(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
出産２回目以上のメスの非ヒト哺乳類の健康を向上させるための方法であって、
投与後に、前記健康の向上が生じるように、出産２回目以上のメスの非ヒト哺乳類に、分娩後に、有効量のインターロイキン-８(ＩＬ-８)を投与することを含み、
前記健康の向上が、産褥性子宮炎の発症の阻害、又はケトーシスの阻害、又はそれらの組み合わせを含む、方法。
【請求項２】
前記出産２回目以上のメスの非ヒト哺乳類が、分娩から２０週以内である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＩＬ-８の投与が子宮内投与又は膣内投与である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記出産２回目以上のメスの非ヒト哺乳類がウシ属の哺乳類である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記ウシ属の哺乳類が乳牛である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
メスの非ヒト哺乳類に、分娩後に、ＩＬ-８を投与すること、及び
前記メスの非ヒト哺乳類にＩＬ-８を投与した後に、前記メスの非ヒト哺乳類からミルクを得ること
を含む、ミルクの生産方法。
【請求項７】
請求項６の方法によって生産されたミルクから派生物を形成することを含む、ミルクの加工方法。
【請求項８】
請求項６の方法によって生産されたミルクを使用して、乳製品（例えば、チーズ、ヨーグルト、ミルクベースのクリーム、ミルクベースのクリーマー、アイスクリーム、または乳製品ベースのトッピング）を作ることを含む、乳製品の製造方法。
【請求項９】
請求項６の方法によって生産されたミルクを、別個の成分に分離することを含み、ここで、分離された成分の一つが乳脂肪を含むものである、ミルクの加工方法。
【請求項１０】
メスの非ヒト哺乳類の産乳量を増加させるため及び／又はメスの非ヒト哺乳類によって生産されるミルクの脂肪含有量を増加させるための方法であって、
投与後に、前記メスの非ヒト哺乳類の産乳量の増加及び／又は前記メスの非ヒト哺乳類によって生産されるミルクの脂肪含有量の増加が生じるように、前記メスの非ヒト哺乳類に、分娩後に、有効量のインターロイキン-８(ＩＬ-８)を投与することを含む方法。
【請求項１１】
前記ＩＬ−８の有効量が、０．００１μｇ〜１０ｍｇである、請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本願は、2015年1月5日に出願された米国特許出願62/099,643に基づく優先権を主張し、その開示は参照により本願に包含される。
【技術分野】
【０００２】
この開示は、一般に、インターロイキン-８(IL-8)を投与することによって、哺乳類における産乳量及びリプロダクティブ・ヘルス(性と生殖に関する健康)を改善することに関する。
【背景技術】
【０００３】
世界の人口が増加するにつれて、そしてさらに重要なことには、一人当たりの購買力平価が増加するにつれて、動物性タンパク質(ミルク、肉、及び卵)に対する需要は着実に且つ必然的に増加する；インフレ圧力を避けるために、動物性タンパク質製品の供給は、農地使用の最小限の拡張とともに、大きく且つ持続的に増加する必要がある。さらに、飼料効率が、カーボン・フットプリントの変動に寄与する唯一最大のファクターであることが報告され、且つ、飼料転換効率の改善が、腸内メタンと肥料産出量の減少の両方を通じて、温室効果ガス排出を減少できることが報告されている。子宮炎、子宮内膜炎、及び胎盤遺残のような分娩後子宮疾患は、動物福祉の理由から重要であり、分娩後子宮疾患は、雌ウシの不快感及び群れからの離脱；大きな影響を受ける繁殖成績に加えて、減少した産乳量及び治療コストの一因となる。子宮炎及び子宮内膜炎は、一般に、大腸菌、Ｔ.ピオゲネス、及びＦ.ネクロホラムを含む子宮の混合細菌感染と関連している(Bicalho et al., 2012)。子宮疾患への感受性を増加させる要因は、周産期に雌ウシが直面する免疫抑制である(Drackley, 1999; Cai et al., 1994; Kimura et al., 1999; Hammon et al., 2006; Galvao et al., 2010)。分娩後疾患の予防と治療のため、及び繁殖成績と産乳量を改善するための、改善されたアプローチに対する継続した満たされていない要求が存在する。本開示は、これらの及び他の要求に対処するものである。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
一面では、本開示は、メスの哺乳類による産乳量を改善するために、組換えIL-8を使用することを含む。IL-8の投与は、メスの哺乳類における、一以上の子宮疾患の予防及び／又は治療のため、及び高ケトン血症の予防又は治療のためにも行われる。
【０００５】
一実施形態では、本開示は、メスの哺乳類の健康を向上させるため、及び／又は、産乳量及び／又は哺乳類によって生産されるミルクの脂肪含有量を増加させるための方法を提供する。前記方法は、メスの哺乳類の健康が少なくとも改善されるように、及び／又は、前記哺乳類の乳量が増加及び／又はその乳中の脂肪含有量が増加するように、メスの哺乳類にIL-8を投与することを含む。
【０００６】
一実施形態では、IL-8は、妊娠中のメスの哺乳類に、又は、分娩後のメスの哺乳類(例えば、分娩から１２ヶ月以内)に投与される。一実施形態では、前記IL-8投与は、哺乳類における、子宮炎又は胎盤遺残の予防あるいは治療、又は高ケトン血症の抑制、又はそれらの組み合わせを伴う。複数の実施形態において、前記IL-8投与は、経口、非経口、皮下、粘膜内又は腹腔内で行われる。非経口投与には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、膣内、子宮内、及び皮下投与が含まれる。一実施形態では、IL-8の投与は、子宮内投与である。
【０００７】
様々な面では、本開示は、産褥性子宮炎の発症を阻害することによって、胎盤遺残を抑制することによって、哺乳類からの産乳量を増加させることによって(エネルギー補正乳量を含むが、これに限定されない)、又はメスの哺乳類によって生産されるミルクの脂肪含有量を増加させることによって、又はそれらの組み合わせによって、哺乳類の健康を改善することを提供する。
【０００８】
複数の実施形態において、メスの哺乳類は、ウシ属の哺乳類(例えば、乳牛)である。複数の実施形態において、メスの哺乳類は、同種のメスの哺乳類の集団の一員であり、IL-8投与は、前記集団の他のメンバーに行われる。
【０００９】
別の面では、本開示は、IL-8が投与されたメスの哺乳類によって生産されたミルク、及び、そのようなミルクを使用して製造された乳製品を含む。
【００１０】
別の面では、本開示は、ｉ)メスの哺乳類の健康を改善するため、及び／又はii)前記哺乳類によって生産される乳量及び／又は乳中の脂肪含有量を増加させるためのキットを含み、当該キットは、一以上の密封容器内のIL-8、送達装置、及び、上記ｉ)又はii)のためにメスの哺乳類にIL-8を導入する説明書を含む。前記送達装置は、非ヒト哺乳類の子宮内にIL-8を導入するために適したものとすることができる。
【００１１】
別の面では、本開示は、密封容器内のIL-8、パッケージ、及び印刷された情報を含む製品を含み、前記印刷された情報は、パッケージの中身がIL-8であることを示し、IL-8がメスの哺乳類の健康を改善するために、及び／又は、ii)哺乳類によって生産される乳量及び／又は乳中の脂肪含有量を増加させるために、使用されるものであることを表示する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
［図１］初産及び出産２回目以上の雌ウシの乳汁分泌週ごとの産乳量(kg/d)。エラーバーは、平均値の標準誤差を表す。総合的な産乳量は、コントロールの雌ウシと比べて、L-IL8及びH-IL8の雌ウシで高かった(Ｐ値＜0.01)。処置と乳汁分泌週の間の相互作用は有意ではなかった(Ｐ値＝0.06)。アスタリスク(*)は、週の平均が異なることを示す(Ｐ値＜0.05)。
【００１３】
［図２］乳汁分泌の最初の２か月間の脂肪補正乳量(kg/d)。総合的な脂肪補正乳量は、コントロールの雌ウシよりも、L-IL8、及びH-IL8の雌ウシで高かった(Ｐ値＝0.02)。処置と乳汁分泌月の間の相互作用は有意ではなかった(Ｐ値＝0.89)。エラーバーは、平均値の標準誤差を表す。
