(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（４）
0006780163.tif 000011
［式中、Ｘ、Ｙはそれぞれ独立に水素原子、塩素原子、水酸基を表す。Ｚは、水素原子、フッ素原子を表す。］で表される化合物を有効成分とする、ｅＩＦ２αのリン酸化促進剤。
【請求項２】
ＸとＹが、塩素原子であることを特徴とする、請求項１に記載のｅＩＦ２αのリン酸化促進剤。
【請求項３】
Ｚが、フッ素原子であることを特徴とする、請求項１又は２に記載のｅＩＦ２αのリン酸化促進剤。
【請求項４】
ｅＩＦ２αのリン酸化がＰＥＲＫ経路やＧＣＮ２経路ではないことを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載のｅＩＦ２αのリン酸化促進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、ｅＩＦ２αリン酸化の新規な促進剤に関する。本発明のｅＩＦ２αリン酸化促進剤は統合的ストレス応答（ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｓｔｒｅｓｓ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）や小胞体ストレス応答を制御する機能を有する。更には、その制御機能に基づき、本発明のｅＩＦ２αリン酸化促進剤を有効成分とする、代謝、脳神経、癌、免疫疾患に対する予防又は治療剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】  生体は、常に外界からの多種多様なストレスに曝されており、通常それらに対して内分泌系や神経系などの制御機構により恒常性を維持している。しかし、過剰なストレスは、時にメンタルヘルスの不調だけでなく、身体的なストレス反応を引き起こし、脳血管障害、心疾患、消化器疾患、更には免疫力の低下を引き起こすことが知られている。そのようなストレス状態では、体を構成する細胞でウイルス感染、栄養欠乏（アミノ酸、糖、血清）、酸素欠乏、熱ショック、酸化ストレスなどが生じていることが知られている。
このような内的及び外的ストレスに曝された場合、細胞がどのような反応を行うかについては、近年多くの知見が発表されている。例えば、タンパクの異常構造に対応する小胞体ストレス応答と、ウイルス感染、栄養欠乏や酸化ストレス等の広範囲な内的及び外的ストレスに対応して、ｅｌＦ２αの翻訳抑制に関与する統合的ストレス応答などが知れている。図１０に示すように、統合的ストレス応答と小胞体ストレス応答はＰＥＲＫ経路を共通に持つストレス応答反応である。そして、この小胞体ストレス応答と統合的ストレス応答により、細胞は、その環境変化に応じてその機能を制御して環境に適応できることが分かって来た。
まず、小胞体ストレス応答について言えば、その活性化機序には大きく分けて３つのルートがあり、それぞれ小胞体ストレス伝達タンパク質（Ｉｒｅｌ、ＡＴＦ６、ＰＥＲＫ）によって、小胞体内の情報をサイトゾルや核に伝える（図１参照）。例えば、小胞体ストレスを感知して活性化したＰＥＲＫは、ｅＩＦ２α（ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ２α  ｓｕｂｕｎｉｔ）をリン酸化する。その結果、リン酸化されたｅＩＦ２αは、グローバルな翻訳抑制を引き起こし、タンパク質の合成を抑制して小胞体への負荷を軽減する。
一方で、リン酸化されたｅＩＦ２αは、転写因子ＡＴＦ４（ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ４）の発現を誘導して、ストレス適応に必要なアミノ酸代謝やレドックス代謝を活性化し、修復が望めない場合にはアポトーシス関連分子であるＣＨＯＰ（Ｃ／ＥＢＰ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ）の発現を誘導して細胞死を起こす。【０００３】  統合的ストレス応答では、図１０に示されるように上記ＰＥＲＫ以外に、ＰＫＲ（ｄｏｕｂｌｅ−Ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＲＮＡ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ）、ＨＲＩ（ｈｅｍｅ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、ＧＣＮ２（ｇｅｎｅｒａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｎｏｎ−ｄｅｒｅｐｒｅｓｓｉｂｌｅ  ２）の３つのストレス伝達タンパク質（ｅｌＦ２αのリン酸化酵素）が機能する。小胞体ストレス応答の場合と同様に、内的及び外的ストレスを感知してｅｌＦ２αをリン酸化修飾し、タンパク質合成を停止させる。そして、小胞体ストレス応答の時と同様に、リン酸化されたｅＩＦ２αは、転写因子ＡＴＦ４（ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ４）の発現を誘導して、ストレス適応に必要なアミノ酸代謝やレドックス代謝を活性化し、修復が望めない場合にはアポトーシス関連分子であるＣＨＯＰ（Ｃ／ＥＢＰ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ）の発現を誘導して細胞死を起こす。その結果として、各種のストレス刺激に対して応答することを行っている。【０００４】  小胞体ストレス応答及び統合的ストレス応答が様々な疾患（代謝、脳神経、癌、免疫疾患など）の発症に関わることが明らかにされつつある（非特許文献１〜１０）。最近では、小胞体ストレス応答及び統合的ストレス応答を標的にした創薬についても注目されている（特許文献１と２）。例えば、２型糖尿病のモデルマウスにケミカルシャペロンと呼ばれる低分子化合物を投与することでインスリン抵抗性などの病態が改善したことが認められている（非特許文献３）。また、低分子化合物のサルブリナル（Ｓａｌｕｂｒｉｎａｌ）は、ｅＩＦ２αの脱リン酸化を抑制し（ｅＩＦ２αのリン酸化を促進させ）、小胞体ストレスを軽減させている。その結果、小胞体ストレスに由来する神経細胞死を回避できている（非特許文献４）。
