(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１又は２の１９７位においてセリン残基からプロリンへの置換を含む、改変ＣＤ１６ポリペプチド又はその対立遺伝子変異体をコードするポリヌクレオチドを含む細胞。
【請求項２】
１９７位においてセリン残基の置換が、ＣＤ１６切断を阻害する構造変化をもたらす、請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
前記ＣＤ１６ポリペプチドが、１７６位においてバリン（１７６Ｖ）をさらに含む、請求項１に記載の細胞。
【請求項４】
前記細胞が、以下の：
（ｉ）ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞；
（ｉｉ）好中球；
（ｉｉｉ）単球；又は
（ｉｖ）多能性幹細胞若しくはその多能性幹細胞から得られた分化細胞
である、請求項１又は請求項２に記載の細胞。
【請求項５】
（ｉ）前記多能性幹細胞が、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）又は胚性幹細胞（ＥＳＣ）であるか；あるいは（ｉｉ）前記多能性幹細胞から作成された分化細胞が、造血細胞である、請求項４に記載の細胞。
【請求項６】
配列番号１又は配列番号２の１９７位でセリンからプロリンへの置換を含む、改変ＣＤ１６又はその対立遺伝子変異体が、同じ修飾を有さないＣＤ１６ポリペプチドと比較して、
（ｉ）エクトドメイン・シェディングに対する低下された感受性；
（ｉｉ）ＡＤＡＭ１７−媒介性シェディングに対する低下された感受性；
（ｉｉｉ）ＮＫ細胞刺激の際の切断に対する低下された感受性；又は
（ｉｖ）増加されたＣＤ１６媒介性の活性
を示す、請求項１に記載の細胞。
【請求項７】
前記改変ポリペプチドを含むＮＫ細胞が、野生型ＣＤ１６ポリペプチドを発現するＮＫ細胞と比較して、少なくとも１の以下の特徴：
（ａ）増強された抗腫瘍能力；
（ｂ）増強された抗ウイルス能力；
（ｃ）改善された抗体依存性細胞毒性
（ｄ）増強されたＩＦＮγ又はＴＮＦα産生
（ｅ）増強されたＣＤ１６媒介型活性
（ｆ）高い表面ＣＤ１６レベル
（ｇ）低い可溶性ＣＤ１６レベル
（ｈ）亢進された細胞刺激；及び
（ｉ）亢進されたインビボ抗癌活性
を示す、請求項４に記載の細胞。
【請求項８】
二重特異性キラーエンゲージャー（ＢｉＫＥ）又は三重特異性キラー細胞エンゲージャー（ＴｒｉＫＥ）をさらに含む、請求項１に記載の細胞。
【請求項９】
前記ＢｉＫＥが、ＣＤ１６×ＣＤ３３ＢｉＫＥ、ＣＤ１６×ＣＤ１９ＢｉＫＥ、又はＣＤ１６×ＥＰ−ＣＡＭ  ＢｉＫＥを含む、請求項８に記載の細胞。
【請求項１０】
細胞集合を含む医薬組成物であって、前記細胞集合が、請求項１〜９のいずれか一項に記載の細胞を含む、医薬組成物。
【請求項１１】
前記組成物が、ＮＫ細胞の集合を含む、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記組成物が、治療薬を投与された対象に投与されるための、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記治療薬が、以下の：
（ｉ）腫瘍抗原を特異的に認識するか；
（ｉｉ）前記腫瘍抗原を特異的に認識する抗体又は抗体フラグメントを含むか；又は
（ｉｉｉ）ウイルス標的を特異的に認識する、
請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
（ｉ）前記腫瘍抗原が、ＨＥＲ２を含むか；又は
（ｉｉ）前記抗体がトラスツズマブ又はリツキシマブ
を含む、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記治療薬が、以下の；
（ｉ）二重特異性キラーエンゲージャー（ＢｉＫＥ）又は
（ｉｉ）三重特異性キラー細胞エンゲージャー（ＴｒｉＫＥ）
を含む、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
前記ＢｉＫＥが、ＣＤ１６×ＣＤ３３  ＢｉＫＥ、ＣＤ１６×ＣＤ１９  ＢｉＫＥ、又はＣＤ１６×ＥＰ−ＣＡＭ  ＢｉＫＥを含む、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
治療を必要とする対象において、新生物の病状に対する医薬の製造における、請求項１〜９のいずれか一項に記載される細胞の使用。
【請求項１８】
請求項１０〜１６のいずれか一項に記載の医薬組成物を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
この出願は、２０１４年３月２８日に出願された米国特許仮出願番号第６１／９７１，９９６号に対する優先権を請求するものであり、そしてそれを参照により本明細書中に援用する。
【発明の概要】
【０００２】
この開示では概して、ＣＤ１６の改変型、改変ＣＤ１６を発現する遺伝子組み換え細胞、及び遺伝子組み換え細胞を伴う方法を説明する。ＣＤ１６の改変型は、少なくとも一部で、ＮＫ細胞刺激時のメタロプロテアーゼ媒介型シェディング（shedding）に対する低い感受性により増強された抗腫瘍及び／又は抗ウイルス活性を示し得る。
そのため、一態様において、この開示では、膜近位領域及び該膜近位領域内のアミノ酸修飾を含んでいるＣＤ１６ポリペプチドを発現するように遺伝子組み換えされた細胞を説明する。
【０００３】
別の態様において、この開示では、膜近位領域及び該膜近位領域にアミノ酸修飾を有するＣＤ１６ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む細胞を説明する。
いずれかの態様において、アミノ酸薬療法は、ＣＤ１６膜近位領域の野生型アミノ酸配列と比較した１若しくは複数のアミノ酸の付加、１若しくは複数のアミノ酸の欠失、又は１若しくは複数のアミノ酸の置換を反映する。これらの実施形態のいくつかにおいて、１若しくは複数のアミノ酸の置換は配列番号１の１９７位におけるセリン残基の置換を含む。
【０００４】
いずれかの態様において、細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、単球、又はＴ細胞であり得る。
いずれかの態様において、改変ＣＤ１６ポリペプチドは、野生型ＣＤ１６ポリペプチドと比較して、ＡＤＡＭ１７媒介型シェディングに対して低い感受性を示す。
いずれかの態様において、改変ＣＤ１６ポリペプチドは、野生型ＣＤ１ポリペプチドと比較して、ＮＫ細胞刺激時の切断に対して低い感受性を示す。
別の態様において、この開示では、斯かる処置を必要としている患者に対して、（ａ）治療用ＮＫエフェクターを該患者に投与し、そして（ｂ）先に概説した実施形態の遺伝子組み換え細胞のいずれかを該患者に投与することを含む治療法を施すことを通常伴う方法を説明する。
【０００５】
いくつかの実施形態において、該治療用ＮＫエフェクターとしては、治療薬が挙げられる。これらの実施形態のいくつかにおいて、該治療薬としては、抗体又は治療用抗体フラグメントを挙げることができる。これらの実施形態のいくつかにおいて、該抗体又は抗体フラグメントはウイルス抗原に特異的に結合する。他の実施形態において、該抗体又は抗体フラグメントは腫瘍抗原に特異的に結合する。
いくつかの実施形態において、該治療薬としては、二重特異性キラーエンゲージャー（ＢｉＫＥ）又は三重特異性キラー細胞エンゲージャー（ＴｒｉＫＥ）を挙げることができる。
【０００６】
更に別の態様において、この開示では、患者に対する免疫療法を改善するための方法を説明し、そして該免疫療法では、治療用ＮＫエフェクターを該患者に投与することを伴う。通常、該方法では、先に概説した実施形態の遺伝子組み換え細胞のいずれかを患者に投与することを更に含む。
本発明の先の概要は、開示した実施形態のそれぞれ又は本発明のあらゆる実施を記載することを意図したものではない。後に続く説明が、説明に役立つ実施形態をより具体的に例示する。当該出願中のいくつかの場所に、実施例の一覧によってガイダンスを提供するが、その実施例は様々な組み合わせで使用できる。どの場合であっても、取り上げた一覧は代表的な群としての役割しかなく、排他的な一覧として解釈されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１Ａ】ヒトＣＤ１６のエクトドメイン切断部位の位置。（Ａ）ＰＭＡ活性化ヒトＮＫ細胞又は好中球の細胞上清から免疫沈降させた可溶性ＣＤ１６のトリプシンペプチドをマススペクトル法分析にかけた。非トリプシン性Ｃ末端を有する４つの高信頼度ペプチド：１つのペプチドがＮＫ細胞（ペプチド番号１、左上）によって放出された可溶性ＣＤ１６由来、及び３つのペプチドが好中球によって放出された可溶性ＣＤ１６由来（ペプチド番号２、左下；ペプチド番号３、右上；及びペプチド番号４、右下）、を同定した。
