(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
６−（２，４−ジクロロフェニル）−５−［４−［（３Ｓ）−１−（３−フルオロプロピル）ピロリジン−３−イル］オキシフェニル］−８，９−ジヒドロ−７Ｈ−ベンゾ［７］アヌレン−２−カルボン酸、又はその薬学的に許容しうる塩、及びパルボシクリブを含む、癌の処置における使用のための組み合わせ医薬。
【請求項２】
癌は乳癌である、請求項１に記載の組み合わせ医薬。
【請求項３】
６−（２，４−ジクロロフェニル）−５−［４−［（３Ｓ）−１−（３−フルオロプロピル）ピロリジン−３−イル］オキシフェニル］−８，９−ジヒドロ−７Ｈ−ベンゾ［７］アヌレン−２−カルボン酸、又はその薬学的に許容しうる塩、及びパルボシクリブ、及び少なくとも１つの薬学的に許容しうる賦形剤を含む、請求項１又は２に記載の組み合わせ医薬。
【請求項４】
６−（２，４−ジクロロフェニル）−５−［４−［（３Ｓ）−１−（３−フルオロプロピル）ピロリジン−３−イル］オキシフェニル］−８，９−ジヒドロ−７Ｈ−ベンゾ［７］アヌレン−２−カルボン酸、又はその薬学的に許容しうる塩、及びパルボシクリブは、同時に、別々に、又は一定期間の間を空けて投与される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組み合わせ医薬。
【請求項５】
パルボシクリブと同時に、別々に、又は一定期間の間を空けて投与される、癌の処置における使用のための、化合物６−（２，４−ジクロロフェニル）−５−［４−［（３Ｓ）−１−（３−フルオロプロピル）ピロリジン−３−イル］オキシフェニル］−８，９−ジヒドロ−７Ｈ−ベンゾ［７］アヌレン−２−カルボン酸又はその薬学的に許容しうる塩を含有する医薬組成物。
【請求項６】
化合物６−（２，４−ジクロロフェニル）−５−［４−［（３Ｓ）−１−（３−フルオロプロピル）ピロリジン−３−イル］オキシフェニル］−８，９−ジヒドロ−７Ｈ−ベンゾ［７］アヌレン−２−カルボン酸又はその薬学的に許容しうる塩と同時に、別々に、又は一定期間の間を空けて投与される、癌の処置における使用のための、パルボシクリブを
含有する医薬組成物。
【請求項７】
（ｉ）６−（２，４−ジクロロフェニル）−５−［４−［（３Ｓ）−１−（３−フルオロプロピル）ピロリジン−３−イル］オキシフェニル］−８，９−ジヒドロ−７Ｈ−ベンゾ［７］アヌレン−２−カルボン酸、又はその薬学的に許容しうる塩、及び少なくとも１つの薬学的に許容しうる賦形剤を含む第一の医薬組成物；
（ｉｉ）パルボシクリブ、及び少なくとも１つの薬学的に許容しうる賦形剤を含む第二の医薬組成物；
を含む、癌の処置における使用のための医薬キットであって、
両方の医薬組成物（ｉ）及び（ｉｉ）は、分離された区画中にあり、そして独立して投与されることを意図されており、他方に関して各投与は同時であるか、別々であるか、時間を空けられる、上記医薬キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書において、パルボシクリブ及び６−（２，４−ジクロロフェニル）−５−［４−［（３Ｓ）−１−（３−フルオロプロピル）ピロリジン−３−イル］オキシフェニル］−８，９−ジヒドロ−７Ｈ−ベンゾ［７］アヌレン−２−カルボン酸の組み合わせ、このような組み合わせを含有する医薬組成物、並びにこのような組み合わせ及び医薬組成物の、特に癌の処置のための治療上の使用が提供される。
【背景技術】
【０００２】
エストロゲン受容体α（ＥＳＲ１）は乳腺腫瘍の大部分において発現され、それらがエストロゲンの分裂促進作用に対して応答することを可能にする。
【０００３】
６−（２，４−ジクロロフェニル）−５−［４−［（３Ｓ）−１−（３−フルオロプロピル）ピロリジン−３−イル］オキシフェニル］−８，９−ジヒドロ−７Ｈ−ベンゾ［７］アヌレン−２−カルボン酸（本明細書では以後「化合物（１）」と呼ばれる）は、選択的エストロゲン受容体機能抑制物質（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｄｅｇｒａｄｅｒ）（ＳＥＲＤ）であり、これは完全エストロゲン受容体アンタゴニスト特性を有し、そしてエストロゲン受容体のプロテアソーム分解を促進する。この化合物は、特許文献１として公開された特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０５３２８２において開示される。
【０００４】
６−アセチル−８−シクロペンチル−５−メチル−２−［５−（１−ピペラジニル）ピリジン−２−イルアミノ］ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７（８Ｈ）−オンとしても知られるパルボシクリブ（Ｐａｌｂｏｃｉｃｌｉｂ）はサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）４及び６の阻害剤である。パルボシクリブは、商標名Ｉｂｒａｎｃｅ（Ｒ）で販売されており、そして以前に内分泌治療を受けたことがある女性において、アロマターゼ阻害剤と組み合わせた、又はフルベストラントと組み合わせたホルモン受容体（ＨＲ）−陽性ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）−陰性局所進行性又は転移性の乳癌の処置に表示される。閉経前又は閉経期前後の女性において、内分泌療法は黄体化ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）アゴニストと組み合わされるべきである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】ＷＯ  ２０１７／１４０６６９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
新しい抗腫瘍処置を見出す必要性が常にある。今や、化合物（１）のパルボシクリブとの組み合わせが、活性成分単独の各々と比較して相乗的効果で、十分に忍容性であり、強い抗腫瘍有効性を示し、かつ腫瘍退縮を誘導するということが示された。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
化合物（１）及びパルボシクリブを含む組み合わせが本明細書において提供される。
【０００８】
本明細書において提供される組み合わせにおいて、化合物（１）は、両性イオン（すなわち、酸基及び塩基基を有する全体として中性の分子）の形態だけではなく、酸又は塩基との付加塩の形態でも存在し得る。このような付加塩は、上記組み合わせにおいて使用され得る。それ故、化合物（１）、又はその薬学的に許容しうる塩、及びパルボシクリブを含む組み合わせが本明細書において提供される。
【０００９】
一実施態様において、化合物（１）、又はその薬学的に許容しうる塩の、パルボシクリブとの組み合わせは治療相乗作用を示す。組み合わせは、その治療効果が組み合わせのいずれかの活性薬剤単独の累積効果と比較して優れている場合、治療相乗作用を示す。
【００１０】
別の実施態様において、化合物（１）、又はその薬学的に許容しうる塩、及びパルボシクリブは経口経路により投与される。
【００１１】
