(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
i)酸性化されたヒト閉経期/閉経後尿をカオリンを用いて処理する工程であって、尿中に存在するゴナドトロピン及び非ゴナドトロピンタンパク質をカオリンに吸着させる、工程と、
ii)カオリンに吸着された、別個のゴナドトロピンを、アルカリ溶出によって1つの画分に溶出させる工程と、
iii)前記画分をアセトンで沈殿させて、画分Aを得る工程と、
iv)酢酸アンモニウムのエタノール(70%)中10%w/v溶液でこの沈殿画分Aから生物活性画分を抽出し、酢酸アンモニウムのエタノール(90%)中10%溶液で沈殿させて、画分Bを得る工程と、
v)イオン交換クロマトグラフィーによって前記画分Bを精製して、画分C(HMG原材料又は同等物)を得る工程と、
vi)強陽イオン樹脂を使用して酢酸アンモニウムで溶出させる陽イオン交換クロマトグラフィーによって、前記画分Cを精製する工程と、
vii)前記工程で得られた溶出物から、酸性媒体中での沈殿によって画分Fを得る工程と、
viii)強陰イオン樹脂を使用して酢酸アンモニウムで溶出させる陰イオン交換クロマトグラフィーによって前記画分Fを精製して、画分Gを得る工程と、
ix)疎水性相互作用クロマトグラフィーを使用して、漸減濃度の硫酸アンモニウムを含有する緩衝液の逐次添加によって、画分G中の得られたゴナドトロピンを精製して、画分J2及びJ3を得る工程であって、画分J2が主に卵胞刺激ホルモン(FSH)生物活性を有し、画分J3が黄体形成ホルモン(LH)生物活性を有する、工程と、
x)マルチモーダル官能性を有する強陰イオン交換体を使用して、pHは一定であるが伝導率を変更する緩衝液で溶出させて、画分J3のゴナドトロピンを精製して、LH活性のみを有する画分J3-UPを得る工程と、
xi)同等の生物活性の画分J2中のFSHと画分J3-UP中のLHとを混合することによるバランス工程において画分HMG-UPを得る工程と、
xii)前記画分HMG-UPの溶液を、
1)滅菌濾過工程、
2)ナノ濾過工程、及び
3)沈殿工程
に供することによって、非ゴナドトロピン夾雑物、プロテアーゼインヒビター、アファミン、インスリン様成長因子結合タンパク質7、亜鉛-α2-糖タンパク質及びアルブミンを含まないHMG-UP(超高純度グレードのヒト閉経期ゴナドトロピン)組成物を得る工程と
を含むことを特徴とする、血漿セリンプロテアーゼインヒビター、アファミン、インスリン様成長因子結合タンパク質7、亜鉛-α2-糖タンパク質及びアルブミンとしての非ゴナドトロピン夾雑物の除去によるHMG-UP(超高純度グレードのヒト閉経期ゴナドトロピン)組成物を得るための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、HMG-UP(超高純度グレードのヒト閉経期ゴナドトロピン)組成物を得るための、マルチモーダルクロマトグラフィーによるHMG(ヒト閉経期ゴナドトロピン)の精製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
「メノトロピン」という用語は、2種の糖タンパク質ホルモン、卵胞刺激ホルモン(FSH)及び黄体形成ホルモン(lutenizing hormone)(LH)を含む、閉経期及び閉経後女性の尿から得られるゴナドトロピンのホルモン組合せに用いられる。これらのホルモンは、下垂体から分泌され、その後に代謝され、尿中に排泄される。
【０００３】
尿中ゴナドトロピンは、排卵誘発周期において又は生殖補助時に卵巣を刺激するために、数十年にわたって成功裏に使用されてきた。
【０００４】
それらが導入されてから今日に至るまで、製造技術及び精製方法はかなり改善されてきた。精製に先端技術を適切に応用したため、例えばHMG-HPのような、高純度グレードのゴナドトロピンを得ることが可能になった。
【０００５】
WO00/63248は、高い生物活性を有するゴナドトロピン組成物、特にFSH(卵胞刺激ホルモン:フォリトロピン)及びメノトロピン組成物、並びに閉経期及び閉経後女性の未精製ヒト尿からこれらの組成物を調製するための方法に関する。開示された方法によれば、実施例1及び2において、それぞれ3700IU/mg(タンパク質)及び4300IU/mg(タンパク質)のFSH力価を含むHMG-HPの組成物を得ることができる。
WO2011/150110は、ポリペプチド及び少なくとも1つの夾雑物を含む組成物からポリペプチドを精製するための方法、並びに当該方法によって精製されたポリペプチドを含む配合物を提供し、ここで、Capto-adhere(商標)が当該方法において使用される。
Basset et al., 2009は、プロテアーゼインヒビターとしての尿ヒトFSH(u-hFSH)における非ゴナドトロフィンタンパク質及び尿ヒト閉経期ゴナドトロフィン(u-HMG)調整物、アファミン、インスリン様成長因子結合タンパク質7、亜鉛α-2-糖タンパク質、並びにアルブミンの同定のための方法を開示する。
【０００６】
この開示にもかかわらず、尿製品は、夾雑物として若干の非ゴナドトロピンタンパク質を依然として含む。
【０００７】
ゴナドトロピンHMG-HP組成物の主な夾雑物の一部には、血漿セリンプロテアーゼインヒビター、アファミン、インスリン様成長因子結合タンパク質7、亜鉛α2-糖タンパク質及びアルブミンが含まれ、それらは全て、2009年のBassettらにおいて同定されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】EP1169349B1
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Bassettら、Analytical identification of additional impurities in urinary-derived gonadotrophins 2009年
【非特許文献２】ASRM Practice Committee;Fertility and Sterility、90、Suppl. 3、S13、2008年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
