(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
３Ｄ組織培養モデルを作製する方法であって、前記方法が：
（ａ）バイオインクの液滴を、基材に印刷する工程；
（ｂ）前記バイオインクの液滴に、活性化剤の液滴を印刷して、ハイドロゲル液滴を形成する工程；
（ｃ）任意の順序で工程（ａ）及び（ｂ）を繰り返して、細胞を含む液滴を受けるように適合されたハイドロゲルモールドを形成する工程；
（ｄ）前記ハイドロゲルモールドに、１０７細胞／ｍＬ以上の細胞濃度を有する細胞を含む液滴を印刷する工程；及び、
（ｅ）任意の順序で工程（ａ）及び（ｂ）を繰り返して、前記ハイドロゲルモールド内に封入された細胞を含む３Ｄ組織培養モデルを形成する工程、
を含み、
ここで、前記印刷が、ドロップ−オン−デマンド液滴分配システムを有するプリンタを使用して印刷が実行されるものであって、前記３Ｄ組織培養モデルは、９５％以上の高い細胞生存率を有する、方法。
【請求項２】
前記工程（ｄ）が、細胞を含む細胞−インクの液滴を、前記ハイドロゲルモールドに印刷する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記工程（ｄ）が、細胞を含むバイオインクの液滴を印刷する工程と、工程（ｅ）の前に、細胞を含む前記バイオインクの液滴に、活性化剤の液滴を印刷する工程とを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記基材が、細胞を収容、保持又は増殖させるのに適している、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記基材が、異なるウェル構成（６、２４、４８及び９６ウェル）のマイクロタイタープレート、異なるウェル構成（６、２４、４８及び９６ウェル）のカバースリップ底面を有するマイクロタイタープレート、蛍光ディッシュ（ｆｌｕｏｒｏｄｉｓｈ）、異なるチャンバー構成（１、２、４、８及び１６）のチャンバースライド、カバースリップ又は顕微鏡スライドから選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記バイオインクが、適切な活性化剤に暴露されたときにハイドロゲルを形成し得る、細胞と適合性である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記バイオインクが、合成高分子、アミン反応性官能基を有するポリマー、チオール反応性官能基を有するポリマー、フルクトース、スクロース若しくはグルコース官能基を含むポリマー、非イオン性ポリマー、高分子電解質、又は天然高分子を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記合成高分子が多糖類であり、前記アミン反応性官能基を有するポリマーがアルデヒド、エポキシ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）又は２−ビニル−４，４−ジメチルアズラクトン（ＶＤＭ）であり、前記チオール反応性官能基がアルケン、アルキン、アジド、ハロゲン又はシアネートであり、前記非イオン性ポリマーがポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、ポリ（ヒドロキシエチルメタクリレート）（ＰＨＥＭＡ）、ポリ（ε−カプロラクトン）（ＰＣＬ）、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）、ポリ（ＮＩＰＡＡＭ）及びポリ（プロピレンフマレート）（ＰＰＦ）又は誘導体であり、前記天然高分子が、アルギネート（ａｌｇｉｎａｔｅ）、キトサン、ヒアルロン酸、アガロース、グリコサミノグリカン若しくはメチルセルロース、タンパク質、ゼラチン、フィブリン、コラーゲン又は基底膜抽出物である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記活性化剤が、前記バイオインクをハイドロゲルへと形成するように選択される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記活性化剤が、無機塩又は光開始剤を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記無機塩が、塩化バリウム、炭酸カルシウム、塩化カルシウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム又は水酸化ナトリウムであり、前記光開始剤が、２，２−ジメトキシ−２−フェニルアセトフェノン（ＤＭＰＡ）及びイルガキュア（Irgacure）である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記バイオインクが、アルギネートであり、前記活性化剤が、塩化カルシウムである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞−インクが、ジェランガム、フィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）（商標）、デキストラン、グリセロール、アルギネート、メチルセルロース又はポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）から選択される、請求項２〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞−インクが、ジェランガムである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記細胞−インクが、フィコール（商標）である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記ハイドロゲルモールドに封入された細胞を、細胞増殖又はスフェロイド形成を可能とする又は維持する温度及び条件においてインキュベートすることをさらに含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記３Ｄ組織培養モデルが、細胞スフェロイドである、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記細胞濃度が、２５０×１０６細胞／ｍＬである、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記細胞濃度が、４５０×１０６細胞／ｍＬまでである、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１５年７月２２日に出願されたオーストラリア仮特許出願第２０１５９０２９１７号の利益を主張し、そのすべての開示は、参照により全体が本明細書に組込まれる。
