(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
造血幹／前駆細胞を増殖させる方法であって、
（ａ）（ｉ）ヒトＮｏｔｃｈ１の細胞外ＥＧＦリピートドメインに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片である、Ｎｏｔｃｈ１アゴニスト、
（ｉｉ）ヒトＮｏｔｃｈ２の細胞外ＥＧＦリピートドメインに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片である、Ｎｏｔｃｈ２アゴニスト、または
（ｉｉｉ）ヒトＮｏｔｃｈ１の細胞外ＥＧＦリピートドメインに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片である、Ｎｏｔｃｈ１アゴニストと、ヒトＮｏｔｃｈ２の細胞外ＥＧＦリピートドメインに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片である、Ｎｏｔｃｈ２アゴニストを含む、
１つ以上の固定化されたＮｏｔｃｈアゴニスト；および
（ｂ）増殖因子
の存在下に造血幹／前駆細胞を培養し、それにより増殖した造血幹／前駆細胞集団を産生することを含む、方法。
【請求項２】
培養工程前および／または培養工程中に、造血幹／前駆細胞によるヒトＮｏｔｃｈ１および／またはヒトＮｏｔｃｈ２発現を検出する工程をさらに含み、
ヒトＮｏｔｃｈ１が該検出工程において検出される場合には、培養工程においてＮｏｔｃｈ１アゴニストが使用され、および／または
ヒトＮｏｔｃｈ２が該検出工程において検出される場合には、培養工程においてＮｏｔｃｈ２アゴニストが使用される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
培養することが、（ａ）（ｉ）Ｎｏｔｃｈ１アゴニスト、（ｉｉ）Ｎｏｔｃｈ２アゴニスト、または（ｉｉｉ）Ｎｏｔｃｈ１アゴニストとＮｏｔｃｈ２アゴニスト、ならびに
（ｂ）増殖因子
の存在下で培養していない造血幹／前駆細胞が増殖を停止し、分化または死滅する期間を過ぎて行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
培養することが、Ｎｏｔｃｈ１アゴニストとＮｏｔｃｈ２アゴニストの存在下で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
培養することが、（ｉ）Ｎｏｔｃｈ２アゴニストではなくＮｏｔｃｈ１アゴニスト、または（ｉｉ）Ｎｏｔｃｈ１アゴニストではなくＮｏｔｃｈ２アゴニストの存在下で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
造血幹／前駆細胞が臍帯血から得られた、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
培養中、Ｎｏｔｃｈ２アゴニストが０．１μｇ／ｍｌから５０μｇ／ｍｌの濃度である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
培養中、Ｎｏｔｃｈ１アゴニストが０．００５μｇ／ｍｌから３０μｇ／ｍｌの濃度である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
増殖因子が、インターロイキン−３（ＩＬ−３）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）およびＦｌｔ−３リガンドである、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
培養の期間が７日から６週間である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
Ｎｏｔｃｈ１アゴニストおよび／またはＮｏｔｃｈ２アゴニストが第一の固相上に固定化されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
Ｎｏｔｃｈ１アゴニストが、第一の固相上に固定化され、Ｎｏｔｃｈ２アゴニストが第二の固相上に固定化されている、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
第一の固相が、組織培養ディッシュまたは組織培養フラスコまたはビーズの表面である、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
（ｉ）第一の固相が組織培養ディッシュまたは組織培養フラスコの表面であり、第二の固相がビーズである、または
（ｉｉ）第一の固相がビーズであり、第二の固相が組織培養ディッシュまたは組織培養フラスコである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
造血幹／前駆細胞が、
（ｉ）造血幹細胞、
（ｉｉ）造血前駆細胞、または
（ｉｉｉ）造血幹細胞と前駆細胞
である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
胸腺に移動し、成熟Ｔ細胞を生じさせ得る、初期Ｔ細胞幹／前駆細胞をさらに産生する、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
造血幹／前駆細胞を増殖させる方法であって、
（ａ）（ｉ）ヒトＮｏｔｃｈ１の細胞外ＥＧＦリピートドメインに特異的に結合し、ヒトＮｏｔｃｈ１を活性化する抗体またはその抗原結合断片である、Ｎｏｔｃｈ１アゴニスト、
（ｉｉ）ヒトＮｏｔｃｈ２の細胞外ＥＧＦリピートドメインに特異的に結合し、ヒトＮｏｔｃｈ２を活性化する抗体またはその抗原結合断片である、Ｎｏｔｃｈ２アゴニスト、または
（ｉｉｉ）ヒトＮｏｔｃｈ１の細胞外ＥＧＦリピートドメインに特異的に結合し、ヒトＮｏｔｃｈ１を活性化する抗体またはその抗原結合断片である、Ｎｏｔｃｈ１アゴニストと、ヒトＮｏｔｃｈ２の細胞外ＥＧＦリピートドメインに特異的に結合し、ヒトＮｏｔｃｈ２を活性化する抗体またはその抗原結合断片である、Ｎｏｔｃｈ２アゴニスト、
を含む、
１つ以上の固定化されたＮｏｔｃｈアゴニスト；および
（ｂ）増殖因子
の存在下で造血幹／前駆細胞を培養することを含み、ここで、ヒトＮｏｔｃｈ１の活性化および／またはヒトＮｏｔｃｈ２の活性化が、Ｎｏｔｃｈリガンドの内因性発現によって起こるシス阻害を克服し、
それにより増殖した造血幹／前駆細胞集団を産生する、方法。
【請求項１８】
Ｎｏｔｃｈ１アゴニストおよび／またはＮｏｔｃｈ２アゴニストの抗原結合断片が、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２または一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）から選択される、請求項１または１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、２０１４年６月４日に出願された米国仮出願第６２／００７，８４８号の利益を主張する。
【０００２】
政府支援の陳述
本発明は、国立衛生研究所により授与されたＨＬ１００３９５に基づく政府支援によってなされた。政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
１．本開示の分野
本開示は、Ｎｏｔｃｈ  １アゴニストおよび／またはＮｏｔｃｈ  ２アゴニスト、ならびに１つ以上の増殖を促進する増殖因子の存在下で、前駆細胞（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｃｅｌｌ）型の細胞がそれを過ぎると増殖を停止し分化または死滅する期間、不死化していない前駆細胞を培養することを含む、不死化した前駆細胞集団を産生するための方法を提供する。本開示はさらに、不死化の前または後に前駆細胞をそれらの分化を促進する状態に曝露することを含む、不死化および分化した細胞型を産生するための方法を提供する。そこから誘導される不死化した細胞は、細胞治療に使用することができる。
【背景技術】
【０００４】
２．開示の背景
２．１  Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路
Ｎｏｔｃｈファミリーのメンバーは、多数の無脊椎系における早期の発生中の細胞−細胞相互作用および細胞運命決定において中心的な役割を果たす大きな膜貫通タンパク質をコードする。Ｎｏｔｃｈ受容体は、様々な細胞型がすぐ隣の細胞によって採用されたものに基づいて、代替の分化経路間で選択することを可能にする高度に保存された経路の一部である。この受容体は、２つの代替的な運命のうちの１つを採用する能力を阻害することによって、コミットしていない細胞の分化状態への進行を制御し、それによって細胞は分化を遅らせる、または適切な発生シグナルの存在下で、阻害されない経路に沿って分化するようコミットさせる、共通のステップを通じて作用すると考えられる。
【０００５】
遺伝学的および分子生物学的研究により、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の別個の要素を規定する一群の遺伝子が同定されている。これらの様々な要素の最初の同定は、初期のガイドとして遺伝的ツールを用いてショウジョウバエのみから得られたが、一方、その後の分析は、ヒトを含む脊椎動物種における同種タンパク質の同定をもたらしている。公知のＮｏｔｃｈ経路要素とそれらの細胞下局在の間の分子的関係は、Ａｒｔａｖａｎｉｓ−Ｔｓａｋｏｎａｓら、１９９５年、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６８：２２５−２３２頁およびＡｒｔｖａｎｉｓ−Ｔｓａｋｏｎａｓら、１９９９年、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８４：７７０−７７６頁に記述されている。
【０００６】
２．１．１．Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路のメンバー
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路のいくつかのメンバーが、無脊椎動物および脊椎動物の生物においてクローニングされおよび配列決定されている。非哺乳動物のＮｏｔｃｈ遺伝子には、ショウジョウバエ（Ｗｈａｒｔｏｎら、１９８５年、Ｃｅｌｌ  ４３：５６７−５８１頁）；アフリカツメガエル（Ｃｏｆｆｍａｎら、１９９０年、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１４３８−１４４１頁）；およびゼブラフィッシュ（Ｂｉｅｒｋａｍｐら、１９９３年、Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ．４３：８７−１００頁）で同定されたものが含まれる。少なくとも４つの哺乳動物のＮｏｔｃｈホモログが同定されている（Ｎｏｔｃｈ−１、−２、−３および−４；Ｗｅｉｎｍａｓｔｅｒら、１９９１年、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １１３：１９９−２０５頁；Ｅｌｌｉｓｅｎら、１９９１年、Ｃｅｌｌ  ６６：５２３−５３４頁；Ｗｅｉｎｍａｓｔｅｒら、１９９２年、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １１６：９３１−９４１頁；Ｆｒａｎｃｏ  ｄｅｌ  Ａｍｏら、１９９３年、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １５：２５９−２６４頁；ＬａｒｄｅｌｌｉおよびＬｅｎｄａｈｌ、１９９３年、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ．Ｒｅｓ．２０４：３６４−３７２頁；Ｍｉｌｎｅｒら、１９９４年、Ｂｌｏｏｄ．８３：２０５７−６２頁；Ｌａｒｄｅｌｌｉら、１９９４年、Ｍｅｃｈ  Ｄｅｖ．４６：１２３−１３６頁；Ｕｙｔｔｅｎｄａｅｌｅら、１９９６年、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２２：２２５１−９頁）。Ｎｏｔｃｈ経路の他のメンバーには、リガンドであるＤｅｌｔａおよびＳｅｒｒａｔｅ／Ｊａｇｇｅｄ、細胞質タンパク質であるＤｅｌｔｅｘ、ＣＢＦ１としても知られる転写活性化因子であるＲＢＰ−Ｊκ、限定されないが、ｂＨＬＨ転写因子のＳｐｌｉｔファミリーのエンハンサーを含む下流標的、および、Ｎｏｔｃｈの上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）モジュールを修飾し、ＮｏｔｃｈのリガンドであるＤｅｌｔａに結合するＮｏｔｃｈの能力を変化させるグリコシルトランスフェラーゼ酵素としてゴルジ体で作用するＦｒｉｎｇｅ（Ｐａｎｉｎら、１９９７年、Ｎａｔｕｒｅ  ３８７：９０８−９１２頁）が含まれる。Ｎｏｔｃｈシグナリング経路の主要メンバーの遺伝子およびタンパク質配列、ならびに機能的役割については、以下の非限定的な論文のリストに記載されている。
【０００７】
無脊椎動物リガンド：（ｉ）Ｄｅｌｔａ（Ｋｏｐｃｚｙｎｓｋｉら、１９８８年、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．２：１７２３−１７３５頁；Ｈｅｎｒｉｑｕｅら、１９９５年、Ｎａｔｕｒｅ  ３７５：７８７−７９０頁；Ｃｈｉｔｎｉｓら、１９９５年、Ｎａｔｕｒｅ  ３７５：７６１−７６６頁）；（ｉｉ）Ｓｅｒｒａｔｅ（Ｆｌｅｍｉｎｇら、１９９０年、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１：２１８８−２２０１頁；Ｌｉｎｄｓｅｌｌら、１９９５年、Ｃｅｌｌ  ８０：９０９−９１７頁；Ｔｈｏｍａｓら、１９９１年、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １１１：７４９−７６１頁；Ｔａｘら、１９９４年、Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：１５０−１５４頁）。
【０００８】
脊椎動物のリガンド：（ｉ）Ｓｅｒｒａｔｅ（Ｔｈｏｍａｓ、１９９１年、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １１１：７４９−７６１頁；Ｌｉｎｄｓｅｌｌら、１９９５年、Ｃｅｌｌ  ８０：９０９−９１７頁）；（ｉｉ）Ｄｅｌｔａ（Ｃｈｉｔｎｉｓら、１９９５年、Ｎａｔｕｒｅ  ３７５：７６１頁；Ｈｅｎｒｉｑｕｅら、１９９５年、Ｎａｔｕｒｅ  ３７５：７８７−７９０頁；Ｂｅｔｔｅｎｈａｕｓｅｎら、１９９５年、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２１：２４０７頁）。
【０００９】
他の無脊椎動物のＮｏｔｃｈ経路メンバー：（ｉ）細胞質タンパク質であるＤｅｌｔｅｘ（Ｂｕｓｓｅａｕら、１９９４年、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １３６：５８５−５９６頁）；（ｉｉ）各タンパク質であるＭａｓｔｅｒｍｉｎｄ、Ｈａｉｒｌｅｓｓ、Ｓｐｌｉｔ複合体のエンハンサー（Ｓｍｏｌｌｅｒら、１９９０年、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．４：１６８８−１７００頁；ＢａｎｇおよびＰｏｓａｋｏｎｙ、１９９２年、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．６：１７５２−１７６９頁；Ｍａｉｅｒら、１９９２年、Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ．３８：１４３−１５６頁；Ｄｅｌｉｄａｋｉｓら、１９９１年、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １２９：８０３−８２３頁；Ｓｃｈｒｏｎｓら、１９９２年、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １３２：４８１−５０３頁；ならびにＦｏｒｔｉｎｉおよびＡｒｔａｖａｎｉｓ−Ｔｓａｋｏｎａｓ、１９９４年、Ｃｅｌｌ  ７９：２７３−２８２頁）；（ｉｉｉ）Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｏｆ  Ｈａｉｒｌｅｓｓ（Ｆｕｒｕｋａｗａら、１９９１年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：２３３３４−２３３４０頁；Ｆｕｒｕｋａｗａら、１９９２年、Ｃｅｌｌ  ６９：１１９１−１１９７頁；およびＳｃｈｗｅｉｓｇｕｔｈおよびＰｏｓａｋｏｎｙ、１９９２年、Ｃｅｌｌ  ６９：１１９９−１２１２頁）；（ｉｖ）Ｆｒｉｎｇｅ（ＩｒｖｉｎｅおよびＷｉｅｓｃｈａｕｓ、１９９４年、Ｃｅｌｌ  ７９：５９５−６０６頁）。
【００１０】
他の脊椎動物のＮｏｔｃｈ経路メンバー：（ｉ）ＲＢＰ−Ｊκ（Ｍａｔｓｕｎａｍｉら、１９８９年、Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：９３４−９３７頁；Ｋａｗａｉｃｈｉら、１９９２年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：４０１６−４０２２頁）；（ｉｉ）Ｄｅｌｔｅｘ（Ｍａｔｓｕｎａｍｉら、１９９８年、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１９：７４−７８頁）；（ｉｉｉ）Ｆｒｉｎｇｅ、例えば、Ｌｕｎａｔｉｃ、ＭａｎｉｃおよびＲａｄｉｃａｌ  Ｆｒｉｎｇｅ（Ｗｕら、１９９６年、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７３：３５５−３５８頁；Ｍｏｒａｎら、１９９９年、Ｍａｍｍ．Ｇｅｎｏｍｅ  １０：５３５−５４１頁）。
【００１１】
２．１．２．Ｎｏｔｃｈファミリーメンバーは細胞質ドメインを介して阻害性シグナルを仲介する表面受容体をコードする。
【００１２】
ショウジョウバエおよび線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）における広範な遺伝子および分子の研究は、Ｎｏｔｃｈホモログによってコードされるタンパク質が、阻害性シグナル伝達経路を活性化することができる細胞表面受容体として作用することを示している（ＧｒｅｅｎｗａｌｄおよびＲｕｂｉｎ、１９９２年、Ｃｅｌｌ．６８：２７１−２８１頁；ＨｅｉｔｚｌｅｒおよびＳｉｍｐｓｏｎ  １９９１年、Ｃｅｌｌ  ６４：１０８３−１０９２頁；ＹｏｃｈｅｍおよびＧｒｅｅｎｗａｌｄ、１９８９年、Ｃｅｌｌ  ５８：５５３−６３頁；Ｆｅｈｏｎら、１９９１年、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１１３：６５７−６６９頁；Ｒｅｂａｙら、１９９３年、Ｃｅｌｌ  ７４：３１９−３２９頁）。
【００１３】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達は、Ｎｏｔｃｈリガンド（Ｄｅｌｔａ−１、−２、−３またはＪａｇｇｅｄ−１もしくは−２）の１つとの相互作用によって開始されると考えられる（Ｓｈａｗｂｅｒら、１９９６年、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １８０：３７０−７６頁；Ｌｕｏら、１９９７年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １７：６０５７−６０６７頁；Ｈｅｎｒｉｑｕｅら、１９９７年、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ７：６６１−７０頁；Ｂｅｔｔｅｎｈａｕｓｅｎら、１９９５年、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２１：２４０７−１８頁；Ｄｕｎｗｏｏｄｉｅら、１９９７年、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２４：３０６５−７６頁）。公知のリガンドの各々は、ショウジョウバエ、線虫、および脊椎動物に見られる複数のＥＧＦリピートおよび高度に保存されたＤＳＬドメインを含む細胞外ドメインによって特徴付けられる（Ｔａｘら、１９９４年、Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：１５０−１５４頁）。Ｎｏｔｃｈ活性化を誘導する特定のＮｏｔｃｈリガンドの能力が他の遺伝子の発現によって修飾され得るという証拠がある。例えば、Ｆｒｉｎｇｅの発現は、Ｓｅｒｒａｔｅ（Ｊａｇｇｅｄのショウジョウバエホモログ）によるＮｏｔｃｈの活性化を妨げるが、Ｄｅｌｔａ活性を増強する（Ｆｌｅｍｉｎｇら、１９９７年、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２４：２９７３−８１頁）。
【００１４】
細胞外ドメインによって媒介される細胞間相互作用は、細胞内ドメインによるシグナル伝達を調節し、分化の調節をもたらすというかなりの証拠がある（ＹｏｃｈｅｍおよびＧｒｅｅｎｗａｌｄ、１９８９年、Ｃｅｌｌ  ５８：５５３−５６３頁；Ｒｅｂａｙら、１９９３年、Ｃｅｌｌ  ７４：３１９−３２９頁）。データは、これが細胞外ドメインがそのリガンドの１つに結合する結果として起こり、続いて一連のタンパク質分解的な切断が起こり、次に、Ｎｏｔｃｈの細胞内ドメインの放出をもたらすことを示す（ＳｔｒｕｈｌおよびＡｄａｃｈｉ、１９９８年、Ｃｅｌｌ．９３：６４９−６６０頁；Ｓｃｈｒｏｅｔｅｒら、１９９８年、Ｎａｔｕｒｅ  ３９３：３８２−３８６頁）。Ｎｏｔｃｈ受容体の切断型の発現を含む機能的分析は、受容体活性化が細胞内ドメインの６つのｃｄｃ１０／アンキリンリピートに依存することを示している。さらに、Ｎｏｔｃｈ活性化は、ｃｄｃ１０／アンキリンリピートが−−おそらくタンパク質の残りからのタンパク質分解的な切断後に−−核に到達し、転写活性化に関与することを必要とする（ＳｔｒｕｈｌおよびＡｄａｃｈｉ、１９９８年、Ｃｅｌｌ  ９３：６４９−６６０頁）。その過剰発現が経路の明らかな活性化をもたらすＤｅｌｔｅｘおよびＳｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｏｆ  Ｈａｉｒｌｅｓｓは、それらのリピートと会合する。最近の証拠は、核進入のためのｃｄｃ１０／アンキリンリピートを放出するタンパク質分解的な切断ステップがプレセニリン活性に依存することを示唆する（Ｄｅ  Ｓｔｒｏｏｐｅｒら、１９９９年、Ｎａｔｕｒｅ  ３９８：５１８−５２２頁；ＳｔｒｕｈｌおよびＧｒｅｅｎｗａｌｄ、ｉｂｉｄ．：５２２−５２５頁；Ｙｅら、ｉｂｉｄ．：５２５−５２９頁）。
【００１５】
Ｎｏｔｃｈ経路は、Ｎｏｔｃｈのアンキリンリピートを核に放出するステップに加えて、タンパク質プロセシング事象に依存する。原形質膜中に存在するＮｏｔｃｈ受容体は、２つのＮｏｔｃｈタンパク質分解的な切断産物のヘテロ二量体を含み、一方は細胞外ドメインの一部、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを含むＮ末端断片を含み、他方は細胞外ドメインの大部分を含む（Ｂｌａｕｍｕｅｌｌｅｒら、１９９７年、Ｃｅｌｌ  ０：２８１−２９１頁）。受容体を活性化するＮｏｔｃｈのタンパク質分解的な切断ステップはゴルジ装置で起こり、フリン様コンバターゼによって媒介される（Ｌｏｇｅａｔら、１９９８年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：８１０８−８１１２頁）。ＮｏｔｃｈリガンドであるＤｅｌｔａは、さらに、活性化のために切断を必要とする。Ｄｅｌｔａは、細胞表面でＡＤＡＭディスインテグリンメタロプロテアーゼのクズバニアンによって切断され、Ｄｅｌｔａの可溶性および活性形態を放出すると考えられている（Ｑｉら、１９９９年、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８３：９１−９４頁）。
【００１６】
Ｎｏｔｃｈの細胞内ドメインは、このドメインの強制的な発現がＣ２筋芽細胞における筋細胞融合を妨げることから、構成的に活性な受容体として作用することが示されており（Ｋｏｐａｎら、１９９４年、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２０：２３８５−２３９６頁）、ＭｙｏＤおよびＭｙｆ−５による３Ｔ３細胞の筋肉変換をブロックし（Ｋｏｐａｎら、１９９４年、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２０：２３８５−２３９６頁）、ＤＭＳＯ誘導されたＰ１９胎児癌細胞の筋肉分化を妨げ、Ｐ１９細胞のグリア分化を可能にしながら神経発生を阻害する（Ｎｙｅら、１９９４年、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２０：２４２１−２４３０頁）。
【００１７】
細胞内ドメインは、それがＣＢＦ１／ＲＢＰ−Ｊκを含む多くの分子標的と相互作用することによって転写を調節するようである核に輸送されると考えられる（ＳｔｒｕｈｌおよびＡｄａｃｈｉ、１９９８年、Ｃｅｌｌ  ９３：６４９−６６０頁；Ｓｃｈｒｏｅｔｅｒら、１９９８年、Ｎａｔｕｒｅ  ３９３：３８２−３８６頁；Ｆｏｒｔｉｎｉら、１９９３年、Ｎａｔｕｒｅ  ３６５：５５５−７頁）。下流の標的は完全には決定されていないが、ＲＢＰ−Ｊκは、転写活性の阻害剤として機能するＳｐｌｉｔ（ＨＥＳ）のＨａｉｒｙエンハンサーの発現を活性化することが知られている（Ｊａｒｒｉａｕｌｔら、１９９８年、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１８：２２３０−９頁）。ＲＢＰ−Ｊκ（言及したように、ショウジョウバエＳｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｏｆ  ＨａｉｒｌｅｓｓのホモログであるＣＢＦ１としても知られている）は、Ｂ細胞のエプスタイン−バーウイルス誘導による不死化に関与する哺乳動物のＤＮＡ結合タンパク質である。少なくとも培養細胞において、Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｏｆ  Ｈａｉｒｌｅｓｓは、細胞質においてｃｄｃ１０／アンキリンリピートと会合し、隣接する細胞上でＮｏｔｃｈ受容体とそのリガンドであるＤｅｌｔａとの相互作用により核内に移行することが示されている（ＦｏｒｔｉｎｉおよびＡｒｔａｖａｎｉｓ、１９９４年、Ｃｅｌｌ  ７９：２７３−２８２頁）。核タンパク質であるＨａｉｒｌｅｓｓとＳｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｏｆ  Ｈａｉｒｌｅｓｓとの会合は、酵母２ハイブリッドシステムを用いて報告されており、したがって、Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｏｆ  Ｈａｉｒｌｅｓｓの転写への関与はＨａｉｒｌｅｓｓによって調節されると考えられている（Ｂｒｏｕら、１９９４年、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  ８：２４９１頁；Ｋｎｕｓｔら、１９９２年、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １２９：８０３頁）。Ｎｏｔｃｈシグナル伝達は、スプリット複合体のエンハンサー内で少なくとも特定のｂＨＬＨ遺伝子の活性化をもたらすことが知られている（Ｄｅｌｉｄａｋｉｓら、１９９１年、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １２９：８０３頁）。Ｍａｓｔｅｒｍｉｎｄは、Ｎｏｔｃｈシグナリングとの関係が不明なままであるが、遺伝子分析によって示されるように、Ｎｏｔｃｈ経路に関与する新規の偏在性核タンパク質をコードする（Ｓｍｏｌｌｅｒら、１９９０年、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．４：１６８８頁）。
【００１８】
また、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達が、Ｄｅｌｔｅｘを介したシグナル伝達を伴い、Ｅタンパク質活性の抑制をもたらす代替のＨＥＳ非依存性経路によって媒介されるという証拠が存在する。例えば、Ｂ細胞系において、ＲＢＰ−ＪκではなくＤｅｌｔｅｘはＥ４７機能の阻害に関与することも示されている（Ｏｒｄｅｎｔｌｉｃｈら、１９９８年、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １８：２２３０−９頁）。Ｄｅｌｔｅｘは、リングジンクフィンガーを含み、Ｎｏｔｃｈのアンキリンリピートと相互作用する細胞質タンパク質である（Ｍａｔｓｕｎｏら、１９９５年、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２１：２６３３−２６４４頁）。
【００１９】
２．１．３．Ｎｏｔｃｈファミリーメンバーの役割
米国特許第５，７８０，３００号は、分化プロセスにおけるＮｏｔｃｈタンパク質の役割を記載している。要約すると、Ｎｏｔｃｈは、分化／増殖／アポトーシスシグナルに応答する多数の異なる細胞型の能力を制御し、特定の細胞運命は、各細胞型の発生履歴およびその中で作動する特異的なシグナル経路に依存して選択される。ショウジョウバエおよび線虫において、特定の細胞運命が決定されているときに、様々な組織の分化中に複数の段階でＮｏｔｃｈｌｌｉｎ−１２ファミリーのメンバーが必要とされる。線虫において、Ｎｏｔｃｈ関連遺伝子ｌｉｎ−１２およびｇｌｐ−１は、１つ以上の潜在的な細胞運命の抑制または発現をもたらす多種多様な細胞−細胞相互作用において機能する（ＧｒｅｅｎｗａｌｄおよびＲｕｂｉｎ、１９９２年、Ｃｅｌｌ  ６８：２７１−８１頁；Ｇｒｅｅｎｗａｌｄら、１９８３年、Ｃｅｌｌ  ３４：４３５−４４４頁；ＡｕｓｔｉｎおよびＫｉｍｂｌｅ、１９８７年、Ｃｅｌｌ  ５１：５８９−９９頁；ＹｏｃｈｅｍおよびＧｒｅｅｎｗａｌｄ、１９８９年、Ｃｅｌｌ  ５８：５５３−５６３頁；Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎら、１９９４年、Ｃｅｌｌ  ７９：１１８７−１１９８頁）。１つの特に明確な例は、発育中の外陰部における細胞運命の特定に関わる相互作用におけるものであり、この場合、２つの等価な多能性前駆体が常に１つのアンカー細胞（ＡＣ）と１つの腹側子宮前駆体（ＶＵ）細胞を形成する（ＧｒｅｅｎｗａｌｄおよびＲｕｂｉｎ、１９９２年、Ｃｅｌｌ  ６８：２７１−８１頁；Ｇｒｅｅｎｗａｌｄら、１９８３年、Ｃｅｌｌ  ３４：４３５−４４頁；ＡｕｓｔｉｎおよびＫｉｍｂｌｅ、１９８７年、Ｃｅｌｌ  ５１：５８９−９９頁；ＹｏｃｈｅｍおよびＧｒｅｅｎｗａｌｄ、１９８９年、Ｃｅｌｌ  ５８：５５３−６３頁；Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎら、１９９４年、Ｃｅｌｌ  ７９：１１８７−９８頁）。幹細胞の１つが除去されると、残りの細胞は常にＡＣとなる；ｌｉｎ−１２活性が欠如していると、両方ともＡＣとなる；ｌｉｎ−１２活性が上昇すると、両方の細胞がＶＵ運命を発現する。さらなる証拠は、ＡＣ分化にコミットしている細胞における、ｌｉｎ−１２のリガンドであるｌａｇ−２の発現の相対的増加が、直接的な細胞−細胞相互作用を介してｌｉｎ−１２活性の増加を誘導することを示しており、これは、ＡＣ分化に対して阻害的であるがＶＵ分化は許容する。
【００２０】
ショウジョウバエにおいて、Ｎｏｔｃｈは、神経系、眼、中胚葉、卵巣および多能性プロジェニターが細胞運命決定を行っている他の領域を含む多数の組織において、適切な細胞運命決定に必要であることが示されている（Ａｒｔａｖａｎｉｓ−Ｔｓａｋｏｎａｓら、１９９９年、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８４：７７０−７７６頁；Ｇｏら、１９９８年、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２５：２０３１−２０４０頁；Ｄｏｈｅｒｔｙら、１９９６年、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１０：４２１−４３４頁；Ａｒｔａｖａｎｉｓ−Ｔｓａｋｏｎｉｓら、１９９５年、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６８：２２５−２３２頁；ＧｒｅｅｎｗａｌｄおよびＲｕｂｉｎ、１９９２年、Ｃｅｌｌ  ６８：２７１−８１頁；ＨｅｉｔｚｌｅｒおよびＳｉｍｐｓｏｎ、１９９１年、Ｃｅｌｌ  ６４：１０８３−１０９２頁；Ａｒｔａｖａｎｉｓ−ＴｓａｋｏｎａｓおよびＳｉｍｐｓｏｎ、１９９１年、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．７：４０３−４０８頁；ＣａｇａｎおよびＲｅａｄｙ、１９８９年、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．３：１０９９−１１１２頁）。例えば、神経原性領域において、Ｎｏｔｃｈの差示的発現は、等価な細胞のクラスター内の単一の細胞が神経運命を採用し、隣接する細胞が表皮運命を採用する横方向の阻害を媒介するようである。同様に、Ｎｏｔｃｈ遺伝子のホモ接合ヌル突然変異を有する胚において、神経原性領域中の全ての細胞は、神経芽細胞になり、表皮前駆体にはならない。
【００２１】
アフリカツメガエルにおいて、発生中の胚におけるＮｏｔｃｈの突然変異型の発現は、正常な発生と深く干渉する（Ｃｏｆｆｍａｎら、１９９３年、Ｃｅｌｌ  ７３：６５９頁）。
【００２２】
ゼブラフィッシュおよびアフリカツメガエルにおける、Ｎｏｔｃｈの３つの公知の脊椎動物のホモログの１つであるＮｏｔｃｈ−１の発現の研究は、一般的なパターンが類似し、Ｎｏｔｃｈ発現が一般的に末梢分化していない増殖細胞集団と関連していることを示している。高発現レベルを有する組織には、発達中の脳、眼および神経管が含まれる（Ｃｏｆｆｍａｎら、１９９０年、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１４３８−１４４１頁；Ｂｉｅｒｋａｍｐら、１９９３年、Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ．４３：８７−１００頁）。哺乳動物における研究では、後に発生が始まる、対応するＮｏｔｃｈホモログの発現が示されているが、タンパク質は、細胞運命決定または急速な増殖を受ける組織において動的なパターンで発現される（Ｗｅｉｎｍａｓｔｅｒら、１９９１年、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １１３：１９９−２０５頁；Ｒｅａｕｍｅら、１９９２年、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１５４：３７７−３８７頁；Ｓｔｉｆａｎｉら、１９９２年、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．２：１１９−１２７頁；Ｗｅｉｎｍａｓｔｅｒら、１９９２年、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １１６：９３１−９４１頁；Ｋｏｐａｎら、１９９３年、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１２１：６３１−６４１頁；Ｌａｒｄｅｌｌｉら、１９９３年、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２０４：３６４−３７２頁；Ｌａｒｄｅｌｌｉら、１９９４年、Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ．４６：１２３−１３６頁；Ｈｅｎｒｉｑｕｅら、１９９５年、Ｎａｔｕｒｅ  ３７５：７８７−７９０頁；Ｈｏｒｖｉｔｚら、１９９１年、Ｎａｔｕｒｅ  ３５１：５３５−５４１頁；Ｆｒａｎｃｏ  ｄｅｌ  Ａｍｏら、１９９２年、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １１５：７３７−７４４頁）。哺乳動物のＮｏｔｃｈホモログが最初に発現される組織の中には、胚の前体節中胚葉および発生中の神経上皮がある。前体節中胚葉において、移動した中胚葉の全てにＮｏｔｃｈ−１の発現が見られ、特に前体節中胚葉の前縁には高密度帯が見られる。この発現は、体節が形成されると減少することが示され、体節前駆細胞の分化におけるＮｏｔｃｈの役割を示している（Ｒｅａｕｍｅら、１９９２年、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１５４：３７７−３８７頁；Ｈｏｒｖｉｔｚら、１９９１年、Ｎａｔｕｒｅ  ３５１：５３５−５４１頁）。同様の発現パターンがマウスＤｅｌｔａについて見られる（Ｓｉｍｓｋｅら、１９９５年、Ｎａｔｕｒｅ  ３７５：１４２−１４５頁）。
【００２３】
発達中の哺乳動物の神経系内では、Ｎｏｔｃｈホモログの発現パターンは、脊髄の心室帯の特定の領域ならびに末梢神経系の構成要素において、重複するが同一ではないパターンで顕著であることが示されている。神経系におけるＮｏｔｃｈ発現は、細胞増殖の領域に限定されているようであり、直近に分化した細胞の近傍集団には存在しない（Ｗｅｉｎｍｓｔｅｒら、１９９１年、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １１３：１９９−２０５頁；Ｒｅａｕｍｅら、１９９２年、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１５４：３７７−３８７頁；Ｗｅｉｎｍａｓｔｅｒら、１９９２年、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １１６：９３１−９４１頁；Ｋｏｐａｎら、１９９３年、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１２１：６３１−６４１頁；Ｌａｒｄｅｌｌｉら、１９９３年、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ．Ｒｅｓ．２０４：３６４−３７２頁；Ｌａｒｄｅｌｌｉら、１９９４年、Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ．４６：１２３−１３６頁；Ｈｅｎｒｙｑｕｅら、１９９５年、Ｎａｔｕｒｅ  ３７５：７８７−７９０頁；Ｈｏｒｖｉｔｚら、１９９１年、Ｎａｔｕｒｅ  ３５１：５３５−５４１頁）。ラットＮｏｔｃｈリガンドはまた、Ｎｏｔｃｈ遺伝子の発現ドメインと重複する心室帯の別個のバンドにおいて、発生中の脊髄内で発現される。このリガンドの時空間的発現パターンは、脊髄ニューロン運命にコミットしている細胞のパターンとよく相関し、これは、ニューロン運命のための細胞集団のマーカーとしてのＮｏｔｃｈの有用性を実証する（Ｈｅｎｒｉｑｕｅら、１９９５年、Ｎａｔｕｒｅ  ３７５：７８７−７９０頁）。これはまた、その発現ドメインもＮｏｔｃｈ−１のものと重複する脊椎動物のＤｅｌｔａホモログについて示唆されている（Ｌａｒｓｓｏｎら、１９９４年、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ２４：２５３−２５８頁；Ｆｏｒｔｉｎｉら、１９９３年、Ｎａｔｕｒｅ  ３６５：５５５−５５７頁；Ｓｉｍｓｋｅら、１９９５年、Ｎａｔｕｒｅ  ３７５：１４２−１４５頁）。アフリカツメガエルおよびニワトリホモログの場合、Ｄｅｌｔａは、実際には側方仕様モデルから予想されるように、Ｎｏｔｃｈ−１発現ドメイン内の散在細胞においてのみ発現され、これらのパターンは将来のニューロン分化パターンを「予見する」（Ｌａｒｓｓｏｎら、１９９４年、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ２４：２５３−２５８頁；Ｆｏｒｔｉｎｉら、１９９３年、Ｎａｔｕｒｅ  ３６５：５５５−５５７頁）。
【００２４】
特に興味のある他の脊椎動物の研究は、網膜、毛包および歯の芽を含む感覚構造の発生におけるＮｏｔｃｈホモログの発現に焦点をあてている。アフリカツメガエル網膜の場合、Ｎｏｔｃｈ−１は中心辺縁帯および中心網膜の未分化細胞において発現する（Ｃｏｆｆｍａｎら、１９９０年、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１４３９−１４４１頁；Ｍａｎｇｏら、１９９１年、Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：８１１−８１５頁）。ラットにおける研究はまた、発生中の網膜における分化細胞とＮｏｔｃｈ−１の会合を示し、Ｎｏｔｃｈ−１がこの組織において連続的な細胞運命選択に役割を果たすことを示唆していると解釈されている（Ｌｙｍａｎら、１９９３年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：１０３９５−１０３９９頁）。
