(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質オリゴマー化ドメインＮＤ１、リンカーＬ１、タンパク質オリゴマー化ドメインＮＤ２、ＦＬＡ、及びさらなる置換部分Ｘを含む連続鎖からなる以下の式（Ｉａ）又は（Ｉｂ）
Ｘ−ＮＤ１−Ｌ１−ＮＤ２−ＦＬＡ  （Ｉａ）又は  ＦＬＡ−ＮＤ１−Ｌ１−ＮＤ２−Ｘ  （Ｉｂ）
の複数の構築ブロック（式中、
ＮＤ１は、ｍ個のＮＤ１サブユニットの（ＮＤ１）ｍオリゴマーを形成するタンパク質であり、
ＮＤ２は、ｎ個のＮＤ２サブユニットの（ＮＤ２）ｎオリゴマーを形成するタンパク質であり、
ｍ及びｎは、それぞれ２と１０の間の数であり、ただし、ｍは、ｎと等しくなく、ｎの倍数でなく、ｎは、ｍの倍数でなく、
Ｌ１は、結合、又は短い柔軟なリンカーであり、
ＦＬＡは、フラジェリンであるか、あるいは、
フラジェリンアミノ酸配列の一部を欠くが少なくともＴＬＲ５結合ドメインＤ１を含むフラジェリンの誘導体であって、
フラジェリンのＤ２及びＤ３ドメインから選択される１又は複数のドメインは、２つの末端を連続ペプチド鎖に再結合させることによりフラジェリンアミノ酸配列から除去されており、且つ／又は１〜２０個のアミノ酸が他のアミノ酸により置換されており、且つ／又は直接結合した若しくは１〜２０個のアミノ酸を含むリンカーを介して結合した抗原をさらに含む、
フラジェリンアミノ酸配列の一部を欠くが少なくともＴＬＲ５結合ドメインＤ１を含むフラジェリンの誘導体であり、
Ｘは、存在しないか、又は１〜１０００個のアミノ酸を含むペプチド若しくはタンパク質配列である）の凝集体からなる自己集合タンパク質ナノ粒子であって、
タンパク質オリゴマー化ドメインＮＤ３、リンカーＬ２、タンパク質オリゴマー化ドメインＮＤ４、並びにさらなる置換部分Ｙ及びＺを含む連続鎖からなる以下の式（ＩＩ）
Ｙ−ＮＤ３−Ｌ２−ＮＤ４−Ｚ  （ＩＩ）
の複数の構築ブロック（式中、
ＮＤ３は、ｙ個のＮＤ３サブユニットの（ＮＤ３）ｙオリゴマーを形成するタンパク質であり、
ＮＤ４は、ｚ個のＮＤ４サブユニットの（ＮＤ４）ｚオリゴマーを形成するタンパク質であり、
ｙ及びｚは、それぞれ２と１０の間の数であり、ただし、ｙは、ｚと等しくなく、ｚの倍数でなく、ｚは、ｙの倍数でなく、
ＮＤ３がＮＤ１と同一であるか、又はＮＤ４がＮＤ２と同一であるか、又はＮＤ３及びＮＤ４の両方がそれぞれＮＤ１及びＮＤ２と同一であり、
Ｌ２は、結合であるか、又はＬ１と異なるか、若しくはＬ１と同一であってもよい短い柔軟なリンカーであり、
Ｙ及びＺは、互いに独立に、存在しないか、又は１〜１０００個のアミノ酸を含むペプチド若しくはタンパク質配列である）と共集合していてもよい自己集合タンパク質ナノ粒子。
【請求項２】
以下の式（ＩＩ）
Ｙ−ＮＤ３−Ｌ２−ＮＤ４−Ｚ  （ＩＩ）
の複数の構築ブロックと共集合した、
以下の式（Ｉａ）又は（Ｉｂ）
Ｘ−ＮＤ１−Ｌ１−ＮＤ２−ＦＬＡ  （Ｉａ）又は  ＦＬＡ−ＮＤ１−Ｌ１−ＮＤ２−Ｘ  （Ｉｂ）
の複数の構築ブロックの凝集体からなる、請求項１に記載のタンパク質ナノ粒子。
【請求項３】
ＮＤ１及びＮＤ２のうちの少なくとも１つ並びにＮＤ３及びＮＤ４のうちの少なくとも１つがコイルドコイルである、請求項１に記載のタンパク質ナノ粒子。
【請求項４】
Ｘ、Ｙ及びＺのうちの少なくとも１つが目的の抗原である、請求項１から３の何れか一項に記載のタンパク質ナノ粒子。
【請求項５】
フラジェリン誘導体が目的の抗原を含む、請求項１から４の何れか一項に記載のタンパク質ナノ粒子。
【請求項６】
式（Ｉａ）の構築ブロックにおけるｎ又は式（Ｉｂ）の構築ブロックにおけるｍが２である、請求項１から５の何れか一項に記載のタンパク質ナノ粒子。
【請求項７】
ＦＬＡが、フラジェリンのＤ２部分において、ｎが２である式（Ｉａ）におけるオリゴマー化ドメインＮＤ２に、又はｍが２である式（Ｉｂ）におけるオリゴマー化ドメインＮＤ１に連結されている、請求項６に記載のタンパク質ナノ粒子。
【請求項８】
ＮＤ１、ＮＤ２、ＮＤ３及びＮＤ４のうちの少なくとも１つがコイルドコイルである、請求項１から７の何れか一項に記載のタンパク質ナノ粒子。
【請求項９】
ＮＤ１、ＮＤ２、ＮＤ３及びＮＤ４のうちの少なくとも１つがバクテリオファージＴ４タンパク質フィブリチンの三量体化ドメインである、請求項１から８の何れか一項に記載のタンパク質ナノ粒子。
【請求項１０】
請求項１から９の何れか一項に記載のタンパク質ナノ粒子を含む組成物。
【請求項１１】
タンパク質オリゴマー化ドメインＮＤ１、リンカーＬ１、タンパク質オリゴマー化ドメインＮＤ２、ＦＬＡ、及びさらなる置換部分Ｘを含む連続鎖からなる以下の式（Ｉａ）又は（Ｉｂ）
Ｘ−ＮＤ１−Ｌ１−ＮＤ２−ＦＬＡ  （Ｉａ）又は  ＦＬＡ−ＮＤ１−Ｌ１−ＮＤ２−Ｘ  （Ｉｂ）
の単量体構築ブロック（式中、
ＮＤ１は、ｍ個のＮＤ１サブユニットの（ＮＤ１）ｍオリゴマーを形成するタンパク質であり、
ＮＤ２は、ｎ個のＮＤ２サブユニットの（ＮＤ２）ｎオリゴマーを形成するタンパク質であり、
ｍ及びｎは、それぞれ２と１０の間の数であり、ただし、ｍは、ｎと等しくなく、ｎの倍数でなく、ｎは、ｍの倍数でなく、
Ｌ１は、結合、又は短い柔軟なリンカーであり、
ＦＬＡは、フラジェリンであるか、あるいは、
フラジェリンアミノ酸配列の一部を欠くが少なくともＴＬＲ５結合ドメインＤ１を含むフラジェリンの誘導体であって、
フラジェリンのＤ２及びＤ３ドメインから選択される１又は複数のドメインは、２つの末端を連続ペプチド鎖に再結合させることによりフラジェリンアミノ酸配列から除去されており、且つ／又は１〜２０個のアミノ酸が他のアミノ酸により置換されており、且つ／又は直接結合した若しくは１〜２０個のアミノ酸を含むリンカーを介して結合した抗原をさらに含む、
フラジェリンアミノ酸配列の一部を欠くが少なくともＴＬＲ５結合ドメインＤ１を含むフラジェリンの誘導体であり、
Ｘは、存在しないか、又は１〜１０００個のアミノ酸を含むペプチド若しくはタンパク質配列である）。
【請求項１２】
請求項１から９の何れか一項に記載の有効量のタンパク質ナノ粒子を、そのようなワクチン接種を必要とする対象に投与することを含む、非ヒト動物にワクチン接種する方法。
【請求項１３】
請求項１から９の何れか一項に記載の有効量のタンパク質ナノ粒子を含む、ヒト又は非ヒト動物へのワクチン接種のための組成物。
【請求項１４】
請求項１から９の何れか一項に記載の有効量のタンパク質ナノ粒子を含む、ヒト又は非ヒト動物のためのワクチン。
【請求項１５】
請求項１から９の何れか一項に記載の有効量のタンパク質ナノ粒子を含む、ヒト又は非ヒト動物のためのアジュバント。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組込みアジュバントとしてのＴＬＲ５結合タンパク質フラジェリンのタンパク質配列を組み込んだ自己集合タンパク質ナノ粒子に関する。さらに、本発明は、ワクチン接種のためのそのようなナノ粒子の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
侵入病原体に対する第一線の防御は、宿主の先天性免疫によるものであり、膜結合受容体であるＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲｓ）は、それにおいて重要な役割を果たしている（Yoon S.I.等、Science 2012、335: p.859-64）。ＴＬＲｓは、それらのロイシンに富むリピート配列（ＬＲＲ）細胞外ドメインを用いて高度保存分子構造を有する抗原を認識する。このＬＲＲは、馬蹄形状を有する。各ＴＬＲは、特殊な形態のウイルス若しくは細菌核酸、リポ多糖（ＬＰＳ）又は特定のパターンを有する他の病原体関連分子などの細菌表面分子であり得る、その特定の分子抗原を認識する別個のリガンド結合ドメインを有する。それらは様々な無関係の分子抗原を認識するが、すべての公知のアゴニスト活性化ＴＬＲ構造、すなわち、それらの分子抗原を認識し結合したＴＬＲｓは、抗原結合により類似の二量体の構成となり、これが、それらのＣ末端領域を互いに近接させ、これは次にそれらの細胞内Ｔｏｌｌ／インターロイキン−１受容体（ＴＩＲ）ドメインを活性化し、それにより、細胞シグナル伝達カスケードを開始する。
【０００３】
本発明の範囲に関して、多くの異なるＴＬＲ受容体のうち、ＴＬＲ５が魚から哺乳動物に至るまでの脊椎動物で保存されている唯一のタンパク質結合ＴＬＲであることに注目することは、興味深い。ＴＬＲ５は、運動フラジェリンに関与する、β−及びγ−プロテオバクテリアに由来する分解された形態のむち様鞭毛フィラメントフラジェリンに結合する。最近の結晶学的研究で、フラジェリンとＴＬＲ５との二量体複合体が示された。ＴＬＲ５へのフラジェリンの結合により、ＭｙＤ８８依存性シグナル伝達経路が誘導され、これがひいては樹状細胞、単球及び上皮細胞における炎症促進性転写因子ＮＦ−ｋＢを活性化し、最終的に有鞭毛細菌に対する先天免疫応答をもたらす。
【０００４】
フラジェリンは、Ｄ０、Ｄ１、Ｄ２及びＤ３の４つのドメインから構成されている分子構造を有する。そのタンパク質鎖は、Ｄ０ドメインにおけるＮ末端から始まって大きなループ状に、他のドメインＤ１、Ｄ２及びＤ３を経て分子の先端に達し、向きを変えて、Ｄ３、Ｄ２及びＤ１を経て戻り、そのＣ末端を、Ｄ０ドメイン内でＮ末端に非常に近接するように配置させる。フラジェリンは、先天免疫系の活性化の２つの様式を有する。第１の様式は、主としてそのＤ１ドメインの高度保存部分を介してＴＬＲ５受容体に結合することによるものである（Yoon等、上記引用文中）。活性化の他の様式は、主としてそのＤ０ドメインの高度保存Ｃ末端部分を介してインフラマソームと相互作用することによるものである（Lightfield K.L.等、Nat Immunol. 2008、9: p.117-8）。
【０００５】
フラジェリンは、通常のアジュバント、すなわち、抗原と一緒に注射される別個の物質として使用されている。あるいは、フラジェリンはまた、それ自体の分子構造内に抗原を含むように改変されてもいる。第２のアプローチは、アジュバント効果が抗原の効果と共局在化し、そのため、アジュバントの用量を著しく減少させることができ、結果として副作用を著しく低減することもできるという利点がある。
【０００６】
フラジェリンのにおける制約の１つとなり得るのは、炎症性免疫応答を誘導するその潜在能力である。インフラマソームと相互作用するＤ０のＣ末端部分を欠くフラジェリン構築物を遺伝子操作により得ることによって免疫刺激の炎症部分を低減することが可能であり得る。
【０００７】
多くのアジュバントはその重度の副作用のため、使用する上で大きな制約がある。例えば、フロイント完全アジュバントは、非常に強い免疫刺激性製剤であり、動物実験でさえもはや用いることができない。現在のところ、ヒト用の承認済みアジュバントは非常に少数しか存在せず、最も重要なものは、ミョウバンである。全身的に適用されるアジュバントの副作用を制限する１つの可能な方法は、微粒子系としてそれらを製剤化すること、すなわち、副作用を制限し、目的の抗原の近傍にアジュバントを濃縮させ得る微粒子の形態又は油乳剤にアジュバントを組み込むことである。したがって、抗原及びアジュバントは、同じリンパ節に同時に到達し、そのため、アジュバントの全身性副作用が低減されると共にアジュバント効果が増大し得る。
【０００８】
フラジェリンは、国際公開第２００４／０７１４９３号に記載されているもののように、タンパク質ナノ粒子に用いられる特に興味深いアジュバントである。その理由は、フラジェリンは、イミキモドなどの小分子又はＣｐＧなどの核酸ベースの物質である多くの他のアジュバントとは対照的に、それ自体タンパク質であるからである。フラジェリンはタンパク質であるので、化学的架橋結合の必要なしに分子生物学によりナノ粒子上に組み込むことができる。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、タンパク質オリゴマー化ドメインＮＤ１、リンカーＬ１、タンパク質オリゴマー化ドメインＮＤ２、フラジェリンの誘導体ＦＬＡ、及びさらなる置換部分Ｘを含む連続鎖からなる以下の式（Ｉａ）又は（Ｉｂ）
Ｘ−ＮＤ１−Ｌ１−ＮＤ２−ＦＬＡ  （Ｉａ）又はＦＬＡ−ＮＤ１−Ｌ１−ＮＤ２−Ｘ  （Ｉｂ）
の複数の構築ブロック（式中、
ＮＤ１は、ｍ個のＮＤ１サブユニットの（ＮＤ１）ｍオリゴマーを形成するタンパク質であり、
ＮＤ２は、ｎ個のＮＤ２サブユニットの（ＮＤ２）ｎオリゴマーを形成するタンパク質であり、
ｍ及びｎは、それぞれ２と１０の間の数であり、ただし、ｍは、ｎと等しくなく、ｎの倍数でなく、ｎは、ｍの倍数でなく、
Ｌ１は、結合、又は短い柔軟なリンカーであり、
