(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
フィブロネクチン−ＥＤＡのＥＤＡ−ドメインに結合する抗体であって、
アミノ酸配列がＧＹＳＩＴＳＧＹＳＷＨであるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１と、
アミノ酸配列がＹＩＨＹＳＧＩＡＮＹＮＰＳＬＫＳであるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２と、
アミノ酸配列がＥＫＴＧＦＦＤＹであるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３と、
を含む重鎖可変領域と、
アミノ酸配列がＲＳＳＱＳＬＶＨＳＮＧＮＴＹＬＨであるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１と、
アミノ酸配列がＫＶＳＮＲＦＳであるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２と、
アミノ酸配列がＳＱＳＡＨＶＰＰＴであるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３と、
を含む軽鎖可変領域と、
を含む抗体であり、
重鎖および軽鎖を含み、
前記重鎖は、配列番号３４のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖は、配列番号３５のアミノ酸配列を含む、抗体。
【請求項２】
請求項１に記載のフィブロネクチン−ＥＤＡのＥＤＡ−ドメインに結合する抗体であって、
前記重鎖可変領域は、
−配列番号３に示したアミノ酸配列を含む前記ＣＤＲ１と、
−配列番号４に示したアミノ酸配列を含む前記ＣＤＲ２と、
−配列番号５に示したアミノ酸配列を含む前記ＣＤＲ３と、
を含み、
前記軽鎖可変領域は、
−配列番号６に示したアミノ酸配列を含む前記ＣＤＲ１と、
−配列番号７に示したアミノ酸配列を含む前記ＣＤＲ２と、
−配列番号８に示したアミノ酸配列を含む前記ＣＤＲ３と、
を含む、抗体。
【請求項３】
前記軽鎖および／または前記重鎖のＣＤＲはヒト由来フレームワーク領域に組み込まれている、
請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
キメラ型抗体である、
請求項１ないし請求項３のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項５】
ヒト化型抗体である、
請求項４に記載の抗体。
【請求項６】
請求項１ないし請求項５のいずれか一項に記載の抗体をコードしている核酸分子。
【請求項７】
請求項６に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項８】
遺伝子治療ベクターである、請求項７に記載のベクター。
【請求項９】
請求項６に記載の核酸分子または請求項７もしくは請求項８に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１０】
哺乳動物の宿主細胞である、請求項９に記載の宿主細胞。
【請求項１１】
ハイブリドーマである、請求項９または請求項１０に記載の宿主細胞。
【請求項１２】
医薬組成物であって、
（ａ）請求項１ないし請求項５のいずれか一項に記載の抗体、
（ｂ）請求項６に記載の核酸分子、
（ｃ）請求項７または請求項８に記載のベクター、
（ｄ）請求項９ないし請求項１１のいずれか一項に記載の宿主細胞、
からなる群から選ばれる剤並びに医薬用に許容される担体を含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医療分野、特に心臓学および血管形成の分野の発明である。本発明は、フィブロネクチン−ＥＤＡのＥＤＡ−ドメインに特異的に結合する、抗体などの免疫グロブリン（Ｉｇ：ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）様分子およびこれらの抗原結合断片を提供する。こうしたＩｇ様分子は、有害となる心臓もしくは血管リモデリングおよび心筋梗塞関連合併症の治療、予防または進行予防並びに血管形成の改善もしくは促進に特に適している。また、本発明は、上記Ｉｇ様分子、例えば抗体、またはその抗原結合もしくは断片を含む医薬組成物、並びに心筋梗塞関連合併症および有害となる心臓もしくは血管リモデリングの治療、予防または進行予防のために、並びに血管形成の改善もしくは促進のために、上記Ｉｇ様分子、例えば抗体、またはその抗原結合もしくは断片を使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
虚血性心疾患は西洋社会にとって最大の社会経済的な負担である。これは、中国やインドのような発展途上国が急速に近代化するこの時代ではなお一層大きな問題になっている。虚血性心疾患における最も重篤で急性の合併症は、心筋梗塞として知られている心臓発作である。米国、ＥＵおよび日本では、毎年２４０万人の患者が心筋梗塞に罹患している。米国およびＥＵにおいて虚血性心疾患の治療のみに費やされる金額は、毎年１，５００億ユーロを超えている。残念なことに、比較的多くの患者が初期の致死的な梗塞を生き延びるがその後心機能が次第に悪化するので、心筋梗塞関連の合併症または疾患は、増加しつつある。心不全、線維症、不整脈などの心筋梗塞後の合併症は高い死亡率および罹患率をもたらす。これらの合併症の最も重要な決定要因は、有害となる（心臓）リモデリングまたは有害となる心室リモデリングとみなされる心臓の不適正な修復応答である。
【０００３】
心不全（ＨＦ：ｈｅａｒｔ  ｆａｉｌｕｒｅ）は、これが心筋梗塞後の有害なリモデリングの最も重篤で最も高頻度の因果関係であるので、かなりの注目を集めている。欧州心臓学会（ＥＳＣ：Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ）は、「ＨＦは西洋社会における２１世紀の流行病である」と表明している。米国、ＥＵおよび日本だけでも、毎年少なくとも新規に診断された梗塞関連ＨＦの患者が１８０万人入院している。診断から１年以内の死亡率は２０％であるが、５年以内に５０％が死亡している。運動耐容能が次第に低下し、正常な日常活動を行う能力が低下するため、生き残っている患者の生活の質は深刻な影響を受ける。社会経済的負担は、（１）運動耐容能の低下およびそれに続く生産性の低下、（２）予防的でも治癒的でもないが症状を緩和する高額な薬物治療、並びに（３）再入院、の結果として、米国とＥＵだけでも年間ほぼ６００億ユーロである。
【０００４】
現在の心筋梗塞治療は閉塞冠動脈の血流を回復させることを目的としている。抗血栓剤（すなわち、血栓形成防止剤）はステントと共に心筋梗塞後の血流回復を最適化するために最も重要な薬剤および機器に分類される。血流最適化におけるこういった進歩にもかかわらず、梗塞関連の合併症は今もなお発生し増加しつつある。その主な理由は、有害となるリモデリングが血流回復とは全く異なる病態生理学的過程であることにある。
【０００５】
梗塞心臓の治癒は、多くの種類の細胞を必要とするきわめて複雑な過程である。心筋梗塞は、心筋の一部が死滅しポンプ機能の低下をもたらす急性事象である。この急性事象の直後に、炎症の促進を特徴とする修復過程が血液および心筋において誘発される。しかしながら、炎症の種類が、梗塞心臓が適正に修復され、リモデリングされるかどうかを決定する。適切さを欠いた治癒および有害な炎症を促進する重要な因子は、心臓死および基質分解に関連する分子による先天免疫の活性化である。多くの患者では、免疫系が有害に活性化され、心筋梗塞後に心臓の不適切な治癒をもたらす。こうした場合、心臓は有害なリモデリングと呼ばれる過程に入る。有害なリモデリングは、既知の合併症である心不全、心臓の拡張および線維形成、収縮および弛緩の障害並びに電気的活性化の障害のように、いくつかの有害な結果をもたらす。心不全のような梗塞関連の病的状態の発生が増大しているため、梗塞後の心臓修復を促進する新規な治療の必要性が強調されている。特に心筋梗塞直後の初期段階における梗塞心臓の治癒に寄与する別の因子は血管形成である。微小血管の新規形成は心筋梗塞後の初期段階で虚血心筋を回復させる可能性を有し、心不全への移行を阻止するのに貢献する。
【０００６】
白血球が有害な炎症反応を引き起こす主な決定要因はフィブロネクチン−ＥＤＡの沈着である。心筋梗塞後、フィブロネクチン−ＥＤＡは梗塞心筋において新規に合成され、一時的に上方制御される。フィブロネクチン−ＥＤＡは免疫系および基質の代謝回転に関与する他の細胞を活性化することができ、それによって心臓修復に関与する細胞（例えば、白血球、リンパ球および線維芽細胞）の遊走および分化が誘発される。その後、フィブロネクチン−ＥＤＡにより活性化された細胞は治癒期の心臓において有害な炎症反応を誘発する。
【０００７】
細胞フィブロネクチンはＥＣＭに存在する多機能性の粘着性糖タンパク質であり、ＭＩと共に生じる組織傷害に応答して細胞により産生される。これは、ＴＬＲ２およびＴＬＲ４の両者並びにインテグリンα４β１、α４β７およびα９β１の内因性リガンドとして作用する、ＩＩＩ型リピートエキストラドメインＡ（ＥＩＩＩＡ；ＥＤＡ）をコードする選択的スプライスエクソンを含有する。生体外では、フィブロネクチン−ＥＤＡは炎症誘発性遺伝子の発現を誘発し、単球を活性化する。ネズミの関節にフィブロネクチン−ＥＤＡを生体内注射すると、炎症が増強される。フィブロネクチン−ＥＤＡは、健康なヒトの組織では通常は発現されないが、胚形成期の新規に発達中の血管系において、また、（心臓の）虚血組織、アテローム性動脈硬化病変、線維性組織、腫瘍、移植拒絶、創傷などのいくつかの（病的）状態においては高度に上方制御されている。ＥＤＡの過剰発現は、脳虚血後、炎症および傷害の増強をもたらす。従って、フィブロネクチン−ＥＤＡは白血球を活性化することができ、サイトカインおよびケモカインの上方制御を引き起こす。最近、フィブロネクチン−ＥＤＡノックアウトマウスが心筋梗塞後の野生型マウスに比し、線維症の緩和、心臓機能の温存および心室拡張の緩和を示すことが分かった（アルスラン（Ａｒｓｌａｎ）Ｆ．ほか、サーキュレーション・リサーチ（Ｃｉｒｃ．  Ｒｅｓ．）２０１１年３月号、１０８：５８２−５９２）。国際公開第２０１２／０５７６１３号には、フィブロネクチン−ＥＤＡのＥＤＡドメインに対する抗体を用いてマウスを処置すると、同マウスの左心室拡張が防止され、心筋梗塞後の生存が向上すると記載されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
当該分野では依然として、対象者における心筋梗塞関連状態を治療し、予防し、またはその進行を防止することができ、心筋梗塞後の対象者の生存の可能性を増大させる抗体が求められている。本発明の課題はそのような抗体を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、アミノ酸配列ＧＩＸＸＸＦ（配列番号１）であって、Ｘは任意のアミノ酸とすることができるものとするアミノ酸配列に特異的に結合する単離された免疫グロブリン（Ｉｇ）様分子またはその抗原結合断片を提供する。
【００１０】
一実施態様において、配列番号１の３位のアミノ酸はヒスチジン、アルギニン、リジンおよびアラニンから選ばれ、好ましくはヒスチジンである。
【００１１】
一実施態様において、配列番号１の４位のアミノ酸はグルタミン酸およびアラニンから選ばれ、好ましくはグルタミン酸である。
【００１２】
一実施態様において、配列番号１の５位のアミノ酸はロイシンおよびアラニンから選ばれ、好ましくはロイシンである。
【００１３】
一実施態様において、上記Ｉｇ様分子またはその断片はアミノ酸配列ＧＩＨＥＬＦ（配列番号２）に特異的に結合する。
【００１４】
さらに、本発明は、アミノ酸配列ＬＦＰＡＰ（配列番号２８）に特異的に結合する単離された免疫グロブリン（Ｉｇ）様分子またはその抗原結合断片を提供する。
【００１５】
上記Ｉｇ様分子またはその抗原結合断片は抗体、例えば、モノクローナル抗体とすることができる。このＩｇ様分子またはその抗原結合断片はネズミ起源のもの、例えば、マウス由来のものとすることができる。また、このＩｇ様分子またはその抗原結合断片はキメラ型、ヒト化型またはヒト型とすることができる。
【００１６】
また、本発明は、配列番号３のアミノ酸配列、または、配列番号３のアミノ酸配列であって多くとも２個、好ましくは、多くとも１個のアミノ酸が置換されているアミノ酸配列を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）１と、配列番号４のアミノ酸配列、または、配列番号４のアミノ酸配列であって多くとも２個、好ましくは、多くとも１個のアミノ酸が置換されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ２と、配列番号５のアミノ酸配列、または、配列番号５のアミノ酸配列であって多くとも３個、好ましくは、多くとも１個のアミノ酸が置換されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ３とを含む重鎖可変領域を含むＩｇ様分子またはその抗原結合断片に関する。
【００１７】
一実施態様において、本発明は、アミノ酸配列がＧＹＳＩＸ１ＳＧＹＳＷＨであって、Ｘ１がＴおよびＡから選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１と、アミノ酸配列がＹＩＨＸ２ＳＧＸ３ＡＮＹＮＰＳＬＫＳであって、Ｘ２がＹおよびＦから選択され、Ｘ３がＳおよびＩから選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２と、アミノ酸配列がＥＸ４Ｘ５ＧＸ６ＦＤＹであって、Ｘ４がＫおよびＡから選択され、Ｘ５がＴおよびＲから選択され、Ｘ６がＦおよびＹから選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３とを含む重鎖可変領域を含むＩｇ様分子またはその抗原結合断片に関する。
【００１８】
また、本発明は配列番号６のアミノ酸配列、または、配列番号６のアミノ酸配列であって多くとも３個、好ましくは、多くとも２個、さらに好ましくは、多くとも１個のアミノ酸が置換されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ１と、配列番号７のアミノ酸配列、または、配列番号７のアミノ酸配列であって多くとも２個、好ましくは、多くとも１個のアミノ酸が置換されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ２と、配列番号８のアミノ酸配列、または、配列番号８のアミノ酸配列であって多くとも３個、好ましくは、多くとも２個、さらに好ましくは、多くとも１個のアミノ酸が置換されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ３とを含む軽鎖可変領域を含むＩｇ様分子またはその抗原結合断片に関する。
【００１９】
一実施態様において、本発明は、アミノ酸配列がＲＳＳＱＳＸ７ＶＸ８ＳＮＧＮＴＹＬＸ９であって、Ｘ７がＬおよびＩから選択され、Ｘ８がＨおよびＲから選択され、Ｘ９がＨおよびＴから選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１と、アミノ酸配列がＫＶＳＮＲＦＳであるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２と、アミノ酸配列がＸ１０ＱＸ１１Ｘ１２ＨＶＰＰＴであって、Ｘ１０がＳおよびＦから選択され、Ｘ１１がＳおよびＧから選択され、Ｘ１２がＡおよびＳから選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３とを含む軽鎖可変領域を含むＩｇ様分子またはその抗原結合断片を提供する。
【００２０】
さらに、本発明は配列番号３のアミノ酸配列、または、配列番号３のアミノ酸配列であって多くとも２個、好ましくは、多くとも１個のアミノ酸が置換されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ１と、配列番号４のアミノ酸配列、または、配列番号４のアミノ酸配列であって多くとも２個、好ましくは、多くとも１個のアミノ酸が置換されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ２と、配列番号５のアミノ酸配列、または、配列番号５のアミノ酸配列であって多くとも３個、好ましくは、多くとも２個、さらに好ましくは、多くとも１個のアミノ酸が置換されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ３とを含む重鎖可変領域と、配列番号６のアミノ酸配列、または、配列番号６のアミノ酸配列であって多くとも３個、好ましくは、多くとも２個、さらに好ましくは、多くとも１個のアミノ酸が置換されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ１と、配列番号７のアミノ酸配列、または、配列番号７のアミノ酸配列であって多くとも２個、好ましくは、多くとも１個のアミノ酸が置換されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ２と、配列番号８のアミノ酸配列、または、配列番号８のアミノ酸配列であって多くとも３個、好ましくは、多くとも２個、さらに好ましくは、多くとも１個のアミノ酸が置換されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ３とを含む軽鎖可変領域と、を含むＩｇ様分子またはその抗原結合断片に関する。
【００２１】
一実施態様において、そのようなＩｇ様分子またはその抗原結合断片は、アミノ酸配列がＧＹＳＩＸ１ＳＧＹＳＷＨであって、Ｘ１がＴおよびＡから選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１と、アミノ酸配列がＹＩＨＸ２ＳＧＸ３ＡＮＹＮＰＳＬＫＳであって、Ｘ２がＹおよびＦから選択され、Ｘ３がＳおよびＩから選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２と、アミノ酸配列がＥＸ４Ｘ５ＧＸ６ＦＤＹであって、Ｘ４がＫおよびＡから選択され、Ｘ５がＴおよびＲから選択され、Ｘ６がＦおよびＹから選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３と、を含む重鎖可変領域と、アミノ酸配列がＲＳＳＱＳＸ７ＶＸ８ＳＮＧＮＴＹＬＸ９であって、Ｘ７がＬおよびＩから選択され、Ｘ８がＨおよびＲから選択され、Ｘ９がＨおよびＴから選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１と、アミノ酸配列がＫＶＳＮＲＦＳであるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２と、アミノ酸配列がＸ１０ＱＸ１１Ｘ１２ＨＶＰＰＴであって、Ｘ１０がＳおよびＦから選択され、Ｘ１１がＳおよびＧから選択され、Ｘ１２がＡおよびＳから選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３とを含む軽鎖可変領域と、を含む。
【００２２】
