(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の工程を含み、任意選択的にはこれらの工程を文字順で含む、殺虫性の形態１のペプチドを配列番号１１９または配列番号３７のアミノ酸の配列を含む殺虫性の形態２のペプチドへ変換する方法であって、前記形態２のペプチドの殺虫活性は前記形態１のペプチドの殺虫活性よりも高い、方法；
ａ）水と前記形態１のペプチドを混合して、液体の形態中にある前記ペプチドまたは半液体の形態中にある前記ペプチドの、水溶液または水性エマルションを形成する工程であって、前記水溶液または水性エマルションが少なくとも１０％の水を含む工程；
ｂ）前記水溶液または水性エマルションのｐＨを測定する工程；
ｃ）前記水溶液または水性エマルションのｐＨをｐＨ２〜６に調整する工程；
ｄ）前記水溶液または水性エマルションの温度を少なくとも約４０℃まで上げる工程であって、
ここで、共有結合している２Ｈ＋Ｏ原子の除去により、前記形態１のペプチドを前記形態２のペプチドに変換し、前記形態２のペプチドは、前記形態１のペプチドから、共有結合している２Ｈ＋Ｏ原子が除去されて得られる、工程。
【請求項２】
前記水溶液または水性エマルションが、約３．０〜約４．０のｐＨに調整される、または約３．２、３．４、３．５、３．６、もしくは３．８のｐＨに調整される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記水溶液または水性エマルションが、約３．０〜約４．０のｐＨに調整され、約１０〜５００℃の温度に加熱される、または、約３．２、３．４、３．５、３．６、もしくは３．８のｐＨに調整され、約１０〜５００℃の温度に加熱される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ｐＨの調整が強酸または弱酸を使用して行われ；前記強酸が使用される場合には、前記強酸が、塩素酸（ＨＣｌＯ３）、塩酸（ＨＣｌ）、臭化水素酸、（ＨＢｒ）、ヨウ化水素酸（ＨＩ）、リン酸（Ｈ３ＰＯ４）、硫酸（Ｈ２ＳＯ４）、過塩素酸（ＨＣｌＯ４）、及び硝酸（ＨＮＯ３）のいずれか、またはこれらの酸の組み合わせから選択され、前記弱酸が使用される場合には、前記弱酸が、酢酸及びシュウ酸のいずれか、またはこれらの組み合わせから選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記ｐＨの調整の間、前記水溶液または水性エマルションは、蒸気もしくは圧力なしに加熱される、または、圧力及び／もしくは蒸気で加熱される、または、それらの組み合わせで加熱される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記水溶液または水性エマルションは、前記水溶液または水性エマルションのｐＨが調整された後、乾燥粉末または顆粒の形態まで乾燥される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記水溶液または水性エマルションは、前記水溶液または水性エマルションのｐＨが調整された後、噴霧乾燥される、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
殺虫性の形態１のペプチドを殺虫性の形態２のペプチドへ変換する方法であって、前記形態２のペプチドの殺虫活性は前記形態１のペプチドの殺虫活性よりも高く、
ａ）配列番号１１９または配列番号３７のアミノ酸の配列を含むペプチドを、乾燥の形態で、または、水溶液もしくは水性エマルション中に前記ペプチドを含み、約１０％未満の水を含む組成物で、圧力ありまたは圧力なしで、蒸気ありまたは蒸気なしで、１０〜４００℃の範囲の望ましい温度まで加熱する工程；
ｂ）形態１のペプチドの望ましい量が、形態２のペプチドに変換されるまで、前記加熱したペプチドを、前記望ましい温度に保持する工程であって、ここで、前記形態２のペプチドは、前記形態１のペプチドから、共有結合している２Ｈ＋Ｏ原子が除去されて得られる、工程；
を含む、方法。
【請求項９】
前記形態１のペプチドが、
ａ）加熱されて約４０℃より高い温度で少なくとも約１時間保持される；
ｂ）加熱されて約８０℃〜約１２０℃の温度で少なくとも約２時間保持される；
ｃ）加熱されて約５０℃〜約８０℃の温度で少なくとも約３時間保持される；
ｄ）加熱されて約１８０℃より高い温度及び少なくとも約５ｐｓｉの圧力で少なくとも約５分間保持される；
ｅ）加熱されて約１００℃より高い温度及び少なくとも約１０ｐｓｉの圧力で少なくとも約１０分間保持される；
ｆ）加熱されて約８０℃〜約１２０℃の温度及び少なくとも約１０ｐｓｉの圧力で少なくとも約３０分間保持される；もしくは
ｇ）加熱されて約５０℃〜約８０℃の温度で少なくとも１時間保持される；
ｈ）加熱されて約２００℃〜約３００℃の温度及び約５〜約１０ｐｓｉの圧力で約５〜約１０分間保持される；
ｉ）加熱されて約１５０℃〜約２００℃の温度及び約１０〜約３０ｐｓｉの圧力で約５〜約３０分間保持される；
ｊ）加熱されて約８０℃〜約１５０℃の温度及び約１０〜約２０ｐｓｉの圧力で約２０〜約６０分間保持される；もしくは
ｋ）加熱されて約５０℃〜約８０℃の温度及び約１０〜約４０ｐｓｉの圧力で約３０〜約６０分間保持される；
または前記ペプチドが、
ｌ）加熱されて約１１０℃〜約１３０℃の温度及び約１０〜約２０ｐｓｉの圧力で約１０〜約２０分間保持される；もしくは
ｍ）加熱されて約１２１℃の温度及び約２１ｐｓｉの圧力で約２０分間保持される、
ことを含む多段階手順のいずれか１つ以上に従って処理される、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記形態１のペプチドは、噴霧乾燥プロセスまたはオートクレーブプロセスを用いて、形態２のペプチドに変換される、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
配列番号１１９または配列番号３７のアミノ酸の配列を含む、形態２のペプチドであって、前記ペプチドは、共有結合している２Ｈ＋Ｏ原子が除去されたものである、形態２のペプチド。
【請求項１２】
配列番号１１９または配列番号３７のアミノ酸の配列を含むペプチドを含む殺虫性の組成物であって、前記ペプチドは、共有結合している２Ｈ＋Ｏ原子が除去されたものであり、前記組成物の製剤は、前記ペプチドで処理されるべき昆虫の生息場所への適用に適したものである、殺虫性組成物。
【請求項１３】
配列番号１１９または配列番号３７のアミノ酸の配列を含む形態１のペプチドから得られる形態２のペプチドであって、前記形態２のペプチドは、共有結合している２Ｈ＋Ｏ原子が除去され、前記形態２のペプチドの１つのアミノ酸はヒドロキシ基を共有結合的に失ったものである、形態２のペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は２０１４年４月４日に出願された米国特許出願Ｎｏ．６１／９７５，１４７の優先権を主張するものであり、その内容全体は参照により本明細書に援用される。
【０００２】
本出願は、毒グモ、巻貝、軟体動物、及び他の動物中で見出される毒に関連する、またはそれらの毒を起源とするペプチド毒などの、天然型及びハイブリッド型の生理学的に活性なペプチドの活性を増加させるための化学的方法及び機械的方法に関する。
【０００３】
（配列表）
本出願は、２０１５年４月３日に作成され、本明細書と共に電子的に提出されている「ＦＡＭ＿Ｎ＿ＰＲＶ＿ＳＥＱ＿ＬＩＳＴＩＮＧ＿２０１５＿０４＿０３＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」（１０６，０１４バイト）というタイトルの配列表全体を包含する。
【背景技術】
【０００４】
オートクレーブによって作り出されて殺菌のために使用される条件のような高熱高圧は、典型的には、真菌、細菌、及びウイルスのような生物学的試料を中性化及び不活性化するために使用される。多くの場合、タンパク質はそのような方法によって変性され、更には破壊される。生物が高温高圧に曝されると、通常、それらのタンパク質が変性し、その結果生物は不活性になり死ぬことから、それらは成長できず、あるいは生き残ることさえできない。その後に続く生物学的プロセスは腐敗のみである。酸性条件単独でも同様な結果を生じさせる場合がある。毒性タンパク質のような非常に活性なペプチドを低ｐＨ条件すなわち酸性条件に曝すと、ペプチドが変性し、もはやネイティブなペプチドまたはタンパク質のようには機能しない。オートクレーブは、機器や装置を再利用のために安全にする目的及び滅菌する目的でこれらを処理するために、医療機関で多くの場合使用されており、また、これらは、生物的に汚染された廃棄物を処理することで廃棄しても安全で中性の無害な廃棄物に変換するためにも益々使用されてきている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本明細書においては、我々は、それら自体が有用であり、また新規な化合物として及び他の重要な化合物を製造するのに有用な新規な安定中間体としても有用である、それらのペプチドの異なる形態及び元のペプチドの新規かつ有用な誘導体の両方を形成するための、特定の毒性ペプチドの人工的に誘起した変換を報告する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は２つのパートを有している。パート１では、我々は、毒性ペプチドを含むペプチドの活性及び毒性を増加させるための、人工的に誘起した化学的及び機械的方法の使用方法であって、ａ）前記ペプチドを水と混合して、液体中にある前記ペプチドまたは半液体中にある前記ペプチドの形態の、水溶液または水性エマルションを形成する工程であって、水溶液または水性エマルションが少なくとも１０％の水からなる工程；ｂ）前記ペプチドの前記水溶液または水性エマルションのｐＨを測定する工程；ｃ）前記溶液またはエマルションのｐＨをｐＨ７．０未満に調整する工程；を含み、任意選択的にはこれらの工程を文字順で含む、方法について述べる。ｐＨは、約１．０〜約６．５、約２．０〜約６．０、約２．５〜約５．５、約３．０〜約５．０、約３．０〜約４．０、約３．２、３．４、３．５、３．６、または３．８であってもよい。
【０００７】
前記ｐＨ調整後、前記ペプチドが乾燥粉末または顆粒の形態へと乾燥される方法。ｐＨ調整は強酸または弱酸を使用して行うことができる。強酸の例は、塩素酸（ＨＣｌＯ３）、塩酸（ＨＣｌ）、臭化水素酸、（ＨＢｒ）、ヨウ化水素酸（ＨＩ）、リン酸（Ｈ３ＰＯ４）、硫酸（Ｈ２ＳＯ４）、過塩素酸（ＨＣｌＯ４）、及び硝酸（ＨＮＯ３）のうちのいずれかである。弱酸の例は酢酸及び／またはシュウ酸である。ｐＨ調整時、水溶液または水性エマルションは乾いた熱、すなわち、蒸気もしくは圧力なしの温度上昇、または熱、圧力及び蒸気に曝される。本明細書に記載の熱条件、及び熱・圧力条件は、本明細書に記載の乾燥粉末手順を含む任意の手順と併用することもできる。
【０００８】
前記ペプチドが水溶液またはエマルションの状態の間に、溶液またはエマルションのｐＨを７．０未満に下げることによる、共有結合している２Ｈ＋Ｏまたは分子のうちのいずれか１つ以上のペプチドからの除去方法。この方法が特によく作用するペプチドは、本明細書に記載されているペプチド、または配列表に記載されているペプチド、特には配列番号１１９及び配列番号３７のペプチドである。
【０００９】
方法に加えて、我々は、ペプチドで処理されるべき昆虫の生息場所への適用に適した、ペプチドの殺虫性組成物及び製剤についても述べる。方法及び組成物に加えて、我々は、水溶液またはエマルションの状態のペプチドのｐＨが７．０未満に下げられ、共有結合している２Ｈ＋Ｏまたは分子のうちのいずれか１つ以上が除去された、毒性ぺプチド自体についても述べる。
【００１０】
我々は、ペプチドの毒性及び／または活性を増加するための方法であって、ａ）純粋な形態１のペプチドすなわちペプチド酸、または約１０％未満の水を含む組成物として前記ペプチドを準備する工程；ｂ）前記形態１のペプチドを制御可能なチャンバーまたは加熱台の中に置く工程；ｃ）前記ペプチドを圧力ありまたは圧力なしで、蒸気ありまたは蒸気なしで、望ましい温度まで加熱する工程；ｄ）ペプチド酸と呼ばれる形態１のペプチドのうちの望ましい量が、ペプチドラクトンと呼ばれる形態２のペプチドに「変換」されるまで、加熱したペプチドを、望ましい温度、圧力、及び蒸気の状態に保持する工程；を含む方法について述べる。制御可能なチャンバーは、０〜５００℃の温度と大気圧〜５００ｐｓｉの圧力を維持することができる。ペプチドは、おおよそ次の温度、すなわち少なくとも約１０℃以上であり、約２００℃、３００℃、または最大でも４００℃から選択される最大温度以下まで加熱することができる。
【００１１】
我々は、１０℃〜２０℃、２０℃〜３０℃、３０℃〜４０℃、４０℃〜５０℃、５０℃〜６０℃、６０℃〜７０℃、７０℃〜８０℃、８０℃〜９０℃、９０℃〜１００℃、１００℃〜１１０℃、１１０℃〜１２０℃、１２０℃〜１３０℃、１３０℃〜１４０℃、１４０℃〜１５０℃、１５０℃〜１６０℃、１６０℃〜１７０℃、１７０℃〜１８０℃、１８０℃〜１９０℃、１９０℃〜２００℃、２００℃〜２１０℃、２１０℃〜２２０℃、２２０℃〜２３０℃、２３０℃〜２４０℃、２４０℃〜２５０℃、２５０℃〜２６０℃、２６０℃〜２７０℃、２７０℃〜２８０℃、２８０℃〜２９０℃、２９０℃〜３００℃、３００℃〜４００℃、及び４００℃〜５００℃のうちのいずれかから選択される温度、温度範囲、または温度範囲の組み合わせ、のうちのおおよそいずれかから選択される温度までペプチドが少なくとも加熱される方法について述べる。
【００１２】
我々は、ａ）約１０ｐｓｉ〜約４０ｐｓｉ、ｂ）約１５ｐｓｉ〜約３５ｐｓｉ、ｃ）約１８ｐｓｉ〜約２５ｐｓｉ、ｄ）約２１ｐｓｉ、のいずれかの圧力または圧力範囲にペプチドすなわちペプチド酸が曝露される方法について述べる。選択される温度及び圧力に応じて、選択される温度範囲及び圧力は、ａ）約５分〜約４０分、ｂ）約１０分〜約３０分、ｃ）約１５分〜約２５分、ｄ）約２１分、の時間の範囲である。
【００１３】
次の条件を使用することができ、ペプチドは、次の温度、及び圧力、及び時間保持される必要がある：ａ）約１００℃〜約１４０℃、約１０ｐｓｉ〜約４０ｐｓｉの圧力、約５分間〜約４０分間；ｂ）約１１０℃〜約１３０℃、約１５ｐｓｉ〜約３５ｐｓｉの圧力、約１０分間〜約３０分間；ｃ）約１１５℃〜約１２５℃、約１８ｐｓｉ〜約２５ｐｓｉの圧力、約１５分間〜約２５分間；ｄ）約１２１℃、約２１ｐｓｉの圧力、約２０分間。複数の事例では、圧力は大気圧以下であり、温度は少なくとも５０℃〜６０℃またはそれ以上の温度から選択される。いくつかの事例では、５０℃〜６０℃、６０℃〜７０℃、７０℃〜８０℃、８０℃〜９０℃、９０℃〜１００℃、１００℃〜１１０℃、１１０℃〜１２０℃、１２０℃〜１３０℃、１３０℃〜１４０℃、１４０℃〜１５０℃、１５０℃〜１６０℃、１６０℃〜１７０℃、１７０℃〜１８０℃、１８０℃〜１９０℃、１９０℃〜２００℃、２００℃〜２１０℃、２１０℃〜２２０℃、２２０℃〜２３０℃、２３０℃〜２４０℃、２４０℃〜２５０℃、２５０℃〜２６０℃、２６０℃〜２７０℃、２７０℃〜２８０℃、２８０℃〜２９０℃、２９０℃〜３００℃、３００℃〜４００℃、及び４００℃〜５００℃の温度、温度範囲、または温度範囲の組み合わせが使用される。
【００１４】
方法では、ペプチドがａ）加熱されて約１００℃より高い温度で少なくとも約１時間保持される；ｂ）加熱されて約８０℃〜約１２０℃の温度で少なくとも約２時間保持される；ｃ）加熱されて約５０℃〜約８０℃の温度で少なくとも約３時間保持される；温度及び時間が使用されてもよい。あるいは、ペプチドは、ａ）加熱されて約１８０℃より高い温度及び少なくとも約５ｐｓｉの圧力で少なくとも約５分間保持されてもよいし、ｂ）加熱されて約１００℃より高い温度及び少なくとも約１０ｐｓｉの圧力で少なくとも約１０分間保持されてもよいし、ｃ）加熱されて約８０℃〜約１２０℃の温度及び少なくとも約１０ｐｓｉの圧力で少なくとも約３０分間保持されてもよいし、またはｄ）加熱されて約５０℃〜約８０℃の温度で少なくとも１時間保持されてもよい。