ＦＬＡは、フラジェリンであるか、又はフラジェリンアミノ酸配列の一部を欠くが、ＴＬＲ５結合ドメインＤ１を少なくとも含むフラジェリンの誘導体であり、欠落ドメイン（一又は複数）が、残りのフラジェリン配列の２つの末端を結合させる１〜２０個のアミノ酸の柔軟なリンカーセグメントにより置換されていても、又は完全に折りたたまれたタンパク質抗原により置換されていてもよく、
Ｘは、存在しないか、又は１〜１０００個のアミノ酸を含むペプチド若しくはタンパク質配列である）の凝集体からなる自己集合タンパク質ナノ粒子であって、
タンパク質オリゴマー化ドメインＮＤ３、リンカーＬ２、タンパク質オリゴマー化ドメインＮＤ４、並びにさらなる置換部分Ｙ及びＺを含む連続鎖からなる以下の式（ＩＩ）
Ｙ−ＮＤ３−Ｌ２−ＮＤ４−Ｚ  （ＩＩ）
の複数の構築ブロック（式中、
ＮＤ３は、ｙ個のＮＤ３サブユニットの（ＮＤ３）ｙオリゴマーを形成するタンパク質であり、
ＮＤ４は、ｚ個のＮＤ４サブユニットの（ＮＤ４）ｚオリゴマーを形成するタンパク質であり、
ｙ及びｚは、２と１０の間の数であり、ただし、ｙは、ｚと等しくなく、ｚの倍数でなく、ｚは、ｙの倍数でなく、
ＮＤ３がＮＤ１と同一であるか、又はＮＤ４がＮＤ２と同一であるか、又はＮＤ３及びＮＤ４の両方がそれぞれＮＤ１及びＮＤ２と同一であり、
Ｌ２は、結合であるか、又はＬ１と異なるか、若しくはＬ１と同一であってもよい短い柔軟なリンカーであり、
Ｙ及びＺは、互いに独立に、存在しないか、又は１〜１０００個のアミノ酸を含むペプチド若しくはタンパク質配列である）と共集合していてもよい自己集合タンパク質ナノ粒子に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】エピトープ含有鎖及び直立位置のフラジェリン又はフラジェリン誘導体含有鎖の共集合から構成される種々のタンパク質ナノ粒子の概略図である。左上隅に、オリゴマー化ドメインＮＤ２及びＮＤ１と融合したフラジェリン含有タンパク質鎖を、右に、Ｔ＝１二十面体対称を仮定した場合の、１：５９の比率でＮＤ３−Ｌ２−ＮＤ４−Ｚと共集合したナノ粒子を示す。明確にするために、ほぼ確実に無秩序なＨｉｓタグ（Ｘ及びＹ）は、示さない。「ＮＤ１」及び「ＮＤ３」：五量体オリゴマー化ドメイン；「ＮＤ２」及び「ＮＤ４」：三量体オリゴマー化ドメイン；「ＦＬＡ」：フラジェリン又はフラジェリン誘導体；「Ｚ」：エピトープＡ）フラジェリンＤ０−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３及び対応するエピトープ提示ナノ粒子のモデル。Ｂ）フラジェリンＤ０−Ｄ１−Ｄ２及び対応するエピトープ提示ナノ粒子のモデル。Ｃ）フラジェリンＤ０−Ｄ１及び対応するエピトープ提示ナノ粒子のモデル。Ｄ）フラジェリンＤ１−Ｄ２−Ｄ３及び対応するエピトープ提示ナノ粒子のモデル。Ｅ）ＮＤ３−Ｌ２−ＮＤ４コアのオリゴマー化ドメインＮＤ４と融合したＮＡＮＰ  Ｂ細胞エピトープ（Ｚ）のモデル。
【図２】フラジェリンとＴＬＲ５との相互作用の概略図である。フラジェリンは理想的には、二量体で、反転した配向でナノ粒子上に提示されなければならない。示したタンパク質鎖の部分は、（例えば、五量体）オリゴマー化ドメインＮＤ１から始まり、ＮＤ１は、リンカーＬにより（例えば、二量体）オリゴマー化ドメインＮＤ２に結合されており、ＮＤ２は、フラジェリンのＤ２ドメイン、続いてＤ１ドメイン、さらに先端（Ｔ）までからなるフラジェリン誘導体ＦＬＡにさらに連結されている。先端において、Ｄ１配列は、それ自体の上に折り返えされ、Ｄ２ドメインに折り込まれる。明確にするために、ほぼ確実に無秩序なＨｉｓタグは、示さない。Ａ）左：単量体のモデル。右：フラジェリンがＴＬＲ５との相互作用のための適切な二量体立体配座で保持されている二量体のモデル。Ｂ）上パネル：ＴＬＲ５二量体と相互作用するフラジェリン二量体のモデル。下パネル：左：切断図（clipped view）での完全集合「フラジェリンのみ」粒子のモデル。右：外形図での完全集合「フラジェリンのみ」粒子のモデル。
【図３】ｐＰＥＰ−Ｔのベクターマップを示す図である。「ｐｒｏｍ」：プロモーター；「ｔｅｒｍ」：ターミネーター；「ｏｒｉ」：起点；「ｂｐ」：塩基対：「ａｍｐ」：アンピシリン耐性遺伝子
【図４】タンパク質ナノ粒子の透過型電子顕微鏡写真である。組換えで発現したタンパク質のリフォールディング及び共集合の後、試料を炭素被覆グリッド上に吸着させ、２％酢酸ウラニルで逆染色した。（Ａ）「ＦＬＡ−ＳＡＰＮの設計」の項及び実施例６で述べるＴ８１ｃ−ＷＲＷ−８ＲＲＶＲＡ−Ｄ０−Ｄ１：Ｔ８１ｃ−ＷＲＷ−８ＲＲＶＲＡ−Ｔ１ＢＴ＊共集合比率１２：４８。バーは、５０ｎｍを表す。（Ｂ）実施例８で述べるＴ８１ｃ−８−Ｄ０−Ｄ１：Ｔ８１ｃ−８−Ｐｆ共集合比率３：５７。バーは、２００ｎｍを表す。（Ｃ）実施例７で述べるＰＤ５２−２ｉ８８−ＰＡＮＤＯＲＡ−Ｄ２−Ｄ１−ｏｒｉ：ＰＤ５２−２ｉ８８−ＰＡＮＤＯＲＡ−Ｎｏｒｏ共集合比率５：５５。バーは、２００ｎｍを表す。（Ｄ）実施例９で述べるＤＩＭ−Ｄ０−Ｄ１：ＤＩＭ−Ｄ２−Ｄ１−ｔｉｐ３＿ＮＩＣ−ｐｅｐｔ共集合比率５：５５。バーは、２００ｎｍを表す。
【図５】実施例１及び５のＬＯＮＧ−Ｄ２−Ｄ１−ｏｒｉ構築物のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。この構築物は、４１．１ｋＤａの理論分子量を有する。ＣＬ−遠心透明溶解液ＦＴ−通過画分１−１０ｍＭイミダゾールによるｐＨ８．０洗浄２−５００ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４によるｐＨ８．０洗浄３−ｐＨ６．３洗浄４−ｐＨ５．９洗浄５−ｐＨ４．５洗浄Ｅｌｕ−５及び１０μｌの試料をゲルに加えることによる２５０ｍＭイミダゾール溶出
【図６】各種解像度でのＬＯＮＧ−Ｄ２−Ｄ１−ｏｒｉ構築物のタンパク質ナノ粒子の透過型電子顕微鏡写真である。組換えで発現したタンパク質のリフォールディング及び共集合の後、試料を炭素被覆グリッド上に吸着させ、２％酢酸ウラニルで逆染色した。バーは、それぞれ右上、左上、右下及び左下の写真について１０００ｎｍ、５００ｎｍ、２００ｎｍ及び１００ｎｍを表す。
【図７】ＴＬＲ５細胞経路の活性化を示す図である。Ａ）ＬＯＮＧ−Ｄ２−Ｄ１−ｏｒｉ（実施例５）Ｂ）Ｔ８１ｃ−ＷＲＷ−８ＲＲＶＲＡ−Ｄ０−Ｄ１：Ｔ８１ｃ−ＷＲＷ−８ＲＲＶＲＡ−Ｔ１ＢＴ＊（１２：４８）（実施例６）Ｃ）ＰＤ５２−２ｉ８８−ＰＡＮＤＯＲＡ−Ｄ２−Ｄ１−ｏｒｉ：ＰＤ５２−２ｉ８８−ＰＡＮＤＯＲＡ−Ｎｏｒｏ（５：５５）（実施例７）上パネル：用量反応活性の評価下パネル：ＥＣ５０の評価ＩＭＧ−２２０５：ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）フラジェリン（０．２９ｎｇ／ｍｌ）、陽性コントロールＸ軸：ナノ粒子の濃度（ｎｇ／ｍｌ）Ｙ軸：ＳＥＡＰ発現（ｎｇ／ｍｌ）又はＡ％＝活性％
【図８】Ｃ５７ＢＩ／６マウスにおける免疫付与後の抗体力価のＥＬＩＳＡ結合解析（実施例８［パネルＡ］及び９［パネルＢ］で述べる）を示す図である。Ａ）■  １μｇの用量のＴＢ１ｃ−８−Ｐｆ単独◆  １０μｇの用量のＴＢ１ｃ−８−Ｐｆ単独×  ３：５７の比率及び１μｇの用量のＴ８１ｃ−８−Ｄ０−Ｄ１及びＴ８１ｃ−８−Ｐｆの共集合▲  ３：５７の比率及び１０μｇの用量のＴ８１ｃ−８−Ｄ０−Ｄ１及びＴ８１ｃ−８−Ｐｆの共集合●  ９：５１の比率及び１μｇの用量のＴ８１ｃ−８−Ｄ０−Ｄ１及びＴ８１ｃ−８−Ｐｆの共集合＊  ９：５１の比率及び１０μｇの用量のＴ８１ｃ−８−Ｄ０−Ｄ１及びＴ８１ｃ−８−Ｐｆの共集合Ｘ軸：血清の希釈係数Ｙ軸：ＯＤ＝光学濃度ＥＬＩＳＡプレートは、免疫付与に用いた全免疫原で被覆されている。Ｂ）●  ５：５５の比率及び１０μｇの用量のＤＩＭ−Ｄ０−Ｄ１及びＤＩＭ−Ｄ２−Ｄ１−ｔｉｐ３＿ＮＩＣ−ｐｅｐｔの共集合■  １０μｇの用量の担体ＫＬＨに結合させたニコチンＸ軸：血清の希釈係数Ｙ軸：ＯＤ＝光学濃度ＥＬＩＳＡプレートは、非関連担体に結合させたニコチンのみで被覆されている。
【図９】Ｎｉｃ−ＤＥＤＤＬ構築物のタンパク質ナノ粒子の透過型電子顕微鏡写真である。組換えで発現したタンパク質のリフォールディング及び共集合の後、ナノ粒子を炭素被覆グリッド上に吸着させ、２％酢酸ウラニルで逆染色した。バーは、１０００ｎｍを表す。
【図１０】抗体形成を示すグラフである。３匹のＣ５７ＢＩ／６マウスの群をそれぞれ１週間の間隔をあけた３回の注射で１０μｇのＮｉｃ−ＤＥＤＤＬ（実施例１０）又は１０μｇの陽性コントロールとしてのＮｉｃ−ＫＬＨ（ＫＨＬ担体に結合させたニコチン）によりｓ．ｃ．で免疫付与した。０日目（すなわち、最初の注射の前）及びその後の毎回の注射の１週間後における抗体力価をＥＬＩＳＡにより測定した。ｄ＝最初の免疫付与後の日数；Ａ＝抗体力価（ｌｏｇ２目盛り）。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
発明の詳細な説明
本発明では、ナノ粒子に何れか一方の向きで組み込まれたフラジェリンの異なるドメインを含む異なる形態のフラジェリンを述べる。一部の設計では、ナノ粒子表面に近いそれらのＮ及びＣ末端によりフラジェリンをナノ粒子に結合させる（図１）が、一方他の設計では、フラジェリンの遠い部分をナノ粒子表面に近接させ、したがって、ナノ粒子上に反対の向きにフラジェリンを発現させる（図２）。
【００１２】
炎症性免疫応答は、アジュバント、特にＴＬＲ結合アジュバントの主要な問題の１つであることから、炎症反応を誘導するそれらの能力を低減することは、有益である。Ｄ０ドメインの一部である、フラジェリンのＣ末端部が、インフラマソームと相互作用するペプチド配列を含み、したがって、フラジェリンの炎症反応に関与していることは、公知である。したがって、インフラマソームを活性化するＤ０ドメインのＣ末端部を欠くフラジェリン構築物が遺伝子操作により得られた（図２）。
【００１３】
本発明は、タンパク質オリゴマー化ドメインＮＤ１、リンカーＬ１、タンパク質オリゴマー化ドメインＮＤ２、フラジェリンの誘導体ＦＬＡ、及びさらなる置換部分Ｘを含む連続鎖からなる以下の式（Ｉａ）又は（Ｉｂ）
Ｘ−ＮＤ１−Ｌ１−ＮＤ２−ＦＬＡ  （Ｉａ）又はＦＬＡ−ＮＤ１−Ｌ１−ＮＤ２−Ｘ  （Ｉｂ）
の複数の構築ブロック（式中、
ＮＤ１は、ｍ個のＮＤ１サブユニットの（ＮＤ１）ｍオリゴマーを形成するタンパク質であり、
ＮＤ２は、ｎ個のＮＤ２サブユニットの（ＮＤ２）ｎオリゴマーを形成するタンパク質であり、
ｍ及びｎは、それぞれ２と１０の間の数であり、ただし、ｍは、ｎと等しくなく、ｎの倍数でなく、ｎは、ｍの倍数でなく、
Ｌ１は、結合、又は短い柔軟なリンカーであり、
ＦＬＡは、フラジェリンであるか、又はフラジェリンアミノ酸配列の一部を欠くが、ＴＬＲ５結合ドメインＤ１を少なくとも含むフラジェリンの誘導体であり、欠落ドメイン（一又は複数）が、残りのフラジェリン配列の２つの末端を結合させる１〜２０個のアミノ酸の柔軟なリンカーセグメントにより置換されていても、又は完全に折りたたまれたタンパク質抗原により置換されていてもよく、
Ｘは、存在しないか、又は１〜１０００個のアミノ酸を含むペプチド若しくはタンパク質配列である）の凝集体からなる自己集合タンパク質ナノ粒子であって、
タンパク質オリゴマー化ドメインＮＤ３、リンカーＬ２、タンパク質オリゴマー化ドメインＮＤ４、並びにさらなる置換部分Ｙ及びＺを含む連続鎖からなる以下の式（ＩＩ）
Ｙ−ＮＤ３−Ｌ２−ＮＤ４−Ｚ  （ＩＩ）
の複数の構築ブロック（式中、
ＮＤ３は、ｙ個のＮＤ３サブユニットの（ＮＤ３）ｙオリゴマーを形成するタンパク質であり、
ＮＤ４は、ｚ個のＮＤ４サブユニットの（ＮＤ４）ｚオリゴマーを形成するタンパク質であり、
ｙ及びｚは、２と１０の間の数であり、ただし、ｙは、ｚと等しくなく、ｚの倍数でなく、ｚは、ｙの倍数でなく、
ＮＤ３がＮＤ１と同一であるか、又はＮＤ４がＮＤ２と同一であるか、又はＮＤ３及びＮＤ４の両方がそれぞれＮＤ１及びＮＤ２と同一であり、
Ｌ２は、結合であるか、又はＬ１と異なるか、若しくはＬ１と同一であってもよい短い柔軟なリンカーであり、
Ｙ及びＺは、互いに独立に、存在しないか、又は１〜１０００個のアミノ酸を含むペプチド若しくはタンパク質配列である）と共集合していてもよい自己集合タンパク質ナノ粒子に関する。
【００１４】
