(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（Ｉ）〜（ＩＩＩ）のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、雄ずい及び雌ずいで特異的に転写調節可能な転写調節領域。
（Ｉ）配列番号２９で表される塩基配列
（ＩＩ）配列番号２９で表される塩基配列のうちの１若しくは数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列からなり、且つ雄ずい及び雌ずいにおいて特異的に転写調節可能な活性を有する塩基配列
（ＩＩＩ）配列番号２９で表される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有し、且つ雄ずい及び雌ずいにおいて特異的に転写調節可能な活性を有する塩基配列
【請求項２】
請求項１に記載の転写調節領域を含むベクター。
【請求項３】
請求項１に記載の転写調節領域を細胞又は植物個体に導入し、該転写調節領域を用いて核酸を転写させる工程を含む核酸の転写調節方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、転写調節領域、ベクター及び転写調節方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物の形態や栽培を制御するため、花で特異的に発現するプロモーターを使用する場合がある。
一方、花粉を生産する花器官である雄ずいや、花粉を受粉する花器官である雌ずいの形成を制御することにより不稔化する方法が試みられている。
キクは、鑑賞用や食用として、世界中で広く栽培される有用な植物である。キクの花器官の形成制御に関して、非特許文献１には、キククラスＣ遺伝子の１つを単離し、これをターゲットにアンチセンス植物を作出したことが報告されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Aida, et al., “Chrysanthemum flower shape modification by suppression of chrysanthemum-AGAMOUS gene” Plant biotechnology, 2008, 25 (1): 55-59
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
非特許文献１で作出されたアンチセンス植物における、花の形態異常は極めて軽微であり、花の形態異常が見られた個体の割合も、１０３個体中１個体と非常に低い。このように非特許文献１に記載の植物体の不稔化は、実用上は必ずしも十分ではない。また、特許文献１では、恒常的プロモーターを使用してアンチセンスの核酸を発現させている。
【０００５】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、花で核酸の転写を調節可能な転写調節領域の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、キククラスC遺伝子のタンパク質を単離して、花での特異的な発現を調節可能な転写調節領域を取得し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は以下の通りである。
【０００７】
[１]下記（Ｉ）〜（ＩＩＩ）のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、雄ずい及び雌ずいで特異的に転写調節可能な転写調節領域。
（Ｉ）配列番号２９で表される塩基配列
（ＩＩ）配列番号２９で表される塩基配列のうちの１若しくは数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列からなり、且つ雄ずい及び雌ずいにおいて特異的に転写調節可能な活性を有する塩基配列
（ＩＩＩ）配列番号２９で表される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有し、且つ雄ずい及び雌ずいにおいて特異的に転写調節可能な活性を有する塩基配列
[２]前記[１]に記載の転写調節領域を含むベクター。
[３]前記[１]に記載の転写調節領域を細胞又は植物個体に導入し、該転写調節領域を用いて核酸を転写させる工程を含む核酸の転写調節方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、花での特異的な発現を調節可能な転写調節活性を有するポリヌクレオチドを提供できる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】実施例において、CAG遺伝子のアミノ酸配列、及びその他の植物種のクラスC遺伝子のアミノ酸配列を用いて作成された系統樹である。
【図２】実施例における、CAG遺伝子の発現解析結果を示す写真である。
【図３】実施例における、CAG type2 long遺伝子のプロモーター活性を示す写真である。
【図４】実施例において、作製された融合遺伝子の発現カセットを模式的に示した図である。
【図５】実施例において、作製された不稔性形質転換体とコントロール植物との花の形態を比較した写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
≪転写調節領域≫
本発明の転写調節領域は、ＣＡＧ  Ｔｙｐｅ２  ｌｏｎｇ遺伝子の転写調節領域であり、花での特異的な発現を調節可能である。
【００１１】
発明者らは、後述の実施例に示すように、栽培ギクであるイエギク（Chrysanthemum morifolium）の“セイマリン”から、ＡＧＡＭＯＵＳの塩基配列に基づいてプライマーを設計し、計１４の遺伝子をクローニングした。これらのうち、ＣＡＧ  Ｔｙｐｅ２  ｌｏｎｇ遺伝子の転写調節領域と本発明に係る融合遺伝子を連結し、本発明に係る融合遺伝子を発現させた植物体では、雄ずい及び雌ずいが花弁化され、完全不稔化された植物体が得られることを見出した。実施例において使用したＣＡＧ  Ｔｙｐｅ２  ｌｏｎｇ遺伝子の転写調節領域の塩基配列を配列番号２９に表す。
【００１２】
本発明のＣＡＧ  Ｔｙｐｅ２  ｌｏｎｇ遺伝子の転写調節領域は、下記（Ｉ）〜（ＩＩＩ）のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
（Ｉ）配列番号２９で表される塩基配列、
（ＩＩ）配列番号２９で表される塩基配列のうちの１〜数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列からなり、且つ雄ずい及び雌ずいにおいて特異的に転写調節可能な活性を有する塩基配列、
（ＩＩＩ）配列番号２９で表される塩基配列と８０％以上の配列同一性を有し、且つ雄ずい及び雌ずいにおいて特異的に転写調節可能な活性を有する塩基配列。
【００１３】
「転写調節領域」としては、転写開始や転写効率を制御可能な配列であり、プロモーター、エンハンサー、応答配列が挙げられる。
「雄ずい及び雌ずいにおいて特異的に転写調節可能」とは、雄ずい及び雌ずいを構成する細胞において遺伝子の発現を調節可能であることを意味する。より詳しくは、遺伝子が雄ずい及び／又は雌ずいの形成に作用可能なように転写調節可能な転写調節領域であってもよい。
【００１４】