【００２５】
毛包の再生中のマトリックス細胞におけるマウスＮｏｔｃｈ−１発現の詳細な分析を行って、上皮／間葉誘導相互作用におけるＮｏｔｃｈタンパク質の潜在的な関与を調べた（Ｆｒａｎｃｏ  ｄｅｌ  Ａｍｏら、１９９２年、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １１５：７３７−７４４頁）。このような役割は、元々、ラットのひげおよび歯の芽における発現に基づいてＮｏｔｃｈ−１について示唆されていた（Ｗｅｉｎｍａｓｔｅｒら、１９９１年、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １１３：１９９−２０５頁）。Ｎｏｔｃｈ−１発現は、代わりに、上皮／間葉相互作用を受けない有糸分裂しない分化細胞のサブセットに限定されることが見出され、Ｎｏｔｃｈ発現と他の所で一致している。
【００２６】
Ｎｏｔｃｈ−１のヒトホモログ（ＴＡＮ−１）は、最初にＴ細胞白血病からクローニングされ、この遺伝子を含む転座を伴い、その後、様々な成体組織に見出されたが、胸腺およびリンパ節において最も多量に見出された（Ｅｌｌｉｓｅｎら、１９９１年、Ｃｅｌｌ  ６６：６４９−６６１頁；Ｚｈｏｎｇら、１９９７年、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２４：１８８７−１８９７頁；Ｖａｒｇｅｓｓｏｎら、１９９８年、Ｍｅｃｈ  Ｄｅｖ．７７：１９７−９頁；Ｌｅｗｉｓら、１９９８年、Ｍｅｃｈ  Ｄｅｖ．７８：１５９−１６３頁；Ｌｉｎｄｓｅｌｌら、１９９６年、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．８：１４−２７頁；Ｈａｓｓｅｒｊｉａｎら、１９９６年、Ｂｌｏｏｄ．８８：９７０−９７６頁）。Ｎｏｔｃｈ／ＴＡＮ−１のホモログは、ヒトＣＤ３４＋造血前駆体（Ｍｉｌｎｅｒら、１９９４年、Ｂｌｏｏｄ  ８３：２０５７−２０６２頁）およびＣＤ３４−骨髄細胞において（Ｍｉｌｎｅｒら、１９９４年、Ｂｌｏｏｄ  ８３：２０５７−２０６２頁；Ｖａｒｎｕｍ−Ｆｉｎｎｅｙら、１９９８年、Ｂｌｏｏｄ  ９１：４０８４−４０９１頁）において発現される。その後の研究は、造血発生中のＮｏｔｃｈ−１およびＮｏｔｃｈ−２タンパク質の広範な発現、ならびに造血間質におけるＮｏｔｃｈリガンドであるＪａｇｇｅｄ−１を実証した（Ｖａｒｎｕｍ−Ｆｉｎｎｅｙら、１９９８年、Ｂｌｏｏｄ  ９１：４０８４−４０９１頁；Ｌｉら、１９９８年、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ８：４３−５５頁）。細胞増殖および分化を受ける組織における脊椎動物のＮｏｔｃｈホモログの優先的発現は、これらの分子が、無脊椎動物においてそうであるように、脊椎動物における細胞運命決定を媒介することに関与していることを示唆する。有糸分裂的に活性である組織におけるこの持続性はまた、Ｎｏｔｃｈが細胞増殖の調節に関与し得ることを示唆する。この見解と一致するのは、Ｎｏｔｃｈ−１の細胞質ドメイン、およびマウスでは、ウイルス誘導性の腫瘍におけるマウス乳癌ウイルスに共通の組込み部位であるＮｏｔｃｈ関連ｉｎｔ−３遺伝子座の発現の脱調節に関連する発癌性表現型である（Ｊｈａｐｐａｎら、１９９２年、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．６：３４５−３５５頁；Ｒｏｂｂｉｎｓら、１９９２年、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２５９４−２５９９頁）。
【００２７】
ヒトＮｏｔｃｈ−１およびヒトＮｏｔｃｈ−２発現のさらなる研究が、正常および新生物の子宮頸部と結腸組織の両方を含む成人組織切片に対して行われている。Ｎｏｔｃｈ−１およびＮｏｔｃｈ−２は、調べられた正常組織の扁平上皮内の細胞集団の分化において重複したパターンで発現しているようであり、前駆細胞の一部を除いて正常な円柱上皮では明らかに発現しない。両方のタンパク質は、比較的良性の扁平上皮化生から、柱状上皮がこれらの腫瘍によって置換された癌性浸潤性腺癌に及ぶ場合に、新生物において発現される（Ｇｒａｙら、１９９９年、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５４：７８５−７９４頁；Ｚａｇｏｕｒａｓら、１９９５年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：６４１４−６４１８頁）。
【００２８】
２．１．４．造血におけるＮｏｔｃｈ機能
ヒトＣＤ３４＋前駆体におけるＮｏｔｃｈ−１  ｍＲＮＡ発現の証拠は、造血におけるＮｏｔｃｈシグナル伝達の役割についての推測をもたらした（Ｍｉｌｎｅｒら、１９９４年、Ｂｌｏｏｄ  ３：２０５７−６２頁）。さらに、これは、Ｎｏｔｃｈ−１および−２タンパク質が造血前駆体に存在し、より多量のＴ細胞、Ｂ細胞および単球に存在すること、および造血間質におけるＪａｇｇｅｄ−１タンパク質の実証によって支持されている（Ｏｈｉｓｈｉら、２０００年、Ｂｌｏｏｄ  ９５：２８４７−２８５４頁；Ｖａｒｎｕｍ−Ｆｉｎｎｅｙら、１９９８年、Ｂｌｏｏｄ  ９１：４０８４−９１頁；Ｌｉら、１９９８年、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ８：４３−５５頁を参照されたい）。
【００２９】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の生理学的役割についての最も明白な証拠は、活性化Ｎｏｔｃｈ−１がＢ細胞成熟を阻害するが、Ｔ細胞成熟を認容することを示すＴ細胞発生の研究からもたらされている（Ｐｕｉら、１９９９年、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １１：２９９−３０８頁）。対照的に、ＨＥＳ−１をノックアウトすることによるＮｏｔｃｈ−１の不活性化またはＮｏｔｃｈ媒介性シグナル伝達の阻害は、Ｔ細胞の発生を阻害したが、Ｂ細胞成熟を認容にした（Ｒａｄｔｋｅら、１９９９年、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １０：４７−５８頁；Ｔｏｍｉｔａら、１９９９年、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１３：１２０３−１０頁）。Ｎｏｔｃｈ−１がＢ細胞およびＴ細胞の発生に及ぼすこれらの相反する効果によって、Ｎｏｔｃｈ−１が共通のリンパ球プロジェニター細胞によって運命決定を制御する可能性が生じる。
【００３０】
トランスジェニックマウスにおける他の研究は、活性化されたＮｏｔｃｈ−１が、ＣＤ４対ＣＤ８表現型ならびにαβ対γΔ細胞運命を仮定した細胞の割合に影響を及ぼすことを示した（Ｒｏｂｅｙら、１９９６年、Ｃｅｌｌ  ８７：４８３−９２頁；Ｗａｓｈｂｕｒｎら、１９９７年、Ｃｅｌｌ  ８８：８３３−４３頁）。これは共通の前駆体による運命決定に影響を及ぼす場合があるが、最近の研究では、これらの影響が、さもなければ死滅する分化中のＴ細胞の生存を可能にするＮｏｔｃｈ−１の抗アポトーシス効果から生じ得ることを示唆している（Ｄｅｆｔｏｓら、１９９８年、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ９：７７７−８６頁；Ｊｅｈｎら、１９９９年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２：６３５−８頁）。
【００３１】
骨髄造血におけるＮｏｔｃｈシグナル伝達の重要な役割を支持する証拠はあまり明確ではない。Ｎｏｔｃｈ−１の過剰発現または不活性化に関するインビボ研究は、Ｔ細胞およびＢ細胞の発生に大きな影響を及ぼすにもかかわらず、成熟骨髄性要素の発生にＮｏｔｃｈ−１シグナル伝達の有意な効果を同定していない（Ｐｕｉら、１９９９年、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １１：２９９−３０８頁；Ｒａｄｔｋｅら、１９９９年、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １０：５４７−５８頁）。しかしながら、インビトロ研究は、骨髄造血における、構成的に活性なＮｏｔｃｈ−１形態の効果を実証している。Ｎｏｔｃｈ−１の活性化形態の構成的過剰発現は、マウス３２Ｄ細胞のＧ−ＣＳＦ誘導された顆粒球分化を阻害した（Ｍｉｌｎｅｒら、１９９６年、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ．９３：１３０１４−９頁）。より最近の研究は、Ｎｏｔｃｈ−１の構成的に活性な細胞内ドメインの過剰発現が、単離されたマウス造血前駆体の分化を阻害し、インビボでの再増殖細胞を含む初期の前駆細胞の産生を増強することを示唆する（Ｍｉｌｎｅｒら、１９９６年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：１３０１４−１３０１９頁；Ｂｉｇａｓら、１９９８年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８：２３２４−２３３３頁）。したがって、成熟骨髄要素のインビボ産生におけるＮｏｔｃｈ−１の同定可能な影響の欠如は、成熟に至っていない前駆体におけるＮｏｔｃｈ活性化の影響を遮蔽し得るサイトカインなどの他の因子により補完されているためにもたらされた可能性がある。
【００３２】
研究はまた、単離された造血前駆細胞の分化が、リガンド誘導されたＮｏｔｃｈシグナル伝達によって阻害され得ることも示している。ヒトＪａｇｇｅｄ−１を発現する３Ｔ３細胞とマウス骨髄前駆細胞（ｌｉｎ−Ｓｃａ−１＋ｃ−ｋｉｔ＋）の共培養は、初期の前駆細胞集団の形成において２から３倍の増加をもたらした（Ｖａｒｎｕｍ−Ｆｉｎｎｅｙら、１９９８年、Ｂｌｏｏｄ  ９１：４０８４−４９９１頁；Ｊｏｎｅｓら、１９９８年、Ｂｌｏｏｄ  ９２：１５０５−１１頁）。ヒトＪａｇｇｅｄ−１の精製された細胞外ドメインで被覆されたビーズによる、選別された前駆体のインキュベーションはまた、前駆細胞の増強された産生をもたらした（Ｖａｒｎｕｍ−Ｆｉｎｎｅｙら、１９９８年、Ｂｌｏｏｄ  ９１：４０８４−９１頁）。
【００３３】
ヒトＣＤ３４＋細胞の研究において、Ｎｏｔｃｈ−１の細胞内ドメインの発現またはＪａｇｇｅｄ−２を過剰発現する細胞への曝露はまた、前駆細胞の増強された産生およびＣＤ３４発現の長期維持をもたらした（Ｃａｒｌｅｓｓｏら、１９９９年、Ｂｌｏｏｄ  ９３：８３８−４８頁）。別の研究において、ＣＤ３４＋細胞におけるＪａｇｇｅｄ−１発現細胞の効果は、培養物中に存在するサイトカインによって影響された；増殖因子が添加されない場合、細胞に結合したＪａｇｇｅｄ−１との相互作用により、非増殖性の未分化状態であるＣＤ３４＋細胞の維持がもたらされたが、一方で、ｃ−ｋｉｔリガンドの添加は、赤芽球コロニー形成細胞の２倍増加をもたらした（Ｗａｌｋｅｒら、１９９９年、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  １７：１６２−７１頁）。
【００３４】
より成熟した骨髄系要素の研究は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達が細胞運命決定の制御において潜在的な役割を示している。これらの研究において、固定化された切断型Ｄｅｌｔａ−１は、マクロファージへのＣＤ１４＋単球の分化を阻害し、特異的サイトカインの存在下でアポトーシスを誘導した（Ｏｈｉｓｈｉら、２０００年、Ｂｌｏｏｄ  ９５：２８４７−２８５４頁）。さらに、リガンド誘導によるＮｏｔｃｈシグナリングは、適切なサイトカイン刺激の状況において、樹状細胞への単球の分化を許容する。したがって、他の発生系において観察されるように、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達は、特定の経路に沿った分化を阻害するようであり、細胞が未分化のままとなり得て、または未分化のデフォルト経路に沿って分化され得る。
【００３５】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達は、多数の発生系における細胞運命決定において中心的な役割を果たすことが示されている。進化的に保存されたＮｏｔｃｈ膜貫通受容体は、分化、増殖およびアポトーシス事象において役割を果たすことが知られている。一般的に、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達は、特定の経路に沿った分化を阻害し、特定の環境的合図に応答して、細胞が未分化のままであり得て、または代替の経路に沿って分化し得る。Ｎｏｔｃｈシグナリングは、受容体リガンド相互作用後に誘導され、タンパク質分解性の切断を生じさせ、核に輸送され、転写調節因子であるＲＢＰ−Ｊκを含む多数の下流標的と相互作用する活性な細胞内ドメインを放出する。現在、Ｎｏｔｃｈ遺伝子の４つのパラログが脊椎動物において同定されている（Ｎｏｔｃｈ−１−４）。また、Ｎｏｔｃｈのリガンドも膜貫通タンパク質であり、Ｊａｇｇｅｄ−１および−２、ならびにＤｅｌｔａ−１、−２および−３が含まれる。ヒトＣＤ３４＋前駆体におけるＮｏｔｃｈ−１  ｍＲＮＡの発現の証拠は、造血におけるＮｏｔｃｈシグナル伝達の役割についての推測をもたらしている。さらなる研究により、造血前駆体において、およびより多量にＴ細胞、Ｂ細胞と単球においてＮｏｔｃｈ−１および−２タンパク質を示し、ならびにＪａｇｇｅｄ−１が造血間質において発現することが示されている。Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の生理学的役割に関する最も明白な証拠は、Ｎｏｔｃｈ−１媒介性シグナル伝達がＴ細胞発生に必要であり、ＣＤ４／ＣＤ８およびαβ／γΔ細胞運命決定に影響を及ぼすＴ細胞発生の研究、およびＮｏｔｃｈ−１の構成的な活性形態のＴ細胞がリンパ腫を誘導するというＴ細胞の研究からもたらされている。さらに、構成的に活性なＮｏｔｃｈ−１形態の過剰発現は、Ｂ細胞成熟を阻害し、これは、Ｎｏｔｃｈ−１が共通のリンパ球プロジェニター細胞によって運命決定を制御し得ることを示唆している。骨髄造血におけるＮｏｔｃｈシグナル伝達の重要な役割を支持する証拠はあまり明確ではない。活性化されたＮｏｔｃｈ−１形態の構成的な過剰発現は、３２Ｄ細胞のＧ−ＣＳＦ誘導による顆粒球分化および単離された造血前駆体の分化を阻害する。前駆細胞の分化もまた、リガンド誘導によるＮｏｔｃｈシグナル伝達によって阻害される。ヒトＪａｇｇｅｄ−１を発現する３Ｔ３細胞層とのマウス骨髄前駆細胞（ｓｃａ−１＋  ｌｉｎ−  ｃ−ｋｉｔ＋）の共培養、またはヒトＪａｇｇｅｄ−１の精製された細胞外ドメインで被覆されたビーズにより、選別された前駆体をインキュベートすることは、初期の前駆細胞集団の形成において２−３倍増加をもたらす。ＮｏｔｃｈリガンドであるＤｅｌｔａ−１の、固定された切断形態は、単離された前駆体の分化を阻害し、ｓｃａ−１＋ｌｉｎ−細胞の数の実質的な増加を可能にすることが見出された。
【００３６】
２．２  発生中の細胞分化
ヒトを含む多細胞生物の個体発生を支配する発生プロセスは、シグナル伝達経路間の相互作用に依存し、それは、元の全能性幹細胞から、心臓細胞または神経細胞などの特殊な機能を果たす、末梢分化した成熟細胞への細胞の発生能を徐々に限定する。
【００３７】
受精卵は、他の全ての細胞系が由来する細胞、すなわち最終幹細胞である。発生が進行するにつれて、初期の胚細胞は増殖および分化シグナルに応答し、細胞は発生成熟に達するまで、すなわち最終的に分化するまで、細胞の発生能を徐々に限定する。これらの最終的に分化した細胞は、特殊な機能および特徴を有し、特定の細胞への前駆細胞分化の多段階プロセスにおける最後ステップを表す。
【００３８】
細胞分化における１つのステップから次のステップへの移行は、成熟に達するまで徐々に進行を制御する特定の生化学的作用機序によって支配される。組織および細胞の分化は、最終的に分化した状態に達するまで、特定のステップに従う漸進的な過程であることは明らかである。
【００３９】
生殖胚は、初期の胚細胞塊の形態形成運動であり、３つの異なる生殖細胞層である外胚葉、中胚葉および内胚葉の形成をもたらす。各生殖細胞層の細胞が種々の発生シグナルに応答するにつれて、特異的な分化細胞で構成される特定の器官が生成される。例えば、表皮および神経系は外胚葉由来の細胞から発生し、呼吸器系および消化管は内胚葉由来の細胞から発生し、中胚葉由来の細胞は結合組織、造血系、泌尿生殖器系、筋肉およびほとんどの内臓器官の部分に発生する。
【００４０】
神経堤は、外胚葉に由来し、末梢神経系、色素細胞、副腎髄質および頭部軟骨の特定の領域を含む、異常に大きく複雑な数の分化した細胞型が産生される細胞塊である。
【００４１】
神経堤細胞の多分化能性は十分に確立されている（ＬｅＤｏｕａｒｉｎら、１９７５年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７２：７２８−７３２頁）。単一の神経堤細胞は、いくつかの異なる細胞型に分化することができる。
【００４２】
表皮は、未分化の有糸分裂的に活性な基底細胞から始まり、最終分化した非分裂ケラチノサイトに至る分化系統を規定するいくつかの細胞層からなる。
【００４３】
内胚葉は、成体内の２本の管をつなぐ組織の源である。消化管は、身体の全長にわたって延びている。消化管は、消化管だけでなく、例えば、肝臓、胆嚢および膵臓にも生じる。第二の管である呼吸管は、肺および咽頭の一部を形成する。咽頭は、扁桃、甲状腺、胸腺および副甲状腺を生じさせる。
【００４４】
腸間膜プロセスとも呼ばれている中胚葉の起源は、外胚葉と消化管および呼吸管との間の全ての臓器をカバーする非常に多数の内部組織を生じる。
【００４５】
胚発生は、完全に形成された生物を産生する。各器官の細胞境界を規定する形態学的プロセスは、増殖および分化だけでなく、アポトーシス（プログラム細胞死）も含む。例えば、神経系において、約５０％のニューロンが胚形成中にプログラム細胞死を起こす。
【００４６】
若年者または成人において、正常な生活中または損傷および疾患に対する応答にかかわらず、組織の維持は、特定の発生シグナルに応答することができる前駆細胞からの器官の補充に依存する。
【００４７】
未成熟細胞の分化による成人細胞再生の最もよく知られた例は造血系である。ここでは、発生上未成熟の前駆体（造血幹細胞およびプロジェニター細胞）が分子シグナルに応答して、徐々に様々な血液およびリンパ系細胞型を形成する。
【００４８】
造血発生中に、多分化能性幹細胞の子孫は、増殖能力および自己再生能力を徐々に失い、所与の分化経路に対するより強いコミットメントを示す。種々の造血系統へのこのコミットメントを制御する因子は理解されていないが、確率的過程および可溶性および細胞結合サイトカインとの相互作用を含むと考えられる（Ｆａｉｒｂａｉｒｎら、１９９３年、Ｃｅｌｌ  ４：８２３−３２頁；Ｏｇａｗａ、１９９３年、Ｂｌｏｏｄ  ８１：２８４４−５３頁；Ｍｅｔｃａｌｆ、１９８９年、Ｎａｔｕｒｅ  ３３９：２７−３０頁；Ｍｅｔｃａｌｆ、１９９３年、Ｂｌｏｏｄ  ８２：３５１５−２３頁；Ｇｏｌｄｓｍｉｔｈら、１９９８年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：７００６−１１頁；Ｓｏｃｏｌｏｖｓｋｙら、１９９７年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１４００９−１２頁）。
【００４９】
造血系が最も理解された自己再生する成人の細胞系である一方で、大部分の、おそらく全ての成人器官が、適切な状況下でプロジェニター細胞を保持し、成体組織を補充するように誘発され得ると考えられる。例えば、神経堤細胞の多分化能性は上記に記載されている。成体の腸は、分化した組織を補充する未熟な前駆体を含む。肝臓には、肝臓の未成熟な前駆体が含まれるため、再生能力がある；皮膚はそれ自体を再生させる。腸間膜プロセスを通じて、ほとんどの中胚葉誘導体は、前駆体の分化によって連続的に補充される。このような修復は、胚性系統を再現し、多分化能性プロジェニター細胞を含む分化経路を伴う。
【００５０】
間充織プロジェニター細胞は、特定のシグナルに応答し、特定の系統を採用する多能性細胞である。例えば、骨形態形成因子に応答して、間葉プロジェニター細胞は、骨形成系統を採用する。例えば、損傷に応答して、中胚葉プロジェニター細胞は、適切な部位に移動し、増殖し、局所分化因子に反応して、その結果、明確な分化経路を採用することができる。
【００５１】
限定された組織修復のみが成体で観察される理由は、特異的な分化系統を採用し得るプロジェニター細胞があまりにも少ないためであることが示唆されている。これらの細胞を培養で不死化することによってこれらの細胞を増殖させることができれば、培養細胞の移植によって組織の修復が促進されることは明らかである。しかしながら、二倍体細胞は、一般的に、インビトロでは増殖能力が限られている。最初の培養後、細胞は、集団が有糸分裂のＧ１／Ｓ期またはＧ２／Ｍ期のブロックの結果である増殖停止を受けるまで減速する一連の急速なサイクルを経る（Ｄｅｒｖｅｎｔｚら、１９９６年、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１６：２９０１−２９１０頁）。例えば、限られた数の分裂後、ヒト線維芽細胞は、細胞老化の結果として非複製状態に入る。ある種のウイルスの癌遺伝子が線維芽細胞で発現されると、複製寿命は延長されるが、細胞は依然として「危機」状態と呼ばれる非複製状態に入る（ＷｅｉおよびＳｅｄｉｖｙ、１９９９年、Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ  ２５３：５１９−５２２頁）。増殖停止段階に達する前に細胞が受ける細胞周期の数は、細胞の種類に依存する；ヒト細胞については、その数は、一般的に３０から６０の間である（Ｄｅｒｖｅｎｔｚら、１９９６年、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１６：２９０１−２９１０頁、およびそこに引用されている参考文献）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００５２】
【非特許文献１】Ａｒｔａｖａｎｉｓ−Ｔｓａｋｏｎａｓら、１９９５年、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６８：２２５−２３２頁
【非特許文献２】Ａｒｔｖａｎｉｓ−Ｔｓａｋｏｎａｓら、１９９９年、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８４：７７０−７７６頁
【非特許文献３】Ｗｈａｒｔｏｎら、１９８５年、Ｃｅｌｌ  ４３：５６７−５８１頁
【非特許文献４】Ｃｏｆｆｍａｎら、１９９０年、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１４３８−１４４１頁
【非特許文献５】Ｂｉｅｒｋａｍｐら、１９９３年、Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ．４３：８７−１００頁
【非特許文献６】Ｗｅｉｎｍａｓｔｅｒら、１９９１年、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １１３：１９９−２０５頁
【非特許文献７】Ｅｌｌｉｓｅｎら、１９９１年、Ｃｅｌｌ  ６６：５２３−５３４頁
【非特許文献８】Ｗｅｉｎｍａｓｔｅｒら、１９９２年、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １１６：９３１−９４１頁
【非特許文献９】Ｆｒａｎｃｏ  ｄｅｌ  Ａｍｏら、１９９３年、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １５：２５９−２６４頁
【非特許文献１０】ＬａｒｄｅｌｌｉおよびＬｅｎｄａｈｌ、１９９３年、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ．Ｒｅｓ．２０４：３６４−３７２頁
【非特許文献１１】Ｍｉｌｎｅｒら、１９９４年、Ｂｌｏｏｄ．８３：２０５７−６２頁
【非特許文献１２】Ｌａｒｄｅｌｌｉら、１９９４年、Ｍｅｃｈ  Ｄｅｖ．４６：１２３−１３６頁
【非特許文献１３】Ｕｙｔｔｅｎｄａｅｌｅら、１９９６年、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２２：２２５１−９頁
【非特許文献１４】Ｐａｎｉｎら、１９９７年、Ｎａｔｕｒｅ  ３８７：９０８−９１２頁
【非特許文献１５】Ｋｏｐｃｚｙｎｓｋｉら、１９８８年、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．２：１７２３−１７３５頁
【非特許文献１６】Ｈｅｎｒｉｑｕｅら、１９９５年、Ｎａｔｕｒｅ  ３７５：７８７−７９０頁
【非特許文献１７】Ｃｈｉｔｎｉｓら、１９９５年、Ｎａｔｕｒｅ  ３７５：７６１−７６６頁
【非特許文献１８】Ｆｌｅｍｉｎｇら、１９９０年、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１：２１８８−２２０１頁
【非特許文献１９】Ｌｉｎｄｓｅｌｌら、１９９５年、Ｃｅｌｌ  ８０：９０９−９１７頁
【非特許文献２０】Ｔｈｏｍａｓら、１９９１年、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １１１：７４９−７６１頁
【非特許文献２１】Ｔａｘら、１９９４年、Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：１５０−１５４頁
【非特許文献２２】Ｂｅｔｔｅｎｈａｕｓｅｎら、１９９５年、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２１：２４０７頁−１８頁
【非特許文献２３】Ｂｕｓｓｅａｕら、１９９４年、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １３６：５８５−５９６頁
【非特許文献２４】Ｓｍｏｌｌｅｒら、１９９０年、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．４：１６８８−１７００頁
【非特許文献２５】ＢａｎｇおよびＰｏｓａｋｏｎｙ、１９９２年、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．６：１７５２−１７６９頁
【非特許文献２６】Ｍａｉｅｒら、１９９２年、Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ．３８：１４３−１５６頁
【非特許文献２７】Ｄｅｌｉｄａｋｉｓら、１９９１年、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １２９：８０３−８２３頁
【非特許文献２８】Ｓｃｈｒｏｎｓら、１９９２年、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １３２：４８１−５０３頁
【非特許文献２９】Ｆｕｒｕｋａｗａら、１９９１年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：２３３３４−２３３４０頁
【非特許文献３０】Ｆｕｒｕｋａｗａら、１９９２年、Ｃｅｌｌ  ６９：１１９１−１１９７頁
【非特許文献３１】ＳｃｈｗｅｉｓｇｕｔｈおよびＰｏｓａｋｏｎｙ、１９９２年、Ｃｅｌｌ  ６９：１１９９−１２１２頁
【非特許文献３２】ＩｒｖｉｎｅおよびＷｉｅｓｃｈａｕｓ、１９９４年、Ｃｅｌｌ  ７９：５９５−６０６頁
【非特許文献３３】Ｍａｔｓｕｎａｍｉら、１９８９年、Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：９３４−９３７頁
【非特許文献３４】Ｋａｗａｉｃｈｉら、１９９２年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：４０１６−４０２２頁
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【非特許文献４４】Ｌｕｏら、１９９７年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １７：６０５７−６０６７頁
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【非特許文献５２】Ｂｌａｕｍｕｅｌｌｅｒら、１９９７年、Ｃｅｌｌ  ０：２８１−２９１頁
【非特許文献５３】Ｌｏｇｅａｔら、１９９８年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：８１０８−８１１２頁
【非特許文献５４】Ｑｉら、１９９９年、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８３：９１−９４頁
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【非特許文献６７】Ａｒｔａｖａｎｉｓ−Ｔｓａｋｏｎａｓら、１９９９年、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８４：７７０−７７６頁
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【非特許文献７０】Ａｒｔａｖａｎｉｓ−ＴｓａｋｏｎａｓおよびＳｉｍｐｓｏｎ、１９９１年、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．７：４０３−４０８頁
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【非特許文献７２】Ｃｏｆｆｍａｎら、１９９３年、Ｃｅｌｌ  ７３：６５９頁
【非特許文献７３】Ｒｅａｕｍｅら、１９９２年、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１５４：３７７−３８７頁
【非特許文献７４】Ｓｔｉｆａｎｉら、１９９２年、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．２：１１９−１２７頁
【非特許文献７５】Ｋｏｐａｎら、１９９３年、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１２１：６３１−６４１頁
【非特許文献７６】Ｈｏｒｖｉｔｚら、１９９１年、Ｎａｔｕｒｅ  ３５１：５３５−５４１頁
【非特許文献７７】Ｆｒａｎｃｏ  ｄｅｌ  Ａｍｏら、１９９２年、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １１５：７３７−７４４頁
【非特許文献７８】Ｓｉｍｓｋｅら、１９９５年、Ｎａｔｕｒｅ  ３７５：１４２−１４５頁
【非特許文献７９】Ｗｅｉｎｍｓｔｅｒら、１９９１年、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １１３：１９９−２０５頁
【非特許文献８０】Ｌａｒｄｅｌｌｉら、１９９３年、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５４：３７７−３８７頁
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【非特許文献８４】Ｌｙｍａｎら、１９９３年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：１０３９５−１０３９９頁
【非特許文献８５】Ｅｌｌｉｓｅｎら、１９９１年、Ｃｅｌｌ  ６６：６４９−６６１頁
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【非特許文献１０３】Ｊｅｈｎら、１９９９年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２：６３５−８頁
【非特許文献１０４】Ｒａｄｔｋｅら、１９９９年、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １０：５４７−５８頁
【非特許文献１０５】Ｍｉｌｎｅｒら、１９９６年、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ．９３：１３０１４−９頁
【非特許文献１０６】Ｂｉｇａｓら、１９９８年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８：２３２４−２３３３頁
【非特許文献１０７】Ｖａｒｎｕｍ−Ｆｉｎｎｅｙら、１９９８年、Ｂｌｏｏｄ  ９１：４０８４−４０９１頁
【非特許文献１０８】Ｊｏｎｅｓら、１９９８年、Ｂｌｏｏｄ  ９２：１５０５−１１頁
【非特許文献１０９】Ｃａｒｌｅｓｓｏら、１９９９年、Ｂｌｏｏｄ  ９３：８３８−４８頁
【非特許文献１１０】Ｗａｌｋｅｒら、１９９９年、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  １７：１６２−７１頁
【非特許文献１１１】ＬｅＤｏｕａｒｉｎら、１９７５年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７２：７２８−７３２頁
【非特許文献１１２】Ｆａｉｒｂａｉｒｎら、１９９３年、Ｃｅｌｌ  ４：８２３−３２頁
【非特許文献１１３】Ｏｇａｗａ、１９９３年、Ｂｌｏｏｄ  ８１：２８４４−５３頁
【非特許文献１１４】Ｍｅｔｃａｌｆ、１９８９年、Ｎａｔｕｒｅ  ３３９：２７−３０頁
【非特許文献１１５】Ｍｅｔｃａｌｆ、１９９３年、Ｂｌｏｏｄ  ８２：３５１５−２３頁
【非特許文献１１６】Ｇｏｌｄｓｍｉｔｈら、１９９８年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：７００６−１１頁
【非特許文献１１７】Ｓｏｃｏｌｏｖｓｋｙら、１９９７年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１４００９−１２頁
【発明の概要】
【００５３】
したがって、所望のタイプの幹細胞またはプロジェニター細胞などの多分化能性細胞または多能性細胞をエクスビボで不死化するプロセスは、所望の細胞型のより迅速な増殖を生じさせ、傷害または外傷のより迅速な治療を可能にする。さらに、この能力は、多くのヒト疾患を治療する可能性を生じさせ、免疫抑制剤を必要とせずに組織拒絶を回避する可能性がある。
【課題を解決するための手段】
【００５４】
３．本開示の概要
本明細書において、（ａ）（ｉ）Ｎｏｔｃｈ  １アゴニスト、（ｉｉ）Ｎｏｔｃｈ  ２アゴニスト、または（ｉｉｉ）Ｎｏｔｃｈ  １アゴニストとＮｏｔｃｈ  ２アゴニストである１つ以上のアゴニスト、および（ｂ）１つ以上の増殖因子の存在下で、造血前駆細胞を培養し、それにより、増殖した造血前駆細胞集団を産生することを含む、造血前駆細胞を増殖させるための方法を記載し、ここで、Ｎｏｔｃｈ  １アゴニストは、Ｎｏｔｃｈ  １に結合する固定化抗体またはその固定化抗原結合断片であり；Ｎｏｔｃｈ  ２アゴニストは、Ｎｏｔｃｈ  ２に結合する固定化抗体またはその固定化抗原結合断片である。特定の実施形態において、１つ以上のアゴニストは、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路活性化レベルを造血前駆細胞における準最大レベルで維持する量で存在する。
【００５５】
本明細書において、（ａ）（ｉ）Ｎｏｔｃｈ  １アゴニスト、（ｉｉ）Ｎｏｔｃｈ  ２アゴニスト、または（ｉｉｉ）Ｎｏｔｃｈ  １アゴニストとＮｏｔｃｈ  ２アゴニストである１つ以上のアゴニスト、および（ｂ）１つ以上の増殖因子の存在下で、造血前駆細胞を培養し、それにより、増殖した造血前駆細胞集団を産生することを含む、造血前駆細胞を増殖させるための方法を記載し、ここで、Ｎｏｔｃｈ  １アゴニストは、Ｎｏｔｃｈ  １に結合する固定化抗体またはその抗原結合断片であり；Ｎｏｔｃｈ  ２アゴニストは、Ｎｏｔｃｈ  ２に結合する固定化抗体またはその抗原結合断片であり、本方法は、培養ステップの前に、造血前駆細胞によるＮｏｔｃｈ  １発現および／もしくはＮｏｔｃｈ  ２発現を検出または測定する第一のステップをさらに含み、ここで、培養ステップにおいて使用される１つ以上のアゴニストが、第一のステップにおいて、検出または発現されることが示されたＮｏｔｃｈパラログのアゴニストである。
【００５６】
本明細書において、（ａ）（ｉ）Ｎｏｔｃｈ  １アゴニスト、（ｉｉ）Ｎｏｔｃｈ  ２アゴニスト、または（ｉｉｉ）Ｎｏｔｃｈ  １アゴニストとＮｏｔｃｈ  ２アゴニストである１つ以上のアゴニスト、および（ｂ）１つ以上の増殖因子の存在下で、造血前駆細胞を培養し、それにより、増殖した造血前駆細胞集団を産生することを含む、造血前駆細胞を増殖させるための方法を記載し、ここで、Ｎｏｔｃｈ  １アゴニストは、Ｎｏｔｃｈ  １に結合する固定化抗体またはその抗原結合断片であり；Ｎｏｔｃｈ  ２アゴニストは、Ｎｏｔｃｈ  ２に結合する固定化抗体またはその抗原結合断片であり、本方法は、培養ステップ中に造血前駆細胞によるＮｏｔｃｈ  １およびＮｏｔｃｈ  ２の発現を繰り返し検出または測定すること、ならびに直前の検出または測定ステップによって造血前駆細胞により発現されることが示されたＮｏｔｃｈパラログのアゴニストである１つ以上のアゴニストを培養ステップにおいて使用することをさらに含む。
【００５７】
特定の実施形態において、培養することは、（ａ）（ｉ）Ｎｏｔｃｈ  １アゴニスト、（ｉｉ）Ｎｏｔｃｈ  ２アゴニスト、または（ｉｉｉ）Ｎｏｔｃｈ  １アゴニストとＮｏｔｃｈ  ２アゴニスト、および（ｂ）増殖因子の存在下で培養していない造血前駆細胞がそれを過ぎると増殖を停止し分化または死滅する期間である。
【００５８】
具体的な実施形態において、培養することは、Ｎｏｔｃｈ  １アゴニストおよびＮｏｔｃｈ  ２アゴニストの存在下で行われる。具体的な実施形態において、培養することは、Ｎｏｔｃｈ  １アゴニストの存在下で行われる。具体的な実施形態において、培養することは、Ｎｏｔｃｈ  ２アゴニストの存在下で行われる。
【００５９】
特定の実施形態において、造血前駆細胞は、骨髄、臍帯血、胎盤血またはホウォートンゼリーから得られる。特定の実施形態において、造血前駆細胞は、胎児または新生児の血液から得られる。
【００６０】
特定の実施形態において、培養中、Ｎｏｔｃｈ  ２アゴニストのＮｏｔｃｈ  １アゴニストに対する重量比は、１５０：１；１４０：１；１３０：１；１２０：１；１１０：１；１００：１；９０：１；８０：１；７０：１；６０：１；５０：１；４０：１；３０：１；２５：１；２４：１；２３：１；２２：１；２１：１；２０：１；１９：１；１８：１；１７：１；１６：１；１５：１；１４：１；１３：１；１２：１；１１：１；１０：１；９：１；８：１；７：１；６：１；５：１；４：１；３：１；２：１；１．５：１；または１．２５：１である。特定の実施形態において、Ｎｏｔｃｈ  ２アゴニストは０．１μｇ／ｍｌから５０μｇ／ｍｌの濃度である。具体的な実施形態において、Ｎｏｔｃｈ  １アゴニストは０．００５μｇ／ｍｌから３０μｇ／ｍｌの濃度である。具体的な実施形態において、Ｎｏｔｃｈ  ２アゴニストは２０μｇ／ｍｌの濃度である。具体的な実施形態において、Ｎｏｔｃｈ  １アゴニストは２．５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌまたは０．１５μｇ／ｍｌの濃度である。具体的な実施形態において、Ｎｏｔｃｈ  ２アゴニストは１０μｇ／ｍｌの濃度である。具体的な実施形態において、Ｎｏｔｃｈ  １アゴニストは０．０２μｇ／ｍｌの濃度である。
【００６１】
特定の実施形態において、１つ以上の増殖因子は、インターロイキン−３（ＩＬ−３）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）およびＦｌｔ−３リガンドである。具体的な実施形態において、ＩＬ−３は１０ｎｇ／ｍｌの濃度である。具体的な実施形態において、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＴＰＯ、ＳＣＦおよびＦｌｔ−３リガンドのうちの１つ以上は５０ｎｇ／ｍｌの濃度である。
【００６２】
特定の実施形態において、培養することは７−８日間にわたって行われる。特定の実施形態において、培養することは少なくとも５週間にわたって行われる。特定の実施形態において、培養することは少なくとも６週間にわたって行われる。
【００６３】
