(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
グリチルリチン酸および／またはその塩を含有する、強皮症予防および／または治療剤。
【請求項２】
前記グリチルリチン酸の塩が、アンモニウム塩またはアルカリ金属塩である、請求項１に記載の強皮症予防および／または治療剤。
【請求項３】
前記強皮症が、全身性強皮症である、請求項１または２に記載の強皮症予防および／または治療剤。
【請求項４】
グリチルリチン酸および／またはその塩を含有する、内皮間葉移行に基づく血管障害の予防および／または治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グリチルレチン酸類および／またはその塩を含有する、強皮症予防および／または治療剤に関する。また、本発明は、グリチルレチン酸類および／またはその塩を含有する、Ｔｈ２亢進抑制剤または血管安定化剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
強皮症は、血管の病変、皮膚や様々な内臓の線維化を特徴とする多臓器に亘る自己免疫疾患である。強皮症の原因は未だ不明であり、寛解に導く治療法も確立していないが、現状においては、早期の患者に対しては副腎皮質ステロイド薬が一般的に使用され、また肺の症状に対しては免疫抑制薬が一般的に使用される。一方、病態である皮膚等の線維芽細胞の活性化によるコラーゲンなど、細胞外基質の蓄積の抑制も考慮の対象であるが、このような効果を示す薬剤は見出されていない。
【０００３】
一方、グリチルリチン酸等のグリチルレチン酸類は、漢方において古来より用いられている甘草の主薬効成分であり、日本において、抗アレルギー剤、肝線維症（非特許文献１）などの治療剤として開発され、その有効性と安全性は広く認められている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Life Sciences, Volume 83, Issues 15-16, 2008, Pages 531-539
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、未だ原因不明である強皮症の予防および／または治療剤を提供することである。本発明のさらなる目的は、Ｔｈ２亢進抑制剤および血管安定化剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は上記課題を解決するために鋭意検討を行った。その結果、グリチルリチン酸等のグリチルレチン酸類および／またはその塩が、強皮症の治療に有効であること、Ｔｈ２亢進抑制作用および血管安定化作用を有することを知見し、本発明を完成した。
【０００７】
すなわち、本発明は以下を提供する。
［１］グリチルレチン酸類および／またはその塩を含有する、強皮症予防および／または治療剤。
［２］前記グリチルレチン酸類が、グリチルリチン酸である、［１］に記載の強皮症予防および／または治療剤。
［３］前記グリチルレチン酸類の塩が、アンモニウム塩またはアルカリ金属塩である、［１］または［２］に記載の強皮症予防および／または治療剤。
［４］前記強皮症が、全身性強皮症である、［１］〜［３］のいずれか一に記載の強皮症予防および／または治療剤。
［５］グリチルレチン酸類および／またはその塩を含有する、Ｔｈ２亢進抑制剤。
［６］グリチルレチン酸類および／またはその塩を含有する、血管安定化剤。
【発明の効果】
【０００８】
グリチルレチン酸類および／またはその塩は、Ｔｈ２亢進状態を抑制し、炎症反応および線維化を改善し、血管を安定化させて、強皮症を予防または治療する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】（A）ブレオマイシン（BLM）誘発強皮症モデルマウスにおいて、グリチルリチン酸投与による真皮厚の変化を測定した結果を示す写真。（B）Aにおいて測定した真皮厚の測定結果を示すグラフ。（C）BLM誘発強皮症モデルマウスにおいて、グリチルリチン酸投与によるコラーゲン量の変化を示すグラフ。各々のコラーゲン量は、BLM誘発を行っていない対照マウスに、グリチルリチン酸の代わりに溶媒を投与した群におけるコラーゲン量を１とした相対値にて示す。