薬剤としてのその使用のための、化合物（１）、又はその薬学的に許容しうる塩、及びパルボシクリブの組み合わせもまた本明細書において提供される。
【００１２】
化合物（１）、又はその薬学的に許容しうる塩、及びパルボシクリブ、さらには少なくとも１つの薬学的に許容しうる賦形剤を含む医薬組成物もまた本明細書において提供される。
【００１３】
賦形剤は、当業者に公知の慣用の賦形剤から選択される。より詳細には、賦形剤は、どんな形態でも（液体液剤、分散剤又は懸濁剤、錠剤、カプセル剤又は同様のもの）経口投与に有用なものから選択される。
【００１４】
別の実施態様において、化合物（１）、又はその薬学的に許容しうる塩、及びパルボシクリブは、同時に、別々に、又は一定期間の間を空けて（逐次投与）投与され得る。従って、本明細書において提供される組み合わせは、単一の医薬組成物中の構成物質の物理的結合により得られるものにのみ限定されず、同時でも時間を空けられても（「広げられても」）よい別々の投与を可能にするものにも限定される。
【００１５】
（ｉ）化合物（１）、又はその薬学的に許容しうる塩、及び少なくとも１つの薬学的に許容しうる賦形剤を含む第一の医薬組成物；
（ｉｉ）パルボシクリブ、及び少なくとも１つの薬学的に許容しうる賦形剤を含む第二の医薬組成物；
を含む医薬キットであって、
両方の医薬組成物（ｉ）及び（ｉｉ）は、分離された区画中にあり、そして独立して投与されることを意図されており、他方に関して各投与は同時であるか、別々であるか、時間を空けられる（逐次的）、上記医薬キットもまた本明細書において提供される。
【００１６】
上記の組み合わせ、医薬組成物及び医薬キットにおいて、化合物（１）又はその薬学的に許容しうる塩及びパルボシクリブは、処置される病態及びそれが投与される患者の状態を考慮して適合された有効用量で有利に存在する。特にパルボシクリブについて、成人患者のための癌処置について推奨される開始用量は、個々の安全性及び忍容性に基づいた投薬中断及び／又は用量減少と併せて、２１日間１日に１回１２５ｍｇ、続いて７日の処置中止である。
【００１７】
癌の処置における使用のための、化合物（１）、又はその薬学的に許容しうる塩、及びパルボシクリブを含む組み合わせ、さらには上記の医薬組成物及びキットもまた本明細書において提供される。
【００１８】
パルボシクリブとの同時投与による癌の処置における使用のための、化合物（１）又はその薬学的に許容しうる塩もまた本明細書において提供される。
【００１９】
化合物（１）又はその薬学的に許容しうる塩との同時投与による癌の処置における使用のためのパルボシクリブもまた本明細書において提供される。
【００２０】
別の実施態様において、癌はホルモン依存性癌である。
【００２１】
別の実施態様において、癌はエストロゲン受容体依存性癌であり、特に癌はエストロゲン受容体α依存性癌である。
【００２２】
別の実施態様において、癌は抗ホルモン処置に対して抵抗性である。
【００２３】
別の実施態様において、癌は野生型エストロゲン受容体を有する癌である。
【００２４】
別の実施態様において、癌は、限定されないが、変異、増幅、スプライスバリアントのようなエストロゲン受容体の少なくとも１つの後成的かつ遺伝的変化に関連する調節解除された機能を伴う癌である。
【００２５】
別の実施態様において、癌は変異したエストロゲン受容体を有する癌である。
【００２６】
別の実施態様において、エストロゲン受容体の変異としては、限定されないが、Ｌｅｕ５３６Ａｒｇ、Ｔｙｒ５３７Ｓｅｒ、Ｔｙｒ５３７Ａｓｎ、又はＡｓｐ５３８Ｇｌｙのような新規又は既知の変異が挙げられ得る。
【００２７】
別の実施態様において、癌はエストロゲン感受性癌である。
【００２８】
別の実施態様において、癌は、乳癌、より特にエストロゲン受容体陽性乳癌（ＥＲα陽性乳癌）、又はその転移、例えば大脳転移である。
【００２９】
それを必要とする被験体に治療有効量の化合物（１）、又はその薬学的に許容しうる塩、及び治療有効量のパルボシクリブを投与することを含む、上に示される病理状態、特に乳癌を処置する方法もまた本明細書において提供される。
【００３０】
それを必要とする被験体に上記の医薬組成物を投与することを含む、上に示される病理状態、特に乳癌を処置する方法もまた本明細書において提供される。
【００３１】
それを必要とする被験体に上記の組み合わせを投与することを含む、上に示される病理状態、特に乳癌を処置する方法もまた本明細書において提供される。
【００３２】
それを必要とする被験体に化合物（１）又はその薬学的に許容しうる塩及びパルボシクリブを同時投与することを含む、上に示される病理状態、特に乳癌を処置する方法もまた本明細書において提供される。
【００３３】
それを必要とする被験体にパルボシクリブ及び化合物（１）又はその薬学的に許容しうる塩を同時投与することを含む、上に示される病理状態、特に乳癌を処置する方法もまた本明細書において提供される。
【００３４】
上記の方法の実施態様において、被験体はヒトである。
【００３５】
上に示される病理状態、特に乳癌を処置する際に有用な薬剤の製造のための、化合物（１）、又はその薬学的に許容しうる塩、及びパルボシクリブを含む組み合わせもまた本明細書において提供される。
【００３６】
パルボシクリブとの同時投与により、上に示される病理状態、特に乳癌を処置する際に有用な薬剤の製造における化合物（１）又はその薬学的に許容しうる塩の使用もまた本明細書において提供される。
【００３７】
化合物（１）又はその薬学的に許容しうる塩との同時投与により、上に示される病理状態、特に乳癌を処置する際に有用な薬剤の製造におけるパルボシクリブの使用もまた本明細書において提供される。
【００３８】
−  パッケージング材料；
−  上で定義される組み合わせ、医薬組成物又は医薬キット；及び
−  該組み合わせ、医薬組成物又は医薬キットが癌の処置のために患者に投与されることを示す、該パッケージング材料内に含まれるラベル又は添付文書
を含む、製品、パッケージング、又は投与ユニットもまた本明細書において提供される。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
以下の実施例は、化合物（１）を合成する方法、並びに化合物（１）、パルボシクリブ及びそれらの組み合わせを用いて得られる、マウスにおける乳癌細胞株異種移植片に対する薬理的結果を示す。
【実施例】
【００４０】
１  −  ６−（２，４−ジクロロフェニル）−５−［４−［（３Ｓ）−１−（３−フルオロプロピル）ピロリジン−３−イル］オキシフェニル］−８，９−ジヒドロ−７Ｈ−ベンゾ［７］アヌレン−２−カルボン酸の合成
特許出願ＷＯ  ２０１７／１４０６６９において記載される６−（２，４−ジクロロフェニル）−５−［４−［（３Ｓ）−１−（３−フルオロプロピル）ピロリジン−３−イル］オキシフェニル］−８，９−ジヒドロ−７Ｈ−ベンゾ［７］アヌレン−２−カルボン酸（化合物（１））を合成するための実験プロトコルは、その分析データとともに以下で再現された。化合物（１）の合成のための合成スキームは図１に見られる。
【００４１】
１Ｈ  ＮＭＲスペクトルは、Ｂｒｕｋｅｒ  Ａｖａｎｃｅ  ＤＲＸ−４００分光計で３０３Ｋの温度にて溶媒ジメチルスルホキシド−ｄ６（ｄ６−ＤＭＳＯ）中２．５ｐｐｍを参照した化学シフト（δ  ｐｐｍ）を用いて行われた。カップリング定数（Ｊ）はヘルツで示される。