【図１Ｂ】（Ｂ）ペプチド番号１〜４（下線）、並びにＣＤ１６ａ（配列番号ｌ）及びＣＤ１６ｂ（配列番号２）の推定切断部位（くさび形）の例示。同定されたペプチドでは、第１７６アミノ酸でＣＤ１６ａ（Ｆ）をＣＤ１６ｂ（Ｖ）と区別する。第１〜１６アミノ酸は、ＣＤ１６ａ及びＣＤ１６ｂの予測されたシグナルが配列を示す。第２１０〜２２９アミノ酸は、ＣＤ１６ａの膜貫通領域を示す。アミノ酸の番号付けはシグナル配列内のメチオニンから始まる。ＣＤ１６ａ及びＣＤ１６ｂのアミノ酸配列は、それぞれＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿０００５６９．６及びＮＭ＿０００５７０．４に基づく。
【図２】ＣＤ１６のエクトドメイン・シェディング、切断領域、及び遺伝子操作したセリン−１９７からプロリンへの突然変異に関する略図。ＣＤ１６ａ及びＣＤ１６ｂは、示してあるように膜近位領域内でＡＤＡＭ１７によってエクトドメイン・シェディングを受ける。膜近位領域内のＣＤ１６切断領域は、極めて近接した３つの異なった切断部位（くさび形）を明らかにしたマススペクトル法分析に基づいている。部位特異的突然変異誘発を実施して、ＣＤ１６のセリン−１９７（配列番号１の第１９０〜２０２アミノ酸）をプロリンで置換した（ＣＤ１６／Ｓ１９７Ｐ）。
【図３】ＣＤ１６ａ及びＣＤ１６ｂシェディングに対する遺伝子操作Ｓ１９７Ｐ突然変異の効果。形質移入ＨＥＫ２９３（ヒト胚腎臓）細胞は、フローサイトメトリーによって測定した場合に（左パネル）、同じレベルでＣＤ１６ｂとＣＤ１６ｂ／Ｓ１９７Ｐ（Ａ）又はＣＤ１６ａとＣＤ１６ａ／Ｓ１９７Ｐ（Ｂ）を別々に発現した。異なった形質移入体をＰＭＡあり（１５ｎｇ／ｍｌ、３７℃にて３０分間）又はなしで処理し、そして培地上清のＣＤ１６の可溶化レベルをＥＬＩＳＡ（右パネル）によって定量化した。それぞれの処理条件を各実験について３回繰り返し、そしてデータは３回の独立した実験を表す。棒グラフは、平均±ＳＤを示す。統計的有意性を***Ｐ＜０．００１として示す。（Ｃ）形質移入ＨＥＫ２９３細胞は、Ｌ−セレクチン（ＣＤ６２Ｌ）又はＬ−セレクチンとＣＤ１６ｂ／Ｓ１９７Ｐを発現した。形質移入及びモック形質移入細胞上のＬ−セレクチン及びＣＤ１６ｂ／Ｓ１９７Ｐの表面レベルを、フローサイトメトリー（ヒストグラムプロット）を使用して計測した。Ｌ−セレクチン又はＬ−セレクチンとＣＤ１６ｂ／Ｓ１９７Ｐを発現する形質移入体を、ＰＭＡの存在又は不存在下で３７℃にて３０分間インキュベートし、及びＬ−セレクチン染色の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を決定した（棒グラフ）。それぞれの処理条件を各実験について３回繰り返し、そしてデータは２回の独立した実験を表す。棒グラフは、平均±ＳＤを示す。統計的有意性を*Ｐ＜０．０５として示す。すべてのヒストグラムプロットに関して、Ｘ軸＝Ｌｏｇ１０蛍光及びＹ軸＝細胞数である。
【図４】ＮＫ細胞における遺伝子操作Ｓ１９７Ｐ突然変異のＣＤ１６ａシェディングに対する効果。空のベクター（ベクターのみ）、ＣＤ１６ａ、又はＣＤ１６ａ／Ｓ１９７Ｐで形質導入したＮＫ９２細胞を、ＰＭＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）で又はそれなしに（刺激なし）３７℃にて３０分間（Ａ）、ＩＬ−１２及びＩＬ−１８（それぞれ１００ｎｇ／ｍｌ及び４００ｎｇ／ｍｌ）で３７℃にて２４時間（Ｂ）、又はＲａｊｉ細胞及びリツキシマブで３７℃にて６０分間（Ｃ）処理した。ＣＤ１６ａの細胞表面レベルをフローサイトメトリーによって測定した。アイソタイプ対応陰性対照の抗体染色を点線で示す。（Ｄ）親ＮＫ９２細胞及びＣＤ１６ａ又はＣＤ１６ａ／Ｓ１９７Ｐを発現する形質導入細胞を、ＡＤＡＭ１７阻害剤ＢＭＳ５６６３９４（５μＭ）の存在又は不存在下、Ｒａｊｉ細胞及びリツキシマブで３７℃にて６０分間処理した。可溶性ＣＤ１６ａレベルをＥＬＩＳＡによって測定した。それぞれの処理条件を各実験について３回繰り返し、そしてデータは３回の独立した実験を表す。棒グラフは、平均±ＳＤを示す。統計的有意性を***Ｐ＜０．００１として示す。（Ｅ）ＣＤ１６ａ又はＣＤ１６ａ／Ｓ１９７Ｐを発現するＮＫ９２細胞を、示してあるように抗ＡＤＡＭ１７であるｍＡｂｓ Ｍ２２０、６２３、６３３、又はアイソタイプ対応陰性対照抗体で染色した。（Ｆ）モック形質導入ｉＰＳＣｓ（左パネル）又は遺伝子組み換えＣＤ１６ａ若しくはＣＤ１６ａ／Ｓ１９７Ｐを発現するｉＰＳＣｓ（右パネル）由来のＣＤ５６+ＣＤ４５+ＮＫ細胞を、Ｋ５６２標的細胞と共に又はそれなしに３７℃にて４時間インキュベートした。すべてのヒストグラムプロットに関して、Ｘ軸＝Ｌｏｇ１０蛍光及びＹ軸＝細胞数であり、並びにデータは少なくとも３回の独立した実験を表す。
【図５】遺伝子操作Ｓ１９７Ｐ突然変異のＣＤ１６ａ機能に対する効果。（Ａ）同等なレベルでＣＤ１６ａ又はＣＤ１６ａ／Ｓ１９７Ｐを発現するＮＫ９２細胞（左のパネル）を、単量体ヒトＩｇＧ（０〜２０μｇ／ｍｌ）で処理した。対照として、細胞を同様に、単量体ヒトＩｇＡ（２０μｇ／ｍｌ）で処理し、及びＮＫ９２親細胞をＩｇＧ（２０μｇ／ｍｌ）で処理した（棒グラフ）。抗体結合を、材料と方法に記載のとおり、フローサイトメトリーによって測定した。棒グラフは、少なくとも３回の別々の実験の平均±ＳＤを示す。統計的有意性を、ＩｇＧ（０μｇ／ｍｌ）、ＩｇＡ、又はＮＫ９２親細胞＋ＩｇＧに対して*Ｐ＜０．０５として示す。（Ｂ）モック形質導入ＮＫ９２細胞又はＣＤ１６ａ若しくはＣＤ１６ａ／Ｓ１９７Ｐを発現するＮＫ９２細胞を、抗ＣＤ２０リツキシマブで又はそれなしに処理したＲａｊｉ細胞の不存在（刺激なし）又は存在下、３７℃にて示してある時点までインキュベートした。ＮＫ９２細胞活性化を、フローサイトメトリーによってＣＤ１０７ａ染色の上方調節によって評価した。ヒストグラムプロットに関して、Ｘ軸＝Ｌｏｇ１０蛍光及びＹ軸＝細胞数である。データは少なくとも３回の独立した実験を表す。
【０００８】
例示的実施形態の詳細な説明
この開示では概して、ＣＤ１６ａの改変型、改変ＣＤ１６ａを発現する遺伝子組み換え細胞、及び遺伝子組み換え細胞が関与する方法を説明する。ＣＤ１６ａの改変型は、少なくとも一部で、ＮＫ細胞刺激時のメタロプロテアーゼ媒介型シェディングに対する低い感受性により増強された抗腫瘍及び／又は抗ウイルス活性を示し得る。
多くの固形癌型とは対照的に、上皮性卵巣癌に罹患している女性の生存率はここ３０年でわずかしか変化していない。そのうえ、再発卵巣癌の現行の標準的治療法は低い（＜２０％）奏功率である。卵巣癌サンプルによるＨＥＲ２過剰発現にもかかわらず、抗ＨＥＲ２抗体トラスツズマブを用いた処置は、進行性卵巣癌に罹患している患者において限定された応答だけしか生じない。トラスツズマブに対するこの抵抗性は、機能不全のＮＫ細胞媒介型抗体依存性細胞毒性から生じている可能性がある。よって、革新的な治療戦略が緊急に必要である。我々は治療法戦略を提供するための新規アプローチについて記載する。
【０００９】
卵巣癌に対する一つの懸念は、腫瘍細胞が進行する環境が高度に炎症誘発性であり、その結果、浸潤性ＮＫ細胞に対してＣＤ１６ａ切断を促進し、これにより抗体依存性細胞毒性が減弱される傾向にあるということである。いくつかの抗体がヒト悪性腫瘍を処置するための有効な標的治療法として現れた。それらの有効性は一つには、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞のＦｃγＲＩＩＩａ／ＣＤ１６ａとの抗体相互作用及び抗体依存性細胞毒性による癌細胞殺滅の誘導による。ヒトＩｇＧのＦｃ受容体ＣＤ１６（ＦｃγＲＩＩＩ）は２つのアイソフォーム：ＣＤ１６ａ（ＦｃγＲＩＩＩａ）及びＣＤ１６ｂ（ＦｃγＲＩＩＩｂ）から成る。ＣＤ１６ａはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞によって発現され、及びＣＤ１６ｂは好中球によって発現される。ＮＫ細胞活性化は、エクトドメイン・シェディング−メタロプロテアーゼＡＤＡＭ１７が関与し、原形質膜に近い単一の細胞外領域で起こるタンパク分解性事象、と呼ばれるプロセスによるＣＤ１６の両アイソフォームの表面レベルの急速な下方調節をもたらす（図１Ａ）。