【図２】（A）BLM誘発強皮症モデルマウスの皮膚をα-平滑筋アクチン（α-SMA）で免疫染色した結果を示す写真。（B）Aにおいて、×４００倍視野内においてα-SMA染色陽性となった線維芽細胞数を示すグラフ。
【図３】（A）BLM誘発強皮症モデルマウスのリンパ節から採取されたCD4陽性細胞におけるIFN-γ、IL-4およびIL17Aの発現を、フローサイトメトリーにより評価した結果を示す。（ｂ）Aの結果をグラフ化したもの。
【図４】（A）BLM誘発強皮症モデルマウスの脾臓から採取されたCD4陽性細胞におけるIFN-γ、IL-4およびIL17Aの発現を、フローサイトメトリーにより評価した結果を示す。（ｂ）Aの結果をグラフ化したもの。
【図５】BLM誘発強皮症モデルマウスの皮膚検体を抗VE-cadherin抗体および抗fibroblast-specific protein 1（FSP1）抗体を用いて免疫染色を行った結果を示す写真。上段は抗FSP1抗体で染色した結果、中段は抗VE-cadherin抗体で染色した結果、下段は上段と中段の結果を重ね合わせた結果を示す。左の縦一列はBLM誘発を行っていない対照群、中央の縦一列はBLM誘発強皮症モデルマウスに溶媒を投与した群、右の縦一列はBLM誘発強皮症モデルマウスにグリチルリチン酸を投与した群を示す。下段の矢印は、VE-cadherinとFSP1が同時に染色されている細胞を示す。
【図６】（A）血管内皮細胞特異的Fli1欠失マウスに、溶媒またはグリチルリチン酸を投与した後、Evans blue dyeを投与し、その後解剖したマウスの真皮側から皮膚血管を観察した結果を示す写真。（B）Evans blue dyeの血管外漏出量を測定した結果を示すグラフ。各々の漏出量は、BLM誘発を行っていない対照マウスに、グリチルリチン酸の代わりに溶媒を投与した群における漏出量を１とした相対値にて示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明の実施の形態について、説明する。
本発明は、グリチルレチン酸類および／またはその塩を含有する、強皮症予防および／または治療剤に関する。また、本発明は、グリチルレチン酸類および／またはその塩を含有する、Ｔｈ２亢進抑制剤または血管安定化剤に関する。
【００１１】
（強皮症予防および／または治療剤）
強皮症は、皮膚が硬くなる皮膚障害を主な症状とする病気であり、皮膚や内臓が硬くなる変化（硬化）を特徴として慢性に経過する全身性強皮症と、皮膚のみに硬化が起こる限局性強皮症に大別される。
【００１２】
全身性強皮症は、主に、自己免疫、線維化および血管障害という３つの異常が起こる疾患であると考えられている。自己免疫の結果、抗セントロメア抗体、抗トポイソメラーゼＩ（Scl-70）抗体、抗U1RNP 抗体、抗RNA ポリメラーゼ抗体等の自己抗体が陽性となる。これらの自己抗体は、症状が起こる前に血液中に現れてくると考えられているため、これら自己抗体が陽性となった患者には、症状が現れていなくとも、予防の意味で本発明の剤を適用してもよい。
【００１３】
線維化は、線維芽細胞が活発に膠原線維を産生することにより、皮膚に過剰な膠原線維が蓄積して起こる。この過剰な膠原線維の産生は、リンパ球が皮膚において様々な細胞成
長因子やサイトカインと呼ばれる物質を産生し、それらが複雑に作用しあって線維芽細胞を刺激することにより起こると考えられている。
【００１４】
