(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
組織因子と界面活性剤とを含有し、式（Ｉ）：
［界面活性剤量（μｍｏｌ）／全タンパク質量（μｇ）］                      （Ｉ）
の値が０．０１３〜０．０５μｍｏｌ／μｇであり、
前記界面活性剤が非イオン性界面活性剤であるプロトロンビン時間測定用試薬。
【請求項２】
前記非イオン性界面活性剤がアルキルグルコシド型界面活性剤またはアシルアルキルグルカミン型界面活性剤である請求項１に記載の試薬。
【請求項３】
前記アルキルグルコシド型界面活性剤がアルキル基の炭素数が６〜１０であるアルキルグルコシド化合物である請求項２に記載の試薬。
【請求項４】
前記アシルアルキルグルカミン型界面活性剤がアルカノイル基の炭素数が７〜９であるアルカノイルメチルグルカミン化合物である請求項２に記載の試薬。
【請求項５】
前記組織因子が組換え組織因子である請求項１〜４のいずれか１項に記載の試薬。
【請求項６】
前記組換え組織因子が組換えヒト組織因子である請求項５に記載の試薬。
【請求項７】
カルシウムイオンをさらに含有してなる請求項１〜６のいずれか１項に記載の試薬。
【請求項８】
リン脂質をさらに含有してなる請求項１〜７のいずれか１項に記載の試薬。
【請求項９】
前記試薬が凍結乾燥物または前記凍結乾燥物が溶媒に溶解された溶液である請求項１〜８のいずれか１項に記載の試薬。
【請求項１０】
組織因子と界面活性剤とを含有し、式（Ｉ）：
［界面活性剤量（μｍｏｌ）／全タンパク質量（μｇ）］                      （Ｉ）
の値が０．０１３〜０．０５μｍｏｌ／μｇである水溶液を凍結乾燥させて凍結乾燥物を得る工程を含み、
前記界面活性剤が非イオン性界面活性剤であるプロトロンビン時間測定用試薬の製造方法。
【請求項１１】
前記凍結乾燥物を溶媒に溶解させる工程をさらに含む請求項１０に記載の製造方法。
【請求項１２】
前記組織因子が組換え組織因子である請求項１０又は１１に記載の製造方法。
【請求項１３】
（ａ）少なくとも請求項１〜９のいずれか１項に記載のプロトロンビン時間測定用試薬と血液試料とを接触させて測定試料を得る工程、および
（ｂ）測定試料のプロトロンビン時間を測定する工程
を含むプロトロンビン時間の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロトロンビン時間測定用試薬、その製造方法およびプロトロンビン時間の測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
プロトロンビン時間測定用試薬は、例えば、組織因子とリン脂質と界面活性剤を含む緩衝液との混合、および得られた混合物からの界面活性剤の除去を行なうことなどによって製造されている（例えば、特許文献１参照）。プロトロンビン時間測定用試薬は、通常、保存、輸送などのために凍結乾燥状態で保存されている。また、凍結乾燥状態のプロトロンビン時間測定用試薬は、使用時に適切な溶媒に再溶解された状態で用いられている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】米国特許第２００４／０８６９５３号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかし、組織因子を含有するプロトロンビン時間測定用試薬では、当該プロトロンビン時間測定用試薬の凍結乾燥の前後で、プロトロンビン時間の測定値が変動することがある。
【０００５】
本発明は、凍結乾燥前後でのプロトロンビン時間の測定値の変動を抑制することができるプロトロンビン時間測定用試薬、その製造方法およびプロトロンビン時間の測定方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の１つの側面は、組織因子と界面活性剤とを含有し、式（Ｉ）：
［界面活性剤量（μｍｏｌ）／全タンパク質量（μｇ）］                      （Ｉ）
の値が０．０１３〜０．０５μｍｏｌ／μｇであるプロトロンビン時間測定用試薬を含む。
【０００７】
本発明の別の側面は、組織因子と界面活性剤とを含有し、式（Ｉ）の値が０．０１３〜０．０５μｍｏｌ／μｇである水溶液を凍結乾燥させて凍結乾燥物を得る工程を含むプロトロンビン時間測定用試薬の製造方法を含む。
【０００８】
本発明の別の側面は、（ａ）前述のプロトロンビン時間測定用試薬と血液試料とを混合して測定試料を得る工程、および
（ｂ）測定試料のプロトロンビン時間を測定する工程