本発明のタンパク質ナノ粒子は、アジュバント分子を目的の免疫原と共局在化する非常に洗練された方法を提供するものであり、したがって、フラジェリンのアジュバント特性は、ワクチン抗原に対する免疫応答が望まれるワクチン抗原と共局在化させることができる。式（Ｉａ）又は（Ｉｂ）の分子にフラジェリン又はフラジェリン（ＦＬＡ）を含むものを一方とし、目的の抗原（Ｙ又はＺ）を組み込んだ式（ＩＩ）のものを他方とする、２つのナノ粒子形成タンパク質鎖の１つの単一タンパク質ナノ粒子への共集合により、アジュバントと抗原は、完全に共局在化する。したがって、これらの設計では、アジュバント効果は、ナノ粒子の反復抗原提示の恩恵と共局在化する。さらに、アジュバント効果の寄与は、式（Ｉａ）又は（Ｉｂ）のフラジェリン含有タンパク質鎖と式（ＩＩ）の抗原含有タンパク質鎖との異なる共集合比率を用いることによって増加又は減少させることができる。アジュバント効果は、最善の抗原性と最低の副作用との間で最適化するために調整される。
【００１５】
上文で示したように、ＦＬＡは、フラジェリン又はフラジェリンアミノ酸配列の一部を欠くが、ＴＬＲ５結合ドメインＤ１を少なくとも含むフラジェリン誘導体である。欠落ドメイン（一又は複数）は、残りのフラジェリン配列の２つの末端を結合させる１〜２０個のアミノ酸の柔軟なリンカーセグメントにより置換されていても、又は完全に折りたたまれたタンパク質抗原により置換されていてもよい。柔軟なリンカー領域は、抗原の共有結合のための適切な結合部位を含み得る。
【００１６】
フラジェリン含有ナノ粒子は、単独で（すなわち、抗原含有ナノ粒子形成タンパク質鎖との共集合を伴わない）所定のワクチンにおける任意の形態の抗原送達に単に加えられる従来のアジュバントとして用いることができる。
【００１７】
さらなる代替選択肢として、抗原ＸをＢ細胞エピトープとして、フラジェリン誘導体ＦＬＡをアジュバントとして用いて、アジュバント効果及び反復抗原提示効果による恩恵を最大限にするために、抗原は、式（Ｉａ）又は（Ｉｂ）のフラジェリンのみを含むナノ粒子形成タンパク質鎖上に置換部分Ｘとして、すなわち、やはり式（ＩＩ）の抗原含有ナノ粒子形成タンパク質鎖との共集合なしに、遺伝子操作により組み込むことができる。
【００１８】
フラジェリンの構造においてタンパク質鎖が、すべてのドメインＤ０、Ｄ１、Ｄ２及びＤ３を経て再び戻るループとなっているので、２つの末端を連続ペプチド鎖に再結合させることによって１つ又はいくつかのドメインを配列から除去して、フラジェリン誘導体ＦＬＡを得ることができる。したがって、フラジェリンのＤ２及びＤ３ドメインを欠くフラジェリン誘導体構築物は、Ｄ１及びＤ２ドメインの境界面におけるタンパク質鎖を単に連結することによって、容易に遺伝子操作により組み込むことができる。同様に、先端ドメイン（Ｄ３又はＤ２とＤ３とが一緒になった）をタンパク質抗原により置換することができるが、ただしこの場合、このタンパク質抗原が、そのＮ及びＣ末端を介して、Ｄ１とＤ２との間の境界面におけるＮ及びＣ末端に連結できることが条件となる。先端ドメインＤ２及びＤ３はまた、抗原分子の共有結合のための適切な残基を含むペプチド配列により置換することができる。そのようなペプチドループの例は、その第一級アミノ基に共有結合するための４つのリシン残基を含む、配列ＫＹＫＤＧＤＫＧＤＤＫ（配列番号１）である。リシン残基を組み込んだそのような親水性ループは、リシンの側鎖の第一級アミノ酸へのリガンド分子の共有結合のための結合部位となる。アルギニンによりフラジェリン配列内のリシン残基を置換することにより、残りの分子における望ましくない結合部位が除去される。これらの２つの修飾により、以下の配列を有するフラジェリンが得られる。
ＭＡＱＶＩＮＴＮＳＬＳＬＬＴＱＮＮＬＮＲＳＱＳＡＬＧＴＡＩＥＲＬＳＳＧＬＲＩＮＳＡＲＤＤＡＡＧＱＡＩＡＮＲＦＴＡＮＩＲＧＬＴＱＡＳＲＮＡＮＤＧＩＳＩＡＱＴＴＥＧＡＬＮＥＩＮＮＮＬＱＲＶＲＥＬＡＶＱＳＡＮＳＴＮＳＱＳＤＬＤＳＩＱＡＥＩＴＱＲＬＮＥＩＤＲＶＳＧＱＴＱＦＮＧＶＲＶＬＡＱＤＮＴＬＴＩＱＶＧＡＮＤＧＥＴＩＤＩＤＬＲＱＩＮＳＱＴＬＧＬＤＱＬＮＶＱＱＫＹＫＤＧＤＫＧＤＤＫＴＥＮＰＬＱＲＩＤＡＡＬＡＱＶＤＡＬＲＳＤＬＧＡＶＱＮＲＦＮＳＡＩＴＮＬＧＮＴＶＮＮＬＳＥＡＲＳＲＩＥＤＳＤＹＡＴＥＶＳＮＭＳＲＡＱＩＬＱＱＡＧＴＳＶＬＡＱＡＮＱＶＰＱＮＶＬＳＬＬＲ（配列番号２８）
【００１９】
フラジェリンをナノ粒子上に二量体として組み込むことは、本発明のさらなる範囲である。したがって、自身もやはり二量体であるＴＬＲ５との相互作用が最適化されている。これは、ＮＤ１（ｍが２である）又はＮＤ２（ｎが２である）のような二量体タンパク質オリゴマー化ドメインを用い、それをフラジェリン誘導体ＦＬＡの結合部位として用いることにより、すなわち、それぞれ式（Ｉｂ）又は（Ｉａ）に示すように容易に達成される。これは、フラジェリン誘導体を強制的に、ＴＬＲ５とより容易に相互作用する二量体にする（図２）。好ましくは、そのような設計では、フラジェリンが結合する式（Ｉａ）又は（Ｉｂ）の構築ブロックにおける二量体オリゴマー化ドメイン（式（Ｉａ）におけるＮＤ２又は式（Ｉｂ）におけるＮＤ１）は、式（ＩＩ）の構築ブロックにおける対応するオリゴマー化ドメイン（式（Ｉａ）の鎖と共集合させる場合にはＮＤ４、又は式（Ｉｂ）の鎖と共集合させる場合にはＮＤ３）と異なる。好ましくは式（Ｉａ）又は（Ｉｂ）の構築ブロックにおける二量体オリゴマー化ドメインは、式（ＩＩ）の構築ブロックにおける対応するオリゴマー化ドメイン（ＮＤ３又はＮＤ４）よりも、強い相互作用、すなわち、二量体形成能力を有する。これは、式（Ｉａ）又は（Ｉｂ）及び式（ＩＩ）の構築ブロックを含む共集合ナノ粒子において、フラジェリン又はフラジェリン誘導体ＦＬＡが式（Ｉａ）又は（Ｉｂ）の隣接構築ブロック上に常に二量体を形成し、共集合ナノ粒子の全体に単一単量体として分布しないことを保証するものである。
【００２０】
さらに、ナノ粒子上に優先的に二量体として、反転した配向でフラジェリンを組み込むことにより、ＴＬＲ５二量体との相互作用を最適化することができる（図２）。そのようなナノ粒子が好ましい。例えば、Ｄ１−Ｄ２フラジェリン構築物は、Ｄ０及びＤ１ドメイン間の境界面にＫＡＫＫＫＤＧＫＤＤＫＤＳ（配列番号２９、図２における「Ｔ」）のようなペプチド配列を有するタンパク質鎖を結合させ、それにより、Ｄ０を除き、タンパク質鎖を再結合させずにＤ３を完全に除去することによって作製することができる。その結果として、得られるフラジェリン分子は、Ｄ２ドメインにそのＮ及びＣ末端を有し、以下のようなＤ２−Ｄ１配列を示す。
ＳＡＲＬＳＤＬＥＡＮＮＡＶＲＧＥＳＫＩＴＶＮＧＡＥＹＴＡＮＡＴＧＤＲＩＴＬＡＧＲＴＭＦＩＤＲＴＡＳＧＶＳＴＬＩＮＥＤＡＡＡＡＲＲＳＴＡＮＰＬＡＳＩＤＳＡＬＳＲＶＤＡＶＲＳＳＬＧＡＩＱＮＲＦＤＳＡＫＡＫＫＫＤＧＫＤＤＫＤＳＫＮＡＮＤＧＩＳＩＡＱＴＴＥＧＡＬＮＥＩＮＮＮＬＱＲＶＲＥＬＳＶＱＡＴＮＧＴＮＳＤＳＤＬＲＳＩＱＤＥＩＱＱＲＬＥＥＩＤＲＶＳＮＱＴＱＦＮＧＶＫＶＬＳＱＤＮＱＭＫＩＱＶＧＡＫＤＧＥＴＩＴＩＤＬＱＫＩＤＶＫＳＬＧＬＤＧＦＮＶＮＧＰＲＥＡＴＶＧＤＬＲＳＳＦＲＮＶＴＧＹＤＴＹＡＡＧＡＤＲＹＲＶＤＩＮＳＧＡＶ（配列番号３０）
【００２１】
例えば、ＧＳ又はＧＫＤＧＫＤＧＳ（配列番号３１）又はＧＫＤＧＫＤＧＫＤＧＫＤＧＳ（配列番号３２）などの１〜２０個のアミノ酸を有する類似の柔軟性リンカー配列（図２における「Ｔ」）を用いることができる。好ましくは、リンカー配列は、リンカーを柔軟にするためにグリシン残基を散在させた主に荷電又は極性アミノ酸を含む。このＤ２−Ｄ１構築物における望ましくない結合部位を排除するために、リシン残基をアルギニン残基により置換する。
【００２２】
その後、フラジェリン誘導体ＦＬＡは、フラジェリンのＤ２部分において二量体オリゴマー化ドメインＮＤ１又はＮＤ２に連結されなければならない。単独の又は式（ＩＩ）の対応する構築ブロックと共集合した、そのような構築ブロックからナノ粒子を調製することにより、反転した配向のフラジェリン誘導体を含む好ましいナノ粒子が形成される。
【００２３】
単量体構築ブロック
ペプチド（又はポリペプチド若しくはタンパク質）は、アミド結合により共有結合したアミノ酸の鎖又は配列である。ペプチドは、天然、修飾天然、部分合成又は完全合成であり得る。修飾天然、部分合成又は完全合成は、天然に存在しないことを意味すると理解される。アミノ酸という用語は、２０種の必須天然α−Ｌ−アミノ酸から選択される天然アミノ酸、α−Ｄ−アミノ酸、６−アミノヘキサン酸、ノルロイシン、ホモシステイン、若しくは同類のものなどの合成アミノ酸、並びにホホセリン若しくはホスホチロシンなどの、電荷などの特定の特性を変化させるある種の方法で、又はｎ−オクタノイル−セリン、若しくは同類のものなどの他の修飾により修飾された天然アミノ酸を含む。アミノ酸の誘導体において、アミド結合を形成するアミノ基がアルキル化され、又は側鎖アミノ、ヒドロキシ若しくはチオ官能基がアルキル化若しくはアシル化され、又は側鎖カルボキシ官能基がアミド化若しくはエステル化されている。好ましくは、本発明のタンパク質は、２０種の必須天然α−Ｌ−アミノ酸から選択されるアミノ酸を含む。
【００２４】
大まかな近似で、ペプチドは、それらのサイズに基づいてタンパク質と区別することができる。すなわち、おおむね、５０個以下のアミノ酸の鎖は、ペプチドであるとみなすことができるが、より長い鎖は、タンパク質であるとみなすことができる。ジペプチドは、最も短いペプチドであり、１つのペプチド結合により結合された２個のアミノ酸からなる。同様にトリペプチドは、３個のアミノ酸からなり、テトラペプチドは、４個のアミノ酸からなる、等である。ポリペプチドは、長く、連続的で、非分枝ペプチド鎖である。文献では、ペプチドをタンパク質と区別するサイズの境界は、多少根拠薄弱である。時には、アミロイドベータなどの長い「ペプチド」は、タンパク質とみなされ、逆の場合も同様に、インスリンなどのより小さいタンパク質は、ペプチドと呼ばれている。
【００２５】
短い柔軟なリンカー鎖Ｌ１又はＬ２は、置換されていてもよい炭素原子、置換されていてもよい窒素原子、酸素原子、硫黄原子及びそれらの組合せから選択され、好ましくは鎖に１〜６０個の原子、特に１〜２０個の原子を含む。そのような短い柔軟なリンカー鎖は、例えば、ポリエチレンオキシ鎖、柔軟な糖鎖又は、好ましくは柔軟なペプチド鎖、例えば、１〜２０個のアミノ酸、特に１個又は数個のグリシンアミノ酸を含む１〜６個のアミノ酸からなるペプチド鎖である。最も好ましいリンカーは、高含量のグリシンを含む１〜６個のアミノ酸からなる。
【００２６】
本発明によるオリゴマー化ドメインは、好ましくはコイルドコイルである。コイルドコイルは、下文でより詳細に説明するように、集合して多量体ヘリックスバンドルを形成する、主に疎水性の残基が３及び４残基の間隔をあけて連続するパターンを有するタンパク質配列である。
【００２７】
コイルドコイルでないオリゴマー化ドメインは、例えば、バクテリオファージＴ４タンパク質フィブリチンの三量体化ドメイン（フォルドン）である（Tao Y.等、Structure 1997、5巻、p.789-798）。
【００２８】
オリゴマー化ドメインＮＤ１、ＮＤ２、ＮＤ３及び／又はＮＤ４、並びにリンカーＬ１及び／又はＬ２は、免疫刺激性核酸、好ましくはデオキシイノシンを含むオリゴデオキシヌクレオチド、デオキシウリジンを含むオリゴデオキシヌクレオチド、ＣＧモチーフを含むオリゴデオキシヌクレオチド、ＣｐＧｓ、イミキモド、レシキモド、ガルジキモド、イノシン及びシチジンを含む核酸分子又は類似のものなどのナノ粒子のアジュバント特性を増強する標的化物質（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｅｎｔｉｔｙ）又は置換部分によりさらに置換されていてもよい。ナノ粒子のアジュバント特性を増強する他の置換部分は、適応免疫応答を促進し、且つ／又は改善することができる免疫刺激性の正に荷電した分子のクラスである、カチオンペプチドなどの抗菌ペプチドである。免疫増強特性を有するそのようなペプチドの例は、プライムブースト免疫付与後の強力なタンパク質特異的２型駆動獲得免疫（protein-specific type-2 driven adaptive immunity）を誘導する正に荷電した人工抗菌ペプチドＫＬＫＬＬＬＬＬＫＬＫ（配列番号２）である。置換部分とみなされる特定の標的化物質は、ＥＲ標的化シグナル、すなわち、小胞体（ＥＲ）へのタンパク質又はペプチドの輸送を誘導するシグナルペプチドである。
【００２９】
任意選択の置換部分、例えば、上述の任意選択の置換部分は、末端の近くであって、オリゴマー化ドメインＮＤ１、ＮＤ２、ＮＤ３及び／又はＮＤ４のＬ１又はＬ２に結合した末端とは反対側にある適切なアミノ酸に連結していることが好ましい。タンパク質ナノ粒子の自己集合時に、そのような置換部分は、ナノ粒子の表面に提示される。そのような置換部分は、連続的タンパク質鎖の末端に連結することができ、あるいはＮＤ１、ＮＤ２、ＮＤ３及び／又はＮＤ４の末端の近くであって、Ｌ１又はＬ２に結合した末端とは反対側に位置するアミノ酸の側鎖官能基に連結することができる。
