(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象の膵臓がんの試験のための方法であって、１つまたは複数の対象に由来する生体試料中で、ＬＯＸＬ３、ＤＮＡＨ５、ＤＮＡＨ１２、ＳＣＹＬ２、ＦＬＲＴ３、ＺＮＦ８０４Ａ、ＡＣＴＮ２およびそれらの組み合わせからなる群から選択される１つまたは複数のバイオマーカーを検出することを含み、１つまたは複数のバイオマーカーの検出が、対象が膵臓がんを有することの指標である方法。
【請求項２】
対象がヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
生体試料が、糞便試料、血液試料、血漿試料、膵嚢胞液試料、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
バイオマーカーがタンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
タンパク質バイオマーカーの存在が、タンパク質バイオマーカーと特異的に結合する試薬を使用して検出される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
試薬が、モノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片、またはポリクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
タンパク質の存在が、酵素結合免疫吸着アッセイにより検出される、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
バイオマーカーが、転写されたポリヌクレオチドまたはその部分を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
対象が膵臓がんを有するか否かを診断するための、または治療的処置の効力を評価するためのキットであって、対象に由来する１つまたは複数の生体試料中で、ＬＯＸＬ３、ＤＮＡＨ５、ＤＮＡＨ１２、ＳＣＹＬ２、ＦＬＲＴ３、ＺＮＦ８０４Ａ、ＡＣＴＮ２およびそれらの組み合わせからなる群から選択される１つまたは複数のバイオマーカーを検出するために有用な試薬を含むキット。
【請求項１０】
パッケージングされたプローブおよびプライマーセット、アレイ／マイクロアレイ、バイオマーカー特異的抗体、または１つもしくは複数のバイオマーカーを検出するためのビーズの１つまたは複数を含む、請求項９に記載のキット。
【請求項１１】
特定しようとする１つまたは複数のバイオマーカーを検出するための、少なくとも１つのモノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片またはポリクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片を含む、請求項９に記載のキット。
【請求項１２】
対象の膵臓がんを予防または治療するための療法の効力を評価する方法であって、
（ａ）療法の前に、対象から得られた生体試料中の、ＬＯＸＬ３、ＤＮＡＨ５、ＤＮＡＨ１２、ＳＣＹＬ２、ＦＬＲＴ３、ＺＮＦ８０４Ａ、ＡＣＴＮ２およびそれらの組み合わせからなる群から選択される１つまたは複数のバイオマーカーのレベルを決定すること、ならびに
（ｂ）療法中の１つまたは複数の時点で、対象から得られた生体試料中の１つまたは複数のバイオマーカーのレベルを決定すること
を含み、第１の試料と比べて、第２のまたはその後の試料中の１つまたは複数のバイオマーカーのレベルがより低い場合、療法が、対象のがんを予防または治療するのに効果的である方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権の主張
本出願は、２０１３年６月２０日に出願された、米国仮特許出願第６１／８３７，３５８号の優先権を主張するものであり、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
助成金情報
本発明は、国立衛生研究所から授与された助成金番号Ｒ３７ＧＭ３６４７７に基づく政府支援でなされたものである。米国政府は、本発明について、ある権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
膵管腺癌（ＰＤＡＣ）は、予後が不良であり、生存率は５％未満である（Ｈｅｚｅｌら、２００６；ＭａｉｔｒａおよびＨｒｕｂａｎ、２００８；Ｒｕｓｔｇｉ、２００６）。初期段階で顕著な症状がないため、診断が困難である場合があり、がんが他の臓器に既に転移してから診断が決定されることが多い。加えて、疾患を初期段階で検出するためのバイオマーカーが少なく、ＰＤＡＣは通常、進行期で検出されることになり、治療選択肢が限定されてしまう。検出が遅れることに加え、膵臓がんは、従来使用される化学療法、放射線療法、および外科手術に対する応答不良を示す。
【０００４】
バイオマーカーとしての役目を果たすことができる、膵臓がんから分泌されるタンパク質（Ｈａｒｓｈａら、２００９）は、多くが進行した侵襲性のＰＤＡＣまたはその細胞系で特定されており、したがって、疾患の初期段階のマーカーではない場合がある。例えば、幾つかのタンパク質バイオマーカーが、膵炎および膵臓がんの患者に由来する血清および膵液で特定されている。現在、膵臓がんをモニターするために、血清バイオマーカータンパク質ＣＡ−１９．９が使用されているが、早期診断には有用ではない（Ｇａｔｔａｎｉら、１９９６）。したがって、ＰａｎＩＮおよび膵管内乳頭粘液性新生物（ＩＰＭＮ）等の前がん性病変のマーカーが探索されているが（Ｂｒａｔら、１９９８；Ｈｒｕｂａｎら、２００１）、それらマーカーは、特にその初期の潜在的に治癒可能な段階での診断可能性の向上を提供することができる分泌または放出タンパク質ではなく、典型的には細胞内または細胞表面タンパク質である（Ｈａｒｓｈａら、２００９）。
【０００５】
ＰＤＡＣの有名な動物モデルは、ヒトＰＤＡＣで頻繁に生じる突然変異であるＫｒａｓのＧ１２Ｄ突然変異対立遺伝子をマウス膵臓上皮に誘導することに基づく（Ｈｉｎｇｏｒａｎｉら、２００３）。マウスは、潜伏期が長く浸透度が不完全なＰＤＡＣを有する膵臓上皮内新生物（ＰａｎＩＮ）を発症する。ＰＤＡＣは、これら突然変異だけでは効率的に引き起こされないが、ＫｒａｓＧ１２Ｄ／＋マウスが、Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆ、Ｔｇｆｂｒ２、ｐ５３、またはＰＴＥＮの突然変異をさらに含む場合、ＰＤＡＣおよび関連腫瘍は、非常に迅速に発達する（Ｍｏｒｒｉｓら、２０１０）。初期膵臓がんのヒトモデルを開発するために、ＰＤＡＣ細胞が、腫瘍断片（Ｒｕｂｉｏ−Ｖｉｑｕｅｉｒａら、２００６）、分散細胞（Ｋｉｍら、２００９）、またはがん幹細胞マーカーで分類した細胞（Ｈｅｒｍａｎｎら、２００７；Ｉｓｈｉｚａｗａら、２０１０；Ｌｉら、２００７）のいずれかとして、免疫不全マウスに移植されている。こうした状況では、該細胞がそれらから由来し、ゆっくりと成長するＰＤＡＣの初期ＰａｎＩＮ段階を経ない進行性ＰＤＡＣ段階と似ている腫瘍が迅速に生じる（Ｄｉｎｇら、２０１０）。しかしながら、ＰＤＡＣおよび疾患進行の初期段階を経るヒト生細胞モデルが必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｈｅｚｅｌら、２００６
【非特許文献２】ＭａｉｔｒａおよびＨｒｕｂａｎ、２００８
【非特許文献３】Ｒｕｓｔｇｉ、２００６
【非特許文献４】Ｈａｒｓｈａら、２００９
【非特許文献５】Ｇａｔｔａｎｉら、１９９６
【非特許文献６】Ｂｒａｔら、１９９８
【非特許文献７】Ｈｒｕｂａｎら、２００１
【非特許文献８】Ｈｉｎｇｏｒａｎｉら、２００３
【非特許文献９】Ｍｏｒｒｉｓら、２０１０
【非特許文献１０】Ｒｕｂｉｏ−Ｖｉｑｕｅｉｒａら、２００６
【非特許文献１１】Ｋｉｍら、２００９
【非特許文献１２】Ｈｅｒｍａｎｎら、２００７
【非特許文献１３】Ｉｓｈｉｚａｗａら、２０１０
【非特許文献１４】Ｌｉら、２００７
【非特許文献１５】Ｄｉｎｇら、２０１０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本開示は、初期から侵襲期の膵臓がんが、対象の生体試料で検出することができるバイオマーカーを放出または分泌するという発見に、少なくとも部分的に基づく。したがって、本開示は、対象の生体試料中に膵臓がんを示すバイオマーカーが存在することを決定するための方法を提供する。ある実施形態では、患者の生体試料中に１つまたは複数のバイオマーカーが検出されることは、初期から侵襲期の膵臓がんが存在することを示す。したがって、本開示の方法は、がんの早期予後予測および早期診断（例えば、従来手段による腫瘍特定の前にバイオマーカーを特定すること）、ならびに対象の療法モニタリングをさらに提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
１つの態様では、本開示は、対象が前がん性病変を有しているか否か、および進行期膵臓がんを発症するリスクがあるか否かを評価するための方法であって、対象から得られた生体試料中のバイオマーカーの存在を決定することを含み、バイオマーカーの存在が、患者の進行期がん発症リスクが増加している指標である方法を提供する。ある実施形態では、バイオマーカーの存在は、対象に初期膵臓がんがあることを示す。ある実施形態では、バイオマーカーの存在は、対象に進行期、侵襲性、および／または転移性の膵臓がんがあることを示す。ある実施形態では、本方法は、対象の原発性腫瘍を特定する前に実施される。
【０００９】
また別の態様では、本開示は、対象の膵臓がんを予防、阻害、または治療するための治療的または予防的療法の効力を評価するための方法であって、療法の前に、対象から得られた生体試料中のバイオマーカーの存在および／またはレベルを決定すること；および治療的または予防的療法中の１つまたは複数の時点で、対象から得られた生体試料中のバイオマーカーの存在および／またはレベルを決定することを含み、第１の試料に比べて、第２のまたはその後の試料のバイオマーカーのレベルがより低い場合、療法が、対象のがんを予防、阻害、または治療するのに効果的である方法を提供する。
【００１０】
ある非限定的な実施形態では、生体試料は、血液試料および／または血漿試料であってもよい。ある実施形態では、生体試料は、糞便試料であってもよい。ある実施形態では、生体試料は、膵嚢胞から排出される流体であってもよい。他の実施形態では、生体試料は、組織、例えば組織生検であってもよい。ある実施形態では、１つまたは複数のバイオマーカーは、対象に由来する１つまたは複数の生体試料で検出することができる。糞便、血漿、および／または血液を生体試料として使用することにより、診断または予後予測手段の侵襲性を排除し、検査が対象に与える負担を劇的に改善することが可能になる。
【００１１】
ある実施形態では、バイオマーカーはタンパク質であり、タンパク質の存在は、タンパク質と特異的に結合する試薬を使用して検出される。例えば、試薬は、抗体、抗体誘導体、抗原結合抗体断片、およびタンパク質と特異的に結合する非抗体ペプチドからなる群から選択することができる。ある実施形態では、抗体または抗原結合抗体断片は、モノクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片、またはポリクローナル抗体もしくはその抗原結合性断片である。ある実施形態では、タンパク質バイオマーカーは、質量分析法等の生物物理学的技法により検出することができる。ある実施形態では、タンパク質バイオマーカーは、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により検出することができる。
【００１２】
また、バイオマーカーは、転写されたポリヌクレオチドまたはその部分、例えば、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡであってもよい。ある実施形態では、転写されたポリヌクレオチドの検出は、転写されたポリヌクレオチドを増幅することを含む。ある実施形態では、核酸バイオマーカーは、ＲＮＡ  ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより検出することができる。
【００１３】
また、本開示は、対象が膵臓がんを有するか否かをモニター、診断、または評価するための、対象の治療的処置をモニターするための、および対象の治療的処置計画の効力を評価するためのキットであって、生体試料中の分泌または放出バイオマーカーを検出するのに有用な試薬を含むキットを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】患者の一致する周縁部および膵管腺癌に由来するｉＰＳ様系統の樹立を示す図である。Ａ．膵臓がんおよび周縁部組織に由来する細胞を再プログラムした。患者＃１０に由来する１０−１２周縁部および１０−２２がんｉＰＳ様クローンの様々な継代が示されている。Ｂ、Ｃ．免疫染色（Ｂ）およびＲＴ−ＰＣＲ（Ｃ）による、１０−１２周縁部および１０−２２がんｉＰＳ様系統での多能性マーカーの発現。Ｄ．１０−１２周縁部および１０−２２がんｉＰＳ様系統に由来するＮＳＧマウスの３か月奇形腫は、３つの胚葉系統全ての組織への分化を示した（図８Ａも参照）。Ｅ．１２〜１４日間培養したＨ１  ｈｕＥＳ細胞ならびに１０−１２周縁部および１０−２２がんｉＰＳ様系統に由来する胚様体における、ＧＡＰＤＨと比べた、内胚葉（ＣＸＣＲ４）、中胚葉（ＲＵＮＸ１）、および外胚葉（ＳＯＸ１、ＰＡＸ６）の分化マーカーの発現。エラーバー、平均±ＳＤ。Ｆ、Ｇ．１０−２２がんｉＰＳ様系統（Ｆ）でのＫＲＡＳ突然変異および四倍性未満（ｓｕｂｔｅｔｒａｐｌｏｉｄｙ）を示す核型、ならびに１０−１２周縁部ｉＰＳ様系統（Ｇ）での野生型ＫＲＡＳおよび正常核型を明らかにするＤＮＡ配列トラック。Ｈ．ＣＤＫＮ２Ａ（ｐ１６Ｉｎｋ４ａ）エクソン２のＰＣＲ分析は、１０−２２細胞でのヘテロ接合性欠失を明らかにする。Ｉ．１０番目の原発性周縁部細胞（ａ）および１０−１２周縁部ｉＰＳ様系統（ｂ）の正常なプロファイルを示す比較ゲノムハイブリダイゼーション。正常な間質細胞と混合された１０番目の原発性がん細胞培養（ｃ）では大規模染色体再編（ｇｒｏｓｓ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔｓ）が明らかであり、再編は、１０−２２がんｉＰＳ様系統（ｄ）でより明白に明らかであり（図９Ｂも参照されたい）、１０−２２系統が、クローン的に派生した代表的な初期腫瘍上皮細胞集団であることを示す。ＰＴＥＮおよびＤＰＣ４（ＳＭＡＤ４）遺伝子座の位置は、１０番目のがん細胞および１０−２２細胞での染色体消失の領域に示されている。
【図２】１０−２２ｉＰＳ様細胞が、奇形腫では腺管構造を優先的に生成することを示す図である。Ａ．観察される組織学的構造の数に基づく、免疫不全マウスにおいて３か月で生じる奇形腫組織タイプの要約。ｈｕＥＳ細胞に由来する奇形腫は、外観はほとんど外胚葉性であるが、１０−１２および１０−２２ｉＰＳ様系統に由来する奇形腫は、ほとんど内胚葉性／腺管状である。Ｂ．患者＃１０の周縁部および腫瘍組織のＨ＆Ｅ染色、および３か月後の１０−１２周縁部および１０−２２がんｉＰＳ様系統により形成された奇形腫のＨ＆Ｅ染色。後者の系統は、継代数とは無関係に、チューブ状の腺管様構造を生成する。注目すべきには、１０−２２がん奇形腫は、原発腫瘍よりもより遥かに高度な分化を示す。Ｃ．原発腫瘍は、侵襲性表現型（点線）および高い核対細胞質比（矢印）を示す。Ｄ．３か月の１０−２２腫瘍ｉＰＳ奇形腫は、低い核対細胞質比、細胞内ムチン（矢印）およびより分化した表現型を示す。
【図３】１０−２２がんｉＰＳ様細胞に由来する３か月の奇形腫が、ＰａｎＩＮ様構造およびマーカー発現を示す図である。Ａ〜Ｃ．マウス皮下組織（陰性対照）ではＫ１９染色はなく、３か月の１０−１２周縁部ｉＰＳ様奇形腫には弱いＫ１９染色があり、３か月の１０−２２がんｉＰＳ様奇形腫には強いＫ１９染色がある。Ｄ〜Ｉ．３か月の１０−２２がんｉＰＳ様奇形腫にのみ、ＰＤＸ１の核染色（矢印）およびＭＵＣ５ＡＣの細胞質染色（矢印）がある。Ｊ、Ｋ．より高い倍率では、１０−２２がんｉＰＳ様細胞に由来する奇形腫の均一なＫ１９染色（Ｊ、Ｊ’、矢印）および不均一なＭＵＣ５ＡＣ染色（Ｋ、Ｋ’）が示される。
【図４】１０−２２がんｉＰＳ様細胞に由来する６か月および９か月の奇形腫が、侵襲期の膵臓がんを示す図である。Ａ〜Ｂ、６か月（Ａ、Ａ’）および９か月（Ｂ、Ｂ’）での、ＮＳＧマウスにおける１０−２２奇形腫のＨ＆Ｅ染色。矢印は、３か月の時よりもより異形成の表現型を有する上皮細胞を示し、核はヘテロタイプであり、低血素性の核を有する上皮が間質に浸潤しつつある（Ａ、Ｂ、矢印）。Ｃ〜Ｒ  １０  ２２細胞を注射したＮＳＧマウスにおいて６か月および９か月で生じる腫瘍中の、Ｋ１９、ＭＵＣ５ＡＣ、ＰＤＸ１、およびＳＯＸ９に陽性の上皮細胞を示す免疫組織化学的検査。腫瘍中の１０−２２細胞の遺伝子的確認は、図１１Ｆを参照されたい。
【図５】３か月時の１０−２２ｉＰＳ様細胞の奇形腫外植片内の分泌されたタンパク質およびＨＮＦ４調節ネットワークを示す図である。１０−２２がんｉＰＳ様系統に由来する３か月の奇形腫のｉｎ  ｖｉｔｒｏ外植片の概略。Ａ〜Ｃ．１０−２２ｉＰＳ様細胞に由来する奇形腫外植片の全載視（Ａ）、ならびに、切片化され、Ｋ１９で染色された外植片（Ｂ）、およびＭＵＣ５ＡＣ（Ｃ）。矢印は、陽性領域を示す。Ｄ．１０−２２がんｉＰＳ様細胞に由来する３つの独立した奇形腫外植片（＃７７６１、９２２３、および９２２５）の順化培地のプロテオミクス分析。順化培地を、ｎａｎｏＬＣ／ＭＳ／ＭＳで分析し、タンパク質候補を、ＩＰＩ  ＤＢのＳｅｑｕｅｓｔ探索で特定した。ＵｎｉＰｒｏＫＢ  ＴｒＥＭＢＬ（２０１１年１０月にダウンロード）を使用して、ペプチドを、ヒトに特有の配列、またはヒトおよびマウスに共通した配列のいずれかからなるリストに含めた。マウス特異的配列を除外した。奇形腫外植片に由来する順化培地のタンパク質Ｉ．Ｄ．を、対側性対照組織の外植片に由来する順化培地中のもの、および未分化１０−２２細胞に由来する培地のものと比較した（左側のベン図）。奇形腫に特異的な合計６９８個の分泌または放出タンパク質が、３つの異なる実験で示された（右側のベン図）。少なくとも２つの奇形腫外植片から分泌されたタンパク質が、表４および５に要約されており、経路分析に使用した。Ｅ．多数のタンパク質が、ＴＧＦβおよびインテグリンシグナル伝達の連結された経路に入る。分子を結ぶ線および矢印は、直接的相互作用を示し、点線および矢印は、間接的な相互作用を示す。Ｆ．太字のタンパク質は全て、１０−２２奇形腫外植片から特異的に分泌または放出され、転写因子ＨＮＦ４αにより制御されるネットワーク内に入る（表９）。星印は、その遺伝子がＨＮＦ４αにより直接結合されるタンパク質を示す。
【図６】ＰａｎＩＮ細胞、およびヒト臨床試料の十分に分化した初期膵臓がん、およびヒトＰＤＡＣのマウスモデルにおけるＨＮＦ４αの活性化を示す図である。Ａ〜Ｄ．主なヒト膵臓塊および腺管（Ａ）で染色がないこと、１０−２２細胞を注射したＮＳＧマウスから生成された３か月の奇形腫におけるＰａｎＩＮ様構造（Ｂ、矢印）および９か月の腫瘍における侵襲性細胞（Ｃ、矢印）の強力な核染色、ならびに小型の中程度に分化した腺管でのほとんど細胞質の染色（Ｄ、対角線より下の画像区画、茶色の破線）、および１０番目の患者の膵臓腫瘍上皮の未分化腺管に染色がないこと（Ｄ、対角線より上の画像区画）を示すＨＮＦ４αの免疫組織化学的検査。Ｅ〜Ｉ．ＨＮＦ４αは、ヒトＰａｎＩＮ−１細胞（Ｅ、矢印、Ｎ＝８）では弱く標識され、ＰａｎＩＮ２（Ｆ、矢印、Ｎ＝７）、ＰａｎＩＮ３（Ｇ、矢印、Ｎ＝３）、および粘液性の十分に分化したヒトＰＤＡＣ（Ｈ、矢印、Ｎ＝８）では強力に標識されるが、未分化／または分化が不良なヒトＰＤＡＣ（Ｉ、Ｎ＝８）では、減少または標識されない。Ｊ、ヒト組織マイクロアレイにおいて複数のＰａｎＩＮおよびＰＤＡＣ試料中の、計数された総上皮核に対するＨＮＦ４α陽性核の割合（表１４を参照）。エラーバー、ＳＥＭ。ＨＮＦ４α発現の差は、両側スチューデントｔ検定によると、周縁部とＰａｎＩＮ−２段階およびＰａｎＩＮ−３段階との間（＊Ｐ＜０．０５）；周縁部と十分に分化したＰＤＡＣとの間（＊＊Ｐ＝５．４６Ｅ−０６）；十分に分化したＰＤＡＣと分化不良／未分化のＰＤＡＣとの間（＊＊Ｐ＝３．０５Ｅ−０６）では統計的に有意である。Ｋ〜Ｐ．ＰＤＡＣのマウスモデルでは、ＨＮＦ４αは、ＰａｎＩＮ１（Ｋ、Ｋ’）では弱く発現され、ＰａｎＩＮ２〜３段階（Ｌ、Ｌ’、Ｍ、Ｍ’）および腫瘍（ＰＤＡＣ）の分化部分（Ｏ、Ｏ’）では強力に発現され、同じ腫瘍の未分化部分（Ｐ、Ｐ’）では弱く発現されるかまたは発現されない。
【図７】Ａ〜Ｂ．患者＃１４からのｉＰＳ様系統の生成。膵臓周縁部およびがんｉＰＳ様系統を患者＃１４から生成し、ＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ４、ＳＳＥＡ４については免疫染色（Ａ）で、多能性遺伝子については、ｑＲＴ−ＰＣＲ（Ｂ）で特徴付けた。Ｃ〜Ｄ．膵臓周縁部およびがんｉＰＳ様系統を患者＃１９から生成し、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、およびＴＲＡ−１−６０については免疫染色（Ｃ）で、多能性については、ＲＴ−ＰＣＲ（Ｄ）で特徴付けた。Ｅ．胚様体を、１４−２４周縁部ｉＰＳ様系統から１５日間生成し、ｑＲＴ−ＰＣＲを使用して、分化マーカーの発現を検査した。発現レベルは、Ｇａｐｄｈとの比較である。エラーバーは、平均±ＳＤ（Ｅ）である。Ｆ．奇形腫アッセイは、１４−２４周縁部および１４−２７がん系統由来ｉＰＳ様系統の、多系列細胞への分化を示したが、１４−２７系統を用いた限定的な実験では、神経誘導体は検出されなかったことに留意されたい。Ｇ〜Ｈ、核型分析は、１４−２４周縁部および１４−２７がんｉＰＳ様系統が、二倍性未満を示し（Ｇ）、１９番目の系統が二倍性を示した（Ｈ）。
【図８】Ａ．３か月後の１０−２２がんｉＰＳ奇形腫組織での様々な胚葉組織の免疫組織化学的（ＩＨＣ）分析。Ｈ１  ｈｕＥＳ奇形腫組織を、陽性対照として使用した。グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）およびベータＩＩＩチューブリンを外胚葉に使用し、ビメンチンおよびＭＦ２０を中胚葉に使用し、Ｋ１９を、内胚葉に使用した。Ｂ．ＮＡＮＯＧ（上段パネル）およびＯＣＴ４（下段パネル）の免疫組織化学的染色。陽性対照としてのＨ１  ｈｕＥＳ系統および原発性腫瘍＃１０実験試料を同時に分析した。データは、ＮＡＮＯＧが原発性＃１０腫瘍では発現されず、ＯＣＴ４が散在性細胞で弱く発現されることを示す。ＮＡＮＯＧ発現の非存在は、原発腫瘍＃１０が、膵臓がん幹細胞をほとんど含まなかったという仮説と一致する（Ｌｏｎａｒｄｏら、２０１１）。Ｃ．亜硫酸水素塩ピロシーケンスによる、ヒトＮＡＮＯＧおよびＯＣＴ４遺伝子の５’上流にある指定のＣｐＧ部位（楕円形、転写開始に対して下の位置）における１０−１２周縁部および１０−２２がんｉＰＳ様系統のＣｐＧメチル化状態の分析。Ｈ１  ｈｕＥＳ細胞に由来するゲノムＤＮＡを陽性対照に使用し、患者＃１０の親原発性腫瘍に由来するゲノムＤＮＡを陰性対照に使用した。この研究で試験した、ＮＡＮＯＧおよびＯＣＴ４の上流領域の概略図。ＰＣＲで増幅した領域が拡大されている。グラフは、指定のＣｐＧ位置でメチル化されたＣの割合を示す。ＮＡＮＯＧでは、試験した９つのＣｐＧ部位全てが、親＃１０腫瘍ＤＮＡではメチル化され、１０−２２ｉＰＳ様系統では、Ｈ１ヒトＥＳ対照細胞で観察されるのと同様に、脱メチル化されていた。ＯＣＴ４では、４９７位および５３２位のＣは、１０−２２ｉＰＳ様系統では著しい脱メチル化を示したが、１６１位での脱メチル化は中程度であった。Ｈ１対照は、４９７部位および５３２部位では、著しくは脱メチル化されなかったが、試験した他の部位では脱メチル化されていた。ＮＡＮＯＧ遺伝子座のメチル化は、原発性腫瘍＃１０が、膵臓がん幹細胞を含んでいなかったというさらなる証拠を提供する。
【図９】Ａ．１０−１２周縁部および１０−２２がんｉＰＳ様クローンの核型分析。Ｂ．１０−１２の周縁部、１０−２２がんｉＰＳ様クローンの比較ゲノムハイブリダイゼーションアッセイ。１０番目の原発性がんの上皮細胞培養に見られる２３個の染色体異常のうち、２０個の異常が、緑色および赤色の二重バーにより示されているように、１０−２２がんｉＰＳ様系統に存在した。斜線バーおよび黒塗りバーは、それぞれ原発性のがんまたは細胞系に固有の異常を示す。ｃｈ１０およびｃｈ１８については、図１Ｉを参照されたい。主にがん上皮細胞で構成されるが、間質細胞も含む１０番目の原発性がん培養に見られる染色体異常（実線のＣＧＨトレース）は、がん培養に由来するクローンである１０−２２ｉＰＳ系統では増幅されている（破線ＣＧＨトレース）ことに留意されたい。
【図１０】Ａ．３か月の１０−１２周縁部および１０−２２がん奇形腫腺管構造は、ＤＢＡレクチンを発現した。対側性対照皮下脂肪組織を陰性対照として使用し、マウス膵臓を陽性対照として使用した。Ｂ〜Ｇ．独立したＮＳＧマウスの３か月での１０−２２がんｉＰＳ様系統に由来する奇形腫に由来するＰａｎＩＮ様構造。患者＃１０の親原発性腫瘍の分化不良な構造（Ｂ）と比較して、１０−２２がんｉＰＳ様系統は、初期１０−２２がんｉＰＳ様系統の継代数に関わらず、独立したマウスにおいてＰａｎＩＮ段階を生成した（Ｃ〜Ｇ）。Ｈ．３か月のＬＣＭ切除１０−２２がんｉＰＳ奇形腫組織でのｒｔ−ＴＡのＰＣＲ。レーザーキャプチャーマイクロダイセクションしたＰａｎＩＮ様腺管、間質、およびマウス腺管でのｒｔ−ＴＡのＰＣＲ。上皮細胞は全て、間質細胞を除去する前に領域から除去して、交差汚染の可能性を回避した。Ｉ．３か月の１０−２２がんｉＰＳ奇形腫組織に由来するＰａｎＩＮ様上皮および間質細胞でのｒｔ−ＴＡの免疫染色。線維芽細胞遠位領域は、ｒｔ−ＴＡに陰性だった。このデータは、奇形腫のＰａｎＩＮ様上皮を取り囲む間質の少なくとも一部が、１０−２２ヒトｉＰＳ様細胞系統に由来することを示す。
【図１１】Ａ．Ｋ１９およびＭＵＣ５ＡＣに対する抗体の検証。抗ヒトＫ１９の種特異性を、１：２０００の希釈率で、マウス皮下組織、マウスおよびヒト膵臓組織で試験した。ＭＵＣ５ＡＣ抗体の特異性を、正常ヒト膵臓および正常ヒト胃で試験した。Ｂ〜Ｅ  ３匹の異なるＮＳＧマウスに３か月で生じた１０−２２がんｉＰＳ奇形腫のＰａｎＩＮ様腺管でのＳＯＸ９の免疫染色。陽性対照として、マウス膵臓をＳＯＸ９で染色した。マウス膵臓の腺管（矢印）および房心細胞（矢印の先端）のサブセットは、ＳＯＸ９を中程度に発現した（Ｂ〜Ｂ’茶色）。島細胞は、ＳＯＸ９を発現しなかった（Ｂ〜Ｂ’、破線矢印）。ＰａｎＩＮ様腺管は、ＳＯＸ９を発現した（茶色、矢印、Ｃ〜Ｅ）。Ｆ．１０−２２がんｉＰＳ様系統を注射したＮＳＧマウスから生じた９か月の１０−２２奇形腫がヒト由来であることを、ｒｔ−ＴＡおよびＣＤＫＮ２ＡのＰＣＲにより確認した。２匹の異なるマウスに由来する４つの腫瘍で、ｒｔ−ＴＡ配列およびＣＤＫＮ２Ａの欠失が保存されていた。対側性対照（ＣＬＣ）組織に由来するＤＮＡを陰性対照に使用した。
【図１２】Ａ．１０−２２がんｉＰＳ様系統に由来する３か月の奇形腫のｉｎ  ｖｉｔｒｏ外植片の概略。３つの独立した奇形腫組織を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養用に外植した（＃７７６１、９２２３、および９２２５）。対側性対照組織および１０−２２奇形腫組織は、球体を生成した。Ｂ．１０−２２奇形腫のｉｎ  ｖｉｔｒｏ外植片がヒト由来であることを、ｒｔ−ＴＡおよびＣＤＫＮ２ＡのＲＴ−ＰＣＲにより確認し、１０−２２ｉＰＳ様細胞のＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｄ突然変異を配列決定することより確認した（図１Ｆ〜Ｈを参照）。Ｃ．マウス肝臓組織および正常膵臓でのＨＮＦ４α免疫染色の対照試験。ＨＮＦ４αは、島細胞でのみ発現され、マウス正常膵臓の腺房細胞または腺管細胞では発現されなかった。実線矢印は陽性細胞を示し、破線矢印は陰性細胞を示す。Ｄ．３か月の独立したマウスに由来する追加の１０−２２がんｉＰＳ奇形腫組織のＨＮＦ４α染色。実線矢印は陽性細胞を示す。
【図１３】対照試料および膵臓がん試料中のバイオマーカーＴＣＨＰの統計分析を示す表である。
【図１４】対照試料および膵臓がん試料中のバイオマーカーＡＢＣＡ１３の統計分析を示す表である。
【図１５】対照試料および膵臓がん試料中のバイオマーカーＳＴＡＲＤ８の統計分析を示す表である。
【図１６】対照試料および膵臓がん試料中のバイオマーカーＡＴＰ２Ａ１の統計分析を示す表である。
【図１７】対照試料および膵臓がん試料中のバイオマーカーＦＫＢＰ１０の統計分析を示す表である。
【図１８】対照試料および膵臓がん試料中のバイオマーカーＳＣＮ８Ａの統計分析を示す表である。
【図１９】対照試料および膵臓がん試料中のバイオマーカーＴＣＦ２０の統計分析を示す表である。
【図２０】対照試料および膵臓がん試料中のバイオマーカーＳＹＮＥ１の統計分析を示す表である。
【図２１】対照試料および膵臓がん試料中のバイオマーカーＵＦＤ１Ｌの統計分析を示す表である。
【図２２】対照試料および膵臓がん試料中のバイオマーカーＦＬＲＴ３の統計分析を示す表である。
【図２３】対照試料および膵臓がん試料中のバイオマーカーＴＯＰ２Ｂの統計分析を示す表である。
【図２４】対照試料および膵臓がん試料中のバイオマーカーＺＨＸ２の統計分析を示す表である。
【図２５】対照試料および膵臓がん試料中のバイオマーカーＬＩＭＣＨ１の統計分析を示す表である。
【図２６】対照試料および膵臓がん試料中のバイオマーカーＴＨＢＳ２の統計分析を示す表である。
【図２７】対照試料および膵臓がん試料中のバイオマーカーＳＨＲＯＯＭ３の統計分析を示す表である。
【図２８】対照試料および膵臓がん試料中のバイオマーカーＨＭＯＸ１の統計分析を示す表である。
【図２９】対照試料および膵臓がん試料中のバイオマーカーＬＯＸＬ３の統計分析を示す表である。
【図３０】対照試料および膵臓がん試料中のバイオマーカーＯＢＳＣＵＲＩＮの統計分析を示す表である。
【図３１】対照試料および膵臓がん試料中のバイオマーカーＭＡＬＥＣＴＩＮの統計分析を示す表である。
【図３２】対照試料および膵臓がん試料中のバイオマーカーＤＮＡＨ５の統計分析を示す表である。
【図３３】対照試料および膵臓がん試料中のバイオマーカーＣＡ１９−９の統計分析を示す表である。
【図３４】対照試料および膵臓がん試料中のバイオマーカーＡＦＰの統計分析を示す表である。
【図３５】対照試料および膵臓がん試料中のバイオマーカーＲＴＴＮの統計分析を示す表である。
【図３６】対照試料および膵臓がん試料中のバイオマーカーＮＬＲＸ１の統計分析を示す表である。
【図３７】対照試料および膵臓がん試料中のバイオマーカーＤＮＡＨ１２の統計分析を示す表である。