このように、小胞体ストレス応答や統合的ストレス応答を標的とした創薬研究が発展してきているが、様々な疾患（代謝、脳神経、癌、免疫疾患など）に対する予防又は治療に使用可能である活性の高い化合物を創出するために、どのような母核構造が必要であるのかは、ほとんど分かっていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】再表２０１２−１０８３９４号公報
【特許文献２】公表２０１４−５１２００８号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ．Ｄｉｓｃｏｖ．７（１２）：１０１３−３０（２００８）
【非特許文献２】Ｏｚｃａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０６，４５７−４６１（２００４）
【非特許文献３】Ｏｚｃａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１３，１１７３−１１４０（２００６）
【非特許文献４】Ｒｅｉｊｏｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ  ３１４，９５０−９６０（２００８）
【非特許文献５】Ｏｙａｄｏｍａｒｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔａｂ  ７，５２０−５３２（２００８）．
【非特許文献６】Ｂａｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ，Ａｄｖ  Ｎｕｔｒ  ３，３０７−３２１（２０１２）．
【非特許文献７】Ｃｏｓｔａ−Ｍａｔｔｉｏｌｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ４３６，１１６６−１１７３（２００５）．
【非特許文献８】Ｓｉｄｒａｕｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｌｉｆｅ  ２，ｅ００４９８（２０１３）．
【非特許文献９】Ｄｅｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １２５，２５９２−２６０８（２０１５）．
【非特許文献１０】Ｍｕｎｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２２，６３３−６４２（２００５）．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】  本発明は、小胞体ストレスと統合的ストレスに由来する疾患の治療剤を開発するために、その有効成分としてｅＩＦ２αのリン酸化を活性化する新規な化合物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】  本発明者は、統合的ストレス応答と小胞体ストレス応答により生体がどのように制御されているかを明らかにするために、臓器特異的（肝臓、脂肪細胞、骨格筋）に統合的ストレス応答と小胞体ストレス応答に共通するＰＥＲＫ経路を活性化することが可能な遺伝子改変マウスを作製した。その結果、肝臓ではＰＥＲＫ経路におけるｅＩＦ２αのリン酸化は、糖の新生のために必須であることを示し、ｅＩＦ２αのリン酸化が抑制される（ｅＩＦ２αの脱リン酸化が加速される）と、糖の新生低下が起きて高血糖になり難く、高脂肪食でも脂肪肝になり難いことを明らかにした（非特許文献５）。また、骨格筋では、ＰＥＲＫ経路におけるｅＩＦ２αのリン酸化は、ホルモンであるＦＧＦ２１の分泌を亢進して、褐色脂肪細胞でのエネルギー消費を亢進することを明らかにした。このように、ｅＩＦ２αのリン酸化活性化はメタボリック・シンドロームのような生活習慣病を抑制する働きがある。【０００９】  上記の肝臓や筋肉でのＰＥＲＫ経路の活性化に示されるように、ＰＥＫＲ経路の下流のｅＩＦ２αのリン酸化がスイッチとなり、代謝異常をはじめとする様々な疾患に関係している。統合的ストレス応答でも、図１０に示されるように、ｅＩＦ２αのリン酸化が様々な疾患のスイッチとなっている（非特許文献５〜１０）。そこで本発明者は、小胞体ストレスのスクリーニング評価系を使用し、新たなｅＩＦ２αリン酸化促進剤を探索することを行った。優れた効果を有する化合物（ｅＩＦ２αリン酸化促進剤）を得ることができれば、小胞体ストレス由来又は統合的ストレス由来の疾患に応用して、治療剤として使用することが可能になる。
そこで、本発明者は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニング系で、小胞体ストレス（ＰＥＲＫ−ｅＩＦ２αのリン酸化シグナルを活性させる）を惹起させるために、図２に示される２量化領域とＰＥＲＫキナーゼ領域の融合タンパク（Ｆｖ２Ｅ−ＰＥＲＫ）を細胞株に導入した。この遺伝子導入細胞株を使用し、更に化学式（１）の化合物ＡＰ２０１８７を使用して、小胞体ストレスを効率的に惹起できるｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニング評価系が作製できる。上記遺伝子導入細胞株は、元々存在するＰＥＲＫ以外に、Ｆｖ２Ｅ−ＰＥＲＫが遺伝子導入しており、Ｆｖ２Ｅの活性化薬剤（ＡＰ２０１８７）を投与によって、自在にＰＥＲＫ経路を活性化によりｅＩＦ２αをリン酸化できる。このｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニング評価系を用いることで、スクリーニングで得られた候補化合物が、ｅＩＦ２αリン酸化促進あるいは抑制する働きを持つかを、的確に評価できる。【００１０】
【化１】
0006780163.tif 000002
