(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物高分子を分離するための、タンパク質および他の非核酸を保持するが核酸は保持しない吸着剤であって、ポリ（アリールメタクリレート）、ポリ（アリールアクリレート）、ポリ（ヘテロアリールメタクリレート）、およびポリ（ヘテロアリールアクリレート）からなる群から選択されるポリマーで少なくとも部分的に覆われた、または形成されたシラン化物質を含む、吸着剤。
【請求項２】
前記シラン化物質は、シラン化シリカ粒子、シラン化シリカファイバ、およびシラン化シリカのモノリシックな膜または構造からなる群から選択される無機物質である、請求項１に記載の吸着剤。
【請求項３】
前記シラン化物質は、多孔質有機物質および多孔質有機膜からなる群から選択される有機物質である、請求項１に記載の吸着剤。
【請求項４】
前記ポリマーは、ベンジルメタクリレート、アニソールメチルメタクリレート、フェニルエタノールメタクリレート、ピリジンメチルメタクリレート、およびナフタレンメチルメタクリレートからなる群から選択される反復ユニットを含む、請求項２または３に記載の吸着剤。
【請求項５】
前記吸着剤は６５°〜１００°の範囲の濡れ性値を有する、請求項１に記載の吸着剤。
【請求項６】
前記吸着剤の比表面積は０．１ｍ２〜１３０ｍ２の範囲である、請求項１に記載の吸着剤。
【請求項７】
前記シラン化物質には、平均孔径が１ｎｍ〜１００ｎｍの範囲のシラン化シリカ粒子が含まれる、請求項１に記載の吸着剤。
【請求項８】
前記平均孔径は３０ｎｍである、請求項７に記載の吸着剤。
【請求項９】
前記シラン化物質には平均直径が２００ミクロン未満のシラン化シリカ粒子が含まれる、請求項１に記載の吸着剤。
【請求項１０】
前記平均直径は１５ミクロンである、請求項９に記載の吸着剤。
【請求項１１】
請求項１に記載の吸着剤を含む成形品であって、微粒子状、モノリシック状、または膜状から選択される形状で、前記吸着剤の平均介在間隔は１０ｎｍ超である、成形品。
【請求項１２】
前記平均介在間隔は１２ミクロン未満である、請求項１１に記載の成形品。
【請求項１３】
前記成形品は膜形状で、前記吸着剤は多孔質の有機または無機のマトリックスに組み込まれている、請求項１２に記載の成形品。
【請求項１４】
ポリ（ベンジルメタクリレート）で少なくとも部分的に覆われたシラン化シリカを含む、タンパク質および他の非核酸を保持するが核酸は保持しない吸着剤を作成する方法であって、
シリカをジメチルビニルクロロシランのトリフルオロトルエン溶液に懸濁するステップと；
前記液体を取り除き、前記シリカを新規のジメチルビニルクロロシランのトリフルオロトルエン溶液に再懸濁するステップと；
前記液体をオプションとして取り除き、前記シリカを再度、新規の５％のジメチルビニルクロロシランのトリフルオロトルエン溶液に再懸濁するステップと；
結果として生じるシラン化シリカを集め、乾燥させるステップと；
前記シラン化シリカ、ベンジルメタクリレート、およびペルオキソ二硫酸カリウムを、ステアリン酸ナトリウムの撹拌水溶液に加えるステップと；
結果として生じる、ポリ（ベンジルメタクリレート）で覆われたシラン化シリカを含む吸着剤を集め、乾燥させるステップと、を含む方法。
【請求項１５】
生物高分子を分離するための吸着剤であって、前記吸着剤は、ポリ（アリールメタクリレート）、ポリ（アリールアクリレート）、ポリ（ヘテロアリールメタクリレート）、およびポリ（ヘテロアリールアクリレート）からなる群から選択されるポリマーで少なくとも部分的に覆われた、または形成された、シラン化物質を含み、前記吸着剤の平均介在間隔は６μｍ超および２３μｍ未満、孔径は１０ｎｍ超および２００ｎｍ未満、ならびに比表面積は０．１ｍ２超および１５０ｍ２以下である、請求項１〜１０のいずれかに記載の吸着剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
ＤＮＡはヌクレオチドと呼ばれるサブユニットからなるアニオン性ポリマーであり、これはともに核酸と呼ばれる分子を形成する。ＤＮＡは1871年にFriedrich Miescherより最初に特定および単離された。ＤＮＡの二重らせん構造は、1953年にJames WatsonとFrancis Crickにより推測された。
【背景技術】
【０００２】
天然のヌクレオ塩基は、４つのサブユニット、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、およびチミン（Ｔ）のうちの１つであり得る。二重鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）は、ホスホジエステル結合により連結した、交互のリン酸残基および糖残基の骨格を有する異なるヌクレオチド塩基（例えば、AGTCATCGTAGCT）を備える２本の長いヌクレオチド鎖を含む。ヌクレオ塩基は２種類に分類され、それは、縮合5および6員複素環式化合物であるプリン、つまりＡおよびＧと、ピリミジン、つまり6員環のＣおよびＴである。
【０００３】
ＤＮＡの二重らせんでは、一方の鎖の各種類のヌクレオ塩基は、もう一方の鎖の１種類のヌクレオ塩基とのみ水素結合する。これは、相補的塩基対合と呼ばれる。ここで、プリンはピリミジンに対し水素結合を形成し、アデニンは、２つの水素結合を介してチミンとのみ選択的に結合し、シトシンは３つの水素結合によりグアニンに結合する。この二重鎖逆平行構造（ｄｓＤＮＡ）は、主に鎖内塩基スタッキング相互作用により維持され、これはＧ、Ｃ配列で最も強力である。ｄｓＤＮＡ形の安定性は、ＧＣ含有量（％Ｇ、Ｃ塩基対）だけでなく、配列（スタッキングが配列特異的であるため）にも長さ（より長い分子がより安定的である）にも左右される。安定性は、種々の方法で測定することが可能である。一般的な方法は「融解温度」であり、これは、二本鎖分子の５０％が一本鎖分子に変換される温度である。融解温度は、ＤＮＡのイオン強度および濃度に左右される。結果として、ＤＮＡの２本の鎖の間の会合強度を決定するのは、ＧＣ塩基対率とＤＮＡ二重らせんの全体の長さの両方である。ＧＣ含有量の高い長いＤＮＡらせんは、より強固に相互作用する鎖を有する一方、ＡＴ含有量の高い短いらせんはより弱く相互作用する鎖を有する。この相補的塩基対の間の可逆的で特異的な相互作用は、生体のＤＮＡの全ての機能にとって重要である。
【０００４】
ＤＮＡ二重らせんの二本の鎖は、互いに反対の方向（逆平行）に進み、一方の骨格は3’（3プライム）であり、もう一方は5’（5プライム）であり、5’末端は終端リン酸基を有し、3’末端は終端ヒドロキシル基を有する。遺伝情報をコードするのは骨格に沿ったこれら４つのヌクレオ塩基の配列であり、これはタンパク質内のアミノ酸配列を規定する。
【０００５】
全種のＤＮＡ構造は２つのらせん状鎖を含み、これらはそれぞれ同じ軸に巻きつき、それぞれピッチは３４オングストローム（３．４ナノメートル）で、半径は２２オングストローム（２．２ナノメートル）である。
【０００６】
鎖は互いに対し対照的に位置していないので、サイズの異なる２つの溝が構造内に見られる。一方の溝である主溝の幅は２２Åであり、もう一方の溝である副溝の幅は１２Åである。副溝の狭さは、主溝の塩基の端がよりアクセスしやすいことを意味する。結果として、二重鎖ＤＮＡの特定の配列に結合することが可能な転写因子のようなタンパク質は、通常、主溝で露呈した塩基の側に接触する。
【０００７】
他の生物高分子および低分子化合物からＤＮＡをワンステップ分離するための吸着剤には、溶液、懸濁液、組織抽出物、および固定化サンプルを含む生体サンプルからの迅速な、および／または自動化されたＤＮＡ分析を助けることが求められてきた。一部のアプリケーションでは、該剤がＤＮＡまたは非ＤＮＡ不純物の何れかの選択的保持を可能にし、それによりＤＮＡの精製を潜在的に容易にすることがさらに望ましい。
【発明の概要】
【０００８】
本開示の実施形態は、チャネルを介した単一流路における生物高分子の、ワンステップ分離のための吸着剤に関する。吸着剤は、ポリ（アリールメタクリレート）、ポリ（アリールアクリレート）、ポリ（ヘテロアリールメタクリレート）、ポリ（ヘテロアリールアクリレート）からなる群から選択されるポリマー、およびそれらのコポリマーで少なくとも部分的に覆われているシラン化無機物質を含む。該物質の表面に特異な構造を作成するための、粒度、疎水性モノマーユニット、および親水性のモノマーユニットの組み合わせの使用について、本明細書に記載する。新しいコモノマーユニットが、重合および表面固定化の前の表面特性調整に対しワンポット（one-pot）解を提供する。本開示全体で、血液を例示的なサンプル型としてのみ用い、他のサンプル型には、限定されるわけではないが、組織、スワブ、痰、および尿が含まれる。本明細書で記載するサンプル型は、本開示の使用範囲を決して限定しない。
【０００９】
望ましい性能特徴のうち少なくとも一部を提供する物質および手法には、限定されるわけではないが、細孔、多孔シリコンナノ構造（一体構成物）、および硬質な鋳型／膜生成物を作成するための、バルク多孔質ポリマー、ゲル、電界紡糸マット／プラグ、ポリマーの共押出し、犠牲塩、または溶解可能なポリマーが含まれる。
【００１０】
本明細書で用いる場合、「アリール」は単環式炭素環（全て炭素）または多環式炭素環の芳香族環系（２つの炭素環が化学結合を共有する縮合環系を含む）を指し、これは全ての環で完全非局在化パイ電子系を有する。アリール基中の炭素原子の数は変更可能である。例えば、アリール基はC6-C14アリール基、C6-C10アリール基、またはC6アリール基とすることが可能である。アリール基の例としては、限定されるわけではないが、ベンゼン、ナフタレン、およびアズレンが挙げられる。アリール基は非置換または置換、例えば、メチルまたはメトキシで置換することができ、より大きい分子の他の部分へのアリール基の結合は、アリール環または置換基を介して可能である。置換されるアリール基の例としては、ベンジル、ヒドロキシベンジル、2-フェニルエチル、ベンズヒドリル、トリフェニルメチル、アニソールメチル、フェニルエタノールおよびナフタレンメチルが挙げられる。
【００１１】
本明細書で用いる場合、「ヘテロアリール」は、単環式または多環式の芳香族環系（完全非局在化パイ電子系を有する環系）を指し、これは１つまたは複数のヘテロ原子（例えば、１つ、２つ、または３つのヘテロ原子）、つまり、限定されるわけではないが窒素、酸素、および硫黄を含む炭素以外の元素を含む。ヘテロアリール基の環における原子数は変更可能である。例えば、ヘテロアリール基は、環において４〜１４個の原子を、環において５〜１０個の原子を、または環において５〜６個の原子を含むことが可能である。さらに、用語「ヘテロアリール」には、少なくとも１つのアリール環と少なくとも１つのヘテロアリール環、または少なくとも２つのヘテロアリール環といった２つの環が少なくとも１つの化学結合を共有している、縮合環系が含まれる。ヘテロアリール環の例としては、限定されるわけではないが、フラン、フラザン、チオフェン、ベンゾチオフェン、フタラジン、ピロール、オキサゾール、ベンゾオキサゾール、1,2,3-オキサジアゾール、1,2,4-オキサジアゾール、チアゾール、1,2,3-チアジアゾール、1,2,4-チアジアゾール、ベンゾチアゾール、イミダゾール、ベンゾイミダゾール、インドール、インダゾール、ピラゾール、ベンゾピラゾール、イソキサゾール、ベンゾイソオキサゾール、イソチアゾール、トリアゾール、ベンゾトリアゾール、チアジアゾール、テトラゾール、ピリジン、ピリダジン、ピリミジン、ピラジン、プリン、プテリジン、キノリン、イソキノリン、キナゾリン、キノキサリン、シンノリン、およびトリアジンが含まれる。ヘテロアリール基は、置換または非置換、例えば、メチルまたはメトキシで置換することができ、より大きい分子の他の部分へのヘテロアリール基の結合は、ヘテロアリール環または置換基を介して可能である。ピリジンメチルおよびチオフェン-3-イルメチルが、置換されているヘテロアリール基の例である。
【００１２】
一態様において、本明細書で提供する開示は生物高分子を分離するための吸着剤に関する。吸着剤は、ポリ（アリールメタクリレート）、ポリ（アリールアクリレート）、ポリ（ヘテロアリールメタクリレート）、ポリ（ヘテロアリールアクリレート）からなる群から選択されるポリマー、およびそれらのコポリマーで少なくとも部分的に覆われている、または該ポリマーで形成されているシラン化物質を含み得る。
【００１３】
一変形形態では、シラン化無機物質は、シラン化シリカ粒子、シラン化シリカファイバ、およびシラン化シリカ膜からなる群から選択される。
【００１４】
一変形形態では、シラン化物質は、多孔質有機物質および多孔質有機膜からなる群から選択される有機物質である。