【図３８】対照試料および膵臓がん試料中のバイオマーカーＯＤＺ３の統計分析を示す表である。
【図３９】対照試料および膵臓がん試料中のバイオマーカーＡＤＡＭＳＴ９の統計分析を示す表である。
【図４０】対照試料および膵臓がん試料中のバイオマーカーＴＰＭ１の統計分析を示す表である。
【図４１】対照試料および膵臓がん試料中のバイオマーカーＤＮＡＨ１の統計分析を示す表である。
【図４２】対照試料および膵臓がん試料中のバイオマーカーＰＭＢＰ１の統計分析を示す表である。
【図４３】対照試料および膵臓がん試料中のバイオマーカーＤＮＡＨ１７の統計分析を示す表である。
【図４４】対照試料および膵臓がん試料中のバイオマーカーＥＰＨＢ１の統計分析を示す表である。
【図４５】対照試料および膵臓がん試料中のバイオマーカーＤＯＳの統計分析を示す表である。
【図４６】対照試料および膵臓がん試料中のバイオマーカーＭＭＰ２の統計分析を示す表である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本開示は、対象に由来する生体試料で膵臓がんの存在を検出すると本明細書において特定された１つまたは複数のバイオマーカーの使用に関する。本開示は、ヒト膵管腺癌（ＰＤＡＣ）試料から生成されたｉＰＳ細胞が、膵臓がんの初期段階を研究するための生細胞ヒトモデルを提供したという発見に少なくとも部分的に基づく。さらに、本開示は、初期から侵襲期の膵臓がんが、対象の生体試料、例えば血液において検出可能である特定のタンパク質を放出または分泌したという発見に少なくとも部分的に基づく。
【００１６】
したがって、本開示は、対象の生体試料に膵臓がんの１つまたは複数のバイオマーカーが存在することを決定するための方法およびキット、ならびにそのようなバイオマーカーの存在またはレベルを使用して、対象の膵臓がんを予測または診断し、膵臓がんを罹患する対象の治療計画を選択し、膵臓がんを罹患する対象を治療する方法あって、生体試料中の１つもしくは複数のバイオマーカーの存在（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２５、または３０個以上）、または対象に応じて別の規定の最小数が、対象に膵臓がんが存在することを示す方法を提供する。本開示の方法で使用することができるバイオマーカーは、表４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、および１５に示されている。ある実施形態では、本開示の方法で使用することができるバイオマーカーには、ＲＴＴＮ、ＤＮＡＨ１２、ＴＰＭ１、ＤＮＡＨ１、ＳＴＡＲＤ８、ＡＴＰ２Ａ１、ＴＯＰ２Ｂ、ＬＩＭＣＨ１、ＳＹＮＥ１、ＴＨＢＳ２、およびＬＯＸＬ３が含まれる。
【００１７】
対象の生体試料中に本開示の分泌または放出バイオマーカーを特定することに基づき、腫瘍形成が発生または特定される前であっても、対象の膵臓がんの診断をなすことができ、したがって、対象の予防的療法が可能になる。例えば、さらなるまたはより頻繁なモニタリング、生検、外科的切除、または腫瘍形成を予防するかまたは非常に早期にがんを特定するための他の予防的方策を、生体試料中の１つまたは複数のバイオマーカーを検出することに基づいて実施することができる。
【００１８】
さらに、１つまたは複数のバイオマーカーの存在および／またはレベルを、療法のコースにわたって評価することにより、がん療法の有効性をモニターすることができ、こうした評価に基づいて、療法のタイプ、継続期間、およびコースに関して意思決定を行うことができる。
【００１９】
ある実施形態では、本明細書に記載のように、生体試料中のバイオマーカーの存在を検査されている対象は、膵臓がんを発症するリスクが高い対象であり得る。ある実施形態では、対象は、例えば、家族歴または遺伝的疾病素質の決定に基づいて、膵臓がんの発症リスクが高い。例えば、それらの知見は、遺伝性膵臓がんを有する親族を有する対象を含む、膵臓がんのリスクが高い個体の管理に示唆を有する。初期段階の膵臓がんからバイオマーカーが分泌または放出されることを特定することに基づくと、後期侵襲性の膵臓がんを検出する前の時期に、ハイリスク対象に予防的療法を施す格好のチャンスが存在する。
【００２０】
膵臓がんを有する患者の大多数は、現行の方法を使用した診断時には転移性疾患を有しているため、本明細書で例示されているように、本開示を使用して、膵管腺癌（ＰＤＡＣ）を診断することができる。はっきりとした外科的周縁部を有し、転移の証拠のない小さな膵臓腫瘍の外科的切除を受けた患者の７５％超が、５年以内に転移性疾患で死亡しており（Ｎｅｏｐｔｏｌｅｍｏｓら、２００４）、この知見は、初期拡散と一致している。さらに、転移性ＰＤＡＣは、慢性膵炎の膵切除術を受け、切除された膵臓の組織学的分析により、ＰａｎＩＮ病変のみが明らかになった患者のコホートで記録されている（ＳａｋｏｒａｆａｓおよびＳａｒｒ、２００３）。したがって、非常に早期の診断および治療が重要である。
【００２１】
定義
本明細書で使用される場合、単語「１つ（ａ）」または「１つ（ａｎ）」の使用は、特許請求の範囲および／または明細書にて、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、または「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」と共に使用される場合、「１つ」を意味していてもよいが、「１つまたは複数」、「少なくとも１つ」、および「１つ以上」の意味とも一致する。本開示のある実施形態は、本発明の１つもしくは複数の要素、方法ステップ、および／または方法からなってもよく、あるいはから本質的になってよい。本明細書に記載の任意の方法または組成物は、本明細書に記載の任意の他の方法または組成物に関して実施することができることが企図される
【００２２】
本明細書で使用される場合、用語「バイオマーカー」は、その初期段階の疾患を検出することを含む、個体の疾患の検出を可能にするマーカー（例えば、ｍＲＮＡおよび／またはタンパク質を含む、発現遺伝子）を指す。本明細書で使用される場合、バイオマーカーには、表４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、および１５に示されている核酸マーカーおよび／もしくはタンパク質マーカー、またはそれらの組み合わせが含まれる。ある非限定的な実施形態では、バイオマーカーは、対象の生体試料で検出することができる放出および／または分泌タンパク質である。ある実施形態では、検査される個体に由来する組織試料または生体試料中のｍＲＮＡおよび／またはタンパク質レベルにより決定されるバイオマーカーの発現レベルは、同じ個体または別の健常個体に由来する正常組織試料または生体試料中のそれぞれのレベルと比較される。ある実施形態では、検査される個体に由来する組織試料または生体試料中のｍＲＮＡおよび／またはタンパク質レベルにより決定されるバイオマーカーの存在は、同じ個体または別の健常個体に由来する正常組織試料または生体試料中のそれぞれの存在または非存在と比較される。ある実施形態では、個体に由来する組織試料または生体試料中のｍＲＮＡおよび／またはタンパク質レベルにより決定されるバイオマーカーの存在は、個体が膵臓がんを有するか、または後期膵臓がんに進行するリスクが高いことを示す。
【００２３】
本明細書で使用される場合、用語「生体試料」は、組織、組織試料、細胞試料、腫瘍試料、糞便試料、および生体液、例えば、血漿、血清、血液、尿、リンパ液、腹水、膵嚢胞液、および乳頭吸引液を含む、対象、例えばヒト対象から得られる生体材料の試料を指す。ある実施形態では、１つまたは複数のバイオマーカーの存在は、対象から得られる末梢血試料で決定される。ある実施形態では、１つまたは複数のバイオマーカーの存在は、対象から得られる糞便試料で検出される。ある実施形態では、１つまたは複数のバイオマーカーの存在は、対象から得られる膵嚢胞液で検出される。ある実施形態では、１つまたは複数のバイオマーカーの存在は、対象から得られる１つまたは複数の血漿試料で検出される。
【００２４】
用語「患者」または「対象」は、本明細書では同義的に使用され、任意の温血動物、例えばヒトを指す。非ヒト対象の非限定的な例には、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ニワトリ、ブタ、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ等が含まれる。
【００２５】
本明細書に記載の用語「膵臓がん」は、これらに限定されないが、ＰａｎＩＮ病変、膵管腺癌、または膵臓腺癌を含む、膵臓の正常組織から生じる任意のタイプのがん組織または前がん性組織を指す。他のタイプの膵臓腫瘍には、腺房細胞癌、漿液性嚢胞腺腫、および膵内分泌腫瘍が含まれる。ある実施形態では、本開示のバイオマーカーは、胆道がんおよび肝臓がん等のがんを検出するために使用することができる。
【００２６】
本明細書で使用される場合、「切除可能ながん」は、初期段階にあり、外科的に切除することができるがんのサブセットを指す。例えば、限定ではなく、膵臓がんの病期ＩＡ、ＩＢ、およびＩＩＡは、典型的には切除可能である。
【００２７】
用語「初期がん」は、本明細書で使用される場合、転移および／または器官血管外漏出前のがんを指す。例えば、限定ではなく、膵臓がんに関して、初期がんは、病期ＩＡ、ＩＢ、およびＩＩＡを含むことができる。
【００２８】
予後予測および診断方法
本開示の実施形態は、対象の膵臓がんを診断するための方法に関する。ある実施形態では、対象の前立腺がんを診断するための方法であって、対象から生体試料を得ること、生体試料中の１つまたは複数のバイオマーカーの存在を決定すること、および対象の膵臓がんを診断することを含み、１つまたは複数のバイオマーカーの存在が、対象の膵臓がんの確定診断と相関する方法が開示されている。本開示の方法で使用することができるバイオマーカーは、表４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、および１５に示されている。
【００２９】
ある実施形態では、対象の膵臓がんを診断するための方法は、少なくとも１つの生体試料を対象から得ることを含む。ある実施形態では、１つまたは複数のバイオマーカーは、血液（血漿または血清を含む）または糞便（例えば、糞便試料）で検出することができる。またはその代わりに、少なくとも１つのバイオマーカーは、１つの試料で、例えば血液、血漿、血清で検出することができ、少なくとも１つの他のバイオマーカーは、別の試料、例えば糞便で検出される。ある実施形態では、１つまたは複数のバイオマーカーは、組織試料で検出される。例えば、生体試料は、腫瘍生検であってもよい。ある実施形態では、１つまたは複数のバイオマーカーは、膵嚢胞液で検出される。生体試料を収集するステップは、任意の好適な技法により、直接的または間接的のいずれかで実施することができる。例えば、対象に由来する血液試料は、静脈切開または他の好適な技法により実施することができ、本開示主題の方法で使用するために、血液試料をさらに処理して、血清試料または他の好適な血液画分、例えば血漿を提供することができる。
【００３０】
ある実施形態では、１つまたは複数のバイオマーカーを検出するための方法を使用して、対象の応答をモニターし、予防的または治療的処置（例えば、予防的がん治療または診断されたがんの治療）を行うことができる。ある実施形態では、本開示は、第１の時点にて対象中の１つまたは複数のバイオマーカーの存在を測定すること、治療剤を投与すること、第２の時点にて１つまたは複数のバイオマーカーを再度測定すること、第１および第２の測定の結果を比較すること、および任意選択で比較に基づいて治療計画を変更することを含む、治療法をさらに提供する。ある実施形態では、１つまたは複数のバイオマーカーは、ＭＡＮＦ、ＺＮＦ４８５、ＩＭＰＡ１、ＳＶＥＰ１、ＫＩＡＡ１６７１、ＫＩＡＡ１５２９、ＧＮＮ、ＤＯＳ、ＳＴＡＲＤ８（ＤＬＣ３）、ＳＣＮ８Ａ、Ｕ２ＳＵＲＰ、ＴＣＨＰ、ＩＰＩ０００２６６６５、ＲＡＤ５１Ｃ、ＡＴＰ２Ａ１、ＮＬＲＸ１、ＺＮＦ１６０、ＲＴＴＮ、ＡＢＣＡ１３、ＤＥＳ、ＩＭＭＴ、ＴＰＭ１、ＳＮＲＰＥ、ＶＣＡＭ１、ＧＲＢ２、ＳＨＲＯＯＭ３、ＨＭＯＸ１、ＰＯＳＴＮ、ＭＭＰ１０、ＭＭＰ−２、ＴＨＢＳ２、ＥＷＳＲ１、ＮＯＤ１、ＡＤＡＭＴＳ９、ＡＦＰ、ＳＹＮＥ１、ＳＹＮＥ２、ＥＰＨＢ１、ＵＦＤ１Ｌ、ＴＥＡＤ１、ＲＹＲ３、ＣＭＹＡ５、ＭＹＬＫ、ＴＯＰ２Ｂ、ＫＩＡＡ１１０９、ＯＤＺ３、ＰＭＦＢＰ１、ＥＰＨＢ３、ＬＩＭＣＨ１、ＴＣＦ２０、ＥＲＰ２９、ＯＢＳＣＮ、ＬＯＸＬ３、ＭＬＥＣ、ＤＮＡＨ１、ＤＮＡＨ５、ＤＮＡＨ１２、ＤＮＡＨ１７、ＳＣＹＬ２、ＦＫＢＰ１０、ＦＬＲＴ３、ＺＨＸ２（ＡＦＲ１）、ＺＮＦ８０４Ａ、ＡＣＴＮ２またはそれらの組み合わせから選択される。ある実施形態では、１つまたは複数のバイオマーカーは、ＲＴＴＮ、ＤＮＡＨ１２、ＴＰＭ１、ＤＮＡＨ１、ＳＴＡＲＤ８、ＡＴＰ２Ａ１、ＴＯＰ２Ｂ、ＬＩＭＣＨ１、ＳＹＮＥ１、ＴＨＢＳ２、ＬＯＸＬ３、またはそれらの組み合わせから選択される。
【００３１】
ある実施形態では、第１の時点は、治療剤の投与前であり、第２の時点は、前記治療剤の投与後である。ある実施形態では、第１の時点は、対象に治療剤を最初に投与する前である。ある実施形態では、用量（任意の１回の投与で投与される治療剤の量と定義される）は、該比較に応じて増加または減少される。ある実施形態では、投薬間隙（連続した投与間の時間として定義される）は、該比較に応じて増加または減少され、治療の完全中止が含まれる。
【００３２】
本開示のある実施形態では、対象の膵臓がんを診断、予後予測、またはスクリーニングするための方法は、（ａ）対象から生体試料を得ること、（ｂ）表４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１５、またはそれらの組み合わせから選択される、対象の生体試料中の１つまたは複数のバイオマーカーのレベルを決定すること、および（ｃ）１つまたは複数のバイオマーカーのレベルを、基準試料と比較することを含み、１つまたは複数のバイオマーカーのレベルの増加が、対象に膵臓がんが存在することを示す。ある実施形態では、基準試料は、例えば、対象の正常生体試料から、例えば隣接する良性組織から、または膵臓がんを有していない対象から得ることができる。
【００３３】
本開示のある実施形態では、対象の膵臓がんを診断、予後予測、またはスクリーニングするための方法は、（ａ）対象から生体試料を得ること、（ｂ）表４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１５、もしくはそれらの組み合わせから選択される、対象の生体試料中の１つもしくは複数のバイオマーカーの存在および／またはレベルを決定することを含み、１つまたは複数のバイオマーカーの検出が、対象に膵臓がんが存在することを示す。
【００３４】
本開示のある実施形態では、膵臓がんを有する対象を診断するための方法は、対象に由来する生体試料中の１つまたは複数のバイオマーカーの存在を決定することを含み、１つまたは複数のバイオマーカーには、ＴＧＦβ／インテグリンシグナル伝達経路の１つまたは複数のバイオマーカーが含まれる。ある実施形態では、１つまたは複数のＴＧＦβ／インテグリンシグナル伝達経路バイオマーカーには、これらに限定されないが、ＤＥＳ、ＩＭＭＴ、ＴＰＭ１、ＳＮＲＰＥ、ＶＣＡＭ１、ＧＲＢ２、ＳＨＲＯＯＭ３、ＨＭＯＸ１、ＰＯＳＴＮ、ＭＭＰ１０、ＭＭＰ−２、ＴＨＢＳ２、ＥＷＳＲ１、ＮＯＤ１、ＡＤＡＭＴＳ９、ＡＦＰ、ＳＹＮＥ１、ＳＹＮＥ２、ＥＰＨＢ１、ＵＦＤ１Ｌ、ＴＥＡＤ１、ＲＹＲ３、ＣＭＹＡ５、ＭＹＬＫ、ＴＯＰ２Ｂまたはそれらの組み合わせが含まれる。ある実施形態では、１つまたは複数のＴＧＦβ／インテグリンシグナル伝達経路バイオマーカーは、ＳＹＮＥ１、ＴＨＢＳ２、ＴＯＰ２Ｂ、ＴＰＭ１、またはそれらの組み合わせである。
【００３５】
本開示のある実施形態では、膵臓がんを有する対象を診断するための方法は、対象に由来する生体試料中の１つまたは複数のバイオマーカーの存在を決定することを含み、１つまたは複数のバイオマーカーには、ＨＮＦ４α転写ネットワーク経路の１つまたは複数のバイオマーカーが含まれる。ある実施形態では、１つまたは複数のＨＮＦ４α転写ネットワーク経路バイオマーカーには、これらに限定されないが、ＯＢＳＣＮ、ＬＯＸＬ３、ＭＬＥＣ、ＤＮＡＨ１、ＤＮＡＨ５、ＤＮＡＨ１２、ＤＮＡＨ１７、ＳＣＹＬ２、ＦＫＢＰ１０、ＦＬＲＴ３、ＺＨＸ２（ＡＦＲ１）、ＺＮＦ８０４Ａ、ＡＣＴＮ２、またはそれらの組み合わせが含まれる。ある実施形態では、１つまたは複数のＨＮＦ４α転写ネットワーク経路バイオマーカーは、ＬＯＸＬ３、ＤＮＡＨ１２、ＤＮＡＨ１、またはそれらの組み合わせであってもよい。
【００３６】
本開示のある実施形態では、膵臓がんを有する対象を診断するための方法は、対象に由来する生体試料中の１つまたは複数のバイオマーカーの存在を決定することを含み、バイオマーカーは、ＲＡＳ／ｐ５３／ＪＵＮ／ＣＴＮＢ１シグナル伝達経路から選択される１つまたは複数のバイオマーカーを含む。ある実施形態では、１つまたは複数のＲＡＳ／ｐ５３／ＪＵＮ／ＣＴＮＢ１シグナル伝達経路バイオマーカーには、これらに限定されないが、ＫＩＡＡ１１０９、ＯＤＺ３、ＰＭＦＢＰ１、ＥＰＨＢ３、ＬＩＭＣＨ１、ＴＣＦ２０、ＥＲＰ２９、またはそれらの組み合わせが含まれる。ある実施形態では、１つまたは複数のＲＡＳ／ｐ５３／ＪＵＮ／ＣＴＮＢ１シグナル伝達経路バイオマーカーは、ＬＩＭＣＨ１である。
【００３７】
本開示のある実施形態では、膵臓がんを有する対象を診断するための方法は、対象に由来する生体試料中の１つまたは複数のバイオマーカーの存在を決定することを含み、バイオマーカーは、ＭＡＮＦ、ＺＮＦ４８５、ＩＭＰＡ１、ＳＶＥＰ１、ＫＩＡＡ１６７１、ＫＩＡＡ１５２９、ＧＮＮ、ＤＯＳ、ＳＴＡＲＤ８（ＤＬＣ３）、ＳＣＮ８Ａ、Ｕ２ＳＵＲＰ、ＴＣＨＰ、ＩＰＩ０００２６６６５、ＲＡＤ５１Ｃ、ＡＴＰ２Ａ１、ＮＬＲＸ１、ＺＮＦ１６０、ＲＴＴＮ、ＡＢＣＡ１３、またはそれらの組み合わせから選択される１つまたは複数のバイオマーカーを含む。ある実施形態では、１つまたは複数のバイオマーカーは、ＳＴＡＲＤ８（ＤＬＣ３）、ＡＴＰ２Ａ１、ＲＴＴＮ、またはそれらの組み合わせである。
【００３８】
本開示のある実施形態では、膵臓がんを有する対象を診断するための方法は、対象に由来する生体試料中の１つまたは複数のバイオマーカーの存在を決定することを含み、バイオマーカーは、ＭＡＮＦ、ＺＮＦ４８５、ＩＭＰＡ１、ＳＶＥＰ１、ＫＩＡＡ１６７１、ＫＩＡＡ１５２９、ＧＮＮ、ＤＯＳ、ＳＴＡＲＤ８（ＤＬＣ３）、ＳＣＮ８Ａ、Ｕ２ＳＵＲＰ、ＴＣＨＰ、ＩＰＩ０００２６６６５、ＲＡＤ５１Ｃ、ＡＴＰ２Ａ１、ＮＬＲＸ１、ＺＮＦ１６０、ＲＴＴＮ、ＡＢＣＡ１３、ＤＥＳ、ＩＭＭＴ、ＴＰＭ１、ＳＮＲＰＥ、ＶＣＡＭ１、ＧＲＢ２、ＳＨＲＯＯＭ３、ＨＭＯＸ１、ＰＯＳＴＮ、ＭＭＰ１０、ＭＭＰ−２、ＴＨＢＳ２、ＥＷＳＲ１、ＮＯＤ１、ＡＤＡＭＴＳ９、ＡＦＰ、ＳＹＮＥ１、ＳＹＮＥ２、ＥＰＨＢ１、ＵＦＤ１Ｌ、ＴＥＡＤ１、ＲＹＲ３、ＣＭＹＡ５、ＭＹＬＫ、ＴＯＰ２Ｂ、ＫＩＡＡ１１０９、ＯＤＺ３、ＰＭＦＢＰ１、ＥＰＨＢ３、ＬＩＭＣＨ１、ＴＣＦ２０、ＥＲＰ２９、ＯＢＳＣＮ、ＬＯＸＬ３、ＭＬＥＣ、ＤＮＡＨ１、ＤＮＡＨ５、ＤＮＡＨ１２、ＤＮＡＨ１７、ＳＣＹＬ２、ＦＫＢＰ１０、ＦＬＲＴ３、ＺＨＸ２（ＡＦＲ１）、ＺＮＦ８０４Ａ、ＡＣＴＮ２またはそれらの組み合わせから選択される１つまたは複数のバイオマーカーを含む。
【００３９】
本開示のある実施形態では、対象の膵臓がんを診断、予後予測、またはスクリーニングするための方法は、対象から生体試料を得ること、およびＲＴＴＮ、ＤＮＡＨ１２、ＴＰＭ１、ＤＮＡＨ１、ＳＴＡＲＤ８、ＡＴＰ２Ａ１、ＴＯＰ２Ｂ、ＬＩＭＣＨ１、ＳＹＮＥ１、ＴＨＢＳ２、ＬＯＸＬ３、もしくはそれらの組み合わせから選択される、対象の生体試料中の１つまたは複数のバイオマーカーの存在を決定することを含み、１つまたは複数のバイオマーカーの検出は、対象に膵臓がんが存在することを示す。
【００４０】
本開示のある実施形態では、本明細書に記載のバイオマーカー、ならびに表４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、および１５に示されているバイオマーカーは、上述のように個々に、または少なくとも２つのバイオマーカー、少なくとも３つのバイオマーカー、少なくとも４つのバイオマーカー、少なくとも５つのバイオマーカー、少なくとも６つのバイオマーカー、少なくとも７つのバイオマーカー、もしくは少なくとも８つのバイオマーカーを含む一団で検出することができる。例えば、一団での検査で使用される場合、任意選択で、少なくとも２つのバイオマーカーのレベルを、対象から得られた同じ血液試料から検査することができ（例えば、患者から得られた同じ血液試料中の種々のバイオマーカーの定量または量を検出することにより）、または対象から得られた異なる血液試料中で検査することができる。一団での検査で組み合わせる場合、一団での検査は、２、３、４、５、６、１０、１５、２０、２５、３５個以上の異なるバイオマーカー各々の存在および／またはレベルを決定することを含むことができる。一団での検査で複数のバイオマーカーを組み合わせることは、一団の１つの特定のメンバーに異常値が見出されても、偽陽性および偽陰性の数を減らす役目をする。
【００４１】
本開示のある実施形態では、膵臓がんを有する対象を診断するための方法は、対象に由来する生体試料中の一団のバイオマーカー中の２つ以上のバイオマーカーの存在を決定することを含み、一団のバイオマーカーは、以下のシグナル伝達経路またはネットワーク：ＴＧＦβ／インテグリンシグナル伝達経路およびＨＮＦ４α転写因子ネットワークの各々から選択される少なくとも１つのバイオマーカーを含む。ＴＧＦβ／インテグリンシグナル伝達経路およびＨＮＦ４α転写因子ネットワークバイオマーカーの非限定的な例は、上記にならびに表４〜１３および１５に記載されている。ある実施形態では、少なくとも１つのＴＧＦβ／インテグリンシグナル伝達経路バイオマーカーは、ＳＹＮＥ１、ＴＨＢＳ２、ＴＯＰ２Ｂ、ＴＰＭ１、またはそれらの組み合わせであってもよい。ある実施形態では、少なくとも１つのＨＮＦ４α転写ネットワーク経路バイオマーカーは、ＬＯＸＬ３、ＤＮＡＨ１２、ＤＮＡＨ１、またはそれらの組み合わせであってもよい。
【００４２】
本開示のある実施形態では、膵臓がんを有する対象を診断するための方法は、対象に由来する生体試料中の一団のバイオマーカー中の２つ以上のバイオマーカーの存在を決定することを含み、一団のバイオマーカーは、以下のシグナル伝達経路またはネットワーク：ＴＧＦβ／インテグリンシグナル伝達経路およびＲＡＳ／ｐ５３／ＪＵＮ／ＣＴＮＢ１シグナル伝達経路の各々から選択される少なくとも１つのバイオマーカーを含む。ＴＧＦβ／インテグリンシグナル伝達経路およびＲＡＳ／ｐ５３／ＪＵＮ／ＣＴＮＢ１シグナル伝達経路バイオマーカーの非限定的な例は、上記にならびに表４〜１３および１５に記載されている。ある実施形態では、少なくとも１つのＴＧＦβ／インテグリンシグナル伝達経路バイオマーカーは、ＳＹＮＥ１、ＴＨＢＳ２、ＴＯＰ２Ｂ、ＴＰＭ１、またはそれらの組み合わせであってもよい。ある実施形態では、少なくとも１つのＲＡＳ／ｐ５３／ＪＵＮ／ＣＴＮＢ１シグナル伝達経路バイオマーカーは、ＬＩＭＣＨ１であってもよい。
【００４３】
本開示のある実施形態では、膵臓がんを有する対象を診断するための方法は、対象に由来する生体試料中の一団のバイオマーカー中の２つ以上のバイオマーカーの存在を決定することを含み、一団のバイオマーカーは、ＴＧＦβ／インテグリンシグナル伝達経路から選択される少なくとも１つのバイオマーカー、およびＭＡＮＦ、ＺＮＦ４８５、ＩＭＰＡ１、ＳＶＥＰ１、ＫＩＡＡ１６７１、ＫＩＡＡ１５２９、ＧＮＮ、ＤＯＳ、ＳＴＡＲＤ８（ＤＬＣ３）、ＳＣＮ８Ａ、Ｕ２ＳＵＲＰ、ＴＣＨＰ、ＩＰＩ０００２６６６５、ＲＡＤ５１Ｃ、ＡＴＰ２Ａ１、ＮＬＲＸ１、ＺＮＦ１６０、ＲＴＴＮ、ＡＢＣＡ１３、またはそれらの組み合わせから選択される少なくとも１つのバイオマーカーを含む。ある実施形態では、少なくとも１つのＴＧＦβ／インテグリンシグナル伝達経路バイオマーカーは、ＳＹＮＥ１、ＴＨＢＳ２、ＴＯＰ２Ｂ、ＴＰＭ１、またはそれらの組み合わせであってもよい。ある実施形態では、少なくとも１つのバイオマーカーは、ＳＴＡＲＤ８（ＤＬＣ３）、ＡＴＰ２Ａ１、ＲＴＴＮ、またはそれらの組み合わせであってもよい。
【００４４】
本開示のある実施形態では、膵臓がんを有する対象を診断するための方法は、対象に由来する生体試料中の一団のバイオマーカー中の２つ以上のバイオマーカーの存在を決定することを含み、一団のバイオマーカーは、以下のシグナル伝達経路またはネットワーク：ＨＮＦ４α転写因子ネットワークおよびＲＡＳ／ｐ５３／ＪＵＮ／ＣＴＮＢ１シグナル伝達経路の各々から選択される少なくとも１つのバイオマーカーを含む。ＨＮＦ４α転写因子ネットワークおよびＲＡＳ／ｐ５３／ＪＵＮ／ＣＴＮＢ１シグナル伝達経路バイオマーカーの非限定的な例は、上記にならびに表４〜１３および１５に記載されている。ある実施形態では、少なくとも１つのＨＮＦ４α転写ネットワーク経路バイオマーカーは、ＬＯＸＬ３、ＤＮＡＨ１２、ＤＮＡＨ１、またはそれらの組み合わせであってもよい。ある実施形態では、少なくとも１つのＲＡＳ／ｐ５３／ＪＵＮ／ＣＴＮＢ１シグナル伝達経路バイオマーカーは、ＬＩＭＣＨ１であってもよい。
【００４５】
本開示のある実施形態では、膵臓がんを有する対象を診断するための方法は、対象に由来する生体試料中の一団のバイオマーカー中の２つ以上のバイオマーカーの存在を決定することを含み、一団のバイオマーカーは、ＲＡＳ／ｐ５３／ＪＵＮ／ＣＴＮＢ１シグナル伝達経路から選択される少なくとも１つのバイオマーカー、ならびにＭＡＮＦ、ＺＮＦ４８５、ＩＭＰＡ１、ＳＶＥＰ１、ＫＩＡＡ１６７１、ＫＩＡＡ１５２９、ＧＮＮ、ＤＯＳ、ＳＴＡＲＤ８（ＤＬＣ３）、ＳＣＮ８Ａ、Ｕ２ＳＵＲＰ、ＴＣＨＰ、ＩＰＩ０００２６６６５、ＲＡＤ５１Ｃ、ＡＴＰ２Ａ１、ＮＬＲＸ１、ＺＮＦ１６０、ＲＴＴＮ、およびＡＢＣＡ１３から選択される少なくとも１つのバイオマーカーを含む。ある実施形態では、少なくとも１つのＲＡＳ／ｐ５３／ＪＵＮ／ＣＴＮＢ１シグナル伝達経路バイオマーカーは、ＬＩＭＣＨ１であってもよい。ある実施形態では、少なくとも１つのバイオマーカーは、ＳＴＡＲＤ８（ＤＬＣ３）、ＡＴＰ２Ａ１、ＲＴＴＮ、またはそれらの組み合わせであってもよい。
【００４６】
本開示のある実施形態では、膵臓がんを有する対象を診断するための方法は、対象に由来する生体試料中の一団のバイオマーカー中の２つ以上のバイオマーカーの存在を決定することを含み、一団のバイオマーカーは、ＨＮＦ４α転写因子ネットワークから選択される少なくとも１つのバイオマーカー、ならびにＭＡＮＦ、ＺＮＦ４８５、ＩＭＰＡ１、ＳＶＥＰ１、ＫＩＡＡ１６７１、ＫＩＡＡ１５２９、ＧＮＮ、ＤＯＳ、ＳＴＡＲＤ８（ＤＬＣ３）、ＳＣＮ８Ａ、Ｕ２ＳＵＲＰ、ＴＣＨＰ、ＩＰＩ０００２６６６５、ＲＡＤ５１Ｃ、ＡＴＰ２Ａ１、ＮＬＲＸ１、ＺＮＦ１６０、ＲＴＴＮ、およびＡＢＣＡ１３から選択される少なくとも１つのバイオマーカーを含む。ある実施形態では、少なくとも１つのＨＮＦ４α転写ネットワーク経路バイオマーカーは、ＬＯＸＬ３、ＤＮＡＨ１２、ＤＮＡＨ１、またはそれらの組み合わせであってもよい。ある実施形態では、少なくとも１つのバイオマーカーは、ＳＴＡＲＤ８（ＤＬＣ３）、ＡＴＰ２Ａ１、ＲＴＴＮ、またはそれらの組み合わせであってもよい。
【００４７】
本開示のある実施形態では、対象の膵臓がんを診断、予後予測、またはスクリーニングするための方法は、対象に由来する試料中の３つ以上または４つ以上のバイオマーカーの存在を決定することを含む。例えば、限定ではないが、膵臓がんを有する対象を診断するための方法は、対象に由来する生体試料中の一団のバイオマーカー中の３つ以上のバイオマーカーの存在を決定することを含み、一団のバイオマーカーは、以下のシグナル伝達経路またはネットワーク：ＴＧＦβ／インテグリンシグナル伝達経路、ＨＮＦ４α転写因子ネットワーク、およびＲＡＳ／ｐ５３／ＪＵＮ／ＣＴＮＢ１シグナル伝達経路の各々から選択される少なくとも１つのバイオマーカーを含む。ある実施形態では、少なくとも１つのＴＧＦβ／インテグリンシグナル伝達経路バイオマーカーは、ＳＹＮＥ１、ＴＨＢＳ２、ＴＯＰ２Ｂ、ＴＰＭ１、またはそれらの組み合わせであってもよい。ある実施形態では、少なくとも１つのＨＮＦ４α転写ネットワーク経路バイオマーカーは、ＬＯＸＬ３、ＤＮＡＨ１２、ＤＮＡＨ１、またはそれらの組み合わせであってもよい。ある実施形態では、少なくとも１つのＲＡＳ／ｐ５３／ＪＵＮ／ＣＴＮＢ１シグナル伝達経路バイオマーカーは、ＬＩＭＣＨ１であってもよい。
【００４８】
ある実施形態では、膵臓がんを有する対象を診断するための方法は、対象に由来する生体試料中の一団のバイオマーカー中の３つ以上のバイオマーカーの存在を決定することを含み、一団のバイオマーカーは、以下のシグナル伝達経路またはネットワーク：ＴＧＦβ／インテグリンシグナル伝達経路およびＨＮＦ４α転写因子ネットワークの各々から選択される少なくとも１つのバイオマーカー、ならびにＭＡＮＦ、ＺＮＦ４８５、ＩＭＰＡ１、ＳＶＥＰ１、ＫＩＡＡ１６７１、ＫＩＡＡ１５２９、ＧＮＮ、ＤＯＳ、ＳＴＡＲＤ８（ＤＬＣ３）、ＳＣＮ８Ａ、Ｕ２ＳＵＲＰ、ＴＣＨＰ、ＩＰＩ０００２６６６５、ＲＡＤ５１Ｃ、ＡＴＰ２Ａ１、ＮＬＲＸ１、ＺＮＦ１６０、ＲＴＴＮ、およびＡＢＣＡ１３から選択される少なくとも１つのバイオマーカーを含む。ある実施形態では、少なくとも１つのＴＧＦβ／インテグリンシグナル伝達経路バイオマーカーは、ＳＹＮＥ１、ＴＨＢＳ２、ＴＯＰ２Ｂ、ＴＰＭ１、またはそれらの組み合わせであってもよい。ある実施形態では、少なくとも１つのＨＮＦ４α転写ネットワーク経路バイオマーカーは、ＬＯＸＬ３、ＤＮＡＨ１２、ＤＮＡＨ１、またはそれらの組み合わせであってもよい。ある実施形態では、少なくとも１つのバイオマーカーは、ＳＴＡＲＤ８（ＤＬＣ３）、ＡＴＰ２Ａ１、ＲＴＴＮ、またはそれらの組み合わせであってもよい。
【００４９】
ある実施形態では、膵臓がんを有する対象を診断するための方法は、対象に由来する生体試料中の一団のバイオマーカー中の３つ以上のバイオマーカーの存在を決定することを含み、一団のバイオマーカーは、以下のシグナル伝達経路またはネットワーク：ＨＮＦ４α転写因子ネットワークおよびＲＡＳ／ｐ５３／ＪＵＮ／ＣＴＮＢ１シグナル伝達経路の各々から選択される少なくとも１つのバイオマーカー、ならびにＭＡＮＦ、ＺＮＦ４８５、ＩＭＰＡ１、ＳＶＥＰ１、ＫＩＡＡ１６７１、ＫＩＡＡ１５２９、ＧＮＮ、ＤＯＳ、ＳＴＡＲＤ８（ＤＬＣ３）、ＳＣＮ８Ａ、Ｕ２ＳＵＲＰ、ＴＣＨＰ、ＩＰＩ０００２６６６５、ＲＡＤ５１Ｃ、ＡＴＰ２Ａ１、ＮＬＲＸ１、ＺＮＦ１６０、ＲＴＴＮ、およびＡＢＣＡ１３から選択される少なくとも１つのバイオマーカーを含む。ある実施形態では、少なくとも１つのＲＡＳ／ｐ５３／ＪＵＮ／ＣＴＮＢ１シグナル伝達経路バイオマーカーは、ＬＩＭＣＨ１であってもよい。ある実施形態では、少なくとも１つのＨＮＦ４α転写ネットワーク経路バイオマーカーは、ＬＯＸＬ３、ＤＮＡＨ１２、ＤＮＡＨ１、またはそれらの組み合わせであってもよい。ある実施形態では、少なくとも１つのバイオマーカーは、ＳＴＡＲＤ８（ＤＬＣ３）、ＡＴＰ２Ａ１、ＲＴＴＮ、またはそれらの組み合わせであってもよい。
