(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクトバチルス・クンキーＢＰＳ４０２（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１４３９）によって蜂蜜濃度２５％超の蜂蜜含有物を発酵して得られる蜂蜜発酵物。
【請求項２】
請求項１に記載の蜂蜜発酵物を含む、食品、化粧品、医薬品又は医薬部外品。
【請求項３】
ラクトバチルス・クンキーＢＰＳ４０２（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１４３９）によって蜂蜜濃度２５％超の蜂蜜含有物を発酵する工程を含む、蜂蜜発酵物の製造方法。
【請求項４】
請求項３に記載の製造方法により得られた蜂蜜発酵物を添加する工程を含む、食品、化粧品、医薬品又は医薬部外品の製造方法。
【請求項５】
ラクトバチルス・クンキーＢＰＳ４０２（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１４３９）を含む、蜂蜜濃度２５％超である蜂蜜含有物の発酵用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蜂蜜発酵物及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
蜂蜜は栄養成分が豊富な素材である。蜂蜜の発酵物は食品として用いられている。例えば特許文献１には、蜂蜜を乳酸菌等で発酵させることを含む健康ドリンクの製造方法が開示されている。特許文献１において発酵原料として用いられている蜂蜜の濃度は約１５％以下である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】中国特許出願公開第１０３７８９１３８号明細書
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】J. Rakuno Gakuen Univ., 34(1), 1-5, 2009
【非特許文献２】Bee world, 73(1), 5-28, 1992
【非特許文献３】General Dentistry, 49(6), 584-589, 2001
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
蜂蜜の糖分は発酵菌以外の菌の栄養源にもなり得るため、蜂蜜濃度が低いと、発酵時に雑菌が繁殖するおそれがある。しかしながら、高い浸透圧等の影響により、高濃度の蜂蜜含有物中で生存できる発酵菌は知られておらず、高濃度の蜂蜜含有物を発酵させるには問題がある。例えば、非特許文献１には、蜂蜜を炭素源としてビフィドバクテリウムを培養すると、培地中の蜂蜜濃度が２０％以上の場合には当該細菌の増殖が見られなかったことが示されている。非特許文献２には、ストレプトコッカス属は蜂蜜２５％以下の濃度で完全に増殖が抑制されることが記載されている。また、非特許文献３には、ラクトバチルス・カゼイが濃度８〜１２％の蜂蜜により増殖が抑制されることが記載されている。【０００６】
本発明は、高濃度の蜂蜜含有物を発酵して得られる発酵物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、ラクトバチルス・クンキーを用いることによって高濃度の蜂蜜含有物を発酵させることができることを新たに見出した。【０００８】
本発明は、ラクトバチルス・クンキーによって蜂蜜濃度２５％超の蜂蜜含有物を発酵して得られる蜂蜜発酵物を提供する。【０００９】
上記ラクトバチルス・クンキーは、ラクトバチルス・クンキーＢＰＳ４０２（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１４３９）であることが好ましい。【００１０】