配列番号２９で表される塩基配列は、配列番号６のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子（ＣＡＧ  Ｔｙｐｅ２  ｌｏｎｇ遺伝子）の第２イントロン部分に相当する塩基配列である。当該配列は、クラスC遺伝子のMADS-boxドメインの下流に位置する第２イントロンに相当する領域であるが、プロモーター活性を有する転写調節可能な配列である。仮に、当該配列単独でプロモーター活性を有さない場合には、当該配列は、広く転写調節領域として扱われてもよい。当該配列単独でプロモーター活性を有さない場合には、例えば、カリフラワーモザイクウイルスの−６０ｂｐ  ｃｏｒｅ領域をＴＡＴＡ−ｂｏｘのコア領域等のコアプロモーター領域を併用し、本発明に係る転写調節領域として利用してもよい。
【００１５】
一般的に、何らかの生理機能を有するポリヌクレオチドは、本来の機能を損なうことなく、１〜数個の塩基を欠失、置換若しくは付加可能なことが知られている。
前記（ＩＩ）の塩基配列において、配列番号２９に記載の塩基配列に対して欠失、置換若しくは付加されていてもよいヌクレオチドの数は、１〜３０個が好ましく、１〜２０個がより好ましく、１〜１０個がさらに好ましく、１〜５個がさらに好ましい。
【００１６】
前記（ＩＩＩ）の塩基配列において、配列番号２９に記載の塩基配列と同一性は、８０％以上１００％未満であり、８５％以上１００％未満が好ましく、９０％以上１００％未満がより好ましく、９５％以上１００％未満がさらに好ましく、９８％以上１００％未満がさらに好ましい。
【００１７】
塩基配列同士の同一性は、公知の各種相同性検索プログラムを用いて求めることができる。本発明における塩基配列同士の同一性は、公知の相同性検索ソフトウェアＢＬＡＳＴＮにより得られた値を採用できる。本発明における塩基配列同士の同一性は、後述する実施例に示すように市販の遺伝情報処理ソフトウェアＧＥＮＥＴＹＸにより得られた値を採用できる。
【００１８】
本発明の転写調節領域であるポリヌクレオチドにおいて、（Ｉ）配列番号２９で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドは、当該塩基配列のみからなるポリヌクレオチドであってもよく、本発明の転写調節領域であるポリヌクレオチドが雄ずい及び雌ずいにおいて転写調節可能な活性を有する範囲において、当該塩基配列からなるヌクレオチドに任意の配列が付加されていてもよい。
前記任意の配列とは、例えば、リンカー配列、タグ配列、タンパク質安定化のための修飾配列等が挙げられる。
【００１９】
本発明の転写調節領域であるポリヌクレオチドは、公知の手法により製造可能である。例えば、自然界から取得したゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号２９の塩基配列に基づいて設計したプライマーにより、ＣＡＧ  Ｔｙｐｅ２  ｌｏｎｇ遺伝子の転写調節領域であるＤＮＡをＰＣＲにより増幅し、得ることができる。
【００２０】
本発明の転写調節領域は、花、特に雄ずい及び雌ずいで特異的に核酸を転写調節可能であるので、本発明の転写調節領域によれば、所望の遺伝子やその産物の発現を制御可能である。
【００２１】
本発明において、本発明の転写調節領域の制御化で転写されるポリヌクレオチドは特に限定されないが、以下に説明するＣＡＧ遺伝子をコードするポリヌクレオチドを含むものが挙げられ、以下に説明する本発明に係る融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドが挙げられる。
【００２２】
本発明のＣＡＧ  Ｔｙｐｅ２  ｌｏｎｇ遺伝子の転写調節領域の下流に、以下に説明する本発明に係る融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド（融合遺伝子）が結合され、これが転写されることが好ましい。
【００２３】
≪融合タンパク質≫
本発明に係る融合タンパク質は、下記ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１タンパク質と、下記転写抑制転換ペプチドとの融合タンパク質であってもよく、下記ＣＡＧ  ｔｙｐｅ２タンパク質と、下記転写抑制転換ペプチドとの融合タンパク質であってもよい。
【００２４】
＜ＣＡＧ遺伝子＞
被子植物の花の発生を説明するモデルとして、ＡＢＣモデルが知られている。ＡＢＣモデルでは、クラスＡ遺伝子、クラスＢ遺伝子、クラスＣ遺伝子の発現パターンの組合せによって、花器官の発生が制御される。クラスＡ遺伝子単独の発現領域では、萼が形成され、クラスＡ遺伝子とクラスＢ遺伝子の発現領域では、花弁が形成される。クラスＢ遺伝子とクラスＣ遺伝子の発現領域では雄ずいが形成され、クラスＣ遺伝子単独の発現領域では雌ずいが形成される。クラスＣ遺伝子としてはシロイヌナズナの  ＡＧＡＭＯＵＳ  （ＡＧ）が知られている。
しかし、上記モデルはシロイヌナズナやキンギョソウ等の一部の植物種を対象とした研究で明らかにされたものであり、他のあらゆる植物種においても上記モデルが同様に適用できるか、また、どの遺伝子が各クラスの遺伝子として機能しているかは不明である。
【００２５】
キクにおいても、これまでにクラスＣ遺伝子の一つと考えられる遺伝子が単離され、これをターゲットにアンチセンス植物を作出したことが報告されている。しかし、観察された花の形態異常は、極めて軽微なものであった。
【００２６】
発明者らは、後述の実施例に示すように、栽培ギクであるイエギク（Chrysanthemum morifolium）の“セイマリン”から、ＡＧＡＭＯＵＳの塩基配列に基づいてプライマーを設計し、計１４の遺伝子をクローニングした。これらの遺伝子は、コードされるアミノ酸配列の相同性に基づき、大きく２タイプに分類可能であり、更に４種類に分類可能であることを明らかにした。上記の２タイプは、CAG Type1とCAG Type２とし、上記の４種類とはCAG Type1 short, CAG Type1 long, CAG Type2 short, CAG Type2 longと名付けた。単離した１４遺伝子の上記分類と、各遺伝子にコードされるアミノ酸配列の配列番号を表１に示す。
【００２７】
【表１】
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【００２８】
後述の実施例に示すように、発明者らは、配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチドを有するＣＡＧ  ｔｙｐｅ１タンパク質と、転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有するペプチドと、が融合してなる融合タンパク質、及び、配列番号５のアミノ酸配列からなるポリペプチドを有するＣＡＧ  ｔｙｐｅ２タンパク質と、転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有するペプチドと、が融合してなる融合タンパク質を発現させた植物体では、雄ずい及び雌ずいが花弁化され、完全不稔化された植物体が得られることを見出した。
【００２９】
本発明に係るＣＡＧ  ｔｙｐｅ１タンパク質は、以下の（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかのタンパク質である。
（Ａ）配列番号１、２、３、８、１１、１２、又は１３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｂ）配列番号１、２、３、８、１１、１２、又は１３に記載のアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ転写制御機能を有するタンパク質
（Ｃ）配列番号１、２、３、８、１１、１２、又は１３に記載のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、且つ転写制御機能を有するタンパク質
【００３０】