【００１０】
先に述べたように、卵巣癌患者はＮＫ細胞媒介型免疫療法に対して抵抗性である−すなわち、腫瘍がＮＫ細胞媒介型治療法に感受性でない、可能性がある。例えば、卵巣癌細胞は上皮成長因子受容体ＨＥＲ２を一般的に発現するが、しかし、治療用抗体トラスツズマブを用いたその標的化は限定された臨床反応しか提供しなかった。この抵抗性は、少なくとも一部には、エクトドメイン・シェディングの結果として生じ得る−すなわち、サイトカインによるＮＫ細胞活性化、標的細胞相互作用、及び／又は腫瘍浸潤はＣＤ１６ａ切断及び欠陥のある抗体依存性細胞毒性をもたらす可能性がある。よって、エクトドメイン・シェディングのプロセスを妨げることは臨床的に意義がある。
【００１１】
我々は、質量分析法を使用してＣＤ１６ａ及びＣＤ１６ｂの切断部位を決定し、そしてヒト白血球からＣＤ１６ａ及びＣＤ１６ｂのｃＤＮＡをクローニングした。各ｃＤＮＡを定方向様式で変異させて、単一アミノ酸の変化を誘導した。１９７位のセリンがプロリンに変更された（図１Ｂ）。この突然変異はＣＤ１６ａ及びＣＤ１６ｂの切断を妨げ、細胞活性化によるそれらの下方調節を予防する。エクスビボにおける切断抵抗性ＣＤ１６ａの発現は、このＩｇＧ Ｆｃ受容体の高い表面レベルを維持するＮＫ細胞を増加させ、そしてそれがＮＫ細胞刺激、治療用抗体の有効性、及び癌細胞殺滅を促進した。
ＡＤＡＭ１７は多くの細胞表面基質を有するが、ＣＤ１６ａ切断の部位を予測するのに使用できるタンパク質分解のためのコンセンサス配列がない。そのため、我々はＬＣＭＳ−ＭＳを使用して、活性化ヒト末梢血白血球から放出された可溶性ＣＤ１６内のＣ末端切断部位を決定した。
【００１２】
我々はＣＤ１６の膜近位領域内に極めて近接した３つの推定切断位置を観察し（図２、くさび形）、１つの領域はＣＤ１６ａ及びＣＤ１６ｂの間で同一であった。ＡＤＡＭ１７のタンパク質分解はコンセンサス配列を必要としないが、切断領域の二次構造は重要である。ＣＤ１６ａ切断を妨げる試みでは、我々はセリン−１９７をプロリンで置換して（ＣＤ１６ａ197P）、立体構造の変化を導入した。我々は、活性化されたＮＫ細胞の培地上清から及び、別個に、好中球の培地上清からＣＤ１６を免疫沈降させることによってＣＤ１６切断の位置を同定した。免疫沈降させたＣＤ１６をＰＮＧａｓｅＦで処理し、Ｎ−グリカンを取り除き、トリプシン消化し、そして生じたペプチドを質量分析にかけた。非トリプシン性Ｃ末端を含む高信頼度の４つの異なったペプチドパターンを同定した（図１Ａ）。
【００１３】
活性化されたＮＫ細胞の培地上清から濃縮されたＣＤ１６に関して、我々は１つのペプチドパターンだけ観察し、それは配列番号１のグリシン−１７４からアラニン−１９５までのアミノ酸に相当する（ペプチド番号１、図１Ａ）。ＣＤ１６ａ及びＣＤ１６ｂの膜近位領域は第１７６残基を除いて同一のアミノ酸配列を有する。この位置のフェニルアラニンはＣＤ１６ａを示唆し、それはペプチド番号１に存在した（図１Ａ及びＢ）。このペプチドはアラニン−１９５／バリン−１９６における非トリプシン性Ｐ１／Ｐ１’切断位置を明らかにした（図１Ｂ）。
【００１４】
活性化された好中球の培地上清から濃縮されたＣＤ１６に関して、我々は非トリプシン性Ｃ末端を有する３つの異なったペプチドパターンを検出した（ペプチド番号２〜４、図１Ａ及び１Ｂ）。ペプチド番号２は配列番号２のグリシン−１７４からアラニン−１９５までのアミノ酸に相当し、ペプチド番号３は配列番号２のグリシン−１７４からバリン−１９６までのアミノ酸に相当し、及びペプチド番号４は配列番号２のアスパラギン−１８０からトレオニン−１９８までのアミノ酸に相当する。
【００１５】
ペプチド番号２及びペプチド番号３は、ＣＤ１６ｂを示唆する、１７６位にバリンを含み、アラニン−１９５／バリン−１９６における及びバリン−１９６／セリン−１９７におけるＰ１／Ｐ１’位置が明らかになった（図１Ｂ）。ペプチド番号４はトレオニン−１９８／イソロイシン−１９９にＰ１／Ｐ１’位置を有していた（図１Ｂ）。このペプチドは濃縮された好中球からの可溶性ＣＤ１６に由来するが、アイソフォームを同定するための１７６位のアミノ酸を含んでいない（図１Ｂ）。それとは関係なく、高信頼度ペプチドはＣＤ１６の第三の切断部位を明らかにした。総合すれば、これらの知見は、単一特異的切断部位よりむしろＣＤ１６の切断領域の存在を実証する。
【００１６】
我々は、部位特異的突然変異誘発を使用することによってＣＤ１６の切断領域を更に調査して、ＣＤ１６ａ及びＣＤ１６ｂ切断が細胞ベースのアッセイにおいて妨害され得るか決定した。ＡＤＡＭ１７は、その触媒部位と相互作用する基質領域におけるα−ヘリカル構造を選択する傾向がある。そのうえ、ＡＤＡＭ１７切断部位特異性に関するプロテオミクス試験は、Ｐ１’、Ｐ２’、又はＰ３’位におけるプロリン残基の非常に低い優先度を明らかにした。そのため、我々は、ＣＤ１６ａ及びＣＤ１６ｂの切断領域内のセリン−１９７をプロリンで置換した（Ｓ１９７Ｐ、図２に示したとおり）。
【００１７】
ＣＤ１６ｂ及びＣＤ１６ｂ／Ｓ１９７Ｐを別々にヒト腎臓細胞株ＨＥＫ２９３で発現させ、そして該ＨＥＫ２９３は内因性ＣＤ１６を発現していない。ＨＥＫ２９３形質移入体は、その表面上において同じレベルでＣＤ１６ｂ又はＣＤ１６ｂ／Ｓ１９７Ｐを発現した（図３Ａ）。高レベルのＣＤ１６ｂが形質移入ＨＥＫ２９３から放出され、そしてそれは、ＥＬＩＳＡによって測定されたように、ＰＭＡでのそれらの処理によって更に増強された（図３Ａ）。しかしながら、未処理又はＰＭＡ処理されたＨＥＫ２９３細胞によって産生されたＣＤ１６ｂ／Ｓ１９７Ｐの可溶性レベルはＣＤ１６ｂのものより顕著に低かった（図３Ａ）。
【００１８】
我々はまた、同じアプローチを使用してＣＤ１６ａ切断に対するＳ１９７Ｐ突然変異の効果も調べた。ＣＤ１６ａの表面発現にはγ鎖二量体との結合を必要とする。そのため、我々はヒトγ鎖を安定して発現するＨＥＫ２９３細胞を使用した。同等な表面レベルのＣＤ１６ａ又はＣＤ１６ａ／Ｓ１９７Ｐを発現するＨＥＫ２９３形質移入体と比較して（図３Ｂ）、我々は未処理及びＰＭＡ処理した細胞の培地上清中のそれぞれの受容体の可溶性レベルを測定した。ＣＤ１６ａと比較して、再び、可溶性ＣＤ１６ａ／Ｓ１９７Ｐの有意に低いレベルを観察した（図３Ｂ）。
【００１９】
ＣＤ１６における遺伝子操作Ｓ１９７Ｐ突然変異がＡＤＡＭ１７活性を妨げ得るかどうか評価するために、我々はまた、ＣＤ１６ｂ／Ｓ１９７Ｐを発現するか又はそれを欠いているＨＥＫ２９３細胞に、白血球で通常発現される十分に記載されたＡＤＡＭ１７基質であるＬ−セレクチンを用いて形質移入した。両方の形質移入体とも同等なレベルのＬ−セレクチンを発現し、そしてそれが、ＰＭＡを用いたそれらの活性化を受けて同様に下方調節され（図３Ｃ）、Ｓ１９７Ｐ突然変異がＡＤＡＭ１７活性ではなく、ＣＤ１６シェディングに影響したことを実証した。
【００２０】
ＮＫ細胞におけるＣＤ１６ａシェディングに対するＳ１９７Ｐ突然変異の効果を評価するために、我々はヒトＮＫ細胞株ＮＫ９２（Gong et al, 1994, Leukemia 8:652-658）を使用した。これらの細胞は内因性ＣＤ１６ａの発現を欠いているが、遺伝子組み換えＣＤ１６ａは安定して発現され得る。我々は、ＣＤ１６ａ及びＣＤ１６ａ／Ｓ１９７Ｐを別々に発現するようにＮＫ９２細胞に形質導入した。これらの受容体を同等なレベルで発現する細胞を、ＰＭＡで活性化し、そして細胞表面ＣＤ１６レベルをフローサイトメトリーによって調べた。ＣＤ１６ａ／Ｓ１９７Ｐではなく、ＣＤ１６ａが細胞表面発現に顕著な下方調節を受けた（図４Ａ）。ＩＬ−１２及びＩＬ−１８は、個別に又は組み合わせでＣＤ１６ａシェディングを引き起こし得るＮＫ細胞の生理的刺激である。ＩＬ−１２及びＩＬ−１８で処理されたＮＫ９２細胞は、ＣＤ１６ａの細胞表面発現を大きく下方調節するが、ＣＤ１６ａ／Ｓ１９７Ｐではそうではないことを実証した（図４Ｂ）。ＣＤ１６ａによる細胞結合ＩｇＧの直接的な関与もまたシェディングを引き起こす可能性があり、我々は、ＣＤ１６ａ又はＣＤ１６ａ／Ｓ１９７Ｐを発現するＮＫ９２細胞を、抗ＣＤ２０ ｍＡｂであるリツキシマブの存在又は不存在下、ＣＤ２０陽性バーキットリンパ腫細胞株Ｒａｊｉと共にインキュベートすることによってここでそれを調べた。リツキシマブで処理したＲａｊｉ細胞は、ＣＤ１６ａの下方調整を誘発したが、ＣＤ１６ａ／Ｓ１９７Ｐではそれがなかった（図４Ｃ）。
