(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
外来性ミトコンドリアを含む哺乳類細胞であって、前記細胞がエンドサイトーシスの機能を有し、前記細胞がマクロファージであり、
前記外来性ミトコンドリアが、ミトコンドリアまたは空のミトコンドリア外殻内にＧＦＰ遺伝子を含む外来性ＤＮＡを導入することによって得られた合成ミトコンドリアであり、
前記外来性ミトコンドリアからの遺伝子は、哺乳類細胞内において安定に発現され、有効に継代される、哺乳類細胞。
【請求項２】
請求項１に記載の哺乳類細胞であって、前記外来性ＤＮＡがＧＦＰ−ＣＯＸＩ融合遺伝子を含む、哺乳類細胞。
【請求項３】
請求項１に記載の外来性ミトコンドリアを含む哺乳類細胞を調製するための方法であって、
エンドサイトーシス機能を有する哺乳類細胞を含む細胞培養系に前記得られた外来性ミトコンドリアを加え、培養を継続して前記外来性ミトコンドリアを含む前記細胞を得ることを含む、方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法であって、
エンドサイトーシス機能を有する前記哺乳類細胞がマクロファージであり、
前記培養の条件が水蒸気飽和密閉インキュベータ内で温度３６〜３８℃且つ４．５〜５．５％ＣＯ２である、方法。
【請求項５】
哺乳類細胞内に外来性ミトコンドリアを導入するための方法であって、
（１）外来性ミトコンドリアを得ることと、
（２）エンドサイトーシス機能を有する哺乳類細胞を含む細胞培養系に前記外来性ミトコンドリアを加え、培養を継続して前記外来性ミトコンドリアを含む前記細胞を得ることと、を含み、
前記外来性ミトコンドリアからの遺伝子は、哺乳類細胞内において安定に発現され、有効に継代され、
前記哺乳類細胞がマクロファージであり、
前記外来性ミトコンドリアが、ミトコンドリアまたは空のミトコンドリア外殻内にＧＦＰ遺伝子を含む外来性ＤＮＡを導入することによって得られた合成ミトコンドリアである、
方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法であって、
前記外来性ＤＮＡがＧＦＰ−ＣＯＸＩ融合遺伝子を含む、方法。
【請求項７】
請求項５に記載の方法であって、
前記外来性ＤＮＡが合成ミトコンドリアＤＮＡであり、これが次のステップ
（１）必要に応じて遺伝子導入、遺伝子ノックアウト、部位特異的変異導入、および遺伝子再構成からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子改変手段を用いて哺乳類ミトコンドリアＤＮＡ配列に基づく新しいＤＮＡ配列組成を設計すること、または野生型ＤＮＡ配列組成を得ること、ならびに
（２）前記ＤＮＡ配列組成に従って５０ｂｐ〜６０ｂｐのＤＮＡ断片を合成し、ギブソン等温ワンステップ法によって前記合成されたＤＮＡ断片をつなぎ合わせて前記合成ミトコンドリアＤＮＡを得ること、
によって調製される、方法。
【請求項８】
請求項５〜７のいずれか一項に記載の方法であって、
前記培養の条件が水蒸気飽和密閉インキュベータ内で温度３６〜３８℃且つ４．５〜５．５％ＣＯ２である、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、生物および遺伝子工学の分野、特に哺乳類細胞内に外来性ミトコンドリアを導入するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ミトコンドリアは真核生物において最も重要なオルガネラであり、細胞のエネルギ供給の９０％よりも多くを担う。ミトコンドリアは独立したゲノム（すなわちミトコンドリアＤＮＡ）を保有し、核ゲノムとは異なる独立した遺伝子転写および蛋白質翻訳機構を有する。哺乳類ミトコンドリアＤＮＡは２２個のｔＲＮＡ、２個のｒＲＮＡ、および１３個のポリペプチドをコードしている。それらのコードされるポリペプチドは、ミトコンドリアの好気呼吸に関わる様々な蛋白質複合体中の重大なサブユニットである。多数の研究は、それらのポリペプチドの変異または低下した発現が細胞の好気呼吸を有意に阻害し得るということを示している。
【０００３】
現代の分子生物学の急速な発展によって、人類は核ゲノム内の様々な遺伝子改変活動、例えば遺伝子ノックイン、遺伝子ノックアウト、部位特異的変異導入、遺伝子再構成などを行うことができた。しかしながら、今のところ、ミトコンドリア遺伝子改変テクノロジは尚、非常に未成熟である。人類は酵母および他の下等真核生物においてミトコンドリア遺伝子改変を達成したのみであり、高等哺乳類においては未だである。哺乳類におけるミトコンドリア改変に関して多くの努力が報告されているが、全体としては、いずれも本当に上首尾ではなかった。１つの試みは、核ゲノム中で目的遺伝子を発現し、局在配列を加え、それからミトコンドリア内に導入することであった。この手法には課題がある。