尿中HMG-HPの精製を改善するための課題は、収率の高い単純な方法を使用して、有効成分と共に共精製されるこれらのタンパク質を除去するが、FSH及びLHの生物活性の完全性を保存することであった。
【００１１】
この目的を達成するために、先行技術のHMG-HP精製を最適化する新しい精製工程を導入した。
【００１２】
簡潔には、以前の特許(欧州特許EP1169349B1)において提示されているHMG-HP製造方法においては、最後のクロマトグラフィー工程(疎水性相互作用クロマトグラフィー、HIC)で2つの重要な画分が得られる。それらの一方はFSH生物活性を有する画分(画分J2)であり、他方はLH生物活性を有する画分(画分J3)である。
【００１３】
メノトロピンは、約1:1のFSH:LH生物活性比を有する必要がある製剤である。
【００１４】
1:1のFSH:LH比を達成するために、両ホルモンの含有量を調整するためのバランス工程が存在する。HMG-HPの場合、このバランス工程は、画分J2からのFSH生物活性を画分J3からのLH生物活性と混合することによって行う。
【００１５】
以下で記載されるように、画分J3には通常、非活性タンパク質が夾雑している。
【００１６】
したがって、検出可能なタンパク質の夾雑がほとんどないHMG-UP(超高純度HMG)材料を得るために、LH生物活性画分(画分J3)を、マルチモーダルクロマトグラフィー、特にマルチモーダル強陰イオン交換体、Capto-adhere(商標)によって成功裏に精製した(画分J3-UP)。
【００１７】
周知の通り(ASRM Practice Committee; Fertility and Sterility、90、Suppl. 3、S13、2008年)、製剤中に存在する少量のhCGは、メノトロピンのLH生物活性の大部分を与えるのに寄与する。それゆえに、画分J3の精製は、この画分中に存在するヒト絨毛性ゴナドトロピン(hCG)を精製して画分J3-UPを得ることを意味した。
【００１８】
最後に、HMG-UPを生成するために、バランス工程はこの場合には、画分J2からのFSH生物活性を、以前の、夾雑物がより多い画分J3からではなく、今回はるかに精製された画分J3-UPからのLH生物活性と同等量で混合することを含んでいた。
【００１９】
HMG-UPの組成物を得るために、バランス工程後に得られた溶液を、滅菌濾過工程、ナノ濾過工程及び沈殿工程に供する。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明は、同封の特許請求の範囲に記載の通りの、非関連ゴナドトロピン夾雑物を含まないHMG-UP(超高純度グレードのヒト閉経期ゴナドトロピン)組成物を得るための方法を含む。
【００２１】
（手続補正書によって削除）
【００２２】
不活性非ゴナドトロピンタンパク質、例えば、血漿セリンプロテアーゼインヒビター、アファミン、インスリン様成長因子結合タンパク質7、亜鉛-α2-糖タンパク質及びアルブミンの除去によってHMG-UP(超高純度グレードのヒト閉経期ゴナドトロピン)組成物を得るための本発明の方法は、
i)酸性化されたヒト閉経期/閉経後尿をカオリンを用いて処理する工程であって、尿中に存在するゴナドトロピン及び非ゴナドトロピンタンパク質をカオリンに吸着させる、工程と、
ii)カオリンに吸着された、別個のゴナドトロピンを、アルカリ溶出によって1つの画分に溶出させる工程と、
iii)前記画分をアセトンで沈殿させて、画分Aを得る工程と、
iv)酢酸アンモニウムのエタノール(70%)中10%w/v溶液でこの沈殿画分Aから生物活性画分を抽出し、酢酸アンモニウムのエタノール(90%)中10%溶液で沈殿させて、画分Bを得る工程と、
v)イオン交換クロマトグラフィーによって前記画分Bを精製して、画分C(HMG原材料又は同等物)を得る工程と、
vi)強陽イオン樹脂を使用して酢酸アンモニウムで溶出させる陽イオン交換クロマトグラフィーによって、前記画分Cを精製する工程と、
vii)前記工程で得られた溶出物から、酸性媒体中での沈殿によって画分Fを得る工程と、
viii)強陰イオン樹脂を使用して酢酸アンモニウムで溶出させる陰イオン交換クロマトグラフィーによって前記画分Fを精製して、画分Gを得る工程と、
ix)疎水性相互作用クロマトグラフィーを使用して、漸減濃度の硫酸アンモニウムを含有する緩衝液の逐次添加によって、画分G中の得られたゴナドトロピンを精製して、画分J2及びJ3を得る工程であって、画分J2が主にFSH生物活性を有し、画分J3がLH生物活性を有する、工程と、
x)マルチモーダル官能性を有する強陰イオン交換体を使用して、pHは一定であるが伝導率を変更する緩衝液で溶出させて、画分J3のゴナドトロピンを精製して、LH活性のみを有する画分J3-UPを得る工程と、
xi)同等の生物活性の画分J2中のFSHと画分J3-UP中のLHとを混合することによるバランス工程において画分HMG-UPを得る工程と、
xii)前記画分HMG-UPの溶液を、
1)滅菌濾過工程、
2)ナノ濾過工程、及び
3)沈殿工程
に供することによって、非ゴナドトロピン夾雑物、例えばプロテアーゼインヒビター、アファミン、インスリン様成長因子結合タンパク質7、亜鉛-α2-糖タンパク質及びアルブミンを含まないHMG-UP(超高純度グレードのヒト閉経期ゴナドトロピン)組成物を得る工程と
を含む。
【００２３】
（手続補正書によって削除）
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】HMG-UPを得るための流れ図である。
【図２】マルチモーダルクロマトグラフィーによってCapto-adhere(商標)を用いて画分J3-UPを得ることを示す図である。
【図３】SDS-PAGE(ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動)による画分J3-UPの特性決定を示す図である。
【図４】SDS-PAGE(ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動)による画分J3-UPの特性決定を示す図である。
【図５】2Dゲルによる、画分J3及び画分J3-UPの特性決定を示す図である。アルファ及びベータhCGの同定を、MALDI-MS(マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析)によって行った。