【００２１】
ＢＭＳ５６６３９４は、他のメタロプロテアーゼよりＡＤＡＭ１７に対して桁違いに高度に選択的なＡＤＡＭ１７阻害剤である。ＢＭＳ５６６３９４は、Ｓ１９７Ｐ突然変異と同様の効率でＣＤ１６ａシェディングを妨げたが、ＣＤ１６ａ／Ｓ１９７Ｐを発現する活性化されたＮＫ９２細胞に対して追加の遮断効果はなかった（図４Ｄ）。これらの知見は、ＡＤＡＭ１７がその切断領域内でＣＤ１６ａを切断する主なシェダーゼ（sheddase）であるさらなる証明を提供する。しかしながら、ＡＤＡＭ１７発現レベルがＣＤ１６ａ又はＣＤ１６ａ／Ｓ１９７Ｐを発現するＮＫ９２細胞と同等でないので、それらの異なったシェディングの原因になった可能性はある。そのため、我々は、ＣＤ１６ａ又はＣＤ１６ａ／Ｓ１９７Ｐを発現するＮＫ９２細胞を複数の抗ＡＤＡＭ１７ｍＡｂｓで染色し、そして同一の細胞表面レベルを観察した（図４Ｅ）。
【００２２】
初代ＮＫ細胞によってＣＤ１６ａシェディングに対するＳ１９７Ｐ突然変異の効果を確立するために、我々は、ヒトｉＰＳＣｓを使用して、遺伝子操作したＮＫ細胞を作出した。我々は以前に、ｉＰＳＣｓからの機能的ＮＫ細胞の誘導、及び末梢血ＮＫ細胞とそれらの類似性について報告した（Knorr et al., 2013 Stem Cells Transl Med. 2:274-283; Ni et al, 2014, Stem Cells 32: 1021-1031）。ｉＰＳＣ細胞における遺伝子挿入と安定発現のためにＣＤ１６ａ及びＣＤ１６ａ／Ｓ１９７Ｐ ｃＤＮＡをSleeping Beautyトランスポゾンプラスミド内にクローニングし、続いて、それを成熟ＮＫ細胞に分化させた。
【００２３】
モック形質導入ｉＰＳＣ細胞から得られたＮＫ細胞は、低レベルの内因性ＣＤ１６ａを発現する一方で、形質導入したＣＤ１６ａ及びＣＤ１６ａ／Ｓ１９７Ｐはより高いレベルで発現された（図４Ｆ）。ＮＫ細胞の活性化は、ＢＹ５５／ＣＤ１６０を含めたＫ５６２細胞とそれらの相互作用によって様々な受容体を通して起こり、ＡＤＡＭ１７活性化及びＣＤ１６ａシェディングをもたらした。我々は、Ｋ５６２細胞でｉＰＳＣ誘導ＮＫ細胞を刺激して、ＣＤ１６ａが細胞表面発現の顕著な下方調整を受けた一方で、ＣＤ１６ａ／Ｓ１９７Ｐの発現は安定した状態を保ったことを見出した（図４Ｆ）。
【００２４】
内因性及び遺伝子組み換えＣＤ１６ａは、単量体ＩｇＧを結合するのに十分な親和性を有する。ＣＤ１６ａ機能に対するＳ１９７Ｐ突然変異の効果を調べるために、我々は、ＣＤ１６ａとＣＤ１６ａ／Ｓ１９７ＰのＩｇＧ結合能を比較した。同等なレベルでＣＤ１６ａ又はＣＤ１６ａ／Ｓ１９７Ｐを発現するＮＫ９２細胞は、同様の用量依存的様式でＩｇＧを結合した（図５Ａ）。対照は、ＣＤ１６ａ又はＣＤ１６ａ／Ｓ１９７Ｐを発現するＮＫ９２細胞へのＩｇＡ結合、及びＮＫ９２親細胞へのＩｇＧ結合から成った。両方とも実質的にバックグラウンドレベルで起こった（図５Ａ）。これらの知見は、ＣＤ１６ａ及びＣＤ１６ａ／Ｓ１９７Ｐによる特異的で同等なＩｇＧ結合を実証する。
【００２５】
ＣＤ１６ａはＮＫ細胞における強力な活性化受容体であるので、我々は、抗体で処理された腫瘍細胞の関与によって細胞活性化を引き起こすＣＤ１６ａの能力に遺伝子操作Ｓ１９７Ｐ突然変異が影響を及ぼすか調べた。ＮＫ９２細胞の活性化は、脱顆粒によって非常に急速に生じ、且つ、ＮＫ細胞活性化に関する高感度指標であるＣＤ１０７ａの上方調節を計測することによって評価された。リツキシマブで又はそれなしに処理にされたＲａｊｉ細胞と共にインキュベートしたモック形質導入ＮＫ９２細胞では、ＣＤ１０７ａの低レベル且つ同様の上方調節が実証された（図５Ｂ）。Ｒａｊｉ細胞単体と共にインキュベートした、同等なレベルでＣＤ１６ａ又はＣＤ１６ａ／Ｓ１９７Ｐを発現するＮＫ９２細胞もまたＣＤ１０７ａを限界的に上方調節したが、リツキシマブで処理したＲａｊｉ細胞を伴ったそれらのインキュベーションもＣＤ１０７ａの大きな上方調節をもたらした（図５Ｂ）。総合すれば、先の知見は、ＣＤ１６ａにおける遺伝子操作Ｓ１９７Ｐ突然変異がその機能を損なうことはなかったことを示している。
【００２６】
よって、我々は、ＣＤ１６ａ及びＣＤ１６ｂにおける遺伝子操作Ｓ１９７Ｐ突然変異が天然ＡＤＡＭ１７を伴った細胞ベースのアッセイにおいて効果的にそれらのシェディングを妨げたことを示す。ＣＤ１６ａにおけるＳ１９７Ｐ突然変異はまた、ヒトＮＫ細胞株であるＮＫ９２において受容体のシェディングを妨げたが、受容体機能は損なわなかった。同等なレベルでＣＤ１６ａ又はＣＤ１６ａ／Ｓ１９７Ｐを発現するＮＫ９２細胞は、さまざまな抗体濃度範囲にわたって同様の効率で単量体ＩｇＧを結合した。加えて、ＣＤ１６ａ又はＣＤ１６ａ／Ｓ１９７Ｐを発現するＮＫ９２細胞は、Ｒａｊｉ細胞に結合したリツキシマブの関与によって類似した様式で活性化マーカーＣＤ１０７ａを上方調節した。
【００２７】
多分化能性幹細胞は、遺伝子操作ＮＫ細胞を作出するための遺伝操作を可能にする。この開示では、野生型ＣＤ１６ａ又はＣＤ１６ａ／Ｓ１９７Ｐを発現する形質導入ｉＰＳＣｓからの遺伝子操作ＮＫ細胞の作出を説明する。ＮＫ９２細胞を用いた場合、ＣＤ１６ａはｉＰＳＣｓ誘導ＮＫ細胞においてシェディングを受け、細胞活性化時の正常なＡＤＡＭが１７活性を実証した一方で、ＣＤ１６ａ／Ｓ１９７Ｐはシェディングを受けなかった。
【００２８】
ＣＤ１６ａ及びＮＫ細胞の細胞傷害機能は癌患者において顕著な下方調節を受ける。ＣＤ１６ａ／Ｓ１９７ＰをコードするｃＤＮＡｓは、安定したヒト誘発多分化能性幹細胞（ｉＰＳＣｓ）及び胚幹細胞（ＥＳＣｓ）を作出するのに使用できる。次に、これらの幹細胞はＣＤ１６ａ／Ｓ１９７Ｐを発現する初代ＮＫ細胞に分化させることができる。切断抵抗性ＣＤ１６ａ／Ｓ１９７Ｐ（例えば、単球）又はＣＤ１６ｂ／Ｓ１９７Ｐ（例えば、好中球）を発現する他の細胞集団もまた、ｈＥＳＣｓ／ｉＰＳＣｓから得られる。
【００２９】
様々な形態の癌又は感染に対してヒト患者で使用されるＮＫ細胞免疫療法を作り出すために、ＣＤ１６ａ／Ｓ１９７Ｐ発現ＮＫ細胞は、増強された抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）活性又は他のＣＤ１６ａ媒介型活性（例えば、ＩＦＮγ及びＴＮＦα産生）を媒介し得る。例えば、ＣＤ１６ａ／Ｓ１９７Ｐ発現ＮＫ細胞は、治療用抗体（例えば、トラスツズマブ又はリツキシマブ）、二重特異性キラーエンゲージャー（例えば、ＢｉＫＥ、ＣＤ１６×ＣＤ３３、ＣＤ１６×ＣＤ１９、又はＣＤ１６×ＥＰ−ＣＡＭ二重特異性キラー細胞エンゲージャー）又は三重特異性キラー細胞エンゲージャー（ＴｒｉＫＥ）と組み合わせられてもよい。他の治療用細胞集団（例えば、好中球、単球、Ｔ細胞など）もまた、増強されたＣＤ１６媒介型活性を生じ得る。
【００３０】
ヒトｉＰＳＣｓ又はヒトＥＳＣｓにおけるＣＤ１６ａ／Ｓ１９７Ｐの発現は、例えばＨＥＲ２卵巣癌などの腫瘍性病態に対して促進されたＡＤＣＣ活性を有するＮＫ細胞集団を作出し得る。場合によっては、腫瘍性病態は、例えばトラスツズマブなどの治療用抗体で処置されてもよい。成熟ＮＫ細胞は、ヒト胚性幹細胞及びｉＰＳＣｓに由来していてもよい。
【００３１】
野生型ＣＤ１６ａ及び／又はＣＤ１６ａ／Ｓ１９７Ｐは、個々のＣＤ１６ａ受容体を発現する安定したｉＰＳＣ株又は安定したＥＣＳ株を作出すためにクローニングされ得る。任意の好適なクローニング法が使用され得る。代表的なクローニング法としては、例えばウイルスベースの方法、トランスポゾンベクター（例えばSleeping Beauty）、又はヌクレオフェクション（nucleofection）が挙げられる。
【００３２】
一例として、ｉＰＳＣｓは、Sleeping Beautyトランスポゾンベクターを使用して改変され得る。ベクターは、例えばＧＦＰ／ゼオシン抵抗性融合タンパク質などの選択系を含んでおり、そしてそれが二元的な選択系（ゼオシン抵抗性及びフローサイトメトリーセルソーティング）を可能にする。ｉＰＳＣｓは以前に記載されているように成熟ＮＫ細胞に分化させる（Ni et al, 2011, J. Virol. 85:43-50; Knorr et al. 2013, Stem Cells Transl Med 2:274-283; Woll et al, 2009, Blood 113:6094-6101）。ｉＰＳＣｓにおけるトランスジェニック受容体の発現は、誘導ＮＫ細胞における高い発現レベルにつながり得る。未分化ｉＰＳＣｓにおけるＣＤ１６発現は、ＮＫ細胞分化を中断し得る。こうした場合、ＣＤ１６発現は、ＣＤ１６発現が通常のＮＫ細胞分化と同時に起こるほうが好都合なように、例えばＣＤ５６又は天然のＣＤ１６ａプロモーターを使用して遅らせてもよい。
