(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
｛４−［３−（ジメチルアミノ）プロポキシル］フェニル｝メチル（４Ｓ）−４−（プロパン−２−イル）−３Ｈ，４Ｈ，５Ｈ，６Ｈ，７Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジン−５−カルボキシレート、又はその獣医学的に許容される塩。
【請求項２】
｛４−［３−（ジメチルアミノ）プロポキシル］フェニル｝メチル（４Ｓ）−４−（プロパン−２−イル）−３Ｈ，４Ｈ，５Ｈ，６Ｈ，７Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジン−５−カルボキシレート又はその医薬として許容される塩、及び１つ以上の適切な助剤を含有する、医薬組成物。
【請求項３】
｛４−［３−（ジメチルアミノ）プロポキシル］フェニル｝メチル（４Ｓ）−４−（プロパン−２−イル）−３Ｈ，４Ｈ，５Ｈ，６Ｈ，７Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジン−５−カルボキシレート又はその獣医学的に許容される塩、及び１つ以上の適切な助剤を含有する、獣医用組成物。
【請求項４】
炎症、炎症性疾患、免疫不全又は自己免疫不全を治療する医薬を製造するため、又は腫瘍成長を阻害する医薬を製造するための、請求項１に記載の化合物の使用。
【請求項５】
炎症、炎症性疾患、免疫不全又は自己免疫不全を治療する、又は腫瘍成長を阻害するための医薬組成物であって、有効量の請求項１に記載の化合物を含む、医薬組成物。
【請求項６】
前記医薬組成物がヒトに供される、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記炎症、炎症性疾患、免疫不全又は自己免疫不全が、関節炎（関節リウマチ、若年性関節リウマチ、変形性関節症及び乾癬性関節炎を含む）、滑膜炎、脈管炎、シェーグレン症、腸の炎症に関連する症状（クローン病、潰瘍性結腸炎、炎症性腸疾患及び過敏性腸症候群を含む）、アテローム性動脈硬化、多発性硬化症、アルツハイマー病、血管性認知症、パーキンソン病、脳アミロイド血管症、皮質下梗塞及び白質脳症を伴う常染色体優性脳動脈症、炎症性肺疾患（喘息、慢性閉塞性肺疾患及び急性呼吸促迫症候群を含む）、線維症（特発性肺線維症、心筋線維化、肝線維症及び全身性硬化症（硬皮症）を含む）、皮膚の炎症性疾患（接触性皮膚炎、アトピー性皮膚炎及び乾癬を含む）、眼の炎症性疾患（加齢性黄斑変性症、ブドウ膜炎及び糖尿病性網膜症を含む）、全身性炎症反応症候群、敗血症、肝臓の炎症性及び／又は自己免疫性の症状（自己免疫性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、アルコール性肝臓疾患、硬化性胆管炎、及び自己免疫性胆管炎を含む）、糖尿病（Ｉ型及びＩＩ型）及び／又はそれらの合併症、慢性心不全、鬱血性心不全、虚血性疾患（脳卒中及び虚血再灌流傷害）又は心筋梗塞及び／又はそれらの合併症、又は癲癇である、請求項５又は６のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項８】
ラット、マウス、アレチネズミ、モルモット、ハムスター、チンチラ、猫、犬及び馬からなる群から選択される動物を治療する医薬を製造するための、請求項１に記載の化合物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規ＳＳＡＯ阻害剤化合物、当該化合物の医学における使用、特に当該化合物のＳＳＡＯ阻害剤による変調に影響を受ける症状に罹患したヒト及び動物の治療における使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
セミカルバジド感受性アミンオキシダーゼ（ＳＳＡＯ）活性は、銅含有アミンオキシダーゼ酵素ファミリー（ＥＣ．１．４．３．６）に属する、Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−１（ＶＡＰ−１）又はＡｍｉｎｅ  Ｏｘｉｄａｓｅ、Ｃｏｐｐｅｒ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ３  （ＡＯＣ３）等により発現する酵素活性である。従って、ＳＳＡＯ酵素の阻害剤は、ＶＡＰ−１タンパク質の生物学的機能も変調し得る。
【０００３】
ＳＳＡＯ活性は、血管及び非血管平滑筋組織、内皮及び死亡組織当の様々な組織で認められている[Lewinsohn, Braz. J. Med. Biol. Res. 1984, 17, 223-256; Nakos & Gossrau, Folia Histochem. Cytobiol. 1994, 32, 3-10; Yu et al., Biochem. Pharmacol. 1994, 47, 1055-1059; Castillo et al., Neurochem. Int. 1998, 33, 415-423; Lyles & Pino, J. Neural. Transm. Suppl. 1998, 52, 239-250; Jaakkola et al., Am. J. Pathol. 1999, 155, 1953-1965; Morin et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 2001, 297, 563-572; Salmi & Jalkanen, Trends Immunol. 2001, 22, 211-216]。加えて、ＳＳＡＯタンパク質は血漿中にも見られ、この可溶性形態は、組織結合形態と類似の性質を有するようである[Yu et al., Biochem. Pharmacol. 1994, 47, 1055-1059; Kurkijarvi et al., J. Immunol. 1998, 161, 1549-1557]。
【０００４】
この豊富な酵素の確かな生理機能は完全に判明していないが、ＳＳＡＯ及びその反応産物は、細胞シグナリング及び制御において幾つかの機能を有すると考えられている。例えば、近年の知見では、ＳＳＡＯがＧＬＵＴ４が誘導するグルコース取込み[Enrique-Tarancon et al., J. Biol. Chem. 1998, 273, 8025-8032; Morin et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 2001, 297, 563-572]及び脂肪細胞分化[Fontana et al., Biochem. J. 2001, 356, 769-777; Mercier et al., Biochem. J. 2001, 358, 335-342]の両方において一定の役割を果たすことが示唆されている。
