(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の標的核酸の一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を検出する方法であって、
前記試料を、第一の核酸を含む第一のオリゴヌクレオチドプライマーおよび第二の核酸配列を含む第二のオリゴヌクレオチドプライマーと接触させて、前記試料中にいずれかの標的核酸が存在すればセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む増幅産物を生成する増幅工程を行うこと、
前記増幅産物に、前記センス鎖の第一のＳＮＰ含有領域に相補な第三の核酸配列を含み、第一の相互作用標識および第二の相互作用標識、第一の５’末端および第一の３’末端を含む第一のＳＮＰ特異性加水分解プローブ、ならびに、前記アンチセンス鎖のＳＮＰ含有領域に相補な第四の核酸配列を含み、第三の相互作用標識および第四の相互作用標識、第二の５’末端および第二の３’末端を含む第二のＳＮＰ特異性加水分解プローブを含む二本鎖のオリゴヌクレオチドプローブを供給することを含むハイブリダイズ工程を行うこと、および
前記増幅産物の有無を検出することを含み、
ここで、前記増幅産物の存在は、前記第一及び／又は第二ＳＮＰ特異的加水分解プローブから放出される検出可能標識を検出することにより決定され、そして前記標的核酸の標的に前記ＳＮＰが存在することを意味し、ここで前記第一及び／又は第二SNP特異的加水分解プローブから、放出された検出可能な標識の非存在は、前記増幅産物の非存在を示し、そして前記標的核酸の標的に前記ＳＮＰが存在しないことを意味し、
ここで、前記第一の相互作用標識は、前記第一の５’末端に第一の供与体蛍光部位を含み、前記第二の相互作用標識は前記第一のＳＮＰ特異性加水分解プローブの第一の供与体蛍光部位の８ヌクレオチド以内に第一の対応する受容体蛍光部位を含み、前記第三の相互作用標識は前記第二の５’末端に第二の供与体蛍光部位を含み、前記第四の相互作用標識は前記第二のＳＮＰ特異性加水分解プローブの第二の供与体蛍光部位の８ヌクレオチド以内に第二の対応する受容体蛍光部位を含む、方法。
【請求項２】
前記第二のＳＮＰ特異性加水分解プローブは、前記第二の３’末端に向かうヘアピン構造を含み、前記ヘアピン構造は、前記ヘアピン構造を作るための１つ以上の追加のヌクレオチドを含む天然に出現しない核酸配列の領域を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第一の受容体蛍光部位は第一のクエンチャーであり、前記第二の受容体蛍光部位は第二のクエンチャーである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記増幅工程は、５’末端から３’末端へのヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ酵素を用いる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記オリゴヌクレオチドプライマーの第一の核酸配列および／または第二の核酸配列、および／または前記加水分解プローブの第三の核酸配列および／または第四の核酸配列は少なくとも１個の修飾ヌクレオチドを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記オリゴヌクレオチドプライマーの第一の核酸配列および第二の核酸配列、および／または前記加水分解プローブの第三の核酸配列および第四の核酸配列は、ヌクレオチドが４０個以下である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
標的核酸が試料中に存在する場合に、標的核酸のセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む増幅産物を生成するのに特異的な第一の核酸を含む第一のオリゴヌクレオチドプライマーおよび第二の核酸配列を含む第二のオリゴヌクレオチドプライマー、ならびに
二本鎖のオリゴヌクレオチドプローブを含み、前記二本鎖のオリゴヌクレオチドプローブは、
前記標的核酸の前記センス鎖の第一のＳＮＰ含有領域に相補な第三の核酸配列を含み、第一の相互作用標識、第二の相互作用標識、第一の５’末端、および第一の３’末端を含む第一のＳＮＰ特異性加水分解プローブ、ならびに、
前記標的核酸の前記アンチセンス鎖のＳＮＰ含有領域に相補な第四の核酸配列を含み、第三の相互作用標識、第四の相互作用標識、第二の５’末端、および第二の３’末端を含む第二のＳＮＰ特異性加水分解プローブを含み、
前記第一の相互作用標識は、前記第一の５’末端に第一の供与体蛍光部位を含み、前記第二の相互作用標識は前記第一のＳＮＰ特異性加水分解プローブの第一の供与体蛍光部位の８ヌクレオチド以内に第一の対応する受容体蛍光部位を含み、前記第三の相互作用標識は前記第二の５’末端に第二の供与体蛍光部位を含み、前記第四の相互作用標識は前記第二のＳＮＰ特異性加水分解プローブの第二の供与体蛍光部位の８ヌクレオチド以内に第二の対応する受容体蛍光部位を含む、試料中の標的核酸のＳＮＰを検出するためのキット。
【請求項８】
前記第二のＳＮＰ特異性加水分解プローブは、前記第二の３’末端に向かうヘアピン構造を含み、前記ヘアピン構造は、前記ヘアピン構造を作るための１つ以上の追加のヌクレオチドを含む天然に出現しない核酸配列の領域を含む、請求項７に記載のキット。
【請求項９】
前記第一の受容体蛍光部位は第一のクエンチャーであり、前記第二の受容体蛍光部位は第二のクエンチャーである、請求項７又は８に記載のキット。
【請求項１０】
５’末端から３’末端へのヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ酵素をさらに含む、請求項７〜９のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１１】
前記オリゴヌクレオチドプライマーの第一の核酸配列および第二の核酸配列、および／または前記加水分解プローブの第三の核酸配列および第四の核酸配列は、ヌクレオチドが４０個以下である、請求項７〜１０のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１２】
ＳＮＰが標的核酸に存在する場合にＳＮＰを検出するための二本鎖のオリゴヌクレオチドプローブであって、当該二本鎖オリゴヌクレオチドプローブが、以下の：
前記標的核酸のセンス鎖の第一のＳＮＰ含有領域に相補な第一の核酸配列を含み、第一の相互作用標識、第二の相互作用標識、第一の５’末端、および第一の３’末端を含む第一のＳＮＰ特異性加水分解プローブ、ならびに、
前記標的核酸のアンチセンス鎖のＳＮＰ含有領域に相補な第二の核酸配列を含み、第三の相互作用標識、第四の相互作用標識、第二の５’末端、および第二の３’末端を含む第二のＳＮＰ特異性加水分解プローブ、
を含み、前記第一の相互作用標識は、前記第一の５’末端に第一の供与体蛍光部位を含み、前記第二の相互作用標識は前記第一のＳＮＰ特異性加水分解プローブの第一の供与体蛍光部位の８ヌクレオチド以内に第一の対応する受容体蛍光部位を含み、前記第三の相互作用標識は前記第二の５’末端に第二の供与体蛍光部位を含み、前記第四の相互作用標識は前記第二のＳＮＰ特異性加水分解プローブの第二の供与体蛍光部位の８ヌクレオチド以内に第二の対応する受容体蛍光部位を含む、前記二本鎖オリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項１３】
前記第二のＳＮＰ特異性加水分解プローブは、前記第二の３’末端に向かうヘアピン構造を含み、前記ヘアピン構造は、前記ヘアピン構造を作るための１つ以上の追加のヌクレオチドを含む天然に出現しない核酸配列の領域を含む、請求項１２に記載の二本鎖のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項１４】
前記第一の受容体蛍光部位は第一のクエンチャーであり、前記第二の受容体蛍光部位は第二のクエンチャーである、請求項１２又は１３に記載の二本鎖のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項１５】