【００３３】
当業者は、野生型ＣＤ１６ａと対比してＣＤ１６ａ／Ｓ１９７Ｐを同等なレベルで発現するＮＫ細胞を比較する。ＣＤ１６構築物の発現レベルは、ＣＤ１６構築物と比例した様式で現れるＧＦＰ発現に基づくＦＡＣＳソーティングで対等にできる。対等にしたＣＤ１６ａレベルはＦＡＣＳによって確認できる。ＨＥＲ２発現卵巣癌細胞に対するＮＫ細胞毒性は、例えばトラスツズマブなどの治療用抗体の存在又は不存在下での標準的なクロム遊離試験で評価できる。非クロム標識された卵巣癌細胞を用いた抗体依存性細胞毒性が評価され得る。当業者は、ＥＬＩＳＡによってＮＫ細胞のサイトカイン産生（例えば、ＩＦＮγ、ＴＮＦ）及びＣＤ１６ａの可溶性レベルを評価でき、及びＦＡＣＳによってＣＤ１６ａ及び他の活性化マーカー（例えば、ＣＤ１０７ａ、ＣＤ６２Ｌ）の細胞表面レベルを評価できる。
【００３４】
実施例３に記載のヒト腫瘍異種移植モデルは、インビボにおいて切断不可能なＣＤ１６ａを発現するＮＫ細胞の抗癌活性を評価するのに使用できる。ヒトＣＤ１６と異なって、マウスＣＤ１６は細胞刺激によってエクトドメイン・シェディングを受けないので、そのため、ＮＫ細胞媒介ＡＤＣＣに対するＣＤ１６ａシェディングの効果を測定することは、正常なマウスではモデル化できない。表１では、実験の群分けと処置の代表的な組み合わせを提供する。
【００３５】
【表１】
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【００３６】
腫瘍の増殖及び／又は退縮は、例えば生物発光造影、超音波、ＣＴ、ＭＲＩ、別の画像技術、及び／又はマウスの計量を含めた従来の方法によって毎週観察され得る（Woll et al, 2009, Blood 113:6094-6101）。マウスもまた、ヒトＮＫ細胞生存率を定量化するために（例えば毎週）採血され得る。様々なエフェクター機能マーカー（例えば、ＩＦＮγ、ＣＤ１６ａ）の発現及び／又は細胞表面レベルは、例えばＦＡＣＳによるなどの従来の手法を使用して評価され得る。マウスは、例えば６０日間などの任意の好適な期間追跡検査され得る。屠殺時点で、内臓（例えば脾臓、肝臓、肺、腎臓、及び／又は卵巣）が、以前に記載されているように（Woll et al, 2009, Blood 113:6094-6101）、（例えば生物発光によって）転移癌の徴候がないか調査され得る。
【００３７】
我々の分析は、当業者が野生型ＣＤ１６ａと対比してＣＤ１６ａ／Ｓ１９７Ｐを発現するｉＰＳＣ誘導ＮＫ細胞の抗体依存性細胞毒性活性及びインビボにおける効力を規定及び比較することを可能にする。よって、我々は、本明細書中にＣＤ１６ａの改変型、改変ＣＤ１６ａを発現する遺伝子組み換え細胞、及び遺伝子組み換え細胞（例えばＮＫ細胞、好中球、単球、Ｔ細胞など）を伴う方法を記載する。例えば、ＣＤ１６ａの改変型、ＣＤ１６ａ／Ｓ１９７Ｐを発現するＮＫ細胞は、少なくとも一部で、ＮＫ細胞刺激時のＡＤＡＭ１７媒介型シェディングに対する低い感受性により増強された抗卵巣癌活性を呈する。これは、同様にして、例えば治療用抗体でタグを付与された癌細胞などの抗体でタグを付与された癌細胞の関与によって抗体依存性細胞毒性活性を増強する。そのうえ、ＮＫ細胞による抗体認識は、腫瘍細胞との接触安定性を増強し、ＮＫＧ２Ｄなどの他の活性化受容体を通してＮＫ細胞活性を強める。
【００３８】
用語「及び／又は」は、列挙した要素のうちの１若しくはすべて、又は列挙した要素のうちの任意の２以上の組み合わせを意味し；用語「含む」とその変化形には、これらの用語が明細書及び請求項に現れた場合に、限定的な意味合いはなく；別段の定めがない限り、「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」、及び「少なくとも１つ」は互換的に使用され、１若しくは複数を意味し；そして、終点による数値範囲の詳述は、その範囲内に包括されたすべての数値を含む（例えば１〜５は、１、１．５、２、２．７５、３、３．８０、４、５などを含む）。
【００３９】
先の説明において、特定の実施形態は明確さのために単独で記載され得る。特定の実施形態の特徴が別の実施形態の特徴と両立しないことについて別段の明白な定めがない限り、特定の実施形態は１若しくは複数の実施形態に関して本明細書中に記載した両立し得る特徴の組み合わせを含む。
別個のステップを含んでいる本明細書中に開示されたいずれの方法でも、該ステップは任意の実現可能な順序で実施されてもよい。そして、適宜、２以上のステップの任意の組み合わせが同時に実施されてもよい。
本発明は以下の実施例によって例示される。特定の例、材料、量、及び手順は本明細書中に記載した本発明の範囲及び要旨に従って広く解釈されるべきであることは、理解されるべきである。
【実施例１】
【００４０】
実施例１
質量分析法
プロトコール番号９７０８Ｍ００１３４によりミネソタ大学施設内倫理委員会によって承認されたプロトコールに従って、健常人からの末梢血採血を実施した。ヒト好中球及びＮＫ細胞単離を以前に記載されているように実施した（Wang et al, 2013, Biochim Biophys Acta. 1833:680-685; Long et al, 2010, J Leukoc Biol. 87: 1097-1101; Long et al, 2012, J Leukoc Biol. 92:667-672）。濃縮した好中球又はＮＫ細胞（ＰＢＳ中に１×１０7／ｍｌ；Mediatech, Inc. Manassas, VA）をＰＭＡ（それぞれ１５ｎｇ／ｍｌ又は５０ｎｇ／ｍｌ；Sigma-Aldrich, St. Louis, MO）を用いて３７℃にて３０分間活性化した。細胞上清を濾過し（０．４５μｍの細孔径）、そしてＣＤ１６を、製造業者の取扱説明書に従ってｍＡｂ ３Ｇ８（BioLegend, Inc., San Diego, CA）及びＰｉｅｒｃｅダイレクト免疫沈降反応キット（Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL）を使用して免疫沈降させた。精製したＣＤ１６を、製造業者の取扱説明書に従ってキチン質結合ドメインにタグを付与したRemove-iT PNGase F（New England BioLabs, Inc., Ipswich, MA）によって脱グリコシル化した。簡単に言えば、１０〜２０μｇの精製ＣＤ１６を４０ｍＭのＤＴＴの存在下、５５℃にて１０分間変性させ、次に、３μｌのREMOVE-IT PNGase F（New England BioLabs, Inc., Ipswich, MA）と一緒に３７℃にて１時間インキュベートした。次に、反応物からキチン磁性ビーズを使用してREMOVE-IT PNGase Fを取り除いた。
【００４１】
ＣＤ１６をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、可溶性ＣＤ１６に相当するゲルバンドを、クリプトン蛍光性タンパク染料（Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL）によって検出し、同じゲルの隣接したレーンのＣＤ１６イムノブロット分析によって確認し、次に、それを切り出し、トリプシンを用いた標準的なゲル内消化にかけた。ゲルから抽出した消化ペプチドをドライダウンし、液体クロマトグラフィー質量分析のために水：アセトニトリル：ギ酸、９８：２：０．０１中で再構成し、＜１μｇのアリコートを、以前に記載されているように、データ依存性走査モードで質量分析（VELOS ORBITRAP、Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL）によって分析した（Lin-Moshier et al, 2013, J Biol Chem. 288:355-367）。データベース検索をProtein Pilot4.5（AB Sciex, Framingham, MA）を用いて実施し、それは、混入物データベース（ｔｈｅｇｐｍ．ｏｒｇ／ｃＲＡＰ／指数、１０９のタンパク質）を備えたＮＣＢＩ参照配列ホモサピエンスタンパク質ＦＡＳＴＡデータベースに対してParagonスコアリングアルゴリズム（Shilov et al, 2007, Mol Cell Proteomics 6: 1638-1655）を使用する。検索パラメーターは：システインヨードアセトアミド；トリプシン；装置Orbi MS（１〜３ｐｐｍ）Orbi MS/MS；生物学的改変ＩＤフォーカス（アスパラギン脱アミド化を含む）；検索成果全体；及び（逆進データベースを用いた）偽発見率分析である。