【００３０】
最も好ましい実施形態において、置換部分は、ペプチド又はタンパク質置換部分であり、タンパク質鎖の単純延長を表すＸ、Ｙ及び／又はＺと称される。これらの単純延長は例えば、１つの単一分子として組換えタンパク質発現システムにおいて発現させることができる複合単一連続タンパク質配列を得るための、例えば、ＮＤ１のＮ末端におけるＸ−ＮＤ１−Ｌ１−ＮＤ２−ＦＬＡのような、又はＹ−ＮＤ３−Ｌ２−ＮＤ４−Ｚのような両端におけるものなどである。
【００３１】
他の実施形態において、ペプチド又は非ペプチド置換部分は、ＮＤ１、ＮＤ２、ＮＤ３及び／又はＮＤ４の末端の近くであって、Ｌ１又はＬ２に結合した末端とは反対側に位置するアミノ酸の側鎖官能基に、あるいは好ましくは、Ｘ、Ｙ及び／又はＺがペプチド又はタンパク質である場合、Ｘ、Ｙ及び／又はＺ延長内のアミノ酸の側鎖官能基に連結することができる。
【００３２】
リンカーＬ１又はＬ２に置換部分を結合させることも可能である。そのような場合、自己集合性タンパク質ナノ粒子のリフォールディング時に、置換部分は、自己集合性タンパク質ナノ粒子の内部空洞に位置する。
【００３３】
オリゴマーを形成する傾向は、そのようなタンパク質が条件によってオリゴマーを形成し得ることを意味する。例えば、変性条件下では、それらは、単量体であるが、生理的条件下では、それらは、例えば、二量体、三量体、四量体又は五量体を形成し得る。所定の条件下で、それらは、ナノ粒子の形成に必要な１つの単一オリゴマー化状態をとる。しかし、それらのオリゴマー化状態は、条件の変化により、例えば、塩濃度の増加により二量体から三量体に（Burkhard P.等、Protein Science 2000、9: p.2294-2301）又はｐＨの低下により五量体から単量体に変化し得る。
【００３４】
式（Ｉａ）、（Ｉｂ）又は（ＩＩ）による構築ブロック構造は、ウイルスキャプシドタンパク質と明らかに異なる。ウイルスキャプシドは、６０のオリゴマーを形成する１つの単一タンパク質又は例えば、Ｂ型肝炎ウイルス粒子のようなその複数（欧州特許第１２６２５５５号、欧州特許第０２０１４１６号）から、あるいは共集合して、ウイルスの種類によって二十面体とは別の他の形状もとり得る、ウイルスキャプシド構造を形成する、複数のタンパク質から構成されている（Fender P.等、Nature Biotechnology 1997,15:52-56）。本発明の自己集合タンパク質ナノ粒子（ＳＡＰＮ）は、ウイルス様粒子とも明らかに異なる。その理由は、それらが（ａ）ウイルスキャプシドタンパク質以外から構築されており、（ｂ）ナノ粒子の中心の空洞が小さすぎて全ウイルスゲノムのＤＮＡ／ＲＮＡを収容することができないからである。
【００３５】
タンパク質オリゴマー化ドメインは、周知のものである（Burkhard P.等、Trends Cell Biol 2001、11: p.82-88）。ＲＣＳＢ−ＰＤＢタンパク質構造データベース（http://www.rcsb.org/）は、タンパク質の原子構造を含んでいる。このウェブサイトは、それらの原子構造間でタンパク質オリゴマーを同定するためのツールを提供する。「タンパク質化学量論（Protein Stoichiometry）」における限定子「Ａ５」により高度検索モード（http://www.rcsb.org/pdb/search/advSearch.do）を用いて、五量体タンパク質オリゴマー化ドメインを検索する。「ＳＣＯＰ分類ブラウザー（SCOP classification Browser）」における限定子「コイルドコイルタンパク質」により高度検索モードを用いて、コイルドコイルタンパク質オリゴマー化ドメインを検索する。２つの検索を組み合わせることにより、データベースにおけるすべての五量体コイルドコイルタンパク質構造が検索される。同様に、「Ａ２」、「Ａ３」又は「Ａ４」をそれぞれ限定子として用いて二量体、三量体又は四量体コイルドコイル構造を検索することができる。本発明において、オリゴマー化ドメインＮＤ１、ＮＤ２、ＮＤ３及びＮＤ４は、好ましくはコイルドコイルドメインである。コイルドコイルは、集合して（折りたたたまれて）多量体ヘリックスバンドルを形成する、通常７アミノ酸（ヘプタッドリピート）又は１１アミノ酸（ウンデカッドリピート）の配列である、主に疎水性の残基が３及び４残基の間隔をあけて連続するパターンを有するタンパク質配列である。３及び４残基間隔が多少不規則に分布したものを含む配列を有するコイルドコイルも予期される。疎水性残基は、特に疎水性アミノ酸Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ及びＴｒｐである。主に疎水性とは、諸残基のうちの少なくとも５０％が、上述の疎水性アミノ酸から選択されなければならないことを意味する。
【００３６】
例えば、式（Ｉａ）、（Ｉｂ）又は（ＩＩ）の好ましい単量体構築ブロック構造において、ＮＤ１、ＮＤ２、ＮＤ３及びＮＤ４は、以下の式の何れかのタンパク質である。
［ａａ（ａ）−ａａ（ｂ）−ａａ（ｃ）−ａａ（ｄ）−ａａ（ｅ）−ａａ（ｆ）−ａａ（ｇ）］Ｘ      （ＩＩＩａ）、
［ａａ（ｂ）−ａａ（ｃ）−ａａ（ｄ）−ａａ（ｅ）−ａａ（ｆ）−ａａ（ｇ）−ａａ（ａ）］Ｘ      （ＩＩＩｂ）、
［ａａ（ｃ）−ａａ（ｄ）−ａａ（ｅ）−ａａ（ｆ）−ａａ（ｇ）−ａａ（ａ）−ａａ（ｂ）］Ｘ      （ＩＩＩｃ）、
［ａａ（ｄ）−ａａ（ｅ）−ａａ（ｆ）−ａａ（ｇ）−ａａ（ａ）−ａａ（ｂ）−ａａ（ｃ）］Ｘ      （ＩＩＩｄ）、
［ａａ（ｅ）−ａａ（ｆ）−ａａ（ｇ）−ａａ（ａ）−ａａ（ｂ）−ａａ（ｃ）−ａａ（ｄ）］Ｘ      （ＩＩＩｅ）、
［ａａ（ｆ）−ａａ（ｇ）−ａａ（ａ）−ａａ（ｂ）−ａａ（ｃ）−ａａ（ｄ）−ａａ（ｅ）］Ｘ      （ＩＩＩｆ）、
［ａａ（ｇ）−ａａ（ａ）−ａａ（ｂ）−ａａ（ｃ）−ａａ（ｄ）−ａａ（ｅ）−ａａ（ｆ）］Ｘ      （ＩＩＩｇ）、
ここで、ａａは、アミノ酸又はその誘導体を意味し、ａａ（ａ）、ａａ（ｂ）、ａａ（ｃ）、ａａ（ｄ）、ａａ（ｅ）、ａａ（ｆ）及びａａ（ｇ）は、同じ若しくは異なるアミノ酸又はその誘導体を意味し、好ましくはａａ（ａ）及びａａ（ｄ）は、同じ若しくは異なる疎水性アミノ酸又はその誘導体を意味し、ｘは、２と２０の間の数、好ましくは３と１０の間の数である。
【００３７】
ヘプタッドリピートは、式ａａ（ａ）−ａａ（ｂ）−ａａ（ｃ）−ａａ（ｄ）−ａａ（ｅ）−ａａ（ｆ）−ａａ（ｇ）（ＩＩＩａ）のヘプタペプチド又は式（ＩＩＩｂ）〜（ＩＩＩｇ）のその並べ替えの何れかである。
【００３８】
好ましいのは、すべてのタンパク質オリゴマー化ドメインＮＤ１、ＮＤ２、ＮＤ３及びＮＤ４が以下の通りである、式（Ｉａ）、（Ｉｂ）又は（ＩＩ）の単量体構築ブロックである。
（１）ｘが３であり、これらの６アミノ酸の表１のスコアの合計が少なくとも１４であるようにａａ（ａ）及びａａ（ｄ）が２０天然α−Ｌ−アミノ酸から選択される式（ＩＩＩａ）〜（ＩＩＩｇ）の何れかのタンパク質、並びに１７までのさらなるヘプタッドを含むそのようなタンパク質；
あるいは
（２）ｘが３であり、これらの６アミノ酸の表１のスコアの合計が少なくとも１２であるようにａａ（ａ）及びａａ（ｄ）が２０天然α−Ｌ−アミノ酸から選択される式（ＩＩＩａ）〜（ＩＩＩｇ）の何れかのタンパク質、ただし、１つのアミノ酸ａａ（ａ）は、隣接ヘプタッドのアミノ酸ａａ（ｄ）若しくはａａ（ｇ）へのらせん間塩橋を形成することができる荷電アミノ酸であり、又は１つのアミノ酸ａａ（ｄ）は、隣接ヘプタッドのアミノ酸ａａ（ａ）若しくはａａ（ｅ）へのらせん間塩橋を形成することができる荷電アミノ酸であり、並びに２つのさらなるヘプタッドを含むそのようなタンパク質。隣接ヘプタッドのアミノ酸へのらせん間塩橋を形成することができる荷電アミノ酸は、例えば、他のアミノ酸がＬｙｓ、Ａｒｇ若しくはＨｉｓである場合にはＡｓｐ若しくはＧｌｕであり、又は逆も同様である。
0006652500.tif 000002
【００３９】
また好ましいのは、１つ又は複数のタンパク質オリゴマー化ドメインＮＤ１、ＮＤ２、ＮＤ３又はＮＤ４が以下の好ましいタンパク質から選択される、式（Ｉａ）、（Ｉｂ）又は（ＩＩ）の単量体構築ブロックである：
（１１）ａａ（ａ）がＶａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ及びＭｅｔ並びにそれらの誘導体から選択され、ａａ（ｄ）がＬｅｕ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ及びＩｌｅ並びにそれらの誘導体から選択される式（ＩＩＩａ）〜（ＩＩＩｇ）の何れかのタンパク質。
（１２）１つのａａ（ａ）がＡｓｎであり、他のａａ（ａ）がＡｓｎ、Ｉｌｅ及びＬｅｕから選択され、ａａ（ｄ）がＬｅｕである式（ＩＩＩａ）〜（ＩＩＩｇ）の何れかのタンパク質。そのようなタンパク質は、通常二量体化ドメインである。
（１３）ａａ（ａ）及びａａ（ｄ）が両方ともＬｅｕ又は両方ともＩｌｅである式（ＩＩＩａ）〜（ＩＩＩｇ）の何れかのタンパク質。そのようなタンパク質は、通常三量体化ドメインである。
（１４）ａａ（ａ）及びａａ（ｄ）が両方ともＴｒｐである式（ＩＩＩａ）〜（ＩＩＩｇ）の何れかのタンパク質。そのようなタンパク質は、通常五量体化ドメインである。
（１５）ａａ（ａ）及びａａ（ｄ）が両方ともＰｈｅである式（ＩＩＩａ）〜（ＩＩＩｇ）の何れかのタンパク質。そのようなタンパク質は、通常四量体化ドメインである。
（１６）ａａ（ａ）及びａａ（ｄ）が両方ともＴｒｐ又はＰｈｅである式（ＩＩＩａ）〜（ＩＩＩｇ）の何れかのタンパク質。そのようなタンパク質は、通常五量体化ドメインである。
（１７）ａａ（ａ）がＬｅｕ又はＩｌｅであり、１つのａａ（ｄ）がＧｌｎであり、他のａａ（ｄ）がＧｌｎ、Ｌｅｕ及びＭｅｔから選択される式（ＩＩＩａ）〜（ＩＩＩｇ）の何れかのタンパク質。そのようなタンパク質は、五量体化ドメインである可能性を有する。
【００４０】
他の好ましいタンパク質は、上文で定義したタンパク質（１）、（２）、（１１）、（１２）、（１３）、（１４）、（１５）、（１６）及び（１６）であり、さらに
（２１）少なくとも１つのａａ（ｇ）がＡｓｐ及びＧｌｕから選択され、以下のヘプタッドにおけるａａ（ｅ）がＬｙｓ、Ａｒｇ若しくはＨｉｓであり；且つ／又は
（２２）少なくとも１つのａａ（ｇ）がＬｙｓ、Ａｒｇ及びＨｉｓから選択され、以下のヘプタッドにおけるａａ（ｅ）がＡｓｐ若しくはＧｌｕであり、且つ／又は
（２３）少なくとも１つのａａ（ａ〜ｇ）がＬｙｓ、Ａｒｇ及びＨｉｓから選択され、配列における３若しくは４アミノ酸離れたａａ（ａ〜ｇ）がＡｓｐ若しくはＧｌｕである。アミノ酸ａａ（ａ〜ｇ）のそのような対は、例えば、ａａ（ｂ）及びａａ（ｅ）又はａａ（ｆ）である。
【００４１】
ＰＣＯＩＬＳ（http://toolkit.tuebingen.mpg.de/pcoils; Gruber M.等、J. Struct. Biol. 2006、155巻(2号)、p.140-5）又はＭＵＬＴＩＣＯＩＬ（http://groups.csail.mit.edu/cb/multicoil/cgi-bin/multicoil.cgi）などのコイルドコイル予測プログラムは、コイルドコイル形成タンパク質配列を予測することができる。したがって、式（Ｉａ）、（Ｉｂ）又は（ＩＩ）の単量体構築ブロックにおいて、ＮＤ１、ＮＤ２、ＮＤ３及びＮＤ４は、コイルドコイル予測プログラムＰＣＯＩＬＳにより１４、２１又は２８のウインドウサイズのうちの少なくとも１つですべてのそのアミノ酸について０．９より高い確率でコイルドコイルを形成すると予測される２ヘプタッドリピートの長さの配列を少なくとも含むタンパク質である。
【００４２】
式（Ｉａ）、（Ｉｂ）又は（ＩＩ）のより好ましい単量体構築ブロックにおいて、ＮＤ１、ＮＤ２、ＮＤ３及びＮＤ４は、コイルドコイル予測プログラムＰＣＯＩＬＳにより１４、２１又は２８のウインドウサイズのうちの少なくとも１つですべてのそのアミノ酸について０．９より高い確率でコイルドコイルを形成すると予測される３ヘプタッドリピートの長さの少なくとも１つの配列を含むタンパク質である。
【００４３】
式（Ｉａ）、（Ｉｂ）又は（ＩＩ）の他のより好ましい単量体構築ブロックにおいて、ＮＤ１、ＮＤ２、ＮＤ３及びＮＤ４は、コイルドコイル予測プログラムＰＣＯＩＬＳにより１４、２１又は２８のウインドウサイズのうちの少なくとも１つですべてのそのアミノ酸について０．９より高い確率でコイルドコイルを形成すると予測される２ヘプタッドリピートの長さの少なくとも２つの別個の配列を含むタンパク質である。
【００４４】
公知のコイルドコイル配列は、ＲＣＳＢタンパク質データバンク（http://www.rcsb.org）などのデータバンクから検索することができる。
