(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体試料の非細胞分画中に存在する循環核酸の増幅のための方法であって、
インタクト細胞から非細胞分画を分離するために生体試料をろ過する工程と、
分離した非細胞分画を乾燥固形マトリクス（１０４，２０４，３０４，４０４）上に回収する工程と、
循環核酸を回収した非細胞分画から抽出する工程と、
１本鎖核酸環を形成させるために、抽出した循環核酸を環状化する工程と、
増幅循環核酸産物を形成させるために、ヌクレオチド類似体を含む完全にランダムなプライマーを用いたランダムプライムドローリングサークル増幅を介して１本鎖核酸環を増幅する工程と
を含み、
前記環状化する工程及び増幅する工程は、いかなる単離工程及び精製工程も介さずに、単一反応容器中で行われ、
乾燥固形マトリクスが界面活性剤を全く欠く、方法。
【請求項２】
抽出前に、回収した非細胞分画を実質的に乾燥状態になるまで乾燥することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
環状化前に、抽出した循環核酸を変性させることをさらに含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
ＴＳ２１２６  ＲＮＡリガーゼを用いて環状化が行われる、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
増幅循環核酸産物中の特異的な循環核酸配列の存在、非存在又は量を検出することをさらに含む、請求項１乃至４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
生体試料が全血であり、非細胞分画が血漿又は血清である、請求項１乃至５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
血漿又は血清が１５０μＬ未満の全血から回収される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
抗凝固薬の非存在下で全血から血漿又は血清が分離される、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
循環核酸が循環ＤＮＡ又は循環ＲＮＡである、請求項１乃至８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
循環核酸が循環ＤＮＡであり、該循環ＤＮＡが、腫瘍由来ＤＮＡ、胎児由来ＤＮＡ、提供臓器由来ＤＮＡ、移植細胞由来ＤＮＡ、移植組織由来ＤＮＡ又はそれらの組合せを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
循環核酸が循環ＤＮＡであり、該循環ＤＮＡが腫瘍由来ＤＮＡを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
生体試料のろ過が、０．０１ミクロン〜５ミクロンの孔径を有する膜を用いることによって行われる、請求項１乃至１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
生体試料のろ過が、１ミクロン〜２ミクロンの孔径を有する膜を用いることによって行われる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
乾燥固形マトリクス（１０４，２０４，３０４，４０４）がセルロースマトリクスである、請求項１乃至１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
乾燥固形マトリクス（１０４，２０４，３０４，４０４）にカオトロピック塩を含浸させる、請求項１乃至１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
生体試料が全血であり、循環核酸が全血中に存在する循環ＤＮＡであり、乾燥固形マトリクス（１０４，２０４，３０４，４０４）が、セルロースマトリクスであり、全血の非細胞分画が、１ミクロン〜２ミクロンの孔径を有するろ過膜（１０２，２０２，３０２，４０２）を通じたろ過を介して分離される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
循環核酸を環状化するために回収時点で全血を処理するための方法であって、
ろ過膜（１０２，２０２，３０２，４０２）の試料適用ゾーン（２１０，４０６）における全血を提供することと、
回収時点で血漿又は血清を分離するために全血をろ過することと
を含み、
前記血漿又は血清は、抗凝固薬の非存在下でろ過膜（１０２，２０２，３０２，４０２）を通じたろ過を介して全血から分離され、
前記方法は、さらに、界面活性剤を全く欠く乾燥固形マトリクス（１０４，２０４，３０４，４０４）上に分離した血漿又は血清を回収することを含み、
前記乾燥固形マトリクスは、前記ろ過膜との間に直接的接触を確立するように構成され、
該乾燥固形マトリクスは、界面活性剤を全く欠くセルロースマトリクスであり、
前記方法は、さらに、
回収した血漿又は血清を乾燥固形マトリクス（１０４，２０４，３０４，４０４）において乾燥させることと、
循環核酸を血漿又は血清の乾燥試料から抽出することと、
増幅循環核酸産物を生成させるために、抽出した循環ＤＮＡの全ゲノム増幅を行うことと、
増幅循環核酸産物中の特異的な循環核酸配列の存在、非存在又は量を検出することと
を含む方法。
【請求項１８】
血漿又は血清が１５０μＬ未満の全血から回収される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ろ過工程、回収工程及び乾燥工程が単一容器中で行われる、請求項１７又は１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ヌクレオチド類似体が、ＬＮＡ、２−アミノｄＡ、２−チオｄＴ、又はこれらの組み合わせのいずれかを含む、請求項１乃至１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記ヌクレオチド類似体が、ホスホロチオエート基を含む、請求項１乃至１６のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、全般的に生体試料からの循環核酸（ＣＮＡ）の回収及び増幅に関する。より具体的には、本願は、生体試料からの循環核酸の分離、回収、増幅及びさらには検出に関する。
【背景技術】
【０００２】
循環核酸は様々な組織から放出され、体液中で蓄積される。ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ及びレトロトランスポゾンを含め、様々なインタクトな及び／又は断片化核酸がＣＮＡ中で同定されている。ＣＮＡは、疾患の早期検出並びに予後及びセラノスティックな適用に理想的に適している。ＣＮＡの診断の潜在力は、腫瘍形成、炎症、心筋梗塞、自己免疫障害及び妊娠関連合併症を含め広範囲の疾患にわたり明らかにされている。
【０００３】
循環核酸は、体液を採取する侵襲性が最小限の方法を用いて検出され得る。しかし、ＣＮＡの存在量は体液中で非常に少ない。ゆえに、ＣＮＡの分析は、一般に大きな体積（ミリリットル又はリットル）の体液の回収及び処理を必要とすることが多い。しかし、多くの場合、特にインビトロ診断、病理及び法医学の分野では、分析に対して利用可能であり得るのは非常に少量の体液試料（マイクロリットル）のみである。さらに、大きな体積の試料の回収は、多大の設定費用、輸送／取り扱い費用及び試料アーチファクトにつながることが多い。さらに、ＣＮＡは体液中で細胞の外側に存在するので、核酸のこの循環プールは、体液中に内在する細胞の溶解を通じて放出される細胞内ＤＮＡ又はＲＮＡに徐々に埋もれ得る。この埋もれ又は混入は、時間、温度、安定化のための処理のタイプ及び体液の単離のために使用される分離力の多パラメーター関数であり得る。これらの分析前変数は、体液中に存在する内在細胞からの望ましくないゲノム混入を生み出し得る。例えば、全血試料中で、ＤＮＡ又はＲＮＡが、保管及び処理中に血液細胞から血漿又は血清に放出され得る。これは、血漿又は血清中に存在する細胞外、循環核酸の分析を妨害し得る。血液試料を４℃で維持し、試料を２時間以内に処理することによって循環核酸プールのゲノム混入を減少させ得る。しかし、このような状態は、多くの適用に対して実現可能ではなく、及び／又は費用効率が良くないことが多い。
【０００４】
循環核酸の天然のプールを拡大するために全ゲノム増幅が使用され得る。しかし、多置換増幅（ＭＤＡ）技術を用いたＣＮＡの全ゲノム増幅における以前の試みから、体液中のＣＮＡの質の低さ及び量の少なさに付随する特有の難題が浮き彫りになっている。一般に、元来、ＣＮＡは、それらがアポトーシス／壊死細胞が供給源であるがゆえに非常に断片化されている。ＣＮＡの核酸断片化パターンは、従来の全ゲノム増幅にとって理想的ではなく、したがって対立遺伝子脱落及び／又は配列が偏った増幅パターンにつながる。さらに、従来の全ゲノム増幅技術の多くはナノグラム量のインプット核酸を必要とする。ゆえに、これらの鋳型濃度の要件に合致させるために大きな体積の非細胞分画からＣＮＡを精製しなければならない。上記を考慮して、特にピコグラム量のＣＮＡを含有する小試料体積を分析する場合、生体試料からの循環核酸の分離、回収、安定化及び／又は増幅を合理化する技術が強く必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２０１２／１３５８１５号パンフレット
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、生体試料からのＣＮＡの回収及び続く増幅を対象とする。
【０００７】