一実施態様において、上記Ｉｇ様分子、抗体またはそれらの抗原結合断片は、配列番号９に示したアミノ酸配列を含むＣＤＲ１と、配列番号１０に示したアミノ酸配列を含むＣＤＲ２と、配列番号１１に示したアミノ酸配列を含むＣＤＲ３とを含む重鎖可変領域と、配列番号１２に示したアミノ酸配列を含むＣＤＲ１と、配列番号１３に示したアミノ酸配列を含むＣＤＲ２と、配列番号１４に示したアミノ酸配列を含むＣＤＲ３とを含む軽鎖可変領域と、を含む。
【００２３】
好ましくは、上記Ｉｇ様分子、抗体またはそれらの抗原結合断片は、配列番号４０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域のヒト化型重鎖可変領域および配列番号４１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域のヒト化型軽鎖可変領域を含む。
【００２４】
別の実施態様において、上記Ｉｇ様分子、抗体またはそれらの抗原結合断片は、配列番号３に示したアミノ酸配列を含むＣＤＲ１と、配列番号４に示したアミノ酸配列を含むＣＤＲ２と、配列番号５に示したアミノ酸配列を含むＣＤＲ３とを含む重鎖可変領域と、配列番号６に示したアミノ酸配列を含むＣＤＲ１と、配列番号７に示したアミノ酸配列を含むＣＤＲ２と、配列番号８に示したアミノ酸配列を含むＣＤＲ３とを含む軽鎖可変領域と、を含む。
【００２５】
好ましくは、上記Ｉｇ様分子、抗体またはそれらの抗原結合断片は、配列番号３８のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域のヒト化型重鎖可変領域および配列番号３９のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域のヒト化型軽鎖可変領域を含む。
【００２６】
さらに別の実施態様において、上記Ｉｇ様分子、抗体またはそれらの抗原結合断片は、配列番号１５に示したアミノ酸配列を含むＣＤＲ１と、配列番号１６に示したアミノ酸配列を含むＣＤＲ２と、配列番号１７に示したアミノ酸配列を含むＣＤＲ３とを含む重鎖可変領域と、配列番号１８に示したアミノ酸配列を含むＣＤＲ１と、配列番号１９に示したアミノ酸配列ＣＤＲ２と、配列番号２０に示したアミノ酸配列を含むＣＤＲ３とを含む軽鎖可変領域と、を含む。
【００２７】
好ましくは、上記Ｉｇ様分子、抗体またはそれらの抗原結合断片は、配列番号４２のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域のヒト化型重鎖可変領域および配列番号４３のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域のヒト化型軽鎖可変領域を含む。
【００２８】
さらに、本発明は、配列番号２９のアミノ酸配列、または、配列番号２９のアミノ酸配列であって、多くとも２個、好ましくは、多くとも１個のアミノ酸が置換されているアミノ酸配列を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）１と、配列番号３０のアミノ酸、または、配列番号３０のアミノ酸であって、多くとも２個、好ましくは、多くとも１個のアミノ酸が置換されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ２と、アミノ酸配列ＳＨＹを含むＣＤＲ３と、を含む重鎖可変領域を含むＩｇ様分子またはその抗原結合断片を提供する。
【００２９】
また、本発明は、配列番号３１のアミノ酸配列、または、配列番号３１のアミノ酸配列であって、多くとも２個、好ましくは、多くとも１個のアミノ酸が置換されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ１と、配列番号３２のアミノ酸配列、または、配列番号３２のアミノ酸配列であって、多くとも２個、好ましくは、多くとも１個のアミノ酸が置換されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ２と、配列番号３３のアミノ酸配列、または、配列番号３３のアミノ酸配列であって、多くとも２個、好ましくは、多くとも１個のアミノ酸が置換されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ３と、を含む軽鎖可変領域を含むＩｇ様分子またはその抗原結合断片を提供する。
【００３０】
一実施態様において、Ｉｇ様分子またはその抗原結合断片は、配列番号２９のアミノ酸配列、または、配列番号２９のアミノ酸配列であって、多くとも２個、好ましくは、多くとも１個のアミノ酸が置換されているアミノ酸配列を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）１と、配列番号３０のアミノ酸、または、配列番号３０のアミノ酸であって、多くとも２個、好ましくは、多くとも１個のアミノ酸が置換されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ２と、アミノ酸配列ＳＨＹを含むＣＤＲ３と、を含む重鎖可変領域と、配列番号３１のアミノ酸配列、または、配列番号３１のアミノ酸配列であって、多くとも２個、好ましくは、多くとも１個のアミノ酸が置換されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ１と、配列番号３２のアミノ酸配列、または、配列番号３２のアミノ酸配列であって、多くとも２個、好ましくは、多くとも１個のアミノ酸が置換されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ２と、配列番号３３のアミノ酸配列、または、配列番号３３のアミノ酸配列であって、多くとも２個、好ましくは、多くとも１個のアミノ酸が置換されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ３と、を含む軽鎖可変領域と、をさらに含む。一実施態様において、上記Ｉｇ様分子、抗体またはそれらの抗原結合断片は、配列番号２９に示したアミノ酸配列を含むＣＤＲ１と、配列番号３０に示したアミノ酸配列を含むＣＤＲ２と、アミノ酸配列ＳＨＹを含むＣＤＲ３と、を含む重鎖可変領域と、および／または配列番号３１に示したアミノ酸配列を含むＣＤＲ１と、配列番号３２に示したアミノ酸配列を含むＣＤＲ２と、配列番号３３に示したアミノ酸配列を含むＣＤＲ３と、を含む軽鎖可変領域と、を含む。
【００３１】
好ましくは、上記Ｉｇ様分子、抗体またはそれらの抗原結合断片は、配列番号４４のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域のヒト化型重鎖可変領域および配列番号４５のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域のヒト化型軽鎖可変領域を含む。
【００３２】
一実施態様において、上記の軽鎖および／または重鎖のＣＤＲは、ヒト由来フレームワーク領域に組み込まれている。
【００３３】
上記Ｉｇ様分子またはその抗原結合断片は、抗体、例えば、キメラ型抗体またはヒト化型抗体とすることができる。
【００３４】
また、本発明は、本明細書に述べたＩｇ様分子またはその抗原結合断片をコードしている核酸分子およびそのような核酸分子を含むベクターを提供する。そのようなベクターは遺伝子治療ベクターとすることができる。
【００３５】
さらに、本発明は、本明細書に述べた核酸分子または本明細書に述べたベクターを含む宿主細胞を提供する。この宿主細胞は哺乳動物の宿主細胞とすることができる。この宿主細胞はハイブリドーマであってもよい。
【００３６】
また、本発明は、医薬組成物であって、（ａ）本明細書に述べたＩｇ様分子またはその抗原結合断片、（ｂ）上記Ｉｇ様分子またはその抗原結合断片をコードしている核酸分子、（ｃ）そのような核酸分子を含むベクターおよび（ｄ）そのような核酸分子またはそのようなベクターを含む宿主細胞からなる群から選ばれる剤並びに医薬用に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
【００３７】
さらに、本発明は、薬剤として使用するための、心筋梗塞および／または圧過負荷に由来または関連する有害な心臓リモデリングおよび状態の治療、予防または進行予防の使用のための、あるいは有害な組織リモデリング、特にフィブロネクチン−ＥＤＡ媒介性の有害な組織リモデリングの治療、予防または進行予防に使用するための本明細書に述べたＩｇ様分子もしくはその抗原結合断片または医薬組成物を提供する。
【００３８】
さらに、本発明は、心筋梗塞および／または圧過負荷に由来または関連する有害な心臓リモデリングおよび状態の治療、予防または進行予防の方法であって、対象に、（ａ）本明細書に述べたＩｇ様分子もしくはその抗原結合断片、このＩｇ様分子もしくはその抗原結合断片をコードしている核酸分子、（ｃ）そのような核酸分子を含むベクターおよび（ｄ）そのような核酸分子またはそのようなベクターを含む宿主細胞からなる群から選ばれる治療的有効量の剤を投与することを含む方法を提供する。上記対象者はヒトとすることができる。
【００３９】
さらに、本発明は、血管形成改善に使用するためのフィブロネクチン−ＥＤＡに結合する抗体またはその抗原結合断片、および血管形成を改善する方法であって、それを必要とする対象者にフィブロネクチン−ＥＤＡに結合する抗体またはその抗原結合断片の治療的有効量を投与することを含む方法を提供する。上記対象者はヒトとすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】フィブロネクチン−ＥＤＡのＥＤＡドメインに対する種々の抗体（すなわち、１７Ｇ８．７２、２７Ａ１２．７０、２９Ｅ７．３５、４２Ｈ１１．５１）で治療したマウスと生理食塩水で治療したマウスとを比較し、３０日間にわたり観察した心筋梗塞後の生存パーセンテージを示す。
【図２】フィブロネクチン−ＥＤＡのＥＤＡドメインに対する種々の抗体（すなわち、１７Ｇ８．７２、２７Ａ１２．７０、２９Ｅ７．３５、４２Ｈ１１．５１）で治療したマウスにおける心筋梗塞後の駆出率（ＥＦ：ｅｊｅｃｔｉｏｎ  ｆｒａｃｔｉｏｎ）を示す。
【図３】フィブロネクチン−ＥＤＡのＥＤＡドメインに対する抗体３３Ｅ３．１０で治療したマウスと生理食塩水で治療したマウスとを比較し、３０日間にわたり観察した心筋梗塞後の生存パーセンテージを示す。
【図４】フィブロネクチン−ＥＤＡのＥＤＡドメインに対する抗体３３Ｅ３．１０で治療したマウスにおける心筋梗塞後の駆出率（ＥＦ）を示す。
【図５】抗ＥＤＡ治療によるＭＩ後の心臓機能の改善を示す図であり、（Ａ）生理食塩水治療マウスの心臓のＭＲＩ画像、（Ｂ）抗ＥＤＡ治療マウスの心臓のＭＲＩ画像、（Ｃ）ＭＩ後の拡張末期容量（ＥＤＶ：ｅｎｄ−ｄｉａｓｔｏｌｉｃ  ｖｏｌｕｍｅ）の増加を示す（抗ＥＤＡ治療は、生理食塩水＊ｐ＝０．０１１、＃ｐ＝０．０１４並びにアイソタイプ対照治療動物と比較してＥＤＶ増加の減退を示す。）（Ｄ）生理食塩水＊ｐ＝０．０１１、＃ｐ＝０．０１４アイソタイプ治療動物と比較したＭＩ後の収縮末期容量（ＥＳＶ：ｅｎｄ−ｓｙｓｔｏｌｉｃ  ｖｏｌｕｍｅ）の増加を示す（生理食塩水ではｎ＝１４、抗ＥＤＡ治療動物ではｎ＝９、アイソタイプ対照治療動物ではｎ＝５。）
【図６】抗ＥＤＡ治療が７日間のＭＩ後に血中白血球レベルを低下させることを示す。（Ａ）Ｌｙ−６Ｇ＋好中球は、対照治療動物と比較して抗ＥＤＡ治療群では有意に低下した。（Ｂ）ＣＤ３＋Ｔ細胞は、抗ＥＤＡ治療後、非有意に減少した。（Ｃ）Ｌｙ−６Ｃ＋／Ｌｙ−６Ｇ−単球は、抗ＥＤＡ治療後、非有意に低下した。（Ｄ）Ｌｙ−６Ｃ−／Ｌｙ−６Ｇ−単球は、抗ＥＤＡ治療後、非有意に低下した。（Ｅ）ＣＤ４９ｄの発現は抗ＥＤＡ治療後、Ｌｙ−６Ｃ−／Ｌｙ−６Ｇ−単球において有意に増加した。対照群ではＮ＝８、抗ＥＤＡ群ではＮ＝５。データは平均±ＳＥＭで表した。
【図７】炎症性サイトカインは梗塞部位において減少するが、これは白血球数に影響を与えないことを示す。（Ａ）炎症性サイトカインＩＬ−１ｂ（ｐ＝０．０３）、ＧＭ−ＣＳＦ（ｐ＝０．０４）、ＴＮＦ−α（ｐ＝非有意）、ＭＩＰ−１ｂ（ｐ＝非有意）、ＲＡＮＴＥＳ（ｐ＝０．０１）、ＩＬ−４（ｐ＝０．０２）は抗ＥＤＡ治療動物の梗塞部位において減少する。抗ＥＤＡ治療動物の梗塞部位では、抗炎症性サイトカインＩＬ−１０は減少（ｐ＝非有意）し、ＩＬ−１７は増加（ｐ＝０．０３）する。Ｐ値は多重検定について補正していない。（Ｂ）梗塞部位におけるＬｙ−６Ｇ好中球染色の例。（Ｃ）好中球染色の定量。（Ｄ）梗塞部位におけるＭａｃ−３マクロファージ染色の例。（Ｅ）好中球染色の定量。対照群ではＮ＝８、抗ＥＤＡ群ではＮ＝５。データは平均±ＳＥＭで表した。
【図８】瘢痕形成は抗ＥＤＡ治療によって影響を受けないことを示す。（Ａ）梗塞部位におけるピクロシリウスレッド染色の偏光写真の例。（Ｂ）ピクロシリウスレッド染色の定量。（Ｃ）梗塞部位におけるＣｏｌ１のｍＲＮＡレベルの定量。（Ｄ）梗塞部位におけるＣｏｌ３のｍＲＮＡレベルの定量。対照群ではＮ＝８、抗ＥＤＡ群ではＮ＝５。データは平均±ＳＥＭで表した。
【図９】抗ＥＤＡ治療が境界および梗塞域における小血管形成を増加させることを示す。（Ａ）対照心臓の境界域におけるＣＤ３１血管染色。（Ｂ）抗ＥＤＡ治療心臓の境界域におけるＣＤ３１血管染色。（Ｃ）境界域における総血管の定量。抗ＥＤＡ治療群では総血管数の増加が認められた（ｐ＜０．０００１）。（Ｄ）血管は直径に基づいた分類で細分されている。抗ＥＤＡ治療群における総血管数の増加は主に５ないし１０μｍの小血管の増加によるものである（ｐ＜０．０００１）。（Ｅ）梗塞域における総血管の定量。抗ＥＤＡ治療群では総血管数の増加が認められた（ｐ＝０．０５）。（Ｆ）血管は直径に基づいた分類で細分されている。抗ＥＤＡ治療群における総血管数の増加は主に１０ないし１６μｍの小血管の増加によるものである（ｐ＝０．０１）。（Ｇ）スプラウティング（発芽）アッセイの陽性対照の例。（Ｈ）スプラウティング（発芽）アッセイにおけるＥＤＡ阻害の例。（Ｉ）相対的スプラウティング（発芽）の定量。陰性対照は１に設定されている。対照群ではＮ＝８、抗ＥＤＡ群ではＮ＝５。データは平均±ＳＥＭで表した。
【図１０】抗ＥＤＡで治療すると、無細胞基質のクリアランスが遅れることを示す。（Ａ）７日間のＭＩ後の対照動物における無細胞基質の代表的画像。（Ｂ）７日間のＭＩ後の抗ＥＤＡ治療動物における無細胞基質の代表的画像。（Ｃ）無細胞基質の定量。抗ＥＤＡ治療群に存在する無細胞基質が増加する。（ｐ＜０．０５）（Ｄ）対照および抗ＥＤＡ治療動物からの心臓組織におけるＭＭＰ２活性を示すザイモグラム。（Ｅ）総ＭＭＰ２活性の定量。抗ＥＤＡ治療動物におけるＭＭＰ２活性は減少する。（Ｆ）異なるＭＭＰ２型の定量。抗ＥＤＡ治療動物では全ての異なるＭＭＰ２型が減少する。（Ｇ）対照および抗ＥＤＡ治療動物の梗塞部位におけるペリオスチン染色の定量。抗ＥＤＡ治療群ではペリオスチン染色が減少する。（Ｈ）線維芽細胞接着アッセイの定量。線維芽細胞は、ＩＩＩ４−ｈｉｓ断片コーティングまたは無コーティングに比し、ＥＤＡ−ｈｉｓ断片コーティングにより多く接着する。このＥＤＡ−ｈｉｓ断片への接着は抗ＥＤＡ抗体によって阻害することができ、アイソタイプ対照によっては阻害することができない。Ｎ＝１。対照群ではＮ＝８、抗ＥＤＡ群ではＮ＝５。データは平均±ＳＥＭで表した。
【図１１】梗塞ヒト心筋におけるＥＤＡ免疫組織化学的染色を示す。（Ａ）心筋細胞の凝固壊死および一部の好中性顆粒球の浸潤を有する心筋梗塞。（Ｂ）梗塞部位において弱い赤色染色を示す壊死心筋のＥＤＡ免疫染色。（Ｃ）梗塞を囲む心筋において細胞質および核（赤色）染色を示す梗塞部位の境界域におけるＥＤＡ免疫染色。（Ｄ）多数の線維芽細胞を有する若い肉芽組織。（Ｅ）線維芽細胞の強い細胞染色を示すＥＤＡ免疫染色。インレー高倍率ＥＤＡ陽性線維芽細胞。（Ｆ）周囲の心筋細胞の一部の弱い細胞質および強い核染色による肉芽組織を囲む心筋のＥＤＡ免疫染色。（Ｇ）幾らかの線維芽細胞を有する膠質性結合組織を有する瘢痕組織。（Ｈ）および（Ｉ）瘢痕および周囲の心筋のＥＤＡ免疫染色の欠如。全てのバーは１００μｍである。各時点当たり３名の患者の代表的写真。Ｈ＆Ｅ＝ヘマトキシリン−エオジン染色。
【図１２】マウスにおいて経動脈狭窄（ＴＡＣ：ｔｒａｎｓａｏｒｔｉｃ  ｃｏｎｓｔｒｉｃｔｉｏｎ）により誘発された圧過負荷の６週間後における（Ａ）駆出率（ＥＦ）（Ｂ）心臓重量／体重比を示す。ＥＤＡ欠損（ＫＯ；ＥＤＡ−／−）マウスと野生型（ＷＴ：ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ）マウスとの間の差はｐ＜０．０５水準にある。（ＥＤＡ欠損マウスについてはアルスラン（Ａｒｓｌａｎ）Ｆ．ほか、サーキュレーション・リサーチ（Ｃｉｒｃ．  Ｒｅｓ．）２０１１年３月号、１０８：５８２−５９２および国際公開第２０１２／０５７６１３号に記載されている。マウスにおける経動脈狭窄（ＴＡＣ）は、圧過負荷誘発性心臓肥大および心不全の一般的な実験モデルである。）
【発明を実施するための形態】
【００４１】
＜免疫グロブリン様分子、抗体およびこれらの抗原結合断片＞
第一の態様において、本発明は、アミノ酸配列ＧＩＸＸＸＦ（配列番号１）であって、Ｘは任意のアミノ酸とすることができるものとするアミノ酸配列またはアミノ酸配列ＬＦＰＡＰ（配列番号２８）に特異的に結合する単離されたＩｇ様分子またはその抗原結合断片に関する。
【００４２】
本明細書で用いている「単離された」という用語は、自然界では通常付随してくる成分を実質的または本質的に含まない物質に関係している。
【００４３】
本明細書で用いている「免疫グロブリン」（「Ｉｇ」と略記）という用語は当該分野でよく知られており、「抗体」という用語と同義である。本明細書で用いている「Ｉｇ様分子」という用語は、少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する抗原結合部位を含む任意のポリペプチドのことをいう。この用語には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単一特異性抗体、多特異的抗体、ヒト化型抗体、キメラ型抗体、ヒト型抗体および一本鎖抗体（例えば、ＶＨＨ）が含まれるが、これらに限定されるものではない。また、「Ｉｇ様分子」という用語には、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆｄ、ｄＡｂなどの抗体断片、および他の抗体断片または抗原結合機能を保持しているＣＤＲを含む他の構築物も含まれる。通常、このような断片は抗原結合ドメインを含むことになる。このＩｇ様分子またはその抗原結合断片は、既知の抗体のアイソタイプ類およびこれらの形態のいずれか、例えば、ＩｇＡ１もしくはＩｇＡ２のようなＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４のようなＩｇＧまたはＩｇＭクラスとすることができ、あるいはこれらの任意の組合せの混合物、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａクラスからの抗体の混合物、を構成することができる。好ましい実施態様では、上記のＩｇ様分子、抗体または抗原結合断片は、ＩｇＧ４アイソタイプのもの、より好ましくは比較的高レベルのＩｇＧ４半分子をもたらす鎖内結合の解離の低下した安定化ＩｇＧ４である。
【００４４】
免疫グロブリン、すなわち、抗体は、免疫系関連タンパク質である。各抗体は、４つのポリペプチド、「Ｙ」形状の分子を形成するように結合した２つの重鎖および２つの軽鎖、からなる。この「Ｙ」の先端部のアミノ酸配列は各種抗体間で大きく異なる。１１０ないし１３０個のアミノ酸からなるこの可変領域は、その抗体に抗原に結合するための特異性を付与している。可変領域には軽鎖および重鎖の端部が含まれる。定常領域は抗原を破壊するために用いられる機構を決定している。抗体は、その重鎖定常領域の構造および免疫機能に基づいて５つの主要なクラスＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥに分類される。重鎖のサブクラスも知られている。例えば、ヒトにおけるＩｇＧ重鎖は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４サブクラスのいずれかとすることができる。