【００１１】  ｅＩＦ２αリン酸化が惹起されたか否かは、ｅＩＦ２αのリン酸化の下流で誘導されるＡＴＦ４の転写活性を測定できる３ｘＡＡＲＥルシフェラーゼ・レポーターで行った。そのために、細胞株にハイグロマイシン耐性遺伝子を含むｐＧＬ４−３ｘＡＡＲＥ  ルシフェラーゼ  レポーター  ベクターを導入した。
更に本発明者は、本発明のスクリーニング系の信頼性を高めるために、使用する細胞株を別の臓器由来の細胞株に交換してスクリーニングを行った。例えば、図４に示すように、一次スクリーニングではヒト胎児腎臓細胞由来のＨＥＫ２９３細胞株を使用して行った。次の二次スクリーニングでは、細胞株をマウス筋芽細胞由来のＣ２Ｃ１２細胞株に交換して行った。三次スクリーニングでは、所望のタンパク質（例えばＦＧＦ２１）の分泌促進に係るｅＩＦ２αリン酸化促進剤であるのか否かを確認するため、使用細胞株を該当タンパク質のプロモーターの上流部分を組込んだルシフェラーゼ  レポーター  ベクターで組換えられたＣ２Ｃ１２細胞株に置き換えてスクリーニングを行った。あるいは、所望のタンパク質（例えばＦＧＦ２１）が発現しているか否かを確認するため、ウエスタン・ブロット法を用いてスクリーニングを行った。
このようなスクリーニング手法により、選択されるｅＩＦ２αリン酸化促進剤の妥当性を向上させることを行った。本発明のスクリーニング手法では、標的とする疾患を選択すれば、それを評価できる適切なタンパク質をターゲットとして使用すればよい。例えばターゲットとしてＦＧＦ２１を選択する場合には、メタボリック・シンドロームに寄与するｅＩＦ２αリン酸化促進剤の選択を行うことができる。【００１２】  本発明者は、本発明の図４に示されるスクリーニング系に、以下の化学式（２）のサルブリナル（Ｓａｌｕｂｒｉｎａｌ）を投与すると、ｅＩＦ２αの脱リン酸化が抑制できることを見出した。そこで、サルブリナル（２）等の化合物をポジテイブ・コントロールとして使用し、ｅＩＦ２αのリン酸化を向上させる低分子化合物のスクリーニングを行うことを検討した。このスクリーニングで有望な化合物が見出された場合には、新たなＦＧＦ２１を介した抗肥満薬あるいはメタボリック・シンドロームの治療薬が作製できると考える。【００１３】
【化２】
0006780163.tif 000003
【００１４】  そこで、本発明者は、図４に示すようなスクリーニング系を用いて、４千を超える低分子化合物のサンプルのスクリーニングを行ったところ、以下の化学式（３）の１−［（２−アミノ−６−フルオローベンジル）アミノ］−３−（３，４−ジクロルフェノキシ）プロパン−２−オール（ＲＤＲ０３０２７）を見出すことができた。【００１５】
【化３】
0006780163.tif 000004
【００１６】  本発明の化合物（３）は、種々の検討の結果、ＦＧＦ２１と同様にアミノ酸代謝に関連するｅＩＦ２αの下流の標的遺伝子を制御していることが分かった。また、本件発明化合物（３）の作用機序は、ＰＥＲＫやＧＣＮ２の活性化ではなく、他のキナーゼの活性化あるいはホスファターゼの阻害などにより、ｅＩＦ２αリン酸化を促進すると考えられた。以上のことから、本発明化合物（３）は、新規の機序によりｅＩＦ２αリン酸化を促進し、メタボリック・シンドロームの予防又は治療剤として使用できることになる。
本発明者は、更に検討を進めてβブロッカーであるブプラノロール誘導体にもｅＩＦ２αリン酸化の促進効果のあることを見出し、本発明を完成した。【００１７】  即ち、本発明の要旨は以下の通りである。
（１）一般式（４）【００１８】
【化４】
0006780163.tif 000005
【００１９】［式中、Ｘ、Ｙはそれぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、水酸基、炭素数１〜４のアルキルオキシ基、炭素数１〜４のアルキルカルボニルオキシ基、炭素数７〜１１のアロイル基を表し、あるいはＸ、Ｙが一緒になって、１，２−ジオキシエチレン基、１，１−ジオキシメチレン基を表す。Ｚは、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、アミノ基、ニトロ基、炭素数１〜４のアルキルオキシ基、炭素数１〜４のアルキルカルボニルオキシ基、炭素数７〜１１のアロイル基を表す。］で表される化合物、又はブプラノロール誘導体を有効成分とする、ｅＩＦ２αのリン酸化促進剤。
（２）ＸとＹが、それぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、水酸基であることを特徴とする、上記（１）に記載のｅＩＦ２αのリン酸化促進剤。
（３）ＸとＹが、ハロゲン原子であることを特徴とする、上記（１）又は（２）に記載のｅＩＦ２αのリン酸化促進剤。
（４）ハロゲン原子が、塩素原子であることを特徴とする、上記（３）に記載のｅＩＦ２αのリン酸化促進剤。
（５）Ｚが、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、アミノ基、ニトロ基であることを特徴とする、上記（１）〜（４）のいずれかに記載のｅＩＦ２αのリン酸化促進剤。
（６）Ｚがハロゲン原子であることを特徴とする、上記（１）〜（５）のいずれかに記載のｅＩＦ２αのリン酸化促進剤。
（７）ハロゲン原子が、フッ素原子であることを特徴とする、上記（６）に記載のｅＩＦ２αのリン酸化促進剤。
（８）ｅＩＦ２αのリン酸化がＰＥＲＫ経路やＧＣＮ２経路ではないことを特徴とする、上記（１）〜（７）のいずれかに記載のｅＩＦ２αのリン酸化促進剤。
（９）上記（１）〜（８）のｅＩＦ２αのリン酸化促進剤を有効成分とする、
褐色脂肪細胞の機能促進剤。
（１０）上記（１）〜（８）のｅＩＦ２αのリン酸化促進剤を有効成分とする、代謝、脳神経、癌、免疫疾患の予防又は治療剤。【００２０】（１１）上記ブプラノロール誘導体が、塩酸カルベジロール又は塩酸ベバントロールである、上記（１）に記載のｅＩＦ２αのリン酸化促進剤。
（１２）上記（１１）のｅＩＦ２αのリン酸化促進剤を有効成分とする、
褐色脂肪細胞の機能促進剤。
（１３）上記（１０）のｅＩＦ２αのリン酸化促進剤を有効成分とする、代謝、脳神経、癌、免疫疾患の予防又は治療剤。