本発明に係るＣＡＧ  ｔｙｐｅ１タンパク質は前記ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１  ｓｈｏｒｔであることが好ましい。よって、本発明に係るＣＡＧ  ｔｙｐｅ１タンパク質は、以下の（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかのタンパク質であることが好ましい。
（Ａ）配列番号１、２、３、１１、又は１３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｂ）配列番号１、２、３、１１、又は１３に記載のアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ転写制御機能を有するタンパク質
（Ｃ）配列番号１、２、３、１１、又は１３に記載のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、且つ転写制御機能を有するタンパク質
【００３１】
一般的に、何らかの生理機能を有するタンパク質は、本来の機能を損なうことなく、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加可能なことが知られている。
前記（Ｂ）のタンパク質において、配列番号１、２、３、８、１１、１２、又は１３に記載のアミノ酸配列に対して欠失、置換若しくは付加されていてもよいアミノ酸の数は、１〜３０個が好ましく、１〜２０個がより好ましく、１〜１０個がさらに好ましく、１〜５個がさらに好ましい。
【００３２】
前記（Ｃ）のタンパク質において、配列番号１、２、３、８、１１、１２、又は１３に記載のアミノ酸配列と同一性は、９０％以上１００％未満であり、９５％以上１００％未満であることが好ましく、９８％以上１００％未満であることがより好ましい。
アミノ酸配列同士の同一性は、公知の各種相同性検索プログラムを用いて求めることができる。本発明におけるアミノ酸配列同士の同一性は、公知の相同性検索ソフトウェアBLASTPにより得られた値を採用できる。本発明におけるアミノ酸配列同士の同一性は、後述する実施例に示すように市販の遺伝情報処理ソフトウェアＧＥＮＥＴＹＸにより得られた値を採用できる。
【００３３】
また、本発明に係るＣＡＧ  ｔｙｐｅ２タンパク質は、以下の（Ｄ）〜（Ｆ）のいずれかのタンパク質である。
（Ｄ）配列番号４、５、６、７、９、１０、又は１４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｅ）配列番号４、５、６、７、９、１０、又は１４に記載のアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ転写制御機能を有するタンパク質
（Ｆ）配列番号４、５、６、７、９、１０、又は１４に記載のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、且つ転写制御機能を有するタンパク質
【００３４】
本発明に係るＣＡＧ  ｔｙｐｅ２タンパク質は前記ＣＡＧ  ｔｙｐｅ２  ｓｈｏｒｔであることが好ましい。よって、本発明に係るＣＡＧ  ｔｙｐｅ２タンパク質は、以下の（Ｄ）〜（Ｆ）のいずれかのタンパク質であることが好ましい。
（Ｄ）配列番号５、９、又は１４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｅ）配列番号５、９、又は１４に記載のアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ転写制御機能を有するタンパク質
（Ｆ）配列番号５、９、又は１４に記載のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、且つ転写制御機能を有するタンパク質
【００３５】
前記（Ｅ）のタンパク質において、配列番号４、５、６、７、９、１０、又は１４に記載のアミノ酸配列に対して欠失、置換若しくは付加されていてもよいアミノ酸の数は、１〜３０個が好ましく、１〜２０個がより好ましく、１〜１０個がさらに好ましく、１〜５個がさらに好ましい。
【００３６】
前記（Ｆ）のタンパク質において、配列番号４、５、６、７、９、１０、又は１４に記載のアミノ酸配列と同一性は、９０％以上１００％未満であり、９５％以上１００％未満であることが好ましく、９８％以上１００％未満であることがより好ましい。
アミノ酸配列同士の同一性は、公知の各種相同性検索プログラムを用いて求めることができる。本発明におけるアミノ酸配列同士の同一性は、公知の相同性検索ソフトウェアBLASTPにより得られた値を採用できる。本発明におけるアミノ酸配列同士の同一性は、後述する実施例に示すように市販の遺伝情報処理ソフトウェアＧＥＮＥＴＹＸにより得られた値を採用できる。
【００３７】
前記（Ａ）〜（Ｆ）のタンパク質は、転写制御機能を有する。転写制御機能とは、転写因子が有する機能である。タンパク質が転写制御機能を有しているかどうかは、公知の転写因子測定用試薬を用いた手法等により調べることができる。
【００３８】
本発明に係るＣＡＧ  ｔｙｐｅ１タンパク質において、（Ａ）配列番号１、２、３、８、１１、１２、又は１３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質は、当該アミノ酸配列のみからなるタンパク質であってもよく、本発明に係るＣＡＧ  ｔｙｐｅ１タンパク質が転写制御機能を有する範囲において、当該アミノ酸配列からなるタンパク質に任意の配列が付加されていてもよい。
本発明に係るＣＡＧ  ｔｙｐｅ２タンパク質において、（Ｄ）配列番号４、５、６、７、９、１０、又は１４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質は、当該アミノ酸配列のみからなるタンパク質であってもよく、本発明に係るＣＡＧ  ｔｙｐｅ２タンパク質が転写制御機能を有する範囲において、当該アミノ酸配列からなるタンパク質に任意の配列が付加されていてもよい。
前記任意の配列とは、例えば、リンカー配列、タグ配列、タンパク質安定化のための修飾配列等が挙げられる。
【００３９】
本発明及び本明細書において、不稔化とは、植物個体が有する花器官のうち一部若しくは全部の雄ずい及び／又は雌ずいの稔性が失われることである。雌性不稔化とは、植物個体が有する花器官のうち一部若しくは全部の雌ずいの稔性が失われることである。雄性不稔化とは、植物個体が有する花器官のうち一部若しくは全部の雄ずいの稔性が失われることである。完全不稔化とは、植物個体が有する花器官の全ての雄ずい及び雌ずいの稔性が失われることである。
雄ずいの不稔化としては、雄ずいが正常に形成されず花粉が生産されないことによるもの、雄ずいが他の器官に置き換わり花粉が生産されないことによるもの、花粉は生産されたが稔性を有さないことによるもの等が挙げられる。同様に、雌ずいの不稔化としては、雌ずいが正常に形成されないことによるもの、雌ずいが他の器官に置き換わることによるもの、雌ずいは形成されるが稔性を有さないことによるもの等が挙げられる。
雄ずい側の不稔は、雄ずいが花弁等の他の器官に置き換わる等を形態観察により調べてもよく、正常個体の雌ずいとの掛け合わせにより種子が形成されるかどうかによっても容易に調べることができる。雌ずい側の不稔は、雌ずいが花弁等の他の器官に置き換わる等を形態観察により調べてもよく、正常個体の雄ずいとの掛け合わせにより種子が形成されるかどうかによっても容易に調べることができる。
【００４０】
＜転写抑制転換ペプチド＞