前記加水分解プローブの第一の核酸配列および第二の核酸配列は、ヌクレオチドが４０個以下である、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の二本鎖のオリゴヌクレオチドプローブ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づく診断の分野、特に重なり合う加水分解プローブを用いたＰＣＲ検出法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＰＣＲは、ＤＮＡまたはＲＮＡの小さなセグメントを複製すなわち「増幅」するのに効率的で、費用効果の高い方法である。ＰＣＲを用いると、わずか数時間でＤＮＡのある断片から数百万個のコピーが作製されて、分析に必要な十分なＤＮＡが得られる。この方法により、臨床医は最少量の試料（例えば、血液または組織）を用いて病気を診断および監視することができる。リアルタイムＰＣＲにより、増幅および検出を同時に行うことができる。検出方法の１つとして、オリゴヌクレオチドプローブの５’末端に共有結合した蛍光色素分子と、例えば、内側または３’末端に結合したクエンチャーを有するオリゴヌクレオチド加水分解プローブ（ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブとしても知られている）を用いて行われるものがある。加水分解プローブは、相補標的配列へのハイブリダイゼーション時に加水分解プローブを開裂するＴａｑポリメラーゼの５’末端から３’末端へのヌクレアーゼ活性に依存した二重標識オリゴヌクレオチドプローブであり、蛍光に基づく検出が行われる。
【０００３】
リアルタイムＰＣＲ法は、一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を有する標的核酸の配列多様性を増幅および検出するのに用いることができる。しかしながら、利用できるＳＮＰの検出／遺伝子型決定アッセイの多くは、ＳＮＰは２つのアレルが対立している（biallelic）という仮説に基づいている（例えば、Morita et al., Mol. Cel. Probes, 2007, 21, 171-176を参照のこと）。既存のリアルタイムＰＣＲ法を用いたＳＮＰの検出は、十分な感度および特異性を欠いている。加水分解プローブ（例えば、標準的なＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ）は、オリゴヌクレオチドプライマーに比べて融解温度（Ｔｍ）が８〜１０℃高くなるように、典型的には長さが約１８〜２２塩基になるように設計される。標準的なＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブは、一般にＳＮＰの検出の特異性および感度が低く、野生型（ＷＴ）と変異型（ＭＴ）標的とを完全に識別することができないことが分かっている。現在のＴａｑＭａｎ（登録商標）に基づくＳＮＰ遺伝子型決定アッセイは、アレルを識別するためにプローブ−鋳型結合安定性が高められた、より短いＴａｑＭａｎ（登録商標）小溝結合剤（マイナーグルーブバインダー、minor groove binder = ＭＧＢ）プローブの使用を含む。また、ＳＮＰの検出および識別を向上させるように設計された標準的なＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブには、さらなる塩基修飾（例えば、塩基を安定化させる（プロピニルｄＵ、プロピニルｄＣ））が含まれていてもよい。よって、当該分野では、特異的にＳＮＰを高感度で検出する高速かつ信頼性の高い方法が求められている。
【発明の概要】
【０００４】
本開示の主題は、２本のオリゴヌクレオチドプローブ鎖はいずれもＳＮＰに特異的であり、ＳＮＰ部位で重なり合っている、二本鎖のＳＮＰ特異性加水分解プローブを含む。態様によっては、前記オリゴヌクレオチドプローブ鎖のうちの１本は、３’末端に向かうヘアピン構造を含むように設計されている。前記オリゴヌクレオチドプローブの３’末端付近のヘアピン構造は、前記プローブの３’部分が鋳型にハイブリダイズするのを遅らせ、それによって、レポーターと５’末端付近のクエンチャーとの１個の不一致に基づくＷＴ標的とＭＴ標的との識別を補助する。前記ＳＮＰ特異性オリゴヌクレオチドプローブの５’部分は、ＷＴ鋳型に比べてＭＴ鋳型により効率的にハイブリッドすることができる。前記ＳＮＰ特異性オリゴヌクレオチドプローブが前記ＷＴ標的に出会うと、前記ＷＴ標的に対する１個の不一致により、ハイブリダイゼーションおよびプローブの開裂が防止されて、これにより、蛍光を検出することができなくなる。
【０００５】
一側面では、試料中の標的核酸のＳＮＰを検出する方法が提供される。前記方法は、前記試料を、第一の核酸を有する第一のオリゴヌクレオチドプライマーおよび第二の核酸配列を有する第二のオリゴヌクレオチドプライマーと接触させて、前記試料中にいずれかの標的核酸が存在すればセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む増幅産物を生成する増幅工程を行うこと；前記増幅産物に、前記センス鎖の第一のＳＮＰ含有領域に相補な第三の核酸配列を有し、第一の相互作用標識および第二の相互作用標識、第一の５’末端および第一の３’末端を含む第一のＳＮＰ特異性加水分解プローブ、ならびに前記アンチセンス鎖のＳＮＰ含有領域に相補な第四の核酸配列を有し、第三の相互作用標識および第四の相互作用標識、第二の５’末端および第二の３’末端を含む第二のＳＮＰ特異性加水分解プローブを含む二本鎖プローブを供給することを含むハイブリダイズ工程を行うこと；および、前記増幅産物の存在は前記標的核酸におけるＳＮＰの存在を意味し、前記増幅産物の非存在は前記標的核酸におけるＳＮＰの非存在を意味する場合に、前記増幅産物の有無を検出することを含む。態様によっては、前記第二のＳＮＰ特異性加水分解プローブは、前記第二の３’末端に向かうヘアピン構造を含んでいてもよく、前記ヘアピン構造は、前記ヘアピン構造を作るための１つ以上の追加のヌクレオチドを含む天然に出現しない（例えば、変化あるいは付加された）核酸配列の領域を含む。前記第一の相互作用標識は、前記第一の５’末端に第一の供与体蛍光部位を含んでいてもよく、前記第二の相互作用標識は前記第一のＳＮＰ特異性加水分解プローブの第一の供与体蛍光部位の８ヌクレオチド以内に第一の対応する受容体蛍光部位を含み、前記第三の相互作用標識は前記第二の５’末端に第二の供与体蛍光部位を含み、前記第四の相互作用標識は、前記第二のＳＮＰ特異性加水分解プローブの第二の供与体蛍光部位の８ヌクレオチド以内に第二の対応する受容体蛍光部位を含む。態様によっては、前記第一の受容体蛍光部位は、第一のクエンチャーであり、前記第二の受容体蛍光部位は第二のクエンチャーである。特定の態様では、前記第一のクエンチャーおよび第二のクエンチャーは同じクエンチャーである。特定の態様では、前記第一のクエンチャーおよび第二のクエンチャーは異なるクエンチャーである。態様によっては、増幅工程では、５’末端から３’末端へのヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ酵素を用いる。態様によっては、前記オリゴヌクレオチドプライマーの第一の核酸配列および／または第二の核酸配列、および／または前記加水分解プローブの第三の核酸配列および／または第四の核酸配列は、少なくとも１個の修飾ヌクレオチドを含む。態様によっては、前記オリゴヌクレオチドプライマーの第一の核酸配列および第二の核酸配列、および／または前記加水分解プローブの第三の核酸配列および第四の核酸配列は、ヌクレオチドが４０個以下である。
【０００６】
他の側面では、試料中の標的核酸のＳＮＰを検出するキットが提供される。前記キットは、標的核酸のセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む増幅産物を生成するのに特異的な第一の核酸を有する第一のオリゴヌクレオチドプライマーおよび第二の核酸配列を有する第二のオリゴヌクレオチドプライマー、ならびに二本鎖のオリゴヌクレオチドプローブを含み、前記二本鎖のオリゴヌクレオチドプローブは、前記センス鎖の第一のＳＮＰ含有領域に相補な第三の核酸配列を有し、第一の相互作用標識、第二の相互作用標識、第一の５’末端、および第一の３’末端を含む第一のＳＮＰ特異性加水分解プローブ、ならびに前記アンチセンス鎖のＳＮＰ含有領域に相補な第四の核酸配列を有し、第三の相互作用標識、第四の相互作用標識、第二の５’末端、および第二の３’末端を含む第二のＳＮＰ特異性加水分解プローブを含む。態様によっては、前記第二のＳＮＰ特異性加水分解プローブは、前記第二の３’末端に向かうヘアピン構造を含んでいてもよく、前記ヘアピン構造は、前記ヘアピン構造を作るための１つ以上の追加のヌクレオチドを含む天然に出現しない（例えば、変化あるいは付加された）核酸配列の領域を含む。態様によっては、前記第一の相互作用標識は、前記第一の５’末端に第一の供与体蛍光部位を含み、前記第二の相互作用標識は、前記第一のＳＮＰ特異性加水分解プローブの第一の供与体蛍光部位の８ヌクレオチド以内に第一の対応する受容体蛍光部位を含み、前記第三の相互作用標識は、前記第二の５’末端に第二の供与体蛍光部位を含み、前記第四の相互作用標識は、前記第二のＳＮＰ特異性加水分解プローブの第二の供与体蛍光部位の８ヌクレオチド以内に第二の対応する受容体蛍光部位を含む。態様によっては、前記第一の受容体蛍光部位は第一のクエンチャーであり、前記第二の受容体蛍光部位は第二のクエンチャーである。特定の態様では、前記第一のクエンチャーおよび第二のクエンチャーは異なるクエンチャーである。態様によっては、増幅は、５’末端から３’末端へのヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ酵素を用いる。態様によっては、前記キットは、５’末端から３’末端へのヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ酵素をさらに含む。態様によっては、前記オリゴヌクレオチドプライマーの第一の核酸配列および／または第二の核酸配列、および／または前記加水分解プローブの第三の核酸配列および／または第四の核酸配列は少なくとも１個の修飾ヌクレオチドを含む。態様によっては、前記オリゴヌクレオチドプライマーの第一の核酸配列および第二の核酸配列、および／または前記加水分解プローブの第三の核酸配列および第四の核酸配列は、ヌクレオチドが４０個以下である。