【００１４】
［図３］乳汁分泌の最初の２か月間のエネルギー補正乳量(kg/d)。総合的なエネルギー補正乳量は、コントロールの対応物と比較して、L-IL8、及びH-IL8の雌ウシで高かった(Ｐ値＝0.02)。処置と乳汁分泌月の間の相互作用は有意ではなかった(Ｐ値＝0.56)。エラーバーは、平均値の標準誤差を表す。
【００１５】
［図４］乳汁分泌の最初の２か月間の体細胞カウント・リニアスコア。総合的な体細胞カウント・リニアスコアは、処置によって影響されなかった(Ｐ値＝0.02)。処置と乳汁分泌月の間の相互作用は有意ではなかった(Ｐ値＝0.09)。エラーバーは、平均値の標準誤差を表す。
【００１６】
［図５］初産と出産２回目以上の雌ウシの産褥性子宮炎発症率(農場で診断)に対する処置の効果。
【００１７】
［図６］初産と出産２回目以上の雌ウシの臨床的子宮内膜炎発症率に対する処置の効果。
【００１８】
［図７］DIM(days in milk)ごとの、血液β-ヒドロキシブチレート(BHBA)濃度。総合的な血液BHBA濃度は、コントロール、L-IL8、及びH-IL8の雌ウシについて、それぞれ0.77μmol/L(95% CI＝0.65−0.90)、0.62μmol/L(95% CI＝0.50−0.74)、及び70μmol/L(95% CI＝0.58−0.82)であった(Ｐ値＝0.22)。処置とDIMの間の相互作用は有意ではなかった(Ｐ値＝0.66)。エラーバーは、平均値の標準誤差を表す。
【００１９】
［図８］DIMごとの血液IL-8濃度。総合的な血液IL-8濃度は、IL-8子宮内注入によって増加しなかった(Ｐ値＝0.17)。処置とDIMの間の相互作用は有意ではなかった(Ｐ値＝0.16)。エラーバーは、平均値の標準誤差を表す。
【００２０】
［図９］DIMごとの直腸温度。総合的な直腸温度は、治療群の間で異ならなかった(Ｐ値＝0.47)。処置とDIMの間の相互作用は有意ではなかった(Ｐ値＝0.13)。エラーバーは、平均値の標準誤差を表す。
【００２１】
［図１０］DIMごとの血液ハプトグロビンレベル。総合的な血液ハプトグロビンレベルは、IL-8子宮内注入によって増加しなかった(Ｐ値＝0.96)。処置とDIMの間の相互作用は有意ではなかった(Ｐ値＝0.48)。エラーバーは、平均値の標準誤差を表す。
【００２２】
［図１１］分娩の日から35DIMまでのボディ・コンディション・スコアの減少は、処置によって影響されなかった(Ｐ値＝0.99)。
【００２３】
［図１２］DIMごとの血液IGF-1濃度。総合的な血液IGF-1濃度は、IL-8子宮内注入によって増加しなかった(Ｐ値＝0.18)。処置とDIMの間の相互作用は有意ではなかった(Ｐ値＝0.25)。エラーバーは、平均値の標準誤差を表す。
【００２４】
［図１３］DIMごとの血清グルコース濃度。総合的な血清グルコース濃度は、IL-8子宮内注入によって増加しなかった(Ｐ値＝0.10)。処置とDIMの間の相互作用は有意ではなかった(Ｐ値＝0.55)。エラーバーは、平均値の標準誤差を表す。
【００２５】
［図１４］潜在性ケトーシス発症率に対する処置の効果。
【００２６】
［図１５］選択した動物種のIL-8の代表的なアミノ酸配列アラインメント。配列は、Ｎ末端からＣ末端で表示される。それぞれの種の配列とコンセンサス配列が、列を通じて近接している。ウシの配列は配列番号１、スイギュウの配列は配列番号４、アカシカの配列は配列番号５、ヒツジの配列は配列番号６、ウマは配列番号７、ヒトの配列は配列番号８、イヌの配列は配列番号９、ネコの配列は配列番号１０である。最終列に示される特異的哺乳類配列のコンセンサスは配列番号１１である。
【００２７】
［図１６］異なる子宮内IL-8処置量が、乳汁分泌の１ヶ月目及び２ヶ月目の乳脂肪パーセントへ与える影響。棒グラフは、１ヶ月目及び２ヶ月目について、左から右に、コントロール、低IL-8、中IL-8、及び高IL-8を示す。
【００２８】
［図１７］異なる子宮内IL-8処置量が、日々の産乳量に与える影響。
【００２９】
［図１８］異なる子宮内IL-8処置量が、毎週の産乳量に与える影響。
【００３０】
［図１９］異なる子宮内IL-8処置量が、3.5%脂肪補正乳に与える影響。棒グラフは、左から右に、コントロール、IL8-高、IL8-中、及びIL8-低を示す。
【００３１】
［図２０］異なる子宮内IL-8処置量が、エネルギー補正乳に与える影響。棒グラフは、左から右に、コントロール、IL8-高、IL8-中、及びIL8-低を示す。
【００３２】
［図２１］膣内IL-8投与が産乳量を有意に増加させることを示すデータのグラフ表示。IL-8は０日目に投与された。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
本開示は、一般に、有効量のIL-8を、メスの哺乳類の健康を改善する意図をもって、メスの哺乳類に投与することに関し、前記健康の改善には、一以上の子宮疾患及び／又は高ケトン血症の予防及び／又は治療、産乳量及び／又は乳中脂肪含有量の増加、及びそれらの組み合わせが含まれる。前記開示は、それゆえ、哺乳類による産乳量が増加するように、及び／又は哺乳類によって生産される乳中の脂肪含有量が増加するように、及び／又は哺乳類の子宮疾患が減少し及び／又は高ケトン血症が減少するように、有効量のIL-8を哺乳類に投与することを含む。複数の実施形態において、前記哺乳類によって生産される乳量は増加した。複数の実施形態において、子宮疾患の減少には、子宮内膜炎及び／又は産褥性子宮炎の減少、及び／又は胎盤遺残の減少が含まれるが、必ずしもこれらに限定されない。
【００３４】
子宮疾患に関して、当該分野で知られているように、子宮炎は通常、子宮壁の炎症を伴い、他方、子宮内膜炎は通常、子宮内膜の炎症を伴う。この関連で、IL-8の既知の機能のうちその炎症との関連性のため、外因的に投与されたIL-8が子宮の健康に有益な影響を及ぼすという本発見は、予見できないものであった。さらに、以下に記載するような、乳脂肪含有量と産乳量に対するIL-8の好ましい効果という思いがけない発見は、予期できないものであった。これらの発見を考慮すると、本開示の方法は、例えば、産乳量の増加、脂肪補正乳量の増加、エネルギー補正乳量の増加、胎盤遺残の発生率の減少、子宮炎、又は臨床的子宮内膜炎、又は産褥性子宮炎の発生率又は重症度の低下、又は分娩の際の哺乳類のボディ・コンディション・スコアの改善、ケトーシスの減少(高ケトン血症の減少を含むが、必ずしもこれに限定されない)、又は、直腸温度の低下、又はそれらの組み合わせによって証明されるように、メスの哺乳類の健康の増加をもたらす。このように、本開示は、メスの哺乳類の全体的な健康及び生殖機能を改善できる様々な方法を含む。
【００３５】
当業者は、エネルギー補正乳量(ECM)が、ミルク、脂肪及びタンパク質に基づく、且つ脂肪3.5%とタンパク質3.2%に調節された乳中のエネルギー量であることを理解するであろう。通常のECMの式は、ECM＝(0.327×ミルク[ポンド])＋(12.95×脂肪[ポンド])＋(7.65×タンパク質[ポンド])である。
【００３６】
本開示の方法は、いかなるメスの哺乳類にも適用できると予想される。複数の実施形態において、本開示は、獣医学のアプローチに関連し、それゆえ、この面では、非ヒト哺乳類に関連する。複数の実施形態において、IL-8を投与される非ヒトのメス哺乳類は、反芻動物(ウシ、ヒツジ、アンテロープ、シカ、キリン、及びそれらの近縁種を含むが、必ずしもそれらに限定されない、さらにラクダ科の動物のような仮性反芻動物[pseudoruminant]も含み得る)である。複数の実施形態において、前記反芻動物は、ウシ属(オックス、カウ、及びバッファローなど)のメンバーであるメスのウシ哺乳類である。一実施形態では、前記反芻動物は乳牛である。複数の実施形態において、前記乳牛は、初産の又は出産２回目以上の雌ウシである。複数の実施形態において、前記メスの哺乳類は有蹄動物である。
【００３７】
一実施形態では、本開示は、IL-8をイノシシ属のメンバーに投与することを含み、それゆえ、本発明をイノシシ属の動物で実施することを包含し、その例は、家畜ブタ(すなわち、Sus domesticus)に限定されず、一般にイノシシ属の動物(swine)又はイノシシ科の動物(hog)と呼ばれるものも含む。
【００３８】