近年、転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有するペプチド（「転写抑制転換ペプチド」ということがある。）が開発され、利用されている。転写抑制転換ペプチドの例としては、ＳＲＤＸと呼ばれる転写抑制ドメインが挙げられる。例えば、ＳＲＤＸを任意の転写因子のＣ末端に付加することにより、転写因子を転写抑制因子に変換可能である（Hiratusu et al. (2003)Plant J. 34(5):733-739）。ＳＲＤＸのアミノ酸配列は、Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ａｌａで表されるアミノ酸配列［ＬＤＬＤＬＥＬＲＬＧＦＡ（配列番号６８）］である。
【００４１】
転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有するペプチドとは、当該ペプチドが転写因子に付加されてなる融合タンパク質と、これを付加されていない、もともとの該転写因子とを比較して、融合タンパク質の転写活性化能を有意に低下させる機能を有するペプチドを意味する。転写活性化能を低下させるとは、転写活性化能を消失させることも包含される。当該ペプチドにより転写活性化能が低下した転写因子は、本来の転写活性化の対象の遺伝子に対する、他の転写因子による転写活性化も抑制し得ることにより、対象の遺伝子の転写が効率的に抑制され得る。また、機能重複した複数の転写因子の同時抑制も可能であり得る。
【００４２】
ペプチドが、転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有しているかどうかは、例えば、解析対象の遺伝子の転写を活性化する転写因子とその発現系を準備し、当該転写因子と、当該転写因子にペプチドを付加したときとで、解析対象の遺伝子の発現を比較すること等により調べることができる。解析対象の遺伝子は、転写因子が本来転写を促進する対象の遺伝子を用いてもよく、人為的に製造されたレポーター遺伝子等を用いてもよい。
【００４３】
転写抑制転換ペプチドの配列は公知であり、これら公知の転写抑制転換ペプチドを使用できる。転写抑制転換ペプチドとして知られている配列は、前記ＳＲＤＸの他にも、ＤＬＴＬＲＬ、ＤＬＳＬＲＬ、ＤＬＳＬＳＬの配列などが知られており、これらのなかではＳＲＤＸが好ましい。
【００４４】
本発明に係る融合タンパク質は、公知の手法により製造可能である。例えば、ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１タンパク質をコードするＤＮＡと転写抑制転換ペプチドをコードするＤＮＡとが連結された配列を、発現ベクターに組み込み、これを発現させることで、融合タンパク質を合成してもよい。または、ポリペプチド合成装置によりＣＡＧ  ｔｙｐｅ１タンパク質と転写抑制転換ペプチドが連結された融合タンパク質を合成してもよい。
【００４５】
＜融合遺伝子＞
本発明に係る融合遺伝子は、本発明に係る融合タンパク質をコードするものである。
【００４６】
具体的には、本発明に係る融合遺伝子は、
ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１タンパク質と、転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有するペプチドと、が融合してなる融合タンパク質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド、
ＣＡＧ  ｔｙｐｅ２タンパク質と、転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有するペプチドと、が融合してなる融合タンパク質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
【００４７】
本発明に係るＣＡＧ  ｔｙｐｅ１タンパク質と、転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有するペプチドと、が融合してなる融合タンパク質をコードする融合遺伝子は、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリヌクレオチドである。
（ａ）配列番号１、２、３、８、１１、１２、又は１３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と、転写抑制転換ペプチドと、が融合してなるタンパク質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号１、２、３、８、１１、１２、又は１３に記載のアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり転写制御機能を有するタンパク質と、転写抑制転換ペプチドと、が融合してなるタンパク質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｃ）配列番号１、２、３、８、１１、１２、又は１３に記載のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり転写制御機能を有するタンパク質と、転写抑制転換ペプチドと、が融合してなるタンパク質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド
【００４８】
また、本発明に係るＣＡＧ  ｔｙｐｅ２タンパク質と、転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有するペプチドと、が融合してなる融合タンパク質をコードする融合遺伝子は、以下の（ｄ）〜（ｆ）のいずれかのポリヌクレオチドである。
（ｄ）配列番号４、５、６、７、９、１０、又は１４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と、転写抑制転換ペプチドと、が融合してなるタンパク質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｅ）配列番号４、５、６、７、９、１０、又は１４に記載のアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり転写制御機能を有するタンパク質と、転写抑制転換ペプチドと、が融合してなるタンパク質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｆ）配列番号４、５、６、７、９、１０、又は１４に記載のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり転写制御機能を有するタンパク質と、転写抑制転換ペプチドと、が融合してなるタンパク質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド
【００４９】
前記（ａ）における配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列としては、配列番号１５で表される塩基配列であってもよい。
前記（ａ）における配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列としては、配列番号１６で表される塩基配列であってもよい。
前記（ａ）における配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列としては、配列番号１７で表される塩基配列であってもよい。
前記（ａ）における配列番号８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列としては、配列番号２２で表される塩基配列であってもよい。