特定の実施形態において、本明細書において、（ａ）（ｉ）Ｎｏｔｃｈ  １アゴニスト、（ｉｉ）Ｎｏｔｃｈ  ２アゴニスト、または（ｉｉｉ）Ｎｏｔｃｈ  １アゴニストとＮｏｔｃｈ  ２アゴニストである１つ以上のアゴニスト、および（ｂ）１つ以上の増殖因子の存在下で、造血前駆細胞を培養し、それにより、増殖した造血前駆細胞集団を産生することを含む、造血前駆細胞を増殖させるための方法を記載し、ここで、Ｎｏｔｃｈ  １アゴニストは、Ｎｏｔｃｈ  １に結合する固定化抗体またはその抗原結合断片であり；Ｎｏｔｃｈ  ２アゴニストは、Ｎｏｔｃｈ  ２に結合する固定化抗体またはその抗原結合断片であり、本方法は、培養ステップ中に造血前駆細胞によるＮｏｔｃｈ  １およびＮｏｔｃｈ  ２の発現を繰り返し測定すること、ならびに培養期間の最初の２４−７２時間において造血前駆細胞により発現されることが示されたＮｏｔｃｈパラログのアゴニストである１つ以上のアゴニストを培養ステップにおいて使用することをさらに含む。
【００６４】
特定の実施形態において、本明細書において、（ａ）（ｉ）Ｎｏｔｃｈ  １アゴニスト、（ｉｉ）Ｎｏｔｃｈ  ２アゴニスト、または（ｉｉｉ）Ｎｏｔｃｈ  １アゴニストとＮｏｔｃｈ  ２アゴニストである１つ以上のアゴニスト、および（ｂ）１つ以上の増殖因子の存在下で、造血前駆細胞を培養し、それにより、増殖した造血前駆細胞集団を産生することを含む、造血前駆細胞を増殖させるための方法を記載し、ここで、Ｎｏｔｃｈ  １アゴニストは、Ｎｏｔｃｈ  １に結合する固定化抗体またはその抗原結合断片であり；Ｎｏｔｃｈ  ２アゴニストは、Ｎｏｔｃｈ  ２に結合する固定化抗体またはその抗原結合断片であり、本方法は、培養ステップ中に造血前駆細胞によるＮｏｔｃｈ  １およびＮｏｔｃｈ  ２の発現を繰り返し測定すること、ならびに培養期間の最初の２４−７２時間において造血前駆細胞により発現されることが示されたＮｏｔｃｈパラログのアゴニストである１つ以上のアゴニストを培養ステップにおいて使用することをさらに含む。
【００６５】
特定の実施形態において、本明細書において、（ａ）（ｉ）Ｎｏｔｃｈ  １アゴニスト、（ｉｉ）Ｎｏｔｃｈ  ２アゴニスト、または（ｉｉｉ）Ｎｏｔｃｈ  １アゴニストとＮｏｔｃｈ  ２アゴニストである１つ以上のアゴニスト、および（ｂ）１つ以上の増殖因子の存在下で、造血前駆細胞を培養し、それにより、増殖した造血前駆細胞集団を産生することを含む、造血前駆細胞を増殖させるための方法を記載し、ここで、Ｎｏｔｃｈ  １アゴニストは、Ｎｏｔｃｈ  １に結合する固定化抗体またはその抗原結合断片であり；Ｎｏｔｃｈ  ２アゴニストは、Ｎｏｔｃｈ  ２に結合する固定化抗体またはその抗原結合断片であり、本方法は、培養ステップ中に造血前駆細胞によるＮｏｔｃｈ  １およびＮｏｔｃｈ  ２の発現を繰り返し測定すること、ならびに培養期間の最後の２４−７２時間において造血前駆細胞により発現されることが示されたＮｏｔｃｈパラログのアゴニストである１つ以上のアゴニストを培養ステップにおいて使用することをさらに含む。
【００６６】
特定の実施形態において、本明細書において、（ａ）（ｉ）Ｎｏｔｃｈ  １アゴニスト、（ｉｉ）Ｎｏｔｃｈ  ２アゴニスト、または（ｉｉｉ）Ｎｏｔｃｈ  １アゴニストとＮｏｔｃｈ  ２アゴニストである１つ以上のアゴニスト、および（ｂ）１つ以上の増殖因子の存在下で、造血前駆細胞を培養し、それにより、増殖した造血前駆細胞集団を産生することを含む、造血前駆細胞を増殖させるための方法を記載し、ここで、Ｎｏｔｃｈ  １アゴニストは、Ｎｏｔｃｈ  １に結合する固定化抗体またはその抗原結合断片であり；Ｎｏｔｃｈ  ２アゴニストは、Ｎｏｔｃｈ  ２に結合する固定化抗体またはその抗原結合断片であり、本方法は、培養ステップ中に造血前駆細胞によるＮｏｔｃｈ  １およびＮｏｔｃｈ  ２の発現を繰り返し測定すること、ならびに培養期間の最初の３分の１においてに造血前駆細胞により発現されることが示されたＮｏｔｃｈパラログのアゴニストである１つ以上のアゴニストを培養ステップにおいて使用することをさらに含む。
【００６７】
特定の実施形態において、本明細書において、（ａ）（ｉ）Ｎｏｔｃｈ  １アゴニスト、（ｉｉ）Ｎｏｔｃｈ  ２アゴニスト、または（ｉｉｉ）Ｎｏｔｃｈ  １アゴニストとＮｏｔｃｈ  ２アゴニストである１つ以上のアゴニスト、および（ｂ）１つ以上の増殖因子の存在下で、造血前駆細胞を培養し、それにより、増殖した造血前駆細胞集団を産生することを含む、造血前駆細胞を増殖させるための方法を記載し、ここで、Ｎｏｔｃｈ  １アゴニストは、Ｎｏｔｃｈ  １に結合する固定化抗体またはその抗原結合断片であり；Ｎｏｔｃｈ  ２アゴニストは、Ｎｏｔｃｈ  ２に結合する固定化抗体またはその抗原結合断片であり、本方法は、培養ステップ中に造血前駆細胞によるＮｏｔｃｈ  １およびＮｏｔｃｈ  ２の発現を繰り返し測定すること、ならびに培養期間の中間の３分の１においてに造血前駆細胞により発現されることが示されたＮｏｔｃｈパラログのアゴニストである１つ以上のアゴニストを培養ステップにおいて使用することをさらに含む。
【００６８】
特定の実施形態において、本明細書において、（ａ）（ｉ）Ｎｏｔｃｈ  １アゴニスト、（ｉｉ）Ｎｏｔｃｈ  ２アゴニスト、または（ｉｉｉ）Ｎｏｔｃｈ  １アゴニストとＮｏｔｃｈ  ２アゴニストである１つ以上のアゴニスト、および（ｂ）１つ以上の増殖因子の存在下で、造血前駆細胞を培養し、それにより、増殖した造血前駆細胞集団を産生することを含む、造血前駆細胞を増殖させるための方法を記載し、ここで、Ｎｏｔｃｈ  １アゴニストは、Ｎｏｔｃｈ  １に結合する固定化抗体またはその抗原結合断片であり；Ｎｏｔｃｈ  ２アゴニストは、Ｎｏｔｃｈ  ２に結合する固定化抗体またはその抗原結合断片であり、本方法は、培養ステップ中に造血前駆細胞によるＮｏｔｃｈ  １およびＮｏｔｃｈ  ２の発現を繰り返し測定すること、ならびに培養期間の最後の３分の１においてに造血前駆細胞により発現されることが示されたＮｏｔｃｈパラログのアゴニストである１つ以上のアゴニストを培養ステップにおいて使用することをさらに含む。
【００６９】
特定の実施形態において、本明細書に開示される方法は、ＨＥＳ１発現を評価することによって造血前駆細胞におけるＮｏｔｃｈシグナル伝達経路活性化を測定することをさらに含む。
【００７０】
特定の実施形態において、１つ以上のアゴニストは、各々、モノクローナル抗体である。特定の実施形態において、１つ以上のアゴニストは、各々、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｃまたは一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）である。具体的な実施形態において、Ｎｏｔｃｈ  １に結合する抗体またはその抗原結合断片は、Ｎｏｔｃｈ  １の細胞外ＥＧＦリピートドメインに結合する。より具体的な実施形態において、Ｎｏｔｃｈ  １に結合する抗体またはその抗原結合断片は、Ｎｏｔｃｈ  １のＥＧＦ様リピート１−６に結合する。より具体的な実施形態において、Ｎｏｔｃｈ  ２に結合する抗体またはその抗原結合断片は、Ｎｏｔｃｈ  ２の細胞外ＥＧＦリピートドメインに結合する。特定の実施形態において、１つ以上のアゴニストは、各々、ヒト抗体、ヒト化抗体、合成抗体またはキメラ抗体である。
【００７１】
培養がＮｏｔｃｈ  １アゴニストおよびＮｏｔｃｈ  ２アゴニストの存在下で行われる特定の実施形態において、Ｎｏｔｃｈ  １アゴニストは、第一の固相に固定化される。培養がＮｏｔｃｈ  １アゴニストおよびＮｏｔｃｈ  ２アゴニストの存在下で行われ、Ｎｏｔｃｈ  １アゴニストが第一の固相に固定化される特定の実施形態において、Ｎｏｔｃｈ  ２アゴニストは第二の固相に固定化され、第一の固相に固定化されない。培養がＮｏｔｃｈ  １アゴニストおよびＮｏｔｃｈ  ２アゴニストの存在下で行われ、Ｎｏｔｃｈ  １アゴニストが第一の固相に固定化される特定の実施形態において、Ｎｏｔｃｈ  ２アゴニストは第一の固相に固定化される。具体的な実施形態において、第一の固相は、組織培養ディッシュまたは組織培養フラスコの表面である。より具体的な実施形態において、第一の固相は、組織培養ディッシュまたは組織培養フラスコの表面であり、第二の固相はビーズである。より具体的な実施形態において、第一の固相はビーズであり、第二の固相は組織培養ディッシュまたは組織培養フラスコの表面である。
【００７２】
特定の実施形態において、Ｎｏｔｃｈ  １アゴニストは、Ｎｏｔｃｈ１およびＤｅｌｔａを発現する細胞株においてＮｏｔｃｈ１のシス阻害を克服することができる。特定の実施形態において、Ｎｏｔｃｈ  １アゴニストは、Ｎｏｔｃｈ  ２に結合するよりも高い親和性でＮｏｔｃｈ１に結合する。特定の実施形態において、Ｎｏｔｃｈ  １アゴニストは、実質的にＮｏｔｃｈ  ２への結合を示さない。特定の実施形態において、Ｎｏｔｃｈ  ２アゴニストは、Ｎｏｔｃｈ  １に結合するよりも高い親和性でＮｏｔｃｈ  ２に結合する。特定の実施形態において、Ｎｏｔｃｈ  ２アゴニストは、実質的にＮｏｔｃｈ  １への結合を示さない。
【００７３】
特定の実施形態において、本明細書において、（ａ）（ｉ）Ｎｏｔｃｈ  １アゴニスト、（ｉｉ）Ｎｏｔｃｈ  ２アゴニスト、または（ｉｉｉ）Ｎｏｔｃｈ  １アゴニストとＮｏｔｃｈ  ２アゴニストである１つ以上のアゴニスト、および（ｂ）１つ以上の増殖因子の存在下で、造血前駆細胞を培養し、それにより、増殖した造血前駆細胞集団を産生することを含む、造血前駆細胞を増殖させるための方法を記載し、ここで、Ｎｏｔｃｈ  １アゴニストは、Ｎｏｔｃｈ  １に結合する固定化抗体またはその抗原結合断片であり；Ｎｏｔｃｈ  ２アゴニストは、Ｎｏｔｃｈ  ２に結合する固定化抗体またはその抗原結合断片であり、本方法は、培養ステップ前に造血前駆細胞によるＮｏｔｃｈ  １発現および／またはＮｏｔｃｈ  ２発現を検出または測定する第一のステップをさらに含み、Ｎｏｔｃｈ  １が発現される場合、Ｎｏｔｃｈ  １アゴニストが上記培養ステップにおいて使用される。
【００７４】
特定の実施形態において、本明細書において、（ａ）（ｉ）Ｎｏｔｃｈ  １アゴニスト、（ｉｉ）Ｎｏｔｃｈ  ２アゴニスト、または（ｉｉｉ）Ｎｏｔｃｈ  １アゴニストとＮｏｔｃｈ  ２アゴニストである１つ以上のアゴニスト、および（ｂ）１つ以上の増殖因子の存在下で、造血前駆細胞を培養し、それにより、増殖した造血前駆細胞集団を産生することを含む、造血前駆細胞を増殖させるための方法を記載し、ここで、Ｎｏｔｃｈ  １アゴニストは、Ｎｏｔｃｈ  １に結合する固定化抗体またはその抗原結合断片であり、Ｎｏｔｃｈ  ２アゴニストは、Ｎｏｔｃｈ  ２に結合する固定化抗体またはその抗原結合断片であり、本方法は、培養ステップ前に造血前駆細胞によるＮｏｔｃｈ  １発現および／またはＮｏｔｃｈ  ２発現を検出または測定する第一のステップをさらに含み、Ｎｏｔｃｈ  ２が発現される場合、Ｎｏｔｃｈ  ２アゴニストが上記培養ステップにおいて使用される。
【００７５】
特定の実施形態において、本明細書において、（ａ）（ｉ）Ｎｏｔｃｈ  １アゴニスト、（ｉｉ）Ｎｏｔｃｈ  ２アゴニスト、または（ｉｉｉ）Ｎｏｔｃｈ  １アゴニストとＮｏｔｃｈ  ２アゴニストである１つ以上のアゴニスト、および（ｂ）１つ以上の増殖因子の存在下で、造血前駆細胞を培養し、それにより、増殖した造血前駆細胞集団を産生することを含む、造血前駆細胞を増殖させるための方法を記載し、ここで、Ｎｏｔｃｈ  １アゴニストは、Ｎｏｔｃｈ  １に結合する固定化抗体またはその抗原結合断片であり、Ｎｏｔｃｈ  ２アゴニストは、Ｎｏｔｃｈ  ２に結合する固定化抗体またはその抗原結合断片であり、本方法は、培養ステップ前に造血前駆細胞によるＮｏｔｃｈ  １発現および／またはＮｏｔｃｈ  ２発現を検出または測定する第一のステップをさらに含み、Ｎｏｔｃｈ  １とＮｏｔｃｈ  ２の両方が発現される場合、Ｎｏｔｃｈ  １アゴニストおよびＮｏｔｃｈ  ２アゴニストが上記培養ステップにおいて使用される。
【００７６】
特定の実施形態において、本明細書において、（ａ）（ｉ）Ｎｏｔｃｈ  １アゴニスト、（ｉｉ）Ｎｏｔｃｈ  ２アゴニスト、または（ｉｉｉ）Ｎｏｔｃｈ  １アゴニストとＮｏｔｃｈ  ２アゴニストである１つ以上のアゴニスト、および（ｂ）１つ以上の増殖因子の存在下で、造血前駆細胞を培養し、それにより、増殖した造血前駆細胞集団を産生することを含む、造血前駆細胞を増殖させるための方法を記載し、ここで、Ｎｏｔｃｈ  １アゴニストは、Ｎｏｔｃｈ  １に結合する固定化抗体またはその抗原結合断片であり、Ｎｏｔｃｈ  ２アゴニストは、Ｎｏｔｃｈ  ２に結合する固定化抗体またはその抗原結合断片であり、本方法は、培養ステップ中に造血前駆細胞によるＮｏｔｃｈ  １およびＮｏｔｃｈ  ２発現を繰り返し測定することをさらに含み、上記培養ステップ中に、検出または測定ステップの１回が、造血前駆細胞がＮｏｔｃｈ  ２を実質的に発現しないことを示し、このような回の後、Ｎｏｔｃｈ  ２ではなくＮｏｔｃｈ  １が上記培養に使用される。
【００７７】
具体的な実施形態において、培養は、Ｎｏｔｃｈ  １アゴニストの存在下で行われ、ここで、培養がＮｏｔｃｈ  １アゴニストの存在下で行われる場合、Ｎｏｔｃｈ  ２アゴニストは存在しない。具体的な実施形態において、培養は、Ｎｏｔｃｈ  ２アゴニストの存在下で行われ、ここで、培養がＮｏｔｃｈ  ２アゴニストの存在下で行われる場合、Ｎｏｔｃｈ  １アゴニストは存在しない。
【００７８】
具体的な実施形態において、造血前駆細胞はヒトである。具体的な実施形態において、Ｎｏｔｃｈ  １およびＮｏｔｃｈ  ２は、ヒトＮｏｔｃｈ  １およびヒトＮｏｔｃｈ  ２である。具体的な実施形態において、増殖因子は、ヒト増殖因子である。
【００７９】
具体的な実施形態において、造血前駆細胞は、造血幹細胞である。具体的な実施形態において、造血前駆細胞は、造血幹細胞および造血プロジェニター細胞である。具体的な実施形態において、造血前駆細胞は、造血プロジェニター細胞である。具体的な実施形態において、造血前駆細胞は、短期間の骨髄生着細胞である。具体的な実施形態において、本明細書に記載される方法は、さらに、胸腺に移動して成熟Ｔ細胞を産生することができる初期Ｔ細胞前駆体を産生する。
【００８０】
プラスチック表面にＤｅｌｔａ１の細胞外ドメイン（Ｄｅｌｔａ１ｅｘｔ−ＩｇＧ）を固定化することによって誘導されるＮｏｔｃｈシグナル伝達が、マウス骨髄またはヒト臍帯血から精製された、短期間の再増殖細胞を含む造血プロジェニターのエクスビボ培養後に増加した数の造血プロジェニターを産生することが以前に示されている。この培養系は、臨床環境において臍帯血移植を改善する生成物を生じさせるために使用されているが、固定化されたＤｅｌｔａ１ｅｘｔ−ＩｇＧは、培養されたＨＳＣによって発現されるＮｏｔｃｈ  １とＮｏｔｃｈ  ２受容体の両方を高度に活性化することができ、それにより、幹細胞の自己再生に阻害となり得る分化プログラムもまた含まれる。
【００８１】
本開示は、低いＮｏｔｃｈシグナル強度の維持が、幹細胞の増殖および生着の改善につながることを提供する。Ｎｏｔｃｈシグナル伝達における定性的差異というよりはむしろ定量的差異が示されるため、Ｎｏｔｃｈ  １および／またはＮｏｔｃｈ  ２のいずれかの活性化を用いて、所望レベルのＮｏｔｃｈシグナル伝達を生じさせることができる。さらに、Ｎｏｔｃｈ  １およびＮｏｔｃｈ  ２受容体発現は、培養中に互いに独立して起こるため、異なるＮｏｔｃｈアゴニストは、経時的な発現レベルの変化に基づいて選択することができる。これらの実施形態において、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達は、Ｎｏｔｃｈ  １アゴニスト；Ｎｏｔｃｈ  ２アゴニスト；またはＮｏｔｃｈ  １アゴニストとＮｏｔｃｈ  ２アゴニストの存在に起因し得る。したがって、本明細書に記載されるように、Ｎｏｔｃｈ  １、Ｎｏｔｃｈ  ２。またはＮｏｔｃｈ  １とＮｏｔｃｈ  ２の活性化を介するかどうかにかかわらず、低レベルのＮｏｔｃｈシグナル強度を維持する必要がある。
【００８２】
本開示はまた、（Ｎｏｔｃｈ活性化後の培養中に発現が増加する）Ｎｏｔｃｈ  １の低活性化と共に、低いＮｏｔｃｈシグナル強度（幹細胞におけるＮｏｔｃｈ  ２によって媒介され得る）の維持が幹細胞の増殖および生着の改善をもたらすことを提供する。結果は、選択的パラログ活性化による幹細胞におけるＮｏｔｃｈシグナルの注意深い滴定が有益であることを示唆する。本開示は、Ｎｏｔｃｈ  １またはＮｏｔｃｈ  ２受容体に特異的なモノクローナル抗体がプラスチック表面に固定化された場合、Ｄｅｌｔａ１ｅｘｔ−ＩｇＧ、Ｎｏｔｃｈ  ２アゴニスト単独または対照リガンドを含む培養物の１倍未満の増加と比較して、培養７−８日後、比較的多量のＮｏｔｃｈ  ２アゴニストと組み合わせた低量のＮｏｔｃｈ  １アゴニストを含むウェル中のマウス骨髄高濃縮幹（ＳＫ−ＳＬＡＭ）細胞の培養は、ＳＫ−ＳＬＡＭ細胞（Ｓｃａ−１＋ｃ−ｋｉｔ＋ＣＤ１５０＋ＣＤ４８−ＣＤ１１ｂ−）の２倍の増加をもたらすことを示す。したがって、Ｎｏｔｃｈ  １アゴニスト、Ｎｏｔｃｈ  ２アゴニストまたはＮｏｔｃｈ  １アゴニストおよびＮｏｔｃｈ  ２アゴニストの使用によるＮｏｔｃｈパラログ特異的活性化は、造血幹細胞を含む幹細胞を増殖させる新規な方法を提供する。
【００８３】
１つの特定の実施形態は、Ｎｏｔｃｈ  １アゴニスト、Ｎｏｔｃｈ  ２アゴニスト、またはＮｏｔｃｈ  １アゴニストとＮｏｔｃｈ  ２アゴニスト（および、特定の実施形態において、１つ以上の増殖因子）の非存在下で前駆細胞型の細胞がそれを過ぎると増殖を停止しおよび／または分化もしくは死滅する期間、Ｎｏｔｃｈ  １アゴニスト、Ｎｏｔｃｈ  ２アゴニスト、またはＮｏｔｃｈ  １アゴニストとＮｏｔｃｈ  ２アゴニスト（および、特定の実施形態において、１つ以上の増殖因子）の存在下で、不死化していない前駆細胞を培養し、前駆細胞が上記期間中に増殖するが最終的に分化しないようにし、それにより、不死化した前駆細胞集団を産生する方法を含む。
【００８４】
別の実施形態において、培養中に、Ｎｏｔｃｈ  ２アゴニストは、Ｎｏｔｃｈ  １アゴニストよりも高い濃度で提供される。
【００８５】
別の実施形態において、培養中、Ｎｏｔｃｈ  ２アゴニストのＮｏｔｃｈ  １アゴニストに対する比は、１５０：１；１４０：１；１３０：１；１２０：１；１１０：１；１００：１；９０：１；８０：１；７０：１；６０：１；５０：１；４０：１；３０：１；２５：１；２４：１；２３：１；２２：１；２１：１；２０：１；１９：１；１８：１；１７：１；１６：１；１５：１；１４：１；１３：１；１２：１；１１：１；１０：１；９：１；８：１；７：１；６：１；５：１；４：１；３：１；２：１；１．５：１；または１．２５：１である。好ましい実施形態において、比は重量比である。
【００８６】
別の実施形態において、培養中、Ｎｏｔｃｈ  ２アゴニストは、０．１μｇ／ｍｌ；１μｇ／ｍｌ；５μｇ／ｍｌ；１０μｇ／ｍｌ；１５μｇ／ｍｌ；２０μｇ／ｍｌ；２５μｇ／ｍｌ；３０μｇ／ｍｌ；３５μｇ／ｍｌ；４０μｇ／ｍｌ；４５μｇ／ｍｌ；５０μｇ／ｍｌ；５５μｇ／ｍｌ；６０μｇ／ｍｌ；６５μｇ／ｍｌ；７０μｇ／ｍｌ；７５μｇ／ｍｌ；８０μｇ／ｍｌ；８５μｇ／ｍｌ；９０μｇ／ｍｌ；９５μｇ／ｍｌ；または１００μｇ／ｍｌの濃度である。
【００８７】
別の実施形態において、培養中、Ｎｏｔｃｈ  １アゴニストは、０．００５μｇ／ｍｌ；０．０５μｇ／ｍｌ；０．５μｇ／ｍｌ；１μｇ／ｍｌ；５μｇ／ｍｌ；１０μｇ／ｍｌ；１５μｇ／ｍｌ；２０μｇ／ｍｌ；２５μｇ／ｍｌ；３０μｇ／ｍｌ；３５μｇ／ｍｌ；４０μｇ／ｍｌ；４５μｇ／ｍｌ；５０μｇ／ｍｌ；５５μｇ／ｍｌ；または６０μｇ／ｍｌの濃度である。
【００８８】
別の実施形態において、培養中、Ｎｏｔｃｈ２  アゴニストは、２０μｇ／ｍｌの濃度であり、Ｎｏｔｃｈ  １アゴニストは２．５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌまたは０．１５μｇ／ｍｌの濃度である。
【００８９】
別の実施形態において、培養中、Ｎｏｔｃｈ  ２アゴニストは１０μｇ／ｍｌの濃度であり、Ｎｏｔｃｈ  １アゴニストは０．０２μｇ／ｍｌの濃度である。
【００９０】
別の実施形態において、１つ以上の増殖因子は、ＩＬ−３；ＩＬ−６；ＴＰＯ；ＳＣＦおよびＦｌｔ−３である。
【００９１】
別の実施形態において、培養中、ＩＬ−３は１０ｎｇ／ｍｌの濃度である。別の実施形態において、培養中、ＩＬ−６；ＴＰＯ；ＳＣＦおよびＦｌｔ−３のうちの１つ以上は、５０ｎｇ／ｍｌの濃度である。
【００９２】
別の実施形態において、前駆細胞集団は、期間中に実質的に分化しない。
【００９３】
別の実施形態において、前駆細胞は幹細胞である。別の実施形態において、前駆細胞はプロジェニター細胞である。別の実施形態において、幹細胞は造血幹細胞（ＨＳＣ）である。別の実施形態において、プロジェニター細胞は、造血プロジェニター細胞である。別の実施形態において、造血幹細胞またはプロジェニター細胞は骨髄から得られる。別の実施形態において、造血幹細胞またはプロジェニター細胞は胎児または新生児の血液から得られる。
【００９４】
別の実施形態において、期間は７−８日間である。別の実施形態において、期間は少なくとも５週間である。別の実施形態において、期間は少なくとも６週間である。
【００９５】
４．図面の簡単な説明
【図面の簡単な説明】
【００９６】
【図１】特定のＮｏｔｃｈ抗体を用いた培養は、ＳＫ−ＳＬＡＭ（Ｓｃａ−１＋ｃ−ｋｉｔ＋ＣＤ１５０＋ＣＤ４８−ＣＤ１１ｂ−）細胞の生成の増加をもたらすことを示す図である。各バーは、（ｉ）５μｇ／ｍｌで固定化されたＤｅｌｔａ１ｅｘｔ−ＩｇＧ（Ｄｅｌｔａ）、（ｉｉ）５μｇ／ｍｌで固定化されたヒト対照ＩｇＧ（ＨｕＩｇＧ）、および（ｉｉｉ）Ｎｏｔｃｈ  ２抗体［ＨＭＮ２−３５（ＭＮ２）］または（ｉｖ）Ｎｏｔｃｈ  ２とＮｏｔｃｈ  １抗体［ＨＭＮ１−１２（ＭＮ１）］（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡから市販されている）に対する、指示された用量の固定化されたモノクローナル抗体を含む培地中でのＳＫ−ＳＬＡＭ細胞数増加の平均倍数を表す。ｘ軸のカッコ内の数字は、μｇ／ｍｌで示す。バーは、２つの別個の実験＋／−範囲の培養ウェルに置かれたＳＫ−ＳＬＡＭの初期数と比較した平均増加倍数である。
【図２Ａ】ＩＬ−３（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−６、ＴＰＯ、ＳＣＦおよびＦｌｔ−３リガンド（全て５０ｎｇ／ｍｌ）を含むＳｔｅｍｓｐａｎにおいて、２つの別個のユニットからの臍帯血ＣＤ３４＋細胞を１４日間培養した。細胞は、５μｇ／ｍｌの固定化レトロネクチンと、（ｉ）固定化されたＤｅｌｔａ１（Ｄｅｌｔａ、２．５μｇ／ｍｌ）、（ｉｉ）固定化された抗ヒトＮｏｔｃｈ  ２（αＮｏｔｃｈ２、クローンＭＨＮ２−２５、０．５μｇ／ｍｌ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡから市販されている））、（ｉｉｉ）固定化された抗ヒトＮｏｔｃｈ  １（αＮｏｔｃｈ１、クローンＭＨＮ１−５１９（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡから市販されている））と組み合わせた０．５μｇ／ｍｌの固定化された抗ヒトＮｏｔｃｈ  ２、または（ｉｖ）固定化された対照ＩｇＧ（ＩｇＧ）の存在下で増殖させた。ＣＤ３４＋プロジェニター細胞のパーセントを決定した。ｘ軸上の数字はμｇ／ｍｌで示す。
【図２Ｂ】ＩＬ−３（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−６、ＴＰＯ、ＳＣＦおよびＦｌｔ−３リガンド（全て５０ｎｇ／ｍｌ）を含むＳｔｅｍｓｐａｎにおいて、２つの別個のユニットからの臍帯血ＣＤ３４＋細胞を１４日間培養した。細胞は、５μｇ／ｍｌの固定化レトロネクチンと、（ｉ）固定化されたＤｅｌｔａ１（Ｄｅｌｔａ、２．５μｇ／ｍｌ）、（ｉｉ）固定化された抗ヒトＮｏｔｃｈ  ２（αＮｏｔｃｈ２、クローンＭＨＮ２−２５、０．５μｇ／ｍｌ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡから市販されている））、（ｉｉｉ）固定化された抗ヒトＮｏｔｃｈ  １（αＮｏｔｃｈ１、クローンＭＨＮ１−５１９（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡから市販されている））と組み合わせた０．５μｇ／ｍｌの固定化された抗ヒトＮｏｔｃｈ  ２、または（ｉｖ）固定化された対照ＩｇＧ（ＩｇＧ）の存在下で増殖させた。ＣＤ３４＋プロジェニター細胞の数を決定した。ｘ軸上の数字はμｇ／ｍｌで示す。
【図２Ｃ】ＩＬ−３（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−６、ＴＰＯ、ＳＣＦおよびＦｌｔ−３リガンド（全て５０ｎｇ／ｍｌ）を含むＳｔｅｍｓｐａｎにおいて、２つの別個のユニットからの臍帯血ＣＤ３４＋細胞を１４日間培養した。細胞は、５μｇ／ｍｌの固定化レトロネクチンと、（ｉ）固定化されたＤｅｌｔａ１（Ｄｅｌｔａ、２．５μｇ／ｍｌ）、（ｉｉ）固定化された抗ヒトＮｏｔｃｈ  ２（αＮｏｔｃｈ２、クローンＭＨＮ２−２５、０．５μｇ／ｍｌ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡから市販されている））、（ｉｉｉ）固定化された抗ヒトＮｏｔｃｈ  １（αＮｏｔｃｈ１、クローンＭＨＮ１−５１９（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡから市販されている））と組み合わせた０．５μｇ／ｍｌの固定化された抗ヒトＮｏｔｃｈ  ２、または（ｉｖ）固定化された対照ＩｇＧ（ＩｇＧ）の存在下で増殖させた。より初期のＣＤ３４＋／９０低細胞の比率を決定した。ｘ軸上の数字はμｇ／ｍｌで示す。
【図２Ｄ】ＩＬ−３（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−６、ＴＰＯ、ＳＣＦおよびＦｌｔ−３リガンド（全て５０ｎｇ／ｍｌ）を含むＳｔｅｍｓｐａｎにおいて、２つの別個のユニットからの臍帯血ＣＤ３４＋細胞を１４日間培養した。細胞は、５μｇ／ｍｌの固定化レトロネクチンと、（ｉ）固定化されたＤｅｌｔａ１（Ｄｅｌｔａ、２．５μｇ／ｍｌ）、（ｉｉ）固定化された抗ヒトＮｏｔｃｈ  ２（αＮｏｔｃｈ２、クローンＭＨＮ２−２５、０．５μｇ／ｍｌ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡから市販されている））、（ｉｉｉ）固定化された抗ヒトＮｏｔｃｈ  １（αＮｏｔｃｈ１、クローンＭＨＮ１−５１９（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡから市販されている））と組み合わせた０．５μｇ／ｍｌの固定化された抗ヒトＮｏｔｃｈ  ２、または（ｉｖ）固定化された対照ＩｇＧ（ＩｇＧ）の存在下で増殖させた。より初期のＣＤ３４＋／９０低細胞の数を決定した。ｘ軸上の数字はμｇ／ｍｌで示す。
【図３】図２のように１４日間培養した後、１０，０００個の臍帯血ＣＤ３４＋細胞の増殖させた子孫を１群あたり６匹のＮＳＧマウスの各々に移植した。マウスからの骨髄吸引物を移植の２週間後にフローサイトメトリーによって生着について分析した。Ｎｏｔｃｈ  １抗体（αＮ１、クローンＭＨＮ１−５１９（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡから市販されている））およびＮｏｔｃｈ  ２抗体（αＮ２、クローンＭＨＮ２−２５、０．５μｇ／ｍｌ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡから市販されている））の組み合わせは、２週目の骨髄吸引物中のＣＤ４５＋細胞のパーセント（ｙ軸）で示されるように、Ｄｅｌｔａ、ＩｇＧまたはＮｏｔｃｈ  ２抗体単独（２つの臍帯血ユニットについて、それぞれｐ＝０．００２４およびｐ＝０．０２２５）よりも著しく高いヒト生着レベルを可能にした。ｘ軸上の数字はμｇ／ｍｌで示す。
【図４Ａ】特異的Ｎｏｔｃｈ抗体上のＡＧＭ由来ＣＤ４５＋／ＶＥ−カドヘリン＋細胞の培養は、ＬＳＫ−ＳＬＡＭ細胞および多系列生着の生成に影響を及ぼすことを示す図である。（Ａ）２．５μｇ／ｍｌのＤｅｌｔａ１ｅｘｔ−ＩｇＧ（Ｄｅｌｔａ）、２．５μｇ／ｍｌのＨｕＩｇＧ、およびＮｏｔｃｈ  １抗体（ＭＮ１または抗Ｎ１、クローンＨＭＮ１−１２（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡから市販されている））またはＮｏｔｃｈ  ２抗体（ＭＮ２または抗Ｎ２、クローンＨＭＮ２−３５（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡから市販されている））に対する、指示された用量の固定化されたモノクローナル抗体上で５日間の培養後に生成されたフローサイトメトリー分析によるＬＳＫ−ＳＬＡＭ（Ｓｃａ１＋ｃ−ｋｉｔ＋ＣＤ１５０＋ＣＤ４８−Ｇｒ１−Ｆ４８０−）細胞の数。細胞数は、インプット開始のＣＤ４５＋／ＶＥ−カドヘリン＋細胞のＡＧＭ  １当量あたりで表され、誤差バーは、分析された３つのウェルの標準偏差を表す。
【図４Ｂ】特異的Ｎｏｔｃｈ抗体上のＡＧＭ由来ＣＤ４５＋／ＶＥ−カドヘリン＋細胞の培養は、ＬＳＫ−ＳＬＡＭ細胞および多系列生着の生成に影響を及ぼすことを示す図である。パネルＡにおいて培養され、３×１０４個のレスキューＣＤ４５．１骨髄細胞と共にマウス１匹あたり０．５ＡＧＭ相当の開始細胞（ＣＤ４５．２）で移植した細胞の第２週の末梢血生着。分析された各マウスの末梢血中の全ＣＤ４５＋細胞のパーセンテージとして、ドナー生着％（ＣＤ４５．２）およびドナー骨髄系統生着（Ｇｒ１および／またはＦ４８０）生着が示される。ｘ軸上の数字はμｇ／ｍｌで示す。
【図４Ｃ】特異的Ｎｏｔｃｈ抗体上のＡＧＭ由来ＣＤ４５＋／ＶＥ−カドヘリン＋細胞の培養は、ＬＳＫ−ＳＬＡＭ細胞および多系列生着の生成に影響を及ぼすことを示す図である。パネルＡにおいて培養され、３×１０４個のレスキューＣＤ４５．１骨髄細胞と共にマウス１匹あたり０．５ＡＧＭ相当の開始細胞（ＣＤ４５．２）で移植した細胞の第６週の末梢血生着。分析された各マウスの末梢血中の全ＣＤ４５＋細胞のパーセンテージとして、ドナー生着％（ＣＤ４５．２）およびドナー骨髄系統生着（Ｇｒ１および／またはＦ４８０）生着が示される。ｘ軸上の数字はμｇ／ｍｌで示す。
【図４Ｄ】特異的Ｎｏｔｃｈ抗体上のＡＧＭ由来ＣＤ４５＋／ＶＥ−カドヘリン＋細胞の培養は、ＬＳＫ−ＳＬＡＭ細胞および多系列生着の生成に影響を及ぼすことを示す図である。パネルＡにおいて培養され、３×１０４個のレスキューＣＤ４５．１骨髄細胞と共にマウス１匹あたり０．５ＡＧＭ相当の開始細胞（ＣＤ４５．２）で移植した細胞の第６週の末梢血生着。分析された各マウスの末梢血中の全ＣＤ４５＋細胞のパーセンテージとして、ドナーＢリンパ球（ＣＤ１９）／Ｔリンパ球（ＣＤ３）生着が示される。ｘ軸上の数字はμｇ／ｍｌで示す。
【図５Ａ】ＩＬ−３（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−６、ＴＰＯ、ＳＣＦおよびＦｌｔ−３リガンド（全て５０ｎｇ／ｍｌ）を含むＳｔｅｍｓｐａｎにおいて、２つの別個のユニットからの臍帯血ＣＤ３４＋細胞を１４日間培養した。細胞は、５μｇ／ｍｌの固定化されたレトロネクチンと、（ｉ）固定化されたＤｅｌｔａ１（Ｄｅｌｔａ  ２．５μｇ／ｍｌ）、（ｉｉ）０．５μｇ／ｍｌの固定化された抗ヒトＮｏｔｃｈ  ２（αＮｏｔｃｈ２、クローンＭＨＮ２−２５（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡから市販されている）、（ｉｉｉ）固定化された抗ヒトＮｏｔｃｈ  １（αＮｏｔｃｈ１、クローンＭＨＮ１−５１９（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡから市販されている））を組み合わせた０．５μｇ／ｍｌの固定化された抗ヒトＮｏｔｃｈ  ２、または（ｉｖ）固定化された対照ＩｇＧの存在下で増殖させた。ＣＤ１４＋細胞のパーセンテージが決定された。ｘ軸上の数字はμｇ／ｍｌで示す。
【図５Ｂ】ＩＬ−３（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−６、ＴＰＯ、ＳＣＦおよびＦｌｔ−３リガンド（全て５０ｎｇ／ｍｌ）を含むＳｔｅｍｓｐａｎにおいて、２つの別個のユニットからの臍帯血ＣＤ３４＋細胞を１４日間培養した。細胞は、５μｇ／ｍｌの固定化されたレトロネクチンと、（ｉ）固定化されたＤｅｌｔａ１（Ｄｅｌｔａ  ２．５μｇ／ｍｌ）、（ｉｉ）０．５μｇ／ｍｌの固定化された抗ヒトＮｏｔｃｈ  ２（αＮｏｔｃｈ２、クローンＭＨＮ２−２５（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡから市販されている）、（ｉｉｉ）固定化された抗ヒトＮｏｔｃｈ  １（αＮｏｔｃｈ１、クローンＭＨＮ１−５１９（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡから市販されている））を組み合わせた０．５μｇ／ｍｌの固定化された抗ヒトＮｏｔｃｈ  ２、または（ｉｖ）固定化された対照ＩｇＧの存在下で増殖させた。ＣＤ１４＋細胞の総数が決定された。ｘ軸上の数字はμｇ／ｍｌで示す。
【図５Ｃ】ＩＬ−３（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−６、ＴＰＯ、ＳＣＦおよびＦｌｔ−３リガンド（全て５０ｎｇ／ｍｌ）を含むＳｔｅｍｓｐａｎにおいて、２つの別個のユニットからの臍帯血ＣＤ３４＋細胞を１４日間培養した。細胞は、５μｇ／ｍｌの固定化されたレトロネクチンと、（ｉ）固定化されたＤｅｌｔａ１（Ｄｅｌｔａ  ２．５μｇ／ｍｌ）、（ｉｉ）０．５μｇ／ｍｌの固定化された抗ヒトＮｏｔｃｈ  ２（αＮｏｔｃｈ２、クローンＭＨＮ２−２５（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡから市販されている）、（ｉｉｉ）固定化された抗ヒトＮｏｔｃｈ  １（αＮｏｔｃｈ１、クローンＭＨＮ１−５１９（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡから市販されている））を組み合わせた０．５μｇ／ｍｌの固定化された抗ヒトＮｏｔｃｈ  ２、または（ｉｖ）固定化された対照ＩｇＧの存在下で増殖させた。ＣＤ１５＋細胞のパーセンテージが同様に決定された。ｘ軸上の数字はμｇ／ｍｌで示す。
【図５Ｄ】ＩＬ−３（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−６、ＴＰＯ、ＳＣＦおよびＦｌｔ−３リガンド（全て５０ｎｇ／ｍｌ）を含むＳｔｅｍｓｐａｎにおいて、２つの別個のユニットからの臍帯血ＣＤ３４＋細胞を１４日間培養した。細胞は、５μｇ／ｍｌの固定化されたレトロネクチンと、（ｉ）固定化されたＤｅｌｔａ１（Ｄｅｌｔａ  ２．５μｇ／ｍｌ）、（ｉｉ）０．５μｇ／ｍｌの固定化された抗ヒトＮｏｔｃｈ  ２（αＮｏｔｃｈ２、クローンＭＨＮ２−２５（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡから市販されている）、（ｉｉｉ）固定化された抗ヒトＮｏｔｃｈ  １（αＮｏｔｃｈ１、クローンＭＨＮ１−５１９（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡから市販されている））を組み合わせた０．５μｇ／ｍｌの固定化された抗ヒトＮｏｔｃｈ  ２、または（ｉｖ）固定化された対照ＩｇＧの存在下で増殖させた。ＣＤ１５＋細胞の総数が同様に決定された。ｘ軸上の数字はμｇ／ｍｌで示す。
【図６Ａ】ＩＬ−３（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−６、ＴＰＯ、ＳＣＦおよびＦｌｔ−３リガンド（全て５０ｎｇ／ｍｌ）を含むＳｔｅｍｓｐａｎにおいて、２つの別個のユニットからの臍帯血ＣＤ３４＋細胞を１４日間培養した。細胞は、５μｇ／ｍｌの固定化されたレトロネクチンと、（ｉ）固定化されたＤｅｌｔａ１（Ｄｅｌｔａ  ２．５μｇ／ｍｌ）、（ｉｉ）０．５μｇ／ｍｌの固定化された抗ヒトＮｏｔｃｈ  ２（αＮｏｔｃｈ２、クローンＭＨＮ２−２５（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡから市販されている））、（ｉｉｉ）固定化された抗ヒトＮｏｔｃｈ  １（αＮｏｔｃｈ１、クローンＭＨＮ１−５１９（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡから市販されている））と組み合わせた０．５μｇ／ｍｌの固定化された抗ヒトＮｏｔｃｈ  ２、または（ｉｖ）固定化された対照ＩｇＧ（ＩｇＧ）の存在下で増殖させた。ＣＤ７＋細胞のパーセンテージを決定した。ｘ軸上の数字はμｇ／ｍｌで示す。
【図６Ｂ】ＩＬ−３（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−６、ＴＰＯ、ＳＣＦおよびＦｌｔ−３リガンド（全て５０ｎｇ／ｍｌ）を含むＳｔｅｍｓｐａｎにおいて、２つの別個のユニットからの臍帯血ＣＤ３４＋細胞を１４日間培養した。細胞は、５μｇ／ｍｌの固定化されたレトロネクチンと、（ｉ）固定化されたＤｅｌｔａ１（Ｄｅｌｔａ  ２．５μｇ／ｍｌ）、（ｉｉ）０．５μｇ／ｍｌの固定化された抗ヒトＮｏｔｃｈ  ２（αＮｏｔｃｈ２、クローンＭＨＮ２−２５（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡから市販されている））、（ｉｉｉ）固定化された抗ヒトＮｏｔｃｈ  １（αＮｏｔｃｈ１、クローンＭＨＮ１−５１９（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡから市販されている））と組み合わせた０．５μｇ／ｍｌの固定化された抗ヒトＮｏｔｃｈ  ２、または（ｉｖ）固定化された対照ＩｇＧ（ＩｇＧ）の存在下で増殖させた。ＣＤ７＋細胞の総数を決定した。ｘ軸上の数字はμｇ／ｍｌで示す。
【図７Ａ】ＩＬ−３（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−６、ＴＰＯ、ＳＣＦおよびＦｌｔ−３リガンド（全て５０ｎｇ／ｍｌ）を含むＳｔｅｍｓｐａｎにおいて１４日間、２単位のプール由来の臍帯血ＣＤ３４＋細胞を培養した。細胞は、５μｇ／ｍｌの固定化されたレトロネクチンと、（ｉ）固定化されたＤｅｌｔａ１（Ｄｅｌｔａ  ２．５μｇ／ｍｌ）、（ｉｉ）０．０２μｇ／ｍｌの固定化された抗ヒトＮｏｔｃｈ１（ａＮ１、クローンＭＨＮ１−５１９（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡから市販されている））、（ｉｉｉ）０．０２μｇ／ｍｌの固定化された抗ヒトＮｏｔｃｈ  １と組み合わせた０．５μｇ／ｍｌの固定化された抗ヒトＮｏｔｃｈ  ２（ａＮ２、クローンＭＨＮ２−２５（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡから市販されている））、または（ｉｖ）固定化された対照ＩｇＧの存在下で培養された。１群あたり５匹のＮＳＧマウスの各々に１０，０００細胞の増殖させた子孫を移植した。骨髄吸引物を、移植から２週間後および移植から８週間後または１０週間後、全ヒト（ＣＤ４５）、リンパ球（ＣＤ１９）および骨髄系についてフローサイトメトリーによって分析した。図３にも示される２週間での実施例４０９からのＣＤ４５＋細胞のパーセンテージの結果を示す。ｘ軸上の数字はμｇ／ｍｌで示す。
【図７Ｂ】ＩＬ−３（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−６、ＴＰＯ、ＳＣＦおよびＦｌｔ−３リガンド（全て５０ｎｇ／ｍｌ）を含むＳｔｅｍｓｐａｎにおいて１４日間、２単位のプール由来の臍帯血ＣＤ３４＋細胞を培養した。細胞は、５μｇ／ｍｌの固定化されたレトロネクチンと、（ｉ）固定化されたＤｅｌｔａ１（Ｄｅｌｔａ  ２．５μｇ／ｍｌ）、（ｉｉ）０．０２μｇ／ｍｌの固定化された抗ヒトＮｏｔｃｈ１（ａＮ１、クローンＭＨＮ１−５１９（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡから市販されている））、（ｉｉｉ）０．０２μｇ／ｍｌの固定化された抗ヒトＮｏｔｃｈ  １と組み合わせた０．５μｇ／ｍｌの固定化された抗ヒトＮｏｔｃｈ  ２（ａＮ２、クローンＭＨＮ２−２５（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡから市販されている））、または（ｉｖ）固定化された対照ＩｇＧの存在下で培養された。１群あたり５匹のＮＳＧマウスの各々に１０，０００細胞の増殖させた子孫を移植した。骨髄吸引物を、移植から２週間後および移植から８週間後または１０週間後、全ヒト（ＣＤ４５）、リンパ球（ＣＤ１９）および骨髄系についてフローサイトメトリーによって分析した。比較のための２週間での実施例４１４からのＣＤ４５＋細胞のパーセンテージの結果を示す。ｘ軸上の数字はμｇ／ｍｌで示す。