【００４２】
液体クロマトグラフィー／質量スペクトル（ＬＣ／ＭＳ）を、ＵＰＬＣ  Ａｃｑｕｉｔｙ  Ｗａｔｅｒｓ機器、光散乱検出器Ｓｅｄｅｒｅ及びＳＱＤ  Ｗａｔｅｒｓ質量分光計でＵＶ検出ＤＡＤ  ２１０＜ｌ＜４００  ｎｍ及びカラムＡｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ  ＣＳＨ  Ｃ１８  １．７μｍ、寸法２．１ｘ３０ｍｍ、移動相Ｈ２Ｏ＋０，１％ＨＣＯ２Ｈ／ＣＨ３ＣＮ＋０，１％  ＨＣＯ２Ｈを使用して得た。
【００４３】
以下の略号及び経験式を使用する：
ＡｃＯＥｔ        酢酸エチル
ＡｌＣｌ３        三塩化アルミニウム
Ｃｓ２ＣＯ３      炭酸セシウム
ＤＣＭ            ジクロロメタン
ＤＭＦ            Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
ＤＭＳＯ          ジメチルスルホキシド
ＨＣｌ            塩化水素
Ｋ２ＣＯ３        炭酸カリウム
ＬＣ／ＭＳ        液体クロマトグラフィー／質量分析
ＭｅＯＨ          メタノール
ＭｇＳＯ４        硫酸マグネシウム
ＮａＨＣＯ３      炭酸水素ナトリウム
ＮａＯＨ          水酸化ナトリウム
Ｐｄ（ｄｐｐｆ）Ｃｌ２      １，１’ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン］  ジクロロパラジウム（ＩＩ）
Ｐｈ３Ｐ又はＰ（Ｐｈ）３    トリフェニルホスフィン
Ｐｈ３Ｐ＝Ｏ      トリフェニルホスフィンオキシド
℃                摂氏度
ｍｌ              ミリリットル
ｍｍｏｌ          ミリモル
μｍｏｌ          マイクロモル
μＭ              マイクロモル濃度
ｎＭ              ナノモル濃度
ｐｐｍ            百万分率
【００４４】
中間体（ｃ）．  （３Ｓ）−３−［４−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２イル）フェノキシ］ピロリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル
【化１】
0006741897.tif 000002
市販の４−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）フェノール（ａ）（８２．７ｇ、３６４．５１ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（２Ｌ）溶液に、アルゴン下で（Ｒ）−１−Ｎ−Ｂｏｃ−３−ヒドロキシピロリジン（ｂ）（８４．４３ｇ、４３７．４１ｍｍｏｌ）、続いてＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルアゾジカルボキサミド（９９．１ｇ、５４６．７７ｍｍｏｌ）を加えた。透明反応混合物は橙色に変わり、そしてトリフェニルホスフィン（１４３．４１ｇ、５４６．７７ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で２４時間撹拌し、その間にトリフェニルホスフィンオキシドの沈殿が形成された（Ｐｈ３Ｐ＝Ｏ）。反応混合物を水（１．５Ｌ）に注ぎ、そして酢酸エチル（ＡｃＯＥｔ）（３ｘ１．５Ｌ）で抽出した。集めた有機相を硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）で乾燥し、濾過し、そして減圧下で濃縮した。残留物をジイソプロピルエーテル（１．５Ｌ）に入れ、そして形成された固形物（Ｐｈ３Ｐ＝Ｏ）を濾過した。溶媒を減圧下で濃縮し、そして残留物をカラムクロマトグラフィーでヘプタンとＡｃＯＥｔとの混合物（９０／１０；体積／体積）で溶出することにより精製して、（３Ｓ）−３−［４−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）フェノキシ］ピロリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル（ｃ）  １４５ｇ（１００％）を無色油状物として得た。
１Ｈ  ＮＭＲ （４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６、δ  ｐｐｍ）：１．２７（ｓ：１２Ｈ）；１．３９（ｓ：９Ｈ）；２．０５（ｍ：１Ｈ）；２．１４（ｍ：１Ｈ）；３．３７（３Ｈ）；３．５５（ｍ：１Ｈ）；５．０５（ｓ：１Ｈ）；６．９４（ｄ、Ｊ＝８．４Ｈｚ：２Ｈ）；７．６１（ｄ、Ｊ＝８．４Ｈｚ：２Ｈ）
【００４５】
中間体（ｄ）．（３Ｓ）−３−［４−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２イル）フェノキシ］ピロリジン、塩酸塩
【化２】
0006741897.tif 000003
（Ｓ）−３−（４−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）フェノキシ）ピロリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル（ｃ）（８０ｇ、１９５．２３ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ（４５０ｍｌ）溶液に、ジオキサン（２５０ｍｌ）中ＨＣｌ  ４Ｎをゆっくりと加えた。
１．５時間後に、反応混合物を減圧下で濃縮し、そして残留物をＥｔ２Ｏに撹拌しながら入れて固体が生じ、次いでこれを濾過し、そして真空乾燥して（３Ｓ）−３−［４−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２イル）フェノキシ］ピロリジン、塩酸塩（ｄ）６１．８ｇ（９５％）を白色粉末として得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６、δ  ｐｐｍ）：１．２８（ｓ：１２Ｈ）；２．１０（ｍ：１Ｈ）；２．２１（ｍ：１Ｈ）；３．３１（３Ｈ）；３．４８（ｍ：１Ｈ）；５．１９（ｍ：１Ｈ）；６．９７（ｄ、Ｊ＝８．４Ｈｚ：２Ｈ）；７．６３（ｄ、Ｊ＝８．４Ｈｚ：２Ｈ）；９．４８（ｓ：１Ｈ）；９．７１（ｓ：１Ｈ）．
ＬＣ／ＭＳ（ｍ／ｚ、ＭＨ＋）：２９０
【００４６】
中間体（ｅ）．（３Ｓ）−１−（３−フルオロプロピル）−３−［４−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）フェノキシ］ピロリジン
【化３】
0006741897.tif 000004
