(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列
Ｘａａ１−Ｖａｌ２−Ｔｈｒ３−Ｏｒｎ４−Ｓｅｒ５−Ｘａａ６−Ｘａａ７−Ｓｅｒ８−Ｉｌｅ９−Ｐｒｏ１０−Ｉｌｅ１１−Ｐｒｏ１２−Ｉｌｅ１３
のペプチドであって、上式で、Ｘａａ６は、ＴｙｒまたはＰｈｅであり；Ｘａａ１およびＸａａ７は、各々独立してＬｙｓまたはＯｒｎであり；前記ペプチドは、環化されており；前記ペプチドは、Ｘａａ１に共有結合している飽和もしくは不飽和の置換型もしくは非置換型の直鎖状もしくは分枝状のＣ４〜Ｃ２０脂肪酸基、または飽和もしくは不飽和の直鎖状もしくは分枝状のＣ４〜Ｃ２０エステルを任意選択で含むことを特徴とするペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載のペプチドであって、前記Ｘａａ１は、Ｏｒｎであることを特徴とするペプチド。
【請求項３】
請求項２に記載のペプチドであって、配列Ｏｒｎ１−Ｖａｌ２−Ｔｈｒ３−Ｏｒｎ４−Ｓｅｒ５−Ｔｙｒ６−Ｌｙｓ７−Ｓｅｒ８−Ｉｌｅ９−Ｐｒｏ１０−Ｉｌｅ１１−Ｐｒｏ１２−Ｉｌｅ１３であることを特徴とするペプチド。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のペプチドであって、前記ペプチドは、Ｘａａ１に共有結合している前記飽和または不飽和の置換型または非置換型の直鎖状または分枝状のＣ４〜Ｃ２０脂肪酸基を含むことを特徴とするペプチド。
【請求項５】
請求項４に記載のペプチドであって、前記脂肪酸基が、式Ｃ１０Ｈ１９Ｏ、Ｃ１１Ｈ２１Ｏ、Ｃ１２Ｈ２３Ｏ、Ｃ１３Ｈ２５Ｏ、Ｃ１４Ｈ２７ＯまたはＣ１５Ｈ２９Ｏを有することを特徴とするペプチド。
【請求項６】
請求項１，２，４のいずれか１項に記載のペプチドであって、Ｘａａ６がＰｈｅであることを特徴とするペプチド。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のペプチドであって、Ｘａａ６がＴｙｒであり、前記ペプチドは、Ｘａａ１に共有結合している前記飽和または不飽和の直鎖状または分枝状のＣ４〜Ｃ２０エステルを含むことを特徴とするペプチド。
【請求項８】
請求項７に記載のペプチドであって、前記エステルが、式Ｃ１０Ｈ１９Ｏ２、Ｃ１１Ｈ２１Ｏ２、Ｃ１２Ｈ２３Ｏ２、Ｃ１３Ｈ２５Ｏ２、Ｃ１４Ｈ２７Ｏ２またはＣ１５Ｈ２９Ｏ２を有することを特徴とするペプチド。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のペプチドであって、Ｔｈｒ３とＩｌｅ１３との間の結合を介して環化されていることを特徴とするペプチド。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載のペプチド、および担体、ビヒクル、賦形剤または希釈剤を含むことを特徴とする組成物。
【請求項１１】
請求項１０に記載の組成物であって、前記組成物は、洗浄製品、消毒製品、パーソナルケア製品、動物飼料製品または食品であることを特徴とする組成物。
【請求項１２】
請求項１０に記載の組成物であって、前記組成物は、薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物であることを特徴とする組成物。
【請求項１３】
請求項１〜９のいずれか１項に記載のペプチドを調製するための方法であって、
（ａ）ペプチドの生産を可能にする条件の下で宿主細胞を培養すること、および
（ｂ）前記ペプチドを精製し単離すること、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項１〜９のいずれか１項に記載のペプチドを含む組成物を調製するための方法であって、
（ａ）前記ペプチドの生産を可能にする条件の下で宿主細胞を培養すること、
（ｂ）前記ペプチドを精製し単離すること、ならびに
（ｃ）単離された前記ペプチド、および担体、ビヒクル、賦形剤または希釈剤を含む組成物を生成すること、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法であって、前記組成物が、洗浄製品、消毒製品、パーソナルケア製品、動物飼料製品または食品であることを特徴とする方法。
【請求項１６】
請求項１４に記載の方法であって、前記組成物が、薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物であることを特徴とする方法。
【請求項１７】
表面上の微生物の生育または増殖を阻害するための組成物であって、請求項１〜９のいずれか１項に記載のペプチドを含み、
前記表面が、収穫後食品と関連する表面、食品加工表面、食品パッケージ、家庭内の表面、食品準備ツール、病院内の表面、外科用品、外科ツール、術後の包帯、創傷被覆帯または外傷であることを特徴とする組成物。
【請求項１８】
対象において微生物の生育または増殖を阻害するための組成物であって、請求項１〜９のいずれか１項に記載のペプチドを含むことを特徴とする組成物。
【請求項１９】
請求項１８に記載の組成物であって、前記対象が、微生物の存在に関連した疾患または状態を有することを特徴とする組成物。
【請求項２０】
請求項１９に記載の組成物であって、前記対象が微生物感染症を有することを特徴とする組成物。
【請求項２１】
請求項２０に記載の組成物であって、前記感染症が、ＭＲＳＡ、ＶＲＳＡまたはＣＲＥ感染症であることを特徴とする組成物。
【請求項２２】
請求項１８に記載の組成物であって、前記対象が、哺乳動物であることを特徴とする組成物。
【請求項２３】
請求項２２に記載の組成物であって、前記対象が、ヒト対象であることを特徴とする組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、抗微生物性ペプチド、抗微生物性ペプチドを含有する医薬組成物、および微生物感染症を抗微生物性ペプチドで治療する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本出願は、２０１４年６月９日に出願の米国特許仮出願第６２／００９４６７号への優先権を主張し、それは参照により完全に本明細書に組み込まれる。
【０００３】
抗生物質耐性病原細菌、例えば、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）、フルオロキノロン耐性緑膿菌およびクロストリジウム・ディフィシレ、ならびに多剤耐性のサルモネラ属の種は、現代医学で新興の問題である。現行の抗生物質の有効性の喪失のため、新しい抗生物質の同定および開発がより重要である。例えば、環境は、それらの天然の発生源から単離、精製することができる効力のある抗微生物薬を生産可能な微生物株の重要な供給源である。
【０００４】
環境に広く分布するペニバシラス属の芽胞形成種は、新しい抗微生物薬の潜在的供与源である。ペニバシラス属の株は、ランチビオティック、リポペプチドおよびマクロライドを含む多様な抗微生物剤を生成することができる。例えば、リポペプチドは、一般にリボソームによって合成されず、広範囲の細菌、真菌類および卵菌類に活性のある化合物である。リポペプチドは、抗ウイルスおよび抗腫瘍剤、免疫調節物質または特異的毒素および酵素阻害剤として作用することができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、グラム陽性およびグラム陰性細菌などの広範囲の微生物病原体に有効である抗微生物剤を同定し、開発する必要性がある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
一態様では、配列、
Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｘａａ７−Ｘａａ８−Ｘａａ９−Ｘａａ１０−Ｘａａ１１−Ｐｒｏ１２−Ｉｌｅ１３（配列番号２）
のペプチドが本明細書に含まれ、上式で、Ｘａａ６は、Ｔｙｒ、ＰｈｅまたはＴｒｐであり；Ｘａａ１、Ｘａａ４およびＸａａ７は、各々独立してＬｙｓまたはＯｒｎであり；Ｘａａ２、Ｘａａ９およびＸａａ１１は、各々独立してＬｅｕ、Ｉｌｅ、ＶａｌまたはＡｌａであり；Ｘａａ３、Ｘａａ５およびＸａａ８は、各々独立してＣｙｓ、Ｔｙｒ、ＴｈｒまたはＳｅｒであり；ペプチドは、Ｘａａ１に共有結合している飽和もしくは不飽和の置換型もしくは非置換型の直鎖状もしくは分枝状のＣ４〜Ｃ２０脂肪酸基または飽和もしくは不飽和の直鎖状もしくは分枝状のＣ４〜Ｃ２０エステルを任意選択で含む。
【０００７】
別の態様では、配列、
Ｘａａ１−Ｖａｌ２−Ｔｈｒ３−Ｘａａ４−Ｓｅｒ５−Ｘａａ６−Ｘａａ７−Ｓｅｒ８−Ｉｌｅ９−Ｐｒｏ１０−Ｘａａ１１−Ｐｒｏ１２−Ｉｌｅ１３（配列番号３）
のペプチドが本明細書に含まれ、上式で、Ｘａａ６は、Ｔｙｒ、ＰｈｅまたはＴｒｐであり；Ｘａａ１１は、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ＶａｌまたはＡｌａであり；Ｘａａ１、Ｘａａ４およびＸａａ７は、独立してＬｙｓまたはＯｒｎであり；ペプチドは、Ｘａａ１に共有結合している飽和もしくは不飽和の置換型もしくは非置換型の直鎖状もしくは分枝状のＣ４〜Ｃ２０脂肪酸基または飽和もしくは不飽和の直鎖状もしくは分枝状のＣ４〜Ｃ２０エステルを任意選択で含む。
【０００８】
ある特定の態様では、ペプチドはＴｈｒ３とＩｌｅ１３の間の結合を介して環化されている。
【０００９】
上記のペプチド、および担体、ビヒクル、賦形剤または希釈剤を含む組成物が、本明細書にさらに含まれる。
【００１０】
さらに別の態様では、上記のペプチドを調製するための方法は、（ａ）ペプチドの生産を可能にする条件の下で宿主細胞を培養すること；および（ｂ）ペプチドを精製し単離することを含む。
【００１１】
さらなる態様では、上記のペプチドを含む組成物を調製するための方法は、（ａ）ペプチドの生産を可能にする条件の下で宿主細胞を培養すること；（ｂ）ペプチドを精製し単離すること、ならびに（ｃ）単離されたペプチド、および担体、ビヒクル、賦形剤または希釈剤を含む組成物を生成することを含む。
【００１２】
またさらなる態様では、微生物の生育または増殖を阻害する方法は、微生物、または微生物を含有する可能性がある表面もしくは製品を、上記のペプチドと接触させることを含む。
【００１３】
またさらなる態様では、対象で微生物の生育または増殖を阻害する方法は、上記のペプチドの１つ以上を含む組成物を対象に投与することを含み、ペプチドは、微生物の生育または増殖を阻害するのに有効な量で投与される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１Ａ】トリプシンダイズ寒天（ＴＳＡ）でのペニバシラス・アルベイＴＳ−１５（図１Ａ；ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１２１７５６）およびＡ６−６ｉ（図１Ｂ；ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１２１８８５）による食物媒介性病原体およびトマトの細菌植物病原体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ阻害を示す図である。阻止帯（ｍｍ）は、サルモネラ属の種、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、クロノバクター・サカザキイ（ＣＳ）、リステリア・モノシトゲネス（ＬＭ）、志賀赤痢菌（ＳＤ）、メチシリン感受性黄色ブドウ球菌（ＭＳＳＡ）、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）、ラルストニア・ソラナセアラム  レース５（Ｒ．ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）、シュードモナス・シリンゲｐｖ．トマト株ｄｃ３０００（Ｐ．ｓｙｒｉｎｇａｅ）およびエルウィニア・カロトボーラ亜種カロトボーラ（Ｅ．ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ）からの株に対して測定した。プロットは、上に掲載した種の各々の最も低い、最も高いおよび平均の測定値を表す。実験は、２回繰り返した。