（１４）以下の工程を有する、小胞体ストレスのＰＥＲＫ経路を制御するｅＩＦ２αリン酸化促進剤のスクリーニング方法であって、
ａ）一次スクリーニングとして、Ｆｖ２Ｅ−ＰＥＲＫとルシフェラーゼの遺伝子を含むレポーター・ベクター改変された細胞株を使用し、薬剤と反応させる、
ｂ）二次スクリーニングとして、ａ）でヒットした化合物に対して、異なる細胞株を用いてＦｖ２Ｅ−ＰＥＲＫとルシフェラーゼの遺伝子を含むレポーター・ベクターで改変された細胞株を使用してスクリーニングを行う、
ｃ）三次スクリーニングとして、ｂ）でヒットした化合物に対して、
１）評価したいタンパク質のプロモーター上流部分を組込んだルシフェラーゼのレポーター・ベクターで改変された細胞株を使用してスクリーニングを行う、あるいは、
２）評価したいタンパク質の発現の評価をウエスタン・ブロットで行う
ことを特徴とする、小胞体ストレスのｅＩＦ２αリン酸化促進剤のスクリーニング方法。
（１５）上記（１４）のａ）の細胞株が、ＨＥＫ２９３細胞株であり、ｂ）の細胞株がＣ２Ｃ１２細胞株である、上記（１４）に記載の小胞体ストレスのｅＩＦ２αリン酸化促進剤のスクリーニング方法。
（１６）上記（１４）のｃ）の細胞株がＣ２Ｃ１２細胞株である、上記（１４）又は（１５）に記載の小胞体ストレスのｅＩＦ２αリン酸化促進剤のスクリーニング方法。
（１７）上記（１４）のａ）とｂ）のルシフェラーゼのレポーター・ベクターが、ｐＧＬ４−３ｘＡＡＲＥ  ｌｕｃ２Ｐ−Ｈｙｇｒｏ  ベクターである、上記（１４）又は（１５）に記載の小胞体ストレスのｅＩＦ２αリン酸化促進剤のスクリーニング方法。
（１８）上記（１４）のｃ）のルシフェラーゼ  レポーター・ベクターが、ｐＧＬ３−ｍＦｇｆ２１プロモーター  ベクターである、上記（１４）又は（１５）に記載の小胞体ストレスのｅＩＦ２αリン酸化促進剤のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【００２１】  本発明の化合物である一般式（４）の化合物又はブプラノロール誘導体（１−フェノキシ−３−アルキルアミノ−プロパン−２−オール誘導体）は、ＲＤＲ０３０２７（化学式（３）の化合物）と同様に、小胞体ストレス応答のＰＥＲＫ経路、ＧＣＮ２経路とは異なる経路でｅＩＦ２αのリン酸化を促進する。その結果、本発明の化合物は、特にＦＧＦ２１を介して褐色脂肪組織の機能を上昇させて抗肥満効果を発揮することが示された。
これにより、本発明の化合物は、例えば糖尿病等のメタボリック・シンドロームの予防及び／又は治療薬として使用できることが分かった。更に、小胞体ストレスや統合的ストレス応答が発症に関与することが示唆されているパーキンソン病等の神経変性疾患、癌、免疫疾患などの治療薬として使用できることを見出した。更には、本発明の化合物をポジテイブ・コントロールに使用して、より活性が高く、ｅＩＦ２αのリン酸化を促進できる薬剤のスクリーニングが可能となった。また、上記スクリーニングの結果、有効な母核の低分子化合物を選択でき、活性の最適化が行えるようになった。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】小胞体ストレスによる蛋白産生コントロールのメカニズムを表した図である。
【図２】Ｆｖ２Ｅ−ＰＥＲＫ遺伝子が導入された細胞株にＡＰ２０１８７を投与すると、２量化が促進してｅＩＦ２αのリン酸化が促進されることを模式的に表した図である。細胞株内では、２量化領域とＰＥＲＫキナーゼ領域の融合した蛋白が産生され、ＡＰ２０１８７の投与により２量化が促進される。
【図３】リン酸化されたｅＩＦ２αによって転写因子ＡＴＦ４が活性化され、抗肥満ホルモンであるＦＧＦ２１が誘導されることを表した図である。
【図４】本願発明のイン・ビトロの系（ＨＥＫ２９３細胞、Ｃ２Ｃ１２細胞を使用）で、ｅＩＦ２αのリン酸化を評価するスクリーニング系の概略を表した図である。第１次と第２次のスクリーニング評価は、ルシフェラーゼ・レポーター活性で評価する。第３次スクリーニングでは、ルシフェラーゼ・レポーター活性で評価、又はウェスタン・ブロットによるＰＥＲＫ経路が亢進しているか否かの確認をおこなった。
【図５】Ｂの図は、２次スクリーニングの結果を表したものである。Ｃ２Ｃ１２細胞が３ｘＡＡＲＥルシフェラーゼ・レポーターで形質転換され、ライブラリーの化合物で１２時間処理された。ポジテイブ・コントロールとして、タプシガルギン（Ｔｈａｐｓｉｇａｒｇｉｎ）が使用された。Ｃの図は、ＲＤＲ０３０２７で処理されたＣ２Ｃ１２細胞における３ｘＡＡＲＥとマウスＦＧＦ２１プロモーターのルシフェラーゼ・レポーター活性（ｍｅａｎ±ＳＥＭ、ｎ＝３、＊＊ｐ＜０．０１）の解析結果を表したものである。ポジテイブ・コントロールとしてヒスチジノール（Ｈｉｓｔｉｄｉｎｏｌ）を使用した。
【図６】Ｂの図は、Ｃ２Ｃ１２細胞を４０μＭのＲＤＲ０３０２７、又は０．２μＭのタプシガルギンで処理し、２時間後の核の分画におけるＡＴＦ４と赤色に染色された全蛋白の代表的なイムノブロットを表したものである。Ｃの図は、Ｃ２Ｃ１２細胞を４０μＭのＲＤＲ０３０２７、又は０．２μＭのタプシガルギンで処理し、指定された時間でのリン酸化されたｅＩＦ２αと全ｅＩＦ２α、リン酸化されたＰＥＲＫと全ＰＥＲＫの代表的なイムノブロットを表したものである。
【図７】Ｃ２Ｃ１２細胞を４０μＭのＲＤＲ０３０２７、又は０．２μＭのタプシガルギン及び／又は０．５μＭのＩＳＲＩＢで処理し、８時間後のｅＩＦ２αリン酸化によって起きたｍＲＮＡの発現状況をＲＴ−ｑＰＣＲ解析（ｍｅａｎ±ＳＥＭ、ｎ＝３、＊＊ｐ＜０．０１）した図である。
【図８】Ｃ２Ｃ１２細胞を４０μＭのＲＤＲ０３０２７及び／又は０．５μＭのＩＳＲＩＢで処理し、４時間後のＡＴＦ４、リン酸化したｅＩＦ２αと全ｅＩＦ２αの代表的なイムノブロットを表したものである。ポジテイブ・コントロールとして、タプシガルギンを使用した。
【図９】４０μＭのＲＤＲ０３０２７で処理し、８時間後に各細胞（ＷＴ、Ｐｅｒｋ＋／−、Ｇｃｎ＋／−、ｅＩＦ２αＡ／Ａ、Ａｔｆ４−／−ＭＥＦｓ）中のＦｇｆ２１ｍＲＮＡのＲＴ−ｑＰＣＲ解析（ｍｅａｎ±ＳＥＭ、ｎ＝３、＊＊ｐ＜０．０１）の結果を表した図である。