血管障害としては、レイノー症状が挙げられ、これは全身性強皮症患者のうち80％以上でみられる障害である。レイノー症状とは、寒冷や情動的ストレスに反応して手の各部に起こる血管攣縮であり、手指に可逆的な不快感および色の変化（蒼白、チアノーゼ、紅斑またはその組み合わせ）を引き起こす。また、上記線維化が血管にも起こると、血管が硬くなって血流低下を来たし、潰瘍を形成する一因となる。このような血管の硬化と血流低下は、皮膚だけではなく、内臓にも起こる。例えば、肺の血管に起こると肺高血圧症となり、腎臓の血管に起こると強皮症腎クリーゼと呼ばれる症状となる。また、強皮症の患者では、爪上皮出血点がみられることがあり、これも血管障害を反映する症状と考えられている。
【００１５】
「全身性強皮症・診断基準 2010 年」によれば、手指あるいは足趾を越える皮膚硬化を大基準とし、１）手指あるいは足趾に限局する皮膚硬化、２）手指尖端の陥凹性瘢痕、あるいは指腹の萎縮、３）両側性肺基底部の線維症、４）抗トポイソメラーゼＩ(Scl-70) 抗体または抗セントロメア抗体または抗RNA ポリメラーゼIII 抗体陽性を小基準とした場合、大基準、あるいは小基準１）かつ２）〜４）の１項目以上を満たせば、全身性強皮症と診断される。
【００１６】
限局性強皮症は、皮膚ならびにその下床である皮下脂肪織、筋および骨に線維性の硬化をきたす疾患であり、この線維性硬化が皮膚における皮疹として認識される。この皮疹は患者により非常に多種多様であり、皮膚硬化が明らかに認識される場合もある一方、陥凹局面として認識される場合もある。皮疹の色調は、紅斑を伴うものや、褐色、白色を呈することが多い。皮疹の形状から、斑状強皮症（モルフィア）と線状強皮症に分類される。線状強皮症の特殊型として、顔面・頭頸部に生じたものは剣創状強皮症と呼ばれ、頭皮に及んで脱毛を生じさせる。斑状強皮症は、皮疹の大きさや数に基づいて、限局型、滴状型、多発型に分類される。
【００１７】
本発明において、強皮症の予防とは、強皮症を発症させないことを意味する。また、強皮症予防には、発症初期等の様々な段階における強皮症症状のそれ以上の悪化を阻止または抑制することを含む。強皮症の治療とは、強皮症症状の改善、緩和、悪化の阻止または抑制することを意味する。
【００１８】
（Ｔｈ２亢進抑制剤）
ヘルパーＴ細胞のサブセットには、Ｔｈ１細胞、Ｔｈ２細胞がある。Ｔｈ１は細胞性免疫を活性化し、Ｔｈ２は体液性免疫を活性化するものであり、相互のバランスにより免疫応答が制御されている。このＴｈ１／Ｔｈ２バランスが適切に制御されないと、自己免疫疾患等の様々な疾病を起こす原因となり得る。たとえば、自己免疫疾患は、大別すると、バセドウ病等の臓器特異性のものと、強皮症等の全身性（臓器非特異性）のものとに分類されるが、一般的に、Ｔｈ１が亢進すると臓器特異性自己免疫疾患が誘発され、Ｔｈ２が亢進すると、全身性自己免疫疾患が誘発される。本発明におけるＴｈ２亢進抑制剤は、そのようなＴｈ２の亢進状態を抑制するものである。したがって、本発明におけるＴｈ２亢進抑制剤は、強皮症、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、多発性筋炎、皮膚筋炎、シェーグレン症候群、混合性結合組織病、抗リン脂質抗体症候群、顕微鏡的多発血管炎、多発血管炎性肉芽腫症等の全身性自己免疫疾患に適用可能である。
【００１９】
（血管安定化剤）
本発明における血管安定化とは、血管脆弱性および／または血管透過性が亢進した状態を改善すること、血管外漏出を改善することを指す。そのため、本発明における血管安定
化剤は、血管脆弱性、血管透過性亢進および／または血管外漏出症状を示す疾患、たとえば、血管漏出症候群、エーラスダンロス症候群、シェーンライン・ヘノッホ紫斑病または単純性紫斑病等の各種紫斑病、遺伝性出血性毛細血管拡張症（ランデュ・オスラー・ウェーバー病）等に適用可能である。他に、抗がん剤血管外漏出を予防するために、抗がん剤投与前の患者に予防措置として適用してもよい。
【００２０】
（グリチルレチン酸類および／またはその塩）