【００４５】
最も好ましいのは、実施例で述べるコイルドコイル配列及び単量体構築ブロックである。
【００４６】
さらに他の好ましい実施形態において、１つのオリゴマー化ドメインＮＤ１、ＮＤ２、ＮＤ３又はＮＤ４は、バクテリオファージＴ４タンパク質フィブリチンの三量体化ドメイン（フォルドン）（Tao Y.等、Structure 1997、5: p.789-798）又はその誘導体である。この三量体化ドメインは、配列ＧＹＩＰＥＡＰＲＤＧＱＡＹＶＲＫＤＧＥＷＶＬＬＳＴＦＬ（配列番号３）を有する。このドメインのわずかな改変も想定される。
【００４７】
自己集合タンパク質ナノ粒子：ＬＣＭユニット
自己集合タンパク質ナノ粒子（ＳＡＰＮ）は、式（Ｉａ）、（Ｉｂ）の単量体構築ブロック又は式（Ｉａ）若しくは（Ｉｂ）の単量体構築ブロックと式（ＩＩ）の単量体構築ブロックとの混合物から形成される。そのような構築ブロックが集合する場合、それらは、いわゆる「ＬＣＭユニット」を形成する。そのようなＬＣＭユニットに集合する、単量体構築ブロックの数は、最小公倍数（ＬＣＭ）により定義される。したがって、例えば、単量体構築ブロックのオリゴマー化ドメインが五量体（ＮＤ１）５（ｍ＝５）及び二量体（ＮＤ２）２（ｎ＝２）を形成する場合、１０単量体がＬＣＭユニットを形成する。リンカーセグメントＬが適切な長さを有する場合、このＬＣＭユニットは、球状タンパク質ナノ粒子の形態に集合し得る。
【００４８】
自己集合タンパク質ナノ粒子（ＳＡＰＮ）は、１つ又は複数のＬＣＭユニットのみの集合により形成され得る（表２）。そのようなＳＡＰＮは、位相幾何学的に閉じた構造を示す。
【００４９】
正多面体
四面体、立方体、八面体、十二面体及び二十面体の５種の正多面体が存在する。それらは、異なる内部回転対称要素を有する。四面体は、２回及び３つの３回軸を有し、立方体及び八面体は、２回、３回及び４回回転対称軸を有し、十二面体及び二十面体は、２回、３回及び５回回転対称軸を有する。立方体では、これらの軸の空間配向は、八面体と正確に同じであり、また十二面体及び二十面体では、互いに対するこれらの軸の空間配向は、正確に同じである。したがって、本発明のＳＡＰＮの目的のために、十二面体及び二十面体は、同一であるとみなすことができる。十二面体／二十面体は、６０個の同じ３次元構築ブロックから構築される（表２）。これらの構築ブロックは、多面体の非対称性ユニット（ＡＵｓ）である。それらは、錐体であり、錐体の稜は、回転対称軸の１つに対応し、したがって、これらのＡＵｓは、それらの稜において２回、３回及び５回対称要素を有する。これらの対称要素がタンパク質オリゴマー化ドメインから得られる場合、そのようなＡＵｓは、上述のように単量体構築ブロックから構築される。２つのオリゴマー化ドメインＮＤ１及びＮＤ２又はＮＤ３及びＮＤ４をＡＵの２つの対称軸に沿って整列させれば十分である。これらの２つのオリゴマー化ドメインが安定なオリゴマーを形成する場合、第３の対称軸に沿った対称境界面が自動的に生じ、それは、この境界面に沿った相互作用、例えば、疎水性、親水性若しくはイオン性相互作用を最適化することにより、又はジスルフィド架橋のような共有結合により、安定化させることができる。
0006652500.tif 000003
【００５０】
正多面体対称を有する自己集合タンパク質ナノ粒子（ＳＡＰＮ）の集合
規則的形状（十二面体、二十面体、八面体、立方体）を有する自己集合タンパク質ナノ粒子（ＳＡＰＮ）を得るために、複数のＬＣＭユニットが必要である。例えば、三量体及び五量体オリゴマー化ドメインを含むモノマーから二十面体を形成するために、それぞれ１５個の単量体構築ブロックから構成される４つのＬＣＭが必要である。すなわち、規則的形状を有するタンパク質ナノ粒子は、６０個の単量体構築ブロックから構成されることとなる。２つのオリゴマー化ドメインのオリゴマー化状態の組合せが必要であり、２つの可能な多面体を形成するためのＬＣＭユニットの数を表２に示す。
【００５１】
ＬＣＭユニットがさらに集合して、複数のＬＣＭユニットから構成される正多面体を形成するかどうかは、２つのオリゴマー化ドメインＮＤ１及びＮＤ２又はＮＤ３及びＮＤ４の互いに対する幾何学的配置に、とりわけ２つのオリゴマー化ドメインの回転対称軸の間の角度に依存する。これは、主として、ｉ）ナノ粒子における隣接ドメイン間の相互作用、ｉｉ）リンカーセグメントＬの長さ、ｉｉｉ）個々のオリゴマー化ドメインの形状によって支配される。この角度は、正多面体における配置と比較してＬＣＭユニットにおいてより大きい。また、この角度は、正多面体とは対照的に単量体構築ブロックにおいて同じでない。この角度が正多面体のより小さい値に制限され（２つのオリゴマー化ドメインの間の引力疎水性、親水性若しくはイオン性相互作用、又は共有結合性ジスルフィド架橋により）、リンカーセグメントＬが十分に短い場合、それぞれが規定の数の単量体構築ブロックを含む所定の数のＬＣＭユニットは、さらにアニールして、正多面体を形成する（表２）か、又はより多くの単量体構築ブロックを取り囲んで、多面体の厳密な内部の対称を欠くナノ粒子を形成する。
【００５２】
２つのオリゴマー化ドメインの間の角度が十分に小さい（二十面体対称を有する正多面体におけるものより小さい）場合、多数（数百）のタンパク質鎖がタンパク質ナノ粒子に集合し得る。そのような設計では、ＳＡＰＮｓは、「全五量体」ウイルス構造の準等価性理論又はウイルスキャプシドのタイリング理論（tiling theory）により記述された構造と同様に６０タンパク質鎖の数倍に相当する分子量を有し得る。
【００５３】
好ましくは、フラジェリン含有ナノ粒子に含まれるべき抗原は、Ｂ細胞エピトープ及び／又はＴ細胞エピトープであり得、（ａ）癌細胞に対する免疫応答を誘導するのに適するタンパク質又はペプチド；（ｂ）感染症に対する免疫応答を誘導するのに適するタンパク質、ペプチド又は炭水化物；（ｃ）アレルゲンに対する免疫応答を誘導するのに適するタンパク質又はペプチド；（ｄ）ヒト疾患の治療のための免疫応答を誘導するのに適するタンパク質又はペプチドホルモン；及び（ｅ）依存症又は他の障害を治療するための免疫応答を誘導するのに適するハプテン分子からなる群から選択される。そのようなタンパク質、そのペプチド断片、ペプチド、炭水化物又はハプテンを含むタンパク質ナノ粒子は、ヒトにおける、あるいはまた家畜及び愛玩動物における免疫応答を誘導するのに適し得る。
【００５４】
さらなる態様において、本発明は、上で定義した式（Ｉａ）又は（Ｉｂ）の単量体構築ブロックに関する。
【００５５】
他の態様において、本発明は、本明細書で述べるタンパク質ナノ粒子を含む組成物に関する。そのような組成物は、ワクチンとして特に適している。好ましいワクチン組成物は、水性緩衝液中タンパク質ナノ粒子を含み、例えば、糖由来賦形剤（グリセロール、トレハロース、スクロース若しくは同類のものなど）又はアミノ酸由来賦形剤（アルギニン、プロリン、グルタミン酸塩若しくは同類のものなど）又はアニオン、カチオン、非イオン性若しくは両性イオン界面活性剤（コール酸塩、デオキシコール酸塩、トゥイーン若しくは同類のものなど）又は溶液のイオン強度を調節するためのあらゆる種類の塩（ＮａＣｌ、ＭｇＣｌ２若しくは同類のものなど）をさらに含み得る。
【００５６】
他の態様において、本発明は、前述の有効量のタンパク質ナノ粒子を、そのようなワクチン接種を必要とする対象に投与することを含む、ヒト又は非ヒト動物にワクチン接種する方法に関する。
【００５７】
ＦＬＡ−ＳＡＰＮ（フラジェリン含有自己集合タンパク質ナノ粒子）の設計
本発明によるＦＬＡ−ＳＡＰＮの特定の例は、以下の構築物「ＦＬＡ−ＳＡＰＮ−１ａ」及び「ＦＬＡ−ＳＡＰＮ−２」である。
式（Ｉａ）に対応するＴ８１ｃ−ＷＲＷ−８ＲＲＶＲＡ−Ｄ０−Ｄ１（ＦＬＪＢ＿ＳＡＬＴＹ）（ＦＬＡ−ＳＡＰＮ−１ａ）
ＭＧＨＨＨＨＨＨＡＳＷＲＷＤＧＧＬＶＰＲＧＳＷＱＴＷＮＡＲＷＤＱＷＳＮＤＷＮＡＷＲＳＤＷＱＡＷＲＤＤＷＡＲＷＲＡＬＷＭＧＧＲＬＬＬＲＬＥＥＬＥＲＲＬＥＥＬＥＲＲＬＥＥＬＥＲＦＶＡＡＷＴＬＲＶＲＡＬＥＲＲＬＥＥＬＥＲＲＩＥＥＩＡＲＧＭＡＱＶＩＮＴＮＳＬＳＬＬＴＱＮＮＬＮＫＳＱＳＡＬＧＴＡＩＥＲＬＳＳＧＬＲＩＮＳＡＫＤＤＡＡＧＱＡＩＡＮＲＦＴＡＮＩＫＧＬＴＱＡＳＲＮＡＮＤＧＩＳＩＡＱＴＴＥＧＡＬＮＥＩＮＮＮＬＱＲＶＲＥＬＡＶＱＳＡＮＳＴＮＳＱＳＤＬＤＳＩＱＡＥＩＴＱＲＬＮＥＩＤＲＶＳＧＱＴＱＦＮＧＶＫＶＬＡＱＤＮＴＬＴＩＱＶＧＡＮＤＧＥＴＩＤＩＤＬＫＱＩＮＳＱＴＬＧＬＤＳＬＮＶＨＧＡＰＶＤＰＡＳＰＷＴＥＮＰＬＱＫＩＤＡＡＬＡＱＶＤＡＬＲＳＤＬＧＡＶＱＮＲＦＮＳＡＩＴＮＬＧＮＴＶＮＮＬＳＥＡＲＳＲＩＥＤＳＤＹＡＴＥＶＳＮＭＳＲＡＱＩＬＱＱＡＧＴＳＶＬＡＱＡＮＱＶＰＱＮＶＬＳＬＬＲ（配列番号４）
式（ＩＩ）に対応するＴ８１ｃ−ＷＲＷ−８ＲＲＶＲＡ−Ｔ１ＢＴ＊（ＦＬＡ−ＳＡＰＮ−２）
ＭＧＨＨＨＨＨＨＡＳＥＹＬＮＫＩＱＮＳＬＳＴＥＷＳＰＳＳＶＴＧＳＷＱＴＷＮＡＲＷＤＱＷＳＮＤＷＮＡＷＲＳＤＷＱＡＷＲＤＤＷＡＲＷＲＡＬＷＭＧＧＲＬＬＬＲＬＥＥＬＥＲＲＬＥＥＬＥＲＲＬＥＥＬＥＲＦＶＡＡＷＴＬＲＶＲＡＬＥＲＲＬＥＥＬＥＲＲＩＥＥＩＡＲＧＳＧＤＰＮＡＮＰＮＶＤＰＮＡＮＰＮＶＮＡＮＰＮＡＮＰＮＡＮＰ（配列番号５）
【００５８】
そのような構築物は、以下の部分構築物から構成されている。
0006652500.tif 000004
【００５９】
精製を容易にするために、ＦＬＡ−ＳＡＰＮ−１ａは、式（Ｉａ）又は（Ｉｂ）で定義するように以下の配列Ｘから始まるものであり、
ＭＧＨＨＨＨＨＨＡＳＷＲＷＤＧＧＬＶＰＲＧＳ      （配列番号６）
これは、ニッケルアフィニティー精製のためのＨｉｓタグ及びＤＮＡレベルでのさらなるサブクローニングのための制限部位（Ｎｃｏｌ、Ｎｈｅｌ、ＢａｍＨＩ）を含む。
【００６０】
ＮＤ１については、五量体化ドメインを選択した（ｍ＝５）。特定の五量体コイルドコイルは、トリプトファンジッパー五量体化ドメインの新規修飾である（Liu J.等、Proc Natl Acad Sci USA 2004; 101(46): p.16156-61、pdb-entry 1T8Z）。
【００６１】
原初のトリプトファンジッパー五量体化ドメインは、以下の配列を有する。
ＳＳＮＡＫＷＤＱＷＳＳＤＷＱＴＷＮＡＫＷＤＱＷＳＮＤＷＮＡＷＲＳＤＷＱＡＷＫＤＤＷＡＲＷＮＱＲＷＤＮＷＡＴ（配列番号１２）。
【００６２】
ＦＬＡ−ＳＡＰＮ−１ａに用いた五量体化ドメインの修飾コイルドコイル配列は、１３位で始まり、４９位で終わり、Ｃ末端においてわずかな配列変異（ＮＱＲＷＤの代わりにＲＡＬＷＭ）を含むが、原初の配列（配列番号１２）におけるトリプトファン残基のヘプタッドリピートパターンを保持している。
１３−ＷＱＴＷＮＡＲＷＤＱＷＳＮＤＷＮＡＷＲＳＤＷＱＡＷＲＤＤＷＡＲＷＲＡＬＷＭ−４９（配列番号７）。
【００６３】
この配列は、２つのグリシン残基の短いリンカーＬ１（ＧＧ）により延長され、次に、極めて安定なコイルドコイル三量体である、以下の配列の三量体化ドメインＮＤ２と連結される。
ＲＬＬＬＲＬＥＥＬＥＲＲＬＥＥＬＥＲＲＬＥＥＬＥＲＦＶＡＡＷＴＬＲＶＲＡＬＥＲＲＬＥＥＬＥＲＲＩＥＥＩＡＲＧ（配列番号８）
【００６４】
三量体は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの完全に変性条件下でさえも形成されることが示された（図５）。それは、最適化三量体コイルドコイルの傾向を有するＰＡＤＲＥ配列の誘導体である、ｐａｎ−ＤＲ結合ＨＴＬエピトープストリングＲＦＶＡＡＷＴＬＲＶＲＡも含む。
【００６５】
ＦＬＡ−ＳＡＰＮ−１ａにおいて、式１ａの「ＦＬＡ」部分は、以下の配列を有するネズミチフス菌フラジェリンのＤ０及びＤ１ドメイン（米国特許第８４２０１０２号におけるような）から構成されている。
ＭＡＱＶＩＮＴＮＳＬＳＬＬＴＱＮＮＬＮＫＳＱＳＡＬＧＴＡＩＥＲＬＳＳＧＬＲＩＮＳＡＫＤＤＡＡＧＱＡＩＡＮＲＦＴＡＮＩＫＧＬＴＱＡＳＲＮＡＮＤＧＩＳＩＡＱＴＴＥＧＡＬＮＥＩＮＮＮＬＱＲＶＲＥＬＡＶＱＳＡＮＳＴＮＳＱＳＤＬＤＳＩＱＡＥＩＴＱＲＬＮＥＩＤＲＶＳＧＱＴＱＦＮＧＶＫＶＬＡＱＤＮＴＬＴＩＱＶＧＡＮＤＧＥＴＩＤＩＤＬＫＱＩＮＳＱＴＬＧＬＤＳＬＮＶＨＧＡＰＶＤＰＡＳＰＷＴＥＮＰＬＱＫＩＤＡＡＬＡＱＶＤＡＬＲＳＤＬＧＡＶＱＮＲＦＮＳＡＩＴＮＬＧＮＴＶＮＮＬＳＥＡＲＳＲＩＥＤＳＤＹＡＴＥＶＳＮＭＳＲＡＱＩＬＱＱＡＧＴＳＶＬＡＱＡＮＱＶＰＱＮＶＬＳＬＬＲ（配列番号９）
【００６６】
この設計は、タンパク質発現、精製及び生物物理学的解析に用いた以下の配列をもたらす。