【図８Ａ】２つの実験（（Ａ）実施例４０９と（Ｂ）実施例４１４）において、ＩＬ−３（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−６、ＴＰＯ、ＳＣＦおよびＦｌｔ−３リガンド（全て５０ｎｇ／ｍｌ）を含むＳｔｅｍｓｐａｎにおいて１４日間、２ユニットのプール由来の臍帯血ＣＤ３４＋細胞を培養した。細胞は、５μｇ／ｍｌの固定化されたレトロネクチンと、（ｉ）固定化されたＤｅｌｔａ１（Ｄｅｌｔａ  ２．５μｇ／ｍｌ）、（ｉｉ）０．０２μｇ／ｍｌの固定化された抗ヒトＮｏｔｃｈ  １（αＮ１、クローンＭＨＮ１−５１９（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡから市販されている））、（ｉｉｉ）０．０２μｇ／ｍｌの固定化された抗ヒトＮｏｔｃｈ  １と組み合わせた０．５μｇ／ｍｌの固定化された抗ヒトＮｏｔｃｈ  ２（αＮ２、クローンＭＨＮ２−２５（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡから市販されている））、または（ｉｖ）固定化された対照ＩｇＧ（ＩｇＧ）の存在下で増殖させた。骨髄吸引物を、移植から２週間後および移植から８週間または１０週間後、全ヒト（ＣＤ４５）、リンパ球（ＣＤ１９）および骨髄系についてフローサイトメトリーによって分析した。１０週間での実施例４０９からのＣＤ４５＋細胞のパーセンテージの結果を示す。ｘ軸上の数字はμｇ／ｍｌで示す。
【図８Ｂ】２つの実験（（Ａ）実施例４０９と（Ｂ）実施例４１４）において、ＩＬ−３（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−６、ＴＰＯ、ＳＣＦおよびＦｌｔ−３リガンド（全て５０ｎｇ／ｍｌ）を含むＳｔｅｍｓｐａｎにおいて１４日間、２ユニットのプール由来の臍帯血ＣＤ３４＋細胞を培養した。細胞は、５μｇ／ｍｌの固定化されたレトロネクチンと、（ｉ）固定化されたＤｅｌｔａ１（Ｄｅｌｔａ  ２．５μｇ／ｍｌ）、（ｉｉ）０．０２μｇ／ｍｌの固定化された抗ヒトＮｏｔｃｈ  １（αＮ１、クローンＭＨＮ１−５１９（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡから市販されている））、（ｉｉｉ）０．０２μｇ／ｍｌの固定化された抗ヒトＮｏｔｃｈ  １と組み合わせた０．５μｇ／ｍｌの固定化された抗ヒトＮｏｔｃｈ  ２（αＮ２、クローンＭＨＮ２−２５（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡから市販されている））、または（ｉｖ）固定化された対照ＩｇＧ（ＩｇＧ）の存在下で増殖させた。骨髄吸引物を、移植から２週間後および移植から８週間または１０週間後、全ヒト（ＣＤ４５）、リンパ球（ＣＤ１９）および骨髄系についてフローサイトメトリーによって分析した。８週間での実施例４１４からのＣＤ４５＋細胞のパーセンテージの結果を示す。ｘ軸上の数字はμｇ／ｍｌで示す。
【図９Ａ】ＩＬ−３（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−６、ＴＰＯ、ＳＣＦおよびＦｌｔ−３リガンド（全て５０ｎｇ／ｍｌ）を含むＳｔｅｍｓｐａｎにおいて１４日間、２単位のプール由来の臍帯血ＣＤ３４＋細胞を培養した。細胞は、５μｇ／ｍｌの固定化されたレトロネクチンと、（ｉ）固定化されたＤｅｌｔａ１（Ｄｅｌｔａ  ２．５μｇ／ｍｌ）、（ｉｉ）０．０２μｇ／ｍｌの固定化された抗ヒトＮｏｔｃｈ１（αＮ１またはαＮ１、クローンＭＨＮ１−５１９（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡから市販されている）、（ｉｉｉ）０．０２μｇ／ｍｌの固定化された抗ヒトＮｏｔｃｈ  １と組み合わせた、０．５μｇ／ｍｌの固定化された抗ヒトＮｏｔｃｈ  ２（αＮ２またはａＮ２、クローンＭＨＮ２−２５（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡから市販されている））、または（ｉｖ）固定化された対照ＩｇＧ（ＩｇＧ）の存在下で増殖させた。骨髄吸引物を、移植から２週間後および移植から８週間後または１０週間後に全ヒト（ＣＤ４５）、リンパ球（ＣＤ１９）および骨髄系についてフローサイトメトリーによって分析した。実施例４０９について１０週間後の骨髄におけるＣＤ３３＋細胞のパーセンテージの結果を示す。ｘ軸上の数字はμｇ／ｍｌで示す。
【図９Ｂ】ＩＬ−３（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−６、ＴＰＯ、ＳＣＦおよびＦｌｔ−３リガンド（全て５０ｎｇ／ｍｌ）を含むＳｔｅｍｓｐａｎにおいて１４日間、２単位のプール由来の臍帯血ＣＤ３４＋細胞を培養した。細胞は、５μｇ／ｍｌの固定化されたレトロネクチンと、（ｉ）固定化されたＤｅｌｔａ１（Ｄｅｌｔａ  ２．５μｇ／ｍｌ）、（ｉｉ）０．０２μｇ／ｍｌの固定化された抗ヒトＮｏｔｃｈ１（αＮ１またはαＮ１、クローンＭＨＮ１−５１９（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡから市販されている）、（ｉｉｉ）０．０２μｇ／ｍｌの固定化された抗ヒトＮｏｔｃｈ  １と組み合わせた、０．５μｇ／ｍｌの固定化された抗ヒトＮｏｔｃｈ  ２（αＮ２またはａＮ２、クローンＭＨＮ２−２５（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡから市販されている））、または（ｉｖ）固定化された対照ＩｇＧ（ＩｇＧ）の存在下で増殖させた。骨髄吸引物を、移植から２週間後および移植から８週間後または１０週間後に全ヒト（ＣＤ４５）、リンパ球（ＣＤ１９）および骨髄系についてフローサイトメトリーによって分析した。（Ｂ）実施例４１４について８週間後の骨髄におけるＣＤ３３＋細胞のパーセンテージの結果を示す。ｘ軸上の数字はμｇ／ｍｌで示す。
【図９Ｃ】ＩＬ−３（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−６、ＴＰＯ、ＳＣＦおよびＦｌｔ−３リガンド（全て５０ｎｇ／ｍｌ）を含むＳｔｅｍｓｐａｎにおいて１４日間、２単位のプール由来の臍帯血ＣＤ３４＋細胞を培養した。細胞は、５μｇ／ｍｌの固定化されたレトロネクチンと、（ｉ）固定化されたＤｅｌｔａ１（Ｄｅｌｔａ  ２．５μｇ／ｍｌ）、（ｉｉ）０．０２μｇ／ｍｌの固定化された抗ヒトＮｏｔｃｈ１（αＮ１またはαＮ１、クローンＭＨＮ１−５１９（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡから市販されている）、（ｉｉｉ）０．０２μｇ／ｍｌの固定化された抗ヒトＮｏｔｃｈ  １と組み合わせた、０．５μｇ／ｍｌの固定化された抗ヒトＮｏｔｃｈ  ２（αＮ２またはａＮ２、クローンＭＨＮ２−２５（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡから市販されている））、または（ｉｖ）固定化された対照ＩｇＧ（ＩｇＧ）の存在下で増殖させた。骨髄吸引物を、移植から２週間後および移植から８週間後または１０週間後に全ヒト（ＣＤ４５）、リンパ球（ＣＤ１９）および骨髄系についてフローサイトメトリーによって分析した。実施例４１４について８週間後の骨髄におけるＣＤ３３＋および／またはＣＤ１４＋／ＣＤ１５＋細胞のパーセンテージの結果を示す。ｘ軸上の数字はμｇ／ｍｌで示す。
【図１０Ａ】全Ｎｏｔｃｈ  ２細胞内ドメイン（ＩＣＤ）についてのゲノムコード領域がＮｏｔｃｈ  １遺伝子座（Ｎｏｔｃｈ  １１２／１２）に入れ替えられ、Ｎｏｔｃｈ  １  ＩＣＤがＮｏｔｃｈ  ２遺伝子座（Ｎｏｔｃｈ  ２２１／２１）に入れ替えられた、正常マウス末梢血（ＰＢ）造血系統の表面マーカー発現。ドットプロットは、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８（Ｔ細胞）、ＣＤ１９（Ｂ細胞）、Ｆ４／８０、ＧＲ１（骨髄）について系統抗体で染色した、示されたマウスのＰＢを示し、ＦＡＣＳで分析した。示された結果は、ＣＤ３およびＣＤ１９発現に関する。角の数字は、四分円内の事象の割合を示す。
【図１０Ｂ】全Ｎｏｔｃｈ  ２細胞内ドメイン（ＩＣＤ）についてのゲノムコード領域がＮｏｔｃｈ  １遺伝子座（Ｎｏｔｃｈ  １１２／１２）に入れ替えられ、Ｎｏｔｃｈ  １  ＩＣＤがＮｏｔｃｈ  ２遺伝子座（Ｎｏｔｃｈ  ２２１／２１）に入れ替えられた、正常マウス末梢血（ＰＢ）造血系統の表面マーカー発現。ドットプロットは、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８（Ｔ細胞）、ＣＤ１９（Ｂ細胞）、Ｆ４／８０、ＧＲ１（骨髄）について系統抗体で染色した、示されたマウスのＰＢを示し、ＦＡＣＳで分析した。示された結果は、ＣＤ４およびＣＤ８発現に関する。角の数字は、四分円内の事象の割合を示す。
【図１０Ｃ】全Ｎｏｔｃｈ  ２細胞内ドメイン（ＩＣＤ）についてのゲノムコード領域がＮｏｔｃｈ  １遺伝子座（Ｎｏｔｃｈ  １１２／１２）に入れ替えられ、Ｎｏｔｃｈ  １  ＩＣＤがＮｏｔｃｈ  ２遺伝子座（Ｎｏｔｃｈ  ２２１／２１）に入れ替えられた、正常マウス末梢血（ＰＢ）造血系統の表面マーカー発現。ドットプロットは、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８（Ｔ細胞）、ＣＤ１９（Ｂ細胞）、Ｆ４／８０、ＧＲ１（骨髄）について系統抗体で染色した、示されたマウスのＰＢを示し、ＦＡＣＳで分析した。示された結果は、Ｆ４／８０およびＧＲ１発現に関する。角の数字は、四分円内の事象の割合を示す。
【図１１】新たに単離した臍帯血（ＣＢ）総ＣＤ３４＋またはＣＤ３４＋ＣＤ９０ｌｏの初期のサブセットを、Ｎｏｔｃｈ  １（Ｎ１）およびＮｏｔｃｈ  ２（Ｎ２）の細胞表面発現について分析した図である。ヒストグラムは、アイソタイプ対照（全てのグラフにおいて最も左のピーク）と比較した、Ｎｏｔｃｈ  １またはＮｏｔｃｈ  ２抗体染色（全てのグラフにおいて最も右のピーク）の相対量を示す。
【図１２Ａ】臍帯血ＣＤ３４＋細胞を１４日間、固定化されたＤｅｌｔａ１（Ｄｅｌｔａ、２．５μｇ／ｍｌ）および０．０２μｇ／ｍｌの固定化されたＮｏｔｃｈ  １抗体（Ｎｏｔｃｈ１、クローンＭＨＮ１−５１９（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡから市販されている））の存在下で培養した。１０，０００細胞の増殖した子孫を各ＮＳＧマウスに移植した。骨髄（ＢＭ）吸引物（２−３週間）を、移植後の全ヒト細胞について分析した。ｙ軸は、ＣＤ４５陽性細胞のパーセンテージを示し、ヒト細胞のパーセンテージを示す。
【図１２Ｂ】臍帯血ＣＤ３４＋細胞を１４日間、固定化されたＤｅｌｔａ１（Ｄｅｌｔａ、２．５μｇ／ｍｌ）および（Ｂ）０．５μｇ／ｍｌの固定化されたＮｏｔｃｈ  ２抗体（Ｎｏｔｃｈ２、クローンＭＨＮ２−２５（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡから市販されている））の存在下で培養した。１０，０００細胞の増殖した子孫を各ＮＳＧマウスに移植した。骨髄（ＢＭ）吸引物（２−３週間）を、移植後の全ヒト細胞について分析した。ｙ軸は、ＣＤ４５陽性細胞のパーセンテージを示し、ヒト細胞のパーセンテージを示す。
【図１３】ヒトＮｏｔｃｈ  １の概略図である。ＥＧＦ−Ｎ１と表示された線は、Ｎｏｔｃｈ  １抗体クローンＭＨＮ１−５１９（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡから市販されている）を生成するために使用されるペプチドの相対的位置を表す。ＮＲＲ−Ｎ１と表示された線は、ＮＲＲ−Ｎ１抗体を生成するために使用されるペプチドの相対位置を表す。
【図１４】ＣＢ由来のＣＤ３４＋細胞は、レトロネクチンと、（ｉ）対照（ＩｇＧ）、（ｉｉ）Ｄｅｌｔａ１（Ｄｅｌｔａ）、（ｉｉｉ）Ｎｏｔｃｈ  １抗体クローンＭＨＮ１−５１９（ＥＧＦ−Ｎ１）、（ｉｖ）ＮＲＲ−Ｎ１、（ｖ）Ｎｏｔｃｈ  ２抗体クローンＭＨＮ２−２５（ＥＧＦ−Ｎ２）、または（ｖｉ）ＮＲＲ−Ｎ２を０．１μｇ／ｍｌまたは２．５μｇ／ｍｌで被覆した非組織培養ウェル上で４時間インキュベートした。回収した細胞から単離されたＲＮＡを用いてｃＤＮＡを生成した。対照ＩｇＧと比較して、各培養条件についてＨｅｓ１（ｙ軸、２ΔΔＣｔ）の相対的発現が報告している。ｘ軸上の数字はμｇ／ｍｌで示す。
【図１５Ａ】臍帯血ＣＤ３４＋細胞をソートして、ＣＤ３４＋ＣＤ９０ｌｏおよびＣＤ３４＋ＣＤ９０−サブセットを分離した。等数の細胞を、レトロネクチンと、（ｉ）ヒトＩｇＧ  ２．５μｇ／ｍｌ、（ｉｉ）Ｄｅｌｔａ１  １０μｇ／ｍｌ、（ｉｉｉ）Ｎｏｔｃｈ  １抗体クローンＭＨＮ１−５１９（ＥＧＦ−Ｎ１）  ０．０２μｇ／ｍｌ、または（ｉｖ）Ｎｏｔｃｈ  １抗体クローンＭＨＮ１−５１９、５μｇ／ｍｌで被覆されたウェルに移し、５ＧＦ（ＩＬ−３  １０ｎｇ／ｍｌ、ＩＬ−６、ＳＣＦ、Ｆｌｔ−３Ｌ、ＴＰＯ  全て５０ｎｇ／ｍｌ）とともにＳｔｅｍｓｐａｎにおいて４時間インキュベートした。細胞をＨｅｓ１  ＲＴ−ＰＣＲのために回収した。対照ＩｇＧと比較して、各培養条件についてＨｅｓ１の相対的発現（ｙ軸、２ΔΔＣｔ）が記録される。ｘ軸上の数字はμｇ／ｍｌで示す。
【図１５Ｂ】未分類の臍帯血ＣＤ３４＋細胞の一部を２．５μｇ／ｍｌの固定化されたヒトＩｇＧおよび５μｇ／ｍｌのレトロネクチンとともに１５日間、５ＧＦを含むＳｔｅｍｓｐａｎにおいて培養した。細胞を、レトロネクチンおよび（ｉ）ヒトＩｇＧ  １０μｇ／ｍｌ、（ｉｉ）Ｄｅｌｔａ１  １０μｇ／ｍｌ、または（ｉｉｉ）Ｎｏｔｃｈ  １抗体クローンＭＨＮ１−５１９（ＥＧＦ−Ｎ１）  ５μｇ／ｍｌで被覆した新しいウェルに移し、４時間インキュベートした。細胞をＨｅｓ１  ＲＴ−ＰＣＲのために回収した。対照ＩｇＧと比較した、各培養条件についてＨｅｓ１（ｙ軸、２ΔΔＣｔ）の相対的発現を記録する。
【図１６Ａ】Ｊｕｒｋａｔ細胞は、ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分に融合されたＤｅｌｔａ１の添加の有りまたは無しで、Ｄｅｌｔａ１−ｍｙｃ（２５μｇ／ｍｌ）とともにインキュベートされた（Ｄｅｌｔａ１、小さな破線の曲線；ブロッカーなし、大きな破線の曲線）。Ｄｅｌｔａ１−ｍｙｃは、抗ｍｙｃ抗体９Ｅ１０を用いて検出された。Ｄｅｌｔａ１−ｍｙｃの対照（実線の曲線）は、結合緩衝液のみであった。
【図１６Ｂ】Ｊｕｒｋａｔ細胞は、ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分に融合されたＤｅｌｔａ１の添加の有りまたは無しで、ＰＥコンジュゲートしたＮｏｔｃｈ  １抗体クローンＭＨＮ１−５１９（ＥＧＦ−Ｎ１）（５μｇ／ｍｌ）とともにインキュベートされた（Ｄｅｌｔａ１、小さな破線の曲線；ブロッカーなし、大きな破線の曲線）。Ｄｅｌｔａ１−ｍｙｃは、抗ｍｙｃ抗体９Ｅ１０を用いて検出された。ＭＨＮ１−５１９の対照（実線の曲線、パネルＢ）は、非結合マウスＩｇＧ１であった。
【図１７Ａ】ＣＨＯ  Ｋ１−ＤＬＬ１細胞をＤＬＬ１を誘導するためにドキシサイクリン（１μｇ／ｍｌ）とともに（破線の曲線）または無しに（実線の曲線）一晩インキュベートし、被覆されていない、レトロネクチン（５μｇ／ｍｌ）を含むウェルに移された。２日後、細胞を回収し、ＹＦＰ発現をフローサイトメトリーで評価した。
【図１７Ｂ】ＣＨＯ  Ｋ１−ＤＬＬ１細胞をＤＬＬ１を誘導するためにドキシサイクリン（１μｇ／ｍｌ）とともに（破線の曲線）または無しに（実線の曲線）一晩インキュベートし、固定化されたヒトＩｇＧ（２．５μｇ／ｍｌ）で被覆された、レトロネクチン（５μｇ／ｍｌ）を含むウェルに移された。２日後、細胞を回収し、ＹＦＰ発現をフローサイトメトリーで評価した。
【図１７Ｃ】ＣＨＯ  Ｋ１−ＤＬＬ１細胞をＤＬＬ１を誘導するためにドキシサイクリン（１μｇ／ｍｌ）とともに（破線の曲線）または無しに（実線の曲線）一晩インキュベートし、固定化されたＤｅｌｔａ１  ２．５μｇ／ｍｌで被覆された、レトロネクチン（５μｇ／ｍｌ）を含むウェルに移された。２日後、細胞を回収し、ＹＦＰ発現をフローサイトメトリーで評価した。
【図１７Ｄ】ＣＨＯ  Ｋ１−ＤＬＬ１細胞をＤＬＬ１を誘導するためにドキシサイクリン（１μｇ／ｍｌ）とともに（破線の曲線）または無しに（実線の曲線）一晩インキュベートし、固定化されたＤｅｌｔａ１  １０μｇ／ｍｌで被覆された、レトロネクチン（５μｇ／ｍｌ）を含むウェルに移された。２日後、細胞を回収し、ＹＦＰ発現をフローサイトメトリーで評価した。
【図１７Ｅ】ＣＨＯ  Ｋ１−ＤＬＬ１細胞をＤＬＬ１を誘導するためにドキシサイクリン（１μｇ／ｍｌ）とともに（破線の曲線）または無しに（実線の曲線）一晩インキュベートし、固定化されたＮｏｔｃｈ  １抗体クローンＭＨＮ１−５１９（ＥＧＦ−Ｎ１）  ０．０２μｇ／ｍｌで被覆された、レトロネクチン（５μｇ／ｍｌ）を含むウェルに移された。２日後、細胞を回収し、ＹＦＰ発現をフローサイトメトリーで評価した。
【図１７Ｆ】ＣＨＯ  Ｋ１−ＤＬＬ１細胞をＤＬＬ１を誘導するためにドキシサイクリン（１μｇ／ｍｌ）とともに（破線の曲線）または無しに（実線の曲線）一晩インキュベートし、固定化されたＮｏｔｃｈ  １抗体クローンＭＨＮ１−５１９  ５μｇ／ｍｌで被覆された、レトロネクチン（５μｇ／ｍｌ）を含むウェルに移された。２日後、細胞を回収し、ＹＦＰ発現をフローサイトメトリーで評価した。
【図１８】ＰＥにコンジュゲートしたヒト抗Ｎｏｔｃｈ  １抗体およびＡＰＣにコンジュゲートしたヒト抗Ｎｏｔｃｈ  ２抗体を用いて、新たに単離した臍帯血ＣＤ３４＋細胞ならびに固定化されたＤｅｌｔａ１上で培養した上記細胞上のＮｏｔｃｈ発現を検出した。平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、培養の０日から１４日間の間隔で、（ｉ）ＰＥにコンジュゲートした抗Ｎｏｔｃｈ  １抗体（Ｎ１、正方形）、（ｉｉ）ＡＰＣにコンジュゲートした抗Ｎｏｔｃｈ  ２抗体（Ｎ２、十字）、（ｉｉｉ）対照ＩｇＧ１（Ｇ１、菱形）、または（ｉｖ）対照ＩｇＧ２ａ（２Ａ、三角）について測定された。
【図１９】２つの別個のユニットからの臍帯血ＣＤ３４＋は、５μｇ／ｍｌの固定されたレトロネクチン、および（ｉ）固定化された対照ＩｇＧ、（ｉｉ）固定化されたＤｅｌｔａ１（０．５、２．５または１０μｇ／ｍｌ）、または（ｉｉｉ）固定化された抗ヒトＮｏｔｃｈ１（Ｎｏｔｃｈ１（０．０２、０．１、０．５または２．５μｇ／ｍｌ）、クローンＭＨＮ１−５１９（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡから市販されている））の存在下で増殖させた。共通のリンパ球プロジェニター細胞（ＣＬＰ）、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−／ＣＤ７＋集団をフローサイトメトリーによって評価した。ｙ軸は、７日目のＣＤ３４＋／ＣＤ３８−／ＣＤ７＋細胞の総数を示す。ｘ軸上の数字はμｇ／ｍｌで示す。
【図２０Ａ】２ユニットのプールからの臍帯血ＣＤ３４＋細胞は、５μｇ／ｍｌの固定化されたレトロネクチン、および（ｉ）２．５μｇ／ｍｌの固定化されたＤｅｌｔａ１、（ｉｉ）固定化された対照ＩｇＧ、（ｉｉｉ）０．０２μｇ／ｍｌの固定化された抗ヒトＮｏｔｃｈ  １（ａＮ１、クローンＭＨＮ１−５１９（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡから市販されている））、または（ｉｖ）０．５μｇ／ｍｌの抗ヒトＮｏｔｃｈ  ２（ａＮ２、クローンＭＨＮ２−２５（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡから市販されている））と組み合わせた０．０２μｇ／ｍｌの固定化された抗ヒトＮｏｔｃｈ  １の存在下で増殖させた。培養１４日目に、１０，０００細胞の増殖した子孫を１群あたり５匹のＮＳＧマウスの各々に移植した。１８週後、骨髄を回収し、全ヒト生着（ＣＤ４５パーセント、ｙ軸）をフローサイトメトリーにより評価した。ｘ軸上の数字はμｇ／ｍｌで示す。
【図２０Ｂ】２ユニットのプールからの臍帯血ＣＤ３４＋細胞は、５μｇ／ｍｌの固定化されたレトロネクチン、および（ｉ）２．５μｇ／ｍｌの固定化されたＤｅｌｔａ１、（ｉｉ）固定化された対照ＩｇＧ、（ｉｉｉ）０．０２μｇ／ｍｌの固定化された抗ヒトＮｏｔｃｈ  １（ａＮ１、クローンＭＨＮ１−５１９（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡから市販されている））、または（ｉｖ）０．５μｇ／ｍｌの抗ヒトＮｏｔｃｈ  ２（ａＮ２、クローンＭＨＮ２−２５（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡから市販されている））と組み合わせた０．０２μｇ／ｍｌの固定化された抗ヒトＮｏｔｃｈ  １の存在下で増殖させた。培養１４日目に、１０，０００細胞の増殖した子孫を１群あたり５匹のＮＳＧマウスの各々に移植した。１８週後、骨髄を回収し、ヒトＴ細胞生着（ＣＤ３パーセント、ｙ軸）をフローサイトメトリーにより評価した。ｘ軸上の数字はμｇ／ｍｌで示す。
【００９７】
５．省略形および定義
本明細書で使用するとき、以下の省略形および定義は示された意味を有する。
【００９８】
ＡＴＲＡ：全トランス型レチノイン酸。
【００９９】
ＢＤＮＦ：脳由来神経栄養因子。
【０１００】
ＢＦＵ−Ｅ：バースト形成単位−赤血球。半固体培地中で赤血球の子孫細胞のコロニーを産生することができる造血プロジェニター細胞。
【０１０１】
ＣＦＵまたはＣＦＵ−Ｃ：コロニー形成単位またはコロニー形成単位細胞。半固体培地中で子孫細胞のコロニーを産生することができる細胞。
【０１０２】
ＣＦＵ−Ｅ／Ｍｅｇａ：コロニー形成単位−赤血球、巨核球。半固形培地中の赤血球および巨核球子孫からなるコロニーを産生することができる造血プロジェニター細胞。
【０１０３】
ＣＦＵ−Ｅｏ：コロニー形成単位−好酸球。半固形培地中の好酸球の子孫からなるコロニーを産生することができる造血プロジェニター細胞。
【０１０４】
ＣＦＵ−Ｇ：コロニー形成単位−顆粒球。半固体培地中の顆粒球（または多形核白血球）の子孫からなるコロニーを産生することができる造血プロジェニター細胞。
【０１０５】
ＣＦＵ−ＧＭ：コロニー形成単位−顆粒球、マクロファージ。半固体培地中の顆粒球およびマクロファージの子孫からなるコロニーを産生することができる造血プロジェニター細胞。
【０１０６】
ＣＦＵ−Ｍ：コロニー形成単位−マクロファージ。半固形培地中のマクロファージの子孫からなるコロニーを産生することができる造血プロジェニター細胞。
【０１０７】
ＣＦＵ−Ｍｅｇａ：コロニー形成単位巨核球。半固形培地中の巨核球の子孫からなるコロニーを産生することができる造血プロジェニター細胞。巨核球は血小板の前駆体。
【０１０８】
ＣＦＵ−Ｓ：コロニー形成単位−脾臓。致死的に照射されたマウスに接種すると、脾臓上に巨核球、顆粒球および赤血球前駆体を含むコロニー（結節）を産生することができる、自己複製能を有する多分化能幹細胞。
【０１０９】
ＣＮＴＦ：毛様体神経栄養因子。
【０１１０】
ＥＧＦ：上皮細胞増殖因子。
【０１１１】
ＥＰＯ：エリスロポイエチン。
【０１１２】
ＦＧＦ−１：線維芽細胞増殖因子−１／酸性ＦＧＦ。
【０１１３】
ＦＧＦ−２：線維芽細胞増殖因子−２／塩基性ＦＧＦ。
【０１１４】
ＦＧＦ−７：線維芽細胞増殖因子−７。
【０１１５】
Ｆｌｔ−３Ｌ：ｆｌｔ−３リガンド。
【０１１６】
ＧＤＮＦ：グリア細胞株由来神経栄養因子。
【０１１７】
ＧＭ−ＣＳＦ：顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子。
【０１１８】
ＨＧＦ：肝細胞増殖因子。
【０１１９】
ＨＳＣ：造血幹細胞。ＨＳＣの定義は機能的であり、移植された細胞が骨髄破壊的治療を受けたレシピエントの造血系を再増殖させる能力に基づいている。ＨＳＣは、約０．０１％の骨髄細胞に相当する。それらは自己再生することができ、骨髄を再生し、長期のリンパ球および骨髄造血を生じる能力によってアッセイすることができる（ＤｅｘｔｅｒおよびＡｌｌｅｎ、１９９２年、Ｎａｔｕｒｅ  ３６０：７０９−７１０頁）。
【０１２０】
ＨＳＰＣ：造血幹細胞およびプロジェニター細胞。
【０１２１】
ＨＰＰ−ＣＦＣまたはＨＰＰ−ミックス：未熟骨髄幹細胞である高増殖潜在性コロニー形成細胞。
【０１２２】
ＩＣＤ：細胞内ドメイン。
【０１２３】
ＩＧＦ−１：インスリン様増殖因子−１。
【０１２４】
ＩＬ−３：インターロイキン−３。
【０１２５】
ＩＬ−６：インターロイキン−６。
【０１２６】
ＩＬ−７：インターロイキン−７。
【０１２７】
ＩＬ−１１：インターロイキン−１１。
【０１２８】
ＩＲＥＳ：内部リボソーム進入部位。
【０１２９】
リンパ系幹細胞：リンパ系幹細胞は、自己再生能力が限られており、リンパ系統全体を再生し、半固形培地中の全てのリンパ様細胞型で構成されるコロニーを産生することができる。マウスリンパ系幹細胞は、それらのＣＤ２５の発現によって特徴付けられる。
【０１３０】
骨髄性幹細胞：骨髄系幹細胞は、自己再生能力が限られており、骨髄系統全体を再生し、半固形培地中の全ての骨髄系細胞型で構成されるコロニーを産生することができる。マウス骨髄系幹細胞は、Ｇｒ−１およびＦ４／８０の発現によって同定される。
【０１３１】
ＮＧＦ：神経増殖因子。
【０１３２】
ＮＳＧマウス：ＮＯＤ−ｓｃｉｄ  ＩＬ２Ｒガンマヌルマウス。
【０１３３】
ＰＤＧＦ：血小板由来増殖因子。
【０１３４】
ＲＡＭ：ＮｏｔｃｈのＲＢＰＪκ結合ドメイン。
【０１３５】
ＲＡＲ：レチノイン酸受容体。
【０１３６】
ＳＣＦ：ｃ−ｋｉｔリガンドまたはマスト細胞増殖因子としても知られている幹細胞因子。
【０１３７】
ＴＧＦ−β：形質転換増殖因子−β。
【０１３８】
ＴＰＯ：トロンボポエチン。
【発明を実施するための形態】
【０１３９】
６．詳細な説明
本開示は、（ａ）（ｉ）Ｎｏｔｃｈ  １アゴニスト、（ｉｉ）Ｎｏｔｃｈ  ２アゴニスト、または（ｉｉｉ）Ｎｏｔｃｈ  １アゴニストとＮｏｔｃｈ  ２アゴニストである１つ以上のアゴニスト、および（ｂ）１つ以上の増殖因子の存在下で造血幹細胞を培養し、それにより、増殖された造血幹細胞集団を産生させることを含む、造血幹細胞を増殖させるための方法を提供し、ここで、Ｎｏｔｃｈ  １アゴニストは、Ｎｏｔｃｈ  １に結合する固定化抗体またはその固定化抗原結合断片であり；Ｎｏｔｃｈ  ２アゴニストは、Ｎｏｔｃｈ  ２に結合する固定化抗体またはその固定化抗原結合断片である。前駆細胞を増殖させるための本発明の方法は、エクスビボで実施される。
【０１４０】
本開示は、末梢分化していない細胞の不死化細胞集団を産生するための方法を提供する。本開示の方法によって不死化した細胞は、以降、不死化細胞と称される。特に、本開示は、本開示によらなかったならば老化、および／または細胞死に至る危機を迎えることによって細胞がそれを過ぎると増殖を停止し分化および／または死滅するはずの期間、前駆細胞（末梢分化していない細胞）を培養中で増殖させるための方法を提供する。この方法は、Ｎｏｔｃｈ  １アゴニスト、Ｎｏｔｃｈ  ２アゴニスト、および／またはＮｏｔｃｈ  １アゴニストとＮｏｔｃｈ  ２アゴニストに細胞を曝露することを含む。特定の実施形態において、細胞はまた、増殖を促進するが、前駆細胞の分化を促進しない１つ以上の増殖因子に曝露される。
【０１４１】
本開示はまた、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達における定量的差異が骨髄分化の遅延の主要因であることを提供する。Ｎｏｔｃｈシグナル伝達における定性的差異というよりはむしろ定量的差異が示されるため、Ｎｏｔｃｈ  １および／またはＮｏｔｃｈ  ２のいずれかの活性化を用いて、所望レベルのＮｏｔｃｈシグナル伝達を産生することができる。Ｎｏｔｃｈ  １およびＮｏｔｃｈ  ２受容体の発現は、培養中に互いに独立して起こるため、異なるＮｏｔｃｈアゴニストは、経時的な発現レベルの変化に基づいて選択することができる。さらに、Ｎｏｔｃｈ  １アゴニスト、Ｎｏｔｃｈ  ２アゴニスト、またはＮｏｔｃｈ  １とＮｏｔｃｈ  ２アゴニストの量は、Ｎｏｔｃｈ  １受容体発現およびＮｏｔｃｈ  ２受容体発現に基づいて較正することができる。したがって、これらの実施形態において、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達は、Ｎｏｔｃｈ  １アゴニスト、Ｎｏｔｃｈ  ２アゴニスト、またはＮｏｔｃｈ  １アゴニストとＮｏｔｃｈ  ２アゴニストの存在に起因し得る。
【０１４２】
本明細書に記載されているように、造血幹細胞集団の少なくとも一部の個々の細胞における低レベルのＮｏｔｃｈシグナル強度（例えば、個々の細胞レベルでの亜最大Ｈｅｓ１発現によって測定される）は、Ｎｏｔｃｈ  １、Ｎｏｔｃｈ  ２、またはＮｏｔｃｈ  １とＮｏｔｃｈ  ２の活性化を介してまたは介さないで維持される必要がある。個々の造血幹細胞における低Ｎｏｔｃｈシグナル強度の維持は、本明細書に記載される造血幹細胞を増殖させるための方法を支持する一方で、より高いＮｏｔｃｈシグナル強度の誘導は、リンパ系統への細胞分化、例えば、Ｔｈｙ１＋およびＣＤ２５＋Ｔ細胞内前駆体への細胞分化を誘導する。Ｄａｌｌａｓら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、Ｖｏｌ．２０１、２００５年５月、１３６１−１３６６頁を参照されたい。造血幹細胞集団の全体で、様々な造血幹細胞における低と高Ｎｏｔｃｈシグナル強度の両方を誘導することは、造血幹細胞とこのようなリンパ球前駆体の両方を集団から産生するのに有用であり得る。
【０１４３】
さらに、本開示は、本開示の方法に従って前駆細胞を不死化し、次に、不死化した細胞および／またはその子孫を、前駆細胞の所望の分化細胞型に分化を促進する条件に曝露することを含む、より分化していない型から所望の分化細胞型を産生するための方法を提供する。本開示の方法によって分化された細胞は、以降、分化細胞と称される。
【０１４４】
これらの方法は、枯渇した細胞集団の再増殖または補充、例えば、ヒト免疫不全ウイルスによる感染後の化学療法またはＴ細胞に続く造血細胞の再構成のための細胞を産生するために使用することができる。また、本開示の方法によって不死化した細胞または分化した細胞を、例えば、所望の遺伝子産物を送達させるために組換え体を作製することもできる。
【０１４５】
本開示の特定の実施形態において、不死化細胞は、被験体の身体の適切な領域に戻して移植され、例えば、不死化したＨＳＣを被験体の骨髄に戻して移植される。別の実施形態において、不死化細胞は、本開示の方法に従ってまたは当該技術分野において公知の任意の方法により、Ｎｏｔｃｈ経路の活性化によっておよび／または細胞が増殖する増殖因子の組合せを変更することによって区別される。さらに別の実施形態において、前駆幹細胞は、Ｎｏｔｃｈ  １、Ｎｏｔｃｈ  ２、またはＮｏｔｃｈ  １とＮｏｔｃｈ  ２活性化の組合せ、および適切な増殖因子によって同時に不死化および分化され、次に被験体に戻して移植される。好ましくは、Ｎｏｔｃｈ  １および／またはＮｏｔｃｈ  ２アゴニストは、被験体への移植前に不活性化される。
【０１４６】
本開示はさらに、本明細書に記載される方法によって産生される培養物およびＨＳＣを提供する。
【０１４７】
本開示はさらになお、限定されないが、Ｎｏｔｃｈ  １、Ｎｏｔｃｈ  ２アゴニスト、およびそれらとともにそれらに曝露された前駆細胞を不死化することができる増殖因子を含む、細胞を不死化させる、または不死化および分化させるための試薬を含むキットを提供する。
【０１４８】
６．１  Ｎｏｔｃｈ  １およびＮｏｔｃｈ  ２アゴニスト
本開示の方法は、Ｎｏｔｃｈ  １アゴニスト、Ｎｏｔｃｈ  ２アゴニスト、またはＮｏｔｃｈ  １アゴニストとＮｏｔｃｈ  ２アゴニスト（および特定の実施形態において、１つ以上の増殖因子）の存在下で、所定期間、前駆細胞（末梢分化していない細胞）を不死化することを包含する。Ｎｏｔｃｈ  １および／またはＮｏｔｃｈ  ２アゴニストは、必要に応じてＮｏｔｃｈ  １またはＮｏｔｃｈ  ２に特異的なＮｏｔｃｈ経路機能の活性化を促進する、すなわち引き起こすまたは増加させる薬剤である。本明細書中で使用するとき、「Ｎｏｔｃｈ経路機能」は、限定されないが、ＲＢＰ−ＪκまたはそのＨａｉｒｌｅｓｓのショウジョウバエホモログサプレッサーの核移行を含むＮｏｔｃｈシグナル伝達経路によって媒介される機能；スプリット複合体のエンハンサーのｂＨＬＨ遺伝子、例えば、Ｍａｓｔｅｒｍｉｎｄの活性化；ショウジョウバエ神経芽細胞の分離の阻害；およびＤｅｌｔａ、Ｊａｇｇｅｄ／Ｓｅｒｒａｔｅ、Ｆｒｉｎｇｅ、ＤｅｌｔｅｘまたはＨａｉｒｌｅｓｓのＲＢＰ−Ｊκ／Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ、またはそれらの同族体もしくは類似体へのＮｏｔｃｈの結合を意味する。
【０１４９】
Ｎｏｔｃｈ活性化は、前駆細胞をＮｏｔｃｈ  １アゴニスト、Ｎｏｔｃｈ  ２アゴニスト、またはＮｏｔｃｈ  １アゴニストとＮｏｔｃｈ  ２アゴニストに曝露することによって行われる。Ｎｏｔｃｈ  １のアゴニストおよびＮｏｔｃｈ  ２のアゴニストは、限定されないが、前駆細胞が曝露される細胞単層上で細胞表面分子として組換え的に発現される可溶性分子、または固相上に固定化される分子であり得る。好ましい実施形態において、Ｎｏｔｃｈ  １アゴニストおよび／またはＮｏｔｃｈ  ２アゴニストは、固定化されたＮｏｔｃｈ  １および／またはＮｏｔｃｈ  ２抗体である。別の実施形態において、Ｎｏｔｃｈ  １アゴニストおよび／またはＮｏｔｃｈ  ２アゴニストは、前駆細胞に導入された核酸から組換え的に発現され得る。
【０１５０】
いくつかの実施形態において、第一の固相に固定化されたＮｏｔｃｈ  １アゴニストおよび第二の固相に固定化されたＮｏｔｃｈ  ２アゴニストとともに細胞を培養することによって細胞を増殖させる。ここで、第一の固相と第二の固相は同じものである。
【０１５１】
いくつかの実施形態において、細胞は、第一の固相に固定化されたＮｏｔｃｈ  １アゴニストおよび第二の固相に固定化されたＮｏｔｃｈ  ２アゴニストとともに細胞を培養することによって増殖され、第二の固相は第一の固相ではない。具体的な実施形態において、第一および第二の固相は、限定されないが、培養ディッシュ、培養フラスコ、培養プレート、ビーズ、粒子などを含む、当該技術分野において公知である、いずれのものから選択される、様々なタイプの固相である。具体的な実施形態では、第一の固相は、組織培養ディッシュまたは組織培養フラスコの表面であり、第二の固相は、ビーズ、例えば、磁気マイクロビーズである。他の具体的な実施形態において、第一の固相は、ビーズ、例えば、磁気マイクロビーズであり、第二の固相は、組織培養ディッシュまたは組織培養フラスコの表面である。Ｎｏｔｃｈ  １アゴニストおよびＮｏｔｃｈ  ２アゴニストが異なる固相に固定化される実施形態において、前駆細胞をＮｏｔｃｈ  １アゴニストおよびＮｏｔｃｈ  ２アゴニストと同時にまたは連続して培養することができる。
【０１５２】
本開示のＮｏｔｃｈ  １およびＮｏｔｃｈ  ２アゴニストには、限定されないが、本明細書に記載されるＮｏｔｃｈタンパク質ならびにそれらの類似体および誘導体（断片を含む）、Ｎｏｔｃｈ経路の他の要素であるタンパク質ならびにそれらの類似体および誘導体（断片を含む）、それらに対する抗体およびそれらの結合領域を含むこのような抗体の断片または他の誘導体、タンパク質および誘導体または類似体をコードする核酸；ならびにＮｏｔｃｈ  １またはＮｏｔｃｈ  ２活性が促進されるようにＮｏｔｃｈタンパク質またはＮｏｔｃｈ経路の他のタンパク質に結合する、またはそうでなければそれらと相互作用するトポリズミックタンパク質およびそれらの誘導体および類似体が含まれる。このようなアゴニストには、限定されないが、細胞内ドメインを含むＮｏｔｃｈタンパク質およびそれらの誘導体、上記をコードするＮｏｔｃｈ核酸、およびＮｏｔｃｈ  １またはＮｏｔｃｈ  ２受容体リガンドのＮｏｔｃｈ相互作用ドメイン（例えば、Ｄｅｌｔａ、Ｊａｇｇｅｄ、Ｓｅｒｒａｔｅの細胞外ドメイン）を含むタンパク質が含まれる。他のアゴニストには、限定されないが、ＨａｉｒｌｅｓｓまたはＤｅｌｔｅｘのＲＢＰＪκ／サプレッサーが含まれる。Ｆｒｉｎｇｅは、例えば、Ｄｅｌｔａタンパク質と組み合わせて、Ｎｏｔｃｈ活性を増強するために使用することができる。これらのタンパク質、それらの断片および誘導体は、組換え的に発現および単離され得て、または化学的に合成され得る。Ｎｏｔｃｈ  １アゴニストおよび／またはＮｏｔｃｈ  ２アゴニストが前駆細胞自体で、例えば、組換え核酸を介したＮｏｔｃｈの優性活性型で発現される場合、Ｎｏｔｃｈ  １アゴニストおよび／またはＮｏｔｃｈ  ２アゴニストを発現する細胞の同定は、内部リボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）、およびそれに続く、マーカータンパク質をコードするオープンリーディングフレームを、組換え核酸構築物中のＮｏｔｃｈ  １アゴニストおよび／またはＮｏｔｃｈ  ２アゴニストのオープンリーディングフレームの３’に導入することによって促進することができる。好ましくは、マーカータンパク質は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ；例えば、米国特許第５、４９１、０８４号および同第５、７７７、０７９号を参照されたい）；異なる強度および／または波長の蛍光に修飾されたＧＦＰ（例えば、Ｈｅｉｍ  ａｎｄ  Ｔｓｉｅｎ、１９９６年、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．６：１７８−８２頁に記載される青色ＧＦＰ）またはサンゴ礁で最近発見された黄色もしくは赤橙色エミッター（Ｍａｔｚら、１９９９、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：９６９−９７３頁）などの蛍光タンパク質である。
【０１５３】
別の具体的な実施形態において、Ｎｏｔｃｈ  １アゴニストおよび／またはＮｏｔｃｈ  ２アゴニストは、Ｎｏｔｃｈ  １および／またはＮｏｔｃｈ  ２に作用するタンパク質またはその断片もしくは誘導体を発現する細胞である。細胞は、例えば、分泌され、細胞表面上で発現されるなど前駆細胞に利用可能なように、Ｎｏｔｃｈ  １アゴニストおよび／またはＮｏｔｃｈ  ２アゴニストを発現する。さらに別の特定の実施形態において、Ｎｏｔｃｈ  １アゴニストおよび／またはＮｏｔｃｈ  ２アゴニストは、Ｎｏｔｃｈ  １またはＮｏｔｃｈ  ２に作用するタンパク質またはその断片もしくは誘導体をコードする核酸である；このようなアゴニストは、例えば、以下のセクション４．３に記載される方法に従って使用または送達することができる。
【０１５４】
さらに別の特定の実施形態において、Ｎｏｔｃｈのアゴニストは、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路のメンバーに結合するペプチド模倣体またはペプチド類似体または有機分子である。このようなアゴニストは、当該技術分野で公知のものから選択される結合アッセイによって同定することができる。
【０１５５】
好ましい実施形態において、アゴニストは、Ｎｏｔｃｈタンパク質またはその接着性断片への結合を媒介するＮｏｔｃｈ相互作用遺伝子によってコードされるタンパク質の少なくとも１つの断片からなるタンパク質である。Ｎｏｔｃｈ相互作用遺伝子は、本明細書で使用するとき、遺伝子Ｎｏｔｃｈ、Ｄｅｌｔａ、Ｊａｇｇｅｄ、Ｓｅｒｒａｔｅ、ＲＢＰＪκ、Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｏｆ  ＨａｉｒｌｅｓｓおよびＤｅｌｔｅｘ、ならびに配列相同性または遺伝的相互作用により同定され得るＤｅｌｔａ／Ｓｅｒｒａｔｅ／ＪａｇｇｅｄファミリーまたはＤｅｌｔｅｘファミリーの他のメンバー、ならびにより一般的には、分子相互作用（例えば、インビトロでの結合、または遺伝的相互作用（表現型的に記述され、例えば、ショウジョウバエにおける））によって同定される「Ｎｏｔｃｈカスケード」または遺伝子の「Ｎｏｔｃｈグループ」のメンバーを意味する。上記で引用されるＮｏｔｃｈ結合タンパク質の接着性断片は、米国特許第５、６４８、４６４号；同第５、８４９、８６９号；および同第５、８５６、４４１号に記載されている。
【０１５６】