前記（ａ）における配列番号１１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列としては、配列番号２５で表される塩基配列であってもよい。
前記（ａ）における配列番号１２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列としては、配列番号２６で表される塩基配列であってもよい。
前記（ａ）における配列番号１３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列としては、配列番号２７で表される塩基配列であってもよい。
【００５０】
前記（ｄ）における配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列としては、配列番号１８で表される塩基配列であってもよい。
前記（ｄ）における配列番号５に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列としては、配列番号１９で表される塩基配列であってもよい。
前記（ｄ）における配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列としては、配列番号２０で表される塩基配列であってもよい。
前記（ｄ）における配列番号７に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列としては、配列番号２１で表される塩基配列であってもよい。
前記（ｄ）における配列番号９に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列としては、配列番号２３で表される塩基配列であってもよい。
前記（ｄ）における配列番号１０に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列としては、配列番号２４で表される塩基配列であってもよい。
前記（ｄ）における配列番号１４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列としては、配列番号２８で表される塩基配列であってもよい。
【００５１】
本発明に係るポリヌクレオチドは、公知の手法により製造可能である。例えば、ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１タンパク質をコードするＤＮＡと転写抑制転換ペプチドをコードするＤＮＡとを、周知の遺伝子組み換え技術を用いて連結することで得られる。ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１タンパク質をコードするＤＮＡは、例えば、自然界から取得したゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号１５〜２８の塩基配列に基づいて設計したプライマーにより、ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１タンパク質をコードするＤＮＡをＰＣＲ等により増幅し、得ることができる。転写抑制転換ペプチドは、例えばオリゴＤＮＡ合成装置により合成可能である。
【００５２】
本発明に係るＣＡＧ  ｔｙｐｅ１タンパク質と、転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有するペプチドと、が融合してなる融合タンパク質をコードする融合遺伝子は、該融合タンパク質をコードする塩基配列のみからなるポリヌクレオチドであってもよく、本発明に係るＣＡＧ  ｔｙｐｅ１タンパク質の融合タンパク質が転写抑制作用を有する範囲において、当該塩基配列のみからなるポリヌクレオチドに任意の配列が付加されていてもよい。
本発明に係るＣＡＧ  ｔｙｐｅ２タンパク質と、転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有するペプチドと、が融合してなる融合タンパク質をコードする融合遺伝子は、該融合タンパク質をコードする塩基配列のみからなるポリヌクレオチドであってもよく、本発明に係るＣＡＧ  ｔｙｐｅ２タンパク質の融合タンパク質が転写抑制作用を有する範囲において、当該塩基配列のみからなるポリヌクレオチドに任意の配列が付加されていてもよい。
前記任意の配列とは、例えば、リンカー配列、タグ配列、タンパク質安定化のための修飾配列等が挙げられる。
【００５３】
本発明に係る融合遺伝子は、本発明の転写調節領域が前記融合タンパク質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドに作動可能に連結されることが好ましい。
「作動可能に連結されている」とは、前記転写調節領域が前記融合遺伝子の発現を調節可能であることを意味する。
【００５４】
＜転写調節領域と遺伝子との組み合わせ＞
本発明に係る遺伝子において、本発明の転写調節領域と、融合タンパク質におけるＣＡＧタンパク質と、の組み合わせは制限されるものではないが、以下の組み合わせが挙げられる。
ＣＡＧ  Ｔｙｐｅ２  ｌｏｎｇ遺伝子の転写調節領域と、ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１  ｓｈｏｒｔタンパク質との組み合わせ、
ＣＡＧ  Ｔｙｐｅ２  ｌｏｎｇ遺伝子の転写調節領域と、ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１  ｌｏｎｇタンパク質との組み合わせ、
ＣＡＧ  Ｔｙｐｅ２  ｌｏｎｇ遺伝子の転写調節領域と、ＣＡＧ  ｔｙｐｅ２  ｓｈｏｒｔタンパク質との組み合わせ、
ＣＡＧ  Ｔｙｐｅ２  ｌｏｎｇ遺伝子の転写調節領域と、ＣＡＧ  ｔｙｐｅ２  ｌｏｎｇタンパク質との組み合わせ。
【００５５】
上記の組み合わせのなかでは、ＣＡＧ  Ｔｙｐｅ２  ｌｏｎｇ遺伝子の転写調節領域と、ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１  ｓｈｏｒｔタンパク質の組み合わせ、又はＣＡＧ  Ｔｙｐｅ２  ｌｏｎｇ遺伝子の転写調節領域と、ＣＡＧ  ｔｙｐｅ２  ｓｈｏｒｔタンパク質の組み合わせが好ましい。
ＣＡＧ  Ｔｙｐｅ２  ｌｏｎｇ遺伝子の転写調節領域、ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１  ｓｈｏｒｔタンパク質、ＣＡＧ  ｔｙｐｅ２  ｓｈｏｒｔタンパク質としては、それぞれ、本明細書中で上記に説明したものが挙げられる。
【００５６】
≪ベクター≫
本発明のベクターは、本発明の転写調節領域を含むベクターであり、宿主植物において、花、特に雄ずい及び雌ずいで特異的に核酸を発現可能な発現ベクターとなり得る。
前記発現ベクターとしては、ＣＡＧ  Ｔｙｐｅ２  ｌｏｎｇ遺伝子の転写調節領域、必要があればプロモーター配列を有するＤＮＡ、本発明に係る融合タンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡ、ターミネーター配列を有するＤＮＡを含むベクターが挙げられ、これらが上流から順に連結されてなるＤＮＡを含むベクターが好ましい。本発明のベクターは、本発明に係る遺伝子の他に、薬剤耐性配列等の配列を有していてもよい。
【００５７】
