(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルス受容性多能性幹細胞由来肝細胞をインビトロで生産する方法であって、
（ａ）多能性幹細胞（ＰＳＣ）由来肝細胞を得ること；および
（ｂ）環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）およびヤヌスキナーゼ阻害剤（ＪＡＫｉ）を含む培地中で前記ＰＳＣ由来肝細胞を培養し、これによりウイルス受容性肝細胞を生産すること、
を含む、上記方法。
【請求項２】
前記ｃＡＭＰおよびＪＡＫｉが、異なる培地中で順次培養される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ｃＡＭＰが第一の培地に投与され、前記ＪＡＫｉが第二の培地に投与される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記多能性幹細胞がヒトである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記多能性幹細胞が胚性幹細胞である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記多能性幹細胞が人工多能性幹細胞である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記ＪＡＫｉが、２−（１，１−ジメチルエチル）−９−フルオロ−３，６−ジヒドロ−７Ｈ−ベンズ［ｈ］−イミダゾ［４，５−ｆ］イソキノリン−７−オン（ＪＡＫ阻害剤１）、１，２，３，４，５，６−ヘキサブロモシクロヘキサン、または（Ｅ）−４，４’−（１，２−ジエチル−１，２−エタンジイル）ビス［２−［（ジエチルアミノ）メチル］−フェノール（９ＣＩ），４，４’−（３Ｅ）−ヘキス（Hex）−３−エン（ene）−３，４−ジイルビス｛２−［（ジエチルアミノ）メチル］フェノール｝（ＮＳＣ３３９９４）である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記ＪＡＫｉが約０．１μＭ〜約５μＭの濃度で存在する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記ＪＡＫｉが約１μＭの濃度で存在する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ｃＡＭＰが約０．１ｍＭ〜約３ｍＭの濃度で存在する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ｃＡＭＰが約１ｍＭの濃度で存在する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ウイルス受容性肝細胞における肝細胞成熟化またはウイルス感染遺伝子の少なくとも１つの発現がＰＳＣ由来肝細胞における発現と比べて多い、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記肝細胞成熟化またはウイルス感染遺伝子が、ＵＧＴ１Ａ１、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、ＴＡＴ、ＰＣＫ１、ＮＲ１３、ＳＬＣ１０Ａ１、ＧＳＴＡ２、ＧＬＹＡＴおよびＭＴ１Ｍからなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ｃＡＭＰが培地中に約２日間〜約６日間存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＪＡＫｉが前記培地中に約１日間〜約３日間存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記培地が無血清培地または規定された培地である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記ウイルス受容性肝細胞が、前記ＰＳＣ由来肝細胞に比べて、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染および／またはＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染を支持する能力が向上している、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記ウイルス受容性肝細胞にＢ型肝炎ウイルスを感染させることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記ウイルス受容性肝細胞において、少なくとも１つのＨＢＶ表面抗原の分泌が増加している、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記少なくとも１つのＨＢＶ表面抗原がＨＢｓＡＧまたはＨＢｅＡＧである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記表面抗原の分泌が、ＨＢＶ感染したＰＳＣ由来肝細胞に比べて少なくとも２倍増加している、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記表面抗原の分泌が、ＨＢＶ感染したＰＳＣ由来肝細胞に比べて少なくとも５倍増加している、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記表面抗原の分泌が、ＨＢＶ感染したＰＳＣ由来肝細胞に比べて少なくとも１０倍増加している、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記ウイルス受容性肝細胞が、他のウイルス受容性肝細胞に感染することができるＢ型肝炎ウイルスを生産する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２５】
ＨＢＶ感染を阻害する化合物をスクリーニングするための方法であって、
（ａ）ＨＢＶに感染したウイルス受容性肝細胞を得ることであって、前記肝細胞を請求項１８に記載の方法によって得ること；
（ｂ）前記肝細胞を候補化合物と接触させること；および
（ｃ）前記ＨＢＶ抗原の分泌のレベルを測定することであって、ＨＢＶ抗原の分泌の減少によってＨＢＶ感染を阻害する化合物を同定することを含む、上記方法。
【請求項２６】
前記ＨＢＶ抗原がＨＢｓＡＧおよび／またはＨＢｅＡＧである、請求項２５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１５年１０月１９日に出願された米国仮出願第６２／２４３，２３７号の優先権を主張するものであり、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
１．技術分野
本発明は、一般に、分子生物学、幹細胞および分化細胞の分野に関する。より具体的には、本発明は、ウイルス感染、特にＢ型肝炎ウイルスに受容的な多能性幹細胞由来肝臓系細胞の成熟化に関する。
【背景技術】
【０００３】
２．関連技術の説明
肝臓の生理学的プロセスおよび、Ｂ型肝炎感染（ＨＢＶ）、肝硬変、肝臓の損傷、および肝細胞癌などの肝臓の疾患や状態の研究における肝細胞の役割をよく理解するために、肝細胞を基にしたインビトロモデル系が使用されている。これらのモデル系は、薬物代謝の研究、抗ＨＢＶ薬などの薬物のスクリーニング、および肝疾患の治療用の細胞を用いた治療法にも使用される。ヒト初代肝細胞は生物学的研究および生物製剤研究において使用されることが多いが、それらは培地中で増殖しないため、供給が限られている。さらに、ヒト初代肝細胞はインビボ環境から分離されると間もなく肝臓の表現型を急速に失い（ギルーゾ（Ｇｕｉｌｌｏｕｚｏ）ら、１９９８）、また、ヒト初代肝細胞の薬物代謝能力にはドナーによって有意な差が認められる。加えて、ヒト初代肝細胞はＨＢＶ感染を支持するが、細胞培地にジメチルスルホキシドまたはポリエチレングリコールを添加したとしても感染は確実ではない（グリポンら、１９８８；グリポンら、１９９３）。
【０００４】
人工多能性幹細胞や胚性幹細胞などのヒト多能性幹細胞（ＰＳＣ）を、肝細胞を含む特定の系統に分化させることができれば、多種多様な疾患の新しい治療の開発、創薬および予測毒性学のプラットフォームの確立、および疾患のインビトロモデルの形成などを含む幅広い用途に、ヒト肝細胞を無制限に使用することができるようになる。患者特異的な機能肝細胞が無制限に供給可能になれば、薬の開発および肝細胞移植の最終臨床適用の両方が大いに進むであろう。そのため、肝細胞を無制限に供給するものの代わりに、ｉｎ  ｓｉｔｕの初代肝細胞の特性を再現するＰＳＣ由来肝細胞の開発に多大な努力が注がれてきた。一般に、このような方法は、内胚葉誘導および肝臓特性を制御することが知られている経路作動薬および拮抗薬をＰＳＣの単層に添加し、分化を誘導する。例えば、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）は、内胚葉誘導およびその後のオンコスタチンＭを含む成熟培地中での培養において、アクチビンＡおよびＷｎｔ３ａと相乗作用して、アルブミン陽性肝細胞を生じることが分かっている（チェンら、２０１２）。
【０００５】
しかし、現在知られているＰＳＣ由来肝細胞を生産するプロトコールでは、重要な薬物代謝酵素が機能レベルに達せず、Ｂ型肝炎ウイルスを効率的に複製しない未成熟肝細胞が生産される。したがって、治療および研究用途のためのさらに成熟化したＰＳＣ由来肝細胞、特に抗ＨＢＶ薬のスクリーニングにおいてモデルとして使用するＢ型肝炎ウイルス複製が可能な肝細胞を生産する方法が必要とされている。
【発明の概要】
【０００６】
本開示は、ウイルス受容性、特にＨＢＶ受容性の肝細胞を、特定の肝細胞成熟培養の条件で多能性幹細胞（ＰＳＣ）由来肝細胞から生産する方法を提供する。第一の態様において、ウイルス受容性多能性幹細胞由来肝細胞を生産するインビトロでの方法を提供し、この方法は、多能性幹細胞（ＰＳＣ）由来肝細胞を得ること、環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）およびヤヌスキナーゼ阻害剤（ＪＡＫｉ）を含む培地中でＰＳＣ由来肝細胞を培養すること、これによりウイルス受容性肝細胞を生産することを含む。
【０００７】
特定の局面において、ｃＡＭＰおよびＪＡＫｉは、異なる培地中で順次培養される。例えば、ｃＡＭＰが第一の培地に投与され、ＪＡＫｉが第二の培地に投与される。いくつかの局面において、ｃＡＭＰは培地中に約２日間〜約６日間含まれる。特定の局面において、ＪＡＫｉは培地中に約１日間〜約３日間含まれる。さらなる局面において、培地は無血清または規定された（defined）培地である。
【０００８】
いくつかの局面において、多能性幹細胞はヒト型である。特定の局面において、多能性幹細胞は胚性幹細胞である。他の局面において、多能性幹細胞は人工多能性幹細胞である。
【０００９】
特定の局面において、ＪＡＫｉは、２−（１，１−ジメチルエチル）−９−フルオロ−３，６−ジヒドロ−７Ｈ−ベンズ［ｈ］−イミダゾ［４，５−ｆ］イソキノリン−７−オン（ＪＡＫ阻害剤１）、１，２，３，４，５，６−ヘキサブロモシクロヘキサン、または（Ｅ）−４，４’−（１，２−ジエチル−１，２−エタンジイル）ビス［２−［（ジエチルアミノ）メチル］−フェノール（９ＣＩ），４，４’−（３Ｅ）−ヘックス−３−エン−３，４−ジイルビス｛２−［（ジエチルアミノ）メチル］フェノール｝（ＮＳＣ３３９９４）である。いくつかの局面において、ＪＡＫｉは約０．１μＭ〜約５μＭの濃度、例えば０．５μＭ〜２．５μＭ、０．７５μＭ〜１．５μＭの濃度で含まれる。特定の局面において、ＪＡＫｉは約１μＭの濃度で含まれる。
【００１０】
いくつかの局面において、ｃＡＭＰは約０．１ｍＭ〜約３ｍＭの濃度、例えば０．５μＭ〜２μＭの濃度で含まれる。特定の局面において、ｃＡＭＰは約１ｍＭの濃度で含まれる。
【００１１】
特定の局面において、ウイルス受容性肝細胞における肝細胞成熟化またはウイルス感染遺伝子の少なくとも１つの発現は、ＰＳＣ由来肝細胞における発現に比べて高い。いくつかの局面において、肝細胞成熟化またはウイルス感染遺伝子は、ＵＧＴ１Ａ１、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ、ＴＡＴ、ＰＣＫ１、ＮＲ１３、ＳＬＣ１０Ａ１、ＧＳＴＡ２、ＧＬＹＡＴおよびＭＴ１Ｍからなる群から選択される。
【００１２】
さらなる局面において、ウイルス受容性肝細胞はＰＳＣ由来肝細胞に比べて、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染および／またはＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染を支持する点で高い能力を有する。
【００１３】
さらなる態様では、ウイルス受容性肝細胞にＢ型肝炎ウイルスを感染させる。いくつかの局面においてウイルス受容性肝細胞は、少なくとも１つのＨＢＶ表面抗原の分泌が増加している。特定の局面において、少なくとも１つのＨＢＶ表面抗原はＨＢｓＡＧまたはＨＢｅＡＧである。特定の局面において、表面抗原の分泌は、ＨＢＶ感染したＰＳＣ由来肝細胞に比べて少なくとも２倍に増加している。いくつかの局面において、表面抗原の分泌は、ＨＢＶ感染したＰＳＣ由来肝細胞に比べて少なくとも５倍に増加している。特定の局面において、表面抗原の分泌は、ＨＢＶ感染したＰＳＣ由来肝細胞に比べて少なくとも１０倍に増加している。いくつかの局面において、ウイルス受容性肝細胞は、他のウイルス受容性肝細胞に感染可能なＢ型肝炎ウイルスを生じる。
【００１４】
