(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍試料中におけるＰＤ−Ｌ１発現をスコア化する方法であって、
−  腫瘍組織試料を標識することであって、標識することは、
・組織試料を抗ＰＤ−Ｌ１一次抗体と接触させること；及び
・同組織試料を
・腫瘍細胞に特異的なマーカーに対する一次抗体；及び
・免疫細胞に特異的なマーカーに対する一次抗体；
と接触させること、
・組織試料中の抗体の各々を、一次抗体の各々に対応する検出可能なシグナルを生成する試薬を用いて可視化すること
を含み、ここで抗ＰＤ−Ｌ１抗体は第１の検出可能なシグナルを有し、腫瘍細胞に特異的なマーカーに対する抗体は、第１の検出可能なシグナルから区別可能な第２の検出可能なシグナルを有し、且つ免疫細胞に特異的なマーカーに対する抗体は、第１の検出可能なシグナル及び第２の検出可能なシグナルから区別可能な第３の検出可能なシグナルを有する、標識することと、
−  腫瘍細胞、免疫細胞、若しくは両方におけるＰＤ−Ｌ１発現をスコア化することとを含み、ここで第１及び第２の検出可能なシグナルの共局在により、ＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍細胞の存在が示され、第１及び第３の検出可能なシグナルの共局在によりＰＤ−Ｌ１陽性免疫細胞の存在が示される、方法。
【請求項２】
腫瘍細胞に特異的なマーカーが、サイトケラチン、クロモグラニン、シナプトフィジン、ＣＤ５６、甲状腺転写因子−１（ＴＴＦ−１）、ｐ５３、白血球共通抗原（ＬＣＡ）、ビメンチン、及び平滑筋アクチンからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
免疫細胞に特異的なマーカーが、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１２３、ＣＤ５６、ＣＤ１４、ＣＤ３３、又はＣＤ６６ｂからなる群より選択される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
免疫細胞に特異的なマーカーがＴ細胞マーカー又はＢ細胞マーカーである、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
組織試料が、腫瘍細胞に特異的なマーカーに対する抗体及び免疫細胞に特異的なマーカーに対する抗体と接触させられ、ここで腫瘍細胞に特異的なマーカーに対する抗体がパンケラチン抗体であり、免疫細胞に特異的なマーカーに対する抗体が抗ＣＤ４抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
抗ＰＤ−Ｌ１抗体がＳＰ２６３又はＳＰ１４２である、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
第１、第２及び第３の検出可能なシグナルが色素原によって生成される、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
第１の検出可能なシグナルが、
・組織試料を、抗ＰＤ−Ｌ１一次抗体を認識するホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート二次抗体と接触させること；
・ＨＲＰを３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）と反応させて褐色を生成すること
により生成され、
第２の検出可能なシグナルが、
・試料を、腫瘍細胞に特異的なマーカーに対する一次抗体を認識するアルカリホスファターゼ（ＡＰ）標識化抗体と接触させること；
・ＡＰをファストレッド色素原及びナフトールと反応させて赤色を生成すること
により生成され；且つ
第３の検出可能なシグナルが、
・試料を、免疫細胞に特異的なマーカーに対する一次抗体を認識するＨＲＰコンジュゲート二次抗体と接触させること；
・ＨＲＰをＨＲＰ−グリーン色素原と反応させて緑色を生成すること
により生成される、
請求項７に記載の方法。
【請求項９】
第１、第２及び／又は第３の検出可能なシグナルが、増幅されたシグナルである、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
増幅されたシグナルがチラミドシグナル増幅により生成される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
試料を一次抗体と接触させることが、同時に実施される、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
試料を一次抗体と接触させることが、連続的に実施される、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
組織試料を対比染色することを更に含み、対比染色が、第１、第２、及び第３の検出可能なシグナルから区別可能な第４の検出可能なシグナルを生成する、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
対比染色がヘマトキシリンを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
第５の検出可能なシグナルが、第１の検出可能なシグナルと第２の検出可能なシグナルの重複により生成される、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
第６の検出可能なシグナルが、第１の検出可能なシグナルと第３の検出可能なシグナルの重複により生成される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍細胞とＰＤ−Ｌ１陰性腫瘍細胞の総数が定量化される、請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
約１０％を上回る腫瘍細胞にＰＤ−Ｌ１の染色が検出された場合に腫瘍がＰＤ−Ｌ１陽性とスコア化される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
約５０％を上回る腫瘍細胞にＰＤ−Ｌ１の染色が検出された場合に腫瘍がＰＤ−Ｌ１陽性とスコア化される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
ＰＤ−Ｌ１陽性免疫細胞とＰＤ−Ｌ１陰性免疫細胞の総数が定量化される、請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
約１０％を上回る免疫細胞にＰＤ−Ｌ１の染色が検出された場合に腫瘍がＰＤ−Ｌ１陽性とスコア化される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
約５０％を上回る免疫細胞にＰＤ−Ｌ１の染色が検出された場合に腫瘍がＰＤ−Ｌ１陽性とスコア化される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
ＰＤ−Ｌ１陽性免疫細胞、ＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍細胞、及びＰＤ−Ｌ１陰性腫瘍細胞が定量化されてＰＤ−Ｌ１値が生成され、ここで：
ＰＤ−Ｌ１値＝ＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍細胞／（ＰＤ−Ｌ１陰性腫瘍細胞＋ＰＤ−Ｌ１陽性免疫細胞）であり、
上式中：
ＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍細胞は、第１及び第２の検出可能なシグナルの両方について染色された細胞の数を数えることにより、又は第１の検出可能なシグナルが第２の検出可能なシグナルに関連付けられる組織試料の面積を計算することにより計算され；
ＰＤ−Ｌ１陰性腫瘍細胞は、第２の検出可能なシグナルのみについて染色された細胞の数を数えることにより、又は第２の検出可能なシグナルが第１の検出可能なシグナルに関連付けられない組織試料の面積を計算することにより計算され；且つ
ＰＤ−Ｌ１陽性免疫細胞は、第１及び第３の検出可能なシグナルの両方について染色された細胞の数を数えることにより、又は第１の検出可能なシグナルが第３の検出可能なシグナルに関連付けられる組織試料の面積を計算することにより計算される、
請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
ＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍細胞中におけるＰＤ−Ｌ１染色の強度をスコア化すること、及びＨスコアを計算することを更に含み、ここで：
Ｈスコア＝１＊（強度１＋でのＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍細胞染色のパーセンテージ）＋２＊（強度２＋でのＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍細胞染色のパーセンテージ）＋３＊（強度３＋でのＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍細胞染色のパーセンテージ）
である、請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の交互参照
[0001]本出願は、２０１４年５月３０日出願の米国特許出願第６２／００５７０１号の利益を主張し、この出願はその全体が参照により本明細書に援用される。
【０００２】
発明の分野
[0001]本開示内容は、腫瘍組織におけるＰＤ−Ｌ１の発現を組織化学的に検出及びスコア化するための材料及び方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
関連技術の説明
[0002]プログラム死（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ｄｅａｔｈ）１（ＰＤ−１）は、受容体のＣＤ２８ファミリーのメンバーであり、これにはＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳ、ＰＤ−１、及びＢＴＬＡが含まれる。ＰＤ−１には、ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２という二つの細胞表面糖タンパク質リガンドが同定されており、ＰＤ−１に結合するとＴ細胞活性化とサイトカイン分泌を下方制御することが示されている（Freeman et al., J Exp Med 192:1027-34 （2000）; Latchman et al., Nat Immunol 2:261-8 （2001）; Carter et al., Eur J Immunol 32:634-43 （2002）; Ohigashi et al., Clin Cancer Res 11:2947-53 （2005））。ＰＤ−Ｌ１（Ｂ７−Ｈ１）及びＰＤ−Ｌ２（Ｂ７−ＤＣ）は共に、ＰＤ−１に結合するが、他のＣＤ２８ファミリーメンバーには結合しないＢ７ホモログである。
