(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の化１で表示されるアモジアキン（ａｍｏｄｉａｑｕｉｎｅ）またはその薬剤学的に許容可能な塩を有効成分として含有し、ＰＰＡＲ−γ（Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｇａｍｍａ）の活性化に反応する第２型糖尿病、およびＰＰＡＲ−α（Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ａｌｐｈａ）の活性化に反応する肥満、異常脂質血症、心血管系疾患、及び脂肪肝の群から選ばれる１以上の予防または治療用薬学的組成物。
【化１】
0006637987.tif 000007
【請求項２】
前記組成物の一日投与量は、８ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇであることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記異常脂質血症は、高脂血症（ｈｙｐｅｒｌｉｐｉｄｅｍｉａ）、高中性脂肪血症（Ｈｙｐｅｒｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅｍｉａ）、および高コレステロール血症（ｈｙｐｅｒｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｅｍｉａ）よりなる群から選択された一つ以上であることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
下記の化２で表示されるアモジアキン（ａｍｏｄｉａｑｕｉｎｅ）またはその薬剤学的に許容可能な塩を有効成分として含有し、ＰＰＡＲ−γ（Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｇａｍｍａ）の活性化に反応する第２型糖尿病、およびＰＰＡＲ−α（Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ａｌｐｈａ）の活性化に反応する肥満、異常脂質血症、心血管系疾患、及び脂肪肝の群から選ばれる１以上の予防または改善用健康機能食品組成物。
【化２】
0006637987.tif 000008
【請求項５】
前記異常脂質血症は、高脂血症（ｈｙｐｅｒｌｉｐｉｄｅｍｉａ）、高中性脂肪血症（Ｈｙｐｅｒｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅｍｉａ）、および高コレステロール血症（ｈｙｐｅｒｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｅｍｉａ）よりなる群から選択された一つ以上であることを特徴とする請求項４に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＰＰＡＲ−γ（Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｇａｍｍａ）およびＰＰＡＲ−α（Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ａｌｐｈａ）の両方を活性化させるアモジアキン（ａｍｏｄｉａｑｕｉｎｅ）を有効成分として含有する代謝性疾患の予防、改善、または治療用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
韓国人の食生活文化が次第に西欧化されていて、これと関連して代謝性疾患が増加している。代表的な代謝性疾患の一つが糖尿病である。糖尿病というのは、すい臓のベータ細胞で分泌される糖（ｇｌｕｃｏｓｅ）調節ホルモンであるインスリンが、体内で要求する量を生成しないか、インスリンが細胞に正確に作用しないため、血液中のブドウ糖がエネルギーとして利用されず、血液中に蓄積され、高血糖を誘発し、尿中に糖が検出される症状をいう。一般的に、糖尿病は、治療のためにインスリンが必須的に要求されるか否かによって、インスリン依存型糖尿病（第１型糖尿病）と、インスリン非依存型糖尿病（第２型糖尿病）とに区分される。第２型糖尿病は、インスリン非依存性糖尿であって、インスリン抵抗性によりインスリン作用が充分でないか、インスリンが相対的に不足して発病し、全体糖尿病患者の９０％が第２型糖尿に属し、主に３０代以後に発病するので、成人型糖尿病とも言う。
【０００３】
糖尿が長期間持続されると、体内ブドウ糖の吸収が正常に起きないため、糖質代謝および脂質代謝、そして蛋白質代謝の異常を招き、高インスリン血症、神経合併症、糖尿性網膜症（非増殖性網膜症、増殖性網膜症、糖尿性白内障）、腎不全症、性機能障害、皮膚疾患（アレルギー）、高血圧、動脈硬化症、脳卒中（中風）、心臓病（心筋梗塞症、狭心症、心臓まひ）、壊疽のような色々な糖尿合併症が発病する。したがって、第２型糖尿病の多様な原因と病因を理解し、改善法案を設けるために、国内外的にブドウ糖の移送および代謝過程、インスリン信号伝達体系などに関する研究が活発に行われているが、まだ根源的に治療できる薬品を開発していないことが現況である。
【０００４】
現在知られた第２型糖尿病治療剤は、大きく、４種類に分類できるが、インスリンの分泌を誘導するスルホニルウレア（ｓｕｌｆｏｎｙｌｕｒｅａｓ）系薬品、筋肉細胞に糖を移動させ、肝で糖の合成を抑制する効果を示すビグアニド（ｂｉｇｕａｎｉｄｅｓ）系、小腸でブドウ糖を作る酵素を抑制させるアルファ−グルコシダーゼ（α−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ）阻害剤、脂肪細胞の分化に関係するＰＰＡＲ（Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）−γを活性化させるチアゾリジンジオン（ＴＺＤ、ｔｈｉａｚｏｌｉｄｉｎｅｄｉｏｎｅ）系薬品などがある。しかし、このような経口用血糖降下剤薬品は、低血糖症誘発（スルホニルウレア系薬品）、腎臓毒性（ビグアニド系薬品）、乳酸アシドーシス（ビグアニド系薬品）、下痢と食もたれ（アルファ−グルコシダーゼ阻害剤）等多くの副作用を伴う。
【０００５】
なお、ペルオキシゾーム（Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ）は、このような代謝機能異常の原因になる細胞内小器官の一つであって、酸素、ブドウ糖、脂質、およびホルモンの代謝において重要な役目をし、細胞増殖および分化の調節、炎症媒介体の調節にも幅広く影響を及ぼす。また、ペルオキシゾームは、脂質代謝とブドウ糖代謝を通じてインスリン感受性だけでなく、細胞膜と肥満細胞の形成に影響を与え、酸化的ストレスに影響を与え、老化および腫瘍の発生において重要な役目をする。ペルオキシゾーム増殖体活性化受容体（Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：ＰＰＡＲ）は、リガンド（Ｌｉｇｎａｄ）結合により遺伝子発現を調節する核受容体の一つであって、色々な脂肪酸が内因性リガンドとして作用する。現在明らかにされたＰＰＡＲは、ペルオキシゾーム増殖体活性化受容体アルファ（ＰＰＡＲ−α）、ペルオキシゾーム増殖体活性化受容体ベータ／デルタ（ＰＰＡＲ−β／δ）、およびペルオキシゾーム増殖体活性化受容体ガンマ（ＰＰＡＲ−γ）がある。
【０００６】
ＰＰＡＲ−γは、脂肪組織で最も多く発見され、その他、血管内皮、大食細胞、およびすい臓のβ細胞で発見され、脂肪細胞の分化を調節し、全身脂質の恒常性に決定的な役目をする。ＰＰＡＲ−γの全体的または部分的活性化化合物は、第２型糖尿病の治療に特に効果的である。ただし、ＰＰＡＲ−γの活性化時に副作用として発生する肥満、異常脂質血症、心血管系疾患、脂肪肝などが問題になる。
【０００７】
ＰＰＡＲ−αは、主に血管壁、肝、心臓、筋肉、腎臓、および褐色脂肪組織などで発見され、作用剤であるフィブラート（ｆｉｂｒａｔｅ）類とともに動脈硬化症を予防したり発病を遅延させ、脂肪酸化促進による抗肥満作用をする。
【０００８】
したがって、ＰＰＡＲの作用により調節される各種疾患の予防、改善、または治療のためにＰＰＡＲの活性をより効果的に調節できる新しい化合物の発掘に対する必要性が提起されている。
【０００９】
これより、本発明者らは、優れた抗糖尿活性を有し、安全に適用され得る化合物に対して研究したところ、アモジアキン（ａｍｏｄｉａｑｕｉｎｅ）に注目した。
【００１０】
アモジアキン（ａｍｏｄｉａｑｕｉｎｅ）は、抗マラリア性化合物であって、マラリアに関する治療剤の研究が多数報告されている。また、従来、アモジアキンに対する特許登録された技術を見ると、経口投与用抗マラリア配合製剤およびその製造方法（韓国特許登録第１０−０６２３３２２号）、抗マラリア製剤としてピペラジン誘導体（韓国特許登録第１０−１４２３７８５号）などがある。