【０００７】
一側面では、第一のＳＮＰ特異性加水分解プローブおよび第二のＳＮＰ特異性加水分解プローブを含む二本鎖のオリゴヌクレオチドプローブが提供され、前記第一のＳＮＰ特異性加水分解プローブは、前記センス鎖の第一のＳＮＰ含有領域に相補な第一の核酸配列を有し、第一の相互作用標識、第二の相互作用標識、第一の５’末端、および第一の３’末端を含み、前記第二のＳＮＰ特異性加水分解プローブは、前記アンチセンス鎖のＳＮＰ含有領域に相補な第二の核酸配列を有し、第三の相互作用標識、第四の相互作用標識、第二の５’末端、および第二の３’末端を含む。前記第一の相互作用標識および前記第三の相互作用標識は、各オリゴヌクレオチドプローブ鎖の５’末端に向かって、５’末端付近、あるいは５’末端の供与体蛍光部位であってもよく、前記第二の相互作用標識および第四の相互作用標識は、例えば、前記二本鎖の加水分解プローブの２本の鎖のそれぞれの上にある前記供与体蛍光部位の８ヌクレオチド以内にある対応する受容体蛍光部位（例えば、クエンチャー）であってもよい。特定の態様では、前記第一のクエンチャーおよび第二のクエンチャーは同じクエンチャーである。特定の態様では、前記第一のクエンチャーおよび第二のクエンチャーは異なるクエンチャーである。態様によっては、前記第二のＳＮＰ特異性加水分解プローブは、前記第二の３’末端に向かうヘアピン構造を含んでいてもよく、前記ヘアピン構造は、前記ヘアピン構造を作るための１つ以上の追加のヌクレオチドを含む天然に出現しない（例えば、変化あるいは付加された）核酸配列の領域を含む。態様によっては、前記第一の受容体蛍光部位は、第一のクエンチャーであり、前記第二の受容体蛍光部位は第二のクエンチャーである。態様によっては、前記加水分解プローブの前記第一の核酸配列および／または第二の核酸配列は、少なくとも１個の修飾ヌクレオチドを含む。態様によっては、前記加水分解プローブの第一の核酸配列および第二の核酸配列は、ヌクレオチドが４０個以下である。
【０００８】
特に断りがなければ、本明細書で用いられるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する当該分野の当業者が一般的に理解するとの同じ意味を有する。本明細書に記載する方法および材料に類似あるいは等価である方法および材料は本発明の実践または試験に用いることができるが、以下で好適な方法および材料を記載する。また、これら材料、方法、および実施例は、単に例示的なものであって、限定を意図するものではない。
【０００９】
添付の図面および以下の記載の中で本発明の１つ以上の態様の詳細を記載する。本発明のその他の特徴、目的、および利点は、図面および詳細な記述から、また請求項から自明である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】センスプローブ鎖およびアンチセンスプローブ鎖の両方を有する二本鎖加水分解プローブを用いた野生型および変異体５２６ＮのＳＮＰ検出のリアルタイムＰＣＲ増幅曲線を示す。ここで、センスプローブ鎖およびアンチセンスプローブ鎖はいずれもＳＮＰに特異的であり、センス鎖は３’末端に向かうヘアピン構造を有する。
【図２】センスプローブ鎖およびアンチセンスプローブ鎖の両方を有する５２６ＮのＳＮＰに特異的な二本鎖加水分解プローブを示す。センスプローブ鎖およびアンチセンスプローブ鎖はいずれもＳＮＰに特異的で、センス鎖は３’末端に向かうヘアピン構造を有する。
【図３】いずれもＳＮＰに特異的なセンスプローブ鎖およびアンチセンスプローブ鎖を有する二本鎖加水分解プローブを用いた野生型および変異体５３１ＬのＳＮＰ検出のリアルタイムＰＣＲ増幅曲線を示す。
【図４】いずれもＳＮＰに特異的なセンスプローブ鎖およびアンチセンスプローブ鎖を有する、５３１ＬのＳＮＰに特異的な二本鎖加水分解プローブを示す。
【図５】いずれもＳＮＰに特異的なセンスプローブ鎖およびアンチセンスプローブ鎖を有する二本鎖加水分解プローブを用いた野生型および変異体５２６ＹのＳＮＰ検出のリアルタイムＰＣＲ増幅曲線を示す。
【図６】いずれもＳＮＰに特異的なセンスプローブ鎖およびアンチセンスプローブ鎖を有する５２６ＹのＳＮＰに特異的な二本鎖加水分解プローブを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
試料中の標的核酸の一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を検出するための方法、キット、および加水分解プローブを本明細書で記載する。他の方法に比べて標的核酸のＳＮＰを検出するためのリアルタイムＰＣＲの感度が高められ、増幅生成物の試料中の含有およびリアルタイム検出を含むリアルタイムＰＣＲの性能が向上したことにより、この技術を臨床実験室での標的核酸のＳＮＰの通常診断および検出で実施することができる。
【００１２】
前記方法は、少なくとも１つの循環工程を含んでいてもよく、前記少なくとも１つの循環工程は、核酸を含むオリゴヌクレオチドプライマー、および他の核酸配列を含む他のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて試料中の標的核酸分子（例えば、検出する目的のＳＮＰを含む遺伝子標的）の１つ以上の部分を増幅して、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む増幅産物を生成することを含む。本明細書で用いられる用語「プライマー」、「複数のプライマー」、および「プライマー対」は、核酸配列標的に特異的にアニールされて、適切な条件でそこから合成を開始するオリゴヌクレオチドプライマーを指す。各プライマーは、少なくとも各増幅産物の一部分が標的およびＳＮＰ（存在する場合）に対応する核酸配列を含むようにそれぞれの標的核酸分子内あるいはそれに近接した領域にアニールされる。増幅産物は、標的核酸分子内に目的のＳＮＰが存在するか否かにかかわらず、標的核酸が試料中に存在すれば生成される。
【００１３】
また、前記方法は、二本鎖のオリゴヌクレオチドプローブを前記増幅産物に供給するハイブリダイズ工程を含んでいてもよい。前記二本鎖のオリゴヌクレオチドプローブは、前記増幅産物のセンス鎖のＳＮＰ含有領域に相補な核酸配列を含む１本のＳＮＰ特異性加水分解プローブ、および前記増幅産物のアンチセンス鎖のＳＮＰ含有領域に相補な他の核酸配列を含む他のＳＮＰ特異性加水分解プローブを含む。前記二本鎖のＳＮＰ特異性加水分解プローブは、前記オリゴヌクレオチドプローブのセンス鎖およびアンチセンス鎖の全長に渡る完全な二本鎖であってもよい。あるいは、前記二本鎖のオリゴヌクレオチドプローブは、前記オリゴヌクレオチドプローブのセンス鎖およびアンチセンス鎖の長さのある領域に渡る部分的な二本鎖であってもよい。例えば、前記二本鎖のオリゴヌクレオチドプローブのセンス鎖およびアンチセンス鎖が二本鎖領域を形成する領域は、例えば、前記二本鎖のオリゴヌクレオチドプローブのセンス鎖およびアンチセンス鎖の５’末端または３’末端に向かう領域、あるいは中央領域であってもよい。前記二本鎖のオリゴヌクレオチドプローブは、目的のＳＮＰが位置する領域に渡って重なり合っていなければならない。前記二本鎖のオリゴヌクレオチドプローブのＳＮＰ特異性加水分解プローブのそれぞれは、第一の相互作用標識、第二の相互作用標識、５’末端、および３’末端を含んでいてもよい。態様によっては、前記二本鎖のオリゴヌクレオチドプローブのうちの１本の加水分解プローブ（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドプローブ）は、例えば、３’末端に向かうヘアピン構造を含んでいてもよい。本明細書では、前記ＳＮＰ特異性加水分解プローブは、前記増幅産物の一方の鎖のＳＮＰ含有領域に相補な核酸配列、および３’末端に向かうヘアピン構造を有していてもよく、第一の相互作用標識および第二の相互作用標識をさらに含んでいてもよい。