(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする複数の配列
を含むデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子であって、各ｇＲＮＡには、配列ＧＴＴＣＡＣＴＧＣＣＧＴＡＴＡＧＧＣＡＧ（配列番号１）からなる少なくとも１つのＣｓｙ４切断配列が隣接する、ＤＮＡ分子。
【請求項２】
プロモーター配列に作動可能に連結されている、請求項１に記載のＤＮＡ分子。
【請求項３】
２つ、３つ、又はそれ以上のｇＲＮＡ配列を含む、請求項１に記載のＤＮＡ分子。
【請求項４】
前記プロモーター配列がＲＮＡポリメラーゼＩＩ（Ｐｏｌ  ＩＩ）プロモーター又はＰｏｌ  ＩＩＩプロモーターである、請求項１に記載のＤＮＡ分子。
【請求項５】
前記プロモーター配列がＲＮＡ  Ｐｏｌ  ＩＩプロモーターである、請求項１に記載のＤＮＡ分子。
【請求項６】
前記Ｐｏｌ  ＩＩプロモーターが、ＣＡＧ、ＥＦ１Ａ、ＣＡＧＧＳ、ＰＧＫ、ＵｂｉＣ、ＣＭＶ、Ｂ２９、デスミン、エンドグリン、ＦＬＴ−１、ＧＦＰＡ、及びＳＹＮ１プロモーターからなる群から選択される、請求項５に記載のＤＮＡ分子。
【請求項７】
Ｃｓｙ４切断部位に連結したガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする配列を含む１つ、２つ、３つ又はそれ以上のカセットと連結したプロモーター配列を含むＤＮＡ分子であって、前記Ｃｓｙ４切断部位は、配列ＧＴＴＣＡＣＴＧＣＣＧＴＡＴＡＧＧＣＡＧ（配列番号１）からなる、ＤＮＡ分子。
【請求項８】
Ｃｓｙ４切断部位に連結した第３のガイドＲＮＡをコードする第３の配列に連結した、Ｃｓｙ４切断部位に連結した第２のガイドＲＮＡをコードする第２の配列に連結した、Ｃｓｙ４切断部位に連結した第１のガイドＲＮＡをコードする第１の配列に作動可能に連結したＰｏｌ  ＩＩプロモーターを含む、請求項７に記載のＤＮＡ分子。
【請求項９】
約１００ｎｔのガイドＲＮＡ配列を含む、請求項７に記載のＤＮＡ分子。
【請求項１０】
機能性Ｃｓｙ４酵素をコードする配列をさらに含む、請求項１又は７に記載のＤＮＡ分子。
【請求項１１】
前記ｇＲＮＡが配列：
【化１】
0006721508.tif 000009
（式中、Ｘ１７−２０は、標的配列、好ましくはプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の直ちに５’側の標的配列の１７〜２０個の連続ヌクレオチドの相補鎖に相補的な配列であり、及びＸＮは、リボ核酸とＣａｓ９との結合を妨げない任意の配列である）を含む、請求項１又は７に記載のＤＮＡ分子。
【請求項１２】
前記分子の３’末端に１つ以上のＵを含む、請求項１又は７に記載のＤＮＡ分子。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載のＤＮＡ分子によってコードされるＲＮＡ分子。
【請求項１４】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載のＤＮＡ分子を含むベクター。
【請求項１５】
機能性Ｃｓｙ４酵素をコードする配列をさらに含む、請求項１４に記載のベクター。
【請求項１６】
細胞において複数のガイドＲＮＡを産生させる方法であって、請求項１３に記載のＲＮＡ分子と前記細胞をインビトロで接触させるステップを含む方法。
【請求項１７】
前記細胞が哺乳類細胞であり、及び前記細胞がまた外因性機能性Ｃｓｙ４酵素配列も発現する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
細胞における複数の標的遺伝子の発現を改変する方法であって、前記方法が、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のＤＮＡ分子又は請求項１３に記載のＲＮＡ分子と前記細胞をインビトロで接触させるステップを含み、各ｇＲＮＡが、標的遺伝子の少なくとも１７〜２０ｎｔに相補的な配列を含む、方法。
【請求項１９】
細胞における標的遺伝子の発現を改変する方法であって、前記方法が、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のＤＮＡ分子又は請求項１３に記載のＲＮＡ分子と前記細胞をインビトロで接触させるステップを含み、各ｇＲＮＡが、前記標的遺伝子の少なくとも１７〜２０ｎｔに相補的な配列を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１３年１２月２６日に出願された米国仮特許出願第６１／９２１，００７号明細書；２０１４年３月１４日に出願された同第１４／２１１，１１７号明細書；２０１４年３月１４日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０２９０６８号明細書；２０１４年３月１４日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０２８６３０号明細書；２０１４年３月２３日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０３５１６２号明細書；及び２０１４年３月１４日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０２９３０４号明細書の利益を主張する。前述の出願は全て、参照により本明細書に援用される。
【０００２】
連邦政府の支援による研究又は開発
本発明は、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）から付与された助成第ＤＰ１  ＧＭ１０５３７８号に基づく連邦政府の支援を受けて行われた。連邦政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
任意選択で哺乳類細胞において、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ及びＩＩＩプロモーターから高活性ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を多重発現させるための方法及びコンストラクトが記載される。
【背景技術】
【０００４】
Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、インビトロで、哺乳類細胞において、及びゼブラフィッシュなどの生きているモデル生物において、標的ＤＮＡ配列に部位特異的切断を作り出すために使用し得るプログラム可能なＲＮＡによってガイドされるクラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム型リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）システム（Ｗｉｅｄｅｎｈｅｆｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４８２，３３１−３３８（２０１２）；Ｈｏｒｖａｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２７，１６７−１７０（２０１０）；Ｔｅｒｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １４，３２１−３２７（２０１１））の基礎をなす（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １５３，９１０−９１８（２０１３）；Ｓｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ（２０１３）；Ｄｉｃａｒｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ（２０１３）；Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３１，２３３−２３９（２０１３）；Ｊｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｌｉｆｅ  ２，ｅ００４７１（２０１３）；Ｈｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３１，２２７−２２９（２０１３）；Ｃｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３９，８１９−８２３（２０１３）；Ｍａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３９，８２３−８２６（２０１３ｃ）；Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３１，２３０−２３２（２０１３）；Ｇｒａｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １９４（４）：１０２９−３５（２０１３））。