【００１１】
しかし、ＰＰＡＲの作用により調節される疾患として、代謝性疾患に対する予防、改善、または治療のためのアモジアキンに対する研究および技術は全然ない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、アモジアキン（ａｍｏｄｉａｑｕｉｎｅ）またはその薬剤学的に許容可能な塩を有効成分として含有する組成物の新しい用途、具体的には、ＰＰＡＲ−γ（Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｇａｍｍａ）およびＰＰＡＲ−α（Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ａｌｐｈａ）信号媒介による代謝性疾患の予防、改善、または治療用としての新規用途を提供することをその目的とする。
【００１３】
しかし、本発明が達成しようとする技術的課題は、以上で言及した課題に制限されず、言及されない他の課題は、以下の記載から当業者に明確に理解され得る。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、下記の化学式１で表示されるアモジアキン（ａｍｏｄｉａｑｕｉｎｅ）またはその薬剤学的に許容可能な塩を有効成分として含有し、ＰＰＡＲ−γ（Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｇａｍｍａ）およびＰＰＡＲ−α（Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ａｌｐｈａ）の両方を活性化させることを特徴とする、代謝性疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供する。
【００１５】
【化１】
0006637987.tif 000002
【００１６】
前記組成物の一日投与量は、８ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇでありうる。
【００１７】
前記代謝性疾患は、糖尿病、高血糖症（ｈｙｐｅｒｇｌｙｃｅｍｉａ）、耐糖能異常（Ｉｍｐａｉｒｅｄ  Ｇｌｕｃｏｓｅ  Ｔｏｌｅｒｅｎｃｅ）、肥満、異常脂質血症（ｄｙｓｌｉｐｉｄｅｍｉａ）、動脈硬化、高血圧、インスリン抵抗性症候群（Ｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、脂肪肝、心血管系疾患、およびＸ症候群（ｓｙｎｄｒｏｍｅ  Ｘ）よりなる群から選択された一つ以上でありうる。
【００１８】
前記異常脂質血症は、高脂血症（ｈｙｐｅｒｌｉｐｉｄｅｍｉａ）、高中性脂肪血症（Ｈｙｐｅｒｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅｍｉａ）、および高コレステロール血症（ｈｙｐｅｒｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｅｍｉａ）よりなる群から選択された一つ以上でありうる。
【００１９】
前記代謝性疾患は、ＰＰＡＲ−γの活性化に反応する第２型糖尿病でありうる。
【００２０】
前記代謝性疾患は、ＰＰＡＲ−αの活性化に反応し、ＰＰＡＲ−γの活性化時に副作用として発生する肥満、異常脂質血症、心血管系疾患および脂肪肝よりなる群から選択された一つ以上でありうる。
【００２１】
本発明の一具現例として、下記の化学式１で表示されるアモジアキン（ａｍｏｄｉａｑｕｉｎｅ）またはその薬剤学的に許容可能な塩を有効成分として含有し、ＰＡＲ−γ（Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｇａｍｍａ）およびＰＰＡＲ−α（Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ａｌｐｈａ）の両方を活性化させることを特徴とする、代謝性疾患の予防または改善用健康機能食品組成物を提供する。
【００２２】
【化２】
0006637987.tif 000003
【００２３】
前記代謝性疾患は、糖尿病、高血糖症（ｈｙｐｅｒｇｌｙｃｅｍｉａ）、耐糖能異常（Ｉｍｐａｉｒｅｄ  Ｇｌｕｃｏｓｅ  Ｔｏｌｅｒｅｎｃｅ）、肥満、異常脂質血症（ｄｙｓｌｉｐｉｄｅｍｉａ）、動脈硬化、高血圧、インスリン抵抗性症候群（Ｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、脂肪肝、心血管系疾患、およびＸ症候群（ｓｙｎｄｒｏｍｅ  Ｘ）よりなる群から選択された一つ以上でありうる。
【００２４】
前記異常脂質血症は、高脂血症（ｈｙｐｅｒｌｉｐｉｄｅｍｉａ）、高中性脂肪血症（Ｈｙｐｅｒｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅｍｉａ）、および高コレステロール血症（ｈｙｐｅｒｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｅｍｉａ）よりなる群から選択された一つ以上でありうる。
【００２５】
前記代謝性疾患は、ＰＰＡＲ−γの活性化に反応する第２型糖尿病でありうる。
【００２６】
前記代謝性疾患は、ＰＰＡＲ−αの活性化に反応し、ＰＰＡＲ−γの活性化時に副作用として発生する肥満、異常脂質血症、心血管系疾患および脂肪肝よりなる群から選択された一つ以上でありうる。
【発明の効果】
【００２７】
本発明によるアモジアキン（ａｍｏｄｉａｑｕｉｎｅ）またはその薬剤学的に許容可能な塩を有効成分として含む組成物は、ＰＰＡＲ−α（Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ａｌｐｈａ）とＰＰＡＲ−γ（Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｇａｍｍａ）の活性を促進することを確認した。特に、ブドウ糖吸収値増加効果、血糖強化および血糖調節効果、糖化血色素（ＨｂＡ１Ｃ）減少効果、体重減少効果、熱生産効果、脂肪肝予防効果および脂肪組織内抗炎症効果を有するところ、本発明の組成物はＰＰＡＲと関連した病気である糖尿病（特に、第２型糖尿病）、高血糖症、耐糖能異常、肥満、異常脂質血症、動脈硬化、高血圧、インスリン抵抗性症候群、脂肪肝、心血管系疾患およびＸ症候群などの代謝性疾患の予防、改善、または治療に便利に活用できるものと期待される。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１ａ】図１ａは、アモジアキン（ａｍｏｄｉａｑｕｉｎｅ）のＰＰＡＲ−γ（Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｇａｍｍａ）活性化効果を測定したグラフである。
【図１ｂ】図１ｂは、アモジアキン（ａｍｏｄｉａｑｕｉｎｅ）のＰＰＡＲ−γ（Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｇａｍｍａ）活性化効果を測定したグラフである。
【図１ｃ】図１ｃは、ＰＰＡＲ−α（Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ａｌｐｈａ）活性化効果を測定したグラフである。
【図１ｄ】図１ｄは、ＰＰＡＲ−α（Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ａｌｐｈａ）活性化効果を測定したグラフである。
【図２】図２は、アモジアキンをラット由来筋肉細胞であるＣ２Ｃ１２ｍｙｏｔｕｂｅ細胞株に２４時間処理したとき、ブドウ糖類似体の吸収値を測定したグラフである。
【図３ａ】図３ａは、アモジアキン摂取がマウスの空腹血糖濃度に及ぼす影響を確認したグラフである。
【図３ｂ】図３ｂは、アモジアキン摂取がマウスにブドウ糖投与後に時間経過による血糖の変化に及ぼす影響を確認した糖耐性検査（ＩＰＧＴＴ）結果を示すグラフである。
【図４】図４は、アモジアキン摂取がマウスの糖化血色素値に及ぼす影響を確認したグラフである。
【図５ａ】図５ａは、高脂肪食餌に誘導する肥満マウス（Ｈｉｇｈ  ｆａｔ  ｄｉｅｔ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｏｂｅｓｉｔｙ  ｍｉｃｅ）を対象に高脂肪摂取と同時にアモジアキン投与をしたとき、マウスの肥満抑制現象を示すグラフである。
【図５ｂ】図５ｂは、マウスの一日平均飼料摂取量を示すグラフである。
【図５ｃ】図５ｃは、高脂肪食餌で長期（２０週）誘導した肥満マウス（Ｈｉｇｈ  ｆａｔ  ｄｉｅｔ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｏｂｅｓｉｔｙ  ｍｉｃｅ）にアモジアキン投与による肥満治療現象を示すグラフである。