【０００５】
加えて、ＳＳＡＯは、炎症プロセスに関与しており、白血球の接着タンパク質として作用する[Salmi & Jalkanen, Trends Immunol. 2001, 22, 211-216; Salmi & Jalkanen, in “Adhesion Molecules: Functions and Inhibition” K. Ley (Ed.), 2007, pp. 237-251]こと、及び結合組織マトリックスの発達及び維持に一定の役割を果たす[Langford et al., Cardiovasc. Toxicol. 2002, 2(2), 141-150; Gokturk et al., Am. J. Pathol. 2003, 163(5), 1921-1928]ことが示されている。更に、ＳＳＡＯ及び血管新生の間の関連が近年見出され[Noda et al., FASEB J. 2008, 22(8), 2928-2935]、この関連に基づいて、ＳＳＡＯの阻害剤が抗血管新生効果を有すると期待されている。
【０００６】
ヒトにおける幾つかの研究により、鬱血性心不全、糖尿病、アルツハイマー病及び炎症当の症状において、血漿中のＳＳＡＯ活性が増大することが実証されている[Lewinsohn, Braz. J. Med. Biol. Res. 1984, 17, 223-256; Boomsma et al., Cardiovasc. Res. 1997, 33, 387-391; Ekblom, Pharmacol. Res. 1998, 37, 87-92; Kurkijarvi et al., J. Immunol. 1998, 161, 1549-1557; Boomsma et al., Diabetologia 1999, 42, 233-237; Meszaros et al., Eur. J. Drug Metab. Pharmacokinet. 1999, 24, 299-302; Yu et al., Biochim. Biophys. Acta 2003, 1647(1-2), 193-199; Matyus et al., Curr. Med. Chem. 2004, 11(10), 1285-1298; O'Sullivan et al., Neurotoxicology 2004, 25(1-2), 303-315; del Mar Hernandez et al., Neurosci. Lett. 2005, 384(1-2), 183-187]。内在的アミンオキシダーゼによって生じる反応性アルデヒド及び過酸化水素が、心臓血管疾患、糖尿病合併症及びアルツハイマー病の進行に関与することが示唆されている[Callingham et al., Prog. Brain Res. 1995, 106, 305-321; Ekblom, Pharmacol. Res. 1998, 37, 87-92; Yu et al., Biochim. Biophys. Acta 2003, 1647(1-2), 193-199; Jiang et al., Neuropathol Appl Neurobiol. 2008, 34(2), 194-204]。更に、ＳＳＡＯの酵素活性は、炎症部位での白血球溢出過程に関与し、ＳＳＡＯが血管内皮で強力に発現していることが示されている[Salmi et al., Immunity 2001, 14(3), 265-276; Salmi & Jalkanen, in “Adhesion Molecules: Functions and Inhibition” K. Ley (Ed.), 2007, pp. 237-251]。従って、ＳＳＡＯの阻害は、糖尿病合併症や炎症性疾患の阻止において、治療的価値を有することが示唆されている[Ekblom, Pharmacol. Res. 1998, 37, 87-92; Salmi et al., Immunity 2001, 14(3), 265-276; Salter-Cid et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 2005, 315(2), 553-562]。
【０００７】
ＷＯ２００７１４６１８８は、ＳＳＡＯ活性が、白血球集合を阻害し、炎症性応答を減少し、癲癇等における発作の予防及び治療に有益であることが期待されることを教示する。
【０００８】
Ｏ´Ｒｏｕｒｋｅら(J Neural Transm. 2007;114(6):845-9)は、ＳＳＡＯ阻害剤の神経系疾患における作用を試験しており、以前脳卒中のラットモデルにおけるＳＳＡＯ阻害の効果を実証した。ＳＳＡＯ阻害剤は、再発寛解型実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）、ヒト多発硬化症と多くの特徴を共有するマウスモデルに対し試験されている。このデータは、このモデルにおける低分子抗ＳＳＡＯ療法の治療的利益の可能性、従ってヒト多発性硬化症の治療の可能性を実証する。
【０００９】
ＳＳＡＯノックアウト動物は形質的には正常であるが、様々な炎症性刺激に応答して引き起こされる炎症性応答の顕著な低下を呈する[Stolen et al., Immunity 2005, 22(1), 105-115]。加えて、抗体及び／又は低分子を用いた複数のヒト疾患の動物モデル（例えばカラギーナン誘導性前肢炎症、オキサゾール誘導性大腸炎、リポ多糖類誘導性肺炎症、コラーゲン誘導性関節炎、エンドトキシン誘導性ブドウ膜炎）において、野生型動物におけるその機能の拮抗作用が、白血球の浸潤の減少、疾患表現型の重症度の低下及び炎症性サイトカイン及びケモカインのレベルの低下において保護的であることが示されている[Kirton et al., Eur. J. Immunol. 2005, 35(11), 3119-3130; Salter-Cid et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 2005, 315(2), 553-562; McDonald et al., Annual Reports in Medicinal Chemistry 2007, 42, 229-243; Salmi & Jalkanen, in “Adhesion Molecules: Functions and Inhibition” K. Ley (Ed.), 2007, pp. 237-251; Noda et al., FASEB J. 2008 22(4), 1094-1103; Noda et al., FASEB J. 2008, 22(8), 2928-2935]。