技術分野
【０００２】
本技術は、三次元組織培養、例えば３Ｄ組織培養モデルの形成方法、及び３Ｄ組織培養モデルにおける使用に関する。
背景
【０００３】
ヒト及び動物体内におけるほとんどの細胞構造は、三次元で組織化されている。これは、細胞培養の二次元単層において模倣され得る複雑な細胞間相互作用を導く（Pampaloni, Ansari and Stelzer, 2013）。しかしながら、二次元細胞培養は、典型的なインビトロ細胞培養のためのパラダイムであった。三次元環境下で培養される場合、細胞はより自然に振る舞うが、しかし三次元細胞培養の形成は、作製するのに困難で、高価で且つ面倒であることが実証されている。
【０００４】
細胞スフェロイドは、三次元細胞培養モデルの例であり、基礎研究及び臨床薬理学において発現され、そして適用された最初のものの中のものであった。細胞スルフェロイドは、数百ミクロンの典型的な直径を有する凝集した細胞クラスターである。現在、スフェロイド形成のために利用できる多くの技法、例えばハンギングドロップ方法又は回転攪拌機が存在する。典型的には、細胞スフェロイドの培養は、４日までを要し、そして成功率は５０％である。
【０００５】
ドロップ−オン−デマンド型技法を用いて細胞を印刷する多くの研究が報告されて来た。Faulkner-Sonesら（２０１３）は、ＤＭＥＭ中、約１×１０5個の細胞／ｍｌの細胞密度を有するドロップ−オン−デマンド方法を用いて培地に懸濁された細胞を印刷した。Ferrisら（２０１５）は、市販のインクジェットプリントヘッドを用いてバイオインク（ジェランガム）中２×１０6個の細胞／ｍｌの印刷を報告している。Ｘｕら（２０１４）は、１×１０7個の細胞／ｍｌの密度でバイオインク中細胞の印刷を報告している。細胞印刷において最も広く使用されている細胞濃度は、１０5〜１０7個の細胞／ｍｌであることも報告されている。多くのこれまでの研究は、ドロップ−オン−デマンド技法を用いての細胞の印刷を記載しているが、ドロップ−オン−デマンド方法によりバイオインクの中、高細胞密度（１０7個の細胞／ｍｌ以上）を印刷する報告は存在しない。
【０００６】
細胞スフェノイドを形成するためには、例えば、高密度の細胞（５×１０7〜２×１０8個の細胞／ｍｌ）が、小さな球状細胞クラスターに凝集されなければならない。ハンギングドロップ技法は、単離された細胞を含む培地の液滴を懸濁し、そして細胞を３〜７日間にわたって凝集することによりこれを達成する。ドロップ−オン−デマンド装置を用いての細胞スフェロイドの作製は、高細胞密度に関連する高い粘性、及びドロップ−オン−デマンドにおける小さな特徴サイズのために困難性を提供する。この理由のために、スフェロイドを用いて組織構造を印刷する従来の試みにおいては、まず、細胞スフェロイドが手動的に形成され、３Ｄプリンターに装填され、そして次に、組織構造を形成するために印刷される。Ｔａｎら（２０１４）は、押出し法による予備形成された細胞スフェロイドの３Ｄ印刷を報告している。Ｔａｎなどは、液滴分配ノズルとして加圧されたパスツールピペットシステム使用し、予備形成されたスフェロイドの連続的堆積をもたらした。Margaら（２０１２）はまた、押出し法による予備形成されたスフェロイドの３Ｄ印刷を報告している。対照的に、細管マイクロピペットを用いて、細胞凝集体を連続して一列に配置した。同様に、Mironovら（２００９）はまた、押出し法による予備形成された細胞スフェロイドの３Ｄ印刷を報告している。
【０００７】
本発明者らは、インビトロ細胞培養アッセイに適切な３Ｄ組織培養モデルを作製するための方法を開発した。
【発明の概要】
【０００８】
第１の側面によれば、３Ｄ組織培養モデルを作製する方法が提供され、ここで前記方法は：
（ａ）バイオインクの液滴を、基材に印刷する工程；
（ｂ）前記バイオインクの液滴に、活性化剤の液滴を印刷して、ハイドロゲル液滴を形成する工程；
（ｃ）任意の順序で工程（ａ）及び（ｂ）を繰り返して、細胞を含む液滴を受けるように適合されたハイドロゲルモールドを形成する工程；
（ｄ）前記ハイドロゲルモールドに、細胞を含む液滴を印刷する工程；及び、
（ｅ）任意の順序で工程（ａ）及び（ｂ）を繰り返して、前記ハイドロゲルモールド内に封入された細胞を含む３Ｄ組織培養モデルを形成する工程、を含む。
【０００９】
１つの実施形態によれば、工程（ｄ）は、ハイドロゲルモールドに、細胞を含む細胞インクの液滴を印刷することを含む。
【００１０】
１つの実施形態によれば、工程（ｄ）は、ハイドロゲルモールドに、細胞を含むバイオインクの液滴を印刷し、そして工程（e）の前、細胞を含むバイオインクの液滴に、活性化剤の液滴を印刷することを含む。
【００１１】
第２の側面によれば、３Ｄ組織培養モデルを作製する方法が提供され、ここで前記方法は：
（ａ）バイオインクの液滴を、基材に印刷する工程；
（ｂ）前記バイオインクの液滴に、活性化剤の液滴を印刷して、ハイドロゲル液滴を形成する工程；
（ｃ）任意の順序で工程（ａ）及び（ｂ）を繰り返して、細胞を含む液滴を受けるように適合されたハイドロゲルモールドを形成する工程；
（ｄ）前記ハイドロゲルモールドに、細胞を含む細胞インクの液滴を印刷する工程；及び、
（ｅ）任意の順序で工程（ａ）及び（ｂ）を繰り返して、前記ハイドロゲルモールド内に封入された細胞を含む３Ｄ組織培養モデルを形成する工程、を含む。
【００１２】
第３の側面によれば、３Ｄ組織培養モデルを作製する方法が提供され、ここで前記方法は：
（ａ）バイオインクの液滴を、基材に印刷する工程；
（ｂ）前記バイオインクの液滴に、活性化剤の液滴を印刷して、ハイドロゲル液滴を形成する工程；