【図５ｄ】図５ｄは、各マウスの一日平均飼料摂取量を確認したグラフである。
【図６】図６は、アモジアキンの摂取による低温度に露出時、高脂肪食誘導性肥満マウスの熱生産を示すグラフである。
【図７ａ】図７ａは、高脂肪食餌と同時にアモジアキン投与を共に進行したマウスを対象にブドウ糖投与後に時間経過による血糖の変化に及ぼす影響を確認した糖耐性検査（ＯＧＴＴ）結果を示すグラフである。
【図７ｂ】図７ｂは、高脂肪食餌と同時にアモジアキン投与を共に進行したマウスを対象にインスリン注射後に時間経過による血糖濃度の変化を確認したインスリン寛容性検査（ＩＰＩＴＴ）を示すグラフである。
【図７ｃ】図７ｃは、高脂肪食餌で長期（２０週）誘導したマウスを対象にアモジアキンを投与した後、インスリンを注射し、時間経過による血糖濃度変化を確認したインスリン寛容性検査（ＩＰＩＴＴ）を示すグラフである。
【図８】図８は、アモジアキンが高脂肪食餌で１４週間飼育した実験動物で肝をＨｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ−Ｅｏｓｉｎでそれぞれ染色し、脂肪の蓄積による肝細胞の組織学的変化を確認したグラフである。
【図９ａ】図９ａは、アモジアキンを摂取した高脂肪食誘導性肥満マウスの肝細胞において、脂肪酸酸化と関連した遺伝子の発現を測定した結果をそれぞれ示すグラフである。
【図９ｂ】図９ｂは、筋肉組織において、脂肪酸酸化と関連した遺伝子の発現を測定した結果をそれぞれ示すグラフである。
【図９ｃ】図９ｃは、脂肪組織において脂肪酸酸化と関連した遺伝子の発現を測定した結果をそれぞれ示すグラフである。
【図１０】図１０は、アモジアキンを摂取した高脂肪食誘導性肥満マウスの脂肪組織において抗炎症に関連した遺伝子の発現を測定した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本発明者らは、アモジアキン（ａｍｏｄｉａｑｕｉｎｅ）またはその薬剤学的に許容可能な塩を有効成分として含有し、ＰＰＡＲ−γ（Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｇａｍｍａ）およびＰＰＡＲ−α（Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ａｌｐｈａ）の両方を活性化させることを特徴とする、代謝性疾患の予防、改善、または治療用組成物を開発することによって、本発明を完成した。
【００３０】
本発明の一実施例では、アモジアキンがＰＰＡＲ−γとＰＰＡＲ−αの二重リガンドとして作用するかを調べるために、ベクターを使用してＰＰＡＲ−γとＰＰＡＲ−αの活性を測定し（実施例１参照）、アモジアキンのブドウ糖吸収能が増加し、血糖阻害効果があるか否かを確認するために、マウスの筋肉細胞株でブドウ糖吸収能評価実験を進行した（実施例２参照）。また、アモジアキンによる血糖降下および血糖調節効果、糖化血色素（ＨｂＡ１Ｃ）減少効果、体重減少効果、熱生産効果および脂肪肝予防効果をマウスで調査した（実施例３〜８参照）。また、アモジアキン投与が肝、筋肉、脂肪組織内ＰＰＡＲ−αの活性化によるターゲット遺伝子（ＡＣＯＸ、ＣＰＴ−１およびｍＣＡＤ）の発現を調節し、脂肪酸分解を促進させることができることを確認し（実施例９参照）、アモジアキン投与が脂肪組織内抗炎症反応によるターゲット遺伝子（ＴＮＦα、ＭＣＰ−１およびｉＮＯＳ）の発現を抑制させることができることを確認した（実施例１０参照）。
【００３１】
その結果、アモジアキン処理によるＰＰＡＲ−γとＰＰＡＲ−αの活性化とそれによる一連の反応が脂肪蓄積を抑制し、血糖調節に効果的であることを確認した。
【００３２】
したがって、本発明は、下記の化学式１で表示されるアモジアキン（４−［（７−ｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｏｌｉｎ−４−ｙｌ）ａｍｉｎｏ］−２−［（ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｍｅｔｈｙｌ］ｐｈｅｎｏｌ）またはその薬剤学的に許容可能な塩をＰＰＡＲ−γおよびＰＰＡＲ−αの両方を活性化させることを特徴とする、代謝性疾患の予防または治療用薬学的組成物として利用できる。
【００３３】
【化３】
0006637987.tif 000004
【００３４】
前記代謝性疾患は、糖尿病、高血糖症（ｈｙｐｅｒｇｌｙｃｅｍｉａ）、耐糖能異常（Ｉｍｐａｉｒｅｄ  Ｇｌｕｃｏｓｅ  Ｔｏｌｅｒｅｎｃｅ）、肥満、異常脂質血症（ｄｙｓｌｉｐｉｄｅｍｉａ）、動脈硬化、高血圧、インスリン抵抗性症候群（Ｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、脂肪肝、心血管系疾患、およびＸ症候群（ｓｙｎｄｒｏｍｅ  Ｘ）よりなる群から選択された一つ以上であることを特徴とするが、これに制限されるものではない。
【００３５】
また、前記異常脂質血症は、高脂血症（ｈｙｐｅｒｌｉｐｉｄｅｍｉａ）、高中性脂肪血症（Ｈｙｐｅｒｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅｍｉａ）、および高コレステロール血症（ｈｙｐｅｒｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｅｍｉａ）よりなる群から選択された一つ以上であることを特徴とするが、これに制限されるものではない。
【００３６】
この際、ＰＰＡＲ−γの活性化に反応する疾患は、第２型糖尿病であることができ、ＰＰＡＲ−αの活性化に反応し、ＰＰＡＲ−γの活性化時に副作用として発生する疾患は、肥満、異常脂質血症、心血管系疾患および脂肪肝よりなる群から選択された一つ以上であることができるが、これに制限されるものではない。
【００３７】
したがって、前記組成物は、ＰＰＡＲ−γおよびＰＰＡＲ−αの両方を活性化させることを特徴とするところ、ＰＰＡＲ−γの活性化に反応する第２型糖尿病に対する予防または治療用途に使用され得、この場合、ＰＰＡＲ−αの活性化に反応し、ＰＰＡＲ−γの活性化時に副作用として発生する肥満、異常脂質血症、心血管系疾患および脂肪肝よりなる群から選択された一つ以上を抑制できる。
【００３８】
本発明で使用される用語「治療」というのは、本発明による薬学的組成物の投与によって代謝性疾患に対する症状が好転されるか、有利に変更されるすべての行為を意味する。
【００３９】
これより、薬学的組成物として製造するために、通常的に使用する適切な担体、賦形剤、および希釈剤をさらに含むことができる。また、通常の方法により散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エアゾールなどの経口型剤形、外用剤、座薬、および滅菌注射溶液の形態で剤形化して使用され得る。
【００４０】
前記組成物に含まれることがある担体、賦形剤、および希釈剤としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アラビアガム、アルギネート、ゼラチン、カルシウムホスフェート、カルシウムシリケート、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、マグネシウムステアレート、および鉱物油などがある。前記組成物を製剤化する場合には、通常使用する充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩解剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を使用して調製される。
【００４１】
本発明による薬学的組成物は、薬学的に有効な量で投与する。本発明において、「薬学的に有効な量」は、医学的治療に適用可能な合理的な恩恵／危険の割合で疾患を治療するのに十分な量を意味し、有効用量水準は、患者の疾患の種類、重症度、薬品の活性、薬品に対する敏感度、投与時間、投与経路および排出比率、治療期間、同時使用される薬品を含む要素、およびその他医学分野に良く知られた要素によって決定され得る。
【００４２】
本発明による薬学的組成物は、治療効果を増進させるために、好ましくは、併用される薬品と同時に（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ）、別途に（ｓｅｐａｒａｔｅ）、または順次的に（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ）投与され得、単一または多重投与され得る。前記した要素を全部考慮して副作用なしに最小限の量で最大効果を得ることができる量を投与することが重要であり、これは、当業者によって容易に決定され得る。具体的に、本発明による薬学的組成物の有効量は、患者の年齢、性別、状態、体重、体内で活性成分の吸収度、不活性率および排泄速度、病気の種類、併用される薬品によって変わることができる。