【００１５】
別の変形形態では、ポリマーは、アニソールメチルメタクリレート、フェニルエタノールメタクリレート、ピリジンメチルメタクリレート、およびナフタレンメチルメタクリレートからなる群から選択される反復ユニットを含む。
【００１６】
別の変形形態では、吸着剤の濡れ性値は約６５°〜約１００°の範囲である。
【００１７】
別の変形形態では、吸着剤の表面積は約０．１ｍ２〜約１３０ｍ２の範囲である。
【００１８】
別の変形形態では、シラン化無機物質には、平均孔径が約１ｎｍ〜約１００ｎｍの範囲であるシラン化シリカ粒子が含まれる。
【００１９】
一実施形態では、平均孔径は約３０ｎｍである。
【００２０】
別の変形形態では、シラン化無機物質には平均直径が約２００ミクロン未満であるシラン化シリカ粒子が含まれる。
【００２１】
一実施形態では、平均直径は約１５ミクロンである。
【００２２】
別の実施形態では、成形品（article）を開示する。該成形品には、ポリ（アリールメタクリレート）、ポリ（アリールアクリレート）、ポリ（ヘテロアリールメタクリレート）、ポリ（ヘテロアリールアクリレート）およびそれらのコポリマーからなる群から選択されるポリマー、で少なくとも部分的に覆われているシラン化無機物質を含む、上記吸着剤が含まれる。
【００２３】
成形品は、微粒子状、モノリシック状、または膜状から選択される形状とすることができる。平均介在距離は約１０ｎｍ超とすることができる。
【００２４】
ある変形形態では、平均介在距離は約１２ミクロン未満である。
【００２５】
別の変形形態では成形品は膜の形状をしており、吸着剤は多孔質の有機または無機のマトリックスに組み込まれている。
【００２６】
ポリ（ベンジルメタクリレート）で少なくとも部分的に覆われたシラン化シリカを含む吸着剤を作成する方法を開示する。該方法は、シリカをジメチルビニルクロロシランのトリフルオロトルエン溶液に懸濁するステップと；前記液体を取り除き、前記シリカを新規のジメチルビニルクロロシランのトリフルオロトルエン溶液に再懸濁するステップと；前記液体をオプションとして取り除き、前記シリカを再度、新規の５％のジメチルビニルクロロシランのトリフルオロトルエン溶液に再懸濁するステップと；結果として生じるシラン化シリカを集め、乾燥させるステップと；前記シラン化シリカ、ベンジルメタクリレート、およびペルオキソ二硫酸カリウムを、ステアリン酸ナトリウムの撹拌水溶液に加えるステップと；結果として生じる、ポリ（ベンジルメタクリレート）で覆われたシラン化シリカを含む吸着剤を集め、乾燥させるステップとを含む。
【００２７】
さらに別の態様では、本明細書で提供する開示は、生体サンプルを溶解し、前記生体サンプルから核酸を単離するための二重処理（dual processing）装置に関する。該装置は、サンプルインプットユニット、サンプル溶解ユニット、核酸抽出ユニット、および核酸受付ユニットを含む。核酸抽出ユニットは、ポリ（アリールメタクリレート）、ポリ（アリールアクリレート）、ポリ（ヘテロアリールメタクリレート）、ポリ（ヘテロアリールアクリレート）およびそれらのコポリマーからなる群から選択されるポリマー、で少なくとも部分的に覆われた、または該ポリマーで形成されたシラン化物質を含む。前記シラン化物質は、生体サンプル由来のタンパク質および他の非核酸を保持し、かつ核酸が核酸受付ユニットに入ることができるように構成される。
【００２８】
一変形形態では、サンプル溶解ユニットは、生体サンプルを溶解するようにサンプル溶解ユニット内で回転するように構成されたブレードを含む。
【００２９】
一変形形態では、サンプル溶解ユニットはビーズを含む。
【００３０】
一変形形態では、装置はさらに、サンプル溶解ユニットのブレードの回転を制御するように構成されたスプリング搭載プランジャを含む。
【００３１】
一変形形態では、装置はさらに、生体サンプルをサンプル溶解ユニットおよび／または核酸抽出ユニットで処理する際に移動キャリヤとして機能するように構成された緩衝液を含む。
【００３２】
一変形形態において、核酸受付ユニットはキャップを含む。
【００３３】
一変形形態において、キャップは、装置から取り外すことが可能な加圧封止された（pressure sealed）キャップである。
【００３４】
さらに別の態様では、本明細書で提供する開示は、生物高分子を分離するための吸着剤に関する。吸着剤は、ポリマーで少なくとも部分的に覆われた、または該ポリマーで形成された、シラン化物質を含み、該吸着剤の平均介在間隔は約６μｍ超および約２３μｍ未満、孔径は約１０ｎｍ超および約２００ｎｍ未満、ならびに表面積は約０．１ｍ２超および約１５０ｍ２以下である。
【００３５】
種々の実施形態を、例示を目的として付随の図面に描くが、これは実施形態の範囲を限定するものとして決して解釈されるべきではない。さらに、開示の異なる実施形態の種々の特徴を組み合わせて追加の実施形態を形成することが可能であり、これも本開示の一部である。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】蛍光強度により決定される接触角の関数としてのタンパク質吸着を示す。
【図２】アルキルシランへの露呈時間の変更に伴う、Si/SiO2基板に置いたナノピュア水の液滴の接触角の変化を示す図である。
【図３ａ】本研究から得られる典型的なＡＦＭ画像を示す図である。７０°超の接触角がＤＮＡの付着を防ぐことが示された。
【図３ｂ】本研究から得られる典型的なＡＦＭ画像を示す図である。６０°を下回る値は、物質の大規模な堆積をもたらす。
【図４】表面濡れ性の関数としての、画分中のＤＮＡおよびタンパク質の定量化を示す図である。
【図５】ある範囲のポリマー系で研究されたベンジルメタクリレートの３つの誘導体から集めた画分における、ＤＮＡおよびタンパク質の濃度を示す図である。
【図６】カラムの例を示す図である。左；平均介在間隔／表面積が特定の基準から外れ、カラムを直進する溶解物が見える例。右；平均介在間隔／表面積が接触し、カラムを実質的に通過する溶解物は明確ではない例。
【図７】電界紡糸ポリマー、モノリシックカラム、およびモノリシックブロックから集めた溶出液に由来するＰＣＲ生成物のアガロースゲル画像を示す図である。「＋」はゲノムＤＮＡを加えたＰＣＲ混合物であり、「−」は水を加えたＰＣＲ混合物である。一部のバンドはディスプレイの質により部分的に見えづらいことに注意すること。
【図８】電界紡糸ポリマー、モノリシックカラム、およびモノリシックブロックから集めた溶出液に由来するＰＣＲ生成物のアガロースゲル画像を示す図である。「＋」はゲノムＤＮＡを加えたＰＣＲ混合物であり、「−」は水を加えたＰＣＲ混合物である。一部のバンドはディスプレイの質により部分的に見えづらいことに注意すること。
【図９】粒子の広範な分布を示すグラフである。
【図１０】比較例を表す抽出物における粒子の広範な分布を示す電子顕微鏡画像である。
【図１１】多孔質ベアシリコン（左）、シラン改質多孔質シリコン（中）、およびベンジルメタクリレートにより改質した多孔質シリコン（右）を示す図である。
【図１２】多孔質ベアシリコンのＡＦＭ分析を示す図である。
【図１３】ベンジルメタクリレートにより改質した多孔質シリコンのＦＴ−Ｉｒスペクトル（３５００〜２０００ｃｍ−１領域）を示す図である。
【図１４】ベンジルメタクリレートにより改質したシリカ粒子のＦＴ−Ｉｒスペクトル（３５００〜２０００ｃｍ−１領域）を示す図である。
【図１５】ポリベンジルメタクリレートの電界紡糸ファイバのＳＥＭ画像である。ＳＥＭ倍率は１８０ｘ（左）および２．０１ｋｘ（右）である。
【図１６】バルクモノリスのＳＥＭ画像である（左パネル：ＳＥＭ倍率は４．９７ｋｘであり、右パネル：ＳＥＭ倍率は９．９９ｋｘである）。
【図１７】ある範囲の多孔質モノリスを示すＳＥＭ分析結果である。左：ベンジルメタクリレートモノマー上に構成されたモノリスのＳＥＭ画像、中央：ベンジルメタクリレートおよびブチルメタクリレートの５０：５０混合物のＳＥＭ画像、右：ブチルメタクリレート上に構成されたモノリスのＳＥＭ画像。
【図１８】ＤＮＡ抽出カセット（ＤＥＣ）およびＤＥＣにより生成された画分を示す図である。
【図１９】in-situで形成された代替充填材のない、そのため構造および容器が独立的な、モノリス調製物を示す図である。
【図２０】生体サンプルを溶解し、次に溶解物を吸着フィルタに通過させることの両方が可能な二重処理装置の実施形態を示す図である。
【図２１】連続流路ＤＥＣを用いた大腸菌抽出物を示す図である。
【図２２】図２２Ａは、血液Ｑ-フィルタと代替装置の間のＤＮＡ濃度の比較データを示す図である（血液Ｑ-フィルタ対代替装置）。図２２Ｂは、組織（ピンチ生検法）についての、Ｑ-フィルタおよび代替装置からのＤＮＡ収率を比較したデータを示す図である（血液Ｑ-フィルタ対代替装置）。図２２Ｃは、細菌プラスミドについての、Ｑ-フィルタおよび代替装置からのＤＮＡ収率を比較したデータを示す図である（血液Ｑ-フィルタ対代替装置）。図２２Ｄは、頬スワブについての、Ｑ-フィルタおよび代替装置からのＤＮＡ収率を比較したデータを示す図である（血液Ｑ-フィルタ対代替装置）。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
血液溶解物中の遊離ＤＮＡは、高感度の分子分析が容易にアクセスできるものではない。溶解血液は、脂質、タンパク質、塩、他の細胞物質、および非細胞物質の非常に複雑な混合物である、この物質の多くは、核酸（ＤＮＡ／ＲＮＡ）のダウンストリーム解析にとって阻害的である。この複雑な溶解混合物から核酸を精製することにより、分子技法および非分子技法による解析が可能になる。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応の生化学は、血液溶解物中に存在するヘモグロビンにより阻害される。血液溶解物からのＤＮＡの精製はヘモグロビンを取り除き、ＰＣＲを著しく効率的に行えるようにする。一部のアプリケーションでは、物質がＤＮＡまたは非ＤＮＡの不純物の何れかの選択的保持を可能にすることにより、ＤＮＡの精製を容易にすることがさらに望ましい。
【００３８】
サンプル由来のＤＮＡの配列および生物学を研究または解析するため、通常は、臨床サンプルまたは生体サンプルの核酸をその他のもの（つまり、脂質、炭水化物、タンパク質などの他の細胞成分）から抽出または単離することが必要である。このやり方でＤＮＡの単離を達成するための標準的な手法は、アプリケーションおよびサンプル型によって異なるバリエーションを持つプロトコルからなり、ＤＮＡを解放するための細胞破壊または細胞溶解で始まる。これは一般的に、機械的溶解（粉砕、または液体窒素中での組織粉砕など）、音波破砕、酵素的、または化学的（サンプルへのカオトロピック塩（例えば、グアニジンチアオシアネート）の添加など）により達成される。細胞脂質膜および他の脂質は、通常、界面活性剤を加えることにより除去され、タンパク質は、通常とは異なり、プロテアーゼ（プロテイナーゼＫなど（オプションだが、たいてい行われる））を加えることにより除去される。水飽和フェノール、クロロホルムは、水性サンプルと溶液の混合物を遠心分離により相分離させることを可能にし、これには、上水相を生じさせながらタンパク質は有機相に残すことが含まれる。最後のステップでは、氷冷2-プロパノールまたはエタノールを用いた沈殿によりＲＮＡが水相から回収される。ＤＮＡはグアニジンチアオシアネートがない場合は水相にあるだろう。ＤＮＡはこれらのアルコールには溶けないため沈殿および凝集し、遠心分離によりペレットを提供するだろう。このステップはまた、アルコール可溶塩を除去する。Mg2+およびCa2+などの二価カチオンを隔離するためにキレート剤を加えることにより、ＤＮＡｓｅ酵素がＤＮＡを分解するのを防ぐ。ＤＮＡに結合した細胞タンパク質およびヒストンタンパク質は、プロテアーゼを加えるか、または、酢酸ナトリウムもしくは酢酸アンモニウムでタンパク質を沈殿させるか、または、ＤＮＡ沈殿の前にフェノール−クロロホルム混合物で抽出することの何れかにより除去することが可能である。
【００３９】
別の方法では、ＤＮＡは、高濃度カオトロピック塩の存在下で結合するというその機能により（どの溶解法を用いるかに関係なく）溶解物から単離される。ＤＮＡは任意のシリカ表面に、それが、マイクロ流体カセットを有するピラー、シリカ被覆常磁性ビーズ、スピンカラム内のシリカフィルタ、または他のシリカ表面であれ、結合することが可能である。カオトロピック塩は次にアルコール系洗浄剤で除去され、ＤＮＡは、ＴＥ緩衝液（トリスヒドロキシメチルアミノメタン（「Ｔｒｉｓ」）からなる緩衝液）およびエチレンジアミン四酢酸（「ＥＤＴＡ」）などのイオン強度の低い溶液または水に溶出される。ＤＮＡは脱水および水素結合の形成によりシリカに結合し、これは弱い静電反発と競合する。つまり、高濃度の塩は、シリカへのＤＮＡ吸着を促進し、低濃度はＤＮＡを解放するだろう。ＤＮＡがシリカ表面に結合するため、Ｈ２ＯまたはＴＥ緩衝液の何れかにおいてシリカに結合したＤＮＡを溶出する前に、細胞破片および他の破片の残りは洗浄緩衝液で容易に洗い流される。