（ｃ）任意の順序で工程（ａ）及び（ｂ）を繰り返して、細胞を含む液滴を受けるように適合されたハイドロゲルモールドを形成する工程；
（ｄ）前記ハイドロゲルモールドに、細胞を含むバイオインクの液滴を印刷する工程； 
（ｅ）細胞を含むバイオインクの液滴に、活性化剤の液滴を印刷する工程；及び、
（ｆ）任意の順序で工程（ａ）及び（ｂ）を繰り返して、前記ハイドロゲルモールド内に封入された細胞を含む３Ｄ組織培養モデルを形成する工程、を含む。
【００１３】
１つの実験形態によれば、前記方法は液滴を形成できる３Ｄバイオプリンターを用いて実施される。３Ｄバイオプリンターは、細胞の完全性、生存能力又は機能性を可能にするような態様で、バイオインク、活性化剤、細胞包含液滴、細胞含有の細胞インクの液滴を印刷するように構成される。
【００１４】
工程（ａ）及び（ｂ）は、任意の順序で実施され得ることが理解されるであろう。バイオインクの液滴が基材に適用され、続いてハイドロゲル液滴又は活性化剤の液滴を形成するための活性化剤の液滴が基材に適用され、続いてハイドロゲル液滴を形成するためにバイオインクの液滴が適用され得る。
【００１５】
１つの実施形態によれば、基材は、細胞を収容し、保持するか、又は増殖させるための任意の適切な容器から選択される。例としては、異なるウェル構成（６、２４、４８及び９６ウェル）のマイクロタイタープレート、異なるウェル構成（６、２４、４８及び９６ウェル）のカバースリップ底面を有するマイクロタイタープレート、種々のサイズの蛍光ディッシュ（ｆｌｕｏｒｏｄｉｓｈ）、異なるチャンバー構成（１、２、４、８及び１６）のチャンバースライド、カバースリップ又は顕微鏡スライドである。
【００１６】
バイオインクは、適切な活性化剤に暴露される場合、細胞と適合でき、そしてハイドロゲルを形成できる任意の適切な材料から選択され得る。
【００１７】
１つの実施形態によれば、バイオインクは、合成高分子、フルクトース、スクロース又はグルコース官能基を含むポリマー、非イオン性ポリマー、高分子電解質、又は天然高分子である。
【００１８】
例としては、合成高分子、例えば多糖類；フルクトース、スクロース又はグルコース官能基を含むポリマー；アミン反応性官能基、例えばアルデヒド、エポキシ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）又は２−ビニル−４，４−ジメチルアズラクトン（ＶＤＭ）を担持するポリマー；チオール反応性官能基、例えばアルケン、アルキン、アジド、ハロゲン又はシアネートを有するポリマー、非イオン性ポリマー、例えばポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、非イオン性ポリマー、例えばポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、ポリ（ヒドロキシエチルメタクリレート）（ＰＨＥＭＡ）、ポリ（ε−カプロラクトン）（ＰＣＬ）、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）、ポリ（ＮＩＰＡＡＭ）及びポリ（プロピレンフマレート）（ＰＰＦ）、及び誘導体；高分子電解質−正又は負の何れかの電荷を担持するポリマー、両性及び双性ポリマー；アミド結合により一緒に保持される多くのアミノ酸（最小２つのアミノ酸）の単一の直鎖であるポリペプチドを含む。天然高分子は、多糖類、例えばアルギネート、キトサン、ヒアルロン酸、アガロース及びグリコサミノグリカン；タンパク質、例えばゼラチン、フィブリン、コラーゲン、ペプチド又はそれらの組合せ；又は基底膜抽出物を含む。
【００１９】
反応性官能基の例は、アミン反応性官能基、例えばアルデヒド、エポキシ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）又は２−ビニル−４，４−ジメチルアズラクトン（ＦＤＭ）及びチオール反応性官能基、例えばアルケン、アルキン、アジド、ハロゲン又はシアネートを含む。
【００２０】
活性化剤は、ハイドロゲルにバイオインクを形成するために選択される。
【００２１】
１つの実施形態によれば、活性化剤は、無機塩、光開始剤、高分子電解質、ポリペプチド、タンパク質、及びアミン又はチオール基を担持する合成若しくは天然高分子を含む。
【００２２】
１つの実施形態によれば、無機塩は、塩化バリウム、炭酸カルシウム、塩化カルシウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム又は水酸化ナトリウムであり、前記光開始剤が、２，２−ジメトキシ−２−フェニルアセトフェノン（ＤＭＰＡ）及びイルガキュア（Irgacure）である。
【００２３】
１つの実施形態によれば、合成又は天然高分子は、天然において、アミン又はチオール基を担持してもよく、又は合成的に修飾されてもよい。
【００２４】
１つの実施形態によれば、バイオインクは、反応性官能基を導入するために、化学的に修飾されてもよい。
【００２５】
１つの実施形態によれば、分散した神経芽腫（ＳＫ−Ｎ−ＢＥ（２））細胞と共にウシ血清（ＦＣＳ）が補充されてもよい、カルシウムフリーのダルベッコ変性イーグル培地（ＤＭＥＭ）に溶解されたアルギネートから形成される。１つの実施形態によれば、バイオインクは、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％ 又は１０％のＦＣＳが補充される。
【００２６】
１つの実施形態によれば、活性化剤は、ＭｉｌｌｉＱ水に溶解された塩化カルシウムである。
【００２７】
細胞インクは、細胞と適合でき、そして印刷工程の間、細胞を懸濁状態に保持する任意の適切な材料から選択されてもよい。
【００２８】
細胞インクは、細胞の完全性又は生存性を可能にする、緩衝液、細胞培地又は他の材料であってもよい。
【００２９】
１つの実施形態によれば、細胞インク材料は、ジェランガム、フィコール（商標）、デキストラン、グリセロール、アルギネート、メチルセルロース又はポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）を含む。
【００３０】
１つの実施形態によれば、細胞インクは、リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）中のジェランガムである。