【００１５】
ペプチドは、次の条件、すなわちａ）加熱されて約２００℃〜約３００℃の温度及び約５〜約１０ｐｓｉの圧力で約５〜約１０分間保持される；ｂ）加熱されて約１５０℃〜約２００℃の温度及び約１０〜約３０ｐｓｉの圧力で約５〜約３０分間保持される；ｃ）加熱されて約８０℃〜約１５０℃の温度及び約１０〜約２０ｐｓｉの圧力で約２０〜約６０分間保持される；またはｄ）加熱されて約５０℃〜約８０℃の温度及び約１０〜約４０ｐｓｉの圧力で約３０〜約６０分間保持される；を使用して変換することができる。
【００１６】
あるいは、条件は、ペプチドがａ）加熱されて約１１０℃〜約１３０℃の温度及び約１０〜約２０ｐｓｉの圧力で約１０〜約２０分間保持されるか、ｂ）加熱されて約１２１℃の温度及び約２１ｐｓｉの圧力で約２０分間保持される条件である。
【００１７】
概して、我々は本明細書に記載の条件、温度、及び圧力のいずれかの下で前記ペプチドを加熱することによって、ペプチドから共有結合している２Ｈ＋Ｏ、またはＨ２Ｏ、または分子のいずれか１つ以上を除去する方法について述べる。本明細書に記載の条件、温度、圧力のいずれかの下で、配列表にある前記ペプチドを加熱することによって、いずれかのペプチドから共有結合している２Ｈ＋Ｏ、またはＨ２Ｏ、または分子のいずれか１つ以上を除去する方法。我々は、「変換」後の、配列表中のいずれかのペプチドについて述べる。我々は、本明細書または請求項に記載のいずれかの手順によって製造されるペプチドについて述べる。我々は、ペプチドで処理されるべき昆虫の生息場所への適用に好適な、請求項の方法のいずれかによって製造されるペプチドの製剤状態の殺虫性組成物について述べる。我々は毒性ペプチドについて述べ、また本明細書に記載の条件、温度、圧力のいずれかの下で前記ペプチドを加熱した際に共有結合している２Ｈ＋Ｏまたは分子のうちのいずれか１つ以上が除去される場合に、これをペプチドラクトンと呼ぶ。我々は、１つ以上の共有結合している２Ｈ＋ＯもしくはＨ２Ｏ分子が除去される本明細書の手順のいずれかによって製造される毒性ペプチドについて述べ、これは本明細書及びパート２でペプチドラクトンと呼ばれる。
【００１８】
変換のために特に適切な条件は、ペプチドを加熱し、これを約１２１℃の温度、約２１ｐｓｉの圧力で約２０分間保持することである。
【００１９】
本出願のパート２では、我々はペプチドラクトンをペプチドヒドラジドへと変換し、ペプチドヒドラジドをペプチドヒドラゾンへと変換し得る方法について述べる。我々は、昆虫捕食者のペプチドラクトンをヒドラジンと混合し、精製することでペプチドヒドラジドを得ることを含む、昆虫捕食者のペプチドをペプチドラクトンの形態からペプチドヒドラジドの形態へと変換する方法によって製造される、ペプチドヒドラジド製品の製造方法及びペプチドヒドラジド製品について述べる。我々は、ペプチドラクトンを水中で調製し、ヒドラジン一水和物を添加し、混合物を撹拌してペプチドヒドラジドを形成し、任意選択的には凍結、融解、及び精製して精製されたペプチドヒドラジドを得る方法について述べる。必要に応じて、昆虫捕食者のペプチドは、約２０個のアミノ酸から約５０個のアミノ酸まで大きさが様々であってもよく、これは２個、３個、または４個のシスチン結合を有する。あるいは、これは３個もしくは４個、または２個もしくは３個のシスチン結合を有する。ペプチドラクトンは、配列表にある任意のペプチド、及び配列表にある任意のペプチドと８０％超の相同性を有する配列表にある任意のペプチドもしくは任意のペプチド、または８５％、９０％、９５％、または９９％以上の相同性があり３個もしくは４個のシスチン結合を有する任意の配列、から調製することができる。
【００２０】
我々は、方法ａまたは方法ｂのいずれかを使用することが可能な、ハイブリッド＋２ペプチドと名付けられたペプチドを用いたこれらの方法の使用方法であって、方法ａ；ａ）１００ｍｇの精製した形態２のペプチド、すなわちハイブリッド＋２ペプチドラクトンが１ｍＬの水に入っている溶液から出発する、ｂ）１００ｍｇのペプチドラクトン１ｍＬを１００μＬのヒドラジン一水和物で処理し、室温で撹拌して、任意選択的には２時間撹拌して、ペプチドヒドラジドを形成する、ｃ）分取ＨＰＬＣ（アセトニトリル／水／トリフルオロ酢酸のグラジエントで溶出）でペプチドヒドラジドの溶液を精製する、ｄ）適切なペプチドヒドラジドのフラクションを選ぶ、ｅ）適切なペプチドヒドラジドのフラクションを合わせて減圧下で濃縮して体積を減らす、ｆ）減らした体積のペプチドヒドラジドを０℃未満で、任意選択的には−８０℃で、凍結する、ｇ）ハイブリッド＋２ペプチドヒドラジドを、任意選択的には凍結乾燥機で、凍結乾燥してハイブリッド＋２ペプチドヒドラジド（Ｉ）を得る；または、以下を含む方法ｂ；ａ）ペプチド酸である形態１、及び形態２の混合物であるスーパーリキッド濃縮物（Ｓｕｐｅｒ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ）２５ｍＬの溶液を、任意選択的には約５０℃〜９０℃で、任意選択的には７５℃で、撹拌する、ｂ）溶液を冷ます、ｃ）溶液を、任意選択的には２ｍＬである、ヒドラジン一水和物で処理して、任意選択的には室温で２時間、撹拌する、ｄ）任意選択的には（アセトニトリル／水／トリフルオロ酢酸）のグラジエントで溶出する、分取ＨＰＬＣで一部を精製する、ｅ）フラクションを集めて濃縮し、任意選択的には減圧で、体積を減らす、ｆ）残っている液体を、任意選択的には−８０℃で及び凍結乾燥機で凍結して、ハイブリッド＋２ペプチドヒドラジドを得る；を含む方法を示した。
【００２１】
我々は、ペプチドヒドラジドの使用方法、及び、これをカルボニルと反応させて有用なペプチドヒドラゾンを作る方法も示す。これは、ａ）ヒドラジド水溶液を混合し、ヘキサナールのエタノール溶液を添加し、撹拌すること、ｂ）ヘキサナール、酢酸、及びエタノールからなるストック溶液で処理して撹拌すること、ｃ）ヘキサナール、酢酸、及びエタノールから作られたストック溶液を添加すること、ｄ）混合し、放置し、その後任意選択的に加熱してヒドラゾンを生成すること、を含む、昆虫捕食者のペプチドをペプチドヒドラジドからペプチドヒドラゾンへと変換することにより行われる。我々は、この方法を、ヒドラゾン（ＩＩ）を作るために使用した。これは、ａ）ヒドラジド（Ｉ）水溶液をヘキサナールのエタノール溶液と混合して撹拌すること、ｂ）請求項１６に記載のストック溶液を少量添加すること、ｄ）混合し、放置し、その後任意選択的に加熱してヒドラゾン（ＩＩ）を生成すること、によって行われる。
【００２２】
ヒドラゾンは、極めて重要な安定中間体であると同時に、最終製品にもなり得る。ペグ化ペプチドつまりＰＥＧペプチドである製品。ヒドラゾンは他のものでもあってもよいが、我々はペグ化された際に最も有用であると考えている。我々はアルキル化ヒドラゾンも示す。ペグ化ペプチドは、実際にはヒドラゾンの形態をとる。実施例９とヒドラゾン（ＩＩＩ）、及び実施例１１と（ＩＸ）を参照のこと。このような化合物はこれまで全く存在しておらず、これらを作るための化学はこれまで全く教示されていなかった。これらのペプチドヒドラゾンは新規であり、ヒドラゾン（ＩＸ）のようなペグ化ペプチドヒドラゾンは２つの観点から新規である。第１に、実施例１０（ｂ）及び１１（ｂ）で示されている不飽和カルボニル結合は、ＰＥＧとペプチドを連結するためにはこれまで全く使用されていなかった。第２に、アルデヒドまたはケトンがＰＥＧに結合し、その後これがペプチドヒドラジドを反応する、「ペグ化側」でのアルデヒドまたはケトンとのこの反応の開始は、これまで全く示されていなかった。通常は、アルデヒドまたはケトンがペプチド上に配置されてからペプチドケトンまたはペプチドアルデヒドがＰＥＧと反応あるいは結合する。この反応で不飽和カルボニルを使用すると、このイミン窒素はより塩基性が低いことから結合がより安定になり、結合を破壊することがより困難になる。そのため、ＰＥＧが飽和カルボニルを有するペプチドに連結している実施例９のカルボニルと、ＰＥＧが不飽和カルボニルを有するペプチドに連結している実施例１１とを比較することができる。実施例１１の不飽和カルボニル結合は、より強い結合を形成してペプチドとＰＥＧとの間をより頑丈に連結することから、特に重要である。このより強い結合は、不飽和カルボニルがより低塩基性であり容易にはプロトン化しない（プロトン化はヒドラゾン結合の加水分解の第１段階である）イミン窒素を形成する結果である。これらのタイプの結合は、ペプチドとＰＥＧまたはアルキル基とを連結するためにはこれまで全く使用されていなかった。
【００２３】
ペグ化ペプチドは周知であるが、ヒドラジドへと変換されるペプチドラクトンから作られたペグ化ヒドラゾンから、これらを製造するこの方法は新規であり、これまで知られていない。ペグ化された毒性のある殺虫性ペプチドは、これらの殺虫剤が植物の摂取によって昆虫に届けられる場合に経口バイオアベイラビリティが非常に重要になるため、極めて重要である。ある意味では、これは経口でヒトに摂取される薬に関して、経口バイオアベイラビリティがいかに重要であるかに非常によく似ている。両方の状況において、薬がいかに「作用」するかを制御する因子はその経口バイオアベイラビリティである。タンパク質をペグ化すると、分子の大きさ及び分子量が増加する。ペグ化は、細網内皮系からの排出を減らすことによって、または特異的な細胞−タンパク質相互作用によって、細胞のタンパク質クリアランスを減少させる。更に、ペグ化はタンパク質の周りに保護的な「シェル」を形成する。このシェル及びそれに関連した水和水は、免疫原性認識からタンパク質を守り、トリプシン、キモトリプシン、及びＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓプロテアーゼなどのタンパク質分解酵素による分解に対する耐性を向上させる。Ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ  Ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｐｒｏｃｅｓｓ  ｏｆ  Ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ  Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ．  Ｊ．  Ｍｉｌｔｏｎ  Ｈａｒｒｉｓ，Ｎａｎｃｙ  Ｅ．  Ｍａｒｔｉｎ  ａｎｄ  Ｍａｒｌｅｎｅ  Ｍｏｄｉ，Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｍｒｙ  ２００１；  ４０（７）：５３９−５５１の５４３ページを参照のこと。ペグ化は、ペプチドの半減期を長くすることによってバイオアベイラビリティを向上させる。例えば、ペグ化はトリプシンによるアスパラギナーゼの分解を減少させた：５０分間のインキュベーションの後、ネイティブのアスパラギナーゼ、ＰＥＧ−アスパラギナーゼ、及び分岐−ＰＥＧ−アスパラギナーゼの残存活性はそれぞれ独立に５、２５、及び９８％であった。
【００２４】
我々は、昆虫捕食者のペプチドを、ペプチドラクトンからペプチドヒドラジドへ、そして最終的にはペグ化ペプチドであるペプチドヒドラゾンへと変換する方法を示す。我々は、ペプチドヒドラジド（Ｉ）をアルデヒド（ＩＶ）と混合してペグ化タンパク質であるぺプチドヒドラゾン（ＩＩＩ）を製造する実施例を示す。方法には、複合グリコールを強酸または弱酸で酸性化することと、ヒドラジドを添加することと、よく混合してペプチドヒドラゾンを製造することとを含む。ペプチドヒドラゾンは、ヒドラゾンを製造するために使用されるカルボニルに応じたペグ化ペプチドとすることができる。我々は、ａ）Ｏ−［２−（６−オキソカプロイルアミノ）エチル］−Ｏ’−メチルポリエチレングリコール（ＩＶ）と呼ばれる化合物のエタノール混合物のストック溶液に酢酸を１滴添加すること、ｂ）工程ａからの、酢酸で処理されたＯ−［２−（６−オキソカプロイルアミノ）エチル］−Ｏ’−メチルポリエチレングリコール（ＩＶ）（分子量約２’０００）のストック溶液を使用し、これをヒドラジド（Ｉ）の水溶液に添加すること、ｃ）混合し、室温に放置すること、ｄ）Ｏ−［２−（６−オキソカプロイルアミノ）エチル］−Ｏ’−メチルポリエチレングリコール（ＩＶ）（分子量約２’０００）のストック溶液の残部を分割して添加し、混合後終夜放置しておくことでペプチドヒドラゾン（ＩＩＩ）を生成すること、によるペプチドヒドラゾン（ＩＩＩ）を製造するための方法を示す。我々は、アクリルケトンをヒドラジドに添加してヒドラゾンを製造することを含む、昆虫捕食者のペプチドヒドラジドをペプチドヒドラゾンへと変換し得る方法を示す。後者の方法は、エタノールに入ったアクリルケトン（Ｖ）をヒドラジド（Ｉ）の水溶液に添加して混合することを含む、ペプチドヒドラゾン（ＶＩ）の製造方法で示される。我々は、ＰＥＧ４ケトン（ＶＩＩＩ）をヒドラジド（Ｉ）の水溶液に添加して混合することでヒドラゾン（ＩＸ）を製造することを含む、ペプチドヒドラゾン（ＩＸ）も製造する。かくして、ペプチドヒドラジドは、我々の方法にかかるペグ化ペプチドを製造するために必要な、極めて重要な中間体であることが示される。
【００２５】
我々は、共有結合している２Ｈ＋ＯまたはＨ２Ｏまたは分子のうちのいずれか１つ以上をペプチドから除去することとして記述される方法であって、本明細書に記載されているまたは明細書もしくは請求項中に見出されるような単独または組み合わせでの、いずれかの条件、温度、圧力、及びｐＨまたは酸性条件の下で、共有結合している２Ｈ＋Ｏまたは分子のうちのいずれか１つ以上が取り除かれた任意の毒性ペプチドを含み、本明細書及び請求項に記載の手順のいずれかによって製造されたいずれかのペプチド、ヒドラジド、またはヒドラゾンを含む方法、により製造されるペプチドの調製方法及びまたはペプチド、及びまたはこの方法によって製造される殺虫性組成物、または、本明細書及び請求項に記載の方法のいずれかによって製造され、その後昆虫の生息場所への適用に好適な製剤中で使用される、ペプチドの殺虫性組成物としてのこれらのペプチドのいずれかの使用について述べる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】配列番号１１９のマススペクトルであり、矢印はピーク１が１１．８４の数字であることを示す。
【図２】図１に示されているピーク１のデコンボリューションされたスペクトルでの、配列番号１１９のマススペクトルであり、デコンボリューションされた図１のピーク１は４５６２．８８９６の値を有する。
【図３】配列番号１１９のマススペクトルであり、矢印はピーク２が１２．８２の数字であることを示す。
【図４】図３に示されているピーク２のデコンボリューションされたスペクトルでの、配列番号１１９のマススペクトルであり、４５４４．８８３８の質量値を有する。
【図５】処理後の新たな形態、すなわちピーク２のペプチドの毒性と比べた、元の形態であるピーク１のペプチドの毒性の比較を示す棒グラフである。両方の形態は対照とも比較されている。
【図６】液体クロマトグラフィーによって別々に用意された、ピーク１とピーク２のバイオアッセイの比較である。ピーク１の結果が示されている。
【図７】液体クロマトグラフィーによって別々に用意された、ピーク１とピーク２のバイオアッセイの比較である。ピーク２の結果が示されている。
【図８】安定性ｐＨ試験でのｐＨ５．６における配列番号１１９のマススペクトルである。
【図９】安定性ｐＨ試験でのｐＨ３．９における配列番号１１９のマススペクトルである。
【図１０】安定性ｐＨ試験でのｐＨ８．３における配列番号１１９のマススペクトルである。
【図１１】ＨＰＬＣからのピーク１、２、及び３を示し、これは加熱によって配列番号３７から、すなわちネイティブハイブリッドから、Ｈ２Ｏ及びＮＨ３が別個に失われ得ることを示している。温度でＵＶ吸光度が変化する３つのＨＰＬＣピークは、４．２分、５．４分、６．９分の保持時間にあると同定された。