さらに、前記第一の相互作用標識は、前記オリゴヌクレオチドプローブの５’末端付近または５’末端に位置してもよく、前記第二の相互作用標識は、前記オリゴヌクレオチドプローブの内側または３’末端に位置してもよい。態様によっては、前記第一の相互作用標識は、例えば、前記オリゴヌクレオチドプローブの５’末端に共有結合した蛍光色素分子部位であってもよく、前記第二の相互作用標識は、例えば、前記オリゴヌクレオチドプローブの内側あるいは３’末端に共有結合した受容体蛍光部位であってもよい。他の態様では、前記第一の相互作用標識は、例えば、前記オリゴヌクレオチドプローブの５’末端に共有結合した受容体蛍光部位であってもよく、前記第二の相互作用標識は、例えば、前記オリゴヌクレオチドプローブの内部または３’末端に結合した蛍光色素分子部位であってもよい。態様によっては、前記受容体蛍光部位はクエンチャーである。前記ヘアピン構造は、天然出現の配列の部分ではない１個以上の変化したヌクレオチド、またはヘアピン構造を作るために天然出現の配列に付加されたヌクレオチドである１個以上の追加の天然に出現しないヌクレオチドを含んでいてもよい天然に出現しない核酸領域を含むように設計されていてもよい。このように、例えば、前記核酸配列を変更する、例えば、３’末端に向かう配列の１つ以上のヌクレオチドを変化させる、あるいは、３’末端の核酸配列に１つ以上のヌクレオチドを付加して、通常は３’末端にヘアピン構造を形成しない核酸配列がヘアピンを形成するよう設計してもよい。
【００１４】
試料中の核酸標的に目的のＳＮＰが存在するか否かを検出するために、前記第一のＳＮＰ特異性加水分解プローブおよび第二のＳＮＰ特異性加水分解プローブの両方から放出された検出可能な標識により前記増幅産物を検出する。二本鎖のＳＮＰ特異性加水分解プローブにより前記増幅産物が検出されると、ＳＮＰが存在することを意味する。あるいは、二本鎖のＳＮＰ特異性加水分解プローブにより前記増幅産物が検出されなければ、ＳＮＰの存在を意味しない。このように、前記増幅産物（センス鎖および／またはアンチセンス鎖）の存在は、標的核酸標的中にＳＮＰが存在すること意味し、前記増幅産物の非存在は、標的核酸標的中にＳＮＰが存在しないことを意味する。
【００１５】
本明細書で用いられる用語「増幅する」は、鋳型核酸分子（例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒト型結核菌（ＭＴＢ）、またはＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に対する標的核酸分子）の片方または両方の鎖に相補である核酸分子を合成する過程を指す。核酸分子を増幅することは、典型的には、鋳型核酸を変性させること、オリゴヌクレオチドプライマーの融解温度より低い温度でオリゴヌクレオチドプライマーを鋳型核酸にアニールすること、および酵素によりオリゴヌクレオチドプライマーから伸長させて増幅産物を生成することを含む。増幅は、典型的には、デオキシリボヌクレオシド三リン酸、ＤＮＡポリメラーゼ酵素（例えば、Platinum（登録商標）Taq）、および適切な緩衝液および／またはポリメラーゼ酵素の最適な活性のための共因子（例えば、ＭｇＣｌ2および／またはＫＣｌ）の存在が必要である。
【００１６】
用語「プライマー」は、当業者に周知のものとして本明細書では用いられており、オリゴマー化合物、主にオリゴヌクレオチドを指すが、鋳型に依存するＤＮＡポリメラーゼによりＤＮＡ合成を「刺激する(prime)」ことができる変性オリゴヌクレオチドをも指す。すなわち、例えば、オリゴヌクレオチドの３’末端は、遊離３’−ＯＨ基を提供する。この遊離３’−ＯＨ基には、さらに３’末端と５’末端とのリン酸ジエステル結合を確立する鋳型に依存するＤＮＡポリメラーゼにより「ヌクレオチド」が付加されていてもよい。これによりデオキシリボヌクレオシド三リン酸が用いられて、ピロリン酸塩が放出される。一般に、プライマーは、周知の鋳型配列に基づいて設計される。あるプライマーはセンス鎖を刺激し、他のプライマーは標的ＤＮＡまたはｃＤＮＡの相補（アンチセンス）鎖を刺激する。ＰＣＲを、均一な標的ＤＮＡまたはＲＮＡ（すなわち、同じ配列を有する標的）に対して、あるいは混合された標的ＤＮＡまたはＲＮＡ（すなわち、保存配列に隣接する異なる介在配列を有する標的）に対して行ってもよい。混合ＤＮＡ／ＲＮＡ（例えば、配列不均一性を含む）の場合、標的の配列が不一致のオリゴヌクレオチドプライマー（すなわち、寛容なオリゴヌクレオチドプライマー）に対して十分な相補性があれば、不一致のオリゴヌクレオチドプライマーでもＰＣＲ反応で機能することができる。
【００１７】
用語「ハイブリダイズする」は、１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブを増幅産物にアニールすることを指す。ハイブリダイゼーションの条件は、典型的には、オリゴヌクレオチドプローブの融解温度より低いが、そのオリゴヌクレオチドプローブの非特異的ハイブリダイゼーションを回避する温度を含む。
【００１８】
用語「５’末端から３’末端へのヌクレアーゼ活性」は、典型的には、核酸二重鎖の合成に関連した核酸ポリメラーゼの活性を指し、これによりヌクレオチドは核酸二重鎖の５’末端から離れる。
【００１９】
用語「熱安定性ポリメラーゼ」は、熱に対して安定なポリメラーゼ酵素、すなわち、鋳型に相補であるプライマー伸長生成物の形成を触媒するが、２本鎖の鋳型核酸を変性するのに必要な時間、温度を上げても不可逆的に変性しない酵素を指す。一般に、合成は各オリゴヌクレオチドプライマーの３’末端で開始されて、鋳型鎖に沿って５’末端から３’末端の方向に進む。熱安定性ポリメラーゼは、テルムス・フラブス（Thermus flavus）、テルムス・ルーバー（T. ruber）、テルムス・サーモフィルス（T. thermophilus）、テルムス・アクアティクス（T. aquaticus）、テルムス・ラクテウス（T. lacteus）、テルムス・ルベンス（T. rubens）、バシラス・ステアロテルモフィラス（Bacillus stearothermophilus）、およびメタノテルムス・フェルビデュス（Methanothermus fervidus）から単離された。それにもかかわらず、熱安定性でないポリメラーゼもまた、酵素を補充すればＰＣＲアッセイに用いることができる。
【００２０】
用語「その補体」は、所与の核酸と同じ長さで、完全に相補である核酸を指す。
【００２１】
核酸に関して用いられる場合の用語「伸長（extension, elongation）」は、追加のヌクレオチド（あるいは他の類似分子）が核酸に組み込まれる場合を指す。例えば、生体触媒（例えば、典型的にはヌクレオチドを核酸の３’末端に付加するポリメラーゼ）を組み込んだヌクレオチドにより核酸を必要に応じて伸長する。
【００２２】
２つ以上の核酸配列の文脈で用語「同一」またはパーセントの「同一性」は、例えば、当業者に利用可能な配列比較算法の１つ、あるいは目視検査を用いて最大一致性について比較および配列した際に２つ以上の配列または下位配列が同じか、所定の値のヌクレオチド百分率を持っていることを指す。百分率配列同一性および配列類似性を決定するのに好適な算法としては、例えば、以下の文献に記載されるBLASTプログラムが挙げられる：Altschul et al. (1990) “Basic local alignment search tool（基本局所配列検索ツール）”, J. Mol. Biol. 215:403-410, Gish et al. (1993) “Identification of protein coding regions by database similarity search（データベースの類似性検索によるタンパク質コード領域の同定）”, Nature Genet. 3:266-272, Madden et al. (1996) “Applications of network BLAST server（ネットワークBLASTサーバーの応用）”, Meth. Enzymol. 266:131-141, Altschul et al. (1997) “Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs（ギャップ付きBLASTおよびPSI-BLAST：新世代のタンパク質データベース検索プログラム）”, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, and Zhang et al. (1997) “PowerBLAST: A new network BLAST application for interactive or automated sequence analysis and annotation（PowerBLAST：相互作用または自動配列分析および注釈のための新たなネットワークBLASTの応用）”, Genome Res. 7:649-656.