【図１０】小胞体ストレスにより活性化されるキナーゼ（ＰＥＲＫ／ＰＥＫ）、アミノ酸枯渇により活性化されるキナーゼ（ＧＣＮ２）、Ｆｅ３＋の欠乏により活性化されるキナーゼ（ＨＲＩ）による、細胞内の情報伝達の流れを表した図である。
【図１１】ＲＤＲ０３０２７の投与によって起きる遺伝子の発現をＲＴ−ｑＰＣＲで評価するために使用したプライマーを表した一覧表の図である。これにより、ＲＤＲ０３０２７の投与によって、ｅＩＦ２αのリン酸化を介する翻訳抑制とそれに続くＡＴＦ４やＣＨＯＰ等のストレス応答遺伝子の転写活性化の様子を確認することができる。
【発明を実施するための形態】
【００２３】  本発明の化合物である一般式（４）において、Ｘ、Ｙとは、それぞれ独立に水素原子、例えばフッ素、塩素、臭素、沃素から選択されるハロゲン原子、水酸基、例えばメトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロピルオキシ基、ｎ−ブチルオキシ基から選択される炭素数１〜４のアルキルオキシ基、例えばアセチルオキシ基、プロピオニルオキシ基、ブタノイルオキシ基、ペンタノイルオキシ基から選択される炭素数１〜４のアルキルカルボニルオキシ基、例えばベンゾイル基、ナフチル基等から選択される炭素数７〜１１のアロイル基を挙げることができる。あるいはＸ、Ｙが一緒になって、１，２−ジオキシエチレン基、１，１−ジオキシメチレン基を表す。Ｚは、水素原子、例えばフッ素、塩素、臭素、沃素から選択されるハロゲン原子、水酸基、アミノ基、ニトロ基、例えばメトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロピルオキシ基、ｎ−ブチルオキシ基から選択される炭素数１〜４のアルキルオキシ基、例えばアセチルオキシ基、プロピオニルオキシ基、ブタノイルオキシ基、ペンタノイルオキシ基から選択される炭素数１〜４のアルキルカルボニルオキシ基、例えばベンゾイル基、ナフチル基等から選択される炭素数７〜１１のアロイル基を挙げることができる。
本発明の「ブプラノロール誘導体」とは、アドレナリンβ受容体遮断薬（βブロッカー）の薬効を示す化合物であり、構造的特徴として、１−フェノキシ−３−アルキルアミノ−プロパン−２−オールの骨格を有するものである。例えば、塩酸アルプレノロール、塩酸インデノロール、塩酸オクスプレノロール、塩酸ブプラノロール、塩酸ブクモロール、塩酸ベフノロール、ピンドロール、塩酸カルテオロール、マレイン酸チモロール、ナドロール、塩酸アセブトロール、塩酸セリプロロール、酒石酸メトプロロール、アテノロール、塩酸ラベタロール、塩酸カルベジロール、塩酸ベバントロール等を挙げることができる。
本発明の「ＰＥＲＫ経路とＧＣＮ２経路とは異なる経路」とは、小胞体ストレスの応答経路の内でｅＩＦ２αのリン酸化を促進し、蛋白合成を抑制する経路の中で図１０に示される、ＰＥＲＫ経路とＧＣＮ２経路以外の経路のことを言う。例えばＨＲＩの経路が想定され、更には、Ｓａｌｉｂｒｉｎａｌと同じ経路又はｅＩＦ２αの脱リン酸化経路が考えられる。
【００２４】  本発明の「ｅＩＦ２αのリン酸化促進剤」とは、ｅＩＦ２αキナーゼの活性化又はｅＩＦ２αの脱リン酸化を促進することによって、ｅＩＦ２αのリン酸化を促進する化合物のことである。例えば図１０に示されるように、小胞体ストレスにより活性化されるキナーゼ（ＰＥＲＫ／ＰＥＫ）、アミノ酸枯渇により活性化されるキナーゼ（ＧＣＮ２）、Ｆｅ３＋の欠乏により活性化されるキナーゼ（ＨＲＩ）等は、二量体化と自己リン酸化によって、きわめて強力なｅＩＦ２αリン酸化能を獲得する。これらの活性化されたキナーゼにより、ｅＩＦ２αのリン酸化が行われる。更には、ｅＩＦ２αホスファターゼ（ＰＰ１：ｓｅｒｉｎｅ／ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ｔｙｐｅ  １）によって脱リン酸化が行われる。このように、ｅＩＦ２αキナーゼ又はホスファターゼの作用により、ｅＩＦ２αのリン酸化が促進される。
なお、このｅｌＦ２αのリン酸化は、翻訳開始に必須であるｅＩＦ２Ｂの働きを阻害して翻訳を抑制する。これにより、多くの遺伝子からの蛋白合成が停止することになる。一方、転写因子ＡＴＦ４は、ｕＯＲＦとその下流で遺伝子をコードしているＯＲＦの選択による制御で、他の遺伝子とは全く逆で翻訳誘導され、それにより、今度は、代謝、酸化ストレス、細胞死に関わる遺伝子が活性化される。
【００２５】  本発明の「メタボリック・シンドロームの予防又は治療剤」とは、小胞体ストレスに起因する代謝、脳神経、癌、免疫疾患の症状の進展予防と治療のために使用される医薬組成物のことを言う。即ち、例えば本発明の化合物（３）（ＲＤＲ０３０２７）と同等以上のｅＩＦ２αのリン酸化の促進活性を持つ化合物を有効成分として含有する医薬組成物のことを言う。これらの医薬組成物は、使用目的に応じて、経口製剤、非経口製剤（注射剤等）として用いることができ、それら製剤は、上記有効成分を通常の医薬製剤と同様に処方することにより製造できる。
そのような製剤の具体例としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤などの経口剤、静注、筋注などの注射剤、点滴静注剤等が挙げられ、それら製剤は通常用いられる医薬用担体を用いて調製される。
上記医薬用担体としては、医薬分野において常用され、かつ本発明の化合物と反応しない物質が用いられる。錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤の製造に用いられる医薬用担体の具体例としては、乳糖、トウモロコシデンプン、白糖、マンニトール、硫酸カルシウム、結晶セルロースのような賦形剤、カルメロースナトリウム、変性デンプン、カルメロースカルシウムのような崩壊剤、メチルセルロース、ゼラチン、アラビアゴム、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドンのような結合剤、軽質無水ケイ酸、ステアリン酸マグネシウム、タルク、硬化油のような滑沢剤が挙げられる。錠剤は、通常のコーティング剤を用い、周知の方法でコーティングしてもよい。
