(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
男性不妊を検出する試薬またはキットの製造のために、アデニル酸キナーゼ6（adenylate kinase 6、AK6）の遺伝子またはタンパク質を使用することを特徴とする方法。
【請求項２】
（i）男性不妊を検出する試薬またはキットの製造、および／または、（ii）ヒトまたはほかの哺乳動物の精子の老化および精子の品質を評価する試薬またはキットの製造のために、男性生殖関連遺伝子またはタンパク質またはその調節性miRNAを使用する方法であって、
前記男性生殖関連遺伝子またはタンパク質は、アデニル酸キナーゼ6（adenylate kinase 6、AK6）の遺伝子またはタンパク質であることを特徴とする方法。
【請求項３】
男性不妊を検出するためのタンパク質の組み合わせであって、
AK6タンパク質、および表1から選ばれ、LMNB2、HADH、UAP1、CALR、AKR7A2、CTSB、HSPA5、GPX5、KLHL15、HSPA1L、GP83、CLDN7、ALDH4A1、およびALDH2からなる群から選択される任意の一つまたは複数のタンパク質を含むことを特徴とするタンパク質の組み合わせ。
【請求項４】
男性不妊を検出するための遺伝子の組み合わせであって、
AK6タンパク質をコードする遺伝子、および表1から選ばれ、LMNB2、HADH、UAP1、CALR、AKR7A2、CTSB、HSPA5、GPX5、KLHL15、HSPA1L、GP83、CLDN7、ALDH4A1、およびALDH2からなる群から選択される任意の一つまたは複数のタンパク質をコードする遺伝子を含むことを特徴とする遺伝子の組み合わせ。
【請求項５】
男性不妊を検出するためのキットであって、請求項３に記載のタンパク質の組み合わせまたは請求項４に記載の遺伝子の組み合わせを検出する検出試薬を含む容器と、前記キットが男性不妊を検出するためのものであることを明記するラベルまたは説明書とを含むことを特徴とするキット。
【請求項６】
固相担体と、前記固相担体に位置する、請求項３に記載のタンパク質の組み合わせを検出するための抗体とを含むことを特徴とする男性不妊を検出するためのチップ。
【請求項７】
前記検出試薬はタンパク質の組み合わせを検出するものであって、抗AK6タンパク質、および、抗CTSB、抗HSPA5、および抗ALDH4A1タンパク質から選択される一つまたは複数のモノクローナル抗体を含むことを特徴とする請求項５に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物技術および医学の分野に属し、より具体的に、男性不妊症の診断または治療における年齢関連の15種類のヒト精子局在タンパク質の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
男性不妊は不妊症の重要な原因の一つである。2000年の世界保健機関(WHO)の報告によると、全世界で、不妊症が約15％で、男性側の原因によるものは約半分を占め、欧州の一部の国では不妊症が30％に達している。男性不妊の原因は非常に複雑で幅広く、生殖系の解剖構造および機能、ホルモン調節、遺伝物質、感染・免疫などの多くの要素による異常および障害に関わる。
【０００３】
男性不妊症は、独立した疾患ではなく、複数の疾患または要素が併せて作用した結果である。男性不妊の原因は非常に複雑で幅広いが、いま、精液のルーチン検査の手段に限界がある。
【０００４】
研究では、男性不妊の主な原因は、異常の精子形成または精子欠乏ことが明らかになった。ヒト睾丸で発生した精子が副睾丸に入って成長して成熟するが、老化の過程に伴い、精子の機能がだんたん低下し、ひいては完全に喪失する。
【０００５】
既に多くの研究で副睾丸および睾丸の機能およびその調節が報告されたが、今まで、副睾丸および睾丸の発育から老化までの過程における各種類のタンパク質（特に精子局在タンパク質）の発現状況があまり知られず、相応の特異的な検出方法も欠けている。そのため、本分野では、精子を老化させ、生育能力を低下させる男性生育関連タンパク質を見つけることが切望されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、男性不妊の診断または治療における一組の年齢関連の男性生殖関連タンパク質およびその組み合わせの使用を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の第一では、（i）男性不妊を検出する試薬またはキットの製造、および／または（ii）避妊用薬物組成物の製造のための、アデニル酸キナーゼ6（adenylate kinase 6、AK6）の遺伝子またはタンパク質、あるいはそのほかの男性生殖関連遺伝子またはタンパク質との組み合わせの使用を提供する。
【０００８】
もう一つの好適な例において、前記のほかの男性生殖関連タンパク質は、一つまたは複数の表１に示されたタンパク質を含む。
【０００９】
もう一つの好適な例において、前記のほかの男性生殖関連タンパク質は、さらに、CN201010195377.9に記載の1種類または複数種類の男性生殖関連タンパク質を含む。
【００１０】
もう一つの好適な例において、前記のアデニル酸キナーゼ6（adenylate kinase 6、AK6）の遺伝子またはタンパク質、あるいはそのほかの男性生殖関連遺伝子またはタンパク質との組み合わせの使用は、さらに、細胞の品質の評価のためにも使用される。
【００１１】
もう一つの好適な例において、前記の組み合わせは、AK6と、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、または14種類の表1に示されたタンパク質とを含む。
【００１２】
もう一つの好適な例において、前記の試薬は、さらに、表1から選ばれる一つまたは複数のタンパク質またはその遺伝子を検出する検出試薬を含む。
【００１３】
もう一つの好適な例において、前記の検出試薬は、AK6および／または表1から選ばれる一つまたは複数のタンパク質またはその遺伝子の抗体、アンチセンスRNA、microRNA、siRNA、shRNAおよびその活性阻害剤、たとえばAK6の阻害剤を含む。
【００１４】
もう一つの好適な例において、前記のAK6の阻害剤は、AK6核酸のアンチセンスRNA、microRNA、siRNA、shRNAおよびAK6の活性阻害剤を含む。
【００１５】
もう一つの好適な例において、前記の拮抗剤は、表1から選ばれる一つまたは複数のタンパク質の抗体、前記タンパク質をコードする核酸のアンチセンスRNA、microRNA、siRNA、shRNAおよび前記タンパク質の活性阻害剤を含む。
【００１６】
本発明の第二では、（i）男性不妊を検出する試薬またはキットの製造、および／または（ii）精子を提供する対象の年齢を判断する試薬またはキットの製造、および／または（iii）ヒトまたはほかの哺乳動物の年齢の判断、または精子の老化の評価および精子の品質の評価に用いられる試薬またはキットの製造のための、男性生殖関連遺伝子またはタンパク質またはその調節性miRNAまたはこれらの組み合わせの使用を提供する。
【００１７】
もう一つの好適な例において、前記の調節性miRNAは、AK6の調節性miRNA、およびGPX5の調節性miRNAを含む。
【００１８】
もう一つの好適な例において、前記のAK6の調節性miRNAは、miR-370、miR-544a、miR-27a、miR-27b、miR-128、miR-20a、miR-20b、miR-106b、miR-106a、miR-17、miR-200b、miR-200c、miR-93、miR-429、miR-519dから選ばれる。
【００１９】