本開示は、非-ウシ属の動物及び非-反芻動物の哺乳類(ウマ科の動物、イヌ科の動物、ネコ科の動物を含むが、必ずしもこれらに限定されない)に、IL-8を投与することも含む。複数の実施形態において、本開示は、IL-8を、水生の哺乳類、例えばクジラ目の哺乳類(例として、クジラ、イルカ及びネズミイルカが挙げられるが、必ずしもこれらに限定されない)に投与することを含む。このように、ある面において本発明は、コンパニオンアニマルにも、保護環境(例えば、動物園又は水族館)で飼われている動物にも関連する。
【００３９】
本明細書に記載されている方法はまた、例えば、乳量を増加させる目的又はその脂肪含有量を増加させることによって乳中の栄養価を増加させる目的のために、IL-8を人間女性に投与することによる、ヒトへの使用に適切であると予想される。
【００４０】
この開示の特定の実施は、特定の状況下でのIL-8投与を除外しうる。例えば、あるアプローチにおいて、IL-8投与は、IL-8投与後にその哺乳類からミルクを得る予定のない哺乳類には行われない。ある実施形態では、例えば乳牛へのIL-8投与後に得られたミルクは、ヒトの飲食に適している。このように、ある実施形態では、IL-8は、ミルクを得ることを目的とする及び／又はミルクを得る非ヒト哺乳類に投与され、そのミルクはヒトの飲食用であり、及び／又はヒトによって消費される。ある面では、本開示は、特定の種類の哺乳類へのIL-8投与を除外しうる。一例において、IL-8は、げっ歯類に投与されない。このように本開示は、げっ歯類(具体例として、マウス、ラット、モルモットが挙げられるが、これらに限定されない)を除く、全ての種類の哺乳類にIL-8を投与することを含む。別の例では、ヒト及び非-ヒト霊長類のどちらか又は両方を含む霊長類は、IL-8を投与される哺乳類のグループから除外されうる。一例では、IL-8を投与される哺乳類は、血栓症(深部静脈血栓症を含むが、これに限定されない)を有さない。ある実施形態では、本開示は、ある期間の間、IL-8投与を除外しうる。例えば、ある実施形態では、本開示は、受精、移植を促進する目的のために、又は子宮収縮を誘発する目的のために、妊娠の間のIL-8投与を除外することができる。ある面では、IL-8は、交尾後の急性炎症が、受胎に有益であり及び／又は受胎を促進する哺乳類の種には、投与されない。ある実施形態では、IL-8は、乳腺組織又は乳首への直接注入によって投与されることはなく、それゆえ、それらの実施形態において、IL-8投与は乳腺炎を誘発又は促進しない。
【００４１】
IL-8は、マクロファージを含む多数の異なる細胞タイプによって産生されるケモカインとして、当分野で周知である。それは、CXCL8とも呼ばれ、CXCR1及びCXCR2レセプターに特異的に結合する。それは、典型的には99個のアミノ酸(ヒトIL-8について)と最大で103個のアミノ酸(その他の種について)の間の前駆体タンパク質として産生され、切断されて活性なアイソフォームを生じる。ヒトマクロファージによって最も頻繁に分泌されるヒトIL-8の切断バージョンは、長さ72のアミノ酸である。これに関連して、本開示では、乳牛への組換えウシIL-8投与効果の代表的な例が提供されるが、任意の動物によって発現される任意のIL-8が、本発明の方法で使用可能と予測される。非限定的な実施形態では、前記IL-8は、組換えで産生されたウシIL-8であり、以下の配列又はそのフラグメントを含む：
MTSKLAVALL AAFLLSAALC EAAVLSRMST ELRCQCIKTH STPFHPKFIK ELRVIESGPH CENSEIIVKL TNGNEVCLNP KEKWVQKVVQ VFVKRAEKQD P(配列番号１)
【００４２】
複数の実施形態において、前記IL-8はプロセシングを受けた型であり、それゆえ前駆体IL-8配列より短い。複数の実施形態において、前記IL-8は長さが少なくとも70個のアミノ酸である。複数の実施形態において、本開示の方法で使用されるIL-8は、少なくとも70個の連続IL-8アミノ酸を有し、ここで、前記少なくとも70個のアミノ酸は、上記ウシ配列と、及び／又は図１５に示すコンセンサス配列(最終列のアラインメント)と、少なくとも70.0%の相同性を有する。複数の実施形態において、前記IL-8は、その70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、又は80以上の連続アミノ酸にわたる前記ウシ配列と、70〜100%同一である配列を含むか、当該配列からなる。複数の実施形態において、そのような配列同一性と長さは、そのＮ末端で始まる、又はそのＮ末端から任意のアミノ酸で始まる(アミノ酸位置２〜２５、この数値は包括的であり、その間にある各アミノ酸位置を含む)アミノ酸配列と比較したものである。複数の実施形態において、前記IL-8は、図１５に示す任意のアミノ酸配列の配列又はフラグメントを含むか、あるいはそれらからなる。一実施形態において、前記IL-8は、図１５に示すウシ配列(配列番号１)におけるELRからAARへの変化を含む。
【００４３】
本開示の方法で使用されるIL-8は、任意の適切なソースから得ることができる。一実施形態では、前記IL-8は、販売会社から商業的に入手できる。例えば、大腸菌で発現され、凍結乾燥粉末として提供されているヒトIL-8は、Sigma Aldrich社から入手できる。ウシIL-8は、ミネソタ州、セントポールにあるKingfisher Biotech社から入手できる。また、前記IL-8は、例えば、タンパク質発現系を使用することによって、当業者に周知の技術を使用して組換えで産生できる。
【００４４】
非限定的且つ説明のための実施形態において、IL-8は、以下のアプローチ、又は本開示の利益の下で当業者に自明であるその変法を使用して組換えで産生される。プラスミド構築：pET28-His-L-EK-IL8は、制限酵素部位NheI及びXhoIを使用して、Trc-His-L-EK-IL8からpET28Aへのサブクローニング(NOVAGEN、ダルムシュタット、ドイツ)によって構築された。元のTrcプラスミドは、以下のヌクレオチド；5’-C GGCGCC GTG CTG TCT CGT ATG TCC ACC GAA C(配列番号２)、及び5’-G CTCGAG TCA CGG ATC TTG TTT TTC TGC ACG(配列番号３)を使用して、コドン最適化ウシIL-8 cDNA ΔSSのPCR増幅によって構築された。PCR産物は、pGEM Tベクタークローン化TA(PROMEGA、マディソン、ウィスコンシン州)であり、ブルー・ホワイト・スクリーニングによって配列決定された。適切なクローンはその後、制限酵素SfoI及びXhoIで消化され、pTrcHis Bベクター(Invitrogen、カールズバッド、カリフォルニア州)に連結された。エンテロキナーゼ切断によるIL-8のネイティブ・バージョンを維持するために、Trcベクターは、BamHIで消化され、続いて、5'オーバーハングを除去し、ライゲーション用の平滑末端を作製するために、マングビーンヌクレアーゼで消化されて調製され、ベクターはその後、XhoIで消化された。最終構築物は配列決定によって確認された。
【００４５】
組換えIL-8の発現：IL-8のフルバージョン及び切断型(シグナルペプチド無し)のための大腸菌BL21の好ましい発現コンディションを決定するために、コード配列をpETベクターにクローン化し、時間経過パイロットを以下のように実施した。全ての増殖ステップは、３７℃・200rpmで、125エルレンマイヤー又はペトリ皿中に、300μg/mLのカナマイシンを含む、LBブロス又はプレートで、インキュベートすることにより行った。冷凍保存培養物(-80℃)を、20mLの培地で一晩再活性化した。翌日、増殖培養物0.4mLを40mLの新鮮培地に移し、O.D.600nmが達した際に1mLのIPTGを添加し、1mLのアリコートを、IPTG誘導前及び１時間間隔で４時間、取り除いた。各サンプルを５分間10,000 gで遠心分離し、ペレットを溶解バッファー(10 mMのTris-HCL；1 mMのEDTA；0.1 NのNaOH；0.5% SDS)で再懸濁した。続いて、不溶性タンパク質と細胞残屑を、4℃、13,000 gで10分間沈殿させた。上清を、ラエミリ(Laemmli)バッファー(63 mMのTris-HCL pH 6.8；10%グリセロール；2%SDS-電気泳動グレード、0.1%β-メルカプトエタノール、及び0.0005%ブロモフェノールブルー)とともに5分間煮沸し、12%SDS-ポリアクリルアミドゲルにかけた。電気泳動は、90分間80Vで行った。ゲルを染色液で30分間染色し、脱染液(Bio-Rad)で2時間脱染した(激しい振盪下)。我々は、大腸菌中で(pET28-His-LEK-IL8)IL8を発現させた。発現pET28-His-LEK-IL8は、部分的に可溶性であり精製に便利である。