【図１Ｂ】トリプシンダイズ寒天（ＴＳＡ）でのペニバシラス・アルベイＴＳ−１５（図１Ａ；ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１２１７５６）およびＡ６−６ｉ（図１Ｂ；ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１２１８８５）による食物媒介性病原体およびトマトの細菌植物病原体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ阻害を示す図である。阻止帯（ｍｍ）は、サルモネラ属の種、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、クロノバクター・サカザキイ（ＣＳ）、リステリア・モノシトゲネス（ＬＭ）、志賀赤痢菌（ＳＤ）、メチシリン感受性黄色ブドウ球菌（ＭＳＳＡ）、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）、ラルストニア・ソラナセアラム  レース５（Ｒ．ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）、シュードモナス・シリンゲｐｖ．トマト株ｄｃ３０００（Ｐ．ｓｙｒｉｎｇａｅ）およびエルウィニア・カロトボーラ亜種カロトボーラ（Ｅ．ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ）からの株に対して測定した。プロットは、上に掲載した種の各々の最も低い、最も高いおよび平均の測定値を表す。実験は、２回繰り返した。
【図２Ａ】Ｐ．アルベイＡ６−６ｉの無細胞培養上清（ＣＦＣ）での主要な食物媒介性病原体の生育阻害を示す図である。対照として、脳心臓浸出物（ＢＨＩ）培養液を用いた。Ｐ．アルベイＡ６−６ｉ  ＣＦＣＳおよびＢＨＩでのＡ）Ｌ．モノサイトゲネス（ＬＭ）、Ｓ．ディセンテリエ（ＳＤ）、大腸菌Ｏ１５７、Ｃ．サカザキイ（ＣＳ）およびＳ．ニューポート株；ならびにＢ）メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）株の細菌生育を、２０分の間隔で２４時間Ｏ．Ｄ．６００を測定することによって５反復で判定した。実験は、２回繰り返した。
【図２Ｂ】Ｐ．アルベイＡ６−６ｉの無細胞培養上清（ＣＦＣ）での主要な食物媒介性病原体の生育阻害を示す図である。対照として、脳心臓浸出物（ＢＨＩ）培養液を用いた。Ｐ．アルベイＡ６−６ｉ  ＣＦＣＳおよびＢＨＩでのＡ）Ｌ．モノサイトゲネス（ＬＭ）、Ｓ．ディセンテリエ（ＳＤ）、大腸菌Ｏ１５７、Ｃ．サカザキイ（ＣＳ）およびＳ．ニューポート株；ならびにＢ）メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）株の細菌生育を、２０分の間隔で２４時間Ｏ．Ｄ．６００を測定することによって５反復で判定した。実験は、２回繰り返した。
【図３】サルモネラ菌叢でのポリミキシンＢ標準を示す図である。１ｍｇ／ｍＬから１μｇ／ｍＬまでの２倍の系列ポリミキシンＢ希釈の１０μＬ量を、サルモネラ・エンテリカ血清型モンテビデオ株２９Ｎの１０６個の細胞の菌叢の上にスポットした。３５±２℃で２４時間のインキュベーションの後に、阻止帯（ＺＩ）を観察した。
【図４】病原体に対するＴＳ−１５の１分活性分画を示す図である。Ｐ．アルベイ株ＴＳ−１５の１分分画からの１０μＬ量を、Ａ）大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７株ＥＤＬ９３３；Ｂ）メチシリン耐性黄色ブドウ球菌株＃１２の１０６個の細胞の菌叢の上にスポットした。３５±２℃で２４時間のインキュベーションの後、１分分画によって示される抗微生物活性が、明瞭な阻止帯（ＺＩ）として観察された。これらの実験は、Ｐ．アルベイ株Ａ６−６ｉでも実行した（データ示さず）。
【図５】ＴＳ−１５からの分画２０−２６のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ結果を示す図である。非標識の矢印は１４Ｄａの質量差を示し、それはＣＨ２の差を示す；アスタリスクはＭＷ１６２３を示し、それは一次配列と指定される；２および１６Ｄａの質量差の２つの例が標識され、それは他の分子変異体に対応する。
【図６】ＭＳ／ＭＳ類似性を示す図である。分子量が１４Ｄａ異なる２つの化合物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ／ＭＳ比較。アスタリスクの付いた質量−電荷比は、２つのスペクトルの比較で観察された１４Ｄａの質量差を示す。
【図７】手動による新規の配列決定によって解明されたＭＷ１６２３のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ／ＭＳスペクトルからの部分配列情報を示す図である。
【図８Ａ】以前に公開された、同定されたリポペプチドおよび本研究で発見されたペプチドの概略図である。Ａ．米国特許出願公開第２０１３／０１６４３１７号に記載され、ペニバクテリンと呼ばれる分子。Ｂ．本研究で発見された分子（複数可）。「Ｒ」基は、構造ＡおよびＢで付着しているアシル鎖に対応する；しかし、例えばＴｙｒが６位にある場合、Ｂ．の構造の「Ｒ」基はエステルであってもよい。
【図８Ｂ】以前に公開された、同定されたリポペプチドおよび本研究で発見されたペプチドの概略図である。Ａ．米国特許出願公開第２０１３／０１６４３１７号に記載され、ペニバクテリンと呼ばれる分子。Ｂ．本研究で発見された分子（複数可）。「Ｒ」基は、構造ＡおよびＢで付着しているアシル鎖に対応する；しかし、例えばＴｙｒが６位にある場合、Ｂ．の構造の「Ｒ」基はエステルであってもよい。
【図９】ＭＳｎスペクトル（ＭＳ３  ６４２２＋）での異なる生成物イオン系列の代表例を示す図である。対応する配列は、環状ペプチド構造のはめ込み概略図のアミノ酸にコードされる。
【図１０Ａ】複数のＭＳｎ分析を合わせた解釈の結果としての生成物イオン帰属を示す図である。６位にＰｈｅ（ＭＷ１６０７）またはＴｙｒ（ＭＷ１６２３）をそれぞれ含有する最も豊富な化合物の２つについて、ＭＳ２スペクトルの代表例を示す。これらの生成物イオン帰属は、図８に示す化学構造につながった。
【図１０Ｂ】複数のＭＳｎ分析を合わせた解釈の結果としての生成物イオン帰属を示す図である。６位にＰｈｅ（ＭＷ１６０７）またはＴｙｒ（ＭＷ１６２３）をそれぞれ含有する最も豊富な化合物の２つについて、ＭＳ２スペクトルの代表例を示す。これらの生成物イオン帰属は、図８に示す化学構造につながった。
【図１１】ＭＳ２スペクトルを示す図である。抗生物質のクラス内の化合物の３系列は、アミノ酸またはそれらの付着脂肪酸の差によって異なる。６位にＴｙｒを含有する化合物は、それらの生じたＭＳ／ＭＳスペクトルで一貫した生成物イオンとしてｍ／ｚ  ６５７２＋を有するが、６位のＰｈｅはｍ／ｚ  ６４９２＋をもたらす。アスタリスクの付いたｍ／ｚ値は、ＭＳ３スペクトルの間の１６Ｄａの質量差を示し、それはＰｈｅとＴｙｒの間の質量差である。ＭＷ１６２３とＭＷ１６２５の間の質量差は、付着脂肪酸（−ＣＨ２＋Ｏ）での１つ少ないＣＨ２基および追加の酸素に対応する。
【図１２】１４Ｄａ異なる分子量の化合物の間の配列類似性を実証する３つの代表的ＭＳ３スペクトルおよびそれらの対応する相補的なイオン対ＭＳ３スペクトルを示す図である。ＭＳ２スペクトルが概説され、ＭＳ３スペクトルが概説され、ＭＳ３のために選択した生成物イオンは強調されている。
【図１３】ＭＷ１６３７（上）およびＭＷ１６３９（下）のＭＳ／ＭＳ比較を示す図である。アスタリスクの付いたｍ／ｚ値は、優占する分子種と比較して付着脂肪酸での１つ少ないＣＨ２および追加の酸素に対応する、２つのスペクトルの生成物イオンの間の１．９７９Ｄａの質量差を示す。
【図１４】同じ分子量の３つの化合物の異なるＭＳ／ＭＳスペクトルが、図８の７位のＬｙｓまたはＯｒｎを、および抽出されたイオンクロマトグラム（ＥＩＣ）に示す異なるクロマトグラフピークによる付着脂肪酸の構造中の潜在的多様性を示すことを示す図である。
【図１５】化学合成された、脂肪酸改変ペプチドの概略図である。
【図１６Ａ】株Ａ６−６ｉ、ＴＳ−１５およびＯＳＹ  ＳＥのｐｔｂＡアラインメントを示す図である。
【図１６Ｂ】株Ａ６−６ｉ、ＴＳ−１５およびＯＳＹ  ＳＥのｐｔｂＡアラインメントを示す図である。
【図１６Ｃ】株Ａ６−６ｉ、ＴＳ−１５およびＯＳＹ  ＳＥのｐｔｂＡアラインメントを示す図である。
【図１６Ｄ】株Ａ６−６ｉ、ＴＳ−１５およびＯＳＹ  ＳＥのｐｔｂＡアラインメントを示す図である。
【図１６Ｅ】株Ａ６−６ｉ、ＴＳ−１５およびＯＳＹ  ＳＥのｐｔｂＡアラインメントを示す図である。
【図１６Ｆ】株Ａ６−６ｉ、ＴＳ−１５およびＯＳＹ  ＳＥのｐｔｂＡアラインメントを示す図である。
【図１６Ｇ】株Ａ６−６ｉ、ＴＳ−１５およびＯＳＹ  ＳＥのｐｔｂＡアラインメントを示す図である。
【図１６Ｈ】株Ａ６−６ｉ、ＴＳ−１５およびＯＳＹ  ＳＥのｐｔｂＡアラインメントを示す図である。
【図１６Ｉ】株Ａ６−６ｉ、ＴＳ−１５およびＯＳＹ  ＳＥのｐｔｂＡアラインメントを示す図である。
【図１６Ｊ】株Ａ６−６ｉ、ＴＳ−１５およびＯＳＹ  ＳＥのｐｔｂＡアラインメントを示す図である。
【図１６Ｋ】株Ａ６−６ｉ、ＴＳ−１５およびＯＳＹ  ＳＥのｐｔｂＡアラインメントを示す図である。
【図１６Ｌ】株Ａ６−６ｉ、ＴＳ−１５およびＯＳＹ  ＳＥのｐｔｂＡアラインメントを示す図である。
【図１６Ｍ】株Ａ６−６ｉ、ＴＳ−１５およびＯＳＹ  ＳＥのｐｔｂＡアラインメントを示す図である。
【図１７Ａ】株Ａ６−６ｉ、ＴＳ−１５およびＯＳＹ  ＳＥのｐｔｂＢアラインメントを示す図である。
【図１７Ｂ】株Ａ６−６ｉ、ＴＳ−１５およびＯＳＹ  ＳＥのｐｔｂＢアラインメントを示す図である。
【図１７Ｃ】株Ａ６−６ｉ、ＴＳ−１５およびＯＳＹ  ＳＥのｐｔｂＢアラインメントを示す図である。
【図１７Ｄ】株Ａ６−６ｉ、ＴＳ−１５およびＯＳＹ  ＳＥのｐｔｂＢアラインメントを示す図である。
【図１７Ｅ】株Ａ６−６ｉ、ＴＳ−１５およびＯＳＹ  ＳＥのｐｔｂＢアラインメントを示す図である。
【図１７Ｆ】株Ａ６−６ｉ、ＴＳ−１５およびＯＳＹ  ＳＥのｐｔｂＢアラインメントを示す図である。
【図１７Ｇ】株Ａ６−６ｉ、ＴＳ−１５およびＯＳＹ  ＳＥのｐｔｂＢアラインメントを示す図である。
【図１７Ｈ】株Ａ６−６ｉ、ＴＳ−１５およびＯＳＹ  ＳＥのｐｔｂＢアラインメントを示す図である。
【図１７Ｉ】株Ａ６−６ｉ、ＴＳ−１５およびＯＳＹ  ＳＥのｐｔｂＢアラインメントを示す図である。
【図１７Ｊ】株Ａ６−６ｉ、ＴＳ−１５およびＯＳＹ  ＳＥのｐｔｂＢアラインメントを示す図である。
【図１７Ｋ】株Ａ６−６ｉ、ＴＳ−１５およびＯＳＹ  ＳＥのｐｔｂＢアラインメントを示す図である。
【図１７Ｌ】株Ａ６−６ｉ、ＴＳ−１５およびＯＳＹ  ＳＥのｐｔｂＢアラインメントを示す図である。
【図１７Ｍ】株Ａ６−６ｉ、ＴＳ−１５およびＯＳＹ  ＳＥのｐｔｂＢアラインメントを示す図である。
【図１８Ａ】株Ａ６−６ｉ、ＴＳ−１５およびＯＳＹ  ＳＥのｐｔｂＣアラインメントを示す図である。
【図１８Ｂ】株Ａ６−６ｉ、ＴＳ−１５およびＯＳＹ  ＳＥのｐｔｂＣアラインメントを示す図である。
【図１８Ｃ】株Ａ６−６ｉ、ＴＳ−１５およびＯＳＹ  ＳＥのｐｔｂＣアラインメントを示す図である。
【図１８Ｄ】株Ａ６−６ｉ、ＴＳ−１５およびＯＳＹ  ＳＥのｐｔｂＣアラインメントを示す図である。
【図１８Ｅ】株Ａ６−６ｉ、ＴＳ−１５およびＯＳＹ  ＳＥのｐｔｂＣアラインメントを示す図である。
【図１８Ｆ】株Ａ６−６ｉ、ＴＳ−１５およびＯＳＹ  ＳＥのｐｔｂＣアラインメントを示す図である。
【図１８Ｇ】株Ａ６−６ｉ、ＴＳ−１５およびＯＳＹ  ＳＥのｐｔｂＣアラインメントを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
上記のおよび他の特徴は、以下の詳細な記載、図および添付の請求項から当業者は認識し、理解する。
【００１６】
抗微生物および広範囲抗菌活性を有する新規ペプチド、具体的には環状ペプチドが本明細書に記載される。具体的には、ペプチドは、ＭＲＳＡおよびＶＲＳＡなどの危険なグラム陽性生物体に活性である。
【００１７】