この抗炎症保護は、１つの特定の疾患又は疾患モデルに限定されるものではなく、原因となるメカニズムが全て独立している広範な炎症モデルに渡って与えられるようである。これは、ＳＳＡＯが炎症性応答の制御における中心的な節点であり、従って、ＳＳＡＯ阻害剤が、広範なヒト及び動物疾患における効果的な抗炎症薬物であり得ることを示唆する。ＶＡＰ−１は、肝臓及び肺の線維性疾患を含む線維性疾患の進行及び維持に関与している。Ｗｅｓｔｏｎ及びＡｄａｍｓ(J Neural Transm. 2011, 118(7), 1055-64)は、肝線維症におけるＶＡＰ−１の関与を示す実験データを纏め、Ｗｅｓｔｏｎら(EASL Poster 2010)は、ＶＡＰ−１のブロックが、四塩化炭素分解が誘導する線維症を促進したことを報告している。加えて、ＶＡＰ−１は、肺の炎症に関与しており（例えばSingh et al., 2003, Virchows Arch 442:491-495）、これは、ＶＡＰ−１ブロッカーが肺炎症を減少し得、従ってこの疾患の線維症促進的及び炎症促進的側面の両方を治療することによって、嚢胞性線維症の治療に有益であることを示唆する。
【００１０】
ＳＳＡＯ（ＶＡＰ−１）は胃癌で上方制御され、ヒトメラノーマ、肝臓癌及び頭頚部腫瘍の腫瘍血管系において同定された(Yoong KF, McNab G, Hubscher SG, Adams DH. (1998), J Immunol 160, 3978-88.; Irjala H, Salmi M, Alanen K, Gre´nman R, Jalkanen S (2001), Immunol. 166, 6937-6943; Forster-Horvath C, Dome B, Paku S, et al. (2004), Melanoma Res. 14, 135-40.)。ある報告は、酵素的に不活性なＶＡＰ−１を担持するマウスはメラノーマの発達がより遅く、腫瘍血管の数や直径が減少することを示している(Marttila-Ichihara F, Castermans K, Auvinen K, Oude Egbrink MG, Jalkanen S, Griffioen AW, Salmi M. (2010), J Immunol. 184, 3164-3173.)。これらの腫瘍の増殖の減少は、骨髄抑制細胞の浸潤の減少（６０〜７０％）においても反映された。ＶＡＰ−１の欠損は、正常組織における血管又はリンパ管形成に影響しなかった。
【００１１】
上記の理由のため、ＳＳＡＯの阻害は、炎症促進性酵素産物（アルデヒド、過酸化水素及びアンモニア）のレベルを低下させ、また免疫細胞の接着能力を低下させ、それに対応してそれらの活性化又は最終的な欠陥脱出を低下させることが期待される。そのような活性が治療的に有益と期待される疾患は、免疫細胞が病理の発生、維持又は分解に重大な役割を果たす全ての疾患を含み、例えば炎症性疾患及び免疫／自己免疫疾患である。そのような疾患の例として、多発性硬化症、関節炎及び血管炎が有る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
ＳＳＡＯ阻害剤による変調に感受性の症状に罹患したヒト及び動物の治療における、医学的、又は獣医学的用途を有する、新規ＳＳＡＯの阻害剤には、満たされていない医学的需要が存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、新規ＳＳＡＯ阻害剤化合物｛４−［３−（ジメチルアミノ）プロポキシル］フェニル｝メチル（４Ｓ）−４−（プロパン−２−イル）−３Ｈ，４Ｈ，５Ｈ，６Ｈ，７Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジン−５−カルボキシレート、及びその薬学的に許容される塩を入手可能とする。
【００１４】
また、本発明は、｛４−［３−（ジメチルアミノ）プロポキシル］フェニル｝メチル（４Ｓ）−４−（プロパン−２−イル）−３Ｈ，４Ｈ，５Ｈ，６Ｈ，７Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジン−５−カルボキシレート、及び１つ以上の医薬として許容される助剤及び／又は担体を含有する、医薬組成物にも関する。
【００１５】
また、本発明は、｛４−［３−（ジメチルアミノ）プロポキシル］フェニル｝メチル（４Ｓ）−４−（プロパン−２−イル）−３Ｈ，４Ｈ，５Ｈ，６Ｈ，７Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジン−５−カルボキシレートの、  獣医学を含む医学における使用にも関する。
【００１６】
また、本発明は、｛４−［３−（ジメチルアミノ）プロポキシル］フェニル｝メチル（４Ｓ）−４−（プロパン−２−イル）−３Ｈ，４Ｈ，５Ｈ，６Ｈ，７Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジン−５−カルボキシレートの、ＳＳＡＯの変調に感受性の疾患又は症状に罹患したヒト又は動物の治療における使用にも関する。
【００１７】
一つの態様において、ＳＳＡＯの変調に感受性の疾患又は症状は、炎症性疾患、免疫又は自己免疫不全、又は腫瘍増殖の阻害から選択される。
【００１８】
一つの態様において、炎症又は炎症性疾患、免疫又は自己免疫不全は、関節炎（関節リウマチ、若年性関節リウマチ、変形性関節症及び乾癬性関節炎を含む）、滑膜炎、脈管炎、シェーグレン症、腸の炎症に関連する症状（クローン病、潰瘍性結腸炎、炎症性腸疾患及び過敏性腸症候群を含む）、アテローム性動脈硬化、多発性硬化症、アルツハイマー病、血管性認知症、パーキンソン病、脳アミロイド血管症、皮質下梗塞及び白質脳症を伴う常染色体優性脳動脈症、炎症性肺疾患（喘息、慢性閉塞性肺疾患及び急性呼吸促迫症候群を含む）、線維症（特発性肺線維症、心筋線維化、肝線維症及び全身性硬化症（硬皮症）を含む）、皮膚の炎症性疾患（接触性皮膚炎、アトピー性皮膚炎及び乾癬を含む）、眼の炎症性疾患（加齢性黄斑変性症、ブドウ膜炎及び糖尿病性網膜症を含む）、全身性炎症反応症候群、敗血症、肝臓の炎症性及び／又は自己免疫性の症状（自己免疫性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、アルコール性肝臓疾患、硬化性胆管炎、及び自己免疫性胆管炎を含む）、糖尿病（Ｉ型及びＩＩ型）及び／又はそれらの合併症、慢性心不全、鬱血性心不全、虚血性疾患（脳卒中及び虚血再灌流傷害）又は心筋梗塞及び／又はそれらの合併症、又は癲癇から選択される。