【００４３】
本発明の薬学的組成物は、個体に多様な経路で投与され得る。投与のすべての方式は、予想され得、例えば、経口投与、鼻腔内投与、経気管支投与、動脈注射、静脈注射、皮下注射、筋肉注射、または腹腔内注射によって投与され得る。一日投与量は、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇであり、好ましくは、８ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇであり、一日一回〜数回に分けて投与することが好ましいが、これに制限されるものではない。前記薬学的組成物の一日投与量が８ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇを維持する場合、ＰＰＡＲ−γ（Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｇａｍｍａ）およびＰＰＡＲ−α（Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ａｌｐｈａ）の両方を活性化させることができるとともに、毒性による問題点を最小化できる利点を有する。
【００４４】
本発明の薬学的組成物は、治療する疾患、投与経路、患者の年齢、性別、体重、および疾患の重症度などの色々な関連因子とともに、活性成分である薬品の種類によって決定される。
【００４５】
本発明の他の様態として、本発明は、前記薬学的組成物を個体に投与する段階を含む代謝性疾患の治療方法を提供する。
【００４６】
本発明において「個体」というのは、病気の治療を必要とする対象を意味し、より具体的には、人間または非−人間である霊長類、マウス（ｍｏｕｓｅ）、ラット（ｒａｔ）、犬、猫、馬、および牛などの哺乳類を意味する。
【００４７】
ひいては、本発明は、前記薬学的組成物を含む代謝性疾患の予防または治療用途を提供する。
【００４８】
また、本発明は、アモジアキンまたはその薬剤学的に許容可能な塩を代謝性疾患の予防または改善用健康機能食品組成物に利用できる。
【００４９】
本発明で使用される用語「改善」というのは、治療される状態と関連したパラメーター、例えば症状の程度を少なくとも減少させるすべての行為を意味する。この際、前記健康機能食品組成物は、代謝性疾患の予防または改善のために当該疾患の発病段階前または発病後、治療のための薬剤と同時に、または別々に使用され得る。
【００５０】
本発明で使用される用語「健康機能食品組成物」は、担体、希釈剤、賦形剤および添加剤のうち一つ以上を含み、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、粉末剤、カプセル剤、および液剤剤形よりなる群から選択された一つで剤形化されたことを特徴とし、好ましくは、液剤剤形でありうるが、これに制限されるものではない。
【００５１】
本発明の組成物に添加できる食品としては、各種食品類、粉末、顆粒、錠剤、カプセル、シロップ剤、飲み物、ガム、お茶、ビタミン複合剤、健康機能性食品類などがある。前記本発明にさらに含まれる添加剤としては、天然炭水化物、香味剤、栄養剤、ビタミン、鉱物（電解質）、風味剤（合成風味剤、天然風味剤など）、着色剤、充填剤、ペクチン酸およびその塩、アルギン酸およびその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、防腐剤、酸化防止剤、グリセリン、アルコール、炭酸化剤、および果肉よりなる群から選択された１種以上の成分を使用できる。前述した天然炭水化物の例は、モノサッカライド、例えば、ブドウ糖、果糖など；ジサッカライド、例えばマルトース、スクロースなど；およびポリサッカライド、例えばデキストリン、シクロデキストリンなどのような通常の糖、およびキシリトール、ソルビトール、エリスリトールなどの糖アルコールである。前記香味剤として、天然香味剤［タウマチン、ステビア抽出物（例えばレバウジオシドＡ、グリシルリジンなど）］および合成香味剤（サッカリン、アスパルタムなど）を有利に使用できる。
【００５２】
前記の他に、本発明による組成物は、色々な栄養剤、ビタミン、鉱物（電解質）、合成風味剤および天然風味剤などの風味剤、着色剤および充填剤、ペクチン酸およびその塩、アルギン酸およびその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に使用される炭酸化剤などを含有できる。
【００５３】
その他、本発明による組成物は、天然果物ジュースおよび野菜飲み物の製造のための果肉を含有できる。このような成分は、独立的に、または組み合わせて使用できる。前記担体、賦形剤、希釈剤および添加剤の具体的な例としては、これに限定するものではないが、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、エリスリトール、デンプン、アラビアガム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、カルシウムホスフェート、カルシウムシリケート、微細結晶性セルロース、ポリビニルクロリドン、セルロース、ポリビニルピロリドン、メチルセルロース、水、砂糖シロップ、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステアリン酸マグネシウム、およびミネラルオイルよりなる群から選択される一つ以上を使用することが好ましい。
【００５４】
以下、本発明の理解を助けるために好適な実施例を提示する。しかし、下記の実施例は、本発明をより簡単に理解するために提供されるものに過ぎず、下記の実施例によって本発明の内容が限定されない。
【００５５】
［準備例］
下記の実施例で使用したアモジアキン（Ａｍｏｄｉａｑｕｉｎｅ）は、シグマアルドリッチ社から購入して使用した。
【実施例】
【００５６】
実施例１．アモジアキン（ａｍｏｄｉａｑｕｉｎｅ）によるＰＰＡＲ−γ（Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｇａｍｍａ）またはＰＰＡＲ−α（Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｌｐｈａ）の活性化測定
アモジアキンがＰＰＡＲ−γまたはＰＰＡＲ−αのリガンドとして作用するかを調べるために、三つのベクターを使用した。ｐＺｅｏベクターのＳＶ４０プロモーターに酵母の転写因子であるＧＡＬ４−ＤＢＤ（ＤＮＡ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ）と、ヒトＰＰＡＲ−γ−ＬＢＤ（ｌｉｇａｎｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ）またはＰＰＡＲ−α−ＬＢＤ（ｌｉｇａｎｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ）を発現するベクターと、ＧＡＬ４遺伝子が結合できる塩基配列（５'−ＣＴＣＧＧＡＧＧＡＣＡＧＴＡＣＴＣＣＧ−３’）が８回繰り返された遺伝子をレポータ遺伝子であるルシフェラーゼ（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）に結合させたベクター、およびトランスフェクション対照群としてベータカラクトシダーゼ（β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ）を発現するベクターを使用して公知の方法（Ｃｅｌｌ、６８：８７９−８８７、１９９２）により行った。
【００５７】
ルシフェラーゼ発現の活性化は、ＢＥ（２）Ｃ細胞をＧＡＬ４−ＰＰＡＲ−γ−ＬＢＤプラスミドまたはＧＡＬ４−ＰＰＡＲ−α−ＬＢＤプラスミドとＧＡＬ４−ルシフェラーゼベクター、β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅベクターで形質変形させた６時間後、アモジアキンを２０時間処理した細胞を、５％ＣＯ２インキュベーターで成長させた後、測定した。この際、アモジアキンを濃度別（０．０１〜５０μＭ）に一緒に処理した実験群、ＤＭＳＯ（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ  Ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）０．３％を処理した対照群、ＰＰＡＲ−γリガンドとして公知された化合物であるロシグリタゾン（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）を濃度別（０．００１〜５０μＭ）に一緒に処理した陽性対照群、ＰＰＡＲ−αリガンドとして公知された化合物であるＷＹ−１４、６４３（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）を濃度別（０．０１〜５０μＭ）に一緒に処理した陽性対照群およびアモジアキンの類似体として公知された化合物であるクロロキン（Ｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅ）（７−ｃｈｌｏｒｏ−４−（４−ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ−１−ｍｅｔｈｙｌｂｕｔｙｌａｍｉｎｏ）ｑｕｉｎｏｌｉｎｅ）（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）を濃度別（０．００１〜５０μＭ）に一緒に処理した陽性対照群を比較した。前記実験結果は、実験群と対照群のｔ検証を実施し、その有意性を検証し、統計学的に有意な差異を示した。
