と比較し、それぞれのアミノ酸位置における変異をプロットした。ナイーブマウス由来の同様のプロットと比較することにより(図19を参照)、かなりの変異が蓄積されており、CDR1領域及びCDR2領域における変異が優勢であることが明らかである。
【０２０８】
更に、公知の技術に従って、また上記のようにVHドメインを単離するために、VHドメインをアッセイし、標的抗原に対する親和性を決定した(図28)。これは、限定するものではないが、ELISA及びBIAcoreを含む、当技術分野で公知の多数の技術によって実施することができる。それに加えて、細胞表面抗原への結合は、蛍光細胞分析分離装置(FACS)によって測定することができる。
【０２０９】
標的抗原への結合強度の他に、所定の標的の機能に影響を及ぼすVHの能力もアッセイすることができる(例えば、これは、リガンド:受容体結合の阻害を含む)。リガンドに特異的なVHの封入によるリガンド/受容体相互作用の阻害の一例を図29に示す。
【０２１０】
(実施例10)
VHの特性
上記のYAC構築物の1つを有するトランスジェニックマウスは、高品質の候補薬剤の発見に関して有効な利点を提供する。従来の供給源(例えば、ヒトcDNA)から単離されるVHドメインとは異なり、VHドメインは発生し、軽鎖の非存在下で成熟する。このように、トランスジェニックマウスに由来するVHドメインは、それらの折り畳みの安定化又はそれらの溶解性の保持に、パートナー軽鎖の存在に依存しない。この証拠は、ナイーブトランスジェニックマウスから単離されたVHを、ヒトcDNAライブラリーからin vitroで誘導されたものと比較する実験から得られた。VHに関する配列を、前述のファージミドベクターにクローニングし、大腸菌における小スケール(50ml)発現試験を試みた。これらは、配列を最適化することなく、またタンパク質生産を最大限にするための特殊な方法を使用することなく実施した。IPTGによる誘導後、可溶性VHの発現を決定した。マッチしたV-遺伝子ファミリーからのVHを使用した場合、ヒトcDNA由来VHクローンでは47%のみ(15/32クローン)が、大腸菌由来のペリプラズム抽出物から少なくとも10ugの可溶性タンパク質を提供することができることを確認した。対照的に、ナイーブトランスジェニックYAC1/TKOマウスからクローニングされたVHでは79%(27/34)が、10ugを超える可溶性発現収量をもたらした。更に、図30に示した結果から明らかなように、個体群ベースで、トランスジェニックマウス内での軽鎖の非存在下で発生したVHでは、本発明者らがパートナー軽鎖と関連して発生したと推定するヒトcDNAライブラリー由来のもの(平均=37.6ug/50ml)と比較した場合、高い収量(平均=176ug/50ml)であることが明らかであった。したがって、いずれの供給源からのVHも可溶性フォーマットで発現することはできるが、トランスジェニックマウス内で発生した個体群は高い溶解性を示し、全体で約5倍の可溶性タンパク質の収率をもたらした。収量の増大は、免疫後のマウスからクローニングされた、in vivoでの親和性-成熟VHに関して明白であった。この場合、小実験室スケール培養で、約10mg/リットルまでの上昇が生じ、これはいかなる最適化も行うことなく、ファージミド発現系を使用して得られた。
【０２１１】
タンパク質の融解温度(Tm)は、そのタンパク質の安定性に関する代用測定値として使用することができる。それらの精製後に、分別的走査蛍光分析(DSF)を使用して、上記VHクローンの選択のTmを測定した。ヒトcDNAから誘導したVHの多くは、それらの非常に低い生産収量のため、試験することができなかった。またこのように、この個体群のクローンに対する平均のTm値は、最善のシナリオを示すと思われる。簡単に説明すると、この技術は、暴露された疎水性残基に首尾よく結合しているシグナルを発するリポーター色素からの蛍光検出によるものである。したがって、タンパク質が加熱され折り畳まれる場合に、リポーター色素は結合され、蛍光が検出され得る。図31に示した結果は、Protein Thermal Shift Kit (Applied Biosytems社、カタログ番号4461146)を使用して作製し、分析は、Protein Thermal Shiftソフトウェア(カタログ番号4466037)を使用して行った。ボルツマン適性値から得たTm値を示したが(図31)、トランスジェニックマウスから単離されたVHの個体群は、ヒトcDNAから単離されたものと比べTmが有意に高いことが明白だった(ヒト供給源からクローニングされたVHに関する54.1℃と比較した場合、トランスジェニックマウスから誘導したVHに関しては57.9℃)。これらのデータはナイーブマウス由来のものであり、また大部分が生殖細胞系列配列であって、親和性成熟を受けていないVHを表わすことに留意されたい。免疫した後、抗原特異的な親和性成熟VHは、多くの場合、ここに示したものと比べ、有意に高いTmを示す。