【００２６】  シロップ剤製造に用いられる担体の具体例としては、白糖、ブドウ糖、果糖のような甘味剤、アラビアゴム、トラガント、カルメロースナトリウム、メチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、結晶セルロース、ビーガムのような懸濁化剤、ソルビタン脂肪酸エステル、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリソルベート８０のような分散剤が挙げられる。
注射剤は、通常、上記の有効成分を注射用蒸留水に溶解して調製するが、必要に応じて溶解補助剤、緩衝剤、ｐＨ調整剤、等張化剤、無痛化剤、保存剤等を添加することができる。更に、該化合物を注射用蒸留水又は植物油に懸濁した懸濁性注射剤の形であってもよく、必要に応じて基剤、懸濁化剤、粘調剤等を添加することができる。
【実施例】
【００２７】  以下、実施例および試験例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれによってなんら限定されるものではない。【００２８】（実施例１）小胞体ストレスのＰＥＲＫ−ｅＩＦ２α経路の活性化によるＦＧＦ２１の分泌誘導を促進する化合物のスクリーニング方法
（１）試剤：
・プラスミドの作製：
Ｆｖ２Ｅ−ＰｅｒｋとＡＴＦ４は、ｐＣＤＦ１−ＭＣＳ２−ＥＦ１−Ｐｕｒｏ（システム  バイオサイエンス社）、ｐＥＢＭｕｌｔｉ−Ｈｙｇ（和光）及びｐｃＤＮＡ３．１（ライフ  テクノロジー社）のベクターに挿入してクローン化した。
ＡＴＦ４が結合するＤＮＡ配列として知られているａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ（ＡＡＲＥ）を含むＤＮＡを合成して、ｐＧＬ３ルシフェラーゼ  レポーター  ベクター（プロメガ社）に挿入してクローン化した。
マウスＦＧＦ２１の転写開始部位の上流領域（−１３２６から＋１００を以下の表１のプライマーを使用してＰＣＲで得た）は、ｐＧＬ３ルシフェラーゼ  レポーターベクター（プロメガ社）に挿入してクローン化した。【００２９】
【表１】
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【００３０】・ＨＥＫ２９３Ａ株の作製：
ＨＥＫ２９３Ａ細胞株に、ハイグロマイシン耐性遺伝子を含むｐＧＬ４−３ｘＡＡＲＥ  ルシフェラーゼ  レポーター  ベクターを導入し形質転換した。この細胞株の感度をタプシガルギン（ｔｈａｐｓｉｇａｒｂｉｎ）とヒスチジノール（ｈｉｓｔｉｄｉｎｏｌ）を用いて確認した。
・Ｃ２Ｃ１２細胞株の作製：
上記ＨＥＫ２９３Ａ細胞株の場合と同様に、Ｃ２Ｃ１２細胞株についても、ハイグロマイシン耐性遺伝子を含むｐＧＬ４−３ｘＡＡＲＥ  ルシフェラーゼ  レポーターベクターを導入し形質転換した細胞を作製した。また、別途、Ｃ２Ｃ１２細胞株にＦＧＦ２１プロモーター  ルシフェラーゼ  レポーターを導入し形質転換した細胞株を作製した。
・培地及び培養方法：
ＨＥＫ２９３Ａ細胞株は、１０％胎児ウシ血清を含むダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）に、約５×１０４  ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の密度になるように播種し、３７℃、０．５％ＣＯ２インキュベーター内で培養した。培養後の細胞をリン酸緩衝液で洗浄し、上記ＤＭＥＭを加えてピペッテイングして細胞を均一化する。ルシフェラーゼ  レポーター  アッセイ試験あるいは他の試験は、更に、上記ＤＭＥＭに分散させ３７℃、０．５％ＣＯ２インキュベーター内で培養したものを用いた。
Ｃ２Ｃ１２細胞株は、１０％胎児ウシ血清を含むダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）で培養した。その後、コラーゲンで被覆した培養皿を用いて、２％ウマ血清を含むＤＭＥＭ中で３日培養し、筋肉に分化誘導させた。ルシフェラーゼ  レポーター  アッセイ試験あるいは他の試験は、分化後１日目又は３日目に行った。【００３１】（２）評価方法：
図４に示されるように、ＦＧＦ２１の分泌促進を行う化合物のスクリーニングを行うため、以下のようなスクリーニング系を作製した。
ａ）一次スクリーニング：
３ｘＡＡＲＥ−ルシフェラーゼを安定的に発現するＨＥＫ２９３Ａ細胞株を９６穴のプレートに播種し、化合物サンプルとホタル・ルシフェリンを加えて１６時間処理した。ルシフェラーゼ活性をＥｎＶｉｓｉｏｎ（パーキンエルマー社）で測定し、ヒットした化合物を選択した。
ｂ）二次スクリーニング：
３ｘＡＡＲＥ−ルシフェラーゼを安定的に発現するＣ２Ｃ１２細胞株を使用し、上記ａ）と同様の処理を行い、ヒットした化合物を選択した。約４０００個の化合物サンプルから、ａ）とｂ）の処理を行い、１２０個の化合物を選択することができた。
ｃ）三次スクリーニング：
ＦＧＦ２１プロモーター  ルシフェラーゼを発現するＣ２Ｃ１２株を使用し、上記ａ）と同様に処理した。ルシフェラーゼ活性は、ＯＮＥ−Ｇｌｏ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社）を使用して測定した。
更には、ＰＥＲＫ経路が亢進しているか否かの確認をウェスタン・ブロット法とＲＴ−ｑＰＣＲ法に基づいて行った。【００３２】（３）評価結果：
４０００個の化合物を用いて、上記ａ）とｂ）のスクリーニングを行ったところ、ｅＩＦ２αのリン酸化を促進する１２０個の化合物が見出された。
更に、この１２０個のサンプルを用いて上記ｃ）の三次スクリーニングを行ったところ、図５に示される活性を持った１−［（２−ａｍｉｎｏ−６−ｆｌｕｏｒｏ−ｂｅｎｚｙｌ）ａｍｉｎｏ］−３−（３，４−ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｘｙ）ｐｒｏｐａｎ−２−ｏｌ（ＲＤＲ０３０２７）を得た。【００３３】（実施例２）本発明の化合物（３）ＲＤＲ０３０２７の作用機序評価