【００４０】
ＣＨＡＲＧＥＳＷＩＴＣＨ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）手法では、溶解物中で（負に帯電したリン酸骨格を介して）負に帯電したＤＮＡが、低ｐＨ（＜６．５）で正の電荷を必要とする特別なリガンドに結合する。タンパク質および他の不純物が、水緩衝液の使用によりＣＨＡＲＧＥＳＷＩＴＣＨ（登録商標）結合核酸から除去される。次に、周囲の媒質のｐＨを上げ（＞８．５）正の電荷を中和した際に、核酸はＣＨＡＲＧＥＳＷＩＴＣＨ（登録商標）リガンドから解放され得る。
【００４１】
ＮｅｘｔｔｅｃＤＮＡ単離システムでは、細胞溶解後４分以内に、単一遠心分離ステップでＤＮＡを精製することが可能である。それは、現在用いられている他のＤＮＡ単離システムよりも最大で５倍速い。これは専売特許の吸着マトリックスを介して可能であり、これはシリカに基づく方法とは逆に、タンパク質および低分子量物質などの阻害物質を保持し、溶解サンプル中の純ＤＮＡが通過できるようにする。この方法の１つの制約は、それが６０℃での長い酵素溶解ステップに依存することである。
【００４２】
複雑な混合物の分離は、典型的には、クロマトグラフィー法を用いて行われる。ここでは、液体およびサンプルの混合物を、吸着剤を充填したカラムに通し、サンプル成分を分離させる。カラムの活性成分、吸着剤は、典型的には、サイズが２〜５０ミクロメートルの固体粒子（例えば、シリカ、ポリマー）でできている粒状物質である。サンプル混合物の成分は、吸着粒子との相互作用度の違いにより互いに分離する。液体は典型的には溶媒（例えば、水、緩衝液、アセトニトリル、および／またはメタノール）の混合物であり、移動相（mobile phase）と言われる。その組成物および温度が、サンプル成分および吸着剤の間で起きる相互作用に影響を与えることにより、分離プロセスにおいて主要な役割を果たす。これらの相互作用は、事実上物理的であり、例えば、疎水性（分散性）、双極子−双極子、およびイオン性、ほとんどの場合は組み合わせである。
【００４３】
カラムクロマトグラフィーで用いられるシリカ粒子は、典型的には、テトラエトキシシランから形成されており、これは部分的に加水分解されてポリエトキシシロキサンとなり、激しい撹拌によりエタノール水混合物に乳化する強粘液を形成する。この撹拌は球状に形成された粒子を生成し、これらの球体は、表面のシラノール種を介して広範囲の架橋を引き起こす触媒誘導加水分解縮合（ウンガー（Unger）法）を介して、シリカヒドロゲルに変換される。ヒドロゲル球体を次に加熱（乾燥）してキセロゲルを生成する。ｐＨ、温度、触媒、および溶媒、ならびにシリカゾル濃度が全て作用して、高多孔質シリカキセロゲル（時にゾルゲルとも呼ばれる）物質の粒径および孔径を制御する。
【００４４】
代替プロセスではシリカミクロ粒子を用い、該粒子は次に尿素／ホルムアルデヒド試薬を用いて溶液中に凝集させて、凝集小球からなる粒子、いわゆる「sil-gel」物質を生成する。ミクロ粒子の濃度および直径、ならびに反応条件が、結果として生じるsil-gel粒子の粒度および孔径を制御する。
【００４５】
シリカ球体の粒度はシリカ物質の効率を制御し、該粒度はシリカ粒子の平均直径を指す。背圧は粒度に反比例し、クロマトグラフィー効率は粒度に反比例する。
【００４６】
小粒子（＜２μｍ）は、典型的には、より長いカラムを用いた高分解能分離、または、より短いカラムを用いた高速分離に用いられる。一方、５〜１０μｍの粒子は、複雑度のより低いサンプルのルーチン解析、または、分析物収容量（積載）が非常に重要な分取クロマトグラフィーで用いられる。
【００４７】
クロマトグラフィー用シリカ粒子は、良好な分析物保持のために必要な特性である、高表面積を有する。大部分の表面積はシリカ粒子の内部細孔構造に含まれ、これは利用可能な表面積の９９％を超える。クロマトグラフィーに用いられるシリカの典型的な表面積は約３３０ｍ２／ｇであり、１５０×４．６ｍｍカラムには１．５ｇものシリカが存在し得る。
【００４８】
粒子の表面積は孔径に反比例するため、孔径が１２０ｎｍである３ｍｍの粒子の表面積は、孔径が３００ｎｍである３μｍの粒子の２倍超となろう。８〜１２ｎｍの範囲の孔径は典型的には小分子（＜３０００Ｄａ）の解析に用いられ、これは細孔に容易に貫入し、シリカ表面の大半にアクセスし得る。これらの小細孔カラムは、ペプチドまたはタンパク質など、そのより大きな流体力学的体積のために細孔に入れない、より大きい分子の解析には有用ではない。典型的には、アクセス可能であるためには、孔径は分析物の流体力学的直径の３倍である必要がある。
【００４９】
理論的には、ファン・デームテルの式（数１）を用いて、分離の物理的、動力学的、および熱力学的特性について、線移動相速度に対する分離カラムの単位長さ当たりの分散を記述することが可能である。ここで、カラムの分解能は、流路および動力学の点から記載される。
【００５０】
【数１】
0006698076.tif 000002
数１
【００５１】
式中、Ｈはプレートの高さであり、λは（充填に関する）粒子形状であり、ｄｐは粒径であり、γ、ω、およびＲは定数であり、Ｄｍは移動相の拡散係数であり、ｄｃはキャピラリ直径であり、ｄｆは膜厚であり、Ｄｓは固定相の拡散係数であり、ｕは線速度である。明らかに、充填材の粒度を低減させることはカラム効率と最適な移動相線速度を高め、より速い解析を可能にする。しかしながら、ミクロ粒子充填材はこのような利点をもたらすものの、それにはまた、カラムにおける圧損失の増加という欠点もある。そのため、充填材の粒度を最適化して、スピードの増加とより高度な分離という利点を生かしながら圧の欠点を緩和しなければならない。
【００５２】
考慮すべき別の重要なパラメータは粒度分布である。粒度は、自動sub-sieve定寸技法を用いて製造業者により実質的に得られる、粒度分布の平均値として記される。実際には、粒子の広範な分布はカラム内の不均一性につながり、そのため分析分子がカラムを通過する際に通る可変経路長を増加させる。
【００５３】
タンパク質が有機表面および無機表面の大部分に物理的に吸収され得ることは周知である。これに関し、有機ポリマーの構造を調整する機会が、表面特性を調整する可能性の大部分である。このような用途では、ポリマーは生物学的な固定または反発のための識別マトリックスとして機能する。モノマーユニットを合成的に改質して、重合後に利用され得るさらなる機能性を導けるということは、濾過基板インターフェース内で特定の役割を果たすように、表面に示される官能基の物理的および化学的な構造を調整する機会を表す。さらに、最近、ナノスケール寸法の物質の製造がますます重視されている。特に、ナノワイヤ、ナノファイバおよびナノチューブなど、高異方形状のポリマーを製造する方法を考案することが着目されている。
【００５４】
ポリマーのナノ構造は、低次元性を有するこれら物質を組み合わせるという潜在的利点のため、高まる関心を引き付けている。ナノメートル領域の寸法の物質は、容易に調整可能な表面特性、高い機械的柔軟性、多くの無機物質よりも優れた生体適合性、および高表面積といった多くの非常に望ましい特性を有する。ナノファイバ膜およびナノファイバ複合物は、延伸、ハード／ソフト鋳型合成、自己組織化、およびエレクトロスピニングなどの多くの方法で製造することが可能である。
【００５５】
鋳型指向型（template-directed）成長がこのような1-Dナノ構造を調製するために最も頻繁に用いられるアプローチであり、いくつかの異なる方法も影響的であることが示されている。ここでは、ポリマーの成長を所望の構造内に導くために外部「膜」が用いられる。種々の代替物がこのプロセスを容易にするために用いられており、これは２つのカテゴリー、「ハード」鋳型または「ソフト」鋳型に大きく分けることが可能である。
【００５６】
「ハード」鋳型の使用はMartinらが先駆者であった。この方法は、ホスト膜としてナノスケールの細孔の使用を必要とし、かなり単純化した次の３ステップアプローチを辿る。１）膜のナノスケール細孔をモノマーで充填する、２）細孔内のモノマーを重合させ、３）純ポリマーを得るために鋳型を取り除く。作成される構造の直径およびモフォロジーは、用いた鋳型の細孔およびチャネルにより決定される。近年で最も一般的に用いられるハード鋳型は、陽極エッチングされた細孔を含むアルミナ膜である（多孔質シリコンが孔径を有する水性または非水性の媒体において結晶シリコンを陽極エッチングすることにより生成され、厚さが電流により決定される）。これらの膜は、比較的高濃度の規則的な六方格子に配置された細孔を有するアルミニウム金属から、調製することが可能である。ある範囲の孔径が合成され、５ｎｍほどの小さいいくつかが報告されている。
【００５７】
このアプローチを用いて、特にMartinのグループが、陽極酸化アルミニウム、多孔質シリコン、およびトラックエッチドポリカーボネート膜を鋳型として用いて、ポリアニリン（ＰＡｎｉ）、ポリピロール（ＰＰｙ）、ポリ（ピロールプロピル酸）、ポリアニリン、およびポリチオフェン（ＰＴｈ）の多くのナノ構造を合成した。このやり方でポリマーナノ構造を作成する唯一の必要条件は、細孔に前駆体物質を装填可能であることである。
【００５８】
これは、対象のモノマーおよび用いる膜により難易度が変わり得る。細孔に装填するのに用いられる別の方法には、負圧、液相注入、気相堆積、または鋳型をモノマー溶液に浸けることが含まれる。後者の方法は、細孔を通過するモノマー量を制御することにより生成される構造の長さを上手く制御することが可能である。モノマー充填細孔の重合は、化学的酸化剤の添加、またはより一般的には電気化学重合を介して達成することが可能である。
【００５９】
ソフト鋳型方法は、比較的単純で、安く、強力な、ポリマーナノ構造を製造するための別のアプローチである。この方法は、ナノスケールポリマー物質の自己組織化を導く、水素結合、ファンデルワース力、π−πスタッキング、配位、および分散力などの非共有結合性相互作用の選択的制御に基づく。今日までに、コロイド状粒子、オリゴマー、石鹸の泡、およびコロイドが全て、ナノ構造のようなワイヤ、リボン、および球体を調製するためのソフト鋳型として実現されてきた。例えば、ＰＰｙナノチューブ（直径〜９４ｎｍ、長さ〜２ｍｍ）は、ナトリウムビス（2-エチルヘキシル）スルホコハク酸（ＡＯＴ）逆円筒状ミセルをソフト鋳型として用いて合成されている。
【００６０】
天然に発生するバイオポリマーなどの既存の1-Dナノ構造も、有用なソフト鋳型またはポリマーナノワイヤの成長を誘導するためのシード（seed）として機能し得る。この方法で製造されるポリマーナノ構造は、しばしば、バイオポリマーコアおよびポリマーシースからなる複合コア−シース物質であり、合成後に鋳型を除去する必要がない。多孔質媒体中での型取りとは対照的に、このアプローチは、ハイブリッド超分子ポリマー、比較的新しい種類の物質を発生させる。高複合超分子構造を自己組織化し、形成する機能のおかげで、生物学的分子は、多くの方式が研究されている超分子ナノスケール構造の構築に用いられる見事なアーセナル（arsenal）を提供する。
【００６１】
エレクトロスピニングは、ポリマーナノファイバを形成することのできる代替法を代表する。ここでは、ポリマー溶液またはポリマー溶融物の液体ジェットの形成を引き起こす高圧のアプリケーション。基本的なエレクトロスピニングセットアップは、３つの主な構成要素：高圧電源、キャピラリ装置、および接地コレクタを有する。ポンプがポリマーをキャピラリの外に押し出す際、高圧電荷が印加され、ノズルにおいてポリマー液の垂滴を帯電させる。キャピラリチューブから流れ出るポリマーへの高電界の印加は表面電荷を引き起こし、これは表面張力を打ち勝つとすぐに細いポリマージェットを射出させ、これはコレクタに向かって移動する。電化ジェットは伸長され、泡立ち、長く細いファイバを生成する。電化ジェットが継続して伸長され、溶媒が蒸発するため、ジェットの直径は数百マイクロメートルから数十ナノメートルまで著しく縮小する。電化ファイバは、不織ファイバマットなどのコレクタプレートに堆積させる。
【００６２】