【０００４】
[0003]ＰＤ−Ｌ１−ＰＤ１経路は、いくつかの免疫応答の負の調節に関与しており、末梢トレランスの調節に重要な役割を担っていると思われる。ＰＤ−Ｌ１とＰＤ１の相互作用の結果、ＴＣＲ媒介性増殖及びサイトカイン生成が阻害される。ＰＤ−Ｌ１は、抗原特異的Ｔ細胞クローンのアポトーシスを増加させることにより、腫瘍免疫に寄与することが示唆されている（Dong et al. Nat Med 8:793-800 （2002））。実際、ＰＤ−Ｌ１の発現は、ヒトの肺癌、卵巣癌及び結腸癌並びに様々な骨髄腫を含む、複数のマウス及びヒトのがんに見出された（Iwai et al. PNAS 99:12293-7 （2002）; Ohigashi et al. Clin Cancer Res 11:2947-53 （2005））。したがって、生物学的試料中のＰＤ−Ｌ１タンパク質の量を測定することは、がん病変の早期検出を助け、ＰＤ−Ｌ１タンパク質の結合を阻害する治験薬の有効性及び耐性の評価を助ける可能性がある。
【０００５】
[0004]しかしながら、ＰＤ−Ｌ１タンパク質の発現のがんの正確な予測因子としての使用及び／又は抗ＰＤ−１及び抗ＰＤ−Ｌ１指向性療法の有効性は、課題として残っている。例えば、多くの腫瘍試料が、腫瘍細胞と免疫細胞の両方にＰＤ−Ｌ１染色を示す。これら二つの細胞種の差別化は、特に同じ試料中に両者が存在するとき、病理学者にとって困難である。
【発明の概要】
【０００６】
[0005]本発明は、ＰＤ−Ｌ１で染色された腫瘍組織の改善されたスコア化のための多重アッセイを主題とする。本アッセイは、第１の色でのＰＤ−Ｌ１染色、腫瘍細胞又は免疫細胞に特異的な差別化マーカーの第２の色での染色、及び任意選択的に、腫瘍細胞又は免疫細胞に特異的な第２の差別化マーカーの第３の色での染色を特徴とする。本発明のアッセイは、ＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍細胞とＰＤ−Ｌ１陽性免疫細胞の差別化を助ける。これは、ＰＤ−Ｌ１のみで染色された試料のスコア化と比較して、試料のスコア化を迅速且つ正確に、再現性を高めて行う能力を向上させうる。
【０００７】
[0006]本明細書に記載される任意の特徴又は特徴の組み合わせは、そのような組み合わせのいずれかに含まれる特徴が、文脈、本明細書、及び当業者の知識から明らかとなるように、相互に矛盾しない限りにおいて、本発明の範囲に含まれる。本発明の更なる利点及び態様は、以下の詳細な説明及び特許請求の範囲から明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】[0007]ＮＳＣＬＣ腫瘍試料の染色を示している。ＰＤ−Ｌ１染色は（ａ）によって示されており、カラー画像において褐色で示される。パンケラチン抗体由来のサイトケラチンは（ｂ）によって示されており、カラー画像では赤である。免疫細胞のＣＤ４は（ｃ）によって示されており、カラー画像では青／緑である。対比染色は希釈されたヘマトキシリンである。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
[0008]本開示内容は、概して、腫瘍細胞、免疫細胞、又は両方におけるＰＤ−Ｌ１発現のスコア化を容易にするための、腫瘍試料標識化の組織化学的又は細胞化学的方法に関する。簡潔に説明すると、細胞は、ＰＤ−Ｌ１に特異的な結合要素と：（１）少なくとも一つの腫瘍細胞マーカー；（２）少なくとも一つの免疫細胞マーカー；又は（３）少なくとも一つの腫瘍細胞マーカー及び少なくとも一つの免疫細胞マーカーとで標識される。この結合要素は次いで、少なくとも三つの異なる検出可能なシグナル：即ち、ＰＤ−Ｌ１結合要素の位置と相関する第１の検出可能なシグナル；腫瘍細胞に特異的な結合要素の位置と相関する第２の検出可能なシグナル；及び免疫細胞マーカーの位置と相関する第３の検出可能なシグナルを生成することによって、腫瘍試料中において可視化される。検出可能な各シグナルは、互いに区別可能である。任意選択的に、第４の検出可能なシグナルでの対比染色を行ってもよく、及び／又は第５の検出可能なシグナルを、第１、第２及び第３の検出可能なシグナルのいずれか二つの共局在から生成してもよい。
【００１０】
[0009]腫瘍試料
[0010]本方法は、例えば、新鮮凍結、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ））試料、細胞学的スミア（子宮頚部スミア）、循環性腫瘍細胞の単離物などを含む、組織化学的又は細胞化学的分析に適した腫瘍試料と適合する。
【００１１】
[0011]腫瘍細胞マーカー及び免疫細胞マーカー
[0012]非腫瘍細胞から腫瘍細胞を区別することのできる任意のマーカーを使用することができる。腫瘍細胞に特異的なバイオマーカーの例には、限定されないが：パンケラチン抗体で検出可能なサイトケラチン（例えば、塩基性サイトケラチン、酸性サイトケラチンの多く）、その他のサイトケラチン、例えばサイトケラチン７（ＣＫ７）及びサイトケラチン２０（ＣＫ２０）、クロモグラニン、シナプトフィジン、ＣＤ５６、甲状腺転写因子−１（ＴＴＦ−１）、ｐ５３、白血球共通抗原（ＬＣＡ）、ビメンチン、平滑筋アクチンなどが含まれる（例えば、Capelozzi, V., J Bras Pneumol. 2009;35（4）:375-382参照）。
【００１２】
[0013]非免疫細胞から免疫細胞を区別することのできる任意のマーカーを使用することができる。免疫細胞に特異的なバイオマーカーの例には、限定されないが：ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１２３、ＣＤ５６、ＣＤ１４、ＣＤ３３、又はＣＤ６６ｂが含まれる。一実施例では、リンパ球に特異的なマーカーが使用される。例えば、Ｔ細胞に特異的なマーカー、例えばＣＤ３、ＣＤ４、若しくはＣＤ８、又はＢ細胞に特異的なマーカー、例えばＣＤ１９若しくはＣＤ２０を使用することができる。
【００１３】
[0014]特定の一実施態様では、免疫細胞マーカーはＣＤ４であり、腫瘍細胞マーカーはパンサイトケラチン抗体によって検出可能なサイトケラチンである。
【００１４】
[0015]結合要素
[0016]組織化学及び細胞化学は、顕微鏡で可視化できる方式で、バイオマーカーに特異的に結合する分子を用いて試料を標識化することにより、無傷細胞の状況においてバイオマーカーを同定するためにしばしば使用される技術である。免疫組織化学（ＩＨＣ）及び免疫細胞化学（ＩＣＣ）は、バイオマーカーを標識するために抗体を用いる組織化学及び細胞化学の種類である。ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）は、組織又は細胞試料中の特定のヌクレオチド配列を標識するために核酸プローブを用いる組織化学又は細胞化学の種類である。組織環境又は細胞環境の状況においてバイオマーカーを同定することにより、バイオマーカーと、細胞又は組織試料の他の形態的又は分子的特徴の空間的相互関係を解明することができ、これにより他の分子的又は細胞的技術からは明らかでない情報が明らかになりうる。
【００１５】
[0017]本明細書において使用される用語「結合要素」は、組織化学的又は細胞化学的分析に適した腫瘍試料中の特定の分子構造に特異的に結合することのできる任意の化合物又は組成物を指す。例には、抗体及びその抗原結合断片、並びに遺伝子操作された特異的結合構造が含まれ、これには、ＡＤＮＥＣＴＩＮ（１０番目のＦＮ３フィブロネクチンベースの足場；Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ−Ｓｑｕｉｂｂ  Ｃｏ．）、ＡＦＦＩＢＯＤＹ（黄色ブドウ球菌由来のプロテインＡのＺドメインベースの足場；Ａｆｆｉｂｏｄｙ  ＡＢ，Ｓｏｌｎａ，Ｓｗｅｄｅｎ）、ＡＶＩＭＥＲ（ドメインＡ／ＬＤＬ受容体ベースの足場；Ａｍｇｅｎ，Ｔｈｏｕｓａｎｄ  Ｏａｋｓ，ＣＡ）、ｄＡｂ（ＶＨ又はＶＬ抗体ドメインベースの足場；ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  ＰＬＣ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ），ＤＡＲＰｉｎ（アンキリンリピートタンパク質ベースの足場；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐａｒｔｎｅｒｓ  ＡＧ，Ｚｕｒｉｃｈ，ＣＨ）、ＡＮＴＩＣＡＬＩＮ（リポカリンベースの足場；Ｐｉｅｒｉｓ  ＡＧ，Ｆｒｅｉｓｉｎｇ，ＤＥ）、ＮＡＮＯＢＯＤＹ（ＶＨＨ（ラクダ科のＩｇ）ベースの足場；Ａｂｌｙｎｘ  Ｎ／Ｖ，Ｇｈｅｎｔ，ＢＥ）、ＴＲＡＮＳ−ＢＯＤＹ（トランスフェリンベースの足場；Ｐｆｉｚｅｒ  Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ）、ＳＭＩＰ（Ｅｍｅｒｇｅｎｔ  Ｂｉｏｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、及びテトラネクチン（Ｃ型レクチンドメインベースの足場（ＣＴＬＤ）、テトラネクチン；Ｂｏｒｅａｎ  Ｐｈａｒｍａ  Ａ／Ｓ，Ａａｒｈｕｓ，ＤＫ）が含まれる。このような遺伝子操作された特異的結合構造の説明は、Wurch et al., Development of Novel Protein Scaffolds as Alternatives to Whole Antibodies for Imaging and Therapy: Status on Discovery Research and Clinical Validation, Current Pharmaceutical Biotechnology、Vol. 9, pp. 502-509 (2008)に概説がある。
【００１６】
[0018]一実施態様では、結合要素は、抗体又はその抗原結合断片である。本明細書において使用される用語「抗体」は、所望の生物又は結合活性を呈する抗体の任意の形態を指す。したがって、この用語は最も広い意味で使用され、限定しないが、具体的にモノクローナル抗体（完全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、キメラ抗体及びラクダ化された単一ドメイン抗体を網羅する。
【００１７】
[0019]本明細書において使用される場合、別途指示がない限り，「抗体断片」又は「抗体結合断片」は、抗体の抗原結合断片、即ち完全長抗体に結合した抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体断片、例えば一又は複数のＣＤＲ領域を保持する断片を指す。抗体結合断片の例には、限定されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片；ダイアボディ；直鎖状抗体；単鎖抗体分子、例えば、ｓｃ−Ｆｖ；抗体断片から形成されたナノボディ及び多重特異性抗体が含まれる。
【００１８】