を含むプロトロンビン時間の測定方法を含む。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、凍結乾燥前後でのプロトロンビン時間の測定値の変動を抑制することができるプロトロンビン時間測定用試薬、その製造方法およびプロトロンビン時間の測定方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】試薬キットの構成を説明する図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
１．プロトロンビン時間測定用試薬
本実施形態に係るプロトロンビン時間測定用試薬（以下、単に、「試薬」という）は、組織因子と界面活性剤とを含有する。本実施形態に係る試薬は、当該技術において公知の測定原理に基づき、組織因子が関与する外因系凝固活性化機序によるプロトロンビン時間を測定するための試薬である。本実施形態に係る試薬においては、式（Ｉ）：
［界面活性剤量（μｍｏｌ）／全タンパク質量（μｇ）］                      （Ｉ）
の値が０．０１３〜０．０５μｍｏｌ／μｇである。
【００１２】
式（Ｉ）において、「界面活性剤量（μｍｏｌ）」は、本実施形態に係る試薬における界面活性剤の含有量を意味する。また、「全タンパク質量（μｇ）」は、本実施形態に係る試薬における全タンパク質の含有量を意味する。なお、全タンパク質は、後述の組織因子と、組織因子の供給源の動物種に由来する夾雑タンパク質とを含むことを意味する。
【００１３】
凍結乾燥の前後でのプロトロンビン時間の測定値の変動は、以下の機序によるものと考えられる。従来の試薬は、通常、組織因子と、リン脂質と、界面活性剤と、当該組織因子の供給源の動物種から不可避的に混入する夾雑タンパク質とを含む。したがって、凍結乾燥前の試薬においては、通常、界面活性剤のほとんどが組織因子および夾雑タンパク質と会合してミセルを形成している。また、界面活性剤の一部は、組織因子および夾雑タンパク質と会合せず、界面活性剤のみからなるミセルを形成している。しかし、従来の試薬を凍結乾燥後に溶媒に再溶解させた場合、組織因子および夾雑タンパク質と会合していない界面活性剤が、リン脂質と会合してリン脂質の本来の機能の発現を抑制すると考えられる。そのため、従来の試薬を用いた場合、凍結乾燥の前後で、プロトロンビン時間の測定値が変動する。
【００１４】
一方、本実施形態に係る試薬では、式（Ｉ）の値が０．０１３〜０．０５μｍｏｌ／μｇであることを満たすように、全タンパク質量に対して界面活性剤量が調整されている。したがって、本実施形態に係る試薬では、組織因子および夾雑タンパク質と会合していない界面活性剤の量が低減されているので、凍結乾燥前後でのプロトロンビン時間の測定値の変動が抑制されると考えられる。
【００１５】
組織因子は、トロンボプラスチン（「凝固因子の第ＩＩＩ因子」ともいう）である。組織因子としては、天然由来の組織因子および組換え組織因子が挙げられる。本実施形態に係る試薬においては、組換え組織因子が好ましい。原料の調達が容易であり、安定的に供給されることおよびロット間の性能の差が小さく、測定結果の再現性に優れるからである。
【００１６】
天然由来の組織因子として、例えば、慣用の手法により、種々の動物種の脳、胎盤などから単離された組織因子などを用いることができる。動物種としては、例えば、ヒト、ウサギ、ウシ、サルなどが挙げられるが、特に限定されない、これらの動物種のなかでは、ヒトのプロトロンビン時間をより的確に測定する観点から、ヒトが好ましい。
【００１７】
組換え組織因子は、例えば、所望の動物種の組織因子をコードするｃＤＮＡを保持する遺伝子組換え生物内で発現させることなどによって得ることができる。また、組換え組織因子は、市販の組換え組織因子であってもよい。組換え組織因子のなかでは、ヒトのプロトロンビン時間をより的確に測定する観点から、遺伝子組み換えヒト組織因子が好ましい。組織因子をコードするｃＤＮＡとしてはヒト組織因子をコードするｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００１９９３）、ウシ組織因子をコードするｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿１７３８７８）などが挙げられるが、特に限定されない。遺伝子組換え生物は、例えば、組織因子をコードするｃＤＮＡを保持するベクターを宿主に導入することなどによって得られる。ベクターとしては、例えば、バキュロウイルスベクターＡＢｖおよびＢＥＶＳなどが挙げられるが、特に限定されない。ベクターは、宿主に応じて適宜選択することができる。宿主としては、例えば、カイコ虫体、Ｓｆ９、Ｓｆ２１などの昆虫細胞などが挙げられるが、特に限定されない。宿主へのベクターの導入は、ベクターの種類に応じた方法によって行なうことができる。ベクターがウイルスベクターである場合、宿主へのウイルスベクターの導入は、ウイルスベクターから得られた組換えウイルスを宿主に感染させることによって行なうことができる。発現した組換え組織因子は、例えば、以下の操作などを行なうことによって遺伝子組換え生物から取得することができる。まず、遺伝子組換え生物を破砕して破砕液を得る。得られた破砕液を遠心分離に供して組換え組織因子を含む画分を得る。つぎに、得られた画分を可溶化させて組換え組織因子を含む溶液を得ることができる。