最近、サルモネラ・ニューポートおよび他のサルモネラ血清型の食物媒介性発生で、トマトが一次媒体として関連付けられた。トマト上のサルモネラ保有率を低減するための長期介入手段は、生育期および収穫後の環境に関して捉えどころがないままである。１６ＳリボソームＤＮＡ配列決定によってペニバシラス・アルベイと同定された天然に存在する細菌が、バージニア州東部海岸のトマト栽培地域に自生する植物地上部から単離された。ヒト食物供給に関連したサルモネラおよび１０種の他の細菌性病原体に対する最初の抗微生物活性スクリーニングの後、分割法による昆虫遮蔽の高いトンネル内でトマト植物の接種したトマト、葉および花の上のＳ．ニューポートの弱毒株にチャレンジするために、株ＴＳ−１５をさらに用いた。花については０、１、２、３および５日目におよびトマトおよび葉については６日目に、アンタゴニストの有る無しの群について接種後のサルモネラの生存をそれぞれ測定した。ＴＳ−１５は、主要な食物媒介性病原体および主要なトマト植物関連の細菌性病原体の両方に対して広い範囲の抗微生物活性を示した。Ｐ．アルベイ株ＴＳ−１５をトマト植物のトマト、葉および花の上へ適用した後、対照と比較してＳ．ニューポートの濃度は有意に低下した（ｐ≦０．０５）。驚くべきことに、花については５日目までに、９０％を超える植物はサルモネラの検出可能なレベルを有していなかった。トマト植物全体におけるサルモネラ・ニューポートの保有を低減する上で、天然に存在するアンタゴニスト株ＴＳ−１５は非常に有効である。Ｐ．アルベイ株ＴＳ−１５の適用は、トマト生産の間のサルモネラ汚染のリスクを低減するための有望な手法である。さらに、ペニバシラス株Ａ６−６ｉは、同等の特性を保持することが見出された。この活性を内部の殺細菌化合物に帰すことができることを考慮して、本発明者らは、ＭＲＳＡおよびＶＲＳＡなどの危険なグラム陽性生物体への効果を含む抗サルモネラ効果および他の抗生物質効果を担うある特定の化合物を化学的に単離し、精製し、同定した。
【００１８】
より具体的には、これらのペニバシラス株から抗微生物化合物を単離し、多段タンデム型質量分析による低分解能および高分解能質量分析の組合せを同定のために用いた。主に脂肪酸鎖長および２つの可能なアミノ酸置換のうちの１つが異なる、一群の近縁の環状リポペプチドを同定した。脂肪酸の長さの変動は、１４Ｄａの質量差をもたらし、関係するＭＳｎスペクトルの群を与える。環式化合物のＭＳ／ＭＳスペクトルの固有の複雑性にもかかわらず、分子量が１４Ｄａ異なる化合物の間の相補的な生成物イオン系列の差を判定することによって、これらのスペクトルの直接分析が達成された。
【００１９】
「抗微生物性化合物」は抗微生物活性を示す化合物または微生物活性に影響する化合物であり、生育および／もしくは増殖を遅くするか停止する、生育および／もしくは増殖の速度を遅くするか停止する、または微生物を気絶させるか、不活性化するか、死滅させる化合物を意味する。抗微生物性化合物には、抗生物質、抗菌性物質（例えば、殺細菌剤または静菌剤）、抗ウイルス薬（例えば、殺ウイルス剤）、抗真菌剤（例えば、殺真菌剤または静真菌剤）、防かび剤、駆虫薬（例えば、駆虫剤または殺寄生虫剤）、駆虫剤などが含まれる。抗微生物活性は、本明細書に記載される方法ならびに当技術分野で公知の方法を用いて判定することができる。
【００２０】
本明細書で用いるように、アミノ酸には、遊離の場合には一般式Ｈ２ＮＣＨＲＣＯＯＨおよびポリペプチド中ではＨＮＣＨＲＣＯのα−アミノ酸であって、式中、Ｒは有機置換基を含むアミノ酸側鎖であり、ならびに、例えばプロリンなどの特異構造のアミノ酸が含まれる。アミノ酸には、例えば、イソロイシン、ロイシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、メチオニン、システイン、フェニルアラニン、トレオニン、トリプトファン、グリシン、バリン、プロリン、セリン、チロシン、アルギニン、ヒスチジン、ノルロイシン、オルニチン、タウリン、セレノシステイン、セレノメチオニン、ランチオニン、２−アミノイソ酪酸、デヒドロアラニン、ヒプシン、シトルリン、３−アミノプロパン酸、アミノ酪酸（アルファ、ベータおよびガンマ）ジアミノ酪酸などが含まれる。用語「アミノ酸側鎖」は、１つのアミノ酸を別のアミノ酸から区別する様々な有機置換基（例えば、Ｈ２ＮＣＨＲＣＯＯＨでは「Ｒ」）を指す。
【００２１】
一態様では、抗微生物性ペプチドは、配列：
Ｘａａ１−Ｖａｌ２−Ｔｈｒ３−Ｘａａ４−Ｓｅｒ５−Ｘａａ６−Ｘａａ７−Ｓｅｒ８−Ｉｌｅ９−Ｐｒｏ１０−Ｉｌｅ１１−Ｐｒｏ１２−Ｉｌｅ１３（配列番号１）
を有し、上式で、Ｘａａ６は、Ｔｙｒ、ＰｈｅまたはＴｒｐ、特にＴｙｒまたはＰｈｅであり；Ｘａａ１、Ｘａａ４およびＸａａ７は、各々独立してＬｙｓまたはＯｒｎであり；または、抗微生物性ペプチドは、配列
Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｘａａ７−Ｘａａ８−Ｘａａ９−Ｘａａ１０−Ｘａａ１１−Ｐｒｏ１２−Ｉｌｅ１３（配列番号２）
を有し、上式で、Ｘａａ６は、Ｔｙｒ、ＰｈｅまたはＴｒｐ、特にＴｙｒまたはＰｈｅであり；Ｘａａ１、Ｘａａ４およびＸａａ７は、各々独立してＬｙｓまたはＯｒｎであり；Ｘａａ２、Ｘａａ９およびＸａａ１１は、各々独立して、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ＶａｌおよびＡｌａから選択される疎水性アミノ酸であり；Ｘａａ３、Ｘａａ５およびＸａａ８は、各々独立して、水素結合、ジスルフィド結合、チオエーテル結合またはエステル結合を形成することができるアミノ酸から選択されるアミノ酸、例えばＣｙｓ、Ｔｙｒ、ＴｈｒおよびＳｅｒである。
【００２２】
より具体的な態様では、抗微生物性ペプチドは、配列：
Ｘａａ１−Ｖａｌ２−Ｔｈｒ３−Ｘａａ４−Ｓｅｒ５−Ｘａａ６−Ｘａａ７−Ｓｅｒ８−Ｉｌｅ９−Ｐｒｏ１０−Ｘａａ１１−Ｐｒｏ１２−Ｉｌｅ１３（配列番号３）
を有し、上式で、Ｘａａ６は、Ｔｙｒ、ＰｈｅまたはＴｒｐ、特にＴｙｒまたはＰｈｅであり；Ｘａａ１、Ｘａａ４およびＸａａ７は、各々独立してＬｙｓまたはＯｒｎであり；Ｘａａ１１は、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ＶａｌおよびＡｌａから選択される疎水性アミノ酸である。具体的な実施形態では、Ｘａａ１およびＸａａ４はＯｒｎであり、Ｘａａ１１はＩｌｅであり；
より具体的には、
Ｏｒｎ１−Ｖａｌ２−Ｔｈｒ３−Ｏｒｎ４−Ｓｅｒ５−Ｘａａ６−Ｘａａ７−Ｓｅｒ８−Ｉｌｅ９−Ｐｒｏ１０−Ｉｌｅ１１−Ｐｒｏ１２−Ｉｌｅ１３（配列番号４）、
であり、上式で、Ｘａａ６は、ＴｙｒまたはＰｈｅであり；Ｘａａ７は、ＬｙｓまたはＯｒｎである。
【００２３】
具体的な実施形態では、ペプチドは、
Ｏｒｎ１−Ｖａｌ２−Ｔｈｒ３−Ｏｒｎ４−Ｓｅｒ５−Ｔｙｒ６−Ｌｙｓ７−Ｓｅｒ８−Ｉｌｅ９−Ｐｒｏ１０−Ｉｌｅ１１−Ｐｒｏ１２−Ｉｌｅ１３（配列番号７７）である。
【００２４】
ある特定の実施形態では、配列番号１〜４のペプチドは、１位のアミノ酸、例えばＸａａ１に共有結合している脂肪酸基、特に、飽和もしくは不飽和の置換型もしくは非置換型の直鎖状もしくは分枝状のＣ４〜Ｃ２０脂肪酸基または飽和もしくは不飽和の直鎖状もしくは分枝状のＣ４〜Ｃ２０エステルを含む。脂肪酸鎖は、−ＣＨ２の数が多様である。例えば、アシル鎖の分子式は、Ｃ１０Ｈ１９Ｏ、Ｃ１１Ｈ２１Ｏ、Ｃ１２Ｈ２３Ｏ、Ｃ１３Ｈ２５Ｏ、Ｃ１４Ｈ２７ＯまたはＣ１５Ｈ２９Ｏであってもよい。エステル基も同様に異なる（Ｃ１０Ｈ１９Ｏ２、Ｃ１１Ｈ２１Ｏ２、Ｃ１２Ｈ２３Ｏ２、Ｃ１３Ｈ２５Ｏ２、Ｃ１４Ｈ２７Ｏ２またはＣ１５Ｈ２９Ｏ２）。
【００２５】
官能基によって、ペプチドは、Ｃ末端からＮ末端にかけて、Ｃ末端から側鎖にかけて、側鎖からＮ末端にかけて、または側鎖から側鎖にかけて環化されてもよい。一態様では、ペプチドは、Ｔｈｒ３／４とＩｌｅ１３／１４の間の結合を介して環化されている。
【００２６】
具体的な実施形態では、Ｘａａ６がＴｙｒである場合、１位のアミノ酸は脂肪酸基またはエステル基に共有結合し、Ｘａａ６がＰｈｅである場合、１位のアミノ酸は脂肪酸基に共有結合する。
【００２７】
現在開示されている化合物は、Ｘ１２が荷電側鎖を有するアミノ酸であることを要求する米国特許出願公開第２０１３／０１６４３１７号で開示される環状ペプチドと異なることに注意する。本化合物では、Ｘ１２はプロリンであり、それは開示されるペプチドに特異構造および抗微生物特性も付与すると予想される。
【００２８】
（ａ）抗微生物性ペプチドの生産を可能にする条件の下で宿主細胞を培養すること；および、任意選択で（ｂ）抗微生物性ペプチドを精製／単離することによって、抗微生物性化合物、具体的には抗微生物性ペプチドを生成する方法も本明細書に含まれる。
【００２９】
宿主細胞は、当技術分野で公知の技術を用いて抗微生物性ペプチドの生産に適する栄養培地で培養される。例えば、細胞は、ポリペプチドの発現および／または単離を可能にする、適する培地および条件の下で実行される、実験室または産業用の発酵槽での振盪フラスコ培養、小規模または大規模な発酵（連続、バッチ、流加または固体発酵を含む）によって培養される。細胞を培養するために適する栄養培地（例えば、炭素および窒素源、無機塩などを含む培地）が用いられる。抗微生物性ペプチドが細胞から栄養培地に分泌される実施形態では、抗微生物性ペプチドは、培地から直接的に回収することができる。抗微生物性ペプチドが分泌されない場合は、それは細胞溶解物から、または封入体として回収することができる。抗微生物性ペプチドは、遠心分離、濾過、抽出、噴霧乾燥、蒸発および沈殿を限定されずに含む手法によって、栄養培地または細胞溶解物から回収することができる。
【００３０】
本明細書に開示される抗微生物性ペプチドは、クロマトグラフィ（例えば、イオン交換、親和性、疎水性、クロマトフォーカシングおよびサイズ排除）、電気泳動的手法（例えば、調製用等電点電気泳動）、差別的溶解性（例えば、硫安沈殿）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび抽出を限定されずに含む様々な手法によって精製することができる。
【００３１】
抗微生物性ペプチドの生成のための細菌培養は、細菌細胞の生育、維持および／またはタンパク質生産に有益な、適する方法および培地を用いて増殖させることができる。
【００３２】
この工程の一部の実施形態では、抗微生物性ペプチドは、有機溶媒および／または水性溶媒または緩衝系を用いる液体クロマトグラフィ、相分離を含む、当技術分野で公知の適する技術を用いて単離および／または精製される。一部の実施形態では、抗微生物性ペプチドは、約７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％以上まで精製される。純度の分析は、分析の方法または技術、例えば、質量分析、ゲル電気泳動、蛍光、比色アッセイ、ＮＭＲ、ＵＶ−可視光、全アミノ酸加水分解、純度をピーク面積に基づいて評価することができる、例えばＨＰＬＣ、ＦＰＬＣ、サイズ排除、親和性結合、疎水性相互作用、イオン荷電などの液体クロマトグラフィ方法を利用するクロマトグラフィ分離法を用いて実行することができる。
【００３３】
他の実施形態では、抗微生物性ペプチドは、当技術分野で公知である標準の化学的および／またはタンパク質およびペプチド合成技術によって生成することができる。一部の実施形態は、化学的、ペプチドおよび酵素的（例えば、シクラーゼ）合成工程の組合せを組み込む合成戦略に関する。ペプチドを環化する化学的技術は、当技術分野で周知である。
【００３４】
開示の態様は、少なくとも１つの抗微生物性ペプチドの有効量を含む医薬組成物および製剤を含む、組成物および製剤に関する。そのような組成物および製剤は、抗微生物性ペプチドの有効量を、薬学的および／または農業上許容される担体、ビヒクル、賦形剤および希釈剤を含む、担体、ビヒクル、賦形剤または希釈剤と一緒に含む。「有効量」は、有意なプラスの結果（例えば、微生物活動を遅くするか終わらせる）または治療する対象の状態のプラスの変化を提供するのに十分高く、好適には重大な副作用を回避するのに十分低い（理にかなった利益／リスク比）、抗微生物性ペプチドの量に関する。担体、ビヒクル、賦形剤および希釈剤は、哺乳動物への投与に適する１つ以上の適合する物質、例えば、固体か液体のフィラー、希釈剤、ヒドロトロープ、界面活性剤および封入物質である。「適合する」は、通常の使用状況の下で組成物の有効性を実質的に低減するであろう相互作用がないような方法で、組成物の構成成分を活性剤と、および互いと混合することが可能であることを意味する。担体、ビヒクル、賦形剤および希釈剤は、好適にはそれらがヒト対象などの治療対象への投与に適するようにするのに十分に高い純度および十分に低い毒性である。担体、ビヒクル、賦形剤または希釈剤は不活性であってもよいか、それは、薬学的有益性および／または審美的有益性、または両方を有することができる。適する担体、ビヒクル、賦形剤および希釈剤は、当技術分野で公知である。
【００３５】
抗微生物性組成物は、例えば、低ｐＨおよび高ｐＨ値の製品、高濃縮および希薄製品、工業分野で（例えば、産業または家庭用の洗浄剤）、医薬分野で（例えば、装置の洗浄／消毒のための、または医薬組成物の調製またはそれらのパッケージング、ならびに手術備品および道具の滅菌／病院手術室）、パーソナルケアで（例えば、化粧品、シャンプ、クリームおよびローションの製造で）、飼料産業で（例えば、装置の洗浄のために、動物用の飼料および飲料品の製造、貯蔵、取扱いおよび調製で）、ならびに食品および飲料産業で（収穫後食物、食品加工表面およびパッケージング）使用可能な製品にわたる、様々な製品および用途に適用可能である。抗微生物性ペプチドは術後の包帯および創傷被覆帯プレップ、外傷治癒および洗浄でも有益である。さらに、抗微生物性ペプチドは、腐敗生物体に対する収穫後および食物保存用途で有益である。製品での組成物の使用に関する実施形態では、抗微生物性組成物は、最終製品（例えば、化粧品、洗浄剤、医薬、食品または飲料品）中の成分として提供されてもよい。したがって、一部の実施形態では、組成物は、食物腐敗に一般に関連した特定の酵母、真菌および細菌に有効である。本明細書に記載される抗微生物性ペプチドの１つ以上を含むそのような製品の製造では、標準の方法を用いることができる。