ＭＧＨＨＨＨＨＨＡＳＷＲＷＤＧＧＬＶＰＲＧＳＷＱＴＷＮＡＲＷＤＱＷＳＮＤＷＮＡＷＲＳＤＷＱＡＷＲＤＤＷＡＲＷＲＡＬＷＭＧＧＲＬＬＬＲＬＥＥＬＥＲＲＬＥＥＬＥＲＲＬＥＥＬＥＲＦＶＡＡＷＴＬＲＶＲＡＬＥＲＲＬＥＥＬＥＲＲＩＥＥＩＡＲＧＭＡＱＶＩＮＴＮＳＬＳＬＬＴＱＮＮＬＮＫＳＱＳＡＬＧＴＡＩＥＲＬＳＳＧＬＲＩＮＳＡＫＤＤＡＡＧＱＡＩＡＮＲＦＴＡＮＩＫＧＬＴＱＡＳＲＮＡＮＤＧＩＳＩＡＱＴＴＥＧＡＬＮＥＩＮＮＮＬＱＲＶＲＥＬＡＶＱＳＡＮＳＴＮＳＱＳＤＬＤＳＩＱＡＥＩＴＱＲＬＮＥＩＤＲＶＳＧＱＴＱＦＮＧＶＫＶＬＡＱＤＮＴＬＴＩＱＶＧＡＮＤＧＥＴＩＤＩＤＬＫＱＩＮＳＱＴＬＧＬＤＳＬＮＶＨＧＡＰＶＤＰＡＳＰＷＴＥＮＰＬＱＫＩＤＡＡＬＡＱＶＤＡＬＲＳＤＬＧＡＶＱＮＲＦＮＳＡＩＴＮＬＧＮＴＶＮＮＬＳＥＡＲＳＲＩＥＤＳＤＹＡＴＥＶＳＮＭＳＲＡＱＩＬＱＱＡＧＴＳＶＬＡＱＡＮＱＶＰＱＮＶＬＳＬＬＲ（配列番号４）
【００６７】
ＦＬＡ−ＳＡＰＮ−１ａ単量体のモデルを図１Ｃに示す。
【００６８】
対応する構築物「ＦＬＡ−ＳＡＰＮ−２」は、以下の通りである。
精製を容易にするために、ＦＬＡ−ＳＡＰＮ−２は、式（ＩＩ）で定義するように以下の配列Ｙから始まるものであり、
ＭＧＨＨＨＨＨＨＡＳＥＹＬＮＫＩＱＮＳＬＳＴＥＷＳＰＳＳＶＴＧＳ（配列番号１０）
これは、ニッケルアフィニティー精製のためのＨｉｓタグ、セリンにより置換された１つのシステインを含む、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）の以下のＣＳタンパク質由来のＴ細胞エピトープ配列Ｔ１ＢＴ＊（Calvo-Calle J.M.、Infection and immunity 2006:p.6929-6939）
ＥＹＬＮＫＩＱＮＳＬＳＴＥＷＳＰＳＳＶＴ（配列番号１３）
及びＤＮＡレベルでのさらなるサブクローニングのための制限部位（Ｎｃｏｌ、Ｎｈｅｌ、ＢａｍＨＩ）を含み、したがって、ＦＬＡ−ＳＡＰＮ−１ａの「Ｘ」と多少異なっている。
【００６９】
ＦＬＡ−ＳＡＰＮ−２におけるＮＤ３は、適切な共集合を保証するためにＦＬＡ−ＳＡＰＮ−１ａにおけるＮＤ１と完全に同一である。
１３−  ＷＱＴＷＮＡＫＷＤＱＷＳＮＤＷＮＡＷＲＳＤＷＱＡＷＫＤＤＷＡＲＷＲＡＬＷＭ−４９（配列番号７）。
【００７０】
次いで、この配列は、これもＦＬＡ−ＳＡＰＮ−１ａと同じである、２つのグリシン残基の短いリンカーＬ２（ＧＧ）により延長される。
【００７１】
ＦＬＡ−ＳＡＰＮ−２において、次にリンカーを以下の配列の三量体化ドメインＮＤ４に連結させる。
ＲＬＬＬＲＬＥＥＬＥＲＲＬＥＥＬＥＲＲＬＥＥＬＥＲＦＶＡＡＷＴＬＲＶＲＡＬＥＲＲＬＥＥＬＥＲＲＩＥＥＩＡＲＧ（配列番号８）
これは、ＦＬＡ−ＳＡＰＮ−１ａにおけるのと正確に同じであり、したがって、ナノ粒子ＦＬＡ−ＳＡＰＮ−１ａ及びＦＬＡ−ＳＡＰＮ−２のコアＮＤ１−Ｌ１−ＮＤ２及びＮＤ３−Ｌ２−ＮＤ４は、完全に同一であり、リフォールディング時の２つのタンパク質鎖の適切な共集合を保証する。
【００７２】
ＦＬＡ−ＳＡＰＮ−２において、式（ＩＩ）の「Ｚ」部分は、３リピート（ＮＡＮＰ）及び天然ＣＳタンパク質配列に存在するそのいくつかの修飾（ＤＰＮＡＮＰＮＶＤＰＮＡＮＰＮＶ、配列番号１４）を含み、免疫応答が生じる、Ｂ細胞エピトープである、熱帯熱マラリア原虫のスポロゾイト周囲タンパク質（ＣＳＰ）のリピート領域から構成されている。それは、以下の配列ＳＧにより粒子に連結される。
ＳＧＤＰＮＡＮＰＮＶＤＰＮＡＮＰＮＶＮＡＮＰＮＡＮＰＮＡＮＰ（配列番号１１）
【００７３】
この設計は、タンパク質発現、精製及び生物物理学的解析に用いた以下の配列をもたらす。
ＭＧＨＨＨＨＨＨＡＳＥＹＬＮＫＩＱＮＳＬＳＴＥＷＳＰＳＳＶＴＧＳＷＱＴＷＮＡＲＷＤＱＷＳＮＤＷＮＡＷＲＳＤＷＱＡＷＲＤＤＷＡＲＷＲＡＬＷＭＧＧＲＬＬＬＲＬＥＥＬＥＲＲＬＥＥＬＥＲＲＬＥＥＬＥＲＦＶＡＡＷＴＬＲＶＲＡＬＥＲＲＬＥＥＬＥＲＲＩＥＥＩＡＲＧＳＧＤＰＮＡＮＰＮＶＤＰＮＡＮＰＮＶＮＡＮＰＮＡＮＰＮＡＮＰ（配列番号５）
【００７４】
ＦＬＡ−ＳＡＰＮ−２単量体のモデルを図１Ｃに示す。
【００７５】
Ｔ＝１二十面体対称を仮定した、１：５９の比率のＦＬＡ−ＳＡＰＮ−１ａ及びＦＬＡ−ＳＡＰＮ−２から共集合するナノ粒子のモデルを図１Ｃに示す。
【００７６】
４８：１２の比率で共集合したＦＬＡ−ＳＡＰＮ−１ａ及びＦＬＡ−ＳＡＰＮ−２タンパク質のＥＭ写真を図４に示す。
【実施例】
【００７７】
実施例１−クローニング
ナノ粒子構築物をコードするＤＮＡは、標準的な分子生物学の手順を用いて作製した。タンパク質配列ＬＯＮＧ−Ｄ２−Ｄ１−ｏｒｉをコードするＤＮＡを含むプラスミド
ＭＧＨＨＨＨＨＨＡＳＷＲＷＤＧＧＬＶＰＲＧＳＷＱＴＷＮＡＲＷＤＱＷＳＮＤＷＮＡＷＲＳＤＷＱＡＷＲＤＤＷＡＲＷＲＡＬＷＭＧＧＲＬＬＬＲＬＥＥＬＥＲＲＬＥＥＬＥＲＲＬＥＥＬＥＲＦＶＡＡＷＴＬＲＶＲＡＬＥＲＲＬＥＥＬＥＲＲＩＥＥＩＡＲＧＳＧＳＳＡＲＬＳＤＬＥＡＮＮＡＶＫＧＥＳＫＩＴＶＮＧＡＥＹＴＡＮＡＴＧＤＫＩＴＬＡＧＫＴＭＦＩＤＫＴＡＳＧＶＳＴＬＩＮＥＤＡＡＡＡＫＫＳＴＡＮＰＬＡＳＩＤＳＡＬＳＫＶＤＡＶＲＳＳＬＧＡＩＱＮＲＦＤＳＡＩＧＳＲＮＡＮＤＧＩＳＩＡＱＴＴＥＧＡＬＮＥＩＮＮＮＬＱＲＶＲＥＬＳＶＱＡＴＮＧＴＮＳＤＳＤＬＫＳＩＱＤＥＩＱＱＲＬＥＥＩＤＲＶＳＮＱＴＱＦＮＧＶＫＶＬＳＱＤＮＱＭＫＩＱＶＧＡＮＤＧＥＴＩＴＩＤＬＱＫＩＤＶＫＳＬＧＬＤＧＦＮＶＮＧＰＫＥＡＴＶＧＤＬＫＳＳＦＫＮＶＴＧＹＤＴＹＡＡＧＡＤＫＹＲＶＤＩＮＳＧＡＶ（配列番号１５）
は、図３の基本ＳＡＰＮ発現構築物のＮｃｏＩ／ＥｃｏＲＩ制限部位にクローニングすることにより構築した。
【００７８】
この構築物については、２種の構築物の混合／共集合ステップは存在しない。ワクチン免疫原は、ニコチンなどのワクチンエピトープを、フラジェリン誘導体を既に組み込んだ担体に、リシン残基に優先的に共有結合させることによって得られる。
【００７９】
この構築物は、ｐａｎＤＲ結合ＣＤ４エピトープストリングＥＲＦＶＡＡＷＴＬＲＶＲＡＬ（配列番号１６）を含む三量体新規設計コイルドコイル（ＮＤ２）に、２つのグリシン残基（ＧＧ）により連結された五量体コイルドコイルトリプトファンジッパー（ＮＤ１）から構成されている。この構築物はＮ末端にＨｉｓタグ及びトロンビン切断部位（Ｘ）を含む。このＸ−ＮＤ１−Ｌ１−ＮＤ２コア構造は、上文で詳細に記載されている。Ｃ末端には、ｐｄｂコード３Ｖ４７（ＲＣＳＢタンパク質データバンク）の構造由来のサルモネラ属（Salmonella）フラジェリンのＤ１及びＤ２ドメインから構成されているフラジェリン構築物（ＦＬＡ）が結合している。Ｄ１及びＤ２ドメインの部分を含む残基３４８〜４４７は、逆の方向にやはりＤ１及びＤ２の部分を含む残基２４〜２１４に、単一グリシン残基により連結されている。この設計は、Ｄ１ドメインがナノ粒子の外表面に提示され、ＴＬＲ５結合部位がナノ粒子の表面に露出するようにフラジェリンＤ１及びＤ２分子をナノ粒子に結合させるものである（図２ａ）。図２と対照的に、新規設計コイルドコイルＮＤ２は、三量体コイルドコイルである。
【００８０】
実施例２−発現
プラスミドをアンピシリンを含むＬｕｒｉａブロス中で３７℃で増殖させた大腸菌（Escherichia coli）ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞に移入して形質転換を起こさせた。発現は、イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシドにより誘導した。誘導の４時間後に、細胞を３７℃から除去し、４０００×ｇで１５分間の遠心分離により収集した。細胞ペレットを−２０℃で保存した。ペレットを氷上で解凍し、９Ｍ尿素、１００ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭトリスｐＨ８、２０ｍＭイミダゾール及び０．２ｍＭトリス−２−カルボキシエチルホスフィン（ＴＣＥＰ）からなる溶解緩衝液に懸濁した。
【００８１】
あるいはＫＲＸ細胞などの、他の細胞株も発現のために用いることができる。ＫＲＸ細胞においては、発現は、Ａｍｐ（１００μｇ／ｍＬ）及びグルコース（０．４％）を含み３７度のＯ／Ｎ前培養を用いたＫＲＸ細胞の早期自動誘導プロトコールにより行うことができる。Ｏ／Ｎ前培養を１：１００に、Ａｍｐ（１００μｇ／ｍＬ）、グルコース（０．０５％）及びラムノース（０．１％）を含む発現培養に希釈し２５℃で２４時間（培養した）。タンパク質発現レベルをドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により評価し、図５に示す。構築物は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの変性条件下でさえも単量体、三量体及び四量体を形成する。
【００８２】
実施例３−精製
細胞を超音波処理により溶解し、溶解物を３０５００×ｇで４５分間遠心分離することにより透明にした。透明溶解液をＮｉ−ＮＴＡアガロースビーズ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ、ＵＳＡ）とともに少なくとも１時間インキュベートした。カラムを溶解緩衝液で、次いで９Ｍ尿素、５００ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭトリスｐＨ８、２０ｍＭイミダゾール及び０．２ｍＭ  ＴＣＥＰを含む緩衝液で洗浄した。タンパク質は、ｐＨ勾配：９Ｍ尿素、１００ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、２０ｍＭクエン酸、２０ｍＭイミダゾール及び０．２ｍＭ  ＴＣＥＰにより溶出した。その後の洗浄は、ｐＨ６．３、５．９及び４．５で行った。ｐＨ勾配後、イミダゾール濃度を増加させることによる溶解緩衝液の勾配を用いて、タンパク質をさらに溶出した。純度は、図５に示すようにドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により評価した。
【００８３】
実施例４−リフォールディング
リフォールディングのためにタンパク質を次の条件に再緩衝した（rebuffered）：９Ｍ尿素、２０ｍＭトリスｐＨ８．５、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５％グリセロール、２ｍＭ  ＥＤＴＡ。第１のスクリーンの迅速なリフォールディングのために、１．８ｍｇ／ｍｌの濃度を有する４μｌの溶液を表３に示す緩衝液に０．０５ｍｇ／ｍｌの最終濃度まで加えた。次いで、溶液を逆染色透過型電子顕微鏡法により種々の解像度で解析した。
0006652500.tif 000005
MES=2-モルホリノエタンスルホン酸
HEPES=2-[4-(2-ヒドロキシエチル)ピペラジン-1-イル]エタンスルホン酸
TRIS=2-アミノ-2-ヒドロキシメチルプロパン-1,3-ジオール
【００８４】
必要な場合、リフォールディング条件を最適化するためのさらなるスクリーンは、ｐＨ及びイオン強度のより小さいサンプリングサイズを用いて実施することができる。さらに、トレハロース、スクロース、アルギニン、プロリン又はその他などの賦形剤を加えることができ、あるいは必要な場合、コール酸塩、デオキシコール酸塩、トィーン−８０又はその他などの界面活性剤を加えることができる。ＬＯＮＧ−Ｄ２−Ｄ１−ｏｒｉについては、リフォールディングのさらなる最適化は必要でなく、リフォールディング条件は、ｐＨ８．５、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭトリス、５％グリセロールであった。リフォールディング後の種々の解像度でのＬＯＮＧ−Ｄ２−Ｄ１−ｏｒｉのＥＭ写真は、十分なナノ粒子形成を示している（図６）。
【００８５】
実施例５−ＴＫＲ５経路活性化アッセイＩ
Ｔｏｌｌ様受容体５（ＴＬＲ５）に対するＬＯＮＧ−Ｄ２−Ｄ１−ｏｒｉのアゴニスト活性をＴＬＲ５／ＳＥＡＰｏｒｔｅｒ  ＨＥＫ２９３細胞（ＩＭＧＥＮＥＸ、カタログ番号ＩＭＬ−１０５）を用いて試験し、活性ＬＯＮＧ−Ｄ２−Ｄ１−ｏｒｉのＥＣ５０を評価した。ＩＭＬ−１０５細胞株を１ウェル当たり５×１０４細胞で９６ウェルプレートに１６時間平板培養した。細胞を様々な濃度（０．０１〜１０００ｎｇ／ｍｌ）の各試験試料、陽性コントロール（ＩＭＧＥＮＥＸフラジェリン、カタログ番号ＩＭＧ−２２０５）又は溶媒コントロール（各対応する緩衝液）で２連で２４時間処理した。次いで各ウェルの細胞培養培地を１：２に希釈し、９６ウェルマイクロタイタープレートに２連で移し、連続希釈分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）標準も２連で加えた。プレートを６５℃で３０分間インキュベートして、任意の内因性アルカリホスファターゼを不活性化した。次いでホスファターゼ基質を各ウェルに加え、室温で３０分間インキュベートした。４０５ｎｍで読み取ることによりプレートを解析し、用量反応活性評価及びＥＣ５０評価を準備した（図７Ａ）。