【００１８】
界面活性剤としては、非イオン界面活性剤、陰イオン界面活性剤、陽イオン界面活性剤および両性界面活性剤が挙げられる。これらの界面活性剤のなかでは、凍結乾燥前後のプロトロンビン時間の測定値の変動をより確実に抑制することができることからから、非イオン界面活性剤が好ましい。なお、本明細書において、「界面活性剤」は、後述のリン脂質以外の化合物を意味する。
【００１９】
非イオン界面活性剤としては、例えば、アルキルグルコシド型界面活性剤、アシルアルキルグルカミン型界面活性剤、エーテル型界面活性剤、エーテルエステル型界面活性剤、エステル型界面活性剤などが挙げられるが、特に限定されない。これらの非イオン界面活性剤は、単独で用いてもよく、２種類以上を混合して用いてもよい。これらの非イオン界面活性剤のなかでは、凍結乾燥前後のプロトロンビン時間の測定値の変動をより確実に抑制する観点から、アルキルグルコシド型界面活性剤およびアシルアルキルグルカミン型界面活性剤が好ましい。
【００２０】
アルキルグルコシド型界面活性剤としては、例えば、アルキル基の炭素数が６〜１０であるアルキルグルコシド化合物などが挙げられるが、特に限定されない。アルキル基の炭素数が６〜１０であるアルキルグルコシド化合物としては、例えば、ヘキシル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ヘプチル−β−Ｄ−グルコピラノシド、オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ノニル−β−Ｄ−グルコピラノシド、デシル−β−Ｄ−グルコピラノシドなどが挙げられるが、特に限定されない。これらのアルキルグルコシド型界面活性剤は、単独で用いてもよく、２種類以上を混合して用いてもよい。
【００２１】
アシルアルキルグルカミン型界面活性剤としては、例えば、アルカノイル基の炭素数が７〜９であるアルカノイルメチルグルカミン化合物などが挙げられるが、特に限定されない。アルカノイル基の炭素数が７〜９であるアルカノイルメチルグルカミン化合物としては、例えば、ｎ−ヘプタノイル−Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン、ｎ−オクタノイル−Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン、ｎ−ノナノイル−Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン、ｎ−デカノイル−Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミンなどが挙げられるが、特に限定されない。これらのアシルアルキルグルカミン型界面活性剤は、単独で用いてもよく、２種類以上を混合して用いてもよい。
【００２２】
本実施形態に係る試薬における組織因子の含有量は、凝固時間測定用試薬としての活性を確保する観点から、好ましくは４．０×１０−５Ｗ／Ｖ％（０．４μｇ／ｍＬ）以上、より好ましくは５．０×１０−５Ｗ／Ｖ％（０．５μｇ／ｍＬ）以上であり、ロット間差を抑制する観点から、好ましくは７．０×１０−５Ｗ／Ｖ％（０．７μｇ／ｍＬ）以下、より好ましくは６．０×１０−５Ｗ／Ｖ％（０．６μｇ／ｍＬ）以下である。
【００２３】
本実施形態に係る試薬において、式（Ｉ）の値は、凍結乾燥前後での凝固時間の変動を抑制する観点から、好ましくは０．０１３μｍｏｌ／μｇ以上、より好ましくは０．０１５μｍｏｌ／μｇ以上であり、凍結乾燥前後での凝固時間の変動を抑制する観点から、好ましくは０．０５μｍｏｌ／μｇ以下、より好ましくは０．０２５μｍｏｌ／μｇ以下である。本実施形態に係る試薬は、式（Ｉ）の値が０．０１３〜０．０５μｍｏｌ／μｇであることを満たすように、組織因子および界面活性剤を含有している。したがって、本実施形態に係る試薬によれば、当該試薬の凍結乾燥前後におけるプロトロンビン時間の測定値の変動が抑制される。本実施形態に係る試薬における界面活性剤の含有量［μｍｏｌ］は、例えば、｛（組織因子原料中の界面活性剤濃度［Ｗ／Ｖ％］×１０［ｇ／ｍＬ］）÷界面活性剤分子量［ｇ／ｍｏｌ］｝×（凝固時間測定用試薬中の組織因子濃度［μｇ／ｍＬ］／組織因子原料中の組織因子濃度［μｇ／ｍＬ］）×凝固時間測定用試薬の容量［ｍＬ］÷１０６によって求めることができる。また、本実施形態に係る試薬における全タンパク質の含有量は、ビシンコニン酸タンパク質定量法（ＢＣＡ法）によって求めることができる。なお、組織因子原料は、凝固時間測定用試薬の製造に用いられる組織因子を含む原料である。組織因子原料は、通常、組織因子に加え、界面活性剤をさらに含有する。
【００２４】