本発明はまた、上記蜂蜜発酵物を含む、食品、化粧品、医薬品又は医薬部外品を提供する。上記蜂蜜発酵物は、乳酸、酢酸等の有用成分を含み、衛生的な環境で得られるものであるため、食品、化粧品、医薬品又は医薬部外品に好適に用いることができる。【００１１】
本発明はまた、ラクトバチルス・クンキーによって蜂蜜濃度２５％超の蜂蜜含有物を発酵する工程を含む、蜂蜜発酵物の製造方法を提供する。【００１２】
上記ラクトバチルス・クンキーは、ラクトバチルス・クンキーＢＰＳ４０２（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１４３９）であることが好ましい。【００１３】
本発明はまた、上記製造方法により得られた蜂蜜発酵物を添加する工程を含む、食品、化粧品、医薬品又は医薬部外品の製造方法を提供する。【００１４】
本発明はまた、ラクトバチルス・クンキーを含む、蜂蜜濃度２５％超である蜂蜜含有物の発酵用組成物を提供する。当該発酵用組成物は、蜂蜜を高濃度で含有する物質を発酵することができ、より雑菌が繁殖しにくい環境での蜂蜜発酵物の製造に用いることができる。【００１５】
上記ラクトバチルス・クンキーは、ラクトバチルス・クンキーＢＰＳ４０２（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１４３９）であることが好ましい。【００１６】
本発明は、蜂蜜濃度が２５％超である蜂蜜含有物の発酵に使用するための、ラクトバチルス・クンキー又はラクトバチルス・クンキーを含む組成物ということもできる。本発明はまた、ラクトバチルス・クンキーを、蜂蜜濃度が２５％超である蜂蜜含有物の発酵用組成物とした応用、又は、ラクトバチルス・クンキーの、蜂蜜濃度が２５％超である蜂蜜含有物の発酵用組成物の製造における応用ということもできる。
【発明の効果】
【００１７】
本発明により、高濃度の蜂蜜含有物を発酵して得られる蜂蜜発酵物を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】１０％蜂蜜培地での各菌株のＯＤ値を示すグラフである。
【図２】１０％蜂蜜培地での各菌株のＣＦＵを示すグラフである。
【図３】（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）はそれぞれ１０、２５、３０％蜂蜜培地での各菌株のＯＤ値を示すグラフである。
【図４】（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）はそれぞれ１０、２５、３０％蜂蜜培地のｐＨを示すグラフである。
【図５】（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）はそれぞれ１０、２５、３０％蜂蜜培地中の乳酸及び酢酸濃度を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。本明細書において「％」は特に言及しない限り「質量％」を意味する。
【００２０】
本実施形態に係る蜂蜜発酵物は、ラクトバチルス・クンキーによって蜂蜜濃度２５％超の蜂蜜含有物を発酵して得られるものである。
【００２１】
蜂蜜は、ミツバチが、植物の花蜜、樹液、植物に寄生する虫の分泌液等から集めた蜜を主原料として作り出したものである。本実施形態において発酵に供される原料の蜂蜜の種類にはとくに制限がなく、例えば、マヌカ蜂蜜、アカシア蜂蜜、甘露蜂蜜、クローバー蜂蜜、オレンジ蜂蜜、レンゲ蜂蜜、ローズマリー蜂蜜、ヒマワリ蜂蜜、菜の花蜂蜜、コーヒー蜂蜜等を用いることができる。蜂蜜は、１種を単独で用いてもよく、複数種を併用してもよい。蜂蜜は、アカシア蜂蜜であることが好ましい。蜂蜜を採取するために利用されるミツバチの種類、及び蜂蜜の産地は特に限定されない。
