(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
テンプレート二本鎖ポリヌクレオチドを修飾する方法であって、
（ａ）前記テンプレートポリヌクレオチドを、ＭｕＡトランスポサーゼ、ならびに各々が（ｉ）少なくとも１つのオーバーハング、および（ｉｉ）前記少なくとも１つのオーバーハングを含む鎖とは反対の鎖内の少なくとも１つのヘアピンループを含む二本鎖ＭｕＡ基質の集団と接触させ、その結果、前記トランスポサーゼが前記テンプレートポリヌクレオチドを断片化し、前記基質を二本鎖断片の一方または両方の末端にライゲートし、それによって複数の断片／基質構築物を生成するステップ、
（ｂ）前記断片／基質構築物をポリメラーゼと接触させ、その結果、前記ポリメラーゼが前記オーバーハングを含む鎖を外し、前記ヘアピンループを含む鎖を相補する鎖と置き換え、それによって、各々が前記テンプレートポリヌクレオチドの二本鎖断片を含む複数の二本鎖構築物を生成するステップ、および
（ｃ）前記二本鎖構築物の２本の鎖を分離し、それらの鎖をテンプレートとして使用して、少なくとも１つのヘアピンループによって連結された２本の相補鎖を各々が含む複数の修飾二本鎖ポリヌクレオチドを形成するステップ
を含む方法。
【請求項２】
ステップ（ｃ）が、ｐＨ、温度およびイオン強度のうちの１つまたは複数を上昇させることによって前記二本鎖構築物の２本の鎖を分離することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップ（ｃ）が、前記分離された鎖をポリメラーゼと接触させ、その結果、前記ポリメラーゼが前記鎖をテンプレートとして使用して前記複数の修飾二本鎖ポリヌクレオチドを形成することを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ステップ（ｃ）が、（ｉ）前記複数の分離された鎖を、前記鎖内のヌクレオチドのすべてに相補的であるヌクレオチドのあらゆる可能な組み合わせを含むヌクレオチドオリゴマーの集団と、前記オリゴマーが前記鎖にハイブリダイズすることができる条件下で接触させること、および（ｉｉ）前記鎖にハイブリダイズするそれらのオリゴマーを一緒にライゲートして、前記複数の修飾二本鎖ポリヌクレオチドを形成することを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
ステップ（ｃ）が、前記複数の二本鎖構築物をポリメラーゼと接触させ、その結果、前記ポリメラーゼが、同時に、前記二本鎖構築物の２本の鎖を分離し、前記鎖をテンプレートとして使用して前記複数の修飾二本鎖ポリヌクレオチドを形成することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記少なくとも１つのヘアピンループが、各基質の２本の鎖を連結しない、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記少なくとも１つのオーバーハングが、４、５または６ヌクレオチドの長さである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
各基質が、選択可能な結合部分を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
各基質が、膜貫通ポアを優先的に通り抜けることができるリーダー配列を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
（ｄ）Ｙアダプターを前記複数の修飾二本鎖ポリヌクレオチドのヘアピンループとは反対の末端に付着させるステップをさらに含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記Ｙアダプターが、膜貫通ポアを優先的に通り抜けることができるリーダー配列を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
１つまたは複数のポリヌクレオチド結合タンパク質を前記複数の修飾二本鎖ポリヌクレオチドと結合させるステップをさらに含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
テンプレートポリヌクレオチドを修飾するための二本鎖ポリヌクレオチドＭｕＡ基質の集団であって、前記基質が請求項１、６〜８のいずれか一項において定義した通りである、集団。
【請求項１４】
テンプレートポリヌクレオチドを特性評価する方法であって、
ａ）請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法を使用して前記テンプレートポリヌクレオチドを修飾して、複数の修飾ポリヌクレオチドを生成するステップと、
ｂ）各修飾ポリヌクレオチドを膜貫通ポアと、各ポリヌクレオチドの少なくとも１本の鎖が前記ポアを通って移動するように接触させるステップと、
ｃ）各ポリヌクレオチドが前記ポアに対して移動するときに、各ポリヌクレオチドの１つまたは複数の特性を示す１つまたは複数の測定値を取り、それによって前記テンプレートポリヌクレオチドを特性評価するステップと
を含む方法。
【請求項１５】
前記修飾ポリヌクレオチド／各修飾ポリヌクレオチドの両方の鎖が前記ポアを通って移動する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
接触させるステップ（ａ）または接触させるステップ（ｂ）が、前記修飾ポリヌクレオチド／各修飾ポリヌクレオチドを、ポリヌクレオチド結合タンパク質と、前記タンパク質が前記ポアを通る前記ポリヌクレオチド／各ポリヌクレオチドの移動を制御するように接触させることをさらに含む、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
テンプレート二本鎖ポリヌクレオチドを修飾するためのキットであって、（ａ）請求項１、６〜８のいずれか一項において定義した通りのＭｕＡ基質の集団と（ｂ）ＭｕＡトランスポサーゼと（ｃ）ポリメラーゼとを含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、テンプレート二本鎖ポリヌクレオチドを修飾する方法、特に、ナノポアシークエンシングを使用する特性評価のために修飾する方法に関する。この方法は、テンプレートから複数の修飾二本鎖ポリヌクレオチドを生成する。その後、これらの修飾ポリヌクレオチドを特性評価することができる。
【背景技術】
【０００２】
商業的事情により核酸ライブラリーの調製が求められることは多い。これは、トランスポサーゼを使用して果されることが多い。ライブラリーを調製するために使用されるトランスポサーゼによっては、インビトロで転位事象を修復しないとライブラリーを例えばシークエンシングに使用できないこともある。
【０００３】
迅速で安価なポリヌクレオチド（例えばＤＮＡまたはＲＮＡ）シークエンシングおよび同定技術が、現今、広範な用途にわたって必要とされている。既存の技術は、主に、大量のポリヌクレオチドを生産するための増幅技法に頼り、シグナル検出に多量の専門蛍光化学物質を必要とするため、時間がかかり、費用が嵩む。
【０００４】
膜貫通ポア（ナノポア）には、高分子および様々な小分子用の直接的、電気的バイオセンサーとして大きな将来性がある。特に、ナノポアは、最近、将来性のあるＤＮＡシークエンシング技術として注目されている。
【０００５】
電位がナノポア全体に印加されると、ヌクレオチドなどの分析物がバレル内に特定の期間、一時的に存在する場合、電流の流れが変化する。ヌクレオチドのナノポア検出は、電流の既知痕跡および継続時間の変化を知らせる。鎖シークエンシング法では、単一ポリヌクレオチド鎖をポアに通して、ヌクレオチドの正体を得る。鎖シークエンシングは、ポアを通るポリヌクレオチドの移動を制御するためにポリヌクレオチド結合タンパク質の使用を含むことがある。
【発明の概要】
【０００６】
本発明者らは、テンプレート二本鎖ポリヌクレオチドを修飾して複数のより短い修飾二本鎖ポリヌクレオチドを生成することが可能であることを、驚くべきことに立証した。修飾二本鎖ポリヌクレオチドは、例えば、ヘアピンループまたは一本鎖リーダー配列を含みうる。例えば鎖シークエンシングによって、修飾二本鎖ポリヌクレオチド各々が元のテンプレートポリヌクレオチドより容易に特性評価されるように、これらの修飾を設計することができる。修飾ポリヌクレオチドのその後の特性評価によってテンプレートポリヌクレオチドの特性のより容易な判定が可能になる。
【０００７】
本発明の修飾方法は、ＭｕＡトランスポサーゼ、ＭｕＡ基質の集団、およびポリメラーゼを使用し、図１に要約される。ＭｕＡ基質は、オーバーハングを含み、反対の鎖にヘアピンループを含む。ＭｕＡトランスポサーゼは、テンプレートポリヌクレオチドを断片化し、両方の末端にオーバーハングを有する断片を生成することができる。ＭｕＡトランスポサーゼは、二本鎖断片の一方または両方の末端のオーバーハングに基質をライゲートすることもできる。オーバーハングを有さない基質の鎖は、概して、オーバーハングを有する断片の鎖にライゲートされる。これによって、得られる二本鎖構築物中に一本鎖ギャップが残る。この二本鎖構築物は、そのギャップとは反対の鎖上にヘアピンループも有する。
【０００８】
ポリメラーゼは、ヘアピンループを含む鎖をテンプレートとして使用し、一本鎖ギャップを含有する鎖を外すことができる。得られる二本鎖構築物は、テンプレートポリヌクレオチドの断片を含有する２本の相補鎖を含有する。この構築物中の２本の鎖を分離することができ、および好ましくは同時に、それらの鎖をテンプレートとして使用して、テンプレートポリヌクレオチドの断片を含み、２本の鎖がヘアピンループによって連結されている、２つの二本鎖構築物を生成することができる。
【０００９】
したがって、本発明は、テンプレート二本鎖ポリヌクレオチドを修飾する方法であって、
（ａ）テンプレートポリヌクレオチドを、ＭｕＡトランスポサーゼ、ならびに各々が（ｉ）少なくとも１つのオーバーハングと、および（ｉｉ）少なくとも１つのオーバーハングを含む鎖とは反対の鎖内の少なくとも１つのヘアピンループを含む二本鎖ＭｕＡ基質の集団と接触させ、その結果、トランスポサーゼがテンプレートポリヌクレオチドを断片化し、基質をそれらの二本鎖断片の一方または両方の末端にライゲートし、それによって複数の断片／基質構築物を生成するステップ、
（ｂ）断片／基質構築物をポリメラーゼと接触させ、ポリメラーゼがオーバーハングを含む鎖を外し、ヘアピンループを含む鎖を相補する鎖と置き換え、それによって、各々がテンプレートポリヌクレオチドの二本鎖断片を含む複数の二本鎖構築物を生成するステップ、および
（ｃ）二本鎖構築物の２本の鎖を分離し、それらの鎖をテンプレートとして使用して、少なくとも１つのヘアピンループによって連結された２本の相補鎖を各々が含む複数の修飾二本鎖ポリヌクレオチドを形成するステップ
を含む方法を提供する。
【００１０】
本発明は、
−  本発明の方法を用いて生成される複数の修飾二本鎖ポリヌクレオチド、
−  テンプレートポリヌクレオチドを修飾するための、上で定義した通りの、二本鎖ポリヌクレオチドＭｕＡ基質の集団、
−  本発明の方法を用いて修飾された少なくとも１つのポリヌクレオチドを特性評価する方法であって、
ａ）修飾ポリヌクレオチドを膜貫通ポアと、ポリヌクレオチドの少なくとも１本の鎖がポアを通って移動するように接触させるステップと、
ｂ）少なくとも１本の鎖がポアに対して移動するときに、少なくとも１本の鎖の１つまたは複数の特性を示す１つまたは複数の測定値を取り、それによって修飾ポリヌクレオチドを特性評価するステップと
を含む方法、
−  テンプレートポリヌクレオチドを特性評価する方法であって、
ａ）本発明の方法を用いてテンプレートポリヌクレオチドを修飾して、複数の修飾ポリヌクレオチドを生成するステップと、
ｂ）各修飾ポリヌクレオチドを膜貫通ポアと、各ポリヌクレオチドの少なくとも１本の鎖がポアを通って移動するように接触させるステップと、
ｃ）各ポリヌクレオチドがポアに対して移動するときに、各ポリヌクレオチドの１つまたは複数の特性を示す１つまたは複数の測定値を取り、それによってテンプレートポリヌクレオチドを特性評価するステップと
を含む方法、および
−  テンプレート二本鎖ポリヌクレオチドを修飾するためのキットであって、（ａ）上で定義した通りのＭｕＡ基質の集団と（ｂ）ＭｕＡトランスポサーゼと（ｃ）ポリメラーゼとを含むキット
も提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】テンプレート二本鎖ポリヌクレオチド（ａと称する）を修飾する方法の略画表現を示す図である。ステップ１は、テンプレート二本鎖ポリヌクレオチドを、ＭｕＡトランスポサーゼ（ｂと称する）、および二本鎖ＭｕＡ基質（ｃと称する；二本鎖ＭｕＡ基質は各々５’ヘアピンループを含有する）の集団と接触させ、その結果、ＭｕＡトランスポサーゼがテンプレート二本鎖ポリヌクレオチドを断片化し、断片化点の両側にＭｕＡ基質を挿入することを含むものとした。ステップ２は、ｄと称するＤＮＡ断片を外し、ＤＮＡ５’ヘアピンループに対する相補鎖を生成する、ポリメラーゼ（ｅと称する）およびｄＮＴＰでテンプレート鎖を処理することを含むものとした。ステップ３は、ｆと称する二本鎖ＤＮＡ構築物を熱処理し、その結果、それらの鎖を一本鎖ＤＮＡ（ｇと称する）に変性させることを含むものとした。最後に、ステップ４は、ＤＮＡポリメラーゼが相補鎖を形成することを含むものとした。
【図２】実施例１に概要を示す、テンプレート二本鎖ポリヌクレオチド（ａと称する）を修飾する方法の略画表現を示す図である。ステップ１は、テンプレート二本鎖ポリヌクレオチドを、ＭｕＡトランスポサーゼ（ｂと称する）、および二本鎖ＭｕＡ基質（ｃと称する；二本鎖ＭｕＡ基質は各々５’ヘアピンループを含有する）の集団と接触させ、その結果、ＭｕＡトランスポサーゼがテンプレート二本鎖ポリヌクレオチドを断片化し、断片化点の両側にＭｕＡ基質を挿入することを含むものとした。ステップ２は、ｄと称するＤＮＡ断片を除去してＤＮＡ５’ヘアピンループに対する相補鎖を生成する、ポリメラーゼ（ｅと称する）およびｄＮＴＰでテンプレート鎖を処理することを含むものとした。ステップ３は、ｆと称する二本鎖ＤＮＡ構築物を熱処理し、その結果、それらの鎖を一本鎖ＤＮＡ（ｇと称する）に変性させることを含むものとした。ステップ４は、相補鎖を形成するＤＮＡポリメラーゼでの第二の処理を含むものとした。最後に、ステップ５は、ステップ４で生成された二本鎖ＤＮＡ構築物のｄＡテーリング、酵素（ｈと称する）が事前結合しているアダプターのライゲーション、およびコレステロールテザー（ｊと称する）を含有するＤＮＡ鎖（ｉと称する）のハイブリダイゼーションを含むものとした。これは最終ＤＮＡ構築物を生成し、その構築物を実施例１で説明するナノポア系で試験した。
【図３】ヘリカーゼ（Ｔ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃ（変異Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃを有する配列番号２４））が、ＭｓｐＡナノポアを通るＤＮＡ試料６の移行を制御したときの電流トレース（ｙ軸表示＝電流（ｐＡ）、ｘ軸表示＝時間（秒））の例を示す図である。
【図４】Ａｇｉｌｅｎｔ  １２，０００  ＤＮＡチップトレースを示す図である。１と称するラインは、未処理ＭｕＡ断片化ＤＮＡ投入材料であり、２と称するラインは、６８℃インキュベーションステップ（実施例１の１．２におけるもの）を受け、その後、実施例１のステップ１．３のすべてを経た分析物であり、３と称するラインは、実施例１のステップ１．２における６８℃インキュベーションを受けていなかったが、実施例１のステップ１．３のすべてを経ていた。領域Ｘは、二本鎖ＤＮＡライブラリーに対応し、領域Ｙは、Ａｇｉｌｅｎｔ  １２，０００の上のマーカーに対応し、領域Ｚは、Ａｇｉｌｅｎｔ  １２，０００チップの下のマーカーに対応した。
【図５】テンプレート二本鎖ポリヌクレオチド（ａと称する）を修飾する好ましい方法の略画表現を示す図である。図５は、各基質が、スペーサー（ｘｘｘ；ｈと称する）によってヘアピンループから離隔されているリーダー配列（ｉと称する）を含むことを除いて、図１と同一である。このリーダー配列は、ポリメラーゼ（ｅと称する）がスペーサーを超えて移動することができなかったため、テンプレートとして使用されなかった。
【図６】ヘリカーゼ（Ｔ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃ）が、ＭｓｐＡナノポアを通るＤＮＡ試料７の移行を制御したときの電流トレースの例（ｙ軸表示＝電流（ｐＡ）、ｘ軸表示＝時間（秒））を示す図である。
【図７】テンプレート二本鎖ポリヌクレオチド（ａと称する）を修飾する方法の略画表現を示す図である。ステップ１は、テンプレート二本鎖ポリヌクレオチドを、ＭｕＡトランスポサーゼ（ｂと称する）、および二本鎖ＭｕＡ基質（ｃと称する；二本鎖ＭｕＡ基質各々は５’ヘアピンループを含有し、この５’ヘアピンループはそのヘアピン内にＧ／Ｃを置き換えるＩ／Ｚ（ｈと表示され、黒丸で示されている）を含有する）の集団と接触させ、その結果、ＭｕＡトランスポサーゼがテンプレート二本鎖ポリヌクレオチドを断片化し、断片化点の両側にＭｕＡ基質を挿入することを含むものとした。ステップ２は、ｄと称するＤＮＡ断片を外し、ＤＮＡ５’ヘアピンループに対する相補鎖を生成する（生成されるｄｓＤＮＡをｆと表示する）、ポリメラーゼ（ｅと称する）およびｄＮＴＰでテンプレート鎖を処理することを含むものとした。ポリメラーゼによって形成される二本鎖領域（１Ｘと称する）は、両方ともヘアピンループを形成することができる２本の鎖で構成されている。鎖Ｆ２によって形成されるヘアピンループは、二本鎖領域１ＸのＴｍより高いＴｍを有する。これは、鎖Ｆ２のヘアピンループがＣ／Ｔ／Ａ／Ｇで構成されており、二本鎖領域１Ｘが、鎖ｆ１にハイブリダイズされた鎖ｆ２であり、鎖Ｆ１がＺ／Ｔ／Ａ／Ｉで構成されている（ならびにＺおよびＩは２つの水素結合しか形成しないが、Ｇ／Ｃは３つの水素結合を形成する）からである。したがって、Ｆ２は、（ｆ２ｈと称する）ヘアピンループを形成し、Ｆ１は、（ｆ１ｈと称する）ヘアピンループを形成し、鎖Ｆ１によって形成されるヘアピンループは、鎖Ｆ２によって形成されるヘアピンループより高いＴｍを有する。それ故、ＤＮＡポリメラーゼは、破線／点線として示されている相補鎖を生成することができた（全ｄｓＤＮＡ構築物は、ｉ１およびｉ２と称する）。したがって、ポリメラーゼは、ステップ２において生成された（およびｆ２にハイブリダイズされたｆ１と称する）ｄｓＤＮＡを加熱する必要なく、相補鎖（破線／点線として示されている）を形成することができた。
【図８】本発明の好ましい方法の略画表現を示す図である。ステップ１〜４は、図１の場合と同じであった。ステップ５は、図１で形成された構築物にヘアピンループを付加させることを含むものとした。ステップ６は、修飾二本鎖ポリヌクレオチドを熱処理し、その結果、それらの鎖を一本鎖構築物に変性させることを含むものとした。最後に、ステップ７は、ＤＮＡポリメラーゼが相補鎖を形成することを含むものとした。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