本実施形態に係る試薬は、カルシウムイオンをさらに含有している。本実施形態に係る試薬におけるカルシウムイオンの量は、第ＶＩＩ因子を活性化させ、凝固反応を進行させるのに適した量であればよい。本実施形態に係る試薬におけるカルシウムイオンの量は、通常、血漿中のクエン酸ナトリウム濃度の変動の影響を抑制する観点から、好ましくは１４ｍＭ以上、より好ましくは２０ｍＭ以上であり、試薬としての安定性を確保する観点から、好ましくは３０ｍＭ以下、より好ましくは２５ｍＭ以下である。
【００２５】
本実施形態に係る試薬は、リン脂質をさらに含有している。リン脂質は、血液の凝固反応を促進する。リン脂質は、分子構造中にリン酸エステル部位を有する脂質である。本実施形態に係る試薬において、リン脂質は、通常、リン脂質層を有するリポソームを形成している。リン脂質は、天然由来リン脂質であってもよく、合成リン脂質であってもよい。天然由来リン脂質としては、例えば、ウサギ、ウシ、ブタ、ニワトリ、ヒトなどの動物、大豆などの植物に由来するリン脂質などが挙げられるが、特に限定されない。動物に由来するリン脂質としては、例えば、ウサギ脳、ウシ脳、卵黄、ヒト胎盤などに由来するリン脂質などが挙げられるが、特に限定されない。リン脂質としては、具体的には、例えば、ホスファチジルエタノールアミン化合物、ホスファチジルコリン化合物、ホスファチジルセリン化合物などのグリセロリン脂質などが挙げられるが、特に限定されない。ホスファチジルエタノールアミン化合物としては、例えば、置換基を有していてもよいホスファチジルエタノールアミンなどが挙げられるが、特に限定されない。ホスファチジルコリン化合物としては、例えば、置換基を有していてもよいホスファチジルコリンなどが挙げられるが、特に限定されない。ホスファチジルセリン化合物としては、例えば、置換基を有していてもよいホスファチジルセリンなどが挙げられるが、特に限定されない。置換基としては、例えば、炭素数８〜２０のアシル基などが挙げられるが、特に限定されない。炭素数８〜２０のアシル基としては、例えば、ラウロイル基、ミリストイル基、パルミトイル基、ステアロイル基、オレオイル基などが挙げられるが、特に限定されない。これらの置換基は、血液の凝固反応を妨げない範囲で適宜選択することができる。
【００２６】
置換基を有していてもよいホスファチジルコリンとしては、例えば、ホスファチジルコリン、ジラウロイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリンなどのアシル基の炭素数が８〜２０であるジアシルホスファチジルコリンなどが挙げられるが、特に限定されない。置換基を有していてもよいホスファチジルエタノールアミンとしては、例えば、ホスファチジルエタノールアミン、ジラウロイルホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンなどのアシル基の炭素数が８〜２０であるジアシルホスファチジルエタノールアミンなどが挙げられるが、特に限定されない。置換基を有していてもよいホスファチジルセリンとしては、例えば、ホスファチジルセリン、ジラウロイルホスファチジルセリン、ジミリストイルホスファチジルセリン、ジパルミトイルホスファチジルセリン、ジステアロイルホスファチジルセリン、ジオレオイルホスファチジルセリンなどのアシル基の炭素数が８〜２０であるジアシルホスファチジルセリンなどが挙げられるが、特に限定されない。これらのリン脂質のなかでは、血液の凝固反応が効率的に進むことから、ホスファチジルエタノールアミン化合物、ホスファチジルコリン化合物およびホスファチジルセリン化合物が好ましく、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンおよびジオレオイルホスファチジルセリンがより好ましい。これらのリン脂質は、単独で用いてもよく、２種類以上を混合して用いてもよい。
【００２７】
本実施形態におけるリン脂質の含有量は、適切な正常凝固時間および国際感度指数〔ＩＳＩ（ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｉｎｄｅｘ）〕を確保する観点から、好ましくは５×１０−５Ｗ／Ｖ％（５０μｇ／ｍＬ）以上、より好ましくは１×１０−４Ｗ／Ｖ％（１００μｇ／ｍＬ）以上であり、適切な正常凝固時間およびＩＳＩを確保する観点から、好ましくは２．５×１０−４Ｗ／Ｖ％（２５０μｇ／ｍＬ）以下である。なお、正常凝固時間とは、正常血漿の凝固時間をいう。
【００２８】
本実施形態に係る試薬において、組織因子は、リポソームのリン脂質層に会合している。また、本実施形態に係る試薬において、リポソームのリン脂質層は、通常、脂質２重層であると考えられる。さらに、本実施形態に係る試薬において、組織因子は、通常、リン脂質層を貫通した状態でリン脂質層と会合していると考えられる。
【００２９】