本発明のベクターは、ＣＡＧ  Ｔｙｐｅ２  ｌｏｎｇ遺伝子の転写調節領域により転写される遺伝子として、ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１タンパク質と、転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有するペプチドと、が融合してなる融合タンパク質をコードする遺伝子、及びＣＡＧ  ｔｙｐｅ２タンパク質と、転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有するペプチドと、が融合してなる融合タンパク質をコードする遺伝子を含むことが好ましい。ここで、ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１タンパク質としては、ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１  ｓｈｏｒtタンパク質が好ましく、ＣＡＧ  ｔｙｐｅ２タンパク質としては、ＣＡＧ  ｔｙｐｅ２  ｓｈｏｒtタンパク質が好ましい。
【００５８】
本発明のベクターは、周知の遺伝子組み換え技術を用いて、ＣＡＧ  Ｔｙｐｅ２  ｌｏｎｇ遺伝子の転写調節領域をベクターに組み込むことで製造可能である。本発明に係る遺伝子を組み込む際には、市販の発現用ベクター作製キットを用いてもよい。
【００５９】
＜形質転換体＞
本発明に係る形質転換体は、本発明に係る融合タンパク質を発現するものであり、ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１タンパク質と、転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有するペプチドと、が融合してなる融合タンパク質、及び／又はＣＡＧ  ｔｙｐｅ２タンパク質と、転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有するペプチドと、が融合してなる融合タンパク質を発現するものである。
本発明に係る形質転換体は、ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１タンパク質と、転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有するペプチドと、が融合してなる融合タンパク質、及びＣＡＧ  ｔｙｐｅ２タンパク質と、転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有するペプチドと、が融合してなる融合タンパク質を発現するものが好ましい。
【００６０】
本発明に係る形質転換体は、本発明に係る融合タンパク質が、ＣＡＧ  Ｔｙｐｅ２  ｌｏｎｇ遺伝子の転写調節領域の制御下で発現するものであることが好ましい。ＣＡＧ  Ｔｙｐｅ２  ｌｏｎｇ遺伝子の転写調節領域としては、本発明の転写調節領域として説明した上記のものが挙げられる。
本発明に係る形質転換体は、ＣＡＧ  Ｔｙｐｅ２  ｌｏｎｇ遺伝子の転写調節領域の制御下で、ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１タンパク質と、転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有するペプチドと、が融合してなる融合タンパク質、及び／又はＣＡＧ  ｔｙｐｅ２タンパク質と、転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有するペプチドと、が融合してなる融合タンパク質を発現するものであることが好ましい。
本発明に係る形質転換体は、ＣＡＧ  Ｔｙｐｅ２  ｌｏｎｇ遺伝子の転写調節領域の制御下で、ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１タンパク質と、転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有するペプチドと、が融合してなる融合タンパク質、及びＣＡＧ  ｔｙｐｅ２タンパク質と、転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有するペプチドと、が融合してなる融合タンパク質を発現するものがより好ましい。
本発明に係る融合タンパク質を、花において転写調節可能な転写調節領域の制御下で発現させる方法としては、前記融合タンパク質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドを、上記の花において転写調節可能な転写調節領域に作動可能に連結させることが挙げられる。
【００６１】
本発明に係る形質転換体は、公知の遺伝子組み換え技術を用いて作出可能であり、本発明に係る融合タンパク質を発現可能なベクターが導入されたものであってもよい。
より詳しくは、ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１タンパク質と、転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有するペプチドと、が融合してなる融合タンパク質をコードする遺伝子を含むベクター、及びＣＡＧ  ｔｙｐｅ２タンパク質と、転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有するペプチドと、が融合してなる融合タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターが導入されたものであってもよい。
或いは、ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１タンパク質と、転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有するペプチドと、が融合してなる融合タンパク質をコードする遺伝子、及びＣＡＧ  ｔｙｐｅ２タンパク質と、転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有するペプチドと、が融合してなる融合タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターが導入されたものであってもよい。
【００６２】
発現ベクターを用いて形質転換体を作出する方法は、特に限定されず、当技術分野で通常行われている方法により行うことが可能である。当該方法としては、例えば、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法、エレクトロポレーション法が挙げられ、アグロバクテリウム法が好ましい。
本発明の形質転換体は、後述する＜作出方法＞及び実施例において示すように、公知の遺伝子組み換え技術を用いて作出可能である。
【００６３】
本明細書において形質転換体とは生物個体のみならず細胞を包含する意味で用いている。細胞は、組織又は器官の状態であってもよい。形質転換体は、植物体、植物細胞、植物の組織又は植物の器官であることが好ましい。本明細書において形質転換体とは、本発明に係る融合タンパク質を発現する限りにおいて、形質転換体として作製された生物又は細胞は、それらの後代若しくはクローンの生物又は細胞であってもよい。例えば、前記クローンの植物体としては挿し木により得られた植物体が挙げられる。
【００６４】
本発明に係る形質転換体は、被子植物であることが好ましく、キク科（Asteraceae）の植物体であることがより好ましい。キク科の植物としては、キク、ガーベラ、アスター、ヒマワリ等を挙げることが出来る。好ましいキクの種類としては、一般的に栽培ギク（輪菊、中ギク、小ギク、スプレーギク、ポットマム等）、イエギク等と称されるChrysanthemum morifoliumが挙げられる。
【００６５】
＜作出方法＞
後述の実施例に示すように、発明者らは、本発明に係る融合タンパク質を発現させた植物体では、雄ずい及び雌ずいが花弁化され、完全不稔化された植物体が得られることを見出した。