（Ｓ）−３−（４−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）フェノキシ）ピロリジン塩酸塩（ｄ）（２０ｇ、６１．４２ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（１００ｍｌ）中懸濁液に、Ｋ２ＣＯ３（２１．２２ｇ、１５３．５４ｍｍｏｌ）及び１−ヨード−３−フルオロプロパン（１２．１５ｇ、６１．４２ｍｍｏｌ）をアルゴン下で加えた。反応混合物を４０℃で２４時間撹拌した。室温まで冷却した後、反応混合物を濾過し、そしてアセトニトリルで洗浄した。ろ液を減圧下で濃縮し、そして残留物をＤＣＭに入れて、形成された固体を濾過し、そしてＤＣＭで洗浄した。ろ液を濃縮して（３Ｓ）−１−（３−フルオロプロピル）−３−［４−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）フェノキシ］ピロリジン（ｅ）  ２１．５ｇ（１００％）を黄色フォームとして得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６、δ  ｐｐｍ）：１．２７（ｓ：１２Ｈ）；１．７７（ｍ：２Ｈ）；１．８４（ｍ：１Ｈ）；２．２７（ｍ：１Ｈ）；２．４１（ｍ：１Ｈ）；２．４９（２Ｈ）；２．６２（ｄｄ、Ｊ＝２．６及び１０．４Ｈｚ：１Ｈ）；２．６９（ｍ：１Ｈ）；２．８３（ｄｄ、Ｊ＝６．２及び１０．４Ｈｚ：１Ｈ）；４．４７（ｔｄ、Ｊ＝６．２及び４７Ｈｚ：２Ｈ）；４．９９（ｍ：１Ｈ）；６．７７（ｄ、Ｊ＝８．４Ｈｚ：２Ｈ）；７．５８（ｄ、Ｊ＝８．４Ｈｚ：２Ｈ）．
ＬＣ／ＭＳ（ｍ／ｚ、ＭＨ＋）：３５０
【００４７】
中間体（Ｂ）．  ２，２−ジメチルプロパン酸５−オキソ−６，７，８，９−テトラヒドロ−５Ｈ−ベンゾ［７］アヌレン−２−イル
【化４】
0006741897.tif 000005
２−ヒドロキシ−６，７，８，９−テトラヒドロ−５Ｈ−ベンゾ［７］アヌレン−５−オン（Ａ）（１．５２ｇ、８．６３ｍｍｏｌ）のアセトン（６０ｍｌ）溶液に、Ｋ２ＣＯ３（１．１９ｇ、８．６３ｍｍｏｌ）及び塩化ピバロイル（１．０６  ｍｌ、８．６３ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で１６時間撹拌し、濾過し、そして減圧下で濃縮した。残留物をＡｃＯＥｔ中ヘプタンのグラジエント（１００／０〜８５／１５、体積／体積）を用いて溶出するフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、２，２−ジメチルプロパン酸５−オキソ−６，７，８，９−テトラヒドロ−５Ｈ−ベンゾ［７］アヌレン−２−イル（Ｂ）１．５５ｇ（６９％）を無色油状物として得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６、δ  ｐｐｍ）：７．６５（ｄ、１Ｈ）；７．１０−７．０４（ｍ、２Ｈ）；２．９５（ｔ、２Ｈ）；２．６８（ｔ、２Ｈ）；１．８５−１．６５（ｍ、４Ｈ）．
ＬＣ／ＭＳ（ｍ／ｚ、ＭＨ＋）：２６１
【００４８】
中間体（Ｃ）．  ２，２−ジメチルプロパン酸９−（トリフルオロメタンスルホニルオキシ）−６，７−ジヒドロ−５Ｈ−ベンゾ［７］アヌレン−３−イル
【化５】
0006741897.tif 000006
２，２−ジメチルプロパン酸５−オキソ−６，７，８，９−テトラヒドロ−５Ｈ−ベンゾ［７］アヌレン−２−イル  （Ｂ）（１５ｇ、５７．６２ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（５００ｍｌ）溶液に、ピリジン（７．２８ｍｌ、８６．４３ｍｍｏｌ）及びトリフルオロメタンスルホン酸無水物（１９．５８ｍｌ、１１５．２４ｍｍｏｌ）をアルゴン下で滴下した。反応混合物を室温で２時間撹拌し、そして氷（２００ｇ）を加えた。相を分離し、水相をＤＣＭで洗浄し、そして集めた有機層をＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、そして減圧下でエバポレートして２，２−ジメチルプロパン酸９−（トリフルオロメタンスルホニルオキシ）−６，７−ジヒドロ−５Ｈ−ベンゾ［７］アヌレン−３−イル  （Ｃ）２２ｇ（９７％）を白色固体として得た。
ＬＣ／ＭＳ（ｍ／ｚ、ＭＨ−）：３９１
【００４９】
中間体（Ｄ）．  ９−（４−｛［（３Ｓ）−１−（３−フルオロプロピル）ピロリジン−３−イル］オキシ｝フェニル）−６，７−ジヒドロ−５Ｈ−ベンゾ［７］アヌレン−３−イル−２，２−ジメチルプロパン酸
【化６】
0006741897.tif 000007
２，２−ジメチルプロパン酸９−（トリフルオロメタンスルホニルオキシ）−６，７−ジヒドロ−５Ｈ−ベンゾ［７］アヌレン−３−イル（Ｃ）（２２ｇ、５６．０７ｍｍｏｌ）及び（３Ｓ）−１−（３−フルオロプロピル）−３−［４−（テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）フェノキシ］ピロリジン（ｅ）（２０．５６ｇ、５８．８７ｍｍｏｌ）のジオキサン（４２０ｍｌ）及び水（１２０ｍｌ）中の溶液に、Ｐｄ（ｄｐｐｆ）Ｃｌ２（２．７５ｇ、３．３６ｍｍｏｌ）及びＣｓ２ＣＯ３（３６．５７ｇ、１１２．１３ｍｍｏｌ）をアルゴン下で加えた。反応混合物を１時間室温で撹拌し、そして水とＤＣＭとの間で分配した。水相をＤＣＭで洗浄し、そして集めた有機層相をＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、そして減圧下で濃縮した。残留物をＤＣＭ中のＭｅＯＨのグラジエント（０〜５％；体積／体積）を用いて溶出するカラムクロマトグラフィーにより精製して、２，２−ジメチルプロパン酸９−（４−｛［（３Ｓ）−１−（３−フルオロプロピル）ピロリジン−３−イル］オキシ｝フェニル）−６，７−ジヒドロ−５Ｈ−ベンゾ［７］アヌレン−３−イル（Ｄ）３１ｇ（１００％）を得た。
ＬＣ／ＭＳ（ｍ／ｚ、ＭＨ＋）：４６６
【００５０】
中間体（Ｅ）．  ９−（４−｛［（３Ｓ）−１−（３−フルオロプロピル）ピロリジン−３−イル］オキシ｝フェニル）−６，７−ジヒドロ−５Ｈ−ベンゾ［７］アヌレン−３−オール
【化７】
0006741897.tif 000008
２，２−ジメチルプロパン酸９−（４−｛［（３Ｓ）−１−（３−フルオロプロピル）ピロリジン−３−イル］オキシ｝フェニル）−６，７−ジヒドロ−５Ｈ−ベンゾ［７］アヌレン−３−イル（Ｄ）（２４．８ｇ、５３．２６ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ（３００ｍｌ）溶液に、アルゴン下でＮａＯＨ  ５Ｍ（２３ｍｌ、１１５．００ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を２時間室温で撹拌した。次いで６Ｎ  ＨＣｌ水溶液を加えることによりｐＨを７に調整した。ＭｅＯＨを減圧下で濃縮し、次いでＤＣＭを加えた。有機相をＭｇＳＯ４で乾燥し、そして減圧下で濃縮した。残留物をＤＣＭ／ＭｅＯＨのグラジエント１００／０〜９５／０５を用いて溶出するフラッシュクロマトグラフィーにより精製して９−（４−｛［（３Ｓ）−１−（３−フルオロプロピル）ピロリジン−３−イル］オキシ｝フェニル）−６，７−ジヒドロ−５Ｈ−ベンゾ［７］アヌレン−３−オール（Ｅ）１８．８ｇ（９３％）をベージュ色固体として得た。
ＬＣ／ＭＳ（ｍ／ｚ、ＭＨ＋）：３８２
【００５１】
中間体（Ｆ）．  ９−（４−｛［（３Ｓ）−１−（３−フルオロプロピル）ピロリジン−３−イル］オキシ｝フェニル）−６，７−ジヒドロ−５Ｈ−ベンゾ［７］アヌレン−３−イル  トリフルオロメタンスルホナート