配列表の説明
配列番号１は、ＭＳ−Ｂ１突然変異体ＭｓｐＡ単量体をコードするコドン最適化ポリヌクレオチド配列を示す。この突然変異体は、シグナル配列を欠き、次の突然変異を含む：Ｄ９０Ｎ、Ｄ９１Ｎ、Ｄ９３Ｎ、Ｄ１１８Ｒ、Ｄ１３４ＲおよびＥ１３９Ｋ。
【００１３】
配列番号２は、ＭｓｐＡ単量体のＭＳ−Ｂ１突然変異体の成熟形態のアミノ酸配列を示す。この突然変異体は、シグナル配列を欠き、次の突然変異を含む：Ｄ９０Ｎ、Ｄ９１Ｎ、Ｄ９３Ｎ、Ｄ１１８Ｒ、Ｄ１３４ＲおよびＥ１３９Ｋ。
【００１４】
配列番号３は、α−ヘモリシン−Ｅ１１１Ｎ／Ｋ１４７Ｎ（α−ＨＬ−ＮＮ；Stoddart et al., PNAS, 2009; 106(19): 7702-7707）の１つの単量体をコードするポリヌクレオチド配列を示す。
【００１５】
配列番号４は、α−ＨＬ−ＮＮの１つの単量体のアミノ酸配列を示す。
【００１６】
配列番号５〜７は、ＭｓｐＢ、ＣおよびＤのアミノ酸配列を示す。
【００１７】
配列番号８は、Ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼをコードするポリヌクレオチド配列を示す。
【００１８】
配列番号９は、Ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列を示す。
【００１９】
配列番号１０は、大腸菌（E. coli）からのｓｂｃＢ遺伝子に由来するコドン最適化ポリヌクレオチド配列を示す。この配列は、大腸菌（E. coli）からのエキソヌクレアーゼＩ酵素（ＥｃｏＥｘｏ  Ｉ）をコードする。
【００２０】
配列番号１１は、大腸菌（E. coli）からのエキソヌクレアーゼＩ酵素（ＥｃｏＥｘｏ  Ｉ）のアミノ酸配列を示す。
【００２１】
配列番号１２は、大腸菌（E. coli）からのｘｔｈＡ遺伝子に由来するコドン最適化ポリヌクレオチド配列を示す。この配列は、大腸菌（E. coli）からのエキソヌクレアーゼＩＩＩ酵素をコードする。
【００２２】
配列番号１３は、大腸菌（E. coli）からのエキソヌクレアーゼＩＩＩ酵素のアミノ酸配列を示す。この酵素は、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の一方の鎖からの５’一リン酸ヌクレオシドの分配性消化（distributive digestion）を３’−５’方向で行う。鎖上での酵素開始は、おおよそ４ヌクレオチドの５’オーバーハングを必要とする。
【００２３】
配列番号１４は、サーマス・サーモフィラス（T. thermophilus）からのｒｅｃＪ遺伝子に由来するコドン最適化ポリヌクレオチド配列を示す。この配列は、サーマス・サーモフィラス（T. thermophilus）からのＲｅｃＪ酵素（ＴｔｈＲｅｃＪ−ｃｄ）をコードする。
【００２４】
配列番号１５は、サーマス・サーモフィラス（T. thermophilus）からのＲｅｃＪ酵素（ＴｔｈＲｅｃＪ−ｃｄ）のアミノ酸配列を示す。この酵素は、ｓｓＤＮＡからの５’一リン酸ヌクレオシドの前進性消化（processive digestion）を５’−３’方向で行う。鎖上での酵素開始は、少なくとも４ヌクレオチドを必要とする。
【００２５】
配列番号１６は、バクテリオファージλ  ｅｘｏ（ｒｅｄＸ）遺伝子に由来するコドン最適化ポリヌクレオチド配列を示す。この配列は、バクテリオファージλエキソヌクレアーゼをコードする。
【００２６】
配列番号１７は、バクテリオファージλエキソヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。この配列は、集合して三量体になる３つの同一のサブユニットの１つである。この酵素は、ｄｓＤＮＡの一方の鎖からのヌクレオチドの５’−３’方向の高前進性消化を行う（http://www.neb.com/nebecomm/products/productM0262.asp）。鎖上での酵素開始は、５’リン酸エステルを有するおおよそ４ヌクレオチドの５’オーバーハングを優先的に必要とする。
【００２７】
配列番号１８は、Ｈｅｌ３０８  Ｍｂｕのアミノ酸配列を示す。
【００２８】
配列番号１９は、Ｈｅｌ３０８  Ｃｓｙのアミノ酸配列を示す。
【００２９】
配列番号２０は、Ｈｅｌ３０８  Ｔｇａのアミノ酸配列を示す。
【００３０】
配列番号２１は、Ｈｅｌ３０８  Ｍｈｕのアミノ酸配列を示す。
【００３１】
配列番号２２は、ＴｒａＩ  Ｅｃｏのアミノ酸配列を示す。
【００３２】
配列番号２３は、ＸＰＤ  Ｍｂｕのアミノ酸配列を示す。
【００３３】
配列番号２４は、Ｄｄａ  １９９３のアミノ酸配列を示す。
【００３４】
配列番号２５は、Ｔｒｗｃ  Ｃｂａのアミノ酸配列を示す。
【００３５】
配列番号２６〜２８は、本発明の好ましいＭｕＡ基質の配列を示す。
【００３６】
配列番号２９は、実施例１で使用されるポリヌクレオチド配列を示す。
【００３７】
配列番号３０は、実施例１で使用されるポリヌクレオチド配列を示す。この配列にはその５’末端に次のポリヌクレオチド配列が付着されている−ＧＡＴＣＵ。
【００３８】
配列番号３１は、腸内細菌ファージλの、実施例１で使用される、ポリヌクレオチド配列を示す。この配列は、テンプレート鎖の５’末端に付着されているさらなる１２塩基オーバーハングを含有する。ここに示す配列は、テンプレート鎖のみのものである（テンプレート補体は示さない）。
【００３９】
配列番号３２は、実施例１で使用されるポリヌクレオチド配列を示す。
【００４０】
配列番号３３は、実施例１で使用されるポリヌクレオチド配列を示す。
【００４１】
配列番号３４は、実施例１で使用されるポリヌクレオチド配列を示す。
【００４２】
配列番号３５は、実施例１で使用されるポリヌクレオチド配列を示す。
【００４３】
配列番号３６は、実施例２で使用されるポリヌクレオチド配列を示す。
【００４４】
配列番号３７は、実施例２で使用されるポリヌクレオチド配列を示す。
【００４５】
発明の詳細な説明
開示する生成物および方法の様々な用途を当技術分野における具体的な必要に合わせて調整できることは理解されるはずである。本明細書において用いる用語法が本発明の特定の実施形態の説明を目的にしたものに過ぎず、限定を意図したものでないことも理解されるはずである。
【００４６】
加えて、本明細書および添付の特許請求の範囲において用いる場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈による別段の明白な指図がない限り、複数の言及対象を含む。したがって、例えば、「ポリヌクレオチド（a polynucleotide）」への言及は、「ポリヌクレオチド（polynucleotides）」を含み、「基質（a substrate）」への言及は、２つ以上のそのような基質を含み、「膜貫通タンパク質ポア（a transmembrane protein pore）」への言及は、２つ以上のそのようなポアを含むなど。
【００４７】
上文であろうと、下文であろうと、本明細書の中で引用するすべての出版物、特許および特許出願は、それら全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【００４８】
本発明の修飾方法
本発明は、テンプレートポリヌクレオチドを修飾する方法を提供する。テンプレートをあらゆる目的で修飾することができる。この方法は、好ましくは、特性評価のために、例えば鎖シークエンシングのために、テンプレートポリヌクレオチドを修飾するためのものである。テンプレートポリヌクレオチドは、概して、本発明に従って最終的に特性評価またはシークエンシングされることになるポリヌクレオチドである。このことは、下でより詳細に論じる。
【００４９】
方法は、複数の修飾二本鎖ポリヌクレオチドの形成を含む。これらの修飾二本鎖ポリヌクレオチドは、特に鎖シークエンシングを使用して、テンプレートポリヌクレオチドより概して容易に特性評価される。複数の修飾二本鎖ポリヌクレオチド自体を特性評価して、テンプレートポリヌクレオチドの特性評価を助長することができるだろう。例えば、修飾二本鎖ポリヌクレオチドの各々をシークエンシングすることによってテンプレートポリヌクレオチドの配列を決定することができる。
【００５０】
修飾二本鎖ポリヌクレオチドは、通常はテンプレートポリヌクレオチドより短く、そのため、鎖シークエンシングを使用してそれらを特性評価するほうが容易である。修飾二本鎖ポリヌクレオチドはまた、下で論じるように２倍の情報量を含む。
【００５１】
ＭｕＡ基質に標識を含めることによって、修飾二本鎖ポリヌクレオチドを選択的に標識することができる。好適な標識としては、較正配列、カップリング部分、およびアダプター結合酵素が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５２】
いくつかの実施形態において、方法は、二本鎖ポリヌクレオチドに鎖シークエンシングを使用するそれらの特性評価を助長する修飾を導入する。ナノポアを含有する膜とのポリヌクレオチドのカップリングが、そのポリヌクレオチドの特性評価およびシークエンシングを可能にするのに必要なポリヌクレオチド量を数桁低下させることは、十分に確証されている。このことは、国際出願番号ＰＣＴ／ＧＢ２０１２／０５１１９１（国際公開第２０１２／１６４２７０号パンフレットとして公開された）において論じられている。本発明の方法は、ポリヌクレオチドを膜とカップリングする手段を各々が含む複数の二本鎖ポリヌクレオチドの生成を可能にする。このことは、下でより詳細に論じる。
【００５３】
ナノポアを使用する二本鎖ポリヌクレオチドの特性評価は、ナノポアを優先的に通り抜けるように設計されたリーダー配列の存在を概して必要とする。本発明の方法は、一本鎖リーダー配列を各々が含む複数の二本鎖ポリヌクレオチドの生成を可能にする。このことは、下でより詳細に論じる。
【００５４】
ヘアピンループなどの架橋部分による二本鎖ポリヌクレオチドの２本の鎖の連結によって、ナノポアによるポリヌクレオチドの両方の鎖の特性評価またはシークエンシングが可能になることも、十分に確証されている。これは、単一の二本鎖ポリヌクレオチドから得られる情報の量を二倍にするので、有利である。さらに、テンプレート相補鎖内の配列は、テンプレート鎖の配列と本質的に直交性であるので、２本の鎖からの情報を情報科学的に組み合わせることができる。したがって、このメカニズムによって、より高い信頼度の観察をもたらす、直交較正能力（orthogonal proof-reading capability）が得られる。このことは、国際出願番号ＰＣＴ／ＧＢ２０１２／０５１７８６（国際公開第２０１３／０１４４５１号パンフレットとして公開された）において論じられている。本発明の方法は、ヘアピンループを使用して各ポリヌクレオチドの２本の鎖が連結されている複数の修飾二本鎖ポリヌクレオチドの生成を可能にする。
【００５５】
テンプレートポリヌクレオチド
本発明の方法は、好ましくは特性評価のために、テンプレート二本鎖ポリヌクレオチドを修飾する。テンプレートポリヌクレオチドは、概して、本発明に従って最終的に特性評価またはシークエンシングされることになるポリヌクレオチドである。テンプレートポリヌクレオチドを標的二本鎖ポリヌクレオチドまたは目的の二本鎖ポリヌクレオチドと呼ぶこともある。
【００５６】
核酸などのポリヌクレオチドは、２つ以上のヌクレオチドを含む高分子である。ポリヌクレオチドまたは核酸は、いずれのヌクレオチドのいずれの組み合わせを含んでもよい。ヌクレオチドは、天然に存在するものであることもあり、または人工的なものであることもある。ポリヌクレオチド中の１つまたは複数のヌクレオチドは、酸化またはメチル化されていることがある。ポリヌクレオチド中の１つまたは複数のヌクレオチドは、損傷されていることがある。例えば、ポリヌクレオチドは、ピリミジン二量体を含むことがある。そのような二量体は概して、紫外線による損傷に関連し、皮膚黒色腫の主原因である。ポリヌクレオチド中の１つまたは複数のヌクレオチドは、例えば標識またはタグで、修飾されていることがある。好適な標識は、下で説明する。ポリヌクレオチドは、１つまたは複数のスペーサーを含むことがある。
【００５７】
ヌクレオチドは、核酸塩基、糖および少なくとも１つのリン酸エステル基を概して含有する。核酸塩基および糖は、ヌクレオシドを形成する。
【００５８】
核酸塩基は、概して複素環式である。核酸塩基としては、プリンおよびピリミジン、より具体的にはアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、ウラシル（Ｕ）およびシトシン（Ｃ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５９】
糖は、概してペントース糖である。ヌクレオチド糖としては、リボースおよびデオキシリボースが挙げられるが、これらに限定されない。糖は、好ましくはデオキシリボースである。
【００６０】
ポリヌクレオチドは、好ましくは次のヌクレオシドを含む：デオキシアデノシン（ｄＡ）、デオキシウリジン（ｄＵ）および／またはチミジン（ｄＴ）、デオキシグアノシン（ｄＧ）ならびにデオキシシチジン（ｄＣ）。
【００６１】
ヌクレオチドは、概してリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドである。ヌクレオチドは、概して、一リン酸エステル、二リン酸エステルまたは三リン酸エステルを含有する。ヌクレオチドは、３つより多くのリン酸エステル、例えば、４つまたは５つのリン酸エステルを含むことがある。リン酸エステルは、ヌクレオチドの５’側に付着されていることもあり、または３’側に付着されていることもある。ヌクレオチドとしては、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）、グアノシン一リン酸（ＧＭＰ）、チミジン一リン酸（ＴＭＰ）、ウリジン一リン酸（ＵＭＰ）、５−メチルシチジン一リン酸、５−ヒドロキシメチルシチジン一リン酸、シチジン一リン酸（ＣＭＰ）、環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）、環状グアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）、デオキシアデノシン一リン酸（ｄＡＭＰ）、デオキシグアノシン一リン酸（ｄＧＭＰ）、デオキシチミジン一リン酸（ｄＴＭＰ）、デオキシウリジン一リン酸（ｄＵＭＰ）、デオキシシチジン一リン酸（ｄＣＭＰ）およびデオキシメチルシチジン一リン酸が挙げられるが、これらに限定されない。ヌクレオチドは、好ましくは、ＡＭＰ、ＴＭＰ、ＧＭＰ、ＣＭＰ、ＵＭＰ、ｄＡＭＰ、ｄＴＭＰ、ｄＧＭＰ、ｄＣＭＰおよびｄＵＭＰから選択される。
【００６２】
ヌクレオチドは、脱塩基性である（すなわち、核酸塩基を欠く）ことがある。ヌクレオチドは、核酸塩基および糖も欠くこともある（すなわち、Ｃ３スペーサーである）。
【００６３】
ポリヌクレオチド中のヌクレオチドは、いずれの様式で互いに付着されていてもよい。ヌクレオチドは、概して、それらの糖およびリン酸基によって核酸の場合のように付着されている。ヌクレオチドは、それらの核酸塩基によってピリミジン二量体の場合のように接続されていることがある。
【００６４】
ポリヌクレオチドは、二本鎖状である。ポリヌクレオチドの少なくとも一部分は、好ましくは二本鎖状である。
【００６５】
ポリヌクレオチドは、核酸、例えば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）でありうる。ポリヌクレオチドは、１本のＤＮＡ鎖にハイブリダイズされた１本のＲＮＡ鎖を含むことができる。ポリヌクレオチドは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、グリセロール核酸（ＧＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、またはヌクレオチド側鎖を有する他の合成重合体などの、当技術分野において公知のいずれの合成核酸であってもよい。ＰＮＡ主鎖は、ペプチド結合によって連結された反復Ｎ−（２−アミノエチル）−グリシンユニットからなる。ＧＮＡ主鎖は、ホスホジエステル結合によって連結された反復グリコールユニットからなる。ＴＮＡ主鎖は、ホスホジエステル結合によって一緒に連結された反復トレオース糖からなる。ＬＮＡは、リボース部分の２’酸素と４’炭素を接続する余分な架橋を有する、上で論じたようなリボヌクレオチドから形成される。
【００６６】
ポリヌクレオチドは、最も好ましくはリボ核酸（ＲＮＡ）またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である。
【００６７】
ポリヌクレオチドは、いずれの長さであってもよい。例えば、ポリヌクレオチドは、少なくとも１０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも４００または少なくとも５００ヌクレオチドまたはヌクレオチド対の長さでありうる。ポリヌクレオチドは、１０００ヌクレオチドもしくはヌクレオチド対以上、５０００ヌクレオチドもしくはヌクレオチド対以上の長さ、または長さが１０００００ヌクレオチドもしくはヌクレオチド対以上の長さでありうる。
【００６８】
本発明を使用して、任意の数のポリヌクレオチドを調査することができる。例えば、本発明は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、５０、１００以上のポリヌクレオチドを特性評価することに関わることがある。２つ以上のポリヌクレオチドを特性評価する場合、それらは、異なるポリヌクレオチドであることもあり、同じポリヌクレオチドの２つの事例であることもある。
【００６９】
ポリヌクレオチドは、天然に存在するものであることもあり、または人工的なものであることもある。例えば、この方法を用いて、製造されたオリゴヌクレオチドの配列を検証してもよい。この方法は、概してインビトロで行われる。
【００７０】
テンプレートポリヌクレオチドは、概して、任意の好適な試料中に存在する。本発明は、テンプレートポリヌクレオチドを含有することが分かっているまたは含有すると推測される試料に対して概して行われる。あるいは、本発明は、試料に対して、その試料中に存在することが分かっているまたは予想される１つまたは複数のテンプレートポリヌクレオチドの正体を確認するために行われることがある。
【００７１】
