(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧＡＧ生合成クラスターの少なくとも一部を欠損し、かつα−１，３−グルカンを発現しない変異型の糸状菌。
【請求項２】
ｕｇｅ３、ｓｐｈ３、ｅｇａ３、ａｇｄ３及びｇｔｂ３からなる群より選択される少なくとも一つのＧＡＧ生合成遺伝子を欠損している、請求項１に記載の糸状菌。
【請求項３】
アスペルギルス属、ボトリティス属、又はコクリオボルス属に属する、請求項１又は２に記載の糸状菌。
【請求項４】
アスペルギルス  オリゼ、アスペルギルス  ソーヤ、アスペルギルス  ニドランス、アスペルギルス  ニガー、アスペルギルス  フミガタス、ボトリティス  シネレア、又はコクリオボルス  コクリオボルス  ヘテロストロフォスである、請求項３に記載の糸状菌。
【請求項５】
α−１，３−グルカン合成酵素ＡＧＳの少なくとも一つを欠損している、請求項１〜４のいずれか１項に記載の糸状菌。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の糸状菌を培養して、当該糸状菌に物質を生成させる工程、及び
得られた物質を回収する工程
を含む、物質生産方法。
【請求項７】
前記物質が糸状菌の細胞壁の構成成分又はその加水分解物以外の物質である、請求項６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、変異型糸状菌及び当該変異型糸状菌を用いた物質生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
糸状菌とは、菌糸と呼ばれる管状の細胞から構成されているものの総称であり、有機酸、色素、農薬原体等の化成品、ペニシリン、スタチン類等の医薬品等の低分子化合物；アミラーゼ、セルラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼの産業用酵素等の発酵生産に使用されている。【０００３】
例えば、特許文献１には、グルコース含有溶液に好熱性菌由来β−グルコシダーゼを添加し、縮合反応により２糖類含有溶液を製造する工程、および２糖類含有溶液を含む培地を使用して糸状菌培養によりセルラーゼを製造する工程を含む、セルラーゼの製造方法が記載されている。【０００４】
また、特許文献２には、真菌ペプチドをプロセシングしてＣ−末端からペプチドおよび／またはＮ−末端からペプチドを切除して、ホスホリパーゼ活性をもつ特定のアミノ酸配列からなるコアペプチドを生成せしめる工程を含むホスホリパーゼの製造方法が記載されている。【０００５】
また、特許文献３〜７には、糸状菌による物質生産の効率化を目的に、糸状菌を宿主として機能するように構築された発現ベクター、また該発現ベクターに同種または異種タンパク質をコードする遺伝子が機能的に連結されてなるプラスミドを糸状菌へ導入し形質転換体を作成する方法、さらに該形質転換体の利用がアミラーゼ、セルラーゼ等の酵素や、ペニシリン等の低分子化合物の増産に資すること、が記載されている。【０００６】
上記のように、糸状菌は、多種多様な有用物質を生産できるという利点を有する。しかし、糸状菌は、その液体培養工程において、菌糸が絡まり塊状に集塊し、高密度培養ができないという問題、有用物質の生産量が低下するという問題、有用物質の生産工程の煩雑化という問題を発生していた（例えば、特許文献８〜９）。【０００７】
かかる状況の下、本発明者らは、α−１，３−グルカンを発現しない変異型の糸状菌を用いることによって、培養の際の菌体の凝集が従来よりも抑制されて培地中に菌体が比較的均一に分散することを見出し、物質生産方法を開発している（特許文献１０）。しかし、当該変異型糸状菌を用いることにより、菌体の凝集が従来よりは抑制されるものの、さらに塊の形成されにくい糸状菌の開発が望まれていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２０１０−２２７０３２
【特許文献２】特開２０１０−１７２３４３
【特許文献３】特開２００１−４６０７８
【特許文献４】特開２００５−５２１１６
【特許文献５】特開２００９−１１８７８３
【特許文献６】特表平１１−５０６０２５
【特許文献７】特表２００７−５０８０２２
【特許文献８】特開２００２−２１８９７０
【特許文献９】特開２０１０−２２７０３１
【特許文献１０】ＷＯ２０１４／０７３６７４
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Fontaine T. et al. (2011) Galactosaminogalactan, a New Immunosupressive Polysacharide of Aspergillus fumigatus, PLoS Pathogens, 7:e1002372
【非特許文献２】Rappleye C.A. et al. (2004) RNA interference in Histoplasma capsulatum demonstrates a role for α-(1,3)-glucan in virulence. Mol. Microbiol. 53:153-165.
【非特許文献３】Beauvais A. et al. (2005) Two α(1-3) Glucan Synthases with Different Functions in Aspergillus fumigatus. Appl. Environ. Microbiol. 71:1531-1538.
【非特許文献４】Maubon D. et al. (2006) AGS3, an α(1-3)glucan synthase gene family member of Aspergillus fumigatus, modulates mycelium growth in the lung of experimentally infected mice. Fungal Genet. Biol. 43:366-375.
【非特許文献５】Henry C. et al. (2011) α1,3 glucans are dispensable in Aspergillus fumigatus. Eukaryot. Cell 11:26-29
【非特許文献６】Mizutani O. et al. (2008) A defect of LigD(human Lig4 homolog) for nonhomologous end joining significantly improves efficiency of gene-targeting in Aspergillus oryzae. Fung. Genet. Biol., 45:878-889.
【非特許文献７】Zhang S. et al. (2017) Self-excising Cre/mutant lox marker recycling system for multiple gene integrations and consecutive gene deletion in Aspergillus oryzae. J. Biosci. Bioengin. 123:403-411
【非特許文献８】Gomi K. et al. (1987) Integrative transformation of Aspergillus oryzae with a plasmid containing the Aspergillus nidulans argB gene. Agric. Biol. Chem. 51:2549-2555
【非特許文献９】Natalie et al (2015) Sph3 Is a Glycoside Hydrolase Required for the Biosynthesis of Galactosaminogalactan in Aspergillus fumigatus．J Biol Chem 290, 27438
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、従来の糸状菌よりもさらに培地中での菌体（菌糸）凝集が抑制される糸状菌変異株を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
かかる状況の下、本発明者らは、糸状菌が有する多種多様な因子について菌体の凝集の観点から鋭意研究を進めた結果、ＧＡＧ（ガラクトサミノガラクタン）生合成クラスターを新たな因子として見出した。非特許文献９ではアスペルギルス  フミガタスを用いてＧＡＧ生合成クラスターの破壊株を得、同クラスター破壊の効果を評価する解析を行っている。この中では、同破壊株の細胞壁表面にはＧＡＧが観察されないこと、一方で出芽や増殖については破壊株と野生株との間で差がないこと、が報告されている。本発明者らは、α−１，３−グルカンを発現しないよう改変した糸状菌又は元々α−１，３−グルカン合成酵素遺伝子ａｇｓを有さない糸状菌について、糸状菌ＧＡＧ生合成クラスターの機能を欠損させた結果、さらなるガラクトサミノガラクタンの発現低下を観察するとともに、驚いたことに菌体の凝集が抑制され、菌体が完全に分散することを見出した。本発明は、かかる新規の知見に基づくものである。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、従来の糸状菌よりもさらに培地中での菌体の凝集が抑制された糸状菌変異株を提供することができる。培養中に菌体が凝集してしまうと凝集塊の中が嫌気的になり細胞が死んでしまうため、凝集が抑制される本発明の糸状菌及びこれを用いた方法は、糸状菌の効率的な培養及び物質生産に資するため非常に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】Ａ．  ｏｒｙｚａｅにおけるＧＡＧ生合成遺伝子クラスターの推定（Ａ）Ａ．  ｆｕｍｉｇａｔｕｓにおけるＧＡＧ生合成遺伝子クラスターの配列を元に、Ａ．  ｏｒｙｚａｅにおけるＧＡＧ生合成遺伝子クラスターの予測を行った。（Ｂ）Ａ．  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ，Ａ．  ｃｌａｖａｔｕｓ，Ａ．  ｏｒｙｚａｅ，Ｍａｒｓｓｏｎｉａ  ｂｒｕｎｎｅａ，Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｐｉｃｋｅｔｔｉおよびＰｈｙｓａｒｕｍ  ｐｏｌｙｃｅｐｈａｌｕｍにおけるｓｐｈ３のＣｌｕｓｔａｌＷによるシーケンスアライメント結果。予測したＡ．  ｏｒｙｚａｅのｓｐｈ３においても保存性の高い領域が存在していた。
【図２】ｕｇｅ３，ｓｐｈ３遺伝子破壊カセット、ＧＡＧ単独欠損株およびＡＧ−ＧＡＧ欠損株の作製  （Ａ）ｕｇｅ３下流（５’側）領域（ａｍｐｌｉｃｏｎ  １）およびｓｐｈ３の下流（３’側）領域（ａｍｐｌｉｃｏｎ  ２）をＡ．  ｏｒｙｚａｅのゲノムＤＮＡを鋳型にＰＣＲで増幅した。また、ＡｎａｄｅＡ遺伝子（ａｍｐｌｉｃｏｎ  ３）をプラスミドＴＯＰＯ−２．１−ａｄｅＡからＰＣＲで増幅した（１ｓｔ  ｒｏｕｎｄ  ｏｆ  ＰＣＲ）。ａｍｐｌｉｃｏｎ  １，２の両側から再度ＰＣＲを行い、３断片を連結させた（２ｎｄ  ｒｏｕｎｄ  ｏｆ  ＰＣＲ）。ＰＣＲ産物のメインバンドをゲル抽出し、ｕｇｅ３，ｓｐｈ３  遺伝子破壊カセットとした。次に、ＡＧ欠損株を親株としてｕｇｅ３，ｓｐｈ３遺伝子破壊カセットの形質転換を行った。ａｄｅＡ無添加のＣＤ寒天平板培地で選抜を行い、ＧＡＧ単独欠損株およびＡＧ−ＧＡＧ欠損株を取得した。（Ｂ）取得したＡＧ−ＧＡＧ欠損株について、コンストラクトの導入をＰＣＲ増幅によって確認を行った。