本実施形態に係る試薬は、当該試薬に含まれるリン脂質、組織因子およびカルシウムイオンを安定的に保持する観点から、緩衝液をさらに含んでいてもよい。緩衝液としては、例えば、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸〔ＨＥＰＥＳ〕緩衝液、トリス緩衝液などが挙げられるが、特に限定されない。緩衝液のｐＨは、本実施形態に係る試薬に含まれるリン脂質、組織因子およびカルシウムイオンを安定的に保持するのに適したｐＨであればよい。緩衝液のｐＨは、リン脂質および組織因子を安定的に保持する観点から、好ましくはｐＨ７．２５以上、より好ましくはｐＨ７．４以上でありリン脂質および組織因子を安定的に保持する観点から、好ましくはｐＨ７．６以下である。緩衝液における緩衝成分の濃度は、通常、２５〜７５ｍＭなどの緩衝作用の働く範囲であればよい。
【００３０】
本実施形態に係る試薬は、助剤をさらに含んでいてもよい。助剤としては、例えば、防腐剤、抗酸化剤、賦形剤などが挙げられるが、特に限定されない。防腐剤としては、例えば、アジ化ナトリウムなどが挙げられるが、特に限定されない。抗酸化剤としては、例えば、ブチルヒドロキシアニソールなどが挙げられるが、特に限定されない。腑形剤としては、例えば、アラニン、スクロース、マンニトールなどが挙げられるが、特に限定されない。
【００３１】
本実施形態に係る試薬は、凍結乾燥物であってもよく、凍結乾燥物が溶媒に溶解された溶液であってもよい。
【００３２】
なお、本実施形態に係る試薬は、２種類の試薬からなるものであってもよく、１種類の試薬からなるものであってもよい。本実施形態に係る試薬が２種類の試薬からなる場合、当該試薬は、例えば、組織因子とリン脂質と界面活性剤とを含む第１の試薬と、カルシウムイオンを含む第２の試薬とから構成されていてもよい。第１の試薬において、組織因子とリン脂質とは、組織因子とリン脂質からなるリポソームとの会合体として当該第１の試薬に含まれている。
【００３３】
本実施形態に係る試薬は、容器に封入された試薬キットとして提供することができる。本実施形態に係る試薬キットの一例を図１に示す。図１に示される試薬キット１０は、本実施形態に係る試薬２１が入った容器２２と、添付文書３１と、箱４１とを含む。試薬２１は、リポソーム２００および組織因子２１０の会合体１０１と、図示しない界面活性剤と、図示しないカルシウムイオンとを含む。リポソーム２００は、リン脂質２０１から構成されている。リポソーム２００のリン脂質層２０２には、組織因子２１０が貫通した状態で会合している。本実施形態では、試薬キット１０には、例えば、希釈用の水系溶媒、対照血漿などが含まれていてもよい。水系溶媒は、血液凝固能の臨床検査に通常用いられる水系溶媒から適宜選択できる。水系溶媒としては、例えば、水、生理食塩水などが挙げられるが、特に限定されない。対照血漿としては、例えば、正常血漿などが挙げられるが、特に限定されない。添付文書３１は、試薬キット１０を用いてプロトロンビン時間の測定を行なう操作手順などの記載を含む。箱４１は、試薬２１が入った容器２２と、添付文書３１とを収容する。なお、図１に示される試薬キットは、１種類の試薬２１からなるが、２種類の試薬それぞれが異なる容器に封入されたキットであってもよい。また、図１において、リン脂質２０１は、１種類のリン脂質であってもよく、２種類以上のリン脂質の混合物であってもよい。
【００３４】
２．プロトロンビン時間測定用試薬の製造方法
本実施形態に係るプロトロンビン時間測定用試薬の製造方法（以下、単に、「試薬の製造方法」ともいう）は、組織因子と界面活性剤とを含有し、式（Ｉ）の値が０．０１３〜０．０５μｍｏｌ／μｇである水溶液を凍結乾燥させて凍結乾燥物を得る工程（以下、単に、「工程（Ａ）」という）を含む。
【００３５】
工程（Ａ）に先立ち、組織因子と界面活性剤とを式（Ｉ）の値が０．０１３〜０．０５μｍｏｌ／μｇとなるように混合して水溶液を得る。組織因子および界面活性剤は、前述のプロトロンビン時間測定用試薬に用いられる組織因子および界面活性剤と同様である。組織因子は、通常、緩衝液などの溶媒と混合された水溶液として用いられる。水溶液の式（Ｉ）の値は、凍結乾燥前後での凝固時間の変動を抑制する観点から、好ましくは０．０１３μｍｏｌ／μｇ以上、より好ましくは０．０１５μｍｏｌ／μｇ以上であり、凍結乾燥前後での凝固時間の変動を抑制する観点から、好ましくは０．０５μｍｏｌ／μｇ以下、より好ましくは０．０２５μｍｏｌ／μｇ以下である。
【００３６】