【００８６】
ＴＬＲ５アゴニスト活性は、ネズミチフス菌の陽性コントロールフラジェリンの０．２９ｎｇ／ｍｌと比較して１２．５９ｎｇ／ｍｌの計算ＥＣ５０値が示されたことから中等度に高かった。
【００８７】
実施例６−ＴＬＲ５経路活性アッセイＩＩ
Ｔ８１ｃ−ＷＲＷ−８ＲＲＶＲＡ−Ｄ０−Ｄ１（ＦＬＪＢ＿ＳＡＬＴＹ）と称される式（Ｉａ）の化合物：
ＭＧＨＨＨＨＨＨＡＳＷＲＷＤＧＧＬＶＰＲＧＳＷＱＴＷＮＡＲＷＤＱＷＳＮＤＷＮＡＷＲＳＤＷＱＡＷＲＤＤＷＡＲＷＲＡＬＷＭＧＧＲＬＬＬＲＬＥＥＬＥＲＲＬＥＥＬＥＲＲＬＥＥＬＥＲＦＶＡＡＷＴＬＲＶＲＡＬＥＲＲＬＥＥＬＥＲＲＩＥＥＩＡＲＧＭＡＱＶＩＮＴＮＳＬＳＬＬＴＱＮＮＬＮＫＳＱＳＡＬＧＴＡＩＥＲＬＳＳＧＬＲＩＮＳＡＫＤＤＡＡＧＱＡＩＡＮＲＦＴＡＮＩＫＧＬＴＱＡＳＲＮＡＮＤＧＩＳＩＡＱＴＴＥＧＡＬＮＥＩＮＮＮＬＱＲＶＲＥＬＡＶＱＳＡＮＳＴＮＳＱＳＤＬＤＳＩＱＡＥＩＴＱＲＬＮＥＩＤＲＶＳＧＱＴＱＦＮＧＶＫＶＬＡＱＤＮＴＬＴＩＱＶＧＡＮＤＧＥＴＩＤＩＤＬＫＱＩＮＳＱＴＬＧＬＤＳＬＮＶＨＧＡＰＶＤＰＡＳＰＷＴＥＮＰＬＱＫＩＤＡＡＬＡＱＶＤＡＬＲＳＤＬＧＡＶＱＮＲＦＮＳＡＩＴＮＬＧＮＴＶＮＮＬＳＥＡＲＳＲＩＥＤＳＤＹＡＴＥＶＳＮＭＳＲＡＱＩＬＱＱＡＧＴＳＶＬＡＱＡＮＱＶＰＱＮＶＬＳＬＬＲ（配列番号４）
Ｔ８１ｃ−ＷＲＷ−８ＲＲＶＲＡ−Ｔ１ＢＴ＊（ＦＬＡ−ＳＡＰＮ−２）と称される式（ＩＩ）の化合物：
ＭＧＨＨＨＨＨＨＡＳＥＹＬＮＫＩＱＮＳＬＳＴＥＷＳＰＳＳＶＴＧＳＷＱＴＷＮＡＲＷＤＱＷＳＮＤＷＮＡＷＲＳＤＷＱＡＷＲＤＤＷＡＲＷＲＡＬＷＭＧＧＲＬＬＬＲＬＥＥＬＥＲＲＬＥＥＬＥＲＲＬＥＥＬＥＲＦＶＡＡＷＴＬＲＶＲＡＬＥＲＲＬＥＥＬＥＲＲＩＥＥＩＡＲＧＳＧＤＰＮＡＮＰＮＶＤＰＮＡＮＰＮＶＮＡＮＰＮＡＮＰＮＡＮＰ（配列番号５）
これらの２つの共集合鎖は、上文で詳細に記載されている。式（Ｉａ）及び（ＩＩ）の両方で同じである、すなわち、ＮＤ３−Ｌ２−ＮＤ４と同じである、ＮＤ１−Ｌ１−ＮＤ２コア構造も実施例１におけるものと同じである。鎖１（式Ｉａ）においては、ＦＬＡ部分は、フラジェリンのＤ０及びＤ１ドメインから構成されているが、実施例１と異なる系統に由来する。鎖２におけるＹ及びＺ置換部分は、Ｔ１ＢＴ＊Ｔ細胞エピトープ及びＢ細胞エピトープとしての熱帯熱マラリア原虫のＣＳタンパク質由来のＮＡＮＰリピート領域由来の２８残基長配列である。
【００８８】
２つの鎖のクローニング、発現、精製及びリフォールディングは、実施例１、２、３及び４で述べたプロトコールに実質的に従う。これらの共集合ナノ粒子のリフォールディング条件は、ｐＨ７．５、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、５％グリセロールである。共集合ナノ粒子のＥＭ写真を図４Ａに示す。
【００８９】
ＴＬＲ５アゴニストとしての用量反応活性評価及びＥＣ５０評価は、実施例５で述べたプロトコールに従って実施した。ＴＬＲ５アゴニスト活性は、ネズミチフス菌の陽性コントロールフラジェリンの０．２９ｎｇ／ｍｌと比較してわずか０．０９０１ｎｇ／ｍｌの計算ＥＣ５０値が示されたことから非常に高かった（図７Ｂ）。したがって、これらのナノ粒子は、非常に強いＴＬＲ５活性化を誘導するものであり、これは、フラジェリン含有鎖が１２：４８のモル比でしか存在していなにも関わらず、天然フラジェリンより約３倍強い。用量反応曲線は、ベル型の曲線であるように思われ、したがって、フラジェリンのより高い濃度では免疫応答が低下している。最適濃度は、約５０ｎｇ／ｍｌである。
【００９０】
実施例７−ＴＬＲ５経路活性アッセイＩＩＩ
ＰＤ５２−２ｉ８８−ＰＡＮＤＯＲＡ−Ｄ２−Ｄ１−ｏｒｉと称される式（Ｉａ）の化合物：
ＭＧＨＨＨＨＨＨＡＳＧＳＷＥＫＷＮＡＫＷＤＥＷＫＮＤＷＮＤＷＲＲＤＷＱＡＷＶＤＤＷＡＹＷＴＬＴＷＫＹＧＥＬＹＳＫＬＡＥＬＥＲＲＮＥＥＬＥＲＲＬＥＥＬＡＲＦＶＡＡＬＳＭＲＬＡＥＬＥＲＲＮＥＥＬＡＲＧＳＧＳＳＡＲＬＳＤＬＥＡＮＮＡＶＲＧＥＳＫＩＴＶＮＧＡＥＹＴＡＮＡＴＧＤＲＩＴＬＡＧＲＴＭＦＩＤＲＴＡＳＧＶＳＴＬＩＮＥＤＡＡＡＡＲＲＳＴＡＮＰＬＡＳＩＤＳＡＬＳＲＶＤＡＶＲＳＳＬＧＡＩＱＮＲＦＤＳＡＩＧＳＫＮＡＮＤＧＩＳＩＡＱＴＴＥＧＡＬＮＥＩＮＮＮＬＱＲＶＲＥＬＳＶＱＡＴＮＧＴＮＳＤＳＤＬＲＳＩＱＤＥＩＱＱＲＬＥＥＩＤＲＶＳＮＱＴＱＦＮＧＶＫＶＬＳＱＤＮＱＭＫＩＱＶＧＡＫＤＧＥＴＩＴＩＤＬＱＫＩＤＶＫＳＬＧＬＤＧＦＮＶＮＧＰＲＥＡＴＶＧＤＬＲＳＳＦＲＮＶＴＧＹＤＴＹＡＡＧＡＤＲＹＲＶＤＩＮＳＧＡＶ（配列番号１７）
ＰＤ５２−２ｉ８８−ＰＡＮＤＯＲＡ−Ｎｏｒｏと称される式（ＩＩ）の化合物：
ＭＧＨＨＨＨＨＨＡＳＧＳＷＥＫＷＮＡＫＷＤＥＷＫＮＤＷＮＤＷＲＲＤＷＱＡＷＶＤＤＷＡＹＷＴＬＴＷＫＹＧＥＬＹＳＫＬＡＥＬＥＲＲＮＥＥＬＥＲＲＬＥＥＬＡＲＦＶＡＡＬＳＭＲＬＡＥＬＥＲＲＮＥＥＬＡＲＧＳＧＳＴＶＥＱＫＴＲＰＦＴＬＰＮＬＰＬＳＳＬＳＮＳＲＡＰＬＰＩＳＳＭＧＩＳＰＤＮＶＱＳＶＱＦＱＮＧＲＣＴＬＤＧＲＬＶＧＴＴＰＶＳＬＳＨＶＡＫＩＲＧＴＳＮＧＴＶＩＮＬＴＥＬＤＧＴＰＦＨＰＦＥＧＰＡＰＩＧＦＰＤＬＧＧＣＤＷＨＩＮＭＴＱＦＧＨＳＳＱＴＱＹＤＶＤＴＴＰＤＴＦＶＰＨＬＧＳＩＱＡＮＧＩＧＳＧＮＹＶＧＶＬＳＷＩＳＰＰＳＨＰＳＧＳＱＶＤＬＷＫＩＰＮＹＧＳＳＩＴＥＡＴＨＬＡＰＳＶＹＰＰＧＦＧＥＶＬＶＦＦＭＳＫＭＰＧＰＧＡＹＮＬＰＣＬＬＰＱＥＹＩＳＨＬＡＳＥＱＡＰＴＶＧＥＡＡＬＬＨＹＶＤＰＤＴＧＲＮＬＧＥＦＫＡＹＰＤＧＦＬＴＣＶＰＮＧＡＳＳＧＰＱＱＬＰＩＮＧＶＦＶＦＶＳＷＶＳＲＦＹＱＬＫＰＶＧＴＡＳ（配列番号１８）
これらの２つの共集合鎖ＰＤ５２−２ｉ８８−ＰＡＮＤＯＲＡ−Ｄ２−Ｄ１−ｏｒｉ及びＰＤ５２−２ｉ８８−ＰＡＮＤＯＲＡ−Ｎｏｒｏは、式（Ｉａ）及び式（ＩＩ）の両方における同じコア構造を有する。すなわち、ＮＤ１−Ｌ１−ＮＤ２がＮＤ３−Ｌ２−ＮＤ４と同じである。ＰＤ５２−２ｉ８８−ＰＡＮＤＯＲＡ−Ｄ２−Ｄ１−ｏｒｉ（式Ｉａ）において、ＦＬＡ部分は、フラジェリンのＤ２及びＤ１ドメインから構成されている。オリゴマー化ドメインＮＤ２（又はＮＤ４、それぞれ）は、二量体コイルドコイルを形成するように設計されている。Ｂ細胞エピトープ（Ｚ）並びにフラジェリン（ＦＬＡ）の形態の両方が二量体タンパク質であるため、これは重要である。共集合比率は、５：５５である。
【００９１】
ＰＤ５２−２ｉ８８−ＰＡＮＤＯＲＡ−Ｎｏｒｏ（式ＩＩ）における置換部分Ｙ及びＺは、それぞれＨｉｓタグ及びリンカーＧＳＧＳによりＮＤ４に連結されたノロウイルスのＰタンパク質由来の２９８残基長配列である。この配列は、ノロウイルスＨｕ／１９６８／ＵＳのＰ２サブドメインに対応し（Jiang X.等、195(1):p.51-61）、そのＸ線結晶構造に対応するｐｄｂエントリーコードは１ＩＨＭである。それは、Ｐドメインである残基２２３〜５２０（１０個のＣ末端残基５２１〜５３０を欠く。その理由は、これらの１０残基がＸ線結晶構造において無秩序であり、高度に正に荷電しているためである）、及びPrasad B.V.V.等、Science 1999; 286:p.287-290により示された命名法によるＳドメインのＣ末端の３アミノ酸である。トレオニン２２３残基は、コンピュータ視覚化プログラムによってｎｏｒｏ−ＳＡＰＮへの結合点として注意深く選択された。その理由は、それがウイルスキャプシドの結晶構造における２回軸にわたる鎖の間の最近接点であるためである。
【００９２】
２つの鎖のクローニング、発現、精製及びリフォールディングは、実施例１、２、３及び４で述べたプロトコールに実質的に従う。これらの共集合ナノ粒子のリフォールディング条件は、ｐＨ６．８、８０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  ＭＥＳ、５％グリセロールである。共集合（比率５：５５）ナノ粒子のＥＭ写真を図４Ｃに示す。
【００９３】
ＴＬＲ５アゴニストとしての用量反応活性評価及びＥＣ５０評価は、実施例５で述べたプロトコールに従って実施した。ＴＬＲ５アゴニスト活性は、ネズミチフス菌の陽性コントロールフラジェリンの０．２９ｎｇ／ｍｌと比較して１７．６６ｎｇ／ｍｌの計算ＥＣ５０値が示されたことから中等度に高かった（図７Ｃ）。
【００９４】
実施例８−免疫原性Ｉ
Ｔ８１ｃ−８−Ｄ０−Ｄ１（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ  ０）と称される式（Ｉａ）の化合物：
ＭＧＨＨＨＨＨＨＡＳＷＫＷＤＧＧＬＶＰＲＧＳＷＱＴＷＮＡＫＷＤＱＷＳＮＤＷＮＡＷＲＳＤＷＱＡＷＫＤＤＷＡＲＷＲＡＬＷＭＧＧＲＬＬＬＲＬＥＥＬＥＲＲＬＥＥＬＡＫＦＶＡＡＷＴＬＫＡＡＡＶＤＬＥＬＡＡＬＲＲＲＬＥＥＬＡＲＧＮＴＮＳＬＳＬＬＴＱＮＮＬＮＫＳＱＳＡＬＧＴＡＩＥＲＬＳＳＧＬＲＩＮＳＡＫＤＤＡＡＧＱＡＩＡＮＲＦＴＡＮＩＫＧＬＴＱＡＳＲＮＡＮＤＧＩＳＩＡＱＴＴＥＧＡＬＮＥＩＮＮＮＬＱＲＶＲＥＬＡＶＱＳＡＮＳＴＮＳＱＳＤＬＤＳＩＱＡＥＩＴＱＲＬＮＥＩＤＲＶＳＧＱＴＱＦＮＧＶＫＶＬＡＱＤＮＴＬＴＩＱＶＧＡＮＤＧＥＴＩＤＩＤＬＫＱＩＮＳＱＴＬＧＬＤＧＧＥＮＰＬＱＫＩＤＡＡＬＡＱＶＤＴＬＲＳＤＬＧＡＶＱＮＲＦＮＳＡＩＴＮＬＧＮＴＶＮＮＬＴＳＶＲＳＲＩＥＤＳＤＹＡＴＥＶＳＮＭＳＲＡＱＩＬＱＱＡＧＴＳＶＬＡＱＡＮＱＶＰＱＮ（配列番号１９）
Ｔ８１ｃ−８−Ｐｆと称される式（ＩＩ）の化合物：
ＭＧＨＨＨＨＨＨＡＳＷＫＷＤＧＧＬＶＰＲＧＳＷＱＴＷＮＡＫＷＤＱＷＳＮＤＷＮＡＷＲＳＤＷＱＡＷＫＤＤＷＡＲＬＲＡＬＬＭＧＧＲＬＬＬＲＬＥＥＬＥＲＲＬＥＥＬＡＫＦＶＡＡＷＴＬＫＡＡＡＶＤＬＥＬＡＡＬＲＲＲＬＥＥＬＡＲＧＧＳＧＡＮＡＮＰＮＡＮＰＮＡＮＰＮＡＮＰ（配列番号２０）
これらの２つの共集合鎖は、実施例６で述べたものと類似している。ＹにおけるＴ１ＢＴ＊Ｔ細胞エピトープが存在せず、Ｚにおける熱帯熱マラリア原虫由来のＣＳタンパク質のリピート領域由来のＢ細胞エピトープは、１６残基長であるにすぎない。三量体コイルドコイル（ＮＤ２及びＮＤ４）は、ｐａｎＤＲ結合エピトープＰＡＤＲＥを含む。鎖１（式Ｉａ）においては、ＦＬＡ部分は、フラジェリンのＤ０（残基６〜１７１）及びＤ１（残基２２９〜３１２）ドメインから構成されているが、実施例１及び６におけるものと再び異なる系統である、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｕｂｓｐ．ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｅｒｏｖａｒ  Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）のフェーズＩフラジェリン中間ドメイン変異体Ｃ１５０に由来する。Ｄ０とＤ１は、２つのグリシン残基により連結されている。
【００９５】
２つの鎖のクローニング、発現、精製及びリフォールディングは、実施例１、２、３及び４で述べたプロトコールに実質的に従う。この種の共集合ナノ粒子のリフォールディング条件は、ｐＨ８．５、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭトリス、５％グリセロールである。３：５７の比率の共集合ナノ粒子のＥＭ写真を図４Ｂに示す。
【００９６】
７匹のＣ５７ＢＩ／６マウスの群にそれぞれ２週間の間隔をあけた３回の注射で１０μｇ又は１μｇを用いてｉ．ｐ．で免疫付与処置した。免疫原は、Ｔ８１ｃ−８−Ｐｆ（式ＩＩ）単独又は３：５７及び９：５１の２種の共集合比率のＴ８１ｃ−８−Ｄ０−Ｄ１（式Ｉａ）及び８１ｃ−８−Ｐｆ（式ＩＩ）の共集合体であった。言い換えると、ナノ粒子のＴ１二十面体対称を仮定すると、ナノ粒子当たりゼロ個又は３個又は９個のＤ０−Ｄ１分子を含む３種の免疫原が存在していた。３回目の注射後の抗体力価をＥＬＩＳＡにより測定し、図８Ａに示す。免疫応答の飽和があるように思われ、３：５７の共集合比率での１μｇ（合計約２０ｎｇのフラジェリンに相当する）が、Ｄ０−Ｄ１ドメインを含まないナノ粒子と比較して抗体力価を約９倍増加させる。９：５１の共集合比率での１０μｇのより高い用量（合計約２μｇのフラジェリンに相当する）は、実際、Ｄ０−Ｄ１ドメインを含まないナノ粒子と比較して免疫応答を多少低下させる。
【００９７】
実施例９−免疫原性ＩＩ
ＤＩＭ−Ｄ０−Ｄ１（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ  １）と称される式（Ｉａ）の化合物：