【図３】野生株、ＡＧ欠損株、ＡＧ−ＧＡＧ欠損株およびＧＡＧ欠損株の培養性状比較  野生株、ＡＧ欠損株、ＡＧ−ＧＡＧ欠損株、ＧＡＧ欠損株を用いて、ＹＰＤ培地による液体振盪培養を２４時間行った。（Ａ）上段はフラスコ写真、中段は菌体を６ｃｍシャーレに移して観察したもの、下段は実体顕微鏡写真である。いずれも培養２４時間目に観察を行った。（Ｂ）培養１０時間目に顕微鏡観察を行った。各図中のバーの長さは以下の通り：図（Ｂ）左  ２００μｍ、図（Ｂ）中央  ２００μｍ、図（Ｂ）右  １００μｍ。（Ｃ）寒天培地の中央に１．０×１０３個の分生子を接種し、３０℃、５日間静置培養を行った。
【図４】ＡＧ−ＧＡＧ欠損株に対するｃｕｔＬ１高発現株の作製（ｃｕｔＬ１高発現型ＡＧ−ＧＡＧ欠損株の作製）（Ａ）ＡＧ−ＧＡＧ欠損株ｃｕｔＬ１高発現株の作製方法を示した。矢印でコンストラクト導入確認のプライマー位置を示した。（Ｂ）ＰＣＲ増幅によるコンストラクト導入確認の結果。（Ｃ）１％のＰＢＳＡを含むＣＤ培地の中心に分生子を植菌し、３０℃、４日間静置培養を行い、ハロー形成試験を行った。
【図５】ＡＧ−ＧＡＧ欠損株におけるＣｕｔＬ１生産性の評価（Ａ）野生株、ＡＧ欠損株、ＡＧ−ＧＡＧ欠損株（それぞれｃｕｔＬ１高発現株）をＹＰＭ培地にて培養した際の乾燥菌体重（２４時間、１００ｒｐｍ、１ｘ１０４分生子接種）。（Ｂ）野生株、ＡＧ欠損株、ＡＧ−ＧＡＧ欠損株（それぞれｃｕｔＬ１高発現株）におけるＣｕｔＬ１分泌量。培養条件は、上記と同じくＹＰＭ培地、２４時間、１００ｒｐｍ、１ｘ１０４分生子接種。
【図６】アスペルギルス  オリゼのＡｇｓＡの推定アミノ酸配列（配列番号１）を示す。
【図７】アスペルギルス  オリゼのＡｇｓＡをコードする核酸分子の塩基配列（配列番号２）を示す。
【図８】アスペルギルス  オリゼのＡｇｓＡをコードする核酸分子の塩基配列（配列番号２）を示す。
【図９】アスペルギルス  オリゼのＡｇｓＢの推定アミノ酸配列（配列番号３）を図９に示す。
【図１０】アスペルギルス  オリゼのＡｇｓＢをコードする核酸分子の塩基配列（配列番号４）を示す。
【図１１】アスペルギルス  オリゼのＡｇｓＢをコードする核酸分子の塩基配列（配列番号４）を示す。
【図１２】アスペルギルス  オリゼのＡｇｓＣの推定アミノ酸配列（配列番号５）を示す。
【図１３】アスペルギルス  オリゼのＡｇｓＣをコードする核酸分子の塩基配列（配列番号６）を示す。
【図１４】アスペルギルス  オリゼのＡｇｓＣをコードする核酸分子の塩基配列（配列番号６）を示す。
【図１５】アスペルギルス  ニドランスのＡｇｓＡの推定アミノ酸配列（配列番号７）を示す。
【図１６】アスペルギルス  ニドランスのＡｇｓＡをコードする核酸分子の塩基配列（配列番号８）を示す。
【図１７】アスペルギルス  ニドランスのＡｇｓＡをコードする核酸分子の塩基配列（配列番号８）を示す。
【図１８】アスペルギルス  ニドランスのＡｇｓＢの推定アミノ酸配列（配列番号９）を示す。
【図１９】アスペルギルス  ニドランスのＡｇｓＢをコードする核酸分子の塩基配列（配列番号１０）を示す。
【図２０】アスペルギルス  ニドランスのＡｇｓＢをコードする核酸分子の塩基配列（配列番号１０）を示す。
【図２１】アスペルギルス  ソーヤのＡｇｓＡの推定アミノ酸配列（配列番号１１）を示す。
【図２２】アスペルギルス  ソーヤのＡｇｓＡをコードする核酸分子の塩基配列（配列番号１２）を示す。
【図２３】アスペルギルス  ソーヤのＡｇｓＡをコードする核酸分子の塩基配列（配列番号１２）を示す。
【図２４】アスペルギルス  ソーヤのＡｇｓＢの推定アミノ酸配列（配列番号１３）を示す。
【図２５】アスペルギルス  ソーヤのＡｇｓＢをコードする核酸分子の塩基配列（配列番号１４）を示す。
【図２６】アスペルギルス  ソーヤのＡｇｓＢをコードする核酸分子の塩基配列（配列番号１４）を示す。
【図２７】アスペルギルス  ソーヤのＡｇｓＣの推定アミノ酸配列（配列番号１５）を示す。
【図２８】アスペルギルス  ソーヤのＡｇｓＣをコードする核酸分子の塩基配列（配列番号１６）を示す。
【図２９】アスペルギルス  ソーヤのＡｇｓＣをコードする核酸分子の塩基配列（配列番号１６）を示す。
【図３０】アスペルギルス  ニガーのＡｇｓＥの推定アミノ酸配列（配列番号１７）を示す。
【図３１】アスペルギルス  ニガーのＡｇｓＥをコードする核酸分子の塩基配列（配列番号１８）を示す。
【図３２】アスペルギルス  ニガーのＡｇｓＥをコードする核酸分子の塩基配列（配列番号１８）を示す。
【図３３】アスペルギルス  フミガタスのＡｇｓ１の推定アミノ酸配列（配列番号１９）を示す。
【図３４】アスペルギルス  フミガタスのＡｇｓ１をコードする核酸分子の塩基配列（配列番号２０）を示す。
【図３５】アスペルギルス  フミガタスのＡｇｓ１をコードする核酸分子の塩基配列（配列番号２０）を示す。
【図３６】アスペルギルス  オリゼのＵｇｅ３の推定アミノ酸配列（配列番号２１）及びＵｇｅ３をコードする核酸分子の塩基配列（配列番号２２）を示す。
【図３７】アスペルギルス  オリゼのＳｐｈ３の推定アミノ酸配列（配列番号２３）及びＳｐｈ３をコードする核酸分子の塩基配列（配列番号２４）を示す。
【図３８】アスペルギルス  オリゼのＥｇａ３の推定アミノ酸配列（配列番号２５）及びＥｇａ３をコードする核酸分子の塩基配列（配列番号２６）を示す。
【図３９】アスペルギルス  オリゼのＡｇｄ３の推定アミノ酸配列（配列番号２７）及びＡｇｄ３をコードする核酸分子の塩基配列（配列番号２８）を示す。
【図４０】アスペルギルス  オリゼのＧｔｂ３の推定アミノ酸配列（配列番号２９）を示す。
【図４１】アスペルギルス  オリゼのＧｔｂ３をコードする核酸分子の塩基配列（配列番号３０）を示す。
【図４２】アスペルギルス  オリゼのＧｔｂ３をコードする核酸分子の塩基配列（配列番号３０）を示す。
【図４３】アスペルギルス  オリゼのＧｔｂ３をコードする核酸分子の塩基配列（配列番号３０）を示す。
【図４４】アスペルギルス  ニドランスのＵｇｅ３の推定アミノ酸配列（配列番号３１）及びＵｇｅ３をコードする核酸分子の塩基配列（配列番号３２）を示す。
【図４５】アスペルギルス  ニドランスのＳｐｈ３の推定アミノ酸配列（配列番号３３）及びＳｐｈ３をコードする核酸分子の塩基配列（配列番号３４）を示す。
【図４６】アスペルギルス  ニドランスのＥｇａ３の推定アミノ酸配列（配列番号３５）及びＥｇａ３をコードする核酸分子の塩基配列（配列番号３６）を示す。
【図４７】アスペルギルス  ニドランスのＡｇｄ３の推定アミノ酸配列（配列番号３７）及びＡｇｄ３をコードする核酸分子の塩基配列（配列番号３８）を示す。
【図４８】アスペルギルス  ニドランスのＧｔｂ３の推定アミノ酸配列（配列番号３９）を示す。
【図４９】アスペルギルス  ニドランスのＧｔｂ３をコードする核酸分子の塩基配列（配列番号４０）を示す。
【図５０】アスペルギルス  ニドランスのＧｔｂ３をコードする核酸分子の塩基配列（配列番号４０）を示す。
【図５１】アスペルギルス  ニドランスのＧｔｂ３をコードする核酸分子の塩基配列（配列番号４０）を示す。
【図５２】アスペルギルス  ソーヤのＵｇｅ３の推定アミノ酸配列（配列番号４１）及びＵｇｅ３をコードする核酸分子の塩基配列（配列番号４２）を示す。
【図５３】アスペルギルス  ソーヤのＳｐｈ３の推定アミノ酸配列（配列番号４３）及びＳｐｈ３をコードする核酸分子の塩基配列（配列番号４４）を示す。
【図５４】アスペルギルス  ソーヤのＥｇａ３の推定アミノ酸配列（配列番号４５）及びＥｇａ３をコードする核酸分子の塩基配列（配列番号４６）を示す。
【図５５】アスペルギルス  ソーヤのＡｇｄ３の推定アミノ酸配列（配列番号４７）及びＡｇｄ３をコードする核酸分子の塩基配列（配列番号４８）を示す。
【図５６】アスペルギルス  ソーヤのＧｔｂ３の推定アミノ酸配列（配列番号４９）を示す。
【図５７】アスペルギルス  ソーヤのＧｔｂ３をコードする核酸分子の塩基配列（配列番号５０）を示す。
【図５８】アスペルギルス  ソーヤのＧｔｂ３をコードする核酸分子の塩基配列（配列番号５０）を示す。
【図５９】アスペルギルス  ソーヤのＧｔｂ３をコードする核酸分子の塩基配列（配列番号５０）を示す。
【図６０】アスペルギルス  ニガーのＵｇｅ３の推定アミノ酸配列（配列番号５１）及びＵｇｅ３をコードする核酸分子の塩基配列（配列番号５２）を示す。
【図６１】アスペルギルス  ニガーのＳｐｈ３の推定アミノ酸配列（配列番号５３）及びＳｐｈ３をコードする核酸分子の塩基配列（配列番号５４）を示す。
【図６２】アスペルギルス  ニガーのＥｇａ３の推定アミノ酸配列（配列番号５５）及びＥｇａ３をコードする核酸分子の塩基配列（配列番号５６）を示す。
【図６３】アスペルギルス  ニガーのＡｇｄ３の推定アミノ酸配列（配列番号５７）及びＡｇｄ３をコードする核酸分子の塩基配列（配列番号５８）を示す。
【図６４】アスペルギルス  ニガーのＧｔｂ３の推定アミノ酸配列（配列番号５９）を示す。
【図６５】アスペルギルス  ニガーのＧｔｂ３をコードする核酸分子の塩基配列（配列番号６０）を示す。
【図６６】アスペルギルス  ニガーのＧｔｂ３をコードする核酸分子の塩基配列（配列番号６０）を示す。
【図６７】アスペルギルス  ニガーのＧｔｂ３をコードする核酸分子の塩基配列（配列番号６０）を示す。
【図６８】アスペルギルス  フミガタスのＵｇｅ３の推定アミノ酸配列（配列番号６１）及びＵｇｅ３をコードする核酸分子の塩基配列（配列番号６２）を示す。
【図６９】アスペルギルス  フミガタスのＳｐｈ３の推定アミノ酸配列（配列番号６３）及びＳｐｈ３をコードする核酸分子の塩基配列（配列番号６４）を示す。
【図７０】アスペルギルス  フミガタスのＥｇａ３の推定アミノ酸配列（配列番号６５）及びＥｇａ３をコードする核酸分子の塩基配列（配列番号６６）を示す。
【図７１】アスペルギルス  フミガタスのＡｇｄ３の推定アミノ酸配列（配列番号６７）及びＡｇｄ３をコードする核酸分子の塩基配列（配列番号６８）を示す。
【図７２】アスペルギルス  フミガタスのＧｔｂ３の推定アミノ酸配列（配列番号６９）を示す。
【図７３】アスペルギルス  フミガタスのＧｔｂ３をコードする核酸分子の塩基配列（配列番号７０）を示す。
【図７４】アスペルギルス  フミガタスのＧｔｂ３をコードする核酸分子の塩基配列（配列番号７０）を示す。
【図７５】アスペルギルス  フミガタスのＧｔｂ３をコードする核酸分子の塩基配列（配列番号７０）を示す。
【図７６】ペニシリウム  クリソゲナムのＡｇｓＢの推定アミノ酸配列（配列番号７１）を示す。
【図７７】ペニシリウム  クリソゲナムのＡｇｓＢをコードする核酸分子の塩基配列（配列番号７２）を示す。
【図７８】ペニシリウム  クリソゲナムのＡｇｓＢをコードする核酸分子の塩基配列（配列番号７２）を示す。
【図７９】ペニシリウム  クリソゲナムのＵｇｅ３の推定アミノ酸配列（配列番号７３）及びＵｇｅ３をコードする核酸分子の塩基配列（配列番号７４）を示す。
【図８０】ペニシリウム  クリソゲナムのＳｐｈ３の推定アミノ酸配列（配列番号７５）及びＳｐｈ３をコードする核酸分子の塩基配列（配列番号７６）を示す。
【図８１】ペニシリウム  クリソゲナムのＥｇａ３の推定アミノ酸配列（配列番号７７）及びＥｇａ３をコードする核酸分子の塩基配列（配列番号７８）を示す。
【図８２】ペニシリウム  クリソゲナムのＡｇｄ３の推定アミノ酸配列（配列番号７９）を示す。
【図８３】ペニシリウム  クリソゲナムのＡｇｄ３をコードする核酸分子の塩基配列（配列番号８０）を示す。