【図１２】ネイティブハイブリッドペプチドのアイソフォームのＴＯＦ  ＭＳ評価の結果を示す。
【図１３】ヒドラジド（Ｉ）のマススペクトルである。
【図１４】デコンボリューションされたスペクトルでの、ヒドラジド（Ｉ）のマススペクトルである。
【図１５】ヒドラゾン（ＩＩ）のマススペクトルである。
【図１６】デコンボリューションされたスペクトルでの、ヒドラゾン（ＩＩ）のマススペクトルである。
【図１７】ヒドラゾン（ＩＩＩ）のマススペクトルである。
【図１８】分布を示す分子イオンが見られる、ヒドラゾン（ＩＩＩ）のマススペクトルである。
【図１９】ＵＶで追跡した、アクリルケトン（Ｖ）のマススペクトルである。
【図２０】アクリルケトン（Ｖ）のマススペクトルである。
【図２１】ヒドラゾン（ＶＩ）のマススペクトルである。
【図２２】デコンボリューションされたスペクトルでの、ヒドラゾン（ＶＩ）のマススペクトルである。
【図２３】ＵＶで追跡した、ＰＥＧ４ケトン（ＶＩＩＩ）のマススペクトルである。
【図２４】ＰＥＧ４ケトン（ＶＩＩＩ）のマススペクトルである。
【図２５】ヒドラゾン（ＩＸ）のマススペクトルである。
【図２６】デコンボリューションされたスペクトルでの、ヒドラゾン（ＩＸ）のマススペクトルである。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
［定義］
定義は、その記載、実施例、及び請求項の出願全体を考慮して解釈及び理解すべきである。
【００２８】
「ＡＩ」は活性成分を意味する。
【００２９】
「オートクレーブ」は、密閉または鍵をかけることが可能な圧力容器を有する、蒸気及びまたは加熱した水を添加することが可能な装置を意味し、蒸気での、時には真空ポンプでの、乾燥空気の除去が典型的には可能であり、任意選択的には、必要に応じて、乾燥した熱及び／または高圧及び任意選択的には蒸気を用いてより高温にするために、蒸気のパルス添加または循環が可能である。これは、通常は装置によって作られる熱及び圧力に電源を与えるために壁の出口から装置まで電流を運ぶ、付属の電気コード、電源コードによって動くが、これはストーブの上で加熱することができる単純な圧力容器を指してもよい。
【００３０】
「カルボニル」はアルデヒドまたはケトンを意味する。
【００３１】
「チャンバー」は密閉された容器または空間を意味する。
【００３２】
「摂氏」は、通常は度としての温度の単位であり、これは４０Ｃの中のＣあるいは４０℃の中の℃のように短縮される場合がある。
【００３３】
「変換する」及び「変換」は、熱、熱と蒸気、及び／または圧力または酸性条件の本明細書に記載の方法を、単独でまたは他の要素と組み合わせて使用することによる、形態１として記述されるペプチドの形態の、形態２への変形を意味する。「変換」については、本明細書でより詳しく記載及び例示する。
【００３４】
「ＤＩ」は脱イオン水を意味する。
【００３５】
「形態１または形態１のペプチド」とはペプチドの形態を意味し、「形態」はその折り畳まれ方、またはその活性部位の存在及びその数、または内部結合の程度を示唆しており、特には形態Ｉあるいは形態１は、これが最初に形成されたときのまま、その分子量から２ＨプラスＯつまり１８ダルトンを失うことなしに存在するペプチドを意味する。形態１はペプチドの酸の形態としても知られており、本明細書ではペプチド酸と呼ぶ場合がある。
【００３６】
「形態２または形態２のペプチド」とはペプチドの形態を意味し、「形態」はその折り畳まれ方、またはその活性部位の存在及びその数、または内部結合の程度を示唆しており、特には形態ＩＩあるいは形態２は、形態１のペプチドとして始まったが、本明細書に記載の処理（熱、温度、圧力、蒸気、酸、低ｐＨ条件など）の組み合わせのいずれか１つを適用することによって変形され、これが形態１から形態２に「変換」される前と後に測定した場合に水分子に等しい１８ダルトン失われているペプチドを意味する。ペプチドが１つの形態から始まり、その後にその分子量から２ＨプラスＯつまり１８ダルトンを失った場合、これは形態２のペプチドとして存在する。形態２は、ペプチドのラクトン形態またはペプチドラクトンとしても知られている。本明細書中で使用されているラクトンの定義についてのパート２の最初の段落を参照のこと。
【００３７】
「製剤」は、通常は活性成分を含む成分の混合物を意味し、本明細書では典型的には毒性ペプチドと、溶解性、安定性、展延性、有効性、安全性、または活性成分の保存もしくは送達に通常は関連する他の望ましい特性を向上させるための他の成分との混合物である。
【００３８】
「昆虫」及び「処理されるべき昆虫」とは、これが食料や資源を消費もしくは破壊するとみなされていることから、またはその本質及びその存在自体が望ましくないことから、その昆虫の知識を有している者がその摂餌量の制限、その成長の制限、またはその寿命の短縮などの何らかの方法で昆虫を抑制したいと望む昆虫を意味する。
【００３９】
昆虫の「生息場所」とは、昆虫が普段生活する、餌をとる、眠る、またはそこへもしくはそこから移動する、場所を意味する。
【００４０】
「生理学的に活性なペプチド」は生物学的に活性な毒性ペプチドを意味する。
【００４１】
「圧力容器」は、水を添加することで加熱蒸気及び高温の生成が可能な乾式加圧または湿式加圧された装置を有する、高圧を保持することができる密閉容器を意味する。圧力容器は、ストーブ上部の加熱リングから、またはオートクレーブ装置の一部としてなどにより、外部供給源から動力を受け取る必要がある。
【００４２】
「強酸」は水溶液中で完全にイオン化する酸を意味する。これは、通常は１〜３である低いｐＨを有する。例としては塩酸−ＨＣｌ、臭化水素酸−ＨＢｒ、ヨウ化水素酸−ＨＩ、硫酸−Ｈ２ＳＯ４、リン酸（Ｈ３ＰＯ４）、過塩素酸ＨＣｌＯ４、硝酸ＨＮＯ３、及び塩素酸ＨＣｌＯ３が挙げられる。
【００４３】
「毒性ペプチド」とは、昆虫がそのペプチドに曝された場合に昆虫に有害な影響を生じさせる、天然または人工のアミノ酸から構成される、天然、人工、または合成のペプチドを意味する。毒性ペプチドには、クモ、ヘビ、軟体動物、及び巻貝などの有毒生物由来のまたはこれらに関連するペプチドである有毒ペプチドが含まれる。毒性ペプチドには、ＵＳ８，２１７，００３及びＵＳ８，５０１，６８４で同定及び記載されているペプチドが含まれる。
【００４４】
「約１０％、または少なくとも約１０％、または１０％前後の水」とは、その総重量または総量の少なくとも約１０％の利用可能な水、すなわち大きな分子の一部として共有結合しているものではなくＨ２Ｏ分子のイオン化が可能な（すなわちｐＨを維持することが可能な）水分子、を有している任意の製剤または混合物を意味する。
【００４５】
弱酸とは、水溶液中にある場合に完全には解離しない酸を意味する。これらは通常３〜６のｐＨを有する。例として酢酸及びシュウ酸が挙げられる。弱酸は、イオン化されている分子とされていない分子が平衡状態で存在する。
【００４６】
［概要及び手順］
本明細書では、熱単独、温水、蒸気と組み合わせた熱、熱と圧力、及び／または独立した酸処理を含む様々な処理が述べられ、これらの処理によっていくつかのペプチドの活性を処理される前よりも約５倍大きい活性に増加させることができる。高温及び高圧の下でこれらの活性が失われず、これらのペプチドの活性は飛躍的な活性の増加を示した。我々は、この変化の特性、並びに、我々が生理学的に活性なペプチド及びまたは毒性ペプチドと称するペプチドを含む、いくつかのペプチドの活性を低下させるのではなく向上させるために使用することができる条件と、温度、圧力、及びｐＨの範囲について示す。
【００４７】
これらのペプチドは、本質的に転位プロセスによる脱水を受ける。我々はこの変形を「変換」と呼ぶ。「変換」は、通常は毒性ペプチドが、高温、または蒸気及び圧力ありもしくはなしでの熱、または酸、または熱と酸、または酸と熱プラス蒸気及び／もしくは圧力、または、温度、熱、熱と圧力、熱と蒸気及び圧力、酸性あるいは低ｐＨ、酸あるいは低ｐＨと熱、酸あるいは低ｐＨと熱及び圧力、酸あるいは低ｐＨと熱、蒸気及び圧力、の様々な組み合わせ、を使用して一層活性で一層毒性のペプチドに変化する場合に生じる。「変換」は、ペプチドに熱がかけられる場合、またはペプチドが水中にありペプチドの水溶液が低ｐＨにされる場合には、比較的迅速に生じさせることができる。温度の上昇、すなわち圧力の上昇ありもしくはなしの加熱、蒸気ありもしくはなしの加熱、またはｐＨの低下、すなわち液体製剤に酸または酸性条件を与えることによるｐＨの低下、または温度と酸の両方の組み合わせは、本明細書に記載の特定の毒性ペプチドの活性を飛躍的に増加させる。この発見に関する様々な実施形態の更なる所見、測定、及び分析は開示され、特許請求される。
【００４８】
いくつかの実施形態では、昆虫に対して毒であるペプチドは、約１００℃〜１５０℃で稼働する典型的なオートクレーブの中などで、熱単独、または蒸気及び圧力と組み合わせた熱、の条件で処理される。温度、圧力、及び酸性の変数に応じた３、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、７５、８０、または９０分のいずれかの時間、約１００ｋＰａすなわち１５ｐｓｉの圧力で蒸気及び圧力が使用される場合には、「変換」は比較的短時間になるであろう。変換のための適切な条件は、ペプチドを加熱してこれを約１２１℃の温度、約２１ｐｓｉの圧力で約２０分保持することである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の手順のいくつかでは、再使用または安全な廃棄のための生体試料のオートクレーブ処理の際に使用される標準的な手順と同様である。
【００４９】
上述したよりも低い温度及び圧力が使用される場合、「変換」には上で提示されている時間よりも長い時間がかかる。方法は、ペプチドの乾燥粉末または結晶の形態に対して使用してもよいし、あるいはペプチドを溶液にしてから「変換」してもよい。ペプチドが水溶液にされる場合、ｐＨが監視、調整、及び制御のための重要な因子となる。通常、ｐＨが低い溶液ほどｐＨが高い溶液よりも「変換」が速く、ｐＨ７．０を超えると「変換」がほぼ停止する。
【００５０】
本明細書に記載の方法に好適な典型的なオートクレーブ運転条件は、約１００ｋＰａすなわち１５ｐｓｉまたは約１０〜２０ｐｓｉの圧力で、約１５分または約１０〜２０分間、約１２０℃〜１３５℃に加熱された蒸気、であり、これは合理的な時間で変換を行わせるのに十分であろう。当業者は、本明細書に記載の測定及び分析を使用することにより、「変換」の速度を監視及び制御するために条件を変更または変化させることができるであろう。
【００５１】
ペプチドの活性を増加させる方法は、室温より高いいくらかの熱を必要とする。熱単独、または蒸気存在下の熱、または圧力の存在下での熱を使用することができる。「変換」にかかる時間は、熱、及びまたは蒸気、及び圧力、及び関係する場合にはペプチドが入っている溶液の酸性度がどのくらいの量かに依存する。熱プラス時間は、変化すなわち本明細書で特定される「変換」をするのに十分にされる。どのくらい時間が必要とされるかは、どのくらいの熱が使用されるか、及び熱と共に蒸気及び圧力が使用されるかどうかに依存する。同様に、どのくらいの熱が必要とされるかは、どのくらいの時間ペプチドが加熱されるか、並びに蒸気及び圧力が使用されるかどうかに依存する。
【００５２】
ペプチドの毒性を増加させるために使用することができる、蒸気あり及びなしでの可能な熱の選択肢及び様々な圧力のいくつかの例が開示される。当業者は、他の多くの可能な温度、圧力、ｐＨ条件、及びこれらの組み合わせを決定するために、これらの教示及び例を使用することができるであろう。
【００５３】
蒸気あり及びなしでの温度、時間、及び圧力の例。
蒸気あり：ａ）１１０Ｃ、３０ｐｓｉ、２０分；ｂ）１２０Ｃ、１５ｐｓｉ、１５分；ｃ）１３０Ｃ、３０ｐｓｉ、容器及び「変換」がされたか否かに応じて３分、８分、１０分〜１５分。
蒸気なし（乾燥した常圧）：ａ）１２０Ｃ、０ｐｓｉ、１２時間；ｂ）１３０Ｃ、０ｐｓｉ、６時間；ｃ）１４０Ｃ、０ｐｓｉ、３時間；ｄ）１５０Ｃ、０ｐｓｉ、２．５時間；ｅ）１６０Ｃ、０ｐｓｉ、２時間；ｆ）１７０Ｃ、０ｐｓｉ、１時間。
【００５４】
反応の進行に十分な時間が与えられるのであれば、温度を極端に高く上昇させなくてもペプチドに望ましい変化を生じさせられることに留意し、また理解するべきである。例えば、室温は典型的には約２０〜２５Ｃの範囲である。調製温度を４０Ｃにしか上げない場合には、数時間または数日かけて反応を生じさせることができる。しかし、蒸気なし圧力なしでの４０Ｃでの反応は非常に遅く進行し、完結までに２年もの長い期間を要するであろう。蒸気なし圧力なしでの１００Ｃでの反応は、完結に６か月もの長い期間を要するであろう。しかし、反応を１２０Ｃ、１５ｐｓｉで行う場合には、「変換」は１５分以内に完結するであろう。
【００５５】
上で示されている熱、時間、蒸気、及び圧力の例は、湿式製剤または乾式製剤で使用することができる。ペプチド毒の市販の製剤においては、測定、輸送、販売、及び使用には乾式製剤が容易なことから、乾式製剤の活性が重要である。蒸気熱は、毒性ペプチドの製造からの望ましくない汚染物として残り得る酵母ハイブリッドなどの生体物質のほとんどを不能にし、不活性化するために使用することもできるため、乾燥粉末を蒸気熱に曝露する方法が特に好ましい。
【００５６】
熱、蒸気、及び圧力に加えて、ペプチドの活性を増加させるために使用可能なもう１つの独立因子は、ｐＨすなわち酸性度である。低ｐＨ、すなわち７未満、すなわち酸性は、ペプチドが溶液中にある場合に、室温で、あるいは上述の時間、温度、圧力、及び蒸気の因子と組み合わせて、使用することができる。
【００５７】
酸性および酸性条件は、「変換」の速度に影響を与え得る重要な因子であると考えられる。第１に、上述のプロセスはペプチドが水なしの乾燥形態にある場合でも生じうるが、水と混合される場合にも、あるいは十分な水と水和して測定可能なｐＨを生じさせる場合にも、これらのより活性な形態へとこれらを変換できることが理解されるべきである。低ｐＨすなわち酸性条件、７．０未満が、「変換」率及び「変換」速度を増加させるために使用できる独立因子であることが見出された。最適なｐＨは約１．５〜約６、好ましくは約２〜約５、より好ましくは約３〜約４、より好ましくは約３．５のようであるが、７．０以下のいずれの酸性条件も、ペプチドが溶液状態にある場合に反応速度を向上させるであろう。これは、本質的にはｐＨによって生じる平衡反応である。水性反応条件を用いた場合、７．０より大きいｐＨでは反応は遅く、ｐＨが高いほど遅くなり、本質的に不活性になるまで遅くなるであろう。ｐＨが７．０のわずかに上から約７．５まではいくらかの変換が生じるであろう。高いｐＨ条件では、「変換」は効果的なほどに遅く、通常、商業的価値はほとんどないとみなされる。
【００５８】
ある実施形態では、ペプチドは水と混合され、ｐＨ６．０以下の溶液にされ、約１０分未満での迅速な「変換」のために、蒸気及び圧力の下で、約１２０℃〜約１５０℃の温度で「変換」される。
【００５９】
反応。理論に拘束されることを望むものではないが、そして記載されている手順がそれを必要とするものではないが、本発見の開示を更に前進させるため、及び本明細書の教示を改善するため、我々は「変換」時に次の反応が生じている可能性があると考えている。特定のペプチドが本明細書に記載の熱、圧力、蒸気、及び酸の状態に従って処理された場合に、これらは水分子相当を失っているようであり、そのため我々はこのプロセスを脱水と呼ぶことがある。
【００６０】
例示の目的で、我々は配列番号１１９（ハイブリッド＋２とも呼ばれる）及び配列番号３７の２つの配列についてのデータを示す。両者共に実施例及び配列表に示されている。これらは、Ｎ−末端のアミノ酸のみが異なる２つの毒性ペプチドである。配列番号１１９はＮ−末端のＧＳを有しており、配列番号３７はＮ−末端のＧＳを有していない。配列番号３７は３９個のアミノ酸を有し、これらは配列番号１１９にある３９個の「Ｃ」末端側アミノ酸と同じである。これらの毒性ペプチドは、「変換」を実証及び説明するのに有用である。