本発明の一態様は、生体試料の非細胞分画中に存在する循環核酸の増幅のための方法に関する。本方法は、インタクト細胞から非細胞分画を分離するために生体試料をろ過し、分離した非細胞分画を乾燥固形マトリクス上に回収し、回収した非細胞分画からＣＮＡを抽出する段階を含む。本方法は、１本鎖核酸環を形成させるために抽出ＣＮＡを環状化し、増幅ＣＮＡ産物を形成させるためにランダムプライムドローリングサークル型増幅によって１本鎖核酸環を増幅する段階をさらに含む。ＣＮＡが２本鎖形態である場合、本方法は、１本鎖核酸環を生成させるための分子内ライゲーション反応前に２本鎖ＣＮＡを１本鎖形態に変性させる段階も含む。１本鎖核酸の分子内ライゲーションが可能であるリガーゼによって、直鎖状１本鎖ＣＮＡの環状化が達成され得る。
【０００８】
本発明の別の態様は、循環核酸を含有する血漿又は血清を回収するために、回収時点で全血を処理するための方法に関する。本方法は、回収時点で全血から血漿又は血清を分離するために全血をろ過し、分離した血漿又は血清を乾燥固形マトリクス上に回収し、回収した血漿を固形マトリクス上に乾燥させる段階を含む。固形マトリクスは界面活性剤を全く欠く。
【０００９】
本発明の別の態様は、血漿又は血清の乾燥試料からのＣＮＡの検出のための方法に関する。本方法は、ＣＮＡを乾燥血漿又は血清から抽出し、増幅循環核酸（ＣＮＡ）産物を形成させるために抽出循環核酸の全ゲノム増幅を行い、増幅ＣＮＡ産物において特異的な循環核酸配列を検出する段階を含む。１本鎖核酸環を形成させるために１本鎖核酸の分子内ライゲーションが可能であるリガーゼを用いて抽出ＣＮＡを最初に環状化し、ランダムプライマーを使用するローリングサークル型増幅により１本鎖核酸環を増幅することによって、全ゲノム増幅を行う。ＣＮＡが２本鎖形態である場合、本方法は、分子内ライゲーション反応前に２本鎖ＣＮＡをその１本鎖形態に変性させる段階も含む。
【００１０】
本発明の別の態様は、循環核酸を含む生体試料の非細胞分画を回収するための装置に関する。本装置は、インタクト細胞から生体試料の非細胞分画を分離するように構成されるろ過膜と、分離した非細胞分画を回収するように構成される乾燥固形マトリクスと、を含む。ろ過膜及び固形マトリクスは、それらの間の直接的接触を確立するように構成される。さらに、固形マトリクスは界面活性剤を全く欠く。
【００１１】
図面全体を通じて同類の文字が同類の部品に相当する添付の図面を参照しながら次の詳細な説明を読めば、記載の発明のこれら及び他の特性、態様及び長所がより理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明の方法の実施形態を説明する流れ図を示す。
【図２】生体試料の非細胞分画の分離及び回収のための側方流動装置の略図を示す。
【図３】生体試料の非細胞分画の分離及び回収のための側方流動装置を作製するための実施形態の略図を示す。
【図４】生体試料の非細胞分画の分離及び回収のための垂直流動装置の略図を示す。
【図５】ヒト全血の側方又は垂直分離後の乾燥固形マトリクス上への血漿ＤＮＡ回収を示す。
【図６】側方又は垂直流動によって全血から分離された血漿ＤＮＡ（すなわち血漿から抽出された循環ＤＮＡ）からの４カ所の異なる染色体座の検出を可能にするリガーゼ支援（ｌｉｇａｓｅ−ａｓｓｉｓｔｅｄ）全ゲノム増幅を示す。
【図７】直鎖状２本鎖ＤＮＡのリガーゼ支援（ｌｉｇａｓｅ−ａｓｓｉｓｔｅｄ）全ゲノム増幅の実施形態の略図を説明する。
【図８】健常個体の血漿から単離される循環ＤＮＡのサイズプロファイルを示す。
【図９Ａ】ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ（商標）ＩＩを用いて全血の非細胞分画から抽出された循環ＤＮＡのリガーゼ支援（ｌｉｇａｓｅ−ａｓｓｉｓｔｅｄ）全ゲノム増幅を説明する。
【図９Ｂ】Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いて全血の非細胞分画から抽出された循環ＤＮＡのリガーゼ支援（ｌｉｇａｓｅ−ａｓｓｉｓｔｅｄ）全ゲノム増幅を説明する。
【図９Ｃ】Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）リガーゼを用いて全血の非細胞分画から抽出された循環ＤＮＡのリガーゼ支援（ｌｉｇａｓｅ−ａｓｓｉｓｔｅｄ）全ゲノム増幅を説明する。
【図１０】４カ所の異なるＣＯＤＩＳ遺伝子座の高感度で均衡がとれたＤＮＡ増幅のためのリガーゼ支援（ｌｉｇａｓｅ−ａｓｓｉｓｔｅｄ）全ゲノム増幅の有効性を説明する。
【図１１】１２カ所の異なるＣＯＤＩＳ遺伝子座の高感度で均衡がとれたＤＮＡ増幅のためのリガーゼ支援（ｌｉｇａｓｅ−ａｓｓｉｓｔｅｄ）全ゲノム増幅の有効性を説明する。
【図１２】様々な反応及び緩衝液条件におけるリガーゼ支援（ｌｉｇａｓｅ−ａｓｓｉｓｔｅｄ）全ゲノム増幅の各種有効性を説明する。
【図１３】リガーゼ支援（ｌｉｇａｓｅ−ａｓｓｉｓｔｅｄ）全ゲノム増幅における高分子量ゲノムＤＮＡの増幅の阻害を説明する。
【図１４】インプットＣＮＡから作製されたライブラリを用いてＤＹＳ１４雄性特異的マーカーが検出される、男女血漿／血液を用いた１試験管リガーゼ支援（ｌｉｇａｓｅ−ａｓｓｉｓｔｅｄ）増幅反応を説明する。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
次の発明を実施するための形態は、代表的なものであり、主張する発明又は主張する発明の使用を限定するものではない。さらに、主張する発明の先行する背景又は次の発明を実施するための形態において与えられる何れの理論によっても限定されるものではない。
【００１４】
次の明細書及び続く特許請求の範囲において、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、内容から別段明確に示されない限り、複数の指示対象を含む。近似を表す語は、明細書及び特許請求の範囲を通じて本明細書中で使用される場合、それが関連づけられる基本的機能の変化を生じることなく許容範囲で変動し得るあらゆる量的表現を修飾するために適用され得る。したがって、「約」などの用語により修飾される値は、指定される正確な値に限定されないものとする。別段の断りがない限り、本明細書及び特許請求の範囲で使用される、成分の量、分子量などの特性、反応条件などを表現する数は全て、「約」という用語により全ての例において修飾されているものと理解されたい。一部の例において、近似を表す語は、値を測定するための機器の精密性に対応し得る。
【００１５】
本明細書中で使用される場合、「生体試料」という用語は、真核起源の生体対象から得られるあらゆるタイプの体液を指す。生体試料の非限定例としては、全血、尿、唾液、汗、涙、羊水、母乳、鼻洗浄液又は気管支肺胞洗浄液が挙げられる。いくつかの実施形態において、生体試料は哺乳動物（例えばラット、マウス、ウシ、イヌ、ロバ、モルモット又はウサギ）起源のものである。ある一定の実施形態において、生体試料はヒト起源のものである。
【００１６】
本明細書中で使用される場合、「インタクト細胞」という用語は、生体試料（すなわち体液）中に存在し得る非破壊細胞を指す。インタクト細胞は破壊されていないので、インタクト細胞の内側から生体試料の非細胞分画に核酸及び／又は核酸断片が放出されない。インタクト細胞は、内在真核細胞（例えば全血中の血液細胞）及び／又は循環細胞（例えば全血中の循環腫瘍細胞）を含み得る。いくつかの実施形態において、インタクト細胞は、生体試料中に存在し得る他の病原性細胞（例えば細菌又はウイルス細胞）を含み得る。
【００１７】
本明細書中で使用される場合、「非細胞分画」という用語は、インタクト細胞を欠く生体試料の構成要素を指す。例えば、全血の非細胞分画は血漿及び血清を含み、これはインタクトな血液細胞（例えば白血球細胞、赤血球細胞及び血小板）を欠く。非細胞分画の生成のために使用されるろ過膜の孔径に基づき、非細胞分画は、真核細胞、原核細胞及び／又はウイルス細胞粒子を欠き得る。
【００１８】
本明細書中で使用される場合、「循環核酸」又は「ＣＮＡ」という用語は、生体試料の非細胞分画中で見出される細胞不含核酸を指す。細胞不含核酸は、生体細胞の内部の細胞区画（例えば核、ミトコンドリアなど）に限定されない核酸である。循環核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）であり得る。
【００１９】
本明細書中で使用される場合、「直接的接触」という用語は、２つの構成要素間の隣接する接触を指す。２つの構成要素間の直接的接触は、それらが互いに直接触れるように２つの構成要素を配置することによって達成される。
【００２０】
本明細書中で使用される場合、「ｓｓリガーゼ」又は「１本鎖特異的なリガーゼ」という用語は、１本鎖核酸の分子内ライゲーションが可能であるリガーゼを指す。
【００２１】
いくつかの実施形態において、本発明は、生体試料からＣＮＡを回収し、増幅するための方法を対象とする。健常個体と比較した場合に、いくつかの病理がある患者から回収される生体試料の非細胞分画中で高濃度のＣＮＡが見られることが多く、それらの疾患バイオマーカーとしての可能性が示される。例えば、癌及び前癌状態を検出、監視又は評価するために、全血の血漿又は血清分画中で見出される腫瘍由来の循環核酸を使用し得る。したがって、生体試料の非細胞分画中のＣＮＡの増幅のための方法は、新生物疾患、炎症、心筋梗塞、自己免疫障害、移植臓器／組織拒絶、妊娠関連合併症などの疾患の検出、診断、監視、処置及び／又は評価に役立ち得る。新生物疾患としては、早期癌、前癌状態又は進行癌が挙げられ得るが限定されない。
【００２２】
