(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
架橋ヒアルロン酸及び非架橋のカルボキシメチルセルロースを含む、ゲルの形態であり注入可能な皮膚充填剤組成物。
【請求項２】
前記カルボキシメチルセルロースが、１．０％〜２５．０％容量／容量の濃度で存在する、請求項１に記載の注入可能な皮膚充填剤組成物。
【請求項３】
前記架橋ヒアルロン酸が、１．０％〜４．０％重量／容量の濃度で存在する、請求項１又は２に記載の注入可能な皮膚充填剤組成物。
【請求項４】
前記架橋ヒアルロン酸が、ＢＤＤＥ（１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル）を用いて架橋され、好ましくは、単結合及び二重結合のＢＤＤＥ架橋剤の合計対ヒアルロン酸二糖単位の合計の比として表される、０．５％〜２５％の改変度を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の注入可能な皮膚充填剤組成物。
【請求項５】
前記組成物が、吸収性かつ生体適合性の微小粒子を１％〜５０％容量／容量の濃度で更に含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の注入可能な皮膚充填剤組成物。
【請求項６】
前記吸収性かつ生体適合性の微小粒子が、リン酸カルシウムベースの物質、アルミナベースの物質、生分解性の天然多糖若しくはその誘導体、又は生分解性のポリエステル、ポリオルトエステル若しくはポリ無水物合成ポリマーからなり、前記リン酸カルシウムベースの物質は、カルシウムヒドロキシアパタイト、カルシウムフルオロアパタイト、カルシウムクロロアパタイト、炭酸カルシウムアパタイト、リン酸四カルシウム、ピロリン酸カルシウム、リン酸三カルシウム、及びリン酸八カルシウムを含む、請求項５に記載の注入可能な皮膚充填剤組成物。
【請求項７】
麻酔剤、ポリオール、ビタミン、アミノ酸、金属、抗酸化剤、及びミネラル塩からなる群から選択される１つ又は複数の化合物を更に含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の注入可能な皮膚充填剤組成物。
【請求項８】
前記組成物が、ポリオール、例えばグリセリン、及び／又は麻酔剤、例えばリドカインを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の注入可能な皮膚充填剤組成物。
【請求項９】
前記組成物が、以下の１つ又は複数の特性：
（ｉ）０．４Ｈｚの周波数（ｆ）及び２５℃において、１００Ｐａ〜４０００Ｐａの弾性係数Ｇ’；
（ｉｉ）０．４Ｈｚの周波数及び２５℃において、２０Ｐａ・ｓ〜１，０００Ｐａ・ｓの粘度；
（ｉｉｉ）０．４Ｈｚの周波数及び２５℃において、０．２５〜０．６のタンデルタ（Ｇ”／Ｇ’）；及び
（ｉｖ）６．５〜７．５のｐＨ；
を有する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の注入可能な皮膚充填剤組成物。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の注入可能な皮膚充填剤組成物を含む、皮膚充填用のキット。
【請求項１１】
以下の工程：
（ａ）架橋ヒアルロン酸ゲルを提供することと、
（ｂ）非架橋のカルボキシメチルセルロースゲルを提供することと、
（ｃ）前記架橋ヒアルロン酸ゲルと前記カルボキシメチルセルロースゲルとを混合することと、
を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の注入可能な皮膚充填剤組成物の調製方法。
【請求項１２】
皮膚の皺及び皺線、眉間の皺線、鼻唇溝、頤襞、マリオネット線、下顎の輪郭、口腔交連、口周囲の皺、目尻の皺、皮膚陥凹、傷痕、こめかみ、額の真皮支持、頬骨及び頬脂肪体、涙くぼみ、鼻、唇、頬、頤、口周囲部、眼窩下部、及び顔面非対称の美容的処置を含む美容的用途に使用される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の注入可能な皮膚充填剤組成物又は請求項１０に記載のキット。
【請求項１３】
治療用途の、請求項１〜９のいずれか一項に記載の注入可能な皮膚充填剤組成物又は請求項１０に記載のキット。
【請求項１４】
腹圧性尿失禁、膀胱尿管逆流、声帯襞不全、及び声帯襞内方化の処置における使用のための、請求項１〜９のいずれか一項に記載の注入可能な皮膚充填剤組成物又は請求項１０に記載のキット。
【請求項１５】
美容又は治療目的の、生物組織の置換若しくは充填又は生物組織のボリューム増加のために使用される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の注入可能な皮膚充填剤組成物又は請求項１０に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、架橋ヒアルロン酸（ＨＡ）、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）及び、任意選択でカルシウムヒドロキシアパタイト（ＣａＨＡＰ）微小粒子等の微小粒子を含む、ゲルの形態であり注入可能な皮膚充填剤組成物に関する。注入可能な皮膚充填剤組成物は、改善されたレオロジー特性を有すると共に、同時に低押出力を有する。本発明は、更に、このような注入可能な皮膚充填剤組成物の調製方法並びに美容及び治療目的のその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
美の共通点として、若々しい外観を達成し、かつ保持することは万人が認める願望である。しかしながら、時が経つにつれ、皮膚は、特に顔面の皮膚はその若々しい外観を失い始める。顔面の老化の最も共通する美的徴候として、皮膚皺、深い鼻唇溝、眉間の皺線、マリオネット線、口腔交連（buccal commissures）及び口周囲の皺が目立つことが挙げられる。
【０００３】
これらの加齢変化は、皮膚充填剤を注入し、組織のボリュームを増加するにより処置されることが多い。現在、入手可能な皮膚充填剤は多くあるが、これらは大きく２種類に分類することができる。第１の種類の充填剤は、ボリュームを生み出すことにより長期効果をもたらし、架橋ヒアルロン酸（ＨＡ）充填剤等の充填剤が含まれる。第２の種類の充填剤は、コラーゲン新生を誘起することにより長期効果をもたらす。最もよく知られ、広く使用されている例は、Ｒａｄｉｅｓｓｅ（登録商標）であり、カルシウムヒドロキシアパタイト小球体、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）のゲル担体及びグリセリンを含む。
【０００４】
理想的な皮膚充填剤は、生体適合性であり、有害事象特性が低く、かつ適度に長期の持続性（寿命）、効果的なボリューム増加能力及び注入の容易さを実現しなければならない。ＨＡベースの充填剤は、皮膚充填剤のこれらの望ましい特性の多くをもたらす。ＨＡはほとんど全ての種に見出されるため、抗原性を持たず、優れた耐性を示す。更に、ＨＡの架橋により、良好なリフティング能力を有し、１２か月を超えて２年まで安定である架橋ＨＡ生成物の製造が可能となる。
【０００５】