【化８】
0006741897.tif 000009
５℃に冷却した（氷浴）９−（４−｛［（３Ｓ）−１−（３−フルオロプロピル）ピロリジン−３−イル］オキシ｝フェニル）−６，７−ジヒドロ−５Ｈ−ベンゾ［７］アヌレン−３−オール（Ｅ）（２０．６ｇ、５４．００ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（２００ｍｌ）及びピリジン（６．５５ｍｌ、８１．００ｍｍｏｌ）中の溶液に、トリフルオロメタンスルホン酸無水物（１８．９３ｍｌ、１０８．００ｍｍｏｌ）をアルゴン下で滴下し、そして反応温度を＜１５℃に維持した。氷浴を外し、そして褐色懸濁液を室温で２時間撹拌した。氷（２００ｇ）及びＤＣＭ（２００ｍｌ）を加え、そして相を分離した。有機相をＭｇＳＯ４で乾燥し、そして減圧下で濃縮した。残留物を、ＤＣＭ／ＭｅＯＨのグラジエント１００／０〜９５／０５を用いて溶出するフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、９−（４−｛［（３Ｓ）−１−（３−フルオロプロピル）ピロリジン−３−イル］オキシ｝フェニル）−６，７−ジヒドロ−５Ｈ−ベンゾ［７］アヌレン−３−イル  トリフルオロメタンスルホナート（Ｆ）２４．７ｇ（８９．１％）を褐色油状物として得た。
ＬＣ／ＭＳ（ｍ／ｚ、ＭＨ＋）：５１４
【００５２】
中間体（Ｇ）．  ９−（４−｛［（３Ｓ）−１−（３−フルオロプロピル）ピロリジン−３−イル］オキシ｝フェニル）−６，７−ジヒドロ−５Ｈ−ベンゾ［７］アヌレン−３−カルボン酸メチル
【化９】
0006741897.tif 000010
９−（４−｛［（３Ｓ）−１−（３−フルオロプロピル）ピロリジン−３−イル］オキシ｝フェニル）−６，７−ジヒドロ−５Ｈ−ベンゾ［７］アヌレン−３−イル  トリフルオロメタンスルホナート（Ｆ）（１０．１ｇ、１９．６７ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（６６ｍｌ）及びＭｅＯＨ（３３ｍｌ）中の溶液に、Ｐｄ（ｄｐｐｆ）Ｃｌ２（９０９ｍｇ、１．１８ｍｍｏｌ）及びジイソプロピルエチルアミン（７．２１ｍｌ）を加えた。黒色懸濁液をオートクレーブで７０℃にて５ｂａｒ  ＣＯ下で５時間カルボニル化した。反応混合物を濾過し、次いでろ液を減圧下で部分的濃縮した。残留物をＡｃＯＥｔと水との間で分配した。有機相を水（２ｘ１００ｍｌ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、そして減圧下で濃縮した。残留物をＤＣＭ／ＭｅＯＨのグラジエント１００／０〜９５／０５を用いて溶出するフラッシュクロマトグラフィーにより精製して９−（４−｛［（３Ｓ）−１−（３−フルオロプロピル）ピロリジン−３−イル］オキシ｝フェニル）−６，７−ジヒドロ−５Ｈ−ベンゾ［７］アヌレン−３−カルボン酸メチル（Ｇ）７．１３ｇ（８６％）を褐色粘性物質として得た。
ＬＣ／ＭＳ（ｍ／ｚ、ＭＨ＋）：４２４
【００５３】
中間体（Ａ１）．  ５−オキソ−６，７，８，９−テトラヒドロ−５Ｈ−ベンゾ［７］アヌレン−２−イル  トリフルオロメタンスルホナート
【化１０】
0006741897.tif 000011
アルゴン下で５℃に冷却した市販の２−ヒドロキシ−６，７，８，９−テトラヒドロ−５Ｈ−ベンゾ［７］アヌレン−５−オン（Ａ）（１８．５ｇ、１０５ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（１８５ｍｌ）及びルチジン（１３．３５ｍｌ、１１３．５０５ｍｍｏｌ）中の溶液に、トリフルオロメタンスルホン酸無水物（２０．２２ｍｌ、１２３．２９ｍｍｏｌ）を、温度を１０と２０℃との間に維持しながら滴下した。反応混合物を１時間５℃で、次いで室温で１時間撹拌した。
【００５４】
次いで、氷（２００ｇ）を加え、そしてこのスラリーを水とＤＣＭとの間で分配した。有機相をＮａＨＣＯ３水溶液で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、そして減圧下で濃縮した。残留物をヘプタン／ＡｃＯＥｔのグラジエント１００〜９０／１０を用いて溶出するフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、５−オキソ−６，７，８，９−テトラヒドロ−５Ｈ−ベンゾ［７］アヌレン−２−イルトリフルオロメタンスルホナート（Ａ１）２８．２  ｇ（８７％）を橙色油状物として得た。
ＬＣ／ＭＳ（ｍ／ｚ、ＭＨ＋）：３０９
【００５５】
中間体（Ｂ１）．  ５−オキソ−６，７，８，９−テトラヒドロ−５Ｈ−ベンゾ［７］アヌレン−２−カルボン酸メチル
【化１１】
0006741897.tif 000012
５−オキソ−６，７，８，９−テトラヒドロ−５Ｈ−ベンゾ［７］アヌレン−２−イルトリフルオロメタンスルホナート（Ａ１）（５．０３ｇ、１６．３２ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（２４ｍｌ）及びＭｅＯＨ（１２ｍｌ）中の溶液に、Ｐｄ（ｄｐｐｆ）Ｃｌ２（７５４ｍｇ、０．９８ｍｍｏｌ）及びジイソプロピルエチルアミン（６ｍｌ）を加えた。黒色懸濁液を、オートクレーブで７０℃にてＣＯ  ５ｂａｒ下で２．５時間カルボニル化した。反応混合物を濾過し、次いでろ液を減圧下で部分的に濃縮し、そして残留物をＡｃＯＥｔと水との間で分配した。有機相を水（２ｘ７５ｍｌ）、そして水性ＨＣｌ  ０．５Ｎで洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、そして減圧下で濃縮した。残留物を、ヘプタン／ＡｃＯＥｔのグラジエント１００／０〜９０／１０を用いて溶出するフラッシュクロマトグラフィーにより精製して５−オキソ−６，７，８，９−テトラヒドロ−５Ｈ−ベンゾ［７］アヌレン−２−カルボン酸メチル（Ｂ１）３．４ｇ（９５％）を無色油状物として得た。
ＬＣ／ＭＳ（ｍ／ｚ、ＭＨ＋）：２１９
【００５６】
中間体（Ｃ１）．  ９−（トリフルオロメタンスルホニルオキシ）−６，７−ジヒドロ−５Ｈ−ベンゾ［７］アヌレン−３−カルボン酸メチル
【化１２】
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アルゴン下で５℃に冷却した５−オキソ−６，７，８，９−テトラヒドロ−５Ｈ−ベンゾ［７］アヌレン−２−カルボン酸メチル（Ｂ１）（１８，１９ｇ、８３，３４ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（５００ｍｌ）及び無水ピリジン（１１ｍｌ、１３０，５６ｍｍｏｌ）中の溶液に、トリフルオロメタンスルホン酸無水物（３０ｍｌ、１７６，５４ｍｍｏｌ）を滴下した。粘性懸濁液の反応混合物を室温で２４時間撹拌し、次いで氷を加え、そして水とＤＣＭとの間で分配した。有機相をＭｇＳＯ４で乾燥し、そして減圧下で濃縮して９−（トリフルオロメタンスルホニルオキシ）−６，７−ジヒドロ−５Ｈ−ベンゾ［７］アヌレン−３−カルボン酸メチル（Ｃ１）２９ｇ（１００％）を黄色粘性物質として得た。
ＬＣ／ＭＳ（ｍ／ｚ、ＭＨ＋）：３５１
【００５７】
中間体（Ｇ）．  ９−（４−｛［（３Ｓ）−１−（３−フルオロプロピル）ピロリジン−３−イル］オキシ｝フェニル）−６，７−ジヒドロ−５Ｈ−ベンゾ［７］アヌレン−３−カルボン酸メチル