エレクトロスピニングプロセスは多くの異なる因子に影響されるため、これらの因子の制御により、所望の寸法のナノファイバを形成することが可能になる。エレクトロスピニングプロセスを調整することにより、扁平筒状でビーズを挿入したファイバまたは細孔を作成することが可能である。条件およびポリマー溶液特性の操作が、生成されるナノファイバの特性の多くを規定する。コレクタを変更することにより、不規則な、または整列したファイバのどちらを得るかを選択することが可能である。例えば、回転シリンダ、回転ワイヤドラム、ディスクコレクタを用いることが可能である。
【００６３】
限定されるわけではないが、マイクロ流体チャネル、ピペットチップ、真空プレート、スピンカラムなどに充填することを含む、シングルパス技術においてＤＮＡを他の細胞物質から分離するための、所与の表面積に所望の機能性および特性を形成するまたは付与するためのポリマー物質の使用について、本明細書では記載する。具体的には、当社は、明確に定義されたアクティブ表面積、疎水性特性、親水性特性、および特定のモノマーユニット特性の組み合わせを用いて適切な大きさの構成物の形成時または改質時に特異的な表面終端を作成して、血液溶解物などの複雑な生物学的混合物の分離を提供する。
【００６４】
望ましい性能特徴の少なくとも一部としては、限定されるわけではないが、バルク多孔質ポリマー、ゲル、電界紡糸マット、共押出しポリマー、犠牲塩、細孔作成を可能にする溶解可能なポリマー、多孔質シリコンナノ構造、および、適切なモノマーまたはポリマーユニットで改質されたハード／ソフト鋳型が挙げられる。
【００６５】
モノリシックポリマーはこれらのアプローチの多くの有利な特徴を組み合わせ、最近の化学分離の文献でかなりの関心を寄せられており、特に、流体装置への直接的な組み込みに適している。モノリシックカラムは、連続骨格を形成する相互接続した細孔を特徴とする「単一の大きな粒子」を作成する。このマクロ多孔質構造はモノリスに、高浸透性および高物質移動を含む多数の独特な特徴を与え、低圧での高流速を可能にする。
【実施例】
【００６６】
以下の記載では、本明細書の一部をなす添付図面に言及する。詳細な説明、図面、および請求項に記載する例示的実施形態は限定を意図しない。本明細書に示す主題の要旨または範囲から離れることなく他の実施形態を利用することができ、他の変更も可能である。本明細書で概して記載され、例示されるように、本開示の態様は幅広い種類の異なる構成で配置し、置換し、組み合わせ、分離し、設計することが可能であり、これらは全て本明細書において明確に検討されることが容易に理解されよう。詳細な説明および例において開示する全てのデータおよび画像は、出願人が生成した。
【００６７】
タンパク質吸着
タンパク質の物理吸着は、基板と分子の間の静電相互作用および疎水性相互作用に関連する多くの因子に影響される複雑なプロセスである。改質表面へのタンパク質の吸着は、表面の濡れ性に対し全体的な依存性を呈すことが示される。タンパク質は疎水性表面（高接触角）に選択的に吸着する。リゾチーム（１４．３ｋＤａ、ｐｌ１１．４）などの小タンパク質は、疎水性表面に対し弱い吸着を示す。ウシ血清アルブミン（６６．５ｋＤａ、ｐｌ４．７）などのより大きいタンパク質は、親水性表面（低接触角）により吸着する。
【００６８】
接触角の関数としてタンパク質吸着を調べるため、当社はサンプルに蛍光標識したタンパク質（BSA-CF568およびリゾチーム-CF568）のしみをつけた。湿潤性チャンバにおいてインキュベーションしてからすすいだ後、サンプルを共焦点蛍光顕微鏡下で調べた。図１は蛍光強度により求められる接触角の関数としてのタンパク質の吸着を示す。提示の結果から、より大きい接触角の値（＞４０）が、大きいタンパク質および小さいタンパク質の両方の表面への吸着をまねくことが分かる。
【００６９】
ＤＮＡ反発
マイカおよび二酸化ケイ素などのＳｉ−Ｏ機能性を示す表面へのＤＮＡの吸着がよく知られている。適切なアルキルシランを用いたこのような表面の処置は、基板を改質して疎水性表面終端を生成する。このような処置は、ＤＮＡとの表面相互作用を低減し、それによりＤＮＡ付着に対する識別を促すことが知られている。
【００７０】
シラン化二酸化ケイ素の表面濡れ性をさらに理解するため、当社は、ＤＮＡ付着に関連する、接触角と、種々のインキュベーション時間に対するシリコン表面の疎水性とに焦点を合わせた。図２は、アルキルシランへの露呈時間の変化に伴うＳｉ＜１１１＞基板に置いたナノピュア水の液滴の接触角の変化を示す。
【００７１】
明確に、接触角は初めに著しく増大し、その後、〜２０秒間露呈させた後は頭打ちになった。データは、これらのより短い露呈時間（２０〜６０秒）では、表面の画分のみが改質すると考えられることを示す。より長い露呈時間（＞６０秒）では、表面全体が改質すると考えられる。
【００７２】
Ｓｉ／ＳｉＯ２表面のシラン化に続き、ＤＮＡ溶液のアリコートを、ある範囲の接触角で、ピペットチップを用いてウェハにコーミングした。図３は、この研究から得られる典型的なＡＦＭ画像を示す。７０°超の接触角がＤＮＡの付着を防ぐ（図３ａ）ことが示された一方、６０°未満の値は物質の全体的な堆積を招く（図３ｂ）。Ｓｉ／ＳｉＯ２は、少なくとも一部の実施形態において、シリカ粒子の表面特性を模倣するために用いられるバルクシリコン基板の結晶構造を指す場合がある。ある実施形態でより一般的にＳｉ／ＳｉＯ２と言われるのは、二酸化ケイ素の層により覆われたシリコン層−実質的に類似した、または同じシリカとしての表面終端である場合がある。
【００７３】
濡れ性の関数としての生物学的活性
ＤＮＡ吸着を排除しながら大きいおよび小さいタンパク質を吸着するための優れたバランスの表面を見つけるため、当社はある範囲のモノマーユニットとその組み合わせについて、その表面濡れ性特性の関数として性能特性を評価した。ここで、窒素ドープＳｉ／ＳｉＯ２ウェハをきれいにし、各モノマー系で改質し、サンプルの範囲に亘り接触角を測った。表１に、研究した１６個の異なるポリマー系の結果をまとめる。
【００７４】
これらの発見をもとに、次に当社は濡れ性の関数として各系の性能特性を調べた。この研究では、当社は直径が〜１５μｍで３００Åの細孔を有するシリカゲル粒子を用いた。簡潔に言うと、ＤＮＡ抽出カセット（ＤＥＣ）−１００ｍｇの吸着剤を保持するように設計した−に化合物または非改質シリカを充填し、これを用いて４０μＬの（ビーズ粉砕（bead beating）を用いた機械的溶解により生成された）血液溶解物または溶解緩衝液のみからＤＮＡを精製した。ＤＮＡ抽出カセットは、限定されるわけではないが、吸着剤を保持でき、溶解血液などの流体を充填剤に通過させることのできる、成形または粉砕した微小寸法の熱可塑性構造とすることが可能である。ＤＥＣの形状因子は、本質的に曲がりくねり、厚く、薄く、そしてまた完全に一体化したカセットとすることが可能である。記載する吸着剤の充填および機能は、該剤を保持する容器に左右されない。実際に、スピンカラムなどの他の容器も用いて、他のサンプルマトリックスのうち、血液からのＤＮＡ抽出、血漿からのセルフリーＤＮＡ抽出、および汚水に混入した大腸菌の抽出を行った。ある範囲の化合物で充填したＤＥＣからの画分におけるＤＮＡおよびタンパク質の定量化。ＤＮＡを１００μＬ／分の流速を用いて３００μＬの画分に溶出し、これらの画分のサンプルを、Ｑｕｂｉｔ（登録商標）２．０蛍光光度計（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用するＤＮＡおよびタンパク質の定量化に用いた。ＤＮＡ濃度もリアルタイム定量的ＰＣＲ（ＲＴ−ｑＰＣＲ）を用いて求めた：５μＬの画分を１２．５μＬの２ｘ Ｒｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＱＩＡＧＥＮ社）、０．２５μＬの１００μＭ ＣＹＰ２ｃ９＊３ｆ（フォワードプライマー）、０．２５μＬの１００μＭ ＣＹＰ２ｃ９＊３ｒ（リバースプライマー）、および脱イオン水を含むＲＴ−ｑＰＣＲ反応液に加えて、最終体積を０．２５μＬとした。ＲＴ―ｑＰＣＲを、Ｒｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅ Ｑ ｃｙｃｌｅｒ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用い、次の反応条件を用いて実行した：９５℃、５分；９５℃、１０秒、５８℃、２０秒；７２℃、２０秒；５０〜９９℃（溶解）で最後の３ステップ（ｘ４４）を繰り返し。次にＤＮＡ濃度を、Ｃｔ（cycle threshold）値を既知の濃度のヒトｇＤＮＡ標準のそれと比較することにより求めた。
【００７５】
【表１】
0006698076.tif 000003
【００７６】
図４は、表面濡れ性の関数としての画分中のＤＮＡおよびタンパク質の定量化を示す。興味深いことに、バルク物質で観察される傾向が、生物学的性能データによく示された。濡れ性が８０°に近づくと、ＤＮＡ濃度は概して増加するのが観察される、一方でタンパク質濃度は減少することが示される。驚くことには、ＤＮＡおよびタンパク質の濃度はその逆反応で互いを映し出し、どの物質がＤＥＣに保持されているかの良い指標となる。重大なことに、８０〜９４°で表面濡れ性に明確な窓（window）があり、これは大きいタンパク質と小さいタンパク質の両方の吸着を容易にする一方で、ＤＮＡの付着を減少させる。
【００７７】
構造変形形態の関数としての生物学的活性
タンパク質の物理吸着は、基板と分子の間の静電相互作用および疎水性相互作用に関連する多くの因子に影響を受ける、複雑なプロセスである。水素結合、ファンデルワース力、π−πスタッキング、配位、およびモノマーユニットの適切な機能化を介した分散力などの、非共有結合性相互作用の選択的制御が、生物学的種の所与の基板への吸着／反発の選択的指向に関与し得る。
【００７８】
かなりの芳香族含有量を含むサンプルのみが、所望の濡れ性範囲の近くまたはその範囲に該当するにも関わらず、タンパク質の吸収とＤＮＡの反発を同時に、良好に行う。例えば、4-ビニルフェノール、ジビニルベンゼン、およびメタクリル酸は、８５．５°の接触角を示し、これは最適窓に十分に該当する。しかしながら、ＤＮＡは、ＤＥＣ画分で集められたタンパク質含有量の高いカラムで保持されているようである。［ベンジルメタクリレート］、［ベンジルメタクリレートおよびスチレン］、［ベンジルメタクリレート、ジビニルベンゼン、およびスチレン］、［2-ヒドロキシエチルメタクリレート、ジビニルベンゼン、およびスチレン］などの芳香族含有系は、ＤＮＡとタンパク質をより上手く識別するようである。これは［エチルメタクリレート］によっても例証され、これは８７°の接触角、高いＤＮＡ濃度を提供するが、高いタンパク質含有量も提供する。図５は、ある範囲のポリマー系で研究されたベンジルメタクリレートの３つの誘導体から集めた画分におけるＤＮＡとタンパク質の濃度を示す。2-ヒドロキシエチルメタクリレート（２ＨＭ）、ベンジルメタクリレート（Ｂ）、またはエチルメタクリレート（Ｅ）の何れかで改質したシリカ−スチレン（ＳＳ）／シリカ−スチレン−ジビニルベンゼン（ＳＳＤ）のサンプルを用い、ＤＮＡを再び血液溶解物から抽出した。
【００７９】
ここで、カラムから得られたＤＮＡ濃度における芳香族置換基の役割は明確であり、化合物を含む全てのベンジルが良好に機能することが示される。ベンジルメタクリレートの直接的な表面改質のみが、より複雑なシステムに同等の性能を与える。一実施形態では、同時に行われるタンパク質の吸着とＤＮＡの反発には８０〜９０°の接触角および芳香族の構造要件が好ましい。
【００８０】
アクティブ表面積の関数としての生物学的活性
ポリマーを用いたシリカの改質は、典型的には、所望の物質で細孔を充填させ、これは本質的には細孔内でポリマーブラシを伸ばす。上記のように、流体力学的半径は、分析物が入り、細孔により保持されることが可能であるような、適切なサイズとするべきである。この場合、当社はこれをアクティブ表面積と定義した。しかしながら、当社は、システムのサイズ排除メカニズムの説明のために、アクティブ表面積は、より正確には、孔径および粒子間の平均介在間隔と記載されることを認める。
【００８１】
ポリマーに関してアクティブ表面積の影響を調べるため、６０Å、１２０Å、または３００Åの孔径を研究した。ＤＮＡを１００μＬ／分の流速を用いて３００μＬの画分に溶出し、これらの画分を上記のＤＮＡおよびタンパク質の定量化に用いた。各実験では、経路長は固定されたままであることにも注意すべきである。
【００８２】
【表２】
0006698076.tif 000004
【００８３】
表２は、アクティブ表面積を増大させることにより、ＤＮＡとタンパク質との間の識別が高まり、ＤＮＡの抽出効率がＤＮＡ濃度の増加およびタンパク質含有量の減少により改善されることを示す。逆に、粒度の関数として表面積が増大する、つまり、アクティブ表面積の寄与が減少する場合、当社は、ＤＮＡ濃度の減少を観察する（表３）。
【００８４】
【表３】