【００１９】
一つの態様において、｛４−［３−（ジメチルアミノ）プロポキシル］フェニル｝メチル（４Ｓ）−４−（プロパン−２−イル）−３Ｈ，４Ｈ，５Ｈ，６Ｈ，７Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジン−５−カルボキシレートは、ＳＳＡＯの変調に感受性の疾患又は症状に罹患した動物の治療における用途を有する。一つの態様において、当該動物は、非ヒト動物である。一つの態様において、当該動物は愛玩動物である。一つの態様において、当該動物は、猫、犬、マウスを含む齧歯類、兎、アレチネズミ、チンチラ、ラット、モルモット、ハムスター、馬、ポニー、驢馬、豚、雌牛、雄牛及び羊を含む家畜から選択される。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、｛４−［３−（ジメチルアミノ）プロポキシル］フェニル｝メチル（４Ｓ）−４−（プロパン−２−イル）−３Ｈ，４Ｈ，５Ｈ，６Ｈ，７Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジン−５−カルボキシレート（本明細書中例示物１と表記する）の、コラーゲン誘導性関節炎マウスモデルにおける関節炎指数に対する効果を示す。データは、疾患発達の速度における用量依存的減少を示す。
【００２１】
【図２】図２は、例示物１で処理後のコラーゲン誘導性関節炎マウスモデルの関節の組織学的評価を示す。データは、炎症、パンヌス形成、軟骨ダメージ及び骨吸収の用量依存的阻害を示す。
【００２２】
【図３】図３は、ＤＳＳ誘導性大腸炎マウスモデルにおける例示物１の効果を示す。データは、ＤＳＳ大腸炎モデルにおける用量依存的改善を示し、用量１００ｍｇ／ｋｇで、全体重において統計的に顕著な効果に達した。
【００２３】
【図４】図４は、ＤＳＳ誘導性大腸炎マウスモデルにおける例示物１の効果を示す。データは、ＤＳＳ大腸炎モデルにおける用量依存的改善を示し、用量１００ｍｇ／ｋｇで、１２日目での内視鏡スコアにおいて統計的に顕著な効果に達した。
【００２４】
【図５】図５は、ＤＳＳ誘導性大腸炎マウスモデルにおける例示物１の効果を示す。データは、ＤＳＳ大腸炎モデルにおける用量依存的改善を示し、用量１００ｍｇ／ｋｇで、大腸重量において統計的に顕著な効果に達した。
【００２５】
【図６】図６は、ＤＳＳ誘導性大腸炎マウスモデルにおける例示物１の効果を示す。データは、ＤＳＳ大腸炎モデルにおける用量依存的改善を示し、用量１００ｍｇ／ｋｇで、下痢において統計的に顕著な効果に達した。
【００２６】
【図７】図７は、マウスＰＬＰ再発寛解型ＥＡＥモデルにおける例示物１の効果を示す。データは、疾患が寛解する時間の減少、疾患再発の時間の増大、及び疾患重症度の減少が、用量依存的であることを示す。
【００２７】
【図８】図８は、四塩化炭素誘導性肝線維症モデルにおける例示物１の効果を示す。データは、例示物１による処理が、肝臓におけるコラーゲンの蓄積を顕著に減少したことを示す。
【００２８】
【図９】図９は、ＬＰＳ−誘導性サイトカイン放出のマウスモデルにおける例示物１の効果を示す。データは、血清ＴＮＦαレベルの統計的に顕著な用量依存的減少を示す。
【００２９】
【図１０】図１０は、マウス脈絡膜血管新生モデルにおける例示物１の効果を示す。データは、病巣サイズの顕著な減少を示す。
【００３０】
【図１１】図１１は、デュシェンヌ型筋ジストロフィーのマウスモデルにおける例示物１の効果を示す。データは、炎症促進性単核球、サイトカイン、マクロファージ、Ｂ細胞、Ｔ細胞及びＴＧＦβがｍｄｘマウスにおいて顕著に減少したことを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
組成物及び製剤
｛４−［３−（ジメチルアミノ）プロポキシル］フェニル｝メチル（４Ｓ）−４−（プロパン−２−イル）−３Ｈ，４Ｈ，５Ｈ，６Ｈ，７Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジン−５−カルボキシレートは、そのまま、又は医薬として許容される塩の形態で使用される。疑義を避けるために、本願において「医薬として許容される塩」は、獣医学的に許容される塩を含み、「医薬組成物」は、獣医学的組成物を含む。例えば、医薬として許容される塩は、無機又は有機酸に由来する酸付加塩、例えば塩化水素酸塩、臭化水素酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、メタンスルホン酸塩、リン酸塩、硫酸塩、過塩素酸塩、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、プロピオン酸塩、クエン酸塩、マロン酸塩、コハク酸塩、乳酸塩、オキサロ酸塩、酒石酸塩及び安息香酸塩を含む。
【００３２】
典型的な用量は、１日１回以上投与又は連続注入で、１〜２００ｍｇ／ｋｇである。当該薬物は、好ましくは静脈内又は経口経路を介して投与される。一つの態様において、典型的な用量は、１日２回１〜１００ｍｇ／ｋｇ経口投与、又は１日１回１〜２００ｍｇ／ｋｇ経口投与である。しかしながら、具体的な患者における具体的な用量レベルは、年齢、体重、一般的健康状態、性別、栄養状態、糖よ時間、薬物の組み合わせ及び治療を実施する具体的な症状の重症度等の、様々な要因に依存し得る。
【００３３】
前記有効成分を含有する医薬又は獣医学的組成物は、水性又は非水性溶液又は懸濁物、分散粉末又は顆粒、経皮又は経粘膜パッチ、クリーム、軟膏又は乳剤等の任意の適切な形態であり得る。
【００３４】
前記医薬又は獣医学的組成物は、滅菌注射水性又は非水性（例えば油性）溶液又は懸濁物の形態であり得る。滅菌注射調製物は、非毒性の非経口的に許容される希釈剤又は溶媒中の滅菌注射溶液又は懸濁物、例えば１，３−ブタンジオール中の溶液として調製されてもよい。採用され得る許容されるビヒクル及び溶媒として、水、リン酸緩衝溶液、リンゲル溶液及び等張塩化ナトリウム溶液が挙げられる。加えて、滅菌固定油は、溶媒又は懸濁媒体として通常使用される。この目的で、合成モノ又はジグリセリドを含む任意のブレンド固定油が採用され得る。加えて、オレイン酸等の脂肪酸は、注射剤の調製における使用を見出す。懸濁物は、本願で示している適切な分散又は湿潤剤及び懸濁剤を使用して、公知の技術に従い製剤化され得る。