【００４２】
ｃＤＮＡ発現構築物の作製
ＣＤ１６ｂは、その細胞外領域のＮ末端部分の４つのアミノ酸が異なるＮＡ１及びＮＡ２と呼ばれる２つの対立遺伝子変異体を生じる。ＣＤ１６ｂの両方の対立遺伝子変異体が、同様の効率でＡＤＡＭ１７によって切断される。この試験について、我々はＮＡ１変異体だけを調べた。１７６位にバリン又はフェニルアラニン残基のいずれかを有するＣＤ１６ａの２つの対立遺伝子変異体も存在する。ＣＤ１６ａのこれらの２つの対立遺伝子変異体は同様の効率でＡＤＡＭ１７によって切断された。この試験について、我々はバリン対立遺伝子変異体ＣＤ１６ａだけを調べた。
【００４３】
ＣＤ１６ａ及びＣＤ１６ｂをヒト白血球ｃＤＮＡから増幅し、別々に以前に記載されているように（Wang et al, 2013, Biochim Biophys Acta. 1833:680-685; Dong et al, 2014, Arthritis Rheumatol. 66: 1291-1299）、ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩ制限酵素部位においてｐｃＤＮＡ３．１プラスミド（Invitrogen, Carlsbad, CA）内にクローニングした。次に、構築物を、製造業者の取扱説明書に従ってQuik- Change Site-directed Mutagenesis（Agilent Technologies, Santa Clara, CA）にかけて、ＣＤ１６ａ及びＣＤ１６ｂの１９７位のセリンをプロリンに変換した。すべての構築物を配列決定して、計画的な突然変異の存在及びいずれかの自然突然変異の不存在を確認した。
【００４４】
続いて、ＣＤ１６ａ ｃＤＮＡをＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩ制限酵素部位において、Dr. G. Nolan（Stanford University, Stanford, CA）によって提供された２シストロン性レトロウイルス発現ベクターｐＢＭＮ−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ内にクローニングした。ＣＤ１６ａ構築物はまた、以前に記載されているように（Wilber et al, 2007, Stem Cells 25:2919-2927; Tian et al, 2009, Stem Cells 27:2675-2685）、２シストロン性Sleeping Beautyトランスポゾンプラスミド（ｐＫＴ２−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ：ｚｅｏ）内にもクローニングした。
【００４５】
簡単に言えば、野生型ＣＤ１６ａ及びＣＤ１６ａ／Ｓ１９７Ｐを、プライマー：５’−CCG GAA TTC CAG TGT GGC ATC ATG TGG CAG CTG CTC−３’（センス、配列番号ＸＸ）及び５’−CCG GAA TTC TCA TTT GTC TTG AGG GTC CTT TCT−３’（アンチセンス、配列番号ＹＹ）を使用してＰＣＲ増幅した。ＥｃｏＲＩ部位に下線を引く。ＥｃｏＲＩ消化ＣＤ１６ａ及びＣＤ１６ａ／Ｓ１９７Ｐ ＰＣＲ断片を、別々にｐＫＴ２−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ：ｚｅｏ内にクローニングした。正しいＣＤ１６ａ方向及び配列をＰＣＲ及び配列決定分析によって確認した。我々は、完全長ヒトＬ−セレクチン（ＣＤ６２Ｌ）ｃＤＮＡを以前クローニングし（Feehan et al, 1996, J Biol Chem. 271 :7019-7024; Matala et al, 2001, J Immunol. 167: 1617-1623）、そしてそれを、制限酵素部位Ｘｂａ１においてｐｃＤＮＡ３．１ベクター内に移した）。完全長ヒトＦｃＲγ ｃＤＮＡを、ｐｃＤＮＡ３．１ベクターを使用した修飾を伴って、以前に記載されているようにクローニングした（Dong et al. , 2014, Arthritis Rheumatol. 66: 1291-1299）。
【００４６】
遺伝子組み換えＬ−セレクチン、ＣＤ１６ａ、及びＣＤ１６ｂを発現する細胞株の作出
ＨＥＫ２９３細胞（ヒト胎児腎臓細胞株）及びＮＫ９２細胞（ヒトＮＫ細胞株）（ATCC, Manassas, VA）を受託所の取扱説明書に従って培養した。ＨＥＫ２９３細胞を、製造業者の取扱説明書に従ってLipofectamine2000（Invitrogen, Carlsbad, CA）を使用して、ＣＤ１６ｂ、ＣＤ１６ｂ／Ｓ１９７Ｐ、及び／又はＬ−セレクチンを含む又は含まないｐｃＤＮＡ３．１を用いて一過性に形質移入した。ヒトＦｃＲγを安定して発現するＨＥＫ２９３細胞を、同じアプローチによってＣＤ１６ａ又はＣＤ１６ａ／Ｓ１９７Ｐを含む又は含まないｐｃＤＮＡ３．１を用いて一過性に形質移入した。ＮＫ９２細胞を、以前に記載されているレトロウイルス作出及び感染手順（Matala et al, 2001, J Immunol. 167: 1617-1623; Walcheck et al, 2003, JLeukoc Biol. 74:389-394; Wang et al, 2009, J Immunol. 182:2449-2457）によってＣＤ１６ａ又はＣＤ１６ａ／Ｓ１９７Ｐを含む又は含まないｐＢＭＮ−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰを用いて安定的に形質導入した。構築物の発現を、ＥＧＦＰ蛍光によって、及びフローサイトメトリーによって測定する場合には、ＣＤ１６染色によって評価した。ヒトｉＰＳＣｓ（ＵＣＢｉＰＳ７、臍帯血ＣＤ３４細胞由来）をマウス胎児線維芽細胞（Knorr et al., 2013, Stem Cells Trans I Med. 2:274-283; Ni et al, 2014, Stem Cells 32: 1021-1031）上で維持した。ＣＤ１６ａ又はＣＤ１６ａ／Ｓ１９７Ｐの安定発現を、以前に記載されているようにSleeping Beautyトランスポゾンシステム（Wilber et al, 2007, Stem Cells 25:2919-2927; Tian et al, 2009, Stem Cells 27:2675-2685）を使用して実現した。簡単に言えば、ｉＰＳＣｓを、プログラム設定Ｂ１６を使用してヌクレオフェクター溶液Ｖ（Lonza Inc., Gaithersburg, MD）中でトランスポザーゼＤＮＡと組み合わせたｐＫＴ２−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ：ｚｅｏを用いてヌクレオフェクトした。ヌクレオフェクト細胞をすぐにゼオシン（５０μｇ／ｍｌ）を含んでいるｉＰＳＣ成長培地中に懸濁し、そしてマウス胎児線維芽細胞上に播種した。
【００４７】
ＣＤ１６ａ−ｈＥＳＣ及びＣＤ１６ａ−ｉＰＳＣ細胞からのＮＫ細胞の誘導