さらなる態様では、ＨＢＶの複製を阻害する化合物をスクリーニングする方法を提供し、この方法は、ＰＳＣ由来肝細胞を環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）とヤヌスキナーゼ阻害剤（ＪＡＫｉ）を含む培地中で培養することによってＨＢＶに感染したウイルス受容性肝細胞を得ること、前記ウイルス受容性肝細胞を候補化合物と接触させること、および、ＨＢＶ抗原の分泌のレベルを測定し、ＨＢＶ抗原の分泌の減少によってＨＢＶ複製を阻害する化合物を同定することを含む。いくつかの局面において、ＨＢＶ抗原はＨＢｓＡＧおよび／またはＨＢｅＡＧである
【００１５】
本発明の他の目的、特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、詳細な説明および特定の実施例は、本発明の好ましい態様を示してはいるが、例示のために示されているだけであり、この詳細な説明から、本発明の精神および範囲内の様々な変更および修正が当業者には明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本発明の特定の局面をさらに示すために含まれるものである。本発明は、本明細書に提示される特定の態様の詳細な説明と組み合わせて、これらの図面の１つ以上を参照することにより、よりよく理解され得る。
【００１７】
【図１Ａ】Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の臨床的進行。ＨＢＶの血清学的プロファイルは、ＨＢＶ感染の第一の兆候は血清中におけるＨＢｓＡＧの検出であることを示す。血清中で、ＨＢｓＡＧは生存しているウイルス粒子の最高１×１０６倍のモル倍まで過剰に存在するため検出しやすい。ＨＢｅＡＧはＨＢＶ感染細胞によってライフサイクルの後期に少ない量で発現し、一般にインビボでの真性（ｔｒｕｅ）のＨＢＶ感染を確認するために使用される。
【図１Ｂ】ＨＢＶのライフサイクルをＳ抗原およびＥ抗原の分泌とともに示す図（Ｎａｓｓａｌ（ナザル）ら、２００８）。
【００１８】
【図２Ａ】異なるロット（Ａ、Ｂ、Ｃ）のｉＣｅｌｌ肝細胞は、感染したｉＣｅｌｌ肝細胞の培養の上清に存在するＨＢｓＡＧのＨＢＶ播種後の増加がＨＢＶ感染に一致するが、検出可能な量のＨＢｅＡＧを含まないことを示す。
【図２Ｂ】化合物Ａ（ｃＡＭＰ）および化合物Ｂ（ヤヌスキナーゼ阻害剤、ＪＡＫｉ）を用いた前処理によってＨＢＶ受容性肝細胞を生産するための培養条件を示す模式図。化合物Ａ（ｃＡＭＰ）および化合物Ｂ（ＪＡＫｉ）で前処理し、その後、ＨＢＶに感染させたｉＣｅｌｌ肝細胞は、２つのｉＣｅｌｌ肝細胞のロット［ロットＡ（図２Ｅ、２Ｆ）およびロットＢ（図２Ｃ、２Ｄ）］においてＨＢｓＡＧ（図２Ｃ、２Ｅ）およびＨＢｅＡＧ（図２Ｄ、２Ｆ）陽性となる。１０倍希釈したアッセイでは、ＨＢｓＡＧの値の最高範囲はグラフの範囲外である。
【図２Ｃ】化合物ＡおよびＢの培養が最も高いＨＢｓＡＧを有し、化合物Ａ、化合物Ｂ、および対照がそれに続いた。
【図２Ｄ】化合物ＡおよびＢの培養が最も高いＨＢｅＡＧを有し、化合物Ａ、化合物Ｂ、および対照がそれに続いた。
【図２Ｅ】化合物ＡおよびＢの培養は対照と比較して有意に高いＨＢｓＡＧを有した。
【図２Ｆ】化合物ＡおよびＢの培養は対照と比較して有意に高いＨＢｅＡＧを有した。
【図２Ｇ】ＨＢＶ感染１０日後のＨＢｓＡＧの生産が示すように、ｉＣｅｌｌ肝細胞の３つのロットは、ｃＡＭＰおよびＪＡＫｉとともに培養した後、ＨＢＶ感染に受容的になる。
【図２Ｈ】ＨＢＶ感染１０日後のＨＢｅＡＧの生産が示すように、ｉＣｅｌｌ肝細胞の３つのロットは、ｃＡＭＰおよびＪＡＫｉとともに培養した後、ＨＢＶ感染に受容的になる。
【００１９】
【図３Ａ】ＨＢＶ受容性肝細胞の肝細胞に再感染できるＨＢＶを生産する能力を、陰性対照として使用される心筋細胞と比較して評価する方法を示す模式図。
【図３Ｂ】ＨＢＶ一次感染後のＨＢｓＡＧのレベルを示す。
【図３Ｃ】ＨＢＶ一次感染後のＨＢｅＡＧのレベルを示す。
【図３Ｄ】肝細胞から生産した上清にはＨＢｓＡＧが存在したが、心筋細胞から生産した上清には存在しなかったことから、一次感染によって生産された上清から得られた濃縮ＨＢＶは再感染の強い兆候を示す。
【図３Ｅ】肝細胞から生産した上清にはＨＢｅＡＧが存在したが、心筋細胞から生産した上清には存在しなかったことから、一次感染によって生産された上清から得られた濃縮ＨＢＶは再感染の強い兆候を示す。
【００２０】
【図４Ａ】ｃＡＭＰおよびＪＡＫｉの存在下で培養したＰＳＣ由来肝細胞の長期生存性を示す。
【図４Ｂ】ＳＬＣ１０Ａ１遺伝子の発現によって、ＨＢＶ受容体ＮＴＣＰの発現を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本開示は、多能性幹細胞（ＰＳＣ）からウイルス感染に受容性がある肝細胞を生産する際の現在の技術におけるいくつかの主要な問題を克服するものであり、ＰＳＣ由来肝細胞の出発集団は肝細胞のウイルス受容性を劇的に増加させる化合物の組み合わせの存在下で単純培養される。注目すべきことに、本開示の方法は、例えば胚性幹細胞または人工多能性幹細胞などを含む多能性幹細胞のいずれの型にも適用される。一例では、ＰＳＣ由来肝細胞は環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）を含む培地で培養されて成熟化を開始し、それからヤヌスキナーゼ阻害剤を含む培地で培養され、特にＨＢＶに対する高いウイルス受容性を持つ肝細胞を生産するプロセスを完了する。いくつかの態様では、ＰＳＣ由来肝細胞はｃＡＭＰおよびＪＡＫｉの両方を含む培地で培養してもよい。処理肝細胞の有用な特徴解析手段としては、ＰＳＣ由来肝細胞の遺伝子発現のパターンを初代肝細胞の遺伝子発現のパターンと単純に比較することが挙げられる。別のアプローチとしては、ＰＳＣ由来肝細胞が、ＰＳＣ由来肝細胞の出発集団のＨＢＶ感染力と比較して増加したレベルでＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の複製（例えば、ＨＢｓＡＧおよびＨＢｅＡＧなどの表面抗原の分泌を特徴とする）を維持する能力を評価する方法がある。
【００２２】
したがって、さらなる態様では、ＨＢＶの複製を阻害する候補化合物をスクリーニングする方法を提供する。特定の局面において、本明細書で提供される処理肝細胞はＨＢＶに感染され、その後に試験化合物と接触する。特定の局面において、ＨＢｓＡＧおよびＨＢｅＡＧなどのＨＢＶ表面抗原の分泌が測定され、抗原の分泌の減少により、抗ＨＢＶ薬の候補が同定される。
【００２３】
したがって、本開示の方法は、Ｂ型肝炎ウイルス感染を含む様々な疾患の新しい治療の開発および肝臓損傷の予防のためのモデル系、予測毒性学のプラットフォームの確立、および疾患のインビトロモデルの形成を含む幅広い用途に適用可能な、ウイルス感染に受容的な無制限の数のヒト肝細胞を提供する。加えて、本明細書に記載の方法は、おそらく急性、慢性、または遺伝性の肝機能障害によりそのような治療を必要とする対象に、肝機能を回復させるために肝細胞を移植する臨床用途のための患者特異的な機能肝細胞の誘導にも使用することができる。
【００２４】
Ｉ．定義
本明細書中で使用される場合、特定の成分に関して「本質的に含まない」とは、特定の成分がいずれも意図的に組成物に処方されていない、および／または汚染物質としてのみ存在する、または微量存在することを意味している。従って、意図しない組成物の汚染に起因する特定の成分の総量は、０．０５％未満、好ましくは０．０１％未満である。最も好ましいのは、組成物中に含まれる特定の成分の量が、標準的な分析方法で検出することができないレベルであることである。
【００２５】
本明細書中で使用される場合、「１つ（ａ）」または「１種（ａｎ）」は、１つ以上であることを意味し得る。添付の特許請求の範囲において使用されるように、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と併せて使用される場合、単語「１つ（ａ）」または「１種（ａｎ）」は、１つまたは複数のことを意味し得る。
【００２６】
特許請求の範囲において用語「または」を使用することは、選択肢の一方のみを指すことを明示しない限り、または選択肢が相互に排他的である場合を除いて「および／または」を意味する。本明細書中で使用される場合、「別の」は、少なくとも第２のまたはそれ以上を意味し得る。
【００２７】
本出願全体を通して、「約」という用語は、ある値が、装置の誤差に固有の変動、値を決定するために使用される方法、または被験者の間に存在する変動を含むことを示すために使用される。
【００２８】
本明細書において「細胞」という用語は、当該分野における最も広義で使用され、多細胞生物組織の構造単位である生体を指し、外側から自身を区別する膜構造に囲まれ、自己複製する能力を有し、遺伝子情報および遺伝子情報を発現するメカニズムを有する。本明細書で使用される細胞は、天然に存在する細胞または人工的に改変された細胞（例えば、融合細胞、遺伝子改変細胞など）であり得る。
【００２９】
本明細書において「幹細胞」という用語は、適切な条件下で多様な範囲の特殊化した細胞型に分化することができ、他の適切な条件下では自己複製して本質的に未分化多能性状態にとどまる細胞を指す。「幹細胞」という用語は、多能性細胞、多分化能性細胞、前駆細胞および前駆体細胞も包含する。例示的なヒト幹細胞は、骨髄組織から得られる造血幹細胞または間葉系幹細胞、胚組織から得られる胚性幹細胞、または胎児の生殖器組織から得られる胚性生殖細胞から得ることができる。例示的な多能性幹細胞はまた、多能性に関連する特定の転写因子を発現させることで体細胞を多能性状態にリプログラミングすることによって体細胞からも産生され得る。このような細胞は、「人工多能性幹細胞」または「ｉＰＳＣ」と呼ばれている。
【００３０】
「胚性幹（ＥＳ）細胞」は、胚盤胞期の内部細胞塊などの初期段階で胚から得られる未分化多能性細胞、または人為的手段（例えば、核移植）によって産生される未分化多能性細胞であり、生殖細胞（例えば、精子および卵）を含む、胚または成体の任意のより分化した細胞型を生じることができる細胞である。
【００３１】
「人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）」は、ある因子の組み合わせ（本明細書ではリプログラミング因子と呼ばれる）を発現させるまたはそれらの発現を誘導することで体細胞をリプログラミングすることによって生成される細胞である。ｉＰＳＣは、胎児、出生後、新生児、若年または成体の体細胞を用いて生成することができる。特定の態様において、体細胞を多能性幹細胞にリプログラミングするために使用され得る因子は、例えば、Ｏｃｔ４（Ｏｃｔ３／４と呼ばれることもある）、Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃ、Ｋｌｆ４、Ｎａｎｏｇ、およびＬｉｎ２８を含む。いくつかの態様において、体細胞は、少なくとも２つのリプログラミング因子、少なくとも３つのリプログラミング因子、または４つのリプログラミング因子を発現させることによって多能性幹細胞にリプログラミングされる。
【００３２】
「リプログラミング」は、培養中またはインビボで、細胞に少なくとも１つの新しい細胞型の後代細胞を形成するために、リプログラミングなしの同じ条件下の細胞よりも、測定できるほどに高い能力を付与するプロセスである。より具体的には、リプログラミングは体細胞に多能性能力を付与するプロセスである。つまり、リプログラミングの前にそのような後代細胞が実質的に形成できなかった場合、十分に増殖させた後には、測定できるほどの割合の後代細胞が新しい細胞型の表現型特徴を示すか、そうでなければ、新しい細胞型の特徴を有する割合がリプログラミングの前よりも測定できるほどに多いことを意味する。特定の条件下において、新しい細胞型の特徴を有する後代細胞の割合は、優先順位の低い方から順に少なくとも約０．０５％、０．１％、０．５％、１％、５％、２５％またはそれ以上である。
【００３３】
「多能性幹細胞」とは、生体中のすべての細胞に分化する能力を有する幹細胞を指し、好ましくは、三胚葉：内胚葉（胃の内壁、消化管、肺）、中胚葉（筋肉、骨、血液、泌尿生殖器）、または外胚葉（表皮組織および神経系）のいずれかとなる細胞を指す。
【００３４】
本明細書で使用する場合「体細胞」という用語は、卵子または精子などの生殖細胞以外のすべての細胞を指し、そのＤＮＡを次の世代に直接伝達しない任意の細胞のことを指す。代表的には、体細胞は限られた多能性を有するか、または多能性を有さない。本明細書において使用される体細胞は、天然に存在し得るか、または遺伝的に改変され得る。
【００３５】
本明細書で細胞に関連して使用する場合、「改変された」という用語は、細胞ゲノムに組み込まれた少なくとも１つの外因性の遺伝要素を含む細胞を指す。いくつかの局面において、外因性の遺伝要素は細胞ゲノムの無作為な位置に組み込まれ得る。他の局面において、遺伝要素はゲノムの特定の部位に組み込まれる。例えば、遺伝要素は特定の部位に組み込まれて、内因性の配列に変更を加えるなど内因性の核酸の配列を交換してもよい（例えば一塩基の位置の変更）。
【００３６】
培地、細胞外マトリックス、または培養条件に関して使用される場合、用語「規定された」または「完全に規定された」は、培地、細胞外マトリックス、または培養条件に含まれる化学組成および全成分のおよその量が分かっている、培地、細胞外マトリックス、または培養条件を指す。例えば、規定された培地は、ウシ胎仔血清、ウシ血清アルブミンまたはヒト血清アルブミンなどの規定されていない因子を含まない。一般に、規定された培地は基礎培地（例えば、アミノ酸、ビタミン、無機塩、緩衝剤、酸化防止剤およびエネルギー源を含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、Ｆ１２、またはロズウェルパークメモリアル研究所培地（ＲＰＭＩ）１６４０）を含み、組換えアルブミン、化学的に規定された脂質、および組換えインスリンが添加される。