一実施形態において、Ｎｏｔｃｈ  １アゴニストおよび／またはＮｏｔｃｈ  ２アゴニストは、組換え核酸から発現される。例えば、細胞外のリガンド結合ドメインを欠損している切断された「活性化された」形態のＮｏｔｃｈ受容体の発現は、機能突然変異表現型の獲得をもたらす。好ましくは、Ｎｏｔｃｈ優性活性突然変異体は、発現が増殖および／または分化のために誘導され得るように、前駆細胞によって誘導性プロモーターから発現され、誘導因子は、移植された細胞はそれらの環境信号に応答することができるように、細胞が由来する生物においてインビボで欠損している。別の実施形態において、Ｎｏｔｃｈ  １アゴニストおよび／またはＮｏｔｃｈ  ２アゴニストをコードする核酸は、Ｃｒｅ部位に隣接する。前駆細胞の増殖および／または分化後であるが、被験体への移植前に、核酸を含む子孫細胞は、以下のセクション４．８に記載されるように、Ｌｏｘタンパク質に曝露される。あるいは、ＦＬＰ／ＦＲＴ組換えシステムを用いて、Ｎｏｔｃｈ  １アゴニストおよび／またはＮｏｔｃｈ  ２アゴニストの存在および発現を制御することができる（Ｂｒａｎｄ  ａｎｄ  Ｐｅｒｒｉｍｏｎ、１９９３年、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １１８：４０１−４１５頁）。
【０１５７】
あるいは、別の実施形態において、Ｎｏｔｃｈのアゴニストは、組換え優性のＮｏｔｃｈ活性突然変異体ではない。あるいは、別の実施形態において、Ｎｏｔｃｈ  １アゴニストおよび／またはＮｏｔｃｈ  ２アゴニストへの前駆細胞の曝露は、Ｎｏｔｃｈ  １アゴニストおよび／またはＮｏｔｃｈ  ２アゴニストを細胞表面上で組換え的に発現する他の細胞とのインキュベーションによっては行われない（もっとも、他の実施形態においては、この方法を使用することができる）。
【０１５８】
別の実施形態において、組換え的に発現されたＮｏｔｃｈ  １アゴニストおよび／またはＮｏｔｃｈ  ２アゴニストは、Ｎｏｔｃｈの細胞内ドメインおよび別のリガンド結合表面受容体の細胞外ドメインを含むキメラＮｏｔｃｈタンパク質である。例えば、ＥＧＦ受容体細胞外ドメインおよびＮｏｔｃｈ細胞内ドメインを含むキメラＮｏｔｃｈタンパク質は、前駆細胞において発現される。しかしながら、Ｎｏｔｃｈ経路は、キメラを発現する前駆細胞がＥＧＦ受容体のリガンド、すなわちＥＧＦに曝露されない限り活性ではない。Ｎｏｔｃｈの切断型形態の発現を制御する誘導性プロモーターと同様に、キメラＮｏｔｃｈタンパク質の活性は可逆的である；ＥＧＦが細胞から除去されると、Ｎｏｔｃｈ活性は止まる。ノッチ活性は、リガンドの添加によって再びオンにすることができる。好ましくは、移植された細胞がＮｏｔｃｈ経路の活性によってインビボでＥＧＦに応答しないように、キメラ受容体は、不死化細胞の移植の前に、例えば、誘導因子を除くことによってオフにされる誘導性プロモーターの制御下で発現される。
【０１５９】
さらに他の実施形態において、Ｎｏｔｃｈ  １およびＮｏｔｃｈ  ２活性は、Ｎｏｔｃｈ  １またはＮｏｔｃｈ  ２受容体の細胞外部分へのＮｏｔｃｈ  １アゴニストまたはＮｏｔｃｈ  ２アゴニストの結合によって操作することができる。Ｎｏｔｃｈシグナリング伝達は、Ｎｏｔｃｈの細胞外ドメインと、隣接する細胞に膜結合したそのリガンドまたは固体表面に固定されたそのリガンドとの間の物理的相互作用によって誘発されると考えられる。全長リガンドは、１つの細胞上でのそれらの発現が、Ｎｏｔｃｈ受容体を発現する隣接細胞における経路の活性化を誘発するため、Ｎｏｔｃｈのアゴニストである。組織培養プレートなどの固体表面上に固定化された、タンパク質またはそれらのＮｏｔｃｈ結合部分の細胞外ドメインを含む可溶性切断型ＤｅｌｔａまたはＳｅｒｒａｔｅ分子を、Ｎｏｔｃｈ経路アゴニストとして、使用することができる。このような可溶性タンパク質は、抗体または相互作用タンパク質、例えば、ＤｅｌｔａまたはＳｅｒｒａｔｅが融合タンパク質として発現されるエピトープタグ（例えば、抗体９Ｅ１０によって認識されるｍｙｃエピトープタグ）、またはＤｅｌｔａまたはＳｅｒｒａｔｅが融合タンパク質として発現されるエピトープタグ（例えば、プロテインＡによって結合される免疫グロブリンエピトープタグ）と相互作用するタンパク質、に指向される抗体によって固体表面上に固定化され得る。細胞内ドメインを欠損している可溶性切断型ＤｅｌｔａまたはＳｅｒｒａｔｅ分子は、それらの発現が隣接するＮｏｔｃｈ発現細胞において非自律的な優性ネガティブ表現型を生じるため、経路のアンタゴニストとして作用する。
【０１６０】
別の具体的な実施形態において、Ａｒｔａｖａｎｉｓ−Ｔｓａｋｏｎａｓらの米国特許第５、７８０、３００号に記載されるように、Ｎｏｔｃｈアゴニストには、ＮｏｔｃｈまたはＮｏｔｃｈシグナル伝達経路のメンバー、例えば、Ｎｏｔｃｈプロセシングに必要とされるフリン様コンバターゼ、クズバニアン（Ｋｕｚｂａｎｉａｎ）、Ｎｏｔｃｈ経路上流の活性化に必要とされ、Ｎｏｔｃｈに匹敵すると考えられるメタロプロテアーゼ−ディスインテグリン（ＡＤＡＭ）（ＳｃｈｌｏｎｄｏｒｆｆおよびＢｌｏｂｅｌ、１９９９年、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．１１２：３６０３−３６１７頁）、またはより具体的には、細胞コンパートメント間の移動に必要とされるＧＴＰａｓｅのｒａｂファミリー（Ｒａｂ  ＧＴＰａｓｅに関する概説については、ＯｌｋｋｏｎｅｎおよびＳｔｅｎｍａｒｋ、１９９７年、Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ．１７６：１−８５頁を参照されたい）などの細胞輸送およびプロセシングタンパク質の活性化に必要とされる成熟またはプロセシングステップを媒介する細胞プロセスを促進または活性化する試薬が含まれる。アゴニストは、フリンをコードする核酸、クズバニアンまたはｒａｂタンパク質、またはその断片もしくは誘導体もしくは優性活性突然変異体、またはペプチド模倣体もしくはペプチド類似体、または上記タンパク質に結合し、機能を活性化する有機分子などの、上記のプロセスの１つの活性化を増大させる任意の分子であり得る。ペプチド模倣体またはペプチド類似体または有機分子は、上記のアッセイによって同定することができる。
【０１６１】
Ｎｏｔｃｈ  １アゴニストおよびＮｏｔｃｈ  ２アゴニストは、必要に応じて、Ｎｏｔｃｈ  １またはＮｏｔｃｈ  ２、ならびにそれらの抗原結合断片に対する抗体を含む。
「抗体」には、例えば、全抗体または一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）が含まれる。抗体の抗原結合断片には、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｃ、またはＮｏｔｃｈ  １もしくはＮｏｔｃｈ  ２の細胞外ドメインに特異的に結合する免疫グロブリンの任意の生物学的に有効な断片が含まれる。抗体または抗原結合断片には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、合成抗体、キメラ抗体、二重特異性抗体、ミニボディ、および線状抗体の全てまたは一部が含まれる。特定の実施形態において、Ｎｏｔｃｈ  １アゴニストは、Ｎｏｔｃｈ  １の細胞外ドメインに結合する抗体またはその抗原結合断片である。具体的な実施形態において、Ｎｏｔｃｈ  １アゴニストは、Ｎｏｔｃｈ  １の細胞外ＥＧＦリピートドメインに結合する抗体またはその抗原結合断片である。より具体的な実施形態において、Ｎｏｔｃｈ  １アゴニストは、Ｎｏｔｃｈ  １のＥＧＦリピート１−６に結合する抗体またはその抗原結合断片である。特定の実施形態において、Ｎｏｔｃｈ  ２アゴニストは、Ｎｏｔｃｈ  ２の細胞外ドメインに結合する抗体またはその抗原結合断片である。具体的な実施形態において、Ｎｏｔｃｈ  ２アゴニストは、Ｎｏｔｃｈ  ２の細胞外ＥＧＦリピートドメインに結合する抗体またはその抗原結合断片である。具体的な実施形態において、Ｎｏｔｃｈ  １アゴニストは、抗Ｎｏｔｃｈ−１  ＭＨＮ１−５１９抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡから市販されている）である。具体的な実施形態において、Ｎｏｔｃｈ  ２アゴニストは、抗Ｎｏｔｃｈ−２ＭＨＮ２−２５抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡから市販されている）である。
【０１６２】
実施例に示されるように、Ｎｏｔｃｈ  １に対する抗体は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路活性化を与えるＮｏｔｃｈシス阻害を克服することができ（実施例４）、Ｎｏｔｃｈ  １に対する抗体およびＮｏｔｃｈ  ２に対する抗体は、ＮｏｔｃｈリガンドのＤｅｌｔａで達成されるよりも造血幹細胞のより大きな増殖を与える（実施例３）。
【０１６３】
任意の作用機序に拘束されることを意図するものではないが、Ｎｏｔｃｈ  １またはＮｏｔｃｈ  ２に結合する抗体は、造血幹細胞集団において造血幹細胞を増大するために、ある範囲の濃度にわたって有用であると考えられている。それは、造血幹細胞集団内において、いくつかの個々の造血幹細胞がシス阻害され、一部はシス阻害されないと考えられるためである。比較的高レベルの抗Ｎｏｔｃｈ  １または抗Ｎｏｔｃｈ  ２抗体濃度では、さもなければシス阻害される造血幹細胞が活性化されて、このような細胞における低レベルから中レベルのＮｏｔｃｈシグナル伝達経路活性化を達成し、より多くの造血幹細胞を産生するように増殖させるために活性化されると考えられる。一方、非シス阻害の造血幹細胞は、このような細胞において、高レベルのＮｏｔｃｈシグナル伝達経路活性化を達成し、胸腺に移動して成熟Ｔ細胞を生じさせ得る初期Ｔ細胞前駆体を産生するために活性化される。比較的低レベルの抗Ｎｏｔｃｈ  １または抗Ｎｏｔｃｈ  ２抗体濃度では、シス阻害されていない造血幹細胞は、このような細胞において、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路活性化の低から中レベルを達成し、より多くの造血幹細胞を産生するように増大させるために活性化されると考えられている。場合によっては、造血幹細胞の増殖（すなわち、より多くの造血幹細胞の造血幹細胞の集団からの産生）、ならびに胸腺に移動し、成熟Ｔ細胞を産生し得る初期Ｔ細胞前駆体の産生が望ましく、本発明によって提供される。
【０１６４】
Ｎｏｔｃｈ  １またはＮｏｔｃｈ  ２の細胞外ドメインに特異的に結合する抗体は、当業者に公知であるように（例えば、米国特許第６、２９１、１６１号および同第６、２９１、１５８号を参照されたい）、モノクローナル抗体を得る方法、ファージディスプレイの方法、ヒトまたはヒト化抗体を産生する方法、または抗体を産生するように操作されたトランスジェニック動物もしくは植物を用いる方法を用いて調製することができる。部分的にまたは完全に合成された抗体のファージディスプレイライブラリーが利用可能であり、Ｎｏｔｃｈ  １またはＮｏｔｃｈ  ２の細胞外ドメインに結合することができる抗体またはその断片についてスクリーニングすることができる。例えば、結合ドメインは、Ｎｏｔｃｈ  １またはＮｏｔｃｈ  ２の細胞外ドメインに特異的に結合するＦａｂ断片については、Ｆａｂファージライブラリーをスクリーニングすることによって同定され得る（Ｈｏｅｔら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：３４４、２００５年を参照されたい）。ヒト抗体のファージディスプレイライブラリーも利用可能である。さらに、好都合な系（例えば、マウス、ＨｕＭＡｂマウス（登録商標）、ＴＣマウス（商標）、ＫＭマウス（登録商標）、ラマ、ニワトリ、ラット、ハムスター、ウサギなど）において免疫原として対象とする標的を用いるハイブリドーマ開発のための従来の戦略は、結合ドメインを開発するために使用することができる。特定の実施形態において、抗体は、Ｎｏｔｃｈ  １またはＮｏｔｃｈ  ２の細胞外ドメインに特異的に結合し、非特異的な成分または無関係の標的と交差反応しない。一旦同定されると、抗体をコードするアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列を単離および／または決定することができる。
【０１６５】
最後に、さらに、米国特許第５、７８０、３００号は、本開示の実施においてＮｏｔｃｈ経路を活性化するために用いることができるＮｏｔｃｈアゴニスト分子のクラス（およびそれらの同定方法）、例えば、ＲＢＰ−ＪκによるＮｏｔｃｈアンキリンリピートの解離を誘発する分子であって、それによりＲＢＰ−Ｊκの細胞質から核への移行を促進する分子を開示する。
【０１６６】
特定の実施形態において、Ｎｏｔｃｈ結合タンパク質、例えば、Ｎｏｔｃｈ  １またはＮｏｔｃｈ  ２に結合する抗体がＮｏｔｃｈアゴニストであるかどうかを決定するために、前駆細胞、例えば、造血幹細胞または造血プロジェニター細胞をＮｏｔｃｈ結合タンパク質の存在下で培養し、次に、例えば、ｑ−ＰＣＲなどにより、（Ｎｏｔｃｈアゴニスト活性を有さない対照分子の存在下で培養された前駆細胞と比較して）増加したＨｅｓ１発現レベルついて試験する。ここで、Ｎｏｔｃｈ結合タンパク質の存在下で培養された細胞におけるＨｅｓ１発現レベルは、Ｎｏｔｃｈ結合タンパク質がＮｏｔｃｈアゴニストであることを示す。他の実施形態において、Ｎｏｔｃｈ結合タンパク質、例えば、Ｎｏｔｃｈ  １またはＮｏｔｃｈ  ２に結合する抗体がＮｏｔｃｈアゴニストであるかどうかを決定するために、前駆細胞、例えば、造血幹細胞または造血プロジェニター細胞をＮｏｔｃｈ結合タンパク質の存在下で培養し、次に、ＮＳＧマウス内に注入される。ここで、（Ｎｏｔｃｈアゴニスト活性を有さない対照分子の存在下で培養された前駆細胞と比較して）ＮＳＧマウスにおけるＮｏｔｃｈ結合タンパク質の存在下で培養された細胞の生着の増加は、Ｎｏｔｃｈ結合タンパク質がＮｏｔｃｈアゴニストであることを示す。
【０１６７】
好ましい実施形態において、本明細書において提供される抗Ｎｏｔｃｈ  １抗体は、ヒトＮｏｔｃｈ  １に結合する。好ましい実施形態において、本明細書において提供される抗Ｎｏｔｃｈ  ２抗体は、ヒトＮｏｔｃｈ  ２に結合する。ヒトＮｏｔｃｈ  １のアミノ酸配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｐ４６５３１またはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０６００８７として入手可能である。ヒトＮｏｔｃｈ  ２のアミノ酸配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｑ０４７２１またはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０７７７１９として入手可能である。
【０１６８】
６．２  増殖因子
本開示は、選択された増殖因子の存在下でＮｏｔｃｈ経路を活性化することによって、前駆細胞を不死化し、任意選択的に分化させることを含む方法を提供する。分化ではなく不死化が達成される、本開示の前駆細胞は、分化ではなく増殖を支持する増殖因子の存在下で培養される。増殖因子は、実質的に分化を引き起こさずに、細胞増殖および／または生存を促進するタンパク質またはキメラ化合物などの任意のタイプの分子であり得る。
【０１６９】
概して、本開示は、前駆細胞の分化ではなく増殖を促進する、Ｎｏｔｃｈ  １アゴニスト、Ｎｏｔｃｈ  ２アゴニスト、またはＮｏｔｃｈ  １アゴニストとＮｏｔｃｈ  ２アゴニスト（および、特定の実施形態において、１つ以上の増殖因子）に細胞を曝露させることによって、そうでなければ細胞がそれを過ぎると増殖を停止し分化および／または死滅するはずの期間、前駆細胞（末梢分化していない細胞）を増殖させるための方法を提供する。細胞を１つ以上の増殖因子に曝露させることは、最初に、Ｎｏｔｃｈ  １アゴニスト、Ｎｏｔｃｈ  ２アゴニスト、またはＮｏｔｃｈ  １アゴニストとＮｏｔｃｈ  ２アゴニストへの細胞の曝露の前、曝露と同時、または曝露の後に行うことができる。前駆細胞は、最小培養時間の少なくとも一部、最も好ましくはこの時間の大部分の間、増殖因子およびＮｏｔｃｈ  １アゴニスト、Ｎｏｔｃｈ  ２アゴニスト、またはＮｏｔｃｈ  １アゴニストとＮｏｔｃｈ  ２アゴニストに同時に曝露される。最小培養時間は、Ｎｏｔｃｈ  １アゴニスト、Ｎｏｔｃｈ  ２アゴニスト  またはＮｏｔｃｈ  １アゴニストとＮｏｔｃｈ  ２アゴニストおよび選択された増殖因子の不存在下で、細胞が死滅しまたは増殖を停止する時間量である。一実施形態において、期間は少なくとも２０回の細胞分裂サイクルの期間であり、別の実施形態において、期間は少なくとも１００回の細胞分裂サイクルの期間である。他の実施形態において、期間は、少なくとも２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０または９０回の細胞分裂サイクルの期間である。さらに他の実施形態において、期間は、少なくとも１２５、１５０、１７５または２００回の細胞分裂サイクルの期間である。時間量は、細胞の種類によって異なり、当業者に公知である。造血細胞について、例えば、最小培養時間は３−４週間であり得る。他の実施形態において、造血細胞の培養時間は、５、６、７、８、９または１０週間である。さらに他の実施形態において、造血細胞の培養時間は、１０週間より長く、例えば、１２、１５、１８、２０または２５週間である。
【０１７０】
特定の例示的な実施形態において、前駆細胞はＨＳＣである。ｃ−ｋｉｔリガンドまたは肥満細胞増殖因子としても知られている幹細胞因子（ＳＣＦ）は、ＨＳＣを不死化するために、単独で、または、例えば、以下の増殖因子：Ｆｌｔ−３Ｌ、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−１１、ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＧＭ−ＣＳＦおよび／もしくはＧ−ＣＳＦのうちの１つ以上と組み合わせて使用することができる。ＳＣＦ、Ｆｌｔ−３Ｌ、ＩＬ−６またはＴＰＯの量は、５−１０００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは約１０−５００ｎｇ／ｍｌ、最も好ましくは約１０−３００ｎｇ／ｍｌの範囲であり得る。特定の具体的な実施形態において、ＳＣＦ、Ｆｌｔ−３Ｌ、ＩＬ−６またはＴＰＯの量は、１０、２０、５０、７５、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５または４５０ｎｇ／ｍｌである。ＩＬ−３、ＩＬ−１１、Ｇ−ＣＳＦまたはＧＭ−ＣＳＦの量は、１−１００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは約５−５０ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは約７．５−２５ｎｇ／ｍｌ、最も好ましくは約１０−１５ｎｇ／ｍｌの範囲であり得る。特定の具体的な実施形態において、ＩＬ−３、ＩＬ−１１、Ｇ−ＣＳＦまたはＧＭ−ＣＳＦの量は、５、６、７、８、９、１０、１２．５または１５ｎｇ／ｍｌである。好ましい実施形態において、前述の因子は、無血清培地中のＨＳＣに添加される。増殖因子はまた、以下の組合せ：ＩＬ−３；ＩＬ−６；ＴＰＯ；ＳＣＦおよびＦｌｔ−３で提供され得る。増殖因子はまた、以下の組合せおよび量：ＩＬ−３（１０ｎｇ／ｍｌ）；ＩＬ−６；ＴＰＯ；ＳＣＦおよびＦｌｔ−３（それぞれ５０ｎｇ／ｍｌ）で提供され得る。
【０１７１】
ＨＳＣを不死化するための好ましい実施形態において、細胞外マトリックスタンパク質が結合した組織培養ディッシュで細胞を培養する。実施形態の好ましい態様において、細胞外マトリックスタンパク質は、フィブロネクチン（ＦＮ）またはその断片である。このような断片は、限定されないが、ＣＨ−２９６（Ｄａｏら、１９９８年、Ｂｌｏｏｄ  ９２（１２）：４６１２−２１頁）を含む。
【０１７２】
ＨＳＣを不死化するための具体的な実施形態において、ＩＬ−３；ＩＬ−６；ＴＰＯ；ＳＣＦおよびＦｌｔ−３の存在下で、Ｎｏｔｃｈ  １アゴニスト、Ｎｏｔｃｈ  ２アゴニスト  またはＮｏｔｃｈ  １アゴニストとＮｏｔｃｈ２  アゴニストを含有するプラスチック組織培養ディッシュ上で細胞を培養する。ＨＳＣを不死化するための別の具体的な実施形態において、各々１００ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ、Ｆｌｔ−３Ｌ、ＴＰＯおよびＩＬ−６、ならびに１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−３の存在下で、Ｎｏｔｃｈ  １アゴニスト、Ｎｏｔｃｈ  ２アゴニスト  またはＮｏｔｃｈ１アゴニストとＮｏｔｃｈ  ２アゴニストを含むプラスチック組織培養ディッシュ上で細胞を培養する。ＨＳＣを不死化するための別の具体的な実施形態において、各々１００ｎｇ／ｍｌのＳＣＦおよびＦｌｔ−３Ｌ、ならびに１０ｍｇ／ｍｌのＧ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦの存在下で、Ｎｏｔｃｈ  １アゴニスト、Ｎｏｔｃｈ  ２アゴニスト、またはＮｏｔｃｈ  １アゴニストとＮｏｔｃｈ  ２アゴニストを含むプラスチック組織培養ディッシュ上で細胞を培養する。ＨＳＣを不死化するための別の具体的な実施形態において、各々１００ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ、Ｆｌｔ−３ＬおよびＴＰＯ、ならびに１０ｍｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦの存在下で、Ｎｏｔｃｈ  １アゴニスト、Ｎｏｔｃｈ  ２アゴニスト、またはＮｏｔｃｈ  １アゴニストとＮｏｔｃｈ  ２アゴニストを含むプラスチック組織培養ディッシュ上で細胞を培養する。ＨＳＣを不死化するための別の具体的な実施形態において、各々３００ｎｇ／ｍｌのＳＣＦおよびＦｌｔ−３Ｌ、各々１００ｎｇ／ｍｌのＴＰＯおよびＩＬ−６、ならびに１０ｍｇ／ｍｌのＩＬ−３の存在下で、Ｎｏｔｃｈ  １アゴニスト、Ｎｏｔｃｈ  ２アゴニスト、またはＮｏｔｃｈ  １アゴニストとＮｏｔｃｈ  ２アゴニストを含むプラスチック組織培養ディッシュ上で細胞を培養する。ＨＳＣを不死化するための非常に好ましい実施形態において、各々１００ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ、Ｆｌｔ−３ＬおよびＴＰＯ、ならびに各々１０ｍｇ／ｍｌのＧ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦの存在下で、Ｎｏｔｃｈ  １アゴニスト、Ｎｏｔｃｈ  ２アゴニスト、またはＮｏｔｃｈ  １アゴニストとＮｏｔｃｈ  ２アゴニストを含むプラスチック組織培養ディッシュ上で細胞を培養する。前述の培養条件に対する代替の実施形態において、フィブロネクチンまたは別の細胞外マトリックスタンパク質を組織培養ディッシュに含めることができる。
【０１７３】
分化が所望される場合、ＳＣＦは、ＧＭ−ＣＳＦまたはインターロイキン−７（ＩＬ−７）と組み合わせて、不死化したＨＳＣを骨髄性幹細胞またはリンパ系幹細胞にそれぞれ分化させるために使用することができる。他の実施形態において、不死化したＨＳＣのＨＰＰ−ＣＦＣへの分化を促進するために、レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アゴニスト、最も好ましくは全トランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）が使用される。
【０１７４】
他の実施形態において、ＥＧＦは、単独でまたはＩＧＦ−１およびＴＧＦ−βと組み合わせて、上皮細胞および線維芽細胞を不死化するために、Ｎｏｔｃｈ  １アゴニスト、Ｎｏｔｃｈ  ２アゴニスト、またはＮｏｔｃｈ  １アゴニストとＮｏｔｃｈ  ２アゴニストとともに使用することができる。別の実施形態において、ＦＧＦ−１は、内皮細胞を不死化するために、Ｎｏｔｃｈ  １アゴニスト、Ｎｏｔｃｈ  ２アゴニスト、またはＮｏｔｃｈ  １アゴニストとＮｏｔｃｈ  ２アゴニストとともに使用することができる。さらに別の実施形態において、ＦＧＦ−２は、中胚葉細胞および神経外胚葉細胞を不死化するために、または脂肪細胞および卵巣顆粒膜細胞を分化させるために、Ｎｏｔｃｈ  １アゴニスト、Ｎｏｔｃｈ  ２アゴニスト、またはＮｏｔｃｈ  １アゴニストおよびＮｏｔｃｈ  ２アゴニストとともに使用することができる。さらに他の実施形態において、ＦＧＦ−７は、ケラチノサイトの不死化および／もしくは分化、または前立腺上皮の不死化および／もしくは分化のために、Ｎｏｔｃｈ  １アゴニスト、Ｎｏｔｃｈ  ２アゴニスト、またはＮｏｔｃｈ  １アゴニストとＮｏｔｃｈ  ２アゴニストとともに使用することができる。別の実施形態において、ＨＧＦは、肝細胞を不死化するために、Ｎｏｔｃｈ  １アゴニスト、Ｎｏｔｃｈ  ２アゴニスト、またはＮｏｔｃｈ  １アゴニストとＮｏｔｃｈ  ２アゴニストとともに使用することができる。さらに別の実施形態において、ＩＬ−６は、ケラチノサイトまたは神経幹細胞およびプロジェニター細胞を分化させるために、Ｎｏｔｃｈ  １アゴニスト、Ｎｏｔｃｈ  ２アゴニスト、またはＮｏｔｃｈ  １アゴニストとＮｏｔｃｈ  ２アゴニストとともに使用することができる。さらに別の実施形態において、ＰＤＧＦは、単独でまたはＥＧＦおよび／もしくはＩＧＦ−１と組み合わせて、中胚葉細胞および神経外胚葉細胞を不死化するために、Ｎｏｔｃｈ  １アゴニスト、Ｎｏｔｃｈ  ２アゴニスト、またはＮｏｔｃｈ  １アゴニストとＮｏｔｃｈ  ２アゴニストとともに使用することができる  。さらに他の実施形態において、ＮＧＦ、ＣＮＴＦ、ＧＤＮＦまたはＢＤＮＦは、ニューロン細胞を不死化するために、個々に、またはＮｏｔｃｈ  １アゴニスト、Ｎｏｔｃｈ  ２アゴニスト、もしくはＮｏｔｃｈ  １アゴニストとＮｏｔｃｈ  ２アゴニストと組み合わせて使用することができる。
【０１７５】
本開示の方法によって利用される増殖因子は、商業的に得られ、組換え発現によって産生され、または化学的に合成され得る。例えば、ＡＴＲＡ、ＢＤＮＦ（ヒト）、ＣＮＴＦ（ヒトおよびラット）、ＥＧＦ（ヒト）、ＦＧＦ−１（ヒトおよびウシ）、ＦＧＦ−２（ヒトおよびウシ）、ＦＧＦ−７（ヒト）、Ｆｌｔ−３Ｌ（ヒト）、ＧＤＮＦ（ヒトおよびラット）、ＨＧＦ（ヒト）、ＩＧＦ−１（ヒト）、ＩＬ−６（ヒトおよびマウス）、ＩＬ−１１（ヒト）、ＮＧＦ（マウス）、ＰＤＧＦ（ヒトＡＡ、ＡＢ、ＢＢアイソフォーム）、ＳＣＦ（ヒト）、ＴＧＦ−β（ヒト）、ＴＰＯ（ヒトおよびマウス）は、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入することができる。ＥＧＦ（ヒトおよびマウス）、ＦＧＦ−１（ヒト）、ＦＧＦ−２（ヒト）、ＧＭ−ＣＳＦ（ヒトおよびマウス）、ＩＧＦ−１（ヒト）、ＩＬ−６（ヒトおよびマウス）、ＩＬ−７（ヒトおよびマウス）、ＮＧＦ（マウス）、ＰＤＧＦ（ヒトＡＡ、ＡＢおよびＢＢアイソフォーム）、ＳＣＦ（ヒト）およびＴＧＦ−β（ヒト）は、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から購入することができる。
【０１７６】
他の実施形態において、増殖因子は、組換え発現（例えば、以下のセクション４．３に記載される）、または化学的ペプチド合成（例えば、ペプチド合成器による）によって産生される。増殖因子の核酸およびペプチド配列は、一般的に、ＧｅｎＢａｎｋから入手可能である。増殖因子（核酸配列とコードされたタンパク質の配列の両方を提供する）の例示的なＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号は、以下に提供される：
【０１７７】
【表１】
0006641299.tif 000002
0006641299.tif 000003
【０１７８】
好ましくは、必ずしも必要ではないが、本開示の方法によりＮｏｔｃｈ  １アゴニスト、Ｎｏｔｃｈ  ２アゴニスト、またはＮｏｔｃｈ  １アゴニストとＮｏｔｃｈ  ２アゴニストの存在下で前駆細胞を不死化しおよび任意選択的に分化させるために使用される増殖因子は、前駆細胞と同種由来である。前駆細胞を不死化または分化させるために利用される特定の増殖因子は、前駆細胞タイプに依存し、当業者に周知である。
【０１７９】
前駆細胞の不死化または不死化した前駆細胞の分化に適した増殖因子の量または濃度は、増殖因子調製物の活性に依存し、増殖因子と前駆細胞間の種の対応などに依存する。概して、増殖因子（単数または複数）および前駆細胞が同種である場合、培地中の増殖因子の総量は、１ｎｇ／ｍｌ−５μｇ／ｍｌ、より好ましくは５ｎｇ／ｍｌ−１μｇ／ｍｌ、最も好ましくは約１０ｎｇ／ｍｌ−２００ｎｇ／ｍｌの範囲である。好ましい実施形態において、前駆細胞はＨＳＣであり、Ｎｏｔｃｈ  １アゴニスト、Ｎｏｔｃｈ  ２アゴニスト、またはＮｏｔｃｈ  １アゴニストとＮｏｔｃｈ  ２アゴニスト、ならびに１００ｎｇ／ｍｌのＳＣＦに細胞を曝露することによって不死化される。別の好ましい実施形態において、前駆細胞はＨＳＣであり、Ｎｏｔｃｈ  １アゴニスト、Ｎｏｔｃｈ  ２アゴニスト、またはＮｏｔｃｈ  １アゴニストとＮｏｔｃｈ  ２アゴニスト、ならびにＩＬ−３；ＩＬ−６；ＴＰＯ；ＳＣＦおよびＦｌｔ−３に細胞を曝露することによって不死化される。別の好ましい実施形態において、各々１００ｎｇ／ｍｌのＳＣＦおよびＩＬ−７に細胞を曝露することによって、不死化したＨＳＣをリンパ系前駆細胞に分化させる。さらに別の好ましい実施形態において、各々１００ｎｇ／ｍｌのＳＣＦおよびＧＭ−ＣＳＦに細胞を曝露することによって、ＨＳＣを骨髄前駆細胞に分化させる。
【０１８０】
６．３  Ｎｏｔｃｈ  １およびＮｏｔｃｈ  ２アゴニストおよび増殖因子の組換え発現
本開示は、前駆細胞を不死化および任意選択的に分化させるための方法を提供し、該方法は、Ｎｏｔｃｈ  １アゴニスト、Ｎｏｔｃｈ  ２アゴニスト、またはＮｏｔｃｈ  １アゴニストとＮｏｔｃｈ  ２アゴニストならびに選択された増殖因子の存在下で前駆細胞を培養することを含む。特定の実施形態において、Ｎｏｔｃｈ  １アゴニストおよびＮｏｔｃｈ  ２アゴニストならびに／または増殖因子が組換え的に産生される。Ｎｏｔｃｈ  １アゴニストおよびＮｏｔｃｈ  ２アゴニストまたは増殖因子は、前駆細胞が培養されている細胞培養培地に添加するために分離しても、不死化および／もしくは分化の期間中に前駆細胞に組換え的に発現しても、または不死化および／もしくは分化の期間中に前駆細胞と一緒に培養される細胞において内因的もしくは組換え的に発現してもよい。
【０１８１】
Ｎｏｔｃｈ  １アゴニストおよびＮｏｔｃｈ  ２アゴニストならびに増殖因子を発現するための方法が本明細書中に提供される。増殖因子もしくは増殖因子経路構成要素、ＮｏｔｃｈもしくはＮｏｔｃｈ経路構成要素、または機能的に活性な断片もしくは他の誘導体をコードするヌクレオシド配列は、このセクションにおいて「対象とする核酸」と呼ばれ、それがコードするタンパク質は「対象とするタンパク質」と呼ばれる。対象とする核酸は、適切な発現ベクター、すなわち、挿入されたタンパク質コード配列の転写および翻訳に必要とされる要素を含むベクターに挿入することができる。必要とされる転写および翻訳シグナルはまた、天然の遺伝子および／またはその隣接領域によって供給され得る。種々の宿主−ベクターシステムが、タンパク質をコードする配列を発現させるために利用され得る。これらには、限定されないが、ウイルス（例えば、ワクシニアウイルス、アデノウイルスなど）に感染した哺乳動物細胞システム；ウイルス（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞システム；微生物、例えば、酵母ベクターを含有する酵母、またはバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡもしくはコスミドＤＮＡで形質転換された細菌が挙げられる。ベクターの発現エレメントは、それらの強度および特異性において変化する。利用される宿主−ベクターシステムに依存して、多数の適切な転写および翻訳エレメントの任意の１つを使用することができる。
【０１８２】
ベクターへのＤＮＡ断片の挿入について以前に記載された方法のいずれかを用いて、適切な転写／翻訳制御シグナルおよびタンパク質コード配列からなるキメラ遺伝子を含む発現ベクターを構築するために使用することができる。これらの方法は、インビトロ組換えＤＮＡおよび合成技術およびインビボ組換え体（遺伝子組換え）を含み得る。対象とするタンパク質が組換えＤＮＡ分子を用いて形質転換された宿主において発現されるように、対象とするタンパク質をコードする核酸配列の発現は、第二の核酸配列によって調節されてもよい。例えば、対象とするタンパク質の発現は、当該技術分野において公知である任意のプロモーター／エンハンサーのエレメントのいずれかによって制御され得る。細胞運命制御遺伝子または細胞運命遺伝子経路構成要素の発現を制御するために用いることができるプロモーターとしては、限定されないが、ＳＶ４０初期プロモーター領域（ＢｅｒｎｏｉｓｔおよびＣｈａｍｂｏｎ、１９８１年、Ｎａｔｕｒｅ  ２９０：３０４−３１０頁）、ラウスサルコーマウイルスの３’長鎖末端反復に含まれるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏら、１９８０年、Ｃｅｌｌ  ２２：７８７−７９７頁）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒら、１９８１年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：１４４１−１４４５頁）、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、１９８２年、Ｎａｔｕｒｅ  ２９６：３９−４２）；熱ショックタンパク質７０遺伝子の調節配列（ＢｉｅｎｚおよびＰｅｌｈａｍ、１９８６、Ｃｅｌｌ  ４５：７５３−６０頁）；β−ラクタマーゼプロモーター（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆら、１９７８年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７５：３７２７−３７３１頁）またはｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒら、１９８３年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８０：２１−２５頁）などの原核生物発現ベクター；また、「Ｕｓｅｆｕｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｒｏｍ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｂａｃｔｅｒｉａ」ｉｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ、１９８０年、２４２：７４−９４頁を参照されたい；ノパリン合成酵素プロモーター領域（Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａら、Ｎａｔｕｒｅ  ３０３：２０９−２１３頁）またはカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ  ＲＮＡプロモーター（Ｇａｒｄｎｅｒら、１９８１年、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．９：２８７１頁）、および光合成酵素リブロースビスホスフェートカルボキシラーゼのプロモーター（Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａら、１９８４年、Ｎａｔｕｒｅ  ３１０：１１５−１２０頁）を含む植物発現ベクター；Ｇａｌ４プロモーターなどの酵母または他の真菌由来のプロモーターエレメント、ＡＤＨ（アルコール脱水素酵素）プロモーター、ＰＧＫ（ホスホグリセロールキナーゼ）プロモーター、アルカリホスファターゼプロモーター、および組織特異性を示し、トランスジェニック動物で利用されている動物の転写制御領域：膵腺房細胞で活性であるエラスターゼＩ遺伝子の制御領域（Ｓｗｉｆｔら、１９８４年、Ｃｅｌｌ  ３８：６３９−６４６頁；Ｏｍｉｔｚら、１９８６年、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５０：３９９−４０９頁；ＭａｃＤｏｎａｌｄ、１９８７年、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ７：４２５−５１５頁）；膵ベータ細胞で活性であるインスリン遺伝子制御領域（Ｈａｎａｈａｎ、１９８５年、Ｎａｔｕｒｅ  ３１５：１１５−１２２頁）、リンパ球細胞で活性である免疫グロブリン遺伝子制御領域（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌら、１９８４年、Ｃｅｌｌ  ３８：６４７−６５８頁；Ａｄａｍｅｓら、１９８５年、Ｎａｔｕｒｅ  ３１８：５３３−５３８頁；Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、１９８７年、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：１４３６−１４４４頁）、精巣、胸部、リンパ球およびマスト細胞で活性であるマウス乳房腫瘍ウイルス制御領域（Ｌｅｄｅｒら、１９８６年、Ｃｅｌｌ  ４５：４８５−４９５頁）、肝臓で活性であるアルブミン遺伝子制御領域（Ｐｉｎｋｅｒｔら、１９８７年、Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌ．１：２６８−２７６頁）、肝臓で活性であるアルファ−フェトプロテイン遺伝子制御領域（Ｋｒｕｍｌａｕｆら、１９８５年、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：１６３９−１６４８頁；Ｈａｍｍｅｒら、１９８７年、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３５：５３−５８頁）、肝臓で活性であるアルファ１−アンチトリプシン遺伝子制御領域（Ｋｅｌｓｅｙら、１９８７年、Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌ．１：１６１−１７１頁）、骨髄細胞で活性であるβ−グロビン遺伝子制御領域（Ｍｏｇｒａｍら、１９８５年、Ｎａｔｕｒｅ  ３１５：３３８−３４０頁；Ｋｏｌｌｉａｓら、１９８６年、Ｃｅｌｌ  ４６：８９−９４頁）、脳のオリゴデンドロサイト細胞で活性であるミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域（Ｒｅａｄｈｅａｄら、１９８７年、Ｃｅｌｌ  ４８：７０３−７１２頁）、骨格筋で活性であるミオシン軽鎖２遺伝子の制御領域（Ｓａｎｉ、１９８５年、Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：２８３−２８６頁）および視床下部で活性である性腺刺激放出ホルモン遺伝子制御領域（Ｍａｓｏｎら、１９８６年、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３４：１３７２−１３７８頁）が挙げられる。
【０１８３】
一実施形態において、「Ｔｅｔシステム」と称される、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のテトラサイクリン調節遺伝子発現を利用する方法（Ｇｏｓｓｅｎら、１９９５年、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６８：１７６６−１７６９頁；Ｇｏｓｓｅｎ  ａｎｄ  Ｂｕｊａｒｄ、１９９２年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：５５４７−５５５１頁）は、遺伝子発現を指示するために使用される。この場合、テトラサイクリン制御転写アクチベーター（ｔＴＡ）のコード領域が、構成的または誘導的な様式でｔＴＡの発現を指示するプロモーター／エンハンサーに作動可能に融合されているトランスジェニック細胞株を作製する。誤発現される対象とする核酸のコード領域がｔＴＡ応答調節エレメントを有するプロモーターに作動可能に融合されるトランスジェニック細胞株を生じさせる。細胞培養培地に十分な量のテトラサイクリンを補充する場合、それは、得られた子孫における対象とする遺伝子の発現を完全にブロックする。対象とする遺伝子の発現は、食品または細胞培養培地からテトラサイクリンを単に除去することにより誘導することができる。また、対象とする遺伝子の発現レベルは、食物中のテトラサイクリンのレベルを変えることによって調整することができる。したがって、誤発現の二元制御機構としてのＴｅｔシステムの使用は、対象とする核酸の誤発現の振幅およびタイミングを制御する手段を提供するという利点を有する。
【０１８４】