ｈＥＳＣｓ及びｉＰＳＣｓの造血細胞分化を以前に記載されているように実施した（Ng et al, 2005, Blood 106: 1601-1603; Ng et al, 2008, Nat Protoc 3:768-776; Le Garff-Tavernier et al, 2010, Aging Cell 9: 527-535）。簡単に言えば、９６ウェル丸底プレートの１ウェル当たり３０００個の単独細胞を、幹細胞因子（ＳＣＦ、４０ｎｇ／ｍｌ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ、２０ｎｇ／ｍｌ）、及び骨形態形成タンパク質４（ＢＭＰ４、２０ｎｇ／ｍｌ）を含んだＢＰＥＬ培地中に播種した。ＢＰＥＬ培地は、Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium（ＩＭＤＭ、８６ｍｌ、Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham. MA）、Glutmax Iを含んだF12 Nutrient Mixture（８６ｍＬ、Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham. MA）、１０％の脱イオンBovine Serum Albumin（ＢＳＡ、５ｍｌ、Sigma-Aldrich, St. Louis, MO）、５％のポリビニルアルコール（１０ｍｌ、Sigma-Aldrich, St. Louis, MO）、リノレン酸（２０μｌの１グラム／ｍｌ溶液、Sigma-Aldrich, St. Louis, MO）、リノール酸（２０μｌの１グラム／ｍｌ溶液、Sigma）、SYNTHECOL ５００×溶液（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO）、ａ−モノチオグリセロール（３．９μｌ／１００ｍｌ、Sigma-Aldrich, St. Louis, MO）、タンパク質不含ハイブリドーマミックスＩＩ（Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham. MA）、アスコルビン酸（５ｍｇ／ｍｌ、Sigma）、GLUTAMAX I（Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham. MA）、インスリン−トランスフェリン−セレニウム１００×溶液（Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham. MA）、ペニシリン／ストレプトマイシン（Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham. MA）を含んでいた。
【００４８】
造血細胞分化の１１日目に、サイトカインを供給したＮＫ培地中でＥＬ０８−１Ｄ２ストロマ細胞と共に又はそれなしに、スピン胚様体を２４ウェルプレートにそのまま移した（Le Garff-Tavernier et al, 2010, Aging Cell 9:527-535）。４〜５週間の培養後に、単独細胞懸濁液を、ＡＰＣ−、ＰＥ−、ＦＩＴＣ−及びＰｅｒＣＰ−ｃｙ５．５結合ＩｇＧ又はヒト血表面抗原に対する特異的抗体：ＣＤ４５−ＰＥ、ＣＤ５６−ＡＰＣ、ＣＤ５６−ＰＥ、ＣＤ１６−ＰｅｒＣＰ−ｃｙ５．５、ＮＫＧ２Ｄ−ＰＥ、ＮＫｐ４４−ＰＥ、ＮＫｐ４６−ＰＥ、ＣＤ１５８ｂ−ＦＩＴＣ、ＣＤ１５８ｅ１／２−ＦＩＴＣ（BD Pharmingen, San Jose, CA）、ＣＤ１５８ａ／ｈ−ＰＥ、及びＣＤ１５８ｉ−ＰＥ（Beckman Coulter, Inc., Pasadena, CA）で染色した。抗体染色をフローサイトメトリーによって評価した。
【００４９】
細胞刺激
ＲＰＭＩ１６４０培地（Mediatech, Inc., Manassas, VA）中のＨＥＫ２９３及びＮＫ９２細胞を、それぞれ１５ｎｇ／ｍｌ及び１００ｎｇ／ｍｌのＰＭＡを用いて３７℃にて３０分間活性化した。ＮＫ９２細胞を、それぞれ１００ｎｇ／ｍｌ及び４００ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１２（PeproTech Inc, Rocky Hill, NJ）及びＩＬ−１８（R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN）を用いて示した時点まで活性化した。ＣＤ１６ａを通じたＮＫ９２細胞活性化は、以前に記載されているように（Romee et al, 2013, Blood 121 :3599-3608）、抗ＣＤ２０ ｍＡｂリツキシマブ（１μｇ／ｍｌ）（Genentech, Inc., South San Francisco, CA）で処理したＣＤ２０陽性バーキットリンパ腫細胞株Ｒａｊｉ（ＡＴＣＣ、受託所の取扱説明書に従って培養）（１：１の比）を伴ったそれらのインキュベーションによって媒介した。余分なリツキシマブを、Ｒａｊｉ細胞を洗浄することによって取り除いた。いくつかの実験では、ＮＫ９２細胞を、選択的ＡＤＡＭ１７阻害剤であるＢＭＳ５６６３９４（５μΜ）（Bristol- Myers Squibb Company, Princeton, NJ）と共に３０分間プレインキュベートした。ｉＰＳＣｓ由来のＮＫ細胞を、以前に記載されているように（Romee et al, 2013, Blood 121 :3599-3608）、ヒト赤白血病細胞株Ｋ５６２（受託所の取扱説明書に従って育てられたＡＴＣＣ）を用いて刺激した。簡単に言えば、ｉＰＳＣ誘導ＮＫ細胞を、Ｋ５６２標的細胞（２：１の比）と共に３７℃にて４時間インキュベートした。
【００５０】
抗体結合アッセイ
単量体ヒトＩｇＧ及びＩｇＡ（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO）に結合する細胞を、いくつかの修飾を用いて以前に記載されているように実現した（Dong et al, 2014, Arthritis Rheumatol. 66: 1291-1299）。ＰＢＳ中、５×１０6／ｍｌにてＣＤ１６ａ又はＣＤ１６ａ／Ｓ１９７Ｐを発現するＮＫ９２親細胞又は形質導入細胞を、三連で指示した濃度のＩｇＧ又はＩｇＡと共に４℃にて１時間インキュベートした。細胞をしっかり洗浄し、製造業者の取扱説明書に従ってＡＰＣ抱合型ロバ抗ヒトＦｃ（重鎖及び軽鎖）抗体（Jackson Immunoresearch, West Grove, PA）と共にインキュベートした。細胞を洗浄し、その後すぐに、フローサイトメトリーによって分析した。
【００５１】
フローサイトメトリー及びＥＬＩＳＡ
細胞染色のために、以前に記載されているように（Wang et al, 2013, Biochim Biophys Acta. 1833:680-685; Romee et al, 2013, Blood 121 :3599-3608）、非特異的抗体結合部位をブロックし、細胞を指示した抗体で染色し、そしてフローサイトメトリーによって調べた。フローサイトメトリー分析をFACSCanto及びLS RII装置（BD Biosciences, San Jose, CA）により実施した。ヒトＣＤ１６をｍＡｂｓ ３Ｇ８（BioLegend, Inc., San Diego, CA）及びＤＪ１３０ｃ（Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, CA）によって検出した。ＣＤ１０７ａをｍＡｂ Ｈ４Ａ３（Biolegend, Inc., San Diego, CA）によって検出した。ＡＤＡＭ１７をｍＡｂｓ Ｍ２２０（Doedens et al, 2000, J Biol Chem. 275:14598-14607）、１１１６３３、及び１１１６２３（R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN）によって検出した。ヒトＬ−セレクチンをｍＡｂ ＬＡＭｌ−１１６（Ancell Corp., Stillwater, MN）によって検出した。アイソタイプ対応陰性対照ｍＡｂｓを、非特異的染色のレベルを評価するために使用した。ＣＤ１６のＥＬＩＳＡを、以前に記載されているように（Wang et al, 2013, Biochim Biophys Acta. 1833:680-685）カスタムサイトメトリービーズアッセイによって実施した。
【００５２】
統計解析
統計解析を必要に応じて、ＡＮＯＶＡ及びスチューデントｔ検定を使用したＰｒｉｓｍソフトウェア（GraphPad, San Diego, CA）を使用して実施した。＜０．０５のｐ値を有意とみなした。
【００５３】
実施例２
同等なレベルのＷＴ ＣＤ１６ａとＣＤ１６ａ197P（ＣＤ１６ａ／Ｓ１９７Ｐ）を発現するＮＫ細胞の比較
【００５４】
ＣＤ１６構築物の発現レベルを、ＣＤ１６構築物と比例した様式で生じるＧＦＰ発現（先に記載のＮＫ９２細胞についておこなったように、図２）に基づくＦＡＣＳソーティングによって対等にした。対等にしたＣＤ１６ａレベルを、すべてのアッセイについてＦＡＣＳによって確認する。対照として、空のSleeping Beautyトランスポゾンベクター（ＧＦＰだけを発現する）で改変したｉＰＳＣ誘導ＮＫ細胞を評価する。ｉＰＳＣ誘導ＮＫ細胞は、低レベルの内因性ＣＤ１６ａを発現する（データ未掲載）。ＨＥＲ２発現卵巣癌細胞に対するＮＫ細胞毒性を、トラスツズマブの存在又は不存在下、標準的なクロム遊離試験によって評価する。非クロム標識卵巣癌細胞を用いた抗体依存性細胞毒性もまた実施する。ＮＫ細胞のサイトカイン産生（例えばＩＦＮγ、ＴＮＦα）及びＣＤ１６ａの可溶性レベルをＥＬＩＳＡによって評価する。ＣＤ１６ａ及び他の活性化マーカー（例えばＣＤ１０７ａ、ＣＤ６２Ｌ）の細胞表面レベルをＦＡＣＳによって評価する。