【００４５】
可変領域は、超可変（ＨＶ：ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ）領域およびフレームワーク（ＦＲ：ｆｒａｍｅｗｏｒｋ）領域に細分される。ＨＶ領域は、所定の位置における最も一般的なアミノ酸と比較してその位置に高い比率で異なるアミノ酸を有する。軽鎖および重鎖内には、３つのＨＶ領域、ＨＶ１、２、３が存在する。４つのＦＲ領域は、より安定なアミノ酸配列を有し、ＨＶ領域を分離させている。ＨＶ領域は抗原表面の一部と直接接触する。このため、ＨＶ領域は相補性決定領域、すなわち、ＣＤＲと呼ばれることもある。ＦＲ領域は、ＨＶ領域を正しい位置に保持して抗原に接触させるための足場の役割を果たすベータシート構造を形成している。本明細書で用いている「抗原」という用語は、それぞれの抗体に特異的に結合する標的分子のことをいう。抗原は、通常、特異的抗体に対する相互作用点となり得るいくつかの表面的特徴を提示している。このような表面的特徴は全てエピトープを構成することができる。従って、多くの抗原はいくつか別個の抗体によって結合される可能性があり、それぞれの抗体は異なるエピトープに結合することができる。
【００４６】
本明細書に述べたＩｇ様分子、抗体または抗原結合断片は、フィブロネクチン−ＥＤＡまたはもっぱらフィブロネクチン−ＥＤＡのＥＤＡドメインもしくは特定のアミノ酸領域のようなフィブロネクチン−ＥＤＡのＥＤＡドメインの一部、特に配列番号１に記載のアミノ酸配列ＧＩＸＸＸＦであって、Ｘは任意のアミノ酸とすることができるものとするアミノ酸配列もしくはアミノ酸配列ＬＦＰＡＰ（配列番号２８）に結合することができる。
【００４７】
本発明において、「抗原結合断片」という用語は、配列番号１、配列番号２および／または配列番号２８に記載のアミノ酸配列に特異的に結合するドメインを少なくとも含む、本明細書に述べたＩｇ様分子、例えば抗体、の部分もしくは一部と理解される。抗原結合断片は、元のままの、すなわち、完全なＩｇ様分子、例えば、抗体の化学的または酵素的処理によって得ることができる。
【００４８】
あるいは、抗原結合断片は、標準的な分子生物学の技術およびプロトコルを用いて得ることができる。Ｉｇ様分子の抗原結合断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖ断片；ダイアボディ；直鎖状抗体並びに一本鎖抗体分子が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００４９】
一実施態様において、上記抗原結合断片は、本明細書に述べたフィブロネクチン−ＥＤＡのＥＤＡドメインに特異的に結合するＩｇ様分子のアミノ酸配列の少なくとも５個の連続するアミノ酸残基、少なくとも１０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも１５個の連続するアミノ酸残基、少なくとも２０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも２５個の連続するアミノ酸残基、少なくとも４０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも５０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも６０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも７０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも８０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも９０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも１００個の連続するアミノ酸残基、少なくとも１２５個の連続するアミノ酸残基または少なくとも１５０個の連続するアミノ酸残基、好ましくはフィブロネクチン−ＥＤＡのＥＤＡドメイン、より好ましくは配列番号１、配列番号２および／または２８に記載したアミノ酸配列に特異的に結合する抗体のＮ末端部分を含む。この抗原結合断片は、好ましくは上記Ｉｇ様分子の抗原特異性を保持している。
【００５０】
好ましい一実施態様において、この抗原結合断片は、３つのＣＤＲ、すなわちＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３の全てを重鎖および軽鎖のいずれにおいても含む。さらに好ましい一実施態様において、この抗原結合断片は、重鎖および軽鎖の両方の可変ドメイン全体を含む。
【００５１】
好ましくは、上記Ｉｇ様分子、例えば抗体またはその抗原結合断片は、フィブロネクチン−ＥＤＡのＥＤＡドメインに特異的に結合する。好ましい一実施態様では、このＩｇ様分子、例えば抗体またはその抗原結合断片は、フィブロネクチン−ＥＤＡのＥＤＡドメインの部分であって、この部分は配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するものとするＥＤＡドメインの部分に特異的に結合する。本明細書で用いている「フィブロネクチン−ＥＤＡに結合する抗体またはその抗原結合断片」は、フィブロネクチンのＥＤＡドメインに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片のことをいう。このような抗体または断片は、ＩＩＩ型リピートエキストラドメインＡ（ＥＩＩＩＡ；ＥＤＡ）を欠損するフィブロネクチンを結合しない。
【００５２】
当業者であれば「特異的に結合する」という用語の意味を知っている。本明細書で用いている「特異的に結合する」という用語は、本明細書に述べたＩｇ様分子または抗体または、これらの断片が抗原または特定のエピトープに対してかなりの結合親和性を示し、好ましくは有意な交差反応性を示さないことを意味する。
【００５３】
「かなりの」結合親和性には、少なくとも１０６Ｍ−１、好ましくは少なくとも１０７Ｍ−１、さらに好ましくは少なくとも１０８Ｍ−１、さらに好ましくは少なくとも１０９Ｍ−１または、さらに好ましくは少なくとも１０１０Ｍ−１の親和性で結合することが含まれる。「有意な交差反応性を示さない」抗体とは、望ましくない物質またはフィブロネクチン−ＥＤＡの発現が存在しない組織には、はっきりとは結合しない抗体である。特異的結合は、そのような結合を測定するための当該技術分野において承認されている任意の手段に従って測定することができる。例えば、特異的結合は、スキャチャード（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ）解析および／または競合結合測定法など、その他のこの分野で受け入れられている測定法に従って測定することができる。
【００５４】
本発明の一実施態様において、本明細書に述べたＩｇ様分子は抗体、好ましくはモノクローナル抗体である。「モノクローナル抗体」という用語は、当該分野ではよく知られている。それは、単一クローン化された抗体産生細胞の産生物である抗体のことを指すと理解されている。モノクローナル抗体は、一般に、普通は短命の抗体産生Ｂ細胞を、がん細胞（「不死」細胞ということもある）などの急激に成長する細胞に融合させることによって作製される。得られるハイブリッド細胞、すなわち、ハイブリドーマは急速に増殖し、その抗体を産生することができるクローンが作製される。モノクローナル抗体は、種々の常用手技によって産生させることができる。
【００５５】
本明細書に述べたＩｇ様分子、抗体または、これらの抗原結合断片は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥなどの任意の免疫グロブリンアイソタイプのものとすることができる。好ましい一実施態様において、本明細書に述べたＩｇ様分子、抗体または、これらの抗原結合断片は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４などのＩｇＧ、好ましくはＩｇＧ４である。一実施態様において、本明細書に述べたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、ヒト、非ヒト霊長類、ヒツジ、ウサギ、ブタ、イヌ、ウマ、ウシ、ニワトリ、ネズミその他の哺乳類由来など、哺乳動物起源からのものである。
【００５６】
本明細書に述べた抗体またはその抗原結合断片は、ハイブリッド抗体、例えば、キメラ型またはヒト化型モノクローナル抗体とすることもできる。本発明において、「ハイブリッド抗体」という用語は、抗体の１つ以上の領域が第一の種（例えばマウス）由来の抗体由来のものであり、その抗体の１つ以上の領域が第二の異なる種（例えばヒト）由来の抗体からのものである抗体のことをいう。キメラ型抗体では、通常、抗体の非ヒト（例えばマウス）定常領域がヒト定常領域によって置換される。
【００５７】
ヒト化型抗体は、重鎖および軽鎖の少なくとも一方がヒト化型である、すなわち、重鎖および軽鎖の少なくとも一方がフレームワーク領域うちの１つ以上、好ましくは全てが本来ヒト型である可変領域を含む抗体のことをいうものとする。ヒト化型抗体の超可変（ＣＤＲ）領域は、非ヒト源由来、通常、齧歯動物（例えばマウス）のものとすることができる。ヒト化型抗体は、任意選択的にＩｇ定常領域（Ｆｃ）、好ましくはヒトＩｇ分子のそれの少なくとも一部分を含むこともできる。
【００５８】
キメラ型およびヒト化型抗体は、ＣＤＲグラフティング手法（例えば、米国特許第５，８４３，７０８号、第６，１８０，３７０号、第５，６９３，７６２号、第５，５８５，０８９号、第５，５３０，１０１号参照）、鎖シャフリング法（例えば、米国特許第５，５６５，３３２号；ラダー（Ｒａｄｅｒ）ほか、プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．）米国（ＵＳＡ）（１９９８年）９５：８９１０−８９１５参照）、分子モデリング法（米国特許第５，６３９，６４１号）などを含む当該分野でよく知られている方法で調製することができる。例えば、最良適合ヒト重鎖および軽鎖を非ヒト抗体の３ＤモデルおよびＣＤＲ長さに基づいて選ぶ。次に、ヒトおよび非ヒト抗体間で異なり、抗原の結合に影響を与える可能性があるフレームワーク領域内のアミノ酸を同定する。キメラ型もしくはヒト化型抗体またはその抗原結合断片を使用すると、ヒトにおける免疫拒絶その他の有害な免疫反応の発生またはリスクを極小化または排除することができる。さらに、一般に、キメラ型、ヒト化型またはヒト型抗体を用いると、非ヒト型抗体と比べてクリアランスが低下するため、循環血液中の半減期が長くなる。
【００５９】
特に好ましい一実施態様において、本発明の抗体はヒト化型抗体である。本発明によるヒト化型抗体は、好ましくはヒト重鎖および軽鎖定常領域を含み、さらに好ましくはヒト重鎖および軽鎖フレームワーク領域をさらに含む。例として、本発明は、ネズミの抗体２７Ａ１２．７０および３３Ｅ３．１０のヒト化型抗体を提供する。生殖系列遺伝子ＶＫ２−２９およびＪＫ４をヒト化型抗体２７Ａ１２．７０の軽鎖のアクセプター配列として使用し、生殖系列遺伝子ＶＨ４−３１およびＪＨ４をヒト化型抗体２７Ａ１２．７０の重鎖のアクセプター配列として使用する。配列番号３４および配列番号３５は、それぞれ、ヒト化型抗体２７Ａ１２．７０の重鎖および軽鎖の配列となる。生殖系列遺伝子ＶＫ１−１２およびＪＫ４はヒト化型抗体３３Ｅ３．１０の軽鎖のアクセプター配列として使用し、生殖系列遺伝子ＶＨ３−２３およびＪＨ４はヒト化型抗体３３Ｅ３．１０の重鎖のアクセプター配列として使用する。配列番号３６および配列番号３７は、それぞれ、ヒト化型抗体３３Ｅ３．１０の重鎖および軽鎖の配列となる。
【００６０】
本発明による特に好ましい抗体はＩｇＧ４サブタイプのヒト化型抗体である。ＩｇＧ４抗体が生体内では他のＩｇＧサブタイプ抗体と異なる挙動を示すことは当該分野では知られている。ＩｇＧ４分子は、重鎖間ジスルフィド結合が形成されている形およびこれらの結合の一方または両方が形成されていない形の両方の形態で存在する。重鎖間ジスルフィド結合が欠損しているＩｇＧ４の形態は１本の重鎖と１本の軽鎖からなり、これは半分子とも呼ばれる。ＩｇＧ４のこの自由度の原因はＩｇＧ４のヒンジ領域のコア配列にあると考えられている。この領域はＣｙｓ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓからなるのに対して、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２における対応する配列はＣｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓである。ＩｇＧ４の自由度の結果として、生体内ＩｇＧ４が、半分子、単一特異性抗体、および異なる抗原特異性を有する２種のＩｇＧ４分子の会合の結果として生じた二重特異性抗体を含むいくつかの形態で存在することになる。抗体の治療的利用のためには、生体内での抗体の安定性が望まれるので、半分子および二重特異性抗体形成は好ましくない。従って、生体内での半分子の形成および置換を低下させた安定化ＩｇＧ４分子が設計されている。好ましい一実施態様において、本発明によるヒト化型ＩｇＧ４抗体は安定化ＩｇＧ４抗体である。本明細書で用いている「安定化ＩｇＧ４抗体」という用語は、半分子の形成および置換を低下させるように改変されたＩｇＧ４抗体のことを指す。好適な安定化ＩｇＧ４抗体の例としては、ヒト型ＩｇＧ４の重鎖定常領域内の４０９位のアルギニン（カバット（Ｋａｂａｔ）のナンバリング、カバットほか、免疫学的対象のタンパク質の配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ）、第５版、国立衛生研究所公衆衛生局（Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）、ベセスダ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ）、ＭＤ、１９９１年）がリジン、スレオニン、メチオニンまたはロイシンで置換されている、および／またはＩｇＧ４のヒンジ領域がＣｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ配列を含む抗体がある。抗体２７Ａ１２．７０の重鎖および軽鎖ＣＤＲを有する好ましい安定化ヒト化型ＩｇＧ４の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号３４および配列番号３５に示し、抗体３３Ｅ３．１０の重鎖および軽鎖ＣＤＲを有する好ましいヒト化型ＩｇＧ４の同配列をそれぞれ配列番号３６および配列番号３７に示した。これらの好ましい安定化ＩｇＧ４の重鎖および軽鎖のうちの１つ以上の定常領域およびフレームワーク領域のアミノ酸配列は、好ましい実施態様では、本明細書に開示したその他の抗体をヒト化するのに用いる。
【００６１】
従って、配列番号１または配列番号２に記載のアミノ酸配列に特異的に結合するヒト化型抗体またはその抗原結合断片であって、この抗体またはその断片は、重鎖および軽鎖を含むものとし、前記重鎖は配列番号３４に示したアミノ酸配列を有し、前記軽鎖は配列番号３５に示したアミノ酸配列を有するものとする抗体またはその断片を提供する。さらに、配列番号２８に記載のアミノ酸配列に特異的に結合するヒト化型抗体またはその抗原結合断片であって、この抗体またはその断片は、重鎖および軽鎖を含むものとし、前記重鎖は配列番号３６に示したアミノ酸配列を有し、前記軽鎖は配列番号３７に示したアミノ酸配列を有するものとする抗体またはその断片を提供する。
【００６２】
さらに、配列番号１、配列番号２または配列番号２８に記載のアミノ酸配列に特異的に結合するヒト化型抗体またはその抗原結合断片であって、この抗体またはその断片は、重鎖および軽鎖を含むものとし、前記重鎖は配列番号３４または配列番号３６に記載のＩｇＧ４重鎖のフレームワーク領域の１つ以上、好ましくは全てを含むヒト化型可変領域を含み、前記軽鎖は配列番号３５または配列番号３７に記載のＩｇＧ４軽鎖のフレームワーク領域の１つ以上、好ましくは全てを含むヒト化型可変領域を含むものとする抗体またはその断片を提供する。さらに、配列番号１、配列番号２または配列番号２８に記載のアミノ酸配列に特異的に結合するヒト化型抗体またはその抗原結合断片であって、この抗体またはその断片は、重鎖および軽鎖を含むものとし、前記重鎖は配列番号３４または配列番号３６に記載のＩｇＧ４重鎖の定常領域（好ましくは、配列番号３４のアミノ酸番号１１８ないし４４４または配列番号３６アミノ酸番号１１２ないし４３８）を含み、前記軽鎖は配列番号３５または配列番号３７に記載のＩｇＧ４軽鎖の定常領域（好ましくは、配列番号３５のアミノ酸番号１１４ないし２１９または配列番号３７のアミノ酸番号１０９ないし２１４）を含むものとする抗体またはその断片を提供する。さらに、前記重鎖および／または軽鎖は配列番号３４または配列番号３６に記載のＩｇＧ４重鎖のフレームワーク領域の１つ以上、好ましくは全てを含む可変領域および／または配列番号３５または配列番号３７に記載のＩｇＧ４軽鎖のフレームワーク領域の１つ以上、好ましくは全てを含む可変領域を含むことができる。前記抗体は、さらに好ましくは抗体２７Ａ１２．７０、２９Ｅ７．３５、１７Ｇ８．７２または３３Ｅ３．１０の重鎖および軽鎖ＣＤＲを含む。これらＣＤＲ配列は、配列番号３ないし８（２７Ａ１２．７０）、配列番号９ないし１４（２９Ｅ７．３５）、配列番号１５ないし２０（１７Ｇ８．７２）および配列番号２９ないし３３（３３Ｅ３．１０）に示した。
【００６３】
従って、さらに、血管形成の改善に使用するための、好ましくは虚血組織、線維性組織、圧過負荷状態もしくは傷害組織における、および／または臓器もしくは組織移植時における血管形成の改善に使用するための、フィブロネクチン−ＥＤＡに結合するヒト化型抗体またはその抗原結合断片であって、前記抗体または断片は配列番号１、配列番号２または配列番号２８に記載のアミノ酸配列に特異的に結合するものとし、この抗体またはその断片は重鎖および軽鎖を含むものとし、前記重鎖は配列番号３４または配列番号３６に記載のＩｇＧ４重鎖の定常領域を含み、前記軽鎖は配列番号３５または配列番号３７に記載のＩｇＧ４軽鎖の定常領域を含むものとする抗体またはその断片を提供する。さらに、前記重鎖および／または軽鎖、好ましくはこれらの両方は、配列番号３４または配列番号３６に記載のＩｇＧ４重鎖のフレームワーク領域の１つ以上、好ましくは全てを含む可変領域および／または配列番号３５または配列番号３７に記載のＩｇＧ４軽鎖のフレームワーク領域の１つ以上、好ましくは全てを含む可変領域を含むことができる。前記抗体は、さらに好ましくは、抗体２７Ａ１２．７０、２９Ｅ７．３５、１７Ｇ８．７２または３３Ｅ３．１０の重鎖および軽鎖ＣＤＲを含む。
【００６４】
一態様において、本明細書に述べたＩｇ様分子または抗原結合断片は、アミノ酸配列ＧＩＸＸＸＦ（配列番号１）であって、Ｘは任意のアミノ酸とすることができるものとする配列に特異的に結合する。
【００６５】