【図６】2DゲルによるHMG-HP及びHMG-UPの特性決定を示す図である。種々のスポットの同定を、MALDI-MS(マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析)によって行った。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本書において提示する研究は、もう1つ新しいクロマトグラフィー工程を既存の製造方法に加えることによって、HMG-HPよりも優れた純度を有する超高純度HMGを得ることが可能であることを示している。
【００２６】
この新しい工程は、LH画分と共溶出される不純物をミックスモードクロマトグラフィーによって、特にマルチモーダル強陰イオン交換体を使用して除去することにある。
【００２７】
ミックスモード又はマルチモーダルクロマトグラフィー担体
ミックスモード又はマルチモーダルクロマトグラフィーは、リガンドと標的分子との間の2つ以上の相互作用機構の組合せが実質的に関係するクロマトグラフィーを指す。この組合せは、シングルモードの担体によって達成できない抗体の分画を達成できるような独特の選択性をもたらすことができる。ミックスモード樹脂は、負に帯電している部分と疎水性部分とを含んでいてもよい。負に帯電している部分は、陽イオン交換のためのアニオン性のカルボキシレート基又はアニオン性のスルホ基であってもよい。このような担体の例としては、Capto-MMC(商標)(GE Healthcare社)が挙げられるが、これに限定するものではない。
【００２８】
種々の他のミックスモードクロマトグラフィー媒体は、市販されており、例えば、Carboxy-Sulfon(商標)、フルオロアパタイト(CFT)、MEP-Hypercel(商標)、Capto-adhere(商標)、Bakerbond(商標)及びBakerbondTM ABx(商標)である。
【００２９】
Capto-adhere(商標)リガンド、N-ベンジル-N-メチルエタノールアミンは、相互作用のための多くの官能性を示す。最も顕著なのは、イオン相互作用、水素結合及び疎水性相互作用である。このリガンドは、化学的に修飾された、ハイフローアガロースマトリックスに結合する。アガロースマトリックスは、細孔サイズを損なうことなく、粒子剛性を提供する。
【００３０】
アガロースマトリックスのこれらの性質により、速い物質移動が可能となり、大流量においてCapto-adhereの高い動的結合能がもたらされる。
【００３１】
高架橋アガロースベースマトリックスは、媒体に高い化学的及び物理的安定性を与える。
【００３２】
材料及び方法
材料の供給源
画分J3からのLH活性は、欧州特許EP1169349B1に記載されるようにして、HIC(疎水性相互作用クロマトグラフィー)によって得た。
【００３３】
画分J3は、40mMトリス緩衝液(pH8.5)に対して透析し、次いでAmiconセルによってポリエーテルスルホンフィルターコードPM10(カットオフ10000、カタログ番号13122、Millipore社)を使用して濃縮した。
【００３４】
試料のタンパク質含有量は、タンパク質75mg/ml(溶液)であった。
【００３５】
マルチモーダルクロマトグラフィー
マルチモーダルクロマトグラフィーは、AKTA Purifierシステムを使用して行った。
【００３６】
カラムXK16/40を、Capto-adhere(商標)コード番号17-5444-99を用いて挿入物の指示に従って準備した。
【００３７】
Capto-adhereの性質
この樹脂は、抗体並びに更に宿主細胞タンパク質及び核酸の製造中において二量体及び凝集体を排除するための、プロテインA工程後における夾雑物の除去に主に推奨されている。
【００３８】
Capto-adhere(商標)は、マルチモーダル官能性を有する強陰イオン交換体である。マルチモーダル官能性は、従来の陰イオン交換体と比較して異なる選択性を与える。
【００３９】
Capto-adhere(商標)リガンド、N-Benzyl-N-メチルエタノールアミンは、相互作用のための多くの官能性を示す。最も顕著なのは、イオン相互作用、水素結合及び疎水性相互作用である。リガンドは、化学的に修飾された、ハイフローアガロースマトリックスに結合する。
【００４０】
アガロースマトリックスは、細孔サイズを損なうことなく、粒子剛性を提供する。
【００４１】
アガロースマトリックスのこれらの性質により、速い物質移動が可能となり、大流量においてCapto-adhere(商標)の高い動的結合能がもたらされる。
【００４２】
高架橋アガロースベースマトリックスは、媒体に高い化学的及び物理的安定性を与える。
【００４３】
本開示において、マルチモーダルクロマトグラフィーは室温において流量3ml/分で行い、選択した溶出モードは、結合-溶出であった。
【００４４】
溶出は、緩衝液のpHは一定に保つが伝導率は変更して行った。
【００４５】
40mMトリス緩衝液(pH8.5)を選択し、工程の勾配の作成にはNaClを使用した。
【００４６】
LH生物活性は、低伝導率で溶出させた。他方、夾雑物は高伝導率で脱着させた。
【００４７】
検出は、280nmで行った。
【００４８】
選択したクロマトグラフィー条件の概要
-  カラムXK 16/40:容量24ml。
-  装填量:LH活性画分ロット4625/51-1のタンパク質50mg。
-  流量:3ml/分
-  検出:280nm
-  溶出緩衝液:
-  40mMトリス緩衝液(pH8.5)+0mM NaCl
-  40mMトリス緩衝液(pH8.5)+50mM NaCl
-  40mMトリス緩衝液(pH8.5)+100mM NaCl
-  40mMトリス緩衝液(pH8.5)+225mM NaCl
-  40mMトリス緩衝液(pH8.5)+300mM NaCl
-  40mMトリス緩衝液(pH8.5)+1000mM NaCl
【００４９】
分析方法
総タンパク質含有量
総タンパク質含有量は、Hartree[Hartree、1972年]によって変更された、Lowry[Lowryら  1951年]の方法に従って決定した。ウシ血清アルブミンを、標準として使用した。
【００５０】
バイオアッセイ
試料のLH及びFSH生物活性を、インビボバイオアッセイを使用して評価した。
【００５１】
a)卵胞刺激ホルモン(FSH)のバイオアッセイ