【００５０】
ある実施形態では、膵臓がんを有する対象を診断するための方法は、対象に由来する生体試料中の一団のバイオマーカー中の３つ以上のバイオマーカーの存在を決定することを含み、一団のバイオマーカーは、以下のシグナル伝達経路またはネットワーク：ＴＧＦβ／インテグリンシグナル伝達経路およびＲＡＳ／ｐ５３／ＪＵＮ／ＣＴＮＢ１シグナル伝達経路の各々から選択される少なくとも１つのバイオマーカー、ならびにＭＡＮＦ、ＺＮＦ４８５、ＩＭＰＡ１、ＳＶＥＰ１、ＫＩＡＡ１６７１、ＫＩＡＡ１５２９、ＧＮＮ、ＤＯＳ、ＳＴＡＲＤ８（ＤＬＣ３）、ＳＣＮ８Ａ、Ｕ２ＳＵＲＰ、ＴＣＨＰ、ＩＰＩ０００２６６６５、ＲＡＤ５１Ｃ、ＡＴＰ２Ａ１、ＮＬＲＸ１、ＺＮＦ１６０、ＲＴＴＮ、およびＡＢＣＡ１３から選択される少なくとも１つのバイオマーカーを含む。ある実施形態では、少なくとも１つのＲＡＳ／ｐ５３／ＪＵＮ／ＣＴＮＢ１シグナル伝達経路バイオマーカーは、ＬＩＭＣＨ１であってもよい。ある実施形態では、少なくとも１つのＴＧＦβ／インテグリンシグナル伝達経路バイオマーカーは、ＳＹＮＥ１、ＴＨＢＳ２、ＴＯＰ２Ｂ、ＴＰＭ１、またはそれらの組み合わせであってもよい。ある実施形態では、少なくとも１つのバイオマーカーは、ＳＴＡＲＤ８（ＤＬＣ３）、ＡＴＰ２Ａ１、ＲＴＴＮ、またはそれらの組み合わせであってもよい。
【００５１】
ある実施形態では、膵臓がんを有する対象を診断するための方法は、対象に由来する生体試料中の一団のバイオマーカー中の４つ以上のバイオマーカーの存在を決定することを含み、一団のバイオマーカーは、以下のシグナル伝達経路またはネットワーク：ＴＧＦβ／インテグリンシグナル伝達経路、ＨＮＦ４α転写因子ネットワーク、およびＲＡＳ／ｐ５３／ＪＵＮ／ＣＴＮＢ１シグナル伝達経路の各々から選択される少なくとも１つのバイオマーカー、ならびにＭＡＮＦ、ＺＮＦ４８５、ＩＭＰＡ１、ＳＶＥＰ１、ＫＩＡＡ１６７１、ＫＩＡＡ１５２９、ＧＮＮ、ＤＯＳ、ＳＴＡＲＤ８（ＤＬＣ３）、ＳＣＮ８Ａ、Ｕ２ＳＵＲＰ、ＴＣＨＰ、ＲＡＤ５１Ｃ、ＡＴＰ２Ａ１、ＮＬＲＸ１、ＺＮＦ１６０、ＲＴＴＮ、およびＡＢＣＡ１３またはそれらの組み合わせから選択される少なくとも１つのバイオマーカーを含む。ある実施形態では、少なくとも１つのＲＡＳ／ｐ５３／ＪＵＮ／ＣＴＮＢ１シグナル伝達経路バイオマーカーは、ＬＩＭＣＨ１であってもよい。ある実施形態では、少なくとも１つのＴＧＦβ／インテグリンシグナル伝達経路バイオマーカーは、ＳＹＮＥ１、ＴＨＢＳ２、ＴＯＰ２Ｂ、ＴＰＭ１、またはそれらの組み合わせであってもよい。ある実施形態では、少なくとも１つのＨＮＦ４α転写ネットワーク経路バイオマーカーは、ＬＯＸＬ３、ＤＮＡＨ１２、ＤＮＡＨ１、またはそれらの組み合わせであってもよい。ある実施形態では、少なくとも１つのバイオマーカーは、ＳＴＡＲＤ８（ＤＬＣ３）、ＡＴＰ２Ａ１、ＲＴＴＮ、またはそれらの組み合わせであってもよい。
【００５２】
ある実施形態では、膵臓がんを有する対象を診断するための方法は、対象に由来する生体試料中の一団のバイオマーカー中の６つ以上のバイオマーカーの存在を決定することを含む。例えば、限定ではないが、６つ以上のバイオマーカーは、以下のシグナル伝達経路またはネットワーク：ＴＧＦβ／インテグリンシグナル伝達経路、ＨＮＦ４α転写因子ネットワーク、ＲＡＳ／ｐ５３／ＪＵＮ／ＣＴＮＢ１シグナル伝達経路、もしくはそれらの組み合わせから選択さすることができ、および／またはＭＡＮＦ、ＺＮＦ４８５、ＩＭＰＡ１、ＳＶＥＰ１、ＫＩＡＡ１６７１、ＫＩＡＡ１５２９、ＧＮＮ、ＤＯＳ、ＳＴＡＲＤ８（ＤＬＣ３）、ＳＣＮ８Ａ、Ｕ２ＳＵＲＰ、ＴＣＨＰ、ＲＡＤ５１Ｃ、ＡＴＰ２Ａ１、ＮＬＲＸ１、ＺＮＦ１６０、ＲＴＴＮ、ＡＢＣＡ１３、もしくはそれらの組み合わせから選択することができる。ある実施形態では、本方法は、対象に由来する生体試料中の一団のバイオマーカー中の６つ以上のバイオマーカーの存在を決定することを含み、一団のバイオマーカーは、以下のシグナル伝達経路またはネットワーク：ＴＧＦβ／インテグリンシグナル伝達経路、ＨＮＦ４α転写因子ネットワーク、およびＲＡＳ／ｐ５３／ＪＵＮ／ＣＴＮＢ１シグナル伝達経路の各々から選択される少なくとも２つのバイオマーカーを含む。
【００５３】
ある実施形態では、膵臓がんを有する対象を診断するための方法は、対象に由来する生体試料中の一団のバイオマーカー中の８つ以上のバイオマーカーの存在を決定することを含む。例えば、限定ではないが、８つ以上のバイオマーカーは、以下のシグナル伝達経路またはネットワーク：ＴＧＦβ／インテグリンシグナル伝達経路、ＨＮＦ４α転写因子ネットワーク、ＲＡＳ／ｐ５３／ＪＵＮ／ＣＴＮＢ１シグナル伝達経路、もしくはそれらの組み合わせから選択さすることができ、および／またはＭＡＮＦ、ＺＮＦ４８５、ＩＭＰＡ１、ＳＶＥＰ１、ＫＩＡＡ１６７１、ＫＩＡＡ１５２９、ＧＮＮ、ＤＯＳ、ＳＴＡＲＤ８（ＤＬＣ３）、ＳＣＮ８Ａ、Ｕ２ＳＵＲＰ、ＴＣＨＰ、ＲＡＤ５１Ｃ、ＡＴＰ２Ａ１、ＮＬＲＸ１、ＺＮＦ１６０、ＲＴＴＮ、ＡＢＣＡ１３、もしくはそれらの組み合わせから選択することができる。ある実施形態では、本方法は、対象に由来する生体試料中の一団のバイオマーカー中の８つ以上のバイオマーカーの存在を決定することを含み、一団のバイオマーカーは、以下のシグナル伝達経路またはネットワーク：ＴＧＦβ／インテグリンシグナル伝達経路、ＨＮＦ４α転写因子ネットワーク、およびＲＡＳ／ｐ５３／ＪＵＮ／ＣＴＮＢ１シグナル伝達経路の各々から選択される少なくとも２つのバイオマーカー、ならびにＭＡＮＦ、ＺＮＦ４８５、ＩＭＰＡ１、ＳＶＥＰ１、ＫＩＡＡ１６７１、ＫＩＡＡ１５２９、ＧＮＮ、ＤＯＳ、ＳＴＡＲＤ８（ＤＬＣ３）、ＳＣＮ８Ａ、Ｕ２ＳＵＲＰ、ＴＣＨＰ、ＲＡＤ５１Ｃ、ＡＴＰ２Ａ１、ＮＬＲＸ１、ＺＮＦ１６０、ＲＴＴＮ、およびＡＢＣＡ１３から選択される少なくとも２つのバイオマーカーを含む。
【００５４】
本開示は、初期段階のがん（例えば、切除可能ながん）または進行期の癌（侵襲性および／または転移性がん）を有する対象を識別診断するための方法をさらに提供する。ある実施形態では、進行期膵臓がんを有する対象を診断するための方法は、対象に由来する生体試料中の１つまたは複数のバイオマーカーの存在を決定することを含み、１つまたは複数のバイオマーカーの検出は、対象が転移性膵臓がんを有することの指標である。例えば、限定ではないが、１つまたは複数のバイオマーカーには、ＤＮＡＨ１２、ＤＮＡＨ１、ＳＴＡＲＤ８、ＡＴＰ２Ａ１、ＴＯＰ２Ｂ、ＴＨＢＳ２、またはそれらの組み合わせが含まれていてよい。
【００５５】
ある実施形態では、初期段階のおよび／または切除可能な膵臓がんを有する対象を診断するための方法は、対象に由来する生体試料中の１つまたは複数のバイオマーカーの存在を決定することを含み、１つまたは複数のバイオマーカーの検出は、対象が初期段階のおよび／または切除可能な膵臓がんを有することの指標である。例えば、限定ではないが、１つまたは複数のバイオマーカーには、ＲＴＴＮ、ＤＮＡＨ１２、ＴＰＭ１、ＤＮＡＨ１、ＳＴＡＲＤ８、ＡＴＰ２Ａ１、ＴＯＰ２Ｂ、ＳＹＮＥ１、ＴＨＢＳ２、ＬＯＸＬ３、またはそれらの組み合わせが含まれていてよい。
【００５６】
ある実施形態では、医師は、本明細書に記載の方法により提供される情報を使用して、処置（例えば、予防的または治療的）の最も有効なコースを決定することができる。治療のコースは、膵臓がんの発症リスク増加の評価がなされた後で、患者のために取られる方策を指す。例えば、対象ががんを発症するリスクが高いと特定される場合、医師は、バイオマーカーを検出するための頻繁なモニタリングが予防策として必要であるか否かを決定することができる。また、対象が膵臓がんを有すると決定された場合（例えば、対象に由来する生体試料中に１つまたは複数のバイオマーカーが存在することに基づき）、そのような検出後に、生検、外科処置、化学療法、放射線、免疫療法、生物学的修飾因子療法（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｍｏｄｉｆｉｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ）、遺伝子療法、およびワクチン等を行うこと、または患者が治療される期間を調節することが有利であり得る。
【００５７】
バイオマーカー検出
本開示の方法で使用されるバイオマーカーは、当技術分野で公知の任意の方法を使用して生体試料で特定することができる。バイオマーカー、タンパク質、もしくはその分解産物の存在、ｍＲＮＡもしくは前躯体ｍＲＮＡの存在、あるいはバイオマーカー発現を示す任意の生体分子もしくは産物またはその分解産物の存在の決定は、本明細書に記載の、または当技術分野で公知の任意の方法により、本開示の方法で使用するために実施することができる。
【００５８】
タンパク質検出技法
タンパク質バイオマーカーを検出するための方法は、当業者に周知であり、これらに限定されないが、質量分析法技法、１Ｄまたは２Ｄゲルに基づく分析システム、クロマトグラフィー、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、放射線免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、ウエスタンブロッティング、免疫沈降法、および免疫組織化学法が含まれる。これらの方法では、タンパク質を検出するための抗体もしくは抗体等価物が使用されるか、または生物物理学的技法が使用される。抗体アレイまたはタンパク質チップを用いることもできる。例えば、米国特許出願第２００３／００１３２０８（Ａ１）号；第２００２／０１５５４９３（Ａ１）号、第２００３／００１７５１５号、ならびに米国特許第６，３２９，２０９号および第６，３６５，４１８号を参照されたい。これらの文献は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【００５９】
ＥＬＩＳＡおよびＲＩＡ手順は、以下のように実施される：バイオマーカー標準物質を標識し（１２５Ｉまたは３５Ｓ等の放射性同位体で、または西洋ワサビペルオキシダーゼもしくはアルカリホスファターゼ等のアッセイ可能な酵素で）、未標識試料と一緒に、対応する抗体と接触させ、二次抗体を使用して第１の抗体と結合させ、放射活性または固定化酵素をアッセイする（競合アッセイ）。あるいは、試料中のバイオマーカーを、対応する固定化抗体と反応させ、放射性同位体または酵素で標識した抗バイオマーカー抗体を、その系と反応させ、放射活性または酵素をアッセイする（ＥＬＩＳＡサンドイッチアッセイ）。他の従来法も好適なものとして用いることができる。
【００６０】
上記の技法は、本質的に「１段階」または「２段階」アッセイとして実施することができる。「１段階」アッセイは、抗原を固定化抗体と接触させ、洗浄せずに、混合物を標識抗体と接触させることを含む。「２段階」アッセイは、混合物を標識抗体と接触させる前に洗浄することを含む。他の従来法を好適なものとして用いることもできる。
【００６１】
ある実施形態では、バイオマーカー発現を測定するための方法は、生体試料、例えば血液および／または血漿を、バイオマーカーと選択的に結合する抗体またはその変異体（例えば、断片）を接触させるステップ、ならびに抗体またはその変異体が試料と結合しているか否かを検出するステップを含む。方法は、試料を二次抗体、例えば標識抗体と接触させることをさらに含んでいてもよい。方法は、例えば１つまたは複数の試薬を除去するための１つまたは複数の洗浄ステップをさらに含んでいてもよい。
【００６２】
アッセイ系の１つの成分を支持体に固定化し、それにより、その成分をその系の他の成分と接触させ、手間や時間を必要とする労力をかけることなく容易に取り出すことが望ましい場合がある。第１の相から離れた第２の相を固定化することが可能であるが、通常は１つの相で十分である。
【００６３】
酵素自体を支持体に固定化することが可能であるが、固相酵素が必要な場合、一般的に、抗体と結合させ、その抗体を支持体と結合させることにより、それを達成するのが最良であり、そのためのモデルおよび系は当技術分野で周知である。単純なポリエチレンは、好適な支持体を提供することができる。
【００６４】
標識化に用いることができる酵素は、特に限定されないが、例えば、オキシダーゼ群のメンバーから選択することができる。オキシダーゼは、それらの基質と反応することにより過酸化水素の産生を触媒する。安定性が良好で、入手が容易で、安価であり、ならびにその基質（グルコース）が容易に入手できるため、グルコースオキシダーゼが使用されることが多い。オキシダーゼの活性は、当技術分野で周知の制御条件下で酵素標識抗体を基質と反応させた後、形成された過酸化水素の濃度を測定することによりアッセイすることができる。
【００６５】
他の技法を使用して、本開示に基づき開業医の選択に従ってバイオマーカーを検出することができる。バイオマーカータンパク質レベルを検出および定量化するために使用することができる１つのそのような技法は、ウエスタンブロッティングである（Ｔｏｗｂｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７６巻：４３５０頁（１９７９））。細胞を、凍結し、溶解緩衝液中でホモジナイズし、溶解産物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、ニトロセルロースフィルター等の膜にブロッティングすることができる。その後、抗体（未標識）を膜と接触させ、標識プロテインＡまたは抗免疫グロブリン（１２５Ｉ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、およびアルカリホスファターゼを含む好適な標識）等の、二次免疫学的試薬によりアッセイする。クロマトグラフィー検出も使用することができる。ある実施形態では、免疫検出は、高感度化学発光系（例えば、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、ボストン、マサチューセッツ州）を使用して、バイオマーカーに対する抗体を用いて実施することができる。その後、膜をストリップし、対照抗体、例えば、Ｓｉｇｍａ社製（セントルイス、ミズーリ州）の抗アクチン（Ａ−２０６６）ポリクローナル抗体で再度ブロッティングすることができる。
【００６６】
免疫組織化学法を使用して、例えば生検試料中のバイオマーカーの発現および／存在を検出することができる。好適な抗体を、例えば細胞の薄層と接触させ、その後洗浄して未結合抗体を除去し、次に第２の標識抗体と接触させる。標識化は、蛍光マーカー、ペルオキシダーゼ等の酵素、アビジン、または放射性標識によることができる。アッセイは、顕微鏡観察を使用して視覚的にスコア化し、結果を定量化することができる。
【００６７】
また、他の機械または自動画像化システムを使用して、バイオマーカーの免疫染色結果を測定することができる。本明細書で使用される場合、「定量的」免疫組織化学法は、免疫組織化学法を行った試料を走査およびスコア化して、抗原または他のタンパク質等の特定のバイオマーカーの存在を特定および定量化するための自動化された方法を指す。試料に与えられたスコアは、試料の免疫組織化学的染色の強度の数値表現であり、試料の中に存在する標的バイオマーカーの量を表わす。本明細書で使用される場合、光学密度（ＯＤ）は、染色の強度を表わす数値スコアである。本明細書で使用される場合、半定量的免疫組織化学法は、人間の目により免疫組織化学結果をスコア化することを指し、結果は、訓練された作業者が数的にランク付けする（例えば、１、２、または３として）。
【００６８】
免疫組織化学法での使用に好適な種々の自動化試料処理、走査、および分析システムが、当技術分野で利用可能である。そのようなシステムには、自動染色（例えば、Ｂｅｎｃｈｍａｒｋシステム、Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．社）および顕微走査、コンピュータ化画像分析、連続切片比較（試料の配向性およびサイズの変動を制御するため）、デジタルレポート作成、および試料（組織切片が配置されるスライド等）の保管および追跡が含まれる。免疫染色した試料を含む細胞および組織の定量分析を行うための、従来の光学顕微鏡をデジタル画像処理システムと組み合わせた細胞画像システムが商業的に入手可能である。例えば、ＣＡＳ−２００システム（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ＆Ｃｏ．社）を参照されたい。
【００６９】
また、バイオマーカーに対する抗体を、例えば、対象の細胞中のバイオマーカーの存在を検出するための画像化目的に使用することができる。好適な標識には、放射性同位体、ヨウ素（１２５Ｉ、１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１２Ｉｎ）、およびテクネチウム（９９ｍＴｃ）、フルオレセインおよびローダミン等の蛍光標識、ならびにビオチンが含まれる。免疫酵素的相互作用は、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等の様々な酵素、またはＤＡＢ、ＡＥＣもしくはＦａｓｔ  Ｒｅｄ等の様々な色原体を使用して視覚化することができる。
【００７０】
抗体は、それ自体は身体外部から検出可能ではなく、したがって、ｉｎ  ｖｉｖｏ画像化のためには、検出が可能になるように標識化しなければならないか、またはそうでなければ修飾しなければならない。そのためのマーカーは、抗体結合を実質的に妨害しないが、外部検出を可能にするものであれば何でもよい。好適なマーカーには、Ｘ線撮影、ＮＭＲ、またはＭＲＩにより検出することができるものが含まれ得る。Ｘ線撮影技法の場合、好適なマーカーには、検出可能な放射線を放射するが、対象に過度に有害ではない、例えばバリウムまたはセシウム等の、任意の放射性同位体が含まれる。ＮＭＲおよびＭＲＩに好適なマーカーには、一般的に、例えば、関連ハイブリドーマの栄養素を適切に標識化することにより抗体に組み込むことができる、重水素等の検出可能な特徴的スピンを有するものが含まれる。
【００７１】
対象の大きさ、および使用される画像システムにより、診断画像を生成するために必要とされる画像化部分の量が決定されることになる。放射性同位体部分の場合、ヒト対象では、注入される放射活性の量は、通常、約５から２０ミリキュリーまでの範囲のテクネチウム−９９ｍであろう。
【００７２】
その後、標識抗体または抗体断片は、バイオマーカーを含有する細胞の位置で優先的に蓄積することになる。その後、標識抗体またはその変異体、例えば抗体断片は、公知の技法を使用して検出することができる。抗体には、天然または合成、全長またはその断片、モノクローナルまたはポリクローナルに関わらず、検出しようとするバイオマーカーと十分に強く特異的に結合するあらゆる抗体が含まれる。抗体は、最大で約１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ、１０−１２ＭのＫｄを有することができる。語句「特異的に結合する」は、例えば、同一または類似のエピトープ、抗原、もしくは抗原決定基の第２の調製物を結合が置換または競合することができるように、抗体が、エピトープまたは抗原もしくは抗原決定基と結合することを指す。
【００７３】
使用することができる抗体およびその誘導体は、ポリクローナルもしくはモノクローナル抗体、キメラ、ヒト、ヒト化、霊長類化（ＣＤＲグラフト）、ベニアまたは単鎖抗体、ファージ産生抗体（ｐｈａｓｅ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）（例えば、ファージディスプレイライブラリに由来する）、ならびに抗体の機能的結合断片を包含する。例えば、これらに限定されないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、およびＦ（ａｂ’）２断片を含む、バイオマーカーまたはその部分に結合可能な抗体断片を使用することができる。そのような断片は、酵素による切断により、または組換え技法により産生することができる。例えば、パパインまたはペプシン切断は、それぞれＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２断片を生成することができる。また、必要な基質特異性を有する他のプロテアーゼを使用して、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２断片を生成することができる。また、抗体は、１つまたは複数の終止コドンが天然終止部位の上流に導入されている抗体遺伝子を使用して、様々な切断形態で産生することができる。例えば、Ｆ（ａｂ’）２重鎖部分をコードするキメラ遺伝子は、重鎖のＣＨドメインおよびヒンジ領域をコードするＤＮＡ配列を含むように設計することができる。
【００７４】
合成および操作抗体は、以下の文献に記載されている：例えば、Ｃａｂｉｌｌｙら、米国特許第４，８１６，５６７号  Ｃａｂｉｌｌｙら、欧州特許第０，１２５，０２３（Ｂ１）号；Ｂｏｓｓら、米国特許第４，８１６，３９７号；Ｂｏｓｓら、欧州特許第０，１２０，６９４（Ｂ１）号；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．Ｓ．ら、ＷＯ８６／０１５３３；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．Ｓ．ら、欧州特許第０，１９４，２７６（Ｂ１）号；Ｗｉｎｔｅｒ、米国特許第５，２２５，５３９号；Ｗｉｎｔｅｒ、欧州特許第０，２３９，４００（Ｂ１）号；Ｑｕｅｅｎら、欧州特許第０４５１２１６（Ｂ１）号；およびＰａｄｌａｎ，Ｅ．Ａ．ら、ＥＰ０５１９５９６Ａ１。また、霊長類化抗体に関しては、Ｎｅｗｍａｎ，Ｒ．ら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０巻：１４５５〜１４６０頁（１９９２）を、単鎖抗体に関しては、Ｌａｄｎｅｒら、米国特許第４，９４６，７７８号およびＢｉｒｄ，Ｒ．Ｅ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２巻：４２３〜４２６頁（１９８８）を参照されたい。
【００７５】
ある実施形態では、抗体以外に、ポリペプチドと特異的に結合する、ペプチド等の作用剤が使用される。特異的に結合するペプチドは、当技術分野で公知の任意の手段、例えばペプチドファージディスプレイライブラリにより特定することができる。一般的に、バイオマーカーの存在が検出および／または定量化されるように、バイオマーカーポリペプチドを検出可能な作用剤を使用することができる。本明細書で定義されるように、「作用剤」は、生体試料中のバイオマーカーを特定または検出する（例えば、バイオマーカーのｍＲＮＡ、バイオマーカーのＤＮＡ、バイオマーカーのタンパク質を特定または検出する）ことが可能な物質を指す。ある実施形態では、作用剤は、バイオマーカーポリペプチドと特異的に結合する標識されたまたは標識可能な抗体である。
【００７６】
加えて、バイオマーカーは、ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ（飛行時間型）、ＳＥＬＤＩ／ＴＯＦ、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＳ）、ガスクロマトグラフィー質量分析（ＧＣ−ＭＳ）、高速液体クロマトグラフィー質量分析（ＨＰＬＣ−ＭＳ）、キャピラリー電気泳動質量分析、核磁気共鳴分析、またはタンデム型質量分析（例えば、ＭＳ／ＭＳ、ＭＳ／ＭＳ／ＭＳ、ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ等）等の質量分析を使用して検出することができる。例えば、米国特許出願第２００３０１９９００１号、第２００３０１３４３０４号、第２００３００７７６１６号を参照されたい。これらの文献は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００７７】
質量分析法は、当技術分野で周知であり、タンパク質等の生体分子を定量化および／または特定するために使用されている（例えば、Ｌｉら（２０００）Ｔｉｂｔｅｃｈ  １８巻：１５１〜１６０頁；Ｒｏｗｌｅｙら、（２０００）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０巻：３８３〜３９７頁；ならびにＫｕｓｔｅｒおよびＭａｎｎ（１９９８）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌ．８巻：３９３〜４００頁を参照）。さらに、単離タンパク質の少なくとも部分的なｄｅ  ｎｏｖｏ配列決定を可能にする質量分析技法が開発されている。Ｃｈａｉｔら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６２巻：８９〜９２頁（１９９３）；Ｋｅｏｕｇｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９６巻：７１３１〜６頁（１９９９）；Ｂｅｒｇｍａｎ、ＥＸＳ  ８８巻：１３３〜４４頁（２０００）に概説。
【００７８】
ある実施形態では、気相イオンスペクトロメータが使用される。他の実施形態では、レーザー脱離／イオン化質量分析法を使用して、試料を分析する。現代的なレーザー脱離／イオン化質量分析法（「ＬＤＩ−ＭＳ」）は、２つの主要な異なるモードで実施することができる：マトリックス支援レーザー脱離／イオン化（「ＭＡＬＤＩ」）質量分析法および表面増強レーザー脱離／イオン化（「ＳＥＬＤＩ」）。ＭＡＬＤＩでは、分析物を、マトリックスを含有する溶液と混合し、その液体の液滴を基材の表面に配置する。その後、マトリックス溶液は、生体分子と共に共同結晶する。基材を、質量分析計に挿入する。レーザーエネルギーが基材表面に向けられ、生体分子は、著しく断片化されずに脱着およびイオン化される。しかしながら、ＭＡＬＤＩには、分析ツールとして制限がある。ＭＡＬＤＩは、試料を分取するための手段を提供せず、マトリックス材料は、特に低分子量分析物の検出を妨害する場合がある。例えば、米国特許第５，１１８，９３７号（Ｈｉｌｌｅｎｋａｍｐら）および米国特許第５，０４５，６９４号（Ｂｅａｖｉｓ＆Ｃｈａｉｔ）を参照されたい。
【００７９】
質量分析計に関する追加情報は、例えば、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ、第３版、Ｓｋｏｏｇ、Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、フィラデルフィア、１９８５；およびＫｉｒｋ−Ｏｔｈｍｅｒ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第４版、１５巻（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ニューヨーク  １９９５）、１０７１〜１０９４頁を参照されたい。
【００８０】
マーカーまたは他の物質の存在の検出は、典型的には、シグナル強度の検出を伴う。シグナル強度は、ひいては、基質と結合したポリペプチドの量および特徴を反映することができる。例えば、ある実施形態では、第１の試料および第２の試料のスペクトルにあるピーク値のシグナル強度を比較して（例えば、視覚的に、コンピュータ分析等により）、特定のバイオマーカーの相対量を決定することができる。Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  Ｗｉｚａｒｄプログラム（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．社、フリーモント、カリフォルニア州）等のソフトウェアプログラムを使用して、質量スペクトルの分析を支援することができる。質量分析計およびそれらの技法は、当業者に周知である。
【００８１】
当業者であれば誰でも、質量分析計の構成要素（例えば、脱離供給源、質量分析器、検出等）および様々な試料調製物はいずれも、本明細書に記載のまたは当技術分野で知られている他の好適な構成要素または調製物と組み合わせることができることを理解する。例えば、ある実施形態では、対照試料は、重原子（例えば、１３Ｃ）を含有していてもよく、それにより、同じ質量分析実験で、試験試料を既知対照試料と混合することが可能になる。
【００８２】
ある実施形態では、レーザー脱離飛行時間型（ＴＯＦ）質量分析計が使用される。レーザー脱離質量分析では、結合マーカーを有する基材を入口システムに導入する。マーカーは、イオン化源からのレーザーにより、気相へと脱離およびイオン化される。生成されたイオンは、イオン光学アッセンブリにより収集され、その後飛行時間型質量分析器では、イオンが短い高電圧場により加速され、高真空チャンバーへと押し出される。加速されたイオンは、高真空チャンバーの遠位端部の感受性検出器表面に様々な時間で到達する。飛行時間は、イオンの質量の関数であるため、イオン形成からイオン検出器到達までの間の経過時間を使用して、特定の質量対電荷比を有する分子の存在または非存在を特定することができる。
【００８３】
ある実施形態では、第１または第２の試料に存在する１つまたは複数のバイオマーカーの相対量は、部分的には、プログラム可能なデジタルコンピュータによるアルゴリズムの実行により決定される。アルゴリズムは、第１の質量スペクトルおよび第２の質量スペクトル中の少なくとも１つのピーク値を特定する。その後、アルゴリズムは、第１の質量スペクトルのピーク値のシグナル強度を、質量スペクトルの第２の質量スペクトルのピーク値のシグナル強度と比較する。相対的なシグナル強度は、第１および第２の試料に存在するバイオマーカーの量の指標である。既知量のバイオマーカーを含有する標準物質を、第２の試料として分析して、第１の試料に存在するバイオマーカーの量をより良好に定量化することができる。ある実施形態では、また、第１および第２の試料中のバイオマーカーの正体を決定することができる。
【００８４】
ＲＮＡ検出技法
核酸バイオマーカーを定性的または定量的に検出するための任意の方法を使用することができる。ＲＮＡ転写物の検出は、例えば、ノーザンブロッティングにより達成することができる。ノーザンブロッティングでは、ＲＮＡの調製物を変性アガロースゲルにかけ、活性化セルロース、ニトロセルロース、またはガラスもしくはナイロンの膜等の好適な支持体に移す。その後、放射性標識ｃＤＮＡまたはＲＮＡを調製物とハイブリダイズさせ、洗浄し、オートラジオグラフィーにより分析する。
【００８５】