【図８４】ペニシリウム  クリソゲナムのＧｔｂ３の推定アミノ酸配列（配列番号８１）を示す。
【図８５】ペニシリウム  クリソゲナムのＧｔｂ３をコードする核酸分子の塩基配列（配列番号８２）を示す。
【図８６】ペニシリウム  クリソゲナムのＧｔｂ３をコードする核酸分子の塩基配列（配列番号８２）を示す。
【図８７】ペニシリウム  クリソゲナムのＧｔｂ３をコードする核酸分子の塩基配列（配列番号８２）を示す。
【図８８】ＷＴ株、ＡＧΔ株及びＡＧ−ＧＡＧΔ株のコンゴレッド（ＣＲ）感受性についての試験結果を示す。
【図８９】麹菌の野生（ＷＴ）株、ＡＧΔ株、ＡＧ−ＧＡＧΔ株及びＧＡＧΔ株の細胞壁構成糖の解析結果を示す。
【図９０】麹菌の野生（ＷＴ）株、ＡＧΔ株、ＡＧ−ＧＡＧΔ株及びＧＡＧΔの硫酸加水分解および単糖成分の分析を示す。
【図９１】（Ａ）コクリオボルス  ヘテロストロフォスにおけるＧＡＧ生合成遺伝子クラスター及び（Ｂ）遺伝子破壊候補株から抽出したゲノムＤＮＡのＰＣＲ産物の電気泳動結果を示す。
【図９２】コクリオボルス  ヘテロストロフォス野生株及びＧＡＧΔ株の培養性状を示す。
【図９３】（Ａ）Ｂ．ｆｕｃｋｅｌｉａｎａにおけるＧＡＧ生合成遺伝子クラスター及び（Ｂ）遺伝子破壊候補株から抽出したゲノムＤＮＡのＰＣＲ産物の電気泳動結果を示す。
【図９４】Ｂ．ｆｕｃｋｅｌｉａｎａ野生株及びＧＡＧΔ株の培養性状を示す。
【図９５】コクリオボルス  ヘテロストロフォス（ａｎａｍｏｒｐｈ：  Ｂｉｐｏｌａｒｉｓ  ｍａｙｄｉｓ）のｕｇｅ３の推定アミノ酸配列（配列番号８９）及びｕｇｅ３の核酸分子の塩基配列（配列番号９０）、ｓｐｈ  ３の推定アミノ酸配列（配列番号９１）、ｓｐｈ３  の核酸分子の塩基配列（配列番号９２）を図９５に示す。
【図９６】コクリオボルス  ヘテロストロフォス（ａｎａｍｏｒｐｈ：  Ｂｉｐｏｌａｒｉｓ  ｍａｙｄｉｓ）のｅｇａ３の推定アミノ酸配列（配列番号９３）、ｅｇａ３の核酸分子の塩基配列（配列番号９４）、ａｇｄ３の推定アミノ酸配列（配列番号９５）、ａｇｄ３の核酸分子の塩基配列（配列番号９６）を図９６〜９７に示す。
【図９７】コクリオボルス  ヘテロストロフォス（ａｎａｍｏｒｐｈ：  Ｂｉｐｏｌａｒｉｓ  ｍａｙｄｉｓ）のｅｇａ３の推定アミノ酸配列（配列番号９３）、ｅｇａ３の核酸分子の塩基配列（配列番号９４）、ａｇｄ３の推定アミノ酸配列（配列番号９５）、ａｇｄ３の核酸分子の塩基配列（配列番号９６）を図９６〜９７に示す。
【図９８】コクリオボルス  ヘテロストロフォス（ａｎａｍｏｒｐｈ：  Ｂｉｐｏｌａｒｉｓ  ｍａｙｄｉｓ）のｇｔｂ３の推定アミノ酸配列（配列番号９７）及びｇｔｂ３の核酸分子の塩基配列（配列番号９８）を図９８〜１０１に示す。
【図９９】コクリオボルス  ヘテロストロフォス（ａｎａｍｏｒｐｈ：  Ｂｉｐｏｌａｒｉｓ  ｍａｙｄｉｓ）のｇｔｂ３の推定アミノ酸配列（配列番号９７）及びｇｔｂ３の核酸分子の塩基配列（配列番号９８）を図９８〜１０１に示す。
【図１００】コクリオボルス  ヘテロストロフォス（ａｎａｍｏｒｐｈ：  Ｂｉｐｏｌａｒｉｓ  ｍａｙｄｉｓ）のｇｔｂ３の推定アミノ酸配列（配列番号９７）及びｇｔｂ３の核酸分子の塩基配列（配列番号９８）を図９８〜１０１に示す。
【図１０１】コクリオボルス  ヘテロストロフォス（ａｎａｍｏｒｐｈ：  Ｂｉｐｏｌａｒｉｓ  ｍａｙｄｉｓ）のｇｔｂ３の推定アミノ酸配列（配列番号９７）及びｇｔｂ３の核酸分子の塩基配列（配列番号９８）を図９８〜１０１に示す。
【図１０２】ボトリティス  シネレアのａｇｓ１の推定アミノ酸配列（配列番号９９）及びａｇｓ１の核酸分子の塩基配列（配列番号１００）を図１０２〜１０４に示す。
【図１０３】ボトリティス  シネレアのａｇｓ１の推定アミノ酸配列（配列番号９９）及びａｇｓ１の核酸分子の塩基配列（配列番号１００）を図１０２〜１０４に示す。
【図１０４】ボトリティス  シネレアのａｇｓ１の推定アミノ酸配列（配列番号９９）及びａｇｓ１の核酸分子の塩基配列（配列番号１００）を図１０２〜１０４に示す。
【図１０５】ボトリティス  シネレアのｕｇｅ３の推定アミノ酸配列（配列番号１０１）、ｕｇｅ３の核酸分子の塩基配列（配列番号１０２）、ｓｐｈ３の推定アミノ酸配列（配列番号１０３）、ｓｐｈ３の核酸分子の塩基配列（配列番号１０４）を図１０５に示す。
【図１０６】ボトリティス  シネレアのｅｇａ３の推定アミノ酸配列（配列番号１０５）、ｅｇａ３の核酸分子の塩基配列（配列番号１０６）、ａｇｄ３の推定アミノ酸配列（配列番号１０７）、ａｇｄ３の核酸分子の塩基配列（配列番号１０８）を図１０６〜１０７に示す。
【図１０７】ボトリティス  シネレアのｅｇａ３の推定アミノ酸配列（配列番号１０５）、ｅｇａ３の核酸分子の塩基配列（配列番号１０６）、ａｇｄ３の推定アミノ酸配列（配列番号１０７）、ａｇｄ３の核酸分子の塩基配列（配列番号１０８）を図１０６〜１０７に示す。
【図１０８】ボトリティス  シネレアのｇｔｂ３の核酸分子の塩基配列（配列番号１０９）、ｇｔｂ３の核酸分子の塩基配列（配列番号１１０）を図１０８〜１１１を示す。
【図１０９】ボトリティス  シネレアのｇｔｂ３の核酸分子の塩基配列（配列番号１０９）、ｇｔｂ３の核酸分子の塩基配列（配列番号１１０）を図１０８〜１１１を示す。
【図１１０】ボトリティス  シネレアのｇｔｂ３の核酸分子の塩基配列（配列番号１０９）、ｇｔｂ３の核酸分子の塩基配列（配列番号１１０）を図１０８〜１１１を示す。
【図１１１】ボトリティス  シネレアのｇｔｂ３の核酸分子の塩基配列（配列番号１０９）、ｇｔｂ３の核酸分子の塩基配列（配列番号１１０）を図１０８〜１１１を示す。
【図１１２】各種菌体に対するＡＧＢＤ−ＧＦＰによる染色の結果を示す。
【図１１３】各種菌体に対するＡＧＢＤ−ＧＦＰによる染色の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、α−１，３−グルカンを発現せず、かつＧＡＧ生合成クラスターの少なくとも一部を欠損している変異型の糸状菌を提供する。
【００１５】
糸状菌変異株
本発明において、「α−１，３−グルカンを発現しない変異型の糸状菌」とは、糸状菌の変異株であって、α−１，３−グルカンを全く発現しないものだけでなく、α−１，３−グルカンを実質的に発現しないものも包含する。より具体的には、α−１，３−グルカンを実質的に発現しない変異株とは、ごくわずかにα−１，３−グルカンを発現するにとどまり、本発明の効果である菌体の凝集が有意に抑制されている変異株を示し、例えば、α−１，３−グルカンの発現量が野生株の３０％以下、より好ましくは野生株の１０％以下である株等が挙げられる。また、本発明における糸状菌変異株には、元々α−１，３−グルカンを発現しない糸状菌であって、ＧＡＧ生合成クラスターの機能を欠損させた変異株も含まれる。
【００１６】
糸状菌としては、例えば、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属（ペニシリウム  クリソゲナム等）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属、セファロスポリウム（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ）属、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属、ボトリティス（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ）属、コクリオボルス（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ）属、モナスカス属等が挙げられる。これらのうち、アスペルギルス属、ボトリティス属、コクリオボルス属がより好ましく、アスペルギルス属がより好ましい。本発明において用いるアスペルギルス属の糸状菌としては、例えば、アスペルギルス  オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス  ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅ）、アスペルギルス  ニドランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ  ／  Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス  ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス  フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）等が挙げられ、アスペルギルス  オリゼ、アスペルギルス  ソーヤ、アスペルギルス  ニドランス、またはアスペルギルス  ニガーが好ましく、アスペルギルス  オリゼ、アスペルギルス  ソーヤがより好ましく、アスペルギルス  オリゼがより好ましい。本発明において用いるボトリティス属の糸状菌としては、例えば、ボトリティス  シネレア（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ  ｃｉｎｅｒｅａ，  ｔｅｌｅｏｍｏｒｐｈ：  Ｂｏｔｒｙｏｔｉｎｉａ  ｆｕｃｋｅｌｉａｎａ）、ボトリティス  アリー、ボトリティス  スカモサ、ボトリティス  バイソイジア等が挙げられる。本発明において用いるコクリオボルス属の糸状菌としては、例えば、コクリオボルス  ヘテロストロフォス  （Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ  ｈｅｔｅｒｏｓｔｒｏｐｈｕｓ，  ａｎａｍｏｒｐｈ：  Ｂｉｐｏｌａｒｉｓ  ｍａｙｄｉｓ）、コクリオボルス  カルボナム、コクリオボルス  ミアビアヌス、コクリオボルス  ビクトリア等が挙げられる。モナスカス属としては、モナスカス  プルプレウス（紅麹菌）、モナスカス  ルーバー、モナスカス  ピロサス等が挙げられる。
【００１７】