方法:卵巣質量増加法(USPXXXV、イギリス薬局方2015、III巻)。
一次参照標準:尿中FSH及び尿中LHの国際標準(NIBSC、WHO-ECBS)。
使用参照標準:一次参照標準に対して較正されたInstituto Massone S.A.社製のMenotrophin(HMG)。
動物:ウィスター系ラット雌、日齢21〜24日、1ケージ当たり動物6匹の群、群内体重差は10g以下。
用量:3×3試験、即ち、使用標準3用量及び試料3用量、1ケージ当たり1用量を試験。低用量:2.4IU;中用量:4.3IU;高用量:7.7IU。
緩衝液:hCG 28IU/mlを含有するリン酸-アルブミン緩衝生理食塩水(pH7.2)。
【００５２】
b)黄体形成ホルモン(LH)のバイオアッセイ
方法:精巣質量増加法(USPXXXV、イギリス薬局方2015、III巻)。
一次参照標準:尿中FSH及び尿中LHの国際標準(NIBSC、WHO-ECBS)。
使用参照標準:一次参照標準に対して較正されたInstituto Massone S.A.社製のMenotrophin(HMG)。
動物:ウィスター系ラット雄、日齢21〜24日、1ケージ当たり動物6匹以上の群、群内体重差10g以下。
用量:3×3試験、即ち、使用標準3用量及び試料3用量、1ケージ当たり1用量を試験。低用量:7IU;中用量:14IU;高用量:28IU。
緩衝液:リン酸-アルブミン緩衝生理食塩水(pH7.2)。
【００５３】
SDS-PAGE
種々の画分を、SDS-PAGEによって還元条件下でPhastSystemユーザーマニュアル(ファイル番号110)に記載されたようにして特性決定した。
【００５４】
試料を、還元剤と共に試料緩衝液中に取り、95〜100℃において5分間加熱した。
【００５５】
銀染色を使用して、タンパク質プロファイルを可視化した。
【００５６】
SDS-PAGEの実施に使用した全ての材料を、以下のように要約できる:
-  電気泳動分離はPhastSystem(GE Healthcare社)を使用して行った。
-  ゲルの画像は、ImageScanner(PowerLook 1120「UMAX」)をソフトウェアLabScan 5.0(GE Healthcare社)と共に使用して処理した。Image Quant TL  バージョン2005、Amersham Biosciences社。
-  試料アプリケーター8/1(1μl)、GE Healthcare社、コード番号18-1618-01。
-  LMW較正混合物、GE Healthcare社製、コード番号17-0446-01。
-  HMG HP参照標準。
-  HCG HP参照標準。
-  Phastgel勾配  SDS 8〜25%、GE Healthcare社、コード番号17-0542-01。
-  ゲル中緩衝液系: 0.112M酢酸塩(リーディングイオン)及び0.112MTris(pH6.5)。
-  Phastgel SDS緩衝液ストリップ  2〜3%アガロース、GE Healthcare社、コード番号17-0516-01。
-  TRIS/HCl p. a.。
-  EDTA-Na2 p. a.。
-  β-メルカプトエタノールp. a.。
-  試料緩衝液: 10mM Tris/HCl、1mM EDTA(pH8.0)+2.5%SDS、+5%β-メルカプトエタノール+0.01%ブロモフェノールブルー。
【００５７】
二次元電気泳動
HMG-UP及びHMG-HPの試料、並びに中間体画分J3及び画分J3-UPを、標品中に存在する異なる種の分子量とそれらのpIの両方によって試料を分離できる二次元電気泳動のような非常に高感度の技法によって、更に特性決定した。
【００５８】
実際には、タンパク質は、第1の次元でそれらの等電点(pI)によって、次いで第2の次元でそれらの分子量によって分離した。
【００５９】
試料は、IEF-緩衝液(7M尿素、2Mチオ尿素、2%CHAPS、2% Triton X-100、20mM DTT、1%w/v担体両性電解質  pH3〜10)中で調製した。タンパク質含有量は、Bradford方法によって決定した。
【００６０】
IPGストリップ(7cm、pH3〜10)を、タンパク質200μgを含有するIEF緩衝液125μlで終夜再水和させた。
【００６１】
第1の次元のゲルを、Ettan IPGphor 3 IEF System(GE Healthcare社)中で20℃において500Vで30分間、1000Vで30分間及び5000Vで1時間40分の工程で泳動した。
【００６２】
フォーカシング後、タンパク質を、IPGストリップを平衡化緩衝液(EB;50mM Tris-HCl(pH8.8)、6M尿素、30%グリセロール、2%SDS及び0.01%ブロモフェノールブルー)4ml及び1%w/v DTTと共に室温で1時間インキュベートすることによって還元した。直ちに、タンパク質を、平衡化緩衝液4ml中5.5%w/vヨードアセトアミドで1時間アルキル化した。
【００６３】
第2の次元の電気泳動を、15%ポリアクリルアミドゲルで行った。
【００６４】
2D分離後、ゲルを、銀又はクーマシーブルー染色によって染色した。
【００６５】
ゲルを、Image Scanner III(GE Healthcare社)を使用して走査した。ソフトウェアImage Master 2D Platinumバージョン7.0を使用してタンパク質スポットの定量化を行った。
【００６６】
プロテオームマップ
二次元電気泳動によって得られた試料のスポットを、MALDI-TOF MSによって分析し、データベースから同定した。
【００６７】
MALDI-TOF MS分析のために、タンパク質を、以前に記載されたようにして[Hellman、2000年]、トリプシン[配列グレード(sequence grade)、Promega社]でインゲル消化させた。
【００６８】
0.1%TFAを含有する60%アセトニトリル(ACN)水溶液を使用してゲルからペプチドを抽出し、真空乾燥によって濃縮した。ペプチド混合物1μlを、マトリックス溶液(0.1%TFAを含有する60%ACN中α-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸)1μlと混合して、MALDI試料プレート上にのせた。ペプチド混合物の質量スペクトルを、4800 MALDI TOF/TOF装置(AB Sciex社)において正反射モードで取得し、ペプチド標準の混合物(Applied Biosystems社)を使用して外部較正した。選択したペプチドイオンの衝突誘起解離MS/MSスペクトルを取得した。