なによりも先ず、哺乳類ミトコンドリアゲノムの大半は機能性ＲＮＡをコードし、一方、核ゲノムによってコードされるＲＮＡがミトコンドリアに入るためのメカニズムは良く理解されていない。公知のメカニズムにおいては、局在ＲＮＡ配列を加えることが要求され、かかる配列が目的ＲＮＡの機能性に影響するであろうかどうかは未だ不明である。他方で、進化の数百万年の後に、哺乳類ミトコンドリアゲノム中に現在残っている１３個のポリペプチドは大部分の核遺伝子と異なる。核ゲノム中でのかかるポリペプチドの発現は細胞毒性の問題を招き得る。加えて、それらのポリペプチドは多くの場合には大変疎水性であり、これは核ゲノム発現の不利である。別の試みは、ミトコンドリア内に目的遺伝子をトランスフェクションするために、ミトコンドリアのための特別なトランスフェクション培地を開発することであった。この点では文献中にかなり報告されて来たが、細胞外からその３層の膜構造を横切ってミトコンドリア内に目的核酸を移入することは非常に難しい。例えばデカリニウムリポソーム（ＤＱＡｓｏｍｅ）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、および誘導体を用いる方法について少ない成功が報告されている。報告された方法は少ない引用をもまた有し、不良な再現性があり、ゆえにそれらの目標を本当には達成し得ない。第３の試みは、ミトコンドリアの遺伝子挙動を操作するために外来性の野生型ミトコンドリアの割合を増大させるための、核移植または細胞質雑種の技術の使用であった。かかる方法は内在性ミトコンドリアおよびＤＮＡを根絶し得ず、一方、それは加えて大量の外来性の細胞質成分を増大させ、それゆえに不確定性をさらに増大させ得る。未だ別の試みは、目的配列を破壊するためにミトコンドリアを標的とするＴＡＬＥＮ分子を発現することであった。この手法はミトコンドリアＤＮＡを上首尾に破壊することが報告されており、これは大きい欠失および特異的な点変異を有する。報告されているミトコンドリアＤＮＡを改変するための最も有効な技術的プロセスであるものの、この方法は多くの点で尚、不十分である。一方で、特異的な点変異のためには、ＴＡＬＥＮが目的配列を特異的に選択し得るかどうかは大変疑わしい。他方で、この方法は特定の配列のピンポイントの破壊のみを達成し得、しかし部位特異的改変または遺伝子ノックインは達成し得ない。ミトコンドリアは１００年前に発見され、一方、ミトコンドリアＤＮＡは数十年間公知である。それ以来、ミトコンドリアＤＮＡ形質転換を目指した努力がなされて来た。しかしながら、今までは、科学者は哺乳類ミトコンドリアＤＮＡの有効な遺伝子改変を実施することができていない。哺乳類細胞における有効なミトコンドリア遺伝子改変技術はそれゆえに世界クラスの技術的課題のまま残っている。
【０００４】
クレイグＪ．ヴェンター研究室は合成生物学の技術によってマウスミトコンドリアＤＮＡの合成完全配列を得ることに成功したが、それに何らかの改変をなしていない。彼らは哺乳類細胞内で合成ミトコンドリアＤＮＡを発現することまたはその機能性を同定することもできていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ゆえに、本開示の１つの態様によれば、外来性ミトコンドリアを含む哺乳類細胞が提供される。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
具体的には、次の技術的解決が開示される。
【０００７】
外来性ミトコンドリアを含む哺乳類細胞が開示され、細胞はエンドサイトーシスの機能を有する。
【０００８】
本明細書の外来性ミトコンドリアは、ミトコンドリアもしくは空のミトコンドリア外殻内に外来性ＤＮＡを導入することによって得られる合成ミトコンドリアであり得る。または、それは単離された哺乳類細胞ミトコンドリアであり得る。
【０００９】
外来性ＤＮＡは合成ミトコンドリアＤＮＡであり得、またはそれは単離されたＤＮＡであり得る。実施形態の１つにおいて、外来性ＤＮＡは任意の出所からの合成ミトコンドリアＤＮＡである。
【００１０】
実施形態の１つにおいて、合成ミトコンドリアＤＮＡは人為的な遺伝子改変を有する哺乳類細胞ミトコンドリアＤＮＡであり得る。当然のことながら、合成ミトコンドリアＤＮＡは野生型哺乳類細胞ミトコンドリアＤＮＡでもまたあり得る。
【００１１】
本明細書において用いられる用語「哺乳類細胞」はエンドサイトーシス機能を有する細胞、最も好ましくはマクロファージを言う。
【００１２】
本開示の別の態様によれば、先述の外来性ミトコンドリアを含む哺乳類細胞を調製するための方法が提供される。
【００１３】
具体的には、次の技術的解決が開示される。
【００１４】
外来性ミトコンドリアを含む哺乳類細胞を調製するための方法は、エンドサイトーシス機能を有する哺乳類細胞を含む細胞培養系に外来性ミトコンドリアを加えることと、培養を継続して外来性ミトコンドリアを有する細胞を得ることとを含み得る。
【００１５】