[0020]例示的抗ＰＤ−Ｌ１抗体には、ＳＰ２６３（米国仮特許出願第６２／００４５７２号に十分に明らかにされている、Ｄｏｃｋｅｔ  Ｎｕｍｂｅｒ  ３２１５１  ＵＳ、２０１４年５月２９日出願、この出願の開示内容全体を参照により本明細書に包含する）、ＳＰ１４２（Ｃａｔ．＃Ｍ４４２０、Ｓｐｒｉｎｇ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ，ＣＡ）、及びＰＤ−Ｌ１（Ｅ１Ｌ３Ｎ（登録商標））ＸＰ（登録商標）Ｒａｂｂｉｔ  ｍＡｂ（Ｃａｔ．＃  ＃１３６８４；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）が含まれる。特定の実施態様では、ＰＤ−Ｌ１結合要素はＳＰ２６３又はＳＰ１４２であり、腫瘍細胞に特異的な結合要素はパンケラチン抗体であり、免疫細胞特異的結合要素は抗ＣＤ４抗体である。別の特定の実施態様では、ＰＤ−Ｌ１結合要素はＳＰ１４２であり、腫瘍細胞に特異的な結合要素はパンケラチン抗体であり、免疫細胞特異的結合要素は抗ＣＤ４抗体である。
【００１９】
[0021]特異的結合要素の可視化
[0022]先述のように、本発明のアッセイは、外因性結合要素が試料に結合した位置と相関する検出可能なシグナルを生成するための、ＰＤ−Ｌ１の染色と、腫瘍及び免疫細胞マーカーのうちの一又は複数の染色を特徴とする。試料中の外因性結合要素に由来する検出可能なシグナルを生成する組織化学的及び細胞化学的方法は、当業者に周知であり、典型的には一又は複数の標識の適用を利用する。例示的標識には、発色性標識、蛍光性標識、発光性標識、放射測定標識などが含まれ、マーカー又は標的（例えば、ＰＤ−Ｌ１、腫瘍細胞特異的マーカー、免疫細胞特異的マーカーなど）の認識のために使用される。標識は、当業者には周知であり、本明細書に記載される標識に限定されない。特定の実施態様では、検出可能なシグナルは、色素原の使用により生成される。
【００２０】
[0023]一実施態様では、標識は、二次抗体の使用により適用される。例えば、結合要素は、ＰＤ−Ｌ１、免疫細胞マーカー、又は腫瘍細胞マーカーに特異的な一次抗体である。動物の複数の異なる種に由来する抗体が一次抗体として使用される場合、そのような抗体の種に特異的な二次抗体を使用して標識を適用することができる。別の実施例では、特定の結合要素が結合できる別個の部分を含むように一次抗体を修飾することができる。このような一次抗体の一例は、ハプテン化抗体（即ち、特定のハプテンを含有するように修飾された抗体）である。多くの異なるハプテンが既知であり、一次抗体の各々を、異なるハプテンを含有するように修飾することができ、異なる抗ハプテン抗体を使用して異なる一次抗体を特異的に標識することができる。
【００２１】
[0024]別の実施態様では、検出可能なシグナルは増幅されうる。本明細書において使用されるシグナルは、一次抗体一つあたり、標準的な一次−二次抗体の構成を用いる場合より多くの標識が沈着するとき、「増幅される」。一般に称される一つの増幅方法はチラミドシグナル増幅であり、これはBobrow, M. N., Harris, T. D., Shaughnessy, K. J., and Litt, G. J. （1989） J. Immunol. Methods 125, 279-285に記載されている。一つの例示的実施態様では、国際公開第２０１３１４８４９８号に記載のチラミドシグナル増幅の修飾型が使用される。
【００２２】
[0025]ここで図１を参照する。本発明は、ＰＤ−Ｌ１で染色される腫瘍組織の改善されたスコア化のための多重アッセイを特徴としている。本アッセイは、第１の色でＰＤ−Ｌ１を染色するための工程（ＰＤ−Ｌ１は図１で褐色で示される）と、腫瘍細胞に特異的なマーカー及び／又は免疫細胞に特異的なマーカーを第２の及び／又は第３の差別化色で染色するための工程とを特徴とする。例えば、図１は、褐色に染色されたＰＤ−Ｌ１（（ａ）により示す）、赤／ピンク色に染色された、パンケラチン抗体によって標的化されたサイトケラチン（上皮がん細胞に特異的なサイトケラチン）（（ｂ）により示す）、及び緑／青色に染色された（免疫細胞の）ＣＤ４（（ｃ）により示す）を示している。差別化の色（赤／ピンク及び緑／青）により、検出されるＰＤ−Ｌ１が腫瘍細胞又は免疫細胞中に存在するかどうかを決定することができる。したがって、本発明のアッセイは、ＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍細胞とＰＤ−Ｌ１陽性免疫細胞を区別することを助ける。これは、ＰＤ−Ｌ１のみで染色された試料のスコア化と比較して、試料のスコア化を迅速且つ正確に、再現性を高めて行う能力（手動／目視、マシン／画像分析）を向上させうる。
【００２３】
[0026]表１は、ＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍細胞とＰＤ−Ｌ１陽性免疫細胞とを差別化するための、差別化マーカー／色の使用を示している。ＰＤ−Ｌ１は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体を用いて検出することができ、ＰＤ−Ｌ１は第１の色（例えば、図１に示される例では褐色）として可視である。ＰＤ−Ｌ１を含む腫瘍細胞は、第１の色（ＰＤ−Ｌ１）を示し、表１の列４の符号「＋」によって示される（ＰＤ−Ｌ１を含まない腫瘍細胞は第１の色を有さず、表１の列４の符号「−」によって示される）。免疫細胞もＰＤ−Ｌ１の発現を呈し、第１の色（ＰＤ−Ｌ１）として示され、表１の列１の符号「＋」によって示される。ＰＤ−Ｌ１について陽性の二つの細胞種を差別化するために、試料は、腫瘍特異的なマーカー（例えば、パンケラチン抗体によって検出されるサイトケラチン）について染色され、これが第２の色（第１の色とは異なる色）として可視である。試料は免疫細胞特異的なマーカー（例えば、ＣＤ４又はその他のマーカー）について染色してもよく、これは第３の色（第１及び第２の色とは異なる色）として可視である。
【００２４】
[0027]表１（以下のまとめを参照）
0006652557.tif 000002
【００２５】
[0028]表１のまとめ：第１の色（ＰＤ−Ｌ１）及び第２の色（腫瘍細胞に特異的な差別化マーカー）の両方を有するが第３の色（免疫細胞に特異的な差別化マーカー）を有さない細胞は、ＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍細胞（列３）であり；第１の色（ＰＤ−Ｌ１）及び第３の色（免疫細胞に特異的な差別化マーカー）の両方を有するが第２の色を有さない細胞はＰＤ−Ｌ１陽性免疫細胞（列１）であり；第２の色（腫瘍細胞に特異的な差別化マーカー）を有するが第１の色（ＰＤ−Ｌ１）も第３の色（免疫細胞に特異的な差別化マーカー）も有さない細胞はＰＤ−Ｌ１陰性腫瘍細胞（列４）である。第３の色を有するが第１の色及び第２の色を有さない細胞はＰＤ−Ｌ１陰性免疫細胞（列２）である。本発明は、いずれかの特定の順序での染色に限定されない。例えば、実施例１には、まずＰＤ−Ｌ１について染色し、次いで腫瘍細胞に特異的なマーカーについて染色し、次いで免疫細胞に特異的なマーカーについて染色し、最後に対比染色を用いることが記載されている。しかしながら、いくつかの実施態様では、染色の順序は異なる。例えば、いくつかの実施態様では、免疫細胞に特異的なマーカーを染色した後で腫瘍細胞に特異的なマーカーを染色するなどする。
【００２６】
[0029]先述のように、本発明のアッセイは、ＰＤ−Ｌ１の染色と、一又は複数の差別化マーカーの染色とを特徴とする。染色方法には、免疫組織化学（ＩＨＣ）、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）、その変形、又は他のいずれかの適切な染色若しくは標識技術が含まれる。このような方法は当業者には周知である。染色技術は、様々な生物学的試料、例えば組織（例えば、新鮮凍結、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ））及び細胞学的試料に対して実施することができる。発色性標識、蛍光性標識、発光性標識、放射測定標識などの標識は、マーカー又は標的（例えば、ＰＤ−Ｌ１、腫瘍細胞特異的マーカー、免疫細胞特異的マーカーなど）の認識のために使用される。標識は、当業者には周知であり、本明細書に記載される標識に限定されない。
【００２７】
[0030]詳細なプロトコールの非限定的実施例は、以下の実施例１に記載される。簡潔に説明すると、対象の試料は、ＰＤ−Ｌ１について染色される。試料は、まず抗ＰＤ−Ｌ１一次抗体と共にインキュベートされる。抗ＰＤ−Ｌ１一次抗体は、第１の色により検出される。実施例１では、試料を、一次抗ＰＤ−Ｌ１抗体に対するホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート二次抗体と共にインキュベートし、基質（３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ））を加え、第１の色（例えば、褐色）を生じさせる。代替的な酵素及び基質（及び結果として得られる色は後述される）。
【００２８】
[0031]次いで試料を第１の差別化マーカー、例えば、腫瘍細胞に特異的なマーカーについて染色する。腫瘍細胞に特異的なバイオマーカーの例には、限定されないが：パンケラチン抗体で検出可能なサイトケラチン（例えば、塩基性サイトケラチン、酸性サイトケラチンの多く）、その他のサイトケラチン、例えばサイトケラチン７（ＣＫ７）及びサイトケラチン２０（ＣＫ２０）、クロモグラニン、シナプトフィジン、ＣＤ５６、甲状腺転写因子−１（ＴＴＦ−１）、ｐ５３、白血球共通抗原（ＬＣＡ）、ビメンチン、平滑筋アクチンなどが含まれる（例えば、Capelozzi, V., J Bras Pneumol. 2009;35（4）:375-382参照）。腫瘍細胞に特異的なバイオマーカーは、ＩＨＣで検出可能なタンパク質に限定されることはなく；例えば、腫瘍細胞に特異的なバイオマーカーは、ＩＳＨ技術により検出可能な対象の核酸配列でもよい。したがって、ＩＨＣ工程を説明する方法（例えば、腫瘍細胞に特異的なマーカーの一次抗体と共に試料をインキュベートすること）は、ＩＳＨ工程により適切に置換されうる。当業者であれば、腫瘍細胞に特異的な別の適切なバイオマーカーで実施例１に記載されるサイトケラチンを置換することができる。試料をまず、第１の差別化マーカー（腫瘍細胞に特異的なマーカー）に対する一次抗体（例えば、抗パンケラチン抗体）と共にインキュベートする。抗差別化マーカーの一次抗体は、第２の色により検出される。実施例１では、試料を、抗差別化マーカーの一次抗体に対するハプテン化抗体と共にインキュベートし、次いでアルカリホスファターゼ（ＡＰ）コンジュゲート抗ハプテン抗体と共にインキュベートする。基質ファストレッド色素原は第２の色（例えば、赤色）を生じさせる。
【００２９】