しかしながら、ＨＡ−ベースの充填剤の主要な欠陥は、注入することが困難であることが多いという点である。この理由のため、一般的に、注入を容易にする滑沢剤として非架橋ＨＡ（「遊離」ＨＡ）が添加される。残念ながら、遊離ＨＡの添加により起きる所望の押出力減少により、ゲルの他の望ましい物理的特性が損なわれる。詳細には、Ｇプライム（Ｇ’）パラメータは低下し、それによって結果として、ボリューム増加効果は低減し、動的粘度は減少する。
【０００６】
Ｒａｄｉｅｓｓｅ（登録商標）は、許容される寿命、生体適合性、及びボリュームを生み出す良好な能力を含む、皮膚充填剤の望ましい特徴も提供する皮膚充填剤である。注入されると、小さいカルシウムヒドロキシアパタイト小球体が、その周囲の環境と同様に新しい組織形成を促進するスカフォードとして作用する。しかしながら、Ｒａｄｉｅｓｓｅ（登録商標）のＣＭＣ担体はインビボで迅速に吸収されるため（約３か月内）、コラーゲン新生をＣＭＣ除去と同時に進行させることができないので、充填効果は潜在的かつ一時的に減少する。更に、充填剤の適用後に部分修正を可能にする、ＣＭＣに対する入手可能な対抗手段（拮抗薬）が存在しない。
【０００７】
１９９３年に出願された欧州特許第１  ０８０  ６９８号は、微粉化したセラミック粒子（例えば、ＣａＨＡ）を含む注入可能な軟部組織増大物質を開示し、とりわけＲａｄｉｅｓｓｅ（登録商標）を含む。加えて、国際公開第２０１４／０５６７２３号には、１％〜４％（ｗ／ｖ）の濃度の架橋ＨＡ及び１０％〜７０％（ｗ／ｖ）の濃度のヒドロキシアパタイト粒子を含む粘弾性ゲルが記載されている。
【０００８】
（本発明の目的）
上記を考慮して、本発明の目的は、改善されたレオロジー特性を有する一方、同時に、容易に注入可能である長期持続性の皮膚充填剤組成物を提供することである。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上述の目的は、カルボキシメチルセルロースを滑沢剤として利用する、ゲルの形態であり注入可能な皮膚充填剤組成物を提供することにより解決される。この新式の皮膚充填剤は、良好な寿命をもたらし、容易に注入可能であり、かつ改善されたレオロジー特性（すなわち、Ｇプライム（Ｇ’）及び動的粘度）を有し、結果としてボリュームを生み出す優れた能力をもたらす。
【００１０】
第１態様では、本発明は、架橋された（例えば、ＢＤＤＥ架橋）ヒアルロン酸（ＨＡ）及びカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）を含む、ゲルの形態であり注入可能な皮膚充填剤組成物を提供する。
【００１１】
架橋ＨＡは、通例、０．１％〜４．０％重量／容量（例えば、０．５％〜４．０％又は１．０％〜４．０％重量／容量）の濃度で存在し、架橋マトリックスを与えるが、ＣＭＣは通例、１．０％〜２５％容量／容量の濃度で存在し、滑沢剤／滑沢剤相として添加される。好ましい実施形態では、注入可能な皮膚充填剤組成物は、吸収性かつ生体適合性の微小粒子、詳細にはカルシウムヒドロキシアパタイト微小粒子を更に含む。
【００１２】
第２態様では、本発明は、本発明の第１態様に基づく注入可能な皮膚充填剤組成物を含むキットを提供する。
【００１３】
第３態様では、本発明は、本発明の第１態様に基づく注入可能な皮膚充填剤組成物の調製方法を提供し、以下の工程：
（ａ）架橋ヒアルロン酸ゲルを生成することと、
（ｂ）カルボキシメチルセルロースゲルを生成することと、
（ｃ）架橋ヒアルロン酸ゲルとカルボキシメチルセルロースゲルとを混合することと、
を含む。
【００１４】
第４態様では、本発明は、顔面の皺線の処置等の美容的用途のための、本発明の第１態様に基づく注入可能な皮膚充填剤組成物又は本発明の第２態様に基づくキットの使用に関する。
【００１５】
第５態様では、本発明は、治療での使用、詳細には腹圧性尿失禁、膀胱尿管逆流、声帯襞不全、及び声帯襞内方化（medialization）の処置での使用のための、本発明の第１態様に基づく注入可能な皮膚充填剤組成物又は本発明の第２態様に基づくキットを提供する。
【００１６】
第６態様では、本発明は、生物組織の置換若しくは充填又は生物組織のボリューム増加のための方法を提供し、有効量の、本発明の第１態様に基づく注入可能な皮膚充填剤組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む。
【００１７】
本発明の特定の実施形態は、添付の特許請求の範囲に明示される。
【００１８】
本発明の付加的目標、利点及び特徴は、以下の本発明の詳細な説明、図面及び実施例を考慮して、当業者には容易に明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明に基づくＨＡ／ＣＭＣ皮膚充填剤組成物（１５％（ｖ／ｖ）ＣＭＣを有するＭＨＡＧゲル、灰色バー）及びＨＡ／遊離ＨＡ皮膚充填剤組成物（１５％（ｖ／ｖ）遊離ＨＡを有するＭＨＡＧゲル、斜線バー）の、「ＨＡのみ」のゲル（ＭＨＡＧゲル、黒色バー）と比較した押出力を示す図である。
【図２】本発明に基づくＨＡ／ＣＭＣ皮膚充填剤組成物（１５％（ｖ／ｖ）ＣＭＣを有するＭＨＡＧゲル、灰色バー）及びＨＡ／遊離ＨＡ皮膚充填剤組成物（１５％（ｖ／ｖ）遊離ＨＡを有するＭＨＡＧゲル、斜線バー）の、「ＨＡのみ」のゲル（ＭＨＡＧゲル、黒色バー）と比較した弾性係数（Ｇ’）を示す図である。
【図３】本発明に基づくＨＡ／ＣＭＣ皮膚充填剤組成物（１５％（ｖ／ｖ）ＣＭＣを有するＭＨＡＧゲル、灰色バー）及びＨＡ／遊離ＨＡ皮膚充填剤組成物（１５％（ｖ／ｖ）遊離ＨＡを有するＭＨＡＧゲル、斜線バー）の、「ＨＡのみ」のゲル（ＭＨＡＧゲル、黒色バー）と比較した粘度を示す図である。
【図４】本発明に基づくＨＡ／ＣａＨＡＰ／ＣＭＣ皮膚充填剤組成物（１０％（ｖ／ｖ）ＣＭＣを有するＭＨＡＩ、黒色バー）の、ＨＡ／ＣａＨＡＰゲル（ＭＨＡＩ、灰色バー）、ＨＡ／ＣａＨＡＰ／遊離ＨＡゲル（１０％遊離ＨＡを有するＭＨＡＩ、斜線バー）、及びＭＨＡＩゲルの希釈物（希釈ＨＡを有するＭＨＡＩ（１５ｍｇ／ｍＬ  ＨＡ）、空白バー）と比較した押出力を示す図である。
【図５】本発明に基づくＨＡ／ＣａＨＡＰ／ＣＭＣ皮膚充填剤組成物（１０％（ｖ／ｖ）ＣＭＣを有するＭＨＡＩ、黒色バー）の、ＨＡ／ＣａＨＡＰゲル（ＭＨＡＩ、灰色バー）、ＨＡ／ＣａＨＡＰ／遊離ＨＡゲル（１０％遊離ＨＡを有するＭＨＡＩ、斜線バー）、及びＭＨＡＩゲルの希釈物（希釈ＨＡを有するＭＨＡＩ（１５ｍｇ／ｍＬ  ＨＡ）、空白バー）と比較した弾性係数（Ｇ’）を示す図である。
【図６】本発明に基づくＨＡ／ＣａＨＡＰ／ＣＭＣ皮膚充填剤組成物（１０％（ｖ／ｖ）ＣＭＣを有するＭＨＡＩ、黒色バー）の、ＨＡ／ＣａＨＡＰゲル（ＭＨＡＩ、灰色バー）、ＨＡ／ＣａＨＡＰ／遊離ＨＡゲル（１０％遊離ＨＡを有するＭＨＡＩ、斜線バー）、及びＭＨＡＩゲルの希釈物（希釈ＨＡを有するＭＨＡＩ（１５ｍｇ／ｍＬ  ＨＡ）、空白バー）と比較した粘度を示す図である。