本発明におけるグリチルレチン酸類としては、５環性トリテルペン構造を含むものを意味し、例えば、グリチルリチン酸、グリチルレチン酸、１８α−グリチルレチン酸３−O-グルクロニド、グリチルレチン酸メチル、グリチルレチン酸ステアリル、グリチルレチン酸ピリドキシン、グリチルレチン酸グリセリル、ステアリン酸グリチルレチニル、およびカルベノキソロン等が挙げられるが、それらに限定されない。これらは単独で、または２種類を併用して用いることができる。それらのグリチルレチン酸類の中で、グリチルリチン酸が好ましい。また、本発明におけるグリチルレチン酸類としては、グリチルレチン酸類を含む限り、マメ科植物である甘草の粗抽出物であってもよい。
【００２１】
本発明のグリチルレチン酸類の塩としては、薬学的に許容されるものであればよく、例えばアルカリ金属（カリウム、ナトリウム等）の塩、アルカリ土類金属（カルシウム、マグネシウム等）の塩、アンモニウム塩、薬学的に許容される有機アミン（テトラメチルアンモニウム、トリエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、シクロペンチルアミン、ベンジルアミン、フェネチルアミン、ピペリジン、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、リジン、アルギニン、N-メチル-D-グルカミン等）の塩があげられる。特に、アンモニウム塩またはアルカリ金属塩が好ましく、グリチルリチン酸・２ナトリウム塩、グリチルリチン酸・２カリウム塩またはグリチルリチン酸・モノアンモニウム塩がより好ましい。これらは単独で、または２種類を併用して用いることができる。また、これら塩の定義は、上記グリチルリチン酸の脂肪酸エステル類（例えばグリチルリチン酸ステアリル、グリチルリチン酸グリセリルなど）にも適用できる。
【００２２】
本発明における剤は、単独で使用しても良いが、公知の強皮症予防・治療剤、Ｔｈ２亢進抑制剤または血管安定剤と併用して使用することも可能である。併用することによって、予防・治療効果を高めることが期待される。併用する予防・治療剤は、本発明における剤の効果を減弱または消失させない限りにおいて、本発明における剤の成分として含有させても良いし、本発明の剤とは別に製剤化して、本発明の剤と組み合わせて配置し、使用時に併用するタイプのキットとしてもよい。
【００２３】
製剤化に関しては、本発明の効果を損なわない限り、上記の有効成分以外の副成分として、必要に応じて賦形剤、滑沢剤、崩壊剤、結合剤、安定剤、界面活性剤、希釈剤、添加物、潤滑剤、防腐剤、コーティング剤等を含有させて、医薬組成物としてもよい。グリチルレチン酸類および／またはその塩の高濃度溶液は、胃などの低pH下においては、ゲル化のおそれがある。それを防止するには、高pH化を可能とするリン酸塩（リン酸一水素二ナトリウムやリン酸二水素カリウムなど）およびゲル化を防止する作用を有するL-アルギニンを添加することが効果的である。また、本発明における剤の製剤形態は特に限定されず、用法に応じて適宜選択できる。具体的には、錠剤、丸剤、散剤、液剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤、ゲル剤、煎じ薬等を例示できる。
【００２４】
本発明におけるグリチルレチン酸類および／またはその塩の投与量は、薬効が発現できる量であれば特に制限はなく、症状、年齢等によって異なるが、好ましくは１回量が５０〜１５０ｍｇ、より好ましくは７０〜１００ｍｇ、さらにより好ましくは８０ｍｇで、１日１〜数回投与することができる。投与方法に制限はなく、たとえば、経口投与、舌下投
与、静脈内投与、皮下投与、経皮投与および腹腔内投与等が挙げられる。投与対象は、いかなる動物であってもよいが、ヒト、マウス、ラット、サル、ウサギ、モルモット等が例示され、特にヒトが好ましい。
【実施例】
【００２５】
以下、実施例により、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はその要旨を超えない限り、これらの実施例に限定されるものではない。