ＭＧＨＨＨＨＨＨＡＳＧＳＷＥＥＷＮＡＲＷＤＥＷＥＮＤＷＮＤＷＲＥＤＷＱＡＷＲＤＤＷＡＲＷＲＡＴＷＭＧＧＲＬＬＳＲＬＥＲＬＥＲＲＮＥＥＬＲＲＬＬＱＬＬＲＮＲＬＥＲＬＡＱＦＶＲＡＬＳＭＱＮＡＥＬＥＲＲＬＥＥＬＡＲＧＭＡＱＶＩＮＴＮＳＬＳＬＬＴＱＮＮＬＮＫＳＱＳＡＬＧＴＡＩＥＲＬＳＳＧＬＲＩＮＳＡＫＤＤＡＡＧＱＡＩＡＮＲＦＴＡＮＩＫＧＬＴＱＡＳＲＮＡＮＤＧＩＳＩＡＱＴＴＥＧＡＬＮＥＩＮＮＮＬＱＲＶＲＥＬＡＶＱＳＡＮＳＴＮＳＱＳＤＬＤＳＩＱＡＥＩＴＱＲＬＮＥＩＤＲＶＳＧＱＴＱＦＮＧＶＫＶＬＡＱＤＮＴＬＴＩＱＶＧＡＮＤＧＥＴＩＤＩＤＬＫＱＩＮＳＱＴＬＧＬＤＳＬＮＶＨＧＡＰＶＤＰＡＳＰＷＴＥＮＰＬＱＫＩＤＡＡＬＡＱＶＤＡＬＲＳＤＬＧＡＶＱＮＲＦＮＳＡＩＴＮＬＧＮＴＶＮＮＬＳＥＡＲＳＲＩＥＤＳＤＹＡＴＥＶＳＮＭＳＲＡＱＩＬＱＱＡＧＴＳＶＬＡＱＡＮＱＶＰＱＮＶＬＳＬＬＲ（配列番号２１）
ＤＩＭ−Ｄ２−Ｄ１−ｔｉｐ３＿ＮＩＣ−ｐｅｐｔと称される式（ＩＩ）の化合物：
ＭＧＨＨＨＨＨＨＡＳＧＳＷＥＥＷＮＡＲＷＤＥＷＥＮＤＷＮＤＷＲＥＤＷＱＡＷＲＤＤＷＡＲＷＲＡＴＷＭＧＧＲＬＬＳＲＬＥＲＬＥＲＲＮＥＥＬＲＲＬＬＱＬＬＲＮＲＬＥＲＬＡＱＦＶＲＡＬＳＭＱＮＡＥＬＥＲＲＬＥＥＬＡＲＧＳＧＳＳＡＲＬＳＤＬＥＡＮＮＡＶＲＧＥＳＫＩＴＶＮＧＡＥＹＴＡＮＡＴＧＤＲＩＴＬＡＧＲＴＭＦＩＤＲＴＡＳＧＶＳＴＬＩＮＥＤＡＡＡＡＲＲＳＴＡＮＰＬＡＳＩＤＳＡＬＳＲＶＤＡＶＲＳＳＬＧＡＩＱＮＲＦＤＳＡＫＡＫＫＫＤＧＫＤＤＫＤＳＫＮＡＮＤＧＩＳＩＡＱＴＴＥＧＡＬＮＥＩＮＮＮＬＱＲＶＲＥＬＳＶＱＡＴＮＧＴＮＳＤＳＤＬＲＳＩＱＤＥＩＱＱＲＬＥＥＩＤＲＶＳＮＱＴＱＦＮＧＶＫＶＬＳＱＤＮＱＭＫＩＱＶＧＡＫＤＧＥＴＩＴＩＤＬＱＫＩＤＶＫＳＬＧＬＤＧＦＮＶＮＧＰＲＥＡＴＶＧＤＬＲＳＳＦＲＮＶＴＧＹＤＴＹＡＡＧＡＤＲＹＲＶＤＩＮＳＧＡＶ（配列番号２２）
実施例５及び実施例６によれば、フラジェリン誘導体は、そのＤ２−Ｄ１形よりもそのＤ０−Ｄ１形において免疫原性が高いと思われる。したがって、Ｄ０−Ｄ１形は、Ｄ２−Ｄ１形のフラジェリンを有する免疫原の免疫原性を増加させるためのＴＬＲ５アゴニストとして用いることができる。したがって、この実施例では配列Ｄ０−Ｄ１
ＭＡＱＶＩＮＴＮＳＬＳＬＬＴＱＮＮＬＮＫＳＱＳＡＬＧＴＡＩＥＲＬＳＳＧＬＲＩＮＳＡＫＤＤＡＡＧＱＡＩＡＮＲＦＴＡＮＩＫＧＬＴＱＡＳＲＮＡＮＤＧＩＳＩＡＱＴＴＥＧＡＬＮＥＩＮＮＮＬＱＲＶＲＥＬＡＶＱＳＡＮＳＴＮＳＱＳＤＬＤＳＩＱＡＥＩＴＱＲＬＮＥＩＤＲＶＳＧＱＴＱＦＮＧＶＫＶＬＡＱＤＮＴＬＴＩＱＶＧＡＮＤＧＥＴＩＤＩＤＬＫＱＩＮＳＱＴＬＧＬＤＳＬＮＶＨＧＡＰＶＤＰＡＳＰＷＴＥＮＰＬＱＫＩＤＡＡＬＡＱＶＤＡＬＲＳＤＬＧＡＶＱＮＲＦＮＳＡＩＴＮＬＧＮＴＶＮＮＬＳＥＡＲＳＲＩＥＤＳＤＹＡＴＥＶＳＮＭＳＲＡＱＩＬＱＱＡＧＴＳＶＬＡＱＡＮＱＶＰＱＮＶＬＳＬＬＲ（配列番号２３）
は、式（Ｉａ）における「ＦＬＡ」に対応し、一方、Ｄ２−Ｄ１−ｔｉｐ３
ＳＡＲＬＳＤＬＥＡＮＮＡＶＲＧＥＳＫＩＴＶＮＧＡＥＹＴＡＮＡＴＧＤＲＩＴＬＡＧＲＴＭＦＩＤＲＴＡＳＧＶＳＴＬＩＮＥＤＡＡＡＡＲＲＳＴＡＮＰＬＡＳＩＤＳＡＬＳＲＶＤＡＶＲＳＳＬＧＡＩＱＮＲＦＤＳＡＫＡＫＫＫＤＧＫＤＤＫＤＳＫＮＡＮＤＧＩＳＩＡＱＴＴＥＧＡＬＮＥＩＮＮＮＬＱＲＶＲＥＬＳＶＱＡＴＮＧＴＮＳＤＳＤＬＲＳＩＱＤＥＩＱＱＲＬＥＥＩＤＲＶＳＮＱＴＱＦＮＧＶＫＶＬＳＱＤＮＱＭＫＩＱＶＧＡＫＤＧＥＴＩＴＩＤＬＱＫＩＤＶＫＳＬＧＬＤＧＦＮＶＮＧＰＲＥＡＴＶＧＤＬＲＳＳＦＲＮＶＴＧＹＤＴＹＡＡＧＡＤＲＹＲＶＤＩＮＳＧＡＶ（配列番号２４）
は、式（ＩＩ）における「Ｚ」に対応する。Ｄ２−Ｄ１−ｔｉｐ３におけるこの配列「Ｚ」は、Ｄ２ドメインが上述のようにフラジェリンのＤ１ドメインと組み合わされているフラジェリンの修飾である。さらに、Ｄ２−Ｄ１−ｔｉｐ３のタンパク質足場は、ニコチン抗原の提示のための担体として用いる。タンパク質足場への活性化ニコチンの共有結合を可能にするために、表面に露出しているアルギニンをリシンに突然変異させると同時に、表面に露出していないリシン側鎖をアルギニンに突然変異させる。タンパク質配列の第一級アミンへの活性化ニコチンの共有結合により、ニコチンがナノ粒子の表面上に提示される。さらに、ナノ粒子の最外表面にニコチン分子を提示するために、Ｄ２−Ｄ１タンパク質は、高密度のリシンを含む分子の最も露出した部分（図２Ａ）に配列ＫＡＫＫＫＤＧＫＤＤＫＤ（配列番号２５）をいわゆる「ｔｉｐ３」として有する。したがって、リシン側鎖へのニコチンの共有結合は、ナノ粒子の表面におけるニコチン分子の高密度提示を可能にする。
【００９８】
ＤＩＭ−Ｄ０−Ｄ１及びＤＩＭ−Ｄ２−Ｄ１−ｔｉｐ３＿ＮＩＣ−ｐｅｐｔのコア（すなわち、ＮＤ１−Ｌ１−ＮＤ２及びＮＤ３−Ｌ２−ＮＤ４）は、同一であり、特に、オリゴマー化ドメインＮＤ２及びＮＤ４は、それぞれ、二量体コイルドコイルを形成するように設計されている。これにより、フラジェリン分子（何れかの形の）を、二量体ＴＬ５受容体と相互作用する状態である、二量体として提示することが可能となる（図２Ｂ）。
【００９９】
２つの鎖のクローニング、発現、精製及びリフォールディングは、実施例１、２、３及び４で述べたプロトコールに実質的に従う。この種の共集合ナノ粒子のリフォールディング条件は、ｐＨ７．０、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、５％グリセロールである。５：５５の比率の共集合ナノ粒子のＥＭ写真を図４Ｄに示す。
【０１００】
７匹のＣ５７ＢＩ／６マウスの群にそれぞれ２週間の間隔をあけた３回の注射で１０μｇを用いてｉ．ｐ．で免疫付与処置した。免疫原は、５：５５の共集合比率のＤＩＭ−Ｄ０−Ｄ１（式Ｉａ）及びＤＩＭ−Ｄ２−Ｄ１−ｔｉｐ３＿ＮＩＣ−ｐｅｐｔ（式ＩＩ）の共集合体又は同じ活性化ニコチン分子が結合していた標準担体ＫＬＨ（スカシガイヘモシアニン）であった。ＫＬＨは、ジャイアントキーホールリンペットの血リンパに見いだされ、免疫付与実験における抗原の担体として頻繁に用いられる大きなマルチサブユニットの酸素運搬メタロプロテインである。３回目の注射後の抗体力価をＥＬＩＳＡにより測定し、図８Ｂに示す。ＴＬＲ５アゴニストを含むこの種のナノ粒子免疫原の抗体力価は、その表面上に同じ抗原（ニコチン）を提示する標準ＫＬＨ担体の力価と比較して有意に高い。
【０１０１】
実施例１０−免疫原性ＩＩＩ
ＤＥＤＤＬと称される式（Ｉａ）の化合物：
ＭＧＤＫＨＨＨＨＨＨＫＤＧＳＤＫＧＳＷＥＥＷＮＡＲＷＤＥＷＥＮＤＷＮＤＷＲＥＤＷＱＡＷＲＤＤＷＡＲＷＲＡＴＷＭＧＧＲＬＬＳＲＬＥＲＬＥＲＲＮＥＥＬＲＲＬＬＱＬＬＲＮＲＬＥＲＬＡＱＦＶＲＡＬＳＭＱＮＡＥＬＥＲＲＬＥＥＬＡＲＧＭＡＱＶＩＮＴＮＳＬＳＬＬＴＱＮＮＬＮＲＳＱＳＡＬＧＴＡＩＥＲＬＳＳＧＬＲＩＮＳＡＲＤＤＡＡＧＱＡＩＡＮＲＦＴＡＮＩＲＧＬＴＱＡＳＲＮＡＮＤＧＩＳＩＡＱＴＴＥＧＡＬＮＥＩＮＮＮＬＱＲＶＲＥＬＡＶＱＳＡＮＳＴＮＳＱＳＤＬＤＳＩＱＡＥＩＴＱＲＬＮＥＩＤＲＶＳＧＱＴＱＦＮＧＶＲＶＬＡＱＤＮＴＬＴＩＱＶＧＡＮＤＧＥＴＩＤＩＤＬＲＱＩＮＳＱＴＬＧＬＤＱＬＮＶＱＱＫＹＫＤＧＤＫＧＤＤＫＴＥＮＰＬＱＲＩＤＡＡＬＡＱＶＤＡＬＲＳＤＬＧＡＶＱＮＲＦＮＳＡＩＴＮＬＧＮＴＶＮＮＬＳＥＡＲＳＲＩＥＤＳＤＹＡＴＥＶＳＮＭＳＲＡＱＩＬＱＱＡＧＴＳＶＬＡＱＡＮＱＶＰＱＮＶＬＳＬＬＲ（配列番号２６）
このナノ粒子タンパク質鎖は、実施例８におけるように、ネズミチフス菌のフェーズＩフラジェリン中間ドメイン変異体Ｃ１５０に由来する修飾Ｄ０−Ｄ１ドメインを「ＦＬＡ」として含む。この配列内のすべてのリシン残基は、アルギニンにより置換されている。Ｄ０及びＤ１ドメインは、分子の共有結合のための結合部位としての４個のリシンを含む、アミノ酸配列ＫＹＫＤＧＤＫＧＤＤＫ（配列番号１）により連結されている。
【０１０２】
三量体コイルドコイル（ＮＤ２）は、ｐａｎＤＲ結合配列ＥＬＲＲＬＬＱＬＬＲＮＲＬＥＲＬＡＱＦＶＲＡＬＳＭＱＮＡ（配列番号２７）を含む。置換部分「Ｘ」は、６個のアミノ酸のｈｉｓタグを含み、３個のリシン残基は、分子の共有結合のため配列全体にわたりほぼ均等に分布している。またＮ末端は、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳ）化学による共有結合に適する。
【０１０３】
タンパク質鎖のクローニング、発現及び精製は、実施例１、２及び３で述べたプロトコールに実質的に従う。
【０１０４】
カップリング反応のための緩衝液の交換の前に、アフィニティー精製によるプールした溶出画分を５ｍＭ  ＥＤＴＡとともに少なくとも１時間インキュベートして、浸出する可能性のあるニッケルイオンをすべてキレート化した。次いでＨｉＰｒｅｐ  ２６／１０脱塩カラムを用いて緩衝液を交換した。カラムを５カラム容積の次のカップリング緩衝液：６Ｍグアニジウム塩酸塩、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．２と平衡化させた後、試料をカラムに結合させた。溶出ステップは、２カラム容積の緩衝液を用いて実施した。
【０１０５】
ＮＨＳ−ニコチン（ニコチン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）のカップリングは、０．２４μｍｏｌのタンパク質に相当する１１．１ｍｇのタンパク質（２．５ｍＬ容積）を用いて１：５０のモル比（ＤＥＤＤＬ：ＮＨＳ−ニコチン）で行った。ＮＨＳ−ニコチン（５ｍｇ）を１２．８μｍｏｌに相当する１５０μｌの１００％ＤＭＳＯに溶解した。５０倍のモル過剰のＮＨＳ−ニコチンのために１２μｍｏｌに相当する１４１μＬのこのＮＨＳ−ニコチン溶液をタンパク質に加えた。カップリング反応物を暗所で（アルミニウムフォイルで被覆）３時間インキュベートし、磁気撹拌機で撹拌した。
【０１０６】
非結合ＮＨＳ−ニコチンを除去し、緩衝液を前リフォールディング緩衝液に交換するための次の緩衝液交換ステップにおいて、ＰＤミニトラップＧ−２５充填カラムを用いて、以下の条件に再緩衝した：８Ｍ尿素、２０ｍＭトリスｐＨ８．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ及び１０％トレハロース。
【０１０７】
タンパク質のリフォールディングは、実施例４で述べたプロトコールに実質的に従った。特に８ｍｇの結合Ｎｉｃ−ＤＥＤＤＬタンパク質（ニコチンに結合したＤＥＤＤＬタンパク質、３．３５ｍｇ／ｍＬの２．４ｍＬのタンパク質溶液）を１５８．４ｍＬのリフォールディング緩衝液（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％トレハロース）に撹拌しながら１滴ずつ加えた。目的とした最終タンパク質濃度は、０．０５ｍｇ／ｍＬであった。リフォールディング反応は、１０分間の総時間にわたって行わせた。リフォールディングされたＮｉｃ−ＤＥＤＤＬナノ粒子を図９に示す。
【０１０８】
３匹のＣ５７ＢＩ／６マウスの群に、それぞれ１週間の間隔をあけた３回の注射で、１０μｇのＮｉｃ−ＤＥＤＤＬ、又は陽性コントロールとしての１０μｇのＮｉｃ−ＫＬＨ（スカシガイヘモシアニンに結合させたニコチン）を用いてｓ．ｃ．で免疫付与処置した。０日目（すなわち、最初の注射の前）とその後の毎回の注射の１週間後（７、１４及び２１日目）における抗体力価をＥＬＩＳＡにより測定し、図１０に示す。これらの実験から、Ｎｉｃ−ＤＥＤＤＬは、高度に免疫原性であり、Ｎｉｃ−ＫＬＨと比較して３０倍以上良好な抗体誘導を示すことが明らかにされた。３回のみの免疫付与処置後の最大値は、１６３８４０に近い力価である。
【図１Ａ）】
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【図１Ｂ）】
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【図１Ｃ）】
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【図１Ｄ）】
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【図１Ｅ）】
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【図２Ａ）】
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【図２Ｂ）】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ）】
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【図７Ｂ）】
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【図７Ｃ）】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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