試料は、生体試料であってもよい。任意の生物または微生物から得られたまたは抽出された試料に対してインビトロで本発明を行ってもよい。生物または微生物は、概して、古細菌性、原核性または真核性であり、五界、すなわち植物界、動物界、菌界、原核生物界および原生生物界の１つに概して属する。任意のウイルスから得られたまたは抽出された試料に対して本発明をインビトロで行ってもよい。試料は、好ましくは流体試料である。試料は、患者の体液を概して含む。試料は、尿、リンパ液、唾液、粘液または羊水であってもよいが、好ましくは血液、血漿または血清である。概して、試料は起源がヒトであるが、代替的に、別の哺乳類動物からのもの、例えば、商業飼育動物、例えばウマ、ウシ、ヒツジ、もしくはブタからのものであってもよく、または代替的にペット、例えばネコもしくはイヌであってもよい。あるいは、植物起源の試料は、商品作物、例えば、穀類、マメ科植物、果実または野菜、例えば、コムギ、オオムギ、オートムギ、キャノーラ、トウモロコシ、ダイズ、イネ、バナナ、リンゴ、トマト、ジャガイモ、ブドウ、タバコ、マメ、レンズマメ、サトウキビ、カカオノキ、ワタから通常得られる。
【００７２】
試料は、非生体試料であってもよい。非生体試料は、好ましくは流体試料である。非生体試料の例としては、外科用流体、水、例えば飲用水、海水または河川水、および検査室検査用の試薬が挙げられる。
【００７３】
試料は、本発明で使用される前に、例えば、遠心分離によって、または望ましくない分子もしくは細胞、例えば赤血球を濾過して取り除く膜を通過させることによって、概して処理される。試料は、採取され次第、測定されることがある。試料は、アッセイ前に、好ましくは−７０℃未満で概して保存されることもある。
【００７４】
ＭｕＡおよび条件
テンプレートポリヌクレオチドをＭｕＡトランスポサーゼと接触させる。この接触は、トランスポサーゼが機能すること、すなわち、テンプレートポリヌクレオチドを断片化し、それらの断片の一方または両方の末端にＭｕＡ基質をライゲートすること、を可能にする条件下で行われる。ＭｕＡトランスポサーゼは、例えば、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから市販されている（カタログ番号Ｆ−７５０Ｃ、２０μＬ（１．１μｇ／μＬ））。ＭｕＡトランスポサーゼが機能することになる条件は、当技術分野において公知である。好適な条件は、実施例で説明する。
【００７５】
基質の集団
テンプレートポリヌクレオチドを二本鎖ＭｕＡ基質の集団と接触させる。これらの二本鎖基質はヌクレオチド基質であり、上で論じたヌクレオチドまたは核酸のいずれから形成されてもよい。基質は、概して、テンプレートポリヌクレオチドと同じヌクレオチドから形成される。
【００７６】
基質の集団は、通常は均一である（すなわち、複数の同一の基質を通常は含有する）。基質の集団は、不均一であることもある（すなわち、複数の異なる基質を含有することもある）。
【００７７】
ＭｕＡトランスポサーゼの好適な基質は、当技術分野において公知である（Saariaho and Savilahti, Nucleic Acids Research, 2006; 34(10): 3139-3149、およびLee and Harshey, J. Mol.Biol., 2001; 314: 433-444）。
【００７８】
各基質は、ＭｕＡトランスポサーゼの基質としてのその活性を提供する二本鎖部分を通常は含む。この二本鎖部分は、通常はどの基質でも同じである。基質の集団は、異なる二本鎖部分を含むこともある。
【００７９】
各基質の二本鎖部分は、概して、少なくとも５０ヌクレオチド対の長さ、例えば、少なくとも５５、少なくとも６０または少なくとも６５ヌクレオチド対の長さである。各基質の二本鎖部分は、好ましくは、各鎖の３’末端にデオキシシチジン（ｄＣ）およびデオキシアデノシン（ｄＡ）を含むジヌクレオチドを含む。ｄＣおよびｄＡは、概して、二本鎖部分の２本の鎖内に異なる配向で存在する。すなわち、５’から３’方向に読み取ったとき、一方の鎖はｄＣ／ｄＡをおよび他方の鎖はｄＡ／ｄＣを３’末端に有する。
【００８０】
二本鎖部分の一方の鎖は、好ましくは、配列番号２６で示される配列を含み、二本鎖部分の他方の鎖は、好ましくは、配列番号２７で示される配列を含む。
５’−ＧＴＴＴＴＣＧＣＡＴＴＴＡＴＣＧＴＧＡＡＡＣＧＣＴＴＴＣＧＣＧＴＴＴＴＴＣＧＴＧＣＧＣＣＧＣＴＴＣＡ−３’（配列番号２６）
３’−ＣＡＡＡＡＧＣＧＴＡＡＡＴＡＧＣＡＣＴＴＴＧＣＧＡＡＡＧＣＧＣＡＡＡＡＡＧＣＡＣＧＣＧＧＣＧＡＡＧＴ−５’（配列番号２７）
【００８１】
各基質は、少なくとも１つのオーバーハングを含む。このオーバーハングは、概してヌクレオチドオーバーハングである。各基質の一方または両方の末端にオーバーハングがあることもある。各基質の二本鎖部分が、配列番号２７で示される配列にハイブリダイズされた、配列番号２６で示される配列を含む場合、少なくとも１つのオーバーハングは、好ましくは、配列番号２７で示される配列の５’末端にある。
【００８２】
各基質は、２つのオーバーハングを、すなわち、各基質の両方の末端に１つのオーバーハングを、含むこともある。基質の両方の末端にオーバーハングがある場合、各オーバーハングは、概して、二本鎖ポリヌクレオチド部分の異なる鎖上にある。オーバーハングは、好ましくは、二本鎖部分の鎖の５’末端に位置する。
【００８３】
各基質は、好ましくは、オーバーハングを１つだけ含む。この１つだけのオーバーハングは、好ましくは、二本鎖部分の一方の鎖の５’末端にある。
【００８４】
オーバーハングは、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６または少なくとも７ヌクレオチドの長さでありうる。オーバーハングは、好ましくは、５ヌクレオチドの長さである。
【００８５】
好ましい実施形態において、基質の一方の鎖は、配列番号２６で示される配列を含み、基質の他方の鎖は、配列番号２８で示される配列を含む（下記参照）。
５’−ＧＴＴＴＴＣＧＣＡＴＴＴＡＴＣＧＴＧＡＡＡＣＧＣＴＴＴＣＧＣＧＴＴＴＴＴＣＧＴＧＣＧＣＣＧＣＴＴＣＡ−３’（配列番号２６）
３’−ＣＡＡＡＡＧＣＧＴＡＡＡＴＡＧＣＡＣＴＴＴＧＣＧＡＡＡＧＣＧＣＡＡＡＡＡＧＣＡＣＧＣＧＧＣＧＡＡＧＴＣＴＡＧ−５’（配列番号２８）
【００８６】
集団内の基質は、国際出願番号ＰＣＴ／ＧＢ２０１４／０５２５０５に開示されている構造のいずれかを有することもある。
【００８７】
各基質は、少なくとも１つのオーバーハングを含む鎖とは反対の鎖に少なくとも１つのヘアピンループを含む。このヘアピンループは、概して、基質の２本の鎖を連結しない。ヘアピンループは、内部ヘアピンループであってもよく、すなわち、少なくとも１つのオーバーハングを含む鎖とは反対の鎖の末端になくてもよい。内部ヘアピンループは、本発明の方法に使用されるいずれのポリメラーゼも超えて移動することができないスペーサーに、好ましくは隣接している。スペーサーは、ヘアピンループのどちら側に位置してもよい。１つもしくは複数のｉＳｐＣ３基（すなわち、糖および塩基を欠くヌクレオチド）、１つもしくは複数のスペーサー９（ｉＳｐ９）基または１つもしくは複数のスペーサー１８（ｉＳｐ１８）基などの、下で論じるスペーサーのいずれを使用してもよい。内部ヘアピンループは、本発明の方法に使用されるいずれのポリメラーゼも超えて移動することができない非天然ヌクレオチド、例えばニトロインドールに、好ましくは隣接している。下で論じる様々なヌクレオチド種のいずれを使用してもよい。
【００８８】
ヘアピンループは、好ましくは、少なくとも１つのオーバーハングを含む鎖とは反対の鎖の末端にまたは末端付近にある。ヘアピンループは、少なくとも１つのオーバーハングを含む鎖とは反対の鎖の末端から２０ヌクレオチド以下、１５ヌクレオチド以下、１０ヌクレオチド以下または５ヌクレオチド以下である場合、少なくとも１つのオーバーハングを含む鎖とは反対の鎖の末端付近にある。ヘアピンループは、鎖の末端のステム部分（ハイブリダイズした部分）を形成する最後のヌクレオチド間にあるヌクレオチドが２０以下である場合、鎖の末端から２０ヌクレオチド以下である。ヘアピンループは、好ましくは、少なくとも１つのオーバーハングを含む鎖とは反対の鎖の末端にある。各基質の一方または両方の末端にヘアピンループがあることもある。ヘアピンループは、好ましくは、基質の少なくとも１つのオーバーハングとは反対の末端にある。
【００８９】
ヘアピンループは、概してヌクレオチドヘアピンループである。各基質の二本鎖部分が、配列番号２７で示される配列にハイブリダイズされた、配列番号２６で示される配列を含む場合、少なくとも１つのヘアピンループは、好ましくは、配列番号２６で示される配列の５’末端にある。
【００９０】
各基質は、２つのヘアピンループを、すなわち、各基質の両方の鎖内に１つのループを、または各基質の両方の末端に１つのループを、含むこともある。基質の両方の末端にヘアピンループがある場合、各ヘアピンループは、概して、二本鎖ポリヌクレオチド部分の異なる鎖上にある。ヘアピンループは、好ましくは、二本鎖部分の鎖の５’末端に位置する。
【００９１】
各基質は、好ましくは、ヘアピンループを１つだけ含む。この１つだけのヘアピンループは、好ましくは、少なくとも１つのオーバーハングを含む鎖とは反対の鎖内にある。１つだけのヘアピンループは、好ましくは、基質の少なくとも１つのオーバーハングとは反対の末端に、および少なくとも１つのオーバーハングを含む鎖とは反対の鎖内にある。１つだけのヘアピンループは、好ましくは、二本鎖部分の一方の鎖の５’末端に、および少なくとも１つのオーバーハングを含む鎖とは反対の鎖内にある。
【００９２】
好ましい実施形態において、各基質は、二本鎖部分の一方の鎖の５’末端に１つのオーバーハングを含み、二本鎖部分の他方の鎖の５’末端にヘアピンループを含む。最も好ましい実施形態において、基質の一方の鎖は、配列番号２６で示される配列を含み、基質の他方の鎖は、配列番号２８で示される配列を含み（上記参照）、ヘアピンループは、配列番号２６で示される配列の５’末端にある。
【００９３】
好適なヘアピンループは、当技術分野において公知の方法を用いて設計することができる。ヘアピンループは、いずれの長さであってもよい。ヘアピンループは、概して１１０ヌクレオチド以下、例えば、１００ヌクレオチド以下、９０ヌクレオチド以下、８０ヌクレオチド以下、７０ヌクレオチド以下、６０ヌクレオチド以下、５０ヌクレオチド以下、４０ヌクレオチド以下、３０ヌクレオチド以下、２０ヌクレオチド以下、または１０ヌクレオチド以下の長さである。ヘアピンループは、好ましくは、約１〜１１０、２〜１００、５〜８０、または６〜５０ヌクレオチドの長さである。
【００９４】
ヘアピンループを上で論じたポリヌクレオチドのいずれから形成してもよい。ヘアピンループを二本鎖部分と同じヌクレオチドから形成してもよい。ヘアピンループは、好ましくは、二本鎖部分より低い融解温度（Ｔｍ）を有するヘアピンループをもたらすヌクレオチドから形成される。融解温度は、通例の技法を用いて測定することができる。二本鎖部分がＲＮＡを含む場合、ヘアピンは、好ましくは、アデノシン（Ａ）、ウリジン（Ｕ）、イノシン（Ｉ）およびゼブラリン（Ｚ）を含有するヌクレオチドから形成される。二本鎖部分がＤＮＡを含む場合、ヘアピンは、好ましくは、デオキシアデノシン（ｄＡ）、チミジン（ｄＴ）、デオキシイノシン（ｄＩ）およびデオキシゼブラリン（ｄＺ）を含有するヌクレオチドから形成される。グアノシン（Ｇ）／デオキシグアノシン（ｄＧ）のイノシン（Ｉ）／デオキシイノシン（ｄＩ）での置き換え、およびシチジン（Ｃ）／デオキシシチジン（ｄＣ）のゼブラリン（Ｚ）／デオキシゼブラリン（ｄＺ）残基での置き換えは、二本鎖部分と比較してヘアピンのＴｍを低下させる。Ｉ／ｄＩおよびＺ／ｄＺは、２つの水素結合しか形成しないが、Ｇ／ｄＧおよびＣ／ｄＣは、３つの水素結合を形成する。本発明の方法において、ポリメラーゼは、オーバーハング鎖を、ヘアピンループを含む鎖を相補する新たな鎖と置き換える。より低いＴｍを有するヘアピンループを使用して、より高いＴｍを有する相補的ヘアピン、すなわち、より高いＴｍを有するヌクレオチドから形成されたヘアピンを形成することができる。ポリメラーゼは、オーバーハング鎖を、ヘアピンループを含む鎖を相補する新たな鎖であって、テンプレート鎖のヘアピンループより高いＴｍを有するヘアピンループを含む新たな鎖と、置き換えることができる。例えば、アデノシン（Ａ）／デオキシアデノシン（ｄＡ）、ウリジン（Ｕ）／チミジン（ｄＴ）、イノシン（Ｉ）／デオキシイノシン（ｄＩ）およびゼブラリン（Ｚ）／デオキシゼブラリン（ｄＺ）を含有するヌクレオチドから形成されたヘアピンループを使用して、相補的ＲＮＡまたはＤＮＡヘアピンループを形成することができる。２つのヘアピン間のＴｍの差は、それらが、個々のヘアピンとしてのほうが一緒にハイブリダイズされるより安定していることを意味する。これは、２つのヘアピンループが、一緒にハイブリダイズするのではなくそれらのそれぞれのループを形成することを意味する。これは、二本鎖構築物の２本の鎖を分離し、テンプレートとして使用して、少なくとも１つのヘアピンループによって連結された２本の相補鎖を各々が含む複数の修飾二本鎖ポリヌクレオチドを形成する、方法の最終ステップを助長する。例えば、分離を室温で行うことができる。
【００９５】
各基質は、選択可能な結合部分を含むことがある。存在する場合、選択可能な結合部分は、好ましくは、ヘアピンループ内にある。選択可能な結合部分は、その結合特性に基づいて選択することができる部分である。したがって、選択可能な結合部分は、好ましくは、表面と特異的に結合する部分である。選択可能な結合部分は、本発明において使用される任意の他の部分よりはるかに大きい程度に表面と結合する場合、その表面に特異的に結合する。好ましい実施形態において、部分は、本発明で使用される他の部分が結合しない表面と結合する。
【００９６】
好適な選択的結合部分は、当技術分野において公知である。好ましい選択的結合部分としては、ビオチン、核酸配列、抗体、抗体断片、例えばＦａｂおよびＳｃＳｖ、抗原、核酸結合タンパク質、ポリヒスチジンテールおよびＧＳＴタグが挙げられるが、これらに限定されない。最も好ましい選択的結合部分は、ビオチンおよび選択可能な核酸配列である。ビオチンは、アビジンで被覆された表面と特異的に結合する。選択可能な核酸配列は、相同配列で被覆された表面と特異的に結合（すなわちハイブリダイズ）する。あるいは、選択可能な核酸配列は、核酸結合タンパク質で被覆された表面と特異的に結合する。
【００９７】
各基質は、リーダー配列を含むことがある。リーダー配列は、概して、少なくとも１つのヘアピンループと同じ鎖上にある。リーダー配列は、概して、基質のヘアピンループと同じ末端にある。リーダー配列は、通常、少なくとも１つのヘアピンループを含む鎖の末端に位置する（すなわち、ヘアピンループは、末端リーダー配列と基質の残部の間に位置する）。リーダー配列は、概して、本発明の方法に使用されるいずれのポリメラーゼも超えて移動することができないスペーサーによってヘアピンループから離隔される。１つもしくは複数のｉＳｐＣ３基（すなわち、糖および塩基を欠くヌクレオチド）、１つもしくは複数のスペーサー９（ｉＳｐ９）基または１つもしくは複数のスペーサー１８（ｉＳｐ１８）基などの、下で論じるいずれのスペーサーを使用してもよい。このスペーサーは、リーダー配列がステップ（ｂ）および（ｃ）においてテンプレートとして使用されず、そのため方法の最終時点で一本鎖のままであることを意味する。これによって、リーダー配列はその機能を果すことが可能になる。この例を図５に示す。
【００９８】
リーダー配列は、ポアを優先的に通り抜ける。リーダー配列は、本発明の特性評価方法を助長する。リーダー配列は、ポアを優先的に通り抜けるように、およびそれによってポアを通るポリヌクレオチドの移動を助長するように、設計される。リーダー配列を使用して、ポリヌクレオチドを下で論じるような１つまたは複数のアンカーに連結させることもできる。リーダー配列は、重合体を概して含む。重合体は、好ましくは負電荷を有する。重合体は、好ましくは、ポリヌクレオチド、例えばＤＮＡもしくはＲＮＡ、修飾ポリヌクレオチド（例えば脱塩基ＤＮＡ）、ＰＮＡ、ＬＮＡ、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリペプチドである。リーダーは、好ましくはポリヌクレオチドを含み、より好ましくは一本鎖ポリヌクレオチドを含む。リーダー配列は、上で論じたポリヌクレオチドのいずれかを含むことができる。一本鎖リーダー配列は、最も好ましくは、ＤＮＡの１本の鎖、例えば、ポリｄＴセクションを含む。リーダー配列は、好ましくは１つまたは複数のスペーサーを含む。
【００９９】
リーダー配列は、任意の長さでありうるが、概して１０〜１５０ヌクレオチドの長さ、例えば２０〜１５０ヌクレオチドの長さである。リーダーの長さは、方法に使用される膜貫通ポアに概して依存する。
【０１００】
断片化
トランスポサーゼは、テンプレート二本鎖ポリヌクレオチドを断片化して、複数の二本鎖断片を形成する。トランスポサーゼは、二本鎖断片の一方または両方の末端に基質をライゲートし、それによって複数の断片／基質構築物を生成する。トランスポサーゼは、好ましくは、二本鎖断片の両方の末端に基質をライゲートし、それによって、各々が両方の末端にヘアピンループを有する複数の断片／基質構築物を生成する。この例は、図１で見ることができる。
【０１０１】
ポリメラーゼ
トランスポサーゼによって生成された断片／基質構築物をポリメラーゼと接触させる。下で論じるポリメラーゼのいずれを使用してもよい。ポリメラーゼは、好ましくは、クレノウまたは９oＮｏｒｔｈである。ポリメラーゼは、より好ましくは、ＬｏｎｇＡｍｐ（登録商標）Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（登録商標）Ｉｎｃ．から市販されている）、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（登録商標）Ｉｎｃ．から市販されている）またはＫＡＰＡ  ＨｉＦｉ（ＫＡＰＡ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから市販されている）である。
【０１０２】
構築物をポリメラーゼと、ポリメラーゼがオーバーハング鎖を外し、相補ポリヌクレオチドを形成する条件下で、接触させる。そのような条件は、当技術分野において公知である。例えば、概して、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（登録商標）またはＫＡＰＡ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓからの緩衝液などの市販のポリメラーゼ緩衝液中で構築物をポリメラーゼと接触させる。温度は、好ましくは、クレノウについては２０〜３７℃、または９oＮｏｒｔｈ、ＬｏｎｇＡｍｐ（登録商標）Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡポリメラーゼもしくはＫＡＰＡ  ＨｉＦｉについては６０〜７５℃である。
【０１０３】
ポリメラーゼは、オーバーハングを含む鎖を断片／基質構築物から外す。ポリメラーゼは、オーバーハング鎖を、ヘアピンループを含む鎖を相補する新たな鎖と置き換える。これによって、各々がテンプレートポリヌクレオチドの二本鎖断片を含む複数の二本鎖構築物が生成される。ポリメラーゼによって形成される新たな鎖の一部は、概してヘアピンループに相補的である。これは、ヘアピンループが、概して、構築物中の二本鎖ポリヌクレオチドの一部を形成することを意味する。この例は、図１で見ることができる。