【００６９】
MS及びMS/MS取得モードで測定されたm/x値により、MASCOT検索エンジン(Matrix Science社、http://www.matrixscience.com)を使用して、タンパク質を同定した。(個々の検索の検索パラメーターは、結果の報告に含まれている)。
【００７０】
有意なタンパク価(p<0.05)及びタンパク質当たり少なくとも1種のペプチドイオンの有意な値(p<0.05)を、正の同定の基準として使用した。
【００７１】
結果
マルチモーダルクロマトグラフィーによる画分J3-UPの生成
マルチモーダルクロマトグラフィーを、強陰イオン交換体を使用して行った。疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)によって得た画分J3中に存在するLH生物活性を、Capto-adhere(商標)を使用して精製した。AKTA精製システムを使用してCapto-adhere(商標)(容量24ml)を用いて準備したXK16/40カラムに画分J3 50mgを装填した。種々の工程の勾配を使用して、不純物を排除した。
使用した一連の緩衝液は以下の通りであった:
-  40mMトリス緩衝液(pH8.5)+0mM NaCl
-  40mMトリス緩衝液(pH8.5)+50mM NaCl
-  40mMトリス緩衝液(pH8.5)+100mM NaCl
-  40mMトリス緩衝液(pH8.5)+225mM NaCl
-  40mMトリス緩衝液(pH8.5)+300mM NaCl
-  40mMトリス緩衝液(pH8.5)+1000mM NaCl
【００７２】
精製LH画分(画分J3-UP)は、40mMトリス緩衝液(pH8.5)+225mM NaCl緩衝液を用いて得た(図2)。図2において見られるように、クロマトグラフの曲線下の主要領域は、クロマトグラフィーにおいて後の方で高モル濃度の緩衝液(1000mM NaCl)を使用する場合に溶出するLH不活性タンパク質に相当する。225mM NaClによって溶出された低分子タンパク質ピークに回収されるLH生物活性は、高精製が達成されたことを強く示唆している。特異的LH生物活性を、バイオアッセイによって決定した[Table 1(表1)を参照のこと]。
【００７３】
画分J3-UPについて行ったLH生物活性に関する生物学的分析を以下に示す。比較のために、出発原料、画分J3について行った生物学的分析も同様にTable 1(表1)に示す。
【００７４】
【表１】
0006647220.tif 000002
【００７５】
画分J3-UP中に回収されたLH生物力価(biopotency)によって決定される方法の収率は、約80%であった。
【００７６】
画分J3-UPを更に、SDS-PAGE(ポリアクリルアミドゲル電気泳動)によって、また二次元電気泳動によって特性決定した(図3、4及び5)。
【００７７】
SDS-PAGE
画分J3及び画分J3-UPのタンパク質パターンを、8〜25%ゲル上で還元条件において分析し、銀染色した。
【００７８】
図3に示されるように、画分J3は、非常に不純な画分である(レーン2)。画分J3は、Capto-adhere(商標)によって成功裏に精製された。実際に、非常に清浄な画分、画分J3-UPが得られた(レーン4)。画分J3-UPは、hCGに相当する典型的な電気泳動パターンを有する(図4、レーン2及びレーン3)。実際に、画分J3-UPのSDS-PAGEにおいて出現する2つのバンドは、hCGのアルファ鎖及びベータ鎖に相当する。
【００７９】
二次元電気泳動
二次元電気泳動によって精製された材料、画分J3-UPの分析(図2)は、Capto-adhereが、MALDI MS(マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析)によって決定されたアルファ及びベータhCGに相当するスポットのみを有する生成物(図5)を引き離すことができることを示している。他方、出発原料(画分J3)中に存在する高量の不純物により、活性物質(アルファ及びベータhCG)に相当するバンドを割り当てるのは更に困難になる。
【００８０】
HMG-UPの調製
LH生物活性を含むCapto-adhere(商標)によって精製された画分J3-UPを、バランス工程に使用してFSH活性及びLH活性を約1:1の比に調整して、HMG-UPを得た。このバランス工程は、画分J2からのFSH活性と画分J3-UPのLH生物活性を同等量で混合することによって行った。
【００８１】
画分J2及び画分J3-UPを解凍し、それぞれ約10,000IUのFSH及びLH量で混合して、約1:1の製剤を得た。
【００８２】
HMG-UPのFSH及びLH生物活性を、以下の示すようにして決定した。HMG-HPに関する結果を、比較のために示す。
【００８３】
【表２】
0006647220.tif 000003
【００８４】
欧州特許EP1169349B1において使用された方法では、それぞれ3700IU/mg(タンパク質)及び4300IU/mg(タンパク質)のFSH力価を含むHMG-HPの組成物を得ることができる(実施例1及び2を参照のこと)が、記載した方法では、両ホルモン(FSH及びLH)について8000IU/mg(タンパク質)超の値が得られる。
【００８５】
観察できるように、HMG-UPは、HMG-HPよりかなり高いFSH及びLH生物力価を有する。
【００８６】
二次元電気泳動によるHMG-UPの特性決定
HMG-UPを、二次元電気泳動によって更に特性決定した。この技法は非常に高感度で、優れた解像度を有する。実際に、タンパク質を1つの次元でそれらの等電点によって、第2の次元でそれらの分子量によって分離することができる。HMG-UPとHMG-HPの両方を、比較のために泳動した。
【００８７】
得られた結果は、図6において観察することができる。
【００８８】