実施形態の１つにおいて、哺乳類細胞はマクロファージであり得る。培養条件は水蒸気飽和密閉インキュベータ内で温度３６〜３８℃且つ４．５〜５．５％ＣＯ２であり得る。
【００１６】
本開示の未だ別の態様によれば、合成ミトコンドリアが提供される。
【００１７】
具体的には、次の技術的解決が開示される。
【００１８】
合成ミトコンドリアが提供され、これはミトコンドリアまたは空のミトコンドリア外殻内に外来性ＤＮＡを導入することによって得られる。
【００１９】
先述の合成ミトコンドリアを調製するための方法もまた提供される。
【００２０】
従って、合成ミトコンドリアを調製するための方法は、
（１）外来性ＤＮＡを得ることと、
（２）空のミトコンドリア外殻を調製すること、または単離によってミトコンドリアを得ることと、
（３）エレクトロポレーションによって、ステップ（２）から得られた空のミトコンドリア外殻内または単離されたミトコンドリア内にステップ（１）から得られた外来性ＤＮＡを導入して、合成ミトコンドリアを得ることと、
を含み得る。
【００２１】
実施形態の１つにおいて、外来性ＤＮＡは単離された野生型ＤＮＡであり得る。または、外来性ＤＮＡは合成ミトコンドリアＤＮＡであり得、これは次のステップ
（１）必要に応じて遺伝子導入、遺伝子ノックアウト、部位特異的変異導入、および遺伝子再構成からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子改変手段を用いて哺乳類ミトコンドリアＤＮＡ配列に基づく新しいＤＮＡ配列組成を設計すること、または野生型ＤＮＡ配列組成を得ること、ならびに
（２）ＤＮＡ配列組成に従って５０ｂｐ〜６０ｂｐのＤＮＡ断片を合成し、ギブソン等温ワンステップ法によって合成されたＤＮＡ断片をつなぎ合わせて、合成ミトコンドリアＤＮＡを得ること、
によって調製される。
【００２２】
本開示の未だ別の態様によれば、哺乳類細胞内に外来性ミトコンドリアを導入するための方法が提供される。
【００２３】
具体的には、次の技術的解決が開示される。
【００２４】
従って、哺乳類細胞内に外来性ミトコンドリアを導入するための方法は、
（１）外来性ミトコンドリアを得ることと、
（２）エンドサイトーシス機能を有する哺乳類細胞を含む細胞培養系にステップ（１）から得られた外来性ミトコンドリアを加え、培養を継続して外来性ミトコンドリアを有する細胞を得ることと、
を含み得る。
【００２５】
実施形態の１つにおいて、外来性ミトコンドリアは単離された哺乳類細胞ミトコンドリアであり得る。
【００２６】
実施形態の１つにおいて、外来性ミトコンドリアは、ミトコンドリアまたは空のミトコンドリア外殻内に外来性ＤＮＡを導入することによって得られた合成ミトコンドリアであり得る。
【００２７】
実施形態の１つにおいて、外来性ＤＮＡは単離された野生型ＤＮＡであり得る。
【００２８】
実施形態の１つにおいて、外来性ＤＮＡは合成ミトコンドリアＤＮＡであり得、これは次のステップ
（１）必要に応じて遺伝子導入、遺伝子ノックアウト、部位特異的変異導入、および遺伝子再構成からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子改変手段を用いて哺乳類ミトコンドリアＤＮＡ配列に基づく新しいＤＮＡ配列を設計すること、または野生型ＤＮＡ配列組成を得ること、および
（２）ＤＮＡ配列組成に従って５０ｂｐ〜６０ｂｐのＤＮＡ断片を合成し、ギブソン等温ワンステップ法によって合成されたＤＮＡ断片をつなぎ合わせて合成ミトコンドリアＤＮＡを得ること、
によって調製され得る。
【００２９】
実施形態の１つにおいて、哺乳類細胞はマクロファージであり得る。
【００３０】
実施形態の１つにおいて、培養条件は水蒸気飽和密閉インキュベータ内で温度３６〜３８℃且つ４．５〜５．５％ＣＯ２であり得る。
【００３１】
本開示は合成生物学を利用して完全なミトコンドリアＤＮＡ配列を人工合成し、野生型配列に基づくＧＦＰおよびＣＯＸ−Ｉの融合発現を実現する。これは、ミトコンドリアゲノムの分子クローニングのための単純且つ有効な手段を提供する。本発明者は、マクロファージによるエンドサイトーシスによって細胞内に外来性ミトコンドリアＤＮＡを導入するための方法を初めて上首尾に開発し、安定なＧＦＰ発現および安定な継代を有する合成ミトコンドリアＤＮＡ細胞を得た。
【００３２】