さらに、ＲＮＡ転写物の検出は、増幅法を使用して達成することができる。例えば、ｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、その後ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を行うこと；または、米国特許第５，３２２，７７０号に記載のように、単一の酵素を両ステップに使用すること、もしくは、Ｒ．Ｌ．Ｍａｒｓｈａｌｌら、ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ４巻：８０〜８４頁（１９９４）に記載のように、ｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、その後対称性ギャップリガーゼ連鎖反応（ｓｙｍｍｅｔｒｉｃ  ｇａｐ  ｌｉｇａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）（ＲＴ−ＡＧＬＣＲ）を行うことは、本開示の範囲内である。
【００８６】
ある実施形態では、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）を使用して、バイオマーカーのｍＲＮＡレベルを評価する。バイオマーカーおよび対照ｍＲＮＡのレベルは、がん組織またはがん細胞および隣接する良性組織で定量化することができる。１つの特定の実施形態では、１つまたは複数のバイオマーカーのレベルは、生体試料中で定量化することができる。
【００８７】
本明細書で利用することができる他の既知の増幅法には、これらに限定されないが、以下のものが含まれる：ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８７巻：１８７４〜１８７８頁（１９９０）に記載されており、Ｎａｔｕｒｅ  ３５０巻（６３１３号）：９１〜９２頁（１９９１）にも記載されている、いわゆる「ＮＡＳＢＡ」または「３ＳＲ」技法；公開欧州特許出願（ＥＰＡ）第４５４４６１０号に記載のＱベータ増幅法；鎖置換増幅法（Ｇ．Ｔ．Ｗａｌｋｅｒら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４２巻：９〜１３頁（１９９６）および欧州特許出願第６８４３１５号；およびＰＣＴ公開ＷＯ９３２２４６１号に記載の、標的媒介性増幅（ｔａｒｇｅｔ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）。
【００８８】
Ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション視覚化を用いることもできる。この場合、放射性標識アンチセンスＲＮＡプローブを、生検試料の薄片とハイブリダイズさせ、洗浄し、ＲＮａｓｅで切断し、オートラジオグラフィー用の感光乳剤へ曝露する。試料をヘマトキシリンで染色して、試料の組織学的組成を示すことができ、好適な光フィルターを用いた暗視野画像化は、感光したエマルジョンを示す。ジゴキシゲニン等の非放射性標識を使用することもできる。
【００８９】
バイオマーカー発現を評価するための別の方法は、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）により、バイオマーカーのｍＲＮＡレベルを検出することである。ＦＩＳＨは、細胞の特定領域のＤＮＡまたはＲＮＡを直接特定することができ、したがって、組織試料中のバイオマーカー発現の視覚的決定を可能にする技法である。ＦＩＳＨ法は、より客観的なスコアリングシステムであり、同じ試料の全ての非新生物細胞に存在するバイオマーカー遺伝子シグナルからなる組込み内部対照が存在するという利点がある。蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、比較的迅速で感度が高い直接ｉｎ  ｓｉｔｕ技法である。また、ＦＩＳＨ試験は、自動化することができる。バイオマーカーの発現レベルを免疫組織化学法だけで決定するのが難しい場合、免疫組織化学法をＦＩＳＨ法と組み合わせることができる。
【００９０】
あるいは、ｍＲＮＡ発現は、ＤＮＡアレイ、チップ、またはマイクロアレイで検出することができる。バイオマーカーに対応するオリゴヌクレオチドをチップに固定化し、その後、それを、対象から得られた試験試料の標識核酸とハイブリダイズさせる。陽性ハイブリダイゼーションシグナルは、バイオマーカー転写物を含有する試料で得られる。ＤＮＡアレイを準備およびそれらを使用するための方法は、当技術分野で周知である。（例えば、米国特許第６，６１８，６７９６号；第６，３７９，８９７号；第６，６６４，３７７号；第６，４５１，５３６号；第５４８，２５７号；Ｕ．Ｓ．２００３０１５７４８５およびＳｃｈｅｎａら、１９９５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０巻：４６７〜４７０頁；Ｇｅｒｈｏｌｄら、１９９９  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２４巻、１６８〜１７３頁；およびＬｅｎｎｏｎら、２０００  Ｄｒｕｇ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ  ５巻：５９〜６５頁を参照されたい。これらの文献は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）。また、遺伝子発現連続分析（ＳＡＧＥ：Ｓｅｒｉａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）を実施することができる（例えば、米国特許出願第２００３０２１５８５８号を参照）。
【００９１】
例えば、ｍＲＮＡレベルをモニターするために、試験する生体試料からｍＲＮＡを抽出することができ、逆転写され蛍光標識されたｃＤＮＡプローブが生成される。マイクロアレイは、バイオマーカーとハイブリダイズ可能であり、その後、標識ｃＤＮＡプローブでｃＤＮＡをプロ−ビングすることができ、スライドを走査して蛍光強度が測定される。この強度は、ハイブリダイゼーション強度および発現レベルと関連する。
【００９２】
ＲＮＡを検出するためのプローブのタイプには、ｃＤＮＡ、リボプローブ、合成オリゴヌクレオチド、およびゲノムプローブが含まれる。例えば、使用されるプローブのタイプは、一般的に、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの場合はリボプローブ、およびノーザンブロッティングの場合はｃＤＮＡ等、特定の状況により決まることになる。ある実施形態では、プローブは、特定のバイオマーカーＲＮＡに特有のヌクレオチド領域に向けられる。プローブは、特定のバイオマーカーｍＲＮＡ転写物を差別的に認識するために必要とされる短さであればよく、例えば１５塩基の短さであってもよい。しかしながら、少なくとも１７塩基、少なくとも１８塩基、および少なくとも２０塩基のプローブを使用することができる。ある実施形態では、プライマーおよびプローブは、ストリンジェントな条件下で、標的遺伝子に対応するヌクレオチド配列を有する核酸断片と特異的にハイブリダイズする。本明細書で使用される場合、用語「ストリンジェントな条件」は、配列間に少なくとも９５％または少なくとも９７％の同一性がある場合にのみ、ハイブリダイゼーションが生じることになることを意味する。
【００９３】
プローブの標識形態は、放射性同位体、例えば３２Ｐおよび３５Ｓの使用等、適切であれば何れでもよい。放射性同位体による標識化は、プローブを化学的もしくは生物学的に合成し、または適切に標識された塩基を使用することでも、いずれでも達成することができる。
【００９４】
キット
ある非限定的な実施形態では、本開示は、対象が膵臓がんを有するか否かを決定するためのキットであって、表４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、および１５に示されているバイオマーカー、またはそれらの組み合わせから選択される１つまたは複数のバイオマーカーを検出するための手段を含むキットを提供する。本開示は、対象の膵臓がんを予防または治療するための療法の効力を決定するためのキットをさらに提供する。
【００９５】
キットのタイプには、これらに限定されないが、プローブおよびプライマーセットのパッケージ（例えば、ＴａｑＭａｎプローブ／プライマーセット）、アレイ／マイクロアレイ、バイオマーカー特異的抗体ならびにビーズが含まれ、それらは、本開示の１つまたは複数のバイオマーカーを検出するための１つまたは複数のプローブ、プライマー、または他の検出試薬をさらに含む。
【００９６】
ある非限定的な実施形態では、キットは、特定しようとする１つまたは複数のバイオマーカーを検出するための、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または核酸配列決定に好適な１対のオリゴヌクレオチドプライマーを含むことができる。１対のプライマーは、表４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、および１５に示されているバイオマーカーに相補的なヌクレオチド配列を含むことができ、前記バイオマーカーと選択的にハイブリダイズするのに十分な長さであってもよい。あるいは、相補的ヌクレオチドは、バイオマーカー位置の’５および／または’３近傍に十分に近接した特定の領域に選択的にハイブリダイズして、ＰＣＲおよび／または配列決定を実施することができる。多数のバイオマーカーを同時にアッセイするために、複数のバイオマーカー特異的プライマーをキットに含めることができる。また、キットは、１つまたは複数のポリメラーゼ、逆転写酵素、およびヌクレオチド塩基を含むことができ、ヌクレオチド塩基は、さらに検出可能に標識化されていてもよい。
【００９７】
ある実施形態では、プライマーは、長さが、少なくとも約１０ヌクレオチド、もしくは少なくとも約１５ヌクレオチドもしくは少なくとも約２０ヌクレオチドであってもよく、および／または長さが、最大で約２００ヌクレオチド、もしくは最大で約１５０ヌクレオチド、もしくは最大で約１００ヌクレオチド、もしくは最大で約７５ヌクレオチド、もしくは最大で約５０ヌクレオチドであってもよい。
【００９８】
ある実施形態では、オリゴヌクレオチドプライマーは、固体表面または支持体、例えば核酸マイクロアレイに固定化することができ、固体表面または支持体に結合された各オリゴヌクレオチドプライマーの位置は、既知であり、特定可能である。
【００９９】
ある非限定的な実施形態では、キットは、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションまたは蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションに好適であり、特定しようとするバイオマーカーを検出するための、少なくとも１つの核酸プローブを含むことができる。そのようなキットは、一般的に、種々のバイオマーカーに特異性を示す１つまたは複数のオリゴヌクレオチドプローブを含む。
【０１００】
ある非限定的な実施形態では、キットは、プライマー伸長によりバイオマーカーを検出するためのプライマーを含むことができる。
【０１０１】
ある非限定的な実施形態では、キットは、特定しようとするバイオマーカーを免疫検出するための少なくとも１つの抗体を含むことができる。バイオマーカーに特異的な抗体は、ポリクローナルおよびモノクローナルの両方とも、当業者に一般的に公知となるような、従来の免疫技法を使用して調製することができる。キットの免疫検出試薬には、所与の抗体または抗原自体に結合または連結される検出可能な標識が含まれ得る。そのような検出可能な標識には、例えば、化学発光分子または蛍光分子（ローダミン、フルオレセイン、緑色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、またはＲＯＸ）、放射性標識（３Ｈ、３５Ｓ、３２Ｐ、１４Ｃ、１３１Ｉ）、または酵素（アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ）が含まれる。
【０１０２】
ある非限定的な実施形態では、バイオマーカー特異的抗体は、カラムマトリックス、アレイ、またはマイクロタイタープレートのウエル等の固体支持体に結合して提供することができる。あるいは、支持体は、キットの個別の要素として提供することができる。
【０１０３】
ある非限定的な実施形態では、キットは、表４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１５に示されている１つまたは複数のバイオマーカー、またはそれらの組み合わせを検出するのに好適な、１つまたは複数のプライマー、プローブ、マイクロアレイ、または抗体を含むことができる。
【０１０４】
ある非限定的な実施形態では、キットは、以下のバイオマーカーの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４個以上を検出するのに好適な、１つまたは複数のプライマー、プローブ、マイクロアレイ、または抗体を含むことができる：ＭＡＮＦ、ＺＮＦ４８５、ＩＭＰＡ１、ＳＶＥＰ１、ＫＩＡＡ１６７１、ＫＩＡＡ１５２９、ＧＮＮ、ＤＯＳ、ＳＴＡＲＤ８（ＤＬＣ３）、ＳＣＮ８Ａ、Ｕ２ＳＵＲＰ、ＴＣＨＰ、ＩＰＩ０００２６６６５、ＲＡＤ５１Ｃ、ＡＴＰ２Ａ１、ＮＬＲＸ１、ＺＮＦ１６０、ＲＴＴＮ、ＡＢＣＡ１３、ＤＥＳ、ＩＭＭＴ、ＴＰＭ１、ＳＮＲＰＥ、ＶＣＡＭ１、ＧＲＢ２、ＳＨＲＯＯＭ３、ＨＭＯＸ１、ＰＯＳＴＮ、ＭＭＰ１０、ＭＭＰ−２、ＴＨＢＳ２、ＥＷＳＲ１、ＮＯＤ１、ＡＤＡＭＴＳ９、ＡＦＰ、ＳＹＮＥ１、ＳＹＮＥ２、ＥＰＨＢ１、ＵＦＤ１Ｌ、ＴＥＡＤ１、ＲＹＲ３、ＣＭＹＡ５、ＭＹＬＫ、ＴＯＰ２Ｂ、ＫＩＡＡ１１０９、ＯＤＺ３、ＰＭＦＢＰ１、ＥＰＨＢ３、ＬＩＭＣＨ１、ＴＣＦ２０、ＥＲＰ２９、ＯＢＳＣＮ、ＬＯＸＬ３、ＭＬＥＣ、ＤＮＡＨ１、ＤＮＡＨ５、ＤＮＡＨ１２、ＤＮＡＨ１７、ＳＣＹＬ２、ＦＫＢＰ１０、ＦＬＲＴ３、ＺＨＸ２（ＡＦＲ１）、ＺＮＦ８０４ＡおよびＡＣＴＮ２。
【０１０５】
ある非限定的な実施形態では、キットは、以下のバイオマーカー：ＫＩＡＡ１１０９、ＯＤＺ３、ＰＭＦＢＰ１、ＥＰＨＢ３、ＬＩＭＣＨ１、ＴＣＦ２０、ＥＲＰ２９の１、２、３、４、５、６、または７個を検出するのに好適な、１つまたは複数のプライマー、プローブ、マイクロアレイ、または抗体を含むことができる。
【０１０６】
ある非限定的な実施形態では、キットは、以下のバイオマーカー：ＲＴＴＮ、ＤＮＡＨ１２、ＴＰＭ１、ＤＮＡＨ１、ＳＴＡＲＤ８、ＡＴＰ２Ａ１、ＴＯＰ２Ｂ、ＬＩＭＣＨ１、ＳＹＮＥ１、ＴＨＢＳ２、およびＬＯＸＬ３の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１個を検出するのに好適な、１つまたは複数のプライマー、プローブ、マイクロアレイ、または抗体を含むことができる。
【０１０７】
ある実施形態では、キットは、これらに限定されないが、ＤＥＳ、ＩＭＭＴ、ＴＰＭ１、ＳＮＲＰＥ、ＶＣＡＭ１、ＧＲＢ２、ＳＨＲＯＯＭ３、ＨＭＯＸ１、ＰＯＳＴＮ、ＭＭＰ１０、ＭＭＰ−２、ＴＨＢＳ２、ＥＷＳＲ１、ＮＯＤ１、ＡＤＡＭＴＳ９、ＡＦＰ、ＳＹＮＥ１、ＳＹＮＥ２、ＥＰＨＢ１、ＵＦＤ１Ｌ、ＴＥＡＤ１、ＲＹＲ３、ＣＭＹＡ５、ＭＹＬＫ、ＴＯＰ２Ｂ、またはそれらの組み合わせを含む、ＴＧＦβ／インテグリンシグナル伝達経路の１つまたは複数のバイオマーカーを検出するのに好適な、１つまたは複数のプライマー、プローブ、マイクロアレイ、または抗体を含むことができる。
【０１０８】
ある実施形態では、キットは、これらに限定されないが、ＫＩＡＡ１１０９、ＯＤＺ３、ＰＭＦＢＰ１、ＥＰＨＢ３、ＬＩＭＣＨ１、ＴＣＦ２０、ＥＲＰ２９、またはそれらの組み合わせを含む、ＲＡＳ／ｐ５３／ＪＵＮ／ＣＴＮＢ１シグナル伝達経路の１つまたは複数のバイオマーカーを検出するのに好適な、１つまたは複数のプライマー、プローブ、マイクロアレイ、または抗体を含むことができる。
【０１０９】
ある実施形態では、キットは、これらに限定されないが、ＯＢＳＣＮ、ＬＯＸＬ３、ＭＬＥＣ、ＤＮＡＨ１、ＤＮＡＨ５、ＤＮＡＨ１２、ＤＮＡＨ１７、ＳＣＹＬ２、ＦＫＢＰ１０、ＦＬＲＴ３、ＺＨＸ２（ＡＦＲ１）、ＺＮＦ８０４Ａ、ＡＣＴＮ２、またはそれらの組み合わせを含む、ＨＮＦ４α転写ネットワーク経路の１つまたは複数のバイオマーカーを検出するのに好適な、１つまたは複数のプライマー、プローブ、マイクロアレイ、または抗体を含むことができる。
【０１１０】
ある実施形態では、キットは、ＭＡＮＦ、ＺＮＦ４８５、ＩＭＰＡ１、ＳＶＥＰ１、ＫＩＡＡ１６７１、ＫＩＡＡ１５２９、ＧＮＮ、ＤＯＳ、ＳＴＡＲＤ８（ＤＬＣ３）、ＳＣＮ８Ａ、Ｕ２ＳＵＲＰ、ＴＣＨＰ、ＩＰＩ０００２６６６５、ＲＡＤ５１Ｃ、ＡＴＰ２Ａ１、ＮＬＲＸ１、ＺＮＦ１６０、ＲＴＴＮ、ＡＢＣＡ１３、またはそれらの組み合わせから選択される１つまたは複数のバイオマーカーを検出するのに好適な、１つまたは複数のプライマー、プローブ、マイクロアレイ、または抗体を含むことができる。
【０１１１】
ある実施形態では、キットは、２つ以上のバイオマーカーを検出するのに好適な２つ以上のプライマー、プローブ、マイクロアレイ、または抗体を含むことができ、キットは、以下のシグナル伝達経路またはネットワークの各々に由来する少なくとも１つまたは複数のバイオマーカーを含む：ＴＧＦβ／インテグリンシグナル伝達経路、例えばＳＹＮＥ１、ＴＨＢＳ２、ＴＯＰ２Ｂ、および／またはＴＰＭ１、ならびにＨＮＦ４α転写因子ネットワーク、例えばＬＯＸＬ３、ＤＮＡＨ１２、および／またはＤＮＡＨ１。
【０１１２】
ある実施形態では、キットは、２つ以上のバイオマーカーを検出するのに好適な２つ以上のプライマー、プローブ、マイクロアレイ、または抗体を含むことができ、キットは、以下のシグナル伝達経路またはネットワークの各々に由来する少なくとも１つまたは複数のバイオマーカーを含む：ＴＧＦβ／インテグリンシグナル伝達経路、例えばＳＹＮＥ１、ＴＨＢＳ２、ＴＯＰ２Ｂ、および／またはＴＰＭ１、ならびにＲＡＳ／ｐ５３／ＪＵＮ／ＣＴＮＢ１シグナル伝達経路、例えばＬＩＭＣＨ１。
【０１１３】
ある実施形態では、キットは、２つ以上のバイオマーカーを検出するのに好適な２つ以上のプライマー、プローブ、マイクロアレイ、または抗体を含むことができ、キットは、以下のシグナル伝達経路またはネットワークの各々に由来する少なくとも１つまたは複数のバイオマーカーを含む：ＨＮＦ４α転写因子ネットワーク、例えばＬＯＸＬ３、ＤＮＡＨ１２、および／またはＤＮＡＨ１、ならびにＲＡＳ／ｐ５３／ＪＵＮ／ＣＴＮＢ１シグナル伝達経路、例えばＬＩＭＣＨ１。
【０１１４】
ある実施形態では、キットは、２つ以上のバイオマーカーを検出するのに好適な２つ以上のプライマー、プローブ、マイクロアレイ、または抗体を含むことができ、キットは、ＴＧＦβ／インテグリンシグナル伝達経路、例えばＳＹＮＥ１、ＴＨＢＳ２、ＴＯＰ２Ｂ、および／またはＴＰＭ１に由来する少なくとも１つまたは複数のバイオマーカー、ならびにＭＡＮＦ、ＺＮＦ４８５、ＩＭＰＡ１、ＳＶＥＰ１、ＫＩＡＡ１６７１、ＫＩＡＡ１５２９、ＧＮＮ、ＤＯＳ、ＳＴＡＲＤ８（ＤＬＣ３）、ＳＣＮ８Ａ、Ｕ２ＳＵＲＰ、ＴＣＨＰ、ＩＰＩ０００２６６６５、ＲＡＤ５１Ｃ、ＡＴＰ２Ａ１、ＮＬＲＸ１、ＺＮＦ１６０、ＲＴＴＮ、ＡＢＣＡ１３、またはそれらの組み合わせから選択される少なくとも１つまたは複数のバイオマーカーを含む。
【０１１５】
ある実施形態では、キットは、２つ以上のバイオマーカーを検出するのに好適な２つ以上のプライマー、プローブ、マイクロアレイ、または抗体を含むことができ、キットは、ＨＮＦ４α転写因子ネットワーク、例えばＬＯＸＬ３、ＤＮＡＨ１２、および／またはＤＮＡＨ１に由来する少なくとも１つまたは複数のバイオマーカー、ならびにＭＡＮＦ、ＺＮＦ４８５、ＩＭＰＡ１、ＳＶＥＰ１、ＫＩＡＡ１６７１、ＫＩＡＡ１５２９、ＧＮＮ、ＤＯＳ、ＳＴＡＲＤ８（ＤＬＣ３）、ＳＣＮ８Ａ、Ｕ２ＳＵＲＰ、ＴＣＨＰ、ＩＰＩ０００２６６６５、ＲＡＤ５１Ｃ、ＡＴＰ２Ａ１、ＮＬＲＸ１、ＺＮＦ１６０、ＲＴＴＮ、ＡＢＣＡ１３、またはそれらの組み合わせから選択される少なくとも１つまたは複数のバイオマーカーを含む。
【０１１６】
ある実施形態では、キットは、２つ以上のバイオマーカーを検出するのに好適な２つ以上のプライマー、プローブ、マイクロアレイ、または抗体を含むことができ、キットは、ＲＡＳ／ｐ５３／ＪＵＮ／ＣＴＮＢ１シグナル伝達経路、例えばＬＩＭＣＨ１に由来する少なくとも１つまたは複数のバイオマーカー、ならびにＭＡＮＦ、ＺＮＦ４８５、ＩＭＰＡ１、ＳＶＥＰ１、ＫＩＡＡ１６７１、ＫＩＡＡ１５２９、ＧＮＮ、ＤＯＳ、ＳＴＡＲＤ８（ＤＬＣ３）、ＳＣＮ８Ａ、Ｕ２ＳＵＲＰ、ＴＣＨＰ、ＩＰＩ０００２６６６５、ＲＡＤ５１Ｃ、ＡＴＰ２Ａ１、ＮＬＲＸ１、ＺＮＦ１６０、ＲＴＴＮ、ＡＢＣＡ１３、またはそれらの組み合わせから選択される少なくとも１つまたは複数のバイオマーカーを含む。
【０１１７】
ある実施形態では、キットは、３つ以上のバイオマーカーを検出するのに好適な３つ以上のプライマー、プローブ、マイクロアレイ、または抗体を含むことができ、キットは、以下のシグナル伝達経路またはネットワークの各々に由来する少なくとも１つまたは複数のバイオマーカーを含む：ＴＧＦβ／インテグリンシグナル伝達経路、ＨＮＦ４α転写因子ネットワーク、およびＲＡＳ／ｐ５３／ＪＵＮ／ＣＴＮＢ１シグナル伝達経路。
【０１１８】
ある実施形態では、キットは、３つ以上のバイオマーカーを検出するのに好適な３つ以上のプライマー、プローブ、マイクロアレイ、または抗体を含むことができ、キットは、以下のシグナル伝達経路またはネットワーク：ＴＧＦβ／インテグリンシグナル伝達経路およびＨＮＦ４α転写因子ネットワークの各々に由来する少なくとも１つまたは複数のバイオマーカー、ならびにＭＡＮＦ、ＺＮＦ４８５、ＩＭＰＡ１、ＳＶＥＰ１、ＫＩＡＡ１６７１、ＫＩＡＡ１５２９、ＧＮＮ、ＤＯＳ、ＳＴＡＲＤ８（ＤＬＣ３）、ＳＣＮ８Ａ、Ｕ２ＳＵＲＰ、ＴＣＨＰ、ＩＰＩ０００２６６６５、ＲＡＤ５１Ｃ、ＡＴＰ２Ａ１、ＮＬＲＸ１、ＺＮＦ１６０、ＲＴＴＮ、およびＡＢＣＡ１３から選択される少なくとも１つのバイオマーカーを含む。
【０１１９】
ある実施形態では、キットは、３つ以上のバイオマーカーを検出するのに好適な３つ以上のプライマー、プローブ、マイクロアレイ、または抗体を含むことができ、キットは、以下のシグナル伝達経路またはネットワーク：ＴＧＦβ／インテグリンシグナル伝達経路およびＲＡＳ／ｐ５３／ＪＵＮ／ＣＴＮＢ１シグナル伝達経路の各々に由来する少なくとも１つまたは複数のバイオマーカー、ならびにＭＡＮＦ、ＺＮＦ４８５、ＩＭＰＡ１、ＳＶＥＰ１、ＫＩＡＡ１６７１、ＫＩＡＡ１５２９、ＧＮＮ、ＤＯＳ、ＳＴＡＲＤ８（ＤＬＣ３）、ＳＣＮ８Ａ、Ｕ２ＳＵＲＰ、ＴＣＨＰ、ＩＰＩ０００２６６６５、ＲＡＤ５１Ｃ、ＡＴＰ２Ａ１、ＮＬＲＸ１、ＺＮＦ１６０、ＲＴＴＮ、およびＡＢＣＡ１３から選択される少なくとも１つのバイオマーカーを含む。
【０１２０】
ある実施形態では、キットは、３つ以上のバイオマーカーを検出するのに好適な３つ以上のプライマー、プローブ、マイクロアレイ、または抗体を含むことができ、キットは、以下のシグナル伝達経路またはネットワーク：ＨＮＦ４α転写因子ネットワークおよびＲＡＳ／ｐ５３／ＪＵＮ／ＣＴＮＢ１シグナル伝達経路の各々に由来する少なくとも１つまたは複数のバイオマーカー、ならびにＭＡＮＦ、ＺＮＦ４８５、ＩＭＰＡ１、ＳＶＥＰ１、ＫＩＡＡ１６７１、ＫＩＡＡ１５２９、ＧＮＮ、ＤＯＳ、ＳＴＡＲＤ８（ＤＬＣ３）、ＳＣＮ８Ａ、Ｕ２ＳＵＲＰ、ＴＣＨＰ、ＩＰＩ０００２６６６５、ＲＡＤ５１Ｃ、ＡＴＰ２Ａ１、ＮＬＲＸ１、ＺＮＦ１６０、ＲＴＴＮ、ＡＢＣＡ１３、またはそれらの組み合わせから選択される少なくとも１つのバイオマーカーを含む。
【０１２１】
ある実施形態では、キットは、４つ以上のバイオマーカーを検出するのに好適な４つ以上のプライマー、プローブ、マイクロアレイ、または抗体を含むことができ、キットは、以下のシグナル伝達経路またはネットワーク：ＴＧＦβ／インテグリンシグナル伝達経路、ＨＮＦ４α転写因子ネットワーク、およびＲＡＳ／ｐ５３／ＪＵＮ／ＣＴＮＢ１シグナル伝達経路の各々に由来する少なくとも１つまたは複数のバイオマーカー、ならびにＭＡＮＦ、ＺＮＦ４８５、ＩＭＰＡ１、ＳＶＥＰ１、ＫＩＡＡ１６７１、ＫＩＡＡ１５２９、ＧＮＮ、ＤＯＳ、ＳＴＡＲＤ８（ＤＬＣ３）、ＳＣＮ８Ａ、Ｕ２ＳＵＲＰ、ＴＣＨＰ、ＩＰＩ０００２６６６５、ＲＡＤ５１Ｃ、ＡＴＰ２Ａ１、ＮＬＲＸ１、ＺＮＦ１６０、ＲＴＴＮ、ＡＢＣＡ１３、またはそれらの組み合わせから選択される少なくとも１つのバイオマーカーを含む。
【０１２２】
キットの測定手段がアレイを用いるある非限定的な実施形態では、上記に示されているバイオマーカーのセットは、マイクロアレイにあるマーカーの種の少なくとも１０パーセント、または少なくとも２０パーセント、または少なくとも３０パーセント、または少なくとも４０パーセント、または少なくとも５０パーセント、または少なくとも６０パーセント、または少なくとも７０パーセント、または少なくとも８０パーセントを構成することができる。ある非限定的な実施形態では、バイオマーカー検出キットは、バイオマーカーを検出するアッセイまたは反応を実施するために必要な、１つまたは複数の検出試薬および他の成分（例えば、緩衝液、ＤＮＡポリメラーゼまたはリガーゼ等の酵素、デオキシヌクレオチドトリホスファート等の鎖伸長ヌクレオチド、およびサンガー型ＤＮＡ配列決定反応の場合は、連鎖停止ヌクレオチド、陽性対照配列、陰性対照配列等）を含むことができる。また、キットは、ウエスタンブロッティング免疫組織化学法で使用される二次抗体等の、バイオマーカーの検出に必要な追加の成分または試薬を含むことができる。キットは、他の予後因子、例えば腫瘍病期を評価するための１つまたは複数の他のバイオマーカーまたは試薬をさらに含むことができる。
【０１２３】
キットは、バイオマーカーを標準物質と比較するための手段をさらに含むことができ、キットを使用して目的のバイオマーカーを検出するための説明書を含むことができる。例えば、説明書には、本明細書に示されているバイオマーカーが存在することにより、対象が膵臓がんを有しているかまたは発症することになることが示されることが記載されていてもよい。
【０１２４】
レポート、プログラムされたコンピュータおよびシステム
表４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、および１５に示されている１つまたは複数のバイオマーカー、ならびに／または検査に関する任意の他の情報をアッセイすることに基づく、検査の結果（例えば、膵臓がん等のがんの個体リスク）または個体の薬物応答性の予測（例えば、化学療法に対する応答）は、本明細書では「レポート」と呼ばれる場合がある。検査プロセスの一部として有形レポートを任意選択で生成することができる（本明細書では、「レポーティング」として、またはレポートを「提供する」、レポートを「作成する」、もしくはレポートを「生成する」と同義的に呼ばれる）。
【０１２５】
有形レポートの例には、これらに限定されないが、紙（検査結果のコンピュータ生成印刷出力等）または同様の形式のレポート、およびコンピュータ可読媒体（ＣＤ、ＵＳＢフラッシュドライブもしくは他の取り外し可能な記憶装置、コンピュータハードドライブ、またはコンピュータネットワークサーバ等）に保存されているレポートが含まれていてもよい。レポート、特にコンピュータ可読媒体に保存されているものは、データベースの一部であってもよく、それは、任意選択でインターネットを介してアクセス可能であってもよい（例えば、患者および患者の医療従事者のみがレポートの閲覧を許可され、他の無許可の個人は、レポートを閲覧できない等の、レポートへのアクセスを制限するセキュリティ機能を有する「安全なデータベース」であってもよい、コンピュータネットワークサーバに保存されている患者記録または遺伝子情報のデータベース等）。有形報告書を生成することに加えてまたはその代わりに、レポートは、コンピュータスクリーン（または別の電子デバイスまたは機器のディスプレイ）に表示することもできる。
【０１２６】
レポートは、例えば膵臓がん等のがんの個体リスクを含んでいてもよく、または表４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、および１５に示されている１つまたは複数のバイオマーカーセットの存在、非存在、またはレベルを含んでいるだけでもよい（例えば、ネットワークサーバ等のコンピュータ可読媒体にあるレポートは、あるバイオマーカーまたはあるバイオマーカーのレベルを有する個体の疾患リスクの増加または減少等の、医学的／生物学的示唆が記載されている１つまたは複数の学術誌刊行物またはウェブサイトへのハイパーリンクを含んでいてもよい）。したがって、例えば、レポートは、任意選択でバイオマーカー情報も含むだけでなく、疾患リスクもしくは他の医学的／生物学的意義（例えば、薬物応答性、推奨される予防的治療等）を含んでいてもよく、またはレポートは、疾患リスクもしくは他の医学的／生物学的意義を含まずに、バイオマーカー情報を含んでいるだけでもよい（レポートを閲覧する個体が、バイオマーカー情報を使用して、医療従事者、刊行物、任意選択でハイパーリンク等によりレポートにリンクされている場合があるウェブサイト等からの、レポート自体以外の情報源から、関連する疾患リスクまたは他の医学的／生物学的意義を決定することができるように）。
【０１２７】
レポートは、検査した個体に、医療従事者（例えば、医師、看護師、臨床検査従事者、遺伝相談員等）、ヘルスケア組織、臨床検査室、および／またはリポートを閲覧もしくは所有することを意図している任意の他の団体もしくは依頼人等に、さらに「送信」または「通信」することができる（これらの用語は、本明細書では同義的に使用することができる）。レポートを「送信」または「通信」する行為は、レポートの形式に基づき、当技術分野で公知の任意の手段によるものであってもよい。さらに、レポートを「送信」または「通信」することは、レポートを送達すること（「プッシング（ｐｕｓｈｉｎｇ）」）および／またはレポートを回収すること（「プリング（ｐｕｌｌｉｎｇ）」）を含むことができる。例えば、レポートは、一方の当事者から別の当事者へと物理的に送達すること等により、当事者間で物理的に移送されること（紙形式のレポートの場合等）、またはコンピュータネットワークサーバ等に保存されているデータベースから取り出すこと等により、電気的にまたはシグナル形式で送信されることによること（例えば、Ｅメールによりまたはインターネットで、ファックスにより、および／または当技術分野で公知の任意の有線または無線通信法により）を含む、種々の手段により送信／通信することができる。
【０１２８】
ある例示的な実施形態では、開示されている主題は、本明細書に記載の方法を実行するようにプログラムされたコンピュータ（または、生物医学的デバイスもしくは実験室機器等の他の装置／デバイス）を提供する。例えば、ある実施形態では、開示されている主題は、単独でまたは他のバイオマーカーと組み合わせて、本明細書で開示された１つまたは複数のバイオマーカーの正体を受信（つまり入力として）し、バイオマーカーのレベルまたはバイオマーカーの正体に基づいて、疾患リスク（例えば膵臓がんのリスク）または他の結果（例えば疾患の診断または予後、薬物応答性等）を提供する（つまり出力として）ようにプログラムされたコンピュータを提供する。そのような出力（例えば、疾患リスク、疾患の診断または予後、薬物応答性等の通信）は、例えば、コンピュータ可読媒体にあるレポート、紙形態に印刷されたレポート、および／またはコンピュータスクリーンもしくは他のディスプレイに表示されたレポートの形態であってもよい。