図6に示されるように、HMG-HP材料において、二次元電気泳動は、約45,000の分子量で溶出する不純物を検出できる。これらのスポットはHMG-UP中には存在せず、この製剤の純度グレードがより高いことを裏付けている。MALDI-TOF MSによる同定及び文献データ(Bassett、2009年;Kuwabara、2009年)のいずれによっても、他の共通のスポットは、ゴナドトロピン製剤の生物活性タンパク質に相当する:ベータHCG(MW約27,000)、ベータFSH(MW約20,000)及び共通のアルファFSH/HCG鎖(MW約17,000)。二次元電気泳動は、不純物がCapto-adhere(商標)クロマトグラフィーによって成功裏に除去されたことを裏付けている。
【００８９】
非ゴナドトロピンタンパク質のMALDI-TOF MSによる同定により、除去された不純物の大部分が血漿セリンプロテアーゼインヒビターに相当することが示された。
【００９０】
最後に、プロテオミクス研究を更に行って、Capto-adhereクロマトグラフィーの間に除去された不純物を特性決定した。同定の感度を増加させるために、Capto-adhere(商標)精製の、不純物を多く含む300mM NaCl画分及び1000mM NaCl画分(図2)を、二次元ゲル電気泳動とその後の質量分析によって分析した。血漿セリンプロテアーゼインヒビター以外の、除去された主な不純物は、アファミン、インスリン様成長因子結合タンパク質7、亜鉛-α2-糖タンパク質及びアルブミンであった。この非ゴナドトロピン夾雑パターンは、公表されているデータ[Bassett、2009年;van der Weijer、2003年]と一致している。これらの不純物は全て、画分J3-UP及び最終HMG-UP製品中では検出できない。
【００９１】
図1の流れ図を参照して、EP1169349B1に開示されている共通の工程を考慮して、前記方法を以下のように行う。
【００９２】
超精製メノトロピンを得るために本発明で使用できる出発原料、以下「HMG原材料」は、欧州特許EP1169349B1に開示されたように、薬局方(USPXXXV、イギリス薬局方2015、III巻)により指定されているメノトロピン特定品目又はこの特定品目と密接に関連した他の全ての材料を構成する。したがって、この調製方法は、メノトロピンに適用可能な要件を厳密には満たさない他の材料にも適用可能であることが理解される。実際に、欧州特許EP1169349B1の実施例において得られる画分Cを使用して、満足のいく結果が得られた。
【００９３】
更に、本発明は、必要に応じてFSH:LH比を調整する、したがって、正確なFSH:LH比の範囲外である出発原料を使用する場合であっても超精製メノトロピン特定品目を提供できる手順を提供する。このため、医薬製剤の生成に必要な適正な1:1の比のFSH及びLHから構成される製品を得ることが可能である。開示される工程は、本明細書中に記載したのとは異なる順序で使用できる。例えば、後述する2つのイオン交換クロマトグラフィー工程の間に疎水性相互作用樹脂を挿入することによって、等しく満足のいく結果が得られた。
【００９４】
超精製メノトロピンを生成するために本発明において使用する出発原料である尿は、閉経期/閉経後尿からゴナドトロピンを吸着するためにカオリンを使用する非常によく知られた方法によって本質的に得られる(BP 1980)。簡潔には、酸性化された尿からカオリンによって生物活性画分を抽出し、アルカリで溶出させ、2容量のアセトンで沈殿させる。次いで、この沈殿物から酢酸アンモニウムのエタノール(70%)中10%w/v溶液で生物活性画分を抽出し、酢酸アンモニウムのエタノール(90%)中10%溶液で沈殿させる。更なる精製を、イオン交換クロマトグラフィーによって行う。この方法によって得られた精製材料は、欧州特許EP1169349B1の実施例において得られる画分Cと同様に、メノトロピン組成物又は幾つかの他の同等の製剤を構成する。
【００９５】
精製の工程
1)0.05〜0.15M酢酸アンモニウム(pH5.0〜6.0)中で希釈された前記未精製ゴナドトロピンを、スルホプロピル型の強陽イオン樹脂を含むイオン交換カラム中で、0.05〜0.5M酢酸アンモニウム溶液(pH5.0〜7.0)によりFSH生物活性及びLH生物活性の両方を溶出させて、精製する工程と、
2)0.01〜0.05M酢酸アンモニウム(pH5.0〜7.0)中で希釈されたこの画分を、第四級アンモニウム型の強陰イオン樹脂を含むイオン交換カラム中で、0.05〜0.2M酢酸アンモニウム溶液(pH5.0〜7.0)によりFSH及びLHの両方を溶出させて、精製する工程と、
3)ゴナドトロピンを、疎水性相互作用樹脂を含むカラム中で、以下の溶液:a)50〜200mMリン酸ナトリウム及び0.8〜1.2M硫酸アンモニウムの緩衝液(pH5.0〜6.0)(不純物)、b)50〜200mMリン酸ナトリウム及び0.4〜0.6M硫酸アンモニウムの緩衝液(pH5.0〜7.0)(画分J2)、並びにc)50〜200mMリン酸ナトリウム(50〜70%v/v)及び96%エタノール(50〜30%v/v)の緩衝液(画分J3)の逐次添加によって精製する工程と、
4)ゴナドトロピン画分J3を、マルチモーダル官能性を有する強陰イオン交換体で精製する工程。溶出は、緩衝液のpHは一定に保つが伝導率は変更して行った。pHが7〜10の範囲の、好ましくはpH8.5の40mMトリス緩衝液を選択し、工程の勾配の作成にはNaClを使用した。LH生物活性は、低伝導率で溶出させた。他方、夾雑物は高伝導率で脱着させた。
【００９６】
SP-Sepharose、Q-Sepharose及び疎水性相互作用樹脂の型の樹脂をこれらの工程で使用できる。好ましい疎水性相互作用樹脂はPhenyl-Sepharose樹脂であり、マルチモーダル樹脂はCapto-adhere(商標)である。
【００９７】
本方法は、沈殿、遠心分離、限外濾過、透析、洗浄、真空乾燥及び冷却の二次工程を更に含む。
【００９８】
方法の説明
画分Fの調製
スルホプロピル型の強陽イオン交換樹脂10リットルを含むクロマトグラフィーカラムで、画分Cをクロマトグラフィー処理する。
【００９９】
画分C(110〜140g)を0.05〜0.15M酢酸アンモニウム溶液(pH5.0〜7.0)1600〜1800mlに溶解させる。カラムを動作させ、容量を20リットルにするのに必要な量の0.05〜0.15M酢酸アンモニウム溶液で溶出させる。溶出は、0.15〜0.20M酢酸アンモニウム溶液(pH5.0〜7.0、20リットル)及び0.2〜0.5M酢酸アンモニウム溶液(pH5.0〜7.0、20リットル)を用いて続ける。後者の溶液で溶出された活性画分を、4容量の96%エタノール及び混合物がpH5.5〜5.7に達するのに十分な酢酸に撹拌しながら加える。沈殿物が形成され、これを遠心分離によって分離し、エタノールで洗浄し、エタノールが除去され且つ水分が5%未満となるまで真空乾燥する(画分F)。