【００６１】
我々は、「変換」しないものを説明することから始める。配列番号３７のような、グルタミンすなわちＱなどのアミノ酸を有するＮ末端のペプチドの場合は「変換」せず、ピログルタミン酸のような環状化合物を自然に形成する。例えば、配列番号３７のＮ−末端グルタミン酸はピログルタミン酸を形成する場合がある。ここでは、我々はＮ−末端またはフリーのＮＨ３基を有する内部アミノ酸のいずれかの自然環化を「ＮＨ３反応」と呼ぶ。ＮＨ３反応は「変換」ではなく、「変換」と並べられるものではない。我々は、「変換」を「２Ｈ＋Ｏ反応」または「Ｈ２Ｏ反応」または「脱水反応」と呼び、これはＮＨ３反応とは完全に異なる。我々が実施例５で示したように、両方とも同じペプチドで生じ得る。単一のペプチドの２つの形態の存在、及び、１つの形態から他の形態へと、あるいは少なくとも２Ｈ＋Ｏを持つものから持たない形態へと変えるための制御された能力については、以降の実施例でこれらの２つのペプチドを用いて示され、また特性評価及び説明がなされる。
【００６２】
［「変換」のための最適なペプチド］
我々は、以降で詳細に述べるものを含む、数多くのペプチドが「変換」に好適であると考えている。毒性昆虫ペプチドすなわち昆虫捕食者ペプチドは、２個、３個、または４個のシスチン結合を有しており、これはそれらが４個、６個、または８個のシステインを有していることを意味する。これらは約１０個超のアミノ酸残基かつ約３００個未満のアミノ酸残基のペプチドである。より好ましくは、これらはアミノ酸すなわちａａサイズが約２０ａａ〜約５０アミノ酸の範囲である。これらは約５５０Ｄａ〜約３５０，０００Ｄａの分子量の範囲である。これらは高い熱及び低いｐＨに曝された場合に、驚異的な安定性を示す。毒性昆虫ペプチドは、いくつかのタイプの殺虫活性を有する。典型的には、これらは昆虫に注入された場合に活性を示すが、多くは昆虫に局所的に適用する場合にはほとんど活性を示さない。毒性昆虫ペプチドの殺虫活性は、様々な方法で測定される。測定の一般的な方法は当業者に周知である。そのような方法としては、麻痺、死亡率、体重増加不良などの様々なパラメーターの評価に基づく用量−反応プロットのフィッティングによる反応用量の中央値（例えばＬＤ５０、ＰＤ５０、ＬＣ５０、ＥＤ５０)の決定が挙げられるが、これらに限定されない。測定は、当該の殺虫性製剤の様々な用量に曝露される昆虫のコホートに対して行うことができる。データの分析は、プロビット分析及び／またはヒルの式等によって規定される曲線を形成することによって行うことができる。そのような場合、用量は皮下注射によって、高圧注入によって、食料または餌の試料の一部としての殺虫性製剤の提示によって、等で投与されるであろう。
【００６３】
毒性昆虫ペプチドは、本明細書では、皮下注射、高圧注入、または経口による昆虫への送達（すなわち、昆虫に与えられる食料の試料の一部としての摂取による）のいずれかによって昆虫へ送達した際に殺虫性を示すすべてのペプチドとして定義される。したがって、この分類のペプチドには、クモ、ダニ、サソリ、ヘビ、巻貝等の毒液の成分として天然に生成する多くのペプチドが含まれるが、これらに限定されない。この分類には、これらに限定されないが、植物により製造される様々なペプチド（様々なレクチン、リボソーム不活性化タンパク質、及びシスチンプロテアーゼ等）、及び昆虫病原性細菌により生成される様々なペプチド（例えば様々なＢａｃｉｌｌｕｓ種によって生成されるタンパク質のＣｒｙｌ／デルタエンドトキシンファミリー）も含まれる。
【００６４】
次の文献は、米国において、許可されるその他の国及び地域において、その全体が参照により包含され、これらはその公開によって示される周知の事実である。更に、特に配列表については、これらにペプチド配列が記載されている範囲内で参照により包含され、公知である。２００８年４月８日に発行されたＵＳ特許７，３５４，９９３Ｂ２、特には配列表に列挙されているペプチド配列、及び１〜３９番の番号が付けられたもの、及びＵ−ＡＣＴＸポリペプチドと名付けられたもの、２〜４個の鎖内ジスルフィド架橋を形成することが可能な毒、及びそれらの変異体、並びに明細書のカラム４〜９と図１に登場するペプチドを参照のこと。２００８年１０月８日に公報２００８／４１に公開され、特許されたＥＰ特許１８１２４６４Ｂ１、特には配列表に列挙されているペプチド配列、２〜４個の鎖内ジスルフィド架橋を形成することが可能な毒、及び１〜３９番の番号が付けられたもの、及びＵ−ＡＣＴＸポリペプチドと名付けられたもの、及びそれらの変異体、及びこれらの特許の００２３段落〜００５５段落と図１に登場するペプチド。
【００６５】
本明細書で特定されているペプチドへの参照により記載され包含されるものは、述べられている配列の相同変異体であり、これらはそのような配列に対する相同性を有するか、本明細書で言及されており、これらは本明細書に記載の方法にかかる「変換」に好適であるとして特定もされ、特許請求もされている。これらには、本明細書に開示のいずれかの配列または参照により包含されるいずれかの配列と、少なくとも次の割合のいずれかの相同性を有する相同配列を含む全ての相同配列が含まれるが、これらに限定されない：上で記載した特許中で同定されているいずれか及びすべての配列、並びに本出願の配列表にあるそれぞれ及び全ての配列を含む本明細書で同定されている全てのその他の配列に対して、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％以上の相同性。本明細書で相同の、または相同性という用語が３０％以上などの数字と共に使用される場合は、これは２つのペプチド間のパーセント同一性あるいはパーセント類似性のことを意味する。相同の、または相同性が数字割合なしで使用される場合には、これは、局所的毒性及び１００％大きい長さもしくは５０％短い長さの範囲内の類似した大きさまたはペプチドなどの、共通の物理的側面及び機能的側面を共有している点で進化及び発生の観点で密接な関係がある２つのペプチド配列のことをいう。
【００６６】
上で言及したＵＳ及びＥＰの特許文献で述べられているいずれかの供給源由来の、本明細書で特定されているペプチドへの参照により記載され、包含されているものには、次のものが含まれるが、これらに限定されない。植物及び昆虫から単離された毒、ジョウゴグモ特にはオーストラリアジョウゴグモなどの、特にはクモ由来の毒、サソリ由来の毒、及び昆虫を捕食するもしくは昆虫からそれら自身を護る植物由来の毒であり、Ａｔｒａｘ属またはＨａｄｒｏｎｙｃｈｅ属中に見出される、これらから単離される、またはこれらから誘導される毒が含まれ、これらにはＨａｄｒｏｎｙｃｈｅ  ｖｅｒｓｕｔａあるいはブルーマウンテンジョウゴグモ、Ａｔｒａｘ  ｒｏｂｕｓｔｕｓ、Ａｔｒａｘ  ｆｏｒｍｉｄａｂｉｌｉｓ、Ａｔｒａｘ  ｉｎｆｅｎｓｕｓ属種が含まれ、これらには「アトラコトキシン」、「コアトラコトキシン」、「カッパ」アトラコトキシン、ω−アトラコトキシンとしても知られる「オメガ」アトラコトキシン、Ｕ−ＡＣＴＸポリペプチド、Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖｌａ、ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖｌａ、ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖｌｂ、または変異体もしくはバリアントとして知られている毒が含まれ、特にはこれらの種類のいずれかのペプチド及び特には約２００個未満のアミノ酸であるが約１０個超のアミノ酸であるもの、及び特には約１５０個未満のアミノ酸であるが約２０個超のアミノ酸であるペプチド、特には約１００個未満のアミノ酸であるが約２５個超のアミノ酸であるペプチド、特には約６５個未満のアミノ酸であるが約２５個超のアミノ酸であるペプチド、特には約５５個未満のアミノ酸であるが約２５個超のアミノ酸であるペプチド、特には約３７個、３９個もしくは約３６から４２個のアミノ酸のペプチド、特には約５５個未満のアミノ酸であるが約２５個超のアミノ酸であるペプチド、特には約４５個未満のアミノ酸であるが約３５個超のアミノ酸であるペプチド、特には約１１５個未満のアミノ酸であるが約７５個超のアミノ酸であるペプチド、特には約１０５個未満のアミノ酸であるが約８５個超のアミノ酸であるペプチド、特には約１００個未満のアミノ酸であるが約９０個超のアミノ酸であるペプチドが含まれ、これには２個、３個、及びまたは４個以上の鎖内ジスルフィド架橋を形成可能な本明細書で記載のあらゆる長さのペプチド毒が含まれ、カルシウムチャネルの電流を乱す毒が含まれ、カリウムチャネルの電流を乱す毒が含まれ、特には昆虫カルシウムチャネルまたはそのハイブリッドであり、特にはこれらの種類のいずれかの毒またはそのバリアント、並びに局所的な殺虫活性を有する本明細書に記載の毒のいずれかの種類の任意の組み合わせ、が含まれ、これらは本明細書に記載の方法によって「変換」することができる。
【００６７】
同じまたは異なるペプチドは本明細書に記載のペプチドと結合できることが理解されるべきである。形態１から形態への変換は内部変換であり、Ｎ及びＣ末端ペプチドは影響を受けず、そのためＮ及びＣ末端アミノ酸は、長い短いを問わず共有結合相手を有することができる。我々は、９００、８００、７００、６００、５００、４００、３００、２００、１００、５０、またはそれより少ないアミノ酸のペプチド結合体が述べられるのに加えて、最大１０００個のアミノ酸の大きさの結合相手も詳細に述べる。
【００６８】
オーストラリアジョウゴグモ、Ａｔｒａｘ属、及びＨａｄｒｏｎｙｃｈｅ属由来の毒性ペプチドが特に好適であり、本発明によって述べられる方法、手順、またはプロセスによって処理された場合によく機能する。これらのクモペプチドは、特には毒サソリペプチド及び毒性植物ペプチドなどの他の多くの毒ペプチドのように、本発明により述べられるプロセスによって処理された場合に局所的に活性または毒性になる。試験される好適なペプチドの例は、データと共に本明細書に示されている。上述の生物に加え、次の種も本発明のプロセスによる「変換」に好適な毒を有している場合がある。次の種は、Ａｇｅｌｅｎｏｐｓｉｓ  ａｐｅｒｔａ、Ａｎｄｒｏｃｔｏｎｕｓ  ａｕｓｔｒａｌｉｓ  Ｈｅｃｔｏｒ、Ａｎｔｒａｘ  ｆｏｒｍｉｄａｂｉｌｌｉｓ、Ａｎｔｒａｘ  ｉｎｆｅｎｓｕｓ、Ａｔｒａｘ  ｒｏｂｕｓｔｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ、Ｂｏｔｈｕｓ  ｍａｒｔｅｎｓｉｉ  Ｋａｒｓｃｈ、Ｂｏｔｈｕｓ  ｏｃｃｉｔａｎｕｓ  ｔｕｎｅｔａｎｕｓ、Ｂｕｔｈａｃｕｓ  ａｒｅｎｉｃｏｌａ、Ｂｕｔｈｏｔｕｓ  ｊｕｄａｉｃｕｓ、Ｂｕｔｈｕｓ  ｏｃｃｉｔａｎｕｓ  ｍａｒｄｏｃｈｅｉ、Ｃｅｎｔｒｕｒｏｉｄｅｓ  ｎｏｘｉｕｓ、Ｃｅｎｔｒｕｒｏｉｄｅｓ  ｓｕｆｆｕｓｕｓ  ｓｕｆｆｕｓｕｓ、Ｈａｄｒｏｎｙｃｈｅ  ｉｎｆｅｎｓａ、Ｈａｄｒｏｎｙｃｈｅ  ｖｅｒｓｕｔａ、Ｈａｄｒｏｎｙｃｈｅ  ｖｅｒｓｕｔｕｓ、Ｈｏｌｏｌｅｎａ  ｃｕｒｔａ、Ｈｏｔｔｅｎｔｏｔｔａ  ｊｕｄａｉｃａ、Ｌｅｉｕｒｕｓ  ｑｕｉｎｑｕｅｓｔｒｉａｔｕｓ、Ｌｅｉｕｒｕｓ  ｑｕｉｎｑｕｅｓｔｒｉａｔｕｓ  ｈｅｂｒａｅｕｓ、Ｌｅｉｕｒｕｓ  ｑｕｉｎｑｕｅｓｔｒｉａｔｕｓ  ｑｕｉｎｑｕｅｓｔｒｉａｔｕｓ、Ｏｌｄｅｎｌａｎｄｉａ  ａｆｆｉｎｉｓ、Ｓｃｏｒｐｉｏ  ｍａｕｒｕｓ  ｐａｌｍａｔｕｓ、Ｔｉｔｙｕｓ  ｓｅｒｒｕｌａｔｕｓ、Ｔｉｔｙｕｓ  ｚｕｌｉａｎｕと命名されている。上に列挙した属のいずれか由来のあらゆるペプチド毒はいずれも、本方法の方法にかかる「変換」用であるとみなされるであろう。
【００６９】
本明細書における実施例は、本発明を限定することを意図しておらず、またそのために使用されるべきではない。これらは本発明を例示するためのみに示されている。
【００７０】
上で述べたように、多くのペプチドが変換に適した候補である。上、以降、及び配列表に記載されている配列は、変換することができる特に適したペプチドである。これらのペプチドのいくつかは、以下の実施例に記載されているような本明細書に記載の手順に従って「変換」された。
【００７１】
配列番号６０（１文字コード）
【化１】
0006800752.tif 000002
【００７２】
配列番号６０（３文字コード）
【化２】
0006800752.tif 000003
「ω−ＡＣＴＸ−Ｈｖｌａ」という名前であり、４−１８、１１−１２、及び１７−３６の位置にジスルフィド架橋を有する。分子量は４０９６である。
【００７３】
配列番号１１７（１文字コード）
【化３】
0006800752.tif 000004
【００７４】
配列番号１１７（３文字コード）
【化４】
0006800752.tif 000005
「ω−ＡＣＴＸ−Ｈｖｌａ＋２」という名前であり、６−２０、１３−２４、１９−３８の位置にジスルフィド架橋を有する。分子量は４１９９である。
【００７５】
配列番号１１８（１文字コード）
【化５】
0006800752.tif 000006
【００７６】
配列番号１１８（３文字コード）
【化６】
0006800752.tif 000007
「ｒκ−ＡＣＴＸ−Ｈｖｌｃ」という名前であり、５−１９、１２−２４、１５−１６、１８−３４の位置にジスルフィド架橋を有する。分子量は３９１２．１５である。
【００７７】
配列番号１１９（１文字コード）
【化７】
0006800752.tif 000008
【００７８】
配列番号１１９（３文字コード）
【化８】
0006800752.tif 000009
「ｒＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖｌａ（「ハイブリッド」）＋２」という名前であり、５−２０、１２−２５、１９−３９の位置にジスルフィド架橋を有する。分子量は４５７０．５１である。
【００７９】
以下の実施例は例示を意図するものであり、更に詳しく書かれた説明を与え、本開示をサポートする。これらは本開示または請求項の限定を意図するものではない。
【実施例】
【００８０】
［実施例に関する一般情報］
配列番号１１９は、ＧＳＱＹＣＶＰＶＤＱＰＣＳＬＮＴＱＰＣＣＤＤＡＴＣＴＱＥＲＮＥＮＧＨＴＶＹＹＣＲＡである。配列番号１１９は４１個のアミノ酸を有している。適切に折り畳まれた場合、これは３つのジスルフィド結合を有する。これは、Ｃ１８５Ｈ２７６Ｎ５６Ｏ６８Ｓ６の元素組成を有する。配列番号１１９は、「＋２ハイブリッド」、「ハイブリッド＋２」、または「プラス２ハイブリッド」と呼ばれる場合がある。
【００８１】
配列番号３７は、ＱＹＣＶＰＶＤＱＰＣＳＬＮＴＱＰＣＣＤＤＡＴＣＴＱＥＲＮＥＮＧＨＴＶＹＹＣＲＡである。配列番号３７は３９個のアミノ酸を有しており、これらは配列番号１１９にある３９個の「Ｃ」末端側アミノ酸と同じである。配列番号３７は「ネイティブ」または「ネイティブハイブリッド」または「ネイティブハイブリッドペプチド」と呼ばれる場合がある。
【００８２】
配列番号１１９のＮ−末端アミノ酸は「Ｇ」、グリシン、すなわちＧｌｙである。配列番号１１９の２つのＮ末端アミノ酸は「ＧＳ」であり、これらのアミノ酸は配列番号３７のＮ−末端部分ではない。配列番号３７のＮ−末端は「Ｑ」、すなわちグルタミンである。
【００８３】
配列番号３７のように、グルタミン、ＱすなわちＧｌｎで終わる配列はグルタミンからピログルタミン酸へと自然に環化することが可能である。反応は、迅速に、自然に生じることができ、熱または酸を加えることを必要としない。ペプチド中でこのアミノ基のＮ−末端環化が時々生じることは知られており、これによってペプチドは１７質量単位、原子単位、つまりダルトンを失うことになり、これは環化によってＮＨ３の１７ダルトンを失うことに対応する。我々は、この反応を「ＮＨ３反応」と呼び、これは我々が「変換」と呼ぶものではない。我々はこの反応について、以下の実施例５でより詳細に説明する。
【００８４】