【００２２】
ラクトバチルス・クンキーは、他の種類の微生物では発酵できない高濃度の蜂蜜含有物を発酵させることができる。本実施形態に係る蜂蜜発酵物を得るために用いられるラクトバチルス・クンキー（Lactobacillus kunkeei）は、グルコース及びフルクトースに対する資化性を示すものであることが好ましく、グルコース、フルクトース、スクロース、トレハロース及びグルコン酸塩に対する資化性を示すものであることが好ましい。
【００２３】
ラクトバチルス・クンキーは、ラクトバチルス・クンキーＢＰＳ４０２であることが好ましい。ラクトバチルス・クンキーＢＰＳ４０２は、２０１１年１０月３日に、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号３０５−８５６６））に、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２２１７７として寄託されており、入手可能である。また、当該菌株は、現在国際寄託に移管されており、受託番号はＦＥＲＭ  ＢＰ−１１４３９である。
【００２４】
上記ラクトバチルス・クンキーは、蜂蜜を高濃度で含有する物質を発酵するためのスターターとして有用である。したがって、本発明はまた、上記ラクトバチルス・クンキーを含む、高蜂蜜濃度、例えば２５％超の蜂蜜濃度である蜂蜜含有物の発酵用組成物を提供する。高蜂蜜濃度の蜂蜜含有物の発酵用組成物とは、蜂蜜を高濃度で含有する物質を発酵させて蜂蜜発酵物を製造するために用いられる組成物であり、高濃度の蜂蜜含有物に接種されるスターターとして用いることができる。上記発酵用組成物は、ラクトバチルス・クンキーからなるものであってもよい。
【００２５】
本発明の一実施態様は、蜂蜜濃度が２５％超である蜂蜜含有物の発酵に使用するための、ラクトバチルス・クンキー又はラクトバチルス・クンキーを含む組成物である。本発明の他の実施態様は、ラクトバチルス・クンキーを、蜂蜜濃度が２５％超である蜂蜜含有物の発酵用組成物とした応用である。本発明の更に他の実施態様は、ラクトバチルス・クンキーの、蜂蜜濃度が２５％超である蜂蜜含有物の発酵用組成物の製造における応用である。
【００２６】
ラクトバチルス・クンキーの培養は、常法に従って行うことができる。培地は、当該菌が培養できるものであれば特に制限はなく、天然培地、合成培地、半合成培地等を用いることができる。培地としては、窒素源及び炭素源を含有するものを使用することができ、窒素源としては、肉エキス、ペプトン、カゼイン、酵母エキス、グルテン、大豆粉、大豆加水分解物、アミノ酸等が挙げられ、炭素源としては、グルコース、ラクトース、フラクトース、イノシトール、ソルビトール、水飴、澱粉、麹汁、フスマ、バカス、糖蜜等が挙げられる。その他、無機質（例えば、硫酸アンモニウム、リン酸カリウム、塩化マグネシウム、食塩、炭酸カルシウム、鉄、マンガン、モリブデン）、各種ビタミン類などを添加することができる。
【００２７】
培養温度は、例えば４〜４５℃であってよく、２５〜４０℃であることが好ましく、２８〜３３℃であることがより好ましい。培養時間は例えば８〜７２時間であってよい。培養は、通気振とう又は通気攪拌して行ってもよい。培地のｐＨは、例えば４．０〜９．０であってよく、６．０〜８．０であることが好ましい。培養方法としては、例えば、ＭＲＳ培地に菌体を植菌し、３０℃で４８時間培養することが挙げられる。
【００２８】