【００３６】
一部の実施形態では、抗微生物性組成物は、製品の表面、または製品の中に存在する。一部の実施形態では、本開示は、食品または飲料品などの製品中の微生物（例えば、グラム陽性菌またはグラム陰性菌）の存在、生育または活性を低減または防止する方法を含み、この方法は、食品または飲料品の製造、取扱い、保存および／または調製の段階を含む、食品加工工程の中の様々な段階の１つ以上の間に、食品または飲料品を本明細書に開示される抗菌組成物と接触させることを含む。抗微生物性組成物は、適する経路または方法によって、例えば、噴霧、すすぎもしくは洗浄溶液として、または様々な食品を浸漬する溶液として適用または導入することができる。さらに、抗微生物性組成物は、製品のパッケージングの前、同時に、またはその後に、容器またはパッケージングフィルムを処理するために用いることができる。
【００３７】
一態様では、微生物の生育または増殖を阻害する方法は、微生物と本明細書に記載される抗微生物性ペプチドとの接触を含む。「細胞を接触させる」のように本明細書で用いられる「接触させる」は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで（すなわち、対象、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ネコおよびイヌを含む哺乳動物の中で）、細胞を直接的または間接的に接触させることを指す。細胞を「反応させる」ことも含む、細胞を接触させることは、対象への投与の結果として起こることができる。接触させることは、細胞、組織、哺乳動物、対象、患者またはヒトへの投与を包含する。さらに、細胞を接触させることは、細胞培養に薬剤を加えることを含む。他の適する方法は、本明細書に規定される適当な手法および投与経路を用いて、細胞、組織、哺乳動物、対象または患者に薬剤を導入または投与することを含むことができる。
【００３８】
本明細書に記載される抗微生物性組成物は、固体または液体形で提供することができる。液体形である場合、組成物は一般的に水性組成物であり、それは、溶液、エマルジョンまたは分散液であってもよい。
【００３９】
したがって、本明細書に記載される方法は１つ以上の医薬組成物の投与を含み、そこにおいて、抗微生物性ペプチドは、本明細書に記載される１つ以上の薬学的に許容される担体、賦形剤、緩衝液、アジュバント、安定剤または他の材料と混合される。
【００４０】
本明細書で用いられる「薬学的に許容される」は、健全な医学的判断の範囲内で、過剰な毒性、刺激、アレルギ応答も、他の問題または合併症もなしで対象（例えば、ヒト）の組織と接触させて用いるのに適し、理にかなった利益／リスク比と釣り合っている、化合物、材料、組成物および／または剤形に関する。各担体、賦形剤などは、製剤の他の成分に適合しているという意味においても「許容され」なければならない。
【００４１】
製剤は単位剤形で都合よく提供することができ、薬学分野で公知の方法によって調製することができる。そのような方法は、活性化合物（複数可）を１つ以上の副成分を構成する担体と合体させる工程を含む。一般に、製剤は、活性化合物を液体担体または微粉固体担体または両方と均一および緊密に合わせ、次に、必要に応じて生成物を成形することによって調製される。
【００４２】
製剤は、液剤、溶液、懸濁液、エマルジョン、エリキシル剤、シロップ、錠剤、ロゼンジ、顆粒剤、散剤、カプセル、カシェ剤、丸剤、アンプル、坐薬、ペッサリ、軟膏、ゲル剤、ペースト、クリーム、噴霧剤、ミスト、フォーム、ローション、オイル、ボーラス、舐剤またはエアゾールの形であってもよい。
【００４３】
経口投与（例えば、摂取による）に適する製剤は、一般的に活性化合物の所定量を各々含有する個別の単位として、例えば、カプセル、カシェ剤または錠剤；散剤または顆粒として；水性または非水性液体中の溶液または懸濁液として；または水中油型の液体エマルジョンまたは油中水型の液体エマルジョンとして；ボーラスとして；舐剤として；またはペーストとして提供される。
【００４４】
錠剤は、任意選択で１つ以上の副成分と一緒に、圧縮または成形によって作ることができる。圧縮錠剤は、任意選択で１つ以上の結合剤（例えば、ポビドン、ゼラチン、アラビアゴム、ソルビトール、トラガカントゴム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース）；フィラーまたは希釈剤（例えば、ラクトース、微結晶性セルロース、リン酸水素カルシウム）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ）；崩壊剤（例えば、グリコール酸デンプンナトリウム、架橋ポビドン、架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム）；表面活性または分散または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）；および保存剤（例えば、メチルｐ−ヒドロキシベンゾアート、プロピルｐ−ヒドロキシベンゾアート、ソルビン酸）と混合した、粉末または顆粒などの自由流動性の形の活性化合物を適する機械の中で圧縮することによって調製される。成形錠剤は、不活性の液体希釈剤で湿らせた粉末化合物の混合物を適する機械の中で成形することによって作られる。錠剤は、任意選択でコーティングするか切り目をつけることができ、また、例えば所望の放出プロファイルを提供するために様々な割合でヒドロキシプロピルメチルセルロースを用いて、活性化合物の徐放性または制御放出を提供するように製剤化することができる。胃以外の腸の部分で放出を提供するために、錠剤は任意選択で、腸溶コーティングで提供される。
【００４５】
非経口投与（例えば、皮膚、皮下、筋肉内、静脈内および皮内注射を含む注射による）に適する製剤には、抗酸化剤、緩衝液、保存剤、安定剤、静菌薬および製剤を予定レシピエントの血液と等張性にする溶質を含有することができる、水性および非水性の等張性の発熱物質を含有しない無菌注射溶液；ならびに、懸濁剤および増粘剤を含むことができる水性および非水性の無菌懸濁液、ならびに化合物が血液構成成分または１つ以上の器官を標的とするように設計されているリポソームまたは他の微小粒子系が含まれる。そのような製剤で用いるための等張性ビヒクルの例には、塩化ナトリウム注射液、リンガー液または乳酸加リンゲル液が含まれる。製剤は、単位用量または多回用量密封容器、例えばアンプルおよびバイアルで提供することができ、使用直前に無菌の液体担体、例えば注射用水を添加するだけでよい、フリーズドライ（凍結乾燥）状態で保存することができる。即時使用の注射溶液および懸濁液は、無菌の粉末、顆粒および錠剤から調製することができる。製剤は、活性化合物が血液構成成分または１つ以上の器官を標的とするように設計されているリポソームまたは他の微小粒子系の形であってもよい。
【００４６】
局所投与（例えば、経皮、鼻腔内、目、口内および舌下）に適する製剤は、軟膏、クリーム、懸濁液、ローション、散剤、溶液、ペースト、ゲル、噴霧剤、エアゾールまたはオイルとして製剤化することができる。あるいは、製剤は、パッチまたは被覆帯、例えば活性化合物および任意選択で１つ以上の賦形剤または希釈剤を含浸させた包帯または絆創膏を含むことができる。目への局所投与に適する製剤には、活性化合物が適する担体、特に活性化合物のための水性溶媒に溶解または懸濁されている点眼剤も含まれる。
【００４７】
皮膚経由の局所投与に適する製剤には、軟膏、クリームおよびエマルジョンが含まれる。軟膏で製剤化される場合、活性化合物は、任意選択でパラフィンまたは水混和性の軟膏基材と一緒に使用されてもよい。あるいは、活性化合物は、水中油型のクリーム基材でクリームに製剤化することができる。局所製剤は、皮膚または他の患部を通した活性化合物の吸収または透過を増強する化合物を望ましくは含むことができる。そのような皮膚透過エンハンサの例には、ジメチルスルホキシドが含まれる。
【００４８】
活性化合物、および活性化合物を含む組成物の適当な投薬量は、対象によって異なってもよいことが理解される。最適な投薬量の決定は、本明細書に記載される治療の任意のリスクまたは有害副作用に対して治療有益性のレベルを均衡させることを一般に含む。選択される投薬量レベルは、特定の対象の種、特定の化合物の活性、投与経路、投与時間、化合物の排泄速度、治療期間、他の薬物、化合物および／または物質が併用されるかどうか、ならびに対象の年齢、性別、体重、状態、健康状態および以前の病歴を限定されずに含む、様々な因子による。化合物の量および投与経路は、最終的に医師の裁量で決められるが、一般に、投薬量は、実質的な有害または有毒な副作用を引き起こさずに所望の効果を達成する、作用部位での局所濃度を達成することを目的とする。
【００４９】
ｉｎ  ｖｉｖｏ投与は、全治療過程において１用量で、連続的にまたは断続的に（例えば、適当な間隔の分割用量で）実行することができる。投与の最も有効な手段および投薬量を判定する方法は当業者に周知であり、療法のために使用する製剤、療法の目的、治療する標的細胞、および治療対象に伴って異なる。１回または複数回の投与を実施することができ、用量レベルおよびパターンは担当医によって選択される。
【００５０】
一般に、活性化合物の適する用量は、１日に単一または複数の用量で投与される、１日につき対象の１キログラム体重につき約１００μｇから約２５０ｍｇの範囲内である。
【００５１】
対象で微生物の生育または増殖を阻害する方法は、抗微生物性ペプチドを含む組成物を対象に投与することを含み、抗微生物性ペプチドは、微生物の生育または増殖を阻害するのに有効な量で投与される。
【００５２】
一実施形態では、微生物の存在に関連した状態または疾患を治療する方法は、抗微生物性ペプチドを含む組成物を、それを必要とする対象に投与することを含み、抗微生物性ペプチドはその状態または疾患を治療するのに有効な量で投与される。
【００５３】
一実施形態では、微生物感染症を治療する方法は、抗微生物性ペプチドを含む組成物を、それを必要とする対象に投与することを含み、抗微生物性ペプチドは、その微生物感染症を治療するのに有効な量で投与される。例示的な感染症には、ＭＲＳＡ、ＶＲＳＡおよびＣＲＥ感染症が含まれる。
【００５４】
本明細書で用いるように、「投与」または「投与する」は、所望の効果を達成するために適当な経路によって化合物（複数可）を提供すること、接触させることおよび／または送達することを指す。投与には、経口、舌下、非経口（例えば、静脈内、皮下、皮内、筋肉内、関節内、動脈内、関節滑液嚢内、胸骨内、クモ膜下、病巣内または頭蓋内注射）、経皮、局所、口内、直腸、膣、経鼻、眼、吸入およびインプラントを限定されずに含めることができる。
【００５５】
本明細書で用いるように、用語「治療」、「治療すること」または「治療する」は、治療的処置と予防措置的または予防的手段の両方を指す。処置を必要とする対象には、特定の疾患、障害または状態の臨床徴候を既に示している対象だけでなく、疾患、障害もしくは状態を有しやすいか起こしやすい対象、または疾患、障害もしくは状態を予防すべき対象が含まれる。他の一次疾患および障害（例えば、免疫抑制状態）から生じる日和見感染からもたらされる二次性の状態を含めて、多くの疾患、障害および状態は微生物の存在に関係し、当業者には公知である。したがって、様々な患者クラスが、本明細書に記載される治療の方法から利益を受けることができる。
【００５６】
本明細書で用いるように、用語「対象」は、ヒトおよびヒト以外の動物を含むものとする。例示的なヒト対象には、障害、例えば本明細書に記載される障害を有するヒト患者、または正常な対象が含まれる。用語「ヒト以外の動物」には、全脊椎動物、例えば、非哺乳動物（鳥類（例えば、カモ、ニワトリなど）、両生類、爬虫類など）ならびに哺乳動物、例えば非ヒト霊長類、家畜および／または農業上有益な動物（ウマ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタなど）および齧歯動物（マウス、ラット、ハムスタ、モルモットなど）が含まれる。
【００５７】