プロトロンビン時間測定用試薬においては、通常、組織因子と界面活性剤とを含有する水溶液は、リン脂質からなるリポソームを含む。この場合、工程（Ａ）では、予め、リン脂質を用いてリン脂質層を有するリポソームを形成させる。具体的には、まず、リン脂質−クロロホルム溶液からクロロホルムを蒸発させることにより、リン脂質の薄膜を形成させる。つぎに、得られたリン脂質の薄膜を適切な緩衝液で膨潤させてリン脂質２重層を有するリポソームを形成させる。これにより、リポソーム含有液を得る。リポソーム含有液におけるリン脂質の濃度は、プロトロンビン時間測定用試薬の用途に応じて適宜設定することができる。工程（Ａ）では、必要に応じ、得られたリポソーム含有液に対してエクストルーダー処理を施してリポソームの粒子径を均一化させてもよい。エクストルーダー処理には、所望の粒子径の第１のリポソームを得るのに適切な孔径を有するメンブランを用いることができる。工程（Ａ）では、つぎに、組織因子および界面活性剤を含む混合液と、リポソーム含有液とを混合する。これにより、組織因子およびリポソームの会合体と、界面活性剤との混合液を得る。なお、リン脂質は、前述のプロトロンビン時間測定用試薬に用いられるリン脂質と同様である。
【００３７】
プロトロンビン時間測定用試薬がカルシウムイオンを含む試薬である場合、組織因子と界面活性剤とを含有する水溶液は、カルシウムイオンを含む。この場合、工程（Ａ）では、得られた混合液に対し、カルシウム溶液をさらに添加して、所望のカルシウムイオン濃度を有する水溶液を得る。カルシウム溶液としては、例えば、塩化カルシウム水溶液などが挙げられるが、特に限定されない。カルシウム溶液におけるカルシウムイオンの濃度は、プロトロンビン時間測定用試薬の用途などに応じて適宜設定することができる。
【００３８】
組織因子と界面活性剤とを含有する水溶液には、必要に応じて、安定化剤などをさらに添加してもよい。
【００３９】
工程（Ａ）では、その後、水溶液を凍結乾燥させることにより、プロトロンビン時間測定用試薬を得る。
【００４０】
本実施形態に係る試薬の製造方法は、凍結乾燥物を溶媒に溶解させる工程をさらに含んでもよい。溶媒としては、例えば、ＨＥＰＥＳ緩衝液、トリス塩酸緩衝液、精製水などが挙げられるが、特に限定されない。溶媒に溶解させる凍結乾燥物の量は、プロトロンビン時間測定用試薬の用途などに応じて適宜設定することができる。
【００４１】
なお、本実施形態に係る試薬の製造方法では、組織因子、リン脂質および界面活性剤と、カルシウムイオンとを混合して１種類の試薬を得た後、凍結乾燥を行なっている。しかし、組織因子、リン脂質および界面活性剤を含む第１の試薬と、カルシウムイオンを含む第２の試薬とを別々に凍結乾燥させてもよい。
【００４２】
３．プロトロンビン時間の測定方法
本実施形態に係るプロトロンビン時間の測定方法（以下、単に、「測定方法」）ともいう）は、（ａ）少なくとも前述のプロトロンビン時間測定用試薬と血液試料とを接触させて測定試料を得る工程、および
（ｂ）測定試料のプロトロンビン時間を測定する工程
を含む。
【００４３】
本実施形態に係る測定方法は、１つの側面では、（ａ１）プロトロンビン時間測定用試薬と血液試料とを混合して測定試料を得る工程、および
（ｂ１）測定試料のプロトロンビン時間を測定する工程
を含む。この場合、プロトロンビン時間測定用試薬は、組織因子と界面活性剤とリン脂質とカルシウムイオンとを含有し、式（Ｉ）の値が０．０１３〜０．０５μｍｏｌ／μｇである試薬である。
【００４４】
また、本実施形態に係る測定方法は、他の側面では、（ａ２）プロトロンビン時間測定用試薬と血液試料とカルシウム塩とを混合して測定試料を得る工程、および
（ｂ２）測定試料のプロトロンビン時間を測定する工程
を含む。この場合、プロトロンビン時間測定用試薬は、組織因子と界面活性剤とリン脂質とを含有し、式（Ｉ）の値が０．０１３〜０．０５μｍｏｌ／μｇである試薬である。
【００４５】
なお、本明細書において、「測定試料」とは、少なくとも血液試料とリン脂質と界面活性剤とカルシウム塩とが混合された混合物をいう。
【００４６】
血液試料としては、例えば、血液、血液から得られた血漿などが挙げられるが、特に限定されない。本実施形態に係る測定方法では、血液試料として、被検者の血液から得られた血漿、対照血漿、それらの混合物などを用いることができる。血漿は、例えば、血液を溶血させないように遠心分離に供して血球成分を除くことなどによって得られる。また、血液には、血液凝固能の臨床検査に通常用いられる公知の抗凝固剤が添加されていてもよい。抗凝固剤としては、例えば、クエン酸ナトリウムなどが挙げられるが、特に限定されない。本実施形態に係る測定方法では、対照血漿として、正常血漿、精度管理用血漿などを用いることができる。正常血漿は、健常者の血液から得られた血漿であってもよく、市販の正常血漿であってもよい。
【００４７】
工程（ａ）では、少なくともプロトロンビン時間測定用試薬と血液試料とを接触させる。プロトロンビン時間測定用試薬と血液試料との接触時の温度は、血液の凝固反応を行なうのに適した温度であればよい。接触時の温度は、好ましくは２５〜４５℃、より好ましくは３５〜３８℃である。また、接触時間は、好ましくは１〜１０分間、より好ましくは３〜５分間である。
【００４８】