本発明のいくつかの実施形態は、循環核酸を含有する生体試料の非細胞分画の分離及び回収のための方法及び装置に関する。非細胞分画をインタクト細胞から分離し、回収した後、本方法は、循環核酸を非細胞分画から抽出し、増幅ＣＮＡライブラリを作製するためにこれらの核酸を増幅させる段階をさらに含む。本明細書中に記載の方法及び装置は、ＣＮＡ回収及び増幅のための簡素化され統合されたソリューションを提供する。本方法及び装置は、回収時点での使用に適切であり得、低試料体積（例えば約１５０μＬ未満）で使用され得る。このように、本明細書中に記載の装置及び関連する方法によって、試料処理時間が短縮され、ゲノムＤＮＡ又はＲＮＡ混入に関連する試料アーチファクトが最小化され、ＣＮＡ増幅及び／又は検出の感度上昇が促進される。
【００２３】
いくつかの実施形態において、ＣＮＡは腫瘍由来の循環核酸であり得る。いくつかの他の実施形態において、ＣＮＡは、胎児、移植後の提供臓器、移植細胞、移植組織又は病的状態由来であり得る。いくつかの実施形態において、循環核酸は循環ＤＮＡ又は循環ＲＮＡを含む。循環ＤＮＡとしては、腫瘍由来ＤＮＡ、胎児由来ＤＮＡ、提供臓器由来ＤＮＡ、移植細胞由来ＤＮＡ、移植組織由来ＤＮＡ又はそれらの組合せが挙げられ得るが限定されない。
【００２４】
本発明の一態様は、生体試料の非細胞分画中に存在する循環核酸の増幅のための方法に関する。本方法は、インタクト細胞から非細胞分画を分離するために生体試料をろ過し、分離した非細胞分画を乾燥固形マトリクス上に回収し、回収した非細胞分画からＣＮＡを抽出する段階を含む。本方法は、１本鎖核酸環を形成させるために１本鎖特異的リガーゼを用いることによって、抽出した循環核酸を環状化し、増幅ＣＮＡ産物を形成させるためにランダムプライムドローリングサークル型増幅によって１本鎖核酸環を増幅する段階をさらに含む。いくつかの実施形態において、生体試料の非細胞分画中の腫瘍由来の循環ＤＮＡの増幅及び検出のための方法が提供される。
【００２５】
図１は、本発明の実施形態を説明する流れ図に相当する。インタクト細胞から非細胞分画を分離するように構成されるろ過膜と、分離した非細胞分画を回収するように構成される乾燥固形マトリクスと、を含む装置上に生体試料が適用される。図１で示されるように、生体試料がろ過膜（１０２）上に適用される。ろ過時に、生体試料のインタクト細胞はろ過膜の上流側／表面上に保持され、非細胞分画は、下流側（側方流動装置中）又は下側の面（垂直流動装置中）上の何れかに配置され得る乾燥固形マトリクス（１０４）上に回収される。非細胞分画を含有する乾燥固形マトリクスは、次いで保管され得るか（１０６）又は循環核酸の抽出（１０８）のために直接使用され得る。次に、抽出循環核酸を続いて１本鎖核酸の分子内ライゲーションが可能であるリガーゼによって環状化して、１本鎖核酸環を形成させる（１１０）。いくつかの実施形態において、本方法は、回収した非細胞分画を抽出前に実質的に乾燥状態になるまで乾燥させることをさらに含む。ＣＮＡが２本鎖形態である場合、ライゲーション反応前に循環核酸を予め変性させることが必要であり得る。次に、増幅ＣＮＡ産物を形成させるために、１本鎖核酸環を続いてランダムプライムドローリングサークル型増幅によって増幅させる。
【００２６】
図２は、生体試料の非細胞分画を分離するために使用され得る装置の一実施形態の略図を示す。ろ過膜（２０２）は、試料適用ゾーン（２１０）及び移動ゾーン（２１２）を有する。ろ過膜は、移動ゾーン（２１２）を介して固形マトリクス（２０４）と直接接触する。ろ過段階は、ろ過膜の試料適用ゾーンで生体試料を提供し、生体試料をろ過膜に通過させることを含む。ろ過膜は複数の孔を有する。生体試料がろ過膜を通過したら、生体試料内の内在インタクト細胞がろ過膜により保持され、殆どが試料適用ゾーン（２１０）それ自体にあり、非細胞分画は孔を通過して移動ゾーン（２１２）に到達し、乾燥固形マトリクス上に移動して回収される。いくつかの実施形態において、約０．０１ミクロンから約５ミクロンの範囲の孔径を有するろ過膜が使用され得る。いくつかの他の実施形態において、ろ過膜の孔径は、約０．２２ミクロン〜約２ミクロンで変動し得る。例示的な一実施形態において、ろ過膜は、約１ミクロン〜約２ミクロンの孔径を有する。１ミクロン孔径のろ過膜が使用される場合、１ミクロンを超える直径を有する何らかの他の循環真核細胞及び／又は病的細胞はろ過膜で保持されるので、ろ過時に乾燥固形マトリクスに到達しない。
【００２７】
いくつかの実施形態において、回収時点それ自体で生体試料から非細胞分画がろ過されて除去され得る。生体試料の先行する予備処置なく、ろ過が行われ得る。何ら安定化剤なく、さらなるろ過が行われ得る。ろ過後、物理的相互作用によって、分離した非細胞分画が乾燥固形マトリクス上に回収され得る。非細胞分画は、吸着又は吸収によって乾燥固形マトリクス上に回収され得る。
【００２８】
ろ過膜は様々な材料から作製され得る。ろ過膜を形成させるために使用される材料は、天然材料、合成材料又は合成により修飾される天然材料であり得る。ろ過膜を作製するために使用され得る適切な材料としては、グラスファイバー、ポリビニルアルコール結合グラスファイバー、ポリエーテルスルホン、ポリプロピレン、ポリビニリデンフルオリド、ポリカーボネート、酢酸セルロース、ニトロセルロース、親水性延伸ポリ（テトラフルオロエチレン）、陽極酸化アルミニウム、トラックエッチドポリカーボネート、エレクトロスパンナノファイバー又はポリビニルピロリドンが挙げられるが限定されない。一実施例において、ろ過膜はポリビニルアルコール結合グラスファイバーフィルターから形成される（ＭＦ１（商標）膜、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）。別の例において、ろ過膜は不斉ポリエーテルスルホンから形成される（Ｖｉｖｉｄ（商標）、Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）。いくつかの実施形態において、ろ過膜は、２以上の異なるポリマーの組合せによって形成され得る。例えば、ろ過膜は、ポリエーテルスルホン及びポリビニルピロリドンの組合せによって形成され得る（Ｐｒｉｍｅｃａｒｅ（商標）、ｉＰＯＣ）。
【００２９】
次に、ろ過時に乾燥固形マトリクス上に回収される非細胞分画を実質的に乾燥状態になるまで乾燥させ、後の分析のために保管し得る。「実質的に乾燥状態」という用語は、本明細書中で使用される場合、乾燥試料が含有する水含量が約１０％（ｗｔ／ｗｔ）未満である状態を指す。いくつかの実施形態において、含有する水が約５％未満となるように試料を乾燥させ得る。いくつかの他の実施形態において、含有する水が約２％未満となるように試料を乾燥させ得る。このように、生体試料の非細胞分画中に存在し得るＣＮＡは、後の続く分析に適切である乾燥形態で保管され得る。乾燥非細胞分画は、長期間、例えば少なくとも２４時間、少なくとも７日間、少なくとも３０日間、少なくとも９０日間、少なくとも１８０日間、少なくとも１年間又は少なくとも１０年間にわたり保管され得る。一実施形態において、非細胞分画は、乾燥固形マトリクス上で少なくとも３０分間保管される。一般的には、試料は、−８０℃〜４０℃の範囲の温度で保管される。さらに、試料は、乾燥又は乾燥化状態で、又は不活性雰囲気下で場合によっては保管され得る。乾燥は、周囲状態下で風乾によって、又は真空による蒸発によって行われ得る。いくつかの実施形態において、通常の蒸発によって周囲状態下で非細胞分画を乾燥させ、低湿度環境で維持し得る。回収した非細胞分画からの水の除去は、非細胞分画中に存在する循環核酸を安定化するのに役立つ。
【００３０】
この目的に適切な乾燥固形マトリクスとしては、天然材料、合成材料又は合成により修飾される天然材料が挙げられるが限定されない。乾燥固形マトリクスとして作用し得る適切な材料としては、セルロース、酢酸セルロース、ニトロセルロース、カルボキシメチルセルロース、石英ファイバー、親水性ポリマー、ポリテトラフルオロエチレン、繊維ガラス及び多孔質セラミクスが挙げられるが限定されない。親水性ポリマーは、ポリエステル、ポリアミド又は炭水化物ポリマーであり得る。いくつかの実施形態において、乾燥固形マトリクスはセルロースから構成される。セルロースに基づく乾燥固形マトリクスは界面活性剤を全く欠く。いくつかの実施形態において、セルロースに基づく乾燥固形マトリクスは何れの試薬も含浸させ得ない。その他の実施形態において、セルロースに基づく乾燥固形マトリクスはカオトロピック塩を含浸させ得ない。カオトロピック塩の例としては、チオシアン酸グアニジン、塩化グアニジン、グアニジン塩酸塩、グアニジンイソチオシアネート、チオシアン酸ナトリウム及びヨウ化ナトリウムが挙げられるが限定されない。いくつかの実施形態において、セルロースに基づく乾燥固形マトリクスはＦＴＡＴＭ  Ｅｌｕｔｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）である。
【００３１】
乾燥固形マトリクス上での非細胞分画の回収後、ＣＮＡをこの回収非細胞分画から抽出する。従来の核酸抽出法の何れかを用いて抽出を行い得る。使用され得る抽出法の非限定例としては、エレクトロエリューション、ゼラチン抽出、シリカ又はガラスビーズ抽出、グアニジン−チオシアネート−フェノール溶液抽出、グアニジンチオシアン酸に基づく抽出、ヨウ化ナトリウム又は同様の勾配を通じた遠心又はフェノール−クロロホルムに基づく抽出が挙げられるが限定されない。抽出段階は、タンパク質などの不純物を除去するのに役立ち、循環核酸を濃縮する。アガロースゲル電気泳動、分光測光法、蛍光光度法又は液体クロマトグラフィーなどの方法を用いて抽出循環核酸を調べ得る。
【００３２】