[0032]試料は次いで免疫細胞に特異的なマーカーについて染色することができる。免疫細胞に特異的なバイオマーカーの非限定的実施例には、ＣＤ４又は他のいずれかのＣＤマーカーが含まれる。免疫細胞に特異的なバイオマーカーは当業者には周知である。免疫細胞に特異的なバイオマーカーは、ＩＨＣで検出可能なタンパク質に限定されることはなく；例えば、免疫細胞に特異的なバイオマーカーは、ＩＳＨ技術により検出可能な対象の核酸配列でもよい。したがって、ＩＨＣ工程を説明する方法（例えば、免疫細胞に特異的なマーカーの一次抗体と共に試料をインキュベートすること）は、ＩＳＨ工程により適切に置換されうる。当業者であれば、免疫細胞に特異的な別の適切なバイオマーカーで実施例１に記載されるＣＤ４を置換することができるであろう。試料をまず、第２の差別化マーカー（免疫細胞に特異的なマーカー）に対する一次抗体（例えば、ＣＤ４抗体）と共にインキュベートする。抗差別化マーカーの一次抗体は、第３の色により検出される。実施例１では、試料を、一次抗差別化マーカー抗体に対するＨＲＰコンジュゲート二次抗体と共にインキュベートし、基質ＨＲＰ−グリーン色素原を加え、第３の色（例えば、緑／青色）を生じさせる。
【００３０】
[0033]いくつかの実施態様では、試料を次いで対比染色し、第４の色（第４の色は第１、第２及び第３の色とは異なる）を生じさせる。いくつかの実施態様では、対比染色はヘマトキシリンを含む；しかしながら、対比染色はヘマトキシリンに限定されない。代替的な対比染色は当業者には周知である。例えば、いくつかの実施態様では、対比染色は、メチレンブルー、ニュークリアレッド、トルイジンブルー、エオシン、メチルグリーンなどを含む。特定の対比染色は通常、可視性を増強するためにコントラストを生むように選択される。
【００３１】
[0034]染色手順に従い、試料を次いで解釈し、スコア化する（スコア化については後述する）。いくつかの実施態様では、染色の結果は表１に記載されるように解釈される。ＰＤ−Ｌ１、腫瘍細胞に特異的なマーカー（例えば、サイトケラチン）、及び免疫細胞に特異的なマーカーについて染色するアッセイの場合、第１の色及び第３の色についてスコアを得るが第２の色についてはスコアを得ない細胞はＰＤ−Ｌ１陽性免疫細胞であり、第１の色及び第２の色の両方についてスコアを得る（が第３の色については得ない）細胞はＰＤ−Ｌ１陽性がん細胞であり、第２の色についてスコアを得るが第１の色についても第３の色についても得ない細胞はＰＤ−Ｌ１陰性がん細胞である。いくつかの実施態様では、第１の色及び第２の色は重複し（又は他が重複し）、第５の（異なる）色を生じさせる。このような重複色はスコア化の助けとなりうる。
【００３２】
[0035]いくつかの実施態様では、染色（例えば、ＰＤ−Ｌ１及び差別化マーカー）は連続的に起こる。いくつかの実施態様では、染色は同時に起こる。
【００３３】
[0036]本発明は、いずれかの特定の順序での染色に限定されない。例えば、実施例１には、まずＰＤ−Ｌ１について染色し、次いで腫瘍細胞に特異的なマーカーについて染色し、次いで免疫細胞に特異的なマーカーについて染色し、最後に対比染色を用いることが記載されている。しかしながら、いくつかの実施態様では、腫瘍細胞に特異的なマーカー（又は免疫細胞に特異的なマーカー）が最初に染色され、続いてＰＤ−Ｌ１が染色されるなどする。
【００３４】
シグナル伝達コンジュゲート（ＩＨＣ／ＩＳＨ  発色性基質）
[0037]本発明は、実施例１に用いられるシグナル伝達コンジュゲート（例えば、酵素及び発色基質）にも、本明細書に記載される他のシグナル伝達コンジュゲートにも限定されることはない。検出方法のための代替的な酵素−発色基質の対（例えば、免疫組織化学、様々なｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法、例えば、シルバーｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法（ＳＩＳＨ）、クロモジェニックｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法（ＣＩＳＨ）、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法（ＦＩＳＨ）、ｍＲＮＡ  ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法など）が、当業者には周知である。
【００３５】
[0038]伝統的に、適切な酵素により活性化されると、発色基質が沈殿する。即ち、伝統的な発色基質は、酵素と接触すると、可溶型試薬から非可溶性の有色沈殿物へと変換する。本発明のために用いられる発色基質は、自動スライド染色機器及び方法及び／又は自動検出及び分析機器及びソフトウエアと適合性にすることができる。これにより、高い検出感度と多重化能が可能になる。
【００３６】
[0039]いくつかの実施態様では、二次抗体の酵素は、ＨＲＰ、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、グルコースオキシダーゼ、ベータガラクトシダーゼなど、及び／又は国際公開第２０１３１４８４４９８号に記載される他のものを含む。いくつかの実施態様では、基質は、ＤＡＢ、ファストレッド及びファストブルー、ファストレッド及びブラック（シルバー）、ニトロブルーテトラゾリウムクロライド（ＮＢＴ）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート（ＢＣＩＰ）、エックスギャル、３−アミノ−９−エチルカルバゾール（ＡＥＣ）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイル−ベータ−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＢＣＩＧ）、ｐ−ニトロフェニルホスフェート（ＰＮＰＰ）、２，２’−アジノビス［３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸］（ＡＢＴＳ）、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、ＨＲＰ−グリーン色素原など、及び／又は国際公開第２０１３１４８４４９８号に記載される他のものを含む。実施例２（後述）は、更に別のシグナル伝達コンジュゲートを記載する。
【００３７】
[0040]本発明は、いずれかの特定の色又は色の組み合わせに限定されることもない。例えば、いくつかの実施態様では第１の色（ＰＤ−Ｌ１）は褐色であるが、いくつかの実施態様では第１の色（ＰＤ−Ｌ１）は、酵素−基質の組み合わせに応じて、他の任意の適切な色、例えば、赤、青、黄色、緑などでもよい。いくつかの実施態様では、第２の色（例えば、サイトケラチン、その他マーカー）は、赤／ピンクとすることができるが、いくつかの実施態様では、第２の色（例えば、サイトケラチン、その他マーカー）は、酵素−基質の組み合わせに応じて、他の任意の適切な色、例えば、褐色、青、黄色、緑などでもよい。いくつかの実施態様では、第３の色（例えば、ＣＤ４、その他マーカー）は、緑／青であるが、いくつかの実施態様では、第３の色（例えば、ＣＤ４、その他マーカー）は、酵素−基質の組み合わせに応じて、他の任意の適切な色、例えば、褐色、赤／ピンク、黄色などでもよい。いくつかの実施態様では、第４の色（対比染色）は青でよいが、第４の色（対比染色）は、他の任意の適切な色、例えば、赤、緑などでもよい。いくつかの実施態様では、第５の色（二色の重複）は、二色の組み合わせに応じて、パープル（例えば、二色が赤と青である場合）、緑（例えば、二色が黄色と青である場合）、オレンジ色（例えば、二色が赤と黄色である場合）などでもよい。
【００３８】
スコア化
[0041]試料は次いでスコア化される。第２の色（及び第３の色）は、腫瘍細胞又は免疫細胞におけるＰＤ−Ｌ１のスコア化を志向する。第３の色の使用はスコア化を改善させうる。例えば、第３の色の使用は、いずれの細胞種（腫瘍対免疫）がＰＤ−Ｌ１陽性であるかを明らかにすることを助けることができる。これは、ＰＤ−Ｌ１陽性免疫細胞、ＰＤ−Ｌ１陰性腫瘍細胞、及びＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍細胞の数の計算の精密化を助けうる。
【００３９】
[0042]陽性の結果（例えば、ＰＤ−Ｌ１陽性の結果）は、様々な方法で計算することができ、本明細書に記載される実施例に限定されない。
【００４０】
[0043]いくつかの実施態様では、ＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍細胞の数又は腫瘍細胞に関連付けられるＰＤ−Ｌ１の面積（例えば、腫瘍細胞に起因してＰＤ−Ｌ１で覆われたスライドの面積）又はＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍細胞のパーセンテージを計算し、次いで等式に因数分解してＨスコアを計算することができる。いくつかの実施態様では、ＨスコアがＰＤ−Ｌ１陽性の閾値を上回った場合、試料はＰＤ−Ｌ１陽性であり、ＨスコアがＰＤ−Ｌ１陽性の閾値を下回った場合、試料はＰＤ−Ｌ１陰性である。
【００４１】
[0044]スコア化の計算の非限定的な実施例を実施例３に示す。いくつかの実施例が、以下に簡単に記載される。
【００４２】
[0045]いくつかの実施態様では、陽性の結果は、ＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍細胞のパーセンテージを計算すること、及びそのパーセンテージが陽性の閾値又は所定のカットオフを上回っているかどうかを決定することにより決定される。例えば、いくつかの実施態様では、ＰＤ−Ｌ１陽性を付与するＰＤ−Ｌ１細胞の最低パーセンテージ、例えば、５％以上のＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍細胞はＰＤ−Ｌ１陽性を付与する、１０％以上のＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍細胞はＰＤ−Ｌ１陽性を付与する、２５％以上のＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍細胞はＰＤ−Ｌ１陽性を付与する、５０％以上のＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍細胞はＰＤ−Ｌ１陽性を付与するなどである。
【００４３】
[0046]いくつかの実施態様では、陽性の結果は、ＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍細胞の数を細胞の総数（例えば、腫瘍＋免疫細胞の数）で除した商を計算し、その値が陽性の閾値（例えば、０．１５を上回る値、０．２５を上回る値、０．５を上回る値など）を上回るかどうかを決定することにより決定される。
【００４４】
[0047]いくつかの実施態様では、陽性の結果は、ＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍細胞とＰＤ−Ｌ１陽性免疫細胞のパーセンテージの和を計算し、その値が陽性の閾値（例えば、４０を上回る値、５０を上回る値、６０を上回る値など）を上回るかどうかを決定することにより決定される。
【００４５】
[0048]いくつかの実施態様では、陽性の結果は、ＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍細胞の数をＰＤ−Ｌ１陰性腫瘍細胞の数で除した商を計算し、その値が陽性の閾値（例えば、１．５を上回る値、１．８を上回る値、２を上回る値など）を上回るかどうかを決定することにより決定される。