【００３１】
１つの実施形態によれば、細胞インクは、ＰＢＳ中のフィコール（商標）である。
【００３２】
１つの実施形態によれば、細胞は、哺乳動物の肝臓細胞、胃腸細胞、膵臓細胞、腎臓細胞、肺細胞、気管細胞、血管細胞、骨格筋細胞、心臓細胞、皮膚細胞、平滑筋細胞、結合組織細胞、角膜細胞、泌尿生殖細胞、乳房細胞、生殖細胞、内皮細胞、上皮細胞、線維芽細胞、神経細胞、シュワン細胞、脂肪細胞、骨細胞、骨髄細胞、軟骨細胞、周皮細胞、中皮細胞、内分泌組織由来の細胞、間質細胞、幹細胞、前駆細胞、リンパ細胞、血液細胞、内胚葉由来細胞、外胚葉由来細胞、中胚葉由来細胞、又はそれらの組み合わせから選択される。
【００３３】
追加の細胞型は、他の哺乳類細胞（すなわち、非ヒト）、細菌、菌類及び酵母を含んでもよい。
【００３４】
１つの実施形態によれば、３Ｄ組織培養モデルはさらに、剤、例えば薬物、治療剤、抗体、小分子阻害剤、キナーゼ阻害剤、ホスファターゼ阻害剤、抗原、病原体、血小板、増殖因子、サイトカイン、アミノ酸、栄養素（単糖類及び多糖類）、馴化培地、抗生物質、抗ウイルス剤、ナノ粒子、ＲＮＡ及び関連する変異体（例えばするｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、など）を含む。
【００３５】
１つの実施形態によれば、前記方法は、液滴を形成することができる３Ｄバイオプリンターを用いて実施される。このバイオプリンターは、少なくともバイオインク、活性化剤、細胞懸濁液及び洗浄溶液のための流体レザーバ、３軸運動制御ステージ、ドロップ−オン−デマンド液滴分配システム、及び液体レザーバ内の圧力を制御するための圧力レギュレーターを有する。液滴分配システム及び３軸ステージは、無菌チャンバー、例えば層流キャビネット内に収容され得る。印刷プラットフォームは、多くの種類の基材、例えばマイクロウェルプレート及びペトリ皿上に印刷するためにアダプターを含み得る。印刷プラットフォームは、細胞増殖を助けるために３７℃に加熱され得る。
【００３６】
３Ｄバイオプリンターは、印刷フォーマットを定義するソフトウェアを有するコンピューターにより制御され得る。
【００３７】
１つの実施形態によれば、３Ｄ組織培養モデルは、少なくとも約１００、１０００、５０００、１００００、５００００、１０００００、１５００００、２０００００、２５００００、３０００００、３５００００、４０００００、４５００００又は ５０００００、又はそれ以上の細胞を含むことができる。他の数の細胞が使用され得ることは理解されるであろう。
【００３８】
約４５０×１０6個の細胞／ｍｌまでの細胞濃度が、３Ｄ組織培養モデルに使用され得る。さらに高い細胞濃度が使用され得ることは理解されるであろう。
【００３９】
１つの実施形態によれば、複数の細胞型が液滴で印刷され得る。例えば、２又はそれ以上の細胞型が、３Ｄ組織培養モデルを形成するために、混合され、そして使用され得る。
【００４０】
１つの実施形態によれば、方法は、基材上に複数の３Ｄ組織培養モデルを形成するために、実施される。例えば、９６ウェルマイクロタイタープレートが適切な基材であり、多数の細胞アッセイのために使用され得る。
【００４１】
１つの実施形態によれば、方法は、実質的に無菌の環境下で実施される。
【００４２】
１つの実施形態によれば、方法は、約３７℃までの温度で実施される。
【００４３】
培地は、細胞生存性を維持するか、又は増殖及び細胞分裂を促進するために、３Ｄ組織培養モデルに添加され得る。
【００４４】
１つの実施形態によれば、方法は自動化される。
【００４５】
１つの実施形態によれば方法はさらに、細胞増殖又はスフェロイド形成を可能にする条件下でハイドロゲルモールド内に封入される細胞をインキュベートすることを含む。
【００４６】
１つの実施形態によれば、インキュベーションは、細胞増殖及び維持するために適切な任意の適切な温度及び条件である。例えば、インキュベーションは、約３７℃、約５％ＣＯ2で少なくとも２４時間、実施され得る。インキュベーションは、ハイドロゲルモールド内の細胞型の細胞増殖又は維持又はスフェロイド形成を可能にする任意の温度及び時間で実施され得ることが理解されるであろう。
【００４７】
１つの実施形態によれば、３Ｄ組織培養モデルは、細胞スフェロイドである。
【００４８】
１つの実施形態によれば、ハイドロゲルは、例えば顕微鏡を用いて３Ｄ組織培養モデルにおける細胞の目視検査を可能にする。
【００４９】
使用においては、３Ｄ組織培養モデルは、細胞研究のためのハイドロゲル内外への栄養素及び試験剤の移動を可能にすることができる。
【００５０】
第４の側面によれば、第１の側面に従っての方法により作製される３Ｄ組織培養モデルが提供される。
【００５１】
第５の側面によれば、３Ｄバイオプリンターにより形成されるハイドロゲルに封入される細胞の液滴を含む３Ｄ組織培養モデルが提供される。
【００５２】
第６の側面によれば、細胞アッセイにおける３Ｄ組織培養モデルの使用が提供される。
【００５３】
１つの実施形態によれば、細胞アッセイは、以下から選択される：細胞運動、細胞遊走、細胞浸潤、経内皮遊走、上皮−間葉移行、間葉−上皮移行、スフェロイド形成及び成長、細胞分化（より具体的には幹細胞分化、細胞分化マーカーのモニタリング）、細胞死（より具体的には細胞アポトーシス；細胞壊死）、細胞オートファジー、細胞増殖、細胞代謝、タンパク質代謝回転、タンパク質の分布及び位置、細胞シグナル伝達及び下流事象、薬物効力、薬物薬力学、作用の薬物メカニズム、薬物受容体媒介輸送、薬物インターナリゼーションのメカニズム、バイオマーカー評価、細胞−細胞接合、細胞−細胞シグナル伝達および下流の事象、細胞形態、細胞接着、遺伝子発現、タンパク質発現、細胞ホーミング、細胞周期調節および制御、サイトカイン放出、インスリン産生、タンパク質分泌及び細胞内輸送および輸送、受容体−リガンド結合、抗体結合、抗体特異性、タンパク質リン酸化、プロテオソーム機能、酵素機能（より特異的には酵素阻害）、免疫調節、クローン原性、酸化ストレス、タンパク質フォールディング、細胞細胞骨格、オルガネラの形態学及び機能（より具体的には、ミトコンドリア、葉緑体、ペルオキシソーム、分泌小胞、液胞、リボソーム、核、リソソーム、繊毛、小胞体、ゴルジ体）、膜輸送、低酸素症、血管新生、創傷治癒、神経突起（伸長又は形成）、キナーゼ機能、ホスファターゼ機能、ラメリポダイアル形成（lamellipodial formation）及び動態；接着点（focal contact）／接着斑（focal adhesion）形成、動態及びシグナル伝達；細胞感知、メカノトランスダクション。