短い約１００ｎｔのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）がＣａｓ９と複合体を形成し、ヌクレアーゼを特定の標的ＤＮＡ部位に誘導する；標的化は、ｇＲＮＡの５’末端にある少なくとも１７〜２０ヌクレオチド（ｎｔ）の配列によって媒介され、これらのヌクレオチドは、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）、例えば配列ＮＧＧ又はＮＡＧに一致するＰＡＭの隣にある目的の標的ゲノムＤＮＡ配列の相補鎖に相補的であるように設計され、それと操作されたｇＲＮＡの最初の１７〜２０ヌクレオチドとの間の単純な塩基対相補性によって相互作用する（Ｓｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ（２０１３）；Ｄｉｃａｒｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ（２０１３）；Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３１，２３３−２３９（２０１３）；Ｊｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｌｉｆｅ  ２，ｅ００４７１（２０１３）；Ｈｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３１，２２７−２２９（２０１３）；Ｃｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３９，８１９−８２３（２０１３）；Ｍａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３９，８２３−８２６（２０１３ｃ）；Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３１，２３０−２３２（２０１３）；Ｊｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３７，８１６−８２１（２０１２））。ｇＲＮＡはまた、触媒的に不活性化したＣａｓ９タンパク質（ｄＣａｓ９として知られる、Ｊｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３７：８１６−８２１（２０１２）を参照）も誘導し、次にはこのｄＣａｓ９がエフ���クタードメイン（例えば転写活性化ドメイン）に融合することができる（例えば、２０１３年３月１５日に出願された米国特許出願第６１／７９９，６４７号明細書、及び２０１３年６月２１日に出願された同第６１／８３８，１４８号明細書（これらは両方ともに、参照により本明細書に援用される）を参照のこと）。これらの後者のシステムは、ＲＮＡのガイドによって異種エフェクタードメインを目的のゲノム遺伝子座に動員することを可能にする。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、少なくとも一部には、ショートＲＮＡヘアピン配列を認識するエンドリボヌクレアーゼであるＣｓｙ４を使用して、個々のｇＲＮＡがＣｓｙ４切断部位によって分かれている単一の長鎖ＲＮＡ転写物（ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩ又はＩＩＩプロモーターから産生される）にコードされた複数の機能性ｇＲＮＡを切り出すことができるという発見に基づく。
【０００６】
従って、第１の態様において本発明は、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする複数の配列を含むデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子を提供し、ここで各ｇＲＮＡには、配列ＧＴＴＣＡＣＴＧＣＣＧＴＡＴＡＧＧＣＡＧ（配列番号１）又はＧＴＴＣＡＣＴＧＣＣＧＴＡＴＡＧＧＣＡＧＣＴＡＡＧＡＡＡ（配列番号２）を含むか又はそれからなる少なくとも１つのＣｓｙ４切断配列が隣接する。
【０００７】
一部の実施形態において、ＤＮＡ分子はプロモーター配列に作動可能に連結されている。
【０００８】
一部の実施形態において、ＤＮＡ分子は、各々少なくとも１つのＣｓｙ４切断配列が隣接する２つ、３つ、又はそれ以上のｇＲＮＡ配列を含む。
【０００９】
一部の実施形態において、プロモーター配列はＲＮＡポリメラーゼＩＩ（Ｐｏｌ  ＩＩ）プロモーター又はＰｏｌ  ＩＩＩプロモーター、好ましくはＲＮＡ  Ｐｏｌ  ＩＩプロモーターである。一部の実施形態において、Ｐｏｌ  ＩＩプロモーターは、ＣＡＧ、ＥＦ１Ａ、ＣＡＧＧＳ、ＰＧＫ、ＵｂｉＣ、ＣＭＶ、Ｂ２９、デスミン、エンドグリン、ＦＬＴ−１、ＧＦＰＡ、及びＳＹＮ１プロモーターからなる群から選択される。
【００１０】
別の態様において、本発明は、Ｃｓｙ４切断部位、例えば配列番号１又は２に連結した、ガイドＲＮＡをコードする配列、即ち、化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ベースのシステムについて約１００ｎｔ、例えば、９５〜３００ｎｔ、例えば、９５〜１０５ｎｔの配列を含む１つ、２つ、３つ又はそれ以上のカセットと連結したプロモーター配列を含むＤＮＡ分子を提供する。
【００１１】
一部の実施形態において、ＤＮＡ分子は、Ｃｓｙ４切断部位に連結した第３のガイドＲＮＡをコードする第３の配列に連結した、Ｃｓｙ４切断部位に連結した第２のガイドＲＮＡをコードする第２の配列に連結した、Ｃｓｙ４切断部位に連結した第１のガイドＲＮＡをコードする第１の配列に作動可能に連結したＰｏｌ  ＩＩプロモーターを含む。一部の実施形態において、Ｃｓｙ４切断部位に連結したさらなるガイドＲＮＡが含まれる。例えば、ＤＮＡ分子は、以下の構造：
プロモーター−Ｃ４−ｇＲＮＡ−Ｃ４−ｇＲＮＡ−Ｃ４−ｇＲＮＡ−Ｃ４
プロモーター−Ｃ４−ｇＲＮＡ−Ｃ４−ｇＲＮＡ−Ｃ４−ｇＲＮＡ−Ｃ４−ｇＲＮＡ−Ｃ４
プロモーター−Ｃ４−ｇＲＮＡ−Ｃ４−ｇＲＮＡ−Ｃ４−ｇＲＮＡ−Ｃ４−ｇＲＮＡ−Ｃ４−ｇＲＮＡ  Ｃ４
などを有し得る。この例において、Ｃ４は、Ｃｓｙ４  ＲＮＡ切断部位をコードする配列であり、及びｇＲＮＡは、ガイドＲＮＡをコードする配列である。
【００１２】
一部の実施形態において、Ｃａｓ９  ｓｇＲＮＡは以下の配列を含む：
【化１】
0006721508.tif 000002
（式中、Ｘ１７−２０は、標的配列、好ましくはプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の直ちに５’側の標的配列の１７〜２０個の連続ヌクレオチドの相補鎖に相補的な配列であり、及びＸＮは、リボ核酸とＣａｓ９との結合を妨げない任意の配列である）。Ｘ１７−２０の配列は、本明細書では化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９システムで例示されるが、例えば他のシステムに応じて適切に、より長い配列もまた使用することができる。
【００１３】
一部の実施形態において、ＤＮＡ分子はまた、機能性Ｃｓｙ４酵素をコードする配列も含む。
【００１４】
また、本明細書には、例えば機能性Ｃｓｙ４酵素をコードする配列を任意選択で含む、本明細書に記載されるＤＮＡ分子を含むベクターも提供される。また、本明細書には、ＤＮＡ分子によって産生される多重転写物、例えば、未だＣｓｙ４で切断されていないインタクトなＲＮＡも提供される。
【００１５】
さらに別の態様において、本明細書には、細胞において複数のガイドＲＮＡを産生させる方法が提供される。本方法は、細胞において本明細書に記載されるＤＮＡ分子を発現させるステップを含む。
【００１６】
一部の実施形態において、細胞は哺乳類細胞であり、この細胞はまた、外因性機能性Ｃｓｙ４酵素配列も発現し、又は本方法は、機能性Ｃｓｙ４酵素又は機能性Ｃｓｙ４酵素をコードする核酸を投与するステップをさらに含む。
【００１７】
別の態様において、本発明は、細胞において１つ又は複数の標的遺伝子の発現を改変する方法を提供する。本方法は、本明細書に記載されるとおりのＤＮＡ分子、例えば、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする複数の配列を含むＤＮＡ分子を発現させるステップを含み、ここで各ｇＲＮＡは、１つ以上の標的遺伝子の少なくとも１７〜２０ｎｔに相補的な可変配列を含み、及び各ｇＲＮＡには、配列ＧＴＴＣＡＣＴＧＣＣＧＴＡＴＡＧＧＣＡＧ（配列番号１）又はＧＴＴＣＡＣＴＧＣＣＧＴＡＴＡＧＧＣＡＧＣＴＡＡＧＡＡＡ（配列番号２）を含むか又はそれからなる少なくとも１つのＣｓｙ４切断配列が隣接する。
【００１８】
本方法及び組成物において、ｇＲＮＡは、本明細書に記載されるとおり、融合したｔｒａｃｒＲＮＡ及びｃｒＲＮＡを含む単一ガイドＲＮＡであってもよく、或いはｃｒＲＮＡだけを含んでもよく、ｔｒａｃｒＲＮＡは同じ又は異なるＤＮＡ分子から発現してもよい。従って一部の実施形態において、本明細書に記載されるＤＮＡ分子はまた、ｔｒａｃｒＲＮＡをコードする配列も含む。一部の実施形態において、本方法は、細胞において別個のｔｒａｃｒＲＮＡを発現させるステップ、例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡを発現するベクター又はＤＮＡ分子と細胞を接触させるステップを含む。
【００１９】
特に定義しない限り、本明細書で使用される全ての科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者が一般に理解するのと同じ意味を有する。本明細書には、本発明に使用される方法及び材料が記載される；当該技術分野において公知の他の好適な方法及び材料もまた使用することができる。材料、方法、及び例は例示に過ぎず、限定することを意図するものではない。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、配列、データベースエントリ、及び他の参照文献は、全体として参照により援用される。矛盾が生じる場合、定義を含め、本明細書が優先するものとする。
【００２０】
本発明の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明及び図、並びに特許請求の範囲から明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】以下のとおりの初期多重化実験で使用するコンストラクトを示す略図である：  １＋２：別個のｔｒａｃｒＲＮＡを伴う、ダイレクトリピートｃｒＲＮＡアレイ及びＣａｓ９  ３＋４：Ｃｓｙ４、Ｃａｓ９、及び別個のｔｒａｃｒＲＮＡを伴う、Ｃｓｙ４部位によって分かれるショートｃｒＲＮＡアレイ  ５＋６：Ｃｓｙ４部位によって分かれる完全長キメラｇＲＮＡ  ７：ｎｌｓ−ＦＬＡＧタグ付加Ｃａｓ９