【００２３】
オリゴヌクレオチドの文脈における用語「修飾ヌクレオチド」は、オリゴヌクレオチド配列の少なくとも１個のヌクレオチドをそのオリゴヌクレオチド配列に所望の特性をもたらす異なるヌクレオチドで置換するような変化を指す。本明細書で記載するオリゴヌクレオチドの中で置換することができる修飾ヌクレオチドとしては、例えば、Ｃ５−メチル−ｄＣ、Ｃ５−エチル−ｄＣ、Ｃ５−メチル−ｄＵ、Ｃ５−エチル−ｄＵ、２，６−ジアミノプリン、Ｃ５−プロピニル−ｄＣ、Ｃ５−プロピニル−ｄＵ、Ｃ７−プロピニル−ｄＡ、Ｃ７−プロピニル−ｄＧ、Ｃ５−プロパルギルアミノ−ｄＣ、Ｃ５−プロパルギルアミノ−ｄＵ、Ｃ７−プロパルギルアミノ−ｄＡ、Ｃ７−プロパルギルアミノ−ｄＧ、７−デアザ−２−デオキシキサントシン、ピラゾロピリミジン類縁体、擬似ｄＵ、ニトロピロール、ニトロインドール、２’−０−メチルリボ−Ｕ、２’−０−メチルリボ−Ｃ、Ｎ４−エチル−ｄＣ、Ｎ６−メチル−ｄＡなどが挙げられる。本開示のオリゴヌクレオチドの中で置換することができる多くの他の修飾ヌクレオチドは、本明細書で述べるか、そうでなければ当該分野で周知である。特定の態様では、修飾ヌクレオチド置換体は、対応する無変性オリゴヌクレオチドの融解温度に対してオリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）を修正する。さらに例示すると、態様によっては、特定の修飾ヌクレオチド置換体は、非特異的な核酸増幅を低減する（例えば、プライマー２量体の形成などを最少にする）、意図する標的増幅産物の歩留まりを高めることができる。これら核酸修飾の種類の例が、例えば、米国特許第６，００１，６１１号に記載されている。
【００２４】
本明細書で記載するオリゴヌクレオチドプローブの３’末端に向かうヘアピン構造の文脈において本明細書で用いられる用語「天然に出現しないヌクレオチド」は、天然の配列（例えば、野生型配列）の中の天然に出現しないヌクレオチドであるヌクレオチドを指す。そのような天然に出現しないヌクレオチドは、例えば、ＡがＧに変化したヌクレオチドであってもよく、あるいは、例えば、Ｇがその配列に挿入された付加型の天然に出現しないヌクレオチドであってもよい。ヘアピン構造を作るために天然に出現しないヌクレオチドを天然の配列に含有するように設計してもよい。換言すれば、天然の配列を遺伝子操作して、天然にはヘアピン構造が出現しないところにヘアピン構造を発生させてもよい。天然の配列に少なくとも１個の天然に出現しないヌクレオチドを変化、すなわち付加して３’末端に向かうヘアピン構造を含むように天然の配列を設計してもよい。例えば、ヘアピン構造を作るために、１個、２個、３個、４個、５個、６個、または７個の天然に出現しないヌクレオチドを天然の配列に含有させてもよい。態様によっては、ヘアピン構造を作るために、例えば１〜７個、１〜５個、１〜３個、３〜７個、３〜５個、または５〜７個の天然に出現しないヌクレオチドを天然の配列に含有させてもよい。特定の態様では、天然に出現しないヌクレオチドはまた、修飾ヌクレオチドを含んでいてもよい。
標的核酸およびオリゴヌクレオチド
【００２５】
この記載では、標的核酸配列の一部を増幅して標的核酸のＳＮＰを検出する方法が提供される。これら標的核酸配列は、例えば、リファンピシン耐性のＨＩＶ、ＨＣＶ、またはＭＴＢから、例えば、標的核酸配列に１つ以上のＳＮＰを含むことが分かっている、あるいは疑われる任意の標的核酸配列であってもよい。
【００２６】
標的核酸配列のＳＮＰを検出する場合、標的核酸配列を増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマーおよびオリゴヌクレオチドプローブを準備してもよい。また、当業者により、通常の方法を用いて機能多様体の特異性および／または感度について評価することができる。典型的な機能多様体としては、例えば、本明細書に開示するオリゴヌクレオチドプライマーおよび／またはオリゴヌクレオチドプローブにおける１つ以上の欠失、挿入、および／または置換が挙げられる。例えば、１種の元のオリゴヌクレオチドプライマーおよびオリゴヌクレオチドプローブ、またはその補体に対して少なくとも、例えば、８０％、９０％、または９５％の配列同一性を有する、上記オリゴヌクレオチドプライマーまたはオリゴヌクレオチドプローブの実質的に同一である多様体を提供してもよい。
【００２７】
それぞれの元の配列に比べて、本明細書で記載する方法、キット、または加水分解プローブで同程度あるいはより高い特異性および感度を提供するオリゴヌクレオチドプライマーおよび／またはオリゴヌクレオチドプローブのいずれかの機能的に活性な多様体を同定してもよい。
【００２８】
上述のように、オリゴヌクレオチドプライマー（および／またはオリゴヌクレオチドプローブ）は化学的に変性されていてもよい。すなわち、オリゴヌクレオチドプライマーおよび／またはオリゴヌクレオチドプローブは、修飾ヌクレオチドまたは非ヌクレオチド化合物を含んでいてもよい。したがって、オリゴヌクレオチドプローブ（またはオリゴヌクレオチドプライマー）は変性オリゴヌクレオチドである。「修飾ヌクレオチド」（「ヌクレオチド類縁体」）は、何らかの修飾により天然の「ヌクレオチド」とは異なるが、塩基化合物または塩基性化合物、ペントフラノシル糖またはペントフラノシル糖状化合物、リン酸塩部分またはリン酸塩状部分、あるいはこれらの組み合わせからなる。例えば、「標識」は「ヌクレオチド」の塩基部分に付加してもよく、これにより「修飾ヌクレオチド」が得られる。「ヌクレオチド」の天然の塩基は、例えば、７−デアザプリンによって置換してもよく、これによっても「修飾ヌクレオチド」が得られる。本願では、用語「修飾ヌクレオチド」または「ヌクレオチド類縁体」は、互いに言い換え可能である。「変性ヌクレオシド」（または「ヌクレオシド類縁体」）は、「修飾ヌクレオチド」（または「ヌクレオチド類縁体」）について上述したように何らかの修飾により天然のヌクレオシドとは異なる。
【００２９】
標的核酸配列を増幅する変性オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド類縁体を含むオリゴヌクレオチドは、例えば、コンピュータプログラム（例えば、OLIGO（Molecular Biology Insights Inc.、コロラド州カスケード）など）を用いて設計してもよい。増幅プライマーとして用いられるオリゴヌクレオチドを設計する際に重要な特徴としては、（例えば、電気泳動による）検出を容易にするための適切な増幅産物のサイズ、オリゴヌクレオチドプライマー対のそれぞれが同程度の融解温度を有すること、および各オリゴヌクレオチドプライマーの長さ（すなわち、これらのオリゴヌクレオチドプライマーは、配列特異性によりアニールし、合成を開始するのに十分な長さであるが、オリゴヌクレオチド合成中に忠実度が低下する程の長さではないことが求められる）などが挙げられるが、これらに限定されない。典型的には、オリゴヌクレオチドプライマーの長さは、８〜５０ヌクレオチド、特に１０〜４０ヌクレオチド、または１２〜４０ヌクレオチド（例えば、長さが８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、または５０ヌクレオチド）である。
【００３０】
１組のオリゴヌクレオチドプライマーに加えて、標的核酸配列のＳＮＰの有無を検出するため、本方法は、二本鎖のオリゴヌクレオチドプローブを用いてもよい。用語「プローブ」は、合成により、あるいは生物学的に生成された核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を指す。プローブは、設計または選択により、規定した所定の厳密さでプローブが特異的に（すなわち、優先的に）「標的核酸」にハイブリッドすることを可能にする特定のヌクレオチド配列を含む。「プローブ」は、標的核酸を検出することを意味する「検出プローブ」として言及される場合がある。
【００３１】
態様によっては、上記のオリゴヌクレオチドプローブは、少なくとも１種の蛍光標識により標識されていてもよい。一態様では、オリゴヌクレオチドプローブは供与体蛍光部位（例えば、蛍光色素）および対応する受容体蛍光部位（例えば、クエンチャー）で標識されていてもよい。本明細書では、前記第一の相互作用標識は、前記オリゴヌクレオチドプローブの５’末端付近または５’末端に位置してもよく、前記第二の相互作用標識は、前記オリゴヌクレオチドプローブの内側または３’末端に位置してもよい。態様によっては、前記第一の相互作用標識は、例えば、前記オリゴヌクレオチドプローブの５’末端に共有結合した蛍光色素分子部位であってもよく、前記第二の相互作用標識は、例えば、前記オリゴヌクレオチドプローブの内側または３’末端に共有結合した受容体蛍光部位であってもよい。他の態様では、前記第一の相互作用標識は、例えば、前記オリゴヌクレオチドプローブの５’末端に共有結合した受容体蛍光部位であってもよく、前記第二の相互作用標識は、例えば、前記オリゴヌクレオチドプローブの内側または３’末端に結合した蛍光色素分子部位であってもよい。態様によっては、前記受容体蛍光部位はクエンチャーである。
【００３２】