0006698076.tif 000005
【００８５】
孔径の役割は、サンプルの表面積全体を減少させつつ、アクティブ表面積の寄与を増加させることによりさらに実証される。表４は、１５μｍ粒子で、３００Å孔径および１０００Å孔径のＤＮＡ抽出性能を比較する。表面積はそれぞれ１０８ｍ２／ｇおよび１９ｍ２／ｇである。したがって、１０００Åにおけるアクティブ表面積の比率の増加は、同一のサンプルからのより高いＤＮＡ濃度をもたらす。
【００８６】
【表４】
0006698076.tif 000006
【００８７】
アクティブ表面積が、タンパク質からのＤＮＡの分離を可能にすることに関与する一方、平均介在間隔も役割を果たす。ここで、粒度は、分離が起きるように、大量のサンプルが確実にアクティブ表面積と十分に接触するようにすることにおいて役割を果たす。介在距離または平均介在距離は、粒度に比例する。この値が大きすぎる場合、抽出効率は低減するだろう。つまり、より大きな粒子はより劣った性能特性を示す。アクティブ表面積の役割と平均介在距離の役割を分けるのは難しいが、平均介在距離／面積は抽出装置の効率を決定する因子であり、研究したサンプルの寸法に基づくと、機能性領域は０．２〜１．５μｍおよび１２〜２４．５μｍ２であると推定される。
【００８８】
ダウンストリームプロセス（例えば、ＰＣＲ）における構造的均一性の影響
上記のように、クロマトグラフィーカラムで述べた任意の粒度は、実際には、自動sub-sieve定寸技法を用いて製造業者により実質的に得られる粒度分布の平均値である。実際には、粒子の広範な分布はカラム内の不均一性につながり、これは、分析分子がカラムを通過する際に通る可変経路長の増加を招き得る。したがって、均一性はテスト間の変動を低減させる鍵である。可変粒度の影響は、均一なサイズ分布のサンプルと、高度な不均一性を有するサンプルの、ｑＰＣＲを用いて解析されるＤＮＡ抽出能力を比較すれば明らかである。表５は、＞５５％のサイズ分布を有する物質（サンプルＡ）と、サイズ分布が１２．５％変動する物質（サンプルＢ）について、ｑＰＣＲを用いて解析したＤＮＡ抽出能力を示す。
【００８９】
【表５】
0006698076.tif 000007
【００９０】
結果は明確に、抽出装置を通る分析物に対する経路長の変動の増加の影響を示す。下記のように、吸着剤またはその形状因子とは関係なく、ある傾向が明らかである。このように、均一性は抽出性能を決める別の因子であると考えられる。表面積およびアクティブ表面積は性能特性を決める因子である。一実施形態では、平均介在距離／面積の機能的領域は、好適には、約０．２〜１．５μｍおよび１２〜２４．５μｍ２である。このように、寸法の不均一性は抽出性能を決める因子である。
【００９１】
表面積、孔径、および平均介在間隔の関数としての生物学的活性
記載する各実施形態の基本的な役割を完全に示すため、吸着剤を記載するパラメータに従って生成した。各物質の生物学的性能が、効率的なＤＮＡ抽出における、平均介在間隔、適切なポリマー選択、孔径、およびアクティブ表面積の具体的基準を示す。
【００９２】
影響的な表面積の定義
シリカ粒子
１５μｍ表面積８０〜１２０ｍ２／ｇ
【００９３】
平均孔径３００Å／３０ｎｍ
【００９４】
カラム／ＤＥＣにおける２００ｍｇの充填＝装置において、１６〜２４ｍ２の表面積
【００９５】
電界紡糸ファイバ
ファイバの表面積＝２πｒＬ
【００９６】
吸着剤の表面積＝２πｒＬ×ファイバ数
【００９７】
Ｒ＝ＳＡ／２πｒＬ×ファイバ数
【００９８】
ＳＡ＝１６ｍ２（間隔短め）〜２４ｍ２（間隔長め）
【００９９】
１％有効表面積＝０．１６ｍ２、つまりシリカ抽出物からの粒子の単なる細孔と仮定する
【０１００】
１ｃｍの内容物〜５００００（２００ｎｍ）ファイバが１辺１ｃｍの正方形を提供するだろう
【０１０１】
Ｒ＝２．５８／ファイバ数〜３８１．９／ファイバ数＝４００ｍ／２００ｎｍ＝２×１０Ｅ９ファイバ
Ｏｅ＝５／ファイバ数〜８００／ファイバ数
【０１０２】
２．０×１０９／１．０×１０５（必要なファイバ数／１ｃｍ２あたりのファイバ数）＝２００００シート数×２００ｎｍ＝４×１０−３ｍ経路長
【０１０３】
電界紡糸ポリマー
上記のやり方で生成したベンジルメタクリレートナノファイバ（０．２ｇ）を５ｍＬのシリンジに入れた。手動の圧力を用い、ファイバを２分間圧縮して計画的な４×１０−３の経路長を提供した。サンプルを次に４０℃で３０分間加熱し、続いてゆっくりと冷却した。活性化緩衝液（７００μＬ）をシステムに揚水してから８０μＬの溶解物を加えた。流体をシステムに押し通し、溶出液を解析用に保持した。図７はこのやり方で調製したシリンジの典型的な性能を示す。
【０１０４】
（適切な平均介在間隔と表面積を提供するのに）適切な経路長が満たされなかった場合、ＰＣＲのための抽出は成功しなかった（図６および７）。
【０１０５】
スピンカラム、事前処置あり溶融シリカキャピラリ、事前処置ありガラスピペット、事前処置なしプラスチックシリンジ、および事前処置なしガラスバイアル内で、モノリス連続の流れテストを実行した。ここで、３５０μＬの活性化緩衝液を加え、１分間遠心分離機で回転させた。回転スピードを５０００ｒｐｍまで上げ、緩衝液を溶出した。８０μＬの血液溶解物を、活性化緩衝液を通過させたカラムに加え、次にこれらを５０００ｒｐｍで１分間回転させた。溶出液を集め、その生体成分をゲル電気泳動法により解析した（図８）。
【０１０６】
例の概要
シリカの平均介在間隔（１５μｍ、３００Å）を、均一な充填を仮定して６．９５μｍと計算した。平均介在間隔はまた表面積の関数であり、２つのパラメータの比である。モノマーユニットを固定し、（上記のように）表面積を定義することにより、新しい構造を適切な寸法で形成して血液溶解物からＤＮＡを抽出した。表６に示すように、約６μｍ未満または約２３μｍ超の平均介在間隔を有する例では、許容可能な解析レベルでＤＮＡを精製することはできない。
【０１０７】
【表６】
0006698076.tif 000008
【０１０８】
平均介在間隔の計画的範囲は、正確なシリカ平均直径値、ならびにモノリスおよび電界紡糸物質の測定値に基づく。「定量化されない」は、典型的には、抽出装置から得られた高いタンパク質濃度または低すぎるＤＮＡ濃度による過剰なＰＣＲ阻害が原因のＲＴ−ＰＣＲの失敗を指す。
【０１０９】
比較例
粒子分布／細孔半径
粒度および細孔半径の広範な分布はカラム内の不均一性に、ひいては分析分子がカラム内で通る可変経路長の増大につながるだろう。ＤＮＡ抽出効率はこのような場合ひどく損なわれ、しばしば高いタンパク質濃度をまねく。
【０１１０】
表面積
アクティブ表面積は、ＤＮＡ抽出効率において重要な役割を果たす。上記のように、当社は、少なくとも一部の実施形態における最適な範囲は、０．１ｍ２〜１５０ｍ２であると理解する。少なくとも一部の実施形態では、具体的な範囲にそれぞれ該当する、記載のパラメータの個々の組み合わせは、血液溶解物からＤＮＡを抽出する吸着剤の機能を決定する役割を果たし得る。
【０１１１】
不十分な抽出のシリカ系物質の測定表面積はこの範囲に該当する。しかしながら、上記で提示したデータから明らかなように、ＤＮＡ抽出メカニズムを提供するのは、孔径、ポリマー系、および平均介在間隔と関連する、具体的な表面積の組み合わせである。一部のテストサンプルの表面積を表７に示す。
【０１１２】
【表７】
0006698076.tif 000009
【０１１３】
例
多孔質シリコンウェハの合成
ｐ−Ｓｉ（１００）ウェハを形成した多孔質シリコン層の定電流陽極酸化。これを４８％のＨＦ水溶液とエタノール溶液の１：１ｖ／ｖ溶液を含むセルを用いて行った。電気化学セルはＰＴＦＥから構成され、これは円形断面を有した。シリコンウェハを、テフロン（登録商標）被膜バイトン（登録商標）Ｏ−リングを用いて基板に封着した。対向電極をループ状に巻き取ったタングステンワイヤで構成した。これは均一な電流分布を提供した。高電流密度（５００ｍＡｃｍ２で５分）を用いて多孔質シリコンの層を生成した。図１１は多孔質ベアシリコン（左）シラン改質多孔質シリコン（中）、およびベンジルメタクリレートで改質した多孔質シリコンを示し、図１２は多孔質ベアシリコンのＡＦＭ解析を示す。
【０１１４】
図１３は、ベンジルメタクリレートで改質した多孔質シリコンのＦＴ−Ｉｒスペクトルを示す（３５００〜２０００ｃｍ−１領域）。ポリマーの固定化が振動、ひいては官能基の振動形式に与える限定的な影響がスペクトルにおいて明らかであり、より低い波数にシフトするＣ−Ｈ振動に起因する多数のバンドをもたらした。ベンジル基の芳香族Ｃ−Ｈ振動は明らかであり、３０６６ｃｍ−１から〜２９５０ｃｍ−１にシフトしたことが観察された。２３００ｃｍ−１で観察される強力なバンドは大気中のＣＯ２の存在に起因することに注意すること。
【０１１５】
シリカ粒子、１５ミクロン、３００Å孔径
３００Åシリカ（２．２０ｇ）を２００℃の真空下で３時間、続いて室温のハウス真空（house vacuum）下で一晩乾燥させた。５０ｍＬの丸底フラスコとスターラーを一晩乾燥機で乾燥させた。
【０１１６】
３００Åシリカ（２．１５ｇ）を５％のジメチルビニルクロロシランのトリフルオロトルエン溶液（６ｍＬ）に懸濁し、１１０℃で１５分間撹拌した。混合物を室温まで冷却し、撹拌を止めた。シリカが沈降したら、液体をピペットで取り出し、新規の５％のジメチルビニルクロロシランのトリフルオロトルエン溶液（６ｍＬ）と交換した。混合物を次に１１０℃まで再加熱し、１５分間撹拌した。この方法をさらに一回行ってから室温まで冷却し濾過した。シリカを真空濾過により集め、アセトン（５×１０ｍＬ）および水（５×１０ｍＬ）で洗浄した。シリカを室温で３０分間風乾させてから、真空で３時間乾燥させながら室温を慎重に１２０℃まで上げて、シリカの損失を避けた。
【０１１７】
水中（１０ｍＬ）のステアリン酸ナトリウム（１４０ｍｇ）の撹拌溶液に、シリカ（〜２ｇ）、ベンジルメタクリレート（０．５３ｍＬ）、およびペルオキソ二硫酸カリウム（５ｍｇ）を加えた。重合を９５℃で４時間行った。混合物を室温まで冷却し濾過した。結果として生じたシリカをＤＭＦ（５×１０ｍＬ）、エタノール（５×１０ｍＬ）、および水（５×１０ｍＬ）で洗浄してから室温で３０分間風乾させた。シリカを最終的に真空で３時間乾燥させながら室温を慎重に８０℃まで上げ、水で飽和させた際にトラップを変えた。３００Åシラン化シリカ-ベンジルメタクリレート（２．２１ｇ）を白色固体として得た。
【０１１８】
図１４は、ベンジルメタクリレートで改質したシリカ粒子のＦＴ−Ｉｒスペクトルを示す（３５００〜２０００ｃｍ−１領域）。ポリマーの固定化が振動、ひいては官能基の振動形式に与える限定的な影響がスペクトルにおいて明らかであり、より低い波数にシフトするＣ−Ｈ振動に起因する多数のバンドをもたらした。ベンジル基の芳香族Ｃ−Ｈ振動は明らかであり、３０６６ｃｍ−１から〜２９００ｃｍ−１にシフトしたことが観察された。
【０１１９】
シリカ粒子の合成についての追加例
３００Å、１５μｍ（シラン化シリカ）を用いた重合
水中（４．８ｍＬ）のステアリン酸ナトリウム（６７ｍｇ）の撹拌溶液に、シリカ、モノマー、およびペルオキソ二硫酸カリウム（２．４ｍｇ）を加えた。重合を９５℃で４時間行った。混合物を室温まで冷却し濾過した。結果として生じたシリカをＤＭＦ（５×５ｍＬ）、エタノール（５×５ｍＬ）、および水（５×５ｍＬ）で洗浄してから室温で３０分間風乾させた。シリカを最終的に真空で３時間乾燥させながら室温を慎重に８０℃まで上げ、水で飽和させた際にトラップを変えた。
【０１２０】
３００Å、１５μｍ（シラン化シリカ-スチレン）の合成
３００Åシリカ（２．２０ｇ）を２００℃の真空下で３時間、続いて室温のハウス真空下で一晩乾燥させた。５０ｍＬの丸底フラスコとスターラーを一晩乾燥機で乾燥させた。
【０１２１】
３００Åシリカ（２．１５ｇ）を５％のジメチルビニルクロロシランのトリフルオロトルエン溶液（６ｍＬ）に懸濁し、１１０℃で１５分間撹拌した。混合物を室温まで冷却し、撹拌を止めた。シリカが沈降したら、液体をピペットで取り出し、新規の５％のジメチルビニルクロロシランのトリフルオロトルエン溶液（６ｍＬ）と交換した。混合物を次に１１０℃まで再加熱し、１５分間撹拌した。この方法をさらに一回行ってから室温まで冷却し濾過した。シリカを真空濾過により集め、アセトン（５×１０ｍＬ）および水（５×１０ｍＬ）で洗浄した。シリカを室温で３０分間風乾させてから、真空で３時間乾燥させながら室温を慎重に１２０℃まで上げて、シリカの損失を避けた。
【０１２２】