本発明に係る不稔性植物体の作出方法は、植物内において、本発明に係る融合タンパク質を発現させる工程を有するものであり、植物内において、ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１タンパク質と、転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有するペプチドと、が融合してなる融合タンパク質、及び／又はＣＡＧ  ｔｙｐｅ２タンパク質と、転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有するペプチドと、が融合してなる融合タンパク質を発現させる工程を有するものである。
本発明に係る形質転換体は、植物内において、ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１タンパク質と、転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有するペプチドと、が融合してなる融合タンパク質、及びＣＡＧ  ｔｙｐｅ２タンパク質と、転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有するペプチドと、が融合してなる融合タンパク質を発現させる工程を有するものが好ましい。
【００６６】
本発明に係る形質転換体の作出方法は、本発明に係る融合タンパク質を、ＣＡＧ  Ｔｙｐｅ２  ｌｏｎｇ遺伝子の転写調節領域の制御下で発現させる工程を有するものであることが好ましい。ＣＡＧ  Ｔｙｐｅ２  ｌｏｎｇ遺伝子の転写調節領域としては、本発明の転写調節領域として説明した上記のものが挙げられる。
本発明に係る形質転換体の作出方法は、ＣＡＧ  Ｔｙｐｅ２  ｌｏｎｇ遺伝子の転写調節領域の制御下で、ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１タンパク質と、転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有するペプチドと、が融合してなる融合タンパク質、及び／又はＣＡＧ  ｔｙｐｅ２タンパク質と、転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有するペプチドと、が融合してなる融合タンパク質を発現させる工程を有するものであることが好ましい。
本発明に係る形質転換体の作出方法は、ＣＡＧ  Ｔｙｐｅ２  ｌｏｎｇ遺伝子の転写調節領域の制御下で、ＣＡＧ  ｔｙｐｅ１タンパク質と、転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有するペプチドと、が融合してなる融合タンパク質、及びＣＡＧ  ｔｙｐｅ２タンパク質と、転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有するペプチドと、が融合してなる融合タンパク質を発現させる工程を有するものであることがより好ましい。
【００６７】
発現ベクターを用いて形質転換体を作出する方法は、特に限定されず、当技術分野で通常行われている方法により行うことが可能である。当該方法としては、例えば、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法、エレクトロポレーション法が挙げられ、アグロバクテリウム法が好ましい。
【００６８】
導入された遺伝子の発現を抑制させる核酸は、ゲノム上に導入されていてもよく、ゲノム上に導入されていなくてもよいが、ゲノム上に導入されることが好ましい。
【００６９】
遺伝子の発現を抑制する核酸を導入する対象の植物としては、植物体、植物細胞、植物培養細胞、カルス等が挙げられる。
【００７０】
本発明に係る形質転換体は、被子植物であることが好ましく、キク科（Asteraceae）の植物体であることがより好ましい。キク科の植物体としては、上述の植物種を例示できる。
【００７１】
≪転写調節方法≫
本発明の転写調節方法は、本発明の転写調節領域を細胞又は植物個体に導入し、該転写調節領域を用いて核酸を転写させる工程を含む。
本発明の転写調節領域を細胞又は植物個体に導入する方法は、特に限定されず、当技術分野で通常行われている方法により行うことが可能である。当該方法としては、例えば、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法、エレクトロポレーション法が挙げられ、アグロバクテリウム法が好ましい。
本発明の転写調節領域を導入する細胞又は植物個体としては、被子植物又は被子植物の細胞であることが好ましい。被子植物としては、キク科（Asteraceae）の植物であることがより好ましい。キク科の植物としては、上述の植物種を例示できる。
該転写調節領域を用いて核酸を転写させる方法は、特に限定されず、当技術分野で通常行われている方法により行うことが可能である。例えば、転写させる遺伝子を上記の細胞又は植物個体において、本発明の転写調節領域に作動可能に連結させることが挙げられる。
【実施例】
【００７２】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００７３】
１-１．遺伝子の単離
まず、イエギク（Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ  ｍｏｒｉｆｏｌｉｕｍ）の“セイマリン”の雄蕊および雌蕊から抽出した総ＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲによりｃDNAを得た。
プライマー：５’‐AAAGGGAGTGATTAAGAGGGTTTGC‐３’（配列番号：３０）とプライマー：５’‐CTTAGGACACACATTGTTCACACGC‐３’（配列番号：３１）を用いて前記ｃＤＮＡから配列を増幅し、配列番号１５で表される塩基配列を含むポリヌクレオチドを得た。以下の各配列番号で表される塩基配列を含むポリヌクレオチドの増幅に使用したプライマーの配列を表２に示す。
【００７４】
【表２】
0006721888.tif 000003
【００７５】
得られた配列番号１５〜２８で表される塩基配列を含む配列からオープンリーディングフレームを推定し、それらをアミノ酸配列に変換し、配列番号１〜１４で表されるアミノ酸配列を得た。
【００７６】
それらのアミノ酸配列に基づき、GENETYX（Ver．８）を使用して、系統樹を作成した。GENETYXでの作製条件は、Neighbor-Joining Method(近隣結合法)で、bootstrap値（10000）、その他デフォルト値である。得られた系統樹を図１に示す。
配列番号１，２，３，１１，１３で表されるアミノ酸配列がひとまとまりの群を形成したため、これらをＣＡＧ  Ｔｙｐｅ  １  ｓｈｏｒｔとした。
配列番号８，１２で表されるアミノ酸配列がひとまとまりの群を形成したため、これらをＣＡＧ  Ｔｙｐｅ  １  ｌｏｎｇとした。
配列番号５，９，１４で表されるアミノ酸配列がひとまとまりの群を形成したため、これらをＣＡＧ  Ｔｙｐｅ  ２  ｓｈｏｒｔとした。
配列番号４，６，７，１０で表されるアミノ酸配列がひとまとまりの群を形成したため、これらをＣＡＧ  Ｔｙｐｅ  ２  ｌｏｎｇとした。
【００７７】
ＣＡＧ  Ｔｙｐｅ１に分類されたアミノ酸配列とＣＡＧ  Ｔｙｐｅ２に分類されたアミノ酸配列との間では、各アミノ酸配列の同一性は８４〜８８％の範囲内であった。
ＣＡＧ  Ｔｙｐｅ１  ｓｈｏｒｔに分類されたアミノ酸配列とＣＡＧ  Ｔｙｐｅ１  ｌｏｎｇに分類されたアミノ酸配列との間では、各アミノ酸配列の同一性は９８〜９９％の範囲内であった。