【００４６】
[0049]いくつかの実施態様では、陽性の結果は、ＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍細胞の数をＰＤ−Ｌ１陰性腫瘍細胞の数とＰＤ−Ｌ１陰性免疫細胞の数の和で除した商を計算し、その値が陽性の閾値（例えば、１．１を上回る、１．３を上回る値など）を上回るかどうかを決定することにより決定される。
【００４７】
[0050]いくつかの実施態様では、陽性の結果は、ＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍細胞の数をＰＤ−Ｌ１陰性腫瘍細胞の数とＰＤ−Ｌ１陽性免疫細胞の数の和で除した商を計算し、その値が陽性の閾値（例えば、１．１を上回る、１．３を上回る値など）を上回るかどうかを決定することにより決定される。
【００４８】
[0051]いくつかの実施態様では、陽性の結果は、ＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍細胞の数をＰＤ−Ｌ１陽性免疫細胞の数で除した商を計算し、その値が陽性の閾値を上回るかどうかを決定することにより決定される。いくつかの実施態様では、陽性の結果は、ＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍細胞の数をＰＤ−Ｌ１陰性免疫細胞の数で除した商を計算し、その値が陽性の閾値を上回るかどうかを決定することにより決定される。
【００４９】
[0052]上述のように、ＰＤ−Ｌ１陽性は、ＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍細胞のパーセンテージを計算することにより決定されうる。いくつかの実施態様では、約１％を上回る細胞（例えば、腫瘍細胞）の染色がＰＤ−Ｌ１陽性とスコア化される。いくつかの実施態様では、約５％を上回る細胞（例えば、腫瘍細胞）の染色がＰＤ−Ｌ１陽性とスコア化される。いくつかの実施態様では、約１０％を上回る細胞（例えば、腫瘍細胞）の染色がＰＤ−Ｌ１陽性とスコア化される。いくつかの実施態様では、約１５％を上回る細胞（例えば、腫瘍細胞）の染色がＰＤ−Ｌ１陽性とスコア化される。いくつかの実施態様では、約２０％を上回る細胞（例えば、腫瘍細胞）の染色がＰＤ−Ｌ１陽性とスコア化される。いくつかの実施態様では、約２５％を上回る細胞（例えば、腫瘍細胞）の染色がＰＤ−Ｌ１陽性とスコア化される。いくつかの実施態様では、約３０％を上回る細胞（例えば、腫瘍細胞）の染色がＰＤ−Ｌ１陽性とスコア化される。いくつかの実施態様では、約３５％を上回る細胞（例えば、腫瘍細胞）の染色がＰＤ−Ｌ１陽性とスコア化される。いくつかの実施態様では、約４０％を上回る細胞（例えば、腫瘍細胞）の染色がＰＤ−Ｌ１陽性とスコア化される。いくつかの実施態様では、約４５％を上回る細胞（例えば、腫瘍細胞）の染色がＰＤ−Ｌ１陽性とスコア化される。いくつかの実施態様では、約５０％を上回る細胞（例えば、腫瘍細胞）の染色がＰＤ−Ｌ１陽性とスコア化される。いくつかの実施態様では、約５５％を上回る細胞（例えば、腫瘍細胞）の染色がＰＤ−Ｌ１陽性とスコア化される。いくつかの実施態様では、約６０％を上回る細胞（例えば、腫瘍細胞）の染色がＰＤ−Ｌ１陽性とスコア化される。いくつかの実施態様では、約６５％を上回る細胞（例えば、腫瘍細胞）の染色がＰＤ−Ｌ１陽性とスコア化される。いくつかの実施態様では、約７０％を上回る細胞（例えば、腫瘍細胞）の染色がＰＤ−Ｌ１陽性とスコア化される。いくつかの実施態様では、約７５％を上回る細胞（例えば、腫瘍細胞）の染色がＰＤ−Ｌ１陽性とスコア化される。いくつかの実施態様では、約８０％を上回る細胞（例えば、腫瘍細胞）の染色がＰＤ−Ｌ１陽性とスコア化される。いくつかの実施態様では、約９０％を上回る細胞（例えば、腫瘍細胞）の染色がＰＤ−Ｌ１陽性とスコア化される。
【００５０】
[0053]ＰＤ−Ｌ１陽性免疫細胞の数又はパーセンテージは、ＰＤ−Ｌ１陽性の決定に関連しうる。いくつかの実施態様では、約５％を上回る免疫細胞の染色が、ＰＤ−Ｌ１陽性であるとするスコア化に関連付けられる。いくつかの実施態様では、約１０％を上回る免疫細胞の染色が、ＰＤ−Ｌ１陽性であるとするスコア化に関連付けられる。いくつかの実施態様では、約１５％を上回る免疫細胞の染色が、ＰＤ−Ｌ１陽性であるとするスコア化に関連付けられる。いくつかの実施態様では、約２５％を上回る免疫細胞の染色が、ＰＤ−Ｌ１陽性であるとするスコア化に関連付けられる。いくつかの実施態様では、約５０％を上回る免疫細胞の染色が、ＰＤ−Ｌ１陽性であるとするスコア化に関連付けられる。
【００５１】
[0054]試料が陽性であることは、染色の度合い又は強度によっても決定されうる（例えば、濃い染色は陽性で、薄い染色は陰性）。いくつかの実施態様では、スコア化方法は、例えば、ＰＤ−Ｌ１発現について０から３の、強度スケールで試料をスコア化すること（例えば、米国仮特許出願第６１／８７５３３４号（「Ｓｃｏｒｉｎｇ  Ｍｅｔｈｏｄ  Ｆｏｒ  Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」、この出願の開示内容の全体が、参照により本明細書に包含される）参照）を特徴とする。いくつかの実施態様では、試料は、細胞染色の強度及びパーセンテージに基づいてスコア化される。例えば、米国仮特許出願第６１／８７５３３４号に記載されるように、Ｈスコアが次のように計算される：１＊（強度１＋での腫瘍細胞染色のパーセンテージ）＋２＊（強度２＋での腫瘍細胞染色のパーセンテージ）＋３＊（強度３＋での腫瘍細胞染色のパーセンテージ）＝Ｈスコア（０から３００の値）。他のスコア化方法が開示されており、当業者には周知である。
【００５２】
スコア化のためのコンピューターベースの免疫検出
[0055]画像化及び検出及び／又はスコア化は、手動で／目視により又はコンピューターシステムを介して実施することができる。スコア化のためのコンピューターベースの免疫検出の例は、当業者には既知である。例えば、その全内容が本明細書に参照により援用される、参照文献の米国仮特許出願第６２／００５２２２号、Ｄｏｃｋｅｔ  Ｎｕｍｂｅｒ３２１５４  ＵＳ（「Ａｕｔｏｍａｔｉｃ  Ｆｉｅｌｄ  ｏｆ  Ｖｉｅｗ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ」）には、自動細胞検出アルゴリズムを用いた病理組織画像における特定の細胞の検出が開示されている。例えば、希薄色アンミックスアルゴリズムが、生物学的に有意義な複数の異なるカラーチャネルにＲＧＢ画像を混合しないために使用される。自動免疫細胞検出アルゴリズムは、一般のニューラルネットワークを用いて免疫細胞マーカーの画像チャネル中の免疫細胞を同定するように訓練される細胞検出器を利用する。更に、自動免疫細胞検出アルゴリズムは、非最大値抑制（ｎｏｎ−ｍａｘｉｍｕｍ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）アルゴリズムを利用して、ＣＮＮ分類器から生成された免疫細胞存在の確率マップから免疫細胞座標を得ることを含む。
【００５３】
患者の処置方法
[0056]ＰＤ−Ｌ１に関する患者のスコア化は、治療的処置を決定するために使用されうる。本発明の一態様は、本明細書に記載されるスコア化が治療手法を予測するものである。一実施態様では、陽性のスコア化は、ＰＤ−Ｌ１阻害剤を用いる治療法の改善された結果を予測する。一実施態様によれば、方法は、腫瘍試料をＰＤ−Ｌ１陽性についてスコア化し、ＰＤ−Ｌ１について陽性とスコア化された腫瘍を有する患者に対して治療剤を投与する。
【００５４】
[0057]開示の実施態様は更に、例えば対象から得られた腫瘍試料が本明細書に提供される方法を用いてスコア化される場合に、ＰＤ−Ｌ１標的化療法剤（又はＰＤ−Ｌ１標的化療法剤の組み合わせ）により治療される対象を同定及び／又は選択することを含む。加えて、開示の方法は更に、対象から得られた試料がＰＤ−Ｌ１陽性であるとスコア化された場合に一又は複数のＰＤ−Ｌ１標的化療法剤を対象に投与することを含みうる。これとは異なり、開示の実施態様は更に、例えば対象から得られた腫瘍試料が本明細書に提供される方法を用いてＰＤ−Ｌ１陰性とスコア化された場合にＰＤ−Ｌ１標的化療法剤による治療の恩恵を受ける可能性が低い対象を同定することを含みうる。
【００５５】
[0058]ＰＤ−Ｌ１標的化療法剤は、治療的有効量で投与されると所望の応答（例えば、例えば腫瘍の大きさ又は体積を減少させること、又は転移の大きさ、体積、若しくは数を減少させることによる、ＰＤ−Ｌ１発現腫瘍の治療）を誘導する治療剤を含む。
【００５６】
[0059]一実施例では、ＰＤ−Ｌ１標的化療法剤は、ＰＤ−Ｌ１発現腫瘍細胞の死滅を増加させる（又はそれらの生存率を低下させる）。このような死滅は、ＰＤ−Ｌ１発現腫瘍細胞の１００％の減少をもたらす必要はない；例えば生存ＰＤ−Ｌ１発現腫瘍細胞の数を少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％（例えばＰＤ−Ｌ１標的化療法剤による治療がない場合と比較して）低減させるＰＤ−Ｌ１標的化療法剤を、本明細書に提供される方法に使用することができる。例えば、ＰＤ−Ｌ１標的化療法剤は、ＰＤ−Ｌ１発現腫瘍細胞の増殖を、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％（例えばＰＤ−Ｌ１標的化療法剤による治療がない場合と比較して）減少させることができる。
【００５７】
[0060]一実施例では、ＰＤ−Ｌ１標的化療法剤は、ＰＤ−Ｌ１の発現又は活性を低減する。このような阻害は、ＰＤ−Ｌ１の発現又は活性の１００％の低減をもたらす必要はない；例えば生存ＰＤ−Ｌ１の発現又は活性を少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％（例えばＰＤ−Ｌ１標的化療法剤による治療がない場合と比較して）低減させるＰＤ−Ｌ１標的化療法剤を、本明細書に提供される方法に使用することができる。例えば、ＰＤ−Ｌ１標的化療法剤は、例えば、ＰＤ−Ｌ１のｍＲＮＡに干渉し、遺伝子産物の翻訳をブロックすることにより、又は遺伝子産物の翻訳後修飾により、又は細胞内局在に変化を生じさせることにより、遺伝子発現に干渉（転写、プロセシング、翻訳、翻訳後修飾）することができる。
【００５８】