次いで抽出後、分子内ライゲーション反応を介して、抽出ＣＮＡを１本鎖核酸環に変換する。ＣＮＡは２本鎖又は１本鎖形態の何れかであり得る。さらに、ＣＮＡは、高度に断片化され得ることが多い。分子内ライゲーション反応前に２本鎖ＣＮＡを１本鎖形態に変性させる。この２本鎖核酸の１本鎖形態への変性は、当技術分野で認められている方法の何れかを用いることによって達成され得る。例えば、２本鎖核酸は、熱変性され得るか、化学的に変性され得るか又は熱及び化学的変性の両方がなされ得る。２本鎖核酸の融解温度を低下させる変性剤（例えば、グリセロール、エチレングリコール、ホルムアミド又はそれらの組合せ）を用いて２本鎖核酸を化学的に変性させ得る。変性剤は、反応混合物に添加される変性剤１０％（ｖｏｌ．／ｖｏｌ．）ごとに融解温度を５℃〜６℃低下させ得る。変性剤又は変性剤の組合せ（例えば１０％グリセロール及び６〜７％エチレングリコール）は、反応混合物の１％、５％、１０％、１５％、２０％又は２５％の（ｖｏｌ．／ｖｏｌ．）を構成し得る。例えば、低温で２本鎖循環ＤＮＡを化学的に変性させるために、ハイブリッド形成ストリンジェンシーを低下させる塩が低濃度で反応緩衝液中に含まれ得る。１本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を形成させるために、９５℃で加熱することによっても２本鎖循環ＤＮＡを熱変性させ得る。変性段階後、１本鎖核酸環を形成させるための１本鎖核酸基質の分子内ライゲーションが可能な１本鎖特異的リガーゼで、生成した１本鎖核酸を処理し得る。
【００３３】
１本鎖核酸の分子内ライゲーションのために使用される従来の方法の何れかを使用することによって、鋳型の存在下又は非存在下で１本鎖循環核酸の分子内ライゲーションを行い得る。例えば、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼなどのライゲーション酵素を用いて、鋳型依存性の分子内ライゲーション反応を介して、直鎖状、１本鎖ＤＮＡ分子の１本鎖ＤＮＡ環への変換を従来のように行う。しかし、特に配列及び／又はサイズが未知の１本鎖ＤＮＡ分子集団において１本鎖ＤＮＡ分子の環状化を行おうとする場合、１本鎖ＤＮＡ又は１本鎖ＲＮＡの鋳型依存性の分子内ライゲーションは限定的にしか成功していない。バクテリオファージＴ４  ＲＮＡリガーゼＩが鋳型非依存性の分子内ライゲーション活性を呈する場合でも、この活性は、直鎖状１本鎖ＤＮＡ分子からの環状１本鎖ＤＮＡ分子の生成における実際的な使用のためにはあまりにも低く、非効率的である。いくつかの実施形態において、鋳型が全くない状態で、抽出した１本鎖循環核酸の分子内ライゲーションを行う。例えば、５００ヌクレオチドよりも短い１本鎖ＤＮＡ配列でさえも、鋳型非依存性の分子内ライゲーションを使用して環状化され得る。さらに、１本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）のライゲーションが鋳型非依存性に行われる場合、ＤＮＡ環を作製するために標的配列の前知識は必要ない。
【００３４】
いくつかの実施形態において、５’ホスホリル及び３’ヒドロキシル基を有する直鎖状１本鎖ＤＮＡ及び／又は１本鎖ＲＮＡ基質に対して良好な鋳型非依存性の分子内ライゲーション活性を有する熱安定性のＲＮＡリガーゼを用いて、直鎖状１本鎖循環核酸の１本鎖核酸環への変換を行う。抽出した１本鎖循環核酸の鋳型非依存性の分子内ライゲーションのために使用され得る適切なリガーゼとしては、ＴＳ２１２６  ＲＮＡリガーゼ、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、Ｔ３  ＤＮＡリガーゼ又はＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡリガーゼが挙げられるが限定されない。例えば、環状の１本鎖ＤＮＡを生成させるために、直鎖状循環ｓｓＤＮＡの鋳型非依存性の環状化に対して、好熱性細菌、サームス・スコトダクタス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ）に感染するサームス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）バクテリオファージＴＳ２１２６由来のＴＳ２１２６ＲＮＡリガーゼを使用し得る。ＴＳ２１２６  ＲＮＡリガーゼは、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼなどの中等温度好性ＲＮＡリガーゼの多くよりも熱安定性が高い（約７５℃まで安定）。結果として、より高い温度ではＴＳ２１２６  ＲＮＡリガーゼが使用され得、これはｓｓＤＮＡの望ましくない二次構造をさらに減少させる。ＴＳ２１２６  ＲＮＡリガーゼが介在する分子内ライゲーションの効率を向上させるために、８．０のｐＨを有するＨＥＰＥＳ緩衝液が使用され得る。抽出した１本鎖循環ＤＮＡの環状化は、ＴＳ２１２６  ＲＮＡリガーゼ以外のリガーゼを使用しても、又はトポイソメラーゼなどのＤＮＡ連結活性を有する何らかの他の酵素を使用することによっても達成され得る。いくつかの実施形態において、ｓｓＤＮＡ分子の環状化は、直鎖状の断片化１本鎖ＤＮＡ分子を環状化することにおいて高い鋳型非依存性のリガーゼ活性を有する、好熱性の始原細菌、メタノバクテリウム・テルモオートトロフィカム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ）（Ｍｔｈ１）由来のＲＮＡリガーゼ１によって達成され得る。
【００３５】
次いで、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）法を使用することによって等温条件下で１本鎖核酸環を増幅し得る。分子内ライゲーションが行われる同じ反応容器において１本鎖核酸環の増幅を行い得る。１本鎖核酸環の単離又は精製及び／又はリガーゼの除去は必ずしも増幅反応前でなくてもよい。いくつかの実施形態において、１本鎖核酸ライゲーション及び増幅の工程全体を中間精製又は単離段階なく１本の試験管中で行い得る。
【００３６】
いくつかの実施形態において、本方法は、増幅循環核酸産物から核酸を検出することをさらに含む。増幅循環核酸産物からの核酸の検出は、当技術分野で公知の方法により行われる。増幅産物の検出の様々な方法としては、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ｑＰＣＲ、ＲＴ−ｑＰＣＲ、制限酵素に基づく方法、アガロースゲル電気泳動、ＥＬＩＳＡ検出法、電気化学発光、高速液体クロマトグラフィー、サザンブロットハイブリッド形成、ノーザンブロットハイブリッド形成又は逆ドットブロット法が挙げられるが限定されない。一実施形態において、循環核酸増幅産物内の指定の標的を増幅させる特異的なプライマーを用いた定量的ＰＣＲによって検出を行う。増幅循環核酸産物中の特異的な循環核酸配列の存在、非存在及び／又は量を同定するために検出を行い得る。
【００３７】
本明細書中で開示される全ゲノム増幅は、増幅感度を改善し、配列脱落を減少させ、より均衡のとれた増幅を可能にする。記載の方法は、特に入手可能な生体試料の量が制限される場合に有利である。いくつかの実施形態において、約１０μＬ〜約５００μＬの総生体試料体積から非細胞分画を単離する。さらに、中間の精製又は単離段階を行わずに１つの反応容器中で環状化及び増幅反応の両方を行い得、それにより混入の機会が減少し、増幅ワークフローが簡素化される。
【００３８】
いくつかの実施形態において、多置換増幅（ＭＤＡ）を介した断片化循環ＤＮＡの全ゲノム増幅が提供される。循環ＤＮＡは、その元の性質によって、高度に断片化されることが多い。さらに、生体試料の非細胞分画中の循環ＤＮＡの量は一般に非常に少ない。ＭＤＡの従来法の結果、直鎖状断片化ＤＮＡにおいて試みられる場合、増幅速度が低下し、配列脱落が顕著になり、非常に配列が偏った増幅につながる。これらの制限を克服するために、乾燥固形マトリクスからの循環ＤＮＡの抽出後、断片化２本鎖循環ＤＮＡを最初にそれらの１本鎖形態に変換する。次いで、鋳型非依存性の分子内ライゲーション反応を介して１本鎖循環ＤＮＡを１本鎖ＤＮＡ環に変換し、それにより、問題があるＤＮＡの末端が除かれる。断片化１本鎖循環ＤＮＡの環状化後、環状化ＤＮＡにおいてＭＤＡを行う。
【００３９】
抽出した循環ＤＮＡのＭＤＡ反応は、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）法を用いることを介して等温条件下で行い得る。１本鎖ＤＮＡ環の増幅の場合、ＲＣＡ反応を開始させるために、増幅反応混合物を生成させるためにライゲーションが行われる同じ反応容器にＤＮＡポリメラーゼ、プライマー及びｄＮＴＰを含む増幅試薬を添加し得る。増幅反応混合物は、１本鎖ＤＮＡ結合タンパク質及び／又は適切な増幅反応緩衝液などの試薬をさらに含み得る。ＲＣＡは、Ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼなどの当技術分野で公知の鎖置換ＤＮＡポリメラーゼの何れかを用いることにより行い得る。ＲＣＡは、ＴｅｍｐｌｉＰｈｉ（商標）ＲＣＡキット（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）などの市販のＲＣＡ増幅キットを用いて行い得る。ＴｅｍｐｌｉＰｈｉ（商標）ローリングサークル増幅はロックド核酸含有ランダムプライマーを使用するが、これはより高い感度及び増幅バランスを提供する。いくつかの実施形態において、ＲＣＡ反応のためにランダムプライマーを使用する。１以上のヌクレオチド類似体（例えばＬＮＡヌクレオチド）を含むプライマー配列を使用し得る。いくつかの実施形態において、増幅反応のためにヌクレアーゼ耐性プライマー（例えば適切な位置にホスホロチオエート基を含むプライマー配列）を使用する（例えばＮＮＮＮ＊Ｎ＊Ｎ、ここで＊Ｎはホスホロチオエート結合があるランダムヌクレオチドに相当）。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ鋳型−プライマー複合体を形成させるためにランダムプライマー混合物を含むプライマー溶液と１本鎖ＤＮＡ環を接触させ、ＤＮＡポリメラーゼ及びデオキシリボヌクレオシド三リン酸とＤＮＡ鋳型プライマー複合体を接触させ、ＤＮＡ鋳型を増幅させることによって、ローリングサークル増幅を行い得る。１本鎖ＤＮＡの鋳型非依存性の環状化が低濃度でも短い配列において達成され得るので、高度に断片化された循環ＤＮＡ（例えば全血中に存在する循環ＤＮＡ）の増幅に対してリガーゼ支援（ｌｉｇａｓｅ−ａｓｓｉｓｔｅｄ）全ゲノム増幅が使用される場合、より速い反応速度でより均衡のとれたＤＮＡ増幅及び配列被覆の向上が達成され得る。