【図７】ＨＡ／ＣａＨＡＰ皮膚充填剤（ＭＨＡＩ、黒色バー）、５％ＣＭＣを有するＨＡ／ＣａＨＡＰゲル（５％ＣＭＣを有するＭＨＡＩ、灰色バー）、１０％ＣＭＣを有するＨＡ／ＣａＨＡＰゲル（１０％ＣＭＣを有するＭＨＡＩ、斜線バー）及び１５％ＣＭＣを有するＨＡ／ＣａＨＡＰゲル（１５％ＣＭＣを有するＭＨＡＩ、空白バー）の押出力に対するＣＭＣの異なる濃度の影響を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明の注入可能な皮膚充填剤は、優れた生体適合性、改善された持続性、高保湿性、非免疫原性、及び安全な身体による吸収を含むと共に、皮膚充填剤としての使用に望ましい機械的及びレオロジー的特性を維持する、周知の充填剤を越える多くの利点を提供する。
【００２１】
詳細には、本発明者らは、少量のカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）を、架橋ＨＡゲルに添加することにより、驚いたことに、低押出力を示すと共に、改善された機械的特性（すなわち、高弾性係数（Ｇ’）及び高動的粘度）を有し、高いボリューム増加能力を実現する長期持続性の皮膚充填剤組成物に至ることを見出した。言い換えれば、本発明に基づく皮膚充填剤は、予想外に、最適なバランスの寿命、リフティング能力及び注入の容易さを実現することが見出された。
【００２２】
更に、本発明の好ましい実施形態では、皮膚充填剤組成物が付加的に微小粒子（例えば、カルシウムヒドロキシアパタイト（ＣａＨＡＰ）微小粒子）を含有する場合、Ｒａｄｉｅｓｓｅの利点（すなわち、カルシウムヒドロキシアパタイト粒子によるコラーゲン新生）は、架橋ＨＡ担体を分解し溶解するヒアルロニダーゼ酵素を使用する可能性から、部分的な可逆性／修復可能性という利点と組み合わせることができる。他の利点は、架橋ＨＡ担体が、現在の、例えばＲａｄｉｅｓｓｅ（登録商標）に使用される非架橋ＣＭＣ担体より長く持続することである。これにより、ＣＭＣの溶解時間と微小粒子によるコラーゲン新生誘発との間に見られる性能／ボリューム増加効果の周知のずれを妨げられるであろう。
【００２３】
第１態様では、本発明は、架橋ヒアルロン酸及びカルボキシメチルセルロースを含む、ゲルの形態であり注入可能な皮膚充填剤組成物に関する。
【００２４】
本明細書で使用するとき、用語「皮膚充填剤」は、軟部組織欠乏の領域に、ボリュームを付加するように設計された物質又は組成物を広く表す。本明細書で使用するとき、用語「皮膚充填剤」は、用語「軟部組織充填剤」と同義であり、区別なく使用される。つまり、用語「皮膚充填剤」は、注入の部位及び種類に関して何らかの制限を加えるものと考えられるべきではなく、一般に真皮の真下、例えば骨膜上のかつ皮下面における筋肉下の、複数レベルでの使用を包含する。本発明の意味の範囲内で、用語「軟部組織」は、一般に、身体の他の構造体及び器官を結合する、支持する、又は取り囲む組織に関する。本発明では、軟部組織は、例えば、筋肉、腱（筋肉を骨に結合する線維帯）、線維組織、脂肪、血管、神経、及び滑膜組織（関節周囲の組織）を含む。
【００２５】
本発明に基づけば、注入可能な皮膚充填剤組成物はゲルである。本明細書で使用するとき、用語「ゲル」は、一般に、室温で液体と固体の間の流動性を有する物質を表す。加えて、用語「ゲル」は、水を吸収することが可能な物質（すなわち、「ヒドロゲル」）を意味することを意図する。本発明の範囲内で、注入可能な皮膚充填剤組成物は、一般に、非発熱性の等張緩衝液、詳細には好ましくは緩衝化した生理食塩水等の生理学的に許容される担体流体を含む。
【００２６】
更に、本発明の皮膚充填剤組成物は、「注入可能」である。これは、この皮膚充填剤組成物が、所望の標的部位に皮膚充填剤組成物を適用するための、皮膚又は他の組織内への注入に好適であることを意味する。本発明の意味の範囲内で「注入可能」な組成物は、通常の条件下、通常の圧力下で、シリンジにより分注することができる。
【００２７】
本発明に基づけば、カルボキシメチルセルロースの濃度は、好ましくは１．０％〜２５．０％、より好ましくは５．０％〜２０％、及び最も好ましくは１０％〜１５％容量／容量である。本発明の範囲内で、カルボキシメチルセルロースは、一般に滑沢剤又は滑沢相として使用される。本明細書での使用に好適なカルボキシメチルセルロースは、５．０×１０４Ｄａ（低粘度ＣＭＣ）〜１．５×１０６Ｄａ（高粘度ＣＭＣ）の範囲の、例えば、９．０×１０４Ｄａ〜７．０×１０５Ｄａの範囲、詳細には１．５×１０５〜５．０×１０５Ｄａの範囲の分子量を有してもよい。
【００２８】
更に、本明細書での使用に好適なカルボキシメチルセルロースは、Ｂｒｏｏｋｆｉｅｌｄスピンドル粘度計（ＬＶＴ型）を用いて、２５℃、及び６０ｒｐｍの回転速度で、サイズＮｏ．１又はＮｏ．２のスピンドルを用いて、２％水溶液を使用して測定して、７５ｍＰａ・ｓ〜７５０ｍＰａ・ｓの粘度を有する低粘度カルボキシメチルセルロース、Ｂｒｏｏｋｆｉｅｌｄスピンドル粘度計（ＬＶＴ型）を用いて、２５℃、及び３０ｒｐｍの回転速度で、サイズＮｏ．２又はＮｏ．３のスピンドルを用いて、２％水溶液を使用して測定して、７５０ｍＰａ・ｓ〜４，０００ｍＰａ・ｓの粘度を有する中粘度カルボキシメチルセルロース、並びにＢｒｏｏｋｆｉｅｌｄスピンドル粘度計（ＬＶＴ型）を用いて、２５℃、及び３０ｒｐｍの回転速度で、サイズＮｏ．３又は４のスピンドルを用いて、１％水溶液を使用して測定して、４，０００ｍＰａ・ｓ〜２５，０００ｍＰａ・ｓの粘度を有する高粘度カルボキシメチルセルロースから選択されてもよい。
【００２９】
その上、カルボキシメチルセルロースは、典型的には、０．２０〜１．５０、好ましくは０．４０〜１．１０、より好ましくは０．６０〜０．９５、最も好ましくは０．７０〜０．９０の置換度を有する。本明細書で使用するとき、「置換度」（エーテル化度）は以下のように定義される：［Ｃ６Ｈ７Ｏ２（ＯＨ）ｘ（ＯＣＨ２ＣＯＯｍ）ｙ］ｎ［式中、ｎは重合度（例えば、４５０〜４，０００）であり、ｘ＋ｙ＝３であり、式中、ｙは置換度である。］置換度は、当技術分野で周知のように（例えば、国際ワイン醸造食品規格（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｏｅｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｏｄｅｘ）ＣＯＥｌ−１−ＣＭＣ：２００９に記載される方法に準拠して）決定することができる。
【００３０】
ヒアルロン酸は、好ましくは０．１％〜５．０％又は０．２％〜４．５％又は０．３％〜４．０％又は０．４％〜４．０％又は０．５％〜４．０％又は０．７％〜４．０％又は１．０％〜４．０％、より好ましくは０．５％〜３．０％又は１．０％〜３．０％又は１．５％〜３．０％又は２．０％〜３．０％、最も好ましくは１．０％〜２．５％又は２．０％〜２．５％重量／容量の濃度で組成物中に存在する。本発明の範囲内で、架橋ＨＡは「マトリックス」を形成する。本明細書で使用するとき、用語「マトリックス」は、架橋又は非架橋のいずれかの、溶液又はゲルの形態である、多糖類の密接な組織を意味することを意図する。更に、本明細書で使用するとき、用語「ヒアルロン酸」又は「ＨＡ」は、ヒアルロン酸、ヒアルロネート及びヒアルロン酸ナトリウム等の任意のヒアルロン酸塩を意味する。
【００３１】