【００４６】
本開示の方法で使用されるIL-8含有組成物は、多様な形態で提供されることができ、多様なルートで送達される。ヒト又は非ヒト哺乳類で使用するための組成物は、IL-8と、適切な薬学的に許容されるキャリア、賦形剤及び／又は安定剤を混合することによって調製できる。IL-8との混合に適切な組成物のいくつかの例は、レミントンの薬学の科学と実践(2005)、第21版(フィラデルフィア、ペンシルベニア州、Lippincott Williams & Wilkins)に記載されている。ある面では、IL-8は、哺乳類の餌に添加することができ、これによって、リプロダクティブ・ヘルス及び／又はミルクの生産をサポートするための食事性添加物として消費される。
【００４７】
IL-8含有組成物は、経口、非経口、皮下、腹腔内、肺内、及び鼻腔内投与を含む、任意の利用可能な方法及びルートを使用して哺乳類に投与できる。非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、膣内、子宮内、及び皮下投与が含まれる。前記組成物は粘膜内アプローチによって投与することもできる。IL-8の投与は、出生の前又は後に行うことができ、及び、妊娠中に行うことができる。
【００４８】
ある実施形態において、本明細書にさらに記載される条件に従って、IL-8を含有する組成物は、妊娠中の哺乳類に投与され、それゆえ分娩前の投与が行われる。あるアプローチでは、分娩前投与は、種によって異なる乳腺形成期間の間に、しかし妊娠の最後の第三期内に行われれる。非限定的な説明として、一実施形態では、ホルスタイン乳牛の妊娠期間は、２８０日である。それゆえ、理論によって拘束されることを意図しないが、約180日の妊娠期間以降のIL-8の投与は、乳腺の発達を助け、産後期に産乳量の増加をもたらすと考えられる。
【００４９】
一実施形態では、分娩前投与は、IL-8含有組成物の膣内投与を含む。一つの非限定的な例では、IL-8含有組成物の膣内投与は、妊娠中の哺乳類、例えば乳牛に投与される。
【００５０】
ある実施形態では、IL-8含有組成物は、最近出産した哺乳類に投与され、それゆえ分娩後投与が行われる。複数の実施形態において、分娩後の子宮内投与が行われる。一つの非限定的な例では、IL-8含有組成物の分娩後子宮内投与は、哺乳類、例えば乳牛に、出産の72時間以内(分娩後)に行われる。分娩後のより短い又はより長い時間内の投与も、本開示に含まれる。ある非限定的な例では、IL-8含有組成物は、分娩の直後、及び分娩後最大で20週までに投与される。それゆえ、あるアプローチでは、本開示は、分娩と同日、又は分娩から1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140日以内(包括的であり、その間の整数値の全ての範囲を含む)の投与を含む。
【００５１】
あるアプローチでは、本開示は、外因性のIL-8投与に代わる手段として、本明細書に記載の効果の一以上が生じるように、内因性IL-8産生を刺激することを含む。非限定的な例では、内因性IL-8産生の刺激には、哺乳類に一以上のIL-8刺激化合物及び／又は組成物−腫瘍壊死因子α(TNF-α)、リポ多糖類(LPS)、インターロイキン-１(IL-1)、血小板活性化因子(PAF)、及び／又は本開示の利益の下、本発明の実施形態で使用できる他の物質を含むが、必ずしもこれらに限定されない−を投与することが含まれる。
【００５２】
ある実施形態では、本開示は、以下のいずれか１つ又は任意の組み合わせが達成されるように、IL-8含有組成物を、一以上の哺乳類−その非限定的な例は乳牛(単数又は複数)である−に投与することを含む：ｉ)産乳量の増加；ii)エネルギー補正乳量の増加；iii)哺乳類によって生産される乳中の脂肪含有量の増加；iv)産褥性子宮炎の進行の減少、及び／又は複数の哺乳類にIL-8を投与した際の産褥性子宮炎の発生率の減少；ｖ)臨床的子宮内膜炎の進行の減少、及び／又は複数の哺乳類にIL-8を投与した際の臨床的子宮内膜炎の発生率の減少；vi)高ケトン血症の減少、例えば潜在性ケトーシスの減少、及び／又は複数の哺乳類にIL-8を投与した際の潜在性ケトーシスの発生率の減少、及びvii)胎盤遺残の抑制。複数の実施形態において、IL-8投与の前述の効果は、IL-8含有組成物の子宮内投与を行うことによって達成されるが、他の投与ルートも使用できると考えられる。
【００５３】
IL-8投与の結果として生じる前述の結果はいずれも、IL-8投与の効果を評価するための基準と比較できることが認識できるであろう。任意の適切な基準が使用でき、当業者は本開示の利益の下、適切な基準を認識できるであろう。複数の実施形態において、前記基準は、単一の値であっても、値域であってもよい。例えば、基準は検量線であっても、グラフのエリアであってもよい。前記基準は、ポジティブコントロール又はネガティブコントロールを含んでもよい。複数の実施形態において、前記基準は、IL-8が投与されなかった、又は異なる量のIL-8が投与された、又は異なるIL-8投薬スケジュールが使用された哺乳類から得たサンプルの測定値を含む。様々な面において、結果の測定は、結果の定性的又は定量的測定を提供するために基準(IL-8投与と正の又は負の相関関係にあってもよい)と比較することができる。ある実施形態では、基準との比較は、動物取扱又は動物試験に熟練している個人によって行われることができる。例えば、胎盤遺残と子宮炎は、当業界で既知の特定のプロトコルに従って、訓練された農場の職員によって診断されることができ、及び、適切な基準との直接比較が行われるか否かに関わらず、それらの個人は、非-胎盤遺残又は非-子宮炎状態と比較して判定を行うことができる。例えば、ある実施形態において、子宮排出物の変化、例えば、発熱を伴った、悪臭のする、水様の、赤褐色の子宮排出物の出現は、産褥性子宮炎の診断に使用することができ、そのような特徴を持つ子宮排出物を生じない分娩後の雌ウシは、産褥性子宮炎ではないと判定される。
【００５４】
本開示は、１又は２以上の哺乳類、例えば複数の又は集団の哺乳類にIL-8を投与することを含む。一実施形態では、前記複数の哺乳類は、例えば、任意の大きさの酪農場(数頭の乳牛〜何千もの乳牛を収容できる商業用の酪農場)に存在しうる乳牛の群れを含む。
【００５５】
本開示の実施例及び図で示される結果から分かるように、代表的な(しかし非限定的な)実験は、様々なIL-8量を有する子宮内及び膣内注入の使用による先に列挙した効果を実証する。特定の且つ非限定的な実施例では、本開示の様々な面は、9.5mg、1.125mg、0.095mg、0.0095mg、及び11.25μgの組換えIL-8を使用して実証される。それゆえ、本開示は、幅広い範囲のIL-8量が、これらの効果のいくつか又は全てを発揮できることを実証し、本開示の利益の下に、当業者は、任意の特定の哺乳類で所望の結果を得るために、IL-8投薬をどのように変更すべきか認識できるであろう。さらに、本開示は、9.5mgから、0.0095mgといった少量にわたるIL-8投与量が、乳脂肪率を統計的に有意に増加させることを実証する。従って、本開示は、有効量のIL-8を投与することを含み、その際、IL-8の有効量は、所望の結果をもたらす量である。一実施形態では、IL-8の量は、0.001μgから10mgであり、0.001μg単位までの間にある全ての整数及び量、及びその間にあるμg及びmgの全ての範囲を含む。複数の実施形態において、少なくとも11.25μgのIL-8が哺乳類に投与される。これに関連して、あるIL-8投与計画の形式と特徴は、投与ルート及び他の既知の要因によって、大きさ、健康状態、年齢、哺乳類種のタイプ、既出産の回数(もしあれば)、子宮又は他の関連疾患の既往歴、及び子宮疾患及び産乳量に関するリスクファクターのようなファクターを考慮して、指示される。一実施形態では、前記哺乳類は、例えば、子宮疾患のリスク又は子宮疾患にかかりやすい素因を有するため、又は、産乳量が少ないため、IL-8投与を受ける必要がある。複数の実施形態において、IL-8投与は、予防的又は治療的、あるいはその両方である。
【００５６】
本開示のIL-8組成物は、一度の又は一連の投与量で投与されることができ、哺乳類の総体的な健康を改善する目的の、あるいは本明細書に記載のIL-8が誘発する効果を促進又は増強する特定の目的のための他の化合物又は組成物と、同時に、又は連続的に投与されることができる。複数の実施形態において、IL-8投与は、抗生物質、ホルモン、又は成長因子と併用される。あるアプローチでは、IL-8は、単回投与でも、本明細書に記載の健康及び／又は産乳量に関する結果のいずれか一つ又はそれらの組み合わせについて、持続的な効果を生じる。