【００４０】
図７は、断片化２本鎖循環ＤＮＡのリガーゼ支援（ｌｉｇａｓｅ−ａｓｓｉｓｔｅｄ）全ゲノム増幅の実施形態の略図を示す。２本鎖ＤＮＡの持続長は１本鎖ＤＮＡよりもかなり長く（〜１５０ｂｐ）、その固有の剛性により、５００ｂｐ未満の断片の環状化の効率が非常に悪くなる。さらに、約２５０ｂｐ範囲の小さな２本鎖断片化ＤＮＡ分子を用いると、末端が正確に並べられない限り、環状化の効率が悪い（〜１０．５ｂｐ／回）。対照的に、２本鎖断片化ＤＮＡと比較した場合、１本鎖断片化ＤＮＡの環状化の持続長は非常に短く、およそ１５ヌクレオチドである。図７で示される場合、リガーゼ支援（ｌｉｇａｓｅ−ａｓｓｉｓｔｅｄ）全ゲノム増幅において、断片化２本鎖循環ＤＮＡを最初に１本鎖ＤＮＡ環に変換する。これは、２本鎖ＤＮＡを１本鎖に変性させるために断片化２本鎖循環ＤＮＡを９５℃で十分な時間にわたり温置することによって達成され得る。次いで、１本鎖ＤＮＡ環を生成させるために、１本鎖循環ＤＮＡ基質の鋳型非依存性の分子内ライゲーションが可能であるＤＮＡ又はＲＮＡリガーゼで断片化１本鎖循環ＤＮＡを処理する。次に、１本鎖ＤＮＡ環においてＲＣＡ反応を開始させるために、ＤＮＡポリメラーゼ、ランダムプライマー及びｄＮＴＰを含む増幅試薬を添加する。このリガーゼ支援（ｌｉｇａｓｅ−ａｓｓｉｓｔｅｄ）全ゲノムＲＣＡ増幅により、従来の全ゲノム増幅法と比較して配列脱落及び増幅バイアスが減少した大量のＤＮＡが生成する。したがってこれは、高度に断片化された循環ＤＮＡさえも増幅させ、検出するために使用され得る。いくつかの実施形態において、途中の精製段階を全く行わずに１本鎖ＤＮＡ環の生成及びその続くＲＣＡによる増幅の工程全体を１本の試験管中で行う。
【００４１】
１本鎖循環ＤＮＡ断片のＤＮＡ環への前のライゲーションを含む、本明細書中で提供されるライゲーション支援（ｌｉｇａｔｉｏｎ−ａｓｓｉｓｔｅｄ）全ゲノム増幅法と続くローリングサークル増幅によって、高分子量ゲノムＤＮＡを凌ぐ断片化ＣＮＡの優先的増幅がもたらされる。例えば、ＣＮＡを含む血漿標品に精製工程中に血液細胞から放出されるゲノムＤＮＡが混入し得ることが多い。ＭＤＡを介した全ゲノム増幅の従来法によって循環ＤＮＡ及びゲノムＤＮＡの両方が増幅される。対照的に、断片化ＣＮＡ分子がＴＳ２１２６ＲＮＡリガーゼを用いて最初に環状化され、続いてＰｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼを用いてＲＣＡを介して増幅される場合、高分子量ゲノムＤＮＡよりも環状ＤＮＡが優先的に増幅された。ゲノムＤＮＡを凌ぐ断片化循環ＤＮＡのこのような優先的増幅は、診断面で関連があるＤＮＡが下流分析のために優先的に増幅され得るので、診断適用に対して特に適している（図１３）。さらに、リガーゼ支援（ｌｉｇａｓｅ−ａｓｓｉｓｔｅｄ）全ゲノム増幅によって、従来のＭＤＡに基づく全ゲノム増幅と比較して、断片化ＤＮＡのよりロバストな増幅が可能となる。
【００４２】
いくつかの実施形態において、ｓｓＤＮＡライゲーション段階及びＲＣＡ前にポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）で抽出循環ＤＮＡをリン酸化することによって生体試料の非細胞分画中の循環ＤＮＡ増幅及び検出の感度がさらに向上し得る。ＤＮＡの分子内ライゲーションは、ｓｓＤＮＡ鋳型が５’リン酸基及び３’ヒドロキシル基を有さない限り、実現不可能である。様々な条件（例えばＤＮａｓｅ  ＩＩ酵素切断及び血液中のホスファターゼ活性）は、５’ヒドロキシル基もしくは３’リン酸基の何れか又は両方を有するライゲーション可能でないＤＮＡ配列がある循環ＤＮＡの生成につながり得る。ＰＮＫ処理によって、５’末端をリン酸化するか又は３’末端を脱リン酸化することによりこれらのライゲーション可能でないＤＮＡ配列がライゲーション可能なＤＮＡ配列に変換される。これによって、ローリングサークル増幅されたＣＮＡライブラリの多様性が向上する。ワークフロー中でＰＮＫ段階を組み込むとき、本明細書中で与えられるリガーゼ支援（ｌｉｇａｓｅ−ａｓｓｉｓｔｅｄ）全ゲノム増幅法によって、１％レベルで添加した場合、雄性循環ＤＮＡが女性の全血中で検出され得た（３つ組反復、図１４）。
【００４３】
一実施形態において、全血中に存在する循環核酸の増幅及び検出のための方法が提供される。全血は、細胞分画（すなわち白血球細胞、赤血球細胞及び血小板）及び非細胞分画（例えば血漿又は血清）を含む。全血の非細胞分画（例えば血漿又は血清）から循環ＤＮＡが増幅される。好ましい実施形態において、指先穿刺体積の血液から血漿又は血清を分離する。本方法は、全血の非細胞分画を回収し、非細胞分画から循環ＤＮＡ（殆どがそのネイティブ２本鎖形態で与えられる。）を抽出し、１本鎖ＤＮＡを生成させるために２本鎖循環ＤＮＡを変性させ、循環１本鎖ＤＮＡを生成される１本鎖ＤＮＡ環に環状化し、増幅循環核酸産物を形成させるためにローリングサークル増幅を介して１本鎖ＤＮＡ環を増幅する段階を含む。本明細書中に記載の装置を用いて全血をろ過する間、血漿又は血清はろ過膜の孔を通過し、乾燥固形マトリクス上に回収される。インタクトな血液細胞はろ過膜により保持される。抗凝固薬の非存在下でのろ過によって全血試料から血漿又は血清を分離し得る。したがって、ろ過前に全血試料の完全性を維持するためにさらなる段階を必要としない。いくつかの実施形態において、ろ過前に抗凝固薬のような試薬で生体試料を前処理し得る。回収時点で全血をろ過することによって、インタクトな血液細胞からのゲノム混入を最小限に抑え得る。一実施形態において、ＣＮＡを含有する分離した血漿又は血清を受動的な吸い込み作用により乾燥固形マトリクス上に吸着させる。一実施形態において、ヨウ化ナトリウム及びアルコールを用いて、固形マトリクス上に既に回収した血漿又は血清から循環ＤＮＡを抽出する（ＤＮＡ  Ｅｘｔｒａｃｔｏｒ  ＳＰ（商標）、和光純薬工業）。一実施例において、１５０μＬ未満の全血から血漿を分離する。
【００４４】
１５０ｂｐより短い配列長を有する２本鎖ＤＮＡを環状化できないことが多く、ＤＮＡが２００ｂｐより長くなるまで２本鎖ＤＮＡを環状化することは非常に困難である。対照的に、１５ヌクレオチド以上の配列長を有する直鎖状１本鎖ＤＮＡ分子は、５’末端がリン酸化され、３’末端がヒドロキシル化されている限り、適切なリガーゼにより非常に効率的に環状化される。１本鎖ＤＮＡの鋳型非依存性の分子内ライゲーションが可能なリガーゼを使用することによって、１本鎖ＤＮＡ環を生成させるための１本鎖ＤＮＡの環状化が達成され得る。いくつかの実施形態において、１本鎖直鎖状ＤＮＡをＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ  ＩＩ（商標）などのＲＮＡリガーゼで処理することによって１本鎖ＤＮＡ分子の環状化が行われる。
【００４５】
本発明の別の態様は、血漿又は血清を回収するために、回収時点それ自体で全血を処理するための方法に関する。本方法は、回収時点で血漿又は血清を分離するために全血をろ過し、分離した血漿又は血清を界面活性剤を全く欠く乾燥固形マトリクス上に回収し、回収した血漿又は血清を固形マトリクスにおいて乾燥させる段階を含む。いくつかの実施形態において、ＭＦ１（商標）膜を用いることによってろ過を行い、ＭＦ１（商標）膜に対して横方向に配置されるセルロースに基づく固形マトリクスを用いて回収を行う。他の実施形態において、Ｖｉｖｉｄ（商標）又はＰｒｉｍａｃａｒｅ（商標）膜及びセルロースに基づく固形マトリクスが垂直に配置される。一実施例において、全血又はろ過膜の何れも抗凝固薬で前処理しない。別の例において、血液及び／又はろ過膜を抗凝固薬で前処理する。いくつかの実施形態において、回収時点で血漿又は血清を回収するために、カオトロピック塩を含浸させるセルロースマトリクスを使用し得る。使用され得る適切なカオトロピック塩としては、チオシアン酸グアニジン、チオシアン酸ナトリウム、チオシアン酸カリウム又はグアニジン塩酸塩が挙げられるが限定されない。乾燥血漿又は血清を含有する固形マトリクスを長期間にわたり保管し得、後の時点でこの乾燥血漿又は血清から循環核酸を抽出し、増幅させ、検出し得る。
【００４６】
いくつかの態様において、血漿又は血清の乾燥試料から循環核酸を検出するための方法が提供される。本方法は、循環核酸を乾燥血漿又は血清試料から抽出し、増幅循環核酸産物を生成させるために抽出循環核酸の全ゲノム増幅を行い、次いで増幅循環核酸産物内の特異的な循環核酸配列の存在、非存在又は量を検出する段階を含む。１本鎖核酸環を形成させるために１本鎖特異的リガーゼにより、抽出循環核酸を最初に環状化し、増幅循環核酸産物を形成させるためにランダムプライムドローリングサークル型増幅により１本鎖核酸環を増幅することによって、抽出循環核酸の全ゲノム増幅が達成され得る。従来の核酸検出技術の何れかによって、増幅ライブラリ中の特異的な循環核酸配列の検出が達成され得る。本方法は、１本鎖特異的リガーゼによる分子内ライゲーション反応前に２本鎖ＣＮＡをそれらの１本鎖形態に変性させる段階をさらに含み得る。
【００４７】
本発明の別の態様は、循環核酸を含有する生体試料の非細胞分画を回収するための装置に関する。本装置は、インタクト細胞から生体試料の非細胞分画を分離するように構成されるろ過膜と、分離した非細胞分画を回収するように構成される乾燥固形マトリクスと、を含む。固形マトリクスは界面活性剤を全く欠き、ろ過膜と直接接触する。本装置は側方流動装置又は垂直流動装置であり得る。