【００３７】
本明細書で使用する場合「肝細胞」という用語は、形態、マーカーの発現、インビトロおよびインビボにおける機能的アッセイによって測定したときに、成熟肝細胞のすべてではないがいくつかの特徴を示す肝細胞様細胞、ならびに肝細胞のすべての特徴を有する成熟化した完全に機能的な肝細胞を含む。
【００３８】
本明細書においては「ＪＡＫｉ」、「ＪＡＫ阻害剤」、および「ＪＡＫ／ＳＴＡＴ阻害剤」という用語は、ＪＡＫ−ＳＴＡＴの相互作用の量および／または活性を下方制御（ダウンレギュレート）する、もしくは低下させるまたは抑えることができる任意の薬剤と同義で使用される。ＪＡＫ阻害剤はＪＡＫ分子の量または活性を下方制御する。ＳＴＡＴ阻害剤はＳＴＡＴ分子の量または活性を下方制御する。これらの細胞成分の阻害は、ＪＡＫへの直接的な結合（例えばＪＡＫ阻害剤と化合物との結合複合体または基質模倣体）、ＳＴＡＴに対する直接的な結合、またはそのような細胞成分をコードする遺伝子の発現を阻害することを含むがこれらには限定されない当該分野で知られている様々なメカニズムによって達成することができる。ＪＡＫ／ＳＴＡＴ阻害剤は、例えば、公開米国特許出願第２００４／０２０９７９９号、ＰＣＴ公報国際公開第２０１４０１３０１４号、ＰＣＴ公報国際公開第２００９１５５５５１号、および米国特許第９１３３２００号に開示され、参照によりすべて本明細書に組み込まれる。
【００３９】
「薬」または「候補化合物」という用語は、疾患に関連する表現型を変化させるまたは変化させる候補である低分子、核酸およびタンパク質、またはその組み合わせを含むがこれらには限定されない分子を指す。
【００４０】
「抗ＨＢＶ剤」は本明細書においては、インビトロでまたはインビボでのＨＢＶの複製を妨害する化合物または組成物として定義される。
【００４１】
「ハイスループットスクリーニング」は、多数の試験化合物の、ウイルス複製、特にＨＢＶの複製を阻害する能力を同時にアッセイする方法を指す。一般に、これらの方法は自動機器を活用して行う。
【００４２】
ＩＩ．成熟肝細胞の生産
Ａ．肝細胞の出発集団
本開示の特定の態様では、肝細胞の出発集団を、成熟化を促進する条件で培養して、慢性ウイルス（例えばＨＢＶ）感染の特徴を示す能力を獲得させることによって、ウイルス受容性肝細胞、特にＨＢＶに受容性があるウイルス受容性肝細胞を生産するための方法および組成物を開示する。ドナーから得られた初代肝細胞は成熟肝細胞であり、ＨＢＶ感染に受容性がある。肝細胞の出発集団は、多能性幹細胞（ＰＳＣ）由来肝細胞または初代肝細胞であってよい。しかし、ＰＳＣ由来肝細胞が慢性ＨＢＶ感染に完全に受容的になるためには、初代肝細胞に近い特定のレベルの成熟化が必要となる。本明細書に記載の方法はそのような特定のレベルの成熟化を提供し、慢性ＨＢＶ感染への受容性を得ることができる。いくつかの態様では肝細胞の出発集団は、人工多能性幹細胞および胚性幹細胞を含み得るが、これらに限定されない幹細胞由来であり得る。
【００４３】
１．多能性幹細胞
ＰＳＣ由来肝細胞の出発集団は、ヒト胚性幹細胞（ＥＳＣ）および人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に由来し得る。ＥＳＣおよびｉＰＳＣの両方ともインビトロでの長期増殖が可能であり、それと同時に肝細胞を含むすべての身体の細胞型に分化する可能性を持つ。ヒトＥＳＣおよびｉＰＳＣ由来肝細胞の出発集団は、一般にヒト初代成体肝細胞の完全な機能スペクトルを示さない。本開示の特定の局面は、ｉＰＳＣの生成と同様に、すべてではないがほとんどの通常の発達段階をバイパスして、肝細胞分化／機能にとって重要な転写因子の組み合わせの発現により、ヒトＥＳＣまたはｉＰＳＣから直接誘導することができるＰＳＣ由来肝細胞の出発集団に関する（米国特許第８，４８１，３１７号、公開米国特許出願第２０１４０２４２５９５号、ＰＣＴ米国特許出願第２０１５／０２６５８３号）。
【００４４】
ａ．胚性幹細胞
特定の局面において、肝細胞の出発集団は胚性幹細胞に由来する。ＥＳ細胞は、胚盤胞の内部細胞塊に由来し、インビトロでの高い分化能を有する。ＥＳ細胞は、発達中の胚の外側栄養外胚葉層を除去し、次いで、非増殖細胞のフィーダー層上で内部質量細胞を培養することによって単離され得る。再播種された細胞は増殖し続け、ＥＳ細胞の新しいコロニーを生成することができる。このＥＳ細胞を、回収し、分離し、再び播種して、増殖させることができる。未分化ＥＳ細胞を「継代培養」するこのプロセスは、未分化ＥＳ細胞を含む細胞株を産生するために何度も繰り返すことができる（米国特許第５，８４３，７８０号、第６，２００，８０６号、第７，０２９，９１３号）。ＥＳ細胞は、それらの多能性を維持しながら増殖するという能力を有する。例えば、ＥＳ細胞は、細胞および細胞分化を制御する遺伝子に関する研究において有用である。ＥＳ細胞の多能性は、遺伝子操作や選択との組み合わせることにより、トランスジェニックマウス、キメラマウス、およびノックアウトマウスの生成を介してインビボでの遺伝子分析研究に使用することができる。
【００４５】
マウスＥＳ細胞の生産方法はよく知られている。ある方法では、１２９系マウスの着床前胚盤胞をマウス抗血清で処理して栄養外胚葉を除去し、内部細胞塊をウシ胎仔血清を含有する培地中で、化学的に不活性化したマウス胚線維芽細胞のフィーダー細胞層上で培養する。発生する未分化ＥＳ細胞のコロニーを、ウシ胎仔血清の存在下、マウス胚線維芽細胞フィーダー層上で継代培養して、ＥＳ細胞の集団を生産する。いくつかの方法において、マウスＥＳ細胞は、血清含有培地（スミス、２０００）にサイトカイン白血病阻害因子（ＬＩＦ）を添加することによって、フィーダー層の非存在下で増殖させることができる。他の方法では、マウスＥＳ細胞を、骨形成タンパク質およびＬＩＦ存在下、無血清培地中で増殖させることができる（インら、２００３）。
【００４６】
ヒトＥＳ細胞は、既に報告されている方法の通り（トムソンおよびマーシェル、１９９８；ルービノフ（Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆ）ら、２０００）、精子と卵細胞の融合、核移植、病原性、またはクロマチンのリプログラミングとその後のリプログラミングされたクロマチンの原形質膜への取り込みによって産生される接合体または胚盤胞期の哺乳類胚から産生または誘導することができる。一方法では、ヒト胚盤胞を抗ヒト血清に曝露し、栄養外胚葉細胞を溶解して内部細胞塊から除去し、これをマウス胚線維芽細胞フィーダー層上で培養する。さらに、内部細胞塊に由来する細胞の塊を化学的にまたは機械的に解離させ、再播種し、未分化形態を有するコロニーをマイクロピペットによって選択し、解離させ、そして再播種する。いくつかの方法では、ヒトＥＳ細胞を、塩基性線維芽細胞増殖因子存在下、線維芽細胞のフィーダー層上で培養することにより、血清を用いずに増殖させることができる（アミットら、２０００）。他の方法では、ヒトＥＳ細胞は、線維芽細胞増殖因子（シュウら、２００１）を含有する「馴化」培地の存在下で、マトリゲル（商標）またはラミニンなどのタンパク質性マトリックス上で細胞を培養することによってフィーダー細胞層なしで増殖させることができる。
【００４７】
ＥＳ細胞はまた、既に報告されている方法に従って、アカゲザルおよびマーモセットを含む他の生物から（トムソンおよびマーシェル、１９９８；トムソンら、１９９５；トムソンおよびオドリコ、２０００；米国特許第５，８４３，７８０）、さらには、樹立されたマウスおよびヒト細胞株から誘導することもできる。例えば、樹立ヒトＥＳ細胞株としては、ＭＡＯＩ、ＭＡ０９、ＡＣＴ−４、ＨＩ、Ｈ７、Ｈ９、Ｈ１３、Ｈ１４およびＡＣＴ３０が挙げられる。さらなる例として、樹立されたマウスＥＳ細胞系としては、１２９系マウス胚の内部細胞塊から樹立されたＣＧＲ８細胞系があり、ＣＧＲ８細胞の培養物は、ＬＩＦが存在すれば、フィーダー層なしで増殖させることができる。
【００４８】
ＥＳ幹細胞は、転写因子Ｏｃｔ４、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、段階特異的胚抗原ＳＳＥＡ−１、段階特異的胚抗原ＳＳＥＡ−３、段階特異的胚抗原ＳＳＥＡ−４、転写因子ＮＡＮＯＧ、腫瘍拒絶抗原１−６０（ＴＲＡ−１−６０）、腫瘍拒絶抗原１−８１（ＴＲＡ−１−８１）、ＳＯＸ２、またはＲＥＸ１などのタンパク質マーカーによって検出することができる。
【００４９】
ｂ．人工多能性幹細胞
他の局面において、肝細胞の出発集団は一般にｉＰＳ細胞またはｉＰＳＣと略される人工多能性幹細胞に由来する。多分化能の誘導は最初、多能性に関連している転写因子の導入による体細胞のリプログラミングによって、２００６年にはマウス細胞を用いて（ヤマナカら、２００６）、そして２００７年にはヒト細胞を用いて（ユーら、２００７、タカハシら、２００７）達成された。ｉＰＳＣを使用することで、ＥＳ細胞の大規模な臨床使用に関連する倫理的および実践的問題の大部分が回避でき、ｉＰＳＣ由来自己移植を有する患者は、移植片拒絶反応を予防するための生涯にわたる免疫抑制治療を必要としない可能性がある。
【００５０】
特定細胞型（生殖細胞および脱核赤血球など）を除き、いずれの細胞もｉＰＳＣの出発材料として使用することができる。例えば、そのような細胞型は、ケラチノサイト、線維芽細胞、造血細胞、間葉細胞、肝臓細胞、または胃細胞であり得る。Ｔ細胞はまた、リプログラミングのための体細胞の供給源として使用され得る（公開米国特許出願第２０１４０３１５３０４号、米国特許第８，７４１，６４８号）。細胞分化の程度または細胞が採取される動物の年齢に制限はない。未分化の前駆細胞（体細胞幹細胞を含む）および最終的に分化した成熟細胞も、本明細書中に開示される方法においては、体細胞の供給源として使用され得る。一態様では、体細胞はそれ自体が、ＣＤ３４＋造血前駆細胞またはヒト線維芽細胞などの皮膚細胞などの血液細胞である。体細胞は、成体または胎児の体細胞であり得る。ＳＳＥＡ−１、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０およびＴＲＡ−１−８１を含むヒトＥＳ細胞マーカーを発現することが知られている条件下でｉＰＳＣを増殖させることができる。
【００５１】
当業者に知られている方法を用いて、体細胞を、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を産生するようにリプログラミングすることができる。当業者は、人工多能性幹細胞を容易に産生することができる（例えば、参照することにより本明細書に組み込まれる、公開米国特許出願第２００９０２４６８７５号、同第２０１０／０２１００１４号、同第２０１２０２７６６３６号；米国特許第８，０５８，０６５号；同第８，１２９，１８７号；ＰＣＴ公報国際公開第２００７／０６９６６６号Ａ１、および米国特許第８，２６８，６２０号を参照のこと）。一般に核リプログラミング因子は、体細胞から多能性幹細胞を産生するために使用される。いくつかの態様では、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、およびＬｉｎ２８のうちの少なくとも３つ、または少なくとも４つが利用される。他の態様では、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２と、ＮａｎｏｇおよびＬｉｎ２８のうちの少なくとも１つが利用される。他の態様では、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２と、ｃ−ＭｙｃおよびＫｌｆ４のうちの少なくとも１つが利用される。
【００５２】
これら核リプログラミング物質のマウスおよびヒトｃＤＮＡ配列は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，１８３，０３８号および国際公開第２００７／０６９６６６号に記載されたＮＣＢＩアクセッション番号を参照することによって入手可能である。１つまたは複数のリプログラミング物質、またはこれらリプログラミング物質をコードする核酸を導入する方法は、当該分野で知られており、例えば、米国特許第８，２６８，６２０号、第８，６９１，５７４号、第８，７４１，６４８号、第８，５４６，１４０号、第８，９００，８７１号、および第８，０７１，３６９号に開示されており、これらは参照により本明細書に組み込まれる。
【００５３】
誘導したｉＰＳＣは、多能性を維持するのに十分な培地中で培養することができる。ｉＰＳＣは、米国特許第７，４４２，５４８号および米国特許出願公開第２００３／０２１１６０３号に記載されているように、多能性幹細胞を、より具体的には胚性幹細胞を培養するために開発された様々な培地および技術と共に使用され得る。マウス細胞の場合、分化抑制因子である白血病抑制因子（ＬＩＦ）を通常の培地に添加して培養する。ヒト細胞の場合、ＬＩＦの代わりに塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を添加することが望ましい。当業者に知られているように、本方法とともにｉＰＳＣを培養および維持するための他の方法を使用することもできる。
【００５４】