一部の実施形態では、「有効量」は、疾患、障害または状態の進行を停止するか遅らせるのに十分な量である。一部の実施形態では、有効量は、疾患、障害もしくは状態を元に戻すか、または疾患、障害もしくは状態の臨床徴候を治すのに十分な量である。実施形態では、量は、微生物に直接的または間接的に関係する感染症の進行を停止するか遅らせるのに十分である。一部の実施形態では、有効量は、微生物の増殖および／または生育を停止するか遅らせるのに十分である。さらなる実施形態では、有効量は、微生物を死滅させるのに十分である。
【００５８】
本明細書で用いるように、「同時投与される」は、複数の化合物または薬剤の同時または逐次的な投与を指す。第１の化合物または薬剤は、第２の化合物または薬剤の投与の前か、同時にか、またはその後に投与することができる。第１の化合物または薬剤および第２の化合物または薬剤は、同日中に同時もしくは逐次的に投与することができるか、または互いから１日、２日、３日、４日、５日、６日、１週、２週、３週または１カ月以内に逐次的に投与することができる。好適には、化合物または薬剤は、化合物または薬剤の各々が少なくとも一部の生理作用を発揮している、および／または残存する効力を有する期間中に同時投与される。一部の実施形態では、本明細書に記載される方法は、本明細書に開示される２つ以上の活性薬剤を同時投与することを含むことができる。一部の実施形態では、２つ以上の活性薬剤を同時投与することを含む方法は、本明細書に開示される少なくとも１つの抗微生物剤を特定の適応症に対する公知の活性薬剤と一緒に含む。一部のさらなる実施形態では、公知の活性薬剤は、抗微生物活性を同様に示す。
【００５９】
追加の抗微生物性薬剤は、抗微生物性薬剤の単独投与と比較してそれが相加的または相乗的抗微生物性効果を提供することができるように、特定の方法および適応症に基づいて選択することができる。例えば、グラム陰性菌に対するその効果を増加させるために、ポリミキシンＢなどの他の抗生物質を同時に適用することができる。さらに、より広い保護のために、殺菌剤を同時投与してもよい。
【実施例】
【００６０】
本発明は、以下の非限定的実施例でさらに例示される。
【００６１】
［方法］
細菌細胞培養：バージニア州東海岸のトマト栽培地域に土着の植物および土から以前に単離された天然に存在する細菌ペニバシラス・アルベイ株Ａ６−６ｉおよびＴＳ−１５を、３５℃のトリプシンダイズ寒天（ＴＳＡ）で増殖させた。含まれる指示株（表１）も、３５℃のＴＳＡで増殖させた。ＴＳＡで、３５℃で一晩生育させた保存培養を、２５％グリセロールを含むブレインハートインフュージョンブロス（ＢＨＩ）に再懸濁し、−８０℃で保存した。エルウィニア・カロトボーラ亜種カロトボーラ、シュードモナス・シリンゲｐｖ．トマト株ｄｃ３０００およびラルストニア・ソラナセアラム  レース５を含む３つのトマト植物関連細菌病原体を、２５℃のＴＳＡで生育させた（表１）。
【００６２】
【表１】
0006698556.tif 000002
【００６３】
［作用様式および抗微生物性活性のスペクトルの判定］
細菌アンタゴニストの作用様式および抗微生物性スペクトルを判定するために、寒天プラグアッセイ（細菌培養を用いる）およびバイオスクリーンアッセイ（培養液上清を用いる）の両方を、広範囲の主要な食物媒介性病原体および細菌植物病原体に対して実行した（表１）。寒天プラグアッセイでは、ＴＳＡプレートの上で生存能力のある細胞が回収されなかった場合、阻止帯での病原性細菌株に対する殺細菌効果が確認された。バイオスクリーンアッセイでは、一晩の培養からのアンタゴニスト上清を、０．２２μｍ孔径酢酸セルロース（ＣＡ）メンブランフィルタで濾過滅菌した。各３ｍｌのＴＳ−１５無細胞培養液上清（ＣＦＣＳ）に、１０８ｃｆｕ／ｍＬの細菌培養の３μｌを接種した（表１）。次に無菌のＢｉｏｓｃｒｅｅｎ  Ｃマイクロウェルプレート（Ｇｒｏｗｔｈ  Ｃｕｒｖｅｓ  ＵＳＡ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）にアリコート（２００μｌ）を分注し、それぞれの細菌株について記載されている通りにインキュベートした。２０分間隔でＯ．Ｄ．６００を２４時間測定することによって、細菌生育を５反復で判定した。
【００６４】
分画収集：改変された方法は、当技術分野で公知の方法に基づいた。細胞スクレーパを用いて細胞をペトリ皿から取り出し、エッペンドルフチューブに置いた。削り取った細胞の全シャーレのために、アセトニトリルの１００μＬの最終量を加えた。試料を３０分間振盪させ、７７１０ｇで１５分の間遠心分離した。上清を取り出して、蒸発させた。水で試料を復元し、０．２２μｍナイロンフィルタで濾過した。Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＮｅｘｅｒａをＫｉｎｅｔｅｘ  Ｃ１８カラム（１．７μ、１００Å、１５０×２．１０ｍｍ）と用いて、液体クロマトグラフィ（ＬＣ）による分画収集を達成した。水と０．１％ギ酸（ｖ／ｖ）およびアセトニトリルと０．１％ギ酸（ｖ／ｖ）を以下の勾配で用いて、６０℃のカラム温度および４００μＬ／分の流速で分離を実行した：９５％水で５分間保持、９５％から５％の水までの直線濃度勾配で５０分間、９５％水で５分間平衡化。分画を濃縮し、ＭＲＳＡおよび大腸菌に対して生物学的活性を試験した。活性のある分画は、複数の質量分析（ＭＳ）プラットホームによってさらに検査した。
【００６５】
生物活性アッセイ：ペニバシラス・アルベイ株Ａ６−６ｉまたはＴＳ−１５からの１分分画の１０μＬを、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７株ＥＤＬ９３３およびメチシリン耐性黄色ブドウ球菌株＃１２の１０６個の細胞の菌叢をそれぞれ含有するプレートの上に直接スポットした。３５±２℃で２４時間のインキュベーションの後、１分分画によって示される抗微生物活性が、明瞭な阻止帯（ＺＩ）として観察された。ＺＩを示した分画に、以降注目した。対照実験として、１ｍｇ／ｍＬの保存液から開始した２倍の系列ポリミキシンＢ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）希釈の１０μＬを、サルモネラ・エンテリカ血清型モンテビデオ株２９Ｎの１０６個の細胞の菌叢の上にスポットした。
【００６６】
マトリックス支援レーザ脱離／イオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ）分析：活性であることが見出された分画を水で１：３０に希釈し、１μＬを、調製したＣＨＣＡマトリックス（０．１％ギ酸を含む７０％アセトニトリルに２０ｍｇ／ｍＬ）の１μＬとＭＡＬＤＩ標的の上に置いた。試料を分析するために用いたＭＡＬＤＩ機器は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／ＭＤＳ  Ｓｃｉｅｘ  ４８００  ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ／ＴＯＦアナライザであった。十分なイオン化のために必要とされる最小レベルを用いるために、各分析についてレーザ出力を最適化した。ポストソース分解（ＰＳＤ）を用いて、目的のイオンでタンデム型質量分析（ＭＳ／ＭＳ）も実行した。
【００６７】
高分解能質量分析によるＬＣ／ＭＳ分析：高分解能質量分析計（Ｑ−Ｅｘａｃｔｉｖｅ（商標）、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に連結した前掲の同じＬＣ条件を用いて、試料抽出物（分画収集前）および生じた分画を分析した。用いたＱ−Ｅｘａｃｔｉｖｅ（商標）設定は、以下の通りであった：１４０，０００の分解能、１ｅ６  ＡＧＣ標的、最大ＩＴ  ６０ｍｓ、および３００〜４０００Ｄａの質量範囲を監視した；加熱エレクトロスプレイオン化プローブ（ＨＥＳＩ−ＩＩ）の設定は、以下の通りであった：４ｋＶスプレ電圧、５０ｐｓｉシースガス、１５の（恣意的な単位）補助ガス、３８０℃キャピラリ温度および３００℃ヒータ温度。以下の改変条件のＬＣ−ＭＳ／ＭＳで活性分画をさらに分析した：１：３０希釈分画の１μＬ注射、完全スキャンモードのための３５，０００分解能、および１２０ｍｓの最大ＩＴ。
【００６８】
ＭＳｎ分析：Ｏｒｂｉｔｒａｐ  Ｅｌｉｔｅ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、多段質量分析実験（ＭＳｎ）を実行した。０．１％ギ酸を含む７０％メタノールで、分画を１：３０に希釈した。Ｔｒｉｖｅｒｓａ  Ｎａｎｏｍａｔｅ（Ａｄｖｉｏｎ）を１．５ｋＶ電圧および０．３ｐｓｉのガス圧で用いて、ナノスプレのための注入を達成した。１２０，０００分解能の完全ＭＳモードで、２２５〜２０００の質量範囲を監視した。ＭＳ／ＭＳおよびＭＳｎ実験のために、衡突解離（ＣＩＤ）および電子伝達解離（ＥＴＤ）の両方を用いた。
【００６９】
１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子増幅および配列決定：潜在する細菌アンタゴニストのゲノムＤＮＡを、Ｗｉｚａｒｄ（登録商標）ゲノムＤＮＡ精製キット（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を用いて抽出した。対応する遺伝子を増幅するために、細菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡに特異的な汎用性プライマの対、Ｅｕｂａｃ２７およびＲ１４９２を用いた。１６Ｓ  ｒＲＮＡのＰＣＲ増幅は、Ｈｏｔｓｔａｒｔ  Ｔａｑ（登録商標）とＤＮＡポリメラーゼキット（ＱＩＡＧＥＮ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）により以下の条件で実行した：９５℃での最初の５分間のインキュベーションの後、混合液を、９５℃で１分、５８℃で１分および７２℃で１分を各々含む３０サイクルにかけた。最終伸長を、７２℃で１０分間実行した。精製したＰＣＲ生成物の両方の鎖を、以下のプライマを用いて直接的にサンガー配列決定した：２７Ｆ（５’−ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ−３’；配列番号７２）、１４９２Ｒ（５’−ＧＧＴＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ−３’；配列番号７３）、３５７Ｆ（５’−ＣＴＣＣＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡ−３’；配列番号７４）、５１８Ｒ（５’−ＣＧＴＡＴＴＡＣＣＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧ−３’；配列番号７５）および１１００Ｒ（５’−ＡＧＧＧＴＴＧＣＧＣＴＣＧＴＴＧ−３’；配列番号７６）
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェアｖ．５．０（ＭＥＧＡ５．０）を用いて、配列断片を編集し、コンティグに組み立てた。Ｇｅｎｂａｎｋに対する相同性検索のために、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いた。ファイロタイプ同定のために最高スコアのクエリからの結果だけが考慮され、９９％の最小類似性であった。
【００７０】
全ゲノム配列決定：Ｑｉａｇｅｎ  ＤＮｅａｓｙ（登録商標）血液および組織キット（ＱＩＡＧＥＮ  Ｉｎｃ．、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用いて、各株の一晩の培養からゲノムＤＮＡを単離した。４５４チタン配列決定技術（Ｒｏｃｈｅ、Ｂｒａｎｆｏｒｄ、ＣＴ）を用いてゲノム配列決定を実行し、＞２５×の平均ゲノムカバレージを達成した。４５４  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｎｅｗｂｌｅｒソフトウェアパッケージｖ．２．５．３（Ｒｏｃｈｅ）を用いて、各ゲノムのために新規のアセンブリを作製した。Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＰａｃＢｉｏ）ＲＳ配列決定プラットホームを用いて、Ｐ．アルベイ株ＴＳ−１５およびＡ６−６ｉのゲノムＤＮＡも配列決定した。８つの単一分子リアルタイム（ＳＭＲＴ）細胞でのＣ２化学をＰａｃＢｉｏ  ＲＳの９０分収集プロトコールと用いて、単一１０ｋｂライブラリーを配列決定した。１０ｋｂ連続ロングリード（ＣＬＲ）データをＰａｃＢｉｏ階層的ゲノムアセンブリプロセス（ＨＧＡＰ）／Ｑｕｉｖｅｒソフトウェアパッケージ、続いてＭｉｎｉｍｕｓ２を用いて新規に組み立て、それらをＱｕｉｖｅｒでみがいた。両方の手法からの組み立てられたコンティグは、ＮＣＢＩ原核生物ゲノム自動アノテーションパイプラインで注釈をつけた。