【０１２９】
開示されている主題のあるさらなる実施形態は、個体のがんリスク、または個体が、化学療法による治療（もしくは他の療法）または予防的治療から利益を得ることになるか否かを決定するためのシステムを提供する。ある例示的なシステムは、個体（または個体の医療従事者）が、そのような個体のがんリスク（または薬物応答）の決定を要求する組込み「ループ」を含み、この決定は、個体に由来する試料を検査することにより実施され、その後、この決定の結果は、依頼人に提供される。例えば、あるシステムでは、試料（例えば、糞便、血液等）を、個体から検査用に取得し（試料は、個体がまたは例えば医療従事者が取得してもよい）、試料を、検査のために（例えば、単独で、または１つもしくは複数の他のバイオマーカーと組み合わせて、本明細書に記載のバイオマーカーを決定するために）実験室（または他の施設）に提出し、次に検査の結果を患者に送り（これは、任意選択で、結果をまず医療従事者等の代理人に送ることにより実施することができ、その後代理人が、結果を個体に提供またはそうでなければ伝達し、および／または結果に基づいて行動する）、それにより個体のがんリスク（または薬物応答等）を決定するための組込みループシステムを形成する。結果が送信される（例えば、検査施設、医療従事者、および／または個体のいずれかの間で）システムの部分は、電子的送信またはシグナル送信により（例えば、電子メールまたはインターネット等を介してコンピュータにより、任意選択で安全なデータベースであってもよいウェブサイトまたはコンピュータネットワークサーバに結果を提供することにより、電話またはファックスにより、または当技術分野で知られている任意の他の有線もしくは無線送信により）実施することができる。
【０１３０】
ある実施形態では、システムは、個体および／または個体の医療従事者により、制御され、個体および／または個体の医療従事者が、検査を依頼し、検査結果を受け取り、および（任意選択で）検査結果に基づいて行動して、疾患管理システムを実装すること等により個体の疾患リスクを低減する。
【０１３１】
バイオマーカーの存在または非存在またはレベルを、がん（例えば、膵臓がん）のリスクの変化（例えば、増加または減少）（またはリスクの無変化）と関連されること等の、本明細書に記載の種々の方法は、本明細書に記載の方法のいずれかを実行するようにプログラムされたコンピュータ（または、生物医学的デバイス、実験室機器、もしくはコンピュータプロセッサを有する他の装置／デバイス等の他の装置／デバイス）を使用すること等による自動化法により実施することができる。例えば、コンピュータソフトウェア（本明細書では、同義的にコンピュータプログラムと呼ばれる場合がある）を実施して、個体におけるバイオマーカーの存在または非存在を、がん、例えば、その個体の膵臓がんのリスクの変化（例えば、増加または減少）（またはリスクの無変化）と関連させることができる。したがって、開示されている主題のある実施形態は、本明細書に記載の方法のいずれかを実行するようにプログラムされたコンピュータ（または他の装置／デバイス）を提供する。
【０１３２】
以下の実施例は、本開示をより完全に説明するために提示されているが、その範囲の限定として解釈されるべきではない。
【実施例１】
【０１３３】
ヒト膵管腺癌に由来するｉＰＳ細胞系は、初期から侵襲期の膵臓がん進行を経る。
材料および方法
一般的細胞培養
２９３Ｔ細胞およびヒト膵管癌細胞系ＰａｎＣ−１およびＭＩＡＰａＣａ−２を、１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ社、ローガン、ユタ州）を補充した９０％ダルベッコ変法基本培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カールズバッド、カリフォルニア州）で維持し、一日おきに栄養供給した。放射線照射したマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）細胞を、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社（ミネアポリス、ミネソタ州）から購入し、０．１％ゼラチン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、ビルリカ、マサチューセッツ州）事前処置組織培養皿にて、１５％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ社）を補充した８５％ＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で維持した。播種した放射線照射ＭＥＦは、５日以内に使用した。
【０１３４】
Ｈ１  ｈｕＥＳ／ヒトｉＰＳ培養
Ｈ１  ｈｕＥＳ（Ｔｈｏｍｓｏｎら、１９９８）およびｉＰＳ様クローンを、２０％のＫＮＯＣＫＯＵＴ血清代替物、０．１ｍＭ非必須アミノ酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、０．１ｍＭ−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ社、セントルイス、ミズーリ州）、および１０ｎｇ／ｍｌヒト塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を補充した８０％ダルベッコ変法基本培地（ＤＭＥＭ）／Ｆ１２で維持した。ヒトＥＳ／ｉＰＳ様クローンを、０．１％ゼラチン組織培養皿の放射線照射ＭＥＦで増殖させた。細胞に毎日栄養供給し、週一回継代した。継代する場合、１ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼＩＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で３分間３７℃にて処置することにより、ヒトＥＳ細胞を剥離し、遠心分離し、１０μｍのＹ２７６３２（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社、ダルムシュタット、ドイツ）を補充したヒトＥＳ培地に再懸濁し、次に放射線照射ＭＥＦに播種した。ｉＰＳ様系統を、５日〜７日毎に針で機械的に継代した。ＲＮＡ精製および分化の場合、ＭＥＦを除去するために、ヒトＥＳおよびｉＰＳ様系統を、ｈＥＳ用Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、サンホゼ、カリフォルニア州）コーティング組織培養皿のｍＴｅＳＲ１培地（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、ブリティッシュコロンビア、カナダ）で培養した。
【０１３５】
レンチウイルス産生および力価測定
マウスｔｅｔ−Ｏｃｔ４、−Ｓｏｘ２、−Ｋｌｆ４、およびＣ−ＭｙＣレンチウイルスベクターは、Ｊａｅｎｉｓｃｈ研究所（Ｂｒａｍｂｒｉｎｋら、２００８）から寄贈されたものである。ｐＷＰＴ  ｒｔＴＡベクターは、ｐＵＨｒＴ  ６２−１ベクター（Ｕｒｌｉｎｇｅｒら、２０００）から単離されたｒｔＴＡ２−Ｍ２遺伝子を、ＧＦＰが除去されたＰＷＴ−ＧＦＰ骨格ベクターにライゲーションすることにより生成した。２９３Ｔ細胞を、１００ｍｍ皿当たり８×１０５細胞の密度で播種した。翌日、供給業者の説明書に従って、３０μｌのＦｕｇｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ社、バーゼル、スイス）を用いて、２．５μｇのベクター（ＰＷＰＴ−ｒｔＴＡまたはＴｅｔＯ−４因子）、１．７μｇのｐｓＰＡＸ２パッケージングベクター、および０．８μｇのＰＭＤＧエンベロープベクターで細胞を形質移入した。形質移入の１６時間後、培地を除去し、新しい培地を添加し、細胞をさらに６０時間培養した。最後に、ウイルス上清を収集し、４℃で１０分間遠心分離した。上清を、０．４５μｍでろ過し、等分化し、ウイルス力価を直接試験するかまたは使用まで維持した。ウイルス力価をモニターするために、Ｔｅｔ０−ＧＦＰレンチウイルスを同時に生成した。レンチウイルスの力価を、感染の２〜３日後にフローサイトメトリーおよび顕微鏡検査で検査した。一般的に、５〜７ＭＯＩの各レンチウイルスを感染に使用した。ＰａｎＣ−１およびＭＩＡＰａＣａ−２対照ＰＤＡＣ細胞のレンチウイルス平均力価は、それぞれ３×１０８感染単位（ＩＵ）／ｍｌおよび３×１０９ＩＵ／ｍｌだった。ＨＴ１０８０線維芽細胞に対するレンチウイルス力価は、２．５×１０８ＩＵ／ｍｌだった。
【０１３６】
ヒト膵臓上皮腫瘍細胞の単離および培養
ヒト膵管腺癌および膵臓周縁部組織は、Ｆｏｘ  Ｃｈａｓｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒが、患者のインフォームドコンセントの下に外科切除により取得した。患者はコンセントに署名し、試料取得は、組織内試料調達手続きに従って施設内治験審査委員会による承認を受けた。組織標本は、切除直後に手術室から得た。１〜２ｃｃの組織を、がんの中心部から採取し、１〜２ｃｃの組織を、がんから最も遠い周縁部から採取し、直ちに、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、１０μｇ／ｍｌゲンタマイシン、２．５μｇ／ｍｌファンギゾン、１０μｇ／ｍｌシプロフロキサシン、１００Ｕ／ｍｌナイスタチン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を補充した無菌Ｆ１２培地／またはライボビッツＬ−１５培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に解離まで入れた。組織を、供給業者のプロトコールの通りに、０．７ｍｇ／ｍｌリベラーゼＨＩ（Ｒｏｃｈｅ社、スイス）で解離した。手短に言えば、ハンクスバランス緩衝生理食塩溶液（ＨＢＳＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で２回すすいだ後、組織を、リベラーゼ作業用溶液（ＨＢＳＳ中、０．７ｍｇ／ｍｌリベラーゼＨＩ、１００μｇ／ｍｌ  ＤＮａｓｅＩ、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ）に移し、メスで細かく刻んだ。刻んだ組織を、ガラスバイアルに移し、３７℃でインキュベートした（時間は、組織サイズに応じて様々であり、最大１時間）。その後、リベラーゼ活性を、反応停止緩衝液（１０％ＦＢＳを補充したＨＢＳＳ）で阻害し、３８０μｍフィルター（Ｓｉｇｍａ社）に通して、組織残屑を除去した。解離した細胞をリベラーゼ反応停止緩衝液ですすぎ、その後遠心分離した。反応停止緩衝液で２回洗浄した後、解離した細胞を、５ｎｇ／ｍｌヒトＥＧＦ（ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）および５０ｎｇ／ｍｌコレラ毒素（Ｓｉｇｍａ社）、５０μｇ／ｍｌウシ下垂体エキス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を補充した完全限定ＫＳＦＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に再懸濁し、５μｇ／ｃｍ２ラットコラーゲンＩ（ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）事前コーティング組織培養皿に播種し、３７℃のＣＯ２インキュベータで培養した。感染まで一日おきに細胞に栄養供給した。組織を送達するまでの時間が長い場合、自己分解細胞を除去するために、刻んだ組織を、ます温和な条件で消化し（０．５ｍｇ／ｍｌリベラーゼＨＩでおよそ３０分間）、次に３８０μｍフィルターに通した。この条件では、解離した単一細胞は、通常、自己分解細胞ならびに血液細胞を含んでいたが、がん細胞を多くは含んでいなかった。したがって、自己分解細胞を除去するために、解離した細胞を別々に収集または廃棄した。第１の消化後の３８０μｍフィルター上部に保持された組織幹を収集し、０．７ｍｇ／ｍｌリベラーゼＨＩ作業用溶液で３０〜４０分間（組織サイズに応じて）３７℃にて消化し、失活させ、洗浄し、その後上記に記載のように培養した。
【０１３７】
ヒト原発性膵管がんおよび周縁部からのｉＰＳ様クローンの生成
上皮細胞
培養した膵臓がんおよび周縁部上皮細胞を、ＰＷＰＴ−ｒｔＴＡウイルスと共に、Ｔｅｔ０−Ｏｃｔ４、Ｔｅｔ０−Ｓｏｘ２、ＴｅｔＯ−Ｋｌｆ４、ＴｅｔＯ−Ｍｙｃウイルスに、播種後３〜４日間感染させた。２４時間後に、細胞を、同じウイルスに再感染させた。第２の感染の４８時間後、感染細胞を剥離および計数することにより、およそ１００，０００個の細胞が各周縁部試料または腫瘍試料で生存したことが明らかになった。細胞を、ヒトＥＳ培地（２０％Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｒ、１ｍＭ  Ｌ−グルタミン、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、０．１ｍＭベータ−メラカプトエタノール（ＢＭＥ）、１０ｎｇ／ｍｌ塩基性Ｆｇｆ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を補充した８０％ＤＭＥＭ／Ｆ１２に再懸濁し、０．１％ゼラチン組織培養皿の放射線照射マウス胚線維芽細胞に播種した。細胞に毎日栄養供給した。ＥＳ様の平らなコロニーを、第２の感染後の１２日目〜３６日目から２２ゲージ針で採取し、放射線照射ＭＥＦに置き、毎日栄養供給し、５〜７日毎に針を用いて機械的に継代した。コロニーを、およそ継代３〜４で凍結し、安定クローンを、継代１０後に凍結した（ＥＳ／ｉＰＳ細胞培養に関しては、上記を参照）。
【０１３８】
ＫＲＡＳコドン１２突然変異のピロシーケンス
原発腫瘍組織のＫＲＡＳコドン１２突然変異を、ピロシーケンス（Ｋａｎｄａら、２０１２）で検査した。パラフィンスライドから単離された２５ナノグラムのゲノムＤＮＡを、製造業者のプロトコールに従って、ＰｙｒｏＭａｒｋポリメラーゼ連鎖反応キット（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いてＰＣＲ増幅した。増幅後、３ｕｌの反応をアガロースゲルに負荷して、ＰＣＲ産物を検査した。１０マイクロリットルのビオチン化ＰＣＲ産物を、ストレプトアビジンセファロースＨＰビーズ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）に固定化し、上述のように、ＰｙｒｏＭａｒｋアッセイ設計ソフトウェア（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて設計した配列決定用プライマー（プライマーは、表１を参照）とアニーリングさせた。ＫＲＡＳコドン１２のピロシーケンスは、ＰｙｒｏＭａｒｋ  ＭＤ（Ｑｉａｇｅｎ社）で行った。実験は全て、異なるバッチのＰＣＲ産物を用いて３回繰り返した。培養した１０−１２周縁部ｉＰＳ様系統および１０番目の周縁部原発性上皮細胞に由来するゲノムＤＮＡを、生物学的陰性対照に使用した（ＧＡＴ  Ｇ１２Ｄの場合は２％基線、ＧＧＴ  Ｇ１２Ｖ突然変異の場合は０．５％基線）。ＤＮＡ増幅ＰＣＲ産物およびプライマーアニーリングＰＣＲ産物は、技術的な陰性対照として使用しなかった。
【０１３９】
ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ
ＲＴ−ＰＣＲ／ｑＲＴ−ＰＣＲの場合、Ｈ１およびｉＰＳ様クローンを、放射線照射ＭＥＦ細胞で培養した。ＣＧＨ分析の場合、Ｈ１／Ｈ９ヒトＥＳ細胞およびｉＰＳ様クローンを、マウス支持細胞層を用いずにｍＴｅＳＲ培地（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のマトリゲルで培養した。全ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｃｒｏキット（Ｑｉａｇｅｎ社、バレンシア、カリフォルニア州）で単離し、１００ｎｇの全ＲＮＡを、ｉＳｃｒｉｐｔ  ｃＤＮＡ合成キット（Ｂｉｏ  ｒａｄ社、ハーキュリーズ、カリフォルニア州）を使用することにより逆転写した。ｃＤＮＡ（２ｎｇ）を、ＳＹＢＲグリーンプライマーセットまたはＴａｑｍａｎプローブのいずれかを用いて、ｉＣｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏ−ｒａｄ社）でリアルタイムＰＣＲにかけた。Ｔａｑｍａｎプローブでの遺伝子発現レベルの場合、デルタＣｔ法を、基準としてのＧａｐｄｈまたはベータアクチンのいずれかと共に使用した。ＳＹＢＲグリーンプライマーのＲＴ−ＰＣＲ産物を、臭化エチジウムで染色した後、２％アガロースゲルで視覚化して、適切な標的増幅を確認した。プライマー対は、表１に示されている。
【０１４０】
免疫染色／免疫組織化学法（ＩＨ）
Ｈ１／ｉＰＳでの免疫染色の場合、細胞を、室温（ＲＴ）にて１５分間４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳで固定し、ＲＴにて１０分間０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００／ＰＢＳで透過処理した。ＰＢＳで２回洗浄した後、ブロッキング溶液（ＰＢＳ中の４％正常ヤギ血清（Ｓｉｇｍａ社）で、ＲＴにて３０分間アプライした。ＳＳＥＡ４（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、１：１００）、ＮＡＮＯＧ（Ａｂｃａｍ社、１：１００）、およびＯＣＴ４（Ａｂｃａｍ社、１：１００）を含む一次抗体を、固定した細胞にアプライして、４℃で一晩インキュベートした。すすいだ後、Ａｌｅｘａ４８８結合ヤギ抗マウスＩｇＧまたはヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体を、ＲＴにて１時間アプライした。最後の洗浄においてＤＡＰＩをアプライして、核を染色した。免疫組織化学法の場合、電子レンジで１５分間、１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６）中で煮沸することにより、パラフィン切片スライドを抗原賦活化した。次に、組織スライドの内因性ペルオキシダーゼ活性を、ＲＴにて１５分間、過酸化水素溶液で失活させた。組織を、１０分間タンパク質遮断剤（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）でブロックし、その後アビジン／ビオチンブロッキング（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂ社、バーリンゲーム、カリフォルニア州）を１５分間行った。０．１％ＢＳＡおよび０．２％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００を補充したＰＢＳで希釈された、Ｋ１９（Ａｂｃａｍ社、１：２０００）、ＭＵＣ５ＡＣ（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂ社、１：１００）、ＰＤＸ−１（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社、１：１０００）、ＳＯＸ９（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社  １：５００）、ＨＮＦ−４α（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社、１：２５０〜１：５００）、ＭＦ２０（ハイブリドーマバンク、１：４０）、ビメンチン（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ社、ケンブリッジ、マサチューセッツ州、１：５００）、ベータＩＩＩチューブリン（Ａｂｃａｍ社、１：２０００）、ＧＦＡＰ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社、１：２００）を含む一次抗体をアプライし、４℃にて１２〜１６時間インキュベートした。２回洗浄した後、組織を、ビオチン化抗マウスＩｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂ社）と共に３７℃にて３０分間インキュベートした。ＶｅｃｔａＳｔａｉｎ  Ｅｌｉｔｅ  ＡＢＣキット（ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂ社）を３７℃にて３０分間使用することにより、組織切片をアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と結合させ、その後、ペルオキシダーゼ用のＤＡＢペルオキシダーゼ基質キット（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂ社）で１〜２分間発色させた。発色させた組織切片を、ヘマトキシリンで核染色し、脱水し、マウントした。ｒｔ−ＴＡ（ＭｏＢｉＴｅｃ社、ドイツ、１：５０）染色の場合、新しい凍結組織を、ＯＣＴに包埋し、８μＭの厚さに切片化した。切片を、アセトンで５分間固定し、ＰＢＳで洗浄し、上述のようにＩＨＣ用に処理した。１０番目の原発腫瘍組織でのＮＡＮＯＧ（Ａｂｃａｍ社  １：１０００）およびＯＣＴ４（Ａｂｃａｍ社  １：２０００）の免疫染色の場合、凍結組織を、ＯＣＴに包埋し、８μＭの厚さに切片化した。陽性対照の場合、Ｈ１ヒトＥＳ細胞を、４％アガロースに包埋し、ＯＣＴ中で瞬間凍結し、１０μＭの厚さに切片化した。切片は全て、４％ＰＦＡで固定し、上記のようにＩＨＣ用に処理した。１０番目の原発腫瘍組織でのＮＡＮＯＧ（Ａｂｃａｍ社  １：１０００）およびＯＣＴ４（Ａｂｃａｍ社  １：２０００）の免疫染色の場合、凍結組織をＯＣＴに包埋し、８μＭの厚さに切片化した。陽性対照の場合、Ｈ１ヒトＥＳ細胞を、４％アガロースに包埋し、ＯＣＴ中で瞬間凍結し、１０μＭの厚さに切片化した。切片は全て、４％ＰＦＡで固定し、上記のようにＩＨＣ用に処理した。
【０１４１】
奇形腫アッセイ
雌の４〜６週齢ＮＯＤ−ＳＣＩＤ−ＩＬ２Ｒｇｃヌル（ＮＳＧ）マウス（ペンシルバニア大学、異種移植コア）（Ｓｈｕｌｔｚら、２００５）を、ヒト膵臓ｉＰＳ様系統の皮下注射に使用した。手短に言えば、注射の２４時間前に、ドキシサイクリンを培養培地から取り除いた。ＤＭＥＭ／Ｆ１２で細胞をすすぎ、コラゲナーゼ（１ｍｇ／ｍｌ）を添加し、３７℃で３分間インキュベートすることにより、コンフルエント細胞を６ウエルプレートの全ウエルから剥離させ、遠心分離で収集した。細胞を、４２０μｌの完全ヒトＥＳ培地に再懸濁し、雌ＮＳＧマウスに皮下注射した。幾つかの場合には、３００μｌの細胞ペレットを、注射前に１２０μｌのマトリゲルと混合した。これは、１０−２２細胞が、ＰａｎＩＮを発生させるか否かに影響を及ぼさなかったが、病変をあまり分散させなかった。注射の１２週（３か月）後または２７３日（９か月）後、注射領域を収集し、４％パラホルムアルデヒドで固定し、パラフィンに包埋した。パラフィン塊を切片化し、分析用にヘマトキシリンおよびエオジンで染色した。
【０１４２】
胚様体へのＨ１／ｉＰＳ様クローンの分化
手短に言えば、Ａｃｃｕｔａｓｅ溶液（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、サンディエゴ、カリフォルニア州）を使用し、ｈｕＥＳ培地ですすいて、単一のサブコンフルエント６ウエルプレートから細胞を回収した。細胞の凝集塊は、７０μｍフィルターを通すことによる解離細胞だった。解離細胞を、Ｆｇｆ２およびＫＳＲを含まないが、２０％ＦＢＳまたはａｇｇｒｅｗｅｌｌ培地（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を補充したｈｕＥＳ培地で、極低付着６ウエルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社、オネオンタ、ニューヨーク州）にて２〜３週間培養し、その後、ｑＲＴ−ＰＣＲのためのＲＮＡ用に収集した。
【０１４３】
比較ゲノムハイブリダイゼーション
全ゲノムＤＮＡを、プロテイナーゼＫ／フェノール−クロロホルムにより、培養原発性がんおよび周縁部上皮細胞、ならびにｉＰＳ様クローンの培養から単離した。製造業者に従って、ゲノムＤＮＡ分析酵素標識キット（Ａｇｉｌｅｎｔ社、サンタクララ  カリフォルニア州）用のＡｇｉｌｅｎｔ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ａｒｒａｙ−Ｂａｓｅｄ  ＣＧＨを使用して、ゲノムＤＮＡを増幅した。標識ゲノムＤＮＡを、Ｐｅｎｎ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ施設によるヒトゲノムＣＧＨマイクロアレイキット４４Ｋ（Ａｇｉｌｅｎｔ社）と同時ハイブリダイズした。アレイを、Ａｇｉｌｅｎｔ社製スキャナーシステムで走査した。データは、Ｐａｒｔｅｋ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｓｕｉｔｅ（Ｐａｒｔｅｋ社、セントルイス、ミズーリ州）を使用することにより分析した。
【０１４４】
ＣｐＧメチル化塩基配列決定
全ゲノムＤＮＡを、Ｈ１  ｈｕＥＳ細胞、１０−１２周縁部ｉＰＳ様細胞、および１０−２２がんｉＰＳ様細胞から、フェノール抽出により精製した。親原発性がんゲノムＤＮＡを、パラフィンまたはＯＣＴ塊に包埋した組織から単離した。製造業者による説明に従ってＣｐＧｅｎｏｍｅ（商標）ＤＮＡ修飾キット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を使用して、１μｇゲノムＤＮＡでの亜硫酸水素塩変換を実施した。以前に発表されているプライマー、またはＰｙｒｏＭａｒｋ  Ａｓｓａｙ  Ｄｅｓｉｇｎソフトウェア（Ｑｉａｇｅｎ社、バレンシア、カリフォルニア州）で設計したプライマーを使用して、ＮＡＮＯＧ上流領域およびＯＣＴ上流領域を、３０ｎｇの変換ＤＮＡを使用して増幅した（プライマーは、表１を参照）。増幅したＰＣＲ産物を、記載のように（ＴｏｓｔおよびＧｕｔ、２００７）、亜硫酸水素塩ピロシーケンスにかけた。手短に言えば、ビオチン結合プライマーを用いて増幅された１０ｕｌのＰＣＲ産物を、ストレプトアビジンセファロースＨＰビーズ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＢ社、スウェーデン）に１０分間固定化した。固定化したＰＣＲ産物を一本鎖に分離し、ＰｙｒｏＭａｒｋ（登録商標）Ｑ９６  Ｖａｃｕｕｍ  Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ（Ｑｉａｇｅｎ社）で、配列決定用プライマーを含むＰｙｒｏｍａｒｋプレートに放出し、８０℃でインキュベーションした後で室温に冷却することにより配列決定用プライマーとアニーリングさせた。対応するＣｐＧ部位のピロシーケンスを、ＰＳＱ９６機器（Ｑｉａｇｅｎ社）で実施した。各ＣｐＧ部位でのメチル化割合を、Ｑ−ＣｐＧメチル化ソフトウェア（Ｑｉａｇｅｎ社）を使用して決定した。
【０１４５】
【表１−１】
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【表１−２】
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【表１−３】
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【表１−４】
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【０１４６】
１０−２２がんｉＰＳ様系統奇形腫のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養
１３〜１４週後に、１０−２２細胞を内包するＮＳＧマウスから奇形腫を回収した。切除した奇形腫組織を切り刻み、リベラーゼＴ−ｆｌｅｘ（１．３Ｗ／ｍｌ）で３７℃にて３０分間解離した。続いて、反応を停止させ、１５％ＦＢＳ／ＤＭＥＭで洗浄した。解離した細胞を、細胞培養全体、または４０μｍフィルターに通した単一細胞のいずれかとして播種した。解離した奇形腫組織を、以前に記載したように包埋した（Ｌｅｅら、２００７）。手短に言えば、事前に冷却した４ウエルプレート（Ｎｕｎｃ社、ロチェスター、ニューヨーク州）を、３７℃のインキュベータにて１５分間、１５０μｌマトリゲル（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）の薄層で被膜した。解離した細胞を、４℃にて５分間１２００ｒｐｍで遠心分離することによりペレットにし、２００μｌのマトリゲルに再懸濁し、３７℃にて３０分間インキュベートして、細胞−マトリゲル複合体をゲル化した。外植片に、５００μｌの無血清培養培地で栄養供給した。播種の６日後に、無血清順化培地を収集し、遠心分離して細胞凝集塊を除去し、上清を収集し、プロテオミクス分析用に−８０℃で維持した。外植片を、さらに培養するために４〜５日毎に栄養供給した。プロテオミクス分析用の陰性対照を準備するために、１０−２２（ｐ１０およびｐ２７）ｉＰＳ様系統を、幹細胞継代ツール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用して機械的に収集し、５μｇ／ｃｍ２ラットコラーゲンで事前にコーティングしたプレートの無血清ＤＭＥＭ培地で２日間培養した。培地を収集し、０．４５μｍフィルターでろ過し、プロテオミクス分析用に−８０℃で維持した。
【０１４７】
プロテオミクス分析