【０１０４】
ポリメラーゼは、上で論じたまたは下で論じるヌクレオチドのいずれかを含む新たな鎖を形成することができる。ポリメラーゼには、ヘアピンループを含む鎖内のヌクレオチドを相補する遊離ヌクレオチドの集団が備えられる。ポリメラーゼは、それらの遊離ヌクレオチドを使用して新たな鎖を形成することができる。
【０１０５】
分離／複製
二本鎖構築物の２本の鎖を分離し、それらの鎖をテンプレートとして使用して、少なくとも１つのヘアピンループによって連結された２本の相補鎖を各々が含む複数の修飾二本鎖ポリヌクレオチドを形成する。この例を図１に示す。
【０１０６】
２本の鎖をテンプレートとして使用する前に完全に分離してもよい。２本の鎖を分離し、同じ時点で（すなわち、同時に）テンプレートとして使用してもよい。言い換えると、テンプレートとして使用する前に、２本の鎖を完全に分離する必要はなく、または２本の鎖を部分的に分離していてもよい。
【０１０７】
２本の鎖は、いかなる手法で分離していてもよい。方法は、好ましくは、ｐＨ、温度およびイオン強度のうちの１つまたは複数を上昇させることによって二本鎖構築物の２本の鎖を分離することを含む。温度上昇が好ましい。方法は、好ましくは、温度を９５℃に上昇させることを含む。方法は、好ましくは、温度を９５℃に上昇させ、その後、その温度を５５℃に低下させることを含む。方法は、好ましくは、温度を９５℃に上昇させ、その温度を５５℃に低下させ、そしてその温度を６８℃に上昇させることを含む。方法は、最も好ましくは、二本鎖構築物を２分間９５℃で、３０秒間５５℃で、および３０分間６８℃でインキュベートすることを含む。ｐＨの上昇は、ホルムアミドまたは水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）の使用によって果すことができる。酵素、例えば、ヘリカーゼ、またはテンプレート鎖を消化するもの（例えば、その鎖がｄＴではなくｄＵを有する場合、ＵＳＥＲ）を使用して、鎖を分離してもよい。下で論じるヘリカーゼのいずれを使用してもよい。
【０１０８】
下でより詳細に論じるように、ポリメラーゼを使用して２本の鎖を分離することができる。ポリメラーゼは、上で論じたまたは下で論じるもののいずれであってもよい。
【０１０９】
分離された鎖をテンプレートとして使用して新たなポリヌクレオチドを形成するために、いずれの方法を使用してもよい。方法は、好ましくは、鎖をポリメラーゼと接触させ、その結果、ポリメラーゼが鎖をテンプレートとして使用して複数の修飾二本鎖ポリヌクレオチドを形成することを含む。上で論じたまたは下で論じるポリメラーゼのいずれを使用してもよい。
【０１１０】
あるいは、方法は、（ｉ）複数の鎖を、それらの鎖内のヌクレオチドのすべてに相補的であるヌクレオチドのあらゆる可能な組み合わせを含むヌクレオチドオリゴマーの集団と、オリゴマーが鎖にハイブリダイズすることができる条件下で接触させるステップ、および（ｉｉ）鎖にハイブリダイズするそれらのオリゴマーを一緒にライゲートして、複数の修飾二本鎖ポリヌクレオチドを形成するステップを含むこともある。ハイブリダイゼーションを可能にする条件は、当技術分野において周知である（例えば、Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning: a laboratory manual, 3rd edition, Cold Spring Harbour Laboratory Press、およびCurrent Protocols in Molecular Biology, Chapter 2, Ausubel et al., Eds., Greene Publishing and Wiley-lnterscience, New York (1995)）。ハイブリダイゼーションを低ストリンジェンシー条件下、例えば、３０〜３５％ホルムアミド、１Ｍ  ＮａＣｌおよび１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）の緩衝溶液の存在下、３７℃で行い、続いて１×（０．１６５０Ｍ  Ｎａ＋）〜２×（０．３３Ｍ  Ｎａ＋）ＳＣＣ（標準クエン酸ナトリウム）中、５０℃での洗浄を行うことができる。ハイブリダイゼーションを中ストリンジェンシー条件下、例えば、４０〜４５％ホルムアミド、１Ｍ  ＮａＣｌおよび１％ＳＤＳの緩衝溶液の存在下、３７℃で行い、続いて０．５×（０．０８２５Ｍ  Ｎａ＋）〜１×（０．１６５０Ｍ  Ｎａ＋）ＳＣＣ中、５５℃での洗浄を行うことができる。ハイブリダイゼーションを高ストリンジェンシー条件下、例えば、５０％ホルムアミド、１Ｍ  ＮａＣｌ、１％ＳＤＳの緩衝溶液の存在下、３７℃で行い、続いて０．１×（０．０１６５０Ｍ  Ｎａ＋）ＳＣＣ中、６０℃での洗浄を行うことができる。好ましい条件は、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７中、１０ｕＭオリゴマー、９８℃への加熱、その後、毎分２℃で１８℃への冷却である。
【０１１１】
集団中のオリゴマーは、概して２〜１６ヌクレオチドを有する。集団中のオリゴマーのすべてが、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６ヌクレオチドを有しうる。集団中のオリゴマーは、異なる長さを有することもある。集団中のオリゴマーのすべてが、好ましくは、同じ長さを有する。オリゴマーは、上で論じたヌクレオチドのいずれかを含みうる。ヌクレオチドは、オリゴマーがハイブリダイズする鎖内のヌクレオチドに相補的である。それらのヌクレオチドに相補的なヌクレオチドを同定することは、当業者には容易である。あるヌクレオチドが、塩基対合、好ましくはワトソン・クリック塩基対合によって、別のヌクレオチドにハイブリダイズする場合、あるヌクレオチドは、そのヌクレオチドに相補的である。相補ヌクレオチドは、相補的であるヌクレオチドにハイブリダイズするより小程度にだが、相補的でない他のヌクレオチドにハイブリダイズすることもある。Ｎは、好ましくは、核酸塩基アデニン（Ａ）、ウラシル（Ｕ）、グアニン（Ｇ）またはシトシン（Ｃ）を含む。あるいは、Ｎは、核酸塩基Ａ、チミン（Ｔ）、ＧまたはＣを含む。Ａは、ＴまたはＵに相補的であり、逆もまた同様である。Ｇは、Ｃに相補的であり、逆もまた同様である。
【０１１２】
集団は、鎖内のヌクレオチドのすべても相補的である、ヌクレオチドのあらゆる可能な組み合わせを含む。これは、オリゴマーが、鎖のすべてではないにせよ大部分に、それらの配列がどうであれ、ハイブリダイズすることになることを意味する。例えば、Ｎが核酸塩基アデニン（Ａ）、ウラシル（Ｕ）、グアニン（Ｇ）またはシトシン（Ｃ）を含む場合、集団は、Ａ、Ｕ、ＧおよびＣのあらゆる可能な組み合わせを含む。同様に、Ｎが核酸塩基Ａ、チミン（Ｔ）、ＧまたはＣを含む場合、集団は、Ａ、Ｔ、ＧおよびＣのあらゆる可能な組み合わせを含む。
【０１１３】
必要な組み合わせを有するオリゴマーの集団を設計し、得ることは容易である。例えば、集団内のオリゴマーのすべてがＮＮを含み、またはＮＮからなり、Ｎが、Ａ、Ｔ、ＧまたはＣである場合には、その集団は、ＡＴ、ＡＧ、ＡＣ、ＴＡ、ＴＧ、ＴＣ、ＧＡ、ＧＴ、ＧＣ、ＣＡ、ＣＴおよびＣＧを含む。同様に、集団内のオリゴマーのすべてがＮＮＮを含み、またはＮＮＮからなり、ＮがＡ、Ｔ、ＧまたはＣである場合には、その集団は、ＡＴＧ、ＡＴＣ、ＡＧＴ、ＡＧＣ、ＡＣＴ、ＡＣＧ、ＴＡＧ、ＴＡＣ、ＴＧＡ、ＴＧＣ、ＴＣＡ、ＴＣＧ、ＧＡＴ、ＧＡＣ、ＧＴＡ、ＧＴＣ、ＧＣＡ、ＧＣＴ、ＣＡＴ、ＣＡＧ、ＣＴＡ、ＣＴＧ、ＣＧＡおよびＣＧＴを含む。遺伝子式、例えばＮＮまたはＮＮＮ、を設計してしまえば、Ｎの可能な組み合わせのすべてを含む集団は、例えば、Ｉｎｔｅｒｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）、ＳｉｇｍａおよびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入可能である。
【０１１４】
オリゴマーを本発明に従って一緒にライゲートすることができる。集団内のオリゴマーのすべては、好ましくは、リン酸基またはアデニル酸基を５’末端に有する。
【０１１５】
ハイブリダイズしたオリゴマーを、当技術分野において公知のいずれの方法を用いて一緒にライゲートしてもよい。オリゴマーは、好ましくは、リガーゼ、例えば、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、大腸菌（E. coli）ＤＮＡリガーゼ、Ｔａｑ  ＤＮＡリガーゼ、Ｔｍａ  ＤＮＡリガーゼおよび９ＯＮ  ＤＮＡリガーゼを使用してライゲートされる。
【０１１６】
反応性基がオリゴマーの末端に存在する場合、オリゴマーを化学的にライゲートすることができる。そのような実施形態では、オリゴマーが溶液中で互いにライゲートすることを防止するステップを用いる必要がある。ライゲーション反応は、概して、鎖上のヘアピンをプライマーとして使用して開始される。
【０１１７】
好ましい実施形態において、方法は、複数の二本鎖構築物をポリメラーゼと接触させ、その結果、ポリメラーゼが、同時に、二本鎖構築物の２本の鎖を分離し、それらの鎖をテンプレートとして使用して複数の修飾二本鎖ポリヌクレオチドを形成することを好ましくは含む。上で論じたまたは下で論じるポリメラーゼのいずれを使用してもよい。ポリメラーゼは、上で論じたまたは下で論じるヌクレオチドのいずれかを含む新たな鎖を形成することができる。ポリメラーゼには、テンプレート鎖内のヌクレオチドを相補する遊離ヌクレオチドの集団が備えられる。ポリメラーゼは、それらの遊離ヌクレオチドを使用して新たな鎖を形成することができる。
【０１１８】
修飾ポリヌクレオチド
ポリメラーゼが鎖をテンプレートとして使用して複数の修飾二本鎖ポリヌクレオチドを形成する場合、方法は、鎖を、ポリメラーゼ、および遊離ヌクレオチドの集団と、ポリメラーゼが鎖をテンプレートとして使用して複数の修飾二本鎖ポリヌクレオチドを形成する条件下で接触させることを含み、ポリメラーゼは、修飾二本鎖ポリヌクレオチドを形成するときに鎖内のヌクレオチド種の１つまたは複数を異なるヌクレオチド種と置き換える。上で論じたように、ポリメラーゼを使用して、同時に鎖を分離することができる。このタイプの修飾は、英国出願第１４０３０９６．９号明細書に記載されている。上で論じたまたは下で論じるポリメラーゼのいずれを使用してもよい。ポリメラーゼは、好ましくは、クレノウまたは９oＮｏｒｔｈである。好適な条件は、下で論じる。
【０１１９】
膜貫通ポアを使用するポリヌクレオチドの特性評価、例えばシークエンシングは、ｋ個のヌクレオチド（ｋは正の整数である）で構成されている重合体ユニット（すなわち「ｋ−ｍｅｒ」）の分析を概して含む。これは、国際出願番号ＰＣＴ／ＧＢ２０１２／０５２３４３（国際公開第２０１３／０４１８７８号パンフレットとして公開された）において論じられている。異なるｋ−ｍｅｒについての電流測定値間に明確な差があることが望ましいが、これらの測定値の一部が重複することはよくあることである。特に、ｋ−ｍｅｒ中の重合体ユニットの数が多いと、すなわちｋの値が大きいと、ポリヌクレオチドについての情報、例えばポリヌクレオチドの基礎配列の推定値の導出が害されて、異なるｋ−ｍｅｒによって生じた測定値を分離することが困難になりうる。
【０１２０】
鎖内の１つまたは複数のヌクレオチド種を修飾二本鎖ポリヌクレオチドの新たな鎖（すなわち、ポリメラーゼを使用して生成された鎖）内の異なるヌクレオチド種と置き換えることによって、新たな鎖は、テンプレート鎖内のものとは異なるｋ−ｍｅｒを含有する。新たな鎖内の異なるｋ−ｍｅｒは、テンプレート鎖内のｋ−ｍｅｒとは異なる電流測定値を生じさせることができ、そのため新たな鎖は、テンプレート鎖とは異なる情報を与える。新たな鎖からの追加情報は、修飾二本鎖ポリヌクレオチドおよびしたがってテンプレートポリヌクレオチドの特性評価をより容易にすることができる。場合によっては、修飾二本鎖ポリヌクレオチド自体を特性評価するほうが容易であることもある。例えば、電流測定値間の離隔が増したもしくは明確な離隔を有するｋ−ｍｅｒ、または減少したノイズを有するｋ−ｍｅｒを含むように、修飾二本鎖ポリヌクレオチドを設計してもよい。
【０１２１】
ポリメラーゼは、好ましくは、修飾二本鎖ポリヌクレオチドを形成するときにテンプレート鎖内のヌクレオチド種の２つ以上を異なるヌクレオチド種と置き換える。ポリメラーゼは、テンプレート鎖中の２つ以上のヌクレオチド種の各々を異質のヌクレオチド種と置き換えることがある。ポリメラーゼは、テンプレート鎖中の２つ以上のヌクレオチド種の各々を同じヌクレオチド種と置き換えることがある。
【０１２２】
テンプレート鎖がＤＮＡである場合、異なるヌクレオチド種は、概して、アデニン、グアニン、チミン、シトシンもしくはメチルシトシンとは異なる核酸塩基を含む、および／またはデオキシアデノシン、デオキシグアノシン、チミジン、デオキシシチジンもしくはデオキシメチルシチジンとは異なるヌクレオシドを含む。テンプレート鎖がＲＮＡである場合、修飾ポリヌクレオチド中の異なるヌクレオチド種は、概して、アデニン、グアニン、ウラシル、シトシンもしくはメチルシトシンとは異なる核酸塩基を含む、および／またはアデノシン、グアノシン、ウリジン、シチジンもしくはメチルシチジンとは異なるヌクレオシドを含む。
【０１２３】
異なるヌクレオチド種は、ユニバーサルヌクレオチドであってもよい。ユニバーサルヌクレオチドは、テンプレート鎖内のヌクレオチドのすべてとある程度にハイブリダイズまたは結合することになるものである。ユニバーサルヌクレオチドは、好ましくは、ヌクレオチドアデノシン（Ａ）、チミン（Ｔ）、ウラシル（Ｕ）、グアニン（Ｇ）およびシトシン（Ｃ）を含むヌクレオチドとある程度にハイブリダイズまたは結合することになるものである。ユニバーサルヌクレオチドは、一部のヌクレオチドと他のものより強くハイブリダイズまたは結合しうる。例えば、ヌクレオシド、２’−デオキシイノシンを含むユニバーサルヌクレオチド（Ｉ）は、Ｉ−Ｃ＞Ｉ−Ａ＞Ｉ−Ｇ近似的に＝Ｉ−Ｔの対合優先順位を示すであろう。ユニバーサルヌクレオチドが集団内のヌクレオチド種の代わりになる場合、ポリメラーゼがヌクレオチド種をユニバーサルヌクレオチドと置き換えることになる。例えば、ポリメラーゼを遊離のｄＡＭＰ、ｄＴＭＰ、ｄＣＭＰおよびユニバーサルヌクレオチドの集団と接触させると、ポリメラーゼはｄＧＭＰをユニバーサルヌクレオチドと置き換えることになる。
【０１２４】
ユニバーサルヌクレオチドは、好ましくは、次の核酸塩基のうちの１つを含む：ヒポキサンチン、４−ニトロインドール、５−ニトロインドール、６−ニトロインドール、ホルミルインドール、３−ニトロピロール、ニトロイミダゾール、４−ニトロピラゾール、４−ニトロベンゾイミダゾール、５−ニトロインダゾール、４−アミノベンゾイミダゾールまたはフェニル（Ｃ６−芳香族環）。ユニバーサルヌクレオチドは、より好ましくは、次のヌクレオシドのうちの１つを含む：２’−デオキシイノシン、イノシン、７−デアザ−２’−デオキシイノシン、７−デアザ−イノシン、２−アザ−デオキシイノシン、２−アザ−イノシン、２−Ｏ’−メチルイノシン、４−ニトロインドール２’−デオキシリボヌクレオシド、４−ニトロインドールリボヌクレオシド、５−ニトロインドール２’−デオキシリボヌクレオシド、５−ニトロインドールリボヌクレオシド、６−ニトロインドール２’−デオキシリボヌクレオシド、６−ニトロインドールリボヌクレオシド、３−ニトロピロール２’−デオキシリボヌクレオシド、３−ニトロピロールリボヌクレオシド、ヒポキサンチンの非環状糖類似体、ニトロイミダゾール２’−デオキシリボヌクレオシド、ニトロイミダゾールリボヌクレオシド、４−ニトロピラゾール２’−デオキシリボヌクレオシド、４−ニトロピラゾールリボヌクレオシド、４−ニトロベンゾイミダゾール２’−デオキシリボヌクレオシド、４−ニトロベンゾイミダゾールリボヌクレオシド、５−ニトロインダゾール２’−デオキシリボヌクレオシド、５−ニトロインダゾールリボヌクレオシド、４−アミノベンゾイミダゾール２’−デオキシリボヌクレオシド、４−アミノベンゾイミダゾールリボヌクレオシド、フェニルＣ−リボヌクレオシド、フェニルＣ−２’−デオキシリボシルヌクレオシド、２’−デオキシネブラリン、２’−デオキシイソグアノシン、Ｋ−２’−デオキシリボース、Ｐ−２’−デオキシリボースおよびピロリジン。ユニバーサルヌクレオチドは、より好ましくは、２’−デオキシイノシンを含む。ユニバーサルヌクレオチドは、より好ましくは、ＩＭＰまたはｄＩＭＰである。ユニバーサルヌクレオチドは、最も好ましくは、ｄＰＭＰ（２’−デオキシ−Ｐ−ヌクレオシド一リン酸）またはｄＫＭＰ（Ｎ６−メトキシ−２，６−ジアミノプリン一リン酸）である。
【０１２５】
異なるヌクレオチド種は、好ましくは、それが置き換えられることになるヌクレオチド種に不在の化学原子または基を含む。化学基は、好ましくは、プロピニル基、チオ基、オキソ基、メチル基、ヒドロキシメチル基、ホルミル基、カルボキシ基、カルボニル基、ベンジル基、プロパルギル基またはプロパルギルアミン基である。化学基または原子は、蛍光分子、ビオチン、ジゴキシゲニン、ＤＮＰ（ジニトロフェノール）、光解離性基、アルキン、ＤＢＣＯ、アジド、遊離アミノ基、酸化還元色素、水銀原子またはセレン原子でありうる、またはこれらを含みうる。
【０１２６】
天然に存在するヌクレオシドに不在である化学基を含む市販のヌクレオシドとしては、６−チオ−２’−デオキシグアノシン、７−デアザ−２’−デオキシアデノシン、７−デアザ−２’−デオキシグアノシン、７−デアザ−２’−デオキシキサントシン、７−デアザ−８−アザ−２’−デオキシアデノシン、８−５’（５’Ｓ）−シクロ−２’−デオキシアデノシン、８−アミノ−２’−デオキシアデノシン、８−アミノ−２’−デオキシグアノシン、８−重水素化−２’−デオキシグアノシン、８−オキソ−２’−デオキシアデノシン、８−オキソ−２’−デオキシグアノシン、エテノ−２’−デオキシアデノシン、Ｎ６−メチル−２’−デオキシアデノシン、Ｏ６−メチル−２’−デオキシグアノシン、Ｏ６−フェニル−２’デオキシイノシン、２’−デオキシプソイドウリジン、２−チオチミジン、４−チオ−２’−デオキシウリジン、４−チオチミジン、５’アミノチミジン、５−（１−ピレニルエチニル）−２’−デオキシウリジン、５−（Ｃ２−ＥＤＴＡ）−２’−デオキシウリジン、５−（カルボキシ）ビニル−２’−デオキシウリジン、５，６−ジヒドロ−２’−デオキシウリジン、５．６−ジヒドロチミジン、５−ブロモ−２’−デオキシシチジン、５−ブロモ−２’−デオキシウリジン、５−カルボキシ−２’−デオキシシチジン、５−フルオロ−２’−デオキシウリジン、５−ホルミル−２’−デオキシシチジン、５−ヒドロキシ−２’−デオキシシチジン、５−ヒドロキシ−２’−デオキシウリジン、５−ヒドロキシメチル−２’−デオキシシチジン、５−ヒドロキシメチル−２’−デオキシウリジン、５−ヨード−２’−デオキシシチジン、５−ヨード−２’−デオキシウリジン、５−メチル−２’−デオキシシチジン、５−メチル−２’−デオキシイソシチジン、５−プロピニル−２’−デオキシシチジン、５−プロピニル−２’−デオキシウリジン、６−Ｏ−（ＴＭＰ）−５−Ｆ−２’−デオキシウリジン、Ｃ４−（１，２，４−トリアゾール−１−イル）−２’−デオキシウリジン、Ｃ８−アルキン−チミジン、ｄＴ−フェロセン、Ｎ４−エチル−２’−デオキシシチジン、Ｏ４−メチルチミジン、ピロロ−２’−デオキシシチジン、チミジングリコール、４−チオウリジン、５−メチルシチジン、５−メチルウリジン、ピロロシチジン、３−デアザ−５−アザ−２’−Ｏ−メチルシチジン、５−フルオロ−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−フルオロ−４−Ｏ−ＴＭＰ−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−メチル−２’−Ｏ−メチルシチジン、５−メチル−２’−Ｏ−メチルチミジン、２’，３’−ジデオキシアデノシン、２’，３’−ジデオキシシチジン、２’，３’−ジデオキシグアノシン、２’，３’−ジデオキシチミジン、３’−デオキシアデノシン、３’−デオキシシチジン、３’−デオキシグアノシン、３’−デオキシチミジンおよび５’−Ｏ−メチルチミジンが挙げられるが、これらに限定されない。異なるヌクレオチド種は、これらのヌクレオシドのいずれかを含むことがある。