水中（１０ｍＬ）のステアリン酸ナトリウム（１４０ｍｇ）の撹拌溶液に、シリカ（〜２ｇ）、スチレン（０．５２ｍＬ）、およびペルオキソ二硫酸カリウム（５ｍｇ）を加えた。重合を９５℃で４時間行った。混合物を室温まで冷却し濾過した。結果として生じたシリカをＤＭＦ（５×１０ｍＬ）、エタノール（５×１０ｍＬ）、および水（５×１０ｍＬ）で洗浄してから室温で３０分間風乾させた。シリカを最終的に真空で３時間乾燥させながら室温を慎重に８０℃まで上げ、水で飽和させた際にトラップを変えた。３００Åシラン化シリカ-スチレン（１．６８ｇ）を白色固体として得た。
【０１２３】
３００Å、１５μｍのシラン化シリカ-ジビニルベンゼンの合成
３００Åシリカ（１．２０ｇ）を２００℃の真空下で３時間、続いて室温のハウス真空下で一晩乾燥させた。５０ｍＬの丸底フラスコとスターラーを一晩乾燥機で乾燥させた。
【０１２４】
３００Åシリカ（１．１５ｇ）を５％のジメチルビニルクロロシランのトリフルオロトルエン溶液（３ｍＬ）に懸濁し、１１０℃で１５分間撹拌した。混合物を室温まで冷却し、撹拌を止めた。シリカが沈降したら、液体をピペットで取り出し、新規の５％のジメチルビニルクロロシランのトリフルオロトルエン溶液（３ｍＬ）と交換した。混合物を次に１１０℃まで再加熱し、１５分間撹拌した。この方法をさらに一回行ってから室温まで冷却し濾過した。シリカを真空濾過により集め、アセトン（５×５ｍＬ）および水（５×５ｍＬ）で洗浄した。シリカを室温で３０分間風乾させてから、真空で３時間乾燥させながら室温を慎重に１２０℃まで上げて、シリカの損失を避けた。
【０１２５】
水中（５ｍＬ）のステアリン酸ナトリウム（７０ｍｇ）の撹拌溶液に、シリカ（〜１ｇ）、ジビニルベンゼン（０．３８ｍＬ）、およびペルオキソ二硫酸カリウム（２．５ｍｇ）を加えた。重合を９５℃で４時間行った。混合物を室温まで冷却し濾過した。結果として生じたシリカをＤＭＦ（５×５ｍＬ）、エタノール（５×５ｍＬ）、および水（５×５ｍＬ）で洗浄してから室温で３０分間風乾させた。シリカを最終的に真空で３時間乾燥させながら室温を慎重に８０℃まで上げ、水で飽和させた際にトラップを変えた。３００Åシラン化シリカ-ジビニルベンゼン（１．００ｇ）を白色固体として得た。
【０１２６】
３００Å、１５μｍ（シラン化シリカ-2-ヒドロキシエチルメタクリレート）の合成
３００Åシリカ（１．２０ｇ）を２００℃の真空下で３時間、続いて室温のハウス真空下で一晩乾燥させた。５０ｍＬの丸底フラスコとスターラーを一晩乾燥機で乾燥させた。
【０１２７】
３００Åシリカ（１．１５ｇ）を５％のジメチルビニルクロロシランのトリフルオロトルエン溶液（３ｍＬ）に懸濁し、１１０℃で１５分間撹拌した。混合物を室温まで冷却し、撹拌を止めた。シリカが沈降したら、液体をピペットで取り出し、新規の５％のジメチルビニルクロロシランのトリフルオロトルエン溶液（３ｍＬ）と交換した。混合物を次に１１０℃まで再加熱し、１５分間撹拌した。この方法をさらに一回行ってから室温まで冷却し濾過した。シリカを真空濾過により集め、アセトン（５×５ｍＬ）および水（５×５ｍＬ）で洗浄した。シリカを室温で３０分間風乾させてから、真空で３時間乾燥させながら室温を慎重に１２０℃まで上げて、シリカの損失を避けた。
【０１２８】
水中（５ｍＬ）のステアリン酸ナトリウム（７０ｍｇ）の撹拌溶液に、シリカ（〜１ｇ）、2-ヒドロキシエチルメタクリレート（０．３３ｍＬ）、およびペルオキソ二硫酸カリウム（２．５ｍｇ）を加えた。重合を９５℃で４時間行った。混合物を室温まで冷却し濾過した。結果として生じたシリカをＤＭＦ（５×５ｍＬ）、エタノール（５×５ｍＬ）、および水（５×５ｍＬ）で洗浄してから室温で３０分間風乾させた。シリカを最終的に真空で３時間乾燥させながら室温を慎重に８０℃まで上げ、水で飽和させた際にトラップを変えた。３００Åシラン化シリカ-2-ヒドロキシエチルメタクリレート（１．００ｇ）を白色固体として得た。
【０１２９】
混合粒度
シリカ粒子の混合物を、相補的または同一のポリマー系で、例えば、限定されるわけではないが、ある実施形態ではスチレンおよび2-ヒドロキシエチルメチルメタクリレートモノマー系をそれぞれ用いて、２つの別箇のバッチの物質をまず改質することにより調製した。所望の比率の粒子混合物は、抽出されるサンプル型に応じて抽出特性を確定するために、組成物を質量組成の比率により調整することを可能にする。
【０１３０】
シリコン表面の改質
シリコンチップ（バルクで多孔質、１ｃｍ２）を２００℃の真空下で３時間、続いて室温のハウス真空下で一晩乾燥させた。５０ｍＬの丸底フラスコとスターラーを一晩乾燥機で乾燥させた。
【０１３１】
シリカチップ（１ｃｍ２）を５％のジメチルビニルクロロシランのトリフルオロトルエン溶液（１２ｍＬ）に懸濁し、１１０℃で１５分間撹拌した。混合物を室温まで冷却し、撹拌を止めた。シリカが沈降したら、液体をピペットで取り出し、新規の５％のジメチルビニルクロロシランのトリフルオロトルエン溶液（１２ｍＬ）と交換した。混合物を次に１１０℃まで再加熱し、１５分間撹拌した。この方法をさらに一回行ってから室温まで冷却し濾過した。シリカを真空濾過により集め、アセトン（５×２０ｍＬ）および水（５×２０ｍＬ）で洗浄した。シリカを室温で３０分間風乾させてから、真空で３時間乾燥させながら室温を慎重に１２０℃まで上げた。
【０１３２】
水中（２０ｍＬ）のステアリン酸ナトリウム（２８０ｍｇ）の撹拌溶液に、スチレン（１．０４ｍＬ）、ジビニルベンゼン（１２８μＬ）、2-ヒドロキシエチルメタクリレート（１２０μＬ）、およびペルオキソ二硫酸カリウム（１０ｍｇ）を加えた。シリカチップを溶液に加えた。重合を９５℃で４時間行った。混合物を室温まで冷却し濾過した。結果として生じたシリカをＤＭＦ（５×２０ｍＬ）、エタノール（５×２０ｍＬ）、および水（５×２０ｍＬ）で洗浄してから室温で３０分間風乾させた。シリカを最終的に真空で３時間乾燥させながら室温を慎重に８０℃まで上げ、水で飽和させた際にトラップを変えた。
【０１３３】
電界紡糸マット
ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）
１０重量％のＰＶＡ（ｍｗ８９０００〜９８０００）溶液を、銅棒に貼ったアルミホイルに揚水した。針とコレクタの間の距離は１６ｃｍであり、２０ｋＶの電圧を印加した。ポリマー溶液の流速は０．０７５ｍＬ／ｈだった。環境条件：１９％Ｒ．Ｈ．、２０．３℃。
【０１３４】
ポリベンジルメタクリレート（Ｐ（ＢｚＭＡ））
ＴＨＦ溶液中の３７．５重量％のＰ（ＢｚＭＡ）を、銅棒に貼ったアルミホイルに揚水した。針とコレクタの間の距離は１０ｃｍであり、２０ｋＶの電圧を印加した。ポリマー溶液の流速は０．０５ｍＬ／分だった。環境条件：２１％Ｒ．Ｈ．、２０．６℃。図１５は、ポリベンジルメタクリレート（Ｐ（ＢｚＭＡ））の電界紡糸マットの光学像を示す。
【０１３５】
この例における孔径は平均介在間隔に相似していると考えられる一方、表面積は上記のようにファイバのサイズから計算することが可能である。アクティブ表面積の役割と平均介在距離の役割を分けることは難しいが、当社は、平均介在距離／面積は抽出装置の効率を決定する因子であると理解している。概して、平均介在距離は約１０ｎｍよりも大きくてよい。変形形態では、平均介在距離は約１２ミクロン未満である。
【０１３６】
多孔質ポリベンジルメタクリレートファイバ
１７．５％ｗ／ｗポリマー／アセトンにおいて、溶液を調整し、室温で水中に一晩放置した。あるいは、ホイル上の２ｃｍ２の正方形のファイバマットを、４０℃の水中において、緩酸（１Ｍエタン酸）、エタノールと水の５０：５０の組み合わせ、メタノールと水の５０：５０の組み合わせで処置した。
【０１３７】
新規のモノマーユニットの合成
【０１３８】
アニソールメチルメタクリレート
【化１】
0006698076.tif 000010
【０１３９】
無水ジクロロメタン（１２ｍＬ）中の、メタクリル酸（１６９ｍｇ、１６７μＬ、１．９６ｍｍｏｌ）、3-メトキシベンジルアルコール（２７１ｍｇ、２４４μＬ、９．１６ｍｍｏｌ）、および4-(ジメチルアミノ)ピリジン（３１１ｍｇ、２．５５ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、N-(3-ジメチルアミノプロピル)-N′-エチルカルボジイミドヒドロクロライド（０．５２ｇ、２．７５ｍｍｏｌ）を加え、撹拌を一晩続けた。溶液をＮａＨＣＯ３飽和水溶液（１０ｍＬ）、水（１０ｍＬ）、飽和塩水（１０ｍＬ）で洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、濃縮して粘性油を得た。この物質を、２５４ｎｍでの検出を伴うＢｉｏｔａｇｅ社のＩｓｏｌｅｒａ自動クロマトグラフィー系を順相条件下（シリカカラム、ペトロール中２→１６％ジエチルエーテルという勾配）で用いて精製して、アニソールメチルメタクリレート（１２１ｍｇ、３０％）を無色油として提供した。Ｒｆ０．３３（ペトロール−ジエチルエーテル、９２：８ｖ／ｖ）。
【０１４０】
フェニルエタノールメタクリレート
【化２】
0006698076.tif 000011
【０１４１】
０℃の無水ジクロロメタン（５ｍＬ）中の、フェニルエタノール（０．５０ｇ、０．５０ｍＬ、４．０９ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（１．２４ｇ、１．７１ｍＬ、１２．２７ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、メタクリロイルクロライド（４７０ｍｇ、４３６μＬ、４．５０ｍｍｏｌ）を滴下し、撹拌を３０分間続け、この間に混合物を室温まで温めた。水（２５ｍＬ）を加え、混合物をジクロロメタン（３×２５ｍＬ）を用いて抽出した。組み合わさった有機相を乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、濃縮して黄色油（０．７４ｇ）を提供した。この物質を、２５４ｎｍでの検出を伴うＢｉｏｔａｇｅ社のＩｓｏｌｅｒａ自動クロマトグラフィー系を順相条件下（シリカカラム、ペトロール中１２→１００％ジエチルエーテルという勾配）で用いて精製して、フェニルエタノールメタクリレート（０．８０ｇ、定量的）を無色油として提供した。Ｒｆ０．６１（ペトロール−ジエチルエーテル、３：１ｖ／ｖ）。
【０１４２】
ピリジンメチルメタクリレート
【化３】
0006698076.tif 000012
【０１４３】
０℃の無水ジクロロメタン（２３ｍＬ）中の、メタクリル酸（０．７２ｇ、０．７１ｍＬ、８．３３ｍｍｏｌ）および3-ピリジンメタノール（１．００ｇ、０．８９ｍＬ、９．１６ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、N-(3-ジメチルアミンプロピル)-N′-エチルカルボジイミドヒドロクロライド（２．２３ｇ、１１．６６ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（１．０５ｇ、１．４５ｍＬ、１０．４１ｍｍｏｌ）、および4-(ジメチルアミノ)ピリジン（１０２ｍｇ、０．８３ｍｍｏｌ）を加え、撹拌を一晩続け、この間に混合物を室温まで温めた。溶液をジクロロメタン（５０ｍＬ）で希釈し、ＮａＨＣＯ３飽和水溶液（３０ｍＬ）、水（２×３０ｍＬ）、および飽和塩水（３０ｍＬ）で洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、濃縮して粘性油を提供した。この物質を、２５４ｎｍでの検出を伴うＢｉｏｔａｇｅ社のＩｓｏｌｅｒａ自動クロマトグラフィー系を順相条件下（シリカカラム、ペトロール中１２→１００％酢酸エチルという勾配）で用いて精製して、ピリジンメチルメタクリレート（１．０６ｇ、７２％）を無色油として提供した。Ｒｆ０．３８（ペトロール−酢酸エチル、１：１ｖ／ｖ）。
【０１４４】
ナフタレンメチルメタクリレート
【化４】
0006698076.tif 000013
【０１４５】
０℃の無水ジクロロメタン（２３ｍＬ）中の、メタクリル酸（０．７２ｇ、０．７１ｍＬ、８．３３ｍｍｏｌ）および1-ナフタレンメタノール（１．４５ｇ、９．１６ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、N-(3-ジメチルアミノプロピル)-N′-エチルカルボジイミドヒドロクロライド（２．２３ｇ、１１．６６ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（１．０５ｇ、１．４５ｍＬ、１０．４１ｍｍｏｌ）、および4-(ジメチルアミノ)ピリジン（１０２ｍｇ、０．８３ｍｍｏｌ）を加え、撹拌を一晩続け、この間に混合物を室温まで温めた。溶液をジクロロメタン（５０ｍＬ）で希釈し、ＮａＨＣＯ３飽和水溶液（３０ｍＬ）、水（２×３０ｍＬ）、および飽和塩水（３０ｍＬ）で洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、濃縮して粘性油を提供した。この物質を、２５４ｎｍでの検出を伴うＢｉｏｔａｇｅ社のＩｓｏｌｅｒａ自動クロマトグラフィー系を順相条件下（シリカカラム、ペトロール中２→２０％酢酸エチルという勾配）で用いて精製して、ナフタレンメチルメタクリレート（１．２８ｇ、６８％）を無色油として提供した。Ｒｆ０．５３（ペトロール−酢酸エチル、９：１ｖ／ｖ）。