本発明の文脈において、架橋ヒアルロン酸は、決して限定されるものではなく、単一のヒアルロン酸から又は分子量の異なる２つ以上のヒアルロン酸から調製される架橋ヒアルロン酸を含む（本明細書に参考として組み込まれる、例えば、米国特許出願公開第２０１０／０３１６６８３  Ａ１号又は国際公開第２０１３／１８５９３４  Ａ１号を参照のこと）。また、本発明の範囲内で、架橋ヒアルロン酸は、ゲル内における架橋度の多様性を特徴とする「多密度化（polydensified）」ゲルを形成することができ、すなわち、「多密度化」ゲルは、より密度の高い部分（高架橋度）及びより密度の低い部分（低架橋度）を有する（少なくとも）２つの異なる密度レベルを有する。
【００３２】
多密度化ゲルは、例えば、第１架橋反応により架橋第１多糖類に、次に第２架橋反応により架橋第２多糖類となり、二重架橋ゲルを形成することで調製され得る。前記第１及び前記第２多糖類は、例えば、独立して同一のヒアルロン酸又はその平均分子量の異なる（例えば、低分子量及び高分子量のヒアルロン酸）２つの異なるヒアルロン酸であってもよい。二重架橋プロセス（動的架橋技術）は、当技術分野で周知であり、例えば欧州特許第１  ７１１  ５５２  Ｂ１号に記載されており、本明細書に参考として組み込まれる。
【００３３】
本発明の範囲内で、架橋ヒアルロン酸は、単一のヒアルロン酸の架橋により、又は第１ヒアルロン酸及び第２ヒアルロン酸、並びに任意選択で少なくとも１つの更なるヒアルロン酸の架橋により調製され得、第１、第２及び少なくとも１つの更なるヒアルロン酸はその平均分子量が異なる。
【００３４】
前記単一のヒアルロン酸は、０．１×１０６〜４．０×１０６Ｄａ又は０．３×１０６〜４．０×１０６Ｄａ又は０．５×１０６〜４．０×１０６Ｄａ、詳細には１．０×１０６〜３．０×１０６Ｄａ又は１．５×１０６〜２．５×１０６Ｄａの平均分子量を有することが好ましい。前記第１ヒアルロン酸は、好ましくは１．０×１０５Ｄａ〜１．０×１０６Ｄａ未満、より好ましくは３．０×１０５Ｄａ〜９．０×１０５Ｄａ、最も好ましくは５．０×１０５Ｄａ〜８．０×１０５Ｄａの平均分子量を有する。前記第２ヒアルロン酸は、通例、１．０×１０６Ｄａ超５．０×１０６Ｄａまで、詳細には１．５×１０６Ｄａ〜４．０×１０６Ｄａ、好ましくは２．０×１０６Ｄａ〜３．０×１０６Ｄａの平均分子量を有する。本発明の注入可能な皮膚充填剤組成物における第１ＨＡ対第２ＨＡの重量比は、限定されないが、例えば０．００１：９９．９９９〜９９．９９９：０．００１、好ましくは約７０：３０〜約９９．９：０．１、最も好ましくは約９０：１０〜約９９．０：１．０の範囲であってもよい。
【００３５】
ＨＡの分子量を決定するために、固有粘度測定（例えば、中国薬局方第２版、２００６に準拠する）、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）（例えば、Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍｅｄ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，２００２，１６：１４１〜４５に準拠する）、高性能ゲル浸透クロマトグラフィー（ＨＰＧＰＣ）（例えば、Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．，２００８，１０９：６３〜７７０）、及びサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳ）と組み合わせた多角度レーザー光散乱（例えば、Ｈｏｋｐｕｔｓａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ．，２００３，３２：４５０〜４５６に準拠する）等の様々な方法を本明細書で適用することができる。
【００３６】
本発明に基づく注入可能な皮膚充填剤組成物は、ＢＤＤＥ（１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル）を用いて架橋することが好ましい。ＢＤＤＥ架橋ヒアルロン酸は、単結合及び二重結合のＢＤＤＥ架橋剤の合計対ヒアルロン酸二糖単位の合計の比として表される、０．５％〜２５％、好ましくは１．０％〜１５％、より好ましくは２．０％〜１０％、最も好ましくは３．０％〜８．０％又は４．０％〜７％の改変度を有してもよい。
【００３７】
改変度は、当技術分野で周知の方法に準拠してＮＭＲにより決定することができる（Ｅｄｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｌ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｅｒｍａｌ  Ｆｉｌｌｅｒｓ，Ｄｅｒｍａｔｏｌ．Ｓｕｒｇ．２０１２，３８：１１７０〜１１７９；Ｇｕａｒｉｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＳＥＣ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｉｎ  ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ  ｆｉｌｌｅｒｓ，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ２０１２，８８：４２８〜４３４；Ｋｅｎｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ  ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ  ｉｎ  ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ−Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ２０１３，９１：４１０〜４１８）。
【００３８】
手短に言えば、透析ゲル及び無菌化ゲルは、ＮＭＲ測定を行う前に分解する。この分解は、コンドロイチナーゼＡＣ（Ｅｄｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，前掲；Ｋｅｎｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，前掲）、ＮａＯＨ（Ｇｕａｒｉｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，前掲）、ヒアルロニダーゼ添加（例えば、１ｇのゲルに１５０Ｕのヒツジヒアルロニダーゼ）により、又は９０℃で少なくとも３５時間インキュベートすることにより実施することができる。次に、得られた溶液を凍結乾燥し、Ｄ２Ｏに溶解し、よく均質化する。
【００３９】
ＮＭＲ測定は、例えば、５００ＭＨｚ、２０度パルスで、周囲温度で数回繰り返して実施し、適切な分解能を有するスペクトルを得ることができる。文献に基づけば、改変度（ＭｏＤ）は、ＨＡのＮ−アセチルシグナル対ＢＤＤＥのメチレンシグナルの比を算出することにより判定する。Ｄ２Ｏに可溶化した場合、臨界シグナルは、ＨＡのＮ−アセチルでは約２．０ｐｐｍに、ＢＤＤＥでは約１．６ｐｐｍに位置する。改変度を算出するために、積分値を特定し、文献に基づき（Ｅｄｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，前掲、及びＫｅｎｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，前掲）、Ｎ−アセチル（ＣＨ３）の３Ｈ対メチレン（ＣＨ２ＣＨ２）の４Ｈのプロトン比を考慮する必要がある。