プロトロンビン時間測定用試薬が組織因子と界面活性剤とリン脂質とカルシウムイオンとを含有する試薬である場合、工程（ａ）では、プロトロンビン時間測定用試薬と血液試料との接触と同時に、工程（ｂ）において、測定試料のプロトロンビン時間を測定する。測定試料のカルシウムイオン濃度は、通常、２０〜２５ｍＭである。また、測定試料のリン脂質濃度は、通常、０．４５〜０．５５ｍＭである。
【００４９】
一方、プロトロンビン時間測定用試薬が組織因子と界面活性剤とリン脂質とを含有し、かつカルシウムイオンを含有しない試薬である場合、工程（ａ）では、まず、プロトロンビン時間測定用試薬と血液試料とを混合する。つぎに、得られた混合物とカルシウム塩とを接触させる。混合物とカルシウム塩との接触と同時に、工程（ｂ）において、測定試料のプロトロンビン時間を測定する。この場合、混合物と混合されるカルシウム塩の量は、測定試料におけるカルシウムイオン濃度が２０〜２５ｍＭとなる量であればよい。
【００５０】
なお、工程（ａ）に先立ち、血液試料を、凝固反応を行なうのに適した温度に加温してもよい。この場合、血液試料の加温温度は、通常、好ましくは３０〜４５℃、より好ましくは３６〜３８℃である。
【００５１】
測定試料のプロトロンビン時間は、凝固情報に基づいて調べることができる。凝固情報としては、例えば、測定試料に光を照射したときの透過光または散乱光の変化、測定試料の粘度の変化などが挙げられるが、特に限定されない。この場合、測定試料のプロトロンビン時間は、測定試料に光を照射し、測定試料を透過した透過光または測定試料からの散乱光の変化をモニターすること、測定試料の粘度の変化をモニターすることなどによって調べることができる。
【００５２】
プロトロンビン時間の測定には、一般的なプロトロンビン時間の測定に用いられる測定装置が用いられる。測定装置としては、例えば、光学的情報検出部を備える市販の血液凝固測定装置などが挙げられるが、特に限定されない。測定装置の具体例としては、シスメックス（株）製の商品名：ＣＳ−２０００ｉ、商品名：ＣＳ−２１００ｉなどが挙げられる。
【実施例】
【００５３】
以下において、各略語の意味は、以下のとおりである。
＜略語＞
ＤＯＰＥ：  ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン
ＤＯＰＣ：  ジオレオイルホスファチジルコリン
ＤＯＰＳ：  ジオレオイルホスファチジルセリン
ＨＥＰＥＳ：  ４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸〔４−（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ〕
【００５４】
実施例１〜５および比較例１〜５
（１）組み換えヒト組織因子の調製
ヒト組織因子をコードするｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００１９９３）が組み込まれた組換えバキュロウイルスをカイコ虫体に感染させた。感染から７日間経過後に、カイコ虫体から発現タンパク質を抽出した。発現タンパク質の抽出は、以下の手順で行なった。まず、凍結させたカイコ虫体を破砕用緩衝液〔組成：１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭベンザミジン、１ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル、１ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭエチレンジアミン四酢酸、１ｍＭグリコールエーテルジアミン四酢酸および２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）〕中で破砕した。得られた破砕物を１０００００×ｇ、４℃で６０分間の遠心分離に供して沈殿画分を回収した。沈殿画分を抽出用緩衝液Ａ〔１質量％ノニル−β−Ｄ−グルコピラノシド、１５０ｍＭ塩化ナトリウムおよび２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）〕または抽出用緩衝液Ｂ〔１質量％ｎ−ノナノイル−Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン、１５０ｍＭ塩化ナトリウムおよび２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）〕を用いて可溶化させることにより、実施例１〜５および比較例１〜５の組織因子原料液を得た。得られた組織因子原料液の組織因子濃度をＥＬＩＳＡ法によって決定した。また、組織因子原料液の全タンパク質濃度をＢＣＡ法によって決定した。その結果を表１に示す。
【００５５】