【００２６】
＜実施例１＞強皮症の線維化に関する検討
8週齢のC57BL/6マウス（野生型）の背部皮膚に、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で1mg/mlとなるように調整したブレオマイシン(BLM)溶液を、300μgずつ4週間連日皮内注射し、BLM誘発強皮症モデルマウスを作製した。対照群は、同量のPBSを皮下注射した。また、同時に、PBSで溶解したグリチルリチン酸モノアンモニウム（宏輝株式会社）を、30mg/kgの用量で腹腔内に4週間連日投与した。対照群は、同量のPBSを腹空内投与した。直径 6 mm の皮膚生検パンチを用いて注射部位の皮膚組織を採取し、Hematoxylin & Eosin染色を行って真皮厚を測定した。また、同様の方法で採取した皮膚検体において、QuickZyme Total Collagen Assay kit (QuickZyme BioSciences B.V, Netherlands)を用いてコラーゲン含量を定量した。
【００２７】
上記BLM誘発強皮症モデルマウスの注射部位である背部皮膚を用いて、パラフィン切片を作成し、VEVTOR M.O.M Immunodetection Kit (Vector laboratories, Burlingame, CA,
USA)の製品マニュアルにしたがって、抗α-smooth muscle actin (α-SMA)抗体(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)と反応させた後、DAB(0.2mg/ml ,DOJINDO LABORATORIES, kumamoto, JAPAN)で発色させた。マウスの皮膚検体ごとに、真皮浅層を400倍の視野でランダムに3枚写真撮影し、α-SMA陽性の紡錘形細胞の数をカウントした。平均値をそのマウスのα-SMA陽性線維芽細胞数とし、グリチルリチン酸群と対照群で比較を行った。
【００２８】
さらに、上記BLM誘発強皮症モデルマウスの注射部位である背部皮膚から、RNeasy min kit（Qiagen Valencia, CA, USA）によりＲＮＡを抽出し、iScript cDNA Synthesis Kits
（Bio-Rad, Hercules, CA, USA）を用いてcDNAに逆転写した。定量的リアルタイムPCRはSYBR Green PCR Master Mix （Life technologies）を用いてABI prism 7000 （Life technologies）で施行、測定した。いずれの検体もtriplicatesで測定し、その平均を値として用いた。リファレンス遺伝子としてはGapdhを用いて、対象遺伝子のmRNAの相対発現量をΔΔCt methodにて算出した。プライマーは以下の配列のものを用いた。
Col1a1
F:GCCAAGAAGACATCCCTGAAG（配列番号１）
R:TGTGGCAGATACAGATCAAGC（配列番号２）
Col1a2
F:GGAGGGAACGGTCCACGAT（配列番号３）
R:GAGTCCGCGTATCCACAA（配列番号４）
Col3a1
F:TTTGTGCAAGTGGAACCTG（配列番号５）
R:TGGACTGCTGTGCCAAAATA（配列番号６）
Mmp13
F:TGATGGCACTGCTGACATCAT（配列番号７）
R:TGTAGCCTTTGGAACTGCTT（配列番号８）
Thbs1
F:TGGTAGCTGGAAATGTGGTG（配列番号９）
R:CAGGCACTTCTTTGCACTCA（配列番号１０）
Gapdh
F:CGTGTTCCTACCCCCAATGT（配列番号１１）
R:TGTCATCATACTTGGCAGGTTTCT（配列番号１２）
【００２９】
＜結果＞