ラクトバチルス・クンキーを培養して得た菌液は、そのまま蜂蜜含有物に播種して発酵に用いてもよく、培地等で希釈して用いてもよい。ラクトバチルス・クンキーによる蜂蜜含有物の発酵は、例えば、４〜４５℃で行うことができ、２５〜４０℃で行うことが好ましい。発酵時間は例えば１２〜６０時間であってよく、２４〜４８時間であることが好ましい。発酵開始時の蜂蜜含有物のｐＨは、例えば３〜８であってよく、４〜６であることが好ましい。蜂蜜含有物のｐＨは、乳酸、酢酸等の酸が産生するに伴い、発酵中に低下する傾向にある。発酵は、通気振とう又は通気攪拌して行ってもよい。
【００２９】
発酵に供する蜂蜜含有物の蜂蜜濃度は、２５％超である。発酵に供する蜂蜜含有物は、蜂蜜を例えば２５％超３５％未満含んでいてよく、２８〜３４％含むことが好ましく、２８〜３２％含むことがより好ましい。また、発酵に供する蜂蜜含有物は、蜂蜜含有物の全量に対して、蜂蜜を固形分として例えば２０％以上含んでいてよく、２０〜２８％含むことが好ましく、２２．４〜２７．２％含むことが好ましく、２２．４〜２５．６％含むことが更に好ましい。
【００３０】
蜂蜜含有物は、ラクトバチルス・クンキーが発酵できる形態であればよく、例えば液体、ペースト、ゲル等であってよい。蜂蜜含有物は例えば水に蜂蜜を溶解又は懸濁させたものであってよい。発酵に供する蜂蜜含有物は、例えば、窒素源、炭素源等を更に含んでいてもよい。発酵に用いる蜂蜜含有物は、加熱等により滅菌処理されていることが好ましい。
【００３１】
本実施形態に係る蜂蜜発酵物の製造工程においては、高濃度の蜂蜜含有物を発酵させるため、浸透圧及び蜂蜜の抗菌作用等により、発酵中に雑菌が繁殖しにくい。また、発酵物には酢酸が含まれるため、得られた発酵物についても高い抗菌性を有する。
【００３２】
本実施形態に係る蜂蜜発酵物は、発酵により得られたものそのままであってもよく、加熱、ろ過、濃縮、蒸発乾固、凍結乾燥等の処理が施されたものであってもよい。本実施形態に係る蜂蜜発酵物は、ラクトバチルス・クンキーの生菌体及び／又は死菌体を含んでいてもよく、ろ過等により菌体が分離除去されていてもよい。蜂蜜発酵物は、例えば、乳酸、酢酸等の有機酸、ビタミン、アミノ酸、ミネラル、微量元素、ポリフェノール等を含んでいてよい。蜂蜜発酵物はアルコールを含んでいてもよいが、アルコールを含まないことが好ましい。蜂蜜発酵物は、蜂蜜を発酵させて得られるものであるため、原料の蜂蜜よりもビタミン、アミノ酸等の成分が増加し、原料の蜂蜜に含まれていなかった有機酸が産生していること等が期待できる。
【００３３】
本実施形態に係る蜂蜜発酵物は、乳酸及び酢酸を含む。乳酸は皮膚の保湿成分として知られる天然保湿因子（ＮＭＦ）の主要な構成成分の１つとされているため、本実施形態に係る蜂蜜発酵物は、皮膚の保湿等の美容効果を有する。また、酢酸は抗菌物質であるため、本実施形態に係る蜂蜜発酵物は、抗菌効果を有する。蜂蜜発酵物中の乳酸の濃度は、例えば、５００〜３０００ｐｐｍであってよく、酢酸の濃度は、例えば５００〜２５００ｐｐｍであってよい。
【００３４】
本実施形態に係る蜂蜜発酵物は、高濃度の蜂蜜含有物をラクトバチルス・クンキーによって発酵して得たものであり、低濃度の蜂蜜含有物を発酵して得られる発酵物とは異なる性質を有する。発酵に供される蜂蜜含有物が例えば蜂蜜含有液である場合には、得られる蜂蜜発酵物は、水分率が低く、例えば水分量が６５〜９０％であってよく、６５〜８０％又は６５〜７５％であってもよい。本実施形態に係る蜂蜜発酵物は、高濃度の蜂蜜を発酵して得られるものであるため、他微生物に汚染されにくい蜂蜜発酵物である。
【００３５】
上記蜂蜜発酵物は、食品、化粧品、医薬品若しくは医薬部外品自体、又はこれらの成分として用いることができる。上記蜂蜜発酵物は、食品、化粧品、医薬品若しくは医薬部外品、又はこれらの成分として、そのまま用いてもよく、必要に応じて、希釈、乾燥、濃縮等の処理をして液状、固形物、ペースト等の形態にしたものを用いてもよい。
【００３６】