ＴａｑＭａｎ加水分解プローブとして用いられるオリゴヌクレオチドの設計は、オリゴヌクレオチドプライマーの設計と同様に行ってもよい。本開示の態様は、前記増幅産物を検出するのに二本鎖のオリゴヌクレオチドプローブを用いてもよい。態様によっては、前記オリゴヌクレオチドプローブは、少なくとも１つの標識および／または少なくとも１つのクエンチャー部位を含んでいてもよい。オリゴヌクレオチドプライマーと同様に、オリゴヌクレオチドプローブは、通常、同程度の融解温度を有し、各オリゴヌクレオチドプローブの長さは、配列に特異的なハイブリダイゼーションを起こすのに十分であるが、合成時に忠実度を低下させる程ではない長さでなければならない。オリゴヌクレオチドプローブの長さは、一般に、ヌクレオチドが４０個以下、特にヌクレオチドが１２〜４０個、１５〜４０個、および１５〜３０個（例えば、１６個、１８個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、または２５個）である。
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
【００３３】
米国特許第４，６８３，２０２号、第４，６８３，１９５号、第４，８００，１５９号、および第４，９６５，１８８号には従来のＰＣＲ技術が開示されている。米国特許第５，２１０，０１５号、第５，４８７，９７２号、第５，８０４，３７５号、第５，８０４，３７５号、第６，２１４，９７９号、および第７，１４１，３７７号にはリアルタイムＰＣＲおよびＴａｑＭａｎ（登録商標）技術が開示されている。ＰＣＲは、典型的には、選択された核酸鋳型（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）に結合する２本のオリゴヌクレオチドプライマーを用いる。記載される態様に有用なオリゴヌクレオチドプライマーは、標的核酸配列内の核酸合成の開始点として作用することができるオリゴヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドプライマーは、従来の方法により制限消化物から精製してもよく、あるいは合成により作製してもよい。前記オリゴヌクレオチドプライマーは、増幅の最大効率のためには一本鎖であることが好ましいが、２本鎖であってもよい。２本鎖のオリゴヌクレオチドプライマーをまず変性して、すなわち、処理して２本鎖を分離する。二本鎖の核酸を変性する方法の１つは加熱である。
【００３４】
前記鋳型核酸が２本鎖である場合、ＰＣＲで鋳型として用いることが可能になる前にこれら２本の鎖を分離する必要がある。鎖の分離は、物理的手段、化学的手段、または酵素手段を含む任意の好適な変性方法により達成されてもよい。前記核酸二重鎖を分離する方法の１つは、核酸が主に変性する（例えば、５０％超、６０％超、７０％超、８０％超、９０％超、または９５％超、変性する）まで加熱することを含む。鋳型核酸を変性するのに必要な加熱条件は、例えば、緩衝液の塩濃度、および変性する核酸の長さおよびヌクレオチド組成に依存するが、典型的には、温度および核酸の長さなど、反応の特徴に応じた時間で約９０℃〜約１０５℃の範囲である。変性は、典型的には、約３０秒〜約４分間（例えば、１分〜２分３０秒間、または１．５分間）行われる。
【００３５】
２本鎖の鋳型核酸を熱で変性する場合、標的核酸分子の標的配列への各オリゴヌクレオチドプライマーのアニールを促進する温度まで反応混合物を冷却する。アニーリング温度は、通常、約３５℃〜約６５℃（例えば、約４０℃〜約６０℃、約４５℃〜約５０℃）である。アニーリング時間は、約１０秒から約１分（例えば、約２０秒から約５０秒、約３０秒から約４０秒）であってもよい。次いで、反応混合物を、ポリメラーゼの活性が促進される、すなわち最適になる温度、すなわち、アニールされたオリゴヌクレオチドプライマーから伸長が起きて鋳型核酸に相補な生成物が生成されるのに十分な温度に調整する。この温度は、核酸鋳型にアニールされた各オリゴヌクレオチドプライマーから伸長生成物を生成するのに十分であるが、その相補な鋳型からの伸長生成物を変性する程高い温度であってはならない（例えば、伸長温度は、一般に約４０℃〜約８０℃の範囲（例えば、約５０℃〜約７０℃、約６０℃）である）。伸長時間は、約１０秒〜約５分間（例えば、約３０秒〜約４分、約１分〜約３分、約１分３０秒〜約２分）であってもよい。
【００３６】
ＰＣＲアッセイは、標的核酸、例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を用いてもよい。鋳型核酸は精製する必要がない。鋳型核酸は、複合混合物（例えば、ヒトの細胞に含まれる標的核酸など）の小画分であってもよい。標的核酸分子は、Diagnostic Molecular Microbiology: Principles and Applications（診断分子微生物学：原理と応用））(Persing et al. (eds), 1993, American Society for Microbiology, Washington D.C.)で記載される技術など、通常の技術により生体試料から抽出してもよい。任意の数の供給源、例えば、プラスミド、天然源（バクテリア、酵母菌、ウイルス、細胞小器官を含む）、あるいは高等生物（植物または動物）から核酸を得てもよい。
【００３７】
プライマー伸長を誘導する反応条件で前記オリゴヌクレオチドプライマーをＰＣＲ試薬と合わせる。例えば、鎖伸長反応は、一般に、５０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ：８．３）、１５ｍＭのＭｇＣｌ2、０．００１％（ｗ／ｖ）のゼラチン、０．５〜１．０μｇの変性済み鋳型ＤＮＡ、５０ｐｍｏｌの各オリゴヌクレオチドプライマー、２．５ＵのＴａｑポリメラーゼ、および１０％のＤＭＳＯ）を含む。上記反応は、通常、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、またはこれらの１種以上の類縁体をそれぞれ１５０〜３２０μＭ含む。
【００３８】
新たに生成された鎖は、反応の次の工程で用いることができる２本鎖分子を形成する。標的核酸分子に対応する増幅産物を所望量生成するのに必要な回数、鎖の分離、アニーリング、および伸長の各工程を繰り返してもよい。反応の制限因子は、反応に存在するオリゴヌクレオチドプライマー、熱安定性酵素、およびヌクレオシド三リン酸の量である。この循環工程（すなわち、変性、アニーリング、および伸長）を、少なくとも１回繰り返すことが好ましい。検出に用いる場合、循環工程数は、例えば、試料の性質に依存する。試料が核酸の複合混合物である場合、検出に十分な標的配列を増幅するのにより多くの循環工程数が必要になる。一般に、循環工程を少なくとも約２０回繰り返すが、４０回、６０回、あるいは１００回繰り返してもよい。
【００３９】
蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）
ＦＲＥＴ技術（例えば、米国特許第４，９９６，１４３号、第５，５６５，３２２号、第５，８４９，４８９号、および第６，１６２，６０３号を参照のこと）は、供与体蛍光部位および対応する受容体蛍光部位が互いの特定の距離以内に位置する場合に、これら２つの蛍光部位間でエネルギー移動が起こり、蛍光部位を視覚化、あるいは検出および／または定量化することができるという概念に基づいている。典型的には、好適な波長を有する光放射により供与体が励起されると、供与体は受容体にエネルギーを移動する。典型的には、受容体は、異なる波長を有する光放射の形態で移動されたエネルギーを再放出する。特定の系では、非蛍光エネルギーは、実質的に非蛍光供与体部位を含む生体分子により供与体部位と受容体部位の間を移動させることができる（例えば、米国特許第７，７４１，４６７を参照のこと）。
【００４０】
一例では、オリゴヌクレオチドプローブは、供与体蛍光部位および対応するクエンチャーを含んでいてもよい。このクエンチャーは、蛍光性であってもなくてもよい。また、光以外の形態で移動されたエネルギーを放出する。オリゴヌクレオチドプローブが損傷を受けていなければ、エネルギー移動は典型的には、供与体蛍光部位からの蛍光放射を消すようにこれら２つの蛍光部位の間で起こる。ポリメラーゼ連鎖反応の伸長工程時に、増幅産物に結合したオリゴヌクレオチドプローブは、供与体蛍光部位の蛍光放射がもはや消されないように、例えば、Ｔａｑポリメラーゼの５’末端から３’末端へのヌクレアーゼ活性により開裂する。この目的のためのオリゴヌクレオチドプローブの例は、例えば、米国特許第５，２１０，０１５号、第５，９９４，０５６号、および第６，１７１，７８５号に記載されている。一般に用いられる供与体−受容体の対としては、ＦＡＭ−ＴＡＭＲＡの対が挙げられる。一般に用いられるクエンチャーはＤＡＢＣＹＬおよびＴＡＭＲＡである。一般に用いられるダーククエンチャー（熱放散クエンチャー）としては、BlackHole Quenchers（登録商標）(BHQ), （Biosearch Technologies, Inc.、カリフォルニア州ノバート）、Iowa Black（登録商標）、（Integrated DNA Tech., Inc.、アイオワ州コーラルヴィル）、BlackBerry（登録商標）Quencher 650 (BBQ-650)（Berry & Assoc.、ミシガン州デクスター）などが挙げられる。
【００４１】
蛍光分析は、例えば、光子計測落射蛍光顕微鏡システム（特定の範囲で蛍光放射を監視するための適切なダイクロイックミラー（二色鏡）および蛍光放射フィルターを含む）、光子計測光電子増倍管システム、または蛍光光度計を用いて行うことができる。アルゴンイオンレーザ、高輝度水銀（Ｈｇ）アークランプ、光ファイバー光源、または所望の範囲の励起を適切にフィルターする他の高輝度光源を用いて、励起を行い、エネルギー移動を開始する、あるいは蛍光色素分子の直接検出を可能にしてもよい。