もう一つの好適な例において、前記のGPX5の調節性miRNAは、miR-419-5p、miR-299-3p、miR-296-3p、miR-194、miR-134、miR-383、miR-206から選ばれる。
【００２０】
もう一つの好適な例において、前記の試薬は、AK6タンパク質あるいはほかの男性生殖関連遺伝子またはタンパク質の捕捉試薬である。
【００２１】
もう一つの好適な例において、前記の試薬は、AK6あるいはほかの男性生殖関連遺伝子またはタンパク質の特異的抗体、特異的増幅プライマー、プローブまたはチップを含む。
【００２２】
もう一つの好適な例において、前記の抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体を含み、好ましくはモノクローナル抗体である。
【００２３】
もう一つの好適な例において、前記の試薬は、
(a)．AK6タンパク質あるいはほかの男性生殖関連遺伝子またはタンパク質に対する特異的抗体、および／または
(b)．特異的にAK6あるいはほかの男性生殖関連遺伝子またはタンパク質のmRNAまたはcDNAを増幅させる特異的プライマー
を含む。
【００２４】
もう一つの好適な例において、前記のAK6は、哺乳動物、好ましくはヒトまたは齧歯動物（マウス、ラット）由来のものである。
もう一つの好適な例において、前記のAK6遺伝子のGenbankのアクセッション番号はNM_016283.4である。
【００２５】
もう一つの好適な例において、前記のAK6タンパク質配列は、配列番号2で示され、当該タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号1で示される。
【００２６】
もう一つの好適な例において、前記の検出は、定性および／または定量の検出を含む。
もう一つの好適な例において、前記の検出は、男性個体の精漿または精液サンプルにおける精子局在タンパク質に対して定性および／または定量の検出を行うものである。
【００２７】
もう一つの好適な例において、前記検出の検出対象は、男性のヒト、好ましくは男性不妊または結婚後1年で未出産女性の配偶者である。
【００２８】
もう一つの好適な例において、前記検出は、タンパク質チップ法、抗体チップ法、DNAチップ法、RT-PCR法、リアルタイム蛍光定量PCR法、ELISA法、免疫ボロット法、免疫組織化学法、免疫細胞化学法、フローサイトメーター法、質量分析法の検出を含む。
【００２９】
本発明の第三では、男性不妊を治療する薬物組成物の製造、および／または（b）抗老化組成物の製造のための、AK6阻害剤またはそのほかの男性生殖関連タンパク質促進剤または阻害剤との組み合わせの使用であって、前記のほかの男性生殖関連タンパク質は、一つまたは複数の表1に示されたタンパク質を含む使用を提供する。
もう一つの好適な例において、前記抗老化組成物は、薬物組成物、美容製品組成物、または健康食品組成物を含む。
【００３０】
もう一つの好適な例において、前記のAK6阻害剤またはそのほかの男性生殖関連タンパク質促進剤または阻害剤との組み合わせは、さらに、薬物標的の選別、疾患の予防検出、環境汚染、健康管理、遺伝的分析、または薬物の治療効果の評価のためにも用いられる。
【００３１】
もう一つの好適な例において、前記のほかの男性生殖関連タンパク質は、GPX5タンパク質を含む。
【００３２】
もう一つの好適な例において、前記のAK6阻害剤は、AK6核酸のアンチセンスRNA、microRNA、siRNA、shRNAおよびAK6の活性阻害剤を含む。
【００３３】
もう一つの好適な例において、前記の薬物組成物は、活性成分としてAK6阻害剤あるいはそのほかの男性生殖関連遺伝子またはタンパク質、またはその促進剤との組み合わせと、薬学的に許容される担体とを含む。
【００３４】
もう一つの好適な例において、前記の薬物組成物は、さらに、表1に示されたタンパク質またはその遺伝子およびその促進剤を含む。
【００３５】
本発明の第四では、男性生殖および／または男性精子の受精成功率に影響するタンパク質の集合であって、
(a) AK6タンパク質、および表1から選ばれる任意の一つまたは複数のタンパク質、あるいは
(b) 表1から選ばれる任意の二つまたは複数のタンパク質
を含むタンパク質の集合を提供する。
【００３６】
もう一つの好適な例において、前記のタンパク質の集合は、CTSB、HSPA5、ALDH4A1、AK6タンパク質、またはその組み合わせを含む。
【００３７】
本発明の第五では、男性生殖および／または男性精子の受精成功率に影響する遺伝子の集合であって、前記遺伝子の集合における遺伝子はそれぞれ本発明の第三に係るタンパク質の集合におけるタンパク質をコードする遺伝子の集合を提供する。
もう一つの好適な例において、前記の遺伝子は、当該遺伝子の全長配列あるいはその断片、cDNAまたはmRNAを含む。
【００３８】
もう一つの好適な例において、前記の遺伝子の集合は、AK6遺伝子およびGPX5遺伝子を含む。
【００３９】
もう一つの好適な例において、前記のAK6タンパク質またはその遺伝子の正常青年男性の精子における発現量および／または活性は、正常老年男性の精子における発現量および／または活性よりも低い。
【００４０】
もう一つの好適な例において、前記表1から選ばれる一つまたは複数のタンパク質またはその遺伝子の正常青年男性の精子における発現量および／または活性は、正常老年男性の精子における発現量および／または活性よりも低い。
【００４１】
本発明の第六では、男性不妊を検出するためのキットであって、本発明の第四に係るタンパク質の集合または本発明の第五に係る遺伝子の集合を検出する検出試薬を含む容器と、前記キットが男性不妊を検出するためのものであることを明記するラベルまたは説明書とを含むキットを提供する。
【００４２】
もう一つの好適な例において、前記の検出試薬は、CTSB、HSPA5、ALDH4A1、AK6タンパク質、またはその組み合わせのモノクローナル抗体を含む。
【００４３】
もう一つの好適な例において、前記の男性不妊は、精子無力症、精子減少無力症を含む。
【００４４】
もう一つの好適な例において、前記のラベルまたは説明書には、さらに、検出対象由来のサンプルにおけるAK6遺伝子またはタンパク質の発現量E1および／または活性と正常者の発現量および／または活性E2との比E1/E2≧2である場合、および／または検出対象由来のサンプルにおける表1における番号1〜14から選ばれる1種類または複数種類の遺伝子またはタンパク質の発現量および／または活性Eaと正常者の発現量および／または活性Ebとの比Ea/Eb≦0.5である場合、前記の検出対象が不妊症を罹患する確率が正常者よりも高いことを示すことが記載されている。
【００４５】
もう一つの好適な例において、前記のサンプルは、血液サンプル、尿液サンプル、精漿/液サンプル、または組織サンプルを含む。
【００４６】
もう一つの好適な例において、前記のE1/E2≧2、および／またはEa/Eb≦0.5の場合、さらに、前記の検出対象の生活環境が悪いことを示す。
【００４７】
本発明の第七では、睾丸または副睾丸によって発現され精子結合タンパク質るを検出するためのチップであって、固相担体と、前記固相担体に位置する本発明の第四に係るタンパク質の集合を検出するための検出点を含むチップを提供する。
【００４８】
もう一つの好適な例において、前記の検出点にそれぞれ前記の男性生殖関連タンパク質の捕捉試薬(例えば抗体)が固定化されている。
【００４９】
もう一つの好適な例において、前記の捕捉試薬は、本発明の第三に係るタンパク質の集合におけるタンパク質と特異的に結合するモノクローナル抗体である。
【００５０】