【００５７】
IL-8組成物の投与は、投与後の様々な期間に、産乳量の増加、及び／又は脂肪含有量の増加したミルクをもたらすことができる。所望の乳脂肪含有量は、適切な方法(そのいくつかは当分野で既知である)を使用して決定できる。例えば、乳脂肪含有量はいわゆるバブコック試験又はゲルベル法によって測定できる。複数の実施形態において、乳脂肪含有量は増加する。本開示は、組換えIL-8の子宮内及び膣内注入後に、乳牛から得られたミルク中の乳脂肪の増加を実証する。このように、あるアプローチでは、本開示は、脂肪分が増加したミルクの生産を刺激する方法を含み、及び、そのような方法によって生産されたミルクを含む。
【００５８】
ある面では、本開示は、コントロール(例えば、IL-8投与を受けなかった乳牛によって生産されたミルク中の乳脂肪量)と比べて、乳牛によって生産されるミルク中の乳脂肪を増加させることを含む。あるアプローチでは、乳脂肪の増加には、少なくとも0.01%〜0.5%の乳脂肪の増加(コントロールと比べて)が含まれ、前記値域は包括的であり、その間の少数第二位までの全ての数値、及び、そのような数値の全ての範囲を含む。あるアプローチでは、本開示の実施形態によって生産されるミルクは、少なくとも3.4%の乳脂肪を含み、3.4%〜4.4%の乳脂肪を含んでもよく、前記値域はその間に存在する少数第二位までの全ての数値、及び、そのような数値の全ての範囲を含む。あるアプローチでは、ミルクは、哺乳類から最初に得られたときに、そのような量の乳脂肪を含む。それゆえ、前述の量は、未加工のミルク中に存在し得る。
【００５９】
本開示の方法の実施は、ある実施形態において、哺乳類に、一定期間持続する一以上の効果を有する。例えば、我々は、単回のIL-8投与から11カ月の間、産乳量と、脂肪補正乳量及びエネルギー補正乳量の増加を実証した。ある実施形態では、IL-8投与は、IL-8投与後少なくとも1，2，3，4，5，6，7，8，9，10又は11カ月間の、産乳量の増加、脂肪補正及び／又はエネルギー補正乳量の増加、及び／又は乳脂肪含有量の増加をもたらす。より長い期間も包含される。あるアプローチでは、IL-8投与は、単一の授乳期、すなわち、IL-8が投与された直後の授乳期全体又はIL-8が投与された授乳期全体にわたる産乳量に、持続的な効果をもたらす。一例では、授乳期は、次の妊娠で終了する。非限定的な一つのアプローチにおいて、本開示は、本明細書に記載された乳含有量及び／又は産乳量に対する一以上の効果が、単一のIL-8投与が行われた後、少なくとも1，2，3，4，5，6，7，8，9，10又は11カ月間、又は単一のIL-8投与が行われた後の授乳期又は単一のIL-8投与が行われた授乳期の全体にわたって持続するような、単回投与のIL-8投与を含む。ある実施形態では、一以上のIL-8の効果は、IL-8投与の1，2，3，4，5，6又は7日目の期間内に始まり、その後、本明細書に記載のいずれかの期間持続しうる。
【００６０】
ある面では、本開示は、乳牛などの哺乳類によって生産される乳量の増加を含む。ある面では、産乳量の増加は、一日あたり少なくとも1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，又は12ポンドの乳量増加を含む。産乳量の増加は、コントロール(例えばIL-8を投与されていない乳牛)と比べて評価することができる。当業者は、本明細書に記載のIL-8が誘発する変化の値を、例えば、ある期間にわたる哺乳類の群から測定された平均値と見なすことができることを認識するであろう。
【００６１】
別の実施形態では、本開示は、上述のように、IL-8による処置を受けた哺乳類からミルクを得ることを含み、且つ、ミルクそれ自体も含む。この側面は、メスの哺乳類にIL-8を投与すること、投与後に生産されたミルクを収集することを含む。一実施形態では、このプロセスによって生産されたミルクは、増加した脂肪含有量(例えば、上述のような乳脂肪含有量)を有する点で、他の種類のミルクとは異なる。複数の実施形態において、IL-8で処置された哺乳類から得られたミルクを含む容器が提供される。容器は、消費者志向の容器など、例えばミルクカートン、又はより大きい容器、例えば、大だる、又は多量のミルクの船や航空便による輸送に適した又は他の輸送に適した容器等、いかなる容器でもよい。複数の実施形態において、本明細書に記載のプロセスで得られたミルクを使用して作られた製品が提供される。そのような製品の非限定的な例には、チーズ、ヨーグルト、ミルクベースのクリーム及びクリーマー、アイスクリーム、乳製品ベースのトッピング及び前記ミルクを用いて作られた他の乳製品が含まれる。それゆえ、複数の実施形態において、前記乳製品は、ミルクからの派生物、例えば、ミルクの分離成分の一以上(乳脂肪を含むが、これに限定されない)を含むことができる。したがって、前記ミルクは、様々な乳製品中に含ませるための乳成分を分離するために、加工されてもよい。本開示は、従来のアプローチを使用して、しかし従前に利用できたミルクを本開示のミルクに置き換えることによって、そのような製品を作ることを含む。
【００６２】
別の面では、本発明は、キットなどの製品を提供する。前記キットは、一以上の密封容器、すなわち、ガラス又はプラスチックのバイアル中にIL-8を含む医薬組成物を含むことができる。前記キットは、注射器、カテーテル又は他の送達装置を含むことができる。例えば、カテーテルの場合、それは人工授精(A.I.)カテーテル、例えば、ギルトA.I.カテーテル、又は同等のものであってもよい。前記キットは、袋、例えば、溶液を入れるのに適した及び哺乳類に溶液を導入する(例えば、膣内又は子宮内送達によって)ためのカテーテルとともに使用するのに適している袋なども含むことができる。前記キットは、任意で、その内容物を使用するための、紙又はコンピューター可読フォーマットのどちらかに記載された説明書を含んでもよい。前記キットは、例えば凍結乾燥形態のIL-8など、キャリアと混合されることを前提としたIL-8を含んでもよく、この場合、キットはさらに、哺乳類への投与のために、凍結乾燥IL-8をキャリア／溶液中で再構築するための説明書を含むことができる。例えば、前記キャリアは滅菌水、通常の生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水であってもよい。前記キャリアは、一以上の別個のバイアルで提供されてもよい。
【００６３】
別の面では、本開示は製品を含む。前記製品は、パッケージで提供されるIL-8を含む。前記パッケージは、容器を含んでもよく、又はそれ自体が容器であってもよい。任意の適切な容器、例えば、プラスチック又はガラス容器など(プラスチック又はガラスバイアルを含むが、これらに限定されない)が使用できる。様々な実施形態において、前記製品は印刷物を含む。前記印刷物は、パッケージの一部であってもよく、又はラベル上に提供されてもよく、あるいは紙の挿入物として、又はパッケージと共に含まれる他の資料として提供されてもよい。前記印刷物は、パッケージの中身がIL-8であることを示す情報を提供し、及び、本明細書に記載の哺乳類に対する効果のいずれか一つ又は任意の組み合わせを生じさせるための、IL-8の使い方を消費者に説明する。
【００６４】