【００３５】
水性懸濁物は、水性懸濁物の製造に適した助剤と混合された有効成分を含有する。そのような助剤は、分散剤、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントゴム及びアカシアゴム；分散剤又は湿潤剤、例えば天然に存在するホスファチド、例えばレシチン、又は脂肪酸とアルキレンオキシドの重合産物、例えばステアリン酸ポリオキシエチレン、又は長鎖脂肪族アルコールとエチレンオキシドの重合産物、例えばヘプタデカエチレンオキシセタノール、又は脂肪酸とヘキシトールに由来する部分エステルとエチレンオキシドの重合産物、例えば脂肪酸とヘキシトール無水物に由来する部分エステルを有するポリオキシエチレン、例えばポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートである。また、水性懸濁物は、１つ以上の保存料、例えばエチル又はｎ−プロピルｐ−ヒドロキシベンゾエート、１つ以上の着色料、１つ以上の香料、及び１つ以上の甘味料、例えばスクロース又はサッカリンを含有してもよい。
【００３６】
非水性（例えば油性）懸濁物は、植物油、例えば落花生油、オリーブ油、胡麻油又はココヤシ油、又は鉱物油、例えば液体パラフィン中に、有効成分を分散することによって製剤化され得る。油性懸濁物は、増粘剤、例えば蜜蝋、硬パラフィン、又はセチルアルコールを含有し得る。これらの組成物は、抗酸化剤、例えばアスコルビン酸を添加することにより保存され得る。
【００３７】
水の添加による水性懸濁物の調製に適した分散粉末及び顆粒は、分散又は湿潤剤、懸濁剤及び１つ以上の保存料と混合した有効成分を提供する。適切な分散又は湿潤剤及び懸濁剤は公知である。
【００３８】
本発明の医薬又は獣医学的組成物は、水中油乳剤の形態をとってもよい。油相は、オリーブ油又は落花生油等の植物油、又は液体パラフィン等の鉱物油、又はこれらの混合物であってもよい。適切な乳化剤は、天然に存在するゴム、例えばアカシアゴム又はトラガカントゴム、天然に存在するホスファチド、例えば大豆、レシチン、及び脂肪酸とヘキシトール無水物に由来するエステル又は部分エステル、例えばソルビタンモノオレエート、及び前記部分エステルとエチレンオキシドとの重合産物、例えばポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートであり得る。
【００３９】
前記有効成分は、薬物の直腸投与用の座薬の形態で投与されてもよい。これらの組成物は、当該薬物を、常温で固体だが直腸温度で液体であるため直腸内で融解して薬物を放出する、適切な無刺激性助剤と混合して調製され得る。そのような材料は、ココアバター及びポリエチレングリコールを含む。
【００４０】
非経口投与のため、経皮及び経粘膜パッチ、クリーム、軟膏、ゼリー、溶液又は懸濁物が採用され得る。舌下送達のため、即時溶解錠剤製剤が使用され、また、多くの上記の発表が有る。経口投与のため、薬物は、錠剤、カプセル又は液体として投与され得る。
【実施例】
【００４１】
｛４−［３−（ジメチルアミノ）プロポキシル］フェニル｝メチル（４Ｓ）−４−（プロパン−２−イル）−３Ｈ，４Ｈ，５Ｈ，６Ｈ，７Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジン−５−カルボキシレート（例示物１）の合成
下記略称を用いる：
ＣＦＡ：完全フロインドアジュバント
ＤＣＭ：ジクロロメタン
ＤＭＳＯ：ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド
（−）−ＤＰＴＴ：（（−）−Ｄｉ−Ｏ，Ｏ´−ｐ−トルイル−Ｌ−酒石酸
ＤＳＣ：Ｎ，Ｎ−ジスクシニミジルカルボネート
ｅｅ：鏡像体過剰率
ＥＳ＋：エレクトロスプレー
ＥｔＯＡｃ：酢酸エチル
ＥｔＯＨ：エタノール
ｈ：時間
ＨＰＬＣ：高性能液体クロマトグラフィー
ＩＵＰＡＣ：国際純正応用化学連合
ＬＣＭＳ：液体クロマトグラフィーマススペクトロメトリー
ＬＰＳ：リポ多糖類
ＭｅＣＮ：アセトニトリル
［ＭＨ］＋：分子プロトン化イオン
ｍｉｎ：分
ＲＰ：逆相
Ｒｔ：保持時間
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸
【００４２】
実験方法
他の特定が無い限り、反応は室温で行った。準備クロマトグラフィーは、ＧｒａｃｅＲｅｓｏｌｖシリカカラムを備えたＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ  Ｃｏｍｐａｎｉｏｎシステムを用いて実施された。逆相ＨＰＬＣは、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｓｙｎｅｒｇｉ  Ｈｙｄｒｏ  ＲＰ  １５０ｘ１０ｍｍ、又はＹＭＣ  ＯＤＳ−Ａ  １００／１５０ｘ２０ｍｍを備えたＵＶ検出器を有するＧｉｌｓｏｎシステム上で実施された。最も純粋なフラクションが回収され、濃縮され、真空下で乾燥された。化合物は、典型的には、純度解析の前に、４０℃の真空オーブン中で乾燥された。化合物解析は、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｓｙｎｅｒｇｉ、ＲＰ−Ｈｙｄｒｏカラムを有するＡｇｉｌｅｎｔ  １１００  ＨＰＬＣと接続したＡｇｉｌｅｎｔ  １１００  ＨＰＬＣ  ｓｙｓｔｅｍ  ／  Ｗａｔｅｒｓ  ＺＱマススペクトロメーターを使用してＨＰＬＣ／ＬＣＭＳにより実施された（１５０ｘ４．６ｍｍ，  ４ｕｍ，  毎分１．５ｍＬ，  ３０℃，  グラディエント５−１００％  ＭｅＣＮ  （＋０．０８５％  ＴＦＡ）水中（＋０．１％  ＴＦＡ）７分以上、２００−３００ｎｍ）。鏡像体過剰率は、Ａｓｔｅｃ  Ｃｈｉｒｏｂｉｏｔｉｃ  Ｖ  １００  ｘ  ４．６ｍｍ  ５ｕｍカラムを使用してＡｇｉｌｅｎｔ  １２００システム上で実施されたＣｈｉｒａｌ  ＨＰＬＣによって決定された。調製された化合物は、ＩＵＰＡＣ命名法を用いて命名された。
【００４３】
中間体１
（４Ｓ）−４−（プロパン−２−イル）−３Ｈ，４Ｈ，５Ｈ，６Ｈ，７Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジン
【化１】
0006795580.tif 000002