【００７１】
ｐｂｔ遺伝子クラスタの同定および特徴付け：これらの２つの株と米国特許出願公開第２０１３／０１６４３１７号に記載のＰ．チアミノリティカス株ＯＳＹ−ＳＥ（受託＃ＡＬＫＦ００００００００）の間のｐｂｔ遺伝子クラスタ（非リボソームのリポペプチド抗生物質の生合成に関与するＮＲＰＳ遺伝子）のゲノム比較を、実行した。非リボソームのペプチド合成酵素（ＮＲＰＳ）機構は、１つのモジュールで各アミノ酸モノマーを組み込むアセンブリラインとして作用する、モジュール式の多ドメイン酵素で構成される。ＮＲＰＳの一般的なモジュール（Ｃ−Ａ−Ｔ）は、担体チオール化（Ｔ）ドメインならびに２つの触媒ドメイン、アミノ酸活性化および選択性のためのアデニル化（Ａ）ドメインおよびペプチド結合形成を触媒する縮合（Ｃ）ドメインを含有する。終結モジュール（Ｃ−Ａ−Ｔ−Ｔｅ）では、Ｔｅドメインが組み立てられたペプチドの放出を担う。さらに、アミノ酸のＬ−からＤ−エピマ化のために、任意選択のエピメラーゼ（Ｅ）ドメインが存在してもよい。ＮＲＰＳアデニル化ドメインを予測するためのウェブサーバＮＲＰＳｐｒｅｄｉｃｔｏｒ２によって、Ｐ．アルベイ株Ａ６−６ｉおよびＴＳ−１５のゲノム中のＮＲＰＳを分析した。Ａドメインは、アミノ酸認識および活性化のために保存された結合ポケットを有する。アミノ酸に対するＡドメインの基質特異性は、基質結合部位でのフィンガープリント残基に基づいて、ＮＲＰＳｐｒｅｄｉｃｔｏｒ２を用いて同定された。さらに、エピマ化（Ｅ）ドメインおよびＴｅドメインが同定された（ＰＫＳ／ＮＲＰＳ分析ウェブサーバ）。
【００７２】
＜実施例１＞
［Ｐ．アルベイ株Ａ６−６ｉおよびＴＳ−１５の広範囲抗微生物性スペクトル］
両Ｐ．アルベイ分離株でチャレンジした場合、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ寒天プラグアッセイは、６つの主要な食物媒介性病原体および３つの主要なトマト細菌植物病原体を含む全ての指示株に対して阻止帯を示した（１Ａおよび１Ｂ）。注目すべきことに、ＳＤ（Ｓ．ディセンテリエ）またはＬＭ（Ｌ．モノサイトゲネス）で阻止帯を形成した後に、アンタゴニストはプラグから外向きに移動し、特にリステリアの場合、アンタゴニスト成長輪は経時的に拡張した。Ａ６−６ｉおよびＴＳ−１５の両方は、ＭＲＳＡ株に対する阻止は広範囲であり、帯の直径はそれぞれ１５〜３５ｍｍおよび１５〜２０ｍｍであった。一部の株が最高１４個の異なる抗微生物薬に耐性であったという事実にもかかわらず、試験した様々なＭＲＳＡ株に対してＡ６−６ｉ株が強力な阻止効果を示したことに注目することも興味深い。
【００７３】
バイオスクリーンアッセイを用いてグラム陰性およびグラム陽性の細菌の一群に対して上清を試験した場合、Ａ６−６ｉ（図２）およびＴＳ−１５（示さず）の両ＣＦＣＳは広範囲の抗微生物活性を示し、試験した全病原体でラグ相は有意に延長し、インキュベーションの終わりには細胞密度が大きく低減した。さらに、ＣＳ（Ｃ．サカザキイ）、ＳＤ（Ｓ．ディセンテリエ）、ＬＭ（Ｌ．モノサイトゲネス）および一部のＭＲＳＡ株でのラグ相は、Ａ６−６ｉおよびＴＳ−１５の両ＣＦＣＳでほぼ２４時間まで延長した。ＳＮ（Ｓ．ニューポート）に対して試験した場合、Ａ６−６ｉと比較してＴＳ−１５からのＣＦＣＳは大いにより強力な阻止効果を有していた（示さず）。
【００７４】
＜実施例２＞
［生物活性結果］
ポリミキシンＢは、Ｓ．モンテビデオ（対照実験）に対して明瞭な抗微生物性用量応答を示した。明瞭なＺＩを示すポリミキシンＢの最小阻止濃度は、Ｓ．モンテビデオ株２９Ｎの菌叢で４μｇ／ｍＬであった（図３）。１分分画の７つは、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７株ＥＤＬ９３３およびメチシリン耐性黄色ブドウ球菌株＃１２の両方に対して抗微生物活性を示した（図４）。同様に、Ｐ．アルベイ株Ａ６−６ｉからの複数の１分分画は、同様に両方の株に対して抗微生物活性を示した（結果を示さず）。
【００７５】
＜実施例３＞
［一次ペプチド配列の同定］
図５に示すように、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析は、７つの生体活性分画の各々に存在するいくつかの化合物を明らかにした。ＭＡＬＤＩスペクトルは、非標識矢印によって示されている、これらの化合物のクラスタが１４Ｄａ異なった単一スペクトルの中の、各生体活性分画からの化合物の完全な相補体の像を提供した。１６２３の分子量の化合物は一次化合物（図５でイオンはアスタリスクで示される）と呼ぶが、類似の存在度の複数の変異体が存在する（図５）。
【００７６】
これらの分子種のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ／ＭＳ分析は類似の断片化パターンを明らかにし、それは１４Ｄａ異なる化合物が関係することを確認した。図６に例示されるように、分子量が１４Ｄａ異なる、一次化合物ＭＷ１６２３およびＭＷ１６３７の化合物のＭＳ／ＭＳスペクトルの比較は、同じ質量を共有する一連の生成物イオンおよび１４Ｄａ異なる第２の生成物イオン系列を明らかにし、化合物の間の質量不一致が分子の１領域に局在化することを示唆した。これは、相補的な生成物イオン対の同定を可能にし、１つの方向は１４Ｄａ質量のシフトを含有していた分子の領域を保持する生成物イオン系列に対応し、他の方向は２つのペプチドの間で同一だった生成物イオンに対応した（図７）。手動の新規の配列決定は部分的なアミノ酸配列をもたらし、推定上の配列帰属を与えた。
【００７７】
本発明の化合物を、図８Ｂに示す。
【００７８】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ／ＭＳスペクトルの分析は、部分配列標識を明らかにしただけであった。配列カバレージを改善するために、個々の分画を注入し、Ｏｒｂｉｔｒａｐ  Ｅｌｉｔｅで分析して、ＭＳｎデータの収集を可能にした。再び、ＭＳｎスペクトルの対を分析し、１４Ｄａの質量差の存在に基づいて相補的なイオン対を同定した。合わせたＭＳｎデータは、完全なアミノ酸配列の決定を可能にした（図８Ｂ）。このアミノ酸配列は、ＭＲＳＡおよび大腸菌に対して広範囲の活性を同様に示した異なるペニバシラス属株から単離された、以前に同定された環式化合物に類似していた；ペニバクテリンと命名されたその化合物の構造を、図８Ａに示す。
【００７９】
生成物イオンのどの系列が１４Ｄａの差をもたらす分子構成成分を含有するかまたはしないかを判定することにより、ＭＳｎ分析による新規配列決定はより直接的であった。化合物が環式であり、生じたＭＳｎスペクトルは部位の分布で起こる複数の開環事象のために解釈するのが困難である可能性があるので、これは特に重要であった。例を図９のＭＳ３スペクトルに示すが、ここで、環は異なるアミノ酸位置で開き、同じスペクトルの中でいくつかの異なる配列系列を与える。したがって、環状ペプチドの一次配列の新規配列決定は、困難を伴う可能性がある。しかし、記載される手法を用いることにより、分子を線状にすることなく、生成物イオンの帰属ならびに一次配列および配列変異体の同定が達成された。一次アミノ酸配列のための累積イオン帰属は、図１０Ａ、Ｂに見出すことができる。
【００８０】
高分解能ＭＳに連結したＵＰＬＣによる以降の分析は、３つの支配的な化合物系列が実際にあり、各系列は１４．０２Ｄａ異なる化合物群を含有することを確認した、正確な質量データを提供した。観察された３つの系列の間で最も顕著な差は、一次化合物系列と比較した質量の１５．９９Ｄａの低下か１．９８Ｄａの増加であった。例は、図５の矢印で指定される。これらの化合物およびそれらの正確な質量分子量の包括的リストは、表２に見出すことができる。これらは、表２およびすべての図の中でＦ、ＹおよびＹ、−ＣＨ２＋Ｏで指定される；ＦおよびＹは、図８Ｂで６位のフェニルアラニンまたはチロシンに対応し、−ＣＨ２＋Ｏは脂肪酸鎖の分子差に対応する。
【００８１】
【表２】
0006698556.tif 000003
【００８２】
生体活性分画中の２つの化合物系列は互いに１５．９９Ｄａ異なり、ＭＳ２スペクトルを示し、１つの系列の全ての化合物はｍ／ｚ６５７２＋で生成物イオンを生じ、他の系列はｍ／ｚ６４９２＋で生成物を生成した（図１１）。図１２は、１４Ｄａ異なった３つの前駆体イオンのＭＳｎスペクトルを例示し、その全てはｍ／ｚ６５７２＋でＭＳ２生成物イオンを生成した。これらは、分子量が１４Ｄａ異なった化合物を含む前駆体系列中の保存された生成物イオンであったので、生成物イオン６５７２＋または６４９２＋を生じる化合物の領域は脂肪酸を含有しないと結論づけることができた。６５７２＋のＭＳ３スペクトルはお互いと一貫し、この配列を生成したペプチドの領域がこれらの化合物の間で保存されていることを確認した（図１２）。６４９２＋でＭＳ２生成物イオンを生成したイオン系列からのＭＳ３スペクトルは、１６Ｄａ異なった生成物イオンの系列を除いて６５７２＋ＭＳ３スペクトルに類似していた（図１２でアスタリスクの付いた質量）。これは、表および図でそれぞれＹおよびＦで指定される、６位のチロシンとフェニルアラニン（図８）の間の区別を可能にした。これらのアミノ酸は、分子量が１６Ｄａ異なる。Ｐｈｅを含有するペプチドのＭＳ／ＭＳスペクトルの帰属は図１０Ａ〜Ｂに例示され、６位にＰｈｅおよびＴｙｒを含有するペプチドの間での直接比較を観察することができる。
【００８３】
＜実施例４＞
［結合脂肪酸の同定］
６位にＴｙｒを含有する化合物の系列のＭＳ２スペクトルは、生成物イオン６５７２＋およびその相補的イオン対によって占められた（図１１）。６５７２＋はＴｙｒ化合物系列の中で保存されていたが、その相補的イオンはその前駆体と同じ１４Ｄａの質量シフトを含有していた（すなわち、図１２のｍ／ｚ  ３１１、３２５および３３９）。Ｐｈｅイオン系列でも、同じ傾向が存在した。６５７２＋および６４９２＋の複数の相補的イオンのリストを、表３に掲載する。これらの相補的イオンが解離した場合（図１２に例を示す）、オルニチンの消失が観察された。環化されたペプチド配列の質量を化合物全体の質量から引き算すると、結合脂肪酸に帰される質量を与える。これらの質量の分子式生成は、異なる脂肪酸変異体の分子式を与える（表４および図８）。これらの脂肪酸はグオ（Ｇｕｏ）らで観察されたものに類似しているが、炭素鎖の長さが異なり、本研究で提示するＴＳ−１５およびＡ６−６ｉの両株は鎖長および組成のより大きな変動性を示す。
【００８４】
上で述べたように、化合物の３つの主要な系列が判定された：６位にチロシンを含有する２系列およびフェニルアラニンを含有する１系列。Ｔｙｒを含有する２つの化合物系列は、分子量が１．９７９Ｄａ異なった。図２に示すＭＳスペクトル分析方法に類似して、これらの化合物系列は類似のＭＳ２断片化パターンを同様に有し、ここで、一部の生成物イオン質量は保存され、他は１．９７９Ｄａ異なる（図１３）。この質量差は、チロシン分子系列と比較して結合脂肪酸の１つ少ないＣＨ２および追加の酸素（−ＣＨ２＋Ｏと標識した）に対応した。
【００８５】
【表３】
0006698556.tif 000004
【００８６】
【表４】
0006698556.tif 000005
【００８７】
＜実施例５＞
［同じ分子量の複数の化合物］
注入実験データの同じＭＳ２スペクトルの中に、１つを超える相補的イオン対が時折存在することも観察された。これは、同じ分離ウィンドウの中で断片化している同じ前駆体質量の２つの化合物に対応した。ＵＰＬＣおよびナノＬＣ／ＭＳデータの中に、同じ質量の実体のいくつかの溶出ピークを示した複数の例があった（図１４に例を示す）。これらのクロマトグラフピークの各々のイオンのＭＳ２スペクトルは、断片化パターンおよび、したがって、これらのそれぞれのペプチドの一次配列で小さな差を示した。同一の分子量（１５７９）の化合物で、ほとんど同一のアミノ酸配列が確認された：７位にＬｙｓを有する化合物および７位のオルニチンと結合脂肪酸の追加のＣＨ２を有する化合物（Ｌｙｓおよびオルニチンはそれらの側鎖でＣＨ２１個分だけ異なる）。具体的には、ｍ／ｚ６４９２＋の生成物イオンは７位のＬｙｓに対応し、ｍ／ｚ６４２２＋は７位のオルニチンに対応する。７位のＬｙｓによる２つのクロマトグラフピークは、滞留時間の観察された差をもたらす結合脂肪酸の構造差を示すことができる（図１４）。類似の置換が、１位でも見出された。断片イオン（図５Ｂのｍ／ｚ３２５１＋および３３９１＋）を含有する脂肪酸の以降のＭＳ３分析の一部は、オルニチンよりもＬｙｓが１位に同様に存在し得ることを示した（図１２のＭＳ３スペクトル中のｍ／ｚ１２９１＋）。１位のＬｙｓおよび結合脂肪酸中のＣＨ２の減少は、各化合物の同一の分子量をもたらした。