【００４０】
本発明の好ましい実施形態に基づけば、注入可能な皮膚充填剤組成物は、吸収性かつ生体適合性の微小粒子を更に含む。本明細書で使用するとき、用語「微小粒子」は、一般に実質的に丸みを帯びた粒子又は球形の粒子に関する。加えて、微小粒子は、好ましくは５μｍ〜５００μｍ、より好ましくは１０μｍ〜２００μｍ、特に好ましくは１５μｍ〜１００μｍ又は２０μｍ〜７５μｍ、最も好ましくは２５μｍ〜４５μｍの平均直径を有する。本発明の文脈の範囲内で、用語「吸収性」は、一般に、崩壊され、組織及び／又は体液内に吸収され得る物質を表す。
【００４１】
微小粒子は、好ましくは０．５％〜５０％又は１．０％〜５０％、より好ましくは１．０％〜４０％、特に好ましくは５．０％〜３５％、詳細には１５．０％〜３０％又は２０％〜２５％、最も好ましくは２５．０％〜３５％容量／容量の濃度で、組成物内に存在する。
【００４２】
本発明の文脈の範囲内で、吸収性かつ生体適合性の微小粒子は、リン酸カルシウムベースの物質、アルミナベースの物質、生分解性の天然多糖若しくはその誘導体、又は生分解性のポリエステル、ポリオルトエステル若しくはポリ無水物合成ポリマーからなり得る。
【００４３】
本明細書で使用するとき、用語「天然多糖」は、一般に、天然に存在する多糖に関する。本明細書で使用するとき、「誘導体」は、天然多糖と関連して使用される場合、例えば、カルボキシル化、エーテル化、メチル化、スルホン化等の化学的改変により、天然多糖から誘導される多糖を表す。本明細書で使用するとき、用語「生分解性」は、生存しているヒトによりインビボで分解可能である物質を広く表し、特定の分解時間又は持続時間に制限されると解釈すべきではない。
【００４４】
リン酸カルシウムベースの物質は、カルシウムヒドロキシアパタイト、カルシウムフルオロアパタイト、カルシウムクロロアパタイト、炭酸カルシウムアパタイト、リン酸四カルシウム、ピロリン酸カルシウム、リン酸三カルシウム、及びリン酸八カルシウムから選択されてもよい。リン酸カルシウムベースの物質は、カルシウムヒドロキシアパタイトであることが好ましい。
【００４５】
生分解性のポリエステル、ポリオルトエステル又はポリ無水物合成ポリマーは、グリコリド、ラクチド、カプロラクトン、及びｐ−ジオキサノンのホモポリマー若しくはコポリマーであってもよく、又は炭酸トリメチレン、若しくはポリ（ヒドロキシ酪酸）若しくはポリ（ヒドロキシ吉草酸）ポリマーである。生分解性のポリエステル、ポリオルトエステル又はポリ無水物合成ポリマーは、ポリ−ε−カプロラクトン、ポリグリコリド、ポリラクチド、ポリジオキサノン、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）、ポリ（グリコリド−ｃｏ−カプロラクトン）、及びポリ（炭酸グリコリド−ｃｏ−トリメチレン）から選択されることが好ましく、ポリ−ε−カプロラクトン又はポリジオキサノンが最も好ましい。
【００４６】
本発明に基づけば、注入可能な皮膚充填剤組成物は、ポリオール、ビタミン、アミノ酸、金属、抗酸化剤、及びミネラル塩からなる群から選択される１つ又は複数の化合物を更に含んでもよい。本明細書での使用に好適なポリオールとして、グリセリン、マンニトール、ソルビトール、プロピレングリコール、エリスリトール、キシリトール、マルチトール、及びラクチトールが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書での使用に特に好適なポリオールは、マンニトール及びグリセリンである。更に、ポリオールはグリコールであることが好ましく、任意選択で１つ又は複数の前述のポリオール化合物、詳細にはマンニトールと組み合わせることが好ましい。ポリオールは、例えば、注入可能な皮膚充填剤組成物内に１％〜２５％又は２％〜１７％又は３％〜１３％容量／容量の濃度で、詳細には５％〜１１％又は７％〜１０％容量／容量の濃度で含まれてもよい。
【００４７】
好適なビタミンとして、ビタミンＣ、ビタミンＥ、並びにビタミンＢ群、すなわち１つ又は複数のＢ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ５、Ｂ６、Ｂ７、Ｂ９及びＢ１２が挙げられる。ビタミンＣ又はビタミンＥの濃度は、好ましくは約０．０１ｍｇ／ｍＬ〜約１０．０ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約５．０ｍｇ／ｍＬであり、ビタミンＢ群の合計濃度は、好ましくは約０．０１ｍｇ／ｍＬ〜約１０．０ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約５．０ｍｇ／ｍＬである。ビタミンは、細胞代謝を刺激し、かつ維持するために存在し得、したがって、コラーゲン産生を促進する。本明細書での使用に特に好ましいものは、ビタミンＣ、ビタミンＥ、及びビタミンＢ６である。
【００４８】
更に、本発明に基づく注入可能な皮膚充填剤組成物は、麻酔剤、詳細には局所麻酔剤、好ましくはリドカインを、例えば、０．０５重量％〜５．０重量％、０．１重量％〜４．０重量％、０．２重量％〜３．０重量％、０．３重量％〜２．０重量％、又は０．４重量％〜１．０重量の濃度で更に含んでもよい。
【００４９】
本明細書において、注入可能な皮膚充填剤組成物は、架橋のＨＡ及びＣＭＣ以外に、架橋及び／又は非架橋のポリマーを含み得ることを更に企図する。詳細には、注入可能な皮膚充填剤組成物は、０．００１％〜１５％、詳細には１％〜１０％容量／容量の非架橋ヒアルロン酸を更に含み得る。前記非架橋ヒアルロン酸の分子量は、好ましくは３．０×１０５Ｄａ〜４．０×１０６Ｄａ、詳細には１．０×１０６Ｄａ〜３．０×１０６Ｄａである。
【００５０】
コンドロイチン硫酸、ケラタン、ケラタン硫酸、ヘパリン、ヘパリン硫酸、セルロース及びその誘導体、キトサン、カラゲナン、キサンタン、並びにアルギネート、又はこれらの塩の内の１種等の他の架橋又は非架橋のポリマーもまた、少量（例えば、１０％未満、通例、５％未満、又は１％容量／容量未満）で、本発明の注入可能な皮膚充填剤組成物内に含まれてもよい。しかしながら、本明細書において、注入可能な皮膚充填剤組成物は、本明細書に記載される架橋ＨＡ以外の任意の架橋ポリマーを含まない、かつ／又は本明細書に記載されるＣＭＣ以外の任意の非架橋ポリマーを含まないことも企図する。本明細書で使用するとき、この文脈において、用語「ポリマー」は、ＨＡ等の多糖類を含む、繰り返し構造単位を有する任意の天然又は合成のポリマー化合物を表す。
【００５１】
本発明の好ましい実施形態では、微小粒子（例えば、カルシウムヒドロキシアパタイト微小粒子）を含む組成物を含む、本発明に基づく注入可能な皮膚充填剤組成物は、麻酔剤、好ましくはリドカイン、及び／又は上述の１つ又は複数のポリオールを更に含む。特に好ましくは、ＣａＨＡＰ微小粒子を含む組成物を含む、本発明に基づく注入可能な皮膚充填剤組成物は、リドカイン及びグリセリンを更に含む。
【００５２】
その上、本発明に基づけば、注入可能な皮膚充填剤組成物は、以下の１つ又は複数の特性：