[0061]ＰＤ−Ｌ１標的化療法剤の他の例には、阻害性核酸分子、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｓｈＲＮＡ又はリボザイムが含まれる。このような分子を使用して、ＰＤ−Ｌ１遺伝子の発現を低減又は除去することができる。ＰＤ−Ｌ１核酸の発現を特異的に標的化及び調節する任意の種類のアンチセンス化合物の使用が考慮される。アンチセンス化合物は、標的の核酸分子（例えばＰＤ−Ｌ１）に特異的にハイブリダイズしてその発現を調節するものである。このような化合物は、一本鎖、二本鎖、円形、分枝又はヘアピン化合物として導入することができ、内部又は末端のバルジ又はループのような要素を含むことができる。二本鎖アンチセンス化合物は、ハイブリダイズして二本鎖化合物を形成する二つの鎖、又はハイブリダイズして完全な若しくは部分的な二本鎖化合物を形成することを可能にするのに十分な自己相補性を有する単一の鎖とすることができる。いくつかの実施例では、アンチセンスＰＤ−Ｌ１オリゴヌクレオチドは一本鎖アンチセンス化合物であり、アンチセンスオリゴヌクレオチドがＰＤ−Ｌ１ｍＲＮＡにハイブリダイズするとき、二本鎖がＲＮａｓｅＨによって認識される結果、ｍＲＮＡが切断される。他の実施例では、ｍｉＲＮＡは、ＲＮＡｉ経路を介して遺伝子発現を調節するｍＲＮＡ分子に少なくとも部分的に相補的な、約２１〜２３のヌクレオチドの一本鎖ＲＮＡ分子である。更なる実施例では、ｓｈＲＮＡは、ｓｉＲＮＡに切断されるタイトなヘアピンを形成するＲＮＡオリゴヌクレオチドである。ｓｉＲＮＡ分子は通常、約２０〜２５ヌクレオチドの長さであり、３′末端上に重複する二つのヌクレオチドを有することができるか、又は平滑末端でありうる。通常、ｓｉＲＮＡの一つの鎖は、少なくとも部分的に標的核酸に相補的である。ＰＤ−Ｌ１遺伝子を特異的に標的化するアンチセンス化合物は、ＰＤ−Ｌ１ヌクレオチド配列、例えばｍＲＮＡ配列に相補的な化合物を設計することにより調製することができる。ＰＤ−Ｌ１アンチセンス化合物は、ＰＤ−Ｌ１にハイブリダイズしてその発現を調節するために、ＰＤ−Ｌ１核酸分子に１００％相補性である必要はない。例えば、二本鎖化合物の場合、アンチセンス化合物、又は化合物のアンチセンス鎖は、ＰＤ−Ｌ１核酸配列に、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％又は１００％相補的でありうる。特異性についてアンチセンス化合物をスクリーニングする方法は周知である（例えば、米国特許出願公開第２００３／０２２８６８９号参照）。加えて、阻害性核酸分子の設計、調製及び使用方法は、当業者の能力の範囲内である。更に、ＰＤ−Ｌ１の配列は公的に入手可能である。
【００５９】
[0062]いくつかの実施例では、開示の方法は、一又は複数のＰＤ−Ｌ１標的化療法剤の治療的有効量を、ＰＤ−Ｌ１陽性の結果を有する対象に提供することを含む。このような薬剤及び処置の方法及び治療的投薬量は当業者に既知であり、例えば、熟練の臨床医によって決定されうる。いくつかの実施例では、開示の方法は更に、外科的手術、放射線療法、及び／又は化学療法を、ＰＤ−Ｌ１標的化療法剤と組み合わせて（例えば、逐次的に、ほぼ同時に、又は同時に）対象に提供することを含む。投与は、単回又は複数回の用量により実施することができる。このような薬剤及び処置の方法及び治療的投薬量は当業者に既知であり、熟練の臨床医によって決定されうる。必要な用量は、対象の人種、年齢、体重及び全身状態、使用される特定の治療剤並びにその投与様式に応じて、対象間で異なるであろう。
【００６０】
[0063]ＰＤ−Ｌ１標的化療法剤を含む治療剤は、治療を必要とする対象に、当技術分野において既知の任意の適切な手段を用いて投与することができる。投与の方法には、限定されないが、皮内、経皮、筋肉内、腹腔内、非経口、静脈内、皮下、膣内、直腸内、鼻腔内、吸入、経口、又は遺伝子ガンによるものが含まれる。鼻腔内投与は、鼻腔の一方又は両方を通して組成物を鼻腔及び鼻腔路の中へ送達することを指し、噴霧機構若しくは液滴機構による送達、又は治療剤のエアロゾル化による送達を含むことができる。
【００６１】
[0064]吸入によるＰＤ−Ｌ１標的化療法剤を含む治療剤の投与は、噴霧又は液滴機構による送達を介して鼻腔又は口腔を通して行うことができる。送達は、挿管により呼吸系のいずれかの領域へ直接行うことができる。非経口投与は、通常注射により実施される。注射剤は、溶液又は懸濁液のような従来の形態に、注前の液体中の懸濁溶液に適した固体の形態に、又は乳濁液として調製することができる。注射溶液及び懸濁液は、滅菌の粉末、顆粒、及び錠剤から調製することができる。投与は全身又は局所とすることができる。
【００６２】
[0065]ＰＤ−Ｌ１標的化療法剤を含む治療剤は、任意の適切な方式で、例えば薬学的に許容される担体を用いて投与することができる。薬学的に許容される担体は、部分的には、投与される特定の組成物により、並びに組成物を投与するために使用される特定の方法により決定される。したがって、本開示の薬学的組成物には多岐にわたる適切な製剤が存在する。本開示に有用な薬学的に許容される担体（ビヒクル）は従来のものである。Remington’s Pharmaceutical Sciences, by E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 15th Edition （1975）は、一又は複数の治療剤の薬学的送達に適した組成物及び製剤について記載している。
【００６３】
[0066]非経口投与のための調製物には、滅菌の水性又は非水性溶液、懸濁液、及び乳濁液が含まれる。非水性の溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルなどの植物油、及びオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルである。水性の担体には、生理食塩水及び緩衝媒体を含む、水、アルコール性／水性溶液、乳濁液又は懸濁液が含まれる。非経口ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リンガーデキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸加リンガー、又は不揮発性油が含まれる。静脈内ビヒクルには、流体及び栄養補液、電解質補液（例えばリンガーデキストロースベースのもの）などが含まれる。防腐剤及びその他の添加剤、例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、及び不活性ガスなども存在してよい。
【００６４】
[0067]局所投与のための製剤は、軟膏、ローション、クリーム、ジェル、点滴、坐薬、スプレー、液体及び粉末を含むことができる。従来の薬学的担体、水性、粉末状又は油性基剤、濃厚剤などが必要又は望ましい場合がある。
【００６５】
[0068]経口投与のための、ＰＤ−Ｌ１標的化療法剤を含む治療剤は、水若しくは非水性媒体中の粉末若しくは顆粒、カプセル剤、サシェ剤、又は錠剤を含む。濃厚剤、香味料、希釈剤、乳化剤、分散補助剤、又は結合剤が望ましいこともある。
【００６６】
[0069]ＰＤ−Ｌ１標的化療法剤を含む治療剤は、塩酸、臭化水素酸、過塩素酸、硝酸、チオシアン酸、硫酸、及びリン酸といった無機酸と、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、及びフマル酸といった有機酸との反応によって形成されるか、又は水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウムといった無機基材と、モノ−、ジ−、トリアルキル及びアリールアミン及び置換されたエタノールアミンといった有機基剤との反応によって形成される、薬学的に許容される酸又は塩基付加塩として投与することができる。
【００６７】
[0070]ＰＤ−Ｌ１標的化療法剤は、別のがん治療法（例えば外科手術、放射線療法，及び／又は化学療法）と組み合わせて使用することができる。一実施例では、追加的治療法は、一又は複数の抗腫瘍性医薬治療を含み、これには、放射線治療、抗腫瘍性化学療法剤、抗生物質、アルキル化剤及び抗酸化剤、キナーゼ阻害剤、及びその他薬剤が含まれうる。使用可能な追加的な治療剤の特定の例には、アルキル化剤、例えばナイトロジェンマスタード（例えば、クロラムブシル、クロルメチン、シクロホスファミド、イホスファミド、及びメルファラン）、ニトロソウレア類（例えば、カルムスチン、ホテムスチン、ロムスチン、及びストレプトゾシン）、白金化合物（例えば、カルボプラチン、シスプラチン、オキサリプラチン、及びＢＢＲ３４６４）、ブスルファン、ダカルバジン、メクロレタミン、プロカルバジン、テモゾロミド、チオテパ、及びウラシルマスタード；葉酸（例えば、メトトレキサート、ペメトレキセド、及びラルチトレキセド）、プリン（例えば、クラドリビン、クロファラビン、フルダラビン、メルカプトプリン、及びチオグアニン）、ピリミジン（例えば、カペシタビン）、シタラビン、フルオロウラシル、及びゲムシタビン；植物アルカロイド、例えばポドフィルム（例えば、エトポシド、及びテニポシド）；マイクロチューブル結合剤（例えば  パクリタキセル、ドセタキセル、ビンブラスチン、ビンデシン、ビノレルビン（ナベルビン）ビンクリスチン、エポチロン、コルヒチン、ドラスタチン１５、ノコダゾール、ポドフィロトキシン、リゾキシン、並びにそれらの誘導体及びアナログ）、ＤＮＡインターカレーター若しくはクロスリンカー（例えばシスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、マイトマイシン、例えばマイトマイシンＣ、ブレオマイシン、クロラムブシル、シクロホスファミド、並びにそれらの誘導体及びアナログ）、ＤＮＡ合成阻害剤（例えばメトトレキサート、５−フルオロ−５’−デオキシウリジン、５−フルオロウラシル及びそのアナログ）；アントラサイクリンファミリーメンバー（例えば、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、及びバルルビシン）；アンチメタボライト、例えば、細胞傷害性／抗腫瘍抗生物質、ブレオマイシン、リファンピシン、ヒドロキシウレア、及びマイトマイシン；トポイソメラーゼ阻害剤、例えばトポテカン及びイリノテカン；モノクローナル抗体、例えばアレムツズマブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、ゲムツズマブ、リツキシマブ、パニツムマブ、ペルツズマブ、及びトラスツズマブ；光増感剤、例えばアミノレブリン剤、アミノレブリン酸メチル、ポリフィマーナトリウム、及びベルテポルフィン、酵素、酵素阻害剤（例えばカンプトテシン、エトポシド、ホルメスタン、トリコスタチン並びにそれらの誘導体及びアナログ）、キナーゼ阻害剤（例えばイマチニブ、ゲフィチニブ、及びエルロチニブ）、遺伝子制御因子（例えばラロキシフェン、５−アザシチジン、５−アザ−２’−デオキシシチジン、タモキシフェン、４−ヒドロキシタモキシフェン、ミフェプリストン並びにそれらの誘導体及びアナログ）；並びに他の薬剤、例えばアレトレチノイン、アルトレタミン、���ムサクリン、アナグレリド、三酸化ヒ素、アスパラギナーゼ、アキシチニブ、ベキサロテン、ベバシズマブ、ボルテゾミブ、セレコキシブ、デニロイキンジフチトクス、エストラムスチン、ヒドロキシカルバミド、ラパチニブ、パゾパニブ、ペントスタチン、マソプロコール、ミトタン、ペグアスパルガーゼ、タモキシフェン、ソラフェニブ、スニチニブ、ベムラフェニブ、バンデタニブ、及びトレチノインが含まれる。このような薬剤の方法及び治療的投薬量は当業者に既知であり、熟練の臨床医によって決定されうる。他の治療剤、上記分類のうちの一又は複数に含まれる又は含まれない例えば抗腫瘍薬剤も、記載される特定の結合剤との組み合わせ投与に適している。このような薬剤の選択及び治療的投与量は当業者に既知であり、熟練の臨床医によって決定されうる。