【００４２】
供与体および対応する受容体蛍光部位に関して本明細書で用いられる用語「対応する」は、供与体蛍光部位の発光スペクトルに重なる吸光度スペクトルを有する受容体蛍光部位を指す。受容体蛍光部位の発光スペクトルの波長極大は、供与体蛍光部位の励起スペクトルの波長極大よりも少なくとも１００ｎｍ大きくなければならない。これにより、これらの部位の間で効率的な非放射性のエネルギー移動が起こり得る。
【００４３】
蛍光供与体および対応する受容体部位は、一般に（ａ）フェルスターエネルギー移動効率が高いこと、（ｂ）最終ストークシフトが大きいこと（＞１００ｎｍ）、（ｃ）放射のシフトが可視光スペクトルの赤色部分（＞６００ｎｍ）からできるだけ離れていること、および（ｄ）放射が、供与体の励起波長での励起により生じるラマン水蛍光発光よりも高い波長にシフトすること、を考慮して選択される。例えば、レーザー線付近（例えば、ヘリウムーカドミウム：４４２ｎｍ、またはアルゴン：４８８ｎｍ）に励起極大を有し、高い減衰係数、高い量子収率、および対応する受容体蛍光部位の励起スペクトルとよく重なる蛍光放射を有する供与体蛍光部位を選択してもよい。高い減衰係数、高い量子収率、供与体蛍光部位の放射とよく重なる励起、および可視光スペクトルの赤色部分の放射（＞６００ｎｍ）を有する対応する受容体蛍光部位を選択してもよい。
【００４４】
ＦＲＥＴ技術で様々な受容体蛍光部位と共に用いることができる典型的な供与体蛍光部位としては、フルオレセイン、ルシファーイエロー、Ｂ−フィコエリスリン、９−アクリジンイソチオシアン酸塩、ルシファーイエローＶＳ、４−アセトアミド−４’−イソチオシアナトスチルベン−２，２’−ジスルホン酸、７−ジエチルアミノ−３−（４’−イソチオシアナトフェニル）−４−メチルクマリン、１−ピレンブチル酸スクシンイミジル、および４−アセトアミド−４’−イソチオシアナトスチルベン−２，２’−ジスルホン酸誘導体などが挙げられる。用いられる供与体蛍光部位に応じた典型的な受容体蛍光部位としては、LC Red 640、LC Red 705、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｌｉｓｓａｍｉｎｅ塩化スルホニルローダミンＢ、イソチオシアン酸テトラメチルローダミン、イソチオシアン酸ローダミンｘ、イソチオシアン酸エリトロシン、フルオレセイン、五酢酸ジエチレトリアミン、またはランタノイドイオン（例えば、ユウロピウム、またはテルビウム）のその他のキレートなどが挙げられる。供与体蛍光部位および受容体蛍光部位は、例えば、Molecular Probes（オレゴン州ジャンクションシティ）、またはSigma Chemical Co.（ミズーリ州セントルイス）から入手してもよい。
【００４５】
これら供与体蛍光部位および受容体蛍光部位は、リンカー腕により適切なプローブオリゴヌクレオチドに結合させることができる。各リンカー腕の長さが重要である。というのは、リンカー腕は、供与体蛍光部位と受容体蛍光部位の距離に影響を及ぼすからである。本開示の目的のためにリンカー腕の長さは、ヌクレオチドの塩基から蛍光部位までの距離がオングストローム（Å）単位の距離である。一般に、リンカー腕は約１０Å〜約２５Åである。リンカー腕は、ＷＯ８４／０３２８５に記載されたようなものであってもよい。ＷＯ８４／０３２８５はまた、リンカー腕を特定のヌクレオチドの塩基に結合させる方法、および蛍光部位をリンカー腕に結合させる方法を開示している。
【００４６】
受容体蛍光部位（例えば、LC Red 640）は、アミノリンカー（例えば、ABI（カリフォルニア州フォスターシティ）またはGlen Research（ヴァージニア州スターリング）から入手可能なＣ６−アミノホスホラミダイト）を含むオリゴヌクレオチドを合わせて、LC Red 640で標識したオリゴヌクレオチドを作製してもよい。供与体蛍光部位（例えば、フルオレセイン）をオリゴヌクレオチドに結合させるのに頻繁に用いられるリンカーとしては、チオ尿素リンカー（ＦＩＴＣ由来、例えば、Glen ResearchまたはChemGene（マサチューセッツ州アッシュランド）から入手可能なフルオレセイン−ＣＰＧ）、アミドリンカー（フルオレセイン−ＮＨＳ−エステル由来（例えば、BioGenex（カリフォルニア州サンラモン）から入手可能なＣＸ−フルオレセイン−ＣＰＧ）、あるいはオリゴヌクレオチド合成後にフルオレセイン−ＮＨＳ−エステルとのカップリングが必要な３’−アミノ−ＣＰＧなどが挙げられる。
標的核酸のＳＮＰの検出
【００４７】
本開示は、生体試料中の標的核酸のＳＮＰの有無を検出する方法を提供する。提供されるこれらの方法は、試料の汚染、偽陰性率、および偽陽性率の問題を回避する。上記方法は、オリゴヌクレオチドプライマー対を用いて試料に由来する標的核酸分子の部分を増幅することを含む少なくとも１つの循環工程、および二本鎖のＳＮＰ特異性加水分解プローブを用いた蛍光検出工程を行うことを含む。態様によっては、前記二本鎖のオリゴヌクレオチドプローブのうちの１本の鎖は、３’末端に向かうヘアピン構造を含む。複数の循環工程を好ましくは熱サイクラーで行ってもよい。上記オリゴヌクレオチドプライマーおよびオリゴヌクレオチドプローブを用いて上記方法を行って、試料中の標的核酸のＳＮＰの存在を検出してもよい。
【００４８】
本明細書で記載するように、ＦＲＥＴ技術の利点を利用した標識されたハイブリダイゼーション加水分解プローブを用いて増幅産物を検出してもよい。１つのＦＲＥＴ形式では、増幅産物の有無、およびそれによる標的核酸の有無を検出するＴａｑＭａｎ（登録商標）技術が用いられる。ＴａｑＭａｎ（登録商標）技術では、例えば、１種の蛍光色素および１種のクエンチャー（蛍光性であってもなくてもよい）で標識した１本鎖のハイブリダイゼーション加水分解プローブ一本が用いられる。好適な波長の光で第一の蛍光部位を励起すると、ＦＲＥＴの原理に従って吸収されたエネルギーが第二の蛍光部位に移動する。第二の蛍光部位は、一般にクエンチャー分子である。ＰＣＲ反応のアニーリング工程中に、上記標識されたハイブリダイゼーションプローブは、標的ＤＮＡ（すなわち、増幅産物）に結合して、続く伸長相の時に例えば、Ｔａｑポリメラーゼの５’末端から３’末端へのヌクレアーゼ活性により分解される。その結果、蛍光部位およびクエンチャー部位は、互いに空間的に離れる。その結果、クエンチャーの非存在下で第一の蛍光部位が励起すると、第一の蛍光部位からの蛍光放射を検出することができる。一例として、ABI PRISM（登録商標）7700配列検出システム（アプライドバイオシステムズ社）は、ＴａｑＭａｎ（登録商標）技術を用いており、試料中の標的核酸の有無を検出するための本明細書で記載する方法を実行するのに好適である。
【００４９】
一般に、ＦＲＥＴの存在は、試料中の標的核酸にＳＮＰが存在することを意味し、ＦＲＥＴが存在しないことは、試料にＳＮＰが存在しないことを意味する。しかしながら、試料の不適切な回収、輸送の遅延、不適切な輸送条件、あるいは特定の回収用具（アルギン酸カルシウムまたはアルミニウムのシャフト）の使用はすべて、検査結果の出来および／または確度に影響を及ぼす可能性がある条件である。本明細書に開示する方法を用いて、例えば、４５回の循環工程内でＦＲＥＴが検出されると、試料中の標的核酸にＳＮＰが存在することを意味する。
【００５０】
本開示の方法を実践するのに用いることができる代表的な生体試料としては、例えば、皮膚の拭き取り検体、鼻の拭き取り検体、傷の拭き取り検体、血液培養物、皮膚、および軟組織感染部が挙げられるが、これらに限定されない。生体試料の回収および保存方法は、当業者に周知のである。生体試料は、（例えば、当該分野で周知の核酸抽出方法および／またはキットにより）処理して標的核酸を放出させてもよく、場合によっては、生体試料を直接ＰＣＲ反応成分および適切なオリゴヌクレオチドと接触させてもよい。
【００５１】
熱サイクラーの各実行回で対照試料も循環させてもよい。陽性対照試料では、例えば、対照プライマーおよび対照プローブを用いて、標的核酸の対照鋳型（上記の標的遺伝子の増幅産物以外）を増幅してもよい。また、陽性対照試料では、例えば、標的核酸分子を含むプラスミド構築物を増幅してもよい。このようなプラスミド対照は、内部で（例えば、試料内で）増幅してもよく、あるいは、意図した標的の検出に用いたのと同じオリゴヌクレオチドプライマーおよびオリゴヌクレオチドプローブを用いて患者の試料と並べて実行した別の試料中で増幅してもよい。このような対照は、増幅、ハイブリダイゼーション、および／またはＦＲＥＴ反応の出来、不出来を示すものである。また、熱サイクラーの各実行回は、例えば、標的鋳型ＤＮＡを欠く陰性対照を含んでいてもよい。陰性対照は、汚染を測定する。これにより、確実にシステムおよび試薬が偽陽性信号を生じないようにする。したがって、対照反応は、例えば、配列特異性によってアニールし、伸長を開始するオリゴヌクレオチドプライマーの能力、配列特異性によってハイブリッドするオリゴヌクレオチドプローブの能力、およびＦＲＥＴが生じることを容易に決定することができる。
【００５２】