凍結した培地を、各々が３０〜６０μｇタンパク質に対応するタンパク質を含む３本のチューブに分割した。各試料をアセトンで析出させて、タンパク質を濃縮し、塩および脂質可溶性夾雑物を除去した。手短に言えば、４容積の冷却アセトンを試料に添加し、試料を−２０℃で一晩インキュベートした。試料を、４℃にて１０分間１６，０００ｇでペレットにして、次いでアセトンおよび水（４：１）の溶液で洗浄した。ペレットを１０分間空気乾燥し、還元剤を含むＮｕＰａｇｅ  ＬＤＳ試料緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で５分間沸騰することにより変性させた。各試料を、Ｎｕｐａｇｅ１０％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲルにかけ、Ｎｕｐａｇｅ  ＭＯＰＳ  ＳＤＳランニング緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて、ほとんど２時間１００ｍＶで流した。ゲルを、ＭＳ分析に関する製造業者の推奨に従って、Ｓｉｍｐｌｙｂｌｕｅ  ｓａｆｅｓｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で染色した。５×５ｍｍ小片を切り出し、２％酢酸溶液で保存した。切り出したゲル試料を、トリプシンで消化した（Ｓｔｒａｄｅｒら、２００６）。５μｌのトリプシン消化試料を、オートサンプラー（Ｅｋｓｉｇｅｎｔ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、ダブリン、カリフォルニア州）で注入し、１０ｃｍのＣ１８カラムを使用して、消化ペプチドを分離した。Ｎａｎｏ  ＬＣ（Ｅｋｓｉｇｅｎｔ社）を、２００ｎｌ／分の流速にて１００分間の勾配で流した。オンラインナノスプレーを使用して、分離したペプチドをＬＴＱ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ社）にスプレーし、Ｘｃａｌｉｂｕｒで生データを得た。Ｓｅｑｕｅｓｔソフトウェアを使用して、データベースＵｎｉｐｒｏｔおよびＩＰＩを検索し、各試料のｓｒｆファイルを生成した。Ｓｃａｆｆｏｌｄ３．３を使用して、Ｓｅｑｕｅｓｔが生成したｓｒｆファイルを、スペクトラムカウントに基づき定量的に統合および分析した。カットオフは、ペプチドがｐ値＞９５％であり、タンパク質がｐ値＞９９％だった。ヒトタンパク質をマウスおよびウシからさらに分別するために、ＵｎｉＰｒｏＫＢ  ＴｒＥＭＢＬ（２０１１年１０月にダウンロードした）を使用し、ミスマッチを許可せずに、ペプチド配列をブラスト検索した。ヒトペプチドならびにヒトおよびマウスに共通するペプチドを使用して、奇形腫および１０−２２ｉＰＳ様系統から分泌されるタンパク質を特定した。ヒトおよびマウスの両方に共通するペプチドのみを有するタンパク質を、マウスバックグラウンドに由来するタンパク質と区別するために、タンパク質は全て、対側性対照から分泌されるタンパク質を差し引いた。Ｍｅｖを使用して（メトリックとしてピアソン相関を使用して）、階層的クラスタリングを適用した（データ非表示）。少なくとも２つの奇形腫外植片から分泌されたタンパク質を、Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ経路分析（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ．ｃｏｍ）に使用した。
【０１４８】
ＰａｎＩＮおよびＰＤＡＣマウスモデル
２〜２．５月齢および４〜６月齢のＰｄｘ−Ｃｒｅ；ＬＳＬ−ＫｒａｓＧ１２Ｄ；ｐ５３ｆｌ／＋；ＲｏｓａＬＳＬ−ＹＦＰマウス（Ｒｈｉｍら、２０１２）を、それぞれＰａｎＩＮおよび腫瘍段階におけるＨＮＦ４α発現を分析した。安楽死させた後、膵臓を洗浄し、亜鉛−ホルマリン（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ社、ウォリントン、ペンシルベニア州）で、２時間４℃にてインキュベートした。洗浄し、エタノールで脱水した後、組織を、パラフィンに包埋し切片化した。キシレンで脱パラフィンした後、蒸気レトリバーを使用して、Ｒ−ｂｕｆｆｅｒ  Ａで、組織切片を抗原賦活化した（両方ともＥｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、ハットフィールド、ペンシルベニア州）。スライドを、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００のＰＢＳ中の５％ロバ血清で１時間ブロッキングし、その後一次抗体（ニワトリαＧＦＰ（Ａｂｃａｍ社、１：５００）およびヤギαＨＮＦ４α（１：２００）と共に１時間室温にてインキュベートした。その後、スライドを、二次抗体（ＦＩＴＣ結合ロバαニワトリ（１：２００；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、グランドアイランド、ニューヨーク州）；Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ５９４結合ロバαヤギ（１：２００；Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ社、ウエストグローブ、ペンシルベニア州）；ＤＡＰＩ（１：１０００））と共に、ブロッキング溶液中で１時間室温でインキュベートし、その後、洗浄し、カバーガラスにマウントした。オリンパスＩＸ７１倒立蛍光顕微鏡を使用して画像を視覚化し、オリンパスＤＰマネージャソフトウェア（ｖ．３．１．１）を使用してキャプチャおよび統合した。
【０１４９】
序文
がん表現型は、核移植により再プログラムして多能性にすると、ある髄芽細胞腫細胞、ＲＡＳ誘導性メラノーマ細胞、および胚性癌細胞、および腎腫瘍細胞では抑制することができる（Ｂｌｅｌｌｏｃｈら、２００４；Ｈｏｃｈｅｄｌｉｎｇｅｒら、２００４；Ｌｉら、２００３；ＭｃＫｉｎｎｅｌｌら、１９６９）。その後、その結果生じた多能性細胞は、複数の初期発生細胞タイプの胚に分化することができる。そのような胚は、推測ではあるががん表現型の再発現のため、部分的には器官形成中に死滅する。ある状況では、多能性ネットワークががん表現型を十分に抑制して、初期組織分化を可能にすることができることは注目すべきことである。ｉＰＳ細胞技術（ＴａｋａｈａｓｈｉおよびＹａｍａｎａｋａ、２００６）を使用して、がん細胞系からｉＰＳ細胞が作製されている（Ｃａｒｅｔｔｅら、２０１０；Ｍｉｙｏｓｈｉら、２０１０）。しかしながら、固形原発性ヒトがんに由来するｉＰＳ細胞系は報告されていない。１つの理論に限定されないが、上皮性腫瘍からｉＰＳ細胞を作製することにより、細胞を多能性状態で無期限に繁殖させることが可能になりその上、分化の際に、細胞のサブセットがヒトがんの初期発生段階を経ることになり、疾患の初期段階の生細胞ヒトモデルを提供する。
【０１５０】
結果
ヒト膵管腺癌からのｉＰＳ様細胞系の作製
ヒト膵管腺癌試料を切除直後に得た（表２）。標本の周縁部の組織学的に正常な膵臓組織を、対照として使用した。上皮細胞を単離し、コレラ毒素と共に無血清培地で培養して、線維芽細胞の増殖を妨害した。膵臓がんおよび周縁部細胞の２回連続感染を、ドキシサイクリン誘導可能マウスＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、およびｃ−Ｍｙｃ、ならびにｒｔ−ＴＡトランス活性化因子を別々にコードする５つのレンチウイルスで実施し、一方、ゲノムＤＮＡを別々に培養した膵臓の標本周縁部およびがん上皮細胞から単離した。ピロシーケンス分析は、初期腫瘍試料の９つのうちの７つでＫＲＡＳ突然変異細胞を明らかにした（表２および３）。ＥＳ様コロニーが７日後に発生し始め、がん上皮細胞から生じたコロニーはより少数だった。がんまたは周縁部に由来するＥＳ様クローンは、ドキシサイクリンを取り除いた４日後に分化および消失し始めた。したがって、低ドキシサイクリン濃度（５０ｎｇ／ｍｌ）の存在下でコロニーを維持し、その結果生じた系統は、ドキシサイクリンに対して依存性であるため、ｉＰＳ様と呼んだ。ｉＰＳ様系統を、９つの腫瘍上皮標本のうち４つから樹立し、対応する周縁部ｉＰＳ様系統を、標本のうち３つから樹立した（図１Ａ、表２）。
【０１５１】
細胞の多能性を、ＲＴ−ＰＣＲ、免疫染色、胚様体形成、奇形腫アッセイ、核型分析により特徴付け、サブセットをＣｐＧメチル化分析により特徴付けた。ほとんどのｉＰＳ様系統が、内因性多能性マーカーＲＮＡおよびタンパク質を発現した（図１Ｂ、Ｃ；図７Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤ）。免疫不全ＮＳＧマウスでの奇形腫アッセイ、および胚様体アッセイは、１０番目の患者に由来する１０−１２膵臓周縁部および１０−２２がんｉＰＳ様系統（図１Ｄ、Ｅ；図８Ａ）、ならびに１４番目の患者に由来する１４−２４膵臓周縁部および１４−２７がんｉＰＳ様クローン（図７Ｅ、Ｆ）が、複数の胚葉の組織を生成し、多能性を示すことができることを明らかにした。原腫瘍＃１０は、ＮＡＮＯＧ発現が陰性であり、ＰＯＵ５Ｆ１／ＯＣＴ４の散在性発現を示した（図８Ｂ）。ＣｐＧメチル化の詳細なピロシーケンス分析は、１０−２２ｉＰＳ様系統が、原発性腫瘍と比較して、ＮＡＮＯＧプロモーターの９つの部位の９つで、およびＯＣＴ４プロモーターの６つの部位のうちの３つで脱メチル化を示し、Ｈ１  ｈｕＥＳ系統は、同様にＮＡＮＯＧで脱メチル化され、ＰＯＵ５Ｆ１の６つの部位のうちの４つで脱メチル化されたことを示した（図８Ｃ）。したがって、ｉＰＳ様系統は、再プログラムされた多能性細胞の多様な特徴を示す。
【０１５２】
【表２】
0006652916.tif 000006
1放射線照射または放射線および化学療法を受けた組織から、コロニーは得られなかった。
2検査室への移送に時間がかかったことによる周縁部組織自己分解、または放射線/化学療法で治療された患者に由来する腫瘍組織自己分解
【０１５３】
全てのｉＰＳ様系統を、膵臓がんに共通の遺伝的変化である、ＫＲＡＳ、ＣＤＫＮ２Ａ、およびＢＲＡＦの突然変異（Ｍｏｓｋａｌｕｋら、１９９７）についてスクリーニングした（表３）。１０番目の患者の再発性で侵襲性の分化不良ＰＤＡＣに由来した１０−２２ｉＰＳ様系統は、初期腫瘍上皮集団に見られるものと同じＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｄ突然変異を内包する（図１Ｆ；表２、３）。また、１０−２２細胞は、ＣＤＫＮ２Ａヘテロ接合性欠失（図１Ｈ；表３）、ならびに原発性がん培養よりも誇張された多数の染色体異常およびそれに応じた異常核型を有する比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）パターン（図１Ｉ；図３）を有する。原発性がん培養は、幾つかの間質細胞を含んでおり、したがって正常遺伝子型の細胞で狭雑されているため、１０−２２ｉＰＳ様系統の原発性がんＣＧＨパターンの誇張は、予想の通りである。具体的には、２３個の全染色体異常が、１０番目の腫瘍のＰＤＡＣ上皮細胞集団で検出され、１０−２２系統では２０個が示された（図１Ｉ、図９Ｂ）。原発腫瘍細胞および１０−２２系統でのＣＧＨシグナル減少は、ＰＴＥＮおよびＤＰＣ４（ＳＭＡＤ４）にわたっていた。これは、ヒト膵臓がんにおけるこれら遺伝子座の対立遺伝子欠失の観察と一致する（Ｈａｈｎら、１９９６；Ｈａｈｎら、１９９５年）。対照的に、同質遺伝子型膵臓１０−１２周縁部ｉＰＳ様系統は、野生型ＫＲＡＳ、親周縁部細胞培養と類似した均一なＣＧＨ染色体プロファイル、および正常核型を有していた（図１Ｇ、Ｈ、Ｉ；図９；表３）。１０−１２および１０−２２ｉＰＳ様系統は、それぞれ膵臓周縁部およびがん上皮細胞に由来し、１０−２２系統は、初期進行性腫瘍上皮集団で見られる著しいゲノム再編成を内包していた。まばらな１ｍｍ増殖巣を含む中程度に分化したＰＤＡＣを有する１４番目の患者に由来するｉＰＳ様系統（図７Ａ、Ｂ）は、ＣＤＫＮ２ＡおよびＢＲＡＦに点突然変異を示したが、親上皮培養のように野生型ＫＲＡＳでは点突然変異を示さず（表２および３）、均一なＣＧＨプロファイルを示した（データ非表示）。また、１９番目の患者に由来する１対の周縁部およびがん由来ｉＰＳ様系統（図７Ｃ、Ｄ）は、野生型ＫＲＡＳおよびＢＲＡＦと共に、ＣＤＫＮ２Ａに体細胞突然変異も有していた（表３）。１０番目の患者に由来する１０−２２がんｉＰＳ様系統は、ＰＤＡＣに典型的なＫＲＡＳ突然変異バックグラウンドを含んでいたため、その系統およびその同質遺伝子型１０−１２、ＫＲＡＳ  ｗｔ周縁部ｉＰＳ様クローンに関する詳細な研究を実施した。
【０１５４】
【表３】
0006652916.tif 000007
【０１５５】
進行性ヒトＰＤＡＣに由来する１０−２２ｉＰＳ様細胞は、分化の際に、初期段階の膵臓がんを経る。
がんに由来するにも関わらず、１０−２２癌ｉＰＳ様系統ならびにその対応する１０−１２周縁部系統は、３か月では、対照Ｈ１ヒトＥＳ細胞に由来するものに見られたものと比較して、はるかに小さな皮下奇形腫を生じさせた。より興味深いことには、１０−１２および１０−２２ｉＰＳ様系統に由来する奇形腫では、内胚葉性ＤＢＡレクチン陽性腺管構造の割合が非常に高かったが（図２Ａ；図１０Ａ）、Ｈ１細胞は、以前に観察されているように（Ｂｏｃｋら、２０１１）、ほとんどニューロン系統を生成した。これらの結果は、他のｉＰＳ細胞系が、それら自体に由来した系統へと分化する傾向があることに関する報告と一致する（ｂａｒ−Ｎｕｒら、２０１１；Ｋｉｍら、２０１１）。
【０１５６】
周縁部（１０−１２）および腫瘍（１０−２２）ｉＰＳ系統から生じた内胚葉奇形腫を、１０番目の患者の原腫瘍と比較した。原腫瘍は、多くの領域が分化不良の病変および浸潤を示したが、より組織化された上皮を示すこともあった。しかしながら、ＰａｎＩＮは示さなかった（図２Ｂ、Ｃ；図１０Ｂ）。腫瘍上皮は、侵襲性表現型を示す細胞質突起と共に（図２Ｃの点線）、不規則な形の多染色体性の核および高い核対細胞質比を示した（図２Ｃ、矢印）。対照的に、１０−２２がんｉＰＳ様系統に由来する３か月の奇形腫腺管組織は、高レベルの構造化組織を示し、原発腫瘍と比較して、大量の腺形成およびより分化した細胞学的特徴を有していた（図２Ｂ）。これは、ＰａｎＩＮ段階を示す、細胞質の増加、均一な核膜輪郭を有するより小さくより多染色体性でない核、核対細胞質比の減少、および細胞極性の増加を含んでいた。大量のムチンが、細胞の頂端面に存在していた（図２Ｄの矢印）。腺房分化または神経内分泌新生物形成の証拠はなかった。ＰａｎＩＮを、正常な腺管と比較した異形構造の程度により分類した（Ｈｒｕｂａｎら、２００１）。一連のＰａｎＩＮ１様構造、ＰａｎＩＮ２様構造、およびＰａｎＩＮ３様構造が、３か月の１０−２２ｉＰＳ様系統に由来する内胚葉奇形腫の組織学的検査で観察されたが、ＰａｎＩＮ２およびＰａｎＩＮ３段階に似た構造が多かった（図１０Ｃ〜Ｇ）。特定の理論に限定されないが、これらの知見は、１０−２２がんｉＰＳ様系統が、ＰａｎＩＮに似た腺管構造を生成することを示唆した（ＭａｉｔｒａおよびＨｒｕｂａｎ、２００８）。
【０１５７】
１０−２２細胞の継代数に関わらず、３か月の奇形腫実験１０回のうちの９回で、ＰａｎＩＮ様奇形腫が形成された。対照的に、１０−１２膵臓周縁部ｉＰＳ様系統は、奇形腫ではＰａｎＩＮ様構造を生成しなかった（ｎ＝４）（図２Ｂ）。また、素因性突然変異を含有するが、ＫＲＡＳの突然変異は含有しない１４番目および１９番目の腫瘍に由来するｉＰＳ様系統は、ＰａｎＩＮ様病変を生成しなかった（ｎ＝５、データ非表示）。したがって、さらなる研究は行わなかった。レーザーキャプチャーマイクロダイセクションで得たＤＮＡのＰＣＲは、１０−２２系統のＰａｎＩＮ様奇形腫の腺管上皮を取り囲む間質細胞が、ｒｔ−ＴＡレンチウイルスＤＮＡを含有しており、したがって、開始１０−２２細胞に由来することを示した（図１０Ｈ）。これは、ｒＴ−ＴＡ発現が、ＰａｎＩＮ様上皮で、ならびに局所間質にわたって検出されるが、皮下組織の遠位間質部分では検出されないことにより確認された（図１０Ｉ）。最近、ＰＤＡＣを取り囲む間質様細胞は、マウスモデルでは、ＥＭＴにより膵臓がん上皮から派生することが見出されている（Ｒｈｉｍら、２０１２）。しかしながら、この研究では、ＥＭＴ由来間質細胞は、ＰａｎＩＮ段階ではほとんど観察されなかった。まとめると、奇形腫のＰａｎＩＮ領域にあるヒト間質細胞の、恐らくは全てではないがほとんどは、多能性１０−２２細胞の上皮組織および間充組織への局所的な同時分化により派生したと考えられる。
【０１５８】
１０−２２がんｉＰＳ様系統の奇形腫の腺管構造をさらに詳細に特徴付けると、それらは、ケラチン１９（Ｋ１９）ならびに核ＰＤＸ１、膵臓決定因子、および核ＳＯＸ９を発現することが見出された（図３Ａ〜Ｆ、Ｊ；図１１Ａ〜Ｅ）。ＰＤＸ１は、成人膵管細胞では非常に低レベルで発現されるが、成人外分泌腺細胞では発現されず、膵炎、ＰａｎＩＮ、およびＰＤＡＣで上方制御される（Ｍｉｙａｔｓｕｋａら、２００６）。ＳＯＸ９は、マウスモデルでは、前駆膵臓病変の、変異体Ｋｒａｓとの協調的エフェクターである（Ｋｏｐｐら、２０１２）。１０−１２膵臓周縁部ｉＰＳ様細胞に由来する奇形腫は、胃ムチンＭＵＣ５ＡＣを発現しなかったが、１０−２２細胞に由来する奇形腫のＰａｎＩＮ様構造は、ＰａｎＩＮ病変および十分に分化したＰＤＡＣで観察されるように（Ｋｉｍら、２００２）、大量のＭＵＣ５ＡＣを発現した（図３Ｇ〜Ｉ、Ｋ、褐色染色；図１１Ａ）。１０−２２ｉＰＳ様系統が由来した親膵臓がん組織の組織学的検査およびＣＧＨゲノムプロファイルを考慮すると、データは、分化が不良な後期ＰＤＡＣに由来する１０−２２ｉＰＳ様系統は、その疾患の初期段階に関連するＰａｎＩＮ病変に分化することができることを示す。
【０１５９】
１０−２２ｉＰＳ様系統ＰＤＡＣは、侵襲性段階のヒト膵臓がんへと進行する。
１０−２２系統に由来するＰａｎＩＮ様構造が、後期段階のＰＤＡＣに進行することができるか否かを評価するために、ＮＳＧマウスで６〜９か月間増殖させた奇形腫を調査した。９か月までに、２匹の注射マウスの各々に、２つの固形で触知可能な腫瘍が生じた（３〜６ｍｍ直径）。腫瘍は全て１０−２２細胞の遺伝子型特徴を有していた（図１１Ｆ）。触知可能な腫瘍は、６か月では明白でなかったが、組織学的分析は、６か月および９か月の両方で、核異型性および血色素減少を有する高度腺状構造を示した（図４Ａ、Ｂ）。上皮細胞は、Ｋ１９、ＭＵＣ５ＡＣ、ＰＤＸ１、およびＳＯＸ９が陽性だった（図４Ｃ〜Ｒ、矢印）。注目すべきには、局所的に侵襲性の表現型を示す構造が観察された（図４Ａ、Ｂ；矢印）。１０−２２ｉＰＳ様系統に由来する奇形腫のＰａｎＩＮ様段階の後には、ｉｎ  ｖｉｖｏでは侵襲性段階のＰＤＡＣが続き、１０−２２ｉＰＳ様モデルが、広範な膵臓発癌現象を経ることを示した。
【０１６０】
１０−２２系統奇形腫に由来するＰａｎＩＮ様細胞の培養オルガノイドは、初期膵臓がんを示すタンパク質を分泌または放出する。
１０−２２細胞に由来する奇形腫内に生じるＰａｎＩＮ様構造を、初期ヒト膵臓がんの生細胞ｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルとして研究することができる系を生成した。したがって、注射した３か月後の奇形腫に由来する組織を、対側性対照組織と共に回収した。組織をマトリゲルに別々に包埋し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養する条件を確立した（図１２Ａ）。その結果生じた球状オルガノイドに由来するＤＮＡのＰＣＲ分析により、１０−２２系統遺伝子型が確認されたが、１０−２２系統遺伝子型は、対側性対照外植片には存在しなかった（図１２Ｂ）。１０−２２がんｉＰＳ様細胞に由来するオルガノイドは、ヒトＫ１９およびＭＵＣ５ＡＣの発現を保持した（図５Ａ〜Ｃ、切片）。
【０１６１】
ＰＤＡＣの予後不良を考慮して、オルガノイド系を使用し、早期検出を可能にすることができ、療法後の疾患モニタリングを容易にすることができるバイオマーカーおよび経路を特定した。Ｎａｎｏ  ＬＣ／ＭＳ／ＭＳを使用して、６日間培養した３つの独立した奇形腫の外植片から分泌または放出されたタンパク質を調査した（図５Ｄ、左）。データを、同様に培養された対側性対照組織の外植片から、および未分化の状態で培養された親１０−２２ｉＰＳ様系統から分泌または放出されたタンパク質と比較した。ヒトペプチドと完全に一致し、ヒトＰａｎＩＮ様奇形腫外植片に特異的だったペプチドを選択した（図５Ｄ、右）。３つ全ての１０−２２奇形腫外植片から分泌または放出された２５個のタンパク質のうち（図５Ｄ、右；表４）、８個は、ＰａｎＩＮ、ＩＰＭＮ、および／またはＰＤＡＣ内のＲＮＡまたはタンパク質レベルで発現されることが以前に報告されているが、残りのタンパク質については報告されていない（Ｈａｒｓｈａら、２００９）（表５）。対の１０−２２奇形腫外植片の交差から特定された８２個のタンパク質のうち（図５Ｄ、右；表６〜８）、１５個のタンパク質が、ＰａｎＩＮ／ＩＰＭＮ／ＰＤＡＣで以前に報告されている（Ｈａｒｓｈａら、２００９（表５）。ＰＧＡＭ−ＭおよびＶＷＦ等の、あるｍＲＮＡが、ＰａｎＩＮにおいて以前に特定されたが（Ｂｕｃｈｈｏｌｚら、２００５）、対応するタンパク質は、細胞から分泌または放出され、培地中で安定性を保つことが判明した。
【０１６２】
Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ経路分析は、少なくとも２つの１０−２２奇形腫外植片から分泌または放出された合計１０７個のタンパク質のうち（図５）、４２個が、相互に関連するＴＧＦβ１およびインテグリンシグナル伝達ネットワークに入ることを明らかにした（３８個のタンパク質については図５Ｅ、および表１３）。これらの経路は、ＰａｎＩＮ、ＩＰＭＮ、およびＰＤＡＣにおいて以前に報告されている（Ｂａｒｄｅｅｓｙら、２００６；Ｊｏｎｅｓら、２００８）。加えて、奇形腫外植片から分泌または放出された７個のタンパク質が、相互に関連するＲａｓ／ｐ５３／ＪＵＮ／ＣＴＮＢ１シグナル伝達経路に入ることが特定された（表１２）。要約すると、初期ヒト膵臓がんの１０−２２生細胞モデルから分泌または放出される多数のタンパク質が発見され、ならびに十分に研究されている経路が早期がん進行に関与する証拠が発見された。
【０１６３】
【表４】
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強調されている数値は、10-22iPS様細胞の3つの独立したテトラトーマ(マウス#9223、9225、および7761)に由来する無血清培地で培養された外植片に由来する順化培地においてのみ、タンパク質特定を提供し、対側性対照組織の外植片に由来する培地または多能性条件下で培養された10-22iPS様系統に由来する培地ではタンパク質特定を提供しないペプチドの数を示す。合計は25個のタンパク質である。H-ヒト特異的ペプチド、M-マウス特異的ペプチド、C-ヒトおよびマウスペプチド、B-ウシ特異的、U-ヒト/マウス/ウシ以外の種。
【０１６４】
ＨＮＦ４αネットワークは、初期から中期膵臓がんで活性化されたが、後期膵臓がんでは活性化されなかった。さらなるＩｎｇｅｎｕｉｔｙ分析は、分泌または放出されたタンパク質の別の２５個が、多数の直接遺伝子標的を含む、転写因子ＨＮＦ４αを中心とするネットワークにあることを明らかにした（Ｏｄｏｍら、２００４）（図５Ｆ、表９および１０）。また、ＨＮＦ４αネットワークのタンパク質のうち９個は、マウスＰＤＡＣモデルのＰａｎＩＮ段階中に血漿へと分泌された（表９）（Ｔａｇｕｃｈｉら、２０１１）。ＨＮＦ４αは、データベースの検索することにより、ＰＤＡＣの発症または進行には報告されていないが、ヒトＰＤＡＣにおけるＨＮＦ４α遺伝子座の増幅（Ｍａｓｅｒら、２００７）およびＨＮＦ４α  ｍＲＮＡの上方制御（Ｉａｃｏｂｕｚｉｏ−Ｄｏｎａｈｕｅら、２００３；Ｌｏｇｓｄｏｎら、２００３）が記されていた。幾つかの報告では、成体マウスの膵腺房細胞ならびに島細胞にＨＮＦ４αが示されているが（Ｇｕｐｔａら、２００７）、ＨＮＦ４ａは、主に島細胞で発現され、正常な膵臓の他所では発現が非常に低いかまたは発現されないことが見出された（図１２Ｃ）。興味深いことには、ＨＮＦ４αは、正常ヒトまたはマウス膵管では発現されなかったが（図６Ａ；図１２Ｃ）、３か月の１０−２２奇形腫ＰａｎＩＮ様細胞および９か月の侵襲期細胞の核で発現された（図６Ｂ、Ｃ；図１２Ｄ）。ＨＮＦ４αは、１０−２２細胞が由来した、１０番目の患者の原腫瘍の中程度に分化した領域で細胞質的に検出されたが、腫瘍の未分化部分では検出されなかった（図６Ｄ）。
【０１６５】
ヒト膵臓がんの様々な段階でのＨＮＦ４α発現をより定量的に評価するために、組織マイクロアレイを使用して、様々な段階のヒトＰａｎＩＮの複数の試料ならびに膵臓がんの試料を評価した。ＨＮＦ４αは、正常膵管の核でわずかに検出され、ＰａｎＩＮ−１細胞の試料では非常に微弱だったが、ＰａｎＩＮ−２の試料での核発現は、統計的に有意な増加を示し（ｐ＜０．０５）、ＰａｎＩＮ−３上皮ではより強力でより均一な発現を示した（ｐ＜０．０５）（図６Ｅ、Ｇ、Ｊ；表１０）。ＨＮＦ４αは、原患者＃１０腫瘍で見られるように（図６Ｄ）、十分に分化したＰＤＡＣのムチン切片で最も頻繁に検出され（ｐ＜０．０１）、未分化または分化不良のＰＤＡＣの上皮構造ではわずかに検出されたかまたは検出可能でなかった（図６Ｈ〜Ｊ）。また、ヒトタンパク質アトラス（Ｕｈｌｅｎら、２０１０）では、ＨＮＦ４αは、十分に分化したＰＤＡＣの上皮構造で陽性であるが、細胞質でも、分化不良または未分化のＰＤＡＣの上皮構造でも発現されず、転移性ＰＤＡＣで発現されないと考えられるとも記されていた。
【０１６６】
【表５−１】
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【表５−２】
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【表５−３】
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【０１６７】
ＨＮＦ４αは、ＫｒａｓＧ１２Ｄ；ｐ５３Ｌ／＋；Ｐｄｘ１−Ｃｒｅ；ＲｏｓａＬＳＬ−ＹＦＰバックグラウンド（Ｒｈｉｍら、２０１２）で生じるＰＤＡＣのマウスモデルで評価した。ヒトでのように、ＨＮＦ４αは、ＰａｎＩＮ−１段階で散在的に発現されるため（図６Ｋ）、ＰａｎＩＮ−２病変（図６Ｌ）およびＰａｎＩＮ−３病変（図６Ｍ）のほとんどの核で発現され、マウス腫瘍のより分化した部分の核で観察されたが、未分化の部分では観察されなかった（図６Ｏ、Ｐ；白色矢印）。結論として、１０−２２ｉＰＳ様細胞がヒト膵臓がんの初期段階を経る能力を、それらの形態、組織学的検査、分泌または放出タンパク質により検証し、それらを使用して、ヒト臨床試料および疾患のマウスモデルにおいて初期から侵襲期の病理に関連する、これまでは正当に評価されていないネットワークを発見した。
【０１６８】
【表６−１】
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【表６−２】
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強調されている数値は、10-22iPS様細胞の2つの独立したテトラトーマ(マウス#9223および9225)に由来する無血清培地で培養された外植片に由来する順化培地においてのみ、タンパク質特定を提供し、対側性対照組織の外植片に由来する培地または多能性条件下で培養された10-22iPS様系統に由来する培地ではタンパク質特定を提供しないペプチドの数を示す。合計は42個のタンパク質である。H-ヒト特異的ペプチド、M-マウス特異的ペプチド、C-ヒトおよびマウスペプチド、B-ウシ特異的、U-ヒト/マウス/ウシ以外の種。
【０１６９】
考察
ＰＤＡＣ進行の生ヒト細胞モデルが存在しなかったため、結果的に、疾患の初期段階の放出バイオマーカーおよび経路指標としての役目を果たすことができるタンパク質に関する情報はほとんどなかった。ヒトＰＤＡＣまたは膵臓がん幹細胞を免疫不全マウスに移植すると、細胞が由来した進行性ＰＤＡＣ段階と似た腫瘍が急速に発生し、ＰＤＡＣ前駆体の遅延増殖表現型を経ることはない。あるがん細胞が、核移植により多能性に再プログラムされ、その後初期哺乳類発生を経る能力に基づき、ヒト膵臓の腫瘍に由来する多能性幹細胞系が、がんの初期発生段階を経て進行する能力を有する可能性があるという仮説を立てた。これにより、破壊的ながんの生初期ヒト細胞の内因性プロセスおよび分泌タンパク質バイオマーカーを発見する機会が提供される。実際、希少な単一の膵臓がんｉＰＳ様系統である１０−２２細胞は、ヒトがん進行に対する新規な洞察を提供することができる。
【０１７０】
Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、およびｃ−Ｍｙｃの異所性発現、ならびに多能性様状態は、がん表現型を抑制した。以前に観察されているように、多能性エピジェネティック環境が、ある発がん状態を支配する場合がある（Ｌｏｎａｒｄｏ  Ｅ、２０１１）。核移植研究では、あるがん細胞だけが、再プログラムを受けやすく（Ｂｌｅｌｌｏｃｈら、２００４；Ｈｏｃｈｅｄｌｉｎｇｅｒら、２００４；Ｌｉら、２００３）、同様に、１つのｉＰＳ様系統が、ＰＤＡＣの主な促進因子であるＫＲＡＳ突然変異を内包する膵臓がんから取得された。ＫＲＡＳ突然変異は、マウスＥＳ細胞の分化を開始させる（Ｋｕｎａｔｈら、２００７）ＭＡＰＫシグナル伝達を、ヒトＥＳ細胞において誘導し、ＭＡＰＫシグナル伝達は、自己複製を促進することができる（Ｅｉｓｅｌｌｅｏｖａら、２００９）。発がん性ＲＡＳは、ｐ５３またはＣＤＫＮ２Ａの蓄積により細胞老化を誘導し（Ｓｅｒｒａｎｏら、１９９７）、４つの再プログラム因子の発現も、ｐ５３およびＣＤＫＮ２Ａを誘導することにより老化を開始させ、それにより再プログラムを妨害する（Ｂａｎｉｔｏら、２００９）。患者＃１０のみが、ＣＤＫＮ２Ａのｅｘｏｎ２に欠失を有していた。恐らくは、これが、１０−２２細胞がどのようにして老化表現型を回避することができるかの説明である。さらなる突然変異が１０−２２細胞で生じて、細胞が特にｉＰＳを形成し易くした可能性がある。
【０１７１】
【表７】
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強調されている数値は、10-22iPS様細胞の2つの独立したテトラトーマ(マウス#9223および7661)に由来する無血清培地で培養された外植片に由来する順化培地においてのみタンパク特定を提供し、対側性対照組織の外植片に由来する培地または多能性条件下で培養された10-22iPS様系統に由来する培地ではタンパク特定を提供しないペプチドの数を示す。合計は18個のタンパク質である。H-ヒト特異的ペプチド、M-マウス特異的ペプチド、C-ヒトおよびマウスペプチド、B-ウシ特異的、U-ヒト/マウス/ウシ以外の種。
【０１７２】
【表８】
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強調されている数値は、10-22iPS様細胞の2つの独立したテトラトーマ(マウス#9223および7761)に由来する無血清培地で培養された外植片に由来する順化培地においてのみタンパク特定を提供し、対側性対照組織の外植片に由来する培地または多能性条件下で培養された10-22iPS様系統に由来する培地ではタンパク特定を提供しないペプチドの数を示す。合計は22個のタンパク質である。H-ヒト特異的ペプチド、M-マウス特異的ペプチド、C-ヒトおよびマウスペプチド、B-ウシ特異的、U-ヒト/マウス/ウシ以外の種。
【０１７３】