【００５８】
その結果、図１ａおよび図１ｂに示すように、ＰＰＡＲ−γリガンドとして公知された化合物であるロシグリタゾンを処理した陽性対照群に比べて、アモジアキンを処理した群が、濃度依存的にさらに高いＰＰＡＲ−γ活性を示すことが分かるが、ＰＰＡＲ−αリガンドとして公知された化合物であるＷＹ−１４、６４３を処理した陽性対照群およびアモジアキンの類似体として公知された化合物であるクロロキンでは、ＰＰＡＲ−γ活性が現れなかった。また、図１ｃおよび図１ｄに示したように、ＰＰＡＲ−αリガンドとして公知された化合物であるＷＹ−１４、６４３を処理した陽性対照群と同様に、アモジアキンを処理した群で濃度依存的に高いＰＰＡＲ−α活性を示すが、ＰＰＡＲ−γリガンドとして公知された化合物であるロシグリタゾンを処理した陽性対照群およびアモジアキンの類似体として公知された化合物であるクロロキンでは、ＰＰＡＲ−α活性がないことが分かった。
【００５９】
したがって、アモジアキン処理がＰＰＡＲ−γおよびＰＰＡＲ−α活性の両方を促進する効能があることを確認し、前記アモジアキンをＰＰＡＲ−γと関連した病気である第２糖尿病などの代謝性疾患に対する予防または治療用に利用できることが分かり、ＰＰＡＲ−α信号により調節される肥満、異常脂質血症、心血管系疾患、脂肪肝など代謝性疾患に対する予防または治療用に利用できることが分かった。
【００６０】
また、図１ｂおよび図１ｄの結果から、アモジアキンは、ベンゼン環とヒドロキシル基が置換されている構造的特徴によりＰＰＡＲ−γおよびＰＰＡＲ−α活性の両方を促進するが、アモジアキンの類似体であるとしても、同一の活性を促進しないことが分かった。
【００６１】
実施例２．Ｃ２Ｃ１２ｍｙｏｔｕｂｅ細胞のブドウ糖吸収値（ｕｐｔａｋｅ）効果測定
筋肉、脂肪、肝細胞などでは、インスリンによる信号伝達によりインスリン受容体のリン酸化が起き、これにより、下位に位置している色々な蛋白質がリン酸化されると、ブドウ糖吸収能が増加し、結果的に、血糖を低下させる。したがって、アモジアキンが糖尿病に効果があるか否かを確認するために、ブドウ糖吸収能評価実験を進行した。筋肉細胞であるＣ２Ｃ１２ｍｙｏｂｌａｓｔ細胞を１０％  ＢＳＡ（ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ）が入っているＤＭＥＭで培養した。細胞密度が約８０〜９０％になったとき、２％ウマ血清（ｈｏｒｓｅ  ｓｅｒｕｍ）が入っているＤＭＥＭ培養液に置換し、Ｃ２Ｃ１２ｍｙｏｂｌａｓｔをｍｙｏｔｕｂｅに細胞分化を誘導し、完全に分化させた後、実験を進行した。完全に分化したＣ２Ｃ１２ｍｙｏｔｕｂｅ細胞に０．５％ＢＳＡが入っているＤＭＥＭ培地とともにそれぞれ１０および３０μＭ濃度のアモジアキンと、ＤＭＳＯ（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ  Ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）０．１％およびブドウ糖吸収能の陽性対照群として公知された化合物であるロシグリタゾン（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）５０μＭをよく混ぜた後、２４時間処理した。２４時間処理後、培地を除去し、３７℃に維持されるプレート上でＫＲＰ（０．１％ＢＳＡ＋５ｍＭブドウ糖）バッファー３ｍＬで洗浄し、残余試料を除去した。洗浄は、２０分間隔で３回繰り返した。次に、１ｍＬのＫＲＰバッファーを注入し、３７℃で標識されない２−ＤＯＧと［３Ｈ］２−ＤＯＧ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を共にＫＲＰバッファーに溶かした溶液（０．２ｍＭ、０．２μＣｉ）を加えて、正確に１０分間処理した。冷たいリン酸緩衝食塩水３ｍＬで洗浄し、ブドウ糖吸収能反応を中止させ、リン酸緩衝食塩水で２回さらに洗浄した後、細胞を１時間程度通風乾燥させた後、０．１％ＳＤＳを１ｍＬ加えて、ピペットで押すか引きしながら溶解させ、溶解物３００μＬを取って、液体ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ  ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、ＵＳＡ）で放射能を測定した。
【００６２】
その結果、図２に示したように、アモジアキン処理群のブドウ糖吸収値が、陽性対照群であるロシグリタゾン処理群のブドウ糖吸収値に比べてさらに増加したことを確認した。
【００６３】
したがって、前記結果から、アモジアキンが細胞内で糖尿病治療剤の代表的な標的蛋白質であるＰＰＡＲ−γの活性を増加させて、筋肉細胞の内部にブドウ糖吸収を促進させる効果があることが分かった。
【００６４】
実施例３．アモジアキン（ａｍｏｄｉａｑｕｉｎｅ）によるマウスの血糖降下効果および血糖調節効果測定
３−１．アモジアキンおよび陰性対照群投与
セロンバイオ社から購入した５週齢のＫＫＡｙを１週間予備飼育した後、５匹ずつ２グループに分けた。
【００６５】
１グループは、リン酸緩衝食塩水を投与して陰性対照群に設定し、２グループは、アモジアキン１８ｍｇ／ｋｇの濃度で６週間毎日経口投与した。
【００６６】
３−２．マウスの空腹血糖降下効果および血糖調節効果測定
６週間空腹血糖は、１２時間絶食させた後、１、２、５、６週に尾静脈から全血を採取して測定した。血糖測定には、血糖ストリップ（韓国、京畿道、緑十字）を利用した。前記実験結果は、実験群と対照群のｔ検証を実施し、その有意性を検証し、統計学的に有意な差異を示した（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５）。また、血糖調節効果を確認するために、１６時間絶食させた後、対照および実験実行群動物の腹腔に２ｇ／ｋｇのブドウ糖を注入し、血中ブドウ糖量を３０分間隔で２時間測定した。血中ブドウ糖量の測定には、糖耐性検査（ＩＰＧＴＴ、ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｔｅｓｔ）を利用した。前記実験結果は、実験群と対照群の集団別ｔ検証を実施し、その有意性を検証し、統計学的に有意な差異を示した（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５）。
【００６７】
その結果、図３ａに示したように、空腹血糖は、対照群に比べてアモジアキンを摂取したマウスで顕著に減少したことを確認した。また、図３ｂに示したように、対照群に比べてアモジアキン投与群においてブドウ糖を投与し、２時間後、血中ブドウ糖が早く減少したことを確認した。具体的に、対照群の空腹血糖は、１３２．４ｍｇ／ｄＬであったが、アモジアキン投与群の空腹血糖は、１００．２ｍｇ／ｄＬであり、対照群の糖負荷２時間後、血糖は、２９３．２ｍｇ／ｄＬであったが、アモジアキンの血糖は、２０７ｍｇ／ｄＬであった。
【００６８】
したがって、アモジアキンが血中ブドウ糖濃度を減少させる優れた効果を示すので、アモジアキンを有効成分として含む薬学的組成物が、糖尿病予防または治療のために便利に使用できることが分かり、空腹血糖を減少させる作用があるので、インスリン抵抗性第２型糖尿病予防剤または治療剤に有用に使用され得ることが分かった。
【００６９】
実施例４．アモジアキン（ａｍｏｄｉａｑｕｉｎｅ）による糖化血色素（ＨｂＡ１Ｃ）含量に及ぼす影響
血液中に分布するブドウ糖の一部が赤血球と堅固に結合され、これを糖化血色素（ＨｂＡ１Ｃ）という。血糖調節は、血糖値だけでなく、必ず糖化血色素数値を共に調査する。これは、糖化血色素１％減少により、糖尿による合併症２０％以上減少させる効果があるからである。本実施例では、アモジアキン摂取によるマウスの糖化血色素の含量を調べる。