一実施態様において、配列番号１の３位のアミノ酸は、任意のアミノ酸とすることができる。あるいは、配列番号１の３位のアミノ酸は、ヒスチジン、アルギニン、リジンおよびアラニンから選ぶことができる。より好ましくは、配列番号１の３位のアミノ酸はヒスチジンである。
【００６６】
同様に、配列番号１の４位のアミノ酸は、任意のアミノ酸とすることができる。配列番号１の４位のアミノ酸は、好ましくはグルタミン酸およびアラニンから選ばれる。好ましい一実施態様において、配列番号１の４位のアミノ酸はグルタミン酸である。
【００６７】
配列番号１の５位のアミノ酸は、任意のアミノ酸とすることができる。好ましくは、配列番号１の５位のアミノ酸は、ロイシンおよびアラニンからなる群から選ばれる小さなアミノ酸である。好ましい一実施態様において、配列番号１の５位のアミノ酸はロイシンである。
【００６８】
より好ましい一実施態様において、上記Ｉｇ様分子またはその抗原結合断片は、アミノ酸配列ＧＩＨＥＬＦ（配列番号２）に特異的に結合する。本発明者は、本明細書に述べたＩｇ様分子またはその断片が、配列番号２に記載のアミノ酸配列に高親和性で結合することを見出した。また、本発明者は、本明細書に述べたＩｇ様分子、抗体およびこれらの断片が、心筋梗塞後において生存の向上および心臓機能の改善をもたらすことを見出した。さらに、本明細書に述べたＩｇ様分子、抗体およびこれらの断片は、これらが心臓組織における筋線維芽細胞の量に影響を与えず、コラーゲン産生を妨げないため、さらに好ましいということを見出した。このことは、梗塞部位の断裂を阻止するためにはこの組織において堅固なコラーゲンをベースとした瘢痕を有することが重要であるので、有利である。実施例５に示したように、本発明のフィブロネクチン−ＥＤＡに結合する抗体で治療しても適正な瘢痕形成に影響しなかった。さらに、抗フィブロネクチン−ＥＤＡ治療により無細胞基質のクリアランスが遅延されることを見出した。そのような暫定的無細胞基質の形成はＭＩ後の壊死組織および瘢痕形成の血行性補償に不可欠である。創傷治癒時に、この暫定的基質は徐々に分解され、堅固なコラーゲン系の瘢痕によって置き換えられる。
【００６９】
非虚血性状態下では、ＥＤＡが存在しないと、マウスにおける心臓の圧過負荷後の有害なリモデリングも阻止された。ＥＤＡ欠損マウスでは、心臓機能および（心不全およびその後のうっ血の程度の指標である）心臓／身体重量比の両方が有意に改善された。これらのデータから、圧過負荷状態（例えば、高血圧、弁膜症および非虚血性心筋症）における抗ＥＤＡ治療は治療的価値があることは明らかである。
【００７０】
また、本発明は、配列番号３に示したアミノ酸配列、もしくは配列番号３に示したアミノ酸配列であって、多くても２個、好ましくは多くても１個のアミノ酸が置換されているものとするアミノ酸配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）１、配列番号４に示したアミノ酸配列、もしくは配列番号４に示したアミノ酸配列であって、多くても２個、好ましくは多くても１個のアミノ酸が置換されているものとするアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および配列番号５に示したアミノ酸配列、もしくは配列番号５に示したアミノ酸配列であって、多くても２個など、多くても３個、好ましくは多くても１個のアミノ酸が置換されているものとするアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含むＩｇ様分子、抗体またはこれらの抗原結合断片を提供する。
【００７１】
例えば、配列番号３の５位のスレオニンはアラニンであってもよいことを見出した。さらに、配列番号４の４位のチロシンはフェニルアラニンであってもよく、配列番号４の７位のイソロイシンはセリンであってもよいことを見出した。最後に、配列番号５の２位のリジンはアラニンであってもよく、配列番号５の３位のスレオニンはアルギニンであってもよく、配列番号５の５位のフェニルアラニンはチロシンであってもよいことを見出した。
【００７２】
また、Ｉｇ様分子、抗体またはこれらの抗原結合断片であって、アミノ酸配列がＧＹＳＩＸ１ＳＧＹＳＷＨであって、Ｘ１がＴおよびＡから選択されるアミノ酸配列（配列番号２１）を含むＣＤＲ１と、アミノ酸配列がＹＩＨＸ２ＳＧＸ３ＡＮＹＮＰＳＬＫＳであって、Ｘ２がＹおよびＦから選択され、Ｘ３がＳおよびＩから選択されるアミノ酸配列（配列番号２２）を含むＣＤＲ２と、アミノ酸配列がＥＸ４Ｘ５ＧＸ６ＦＤＹであって、Ｘ４がＫおよびＡから選択され、Ｘ５がＴおよびＲから選択され、Ｘ６がＦおよびＹから選択されるアミノ酸配列（配列番号２３）を含むＣＤＲ３とを含む重鎖可変領域を含むＩｇ様分子、抗体またはこれらの断片を提供する。
【００７３】
また、本発明は、配列番号６のアミノ酸配列、または、配列番号６のアミノ酸配列であって多くとも３個、好ましくは、多くとも２個、さらに好ましくは、多くとも１個のアミノ酸が置換されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ１と、配列番号７のアミノ酸配列、または、配列番号７のアミノ酸配列であって多くとも２個、好ましくは、多くとも１個のアミノ酸が置換されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ２と、配列番号８のアミノ酸配列、または、配列番号８のアミノ酸配列であって多くとも３個、好ましくは、多くとも２個、さらに好ましくは、多くとも１個のアミノ酸が置換されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ３とを含む軽鎖可変領域を含むＩｇ様分子、抗体またはこれらの抗原結合断片を提供する。
【００７４】
例えば、配列番号６の６位のロイシンはイソロイシンであってもよく、配列番号６の８位のヒスチジンはアルギニンであってもよく、配列番号６の１６位のヒスチジンはスレオニンであってもよいことを見出した。さらに、配列番号８の１位のセリンはフェニルアラニンであってもよく、配列番号８の３位のセリンはグリシンであってもよく、配列番号８の４位のアラニンはセリンであってもよいことを見出した。
【００７５】
また、Ｉｇ様分子、抗体またはこれらの抗原結合断片であって、アミノ酸配列がＲＳＳＱＳＸ７ＶＸ８ＳＮＧＮＴＹＬＸ９であって、Ｘ７がＬおよびＩから選択され、Ｘ８がＨおよびＲから選択され、Ｘ９がＨおよびＴから選択されるアミノ酸配列（配列番号２４）を含むＣＤＲ１と、アミノ酸配列がＫＶＳＮＲＦＳであるアミノ酸配列（配列番号２５）を含むＣＤＲ２と、アミノ酸配列がＸ１０ＱＸ１１Ｘ１２ＨＶＰＰＴであって、Ｘ１０がＳおよびＦから選択され、Ｘ１１がＳおよびＧから選択され、Ｘ１２がＡおよびＳから選択されるアミノ酸配列（配列番号２６）を含むＣＤＲ３とを含む軽鎖可変領域を含むＩｇ様分子、抗体またはこれらの断片を提供する。
【００７６】
好ましい一実施態様において、そのようなＩｇ様分子、抗体またはこれらの抗原結合断片は、配列番号３のアミノ酸配列、または、配列番号３のアミノ酸配列であって多くとも２個、好ましくは、多くとも１個のアミノ酸が置換されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ１と、配列番号４のアミノ酸配列、または、配列番号４のアミノ酸配列であって多くとも２個、好ましくは、多くとも１個のアミノ酸が置換されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ２と、配列番号５のアミノ酸配列、または、配列番号５のアミノ酸配列であって多くとも３個、好ましくは、多くとも２個、さらに好ましくは、多くとも１個のアミノ酸が置換されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ３とを含む重鎖可変領域と、配列番号６のアミノ酸配列、または、配列番号６のアミノ酸配列であって多くとも３個、好ましくは、多くとも２個、さらに好ましくは、多くとも１個のアミノ酸が置換されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ１と、配列番号７のアミノ酸配列、または、配列番号７のアミノ酸配列であって多くとも２個、好ましくは、多くとも１個のアミノ酸が置換されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ２と、配列番号８のアミノ酸配列、または、配列番号８のアミノ酸配列であって多くとも３個、好ましくは、多くとも２個、さらに好ましくは、多くとも１個のアミノ酸が置換されているアミノ酸配列を含むＣＤＲ３とを含む軽鎖可変領域とを含む。本発明者は、本実施態様のＩｇ様分子、抗体またはこれらの抗原結合断片が心臓および血管リモデリング、心筋梗塞および圧過負荷関連の合併症の治療、予防または進行予防に特に好適であることを見出した。具体的には、本実施態様のＩｇ様分子、抗体またはこれらの抗原結合断片は、心筋梗塞後の生存を向上させ、心臓機能を改善するのに特に有効であることが分かった。さらに、本発明のＩｇ様分子、抗体またはこれらの抗原結合断片は、これらが無細胞基質のクリアランスを遅延させ、心筋梗塞後の心臓の拡張および断裂を阻止するのに重要な適切な瘢痕形成に影響を与えないため、特に好ましい。さらに、本発明のＩｇ様分子、抗体またはこれらの抗原結合断片は、これらが心筋梗塞後の梗塞および境界域における血管形成をも改善することにより創傷治癒の改善に寄与し、有害なリモデリングを予防するので、好ましい。
【００７７】
別の好ましい実施態様において、そのようなＩｇ様分子、抗体またはこれらの抗原結合断片は、アミノ酸配列がＧＹＳＩＸ１ＳＧＹＳＷＨであって、Ｘ１がＴおよびＡから選択されるアミノ酸配列（配列番号２１）を含むＣＤＲ１と、アミノ酸配列がＹＩＨＸ２ＳＧＸ３ＡＮＹＮＰＳＬＫＳであって、Ｘ２がＹおよびＦから選択され、Ｘ３がＳおよびＩから選択されるアミノ酸配列（配列番号２２）を含むＣＤＲ２と、アミノ酸配列がＥＸ４Ｘ５ＧＸ６ＦＤＹであって、Ｘ４がＫおよびＡから選択され、Ｘ５がＴおよびＲから選択され、Ｘ６がＦおよびＹから選択されるアミノ酸配列（配列番号２３）を含むＣＤＲ３とを含む重鎖可変領域と、アミノ酸配列がＲＳＳＱＳＸ７ＶＸ８ＳＮＧＮＴＹＬＸ９であって、Ｘ７がＬおよびＩから選択され、Ｘ８がＨおよびＲから選択され、Ｘ９がＨおよびＴから選択されるアミノ酸配列（配列番号２４）を含むＣＤＲ１と、アミノ酸配列がＫＶＳＮＲＦＳであるアミノ酸配列（配列番号２５）を含むＣＤＲ２と、アミノ酸配列がＸ１０ＱＸ１１Ｘ１２ＨＶＰＰＴであって、Ｘ１０がＳおよびＦから選択され、Ｘ１１がＳおよびＧから選択され、Ｘ１２がＡおよびＳから選択されるアミノ酸配列（配列番号２６）を含むＣＤＲ３とを含む軽鎖可変領域と、を含む。
【００７８】
一実施態様において、そのようなＩｇ様分子、抗体またはこれらの抗原結合断片は、
−配列番号３に示したアミノ酸配列を含むＣＤＲ１と、
−配列番号４に示したアミノ酸配列を含むＣＤＲ２と、
−配列番号５に示したアミノ酸配列を含むＣＤＲ３と
を含む重鎖可変領域と、
−配列番号６に示したアミノ酸配列を含むＣＤＲ１と、
−配列番号７に示したアミノ酸配列を含むＣＤＲ２と、
−配列番号８に示したアミノ酸配列を含むＣＤＲ３と
を含む軽鎖可変領域と、を含む。
【００７９】
別の実施態様において、そのようなＩｇ様分子、抗体またはこれらの抗原結合断片は、
−配列番号９に示したアミノ酸配列を含むＣＤＲ１と、
−配列番号１０に示したアミノ酸配列を含むＣＤＲ２と、
−配列番号１１に示したアミノ酸配列を含むＣＤＲ３と
を含む重鎖可変領域と、
−配列番号１２に示したアミノ酸配列を含むＣＤＲ１と、
−配列番号１３に示したアミノ酸配列を含むＣＤＲ２と、
−配列番号１４に示したアミノ酸配列を含むＣＤＲ３と
を含む軽鎖可変領域と、
を含む。
【００８０】
さらに別の実施態様において、上記Ｉｇ様分子、抗体またはこれらの抗原結合断片は、
−配列番号１５に示したアミノ酸配列を含むＣＤＲ１と、
−配列番号１６に示したアミノ酸配列を含むＣＤＲ２と、
−配列番号１７に示したアミノ酸配列を含むＣＤＲ３と
を含む重鎖可変領域と、
−配列番号１８に示したアミノ酸配列を含むＣＤＲ１と、
−配列番号１９に示したアミノ酸配列ＣＤＲ２と、
−配列番号２０に示したアミノ酸配列を含むＣＤＲ３と
を含む軽鎖可変領域と、を含む。
【００８１】
別の態様において、本明細書に述べたＩｇ様分子、抗体またはこれらの抗原結合断片は、アミノ酸配列ＬＦＰＡＰ（配列番号２８）に特異的に結合する。本発明者は、本明細書に述べたＩｇ様分子またはその断片が配列番号２８に記載のアミノ酸配列に高い親和性で結合することを見出した。また、本発明者は、本明細書に述べたＩｇ様分子が心筋梗塞後の生存の向上をもたらすことを見出した。
【００８２】
また、本発明は、配列番号２９に示したアミノ酸配列、または配列番号２９に示したアミノ酸配列であって、多くても２個、好ましくは多くても１個のアミノ酸が置換されているものとするアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号３０に示したアミノ酸配列、または配列番号３０に示したアミノ酸配列であって、多くても２個、好ましくは多くても１個のアミノ酸が置換されているものとするアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、およびアミノ酸配列ＳＨＹを有するＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含むＩｇ様分子、抗体またはこれらの抗原結合断片を提供する。
【００８３】
さらに、本発明は、配列番号３１に示したアミノ酸配列、または配列番号３１に示したアミノ酸配列であって、多くても２個、好ましくは多くても１個のアミノ酸が置換されているものとするアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号３２に示したアミノ酸配列、または配列番号３２に示したアミノ酸配列であって、多くても２個、好ましくは多くても１個のアミノ酸が置換されているものとするアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および配列番号３３に示したアミノ酸配列、または配列番号３３に示したアミノ酸配列であって、多くても２個、好ましくは多くても１個のアミノ酸が置換されているものとするアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含むＩｇ様分子、抗体またはこれらの抗原結合断片を提供する。
【００８４】
一実施態様において、上記Ｉｇ様分子、抗体またはこれらの抗原結合断片は、配列番号２９に示したアミノ酸配列、または配列番号２９に示したアミノ酸配列であって、多くても２個、好ましくは多くても１個のアミノ酸が置換されているものとするアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号３０に示したアミノ酸配列、または配列番号３０に示したアミノ酸配列であって、多くても２個、好ましくは多くても１個のアミノ酸が置換されているものとするアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、およびアミノ酸配列ＳＨＹを有するＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含み、かつ配列番号３１に示したアミノ酸配列、または配列番号３１に示したアミノ酸配列であって、多くても２個、好ましくは多くても１個のアミノ酸が置換されているものとするアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号３２に示したアミノ酸配列、または配列番号３２に示したアミノ酸配列であって、多くても２個、好ましくは多くても１個のアミノ酸が置換されているものとするアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および配列番号３３に示したアミノ酸配列、または配列番号３３に示したアミノ酸配列であって、多くても２個、好ましくは多くても１個のアミノ酸が置換されているものとするアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域をさらに含む。
【００８５】
好適な一実施態様において、さらに、本発明は、配列番号３１に示したアミノ酸配列、または配列番号３１に示したアミノ酸配列であって、多くても２個、好ましくは多くても１個のアミノ酸が置換されているものとするアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号３２に示したアミノ酸配列、または配列番号３２に示したアミノ酸配列であって、多くても２個、好ましくは多くても１個のアミノ酸が置換されているものとするアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、および配列番号３３に示したアミノ酸配列、または配列番号３３に示したアミノ酸配列であって、多くても２個、好ましくは多くても１個のアミノ酸が置換されているものとするアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含むＩｇ様分子、抗体またはこれらの抗原結合断片を提供する。
【００８６】
一実施態様において、上記Ｉｇ様分子、抗体またはこれらの抗原結合断片は、
−配列番号２９に示したアミノ酸配列を含むＣＤＲ１と、
−配列番号３０に示したアミノ酸配列を含むＣＤＲ２と、
−アミノ酸配列ＳＨＹを含むＣＤＲ３と、
を含む重鎖可変領域と、
および／または
−配列番号３１に示したアミノ酸配列を含むＣＤＲ１と、
−配列番号３２に示したアミノ酸配列を含むＣＤＲ２と、
−配列番号３３に示したアミノ酸配列を含むＣＤＲ３と、
を含む軽鎖可変領域と、
を含む。
【００８７】
本発明者は、本明細書に述べたＩｇ様分子、抗体または抗原結合断片が全て、心筋梗塞後に生存を向上させ、心臓機能を改善するのに特に有効であることを見出した。さらに、本明細書に述べたＩｇ様分子、抗体またはこれらの抗原結合断片が、無細胞基質のクリアランスを遅延させると共に、心筋梗塞後の心臓の拡張および断裂を阻止するのに重要である適切な瘢痕形成に影響を与えないことを見出した。
【００８８】
＜本発明の核酸分子、ベクターおよび宿主細胞＞
また、本発明は、本明細書に述べたＩｇ様分子、抗体またはこれらの抗原結合断片をコードしている（単離）核酸分子に関する。本発明において、「核酸分子」または「ポリヌクレオチド分子」という用語は、任意の長さのヌクレオチドのポリマーのことを指し、ＤＮＡおよびＲＮＡを含むものとする。これらのヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、改変ヌクレオチドもしくは塩基および／またはこれらの類似体、またはＤＮＡもしくはＲＮＡポリメラーゼによってまたは合成反応によってポリマーに組み込むことができる任意の基質とすることができる。本明細書に述べたＩｇ様分子、抗体またはこれらの抗原結合断片をコードすることができる核酸分子を調製、合成および製造するための方法および標準的なプロトコルについては、従来の分子生物学の教示により当該分野では周知されている。
【００８９】
本明細書に述べたＩｇ様分子が軽鎖および重鎖を含む抗体である場合、宿主細胞には２種の核酸分子、すなわち、軽鎖のアミノ酸配列をコードしている１つの核酸分子と重鎖のアミノ酸配列をコードしている第２の核酸分子を導入することができる。本発明は、１組の核酸分子であって、この組は、抗体の軽鎖をコードしている第１の核酸分子を含むものとし、この軽鎖は可変領域および定常領域を含むものとし、および抗体の重鎖をコードしている第２の核酸分子を含むものとし、この重鎖は可変領域および定常領域を含むものとする１組の核酸分子を提供することができる。