特定の態様では、規定されていない条件を使用することができる。例えば、幹細胞を未分化状態に維持するために、線維芽細胞フィーダー細胞上、または線維芽細胞フィーダー細胞に曝露された培地上で多能性細胞を培養することができる。いくつかの態様において、細胞は、フィーダー細胞として、細胞分裂を終了させるために放射線または抗生物質で処理されたマウス胚線維芽細胞の共存下で培養される。あるいは多能性細胞は、ＴＥＳＲ（商標）培地（ルドウィグら、２００６ａ；ルドウィグら、２００６ｂ）またはＥ８（商標）／Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ８（商標）培地（チェンら、２０１１）などの規定されたフィーダー非依存性培養系を使用することで、本質的に未分化な状態で培養および維持され得る。
【００５５】
プラスミドは、制御された状態で高いコピー数を達成すること、バクテリア内でプラスミドが不安定性を示す潜在的原因を回避すること、ヒト細胞を含む哺乳動物細胞での使用に適合するプラスミドを選抜するための手段を提供することなど、多くの目的を考慮して設計されている。ヒト細胞で使用するためのプラスミドの二大要件に特に注意が払われている。第一の要件は、大腸菌での維持および発酵に適しており、大量のＤＮＡを生産および精製することができる、ということである。第二の要件は、それらが安全であり、ヒト患者および動物における使用に適していることである。第一の要件には、バクテリア発酵中に比較的容易に選択および安定に維持できる高コピー数プラスミドであることが必要となる。第二の要件には、選択可能なマーカーおよび他のコード配列などの要素に注意する必要がある。いくつかの態様においてマーカーをコードするプラスミドは、（１）高コピー数複製起点、（２）カナマイシンによる抗生物質選択のためのｎｅｏ遺伝子など（これには限定されないが）の選択マーカー、（３）チロシナーゼエンハンサーなどの転写終結配列、および（４）種々の核酸カセット取り込みのためのマルチクローニング部位；ならびに（５）チロシナーゼプロモーターに作動可能に連結されたマーカーをコードする核酸配列、から構成される。タンパク質をコードする核酸を誘導するための多数のプラスミドベクターが存在し、当該分野で知られている。これらには、参照することにより本明細書に組み入れられる、米国特許第６，１０３，４７０号；米国特許第７，５９８，３６４号；米国特許第７，９８９，４２５号；および米国特許第６，４１６，９９８号に開示されているベクターが含まれるがこれらには限定されない。
【００５６】
エピソーム遺伝子送達系は、プラスミド、ＥＢＶ（エプスタイン・バーウイルス、Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ）を基礎とするエピソームベクター（米国特許第８，５４６，１４０号）、酵母を基礎とするベクター、アデノウイルスを基礎とするベクター、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）を基礎とするエピソームベクター、ウシ乳頭腫ウイルス（ＢＰＶ）を基礎とするベクター、またはレンチウイルスベクターであり得る。ウイルス遺伝子送達系は、ＲＮＡ系またはＤＮＡ系のウイルスベクターであり得る。（ＰＣＴ特開２００９−０６２９１１号公報）
【００５７】
ｃ．体細胞核移植によって誘導される胚性幹細胞
肝細胞の出発集団を誘導するための多能性幹細胞は、紡錘体を含まない卵母細胞へのドナー核の移動を伴う体細胞核移植によっても調製することができる。核移植によって生産した幹細胞は、ドナーの核と遺伝子的に同一である。一方法では、アカゲザルの皮膚線維芽細胞由来のドナー線維芽細胞核を、電気融合によって紡錘体を含まない成熟中期ＩＩ型アカゲザル眼細胞の細胞質に導入する（ビルンら、２００７）。融合した卵母細胞をイオノマイシンに曝露することにより活性化し、次いで胚盤胞期までインキュベートする。その後、選択された胚盤胞の内部細胞塊を培養して、胚性幹細胞株を産生する。胚性幹細胞株は正常なＥＳ細胞の形態を示し、様々なＥＳ細胞マーカーを発現し、インビトロでもインビボでも、複数の細胞型に分化する。
【００５８】
２．ＰＳＣ由来肝細胞用のプログラミング因子
本開示の特定の局面は、肝細胞のフォワードプログラミングのための肝細胞プログラミング因子によって生産されるｉＰＳＣ由来肝細胞の出発集団に関する。肝細胞は、細胞中の肝細胞プログラミング因子のレベルを上げることにより、ＰＳＣから直接生産することができる（参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，４８１，３１７号、公開米国特許出願第２０１４０２４２５９５号、ＰＣＴ米国特許出願第２０１５／０２６５８３号）。肝細胞の多数の機能は、肝細胞に豊富な限られた数の転写因子の協調作用によって転写レベルで調節され得る。肝細胞に豊富な転写因子、特に表１に列挙した遺伝子のような、肝細胞の分化または機能にとって重要な任意の転写因子が、本明細書に記載のＰＳＣ由来肝細胞の出発集団を生産するために使用され得る。
【００５９】
例えば、表１に示す転写因子の組み合わせを発現させることによる多能性幹細胞から肝細胞へのフォワードプログラミングが、ＰＳＣ由来肝細胞を得るために使用され得る。例えば、ＰＳＣ由来肝細胞は以下の転写因子：ＦＯＸＡ２、ＨＨＥＸ、ＨＮＦ１Ａ、ＧＡＴＡ４、ＭＡＦＢ、およびＴＢＸ３の組み合わせから誘導することができる。
【表１】
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【００６０】
Ｂ．成熟肝細胞の作成方法
本開示の態様は、肝細胞の成熟化の状態を促進することによって、ウイルス受容性肝細胞、特にＨＢＶ感染への受容性を有するウイルス受容性肝細胞を生産する方法を提供する。本態様の肝細胞は、多能性幹細胞（ＰＳＣ）由来肝細胞または初代肝細胞を、肝細胞のウイルス感染への受容性を増加させる特定の成熟条件下で培養することによって得ることができる。培地は、肝細胞の成熟化を促進する薬剤などのウイルス受容性を高める薬剤を２つ以上含み得る。
【００６１】
ＰＳＣ由来肝細胞の出発集団は培養プレートに接着された後、それらの細胞は好ましくは播種培地（Ｐｌａｔｉｎｇ  Ｍｅｄｉｕｍ）中で培養される。播種培地は、ＲＰＭＩ１６４０およびオンコスタチンＭなどの培地を含み得る。播種培地はさらに、Ｂ２７サプリメント、デキサメタゾン、ゲンタマイシン、およびｉＣｅｌｌ（登録商標）肝細胞２．０培地サプリメントなどの肝細胞培地サプリメントを含み得る。播種培地の一例を表３に示す。
【００６２】
細胞を播種培地で約２４時間培養した後、その細胞を、ウイルス受容性を惹起する薬剤とともに播種培地で培養する。特定の局面では、成熟化プロセスの少なくとも一定の期間、肝細胞を環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）の存在下で培養する。ｃＡＭＰは、約１ｍＭのｃＡＭＰなど、少なくとも、もしくは約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭの有効濃度で使用され得る。肝細胞は一般に、ｃＡＭＰ−処理した肝細胞を生産するために、ｃＡＭＰを含む播種培地中で約１〜約６日間、例えば約１、２、３、４または５日間、例えば約４日間培養される。培地は毎日吸引され、ｃＡＭＰを含む新鮮な播種培地に交換される。
【００６３】
成熟化プロセスを完了するために、ｃＡＭＰで培養した肝細胞は次いで、１つ以上のヤヌスキナーゼ阻害剤を添加した維持培地中で培養される。ヤヌスキナーゼ阻害剤は、少なくとも、もしくは約０．０２、０．０５、０．１、０．２、０．５、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、〜約３０μＭ、またはそこから導出可能な任意の範囲の有効濃度で使用され得る。好ましくは、ヤヌスキナーゼ阻害剤は、約１μＭなどの、約０．１μＭ〜約５μＭの有効濃度で使用され得る。それらの細胞は一般に、ウイルス受容性肝細胞を生産するために、ＪＡＫ阻害剤を含む維持培地中で約１〜約６日間、例えば約１、２、３、４または５日間、例えば約２日間培養される。培地は毎日吸引され、ＪＡＫｉを含む新鮮な維持培地に交換される。結果として生じるｃＡＭＰおよびＪＡＫｉで処理した肝細胞は、Ｂ型肝炎感染への受容性の評価などの、本明細書に開示される方法によって機能解析され得る。
【００６４】
あるいは、約２４時間培養したＰＳＣ由来肝細胞は次いで、ｃＡＭＰおよび１つ以上のＪＡＫ阻害剤を添加した維持培地または播種培地などの培地中で培養され得る。ｃＡＭＰは約１ｍＭのｃＡＭＰなどの、少なくとも、もしくは約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭの有効濃度で使用され得る。ヤヌスキナーゼ阻害剤は少なくとも、もしくは約０．０２、０．０５、０．１、０．２、０．５、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、〜約３０μＭ、またはそこから導出可能な任意の範囲の有効濃度で使用され得る。好ましくは、ヤヌスキナーゼ阻害剤は約１μＭなどの、約０．１μＭ〜約５μＭの有効濃度で使用され得る。細胞は、ウイルス受容性肝細胞を生産するために、維持培地または播種培地などの培地中でｃＡＭＰおよびＪＡＫ阻害剤とともに約１〜約６日間、例えば約１、２、３、４または５日間培養され得る。培地は毎日吸引され、ｃＡＭＰおよびＪＡＫｉを含む、維持培地または播種培地などの新鮮な培地に交換される。結果として生じるｃＡＭＰおよびＪＡＫｉ処理肝細胞は、Ｂ型肝炎感染への受容性の評価などの、本明細書に開示される方法によって機能解析され得る。
【００６５】
１．細胞培地
本開示の細胞は一般的に、細胞の増殖を維持することができる、栄養素が豊富な緩衝液である培地で培養される。しかし、出発未成熟肝細胞および終末成熟ウイルス受容性肝細胞は、培地および条件において異なる要件を有し得る。
【００６６】
幹細胞を単離、増殖、および分化して肝細胞にし、本明細書に記載のＰＳＣ由来肝細胞の出発集団を得るために好適な培地には、高グルコースダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＤＭＥＭ／Ｆ−１５、ライボビッツ（Ｌｉｅｂｏｖｉｔｚ  ）Ｌ−１５、ＲＰＭＩ１６４０、イスコフ（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ）改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、およびＯｐｔｉ−ＭＥＭ  ＳＦＭ（インビトロジェンＩｎｃ．）が含まれるがこれらには限定されない。化学的に規定された培地（規定された培地）としては、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）（ギブコ）などの最小必須培地に、ヒト血清アルブミン、ヒトＥＸＣＹＴＥ（商標）リポタンパク質、トランスフェリン、インスリン、ビタミン、必須および非必須アミノ酸、ナトリウムピルビン酸塩、グルタミンおよびマイトジェンが添加されたものも適切である。本明細書中で使用される場合マイトジェンとは、細胞の細胞分裂を刺激する薬剤を指す。薬剤は化学物質であり得て、通常、細胞に細胞分裂を開始させ、有糸分裂を引き起こすタンパク質のいくつかの形態であり得る。一つの態様において、米国特許第５，９０８，７８２号および国際公開第９６／３９４８７号に記載されるものなどの無血清培地、および米国特許第５，４８６，３５９号に記載される「完全培地」は、本明細書に記載の方法における使用を考えられる。いくつかの態様では、培地には１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、ヒト自己血清、ヒトＡＢ血清、またはヘパリン（２Ｕ／ｍｌ）を添加した血小板を豊富に含む血漿が添加される。
【００６７】
本開示の肝細胞を培養する培地はまた、脂肪酸または脂質、アミノ酸（非必須アミノ酸など）、ビタミン、増殖因子、サイトカイン、抗酸化物質、２−メルカプトエタノール、ピルビン酸、緩衝剤および無機塩を含み得る。２−メルカプトエタノールの濃度は、例えば約０．０５〜１．０ｍＭ、特に約０．１〜０．５ｍＭであり得るが、肝細胞の培養に適切であれば、濃度は特にそれらに限られない。
【００６８】
幹細胞を培養するために使用される培養容器としては、その中で幹細胞を培養することができるものであれば、フラスコ、組織培養用フラスコ、シャーレ、ペトリ皿、組織培養用皿、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウェルプレート、マルチプレート、マルチウエルプレート、マイクロスライド、チャンバースライド、チューブ、トレイ、セルスタック（ＣＥＬＬＳＴＡＣＫ、登録商標）チャンバー、培養バッグ、ローラーボトルなどが挙げられる。幹細胞は、少なくとも、もしくは約０．２、０．５、１、２、５、１０、２０、３０、４０、５０ｍｌ、１００ｍｌ、１５０ｍｌ、２００ｍｌ、２５０ｍｌ、３００ｍｌ、３５０ｍｌの４００ｍｌ、４５０ｍｌ、５００ｍｌ、５５０ｍｌ、６００ｍｌ、８００ｍｌ、１０００ｍｌ、１５００ｍｌ、またはそこから導出可能な任意の範囲の容量で培養することができる。特定の態様では、培養容器は、生物学的に活性な環境を支持する任意のデバイスまたはシステムを意味するバイオリアクターであってもよい。バイオリアクターは、少なくとも、もしくは約２、４、５、６、８、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、５００リットルの、１、２、４、６、８、１０、１５立方メートルの、またはそこから導出可能な任意の範囲の容量を有することがある。
【００６９】