【０１００】
画分Gの調製
第四級アンモニウム型の強陰イオン交換樹脂4リットルを含むクロマトグラフィーカラムで、画分Fをクロマトグラフィー処理する。
【０１０１】
画分F(650ml中40〜60g)を0.01〜0.05M酢酸アンモニウム溶液(pH5.0〜7.0)に溶解させ、カラムを動作させ、同じ溶液で溶出させて、容量を7リットルとする。0.05〜0.07M酢酸アンモニウム(pH5.0〜7.0)12リットルを用いて、次いで0.07〜0.2M酢酸アンモニウム(pH5.0〜7.0)10リットルを用いて、溶出を続ける。後者の溶液で溶出された活性画分を、PM10(10000D)Ultrafilters(Amicon-Millipore社)膜を使用する限外濾過プロセスに供する。緩衝液100〜150ml中タンパク質2〜4gの濃度となるまで50mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH5.5〜5.7)に対して、溶液を濃縮及び透析する。次いで、これを-75℃において凍結させる(画分G)。
【０１０２】
画分Jの調製
疎水性相互作用樹脂(Phenyl Sepharose HP、Amersham-Pharmacia Biotech社)400mlを含むクロマトグラフィーカラムで、画分Gをクロマトグラフィー処理する。
【０１０３】
十分量の硫酸アンモニウムを画分Gの溶液に加えて、0.8〜1.2Mの濃度を得る。
-  画分Gの溶液をクロマトグラフィーカラム中に入れる。
-  2容量の50〜200mMリン酸ナトリウム緩衝液、0.8〜1.2M硫酸アンモニウム、pH5.0〜7.0で溶出させる。
-  2容量の50〜200mMリン酸ナトリウム緩衝液、0.4〜0.6M硫酸アンモニウム、pH5.0〜7.0で、最後に2容量の50〜200mMリン酸緩衝液(50〜70%v/v)及び96%エタノール(50〜30%v/v)で溶出を続ける。
【０１０４】
50〜200mMリン酸ナトリウム緩衝液、0.4〜0.6M硫酸アンモニウムで溶出させた活性画分(画分J2)を-75℃において凍結させる。この画分は主にFSH活性を有する。
【０１０５】
50〜200mMリン酸緩衝液(50〜70%v/v)及び96%エタノール(50〜30%v/v)で溶出させた活性画分(画分J3)を-75℃において凍結させる。この画分は、LH生物活性のみを有する。
【０１０６】
画分J3-UPの調製
マルチモーダル官能性を有する強陰イオン交換体(Capto-adhere(商標)、GE社)24mlを含むクロマトグラフィーカラムで、画分J3をクロマトグラフィー処理する。pH7〜10、好ましくはpH8.5の40mMトリス緩衝液を選択し、工程の勾配の作製にはNaClを用いた。
【０１０７】
LH生物活性は、低伝導率で溶出させた。他方、夾雑物は高伝導率で脱着させた。段階的溶出は、pH7〜10、好ましくはpH8.5の40mMトリス緩衝液中、30mM未満、好ましくは0mM;30mM〜75mM、好ましくは50mM;75mM〜180mM、好ましくは100mM;180mM〜250mM、好ましくは225mM;250mM〜700m、好ましくは300mM;及び700mM〜1500mM、好ましくは1000mMのNaClを使用して行った。
【０１０８】
LH生物活性画分(J3-UP)は、225mM NaClで溶出させた。
【０１０９】
画分J3-UPは、-75℃において凍結させる。この画分は、LH生物活性のみを有する。
【０１１０】
バランス工程
FSH(画分J2から)とLH(画分J3-UPから)を同等量で混合して両ホルモンの比を1:1とすることによって、HMG-UPを得る。
【０１１１】
前記技法によって生成されるバッチの例
1.1 画分Fの調製
画分C 231.2gを、2つの等しい部分に分け、前述のようにしてクロマトグラフィーカラムで2つの同等なプロセスでクロマトグラフィー処理した。
【０１１２】
画分C 115.6g(各プロセス)を、0.05M酢酸アンモニウム緩衝液(pH5.0)1700mlに溶解させた。カラムを動作させ、更に18.7リットルの同じクロマトグラフィー緩衝液で溶出させた。0.15M酢酸アンモニウム緩衝液(pH5.0)20リットルを用いて、最後に0.5M酢酸アンモニウム緩衝液(pH5.0)20リットルを用いて、溶出を続けた。0.5M酢酸アンモニウム(22リットル)を用いて溶出させることによって得られた活性画分を、96%エタノール88リットル及び酢酸2400mlの溶液に、撹拌しながら加えた。混合物のpHは、5.7であった。得られた沈殿物を、終夜冷蔵庫(2〜8℃)中に放置した。沈殿物を遠心分離し、96%エタノールで洗浄し、17時間真空乾燥した。
【０１１３】
2つの同等のプロセスのそれぞれについて、それぞれ20.7g及び19.5gの2つの画分Fが得られた。
【０１１４】
1.2 画分Gの調製
前記工程で得られた2つの画分Fを一緒にし、前記技法に従ってカラムでクロマトグラフィー処理した。
【０１１５】
画分F 40.2gを、0.01M酢酸アンモニウム緩衝液(pH5.0)650ml中に溶解させた。カラムをこの溶液を用いて動作させ、同じ希釈緩衝液6350mlを用いて溶出させた。次に、0.05M酢酸アンモニウム(pH5.0)12リットルを用いて、次いで0.2M酢酸アンモニウム(pH5.0)10リットルを用いて溶出を続けた。後者の溶液で溶出された活性画分(4500ml)を、PM10(10000D)Diaflo Ultrafilters(Amicon-Millipore社)膜を使用する限外濾過プロセスに供した。50mMリン酸ナトリウム(pH5.7)に対して、溶液を濃縮及び透析して、緩衝液150ml中タンパク質2〜4gの濃度を得た。最終溶液(400ml)を、-75℃において凍結させた。
【０１１６】
画分Gを動物で生物学的に試験して、42.000IU/mlのFSH力価及び33.780IU/mlのLH力価を検出した。この結果を用いて、画分Gの溶液の一部(80ml)を、FSH及びLH(それぞれ、画分J2及びJ3)を分離する条件下で処理した。
【０１１７】