【図２】図１に示すコンストラクトを発現する細胞における実験結果を示す棒グラフである。Ｃｓｙ４部位＋完全ｇＲＮＡ（コンストラクト５及び６）が、最も高効率の多重化フレームワークであった。
【図３】例示的標準及び多重Ｃｓｙ４ベースｇＲＮＡフレームワーク、及びそれらが産生する転写物の概略図及び比較である。Ｃｓｙ４は、ＲＮＡ  Ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターのＵ６に代えてＲＮＡ  Ｐｏｌ  ＩＩプロモーター（例えば、ＣＡＧ）の使用を可能にすることに留意されたい。
【図４】Ｃｓｙ４がヒト細胞においてトランケート型認識部位を切断してｇＲＮＡをより高い活性で産生することを示す棒グラフである。トランケート型部位のプロセシングはまた、クリーンな５’末端を残すため、Ｕ６プロモーターによって課されるｇＲＮＡ標的配列の５’Ｇ制約が事実上除かれる。
【図５Ａ】図５Ａ〜図５Ｃは、単一ヒト細胞における２標的多重編集のエビデンスを示す配列である。意図した部位２又は３に個々の欠失が観察される。部位２及び３について、同じ配列上の複数の欠失が観察される。部位２及び３にまたがる欠失もまた観察される。
【図５Ｂ】図５Ａ〜図５Ｃは、単一ヒト細胞における２標的多重編集のエビデンスを示す配列である。意図した部位２又は３に個々の欠失が観察される。部位２及び３について、同じ配列上の複数の欠失が観察される。部位２及び３にまたがる欠失もまた観察される。
【図５Ｃ】図５Ａ〜図５Ｃは、単一ヒト細胞における２標的多重編集のエビデンスを示す配列である。意図した部位２又は３に個々の欠失が観察される。部位２及び３について、同じ配列上の複数の欠失が観察される。部位２及び３にまたがる欠失もまた観察される。
【図６】Ｃｓｙ４ベースのシステムを使用した３つのｇＲＮＡの多重発現の成功を示す略図である。
【図７】ＲＮＡ  Ｐｏｌ  ＩＩ転写ｍＲＮＡからＣｓｙ４によって切断されたｇＲＮＡがヒト細胞においてＣａｓ９ヌクレアーゼを特定の標的に効率的に動員し得ることを示す棒グラフである。これらの実験において、ｇＲＮＡは、ＲＮＡ  Ｐｏｌ  ＩＩ  ＣＡＧプロモーターから作られる長鎖ｍＲＮＡ転写物において発現した。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
Ｃａｓ９システムの潜在的利点の一つは、細胞においてヌクレアーゼ活性或いは異種エフェクタードメインを２つ以上のゲノム遺伝子座又は標的部位に動員する能力である。しかしながら、かかる多重的適用のためには、細胞において２つ以上のｇＲＮＡが効率的に発現可能である必要がある。哺乳類細胞に関しては、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター（例えば、Ｕ６プロモーター）が、単一のショートｇＲＮＡの発現に用いられている。ヒト細胞において単一の転写物から複数のｇＲＮＡ構成要素を発現させる先行の試みは、効率的でないことが分かっている。
【００２３】
Ｃａｓ９システムのさらなる望ましい能力は、誘導性バージョンの構成要素を作り出し、且つそれらの構成要素の組織特異的発現を可能にすることであろう。誘導性の及び／又は組織特異的なＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターについては、これまでに記載がなされている。しかしながら、かかるＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩプロモーターからＣａｓ９又はｄＣａｓ９タンパク質は発現し得るものの、短い定義付けられたｇＲＮＡは、ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩからの転写の開始及び終結部位が不正確であるため、このようにして発現させることができない。実際、これまで全てのｇＲＮＡがＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター（理想的にはショートＲＮＡの発現に適している）から発現されている。
【００２４】
本明細書において実証するとおり、ショートＲＮＡヘアピン配列を認識するエンドリボヌクレアーゼであるＣｓｙ４を使用して、個々のｇＲＮＡがＣｓｙ４切断部位によって分かれている単一長鎖ＲＮＡ転写物（ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターから産生される）カセットにコードされた複数の機能性ｇＲＮＡを切り出すことができる。機能性ｇＲＮＡは、ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩプロモーターから発現する長鎖ＲＮＡ転写物から成功裏に切断されることができる。
【００２５】
ｇＲＮＡ／Ｃｓｙ４多量体カセット
従って、本明細書には、本明細書において多量体カセットと称される、２つ以上のｇＲＮＡ配列を含む長鎖ＲＮＡ転写物をコードするＤＮＡ分子が記載され、ここで各ｇＲＮＡにはＣｓｙ４切断配列が隣接している。このＤＮＡ分子はまたプロモーターも含むことができ、及び任意選択で、１つ以上の他の転写調節配列、例えば、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、及びポリＡ配列を含むことができる。例えば、Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ．２００１  Ｊｕｌ  １１；２７２（１−２）：１４９−５６を参照のこと。
【００２６】
プロモーター
本方法で使用することのできる幾つものプロモーターが、当該技術分野において公知である。一部の実施形態において、プロモーターはＰｏｌＩＩ又はＰｏｌ  ＩＩＩプロモーター、好ましくはＰｏｌ  ＩＩプロモーターである。ＣＡＧプロモーターを含め、様々なＰｏｌ  ＩＩプロモーターが記載されており、本組成物及び方法に使用することができる（例えば、Ａｌｅｘｏｐｏｕｌｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ９：２，２００８；Ｍｉｙａｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ７９（２）：２６９−７７（１９８９）；Ｎｉｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １０８（２）：１９３−９（１９９１）を参照のこと；さらなるプロモーターとしては、ＥＦ１Ａ、ＣＡＧＧＳ、ＰＧＫ、ＵｂｉＣ及びＣＭＶプロモーター、並びに組織特異的プロモーター、例えば、とりわけ、Ｂ２９、デスミン、エンドグリン、ＦＬＴ−１、ＧＦＰＡ、ＳＹＮ１が挙げられる；多数のプロモーターの配列が当該技術分野において公知である。例えば、ＣＭＶ及びＰＧＫプロモーターは、それぞれｐＳｉｃｏＲ及びｐＳｉｃｏＲ  ＰＧＫから増幅することができ（Ｖｅｎｔｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０１：１０３８０−１０３８５（２００４））、ＵｂｉＣプロモーターはｐＤＳＬ＿ｈｐＵＧＩＨ（ＡＴＣＣ）から増幅することができ、ＣＡＧＧＳプロモーターはｐＣＡＧＧＳ（ＢＣＣＭ）から増幅することができ、及びＥＦ１ＡプロモーターはｐＥＦ６ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から増幅することができる。Ｐｏｌ  ＩＩコアプロモーターは、Ｂｕｔｌｅｒ  ａｎｄ  Ｋａｄｏｎａｇａ，Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖ．１６：２５８３−２５９２（２００２）に記載されている。Ｐｏｌ  ＩＩ発現によって駆動される大型転写物からのｇＲＮＡの切断は、最も５’側の位置に任意のヌクレオチドを有するｇＲＮＡの産生を可能にする（Ｕ６又は他のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターからの標準発現は、このヌクレオチドのアイデンティティに制約を加える）。
【００２７】
一部の実施形態において、組織特異的プロモーターが使用され、及び短い定義付けられたｇＲＮＡ配列がＲＮＡ−Ｐｏｌ  ＩＩ転写物からプロセシングされ得る。
【００２８】
Ｕ６核内低分子（ｓｎ）ＲＮＡプロモーター、７ＳＫプロモーター、及びＨ１プロモーターを含め、幾つものＰｏｌ  ＩＩＩプロモーターが当該技術分野において公知である。例えば、Ｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，３８（４）：６２５−６２７（２００５）を参照のこと。
【００２９】
ガイドＲＮＡ
Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、その５’末端にゲノムＤＮＡ標的部位に相補的な少なくとも１７〜２０ｎｔを有する単一ｇＲＮＡを使用することによって、配列ＮＧＧのさらなる近位プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を有する少なくとも１７〜２０ｎｔの特定のゲノム標的にガイドすることができる。
【００３０】
従って、本明細書に記載される組成物は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）、例えば、ＮＧＧ、ＮＡＧ、又はＮＮＧＧの直ちに５’側の標的配列の１７〜２０ヌクレオチド（ｎｔ）に相補的な配列を５’末端に有する、通常トランスにコードされたｔｒａｃｒＲＮＡに融合したｃｒＲＮＡを含む単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）、例えばＭａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０１３  Ｆｅｂ  １５；３３９（６１２１）：８２３−６に記載されるとおりの単一Ｃａｓ９ガイドＲＮＡをコードする配列を含むことができる。