先の記載を考慮して、且つ、いかなる特定の理論に拘束されることも意図しないが、本発明は、子宮疾患への感受性を増加させる要因が、分娩前後の期間に雌ウシが直面する免疫抑制であるという観察にある程度関係する(Drackley, 1999; Cai et al., 1994; Kimura et al., 1999; Hammon et al., 2006; Galvao et al., 2010)。好中球は、胎盤の排出(Kimura et al., 2002)、及び子宮(Hussain, 1989)と乳腺(Paape et al., 2002)感染後の細菌排出に関与する主な白血球種である。血中好中球の機能は、分娩前に低下し始め、分娩直後に最も低くなり、分娩後約４週間までに、分娩前のレベルまでゆっくりと戻る(Kehrli and Goff, 1989; Goff and Horst, 1997)。複数の要素、例えば分娩前後の血中エストラジオール及びコルチゾール濃度の増加、及び、ビタミンＡ及びＥ、カルシウム及びセレンなどの栄養素やミネラルの欠乏などが、好中球機能の損失の主な原因となりうる(Goff and Horst, 1997; Kimura et al., 2002; Hammon et al., 2006)。さらに、胎盤遺残(RP)を有する雌ウシの好中球も、遊走能力の低下、及びミエロペルオキシダーゼ活性の低下を示す(Kimura et al., 2002)。子宮内への好中球の流入が最も多い雌ウシは、細菌感染のリスクが低く、及び子宮内膜炎の発生率が低かった(Gilbert et al., 2007)。また、好中球の乳腺への遊走は、乳腺炎病原菌の排除に関与すると考えられている(Paape et al., 2002)。IL-8は、好中球の走化性因子である；IL-8は、好中球のレセプター(CXCR1とCXCR2)に結合し、好中球を活性化させ、走化性を刺激し、食作用と殺傷能力を増加させる(Mitchell et al., 2003)。好中球が子宮内膜の健康の維持に関与するため、子宮内へ好中球を選択的に誘引する適切な刺激が必要と考えられている。しかしながら、継続する炎症は、慢性子宮疾患の発症をもたらし、それは妊孕性を損ない、酪農の収益性を低下させる(Dubuc et al., 2011; Lima et al., 2013)。それゆえ、本発明は、一面では、炎症を促進することでも知られているIL-8を投与することによって、炎症と正に相関することが知られている子宮疾患の治療及び／又は予防を提供するための、直観に反したアプローチを提供する。これに関連して、理論に拘束されることは意図しないが、我々は、IL-8の投与が、その炎症促進性の性質にも関わらず、子宮内に好中球を補充し且つ活性化させるにも関わらず、子宮腔への好中球の早期流入、胎盤の早期剥離、早期の細菌汚染クリアランス、及び、最終的にはより健康なより繁殖力のある乳牛の形で正味のポジティブな結果をもたらすことができるかどうか、調査することによって、本発明を開発した。以下の実施例によって証明されるように、IL-8の投与は、より健康でより繁殖力のある乳牛をもたらし、且つ、予想外のことに、それらの産乳量及び乳中の脂肪含有量を向上させた。
【００６５】
以下の実施例は、本発明の特定の実施形態を説明するものであり、限定は意図していない。
【実施例１】
【００６６】
この実施例は、実施例２に記載のデータを作成するために使用した物質及び方法を説明する。
【００６７】
農場及び管理
【００６８】
この研究は、ニューヨーク州、イサカ近郊のカユガ郡にある大規模な商業用酪農場で実施された。この農場は、2×52-ストール・パラレルミルキングパーラーで、1日3回、3300頭のホルスタイン乳牛を搾乳していた。雌ウシは、マットレスで覆われ、固体肥料を敷き詰めたコンクリートのストールを有するフリーストール牛舎で飼育されていた。全ての雌ウシは、DMベースで約55%の飼料(コーンサイレージ、ヘイレージ、及び麦わら)及び45%の濃縮物(コーンミール、大豆ミール、キャノーラ、コットンシード、シトラスパルプ)からなるTMRを提供された。前記食餌は、650kgの重さで、45kgの3.5% FCMを生産する泌乳ホルスタイン乳牛用のNRC栄養所要量(NRC, 2001)に適合するか又は超えるように処方された。農場の繁殖管理は、プレシンク(Presynch)、オブシンク(Ovsynch)、レシンク(Resynch)及び発情期の検出の組み合わせを利用し、定時AIにより繁殖された雌ウシ(25〜30%)、及び、単に活動モニター(Alpro; DeLaval、カンザスシティー、ミズーリ州)による発情期の検出後に繁殖された雌ウシ(残り)を用いた。
【００６９】
研究設計、処置及びサンプル収集
【００７０】
合計217頭の若い雌ウシがこの研究に登録された。雌ウシは、出産数で分けられ、３つの処置−コントロール、低用量IL-8(L-IL8)、高用量IL-8(H-IL8)−の１つに無作為に割り当てられた。H-IL8とL-IL8に割り当てられた雌ウシは、1,125及び11.25μgの組換えIL-8をそれぞれ含む生理食塩水250mLを子宮内に注入された。IL-8は、上述した及び配列番号１の配列からなるpET28-His-LEK-IL8を使用して産生された。
【００７１】
コントロールの雌ウシは、プラセボとして250mLの生理食塩水を子宮内注入された。登録期間の間に利用できる全ての若い雌ウシがこの研究で使用された。無作為化は、乱数機能を使用し、the farm’s Dairy Comp 305 program(Valley Agricultural Software、トゥーレア、カリフォルニア州)にインポートされたエクセル(Microsoft、レドモンド、ワシントン州)で行われた。
【００７２】
処置は、研究チームによって、分娩後14時間以内に、以下のように行われた：雌ウシは拘束され、会陰部が洗浄され、70%エタノールで消毒された。その後、250mLの生理食塩水バッグ付きの無菌の"Gilt"A.I.カテーテル(Livestock concepts, Hawarden)が、頭側膣部に導入された。カテーテルが子宮内で操作され、先端部が子宮腔にさらされ、処置液が子宮内に注入された。スワブがカテーテルの先端部から採取され；それは、CHROMagar-E.coli(CHROMagar、パリ、フランス)で、３７℃にて好気的に培養された。
【００７３】
乳汁及び血液サンプルが、乳汁分泌の最初の4日間、60頭の雌ウシ(処置グループあたり20頭の雌ウシ)から採取された。血清サンプルを得るために、抗凝血剤無しのバキュテナー・チューブ及び20ゲージ62.54cmのバキュテナー・ニードル(Becton, Dickinson and Company、フランクリンレイクス、ニュージャージ州)を使用して、尾骨静脈／動脈から血液が採取された。全ての血液サンプルは、氷の上に乗せた状態で研究室に輸送され、4℃にて15分間、遠心分離機内で回転された(2000×g)；血清は収集され、-80℃で凍結された。
【００７４】
症例定義
【００７５】
胎盤遺残と子宮炎は、コーネル・ユニバーシティの「Ambulatory and Production Medicine Clinic」によってデザインされた特定のプロトコルに従って、熟練した農場の職員によって診断され処置された。分娩後、雌ウシは20 DIMまで同じ囲いの中で飼育された。この囲いは、農場の従業員によってモニターされ、雌ウシは、鈍麻や抑うつの徴候を示している場合は、詳細な身体検査にかけられた；熱を伴い、悪臭のする、水っぽい、赤褐色の子宮分泌物を伴う雌ウシは、産褥性子宮炎と診断され、農場の従業員によって治療された。農場の職員は、処置については知らされなかった。胎盤遺残は、雌ウシが分娩から24時間以内に胎膜を排出できなかった状態として定義された。
【００７６】
臨床的子宮内膜炎の評価は、研究者によって35±3 DIMに行われ、化膿性あるいは粘液膿性の分泌物の存在として定義され、Metricheck device(Metricheck, SimcroTech、ハミルトン、ニュージーランド)を使用して膣粘液を回収することによって、行われた。膣分泌物は、修正０〜５スケールを使用してスコア化された(０＝回収された分泌物無し、１＝クリアな粘液、２＝膣分泌物中に膿汁の斑点、３＝膣分泌物中に膿汁５０％未満、４＝膣分泌物中に膿汁５０％以上、５＝水っぽく悪臭のする膣分泌物)。スコア３以上の雌ウシは、臨床的子宮内膜炎とみなされた。
【００７７】
直腸温度は、斜角探触子(11.5 cm、42o)を備えたデジタル温度計(GLA M750, GLA Agriculture Electronics、カリフォルニア州)を使用して、登録時、3，6及び9 DIMに測定された。ボディ・コンディション・スコアは、上述したように、クォーター・ポイントシステム(Edmonson et al., 1989)による５ポイントスケールを使用して、一人の研究者によって、登録時と35 DIMに記録された。ボディ・コンディション・スコアの減少は、登録時と35 DIMのBCS間の差と定義された。
【００７８】
仔ウシ(メス、オス、双子、及び死産)、補助分娩、分娩時の妊娠期間の日数、産乳量及び体細胞計数に関するデータは、farm's Dairy Comp 305データベース(Valley Agricultural Software、トゥーレア、カリフォルニア州)から抽出した。
【００７９】
血液及び乳汁パラメータ
【００８０】