【００６８】
[0071]アッセイの結果、所見、予後、予測及び／又は治療勧告は、記録し、例えば専門家、医師、及び／又は患者に伝達することができる。特定の実施態様では、このような情報を、興味を持った当事者、例えば患者及び／又は主治医に伝達するためにコンピューターが使用される。ＰＤ−Ｌ１腫瘍の予後（例えば腫瘍がＰＤ−Ｌ１標的化療法剤に応答する可能性があるかどうか）に基づき、試料が得られた対象を、ＰＤ−Ｌ１標的化療法剤を用いた又は用いない治療計画に割り付けることができる。
【００６９】
一実施態様では、出力された値に基づく予後、予測及び／又は治療勧告が、興味を持った当事者に対し、アッセイが終了して予後が生成された後可能な限り早く伝達される。結果及び／又は関連情報は、対象を治療する医師により対象に伝達されてもよい。或いは、結果は、興味を持った当事者に対し、報告書の提出によるなどの書面、ｅメールのような電子的伝達形態、又は電話を含むいずれかの通信手段により伝達されてもよい。伝達は、ｅメール通信の場合ように、適切にプログラミングされたコンピューターの使用により容易になりうる。特定の実施態様では、予後検査の結果及び／又は検査から導かれた結論及び／又は検査に基づく治療勧告を含む通信が生成され、電子通信の当業者に周知であろうコンピューターハードウエア及びソフトウエアを用いて、興味を持った対象に自動的に伝達される。医療志向の通信システムの一実施例は、米国特許第６２８３７６１号に記載されている；しかしながら、本発明は、このような特定の通信システムを用いる方法に限定されない。
【００７０】
[0072]本発明の方法の特定の実施態様では、試料の分析、ＰＤ−Ｌ１タンパク質発現のスコア化、腫瘍の予後、及びアッセイ結果又は予後の伝達を含む方法の工程の全部又は一部は、様々な（例えば、外国の）区域で実施することができる。
【００７１】
ＰＤ−Ｌ１スコア化のためのキット
[0073]本発明はＰＤ−Ｌ１をスコア化するためのキットも特徴とする。いくつかの実施態様では、キットは、抗ＰＤ−Ｌ１抗体及び一又は二（以上）の差別化抗体、例えば、腫瘍細胞に特異的なマーカーに対する抗体、免疫細胞に特異的なマーカーに対する抗体、又は腫瘍細胞に特異的なマーカーに対する抗体と免疫細胞に特異的なマーカーに対する抗体の両方を含む。いくつかの実施態様では、キットは更に、含まれる一次抗体の検出のための二次抗体又は他の試薬を含む。例えば、キットは、検出に使用される二次抗体と基質（例えば、ＤＡＢ、ＡＥＣ、ファストレッドなど）を含みうる。いくつかの実施態様では、キットは更に対比染色を含む。いくつかの実施態様では、キットは更に、含まれる抗体及び／又は他の試薬との使用に適切なバッファーを含む。
【００７２】
[0074]いくつかの実施態様では、キットは更に、酵素−基質反応の色（又は他の）シグナルを増幅するための増幅試薬を含む。
【００７３】
[0075]いくつかの実施態様では、キットの試薬は、自動スライド染色プラットフォーム上での使用のために構成された容器内に包装される。例えば、容器は、ＢＥＮＣＨＭＡＲＫシリーズの自動スライド染色器上での使用のために構成されたディスペンサーである。
【００７４】
[0076]例示的実施態様では、キットは、特定のアッセイを実施するためにまとまって作用する、異なる容器に収容された一連の試薬を含む。一実施態様では、キットは第１の容器内の緩衝液中に標識コンジュゲートを含む。緩衝液は、試薬が冷凍環境において貯蔵される間、及び機器上に配置されるとき、安定性を維持し、標識コンジュゲートの特定の結合能を維持するように構成される。別の実施態様では、キットは第２の容器内の水溶液中にシグナル伝達コンジュゲートを含む。別の実施態様では、キットは、第３の容器内に、試料に対してシグナル伝達コンジュゲートと併用される過酸化水素溶液を含む。第２又は第３の容器内において、様々なエンハンサー（例えばピリミジン）が、酵素によって潜在的反応性種を反応性腫に活性化される効率を上昇させることが見出されうる。更なる実施態様では、キットは増幅コンジュゲートを含む。
【実施例】
【００７５】
実施例１−多重アッセイのプロトコール
[0077]実施例１は、本発明の多重ＩＨＣアッセイの非限定的実施例を記載する。ＮＳＣＬＣ試料のスライドが、標準プロトコールに従って調製される。
【００７６】
[0078]１．１滴のＰＤ−Ｌ１  ＳＰ１４２抗体（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｔｕｃｓｏｎ，Ａｒｉｚｏｎａ）をスライドに塗布し、１６分間インキュベートする。反応バッファーでスライドをすすぐ。
【００７７】
[0079]２．１滴のＯｐｔｉＶｉｅｗ  ＨＱ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｌｉｎｋｅｒ（カタログ番号７６０−７００、Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｔｕｃｓｏｎ，Ａｒｉｚｏｎａ）を塗布し、８分間インキュベートする。反応バッファーでスライドをすすぐ。
【００７８】
[0080]３．１滴のＯｐｔｉＶｉｅｗ  ＨＲＰ  Ｍｕｌｔｉｍｅｒ（カタログ番号７６０−７００、Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｔｕｃｓｏｎ，Ａｒｉｚｏｎａ）を塗布し、８分間インキュベートする。反応バッファーでスライドをすすぐ。
【００７９】
[0081] ４．各１滴のＯｐｔｉＶｉｅｗ  Ａｍｐｌｉｆｉｅｒ  Ｈ２０２及びＯｐｔｉＶｉｅｗ  Ａｍｐｌｉｆｉｅｒ（カタログ番号７６０−７００、Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｔｕｃｓｏｎ，Ａｒｉｚｏｎａ）を塗布し、８分間インキュベートする。反応バッファーでスライドをすすぐ。
【００８０】
[0082]５．１滴のＯｐｔｉＶｉｅｗ  Ａｍｐｌｉｆｉｅｒ  Ｍｕｌｔｉｍｅｒ（カタログ番号７６０−７００、Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｔｕｃｓｏｎ，Ａｒｉｚｏｎａ）を塗布し、８分間インキュベートする。反応バッファーでスライドをすすぐ。
【００８１】
[0083]６．１滴のＯｐｔｉＶｉｅｗ  Ｈ２０２及び１滴のＯｐｔｉＶｉｅｗ  ＤＡＢ（カタログ番号７６０−７００、Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｔｕｃｓｏｎ、Ａｒｉｚｏｎａ）を塗布し、８分間インキュベートする。反応バッファーでスライドをすすぐ。
【００８２】
[0084]７．１滴のＯｐｔｉＶｉｅｗ  Ｃｏｐｐｅｒ（カタログ番号７６０−７００、Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｔｕｃｓｏｎ，Ａｒｉｚｏｎａ）を塗布し、４分間インキュベートする。反応バッファーでスライドをすすぐ。
【００８３】
[0085]８．１滴のパンケラチン抗体（ＡＥ１／ＡＥ３／ＰＣＫ２６）一次抗体（カタログ番号７６０−２５９５、Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｔｕｃｓｏｎ、Ａｒｉｚｏｎａ）を塗布する。８分間インキュベートする。反応バッファーでスライドをすすぐ。
【００８４】
[0086]９．１滴のハプテン化抗マウス抗体を塗布し、８分間インキュベートする。反応バッファーでスライドをすすぐ。
【００８５】
[0087]１０．１滴のＡＰコンジュゲート抗ハプテン抗体を塗布し、８分間インキュベートする。反応バッファーでスライドをすすぐ。
【００８６】
[0088]１１．ファストレッド色元素を塗布し、８分間インキュベートする。反応バッファーですすぐ。
【００８７】
[0089]１２．１滴の抗ＣＤ４（ＳＰ３５）ウサギモノクローナル一次抗体（カタログ番号７９０−４４２３、Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｔｕｃｓｏｎ、Ａｒｉｚｏｎａ）を塗布し、１６分間インキュベートする。反応バッファーでスライドをすすぐ。
【００８８】
[0090]１３．１滴のＨＲＰコンジュゲート抗ウサギ抗体を塗布し、１６分間インキュベートする。反応バッファーでスライドをすすぐ。
【００８９】
[0091]１４．２滴のＨＲＰ−Ｇｒｅｅｎ  Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  １を塗布し、４分間インキュベートする。
【００９０】
[0092]１５．２滴のＨＲＰ−Ｇｒｅｅｎ  Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ２を塗布し、１２分間インキュベートする。反応バッファーでスライドをすすぐ。
【００９１】
[0093]１６．１滴のマイアーのヘマトキシリン（１：５）を塗布し、４分間インキュベートする。反応バッファーでスライドをすすぐ。
【００９２】
実施例２−シグナル伝達コンジュゲート
[0094]以下の実施例は、国際公開第２０１３１４８４９８号に記載される別のシグナル伝達コンジュゲートを記載しており、この特許文献の全内容が本明細書に参照により援用される。
【００９３】
[0095]いくつかの実施態様では、生物学的試料中の標的を検出する方法は、生物学的試料を検出プローブと接触させること、生物学的試料を標識コンジュゲートと接触させること、及び生物学的試料をシグナル伝達コンジュゲートと接触させることを含む。標識コンジュゲートは酵素を含む。シグナル伝達コンジュゲートは潜在的反応性部分及び発色性部分を含む。酵素は、潜在的反応性部分の反応性部分への変換を触媒し、反応性部分は、生物学的試料に対し、標的に近接して、又は標的に直接、共有結合する。方法は更に、生物学的試料に光を照射すること、及びシグナル伝達コンジュゲートの発色性部分による光の吸光度を通して標的を検出することを含む。一実施態様では、反応性部分は、生物学的試料のチロシン残基、酵素コンジュゲート、検出プローブ、又はこれらの組み合わせと反応する。
【００９４】
[0096]いくつかの実施態様では、検出プローブは抗体プローブである。いくつかの実施態様では、標識コンジュゲートは、酵素に結合した抗体を含む。酵素は酸化還元酵素、ペルオキダーゼ、又は加水分解酵素を含みうる。標識コンジュゲートのための抗体は、抗種又は抗ハプテン抗体でありうる。検出プローブは、オキサゾールハプテン、ピラゾールハプテン、チアゾールハプテン、ニトロアリールハプテン、ベンゾフランハプテン、トリテルハプテン、尿素ハプテン、チオウレアハプテン、ロテノイドハプテン、クマリンハプテン、シクロリグナンハプテン、ジ−ニトロフェニルハプテン、ビオチンハプテン、ジゴキシゲニンハプテン、フルオレセインハプテン、及びローダミンハプテンからなる群より選択されたハプテンを含みうる。他の実施例では、検出プローブは、ヤギ、ウサギ、マウスなどといった第２の種から誘導されるモノクローナル抗体である。標識コンジュゲートは、検出プローブに選択的に結合する抗種又は抗ハプテン抗体をそれに含むことによって構成される。
【００９５】