本発明にかかるα−１，３−グルカンを発現しない糸状菌変異株としては、α−１，３−グルカン合成酵素遺伝子ａｇｓの少なくとも一つを欠損しているものが挙げられる。α−１，３−グルカン合成酵素遺伝子ａｇｓとしては、アスペルギルス  ニドランスのａｇｓＡ（Genbank accession No. AN5885）、ａｇｓＢ（Genbank accession No. AN3307）、アスペルギルス  オリゼのａｇｓＡ、ａｇｓＢ、ａｇｓＣ、アスペルギルス  ソーヤのａｇｓＡ、ａｇｓＢ、ａｇｓＣ、アスペルギルス  フミガタスのａｇｓ１（Genbank accession No. AFUA_3G00910）、アスペルギルス  ニガーのａｇｓＥ（Genbank accession No. ANI_1_360084）、ペニシリウム  クリソゲナムのａｇｓＢ（Genbank accession No. Pc16g06130）などが挙げられる。ここで、アスペルギルス  オリゼのａｇｓＡ、ａｇｓＢ、ａｇｓＣは、アスペルギルスデータベースＡｓｐＧＤ（http://www.aspergillusgenome.org）に、遺伝子番号ａｇｓＡ（AOR_1_956014）、ａｇｓＢ（AOR_1_2634154）、ａｇｓＣ（AOR_1_1350024）で登録されている。アスペルギルス  オリゼのＡｇｓＡの推定アミノ酸配列（配列番号１）を図６に、アスペルギルス  オリゼのＡｇｓＡをコードする核酸分子の塩基配列（配列番号２）を図７〜８に示す。アスペルギルス  オリゼのＡｇｓＢの推定アミノ酸配列（配列番号３）を図９に、アスペルギルス  オリゼのＡｇｓＢをコードする核酸分子の塩基配列（配列番号４）を図１０〜１１に示す。アスペルギルス  オリゼのＡｇｓＣの推定アミノ酸配列（配列番号５）を図１２に、アスペルギルス  オリゼのＡｇｓＣをコードする核酸分子の塩基配列（配列番号６）を図１３〜１４に示す。アスペルギルス  ニドランスのＡｇｓＡの推定アミノ酸配列（配列番号７）を図１５に、アスペルギルス  ニドランスのＡｇｓＡをコードする核酸分子の塩基配列（配列番号８）を図１６〜１７に示す。また、アスペルギルス  ニドランスのＡｇｓＢの推定アミノ酸配列（配列番号９）を図１８に、アスペルギルス  ニドランスのＡｇｓＢをコードする核酸分子の塩基配列（配列番号１０）を図１９〜２０に示す。本発明においては、アスペルギルス  ソーヤのＡｇｓＡ、ＡｇｓＢ及びＡｇｓＣのアミノ酸配列としては、ＧｅｎＢａｎｋに登録されている遺伝子配列（Genbank accession No. DF093557-DF093585）から、アスペルギルス  オリゼとの相同性に基づき推定したアミノ酸配列等が挙げられる。アスペルギルス  ソーヤのＡｇｓＡの推定アミノ酸配列（配列番号１１）を図２１に、アスペルギルス  ソーヤの上記ＡｇｓＡをコードする推定核酸分子の塩基配列（配列番号１２）を図２２〜２３に示す。また、アスペルギルス  ソーヤのＡｇｓＢの推定アミノ酸配列（配列番号１３）を図２４に、アスペルギルス  ソーヤのＡｇｓＢをコードする核酸分子の塩基配列（配列番号１４）を図２５〜２６に示す。また、アスペルギルス  ソーヤのＡｇｓＣの推定アミノ酸配列（配列番号１５）を図２７に、アスペルギルス  ソーヤのＡｇｓＣをコードする核酸分子の塩基配列（配列番号１６）を図２８〜２９に示す。アスペルギルス  ニガーのＡｇｓＥの推定アミノ酸配列（配列番号１７）を図３０に示す。アスペルギルス  ニガーのＡｇｓＥをコードする核酸分子の塩基配列（配列番号１８）を図３１〜３２に示す。アスペルギルス  フミガタスのＡｇｓ１の推定アミノ酸配列（配列番号１９）を図３３に示す。アスペルギルス  フミガタスのＡｇｓ１をコードする核酸分子の塩基配列（配列番号２０）を図３４〜３５に示す。ペニシリウム  クリソゲナムのＡｇｓＢの推定アミノ酸配列（配列番号７１）及びＡｇｓＢをコードする核酸分子の塩基配列（配列番号７２）を図７５に示す。
変異型糸状菌としては、これらのα−１，３−グルカン合成酵素遺伝子の１つ又は２つ以上を欠損しているものが挙げられ、３つ全てを欠損しているものが好ましい。
【００１８】
本発明において、α−１，３−グルカン合成酵素遺伝子ａｇｓの欠損とは、ゲノム中のα−１，３−グルカン合成酵素のコード領域の全部または一部が欠失しているもの、コード領域の全部または一部に別の核酸分子が挿入されているもの、当該コード領域の全部または一部が別の核酸分子で置換されているもの等が挙げられる。また、α−１，３−グルカン合成酵素遺伝子ａｇｓの欠損には、上記コード領域への所定の核酸分子の付加、欠失及び置換だけでなく、α−１，３−グルカンが一定の条件下でのみ発現されるように設計された、コンディショナルな遺伝子欠損も含まれる。
【００１９】
本発明にかかる糸状菌変異株は、α−１，３−グルカンを発現しないだけでなく、ガラクトサミノガラクタン（ＧＡＧ）生合成クラスターの少なくとも一部も欠損していることを特徴とする。
【００２０】
ガラクトサミノガラクタンは、２０１１年にアスペルギルス  フミガタスにおいて同定された細胞外多糖であり、ガラクトース（Ｇａｌ）、Ｎアセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）及びガラクトサミン（ＧａｌＮ）から構成される（非特許文献１）。そして、ＧＡＧ生合成クラスターを構成する遺伝子としては、ｕｇｅ３、ｓｐｈ３、ｅｇａ３、ａｇｄ３及びｇｔｂ３が挙げられる。
【００２１】
従って、本発明にかかるＧＡＧ生合成クラスターの少なくとも一部も欠損している糸状菌変異株としては、ｕｇｅ３、ｓｐｈ３、ｅｇａ３、ａｇｄ３及びｇｔｂ３からなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子を欠損しているもの等が挙げられる。本発明の一実施形態においては、例えば、ＧＡＧ生合成クラスターの少なくとも一部も欠損している糸状菌変異株としては、これらの遺伝子の内、少なくともｕｇｅ３及びｓｐｈ３を欠損しているもの等が挙げられる。
【００２２】
ＧＡＧ生合成クラスターを構成するこれらの遺伝子の例としては、例えば、アスペルギルス  オリゼのｕｇｅ３（Genbank accession No.AOR_1_2588174）、ｓｐｈ３(Genbank accession No. AOR_1_2586174)、ｅｇａ３（Genbank accession No. AOR_1_2584174）、ａｇｄ３（Genbank accession No. AOR_1_2582174）及びｇｔｂ３（Genbank accession No. AOR_1_2580174）、アスペルギルス  ニドランスのｕｇｅ３（Genbank accession No.AN2951）、ｓｐｈ３（Genbank accession No.AN2952）、ｅｇａ３（Genbank accession No.AN2953）、ａｇｄ３（Genbank accession No.AN2954）及びｇｔｂ３（Genbank accession No.AN2955）、アスペルギルス  ソーヤのｕｇｅ３、ｓｐｈ３、ｅｇａ３、ａｇｄ３及びｇｔｂ３、アスペルギルス  ニガーのｕｇｅ３（Genbank accession No. ANI_1_1578024）、ｓｐｈ３（Genbank accession No.ANI_1_3046024）、ｅｇａ３（Genbank accession No.ANI_1_1582024）、ａｇｄ３（Genbank accession No.ANI_1_3048024）及びｇｔｂ３（Genbank accession No.ANI_1_3050024）、アスペルギルス  フミガタスのｕｇｅ３（Genbank accession No.AFUA_3G07910）、ｓｐｈ３（Genbank accession No. AFUA_3G07900）、ｅｇａ３（Genbank accession No.AFUA_3G07890）、ａｇｄ３（Genbank accession No.AFUA_3G07870）及びｇｔｂ３（Genbank accession No. AFUA_3G07860）及びペニシリウム  クリソゲナムのｕｇｅ３（Genbank accession No.Pc20g06140）、ｓｐｈ３（Genbank accession No.Pc20g06130）、ｅｇａ３（Genbank accession No.Pc20g06110）、ａｇｄ３（Genbank accession No.Pc20g06090）及びｇｔｂ３（Genbank accession No.Pc20g06080）、コクリオボルス  ヘテロストロフォス（anamorph: Bipolaris maydis）のｕｇｅ３の(Gene ID: COCHEDRAFT_1185586)、ｓｐｈ  ３(Gene ID: COCHEDRAFT_1023805)、ｅｇａ３ (Gene ID: COCHEDRAFT_1023806)、ａｇｄ３(Gene ID: COCHEDRAFT_1146217)、ｇｔｂ３(Gene ID: COCHEDRAFT_1146218)、ボトリティス  シネレアのｕｇｅ３(Gene ID: Bcin01p05750.1)、ｓｐｈ３（Gene ID: Bcin01p05740.1)、ｅｇａ３(Gene ID: Bcin01p05730.1)、ａｇｄ３(Gene ID: Bcin01p05720.1)、ｇｔｂ３(Gene ID: Bcin01p05710.1)などが挙げられる。
【００２３】
アスペルギルス  オリゼのＵｇｅ３のアミノ酸配列（配列番号２１）及びＵｇｅ３をコードする核酸分子の塩基配列（配列番号２２）を図３６に示す。また、アスペルギルス  オリゼのＳｐｈ３のアミノ酸配列（配列番号２３）及びＳｐｈ３をコードする核酸分子の塩基配列（配列番号２４）を図３７に示す。また、アスペルギルス  オリゼのＥｇａ３のアミノ酸配列（配列番号２５）及びＥｇａ３をコードする核酸分子の塩基配列（配列番号２６）を図３８に示す。また、アスペルギルス  オリゼのＡｇｄ３のアミノ酸配列（配列番号２７）及びＡｇｄ３をコードする核酸分子の塩基配列（配列番号２８）を図３９に示す。また、アスペルギルス  オリゼのＧｔｂ３のアミノ酸配列（配列番号２９）を図４０に、アスペルギルス  オリゼのＧｔｂ３をコードする核酸分子の塩基配列（配列番号３０）を図４１〜４３に示す。
【００２４】
アスペルギルス  ニドランスのＵｇｅ３のアミノ酸配列（配列番号３１）及びＵｇｅ３をコードする核酸分子の塩基配列（配列番号３２）を図４４に示す。また、前述したアスペルギルス  ニドランスのＳｐｈ３のアミノ酸配列（配列番号３３）及びＳｐｈ３をコードする核酸分子の塩基配列（配列番号３４）を図４５に示す。また、アスペルギルス  ニドランスのＥｇａ３のアミノ酸配列（配列番号３５）及びＥｇａ３をコードする核酸分子の塩基配列（配列番号３６）を図４６に示す。また、アスペルギルス  ニドランスのＡｇｄ３のアミノ酸配列（配列番号３７）及びＡｇｄ３をコードする核酸分子の塩基配列（配列番号３８）を図４７に示す。また、アスペルギルス  ニドランスのＧｔｂ３のアミノ酸配列（配列番号３９）を図４８に、アスペルギルス  ニドランスのＧｔｂ３をコードする核酸分子の塩基配列（配列番号４０）を図４９〜５１に示す。
【００２５】
本発明においては、アスペルギルス  ソーヤのＵｇｅ３、Ｓｐｈ３、Ｅｇａ３、Ａｇｄ３及びＧｔｂ３のアミノ酸配列としては、ＧｅｎＢａｎｋに登録されているアスペルギルス  ソーヤの遺伝子配列（Genbank accession No.DF093557-DF093585）から、アスペルギルス  オリゼとの相同性に基づき推定したアミノ酸配列等が挙げられる。アスペルギルス  ソーヤのＵｇｅ３の推定アミノ酸配列（配列番号４１）及びＵｇｅ３をコードする推定核酸分子の塩基配列（配列番号４２）を図５２に示す。アスペルギルス  ソーヤのＳｐｈ３の推定アミノ酸配列（配列番号４３）及びＳｐｈ３をコードする推定核酸分子の塩基配列（配列番号４４）を図５３に示す。アスペルギルス  ソーヤのＥｇａ３の推定アミノ酸配列（配列番号４５）及びＥｇａ３をコードする推定核酸分子の塩基配列（配列番号４６）を図５４に示す。また、アスペルギルス  ソーヤのＡｇｄ３の推定アミノ酸配列（配列番号４７）及びＡｇｄ３をコードする推定核酸分子の塩基配列（配列番号４８）を図５５に示す。また、アスペルギルス  ソーヤのＧｔｂ３の推定アミノ酸配列（配列番号４９）を図５６に、アスペルギルス  ソーヤのＧｔｂ３をコードする推定核酸分子の塩基配列（配列番号５０）を図５７〜５９に示す。
【００２６】