【００７０】
４−１．アモジアキンおよび陰性対照群投与
アモジアキンによるマウスの糖化血色素を測定するために、５週齢のＫＫＡｙをセロンバイオ社から購入し、１週間予備飼育した後、５匹ずつ２グループに分けた。前記実施例３と同様に、実験動物の第１グループは、リン酸緩衝食塩水を投与し、対照実行群に設定し、第２グループは、アモジアキンを１８ｍｇ／ｋｇの濃度で６週間毎日１ｍｌ注射器を通じて経口投与した。
【００７１】
４−２．マウスの糖化血色素測定
アモジアキンの糖化血色素の低下効果を測定するために、対照および実験実行群の動物の尾静脈から全血を採取し、ｅａｓｙ  Ａ１ｃ  ｃａｒｔｒｉｄｇｅに注入した後、ｅａｓｙ  Ａ１ｃ  ａｎａｌｙｚｅｒ（韓国、ソウル、アサン製薬）を利用して測定した。前記実験結果は、実験群と対照群の集団別にｔ検証を実施し、その有意性を検証し、統計学的に有意な差異を示した（＊＊ｐ＜０．００５）。
【００７２】
その結果、図４に示したように、対照群マウスに比べてアモジアキンの摂取マウスで糖化血色素の生成が６９％近く抑制されたことを確認した。
【００７３】
したがって、アモジアキンが糖化血色素を減少させる効果があることが分かった。
【００７４】
実施例５．アモジアキン（ａｍｏｄｉａｑｕｉｎｅ）による体重減少測定
５−１．実験動物の設計および実験食餌組成
アモジアキンによるマウスの体重減少を測定するために、７週齢のＣ５７ＢＬ／６雄性マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）を購入し、一定の条件（温度：２２±２℃、相対湿度：５５±１０％、一周期：１２時間）で飼育した。７匹を一群にしてケージで水と餌を自由供給し、実験前に１週間純化を経て実験に使用した。
【００７５】
順応期間が終わった後、７個の群に分けて、下記の表１のような期間中に食餌とアモジアキンおよび陽性対照群（ＷＹ−１４、６４３、ロシグリタゾン）の投与を進行した。
【００７６】
【表１】
0006637987.tif 000005
0006637987.tif 000006
ＬＦＤ（１０％  ｋｃａｌ  ａｓ  ｆａｔ；Ｄ１２４５０Ｂ、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔｓ  Ｉｎｃ．）
ＨＦＤ（６０％  ｋｃａｌ  ａｓ  ｆａｔ；Ｄ１２４９２、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔｓ  Ｉｎｃ．）
【００７７】
５−２．マウスの体重変化測定
体重変化調査は、正常飼料を給与したマウスと、高脂肪を給与した高脂肪食誘導性肥満マウス、および高脂肪にアモジアキンおよび陽性対照群（ＷＹ−１４，６４３およびロシグリタゾン）を投与した高脂肪食誘導性肥満マウスを、１週１回午前１０時を基準として２１週間電子秤（Ｄｒａｇｏｎ  ２０４／Ｓ、Ｍｅｔｔｌｅｒ  Ｔｏｌｅｄｏ、ＵＳＡ）を使用して体重を測定した。体重平均は、グループ当たり７匹のマウスの体重を合算し、マウスで分けて、それぞれの平均体重にした。前記実験結果は、高脂肪食誘導性肥満対照群と、アモジアキンおよび陽性対照群（ＷＹ−１４，６４３およびロシグリタゾン）間の集団別にｔ検定を実施し、その有意性を検証し、統計学的に大きく有意な差異を示した（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００５、＊＊＊Ｐ＜０．０００５）。
【００７８】
実験結果、図５ａに示したように、アモジアキン投与群の高脂肪食誘導性肥満マウスの体重は、高脂肪誘導肥満マウスの体重より顕著に減少することを観察でき、陽性対照群（ＷＹ−１４，６４３）と類似していることを観察することができた。高脂肪で肥満を誘導した後、アモジアキンを投与した図５ｃの場合にも、高脂肪食誘導性肥満マウスの体重より顕著に減少することを観察することができた。一方、ＰＰＡＲ−γの作用剤である陽性対照群（ロシグリタゾン）の場合、高脂肪食誘導性肥満マウスと類似しているか、または、それよりさらに体重が増加することを確認することができた。
【００７９】
５−３．高脂肪食誘導性肥満マウスの餌摂取量測定
餌摂取量の調査は、正常飼料を食べて成長したマウスと、高脂肪を摂取した高脂肪食誘導性肥満マウス、および高脂肪にアモジアキンおよび陽性対照群（ＷＹ−１４，６４３およびロシグリタゾン）を投与した高脂肪食誘導性肥満マウスを、毎日午前１１時を基準とし摂取量を測定した。餌摂取量の平均は、グループ当たり７匹であるので、７で分けて、それぞれの平均餌摂取量にした。毎日食べた摂取量は、ｋｃａｌに換算して示した。実験結果、図５ｂおよび図５ｄに示したように、アモジアキンおよび陽性対照群（ＷＹ−１４，６４３およびロシグリタゾン）を投与した高脂肪食誘導性肥満マウスの餌摂取量と高脂肪食誘導性肥満マウスの餌摂取量との間の差異がないことを観察することができた。
【００８０】
前記結果は、アモジアキンが餌摂取量に関係なく、マウスの体重を減少させる効果があり、したがって、前記アモジアキンが抗肥満医薬品として利用できることを示す。
【００８１】
実施例６．アモジアキン（ａｍｏｄｉａｑｕｉｎｅ）による熱生産効果測定
脂肪細胞は、脂肪の蓄積に作用する白色脂肪細胞と、非常に少ない量であるが、熱生産に作用する褐色脂肪細胞とに区分される。褐色脂肪細胞は、食事後に身体が暖かくなる食事誘導性熱生産作用があり、気温が低くなると、活動が増加し、熱を生産し、体温は維持する機能をする。肥満の実験モデルである遺伝性肥満動物であるｏｂ／ｏｂマウスは、褐色脂肪細胞の機能が良くないため、４℃の低温に露出させると、体温が次第に降り、４時間程度後には死んでしまう。褐色脂肪細胞の機能が正確に発揮されなければ、日常温度で熱により損失されるエネルギーが少ないため、過剰エネルギーが蓄積され、肥満が発生する可能性が高い。したがって、本実施例では、アモジアキン投与による高脂肪食誘導性肥満マウスの熱生産能力を調べる。
【００８２】
６−１．高脂肪食誘導性肥満マウスの熱生産能力測定
実施例５で設計した実験動物のうち１４週間の高脂肪食餌をしたマウスを対象に熱生産能力を測定するために、４℃  ｃｏｌｄ  ｔｅｓｔを実施した（Ｓｐｉｅｇｅｌｍａｎ  Ｂ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ、．Ｃｅｌｌ  ９２：８２９−８３９、１９９８）。以下、前記測定方法を詳しく説明する。高脂肪食誘導性肥満マウスグループのマウスを４℃に露出させる前に、体温を測定し、実験開始測定温度として記録し、４℃ルームに６時間まで露出し、毎時ごとに体温を測定した。体温は、マウス用直腸温度計（ｔｅｓｔｏ  ９２５、Ｇｅｒｍａｎｙ）を利用して測定した。熱生産測定値は、毎時ごとに測定した温度を示す。前記実験結果は、実験群と対照群の集団別にｔ検定を実施し、その有意性を検証し、統計学的に有意な差異を示した（＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．０００５）。
【００８３】
実験結果、図５に示したように、アモジアキン投与群高脂肪肥満誘導マウスが高脂肪肥満誘導マウスに比べて体温の減少が少ないことが確認され、熱生産効果に優れていることが分かった。
【００８４】
したがって、前記結果から、本発明によるアモジアキンが高脂肪食誘導性肥満マウスの熱生産活性を高め、熱として生産されるエネルギーが多いため、肥満になる可能性を低減する効果があることが分かった。
【００８５】
実施例７．アモジアキン（ａｍｏｄｉａｑｕｉｎｅ）によるマウスの血糖調節効果測定
本実施例では、実施例５で設計した実験動物を対象に血糖調節効果を測定するために、糖耐性検査とインスリン耐性試験を実施した。
【００８６】
７−１．マウスの経口要請下検査測定
１６時間絶食させた後、対照および実験実行群の動物を対象に２ｇ／ｋｇのブドウ糖を経口で投与し、血中ブドウ糖量を３０分間隔で２時間測定した。血中ブドウ糖量の測定には、糖耐性検査（ＯＧＴＴ、ｏｒａｌ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｔｅｓｔ）を利用した。前記実験結果は、高脂肪食誘導性肥満マウス対照群と、アモジアキン、陽性対照群（ＷＹ−１４、６４３）および正常飼料摂取マウス間の集団別にｔ検定を実施し、その有意性を検証し、統計学的に有意な差異を示した（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊ｐ＜０．０００５）。
【００８７】
その結果、図７ａに示したように、高脂肪食誘導性肥満マウス対照群に比べてアモジアキン投与群においてブドウ糖を投与し、２時間後、血中ブドウ糖が早く減少したことを確認した。具体的に、高脂肪食誘導性肥満マウス対照群の糖負荷２時間後、血糖は１８０．５ｍｇ／ｄＬであったが、アモジアキンの血糖は、１３９．１ｍｇ／ｄＬであった。