もう一つの好適な例において、前記のタンパク質の集合は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、または14種類の表1に示されたタンパク質を含む。
【００５１】
もう一つの好適な例において、前述の固相担体は、ガラスシート、プラスチックシート、ニトロセルロース 膜、ポリフッ化ビニリデン膜、マイクロスフェアなどの担体から選ばれる。
【００５２】
本発明の第八では、男性受精成功率を向上させる薬物組成物であって、（a）AK6阻害剤と、任意に（b）表1から選ばれる一つまたは複数のタンパク質または遺伝子あるいはその促進剤と、（c）薬学的に許容される担体とを含む組成物を提供する。
【００５３】
もう一つの好適な例において、前記の阻害剤は、AK6タンパク質のモノクローナル抗体を含む。
【００５４】
本発明の第九では、（a1）AK6遺伝子またはタンパク質と、任意に（b1）表1から選ばれる一つまたは複数のタンパク質または遺伝子の拮抗剤と、（c1）薬学的に許容される担体とを含む避妊薬物組成物を提供する。
【００５５】
本発明の第十では、男性不妊症を検出または診断する方法であって、
（i）対象のサンプル由来の本発明の第四に係るタンパク質の集合または本発明の第五に係る遺伝子の集合の発現量および／または活性を検出する工程と、
（ii）（i）における測定結果に基づいて前記の対象が男性不妊症を罹患しているかどうか検出または診断する工程とを含み、
ここで、検出対象由来のサンプルにおけるAK6遺伝子またはタンパク質の発現量E1および／または活性と正常者の発現量および／または活性E2との比E1/E2≧2である場合、および／または検出対象由来のサンプルにおける表1における番号1〜14から選ばれる1種類または複数種類の遺伝子またはタンパク質の発現量および／または活性Eaと正常者の発現量および／または活性Ebとの比Ea/Eb≦0.5である場合、前記の検出対象が不妊症を罹患する確率が正常者よりも高いことを示すことが記載されている方法を提供する。
【００５６】
もう一つの好適な例において、前記の検出方法は、さらに、AK6調節性miRNAを検出することを含む。
【００５７】
もう一つの好適な例において、前記AK6調節性miRNAは、miR-370、miR-544a、miR-27a、miR-27b、miR-128、miR-20a、miR-20b、miR-106b、miR-106a、miR-17、miR-200b、miR-200c、miR-93、miR-429、miR-519dを含む。
【００５８】
もう一つの好適な例において、正常者の静止と比べると、miR-370、miR-544a、miR-27a、miR-27b、miR-128、miR-20a、miR-20b、miR-106b、miR-106a、miR-17、miR-200b、miR-200cの精子減少無力症患者における発現量が低下する。
【００５９】
もう一つの好適な例において、正常者の静止と比べると、miR-93、miR-429の精子無力症患者における発現量が低下する。
【００６０】
もう一つの好適な例において、正常者の静止と比べると、高齢者、精子無力症および精子減少無力症患者のいずれにおいてもmiR-519dが顕著に低下する。
【００６１】
もう一つの好適な例において、前記AK6調節性miRNAの前記検出対象における発現が低下する場合、前記の検出対象が不妊症を罹患する確率が正常者よりも高いことを示す。
【００６２】
もう一つの好適な例において、前記の検出方法は、さらに、GPX5調節性miRNAを検出することを含む。
【００６３】
もう一つの好適な例において、前記のGPX5調節性miRNAは、miR-419-5p、miR-299-3p、miR-296-3p、miR-194、miR-134、miR-383、miR-206を含む。
【００６４】
もう一つの好適な例において、前記のGPX5調節性miRNAの前記検出対象における発現が向上する場合、前記の検出対象が不妊症を罹患する確率が正常者よりも高いことを示す。
【００６５】
本発明の第十一では、男性受精成功率の向上および／または不妊症の治療のための方法であって、本発明の第九に係る薬物組成物、または
（a1）AK6阻害剤、
（b1）表１から選ばれる任意の一つまたは複数のタンパク質またはその遺伝子あるいはその促進剤、
（a1）と（b1）の組み合わせ
から選ばれる１種類または複数種類の物質を受精能獲得液と接触させることによって、男性受精成功率の向上および／または不妊症の治療を果たす方法を提供する。
【００６６】
本発明の第十二では、精子を提供する対象の年齢の判断、および／まはた精細胞の老化の判断、および／または精子および細胞の品質の評価のための方法であって、
（i）対象のサンプル由来の本発明の第四に係るタンパク質の集合または本発明の第五に係る遺伝子の集合の発現量および／または活性を検出する工程と、
（ii）（i）における測定結果に基づいて前記の対象の年齢範囲、または精細胞の老化状況、または精子および細胞の品質を判断する工程と
を含む方法を提供する。
【００６７】
もう一つの好適な例において、AK6タンパク質の精子（精細胞）における発現が向上し、表１から選ばれる一つまたは複数のタンパク質の精子（精細胞）における発現が低下する場合、精子を提供する対象の年齢が高く、精細胞の老化の程度が高く、または精子の品質が低いことを示す。
【００６８】
もう一つの好適な例において、AK6タンパク質の精子（精細胞）における発現が低下し、表１から選ばれる一つまたは複数のタンパク質の精子（精細胞）における発現が向上する場合、精子を提供する対象の年齢が低く、精細胞の老化の程度が低く、または精子の品質が高いことを示す。
【００６９】
もちろん、本発明の範囲内において、本発明の上記の各技術特徴および下記（例えば実施例）の具体的に記述された各技術特徴は互いに組合せ、新しい、または好適な技術方案を構成できることが理解される。紙数に限りがあるため、ここで逐一説明しない。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】精子局在タンパク質LMNB2、HADH、UAP1、CALR、AKR7A2、GPX5、HSPA5、CTSBの青年（30±2歳）および高齢者（70±2歳）が出した精子における免疫蛍光による分布解析の図（図１、A1-I1、図1、A2-I2）、およびその30、40、50、60、65、70歳（±2歳）の六つの異なる年齢群の精子における定量（図１、A3-I3）および局在率（図１、A4-I4）の統計的分析結果を示す。ここで、バー（bar）は20μmを示し、赤色の臭化エチジウム染色は核を示し、白色の矢印は緑色のフルオロセインイソチオシアネート染色の目的タンパク質の精子における局在位置と定量を示す。
【図２】精子局在タンパク質SPA1L、CLDN7、GP83、ALDH2、ALDH4A1、KLHL15の青年（30±2歳）および高齢者（70±2歳）が出した精子における免疫蛍光による分布解析の図（図２、A1-F1、図２、A2-F2）、およびその30、40、50、60、70歳（±2歳）の五つの異なる年齢群の精子における定量（図２、A3-F3）および局在率（図２、A4-F4）の統計的分析結果を示す。ここで、バー（bar）は10μmを示し、赤色の臭化エチジウム染色は核を示す。
【図３】精子局在タンパク質HSPA5の発現精製SDS-PAGE電気泳動像を示す。ここで、各レーンは、1.分子量標準品(Marker)、2. 親和性精製後のHSPA5タンパク質(GRP78タンパク質とも呼ぶ)、3.菌破壊液の上清、4.親和性精製の時除去された不純タンパク質である。