アスペルギルス  ニガーのＵｇｅ３の推定アミノ酸配列（配列番号５１）及びＵｇｅ３をコードする核酸分子の塩基配列（配列番号５２）を図６０に示す。アスペルギルス  ニガーのＳｐｈ３の推定アミノ酸配列（配列番号５３）及びＳｐｈ３をコードする核酸分子の塩基配列（配列番号５４）を図６１に示す。アスペルギルス  ニガーのＥｇａ３の推定アミノ酸配列（配列番号５５）及びＥｇａ３をコードする核酸分子の塩基配列（配列番号５６）を図６２に示す。アスペルギルス  ニガーのＡｇｄ３の推定アミノ酸配列（配列番号５７）及びＡｇｄ３をコードする核酸分子の塩基配列（配列番号５８）を図６３に示す。アスペルギルス  ニガーのＧｔｂ３の推定アミノ酸配列（配列番号５９）を図６４に示す。アスペルギルス  ニガーのＧｔｂ３をコードする核酸分子の塩基配列（配列番号６０）を図６５〜６７に示す。アスペルギルス  フミガタスのＵｇｅ３の推定アミノ酸配列（配列番号６１）及びＵｇｅ３をコードする核酸分子の塩基配列（配列番号６２）を図６８に示す。アスペルギルス  フミガタスのＳｐｈ３の推定アミノ酸配列（配列番号６３）及びＳｐｈ３をコードする核酸分子の塩基配列（配列番号６４）を図６９に示す。アスペルギルス  フミガタスのＥｇａ３の推定アミノ酸配列（配列番号６５）及びＥｇａ３をコードする核酸分子の塩基配列（配列番号６６）を図７０に示す。アスペルギルス  フミガタスのＡｇｄ３の推定アミノ酸配列（配列番号６７）及びＡｇｄ３をコードする核酸分子の塩基配列（配列番号６８）を図７１に示す。アスペルギルス  フミガタスのＧｔｂ３の推定アミノ酸配列（配列番号６９）を図７２に示す。アスペルギルス  フミガタスのＧｔｂ３をコードする核酸分子の塩基配列（配列番号７０）を図７３〜７５に示す。ペニシリウム  クリソゲナムのＵｇｅ３の推定アミノ酸配列（配列番号７３）及びＵｇｅ３をコードする核酸分子の塩基配列（配列番号７４）を図７９に示す。ペニシリウム  クリソゲナムのＳｐｈ３の推定アミノ酸配列（配列番号７５）及びＳｐｈ３をコードする核酸分子の塩基配列（配列番号７６）を図８０に示す。ペニシリウム  クリソゲナムのＥｇａ３の推定アミノ酸配列（配列番号７７）及びＥｇａ３をコードする核酸分子の塩基配列（配列番号７８）を図８１に示す。ペニシリウム  クリソゲナムのＡｇｄ３の推定アミノ酸配列（配列番号７９）を図８２に示す。ペニシリウム  クリソゲナムのＡｇｄ３をコードする核酸分子の塩基配列（配列番号８０）を図８３に示す。ペニシリウム  クリソゲナムのＧｔｂ３の推定アミノ酸配列（配列番号８１）を図８４に示す。ペニシリウム  クリソゲナムのＧｔｂ３をコードする核酸分子の塩基配列（配列番号８２）を図８５〜８７に示す。
【００２７】
コクリオボルス  ヘテロストロフォス（anamorph: Bipolaris maydis）のｕｇｅ３の推定アミノ酸配列（配列番号８９）及びｕｇｅ３の核酸分子の塩基配列（配列番号９０）、ｓｐｈ  ３の推定アミノ酸配列（配列番号９１）、ｓｐｈ３  の核酸分子の塩基配列（配列番号９２）を図９５に示す。コクリオボルス  ヘテロストロフォス（anamorph: Bipolaris maydis）のｅｇａ３の推定アミノ酸配列（配列番号９３）、ｅｇａ３の核酸分子の塩基配列（配列番号９４）、ａｇｄ３の推定アミノ酸配列（配列番号９５）、ａｇｄ３の核酸分子の塩基配列（配列番号９６）を図９６〜９７に示す。コクリオボルス  ヘテロストロフォス（anamorph: Bipolaris maydis）のｇｔｂ３の推定アミノ酸配列（配列番号９７）及びｇｔｂ３の核酸分子の塩基配列（配列番号９８）を図９８〜１０１に示す。
【００２８】
ボトリティス  シネレアのａｇｓ１の推定アミノ酸配列（配列番号９９）及びａｇｓ１の核酸分子の塩基配列（配列番号１００）を図１０２〜１０４に示す。ボトリティス  シネレアのｕｇｅ３の推定アミノ酸配列（配列番号１０１）、ｕｇｅ３の核酸分子の塩基配列（配列番号１０２）、ｓｐｈ３の推定アミノ酸配列（配列番号１０３）、ｓｐｈ３の核酸分子の塩基配列（配列番号１０４）を図１０５に示す。ボトリティス  シネレアのｅｇａ３の推定アミノ酸配列（配列番号１０５）、ｅｇａ３の核酸分子の塩基配列（配列番号１０６）、ａｇｄ３の推定アミノ酸配列（配列番号１０７）、ａｇｄ３の核酸分子の塩基配列（配列番号１０８）を図１０６〜１０７に示す。ボトリティス  シネレアのｇｔｂ３の核酸分子の塩基配列（配列番号１０９）、ｇｔｂ３の核酸分子の塩基配列（配列番号１１０）を図１０８〜１１１に示す。
【００２９】
本発明において、ＧＡＧ生合成クラスターの少なくとも一部の欠損とは、例えば、ゲノム中のＧＡＧ生合成クラスターのうちコード領域の全部または一部が欠失しているもの、コード領域の全部または一部に別の核酸分子が挿入されているもの、当該コード領域の全部または一部が別の核酸分子で置換されているもの等が挙げられる。また、ＧＡＧ生合成クラスターの少なくとも一部の欠損には、上記コード領域への所定の核酸分子の付加、欠失及び置換だけでなく、ＧＡＧが一定の条件下でのみ発現されるように設計された、コンディショナルな遺伝子欠損も含まれる。
【００３０】
また、本発明において、ｕｇｅ３の欠損とは、例えば、ゲノム中のＵｇｅ３コード領域の全部または一部が欠失しているもの、コード領域の全部または一部に別の核酸分子が挿入されているもの、当該コード領域の全部または一部が別の核酸分子で置換されているもの等が挙げられる。本発明において、ｓｐｈ３の欠損とは、例えば、ゲノム中のＳｐｈ３コード領域の全部または一部が欠失しているもの、コード領域の全部または一部に別の核酸分子が挿入されているもの、当該コード領域の全部または一部が別の核酸分子で置換されているもの等が挙げられる。本発明において、ｅｇａ３の欠損とは、例えば、ゲノム中のＥｇａ３コード領域の全部または一部が欠失しているもの、コード領域の全部または一部に別の核酸分子が挿入されているもの、当該コード領域の全部または一部が別の核酸分子で置換されているもの等が挙げられる。本発明において、ａｇｄ３の欠損とは、例えば、ゲノム中のＡｇｄ３コード領域の全部または一部が欠失しているもの、コード領域の全部または一部に別の核酸分子が挿入されているもの、当該コード領域の全部または一部が別の核酸分子で置換されているもの等が挙げられる。本発明において、ｇｔｂ３の欠損とは、例えば、ゲノム中のＧｔｂ３コード領域の全部または一部が欠失しているもの、コード領域の全部または一部に別の核酸分子が挿入されているもの、当該コード領域の全部または一部が別の核酸分子で置換されているもの等が挙げられる。
【００３１】
また、ｕｇｅ３、ｓｐｈ３、ｅｇａ３、ａｇｄ３及びｇｔｂ３についても、これらの遺伝子の欠損には、上記コード領域への所定の核酸分子の付加、欠失及び置換だけでなく、ＧＡＧが一定の条件下でのみ発現されるように設計された、コンディショナルな遺伝子欠損も含まれる。
【００３２】
本発明にかかるＧＡＧ生合成クラスターの少なくとも一部を欠損している糸状菌変異株は、好ましくは、ＧＡＧを全く発現しないものだけでなく、ＧＡＧを実質的に発現しないものも包含する。より具体的には、ＧＡＧを実質的に発現しない変異株とは、ごくわずかにＧＡＧを発現するにとどまり、本発明の効果である菌体の凝集が有意に抑制されている変異株を示し、例えば、ＧＡＧの発現量が野生株の３０％以下、より好ましくは野生株の１０％以下である株等が挙げられる。
【００３３】
本発明の方法を糸状菌が本来産生能を有するアミラーゼ、セルラーゼ等の酵素、ペニシリン等の低分子化合物等の有用物質の生産に用いてもよいが、本発明の方法においては、糸状菌が本来産生能を有する有用物質の発現を増強する、又は糸状菌が本来産生能を有さない物質を発現するように形質転換を行ってもよい。かかる形質転換方法としては、糸状菌を宿主とできるように構築された発現ベクターと、該発現ベクターに同種または異種タンパク質をコードする遺伝子を機能的に連結して構築されるプラスミドを利用する、自体公知の方法（例えば特開２００１−４６０７８号公報、特開２００５−５２１１６号公報、特開２００９−１１８７８３号公報、特表平１１−５０６０２５号公報、特表２００７−５０８０２２号公報に記載の方法）を用いることが可能である。
【００３４】
かかる変異株の作製方法としては、糸状菌に対し、自体公知の方法（例えば、非特許文献２〜５に記載の方法）を適宜用いて、例えば、α−１，３−グルカン遺伝子の破壊カセットの構築及びゲノム遺伝子への当該カセットの導入、ＧＡＧ生合成クラスターを構成する遺伝子の破壊カセットの構築及びゲノム遺伝子への当該カセットの導入等により行うことができる。本発明においては、これらの遺伝子操作に供する糸状菌として、例えば、高確率に目的部位への遺伝子導入を可能にするために、遺伝子ｌｉｇＤ破壊及び／又は遺伝子ａｄｅＡ破壊（好ましくはこれらの両方）の変異を予め導入しておいたものを用いてもよい。ここで、ｌｉｇＤは、ＤＮＡの修復における非相同組換え修復に関わる遺伝子であり、当該遺伝子を破壊することによって、相対的に相同組換えにより目的部位へ遺伝子導入された形質転換体が高効率に取得できるようになるため好ましい。当該遺伝子を破壊する変異としては、例えば、ｓＣマーカーを用いて破壊したｌｉｇＤ：：ｓＣ変異（非特許文献６）等が挙げられる。また、ａｄｅＡはアデニン要求性遺伝子であり、これを破壊する変異としては、例えば、ピリチアミン耐性遺伝子（ｐｔｒＡ）で破壊したａｄｅＡΔ：：ｐｔｒＡ（非特許文献７）等が挙げられる。従って、本発明の糸状菌変異株としては、これらの変異をさらに有するものも挙げられる。
【００３５】
本発明にかかる糸状菌変異株は、物質生産に用いることができ、例えば、下記方法に用いることができる。
【００３６】
物質生産方法
本発明は、
前述した糸状菌変異株を培養して、当該糸状菌に物質を生成させる工程、及び
得られた物質を回収する工程
を含む、物質生産方法。
を提供する。
【００３７】
本発明の方法により製造することができる有用物質としては、糸状菌により生産され得る物質であれば特に限定されず、例えば、ペニシリン、スタチン類、セファロスポリン、麹酸、クエン酸、リンゴ酸等の低分子化合物；アミラーゼ、セルラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、ペプチターゼ、エステラーゼ、ハイドロフォビン、酸化酵素等の高分子化合物等が挙げられる。また有用物質としては、上記以外にも、有機酸、色素、農薬原体等の化成品、医薬品として用いられる各種物質が挙げられる。また、本発明の方法は、バイオマスの分解によるバイオエタノールの生産（セルラーゼ等を高生産するよう遺伝子組換えをしたカビを使用するもの等）等にも応用が可能である。本発明の方法によって、細胞壁の構成成分又はその加水分解物を製造することもできるが、細胞壁の構成成分又はその加水分解物以外の物質も製造することができる。細胞壁の構成成分又はその加水分解物としては、例えば、α−１，３−グルカン、β−１，３−グルカン、ポリガラクトース、グルコース、ガラクトース、グルコサミン、アミノ酸、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン及びキチン等が挙げられる。本発明においては、本発明の方法により製造することができる「物質」には、糸状菌を殺傷してしまう化合物、生きた細胞、化学合成によってしか得られない物質等は包含されないものと解釈される。
【００３８】
培養工程
本発明の方法は、α−１，３−グルカンを発現しない変異型の糸状菌を培養して、当該糸状菌に物質を生成させる工程を含む。当該工程で用いる培地としては、特に限定されず、糸状菌の培養に用いることができるものを広く使用することができる。例えば、ＣＤ最少培地、ＹＰＤ培地、ＴＳＢ培地、モルト培地、ＰＤＡ培地等が挙げられる。上記培地には、炭素源として、グルコース、でんぷん、可溶性でんぷん等を添加してもよい。かかる炭素源の添加量としては特に限定されないが、例えば、０．５〜１０％、より好ましくは１〜４％の範囲で適宜設定できる。培養温度は特に限定されず、２０〜４５℃、より好ましくは２５〜３７℃の範囲で適宜設定できる。培養時間も特に限定されないが、例えば、１２〜７２時間、より好ましくは２４〜４８時間の範囲で適宜設定できる。また、前述したように、本発明にかかる糸状菌変異株には、α−１，３−グルカン及び／又はＧＡＧが一定の条件下でのみ発現されるように設計された、コンディショナルな遺伝子欠損を有するものも包含される。従って、本発明の方法には、上記コンディショナルな遺伝子欠損のされた変異株を、α−１，３−グルカン及びＧＡＧが発現しない（又は発現が抑制される）条件下で培養する工程を含む方法も含まれる。