【００５４】
この方法の利点は、高濃度の細胞が組織培養モデルに含められ得ることである。
【００５５】
この方法の利点は、高い細胞生存率が、印刷の後、達成され得ることである。
【００５６】
この方法の利点は、それが安価で、反復可能であり、且つスケーラブルであり得ることである。
定義
【００５７】
本明細書を通して、特にことわらない限り、用語「含む（comprise）」、又は「含む（comprise）」又は「含む（comprising）」などの変形は、言及される要素、整数又は工程、又は要素群の包含を意味することが理解されるが、但し任意の他の要素、整数又は工程、又は要素群を除外するものではない。
【００５８】
本明細書を通して、用語「〜から成る（consisting of）」は、〜からのみ成ることを意味する。
【００５９】
本明細書に含まれる文書、行為、材料、装置、製品又は同様のものの任意の議論は、単に本発明の文脈を提供することを目的とするものである。それらの事項の何れか又はすべてが先行技術拠点の一部を形成するか、又は本明細書の各請求項の優先日の前に存在した本明細書に関連する分野において通常の一般的知識であることは、認められるべきではない。
【００６０】
特に記載されるか、又は反対の記載がない限り、単数の整数、工程又は要素として本明細書に列挙される本発明の整数、工程又は要素は、列挙された整数、工程又は要素の単数形及び複数形の両者を明確に包含する。
【００６１】
本明細書において、用語「ａ」及び「ａｎ」は、製品の１又は複数（すなわち、少なくとも１つの）の文法的対象を示すために使用される。例によれば、「要素（an element）」への言及は、１つの要素又は２以上の要素を意味する。
【００６２】
本明細書においては、用語「約（about）」とは、数字又は値への言及が絶対数字又は値として解釈されるべきではなく、エラー又は機器の限界の典型的なマージン内にある、当業者が当核技術に従って理解するであろう線に沿った数字又は値の上又は下の変動のマージンを含むことを意味する。言い換えると、用語「約」の使用は、当業者が同じ機能又は結果において列挙される値と同等であると考える範囲又は近似を言及すると理解される。
【００６３】
当業者は、本明細書に記載される本発明は、具体的に記載されたもの以外の変形及び修飾が可能であることを理解するであろう。誤解を避けるために、本発明はまた、本明細書において、個々に又は集合的に言及又は指示される工程、特徴及び化合物のすべて、並びに任意の２以上の前記工程、特徴及び化合物の任意及びすべての組合せも含む。
【００６４】
本明細書をより明確に理解するために、好ましい実施形態が、以下の図面及び実施例を参照して記載されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】図１は、３Ｄバイオプリンターの概略図を示す。
【００６６】
【図２】図２は、内部に印刷された細胞コロニーを有する印刷されたハイドロゲルモールドの例を示す。Ａ：中央にカップを有する印刷されたハイドロゲルモールド；Ｂ：ハイドロゲルモールドの中央でカップに印刷された細胞；Ｃ：４８時間のインキュベーションの後に形成された細胞スフェロイド；Ｄ：７２時間のインキュベーションの後に形成された細胞スフェロイド。
【００６７】
【図３】図３は、３Ｄ組織培養モデルアッセイ（ｍｍ単位での寸法）の概略図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００６８】
材料及び方法
バイオインク：
本明細書においては、バイオインクとは、細胞が懸濁又は収容されてもよい、１又は２以上のタイプの高分子の水溶液として定義される。活性化又は架橋に際し、それは、バイオインクの化学的及び物理的組成により定義されるその物理的及び化学的特性を有するハイドロゲル構造を作製する。高分子は、合成及び天然ポリマー、タンパク質及びペプチドのアレイとして定義される。高分子は、それらの未変性状態であってもよく、又はアミン又はチオール反応性官能基により化学的に修飾されてもよい。
【００６９】
合成高分子は、以下を含んでもよい：
多糖類、例えばフルクトース、スクロース又はグルコース官能基を含むポリマー；
非イオン性ポリマー、例えばポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、ポリ（ヒドロキシエチルメタクリレート）（ＰＨＥＭＡ）、ポリ（ε−カプロラクトン）（ＰＣＬ）、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）、ポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）、ポリ（ＮＩＰＡＡＭ）及びポリ（プロピレンフマレート）（ＰＰＦ）及び誘導体；
高分子電解質−正又は負の荷電を担持するポリマー、両性及び双性ポリマー；
ポリペプチド−アミド結合により一緒に保持される多くのアミノ酸（最少２個のアミノ酸）の単一単鎖；
合成ポリマーを含む核酸塩基−核酸塩基（アデニン、チミン、グアニン又はシトシン）反復単位を有するポリマー。
【００７０】
天然高分子は、以下を含むことができる：
多糖類、例えばアルギネート、キトサン、ジェランガム、ヒアルロン酸、アガロース及びグリコサミノグリカン；
タンパク質、例えばゼラチン、フィブリン及びコラーゲン；
ＤＮＡ及びオリゴヌクレオチド、例えば一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）、ＤＮＡzyme及びアプタマー；
基底膜抽出物。
【００７１】
アミン反応性官能基は、以下を含んでもよい：アルデヒド、エポキシ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）及び２−ビニル−４，４−ジメチルアズラクトン（ＶＤＭ）。
【００７２】
チオール反応性官能基は、以下を含んでもよい：アルケン、アルキン、アジド、ハロゲン及びシアネート。