ヒスタミン二塩酸塩（４７．７ｇ，  ２５９ｍｍｏｌ）をＥｔＯＨ  （１５０ｍＬ）中に懸濁し、水（５ｍＬ）、ＮａＯＨ  （２０．７ｇ，  ５１８ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を７５℃に加熱した。イソブチルアルデヒド（２８．６ｍＬ，  ３１４ｍｍｏｌ）を５０分かけて滴下し、反応混合物を７５℃で１８時間撹拌し、１時間０℃に冷却し、濾過し、ＥｔＯＣ（２５０ｍＬ）で洗浄した。組み合わせた濾過物をＥｔＯＨ（４００ｍＬ）で希釈し、（−）−ＤＰＴＴ  （２００ｇ，  ５１８ｍｍｏｌ）水（１．２Ｌ）及びＥｔＯＨ（４００ｍＬ）を添加した。反応混合物を５８℃に加熱して溶解を完遂させ、それを１６時間かけて室温に冷ました。濾過により沈殿を回収し、エタノール：水１：１から３回再結晶化した。このプロセスを同じスケール（４７．７ｇ）で繰り返し、産物を組み合わせ、８０℃でＥｔＯＨ：水１：１から６回再結晶化した。残留物（１４６ｇ，  １５５ｍｍｏｌ）をＥｔＯＡｃ  （２８５ｍＬ）中に懸濁し、水（１０７ｍＬ）中Ｈ２ＳＯ４  （９．００ｍＬ，  １６８ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で１．５時間撹拌し、水層を分離し、ＥｔＯＡｃ  （１７７ｍＬ）で洗浄し、０℃まで冷却し、水（１６ｍＬ）及びＥｔＯＨ  （７３ｍＬ）中のＫＯＨ  （１９．２ｇ，  ３４２ｍｍｏｌ）溶液を慎重に添加した。反応混合物をＥｔＯＨ（１７７ｍＬ）で希釈し、７２時間かけて室温に温めた。反応混合物を濾過し、ＥｔＯＨ（１００ｍＬ）で洗浄し、真空下で濃縮して、黄色の油として標記化合物（２１．０ｇ，  ２４．５％）を得た。ＬＣＭＳ  （ＥＳ＋）：  １６６．１  ［ＭＨ］＋．  ＨＰＬＣ：  Ｒｔ  ０．５１ｍｉｎ，  ９８．８％  ｐｕｒｉｔｙ．  Ｃｈｉｒａｌ  ＨＰＬＣ：  Ｒｔ  ８．７９ｍｉｎ，  ＞９９％  ｅｅ
【００４４】
例示物１
｛４−［３−（ジメチルアミノ）プロポキシル］フェニル｝メチル（４Ｓ）−４−（プロパン−２−イル）−３Ｈ，４Ｈ，５Ｈ，６Ｈ，７Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジン−５−カルボキシレート
【化２】
0006795580.tif 000003
｛４−［３−（ジメチルアミノ）プロポキシル］フェニル｝メタノール（１３．９ｇ，  ６６．６ｍｍｏｌ）をＭｅＣＮ  （２００ｍＬ）中に溶解し、０℃まで冷却した。ＤＳＣ  （１７．１ｇ，  ６６．６ｍｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ  （１１．７ｍＬ，  ９０．８ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を０℃で１時間撹拌した。ＤＣＭ（１００ｍＬ）中の中間体１（１０．０ｇ，  ６０．５ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を１７時間撹拌し、真空下で濃縮した。残留物をＥｔＯＡｃ  （２００ｍＬ）とＮａＨＣＯ３飽和水溶液（２５０ｍＬ）との間で分離し、水相をＥｔＯＡｃ  （５  ｘ  １００ｍＬ）で抽出した。有機フラクションを組み合わせ、真空下で濃縮し、残留物を通常相カラムクロマトグラフィーで精製して、無色のゴムとして標記化合物を得た（７．５２ｇ，  ３１％）。このプロセスを２．００ｇの中間体１を用いて繰り返し、それらの産物を組み合わせ、逆相クロマトグラフィーで精製して、無色のゴムとして標記化合物を得た（１１．５ｇ，  ３９．５％）。ＬＣＭＳ  （ＥＳ＋）：  ４０１．０  ［ＭＨ］＋．  ＨＰＬＣ：  Ｒｔ  ３．９１ｍｉｎ，  ９９．７％  ｐｕｒｉｔｙ．
【００４５】
生物学的試験
インビトロＳＳＡＯ酵素阻害アッセイ
インビトロＳＳＡＯ酵素阻害アッセイは、室温で、精製組換え発現ヒトＳＳＡＯを用いて実施された。酵素は、概ねＯｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．  （Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ４６  （２００６）  ３２１-３３１）に記載の通りに調製された。酵素活性は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）会合反応における過酸化水素の生成を測定することによってベンジルアミンを基質として用いてアッセイされた。要するに、試験化合物をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に溶解して、１０ｍＭとした。用量応答測定を、ＤＭＳＯで１：１０希釈系列を作って７点曲線を得るか、又はＤＭＳＯで１：３希釈系列を作って１１点曲線を得ることによりアッセイした。最高の濃度は化合物の強度によって調整され、反応緩衝剤中の以後の希釈において、最終ＤＭＳＯ濃度は２％以下であった。
【００４６】
ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）会合反応において、１０−アセチル−３，７−ジヒドロキシフェノキサジンの過酸化水素酸化により、高度な蛍光を有するレゾルフィンが生成した（Ｚｈｏｕｔ  ａｎｄ  Ｐａｎｃｈｕｋ−Ｖｏｌｏｓｈｉｎａ．  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２５３  （１９９７）  １６９−１７４；  Ａｍｐｌｅｘ（登録商標）  Ｒｅｄ  Ｈｙｄｒｏｇｅｎ  Ｐｅｒｏｘｉｄｅ／ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ａｓｓａｙ  ｋｉｔ，  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ａ２２１８８）。ｐＨ７．４の５０ｍＭリン酸ナトリウム中の酵素及び試験化合物を、平底マイクロタイタープレート中で約１５分間プレインキュベーションした後、ＨＲＰ、ベンジルアミン及びＡｍｐｌｅｘ試薬の混合物を添加して、反応を開始させた。ベンジルアミン濃度は、標準的な手順を用いて決定される、ミカエリス定数に対応する濃度で固定された。そして、蛍光強度が、１〜２時間の間のタイムポイントで、５４４ｎｍで励起し、放出を５９０ｎｍで読み取って測定された。アッセイウェル中の試薬の最終濃度は、ＳＳＡＯ酵素１ｕｇ／ｍｌ、ベンジルアミン１００ｕＭ、Ａｍｐｌｅｘ試薬２０ｕＭ、ＨＲＰ  ０．１  Ｕ／ｍＬ及び様々な濃度の試験化合物であった。阻害は、阻害剤の無い対照（希釈したＤＭＳＯのみ）と比較したシグナルの減少％として測定された。ＳＳＡＯ酵素を含有しない試料からの  バックグラウンドシグナルを、全てのデータポイントから差し引いた。データは４つのパラメーターロジスティックモデルと適合され、ＩＣ５０値が、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ４又はＸＬｆｉｔ  ４プログラムを用いて計算された。