得られた組織因子原料液を組織因子の濃度が５０μｇ／ｍＬとなるように緩衝液Ａ〔組成：１５０ｍＭ塩化ナトリウムおよび２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）〕で希釈し、実施例１〜５および比較例１〜５の組織因子含有液を得た。得られた組織因子含有液の組織因子濃度をＥＬＩＳＡ法によって決定した。また、組織因子含有液の全タンパク質濃度をＢＣＡ法によって決定した。その結果を表１に示す。
【００５６】
【表１】
0006652873.tif 000002
【００５７】
（２）リポソーム含有液の調製
２５ｍｇ／ｍＬ  ＤＯＰＣ−クロロホルム溶液８６．８ｍＬと、２５ｍｇ／ｍＬ  ＤＯＰＥ−クロロホルム溶液１８．６ｍＬと、２５ｍｇ／ｍＬ  ＤＯＰＳ−クロロホルム溶液１８．６ｍＬとをフラスコ中にて混合し、リン脂質−クロロホルム溶液を得た。つぎに、リン脂質−クロロホルム溶液が入ったナスフラスコをロータリエバポレーターで回転させながら、クロロホルムを蒸発させた。これにより、ナスフラスコの内壁面にリポソーム膜を形成させた。得られたリポソーム膜を緩衝液Ａで膨潤させ、リポソームを含む混合物を得た。つぎに、得られた混合物を、０．６μｍのポリカーボネート製メンブランで濾過してリポソームの粒子径を均一化させ、リポソーム含有液を得た。
【００５８】
（３）組織因子の合成リポソームへの再構成
（２）で得られたリポソーム含有液１５５０ｍＬを緩衝液Ｂ〔組成：１２．５ｍＭ塩化カルシウム、０．１ｇ／Ｌブチルヒドロキシアニソールおよび２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）〕１２４０ｍＬに添加した。得られた混合液を３７℃で撹拌した。混合液が十分に攪拌されていることを確認した後、混合液に（１）で得られた組織因子含有液を滴下した。得られた混合物を３７℃で撹拌した。撹拌中に、混合物の一部を複数回採取した。
【００５９】
採取された混合物に、塩化カルシウム濃度が２５．０ｍＭとなるように塩化カルシウムを添加し、プロトロンビン時間測定用試薬を得た。つぎに、プロトロンビン時間測定用試薬における界面活性剤の含有量（界面活性剤量）およびプロトロンビン時間測定用試薬における全タンパク質の含有量（全タンパク質量）を求めた。界面活性剤量は、組織因子含有液の組織因子濃度を用いて、｛（組織因子含有液中の界面活性剤濃度［Ｗ／Ｖ％］×１０［ｇ／ｍＬ］）÷界面活性剤分子量［ｇ／ｍｏｌ］｝×（プロトロンビン時間測定用試薬中の組織因子濃度［μｇ／ｍＬ］／組織因子含有液中の組織因子濃度［μｇ／ｍＬ］）×プロトロンビン時間測定用試薬の容量［ｍＬ］÷１０６によって求めた。全タンパク質量は、｛組織因子含有液中の界面活性剤濃度［μｇ／ｍＬ］×（プロトロンビン時間測定用試薬中の組織因子濃度［μｇ／ｍＬ］／組織因子含有液中の組織因子濃度［μｇ／ｍＬ］）×プロトロンビン時間測定用試薬の容量［ｍＬ］によって求めた。つぎに、式（Ｉ）：
［界面活性剤量（μｍｏｌ）／タンパク質量（μｇ）］                        （Ｉ）
の値を算出した。その結果を表２に示す。
【００６０】
得られたプロトロンビン時間測定用試薬の一部を用いて健常人プール血漿のプロトロンビン時間を測定した。また、得られたプロトロンビン時間測定用試薬の一部を容器に入れ、凍結乾燥させた。つぎに、凍結乾燥状態のプロトロンビン時間測定用試薬を緩衝液Ｂ（凍結乾燥前の２倍量）に再溶解させた。溶解後のプロトロンビン時間測定用試薬を用いて健常人プール血漿のプロトロンビン時間を測定した。プロトロンビン時間の測定には、全自動凝固測定器〔シスメックス（株）製、商品名：ＣＳ−５１００〕を用いた。凍結乾燥前後のプロトロンビン時間の差を、式（ＩＩ）：
［凍結乾燥前後のプロトロンビン時間の差］＝
［凍結乾燥後に再溶解させたプロトロンビン時間測定用試薬を用いたときのプロトロンビン時間］−［凍結乾燥前のプロトロンビン時間測定用試薬を用いたときのプロトロンビン時間］
（ＩＩ）
にしたがって算出した。その結果を表２に示す。
【００６１】
【表２】
0006652873.tif 000003
【００６２】
凍結乾燥前後のプロトロンビン時間の差が１秒間以内であれば、実際の凝固時間の測定に要求される性能を有すると考えられる。表２に示された結果から、式（Ｉ）の値が０．０１３５〜０．０４７２μｍｏｌ／μｇである実施例１〜５のプロトロンビン時間測定用試薬を用いた場合、凍結乾燥前後のプロトロンビン時間の差が、１秒間以内であることがわかる。したがって、組織因子と界面活性剤とを含有し、式（Ｉ）の値が０．０１３〜０．０５μｍｏｌ／μｇであるプロトロンビン時間測定用試薬によれば、凍結乾燥前後でのプロトロンビン時間の測定値の変動を抑制することができることがわかる。
【符号の説明】
【００６３】
１０  試薬キット
２１  試薬
２２  容器
３１  添付文書
４１  箱
２００  リポソーム
２１０  組織因子
１０１  会合体
２０１  リン脂質
２０２  リン脂質層
【図１】
0006652873.tif 000004