【００４８】
図２は、本発明の一実施形態に記載のような側方流動装置（２００）の略図を示す。側方流動装置は、ろ過膜（２０２）及び乾燥固形マトリクス（２０４）を含有する。生体試料の非細胞分画が横方向にろ過膜を通過して固形マトリクスまで行くように、ろ過膜及び乾燥固形マトリクスが横方向に配置される。ろ過膜は、試料適用ゾーン（２１０）及び移動ゾーン（２１２）を有する。ろ過膜は、移動ゾーンを介して固形マトリクスと直接接触する。基本的に、ろ過膜の移動ゾーンは、ろ過膜が固形マトリクスと直接的に接触する場合、乾燥固形マトリクスに触れるろ過膜の一部である。試料適用ゾーンは生体試料を受けるために使用され、移動ゾーンは生体試料の非細胞分画を乾燥固形マトリクスに送達するために使用される。いくつかの実施形態において、ろ過膜及び乾燥固形マトリクスは、それらが互いに部分的に重複し得るように配置される。他の実施形態において、ろ過膜及び乾燥固形マトリクスは、互いに重複し得ないが、生体試料が依然として横方向にろ過膜を通過して固形マトリクスに行くように配置される。このような場合において、乾燥固形マトリクスはろ過膜の下流に置かれ、ろ過膜に接触するが重複しない。いくつかの実施形態において、ろ過膜は第一の固形支持体（２０６）上に設けられ、乾燥固形マトリクスは第二の固形支持体（２０８）上に設けられる。いくつかの実施形態において、第一の固形支持体及び第二の固形支持体は、互いに反対方向に向くように配置される。他の実施形態において、第一の固形支持体及び第二の固形支持体は、互いに隣り合って配置され得る。いくつかの実施形態において、ろ過膜及び乾燥固形マトリクスは、固形支持体（２０６）上に横方向に設けられる。いくつかの実施形態において、第二の固形支持体（２０８）は、例えば図２におけるように、ろ過膜に対して乾燥固形マトリクスを挟み、有効な移動ゾーンを確立するために、乾燥固形マトリクスを覆うように含まれる。
【００４９】
第一の固形支持体は、乾燥固形マトリクスとろ過膜の直接的接触（ｃｏｎｔｒａｃｔ）を確立するための手段を介して第二の固形支持体に連結され得る。直接的接触を確立するための手段は、ヒンジ、折り畳み可能な刻み目又はさもなくば柔軟な連結であり得る。いくつかの実施形態において、側方流動装置は、図３で示されるような突起（３００）により構成され得る。第一の固形支持体（３０６）及び第二の固形支持体（３０８）は折り畳み可能なヒンジ（３１０）を介して互いに連結される。第一の固形支持体上にはろ過膜（３０２）が設けられ、第二の固形支持体上には乾燥固形マトリクス（３０４）が設けられる。ろ過膜及び乾燥固形マトリクスが互いに部分的に重複するように、ヒンジを折り畳むことによってろ過膜を乾燥固形マトリクスと直接接触させ得る。一実施形態において、側方流動装置は、ＭＦ１（商標）ろ過膜及びセルロースに基づく乾燥固形マトリクスを備える。血漿／血清が全血から回収される実施形態において、全血をろ過膜に適用し、通過させ、非細胞血漿又は血清を乾燥固形マトリクス上に回収するか又は運ぶ。
【００５０】
いくつかの実施形態において、本装置は垂直流動装置であり得る。垂直流動装置（４００）の略図を図４で示す。装置（４００）はろ過膜（４０２）及び乾燥固形マトリクス（４０４）を含有し、このろ過膜は乾燥固形マトリクス上に設けられる。ろ過膜は、固形マトリクスと直接接触する。ろ過膜は、試料適用ゾーン（４０６）及び移動ゾーン（４０８）を有する。試料適用ゾーンは生体試料を受けるために使用され、移動ゾーンは生体試料のろ過した非細胞分画を乾燥固形マトリクスに送達するために使用される。ろ過膜の移動ゾーンは、乾燥固形マトリクスと接触するゾーンにより規定される。示されるように、生体試料の非細胞分画が垂直方向にろ過膜を通過して固形マトリクスに行き得るように、ろ過膜及び乾燥固形マトリクスが配置される。いくつかの実施形態において、乾燥固形マトリクスは、第三の固形支持体（４１０）上に設けられる。一実施形態において、垂直流動装置は、Ｖｉｖｉｄ（商標）又はＰｒｉｍｅｃａｒｅ（商標）ろ過膜及びセルロースに基づく乾燥固形マトリクスを備える。血漿／血清が全血から回収される実施形態において、全血をろ過膜に適用し、通過させ、非細胞血漿又は血清を乾燥固形マトリクス上に回収するか又は運ぶ。
【００５１】
上記のように、第一の固形支持体はろ過膜を保有し得、第二及び第三の固形支持体は乾燥固形マトリクスを保有し得る。固形支持体は、図２、図３又は図４で示されるようにろ過膜又は乾燥固形マトリクス膜に対して直接隣接して置かれ得る。いくつかの実施形態において、固形支持体とろ過膜及び／又は乾燥固形マトリクスとの間に１以上の中間層が置かれ得る。固形支持体は、ろ過膜及び／又は乾燥固形マトリクスを保有可能な何らかの材料から形成され得る。支持体は、透明又は光散乱性（例えば半透明）材料などの光透過性の材料から形成され得る。膜又は固形マトリクスを流れる流体が固形支持体を通じて漏出しないように、固形支持体が液体不浸透性であることが所望され得る。固形支持体に適切な材料の例としては、ガラス、ポリマー性材料、例えばポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリブタジエン、ポリビニルクロリド、ポリアミド、ポリカーボネート、エポキシド、メタクリレート又はポリメラミンが挙げられるが限定されない。膜又は固形マトリクスに対する十分な構造的裏打ちを提供するために、固形支持体は一般に、ある一定の最低限の厚さを有するように選択される。例えば、固形支持体は、約１／１６インチ〜約１／４インチの範囲の厚さを有し得る。一実施形態において、固形支持体は、約０．１０インチの厚さを有するポリカーボネートに基づく（Ｃｌｅａｒ  Ｌｅｘａｎ（商標））。
【００５２】
界面活性剤は、上記の核酸沈殿法を使用している間に溶液から析出し得、したがって核酸調製及び分析の方法を妨害する。したがって、本明細書中に記載の装置の乾燥固形マトリクスは、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ＳＬＳ（ラウリル）、アルキルアリールスルホン酸塩、長鎖アルコール硫酸エステル、オレフィン硫酸塩、スルホコハク酸塩、リン酸エステル、硫酸ナトリウム２−エチルヘキシル（ｓｏｄｉｕｍ  ２−ｅｔｈｙｌｈｅｘｙｓｕｌｆａｔｅ）、ポリビニル硫酸塩、ポリアクリレート、ポリホスフェート、ポリアクリル酸ナトリウム又はポリビニル硫酸ナトリウムなどの界面活性剤を全く欠く。いくつかの実施形態において、乾燥固形マトリクスにカオトロピック塩を含浸させ得る。
【００５３】
いくつかの実施形態において、本装置は、コアリング（ｃｏｒｉｎｇ）又は押し抜き（ｐｕｎｃｈｉｎｇ）などの何らさらなる処理なく乾燥固形マトリクスが直接的な下流分析（例えば核酸抽出）によく適合するように設計される。特に、本装置の乾燥固形マトリクスは、標準的な実験室の抽出容器（例えば微量遠心管、遠心管）に完全に適合するのに適するようになる直径を有する。一実施形態において、乾燥固形マトリクスの寸法幅は、それが抽出容器内部に完全に適合するように、約８ｍｍ以下である。このような装置設計は、試料抽出前に材料をコアリング（ｃｏｒｉｎｇ）又は押し抜き（ｐｕｎｃｈｉｎｇ）するための要件を排除するのに役立ち、したがって全ゲノム増幅に送り込み得る周囲の試料環境からのＤＮＡ混入を最小限にする。
【００５４】
いくつかの実施形態において、固形マトリクスで均等な試料吸い込みを確立するために、ろ過膜の大きさをまた８ｍｍの最大寸法幅まで比例的に調整する。ろ過膜及び固形マトリクスの寸法長は、生体試料の所望のインプット体積により決定される。一実施形態において、１００μＬ全血の側方流動分離の場合、ＭＦ１（商標）ろ過膜の最適寸法は８ｍｍ幅×２０ｍｍ長である。この寸法で、赤血球細胞前面は固形マトリクスの境界面付近で停止し、それによりろ過膜上で保持される血漿の体積が最小になり、乾燥固形マトリクス上への血漿の移動が最大となる。１００μＬ全血の垂直流動分離の場合、Ｖｉｖｉｄ（商標）又はＰｒｉｍｅｃａｒｅ（商標）ろ過膜の最適寸法は８ｍｍ幅×３２ｍｍ長である。
【００５５】
いくつかの実施形態において、試料ろ過及び非細胞分画の固形マトリクス上への移動後、固形マトリクスを上流のろ過膜から脱カップリングさせ、周囲温度で長期保存のために保管し得る。さらに、乾燥固形マトリクスに移動させられる非細胞分画は、その中に存在する循環核酸に損傷を与えずにそれが長期間にわたり保管することができるように乾燥させ得る。分析時に、固形マトリクスを従来の抽出容器（例えば微量遠心管）に移し、適切な抽出緩衝液中でマトリクスを再水和することによって、固形マトリクスから循環核酸を抽出し得る。
【００５６】
前記の生体試料の回収時点で生体試料の非細胞分画を回収するために上記のような装置を使用し得る。試料回収時点で何ら前処理なく、生体試料がろ過膜上で直接提供され得る。ろ過段階が完了したら、非細胞分画を乾燥固形マトリクス上に回収し、保管し得る。いくつかの実施形態において、本装置を用いて血漿又は血清を全血から回収するための方法を記載する。本方法は、ろ過膜の試料適用ゾーンで全血を提供し、血漿又は血清を血液細胞から分離するために全血をろ過膜に通過させ、乾燥固形マトリクス上で分離血漿又は血清を回収する段階を含む。回収したら、長期保管のために血漿又は血清を固形マトリクス上で乾燥させ得る。全血試料の回収時点で工程全体を行い得る。後に、下流分析のために本明細書中に記載の方法によって、循環核酸を有する乾燥血漿又は血清分画をさらに処理し得る。いくつかの実施形態において、血漿又は血清を回収するために１００μＬ未満の全血試料を使用し得る。
【００５７】