我々は、配列番号３７のような毒性ペプチドに熱をかけた場合に全く異なる反応が起こると考えており、我々はこの反応を「変換」または「２Ｈ＋Ｏ反応」という。全く異なる反応である「変換」によって、ペプチドの活性は驚異的に増加し、このペプチドはＮＨ３反応を経たペプチドに生じるものと比較して異なる特性を有する。
【００８５】
「変換」による活性の増加をほぼ５倍すなわち５×にすることができ、データは下に示されている。毒性ペプチドが、我々が本明細書で述べている「変換」条件のいずれか、すなわち熱、圧力、蒸気、水溶液に関しての酸条件に曝された場合、我々は「２Ｈ＋Ｏ反応」によって活性が増加したペプチドが得られると考えている。
【００８６】
「変換」、すなわち「２Ｈ＋Ｏ反応」によって、反応が出発する前よりも水分子が１つ少ない化合物が得られる。以降で我々は、「変換」で得られたペプチドが、Ｈ２Ｏ１つ分少ない、すなわち１８ダルトン少ないペプチドとなり、本質的に脱水されるが、「変換」される前のペプチドよりも遥かに頑丈で毒性のペプチドでもあることを示すデータを提示する。これは、本明細書では形態１またはピーク１と呼ぶ元の形態が、「変換」された形態２のペプチドと比較して１８ダルトン多くなるようなペプチド変化の形態である。
【００８７】
マススペクトルによって、２Ｈ＋Ｏ反応はＮＨ３反応と同じではなく、２Ｈ＋Ｏ反応によってＮＨ３の１７ダルトンではなくＨ２Ｏの１８ダルトンに対応する１８ダルトンが失われることが示されることが証明される。我々は実施例１において２Ｈ＋Ｏ反応でＨ２Ｏのダルトンを失うことを示し、実施例５でＮＨ３の１７ダルトンを失うことを示す。
【００８８】
＜実施例１＞
マススペクトルグラフのピーク１／形態１及びピーク２／形態２。図１〜４では、以下に示される説明文及び記載と共に配列番号１１９のマススペクトルグラフが示されており、これは２つの明瞭なピークを有している。この２つのピークは、太字の大きい数字と、数字を指す括弧状の矢印で特定されている。我々は、この２つのピークをピーク１及びピーク２という。これらの図中のスペクトルは、ＷａｔｅｒｓのＮａｎｏＡｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣシステムで、オンラインでＷａｔｅｒ／Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ四重極−飛行時間型（Ｑ−Ｔｏｆ  Ｐｒｅｍｉｅｒ）質量分析計を使用して生成し、分析した。
【００８９】
図１はピーク１が１１．８４にあることを示す矢印を有するマススペクトルを示す。
【００９０】
図２は、図１に示されているピーク１のデコンボリューションされたスペクトルでの、配列番号１１９のマススペクトルであり、デコンボリューションされた図１のピーク１は４５６２．８８９６の値を有する。
【００９１】
図３はピーク２が１２．８２の数字であることを示す矢印を有するマススペクトルを示す。
図４は、図３に示されているピーク２のデコンボリューションされたスペクトルでの、配列番号１１９のマススペクトルであり、４５４４．８８３８の質量値を有する。
【００９２】
図１〜４は、ピーク１とピーク２の差が１８ダルトンあるいは２Ｈ＋Ｏであることを示している。
【００９３】
図２と図４の２つの質量値をお互い差し引くと、４５６２．８８９６−４５４４．８８３８＝１８．００であり、その値は水分子の質量値に相当する１８である。ピーク２はペプチドの「脱水形態」、またはペプチドラクトン、または形態２とも呼ばれる。ラクトンは、パート２の始まりとして定義される。ピーク２は、ピーク１を示す構造と比較した場合にペプチドがその構造から水分子が失われた形態を成したことを示した。
ペプチド並びにピーク１及びピーク２によって示されるその形態は単離され、その活性が比較された。以下の実施例に、ペプチドのピーク１、形態１、ネイティブ、酸形態、ペプチド酸、元の、「変換」前、未変換、または「変換」されてない形態、のいずれかとして呼ばれる元々の形態の活性の比較が示されている。形態１は、パート２で規定されているラクトンのような形態２あるいはラクトン形態あるいはペプチドラクトンへと変わるために熱をかけられるか酸性化される形態あるいは酸形態である。これらの実施例のいくつかでは、熱処理は２１ｐｓｉ、約１２１℃で２０分のオートクレーブ処理である。あるいは、ペプチドが液体の形態の場合には、これはペプチドを、ピーク２、形態２、ラクトン形態、ペプチドラクトン（ラクトンはパート２で定義される）、ペプチドの脱水形態、またはペプチドの「変換」された形態、のうちのいずれかとして呼ばれるものへと「変換」するために７．０未満のｐＨに下げることを意味する。
【００９４】
＜実施例２＞
飼料混入試験。図５のグラフは、ピーク２で示されるラクトン形態のペプチドの、あるいはペプチドラクトンの、処理後の、あるいは「変換」された、ペプチドの毒性と比べた、元の形態、ピーク１、ペプチド酸、未変換、のペプチドの毒性の比較を示している。両方の形態は対照とも比較される。図５は、空腹の幼虫に対照の飼料または処理した飼料を与えた後の１日目、２日目、３日目、及び４日目の幼虫死亡率（１００％は１６匹すべての幼虫が死亡）を示している。この試験で使用されたペプチドは配列番号１１９であり、これらは粉末６１８または６１８ハイブリッド粉末（両方の語は同じ意味である）と呼ばれる噴霧乾燥粉末に製剤された。飼料中に２ｐｐｔ（１０００分の１）相当の用量割合で昆虫に投与した。ピーク１は「変換」または処理前の元のペプチドである。これは、「従来型６１８」、または単に６１８粉末もしくは乾燥粉末とも呼ばれる。ピーク２は、「変換」あるいは処理後の、この場合では１２１℃、２１ｐｓｉ（すなわち高温、蒸気、及び圧力）で２０分間のオートクレーブ処理後のペプチドである。ピーク２は、図５で「オートクレーブ処理された６−１８乾燥粉末」と名付けられている。図５は、水平軸すなわちＸ軸上の各数字に対して３つの組のデータすなわち棒についての、棒グラフの形態でのデータを示している。この数字は試験に使用した昆虫（ジュウイチホシウリハムシ（ｓｏｕｔｈｅｒｎ  ｃｏｒｎ  ｒｏｏｔｗｏｒｍ（ＳＣＲ））と呼ばれる実際の昆虫）に餌を与えた後の日数であり、試験は、幼虫期に対して行われた。各試験を始めるために１６匹の昆虫の幼虫が使用された。凡例が図５に示されており、これは、４日目の上の３つ組の棒の右にある４日目の上に見られる大きい暗い棒が、形態２のペプチドラクトンを昆虫に与えた結果であることを説明している。マススペクトルのピーク２は、ペプチドの「変換」された形態２、ペプチドラクトンの形態である。図５において、４日目のピーク２である黒い棒は、ペプチドの「変換」された形態２を幼虫に摂取させたことによる死亡率を示している。この事例では、形態２は形態１をオートクレーブ処理することによって「変換」された。４日目では、形態１、ペプチド酸、またはネイティブのもしくは未変換のペプチドについては約２２％の死亡率なのに対し、形態２、ペプチドラクトンは９５％のレベルのウリハムシ死亡率である。４日目の対照は５％未満の死亡率である。幼虫には、未処理の昆虫飼料すなわち対照も与えられた。これは、図５の細かいグレーのクロスハッチであるそれぞれの日の１番目の棒である。より大きい白と黒のクロスハッチ模様の２番目の棒は、マススペクトルのピーク１によって示される「変換」前のペプチドである形態１のペプチドの餌が与えられた幼虫についてのデータを示している。微細な暗色の棒の３番目の棒は、マススペクトル分析のピーク２によって示される形態２の餌が与えられた幼虫についてのデータを示している。餌を与えた後の１〜４日目が示されており、ほとんどの死亡が４日目に生じている。Ｙ軸は死亡した幼虫の割合を示しており、初めに１６匹の生きている幼虫が使用された。
【００９５】
昆虫に餌を与えて４日後、従来型６１８（「変換」前）とオートクレーブ処理された６１８（「変換」後）の死亡率の違いは顕著になった。オートクレーブ処理することで、幼虫が処理された餌を食べた後の死亡がより素早く迅速になった。６１８乾燥粉末形態１、ネイティブのペプチド、あるいは「変換」されていないペプチド、形態１が約２２％であるのに対し、形態２で処理されて死亡した昆虫の数は約９５％である。通常のペプチドをオートクレーブ処理しても予想のようにはハイブリッドタンパク質は不活性化せず、代わりにその活性が向上した。この効能における劇的な変化には複数の理由が存在するであろう。
【００９６】
方法：昆虫：ＳＣＲは、Ｃｒｏｐ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ（ミシガン州ファーミントン）から購入される。昆虫は濾紙上の「孵化間近」なものとして受け取った。昆虫は室温（２６Ｃ）で孵化させ、これらが出荷の際に入っていたプラスチック袋に入れたままにした。昆虫は１〜２日後に孵化し、これを孵化した日に分析のために使用した。
培地：ＳＣＲの幼虫の飼料は、Ｂｉｏｓｅｒｖｅ（製品番号Ｆ９８００Ｂ、ニュージャージー州フレンチタウン）から購入した。１００ｍＬの飼料を作るため、１００ｍＬの脱イオン水を１．４４ｇの準備された寒天と共に沸騰させる。寒天が完全に溶解するまで溶液を沸騰させる。その後、１３．２８ｇの飼料と４６０μｌのＫＯＨを添加し、培地を温かい撹拌プレート上で均一になるまで混合する。その後、培地を２０ｍＬずつ分割し、水浴中で６５Ｃまで冷却する。
【００９７】
処理：６１８処理は、２５％ＡＩの計算を使用して準備した。２６０ｍｇの粉末を６．５ｍＬの水と混合することにより１０ｐｐｔの溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）を作製した。溶液を十分に混合し、必要であれば全ての粉末を完全に溶解させるために超音波をかける。２００ｍｇの６１８粉末を上部にスクリューがついたガラス瓶の中に入れた。その後、キャップをゆるめた状態で２０分間、ドライサイクルで粉末をオートクレーブにかけた。オートクレーブサイクルの後、粉末はいくらかの液体を吸収していた。その後、５ｍＬの水を粉末に添加し、溶解させるためによく混合した。その後、５ｍＬの水または処理物を２０ｍＬの６５Ｃの飼料に添加し、よく混合し、その後１ｍＬのＤＩを、繰り返しピペットを使用してバグコンド（虫用マンション、Ｂｉｏｓｅｒｖｅの製品番号ＢＡＷ１２８）の各ウェルへ移し、冷ました。
【００９８】
その後、培地が冷めて固まった後（２０分）、ＳＣＲを移すために絵筆を用いて、１つのウェル当たり１匹の昆虫を入れた。その後、ウェルを穴の開いた蓋（Ｂｉｏｓｅｒｖｅの製品番号ＢＡＣＶ１６）で密閉し、昆虫実験室の照明付カートの上に置いた。
【００９９】
＜実施例３＞
バイオアッセイの比較。バイオアッセイ比較の結果は表６及び７に示されている。ピーク１及びピーク２は、図１〜４に示されている試験を行うために使用されたものと同様に、別個に用意され、別個に液体クロマトグラフィーカラムから単離された。配列番号１１９のペプチドはこの比較のために使用された。「変換」前ピークであるピーク１、または「変換」後ピークであるピーク２のいずれかを取り出して測定された濃縮物を作り、その後、これを注射によってイエバエに投与した。ＬＤ５０すなわちハエの５０％致死量は、ｐｍｏｌ／ｇの濃度として決定された。ハエは１２〜２０ｍｇの重さであった。各試料に１０匹のハエが存在した。ピーク１の形態とピーク２の形態の分子量の差は、基準のｐｍｏｌ／ｇ溶液を調製する際に考慮しなかった。ＬＤ５０溶液を形成する全ての溶液は、我々が「スーパーＬＣ」またはスーパーリキッド濃縮物と呼ぶものから、ＲｐＨＰＬＣすなわち逆相高圧液体クロマトグラフィーを使用して製造した。
【０１００】
図６は、液体クロマトグラフィーによって各ピークフラクションが別々に用意された、ピーク１とピーク２のバイオアッセイの比較である。ピーク１のバイオアッセイの結果が示されている。
【０１０１】
図７は、液体クロマトグラフィーによって各ピークフラクションが別々に用意された、ピーク１とピーク２のバイオアッセイの比較である。ピーク２のバイオアッセイの結果が示されている。
【０１０２】
致死量５０としてのバイオアッセイの比較の結果は、下の表１に示されている。
【０１０３】
【表１】
0006800752.tif 000010
【０１０４】
＜実施例４＞
安定性ｐＨ試験。これは、安定性とｐＨの試験の両方であった。これは、「変換」前すなわち形態１と、「変換」後すなわち形態２のペプチドとを比較する。この試験は配列番号１１９のペプチドを使用した。この試験は、熱に加えて、ｐＨを下げると、すなわち酸またはｐＨを７以下にするための任意の手段によってペプチド溶液のｐＨを下げると、形態１から形態２へのペプチドの「変換」が増加する結果になることを示す。
安定性ｐＨ試験の結果は図８〜１０に示されている。
【０１０５】
図８は、ｐＨ５．６における配列番号１１９のマススペクトルである。図９はｐＨ３．９における配列番号１１９のマススペクトルである。図１０はｐＨ８．３における配列番号１１９のマススペクトルである。図８、９、及び１０はピーク１及びピーク２を示しているが、具体的に同定していない。３つすべての図で、ピーク１はピーク２の左側であり、これらは共に図の中で大きなピークである。これらの３つの図、図８、９、及び１０は、この試験で得られる結果のマススペクトルの典型である。これらの図からのデータ及び他のデータが下の表２〜７に示されている。ピーク１はピーク２の前に溶出する。図８では、２つのピークの高さはほぼ同じである。図９では、ピーク２の方がピーク１より高い。図１０では、ピーク１の方がピーク２より高い。この試験中の全ての試料は、２ｍＬのｐＨ２またはｐＨ１０の緩衝液を２ｍＬのスーパーリキッド濃縮物（５４ＰＰＴ）に添加することによって調製した。試料はＡｇｉｌｅｎｔのＨＰＬＣで分析した。
５μＬの注入体積を用いた。結果は下に記載されている。
【０１０６】
【表２】
0006800752.tif 000011
【０１０７】
【表３】
0006800752.tif 000012
【０１０８】
【表４】
0006800752.tif 000013
【０１０９】
【表５】
0006800752.tif 000014
【０１１０】
【表６】
0006800752.tif 000015
【０１１１】
【表７】
0006800752.tif 000016
【０１１２】
この試験は、「変換」前のペプチド形態１であるピーク１と、「変換」されたペプチド形態２であるピーク２の、これらが水溶液から取り出され、様々なｐＨすなわち様々な酸性レベルに調整された後のピークを示している。この試験によって、溶液中では形態１から形態２への移動は困難であり、ほとんどないか、自然には生じないことが明らかになる。ペプチドの形態は、ｐＨが７．０以下、好ましくは６．０以下、より好ましくは５．０、４．５、４，０、３．５、３．０、２．５、２．０またはそれ以下にならない限りは変換されず、３．２〜３．５〜３．８及び３〜４の間の全てのｐＨ値が好ましい。この試験はｐＨが低いほど、より速く形態１が形態２へと変換されることも明らかにする。形態２はペプチドの脱水された、または２Ｈ＋Ｏ少ない、または１８ダルトン少ない形態である。
【０１１３】
＜実施例５＞
「変換」なしのアイソフォーム。我々は、配列番号１１９が高温で分子量中の１８ダルトンを失ってアイソフォームを形成し得ることを示した。実施例２では、我々は粉末としての配列番号１１９の元々の形態、形態１を、形態２に「変換」するためにオートクレーブ処理し、これをジュウイチホシウリハムシの幼虫群の飼料に添加することによって試験した場合に、殺虫効果が約５倍に増加することを示した。しかし、ハイブリッドペプチドである配列番号１１９におけるこの変形は、天然型ペプチドである配列番号３７のようなペプチドでは注目されていなかった。配列番号１１９とは対照的に、配列番号３７にはＮ末端Ｇｌｎが存在し、これはそれ自体がＮＨ３を失って、すなわち分子量中の１７ダルトンを失ってＮ−Ｐｙｒへと環化する場合がある。これら２つの化学的変性、Ｈ２Ｏを失うこととＮＨ３を失うことは、これらの２つのプロセスで失う分子量が非常に近いことから区別することは困難である。我々は、これらの化学的変性の両方が配列番号３７のような配列（我々はこれを天然型ハイブリッドペプチドとも呼ぶ）に生じ得るかどうかを評価するために、分析用ＨＰＬＣと高感度ＴＯＦ  ＬＣ／ＭＳ法を使用した。以下のデータは、このプロセスについて我々が本明細書で記載しているような適切な条件に置いた場合に天然型ハイブリッドペプチドに「変換」が生じ得るかを示している。