【００３９】
回収工程
培養培地からの有用物質の回収方法としては、特に限定されず、自体公知の方法（遠心分離、再結晶、蒸留法、溶媒抽出法、クロマトグラフィー等）を適宜用いることができる。本発明の方法は、有用物質の回収方法である。従って、糸状菌自体等の研究のために、その菌体の構成成分を分析する目的で糸状菌変異体の構成成分を分解、検出する方法は、本発明の方法とは本質的に異なる。
【００４０】
以下実施例を挙げて、本発明の実施の形態をさらに具体的に説明するとともに本発明による作用効果を例証する。これらの実施例は例示及び具体的説明のためのものであり、本発明はこれらの実施例に限定されない。
【実施例】
【００４１】
実施例１
材料と方法
菌株
本研究では、糸状菌  Ａ．  ｏｒｙｚａｅ  の野生株としてＮＳ４株（遺伝子型；ｎｉａＤ−，ｓＣ−）の改変株を用いた。本研究で用いたＮＳ４改変株は、高確率に目的部位へ遺伝子導入が可能なｌｉｇＤΔ：：ｓＣの変異およびアデニン栄養要求性をもつａｄｅＡΔ：：ｐｔｒＡの変異を導入した株（ｌｉｇＤΔ：：ｓＣ，ａｄｅＡΔ：：ｐｔｒＡ）である。また、３種のα−１，３−グルカン合成酵素遺伝子欠損株（ａｇｓＡΔａｇｓＢΔａｇｓＣΔ）をＡＧ欠損株として使用した。その他、作製した遺伝子変異株とその遺伝子型は表１に示した通りである。【００４２】
【表１】
0006647653.tif 000002
【００４３】
培地
本研究では、Ａ．  ｏｒｙｚａｅの選択最少培地としてＣｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ（ＣＤ）培地を使用した。また、富栄養培地としてＹＰＤ培地を用いた。ここでＣＤ培地について、ｎｉａＤ−の株を培養する際に窒素源として硝酸ナトリウムの代わりに７０ｍＭのグルタミン酸ナトリウムを添加したものを用いた  （今後、これをＣＤＥ培地と呼ぶ）。また、ａｄｅＡ−の株を培養する際、終濃度０．０１％となるようにアデニン硫酸塩を添加した（今後、これをＣＤＥＡ培地と呼ぶ）。培地、培養液の組成は表２に示した通りである。培地を寒天平板培地として用いる場合、終濃度１．５％（ｗ／ｖ）となるように寒天を培地に加えた。【００４４】
【表２】
0006647653.tif 000003
【００４５】
培養
本研究では特に記載のない限り、Ａ．  ｏｒｙｚａｅの培養は３０℃で行った。寒天平板培養時にはプレートを静置し、液体培養時には１２０ｒｐｍでロータリー振盪培養を行った。【００４６】
胞子懸濁液
Ａ．  ｏｒｙｚａｅ  は、変異株の種類により、それぞれの栄養要求性を満たすＣＤ培地の寒天平板培地に分生子を植菌し、分生子が十分に形成されるまで３０℃で約７日間培養した。さらに、Ｍａｌｔ培地に植え継ぎ、分生子が十分に形成されるまで３０℃で約４日間培養した。プレート１枚あたり１０ｍＬの滅菌済み分生子懸濁溶液（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，  ０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０，  １０ｍＭ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ  ７．２））  を寒天平板培地上に注ぎ、コンラージ棒で分生子を掻き取り懸濁した。この懸濁液中に混入する菌糸を取り除く目的で、滅菌済みセルストレイナー（穴径７０μｍ）または、滅菌済みミラクロス（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社）を用いてろ過し、分生子のみを５０ｍＬ容または１５ｍＬ容ファルコンチューブに回収し、分生子懸濁液とした。分生子の数はトーマの血球計算盤を用いて計測した。【００４７】
ｕｇｅ３，ｓｐｈ３遺伝子破壊カセットの作製
Ａ．  ｏｒｙｚａｅのｕｇｅ３とｓｐｈ３遺伝子は隣接しているため、両遺伝子を一度に破壊する破壊カセットを作製した。まず、ｕｇｅ３下流（５’側）領域（ａｍｐｌｉｃｏｎ  １）およびｓｐｈ３の下流（３’側）領域（ａｍｐｌｉｃｏｎ  ２）をＡ．  ｏｒｙｚａｅのゲノムＤＮＡを鋳型にＰＣＲで増幅した。また、ＡｎａｄｅＡ遺伝子（ａｍｐｌｉｃｏｎ  ３）をプラスミドＴＯＰＯ−２．１−ａｄｅＡからＰＣＲで増幅した（１ｓｔ  ｒｏｕｎｄ  ｏｆ  ＰＣＲ）。Ａｍｐｌｉｃｏｎ  １にはプライマーＳｐｈ３＋Ｕｇｅ３−ＬＵとＳｐｈ３＋Ｕｇｅ３−ＬＬ＋Ａｄｅを、ａｍｐｌｉｃｏｎ  ２にはプライマーＳｐｈ３＋Ｕｇｅ３−ＲＵ＋ＡｄｅとＳｐｈ３＋Ｕｇｅ３−ＲＬを、ａｍｐｌｉｃｏｎ  ３にはプライマーＳｐｈ３＋Ｕｇｅ３−ＡＵとＳｐｈ３＋Ｕｇｅ３−ＡＬをそれぞれＰＣＲ増幅に用いた（表３）。プライマーＳｐｈ３＋Ｕｇｅ３−ＬＬ＋ＡｄｅとＳｐｈ３＋Ｕｇｅ３−ＡＵ，Ｓｐｈ３＋Ｕｇｅ３−ＲＵ＋ＡｄｅとＳｐｈ３＋Ｕｇｅ３−ＡＬの５’側には、ｆｕｓｉｏｎ  ＰＣＲによる連結のため、相補鎖との相同配列を含んでいる。ＰＣＲ産物はゲル抽出を行い、プライマーＳｐｈ３＋Ｕｇｅ３−ＬＵとＳｐｈ３＋Ｕｇｅ３−ＲＬを用いてＰＣＲを行い、これら３断片を連結させた（２ｎｄ  ｒｏｕｎｄ  ｏｆ  ＰＣＲ）。ＰＣＲ産物のメインバンドをゲル抽出し、ｕｇｅ３，ｓｐｈ３遺伝子破壊カセットとした。【００４８】
【表３】
0006647653.tif 000004
【００４９】
プロトプラスト・ＰＥＧ法による  Ａ．  ｏｒｙｚａｅ  の形質転換
Ａ．  ｏｒｙｚａｅ  の形質転換はプロトプラスト・ＰＥＧ法を用いて行った（非特許文献８）。宿主株には、野生株およびＡＧ欠損株（ａｇｓＡΔａｇｓＢΔａｇｓＣΔ）を用いた。宿主株の分生子２×１０８個を５００ｍＬ容三角フラスコ中の２００ｍＬのＹＰＤ液体培地に接種し、３０℃、２０時間回転振盪培養した菌体を、滅菌したミラクロス  （Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社）  でろ過、集菌した。菌体を蒸留水で洗浄し、滅菌したスパーテルで菌体をプレスし脱水した。集めた菌体を５０ｍＬ容ファルコンチューブに入れ、穴径０．２０μｍのフィルターＤＩＳＭＩＣ−２５ＣＳ（ＡＤＶＡＮＴＥＣ社）でろ過したプロトプラスト化溶液［１０ｍｇ／ｍＬ  Ｌｙｓｉｎｇ  Ｅｎｚｙｍｅｓ（Ｓｉｇｍａ社）、５ｍｇ／ｍＬ  Ｃｅｌｌｕｌａｓｅ  Ｏｎｏｚｕｋａ（Ｙａｋｕｌｔ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｉｎｄ．  Ｃｏ．，  Ｌｔｄ）、２．５ｍｇ／ｍＬ  Ｙａｔａｌａｓｅ（ＴａＫａＲａ）、Ｌｙｓｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ  ｂｕｆｆｅｒ（表４）］２５ｍＬを加えて懸濁した。３０℃、８３ｒｐｍで３時間振盪し、細胞壁を消化することでプロトプラストを調製した。反応後、滅菌したミラクロスで未消化の菌体をろ過し、ろ液を４℃、２，０００×ｇ、５分間遠心分離しプロトプラストを回収した。回収したプロトプラストを０．８Ｍ  ＮａＣｌで洗浄し、４℃、２，０００×ｇで５分間遠心分離しプロトプラストを沈殿させ回収した。プロトプラストが２×１０８個／ｍＬとなるようにＳｏｌ．Ｉ（表４）を加え、懸濁した後、１／５量のＳｏｌ．ＩＩ（表４）を加え、よく混合した。２４０μＬのプロトプラスト液を１５ｍＬ容ファルコンチューブに分注し、ＤＮＡ溶液を適量（１〜１０μｇ程度）加えてよく混合し、氷中で２５分間放置した。次に、１ｍＬのＳｏｌ．ＩＩ  （表４）を加え、よく混合した後、室温で２０分間放置した。１０ｍＬのＳｏｌ．Ｉを加え、よく混合した後、室温、２，０００×ｇで５分間遠心し、上清を取り除き、３００μＬ  のＳｏｌ．Ｉを加えた。プロトプラストを均一に懸濁し、０．８Ｍ  ＮａＣｌを含むＣＤ選択培地（表２）に撒いた後、５５℃に温めておいた同じ組成の軟寒天培地［０．６％（ｗ／ｖ）Ａｇａｒ］５ｍＬを周りから注ぎ、プロトプラストを手早く均一に懸濁するように重層した。その後、３０℃でコロニーを形成するまで培養した。【００５０】
【表４】
0006647653.tif 000005
【００５１】
形質転換候補株の選抜
得られた形質転換候補株のゲノムＤＮＡに対して、目的とする形質転換が行われたかを確認するため、簡易的に菌株の分生子からゲノムＤＮＡを抽出し、設計したプライマーを用いたＰＣＲにより形質転換株を選抜した。１．５ｍＬエッペンドルフチューブに５００  μＬのＹＰＤ液体培地を取り、滅菌済みの爪楊枝にて形質転換候補株の分生子をつつき植菌し、３０℃で菌体が生育するまで培養した。遠心後に培地を除去し、菌体と等量のガラスビーズ、１５０μＬのＮｕｃｌｅｉ  Ｌｙｓｉｓ  Ｓｏｌ．（Ｐｒｏｍｅｇａ）を加え、Ｍｉｃｒｏ  ＳｍａｓｈＴＭ  ＭＳ−１００Ｒ（ＴＯＭＹ社）２分間４，５００ｒｐｍで菌体を粉砕した。６５℃で１５分間放置し、１００μＬのＰｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｅｐ．  Ｓｏｌ．（Ｐｒｏｍｅｇａ）を加えよく混合した。室温で５分間放置し、４℃、１５，０００ｒｐｍで５分間遠心後、上清を別の１．５ｍＬチューブに移し、１／１０量の３Ｍ酢酸ナトリウムと２．５倍量のエタノールを加え混合した。４℃、１５，０００ｒｐｍで２０分間遠心後、１ｍＬの７０％  エタノールで洗浄し、ペレットを５０μＬのＲＮａｓｅ入りＴＥに溶解した。この溶液をゲノムＤＮＡ溶液とし、ＰＣＲのテンプレートとして用いるまで４℃で保存した。【００５２】
核純化
目的の形質転換候補株を最小栄養寒天平板培地上で生育させ、回収した分生子懸濁液を予めオートクレーブ処理により滅菌した単核化フィルター（ＩＳＯＰＯＲＥ  ＴＭ  ＭＥＭＢＲＡＮＥ  ＦＩＬＴＥＲＳ，  ５．０  μｍ  ＴＭＴＰ，  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通すことで単核分生子を回収した。単核化処理した分生子懸濁液は適宜希釈し、最小栄養寒天平板培地上で生育させた。得られた候補株を再度  ＰＣＲ  により確認し、目的とする形質転換株の純化を行った。【００５３】
ＹＰＤ培地よる液体振盪培養
野生株、ＡＧ欠損株、ＡＧ−ＧＡＧ欠損株を用いて、ＹＰＤ培地による液体振盪培養を  ２４時間行った。温度は３０℃、回転数は１２０ｒｐｍ、培地スケールは５０ｍＬ／２００ｍＬ三角フラスコ（バッフル無し）とし、分生子を１×１０５個／ｍＬ接種した。【００５４】
ｃｕｔＬ１高発現株によるｐｏｌｙｂｕｔｙｌｅｎｅ  ｓｕｃｃｉｎａｔｅ−ｃｏ−ａｄｉｐａｔｅ（ＰＢＳＡ）分解能試験
作製したｃｕｔＬ１高発現型ＡＧ−ＧＡＧ欠損株について、ｃｕｔＬ１高発現プラスミドの導入を確認するため、ＰＢＳＡ分解能試験を行った。試験には１％のＰＢＳＡを含む  ＣＤＥ（２％Ｍａｌｔｏｓｅ）培地を用いた。培地の中心に分生子を植菌し、３０℃、４日間静置培養を行い、形成されるハローの観察を行った。コントロールとして、ｃｕｔＬ１高発現型野生株とｃｕｔＬ１非高発現型ＡＧ−ＧＡＧ欠損株を用いた。【００５５】
ＣｕｔＬ１分泌量の定量