【００３１】
ガイドＲＮＡを設計し及び発現させる方法は当該技術分野において公知である。ガイドＲＮＡは、一般的に言えば、２つの異なるシステムとして提供される：１）システム１は、一緒になってＣａｓ９による切断をガイドする働きをする別個のｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを使用し；及び２）システム２は、２つの別個のガイドＲＮＡを組み合わせて単一のシステムにしたキメラｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッドを使用する（Ｊｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．２０１２）。ｔｒａｃｒ−ＲＮＡは可変的にトランケートされることができ、別個のシステム（システム１）及びキメラｇＲＮＡシステム（システム２）の両方で様々な長さが機能することが示されている。例えば、Ｊｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０１２；３３７：８１６−８２１；Ｍａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１３  Ｆｅｂ  １５；３３９（６１２１）：８２３−６；Ｃｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１３  Ｆｅｂ  １５；３３９（６１２１）：８１９−２３；及びＨｗａｎｇ  ａｎｄ  Ｆｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１３  Ｍａｒ；３１（３）：２２７−９；Ｊｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｌｉｆｅ  ２，ｅ００４７１（２０１３））を参照のこと。システム２については、概して長さが長いキメラｇＲＮＡほど高いオンターゲット活性を示しているが、しかし種々の長さのｇＲＮＡの相対的特異性は今のところ不明確のままであり、従って場合によっては短いｇＲＮＡの使用が望ましい可能性もある。一部の実施形態において、ｇＲＮＡは、転写開始部位の上流約１００〜８００ｂｐの範囲内、例えば、転写開始部位の上流約５００ｂｐの範囲内の領域、転写開始部位を含む領域、又は転写開始部位の下流約１００〜８００ｂｐの範囲内、例えば約５００ｂｐの範囲内の領域に相補的である。一部の実施形態において、２つ以上のｇＲＮＡをコードするベクター（例えばプラスミド）、例えば、標的遺伝子の同じ領域内の異なる部位に向けた２つ、３つ、４つ、５つ、又はそれ以上のｇＲＮＡをコードするプラスミドが使用される。さらなるガイドＲＮＡ、及びゲノム編集の特異性を高める方法が、「ＩＮＣＲＥＡＳＩＮＧ  ＳＰＥＣＩＦＩＣＩＴＹ  ＦＯＲ  ＲＮＡ−ＧＵＩＤＥＤ  ＧＥＮＯＭＥ  ＥＤＩＴＩＮＧ」と題される米国仮特許出願第６１／８３８，１７８号明細書に記載される。
【００３２】
一部の実施形態において、ｇＲＮＡは以下の配列を含むか又はそれからなる：
【化２】
0006721508.tif 000003
（式中、Ｘ１７−２０は、標的配列、好ましくはプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）、例えば、ＮＧＧ、ＮＡＧ、又はＮＮＧＧの直ちに５’側の標的配列の少なくとも１７〜２０個の連続ヌクレオチドの相補鎖に相補的な配列である（しかしながら一部の実施形態では、この相補性領域は２０ｎｔより長く、例えば、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０ｎｔ又はそれ以上、例えば、１７〜３０ｎｔであってもよい））。ＸＮは、任意の配列であり、ここでＮは（ＲＮＡにおいては）、リボ核酸とＣａｓ９との結合を妨げない０〜３００又は０〜２００、例えば、０〜１００、０〜５０、又は０〜２０であり得る。一部の実施形態において、ＲＮＡは、ＲＮＡ  ＰｏｌＩＩＩ転写を終結するための終結シグナルとして使用される１つ以上のＴが任意選択で存在する結果として、分子の３’末端に１つ以上のＵ、例えば１〜８個又はそれ以上のＵ（例えば、Ｕ、ＵＵ、ＵＵＵ、ＵＵＵＵ、ＵＵＵＵＵ、ＵＵＵＵＵＵ、ＵＵＵＵＵＵＵ、ＵＵＵＵＵＵＵＵ）を含む。一部の実施形態において、ＲＮＡは、そのＲＮＡ分子の５’末端に、標的配列に相補的でない１つ以上、例えば最大３つ、例えば、１つ、２つ、又は３つ、又はそれ以上のさらなるヌクレオチドを含む。任意選択で、ＲＮＡヌクレオチドの１つ以上、例えば、配列Ｘ１７−２０内のヌクレオチドの１つ以上、配列ＸＮ内のヌクレオチドの１つ以上、又はｇＲＮＡの任意の配列内のヌクレオチドの１つ以上は修飾されており、例えばロックされている（２’−Ｏ−４’−Ｃメチレン架橋）、５’−メチルシチジンであるか、２’−Ｏ−メチル−プソイドウリジンであるか、又はそこでリボースリン酸骨格がポリアミド鎖によって置換されている。
【００３３】
例えば、一部の実施形態では、Ｊｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．（Ｓｃｉｅｎｃｅ．３３７（６０９６）：８１６−２１（２０１２））に記載されるキメラガイドＲＮＡ、例えば、
（Ｘ１７−２０）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧ（配列番号８）；（Ｘ１７−２０）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧ（配列番号９）を使用することができ；一部の実施形態では、標的ＤＮＡ配列に相補的な５’末端１７〜２０ヌクレオチド配列、及びＪｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｌｉｆｅ．２：ｅ００４７１（２０１３）に記載されるＣａｓ９結合に必要な４２ヌクレオチド３’末端ステムループ構造を有するｓｇＲＮＡ、例えば、（Ｘ１７−２０）ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧ（配列番号８）が使用される。
【００３４】
一部の実施形態において、ガイドＲＮＡは、３’末端に１つ以上のアデニン（Ａ）又はウラシル（Ｕ）ヌクレオチドを含む。
【００３５】
本明細書に記載される例は単一ｇＲＮＡを利用するが、本方法はまた、二重ｇＲＮＡ（例えば、天然に存在するシステムに見られるｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ）で用いることもできる。この場合、単一のｔｒａｃｒＲＮＡを、本システムを使用して発現する複数の異なるｃｒＲＮＡと併せて、例えば、以下（ＲＮＡについては、Ｔは本明細書ではＵであると理解されることに留意されたい）：
ｃｒＲＮＡ配列：Ｘ１７−２０−ＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡＧＡＡＡ（配列番号１５）
ｔｒａｃｒＲＮＡ配列：ＴＡＧＣＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＡＡＧＧＣＴＡＧＴＣＣＧＴＴＡＴＣＡＡＣＴＴＧＡＡＡＡＡＧＴＧＧＣＡＣＣＧＡＧＴＣＧＧＴＧＣ（配列番号１６）を使用することになる。この場合、ｃｒＲＮＡが本明細書に記載される方法及び分子におけるガイドＲＮＡとして使用され、及びｔｒａｃｒＲＮＡは同じ又は異なるＤＮＡ分子から発現し得る。
【００３６】
さらに、相補性の１７〜２０ヌクレオチドの配列を有するガイドＲＮＡが本明細書に例示されるが、一部の実施形態では、１７〜２０ｎｔの代わりにより長い配列、例えば、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０ｎｔ又はそれ以上、例えば１７〜３０ｎｔを使用することができる。
【００３７】
Ｃｓｙ４切断配列
本明細書に記載される方法及び組成物においては、各ガイドＲＮＡに切断配列が隣接することで１つ又は少なくとも１つの切断配列が各ガイドＲＮＡの間にあるように、ＤＮＡ分子にＣｓｙ４切断配列が挿入される。例示的Ｃｓｙ４切断配列としては、ＧＴＴＣＡＣＴＧＣＣＧＴＡＴＡＧＧＣＡＧ（トランケート型２０ｎｔ）（配列番号１）及びＧＴＴＣＡＣＴＧＣＣＧＴＡＴＡＧＧＣＡＧＣＴＡＡＧＡＡＡ（完全２８ｎｔ）（配列番号２）が挙げられる。本明細書において実証されるとおり、トランケート型Ｃｓｙ４切断部位（配列番号１）の使用は、標準的な部位を使用するよりヒト細胞において効率が高い。本発明者らの知る限りでは、これは、ヒト細胞におけるＣｓｙ４活性の利用を初めて実証するものである。
【００３８】
機能性Ｃｓｙ４酵素配列
本明細書に記載される方法においては、Ｃｓｙ４切断部位で転写物を切断する能力を有する機能性Ｃｓｙ４酵素もまた細胞で発現する。
【００３９】
緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＵＣＢＰＰ−ＰＡ１４（Ｐａ１４）、エルシニア・ペスチス（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ）ＡＡＭ８５２９５（Ｙｐ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＵＴＩ８９（Ｅｃ８９）、ディケロバクター・ノドーサス（Ｄｉｃｈｅｌｏｂａｃｔｅｒ  ｎｏｄｏｓｕｓ）ＶＣＳ１７０３Ａ（Ｄｎ）、アシネトバクター・バウマンニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ）ＡＢ００５７（Ａｂ）、モリテーラ属種（Ｍｏｒｉｔｅｌｌａ  ｓｐ．）ＰＥ３６（ＭＰ１、ＭＰ０１）、シュワネラ属種（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｓｐ．）Ｗ３−１８−１（ＳＷ）、パスツレラ・ムルトシダ亜種ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ  ｓｕｂｓｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）Ｐｍ７０（Ｐｍ）、ペクトバクテリウム・ワサビエ（Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｗａｓａｂｉａｅ）（Ｐｗ）、及びディケヤ・ダダンティイ（Ｄｉｃｋｅｙａ  ｄａｄａｎｔｉｉ）Ｅｃｈ７０３（Ｄｄ）由来のＣｓｙ４ホモログの例示的Ｃｓｙ４配列が、Ｈａｕｒｗｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２９（５９９７）：１３５５−１３５８（２０１０）の図Ｓ６に示される。好ましい実施形態において、Ｃｓｙ４は緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来である。
【００４０】
一部の実施形態において、Ｃｓｙ４は、異種エフェクタードメインをｇＲＮＡに共有結合的に連結するためにも使用される。Ｃｓｙ４は、シングルターンオーバー酵素であり、切断後もその標的ヘアピン配列に結合したままであると考えられる（Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＲＮＡ．２０１２  Ａｐｒ；１８（４）：６６１−７２）。従ってＣｓｙ４は、切断された各ｇＲＮＡの３’末端に結合したままであると予想される。本明細書において実証されるとおり、切断されたｇＲＮＡはヒト細胞において機能性であると思われるため、ｇＲＮＡの３’末端におけるこのＣｓｙ４タンパク質の存在は、ｇＲＮＡがＣａｓ９と複合体を形成してその活性を誘導する能力に影響を及ぼさないものと思われる。従って、これらのｇＲＮＡ−Ｃｓｙ４融合物はまた、その触媒ヌクレアーゼ活性を不活性化する突然変異を有するＣａｓ９突然変異体（ｄＣａｓ９タンパク質）も誘導可能であろうと考えられる。従って、異種機能ドメイン（ＨＦＤ）をＣｓｙ４と融合することができ（Ｃｓｙ４−ＨＦＤ）、次にはｄＣａｓ９：ｓｇＲＮＡ：Ｃｓｙ４−ＨＦＤ複合体がかかるドメインを特定のゲノム遺伝子座に誘導し得る。かかるＨＦＤの例には、他のヌクレアーゼドメイン、例えばＦｏｋＩ由来のもの、転写活性化因子若しくはリプレッサードメイン、又はヒストン若しくはＤＮＡメチル化状態を修飾する他のドメインが含まれ得る。
【００４１】
Ｃｓｙ４−ＨＦＤは、異種機能ドメイン（例えば、転写活性化ドメイン、例えばＶＰ６４又はＮＦ−κＢ  ｐ６５由来）を、介在リンカー、例えば約５〜２０又は１３〜１８ヌクレオチドのリンカーを伴い又は伴わずＣｓｙ４タンパク質のＮ末端又はＣ末端に融合することによって作り出される。転写活性化ドメインはＣｓｙ４のＮ末端又はＣ末端に融合することができる。転写活性化ドメインに加えて、当該技術分野において公知のとおりの他の異種機能ドメイン（例えば、転写リプレッサー（例えば、ＫＲＡＢ、ＳＩＤなど）又はサイレンサー、例えばヘテロクロマチンタンパク質１（ＨＰ１、別名ｓｗｉ６）、例えばＨＰ１α又はＨＰ１β；ＭＳ２コートタンパク質、エンドリボヌクレアーゼＣｓｙ４、又はλＮタンパク質が結合するものなどの固定的なＲＮＡ結合配列に融合したロング非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）を動員することのできるタンパク質又はペプチド；ＤＮＡのメチル化状態を修飾する酵素（例えば、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）又はＴＥＴタンパク質）；又はヒストンサブユニットを修飾する酵素（例えば、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）、ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）、ヒストンメチルトランスフェラーゼ（例えば、リジン又はアルギニン残基のメチル化について）又はヒストンデメチラーゼ（例えば、リジン又はアルギニン残基の脱メチル化について））もまた使用することができる。かかるドメインの幾つもの配列、例えばＤＮＡにおけるメチル化シトシンのヒドロキシル化を触媒するドメインが当該技術分野において公知である。例示的タンパク質としては、ＤＮＡにおいて５−メチルシトシン（５−ｍＣ）を５−ヒドロキシメチルシトシン（５−ｈｍＣ）に変換する酵素である１０−１１転座（ＴＥＴ）１〜３ファミリーが挙げられる。例えば、国際公開第２０１４／１４４７６１号パンフレットを参照のこと。
【００４２】
ヒトＴＥＴ１〜３の配列は当該技術分野において公知であり、以下の表に示す：
【００４３】
【表１】
0006721508.tif 000004
【００４４】
一部の実施形態において、触媒ドメインの完全長配列の全て又は一部、例えば、７つの高度に保存されたエクソンによってコードされるシステインリッチ伸長部及び２ＯＧＦｅＤＯドメインを含む触媒モジュール、例えばアミノ酸１５８０〜２０５２を含むＴｅｔ１触媒ドメイン、アミノ酸１２９０〜１９０５を含むＴｅｔ２及びアミノ酸９６６〜１６７８を含むＴｅｔ３が含まれ得る。例えば、３つ全てのＴｅｔタンパク質における主要な触媒残基を示すアラインメントについては、Ｉｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｃｙｃｌｅ．２００９  Ｊｕｎ  １；８（１１）：１６９８−７１０．Ｅｐｕｂ  ２００９  Ｊｕｎ  ２７の図１、及び完全長配列についてはその補助資料（ｆｔｐサイトｆｔｐ．ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｕｂ／ａｒａｖｉｎｄ／ＤＯＮＳ／ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ＿ｍａｔｅｒｉａｌ＿ＤＯＮＳ．ｈｔｍｌで利用可能）（例えばｓｅｑ  ２ｃを参照）を参照のこと；一部の実施形態において、配列はＴｅｔ１のアミノ酸１４１８〜２１３６又はＴｅｔ２／３における対応する領域を含む。
【００４５】
他の触媒モジュールは、例えば、Ｉｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００９に同定されるタンパク質由来であり得る。
【００４６】
一部の実施形態において、融合タンパク質は、Ｃｓｙ４と異種機能ドメインとの間にリンカーを含む。これらの融合タンパク質に（又はコンカテネート構造の融合タンパク質間に）使用することのできるリンカーには、融合タンパク質の機能を妨げない任意の配列が含まれ得る。好ましい実施形態において、リンカーは短く、例えば２〜２０アミノ酸であり、典型的には可動性である（即ち、グリシン、アラニン、及びセリンなど、高い自由度のアミノ酸を含む）。一部の実施形態において、リンカーは、ＧＧＧＳ（配列番号３）又はＧＧＧＧＳ（配列番号１７）からなる１つ以上のユニット、例えば、ＧＧＧＳ（配列番号３）又はＧＧＧＧＳ（配列番号１７）ユニットの２つ、３つ、４つ、又はそれ以上のリピートを含む。他のリンカー配列、例えば、ＧＧＳ、ＧＧＳＧ（配列番号２２）、ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡ（配列番号２３）、ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ（配列番号２４）、又はＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＧＧＳＧＧＳ（配列番号２５）もまた使用することができる。
【００４７】
Ｃａｓ９
本明細書に記載される方法においては、Ｃａｓ９もまた細胞において発現する。幾つもの細菌がＣａｓ９タンパク質変異体を発現する。化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９が、現在最も一般的に用いられている；他のＣａｓ９タンパク質の幾つかは化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９と高い配列同一性レベルを有し、同じガイドＲＮＡを使用する。他はさらに多様で、異なるｇＲＮＡを使用し、その上認識するＰＡＭ配列（ＲＮＡによって指定される配列に隣接するタンパク質によって指定される２〜５ヌクレオチド配列）も異なる。Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．が大規模な細菌群からＣａｓ９タンパク質を分類しており（ＲＮＡ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １０：５，１−１２；２０１３）、参照によって本明細書に援用されるその補図１及び補表１に多数のＣａｓ９タンパク質が掲載されている。本明細書に記載されるコンストラクト及び方法は、それらのＣａｓ９タンパク質の任意のもの、及びそれらの対応するガイドＲＮＡ又は適合性のある他のガイドＲＮＡの使用を含み得る。ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＬＭＤ−９  ＣＲＩＳＰＲ１システム由来のＣａｓ９もまた、Ｃｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３９，８１９（２０１３））の中でヒト細胞において機能することが示されている。加えて、Ｊｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．は、インビトロで、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）及びＬ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）由来のＣａｓ９オルソログ（但し髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）又はＣ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）由来のものではない、これらは異なるガイドＲＮＡを使用するものと思われる）が、二重化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ｇＲＮＡによってガイドされることで、効率はやや低いが、標的プラスミドＤＮＡを切断し得ることを示した。