【０１１４】
材料及び方法。配列番号３７は、ハイブリッドＡＣＴＸ−Ｈｖｌａ  Ｋ．ラクティス株、ｐＬＢ１２Ｄ−ＹＣＴ−２４−１から作られた。Ｏｎｙｘ１００モノリス型Ｃ１８ＨＰＬＣカラムを備えたＡｇｉｌｅｎｔ  ＨＰＬＣシステムを使用して、配列番号３７のペプチドの生成及びアイソフォームの形成を分析した。
【０１１５】
ＬＣ−ＭＳシステムは、ＳＭＩＣのＬａｕｎｃｈ  ＭＩ  Ｌａｂにあり、Ｗａｔｅｒｓ  ＮａｎｏＡｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣシステムとオンラインで結ばれた、Ｗａｔｅｒｓ／Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ四重極飛行時間型（Ｑ−Ｔｏｆ  Ｐｒｅｍｉｅｒ）質量分析計からなる。試料は０．１％のギ酸水溶液で１：５０に希釈した。
【０１１６】
（方法Ａ）
５μＬの試料を、流速５μｍ／分でＷａｔｅｒｓ  ＢＥＨ１３０  Ｃ−１８  Ｓｙｍｍｅｔｒｙカラム（０．３ｍｍＩＤ×１５ｃｍ）に注入した。０．１％の移動相Ｂ（０．１％のギ酸が入った水）から４０％の移動相Ｂ（０．１％のギ酸が入った１００％アセトニトリル）まで２５分かけて直線的な濃度勾配をかけ、２５．５分で８５％のＢ、２７．５分で８５％のＢ、そして２８分で０．１％のＢとすることで逆相分離を行った。
【０１１７】
（方法Ｂ）
１０〜３０μＬμＬの試料を、流速１ｍＬ／分でＷａｔｅｒｓ  Ｃ−１８  Ｘ−Ｂｒｉｄｇｅカラム（４．６ｍｍＩＤ×５０ｍｍ）に注入した。９９％の移動相Ａ（０．１％のギ酸が入った水）から９５％の移動相Ｂ（０．１％のギ酸が入った１００％アセトニトリル）まで６分かけて直線的な濃度勾配をかけ、１１分で９５％のＢ、１１．２分で１％のＢで、１５分かけて逆相分離を行い、全体の実行時間は１８分であった。
【０１１８】
カラムの溶出物は、エレクトロスプレーイオン化源による質量分析計によってサンプリングされた。装置の制御並びにＭＳ及びＭＳ／ＭＳデータの取得のためにＷａｔｅｒｓ  Ｍａｓｓｌｙｎｘ  ４．１ソフトウェアを用いた。多価イオンをデコンボリューションするためにＭａｓｓｌｙｎｘ中のＭａｘＥｎｔ３アルゴリズムを使用し、モノアイソトピックなＭ＋Ｈの質量値を計算した。
【０１１９】
（方法Ｃ）
ＬＣ−ＭＳシステムは、エレクトロスプレーイオン化源を備えたＷａｔｅｒｓ／ＭｉｃｒｏｍａｓｓＺＱスペクトロメーターから構成された。試料は、流速１ｍＬ／分でＺｏｒｂａｘ  ＳＢ−Ｃ１８カラム（２．１×３０ｍｍ）に注入した。逆相分離は、ダイオードアレイ検出器（２１０〜３００ｎｍ）を使用して、９６％の移動相Ａ（０．１％のギ酸が入った水）から９８％の移動相Ｂ（０．０７％のギ酸が入った１００％アセトニトリル）まで直線的な濃度勾配をかけることにより３．１分かけて行った。
【０１２０】
結果及び考察。配列番号３７、別名天然型ハイブリッドペプチドの製造、ｐＬＢ２４−ＹＣＴ−２４−１株の製造は、炭素源として２％のソルビトールが添加された合成培地で、２３．５Ｃで６日間培養した。細胞を除去した後にならし培地を集めた時、ＯＤ６００は３０に到達していた。ならし培地３００μＬをＡｇｉｌｅｎｔ  ＨＰＬＣ分析システムに注入したところ、天然型ハイブリッドペプチドの収率は１６４ｍｇ／Ｌと決定された。
【０１２１】
天然型ハイブリッドアイソフォームのＡｇｉｌｅｎｔ  ＨＰＬＣ評価。それぞれ３００μＬのロード量で、Ａｇｉｌｅｎｔ分析用ＨＰＬＣで分析する前に、集めた天然型ハイブリッドのならし培地を、４Ｃ、室温（約２３Ｃ）、及び５０Ｃで２４時間処理した。異なる温度で処理された天然型ハイブリッドペプチド試料のＨＰＬＣクロマトグラフが図１１に示されている。３つのＨＰＬＣピークは、温度によってそのＵＶ吸光度が変化し、これらは４．２分、５．４分、６．９分の保持時間と同定された。我々は、ピーク１が少なくとも疎水性のアイソフォームであり、ピーク３が最も疎水性のアイソフォームであると考えている。
【０１２２】
形態１を示唆するピーク１は、最初は最も多く存在するアイソフォームであったが、ピーク１／形態１は時間がたつ及び高温になるにつれて、ピーク２とピーク３のアイソフォームへと転換し得る。我々は、５０℃で２４時間処理すると、ほとんどのピーク１が消失（わずか５．６％まで）することを示す。逆に、ピーク２とピーク３のアイソフォームは温度と共に増加し、温度が高くなるにつれその増加は早まる。
【０１２３】
図１２は、天然型ハイブリッドペプチドのアイソフォームのＴＯＦ  ＭＳ評価（飛行時間型質量分析）の結果を示している。結果は、ベースピーク強度（ＢＰＩ）クロマトグラフの形態で示されている。図１１のピーク１、ピーク２、及びピーク３を同定するために、ＲＴ処理をした天然型ペプチドのならし培地を用いて飛行時間型質量分析を行った。飛行時間型ＭＳは、ＭＳ装置から生じるアイソトピックｍ／ｚ比を分離することができ、そのためこのＭＳ法はペプチドのモノアイソトピック分子量を検出することができる。天然型ハイブリッドの理論的なモノアイソトピック分子量は４４１７．８１２である。ＴＯＦ  ＭＳによって、ならし培地試料中の天然型ハイブリッドペプチドの４つのアイソフォームが検出された。
【０１２４】
ＴＯＦ  ＭＳによって検出された１つのアイソフォームは４４１７．６８２６の分子量のものであり、これは「ネイティブ」な天然型ハイブリッドペプチド、すなわち未変性の天然型ハイブリッドを表し、これは図１１のピーク１及び図１２のピーク１としてラベリングされる。
【０１２５】
検出された２つ目のアイソフォームは４３９９．６４５５の分子量を有していた。このアイソフォームは「ネイティブ」なアイソフォームから分子量を１８ダルトン失っており、これは水分子を失ったことを示唆している。このＨ２Ｏを失ったアイソフォームは、図１１ではラベリングされず、図１２のピーク４としてラベリングされる。
【０１２６】
検出された３つ目のアイソフォームは４４００．６６６０の分子量を有していた。このアイソフォームは「ネイティブ」なアイソフォームから分子量を１７ダルトン失っており、これはＮＨ３を失ったようである。このＮＨ３を失ったアイソフォームは、図１１のピーク２、及び図１２のピーク２としてラベリングされる。ＴＥＰ融合ハイブリッド＋２の以前の研究から、Ｎ−ＧｌｎペプチドはＮＨ３を失いつつＮ−ピログルタミン酸へと自然に環化するであろう。したがって、天然型ハイブリッドペプチドはＮ−Ｇｌｎを有していることから、３番目のアイソフォームはＮ−ＧｌｎがＮ−Ｐｙｒへと環化したペプチドを表し、これは図１２のピーク２として示されている。
【０１２７】
４つ目のアイソフォームは、Ｈ２ＯとＮＨ３の両方の分子を失うことの組み合わせであり、その結果４３８２．６３１３の分子量のアイソフォームとなる。このＨ２ＯとＮＨ３の両方を失ったアイソフォームは、図１１のピーク３、及び図１２のピーク３としてラベリングされる。
【０１２８】
これらの結果は、Ｎ−末端グルタミンのピログルタミン酸への環化と、脱水反応の、天然型ハイブリッドペプチド分子中で可能な少なくとも２つの化学的変性が存在することを示している。ＴＯＦ  ＭＳベースピーク強度クロマトグラフからは、Ｈ２Ｏだけ失われたアイソフォームはほとんど検出されなかった。これは、３つのピークしか検出されなかったＨＰＬＣ評価と一致する。Ｈ２Ｏ分子を失うことによってペプチドをより疎水性にすることができ、ＮＨ３を更に失うことにより、ペプチドを一層疎水性にすることができる。我々は、Ｈ２Ｏが失われると、ＨＰＬＣクロマトグラフにおいて天然型ハイブリッドのピークがより遅い保持時間にシフトすると予測することができる。Ｈ２ＯとＮＨｙの両方を失われると、ピークが更に遅い保持時間へと一層シフトするであろう。
【０１２９】
「パート２」
パート１では、我々は、そのネイティブな状態すなわち我々が形態１と呼ぶペプチドから、我々が形態２と呼ぶ有用な状態へと変換するために、温度、圧力、強い及び／または弱い酸などの機械的または化学的手段で毒性ペプチドを人工的に操ることが可能な方法を述べている。形態２の構成は、本明細書では「カルボニル」、「活性化カルボニル」、「ラクトン」、「ラクトン状」、及び／または「ラクトン状形態」と呼ばれる場合がある。この文書では、我々は通常この形態２の構成を単にラクトンまたはペプチドラクトンと呼ぶ。この文書中ではこれらの化合物の構造は辞書的定義を有しておらず、ここで我々が述べる特性によってこれらは定義される。ここで、「ラクトン」は、われわれが形態２の化合物に起因すると考える特性を有する。これらの化合物はラクトンのように反応することから、我々は、「ラクトン」及びペプチド「ラクトン」という語を使用する。我々はこれらの製造方法、これらの同定方法、これらの単離方法、及びこれらの使用方法を述べる。我々は、これらのペプチドラクトンがネイティブなペプチドよりも生物学的に活性であり、これらが非常に有用かつ多用途であることを示すためのデータを提示する。これらは他の有益な化合物の製造に使用可能な安定な中間体である。パート２では、我々はペプチドラクトンを、様々な他の化合物を製造するための安定な中間体として有用な２つの異なる安定な活性化合物にする方法を示す。
【０１３０】
パート２では我々はペプチドヒドラジド、ペプチドヒドラゾンについて述べ、我々はこれらの製造方法及び使用方法を教示する。ヒドラジドあるいはペプチドヒドラジドは、パートＩのペプチドラクトンとヒドラジンとの反応によって生じる。我々が述べる他の安定な中間化合物は、我々がヒドラゾンまたはペプチドヒドラゾンと呼ぶものである。ペプチドヒドラゾンは、ペプチドヒドラジドとカルボニル化合物との反応により生じる。ペプチドヒドラゾンについて特に有用なことは、これらがアルキル鎖及びまたはペグ化生成物などの他の有用な部位と共有結合することができ、その結果、様々な目的のために使用できることである。これら目的のいくつかについては我々がここで述べる。我々が述べるような方法でアルキル化タンパク質を形成する能力は非常に有用である。我々が述べるような方法でペグ化タンパク質を容易に製造する能力は、おそらく更に有用である。ペグ化タンパク質は、タンパク質の免疫原性を低下させるため、タンパク質の代謝を減らすため、及びタンパク質のバイオアベイラビリティを増加させるために使用されてきた。我々は、最初にここで開示する我々の技術が、非常に高い価値を有するペグ化タンパク質を作るために使用できると考えている。これらの技術は、以前に可能だったものよりも、より容易に、迅速に、且つ低コストで、アルキル化及びペグ化タンパク質並びに他の種類のタンパク質を製造するために使用することができる。ペグ化により強化される１つのタンパク質はインシュリンである。
【０１３１】
我々は、ペプチドラクトン、ペプチドヒドラジド、及びペプチドヒドラゾンを実証することができ、これらは「ペプチド中間体」、新規な、化学的に安定な、実施例１１のＰＥＧ４ケトン（ＶＩＩＩ）のように他の化合物と反応させるために使用される化学的に有用な化合物でもあり得るし、またこれらはペグ化ペプチドまたは実施例１１のペグ化ペプチドヒドラゾン（実施例１１ではペグ化されていない同様の毒性ペプチドよりも大きい活性を有する新規なペグ化毒性ペプチドヒドラゾンが示されている）のように最終製品でもあり得る。ペプチドラクトン及びペプチドヒドラジドは、これらのペプチドまたはペプチド酸に官能基が付加される部位である単一の別個の部位を与える。ペプチド及び毒性ペプチド製品及び中間体は、特徴的な化学を有する単一の別個の結合手を付与して合成分子もしくは生体分子をより有用かつ機能性にする。例えば、この化学によって、ポリペプチドの１つの部位でペグ化鎖によって一官能化することが可能である。もう１つの例は、これによって過ヨード化消化グリコシル化ペプチドまたは他の炭化水素などのペプチドまたはペプチド酸上の１つの別個の部位で分子と１つの連結が可能なことである。これらのペプチド中間体は、幅広い製品の製造に使用することができる。我々はこれらの毒性ペプチド中間体が有用であり、良好な活性を有し、典型的な毒性ペプチドよりも多くの反応の選択肢を与えることを示す。我々は、ペグ化毒性ペプチドは、ペグ化されていないペプチドよりもずっと活性であることを理解している。
【０１３２】
ＰＥＧ化すなわちペグ化は、ペプチドのポリエチレングリコール及び／またはポリプロピレングリコールすなわち（ＰＥＧ）への連結である。ペプチドに連結すると、各ＰＥＧサブユニットは２個または３個の水分子と固く会合するようになり、これは、ペプチドの水への溶解度を上げることと、その分子構造をより大きくすることの２つの機能を有する。タンパク質ペグ化の最初の生成では、ＰＥＧはタンパク質上のリシンやＮ末端アミンなどの複数の可能な部位のうちの１つ以上と結合する。この手法での問題は、変性されたペプチドの集団が、異なる数の連結したＰＥＧを有する分子のみならず、異なるリシンに結合したＰＥＧを有する分子の混合物も含み得ることである。この変性の多様性は最終製品の純度を下げ、また再現性を低くする。
【０１３３】
より制御された方法でタンパク質にＰＥＧを付加するために使用される、２つの他のより最新の手法が基本的に存在し、これは、Ａ）より反応性が高くなるようにＰＥＧを改造する、またはＢ）ＰＥＧとの連結のための特別な部位が設けられるようにタンパク質を改造する、のいずれかである。
【０１３４】
ＰＥＧを改造する、ＰＥＧ法タイプＡ）は、１９７９年１２月１８日に発行されたＤａｖｉｓらのＵＳ４，１７９，３３７に記載されており、これは参照により本明細書に包含され、特にはペグ化に好適なポリマーの記載に関して包含される。この特許には、末端基を変更すること、またはペプチドへの活性を有する連結基をペプチドに付加すること、のいずれかによってポリマーの一端を修正し、その活性化したポリマーとペプチドとを反応させることが記載されている。この方法は、ペグ化インシュリン及びその他のホルモンに使用された。ＵＳ４，１７９，３３７参照のこと。
【０１３５】
ＰＥＧではなくペプチドを改造する、タイプＢ）のＰＥＧ法は、ペプチドの免疫原性を減らしながらもペプチドの生物学的機能への干渉を最小限にするように選択された位置で位置特異的ＰＥＧ化を生じさせるのに望ましい場所にシステインを付加することである。ＰＥＧ−マレイミド、ＰＥＧ−ビニルスルホン、ＰＥＧ−ヨードアセトアミド、及びＰＥＧ−オルトピリジルジスルフィドは、ＰＥＧ化なしのシステイン残基のために作られたチオール反応性ＰＥＧである。この手法は、モノペグ化されたヒト成長ホルモン類似物の製造などの数多くの方法で使用されてきた。Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、３５巻のＢａｏｓｈｅｎｇ  ＬｉｕによるＰｅｐｔｉｄｅ  ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ：Ｔｈｅ  Ｎｅｘｔ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎを参照のこと。
【０１３６】
本明細書に記載の方法は、これまでに使用されていたいずれの方法と比較しても新規で異なる方法であり、これによってタンパク質の特異的な位置にＰＥＧを特異的に連結することが可能になる。我々が述べる新規な方法によって、ＰＥＧカルボニルのペプチドヒドラジドへの反応を利用したペプチドへのＰＥＧの連結が与えられ、これは以下で詳細に述べる。これは、ポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとからなる群から選択される約５００〜約２０，０００ダルトンの分子量を有する任意の直鎖または分岐のポリマーと共に使用することができる。ポリマーは、未置換のものであってもよいし、置換基が５個未満の炭素原子を有するアルコキシ基またはアルキル基によって置換されていてもよい。ＰＥＧ毒性昆虫ペプチドを製造できることの利点は数多く存在し、上の「発明の概要」で述べられている。