[0097]本発明に使用される色素原コンジュゲートは、伝統的に利用可能な色素原よりも選択的に光を吸収するように構成することができる。検出は、シグナル伝達コンジュゲートによる光の吸光により実現される；例えば、入射光の少なくとも約５％の吸光が標的の検出を容易にする。他のもっと暗い染色では、入射光の少なくとも約２０％が吸収されうる。可視スペクトル内での光の不均一な吸光により、発色団部分が有色に見える。本明細書に開示されるシグナル伝達コンジュゲートは、その吸光に起因して有色に見える；シグナル伝達コンジュゲートは、アッセイに使用されるといずれかの色を提供するように見え、その特定の色には、発色団部分に関連付けられるスペクトル吸光度に応じて、赤、オレンジ色、黄色、緑、インディゴ、又はバイオレットが含まれる。別の態様によれば、発色団部分のスペクトル吸光度は伝統的に使用される色素源（例えばＤＡＢ、ファストレッド、ファストブルー）の吸光度より狭い。例示的実施態様では、第１のシグナル伝達コンジュゲートの第１の発色団部分に関連付けられるスペクトル吸光度は、約３０ｎｍから約２５０ｎｍ、約３０ｎｍから約１５０ｎｍ、約３０ｎｍから約１００ｎｍ、又は約２０ｎｍから約６０ｎｍの半値全幅（ＦＷＨＭ）を有する。
【００９６】
[0098]狭いスペクトル吸光度は、シグナル伝達コンジュゲート発色団部分を、伝統的な色素原とは差別化して分析することを可能にする。伝統的な色素原と比較して強化された特徴を有するが、シグナル伝達コンジュゲートの検出は依然として単純である。例示的実施態様では、検出は、明視野顕微鏡又は同等のデジタルスキャナーを用いることを含む。狭いスペクトル吸光度は、伝統的な色素原の能力を超えたレベルでの発色多重化を可能にする。例えば、伝統的な色素原は、いくらか日常的に二重化されている（例えばファストレッドとファストブルー、ファストレッドとブラック（シルバー）、ファストレッドとＤＡＢ）。しかしながら、発色団を互いに見分けることが困難となるため、三重化又は三色の使用、若しくはそれ以上の使用は典型的でない。本開示技術の例示的実施態様では、方法は、異なるシグナル伝達コンジュゲート又はその組み合わせを用いた二つから少なくとも約六の異なる標的からの検出を含む。一実施態様では、生物学的試料を光で照射することは、生物学的試料をスペクトルの狭い光源で照射することを含み、スペクトルの狭い光源は、約３０ｎｍから約２５０ｎｍ、約３０ｎｍから約１５０ｎｍ、約３０ｎｍから約１００ｎｍ、又は約２０ｎｍから約６０ｎｍの第２の半値全幅（ＦＷＨＭ）でのスペクトル放射を有する。別の実施態様では、生物学的試料を光で照射することは、生物学的試料をＬＥＤ光源で照射することを含む。別の実施態様では、生物学的試料を光で照射することは、生物学的試料をフィルタリングされた光源で照射することを含む。
【００９７】
[0099]例示的実施態様では、試料内の標的を検出することは、生物学的試料を、第１の標識コンジュゲートに近位側で共有結合的に沈着するか、又は第１の標識コンジュゲートに直接共有結合する第１の増幅コンジュゲートと接触させることを含む。第１の増幅コンジュゲートに続いて、生物学的試料を二次的標識コンジュゲートと接触させる。事例として、増幅コンジュゲートを用いたシグナルの増幅は、シグナル伝達コンジュゲートの沈着を増強する。シグナル伝達コンジュゲートの増強された沈着は、発色性シグナルの目視による同定を容易にすることができる、即ち、増幅により色が暗くなり、見易くなる。低発現の標的の場合、この増幅により、シグナルは目視するために十分に暗くなり、反対に増幅しない場合は標的は見えない。一実施態様では、シグナル伝達コンジュゲートは、生物学的試料の１ｃｍ２＊μｍ当たり約１ｘ１０１１個から約１ｘ１０１６個の分子を上回る濃度において、標的に近位側で共有結合的に沈着する。一実施態様では、第１の標的及び第２の標的は遺伝的核酸である。第１の標的を第１のシグナル伝達コンジュゲートによる光の吸光度により検出することは、赤、オレンジ色、黄色、緑、インディゴ、又はバイオレットから選択された第１の有色シグナルを検出することを含み、第１の有色シグナルは、第１のシグナル伝達コンジュゲートの第１の発色性部分に関連付けられたスペクトル吸光度に関連付けられる。第２の標的を第２のシグナル伝達コンジュゲートによる光の吸光度により検出することは、赤、オレンジ色、黄色、緑、インディゴ、又はバイオレットから選択された第２の有色シグナルを検出することを含み、第２の有色シグナルは、第２のシグナル伝達コンジュゲートの第２の発色性部分に関連付けられたスペクトル吸光度に関連付けられる。第２のシグナル伝達コンジュゲートと近距離で重複する第１のシグナル伝達コンジュゲートによる光の吸収により近距離での重複を検出し、第３の有色シグナルは、第１のスペクトル吸光度と第２のスペクトル吸光度の重複するスペクトル吸光度に関連付けられる。一実施例によれば、この第３の色は、正常な遺伝子配置をシグナル伝達し、第１及び第２の色は、遺伝的再構成又は転座をシグナル伝達する。
【００９８】
実施例３−スコア化
[00100]以下の実施例は、ＰＤ−Ｌ１陽性を決定するための様々な計算を記載する（３Ａ−３Ｅ）。
【００９９】
実施例３Ａ
[00101]等式：ＰＤ−Ｌ１の値＝ＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍細胞のパーセンテージ
[00102]陽性の閾値：＞４０％のＰＤ−Ｌ１値がＰＤ−Ｌ１陽性である。
[00103]病理学者は、試料３Ａを調べ、ＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍細胞のパーセンテージを４８％と計算する。陽性の閾値に基づき、試料３ＡはＰＤ−Ｌ１陽性と標識される。
【０１００】
実施例３Ｂ
[00104]等式：ＰＤ−Ｌ１の値＝ＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍細胞の数／細胞の総数
[00105]陽性の閾値：＞０．２５のＰＤ−Ｌ１値がＰＤ−Ｌ１陽性である。
[00106]病理学者は試料３Ｂを調べる。ＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍細胞の数は６８であり、細胞の総数は４６０である。上記計算に基づくＰＤ−Ｌ１値は６８／４６０＝０．１４７である。陽性の閾値に基づき、試料３ＢはＰＤ−Ｌ１陰性と標識される。
【０１０１】
実施例３Ｃ
[00107]等式：ＰＤ−Ｌ１の値＝ＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍細胞の％＋ＰＤ−Ｌ１陽性免疫細胞の％
[00108]陽性の閾値：＞６０のＰＤ−Ｌ１値がＰＤ−Ｌ１陽性である。
[00109]病理学者は試料３Ｃを調べる。ＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍細胞のパーセントは５０であり、ＰＤ−Ｌ１陽性免疫細胞のパーセントは２０である。上記計算に基づくＰＤ−Ｌ１値は５０＋２０＝７０である。陽性の閾値に基づき、試料３ＣはＰＤ−Ｌ１陽性と標識される。
【０１０２】
実施例３Ｄ
[00110]等式：ＰＤ−Ｌ１の値＝ＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍細胞の数／（ＰＤ−Ｌ１陰性腫瘍細胞の数＋ＰＤ−Ｌ１陽性免疫細胞の数）
[00111]陽性の閾値：＞０．８のＰＤ−Ｌ１値がＰＤ−Ｌ１陽性である。
[00112]病理学者は試料３Ｄを調べる。ＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍細胞の数は６８であり、ＰＤ−Ｌ１陰性腫瘍細胞の数は４５であり、ＰＤ−Ｌ１陽性免疫細胞の数は２１０である。上記計算に基づくＰＤ−Ｌ１値は６８／（４５＋２１０）＝０．２６６である。陽性の閾値に基づき、試料３ＤはＰＤ−Ｌ１陰性と標識される。
【０１０３】
実施例３Ｅ
[00113]等式：Ｈスコア＝１＊（強度１＋での腫瘍細胞染色のパーセンテージ）＋２＊（強度２＋での腫瘍細胞染色のパーセンテージ）＋３＊（強度３＋での細胞染色のパーセンテージ）
[00114]陽性の閾値：＞１２５のＨスコアがＰＤ−Ｌ１陽性である。
[00115]病理学者は試料３Ｅを調べる。強度１＋でのＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍細胞染色のパーセンテージは５％であり、強度２＋でのＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍細胞染色のパーセンテージは３５％であり、強度３＋でのＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍細胞染色のパーセンテージは２０％である。Ｈスコアは５（１）＋２（３５）＋３（２０）＝１３５である。陽性の閾値に基づき、試料３ＥはＰＤ−Ｌ１陽性と標識される。
【０１０４】
参考文献
[00116]以下の非特許文献及び特許文献の開示内容の全体が参照により本明細書に援用される：（１）Capelozzi, V., Role of Immunohistochemistry in the diagnosis of lung cancer, J Bras Pneumol. 2009；３５（４）：３７５−３８２；（２）国際公開第２０１３１４８４４９８号／米国特許出願公開第２０１３／０２６０３７９号（Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｕｓｅ）；（３）米国仮特許出願第６２／００５２２２号  Ｄｏｃｋｅｔ  Ｎｕｍｂｅｒ  ３２１５４  ＵＳ（Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｆｉｅｌｄ  ｏｆ  Ｖｉｅｗ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ）；（４）米国仮特許出願第６１／８７５３３４号  Ｄｏｃｋｅｔ  Ｎｕｍｂｅｒ  ３１８７２  ＵＳ（Ｓｃｏｒｉｎｇ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｍｅｔｈｏｔｈｅｌｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）；仮特許出願第６２／００４５７２号、Ｄｏｃｋｅｔ  Ｎｕｍｂｅｒ  ３２１５１  ＵＳ、２０１４年５月２９日出願。
【０１０５】
[00117]本明細書において使用される用語「約」は、参照数の±１０％を指す。本明細書に引用される各参照文献は、内容の全体が参照により本明細書に援用される。
【０１０６】
[00118]本明細書に記載されるもの以外に、上記説明から当業者には本発明の種々の修正例が明らかである。このような修正例も、特許請求の範囲に含まれることが意図される。例えば、本発明により使用される「抗体」は、所望の標的部位への結合に有効な全抗体又は抗体の断片でありうる。また、適切である場合、本発明の「抗体」は、標的化部分（例えば、リガンドペプチド、小分子など）で置換されうる。例えば、腫瘍細胞又は免疫細胞が特異的で差別化される固有の細胞表面受容体を有する場合、対応する標的化部分は、本発明により、免疫細胞から腫瘍細胞を差別化するために使用されうる。
【図１】
0006652557.tif 000003