【００８８】
＜実施例６＞
［ｐｂｔ遺伝子クラスタの同定および特徴付け］
非リボソームペプチド合成のためのゲノムマイニングによって、図８Ｂに示す配列が確認された。細菌の多くの薬理的に重要なペプチドは、非リボソームペプチド合成酵素（ＮＲＰＳ）によって合成される。ＮＲＰＳ機構は、１つのモジュールで各アミノ酸モノマーを組み込むアセンブリラインとして作用する、モジュール式の多ドメイン酵素で構成される。ＮＲＰＳの一般的なモジュールは、最終ペプチド生成物に組み込まれる予定のアミノ酸モノマーの補充のための、保存された結合ポケットを有するアデニル化（Ａ）ドメインを含有する。Ｐ．アルベイ株Ａ６−６ｉおよびＴＳ−１５のための完全な染色体に対応する６５３６３２４ｂｐの単一コンティグ（Ｇ＋Ｃ含有量、４６．６３％）および６７８４７６６ｂｐの単一コンティグ（Ｇ＋Ｃ含有量、４６．６９％）をそれぞれ生成した。株Ａ６−６ｉおよびＴＳ−１５のゲノムのドラフト配列は、ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋにおいてそれぞれＧｅｎＢａｎｋ受託＃ＡＴＭＳ００００００００およびＡＴＭＴ００００００００の下で入手できる。Ａ６−６ｉ  ｐｔｂＡ、ｐｔｂＢおよびｐｔｂＣのＤＮＡ配列は、それぞれ、配列番号５、６および７である。ＴＳ−１５  ｐｔｂＡ、ｐｔｂＢおよびｐｔｂＣのＤＮＡ配列は、それぞれ、配列番号８、９および１０である。Ａ６−６ｉ  ｐｔｂＡ、ｐｔｂＢおよびｐｔｂＣのタンパク質配列は、それぞれ、配列番号１１、１２および１３である。ＴＳ−１５  ｐｔｂＡ、ｐｔｂＢおよびｐｔｂＣのタンパク質配列は、それぞれ、配列番号１４、１５および１６である。Ｐ．チアミノリティカス株ＯＳＹ−ＳＥのｐｂｔ遺伝子クラスタ（受託＃ＡＬＫＦ００００００００；米国特許出願公開第２０１３／０１６４３１７号）に対する局所ＢＬＡＳＴＸ分析は、化合物生合成を担う４９ｋｂＤＮＡ領域を同定した（表５）。ＯＳＹ−ＳＥ  ｐｔｂＡ、ｐｔｂＢおよびｐｔｂＣのタンパク質配列は、それぞれ、配列番号１７、１８および１９である。比較ゲノム分析は、２つのＰ．アルベイ株とＰ．チアミノリティカス株ＯＳＹ−ＳＥの間でｐｂｔ遺伝子クラスタのＤＮＡ配列で６４％〜７０％の類似性；およびアミノ酸配列でわずか６０％〜６７％の類似性を示した（図１６〜１８）。このＤＮＡ領域は、化合物に１３個のアミノ酸を組み込む役割を担う１３個のモジュール（表５）からなる、３つのペプチド合成酵素単位をコードする。予測されたペプチド配列は、ＭＳ／ＭＳによって決定された化合物の化学構造に一致した（表４）。さらに、エピマ化（Ｅ）ドメインがＯｒｎ１、Ｏｒｎ４、Ｏｒｎ７およびＳｅｒ８のためのモジュールで見出され、それは、それらのアミノ酸がＤ形であるかもしれないことを示した。
【００８９】
細菌によって生成される環状ペプチドは、非リボソームペプチド合成酵素（ＮＲＰＳ）として知られる酵素のクラスによって合成される。ＮＲＰＳは多くの生物体で見出され、抗生物質および免疫抑制薬などのいくつかの医療用に重要なペプチドを合成する。配列分析によって、１４個のＮＲＰＳ遺伝子が、Ｐ．アルベイＡ６−６ｉおよびＴＳ−１５ゲノムで同定された。４９ｋｂを含む３つのＮＲＰＳ遺伝子が、本出願中の化合物の生成を制御することが見出された。ＮＲＰＳは、官能性ドメインで構成されるモジュールの中に組織化される大きな酵素である。アミノ酸配列の全体の長さは、先行技術特許のＰ．チアミノリティカス株ＯＳＹ−ＳＥのｐｂｔ遺伝子クラスタによってコードされるＰｂｔへの相同性を示した（ｐｂｔＡ遺伝子への６６％の類似性、ｐｂｔＢ遺伝子への６６％の類似性およびｐｂｔＣ遺伝子への５９％の類似性）。ｐｂｔＡＢＣ遺伝子クラスタの詳細な分析は、各遺伝子が表５Ｂのようなドメインおよびモジュール組織を有することを示した。各モジュールのアデニル化（Ａ）ドメインで基質特異性を付与するアミノ酸を予測するために、Ａドメインの構造領域、Ａ３およびＡ６モチーフをＮＣＢＩタンパク質データベースに対してブラストしたところ、それらは、ｐｔｂＢ１モジュールへの３６％の同一性、ｐｔｂＣ１モジュールへの３８％の同一性およびｐｔｂＣ２モジュールへの３５％の同一性しか示さず、これから、先行技術特許でのペニバクテリンとは異なる構造的に特異な抗生物質であることが示される。
【００９０】
【表５】
0006698556.tif 000006
【００９１】
【表６】
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【００９２】
表５は、ＰＫＳ／ＮＲＰＳウェブサーバで生成された抗微生物性ペプチドの予測されたアミノ酸を示す。例えば、ｐｂｔＡ遺伝子（非リボソームペプチド合成酵素をコードする）は５つのモジュールを含有し、各々は、Ｃ（縮合）ドメイン、Ａ（アデニル化）ドメインおよびＴ（チオール化）ドメインで構成される。Ａドメインは、アミノ酸活性化および選択性の役割を担う。各Ａドメインの結合ポケットは保存配列であるので、アミノ酸基質は予測することができる。さらに、エピマ化（Ｅ）ドメインがＯｒｎ１、Ｏｒｎ４、Ｏｒｎ７およびＳｅｒ８のためのモジュールで見出され、それは、それらのアミノ酸がＤ形である可能性を示した。同様に、ｐｂｔＢ遺伝子は５つのモジュールを含有し、ｐｂｔＣ遺伝子は３つのモジュールを含有する。
【００９３】
【表７】
0006698556.tif 000008
【００９４】
【表８】
0006698556.tif 000009
【００９５】
表５は、ｐｂｔ遺伝子クラスタの同定および特徴付けを示す。Ａ．Ｐ．アルベイ株Ａ６−６ｉおよびＴＳ−１５とＰ．チアミノリティカス株ＯＳＹ−ＳＥの間の、ｐｂｔ遺伝子クラスタのＤＮＡ配列類似性およびアミノ酸配列類似性。Ｂ．ＮＲＰＳサブユニットで同定されたモジュールおよびドメイン：Ｃ、Ａ、Ｔ、ＥおよびＴｅは、縮合ドメイン、アデニル化ドメイン、チオール化ドメイン、エピマ化ドメインおよびチオエステラーゼドメインをそれぞれ表している。Ｃ．ペプチド中の１３個のモジュールの各々についての基質予測。
【００９６】
ゲノムマイニングは豊富な配列変異体の存在を予測しなかったことに、留意する価値がある。ＬｙｓおよびオルニチンはＣＨ２１個分だけ異なるので、それらの結合親和性はおそらく類似し、そのことが、観察された分子多様性に寄与しているかもしれない。同様に、ＴｙｒおよびＰｈｅは、ヒドロキシル基１個分だけ異なる。さらに、ＮＲＰＳｐｒｅｄｉｃｔｏｒ２は、ＰｈｅおよびＬｙｓに関してより低い単一アミノ酸基質予測スコアを有し、そのことは、これらが一次配列でさらに予測されなかった理由を示しているかもしれない。ＮＲＰＳｐｒｅｄｉｃｔｏｒ２はエピマ化（Ｅ）ドメインがモジュール１、４、７および８にあることも予測し、それは、これらの生じるアミノ酸基質がＤ形であるかもしれないことを示した。予想された通り、ＮＲＰＳ分析はアルキル鎖の存在や長さに関する情報を提供しない。
【００９７】
ＮＲＰＳ分析は、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ、高分解能質量分析およびＭＳｎ分析の組合せにより得られたペプチド帰属のアミノ酸の存在および順序の両方を確認した。ＮＲＰＳは、抗生物質として作用することができる潜在的非リボソームペプチドを同定するスクリーニング技術として用いることができる。しかし、それは、生成し得るいかなる分子変異体に関する情報も与えない。先に進むと、ＮＲＰＳ分析および質量分析は、分子多様性および複雑なスペクトルの存在にもかかわらず環式抗生物質ならびにそれらの配列および脂肪酸変異体の同定を可能にするために、候補ペプチドの迅速予測を質量分析の分子特異性と組み合わせるために用いることができる。
【００９８】
＜実施例６＞
［合成ペプチドの設計および特徴付け］
図８Ｂの同定された配列に基づき、本明細書で合成デプシペプチドＡと呼ぶペプチドを、図１５によって化学的に合成した。
【００９９】
当技術分野で公知であるように、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＣＬＳＩ）の手順に従って、抗生物質耐性株（表６）を含む選択された細菌に対する合成デプシペプチドＡの最小阻止濃度（ＭＩＣ）を、培養液微量希釈方法によって判定した。簡潔には、保存液濃度として２５．６ｍｇ／ｍｌに到達するように、合成したデプシペプチドをオプティマグレードの水に溶解させた。カチオン調整ミュラー−ヒントンＩＩ培養液（ＣＡＭＨＢＩＩ）（Ｂｅｃｔｏｎ、Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ＆Ｃｏ．、Ｓｐａｒｋｓ、ＭＤ）で１００回希釈した後に、透明な滅菌無処理丸底９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ、Ｒｏｓｋｉｌｄｅ、Ｄｅｎｍａｒｋ）中でデプシペプチドをＣＡＭＨＢＩＩでさらに２倍に連続希釈した。０．５のＭｃＦａｒｌａｎｄ濁度基準（Ｒｅｍｅｌ、Ｌｅｎｅｘａ、ＫＡ）に等しい濁度を達成するために、細菌培養を脱塩水に懸濁した。培養懸濁液の等量を希釈したデプシペプチドに加え、アッセイプレートで１００μｌ／ウェルの最終量を与えた。ＡＳＴアッセイの陽性対照として、ポリミキシンＢ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）およびバンコマイシン（Ｓｉｇｍａ）を用いた。大腸菌ＡＴＣＣ  ２５８５３、緑膿菌ＡＴＣＣ  ２７８５３、エンテロコッカス・フェカーリスＡＴＣＣ  ２９２１２および黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣ  ２９２１３株を、アッセイの品質管理株として用いた。ＭＩＣエンドポイントは、３５℃で２０〜２４時間のインキュベーションの後に細菌細胞の生育を完全に阻止する、抗微生物剤の最も低い濃度を指す。
【０１００】
【表９】
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【０１０１】
合成デプシペプチドは、重要な抗生物質耐性臨床分離株を含むグラム陰性とグラム陽性の両方の細菌に対して、広い抗微生物性スペクトルを示した（表１）。具体的には、合成したデプシペプチドは、カルバペネム耐性（ＣＲＥ）株およびＭＲＳＡ株に非常に強い活性を示した。さらに、細菌は、米国特許出願公開第２０１３／０１６４３１７号のペニバクテリンに対してより、このペプチドに対して大いにより大きな感受性を示した。
【０１０２】
この研究で見出されたペプチドが、異なる親水性および疎水性の領域により両親媒性であることは衝撃的である：一方は疎水性で、他方は主に極性で荷電したアミノ酸、および疎水性の脂肪酸鎖を有する（図８Ｂ）。ペニバクテリンとこの研究で発見された化合物の間の主要な差は、結合脂肪酸の長さ、１位および７位のリシンおよびオルニチンの異なる組合せ、ならびに６位および１２位のアミノ酸である。６位および１２位のアミノ酸が異なる特性（例えば、疎水性、親水性または正荷電）を有するので、これは特に興味深い。さらに、Ｄ−アミノ酸の存在は、ペプチドの構造および特性に影響し、また化合物を酵素分解により耐性にし、したがって本来的により安定にする。
【０１０３】
ペニバクテリンの作用様式の態様は、以前に研究されている。その結果は、その化合物がグラム陰性菌の負荷電した外膜に高い親和性を有することを示唆する。これはおそらく、分子中の正に荷電したアミノ酸の存在によるものであり、このことはポリミキシンの作用様式に類似する。ペニバクテリンでの４つと比較して、ここで発見された分子で３つの正に荷電したアミノ酸が見出され（図８）、それは様々な程度の有効性をもたらすことができる。しかし、１２位のＬｙｓからＰｒｏへの置換は、分子のその部分の疎水性も増加させ、そのことは、細胞膜の疎水性コアへのより優れた親和性をもたらすことができ、これは、その破壊を助けることができる特性である。同様に、６位のＴｙｒの存在は、分子のより極性の領域に寄与する。作用様式は、細胞膜を破壊する界面活性剤として作用する、化合物の両親媒性の性質による可能性もある。ポリミキシンが異なる親水性および疎水性のドメインを同様に有することは、注目すべきである。
【０１０４】
ペニバクテリンがグラム陽性および陰性の両方の細胞膜の透過性化をもたらすとも判断されたが、細胞膜はおそらく結合脂肪酸によって破壊された。鎖長はおそらく観察された抗微生物活性に影響するが、それがより長い／短い鎖の場合に有効性がより低いかまたは高いかは不確実である。ポリミキシンについては、脂肪アシル鎖が細胞膜を破壊すると仮定されている。ポリミキシンの脂肪酸鎖に関する研究は、抗微生物活性がこの部分の長さおよびかさ高性と相関することを示す。しかし、報告書は様々であり、この研究での化合物の脂肪酸類似体を設計するための以降の実験は、これが抗微生物活性にどのように影響するかに関する洞察を与えるだろう。細菌の単一株が、そのような多数の分子変異体を生成することができることは、同様に興味深い。これは、この株がより協調した抗微生物性効果を発揮することを可能にすることができ、それが単離されたコミュニティでの莫大な選択圧からもたらされたのかもしれない。