【００９０】
一実施態様において、本発明は、本明細書に述べたＩｇ様分子、抗体またはこれらの抗原結合断片をコードすることができる、本明細書に述べた核酸分子（単数または複数）を含むベクターに関する。「ベクター」という用語は、当該分野では周知されており、これに連結されている外来性遺伝物質（すなわち、核酸分子）を、この物質を複製および／または発現することができる別の細胞内に人工的に運搬または輸送することができる核酸分子のことを指すと理解されている。本発明の一実施態様において、ある特定のベクターは、これが導入される宿主細胞において自律複製することができる（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム性哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム性哺乳動物ベクター）は、宿主細胞に導入するとその宿主細胞のゲノムに組み込むことができ、その結果、その宿主ゲノムと共に複製される。さらに、ベクターは、これが動作可能なように連結されている遺伝子の発現を誘導することができるプロモータを含むことができる。ベクターは「発現ベクター」とすることができる。他の種類のベクターとしては、コスミドおよび人工染色体が挙げられる。また、本明細書に述べたＩｇ様分子またはその断片をコードすることができる核酸分子を含む好適なベクターを作製するための方法および標準的プロトコルは当業者に周知されている。
【００９１】
一実施態様において、上記ベクター（単数または複数）は、好ましくは遺伝子治療ベクター（単数または複数）である。
【００９２】
また、本発明は、本発明の核酸分子（単数または複数）またはベクター（単数または複数）を含み任意選択的に発現する宿主細胞に関する。好ましくは、この宿主細胞は、哺乳動物の宿主細胞である。哺乳動物の宿主細胞は当該分野では周知のものであり、市販されている。哺乳動物宿主細胞の例としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ：Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｏｖａｒｙ）細胞、ＮＳ０ネズミ骨髄細胞およびＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）ヒト細胞が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００９３】
好ましい一実施態様において、この哺乳動物宿主細胞はハイブリドーマである。本明細書に述べた抗体またはＩｇ様分子またはこれらの断片を製造するための培養培地において不死化Ｂ細胞を製造し、維持する方法およびプロトコルは当該分野で周知されている。
【００９４】
＜医薬組成物＞
また、本発明は、（ａ）本明細書に述べたＩｇ様分子、抗体またはこれらの抗原結合断片、（ｂ）本明細書に述べたＩｇ様分子、抗体またはこれらの抗原結合断片をコードしている核酸分子を含む核酸、（ｃ）本明細書に述べたＩｇ様分子、抗体またはこれらの抗原結合断片をコードしている核酸分子を含むベクターおよび（ｄ）本明細書に述べた（ｂ）の核酸または（ｃ）のベクターを発現する宿主細胞からなる群から選ばれる剤ならびに医薬用として許容可能な希釈剤または担体を含む医薬組成物を提供する。
【００９５】
本発明において、「医薬用として許容可能な」という用語は、正しい医学的判断の範囲内で、妥当なベネフィット／リスク比に見合って、過度の毒性、刺激、アレルギー反応その他の問題もしくは合併症もなく、ヒトその他の動物の組織と接触させて用いるのに適している組成物または剤、材料もしくは組成物の組合せおよび／またはそれらの剤形に関係している。さらに、「医薬用として許容可能な希釈剤または担体」という用語は、主題の化学物質をある臓器もしくは体の部分から別の臓器もしくは体の部分へ運搬または輸送することに関与する、液体もしくは固体賦形剤、希釈剤、添加剤、溶剤または封入材などの医薬用として許容可能な材料、組成物またはビヒクルのことをいう。医学の分野で広く用いられる材料の他の例としては、ステントがあり、ポリマー系または吸収性（すなわち、生分解性）ステントが挙げられるが、これらに限定されるものではない。当該分野では、これらのステントは薬剤溶出性ステントと呼ばれる。本発明において、こうしたステントは、目的とする部位（例えば、心筋梗塞の場合は冠状動脈、虚血脳損傷／脳卒中の場合は頸動脈またはその末端分枝）に医薬組成物を放出させるために、医薬組成物で覆うかこれを含む。医薬用として許容可能な担体として機能することができる材料の他の例としては、（１）ラクトース、グルコースおよびスクロースなどの糖類、（２）トウモロコシ澱粉およびジャガイモ澱粉などの澱粉類、（３）セルロースおよびカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、酢酸セルロースなどのその誘導体、（４）トラガント末、（５）麦芽、（６）ゼラチン、（７）タルク、（８）ココアバターおよび坐剤ワックスなどの賦形剤、（９）落花生油、綿実油、サフラワー油、ごま油、オリーブ油、コーン油、大豆油などの油類、（１０）プロピレングリコールなどのグリコール類、（１１）グリセリン、ソルビトール、マンニトール、ポリエチレングリコールなどのポリオール類、（１２）オレイン酸エチル、ラウリン酸エチルなどのエステル類、（１３）寒天、（１４）水酸化マグネシウム、水酸化アルミニウムなどの緩衝剤、（１５）アルギン酸、（１６）発熱性物質除去水、（１７）等張食塩水液、（１８）リンゲル液、（１９）エチルアルコール、（２０）リン酸緩衝溶液、並びに（２１）医薬製剤に用いられる他の非毒性適合性物質が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００９６】
上記医薬組成物は、任意の好適な経路および様式によって投与することができる。当業者には明らかなように、投与の経路および／または様式は所望される結果によって異なる。
【００９７】
本発明による医薬組成物は、全身性、局所性、経口、舌下、経皮、吸入、薬剤溶出性ステントによるなどの任意の経路による投与のための常法に従って製剤化することができる。こうした組成物は、錠剤、カプセル剤、散剤、薬剤溶出性ステント、顆粒剤、トローチ剤、クリーム剤、または滅菌注射剤もしくは懸濁剤などの液状製剤の形態、あるいはスプレー剤、エアロゾル剤その他の吸入のための従来の方法の形態にすることができる。
【００９８】
本発明の医薬組成物としては、経口、鼻腔内、局所（口腔および舌下を含む）、直腸内、膣内および／または全身投与に適したものが挙げられる。
【００９９】
一実施態様において、上記医薬組成物は、全身性に投与される。
【０１００】
本明細書に用いている「全身性投与」および「全身性に投与される」という語句は、腸内および局所投与以外の、通常、注射による投与方法を意味し、静脈内、筋肉内、動脈内、冠動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心腔内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、髄腔内、硬膜外、胸骨内注射および注入が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１０１】
一実施態様において、上記医薬組成物は、静脈内注射または注入によって投与される。
【０１０２】
医薬用として許容可能な担体としては、滅菌水溶液または分散液および滅菌注射液または分散液の用時調製のための滅菌粉末が挙げられる。医薬として有効な物質のためのそのような媒体および剤の使用は、当該分野では周知されている。従来のいずれの媒体または剤が上記活性化合物と混合できない場合を除き、本発明の医薬組成物におけるそれらの使用が想定されている。好ましくは、上記担体は全身性投与、例えば、静脈内注射または注入に適したものである。
【０１０３】
一般的に、医薬組成物は、製造および保存の条件下では滅菌および安定でなければならない。この組成物は、溶液、微細乳濁液、リポソームまたは他の高い薬物濃度に適した規則構造物として製剤化することができる。
【０１０４】
本発明の医薬組成物に用いることができる好適な水性および非水性担体の例としては、水、エタノール、（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなどの）ポリオール類およびこれらの好適な混合物、オリーブ油などの植物油、並びにオレイン酸エチルなどの注射用有機エステル類が挙げられる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング材の使用、分散液の場合は必要とされる粒径の維持、および界面活性剤の使用によって維持することができる。
【０１０５】
注射可能な組成物の吸収は、この組成物に、吸収を遅らせる剤、例えば、ステアリン酸塩類およびゼラチンを含有させることによって延長させることができる。
【０１０６】
滅菌注射液は、必要量の、本明細書に述べたＩｇ様分子、抗体またはこれらの抗原結合断片を必要な、例えば上記の成分類の１種または組合せと共に適切な溶剤に添合した後、滅菌精密ろ過を行うことによって調製することができる。一般に、分散液は、塩基性分散媒および必要な他の成分、例えば、上記からのもの、を含有する滅菌ビヒクルに上記活性化合物を添合することによって調製される。滅菌注射液調製用滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、上記有効成分および任意の追加的な所望の成分の粉末を前もって滅菌ろ過したその溶液からもたらす真空乾燥およびフリーズ・ドライ（凍結乾燥）である。
【０１０７】
用法用量は最適な所望の治療反応が得られるように調節することができる。例えば、単一ボーラス投与量を投与することができ、または数回の分割投与量を、ゆっくり時間をかけて投与することができ、または治療状況の緊急性が示すのに比例してその投与量を増減することができる。全身性の組成物を投与しやすくし、投与量を均一にするための投与単位形態で製剤化することが特に有利である。本明細書に用いている「投与単位形態」とは、治療すべき対象に単位投与量として適した物理的に個別の単位のことを言い、各単位は、必要とされる医薬用担体と共同して所望の治療効果を生じるように計算された所定量の活性化合物を含む。本発明の投与単位形態の規格は、（ａ）上記活性化合物の独特の特性および達成すべき特定の治療効果、（ｂ）個体における過敏症の治療にそのような活性化合物を調合することの当該分野に固有の限界および（ｃ）関連疾病単位におけるフィブロネクチン−ＥＤＡの発現の期間と量によって決まり、これらに直接依存している。例えば、フィブロネクチン−ＥＤＡの発現は、急性心筋梗塞後、２ないし３週でピークに達し、５ないし６週でベースラインレベルに低下する。抗フィブロネクチン−ＥＤＡ化合物（例えば、本明細書に述べたＩｇ様分子、抗体またはこれらの抗原結合断片）の半減期にもよるが、こうした化合物は、フィブロネクチン−ＥＤＡの全発現期間をカバーするために一度、二度、三度または必要ならそれ以上の頻度で投与することになる。
【０１０８】
本発明の医薬組成物における本明細書に述べたＩｇ様分子、抗体またはこれらの抗原結合断片の実際の投与量レベルは、患者に毒性を示すことなく、特定の患者、組成物および投与様式について所望の治療反応を達成するのに有効であるＩｇ様分子、抗体またはこれらの抗原結合断片の量（「有効量」）が得られるように、変更することができる。選ばれる投与量レベルは、使用する本発明の特定の組成物の活性、投与経路、投与時期、排泄速度、治療期間、使用する特定の組成物と併用する他の薬物、化合物および／または材料、治療される患者の年齢、性、体重、状態、全体的な健康およびこれまでの病歴、並びに医学分野で周知されている同様の因子を含む種々の薬物動態学的要因に依存することになる。
【０１０９】
＜本発明の方法および用途＞
また、本発明は、虚血性傷害後のフィブロネクチン−ＥＤＡ媒介性創傷治癒において内因性血管形成反応を改善する方法に関する。そのような方法は、それを必要とする対象者に、フィブロネクチン−ＥＤＡに結合する抗体またはその抗原結合断片の治療的有効量を投与することを含む。さらに、血管形成を促進するために用いられるフィブロネクチン−ＥＤＡに結合する抗体またはその抗原結合断片を提供する。実施例５からも明らかなように、本発明者は、心筋梗塞後の抗フィブロネクチン−ＥＤＡ抗体による治療が、心臓において、特に、心臓の梗塞部位並びに心臓の梗塞および非梗塞部位の境界域のいずれにおいても血管形成を増加させることを見出した。さらに、生体外出芽アッセイから、フィブロネクチン−ＥＤＡは内皮細胞の出芽を阻害することができることが分かる。これらの知見は、全体として、フィブロネクチン−ＥＤＡが梗塞心臓において血管形成を阻害することを意味している。理論にとらわれることを望まないが、フィブロネクチン−ＥＤＡは内皮細胞の出芽を、こうした細胞表面のα１インテグリンに結合することにより阻害すること、および抗フィブロネクチン−ＥＤＡ抗体による血管形成の増加はこの阻害が阻止されることによるものであることが考えられる。それ故に、本発明者には、組織傷害後の血管形成に対するフィブロネクチン−ＥＤＡの阻害作用を阻止するのに抗フィブロネクチン−ＥＤＡ抗体を用いることができることが分かった。このことは、抗フィブロネクチン−ＥＤＡ抗体の抗腫瘍剤としての使用が現在検討されているので、特に予想外のことである。フィブロネクチン−ＥＤＡは腫瘍血管系周囲で高度に上方制御されていることが分かっており、本発明者の知見とは対照的に、フィブロネクチン−ＥＤＡは腫瘍における血管形成と関連があると考えられている。
【０１１０】
心筋梗塞後の心臓の他に、フィブロネクチン−ＥＤＡは他の虚血組織において上方制御され得るので、こうした組織では血管形成反応の改善は、一般に、虚血傷害後に有益な効果を示す。
【０１１１】
従って、血管形成を、それを必要とする対象者において改善する方法であって、この対象者にフィブロネクチン−ＥＤＡに結合する抗体またはその抗原結合断片の治療的有効量を投与することを含む方法を提供する。また、血管形成を改善するのに使用するためのフィブロネクチン−ＥＤＡに結合する抗体またはその抗原結合断片を提供する。血管形成の改善は、虚血性傷害後のフィブロネクチン−ＥＤＡ媒介性創傷治癒において行うことが好ましい。
【０１１２】
本明細書で用いている「血管形成を改善する」という用語は、フィブロネクチン−ＥＤＡが発現されているが、本発明によるフィブロネクチン−ＥＤＡに結合する抗体が存在しない組織、好ましくは傷害後の組織における血管形成のレベルと比較して、本発明によるフィブロネクチン−ＥＤＡに結合する抗体の投与後に、この組織において、特に傷害後のこの組織において血管形成のレベルが増加することを意味している。それ故に、本発明によるそのような抗体は、この抗体が存在しないが、好ましくはフィブロネクチン−ＥＤＡが発現されている状況に比して、血管形成を誘導する。血管形成の改善は、好ましくは、虚血組織、創傷、線維性組織などの傷害後の組織において、および／または臓器もしくは組織移植時に行われることが好ましい。血管形成の改善は、好ましくは、虚血性疾患、特に、心臓虚血、末梢虚血および／または末梢動脈疾患に罹患している対象者において、線維症、圧過負荷状態、創傷、および／または臓器または組織移植時において、最も好ましくは、虚血性疾患に罹患している対象者において行われる。血管形成の改善は、心臓虚血組織もしくは末梢虚血組織などの虚血組織、線維性組織、圧過負荷状態、創傷組織において、および／または臓器または組織移植時において行われるのが好ましい。虚血組織において血管形成の改善が行われるのが最も好ましい。本明細書で用いている「虚血性疾患」という用語は、１つ以上の臓器または組織が虚血の影響を受けている疾患のことを指す。虚血性疾患の例としては心臓虚血、末梢虚血および末梢動脈疾患がある。心臓虚血またはその原因の例としては、血栓が生じやすい心筋梗塞、僧帽弁疾患、慢性心房細動および心筋症が挙げられるが、これらに限定されるものではない。本明細書で用いている「末梢虚血」とは、四肢の１つ以上への血液供給の低下状態のことをいい、これは末梢動脈疾患に結びつけることができる。末梢虚血の原因の例としては、塞栓症、血栓症、切開、静脈閉塞、アテローム性動脈硬化、動脈瘤および外傷が挙げられる。「圧過負荷状態」は当該分野で周知の用語であり、に関係している。圧過負荷状態の好ましい例としては、高血圧、弁膜症および非虚血性心筋症があるが、これらに限定されるものではない。
【０１１３】
好ましい一実施態様において、本発明によるＩｇ様分子またはその抗原結合断片は、本明細書に記載したように、血管形成を促進するのに用いられる。従って、血管形成を促進するのに用いるための配列番号１、配列番号２または配列番号２８に記載のアミノ酸配列に特異的に結合する単離された免疫グロブリン（Ｉｇ）様分子またはその抗原結合断片を提供する。好ましくは、配列番号３に示したアミノ酸配列を含むＣＤＲ１と、配列番号４に示したアミノ酸配列を含むＣＤＲ２と、配列番号５に示したアミノ酸配列を含むＣＤＲ３とを含む重鎖可変領域と、配列番号６に示したアミノ酸配列を含むＣＤＲ１と、配列番号７に示したアミノ酸配列を含むＣＤＲ２と、配列番号８に示したアミノ酸配列を含むＣＤＲ３とを含む軽鎖可変領域とを含むＩｇ様分子、抗体またはこれらの抗原結合断片、配列番号９に示したアミノ酸配列を含むＣＤＲ１と、配列番号１０に示したアミノ酸配列を含むＣＤＲ２と、配列番号１１に示したアミノ酸配列を含むＣＤＲ３とを含む重鎖可変領域と、配列番号１２に示したアミノ酸配列を含むＣＤＲ１と、配列番号１３に示したアミノ酸配列を含むＣＤＲ２と、配列番号１４に示したアミノ酸配列を含むＣＤＲ３とを含む軽鎖可変領域とを含むＩｇ様分子、抗体またはこれらの抗原結合断片、配列番号１５に示したアミノ酸配列を含むＣＤＲ１と、配列番号１６に示したアミノ酸配列を含むＣＤＲ２と、配列番号１７に示したアミノ酸配列を含むＣＤＲ３とを含む重鎖可変領域と、配列番号１８に示したアミノ酸配列を含むＣＤＲ１と、配列番号１９に示したアミノ酸配列ＣＤＲ２と、配列番号２０に示したアミノ酸配列を含むＣＤＲ３とを含む軽鎖可変領域とを含むＩｇ様分子、抗体またはこれらの抗原結合断片、配列番号２９に示したアミノ酸配列を含むＣＤＲ１と、配列番号３０に示したアミノ酸配列を含むＣＤＲ２と、アミノ酸配列ＳＨＹを含むＣＤＲ３と、を含む重鎖可変領域と、および／または、配列番号３１に示したアミノ酸配列を含むＣＤＲ１と、配列番号３２に示したアミノ酸配列を含むＣＤＲ２と、配列番号３３に示したアミノ酸配列を含むＣＤＲ３と、を含む軽鎖可変領域とを含む請求項１０に記載のＩｇ様分子、抗体またはこれらの抗原結合断片、からなる群から選ばれるＩｇ様分子またはその抗原結合断片は、対象として、虚血性疾患に罹患している、線維症、圧過負荷状態、創傷における、および／または臓器もしくは組織移植時に、血管形成を改善するために、好ましくは血管形成を改善するために用いられる。より好ましくは、そのようなＩｇ様分子、抗体またはこれらの抗原結合断片は、心臓虚血組織もしくは末梢虚血組織などの虚血組織における、線維性組織における、圧過負荷状態における、創傷組織における、および／または臓器もしくは組織移植時における、最も好ましくは虚血組織における血管形成の改善において用いられる。好ましくは、そのような抗体はヒト化型抗体、好ましくは本明細書に記載したヒト化安定化型ＩｇＧ４抗体である。
【０１１４】