（ｉ）０．４Ｈｚの周波数（ｆ）及び２５℃において、５０Ｐａ〜４，５００Ｐａ、好ましくは１００Ｐａ〜４０００Ｐａ、より好ましくは１５０Ｐａ〜２，５００Ｐａの弾性係数Ｇ’；
（ｉｉ）０．４Ｈｚの周波数及び２５℃において、２０Ｐａ・ｓ〜１，４００Ｐａ・ｓ、好ましくは２５Ｐａ・ｓ〜１，０００Ｐａ・ｓ、より好ましくは３０Ｐａ・ｓ〜９００Ｐａ・ｓの粘度；及び
（ｉｉｉ）０．４Ｈｚの周波数及び２５℃において、０．２０〜０．８、好ましくは０．２５〜０．６のタンデルタ（Ｇ”／Ｇ’）
を有してもよい。
【００５３】
加えて、任意の微小粒子（例えば、カルシウムヒドロキシアパタイト微小粒子）を含まない、本発明に基づく注入可能な皮膚充填剤組成物での押出力は、一般に、標準１ｍＬシリンジ（例えば、１．０ｍＬ  ＢＤシリンジ）を使用し、約５０ｍｍ／分の押出速度にて（例えば、Ｎｅｏｊｅｃｔ）２５Ｇ×５／８”ニードルで測定して、１０Ｎ〜３０Ｎの範囲である。微小粒子（例えば、カルシウムヒドロキシアパタイト微小粒子）を含む、本発明に基づく注入可能な皮膚充填剤組成物での押出力は、一般に、標準１．５ｍＬシリンジ（例えば、１．５ｍＬプラスチックシリンジ）を使用し、約５０ｍｍ／分の押出速度にて（例えば、Ｔｅｒｕｍｏ  Ｋ  ｐａｃｋ  ＩＩ）２５Ｇ  ＴＷ  ３／４ニードルで測定して３５Ｎ〜７０Ｎの範囲である。
【００５４】
更に、注入可能な皮膚充填剤組成物は、通例、ＰＨを調節するために、緩衝液、例えばリン酸緩衝液を含む。本発明の注入可能な皮膚充填剤組成物は、人体への挿入を意図しているため、ｐＨは一般に６．５〜７．５の範囲、好ましくは６．８〜７．４の範囲である。加えて、オスモル濃度は好ましくは約２００ｍＯｓｍｏｌ／Ｌ〜約４００ｍＯｓｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは約２８０ｍＯｓｍｏｌ／Ｌ〜約３３０ｍＯｓｍｏｌ／Ｌである。
【００５５】
第２態様では、本発明は、本発明の第１態様に基づく注入可能な皮膚充填剤組成物を含むキットに関する。キットはまた、使用説明書も含む。
【００５６】
第３態様では、本発明は、本発明の第１態様に基づく注入可能な皮膚充填剤組成物の調製方法に関し、以下の工程：
（ａ）架橋ヒアルロン酸ゲルを生成することと、
（ｂ）カルボキシメチルセルロースゲルを生成することと、
（ｃ）架橋ヒアルロン酸ゲルとカルボキシメチルセルロースゲルとを混合することと、
を含む。
【００５７】
工程（ａ）で生成される架橋ヒアルロン酸ゲル及び／又は工程（ｂ）で生成されるカルボキシメチルセルロースゲルは、好ましくは上述の１つ又は複数のポリオール、詳細にはグリセリンを含む。追加的に又は代替的に、上述の１つ又は複数のポリオール、詳細にはグリセリンはまた、工程（ｃ）において、又は工程（ｃ）後に添加してもよい。更に、本発明の範囲内で、微小粒子は工程（ｂ）で生成されるカルボキシメチルセルロースゲル内で懸濁していてもよく、又は代替的には、微小粒子は架橋ヒアルロン酸ゲル及びカルボキシメチルセルロースゲルと共に、工程（ｃ）において混合してもよい。また、微小粒子は、工程（ｃ）で得られた混合物に添加してもよい。
【００５８】
工程（ａ）の架橋ヒアルロン酸ゲル及び／又は工程（ｂ）のカルボキシメチルセルロースゲルは、麻酔剤、例えばリドカインを含むことが好ましい。麻酔剤（例えばリドカイン）は、工程（ｃ）において、又は工程（ｃ）後に、工程（ｃ）で得られた混合物に添加することがより好ましい。
【００５９】
第４態様では、本発明は、本発明の第１態様に基づく注入可能な皮膚充填剤組成物又は本発明の第２態様に基づくキットの、美容用途の使用に関する。
【００６０】
第４態様に基づく使用は、好ましくは皮膚の皺及び皺線（例えば、顔面の皺線及び顔面の皺）、眉間の皺線、鼻唇溝、頤襞、マリオネット線、口腔交連、口周囲の皺、目尻の皺、皮膚陥凹、傷痕、こめかみ、額の真皮支持、頬骨及び頬脂肪体、涙くぼみ（tear troughs）、鼻、唇、頬、口周囲部、眼窩下部、顔面非対称、下顎の輪郭、及び頤の美容的処置を含む。
【００６１】
第５態様では、本発明は、治療用途の、本発明の第１態様に基づく注入可能な皮膚充填剤組成物に関する。詳細には、本発明の第１態様に基づく注入可能な皮膚充填剤組成物は、腹圧性尿失禁、膀胱尿管逆流、声帯襞不全、声帯襞内方化の処置に使用され得る。
【００６２】
第６態様では、本発明は、生物組織の置換若しくは充填又は生物組織のボリューム増加のための方法に関し、有効量の、本発明の第１態様に基づく注入可能な皮膚充填剤組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む。
【００６３】
典型的には、注入可能な皮膚充填剤組成物は、皮下注入又は皮内注入による等の注入により投与される。例えば、組成物は、連続穿刺技術を使用して、皮内に又は皮下に注入され得る。用語「有効量」は、所望の美容的（美的）又は治療的結果をもたらすのに十分である、注入可能な皮膚充填剤組成物の量を表す。本発明の意味において、「対象」は、特定の状態又は疾患の処置を必要としている任意の個体又は患者である。本発明の枠組みの範囲内で、対象は通例、ヒトである。
【００６４】
組成物は、好ましくは、皮膚の皺又は皺線（例えば、顔面の皺線及び顔面の皺）、眉間の皺線、鼻唇溝、頤襞、マリオネット線、口腔交連、口周囲の皺、目尻の皺、皮膚陥凹、傷痕、こめかみ、額の真皮支持、頬骨及び頬脂肪体、涙くぼみ、鼻、唇、頬、口周囲部、眼窩下部、顔面非対称、下顎の輪郭、及び頤の処置等の美容的状態の処置のために投与される。しかしながら、組成物はまた、腹圧性尿失禁、膀胱尿管逆流、声帯襞不全、及び声帯襞内方化等の治療的徴候の処置のためにも投与され得る。
【００６５】
本発明の第１態様に関連して上に提供した全ての説明及び見解（例えば、注入可能な皮膚充填剤組成物に含まれる原料又は材料に関するその製造方法、及びいくつかの専門用語の定義）は、本発明の第６態様に基づく方法に等しく適用される。
【００６６】
本発明は、ここで以下の非限定的実施例により更に例証される。
【実施例】
【００６７】
以下に提供する実施例は、本発明に基づく皮膚充填剤組成物が、著しく低減された押出力を有すると共に、その機械的特性（すなわち、弾性係数（Ｇ’）及び粘度）は予想外に維持されるか又は改善さえされることを実証する。
【００６８】
押出力の測定
ＨＡゲル（ＣＭＣ若しくは遊離ＨＡ滑沢相を含むか又は含まない）の押出力を、１．０ｍＬ  ＢＤシリンジ及びＮｅｏｊｅｃｔ  ２５Ｇ×５／８”ニードルを用いて決定した。この目的のために、質感分析器ＴＡ．ＸＴＰＬＵＳを使用した。０．５００Ｎの予負荷、及び５センチメートル／分（２インチ／分）の試験速度を利用して試験を実施した。
【００６９】
ＨＡ／ＣａＨＡＰゲル（ＣＭＣ若しくは遊離ＨＡ滑沢相を含むか又は含まない）の押出力を、１．５ｍＬプラスチックシリンジ及びＴｅｒｕｍｏ  Ｋ  ｐａｃｋ  ＩＩ  ２７Ｇ  ＴＷ  ３／４ニードルを用いて決定した。この目的のために、質感分析器ＴＡ．ＸＴＰＬＵＳを使用した。０．５００Ｎの予負荷、及び５センチメートル／分（２インチ／分）の試験速度を利用して試験を実施した。
【００７０】
弾性係数（Ｇ’）及び動的粘度の測定
２０ｍｍの直径を有するプレート−プレート系を装備したＡｎｔｏｎ  Ｐａａｒ  ＭＣＲ  ３０２レオメータを使用して弾性係数（Ｇ’）及び粘度を測定した。