【００４７】
試験１
樹立されたマウスコラーゲン誘導性関節炎モデルにおける例示物１の効果
例示物１の効果を、樹立されたマウスコラーゲン誘導性関節炎モデルにおいて評価した。雄ＤＢＡ／１Ｊマウスの尾の付け根に、コラーゲン（牛）／ＣＦＡを皮下注射して、疾患を誘導した。各肢を毎日評点し、４つの評点の全部の合計を、関節炎指数（ＡＩ）として記録した。ＡＩの可能な最大値は１６となる（０＝関節炎の可視的効果無し、１＝指１本に浮腫及び／又は紅斑、２＝２つの関節の浮腫及び／又は紅斑、３つ以上の関節の浮腫及び／又は紅斑、４＝肢の変形及び関節の強直を含む全ての肢及び指の重度の関節炎）。疾患を発症した動物として、それらはＡＩが２〜６及び投与計画の開始前の平均ＡＩ３．６の範囲内で、治療群に分けられた。例示物１（１０、５０及び１００ｍｇ／ｋｇ）は、接種後３０日から１日２回経口投与された。この治療は、疾患進行の速度の用量依存的低下をもたらし、２週間の治療後、最高の用量の場合（１００ｍｇ／ｋｇ）において疾患の重症度が４６％低下した（図１）。
【００４８】
右後肢の組織学的評価も実施された。関節は、割り当てられた治療を知らない有資格の病理学者によって、関節炎の重症度（炎症、パンヌス、軟骨ダメージ及び骨ダメージ）において評点された。例示物１の効果の評価により、間接に対する用量依存的効果が判明し、最高の用量の場合（１００ｍｇ／ｋｇ）において、炎症（６０％）、パンヌス形成（８４％）、軟骨ダメージ（６０％）、及び骨吸収（８４％）の顕著な阻害が記録された（図２）。
【００４９】
試験２
ＤＳＳマウス大腸炎モデル
例示物１の効果を、慢性硫酸デキストラン（ＤＳＳ）誘導性大腸炎モデルにおいて樹立された疾患の治療において評価した。ＤＳＳは、３％溶液を５日間飲用水として投与した。６〜１９日後にかけて、ＤＳＳ処理マウスに、ビヒクル、６−チオグアニン（０．５ｍｇ／ｋｇ）又は例示物１（１０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ又は１００ｍｇ／ｋｇ）を１日２回経口投与した。無処理対照群の５頭のマウスも使用した。１９日間体重を測定し、下痢及び／又は血便の存在を視覚的に評価した。全ての動物において５、１２及び１９日にビデオ内視鏡検査を行い、大腸炎の程度の評価及び何らかの有益な治療効果が観察されるかを評価した。全ての動物は１９日に安楽死させて、病理試験のための大腸組織を取得した。
【００５０】
例示物１の治療的投与は、ＤＳＳ大腸炎モデルにおいて用量依存的改善をもたらし、１００ｍｇ／ｋｇの用量の場合、全体重（図３）、１２日の内視鏡スコア（図４）、大腸重量（図５）及び下痢（図６）において、統計的に有意な効果を示した。この用量での効果の大きさは、６−チオグアニン陽性対照で見られる効果に匹敵した。
【００５１】
試験３
マウスＰＬＰ再発寛解ＥＡＥモデルにおける例示物１の効果
例示物１の効果を、ヒトの多発性硬化症の治療の可能性の指標となる雌ＳＪＬマウスにおける実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）のＰＬＰ１３９−１５１再発寛解モデルにおいて評価した。
【００５２】
２ｍｇ／ｍＬ懸濁物となるように不完全フロインドアジュバント５０ｍＬ中で１００ｍｇをホモジナイズすることによりアジュバントを調製し、４〜８℃で保存した。Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ由来の百日咳毒素５０μｇを滅菌ＰＢＳ５０ｍＬ中で再構築して１ｕｇ／ｍＬ溶液を調製し、アイスバス中で維持した。１０．３５ｍｇのＰＬＰ１３９−１５１を１０．３５ｍＬ滅菌ＰＢＳ中に溶解して、１ｍｇ／ｍＬ溶液を調製した。１０ｍＬのＰＬＰ１３９−１５１を１０ｍｌのアジュバントと共にアイスバス中で乳化して、０．５ｍｇ／ｍＬ  ＰＬＰ１３９−１５１  ／  １ｍｇ／ｍＬ  Ｍ．  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  Ｈ３７  ＲＡ乳剤を調製し、アイスバス中で維持した。乳剤の液滴は水上に浮かべられ、分散しなかった。０日で、０．１ｍＬのＰＬＰ１３９−１５１／ＣＦＡ乳剤を７０頭のマウスの両脇に皮下注射した。２時間後、マウスに０．２ｍＬの百日咳毒素（２００ｎｇ／マウス）を腹腔内注射した。マウスを日常維持に戻し、副作用はみられなかった。２日目、マウスに０．２ｍＬの百日咳毒素（２００ｎｇ／マウス）を腹腔内注射した。７日目からマウスを計量し、以下のように疾患のサインを評点した：０＝非免疫化対照と比較して運動機能不全の明らかなサイン無し；１＝尾のひきずり又は垂れ；２＝尾の引きずり及び後肢の脱力；３＝尾の引きずり及び肢の完全な麻痺又は１つの前肢及び１つの後肢の麻痺を有する尾のひきずり；４＝尾の引きずり、後肢の完全な及び前肢の部分的な麻痺；５＝後肢の完全な及び前肢の完全な麻痺。１０〜１２日目、マウスを平均スコアに基づいて治療群に分類し、例示物１（３、１０、３０又は１００ｍｇ／ｋｇ）、デキサメタゾン又はビヒクルの１日２回毎日経口投与を開始した（各群ｎ＝１０）。疾患の評点は２０日間続けられた。
【００５３】
例示物１による１日２回治療的経口療法は、用量依存的に、疾患緩和までの時間の短縮、疾患再発までの時間の増大及び疾患重症度の減少をもたらした（図７において、０日は治療の開始として再設定された）。
【００５４】
試験４
四塩化炭素誘導性肝線維症モデルにおける例示物１の効果