【図４】CTSB、HSPA5、ALDH4A1、AK6の正常青年Young（30±2歳）、高齢者Aged（70±2歳）、精子無力症患者（Asthenozoospermia）の精子における蛍光局在位置および強度を示す。緑色の矢印は正常青年の精子局在タンパク質の表現型を、黄色の矢印は青年の精子無力症の精子局在タンパク質の発現低下の表現型を、赤色の矢印は精子局在タンパク質の増強または欠失の発現型を示し、目盛り尺は10μmである。
【図５】AK6の正常青年（30±2歳）および高齢者（70±2歳）の精子における定量および局在率の統計的分析結果を示す。
【図６】七つの年齢関連の精子局在タンパク質mRNAの異なる由来の精子における定量検出結果を示す。Young adultは正常青年を、Agedは高齢者を、Asthenozoospermiaは精子無力症患者を、Oligo asthenozoospermiaは精子減少無力症患者を指す。
【図７】正常青年、高齢者、精子無力症および精子減少無力症患者の精子における15個のAK6調節関連miRNA発現のqRT-PCR分析結果を示す。
【図８】正常青年、高齢者、精子無力症および精子減少無力症患者の精子における9個のGPX5調節関連miRNA発現のqRT-PCR分析結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００７１】
本発明者は、幅広く深く研究したところ、初めて、アデニル酸キナーゼ6（AK6）タンパク質とヒト男性不妊の間に密接な関連性が存在し、すなわち、男性不妊患者において、AK6の発現量および／または活性が増加し、かつAK6の発現量および／または活性が正常者においても加齢によって増加することを見出した。本発明者は、実験によって、AK6の発現量および／または活性を低下させることによって、男性受精の成功率を増加させることができることを見出した。また、本発明者は、さらに、AK6を表1における14種類のタンパク質と組み合わせて応用すると、男性不妊症の診断により有用で、またAK6の発現量および／または活性を低下させるか、または同時に表1における14種類のタンパク質から選ばれる1種類または複数種類の発現量および／または活性を増加させると、男性不妊症、特に精子無力症、精子減少無力症に対して治療作用があることを見出した。これに基づき、本発明を完成させた。
【００７２】
精子局在タンパク質
ここで用いられるように、用語の「本発明のタンパク質」、「男性生殖関連タンパク質」、「本発明の精子局在タンパク質」、「精子局在タンパク質」および「年齢関連の精子局在タンパク質」とは、雄性哺乳動物（特にヒト）の睾丸および／または副睾丸で発現される、年齢関連の、精子に局在するタンパク質を指し、入れ替えて使うことができる。その関連の分子生物学的材料は、突然変異タンパク質、タンパク質の任意の断片、遺伝子およびその任意のDNA断片、突然変異遺伝子、mRNA、干渉RNA、抗体などを含むが、これらに限定されない。代表的な精子局在タンパク質は、表1に示された14種類の下方調節タンパク質および1種類の上方調節タンパク質（AK6）を含む。
【００７３】
ここで用いられるように、「哺乳動物」とは、胎生で且つ乳腺で子を育てる動物の種類であって、脊椎動物に属する代表的な哺乳動物は、例えば、ヒト、サル、ヒツジ、ウシ、ウサギ、ウマ、マウス、ラットなどを含むが、これらに限定されず、ヒトが特に好ましい。
【００７４】
表１に示された14種類の下方調節タンパク質のうち、14種類が高齢者の精子、精子無力症患者の精子における含有量が少ないため、高齢者または精子無力症における発現下方調節の精子局在タンパク質（番号1〜14）に分類される。もう１種類の本発明のタンパク質（AK6）は高齢者の精子、精子無力症患者の精子における含有量が高いため、高齢者または精子無力症における発現上方調節の精子局在タンパク質に分類される。
【００７５】
【表１】
0006721571.tif 000002
配列番号4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30で示されるタンパク質をコードするヌクレオチド配列はそれぞれ配列番号3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29で示される。
【００７６】
タンパク質の集合
本発明は、男性不妊の診断または治療に有用なタンパク質の集合であって、少なくともAK6、およびほかの男性不妊に関連するタンパク質、特に精子局在タンパク質を含むタンパク質の集合を提供する。通常、ここに記載される「ほかの男性不妊に関連するタンパク質」とは、既存技術で発見された男性不妊と関連性が存在するタンパク質を指す。好ましくは、本発明のタンパク質の集合は、AK6および表1における1種類または複数種類の精子局在タンパク質を含む。その中で、AK6タンパク質は、本発明で新しく発見された、男性不妊と密接に関連し、かつ青年と高齢者で差次的発現があるタンパク質である。
【００７７】
ここで、本発明のタンパク質の集合は、(a) AK6タンパク質、および表1から選ばれる任意の一つまたは複数のタンパク質、あるいは
(b) 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、または14個の表1から任意に選ばれるタンパク質を含む。
【００７８】
本発明者は、実験によって、AK6、表1おける任意の数のタンパク質、またはその組み合わせの青年と高齢者の精子において発現量および／または活性が顕著に異なるため、精子の老化、機能の衰退を判断する目的タンパク質とすることができることを見出した。深い研究によって、本発明者は、さらに、その一部のタンパク質が既に精子無力症、精子減少無力症と診断された患者においても正常者（青年）と差次的発現を表すことを見出した。
【００７９】
以上の実験結果に基づき、本発明者は、男性不妊の診断または治療に有用なタンパク質の集合を得た。すなわち、AK6を既存技術（特に本発明の表1）におけるタンパク質と組み合わせたタンパク質の集合で、これらのタンパク質の集合の発現量および／または活性を測定すると、検出される対象が不妊症を罹患する確率の判断または予測に有用である。また、これらのタンパク質の集合に対する抗体の研究・開発は、男性不妊症の治療または避妊薬物の開発に有用である。たとえば、AK6タンパク質のモノクローナル抗体の製造が挙げられる。
【００８０】
もちろん、本発明のタンパク質の集合は、AK6と任意の男性不妊関連タンパク質からなる集合でもよい。AK6またはほかの男性不妊関連タンパク質に対して発現量および／または活性の調節を行うことによって、それぞれ受精率の向上（生殖の促進）または受精率の低下（避妊）のための薬物組成物を製造することができる。
【００８１】
また、本発明は、本発明のタンパク質の集合をコードする遺伝子の集合を提供するが、前記の遺伝子の集合は、タンパク質をコードするcDNA、全長の遺伝子配列、または元のコード核酸と70％、80％、より好ましくは85％、90％、95％以上の相同性を有する核酸配列を含む。これらの遺伝子（またはコード核酸）の集合を利用すると、通常の手段でそのアンチセンス核酸を製造すること、またはそのmRNAを測定すること、または相応のmiRNAを測定することによってこれらの遺伝子に対する定性または定量的検出を行うことができる。
【００８２】
miRNA
本発明は、不妊症を診断または予測/検出する目的遺伝子の集合を提供するが、本発明の遺伝子の集合における各遺伝子の既知のmiRNAで前記の遺伝子の集合の発現量を測定することができる。
【００８３】
好適な遺伝子調節関連miRNAは以下の通りである。
AK6の遺伝子調節関連miRNAのうち、miR-370、miR-544a、miR-27a、miR-27b、miR-128、miR-20a、miR-20b、miR-106b、miR-106a、miR-17、miR-200b、miR-200cは精子減少無力症群では発現が低下し、miR-93、miR-429は精子無力症群では発現が低下し、miR-519dは高齢者、精子無力症、精子減少無力症患者においていずれも顕著な低下を示す。AK6遺伝子調節関連miRNAの配列は以下の通りである。