現在、ｅＩＦ２αのリン酸化を亢進させる化合物がいくつか知られている。例えば、以下の化学式（５）の３−（２，３−ｄｉｈｙｄｒｏｂｅｎｚｏ［ｂ］［１，４］ｄｉｏｘｉｎ−６−ｙｌ）−５，７−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−４Ｈ−ｃｈｒｏｍｅｎ−４−ｏｎｅ（ＤＨＢＤＣ）、以下の化学式（２）のｓａｌｕｂｒｉｎａｌ、以下の化学式（６）のｇｕａｎａｂｅｎｚがある。【００３４】
【化５】
0006780163.tif 000007
【００３５】
【化６】
0006780163.tif 000008
【００３６】
【化７】
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【００３７】  本発明の化合物（３）は、公知の化合物（化学式（２）、（５）〜（６））とは構造が大きく異なっている。構造的には、βブロッカーの塩酸ラベタロール、塩酸カルベジロール、塩酸ベバントロールに近い構造のものである。そこで、本発明の化合物（３）の作用機序の解明を行った。【００３８】（１）ＰＥＲＫ誘導能
ａ）試剤：
全細胞溶解液、細胞質顆粒、核抽出物をＰｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ（ナカライ  テスク社）とＰｈｏｓＳＴＯＰ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ（ロシュ  ダイアグノスチック社）を使用して処理した。
蛋白濃度はＢＣＡ法を使用して測定した。イムノブロット解析は、公知方法に従って行った（Ｃｅｌｌ  １２６：７２７−７３９（２００６年））。
蛋白は、抗ＰＥＲＫ抗体、抗ｅＩＦ２α抗体、抗ＡＴＦ４抗体（サンタ  クルス  バイオテクノロジー社）、抗ホスフォ−ｅＩＦ２α抗体を使用して、それぞれの確認を行った。
電気泳動のバンドは、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ＨＲＰ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ミリポア社）を使用して確認した。画像は、ＥＺ−Ｃａｐｔｕｒｅ  ＩＩ  Ｃｏｏｌｅｄ  ＣＣＤ  Ｃａｍｅｒａ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＡＴＴＯ社）を使用して記録された。
ｂ）方法：
ｅＩＦ２αのリン酸化シグナルに対する化合物（３）の効果を評価するため、ＡＴＦ４とｅＩＦ２αのリン酸化の誘導を、常法のイムノブロット解析で観察した。【００３９】ｃ）評価結果：
本発明の化合物（３）でＣ２Ｃ１２細胞株を処理すると、図６に示されるように、ＡＴＦ４とｅＩＦ２αのリン酸化が増加した。この結果は、化合物（３）がＰＥＲＫ経路のリン酸化を惹起しないことを表しており、小胞体ストレスの引き金になっていないことを示している。【００４０】（２）ｅＩＦ２α誘導能とＡＴＦ４の誘導能
本発明の化合物（３）が、ｅＩＦ２αのリン酸化を介する翻訳抑制とそれに続くＡＴＦ４やＣＨＯＰの活性化（ＩＳＲ：ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｓｔｒｅｓｓ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）を行うか否かを確認するため、そのＩＳＲの対象となる遺伝子の誘導をＲＴ−ｑＰＣＲで評価した。
ａ）試剤：
細胞と組織サンプルから得られた全ＲＮＡを、ｃＤＮＡ合成用の鋳型として使用した。ｇＤＮＡ  Ｒｅｍｏｖｅｒ（東洋紡）と共に、ＲｅｖｅｒＴｒａ  Ａｃｅ  ｑＰＣＲ  ＲＴ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘを使用した。ｑＰＣＲ解析には、Ｐｒｉｓｍ  ７９００ＨＴ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（ライフ  テクノロジー社）、Ｔｈｕｎｄｅｒｂｉｒｄ  ｑＰＣＲ  Ｍｉｘ（東洋紡）と併用するＳｔｅｐ  Ｏｎｅ  Ｐｌｕｓ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（ライフ  テクノロジー社）、あるいはＦａｓｔＳｔａｒｔ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｍａｓｔｅｒ（ロシュ  ダイアゴニスティク社）の装置が使用された。使用されるプライマーは図１１に示す。【００４１】ｂ）方法：
マイクロアレイ解析を実施する前に、Ｌｏｗ  Ｉｎｐｕｔ  Ｑｕｉｃｋ  ＡｍｐＬａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（アジレント  テクノロジー社）を用いてＲＮＡのラベル化を行い、ＲＮｅａｓｙ  ＭｉｎＥｌｕｒｅ  Ｃｌｅａｎｕｐ  Ｋｉｔ（クィアジェン社）を使用して精製した。
ラベル化されたＲＮＡをＳｕｒｅＰｒｉｎｔ  Ｇ３  Ｍｏｕｓｅ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ８×６０Ｋ  マイクロアレイ（アジレント  テクノロジー社）で処理し、そのシグナルをＧ２５６５マイクロアレイ  スキャナー（アジレント  テクノロジー社）を使用してデータの読み込みを行った。マイクロアレイのデータは、Ｆｅａｔｕｒｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  １０．７（アジレント  テクノロジー社）を使用して、取り込んだ画像から読み出した。
ｃ）評価結果：
化合物（３）で処理したＣ２Ｃ１２細胞株では、Ａｔｆ３、ＦＧＦ２１、Ｐｈｇｄｈ、Ｃｔｈ、Ｓｌｃ７ａ５、Ｓｌｃ７ａ１１が発現誘導されていることが分かった。【００４２】（実施例３）本発明の化合物（３）の作用機序の確認