【００７１】
ＨＡゲル（ＣＭＣ若しくは遊離ＨＡ滑沢相を含むか又は含まない）の場合では、以下の設定を使用してＧ’及び粘度を決定した：
【００７２】
【表１】
0006721584.tif 000002
【００７３】
ＨＡ／ＣａＨＡＰゲル（ＣＭＣ若しくは遊離ＨＡ滑沢相を含むか又は含まない）の場合では、以下の設定を使用してＧ’及び粘度を決定した：
【００７４】
【表２】
0006721584.tif 000003
【００７５】
（実施例１）
滑沢相を含まず、かつカルシウムヒドロキシアパタイト（ＣａＨＡＰ）粒子を含むか又は含まないＨＡゲル（ＭＨＡＧゲル及びＭＨＡＩゲル）の調製
（比較ゲル）
架橋溶液の調製
４３ｇのヒアルロン酸ナトリウム（約２．８ＭＤａの平均分子量）を２７０．３５ｇのリン酸緩衝液に溶解することにより、ＨＡ「固形状物」を調製した。得られたＨＡ固形状物は、必要になるまで冷蔵庫で保存することができる。更に、３．３１ｇの固体水酸化ナトリウムを１０ｍＬの緩衝液に溶解することにより、アルカリ溶液を調製した。更に、１２．５ｇの２Ｍ  ＮａＯＨ溶液と８８．５ｇのリン酸緩衝液とを混合し、次にこの溶液８．２１ｍＬとＢＤＤＥ  ３．３９５ｍＬとを混合することにより、ＢＤＤＥ溶液を調製した。
【００７６】
架橋
ＨＡ固形状物を手作業で小塊に砕き、前記アルカリ溶液の全量を容器に添加し、次に３０〜４０分間１２ｒｐｍで混合した。次に、ＢＤＤＥ溶液を容器に添加し、１０〜１５分間２５ｒｐｍで混合し続けた。温度設定ポイントを３３．３３℃に変更し、混合物をこの温度で４時間放置した。
【００７７】
中和及び精製
９２０．９９ｇの緩衝液を８４．６２ｇの１Ｍ  ＨＣｌに添加することにより、中和溶液を調製した。次に全ての中和溶液を容器に添加し、５℃で２時間撹拌した。その後、このゲルを当業者に周知の方法に基づいて精製した。次に、得られたゲル（「ＭＨＡゲル」）を使用して、以下に記載のＭＨＡＧ（ＣａＨＡＰを含まない）及びＭＨＡＩ（ＣａＨＡＰを含む）ゲル配合物を調製した。
【００７８】
ＭＨＡＧゲル
ＭＨＡＧゲルを調製するために、２ｇのリドカインを２ｇのリン酸緩衝液に添加し、次にマグネチックスターラを使用して完全に溶解するまで静かに撹拌することにより、濃縮リドカイン溶液「ＬＳ１」を調製した。次に、実施例１で調製したＭＨＡゲル４６７ｇを、２１１６μＬの「ＬＳ１」溶液と適切なミキサーを使用して１５分間混合した。その後、３３ｇのグリセリンを添加し、化合物を穏やかに１．５時間混合した。更なる脱気工程の後、１ｍＬシリンジを充填し、１２７℃で４分間無菌化した。
【００７９】
ＭＨＡＩゲル
更に、ＭＨＡＧゲルに相当するが付加的にＣａＨＡＰ粒子を含有するゲルを、実施例４〜６で調製したゲルと同量で、ＭＨＡＧゲルに関して上述した手順に基づいて調製した。このＣａＨＡＰを含む架橋ＨＡゲルは、本明細書において以下、「ＭＨＡＩ」と称する。
【００８０】
（実施例２）
１５％  ＣＭＣを滑沢相として含むＨＡゲルの調製
（本発明のゲル）
６２．７５ｇのグリセリンを２．１５０ｇのリドカインＨＣｌに添加し、この混合物を１３５．１４２ｇのリン酸緩衝液に溶解することにより、溶液「ＬＢ１」を調製した。次に、マグネチックスターラを使用して完全に溶解するまで静かに撹拌した。
【００８１】
次に、２．７６４ｇのＮａＣＭＣを、１０５．２４ｇのＬＢ１と容器内で１時間強く混合した。脱気した後、実施例１で調製したＭＨＡＧゲル３９２．０２５ｇを添加し、穏やかに１．５時間混合した。更なる脱気工程の後、１ｍＬシリンジを充填し、１２７℃で４分間無菌化した。
【００８２】
（実施例３）
１５％（ｖ／ｖ）遊離ＨＡを滑沢相として含むＨＡゲルの調製
（比較ゲル）
１．１３１ｇのリドカインＨＣｌを７２．７４３ｇのリン酸緩衝液に溶解することにより、溶液「ＬＢ２」を調製した。次に、１．１７０ｇのヒアルロン酸ナトリウム（２．５〜３．０ＭＤａ）を添加した。完全な溶解後、３３．００５ｇのグリセリンを添加した。次に、この混合物を中等度の速度で１時間３０分間撹拌し、使用前に５℃で保持した。
【００８３】
１０６．７２１ｇのＬＢ２と実施例１で調製したＭＨＡＧゲル３８７．３５７ｇとを混合することにより、１５％（ｖ／ｖ）遊離ＨＡ滑沢剤を含むＨＡゲルを調製した。穏やかな混合を２時間維持した。脱気した後、混合物を１ｍＬシリンジに移し、１２７℃で４分間無菌化した。
【００８４】
（実施例４）
５％（ｖ／ｖ）ＣＭＣを滑沢相として含むＨＡ／ＣａＨＡＰゲルの調製
（本発明のゲル）
以下の物質及び量を使用したことを除いて、ＬＢ１に関するものと同じ手法で、溶液「ＬＢ３」を調製した：４．６３３ｇのＮａＣＭＣ、２７４．１６ｇのグリセリン、及び１２１．３ｇのリン酸緩衝液。
【００８５】
２８０．０２ｇのＣａＨＡＰ（２５μｍ〜４５μｍ）、４８．２２ｇのＬＢ３、及び実施例１で調製したＭＨＡＧゲル１７１．８４ｇを混合容器に入れることにより、５％（ｖ／ｖ）ＣＭＣ滑沢剤を含むＨＡ／ＣａＨＡＰゲルを調製した。次に、２．１２０ｍＬのリドカイン溶液（２ｇのリン酸緩衝液中、２ｇのリドカイン）を添加した。この混合物を中等度の速度で１．５時間撹拌した。真空下で脱気した後、１ｍＬシリンジを充填し、１２１℃で２０分間無菌化した。
【００８６】
（実施例５）
１０％（ｖ／ｖ）ＣＭＣを滑沢相として含むＨＡ／ＣａＨＡＰゲルの調製
（本発明のゲル）
以下の物質及び量を使用したことを除いて、ＬＢ１に関するものと同じ手法で、溶液「ＬＢ４」を調製した：７．０３９ｇのＮａＣＭＣ、２０８．５２７ｇのグリセリン、及び１８４．４６ｇのリン酸緩衝液。
【００８７】
以下の量を使用したことを除いて、実施例４に記載されるように、１０％（ｖ／ｖ）ＣＭＣ滑沢を含むＨＡ／ＣａＨＡＰゲルを調製した：２８０．０２ｇのＣａＨＡＰ（２５μｍ〜４５μｍ）、６３．２９ｇのＬＢ４、及び実施例１で調製したＭＨＡＧゲル１５６．７９ｇ。
【００８８】
（実施例６）
１５％（ｖ／ｖ）ＣＭＣを滑沢相として含むＨＡ／ＣａＨＡＰゲルの調製
（本発明のゲル）
以下の物質及び量を使用したことを除いて、ＬＢ１に関するものと同じ手法で、溶液「ＬＢ５」を調製した：８．５２９ｇのＮａＣＭＣ、１６８．２６６ｇのグリセリン、及び２２３．２９ｇのリン酸緩衝液。
【００８９】
以下の量を使用したことを除いて、実施例４に記載されるように、１５％（ｖ／ｖ）ＣＭＣ滑沢剤を含むＨＡ／ＣａＨＡＰゲルを調製した：２８０．０２ｇのＣａＨＡＰ（２５μｍ〜４５μｍ）、７８．４６ｇのＬＢ５、及び実施例１で調製したＭＨＡＧゲル１４１．５６２ｇ。
【００９０】
（実施例７）
１０％（ｖ／ｖ）遊離ＨＡを滑沢相として含むＨＡ／ＣａＨＡＰゲルの調製
（比較ゲル）
以下の物質及び量を使用したことを除いて、ＬＢ２に関するものと同じ手法で、溶液「ＬＢ６」を調製した：２０８．５４８ｇのグリセリン、３．１０８ｇのヒアルロン酸ナトリウム、及び１８８．５８１ｇのリン酸緩衝液。
【００９１】
実施例１で調製したＭＨＡＧゲル１５６．７８１ｇと、６３．３２ｇのＬＢ６及び２１２０μＬのリドカイン溶液（２ｇのリン酸緩衝液中、２ｇのリドカイン）とを混合することにより、１０％（ｖ／ｖ）遊離ＨＡ滑沢剤を含むＨＡ／ＣａＨＡＰゲルを調製した。次に、２８０．０２ｇのＣａＨＡＰ（２５μｍ〜４５μｍ）を添加し、穏やかに１．５時間混合した。脱気後、１ｍＬシリンジを充填し、１２１℃で２０分間無菌化した。