まず、BLM誘発強皮症モデルマウスにおける線維化について検討するために、当該マウスの真皮厚を測定したところ、BLMの代わりにPBSを投与した対照マウスよりも、モデルマウスの真皮厚は肥厚した（図１AおよびB）。すなわち、BLMで強皮症を誘発することにより、真皮厚は肥厚した。そして、それらモデルマウスおよび対照マウスに、グリチルリチン酸を投与すると、BLM誘発強皮症モデルマウスにおける真皮の肥厚が減少したことが示された（図１AおよびB）。一方、BLM誘発を行っていない対照マウスでは、グリチルリチン酸投与により真皮厚は変化しなかったため、グリチルリチン酸は、正常な真皮には働きかけず、強皮症モデルマウスにおける肥厚した真皮にのみ、肥厚抑制効果を発揮することが示された。
【００３０】
BLM誘発強皮症モデルマウスにおいて、膠原線維（コラーゲン）の定量を行ったところ、BLM誘発強皮症モデルマウスにおいて増加した膠原線維の量は、グリチルリチン酸の投与により減少した（図１C）。BLM誘発を行っていない対照マウスにおいては、グリチルリチン酸投与により膠原線維の量は変化しなかったため、グリチルリチン酸は、正常なマウスの膠原線維には働きかけず、強皮症モデルマウスにおける膠原線維にのみ効果を発揮することが示された。
【００３１】
また、BLM誘発強皮症モデルマウスにグリチルリチン酸を投与すると、皮膚の筋線維芽細胞数が有意に減少した（図２AおよびB）。筋線維芽細胞は膠原線維を産生することが知られているため、上記強皮症モデルマウスにおけるグリチルリチン酸投与による膠原線維の減少の一因は、筋線維芽細胞を減少することによるものであると考えられる。
さらに、強皮症モデルマウスにおいて、膠原線維産生に関係する遺伝子のmRNA量を測定したところ、膠原線維をコードするコラーゲン遺伝子であるCol1a1、Col1a2およびCol3a1のmRNAはグリチルリチン酸の投与により有意に減少し、コラゲナーゼをコードする遺伝子であるMmp13のmRNAはグリチルリチン酸の投与により有意に増加した。また、潜在型TGF-βを活性型TGF-βに変換するトロンボスポンジン（Thbs1）のmRNAも、強皮症モデルマウスへのグリチルリチン酸の投与により減少した。活性型TGF-βは膠原線維の産生を促進することが知られている。
【００３２】
以上より、BLM誘発強皮症モデルマウスにおいて、線維化に対する検討を行ったところ、グリチルリチン酸の投与により、真皮の肥厚および膠原線維量が減少する効果が示された。当該効果は、膠原線維を産生する筋線維芽細胞数の減少、コラーゲン遺伝子のmRNA発現量の減少、コラゲナーゼ遺伝子のmRNA発現量の増加、トロンボスポンジンmRNA発現量の減少によるものであることが示唆された。
【００３３】
＜実施例２＞強皮症の炎症及び免疫異常に関する検討
BLM誘発強皮症モデルマウスを、ブレオマイシン投与処理を1週間だけ行うこと以外は実施例１と同様の処理をして作製し、最終投与翌日にマウスの両側鼠径リンパ節と脾臓を摘出した。リンパ節はすり潰してリンパ球を分離した。脾臓から取り出した血球は、RBC lysis buffer (0.0017M Trizma, Sigma-Aldrich, 0.1M NH4Cl 2.675g, Sigma-Aldrich) を添加してリンパ球を分離した。リンパ球は抗CD3抗体(17A2),抗CD4抗体(RM4-5),抗CD8a抗体53-6.7)を用いて表面抗原の染色を行った。また10 ng/ml phorbol myristate acetate (Sigma-Aldrich), 1μg/ml ionomycin (Sigma-Aldrich), 1μg/ml brefeldin A (GolgiStop; BD PharMingen)で4時間刺激を行い、抗インターロイキン（IL）-4抗体(11B11)、抗IL17A抗体(TC11-18HC0.1)、抗インターフェロン（ＩＦＮ）-γ抗体(XMG1.2)(抗体は全てBioLegend, San Diego, CA, USA)を用いて、細胞内抗原の染色を行った。染色されたリンパ