本開示は、哺乳類ミトコンドリアＤＮＡに分子クローニング作業が上首尾に実施された世界で最初である。本開示は、マクロファージによるエンドサイトーシスによって細胞内に外来性ミトコンドリアＤＮＡを導入し、哺乳類細胞内における外来性ミトコンドリアＤＮＡからの遺伝子の安定な発現をもたらす。かかる細胞は有効に継代され得る。ゆえに、細胞内における外来性ミトコンドリアの有効な機能性が実現され得る。本明細書において開示される哺乳類細胞内に外来性ミトコンドリアＤＮＡを導入するための方法は、部位特異的変異導入、遺伝子挿入、遺伝子ノックアウト、遺伝子再構成などをミトコンドリアに実施するための完全に新しいミトコンドリア分子クローニング手段として用いられ得る。ゆえに、高純度で且つ出所の何らかの限定なしに哺乳類ミトコンドリアＤＮＡに任意の分子クローニング改変が実施され得、これはミトコンドリアＤＮＡ変異系の疾患の治療にとって大きい重要性がある。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】実施例１に記載されるマクロファージに外来性ミトコンドリアが入る結果を示す、顕微画像である。１ＡはそのＤｓＲｅｄ２検出結果を示しており、ＮＩＨ３Ｔ３に由来する外来性ミトコンドリアを示している。１Ｂは対応するＥＹＦＰ検出結果を示しており、マクロファージ内の内在性ミトコンドリアを示している。１Ｃは２色オーバーレイの結果を示している。
【図２】実施例３に記載される合成ミトコンドリアのインビトロアセンブリを示す、電気泳動像である。２Ａは、アセンブリされた合成ミトコンドリア内の正しい転写物の検出を示している。２Ｂは、アセンブリされた合成ミトコンドリア内のＤＮＡ複製の検出を示している。符号の説明：Ｍ：分子量マーカー、正：正の対照、アセンブリ：アセンブリされた合成ミトコンドリア、負：負の対照。
【図３】実施例４に記載されるマウスマクロファージＲＡＷ２６４．７内におけるＧＦＰ−ＣＯＸＩの融合発現を示す、顕微画像である。３Ａは、Ｍｉｔｏ−ＴｒａｃｋｅｒＲｅｄ色素によって染色された細胞内の全てのミトコンドリアの位置を示している。Ｍｉｔｏ−ＴｒａｃｋｅｒＲｅｄはミトコンドリア特異的色素である。３Ｂは緑色のＧＦＰ−ＣＯＸＩ融合遺伝子のＧＦＰシグナルを示している。３ＣはＤＡＰＩ染色結果を示しており、核の位置を示している。３Ｄは３色オーバーレイの結果である。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
本明細書において用いられる用語「遺伝子改変」は、インビトロ設計および全合成技術による目的配列のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子の構築を言う。本明細書において用いられる遺伝子改変は、新しいＤＮＡ配列を設計することを包含し、それは野生型配列と厳密に同じか、または必要に応じて任意の配列改変（部位特異的変異導入、遺伝子導入、遺伝子ノックアウト、および遺伝子再構成を包含する）を有し得る。
【００３５】
エンドサイトーシス（入胞作用（ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ  ｅｆｆｅｃｔ）としてもまた公知）は、形質膜の変形運動によって細胞内に細胞外物質を輸送するプロセスである。貪食された物質の種々のサイズおよび異なるエンドサイトーシスメカニズムに応じて、エンドサイトーシスは３種類（ファゴサイトーシス、ピノサイトーシス、および受容体を介したエンドサイトーシス）に分けられ得る。
【００３６】
本開示の技術的内容のはっきりした理解を促すために、添付の図面を参照して次の特定の実施形態が下記に詳細に記載される。これらの実施形態が、その範囲に対する何らかの限定なしに本発明を例示する目的のみを意図されているということは理解されるべきである。次の実施例において明示的に言及されていない具体的な実験方法は、通常は例えばSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual（New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989）に記載されている従来の条件に従って、または製造者の推奨に従っている。実施形態に関わる全ての化学試薬は市販製品である。
【００３７】
［実施例１］
この実施形態は、外来性ミトコンドリアがエンドサイトーシスによって哺乳類細胞内に入り得るということを明証している。マクロファージ内のミトコンドリアに局在した蛍光蛋白質ＥＹＦＰを安定に発現することによって、マクロファージの内在性ミトコンドリアがＥＹＦＰによって標識された。ＮＩＨ３Ｔ３細胞内のミトコンドリアに局在した蛍光蛋白質ＤｓＲｅｄ２を安定に発現することによって、ＮＩＨ３Ｔ３細胞の内在性ミトコンドリアがＤｓＲｅｄ２によって標識された。ＤｓＲｅｄ２によって標識されたＮＩＨ３Ｔ３ミトコンドリアが単離され、マクロファージ培養系に加えられた。１２時間後に共焦点顕微鏡を用いて観察がなされた。ＤｓＲｅｄ２によって標識されたミトコンドリアがマクロファージに入っており、ＥＹＦＰによって標識されたマクロファージの内在性ミトコンドリアと同じ形態を呈したということが観察された。具体的には、