例示物１は、四塩化炭素（ＣＣｌ４）誘導性肝線維症モデルにおいて評価された。７秀麗の雌マウスを、処理開始前日の体重に基づいて４つの群に分けた（無疾患比較群としての役割を果たす１つの対照群においてｎ＝５／群、３つのＣＣｌ４−処理群においてｎ＝１０／群）。３０頭のマウスに、週２回（０、４、１１、１４、１８、２１、２５日）１００μｌの体積の鉱物油中の５％ＣＣｌ４を腹腔内投与した。５頭のマウスには、５％ＣＣｌ４の代わりに鉱物油を腹腔内投与し、無疾患対照群とした。例示物１（１００ｍｇ／ｋｇ  ｂｉｄ）、バルサルタン（２０ｍｇ／ｋｇ  ｑｄ、陽性対照）及びビヒクルを、２８日間（−１〜２７日）経口投与した（投与体積＝１０ｍＬ／ｋｇ）。全てのマウス群は、最後の投与から１６〜２０時間後に屠殺された。Ｂｏｕｉｎの固定された左側肝臓切片を、ピクロシリウスレッド溶液を用いて染色した。線維症領域の定量的解析のため、シリウスレッド染色切片の明視野画像を倍率１００倍でデジタルカメラを用いて無作為に撮影し、ＩｍａｇｅＪ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  （Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，  ＵＳＡ）を使用して、５視野／４ｕｍ切片／マウスにおけるシリウスレッド染色陽性領域を、（コラーゲン面積／全面積−血管腔面積）ｘ１００に従い測定した。処理内容を承知していない者が操作を行った。統計的解析は、ワンウエイＡＮＯＶＡを用いて、その後ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ４  （ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，  ＵＳＡ）上でのＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ多重比較試験によって実施された。Ｐ値＜０．０５で統計的に有意と見做された。トレンド又は傾向は、片側ｔ検定がＰ値＜０．１０を返したときに仮定された。結果は、平均±ＳＤとして表現された。バルサルタン群とビヒクル群の線維症面積の比較は、バルサルタンが陽性対照として動作したかを確かめるため、スチューデントｔ検定を用いて評価された。
【００５５】
例示物１による処理は、シリウスレッド染色で示されたように肝臓におけるコラーゲンの沈着を顕著に減少し、抗線維症効果を示した（図８）。
【００５６】
試験５
ＬＰＳ誘導性サイトカイン放出のマウスモデルにおける例示物１の効果
例示物１は、ＬＰＳ誘導性サイトカイン放出アッセイにおいて評価された。例示物１の投与の１時間後、雌Ｓｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒマウス（群あたりｎ＝５）に２ｍＬ／ｋｇ  ＬＰＳ  （１．５ｍｇ／ｍＬ）を腹腔内注射した。ＬＰＳ注射の１時間後、マウスに麻酔をかけ、予冷した血清分離マイクロタイターチューブ中に放血させた。この血液を処理して血清を取得して、−８０℃で保存した。凍結血清アリコートを室温まで溶かし、滅菌食塩水で１：５に希釈し、ＴＮＦαのためにＥＬＩＳＡによってアッセイした。
【００５７】
ＬＰＳ処理の１時間前に例示物１を経口投与したマウスにおいて、ビヒクル対照（群１）と比較して、統計的に顕著な用量依存的血清ＴＮＦαレベルの減少が見られた（図９）。
【００５８】
試験６
マウス脈絡膜血管新生モデルにおける例示物１の効果
例示物１は、マウス脈絡膜血管新生モデルにおいて評価された。色素を付けたマウス（Ｃ５７ＢＬ６  ｓｔｒａｉｎ群あたりｎ＝１５）が、５３２ｎｍ光凝固装置を使用して右目の中に３つの脈絡膜熱傷を誘導した。例示物１及びビヒクルを、０〜１２日５ｕＬ点滴ｔｉｄを使用して局所的に投与した。１２日目、病巣サイズを、処理した眼球から作製した平坦封入脈絡膜のイソレクチンＢ４免疫染色及び病巣のサイズを決定するための共焦点顕微鏡によって決定した。
【００５９】
例示物１は、ビヒクルで処理したものと比較して、病巣サイズの顕著な減少を示した（図１０）。
【００６０】
試験７
デュシェンヌ型筋ジストロフィーのマウスモデルにおける例示物１の効果
雄のＣ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎ−Ｄｍｄｍｄｘ／Ｊマウスに、２７日から４週間、ビヒクル（ｎ＝５）、プレドニソロン（１ｍｇ／ｋｇ  ｉｐ  ｑｄ，  ｎ＝８）又は例示物１（１００ｍｇ／ｋｇ  ｐｏ  ｂｉｄ，  ｎ＝８）のいずれかを投与した。８週齢で血液を後眼窩静脈叢から採取し、マウスをＣＯ２窒息により人道的に安楽死させた。新鮮な下腿三頭筋を回収し、免疫細胞ソーティングのために処理し、前脛骨筋をＲＮＡ抽出のためにＲＮＡＬａｔｅｒ中で保存し、後肢全体及び横隔膜を４℃で一晩２％パラホルムアルデヒド中で固定し、パラフィンで包埋し、組織染色した。血清は回収後即座に調製され、−２０℃で凍結された。試験の最後に、全ての血清試料は、説明書に従い（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ方法の変法）、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＡＵ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙアナライザー上でＣｒｅａｔｉｎｅ  Ｋｉｎａｓｅのために投与された。
【００６１】
免疫細胞ソーティングのため、説明書に従い（Ｓｋｅｌｅｔａｌ  Ｍｕｓｃｌｅ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ＫｉｔＣａｔａｌｏｇ  ｎｏ．  １３０−０９８−３０５，  Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）、筋肉試料を酵素的及び化学的に解離した。細胞は、以下の抗体を用いて染色された。
【表１】
0006795580.tif 000004
【００６２】
染色された細胞はサイトメーター上で解析され、異なる集団のカウントは、カウントされた生細胞の数のパーセンテージで表された。全ＲＮＡはＴｒｉｚｏｌ法の変法によって抽出され、逆転写され、ＴＧＦα、及び下記の炎症マーカーのｍＲＮＡが、ＧＡＰＤＨをノーマライザーとして用いるＳＹＢＲグリーン法によって定量された。
【表２】
0006795580.tif 000005
【００６３】
例示物１は、ｍｄｘマウスにおいて、炎症促進性単核球、サイトカイン、マクロファージ、Ｂ細胞、Ｔ細胞及びＴＧＦβの顕著な減少をもたらした（図１１）。
【図１】
0006795580.tif 000006
【図２】
0006795580.tif 000007
【図３】
0006795580.tif 000008
【図４】
0006795580.tif 000009
【図５】
0006795580.tif 000010
【図６】
0006795580.tif 000011
【図７】
0006795580.tif 000012
【図８】
0006795580.tif 000013
【図９】
0006795580.tif 000014
【図１０】
0006795580.tif 000015
【図１１】
0006795580.tif 000016