さらに、血管形成を、これを必要とする対象者において改善する方法であって、この対象者に、（ａ）本明細書に述べたＩｇ様分子、抗体またはこれらの抗原結合断片、（ｂ）（ａ）本明細書に述べたＩｇ様分子、抗体またはこれらの抗原結合断片をコードしている核酸分子（単数または複数）を含む核酸、（ｃ）本明細書に述べた核酸分子（単数または複数）を含む１つ以上のベクター（単数または複数）および（ｄ）本明細書に述べた核酸分子（単数または複数）を発現する宿主細胞からなる群から選ばれる、治療的有効量の剤を投与することを含む方法を提供する。
【０１１５】
また、血管形成を、これを必要とする対象者において改善するのに用いるための、（ａ）本明細書に述べたＩｇ様分子、抗体またはこれらの抗原結合断片、（ｂ）（ａ）本明細書に述べたＩｇ様分子、抗体またはこれらの抗原結合断片をコードしている核酸分子（単数または複数）を含む核酸、（ｃ）本明細書に述べた核酸分子（単数または複数）を含む１つ以上のベクター（単数または複数）および（ｄ）本明細書に述べた核酸分子（単数または複数）を発現する宿主細胞からなる群から選ばれる剤を提供する。
【０１１６】
さらに、本発明は、本明細書に記載した血管形成を促進するのに用いるためのフィブロネクチン−ＥＤＡに結合する抗体またはその抗原結合断片、および血管形成を促進するための方法であって、これを必要とする対象者にフィブロネクチン−ＥＤＡに結合する抗体またはその抗原結合断片の治療的有効量を投与することを含む方法を提供する。
【０１１７】
また、本発明は、有害な心臓および血管リモデリングならびに心筋梗塞関連および圧過負荷関連の合併症の治療、予防または進行予防の方法に関する。本明細書に述べたそのような方法は、これを必要とする対象者に（ａ）本明細書に述べたＩｇ様分子、抗体またはこれらの抗原結合断片、（ｂ）本明細書に述べたＩｇ様分子、抗体またはこれらの抗原結合断片をコードしている核酸分子（単数または複数）を含む核酸、（ｃ）本明細書に述べた核酸分子（単数または複数）を含む１つ以上のベクター（単数または複数）および（ｄ）本明細書に述べた核酸分子（単数または複数）を発現する宿主細胞からなる群から選ばれる治療的有効量の剤を投与することを含む。本明細書で用いている「有効量」という用語は、所望の治療的および／または予防的効果を達成するのに十分な量、例えば、有害な心臓リモデリング、および／または心不全もしくは心不全に伴う１つ以上の症状などの、心筋梗塞および／または圧過負荷に伴う、関連する、または由来する疾患または状態の治療、予防または進行予防をもたらす量のことを指す。
【０１１８】
本明細書に述べたＩｇ様分子、抗体または抗原結合断片は、胸痛、呼吸困難、浮腫および心臓肥大などの、心筋梗塞および／または心不全の１つ以上の徴候または症状を有する対象者に投与することができる。例えば、本明細書に述べたＩｇ様分子、抗体または抗原結合断片の治療的有効量とは、心不全などの、心筋梗塞、圧過負荷および／または有害な心臓リモデリングに伴う、関連する、または由来する疾患または状態の生理学的効果が最低でも改善されるレベルのことをいう。当業者であれば、いつ、そのような疾患もしくは状態が治療または予防されたか、または、いつ、その進行が阻止されたかを確認することが可能である。
【０１１９】
一実施態様において、モノクローナル抗体などの、本明細書に述べたＩｇ様分子、抗体またはこれらの抗原結合断片の有効量は、約０．１μｇ／ｋｇないし約１０ｇ／ｋｇの範囲内、例えば、約１μｇ／ｋｇないし約１ｇ／ｋｇ、約１０μｇ／ｋｇないし約１００ｍｇ／ｋｇ、または約０．１ｍｇ／ｋｇないし約５０ｍｇ／ｋｇとすることができる。
【０１２０】
本明細書に述べたＩｇ様分子、抗体またはこれらの抗原結合断片は、単一投与量で１回投与することができ、または心筋梗塞後数回投与することができる。例えば、本明細書に述べたＩｇ様分子、抗体またはこれらの抗原結合断片は、心筋梗塞直後（すなわち、心筋梗塞の４８時間以内に）１回静脈投与した後、本発明の結合メンバーの第１回投与に続く各日に１回以上静脈内投与することができる。本明細書に述べたＩｇ様分子、抗体またはこれらの抗原結合断片は、約２時間ないし約１４日間、例えば、約４時間ないし約１０日間、約６時間ないし約８日間、約８時間ないし約６日間、約１２時間ないし約４日間または約２４時間ないし約２日間の範囲の間隔で投与して最適の治療または予防効果を達成することができる。
【０１２１】
一実施態様において、本明細書に述べた方法に従って対象者を治療後に治療的有用性が認められる。例えば、治療的有用性は、（１）対象者における心筋梗塞および圧過負荷関連状態並びに有害な心臓リモデリングの進行の予防、および／または、（２）対象者における心筋梗塞、圧過負荷および有害な心臓リモデリングに関連または由来する合併症のレベル減少または低下、および／または、（３）対象者における心筋梗塞、圧過負荷および有害な心臓リモデリングに関連または由来する合併症の発症または罹患のリスクの低下、および／または、（４）対象者における心筋梗塞および圧過負荷関連状態並びに有害な心臓リモデリングの進行の停止、および／または、（５）対象者における心筋梗塞、圧過負荷および有害な心臓リモデリング後の生存の向上を認めることによって例示することができる。
【０１２２】
本発明において、心筋梗塞、圧過負荷および有害な心臓リモデリングに関連または由来する病状としては、心不全、陳旧性心筋線維症、動脈瘤または心室の断裂、特に梗塞が大きく、重篤な心室拡張をもたらしそうな場合には僧帽弁逆流、および心室拡大、反応性および／または、置換性（瘢痕）線維形成による心室細動および心室性頻拍などの不整脈といった状態または疾患が挙げられる。
【０１２３】
本発明の一実施態様において、本明細書に述べたＩｇ様分子、抗体またはこれらの断片およびこれらを用いる方法は、心筋梗塞および圧過負荷関連状態（例えば、心不全、陳旧性心筋線維症、動脈瘤または心室の断裂、特に梗塞が大きく、重篤な心室拡張をもたらしそうな場合には僧帽弁逆流、および心室拡大、反応性および／または、置換性（瘢痕）線維形成による心室細動および心室性頻拍などの不整脈）の治療、予防または進行予防に特に適している。
【０１２４】
また、上記Ｉｇ様分子、抗体またはこれらの断片は、高血圧および／または、大動脈弁狭窄由来の線維症および心臓機能低下、心臓移植後に生じる同種移植拒絶、肺線維症由来の肺高血圧症および肺機能不全、関節リウマチおよび／または、変形性関節症、痙攣、麻痺および／または、不全麻痺由来の関節機能障害並びに虚血性脳梗塞由来の脳梗塞といった有害な組織リモデリングの治療、予防または進行予防に好適であると考えられる。
【０１２５】
本発明の一実施態様において、（１）高血圧および／または大動脈弁狭窄症に罹患している対象者における心臓不全の緩和または線維症の緩和または不整脈のリスク低下、および／または、（２）心臓移植後の同種移植拒絶に罹患している対象者における心臓機能の改善または線維症の緩和または不整脈のリスク低下、および／または、（３）虚血性脳梗塞に罹患している対象者における梗塞サイズの減少、重篤な麻痺および／または不全麻痺の緩和または神経学的状態の改善、および／または、（４）ある特定の薬物（アミオダロン、ブレオマイシン、メソトレキセート、ニトロフラントイン、ブスルファン）または放射線またはサルコイドーシスもしくは他の結合織疾患に暴露された対象者における肺線維症発症のリスクの低下、および／または、（５）変形性関節症または関節リウマチに罹患している対象者における疼痛の緩和または関節機能の改善、および／または、（６）癌に罹患している対象者における転移の減少または局所機能の改善または生存の向上を認めることによって、他の治療的有用性を例示することができる。
【０１２６】
本発明において、「心不全」という用語は、心拍出量の減少および／または心室における異常な充満圧を特徴とする任意の状態をいうものとする。こうした状況では、心臓は、適切な速度もしくは適切な容量および／または適切な力で血液を送り込むことができず（すなわち、収縮期心不全）または心室硬直の増大および／または心室弛緩の障害（すなわち拡張期心不全）を示す。心不全では、臓器の血液潅流が阻害され、その結果、臓器機能が悪化する（例えば、腎または肝不全）。さらに、血液が肺へ逆流し、肺が鬱血することがある。心不全の代表的な症状としては、息切れ（呼吸困難）、疲労、脱力、横になった状態での呼吸困難、脚、足首または腹部の腫脹（浮腫）が挙げられる。
【０１２７】
本発明では、「治療する」、「予防する」または「の進行を予防する」という用語は、有害な心臓リモデリングの発症を包含するばかりでなく、有害な心臓リモデリングが始まったが、さらに持続するのを止める状況をも包含するものとする。従って、それは、心筋梗塞関連および圧過負荷関連の合併症が既に発症し始めていたとしても、そのような心筋梗塞関連および圧過負荷関連の合併症の本格的な発症は予防される状況を包含する。例えば、既に始まった心臓拡張でも、本明細書に述べたＩｇ様分子、抗体またはこれらの抗原結合断片を用いた治療的介入によって止めることができる。そのような方法は本発明に包含される。有害なリモデリングは可逆性であるので、本明細書では「心筋梗塞関連および／または圧過負荷関連合併症」とも称する有害なリモデリング関連合併症は、本発明の方法を用いて治療することもできる。
【０１２８】
本発明において、「対象者」という用語は、任意の脊椎動物を指すものとするが、通常は哺乳動物、例えば、ヒト患者、(イヌ、ネコなどの) 愛玩用家畜、（ウマ、ウシ、ヒツジなどの）農家の家畜または（ラット、マウス、非ヒト霊長類、モルモットなどの）実験動物に関することになる。特定の例では、対象者はヒトである。
【０１２９】
一実施態様において、この対象者は、ウマ、イヌおよびヒトからなる群から選ばれる。本発明の別の実施態様では、本明細書に述べたＩｇ様分子、抗体またはこれらの断片、本明細書に述べた医薬組成物および本明細書に述べた本発明の方法は、心筋梗塞、圧過負荷および有害な心臓リモデリングに関連する合併症を予防または治療するために、および／またはイヌおよびウマ、特にレース用犬および馬における心筋梗塞、圧過負荷および有害な心臓リモデリング後の生存を向上させ、または死亡率を減少させるために用いることができる。
【０１３０】
好ましい一実施態様において、対象者はヒト、特に、有害な心臓リモデリングを発症するリスクのあるヒト対象者、および／または心筋梗塞、圧過負荷および／または有害な心臓リモデリングに罹患しているヒト対象者、および／または心筋梗塞、圧過負荷および／または有害な心臓リモデリングに関連する合併症に罹患しているヒト対象者である。別の実施態様において、上記ヒト対象者は、フィブロネクチン−ＥＤＡ媒介性の有害な組織リモデリングを肺（例えば、肺線維症由来の呼吸困難、肺高血圧および肺不全）において、関節（例えば、関節リウマチおよび／または変形性関節症由来の関節機能障害）において、脳（例えば、痙攣、麻痺および／または不全麻痺および虚血性脳梗塞由来の脳梗塞）において罹患または発症するリスクを有する。本発明者は、本明細書に述べたＩｇ様分子、抗体またはこれらの抗原結合断片が対象者において、恐らく有害な心臓リモデリングを予防、治療および／または進行予防することによって、心筋梗塞および圧過負荷後の生存を向上させ、心臓機能を改善することを見出した。
【０１３１】
本発明において用いる従来の技術を実施する方法は当業者には明らかであろう。分子生物学、生化学、計算化学、細胞培養、組み換えＤＮＡ、バイオインフォマティクス、ゲノム学、塩基配列決定および関連分野における従来の技術の実施については、当該分野において周知されており、例えば、以下の参考文献において論じられている：サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ほか、分子クローニング。実習マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、第２版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス社（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ）、ニューヨーク（Ｎ．Ｙ．）、１９８９年；オースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ほか、分子生物学における最新のプロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、ジョンワイリー＆サンズ社（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、１９８７年および定期的更新；並びにシリーズ酵素学における方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、アカデミック・プレス社（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、サンディエゴ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）。
【０１３２】
本文書およびその特許請求の範囲において、動詞「含む（ｔｏ  ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」およびその活用型は、その語に続く項目が含まれることを意味するように、その非限定的な意味で使用されるが、具体的に述べられていない項目が除外されない。加えて、動詞「からなる（ｔｏ  ｃｏｎｓｉｓｔ）」は、本発明の組成物が、具体的に特定されたもの以外の追加の成分（単数または複数）であって、本発明のユニークな特徴を変えないこの追加の成分（単数または複数）を含んでもよいことを意味する「から本質的になる（ｔｏ  ｃｏｎｓｉｓｔ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」で置き換えられてもよい。
【０１３３】
本明細書に用いている「および／または」という用語は、記載されたケースの１つ以上が単独で、または記載されたケースの少なくとも１つのケースとの組合わせ、最大で記載されたケースの全てとの組合せで生じる状況のことを指す。
【０１３４】
「少なくとも」という用語は、ある特定の値がその特定の値以上と同じである状況のことを指す。例えば、「少なくとも２」は、「２以上」、すなわち、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、…、などであるものとする。
【０１３５】
従って、不定冠詞「ａ」または「ａｎ」は、通常「少なくとも１」を意味する。さらに、本明細書において「配列」に言及する場合、一般に、サブユニット（例えば、アミノ酸）のある特定の配列を有する実際の物理的分子が言及されるものとする。
【０１３６】
＜実施例＞
実施例１．
＜方法＞
＜ペプチド合成およびスクリーニング・アッセイ＞
直鎖およびＣＬＩＰＳペプチドは、標準的なＦｍｏｃ化学を用いて標的ペプチドのアミノ酸配列（すなわち、ＴＹＳＳＰＥＤＧＩＨＥＬＦＰＡＰＤＧＥＥＤＴＡＥＬＱＧＧＣ（配列番号２７））に基づき合成し、スカベンジャーと共に三フッ素酸を用いて脱保護した。これら直鎖およびＣＬＩＰＳペプチドは、種々の長さの短い断片であり、場合によりエピトープを含むことがある。こうした束縛されたＣＬＩＰＳペプチドは、Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  Ｌｉｎｋｅｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｏｎ  Ｓｃａｆｆｏｌｄｓ（ＣＬＩＰＳ）技術を用いて、立体構造エピトープを再構築するために化学的足場上で合成した。例えば、ジシステインを含む単ループ型ペプチドを合成し、これをアルファ、アルファ’−ジブロモキシレンで処理することによって環化した。このループの大きさは、システイン残基を可変間隔に導入することによって変更した。新規に導入したシステインのほかに他のシステインが存在する場合は、これをアラニンに置き換えた。ペプチド内の複数のシステインの側鎖は、クレジット−カード形式のポリプロピレン製ＰＥＰＳＣＡＮカード（４５５ペプチド形式／カード）上で１，３−ビス（ブロモメチル）ベンゼンを含む重炭酸アンモニウム（２０ｍＭ、ｐＨ７．９）／アセトニトリル（１：１（ｖ／ｖ））などのＣＬＩＰＳ鋳型の０．５ｍＭ溶液と反応させることにより、ＣＬＩＰＳ鋳型に結合させた。カードは、その溶液に完全に覆われている状態で３０ないし６０分間溶液中で軽く振盪させた。最後に、カードを過剰なＨ２Ｏで徹底的に洗浄し、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中に１％ＳＤＳ／０．１％β−メルカプトエタノールを含む中断緩衝液の中で７０℃にて３０分間にわたって超音波処理した後、Ｈ２Ｏ中でさらに４５分間にわたって超音波処理した。
【０１３７】
ＰＥＰＳＣＡＮをベースとしたＥＬＩＳＡによって各ペプチドへの抗体の結合を調べた。共有結合したペプチドを含む４５５穴のクレジット−カード形式のポリプロピレン製カーズを、ブロッキング溶液、すなわち、４％ウマ血清、５％オボアルブミン（ｗ／ｖ）を含むＰＢＳ／０．１％トゥイーン溶液で希釈した０．０５マイクログラム／ｍＬの抗体からなる一次抗体溶液と共にインキュベートした。洗浄後、各ペプチドを抗体ペルオキシダーゼ複合体の１／１０００希釈液と共に２５℃で１時間インキュベートした。洗浄後、ペルオキシダーゼの基質２，２’−アジノ−ジ−３−エチルベンズチアゾリンスルホネート（ＡＢＴＳ：２，２’−ａｚｉｎｏ−ｄｉ−３−ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ  ｓｕｌｆｏｎａｔｅ）と、２マイクロリットルの３パーセントＨ２Ｏ２を添加した。１時間後、発色を測定した。発色は、（スルーツトラ（Ｓｌｏｏｔｓｔｒａ）ほか、モレキュラー・ダイバーシティ（Ｍｏｌ  Ｄｉｖｅｒｓ）、１９９６年２月号；１（２）：８７−９６に最初に報告されているようにして）電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラおよび画像処理システムを用いて定量した。
【０１３８】
＜データ計算＞
＜生データ：光学濃度（任意のＯＤ単位）＞
生データはＣＣＤカメラにより得られた光学値であった。こうした値はほぼ０〜３０００の範囲であり、対数尺度は標準的な９６穴プレートＥＬＩＳＡリーダーの１〜３に近似した。最初に、ペルオキシダーゼの着色前にＣＣＤカメラによりカードの写真を作製し、次いでペルオキシダーゼ着色後に再度写真を作製した。これら２枚の写真を互いに差し引きして、生データを得た。この生データをＰｅｐｌａｂ（商標）データベース中にコピーした。カードを手作業で検査して偽陽性（例えば、気泡の存在）を補正した。
【０１３９】
＜結果＞
配列が免疫化に用いられるペプチド（配列番号２７）に基づいた重複する７ないし１４−マーの直鎖およびＣＬＩＰＳペプチドを用いるＣＬＩＰＳ（商標）技術（テインマーマン（Ｔｉｍｍｅｒｍａｎ）ほか、ジャーナル・オブ・モレキュラー・リコグニション（Ｊ  Ｍｏｌ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔ）、２００７年９−１０月号；２０（５）：２８３−９９）により抗体２７Ａ１２．７０、２９Ｅ７．３５、１７Ｇ８．７２、４２Ｈ１１．５１および３３Ｅ３．１０のエピトープをマッピングした。抗体２７Ａ１２．７０、２９Ｅ７．３５、１７Ｇ８．７２および４２Ｈ１１．５１のエピトープは、アミノ酸ＧＩＨＥＬＦからなることが分かった。抗体３３Ｅ３．１０のエピトープはアミノ酸ＬＦＰＡＰからなることが分かった。
【０１４０】