対象とする核酸を含む発現ベクターは、４つの一般的アプローチ：（ａ）核酸ハイブリダイゼーション；（ｂ）分子生物学；（ｃ）挿入された配列の発現；および（ｄ）「マーカー」遺伝子機能の有無によって同定することができる。第一のアプローチにおいて、発現ベクターに挿入された対象とする核酸の存在は、挿入された対象とする核酸と相同である配列を含むプローブを用いた核酸ハイブリダイゼーションによって検出することができる。第二のアプローチにおいて、分子生物学と「マーカー」遺伝子機能の組合せは、対象とする核酸を含む組換え発現ベクターを同定するために使用される。例えば、対象とする核酸が、両方の抗生物質耐性をコードする発現ベクターの特定の制限部位に挿入される場合、ベクターを取り込む細菌細胞は抗生物質に対する耐性によって同定され、対象とする核酸を含むベクターは、増幅されたベクターＤＮＡを特定の制限酵素で制限消化することにより同定することができる。第三のアプローチにおいて、組換え発現ベクターは、組換え体によって発現される対象とするタンパク質をアッセイすることによって同定することができる。このようなアッセイは、例えば、対象とするタンパク質の物理的または機能的特性に基づくことができる。第四のアプローチでは、ベクター／宿主系は、ベクターにおける対象とする核酸の挿入によって引き起こされる特定の「マーカー」遺伝子機能（例えば、チミジンキナーゼ活性、β−ガラクトシダーゼ、抗生物質に対する耐性、形質転換表現型、バキュロウイルスにおける封入体形成など）の有無に基づいて同定することができる。例えば、対象とする核酸がベクターのマーカー遺伝子配列内に挿入される場合、対象とする核酸を含む組換え体は、マーカー遺伝子機能の不存在によって同定することができる。
【０１８５】
特定の組換えＤＮＡ分子が同定され単離されると、当該技術分野において公知のいくつかの方法を用いてそれを増殖させることができる。適切な宿主系および増殖条件が確立されると、組換え発現ベクターを増殖させ、多量に調製することができる。先に説明したように、使用することができる発現ベクターは、限定されないが、以下のベクターまたはその誘導体：いくつかの例を挙げるとすると、ワクシニアウイルスもしくはアデノウイルスなどのヒトまたは動物ウイルス；バキュロウイルスなどの昆虫ウイルス；酵母ベクター；バクテリオファージベクター（例えば、ラムダ）、およびプラスミドおよびコスミドＤＮＡベクターを含むことができる。
【０１８６】
さらに、挿入された配列の発現を調節し、または所望の特定の様式で遺伝子産物を修飾およびプロセシングする宿主細胞株を選択することができる。特定の誘導因子の存在下で、特定のプロモーターからの発現を上昇させることができる；したがって、遺伝子操作された対象とするタンパク質（例えば、Ｎｏｔｃｈ  １アゴニストおよびＮｏｔｃｈ  ２アゴニスト）の発現を制御することができる。さらに、異なる宿主細胞は、タンパク質の翻訳および翻訳後プロセシングと修飾（例えば、グリコシル化、［例えば、シグナル配列の］切断）のための特徴的および特異的な作用機序を有する。適切な細胞株または宿主系を選択して、発現された外来タンパク質の所望の修飾およびプロセシングを確実にすることができる。例えば、細菌系における発現は、それらの機能に必要な翻訳後修飾がほとんどないため、大量のＮｏｔｃｈ  １アゴニストおよびＮｏｔｃｈ  ２アゴニストを産生するために使用することができる。真核生物細胞における発現は、ＴＰＯなどのいくつかのタンパク質に必要なグリコシル化産生物を生じさせる。間葉系細胞における発現は、シグナル伝達分子のシグナル配列の「天然の」プロセシングを確実にするために使用することができる。
【０１８７】
他の特定の実施形態において、対象とするタンパク質は、（（異なるタンパク質の）異種タンパク質配列にペプチド結合を介して結合したペプチド、断片、類似体または誘導体を含む）融合体またはキメラタンパク質産生物として発現させることができる。このようなキメラ産生物は、当該技術分野において公知の方法によって、適切なコーディングフレームで、所望のアミノ酸配列をコードする適切な核酸配列を互いに連結し、当該技術分野において一般的に知られている方法によって、キメラ産生物を発現させることによって作製することができる。あるいは、このようなキメラ産生物は、タンパク質合成技術により、例えば、ペプチドシンセサイザーを用いて作製されてもよい。ｃＤＮＡとゲノム配列はともにクローニングされおよび発現され得る。
【０１８８】
このセクションに記載される方法はまた、Ｎｏｔｃｈ経路の構成要素ではない遺伝子およびタンパク質にも適用可能であるが、Ｎｏｔｃｈ経路の遺伝子またはタンパク質の機能を間接的に変更するために使用され得る遺伝子およびタンパク質に利用可能である。
【０１８９】
６．４  前駆細胞
本開示は、前駆細胞の細胞周期停止または非複製期への侵入を回避または遅延させることによって、前駆細胞を不死化させおよび場合により分化させるための方法を提供する。本開示による不死化のための前駆細胞は、末梢分化していない細胞であり、任意の種由来であり得て、限定されないが、ヒト、動物、植物、哺乳動物、霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、昆虫、ショウジョウバエおよびＣ．エレガンスを含む。最も好ましくは、前駆細胞は脊椎動物であり、より好ましくは哺乳動物であり、最も好ましくはヒトである。好ましい実施形態において、前駆細胞は、細胞株の特徴（例えば、安定した表現型変化をもたらす形質転換）をもたらす「転機」または「老化」期を経ていない細胞である（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、１９９４年、「Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ−−Ａ  ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ」、第三版、１２頁、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．を参照されたい）。好ましい実施形態において、前駆細胞は、初代細胞である。用語「初代細胞」は、細胞が、哺乳動物の被験体などの、組織供給源からの外植後の継代を経由していない細胞である。
【０１９０】
一般的に、必須ではないが、前駆細胞は、多分化能性幹細胞または多分化能プロジェニター細胞である。一実施形態において、前駆細胞は幹細胞である。別の実施形態において、前駆細胞はプロジェニター細胞である。前駆細胞は、必要に応じて、不死化の前後で細胞集団から単離することができる。Ｎｏｔｃｈ経路の活性化は、好ましくは、例えば、固体表面に固定化され、もしくは細胞表面上に組換え的に発現される、Ｎｏｔｃｈ  １アゴニスト、Ｎｏｔｃｈ  ２アゴニスト、もしくはＮｏｔｃｈ  １アゴニストおよびＮｏｔｃｈ  ２アゴニストに細胞を曝露することにより、または、優性活性型Ｎｏｔｃｈ変異体もしくは活性化Ｎｏｔｃｈリガンド、もしくはＮｏｔｃｈ  １および／もしくはＮｏｔｃｈ  ２を活性化する他の分子を発現する組換え核酸を細胞に導入することにより達成される。
【０１９１】
最も好ましくは、前駆細胞の不死化および／または分化した子孫が再増殖または遺伝子治療に使用されるべきである場合、前駆細胞は、不死化後および場合により分化後に投与される被験体の組織から直接得られる。例えば、前駆細胞がＨＳＣである場合、それは、Ｎｏｔｃｈ  １アゴニスト、Ｎｏｔｃｈ  ２アゴニスト、またはＮｏｔｃｈ  １アゴニストとＮｏｔｃｈ  ２アゴニスト、ならびにＩＬ−３、ＩＬ−６、ＴＰＯ、ＳＣＦおよびＦｌｔ−３Ｌの組合せの存在下で細胞を培養することによって、被験体からの単離後に不死化することができる。別の実施形態において、細胞を記載されるように培養し、ＳＣＦと、ＧＭ−ＣＳＦまたはＩＬ−７のいずれかに曝露して、骨髄系統またはリンパ系統への分化を刺激し、次に、得られた骨髄系またはリンパ系細胞集団を被験体に移植する。移植は、自己由来であることが好ましいが、非自己由来であってもよい。非自己移植について、移植された細胞の拒絶の危険性を低減させるために、レシピエントに免疫抑制剤を投与することが好ましい。
【０１９２】
以下の例示的な実施形態は、本開示によるＮｏｔｃｈ  １アゴニスト、Ｎｏｔｃｈ  ２アゴニスト、またはＮｏｔｃｈ  １アゴニストとＮｏｔｃｈ  ２アゴニスト、および増殖因子で処理されるべき前駆細胞および前駆細胞含有組織の単離を可能にするアプローチを記載する。既に示唆したように、単離された細胞型またはさらには細胞集団の混合物も、本開示の方法に従って処理することができる。得られた細胞集団が移植に使用される場合、その細胞またはその子孫が移植前に所望の遺伝子産物を発現するように、組換え遺伝子を細胞に導入することができる。組換え遺伝子の導入は、前駆細胞の増殖および／または分化の前と後のいずれかで行うことができる。
【０１９３】
好ましい実施形態において、前駆細胞集団は精製され、または少なくとも高度に富化される。しかしながら、本開示の方法によって前駆細胞を不死化および／または分化させるために、前駆細胞が純粋な集団である必要はない。一旦混合物が処理されると、所望の集団を選択して精製することができる。さらに、精製は、インビボでの治療的投与前に必要でないまたは望ましくない場合がある。
【０１９４】
本開示における使用のための前駆細胞の単離は、当業者に一般的に知られている多数の方法のいずれかによって行うことができる。例えば、前駆細胞を単離するための１つの一般的な方法は、示差的な抗体結合を用いて、被験体から細胞の集団を回収することであり、ここで、１つ以上の特定の分化段階の細胞を、分化抗原に対する抗体によって結合し、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を用いて、単離された細胞の集団から、選択された分化抗原を発現する所望の前駆細胞を分離する。ＦＡＣＳは、粒子の蛍光特性に基づいて、細胞を含む粒子を分離するための周知の方法である（Ｋａｍａｒｃｈ、１９８７年、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５１：１５０−１６５頁）。個々の粒子中の蛍光部分のレーザー励起は、混合物からの正および負の粒子の電磁分離を可能にする小さな電荷を生じさせる。
【０１９５】
別の実施形態において、前駆細胞を細胞集団から単離するために磁気ビーズを使用することができる。具体的には、磁気活性化セルソーティング（ＭＡＣＳ）技術を使用することができる。ＭＡＣＳは、磁気ビーズ（直径０．５−１００μｍ）に結合する能力に基づいて、粒子を分離する方法である。磁気ビーズは、Ｄｙｎａｌ（Ｏｓｌｏ、Ｎｏｒｗａｙ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｙｎａｌ．ｎｏ）から得ることができる。細胞−固相表面分子またはハプテンを特異的に認識する抗体の共有結合的付加を含む、種々の有用な修飾を磁性ミクロスフェア上で行うことができる。次に、選択されたビーズを物理的に操作するために磁場が印加される。その後、ビーズを細胞、例えば、前駆細胞を含む細胞集団と混合し、結合させる。続いて、細胞を磁場に通して、所望の細胞表面マーカーを有する細胞を分離する。
【０１９６】
別の実施形態において、培養ディッシュの表面を抗体で被覆し、パンニングと呼ばれる方法によって細胞を分離するために使用することができる。細胞は、別々のディッシュに連続的にインキュベートすることができ、その各々は、所望の細胞型のマーカーに対する抗体で被覆され、各インキュベーション後に完全に濯がれる。使用される抗体の特定の組合せは、所望の細胞型に特異的であるが、混合細胞集団に存在する可能性のある他の細胞型には特異的でないマーカーの対応する組合せを認識する。最後の濯ぎステップの後、プレートに結合したままの細胞が所望の細胞型の細胞である。
【０１９７】
不死化または分化した細胞を、クローン単離のために、マイクロタイターディッシュなどの別個のディッシュに希釈することができる。好ましくは、希釈前に、所望の細胞型の細胞は、当該技術分野において公知の任意の方法によって精製され得る。例えば、不死化または分化した細胞は、ＦＡＣＳまたはＭＡＣＳによって精製され得る。前駆細胞タイプまたは分化細胞タイプの内因性マーカーに加えて、不死化したまたは分化した細胞は、所望の細胞型において活性化される系統特異的プロモーターの制御下で、レポーター遺伝子をコードする構築物を前駆細胞にトランスフェクトすることによって精製され得る（例えば、米国特許第５、６３９、６１８号を参照されたい）。
【０１９８】
以下のセクションは、特定のタイプの細胞の抽出または単離のための例示的な方法を記載する。さらに、当該技術分野において公知の任意の方法を用いることができる。
【０１９９】
６．４．１．造血細胞
好ましくは、本明細書に記載の方法に従って増殖させる前駆細胞は、造血前駆細胞である。本開示の方法は、限定されないが、ＨＳＣ、リンパ系幹細胞および骨髄系幹細胞を含む、任意の末梢分化していない造血細胞の不死化および任意選択的に分化を包含する。造血細胞の単離を提供する任意の技術が、本開示のこの実施形態において使用され得る。
【０２００】
好ましい実施形態において、造血細胞はＨＳＣである。造血幹細胞は、長期骨髄正嫡細胞とも呼ばれる。好ましい実施形態において、造血幹細胞および／または造血プロジェニター細胞は、ヒト造血幹細胞および／または造血プロジェニター細胞である。
【０２０１】
ＨＳＣの単離を達成し得る技術は、ドナーから単離された骨髄細胞からのＨＳＣの単離を含み、またはＨＳＣの子孫が移植のために使用されるべき場合は、将来の宿主を含む。非自己ＨＳＣは、好ましくは、将来の宿主／被験体の移植免疫反応を抑制する方法と併用して用いられる。本開示の特定の実施形態において、ヒト骨髄細胞は、針吸引によって後腸骨稜から得ることができる（例えば、Ｋｏｄｏら、１９８４年、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．７３：１３７７−１３８４頁を参照されたい）。本開示の好ましい実施形態において、ＨＳＣまたはその子孫は、高度に富化された形態または実質的に純粋な形態で作製され得る。この富化は、本開示の方法に従って不死化および／または分化の前、最中または後に達成することができる。
【０２０２】
ＨＳＣの単離のための別の技術は、Ｍｉｌｎｅｒら、１９９４年、Ｂｌｏｏｄ  ８３：２０５７−２０６２頁に記載されている。骨髄サンプルを採取し、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離によって分別し、洗浄し、２色間接免疫蛍光抗体結合を用いて染色し、次に、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）により分離する。個々の系統関連抗原の発現を欠く未成熟サブセット（ＣＤ３４＋ｌｉｎ−）を含むＣＤ３４＋ＨＳＣが、骨髄から回収された細胞から単離されるように、細胞をＩｇＧ抗体を用いて同時に標識する。
【０２０３】
造血プロジェニター細胞が望ましい場合、造血プロジェニター細胞および／またはそれらの子孫の存在は、一般的に知られているインビトロでのコロニー形成アッセイ（例えば、ＣＦＵ−ＧＭ、ＢＦＵ−Ｅを検出するアッセイ）により検出することができる。別の例として、ＨＳＣについてのアッセイもまた当該技術分野において知られている（例えば、脾臓フォーカス形成アッセイ、再プレーティング後にプロジェニターを形成する能力を検出するアッセイ）。
【０２０４】
特定の実施形態において、前駆細胞は造血幹細胞である。特定の実施形態において、前駆細胞は造血プロジェニター細胞である。特定の実施形態において、前駆細胞は、造血幹細胞および造血プロジェニター細胞である。
【０２０５】
一実施形態において、造血前駆細胞は、短期間の骨髄生着細胞（迅速に再増殖する細胞）である多能性プロジェニター細胞を含む。
【０２０６】
具体的な実施形態において、前駆細胞は、造血幹細胞が豊富な細胞の集団である。別の実施形態において、前駆細胞は、造血幹細胞およびプロジェニター細胞が豊富な細胞の集団である。
【０２０７】
造血細胞マーカー
造血細胞を同定し、所望の造血細胞型（前駆細胞集団または不死化もしくは分化した細胞の集団において）を選択または濃縮するために、造血細胞型の以下のマーカーを使用することができる。
【０２０８】
主に、様々な造血細胞型上の種々の細胞表面抗原の差示的な発現に基づいて、造血系の様々な細胞を区別するために抗体群が使用されている。モノクローナル抗体は、最適な造血細胞を富化するために細胞選別と併用して使用することができる。例えば、ヒトＨＳＣは、ＣＤ３４発現と、ＣＤ３８発現の欠如に基づいて最初に精製された。抗ＣＤ３４抗体を使用して、正常な骨髄細胞集団の１−２％（Ｃｉｖｉｎら、１９８９年、Ｒｅｐｏｒｔ  ｏｎ  ｔｈｅ  ＣＤ３４  ｃｌｕｓｔｅｒ  ｗｏｒｋｓｈｏｐ、Ｉｎ：Ｌｅｕｃｏｃｙｔｅ  ｔｙｐｉｎｇ  ＩＶ、Ｗｈｉｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ．Ｋｎａｐｐら、Ｅｄｓ．、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ．Ｏｘｆｏｒｄ、８１８頁）からＨＳＣを約５０−８０％の集団（Ｉｓｈｉｚａｗａら、Ｉｎ：ＨＳＣｓ：Ｔｈｅ  Ｍｕｌｈｏｕｓｅ  Ｍａｎｕａｌ、Ｗｕｎｄｅｒら、編集、ＡｌｐｈａＭｅｄ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｈｉｏ、１７１−１８２頁；Ｓｈｐａｌｌら、１９９４年、Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  １２：２８−３６頁；Ｗｉｎｓｌｏｗら、１９９４年、Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  １４：２６５−２７１頁；Ｔｈｏｍａｓ、１９９４年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ４（２）：１１９−１２８頁）に濃縮することができた。目的の細胞上に存在する抗原を発現する細胞を選択することによって、または望ましくない抗原を発現する細胞を枯渇させることによって、所望の造血細胞型を同定または選択するために、当該技術分野において公知の抗体の任意の組合せを使用することができる。
【０２０９】
ＣＤ３４＋であることに加えて、ＨＳＣは、好ましくは、ＣＤ３３−、ＣＤ３８−、ＨＬＡ  ＤＲ−およびＴｈｙ−１−ｌｏである（Ｃｒａｉｇら、１９９３年、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７７：１３３１頁；Ｃｉｖｉｎら、１９９４年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３３：１５７頁；Ｃｉｖｉｎら、１９８７年、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．１５：１０頁；Ｔｅｒｓｔａｐｐｅｎら、１９９１年、Ｂｌｏｏｄ  ７７：１２１８頁）。さらに、ヒトＨＳＣは、好ましくは、ＣＤ４５Ｒａ−、ＣＤ１９−およびｃ−ｋｉｔ＋である（Ｓｃａｄｄｅｎによる米国特許第５、９６５、４３７号）。
【０２１０】
ＨＳＣを選択するおよび／または濃縮するために使用することができる別のＨＳＣマーカーは、血管内皮増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２、ＫＤＲとしても知られる；Ｚｉｅｇｌｅｒら、１９９９年、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８５：１５５３−１５５８頁）である。
【０２１１】
ヒト造血プロジェニター細胞およびヒトＨＳＣはまた、ヒト骨髄抽出物などの試料を、グリコホリンＡ、ＣＤ３、ＣＤ２４、ＣＤ１６、およびＣＤ１４を認識する抗体とともにインキュベートし、抗体が結合しない細胞から抗体が結合している細胞を分離することによって濃縮することができる。ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ３６、ＣＤ５６、ＣＤ２、ＣＤ１９、ＣＤ６６ａおよびＣＤ６６ｂに対する抗体もまた、このプロセスを改良するために使用することができる。抗体が結合しない細胞集団は、造血幹細胞およびプロジェニター細胞について濃縮される（ＴｈｏｍａｓおよびＬａｎｓｄｏｒｐによる米国特許第５、８７７、２９９号を参照されたい）。他の研究において、Ｍｙ１０およびＨＬＡ−ＤＲ抗体は、ヒト骨髄から高度に濃縮されたプロジェニター細胞集団を得るために２色選別と関連して使用されている（Ｌｕら、１９８７年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９（６）：１８２３−１８２９頁）。また、Ｔリンパ球枯渇は、造血幹細胞またはプロジェニター細胞を濃縮するために使用することができる。この手順において、Ｔリンパ球は、Ｔ細胞抗原プラス補体を認識するモノクローナル抗体を用いて細胞を前処理することによって、細胞集団から選択的に除去される。このような手順は、以前に報告されている（Ｂｒｏｘｍｅｙｅｒら、１９８４年、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．７３：９３９−９５３頁）。
【０２１２】
グリコホリンＡ抗体を使用いて、赤血球を含めるまたは除くように選択することができる。ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ６６ａおよびＣＤ６６ｂに対する抗体を使用して、単球を含めるまたは除くように選択することができる。ＣＤ２４、ＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ５６、ＣＤ２に対する抗体を使用して、Ｂリンパ球およびＴリンパ球およびＮＫ細胞を含めるまたは除くように選択することができる。ＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ３６に対する抗体を使用して、Ｔ細胞、Ｂ細胞、顆粒球、血小板、単球、分化した赤血球前駆体、および一部のコミットした成熟プロジェニターを含めるまたは除くように選択することができる。例えば、米国特許第５、８７７、２９９号を参照されたい。他のＴ細胞マーカーには、ＣＤ７、ＣＤ５、ＴＣＤ−２、およびＣＤ４またはＣＤ８が含まれる。ＣＤ７および末端デオキシリボヌクレオチジルトランスフェラーゼ（Ｔｄｔ）は、プレＴプロジェニター細胞のマーカーである。プレＢプロジェニター細胞の更なるマーカーは、ＭＨＣクラスＩＩ抗原である。成熟Ｂ細胞は、ＣＤ２１の発現によってさらに特徴づけられる。例えば、Ｒａｓｋａ  ａｎｄ  Ｐｏｎｚｉｏ、１９９４、「Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ：Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」、ＳｉｇａｌおよびＲｏｎ編、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ、Ｉｎｃを参照されたい。
【０２１３】
特定の実施形態において、現在利用可能であり、濃縮プロトコールで使用することができる抗体としては、Ｍｙ−１０および３Ｃ５（ＣＤ３４を認識する）またはＲＦＢ−１（ＣＤ９９を認識し（Ｐｅｔｔｙ  ａｎｄ  Ｔｉｐｐｅｔｔ、１９９５年、Ｖｏｘ  Ｓａｎｇ  ６９（３）：２３１−５頁）、ＢＦＵ−Ｅ細胞の集団を同定する（Ｋａｎｎｏｕｒａｋｉｓ  ａｎｄ  Ｊｏｈｎｓｏｎ、１９８８年、Ｂｌｏｏｄ  ７１（３）：７５８−６５頁）が挙げられる。上記の造血抗原に対する他の現在利用可能な抗体は、米国特許第５、８７７、２９９号に開示されている。これらの抗体は、単独で、または「パニング」（Ｂｒｏｘｍｅｙｅｒら、１９８３年、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．７３：９３９−９５３頁）または蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）（Ｗｉｌｌｉａｍｓら、１９８５年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３５：１００４頁；Ｌｕら、１９８６年、Ｂｌｏｏｄ  ６８（１）：１２６−１３３頁）などの手順を併用して、モノクローナル抗体によって認識される表面決定基を含むそれらの細胞を単離することができる。
【０２１４】
使用することができる別の方法は、ダイズなどのレクチンを用いた選択的凝集によって幹細胞およびプロジェニター細胞を分離する方法である（Ｒｅｉｓｎｅｒら、１９８０年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７７：１１６４頁）。この手順は、おそらく必要なアクセサリー細胞を除去することなく、幹細胞およびプロジェニター細胞を分離および濃縮するための実行可能な代替物であり得る（Ｒｅｉｓｎｅｒら、１９８３年、Ｂｌｏｏｄ  ６１（２）：３４１−３４８頁；Ｒｅｉｓｎｅｒら、１９８２年、Ｂｌｏｏｄ  ５９（２）：３６０−３６３頁）。
【０２１５】
理論的には、造血系全体の再増殖のために初期の幹細胞は１つだけ必要である。理想的な条件下で、レシピエント動物の幹細胞およびプロジェニター細胞を育成する微小環境が影響を受けない場合、単一の幹細胞は、マウスの造血系の欠損を完全に再増殖させ、致死的な貧血の合併症から救うことができるという実験的な証拠がある（Ｂｏｇｇｓら、１９８２年、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．７０：２４２−２５３頁）。間違いなく、ヒトの臨床条件下では、一般的に、造血系を救うために１を超える幹細胞を必要とする。さらに、特に、宿主の微環境が照射または化学療法などの処置によって傷害を受ける場合には、幹細胞およびプロジェニター細胞に加えて、アクセサリー細胞またはヘルパー細胞（幹細胞／プロジェニター細胞の増殖に影響を与える非幹細胞／プロジェニター細胞）の存在が必要とされ得る（Ｓｐｏｏｎｃｅｒら、１９８５年、Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３１６：６２−６４頁）。したがって、造血幹細胞およびプロジェニター細胞を他の臍帯血細胞から分離する方法があり（Ｌｅａｒｙら、１９８４年、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．７４：２１９３−２１９７頁）、これらの方法および他の方法を用いて、不死化および最終的には移植のためにこれらの細胞の純粋または高度に濃縮された調製物を単離し、保存することができるが、幹細胞およびプロジェニター細胞の精製された調製物を用いて患者を移植する試みには注意が必要である。
【０２１６】
６．４．２．間葉系幹細胞
治療用途に用いられる前駆細胞の最も重要なタイプのうちの１つは間葉由来のものである。間葉系幹細胞は、インビトロまたはインビボの微小環境に依存して、種々の系統（例えば、ステロイド、軟骨形成、腱形成、脂肪産生、筋原性系統など）の細胞に分化することができる骨髄、血液、真皮および骨膜に見出される多分化能性細胞である。（Ｃａｐｌａｎ、１９９１年、Ｊ．Ｏｒｔｈ．Ｒｅｓ．６４１−６５０頁）。今日までのほとんどの研究は、軟骨細胞および骨芽細胞に分化することができる細胞の単離および培養を伴う。関連するプロジェニター細胞集団を単離するために開発されたシステムは、ニワトリ胚において最初に研究された（Ｃａｐｌａｎ、１９７０年、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ．Ｒｅｓ．６２：３４１−３５５頁；Ｃａｐｌａｎ、１９８１年、３９ｔｈ  Ａｎｎｕａｌ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、３７−６８頁；Ｃａｐｌａｎら、１９８０、Ｄｉｌａｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｔｅｒｉｎｅ  Ｃｅｒｖｉｘ  ７９−９８頁；ＤｅＬｕｃａら、１９７７年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２：６６００−６６０８頁；Ｏｓｄｏｂｙら、１９７９年、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．７３：８４−１０２頁；Ｓｙｆｔｅｓｔａｄら、１９８５年、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１１０：２７５−２８３頁）。
【０２１７】
Ｃａｐｌａｎら、１９９３年およびＣａｐｌａｎら、１９９６年の米国特許第５、２２６、９１４号および同第５、４８６、３５９号は、骨髄から間葉系幹細胞を単離するための例示的な方法を記載している。これらの単離された骨髄幹細胞は、Ｎｏｔｃｈ  １アゴニスト、Ｎｏｔｃｈ  ２アゴニスト、またはＮｏｔｃｈ  １アゴニストおよびＮｏｔｃｈ  ２アゴニスト、ならびに増殖を促進するが、分化を促進しない増殖因子を用いて不死化することができる。次に、これらの前駆細胞は、例えば、分化を促進させる増殖因子の存在下で増殖させることにより、さらに分化されてもよい。細胞は、好ましくは、骨細胞、軟骨、軟骨細胞、脂肪細胞などに分化される。
【０２１８】
いくつかの骨髄単離プロトコールが報告されており、前駆細胞を得るために使用することができる。ラット骨髄由来の単一の細胞懸濁液は、Ｇｏｓｈｉｍａら、１９９１年、Ｃｌｉｎ．Ｏｒｔｈ．ａｎｄ  Ｒｅｌ．Ｒｅｓ．２６２：２９８−３１１頁に従って調製し得る。骨髄由来のヒト幹細胞培養物は、以下のように、Ｂａｂら、１９８８年、Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒａｌ  ４：３７３−３８６頁に記載されているように調製することができる：全骨髄細胞を被験体から得る。骨髄サンプルは、腸骨稜または大腿骨の中軸から分離される。容量３ｍｌの骨髄サンプルを、５０Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび０．０５ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン硫酸を含有する６ｍｌの無血清最小必須培地（ＭＥＭ）に移す。主に単一細胞の懸濁液は、以前に記載されるように（Ｂａｂら、１９８４年、Ｃａｌｃｉｆ．Ｔｉｓｓｕｅ  Ｉｎｔ．３６：７７−８２頁；Ａｓｈｔｏｎら、１９８４年、Ｃａｌｃｉｆ．Ｔｉｓｓｕｅ  Ｉｎｔ．３６：８３−８６頁）、調製物をシリンジに引き入れ、数回、連続して、１９、２１、２３および２５ゲージの針を通して吐き出すことによって調製される。固定体積の血球計を用いて細胞を計数し、懸濁液１ｍｌあたり１−５×１０８個の全骨髄細胞に濃度を調整する。陽性および陰性対照の細胞懸濁液は、ウサギの全骨髄および脾臓細胞をそれぞれ用いて、以前に記載されるように設定することができる（Ｓｈｔｅｙｅｒら、１９８６年、Ｃａｌｃｉｆ．Ｔｉｓｓｕｅ  Ｉｎｔ．３９：４９−５４頁）。
【０２１９】
６．４．３．線維芽細胞
結合組織は、線維芽細胞、軟骨、骨、脂肪および平滑筋細胞を含む。線維芽細胞は、結合組織細胞のうち最も分化しておらず、体内の結合組織に分散している。それらは、Ｉ型および／またはＩＩＩ型コラーゲンの特徴的な分泌によって同定することができる。線維芽細胞は、組織の創傷に移動し、創傷を治癒させて分離するコラーゲンマトリックスを分泌する。さらに、それらは、それらの局所手掛かりに応じて、結合組織ファミリーの他のメンバーに分化することができる。線維芽細胞は、当業者に公知の方法に従って、骨髄間質を含むがこれに限定されない種々の異なる組織から単離することができる。
【０２２０】
６．４．４．神経幹細胞
一般的に、中枢神経系の神経新生は、出生前または出生直後に停止すると考えられている。近年、いくつかの研究が、少なくともある程度まで、新しいニューロンが成体脊椎動物の脳に継続して添加されていることを示す証拠を示している（Ａｌｖａｒｅｚ−Ｂｕｙｌｌａ  ａｎｄ  Ｌｏｉｓ、１９９５年、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ（Ｄａｙｔ）１３：２６３−２７２頁）。前駆体は、一般的に脳室の壁に局在する。これらの増殖性領域から、ニューロン前駆体は、微小環境がそれらを誘導して分化させる標的位置に向かって移動すると考えられる。脳室下帯からの細胞がインビボおよびインビトロの両方でニューロンを産生することができ、Ａｌｖａｒｅｚ−Ｂｕｙｌｌａ  ａｎｄ  Ｌｏｉｓ、１９９５年、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ（Ｄａｙｔ）１３：２６３−２７２頁に概説されている研究が報告されている。
【０２２１】
成体脳由来のニューロン前駆体は、神経移植のための細胞源として使用することができる（Ａｌｖａｒｅｚ−Ｂｕｙｌｌａ、１９９３年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：２０７４−２０７７頁）。また、神経堤細胞は、多分化能性ニューロン細胞であることが長く認識されており、それは、自分自身が発見した微小環境から受ける指示に従って、異なる細胞の神経細胞型に移動して分化することができる（ＬｅＤｏｕａｒｉｎ  ａｎｄ  Ｚｉｌｌｅｒ、１９９３年、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．５：１０３６−１０４３頁）。
【０２２２】
６．４．５．胎児細胞
本開示の特定の実施形態において、前駆細胞は、例えば、生涯のうち遅い時点で必要とされるまで培養するための胎児細胞であり得る。胎児の血液は、当該技術分野において公知である任意の方法によって得ることができる。例えば、胎児の血液は、超音波によって（Ｄａｆｆｏｓら、１９８５年、Ａｍ．Ｊ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．１５３：６５５−６６０頁；Ｄａｆｆｏｓら、１９８３年、Ａｍ．Ｊ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．１４６：９８５頁）、プラセントセンチシス（ｐｌａｃｅｎｔｏｃｅｎｔｉｓｉｓ）（Ｖａｌｅｎｔｉ、１９７３年、Ａｍ．Ｊ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．１１５：８５１頁；Ｃａｏら、１９８２年、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．１９：８１頁）によって、胎児鏡検査（Ｒｏｄｅｃｋ、１９８４年、ｉｎ  Ｐｒｅｎａｔａｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ、Ｒｏｄｅｃｋ、Ｃ．Ｈ．ａｎｄ  Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ、Ｋ．Ｈ．、編集、Ｒｏｙａｌ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｏｂｓｔｅｔｒｉｃｉａｎｓ  ａｎｄ  Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｉｓｔｓ、Ｌｏｎｄｏｎ）等によって誘導される針を使用して胎盤根の胎児循環から採取することができる。特定の実施形態において、胎児細胞は、臍帯血、胎盤血またはＷｈａｒｔｏｎゼリーから取得される。Ｗｈａｒｔｏｎゼリーは、一般的に、緩い粘液結合組織とみなされている臍帯に見出されるゼラチン状物質であり、繊維芽細胞、コラーゲン線維および主にヒアルロン酸で構成されるアモルファス基質物質からなると頻繁に記載されている（Ｔａｋｅｃｈｉら、１９９３年、Ｐｌａｃｅｎｔａ  １４：２３５−４５頁）。
【０２２３】
あるいは、本開示の前駆細胞は、新生児の血液から得ることができる。新生児の血液は、好ましくは、臍帯からの直接排液によって、および／または腐敗部および拡張静脈での送達された胎盤からの針吸引によって得ることができる。
【０２２４】
回収は無菌条件下で行う必要がある。回収直後に、新生児または胎児の血液を抗凝固剤と混合する必要がある。このような抗凝固剤は、限定されないが、ＣＰＤ（クエン酸塩−リン酸塩−デキストロース）、ＡＣＤ（クエン酸−デキストロース）、Ａｌｓｅｖｅｒ溶液（ＡｌｓｅｖｅｒおよびＡｉｎｓｌｉｅ、１９４１年、Ｎ．Ｙ．Ｓｔ．Ｊ．Ｍｅｄ．４１：１２６頁）、ＤｅＧｏｗｉｎ溶液（ＤｅＧｏｗｉｎら、１９４０年、Ｊ．Ａｍ．Ｍｅｄ．Ａｓ．１１４：８５０頁）、Ｅｄｇｌｕｇａｔｅ−Ｍｇ（Ｓｍｉｔｈら、１９５９年、Ｊ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．３８：５７３頁）、Ｒｏｕｓ−Ｔｕｒｎｅｒ溶液（Ｒｏｕｓ  ａｎｄ  Ｔｕｒｎｅｒ、１９１６年、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２３：２１９頁）、他のグルコース混合物、ヘパリン、エチルビススコマメートなどを含み、当該技術分野において公知である。（Ｈｕｒｎ、１９６８年、Ｓｔｏｒａｇｅ  ｏｆ  Ｂｌｏｏｄ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、２６−１６０頁）。
【０２２５】
ヒト胎児脳細胞の初代培養は、妊娠５から１２週間後の法的流産から得られたヒト胎児から単離することができる。排出は、心エコー検査下で注射器駆動の穏やかな吸引によって行うことができる。
【０２２６】
６．４．６．上皮性幹細胞およびケラチノサイト
上皮幹細胞（ＥＳＣ）およびケラチノサイトは、公知の手順（Ｒｈｅｉｎｗａｌｄ、１９８０年、Ｍｅｔｈ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ．２１Ａ：２２９頁）により、皮膚および消化管の内層などの組織から得ることができる。皮膚などの重層化した上皮組織において、再生は、基底層に最も近い層である胚層内の前駆細胞の有糸分裂によって起こる。消化管の内層の前駆細胞は、この組織の迅速な再生速度を提供する。被験体またはドナーの皮膚または消化管の内層から得られたＥＳＣ（Ｒｈｅｉｎｗａｌｄ、１９８０年、Ｍｅｔｈ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ．２１Ａ：２２９頁；ＰｉｔｔｅｌｋｏｗおよびＳｃｏｔｔ、１９８６、Ｍａｙｏ  Ｃｌｉｎｉｃ  Ｐｒｏｃ．６１：７７１頁）は、本開示の以下の方法に従って不死化することができる。
【０２２７】
６．４．７．肝幹細胞
肝幹細胞は、１９９４年４月２８日付けＰＣＴ公開公報第ＷＯ９４／０８５９８号に記載される方法によって単離することができる。
【０２２８】
６．４．８．腎幹細胞
哺乳動物の腎臓は、尿管芽を誘導して一連の形態形成を行い、最終的には成熟した尿収集系を形成する後腎間葉から発生する（ＮｉｇａｍおよびＢｒｅｎｎｅｒ、１９９２年、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．Ｈｕｐｅｒ  １：１８７−１９１頁）。尿管芽は、ウォルフ管の上皮性の増殖したもので、初期胚の時期において、上皮の多様化の分化経路に伴って隣接する間葉の凝縮を行い、それを誘導する。このプロセスをインビトロで研究しようという試みが報告されている；器官培養中で後腎は、胚性脊髄を誘導因子として用いて、誘導して尿細管を形成させることができる。インビボでの尿管芽による、もしくはインビトロでの脊髄による、後腎間葉の誘導をもたらすような特異的な形質導入物質は知られていないが、細胞特異的マーカーは、プロジェニター細胞中では分化のプログラムが誘導されることを示す（Ｋａｒｐら、１９９４年、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．９１：５２８６−５２９０頁）。
【０２２９】
６．５  前駆細胞の分化
本開示は、本開示の方法に従って、それらの不死化の前、後または同時に前駆細胞を分化するための方法を提供する。前駆細胞の分化は、分化を促進する１つ以上の増殖因子に細胞を曝露し、および分化が起こり得る条件下で細胞を増殖させることによって達成される。前駆細胞またはそれらの不死化した子孫を分化させるための増殖因子としては、上述のセクション４．２に記載されているものが含まれる。前駆細胞の分化を促進する増殖因子の選択は、前駆細胞タイプに依存し、当業者に公知である。例えば、セクション４．２に記載されているように、不死化したＨＳＣは、細胞を１００ｎｇ／ｍｌのＳＣＦおよびＩＬ−７に曝露することによってリンパ系幹細胞に分化され、細胞をそれぞれ１００ｎｇ／ｍｌのＳＣＦおよびＧＭ−ＣＳＦに曝露することによって骨髄系幹細胞に分化させる。特定の場合において、異なる増殖因子と組み合わせることによって、増殖因子を分化と増殖の両方のために使用することができる；例えば、ＳＣＦは、単独でまたはＩＬ−６、ＩＬ−１１およびＦｌｔ−３Ｌと組み合わせて使用して、（ＨＳＣが通常ならばそれを過ぎると増殖を停止しおよび／または死滅させるはずの期間、ＨＳＣをＳＣＦ（および任意選択的にＩＬ−６、ＩＬ−１１およびＦｌｔ−３Ｌ）およびＮｏｔｃｈ  １アゴニスト、Ｎｏｔｃｈ  ２アゴニストまたはＮｏｔｃｈ  １アゴニストおよびＮｏｔｃｈ  ２アゴニストに曝露することにより）ＨＳＣを不死化することができ、ＩＬ−７またはＧＭ−ＣＳＦと組み合わせて使用して、それぞれリンパ系幹細胞または骨髄系幹細胞に不死化したＨＳＣの分化を促進することができる。