本実施形態に係る食品は、上記蜂蜜発酵物を含む。食品は飲料であってもよい。本実施形態に係る蜂蜜発酵物を含む食品は、食品中の蜂蜜発酵物濃度が例えば０．１〜１００％であってよい。蜂蜜発酵物を含む食品は、必要に応じて、ミネラル類、ビタミン類、フラボノイド類、キノン類、ポリフェノール類、アミノ酸、核酸、必須脂肪酸、清涼剤、結合剤、甘昧料、崩壊剤、滑沢剤、着色料、香料、安定化剤、防腐剤、徐放調整剤、界面活性剤、溶解剤、湿潤剤等が配合されていてもよい。食品は、固体、液体、ペースト等のいずれの形状であってもよい。
【００３７】
食品としては以下のようなものが挙げられ、これらの製造工程中の中間製品、又は最終製品に上記蜂蜜発酵物を添加して、食品を得ることができる：ジュース及び茶飲料等の清涼飲料、乳飲料、乳酸菌飲料、ヨーグルト飲料、炭酸飲料、コーヒー、並びに、日本酒、洋酒、果実酒及びハチミツ酒等の酒などの飲料；カスタードクリーム等のスプレッド；フルーツペースト等のペースト；チョコレート、ドーナツ、パイ、シュークリーム、ガム、ゼリー、キャンデー、クッキー、ケーキ及びプリン等の洋菓子；大福、餅、饅頭、カステラ、あんみつ及び羊羹等の和菓子；アイスクリーム、アイスキャンデー及びシャーベット等の氷菓；カレー、牛丼、雑炊、味噌汁、スープ、ミートソース、パスタ、漬物、ジャム等の調理済みの食品；ドレッシング、ふりかけ、旨味調味料及びスープの素等の調味料。
【００３８】
本実施形態に係る食品は、食品の３次機能（体調調節機能）が強調された食品であってもよい。食品の３次機能が強調された食品としては、例えば、健康食品、機能性表示食品、栄養補助食品、サプリメント及び特定保健用食品を挙げることができる。
【００３９】
本実施形態に係る化粧品は、上記蜂蜜発酵物を有効成分として含む。上記蜂蜜発酵物を含む化粧品には、保湿等の美容効果を期待することができる。また、上記蜂蜜発酵物には酢酸が含まれるため、上記化粧品は、防腐剤を添加しなくても抗菌効果を期待することができる。本実施形態に係る化粧品は、例えば、ヒトを含む動物の、皮膚、粘膜、体毛、頭髪、頭皮、爪、歯、顔皮、口唇等に適用されるものであってよい。本実施形態に係る蜂蜜発酵物を含む化粧品は、化粧品中の蜂蜜発酵物濃度が例えば０．１〜１００％であってよい。
【００４０】
本実施形態に係る化粧品には、蜂蜜発酵物以外に、通常化粧品に用いられる成分、例えば、美白剤、保湿剤、酸化防止剤、油性成分、紫外線吸収剤、界面活性剤、増粘剤、アルコール類、粉末成分、色材、水性成分、水、各種皮膚栄養剤等を必要に応じて適宜配合することができる。本実施形態に係る化粧品は、例えば、化粧品の製造工程における中間製品又は最終製品に、上記蜂蜜発酵物を添加することにより製造することができる。
【００４１】
本実施形態に係る化粧品の剤形は、例えば、可溶化系、乳化系、粉末系、油液系、ゲル系、軟膏系、エアゾール系、水−油２層系、水−油−粉末３層系等であってよい。上記化粧品は、例えば、洗顔料、化粧水、乳液、クリーム、ジェル、エッセンス、美容液、パック、マスク、ミスト、ＵＶ予防化粧品等の基礎化粧品、ファンデーション、口紅、頬紅、アイシャドウ、アイライナー、マスカラ等のメークアップ化粧品、洗顔料、マッサージ用剤、クレンジング用剤、アフターシェーブローション、プレシェーブローション、シェービングクリーム、ボディソープ、石けん、シャンプー、リンス、へアートリートメント、整髪料、へアートニック剤、ヘアミスト、ヘアフォーム、ヘアリキッド、ヘアジェル、ヘアスプレー、育毛剤、制汗剤、入浴剤、マウスリンス、口腔化粧品、歯磨剤などであってよい。
【００４２】