【００７３】
使用され、そして適切であることが見出されたバイオインクは、１０％ｖ／ｖＦＣＳ、Ｌ−グルタミン及びピルビン酸ナトリウムが補充されたカルシウムフリーＤＭＥＭに溶解されたアルギネート（２％ｗ／ｖ）であった。
【００７４】
分散されたＳＫ−Ｎ−ＢＥ（２）神経芽腫細胞を有するバイオインクは、細胞を含むバイオインクとして言及される。
活性化剤：
【００７５】
活性化剤は、ハイドロゲル構造を形成するためにバイオインクと相互作用する小分子又は高分子の何れかを含む水溶液である。活性化剤の組成は、得られるハイドロゲルの物性を制御するよう変更され得る。使用される活性化剤のタイプは、使用される高分子及び意図される架橋工程に高く依存する。
【００７６】
活性化剤は、以下から選択され得る：
無機塩、例えば炭酸カルシウム、塩化カルシウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム。 水酸化ナトリウム及び塩化バリウム；
光開始剤、例えば２，２−ジメトキシ−フェニルアセトフェノン（ＤＭＰＡ）及びイルガキュア；
高分子電解質−バイオインク中の高分子に反対の電荷を担持するポリマー、それは、カチオン、アニオン、両性及び双性イオンであり得た；
ポリペプチド−アミド結合により一緒に保持される、多くのアミノ酸（最少２個のアミノ酸）の単一の直鎖；
ＤＮＡリンカー−バイオインクの高分子上に存在するものを補充するヌクレオチド又はＤＮＡ配列を担持する高分子；
天然の又は化学的修飾を介してアミン又はチオール基を担持する天然又は合成高分子。
【００７７】
アルギネートバイオインクのために使用される活性化剤は、ＭｉｌｌｉＱ水に、４％ｗ／ｖで溶解された塩化カルシウムであった。
架橋又はゲル化：
【００７８】
これは、個々の高分子鎖がハイドロゲルを形成するために活性化剤により一緒に連結される工程である。架橋工程は、化学的又は物理的架橋により分類され得る。物理的架橋又は非共有架橋は、以下を含んでもよい：
イオン架橋−高分子及び活性化剤に存在する反対の電荷の相互作用を通しての架橋。活性化剤は、荷電されたオリゴマー、イオン性塩及びイオン性分子を含んでもよい；
水性結合−極性分子の静電引力を通しての架橋。この場合、高分子及び活性化剤は極性官能基を担持する；
温度架橋−温度の変化（加熱又は冷却）に対する応答としての、高分子鎖の再配列を介した架橋；
疎水性相互作用又はファンデルワールス力。
【００７９】
化学的又は共有架橋は、高分子と活性化剤との間の化学的反応を含む。反応の型は、以下を含んでもよい：
架橋反応がＵＶ又は光照射により促進される光架橋；
水性媒体中、チオールとビニル担持の高分子との間のマイケル型付加反応（Michael-type addition reaction）；
アミノ基とアルデヒド基との間のシッフ塩基反応；
ディールス・アルダー反応；
クリック化学；
活性エステル基へのアミノリシス反応；
酵素架橋。
【００８０】
他のバイオインク及び活性化剤の組合せの例が、下記表に示される：
【表１】
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【００８１】
細胞インク：
細胞インクは、３Ｄバイオ印刷工程の間中、細胞が均等に懸濁され、それが維持されたままである１又は２以上のタイプの分子又は高分子の水溶液である。細胞インクの濃度は、細胞の沈降を防ぐために最適化されるが、しかしまだ高い細胞生存性を維持している。
【００８２】
細胞インクは、下記から選択され得る：
小分子、例えばグリセロール；
高分子、例えばフィコール（商標）、デキストラン、アルギネート、ジェランガム、メチルセルロース及びポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）。
【００８３】
フィコール（商標）は、水溶液に容易に溶解する、中性、高分岐、高質量、親水性多糖類である。フィコール（商標）の半径は、２〜７ｎｍの範囲であり、そして多糖類とエピクロロヒドリンとの反応により調製される。フィルコール（登録商標）は、ＧＨ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社が所有する登録商標である。
【００８４】
使用される細胞インクは、ＰＢＳに溶解されたフィコール（商標）４００（１０％ｗ／ｖ）であった。
【００８５】
分散されたＳＫ−Ｎ−ＢＥ（２）神経芽腫細胞は、細胞を含む細胞インクとして言及される。
【００８６】
ジェランガムは、細菌スフィンゴモナス・エロデア（Sphingomonas elodea）（以前は、シュードモナス・エロデア（Pseudomonas elodea））により生成される水溶性アニオン性多糖類である。
細胞培養溶液：
【００８７】
細胞培養溶液は、培養された細胞と接触する液体であり、そして種々の細胞関連の作業のために適切である。調製方法は、塩及びｐＨバランスの注意した分析、生体適合性分子のみの取り込み、及び滅菌を含む。
【００８８】
細胞培養溶液のいくつかは、以下を含む：
細胞培地、例えばダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、最小必須培地（ＭＥＭ）、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、Ｍｅｄｉａ １９９、Ｈａｍ’ｓ Ｆ１０、 Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２、 ＭｃＣｏｙ‘ｓ ５Ａ及びロズウェルパーク記念研究所（ＲＰＭＩ）培地；
成長サプリメント、例えばウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、表皮成長因子（ＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＢＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＢＦ）、内皮細胞増殖因子（ＥＣＧＦ）、インスリン様成長因子1（ＩＧＦ−１）及び血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）；
生物学的緩衝液、例えばＰＢＳ、ＨＥＰＥＳ及びＣＨＥＳ；