【化１３】
0006741897.tif 000014
９−（トリフルオロメタンスルホニルオキシ）−６，７−ジヒドロ−５Ｈ−ベンゾ［７］アヌレン−３−カルボン酸メチル（Ｃ１）（２９ｇ、８２．９ｍｍｏｌ）、（３Ｓ）−１−（３−フルオロプロピル）−３−［４−（テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）フェノキシ］ピロリジン（ｅ）（２８．９ｇ、８２．９ｍｍｏｌ）のジオキサン（２２５ｍｌ）中の溶液に、アルゴン下でＤＣＭとの複合体のＰｄ（ｄｐｐｆ）Ｃｌ２（３．７３ｇ、４．５７ｍｍｏｌ）及びＣｓ２ＣＯ３  １．５Ｍ水溶液（１１１．１２ｍｌ、１６６．６８ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を６０℃で１時間撹拌した。
室温まで冷却した後、反応混合物を水（５００ｍｌ）及びＡｃＯＥｔ（４００ｍｌ）の混合物に注いた。有機相をブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、セライトで濾過し、そして減圧下で濃縮した。残留物をＤＣＭ／ＭｅＯＨのグラジエント１００／０〜９５／０５を用いて溶出するフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、９−（４−｛［（３Ｓ）−１−（３−フルオロプロピル）ピロリジン−３−イル］オキシ｝フェニル）−６，７−ジヒドロ−５Ｈ−ベンゾ［７］アヌレン−３−カルボン酸メチル（Ｇ）２３ｇ（６５％）を褐色粘性物質として得た。
ＬＣ／ＭＳ（ｍ／ｚ、ＭＨ＋）：４２４
【００５８】
中間体（Ｈ）．  ８−ブロモ−９−（４−｛［（３Ｓ）−１−（３−フルオロプロピル）ピロリジン−３−イル］オキシ｝フェニル）−６，７−ジヒドロ−５Ｈ−ベンゾ［７］アヌレン−３−カルボン酸メチル臭化水素酸塩
【化１４】
0006741897.tif 000015
９−（４−｛［（３Ｓ）−１−（３−フルオロプロピル）ピロリジン−３−イル］オキシ｝フェニル）−６，７−ジヒドロ−５Ｈ−ベンゾ［７］アヌレン−３−カルボン酸メチル（Ｇ）（１３．９３ｇ、３２．８９ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（１５０ｍｌ）溶液に、アルゴン下で三臭化ピリジニウム（１５．７８ｇ、４４．４１ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を１時間室温で撹拌した。水（２００ｍｌ）を加え、次いで有機相をＭｇＳＯ４で乾燥し、そして減圧下で濃縮した。残留物を、ＤＣＭ／ＭｅＯＨのグラジエント１００／０〜９５／０５を用いて溶出するフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、８−ブロモ−９−（４−｛［（３Ｓ）−１−（３−フルオロプロピル）ピロリジン−３−イル］オキシ｝フェニル）−６，７−ジヒドロ−５Ｈ−ベンゾ［７］アヌレン−３−カルボン酸メチル臭化水素酸塩（Ｈ）１６．４ｇ（８５％）を黄色メレンゲ状物質として得た。
ＬＣ／ＭＳ（ｍ／ｚ、ＭＨ＋）：５０２
【００５９】
中間体（Ｉ）．  ６−（２，４−ジクロロ−フェニル）−５−｛４−［１−（３−フルオロ−プロピル）−ピロリジン−３−イルオキシ］−フェニル｝−８，９−ジヒドロ−７Ｈ−ベンゾシクロヘプタン−２−カルボン酸メチルエステル
【化１５】
0006741897.tif 000016
８−ブロモ−９−（４−｛［（３Ｓ）−１−（３−フルオロプロピル）ピロリジン−３−イル］オキシ｝フェニル）−６，７−ジヒドロ−５Ｈ−ベンゾ［７］アヌレン−３−カルボン酸メチル臭化水素酸塩（Ｈ）（１５０ｍｇ、２９８．５６μｍｏｌ）のジオキサン（１２ｍｌ）及び水（２ｍｌ）中の溶液に、２，４−ジクロロフェニル−ボロン酸（６２．６７ｍｇ、３２８．４１μｍｏｌ）、Ｃｓ２ＣＯ３（２０４．４８ｍｇ、６２６．９７μｍｏｌ）、及びＰｄ（ｄｐｐｆ）Ｃｌ２（１４．６３ｍｇ、１７．９１μｍｏｌ）を加えた。反応混合物を９０℃で３時間加熱し、そしてＡｃＯＥｔと水との間で分配した。相を分離し、そして有機相をブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、そして減圧下で濃縮した。残留物を、ＤＣＭ、アセトニトリル及びＭｅＯＨ（９６／２／２；体積／体積／体積）を用いて溶出してカラムクロマトグラフィーにより精製して、６−（２，４−ジクロロ−フェニル）−５−｛４−［１−（３−フルオロ−プロピル）−ピロリジン−３−イルオキシ］−フェニル｝−８，９−ジヒドロ−７Ｈ−ベンゾシクロヘプテン−２−カルボン酸メチルエステル（Ｉ）８０ｍｇ（４７％）を得た。
ＬＣ／ＭＳ（ｍ／ｚ、ＭＨ＋）：５６８
【００６０】
化合物（１）．  ６−（２，４−ジクロロフェニル）−５−［４−［（３Ｓ）−１−（３−フルオロプロピル）ピロリジン−３−イル］オキシフェニル］−８，９−ジヒドロ−７Ｈ−ベンゾ［７］アヌレン−２−カルボン酸
【化１６】
0006741897.tif 000017
６−（２，４−ジクロロ−フェニル）−５−｛４−［１−（３−フルオロ−プロピル）−ピロリジン−３−イルオキシ］−フェニル｝−８，９−ジヒドロ−７Ｈ−ベンゾシクロヘプテン−２−カルボン酸メチルエステル（Ｉ）（８０ｍｇ、１４０．７２μｍｏｌ）のＭｅＯＨ（５ｍｌ）溶液に、ＮａＯＨ（５６２．８８μｌ、５Ｍ）の溶液を加え、そして反応混合物を６０℃で５時間加熱し、そして溶媒を減圧下で除去した。残留物を水（１０ｍｌ）に入れて水性ＨＣｌ（５Ｍ）を加えてｐＨ７にした。このスラリーをＤＣＭで抽出し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、そして減圧下で濃縮した。固形物を、ＤＣＭ、アセトニトリル及びＭｅＯＨの混合物（９０／５／５；体積／体積／体積）を用いて溶出するカラムクロマトグラフィーにより精製して、６−（２，４−ジクロロフェニル）−５−［４−［（３Ｓ）−１−（３−フルオロプロピル）ピロリジン−３−イル］オキシフェニル］−８，９−ジヒドロ−７Ｈ−ベンゾ［７］アヌレン−２−カルボン酸６０ｍｇ（７７％）を得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６、δ  ｐｐｍ）：１．６８（ｍ、１Ｈ）；１，７９（ｄｍ、Ｊ＝２５．３Ｈｚ、２Ｈ）；２．０７〜２．２３（ｍ、５Ｈ）；２．３８（ｍ、１Ｈ）；２．４６（ｔ、Ｊ＝７．２Ｈｚ、２Ｈ）；２．５２（ｍ、１Ｈ）；２．６２（ｍ、１Ｈ）；２．５５〜２．８９（ｍ、３Ｈ）；４．４７（ｔｄ、Ｊ＝６．２及び４７．６Ｈｚ、２Ｈ）；４．７２（ｍ、１Ｈ）；６．６３（ｄ、Ｊ＝８．９Ｈｚ、２Ｈ）；６．７１（ｍ、３Ｈ）；７．１８（ｄ、Ｊ＝８．４Ｈｚ、１Ｈ）；８．２６（ｄｄ、Ｊ＝２．０及び８．４Ｈｚ、１Ｈ）；７．５８（ｄ、Ｊ＝２，０Ｈｚ、１Ｈ）；７．６３（ｄ、Ｊ＝８．４Ｈｚ、１Ｈ）；７．７９（ｓ、１Ｈ）；１２．３（ｍ、１Ｈ）
ＬＣ／ＭＳ（ｍ／ｚ、ＭＨ＋）：５５４
【００６１】