【００５５】
実施例３
ＣＤ１６ａ197P（ＣＤ１６ａ／Ｓ１９７Ｐ）を発現するｉＰＳＣ誘導ＮＫ細胞が、トラスツズマブの存在下、インビボにおいて増強された抗卵巣癌活性を有するか試験するためのヒト腫瘍異種移植モデル。
【００５６】
生物発光造影（Geller et al., 2013, Cytotherapy 15: 1297-1306）のためにホタルルシフェラーゼを安定的に発現するように設計されたＮＯＤ／ＳＣＩＤ／γｃ-/-（ＮＳＧ）マウス及びヒト卵巣癌細胞株を使用した異種移植モデルを、卵巣癌細胞に対するＮＫ細胞活性の腹腔内（ｉｐ）送達を試験するのに使用する。ＨＥＲ２を過剰発現するＯＶＣＡＲ３卵巣癌細胞株を、インビボ標的として使用する（Hellstrom et al, 2001, Cancer Res 61: 2420-2423）。亜致死的照射（２２５ｃＧＹ）を受けたＮＳＧ雌マウスに、腫瘍の増殖又は退縮を定量化するための生物発光造影用にルシフェラーゼを発現するように作出したＯＶＣＡＲ３（２×１０5細胞）を腹腔内に注射する（Geller et al, 2013, Cytotherapy 15: 1297-1306）。腫瘍を７日間増殖させ、その後、マウスに２０×１０6のＮＫ細胞を単回腹腔内注射する。次に、以前に記載されているように（Woll et al, 2009, Blood 113: 6094-6101）マウスに所定のＩＬ−２（５μｇ／マウス）を一日おきに４週間与え、ＮＫ細胞のインビボにおける生存を促す。トラスツズマブを、このモデルで以前に使用されていた用量である、５０μｇの用量にて毎週、４週間にわたり腹腔内投与する（Warburton et al, 2004, Clinical cancer research 10:2512-2524）。同等なレベルのＷＴ ＣＤ１６又はＣＤ１６ａ197P（ＣＤａ６ａ／Ｓ１９７Ｐ）を発現するｉＰＳＣ誘導ＮＫ細胞のインビボにおける効力を比較する。対照には、ＧＦＰのみを発現するｉＰＳＣ誘導ＮＫ細胞（ベクターのみ）、及び卵巣癌細胞のみを与えられたマウスのコホートが含まれる。すべてのマウスに同じＩＬ−２処置を与える。
【００５７】
腫瘍の増殖／退縮を、以前に記載されているように（Woll et al, 2009, Blood 113: 6094-6101）生物発光造影及びマウスの計量によって毎週観察する。マウスはまた、ヒトＮＫ細胞生存率を定量化するために毎週採血される。様々なエフェクター機能マーカー（例えばＩＦＮγ、ＣＤ１６ａ）の発現／細胞表面レベルをＦＡＣＳによって評価する。マウスを〜６０日間追跡検査する。屠殺時点で、内臓（脾臓、肝臓、肺、腎臓、及び卵巣）を、以前に記載されているように（Ｂｌｏｏｄ１１３：  Ｗｏｌｌら、２００９、６０９４−６１０１）生物発光によって転移癌の徴候がないか調査する。
【００５８】
代表的な実施形態
実施形態１．膜近位領域及び該膜近位領域内のアミノ酸修飾を含んでいるＣＤ１６ポリペプチドを発現するように遺伝子組み換えされた細胞。
実施形態２．膜近位領域及び該膜近位領域内のアミノ酸修飾を含んでいるＣＤ１６ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む細胞。
実施形態３．アミノ酸薬療法が、ＣＤ１６膜近位領域の野生型アミノ酸配列と比較した１若しくは複数のアミノ酸の付加、１若しくは複数のアミノ酸の欠失、又は１若しくは複数のアミノ酸の置換を反映する、実施形態１又は実施形態２に記載の細胞。
【００５９】
実施形態４．前記１若しくは複数のアミノ酸の置換が配列番号１の１９７位におけるセリン残基の置換を含む、実施形態３に記載の細胞。
実施形態５．前記細胞がナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である、実施形態１〜４のいずれか１項に記載の細胞。
実施形態６．前記細胞が好中球である、実施形態１〜５のいずれか１項に記載の細胞。
実施形態７．前記細胞が単球である、実施形態１〜６のいずれか１項に記載の細胞。
実施形態８．前記改変ＣＤ１６ポリペプチドが、野生型ＣＤ１６ポリペプチドと比較して、ＡＤＡＭ１７媒介型シェディングに対して低い感受性を示す、実施形態１〜７のいずれか１項に記載の細胞。
【００６０】
実施形態９．前記改変ＣＤ１６ポリペプチドが、野生型ＣＤ１６ポリペプチドと比較して、ＮＫ細胞刺激時の切断に対して低い感受性を示す、実施形態１〜８のいずれか１項に記載の細胞。
実施形態１０．斯かる処理を必要としている患者に対して、以下の：
治療用ＮＫエフェクターを該患者に投与し；及び
請求項１〜９のいずれか１項に記載の細胞を該患者に投与すること、
を含む治療法を施すことを含む方法。
【００６１】
実施形態１１．前記治療用ＮＫエフェクターが治療薬を含む、実施形態１０に記載の方法。
実施形態１２．前記治療薬が特異的に腫瘍抗原を認識する、実施形態１１に記載の方法。
実施形態１３．前記治療薬が、腫瘍抗原を特異的に認識する抗体又は抗体フラグメントを含む、実施形態１２に記載の方法。
実施形態１４．前記腫瘍抗原がＨＥＲ２を含む、実施形態１３に記載の方法。
実施形態１５．前記抗体がトラスツズマブ又はリツキシマブを含む、実施形態１３又は実施形態１４に記載の方法。
【００６２】
実施形態１６．前記治療用ＮＫエフェクターが、二重特異性キラーエンゲージャー（ＢｉＫＥ）を含む、実施形態１０に記載の方法。
実施形態１７．前記ＢｉＫＥが、ＣＤ１６×ＣＤ３３ ＢｉＫＥ、ＣＤ１６×ＣＤ１９ ＢｉＫＥ、又はＣＤ１６×ＥＰ−ＣＡＭ ＢｉＫＥを含む、実施形態１６に記載の方法。
実施形態１８．前記治療用ＮＫエフェクターが三重特異性キラー細胞エンゲージャー（ＴｒｉＫＥ）を含む、実施形態１０に記載の方法。
【００６３】
実施形態１９．前記治療薬がウイルス標的を特異的に認識する、実施形態１１又は１６〜１８のいずれか１項に記載の方法。
実施形態２０．治療用ＮＫエフェクターを患者に投与することを伴う患者に対する治療法を改善する方法であって、以下の：
請求項１〜９のいずれか１項に記載の細胞を該患者に投与すること、
を含む方法。
【００６４】
明細書中に記載される全特許、特許出願、及び公報、並びに電子的に利用可能な資料（例えば, ヌクレオチド配列寄託、例えば、GenBank及びRefSeq、並びにアミノ酸配列寄託、例えば、SwissProt、PIR、PRF、PDB、並びに、GenBank及びRefSeqの注釈付翻訳領域からの翻訳など）の全ての開示内容は、参照によりそれら全体が援用される。本出願の開示内容と参照により明細書中に援用された任意の文献の開示内容との間に何らかの矛盾が存在する場合、本出願の開示が優先されるべきである。上述の詳細な説明及び実施例は、単に理解の明確化のために供したものであり、これらから不必要に限定解釈してはならない。本発明は、示され且つ記載される正確且つ詳細な説明に限定されず、特許請求の範囲で特許請求する本発明には当業者にとって明らかである変形が含まれる。
【００６５】
特に記載しない限り、明細書及び特許請求の範囲の中で使用される成分、分子量、及びその他の量を表わす数値はいずれも、用語「約」により、全ての場合において修飾されるものと解すべきである。従って、これとは反対の記載が別途ない限り、明細書及び特許請求の範囲中で説明される数値パラメーターは概算値であり、本発明によって得ようとする目的の特性に応じて変化し得る。特許請求の範囲に関する均等論を制限するものではないが、最低限でも、各数値パラメーターを解釈する際には、少なくとも報告値の有効桁数を考慮し、従来の端数処理の手法（rounding techniques）を用いるべきである。
【００６６】
発明の広い範囲を規定する数値範囲及びパラメーターは概算値であるが、個々の実施例に記載した数値は、可能な限り正確に報告した。しかしながら、何れの数値も、対応する試験の測定値に見られる標準偏差に応じて、必然的にある範囲を内在することになる。
【００６７】
見出しは何れも読者の便宜のためのものであり、特に明示した場合を除いて、その見出しに続く本文の意味を限定するために用いるべきではない。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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