培地容器は、細胞接着性または非接着性のもの、および目的に応じて選ぶことができる。細胞接着性の培地容器は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）などの細胞接着のための基質によってコーティングされ、容器表面への細胞の接着性が向上され得る。細胞接着のための基質は、幹細胞またはフィーダー細胞（使用されている場合）を付着させるためのあらゆる材料であり得る。細胞接着のための基質は、コラーゲン、ゼラチン、ポリ−Ｌ−リシン、ポリ−Ｄ−リシン、ビトロネクチン、ラミニン、フィブロネクチン、およびレトロネクチン（ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ）およびそれらの混合物、例えばマトリゲル（商標）、および可溶性細胞膜調整品を含む（クリマンスカヤら、２００５）。
【００７０】
他の培養条件も適宜、決定することができる。例えば、培養温度は約３０〜４０℃、例えば、少なくとも、もしくは約３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９℃とすることができるが、特にこれらに限定されない。ＣＯ２濃度は、約１〜１０％、例えば約２〜５％、またはその中で導出可能な任意の範囲とすることができる。酸素分圧は、少なくとも、もしくはおよそ１、５、８、１０、２０％またはそれに由来する任意の範囲にすることができる。
【００７１】
ＰＳＣ肝細胞の出発集団に分化される多能性幹細胞は、多能性を維持するのに十分な培地中で培養することができる。本開示の特定の局面において生成される人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞の培養には、米国特許第７，４４２，５４８号および米国特許出願第２００３０２１１６０３号に記載されるように、霊長類多能性幹細胞、より具体的には胚性幹細胞を培養するために開発された様々な培地および技術を使用することができる。例えば、ヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞のように、ｉＰＳ細胞は、８０％ＤＭＥＭ（ギブコ＃１０８２９−０１８または＃１１９６５−０９２）、熱失活していない２０％の規定されたウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１％非必須アミノ酸、１ｍＭのＬ−グルタミン、および０．１ｍＭのベータメルカプトエタノールの中で維持することができる。あるいは、ＥＳ細胞は、８０％Ｋｎｏｃｋ−ＯｕｔＤＭＥＭ（ギブコ＃１０８２９−０１８）、２０％血清代替品（ギブコ＃１０８２８−０２８）、１％非必須アミノ酸、１ｍＭのＬ−グルタミン、および０．１ｍＭのベータメルカプトエタノールで生産した無血清培地中で維持することができる。使用の直前に、ヒトｂＦＧＦを最終濃度約４ｎｇ／ｍＬで添加してもよい（国際公開第９９／２０７４１号）。
【００７２】
２．ヤヌスキナーゼ阻害剤
本開示の特定の局面は、肝細胞においてウイルス受容性を高める因子としてのヤヌスキナーゼ阻害剤に関する。ヤヌスキナーゼ（ＪＡＫ）ファミリーは、免疫応答に関与する細胞の増殖および機能のサイトカイン依存性調節において一役を果たす。現在、４つの哺乳類ＪＡＫファミリーのメンバーが知られている：ＪＡＫ１（ヤヌスキナーゼ−１としても知られる）、ＪＡＫ２（ヤヌスキナーゼ−２としても知られる）、ＪＡＫ３（ヤヌスキナーゼ、白血球；ＪＡＫＬ；Ｌ−ＪＡＫおよびヤヌスキナーゼ−３としても知られる）およびＴＹＫ２（タンパク質−チロシンキナーゼ２としても知られる）。ＪＡＫタンパク質は１２０〜１４０ｋＤａのサイズであり、７つの保存ＪＡＫ相同性（ＪＨ）ドメインを含むことができ；そのうちの１つは、機能的触媒キナーゼドメイン、もう１つは、調節機能を潜在的に果たし、かつ／またはＳＴＡＴのためのドッキング部位として役立つ偽性キナーゼドメインであり得る（スコット、ゴッドシャル（Ｇｏｄｓｈａｌｌ）ら、２００２）。
【００７３】
本方法において有用であり得るＪＡＫ／ＳＴＡＴ阻害剤の例としては、ＳＴＡＴタンパク質のレベルで結合して阻害するＰＩＡＳタンパク質（チュンら、サイエンス、１９９７）；ＪＡＫおよび／または受容体に結合して、シグナル伝達を阻止することができるＳＨ２含有タンパク質ファミリーのメンバー（例えば、アマン（Ａｍａｎ）およびレオナルド、１９９７、ニコルソンおよびヒルトン、１９９８を参照のこと）；サイトカインにより誘導され得るＳｒｃ相同２含有（ＣＩＳ）タンパク質、ＳＴＡＴシグナル伝達阻害剤（ヨシムラら、１９９５）；ＳＴＡＴシグナル伝達を阻害し得るか、またはヤヌスキナーゼに直接結合し得るＣＩＳ関連タンパク質；ＳＴＡＴ３の下流の活性化を阻止するためにすべてのＪＡＫと会合すると考えられるサイトカインシグナル伝達-Ｉタンパク質の抑制因子（ＳＯＣＳ−１、これはまたＪＡＢまたはＳＳＩ−１とも呼ばれる）（オオヤら、１９９７）；チロシン成分およびエルブスタチン成分に類似するベンジリデンマロノニトリルの誘導体であるチルホスチン類（ガジット（Ｇａｚｉｔ）ら、１９８９）；チロシンキナーゼ阻害剤のチロホスチンファミリーのメンバーであるＡＧ-４９０（ワンら、１９９９）、ＪＡＫ３を特異的に阻害する４，５-ジメトキシ-２-ニトロ安息香酸および４，５-ジメトキシ-２-ニトロベンズアミド；ジメトキシキナゾリン化合物に構造的に由来する４-（フェニル）-アミノ-６，７-ジメトキシキナゾリン（親化合物ＷＨＩ-２５８）およびこの化合物の誘導体；４-（４’-ヒドロキシフェニル）-アミノ-６，７-ジメトキシキナゾリン（ＷＨＩ-Ｐ１３１）、４-（３’-ブロモ-４’-ヒドロキシルフェニル）-アミノ-６，７-ジメトキシキナゾリン（ＷＨＩ-Ｐ１５４）、および４-（３’，５’-ジブロモ-４’-ヒドロキシルフェニル）-アミノ-６，７-ジメトキシキナゾリン（ＷＨＩ-Ｐ９７）を含む４’-ＯＨ基を含有する化合物；別のジメトキシキナゾリン化合物であるＷＨＩ-Ｐ１８０；およびホルスコリン、アデニル酸シクラーゼの直接的な活性化剤、およびジブチリルｃＡＭＰなどのｃＡＭＰ上昇剤、ならびに３-イソブチル-１-メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）、ｃＡＭＰホスホジエステラーゼの阻害剤、が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、ＪＡＫ阻害剤は２−（１，１−ジメチルエチル）−９−フルオロ−３，６−ジヒドロ−７Ｈ−ベンズ［ｈ］−イミダゾ［４，５−ｆ］イソキノリン−７−ｏｎｅ（ＪＡＫ阻害剤１；ＥＭＤミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、カタログ番号４２００９９）である。
【００７４】
３．環状アデノシン一リン酸
特定の態様は、細胞をさらに成熟化させることによって肝細胞のウイルス受容性を高める因子としての環状アデノシン一リン酸に関する。環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ、環状ＡＭＰ、または３’，５’−環状アデノシン一リン酸）は、多くの生物学的プロセスにおいて重要なセカンドメッセンジャーである。ｃＡＭＰはアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）に由来し、多くの異なる生物において細胞内シグナル伝達に使用され、ｃＡＭＰ依存性経路を輸送する。ｃＡＭＰは、血漿膜の内側に位置し、細胞内の様々な部位に固定されたアデニル酸シクラーゼによって、ＡＴＰから合成される。アデニル酸シクラーゼは、アデニル酸シクラーゼ刺激性のＧ（Ｇｓ）−タンパク質共役受容体の活性化によって、様々なシグナル伝達分子によって活性化される。アデニル酸シクラーゼは、アデニル酸シクラーゼ阻害性のＧ（Ｇｉ）−タンパク質共役受容体のアゴニストによって阻害される。肝臓アデニル酸シクラーゼはグルカゴンに対してより強く反応し、筋肉アデニル酸シクラーゼはアドレナリンに対してより強く反応する。
【００７５】
ｃＡＭＰまたはその塩を本開示の方法に使用することができる。例えば、アデノシン３’，５’−環状一リン酸ナトリウム水和物またはアデノシン３’，５’−環状一リン酸ナトリウム水和物を、ウイルス受容性肝細胞の作成に使用することができる。
【００７６】
４．ウイルス受容性肝細胞の特徴分析
本開示の処理肝細胞は、いくつかの表現型および／または機能性の基準に基づいて特徴分析され得る。その基準は、ＨＢＶ感染などのウイルス感染への受容性、発現細胞マーカーの検出または定量化、酵素活性、および形態的特徴および細胞間シグナル伝達の特徴分析を含むがこれらには限定されない。
【００７７】
ａ．ウイルス感染への寛容性
ｃＡＭＰおよびＪＡＫｉによって処理されていないｉＣｅｌｌ肝細胞は、未処理肝細胞をＨＣＶ感染粒子と接触させること、およびウイルス粒子の取り込みが抗ＣＤ８１阻害抗体によって用量依存的な様式で阻害されることを検出できることから分かるように、ＨＣＶ感染に受容的である（参照により本明細書に組み込まれるマンら、２０１３）。しかし、ＨＢＶ慢性感染への受容性には、ｉＣｅｌｌ肝細胞を本開示のｃＡＭＰおよびＪＡＫｉ中で培養してさらに成熟させることが必要となる。本開示の処理肝細胞の特徴の一つとして、霊長類初代肝臓細胞向性をもつ特定の病原体に対して初代肝細胞に匹敵する感受性がある、または感受性があり得る、または感受性を示し得ることが挙げられる。そのような病原体はＡ、Ｂ、Ｃ、およびデルタ型肝炎、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、結核、およびマラリアを含む。例えば、Ｂ型肝炎ウイルスによる感染への受容性は、肝細胞に再感染することが可能なＨＢＶを生産することにより、薬剤処理した肝細胞をヒトＨＢＶキャリアから得た血清などのＢ型肝炎粒子の感染源に接触させ、次いでＨＢＶ表面抗原の分泌およびＨＢＶの複製を含むＨＢＶ感染を特徴分析することによって、決定することができる。
【００７８】
このようにして、本開示の方法によって生産した肝細胞は、特徴分析のためにＢ型肝炎ウイルスに感染させることができる。通常、維持培地は吸引され、感染培地に交換され得る。感染培地はＨＢＶ粒子を含み、加えてＪＡＫｉおよびポリエチレングリコールを含有する維持培地を含み得る。成熟肝細胞がＨＢＶに感染した後、例えば約１２時間〜約２日後、例えば約２４時間後、培地は吸引され、ＪＡＫｉを含むまたは含まない維持培地に交換される。
【００７９】
処理肝細胞のＨＢＶ感染は、ＨＢＶ抗原の分泌レベルまたはＨＢＶ  ｃＤＮＡをウイルスのライフサイクル中、例えば感染後最長１５日間にわたりモニターすることによって特徴づけることができる。例えば、確実に感染するとＨＢｓＡＧおよびＨＢｅＡＧの両方のレベルが上昇する。ＨＢＶ抗原の分泌をモニターする方法は、当該分野で知られている。特定の局面において、確実な感染は、成熟肝細胞のＨＢｓＡＧおよび／またはＨＢｅＡＧ抗原の分泌が、ＰＳＣ由来肝細胞の出発集団における抗原の分泌の約２、５、または１０倍となることを特徴とする。
【００８０】
さらに、処理肝細胞のＨＢＶ感染力は、肝細胞に再感染することができるＨＢＶを生産する能力によって特徴づけられる。例えば、成熟肝細胞はＨＢＶに感染することができ、結果として生じる上清を採取し、成熟肝細胞に生産されたＨＢＶを単離することができる。その濃縮されたＨＢＶは次いでウイルス受容性肝細胞の第二培養の再感染に使用され、ＨＢＶ感染をモニターすることができる。
【００８１】
ｂ．肝細胞の成熟化マーカー
ｃＡＭＰおよびＪＡＫｉで処理した本開示の肝細胞はまた、成熟化のプロセスにある肝細胞に特徴的なマーカーが発現しているかどうかに基づいて特徴づけることができる。成熟肝細胞の識別に有用な成熟化マーカーの非限定的な例としては、溶質輸送体ファミリー１０（ナトリウム胆汁酸共輸送体）、メンバー１（ＳＬＣ１０Ａ１）、ＵＤＰグルクロノシルトランスフェラーゼ１ファミリー、ポリペプチドＡ１（ＵＧＴ１Ａ１）、ペルオキシソーム増殖因子活性化型受容体ガンマ、活性化補助因子１アルファ（ＰＰＡＲＧＣ１Ａ）、チロシンアミノトランスフェラーゼ（ＴＡＴ）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ１（ＰＣＫ１）、抗アポトーシスタンパク質ＮＲ１３、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼアルファ２（ＧＳＴＡ２）、グリシン−Ｎ−アシルトランスフェラーゼ（ＧＬＹＡＴ）、およびメタロチオネイン１Ｍ（ＭＴ１Ｍ）が挙げられる。
【００８２】
そのようなマーカーの発現レベルの評価は、他の細胞と比較して決定することができる。成熟肝細胞のマーカーの陽性対照は、成体ヒト初代肝細胞を含む。陰性対照は、成体線維芽細胞の細胞株または網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞など、別系統のＰＳＣ由来肝細胞の出発集団を含む。
【００８３】
成熟化に付随する肝細胞マーカーの発現は、ノーザンブロット解析、ドットブロットハイブリダイゼーション分析、または標準的な増幅法で配列特異的プライマーを使用したリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、ｍＲＮＡレベルで検出することができる（米国特許第５，８４３，７８０号）。本開示に列挙される特定のマーカーの配列データは、ジェンバンクなどの公共のデータベースから得ることができる。典型的な対照実験における標準的な手順によるアッセイによる細胞試料に対するパフォーマンスが、標準的な時間枠中に明確に識別可能なハイブリダイゼーションまたは増殖産物をもたらす場合、本開示に記載されるアッセイのうちの一つによってｍＲＮＡレベルでの発現が「検出可能」であると言える。別段の要件がない限り、対応するｍＲＮＡがＲＴ−ＰＣＲによって検出可能である場合、特定のマーカーの発現が示される。タンパク質またはｍＲＮＡレベルで検出された成熟肝細胞マーカーの発現レベルが、ｉＰＳＣ由来肝細胞、未分化多能性幹細胞、線維芽細胞、または他の無関係な細胞型などの対照細胞のものよりも、少なくとも２倍、好ましくは１０倍または５０倍以上高い場合に、そのマーカーに関して陽性とみなされる。