培養上清１００μＬ中のタンパク質をＴＣＡ沈殿により精製し、適宜希釈しＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した（バッファー組成は表５に示す通り）。スタンダードとして、ＢＣＡ法により定量した０．４〜２μｇの精製α−アミラーゼ（Ａ．  ｏｒｙｚａｅ  由来、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）または０．２〜１ｎｇの精製ＣｕｔＬ１を用いた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで検出されたゲルの画像をＩｍａｇｅＪに取り込み、目的のバンドをピクセル数値化した。スタンダードから検量線を作成し、内在性アミラーゼまたはＣｕｔＬ１分泌量の定量を行った。【００５６】
【表５】
0006647653.tif 000006
【００５７】
ＹＰＭ培地における液体振盪培養
ｃｕｔＬ１高発現型の野生株、ＡＧ欠損株、ＡＧ−ＧＡＧ欠損株を用いて、ＹＰＭ培地（表２）による液体振盪培養を２４時間行った。温度は３０℃、回転数は１００ｒｐｍ、培地スケールは５０ｍＬ／２００ｍＬ三角フラスコとし、分生子を１×１０４個／ｍＬ  接種した。【００５８】
実験結果
Ａ．  ｏｒｙｚａｅにおけるＧＡＧ生合成遺伝子クラスターの推定
Ａ．  ｆｕｍｉｇａｔｕｓにおいてＧＡＧの生合成を担うとされた５つの遺伝子クラスター配列を元にＡ．  ｏｒｙｚａｅにも同遺伝子クラスターが存在するか否かをデータベース（ＡｓｐＧＤ）で検索した。その結果、Ａ．  ｏｒｙｚａｅにもクラスター遺伝子配列が存在しており、ｇｔｂ３  （ＡＯＲ＿１＿２５８０１７４），  ａｇｄ３（ＡＯＲ＿１＿２５８２１７４），  ｅｇａ３（ＡＯＲ＿１＿２５８４１７４），  ｓｐｈ３（ＡＯＲ＿１＿２５８６１７４），  ｕｇｅ３（ＡＯＲ＿１＿２５８８１７４）  のＯＲＦがＡ．  ｏｒｙｚａｅにおけるＧＡＧ生合成遺伝子であることが示唆された（図１Ａ）。【００５９】
ＧＡＧ単独欠損株およびＡＧ−ＧＡＧ欠損株の作製（図２）
野生株およびＡＧ欠損株を親株として、プロトプラスト・ＰＥＧ法により、ｕｇｅ３，ｓｐｈ３遺伝子破壊カセットをゲノム中に導入した。形質転換体の選抜はａｄｅＡ無添加のＣＤＥ寒天平板培地で行った。得られた形質転換体は、核純化を行い、プライマーＳｐｈ３＋Ｕｇｅ３−ＬＵとＳｐｈ３＋Ｕｇｅ３−ＲＬを用いてＰＣＲ増幅による確認を行った。【００６０】
ＧＡＧ単独欠損株およびＡＧ−ＧＡＧ欠損株の培養性状（図３）
ＧＡＧ単独欠損株は、野生株と比較して大きな菌糸塊を形成した。また、野生株とＡＧ  欠損株では菌糸が凝集し、菌糸塊を形成しているのに対し、ＡＧ−ＧＡＧ欠損株は菌糸の凝集が見られず、液体培地中で菌糸が完全に分散している様子が観察された。これまでに  Ａ．  ｏｒｙｚａｅにおいて、このように完全分散する培養性状を示す変異株は確認されていない。また、寒天平板培地上ではＡＧ−ＧＡＧ欠損株は野生株と同等の生育を示した。【００６１】
ＡＧ−ＧＡＧ欠損株に対するｃｕｔＬ１高発現株の取得（図４）
ＡＧ−ＧＡＧ欠損株を宿主株として、ｃｕｔＬ１高発現用プラスミドｐＮＧＡ−ｇｌａ−ｃｕｔ（Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５）の形質転換を行った。ｃｕｔＬ１高発現株の選抜には  ０．８Ｍ  ＮａＣｌを含むＣＤ培地を用い、硝酸独立栄養性を示す形質転換候補株を取得した。得られた形質転換体は核純化を行い、プライマーｎｉａＤ−ｔａｉｌ−ＦｗとｃｕｔＬ１−ＲＴ−Ｆを用いてＰＣＲ増幅による確認を行った。【００６２】
さらに、１％のＰＢＳＡを含むＣＤＥ（２％Ｍａｌｔｏｓｅ）培地を用いてハロー形成試験を行った。その結果、ｃｕｔＬ１高発現型ＡＧ−ＧＡＧ欠損株はコントロールとした  ｃｕｔＬ１高発現型野生株と同等のハロー形成が観察された。このことから、ｃｕｔＬ１高発現プラスミドが正しく導入されていると考えられた。【００６３】
ＡＧ−ＧＡＧ欠損株のＣｕｔＬ１生産性の評価
ＹＰＭ培地で培養を行った結果、培養２４時間目における乾燥菌体重は野生株、ＡＧ欠損株、ＡＧ−ＧＡＧ欠損株の順に増加していた。特にＡＧ−ＧＡＧ欠損株の乾燥菌体重は野生株の約１０倍となり有意に増加していた（図５Ａ）。また、ＣｕｔＬ１生産量についても野生株、ＡＧ欠損株、ＡＧ−ＧＡＧ欠損株の順に増加しており、ＡＧ欠損株は野生株の約２．５倍、ＡＧ−ＧＡＧ欠損株は野生株の約５倍でありそれぞれ有意に増加していた（図５Ｂ）。この結果から完全分散性を示すＡＧ−ＧＡＧ欠損株は高密度培養における物質高生産に好適な性質を持つことが示唆された。【００６４】
ＡＧΔおよびＡＧ−ＧＡＧΔ株のＣＲ感受性試験
コンゴレッド（ＣＲ）を０，１０，２０，４０，８０，１２０μｇ／ｍＬ含むＣＤ寒天培地の中央に５ｘ１０３／μＬに調製したＷＴ株、ＡＧΔ株又はＡＧ−ＧＡＧΔ株の分生子懸濁液を２μＬスポットし（計１ｘ１０４個／プレート）、３日間３０℃でインキュベートした。３日後のコロニー直径を計測し、ＣＲ無添加の際のコロニー直径を基準として、ＣＲ含有培地の生育率を算出した（図８８）。その結果、ＡＧ−ＧＡＧΔ株は全ての濃度において野生株、ＡＧΔ株より生育率が低下した。このことから、ＡＧだけでなくＧＡＧもＣＲ感受性に関与していることが示唆された。【００６５】
麹菌ＡＧ−ＧＡＧΔ株の細胞壁構成糖の解析
麹菌の野生（ＷＴ）株、ＡＧΔ株、ＡＧ−ＧＡＧΔ株及びＧＡＧΔ株の細胞壁成分は、熱水アルカリ抽出法を用いて菌体の多糖成分を分画し、各画分の硫酸加水分解物に含まれる単糖成分を定量することにより解析した。まず、各株の分生子を終濃度１．０ｘ１０５／ｍＬとなるように２００ｍＬのＹＰＤ培地（２％ｐｅｐｔｏｎｅ，１％  ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ，２％  ｇｌｕｃｏｓｅ）に接種し、３０℃，１２０ｒｐｍ，２４時間振盪培養した。培養後の培養液はミラクロスでろ過した。得られた菌体は水で洗浄した。菌体は凍結乾燥後、ミキサーミルで粉砕した。次に、各株の乾燥菌体粉末１ｇをＹｏｓｈｉｍｉら（Ｙｏｓｈｉｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＬｏＳ  ＯＮＥ，２０１３）の方法に従って熱水可溶（ＨＷ）画分、アルカリ可溶・水可溶（ＡＳ１）画分、アルカリ可溶（ＡＳ２）画分およびアルカリ不溶（ＡＩ）画分に分画した（表６）。
【表６】
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Ｙｏｓｈｉｍｉらの報告により、α−１，３−グルカンは主にＡＳ２画分に、β−１，３−グルカンやキチンは主にＡＩ画分に含まれていることが分かっている（Ｙｏｓｈｉｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  ＯＮＥ，２０１３）。これら４画分１０ｍｇを用いて２Ｎ  Ｈ２ＳＯ４存在下で１００℃，１２時間加熱し、画分中の多糖成分を単糖まで分解した。加水分解した各画分は炭酸バリウムを用いて中和し、遠心分離により上清を得た。各画分の加水分解物に含まれる単糖成分は、陰イオン交換カラムＣａｒｂｏ  ＰＡＣ  ＰＡ−１（４ｘ２５０ｍｍ，ＤＩＯＮＥＸ）およびガードカラムＣａｒｂｏ  ＰＡＣを用い、流速１ｍＬ／ｍｉｎ，カラム温度３５℃，コンパートメント温度２０℃，溶離液１８ｍＭ  ＮａＯＨの条件下で分離し、パルスドアンペロメトリ検出器を用いて検出した。単糖成分は１〜１００μｇ／ｍＬのガラクトサミン、グルコサミン、ガラクトース、グルコースおよびマンノースを標準として定量化した。また、１０μｇ／ｍＬのフコースを内部標準として用いた。その結果、各株のＨＷ，ＡＳ１，ＡＩ画分の単糖成分には有意な差が認められなかった（図８９）。それに対し、ＡＳ２画分においてはＡＧΔ株およびＡＧ−ＧＡＧΔ株でグルコース量が野生株に比べて顕著に減少した（図８９）。このことから、ＡＧΔ株およびＡＧ−ＧＡＧΔ株の細胞壁にはα−１，３−グルカンがほとんど含まれていないことが示唆された。
また、各株のＨＷ画分５０μｇを上述と同様の方法で硫酸加水分解および単糖成分の分析を行った。その結果、野生株およびＡＧΔ株ではガラクトサミンが生育菌体１ｇ当たりそれぞれ０．２５ｍｇおよび０．６０ｍｇ含まれていたのに対し、ＡＧ−ＧＡＧΔ株では全く検出されなかった（図９０）。これまでの研究でＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属糸状菌の細胞壁にはＧＡＧ以外にガラクトサミンを含む多糖は報告されていない。このことから、ＡＧ−ＧＡＧΔ株の細胞壁にはＧＡＧが含まれていないことが明らかとなった。【００６６】
実施例２
トウモロコシごま葉枯病菌におけるＧＡＧ破壊株の造成と培養性状
トウモロコシごま葉枯病菌（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ  ｈｅｔｅｒｏｓｔｒｏｐｈｕｓ，  ａｎａｍｏｒｐｈ：  Ｂｉｐｏｌａｒｉｓ  ｍａｙｄｉｓ）は、ゲノム中にガラクトサミノガラクタン生合成遺伝子クラスターと相同な遺伝子クラスターを持つ（配列情報、Ｆｉｇｕｒｅ  １Ａ）。本クラスターには５つの遺伝子が含まれるが、これらのうちｓｐｈ３とｕｇｅ３に対応する領域をハイグロマイシン耐性遺伝子で置換するコンストラクトを作製した（図９１Ａ）。まず、トウモロコシごま葉枯病菌の野生株ＨＩＴＯ７７１１株を完全培地（ＣＭ：１．５ｇ  Ｃａ（ＮＯ３）２・４Ｈ２Ｏ，０．５ｇ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ，０．５ｇ  ＫＣｌ，０．４ｇ  ＫＨ２ＰＯ４，３０ｍｇ  Ｋ２ＨＰＯ４，１０ｇ  ｇｌｕｃｏｓｅ，１．０ｇ  ｔｒｙｐｔｏｎｅ，ａｎｄ１．０ｇ  ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ  ｐｅｒ  ｌｉｔｅｒ）で２５℃において３６時間震とう培養（１２０ｒｐｍ）し、ミラクロスでろ過することによって菌体を回収した。次に、プロトプラスト化液（Ｌｙｓｉｎｇ  Ｅｎｚｙｍｅ  ５０ｍｇ／ｍＬ，Ｃｅｌｌｕｌａｓｅ  ｏｎｏｚｕｋａ５ｍｇ／ｍＬ，Ｙａｔａｌａｓｅ２．５ｍｇ／ｍＬ  ｉｎ  １０ｍＭ  Ｎａ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ  ｐＨ６．０）で菌体を処理し、プロトプラストを作製した。作製したプロトプラストを用いて、Ｙｏｓｈｉｍｉ  ｅｔ  ａｌ．らの方法（Ｙｏｓｈｉｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ２７１：２２８−２３６）に従ってプロトプラストＰＥＧ法により形質転換を行った。得られた１株の遺伝子破壊候補株からゲノムＤＮＡを抽出し、ＰＣＲにより遺伝子破壊の確認を行った。その結果、遺伝子破壊が成功した際にのみ増幅する約３．５ｋｂと５．５ｋｂのバンドが認められたことから（図９１Ｂ）、この株は設計どおりｓｐｈ３とｕｇｅ３に対応する領域が欠失しているＧＡＧ破壊株であることが確認された。
次に、得られたＧＡＧ破壊株を炭素源がマルトースのＹＰＭ培地（Ｐｅｐｔｏｎｅ  ２％，Ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ１％，Ｍａｌｔｏｓｅ２％）で震とう培養し（２５℃，１２０ｒｐｍ，７２  ｈｏｕｒ）、培養性状を観察した。その結果、野生株が菌糸の塊を形成しながら生育するのに対し（図９２Ａ）、ＧＡＧ破壊株の菌糸は分散する傾向を示した（図９２Ｂ）。この特性はＡ．ｏｒｙｚａｅのＡＧ−ＧＡＧ欠損株に類似していることから、Ｃ．ｈｅｔｅｒｏｓｔｒｏｐｈｕｓにおいてもＧＡＧ欠損により高密度培養に適する培養特性となることが示唆された。【００６７】
実施例３