【０１２７】
あるいは、異なるヌクレオチド種は、好ましくは、それが置き換えられることになるヌクレオチド種に存在する化学基または原子を欠く。
【０１２８】
異なるヌクレオチド種は、好ましくは、置き換えられることになる１つまたは複数のヌクレオチドと比較して改変された電気陰性度を有する。改変された電気陰性度を有する異なるヌクレオチド種は、好ましくはハロゲン原子を含む。ハロゲン原子は、核酸塩基および／糖などの、異なるヌクレオチド種上のいずれの位置に付着されていてもよい。ハロゲン原子は、好ましくはフッ素（Ｆ）、塩素（Ｃｌ）、臭素（Ｂｒ）またはヨウ素（Ｉ）である。ハロゲン原子は、最も好ましくはＦまたはＩである。
【０１２９】
ハロゲンを含む市販のヌクレオシドとしては、８−ブロモ−２’−デオキシアデノシン、８−ブロモ−２’−デオキシグアノシン、５−ブロモウリジン、５−ヨードウリジン、５−ブロモウリジン、５−ヨードウリジン、５’−ヨードチミジンおよび５−ブロモ−２’−Ｏ−メチルウリジンが挙げられるが、これらに限定されない。異なるヌクレオチド種は、これらのヌクレオシドのいずれかを含むことがある。
【０１３０】
方法は、好ましくは、修飾二本鎖ポリヌクレオチド中の１つまたは複数の異なるヌクレオチド種から核酸塩基を選択的に除去するステップをさらに含む。これは、修飾二本鎖ポリヌクレオチドに脱塩基ヌクレオチドをもたらす。脱塩基ヌクレオチドは、核酸塩基を欠くヌクレオチドである。脱塩基ヌクレオチドは、糖および少なくとも１つのリン酸基を概して含有する。糖は、概してペントース糖、例えば、リボースおよびデオキシリボースである。脱塩基ヌクレオチドは、概して、脱塩基リボヌクレオチドまたは脱塩基デオキシリボヌクレオチドである。脱塩基ヌクレオチドは、概して、一リン酸エステル、二リン酸エステルまたは三リン酸エステルを含有する。リン酸エステルは、脱塩基ヌクレオチドの５’側に付着されていることもあり、または３’側に付着されていることもある。’
【０１３１】
当技術分野において公知のいずれの方法を用いて核酸塩基を選択的に除去してもよい。例えば、ある特定のＤＮＡ修復タンパク質、例えば、ヒトアルキルアデニンＤＮＡグリコシラーゼ（ｈＡＡＧ）は、３−メチルアデニン、７−メチルグアニン、１，Ｎ６−エテノアデニンおよびヒポキサンチンをヌクレオチドから選択的に除去することができる。また、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼを使用してｄＵＭＰを選択的に除去することができる。
【０１３２】
さらなるポリメラーゼステップ
別の好ましい実施形態では、修飾二本鎖ポリヌクレオチドの情報量を倍増させて、テンプレートポリヌクレオチドの特性評価を助長する。この例を図８に示す。方法は、好ましくは、（ｄ）修飾二本鎖ポリヌクレオチドの２本の鎖を分離し、それらの鎖をテンプレートとして使用して、少なくとも１つのヘアピンループによって連結された２本の相補鎖を各々が含む複数の適合二本鎖ポリヌクレオチドを形成するステップであって、各相補鎖が２つの相補配列を含む、ステップを含む。各相補鎖内の２つの相補配列の一方は、テンプレート二本鎖ポリヌクレオチドに由来する。ステップ（ｄ）は、分離前に、修飾二本鎖ポリヌクレオチドにおける相補鎖を連結する少なくとも１つのヘアピンループとは別のその修飾二本鎖ポリヌクレオチドの末端にヘアピンループを付着させることを概して含む。このヘアピンループは、好ましくは、修飾二本鎖ポリヌクレオチドの鎖を連結しない。ヘアピンは、ポリメラーゼの核形成点を形成することがある。修飾二本鎖ポリヌクレオチドの分離された鎖がテンプレートとして使用される場合、付着されたヘアピンループもテンプレートとして使用され、適合二本鎖ポリヌクレオチドの２本の相補鎖を連結する、すなわち、修飾二本鎖ポリヌクレオチドからのテンプレート鎖と、そのテンプレートから形成された新たな鎖とを連結する。
【０１３３】
ステップ（ｄ）は、上で論じた仕方のいずれで行ってもよい。例えば、ステップ（ｄ）は、ｐＨ、温度およびイオン強度のうちの１つまたは複数を上昇させることによって修飾二本鎖ポリヌクレオチドの２本の鎖を分離することを含むことがある。ステップ（ｄ）は、分離された鎖をポリメラーゼと接触させ、その結果、ポリメラーゼがそれらの鎖をテンプレートとして使用して複数の適合二本鎖ポリヌクレオチドを形成することを含むこともある。ステップ（ｄ）は、（ｉ）複数の分離された鎖を、それらの鎖内のヌクレオチドのすべてに相補的であるヌクレオチドのあらゆる可能な組み合わせを含むヌクレオチドオリゴマーの集団と、オリゴマーが鎖にハイブリダイズすることができる条件下で接触させること、および（ｉｉ）鎖にハイブリダイズするそれらのオリゴマーを一緒にライゲートして、複数の適合二本鎖ポリヌクレオチドを形成することを含むこともある。ステップ（ｄ）は、複数の修飾二本鎖ポリヌクレオチドをポリメラーゼと接触させ、その結果、ポリメラーゼが、同時に、修飾二本鎖ポリヌクレオチドの２本の鎖を分離し、それらの鎖をテンプレートとして使用して複数の適合二本鎖ポリヌクレオチドを形成することを含むこともある。上で論じた実施形態のいずれもステップ（ｄ）に当てはまる。例えば、ステップ（ｄ）は、テンプレート鎖内の１つまたは複数のヌクレオチド種を新たな鎖内の異なるヌクレオチド種と置き換えることを含むこともある。
【０１３４】
Ｙアダプター
各基質がリーダー配列を含まない場合、方法は、好ましくは、複数の修飾二本鎖ポリヌクレオチドのヘアピンループとは反対の末端にＹアダプターを付着させることをさらに含む。Ｙアダプターは、概してポリヌクレオチドアダプターである。それらのアダプターを上で論じたポリヌクレオチドのいずれから形成してもよい。Ｙアダプターは、概して、（ａ）二本鎖領域、および他方の末端に（ｂ）一本鎖領域または相補的でない領域を含む。Ｙアダプターは、一本鎖領域を含む場合、オーバーハングを有すると記述されることがある。Ｙアダプター内の非相補領域の存在はこのアダプターをＹ形にする。２本の鎖が、通常は、二本鎖部分とは異なり互いにハイブリダイズしないからである。Ｙアダプターは、下でより詳細に論じるように、１つまたは複数のアンカーを含むことがある。
【０１３５】
Ｙアダプターを修飾二本鎖ポリヌクレオチドにライゲートすることができる。当技術分野において公知のいずれの方法を用いてライゲーションを行ってもよい。例えば、リガーゼ、例えば、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、大腸菌（E. coli）ＤＮＡリガーゼ、Ｔａｑ  ＤＮＡリガーゼ、Ｔｍａ  ＤＮＡリガーゼおよび９ＯＮ  ＤＮＡリガーゼを使用して、Ｙアダプターをライゲートしてもよい。
【０１３６】
本発明の生成物
本発明は、テンプレートポリヌクレオチドを修飾するための二本鎖ＭｕＡ基質の集団であって、各基質がユニバーサルヌクレオチドの少なくとも１つのオーバーハングを含む集団も提供する。本発明は、テンプレートポリヌクレオチドを修飾するための二本鎖ＭｕＡ基質の集団であって、各基質が、（ｉ）少なくとも１つのオーバーハング、および（ｉｉ）少なくとも１つのオーバーハングを含む鎖とは反対の鎖内の少なくとも１つのヘアピンループを含む、集団も提供する。基質は、上で論じたもののいずれであってもよい。基質は、好ましくは、上で定義したような二本鎖部分を含む。二本鎖部分は、好ましくは、上で論じたような配列番号２６および２７を含む。二本鎖部分は、より好ましくは、上で論じたような配列番号２６および２８を含む。本発明の好ましい集団は、各基質が、一方の末端にオーバーハングをおよび他方の末端にヘアピンループを含むものである。
【０１３７】
本発明は、本発明の方法を用いて修飾された複数のポリヌクレオチドも提供する。複数のポリヌクレオチドは、上で論じた形態のいずれであってもよい。修飾二本鎖ポリヌクレオチドは、ヘアピンループによって連結されたテンプレートポリヌクレオチドの二本鎖断片を含む２本の相補鎖を含む。
【０１３８】
集団または複数は、単離されていることもあり、実質的に単離されていることもあり、精製されていることもあり、または実質的に精製されていることもある。集団または複数は、テンプレートポリヌクレオチド、脂質またはポアなどのいずれの他の成分も完全にない場合、単離または精製されている。集団または複数は、その所期の使用に干渉しないであろう担体または希釈剤と混合されている場合、実質的に単離されている。例えば、集団または複数は、１０％未満、５％未満、２％未満または１％未満の他の成分、例えば脂質またはポア、を含む形態で存在する場合、実質的に単離または実質的に精製されている。
【０１３９】
特性評価方法
本発明は、本発明の方法を用いて修飾された少なくとも１つのポリヌクレオチドを特性評価する方法も提供する。修飾ポリヌクレオチドを膜貫通ポアと、ポリヌクレオチドの少なくとも１本の鎖がポアを通って移動するように接触させる。少なく１本の鎖がポアに対して移動するときに１つまたは複数の測定値を取る。これらの測定値は、少なくとも１本の鎖の１つまたは複数の特性を示し、これによって修飾ポリヌクレオチドの特性評価が可能になる。
【０１４０】
本発明は、テンプレートポリヌクレオチドを特性評価する方法も提供する。本発明を用いてテンプレートポリヌクレオチドを修飾して、複数の修飾ポリヌクレオチドを生成する。各修飾ポリヌクレオチドを膜貫通ポアと、各ポリヌクレオチドの少なくとも１本の鎖がポアを通って移動するように接触させる。各ポリヌクレオチドがポアに対して移動するときに１つまたは複数の測定値を取る。これらの測定値は、各ポリヌクレオチドの１つまたは複数の特性を示し、これによって、テンプレートポリヌクレオチドを特性評価することが可能になる。
【０１４１】
好ましい実施形態では、修飾ポリヌクレオチド／各修飾ポリヌクレオチドの両方の鎖がポアを通って移動する。両方の鎖がポアを通って移動する場合、それら２本の鎖は、通常は分離されている。当技術分野において公知のいずれの方法を用いて２本の鎖を分離してもよい。例えば、ポリヌクレオチド結合タンパク質によって、または脱ハイブリダイゼーションに有利に働く条件を用いて、それらの鎖を分離してもよい（脱ハイブリダイゼーションに有利に働く条件の例としては、高温、高ｐＨ、ならびに水素結合または塩基対合を破壊することができる作用物質、例えばホルムアミドおよび尿素の添加が挙げられるが、これらに限定されない）。
【０１４２】
膜貫通ポア
膜貫通ポアは、ある程度膜を交差する構造である。膜貫通ポアは、印加された電位によって駆動される水和イオンが膜を横断して流れるまたは膜内を流れることを可能にする。膜貫通ポアは、概して膜全体を交差しており、したがって、水和イオンは、膜の一方の面から膜の他方の面に流れることがある。しかし、膜貫通ポアが膜を交差している必要はない。膜貫通ポアは、一方の末端が閉じられていることがある。例えば、ポアは、膜内のウェル、ギャップ、チャネル、溝またはスリットであることがあり、水和イオンは、それに沿って流れることもあり、またはその中に流入することもある。
【０１４３】
１もしくは複数の選択的に増幅されたプローブまたは１つもしくは複数の増幅産物は、好ましくは、（ｉ）プローブまたは増幅産物を膜貫通ポアと、プローブまたは増幅産物がポアを通って移動するように接触させるステップ、および（ｉｉ）プローブまたは増幅産物がポアを通って移動するときに、プローブまたは増幅産物の１つまたは複数の特性を示す１つまたは複数の測定値を取り、それによってプローブまたは増幅産物を特性評価するステップによって、特性評価される。
【０１４４】
いずれの膜貫通ポアを本発明において使用してもよい。ポアは、生物学的なものであってもよく、または人工的なものであってもよい。好適なポアとしては、タンパク質ポア、ポリヌクレオチドポアおよび固体ポアが挙げられるが、これらに限定されない。ポアは、ＤＮＡ折り紙ポア（Langecker et al., Science, 2012; 338: 932-936）であってもよい。
【０１４５】
膜貫通ポアは、好ましくは膜貫通タンパク質ポアである。
【０１４６】
本発明に従って使用するための膜貫通タンパク質ポアは、βバレルポアまたはαヘリックスバンドルポアに由来しうる。βバレルポアは、β鎖から形成されるバレルまたはチャネルを含む。好適なβバレルポアとしては、βポア形成毒素、例えばα−ヘモリシン、炭疽毒素およびロイコシジン、ならびに外膜タンパク質／細菌のポリン、例えば、スメグマ菌（Mycobacterium smegmatis）ポリン（Ｍｓｐ）、例えばＭｓｐＡ、ＭｓｐＢ、ＭｓｐＣまたはＭｓｐＤ、外膜ポリンＦ（ＯｍｐＦ）、外膜ポリンＧ（ＯｍｐＧ）、外膜ホスホリパーゼＡおよびナイセリア（Neisseria）オートトランスポーターリポタンパク質（ＮａｌＰ）ならびに他のポア、例えばライセニンが挙げられるが、これらに限定されない。αヘリックスバンドルポアは、αヘリックスから形成されるバレルまたはチャネルを含む。好適なαヘリックスバンドルポアとしては、内膜タンパク質およびα外膜タンパク質、例えば、ＷＺＡおよびＣｌｙＡ毒素が挙げられるが、これらに限定されない。膜貫通ポアは、ライセニンに由来しうる。ライセニンに由来する好適なポアは、国際出願番号ＰＣＴ／ＧＢ２０１３／０５０６６７（国際公開第２０１３／１５３３５９号パンフレットとして公開された）に開示されている。膜貫通ポアは、ＭｓｐＡなどのＭｓｐに由来することもあり、またはα−ヘモリシン（α−ＨＬ）に由来することもある。野生型α−ＨＬポアは、７つの同一の単量体またはサブユニットで形成されている（すなわち、このポアは七量体である）。α−ヘモリシン−ＮＨの１つの単量体またサブユニットの配列は、配列番号４で示される。
【０１４７】
膜貫通タンパク質ポアは、好ましくはＭｓｐに、好ましくはＭｓｐＡに由来する。そのようなポアは、オリゴマー性となり、Ｍｓｐに由来する７、８、９または１０個の単量体を概して含む。ポアは、同一の単量体を含むＭｓｐに由来するホモオリゴマー性ポアであることがある。あるいは、ポアは、他と異なる少なくとも１つの単量体を含むＭｓｐに由来するヘテロオリゴマー性ポアであることがある。好ましくは、ポアは、ＭｓｐＡまたはそのホモログもしくはパラログに由来する。
【０１４８】
Ｍｓｐに由来する単量体は、配列番号２で示される配列またはその変異体を概して含む。配列番号２は、ＭｓｐＡ単量体のＭＳ−（Ｂ１）８突然変異体である。これは、次の突然変異：Ｄ９０Ｎ、Ｄ９１Ｎ、Ｄ９３Ｎ、Ｄ１１８Ｒ、Ｄ１３４ＲおよびＥ１３９Ｋを含む。配列番号２の変異体は、配列番号２のものとは異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドであって、ポアを形成するその能力を保持するポリペプチドである。好適な変異体は、国際出願番号ＰＣＴ／ＧＢ２０１２／０５０３０１（国際公開第２０１２／１０７７７８号パンフレットとして公開された）および英国出願第１４０７８０９．１号（ＯＮＴ  ＩＰ  ０５７）明細書に開示されている。配列番号２の好ましい変異体は、Ｎ９３Ｄを含む。ポアを形成する変異体の能力は、当技術分野において公知の任意の方法を用いてアッセイすることができる。例えば、変異体を両親媒性層に他の適切なサブユニットとともに挿入してもよく、オリゴマー化してポアを形成するその能力を判定してもよい。両親媒性層などの膜にサブユニットを挿入する方法は、当技術分野において公知である。例えば、サブユニットを精製形態でトリブロック共重合体膜を含有する溶液に懸濁させてもよく、その結果、サブユニットは膜に分散し、膜と結合することによって挿入され、集合して機能性状態になる。あるいは、M.A. Holden, H. Bayley. J. Am. Chem.Soc.2005, 127, 6502-6503および国際出願番号ＰＣＴ／ＧＢ２００６／００１０５７（国際公開第２００６／１００４８４号パンフレットとして公開された）に記載されている「ピックアンドプレース」法を用いて、サブユニットを膜に直接挿入してもよい。
【０１４９】
配列番号２のアミノ酸配列の全長にわたって、変異体は、好ましくは、アミノ酸同一性に基づきその配列と少なくとも５０％相同であることになる。より好ましくは、変異体は、アミノ酸同一性に基づき、配列全体にわたって配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％およびより好ましくは少なくとも９５％、９７％または９９％相同であることがある。１００以上、例えば１２５、１５０、１７５または２００以上の連続するアミノ酸のストレッチにわたって、少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、９０％または９５％アミノ酸同一性（「確かな相同性」）があることがある。
【０１５０】
膜貫通タンパク質ポアなどの、本明細書に記載するタンパク質のいずれも、合成的に作製してもよく、または組み換え手段によって作製してもよい。例えば、ポアをインビトロ翻訳および転写（ＩＶＴＴ）によって合成してもよい。ポアのアミノ酸配列は、天然に存在しないアミノ酸を含むように修飾されることもあり、またはタンパク質の安定性を増すように修飾されることもある。タンパク質が合成手段によって生産される場合、そのようなアミノ酸を生産中に導入してもよい。合成または組み換え生産のいずれかの後にポアを改変してもよい。
【０１５１】
特性評価
方法は、修飾またはテンプレートポリヌクレオチドの２、３、４または５以上の特性を測定するステップを含むことがある。１つまたは複数の特性は、好ましくは、（ｉ）ポリヌクレオチドの長さ、（ｉｉ）ポリヌクレオチドの同一性、（ｉｉｉ）ポリヌクレオチドの配列、（ｉｖ）ポリヌクレオチドの二次構造、および（ｖ）ポリヌクレオチドが修飾されているか否かから選択される。｛ｉ｝、｛ｉｉ｝、｛ｉｉｉ｝、｛ｉｖ｝、｛ｖ｝、｛ｉ、ｉｉ｝、｛ｉ、ｉｉｉ｝、｛ｉ、ｉｖ｝、｛ｉ、ｖ｝、｛ｉｉ、ｉｉｉ｝、｛ｉｉ、ｉｖ｝、｛ｉｉ、ｖ｝、｛ｉｉｉ、ｉｖ｝、｛ｉｉｉ、ｖ｝、｛ｉｖ、ｖ｝、｛ｉ、ｉｉ、ｉｉｉ｝、｛ｉ、ｉｉ、ｉｖ｝、｛ｉ、ｉｉ、ｖ｝、｛ｉ、ｉｉｉ、ｉｖ｝、｛ｉ、ｉｉｉ、ｖ｝、｛ｉ、ｉｖ、ｖ｝、｛ｉｉ、ｉｉｉ、ｉｖ｝、｛ｉｉ、ｉｉｉ、ｖ｝、｛ｉｉ、ｉｖ、ｖ｝、｛ｉｉｉ、ｉｖ、ｖ｝、｛ｉ、ｉｉ、ｉｉｉ、ｉｖ｝、｛ｉ、ｉｉ、ｉｉｉ、ｖ｝、｛ｉ、ｉｉ、ｉｖ、ｖ｝、｛ｉ、ｉｉｉ、ｉｖ、ｖ｝、｛ｉｉ、ｉｉｉ、ｉｖ、ｖ｝または｛ｉ、ｉｉ、ｉｉｉ、ｉｖ、ｖ｝などの、（ｉ）〜（ｖ）のいずれの組み合わせを、本発明に従って測定してもよい。上に列挙したあらゆる組み合わせを含む（ｉ）〜（ｖ）の様々な組み合わせを、第二のポリヌクレオチドと比較して第一のポリヌクレオチドについて測定することができる。