【００４８】
一部の実施形態において、本システムは、細菌にコードされたものとしての、又は哺乳類細胞における発現にコドンが最適化されたものとしての、化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９タンパク質を利用する。ＨＡエピトープ（アミノ酸配列ＤＡＹＰＹＤＶＰＤＹＡＳＬ（配列番号１８））及び核局在化シグナル（アミノ酸配列ＰＫＫＫＲＫＶＥＤＰＫＫＫＲＫＶＤ（配列番号１９））に融合した化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９（残基１〜１３６８）の例示的配列は、以下のとおりである：
【化３】
0006721508.tif 000005
Ｊｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ，２０１３、前掲を参照のこと。
【００４９】
一部の実施形態において、ヌクレアーゼをニッカーゼにするためＤ１０Ａ及びＨ８４０Ａのいずれかの突然変異を含むか、又はタンパク質のヌクレアーゼ部分を触媒的に不活性にするためＤ１０Ａ及びＨ８４０Ａの両方の突然変異を含むＣａｓ９配列が使用される。本明細書に記載される方法及び組成物で使用し得る触媒的に不活性の化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）の配列は、以下のとおりである；突然変異は太字及び下線で示す。
【化４】
0006721508.tif 000006
【化５】
0006721508.tif 000007
例えば、Ｍａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３、前掲；及びＪｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２、前掲を参照のこと。或いは、Ｃａｓ９は、２０１３年６月２１日に出願され、且つ通し番号６１／８３８，１４８が割り当てられた、「ＲＮＡ−ＧＵＩＤＥＤ  ＴＡＲＧＥＴＩＮＧ  ＯＦ  ＧＥＮＥＴＩＣ  ＡＮＤ  ＥＰＩＧＥＮＯＭＩＣ  ＲＥＧＵＬＡＴＯＲＹ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ  ＴＯ  ＳＰＥＣＩＦＩＣ  ＧＥＮＯＭＩＣ  ＬＯＣＩ」と題される米国仮特許出願、及びＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０２７３３５号明細書に記載されるとおりのｄＣａｓ９−ヘテロ機能ドメイン融合物（ｄＣａｓ９−ＨＦＤ）であってもよい。
【００５０】
Ｃａｓ９は、本明細書に記載されるとおりの発現ベクター、例えば、Ｃａｓ９をコードする配列、例えばＣａｓ９  ｃＤＮＡ又は遺伝子を含む染色体外プラスミド又はウイルスベクターから発現させてもよく；細胞のゲノムに組み込まれた外因性Ｃａｓ９  ｃＤＮＡ又は遺伝子から発現させてもよく；Ｃａｓ９をコードするｍＲＮＡ；実際のＣａｓ９タンパク質それ自体；又は、非哺乳類細胞の場合、外因性Ｃａｓ９であってもよい。
【００５１】
発現系
例えば、本明細書に記載されるＣｓｙ４／ガイドＲＮＡコンストラクトのインビボ又はインビトロ発現に、発現ベクターを含む核酸分子を使用することができる。複数のｇＲＮＡを（潜在的に誘導性の又は組織型／細胞型特異的な形で）発現するベクターは、研究及び治療用途に使用することができる。
【００５２】
本明細書に記載される融合タンパク質及び多量体ガイドＲＮＡカセットを使用するためには、それらをコードする核酸からそれらを発現させることが望ましい場合もあり得る。これは種々の方法で実施することができる。例えば、ガイドＲＮＡカセット又はＣｓｙ４又はＣａｓ９タンパク質をコードする核酸を、複製及び／又は発現用の原核細胞又は真核細胞に形質転換される中間ベクターにクローニングすることができる。中間ベクターは、典型的には、融合タンパク質をコードする核酸の保存若しくは操作用又は融合タンパク質の産生用の原核生物ベクター、例えば、プラスミド、又はシャトルベクター、又は昆虫ベクターである。ガイドＲＮＡ又は融合タンパク質をコードする核酸はまた、植物細胞、動物細胞、好ましくは哺乳類細胞又はヒト細胞、真菌細胞、細菌細胞、又は原虫細胞への投与用の発現ベクターにクローニングすることもできる。
【００５３】
発現を得るため、ガイドＲＮＡ又は融合タンパク質をコードする配列は、典型的には、転写を誘導するプロモーターを含む発現ベクターにサブクローニングされる。好適な細菌及び真核生物プロモーターは当該技術分野において周知されており、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（３ｄ  ｅｄ．２００１）；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９９０）；及びＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，２０１０）に記載されている。操作されたタンパク質を発現させるための細菌発現系は、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、バチルス属種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）、及びサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）において利用可能である（Ｐａｌｖａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｇｅｎｅ  ２２：２２９−２３５）。かかる発現系のキットが市販されている。哺乳類細胞、酵母、及び昆虫細胞用の真核生物発現系は当該技術分野において周知されており、同様に市販されている。
【００５４】
幾つもの好適なベクター、例えば、ウイルスベクター、例えば、組換えレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、及び単純ヘルペスウイルス１型、アデノウイルス由来ベクター、又は組換え細菌若しくは真核生物プラスミドが、当該技術分野において公知である。例えば、発現コンストラクトは以下を含み得る：コード領域；プロモーター配列、例えば、発現を選択の細胞型に制限するプロモーター配列、条件的プロモーター、又は強力な汎用プロモーター；エンハンサー配列；非翻訳調節配列、例えば、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、３’ＵＴＲ；ポリアデニル化部位；及び／又はインスレーター配列。かかる配列は当該技術分野において公知であり、当業者であれば好適な配列を選択することが可能である。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，（１９８９），Ｓｅｃｔｉｏｎｓ  ９．１０−９．１４及び他の標準実験マニュアルを参照のこと。一部の実施形態では、当該技術分野において公知のとおりの組織特異的プロモーターを使用して、発現を特定の細胞型に限定することができる。
【００５５】
上記に記載したとおり、ガイドＲＮＡを発現させるベクターは、ガイドＲＮＡの発現を駆動するためＲＮＡ  Ｐｏｌ  ＩＩ又はＰｏｌ  ＩＩＩプロモーターを含み得る。これらのヒトプロモーターは、プラスミドトランスフェクション後の哺乳類細胞におけるｇＲＮＡの発現を可能にする。或いは、例えばインビトロ転写のため、Ｔ７プロモーターを使用してもよく、ＲＮＡをインビトロで転写して精製することができる。核酸の発現を誘導するために使用されるプロモーターは、特定の適用に依存する。例えば、融合タンパク質の発現及び精製には、典型的には強力な構成的プロモーターが使用される。対照的に、遺伝子調節のため融合タンパク質がインビボ投与される場合、融合タンパク質の詳細な用途に応じて構成的プロモーター又は誘導性プロモーターのいずれかが使用され得る。加えて、融合タンパク質の投与に好ましいプロモーターは、ＨＳＶ  ＴＫなどの弱いプロモーター、又は同様の活性を有するプロモーターであり得る。プロモーターにはまた、トランス活性化に応答するエレメント、例えば、低酸素応答エレメント、Ｇａｌ４応答エレメント、ｌａｃリプレッサー応答エレメント、及びテトラサイクリン調節系及びＲＵ−４８６系などの小分子制御系も含まれ得る（例えば、Ｇｏｓｓｅｎ  ＆  Ｂｕｊａｒｄ，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：５５４７；Ｏｌｉｇｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，５：４９１−４９６；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，４：４３２−４４１；Ｎｅｅｒｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｂｌｏｏｄ，８８：１１４７−５５；及びＲｅｎｄａｈｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１６：７５７−７６１を参照のこと）。
【００５６】