本明細書中で与えられる装置は、本装置の基本の機能性、すなわち生体試料からの循環核酸を有する非細胞分画の回収に影響を及ぼさないさらなる機能的構成要素をさらに含み得る。例えば、異なる孔径のさらなるろ過膜が本装置に含まれ得る。いくつかの実施形態において、本装置は、インタクト細胞から非細胞分画を分離するように構成される単一ろ過膜と、分離非細胞分画を回収するように構成される単一乾燥固形マトリクスと、を含む。いくつかの他の実施形態において、本装置は、インタクト細胞から非細胞分画を分離するように構成されるろ過膜と、分離非細胞分画を回収するように構成される乾燥固形マトリクスと、本装置の基本の機能性を変更しない他の機能的構成要素と、を含み得る。このような他の機能的構成要素の例としては、固形支持体、装置のためのケーシング、支持リング及び／又は被覆する膜が挙げられるが限定されない。
【００５８】
単なる説明のために本明細書中で与えられ、添付の特許請求の範囲により定められるように本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない次の実施例から、本発明の実施がより完全に理解されよう。実施例セクション中で使用されるいくつかの略語を次のとおり拡大する：「ｍｇ」：ミリグラム、「ｎｇ」：ナノグラム、「ｐｇ」：ピコグラム、「ｆｇ」：フェムトグラム、「ｍＬ」：ミリリットル、「ｍｇ／ｍＬ」：ミリグラム／ミリリットル、「ｍＭ」：ミリモーラー、「ｍｍｏｌ」：ミリモル、「ｐＭ」：ピコモーラー、「ｐｍｏｌ」：ピコモル、「μＬ」：マイクロリットル、「ｍｉｎ．」：分及び「ｈ．」：時間。
【実施例】
【００５９】
実施例１：ヒト全血の側方又は垂直分離後の血漿回収膜上での循環ＤＮＡ回収
側方流動装置の場合、ＭＦ１（商標）膜をろ過膜として使用し、９０３セルロース紙を乾燥固形マトリクスとして使用した。垂直流動装置の場合、Ｐｒｉｍｅｃａｒｅ（商標）及びＶｉｖｉｄ（商標）膜をろ過膜として使用し、９０３セルロース紙を乾燥固形マトリクスとして使用した。１００μＬのヒト全血を側方又は垂直流動装置のろ過膜上に適用し、血漿を乾燥固形マトリクス上に回収した。乾燥血漿試料を形成させるために、回収した血漿をデシケーターキャビネットに入れ、室温で乾燥させた。保管２４時間後、ＤＮＡ  Ｅｘｔｒａｃｔｏｒ  ＳＰ（和光純薬工業）の適応によって血漿ＤＮＡを各固形マトリクスから抽出し、ゲル電気泳動を用いて沈殿した血漿ＤＮＡを分析した。比較目的のために、３段階の穏やかなプロトコール（１６００ｘｇ、１０分間、１６００ｘｇで１０分間、血漿を回収及び再スピン、細胞不含血漿に対しては、１６，０００ｘｇで１０分間、回収及びスピン）で全血を遠心し、５０μＬの遠心血漿を同一の９０３セルロース紙上にスポット添加し、抽出し、平行して分析した。図５は、循環血漿ＤＮＡが効率的に回収され、市販のろ過膜の下流と重複する乾燥固形マトリクスから安定化されることを示す。ＰｉｃｏＧｒｅｅｎアッセイで血漿循環ＤＮＡの収率を測定し、ＭＦ１−ろ過全血（１７５ｐｇ／μＬ）と遠心血漿（１７９ｐｇ／μＬ）との間で同様のＤＮＡ回収が明らかになった。対照的に、Ｐｒｉｍｅｃａｒｅ（商標）及びＶｉｖｉｄ（商標）膜（垂直流動ろ過）を用いたろ過後、少量のゲノム混入（ＤＮＡ＞１０ｋＢ）が見えた。しかし、ＭＦ１側方流動ろ過又は穏やかな遠心後、ゲノム混入は見られなかった。
【００６０】
実施例２：側方又は垂直流動によって全血から分離された血漿ＤＮＡからの４カ所の異なる染色体座の検出のためのリガーゼ支援（ｌｉｇａｓｅ−ａｓｓｉｓｔｅｄ）全ゲノム増幅：
市販の１本鎖特異的なリガーゼ（ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ、ＥｐｉＣｅｎｔｒｅ）の非存在下又は存在下でローリングサークル増幅技術を用いて、実施例１からの乾燥固形マトリクス（９０３セルロース紙）から抽出された血漿ＤＮＡを増幅させ、４カ所のランダムＳＴＲ染色体座（ｖＷＡ、ＴＰＯＸ、Ｄ８Ｓ１１２９及びＤ１３Ｓ３１７）を調べてゲノムの被覆度を評価した。図６から、１本鎖特異的なリガーゼ活性と組合せたローリングサークル増幅技術によって、ピコグラム量の血漿−循環ＤＮＡから全４カ所の染色体ＳＴＲ遺伝子座を高感度で検出することが可能となることが明らかとなる。従来のＳＴＲプライマー対は通常、循環ＤＮＡそれ自体よりも大きいＤＮＡの領域を増幅させるので、ミニＳＴＲプライマーセットを用いて実験を行った。ローリングサークル増幅技術と組合せた１本鎖特異的なリガーゼ活性によって、遠心により単離され、ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ血液ミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて抽出されたバフィーコート分画からの未増幅ゲノムＤＮＡとｑＰＣＲ  ＣＴ値が近い血漿ＳＴＲ遺伝子座の検出が可能となった（図６）。１本鎖特異的なリガーゼ活性なしで、ローリングサークル増幅技術のみを用いて４種類の血漿ＳＴＲマーカーのうち２種類のみを検出することができた。リガーゼ支援（ｌｉｇａｓｅ−ａｓｓｉｓｔｅｄ）全ゲノム増幅を用いた場合、血漿からのＳＴＲ検出レベルは膜ろ過した血液と遠心した血液との間で同様であると思われた。
【００６１】
実施例３：血漿からの循環核酸の全ゲノム増幅
Ｗａｋｏ  ＤＮＡ  ｅｘｔｒａｃｔｏｒ  ＳＰキット（和光純薬工業）を用いて、明らかに健常な個体のクエン酸−リン酸デキストロース（ＣＰＤ）安定化血漿から循環ＤＮＡを単離した。ＴＢＥ緩衝液を用いて２％アガロースゲルを通じて電気泳動によっておよそ１．３ｎｇを分析し、ＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄで染色し、Ｔｙｐｈｏｏｎ  ｉｍａｇｅｒを用いて可視化した。図８で示されるように、循環ＤＮＡの大部分はおよそ１８０ｂｐ長であり、およそ３７０ｂｐ長であったさらなるより少量の配列及び実質的により少量のより高分子量の配列があった。
【００６２】
血漿からの３５０ｐｇ循環ＤＮＡを９５℃で加熱して鋳型を変性させた。次いで、変性１本鎖ＤＮＡ鋳型をＲＮＡ又はＤＮＡリガーゼで処理して、１本鎖ＤＮＡ環を生成させた。ＡＴＰ依存性Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、細胞コードＮＡＤ依存性Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡリガーゼ又は熱安定性のＲＮＡリガーゼ（ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ  ＩＩ）をこれらのライゲーション反応のために使用した。次に、Ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼを使用してＧｅｎｏｍｉＰｈｉキット（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、１００ｐｇのライゲーションした１本鎖ＤＮＡ環を全ゲノム増幅に供した。プライマー混合物＋Ｎ＋Ｎ（ａｔ  Ｎ）（ａｔ  Ｎ）（ａｔ  Ｎ）＊Ｎ（＋ＮはＬＮＡヌクレオチドに相当し、「ａｔ  Ｎ」は２−アミノｄＡ、２−チオｄＴ、通常のＧ及び通常のＣを含有するランダム混合物に相当する。）を用いて増幅を行った。少量のＳＹＢＲ  ｇｒｅｅｎ  Ｉを増幅混合物に添加し、Ｔｅｃａｎプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ  Ｓｎｉｐｅｒ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍｅｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）において経時的に蛍光シグナル増加を監視することによって、標的核酸の増幅及び定量が同時に行われるリアルタイム増幅を行った。比較のために、同等濃度の未処理ゲノムＤＮＡ、未処理血漿ＤＮＡ及びＤＮＡ鋳型なしの試料（鋳型増幅なし）を含めた。
【００６３】
図９で示されるように、未処理の断片化血漿ＤＮＡの増幅反応速度は、同当量の高分子量ゲノムＤＮＡと比較した場合、大幅に低く、このことから増幅の欠陥が示される。しかし、断片化血漿ＤＮＡを前処理し、ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ（商標）ＩＩを用いて１本鎖ＤＮＡ環に変換した場合、迅速な増幅反応速度が達成された（図９Ａ）。ＡＴＰ依存性Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（図９Ｂ）及び細胞コードＮＡＤ依存性Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡリガーゼ（図９Ｃ）を含む他のリガーゼも、断片化血漿ＤＮＡの増幅反応速度を復元することにおいて有効であった。これらの例において、増幅反応速度の相対的上昇から、１本鎖ＤＮＡ鋳型の分子内ライゲーションを促進することにおけるリガーゼのそれぞれの有効性が示される。
【００６４】
実施例４：リガーゼ支援（ｌｉｇａｓｅ−ａｓｓｉｓｔｅｄ）全ゲノム増幅による血漿からの増幅循環核酸の分析
高感度で均衡のとれたＤＮＡ増幅を促進するためのリガーゼ支援（ｌｉｇａｓｅ−ａｓｓｉｓｔｅｄ）全ゲノム増幅法の有効性を試すために、４カ所の異なるＣＯＤＩＳ遺伝子座（ｖＷＡ、ＴＰＯＸ、Ｄ８Ｓ１１２９及びＤ１３Ｓ３１７）を標的とするプライマーを用いた定量的ＰＣＲによって、実施例３で生成した増幅ＤＮＡをさらに分析した。増幅後の相対的な代表的レベルを決定するために、これらのＤＮＡレベルを未増幅ＤＮＡからの値と比較した。図１０で示されるように、両方の例において、未処理血漿ＤＮＡのｑＰＣＲ分析によって、配列脱落につながったか、又は試験した遺伝子座で標本として不十分なＤＮＡが生じた。対照的に、本方法においてＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ（商標）ＩＩ又はＴ４  ＤＮＡリガーゼの何れかを含むことにより、４個の遺伝子座の配列脱落が妨げられ、増幅された高分子量ゲノムＤＮＡに対する代表例とより類似したＤＮＡが産生された。１本鎖ＤＮＡリガーゼとしてＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ（商標）ＩＩを用いたさらなる例において、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）により試験した１２カ所の異なるＣＯＤＩＳ遺伝子座のうち、リガーゼ支援（ｌｉｇａｓｅ−ａｓｓｉｓｔｅｄ）全ゲノム増幅後に１１種類が検出され、一方で未処理血漿ＤＮＡ中には４種類しか存在しなかった（図１１）。図１１において、報告されるＣｔ値は２回の反復の平均である。Ｃｔ値が決定されなかったＰＣＲ反応には「Ｘ」の印を付す。