【００８８】
したがって、アモジアキンが血中ブドウ糖濃度を減少させる優秀な効果を示すので、アモジアキンを有効成分として含む薬学的組成物がインスリン抵抗性第２型糖尿病予防剤および治療剤に便利に使用され得ることが分かった。
【００８９】
７−２．マウスのインスリン耐性試験測定
１６時間絶食させた後、対照および実験実行群の動物を対象に０．５Ｕ／ｋｇのインスリンを腹腔に投与し、血中ブドウ糖量を３０分間隔で２時間測定した。血中ブドウ糖量の測定には、インスリン耐性試験（ＩＰＩＴＴ、ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｔｅｓｔ）を利用した。前記実験結果は、高脂肪食誘導性肥満マウス対照群と、アモジアキン、陽性対照群（ＷＹ−１４，６４３およびロシグリタゾン）および正常飼料摂取マウス間の集団別にｔ検定を実施し、その有意性を検証し、統計学的に有意な差異を示した（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊ｐ＜０．０００５）。
【００９０】
その結果、図７ｂに示したように、高脂肪食誘導性肥満マウスの対照群および実験群においてインスリンを投与し、インスリン抵抗性を測定した結果、すべての群において３０分で血糖が最も最低値を示し、その後、徐々に増加した。高脂肪食誘導性肥満マウス対照群は、１２０分に血糖が空腹血糖まで上昇し、正常飼料摂取群、陽性対照群（ＷＹ−１４、６４３）、アモジアキン投与群では、２時間後、血中ブドウ糖が空腹血糖より低い水準に血糖が維持された。また、図７ｃの高脂肪誘導によるインスリン抵抗性が作用した肥満マウス対照群と実験群にインスリンを投与し、初期血糖の％で示した。インスリン抵抗性を測定した結果、高脂肪食誘導性肥満マウスとアモジアキン投与群では、３０分で最低値を示し、その後、徐々に増加した。陽性対照群（ロシグリタゾン）および正常飼料摂取群では、６０分で血糖が最低値を示し、その後、徐々に増加した。高脂肪食誘導性肥満マウス対照群は、１２０分に血糖が初期血糖の７０％近く上昇し、正常飼料摂取群、陽性対照群（ロシグリタゾン）、アモジアキン投与群では、２時間後、血中ブドウ糖が初期血糖の４０〜４５％程度に血糖が維持された。
【００９１】
したがって、アモジアキンの摂取がインスリン感受性を増加させる作用があるので、インスリン抵抗性第２型糖尿病予防剤または治療剤に有用に使用され得ることが分かった。
【００９２】
実施例８．アモジアキン（ａｍｏｄｉａｑｕｉｎｅ）による脂肪肝予防効果測定
脂肪肝の原因は、アルコールの過多摂取によって発生するアルコール性脂肪肝を除いて、高熱量と高脂肪食餌、単純糖の摂取と関連した栄養不均衡が挙られる。特に、高熱量または高脂肪食餌の持続的な摂取は、肝においての脂肪合成と分解間の脂質代謝障害を招き、脂肪肝を誘発する（Ｆｒｏｍｅｎｔｙ  Ｂ．ｅｔ  ａｌ．、Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉｏｎ  ６：１−２８、２００６）。
【００９３】
これより、本実施例では、アモジアキンの処理による脂肪肝の誘発に及ぼす影響を検討した。
【００９４】
８−１．高脂肪食誘導性肥満マウスグループの組織採取
実施例５で設計した実験動物のうち１４週間高脂肪を給与した高脂肪食誘導性肥満マウスグループのマウスを頚椎脱骨法で犠牲させた後、解剖用固定フレームに固定し、手術用メスで腹部を切開し、肝を摘出した。摘出された肝組織は、縮化した変形を防止するために、１０％ホルマリン溶液に固定した。固定された組織は、２４時間後、流れる水で水洗した後、一般的な組織の脱水、透明および浸透過程を自動組織処理装置（６４６０Ｂ、Ｓａｋｕｒａ、Ｊａｐａｎ）機器を使用して１４時間処理し、パラフィンブロックの製作と冷却は、自動包埋装置（Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｘ、Ｊａｐａｎ）を使用した。製作されたパラフィンブロックをロータリーミクロトーム（Ｒｏｔａｒｙ  Ｍｉｃｒｏｔｏｍｅ  ２０４０、Ｊａｐａｎ）を使用して組織を垂直方向に４〜５μｍの厚さで連続切片し、浮遊温水槽と伸展器過程を経てスライドに付着させた。
【００９５】
８−２．アモジアキンによる脂肪肝予防効果観察
薄切した組織切片をヘマトキシリンで染色した後、過染色された部分は、流れる水道水に水洗した後、１％ＨＣＬ、７０％Ａ／Ｃ溶液に３〜５回浸漬することによって、核を青化した。次に、水洗を５〜１０分程度十分に水洗し、核が清明な色になるように、細胞質対照染色で染色した後、１５秒間過度なエオシン溶液を、流れる水で洗浄し、脱水および透明過程を経た。光学顕微鏡（ＢＸ５０、Ｏｌｙｍｐｕｓ、Ｊａｐａｎ）を使用してそれぞれの肝組織を観察し、顕微鏡に装着されたＣＣＤカメラ（ＰＭ−Ｃ３５ＤＸ、Ｏｌｙｍｐｕｓ、Ｊａｐａｎ）で各群の組織を撮影した。
【００９６】
実験結果、図８に示したように、高脂肪食誘導性肥満マウスの肝は、脂肪で完全に満たされているのに対し、アモジアキン投与群高脂肪食誘導性肥満マウスの肝の場合、ほぼ正常マウスの肝と同じ形態を確認することができた。
【００９７】
したがって、前記結果から、本発明によるアモジアキンが脂肪肝の抑制効果に優れていることが分かった。
【００９８】
実施例９．アモジアキン（ａｍｏｄｉａｑｕｉｎｅ）の投与による肝、筋肉、脂肪組織内ＰＰＡＲ−αの活性化によるターゲット遺伝子の発現確認
ＰＰＡＲ−αは、脂肪酸の酸化代謝経路に関与する酵素の遺伝子であるＡＣＯＸ（ａｃｙｌ−ＣｏＡ  ｏｘｉｄａｓｅ）、ＣＰＴ−１（ｃａｒｎｉｔｉｎｅ  ｐａｌｍｉｔｏｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ−１）、およびｍＣＡＤ（ｍｅｄｉｕｍ  ｃｈａｉｎ  ａｃｙｌ−ＣｏＡ  ｄｅｈｙｒｏｇｅｎａｓｅ）の発現を誘導し、脂肪酸（ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ）の合成を減少させると知られている（Ｄｒｅｙｅｒ  Ｃｈｒｉｓｔｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｅｌｌ、６８：８７９−８８７、１９９２）。したがって、前記ＡＣＯＸ、ＣＰＴ−１およびｍＣＡＤ遺伝子の発現量を測定すると、脂肪酸の酸化効能を把握できる。これより、本実施例では、肝、筋肉、脂肪組織にアモジアキンの投与がＡＣＯＸ、ＣＰＴ−１およびｍＣＡＤ遺伝子の発現量に及ぼす影響を調べた。
【００９９】
各組織は、実施例５で設計した実験動物のうち１４週間高脂肪を給与した高脂肪食誘導性肥満マウスグループのマウスを頚椎脱骨法で犠牲させた後、解剖用固定フレームに固定し、手術用メスで切開し、肝、筋肉、脂肪組織を摘出して使用し、β−ａｃｔｉｎ、ＡＣＯＸ、ＣＰＴ−１およびｍＣＡＤのプライマー塩基配列は、それぞれ次のとおりである。
【０１００】
β−ａｃｔｉｎ  ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ＧＧＧ  ＡＡＧ  ＧＴＧ  ＡＣＡ  ＧＣＡ  ＴＴＧ−３’
ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＡＴＧ  ＡＡＧ  ＴＡＴ  ＴＡＡ  ＧＧＣ  ＧＧＡ  ＡＧＡ  ＴＴ−３’
ＡＣＯＸ  ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ＡＣＡ  ＣＴＡ  ＡＣＡ  ＴＡＴ  ＣＡＡ  ＣＡＡ  ＧＡＧ  ＧＡＧ−３’
ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＣＡＴ  ＴＧＣ  ＣＡＧ  ＧＡＡ  ＧＡＣ  ＣＡＧ−３’
ＣＰＴ−１  ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ＣＣＡ  ＣＣＴ  ＣＴＴ  ＣＴＧ  ＣＣＴ  ＣＴＡ  Ｔ−３’
ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＴＴＣ  ＴＣＡ  ＡＡＧ  ＴＣＡ  ＡＡＣ  ＡＧＴ  ＴＣＣ  Ａ−３’
ｍＣＡＤ  ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ＣＣＧ  ＡＡＧ  ＡＧＴ  ＴＧＧ  ＣＧＴ  ＡＴＧ−３’
ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＡＧＣ  ＡＡＧ  ＡＡＴ  ＣＡＣ  ＡＧＧ  ＣＡＴ  Ｔ−３’
【０１０１】
各組織を粉砕機を利用して研磨した後、Ｔｒｉｚｏｌを利用してＲＮＡを抽出し、逆転写重合酵素連鎖反応（ＲＴ  ＰＣＲ、Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）を利用してｃＤＮＡを合成した。