本実施形態に係る医薬品及び医薬部外品は、上記蜂蜜発酵物を有効成分として含む。上記医薬品及び医薬部外品は、上記蜂蜜発酵物をその他必要に応じて用いられる原料に添加する工程を含む方法により製造することができる。医薬品又は医薬部外品としては、蜂蜜発酵物をそのまま用いてもよく、タブレット（素錠、糖衣錠、発泡錠、フィルムコート錠、チュアブル錠、トローチ剤等を含む）、カプセル剤、丸剤、粉末剤（散剤）、細粒剤、顆粒剤、液剤、懸濁液、乳濁液、シロップ、ペースト、注射剤（使用時に、蒸留水又はアミノ酸輸液若しくは電解質輸液等の輸液に配合して液剤として調製する場合を含む）等の剤形としたものを用いてもよい。これらの各種製剤は、例えば、有効成分である蜂蜜発酵物と、必要に応じて他の成分とを混合して上記剤形に成形することによって調製することができる。
【００４３】
本実施形態に係る医薬品及び医薬部外品は、その全量中の蜂蜜発酵物の含有量が、固形分として例えば０．１〜１００％であってよい。本実施形態に係る医薬品又は医薬部外品は、有効成分として含まれる蜂蜜発酵物中の酢酸等の抗菌成分により、例えば抗菌剤等として用いることができる。
【実施例】
【００４４】
以下、本発明を実施例に基づいてより具体的に説明する。ただし、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【００４５】
以下のラクトバチルス属に属する５つの菌株を使用した。各菌の至適培養環境を表１に示す。
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｕｎｋｅｅｉ  ＢＰＳ４０２
Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ＮＢＲＣ１４７１２
Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ  ＮＢＲＣ１２００５
Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ  ｓｕｂｓｐ．Ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ  ＮＢＲＣ１３９５３
Ｌ．ｃａｓｅｉ  ＮＢＲＣ１５８８３【００４６】
【表１】
0006750903.tif 000002
【００４７】
［試験例１：蜂蜜培地での生育能］
ルーマニア産アカシア蜂蜜（山田養蜂場社）を１０％（ｗ／ｗ）となるように精製水で希釈し、ｐＨ８．０の蜂蜜水溶液を調製した。該水溶液を１２１℃で５分間処理して滅菌し、１０％蜂蜜培地を得た。使用した蜂蜜の固形分濃度は８１．６％以上であった。【００４８】
上記５種の菌株をＭＲＳ寒天培地（ＢＤ社）で、至適環境にて４８時間培養し、シングルコロニー化させた。シングルコロニーをＭＲＳ液体培地（ＢＤ社）４ｍＬに播種し、４８時間培養し、前培養液を得た。前培養液の菌液をＭＲＳ液体培地で希釈し、マクファーランド２（ＯＤ６００＝０．４５１）に調整した菌液を、本培養用の種菌液とした。【００４９】
１０％蜂蜜培地２０ｍＬに、各種菌液を２００μＬずつ播種し、至適温度にて振とう培養した。培養開始０、１２及び２４時間後の各発酵液を採取し、発酵液の６００ｎｍでのＯＤ値を測定した。結果を図１に示す。【００５０】
また、培養開始０、１２及び２４時間後の各発酵液を、２〜７段階にわたり１０倍希釈した。各希釈液をＢＣＰ培地（ＢＣＰ加プレートカウントアガール「ニッスイ」、日水製薬社）にコンラージ棒を用いて塗抹し、４８時間至適環境にて培養し、コロニー形成単位（ＣＦＵ）を測定した。結果を図２に示す。【００５１】