【０１３７】
［一般的反応］
Ｉ）ペプチドヒドラジド
ペプチドヒドラジドは、ペプチドラクトン（パート１参照）とヒドラジンから作られ、ペプチドヒドラジドを形成する。ペプチドヒドラジドは、本質的に３段階の手順で作られる。ペプチドラクトンをヒドラジン一水和物と混合する。混合物を溶液になるまで撹拌してペプチドヒドラジドを形成する、そしてペプチドヒドラジドを精製する。
【０１３８】
当業者であれば、この手順の多くのバージョンを生み出すことができるであろう。例えば、ペプチドラクトンとヒドラジンの混合物は溶液を形成するためによく撹拌する必要がある。この溶液中で形成されたペプチドヒドラジンはその後分取ＨＰＬＣなどの様々な方法によって精製することができる。
【０１３９】
我々は、ペプチドラクトンの水溶液と、ヒドラジン一水和物として添加されるヒドラジン溶液との混合、及びその後の室温での十分な撹拌の両方を教示する。ペプチドヒドラジドはその後精製することができる。我々は、精製のためにＨＰＬＣを使用したが、当業者に公知の他の選択肢も利用可能である。このタイプの手順は通常の化学者に周知であり、また本明細書に概説されている手順は当業者によって大きく変更されてもよい。回収及び精製のために他の選択肢を用いてもよい。下の実施例では、比較的純粋な試料のラクトンと純粋ではない試料のラクトンの両方が出発物質として用いられており、これらの両方で高純度のペプチドヒドラジド（Ｉ）が得られる結果となった。これらは実施例６に記載されている。他の手順を使用することもできるであろう。実施例６ａ及び６（ｂ）では、ペプチドラクトンとヒドラジドは共に混合され撹拌される。精製工程は様々に変更することができ、様々な選択肢が利用可能であり、また当業者に知られている。
【０１４０】
ＩＩ）ペプチドヒドラゾン
ペプチドヒドラゾンとペプチドヒドラジドは重要な中間体である。ペプチドに望まれる官能基が何であるかに応じて、様々な種類のペプチドヒドラゾンを製造することができる。ここでは我々は異なるペプチドヒドラゾンの様々な実施例を示す。ヒドラゾンの例は実施例８〜１１に示されている。当業者はこれらが実施例を限定しない代表的で例示的なものに過ぎず、他の試薬や条件も使用できることを理解するであろう。
【０１４１】
これらの実施例では、１種またはもう１つの種類のカルボニルと共に、ペプチドヒドラジドを使用して、式、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＶＩ）、及び（ＩＸ）の実施例のような新規なペプチドヒドラゾンを形成する。新規なペグ化タンパク質を生成する反応性カルボニル化合物のいくつかの例が示される。
【０１４２】
ヘキサナールがヒドラジドに添加されるとヒドラゾン（ＩＩ）を生成する。
【０１４３】
上で論じた反応は、以下の説明で示されている詳細と共に、以下の構造に示されており、裏付け資料は図１３〜２６中で見ることができる。
【０１４４】
実施例６には、ペプチドヒドラジド（Ｉ）またはヒドラジド（Ｉ）と呼ばれるペプチドヒドラジドが示されており、これはペプチドラクトンから作ることができる。質量分析データは図１３及び１４に示されている。
【０１４５】
実施例７には、通常の酸の形態のペプチドがそのヒドラジド形態にされた場合、ペプチドヒドラジドがより迅速に機能することを示すデータが提示されている。両方の化合物のために使用された毒性ペプチドはハイブリッド＋２を出発物質とした。ハイブリッド＋２がヒドラジドに変換された後は、２つの化合物（ペプチド酸形態及びペプチドヒドラジド形態）は異なる化合物であるが、これらは非常によく似ており同じペプチド骨格を有する。正味の本質的な違いは、一方のペプチドにはハイブリッド＋２のヒドラジド（Ｉ）を形成するためにヒドラジンが添加されたことである。これらの２つの試料はその後、ハエに対して試験された。試料のうちの１つ、ペプチドの通常の酸形態またはペプチドのヒドラジド形態（すなわちヒドラジド（Ｉ））のいずれかを、２つのハエのグループの一方に曝露した。ハエの１つのグループはヒドラジド形態の毒性ペプチド、すなわちヒドラジド（Ｉ）に曝露し、ハエの他方のグループはそのネイティブな酸形態の毒性ペプチドに曝露した。実施例７中で下に示されているデータは、ヒドラジドが同じペプチドのネイティブな酸形態よりも早く昆虫を殺すことを示している。
【０１４６】
実施例８は、ペプチドのヒドラゾン形態を作るためにヘキサナールをどのように使用できるかを示している。実施例８では、ヒドラジド（Ｉ）から出発し、ヘキサナールが添加され、その結果、ここで式（ＩＩ）またはヒドラゾン（ＩＩ）と呼ばれるヒドラゾンとなる。質量分析データは図１５及び１６に示されている。
【０１４７】
実施例９は、実施例８とは異なるヒドラゾンの合成を示している。実施例９では、ペプチドヒドラゾンを作るために、化合物「Ｏ−［２−（６−オキソカプロイルアミノ）エチル］−Ｏ’−メチルポリエチレングリコール（ＩＶ）（分子量約２’０００）」が使用される。質量分析データは図１７及び１８に示されている。
【０１４８】
実施例１０は、ヒドラゾンを作るための別の方法を示している。ここでは、これはヒドラジドとアクリルケトンから作られるヒドラゾンである。これは、アクリルケトン（Ｖ）を使用した、ヒドラジド（Ｉ）からのヒドラゾン（ＶＩ）の合成である。質量分析データは図１９〜２２に示されている。
【０１４９】
実施例１１は、ＰＥＧ４ケトン（ＶＩＩＩ）を用いたヒドラゾン（ＩＸ）の合成を述べている。この実施例は、３−アセチルアクリル酸とカルボジイミドを使用してＰＥＧ４ケトン（ＶＩＩＩ）を製造する実施例１１（ａ）から始まる。その後、実施例１１（ｂ）でＰＥＧ４ケトン（ＶＩＩＩ）とヒドラジドＩが使用されてヒドラゾン（ＩＸ）が製造される。質量分析データは図２３〜２６に示されている。
【０１５０】
［実施例６〜１１：詳細及びデータ］
そのネイティブな酸形態のペプチド、パート１で述べられたペプチドラクトン、及びパート２のペプチドヒドラジドを表す典型的な式が示される。他のヒドラジド及びヒドラゾンは実施例８〜１１で述べる。
【０１５１】
【化９】
0006800752.tif 000017
【０１５２】
＜実施例６：ペプチドヒドラジド（Ｉ）の合成＞
この実施例では、ペプチドヒドラジド（Ｉ）を合成するための２つの方法を示す。最初の方法の実施例６（ａ）では、ペプチドラクトンの出発溶液は比較的純度の高い、ＨＰＬＣ分取したものである。２つ目の方法の実施例６（ｂ）では、ペプチドラクトンの出発溶液は純度が低く、形態１と形態２の両方を含んでいる。すなわち、ペプチドラクトンと混ざったペプチドが存在する。両方の手順でも、ペプチドヒドラジドの同じマススペクトルが得られる。
【０１５３】
実施例６（ａ）。１ｍＬの水に入った１００ｍｇの純粋な形態２のペプチド、ペプチドラクトンを１００μＬのヒドラジン一水和物で処理し、室温で２時間撹拌した。この材料を分取ＨＰＬＣ（アセトニトリル／水／トリフルオロ酢酸のグラジエントで溶出）で少しずつ精製した。適切なフラクションを合わせ、減圧で濃縮して体積を減らした。液体を−８０℃の冷凍庫で冷凍し、その後凍結乾燥機で凍結乾燥することによって３６．９４ｍｇのペプチドヒドラジド（Ｉ）を白色固体として得た。
【０１５４】
実施例６（ｂ）。スーパーリキッド濃縮物（形態１と形態２（別名ペプチドラクトン）のペプチド混合物、１４ｍｇ／ｍＬ）の溶液（２５ｍＬ）を７５℃で終夜撹拌した。冷却後、ＨＰＬＣはほぼ形態２ペプチド、ペプチドラクトンを示した。溶液を２ｍＬのヒドラジン一水和物で処理し、室温で２時間撹拌した。この材料を少しずつ分取ＨＰＬＣ（アセトニトリル／水／トリフルオロ酢酸のグラジエントで溶出）で精製した。適切なフラクションを合わせ、減圧で濃縮して体積を減らした。液体を−８０℃の冷凍庫で冷凍し、その後凍結乾燥機で凍結乾燥することによって２５２．２ｍｇのペプチドヒドラジド（Ｉ）を白色固体として得た。方法Ｂによるヒドラジド（Ｉ）のＬＣＭＳ  ＥＳＩ／ＭＳ  ４５７８．００（Ｍ＋Ｈ）、保持時間３．６〜４．１分。図１３及び１４参照。
【０１５５】
＜実施例７：ハイブリッド＋２と比較したヒドラジド（Ｉ）のハエへの注射＞
実施例７では我々はその典型的な酸の形態、形態１すなわちペプチドの形態の毒性ペプチドと、ここで示される式でラベリングされるようなペプチドヒドラジド、すなわちペプチドヒドラジド（Ｉ）へと変換された後の同じ毒性ペプチドとを比較する。注射のために次の試料が準備される：
１．１００ｎｇ／μＬのヒドラジド（Ｉ）水溶液。この溶液を水で希釈して５０ｎｇ／μＬと５ｎｇ／μＬの溶液を作製する。
２．１００ｎｇ／μＬのハイブリッド＋２水溶液。この溶液を水で希釈して５０ｎｇ／μＬと５ｎｇ／μＬの溶液を作製する。
適切な標識をした、注射されるハエの容器を用意し、１８ゲージの針で容器の蓋に空気穴を開ける。ハエを選択する。完全に孵化して１日目及び２日目のハエを使用する。１日目とは完全に孵化した日である。ＣＯ２ガスラインを開き、針でＣＯ２ガスを入れることにより箱の中でハエを動かなくする。ハエが動かなくなった後、ハエをＣＯ２プレートに移し、これらを眠らせたままにする。ハエの重さを量り、１２〜１８ｍｇの質量を有するものを注射の生物学的分析に使用する。
【０１５６】
注射を行う。３０ゲージの針がついた１ｍｌのシリンジに１００〜２００μｌの溶液を装填し、装填したシリンジをマイクロアプリケーターに取り付ける。マイクロアプリケーターの押し棒を回転させてシリンジから気泡を抜く。その後、マイクロアプリケーターの注入体積を０．５μｌに設定する。押し棒を回転させて背面の胸部から上で調製した溶液０．５μｌをイエバエに注射する。上で調製したそれぞれの溶液につき１０匹のハエに注射する。空気穴付きの蓋を有する、準備しておいたカップに注射したハエを入れる。２つのＷｈａｔｍａｎ♯４  ４．２ｃｍろ紙ディスクを入れる。殺菌した１ｍＬのｎａｎｏｐｕｒｅ水を添加する。全ての注射したハエを室温におく。注射３時間後、５時間後、２１時間後、及び２４時間後に注射したハエを記録する。陰性対照群が２０％超の死亡率だった場合、上述したようなハエの注射をやり直す。４つすべての記録時点で、水と麻酔の対照群は０％の死亡率であった。
【０１５７】
５時間の時点では、同じ濃度のハイブリッド＋２が１０％の死亡率だったのに対し、１００ｎｇ／μＬの濃度のヒドラジドは８０％の死亡率であった。
【０１５８】
＜実施例８：ヘキサナールからのヒドラゾン（ＩＩ）＞
【化１０】
0006800752.tif 000018
【０１５９】
５ｍｇ（０．００１０９ｍｍｏｌ）のヒドラジド（Ｉ）が１００μＬの水に入っている溶液を、０．１６μＬ（０．００１３３ｍｍｏｌ）のヘキサナールが１０μＬの無水エタノールに入っている溶液で処理した。混合物を１時間撹拌した。４９０μＬの無水エタノールの中に５ｍｇのヘキサナールと２．８６μＬの酢酸が入ったストック溶液を作製した。反応を１０．９μＬのストック溶液で処理し、混合後２時間放置した。混合物を約６０℃で１時間加熱した。方法ＢによるＬＣＭＳ  ＥＳＩ／ＭＳ  ４６６１．６０（Ｍ＋Ｈ、ヒドラゾン）、保持時間６．８〜７．１分。図１５及び１６参照。
【０１６０】
＜実施例９：Ｏ−［２−（６−オキソカプロイルアミノ）エチル］−Ｏ’−メチルポリエチレングリコール（ＩＶ）（分子量約２’０００）からのヒドラゾン（ＩＩＩ）＞
【化１１】
0006800752.tif 000019
【０１６１】
Ｏ−［２−（６−オキソカプロイルアミノ）エチル］−Ｏ’−メチルポリエチレングリコール（分子量約２’０００）（ＩＶ）（１０．９ｍｇ）が１００μＬの無水エタノールに入っているストック溶液を、１滴の酢酸で処理した。注：Ｏ−［２−（６−オキソカプロイルアミノ）エチル］−Ｏ’−メチルポリエチレングリコール（分子量約２’０００）は、分子量２０００前後に分布している化合物の混合物であり、単一の化合物ではない。５ｍｇ（０．００１０９ｍｍｏｌ）のヒドラジド（Ｉ）が１００μＬの水に入っている溶液を、Ｏ−［２−（６−オキソカプロイルアミノ）エチル］−Ｏ’−メチルポリエチレングリコール（ＩＶ）（分子量約２’０００）のストック溶液２２μＬ（０．００１２ｍｍｏｌ）で処理した。混合後、混合物を室温で放置した。Ｏ−［２−（６−オキソカプロイルアミノ）エチル］−Ｏ’−メチルポリエチレングリコール（ＩＶ）（分子量約２’０００）のストック溶液の残部を小分けして添加し、混合物を混合後終夜放置した。方法ＢによるＬＣＭＳ  ＥＳＩ／ＭＳ保持時間７．２〜７．６分。図１７及び１８参照。
【０１６２】
＜実施例１０：アクリルケトン（Ｖ）を用いたヒドラジド（Ｉ）からのヒドラゾン（ＶＩ）＞
（実施例１０（ａ）：アクリルケトン（Ｖ）の合成）
【化１２】
0006800752.tif 000020
【０１６３】
４ｍＬのジクロロメタンと４ｍＬのテトラヒドロフランの中に、０．５ｇ（４．３８ｍｍｏｌ）の３−アセチルアクリル酸、０．９２４ｇ（４．８２ｍｍｏｌ）のＮ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）、及び０．６５１ｇ（４．８２ｍｍｏｌ）の１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（ＨＯＢｔ）が入った混合物を、窒素下室温で１０分間撹拌した。反応を氷浴で冷却し、８ｍＬのジクロロメタンの中に０．４４３ｇ（４．３８ｍｍｏｌ）のヘキシルアミンが入った溶液で処理した。反応を冷やして１時間、そして室温で終夜撹拌した。反応をジクロロメタンで希釈し、有機物を飽和炭酸ナトリウム溶液で洗浄し、次いで水で洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮することによって黄色固体を得た。固体を取り出してジクロロメタンに入れ、シリカゲルのカラムで精製した（５０％酢酸エチル／ヘキサンで溶出）。適切なフラクションを合わせ、減圧下で濃縮することによって５３７．０６ｍｇのアクリルケトン（Ｖ）を白色固体として得た。方法ＣによるＬＣＭＳ  ＥＳＩ／ＭＳ  １９８．１（Ｍ＋Ｈ）、１９６．０２（Ｍ−Ｈ）。図１９及び２０参照。
【０１６４】
（実施例１０（ｂ）：アクリルケトン（Ｖ）からのヒドラゾン（ＶＩ））
【化１３】
0006800752.tif 000021
【０１６５】
１５０μＬの水に５ｍｇ（０．００１０９ｍｍｏｌ）のヒドラジド（Ｉ）が入った溶液を、４８μＬの無水エタノールに入った０．９６ｍｇ（０．００４８ｍｍｏｌ）のアクリルケトン（Ｖ）で少しずつ処理した。各添加後に混合物を３０分間撹拌し、その後終夜撹拌した。方法ＢによるＬＣＭＳ  ＥＳＩ／ＭＳ  １９８．２４（Ｍ＋Ｈ、アクリルケトン）；４７６０．６０（Ｍ＋Ｈ、ヒドラゾン）、保持時間５．１〜５．８分。図２１及び２２参照。
【０１６６】
＜実施例１１：３−アセチルアクリル酸から合成されたＰＥＧ４ケトン（ＶＩＩＩ）を用いたヒドラゾン（ＩＸ）＞
（実施例１１（ａ）：ＰＥＧ４ケトン（ＶＩＩＩ）の合成）
【化１４】
0006800752.tif 000022
【０１６７】
１ｍＬのジクロロメタンと１ｍＬのテトラヒドロフランの中に、１３７．６ｍｇ（１．２１ｍｍｏｌ）の３−アセチルアクリル酸、２５４．３ｍｇ（１．３２７ｍｍｏｌ）のＮ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）、及び１７９．２５ｍｇ（１．３２７ｍｍｏｌ）の１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（ＨＯＢｔ）が入った混合物を、窒素下室温で１０分間撹拌した。反応を氷浴で冷却し、２ｍＬのジクロロメタンの中に２５０ｍｇ（１．２１ｍｍｏｌ）のｍ−ＰＥＧ４−アミン（ＶＩＩ）が入った溶液で処理した。反応を冷やして１時間、そして室温で終夜撹拌した。反応をジクロロメタンで希釈し、有機物を飽和炭酸水素ナトリウム溶液で洗浄し、次いで水で洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮することによって３０２．２９ｍｇのＰＥＧ４ケトン（ＶＩＩＩ）をオイルとして得た。方法ＣによるＬＣＭＳ  ＥＳＩ／ＭＳ  ３０４．１（Ｍ＋Ｈ）、３０２．１（Ｍ−Ｈ）。図２３及び２４参照。