【００８４】
ＩＩＩ．ウイルス受容性肝細胞の使用
本開示の特定の局面による方法および組成物によって提供される肝細胞は、様々な用途に使用され得る。用途の例としては、インビボでの肝細胞の移植またはインプラント、インビトロでの抗ウイルス、細胞傷害性化合物、発癌物質、変異原増殖／制御因子、医薬化合物などのスクリーニング、肝疾患および感染のメカニズムの解明、薬物および／または増殖因子が機能するメカニズムの研究、患者の癌の診断およびモニター、遺伝子治療、および生物学的に活性な産物の生産などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８５】
Ａ．試験化合物のスクリーニング
１．肝細胞の特性に影響を及ぼす化合物
本開示の肝細胞を利用して、本明細書で提供される肝細胞の特性に影響を及ぼす因子（溶媒、低分子薬、ペプチド、ポリヌクレオチドなど）または環境条件（培養条件または操作など）をスクリーニングすることができる。
【００８６】
本態様の特定のスクリーニング系の用途は、薬物研究における医薬化合物の試験に関する。読者は一般に、標準的な教本である「医薬研究におけるインビトロ法、アカデミックプレス（Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、１９９７」を参照する。特定の局面において、薬剤処理した肝細胞は、前もって短期培養中に肝細胞の細胞株または初代肝細胞に行われたように、標準的な薬のスクリーニングおよび毒性アッセイの試験細胞の役割を果たす。候補医薬化合物の活性のアセスメントは一般に、本開示の特定の局面で提供される肝細胞と候補化合物を組み合わせること、化合物に起因する細胞の形態、マーカー表現型、または代謝活性におけるあらゆる変化（未処理細胞または不活性化合物で処理した細胞と比較して）を測定すること、そして化合物の効果と観察された変化を相関することを含む。このようなスクリーニングは、化合物が肝臓細胞に対して薬理学的効果を有するように設計されているか、または他の所で効果を有するように設計されている化合物が、この組織型の細胞に対して意図しない肝性副作用を有する可能性があるため、実施される場合がある。考えられる薬物間相互作用の効果を検出するために、２つ以上の薬物を組み合わせて（同時にまたは連続して、細胞と組み合わせることによって）試験することができる。
【００８７】
いくつかの用途において、化合物ははじめに潜在的な肝毒性のスクリーニングを受ける（カステル（Ｃａｓｔｅｌｌ）ら、１９９７）。細胞傷害性は最初の実例において、細胞生存性、生存、形態、および酵素の培地中への漏出に対する効果によって測定することができる。さらに詳細な分析は、化合物が毒性を引き起こさずに細胞機能（糖新生、尿素形成、血漿タンパク質合成など）に効果を及ぼすかどうかを測定することによりなされる。乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）は、肝臓のイソ酵素（タイプＶ）は培地条件中で安定的であり、１２〜２４時間インキュベートした後に培地の上清中で再現性のある測定が可能になるため、良いマーカーである。ミトコンドリアグルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼおよびグルタミン酸ピルビン酸塩トランスアミナーゼなどの酵素の漏出も使用することができる。ゴメス−レホン（Ｇｏｍｅｚ−Ｌｅｃｈｏｎ）ら（１９９６）には、グリコーゲンを測定する微量検定法が記載されており、この微量検定法は肝細胞の糖新生における医薬化合物の効果の測定に使用することができる。
【００８８】
その他の肝毒性を評価する現在の方法は、アルブミン、コレステロール、およびリポタンパク質の合成および分泌；抱合胆汁酸およびビリルビンの輸送；尿素生成；シトクロムＰ４５０のレベルおよび活性；グルタチオンのレベル；α−グルタチオンｓ−トランスフェラーゼの放出；ＡＴＰ、ＡＤＰ、およびＡＭＰ代謝；細胞内Ｋ＋およびＣａ２＋の濃度；核マトリックスタンパク質またはオリゴヌクレオゾームの放出；およびアポトーシスの誘導（細胞円形化、クロマチンの凝縮、および核断片化によって示される）、の測定を含む。ＤＮＡ合成は、［３Ｈ］−チミジンまたはブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）の取り込みとして測定することができる。ＤＮＡの合成または構造に対する薬の効果は、ＤＮＡの合成または修復を測定することにより決定することができる。特に細胞周期における不定期のタイミングにおける、または細胞複製に必要なレベルを上回る［３Ｈ］−チミジンまたはＢｒｄＵの取り込みは、薬効と一致する。望ましくない効果としては、分裂中期スプレッドによって決定される姉妹染色分体交換の異常な比率が挙げられる。さらなる詳細についてはビッカーズ（Ｖｉｃｋｅｒｓ）（１９９７）を参照されたい。
【００８９】
２．抗ウイルス化合物
ＨＢＶ初感染のリスクを減らすためにいくつかのワクチンが利用可能であるが、今なお多くの人がウイルスに慢性感染している。加えて、ワクチンでは治療できない多数の（世界中でおそらく３億人ほどの）慢性キャリアが生存している。医薬業界にとって、ＨＢＶ感染の治療に有効な方法および組成物の開発は重要な目標となっている。したがって、当該分野において、このウイルス病原体に曝露中および曝露後に投与することができる新しい抗ＨＢＶ薬を同定する方法が必要とされている。
【００９０】
したがって、本方法によって生産した肝細胞を使用して、Ａ、Ｂ、Ｃ、およびデルタ型肝炎、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、およびサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）などの治療に有用な抗ウイルス化合物をスクリーニングすることができる。特定の態様において、抗ウイルス化合物はＨＢＶの複製を阻害する化合物であり得る。候補抗ウイルス薬の活性の評価は一般に、本開示で提供される成熟肝細胞と候補化合物を接触させること、化合物に起因する細胞の形態、マーカー表現型、または代謝活性におけるあらゆる変化（未処理細胞または不活性化合物で処理した細胞と比較して）を測定すること、そして化合物の効果と観察された変化を相関させることを含む。例えば、ＨＢＶの場合、マーカーの表現型の変化は、ＨＢｓＡＧおよび／またはＨＢｅＡＧ抗原の分泌の減少、またはＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡの減少が起こり得る。
【００９１】
スクリーニングアッセイは、ハイスループット方法を含む当該分野でよく知られている技術を使用して行われる。アッセイは試験化合物の非存在下および存在下で行われる。試験化合物は、アッセイと互換性がある溶媒または緩衝液中で３〜１０倍に段階希釈されて調製される。ＨＢＶ抗原の分泌が、対照に対して３０％以上減少した試験化合物が、抗ＨＢＶ剤の候補となる。
【００９２】
多くの抗ＨＢＶ試験化合物は、費用効果が高く、迅速な方法でアッセイされ得る。有用な薬剤は膨大な化学物質群の中で発見され得るが、典型的にはそれらは有機化合物、好ましくは低分子有機化合物である。低分子有機化合物は、分子量が５０以上で約２，５００ダルトン未満、好ましくは約７５０ダルトン未満、より好ましくは約４００ダルトン未満である。化合物の例は、ペプチド、糖類、ステロイドなどを含む。化合物は、効力、安定性、および医薬適合性を高めるために改変してもよい。天然抽出物も試験することができ、ＨＢＶ抗原の分泌を減少させる成分は、後続のステップで混合物から精製することができる。
【００９３】
ハイスループットスクリーニング方法で使用される試験化合物は、合成のまたは天然の物質を多数含むライブラリーから探してもよい。現在、非常に多くの方法が糖類、ペプチド、および核酸を基にした化合物の無作為合成および定方向合成に使用されている。合成化合物ライブラリーは、メイブリッジケミカル社（トレビレット、コーンウォール州、英国）、コムジェニックス（プリンストン、ニュージャージー州）、ブランドン・アソシエーツ（Ｂｒａｎｄｏｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）（メリマック、ニューハンプシャー州）、およびミクロソース（ニューミルフォード、コネティカット州）から市販されている。レアケミカルライブラリーは、アルドリッチ（ミルウォーキー、ウィスコンシン州）から入手することができる。加えて、ペプチド、オリゴヌクレオチド、および他の有機化合物に基づくコンビナトリアルライブラリーを生成する方法もある（バウム（Ｂａｕｍ）、Ｃ＆ＥＮ、２月７日、１９９４、ｐ２０〜２６）。あるいは、細菌、真菌、植物および動物抽出物の形態による天然化合物のライブラリーは、例えばパンラボラトリーズ（Ｐａｎ  Ｌａｂｓ）（ボセル、ワシントン州）またはマイコサーチ（ノースカロライナ州）から入手することができ、または容易に生産することができる。さらに、天然のおよび合成により生産されたライブラリーおよび化合物は、従来の化学的、物理的、および生化学的手段により容易に改変される。
【００９４】
試験化合物が候補抗ＨＢＶ剤としてインビトロで同定されると、さらにインビトロでＨＢＶの複製を阻害する能力を試験され、動物モデル系でも試験される。当該分野でよく知られている、例えば電気穿孔、リポソーム被包、微量注入、またはスクレープ負荷などの技術を使用して、細胞による化合物の取り込み、または細胞膜を横切った化合物の透過を強化してもよい。ＨＢＶの複製は、放射標識されたＨＢＶ特異的なプローブを用いたサザンブロット法によって、細胞内および細胞外のＨＢＶ  ＤＮＡのレベルをモニターすることによって測定する（セルズら、ウイルス学（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．）６２：２８３６、１９８８）。ウイルスＤＮＡが、対照フラスコで観察されたものより例えば約４０％減少した場合、その候補化合物は抗ＨＢＶ剤であることを示す。
【００９５】
同様に、ＨＢＶ感染の動物モデル系は、チンパンジー、地リスおよび樹上性リス、ペキンアヒル、または、最も好ましくはウッドチャックを含む。ウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＶ）の自然宿主であるイースタンウッドチャックの当該ウイルス感染は、ヒトのＨＢＶ誘導性肝疾患のモデルとして開発されてきた。慢性ＷＨＶ感染は実験条件下で予想通りに確立することができ、進行性の肝疾患を引き起こす（ポンセットら、肝臓学１４：１６−２３、１９９１）。前述したスクリーニング方法で同定された候補抗ＨＢＶ剤の評価は、この動物モデルで実施することもできる。ウイルス血症、肝疾患、および肝細胞癌を、増加量の候補化合物の非存在下及び存在下で慢性的に感染させたウッドチャックでモニターする。動物モデルにおいてウイルス血症が減少すること、たとえば約５０％〜約９０％減少することは、候補化合物が抗ＨＢＶ剤であることを示す。
【００９６】
本発明の方法を使用して抗ＨＢＶ剤として同定された化合物は、抗ウイルス療法の分野で様々な用途を持ち得る。まず、臨床環境で使用される初期に同定された化合物より適切な抗ＨＢＶ剤を設計するための出発材料として使用することができる。例えば、ペプチド抗ＨＢＶ剤が１度同定されると、例えばその安定性、溶解特性、効力等を高めるために多様な方法で系統的に改変することができる。可能性のある改変の例には、非天然アミノ酸、例えばＤ−アミノ酸、そして特にＤ−アラニンの導入；および例えばアシル化、アルキル化、エステル化又はアミド化によるアミノ又はカルボキシル末端の官能化が含まれるが、これらに限定されない。他の改変には、例えばリポソーム内カプセル化又は他の成分とのコンプレックス形成が含まれる。
【００９７】
特定の局面において、肝臓を治療用化合物の標的にすることが望ましいと思われる。これは、肝細胞を特異的に認識する抗体との結合；肝臓特異的アシアログリコプロテインレセプター用のリガンドとして役立つガラクトース終結オリゴ糖との結合；及びリポソーム中への組み入れを含む、当該技術分野で既知のいくつかの方法のいずれかによって達成することができる。
【００９８】
哺乳類のＨＢＶ感染の治療などの治療用途では、本開示の方法で同定された抗ＨＢＶ剤は生理学的に許容可能な担体、例えばリン酸緩衝生理食塩液又は脱イオン水と共に処方することができる。医薬製剤は、当該分野でよく知られている防腐剤および安定剤を含有する賦形剤も含むことができる。投与方法は、経口および経腸、静脈内、筋内、皮下、経粘膜（直腸および口腔を含む）、および吸入によるものを含む。一般に、投与される薬剤の量は経験的に決定され、典型的には受容者の約１０〜１０００ｐｇ／ｋｇの範囲である。ペプチド剤では、濃度は投与量中で一般的には約１００〜５００μｇ／ｍｌの範囲であろう。本開示の医薬製剤は、このような医薬製剤の単回投与量又は複数回投与量の投与で有効量に到達することができるので、該製剤中にＨＢＶ感染の治療に有効な物質の全量を含有している必要はないことが理解されるであろう。
【００９９】
Ｂ．肝臓の治療および移植
本開示はまた、本明細書で提供される肝細胞を、おそらく肝機能の急性、慢性、または遺伝性損傷によってそのような治療を必要とする対象の肝機能の程度を回復させるための使用も提供する。本明細書に記載の方法は肝細胞の成熟度を増加させるため、そのような方法はまた、そのような肝細胞を移植および治療用途にさらに受容的にし得る。
【０１００】