【００８４】
【表２】
0006721571.tif 000003
【００８５】
また、GPX5遺伝子調節関連miRNAのうち、miR-419-5p、miR-299-3p、miR-296-3p、miR-194、miR-134、miR-383、miR-206は精子減少無力症および精子無力症患者においていずれも顕著な向上を示す。GPX5遺伝子調節関連miRNAの配列は以下の通りである。
【００８６】
【表３】
0006721571.tif 000004
【００８７】
そのため、当業者は、本発明の示唆および既存技術におけるmiRNAの選別方法に基づき、本発明の遺伝子の組み合わせにおける各遺伝子調節関連miRNAを測定することによって、より多くの男性不妊に関連する検出試薬またはキット、および男性不妊を治療する薬物組成物を開発することができる。
【００８８】
検出方法
本発明において、本発明の15種類の精子局在タンパク質およびその関連分子生物学的材料を定性または定量的に検出する方法を提供するが、ヒト精子局在タンパク質の検出、遺伝子突然変異の検出、遺伝子転写のmRNAの検出、調節関連miRNAの検出、突然変異タンパク質の検出、タンパク質活性の検出を含むが、これらに限定されない。検出に供される生物試料は、精子、精液、尿液、血液、前立腺液を含むが、これらに限定されない。
【００８９】
代表的な検出方法は、タンパク質チップ法、抗体チップ法、DNAチップ法、液体チップ、ELISA法、免疫ボロット法、RT-PCR、リアルタイム蛍光定量PCR法、免疫組織化学法、免疫蛍光法、フローサイトメーター法、質量分析法、キャピラリー電気泳動法、免疫沈降法、酵素活性検出法などを含むが、これらに限定されない。
【００９０】
精子無力症
ヒト精液検査と手技 WHOラボマニュアル第5版の規定によると、前進運動（PR）精子が占める比率が32％未満の場合、精子無力症とする。本発明に記載される精子無力症とは、精液ルーチンのほかの各項目（たとえば奇形率、精子密度、白血球数、精液量など）が基本的に正常の青年の精子無力症である。
【００９１】
精子減少無力症
本発明に記載される精子減少無力症とは、精液における前進運動精子が占める比率が＜32％、精子濃度が15×106/mlまたは単回射精が39×106の人を指す。
【００９２】
ヒト精子局在タンパク質の定性または定量の検出
本発明のヒト精子局在タンパク質の定性または定量の検出に使用できる方法は特に限定されず、本分野の任意の蛍光強度または蛍光値を検出することができる装置、ソフトウェアまたは方法でもよい。
【００９３】
通常、特異的抗体を検出標本(精子)とともにインキュベートした後、蛍光標識の二次抗体で精子局在タンパク質の位置を確認し、さらに共焦点レーザー顕微鏡の走査結果でタンパク質の局在率および含有率を計算する。共焦点レーザー顕微鏡で精子タンパク質の発現の定量を行う方法では、400倍の拡大比率で免疫蛍光切片を観察する。視野における精子の合計が200個になるまで、順に精子を含むの視野（当該視野は、非精子細胞がなく、精子の尾部が重ならず、視野における精子の尾部が欠けていないと要求される）を観測する。背景の蛍光は、精子のない空白領域を選んで計測する。蛍光値がブランク値（平均値が約10）よりも低いか高い精子を染色精子比率の統計に使用する。LSM 510 META付属ソフト（LSM 5 version 3.2）が自動的にすべての染色精子の蛍光値を測量し、蛍光背景閾値を引いた後、染色精子の平均免疫蛍光強度値を出す。当該方法で検出した結果はフローサイトメーターで検出した結果と一致する。フローサイトメーターのタンパク質の局在率および含有量に対する検出方法は以下の通りである。精子の洗浄および準備は前者と同様で、精子試料の蛍光値はBDフローサイトメーターによって測定され、10000個の精子をカウントし、Cellquestソフトで染色細胞の比率および染色細胞の蛍光強度を分析する。
【００９４】
特異的蛍光標識抗体は、溶液に溶解させ、精子の表面に結合させ、フローサイトメトリーなどの検出手段で定性または定量的に流れる精子の表面におけるタンパク質の含有量を測定してもよく、抗体を支持物(例えばポリエチレン板、免疫マイクロスフェア、ガラスシート、ニトロセルロース膜、PVDF膜など)に固定化し、通常のスキャナーで定性または定量的に陽性の精子の百分率含有量を測定してもよく、また抗体を磁気ビーズまたはプラスチックビーズにカップリングし、液体チップの二抗体サンドイッチ法によって定性または定量的に精漿または精子溶解液などの試料における精子局在タンパク質を検出してもよい。
【００９５】
タンパク質チップおよびそのヒト精漿などの試料の検出における応用
また、本発明は、精子局在タンパク質の検出に用いられるタンパク質チップを提供する。このようなチップは、定性または定量的にサンプルにおける精子局在タンパク質の含有量を検出することができる。これらの検出結果は、補助的に例えば精子の品質、精子の機能レベルおよび／または精子の品質低下の原因の判断に用いることができる。
【００９６】
用語の「タンパク質アレイ」または「タンパク質チップ」とは、いずれも捕捉試薬がタンパク質標識物と結合できるアレイを指し、液体チップを含み、入れ替えて使うことができる。典型的に、捕捉試薬は、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体で、特異的なタンパク質と結合することができる。標識物が捕捉された後、さらに標識の検出分子で検出し、定性または定量（標準品を使用する）の検出を果たす。
【００９７】
本発明のタンパク質チップの特徴は、前記のチップに精子局在タンパク質の検出点を設けることにあり、ここで用いられるように、用語の「検出点」とは、タンパク質チップに位置し、あるタンパク質の検出のためのサンプル添加点を指すが、例えばAK6タンパクの検出のための検出点は、通常、抗AK6タンパクのモノクローナル抗体をチップの基板に添加してまたは磁気ビーズまたはプラスチックビーズにカップリングして形成したものである。
【００９８】
本発明に適用されるタンパク質チップは特に制限されず、本分野で既知の各種類の構造の空白のタンパク質チップを使用することができる。通常、これらのタンパク質チップの担体は、磁気ビーズ、プラスチックビーズ、免疫マイクロスフェア、ガラスシート、プラスチックシート、ニトロセルロース (NC)膜、PVDF膜などを含むが、中でも、磁気ビーズ、プラスチックビーズ、免疫マイクロスフェアおよび各種の基板が特に好ましい。in-situ合成、機械による添加または共役結合の方法でポリペプチド、タンパク質、または抗体を順に各種の担体に固定化・カップリングして検出用のチップとし、蛍光標識抗体または他の成分を検出されるサンプルが結合したチップと相互に作用させ、洗浄してチップにあるタンパク質と相補的に結合しなかった成分を除去し、さらに蛍光スキャナーまたは共焦点レーザー走査技術でチップまたは他の担体における各点の蛍光強度を測定して各種のタンパク質の含有量を分析することによって、各種のタンパク質の測定する目的を実現させる。
【００９９】
本発明のタンパク質チップは、1種類または複数種類の表1に示された精子局在タンパク質、たとえば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、または15種類の本発明で初めて開示された精子局在タンパク質の検出点を含んでもよい。この15個の検出点は、単独で使用してもよく、任意に組み合わせて使用してもよく、または既に公開された精子検出指標と併用し、精子の品質の評価、男性不妊の診断などに使用してもよい。