プロモーターに加えて、発現ベクターは典型的には、原核生物又は真核生物のいずれであれ、宿主細胞での核酸の発現に必要なあらゆる追加的なエレメントを含む転写ユニット又は発現カセットを含む。従って典型的な発現カセットは、例えば融合タンパク質をコードする核酸配列に作動可能に連結されたプロモーター、及び例えば転写物の効率的なポリアデニル化、転写終結、リボソーム結合部位、又は翻訳終結に必要な任意のシグナルを含む。カセットの追加的なエレメントには、例えば、エンハンサー、及び異種スプライシングイントロンシグナルが含まれ得る。
【００５７】
遺伝情報を細胞に運び込むために使用される詳細な発現ベクターは、融合タンパク質の目的の用途、例えば、植物、動物、細菌、真菌、原虫等における発現に関連して選択される。標準的な細菌発現ベクターは、プラスミド、例えば、ｐＢＲ３２２ベースのプラスミド、ｐＳＫＦ、ｐＥＴ２３Ｄ、及び市販のタグ融合発現系、例えばＧＳＴ及びＬａｃＺを含む。好ましいタグ融合タンパク質は、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）である。かかるタグ融合タンパク質は、操作されたＴＡＬＥリピートタンパク質の精製に使用することができる。組換えタンパク質にエピトープタグ、例えば、ｃ−ｍｙｃ又はＦＬＡＧもまた付加することができ、それにより単離、発現のモニタリング、並びに細胞及び細胞内局在性のモニタリングに好都合な方法がもたらされる。
【００５８】
真核細胞発現ベクター、例えば、ＳＶ４０ベクター、パピローマウイルスベクター、及びエプスタイン・バーウイルス由来のベクターにおいては、多くの場合に真核生物ウイルス由来の調節エレメントを含む発現ベクターが用いられる。他の例示的真核生物ベクターとしては、ｐＭＳＧ、ｐＡＶ００９／Ａ＋、ｐＭＴＯ１０／Ａ＋、ｐＭＡＭｎｅｏ−５、バキュロウイルスｐＤＳＶＥ、及び任意の他の、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーター、又は真核細胞における発現に有効であることが示される他のプロモーターの誘導下でタンパク質の発現を可能にするベクターが挙げられる。
【００５９】
一部の発現系は、チミジンキナーゼ、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ、及びジヒドロ葉酸レダクターゼなどの、安定にトランスフェクトされた細胞株を選択するためのマーカーを有する。昆虫細胞においてバキュロウイルスベクターを使用するなど、高収率発現系もまた好適であり、ここで融合タンパク質コード配列はポリヘドリンプロモーター又は他の強力なバキュロウイルスプロモーターの誘導下にある。
【００６０】
発現ベクターに典型的に含まれるエレメントとしてはまた、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で機能するレプリコン、組換えプラスミドを有する細菌の選択を可能にするための抗生物質耐性をコードする遺伝子、及び組換え配列の挿入を可能にするプラスミドの非必須領域におけるユニークな制限部位も挙げられる。
【００６１】
標準的なトランスフェクション方法を用いて、多量のタンパク質を発現する細菌、哺乳類、酵母又は昆虫細胞株が作製され、次にはそれが標準的な技法を用いて精製される（例えば、Ｃｏｌｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４：１７６１９−２２；Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１８２（Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，ｅｄ．，１９９０）を参照のこと）。真核及び原核細胞の形質転換は、標準的な技法に従い実施される（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，１９７７，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１３２：３４９−３５１；Ｃｌａｒｋ−Ｃｕｒｔｉｓｓ  ＆  Ｃｕｒｔｉｓｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １０１：３４７−３６２（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ，１９８３を参照のこと）。
【００６２】
宿主細胞への外来性ヌクレオチド配列の導入には、公知の手順のいずれを用いてもよい。それらの手順は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ポリブレン、プロトプラスト融合、電気穿孔、ヌクレオフェクション、リポソーム、マイクロインジェクション、ネイキッドＤＮＡ、プラスミドベクター、ウイルスベクター（エピソーム及び組込みの両方）、及びクローニングされたゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ又は他の外来性遺伝物質を宿主細胞に導入するための他の周知の方法のいずれかの使用を含む（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．、前掲を参照のこと）。用いられる特定の遺伝子操作手順が選択のタンパク質の発現能を有する宿主細胞への少なくとも１つの遺伝子の導入を成功させることが可能であれば、十分である。
【００６３】
一部の実施形態において、Ｃａｓ９又はＣｓｙ４タンパク質は、タンパク質の核移行をもたらす核局在ドメインを含む。幾つかの核局在配列（ＮＬＳ）が知られており、任意の好適なＮＬＳを使用することができる。例えば、多くのＮＬＳは、二分塩基性リピート（ｂｉｐａｒｔｉｔｅ  ｂａｓｉｃ  ｒｅｐｅａｔ）と称される複数の塩基性アミノ酸を有する（Ｇａｒｃｉａ−Ｂｕｓｔｏｓ  ｅｔ  ａｌ，１９９１，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１０７１：８３−１０１にレビューされる）。二分塩基性リピートを含むＮＬＳは、キメラタンパク質の任意の部分に置くことができ、核内に局在化するキメラタンパク質をもたらす。好ましい実施形態において、本明細書に記載される融合タンパク質の究極的な機能は典型的にはタンパク質の核局在を必要とするため、最終的な融合タンパク質に核局在ドメインが取り込まれる。しかしながら、タンパク質が内因性の核局在機能を有する場合には、別個の核局在ドメインを加える必要はないこともある。
【００６４】
本発明は、ベクター及びベクターを含む細胞を含む。
【００６５】
ライブラリ
また、本明細書には、研究用途、例えば潜在的な薬物標的のスクリーニング又は遺伝子レベルの相互作用の定義付けのための、例えば、誘導性の、組織型又は細胞型特異的多重ベクターにおけるｇＲＮＡのコンビナトリアルライブラリも提供される。
【００６６】
使用方法
記載される本方法は、本明細書に記載されるとおりの多量体カセットと、加えて短縮型ｇＲＮＡによってガイドされ得るヌクレアーゼ、例えば、上記に記載したとおりのＣａｓ９ヌクレアーゼ、及び上記に記載したとおり、Ｃｓｙ４ヌクレアーゼを、細胞において発現させるステップ、又は細胞と接触させるステップを含み得る。
【００６７】
記載されるシステムは、複数の内因性遺伝子の発現の同時修飾、又は単一遺伝子の複数の部分の標的化に有用且つ万能なツールである。現行の方法でこれを実現するには、標的化する部位毎に別個のｇＲＮＡコード転写物を使用する必要がある。別個のｇＲＮＡは、各細胞が各ｇＲＮＡを発現することを保証できないため、細胞集団の多重ゲノム編集には最適でない；複数の転写物では、細胞は、複雑で均一でないランダムなｇＲＮＡ混合物を受け取る。しかしながら、本システムは、単一の転写物からの複数のｇＲＮＡの発現を可能にし、これにより複数のｇＲＮＡの発現によってゲノムにおける複数の部位を標的化することが可能になる。さらに、単一転写物システムでは、各細胞が全てのｇＲＮＡを同様の化学量論で発現するはずである。従ってこのシステムを、多数の遺伝子の発現の同時改変又は単一遺伝子、プロモーター、若しくはエンハンサーへの複数のＣａｓ９若しくはＨＦＤの動員に容易に使用し得る。この能力は、例えば基礎生物学研究に（遺伝子機能を調べ、単一経路内の複数の遺伝子の発現を操作するために用いることができる）、及び合成生物学において（研究者は細胞内に複数の入力シグナルに応答する回路を作成することが可能になる）、幅広い有用性を有するであろう。この技術を実施すること及び多重化に適合させることは比較的容易であるため、これは多くの多岐にわたる適用性を有する幅広く有用な技術となる。
【００６８】
本明細書に記載される方法は、１つ以上の遺伝子に向けられた本明細書に記載される多量体ｇＲＮＡカセットをコードする核酸、及びＣｓｙ４及びＣａｓ９をコードする核酸と細胞を接触させて、それにより１つ以上の遺伝子の発現を調節するステップを含む。
【実施例】
【００６９】
以下の例に本発明がさらに説明され、これらの例は、特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定するものではない。
【００７０】
実施例１．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９による多重編集
以下のとおりの、単一転写物から発現するｃｒＲＮＡ又はｓｇＲＮＡのいずれかのアレイからＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によって多重編集を行う目的で３つの戦略を試みた：
１．別個のｔｒａｃｒＲＮＡを伴う、ダイレクトリピート隣接ｃｒＲＮＡアレイ及びＣａｓ９
２．Ｃｓｙ４、Ｃａｓ９、及び別個のｔｒａｃｒＲＮＡと共に発現する、Ｃｓｙ４部位によって分かれるショートｃｒＲＮＡアレイ