以下の化学式（７）のＩＳＲＩＢ（ｔｒａｎｓ−Ｎ，Ｎ‘−（ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１，４−ｄｉｙｌ）ｂｉｓ（２−（４−ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｘｙ）ａｃｅｔａｍｉｄｅ））は、ＡＴＦ４やＣＨＯＰの活性化阻害剤である。ＩＳＲＩＢは、ｅＩＦ２αのリン酸化によって生じる翻訳機能の減少を阻害する。
そこで、実施例２で示される化合物（３）に由来するｍ−ＲＮＡの発現誘導が、ＩＳＲ（ｅＩＦ２αのリン酸化を介する翻訳抑制）に由来するものか否かを確認するため、下記ＩＳＲＩＢ（７）を使用し検討を行った。【００４３】
【化８】
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【００４４】ａ）試剤：
タブシガルギン（ｔｈａｐｓｉｇａｒｇｉｎ）：小胞体へのカルシウムイオンの取り込みを阻害すると共に、小胞体から細胞質へカルシウムイオンの漏出を引き起こして、小胞体ストレスを惹起し、アポトーシスを誘導する化合物である。
ｂ）方法：
化合物（３）がＡＴＦ４やＣＨＯＰの活性化（ＩＳＲ）を起こすか否かを評価するため、常法に基づき、図１１のプライマーを用いてＲＴ−ｑＰＣＲ法でＩＳＲ標的遺伝子の変動を評価した。
ｃ）評価結果：
図７と図８に示されるように、本発明の化合物（３）によるＩＳＲ標的遺伝子の遺伝子増幅と、Ｃ２Ｃ１２細胞株で惹起されたＡＴＦ４の誘導は、ＩＳＲＩＢ（７）によって部分的に抑制された。
しかし、ＩＳＲＩＢ（７）は、タプシガルギンで惹起されたＡＴＦ４誘導を完全に抑制できなかった。このことから、化合物（３）によるＦＧＦ２１のｍＲＮＡ誘導は、ｅＩＦ２αのリン酸化を経由して起こるものなのか、他の経路によって起こるものなのかが課題として残った。【００４５】（実施例４）本発明の化合物（３）によるＦＧＦ２１ｍＲＮＡの発現誘導の作用機序評価
化合物（３）によるＦＧＦ２１のｍＲＮＡ誘導が、ｅＩＦ２αのリン酸化に基づくものか否かを確認するため、総合ストレス反応（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｓｔｒｅｓｓ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ：ＩＳＲ）のないマウス胚性線維芽細胞（ＩＳＲ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  Ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ）を用いて評価した。
（１）試剤：
総合ストレス反応欠損のマウス胚性線維芽細胞（ＩＳＲ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ＭＥＦｓ）：
Ｐｅｒｋ−／−ＭＥＦ、Ｇｃｎ２−／−ＭＥＦ、Ａｔｆ４−／−ＭＥＦは、ニューヨーク大のＤ．Ｒｏｎ教授より供与された（Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２４，１３６５−１３７７、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ，１１，６１９−６３３、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ，６，１０９９−１１０８）。
ｅｌＦ２ａＡ／Ａ  ＭＥＦは、ミシガン大のＲ．Ｋｏｕｆｍａｎ教授より供与された（Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１８６（５），７５５−７６５）。【００４６】（２）方法：
上記細胞株を、上記の文献記載に準じて培養し、化合物（３）を添加して、ＦＧＦ２１ｍＲＮＡの発現誘導を評価した。評価は、常法に基づき、図１１に示すプライマーを使用して、ＲＴ−ｑＰＣＲ法でＦｇｆ２１を含むＩＳＲ標的遺伝子のｍＲＮＡの発現変動を評価した。
（３）評価結果：
図９に示されるように、ＲＴ−ｑＰＣＲの結果から、化合物（３）によるＦＧＦ２１ｍＲＮＡの発現誘導は、ｅＩＦ２αＡ／Ａ（リン酸化部位のホモ変異体）とＡＴＦ４−／−ＭＥＦ（ＡＴＦ４欠損のマウス胚性線維芽細胞）において消失していた。このことは、化合物（３）の作用がｅＩＦ２αのリン酸化に由来するものであることを示している。即ち、化合物（３）の投与によって、図１０に示されるようにｅＩＦ２αのリン酸化が起こり、タンパク質の翻訳抑制が起きる。それに伴い、ＡＴＦ４の翻訳誘導が起こり、ＡＴＦ４やＣＨＯＰ等のストレス応答遺伝子の転写活性化が惹起される。
上記結果と実施例１〜３の結果から、化合物（３）は、ＰＥＲＫとＧＣＮ２の経路ではなくＦＧＦ２１ｍＲＮＡを誘導することが分かった。このことから、化合物（３）は、もう一つのｅＩＦ２αキナーゼ又はｅＩＦ２α脱リン酸化酵素を制御していることが示された。
以上の結果は、化合物（３）が、ＦＧＦ２１ｍＲＮＡの発現を促進する作動薬であり、これまで報告されていない新規なストレス応答の作動薬であることを示している。
【産業上の利用可能性】
【００４７】  本発明の化合物（３）を含む一般式（４）の化合物、又はブプラノロール誘導体（１−フェノキシ−３−アルキルアミノ−プロパン−２−オール誘導体）は、ｅＩＦ２αのリン酸化促進剤として作用する。しかし、本発明の化合物は、これまでのＰＥＲＫとＧＣＮ２の経路ではなく、別の経路でｅＩＦ２αのリン酸化又は脱リン酸化を促進し、ＦＧＦ２１ｍＲＮＡを誘導している。従って、本発明の化合物は、新しい母核化合物を持った、これまでにない新規な小胞体ストレスの予防又は改善の薬剤であり、代謝、脳神経、癌、免疫疾患の予防又は治療剤として利用可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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