【００９２】
（実施例８）
架橋ＨＡゲルの押出力に対するＣＭＣ滑沢剤又は遊離ＨＡ滑沢剤の効果
この実施例では、ＣＭＣ又は遊離ＨＡを滑沢剤として添加することの、ＨＡゲルの押出力に対する効果を検討した。この目的のために、以下のゲルの押出力を測定した：ＭＨＡＧゲル（実施例１）、１５％  ＣＭＣを含むＭＨＡＧゲル（実施例２）及び１５％遊離ＨＡを含むＭＨＡＧゲル（実施例３）。
【００９３】
ＣＭＣを滑沢剤として使用することにより、押出力が著しく減少することが見出された。この減少は、遊離ＨＡについて観察された減少と同様であった（図１を参照のこと）。
【００９４】
（実施例９）
架橋ＨＡゲルの弾性係数（Ｇ’）に対するＣＭＣ滑沢剤又は遊離ＨＡ滑沢剤の影響力
この実施例では、ＨＡゲルの弾性係数（Ｇ’）に対するＣＭＣ滑沢剤及び遊離ＨＡ滑沢剤の影響力を検討した。この目的のために、実施例８と同じゲルのＧ’（１Ｈｚ、２５℃における）を測定した。
【００９５】
ＣＭＣの添加によりＧ’はわずかに増加するが、一方、遊離ＨＡの添加によりＧ’が減少することが見出された（図２を参照のこと）。Ｇ’のパラメータは充填剤のリフティング能力に影響を及ぼすため、Ｇ’を維持することは重要である。このように、ＣＭＣを用いて軽微ではあるが増加が観察されたため、１５％（ｖ／ｖ）ＣＭＣを含むＭＨＡＧゲルは、いったん皮膚下に入るとあまり置換されず、そのため、より「リフト」するという結果をもたらすことが期待される。
【００９６】
（実施例１０）
架橋ＨＡゲルの粘度に対するＣＭＣ滑沢剤又は遊離ＨＡ滑沢剤の影響
この実施例では、粘度に対するＣＭＣ滑沢剤及び遊離ＨＡ滑沢剤の影響を検討した。この目的のために、実施例８と同じゲルに関して、粘度（０．４Ｈｚ、２５℃における）を決定した。
【００９７】
ＣＭＣの添加により粘度は増加するが、一方、遊離ＨＡの添加により粘度がわずかに減少することが見出された（図３を参照のこと）。粘度が増加すると、軟部組織内でのゲルの拡散が制限されるため、粘度もまた充填剤組成物の重要なパラメータであり、ボリューム増加効果にも寄与する。
【００９８】
（実施例１１）
架橋ＨＡ／ＣａＨＡＰゲルの押出力に対するＣＭＣ滑沢剤又は遊離ＨＡ滑沢剤の効果
カルシウムヒドロキシアパタイト（ＣａＨＡＰ）粒子の添加により、ＣＭＣ又は遊離ＨＡを架橋ＨＡゲルに添加することにより得られた上記結果が変化するかどうかを研究するために、以下のゲルを調製した：ＭＨＡＩ（架橋ＨＡ及びＣａＨＡＰ粒子を含む；実施例１を参照のこと）、１０％  ＣＭＣを含むＭＨＡＩ（実施例５）及び１０％遊離ＨＡを含むＭＨＡＩ（実施例７）。加えて、「希釈ＭＨＡＩ」ゲルを調製したが、これは、希釈ＭＨＡＩゲルが１５ｍｇ／ｇのＨＡ濃度を有することを除いて、ＭＨＡＩゲルに相当する。次に、上述のゲルの押出力を測定した。
【００９９】
１０％  ＣＭＣ滑沢剤の添加により、押出力が著しく減少することが見出された。この減少は、遊離ＨＡについて観察された減少よりわずかに大きかった。加えて、ＣＭＣ又は遊離ＨＡ滑沢剤の使用により、低濃縮のＨＡマトリックスを有する「希釈ＭＨＡＩゲル」について観察された減少と同様の押出力の減少がもたらされる（図４を参照のこと）ことに留意されたい。
【０１００】
したがって、ＣａＨＡＰ粒子を架橋ＨＡゲルに組み込むことにより、ＣａＨＡＰ粒子を含まない架橋ＨＡゲルについて観察された基本的な結果は変化しないが、しかしながら押出力の減少はＣａＨＡＰ粒子を含むＨＡゲルの場合に、よりはっきりと示された。
【０１０１】
（実施例１２）
架橋ＨＡ／ＣａＨＡＰゲルの弾性係数（Ｇ’）に対するＣＭＣ滑沢剤又は遊離ＨＡ滑沢剤の影響力
この実施例では、架橋ＨＡ／ＣａＨＡＰゲルの弾性係数（Ｇ’）に対するＣＭＣ滑沢剤又は遊離ＨＡ滑沢剤の影響力を検討した。この目的のために、実施例１１と同じゲルに関して、Ｇ’（１Ｈｚ、２５℃における）を決定した。
【０１０２】
１０％  ＣＭＣの添加により、結果としてＧ’が非常に大きく増加することが見出された。対照的に、１０％遊離ＨＡの添加はＧ’の軽微な減少を伴い、ＨＡマトリックスの希釈により弾性係数の大きな低下に至り、これによりゲルの特性及び臨床成績は大幅に変化する（図５を参照のこと）。
【０１０３】
上述のように、高Ｇ’を有するゲルは、結果としてより良好なボリューム増加効果をもたらす。したがって、この実施例は、ＣＭＣ滑沢剤の架橋ＨＡ／ＣａＨＡＰゲルへの添加により、結果として優れたリフティング能力がもたらされることを示している。
【０１０４】
（実施例１３）
架橋ＨＡ／ＣａＨＡＰゲルの粘度に対するＣＭＣ滑沢剤又は遊離ＨＡ滑沢剤の影響
この実施例では、架橋ＨＡ／ＣａＨＡＰゲルの粘度に対するＣＭＣ滑沢剤又は遊離ＨＡ滑沢剤の影響を検討した。この目的のために、実施例１１と同じゲルに関して、粘度（０．４Ｈｚ、２５℃における）を決定した。
【０１０５】
１０％  ＣＭＣの添加により、結果として粘度が大きく増加するが、一方、ＨＡの添加はわずかな影響力しか持たないことが見出された。予想の通り、ＨＡマトリックスの希釈により、結果として約７５％以上の粘度損失がもたらされる。
【０１０６】
この点において、添加したＣＭＣ滑沢剤の濃度は、以下の実施例１４に示すように、必要とされる押出力に応じて調節され得ることに注目すべきである。
【０１０７】
（実施例１４）
架橋ＨＡ／ＣａＨＡＰゲルの押出力に対するＣＭＣ滑沢剤濃度の変化の影響
この実施例では、添加ＣＭＣ滑沢剤の濃度変化と押出力との相関関係を検討した。この目的のために、以下のゲルに関する押出力を測定した：ＭＨＡＩ（架橋ＨＡ／ＣａＨＡＰゲル；実施例１）、５％  ＣＭＣを含むＭＨＡＩ（実施例４）、１０％  ＣＭＣを含むＭＨＡＩ（実施例５）、及び１５％  ＣＭＣを含むＭＨＡＩ（実施例６）。
【０１０８】
５％のみのＣＭＣの添加で押出力は著しく低減されるが、１０％  ＣＭＣの添加により更に低減され、１５％  ＣＭＣの添加によりまた更に低減され得ることが見出された（図７を参照のこと）。
【０１０９】
全般に、上記実施例１〜１４は、ＨＡゲルの希釈により押出力が低減されるが、弾性係数（Ｇ’）及び粘度の大きな減少にも関連し、これにより充填剤の臨床成績は劇的に損なわれることを示している。この試験は、遊離ＨＡを滑沢剤として添加した場合、押出力は低下するが、残念ながら、Ｇ’及び粘度の軽微から中等度の減少も伴うことを更に示している。
【０１１０】
対照的に、ＣＭＣを本発明に基づく滑沢剤として使用した場合、驚いたことに、これにより押出力が強度に低減されるだけでなく、特に分散粒子（ＣａＨＡＰ粒子）を含む架橋ＨＡゲルの場合に、Ｇ’及び粘度の増加にも至ることが見出された。Ｇ’の増加及び粘度の増加の両方により、結果として、注入時の皮膚充填剤組成物の改善されたリフティング効果がもたらされる。更に、ＨＡゲルの架橋性質のため、人体中における長期の持続性が得られる。
【０１１１】
したがって、上に提示される試験により、本発明に基づく皮膚充填剤組成物が、最適なバランスの寿命、リフティング能力及び注入の容易さを実現するという証拠が提供される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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