1.3 画分Jの調製
1)画分J2(FSH生物活性)及びJ3(LH生物活性)の調製
硫酸アンモニウムを、濃度1Mまで画分Gのアリコート(80ml)に加えた。この溶液をPhenyl- Sepharose HPクロマトグラフィーカラム中に流し、2容量の緩衝液、50mMリン酸ナトリウム、1M硫酸アンモニウム、pH5.1を用いて溶出させた。2容量の緩衝液、50mMリン酸ナトリウム、0.5M硫酸アンモニウム、pH5.1を用いて、最後に2容量の50mMリン酸緩衝液(60%v/v)及び96%エタノール(40%v/v)を用いて、溶出を続けた。
【０１１８】
緩衝液、50mMリン酸ナトリウム、0.5M硫酸アンモニウム、pH5を用いて溶出させたFSH生物活性画分(画分J2)を、PM 10膜限外濾過(Diaflo Ultrafilters、Amicon-Millipore社)を使用して50mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH5.7)に対して透析及び濃縮し、次いで-75℃において凍結させた。
【０１１９】
50mMリン酸ナトリウム緩衝液(60%v/v)及び96%エタノール(40%v/v)を用いて溶出させたLH生物活性画分(画分J3)を、PM 10膜限外濾過(Diaflo Ultrafilters、Amicon-Millipore社)を使用して50mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH5.7)に対して透析及び濃縮し、次いで-75℃において凍結させた。
【０１２０】
画分J3-UP
画分J3 50mgを40mMトリス緩衝液(pH8.5)に対して透析し、AKTA精製システムを使用してCapto-adhere(商標)(容量24ml)を用いて準備したXK16/40カラムに装填した。種々の工程の勾配を使用して、不純物を排除した。
【０１２１】
一連の緩衝液及び溶出容量は、以下の通りであった:
-  40mMトリス緩衝液(pH8.5)+0mM NaCl:1容量
-  40mMトリス緩衝液(pH8.5)+50mM NaCl:3容量
-  40mMトリス緩衝液(pH8.5)+100mM NaCl:3容量
-  40mMトリス緩衝液(pH8.5)+225mM NaCl:5容量
-  40mMトリス緩衝液(pH8.5)+300mM NaCl:5容量
-  40mMトリス緩衝液(pH8.5)+1000mM NaCl:3容量
【０１２２】
精製LH画分(画分J3-UP)は、40mMトリス緩衝液(pH8.5)+225mM NaCl緩衝液を用いて得た(図2)。クロマトグラムの曲線下の主要領域は、1000mM NaClで溶出するLH不活性タンパク質に相当する。225mM NaClによって溶出された低分子タンパク質ピーク中に回収されるLH生物活性は、高精製が達成されたことを強く示唆している。特異的LH生物活性を、バイオアッセイによって決定した[Table 1(表1)を参照のこと]。生物力価で6倍超の精製(LH 9,400IU/mg(タンパク質)からLH 58,300IU/mg(タンパク質)まで)が達成された。
【０１２３】
J3-UP画分中に回収されたLH生物力価によって決定される方法の収率は、約80%であった。
【０１２４】
HMG-UPを得るためのバランス工程
最後に、1:1のFSH:LH比を必要とするHMG-UPを生成するために、両ホルモンの含有量を調整するバランス工程を行った。画分J2からのFSH生物活性と画分J3-UPからのLH生物活性を同等量で混合した。混合溶液を、滅菌濾過し、ナノ濾過し、沈殿させた。
【０１２５】
結論
尿中HMG-HPは、夾雑物として非ゴナドトロピンタンパク質を依然として含有する。
【０１２６】
Capto-adhere(商標)樹脂を用いて行うマルチモーダルクロマトグラフィーを導入して、画分J3の夾雑タンパク質を効率的に除去し、画分J3-UPと称する画分を生成した。非ゴナドトロピンタンパク質、例えば、血漿セリンプロテアーゼインヒビター、アファミン、インスリン様成長因子結合タンパク質7、亜鉛-α2-糖タンパク質及びアルブミンが、前記精製方法の間に除去された。これらの不純物は、カラムに強く吸着されて、クロマトグラフィーの後半で溶出する。興味深いことに、画分J3-UPは、クロマトグラムにおいて曲線下の小さい領域を示し、これはLH生物活性の精製度が高いことを示している。
【０１２７】
Capto-adhere(商標)によって得られた画分J3-UPをアッセイして、そのLH生物力価を決定した。特異的なLH生物活性は、このホルモンが成功裏に精製されたことを裏付けている。この画分の生物力価はタンパク質mg当たりLH約58,300IUであった。これは、画分J3の活性(タンパク質mg当たりLH 9,400IU)と比較した場合に、このパラメーターの6倍超の増加に相当する。同様に、二次元電気泳動により、Capto-adhere(商標)によって得られた画分J3-UPの純度が高いことが裏付けられる。
【０１２８】
バランス工程において、画分J2(FSH生物活性画分)と画分J3-UP(LH生物活性画分)を混合することによって、HMG-UPが得られた。
【０１２９】
このHMG-UP材料は、FSH及びLH特異的生物力価の両方の有意な増加を示している。実際に、FSH及びLHの両方に関して、タンパク質mg当たり8,200IUもの高い値が得られた。これは、HMG-HP材料において測定された同じパラメーターと比較して、ほぼ175%の増加に相当する。
【０１３０】
2Dゲルのような高感度の技法によるクロマトグラフィーパターンの特性決定により、HMG-UPの純度グレードがより高く、他の検出可能な不純物を含まないことが裏付けられる。最後に、提示した製造方法は、工業規模で使用できる単一の単純なクロマトグラフィー法を導入して、尿中ゴナドトロピンの純度を増加させる。
【０１３１】
(参考文献)
0006647220.tif 000004
0006647220.tif 000005
【図１】
0006647220.tif 000006
【図２】
0006647220.tif 000007
【図３】
0006647220.tif 000008
【図４】
0006647220.tif 000009
【図５】
0006647220.tif 000010
【図６】
0006647220.tif 000011