球をFACS  Verseflow cytometer (BD Biosciences)を用いて解析した。
【００３４】
さらに、上記BLM誘発強皮症モデルマウスの注射部位である背部皮膚から、実施例１と同様の方法でＲＮＡを抽出し、ＩＬ４、ＩＬ１ｂ、およびアルギナーゼのｍＲＮＡ量を測定した。プライマーは以下の配列のものを用いた。
Il4
F:ACGGAGATGGATGTGCCAAACGTC（配列番号１３）
R:CGAGTAATCCATTTGCATGATGC（配列番号１４）
Il1b
F:TTGACGGACCCCAAAAGAT（配列番号１５）
R:GAAGCTGGATGCTCTCATCTG（配列番号１６）
Arg1
F:CAGAAGAATGGAAGAGTCAG（配列番号１７）
R:CAGATATGCAGGGAGTCACC（配列番号１８）
【００３５】
＜結果＞
BLM誘発強皮症モデルマウスにおいて、リンパ節または脾臓におけるＣＤ４陽性T細胞に占めるＩＬ４陽性細胞の割合を、ＦＡＣＳにて測定したところ、リンパ節および脾臓のどちらにおいても、グリチルリチン酸の投与により、ＩＬ４陽性細胞は有意に減少していた（図３および４）。一方、ＣＤ４陽性細胞に占めるＩＦＮ−γまたはＩＬ１７Ａ陽性細胞の割合は、グリチルリチン酸の投与により変化しなかった。
【００３６】
また、BLM誘発強皮症モデルマウスの皮膚組織中において、グリチルリチン酸投与がサイトカイン産生に及ぼす影響を検討した。その結果、インターロイキン４およびインターロイキン１ｂのmRNAが、グリチルリチン酸の投与により減少した。また、M2マクロファージのマーカーであるアルギナーゼのｍＲＮＡも、グリチルリチン酸の投与により減少した。
【００３７】
以上より、BLM誘発強皮症モデルマウスにおいて、グリチルリチン酸が炎症および免疫異常に及ぼす影響を検討したところ、Ｔｈ２細胞であるＩＬ４陽性ＣＤ４陽性T細胞は、グリチルリチン酸の投与により有意に減少した。一方、Ｔｈ１細胞であるＩＦＮ−γ陽性ＣＤ４陽性Ｔ細胞と、Ｔｈ１７細胞であるＩＬ１７Ａ陽性ＣＤ４陽性Ｔ細胞は、グリチルリチン酸の投与による顕著な変化は観察されなかった。また、Ｔｈ２細胞への分化を誘導するＩＬ４および炎症促進性サイトカインであるＩＬ１ｂもグリチルリチン酸の投与により有意に減少し、さらに、ＩＬ４により誘導されるM2マクロファージのマーカーであるアルギナーゼも減少した。これらの結果から、グリチルリチン酸は、強皮症モデルマウスにおいて、炎症を抑制し、Ｔｈ２優位の環境を改善させる可能性が示唆された。強皮症は自己免疫疾患の１つであり、その患者は体液性免疫を活性化するＴｈ２細胞が優位となっていることが知られているが、グリチルリチン酸は、そのようなＴｈ２優位を抑制することが示唆された。
【００３８】
＜実施例３＞強皮症の血管障害に関する検討
強皮症患者においては、線維化の他に血管内皮障害が見られるが、これは、血管内皮が線維芽細胞等の間葉系細胞に移行する（内皮間葉移行（Endo-MT））ことが原因である可能性が示唆されている。そこで、強皮症モデルマウスを用いて、グリチルリチン酸がEndo-MTにどのような影響を及ぼすかを検討した。
【００３９】
実施例１と同じ条件で作製したＢＬＭ誘発強皮症モデルマウスの注射部位の皮膚検体を用いて、パラフィン切片を作成し、一次抗体としてrabbit抗VE-cadherin抗体(Santa Cruz
Biotechnolog) とgoat抗fibroblast-specific protein 1 (FSP1)抗体(abcam, Cambridge
, UK)を、二次抗体としてFITC-conjugated donkey 抗rabbit IgG抗体 (Santa Cruz Biotechnolog)とAlexa Fluor donkey 555 抗goat IgG抗体 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)を用いて反応させ、Vectashield with DAPI (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)で核の染色を行い、Bio Zero BZ-8000 (Keyence, Osaka, Japan) を用いて495nm (緑),