治療剤投与のための本明細書で提供される肝細胞の適合性を決定するために、細胞を最初に適切な動物モデルで試験することができる。あるレベルにおいて、細胞は生存し、インビボでその表現型を維持するそれらの能力について評価される。本明細書で提供される肝細胞は、免疫不全動物（例えば、ＳＣＩＤマウス、または化学的にまたは放射線照射によって免疫不全にされた動物）の、腎臓被膜の下、脾臓内、または肝臓小葉内などの、さらなる観察に適した部位に投与される。組織を２〜３日間から数週間、またはそれ以上の期間後に回収し、多能性幹細胞などの出発細胞型が依然として存在するかどうかについて評価する。これは、投与した細胞に検出可能な標識（緑色蛍光タンパク質またはβ−ガラクトシダーゼなど）を付与すること；または投与した細胞に対して特異的な構成性マーカーを測定することによって行える。本明細書で提供される肝細胞をげっ歯類モデルで試験する場合には、ヒト特異抗体を用いる免疫組織化学的手法もしくはＥＬＩＳＡ、またはヒトポリヌクレオチド配列に対して特異的な増幅が起こるようなプライマーおよびハイブリダイゼーション条件を用いるＲＴ−ＰＣＲ分析により、投与した細胞の存在および表現型を評価することができる。遺伝子発現をｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルで評価するのに適したマーカーは、本開示の他の箇所で提示される。動物モデルにおける肝細胞様細胞の運命の判定に関する一般的な説明はグロンペ（Ｇｒｏｍｐｅ）ら（１９９９）、ピーターズら（１９９７）、およびオオハシら（２０００）に記載されている。
【０１０１】
別のレベルでは、本明細書で提供される肝細胞が、肝機能が完全でない動物において肝機能を回復させる能力を評価する。ブラウン（Ｂｒａｕｎ）ら（２０００）は、ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子に関するトランスジェニックマウスにおける毒素誘発性肝疾患のモデルの概要を説明している。リム（Ｒｈｉｍ）ら（１９９５）およびリーバー（Ｌｉｅｂｅｒ）ら（１９９５）は、ウロキナーゼの発現による肝疾患モデルの概要を説明している。ミグノン（Ｍｉｇｎｏｎ）ら（１９９８）は、細胞表面マーカーＦａｓに対する抗体によって誘発される肝疾患の概要を説明している。オーバーターフ（Ｏｖｅｒｔｕｒｆ）ら（１９９８）は、Ｆａｈ遺伝子の標的破壊によるマウスにおける遺伝子性Ｉ型チロシン血症のモデルを開発した。この動物は２−（２−ニトロ−４−フルオロ−メチル−ベンゾイル）−１，３−シクロヘキサンジオン（ＮＴＢＣ）を供給すると欠損症から回復するが、ＮＴＢＣを中断すると肝疾患を発症する。急性肝疾患は、９０％肝切除によりモデル化が可能である（コバヤシら、２０００）。動物にガラクトサミン、ＣＣｌ４またはチオアセトアミドなどの肝臓毒を投与することによって急性肝疾患をモデル化することもできる。
【０１０２】
肝硬変などの慢性肝疾患は、動物に対して亜致死量の肝臓毒を、線維化を誘発する程度に十分に長期にわたって投与することによってモデル化し得る（ルドルフら、２０００）。本明細書で提供される肝細胞が肝機能を再構成する能力の評価には、このような動物に細胞を投与すること、および、疾患の進行に関して動物をモニタリングしながら、１〜８週間またはそれ以上の期間にわたって生存を判定することが含まれる。肝機能に対する影響は、肝組織中で発現されるマーカー、シトクロムｐ４５０活性およびアルカリホスファターゼ活性、ビリルビン結合およびプロトロンビン時間などの血液学的指標、ならびに宿主の生存を評価することによって判定し得る。これらの基準のいずれかに従って認められた生存、疾患の進行または肝機能の維持に関する何らかの改善は治療法の有効性と関係があり、さらなる最適化につながる可能性がある。
【０１０３】
本開示の特定の局面で提供される肝細胞は、その代謝酵素のプロファイルによって望ましい機能的特徴、または動物モデルにおける効力を示し、肝機能障害を有するヒト患者への直接投与に好適である。それらの細胞を止血目的で、循環に十分なアクセスがあるいずれかの部位、典型的には腹腔内に投与することができる。代謝および解毒機能においては、細胞は胆管系にアクセスがあると有利である。したがって、それらの細胞は肝臓（例えば慢性肝疾患の治療において）または脾臓（例えば劇症肝不全の治療において）の近くに投与される。一方法においてそれらの細胞は、留置カテーテルによる注入によって、肝動脈または門脈のいずれかを経由して肝循環に投与される。カテーテルは門脈中で、細胞が主に脾臓へ、または肝臓へ、または両方の組み合わせへ流れ込むように操作することができる。別の方法においてそれらの細胞は、一般的にボーラス（ｂｏｌｕｓ）を適所にとどめる賦形剤またはマトリックスに含有されて、ボーラスを標的臓器付近の腔に留置することによって投与される。別の方法においてそれらの細胞は、肝臓または脾臓の葉に直接注入される。
【０１０４】
本開示の特定の局面で提供される肝細胞は、肝機能の回復または補助を必要とするあらゆる対象の治療に使用できる。そのような治療が適したヒトの条件は、あらゆる原因に起因する劇症肝不全、ウイルス肝炎、薬物性肝障害、肝硬変、遺伝性肝不全（ウィルソン病、ジルベール症候群、またはα１−アンチトリプシン欠乏症など）、肝胆道癌、自己免疫性肝疾患（自己免疫性慢性肝炎または原発性胆汁性肝硬変など）、および肝機能障害を引き起こすその他の条件すべてを含む。ヒトの治療としては、投与量は一般に約１０９〜１０１２細胞であり、典型的には約５×１０９〜５×１０１０細胞であり、対象の体重、苦痛の性質および重篤度、および投与された細胞の複製能力によって調整を行う。治療方法および適切な投与量を決定する最終責任は管理する臨床医にある。
【０１０５】
Ｃ．肝臓補助装置における使用
本開示の特定の局面は、本明細書で提供する肝細胞を、バイオ人工肝臓装置中に封入された形で、またはその一部として含む。様々な形態の封入が、「細胞封入技術および治療薬（Ｃｅｌｌ  Ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、１９９９に記載されている。本開示の特定の局面で提供される肝細胞インビトロまたはインビボで用いるために、このような方法に従って封入可能である。
【０１０６】
臨床使用のためのバイオ人工臓器は、（長期療法の一部として、または劇症肝不全と肝再構成または肝移植との間の期間を乗り越える目的で）肝機能障害のある個体を補助するために設計される。バイオ人工肝臓装置は、マクドナルドら（１９９９）に概説されており、米国特許第５，２９０，６８４号、第５，６２４，８４０号、第５，８３７，２３４号、第５，８５３，７１７号、および第５，９３５，８４９号に具体例が示されている。懸濁液型のバイオ人工肝臓は、平板透析器内に懸濁化された状態、適した基質中に封入された状態、または細胞外マトリックスをコーティングした微小担体ビーズに付着した状態で細胞を含む。または、肝細胞を固定層内、マルチプレートフラットベッド（ｍｕｌｔｉｐｌａｔｅ  ｆｌａｔ  ｂｅｄ）内、マイクロチャネルスクリーン上、中空糸キャピラリーの周囲の固体支持体の表面に配置することもできる。本装置には対象の血液が通過する流入口および流出口があり、時には栄養分を細胞に供給するための入口が別に用意されている場合もある。
【０１０７】
肝細胞は前述した方法に基づいて調製した後に、マトリゲル（登録商標）またはコラーゲンなどのマトリックスなどの適した基質上にある装置内にプレーティングする。装置の有効性は、流入路における血液の組成を流出路におけるものと比較すること（流入路の流れから除去された代謝産物および流出路の流れの中の新たに合成されたタンパク質に関して）によって評価することができる。
【０１０８】
この種の装置は、細胞が流体中の毒素を除去または改変するのを可能にする条件下で、流体が本開示の特定の局面で提供される肝細胞と接触するような状況の下で、血液などの流体を解毒するために用いることができる。解毒には、肝臓によって通常処理される少なくとも１つのリガンド、代謝産物または他の化合物（天然物または合成物のいずれか）を除去または改変することが含まれると考えられる。このような化合物には、ビリルビン、胆汁酸、尿素、ヘム、リポタンパク質、糖質、トランスフェリン、ヘモペキシン、アシアロ糖タンパク質、インスリンおよびグルカゴンなどのホルモン、ならびに種々の低分子薬が含まれるが、これらに限定されない。本装置を、アルブミン、急性期反応物質および保有していない輸送タンパク質などの合成タンパク質を流出液に多く含ませるために用いることもできる。これらの種々の機能が果たされ、それによって必要な数の肝機能が回復するように装置を最適化することができる。治療的使用の状況では、装置は肝細胞不全の患者から流れてきた血液を処理し、その後に血液を患者に戻す。
【０１０９】
Ｄ．商業用、治療用および研究目的のための流通
製造、分配、および使用の目的で、本開示の肝細胞は通常、低温保存細胞、細胞培養液、等張性賦形剤または培養液に入れて混濁液の形態で供給され、輸送または貯蔵しやすいように必要に応じて凍結された形態で供給される。
【０１１０】
本開示では種々の試薬システムも提供し、この試薬システムには、製造、分配または使用中にいつでも存在する細胞のセットまたは組み合わせが含まれる。細胞セットは、本開示に記載の肝細胞、および／またはエンドユーザーが本開示のウイルス受容性肝細胞を作成するために使用するｃＡＭＰおよび／またはＪＡＫｉを含む試薬とともにキットに含まれる肝細胞を含む場合がある。また、培地、未分化幹細胞、または他の分化した細胞型との組み合わせも含み得る。セットの細胞集団は、同じゲノムまたはそのゲノムの遺伝子改変型を有していることもある。セットの各細胞型は、まとめてまたはそれぞれ別々の容器中に、取引関係を共有する同じ組織または異なる組織の制御下で、同じ施設内でまたは異なる場所で、同じ時刻または異なる時刻に、包装することができる。
【実施例】
【０１１１】
ＩＶ．実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい態様を実証するために含まれる。当業者には、以下の実施例に開示される技術が本発明の実施において良好に機能するように発明者によって発見された技術を表し、従って、その実施のための好ましい様式を構成すると考えることができると理解される。しかし、当業者であれば、本開示に照らして、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、開示された特定の態様において多くの変更がなされ得、同様のまたは類似の結果が得られることを認識できる。
【０１１２】
実施例１−ｉＰＳＣ由来肝細胞の出発集団
本実施例の目的は、肝細胞におけるＨＢＶ病原性の研究、特に感染のプロセスや抗ＨＢＶ治療剤のスクリーニングの研究に使用するための、ウイルス感染、特にＨＢＶ感染に受容性がある肝細胞を産生することであった。ＰＳＣ由来肝細胞の出発集団はヒト人工多能性幹細胞から調製され、セルラーダイナミクスインターナショナル社からｉＣｅｌｌ（登録商標）肝細胞（ｉＣｅｌｌ（登録商標）肝細胞２．０培地サプリメントを含むキットである、カタログ番号ＨＣＣ−１００−０１０−００１およびＰＣＨ−１００−０２０−００１）として販売されている。
【０１１３】
他の供給源から得たＰＳＣ由来肝細胞、および様々な方法（その全体が参照によりすべて本明細書に組み込まれる米国特許第７，４７３，５５５号、米国特許第８，２８３，１６８号、米国特許第８，１４８，１５１号、米国特許第７，９８９，２０４号、米国特許第８，４８１，３１７号、公開米国特許出願第２０１４０２４２５９５号、ＰＣＴ米国特許出願第２０１５／０２６５８３号に開示される方法など）で生産された肝細胞もまた、ウイルス受容性肝細胞、特にＨＢＶ感染に受容的なウイルス受容性肝細胞を産生するこの方法の出発肝細胞集団として使用され得る。
【０１１４】
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染は、急性肝炎、慢性肝炎、および劇症肝炎などの重症疾患を引き起こす。インビボにおいてＨＢＶは主に肝細胞で複製され、急性または慢性感染のいずれをも引き起こす。ＨＢＶの粒子は、脂質の外被およびタンパク質からなる正二十面体のヌクレオカプシド核からなる。ＨＢＶは表面抗原であるＨＢｓＡＧを有し、ＨＢｓＡＧは多く存在するため、容易に感染培地および患者から検出される。別のＨＢＶ抗原であるＨＢｅＡＧは、ウイルスのライフサイクル中に生産され、慢性疾患の治療および分析のアウトカムを決定するのに使用される。したがって、本開示のウイルス受容性肝細胞におけるＨＢｅＡＧおよびＨＢｓＡＧ分泌の両方を、真性の感染およびＨＢＶライフサイクルの複製を判定するのに使用した。
【０１１５】
ｉＣｅｌｌ（登録商標）肝細胞（セルラーダイナミクスインターナショナル社）を、Ｂ型肝炎ウイルス粒子に約２４時間感染させた。次に、培地を交換し、感染後約１２日間、１日おきに上清を採取し、ＥＬＩＳＡキットを使用してＨＢｓＡＧおよびＨＢｅＡＧの分泌を測定した。ＥＬＩＳＡキットでは、ＨＢｓＡｇまたはＨＢｅＡＧに特異的なモノクローナル抗体が、各マイクロプレートウェルの表面と結合した。アッセイの期間中、陽性対照、陰性対照、および肝細胞の上清から採取した試料を各マイクロプレートウェルに添加した。ＨＢｓＡｇまたはＨＢｅＡＧに特異的な酵素標識（西洋わさびペルオキシダーゼ）抗体を添加し、インキュベートした。未結合の抗原・抗体・酵素の複合体を除去するために洗浄した後、ＴＭＢ（３，３’，５，５’テトラメチルベンジジン）基質溶液を各ウェルに添加する。酵素（ＨＲＰ）と基質は、１０分間のインキュベート時間内に反応する。酵素基質反応は、硫酸溶液の添加によって終了される。色の変化を分光光度的に４５０±２ｎｍの波長で測定する。ＨＢｓＡｇまたはＨＢｅＡＧおよび抗体複合体を含むウェルのみが、色の変化を示すであろう。この色の変化の強度は、試料中のＨＢｓＡｇまたはＨＢｅＡＧの濃度に比例する。
【０１１６】