【０１５２】
（ｉ）については、ポリヌクレオチドの長さは、例えば、ポリヌクレオチドとポアとの相互作用数、またはポリヌクレオチドとポアとの相互作用の継続時間を判定することによって測定することができる。
【０１５３】
（ｉｉ）については、ポリヌクレオチドの同一性は、いくつかの方法で測定することができる。ポリヌクレオチドの同一性は、ポリヌクレオチドの配列測定とともに測定されることもあり、またはポリヌクレオチドの配列測定なしで測定されることもある。前者は容易であり、ポリヌクレオチドをシークエンシングし、それによって同定する。後者は、いくつかの方法で行うことができる。例えば、ポリヌクレオチド内の特定のモチーフの存在が（ポリヌクレオチドの残存配列を測定せずに）測定されることがある。あるいは、方法の中で特定の電気および／または光シグナルを測定することによって、ポリヌクレオチドを特定の源に由来すると同定することができる。
【０１５４】
（ｉｉｉ）については、ポリヌクレオチドの配列を以前に記載されているように判定することができる。好適なシークエンシング方法、特に電気的測定を用いるものは、Stoddart D et al., Proc Natl Acad Sci, 12;106(19):7702-7、Lieberman KR et al, J Am Chem Soc.2010;132(50):17961-72、および国際出願ＷＯ２０００／２８３１２に記載されている。
【０１５５】
（ｉｖ）については、二次構造を様々な方法で測定することができる。例えば、方法が電気的測定を含む場合、滞留時間の変化、またはポアを通って流れる電流の変化を利用して、二次構造が測定されることがある。これによって、一本鎖ポリヌクレオチド領域と二本鎖ポリヌクレオチド領域を区別することが可能になる。
【０１５６】
（ｖ）については、任意の修飾の存在または不在を測定することができる。方法は、ポリヌクレオチドがメチル化によって、酸化によって、損傷によって、１つもしくは複数のタンパク質で、または１つもしくは複数の標識、タグもしくはスペーサーで修飾されているか否かを判定するステップを好ましくは含む。特異的修飾は、ポアとの特異的相互作用をもたらすことになり、下で説明する方法を用いてそのような特異的相互作用を測定することができる。例えば、メチルシトシンとシトシンとを、各ヌクレオチドとのその相互作用中にポアを通って流れる電流に基づいて区別してもよい。
【０１５７】
ポリヌクレオチドを膜貫通ポアと接触させる。ポアは、通常は膜内に存在する。好適な膜は、下で論じる。ポアが膜内に存在する膜／ポア系の調査に適しているいずれの装置を使用して方法を行ってもよい。膜貫通ポア検知に適しているいずれの装置を使用して方法を行ってもよい。例えば、装置は、水溶液を含むチャンバーと、該チャンバーを２区画に分ける遮断壁とを備えている。遮断壁は、ポアを含有する膜を形成する開口部を概して有する。あるいは、遮断壁は、ポアが存在する膜を形成する。
【０１５８】
国際出願番号ＰＣＴ／ＧＢ０８／０００５６２（国際公開第２００８／１０２１２０号パンフレット）に記載されている装置を使用して方法を行ってもよい。
【０１５９】
様々な異なるタイプの測定を行うことができる。この測定は、限定ではいが、電気的測定および光学的測定を含む。可能な電気的測定としては、電流測定、インピーダンス測定、トンネル効果測定（Ivanov AP et al., Nano Lett.2011 Jan 12; 11(1):279-85）、およびＦＥＴ測定（国際出願ＷＯ２００５／１２４８８８）が挙げられる。光学的測定は電気的測定と組み合わされることがある（Soni GV et al., Rev Sci Instrum.2010 Jan; 81(1):014301）。測定は、膜貫通電流測定、例えば、ポアを通って流れるイオン電流の測定であってもよい。
【０１６０】
電気的測定は、Stoddart D et al., Proc Natl Acad Sci, 12;106(19):7702-7、Lieberman KR et al, J Am Chem Soc.2010;132(50):17961-72、および国際出願ＷＯ２０００／２８３１２に記載されているような、標準的なシングルチャンネル記録装置を使用して行ってもよい。あるいは、電気的測定は、例えば、国際出願ＷＯ２００９／０７７７３４および国際出願ＷＯ２０１１／０６７５５９に記載されているような、マルチチャンネルシステムを使用して行ってもよい。
【０１６１】
方法は、好ましくは、膜を横断して印加される電位を用いて行われる。印加される電位は、電圧電位であってもよい。あるいは、印加される電位は、化学的電位であってもよい。この方法の例は、両親媒性層などの膜を横断する塩勾配の使用である。塩勾配は、Holden et al., J Am Chem Soc.2007 Jul 11; 129(27):8650-5に開示されている。場合によっては、ポリヌクレオチドがポアに対して移動するときにポアを通過する電流を用いて、ポリヌクレオチドの配列を推定または判定する。これは鎖シークエンシングである。
【０１６２】
方法は、ポリヌクレオチドがポアに対して移動するときポアを通過する電流を測定するステップを含むことがある。したがって、方法で使用される装置は、電位を印加することができ、膜およびポアを横断する電気シグナルを測定することができる電気回路も含むことがある。方法をパッチクランプまたは電圧クランプを用いて行ってもよい。方法は、好ましくは電圧クランプの使用を含む。
【０１６３】
本発明の方法は、ポリヌクレオチドがポアに対して移動するときポアを通過する電流を測定するステップを含むことがある。膜貫通タンパク質ポアを通るイオン電流の測定に好適な条件は、当技術分野において公知であり、実施例において開示する。方法は、概して、電圧を膜およびポアを横断して印加して行われる。使用される電圧は、概して、＋５Ｖ〜−５Ｖ、例えば、＋４Ｖ〜−４Ｖ、＋３Ｖ〜−３Ｖ、または＋２Ｖ〜−２Ｖである。使用される電圧は、概して、−６００ｍＶ〜＋６００ｍＶまたは−４００ｍＶ〜＋４００ｍＶである。使用される電圧は、好ましくは、−４００ｍＶ、−３００ｍＶ、−２００ｍＶ、−１５０ｍＶ、−１００ｍＶ、−５０ｍＶ、−２０ｍＶおよび０ｍＶから選択される下限と＋１０ｍＶ、＋２０ｍＶ、＋５０ｍＶ、＋１００ｍＶ、＋１５０ｍＶ、＋２００ｍＶ、＋３００ｍＶおよび＋４００ｍＶから独立して選択される上限とを有する範囲である。使用される電圧は、より好ましくは、１００ｍＶ〜２４０ｍＶの範囲、最も好ましくは１２０ｍＶ〜２２０ｍＶの範囲である。増加した印加電位を使用することによって、ポアによる異なるヌクレオチド間の識別を増すことが可能である。
【０１６４】
方法は、金属塩、例えばアルカリ金属塩、ハロゲン化物塩、例えば塩化物塩、例えばアルカリ金属塩化物塩などの、任意の電荷担体の存在下で概して行われる。電荷担体としては、イオン性液体または有機塩、例えば塩化テトラメチルアンモニウム、塩化トリメチルフェニルアンモニウム、塩化フェニルトリメチルアンモニウムまたは塩化１−エチル−３−メチルイミダゾリウムを挙げることができる。上で論じた例示的装置において、塩は、チャンバー内の水溶液中に存在する。塩化カリウム（ＫＣｌ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化セシウム（ＣｓＣｌ）、またはフェロシアン化カリウムとフェリシアン化カリウムの混合物が概して使用される。ＫＣｌ、ＮａＣｌ、およびフェロシアン化カリウムとフェリシアン化カリウムの混合物が好ましい。電荷担体は、膜に対して非対称であることがある。例えば、電荷担体のタイプおよび／または濃度は膜の両側で異なることがある。
【０１６５】
塩濃度は、飽和時のものでありうる。塩濃度は、３Ｍ以下でありうるが、通常は０．１〜２．５Ｍ、０．３〜１．９Ｍ、０．５〜１．８Ｍ、０．７〜１．７Ｍ、０．９〜１．６Ｍ、または１Ｍ〜１．４Ｍである。塩濃度は、好ましくは、１５０ｍＭ〜１Ｍである。方法は、好ましくは、少なくとも０．３Ｍ、例えば、少なくとも０．４Ｍ、少なくとも０．５Ｍ、少なくとも０．６Ｍ、少なくとも０．８Ｍ、少なくとも１．０Ｍ、少なくとも１．５Ｍ、少なくとも２．０Ｍ、少なくとも２．５Ｍ、または少なくとも３．０Ｍの塩濃度を用いて行われる。高い塩濃度は、高いシグナル対ノイズ比をもたらし、ヌクレオチドの存在を示す電流を、正常電流変動のバックグラウンドと対照して同定することを可能にする。
【０１６６】
方法は、緩衝液の存在下で概して行われる。上で論じた例示的装置において、緩衝液は、チャンバー内の水溶液中に存在する。いずれの緩衝液を本発明の方法において使用してもよい。通常は、緩衝液はリン酸緩衝液である。他の好適な緩衝液は、ＨＥＰＥＳおよびＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液である。方法は、４．０〜１２．０、４．５〜１０．０、５．０〜９．０、５．５〜８．８、６．０〜８．７、または７．０〜８．８、または７．５〜８．５のｐＨで概して行われる。使用されるｐＨは、好ましくは約７．５である。
【０１６７】
方法は、０℃〜１００℃、１５℃〜９５℃、１６℃〜９０℃、１７℃〜８５℃、１８℃〜８０℃、１９℃〜７０℃、または２０℃〜６０℃で行われることがある。方法は、概して室温で行われる。方法は、場合により、酵素機能を支援する温度、例えば、約３７℃で行われる。
【０１６８】
ポリヌクレオチド結合タンパク質
方法は、ポリヌクレオチド／各ポリヌクレオチドを、ポリヌクレオチド結合タンパク質と、タンパク質がポリヌクレオチド／各ポリヌクレオチドの少なくとも１本の鎖のポアを通る移動を制御するように、接触させるステップを好ましくは含む。
【０１６９】
より好ましくは、方法は、（ａ）ポリヌクレオチド／各ポリヌクレオチドをポアおよびポリヌクレオチド結合タンパク質と、タンパク質がポリヌクレオチド／各ポリヌクレオチドの少なくとも１本の鎖のポアを通る移動を制御するように接触させるステップ、および（ｂ）ポリヌクレオチド／各ポリヌクレオチドがポアに対して移動するときに、ポリヌクレオチド／各ポリヌクレオチドの１つまたは複数の特性を示す１つまたは複数の測定値を取り、それによって修飾またはテンプレートポリヌクレオチドを特性評価するステップを含む。
【０１７０】
ポリヌクレオチド結合タンパク質は、ポリヌクレオチドと結合することができ、かつポアを通るその移動を制御することができる、いずれのタンパク質であってもよい。当技術分野においてタンパク質がポリヌクレオチドと結合するか否かを判定することは容易である。タンパク質は、概して、ポリヌクレオチドと相互作用し、ポリヌクレオチドの少なくとも１つの特性を修飾する。タンパク質は、ポリヌクレオチドを切断して個々のヌクレオチドまたはより短いヌクレオチド鎖、例えばジもしくはトリヌクレオチドを形成することによって、ポリヌクレオチドを修飾することがある。タンパク質は、ポリヌクレオチドを配向させることによって、または特定の位置に移動させること、すなわち、その移動を制御することによって、ポリヌクレオチドを修飾することがある。
【０１７１】
ポリヌクレオチド結合タンパク質は、好ましくはポリヌクレオチドハンドリング酵素（polynucleotide handling enzyme）に由来する。ポリヌクレオチドハンドリング酵素は、ポリヌクレオチドと相互作用してポリヌクレオチドの少なくとも１つの特性を修飾することができるポリペプチドである。この酵素は、ポリヌクレオチドを切断して個々のヌクレオチドまたはより短いヌクレオチド鎖、例えばジもしくはトリヌクレオチドを形成することによって、ポリヌクレオチドを修飾することがある。この酵素は、ポリヌクレオチドを配向させることによって、または特定の位置に移動させることによって、ポリヌクレオチドを修飾することがある。ポリヌクレオチドハンドリング酵素は、ポリヌクレオチドに結合することができ、かつポアを通るその移動を制御することができるのであれば、酵素活性を示す必要はない。例えば、酵素は、その酵素活性を除去するように修飾されることもあり、または酵素として作用することを妨げる条件下で使用されることもある。そのような条件は、下でより詳細に論じる。
【０１７２】
ポリヌクレオチドハンドリング酵素は、好ましくは、核酸分解酵素に由来する。酵素の構築物に使用されるポリヌクレオチドハンドリング酵素は、より好ましくは、酵素分類（ＥＣ）群３．１．１１、３．１．１３、３．１．１４、３．１．１５、３．１．１６、３．１．２１、３．１．２２、３．１．２５、３．１．２６、３．１．２７、３．１．３０および３．１．３１のいずれかのメンバーに由来する。酵素は、国際出願番号ＰＣＴ／ＧＢ１０／０００１３３（国際公開第２０１０／０８６６０３号パンフレットとして公開された）に開示されているもののいずれかであってもよい。
【０１７３】
好ましい酵素は、ポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼ、ヘリカーゼおよびトポイソメラーゼ、例えばジャイレースである。好適な酵素としては、大腸菌（E. coli）からのエキソヌクレアーゼＩ（配列番号１１）、大腸菌（E. coli）からのエキソヌクレアーゼＩＩＩ酵素（配列番号１３）、サーマス・サーモフィラス（T. thermophilus）からのＲｅｃＪ（配列番号１５）、およびバクテリオファージλエキソヌクレアーゼ（配列番号１７）、ＴａｔＤエキソヌクレアーゼならびにこれらの変異体が挙げられるが、それらに限定されない。配列番号１５で示される配列またはその変異体を含む３つのサブユニットは相互作用して三量体エキソヌクレアーゼを形成する。ポリメラーゼは、ＰｙｒｏＰｈａｇｅ（登録商標）３１７３  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｌｕｃｉｇｅｎ（登録商標）Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから市販されている）、ＳＤポリメラーゼ（Ｂｉｏｒｏｎ（登録商標）から市販されている）またはそれらの変異体であることがある。酵素は、好ましくはＰｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼ（配列番号９）またはその変異体である。トポイソメラーゼは、好ましくは、部分分類（ＥＣ）群５．９９．１．２および５．９９．１．３のいずれかのメンバーである。
【０１７４】
酵素は、最も好ましくは、ヘリカーゼ、例えば、Ｈｅｌ３０８  Ｍｂｕ（配列番号１８）、Ｈｅｌ３０８  Ｃｙｓ（配列番号１９）、Ｈｅｌ３０８  Ｔｇａ（配列番号２０）、Ｈｅｌ３０８  Ｍｈｕ（配列番号２１）、ＴｒａＩ  Ｅｃｏ（配列番号２２）、ＸＰＤ  Ｍｂｕ（配列番号２３）またはその変異体に由来する。いずれのヘリカーゼを本発明において使用してもよい。ヘリカーゼは、Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼ、ＲｅｃＤヘリカーゼ、例えばＴｒａＩヘリカーゼもしくはＴｒｗＣヘリカーゼ、ＸＰＤヘリカーゼ、またはＤｄａヘリカーゼであってもよく、あるいはこれらのヘリカーゼに由来してもよい。ヘリカーゼは、国際出願番号ＰＣＴ／ＧＢ２０１２／０５２５７９（国際公開第２０１３／０５７４９５号パンフレットとして公開された）、ＰＣＴ／ＧＢ２０１２／０５３２７４（国際公開第２０１３／０９８５６２号パンフレットとして公開された）、ＰＣＴ／ＧＢ２０１２／０５３２７３（国際公開第２０１３０９８５６１号パンフレットとして公開された）、ＰＣＴ／ＧＢ２０１３／０５１９２５（国際公開第２０１４／０１３２６０号パンフレットとして公開された）、ＰＣＴ／ＧＢ２０１３／０５１９２４（国際公開第２０１４／０１３２５９号パンフレットとして公開された）ＰＣＴ／ＧＢ２０１３／０５１９２８（国際公開第２０１４／０１３２６２号パンフレットとして公開された）、ならびにＰＣＴ／ＧＢ２０１４／０５２７３６に開示されている、ヘリカーゼ、修飾ヘリカーゼまたはヘリカーゼ構築物のいずれであってもよい。
【０１７５】
好ましくは、ヘリカーゼは、配列番号２５（Ｔｒｗｃ  Ｃｂａ）で示される配列もしくはその変異体、配列番号１８（Ｈｅｌ３０８  Ｍｂｕ）で示される配列もしくはその変異体、または配列番号２４（Ｄｄａ）で示される配列もしくはその変異体を含む。変異体は、膜貫通ポアについて下で論じる点のいずれかにおいてネイティブ配列と異なることがある。配列番号２４の好ましい変異体は、（ａ）Ｅ９４ＣおよびＡ３６０Ｃ、または（ｂ）Ｅ９４Ｃ、Ａ３６０Ｃ、Ｃ１０９およびＣ１３６Ａおよび次いで場合により（ΔＭ１）Ｇ１Ｇ２（すなわち、Ｍ１の欠失、次いでＧ１およびＧ２付加）を含む。
【０１７６】
鎖シークエンシングでは、ポリヌクレオチドは、印加電位に伴ってまたは反発してポアを通って移行される。二本鎖ポリヌクレオチドに対して漸進的にまたは前進的に作用するエキソヌクレアーゼは、印加電位のもとで残りの１本の鎖を送り込むためにポアのシス側で使用することができ、または逆転電位のもとでトランス側で使用することができる。同様に、二本鎖ＤＮＡを巻き戻すヘリカーゼも、同じ要領で使用することができる。ポリメラーゼを使用してもよい。印加電位に逆らった鎖移行を要するシークエンシング応用の可能性もあるが、逆転電位のもとではまたは電位のない状態ではＤＮＡが酵素によって最初に「捕らえらる」はずである。その場合、結合後に電位が切り替わると、鎖は、ポアを通ってシスからトランスへと進み、伸長された高次構造で電流によって保持される。一本鎖ＤＮＡエキソヌクレアーゼまたは一本鎖ＤＮＡ依存性ポリメラーゼは、分子モーターとして作用して、移行されたばかりの一本鎖を印加電位に反発してトランスからシスへ、制御された段階的様式で、ポアを通って引き戻すことができる。
【０１７７】
いずれのヘリカーゼを方法に使用してもよい。ヘリカーゼは、ポアに対して２つのモードで作用しうる。第一に、方法は、好ましくは、ヘリカーゼを使用して、ヘリカーゼがポリヌクレオチドを印加された電圧の結果として生ずる場に伴ってポアを通って移動させるように行われる。このモードでは、ポリヌクレオチドの５’末端が先ずポア内に捕捉され、ヘリカーゼがそのポリヌクレオチドをポアの中に、そのポリヌクレオチドが最終的に膜のトランス側に移行するまで場に伴ってそのポリヌクレオチドをポアに通すように移動させる。あるいは、方法は、好ましくは、ヘリカーゼがポリヌクレオチドを印加された電圧の結果として生ずる場に反発してポアを通って移動させるように行われる。このモードでは、ポリヌクレオチドの３’末端が先ずポア内に捕捉され、ヘリカーゼがそのポリヌクレオチドを、そのポリヌクレオチドが最終的に膜のシス側に押し戻されるまで印加された場に反発してポアから引き出されるように、ポアを通って移動させる。