【０２１２】
免疫したマウス由来のVHは、凝集傾向を示さない(図32を参照)。精製VHのHPLCサイズ排除分析を実施した。簡単に説明すると、VH溶液は、280nMで検出するTSKゲルG2000SWXL(TOSOH)カラムでWaters 2795単離モジュールを使用し、10%イソプロパノール、90%PBS又は100mMリン酸緩衝液pH6.8、150mM NaClの移動相と0.5〜0.7ml/分の流速を用いて分析した。いくつかのVH調製物に関し、使用した特定の大腸菌株は、ファージミドベクター内の遺伝子III配列へのリードスルーを可能にし、VH-遺伝子III融合産物が少量であることが明らかである。しかし、無視できる量の二量体又は凝集VHは確認される。
【０２１３】
総括すると、これらの実験から、トランスジェニックマウスに由来するヒトVHは、再配列されたパートナー軽鎖と関連して発生したものと比べた場合、高い溶解性及び安定性を有することが証明されている。
【表１１Ａ】
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【表１１Ｂ】
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【図１】
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【図２】
0006641379.tif 000022
【図３】
0006641379.tif 000023
【図４】
0006641379.tif 000024
【図５】
0006641379.tif 000025
【図６】
0006641379.tif 000026
【図７】
0006641379.tif 000027
【図８】
0006641379.tif 000028
【図９】
0006641379.tif 000029
【図１０】
0006641379.tif 000030
【図１１】
0006641379.tif 000031
【図１２】
0006641379.tif 000032
【図１３】
0006641379.tif 000033
【図１４】
0006641379.tif 000034
【図１５−１】
0006641379.tif 000035
【図１５−２】
0006641379.tif 000036
【図１６】
0006641379.tif 000037
【図１７】
0006641379.tif 000038
【図１８】
0006641379.tif 000039
【図１９−１】
0006641379.tif 000040
【図１９−２】
0006641379.tif 000041
【図２０】
0006641379.tif 000042
【図２１】
0006641379.tif 000043
【図２２−１】
0006641379.tif 000044
【図２２−２】
0006641379.tif 000045
【図２３】
0006641379.tif 000046
【図２４】
0006641379.tif 000047
【図２５Ａ】
0006641379.tif 000048
【図２５Ｂ】
0006641379.tif 000049
【図２６】
0006641379.tif 000050
【図２７ａ】
0006641379.tif 000051
【図２７ｂ】
0006641379.tif 000052
【図２７ｃ】
0006641379.tif 000053
【図２８】
0006641379.tif 000054
【図２９】
0006641379.tif 000055
【図３０】
0006641379.tif 000056
【図３１】
0006641379.tif 000057
【図３２−１】
0006641379.tif 000058
【図３２−２】
0006641379.tif 000059
【図３３】
0006641379.tif 000060
【図３４】
0006641379.tif 000061
【図３５】
0006641379.tif 000062
【配列表】
0006641379000001.app