【０１０５】
本明細書に記載される抗微生物性ペプチドの主要な重要性は、ヒト細菌病原体のいくつかの主要なクラスによる薬物耐性の世界的な公衆衛生危機の克服に関する。ＭＲＳＡ、ＶＲＳＡおよびＣＲＥなどの最も危険な細菌病原体のいくつかは、ヒト抗微生物防御の兵器庫中に現在あるほとんど全ての抗生物質に耐性である。例えば、ＣＲＥは、抗生物質への公知の弱点がない。最も重要なことは、これらの抗微生物性ペプチドが全く新しいクラスの抗生物質に対応する可能性があることであり、各々はこれらの致命的な細菌を制御し、関連する病状を治療する能力を有する。抗微生物性ペプチドを生成する宿主生物体を有するラットでの安全性研究は非常に励みになり、ラットはこの株に起因する明白な病状を示さなかった。
【０１０６】
本明細書で特記されない限り、または文脈によって明確に否定されない限り（特に以下の請求項との関連で）、用語「ａ」および「ａｎ」および「ｔｈｅ」および類似の指示語の使用は、単数形および複数形の両方をカバーするとみなすものとする。本明細書で用いられる第１、第２などの用語は、いかなる特定の順序も表すものではなく、単に、例えば層の複数性を表す都合のためである。用語「含む」、「有する」、「含む」および「含有する」は、特に指摘されない限り、限定しない用語（すなわち、「限定されずに含む」ことを意味する）と解釈されるべきである。本明細書で特に明記しない限り、値の範囲の列挙は、単にその範囲に入る各別個の値に個々に言及する簡略な方法の役割を果たすものであり、各別個の値は、それが本明細書に個々に挙げられているかのように明細書に組み込まれている。すべての範囲のエンドポイントは範囲の中に含まれ、独立して組み合わせ可能である。本明細書で特記されない限り、さもなければ文脈によって明らかに否定されない限り、本明細書に記載される全ての方法は適する順序で実行することができる。特に主張されない限り、任意および全ての例、または例示を示す表現（例えば、「など」）の使用は、本発明を単により良好に例示することが目的であり、本発明の範囲を限定するものではない。本明細書で用いるように、明細書中の表現は、請求されないなんらかの要素が本発明の実施に必須であることを示すと解釈されるべきでない。
【０１０７】
本発明はその例示実施形態を参照して記載されているが、本発明の範囲を逸脱しない範囲で、様々な変更を加えることができることおよびその要素の均等物を置換することができることが当業者に理解される。さらに、特定の状況または材料を本発明の教示に適合させるために、その本質的な範囲を逸脱しない範囲で、多くの改変を加えることができる。したがって、本発明は、本発明を実行するために企図された最良の様式として開示される特定の実施形態に限定されないが、本発明は添付の請求項の範囲内に入る全ての実施形態を含むことが意図されている。本明細書で特記されない限り、さもなければ文脈によって明らかに否定されない限り、その全ての可能な変形形態での上記の要素の任意の組合せが、本発明に包含される。
（１）配列
Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｘａａ７−Ｘａａ８−Ｘａａ９−Ｘａａ１０−Ｘａａ１１−Ｐｒｏ１２−Ｉｌｅ１３（配列番号２）
のペプチドであって、上式で、Ｘａａ６は、Ｔｙｒ、ＰｈｅまたはＴｒｐであり；Ｘａａ１、Ｘａａ４およびＸａａ７は、各々独立してＬｙｓまたはＯｒｎであり；Ｘａａ２、Ｘａａ９およびＸａａ１１は、各々独立してＬｅｕ、Ｉｌｅ、ＶａｌまたはＡｌａであり；Ｘａａ３、Ｘａａ５およびＸａａ８は、各々独立してＣｙｓ、Ｔｙｒ、ＴｈｒまたはＳｅｒであり；前記ペプチドは、Ｘａａ１に共有結合している飽和もしくは不飽和の置換型もしくは非置換型の直鎖状もしくは分枝状のＣ４〜Ｃ２０脂肪酸基、または飽和もしくは不飽和の直鎖状もしくは分枝状のＣ４〜Ｃ２０エステルを任意選択で含む、ペプチド。
（２）（１）に記載のペプチドであって、配列
Ｘａａ１−Ｖａｌ２−Ｔｈｒ３−Ｘａａ４−Ｓｅｒ５−Ｘａａ６−Ｘａａ７−Ｓｅｒ８−Ｉｌｅ９−Ｐｒｏ１０−Ｘａａ１１−Ｐｒｏ１２−Ｉｌｅ１３（配列番号３）
を有し、上式で、Ｘａａ６は、Ｔｙｒ、ＰｈｅまたはＴｒｐであり；Ｘａａ１１は、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ＶａｌまたはＡｌａであり；Ｘａａ１、Ｘａａ４およびＸａａ７は、独立してＬｙｓまたはＯｒｎであり；前記ペプチドは、Ｘａａ１に共有結合している飽和もしくは不飽和の置換型もしくは非置換型の直鎖状もしくは分枝状のＣ４〜Ｃ２０脂肪酸基、または飽和もしくは不飽和の直鎖状もしくは分枝状のＣ４〜Ｃ２０エステルを任意選択で含む、ペプチド。
（３）（２）に記載のペプチドであって、Ｘａａ６は、ＴｙｒまたはＰｈｅであり；Ｘａａ１１は、Ｉｌｅであり；Ｘａａ１およびＸａａ４は、Ｏｒｎであり；Ｘａａ７は、ＬｙｓまたはＯｒｎである、ペプチド。
（４）（１）〜（３）のいずれか１つに記載のペプチドであって、前記ペプチドは、Ｘａａ１に共有結合している飽和または不飽和の置換型または非置換型の直鎖状または分枝状のＣ４〜Ｃ２０脂肪酸基を含む、ペプチド。
（５）（４）に記載のペプチドであって、前記脂肪酸基が、式Ｃ１０Ｈ１９Ｏ、Ｃ１１Ｈ２１Ｏ、Ｃ１２Ｈ２３Ｏ、Ｃ１３Ｈ２５Ｏ、Ｃ１４Ｈ２７ＯまたはＣ１５Ｈ２９Ｏを有する、ペプチド。
（６）（５）に記載のペプチドであって、Ｘａａ６がＰｈｅである、ペプチド。
（７）（１）〜（３）のいずれか１つに記載のペプチドであって、Ｘａａ６がＴｙｒであり、前記ペプチドは、Ｘａａ１に共有結合している飽和または不飽和の直鎖状または分枝状のＣ４〜Ｃ２０エステルを含む、ペプチド。
（８）（７）に記載のペプチドであって、前記エステルが、式Ｃ１０Ｈ１９Ｏ２、Ｃ１１Ｈ２１Ｏ２、Ｃ１２Ｈ２３Ｏ２、Ｃ１３Ｈ２５Ｏ２、Ｃ１４Ｈ２７Ｏ２またはＣ１５Ｈ２９Ｏ２を有する、ペプチド。
（９）（１）〜（８）のいずれか１つに記載のペプチドであって、Ｘａａ３またはＴｈｒ３とＩｌｅ１３との間の結合を介して環化されている、ペプチド。
（１０）（１）〜（９）のいずれか１つに記載のペプチド、および担体、ビヒクル、賦形剤または希釈剤を含む、組成物。
（１１）（１０）に記載の組成物であって、前記組成物は、洗浄製品、消毒製品、パーソナルケア製品、動物飼料製品または食品である、組成物。
（１２）（１０）に記載の組成物であって、前記組成物は、薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物である、組成物。
（１３）（１）〜（９）のいずれか１つに記載のペプチドを調製するための方法であって、
（ａ）ペプチドの生産を可能にする条件の下で宿主細胞を培養すること、および
（ｂ）前記ペプチドを精製し単離すること、
を含む、方法。
（１４）（１）〜（９）のいずれか１つに記載のペプチドを含む組成物を調製するための方法であって、
（ａ）前記ペプチドの生産を可能にする条件の下で宿主細胞を培養すること、
（ｂ）前記ペプチドを精製し単離すること、ならびに
（ｃ）単離された前記ペプチド、および担体、ビヒクル、賦形剤または希釈剤を含む組成物を生成すること、
を含む、方法。
（１５）（１４）に記載の方法であって、前記組成物が、洗浄製品、消毒製品、パーソナルケア製品、動物飼料製品または食品である、方法。
（１６）（１４）に記載の方法であって、前記組成物が、薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物である、方法。
（１７）微生物の生育または増殖を阻害する方法であって、前記微生物、または微生物を含有する可能性がある表面もしくは製品を、（１）〜（９）のいずれか１つに記載のペプチドと接触させることを含む、方法。
（１８）（１７）に記載の方法であって、微生物を含有する可能性がある前記表面または製品が、収穫後食品と関連する表面、食品加工表面、食品パッケージ、家庭内の表面、食品準備ツール、病院内の表面、外科用品、外科ツール、術後の包帯、創傷被覆帯または外傷である、方法。
（１９）対象において微生物の生育または増殖を阻害する方法であって、（１）〜（９）のいずれか１つに記載のペプチドを含む組成物を前記対象に投与することを含み、前記ペプチドが、前記微生物の生育または増殖を阻害するのに有効な量で投与される、方法。
（２０）（１９）に記載の方法であって、前記対象が、微生物の存在に関連した疾患または状態を有する、方法。
（２１）（２０）に記載の方法であって、個体が微生物感染症を有する、方法。
（２２）（２１）に記載の方法であって、前記感染症が、ＭＲＳＡ、ＶＲＳＡまたはＣＲＥ感染症である、方法。
（２３）（１９）に記載の方法であって、前記対象が、哺乳動物である、方法。
（２４）（２３）に記載の方法であって、前記対象が、ヒト対象である、方法。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
0006698556.tif 000022
【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
0006698556.tif 000030
【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１６Ｅ】
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【図１６Ｆ】
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【図１６Ｇ】
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【図１６Ｈ】
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【図１６Ｉ】
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【図１６Ｊ】
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【図１６Ｋ】
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【図１６Ｌ】
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【図１６Ｍ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１７Ｅ】
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【図１７Ｆ】
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【図１７Ｇ】
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【図１７Ｈ】
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【図１７Ｉ】
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【図１７Ｊ】
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【図１７Ｋ】
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【図１７Ｌ】
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【図１７Ｍ】
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【図１８Ａ】
0006698556.tif 000056
【図１８Ｂ】
0006698556.tif 000057
【図１８Ｃ】
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【図１８Ｄ】
0006698556.tif 000059
【図１８Ｅ】
0006698556.tif 000060
【図１８Ｆ】
0006698556.tif 000061
【図１８Ｇ】
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【配列表】
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