【０１６８】
（実施例１１（ｂ）：ＰＥＧ４ケトン（ＶＩＩＩ）を用いたヒドラゾン（ＩＸ））
【化１５】
0006800752.tif 000023
【０１６９】
１５０ｕＬの水に５ｍｇ（０．００１０９ｍｍｏｌ）のヒドラジド（Ｉ）が入った溶液を、２．０ｍｇ（０．００６６ｍｍｏｌ）のＰＥＧ４ケトン（ＶＩＩＩ）で少しずつ処理した。各添加後に混合物を３０分間撹拌した。方法ＢによるＬＣＭＳ  ＥＳＩ／ＭＳ  ３０４．２８（Ｍ＋Ｈ、ＰＥＧ４ケトン）；４８６７．７０（Ｍ＋Ｈ、ヒドラゾン）、保持時間４．７〜５．１分。図２５及び２６参照。
【０１７０】
実施例は例示を意図しており、請求項及び請求項に係る発明を限定するものではない。ここに示されているものの数多くの変形及び様々な改造を当業者が行えることは当然であろう。
（１）次の工程を含み、任意選択的にはこれらの工程を文字順で含む、毒性ペプチドを含むペプチドの活性または毒性の増加方法。
ａ）水と前記ペプチドを混合して、液体中にある前記ペプチドまたは半液体中にある前記ペプチドの形態の、水溶液または水性エマルションを形成する工程であって、前記水溶液または水性エマルションが少なくとも１０％の水からなる工程；
ｂ）前記ペプチドの前記水溶液または水性エマルションのｐＨを測定する工程；
ｃ）前記溶液またはエマルションのｐＨをｐＨ７．０未満に調整する工程
（２）前記水溶液または水性エマルションが、約１．０〜約６．５、約２．０〜約６．０、約２．５〜約５．５、約３．０〜約５．０、約３．０〜約４．０のｐＨに調整される、または約３．２、３．４、３．５、３．６、または３．８のｐＨに調整される、（１）に記載の方法。
（３）前記ｐＨの調整が強酸または弱酸を使用して行われ；前記強酸が使用される場合には、前記強酸によるｐＨ調整が、塩素酸（ＨＣｌＯ３）、塩酸（ＨＣｌ）、臭化水素酸、（ＨＢｒ）、ヨウ化水素酸（ＨＩ）、リン酸（Ｈ３ＰＯ４）、硫酸（Ｈ２ＳＯ４）、過塩素酸（ＨＣｌＯ４）、及び硝酸（ＨＮＯ３）のいずれか、またはこれらの酸の組み合わせから選択され、リン酸、硫酸、または硝酸から選択される強酸を使用することが注目され；前記弱酸が使用される場合には、前記弱酸によるｐＨ調整が酢酸及び／またはシュウ酸から選択される弱酸を独立に、または組み合わせて使用して行われる、（１）に記載の方法。
（４）前記ｐＨの調整時、前記水溶液または水性エマルションは乾いた熱、すなわち蒸気もしくは圧力なしの温度上昇、または蒸気及びもしくは蒸気ありの温度上昇、またはこれらのいずれかの組み合わせ、を含む熱に曝露され、任意選択的には前記ｐＨの調整の後にペプチドが乾燥粉末または顆粒の形態へと乾燥される、（１）〜（３）のいずれか１つに記載の方法。
（５）前記ペプチドの水溶液またはエマルションの状態時に前記溶液またはエマルションの前記ｐＨを７．０未満に下げることによる、共有結合している２Ｈ＋Ｏまたは分子のうちのいずれか１つ以上のペプチドからの除去方法。
（６）任意のペプチド、任意の毒性ペプチド、配列表にある任意のペプチド；配列番号１１９のペプチド；配列番号３７のペプチド；本明細書及び請求項に記載されているいずれかのペプチド、を使用する、（１）〜（５）のいずれか１つに記載の方法。
（７）前記ペプチドまたは毒性ペプチドで処理されるべき昆虫の生息場所への適用に適した、（１）〜（６）のいずれか１つに記載の方法からの毒性ペプチドの前記ペプチドの、製剤状態の殺虫性組成物。
（８）前記ペプチドが入った水溶液またはエマルションのｐＨが７．０未満に下げられ、ペプチドの共有結合している２Ｈ＋Ｏまたは分子のうちのいずれか１つ以上が除去される、毒性ペプチド。
（９）ペプチドの毒性及び／または活性を増加させるための方法であって、
ａ）純粋な形態１のペプチドすなわちペプチド酸として、または約１０％未満の水を含む組成物として、前記ペプチドを準備する工程；
ｂ）前記形態１のペプチドすなわちペプチド酸を制御可能なチャンバーまたは加熱台の中に置く工程；
ｃ）前記ペプチドを圧力ありまたは圧力なしで、蒸気ありまたは蒸気なしで、望ましい温度まで加熱する工程；
ｄ）形態１のペプチドすなわちペプチド酸のうちの望ましい量が、形態２のペプチドすなわちペプチドラクトンに変換されるまで、前記加熱したペプチドを、望ましい温度、圧力、及び蒸気の状態に保持する工程；
を含み、
任意選択的かつ独立的には、工程ａ）〜ｄ）は次の条件、すなわち
任意選択的かつ独立的に、制御可能なチャンバーを０〜５００℃の温度と大気圧〜５００ｐｓｉの圧力を維持可能である；
任意選択的かつ独立的に、前記ペプチドをおおよそ次の温度まで加熱すること、すなわち少なくとも約１０℃以上であり、約２００℃、３００℃、または最大でも４００℃から選択される最大温度以下まで加熱する；
任意選択的かつ独立的に、前記ペプチドを１０℃〜２０℃、２０℃〜３０℃、３０℃〜４０℃、４０℃〜５０℃、５０℃〜６０℃、６０℃〜７０℃、７０℃〜８０℃、８０℃〜９０℃、９０℃〜１００℃、１００℃〜１１０℃、１１０℃〜１２０℃、１２０℃〜１３０℃、１３０℃〜１４０℃、１４０℃〜１５０℃、１５０℃〜１６０℃、１６０℃〜１７０℃、１７０℃〜１８０℃、１８０℃〜１９０℃、１９０℃〜２００℃、２００℃〜２１０℃、２１０℃〜２２０℃、２２０℃〜２３０℃、２３０℃〜２４０℃、２４０℃〜２５０℃、２５０℃〜２６０℃、２６０℃〜２７０℃、２７０℃〜２８０℃、２８０℃〜２９０℃、２９０℃〜３００℃、３００℃〜４００℃、及び４００℃〜５００℃のうちの温度、温度範囲、または温度範囲の組み合わせのうちのおおよそいずれかから選択される温度に少なくとも加熱する；
任意選択的かつ独立的に、前記圧力をａ）約１０ｐｓｉ〜約４０ｐｓｉ、ｂ）約１５ｐｓｉ〜約３５ｐｓｉ、ｃ）約１８ｐｓｉ〜約２５ｐｓｉ、ｄ）約２１ｐｓｉ、の圧力または圧力範囲のうちのいずれかから選択する；
任意選択的かつ独立的に、選択される温度及び圧力に応じて、ａ）約５分〜約４０分、ｂ）約１０分〜約３０分、ｃ）約１５分〜約２５分、ｄ）約２１分、の時間の範囲で、前記ペプチドを選択される前記温度及び圧力に維持する；
任意選択的かつ独立的に、前記ペプチドを、ａ）約１００℃〜約１４０℃、約１０ｐｓｉ〜約４０ｐｓｉの圧力、約５分間〜約４０分間；ｂ）約１１０℃〜約１３０℃、約１５ｐｓｉ〜約３５ｐｓｉの圧力、約１０分間〜約３０分間；ｃ）約１１５℃〜約１２５℃、約１８ｐｓｉ〜約２５ｐｓｉの圧力、約１５分間〜約２５分間；ｄ）約１２１℃、約２１ｐｓｉの圧力、約２０分間；の温度、圧力、及び時間まで加熱及びそこで保持する；
任意選択的かつ独立的に、前記圧力が大気圧以下であり、前記温度を少なくとも５０℃〜６０℃またはそれ以上の温度から選択する；
任意選択的かつ独立的に、５０℃〜６０℃、６０℃〜７０℃、７０℃〜８０℃、８０℃〜９０℃、９０℃〜１００℃、１００℃〜１１０℃、１１０℃〜１２０℃、１２０℃〜１３０℃、１３０℃〜１４０℃、１４０℃〜１５０℃、１５０℃〜１６０℃、１６０℃〜１７０℃、１７０℃〜１８０℃、１８０℃〜１９０℃、１９０℃〜２００℃、２００℃〜２１０℃、２１０℃〜２２０℃、２２０℃〜２３０℃、２３０℃〜２４０℃、２４０℃〜２５０℃、２５０℃〜２６０℃、２６０℃〜２７０℃、２７０℃〜２８０℃、２８０℃〜２９０℃、２９０℃〜３００℃、３００℃〜４００℃、及び４００℃〜５００℃の温度、温度範囲、または温度範囲の組み合わせを使用する；
条件で行われる、方法。
（１０）前記ペプチドが、
ａ）加熱されて約１００℃より高い温度で少なくとも約１時間保持される；
ｂ）加熱されて約８０℃〜約１２０℃の温度で少なくとも約２時間保持される；
ｃ）加熱されて約５０℃〜約８０℃の温度で少なくとも約３時間保持される；
または前記ペプチドが、
ａ）加熱されて約１８０℃より高い温度及び少なくとも約５ｐｓｉの圧力で少なくとも約５分間保持される；
ｂ）加熱されて約１００℃より高い温度及び少なくとも約１０ｐｓｉの圧力で少なくとも約１０分間保持される；
ｃ）加熱されて約８０℃〜約１２０℃の温度及び少なくとも約１０ｐｓｉの圧力で少なくとも約３０分間保持される；もしくは
ｄ）加熱されて約５０℃〜約８０℃の温度で少なくとも１時間保持される；
または前記ペプチドが、
ａ）加熱されて約２００℃〜約３００℃の温度及び約５〜約１０ｐｓｉの圧力で約５〜約１０分間保持される；
ｂ）加熱されて約１５０℃〜約２００℃の温度及び約１０〜約３０ｐｓｉの圧力で約５〜約３０分間保持される；
ｃ）加熱されて約８０℃〜約１５０℃の温度及び約１０〜約２０ｐｓｉの圧力で約２０〜約６０分間保持される；もしくは
ｄ）加熱されて約５０℃〜約８０℃の温度及び約１０〜約４０ｐｓｉの圧力で約３０〜約６０分間保持される；
または前記ペプチドが、
ａ）加熱されて約１１０℃〜約１３０℃の温度及び約１０〜約２０ｐｓｉの圧力で約１０〜約２０分間保持される；もしくは
ｂ）加熱されて約１２１℃の温度及び約２１ｐｓｉの圧力で約２０分間保持される、
ことを含む多段階手順のいずれかに従って処理される、（９）に記載の方法。
（１１）昆虫捕食者のペプチドラクトンをヒドラジンと混合し、精製することでペプチドヒドラジドを得ることを含む、昆虫捕食者ペプチドをペプチドラクトンの形態からペプチドヒドラジドの形態へと変換する方法によって製造される、ペプチドヒドラジド製品の製造方法及び前記ペプチドヒドラジド製品。
（１２）前記ペプチドラクトンを水中に用意し、ヒドラジン一水和物を添加し、混合物を撹拌してペプチドヒドラジドを形成し、これを任意選択的には凍結、解凍、及び精製することで精製されたペプチドヒドラジドを得る、（１１）に記載の方法及び製品。
（１３）前記昆虫捕食者ペプチドが、約２０個のアミノ酸から約５０個のアミノ酸まで大きさが多様であり、２個、３個、もしくは４個のシスチン結合、または、３個もしくは４個のシスチン結合を有する、（１２）に記載の方法及び製品。
（１４）前記ペプチドラクトンが、配列表にある任意のペプチド、並びに、配列表にある任意のペプチドと８０％超の相同性を有する配列表にある任意のペプチド及び任意のペプチド、または８５％、９０％、９５％、もしくは９９％以上の相同性があり３個もしくは４個のシスチン結合を有する任意の配列、から調製される、（１３）に記載の方法及び製品。
（１５）方法ａまたは方法ｂのいずれかを使用することが可能な、（１４）に記載のハイブリッド＋２ペプチドと名付けられた、（１４）に記載の方法及び製品であって、
方法ａ；ａ）１００ｍｇの精製した形態２のペプチド、ハイブリッド＋２ペプチドラクトンが１ｍＬの水に入っている溶液から出発する、
ｂ）１００ｍｇの前記ペプチドラクトンの１ｍＬを１００μＬのヒドラジン一水和物で処理し、室温で撹拌して、任意選択的には２時間撹拌して、ペプチドヒドラジドを形成する、
ｃ）分取ＨＰＬＣ（アセトニトリル／水／トリフルオロ酢酸のグラジエントで溶出）で前記ペプチドヒドラジドの溶液を精製する、
ｄ）適切なペプチドヒドラジドのフラクションを選ぶ、
ｅ）適切なペプチドヒドラジドのフラクションを合わせて減圧下で濃縮して体積を減らす、
ｆ）前記減らした体積のペプチドヒドラジドを０℃未満で、任意選択的には−８０℃で、凍結する、
ｇ）前記ハイブリッド＋２ペプチドヒドラジドを、任意選択的には凍結乾燥機で、凍結乾燥してハイブリッド＋２ペプチドヒドラジド（Ｉ）を得る、
または、
以下を含む方法ｂ；
ａ）ペプチド酸である形態１と形態２との混合物であるスーパーリキッド濃縮物（Ｓｕｐｅｒ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ）２５ｍＬの溶液を、任意選択的には約５０℃〜９０℃で、任意選択的には７５℃で、撹拌する、
ｂ）溶液を冷ます、
ｃ）溶液を、任意選択的には２ｍＬである、ヒドラジン一水和物で処理して、任意選択的には室温で２時間、撹拌する、
ｄ）任意選択的にはアセトニトリル／水／トリフルオロ酢酸）のグラジエントで溶出する、分取ＨＰＬＣで一部を精製する、
ｅ）フラクションを集めて濃縮し、任意選択的には減圧下で、体積を減らす、
ｆ）残っている液体を凍結して、任意選択的には−８０℃及び凍結乾燥機で凍結乾燥してハイブリッド＋２ペプチドヒドラジドを得る、
を含む、方法及び製品。
（１６）ａ）ヒドラジド水溶液を混合し、ヘキサナールのエタノール溶液を添加し、撹拌すること、
ｂ）ヘキサナール、酢酸、及びエタノールからなるストック溶液で処理して撹拌すること、
ｃ）ヘキサナール、酢酸、及びエタノールからなるストック溶液を添加すること、
ｄ）混合し、放置し、その後任意選択的に加熱してヒドラゾンを生成すること、
を含む、昆虫捕食者のペプチドをペプチドヒドラジドからペプチドヒドラゾンへと変換するプロセスによって作られる、ペプチドヒドラジド製品の製造方法及び前記ペプチドヒドラジド製品。
（１７）ａ）ヒドラジド（Ｉ）水溶液をヘキサナールのエタノール溶液と混合して撹拌すること、
ｂ）（１６）に記載のストック溶液を少量添加すること、
ｄ）混合し、放置し、その後任意選択的に加熱してヒドラゾン（ＩＩ）（ＩＩ）を生成すること、
を含む、前記製品がペプチドヒドラゾン（ＩＩ)である（１６）に記載の方法及び製品。
（１８）複合グリコールを強酸または弱酸で酸性化することと、ヒドラジドを添加してよく混ぜてペプチドグリコールヒドラゾンを製造することとを含む、昆虫捕食者のペプチドをペプチドヒドラジドからペプチドヒドラゾンへと変換するプロセスによって作られる、ペプチドヒドラジド製品の製造方法及び前記ペプチドヒドラジド製品。
（１９）ａ）Ｏ−［２−（６−オキソカプロイルアミノ）エチル］−Ｏ’−メチルポリエチレングリコール（ＩＶ）と呼ばれる化合物のエタノール混合物のストック溶液に酢酸を１滴添加すること、
ｂ）工程ａからの、酢酸で処理されたＯ−［２−（６−オキソカプロイルアミノ）エチル］−Ｏ’−メチルポリエチレングリコール（ＩＶ）（分子量約２’０００）のストック溶液を使用し、ヒドラジド（Ｉ）の水溶液にこれを添加すること、
ｃ）混合し、室温で放置すること、
ｄ）Ｏ−［２−（６−オキソカプロイルアミノ）エチル］−Ｏ’−メチルポリエチレングリコール（ＩＶ）（分子量約２’０００）のストック溶液の残部を分割して添加し、混合後終夜放置しておくことでペプチドヒドラゾン（ＩＩＩ）を生成すること、
を含む、前記製品がペプチドヒドラゾン（ＩＩＩ）である（１８）に記載の方法及び製品。
（２０）アクリルケトンをヒドラジドに添加してヒドラゾンを形成することを含む、昆虫捕食者ペプチドをペプチドヒドラジドからペプチドヒドラゾンへと変換するプロセスによって製造される、ペプチドヒドラジドケトン製品の製造方法及び前記ペプチドヒドラジドケトン製品。
（２１）エタノールに入ったアクリルケトン（Ｖ）をヒドラジド（Ｉ）水溶液に添加して混合することを含む、前記製品がペプチドヒドラゾン（ＶＩ）である（２０）に記載の方法及び製品。
（２２）ＰＥＧ４ケトン（ＶＩＩＩ）をヒドラジド（Ｉ）の水溶液に添加して混合することでヒドラゾン（ＩＸ）を形成することを含む、前記製品がペプチドヒドラゾン（ＩＸ）である（２０）に記載の方法及び製品。
（２３）共有結合している２Ｈ＋ＯまたはＨ２Ｏまたは分子のうちのいずれか１つ以上をペプチドから除去することとして記述される方法であって、本明細書に記載されているまたは明細書もしくは請求項中に見出されるような単独または組み合わせでの、いずれかの条件、温度、圧力、及びｐＨまたは酸性条件の下で、共有結合している２Ｈ＋Ｏまたは分子のうちのいずれか１つ以上が取り除かれた任意の毒性ペプチドを含み、本明細書及び請求項に記載の手順のいずれかによって製造されたいずれかの前記ペプチド、ヒドラジド、またはヒドラゾンを含む方法、により製造されるペプチドの調製方法及びまたはペプチド、及びまたは前記方法によって製造される殺虫性組成物、または、本明細書及び請求項に記載の方法のいずれかによって製造され、その後昆虫の生息場所への適用に好適な製剤中で使用される、前記ペプチドの殺虫性組成物としてのこれらのペプチドのいずれかの使用。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【配列表】
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