565 nm (赤), 400 nm (青)の波長で観察を行った。緑色に観察されるFSP1と赤色に観察されるVE-Cadherin が同時に染まる細胞(Endo-MTを起こした細胞)の数の比較を行った。また、上記皮膚検体から実施例１と同様の方法でＲＮＡを抽出し、Ｓｎａｉｌ１のｍＲＮＡ量を測定した。プライマーは以下の配列のものを用いた。
Snail1
F:CAACTATAGCGAGCTGCAGGA（配列番号１９）
R:ACTTGGGGTACCAGGAGAGAGT（配列番号２０）
【００４０】
次に、強皮症における血管障害のモデルマウスである10週齢の血管内皮細胞特異的Fli1欠失マウス(Fli1flox/flox;Tie2-Cre：American Journal of Pathology,  April 2010 Volume 176, Issue 4,p1983-1998参照)あるいは対照マウス(Fli1flox/flox)に、実施例１と同様の条件でグリチルリチン酸モノアンモニウムあるいはPBSの腹腔内投与を行った。2週間後、マウスの尾静脈に200μlのEvans blue dye (0.5% in PBS)を投与し、30分後にマウスを安楽死させた後、腹部正中より皮膚を切開し、真皮側から皮膚血管を肉眼的に観察し、色素の漏出の程度を評価した。また、エバンスブルーの血管外漏出量を測定するために、直径 4 mm の皮膚生検パンチを用いて3箇所皮膚を採取し、37℃で24時間formamide に溶解したのち、Microplate Reader を用いて620nmの波長の吸光度を測定した。
【００４１】
＜結果＞
抗VE-cadherin抗体および抗FSP1抗体を用いて免疫染色を行った結果を、図５に示す。図５における下段の重ね合わせ写真には、矢印が付されており、これは、抗VE-cadherin抗体と抗FSP1抗体の両方で同時に染まった細胞であり、すなわち、Endo-MTを起こした細胞を示している。Endo-MTを起こした細胞は、ブレオマイシン投与により増加しており（図５のBLM+溶媒、下段）、当該増加作用はグリチルリチン酸の投与により抑制されている（図５のBLM+グリチルリチン酸、下段）。
【００４２】
また、BLM誘発強皮症モデルマウスにおいて、Endo-MTを誘導するSnail1のmRNAを測定した。その結果、グリチルリチン酸の投与により、Snail１のmRNA量が有意に減少した。
【００４３】
さらに、強皮症における血管障害のモデルマウスである血管内皮細胞特異的Fli1ノックアウトマウスを作製し、エバンスブルーの血管外への漏出を検討した。その結果、Fli1ノックアウトにより増加したエバンスブルーへの血管外への漏出量が、グリチルリチン酸の投与により有意に減少した（図６AおよびB）。
【００４４】
以上から、グリチルリチン酸は、血管の安定性を改善することが示唆された。当該安定性の改善は、内皮間葉移行の抑制によるものである可能性が示唆された。
【産業上の利用可能性】
【００４５】
本発明による強皮症予防および／または治療剤の投与により、強皮症を予防および／または治療することが可能となる。また、本発明の剤に含まれるグリチルレチン酸類および／またはその塩は、漢方において古来より用いられている甘草の主薬効成分であり、その安全性は広く認められていることから、安全に強皮症を予防および／または治療することが可能となる。また、グリチルレチン酸類および／またはその塩は、Ｔｈ２亢進抑制剤または血管安定化剤としても使用可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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