血清及び乳汁サンプルのIL-8濃度は、ウシでの使用が検証されたヒトIL-8 ELISAキット(R&D Systems Inc.、ミネアポリス、ミネソタ州)を使用して測定された。血清サンプルは、動物での使用が検証済みの電子BHBA測定システム(Precision Xtra, Abbott、アビンドン、英国)を使用して、BHBA濃度についても試験された。乳汁分泌の最初の４日間の少なくとも１日に、1.2μmol/Lを超えるBHBAで試験された雌ウシは、潜在性ケトーシスを有すると見なされた。血清グルコース濃度は、携帯型のglucometer(Accu-Check Active, Roche Diagnostics、インディアナポリス、インディアナ)を使用して測定された。血清IGF-1濃度は、ヒトIGF-1 ELISAキット(R&D Systems Inc.、ミネアポリス、ミネソタ州)を使用して測定された。
【００８１】
血清ハプトグロビンレベルは、ペルオキシダーゼ活性の推定差によってハプトグロビン/ヘモグロビン複合体を測定する、比色分析法を使用して測定された。手短に説明すると、5μLの血漿又は蒸留水(ブランク測定用)を、ホウケイ酸管内の7.5mLのO-ジアニジン溶液(蒸留水中に、0.6 g/LのO-ジアニジン、0.5 g/LのEDTA、及び13.8 g/Lのリン酸二水素ナトリウムを含む；pHは4.1に調節)に添加した。ヘモグロビン溶液(蒸留水中、0.3 g/Lのウシヘモグロビンを含む)25μLをすぐに各管に添加した。全ての管を、37℃に設定した水浴中で45分間インキュベートした。インキュベーション後、100μLの新たに調製した作用濃度156mMの過酸化水素溶液を各管に添加した。全ての管を、室温で１時間インキュベートした。インキュベーション後、各管の200μLを、96ウェル・ポリスチレン平底マイクロプレートの１ウェルに移し、光学密度(OD)を直ちにマイクロプレート・リーダー(BioTek Instruments, Model EL 340、ウィヌースキー、バーモント州)で450nmで読み取った。ブランク・サンプルのODを、全ての血漿含有サンプルのODから差し引いた。結果は、使用した方法が検量線を含まない場合は、波長450nmの光学密度測定値として報告した。
【００８２】
統計分析
【００８３】
記述統計学分析は、連続及びカテゴリーデータのためにANOVAとカイ二乗機能をそれぞれ使用するJMP[登録商標]PRO 10で行われた。10の混合一般線形モデルを、SAS(SAS Institute)のMIXED手順を使用してデータに適合させた。この研究で評価された従属変数は以下の通りである：平均一日乳量(kg/d)、平均脂肪補正乳量(kg/d)、平均一日エネルギー補正乳量(kg/d)、SCC線形スコア、血液BHBA濃度(μmol/L)、血液IL-8濃度(pg/ml)、血液ハプトグロビン、血液IGF-1濃度(ng/ml)、血清グルコース濃度(mg/dL)、及び直腸温度(℃)。データは、以下に示す各従属変数の一連の反復測定を含んだ；平均一日乳量のために、乳汁分泌の最初の8週間；平均脂肪補正乳量、平均一日エネルギー補正乳量、及びSCC線形スコアのために、乳汁分泌の最初の2ヶ月；血液BHBA濃度、血液IL-8濃度、血液ハプトグロビン、血液IGF-1濃度、血清グルコース濃度のために、乳汁分泌の最初の4日間、直腸温度のために、分娩後3，6，9日目。雌ウシ内の相関性を適切に説明するために、誤差項は、全ての統計モデル(反復測定の雌ウシ内の相関性が想定されている)に一次自己回帰共分散構造を課すことによってモデル化した。モデルに適用される独立変数は以下の通りである：処置、出産数、登録時の胎盤の存在、大腸菌子宮内培養結果、補助分娩、仔ウシ、分娩時のボディ・コンディション・スコア、分娩時の妊娠期間の日数、登録時の体温、及びデータ収集時間。生物学的に妥当な二方向及び三方向相互作用が、モデルに提供された。さらに、全てのモデルにおける変数及びそれぞれの相互作用項は、Ｐ値＜0.10の時にモデルに保持された。可変処置は全てのモデルに強制された。
【００８４】
産褥性子宮炎、臨床的子宮内膜炎、及び潜在性ケトーシスのオッズに対する処置の効果を評価するために、三混合ロジスティック回帰分析が、SASのGLIMMIX手順を使用して、データに当てはめられた。前記モデルは、処置、出産数、登録時の胎盤の存在、大腸菌子宮内培養結果、補助分娩、仔ウシ、分娩時のボディ・コンディション・スコア、分娩時の妊娠期間の日数、及び登録時の体温に関する固定効果を含んだ。生物学的に妥当な二方向及び三方向相互作用が、モデルに提供された。さらに、全てのモデルにおける変数及びそれぞれの相互作用項は、Ｐ値＜0.10の時にモデルで保持された。可変処置、出産数、出産数と処置の間の相互作用項は、全てのモデルに強制された。出産数と処置の間の相互作用項の異なる濃度での層別オッズ比パラメーターを得るために、GLIMMIX手順(二極分布)のlsmeansオプションを使用した。Ｐ値は、チューキーHSD検定を使用して多重比較のために調節された。乳汁サンプル中に検出可能なレベルのIL-8を含む雌ウシの比率、産褥性子宮炎、臨床的子宮内膜炎、及び潜在性ケトーシスの発生率を評価するために、JMP(登録商標)PRO 10のカイ二乗機能が使用された。
【実施例２】
【００８５】
本実施例は、実施例１に記載の物質及び方法を使用して得られた結果を提示する。
【００８６】
出産２回目以上及び初産の登録動物の数、子宮内大腸菌培養が陽性であった登録動物の数、登録時に胎盤が存在している登録動物の数、分娩を補助された登録動物の数、メス、オス、双子又は死産の仔ウシを生んだ登録動物の数、分娩時の妊娠期間の平均日数、分娩時の平均ボディ・コンディション・スコア、及び登録時の平均直腸温度に関する記述統計学を表１に示す。
【表１】
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【００８７】
初産及び出産２回目以上の雌ウシの、乳汁分泌週ごとの産乳量に対する処置の効果を図１に示す。全体的な産乳量は、IL-8処置雌ウシでより多かった；コントロール、L-IL8、及びH-IL8雌ウシで、それぞれ33.1 kg/d(95% CI＝32.0−34.2)、35.6 kg/d(95% CI＝34.5−36.7)、及び35.9 kg/d(95% CI＝34.9−37.0)(Ｐ値＜0.01)。変数である、出産数、仔ウシ、分娩時の妊娠期間の平均日数、登録時の直腸温度、乳汁分泌週は、前記モデルで保持された。処置と乳汁分泌週の間の相互作用は有意ではなかった(Ｐ値＝0.06)。
【００８８】
乳汁分泌の最初の２ヶ月間の脂肪補正乳量に対する処置の効果を図２に示す。全体的な脂肪補正乳量は、IL-8処置雌ウシでより高かった；コントロール、L-IL8、及びH-IL8雌ウシで、それぞれ34.2 kg/d(95% CI＝32.6−35.7)、37.1 kg/d(95% CI＝35.7−38.5)、及び36.6 kg/d(95% CI＝35.0−38.1)(Ｐ値＝0.02)。変数である、出産数、分娩時のボディ・コンディション・スコア、分娩時の妊娠期間の平均日数、登録時の直腸温度、乳汁分泌月は、前記モデルで保持された。処置と乳汁分泌月の間の相互作用は有意ではなかった(Ｐ値＝0.89)。
【００８９】
乳汁分泌の最初の２ヶ月間のエネルギー補正乳量に対する処置の効果を図３に示す。全体的なエネルギー補正乳量は、IL-8処置雌ウシでより高かった；コントロール、L-IL8、及びH-IL8雌ウシで、それぞれ32.8 kg/d(95% CI＝30.9−34.6)、35.7 kg/d(95% CI =34.0−37.3)、及び36.2 kg/d(95% CI＝34.3−38.1)(Ｐ値＝0.02)。変数である、出産数、分娩時のボディ・コンディション・スコア、分娩時の妊娠期間の平均日数、乳汁分泌月は、前記モデルで保持された。処置と乳汁分泌月の間の相互作用は有意ではなかった(Ｐ値＝0.56)。
【００９０】
乳汁分泌の最初の２ヶ月間のSCCリニアスコアに対する処置の効果を図４に示す。全体的な体細胞カウント・リニアスコアは、処置グループ間で異ならなかった；コントロール、L-IL8、及びH-IL8雌ウシで、それぞれ2.46(95% CI＝1.64−3.28)、2.44(95% CI =1.66−3.23)、及び2.48(95% CI＝1.65−3.31)(Ｐ値＝0.99)。変数である、補助分娩、及び乳汁分泌月は、前記モデルで保持された。処置と乳汁分泌月の間の相互作用は有意ではなかった(Ｐ値＝0.09)。
【００９１】