２  −  パルボシクリブと組み合わせた６−（２，４−ジクロロフェニル）−５−［４−［（３Ｓ）−１−（３−フルオロプロピル）ピロリジン−３−イル］オキシフェニル］−８，９−ジヒドロ−７Ｈ−ベンゾ［７］アヌレン−２−カルボン酸の、雌性ヌードマウスにおける皮下乳癌細胞株異種移植片に対する有効性の評価
本研究において、サイクリン依存性キナーゼ４（ＣＤＫ４）阻害剤パルボシクリブと組み合わせた、６−（２，４−ジクロロフェニル）−５−［４−［（３Ｓ）−１−（３−フルオロプロピル）ピロリジン−３−イル］オキシフェニル］−８，９−ジヒドロ−７Ｈ−ベンゾ［７］アヌレン−２−カルボン酸（「化合物（１）」）の抗腫瘍有効性を、雌性ヌードマウスにおける皮下ＭＣＦ７−Ｙ５３７Ｓヒト乳癌細胞株異種移植に対する３０日の処置の後に調べた。
【００６２】
処置された群は、化合物（１）５ｍｇ／ｋｇ単独、パルボシクリブ  １００ｍｇ／ｋｇ単独、並びに同じ用量及びレジメンの化合物（１）及びパルボシクリブの組み合わせを含んでいた。
【００６３】
３０日間、化合物（１）は１日に２回（ＢＩＤ）経口投薬され、そしてパルボシクリブは１日に１回（ＱＤ）経口投薬された。抗腫瘍有効性を腫瘍体積測定により評価した。
【００６４】
２−１：実験手順
２−１−１：動物、細胞株、化合物
雌性無胸腺ヌードマウスをＨａｒｌａｎ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ、ＵＳＡ）から入手した。試験登録前少なくとも４日間、動物を順化させた。マウスは１２〜１３週齢であり、処置開始時に体重は２０．２グラムと２７．３グラムとの間であった。これらの動物を、ＵＳＤＡ研究動物福祉法（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｗｅｌｆａｒｅ  Ａｃｔ）を遵守して研究動物の管理及び使用に関するＮＩＨ指針（ＮＩＨ  Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ）に概説される条件下で飼育した。
【００６５】
親ＭＣＦ７細胞をアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ（Ｒ）  ＨＴＢ−２２TM）から入手した。ＭＣＦ７−Ｙ５３７Ｓ（ＥＳＲ１）細胞株は、Ｓａｎｏｆｉバイオロジー開発グループ（Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｇｒｏｕｐ）により生成されたＥＲ．Ｙ５３７Ｓ変異体を発現するＭＣＦ７細胞であった。Ｙ５３７Ｓ変異は、部位特異的変異誘発（Ｔｏｙ  Ｗ．  ｅｔ  ａｌ．、Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、２０１７、７、２７７−２８７）によりＥＳＲ１構築物（ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ＿０００１２５．３）に導入された。この構築物をＭＣＦ７細胞にトランスフェクトし、これはエストラジオールの存在しない場合のそれらの増殖について選択された。ＭＣＦ−Ｙ５３７Ｓは、エストロゲン非依存性活性をＥＲα（エストロゲン受容体アルファ）に付与し、そして内分泌抵抗性疾患に寄与するＥＳＲ１変異である（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  Ｄ．Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．、２０１３、４５（１２）、１４４６−１４５１）。１０％  ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、ヒトインスリンを添加したイーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）中で５％ＣＯ２下にて３７℃で細胞を増殖させた。細胞を０．２５％トリプシンＥＤＴＡ中に採取し、そしてダルベッコリン酸緩衝化食塩水（ＤＰＢＳ）で洗浄し、そして５０％マトリゲル（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎカタログ番号３５６２３４、ロット番号３２２７７）を含むＤＰＢＳ中に再懸濁した。細胞（２０×１０６細胞／マウスあたり）を雌性ヌードマウスの右側腹部中に皮下（ＳＣ）移植した。
【００６６】
ＭＣＦ７−Ｙ５３７Ｓ腫瘍が樹立した場合、腫瘍を断片移植のための腫瘍ストックとして保存した。腫瘍を皮下への断片組織移植により段階的に増殖させた。断片腫瘍組織を雌性ヌードマウスの右側腹部に皮下移植した。５０匹のマウスをこの実験に割り当てた。
【００６７】
化合物（１）及びパルボシクリブ（市販、商品名Ｉｂｒａｎｃｅ（Ｒ）で販売されている）を以下のように配合した：
．  ビヒクルＡ：２０％  Ｌａｂｒａｓｏｌ（Ｒ）（Ｇａｔｔｅｆｏｓｓｅ  ＳＡＳ、Ｆｒａｎｃｅより供給される）；
．  ビヒクルＢ：５％デキストロース。
【００６８】
化合物（１）をビヒクルＡ中で調製し、次いでＳｏｌｕｔｏｌ  ＨＳ１５（Ｓｉｇｍａより購入）を加えて最終濃度５％とし、そしてこの溶液を溶解を完全にするために１時間撹拌下で放置した。その後、ビヒクルＢを加えた。最終ｐＨは５．５であった。
化合物（１）投与の投薬体積：経口経管栄養法により１０ｍｌ／ｋｇ。
用量：５ｍｇ／ｋｇ（上記体積での化合物（１）の投薬量）。
【００６９】
パルボシクリブをビヒクルＡ中で調製し、次いでＳｏｌｕｔｏｌ  ＨＳ１５を加えて最終濃度５％とし、そしてこの溶液を溶解を完全にするために１時間撹拌下で放置した。その後、ビヒクルＢを加えた。最終ｐＨは５．５であった。
投薬体積：経口経管栄養法により１０ｍｌ／ｋｇ。
用量：１００ｍｇ／ｋｇ（上記体積でのパルボシクリブの投薬量）。
【００７０】
２−１−２：研究設計、評価項目
実験に必要な動物（余分を加えて）をプールし、そしてこれらにＭＣＦ７−Ｙ５３７Ｓ腫瘍断片組織を０日目に移植した。移植２１日後に、マウスをプールし、そして無作為に処置群及び対照群に分配し（群あたり１０マウス）、ここで各群についての腫瘍体積中央値は２０２．５〜２１１．５ｍｍ３の範囲に及んだ。化合物（１）及びパルボシクリブの処置を２２日目に開始した。３０日間、化合物（１）を５ｍｇ／ｋｇ  ＢＩＤ（少なくとも５時間間を空けて）で経口投与し、そしてパルボシクリブを１００ｍｇ／ｋｇ  ＱＤで経口投与した。動物体重を毎日評価した。
【００７１】
投薬量をｍｇ／ｋｇで表し、そしてこれは動物の毎日の体重に基づくものであった。ビヒクル処置動物を対照として使用した。マウスを毎日チェックし、そして有害臨床反応を書き留めた。実験の終了まで個々のマウスの体重を計った。病的状態又は体重減少≧２０％が観察された場合にマウスを安楽死させる。最終の安楽死まで腫瘍をノギスで週に２回測定した。腫瘍サイズが約２０００ｍｍ３に達した場合、又は動物の健康問題（腫瘍の４０％面積が潰瘍化）がある場合、動物は安楽死され、そして死亡日が記録される。固形腫瘍体積は二次元腫瘍測定から見積もられ、そして以下の式に従って計算された：
【数１】
0006741897.tif 000018
【００７２】
毒性評価項目：