【００６５】
実施例５：リガーゼ支援（ｌｉｇａｓｅ−ａｓｓｉｓｔｅｄ）全ゲノム増幅に対する反応条件の最適化
ＴＳ２１２６  ＲＮＡリガーゼによる１本鎖ＤＮＡ分子のライゲーション反応の効率を最適化することによって、リガーゼ支援（ｌｉｇａｓｅ−ａｓｓｉｓｔｅｄ）ＤＮＡ増幅反応をさらに最適化した。標準的な製造者推奨の緩衝液からマンガンを除去すると増幅速度がバックグラウンドレベルに低下したので、金属イオンの存在はライゲーション反応に必須であった。改変緩衝液条件を使用して、未処理ゲノムＤＮＡ及び未処理血漿ＤＮＡをＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ  ＩＩ（商標）処理血漿ＤＮＡ試料と比較した。全緩衝液条件が３３ｍＭ  ＫｏＡｃ、０．５ｍＭ  ＤＴＴ及び１Ｍベタインを含有した。指定される場合、緩衝液は３３ｍＭ  Ｔｒｉｓ−酢酸（ｐＨ７．５）又は３３ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ８．０）を含有し、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2又は２．５ｍＭ  ＭｎＣｌ2をさらに含有した。少量のＳＹＢＲ  ｇｒｅｅｎ  Ｉを増幅混合物に添加し、Ｔｅｃａｎプレートリーダーにおいて経時的な蛍光の増加を監視することによって、リアルタイム増幅を行った。増幅閾値は、蛍光がバックグラウンドレベル（２０００ＲＦＵ）を超えて上昇する時間である。
【００６６】
リガーゼ支援（ｌｉｇａｓｅ−ａｓｓｉｓｔｅｄ）全ゲノム増幅反応の増幅反応速度（循環ＤＮＡの１００ｐｇインプット）の比較を図１２で示す。マグネシウム及びマンガンの両方とも、標準的ＴＲＩＳ緩衝液の存在下で同様の効果を生み出した。しかし、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ８．０の存在下でのマンガン及びマグネシウムの組合せは、より高い増幅速度を促進した。ＨＥＰＥＳ緩衝液は、ＴＲＩＳ緩衝液と比較してマンガン陽イオンの酸化速度を低下させることによって、これらの反応において血漿ＤＮＡの環状化効率を上昇させた。
【００６７】
実施例６：リガーゼ支援（ｌｉｇａｓｅ−ａｓｓｉｓｔｅｄ）全ゲノム増幅における高分子量ゲノムＤＮＡの増幅の阻害
未処理ゲノムＤＮＡの全ゲノム増幅の増幅反応速度をＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ（商標）Ｉ及びＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ（商標）ＩＩ−処理ゲノムＤＮＡ試料（１００ｐｇ  ＤＮＡインプット）と比較した。この結果は図１３で示す。図１３で示されるように、１本鎖ゲノムＤＮＡのＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ（商標）処理は、高分子量ゲノムＤＮＡの増幅速度において阻害効果を生み出した（図９Ａで示されるような血漿ＤＮＡにおける陽性の効果とは異なる。）。ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ（商標）Ｉ及びＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ（商標）ＩＩの両方について阻害が明らかであった。
【００６８】
Ｐｈｉ２９に基づく増幅がリガーゼにより阻害されたか否かを調べるために、活性リガーゼ存在下で未処理２本鎖ゲノムＤＮＡを増幅させた。少量のＳＹＢＲ  ｇｒｅｅｎ  Ｉを増幅混合物に添加し、Ｔｅｃａｎプレートリーダーにおいて経時的な蛍光の増加を監視することによって、リアルタイム増幅を行った。増幅閾値は、蛍光がバックグラウンドレベル（２０００ＲＦＵ）を超えて上昇する時間である。ゲノムＤＮＡ増幅阻害は、増幅中に活性リガーゼが存在することの結果ではなかったことが観察された。
【００６９】
血液細胞からのゲノムＤＮＡが循環核酸の検体に混入することが多く、診断価値が低くなるので、高分子量ゲノムＤＮＡよりも循環の増幅が優先されることは、ある一定の適用に対して長所であり得る。
【００７０】
実施例７：リガーゼ支援（ｌｉｇａｓｅ−ａｓｓｉｓｔｅｄ）全ゲノム増幅を用いた断片化ＤＮＡの単一試験管での増幅−分子内ライゲーション前のキナーゼによる循環ＤＮＡ断片のリン酸化の効果
血漿中の循環ＤＮＡのより高感度の検出を導くために、キナーゼによる循環ＤＮＡ断片のリン酸化を探索した。男女血漿／血液混合実験から、キナーゼで処理したインプットＣＮＡから作製されたＤＮＡライブラリがより代表的であり、ＤＹＳ１４雄性特異的マーカーのより高感度の検出が可能になることが明らかになった（３／３再現、リン酸化がなされなかった場合、１／３のみが検出された。）。１００μＬの血液／血漿混合物を次のように調製した：１００Ａ：１００％男性血漿、５Ａ−Ｃ：女性全血に５％ｖ／ｖで男性血漿を添加、１Ａ−Ｃ：女性全血に１％ｖ／ｖで男性血漿を添加、及び０Ａ：１００％男性血液。ＭＦ１膜を通じた側方流動によって血液細胞から血漿を分離し、次に９０３セルロースパッド上に回収し、これを続いて乾燥させ、一晩保管した。次に、ＷａｋｏエキストラクターＳＰキット（和光純薬工業）、標準ヨウ化ナトリウム／界面活性剤に基づく方法の改法によって循環ＤＮＡをセルロースパッドから抽出した。次いで、ＧＴＰ、マンガン及びベタインの存在下でおよそ１．８ｎｇのＤＮＡをＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで処理するか又はこれで処理せず、次にＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ  ＩＩ（商標）で処理して１本鎖ＤＮＡ断片を環状化した。次に、ＤＮＡをＧｅｎｏｍｉＰｈｉ全ゲノム増幅（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に供し、定量的ＰＣＲによって生成物を分析して、２種類のマーカー：Ｙ染色体上にあるマルチコピー遺伝子であり、男性画分のみから検出可能であるはずのＤｙｓ１４及び１６番染色体上にあるＳＴＲ遺伝子座であり、男女両方の分画から検出可能であるはずのＤ１６Ｓ５３９の検出を評価した。この反応は、ワークフロー中の中間精製又は単離段階なく、単一反応容器中で行った。これは、比較的低濃度のＧＴＰでリン酸化反応を行うことによって達成した。
【００７１】
図１４は、反応中にキナーゼが含まれることによって、必ずしも５’リン酸基を含有しないＣＮＡ断片の環状化及び増幅が可能となり、それによってより代表的なライブラリが作製されることを示す。これは５’ヒドロキシルを含有するＤＮＡ断片を含み、細胞死の間にＤＮａｓｅ  ＩＩ消化により特異的に生成される。男女血漿／血液混合実験を使用して、キナーゼで処理したインプットＤＮＡから作製されたライブラリがより代表的であり、ＤＹＳ１４雄性特異的マーカーのより高感度の検出が可能になることが明らかになる（３／３再現、リン酸化がなされなかった場合、１／３のみが検出された。）。
【００７２】
主張する発明は、その精神又は必須の特徴から逸脱することなく、他の具体的な形態で具現化され得る。先行実施形態は、多様な全ての可能な実施形態又は例からの、選択される実施形態又は例である。したがって先行実施形態は、全ての点において本明細書中に記載の発明における限定ではなく説明とみなされるべきものである。主張される発明のある一定の特性のみを本明細書中で説明し、記載してきたが、当業者は、この開示の有益性を考えると、これら及び他のタイプの適用に適切な、本発明の原理に従い本方法を使用するための、適切な条件／パラメーターを同定、選択、最適化又は改変することができることを理解されたい。的確な使用、試薬の選択、濃度、体積、温置時間、温置温度などの可変要素の選択は、それが意図される特定の適用に大きく依存し得る。したがって、添付の特許請求の範囲が、本発明の真の精神に入る全ての改変及び変更を包含するものであることを理解されたい。さらに、特許請求の範囲の等価の意味及び範囲内にある全ての変更が特許請求の範囲に包含されるものとする。
【符号の説明】
【００７３】
１０２  ろ過膜
１０４  乾燥固形マトリクス
２００  側方流動装置
２０２  ろ過膜
２０４  固形マトリクス
２０６  第一の固形支持体
２０８  第二の固形支持体
２１０  試料適用ゾーン
２１２  移動ゾーン
３００  突起
３０２  ろ過膜
３０４  乾燥固形マトリクス
３０６  第一の固形支持体
３０８  第二の固形支持体
３１０  折り畳み可能なヒンジ
４００  垂直流動装置
４０２  ろ過膜
４０４  乾燥固形マトリクス
４０６  試料適用ゾーン
４０８  移動ゾーン
４１０  第三の固形支持体
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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