多能性からの解放は、後期表現型への即時回帰を起こすのではなく、がんゲノムを病期特異的な様式で発現させることを可能にした。多能性からの解放には、通常、胚葉細胞の発生およびその後の特殊組織の発生が伴い、それが引き続き後成的に常在がんゲノムを圧倒することができる（Ｂｌｅｌｌｏｃｈら、２００４；Ｈｏｃｈｅｄｌｉｎｇｅｒら、２００４；Ｌｉら、２００３）。ＰＤＡＣに由来する１０−２２細胞は、奇形腫、ならびにＰａｎＩＮ病変および後期進行を示した膵管組織において多様な組織タイプを生成した。多能性細胞が、それら自体が由来したがんタイプを再現する明白な傾向を示すことは、ｉＰＳ細胞系が、一般的に自らの由来起原に優先的に分化する傾向を反映する（ｂａｒ−Ｎｕｒら、２０１１；Ｋｉｍら、２０１１）。幾つかの証拠は、１０−２２ｉＰＳ様系統がＰＤＡＣに由来することを示している。第１に、原再発腫瘍の病理は、ＰＤＡＣの病理であり、培養細胞のバルク集団のＣＧＨプロファイルは、高度に破壊されたゲノムを有し、１０−２２ｉＰＳ様系統のＣＧＨプロファイルを示していた（図１Ｉ、９Ｂ）。腫瘍が、大部分の未分化細胞中で、より多くの分化上皮細胞のポケットを内包し、したがって、どのタイプの細胞が１０−２２系統で不死化されたかが不確かであり、１０−２２細胞の破壊されたゲノムは、再発腫瘍の典型的な上皮細胞のゲノムを反映している。第２に、１０−２２細胞の奇形腫に由来するＰａｎＩＮ様構造は、ＳＯＸ９を発現した（図１１Ｂ〜Ｅ）。これは、マウスモデルの初期ＫｒａｓＧ１２Ｄ依存性膵臓前駆体病変（Ｋｏｐｐら、２０１２）ならびに決定的な膵臓がん上皮マーカーであるＰＤＸ１に必要である。したがって、１０−２２細胞に由来する腺管病変は膵臓型である。第３に、１０−２２細胞に由来する９か月の奇形腫は、後期ＰＤＡＣの組織学および局所的侵襲性特徴に進行した（図４）。したがって、１０−２２系統は、もっぱら初期表現型を経ることになる初期細胞由来ではなかった。特定の理論に限定されないが、１０−２２ｉＰＳ様系統が、原腫瘍のＰＤＡＣ細胞に由来し、奇形腫での再分化の際に疾患の進行を経ることを示す証拠がある。これは、後期のがんを示す他のヒトＰＤＡＣ系統とは異なる（Ｌｉｅｂｅｒら、１９７５；Ｙｕｎｉｓら、１９７７）。
【０１７４】
ＮＡＮＯＧ等の多能性遺伝子は、膵臓がん幹細胞（ＣＳＣ）の球形培養で発現し、そのような細胞が再プログラムを受けやすいことを示唆する（Ｌｏｎａｒｄｏら、２０１１）。しかしながら、ＣＤ１３３＋ＣＸＣＲ４＋膵臓ＣＳＣは、豊富にならず、多能性遺伝子の発現は、１０−２２細胞を導出するために使用された接着培養条件では観察されない（Ｈｅｒｍａｎｎら、２００７）。また、ＯＣＴ４およびＮＡＮＯＧ多能性遺伝子は、１０−２２細胞系およびｈｕＥＳ  Ｈ１対照とは対照的に、親腫瘍＃１０上皮培養で高度にメチル化され、ＮＡＮＯＧ自体は、原発性腫瘍では発現されなかったが、ＯＣＴ４は、散在的に発現された（図８Ｂ、Ｃ）。特定の理論に限定されないが、１０−２２細胞が膵臓ＣＳＣに由来した可能性は低いと考えられる。加えて、膵臓ＣＳＣ（Ｈｅｒｍａｎｎら、２００７；Ｉｓｈｉｚａｗａら、２０１０；Ｌｉら、２００７）は、原発性腫瘍を表す浸潤性腫瘍を急速に生成するが、１０−２２細胞は、ゆっくりと増殖するＰａｎＩＮを生成する（図３、１０）。最後に、膵臓ＣＳＣで生成された腫瘍は、３か月の奇形腫でのＰａｎＩＮ様腺管の均質なＫ１９陽性染色とは対照的に、その結果生じた腫瘍のサイトケラチン陰性細胞および陽性細胞を両方とも生じさせる（図３、８Ａ）。したがって、１０−２２細胞は、膵臓がん幹細胞の特性を示さないと考えられる。
【０１７５】
ＰａｎＩＮ様奇形腫から放出または分泌されたタンパク質は、ＰＤＡＣ進行を抑制するＴＧＦβおよびインテグリンのシグナル伝達の相互関連ネットワークを含む、少なくとも３つの主要なネットワークに入る（Ｈｅｚｅｌら、２０１２）。ＨＮＦ４αネットワークの活性化が後期ＰａｎＩＮから侵襲性段階に特有であることを、初めて発見した。ＨＮＦ４αは、正常膵管細胞では発現されないかまたはわずかに発現されるに過ぎず、ＰａｎＩＮ１段階での発現は不良であるが、ＰａｎＩＮ２段階およびＰａｎＩＮ３段階、侵襲期、および初期の十分に分化したヒト膵臓がんでは活性化される。その後、ＨＮＦ４αレベルは、進行性または未分化のＰＤＡＣでは著しく減少する。これらの発現状態は、ＰＤＡＣ進行のマウスモデルでも生じることが判明した。ＨＮＦ４α発現のダイナミックスは、肝細胞の発がん性形質転換に影響を及ぼす（Ｈａｔｚｉａｐｏｓｔｏｌｏｕら、２０１１）。ＨＮＦ４αおよびその標的遺伝子の発現が、膵臓がん進行の原因であるかまたは結果であるかは依然として分かっていない。しかしながら、膵臓がんが、典型的には進行段階または転移段階で発見されることを考慮すると、特に後期ＰａｎＩＮ段階における、ＨＮＦ４αの活性化およびこの因子の標的遺伝子に由来するタンパク質の放出または分泌は、有用な診断法を提供するはずである。
【０１７６】
【表９】
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マトリゲルに包埋された少なくとも2つの10-22奇形腫外植片に由来する分泌タンパク質のうち、HNF4αにより直接的または間接的に調節されるタンパク質。
【０１７７】
１０−２２系統に由来するＰａｎＩＮ様細胞から再現性よく放出または分泌された１０７個のタンパク質うち、合計６８個のタンパク質が、ヒトＰａｎＩＮおよびＰＤＡＣで発現した遺伝子、タンパク質、およびネットワークと重複し（表１０、１１、１２、および１３）、細胞の由来がさらに確証される。加えて、そのようなタンパク質は、細胞から放出され、安定しており、したがって初期ＰＤＡＣのバイオマーカーとしての役目を果たす。分泌されたタンパク質のサブセットは、外植片の局所的に活性化された間質細胞に由来する可能性がある。特定の理論に限定されないが、ＰａｎＩＮおよび侵襲性ＰＤＡＣ細胞内のＨＮＦ４α、ＴＧＦβ、およびインテグリンネットワークの産物である放出タンパク質の検出を合わせることにより、ヒトにおける膵臓がんの進行を非侵襲的に検出するための手段が提供される。
【０１７８】
【表１０】
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【０１７９】
【表１１−１】
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【表１１−２】
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【０１８０】
【表１２−１】
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【表１２−２】
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【０１８１】
【表１３−１】
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【表１３−２】
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【表１３−３】
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【表１３−４】
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【０１８２】
【表１４】
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【実施例２】
【０１８３】
ＥＬＩＳＡによる、膵臓がんを有する対象のバイオマーカーの検出。
この実施例では、開示された膵臓がんのバイオマーカーの検証を、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用して、膵臓がんを有する対象の血漿試料で実施した。
【０１８４】
開示されたバイオマーカーの検証は、種々の段階の膵臓がんを有する１０人の患者の血漿試料を分析すること、および膵臓がんを有していなかった１０人の対照対象の血漿試料を分析することにより実施した。膵臓がんの１０人の対象のうち、７人は、切除可能な局所的進行がんを有し、５人は、それほど進行していない切除可能な膵臓がんを有していた（表１５）。
【０１８５】
実施例１に記載の特定されたバイオマーカーのうちの３３個および１つの対照を、ＥＬＩＳＡにより対象の血漿で分析した（表１５）。ヒト血漿試料を、抗凝血剤としてのＥＤＴＡまたはヘパリンで処理することにより、患者または対照から採取した血液から調製した。混合物を、血液収集の３０分以内に１０００×ｇで１５分間２〜８℃にて遠心分離した。物質を等分して凍結し、凍結解凍サイクルの繰り返しを回避した。ＥＬＩＳＡアッセイは、ＥＬＩＳＡキットの製造業者の説明書に従って実施した。手短に述べると、１００μｌの標準物質または１０μｌの試料を、マイクロタイタープレートのウエル毎に添加し、９０ｕｌの希釈剤を試料ウエルに添加した。付属の粘着性ストリップでウエルをカバーし、３７℃で２時間インキュベートした。各ウエルに存在する液体を取り除き、１００μｌの製造業者のビオチン抗体（１×）を各ウエルに添加し、新しい粘着性ストリップでカバーし、その後１時間３７℃でインキュベーションした。各ウエルを吸引し、２００μｌの製造業者の洗浄緩衝で洗浄し、合計３回の洗浄を繰り返した。最後の洗浄後、吸引またはデカントすることにより、あらゆる残留洗浄緩衝液を除去し、マイクロタイタープレートを逆さまにしてブロットし、各ウエルの一切の残存液体をさらに取り除いた。１００μｌのＨＲＰ−アビジン（１×）を各ウエルに添加し、マイクロタイタープレートを、新しい粘着性ストリップでカバーし、３７℃で１時間インキュベートした。吸引／洗浄プロセスを、上記の洗浄ステップで実施したように５回繰り返し、その後、９０μｌの製造業者のＴＭＢ基質を各ウエルに添加し、３７℃で１５〜３０分間インキュベーションした。３７℃でインキュベーションした後、５０μｌの製造業者の停止溶液を、各ウエルに添加し、プレートを穏やかにタッピングして、十分な混合を保証した。各ウエルの光学密度を、４５０ｎｍに設定したマイクロプレートリーダを使用して、５分以内に決定した。Ｓｏｆｔ  Ｍａｘ  Ｐｒｏを使用して、４パラメータのロジスティック非線形回帰モデルにより各ウエルのシグナルを分析し、標準曲線にフィッティングし、各血漿試料中の抗原濃度の決定を可能にした。
【０１８６】
試料間および患者（症例）血漿および対照個人の血漿間の抗原濃度を比較するために、ロジスティック回帰分析を実施して、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線下の面積（つまりｃ−統計値）を推定した。ＲＯＣ曲線は、真陽性率（感度）対偽陽性率（１−特異性）を、データセットの目的バイオマーカーについて観察された値の範囲にわたってプロットすることにより推定した。０．５のｃ−統計値は、症例／対照ステータスを５０％の正確性で正しく予測するマーカーと一致する。０．７を超えるｃ−統計値は、バイオマーカーが、膵臓がんの診断として信頼できることを示す。
【０１８７】
【表１５】
0006652916.tif 000027
【０１８８】
試験した３３個のバイオマーカーは、ＡＦＰ、ＲＴＴＮ、ＮＬＲＸ１、ＤＮＡＨ１２、ＯＤＺ３、ＡＤＡＭＳＴ９、ＴＰＭ１、ＤＮＡＨ１、ＰＭＦＢＰ１、ＤＮＡＨ１７、ＥＰＨＢ１、ＤＯＳ、ＭＭＰ２、ＳＴＡＲＤ８、ＡＴＰ２Ａ１、ＦＫＢＰ１０、ＴＣＨＰ、ＴＣＦ２０、ＡＢＣＡ１３、ＳＣＮ８Ａ、ＴＯＰ２Ｂ、ＬＩＭＣＨ１、ＵＦＤ１Ｌ、ＦＬＲＴ３、ＺＨＸ２、ＳＹＮＥ１、ＴＨＢＳ２、ＨＭＯＸ１、Ｏｂｓｃｕｒｉｎ、ＤＮＡＨ５、Ｓｈｒｏｏｍ３、ＬＯＸＬ３、Ｍａｌｅｃｔｉｎだった（表１５および図１３〜４６）。がん抗原１９−９（Ｃａ１９９）は、膵臓がんの信頼できる腫瘍マーカーであり、陽性対照として使用され、１．０のｃ−統計値をもたらした（表１５および図３３）。試験した３３個のバイオマーカーのうち、ＲＴＴＮ、ＤＮＡＨ１２、ＴＰＭ１、ＤＮＡＨ１、ＳＴＡＲＤ８、ＡＰ２Ａ１、ＴＯＰ２Ｂ、ＬＩＭＣＨ１、ＳＹＮＥ１、ＴＨＢＳ２、およびＬＯＸＬ３は、０．７を超えるｃ−統計値を示したため、対象に膵臓がんが存在することを示すための信頼できるバイオマーカーであることが特定された（表１５および図１３〜４６）。例えば、ＴＯＰ２Ｂは、ＴＧＦβ／インテグリン経路のメンバーであり、膵臓がん全てで０．８６０のｃ−統計値を示した。これは、ＴＯＰ２Ｂが、初期および進行期膵臓がんの信頼できるバイオマーカーであることを示す（表１５および図２３）。同様の結果が、ＤＮＡＨ１、ＳＴＡＲＤ８、ＡＴＰ２Ａ１、ＬＩＭＣＨ１、およびＴＨＢＳ２で観察された（表１５、図１５、１６、２５、２６、および４１）。ＲＴＴＮ、ＴＰＭ１、ＬＯＸＬ３、およびＳＹＮＥ１は、切除可能ながんを有する対象の血漿試料で０．７を超えるｃ−統計値を示した。これは、ＲＴＴＮ、ＴＰＭ１、ＬＯＸＬ３、およびＳＹＮＥ１が、初期の切除可能な膵臓がんの信頼できるバイオマーカーであることを示す（表１５、図２０、２９、３５、および４０）。ＤＮＡＨ１２は、ＨＮＦａ経路のメンバーであり、膵臓がん患者全て、つまり局所的に進行した切除可能な膵臓がんを有する患者の血漿試料で１．０のｃ−統計値を示した。これは、ＤＮＡＨ１２が、膵臓がんの信頼できるバイオマーカーであり得ることを示す（表１５および図３７）。
【実施例３】
【０１８９】
質量分析による、膵臓がんを有する対象でのバイオマーカーの検出。
この実施例では、質量分析を使用して、開示された膵臓がんのバイオマーカーの検出を、膵臓がんを有する対象の血漿試料で実施した。
【０１９０】
２つの対照血漿（Ｍ１、Ｍ２）および２つの転移性ＰＤＡＣ症例血漿（Ｍ３、Ｍ４）を選択し、盲検を可能にするためにコード化した。各血漿試料を、血清アルブミン除去ゲルにかけ（「プル−ダウン」）、上清を収集した。各血漿試料の上清を、プロテインＡビーズおよびプロテインＧビーズの混合物にかけてＩｇＧを除去し、６Ｍ尿素、１０ｍＭ  ＤＴＴ、および５０ｍＭ  ＩＡＡで調整して、遊離スルフヒドリル基をブロッキングした。その後、上清を、１：５０のトリプシンで処理し、Ｃ１８カートリッジ脱塩ステップにかけた。各上清試料から３０μｇを等分し、各々をＬＣ−ＭＳ／ＭＳにかけた。ｐＦｉｎｄを使用して、データを分析し、ペプチドＩＤを特定した。逆方向ペプチドデコイを、順方向ペプチドと比較し、５％ＦＤＲフィルターを適用し、ペプチドヒットを提供したリストを作成した。各血漿試料は、約２２，０００個のペプチドヒット（ＭＳ−１：２１２９４個のペプチドヒット；ＭＳ−２：２３６２１個のペプチドヒット；ＭＳ−３：２２３４２個のペプチドヒット；およびＭＳ−４：２１９９１個のペプチドヒット）をもたらし、試料間の比較を可能にした。表１６に示されているように、６４個のバイオマーカー候補の幾つかのペプチドヒットが、ＰＤＡＣ試料で観察された。
【０１９１】
試料から特定された最も豊富なタンパク質は、３０１個のペプチドヒットを示したアルファ−２−マクログロブリン、２７００個のペプチドヒットを示したＡ２Ｍ、１４９５個のペプチドヒットを示したセルロプラスミン、および１３９８個のペプチドヒットを示したアルブミンだった。これらの結果は、上記に示されているように、幾つかのタンパク質が、最も多くのペプチドヒットを示し、スペクトラムを圧倒して、試料中の少量タンパク質を遮蔽することに結び付いたことを示す。これは、血漿試料に由来する血漿タンパク質の枯渇が不十分だったことによる場合がある。
【０１９２】
６４個の候補タンパク質のうち、下記のものが、２つの試験したＰＤＡＣ試料（ＭＳ３およびＭＳ４）で検出された：ＤＮＡＨ１、ＶＣＡＭ１、およびＭＹＬＫ（表１６）。６４個の候補タンパク質のうち、下記のものが、ＰＤＡＣ症例試料（ＭＳ３またはＭＳ４）の１つで検出された：ＡＣＴＮ２、ＡＴＰ２Ａ１、ＤＮＡＨ５、ＴＣＦ２０、ＳＹＮＥ２、ＳＹＮＥ１、ＫＩＡＡ１１０９、ＡＢＣＡ１３、ＺＮＦ８０４Ａ、ＳＣＹＬ２、およびＫＩＡＡ１６７１（表１６）。実施例２および表１５に記載されているように、ＥＬＩＳＡにより、＞０．７のｃ−統計値を有すると特定された４つの候補のうち、ＤＮＡＨ１、ＡＴＰ２Ａ１、ＳＹＮＥ１が、ＰＤＡＣ血漿試料（ＭＳ３またはＭＳ４）の少なくとも１つで検出された（表１６）。これらのデータは、特定されたタンパク質が膵臓がんのバイオマーカーとしての役目を果たすことができることを示す独立した実験結果を提供する。
【０１９３】
【表１６】
0006652916.tif 000028
【０１９４】
参考文献
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Ｂｌｅｌｌｏｃｈ，  Ｒ．Ｈ．，  Ｈｏｃｈｅｄｌｉｎｇｅｒ，  Ｋ．，  Ｙａｍａｄａ，  Ｙ．，  Ｂｒｅｎｎａｎ，  Ｃ．，  Ｋｉｍ，  Ｍ．，  Ｍｉｎｔｚ，  Ｂ．，  Ｃｈｉｎ，  Ｌ．，  ａｎｄ  Ｊａｅｎｉｓｃｈ，  Ｒ．  （２００４）．  Ｎｕｃｌｅａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｅｍｂｒｙｏｎａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌｓ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０１，  １３９８５−１３９９０．
Ｂｏｃｋ，  Ｃ．，  Ｋｉｓｋｉｎｉｓ，  Ｅ．，  Ｖｅｒｓｔａｐｐｅｎ，  Ｇ．，  Ｇｕ，  Ｈ．，  Ｂｏｕｌｔｉｎｇ，  Ｇ．，  Ｓｍｉｔｈ，  Ｚ．Ｄ．，  Ｚｉｌｌｅｒ，  Ｍ．，  Ｃｒｏｆｔ，  Ｇ．Ｆ．，  Ａｍｏｒｏｓｏ，  Ｍ．Ｗ．，  Ｏａｋｌｅｙ，  Ｄ．Ｈ．，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１１）．  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｍａｐｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ＥＳ  ａｎｄ  ｉＰＳ  ｃｅｌｌ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ｅｎａｂｌｅ  ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ．  Ｃｅｌｌ  １４４，  ４３９−４５２．
Ｂｒａｍｂｒｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）  Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ２，  １５１．
Ｂｒａｔ，  Ｄ．Ｊ．，  Ｌｉｌｌｅｍｏｅ，  Ｋ．Ｄ．，  Ｙｅｏ，  Ｃ．Ｊ．，  Ｗａｒｆｉｅｌｄ，  Ｐ．Ｂ．，  ａｎｄ  Ｈｒｕｂａｎ，  Ｒ．Ｈ．  （１９９８）．  Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｉｎｔｒａｄｕｃｔａｌ  ｎｅｏｐｌａｓｉａｓ  ｔｏ  ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐａｎｃｒｅａｓ．  Ａｍ  Ｊ  Ｓｕｒｇ  Ｐａｔｈｏｌ  ２２，  １６３−１６９．
Ｂｕｃｈｈｏｌｚ，  Ｍ．，  Ｂｒａｕｎ，  Ｍ．，  Ｈｅｉｄｅｎｂｌｕｔ，  Ａ．，  Ｋｅｓｔｌｅｒ，  Ｈ．Ａ．，  Ｋｌｏｐｐｅｌ，  Ｇ．，  Ｓｃｈｍｉｅｇｅｌ，  Ｗ．，  Ｈａｈｎ，  Ｓ．Ａ．，  Ｌｕｔｔｇｅｓ，  Ｊ．，  ａｎｄ  Ｇｒｅｓｓ，  Ｔ．Ｍ．  （２００５）．  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｄｉｓｓｅｃｔｅｄ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｉｎｔｒａｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  ｌｅｓｉｏｎｓ．  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２４，  ６６２６−６６３６．
Ｃａｒｅｔｔｅ，  Ｊ．Ｅ．，  Ｐｒｕｓｚａｋ，  Ｊ．，  Ｖａｒａｄａｒａｊａｎ，  Ｍ．，  Ｂｌｏｍｅｎ，  Ｖ．Ａ．，  Ｇｏｋｈａｌｅ，  Ｓ．，  Ｃａｍａｒｇｏ，  Ｆ．Ｄ．，  Ｗｅｒｎｉｇ，  Ｍ．，  Ｊａｅｎｉｓｃｈ，  Ｒ．，  ａｎｄ  Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ，  Ｔ．Ｒ．  （２０１０）．  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉＰＳＣｓ  ｆｒｏｍ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｃｅｌｌｓ．  Ｂｌｏｏｄ  １１５，  ４０３９−４０４２．
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Ｈｅｚｅｌ，  Ａ．Ｆ．，  Ｄｅｓｈｐａｎｄｅ，  Ｖ．，  Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ，  Ｓ．Ｍ．，  Ｃｏｎｔｉｎｏ，  Ｇ．，  Ａｌａｇｅｓａｎ，  Ｂ．，  Ｏ´Ｄｅｌｌ，  Ｍ．Ｒ．，  Ｒｉｖｅｒａ，  Ｌ．Ｂ．，  Ｈａｒｐｅｒ，  Ｊ．，  Ｌｏｎｎｉｎｇ，  Ｓ．，  Ｂｒｅｋｋｅｎ，  Ｒ．Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１２）．  ＴＧＦ−ｂｅｔａ  ａｎｄ  ａｌｐｈａｖｂｅｔａ６  Ｉｎｔｅｇｒｉｎ  Ａｃｔ  ｉｎ  ａ  Ｃｏｍｍｏｎ  Ｐａｔｈｗａｙ  ｔｏ  Ｓｕｐｐｒｅｓｓ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ７２，  ４８４０−４８４５．
Ｈｅｚｅｌ，  Ａ．Ｆ．，  Ｋｉｍｍｅｌｍａｎ，  Ａ．Ｃ．，  Ｓｔａｎｇｅｒ，  Ｂ．Ｚ．，  Ｂａｒｄｅｅｓｙ，  Ｎ．，  ａｎｄ  Ｄｅｐｉｎｈｏ，  Ｒ．Ａ．  （２００６）．  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｄｕｃｔａｌ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ．  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  ２０，  １２１８−１２４９．
Ｈｉｎｇｏｒａｎｉ，  Ｓ．Ｒ．，  Ｐｅｔｒｉｃｏｉｎ，  Ｅ．Ｆ．，  Ｍａｉｔｒａ，  Ａ．，  Ｒａｊａｐａｋｓｅ，  Ｖ．，  Ｋｉｎｇ，  Ｃ．，  Ｊａｃｏｂｅｔｚ，  Ｍ．Ａ．，  Ｒｏｓｓ，  Ｓ．，  Ｃｏｎｒａｄｓ，  Ｔ．Ｐ．，  Ｖｅｅｎｓｔｒａ，  Ｔ．Ｄ．，  Ｈｉｔｔ，  Ｂ．Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．  （２００３）．  Ｐｒｅｉｎｖａｓｉｖｅ  ａｎｄ  ｉｎｖａｓｉｖｅ  ｄｕｃｔａｌ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｅａｒｌｙ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ４，  ４３７−４５０．
Ｈｏｃｈｅｄｌｉｎｇｅｒ，  Ｋ．，  Ｂｌｅｌｌｏｃｈ，  Ｒ．，  Ｂｒｅｎｎａｎ，  Ｃ．，  Ｙａｍａｄａ，  Ｙ．，  Ｋｉｍ，  Ｍ．，  Ｃｈｉｎ，  Ｌ．，  ａｎｄ  Ｊａｅｎｉｓｃｈ，  Ｒ．  （２００４）．  Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｇｅｎｏｍｅ  ｂｙ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １８，  １８７５−１８８５．
Ｈｒｕｂａｎ，  Ｒ．Ｈ．，  Ａｄｓａｙ，  Ｎ．Ｖ．，  Ａｌｂｏｒｅｓ−Ｓａａｖｅｄｒａ，  Ｊ．，  Ｃｏｍｐｔｏｎ，  Ｃ．，  Ｇａｒｒｅｔｔ，  Ｅ．Ｓ．，  Ｇｏｏｄｍａｎ，  Ｓ．Ｎ．，  Ｋｅｒｎ，  Ｓ．Ｅ．，  Ｋｌｉｍｓｔｒａ，  Ｄ．Ｓ．，  Ｋｌｏｐｐｅｌ，  Ｇ．，  Ｌｏｎｇｎｅｃｋｅｒ，  Ｄ．Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）．  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｉｎｔｒａｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｎｅｏｐｌａｓｉａ：  ａ  ｎｅｗ  ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｄｕｃｔ  ｌｅｓｉｏｎｓ．  Ａｍ  Ｊ  Ｓｕｒｇ  Ｐａｔｈｏｌ  ２５，  ５７９−５８６．
Ｉａｃｏｂｕｚｉｏ−Ｄｏｎａｈｕｅ，  Ｃ．Ａ．，  Ｍａｉｔｒａ，  Ａ．，  Ｏｌｓｅｎ，  Ｍ．，  Ｌｏｗｅ，  Ａ．Ｗ．，  ｖａｎ  Ｈｅｅｋ，  Ｎ．Ｔ．，  Ｒｏｓｔｙ，  Ｃ．，  Ｗａｌｔｅｒ，  Ｋ．，  Ｓａｔｏ，  Ｎ．，  Ｐａｒｋｅｒ，  Ａ．，  Ａｓｈｆａｑ，  Ｒ．，  ｅｔ  ａｌ．  （２００３）．  Ｅｘｐｌｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｌｏｂａｌ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐａｔｔｅｒｎｓ  ｉｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｕｓｉｎｇ  ｃＤＮＡ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ．  Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  １６２，  １１５１−１１６２．
Ｉｓｈｉｚａｗａ，  Ｋ．，  Ｒａｓｈｅｅｄ，  Ｚ．Ａ．，  Ｋａｒｉｓｃｈ，  Ｒ．，  Ｗａｎｇ，  Ｑ．，  Ｋｏｗａｌｓｋｉ，  Ｊ．，  Ｓｕｓｋｙ，  Ｅ．，  Ｐｅｒｅｉｒａ，  Ｋ．，  Ｋａｒａｍｂｏｕｌａｓ，  Ｃ．，  Ｍｏｇｈａｌ，  Ｎ．，  Ｒａｊｅｓｈｋｕｍａｒ，  Ｎ．Ｖ．，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１０）．  Ｔｕｍｏｒ−ｉｎｉｔｉａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ  ａｒｅ  ｒａｒｅ  ｉｎ  ｍａｎｙ  ｈｕｍａｎ  ｔｕｍｏｒｓ．  Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ７，  ２７９−２８２．
Ｊｏｎｅｓ，  Ｓ．，  Ｚｈａｎｇ，  Ｘ．，  Ｐａｒｓｏｎｓ，  Ｄ．Ｗ．，  Ｌｉｎ，  Ｊ．Ｃ．，  Ｌｅａｒｙ，  Ｒ．Ｊ．，  Ａｎｇｅｎｅｎｄｔ，  Ｐ．，  Ｍａｎｋｏｏ，  Ｐ．，  Ｃａｒｔｅｒ，  Ｈ．，  Ｋａｍｉｙａｍａ，  Ｈ．，  Ｊｉｍｅｎｏ，  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）．  Ｃｏｒｅ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒｓ  ｒｅｖｅａｌｅｄ  ｂｙ  ｇｌｏｂａｌ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ａｎａｌｙｓｅｓ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２１，  １８０１−１８０６．
Ｋａｎｄａ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１２）  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １４２，  ７３０．
Ｋｉｍ，  Ｇ．Ｅ．，  Ｂａｅ，  Ｈ．Ｉ．，  Ｐａｒｋ，  Ｈ．Ｕ．，  Ｋｕａｎ，  Ｓ．Ｆ．，  Ｃｒａｗｌｅｙ，  Ｓ．Ｃ．，  Ｈｏ，  Ｊ．Ｊ．，  ａｎｄ  Ｋｉｍ，  Ｙ．Ｓ．  （２００２）．    Ａｂｅｒｒａｎｔ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＭＵＣ５ＡＣ  ａｎｄ  ＭＵＣ６  ｇａｓｔｒｉｃ  ｍｕｃｉｎｓ  ａｎｄ  ｓｉａｌｙｌ  Ｔｎ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｉｎ  ｉｎｔｒａｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｎｅｏｐｌａｓｍｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐａｎｃｒｅａｓ．  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １２３，  １０５２−１０６０．
Ｋｉｍ，  Ｋ．，  Ｚｈａｏ，  Ｒ．，  Ｄｏｉ，  Ａ．，  Ｎｇ，  Ｋ．，  Ｕｎｔｅｒｎａｅｈｒｅｒ，  Ｊ．，  Ｃａｈａｎ，  Ｐ．，  Ｈｕｏ，  Ｈ．，  Ｌｏｈ，  Ｙ．Ｈ．，  Ａｒｙｅｅ，  Ｍ．Ｊ．，  Ｌｅｎｓｃｈ，  Ｍ．Ｗ．，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１１）．  Ｄｏｎｏｒ  ｃｅｌｌ  ｔｙｐｅ  ｃａｎ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｔｈｅ  ｅｐｉｇｅｎｏｍｅ  ａｎｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２９，  １１１７−１１１９．
Ｋｉｍ，  Ｍ．Ｐ．，  Ｅｖａｎｓ，  Ｄ．Ｂ．，  Ｗａｎｇ，  Ｈ．，  Ａｂｂｒｕｚｚｅｓｅ，  Ｊ．Ｌ．，  Ｆｌｅｍｉｎｇ，  Ｊ．Ｂ．，  ａｎｄ  Ｇａｌｌｉｃｋ，  Ｇ．Ｅ．  （２００９）．    Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ  ａｎｄ  ｈｅｔｅｒｏｔｏｐｉｃ  ｈｕｍａｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ  ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｉｃｅ．  Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ  ４，  １６７０−１６８０．
Ｋｏｐｐ，  Ｊ．Ｌ．，  ｖｏｎ  Ｆｉｇｕｒａ，  Ｇ．，  Ｍａｙｅｓ，  Ｅ．，  Ｌｉｕ，  Ｆ．Ｆ．，  Ｄｕｂｏｉｓ，  Ｃ．Ｌ．，  Ｍｏｒｒｉｓ，  Ｊ．Ｐ．ｔ．，  Ｐａｎ，  Ｆ．Ｃ．，