【０１４６】
チオフェン-3-イルメチルメタクリレート
【化５】
0006698076.tif 000014
【０１４７】
０℃の無水メタノール（３０ｍＬ）中のチオフェン-3-カルボキシアルデヒド（１．００ｇ、０．７８ｍＬ、８．９２ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に水素化ホウ素ナトリウム（０．３５ｇ、９．３６ｍｍｏｌ）を少しずつ加え、撹拌を２時間続け、この間に混合物を室温まで温めた。溶液を濃縮し酢酸エチル（２５ｍＬ）および水（２５ｍＬ）を加えた。層を分離し、水層を酢酸エチル（２×２５ｍＬ）を用いて抽出した。組み合わさった有機層を水（２×２５ｍＬ）および飽和塩水（２５ｍＬ）で洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、濃縮して、褐色の油としてチオフェン-3-イルメタノール（１．０１ｇ、９８％）を提供した。この物質はさらなる精製なしに用いた。
【０１４８】
０℃の無水ジクロロメタン（２０ｍＬ）中の、チオフェン-3-イルメタノール（１．０１ｇ、８．９２ｍｍｏｌ）および無水ピリジン（２．０４ｇ、２．０８ｍＬ、２５．８２ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、メタクリロイルクロライド（０．９９ｇ、０．９２ｍＬ、９．８１ｍｍｏｌ）を滴下し、撹拌を１時間間続け、この間に混合物を室温まで温めた。溶液を水（２５ｍＬ）で希釈し、ジクロロメタン（３×２５ｍＬ）を用いて抽出した。組み合わさった有機層を、０．５Ｍの塩酸（２５ｍＬ）、水（２×２５ｍＬ）、および飽和塩水（２５ｍＬ）で洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、濃縮して褐色の油を提供した。この物質を、２５４ｎｍでの検出を伴うＢｉｏｔａｇｅ社のＩｓｏｌｅｒａ自動クロマトグラフィー系を順相条件下（シリカカラム、ペトロール中０→１００％ジクロロメタンという勾配）で用いて精製して、チオフェン-3-イルメチルメタクリレート（０．６８ｇ、４４％）を無色油として提供した。Ｒｆ０．５３（ペトロール−ジクロロメタン、２：３ｖ／ｖ）。
【０１４９】
ベンジルアクリレート
【化６】
0006698076.tif 000015
【０１５０】
室温の無水ジクロロメタン（２５ｍＬ）中の、ベンジルアルコール（２．００ｇ、１８．５ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（４．６７ｇ、６．４３ｍＬ、４６．３ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、アクリロイルクロライド（１．７６ｇ、１．５８ｍＬ、１９．４ｍｍｏｌ）を滴下し、撹拌を３時間続けた。溶液を水（３０ｍＬ）で希釈し、ジクロロメタン（２×３０ｍＬ）を用いて抽出した。組み合わさった有機相を飽和塩水（３０ｍＬ）で洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、濃縮してオレンジ色の油を提供した。この物質を、２５４ｎｍでの検出を伴うＢｉｏｔａｇｅ社のＩｓｏｌｅｒａ自動クロマトグラフィー系を順相条件下（シリカカラム、ペトロール中７→６０％酢酸エチルという勾配）で用いて精製して、ベンジルアクリレート（２．０２ｇ、６７％）を無色油として提供した。Ｒｆ０．６９（ペトロール−酢酸エチル、７：３ｖ／ｖ）。
【０１５１】
2-ヒドロキシベンジルメタクリレート
【化７】
0006698076.tif 000016
【０１５２】
０℃の無水ジクロロメタン（１０ｍＬ）中の、2-ヒドロキシベンジルアルコール（１．００ｇ、８．０６ｍｍｏｌ）およびピリジン（１．９１ｇ、１．９６ｍＬ、２４．２ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、メタクリロイルクロライド（０．８４ｇ、０．８７ｍＬ、８．０６ｍｍｏｌ）を滴下し、室温まで温めながら撹拌を１時間続けた。溶液を０．５Ｍの塩酸（１０ｍＬ）および水（１０ｍＬ）で希釈し、ジクロロメタン（３×１０ｍＬ）を用いて抽出した。組み合わさった有機相を飽和塩水（２５ｍＬ）で洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、濃縮して薄茶色の油を提供した。該物質を、２５４ｎｍでの検出を伴うＢｉｏｔａｇｅ社のＩｓｏｌｅｒａ自動クロマトグラフィー系を順相条件下（シリカカラム、ペトロール中１５→１００％ジクロロメタンという勾配）で用いて精製して、2-ヒドロキシベンジルメタクリレート（３８１ｍｇ、２５％）を無色油として提供した。Ｒｆ０．３６（ジクロロメタン−ペトロール、６：４ｖ／ｖ）。
【０１５３】
2-フェニルエチルメタクリレート
【化８】
0006698076.tif 000017
【０１５４】
無水ジクロロメタン（３５ｍＬ）中の、2-フェニルエタノール（２．５０ｇ、２０．５ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（６．２０ｇ、８．５４ｍＬ、６１．４ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、メタクリロイルクロライド（２．１６ｇ、２．００ｍＬ、２０．７ｍｍｏｌ）を滴下し、撹拌を室温で２時間続けた。溶液を水（３０ｍＬ）で希釈し、ジクロロメタン（３×３０ｍＬ）を用いて抽出した。組み合わさった有機相を飽和塩水（３０ｍＬ）で洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、濃縮して黄色油を提供した。該物質を、２５４ｎｍでの検出を伴うＢｉｏｔａｇｅ社のＩｓｏｌｅｒａ自動クロマトグラフィー系を順相条件下（シリカカラム、ペトロール中７→４２％酢酸エチルという勾配）で用いて精製して、2-フェニルエチルメタクリレート（３．２３ｇ、８３％）を黄色油として提供した。Ｒｆ０．５８（ペトロール−酢酸エチル、７：３ｖ／ｖ）。
【０１５５】
ベンズヒドリルメタクリレート
【化９】
0006698076.tif 000018
【０１５６】
無水ジクロロメタン（３５ｍＬ）中の、ベンズヒドリル（３．７７ｇ、２０．５ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（６．２１ｇ、８．５５ｍＬ、６１．４ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、メタクリロイルクロライド（２．１６ｇ、２．００ｍＬ、２０．７ｍｍｏｌ）を滴下し、撹拌を室温で２時間続けた。溶液を水（３０ｍＬ）で希釈し、ジクロロメタン（２×２０ｍＬ）を用いて抽出した。組み合わさった有機相を飽和塩水（４０ｍＬ）で洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、濃縮してオレンジ色の油を提供した。該物質を、２５４ｎｍでの検出を伴うＢｉｏｔａｇｅ社のＩｓｏｌｅｒａ自動クロマトグラフィー系を順相条件下（シリカカラム、ペトロール中７→３３％酢酸エチルという勾配）で用いて精製して、ベンズヒドリルメタクリレート（３．８５ｇ、７５％）を白色固体として提供した。Ｒｆ０．７７（ペトロール−酢酸エチル、７：３ｖ／ｖ）。
【０１５７】
トリフェニルメチルメタクリレート
【化１０】
0006698076.tif 000019
【０１５８】
Ｎ２下の氷浴で、無水ＤＭＥ（６０ｍＬ）中の、トリフェニルメチルクロライド（６．１１ｇ、２２．０ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（１１．１ｇ、１５．３ｍＬ、１１０ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、メタクリル酸（９．４７ｇ、９．３０ｍＬ、１１０ｍｍｏｌ）を滴下し、８０℃まで温めながら撹拌を１時間続けた。混合物をセライト（登録商標）で濾過し、濾過物をＮａＨＣＯ３飽和水溶液（３×４０ｍＬ）および飽和塩水（３０ｍＬ）で洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、濃縮してクリーム色／白色の固体を提供した。固体を室温の真空下で３時間乾燥させてオフホワイト色の固体としてトリフェニルメチルメタクリレートを提供した（６．５１ｇ、９０％）。Ｒｆ０．５２（ペトロール−酢酸エチル、９：１ｖ／ｖ）。
【０１５９】
2-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロピランメタクリレート
【化１１】
0006698076.tif 000020
【０１６０】
無水ジクロロメタン（４０ｍＬ）中の、2-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロピラン（２．７５ｇ、２．６８ｍＬ、２３．７ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（７．１８ｇ、９．９ｍＬ、７１．０ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、メタクリロイルクロライド（２．５０ｇ、２．３１ｍＬ、２３．９ｍｍｏｌ）を滴下し、撹拌を１時間続けた。溶液を水（４０ｍＬ）で希釈し、ジクロロメタン（３×１０ｍＬ）を用いて抽出した。組み合わさった有機相を飽和塩水（３０ｍＬ）で洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、濃縮してオレンジ色の油を提供した。該物質を、２５４ｎｍでの検出を伴うＢｉｏｔａｇｅ社のＩｓｏｌｅｒａ自動クロマトグラフィー系を順相条件下（シリカカラム、ペトロール中７→５４％酢酸エチルという勾配）で用いて精製して、2-(ヒドロキシメチル)テトラヒドロピランメタクリレート（３．０９ｇ、７１％）を無色油として提供した。Ｒｆ０．６６（ペトロール−酢酸エチル、７：３ｖ／ｖ）。
【０１６１】
他の潜在的モノマー
表８に、本開示の一部の実施形態で用いることが可能ないくつかの他のモノマーを列挙する。
【０１６２】
【表８】
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【０１６３】
表９に、本開示のテストしたモノマーの一部の生物学的特性をまとめる。
【０１６４】
【表９】
0006698076.tif 000022
【０１６５】
モノリシックポリマー
サンプル事前処置
ガラスの事前処置ができないプラスチック容器で生成したサンプルを除く全てのモノリスサンプル調整物について、以下の基本的な手順を辿った。０．１Ｍ水酸化ナトリウム洗浄（５分）、脱イオン水洗浄（２０分）、メタノール洗浄（５分）、窒素流下での乾燥、3-(トリメトキシシリル)プロピルメタクリレート（ＭＳＭＡ）：メタノール（１：１）の注入、容器端の封止、３５℃の水槽への容器の浸漬（１７時間）、メタノール洗浄（１３分）、脱イオン水洗浄（１３分）、窒素流下での乾燥。
【０１６６】
モノリス重合
事前コンディショニングの直後、容器を、ラジカル重合を介した、機能化のための重合反応混合物で充填することができた。モノマー、ラジカル開始剤、およびポロジェニック（porogenic）溶媒系からなる、キャピラリまたは他の容器に注入される反応混合物を、このように調整した。モノマー混合物は予め混ぜられ、種々の比率のスチレン（Ｓｔｙ）、ブチルメタクリレート（Ｂｕｔ）、および／またはベンジルメタクリレート（Ｂｎｚ）を、ジビニルベンゼン（ＤＶＢ）またはエチレングリコールジメタクリレート（ＥＤＭＡ）という架橋剤とともに含んだ。活性剤、ビニルベンゼンスルホン酸（ＶＢＳＡ）、および／またはアゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）を次に加えた。２つのポロジェニック溶媒系のうち１つを次に反応混合物（シクロヘキサノール、水、およびＮＭＰまたは1-プロパン-1-オール、1,4-ブタンジオール）に加えた。モノマー混合物を超音波処理した（１５分／均一化まで）。次にモノリス容器にモノマー混合物を注入し、端を封止した。残ったモノマー混合物をガラス容器に移した。容器を７０℃の水槽に２０時間浸漬するか、または、ＵＶ光で１５分間処置した。サンプルをメタノールで洗浄した（１５分）。
【０１６７】