【０１７８】
ヘリカーゼおよび分子ブレーキ
好ましい実施形態において、方法は、
（ｉ）１つまたは複数のヘリカーゼおよび１つまたは複数の分子ブレーキが付着されているポリヌクレオチド／各ポリヌクレオチドを用意するステップ、
（ｂ）ポリヌクレオチド／各ポリヌクレオチドを膜貫通ポアと接触させ、１つまたは複数のヘリカーゼおよび１つまたは複数の分子ブレーキが集められ、両方が、ポアを通るポリヌクレオチド／各ポリヌクレオチドの少なくとも１つの鎖の移動を制御するように、ポア全域に電位を印加するステップ、および
（ｃ）ポリヌクレオチド／各ポリヌクレオチドがポアに対して移動するときに、ポリヌクレオチドの１つまたは複数の特性を示す１つまたは複数の測定値を取り、それによって修飾またはテンプレートポリヌクレオチドを特性評価するステップ
を含む。
【０１７９】
このタイプの方法は、国際出願番号ＰＣＴ／ＧＢ２０１４／０５２７３７において詳細に論じられている。
【０１８０】
スペーサー
国際出願番号ＰＣＴ／ＧＢ２０１４／０５０１７５（国際公開第２０１４／１３５８３８号パンフレットとして公開された）において論じられているように１つまたは複数のヘリカーゼを１つまたは複数のスペーサーで停止させてもよい。国際出願に開示されている１つまたは複数のヘリカーゼおよび１つまたは複数のスペーサーのいずれの配置を本発明において使用してもよい。
【０１８１】
ポリヌクレオチドの一部がポアに侵入し、印加された電位の結果として生じる場に沿ってポアを通って移動する場合、１つまたは複数のヘリカーゼは、ポリヌクレオチドがポアを通って移動するとき、ポアによってスペーサーを超えて移動される。これは、（１つまたは複数のスペーサーを含む）ポリヌクレオチドがポアを通って移動し、１つまたは複数のヘリカーゼがポアの上部に残存するためである。
【０１８２】
１つまたは複数のスペーサーは、好ましくは、ポリヌクレオチドの一部であり、例えば、スペーサーはポリヌクレオチド配列に割り込んでいる。１つまたは複数のスペーサーは、好ましくは、ポリヌクレオチドにハイブリダイズされた１つまたは複数の遮断分子、例えばスピードバンプの一部ではない。
【０１８３】
ポリヌクレオチド内にいずれの数のスペーサーがあってもよく、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上のスペーサーがあってもよい。好ましくは、ポリヌクレオチド内に２、４または６個のスペーサーがある。１つまたは複数のスペーサーは、好ましくは、Ｙアダプターまたはリーダー配列内にある。ポリヌクレオチドの異なる領域内に１つまたは複数のスペーサーがあることもあり、例えば、Ｙアダプターおよび／またはヘアピンループアダプター内に１つまたは複数のスペーサーがあることもある。
【０１８４】
１つまたは複数のスペーサーは各々、１つまたは複数のヘリカーゼが活性モードであっても克服できないエネルギー障壁をもたらす。１つまたは複数のスペーサーは、（例えばポリヌクレオチド中のヌクレオチドから塩基を除去することにより）ヘリカーゼの牽引を低減させることによって、または（例えば嵩高い化学基を使用して）１つもしくは複数のヘリカーゼの移動を物理的に遮断することによって、１つまたは複数のヘリカーゼを停止させることがある。
【０１８５】
１つまたは複数のスペーサーは、１つまたは複数のヘリカーゼを停止させる、いずれの分子、または分子の組み合わせを含んでもよい。１つまたは複数のスペーサーは、１つまたは複数のヘリカーゼがポリヌクレオチドに沿って移動することを防止する、いずれの分子、または分子の組み合わせを含んでもよい。１つまたは複数のヘリカーゼが、膜貫通ポアおよび印加電位の不在下で１つまたは複数のスペーサーで停止されるか否かを判定することは容易である。例えば、スペーサーを超えて移動し、ＤＮＡの相補鎖を置き換えるヘリカーゼの能力を、ＰＡＧＥによって測定することができる。
【０１８６】
１つまたは複数のスペーサーは、重合体などの直鎖状分子を概して含む。１つまたは複数のスペーサーは、ポリヌクレオチドとは異なる構造を概して有する。例えば、ポリヌクレオチドがＤＮＡである場合、１つまたは複数のスペーサーは概してＤＮＡではない。特に、ポリヌクレオチドが、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）である場合、１つまたは複数のスペーサーは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、グリセロール核酸（ＧＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、またはヌクレオチド側鎖を有する合成重合体を好ましくは含む。１つまたは複数のスペーサーは、１つまたは複数のヌクレオチドをポリヌクレオチドと反対方向で含むことがある。例えば、ポリヌクレオチドが５’から３’方向である場合、１つまたは複数のスペーサーは、１つまたは複数のヌクレオチドを３’から５’方向で含むことがある。ヌクレオチドは、上で論じたもののいずれであってもよい。
【０１８７】
１つまたは複数のヘリカーゼは、各直鎖状分子スペーサーによって（すなわちそれらの前で）または各直鎖状分子スペーサーで停止されることがある。直鎖状分子スペーサーが使用される場合、ポリヌクレオチドには、１つまたは複数のヘリカーゼが超えて移動されることになる各スペーサーの末端に隣接したポリヌクレオチドの二本鎖領域が好ましくは備えられる。直鎖状分子スペーサーが使用される場合、ポリヌクレオチドには、１つまたは複数のヘリカーゼが超えて移動されることになる末端とは反対側の各スペーサーの末端に遮断分子が好ましくは備えられる。これは、１つまたは複数のヘリカーゼが各スペーサーで停止したままでいることを確実にするのに役立ちうる。それは、１つまたは複数のヘリカーゼを、該ヘリカーゼが溶液に拡散する場合、ポリヌクレオチド上に保持することに役立つこともある。遮断分子は、１つまたは複数のヘリカーゼを物理的に停止させる、下で論じる化学基のいずれであってもよい。遮断分子は、ポリヌクレオチドの二本鎖領域であってもよい。遮断分子は、ＢＮＡであってもよい。
【０１８８】
方法は、２つ以上のヘリカーゼをスペーサーを超えて移動させることに関わることがある。そのような場合、スペーサーの長さを概して増加させて、ポアおよび印加電位の不在下で後従ヘリカーゼがスペーサーを超えて先導ヘリカーゼを押さないようにする。方法が、１つまたは複数のスペーサーを超えて２つ以上のヘリカーゼを移動させることに関わる場合、上で論じたスペーサー長は、少なくとも１．５倍、例えば２倍、２．５倍または３倍増加されることがある。例えば、方法が、１つまたは複数のスペーサーを超えて２つ以上のヘリカーゼを移動させることに関わる場合、スペーサー長は、１．５倍、２倍、２．５倍または３倍増加されることがある。
【０１８９】
膜
本発明において使用されるポアは、膜内に存在することがある。本発明の方法では、概してポリヌクレオチドを膜内のポアと接触させる。いずれの膜を本発明に従って使用してもよい。好適な膜は、当技術分野において周知である。膜は、好ましくは両親媒性層である。両親媒性層は、親水性と親油性の両方を有する両親媒性分子、例えばリン脂質から形成される層である。両親媒性分子は、合成のものであってもよく、または天然に存在するものであってもよい。天然に存在しない両親媒性物質、および単層を形成する両親媒性物質は、当技術分野において公知であり、例えば、ブロック共重合体を含む（Gonzalez-Perez et al., Langmuir, 2009, 25, 10447-10450）。ブロック共重合体は、２つ以上の単量体サブユニットが一緒に重合されて単一高分子鎖を作っている高分子材料である。ブロック共重合体は、各単量体サブユニットが一因となる特性を概して有する。しかし、ブロック共重合体は、個々のサブユニットから形成された重合体が有さない固有の特性を有することがある。ブロック共重合体は、単量体サブユニットの１つが疎水性（すなわち親油性）であるが他のサブユニットは水性媒体中にあるとき親水性であるように、工学的に操作することができる。この場合、ブロック共重合体は、両親媒性を有することがあり、生体膜を模倣する構造を形成することがある。ブロック共重合体は、（２つの単量体サブユニットからなる）ジブロックであることがあるが、２つより多くの単量体サブユニットから、両親媒性物質として挙動するより複雑な配置を形成するように、構築されることもある。共重合体は、トリブロック、テトラブロックまたはペンタブロック共重合体であることがある。膜は、好ましくは、トリブロック共重合体膜である。
【０１９０】
膜は、最も好ましくは、国際出願番号ＰＣＴ／ＧＢ２０１３／０５２７６６またはＰＣＴ／ＧＢ２０１３／０５２７６７において開示されている膜の１つである。
【０１９１】
両親媒性分子は、ポリヌクレオチドのカップリングを助長するように化学的に修飾されるまたは官能化されることがある。
【０１９２】
カップリング
修飾ポリヌクレオチド／各修飾ポリヌクレオチドは、好ましくは、ポアを含む膜とカップリングされる。方法は、ポアを含む膜にポリヌクレオチド／各ポリヌクレオチドをカップリングするステップを含むことがある。ポリヌクレオチドは、好ましくは、１つまたは複数のアンカーを使用して膜とカップリングされる。いずれの公知の方法を用いてポリヌクレオチドを膜とカップリングしてもよい。
【０１９３】
各アンカーは、ポリヌクレオチドとカップリング（または結合）する基、および膜とカップリング（または結合）する基を含む。各アンカーは、ポリヌクレオチドおよび／または膜と共有結合でカップリング（または結合）することがある。ポリヌクレオチドは、好ましくは、Ｙアダプターもしくはリーダー配列および／またはヘアピンループを使用して膜にカップリングされる。
【０１９４】
２、３、４以上のアンカーなどのいずれの数のアンカーを使用して、ポリヌクレオチドを膜とカップリングしてもよい。例えば、各々のアンカーがポリヌクレオチドおよび膜の両方と別々にカップリング（または結合）する、２つのアンカーを使用して、１つのポリヌクレオチドを膜とカップリングしてもよい。
【０１９５】
１つまたは複数のアンカーは、１つもしくは複数のヘリカーゼおよび／または１つもしくは複数の分子ブレーキを含むことがある。
【０１９６】
膜が、両親媒性層、例えば、共重合体膜または脂質二重層である場合、１つまたは複数のアンカーは、好ましくは、膜中に存在するポリペプチドアンカー、および／または膜中に存在する疎水性アンカーを含む。疎水性アンカーは、好ましくは、脂質、脂肪酸、ステロール、カーボンナノチューブ、ポリペプチド、タンパク質またはアミノ酸、例えばコレステロール、パルミチン酸エステルまたはトコフェロールである。好ましい実施形態において、１つまたは複数のアンカーはポアではない。
【０１９７】
膜の成分、例えば、両親媒性分子、共重合体または脂質は、１つまたは複数のアンカーを形成するように化学的に修飾されるまたは官能化されることがある。好適な化学的修飾、および膜の成分を官能化する好適な方法の例は、下でより詳細に論じる。膜成分の任意の比率、例えば、少なくとも０．０１％、少なくとも０．１％、少なくとも１％、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％または１００％を官能化してもよい。
【０１９８】
ポリヌクレオチドを膜に直接カップリングしてもよい。ポリヌクレオチドを膜とカップリングするために使用される１つまたは複数のアンカーは、好ましくはリンカーを含む。１つまたは複数のアンカーは、１つまたは複数、例えば２、３、４以上のリンカーを含むことがある。１つのリンカーを使用して、１つより多く、例えば２、３、４以上のポリヌクレオチドを膜とカップリングしてもよい。
【０１９９】
好ましいリンカーとしては、重合体、例えばポリヌクレオチド、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、多糖類およびポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。これらのリンカーは、直鎖状であってもよく、分岐状であってもよく、または環状であってもよい。例えば、リンカーは、環状ポリヌクレオチドであることがある。ポリヌクレオチドは、環状ポリヌクレオチドリンカーにおける相補配列にハイブリダイズすることがある。
【０２００】
下で論じるシークエンシング実施形態ではリンカーの使用が好ましい。ポリヌクレオチドが、ポアと相互作用しているときにはアンカップリングしない（すなわち、ステップ（ｂ）でも（ｅ）でもアンカップリングしない）という意味で永続的に膜と直接カップリングされている場合には、膜とポアの間の距離のためシークエンシング実行をポリヌクレオチドの末端まで継続することができないので、一部の配列データが失われることになる。リンカーを使用する場合には、ポリヌクレオチドを完了まで処理することができる。
【０２０１】
カップリングは、永続的または安定性であることがある。言い換えれば、カップリングは、ポリヌクレオチドが、ポアと相互作用すると、膜とカップリングされたままであるようなカップリングであることがある。
【０２０２】
カップリングは、一時的であることがある。言い換えれば、カップリングは、ポリヌクレオチドが、ポアと相互作用すると、膜から分離されうるようなカップリングであることがある。
【０２０３】
好適なカップリング方法は、国際出願番号ＰＣＴ／ＧＢ１２／０５１１９１（国際公開第２０１２／１６４２７０号パンフレットとして公開された）および英国出願第１４０６１５５．０号明細書に開示されている。
【０２０４】
アンカップリング
本発明の方法は、複数の修飾二本鎖ポリヌクレオチドの特性評価および少なくとも第一の修飾二本鎖ポリヌクレオチドのアンカップリングを含むことがある。
【０２０５】
好ましい実施形態において、本発明は、２つ以上の修飾二本鎖ポリヌクレオチドの特性評価を含む。この方法は、
（ａ）第一の試料中の第一の修飾二本鎖ポリヌクレオチドを用意するステップ、
（ｂ）第二の試料中の第二の修飾二本鎖ポリヌクレオチドを用意するステップ、
（ｃ）１つまたは複数のアンカーを使用して第一の試料中の第一のポリヌクレオチドを膜とカップリングするステップ、
（ｄ）第一のポリヌクレオチドを膜貫通ポアと、第一のポリヌクレオチドの少なくとも１本の鎖がポアを通って移動するように接触させるステップ、
（ｅ）第一ポリヌクレオチドがポアに対して移動するときに第一のポリヌクレオチドの１つまたは複数の特性を示す１つまたは複数の測定値を取り、それによって第一のポリヌクレオチドを特性評価するステップ、
（ｆ）第一のポリヌクレオチドを膜からアンカップリングするステップ、
（ｇ）１つまたは複数のアンカーを使用して第二の試料中の第二のポリヌクレオチドを膜とカップリングするステップ、
（ｈ）第二のポリヌクレオチドをポアと、第二のポリヌクレオチドの少なくとも１本の鎖がポアを通って移動するように接触させるステップ、および
（ｉ）第二のポリヌクレオチドがポアに対して移動するときに第二のポリヌクレオチドの１つまたは複数の特性を示す１つまたは複数の測定値を取り、それによって第二のポリヌクレオチドを特性評価するステップ
を含む。
【０２０６】
このタイプの方法は、英国出願第１４０６１５５．０号明細書において詳細に論じられている。
【０２０７】
他の特性評価方法
別の実施形態において、修飾二本鎖ポリヌクレオチド／各修飾二本鎖ポリヌクレオチドは、ポリメラーゼがヌクレオチドをポリヌクレオチドに組み込むときに放出される標識種を検出することによって特性評価される。ポリメラーゼは、ポリヌクレオチドをテンプレートとして使用する。各標識種は、各ヌクレオチドに特異的である。ポリヌクレオチド／各ポリヌクレオチドを、膜貫通ポア、ポリメラーゼおよび標識種と、ヌクレオチドがポリメラーゼによってポリヌクレオチドに付加されるときに、各ヌクレオチドに特異的な標識を含有するリン酸エステル標識種が連続的に放出されるように接触させる。ポリメラーゼは、上で論じたいずれのものであってもよい。ポアを使用してリン酸エステル標識種を検出し、それによってポリヌクレオチドを特性評価する。このタイプの方法は、欧州出願第１３１８７１４９．３号（欧州特許第２６８２４６０号明細書として公開された）明細書に開示されている。上で論じた実施形態のいずれも、この方法に同等に当てはまる。
【０２０８】
キット
本発明は、テンプレートポリヌクレオチドを修飾するためのキットも提供する。キットは、（ａ）本発明のＭｕＡ基質の集団および（ｂ）ＭｕＡトランスポサーゼおよび（ｃ）ポリメラーゼを含む。本発明の方法および本発明の生成物に関して上で論じた実施形態のいずれも、キットに同等に当てはまる。
【０２０９】
キットは、膜の成分、例えば、両親媒性層または脂質二重層の成分をさらに含むことがある。キットは、膜貫通ポア、または膜貫通ポアの成分をさらに含むことがある。キットは、ポリヌクレオチド結合タンパク質をさらに含むことがある。好適な膜、ポアおよびポリヌクレオチド結合タンパク質は、上で論じている。
【０２１０】
本発明のキットは、上述の実施形態のいずれかを実施できるようにする１つまたは複数の他の試薬または器具をさらに含むことがある。そのような試薬または器具としては、次のものの１つまたは複数が挙げられる：好適な緩衝液（水溶液）、対象から試料を得るための手段（例えば、容器、もしくは針を備えている器具）、ポリヌクレオチドを増幅および／もしくは発現させるための手段、上で定義した通りの膜、または電圧もしくはパッチクランプ装置。試薬は、流体試料が該試薬を再懸濁するように、乾燥状態でキット内に存在することがある。キットは、場合により、キットを本発明の方法で使用できるようにする説明書、またはその方法をどの患者に使用してもよいのかに関する詳説も含むことがある。キットは、場合により、ヌクレオチドを含むこともある。
【０２１１】
以下の実施例は、本発明を例証するものである。
【実施例１】
【０２１２】
この実施例は、テンプレート二本鎖ポリヌクレオチドを修飾する方法、特に、ナノポアシークエンシングを使用する特性評価のために修飾する方法を説明するものである。この実施例は、ＭｕＡトランスポサーゼが、ヘアピンループを含有するＭｕＡ基質を挿入することができたことを明らかにする。そのため、ポリメラーゼを使用して構築物中のギャップを充填し、次いで、その二本鎖構築物を加熱して二本鎖ＤＮＡを融解した。これによって、ポリメラーゼが補体を生成するヘアピンを有する一本鎖ＤＮＡを得た。次いで、この構築物を、酵素が事前結合しているアダプターにライゲートし、最後にテザーにハイブリダイズした。すると、このＤＮＡ構築物は、ヘリカーゼがナノポアを通るＤＮＡの移動を制御することを示した。
【０２１３】
材料及び方法
１．１−ＭｕＡトランスポサーゼを使用するＤＮＡテンプレートの断片化
この実施例で使用したＭｕＡアダプターＸは、５’２１ｂｐヘアピン（図２にｃと称するアダプター、上の鎖＝配列番号２９、下の鎖＝その５’末端が配列ＧＡＴＣＵの３’末端に付着されている配列番号３０）を有した。アダプターの上および下の鎖を、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、５０ｍＭ  ＮａＣｌ中、１０ｕＭで、９５℃から毎分２℃でアニールした。