ＣＡＧ  Ｔｙｐｅ２  ｓｈｏｒｔに分類されたアミノ酸配列とＣＡＧ  Ｔｙｐｅ２  ｌｏｎｇに分類されたアミノ酸配列との間では、各アミノ酸配列の同一性は９８〜９９％の範囲内であった。
【００７８】
１-２．発現解析
単離した１４遺伝子の、特に４種に分類した群に含まれる遺伝子同士の配列は非常に似ているため、４種に分類した群全体の遺伝子の配列をＲＴ−ＰＣＲで解析した。ＲＴ−ＰＣＲに用いたプライマーの配列を表３に示す。
【００７９】
【表３】
0006721888.tif 000004
【００８０】
イエギクの“セイマリン”の葉、がく、花床、舌状花の花弁、舌状花の雌ずい、管状花の花弁、管状花の雌ずい、管状花の雄ずいから抽出した総ＲＮＡに対し、それぞれＲＴ−ＰＣＲを行った。
図２に、ＲＴ−ＰＣＲの結果を示す。ＣＡＧ  Ｔｙｐｅ１  ｓｈｏｒｔ、ＣＡＧ  Ｔｙｐｅ２  ｓｈｏｒｔ、ＣＡＧ  Ｔｙｐｅ１  ｌｏｎｇの遺伝子の発現が、舌状花の雌ずい、管状花の雄ずい、管状花の雌ずいにおいて確認された。ＣＡＧ  Ｔｙｐｅ１  ｌｏｎｇの遺伝子の発現は弱いながらも、舌状花の雌ずい、管状花の雄ずい、管状花の雌ずいにおいて確認された。
【００８１】
２−１．転写調節領域の単離
イエギクの“セイマリン”からＤＮＡを抽出し、プライマー：５’‐ATGGCAAATTCTGATGCTTTT‐３’（配列番号：６６）とプライマー：５’‐TTACACTAACTGGAGAGGAGTTTGG‐３’（配列番号：６７）を用いて前記ｃＤＮＡから配列を増幅し、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）と、エキソン、イントロンの領域を推定し、配列番号６のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子（ＣＡＧ  Ｔｙｐｅ２  ｌｏｎｇ遺伝子）のイントロン部分の塩基配列である、配列番号２９で表される塩基配列を含むポリヌクレオチドを得た。
【００８２】
２−２．転写調節の確認
配列番号２９で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドの下流にＧＵＳレポーター遺伝子を連結したＤＮＡ断片を、ベクター（pBI121）上の35Sプロモーター配列と置換し、バイナリーベクターを作製した。このバイナリーベクターをアグロバクテリウムに導入し、次いでこのアグロバクテリウムを用いて、アグロバクテリウム法によりイエギクの“セイマリン”に導入し形質転換体を作製した。
得られた形質転換体におけるＧＵＳレポーター遺伝子の発現を、常法により解析した。結果を図３に示す。舌状花では、舌状花弁の基部に付随した雌ずいのみがで染色が確認された。筒状花では、筒状花（上図）の花弁を除くと、花弁の内側にある雄ずいと雌ずい全体（下図）が、どちらも染色されているのが確認された。一方、葉や茎では染色が確認されなかった。以上のことから、配列番号２９で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドが、雄蕊および雌蕊において特異的な転写調節活性を有することが明らかとなった。
【００８３】
３−１．キク形質転換体の作出
上記で得た配列番号１５で表される塩基配列からなるＤＮＡ（ＣＡＧ  Ｔｙｐｅ１  ｓｈｏｒｔ遺伝子（配列番号１））とＳＲＤＸ（転写抑制転換ペプチド）とを連結し、融合遺伝子ＣＡＧ１Ｓ（ｎｏ．１）−ＳＲＤＸを作製した。ＣＡＧ１Ｓ（ｎｏ．１）−ＳＲＤＸに、さらに配列番号２９で表される塩基配列からなるＤＮＡ［配列番号６のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子（ＣＡＧ  Ｔｙｐｅ２  ｌｏｎｇ遺伝子）の転写調節領域］を連結した。
上記で得た配列番号１９で表される塩基配列からなるＤＮＡ（ＣＡＧ  Ｔｙｐｅ２  ｓｈｏｒｔ遺伝子（配列番号５））とＳＲＤＸ（転写抑制転換ペプチド）とを連結し、融合遺伝子ＣＡＧ２ｓ（ｎｏ．５）−ＳＲＤＸを作製した。ＣＡＧ２ｓ（ｎｏ．５）−ＳＲＤＸに、さらに配列番号２９で表される塩基配列からなるＤＮＡ［配列番号６のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子（ＣＡＧ  Ｔｙｐｅ２  ｌｏｎｇ遺伝子）の転写調節領域］を連結した。
上記の融合遺伝子ＣＡＧ１Ｓ（ｎｏ．１）−ＳＲＤＸを含むＤＮＡ断片とＣＡＧ２  ｓ（ｎｏ．５）−ＳＲＤＸを含むＤＮＡ断片とを連結した。
図４に上記で作製された、２つの融合遺伝子が連結された発現カセットを模式的に示す。
図４中、３５Ｓｃｏｒｅは、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）  の３５Ｓプロモーターのコアプロモーター配列を示す。ＡＤＨ５’は、ＡＤＨ（Ａｌｃｏｈｏｌ  Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）遺伝子由来の５’非翻訳領域（５’−ＵＴＲ）配列を示す。ＨＳＰｔｒｅｒは、ＨＳＰ（Ｈｅａｔ  Ｓｈｏｃｋ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子由来のｔｅｒｍｉｎａｔｏｒを示す。
【００８４】
この図４に示す発現カセットを、ベクター（P35SSRDXG2）上のHindIII/EcoRIサイトの位置と置換し、LR反応にてpBCKKベクターに導入したバイナリーベクターを、アグロバクテリウムに導入し、次いでこのアグロバクテリウムを用いて、アグロバクテリウム法によりイエギクの“セイマリン”に導入し形質転換体（５２２１−５系統）を作製した。
【００８５】
３−２．キク形質転換体の形質
得られた形質転換体（５２２１−５系統）の花の形態を図５に示す。形質転換体（５２２１−５系統）の花は、コントロールのイエギクの“セイマリン”（野生型）の花と比較して、舌状花と管状花の配置は保たれており、萼と花弁の形成が繰り返される態様を伴わない、キクの花特有の形態を有する美しいものであった。
一方で、形質転換体（５２２１−５系統）では、雌しべが完全に花弁化しており、また雄ずいが完全に花弁化していた。その結果、形質転換体（５２２１−５系統）では完全不稔化されていた。
このように、本発明に係るキクは、キク特有の花の姿が持つ鑑賞性の高さと完全不稔性とを兼ね備えた非常に有用な植物体であった。
【００８６】
形質転換体（５２２１−５系統）を切り戻し、再花させても完全不稔形質は維持されていた。形質転換体（５２２１−５系統）は完全不稔化のため種ができず、挿し木又は培養植物として植物個体を維持した。
【００８７】
以上で説明した各実施形態における各構成及びそれらの組み合わせ等は一例であり、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で、構成の付加、省略、置換、およびその他の変更が可能である。また、本発明は各実施形態によって限定されることはなく、請求項（クレーム）の範囲によってのみ限定される。
【図１】
0006721888.tif 000005
【図２】
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【図３】
0006721888.tif 000007
【図４】
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【図５】
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【配列表】
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