一態様では、前記方法は、汚染を回避するための工程を含む。例えば、ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼを用いた酵素法が米国特許第５，０３５，９９６号、第５，６８３，８９６号に記載されている。また、ある熱サイクラーのある実行回と次の実行回の間で汚染を低減あるいは除去する方法が米国特許第５，９４５，３１３号に記載されている。
【００５３】
従来のＰＣＲ法をＦＲＥＴ技術と併用して、本開示の方法を実践してもよい。一態様では、LightCycler（登録商標）装置が用いられる。以下の特許出願では、LightCycler（登録商標）技術に用いられるリアルタイムＰＣＲが記載されている：ＷＯ９７／４６７０７、ＷＯ９７／４６７１４、およびＷＯ９７／４６７１２。
【００５４】
LightCycler（登録商標）は、ＰＣワークステーションを用いて操作するができ、Windows NTオペレーションシステムを利用することができる。機械が順次、細管（capillaries）を光学ユニットにかざして、試料からの信号を得る。ソフトウェアは、各測定の直後にリアルタイムで蛍光信号を表示することができる。蛍光が得られるまでの時間は１０〜１００ミリ秒（ｍｓｅｃ）である。各循環工程後に、すべての試料について蛍光の定量的な表示とサイクル数を絶えず更新することができる。生成されたデータは、さらなる分析のために保存することができる。
【００５５】
自明であるが、本開示の態様は、１つ以上の市販の装置の構成によって限定されない。
【００５６】
製造品／キット
本開示はさらに、標的核酸のＳＮＰを検出するための製造品またはキットを提供する。製造品は、好適な梱包材料と共に、本明細書で記載するＳＮＰを検出するのに用いられるオリゴヌクレオチドプライマーおよび二本鎖のオリゴヌクレオチドプローブを含んでいてもよい。ＳＮＰを検出するための代表的なオリゴヌクレオチドプライマーおよびオリゴヌクレオチドプローブは標的核酸分子をハイブリダイズすることができる。また、前記キットは、ＤＮＡの固定、ハイブリダイゼーション、および検出に必要な好適に包装された試薬および材料、例えば、固体支持体、緩衝液、酵素、およびＤＮＡ標準物質を含んでいてもよい。オリゴヌクレオチドプライマーおよびオリゴヌクレオチドプローブを設計する方法は本明細書で開示され、標的核酸のＳＮＰに対して増幅およびハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーおよびオリゴヌクレオチドプローブの代表的な例が示される。
【００５７】
また、製造品は、オリゴヌクレオチドプローブを標識するための１つ以上の蛍光部位を含んでいてもよく、あるいはキットと共に供給されるオリゴヌクレオチドプローブを標識してもよい。例えば、製造品は、ＳＮＰ特異性オリゴヌクレオチドプローブを標識するための供与体および／または受容体蛍光部位を含んでいてもよい。好適なＦＲＥＴ供与体蛍光部位および対応する受容体蛍光部位の例は、上で示されている。
【００５８】
また、製造品は、上記オリゴヌクレオチドプライマーおよびオリゴヌクレオチドプローブを用いて試料中の標的核酸のＳＮＰを検出するための指示を含む包装袋の折り込みまたは包装袋のラベルを含んでいてもよい。また、製造品は、本明細書で開示される方法を実行するための試薬（例えば、緩衝液、ポリメラーゼ酵素、共因子、または汚染を防止するための試薬）を含んでいてもよい。そのような試薬は、本明細書に記載される市販の装置のいずれかに特定であってもよい。
【００５９】
開示された主題の態様は以下の実施例でさらに記述されるが、これらの実施例は請求項に記載される本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００６０】
以下の実施例および図は、本発明の理解を助けるために提供されるものであり、本発明の真の範囲は添付の請求項に記載される。自明であるが、本発明の精神を逸脱することなく、記載の手順に変更を加えることができる。
【００６１】
実施例１
ＭＴＢ−ＲＩＦのＴａｑＭａｎ（登録商標）によるＳＮＰの検出
結核（ＴＢ）は、一般に、ヒト型結核菌（ＭＴＢ）またはＭＴＢ複合体の他の菌により引き起こされる重篤な肺障害である。ＭＴＢの薬剤耐性菌種が増加しており、薬剤耐性結核の特に危険な形態が多剤耐性結核菌（ＭＤＲ−ＴＢ）である。ＭＤＲ−ＴＢは、最も一般に用いられる抗結核薬の少なくとも２種であるリファンピシンおよびイソニアジドに対する耐性を発達させたＭＴＢとして定義される。リファンピシン耐性の約８３〜８７％は、ＲＮＡポリメラーゼのβ下位ユニットをコードするｒｐｏＢ遺伝子の８１塩基対のリファンピシン耐性決定領域（ＲＲＤＲ）内の一ヌクレオチド多型によって生じる。
【００６２】
各プローブ鎖において５’末端の蛍光色素分子および内側クエンチャーを用いて、変異体に特異的な二本鎖のＴａｑＭａｎ（登録商標）加水分解プローブを設計した。これらオリゴヌクレオチドプローブのセンス鎖およびアンチセンス鎖のそれぞれをＳＮＰに特異的であるように、すなわち、目的のＳＮＰを含む標的のセンス変異体およびアンチセンス変異体と完全に一致し、かつその標的の野生型と同様に不一致であるように設計した。また、態様によっては、１個以上の追加の塩基を、オリゴヌクレオチドプローブの３’末端に導入して、３’末端に向かうヘアピン構造を得た。ＷＴとＭＴの不一致がオリゴヌクレオチドプローブの各鎖の５’末端付近のレポーターとクエンチャーの間に位置するようにオリゴヌクレオチドプローブを設計した。ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブに損傷がなければ、レポーターおよびクエンチャーは互いに近くに留まって、任意の蛍光放射を防止する。
【００６３】
ＰＣＲでは変性に続いて、前記オリゴヌクレオチドプライマーおよびＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを相補ＤＮＡ鎖にアニールする。ハイブリダイゼーションの後およびＰＣＲの伸長相の間に、ＤＮＡポリメラーゼの５’末端から３’末端へのヌクレアーゼ活性により、前記オリゴヌクレオチドプローブが開裂して、レポーター色素とクエンチャー色素を分離させ、蛍光が検出される。ヘアピン構造を含む態様では、前記オリゴヌクレオチドプローブの３’末端付近のヘアピン構造は、オリゴヌクレオチドプローブの３’末端半分が鋳型にハイブリダイズするのを遅らせて、それにより一塩基対の違い、すなわち不一致に基づいてＷＴ標的とＭＴ標的を識別するのを補助する。ＭＴヘアピンＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブの５’末端半分は、ＷＴ鋳型に比べて、より効率的にＭＴプラスミドＤＮＡ鋳型にハイブリダイズする。このＭＴに特異的なオリゴヌクレオチドプローブがＷＴ標的に出会うと、このＷＴ標的に対する１個の不一致によりハイブリダイゼーションおよびプローブの開裂が防止されて、蛍光はほとんど、あるいは全く検出されない。
【００６４】
材料および方法
ＤＮＡ標的：野生型（ＷＴ）プラスミドおよび変異型（ＭＴ）プラスミド
ＭＴプラスミドおよびＷＴプラスミドのＤＮＡ：表Ｉに示す１×１０6ｃｐ／ＰＣＲから１０ｃｐ／ＰＣＲの範囲の入力を試験した。表Ｉは、ヒト型結核菌のｒｐｏＢ遺伝子のリファンピシン耐性決定領域（ＲＲＤＲ）の部分を示す。
【表１】
0006741665.tif 000002
【００６５】
ＭＴＢに特異的なオリゴヌクレオチド：野生型プラスミドおよび変異体プラスミドの両方に対する１組のオリゴヌクレオチド正プライマーおよび逆プライマー
変異体に特異的な二本鎖のＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを表ＩＩに示す。
【表２】
0006741665.tif 000003
【００６６】
符号：ＥはＴｈｒｅｏ−ＨＥＸ、Ｐはリン酸塩、ＱはＢＨＱ−２クエンチャー、ＬはプロピニルｄＣ、ＵはプロピニルｄＵを表す。二重下線の付いた文字は、ＳＮＰの部位である。太字下線の付いた文字はヘアピンを形成するために変更または付加された塩基である。
【００６７】
フラットフォーム：LightCycler（登録商標）４８０システム
１組の正プライマーおよび逆プライマー、および二本鎖のＳＮＰに特異的なＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを用いてリアルタイムＰＣＲによる増幅を行った。野生型または変異体プラスミドＤＮＡを１×１０6ｃｐ／ＰＣＲ、１×１０2ｃｐ／ＰＣＲ、１×１０3ｃｐ／ＰＣＲ、および１×１０1ｃｐ／ＰＣＲで検査した。ＰＣＲ反応体積は５０ｕＬであり、主要混合成分および熱特性条件は以下に示す。ＬＣ４８０プラットフォームで増幅を行い、ＡＴＦデータ分析ソフトウェアを用いてＰＣＲ成長曲線を分析した。結果を図１〜図６に示す。
【００６８】
上記発明を明確さおよび理解のために幾分詳細に記述したが、本開示を読めば当業者には自明であるが、形態および詳細に様々な変更を行うことができる。例えば、上記のすべての技術および装置は、様々な組み合わせで用いることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
0006741665.tif 000007
【図５】
0006741665.tif 000008
【図６】
0006741665.tif 000009
【配列表】
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