灰色カビ病菌におけるＡＧ−ＧＡＧ破壊株の造成と培養性状
灰色カビ病菌（Ｂｏｔｒｙｏｔｉｎｉａ  ｆｕｃｋｅｌｉａｎａ，  ａｎａｍｏｒｐｈ：  Ｂｏｔｒｙｔｉｓ  ｃｉｎｅｒｅａ）は、ゲノム中にガラクトサミノガラクタン生合成遺伝子クラスターと相同な遺伝子クラスターを持つ（配列情報、図９３Ａ）。本クラスターには５つの遺伝子が含まれるが、これらのうちｓｐｈ３とｕｇｅ３に対応する領域をハイグロマイシン耐性遺伝子で置換するコンストラクトを作製した（図９３Ａ）。まず、灰色カビ病菌のＡＧ破壊株を完全培地（ＣＭ：１．５ｇ  Ｃａ（ＮＯ３）２・４Ｈ２Ｏ，０．５ｇ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ，０．５ｇ  ＫＣｌ，０．４ｇ  ＫＨ２ＰＯ４，３０ｍｇ  Ｋ２ＨＰＯ４，１０ｇ  ｇｌｕｃｏｓｅ，１．０ｇ  ｔｒｙｐｔｏｎｅ，ａｎｄ１．０ｇ  ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ  ｐｅｒ  ｌｉｔｅｒ）で２５℃において３６時間震とう培養（１２０ｒｐｍ）し、ミラクロスでろ過することによって菌体を回収した。次に、前述のプロトプラスト化液で菌体を処理し、プロトプラストを作製した。作製したプロトプラストを用いて、同様にプロトプラストＰＥＧ法により形質転換を行った。得られた２４株の遺伝子破壊候補株からゲノムＤＮＡを抽出し、ＰＣＲにより遺伝子破壊の確認を行った。その結果、２株において遺伝子破壊が成功した際にのみ増幅する約３．５ｋｂと５．５ｋｂのバンドが認められたことから（図９３Ｂ）、これらの株は設計どおりｓｐｈ３とｕｇｅ３に対応する領域が欠失しているＧＡＧ破壊株であることが確認された。
次に、得られたＧＡＧ破壊株を炭素源がマルトースのＹＰＭ培地（Ｐｅｐｔｏｎｅ  ２％，Ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ  １％，Ｍａｌｔｏｓｅ  ２％）で震とう培養し（２５℃，１２０ｒｐｍ，７２ｈｏｕｒ）、培養性状を観察した。後述するように、この培養条件でＢ．  ｃｉｎｅｒｅｒａ  ＧＡＧ破壊株の菌体表面のＡＧ発現をα−１，３−ｇｌｕｃａｎａｓｅ−ｇｌｕｃａｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ−ＧＦＰ融合体で検出すると（図１１２）、ＡＧの発現は検出されず、実質Ａ．  ｏｒｙｚａｅ  ＡＧ−ＧＡＧ破壊株と同等であることがわかった。そのためこの培養条件では、Ｂ．ｃｉｎｅｒｅｒａＧＡＧ破壊株はＧＡＧ単独欠損でありながら、野生株が菌糸の塊を形成しながら生育するのに対し（図９４Ａ）、Ｂ．  ｃｉｎｅｒｅｒａＧＡＧ破壊株の菌糸は野生株より分散する傾向を示した（図９４Ｂ）。この性質はＡ．ｏｒｙｚａｅのＡＧ−ＧＡＧ破壊株と類似していることから、灰色カビ病菌では、ＧＡＧ破壊のみでも高密度培養に好適となる可能性が考えられた。【００６８】
ＡＧＢＤ−ＧＦＰ方法と結果
菌体（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅのＷＴ又はＡＧ−ＧＡＧΔ；Ｂｏｔｒｙｔｉｓ  ｃｉｎｅｒｅａのＷＴ又はＧＡＧΔ；Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ  ｈｅｔｅｒｏｓｔｒｏｐｈｕｓのＷＴ又はＧＡＧΔ）をスライドガラス上にのせ、６５℃で１５分間インキュベートして、固定した。固定した菌体をＡＧＢＤ−ＧＦＰ溶液（１００μｇ／ｍＬ  ｉｎ  ５０  ｍＭ  ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ）１０  μＬで浸し、３時間３０℃でインキュベートした。ＡＧＢＤ−ＧＦＰとはα−１，３−グルカナーゼのα−１，３−グルカン結合部位とＧＦＰをフュージョンした組換タンパク質であり、α−１，３−グルカンを特異的に染色することができる（Ｓｕｙｏｔｈａ  ｅｔ  ａｌ  （２０１３）  Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ７７：    ６３９−６４７．）。３時間の反応の後、菌体を５０  ｍＭ  ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒで３回洗浄し、蛍光顕微鏡で観察した。その結果、麹菌Ａ．  ｏｒｙｚａｅ  の菌体においては、α−１，３−グルカン由来の明確な蛍光が観察されたのに対し、ＡＧ−ＧＡＧΔ株では蛍光は観察されなかった（図１１２）。また、Ｂ．  ｃｉｎｅｒｅａにおいても野生型株、ＧＡＧΔ株とも蛍光は観察されなかった（図１１２）。したがって、Ｂ．  ｃｉｎｅｒｅａはα−１，３−グルカン合成酵素を有しているにもかかわらず、本培養条件ではα−１，３−グルカンを発現していないことが示唆された。
また、α−１，３−グルカン合成酵素を持たないＣ．  ｈｅｔｅｒｏｓｔｒｏｐｈｕｓにおいては当然ながら、α−１，３−グルカン由来の蛍光は観察されなかった（図１１３）。
【産業上の利用可能性】
【００６９】
本発明によれば、糸状菌を用いた物質生産方法において、有用物質の生産量を飛躍的に上昇させることができる。また、本発明の方法により生産することができる有用物質は、特に限定されず、多岐にわたるため、産業上、非常に有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６９】
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【図７０】
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【図７１】
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【図７２】
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【図７３】
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【図７４】
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【図７５】
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【図７６】
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【図７７】
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【図７８】
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【図７９】
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【図８０】
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【図８１】
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【図８２】
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【図８３】
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【図８４】
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【図８５】
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【図８６】
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【図８７】
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【図８８】
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【図８９】
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【図９０】
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【図９１】
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【図９２】
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【図９３】
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【図９４】
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【図９５】
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【図９６】
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【図９７】
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【図９８】
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【図９９】
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【図１００】
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【図１０１】
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【図１０２】
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【図１０３】
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【図１０４】
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【図１０５】
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【図１０６】
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【図１０７】
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【図１０８】
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【図１０９】
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【図１１０】
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【図１１１】
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【図１１２】
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【図１１３】
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【配列表】
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