Ａｋｉｙａｍａ，  Ｈ．，  Ｗｒｉｇｈｔ，  Ｃ．Ｖ．，  Ｊｅｎｓｅｎ，  Ｋ．，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１２）．  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｏｘ９−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ａｃｉｎａｒｔｏ−Ｄｕｃｔａｌ  Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ａｓ  ｔｈｅ  Ｐｒｉｎｃｉｐａｌ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｆｏｒ  Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｄｕｃｔａｌ  Ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ２２，  ７３７−７５０．
Ｋｕｎａｔｈ，  Ｔ．，  Ｓａｂａ−Ｅｌ−Ｌｅｉｌ，  Ｍ．Ｋ．，  Ａｌｍｏｕｓａｉｌｌｅａｋｈ，  Ｍ．，  Ｗｒａｙ，  Ｊ．，  Ｍｅｌｏｃｈｅ，  Ｓ．，  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，  Ａ．    （２００７）．  ＦＧＦ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｒｋ１／２  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ｃａｓｃａｄｅ  ｔｒｉｇｇｅｒｓ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｓｅｌｆ−ｒｅｎｅｗａｌ  ｔｏ  ｌｉｎｅａｇｅ  ｃｏｍｍｉｔｍｅｎｔ．  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １３４，  ２８９５−２９０２．
Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ４，  ３５９．
Ｌｉ，  Ｃ．，  Ｈｅｉｄｔ，  Ｄ．Ｇ．，  Ｄａｌｅｒｂａ，  Ｐ．，  Ｂｕｒａｎｔ，  Ｃ．Ｆ．，  Ｚｈａｎｇ，  Ｌ．，  Ａｄｓａｙ，  Ｖ．，  Ｗｉｃｈａ，  Ｍ．，  Ｃｌａｒｋｅ，  Ｍ．Ｆ．，  ａｎｄ  Ｓｉｍｅｏｎｅ，  Ｄ．Ｍ．  （２００７）．  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６７，  １０３０−１０３７．
Ｌｉ，  Ｌ．，  Ｃｏｎｎｅｌｌｙ，  Ｍ．Ｃ．，  Ｗｅｔｍｏｒｅ，  Ｃ．，  Ｃｕｒｒａｎ，  Ｔ．，  ａｎｄ  Ｍｏｒｇａｎ，  Ｊ．Ｉ．  （２００３）．  Ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏｓ  ｃｌｏｎｅｄ  ｆｒｏｍ  ｂｒａｉｎ  ｔｕｍｏｒｓ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６３，  ２７３３−２７３６．
Ｌｉｅｂｅｒ，  Ｍ．，  Ｍａｚｚｅｔｔａ，  Ｊ．，  Ｎｅｌｓｏｎ−Ｒｅｅｓ，  Ｗ．，  Ｋａｐｌａｎ，  Ｍ．，  ａｎｄ  Ｔｏｄａｒｏ，  Ｇ．  （１９７５）．  Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｔｕｍｏｒ−ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  （ｐａｎｃ−１）  ｆｒｏｍ  ａ  ｈｕｍａｎ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｘｏｃｒｉｎｅ  ｐａｎｃｒｅａｓ．  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １５，  ７４１−７４７．
Ｌｏｇｓｄｏｎ，  Ｃ．Ｄ．，  Ｓｉｍｅｏｎｅ，  Ｄ．Ｍ．，  Ｂｉｎｋｌｅｙ，  Ｃ．，  Ａｒｕｍｕｇａｍ，  Ｔ．，  Ｇｒｅｅｎｓｏｎ，  Ｊ．Ｋ．，  Ｇｉｏｒｄａｎｏ，  Ｔ．Ｊ．，  Ｍｉｓｅｋ，  Ｄ．Ｅ．，  Ｋｕｉｃｋ，  Ｒ．，  ａｎｄ  Ｈａｎａｓｈ，  Ｓ．  （２００３）．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｏｆ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ  ａｎｄ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｔｉｓ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｇｅｎｅｓ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｉｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６３，  ２６４９−２６５７．
Ｌｏｎａｒｄｏ，  Ｅ．，  Ｈｅｒｍａｎｎ，  Ｐ．Ｃ．，  Ｍｕｅｌｌｅｒ，  Ｍ．Ｔ．，  Ｈｕｂｅｒ，  Ｓ．，  Ｂａｌｉｃ，  Ａ．，  Ｍｉｒａｎｄａ−Ｌｏｒｅｎｚｏ，  Ｉ．，  Ｚａｇｏｒａｃ，  Ｓ．，  Ａｌｃａｌａ，  Ｓ．，  Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ａｒａｂａｏｌａｚａ，  Ｉ．，  Ｒａｍｉｒｅｚ，  Ｊ．Ｃ．，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１１）．  Ｎｏｄａｌ／Ａｃｔｉｖｉｎ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｄｒｉｖｅｓ  ｓｅｌｆ−ｒｅｎｅｗａｌ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｖｉｄｅｓ  ａ  ｔａｒｇｅｔ  ｆｏｒ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｄｒｕｇ  ｔｈｅｒａｐｙ．  Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ９，  ４３３−４４６．
Ｌｏｎａｒｄｏ  Ｅ，  Ｈ．Ｐ．，  Ｍｕｅｌｌｅｒ  ＭＴ，  Ｈｕｂｅｒ  Ｓ，  Ｂａｌｉｃ  Ａ，  Ｍｉｒａｎｄａ−Ｌｏｒｅｎｚｏ  Ｉ，  Ｚａｇｏｒａｃ  Ｓ，  Ａｌｃａｌａ  Ｓ，  Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ａｒａｂａｏｌａｚａ  Ｉ，  Ｒａｍｉｒｅｚ  ＪＣ，  Ｔｏｒｒｅｓ−Ｒｕｉｚ  Ｒ，  Ｇａｒｃｉａ  Ｅ，  Ｈｉｄａｌｇｏ  Ｍ，  Ｃｅｂｒｉａｎ  ＤＡ，  Ｈｅｕｃｈｅｌ  Ｒ，  Ｌｏｈｒ  Ｍ，  Ｂｅｒｇｅｒ  Ｆ，  Ｂａｒｔｅｎｓｔｅｉｎ  Ｐ，  Ａｉｃｈｅｒ  Ａ，  Ｈｅｅｓｃｈｅｎ  Ｃ．  （２０１１）．  Ｎｏｄａｌ／Ａｃｔｉｖｉｎ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｄｒｉｖｅｓ  ｓｅｌｆ−ｒｅｎｅｗａｌ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｖｉｄｅｓ  ａ  ｔａｒｇｅｔ  ｆｏｒ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｄｒｕｇ  ｔｈｅｒａｐｙ．  Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ９，  ４３３−４４６．
Ｍａｉｔｒａ，  Ａ．，  ａｎｄ  Ｈｒｕｂａｎ，  Ｒ．Ｈ．  （２００８）．  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ．  Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｐａｔｈｏｌ  ３，  １５７−１８８．
Ｍａｓｅｒ，  Ｒ．Ｓ．，  Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙ，  Ｂ．，  Ｃａｍｐｂｅｌｌ，  Ｐ．Ｊ．，  Ｆｅｎｇ，  Ｂ．，  Ｗｏｎｇ，  Ｋ．Ｋ．，  Ｐｒｏｔｏｐｏｐｏｖ，  Ａ．，  Ｏ´Ｎｅｉｌ，  Ｊ．，  Ｇｕｔｉｅｒｒｅｚ，  Ａ．，  Ｉｖａｎｏｖａ，  Ｅ．，  Ｐｅｒｎａ，  Ｉ．，  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）．  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌｌｙ  ｕｎｓｔａｂｌｅ  ｍｏｕｓｅ  ｔｕｍｏｕｒｓ  ｈａｖｅ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ  ｓｉｍｉｌａｒ  ｔｏ  ｄｉｖｅｒｓｅ  ｈｕｍａｎ  ｃａｎｃｅｒｓ．  Ｎａｔｕｒｅ  ４４７，  ９６６−９７１．
ＭｃＫｉｎｎｅｌｌ，  Ｒ．Ｇ．，  Ｄｅｇｇｉｎｓ，  Ｂ．Ａ．，  ａｎｄ  Ｌａｂａｔ，  Ｄ．Ｄ．  （１９６９）．  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｎｕｃｌｅｉ  ｆｒｏｍ  ｔｒｉｐｌｏｉｄ  ｆｒｏｇ  ｔｕｍｏｒｓ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １６５，  ３９４−３９６．
Ｍｉｙａｔｓｕｋａ，  Ｔ．，  Ｋａｎｅｔｏ，  Ｈ．，  Ｓｈｉｒａｉｗａ，  Ｔ．，  Ｍａｔｓｕｏｋａ，  Ｔ．Ａ．，  Ｙａｍａｍｏｔｏ，  Ｋ．，  Ｋａｔｏ，  Ｋ．，  Ｎａｋａｍｕｒａ，  Ｙ．，  Ａｋｉｒａ，  Ｓ．，  Ｔａｋｅｄａ，  Ｋ．，  Ｋａｊｉｍｏｔｏ，  Ｙ．，  ｅｔ  ａｌ．  （２００６）．  Ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＰＤＸ−１  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐａｎｃｒｅａｓ  ｃａｕｓｅｓ  ａｃｉｎａｒ−ｔｏ−ｄｕｃｔａｌ  ｍｅｔａｐｌａｓｉａ  ｔｈｒｏｕｇｈ  Ｓｔａｔ３  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  ２０，  １４３５−１４４０．
Ｍｉｙｏｓｈｉ，  Ｎ．，  Ｉｓｈｉｉ，  Ｈ．，  Ｎａｇａｉ，  Ｋ．，  Ｈｏｓｈｉｎｏ，  Ｈ．，  Ｍｉｍｏｒｉ，  Ｋ．，  Ｔａｎａｋａ，  Ｆ．，  Ｎａｇａｎｏ，  Ｈ．，  Ｓｅｋｉｍｏｔｏ，  Ｍ．，  Ｄｏｋｉ，  Ｙ．，  ａｎｄ  Ｍｏｒｉ，  Ｍ．  （２０１０）．  Ｄｅｆｉｎｅｄ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｉｎｄｕｃｅ  ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ｏｆ  ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０７，  ４０−４５．
Ｍｏｒｒｉｓ，  Ｊ．Ｐ．ｔ．，  Ｗａｎｇ，  Ｓ．Ｃ．，  ａｎｄ  Ｈｅｂｒｏｋ，  Ｍ．  （２０１０）．  ＫＲＡＳ，  Ｈｅｄｇｅｈｏｇ，  Ｗｎｔ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｔｗｉｓｔｅｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｄｕｃｔａｌ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ．  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  １０，  ６８３−６９５．
Ｍｏｓｋａｌｕｋ，  Ｃ．Ａ．，  Ｈｒｕｂａｎ，  Ｒ．Ｈ．，  ａｎｄ  Ｋｅｒｎ，  Ｓ．Ｅ．  （１９９７）．  ｐ１６  ａｎｄ  Ｋ−ｒａｓ  ｇｅｎｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｉｎｔｒａｄｕｃｔａｌ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５７，  ２１４０−２１４３．
Ｏｄｏｍ，  Ｄ．Ｔ．，  Ｚｉｚｌｓｐｅｒｇｅｒ，  Ｎ．，  Ｇｏｒｄｏｎ，  Ｄ．Ｂ．，  Ｂｅｌｌ，  Ｇ．Ｗ．，  Ｒｉｎａｌｄｉ，  Ｎ．Ｊ．，  Ｍｕｒｒａｙ，  Ｈ．Ｌ．，  Ｖｏｌｋｅｒｔ，  Ｔ．Ｌ．，  Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，  Ｊ．，  Ｒｏｌｆｅ，  Ｐ．Ａ．，  Ｇｉｆｆｏｒｄ，  Ｄ．Ｋ．，  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）．  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｐａｎｃｒｅａｓ  ａｎｄ  ｌｉｖｅｒ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｂｙ  ＨＮＦ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒｓ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０３，  １３７８−１３８１．  
Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）  Ｃｅｌｌ  １３４，  ８７７．
Ｒｈｉｍ，  Ａ．Ｄ．，  Ｍｉｒｅｋ，  Ｅ．Ｔ．，  Ａｉｅｌｌｏ，  Ｎ．Ｍ．，  Ｍａｉｔｒａ，  Ａ．，  Ｂａｉｌｅｙ，  Ｊ．Ｍ．，  ＭｃＡｌｌｉｓｔｅｒ，  Ｆ．，  Ｒｅｉｃｈｅｒｔ，  Ｍ．，  Ｂｅａｔｔｙ，  Ｇ．Ｌ．，  Ｒｕｓｔｇｉ，  Ａ．Ｋ．，  Ｖｏｎｄｅｒｈｅｉｄｅ，  Ｒ．Ｈ．，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１２）．  ＥＭＴ  ａｎｄ  ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｉｏｎ  ｐｒｅｃｅｄｅ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｔｕｍｏｒ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．  Ｃｅｌｌ  １４８，  ３４９−３６１．
Ｒｕｂｉｏ−Ｖｉｑｕｅｉｒａ，  Ｂ．，  Ｊｉｍｅｎｏ，  Ａ．，  Ｃｕｓａｔｉｓ，  Ｇ．，  Ｚｈａｎｇ，  Ｘ．，  Ｉａｃｏｂｕｚｉｏ−Ｄｏｎａｈｕｅ，  Ｃ．，  Ｋａｒｉｋａｒｉ，  Ｃ．，  Ｓｈｉ，  Ｃ．，  Ｄａｎｅｎｂｅｒｇ，  Ｋ．，  Ｄａｎｅｎｂｅｒｇ，  Ｐ．Ｖ．，  Ｋｕｒａｍｏｃｈｉ，  Ｈ．，  ｅｔ  ａｌ．  （２００６）．  Ａｎ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｆｏｒ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｄｒｕｇ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｉｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １２，  ４６５２−４６６１．
Ｒｕｓｔｇｉ，  Ａ．Ｋ．  （２００６）．  Ｔｈｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ：  ｃｌａｒｉｆｙｉｎｇ  ａ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｃｉｒｃｕｉｔｒｙ．  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  ２０，  ３０４９−３０５３．
Ｓｅｒｒａｎｏ，  Ｍ．，  Ｌｉｎ，  Ａ．Ｗ．，  ＭｃＣｕｒｒａｃｈ，  Ｍ．Ｅ．，  Ｂｅａｃｈ，  Ｄ．，  ａｎｄ  Ｌｏｗｅ，  Ｓ．Ｗ．  （１９９７）．  Ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ  ｒａｓ  ｐｒｏｖｏｋｅｓ  ｐｒｅｍａｔｕｒｅ  ｃｅｌｌ  ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐ５３  ａｎｄ  ｐ１６ＩＮＫ４ａ．  Ｃｅｌｌ  ８８，  ５９３−６０２．
Ｓｈｕｌｔｚ，  Ｌ．Ｄ．，  Ｌｙｏｎｓ，  Ｂ．Ｌ．，  Ｂｕｒｚｅｎｓｋｉ，  Ｌ．Ｍ．，  Ｇｏｔｔ，  Ｂ．，  Ｃｈｅｎ，  Ｘ．，  Ｃｈａｌｅｆｆ，  Ｓ．，  Ｋｏｔｂ，  Ｍ．，  Ｇｉｌｌｉｅｓ，  Ｓ．Ｄ．，  Ｋｉｎｇ，  Ｍ．，  Ｍａｎｇａｄａ，  Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．  （２００５）．  Ｈｕｍａｎ  ｌｙｍｐｈｏｉｄ  ａｎｄ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｃｅｌｌ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｉｎ  ＮＯＤ／ＬｔＳｚ−ｓｃｉｄ  ＩＬ２Ｒ  ｇａｍｍａ  ｎｕｌｌ  ｍｉｃｅ  ｅｎｇｒａｆｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｍｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７４，  ６４７７−６４８９．
Ｓｔｒａｄｅｒ  （２００６）  Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ  ７８，  １２５．
Ｔａｇｕｃｈｉ，  Ａ．，  Ｐｏｌｉｔｉ，  Ｋ．，  Ｐｉｔｔｅｒｉ，  Ｓ．Ｊ．，  Ｌｏｃｋｗｏｏｄ，  Ｗ．Ｗ．，  Ｆａｃａ，  Ｖ．Ｍ．，  Ｋｅｌｌｙ−Ｓｐｒａｔｔ，  Ｋ．，  Ｗｏｎｇ，  Ｃ．Ｈ．，  Ｚｈａｎｇ，  Ｑ．，  Ｃｈｉｎ，  Ａ．，  Ｐａｒｋ，  Ｋ．Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１１）．  Ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ  ｉｎ  ｐｌａｓｍａ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｐｒｏｔｅｏｍｅ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｏｆ  ｍｏｕｓｅ  ｔｕｍｏｒ  ｍｏｄｅｌｓ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ２０，  ２８９−２９９．
Ｔａｋａｈａｓｈｉ，  Ｋ．，  ａｎｄ  Ｙａｍａｎａｋａ，  Ｓ．  （２００６）．  Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｄ  ａｄｕｌｔ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｂｙ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｆａｃｔｏｒｓ．  Ｃｅｌｌ  １２６，  ６６３−６７６．
Ｔｈｏｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２，  １１４５．
Ｔｏｓｔ  ａｎｄ  Ｇｕｔ  （２００７）  Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ２，  ２２６５．
Ｕｈｌｅｎ，  Ｍ．，  Ｏｋｓｖｏｌｄ，  Ｐ．，  Ｆａｇｅｒｂｅｒｇ，  Ｌ．，  Ｌｕｎｄｂｅｒｇ，  Ｅ．，  Ｊｏｎａｓｓｏｎ，  Ｋ．，  Ｆｏｒｓｂｅｒｇ，  Ｍ．，  Ｚｗａｈｌｅｎ，  Ｍ．，  Ｋａｍｐｆ，  Ｃ．，  Ｗｅｓｔｅｒ，  Ｋ．，  Ｈｏｂｅｒ，  Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１０）．  Ｔｏｗａｒｄｓ  ａ  ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ−ｂａｓｅｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｔｌａｓ．  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２８，  １２４８−１２５０．
Ｕｒｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９７，  ７９６３．
Ｙｕｎｉｓ，  Ａ．Ａ．，  Ａｒｉｍｕｒａ，  Ｇ．Ｋ．，  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｉｎ，  Ｄ．Ｊ．  （１９７７）．  Ｈｕｍａｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  （ＭＩＡ  ＰａＣａ−２）  ｉｎ  ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｃｕｌｔｕｒｅ：  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｔｏ  ａｓｐａｒａｇｉｎａｓｅ．  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １９，  １２８−１３５．
【０１９５】
その内容全体が本明細書に参照により組み込まれる、様々な刊行物、特許および特許出願が本明細書中で引用されている。
【図１−１】
0006652916.tif 000029
【図１−２】
0006652916.tif 000030
【図１−３】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図７−４】
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【図７−５】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ−１】
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【図９Ｂ−２】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１２−３】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図２０−１】
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【図２０−２】
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【図２１−１】
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【図２１−２】
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【図２２−１】
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【図２２−２】
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【図２３−１】
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【図２３−２】
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【図２４−１】
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【図２４−２】
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【図２５−１】
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【図２５−２】
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【図２６−１】
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【図２６−２】
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【図２７−１】
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【図２７−２】
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【図２８−１】
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【図２８−２】
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【図２９−１】
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【図２９−２】
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【図３０−１】
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【図３０−２】
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【図３１−１】
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【図３１−２】
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【図３２−１】
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【図３２−２】
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【図３３−１】
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【図３３−２】
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【図３４−１】
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【図３４−２】
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【図３５−１】
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【図３５−２】
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【図３６−１】
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【図３６−２】
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【図３７−１】
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【図３７−２】
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【図３８−１】
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【図３８−２】
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【図３９−１】
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【図３９−２】
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【図４０−１】
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【図４０−２】
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【図４１−１】
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【図４１−２】
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【図４２−１】
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【図４２−２】
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【図４３−１】
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【図４３−２】
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【図４４−１】
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【図４４−２】
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【図４５−１】
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【図４５−２】
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【図４６−１】
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【図４６−２】
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