個々のマウスについて連続した３日の間の１５％体重減少、１日の間の２０％体重減少、又は１０％もしくはそれ以上の薬物関連死のいずれかを生じる投薬量は、特定の環境下で体重減少又は動物の脂肪が薬物関連ではないとみなすことができなければ、過剰な毒性の投薬量とみなされた。例としては、経管栄養ミス（ｍｉｓｇａｖａｇｅ）のような動物の取り扱いの問題、対照群又はビヒクル処置群において観察され得る体重減少をもたらす腫瘍誘導悪液質のような腫瘍モデル関連の問題又は過剰な腫瘍潰瘍化が挙げられる。薬物に関連しない死亡又は重篤な体重減少を有するマウスは、毒性とはみなされず、統計解析から除外される。動物の体重は腫瘍質量を含んでいた。
【００７３】
有効性評価項目：
主要有効性評価項目は、処置群と対照群との間のベースラインからの腫瘍体積変化の中央値の比（ΔＴ／ΔＣ）により要約されるベースラインからの腫瘍体積変化を含む。各処置（Ｔ）群及び対照（Ｃ）群についての腫瘍体積変化は、各動物について毎日、特定の観察日の腫瘍体積から最初の処置（病期診断日）の腫瘍体積を引くことにより計算される。中央値ΔＴは処置群について計算され、そして中央値ΔＣは対照群について計算される。比ΔＴ／ΔＣは計算されてパーセンテージとして表される：
【数２】
0006741897.tif 000019
【００７４】
ΔＴ／ΔＣ≦４０％は治療的に活性とみなされ、ΔＴ／ΔＣ＝０％は腫瘍停滞とみなされ、そしてΔＴ／ΔＣ＜０％は腫瘍退縮（非常に活性）とみなされる。ΔＴ／ΔＣ＞４０％は治療的に不活性とみなされる。
【００７５】
腫瘍退縮パーセントは、研究が開始されたときのその体積と比較した、特定の観察日の処置群における腫瘍体積減少の％（パーセンテージ）として定義される。特定の時点（ｔ）でかつ各動物について、退縮パーセンテージは以下の式を使用して計算される：
【数３】
0006741897.tif 000020
【００７６】
次いで所定の日の群についての退縮パーセント中央値を、その群における各動物について計算された個々の退縮％値の中央値を取ることにより計算した。計算の日は退縮パーセント中央値が群の活性の典型ではない場合を除いてΔＴ／ΔＣが計算される日により決定した。この場合、退縮パーセント中央値が最大である最初の日により決定した。
【００７７】
２−１−３：統計解析
処置及び日（反復）の因子を用いた二元配置分散分析型分析を、ベースラインからの腫瘍体積変化に対して行う。その後、多重度についてのＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ−Ｈｏｌｍ補正を用いたコントラスト分析により、対照群と全ての処置群を比較し、そして  ２７〜５１日目の各日に組み合わせに含まれる用量でそれぞれの単一の薬剤に対して組み合わせを比較する。
【００７８】
図面において、各群の中央値及び中央絶対偏差（ＭＡＤ）を各測定日について表した。
【００７９】
表において、各群の中央値及び正規化ＭＡＤ（ｎＭＡＤ＝１．４８２６＊ＭＡＤ）は各測定日について報告される。
【００８０】
ベースラインからの腫瘍体積変化を、各動物について毎日、特定の観察日の腫瘍体積から最初の処置の日（２１日目）の腫瘍体積を引くことにより計算した。
【００８１】
全ての統計解析は、ＳＡＳバージョン９．２ソフトウェアを使用して行われた。５％未満の確率（ｐ＜０．０５）を有意とみなした。
【００８２】
２−２：結果
３０日間、５ｍｇ／ｋｇ  ＢＩＤでの化合物（１）、パルボシクリブ１００ｍｇ／ｋｇ  ＱＤ並びにこの用量レジメンでの化合物（１）及びパルボシクリブの組み合わせは、この研究において十分に忍容性であり、最下点で群あたり（その群における体重低下の最低）それぞれ−１．７％（２２日目）、−２．０％（２２日目）及び−６．４％（２６日目）の平均体重変化（％）を示した（表１）。
【００８３】
３０日間５ｍｇ／ｋｇ  ＢＩＤの用量の化合物（１）は、５１日目にΔＴ／ΔＣ値５９％（ｐ＝０．４１１３）で腫瘍増殖に対する最小効果を有していた。３０日間１００ｍｇ／ｋｇ  ＱＤのパルボシクリブは、５１日目にΔＴ／ΔＣ値２７％（ｐ＜０．０００１）で抗腫瘍有効性を達成した。化合物（１）についてＢＩＤ及びパルボシクリブについてＱＤと同じ投薬レジメンを用いて５ｍｇ／ｋｇ化合物（１）をパルボシクリブ１００ｍｇ／ｋｇと組み合わせた場合、この組み合わせ処置は、ΔＴ／ΔＣ値０未満（ｐ＜０．０００１）で強い抗腫瘍有効性を示し、そして５１日目に腫瘍退縮を誘導した（腫瘍退縮中央値３２％）。統計解析は、組み合わせ効果が、５１日目に化合物（１）単独又はパルボシクリブ単独のいずれかと比較した場合に有意に異なっていたことを示した（ｐ＜０．０００１）。詳細な結果を以下の表１、２及び３、さらに図２及び３に示す：
−  図２：パルボシクリブと組み合わせた化合物（１）のヌードマウスにおける皮下ヒト乳癌細胞株ＭＣＦ７−Ｙ５３７Ｓ異種移植片に対する抗腫瘍活性：腫瘍体積進化。曲線は毎日各群についての中央値＋又は−ＭＡＤ（中央絶対偏差）を表す；
−  図３：パルボシクリブと組み合わせた化合物（１）のヌードマウスにおける皮下ヒト乳癌細胞株ＭＣＦ７−Ｙ５３７Ｓ異種移植片に対する抗腫瘍活性：５１日目のベースラインからの腫瘍体積変化。点は５１日目のベースラインからの個々の腫瘍体積変化を表し、バーは中央値に相当する。
【００８４】
この実験から、我々は、１日に１回１００ｍｇ／ｋｇでのＣＤＫ４阻害剤パルボシクリブと組み合わせた１日に２回５ｍｇ／ｋｇでの化合物（１）が、ヌードマウスにおけるＭＣＦ７−Ｙ５３７Ｓヒト乳癌細胞株異種移植モデルにおいて有意な抗腫瘍有効性及び腫瘍退縮を誘導したと結論づけた。
【００８５】
【表１】
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【００８６】
【表２】
0006741897.tif 000022
【００８７】
【表３】
0006741897.tif 000023
【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１】化合物（１）の合成のための合成スキーム。
【図２】図２：パルボシクリブと組み合わせた化合物（１）のヌードマウスにおける皮下ヒト乳癌細胞株ＭＣＦ７−Ｙ５３７Ｓ異種移植片に対する抗腫瘍活性：腫瘍体積進化。曲線は毎日各群についての中央値＋又は−ＭＡＤ（中央絶対偏差）を表す。
【図３】図３：パルボシクリブと組み合わせた化合物（１）のヌードマウスにおける皮下ヒト乳癌細胞株ＭＣＦ７−Ｙ５３７Ｓ異種移植片に対する抗腫瘍活性：５１日目のベースラインからの腫瘍体積変化。点は５１日目のベースラインからの個々の腫瘍体積変化を表し、バーは中央値に相当する。
【要約】
パルボシクリブと６−（２，４−ジクロロフェニル）−５−［４−［（３Ｓ）−１−（３−フルオロプロピル）ピロリジン−３−イル］オキシフェニル］−８，９−ジヒドロ−７Ｈ−ベンゾ［７］アヌレン−２−カルボン酸又はその薬学的に許容しうる塩との組み合わせ、このような組み合わせを含有する医薬組成物、及びその治療上の使用、特に乳癌を含む癌の処置のためのその治療上の使用が本明細書において提供される。【図１】
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【図２】
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【図３】
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