１．マウスマクロファージ細胞株ＲＡＷ２６４．７の細胞およびＮＩＨ３Ｔ３細胞培養培地（高グルコースＤＭＥＭ（Ｈｙｃｌｏｎｅから市販、品番：ＳＨ３００２２．０１Ｂ）、１０％ウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯから市販、品番：１６０００−０４４）、二重抗生物質（１００００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを包含する。１：１００希釈使用。ＧＩＢＣＯから市販、品番：１５１４０−１２２））。細胞は従来の方法に従って培養シャーレ中で培養された。
【００３８】
２．プラスミドｍｉｔｏＤｓＲｅｄ２およびｍｉｔｏＥＹＦＰが分子クローニングの手段によって構築された。ミトコンドリア局在配列シグナル（ＭＳＶＬＴＰＬＬＬＲＧＬＴＧＳＡＲＲＬＰＶＰＲＡＫＩＨＳＬ）が標準的なＤｓＲｅｄ２（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＦＳ６３３９２．１）およびＥＹＦＰ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＣＯ４８２６６．１）蛍光蛋白質配列のＮ末端に取り付けられた。プラスミドはｐＭＸｓベクターを用いて構築された。対応する細胞はエレクトロポレーションによってプラスミドをトランスフェクションされ、フローソーティング単クローン培養によって培養されて、蛍光蛋白質を安定に発現する細胞株を得た。
【００３９】
３．ミトコンドリアはミトコンドリア／サイトゾル単離キット（ＡＰＰＬＹＧＥＮ）の使用によって単離された。
（１）細胞はＰＢＳによって１回洗浄され、６０００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心され、上清は捨てられた。
（２）細胞ペレットがチューブ底に集められ、氷によって予冷された１．５ｍｌのＭｉｔｏ−Ｃｙｔｏ緩衝液によって細胞懸濁液として再懸濁され、例えば、約４０回の極小針を有する５ｍｌシリンジによる吸引および排出によって良く混合されて、細胞ホモジネートを生じた。
（３）上からの細胞ホモジネートが遠心チューブに移され、８００×ｇで４℃において５ｍｉｎ遠心されて、核、大きい膜断片、未リシスの細胞などをチューブの底に沈積させた。
（４）ペレットは捨てられ、上清は新しい遠心チューブに移され、８００×ｇで４℃において５ｍｉｎ再度遠心された。
（５）ペレットは捨てられ、上清は新しい遠心チューブに移され、１２，０００×ｇで４℃において１０ｍｉｎ再度遠心されて、空のミトコンドリア外殻はチューブの底に沈殿した。
【００４０】
４．上からのもたらされた沈殿したミトコンドリア外殻が２００μＬのＲＡＷ２６４．７細胞培養培地によって再懸濁された。懸濁液のアリコートが培養シャーレに加えられ、水蒸気飽和密閉インキュベータ内で温度３７℃且つ５％ＣＯ２でインキュベーションされた。観察はエンドサイトーシス後１２時間でなされ得た。結果は図１に示されている。
【００４１】
［実施例２］
この実施形態においては、設計された配列の環状ミトコンドリアＤＮＡ、すなわちＧＦＰ−ＣＯＸ−Ｉ融合遺伝子を含有する環状ミトコンドリアＤＮＡが、マウスミトコンドリアＤＮＡへの遺伝子導入、すなわちＧＦＰおよびリンカ配列の挿入、プライマ合成、ならびにＤＮＡスプライシングによって得られる。
【００４２】
１．新しい人工の環状ミトコンドリアＤＮＡを設計する：
この実施形態においては、環状ミトコンドリアＤＮＡは、マウスミトコンドリアＤＮＡへの遺伝子導入、すなわちＧＦＰおよびリンカ配列の挿入、プライマ合成、ならびにＤＮＡスプライシングによって得られる。具体的には、配列は野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの公知のミトコンドリアＤＮＡ配列に基づき（配列の出所：ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋ：ＥＦ１０８３３６）、ＧＦＰ遺伝子およびリンカ配列が位置５３２８に挿入されて（具体的には、配列番号１に示されている通り）、ＧＦＰ−ＣＯＸ−Ｉ融合遺伝子を含有する５Ｋｂ前後の設計された環状ミトコンドリアＤＮＡを得た。
【００４３】
２．上からの設計された環状ミトコンドリアＤＮＡの具体的な組成に応じて、従来のプライマ合成法が用いられて、スプライシングされるべき複数のＤＮＡ断片を得、それらは５０ｂｐ〜６０ｂｐ前後であった。
【００４４】
３．ＤＮＡスプライシング：
（１）従来技術に基づいて、ギブソン等温ワンステップ法がＤＮＡスプライシングのために用いられた。ギブソン等温ワンステップ法に使用された酵素系は次の通り調製された。３２０μｌの５×ＩＳＯ緩衝液（２５％ＰＥＧ−８０００、５００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５０ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのＤＴＴ、各１ｍＭの４つのｄＮＴＰ、５ｍＭのＮＡＤ）、０．６４μｌの１０Ｕ／μｌのＴ５エキソヌクレアーゼ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）、２０μｌの２Ｕ／μｌのＰｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ、および１６０μｌの４０Ｕ／μｌのＴａｑリガーゼと混合し、１．２ｍｌまで滅菌水を足し、小分けし、使用前は−２０℃において保存する。