【０２３０】
６．６  開示の培養細胞の治療的使用
本開示は、前駆細胞の不死化および任意選択的に分化を可能にする方法を提供する。特定の実施形態において、得られた細胞を細胞治療に使用する。限定ではなく一例として、以下のセクションでは、本開示の方法によって産生される細胞を用いて、造血障害および神経組織に対する損傷の治療のための例示的な実施形態を記載する。しかしながら、不死化または分化した細胞は、いずれもの欠損した細胞集団を補充するために有用であり、または前駆細胞タイプの治療用細胞集団もしくは遺伝子治療ベクターとして供給し得る（下記セクション４．８参照）。さらに、前駆細胞を、例えば、不死化の前後で凍結することにより保存することができる（下記セクション４．７参照）。
【０２３１】
６．６．１．造血障害
不死化したＨＳＣまたは分化した造血細胞の移植は、造血性の障害および疾患の治療または予防に有用であり得る。一実施形態において、不死化または分化した細胞は、正常な血液細胞の産生および細胞成熟における損傷または機能不全によって特徴づけられる造血性の障害または疾患を治療または予防するために用いられる。別の実施形態では、不死化または分化した細胞は、造血性の悪性腫瘍にから生じる造血性の障害または疾患を治療または予防するために用いられる。更なる別の実施形態において、不死化または分化した細胞は、免疫抑制、特に悪性の固体腫瘍を患う被験体における免疫抑制から生じる造血性の障害または疾患を治療または予防するために用いられる。更なる別の実施形態において、不死化または分化した細胞は、造血系を冒す自己免疫疾患を治療または予防するために用いられる。更なる別の実施形態において、不死化または分化した細胞は、遺伝的もしくは先天性の造血性の障害または疾患を治療または予防するために用いられる。被験体における造血性の疾患または障害の治療に用いられる分化した細胞のタイプは、被験体の状態を改善するように選択され、例えば、貧血を治療するための赤血球経路に沿って分化した細胞が挙げられる。
【０２３２】
本開示の不死化および／または分化した細胞によって治療することができる特定の造血性の疾患および障害の例には、限定されないが、表２に列挙されたものが含まれる。
【０２３３】
【表２】
0006641299.tif 000004
0006641299.tif 000005
0006641299.tif 000006
【０２３４】
一実施形態において、不死化または分化した細胞は、造血欠陥を伴う被験体に投与される。この実施形態の１つの様式において、不死化または分化した細胞は、造血欠陥と診断された胎児に出生前に投与される。
【０２３５】
本開示の不死化または分化した細胞を用いた治療が本開示の方法によって包含される造血欠陥には、限定されないが、表２に列挙されるものを含む、造血系における骨髄系、赤血球系、リンパ球系もしくは巨核球系の細胞、またはそれらの組合せのレベル減少が含まれる。造血疾患もしくは障害の治療または予防に使用される分化した細胞のタイプは、それが被験体の造血欠陥を補完するように選択される；例えば、リンパ球経路に沿って分化した不死化ＨＳＣは、ＡＩＤＳの個体を治療するために使用される。
【０２３６】
本開示の細胞株を用いた治療に効果が得やすい状態には、末梢血中を循環する白血球細胞（白血球）の数の減少である白血球減少症がある。白血球減少症は、ある種のウイルスまたは放射線への暴露によって誘発されることがある。白血球減少症は、例えば、化学療法剤、放射線への暴露などの多様な形態の癌治療の副作用、および感染または出血の副作用であることが多い。
【０２３７】
不死化したＨＳＣまたは分化した造血細胞はまた、好中球減少症の治療または予防において有用であり得て、例えば、再生不良性貧血、周期性好中球減少症、特発性好中球減少症、チェディアック・東症候群、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、白血病、骨髄異形成症候群、骨髄線維症、血小板減少症などの状態の治療において有用であり得る。重度の血小板減少症は、ファンコーニ貧血、ウィスコット・アルドリッチ症候群またはメイ・ヘグリン症候群などの遺伝的な欠損、ならびに化学療法および／または放射線治療もしくは癌によって生ずることがある。後天性の血小板減少症は、免疫性血小板減少性紫斑病、全身性狼瘡エリスロマトーシス、溶血性貧血または胎児母子不適合として自己抗体または同種抗体によって生ずることがある。さらに、脾腫大、播種性血管内凝固症候群、血栓性血小板減少性紫斑病、感染または心臓人工弁が、血小板減少症を生じさせることがある。血小板減少症はまた、癌腫、リンパ腫、白血病または線維症による骨髄浸潤によって生ずることがある。
【０２３８】
多数の薬剤が、骨髄抑制または造血欠陥を引き起こす場合がある。このような薬剤の例としては、化学療法において用いられるＡＺＴ、ＤＤＩ、アルキル化剤および代謝拮抗物質、クロラムフェニコール、ペニシリン、ガンシクロビル、ダウノマイシンおよびサルファ剤などの抗生物質、フェノチアジン、メプロバメートなどの精神安定薬、アミノピリンおよびジピロンなどの鎮痛剤、フェニトインまたはカルバマゼピンなどの抗痙攣薬、プロピルチオウラシルおよびメチマゾールなどの抗含甲状腺薬、ならびに利尿剤がある。不死化したＨＳＣの移植は、これらの薬剤を用いて治療を受けた被験体においてしばしば発症する骨髄抑制または造血欠陥を予防または治療するために用いることができる。
【０２３９】
造血欠陥はまた、ウイルス性、微生物性または寄生虫性の感染症の結果、および、例えば透析などの腎疾患または腎不全に対する治療の結果、発症することがある。不死化したＨＳＣの移植は、このような造血欠陥の治療に有用であり得る。
【０２４０】
例えばＴリンパ球および／またはＢリンパ球における様々な免疫不全、もしくは、例えば関節リウマチなどの免疫障害もまた、不死化したＨＳＣを用いた治療によって有益に影響を与える可能性がある。免疫不全は、ウイルス性感染（例えば、限定されないが、ＨＩＶ、ＨＴＬＶＩ、ＨＴＬＶＩＩ、ＨＴＬＶＩＩＩなどを含む）、放射線に対する重度の曝露、癌治療または他の医療の結果であり得る。
【０２４１】
６．６．２．神経系障害および損傷の治療
補足または置換を必要とし、不死化または分化した細胞の移植によって補充することができる細胞型に関与する神経系障害は、本開示の方法によって治療することができる。これらには、限定されないが、神経系損傷、および軸索の切断、ニューロンの減少もしくは変性、または脱髄のいずれかをもたらす疾患または障害が含まれる。本開示による被験体（ヒトおよび非ヒト哺乳動物被験体を含む）において処置され得る神経系病変には、限定されないが、中枢神経径（脊髄、脳を含む）または末梢神経系のいずれかの以下の病変が含まれる：（ｉ）例えば、神経系の一部を切断する病変または圧迫傷害など、外傷または外科手術に関連する病変を含む外傷性病変；（ｉｉ）神経系の一部における酸素の欠如が、脳梗塞または虚血、または脊髄梗塞または虚血を含むニューロンの損傷または死をもたらす虚血性病変；（ｉｉｉ）神経系の一部が、悪性組織に関連する神経系または非神経系組織に由来する悪性腫瘍のいずれかである悪性組織によって破壊または損傷される悪性病変；（ｉｖ）神経系の一部が、感染の結果として、例えば、膿瘍による感染の結果として、あるいはヒト免疫不全ウイルス、帯状ヘルペスもしくは単純ヘルペスウイルスによる感染、またはライム病、結核、梅毒と関連した結果として破壊または損傷される感染性病変；（ｖ）神経系の一部が、限定されないが、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン舞踏病または筋萎縮性側索硬化症と関連した変性を含む変性プロセスの結果として破壊または損傷される変性病変；（ｖｉ）神経系の一部が、限定されないが、ビタミンＢ１２欠乏症、葉酸欠乏症、ヴェルニケ病、タバコ−アルコール弱視、マリアアファヴァ・ビグナミ病（脳梁の一次変性）およびアルコール性小脳変性症を含む栄養障害または代謝障害によって破壊または損傷される病変；（ｖｉｉ）限定されないが、糖尿病（糖尿病性神経障害、ベル麻痺）、全身性エリテマトーデス、癌腫またはサルコイドーシスを含む全身性疾患にと関連付けられた神経学的病変；（ｖｉｉｉ）アルコール、鉛または特定の神経毒を含む有毒物質によって引き起こされる病変；ならびに（ｉｘ）神経系の一部が、限定されないが、多発性硬化症、ヒト免疫不全ウイルス関連脊髄症、横断性脊髄症または種々の病因、進行性多巣性白質脳症、および中枢性ミエリン分解を含む脱髄疾患によって破壊または損傷される脱髄病変。
【０２４２】
特定の実施形態において、本開示に従って治療することができる運動ニューロン障害には、限定されないが、梗塞、感染、毒素への曝露、外傷、外科的損傷、変性疾患、運動ニューロンならびに神経系の他の成分に影響を及ぼし得る悪性腫瘍などの障害、ならびに筋萎縮性側索硬化症などのニューロンに選択的に影響を及ぼす障害、限定されないが、進行性脊髄性筋萎縮症、進行性球麻痺、原発性側索硬化症、乳児および若年性筋萎縮、小児期進行性球麻痺（Ｆａｚｉｏ−Ｌｏｎｄｅ症候群）、ポリオウイルス感染症およびポストポリオ症候群および遺伝性運動感覚ニューロパシー（シャルコー・マリー・ツース病）を含む障害が含まれる。
【０２４３】
上記実施形態は単なる例示であり；本開示の不死化および／もしくは分化した細胞またはその子孫は、細胞または組織の補充を必要とする疾患の治療に使用され得ることを当業者は理解する。
【０２４４】
６．７  前駆細胞の保存
特定の実施形態において、本開示の前駆細胞は、（ｉ）不死化および任意選択的に分化の前に、または（ｉｉ）細胞とそれらのゲノムの完全性を維持しながら、不死化および任意選択的に分化の後に保存される。
【０２４５】
好ましい実施形態において、前駆細胞を凍結保存によって保存する。凍結はほとんどの生きた細胞にとって破壊的である。冷却すると、外部媒体が凍結するため、細胞は水を失うことによって平衡状態になり、したがって、細胞内の溶質濃度が上昇する。約１０℃−１５℃未満では、細胞内凍結が起こる。細胞内凍結と溶液効果の両方が細胞傷害の原因である（Ｍａｚｕｒ、１９７０年、Ｓｃｉｅｎｃｅ  １６８：９３９−９４９頁）。したがって、前駆細胞は、好ましくは、凍結生細胞の細胞損傷回避するために確立された方法、例えば、凍結保護剤の使用および最適な冷却速度を用いて凍結保存される（Ｍｅｒｙｍａｎら、１９７７年、Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４：２８７−３０２頁）。
【０２４６】
前駆細胞、不死化細胞および分化細胞もまた、凍結乾燥によって保存することができる（Ｓｉｍｉｏｎｅ、１９９２年、Ｊ．Ｐａｒｅｎｔｅｒ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．４６（６）：２２６−３２頁によって概説されている）。
【０２４７】
凍結保存は凍結乾燥よりも損傷をあまり与えないため、原液は、通常、液体窒素またはそれに類する温度で維持され、一方、作業溶液は凍結または凍結乾燥することができる。
【０２４８】
６．８  細胞の遺伝的操作
不死化細胞集団は、遺伝的に操作された細胞の被験体への移植に有益な遺伝子産物を産生するように遺伝子操作され得る。このような遺伝子産物には、限定されないが、抗炎症因子、例えば、抗ＴＮＦ、抗ＩＬ−１、抗ＩＬ−２が含まれる。あるいは、間葉系幹細胞およびプロジェニター細胞は、拒絶反応のリスクを低下させるためのＭＨＣの発現を「ノックアウト」するように遺伝子操作され得る。さらに、細胞集団は、遺伝子治療における使用のために遺伝的に操作して、被験体における遺伝子活性のレベルを調節して、移植の結果を助けもしくは改善することができ、または、例えば、組換え遺伝子の欠損によって引き起こされる疾患を治療することができる。細胞集団は、組換え核酸を前駆細胞または不死化細胞集団もしくは分化細胞集団に導入することによって、組換え体となる。
【０２４９】
その最も広い意味において、遺伝子治療は、被験体への核酸の投与によって行われる療法を指す。核酸は、そのコードされたタンパク質を介して直接的または間接的に、被験体における治療効果を媒介する。本開示は、治療値のタンパク質をコードする核酸（好ましくはヒトに対する）が、開示の方法に従って操作される前駆細胞に、操作の前後および不死化の前後に導入することで、核酸が、前駆細胞および／またはそれらの子孫によって発現可能となるようにし、続いて、組換え細胞を被験体に投与する遺伝子治療の方法を提供する。
【０２５０】
本開示の組換え細胞は、当該技術分野において利用可能な遺伝子治療のいずれかの方法において使用することができる。したがって、細胞に導入される核酸は、任意の所望のタンパク質、例えば、疾患または障害において欠損または機能不全であるタンパク質をコードしてもよい。以下の説明は、このような方法の例示を意図したものである。例示された方法は、遺伝子治療の利用可能な全ての方法のサンプルのみを表すことが、当業者に容易に理解される。
【０２５１】
遺伝子治療の方法の一般的な概説については、Ｌｕｎｄｓｔｒｏｍ、１９９９年、Ｊ．Ｒｅｃｅｐｔ．Ｓｉｇｎａｌ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔ．Ｒｅｓ．１９：６７３−６８６頁；Ｒｏｂｂｉｎｓ  ａｎｄ  Ｇｈｉｖｉｚｚａｎｉ、１９９８年、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．８０：３５−４７頁；Ｐｅｌｅｇｒｉｎら、１９９８年、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．９：２１６５−２１７５頁；Ｈａｒｖｅｙ  ａｎｄ  Ｃａｓｋｅｙ、１９９８年、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２：５１２−５１８頁；ＧｕｎｔａｋａおよびＳｗａｍｙｎａｔｈａｎ、１９９８年、Ｉｎｄｉａｎ  Ｊ．  Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．３６：５３９−５３５頁；ＤｅｓｎｉｃｋおよびＳｃｈｕｃｈｍａｎ、１９９８年、Ａｃｔａ  Ｐａｅｄｉａｔｒ．Ｊｐｎ．４０：１９１−２０３頁；Ｖｏｓ、１９９８年、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．８：３５１−３５９頁；ＴａｒａｈｏｖｓｋｙおよびＩｖａｎｉｔｓｋｙ、１９９８年、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｍｏｓｃ）６３：６０７−６１８頁；Ｍｏｒｉｓｈｉｔａら、１９９８年、Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．２：１０２３−１０２８頁；Ｖｉｌｅら、１９９８年、Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．Ｔｏｄａｙ  ４：８４−９２頁；Ｂｒａｎｃｈ  ａｎｄ  Ｋｌｏｔｍａｎ、１９９８年、Ｅｘｐ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．６：７８−８３頁；Ａｓｃｅｎｚｉｏｎｉら、１９９７年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．１１８：１３５−１４２頁；ＣｈａｎおよびＧｌａｚｅｒ、１９９７年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．７５：２６７−２８２頁を参照されたい。使用することができる組換えＤＮＡ技術の当該技術分野において一般的に知られている方法は、Ａｕｓｕｂｅｌら（編集）、１９９３年、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ＮＹ；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ、１９９０年、Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹに記載されている。
【０２５２】
組換え前駆細胞が遺伝子治療に使用される実施形態において、被験体において発現が望まれる遺伝子が前駆細胞に導入され、その結果、細胞および／またはそれらの子孫によって発現可能であり、次に、組換え細胞が治療効果のためにインビボで投与される。
【０２５３】
組換え細胞集団は、本開示を考慮した当業者によって認識されるように、遺伝子治療の任意の適切な方法において使用することができる。被験体に投与された組換え細胞集団の結果としての作用は、例えば、被験体において予め選択された遺伝子の活性化または阻害をもたらし、被験体を苦しめている疾患状態の改善をもたらすことができる。
【０２５４】
この実施形態において、所望の遺伝子は、得られた組換え細胞のインビボでの投与前に、前駆細胞またはその子孫に導入される。このような導入は、当該技術分野において公知の方法によって行うことができ、限定されないが、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション、リン酸カルシウム媒介性のトランスフェクション、遺伝子配列を含むウイルスベクターまたはバクテリオファージベクターによる感染、細胞融合、染色体媒介性の遺伝子導入、マイクロセル媒介性の遺伝子導入、スフェロプラスト融合が挙げられる。外来遺伝子を細胞に導入するための多数の技術が当該技術分野で知られ（例えば、ＬｏｅｆｆｌｅｒおよびＢｅｈｒ、１９９３年、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：５９９−６１８頁；Ｃｏｈｅｎら、１９９３年、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：６１８−６４４頁；Ｃｌｉｎｅ、１９８５年、Ｐｈａｒｍａｃ．Ｔｈｅｒ．２９：６９−９２頁を参照されたい）、レシピエント細胞の必要な発生的および生理学的機能が破壊されなければ、本開示に従って使用することができる。この技術は、細胞に遺伝子の安定した導入を提供することで、該遺伝子が細胞によって発現可能であり、好ましくはその細胞子孫によって遺伝可能であり、発現可能であるようにする必要がある。通常、導入方法には、細胞への選択マーカーの導入が含まれる。次に、細胞を選択下に置き、導入された遺伝子を取り込んで発現している細胞を単離する。その後、これらの細胞を被験体に送達する。
【０２５５】
遺伝子治療を実施する１つの共通の方法は、レトロウイルスベクターを使用することによる（Ｍｉｌｌｅｒら、１９９３年、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：５８１−５９９頁を参照されたい）。レトロウイルスベクターは、その遺伝子の発現を達成させるために、予め選択された遺伝子を組み込むように修飾されたレトロウイルスである。レトロウイルスの天然に存在するＤＮＡ配列の多くは、レトロウイルスベクターに不必要であることが見出されている。レトロウイルスの天然に存在するＤＮＡ配列のわずかなサブセットのみが必要である。一般的に、レトロウイルスベクターは、ウイルスゲノムのパッケージングおよび組み込みに必要なシス作用配列の全てを含有しなければならない。これらのシス作用配列は、（ａ）ベクターの各末端にある長い末端反復配列（ＬＴＲ）またはその一部；（ｂ）マイナス鎖およびプラス鎖のＤＮＡ合成のためのプライマー結合部位；ならびに（ｃ）ビリオンへのゲノムＲＮＡの取り込みに必要なパッケージングシグナルである。
【０２５６】
遺伝子治療に使用される遺伝子をベクター中にクローニングし、細胞にベクターの感染または送達によって前駆細胞への遺伝子の送達を容易にする。レトロウイルスベクターに関するさらなる詳細は、Ｂｏｅｓｅｎら、１９９４年、Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ６：２９１−３０２頁に記載され、それは、幹細胞を化学療法に対してより耐性にするために、ｍｄｒ１遺伝子をＨＳＣに送達するためのレトロウイルスベクターの使用を記載している。遺伝子治療におけるレトロウイルスベクターの使用を説明する他の参考文献は、Ｃｌｏｗｅｓら、１９９４年、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９３：６４４−６５１頁；Ｋｉｅｍら、１９９４年、Ｂｌｏｏｄ  ８３：１４６７−１４７３頁；ＳａｌｍｏｎｓおよびＧｕｎｚｂｅｒｇ、１９９３年、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ４：１２９−１４１頁；ＧｒｏｓｓｍａｎおよびＷｉｌｓｏｎ、１９９３年、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌ．３：１１０−１１４頁である。
【０２５７】
アデノウイルスもまた遺伝子治療に使用されている。アデノウイルスは、呼吸前駆細胞に遺伝子を送達するための特に魅力的な媒体である。アデノウイルスはまた、肝臓、中枢神経系、内皮および筋肉から前駆細胞へ遺伝子を送達するために使用され得る。アデノウイルスは、非分裂細胞に感染することができるという利点を有する。ＫｏｚａｒｓｋｙおよびＷｉｌｓｏｎ、１９９３年、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ３：４９９−５０３頁は、アデノウイルスに基づく遺伝子治療の総説を提示している。遺伝子治療におけるアデノウイルスの使用の他の例は、Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、１９９１年、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２：４３１−４３４頁；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、１９９２年、Ｃｅｌｌ  ６８：１４３−１５５頁；Ｍａｓｔｒａｎｇｅｌｉら、１９９３年、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９１：２２５−２３４頁に見出すことができる。
【０２５８】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を遺伝子治療に使用することが提案されている（Ｗａｌｓｈら、１９９３年、Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．２０４：２８９−３００頁）。アルファウイルスを遺伝子治療に使用することもまた提案されている（Ｌｕｎｄｓｔｒｏｍ、１９９９年、Ｊ．Ｒｅｃｅｐｔ．Ｓｉｇｎａｌ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔ．Ｒｅｓ．１９：６７３−６８６頁）。
【０２５９】
遺伝子治療における遺伝子送達の他の方法には、哺乳動物人工染色体（Ｖｏｓ、１９９８年、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．８：３５１−３５９頁）；リポソーム（ＴａｒａｈｏｖｓｋｙおよびＩｖａｎｉｔｓｋｙ、１９９８年、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｍｏｓｃ）６３：６０７−６１８頁）；リボザイム（ＢｒａｎｃｈおよびＫｌｏｔｍａｎ、１９９８年、Ｅｘｐ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．６：７８−８３頁）；および三重らせんＤＮＡ（ＣｈａｎおよびＧｌａｚｅｒ、１９９７年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．７５：２６７−２８２頁）が含まれる。
【０２６０】
相同組換えにより、所望の遺伝子を細胞内に導入し、発現のために宿主前駆細胞ＤＮＡに組み込むことができる（ＫｏｌｌｅｒおよびＳｍｉｔｈｉｅｓ、１９８９年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：８９３２−８９３５頁；Ｚｉｊｌｓｔｒａら、１９８９年、Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：４３５−４３８頁）。
【０２６１】
具体的な実施形態において、遺伝子治療の目的で導入される前駆細胞またはその子孫において組換え発現される所望の遺伝子は、コード領域に作動可能に連結された誘導性プロモーターを含み、その結果、組換え遺伝子の発現は、適切な転写誘導因子の存在または不存在を制御することによって制御可能である。
【０２６２】
好ましい実施形態において、前駆細胞またはその子孫において組換え的に発現される所望の遺伝子は、Ｃｒｅ部位によって隣接される。遺伝子機能がもはや必要とされなくなったら、組換え遺伝子を含む細胞は、例えば、誘導性もしくは組織特異的なプロモーターに機能的に結合したＬｏｘコード配列を含む核酸を供給する手段によって、または核内在化シグナルに機能的に結合したＬｏｘタンパク質を供給することによって、Ｌｏｘタンパク質に供される。Ｌｏｘリコンビナーゼは、プロセスにおいて介在配列を切り出す、この実施形態によれば、所望の遺伝子の核酸を含有する、Ｃｒｅ配列（Ｈａｍｉｌｔｏｎら、１９８４年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７８：４８１−４８６頁）を組み換えるように機能する。この実施形態によれば、所望の遺伝子の核酸を含むプロセスにおける介在配列を切り出す。この方法は、組換え遺伝子発現を首尾よく操作するために使用されている（Ｆｕｋｕｓｈｉｇｅら、１９９２年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：７９０５−７９０９頁）。あるいは、ＦＬＰ／ＦＲＴ組換えシステムを用いて、部位特異的組換えを介して遺伝子の存在および発現を制御することができる（ＢｒａｎｄおよびＰｅｒｒｉｍｏｎ、１９９３年、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １１８：４０１−４１５頁）。
【０２６３】
６．９  移植法
不死化および／または分化した細胞集団は、所望の遺伝子を組換え的に発現するか否かにかかわらず、疾患または損傷の処置のために、または移植される幹細胞のタイプおよび移植部位に適している、当該技術分野において公知の任意の方法による遺伝子治療のために被験体に移植することができる。ＨＳＣまたはより分化した誘導体は、肝臓に位置する肝細胞と同様に、静脈内に移植することができる。神経幹細胞は、損傷または疾患の部位で、脳内に直接移植することができる。
【０２６４】
好ましい実施形態において、移植のための不死化または分化した細胞を含む細胞集団を精製しまたは少なくとも高度に濃縮する。上記のセクション４．４の前駆細胞について記載された細胞集団の精製および富化を説明する方法（例えば、ＦＡＣＳ、ＭＡＣＳなど）は、移植のための細胞集団の精製または富化に適用可能である。
【０２６５】
一実施形態において、不死化細または分化した細胞の移植は自己由来である。自己移植は、例えば、不死化または分化した細胞が遺伝子工学的に操作されて、そうでなければ被験体において欠損している遺伝子を発現する場合に行うことができる。不死化または分化した細胞の自己移植を行って、化学療法によって枯渇した造血細胞集団を被験体において再構成することができる。好ましくは、化学療法への患者の曝露前に、本開示の方法に従って不死化のためにＨＳＣを単離し、化学療法への曝露後に患者に移植された不死化または分化した細胞を単離する。
【０２６６】
別の実施形態において、不死化または分化した細胞の移植は非自己である。この実施形態は、例えば、被験体自身の細胞が存在しない、もしくは培養を確立するために数が少なすぎる場合、または被験体が体外移植手順を受けるにはあまりにも病弱である場合に実施される。非自己移植は、好ましくは、拒絶反応を抑制する方法と組み合わせて使用される。
【０２６７】
導入方法には、限定されないが、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内および硬膜外の経路が含まれる。細胞集団は、任意の好都合な経路によって投与され得て、例えば、注入またはボーラス注射、上皮または粘膜皮膚内層（例えば、口腔粘膜、直腸および腸粘膜など）を介した吸収が挙げられ、他の生物学的に活性な薬剤と一緒に投与されてもよい。投与は、全身または局所であり得る。さらに、脳室内および髄腔内注射を含む任意の適切な経路によって、本開示の医薬組成物を中枢神経系に導入することが望ましい場合がある；脳室内注射は、例えば、Ｏｍｍａｙａリザーバーなどのリザーバーに取り付けられた脳室内カテーテルによって促進され得る。
【０２６８】
特定の実施形態において、本開示の細胞集団を、処置を必要とする領域に局所的に投与することが望ましい場合がある；これは、例えば、限定する目的ではなく、手術中の局所注入、局所適用、例えば、手術後の創傷被覆材との組み合わせたもの、注入、カテーテルの手段、またはインプラントの手段によって達成することができ、インプラントは、シアラスティック膜などの膜または繊維を含む多孔質、非多孔質またはゼラチン状物質である。
【０２６９】
一例として、脳への細胞の移植は、以下のように行うことができる。移植は、定位固定技術（Ｌｉｎｄｖａｌｌら、１９８９年、Ａｒｃｈ．Ｎｅｕｒｏｌ．４６：６１５頁）を用いて、左被殻の３つの部位で行われる。各部位について、２０μｌの解離した細胞を器具（外径１．０ｍｍ）に引き込む。細胞をそれぞれ１０、１２および１４ｍｍの線状管に沿って、２．５μｌずつ１５から２０秒間注入する。各注入の間に２分の遅延があり、カニューレは１．５から１．７ｍｍ後退させる。最終の注射後、カニューレを８分間その場で放置し、その後、脳からゆっくりと抜き取る。手術後、Ｂｒｕｎｄｉｎら、１９８５年（Ｂｒａｉｎ．Ｒｅｓ．３３１：２５１頁）の手順に従って、細胞生存率を評価する。
【０２７０】
好ましい実施形態において、細胞移植は自己由来である。別の実施形態において、移植は非自己である。特定の実施形態において、移植された細胞は、本開示の方法に従って産生される臓器型または組織型であり得る。
【０２７１】
特定の障害または状態の治療に有効である移植された幹細胞の力価は、障害または状態の性質に依存し、標準的な臨床技術によって決定することができる。さらに、最適な投薬量範囲を同定するのを助けるために、インビトロアッセイを任意選択的に用いることができる。製剤に使用される正確な投薬量はまた、投与経路および疾患または障害の重症度に依存し、施術者の判断および各被験体の状況に従って決定されるべきである。
【０２７２】
被験体は、好ましくは、限定されないが、ウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌなどの動物であり、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトである。
【０２７３】
６．１０  医薬組成物
本開示は、本開示の方法に従って前駆細胞を不死化させ、任意選択的に分化させることによって産生される治療有効量の組換えまたは非組換え細胞を含む医薬（治療）組成物を被験体に投与することによる治療方法を提供する。好ましい態様において、不死化または分化した細胞を実質的に精製する。
【０２７４】
本開示は、医薬組成物を提供する。このような組成物は、治療有効量の不死化細胞、および医薬として許容される担体または賦形剤を含む。このような担体には、限定されないが、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノールおよびこれらの組合せが含まれる。担体および組成物は無菌であり得る。製剤は、投与様式に適合すべきである。
【０２７５】
組成物は、必要に応じて、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含有することもできる。組成物は、液体溶液、懸濁液またはエマルジョンであり得る。
【０２７６】
好ましい実施形態において、組成物は、ヒトへの静脈内投与に適合した医薬組成物として、日常的な手順に従って処方される。典型的には、静脈内投与のための組成物は、滅菌等張水性緩衝液中の溶液である。必要に応じて、組成物はまた、可溶化剤および注射部位での痛みを緩和するためのリグノカインなどの局所麻酔剤を含み得る。
【０２７７】
６．１０．１．医薬用キット
本開示はまた、本開示の方法によって産生された１つ以上の細胞集団および／もしくは細胞を調製するための試薬で、または細胞を遺伝子操作するための試薬で充填された１つ以上の容器を含む医薬用パックまたはキットを提供する。
【０２７８】
好ましい実施形態において、本開示のキットは、１つ以上の容器に、前駆細胞の増殖を促進するが、分化させない１つ以上の精製された増殖因子、ならびにＮｏｔｃｈ  １アゴニストおよび／またはＮｏｔｃｈ  ２アゴニストを含み、増殖因子およびＮｏｔｃｈ  １アゴニストならびに／またはＮｏｔｃｈ  ２アゴニストはともに、培養中、それらに曝露された前駆細胞を不死化するのに有効である。任意選択的にキットは、前駆細胞の分化を促進する１つ以上の精製された増殖因子を別個の容器にさらに含む。任意選択的に細胞培養培地もまた提供される。任意選択的にこのような容器に付随するものは、医薬品または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府機関によって規定された形態の通知であり得て、この通知は、ヒト投与のための製造、使用または販売の代理店による承認を反映する。
【０２７９】
実験的な実施形態
１．不死化した前駆細胞集団を産生する方法であって、（ｉ）Ｎｏｔｃｈ  １アゴニスト、Ｎｏｔｃｈ  ２アゴニスト、またはＮｏｔｃｈ  １アゴニストとＮｏｔｃｈ  ２アゴニスト、および（ｉｉ）増殖因子の非存在下で前駆細胞型の細胞がそれを過ぎると増殖を停止し分化または死滅する期間、（ｉ）Ｎｏｔｃｈ  １アゴニスト、Ｎｏｔｃｈ  ２アゴニスト、またはＮｏｔｃｈ  １アゴニストとＮｏｔｃｈ  ２アゴニスト、および（ｉｉ）１つ以上の増殖因子の存在下で、不死化していない前駆細胞を培養し、前駆細胞が、上記期間中に増殖するが最終的に分化しないようにし、それにより、不死化した前駆細胞集団を産生することを含む方法。
【０２８０】
２．不死化した前駆細胞集団を産生する方法であって、（ｉ）Ｎｏｔｃｈ  １アゴニスト、Ｎｏｔｃｈ  ２アゴニスト、またはＮｏｔｃｈ  １アゴニストとＮｏｔｃｈ  ２アゴニスト、および（ｉｉ）増殖因子の非存在下で前駆細胞型の細胞がそれを過ぎると増殖を停止し分化または死滅する期間、（ｉ）低いＮｏｔｃｈシグナル強度を維持する量のＮｏｔｃｈ  １アゴニスト、Ｎｏｔｃｈ  ２アゴニスト、またはＮｏｔｃｈ  １アゴニストとＮｏｔｃｈ  ２アゴニスト、および（ｉｉ）１つ以上の増殖因子の存在下で、不死化していない前駆細胞を培養し、前駆細胞が、上記期間中に増殖するが最終的に分化しないようにし、それにより、不死化した前駆細胞集団を産生することを含む方法。
【０２８１】
３．不死化した前駆細胞集団を産生する方法であって、
前駆細胞によるＮｏｔｃｈ  １受容体発現および／またはＮｏｔｃｈ  ２受容体発現を評価すること；
（ｉ）Ｎｏｔｃｈ  １アゴニスト、Ｎｏｔｃｈ  ２アゴニスト、またはＮｏｔｃｈ  １アゴニストとＮｏｔｃｈ  ２アゴニスト、および（ｉｉ）増殖因子の非存在下で前駆細胞型の細胞がそれを過ぎると増殖を停止し分化または死滅する期間、（ｉ）低いＮｏｔｃｈシグナル強度を維持する量の、評価に基づいて選択されるＮｏｔｃｈ  １アゴニスト、Ｎｏｔｃｈ  ２アゴニスト、またはＮｏｔｃｈ  １アゴニストとＮｏｔｃｈ  ２アゴニスト、および（ｉｉ）増殖因子の存在下で、不死化していない前駆細胞を培養し、前駆細胞が、上記期間中に増殖するが最終的に分化しないようにし、それにより、不死化した前駆細胞集団を産生することを含む方法。
【０２８２】
４．培養中、Ｎｏｔｃｈ  ２アゴニストが、Ｎｏｔｃｈ  １アゴニストよりも高い濃度で提供される、本明細書に開示される実施形態の方法。
【０２８３】
５．培養中、Ｎｏｔｃｈ  ２アゴニストのＮｏｔｃｈ  １アゴニストに対する比が、１５０：１；１４０：１；１３０：１；１２０：１；１１０：１；１００：１；９０：１；８０：１；７０：１；６０：１；５０：１；４０：１；３０：１；２５：１；２４：１；２３：１；２２：１；２１：１；２０：１；１９：１；１８：１；１７：１；１６：１；１５：１；１４：１；１３：１；１２：１；１１：１；１０：１；９：１；８：１；７：１；６：１；５：１；４：１；３：１；２：１；１．５：１；または１．２５：１である、本明細書に開示される実施形態の方法。
【０２８４】
６．培養中、Ｎｏｔｃｈ  ２アゴニストが０．１μｇ／ｍｌから５０μｇ／ｍｌの濃度である、本明細書に開示される実施形態の方法。
【０２８５】
７．培養中、Ｎｏｔｃｈ  １アゴニストが０．００５μｇ／ｍｌから３０μｇ／ｍｌの濃度である、本明細書に開示される実施形態の方法。
【０２８６】
８．培養中、Ｎｏｔｃｈ  ２アゴニストが２０μｇ／ｍｌの濃度である、本明細書に開示される実施形態の方法。
【０２８７】
９．培養中、Ｎｏｔｃｈ  １アゴニストが２．５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌまたは０．１５μｇ／ｍｌの濃度である、本明細書に開示される実施形態の方法。
【０２８８】
１０．培養中、Ｎｏｔｃｈ  ２アゴニストが１０μｇ／ｍｌの濃度である、本明細書に開示される実施形態の方法。
【０２８９】
１１．培養中、Ｎｏｔｃｈ  １アゴニストが０．０２μｇ／ｍｌの濃度である、本明細書に開示される実施形態の方法。
【０２９０】
１２．１つ以上の増殖因子が、ＩＬ−３；ＩＬ−６；ＴＰＯ；ＳＣＦおよびＦｌｔ−３である、本明細書に開示される実施形態の方法。
【０２９１】
１３．培養中、ＩＬ−３が１０ｎｇ／ｍｌの濃度である、本明細書に開示される実施形態の方法。
【０２９２】
１４．培養中、ＩＬ−６、ＴＰＯ、ＳＣＦおよびＦｌｔ−３のうちの１つ以上が５０ｎｇ／ｍｌの濃度である、本明細書に開示される実施形態の方法。
【０２９３】
１５．前駆細胞集団が、期間中の実質的に分化しない、本明細書に開示される実施形態の方法。
【０２９４】
１６．前駆細胞が幹細胞である、本明細書に開示される実施形態の方法。
【０２９５】
１７．前駆細胞がプロジェニター細胞である、本明細書に開示される実施形態の方法。
【０２９６】
１８．幹細胞が造血幹細胞（ＨＳＣ）である、本明細書に開示される実施形態の方法。
【０２９７】
１９．プロジェニター細胞が造血プロジェニター細胞である、本明細書に開示される実施形態の方法。
【０２９８】
２０．造血幹細胞または造血プロジェニター細胞が骨髄から得られる、本明細書に開示される実施形態の方法。
【０２９９】
２１．造血幹細胞または造血プロジェニター細胞が胎児または新生児の血液から得られる、本明細書に開示される実施形態の方法。
【０３００】
２２．期間が７から８日間である、本明細書に開示される実施形態の方法。
【０３０１】
２３．期間が少なくとも５週間である、本明細書に開示される実施形態の方法。
【０３０２】
２４．期間が少なくとも６週間である、本明細書に開示される実施形態の方法。
【０３０３】
２５．Ｎｏｔｃｈ  １、Ｎｏｔｃｈ  ２アゴニスト、またはＮｏｔｃｈ  １とＮｏｔｃｈ  ２アゴニストが、一部の期間中の前駆細胞によるＮｏｔｃｈ  １受容体発現レベルに基づいて選択される、本明細書に開示される実施形態の方法。
【０３０４】
２６．一部の期間が、培養期間の最初の２４時間を含む、本明細書に開示される実施形態の方法。
【０３０５】
２７．一部の期間が、培養期間の最初の４８時間を含む、本明細書に開示される実施形態の方法。
【０３０６】
２８．一部の期間が、培養期間の最初の７２時間を含む、本明細書に開示される実施形態の方法。
【０３０７】
２９．一部の期間が、培養期間の最初の３分の１を含む、本明細書に開示される実施形態の方法。
【０３０８】
３０．一部の期間が、培養期間の最初の４分の１を含む、本明細書に開示される実施形態の方法。
【０３０９】
３１．一部の期間が、培養期間の最後の２４時間を含む、本明細書に開示される実施形態の方法。
【０３１０】
３２．一部の期間が、培養期間の最後の４８時間を含む、本明細書に開示される実施形態の方法。
【０３１１】
３３．一部の期間が、培養期間の最後の７２時間を含む、本明細書に開示される実施形態の方法。
【０３１２】
３４．一部の期間が、培養期間の最後の３分の１を含む、本明細書に開示される実施形態の方法。
【０３１３】
３５．一部の期間が、培養期間の最後の４分の１を含む、本明細書に開示される実施形態の方法。
【０３１４】
３６．一部の期間が、培養期間の中間の２４時間を含む、本明細書に開示される実施形態の方法。