対照群としては、β−ａｃｔｉｎを使用し、ＰＰＡＲ−αの活性化によるターゲット遺伝子および脂肪酸の分解に関与するＡＣＯＸ、ＣＰＴ−１およびｍＣＡＤ遺伝子の発現量を調べるために、それぞれのプライマーを利用してリアルタイム重合酵素連鎖反応（ＲＴ  ＰＣＲ、Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）を行った。（９５℃で３分、＜９５℃で１０秒、６０℃で１０秒、７２℃で３０秒＞３９回、９５℃で１０秒、６５℃で５秒）。ＡＣＯＸ、ＣＰＴ−１およびｍＣＡＤをβ−ａｃｔｉｎで補正し、結果値を算出した。前記実験結果は、高脂肪食誘導性肥満マウス対照群とアモジアキンおよび陽性対照群（ＷＹ−１４、６４３）マウス間の集団別にｔ検定を実施し、その有意性を検証し、統計学的に有意な差異を示した（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊ｐ＜０．０００５）。
【０１０２】
その結果、図９ａ、図９ｂ、図９ｃに示したように、アモジアキンを投与した実験群において対照群に比べてほぼ２〜１５倍以上遺伝子発現量が増加したことを確認した。
【０１０３】
したがって、アモジアキンの処理がＰＰＡＲ−αの活性化によるターゲット遺伝子であり、脂肪酸の分解に関与するＡＣＯＸ、ＣＰＴ−１およびｍＣＡＤ遺伝子の発現を各組織で増加させることから見て、アモジアキンがＰＰＡＲ−αを活性化させ、ＰＰＡＲ−αのターゲット遺伝子の発現を調節できることを意味し、脂肪酸の酸化を促進させて、脂肪蓄積を抑制させることができると判断された。
【０１０４】
実施例１０．アモジアキン（ａｍｏｄｉａｑｕｉｎｅ）の投与による脂肪組織内抗炎症反応によるターゲット遺伝子の発現確認
脂肪細胞は、肝葉細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）および前駆脂肪細胞（ｐｒｅａｄｉｐｏｃｙｔｅ）から分化し、脂質代謝機能、糖代謝機能、ひいては、アディポサイトカイン分泌に変化をもたらす（Ｃｒｉｓｔｉｎａ  Ｍ．Ｒｏｎｄｉｎｏｎｅ、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ、２９：８１−９０、２００６）。肥満患者において増加しているＴＮＦα、ＭＣＰ−１およびｉＮＯＳなどは、脂肪細胞の炎症発現で脂肪分化を促進し、その他成人病の罹患率を増加させる（Ｔｏｍａｓｚ  Ｊ．Ｇｕｚｉｋ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ５７：５０５−５２８、２００６）。ＴＮＦ−αは、炎症反応において重要な作用をする細胞分泌物質であり、ＭＣＰ−１は、炎症性ケモカインであって、脂肪細胞で分泌され、肥満、インスリン抵抗性、動脈硬化症に影響を及ぼすと知られている。また、ｉＮＯＳは、炎症性前駆物質であって、炎症反応を促進させるものと知られている。
【０１０５】
したがって、前記ＴＮＦα、ＭＣＰ−１およびｉＮＯＳ遺伝子の発現量を測定すると、抗炎症効能を把握できる。これより、本実施例では、脂肪組織においてアモジアキン投与がＴＮＦα、ＭＣＰ−１およびｉＮＯＳ遺伝子の発現量に及ぼす影響を調べた。
【０１０６】
各組織は、実施例５で設計した実験動物のうち１４週間高脂肪を給与した高脂肪食誘導性肥満マウスグループのマウスを頚椎脱骨法で犠牲させた後、解剖用固定フレームに固定し、手術用メスで切開し、脂肪組織を摘出して使用し、β−ａｃｔｉｎ、ＴＮＦα、ＭＣＰ−１およびｉＮＯＳのプライマー塩基配列は、それぞれ次の通りである。
【０１０７】
β−ａｃｔｉｎ  ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ＧＧＧ  ＡＡＧ  ＧＴＧ  ＡＣＡ  ＧＣＡ  ＴＴＧ−３’
ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＡＴＧ  ＡＡＧ  ＴＡＴ  ＴＡＡ  ＧＧＣ  ＧＧＡ  ＡＧＡ  ＴＴ−３’
ＴＮＦαｆｏｒｗａｒｄ：５’−ＡＴＧ  ＡＧＡ  ＡＧＴ  ＴＣＣ  ＣＡＡ  ＡＴＧ  ＧＣ−３’
ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＴＴＴ  ＧＡＧ  ＡＡＧ  ＡＴＧ  ＡＴＣ  ＴＧＡ  ＧＴＧ  ＴＧＡ  Ｇ−３’
ＭＣＰ−１  ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ＡＡＴ  ＧＡＧ  ＴＡＧ  ＧＣＴ  ＧＧＡ  ＧＡＧ−３’
ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＴＣＴ  ＣＴＴ  ＧＡＧ  ＣＴＴ  ＧＧＴ  ＧＡＣ−３’
ｉＮＯＳ  ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ＧＣＴ  ＴＣＴ  ＧＧＣ  ＡＣＴ  ＧＡＧ  ＴＡＡ−３’
ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＧＧＡ  ＧＧＡ  ＧＡＧ  ＧＡＧ  ＡＧＡ  ＧＡＴ−３’
【０１０８】
粉砕機を利用して脂肪組織を粉砕した後、Ｔｒｉｚｏｌを利用してＲＮＡを抽出し、逆転写重合酵素連鎖反応（ＲＴ  ＰＣＲ、Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）を利用してｃＤＮＡを合成した。
対照群としては、β−ａｃｔｉｎを使用し、炎症反応に関与するＴＮＦα、ＭＣＰ−１およびｉＮＯＳ遺伝子の発現量を調べるために、それぞれのプライマーを利用してリアルタイム重合酵素連鎖反応（ＲＴ  ＰＣＲ、Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）を行った。（９５℃で３分、＜９５℃で１０秒、６０℃で１０秒、７２℃で３０秒＞３９回、９５℃で１０秒、６５℃で５秒）。ＴＮＦα、ＭＣＰ−１およびｉＮＯＳをβ−ａｃｔｉｎで補正し、結果値を算出した。前記実験結果は、高脂肪食誘導性肥満マウス対照群とアモジアキンおよび陽性対照群（ＷＹ−１４、６４３）マウス間の集団別にｔ検定を実施し、その有意性を検証し、統計学的に有意な差異を示した（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５）。
【０１０９】
その結果、図１０に示したように、アモジアキンを投与した実験群において対照群に比べてほぼ５〜４０％近く遺伝子発現量が減少したことを確認した。
【０１１０】
したがって、アモジアキンの処理が抗炎症反応に関与するＴＮＦα、ＭＣＰ−１およびｉＮＯＳ遺伝子の発現を各組織で抑制させることから見て、アモジアキンが炎症反応に重要な作用をする因子を抑制することによって、肥満、インスリン抵抗性、動脈硬化症に影響を及ぼすと判断された。
【０１１１】
前述した本発明の説明は、例示のためのものであり、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者は、本発明の技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で簡単に変形が可能であることを理解できる。したがって、以上で記述した実施例は、すべての点において例示的なものであり、限定的でないものと理解すべきである。
【図１ａ】
0006637987.tif 000009
【図１ｂ】
0006637987.tif 000010
【図１ｃ】
0006637987.tif 000011
【図１ｄ】
0006637987.tif 000012
【図２】
0006637987.tif 000013
【図３ａ】
0006637987.tif 000014
【図３ｂ】
0006637987.tif 000015
【図４】
0006637987.tif 000016
【図５ａ】
0006637987.tif 000017
【図５ｂ】
0006637987.tif 000018
【図５ｃ】
0006637987.tif 000019
【図５ｄ】
0006637987.tif 000020
【図６】
0006637987.tif 000021
【図７ａ】
0006637987.tif 000022
【図７ｂ】
0006637987.tif 000023
【図７ｃ】
0006637987.tif 000024
【図８】
0006637987.tif 000025
【図９ａ】
0006637987.tif 000026
【図９ｂ】
0006637987.tif 000027
【図９ｃ】
0006637987.tif 000028
【図１０】
0006637987.tif 000029