農場で診断された産褥性子宮炎の発生率に対する処置の効果は、出産数に依存した(図５に示す)。処置と出産数の間の相互作用は有意であった(Ｐ値＜0.01)。初産動物では、H-IL8雌ウシは、コントロール雌ウシと比較して産褥性子宮炎を有するオッズが7.43高く(Ｐ値＝0.03)、一方、L-IL8雌ウシとコントロール雌ウシの産褥性子宮炎を有するオッズは異ならなかった(Ｐ値＝0.27)。他方、出産２回目以上の動物では、子宮内IL-8処置は、産褥性子宮炎に対する防御効果を有した；コントロール雌ウシは、L-IL8及びH-IL8雌ウシよりも、産褥性子宮炎を有するオッズが、それぞれ7.14(Ｐ値＝0.02)及び5.88(Ｐ値＝0.02)高くなった。非限定的な一実施形態では、本開示は、出産２回目以上の動物における産褥性子宮炎の予防に関する。臨床的子宮内膜炎発生率に対する処置の効果を図６に示す。IL-8の子宮内注入は、臨床的子宮内膜炎に対して防御的ではなかった(Ｐ値＝0.73)。
【００９２】
全体的な血液BHBA濃度は、コントロール、L-IL8、及びH-IL8雌ウシで、それぞれ0.77μmol/L(95% CI＝0.65−0.90)、0.62μmol/L(95% CI =0.50−0.74)、及び70μmol/L(95% CI＝0.58−0.82)であった(Ｐ値＝0.22)。さらに、処置とDIMの間の相互作用は有意ではなかった(Ｐ値＝0.66、図７)。
【００９３】
全体的な血液IL-8濃度は、コントロール、L-IL8、及びH-IL8雌ウシで、それぞれ235.0 pg/ml(95% CI＝193.9−276.0)、275.5 pg/ml(95% CI =233.7−317.4)、及び287.5 pg/ml(95% CI＝246.0−329.0)であった(Ｐ値＝0.17、図８)。変数である、登録時の直腸温度及びDIMは前記モデルで保持された。処置とDIMの間の相互作用は有意でなかった(Ｐ値＝0.16)。
【００９４】
IL-8濃度を試験した乳汁サンプルのほとんどは、使用したアッセイの検出限界未満の濃度を有した(1.5 pg/ml)。試験した182のサンプル全てのうち、13.7%(25サンプル)のみが、検出限界を超えるIL-8濃度を有した。それゆえ、IL-8の子宮内注入によるこのサイトカインの乳汁濃度に対する影響は、ほとんど推測されない。処置前に集めたサンプルが検出限界を超えるIL-8濃度を有する比率は、コントロール、L-IL8、及びH-IL8で、それぞれ40.0%、43.0%、及び23.5%であった(Ｐ値＝0.10)。処置後に集めたサンプルがアッセイの検出限界を超えるIL-8濃度を有する比率は、コントロール、L-IL8、及びH-IL8で、それぞれ2.2%、20.0%、及び0.0%であった(Ｐ値＜0.01)。
【００９５】
全体的な直腸温度は、コントロール、L-IL8、及びH-IL8雌ウシで、それぞれ38.8℃(95% CI＝38.7−38.9)、38.8℃(95% CI＝38.8−38.9)、及び38.8℃(95% CI＝38.8−38.9)(Ｐ値＝0.47、図９)であった。変数である、登録時の胎盤、分娩時のボディ・コンディション・スコア、分娩時の妊娠期間の日数、及びDIMは、前記モデルで保持された。処置とDIMの間の相互作用は有意ではなかった(Ｐ値＝0.13)。6 DIMで、コントロール雌ウシは、H-IL8雌ウシと比べて直腸温度が低かった(Ｐ値＝0.02)。
【００９６】
分娩後最初の４日間のハプトグロビンレベルは、処置によって影響を受けなかった(図１０)。全体的なハプトグロビンレベルは、コントロール、L-IL8、及びH-IL8雌ウシで、それぞれ0.13(95% CI＝0.11−0.16)、0.13(95% CI＝0.11−0.16)、及び0.13(95% CI＝0.11−0.15) (Ｐ値＝0.96)であった。変数である、出産数、仔ウシ、及びDIMは、前記モデルで保持された。処置とDIMの間の相互作用は有意ではなかった(Ｐ値＝0.48)。
【００９７】
処置は、分娩の日から35 DIMまでの、ボディ・コンディション・スコアの減少に影響を与えなかった(図１１)。平均ボディ・コンディション・スコアの減少は、コントロール、L-IL8、及びH-IL8雌ウシで、それぞれ0.23(95%CI＝0.15−0.30)、0.23(95% CI＝0.16−0.30)、及び0.23(95% CI＝0.16−0.31) (Ｐ値＝0.99)であった。変数である出産数は、前記モデルで保持された。
【００９８】
全体的なIGF-1血清濃度は、コントロール、L-IL8、及びH-IL8雌ウシで、それぞれ149.9 ng/ml(95% CI＝133.2−166.5)、172.0 ng/ml(95% CI＝153.6−190.4)、及び153.9 ng/ml(95% CI＝136.5−171.4)であった(Ｐ値＝0.18、図１２)。変数であるDIMは、前記モデルで保持された。処置とDIMの間の相互作用は有意ではなかった(Ｐ値＝0.25)。しかしながら、L-IL8雌ウシは、分娩後1日目(Ｐ値＝0.09)、2日目(Ｐ値＝0.01)、3日目(Ｐ値＝0.08)に、より高い血液IGF-1濃度を有するか、あるいは有する傾向があった。
【００９９】
全体的な血清グルコース濃度は、コントロール、L-IL8、及びH-IL8雌ウシで、それぞれ218.5 mg/dl(95% CI＝195.2−241.8)、220.5 mg/dl(95% CI＝196.7−244.3)、及び241.6 mg/dl(95% CI＝218.6−264.5)であった(Ｐ値＝0.11、図１３)。変数である、出産数、仔ウシ、及びDIMは、前記モデルで保持された。処置とDIMの間の相互作用は有意ではなかった(Ｐ値＝0.53)。
【０１００】
潜在性ケトーシス発生率に対する処置の効果を図１４に示す。L-IL8処置は、潜在性ケトーシスに対して防御効果を有した：コントロール雌ウシは、L-IL8雌ウシより潜在性ケトーシスを有するオッズが8.04高かった(Ｐ値＝0.02)。しかしながら、潜在性ケトーシスの発生率は、コントロールとH-IL8雌ウシの間で異ならなかった(Ｐ値＝0.30)。
【実施例３】
【０１０１】
本実施例は、先の実施例１及び２に記載したアプローチを再現し、さらに、より広い範囲のrIL-8用量が、産乳量及び乳含量を改善するのに有効であることを実証する。この研究も、ニューヨーク州、カユガ郡にある商業用酪農場で実施された。合計341頭の若い雌ウシがこの研究に、116日間登録された。分娩の12時間以内に、雌ウシは、9.5mgのrIL-8(高IL-8、n＝86)、0.095mgのrIL-8(中IL-8；n＝82)、0.0095mgのrIL8(低IL8；n＝88) の子宮内注入を受けるため、又は処置無し(コントロール；n＝85)に無作為に割り当てられた。分娩後の雌ウシは、分娩後１２時間以内に処置を受けた。雌ウシは、ヘッドロック・ステーションで拘束され、会陰部がエタノール(70% v/v)で消毒された。各用量のrIL8を含む250mLの生理食塩水バッグに取り付けられた無菌のギルト人工授精カテーテル(Livestock Concepts Inc.、ハワーデン、アイオワ州)が、頭側膣部に導入され、子宮頚部を通じて操作され、処置液が子宮腔に注入された。産乳量は、日ベースで及び月ベースで記録され、乳汁サンプルは、乳成分評価(タンパク質と乳脂肪)のために研究所(DairyOne、イサカ、ニューヨーク州)に提出された。エネルギー補正乳量及び3.5%脂肪補正乳量が算出され、本明細書で報告される。
【０１０２】
rIL8処置は、処置量にかかわらず、乳脂肪率を増加させた(図１６)。rIL8処置は、日々の乳量(図１７)、週ごとの乳量(図１８)、3.5%脂肪補正乳量(図１９)、及びエネルギー補正乳量(図２０)も増加させた。この結果は、実施例１及び２に記載の実験から得られた結果と一致し、rIL8処置雌ウシが、コントロールと比べて、一日あたり平均１０ポンド多いミルクを産出したことを示す。
【実施例４】
【０１０３】
本実施例は、膣内IL-8投与を実証する。図２１に要約したデータを得るために、合計で60頭の雌ウシが、プラセボ処理(無菌生理食塩水；n＝30)、又は1.125 mgのrIL-8(n＝30)を受けるために無作為に割り当てられた。処置とプラセボは膣内投与された。登録雌ウシは、分娩後３０〜８０日(授乳後期)であった。図２１から分かるように、膣内IL-8処置は産乳量を有意に増加させた。
【０１０４】
本発明を、特定の実施形態を通じて説明してきたが、通常の変更は当業者に自明であり、そのような修正は本発明の範囲内である。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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