【０１００】
産業上の応用
精子の生成、成熟および老化は主に睾丸・副睾丸で分泌されて精子に結合するタンパク質分子の量に表れ、増加、減少または欠失のいずれも精子の成熟障害または機能異常を引き起こし、そして男性不妊につながる。本発明に基づき、精子局在タンパク質の検出方法および検出手段は、年齢関連の15種類の精子局在タンパク質の含有量の検出に使用し、そして精子の品質を判断し、男性不妊を診断することができる。
【０１０１】
たとえば、14種類の発現下方調節の精子局在タンパク質の含有量を測定することによって、検出または診断の結果、たとえば精子の品質、精子の健康状態、不妊であるかどうかなどを得る。つまり、この14種類の精子局在タンパク質の含有量が高いと、精子の健康状態がよく、品質がよくまたは精子が正常青年由来のものであることを示し、含有量が低いと、精子の健康状態が良くなくまたは精子が高齢者由来のものであることを示す。
【０１０２】
また、この14種類の発現下方調節の精子局在タンパク質の1種類または複数種類の補充は、精子の健康状態の改善、精子の活力の増強に有用である。
正常者にとって、抗体ブロッキングまたはsiRNA干渉などの方法によって、この14種類の発現下方調節の精子局在タンパク質の発現または活性を低下させることは、避妊に有用である。
【０１０３】
異なる分野にとって、代表的な応用は以下のことを含むが、これらに限定されない。
（a）精子の品質および健康状態の評価：精子または精漿における本発明のタンパク質の含有量を測定することによって、精子の健康状態および品質を評価する。14種類の発現下方調節タンパク質の含有量が低下または欠失し、1種類の発現上方調節タンパク質（たとえばAK6タンパク質）の含有量が向上すると、精子の健康状態が良くなく、精子の品質のレベルが低く、精子に不完全の現象があることを示す。逆の場合、健康状態が良く、精子の品質が高いことを示す。
（b）男性不妊症の診断：精子または精漿における本発明のタンパク質の含有量を測定することによって、男性不妊症を診断する。14種類の発現下方調節タンパク質の含有量が低下または欠失し、1種類の発現上方調節タンパク質の含有量が向上すると、不妊の可能性があることを示す。
（c）環境汚染の評価：精子における本発明のタンパク質の含有量を検査することによって、生殖健康の予防検出または環境汚染の評価を行う。異なるところで生活する人は、タンパク質の含有量が低いと、生活の環境が良くないことを示す。多くの人に対する統計学的分析は、環境問題の判断に有用である。
（d）人類の健康管理：本発明のタンパク質の人類サンプル（たとえば血、尿、精漿、組織など）における含有量を測定し、正常の範囲を超えると、健康に問題がある可能性が現れ、さらなる検査または診断が必要であることを示す。
（e）年齢査定：たとえば、法医学の分野において、本発明のタンパク質含有量の測定によって、年齢の査定または測定の補助ができる。
（f）保健、治療の応用：本発明のタンパク質を補充することによって、当該タンパク質の機能に関連する疾患を治療することができ、精子の活力の増強、男性不妊症の治療に有用である。たとえば、坐剤とし、体外で女性生殖道に使用され、あるいは注射剤とし、男性に使用される（局部注射、皮下注射など）。
（g）避妊：抗本発明のタンパク質の抗体を使用し、製剤（たとえば坐剤）とし、避妊に使用することができる。
（h）薬物標的および選別：本発明のタンパク質は薬物標的とし、避妊薬物または男性不妊症の治療薬の選別に使用することができる。
（i）治療効果の評価指標：本発明のタンパク質の含有量の変化は、男性不妊症の治療手段の治療効果を評価する補助指標として使用することができる。
（j）毒性試験：動物の精子または精漿における当該タンパク質の含有量の変化を測定することによって、医薬品、化学品、化粧品などの生殖に対する影響を評価する。
以上の応用の完成は、この15種類のタンパク質の人類試料における含有量の変化の測定によって実現することができる以外、また遺伝子の突然変異、転写レベル、アミノ酸の変化、ヌクレオチドまたはアミノ酸の増加・欠失、調節関連miRNAレベル、抗体などを検出することによって実現することができる。
【０１０４】
本発明の主な利点は以下の通りである。
（a）速く有効に年齢と関連する精子局在タンパク質の含有量の検出結果を得ることができる。
（b）本発明のタンパク質の関連分子生物学的材料およびその検出方法は、男性不妊症に対する診断、治療、予防に関する医療技術の推進および診断薬、治療薬、予防薬または避妊薬の開発に有用である。
（c）本発明のタンパク質は、さらに、ヒトまたはほかの哺乳動物の年齢の判断、または細胞老化の評価および精子と細胞の品質の評価、または抗老化製品の開発に使用することができる。
【０１０５】
以下、具体的な実施例によって、さらに本発明を説明する。これらの実施例は本発明を説明するために用いられるものだけで、本発明の範囲の制限にはならないと理解されるものである。下述実施例で具体的な条件が示されていない実験方法は、通常、例えばSambrookら、「モレキュラー・クローニング：研究室マニュアル」(ニューヨーク、コールド・スプリング・ハーバー研究所出版社、1989) に記載の条件などの通常の条件に、或いは、メーカーのお薦めの条件に従う。
【０１０６】
共通の方法
遺伝子のクローニング、原核発現およびタンパク質精製
上記15種類の遺伝子のタンパク質製品は以下のような方法で得ることができる。遺伝子配列によって、成熟コーディング領域を増幅するための一対の特異的プライマーを合成する。通常の方法で調製されたヒト副睾丸cDNAライブラリーを鋳型とし、PCRで目的の遺伝子を直接増幅し、さらに市販のベクターのpGM-T vector(上海貝博生物公司から購入)にクローンして配列決定で正確と確認する。配列決定で確認した遺伝子を制限酵素切断部位で発現ベクターのpET32b(+)(上海貝博生物公司から購入)にクローンし、融合タグの読み枠と一致させる。組換え発現ベクターで大腸菌BL21（DE3）を形質転換し、IPTGによって発現を誘導し、超音波で菌体を破砕させ、ベクターにおけるHis-Tagタグによって、「二段階ネッケル親和性クロマトグラフィー」で組換えタンパク質を分離して精製する。
【０１０７】
実施例１  表１における15種類の精子局在タンパク質の異なる年齢の人の精子における定量分析
異なる年齢の正常者の精液試料（30、40、50、60、65、70±2歳）をそれぞれ30例ずつ採取し、いずれも生殖系疾患の記録がなかった。精液が完全に液化した後、それぞれ1mlの精液を15mlの無菌円錐底試験管に入れ、その後それぞれ8mlになるまでPBSを入れ、軽く吹いて均一に混合した後、500gを15min遠心した。上清を捨てた後、さらにPBSで2回洗浄し（500g、10 min）、上清を捨て、収集された精子沈殿を3％（w/v）BSA含有PBSで精子濃度が1×106個/mlになるように調整した後、それぞれ0.1％ゼラチンで被覆された切片に塗布し、室温で自然乾燥し、-20℃でメタノールで10min固定し、乾燥後PBSで5 minずつ3回洗浄した後、目的タンパク質に対する第一抗体（3％BSA含有PBSで1:50で希釈した）を滴下し、室温で1hインキュベートした。PBSで5 minずつ3回洗浄した。FITC標識の第二抗体(3％ BSA含有PBSで1:100で希釈した)を入れ、室温で1hインキュベートした。PBSで5 minずつ3回洗浄した。PIで再染色し、蒸留水で10 minずつ2回洗浄した。緩衝してグリセリンで封じ、それぞれMeta 510共焦点レーザー顕微鏡（Zeiss、Germany）にセットしてタンパク質の局在位置および定量の分析を行った。
【０１０８】