さらに、アラニンスキャニング変異誘発を行って、Ｔｙｒ３６からＰｒｏ４８までの範囲の１３−マーペプチドを用いて抗体２７Ａ１２．７０、２９Ｅ７．３５、１７Ｇ８．７２および４２Ｈ１１．５１のエピトープ内の重要なアミノ酸を決定した。アラニンスキャニング変異誘発によってＧｌｙ４２、Ｉｌｅ４３およびＰｈｅ４７がエピトープＧＩＨＥＬＦ内の極めて重要なアミノ酸であることが明らかとなった。
【０１４１】
実施例２．
＜動物および実験デザイン＞
雄性Ｂａｌｂ／Ｃ野生型マウス（１０ないし１２週齢、２５ないし３０ｇ）に標準的な食餌および水を自由に与えた。左心耳直下の左冠動脈を結紮することにより心筋梗塞を誘発させた。全ての動物実験は、ユトレヒト（Ｕｔｒｅｃｈｔ）大学の動物実験委員会の事前の承認を得て、動物保護に関する国のガイドラインに従って行った。
【０１４２】
＜生体内心筋梗塞＞
マウス（Ｂａｌｂ／Ｃ）は、フェンタニル（Ｆｅｎｔａｎｙｌ）（ヤンセン・シラグ（Ｊａｎｓｅｎ−Ｃｉｌａｇ））０．０５ｍｇ／ｋｇ、ドルミカム（Ｄｏｒｍｉｃｕｍ）（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ））５ｍｇ／ｋｇおよびメデトミジン（ｍｅｄｅｔｏｍｉｄｉｎｅ）０．５ｍｇ／ｋｇの混合物を腹腔内に注射して麻酔した。直腸体温計および自動加熱ブランケットを用いて連続モニタリングを行うことにより手術中の中核体温を３７℃付近に維持した。マウスは挿管して１００％酸素で人工呼吸（ハーバードアパレータス社（Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ  Ｉｎｃ．））を施した。左冠動脈（ＬＣＡ：ｌｅｆｔ  ｃｏｒｏｎａｒｙ  ａｒｔｅｒｙ）は８−０バイクリル縫合糸により永続的に結紮した。虚血は、心筋の退色および心室頻脈によって確認した。擬似手術動物では、縫合糸を結紮しないでＬＣＡの真下に設置した。胸壁を閉じ、動物にアンチセダン（Ａｎｔｉｓｅｄａｎ）（ファイザー（Ｐｆｉｚｅｒ））２．５ｍｇ／ｋｇ、アネキセート（Ａｎｅｘａｔｅ）（ロシュ）０．５ｍｇ／ｋｇおよびテムゲシック（Ｔｅｍｇｅｓｉｃ）（シェリング・プラウ（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ））０．１ｍｇ／ｋｇを皮下投与した。
【０１４３】
心筋梗塞後２８日のマウスにおいて心臓の機能および形状評価を行った。マウスには２５０マイクロリットル（μｌ）の生理食塩水（対照）または抗体溶液を尾静脈から静脈内投与した。動物は、梗塞後２日に生理食塩水または２７Ａ１２．７０（１０ｍｇ／ｋｇ）、２９Ｅ７．３５（１０ｍｇ／ｋｇ）、１７Ｇ８．７２（１０ｍｇ／ｋｇ）、４２Ｈ１１．５１（１０ｍｇ／ｋｇ）もしくは３３Ｅ３．１０（１０ｍｇ／ｋｇ）のモノクローナル抗体を投与するために無作為化した。梗塞後４日目および５日目にボーラス注射を繰り返した。これら２回目および３回目の抗体注射は１０ｍｇ／ｋｇの投与量で行った。
【０１４４】
＜結果＞
＜生存パーセンテージ＞
＜抗体２７Ａ１２．７０、２９Ｅ７．３５、１７Ｇ８．７２、４２Ｈ１１．５１＞
ベースライン（ｔ＝０）では異なるマウス群間で差は認められなかった。しかしながら、調べた抗体に応じて生存プロフィルの差が明らかになった。調べた抗体は、対照の状況（生理食塩水）に対し、心筋梗塞後のマウスの生存を向上させた。抗体２７Ａ１２．７０および２９Ｅ７．３５で治療したマウスは、心筋梗塞後の３０日間にわたる追跡調査において心筋梗塞後の生存パーセンテージが最も高かったことが示された（図１）。具体的には、抗体２７Ａ１２．７０および２９Ｅ７．３５で治療したマウスの生存パーセンテージは、対照群（生理食塩水）のマウスの生存パーセンテージに対して有意に改善され、対照群では心筋梗塞後３０日間の期間後には、５０％のマウスしか生存していないことが認められた。さらに、抗体１７Ｇ８．７２および４２Ｈ１１．５１で治療したマウスの生存は、対照群（生理食塩水）のマウスと比較して改善された。
【０１４５】
＜抗体３３Ｅ３．１０＞
ベースライン（ｔ＝０）ではマウスの２群間で差は認められなかった。しかしながら、調べた抗体に応じて生存プロフィルの差が明らかになった。調べた抗体は、対照の状況（生理食塩水）に対し、心筋梗塞後のマウスの生存を向上させた。抗体３３Ｅ３．１０で治療したマウスは、心筋梗塞後の３０日間にわたる追跡調査において心筋梗塞後の生存が向上したことが示された（図３）。具体的には、抗体３３Ｅ３．１０で治療したマウスの生存パーセンテージは、対照群（生理食塩水）のマウスの生存パーセンテージに対して有意に改善され、対照群では心筋梗塞後３０日間の期間後には、５０％のマウスしか生存していないことが認められた。
【０１４６】
実施例３．
＜生体内心筋梗塞＞
雄性Ｂａｌｂ／Ｃ野生型マウス（１０ないし１２週齢、２５ないし３０ｇ）において、実施例２で述べた心筋梗塞誘発の手順を施した。また、マウスを同じ抗体で治療した。
【０１４７】
＜心エコー検査＞
心筋梗塞後２８日にイソフルラン麻酔したマウスにおいて高分解能心エコー検査（Ｖｅｖｏ  ２１００、フジフィルム・ビジュアルソニックス社（ＦＵＪＩＦＩＬＭ  ＶｉｓｕａｌＳｏｎｉｃｓ，  Ｉｎｃ．）、トロント（Ｔｏｒｏｎｔｏ）、カナダ（Ｃａｎａｄａ））による心臓の大きさおよび機能の経時的評価を行った。スライス間隔を１．０ｍｍとする長軸および短軸画像を得て拡張末期容量（ＥＤＶ（ｅｎｄ−ｄｉａｓｔｏｌｉｃ  ｖｏｌｕｍｅ）、最大容量）および収縮末期容量（ＥＳＶ（ｅｎｄ−ｓｙｓｔｏｌｉｃ  ｖｏｌｕｍｅ）、最小容量）を算出するのに用いた。駆出率（ＥＦ：ｅｊｅｃｔｉｏｎ  ｆｒａｃｔｉｏｎ）は、１００＊（ＥＤＶ−ＥＳＶ）／ＥＤＶとして計算した。
【０１４８】
＜結果＞
＜抗体２７Ａ１２．７０、２９Ｅ７．３５、１７Ｇ８．７２、４２Ｈ１１．５１＞
その結果、生理食塩水で治療したマウスに対して、抗体２７Ａ１２．７０、２９Ｅ７．３５、１７Ｇ８．７２および４２Ｈ１１．５１で治療したマウスは、駆出率（ＥＦ）の増加で示されるように心筋梗塞後の心臓機能の改善を示し、抗体２７Ａ１２．７０および２９Ｅ７．３５で治療すると、ＥＦ測定値の比較的高いパーセンテージによって示されるように最も高い改善が示されることが分かった（図２）。
【０１４９】
＜抗体３３Ｅ３．１０＞
得られた結果から、生理食塩水で治療したマウスに対して、抗体３３Ｅ３．１０で治療したマウスは、駆出率（ＥＦ）の増加で示されるように心筋梗塞後の心臓機能の改善を示し、抗体３３Ｅ３．１０で治療すると、ＥＦ測定値の比較的高いパーセンテージによって示されるように最も高い改善が示されることが分かった（図４）。
【０１５０】
実施例４．
＜方法＞
ペプチド合成、スクリーニング・アッセイおよびフィブロネクチン−ＥＤＡエピトープのアラニンスキャンのためのデータ計算は、実施例１と同様にして行った。ＴＹＳＳＰＥＤＧＩＨＥＬＦＰに基づいたペプチドは、各ペプチドにおいて１つのアミノ酸がアラニンによって置換されるようにして合成された。これらのペプチドは、抗体２７Ａ１２．７０、２９Ｅ７．３５、１７Ｇ８．７２および４２Ｈ１１．５１による結合について調べた。
【０１５１】
＜結果＞
結果は下記表に示した。
0006698529.tif 000002
【０１５２】
実施例５．
＜方法＞    
＜動物および実験デザイン＞
雄性Ｂａｌｂ／Ｃ野生型（ＷＴ）マウス（１０ないし１２週齢、２５ないし３０ｇ）に標準的な食餌および水を自由に与えた。心筋梗塞は、実施例２と同様にして、左心耳直下の左冠動脈を結紮することにより誘発させた。動物は、エピトープＧＩＸＸＸＦに対する抗ＥＤＡ  ＩｇＧ１抗体（２０ｍｇ／ｋｇ；２５０μＬ）または生理食塩水の対照に対して無作為化した。また、アイソタイプ対照（２０ｍｇ／ｋｇ；２５０μＬ）を用いた別の群を異なる時点に設けた。ＭＩの３日後に、治療またはプラセボ投与を静脈を介して開始した。治療に対してブラインド化された研究者が心臓の機能および形状を評価した。全ての動物実験は、ユトレヒト（Ｕｔｒｅｃｈｔ）大学の動物実験委員会の事前の承認を得て、動物保護に関する国のガイドラインに従って行った。
【０１５３】
＜抗ＥＤＡ  ＩｇＧ１モノクローナル抗体＞
プロテインＡセファロースからのｐＨ溶出の差によりハイブリドーマ馴化培地からＩｇＧ１およびＩｇＧ２ｂアイソタイプを別々に精製し、精製したＩｇＧ１を本研究に述べた実験に用いた。
【０１５４】
＜梗塞の大きさおよび心臓磁気共鳴映像法＞
ＭＩ後３日に、ガドリニウム（Ｇａｄｏｌｉｎｉｕｍ）遅延造影磁気共鳴映像法（ＬＧＥ−ＭＲＩ）を用いて化合物注入前の一部のマウスにおいて梗塞の大きさを評価した。心臓の局所および全体機能並びに左心室の形状を高分解能ＭＲＩ（９．４Ｔ、ブルカー社（Ｂｒｕｋｅｒ）、ラインシュテッテン（Ｒｈｅｉｎｓｔｅｔｔｅｎ）、ドイツ（Ｇｅｒｍａｎｙ））によって評価した。
【０１５５】
＜フローサイトメトリー＞
ＭＩ後７日に血液をＥＤＴＡチューブに採取した。５０μＬの血液を１００μＬの抗体混合液に添加し、ＲＴの暗所で３０分間インキュベートした。オプティライズ（Ｏｐｔｉｌｙｓｅ）緩衝液（ベックマン・コールター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ））を１０分間用いて赤血球を溶解させた後、試料をガリオス（Ｇａｌｌｉｏｓ）（ベックマン・コールター）で測定した。
【０１５６】
＜定量ＰＣＲ＞
ｉＳｃｒｉｐｔ（商標）ｃＤＮＡ合成キット（バイオ・ラド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ））をメーカーのガイドラインに従って用い、マウス心臓から単離した全ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。ｉＱ（商標）５実時間ＰＣＲ検出システム（バイオ・ラド）を用い、ＳＹＢＲグリーン（バイオ・ラド）法により定量ＰＣＲを実施した。この研究では以下のプライマ・セットを用いた：コラーゲンＩプロ−アルファＩ鎖（順方向）、（逆方向）；コラーゲンＩプロ−アルファＩＩＩ鎖（順方向）、（逆方向）；ＴＩＭＰ−１（順方向）、（逆方向）；ＴＩＭＰ−２（順方向）、（逆方向）、ＭＭＰ−２（順方向）、（逆方向）；Ｐ０（順方向）、（逆方向）、ＲＰＬ２７（順方向）、（逆方向）、ＥＤＡ−ＦＮ（順方向）、（逆方向）、全ＦＮ（順方向）、（逆方向）。各試料について２回ずつ実験を行った。遺伝子発現量は、（ウイレムズ（Ｗｉｌｌｅｍｓ）、レインズ（Ｌｅｙｎｓ）およびヴァンデサムペレ（Ｖａｎｄｅｓｏｍｐｅｌｅ）、アナリティカル・バイオケミストリ（Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．）２００８年８月号１；３７９（１）：１２７−９）に記載のプロトコルを用いてＰ０およびＲＰＬ２７に対して規格化した。ｑＰＣＲの効率を評価するために５種の異なるｃＤＮＡ希釈液による検量線を設けた。
【０１５７】
＜ザイモグラフィ＞
心筋梗塞およびゼラチンパッドにおけるＭＭＰ活性をゼラチンザイモグラフィにより調べた。分離ゲル（２．６８ｍｌの３０％（ビス）アクリルアミド（バイオ・ラド）、４．８２ｍｌの２ｍｇ／ｍｌブタ皮膚ゼラチン溶液（シグマ・アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ））、２．５ｍｌのトリス−ＨＣｌ  １．５Ｍ  ｐＨ８．８（ロシュ）、１００μｌの１０％ＳＤＳ（シグマ・アルドリッチ）、５０μｌのＡＰＳおよび１７．８μｌのＴＥＭＥＤ（ＧＥライフ・サイエンシズ（ＧＥ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ピッツバーグ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ）、米国（ＵＳ）））並びに濃縮用ゲル（０．６７ｍｌの３０％、（ビス）アクリルアミド、３．０４ｍｌの蒸留水、１．２５ｍｌのトリス−ＨＣｌ  ０．５Ｍ  ｐＨ６．８、５０μｌの１０％ＳＤＳ、２５μｌのＡＰＳおよび８．８μｌのＴＥＭＥＤ）を注いだ。心筋試料は、ロシュ溶解用緩衝液中にホモゲナイズした。タンパク質濃度はＢＣＡタンパク質定量キット（ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ）（テルモ・サイエンティフィック（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））を用いて測定した。５μｇの心筋抽出物をレムリ（Ｌａｅｍｌｌｉ）緩衝液と１：４の比で混合し、ゲルに負荷した。こうしたゲルは、濃縮相に３０ｍＡで流し、分離相では６０ｍＡで流した。流した後のゲルは、２．５％トリトンＸ−１００で１５分間の洗浄を２回行い、ＳＤＳを除去した。次いで、ゲルをブリジ（Ｂｒｉｊ）溶液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ７．４；１０ｍＭ  ＣａＣｌ２（メルク（Ｍｅｒｃｋ）、ホワイトホース・ステーション（Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ  Ｓｔａｔｉｏｎ）、米国（ＵＳＡ））；０．０５％ブリジ３５（シグマ・アルドリッチ））中、一夜インキュベートした。インキュベーション後、ゲルをクマシー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ）ブルー（０．１％クマシーブリリアントブルーＲ−２５０（バイオ・ラド）、２５％メタノールおよび１５％酢酸（シグマ・アルドリッチ））で染色し、次いで青色の背景からクリアなバンドが現れるまで（２５％メタノールおよび１５％酢酸で）脱染色した。ケミドック（Ｃｈｅｍｉｄｏｃ）ＸＲＳ＋で写真を撮った。画像はイメージラボ（ＩｍａｇｅＬａｂ）（バイオ・ラド）を用いて解析した。
【０１５８】
＜細胞培養＞
ヒト乳房上皮細胞（ＨＭＥＣ）を１０％ＦＢＳ、ペン／ストレップ、５０ｍＭヒドロコルチゾン、５０ｍＭ上皮細胞増殖因子およびＬ−グルタミンを補充したＭＣＤＢ１３１培地（１０３７２−０１９、ギブコ（Ｇｉｂｃｏ））中で培養した。細胞は３日ごとに継代した。接着研究にはＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞株を用いた。細胞は１０％ＦＢＳおよびペン／ストレップを補充したＤＭＥＭ培地（４１９６５、ギブコ）中で培養した。細胞は３日ごとに継代した。
【０１５９】
＜スプラウティング（発芽）アッセイ＞
サイテックス（Ｃｙｔｅｘ）ビーズをＨＭＥＣでコーティングし、マトリゲル（コーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ））中に入れた。ＭＣＤＢ１３１培地そのものを陰性対照とし、フルのＭＣＤＢ１３１を陽性対照とした。ＥＤＡ断片およびＩＩＩ４断片は、１μＭの濃度で添加した。４８時間目に写真を撮り、フオトショップおよびイメージＪ（ＩｍａｇｅＪ）を用いて定量した。
【０１６０】
＜細胞接着アッセイ＞
９６穴プレートを１μＭのＥＤＡ−ｈｉｓまたはＩＩＩ４−ｈｉｓ断片により１時間３７℃でコーティングした後、ＰＢＳ  １％ＢＳＡでブロックした。ＤＭＥＭそのものに１穴当たり０．５×１０５個のＮＩＨ３Ｔ３細胞を加え、３７℃で１時間インキュベートした。未付着の細胞を洗浄した後、０．５％クリスタルバイオレット、１％ホルムアルデヒド、２０％メタノールを用いて付着細胞を固定、染色した。プレートは、マイクロプレート・リーダーを用いて５４０ｎｍで読み取った。
【０１６１】
＜タンパク質の精製＞
ＢＬ２１  ｐＬｙｓＳ大腸菌を１μｌの上記ＤＮＡ構築物で形質転換し、酵母トリプトン・アンピシリン／クロラムフェニコール・プレート上で一夜平板培養した。次の日、全てのコロニーを掻き落とし、ＯＤが０．６ないし０．８に達するまでＡｍｐ／Ｃｈｌｏｒを含むＬＢ培地中で増殖させた。次いで、ＩＰＴＧを加えて上記タンパク質の産生を開始させた。２４時間後、細菌をペレット化し、溶解用緩衝液および音波処理工程により溶解させた。デブリをペレット化し、上清を更なる処理に用いた。Ｎｉ−ＮＴＡビーズを用いてｈｉｓ精製を行った。簡単に言うと、Ｎｉ−ＮＴＡビーズを４℃で上清と共にＯＮインキュベートした。ビーズをＡＣＴＡシステム上のカラムに注いだ。２、３回洗浄した後、結合ＥＤＡ−ｈｉｓまたはＩＩＩ４−ｈｉｓを３００ｍＭのイミダゾールを用いて溶出させた。ＥＤＡ−ｈｉｓまたはＩＩＩ４−ｈｉｓを含む画分を採取し、ゲルろ過カラム上に注入した。タンパク質を大きさに基づいて分離し、ＨＥＰＥＳ緩衝液で溶出させた。ＥＤＡ−ｈｉｓまたはＩＩＩ４−ｈｉｓを含む画分をプールし、ビバスピン（Ｖｉｖａｓｐｉｎ）５ｋＤ濃縮カラムを用いて濃縮した。断片の濃度は、ＢＣＡキットを用いて測定した。ＬＡＬアッセイを行ってエンドトキシンの有無を調べた。断片は＜０．１ＥＵ／μＭ未満の濃度で用いた。
【０１６２】
＜組織構造＞
終了時に、心臓を摘出し、４％ホルムアルデヒドで固定し、パラフィン包埋した。パラフィン切片をＬｙ−６Ｇ（好中球の場合；ラット抗マウスＬｙ−６Ｇ、アブカム（Ａｂｃａｍ）、ケンブリッジ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ）、英国（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ））、ＭＡＣ−３（マクロファージの場合；ラット抗マウスＭＡＣ−３、ＢＤファーミンゲン（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ブレダ（Ｂｒｅｄａ）、オランダ（ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ））およびＣＤ３１（血管の場合；サンタ・クルツ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、ドイツ（Ｇｅｒｍａｎｙ））について染色した。
【０１６３】
染色の前に、切片を脱パラフィン化し、内因性ペルオキシダーゼを１．５％Ｈ２Ｏ２含有メタノール中での３０分間インキュベーションによりブロックした。抗原回復は、クエン酸緩衝液（ＭＡＣ−３およびＣＤ３１）中での２０分間煮沸または０．０８％ペプシン溶液（Ｌｙ−６Ｇ）中３７℃での１５分間インキュベーションにより行った。
【０１６４】
ＭＡＣ−３染色の場合、切片は、正常ヤギ血清と共にプレインキュベートした後、４℃で一夜インキュベートした（ＭＡＣ−３、１：３０；ＣＤ１６３、１：５００）。ＣＤ３１染色の場合、切片は、一次抗体と共にＲＴで一夜インキュベートした（１：１５００）。次いで、切片をビオチン標識二次ヤギ抗体と共にＲＴで１時間インキュベートした後、ストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼと共にＲＴで１時間インキュベートした。全ての切片はＡＥＣで発色させた。
【０１６５】
Ｌｙ−６Ｇの場合、切片は、上記一次抗体（１：１００）と共にＲＴで１時間インキュベートした。次いで、切片をパワービジョン（Ｐｏｗｅｒｖｉｓｉｏｎ）・ポリ−ＨＲＰ抗ウサギＩｇＧ（イムノビジョン・テクノロジーズ（Ｉｍｍｕｎｏ  Ｖｉｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、デイリー・シティ（Ｄａｉｌｙ  Ｃｉｔｙ）、米国（ＵＳＡ））と共に３０分間インキュベートした。染色は、直ちに、ベクター・ノバＲＥＤＴＭ（Ｖｅｃｔｏｒ  ＮｏｖａＲＥＤＴＭ）基質キットをメーカーの使用説明書（ベクター・ラボラトリーズ社（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．）、バーリンゲーム（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ）、米国）に従って用いて可視化した。