３．Ｃｓｙ４部位によって分かれる完全長単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）
コンストラクトの各セットについて（図１に示される）、Ｕ２ＯＳ−ＥＧＦＰ破壊アッセイにおいてＥＧＦＰを効率的に破壊する能力を試験した。結果は図２に示す。戦略１及び２を用いて設計したコンストラクトは、単一の標的であっても、ＥＧＦＰ破壊アッセイにおいて最も低い活性を呈した；従ってさらなる実験（以下に記載する）は、戦略３の最適化に重点を置いた。
【００７１】
実施例２．哺乳類細胞におけるＲＮＡポリメラーゼＩＩ及びＩＩＩプロモーターからの高活性ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡの多重発現
長鎖転写物からＣｓｙ４ヌクレアーゼを使用してｇＲＮＡを切り出す例示的戦略の概略図を図３に示す。概念実証を行う初期実験では、ヒト細胞における切断について、２つのバージョンのＣｓｙ４切断ＲＮＡヘアピン部位を試験した。これを行うため、２つのＣｓｙ４切断部位のうちの一方が隣接するｇＲＮＡを発現させた：
１．ＧＴＴＣＡＣＴＧＣＣＧＴＡＴＡＧＧＣＡＧＣＴＡＡＧＡＡＡ（完全２８ｎｔ）（配列番号２）
２．ＧＴＴＣＡＣＴＧＣＣＧＴＡＴＡＧＧＣＡＧ（トランケート型２０ｎｔ）（配列番号１）
この結果、その５’末端及び３’末端にトランケート型２０ｎｔ配列が隣接したｇＲＮＡは、より長い２８ｎｔ配列が隣接するものと比べて哺乳類細胞において活性がより高いことが示された（図４）。本発明者らの知る限りでは、これは、ヒト生細胞においてＣｓｙ４ヌクレアーゼを使用してＲＮＡ転写物をプロセシングし得ることを初めて実証するものである。２０ｎｔトランケート部位の一つの重要なさらなる利点は、より長い２８ｎｔ配列と異なり、長鎖転写物からプロセシングされたｇＲＮＡの５’末端に追加のヌクレオチドが残らないことである（図４）。これにより、最も５’側の位置にいかなる所望のヌクレオチドを有するｇＲＮＡの発現も可能になる。これは、最も５’側の位置に特定の１つ又は複数のヌクレオチドを必要とするＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターからのｇＲＮＡの発現と比べて改善である。
【００７２】
このＣｓｙ４ベースのシステムを使用して、２つ及び３つの異なるｇＲＮＡの効率的な発現（図５及び図６）が実証された。この手法を用いて同時に発現させたｇＲＮＡは、ヒト細胞において予想された部位に改変を誘導した。
【００７３】
これらの結果はまた、このＣｓｙ４ベースの戦略を、ＲＮＡ  Ｐｏｌ  ＩＩプロモーターによって産生される長鎖ｍＲＮＡにコードされるｇＲＮＡで用い得ることも実証した（図７）。これらの実験では、トランケート型Ｃｓｙ４部位が隣接する３つの異なる単一ｇＲＮＡの１つが、ＣＡＧプロモーターによって産生されるｍＲＮＡ（ＲＮＡ  Ｐｏｌ  ＩＩプロモーター）にコードされた。図７に示すとおり、これらのコンストラクトの３つ全てが、ヒト細胞においてＣａｓ９ヌクレアーゼを誘導し得る機能性ｇＲＮＡを産生することができたが、但しＣｓｙ４の存在下に限られた。観察された標的化Ｃａｓ９活性のレベルは、これらのｇＲＮＡが標準的なＲＮＡ  Ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターを単独で使用して又はＲＮＡ  Ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターからのＣｓｙ４が隣接する転写物として発現するときに観察されるレベルと（やや低かったものの）同等であった（図７）。
【００７４】
要約すれば、これらの結果から以下のことが実証された：１）Ｃｓｙ４切断部位によって分けたとき、且つＣｓｙ４の存在下では、ヒト細胞において単一のＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩ転写物から最大３つの機能性ｇＲＮＡを産生させることができる、２）複数のＣｓｙ４によってプロセシングされたｇＲＮＡを使用してＣａｓ９ヌクレアーゼを誘導し、単一のヒト細胞に多重変化を導入することができる、及び３）Ｃｓｙ４切断部位が隣接する機能性ｇＲＮＡを、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターから作られる長鎖ｍＲＮＡ転写物からＣｓｙ４ヌクレアーゼによって切断することができる。
【００７５】
他の実施形態
本発明はその詳細な説明と併せて説明されているが、前述の説明は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を限定するのでなく、例示するよう意図されることが理解されるべきである。他の態様、利点、及び変形例が以下の特許請求の範囲内にある。
本発明は、以下の態様を包含し得る。
［１］
ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする複数の配列
を含むデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子であって、各ｇＲＮＡには、配列ＧＴＴＣＡＣＴＧＣＣＧＴＡＴＡＧＧＣＡＧ（配列番号１）又はＧＴＴＣＡＣＴＧＣＣＧＴＡＴＡＧＧＣＡＧＣＴＡＡＧＡＡＡ（配列番号２）を含むか又はそれからなる少なくとも１つのＣｓｙ４切断配列が隣接する、ＤＮＡ分子。
［２］
プロモーター配列に作動可能に連結されている、上記［１］に記載のＤＮＡ分子。
［３］
２つ、３つ、又はそれ以上のｇＲＮＡ配列を含む、上記［１］に記載のＤＮＡ分子。
［４］
前記プロモーター配列がＲＮＡポリメラーゼＩＩ（Ｐｏｌ  ＩＩ）プロモーター又はＰｏｌ  ＩＩＩプロモーターである、上記［１］に記載のＤＮＡ分子。
［５］
前記プロモーター配列がＲＮＡ  Ｐｏｌ  ＩＩプロモーターである、上記［１］に記載のＤＮＡ分子。
［６］
前記Ｐｏｌ  ＩＩプロモーターが、ＣＡＧ、ＥＦ１Ａ、ＣＡＧＧＳ、ＰＧＫ、ＵｂｉＣ、ＣＭＶ、Ｂ２９、デスミン、エンドグリン、ＦＬＴ−１、ＧＦＰＡ、及びＳＹＮ１プロモーターからなる群から選択される、上記［５］に記載のＤＮＡ分子。
［７］
Ｃｓｙ４切断部位に連結したガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする配列を含む１つ、２つ、３つ又はそれ以上のカセットと連結したプロモーター配列を含むＤＮＡ分子。
［８］
Ｃｓｙ４切断部位に連結した第３のガイドＲＮＡをコードする第３の配列に連結した、Ｃｓｙ４切断部位に連結した第２のガイドＲＮＡをコードする第２の配列に連結した、Ｃｓｙ４切断部位に連結した第１のガイドＲＮＡをコードする第１の配列に作動可能に連結したＰｏｌ  ＩＩプロモーターを含む、上記［７］に記載のＤＮＡ分子。
［９］
約１００ｎｔのガイドＲＮＡ配列を含む、上記［７］に記載のＤＮＡ分子。
［１０］
配列番号１又は２のＣｓｙ４切断部位を含む、上記［７］に記載のＤＮＡ分子。
［１１］
機能性Ｃｓｙ４酵素をコードする配列をさらに含む、上記［１］又は［７］に記載のＤＮＡ分子。
［１２］
前記ｇＲＮＡが配列：
【化６】
0006721508.tif 000008
（式中、Ｘ１７−２０は、標的配列、好ましくはプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の直ちに５’側の標的配列の１７〜２０個の連続ヌクレオチドの相補鎖に相補的な配列であり、及びＸＮは、リボ核酸とＣａｓ９との結合を妨げない任意の配列である）を含む、上記［１］又は［７］に記載のＤＮＡ分子。
［１３］
前記分子の３’末端に１つ以上のＵを含む、上記［１］又は［７］に記載のＤＮＡ分子。
［１４］
上記［１］〜［１３］のいずれか一項に記載のＤＮＡ分子によってコードされるＲＮＡ分子。
［１５］
上記［１］〜［１３］のいずれか一項に記載のＤＮＡ分子を含むベクター。
［１６］
機能性Ｃｓｙ４酵素をコードする配列をさらに含む、上記［１５］に記載のベクター。
［１７］
細胞において複数のガイドＲＮＡを産生させる方法であって、前記細胞において上記［１］〜［１３］のいずれか一項に記載のＤＮＡ分子を発現させるステップ、又は上記［１４］に記載のＲＮＡ分子と前記細胞を接触させるステップを含む方法。
［１８］
前記細胞が哺乳類細胞であり、及び前記細胞がまた外因性機能性Ｃｓｙ４酵素配列も発現し、又は前記方法が、機能性Ｃｓｙ４酵素又は機能性Ｃｓｙ４酵素をコードする核酸を投与するステップをさらに含む、上記［１７］に記載の方法。
［１９］
細胞における複数の標的遺伝子の発現を改変する方法であって、前記方法が、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする複数の配列を含むＤＮＡ分子を発現させるステップを含み、各ｇＲＮＡが、標的遺伝子の少なくとも１７〜２０ｎｔに相補的な配列を含み、及び各ｇＲＮＡには、配列ＧＴＴＣＡＣＴＧＣＣＧＴＡＴＡＧＧＣＡＧ（配列番号１）又はＧＴＴＣＡＣＴＧＣＣＧＴＡＴＡＧＧＣＡＧＣＴＡＡＧＡＡＡ（配列番号２）を含むか又はそれからなる少なくとも１つのＣｓｙ４切断配列が隣接する、方法。
［２０］
細胞における標的遺伝子の発現を改変する方法であって、前記方法が、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする複数の配列を含むＤＮＡ分子を発現させるステップを含み、各ｇＲＮＡが、前記標的遺伝子の少なくとも１７〜２０ｎｔに相補的な配列を含み、及び各ｇＲＮＡには、配列ＧＴＴＣＡＣＴＧＣＣＧＴＡＴＡＧＧＣＡＧ（配列番号１）又はＧＴＴＣＡＣＴＧＣＣＧＴＡＴＡＧＧＣＡＧＣＴＡＡＧＡＡＡ（配列番号２）を含むか又はそれからなる少なくとも１つのＣｓｙ４切断配列が隣接する、方法。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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