キレート化及び安定化溶液；
滅菌MilliQ水。
細胞培養条件：
【００８９】
細胞及び３Ｄ組織培養モデルは、標準的細胞培養技法を用いて、インキュベートされ、培養され、そして維持され得る。ハイドロゲルモールドに封入された細胞を含む３Ｄ組織培養モデルは、細胞増殖又はスフェロイド形成を可能にするか、又は維持するための条件下でインキュベートされ得る。インキュベーションは典型的には、ほとんどの動物及びヒト細胞系で、約３７℃、５％のＣＯ2レベルで少なくとも２４時、実施される。インキュベーションは、ハイドロゲルモールドにおいて細胞型の増殖、維持又はスフェロイド形成を可能にする、任意の適切な条件、温度及び時間、実施され得ることは理解されるであろう。
実用溶液：
【００９０】
実用溶液は、細胞と接触しないが、しかし細胞に暴露されるすべてのプリンター表面を清浄し、そして滅菌するために使用される溶液として定義される。それらの溶液は、下記を含む：
正しい濃度のエタノール；
無菌MilliQ水；
細胞培養培地；
洗剤（detergent）；
過酸化水素溶液（最大２％ｗ／ｖの濃度）。
印刷基材：
【００９１】
印刷基材は、印刷された細胞構造を封入し、そして培養するために使用される生体適合性消耗品である。それらの基材は、以下を含むことができる：
異なるウェル構成のマイクロタイタープレート（６、２４、４８及び９６ウェル）；
異なるウェル構成のカバースリップ底を有するマイクロタイタープレート（６、２４、４８及び９６ウェル）；
カバースリップ及び顕微鏡スライド；
種々の大きさの蛍光ディッシュ；
異なるチャンバー構成のチャンバースライド（１、２、４、８及び１６）。
３Ｄバイオ印刷プラットフォーム：
【００９２】
Inventia Life Scienceにより開発され、そして組立てられた３Ｄバイオプリンターの概略が図１に示される。３Ｄバイオプリンター内の構成要素は、３軸運動制御ステージ、ドロップ−オン−デマンド液滴分配システム及び流体リザーバ内の圧力を制御するための圧力レギュレーターを含む。液滴分配システム及び３軸ステージは、無菌チャンバー、例えば層流キャビネット内に収容され得る。印刷プラットフォームは、多くの種類の基材、例えばマイクロ−ウェルプレート及びペトリ皿上を印刷するためのアダプターを含む。印刷プラットフォームは、細胞増殖を助けるために、３７℃に加熱され得る。
【００９３】
３Ｄ軸運動制御ステージは、すべての３つの（Ｘ、Ｙ及びＺ）次元において１０μｍの解像度で液体分配システムを正確に位置決定することができる。４つの液滴分配システムは、マイクロコントローラーにより制御されるジュエリーオリフィス分配ノズル（jewelled orifice dispensing nozzle）を備えたソレノイド弁からなる。ジュエリーオリフィスノズルの内径は、流体粘度及び所望の液滴体積に依存して、１２７〜２５４μｍであり得る。各液滴分配システムは、柔軟な管を介して分配されるバイオインク及び活性化剤溶液のための静圧リザーバに取り付けられる。所望の液滴体積は、流体レザーバ内の背圧(backpressure)及びソレノイド弁の開放時間を用いて調整され得る。典型的には、背圧は、1〜60ｐｓｉの圧力に設定され、ソレノイド弁の開放時間は、０．３ｍｓ又はそれ以上であり、そして液滴体積は１〜５００ｎｌである。バイオインク及び活性化剤レザーバを連結する柔軟な管は、システムをプライムし、そして印刷ルーチンの最後にパージするのにかかる時間を最小限にするために、できるだけ短くした。
制御ソフトウェア：
【００９４】
３Ｄバイオプリンターは、生物学的アッセイを印刷するために開発されたカスタムソフトウェアを通して制御される。ソフトウェアは、グラフィカルユーザーインターフェース（ＧＵＩ）を含む。ＧＵＩを通して、エンドユーザーは、異なるアッセイ印刷ルーチンを選択し、そしてアッセイパラメーター、例えば液滴間隔及び液滴体積を変更することができる。ユーザーは、液滴分配システムの空間位置を手動で制御し、そして液滴のカスタムパターンを創造することもできる。ソフトウェアの追加の特徴は、液滴分配システムのプライミング及びパージのためのルーチンを含む。
バイオインクの調製：
【００９５】
最初に、バイオインクは、適切な細胞培養溶液において適切なタイプ及び量の高分子を混合することにより調製される。均質性を達成した後、ブランクのバイオインクがＵＶ照射及び濾過（０．２２μｍのフィルター）の両者を用いて滅菌される。次に、バイオインクは、さらなる使用まで、４℃で維持される。
細胞の調製：
【００９６】
ＰＢＳにより洗浄することにより細胞を収穫する。ＰＢＳを吸引する。トリプシンを添加し、そして３７℃でインキュベートし、フラスコ表面から細胞を分離する。組織培養培地を添加し、分離された細胞を管中に集める。細胞を遠心分離し、上清液を吸引し、そしてペレットを新しい培地に再懸濁する。同量の細胞懸濁液及びトリパンブルー染色を混合することにより、細胞数を測定する。計算を行い、細胞濃度を決定する。次に、所望の数の細胞を、バイオインク、細胞インクに添加するか、又は細胞培養溶液に添加する。
活性化剤の調製：
【００９７】
正しいタイプ及び量の分子を、適切な細胞培養溶液に溶解した。得られる溶液を、使用の前、ＵＶ照射及び濾過により滅菌した。
細胞インクの調製：
【００９８】
正しいタイプ及び量の分子を、適切な細胞培養溶液に溶解した。均質性を達成した後、得られる溶液を、使用の前、ＵＶ照射及び濾過により滅菌した。次に、細胞インクを、さらなる使用まで、室温で保持した。
３Ｄバイオプリンターの調製：
【００９９】
作動流体を含む印刷カートリッジを、連結を通して３Ｄバイオプリンターに装填する。印刷ルーチンを開始する前、液滴分配システム及び連結流体チャネルを、エタノール、水、媒体及び空気により滅菌する。滅菌の後、液滴分配システムをプライムし、そして気泡を、流体システムから除去する。
細胞収穫：
【０１００】
一定の集密度での目的の培養細胞を、すでに確立されたプロトコルに従って収穫する。細胞を含むバイオインク又は細胞インクを作製するために、収穫された細胞を、２００μｌのバイオインク又は細胞インクに、２．５×１０8個の細胞／ｍｌの濃度を得るための正しい細胞濃度で再懸濁する。次に、得られる細胞ペレットを、適切な体積のバイオインク又は細胞インクに再分配する。細胞を含むバイオインク又は細胞インクは、３Ｄバイオプリンターへの使用の準備が整っている。