（２）ギブソン等温ワンステップ法において、スプライシングされるべき断片が等しい割合で２ｎｇ／μｌの終濃度で混合された。混合物の５μｌが上に記載されている酵素系の１５μｌとむらなく混合され、５０℃において１時間インキュベーションされて、正しくスプライシングされた断片を得た。
【００４５】
４．ＤＮＡが集められて精製された。スプライシングされた断片は、上の設計された環状ミトコンドリアＤＮＡであることがシーケンシングによって確認された。
【００４６】
［実施例３］
この実施形態においては、実施例２において得られた環状ミトコンドリアＤＮＡとＮＩＨ３Ｔ３Ｒｈｏ０細胞の空のミトコンドリア外殻とのインビトロアセンブリによって合成ミトコンドリアを産生するプロセス、さらには合成されたミトコンドリアのＲＮＡおよびＤＮＡの抽出および同定プロセスが記載される。図２は合成ミトコンドリア内の正しい転写物（図２Ａ）およびＤＮＡ複製物（図２Ｂ）の検出を示している。
【００４７】
Ｉ．ミトコンドリアＤＮＡ不含Ｒｈｏ０細胞の培養：
１．１．５μｇ／ｍＬジテルカリニウムまたは２５０ｎｇ／ｍＬ臭化エチジウム、５０μｇ／ｍＬウリジン（シグマ社）、および１１０μｇ／ｍＬピルビン酸ナトリウムがＮＩＨ３Ｔ３細胞培養培地に加えられた。
２．従来の方法に従って１ヶ月間継続的にインキュベーションが実施された。
３．ＮＩＨ３Ｔ３Ｒｈｏ０培地（高グルコースＤＭＥＭ、１０％ウシ胎児血清、５０μｇ／ｍＬウリジン、１１０μｇ／ｍＬピルビン酸ナトリウム、ペニシリンおよびストレプトマイシンの二重抗生物質）が培養に用いられた。
４．細胞が集められ、すなわちミトコンドリアＤＮＡなしのＮＩＨ３Ｔ３Ｒｈｏ０細胞が得られた。
【００４８】
ＩＩ．空のＲｈｏ０ミトコンドリア外殻の単離：
１．ミトコンドリアが、ミトコンドリア／サイトゾル単離キット（ＡＰＰＬＹＧＥＮ）の使用によって単離された。
（１）細胞がＰＢＳによって１回洗浄され、６０００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心され、上清は捨てられた。
（２）細胞ペレットがチューブ底から集められ、氷によって予冷された１．５ｍｌのＭｉｔｏ−Ｃｙｔｏ緩衝液によって細胞懸濁液として再懸濁され、例えば、約４０回の極小針を有する５ｍｌシリンジによる吸引および排出によって良く混合されて、細胞ホモジネートを生じた。
（３）上からの細胞ホモジネートが遠心チューブに移され、８００×ｇで４℃において５ｍｉｎ遠心されて、核、大きい膜断片、未リシスの細胞などをチューブの底に沈積させた。
（４）ペレットは捨てられ、上清は新しい遠心チューブに移され、８００×ｇで４℃において５ｍｉｎ再度遠心された。
（５）ペレットは捨てられ、上清は新しい遠心チューブに移され、１２，０００×ｇで４℃において１０ｍｉｎ遠心され、空のミトコンドリア外殻はチューブの底に沈殿した。
【００４９】
ＩＩＩ．ミトコンドリア外殻とＤＮＡ配列とのアセンブリ（エレクトロポレーション）：
（１）空のミトコンドリア外殻が５０μｌのエレクトロポレーション緩衝液（０．３３Ｍショ糖、１０％グリセロール）によって再懸濁された。
（２）１０μｇのミトコンドリアゲノム（ブランク群については１０μｌのＴＥ緩衝液）がチューブに加えられ、良く混合された。
（３）良く混合された懸濁液が、電気ショック（パラメータ：電界強度：１２〜１６Ｋｖ／ｃｍ、電気容量：２５μＦ、および抵抗：４００Ω）のための１ｍｍキュベット中に移された。
（４）ショック後に、１ｍｌのインキュベーション緩衝液１（４０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（７．４）、２５ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１０％グリセロール）がキュベットに直ちに加えられ、ピペットによって良く混合された。
（５）混合物は新しい２ｍｌ遠心チューブに移され、２１０００ｇ／ｍｉｎで４℃において１０ｍｉｎ遠心され、上清は捨てられた。
（６）それぞれ１ｍｌのインキュベーション緩衝液を用いて沈殿が２回洗浄された。
【００５０】
ＩＶ．合成ミトコンドリアのＲＮＡ抽出、逆転写、および同定：
１．合成ミトコンドリアＲＮＡの当初の抽出：
（１）ペレットが５０μｌのインキュベーション緩衝液２（４０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（７．４）、２５ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１０％グリセロール、１ｍＭピルビン酸、１ｍＭのＡＴＰ、１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ）によって再懸濁され、３７℃において３ｈインキュベーションされた。