１０％蜂蜜培地で５種の菌株を培養した結果、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍのＯＤ値が最も高く、ＢＰＳ４０２及びＬ．ｂｒｅｖｉｓが続いた（図１）。Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ及びＬ．ｃａｓｅｉは１０％蜂蜜培地での増殖は認められなかった。ＣＦＵを測定したところ、培養開始後２４時間まではＢＰＳ４０２のコロニー数が最も多かった（図２）。Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉのコロニー形成はどの時間でも確認されなかった。Ｌ．ｃａｓｅｉは増殖が認められなかったもののコロニー形成は確認された。【００５２】
［試験例２：各蜂蜜濃度培地での菌の生育能］
ルーマニア産アカシア蜂蜜を１０、２５又は３０％（ｗ／ｗ）になるように精製水で希釈し、ｐＨ８．０の蜂蜜水溶液を調整した。該水溶液を１２１℃で５分間処理して滅菌し、１０、２５又は３０％蜂蜜培地を得た。【００５３】
ＢＰＳ４０２、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ及びＬ．ｂｒｅｖｉｓを用いて、試験例１と同様に種菌液を調製した。各濃度の蜂蜜培地２０ｍＬに、各菌液を２００μＬずつ播種し、至適温度にて４８時間振とう培養した。培養開始０、１２、２４及び４８時間後の各発酵液を採取し、発酵液の６００ｎｍでのＯＤ値及びｐＨを測定した。結果を図３及び４に示す。【００５４】
１０％蜂蜜培地（図３（ａ））又は２５％蜂蜜培地（図３（ｂ））では、ＢＰＳ４０２、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ及びＬ．ｂｒｅｖｉｓのいずれにおいても良好な増殖が認められた。一方３０％蜂蜜培地（図３（ｃ））では、ＢＰＳ４０２のみ増殖が認められた。【００５５】
ＢＰＳ４０２、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ及びＬ．ｂｒｅｖｉｓのいずれにおいても、１０％蜂蜜培地（図４（ａ））又は２５％蜂蜜培地（図４（ｂ））で得られた発酵液のｐＨは、培養当初より低下していた。一方３０％蜂蜜培地（図４（ｃ））では、ＢＰＳ４０２を用いた場合のみ発酵液のｐＨが培養当初より低下していた。【００５６】
［試験例３：発酵物のＨＰＬＣ分析］
試験例２で得られた発酵液のうち、２４時間及び４８時間時点の発酵液を０．２μｍフィルターでろ過滅菌し、ＨＰＬＣ分析用サンプルとした。ＨＰＬＣ分析前に、各サンプルを０．４５μｍフィルターで再度ろ過した。市販の乳酸及び酢酸を希釈して検量線サンプルを調製し、検量線を作成した。乳酸及び酢酸の保持時間はそれぞれ５．０８分、５．４６分であった。【００５７】
発酵液の乳酸及び酢酸濃度を、ＨＰＬＣによって下記条件で測定した。結果を図５に示す。
カラム：ｃｏｓｍｏｓｉｌ  ５Ｃ１８−ＡＲ−ＩＩ  ５μｍ、４．６ｍｍｉ．ｄ．×２５０ｍｍ）ａ−０１８
移動相：０．８５％リン酸水
流速：１．０ｍＬ／分
カラム温度：４０℃
検出条件：２１０ｎｍ【００５８】
１０、２５、及び３０％蜂蜜培地で発酵させて得られた発酵液中の乳酸及び酢酸濃度をそれぞれ図５（ａ）、図５（ｂ）、図５（ｃ）に順に示す。ＢＰＳ４０２を用いた場合には、１０、２５及び３０％蜂蜜培地で得られた発酵液において、乳酸及び酢酸が検出された。Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍを用いた場合には、１０、２５％蜂蜜培地で得られた発酵液中で乳酸が検出された。Ｌ．ｂｒｅｖｉｓでは、１０％蜂蜜培地で得られた発酵液において若干の酢酸が検出されたものの、いずれの発酵液中でも乳酸の産生は確認されなかった。
【図１】
0006750903.tif 000003
【図２】
0006750903.tif 000004
【図３】
0006750903.tif 000005
【図４】
0006750903.tif 000006
【図５】
0006750903.tif 000007