結果は図１および図2に示すように、14種類の精子局在タンパク質（表1における番号1〜14の14種類のタンパク質）の精子における局在率および含有量が加齢につれて低下する傾向が表れ、一部の高齢者の精子では局在タンパク質欠失の現象も確認された。
【０１０９】
一方、表１における番号15の精子局在タンパク質AK6は発現上方調節のもので、その高齢者の精子における局在率および含有量が正常青年よりも顕著に高かった（図４、図５を参照）。これは、AK6タンパク質の高齢者の精子における高発現は代償的に精子の低エネルギー状態を緩和するための形態の一つかもしれないことを示唆する。
【０１１０】
実施例２  組換えタンパク質の同定
精製された15個の組換えタンパク質はBradford(Bradford  1976)法で定量・同定した後、凍結乾燥して保存した。図3は、15種類の精子局在タンパク質のうちの1種類、すなわちHSPA5遺伝子の相応のタンパク質（GRP78タンパク質とも呼ぶ）の発現精製SDS-PAGE電気泳動結果を示す。
同定によって、精製して得られた組換えタンパク質は本発明のタンパク質であることが確認された。
【０１１１】
実施例３  精子無力症の精子の関連タンパク質の分析
青年精子無力症の試料を102例収集し、CTSB、HSPA5、ALDH4A1、AK6といった4種類のタンパク質の精子無力症の精子における局在率および含有量の定量分析を行った。具体的な方法は実施例１と同様で、結果を図4に示す。
【０１１２】
結果から、精子無力症の精子におけるCTSB、HSPA5、ALDH4A1といった3種類のタンパク質は、局在分布が顕著に欠失した比率がそれぞれ45.1％、45.1％および57.8％、合計カバー率が85.5％に達し、すなわち85％以上の精子無力症の精子に上記タンパク質の少なくとも１種類の発現欠失があり、一方、AK6が増加する傾向が表れたことがわかる。この4種類のタンパク質の精子における定量検出は、精子無力症、男性不妊の診断に有用であることがわかる。
【０１１３】
実施例４  モノクローナル抗体の製造および使用
4.1  モノクローナル抗体の製造
本発明のタンパク質のモノクローナル抗体は通常のタンパク質のモノクローナル抗体の製造方法で得ることができるが、好ましくは本実施例で以下のような方法で得られた。精製された各本発明の組み換えタンパク質でそれぞれBALB/Cマウスを免疫させ、各マウスに1日目に50μgの組み換えタンパク質および等量の完全フロインドアジュバント（CFA）を注射した。その後、15、30および45日目にそれぞれ25μgの組み換えタンパク質および等量の不完全フロインドアジュバント（IFA）を注射して免疫を強化した。最後の免疫から3〜4日後、脾臓細胞を分離してSp2骨髄腫細胞株と混合し、さらにPEGを入れて細胞を互いに融合させ、融合した細胞を適当に希釈し、培養プレートに置いて培養し、通常は0.8個細胞／穴まで希釈し、穴の底の20％を覆うように細胞を培養した時点で、培養の上清液を吸い取ってELISAで抗体の含有量を測定した。陽性細胞株を選んでマウスの腹腔に接種し、腹水を収集し、ブドウ球菌のプロテインAで親和性クロマトグラフィーのカラムを調製し、その中の抗体を集中させた後、溶離し、モノクローナル抗体を回収した。
【０１１４】
4.2  4.1におけるモノクローナル抗体を使用したタンパク質の免疫蛍光による分布解析
精子を収集してPBSで洗浄した後、1％ゼラチンで覆われたスライドガラスに塗布し、自然に乾燥させ、さらにメタノールで10分間固定した。精子を含むスライドガラスを3％BSAで室温で1時間ブロックした後、4.1で製造された各種のタンパク質のモノクローナル抗体(1:200)を添加し、4℃で一晩置いた。PBST(0.1％のTween-20を含むPBS)で3回洗浄し、相応のFITC-標識ヒツジ抗マウスIgGである第二抗体(1:200)を入れた。スライドガラスをPBSTで3回洗浄した後、80％グリセリンで封じた。Olympus  BX-52顕微鏡で結果を観察した。結果を表1に示す。各タンパク質はそれぞれ成熟精子の尾部、頸部や先体などの部位に局在する。
【０１１５】
実施例５  タンパク質チップの製造
以下の方法でタンパク質チップNo.1〜3を製造した。
a  スライドガラスチップNo.1
(1)  高速スポッターで複数穴の板における各タンパク質サンプル(抗本発明のタンパク質の抗体)を直接高密度で化学処理した、表面に活性アルデヒド基があるスライドガラスにスポットし、各アレイに15個のサンプル点（それぞれ表1における番号1〜15の15種類のタンパク質に相応する）があり、各サンプル点は直径0.4mmであった。
(2)  室温で一晩または37℃で1時間インキュベートし、タンパク質のアミノ基をスライドガラスにおけるアルデヒド基と縮合反応させ、サンプルを固定化した。
(3)  スライドガラスにおけるタンパク質と結合しなかった活性アルデヒド基を還元させ、されに充分に洗浄して室温で乾燥した。
(4)  乾燥後、遮光材料で密封して包装し、4℃の環境で保存した。
【０１１６】
b  PVDF膜チップNo.2
(1)  高速スポッターで複数穴の板における各タンパク質サンプル(抗本発明のタンパク質の抗体)をPDVF膜にスポットし、各アレイに15個のサンプル点（上記と同様）があり、各サンプル点は直径0.4mmであった。
(2)  緩衝液で膜を2〜3回、毎回3〜6分間洗浄した。
(3)  5％のウシ胎児血清または脱脂粉乳で室温で1〜2時間ブロックした。
(4)  さらに緩衝液で膜を2〜3回、毎回3〜6分間洗浄した。
(5)  乾燥後、遮光材料で密封して包装し、4℃の環境で保存した。
【０１１７】
c  液体チップNo.3
（1）  被験タンパク質に対応する抗体対を製造したが、一方は捕捉抗体で、もう一方は検出抗体であった。
（2）  捕捉抗体を磁気ビーズにカップリングし、1種類の捕捉抗体が1種類の番号の磁気ビーズに相応した。
（3）  検出抗体に対して蛍光標識を行った。
（4）  異なる被験タンパク質の間で交差反応が発生することを防止するように、捕捉抗体と検出抗体を最適化した。
【０１１８】
実施例６  坐剤処方および製造プロセス
5.1  配合
【表４】
0006721571.tif 000005
【０１１９】
5.2  製造プロセス：
1．β-CDに適量のエタノールを入れてペースト状に均一に撹拌し、HSPA5蛋白質を45分間研磨・包接し、使用に備えた。
2．36型半合成リポラーゼを加熱溶解した後、38℃に維持し、主剤の包接物、ツイン80を入れ、均一に混合して保温した。
3．均一に混合した保温物を膜に充填し、冷却して成形した。
【０１２０】
実施例８  体外受精成功率を向上させるための薬物の製造
体外受精に使用される精子における15種類の上記タンパク質の含有量を検出することによって、含有量が比較的に低いタンパク質を確認し、実施例2で得られた当該精子局在タンパク質または複数種類のタンパク質の組成物を体外受精能獲得液に置き換えした後、精子と卵子の受精過程をタンパク質を含有する受精能獲得液で完成させた。男性不妊障害、精子無力症患者に対し、タンパク質を入れて30min後、精子の活力が向上し、前進運動精子の数が増加し、そして体外受精の成功率が向上した。
【０１２１】
実施例９  精子局在タンパク質に相応するmRNAの定量検出
30±5歳の正常青年、精子無力症患者、精子減少無力症患者、70±2歳の高齢者の精液の試料を10例ずつ収集し、PBSで3回洗浄し、顕微鏡でカウントし、遠心して得られた精子をTrizol法で精子RNAを抽出した。精子RNAの試料をCD52、CDH1遺伝子で選別した後、リアルタイムPCRを行った。
【０１２２】