【０３１５】
３７．一部の期間が、培養期間の中間の４８時間を含む、本明細書に開示される実施形態の方法。
【０３１６】
３８．一部の期間が、培養期間の中間の７２時間を含む、本明細書に開示される実施形態の方法。
【０３１７】
３９．一部の期間が、培養期間の中間の３分の１を含む、本明細書に開示される実施形態の方法。
【０３１８】
４０．一部の期間が、培養期間の中間の４分の１を含む、本明細書に開示される実施形態の方法。
【０３１９】
４１．培養期間中の前駆細胞による、変化したＮｏｔｃｈ  １受容体発現レベルに基づいて、培養を継続するために、Ｎｏｔｃｈ  １、Ｎｏｔｃｈ  ２アゴニスト、またはＮｏｔｃｈ  １とＮｏｔｃｈ  ２アゴニストを選択することをさらに含む、本明細書に開示される実施形態の方法。
【０３２０】
４２．低いＮｏｔｃｈシグナル強度がＨｅｓ１発現を評価することにより測定される、本明細書に開示される実施形態の方法。
【０３２１】
４３．低いＮｏｔｃｈシグナル強度が、Ｔｈｙ１＋およびＣＤ２５＋Ｔ細胞前駆体への前駆細胞分化の欠如によって確認される、本明細書に開示される実施形態の方法。
【０３２２】
４４．Ｎｏｔｃｈ  １、Ｎｏｔｃｈ  ２アゴニスト、またはＮｏｔｃｈ  １とＮｏｔｃｈ  ２アゴニストが、期間中の前駆細胞によるＮｏｔｃｈ  １受容体発現レベルに基づいて選択される、本明細書に開示される実施形態の方法。
【０３２３】
４５．Ｎｏｔｃｈ  １、Ｎｏｔｃｈ  ２アゴニスト、またはＮｏｔｃｈ  １とＮｏｔｃｈ  ２アゴニストが、期間中の前駆細胞によるＮｏｔｃｈ  ２受容体発現レベルに基づいて選択される、本明細書に開示される実施形態の方法。
【０３２４】
４６．培養期間中の前駆細胞による、変化したＮｏｔｃｈ  ２受容体発現レベルに基づいて、培養を継続するために、Ｎｏｔｃｈ  １、Ｎｏｔｃｈ  ２アゴニスト、またはＮｏｔｃｈ  １とＮｏｔｃｈ  ２アゴニストを選択することをさらに含む、本明細書に開示される実施形態の方法。
【０３２５】
４７．Ｎｏｔｃｈ  １、Ｎｏｔｃｈ  ２アゴニスト、またはＮｏｔｃｈ  １とＮｏｔｃｈ  ２アゴニストが、期間中の前駆細胞によるＮｏｔｃｈ  １受容体発現レベルとＮｏｔｃｈ  ２受容体発現レベルに基づいて選択される、本明細書に開示される実施形態の方法。
【０３２６】
４８．培養期間中の前駆細胞による、変化したＮｏｔｃｈ  ２受容体発現レベルに基づいて、培養を継続するために、Ｎｏｔｃｈ  １、Ｎｏｔｃｈ  ２アゴニスト、またはＮｏｔｃｈ  １とＮｏｔｃｈ  ２アゴニストを選択することをさらに含む、本明細書に開示される実施形態の方法。
【０３２７】
４９．培養期間中の前駆細胞による、変化したＮｏｔｃｈ  １受容体発現レベルとＮｏｔｃｈ  ２受容体発現レベルに基づいて、培養を継続するために、Ｎｏｔｃｈ  １、Ｎｏｔｃｈ  ２アゴニスト、またはＮｏｔｃｈ  １とＮｏｔｃｈ  ２アゴニストを選択することをさらに含む、本明細書に開示される実施形態の方法。
【０３２８】
５０．評価または更なる評価がＮｏｔｃｈ  １受容体発現を測定する、本明細書に開示される実施形態の方法。
【０３２９】
５１．評価または更なる評価がＮｏｔｃｈ  ２受容体発現を測定する、本明細書に開示される実施形態の方法。
【０３３０】
５２．評価または更なる評価がＮｏｔｃｈ  １受容体発現とＮｏｔｃｈ  ２受容体発現を測定する、本明細書に開示される実施形態の方法。
【０３３１】
本開示の方法を実施し、細胞および動物を産生するための代替的な実施形態は、当業者に明らかであり、添付の特許請求の範囲内で理解されることが意図される。以下の実験例は、例示のために提供され、限定ではない。
【実施例】
【０３３２】
７．実施例
以下の実施例は、本開示の特定の実施形態を実証するために含まれる。当業者は、本開示に照らして、本明細書に開示されている特定の実施形態に多くの変更を加えることができ、本開示の精神および範囲から逸脱することなく、同様のまたは類似の結果を得ることができることを認識すべきである。
【０３３３】
記載されている実施例は、（Ｎｏｔｃｈ  １および／またはＮｏｔｃｈ  ２によって媒介され得る）低いＮｏｔｃｈシグナル強度の維持が、幹細胞の改善された増殖および生着をもたらすことを示す。結果は、選択的パラログの活性化による幹細胞におけるＮｏｔｃｈシグナルの注意深い滴定が有益であり得ることを示唆する。現在の開示は、相対的に多量のＮｏｔｃｈ  ２アゴニストと組み合わせた少量のＮｏｔｃｈ  １アゴニストを含むウェル中のマウス骨髄の高濃縮された幹（ＳＫ−ＳＬＡＭ）細胞の培養が、Ｎｏｔｃｈ  １またはＮｏｔｃｈ  ２レセプターのいずれかに特異的なモノクローナル抗体がプラスチック表面に固定化されている場合、Ｄｅｌｔａ１ｅｘｔ−ＩｇＧ、Ｎｏｔｃｈ  ２アゴニスト単独または対照リガンドによる培養物における１倍未満の増加と比較して、培養の７−８日後、ＳＫ−ＳＬＡＭ細胞（Ｓｃａ−１＋ｃ−ｋｉｔ＋ＣＤ１５０＋ＣＤ４８−ＣＤ１１ｂ−）の２倍の増加をもたらすことを示す。したがって、低いＮｏｔｃｈシグナル強度を与える、Ｎｏｔｃｈ  １アゴニスト、Ｎｏｔｃｈ  ２アゴニスト、またはＮｏｔｃｈ  １アゴニストとＮｏｔｃｈ  ２アゴニストの使用によるＮｏｔｃｈパラログ特異的活性化は、造血幹細胞を含む幹細胞を増殖させる新規な方法を提供する。
【０３３４】
本開示はまた、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達における定量的差異が骨髄分化の遅延の主な原因となることを与える。Ｎｏｔｃｈシグナル伝達における定性的差異ではなく定量的差異が示されるため、Ｎｏｔｃｈ  １および／またはＮｏｔｃｈ  ２のいずれかの活性化を用いて、所望レベルのＮｏｔｃｈシグナル伝達を産生することができる。さらに、Ｎｏｔｃｈ１およびＮｏｔｃｈ２受容体発現は、培養中に互いに独立して生じるため、異なるＮｏｔｃｈアゴニストは、経時的な発現レベルの変化に基づいて選択することができる。これらの実施形態において、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達は、Ｎｏｔｃｈ  １アゴニスト；Ｎｏｔｃｈ  ２アゴニスト；またはＮｏｔｃｈ  １アゴニストとＮｏｔｃｈ  ２アゴニストの存在に起因し得る。
【０３３５】
７．１  実施例１
図１。特異的Ｎｏｔｃｈ抗体を用いた培養は、ＳＫ−ＳＬＡＭ細胞の増加した発生をもたらす。各バーは、５μｇ／ｍｌのＤｅｌｔａ１ｅｘｔ−ＩｇＧ、５μｇ／ｍｌのＨｕＩｇＧ、および指示用量のＮｏｔｃｈ  １抗体に対する固定化されたモノクローナル抗体［ＨＭＮ１−１２（ＭＮ１）］またはＮｏｔｃｈ  ２抗体［ＨＭＮ２−３５（ＭＮ２）］（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を用いた培養物中のＳＫ−ＳＬＡＭ細胞の平均増加倍数を表す。バーは、２つの別個の実験＋／−範囲の培養ウェルに置かれたＳＫ−ＳＬＡＭの初期数と比較した平均増加倍数である。
【０３３６】
図２。ＩＬ−３（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−６、ＴＰＯ、ＳＣＦおよびＦｌｔ−３リガンド（全て５０ｎｇ／ｍｌ）を用いて、２つの別個のユニットからの臍帯血ＣＤ３４＋細胞を１４日間、Ｓｔｅｍｓｐａｎで培養した。細胞は、抗ヒトＮｏｔｃｈ  １（クローンＭＨＮ１−５１９）または対照ＩｇＧと組み合わせて、５μｇ／ｍｌの固定化されたレトロネクチンおよびＤｅｌｔａ  １（２．５μｇ／ｍｌ）、抗ヒトＮｏｔｃｈ  ２（クローンＭＨＮ２−２５、０．５μｇ／ｍｌ）、０．５μｇ／ｍｌの抗ヒトＮｏｔｃｈ  ２の存在下で増殖させた。Ｎｏｔｃｈ抗体は、Ｄｅｌｔａまたは対照ＩｇＧのいずれかと比較して、高い割合のＣＤ３４＋プロジェニター細胞およびより原始的なＣＤ３４＋９０の低細胞を維持した。さらに、Ｎｏｔｃｈ  ２抗体は単独でおよびＮｏｔｃｈ  １抗体と組み合わせて、ＣＤ３４＋ＣＤ９０の低細胞のより大きな増殖がもたらされた。
【０３３７】
図３。上記のように１４日間培養後、１０、０００個の臍帯血ＣＤ３４＋細胞の増殖した子孫を１群あたり６匹のＮＳＧマウスの各々に移植した。マウスからの骨髄吸引物を移植の２週間後にフローサイトメトリーにより移植について分析した。Ｎｏｔｃｈ  １およびＮｏｔｃｈ  ２抗体の組合せは、Ｄｅｌｔａ、ＩｇＧ、またはＮｏｔｃｈ  ２抗体単独よりも有意に高いヒト生着レベルを可能にした（２つの臍帯血ユニットについて、それぞれｐ＝０．００２４およびｐ＝０．０２２５）。
【０３３８】
別の適用において、これらの方法は、インビボで誘導された胚性造血幹細胞に適用された。最初のＨＳＣは、ＡＧＭ（大動脈−性腺−中腎領域）領域において発生中に生じ、内皮（ＶＥ−カドヘリン）マーカーおよび造血（ＣＤ４５）マーカーを同時発現する。培養中のマウスＡＧＭ由来のＣＤ４５＋／ＶＥ−カドヘリン＋細胞から短期間および長期間の再増殖性ＨＳＣ／プロジェニターを増殖させることができる、固定化されたリガンドＤｅｌｔａ  １（２．５μｇ／ｍｌ）、レトロネクチン  ５μｇ／ｍｌ、ｒｍＳＣＦ、ｒｈＩＬ６、ｒｈＦＬＴ３Ｌ（全て１００ｎｇ／ｍｌ）、ｒｈＴＰＯ（２０ｎｇ／ｍｌ）、および小分子ＴＧＦ−β阻害（１０μＭ）の組合せを用いた条件を決定した。プラスチック表面に固定化されたＮｏｔｃｈ  １またはＮｏｔｃｈ  ２受容体のいずれかに特異的なモノクローナル抗体は、この培養系においてＤｅｌｔａ  １の代わりとなることができ、移植アッセイにおいて骨髄およびリンパ球の生着が可能な細胞を産生することがここに示される。さらに、予備実験において、固定化されたＭＮ２抗体を用いたＮｏｔｃｈ  ２特異的パラログ活性化は、５日間の培養期間後、より多くのＬＳＫ−ＳＬＡＭ（Ｓｃａ１＋ｃ−ｋｉｔ＋ＣＤ１５０＋ＣＤ４８−Ｆ４８０−Ｇｒ１−）細胞（Ａ）を生じさせ、固定化されたＮｏｔｃｈリガンドＤｅｌｔａ  １ｅｘｔ−ＩｇＧ（Ｂ）と比較して増強された２週間および６週間の末梢血生着をもたらす。したがって、Ｎｏｔｃｈパラログ特異的活性化は、胚発生源から多系列ＨＳＣが増殖する能力をさらに高めることができ、これは、胚性幹細胞および誘導された多分化能性幹細胞などの新規の供給源からのＨＳＣの増殖に応用することができる。
【０３３９】
図４。特定のＮｏｔｃｈ抗体上のＡＧＭ由来ＣＤ４５＋／ＶＥ−カドヘリン＋細胞の培養は、ＬＳＫ−ＳＬＡＭ細胞および多系列生着の産生をもたらす。Ａ．２．５μｇ／ｍｌのＤｅｌｔａ  １ｅｘｔ−ＩｇＧ、２．５μｇ／ｍｌのＨｕＩｇＧ、および指示投薬量の、Ｎｏｔｃｈ  １［ＨＭＮ１−１２（ＭＮ１）］またはＮｏｔｃｈ  ２抗体［ＨＭＮ２−３５（ＭＮ２）］（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）に対する固定化されたモノクローナル抗体上の培養５日後に生じた、フローサイトメトリー分析によるＬＳＫ−ＳＬＡＭ（Ｓｃａ１＋ｃ−ｋｉｔ＋ＣＤ１５０＋ＣＤ４８−Ｇｒ１−Ｆ４８０−）細胞の数。細胞数は、投入される開始ＣＤ４５＋／ＶＥ−カドヘリン＋細胞の１ＡＧＭ当量あたりで表され、エラーバーは、分析される３つのウェルの標準偏差を表す。Ｂ−Ｄ。３×１０４個のレスキューＣＤ４５．１骨髄細胞をマウス１匹につき０．５ＡＧＭ当量の開始細胞（ＣＤ４５．２）に移植した、パネルＡにおいて培養された細胞の２週目および６週目の末梢血生着。分析された各マウスの末梢血中の全ＣＤ４５＋細胞の百分率としてのドナー生着％（ＣＤ４５．２）、ドナー骨髄系統生着（Ｇｒ１および／またはＦ４８０）、ならびにドナーＢリンパ球（ＣＤ１９）／Ｔリンパ球（ＣＤ３）生着を示す。
【０３４０】
図５および図６は追加データを与える。
【０３４１】
図３および図７。図７  ２つの別個のユニット（Ｅｘｐ．４０９）または２つのユニットのプール（Ｅｘｐ．４１４）由来の臍帯血ＣＤ３４＋細胞をＳｔｅｍｓｐａｎ中で、ＩＬ−３（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−６、ＴＰＯ、ＳＣＦおよびＦｌｔ−３リガンド（全て５０ｎｇ／ｍｌ）とともに１４日間培養された。細胞は、固定化されたレトロネクチン  ５μｇ／ｍｌおよびＤｅｌｔａ  １（２．５μｇ／ｍｌ）、抗ヒトＮｏｔｃｈ  ２（クローンＭＨＮ２−２５、０．５μｇ／ｍｌ、Ｅｘｐ．４０９）、抗ヒトＮｏｔｃｈ  １（クローンＭＨＮ１−５１９、０．０２μｇ／ｍｌ、Ｅｘｐ．４１４）、抗ヒトＮｏｔｃｈ  １  ０．０２μｇ／ｍｌと組み合わせた抗ヒトＮｏｔｃｈ  ２  ０．５μｇ／ｍｌ、または対照ＩｇＧの存在下で増殖させた。
【０３４２】
１群当たり５匹（Ｅｘｐ．４１４）または６匹（Ｅｘｐ．４０９）のＮＳＧマウスのそれぞれに１０、０００細胞の増殖させた子孫を移植した。移植後２週間（両方の実験）および移植後８週間（Ｅｘｐ．４１４）の全ヒト（ＣＤ４５）、リンパ球（ＣＤ１９）および骨髄細胞について、フローサイトメトリーにより骨髄吸引物を分析した。Ｅｘｐ．４０９の移植の１０週間後に骨髄を採取し、分析した。
【０３４３】
図８Ａおよび８Ｂ、ならびに９Ａ、９Ｂおよび９Ｃは更なるデータを提供する。
【０３４４】
７．２  実施例２
個々のＮｏｔｃｈパラログの細胞内ドメイン（ＩＣＤ）における定性的な差異は系統決定に影響しない。系統決定がＮｏｔｃｈシグナル強度の定量的差異によって影響を受けるというモデルをさらに進展させるステップとして、Ｎｏｔｃｈ  １またはＮｏｔｃｈ  ２のシグナル伝達能力の定性的差異を評価して、それらが細胞運命決定に影響を与えるかどうかを決定した。これらの差異を評価するために、Ｎｏｔｃｈ  ２−ＩＣＤ全体のゲノムコード領域をＮｏｔｃｈ  １遺伝子座（Ｎ１１２／１２）に交換し、Ｎｏｔｃｈ  １−ＩＣＤをＮｏｔｃｈ  ２（Ｎ２２１／２１）遺伝子座に交換したマウスを使用した（Ｌｉｕ  Ｚ、Ｃｈｅｎ  Ｓ、Ｂｏｙｌｅ  Ｓ、Ｚｈｕ  Ｙ、Ｚｈａｎｇ  Ａ、Ｐｉｗｎｉｃａ−Ｗｏｒｍｓ  ＤＲら、Ｄｅｖ  Ｃｅｌｌ．２０１３；２５（６）：５８５−９８頁）。腎臓発生の研究において、Ｎｏｔｃｈ  １ではなくＮｏｔｃｈ  ２が器官形成に不可欠な役割を果たすが場合、発生はＮ２２１／２１マウスにおいて正常であることが判明し、これは、交換されたＮｏｔｃｈ  １−ＩＣＤが機能的であり、Ｎｏｔｃｈ  ２−ＩＣＤと同程度に機能することを示す。造血に関して、結果は、Ｎ１１２／１２およびＮ２２１／２１マウスがともに、インビボとインビトロの両方で同腹子対照と同様に、Ｔ、Ｂおよび骨髄細胞の数を生じさせ得ることを示した（図１０）。この結果は、系列決定におけるＮｏｔｃｈシグナル伝達の本発明者らの定量的モデルの裏付けとなる。
【０３４５】
７．３  実施例３
固定化されたパラログ特異的抗体によって媒介されるＮｏｔｃｈ活性化は、固定化されたＤｅｌｔａ１リガンドと比較して迅速な再増殖細胞の有意な増加を生じさせる。Ｎｏｔｃｈパラログ発現の動的変化はマウスの造血を伴う。Ｎｏｔｃｈ  ２は、新たに単離されたＬＳＫ−ＳＬＡＭ（系統−Ｓｃａ１＋Ｋｉｔ＋ＣＤ１５０＋ＣＤ４８−）およびＬＳＫ細胞の表面上の優勢なＮｏｔｃｈ受容体であり、一方、Ｎｏｔｃｈ  １は、ＨＳＰＣプールの代償にして、Ｔ細胞に向けた分化を促進するという条件で、高密度のＤｅｌｔａ１を用いた培養後に優勢になる（データを示さず）。細胞表面発現におけるこのシフトの結果として、パラログ特異的抗体を用いた個々の受容体の選択的活性化が、Ｎｏｔｃｈ活性化を制限し、固定化されたＤｅｌｔａ１と比較して再増殖細胞のエクスビボ産生を増大させるかどうかを調べた。マウス骨髄ＬＳＫ−ＳＬＡＭ細胞を、固定化されたＤｅｌｔａ１、またはＮｏｔｃｈ  ２細胞外ドメインに対する固定化された活性化固体とともに培養し、限界希釈移植アッセイに使用した。Ｄｅｌｔａ１と比較して、抗体選択的Ｎｏｔｃｈ  ２活性化は、移植から６週間後、再増殖細胞の頻度を３．６倍に高めることが見出された（試験された最大の細胞容量での系統再増殖について、Ｌ−ｃａｌｃ  ｐ＝０．０２（データを示さず））。これらの研究は、Ｎｏｔｃｈパラログ特異的抗体が、Ｎｏｔｃｈリガンドよりも高い程度まで再増殖細胞のエクスビボ産生を増大させることを示した。
【０３４６】
マウスＬＳＫ−ＳＬＡＭ細胞とは対照的に、新たに単離された臍帯血（ＣＢ）ＣＤ３４＋細胞は、Ｎｏｔｃｈ  １とＮｏｔｃｈ  ２の両方を発現する（図１１）。ヒトＮｏｔｃｈ  １またはＮｏｔｃｈ  ２の細胞外ドメインに特異的な固定化された抗体（ＭＨＮ１−５１９およびＭＨＮ２−２５、ｗｗｗ．Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ．ｃｏｍ；Ｈａｒａｇｕｃｈｉ  Ｋ、Ｓｕｚｕｋｉ  Ｔ、Ｋｏｙａｍａ  Ｎ、Ｋｕｍａｎｏ  Ｋ、Ｎａｋａｈａｒａ  Ｆ、Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ  Ａら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００９；１８２（１０）：６１６８−７８頁参照）とともに２週間培養したＣＢ  ＣＤ３４＋細胞は、以前に公開された至適投薬量の固定化されたＤｅｌｔａ１と比較して、実質的に多いＣＤ３４＋とＣＤ３４＋ＣＤ９０ｌｏ細胞、およびより少ない成熟ＣＤ３４＋細胞のサブセットを再現良く産生させた（Ｄｅｌａｎｅｙ  Ｃ、Ｖａｒｎｕｍ−Ｆｉｎｎｅｙ  Ｂ、Ａｏｙａｍａ  Ｋ、Ｂｒａｓｈｅｍ−Ｓｔｅｉｎ  Ｃ、Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ  ＩＤ．Ｂｌｏｏｄ．２００５年；１０６（８）：２６９３−９頁；Ｄｅｌａｎｅｙ  Ｃ、Ｈｅｉｍｆｅｌｄ  Ｓ、Ｂｒａｓｈｅｍ−Ｓｔｅｉｎ  Ｃ、Ｖｏｏｒｈｉｅｓ  Ｈ、Ｍａｎｇｅｒ  ＲＬ、Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ  ＩＤ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ．２０１０年；１６（２）：２３２−６頁；ＣＤ９０ｌｏ細胞は、Ｍａｊｅｔｉ  Ｒ、Ｐａｒｋ  ＣＹ、Ｗｅｉｓｓｍａｎ  ＩＬ．Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ２００７年；１：６３５−６４５頁において以前に定義されたゲートカットオフ量によって決定される少量のＣＤ９０を発現する細胞であった）（データを示さず）。最も重要なことに、固定化されたＤｅｌｔａ１と比較して、ＣＤ３４＋ＣＤ９０ｌｏ細胞産生を最大にする、様々な濃度の固定化された抗Ｎｏｔｃｈ  １抗体または抗Ｎｏｔｃｈ  ２抗体（それぞれ、ＭＨＮ１−５１９およびＭＨＮ２−２５）とともに培養したＣＤ３４＋細胞は、ＮＯＤ−ｓｃｉｄ  ＩＬ２Ｒガンマヌル（ＮＳＧ）マウスにおける有意に大きく、迅速な再増殖（２−３週間）活性を誘導した（図１２；ｐ値  ＭＨＮ１−５１９＝０．０２８６、ｐ値  ＭＨＮ２−２５＝０．０４６０）。全体として、これらのデータは、治療適用のための急速な再増殖細胞の産生を増大させる、エクスビボにおいて誘導されるＨＳＰＣを増加させるためのパラログ特異的なＮｏｔｃｈ活性化の使用を示す。
【０３４７】
７．４  実施例４
パラログ特異的なＮｏｔｃｈ抗体はリガンド誘導の活性化に対して感受性でないＮｏｔｃｈ受容体を活性化する。何故個々の受容体抗体が、生着可能なＨＳＰＣの増殖の誘導において、リガンドよりも効果的であるかのかについての第一のステップとして、ＣＢ  ＣＤ３４＋細胞が、固定化されたＤｅｌｔａ１、抗Ｎｏｔｃｈ  １抗体または抗Ｎｏｔｃｈ  ２抗体による４時間のＮｏｔｃｈ活性化後、標的遺伝子であるＨｅｓ１の発現を即座に誘導する能力において差異を示すかどうかについて試験した。リガンドに関与するＥＧＦドメインを含む、それぞれのアミノ末端断片に対して生じさせた抗Ｎｏｔｃｈ  １抗体（ＭＨＮ１−５１９）または抗Ｎｏｔｃｈ  ２抗体（ＭＨＮ２−２５）（ともにＢｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡから市販されている）を比較し、ならびに可溶状態のときにＮｏｔｃｈ活性化を阻害し、固定化されているときに活性化することが知られている、同種の膜近傍の負の調節領域（ＮＲＲ）（このような抗体は、以下においてＮＲＲ−Ｎ１およびＮＲＲ−Ｎ２とそれぞれ呼ぶ）に対して生じさせた抗Ｎｏｔｃｈ  １抗体および抗Ｎｏｔｃｈ  ２抗体を比較した（パーソナルコミュニケーションＣ．Ｓｉｅｂｅｌ、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ；Ｗｕ  Ｙ、Ｃａｉｎ−Ｈｏｍ  Ｃ、Ｃｈｏｙ  Ｌ、Ｈａｇｅｎｂｅｅｋ  ＴＪ、ｄｅ  Ｌｅｏｎ  ＧＰ、Ｃｈｅｎ  Ｙら、Ｎａｔｕｒｅ．２０１０年；４６４（７２９１）：１０５２−７頁）（図１３）。図１４に示すように、ＭＨＮ１−５１９による誘導は、Ｄｅｌｔａ１よりも２−３倍高いＨｅｓ１発現をもたらした。対照的に、ＭＨＮ２−２５は、試験された低用量ではＤｅｌｔａ１より約２倍大きなＨｅｓ１発現を生じさせたが、高用量ではＤｅｌｔａ１と同等であった。比較において、ＮＲＲ−Ｎ１およびＮＲＲ−Ｎ２は、Ｈｅｓ１発現を誘導する際のそれぞれのＥＧＦ抗体のいずれよりも効果が小さかった。
【０３４８】
さらなる研究では、アゴニスト活性化効力において観察された差異が、Ｄｅｌｔａ１およびＭＨＮ１−５１９またはＭＨＮ２−２５のいずれかが、より原始的なＣＤ３４＋ＣＤ９０ｌｏ  ＨＳＰＣサブセットにおいてＮｏｔｃｈと相互作用する差異的な能力を反映するかどうかを検討した。新たに単離したＣＢ  ＣＤ３４＋ＣＤ９０ｌｏおよびＣＤ３４＋ＣＤ９０−細胞をＤｅｌｔａ１、ＭＨＮ１−５１９または対照ＩｇＧのいずれかとともに４時間インキュベートし、Ｈｅｓ１発現をｑＰＣＲによって決定した。ＣＤ３４＋ＣＤ９０−細胞と比較して、ＣＤ３４＋ＣＤ９０ｌｏ集団のＭＨＮ１−５１９への曝露後により大きなＮｏｔｃｈ活性化への傾向が、Ｄｅｌｔａ１への暴露と比較して観察された（図１５Ａ）。これらのデータは、ＣＤ３４＋ＣＤ９０ｌｏ細胞におけるリガンド結合アッセイの結果と相関し、この場合、ＭＨＮ１−５１９およびＭＨＮ２−２５はそれぞれのパラログに結合することができ、Ｄｅｌｔａ１はほとんど結合しないまたは全く結合しないことが示された（データを示さず）。サイトカインとの培養によりこれらの細胞を分化した後、Ｈｅｓ１発現によって測定した場合、同等レベルのＮｏｔｃｈ活性化が、固定化されたＤｅｌｔａ１またはＭＨＮ１−５１９のいずれかで見出された（図１５Ｂ）。まとめると、これらの研究は、ＭＨＮ１−５１９およびＭＨＮ２−２５が、Ｄｅｌｔａ１の結合および活性化に対して初期には感受性でない受容体に結合する能力に起因して、ＣＤ３４＋ＣＤ９０ｌｏ細胞の産生においてより有効であることを示唆する。
【０３４９】
Ｎｏｔｃｈ受容体のトランス発現したリガンドの活性化を抑制することができる１つの作用機序は、内在的に発現したリガンドによって媒介されるシス阻害である。最近の研究は、シス発現したリガンドが、トランスに結合したリガンドと同じＮｏｔｃｈ受容体界面と相互作用することができることを示している（Ｌｕｃａ  ＶＣ、Ｊｕｄｅ  ＫＭ、Ｐｉｅｒｃｅ  ＮＷ、Ｎａｃｈｕｒｙ  ＭＶ、Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｓ、Ｇａｒｃｉａ  ＫＣ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１５年；３４７（６２２４）：８４７−５３頁）。抗体−受容体界面がリガンド−受容体界面とは異なるため、Ｎｏｔｃｈ抗体アゴニストは、リガンドがシス発現している下でそれらの同種受容体の活性化を誘導することができるという仮説が立てられた。この仮説を試験するために、Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるクロスブロッキングアッセイを利用した。Ｄｅｌｔａ１の添加により、ｍｙｃタグ化されたＤｅｌｔａ１の結合が遮断されるが、ＭＨＮ１−５１９の結合は遮断されないことが判明した（図１６）。これらの研究は、ＭＨＮ１−５１９が、Ｄｅｌｔａ１結合部位とは異なるＮｏｔｃｈ  １上のエピトープに結合することを示唆する。さらに、リガンド結合に関与するＥＧＦ様リピート１１および１２などのＮｏｔｃｈ  １  ＥＧＦ様リピート７−１４を包含するポリペプチドは、Ｄｅｌｔａ１のＮｏｔｃｈ  １への結合を阻害するが、ＭＨＮ１−５１９とＮｏｔｃｈ  １の相互作用を変化させないことが判明したが（データ示さず）、アゴニスト抗体とリガンドの相互作用界面が固有であるというさらなる証拠を提供する。さらに、ＭＨＮ１−５１９抗体を産生するために使用される免疫原は、Ｎｏｔｃｈ  １  ＥＧＦ様リピート１−１３を包含するため、単純な消去法から、抗体エピトープが、リガンド結合部位に対してＮ末端である、Ｎｏｔｃｈ  １膜遠位のＥＧＦ様リピート１−６に存在する可能性が高いことが示唆される。
【０３５０】
抗体がそうでなければシス阻害されたリガンドを活性化することができるかどうかを決定するために、Ｎｏｔｃｈ  １改変体を発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞中の以前に開発されたＮｏｔｃｈレポーター系を使用した。このレポーター系では、Ｎｏｔｃｈ  １のＩＣＤが、ＵＡＳで駆動されるＹＦＰレポーターと一緒に酵母Ｇａｌ４によって置換されている。この系を用いて、外因性Ｄｅｌｔａ１によるＮｏｔｃｈ受容体刺激がＹＦＰの蓄積をもたらすことが示された（Ｓｐｒｉｎｚａｋ  Ｄ、Ｌａｋｈａｎｐａｌ  Ａ、Ｌｅｂｏｎ  Ｌ、Ｓａｎｔａｔ  ＬＡ、Ｆｏｎｔｅｓ  ＭＥ、Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ＧＡら、Ｎａｔｕｒｅ．２０１０年；４６５（７２９４）：８６−９０頁）。しかしながら、安定に組み込まれたテトラサイクリン誘導性のＤｅｌｔａ１遺伝子の共発現は、シス阻害をもたらし、トランス−リガンドによるＮｏｔｃｈの活性化を妨げ、ＹＦＰ蓄積を減少させる。したがって、これらの細胞は、シス阻害およびＮｏｔｃｈ活性化の分析のための有効なモデルを提供する。この系を用いて、ＭＨＮ１−５１９とＤｅｌｔａ１の両方が、シス−リガンドの非存在下で外因的に提示される場合、用量依存的にＹＦＰを誘導することができることが観察された（図１７）。シス発現したリガンドの誘導について先に示したように、トランス−ＤｅｌｔａはＮｏｔｃｈを活性化することができない。しかしながら、ＭＨＮ１−５１９で提示される場合、Ｎｏｔｃｈ  １はシス−リガンド状態にかかわらず、シグナル伝達することができる。まとめると、これらのデータは、Ｄｅｌｔａ１界面とは別個であるＮｏｔｃｈ  １界面を介して、ＭＨＮ１−５１９が、通常はリガンドのシス阻害に起因して感受性ではないＮｏｔｃｈ受容体を活性化することができることを示唆する。
【０３５１】
内因性リガンドの発現によるシス阻害が、本発明者らのヒトＣＢ研究において抗体の優位性の主な原因となったという可能性を評価するために、ＣＢ  ＣＤ３４＋ＣＤ９０ｌｏ細胞が、カノニカル（ＤＬＬ１、ＤＬＬ３、ＤＬＬ４、ＪＡＧ１およびＪＡＧ２）または非カノニカル（ＤＬＫ１およびＤＬＫ２）リガンドを発現するかどうかを定量的ＲＴ−ＰＣＲおよびＦＡＣＳ分析を使用して決定した。ＰＣＲ評価は、Ｊａｇ２、Ｄｌｌ１、Ｄｌｌ４およびＤｌｋ１の発現を明らかにした（データを示さず）。ＦＡＣＳ分析を用いて、Ｊａｇ２の細胞表面発現は、再増殖細胞を含むことが知られている原始的なＣＤ３４＋ＣＤ９０ｌｏサブセットにおいて確認されたが、ＣＤ３４＋ＣＤ９０−サブセットでは確認されなかった（データを示さず）。
【０３５２】
ＭＨＮ１−５１９およびＭＨＮ２−２５を用いて、固定化されたＤｅｌｔａ１上での増殖前および２週間の増殖中に、ＣＢ由来ＣＤ３４＋細胞についてＮｏｔｃｈ  １およびＮｏｔｃｈ  ２の細胞表面発現を評価した（図１８）。新たに選別されたＣＢ  ＣＤ３４＋細胞は、相対的に同じ量のＮｏｔｃｈ  １およびＮｏｔｃｈ  ２を発現するが、培養時間は、細胞表面発現の動的変化を示し、Ｎｏｔｃｈ  １は連続的に増加し、Ｎｏｔｃｈ  ２は減少し、その後、一定のままであった。
【０３５３】
７．５  実施例５
パラログ特異的Ｎｏｔｃｈ  １抗体はＤｅｌｔａよりも多数のリンパ系プロジェニター細胞を産生する。ＩＬ−３（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−６、ＴＰＯ、ＳＣＦおよびＦｌｔ−３リガンド（全て５０ｎｇ／ｍｌ）を含むＳｔｅｍｓｐａｎにおいて、２つの別個のユニット由来の臍帯血ＣＤ３４＋細胞を７日間培養した。細胞を、固定化されたレトロネクチン５μｇ／ｍｌ、および（ｉ）固定化された対照ＩｇＧ、（ｉｉ）固定化されたＤｅｌｔａ１  ０．５、２．５もしくは１０μｇ／ｍｌ、または（ｉｉｉ）固定化された抗ヒトＮｏｔｃｈ  １抗体（（０．０２、０．１、０．５もしくは２．５μｇ／ｍｌ、クローンＭＨＮ１−５１９（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡから市販されている）の存在下で増殖させた。ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−／ＣＤ７＋集団である共通リンパ球プロジェニター細胞（ＣＬＰ）をフローサイトメトリーによって評価した。結果を図１９に示す。抗Ｎｏｔｃｈ１  抗体を用いた細胞の増殖により、Ｄｅｌｔａ１よりも多数のＣＬＰを生じさせた。
【０３５４】
７．６  実施例６
固定化されたＮｏｔｃｈ  １抗体とともに培養された臍帯血ＣＤ３４＋細胞は、ＮＳＧマウスに移植された場合にＴ細胞生着をもたらす。ＩＬ−３（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−６、ＴＰＯ、ＳＣＦおよびＦｌｔ−３リガンド（全て５０ｎｇ／ｍｌ）を含むＳｔｅｍｓｐａｎにおいて、２つのユニットのプール由来の臍帯血ＣＤ３４＋細胞を１４日間培養した。細胞を、固定化されたレトロネクチン５μｇ／ｍｌ、および（ｉ）Ｄｅｌｔａ  ２．５μｇ／ｍｌ、（ｉｉ）対照ＩｇＧ、（ｉｉｉ）抗ヒトＮｏｔｃｈ  １抗体０．０２μｇ／ｍｌ（クローンＭＨＮ１−５１９（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡから市販されている））、または（ｉｖ）抗ヒトＮｏｔｃｈ  ２  ０．５μｇ／ｍｌと組み合わせた抗ヒトＮｏｔｃｈ  １  ０．０２μｇ／ｍｌ（クローンＭＨＮ２−２５（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡから市販されている））の存在下で増殖させた。
【０３５５】
培養１４日目に、１０、０００細胞の増殖させた子孫を１群あたり５匹のＮＳＧマウスの各々に移植した。１８週間後、骨髄を採取し、フローサイトメトリーにより全ヒト生着（ＣＤ４５パーセント、図２０Ａ）およびヒトＴ細胞生着（ＣＤ３パーセント、図２０Ｂ）を評価した。抗Ｎｏｔｃｈ１抗体とともに培養した細胞は、５匹のマウス中４匹においてＴ細胞を増殖させた。抗Ｎｏｔｃｈ  １抗体とともに培養した細胞を受け入れたマウスにのみヒトＴ細胞（ＣＤ３＋）が形成され（図２０Ｂ）、これは、Ｔ細胞系統への分化を誘導するのに十分なより高いＮｏｔｃｈシグナルが細胞の一部に誘導され、それらがＣＤ３＋Ｔ細胞に成熟する胸腺に移動して、胸腺に生着する細胞を生じさせることを示唆する。
【０３５６】
他に指示がない限り、本開示の実施は、免疫学、分子生物学、微生物学、細胞生物学および組換えＤＮＡの従来の技術を用いることができる。これらの方法は、以下の刊行物に記載されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第二版（１９８９年）；Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら、編集、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８７年）；ｔｈｅ  ｓｅｒｉｅｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ＩＮ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．）；Ｍ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎら、ＰＣＲ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９１年）；ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎら、編集、ＰＣＲ  ２：Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（１９９５年）；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、編集、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８８年）；Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、編集、Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（１９８７）を参照されたい。
【０３５７】
当業者に理解されるように、本明細書に開示されている各実施形態は、その特定の記載された要素、ステップ、成分または構成要素を含むことができ、本質的にそれらからなることができる。本明細書で使用するとき、移行用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は、限定されないが、主要な量でさえ、不特定の要素、ステップ、成分または構成要素を含むことを可能とする。移行句「からなる」は、特定されていないいずれの要素、ステップ、成分または構成要素を除外する。移行句「から本質的になる」は、実施形態の範囲を、特定の要素、ステップ、成分もしくは構成要素に限定し、または実施形態に重大な影響を及ぼさないものに限定する。本明細書で使用するとき、重大な影響は、ＨＳＰＣの増殖または生着における統計的に有意な減少を引き起こす。
【０３５８】
他に指示がない限り、本明細書および特許請求の範囲において使用される、成分、分子量、反応条件などの特性等の量を表す全ての数字は、全ての場合において「約」という用語によって修飾されるものとして理解されるべきである。したがって、それとは反対に指示がなければ、本明細書および添付の特許請求の範囲に記載される数値パラメータは、本発明によって得られることが求められる所望の特性に応じて変化し得る近似値である。少なくとも、特許請求の範囲に対する均等論の適用を制限する試みとしてではなく、各数値パラメータは少なくとも、報告された有効数字の数に照らし、通常の丸め技法を適用して解釈されるべきである。さらなる明確性が必要とされる場合、「約」という用語は、記載された数値または範囲と関連して使用されるとき、当業者によってそれに合理的に与えられた意味を有する、すなわち、記載値の±２０％、記載値の±１９％、記載値の±１８％、記載値の±１７％、記載値の±１６％、記載値の±１５％、記載値の±１４％、記載値の±１３％、記載値の±１２％、記載値の±１１％、記載値の±１０％、記載値の±９％、記載値の±８％、記載値の±７％、記載値の±６％、記載値の±５％、記載値の±４％、記載値の±３％、記載値の±２％、または記載値の±１％の範囲内まで、記載値または範囲より幾分多いまたは幾分少ないことを示す。
【０３５９】
本発明の広い範囲を記載する数値範囲およびパラメータは近似値であるにもかかわらず、特定の実施例において記載される数値は、できる限り正確に報告されている。しかしながら、任意の数値は、それぞれの試験測定において見出された標準偏差から必然的に生じる特定の誤差を本質的に含む。
【０３６０】
本発明を説明する文脈において（特に、以下の特許請求の範囲の文脈において）使用される、不定冠詞と定冠詞（「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、「その（ｔｈｅ）」という用語）、および同様の指示物は、本明細書において他に指示がない、または文脈によって明らかに矛盾しない限り、単数と複数の両方を含むと解釈されるべきである。本明細書における数値範囲の列挙は、単に、その範囲内に入るそれぞれの単独の値を、個別に指すための簡易法としての役割を果たすことが意図されている。本明細書において他に指示がない限り、個別の値のそれぞれは、本明細書において個別に列挙されているものとして、本明細書に組み込まれる。本明細書に記載された全ての方法は、本明細書において他に指示がない、または文脈によって明らかに矛盾しない限り、任意の好適な順序で実行され得る。本明細書において提供される任意の、全ての実施例、または例示的な用語（例えば、「など」）の使用は、単に、本発明をより解りやすくすることを意図しており、請求されるものに加えて、本発明の範囲を限定するものではない。本明細書における用語は、本発明の実践に必須な任意の非特許請求要素を指していると解釈されるべきではない。
【０３６１】
本明細書において開示された発明の代替の要素または実施形態のグループ分けは、制限として解釈されるべきではない。各グループメンバーは、個別にあるいはグループの他のメンバーまたは本明細書に見られる他の要素との任意の組合せで、参照され、および請求され得る。グループの１つ以上のメンバーが、便宜上および／または特許性の理由から、グループに含まれ、またはグループから削除され得ることが予期される。任意のこのような包含または削除が生じるときには、本明細書は、修正されたグループを含むものとみなされ、従って、付属の特許請求の範囲において使用される全てのマーカッシュグループの書面による記載を満たす。
【０３６２】
本発明を実施するために本発明者らに知られる最良の形態を含む、本発明の特定の実施形態が、本明細書において説明されている。言うまでもなく、前述の説明を読めば、これらの記載された実施形態の変形形態が、当業者には明らかとなる。本発明者は、当業者がこのような変形例を適切に利用することを期待し、本発明者らは、本明細書に具体的に記載されたものとは別の方法で、本発明が実施されることを意図する。したがって、本発明は、適用法令により許される範囲で、本明細書に添付される特許請求の範囲において列挙される主題のあらゆる修正形態および同等物を含む。さらに、その全ての可能な変形例における前述の要素の任意の組み合わせは、本明細書において他に指示されない、または文脈によって明らかに矛盾しない限り、本発明によって包含される。
【０３６３】
さらに、多数の特許および刊行物が、本明細書を通して参照されている。前述の参考文献および刊行物のそれぞれは、その全体が個別に、参考により本明細書に組み込まれる。
【０３６４】
最後に、本明細書において開示された本発明の実施形態は、本発明の原理を例示するものであることが理解されるべきである。利用され得る他の修正形態は、本発明の範囲内である。したがって、限定ではなく一例として、本発明の代替の構成が、本明細書の教示に従って利用され得る。したがって、本発明は、図示され、説明されたように厳密には、それに限定されない。
【０３６５】
本明細書に示される詳細は、一例として、また、本発明の好ましい実施形態を単に例示的に述べることを目的とするものであり、本発明の種々の実施形態の原理および概念的側面の最も有用で容易に理解される記載であると考えられるものを示すために提示される。これに関して、本発明の基本的理解に必要なもの以上の本発明の構造的詳細を示そうとするものではなく、この記載を図面および／または実施例とともに理解すれば、本発明のいくつかの形態が実際にどのように具体化することができるかが当業者に明らかとなる。
【０３６６】
本開示において使用される定義および説明は、以下の実施例において明瞭におよび明確に修正されていない限り、またはその意味の適用がいずれかの構成を無意味または本質的に無意味にしない限り、今後のいずれの構成にも効力を及ぼすことを意味し、そのように意図される。この用語の構成が、それを無意味または本質的に無意味にする場合には、その定義は、Ｗｅｂｓｔｅｒ’ｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ、第３版、または当業者に公知の辞書、例えば、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｅｄ．Ａｎｔｈｏｎｙ  Ｓｍｉｔｈ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、２００４年）から採用すべきである。
【０３６７】
特許、特許出願および刊行物などの様々な参考文献は本明細書に引用され、それらの開示は、全体として参照により本明細書に組み込まれる。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１７Ｅ】
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【図１７Ｆ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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