【０２１４】
ＭｕＡ断片化反応（１０μＬ）を下の表１に記載するように構成し、１時間、３０℃でインキュベートした。次いで、ＭｕＡ酵素を７５℃で１５分間加熱することによって熱不活性化した。最後に、得られたＤＮＡを１．５ｘ  ＳＰＲＩ精製し、ヌクレアーゼ不含水で溶離した（４２μＬ、試料１）。
【０２１５】
【表１】
0006637040.tif 000002
【０２１６】
１．２−ＤＮＡテンプレートとＤＮＡポリメラーゼのインキュベーション
ＭｕＡ断片化手順後に、精製ＤＮＡをＤＮＡポリメラーゼとともにインキュベートして、上の鎖のヘアピンをコピーした。
【０２１７】
ＤＮＡポリメラーゼ反応（５０μＬ）を下の表２に記載するように構成し、１０分間、６８℃でインキュベートした。最後に、得られたＤＮＡを１．５ｘ  ＳＰＲＩ精製し、ヌクレアーゼ不含水で溶離した（４２μＬ、試料２）。
【０２１８】
【表２】
0006637040.tif 000003
【０２１９】
１．３−熱変性およびポリメラーゼ充填
ヘアピンコピー段階後に、試料２に単回変性ステップおよびポリメラーゼ充填を施した。ポリメラーゼ充填反応のために、ポリメラーゼにｄＣＴＰ／ｄＧＴＰ／ｄＡＴＰを備えさせたが、標準ｄＴＴＰを異なるヌクレオチド種５−プロピニル−ｄＵと置き換えた。反応（５０μ）を下の表３に記載するように構成し、２分間９５℃で、３０秒間５５℃で、そして３０分間６８℃でインキュベートした。最後に、得られたＤＮＡを１．５ｘ  ＳＰＲＩ精製し、ヌクレアーゼ不含水で溶離した（４５μＬ、試料３）。
【０２２０】
【表３】
0006637040.tif 000004
【０２２１】
１．４−ｄＡテーリング反応
次いで、試料３を下の表４に記載するようにｄＡテーリングし、３０分間、３７℃でインキュベートした。得られたＤＮＡを１．５ｘ  ＳＰＲＩ精製し、ヌクレアーゼ不含水で溶離した（２０μＬ、試料４）。
【０２２２】
【表４】
0006637040.tif 000005
【０２２３】
１．５−酵素が前負荷されたアダプターのライゲーション
次いで、下の表５に記載するように、酵素（Ｔ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ（突然変異Ｅ９４Ｃ／Ａ３６０Ｃ／Ｃ１１４Ａ／Ｃ１７１Ａ／Ｃ４２１Ｄおよび次いで（ΔＭ１）Ｇ１Ｇ２）を有する、配列番号２４）が前負荷されたＹアダプター１（上の鎖＝配列番号３３の３’末端に付着されている４個のｉＳＰ１８スペーサーに３’末端が付着されている配列番号３２に３’末端が付着されている２０個のｉＳｐＣ３スペーサー、下の鎖＝５’リン酸エステルが付着されている配列番号３４）に、試料４をライゲートし、２０分間、室温でインキュベートした。得られたＤＮＡを０．４ｘ  ＳＰＲＩ精製し、緩衝液（２００μＬの７５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％ＰＥＧ８０００、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ  ｐＨ８）で洗浄し、緩衝液（２０μＬの４０ｍＭ  ＣＡＰＳ  ｐＨ１０、４０ｍＭ  ＫＣｌ）で溶離した（試料５）。
【０２２４】
【表５】
0006637040.tif 000006
【０２２５】
１．６−テザーのアニーリング
次いで、試料５中に存在するＤＮＡ分析物をテザーにアニールした。試料５をＤＮＡテザー（配列ＡＡＣＡＡＣＣＴの５’末端を３個のｉＳｐ１８スペーサー、２個のチミンおよび５’コレステロールＴＥＧに付着させ、配列ＡＡＣＡＡＣＣＴの３’末端を、配列番号３５に３’末端が付着されている３個のｉＳｐ１８スペーサーに付着させた）（５００ｎＭ、５μＬ）とともに１０分間、室温でインキュベートした。得られた試料は試料６と称した。
【０２２６】
１．７−電気生理学的試験
実験を始める前に、ＤＮＡ試料６（試料６の全体積の４分の１）を緩衝液（２５ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）、５００ｍＭ  ＫＣｌ）、ＭｇＣｌ２（１ｍＭ）およびＡＴＰ（２ｍＭ）に添加し、１５０μＬの全体積を得た。
【０２２７】
電気的測定値は、緩衝液（２５ｍＭリン酸Ｋ緩衝液、１５０ｍＭフェロシアン化カリウム（ＩＩ）、および１５０ｍＭフェリシアン化カリウム（ＩＩＩ）、ｐＨ８．０）中のブロック共重合体に挿入された単一ＭｓｐＡナノポアから得た。ブロック共重合体に挿入された単一ポアを得た後に、緩衝液（２ｍＬ、２５ｍＭリン酸Ｋ緩衝液、１５０ｍＭフェロシアン化カリウム（ＩＩ）、１５０ｍＭフェリシアン化カリウム（ＩＩＩ）、ｐＨ８．０）をその系に流して一切の過剰ＭｓｐＡナノポアを除去した。次いで、酵素（Ｔ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃ、最終濃度１０ｎＭ）、ＤＮＡ試料６および燃料（ＭｇＣｌ２  最終濃度２ｍＭ、ＡＴＰ  最終濃度２ｍＭ）プレミックス（合計１５０μＬ）をその単一ナノポア実験系に流し込んだ。実験を１２０ｍＶで実行し、ヘリカーゼによって制御されるＤＮＡの移動を６時間モニターした。
【０２２８】
結果
試料調製手順（試料６）の最後に生成されたＤＮＡについて、ヘリカーゼによって制御されるＤＮＡの移動を観察した。図３は、ヘリカーゼによって制御されるＤＮＡの移動の例を示すものである。
【０２２９】
試料調製手順も、Ａｇｉｌｅｎｔ  １２，０００  ＤＮＡチップトレースを使用して分析した。ステップ１．２（５’ヘアピンを転写させる）の前に６８℃でのプレインキュベーションがなかった場合には、鎖はポリメラーゼを開始させる必須３’ヘアピンを欠いていたので、鎖解離（熱変性ステップ１．３）後に合成補体は作製されなかった（図２のステップ４の後に破線／点線として示す）。このことが、図４に示すＡｇｉｌｅｎｔ  １２，０００  ＤＮＡチップトレースで観察された。図４中の１と称するラインは、未処理ＭｕＡ断片化ＤＮＡ投入材料であり、２と称するラインは、６８℃インキュベーションステップ（上記１．２におけるもの）を受け、その後、ステップ１．３のすべてを経た分析物であり、３と称するラインは、ステップ１．２における６８℃インキュベーションを受けていなかったが、ステップ１．３のすべてを経ていた。それ故、ライン３についてはｄｓＤＮＡが作製されず、したがって、９５℃での鎖解離前にコピーされたヘアピンがなかったので、Ａｇｉｌｅｎｔトレースで平坦なライン（Ｘと称する領域）が観察された。しかし、ライン２については、ヘアピンが転写され、それ故、鎖解離時にポリメラーゼが新たな３’ヘアピンからの充填を開始した。これは、ライン２が、コピーされたヘアピンから作製されたｄｓＤＮＡ生成物に対応する領域Ｘのピークを示すことを意味する。
【０２３０】
上記手順を上記の通りに繰り返したが、ステップ１．３では、ポリメラーゼに、５−プロピニル−ｄＵではなく標準ＤＮＡ  ｄＮＴＰ−ｄＣＴＰ／ｄＡＴＰ／ｄＧＴＰ／ｄＴＴＰを備えさせ、ＤＮＡ試料７を生成した。図６は、ＤＮＡ試料７（ステップ１．３において標準ＤＮＡ  ｄＮＰを使用して生成した）についてのヘリカーゼによって制御されるＤＮＡの移動の例を示す。試料調製手順は成功し、ヘリカーゼによって制御されるＤＮＡの移動がこの試料について観察された。
【実施例２】
【０２３１】
この実施例は、テンプレート二本鎖ポリヌクレオチドを修飾する方法、特に、ナノポアシークエンシングを使用する特性評価のために修飾する方法を説明するものである。図７は、下のステップ２．１および２．２で説明する試料調製ステップの略画表現を示す。この実施例は、ＭｕＡトランスポサーゼが、ＭｕＡアダプターのヘアピンループにｄＧおよびｄＣの類似体（ｄＧをデオキシイノシンと置き換え、ｄＣをデオキシゼブラリンと置き換えたもの）を含有するヘアピンループを含有するＭｕＡ基質を挿入することができたことを明らかにする。そのため、ヘアピンループを含む鎖を相補する新たな鎖とオーバーハング鎖を置き換えるポリメラーゼを使用して、構築物中のギャップを充填した。ヘアピンループを含む鎖を相補する新たな鎖もまた、ヘアピンループを形成することができた。新たな鎖のヘアピンループは、相補鎖と、Ａ／Ｔ／Ｚ／Ｉで構成されているヘアピンループとで形成される二本鎖領域（図７に１Ｘと称する）より高いＴｍを有した。それ故、新たな鎖内にヘアピンが形成し（図７にｆ２ｈと称する）、Ａ／Ｔ／Ｚ／Ｉで構成されているヘアピンループも形成した（図７にｆ１ｈと称する）。すると、ポリメラーゼがヘアピンループをプライマーとして使用して相補鎖を作製した。それ故、図７のステップ２の後に生成されるｄｓＤＮＡ構築物を分離するためのさらなる加熱ステップは必要なかった。
【０２３２】
２．１−ＭｕＡトランスポサーゼを使用するＤＮＡテンプレートの断片化
この実施例で使用したＭｕＡは、ｄＧがｄイノシンに置き換えられ、ｄＣがｄゼブラリンに置き換えられた５’７ｂｐヘアピンを有した。アダプターＰの上の鎖（修飾ポリヌクレオチド配列ＩＺＩＴＡＺ（この配列中、Ｉはデオキシイノシンであり、Ｚはデオキシゼブラリンである）が、配列番号３９の５’末端に付着されている修飾ポリヌクレオチド配列ＩＴＡＺＩＺ（この配列中、Ｉはデオキシイノシンであり、Ｚは、デオキシゼブラリンである）に３’末端が付着されている非修飾ポリヌクレオチド配列ＴＴＴＴＴＡの５’末端に付着されている）および下の鎖（配列番号３８）を、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、５０ｍＭ  ＮａＣｌ中、１０ｕＭで、９５℃から毎分２℃でアニールした。
【０２３３】
アダプターＸではなくアダプターＰを使用して上の表１に記載したようにＭｕＡ断片化反応（１０μＬ）を構成し、１時間、３０℃でインキュベートした。次いで、ＭｕＡ酵素を７５℃で１５分間加熱することによって熱不活性化した。最後に、得られたＤＮＡを１．５ｘ  ＳＰＲＩ精製し、ヌクレアーゼ不含水で溶離した（４２μＬ）。
【０２３４】
２．２−ＤＮＡテンプレートとＤＮＡポリメラーゼのインキュベーション
ＭｕＡ断片化手順後に、精製ＤＮＡをＤＮＡポリメラーゼとともにインキュベートして、上の鎖のヘアピン（Ｉ／Ｚと置き換えられたＧ／Ｃを有した）をコピーした。
【０２３５】
このステップ中に、ヘアピンループを含む鎖を相補する新たな鎖がヘアピンループを形成した。これは、新たな鎖によって形成されたヘアピンループが、相補鎖とｄＺおよびｄＩの類似体を含有するヘアピンループとで形成された二本鎖領域より高いＴｍを有したことに起因した。したがって、より高いＴｍを有するヘアピンが優先的に形成され、次いでポリメラーゼがこのヘアピンループをプライマーとして使用して相補鎖を作製したので、二本鎖ＤＮＡをｓｓＤＮＡに分離するために加熱する必要はなかった。
【０２３６】
ＤＮＡポリメラーゼ反応（５０μＬ）を下の表に記載するように構成し、３０分間、３７℃でインキュベートした。最後に、得られたＤＮＡを１．５ｘ  ＳＰＲＩ精製し、ヌクレアーゼ不含水で溶離した（４２μＬ）。
【０２３７】
【表６】
0006637040.tif 000007
【０２３８】
ｄＡテーリング、酵素が前負荷されたアダプターのライゲーション、およびテザーのハイブリダイゼーション（実施例１．４〜１．６で説明した通り）によってこの鎖をさらに修飾して、（実施例１．７で説明したように）ナノポア系を使用して特性評価することができる鎖を生成することができた。
また、本発明は以下を提供する。
［１］  テンプレート二本鎖ポリヌクレオチドを修飾する方法であって、
（ａ）前記テンプレートポリヌクレオチドを、ＭｕＡトランスポサーゼ、ならびに各々が（ｉ）少なくとも１つのオーバーハング、および（ｉｉ）前記少なくとも１つのオーバーハングを含む鎖とは反対の鎖内の少なくとも１つのヘアピンループを含む二本鎖ＭｕＡ基質の集団と接触させ、その結果、前記トランスポサーゼが前記テンプレートポリヌクレオチドを断片化し、前記基質を二本鎖断片の一方または両方の末端にライゲートし、それによって複数の断片／基質構築物を生成するステップ、
（ｂ）前記断片／基質構築物をポリメラーゼと接触させ、その結果、前記ポリメラーゼが前記オーバーハングを含む鎖を外し、前記ヘアピンループを含む鎖を相補する鎖と置き換え、それによって、各々が前記テンプレートポリヌクレオチドの二本鎖断片を含む複数の二本鎖構築物を生成するステップ、および
（ｃ）前記二本鎖構築物の２本の鎖を分離し、それらの鎖をテンプレートとして使用して、少なくとも１つのヘアピンループによって連結された２本の相補鎖を各々が含む複数の修飾二本鎖ポリヌクレオチドを形成するステップ
を含む方法。
［２］  ステップ（ｃ）が、ｐＨ、温度およびイオン強度のうちの１つまたは複数を上昇させることによって前記二本鎖構築物の２本の鎖を分離することを含む、［１］に記載の方法。
［３］  ステップ（ｃ）が、前記分離された鎖をポリメラーゼと接触させ、その結果、前記ポリメラーゼが前記鎖をテンプレートとして使用して前記複数の修飾二本鎖ポリヌクレオチドを形成することを含む、［１］または［２］に記載の方法。
［４］  ステップ（ｃ）が、（ｉ）前記複数の分離された鎖を、前記鎖内のヌクレオチドのすべてに相補的であるヌクレオチドのあらゆる可能な組み合わせを含むヌクレオチドオリゴマーの集団と、前記オリゴマーが前記鎖にハイブリダイズすることができる条件下で接触させること、および（ｉｉ）前記鎖にハイブリダイズするそれらのオリゴマーを一緒にライゲートして、前記複数の修飾二本鎖ポリヌクレオチドを形成することを含む、［１］または［２］に記載の方法。
［５］  ステップ（ｃ）が、前記複数の二本鎖構築物をポリメラーゼと接触させ、その結果、前記ポリメラーゼが、同時に、前記二本鎖構築物の２本の鎖を分離し、前記鎖をテンプレートとして使用して前記複数の修飾二本鎖ポリヌクレオチドを形成することを含む、［１］に記載の方法。
［６］  前記少なくとも１つのヘアピンループが、各基質の２本の鎖を連結しない、［１］〜［５］のいずれか一項に記載の方法。
［７］  前記少なくとも１つのオーバーハングが、４、５または６ヌクレオチドの長さである、［１］〜［６］のいずれか一項に記載の方法。
［８］  各基質が、選択可能な結合部分を含む、［１］〜［７］のいずれか一項に記載の方法。
［９］  各基質が、膜貫通ポアを優先的に通り抜けることができるリーダー配列を含む、［１］〜［８］のいずれか一項に記載の方法。
［１０］  （ｄ）Ｙアダプターを前記複数の修飾二本鎖ポリヌクレオチドのヘアピンループとは反対の末端に付着させるステップをさらに含み、前記Ｙアダプターが、膜貫通ポアを優先的に通り抜けることができるリーダー配列を場合により含む、［１］〜［８］のいずれか一項に記載の方法。
［１１］  １つまたは複数のポリヌクレオチド結合タンパク質を前記複数の修飾二本鎖ポリヌクレオチドと結合させるステップをさらに含む、［１］〜［１０］のいずれか一項に記載の方法。
［１２］  ［１］〜［１１］のいずれか一項に記載の方法を使用して生成される複数の修飾二本鎖ポリヌクレオチド。
［１３］  テンプレートポリヌクレオチドを修飾するための二本鎖ポリヌクレオチドＭｕＡ基質の集団であって、前記基質が［１］、［６］、［７］および［８］のいずれか一項において定義した通りである、集団。
［１４］  ［１］〜［１１］のいずれか一項に記載の方法を使用して修飾された少なくとも１つのポリヌクレオチドを特性評価する方法であって、
ａ）修飾ポリヌクレオチドを膜貫通ポアと、前記ポリヌクレオチドの少なくとも１本の鎖が前記ポアを通って移動するように接触させるステップと、
ｂ）前記少なくとも１本の鎖がポアに対して移動するときに、前記少なくとも１本の鎖の１つまたは複数の特性を示す１つまたは複数の測定値を取り、それによって前記修飾ポリヌクレオチドを特性評価するステップと
を含む方法。
［１５］  テンプレートポリヌクレオチドを特性評価する方法であって、
ａ）［１］〜［１１］のいずれか一項に記載の方法を使用して前記テンプレートポリヌクレオチドを修飾して、複数の修飾ポリヌクレオチドを生成するステップと、
ｂ）各修飾ポリヌクレオチドを膜貫通ポアと、各ポリヌクレオチドの少なくとも１本の鎖が前記ポアを通って移動するように接触させるステップと、
ｃ）各ポリヌクレオチドが前記ポアに対して移動するときに、各ポリヌクレオチドの１つまたは複数の特性を示す１つまたは複数の測定値を取り、それによって前記テンプレートポリヌクレオチドを特性評価するステップと
を含む方法。
［１６］  前記修飾ポリヌクレオチド／各修飾ポリヌクレオチドの両方の鎖が前記ポアを通って移動する、［１４］または［１５］に記載の方法。
［１７］  前記１つまたは複数の特性が、（ｉ）前記ポリヌクレオチドの長さ、（ｉｉ）前記ポリヌクレオチドの同一性、（ｉｉｉ）前記ポリヌクレオチドの配列、（ｉｖ）前記ポリヌクレオチドの二次構造、および（ｖ）前記ポリヌクレオチドが修飾されているか否かから選択される、［１１］〜［１３］のいずれか一項に記載の方法。
［１８］  接触させるステップ（ａ）または接触させるステップ（ｂ）が、前記修飾ポリヌクレオチド／各修飾ポリヌクレオチドを、ポリヌクレオチド結合タンパク質と、前記タンパク質が前記ポアを通る前記ポリヌクレオチド／各ポリヌクレオチドの移動を制御するように接触させることをさらに含む、［１４］〜［１７］のいずれか一項に記載の方法。
［１９］  （ｉ）前記修飾ポリヌクレオチド／各修飾ポリヌクレオチドを、膜貫通ポアおよび１つまたは複数のポリヌクレオチド結合タンパク質と、前記ポリヌクレオチド／各ポリヌクレオチドの少なくとも１本の鎖が、前記ポアを通って移動し、前記１つまたは複数のタンパク質が、前記ポアを通る前記ポリヌクレオチド／各ポリヌクレオチドの移動を制御するように接触させるステップ、
（ｉｉ）前記ポリヌクレオチド／各ポリヌクレオチドが前記ポアに対して移動するときに前記ポアを通過する電流を測定し、前記電流が前記ポリヌクレオチド／各ポリヌクレオチドの１つまたは複数の特性を示し、それによって前記ポリヌクレオチドを特性評価するステップ
を含む、［１８］に記載の方法。
［２０］  前記修飾ポリヌクレオチド／各修飾ポリヌクレオチドを前記膜貫通ポアと接触させる前に、前記１つまたは複数のポリヌクレオチド結合タンパク質を、前記修飾ポリヌクレオチド／各修飾ポリヌクレオチドと結合させる、［１９］に記載の方法。
［２１］  前記１つまたは複数のポリヌクレオチド結合タンパク質が、ヘリカーゼに由来する、［１９］または［２０］に記載の方法。
［２２］  テンプレート二本鎖ポリヌクレオチドを修飾するためのキットであって、（ａ）［１］、［６］、［７］および［８］のいずれか一項において定義した通りのＭｕＡ基質の集団と（ｂ）ＭｕＡトランスポサーゼと（ｃ）ポリメラーゼとを含むキット。
【図１】
0006637040.tif 000008
【図２】
0006637040.tif 000009
【図３】
0006637040.tif 000010
【図４】
0006637040.tif 000011
【図５】
0006637040.tif 000012
【図６】
0006637040.tif 000013
【図７】
0006637040.tif 000014
【図８】
0006637040.tif 000015
【配列表】
0006637040000001.app