前述の感染分析の結果を図２Ａに示す。図から分かるように、ｉＣｅｌｌ（登録商標）肝細胞の３つの異なるロット（Ａ、Ｂ、およびＣ）のＨＢＶ感染出発集団は、時間の経過に伴いＨＢｓＡＧの分泌が増加し、ＨＢＶ感染と一致した（図２Ａ）。しかし、感染していないｉＣｅｌｌ肝細胞は検出可能なレベルのＨＢｅＡＧを示さなかったことが分かった。したがって、前述のアッセイは、ｉＣｅｌｌ（登録商標）肝細胞はＨＢｓＡＧおよびＨＢｅＡＧ両方の分泌を有する真性のＨＢＶ感染を支持しないことを示す。
【０１１７】
実施例２−ウイルス受容性肝細胞の生産
この実施例では、本方法に従ってＰＳＣ由来肝細胞をさらに培養し、次いで実施例１のようにＨＢＶ感染力を試験する、本開示の一実施例を記載する。ここでは、ｉＣｅｌｌ（登録商標）肝細胞を本方法に従って培養した：播種培地は、ＲＰＭＩ１６４０、オンコスタチンＭ、Ｂ２７サプリメント、デキサメタゾン、ゲンタマイシン、およびｉＣｅｌｌ（登録商標）肝細胞２．０培地サプリメントなどの肝細胞培地サプリメントを加えて調整した（表３）。ｉＣｅｌｌ（登録商標）肝細胞の細胞懸濁液は室温の播種培地を使用して希釈し、細胞播種密度を１１．２×１０５細胞／ｍＬにした。約１００μＬの細胞懸濁液をコラーゲンコート９６ウェルプレートである各ウェルに分注し、１．１２×１０５細胞／ウェル（３．５×１０５細胞／ｃｍ２）となった。ｉＣｅｌｌ（登録商標）肝細胞は次いで細胞培地インキュベーター中、３７℃および５％ＣＯ２で約３〜４時間培養した。インキュベート中、播種培地の一定量は室温に平衡化した。インキュベートした後、マルチチャンネルピペットを使用して播種培地をプレートから吸引し、１００μＬの室温の播種培地と交換した。
【表２】
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【表３】
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【０１１８】
ウイルス受容性の誘導を開始するために、肝細胞を播種した２４時間後にマルチチャンネルピペットを使用して培地を吸引し、約１ｍＭのｃＡＭＰを添加した室温の播種培地（１００μＬ）と交換した。細胞のフィーディングは、播種後５日目まで毎日繰り返した。
【０１１９】
播種後５日目に、培地を吸引し、維持培地（Ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  Ｍｅｄｉｕｍ）であるＲＰＭＩ、Ｂ２７サプリメント、デキサメタゾン、ゲンタマイシン、および約１μＭのＪＡＫ阻害剤（ＪＡＫｉ：ＥＭＰミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、カタログ番号４２００９９）を添加したｉＣｅｌｌ（登録商標）肝細胞２．０培地サプリメント（表４）に交換した。約２４時間後、培地を吸引しＪＡＫｉを添加した１００μＬの維持培地に交換した。細胞をその維持培地でもう１日培養した。次いで、得られた肝細胞をＨＢＶ感染力特徴分析にかけた。本明細書においては「処理肝細胞」または同様の名称で示す。
【表４】
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【０１２０】
実施例３−肝細胞の特徴分析
実施例２の処理肝細胞は、それらのＢ型肝炎感染への受容性によって、および実施例１に記載される対照の（未処理）ｉＣｅｌｌ（登録商標）肝細胞との比較によって特徴分析された。未処理ｉＣｅｌｌ（登録商標）肝細胞および処理肝細胞は両方とも、細胞をＨＢＶに曝露することによりＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）に感染した。ＨＢＶ感染では、維持培地および約４％のポリエチレングリコールを含む感染培地（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍ）にＨＢ粒子を混合した。肝細胞培地を吸引し、９０％の維持培地、４％のポリエチレングリコールおよびＨＢＶ粒子を含む、約１００〜１５０μＬの感染培地に交換した。ＨＢＶ感染の約２４時間後に培地は維持培地に変化し、さらなる分析のためにその上清を採取して別々の９６ウェルプレートに保存した。培地の変化および上清の採取は感染後１２日目まで１日おきに繰り返した。上清は分析のために４℃で保存した。
【表５】
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【０１２１】
ＨＢＶに感染したｃＡＭＰ、ＪＡＫｉ未処理ｉＣｅｌｌ（登録商標）肝細胞、および処理肝細胞の上清を前述したＨＢｓＡＧおよびＨＢｅＡＧ  ＥＬＩＳＡキットを使用して分析し、感染への受容性を測定した。両方の抗原を使用して、真性感染を実現することができたか、およびＨＢＶライフサイクルの複製が顕在化しているかどうかを判断した。ＨＢｓＡＧの測定値がアッセイのダイナミックレンジの範囲外となった場合、アッセイ開始前に上清を必要に応じて維持培地中で希釈し（例えば１：１０またはそれ以上）、測定値がアッセイのダイナミックレンジ内となるようにした。肝細胞を処理してＨＢＶ受容性を誘導し、処理肝細胞を感染させる典型的なスケジュール表を図２Ｂに示す。
【０１２２】
前述のように、実施例１のｉＣｅｌｌ（登録商標）肝細胞（ｃＡＭＰまたはＪＡＫｉ未処理の）は、ＨＢｅＡＧの証拠を示さなかった。対照的に、実施例２においてｃＡＭＰおよびａＪＡＫ阻害剤とともに処理して生産した処理肝細胞は、ＨＢＶ感染後にＨＢｓＡＧおよびＨＢｅＡＧ両方が陽性であった（図２Ｃ〜２Ｈ）。特に、ｃＡＭＰおよびＪＡＫ阻害剤とともに処理した肝細胞は、ｃＡＭＰのみまたはＪＡＫｉのみと処理した場合と比較してＨＢｓＡＧおよびＨＢｅＡＧの分泌レベルが相乗的に増加した。したがって、ｃＡＭＰおよびＪＡＫｉ処理肝細胞は未処理のｉＣｅｌｌ肝細胞と比較して、Ｂ型肝炎への感染を支持する高い能力を有する。
【０１２３】
さらに、ｃＡＭＰおよびＪＡＫｉで前処理した感染肝細胞によって生産したウイルスを上清から単離し、ＨＢＶの複製を実証するための二次感染および完全な受容性をもつウイルスの生産に使用された（図３Ａ）。本開示の処理肝細胞および陰性対照（ｉＣｅｌｌ心筋細胞）であるＨＢＶ感染を支持可能な細胞型ではない心筋細胞を、ＨＢＶに再感染させた。ＨＢｓＡＧおよびＨＢｅＡＧの分泌レベルを、上清を採取しＥＬＩＳＡキットを使用して抗原レベルを測定することによって１４日間モニターした（図３Ｂ、３Ｃ）。心筋細胞は感染の兆候を全く示さなかったが、処理肝細胞はＨＢｓＡＧおよびＨＢｅＡＧの産生から明らかなように確実な感染の兆候を示した。次に、一次感染によって生産したＨＢＶを二次感染中の処理肝細胞および心筋細胞の上清から濃縮した。ＨＢＶに曝露した心筋細胞から採取した濃縮されたＨＢＶは感染の兆候を全く示さなかったが（図３Ｄ、３Ｅ）、処理肝細胞の第一培地の上清から単離したＨＢＶは処理肝細胞の第二培地を確実に感染させることができた。ＨＢＶの肝細胞に再感染する能力は、処理肝細胞の培地中で完全なウイルスライフサイクルの証拠を示した。
【０１２４】
処理肝細胞はまた、培養中で長期間生存すること（図４Ａ）、およびＨＢＶ受容体ＮＴＣＰの発現が増加することが分かった（図４Ｂ）。したがって、実施例２において生産した処理肝細胞は、ＨＢＶ感染に受容的で支持的となり得るのに必要なレベルの成熟化に達すると特徴付けられた。
【０１２５】
本明細書に開示され特許請求される方法の全ては、本開示に照らして過度の実験をすることなく準備・実行され得る。本発明の組成物および方法は、好ましい態様という観点から記載されているが、当業者には、本発明の概念、精神および範囲から逸脱することなく、これらの方法および工程または記載された方法の工程の順序に変更を適用することができることは明らかであろう。より具体的には、化学的にも生理学的にも関連する特定の薬剤を、本明細書に記載の薬剤と置き換えて、同じまたは類似の結果を達成することができることは明らかであろう。当業者に明らかなこのような類似の置換および変更はすべて、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の精神、範囲および概念の範囲内であるとみなされる。
参考文献
以下の参考文献は、本明細書に記載されたものに補足的な例示的な手順または他の詳細を提供する範囲で、参照することにより本明細書に具体的に組み込まれる。
アマンおよびレオナルド、カレントバイオロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、７：Ｒ７８４−７８８、１９９７
アミットら、発生生物学（Ｄｅｖ．Ｂｉｏ．）、２２７：２７１−２７８、２０００
チェンら、肝臓学（Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ）、５５（４４）：１１９３−２０３、２０１２
チュンら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２７８：１８０３−１８０５、１９９７
ガジット（Ｇａｚｉｔ）ら、ジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．）、３２：２３４４−２３５２、１９８９
グリポンら、ウイルス学（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ）、６２（１１）４１３６−４１４３、１９８８
グリポンら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１９２（２）５３４−５４０、１９９３
ギルーゾ（Ｇｕｉｌｌｏｕｚｏ）ら、Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔ、１０６：５１１−５３２、１９９８
マンら、Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｎｅｗｓ：Ａｓｓａｙ  Ｔｕｔｏｒｉａｌｓ、３３：９、２０１３
Ｎａｓｓａｌら、Ｍ  Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１３４：２３５−２４９、２００８
ニコルソンおよびヒルトン、Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｂｉｏｌ．、６３：６６５−６６８、１９９８
オオヤら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７２：２７１７８−２７１８２、１９９７
ＰＣＴ公報国際公開第２００７／０６９６６６号
公開米国特許出願第２００９／０２４６８７５号
公開米国特許出願第２０１０／０２１００１４号
公開米国特許出願第２０１２／０２７６６３６号
ルービノフ（Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆ）ら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１８：３９９−４０４、２０００
スミス著「マウス胚性幹細胞の起源と特徴（Ｏｒｉｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ）」、細胞および発生生物学年次報告（Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．）、２０００
タカハシら、セル、１２６、６６３−６７６、２００７
トムソンおよびマーシェル、発生生物学における最新の知見（Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．）、３８：１３３−１６５、１９９８
トムソンおよびオドリコＪ、トレンズインバイオテクノロジー（Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）、１８：５３−５７、２０００
トムソンら、サイエンス、２８２：１１４５、１９９８
米国特許第５，８４３，７８０号
米国特許第５，８４３，７８０号
米国特許第６，１０３，４７０号
米国特許第６，２００，８０６号
米国特許第６，４１６，９９８号
米国特許第７，０２９，９１３号
米国特許第７，４４２，５４８号
米国特許第７，４４２，５４８号
米国特許第７，５９８，３６４号
米国特許第７，９８９，４２５号
米国特許第８，０５８，０６５号
米国特許第８，０７１，３６９号
米国特許第８，１２９，１８７号
米国特許第８，２６８，６２０号
米国特許第８，２７８，６２０号
米国特許第８，７４１，６４８号
米国特許第８，９００，８７１号
公開米国特許出願第２００３／０２１１６０３号
公開米国特許出願第２００３／０２１１６０３号  
公開米国特許出願第２０１４／０２４２５９５号
ワンら、免疫学（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）、１６２（７）：３８９７−３９０４、１９９９
シュウら、ネイチャーバイオテクノロジー、１９：９７１−９７４、２００１
インら、セル、１１５：２８１−２９２、２００３
ヨシムラら、ＥＭＢＯ  Ｊ．、１４：２８１６−２８２６、１９９５
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図２Ｈ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
0006800987.tif 000020
【図３Ｄ】
0006800987.tif 000021
【図３Ｅ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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