各群のサンプルは3つの平行実験を行った。Invitrogen社のPlatinum(R) SYBR(R) Green qPCR SuperMix-UDG反応キットの製品説明に従って反応を行い、QIAGEN社のRotor-Gene Q で蛍光定量PCR検出を行い、反応条件は、50℃ 10 min，95℃10 min，95℃ 15s，60℃ 45s，40サイクルであった。2-△△CT法で標的遺伝子の相対発現レベルを計算した(Kenneth Jなど)。△△CT=(Ct(実験群の目的遺伝子)- Ct(実験群の内部参照遺伝子))- (Ct(コントロール群の目的遺伝子)- Ct((コントロール群の内部参照遺伝子) )GAPDHを内部参照遺伝子とした。
【０１２３】
上記方法で表1における15種類の遺伝子の正常青年の精子におけるmRNA転写レベルを検出したところ、7つの遺伝子が検出された。さらにその高齢者、精子無力症、精子減少無力症の精子における転写レベルを分析したところ、そのうちのAK6のmRNAの高齢者の精子における含有量は正常青年の2倍で、精子減少無力症患者の精子における含有量は青年の8倍で、GPX5のmRNAの高齢者の精子における含有量は正常青年の0.12倍で、精子減少無力症患者の精子における含有量は正常青年の0.07倍であった。UAP1、CTSB、HSPA1L、HSPA5、CALRのmRNAは正常青年の精子および高齢者の精子、精子無力症の精子、精子減少無力症の精子における含有量には顕著な差がなかった。統計結果は図6に示す。
【０１２４】
実施例１０  AK6遺伝子調節関連miRNAの精子における定量検出
TargetScan (http://www.targetscan.org/) およびmiRanda (http://www.microrna.org/microrna/home.do)の二つのソフトを併用して同時にAK6転写を調節するmiRNA分子を予測した。TargetScanで53個のmiRNAが、miRandaで17個のmiRNAが予測され、そのうち、15個のmiRNAが二つのデータベースで重複した。この15個のmiRNAの精子における含有量を定量検出した。方法は、正常者が提供した精子、精子無力症患者が提供した精子、高齢者が提供した精子（70±2歳）、精子減少無力症患者が提供した精子を10例ずつ選択し、全RNAを抽出した。各miRNA逆転写反応に、miRNA特異的なステムループプライマー、1 ng-1 μg 全RNAおよびReverTra Ace逆転写酵素(Toyobo)を使用した。PCRの場合、miRNA特異的なフォワードプライマーおよび共通のリバースプライマー(URP)を使用し、装置はQIAGEN’s Roter-Gene Qであった。20 μLの反応系において、1 μLのcDNA鋳型を含み、PCR反応条件は95℃5分間、95℃10秒、60℃ 45秒、計40サイクルであった。PCRに使用される酵素はPlatinum SYBR Green qPCR SuperMix-UDGで、Life Technologies社から購入された(製品番号:11733-038)。U6 snRNAを参照遺伝子とした。2-△△Ct方法で試料におけるmiRNA含有量の差を計算した。すべての実験を3回繰り返した。結果は図7に示す。
【０１２５】
結果から、正常者精子群に対し、miR-370、miR-544a、miR-27a、miR-27b、miR-128、miR-20a、miR-20b、miR-106b、miR-106a、miR-17、miR-200b、miR-200cは精子減少無力症群では発現が低下し、miR-93、miR-429は精子無力症群では発現が低下し、miR-519dは高齢者、精子無力症、精子減少無力症患者においていずれも顕著な低下があったことが示された。この15個のmiRNAの定量検出によって、精子無力症、男性不妊などに対する補助診断の実現が期待される。
【０１２６】
実施例１１  GPX5遺伝子調節関連miRNAの精子における定量検出
GPX5転写調節関連miRNAの予測およびその精子における定量検出方法は実施例11と同様である。計9個のGPX5転写調節関連miRNAが予測され、その正常青年、高齢者（70±2歳）、精子無力症患者、精子減少無力症患者の精子における定量検出結果は図8に示す。
【０１２７】
結果から、正常者精子群に対し、この9個のmiRNAの高齢者および精子減少無力症患者における発現が少なくとも2.5倍増加したことが示された。そのうち、miR-419-5p、miR-299-3p、miR-296-3p、miR-194、miR-134、miR-383、miR-206は精子減少無力症群では発現が少なくとも66倍増加し、精子無力症群では発現が少なくとも2.4倍増加した。
【０１２８】
検討
現在、臨床ではすでにいくつかの精漿タンパクが補助的に不妊症の診断および治療に用いられ、複数のマーカーを合わせて検出すると、スクリーニングができ、診断の陽性率が向上する。通常の免疫学的な検出方法は、放射免疫測定(RIA)、酵素結合免疫測定(ELISA)、化学発光免疫測定(CLIA)などを含み、それぞれ利点があるが、これらの技術は共通の制限があり、即ち、毎回1種の不妊症タンパクマーカーしか検出できない。これは臨床上の同時に複数の不妊症マーカーの検出の要求に応えられず、遺伝子チップおよびタンパク質チップは同一の標本における複数の異なる目的の遺伝子またはタンパク質を同時に分析することができ、また同時に複数の標本を検出することもできるため、効率が大幅に向上し、感度と精度が高く、信号雑音比が良く、微量の標本で済み、操作が簡単で、再現性が優れる。
【０１２９】
本発明は、初めて、年齢に関連する15種類のヒト精子局在タンパク質を選別し、これらのタンパク質およびその分子生物学的材料、たとえば遺伝子、抗体、mRNA、およびこれらの遺伝子の転写を調節するmiRNAなどの分子生物学的材料、干渉RNA、タンパク質または遺伝子の任意の断片、ワクチンなどを含み、そして15種類の男性生殖関連遺伝子のうちの1種類または1種類以上の遺伝子の転写レベル、発現レベル、遺伝子の突然変異、アミノ酸の変化、増加・欠失、調節関連miRNAレベル、抗体などを検出する方法を確立し、1種類または1種類以上の表1におけるタンパク質およびAK6を含む薬物組成物を製造した。また、本発明者は、正常青年の睾丸および副睾丸の成熟微環境のプロテオミクスに基づき、人類の異なる年齢群の睾丸、副睾丸の2D-DIGEの差異プロテオミクスおよび精子におけるタンパク質の免疫蛍光の局在位置と定量などの分析研究を行い、計15種類のタンパク質の高齢者の精子における局在位置と定量は青年と顕著な差があったことを見出した（そのうち、14種類は顕著な減少で、1種類は顕著な増加である）。また、加齢につれ、このような差が顕著になる。これは、高齢者の精子の機能低下または機能喪失はこれらの精子局在タンパク質と関連し、特に14種類の発現下方調節タンパク質の減少と関連することあるいは前記14種類の発現下方調節タンパク質の減少がある程度で生殖機能の低下または喪失につながることを示唆する。本発明は、男性不妊症に対する診断、治療、予防に関する医療技術の開発および診断薬、治療薬、予防薬または避妊薬の開発の推進に有用である。また、本発明は、抗老化製品および医療美容技術の開発の推進にも有用である。
【０１３０】
各文献がそれぞれ単独に引用されるように、本発明に係るすべての文献は本出願で参考として引用する。また、本発明の上記の内容を読み終わった後、この分野の技術者が本発明を各種の変動や修正をすることができるが、それらの等価の様態のものは本発明の請求の範囲に含まれることが理解されるはずである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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