（２）上のステップ（１）からの培養物に１ｍｌのインキュベーション緩衝液２が加えられ、３回洗浄され、１０００ｇ／ｍｉｎで４℃において１０ｍｉｎ遠心された。
（３）ピペットによって可能な最大限まで上清が除かれ、それから残りの材料が１０μｌのロシュＤＮａｓｅＩ、５μｌの１０×ＤＮａｓｅＩ緩衝液（１１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（７．４）、３２．５ｍＭのＭｇＣｌ２）、および３５μｌのインキュベーション緩衝液２によって再懸濁され、３７℃において３０ｍｉｎインキュベーションされた。
（４）上のステップ（３）からの培養物が１ｍｌの洗浄緩衝液（１０％グリセロール、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ）によって３回洗浄され、１０００ｇ／ｍｉｎで４℃において１０ｍｉｎ遠心された。
【００５１】
２．キアゲンＲＮＡ抽出キットを用いる合成ミトコンドリアのＲＮＡ抽出：
（１）遠心からの材料が７００μｌのＱＩＡｚｏｌリシス試薬によって再懸濁され、ピペットを用いてむらなく混合され、室温に５ｍｉｎ放置された。
（２）懸濁液に１４０μｌのクロロホルムが加えられ、１５ｓ良く振盪され、室温に２〜３ｍｉｎ放置された。
（３）混合物は１２０００ｇで４℃において１５ｍｉｎ遠心された。
（４）上清が新しいＥＰ遠心チューブ（ＲＮａｓｅ不含）に移され、１．５倍の無水エタノールが加えられ、ピペッティングによって混合された。
（５）混合された溶液がスピンカラムに加えられ（カラム容積：７００μｌ。余りは分けて加えられ得る）、８０００ｇ超で室温において１５ｓ遠心された。
（６）８０００ｇ超で室温において１５ｓ遠心する前に７００μｌの緩衝液ＲＷＴが加えられた。
（７）８０００ｇ超で室温において１５ｓ遠心する前に５００μｌの緩衝液ＲＰＥが加えられた。
（８）８０００ｇ超で室温において２ｍｉｎ遠心する前に５００μｌの緩衝液ＲＰＥが加えられた。
（９）２１０００ｇ／ｍｉｎで室温において１ｍｉｎ遠心する前に新しい２ｍｌコレクションチューブが用いられた。
（１０）スピンカラムは新しい１．５ｍｌＥＰチューブに移され、ＲＮａｓｅ不含有の水４０μｌが加えられ、８０００ｇ超で室温において１ｍｉｎ遠心された。
（１１）ＥＰチューブ中の溶出されたＲＮＡがカラムに再度かけられ、８０００ｇ超で室温において１ｍｉｎ遠心された。
【００５２】
３．合成ミトコンドリアＲＮＡのインビトロ逆転写：
（１）ＲＮＡ中のＤＮＡの消化：次の通りの消化系によって３７℃においてプロメガＤＮａｓｅＩによって３０ｍｉｎ行われた。
１０×ＤＮａｓｅＩ緩衝液  １μｌ
ＤＮａｓｅＩ              １μｌ
ＲＮＡ                    ８μｌ
（２）１μｌのストップ緩衝液が消化後に加えられ、処理は６５℃において１０ｍｉｎ続いた。
（３）ＲＮＡの逆転写：消化されたＲＮＡは、次の通りの処理系によって６５℃において５ｍｉｎ処理された。
消化されたＲＮＡ          ８μｌ
ランダムプライマ        １μｌ
１０ｍＭのｄＮＴＰ        １μｌ
処理されたＲＮＡは処理後直ちに氷上で冷やされた。
（４）次の試薬が加えられ、良く混合された。
１０×ＲＴ緩衝液          ２μｌ
２５ｍＭのＭｇＣｌ２      ４μｌ
０．１ＭのＤＴＴ          ２μｌ
ＲＮａｓｅＯＵＴ          １μｌ
ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ    １μｌ
次の温度処理が順になされた。
２５℃    １０ｍｉｎ
５０℃    ５０ｍｉｎ
８５℃    ５ｍｉｎ
処理されたＲＮＡは処理後直ちに氷上で冷やされた。
（５）１μｌＲＮａｓｅＨが加えられ、混合され、３７℃で２０ｍｉｎインキュベーションされ、ｃＤＮＡが得られ、−２０℃で保存された。
【００５３】
４．ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ酵素を用いるｃＤＮＡ中の転写物の同定：
（１）ＰＣＲ反応系は次の通りである。
５×ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）緩衝液（Ｍｇ２＋プラス）    １０μｌ
ｄＮＴＰ混合物（各２．５ｍＭ）            ４μｌ
プライマ１（１０μＭ）                    １μｌ
プライマ２（１０μＭ）                    １μｌ
鋳型ＤＮＡ                                ２μｌ
ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ酵素（２．５Ｕ／μｌ）  ０．５μｌ
滅菌蒸留水                              ３１．５μｌ
反応条件：
９８℃    １０ｓｅｃ
５５℃    １２ｓｅｃ
７２℃    １ｍｉｎ
サイクル数：３０
（２）ＰＣＲ産物は１．５％アガロースゲル電気泳動に供され、検出のために写真がとられた。得られた結果が図２Ａに示されている。「正」レーンは、ＮＩＨ３Ｔ３細胞からの単離されたＲＮＡの逆転写物であるｃＤＮＡを鋳型として用いて得られたＰＣＲ産物に相当する。「アセンブリ」レーンは、エレクトロポレーション後に単離されたｃＤＮＡを鋳型として用いて得られたＰＣＲ産物に相当する。「負」レーンは、鋳型として水のみを用いて得られたＰＣＲ産物に相当する。
【００５４】
Ｖ．合成ミトコンドリアＤＮＡのインビトロ複製および検出：
１．逆さにされたミトコンドリア沈殿物が５０μｌのインキュベーション緩衝液２によって再懸濁され、１μＣｉのアルファ−３２ｐ−ｄＣＴＰを含有するｄＮＴＰが加えられ、３７℃において３ｈインキュベーションされた。
２．全ＤＮＡ抽出キット（Ｔｉａｎｇｅｎ）を用いて全細胞ＤＮＡが集められた。
３．６５℃において一晩ＢｓｔＵＩ制限酵素によって消化が実施された。
４．消化産物は５％アクリルアミドゲル電気泳動に供された。その後、ゲルが取り出され、フード内で乾燥され、オートラジオグラフィ露光によって検出された。その結果が図２Ｂに示されている。「正」レーンは、同位体取り込み後のＮＩＨ３Ｔ３細胞から単離されたミトコンドリアからのミトコンドリアＤＮＡから得られた産物に相当する。「アセンブリ」レーンは、同位体取り込み後のエレクトロポレーション後のミトコンドリアＤＮＡから得られた産物に相当する。「負」レーンは、同位体取り込み後の水のみから得られた産物に相当する。
【００５５】
［実施例４］
この実施形態においては、エンドサイトーシスによってマウスマクロファージ細胞株内にＧＦＰ−ＣＯＸ−Ｉ融合遺伝子を含有する合成ミトコンドリアを取り込ませるプロセスが記載され、結果は図３に示されている。
【００５６】
（１）マウスマクロファージ細胞株ＲＡＷ２６４．７細胞培養培地（高グルコースＤＭＥＭ（Ｈｙｃｌｏｎｅから市販、品番：ＳＨ３００２２．０１Ｂ）、１０％ウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯから市販、品番：１６０００−０４４）、二重抗生物質（１００００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを包含する。１：１００希釈使用。ＧＩＢＣＯから市販、品番：１５１４０−１２２））。細胞は従来の方法に従って培養シャーレ中で培養された。
（２）実施例３において例示されているエレクトロポレーション後に得られた沈殿した合成ミトコンドリアが、２００μＬのＲＡＷ２６４．７細胞培養培地によって再懸濁された。懸濁液のアリコートが培養シャーレに加えられ、水蒸気飽和密閉インキュベータ内で温度３７℃且つ５％ＣＯ２でインキュベーションされた。外来性ミトコンドリアを含有するＧＦＰ発現マウスマクロファージ細胞がエンドサイトーシス後、１２時間で観察され得た。培養は１２時間さらにインキュベーションされ、検出のために観察がなされた。結果は図３に示されている。
【００５７】
結果は、ＧＦＰ−ＣＯＸＩ融合遺伝子の本発明者の設計がミトコンドリア内で正しく発現することができるということをはっきりと示している。図３において、図３Ａはミトコンドリア特異的色素ＭｉｔｏｔｒａｃｋｅｒＲｅｄによる染色結果を示している。図３ＢはＧＦＰ検出結果である。図３ＣはＤＡＰＩ染色結果であり、核の位置を示している。図３Ｄは３色オーバーレイである。
【００５８】
この実施形態においては、設計されたＧＦＰ−ＣＯＸＩ融合遺伝子がマクロファージ内で安定に発現され得るということが確認されている。当然のことながら、遺伝子改変されていない単離によって得られたミトコンドリア（例えば、そのＤＮＡ配列が野生型哺乳類ミトコンドリアＤＮＡである、単離されたまたは合成のミトコンドリア）もまた、エンドサイトーシスによってマクロファージに入った後にマクロファージ内で安定に発現され得る。
【００５９】
本明細書に記載される詳細な実施形態は本発明を例示する目的のためのみであり、何らかの点で本発明の範囲を限定することを意図されてはいない。本発明の範囲および趣旨から外れることなしに本明細書に記載される実施形態に種々の変更および改変がなされ得るということは、当業者によって理解されるであろう。かかる変更および改変は本発明によって企図されており、その範囲は次の請求項によってのみ定められるべきである。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【配列表】
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