【０１６６】
全ての切片は、マイアー（Ｍａｙｅｒ）のヘマトキシリン染色で対比染色した。
【０１６７】
コラーゲン密度の定量は、４％ホルマリン固定パラフィン包埋心臓切片のピクロシリウスレッド（Ｐｉｃｒｏｓｉｒｉｕｓ  Ｒｅｄ）染色により行った。コラーゲン密度の分析は、濃淡値に変換後の円偏光およびデジタル画像顕微鏡を用いて行った。３０未満の濃淡値は画像の背景信号と考えられた。
【０１６８】
＜急性ＭＩ後のヒトＥＤＡ染色＞
心筋組織は、心筋梗塞のために死亡した患者の剖検時に得られたものであり、病理保管庫から取り出された。この研究は、オランダで使用される適切な使用ヒト組織のコードの基準を満たした。ＥＤＡを可視化するために、切片は、クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で煮沸した後、我々のモノクローナルマウス抗ＥＤＡ抗体（１／８００希釈）と共にインキュベートした。ポリＡＰ抗マウスＩｇＧ（イムノロジック（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ）、ダイフェン（Ｄｕｉｖｅｎ）、オランダ）を二次抗体として用い、シグナルは液体パーマネントレッド（ダコ（Ｄａｋｏ）、グロストルブ（Ｇｌｏｓｔｒｕｐ）、デンマーク（Ｄｅｎｍａｒｋ））を用いて可視化した。
【０１６９】
＜統計＞
データは平均±ＳＥＭで表した。群間の多重比較のためにポストホック両側ダネットｔ検定調整（生理食塩水を対照とした）を行う一元配置ＡＮＯＶＡを用いた。抗ＥＤＡおよび生理食塩水治療動物間の生存の差を比較するためにマンホイットニー（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ）Ｕ検定を用いた。全ての統計解析はＳＰＳＳ１５．１．１．を用いて行い、ｐ＜０．０５を有意とみなした。
【０１７０】
＜結果＞
＜抗ＥＤＡ治療は心筋梗塞後の生存を向上させ、有害なリモデリングを予防する＞
ベースラインにおける心臓の機能および大きさのＭＲＩ評価では治療群間で差は示されなかった。梗塞の大きさは、化合物注入前では４２±３％であった（図５Ａ）。２８日の研究期間中、抗ＥＤＡ治療マウスの３／９は死亡していることが分かったが、生理食塩水治療動物の９／１４は追跡期間中に死亡した（ｐ＝０．０６）。病理解析では、２つの断裂のみ（両方とも生理食塩水群）が明らかとなったが、残る死体では、過度の肺うっ血が目立った。ＭＲＩによる心臓の機能および形状の経時的評価から、生理食塩水およびアイソタイプ対照と比較して抗ＥＤＡ治療動物では左心室の機能および大きさが有意に維持されることが分かった（図５；表１）。
【０１７１】
【表１】
0006698529.tif 000003
表１   急性ＭＩ後の心臓の機能および形状
【０１７２】
＜循環白血球数は抗ＥＤＡ治療マウスにおいて減少し、抗ＥＤＡ治療はＭＩ後の末梢血液中の白血球数を減少させる＞
ＭＩ後７日目にフローサイトメトリーで血中の白血球サブセット数を評価した。抗ＥＤＡ治療マウスは、好中球の有意な減少および抗ＥＤＡ治療後のＴ細胞数の減少傾向を示した（図６Ａおよび図６Ｂ）。炎症性Ｌｙ６Ｃ陽性単球サブセットおよび抗炎症性Ｌｙ６Ｃ陰性単球サブセットは、共に抗ＥＤＡ治療後、有意には減少しなかった（図６Ｃおよび６Ｄ）。
【０１７３】
＜抗ＥＤＡ治療は梗塞心臓においてサイトカインバーストを減少させるが、白血球数は減少させない＞
梗塞部位では、抗ＥＤＡ治療動物において炎症性サイトカインＩＬ−１β、ＴＮＦα、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＲＡＮＴＥＳ、ＩＬ−１０およびΜΙΡ−１αが減少した（図７Ａ）。心臓の陳旧性部位では、サイトカインレベルに差は認められなかった（データは示されていない）。好中球、Ｔ細胞およびマクロファージ数は、ＭＩ後７日目の抗ＥＤＡ治療によって影響を受けなかった（図７Ｂないし図７Ｅ）。
【０１７４】
＜抗ＥＤＡ治療は適切な瘢痕形成に影響しない＞
適切な瘢痕形成は、ＭＩ後のリモデリングの拡大、瘢痕の薄化および／または梗塞壁の断裂を阻止するのに最も重要である。今回の研究では、ＭＩ後２８日目において対照および抗ＥＤＡ治療動物の間でコラーゲン含量に差はなかった（図８Ａおよび図８Ｂ）。この観察と一致して、ＭＩ後の主要なコラーゲン産生細胞である筋線維芽細胞の総量またはＣｏｌ１およびＣｏｌ３のｍＲＮＡレベルに何ら差を認めなかった（図８Ｃおよび８Ｄ）。
【０１７５】
＜抗ＥＤＡ治療は心臓において血管形成を増加させる＞
抗ＥＤＡ治療を行うと、梗塞域および境界域のいずれにおいても形成される血管形成が増加した（図９）。これらの血管を大きさの異なるクラスに細分すると、この差は境界域では５ないし１０μｍの最も小さな血管でみられ（図９Ｄ）、梗塞域では１０ないし１６μｍの血管でみられる（図９Ｆ）ことがはっきりと分かる。これらのクラスは心筋の毛細血管に相当する。生体外の３Ｄスプラウティング（発芽）アッセイから、ＥＤＡは内皮細胞の発芽を阻害するが、対照の断片ＩＩＩ４は阻害しないことが分かる（図９Ｇないし図９Ｉ）。
【０１７６】
＜抗ＥＤＡ治療は無細胞基質のクリアランスを遅延させる＞
暫定的無細胞基質の形成はＭＩ後の壊死組織および瘢痕形成の血行性補償に不可欠である。創傷治癒時に、この暫定的基質は徐々に分解され、堅固なコラーゲン系の瘢痕によって置き換えられる。我々は、抗ＥＤＡ治療マウスにおいて無細胞基質のクリアランスが遅延されるのを認めた（図１０Ａないし図１０Ｃ）。暫定的無細胞基質のクリアランスが遅延されることを説明付けるために、我々は上記治療群における内因性ＭＭＰ２および９活性を検討した。その結果、抗ＥＤＡ治療は、ザイモグラフィにより定量されるＭＭＰ２および９活性を低下させることが分かった（図１０Ｄないし図１０Ｆ）。これらの群間でＭＭＰ２および９のｍＲＮＡレベルに変化は認められなかった（データは示されていない）。線維芽細胞は心臓における主要なＭＭＰ産生細胞である。ペリオスチン染色により心臓における成熟線維芽細胞の量を評価することができる。抗ＥＤＡ治療を行うと、ペリオスチンの発現は低下する（図１０Ｇ）。さらに、生体外細胞接着アッセイから線維芽細胞はＥＤＡに接着することができること、抗ＥＤＡ抗体はこの細胞接着を阻止することができることが分かる（図１０Ｈ）。
【０１７７】
＜ＥＤＡは梗塞ヒト心臓において一過性に発現される＞
現在までのところ、急性ＭＩに罹患した患者においてＥＤＡが発現されるという証拠はない。我々は、死後のヒト心臓検体を用いてＭＩ後のヒトにおけるＥＤＡ発現の時系列を検討した。その結果、梗塞部位および梗塞境界域において梗塞後最初の２ないし３週間のうちにＥＤＡが認められた（図１１）。ＥＤＡの発現は、若い肉芽組織および境界域心筋細胞に存在する線維芽細胞において認められた。これらの知見は、ＥＤＡ−ＦＮが虚血心筋において実際に一時的に発現されることを示す我々のこれまでのネズミのデータと一致している。
【配列表フリーテキスト】
【０１７８】
配列番号１：エピトープＧＩＸＸＸＦのアミノ酸配列
配列番号２：エピトープＧＩＨＥＬＦのアミノ酸配列
配列番号３：重鎖可変領域（抗体２７Ａ１２．７０）のＣＤＲ１  ＧＹＳＩＴＳＧＹＳＷＨ
配列番号４：重鎖可変領域（抗体２７Ａ１２．７０）のＣＤＲ２    ＹＩＨＹＳＧＩＡＮＹＮＰＳＬＫＳ
配列番号５：重鎖可変領域（抗体２７Ａ１２．７０）のＣＤＲ３  ＥＫＴＧＦＦＤＹ
配列番号６：軽鎖可変領域（抗体２７Ａ１２．７０）のＣＤＲ１  ＲＳＳＱＳＬＶＨＳＮＧＮＴＹＬＨ
配列番号７：軽鎖可変領域（抗体２７Ａ１２．７０）のＣＤＲ２  ＫＶＳＮＲＦＳ
配列番号８：軽鎖可変領域（抗体２７Ａ１２．７０）のＣＤＲ３  ＳＱＳＡＨＶＰＰＴ
配列番号９：重鎖可変領域（抗体２９Ｅ７．３５）のＣＤＲ１  ＧＹＳＩＴＳＧＹＳＷＨ
配列番号１０：重鎖可変領域（抗体２９Ｅ７．３５）のＣＤＲ２  ＹＩＨＹＳＧＳＡＮＹＮＰＳＬＫＳ
配列番号１１：重鎖可変領域（抗体２９Ｅ７．３５）のＣＤＲ３  ＥＫＴＧＦＦＤＹ
配列番号１２：軽鎖可変領域（抗体２９Ｅ７．３５）のＣＤＲ１  ＲＳＳＱＳＬＶＨＳＮＧＮＴＹＬＨ
配列番号１３：軽鎖可変領域（抗体２９Ｅ７．３５）のＣＤＲ２  ＫＶＳＮＲＦＳ
配列番号１４：軽鎖可変領域（抗体２９Ｅ７．３５）のＣＤＲ３  ＳＱＳＡＨＶＰＰＴ
配列番号１５：重鎖可変領域（抗体１７Ｇ８．７ＶＬ）のＣＤＲ１  ＧＹＳＩＡＳＧＹＳＷＨ
配列番号１６：重鎖可変領域（抗体１７Ｇ８．７ＶＬ）のＣＤＲ２  ＹＩＨＦＳＧＳＡＮＹＮＰＳＬＫＳ
配列番号１７：重鎖可変領域（抗体１７Ｇ８．７ＶＬ）のＣＤＲ３  ＥＡＲＧＹＦＤＹ
配列番号１８：軽鎖可変領域（抗体１７Ｇ８．７ＶＬ）のＣＤＲ１  ＲＳＳＱＳＩＶＲＳＮＧＮＴＹＬＴ
配列番号１９：軽鎖可変領域（抗体１７Ｇ８．７ＶＬ）のＣＤＲ２  ＫＶＳＮＲＦＳ
配列番号２０：軽鎖可変領域（抗体１７Ｇ８．７ＶＬ）のＣＤＲ３  ＦＱＧＳＨＶＰＰＴ
配列番号２１：重鎖可変領域（コンセンサス）のＣＤＲ１  ＧＹＳＩＸ１ＳＧＹＳＷＨ
Ｘ１＝ＴまたはＡ
配列番号２２：重鎖可変領域（コンセンサス）のＣＤＲ２  ＹＩＨＸ２ＳＧＸ３ＡＮＹＮＰＳＬＫＳ
Ｘ２＝ＹまたはＦ；およびＸ３＝ＳまたはＩ
配列番号２３：重鎖可変領域（コンセンサス）のＣＤＲ３  ＥＸ４Ｘ５ＧＸ６ＦＤＹ
Ｘ４＝ＫまたはＡ；およびＸ５＝ＴまたはＲ；およびＸ６＝ＦまたはＹ
配列番号２４：軽鎖可変領域（コンセンサス）のＣＤＲ１  ＲＳＳＱＳＸ７ＶＸ８ＳＮＧＮＴＹＬＸ９
Ｘ７＝ＬまたはＩ；およびＸ８＝ＨまたはＲ；およびＸ９＝ＨまたはＴ
配列番号２５：軽鎖可変領域（コンセンサス）のＣＤＲ２  ＫＶＳＮＲＦＳ
配列番号２６：軽鎖可変領域（コンセンサス）のＣＤＲ３  Ｘ１０ＱＸ１１Ｘ１２ＨＶＰＰＴ
Ｘ１０＝ＳまたはＦ；およびＸ１１＝ＳまたはＧ；およびＸ１２＝ＡまたはＳ
配列番号２７（免疫化ペプチド）  ＴＹＳＳＰＥＤＧＩＨＥＬＦＰＡＰＤＧＥＥＤＴＡＥＬＱＧＧＣ
配列番号２８：抗体３３Ｅ３．１０）に関するフィブロネクチン−ＥＤＡのＥＤＡドメイン上のエピトープのアミノ酸配列  ＬＦＰＡＰ
配列番号２９：重鎖可変領域（抗体３３Ｅ３．１０）のＣＤＲ１  ＧＦＴＦＳＮＳＡＭＴ
配列番号３０：重鎖可変領域（抗体３３Ｅ３．１０）のＣＤＲ２  ＳＩＳＧＧＧＴＴＹＹＰＤＳＶＫＧ
重鎖可変領域（抗体３３Ｅ３．１０）のＣＤＲ３  ＳＨＹ
配列番号３１：軽鎖可変領域（抗体３３Ｅ３．１０）のＣＤＲ１  ＫＡＳＱＮＶＶＴＮＶＡ
配列番号３２：軽鎖可変領域（抗体３３Ｅ３．１０）のＣＤＲ２  ＳＡＳＹＲＹＳ
配列番号３３：軽鎖可変領域（抗体３３Ｅ３．１０）のＣＤＲ３  ＱＱＹＮＳＹＰＹＴ
配列番号３４：抗体２７Ａ１２．７０のヒト化重鎖  ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＱＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＹＳＩＴＳＧＹＳＷＨＷＩＲＱＨＰＧＫＫＬＥＷＭＧＹＩＨＹＳＧＩＡＮＹＮＰＳＬＫＳＲＩＴＩＳＲＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＴＥＫＴＧＦＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ
配列番号３５：抗体２７Ａ１２．７０のヒト化軽鎖  ＤＶＶＭＴＱＴＰＬＳＬＳＶＴＰＧＱＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＶＨＳＮＧＮＴＹＬＨＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＳＱＳＡＨＶＰＰＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
配列番号３６：抗体３３Ｅ３．１０のヒト化重鎖  ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＮＳＡＭＴＷＶＲＱＡＰＧＫＲＬＥＷＶＡＳＩＳＧＧＧＴＴＹＹＰＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＨＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＷＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ
配列番号３７：抗体３３Ｅ３．１０のヒト化軽鎖  ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＶＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＮＶＶＴＮＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＳＰＫＡＬＩＹＳＡＳＹＲＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＦＣＱＱＹＮＳＹＰＹＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
配列番号３８：重鎖可変領域（抗体２７Ａ１２．７０）  ＤＶＱＬＱＥＳＧＰＤＬＶＫＰＳＱＳＬＳＬＴＣＴＶＴＧＹＳＩＴＳＧＹＳＷＨＷＩＲＱＦＰＧＮＫＬＥＷＭＧＹＩＨＹＳＧＩＡＮＹＮＰＳＬＫＳＲＩＳＩＴＲＤＴＳＫＮＨＦＦＬＱＬＮＳＶＴＴＥＤＴＡＴＹＹＣＡＴＥＫＴＧＦＦＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳ
配列番号３９：軽鎖可変領域（抗体２７Ａ１２．７０）  ＤＶＶＭＴＱＴＰＬＳＬＰＶＳＬＧＤＱＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＶＨＳＮＧＮＴＹＬＨＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＬＧＶＹＦＣＳＱＳＡＨＶＰＰＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＲ
配列番号４０：重鎖可変領域（抗体２９Ｅ７．３５）  ＡＶＱＬＱＥＳＧＰＤＬＶＫＰＳＨＳＬＳＬＴＣＴＶＴＧＹＳＩＴＳＧＹＳＷＨＷＩＲＱＦＰＧＮＫＬＥＷＭＧＹＩＨＹＳＧＳＡＮＹＮＰＳＬＫＳＲＦＳＩＴＲＤＴＳＫＮＱＦＦＬＱＬＮＳＶＴＴＥＤＴＡＴＹＹＣＡＴＥＫＴＧＦＦＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳ
配列番号４１：軽鎖可変領域（抗体２９Ｅ７．３５）  ＤＶＶＭＴＱＴＰＬＳＬＰＶＳＬＧＤＱＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＶＨＳＮＧＮＴＹＬＨＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＬＧＶＹＦＣＳＱＳＡＨＶＰＰＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＲ
配列番号４２：重鎖可変領域（抗体１７Ｇ８．７ＶＬ）  ＤＶＱＬＱＥＳＧＰＤＬＶＫＰＳＱＳＬＳＬＴＣＴＶＴＧＹＳＩＡＳＧＹＳＷＨＷＩＲＱＦＰＧＮＫＬＥＷＭＧＹＩＨＦＳＧＳＡＮＹＮＰＳＬＫＳＲＩＳＩＴＲＤＴＳＫＮＱＦＦＬＱＬＮＳＶＴＴＥＤＴＡＴＹＹＣＡＳＥＡＲＧＹＦＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳ
配列番号４３：軽鎖可変領域（抗体１７Ｇ８．７ＶＬ）  ＤＶＬＭＴＱＴＰＬＳＬＰＶＳＬＧＤＱＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＩＶＲＳＮＧＮＴＹＬＴＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＬＧＶＹＦＣＦＱＧＳＨＶＰＰＴＦＧＳＧＴＫＬＥＩＫＲ
配列番号４４：重鎖可変領域（抗体３３Ｅ３．１０）  ＥＶＫＬＶＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＫＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＮＳＡＭＴＷＶＲＱＴＰＥＫＲＬＥＷＶＡＳＩＳＧＧＧＴＴＹＹＰＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＲＮＩＬＹＬＱＭＳＳＬＲＳＥＤＴＡＩＹＹＣＡＲＳＨＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳ
配列番号４５：軽鎖可変領域（抗体３３Ｅ３．１０）  ＤＩＶＭＴＱＳＱＫＦＭＳＴＳＩＧＤＲＶＳＶＴＣＫＡＳＱＮＶＶＴＮＶＡＷＹＱＱＫＰＧＱＳＰＫＡＬＩＹＳＡＳＹＲＹＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＮＶＱＳＥＤＬＡＥＹＦＣＱＱＹＮＳＹＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＲ
【図１】
0006698529.tif 000004
【図２】
0006698529.tif 000005
【図３】
0006698529.tif 000006
【図４】
0006698529.tif 000007
【図５Ａ】
0006698529.tif 000008
【図５Ｂ】
0006698529.tif 000009
【図５Ｃ】
0006698529.tif 000010
【図５Ｄ】
0006698529.tif 000011
【図６Ａ】
0006698529.tif 000012
【図６Ｂ】
0006698529.tif 000013
【図６Ｃ】
0006698529.tif 000014
【図６Ｄ】
0006698529.tif 000015
【図６Ｅ】
0006698529.tif 000016
【図７Ａ】
0006698529.tif 000017
【図７Ｂ】
0006698529.tif 000018
【図７Ｃ】
0006698529.tif 000019
【図７Ｄ】
0006698529.tif 000020
【図７Ｅ】
0006698529.tif 000021
【図８Ａ】
0006698529.tif 000022
【図８Ｂ】
0006698529.tif 000023
【図８Ｃ】
0006698529.tif 000024
【図８Ｄ】
0006698529.tif 000025
【図９Ａ】
0006698529.tif 000026
【図９Ｂ】
0006698529.tif 000027
【図９Ｃ】
0006698529.tif 000028
【図９Ｄ】
0006698529.tif 000029
【図９Ｅ】
0006698529.tif 000030
【図９Ｆ】
0006698529.tif 000031
【図９Ｇ】
0006698529.tif 000032
【図９Ｈ】
0006698529.tif 000033
【図９Ｉ】
0006698529.tif 000034
【図１０Ａ】
0006698529.tif 000035
【図１０Ｂ】
0006698529.tif 000036
【図１０Ｃ】
0006698529.tif 000037
【図１０Ｄ】
0006698529.tif 000038
【図１０Ｅ】
0006698529.tif 000039
【図１０Ｆ】
0006698529.tif 000040
【図１０Ｇ】
0006698529.tif 000041
【図１０Ｈ】
0006698529.tif 000042
【図１１】
0006698529.tif 000043
【図１２Ａ】
0006698529.tif 000044
【図１２Ｂ】
0006698529.tif 000045