種々の容器において、ある範囲のポロジェニック溶媒系を用いて、種々のモノマー組成を使用した一連のモノリス調製物を調整した（表１０および図１９）。容器は２つのフォーマット：サンプル検査および解析のためのガラスバイアル／プラスチックエッペンドルフチューブと；溶融シリカガラスキャピラリ、ＤＮＡ抽出スピンカラム、ならびに他の使い捨てのフィルタおよびガラスピペット（形状の異なる充填カラム）といった、ＤＮＡ抽出で用いるように設計された形態とに従った。
【０１６８】
【表１０】
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【０１６９】
アルケニル担持シランを用いたガラスバイアルおよび溶融シリカキャピラリの内面の機能化は、この基板への直接的なモノリス結合を可能にし、これはより強固で耐久性のあるモノリスを生成した。
【０１７０】
ベンジルメタクリレートモノマーからなるモノリスは微多孔性構造を有し（図１６、バルクモノリス）、マクロ多孔性性質を欠くことが示される。ブチルメタクリレートの添加により多孔度が著しく増した、ベンジルメタクリレートおよびブチルメタクリレートの５０：５０混合。
【０１７１】
ＳＥＭ解析により、ある範囲の多孔質モノリス生成の成功が明らかである。ベンジルメタクリレートモノマーからなるモノリスは、微多孔性構造を有することが示される（図１７、左）。ブチルメタクリレートの添加により多孔度が著しく増した、ベンジルメタクリレートおよびブチルメタクリレートの５０：５０混合物（図１７、中）。
【０１７２】
ここでモノリスは、マクロ多孔性および微多孔性の両方の特性、モノリシックカラム流入の質を示す。マクロ多孔性および微多孔性の両方の性質を再度唯一示す、ブチルメタクリレートを含むカラム（図１７、Ｂ）。これらの発見は、アルキルメタクリレート成分をモノマー反応混合物に組み込んで所望の多孔度性質を達成するという役割を強調する。シリカ粒子のシラン改質と類似し、アルキルメタクリレート成分は、タンパク質吸着に対し適切な表面濡れ性特性と、全面的なＤＮＡ付着に対する識別を提供する。
【０１７３】
吸着剤のインフィールドアプリケーション
一例では、ＤＮＡ抽出カセット（ＤＥＣ、図１８）−吸着剤を保持するように設計されている−を用いて、４０μＬの（ビーズ粉砕を用いた機械的溶解により生成された）血液溶解物または溶解緩衝液のみからＤＮＡを精製した。上記の作業は、吸着剤で充填したＤＥＣ（表２〜５）がＤＮＡを血液溶解物から精製可能であることを示した。図２１は、連続流路ＤＥＣを用いた大腸菌の抽出を示す。図は、濃度を低くした大腸菌サンプル（細胞／ｍＬ）由来のインプット溶解物質から生じたＤＥＣの１００μＬ画分における、溶出ＤＮＡの濃度（ｐｇ／ｍＬ）を示す。
【０１７４】
別の例では、この実施形態は、生体サンプルの溶解と、記載する吸着剤フィルタに溶解物を通すことの両方が可能な二重処理装置の一部を実行する。装置の例示的な実施形態を図２０に示す。ここで、細胞マトリックスは装置内に含まれる吸着剤に結合する一方、ＤＮＡはフィルタを通過してサンプル受付装置に入り込むことが可能であり、これは取り出して解析のために保存／送ることが可能である。処理時間は５分未満で完了する。
【０１７５】
装置は、加圧封止されたキャップを有するサンプル受付ポートを利用する。サンプルはスプリング搭載プランジャにより制御される溶解チャンバに置くが、これにより、ユーザがチャンバ内のブレードを回転させ、ブレード自体、またはチャンバ内の撹拌されるビーズの何れかを用いてサンプルを溶解することが可能になる。サンプルチャンバはまた、抽出ステージを通して移動キャリヤとして機能する、または、サンプルの必要性に応じて酵素的または化学的の何れかで溶解を促進する、緩衝液を含んでよい。
【０１７６】
同時に、機械的溶解の動作はまた、装置内の圧力を高める。この圧力の高まりが駆動力を生んでサンプルをフィルタに通し、溶解物をフィルタにとどめ、ＤＮＡ／ＲＮＡ／核酸を含む上澄みをサンプル受付「キャップ」に流し、これは次に取り出して保存／解析することが可能である。
【０１７７】
装置の抽出セクションへの溶解物の放出は、２つのセクションを回転させ圧力を解除すること、または２つの構成要素の間の封止に別箇に穴を開けることにより達成することが可能である。
【０１７８】
別の例では、スピンカラムに、記載のポリマーで覆われたシリカビーズを充填する。典型的には、活性緩衝液を加え、１分間遠心分離機で回転させる。回転スピードを５０００ｒｐｍまで上げ、緩衝液を溶出する。８０μＬの血液溶解物を、活性化緩衝液を通過させたカラムに加え、次にこれらを５０００ｒｐｍで１分間回転させた。溶出液を集め、ゲル電気泳動法によりその生体成分について解析した。ユニバーサルスピンカラムのフォーマットおよび各サンプル型で異なるプロトコルを用いて、以下のサンプル型についてＤＮＡ抽出を行った。
【０１７９】
指示がない限りスピンカラムを用いた、種々のサンプル型についての、開示のＤＮＡ抽出プロセス（本明細書では「Ｑ−フィルタ」として既知のフォーム）のデータ比較。図２２Ａは、血液Ｑ−フィルタと代替装置のＤＮＡ濃度の比較データを示す（血液Ｑ−フィルタ対代替装置）。図２２Ｂ〜Ｄは、組織（ピンチ生検法）、細菌プラスミド、および頬スワブについての、Ｑ−フィルタと代替装置からのＤＮＡ収率を比較したデータを示す（血液Ｑ−フィルタ対代替装置）。
【０１８０】
本開示は、本出願に記載する特定の実施形態の点で限定されるべきではなく、これは、種々の態様の説明として意図される。当業者には明白なように、多くの修正および変形をその趣旨と範囲から離れることなく行うことが可能である。本明細書で挙げたものに加え、開示の範囲内の機能的に同等な方法および装置が、前記記載から当業者には明白であろう。このような修正および変形は、添付の特許請求の範囲の範囲にあることが意図される。本開示は、添付の特許請求の範囲の観点でのみ、そのような請求項が権利を持つ対応特許の全範囲に沿って限定されるべきである。この開示は、特定の方法、試薬、化合物、組成物または生物学的システムに限定されるものではなく、これらは当然変更可能であることが理解されるべきである。また、本明細書で用いる専門用語は、特定の実施形態を記載することのみを目的とし、限定することを意図しない。
【０１８１】
当業者は、本明細書に開示される、これおよび他のプロセスおよび方法について、該プロセスおよび方法で実行される機能は別の順で実施できることを理解しよう。さらに、概説したステップおよび操作は例として提供されるのみであり、一部のステップおよび操作は、開示の実施形態の本質を減じることなく、任意とすることができ、より少ないステップおよび操作にまとめることができ、または、追加のステップおよび操作に拡張することができる。
【０１８２】
本明細書の実質的に任意の複数形および／または単数形の用語の使用について、当業者は、文脈および／または出願に適するように、複数形を単数形に、および／または単数形を複数形に変えることが可能である。本明細書では、明確性を目的として、種々の単数形／複数形の置き換えが明記される場合もある。
【０１８３】
概して、本明細書および特に添付の特許請求の範囲（例えば、添付の特許請求の範囲の本文）で用いられる用語は、通常、「オープン（open）」な用語として意図されていることが当業者により理解されよう（例えば、用語「含み（including）」は、「限定されるわけではないが〜を含み」と解釈されるべきであり、用語「有し（having）」は「少なくとも〜を有し」と解釈されるべきであり、用語「含む（includes）」は、「限定されるわけではないが〜を含む」などと解釈されるべきである）。さらに、導入される請求項の記載において特定の数が意図される場合、そのような記載は請求項において明確に記載され、そのような記載がない場合はそのような意図は存在しないことが当業者により理解されよう。例えば、理解と助けとして、以下の添付の特許請求の範囲は、「少なくとも１つの」および「１つまたは複数の」という導入句を使用し、請求項の記載を導入することがある。しかしながら、このような句の使用は、たとえ同一のクレームに「１つまたは複数の」または「少なくとも１つの」といった導入句と、「１つ（a）」または「１つ（an）」などの不定冠詞を含んでも、不定冠詞「１つ（a）」または「１つ（an）」による請求項の記載の導入が、当該導入された請求項の記載を含む特定の請求項を、当該記載を１つのみ含む例に限定されることを示唆すると解釈されるべきではない（例えば、「１つ（a）」または「１つ（an）」は、「少なくとも１つの」または「１つまたは複数の」を意味すると解釈されるべきである）。定冠詞を使用して請求項の記載を導入する場合にも同様のことが当てはまる。加えて、導入される請求項の記載において特定の数が明確に記載される場合も、そのような記載は、少なくとも記載された数を意味すると解釈されるべきであることを当業者は理解しよう（例えば、他に修飾語のない、単なる「２つの記載事項」という記載は、少なくとも２つの記載事項、または２つ以上の記載事項を意味する）。さらに、「Ａ，Ｂ、およびＣなどの少なくとも１つ」に類する表現が用いられる場合、通常、そのような表現は、当業者が該表現を理解する意味が意図されている（例えば、「Ａ，Ｂ、およびＣなどの少なくとも１つを有するシステム」には、限定されるわけではないが、Ａのみ、Ｂのみ、Ｃのみ、ＡとＢの両方、ＡとＣの両方、ＢとＣの両方、および／または、ＡとＢとＣの全て、などを有するシステムが含まれるだろう）。「Ａ，Ｂ、およびＣなどの少なくとも１つ」に類する表現が用いられる場合、通常、そのような表現は、当業者が該表現を理解する意味が意図されている（例えば、「Ａ，Ｂ、およびＣの少なくとも１つを有するシステム」には、限定されるわけではないが、Ａのみ、Ｂのみ、Ｃのみ、ＡとＢの両方、ＡとＣの両方、ＢとＣの両方、および／または、ＡとＢとＣの全て、などを有するシステムが含まれるだろう）。さらに、２つ以上の代替可能な用語を表す実質的に任意の離接語および／または離接句は、説明、請求の範囲、または図面のいずれにおいても、用語のうち１つ、用語のいずれか、または、両方の用語を含む可能性が意図されると理解されるべきであることが、当業者には理解されよう。例えば、「ＡまたはＢ」という句は、「Ａ」もしくは「Ｂ」、または「ＡおよびＢ」の可能性を含むことが理解されよう。
【０１８４】
加えて、本開示の特徴または態様がマーカッシュグループによって記載されると、それにより本開示がマーカッシュグループのあらゆる個々の要素、または要素のサブグループの観点からも記載されるということを当業者は認識するであろう。
【０１８５】
当業者に理解されるように、記述を提供するなどあらゆるかつ全ての目的のため、本明細書に開示される全ての範囲は、あらゆるかつ全ての可能な部分範囲およびその部分範囲の組み合わせをも含む。挙げられたあらゆる範囲は、少なくとも半分、３分の１、４分の１、５分の１、１０分の１等へと細分化される同一の範囲を十分に記載し、かつ可能にしていることが容易に認識されるだろう。非限定的例として、明細書で記載される各範囲は、下部３分の１、中部３分の１、上部３分の１等に容易に分けられる。また、当業者には理解されるように、例えば、「まで（up to）」「少なくとも（at least）」「より大きい（greater than）」「未満（less than）」等の全ての文言は、記載される数を含み、上述のような部分範囲に続いて細分化し得る範囲を指す。最後に、当業者に理解されるように、範囲は個々の要素を含む。したがって、例えば、１〜３個の細胞を有する群は、１個、２個、または３個の細胞を有するグループを指す。同様に１〜５個の細胞を有する群は、１個、２個、３個、４個、または５個の細胞を有する群などを指す。
【０１８６】
上記より、本開示の種々の実施形態が例示を目的に本明細書で記載されたこと、および、種々の修正を本開示の範囲および趣旨から離れることなく行えることが理解されよう。したがって、本明細書に記載する種々の実施形態は限定的だと意図されるものではなく、真の範囲と趣旨が以下の特許請求の範囲に示されている。
【図１】
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【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
0006698076.tif 000031
【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
0006698076.tif 000045
【図２２−１】
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【図２２−２】
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