印刷カートリッジの調製：
【０１０１】
滅菌環境下で、活性化剤、バイオインク、及び細胞を含むバイオインク又は細胞インクを、マイクロピペットを用いて、適切なカートリッジバイアルに、ゆっくり装填し、小気泡の生成を回避する。次に、カートリッジを閉じ、その無菌性を維持し、そして印刷工程のためのプリンターに装填する。
ハイドロゲルモールドの印刷：
【０１０２】
ハイドロゲルモールドを、ドロップ−オン−ドロップ工程を用いて印刷し、それにより、バイオインクの液滴及び活性化剤の液滴を、互いに重ねて堆積させ、ハイドロゲルを生成した。この工程を反復し、そしてハイドロゲルの層を構築することにより、３Ｄハイドロゲル構造を形成することができる。中央に印刷された細胞を有する印刷されたハイドロゲルモールドの例が、図２に示される。
細胞型：
【０１０３】
スフェロイドなどの３D組織培養モデルは、接着細胞、例えば：：哺乳動物の肝臓細胞、胃腸細胞、膵臓細胞、腎臓細胞、肺細胞、気管細胞、血管細胞、骨格筋細胞、心臓細胞、皮膚細胞、平滑筋細胞、結合組織細胞、角膜細胞、泌尿生殖細胞、乳房細胞、生殖細胞、内皮細胞、上皮細胞、線維芽細胞、神経細胞、シュワン細胞、脂肪細胞、骨細胞、骨髄細胞、軟骨細胞、周皮細胞、中皮細胞、内分泌組織由来の細胞、間質細胞、幹細胞、前駆細胞、リンパ細胞、血液細胞、内胚葉由来細胞、外胚葉由来細胞、中胚葉由来細胞、又はそれらの組み合わせなどの接着細胞を含む任意の適切な細胞型から調整され得る。
【０１０４】
追加の細胞型は、真核細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣）、細菌（例えば、ヘリコバクターピロリ（Helicobacter pylori））、真菌（例えば、ペニシリウム・クリソゲナム（Penicillium chrysogenum））及び酵母（例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae））を含んでもよい。
【０１０５】
細胞株ＳＫ−Ｎ−ＢＥ（２）（神経芽細胞腫細胞）は、ある範囲の条件下で３Ｄ組織培養モデルを作成する工程において都合良く使用されて来た。他の細胞株が、開発された方法により生成された３Ｄ組織モデルにおいて、必要に応じて実施されることが予測されることは理解されるであろう。使用される他の細胞株は、以下を含む：ＤＡＯＹ（ヒト髄芽腫癌細胞）、Ｈ４６０（ヒト非小細胞肺癌）及びｐ５３R127H（ヒト膵臓癌細胞）。適切である他の細胞株は、段落番号０８８及び０８９に列挙される。
【０１０６】
３Ｄバイオ印刷技法は、ドロップ−オン−デマンド技法を通してハイドロゲルモールドに封入される高密度３Ｄ組織培養モデルを生成するために開発された。特に、３Ｄ印刷技法は、種々の３Ｄ構造を製造するために、層ごとに構築されるバイオインク及び活性化剤を用いて生体適合性ハイドロゲルモールドを印刷するのに使用された。ハイドロゲルモールドの製造の間、高細胞密度液滴は、ハイドロゲルモールド中に含まれ得る。
【実施例】
【０１０７】
実施例１
材料及び方法
【０１０８】
以下をそのまま使用した：アルギネート（５５％以上のグルロン酸含有、50,000〜80,000g / mol、FMC Biopolymer）、塩化カルシウム（Bio Reagent、Sigma Aldrich）、塩化カルシウムを含まないリン酸緩衝溶液（PBS、Gibco）、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM、Gibco）、カルシウム非含有DMEM（Gibco）、ピルビン酸ナトリウム（Gibco）、L-グルタミン（Gibco）、ジェランガム（Sigma Aldrich）、トリプシン（Sigma Aldrich）、0.22μmシリンジフィルター（ポリエーテルスルホン膜、Merck Millipore）、T150フラスコ（Corning）、15ml遠心分離管（Corning）、エタノール（Sigma Aldrich）。組織培養培地を、１０％v/vのＦＣＳとＤＭＥＭとを混合することにより作製した。
細胞型：
【０１０９】
ＳＫ−ＮＢＥ（２）神経芽腫細胞を使用した。
細胞培養：
【０１１０】
Ｔ１５０フラスコ中の８０％の集密性での神経芽腫を、３ｍｌのＰＢＳにより洗浄した。過剰のＰＢＳの吸引の後、３ｍｌのトリプシンを添加し、そしてフラスコを３７℃で５分間、インキュベートし、細胞表面から細胞を解離した。続いて、７ｍｌの組織培地を添加し、そして解離された細胞を、１５ｍｌの管中に移した。細胞分散液を、４００ｇで３分間、遠心分離した。上清液を捨て、そして細胞ペレットを、５ｍｌの培地に再懸濁した。次に、細胞の計数を、等体積の細胞懸濁液及びトリパンブルー染色を混合することにより実施し、細胞濃度を決定した。
基質：
【０１１１】
Corning社により供給される６ウェルマイクロタイタープレートを、そのまま使用した。無菌包装を、内容物の無菌性を維持するために無菌環境下で開封した。
バイオインク：
【０１１２】
ピルビン酸ナトリウム（１００ｍＭで５．５ｍｌ）、ＦＣＳ（４４ｍｌ）及びＬ−グルタミン（２００ｍＭで５．５ｍｌ）を、カルシウムフリーのＤＭＥＭ（５００ｍｌ）に添加し、バイオインク分散体を創造した。アルギネート（０．２ｇ）を、激しい攪拌下で、前記分散体（１０ｍｌ）にゆっくり添加し、２％ｗ／ｖでバイオインクを得た。次に、得られる均質溶液を、０．２２μｍのシリンジフィルターを通して、滅菌環境下で濾過した。
活性化剤：
【０１１３】
塩化カルシウム（０．４ｇ）を、１０ｍｌのＭｉｌｌｉＱ水に溶解し、４％ｗ／ｖにした。次に、その溶液を、１０分間、ＵＶ滅菌し、そして滅菌環境下で０．２２μｍのフィルターを通して濾過した。
細胞インク：
【０１１４】
ジェランガム（０．０５ｇ）を、１０ｍｌの温ＰＢＳに溶解し、０．５％ｗ／ｖにした。その溶液を、室温に冷却するよう、渦動した。次に、その溶液を、１０分間、ＵＶ滅菌し、そして滅菌環境下で０．２２μｍのフィルターを通して濾過した。
【０１１５】
１０×１０6個の細胞／ｍｌでＤＭＥＭに分散された、収穫された神経芽腫細胞（５ｍｌ）を、遠心分離し、５０×１０6個の細胞の細胞ペレットを得た。次に、得られるペレットを、細胞インク（０．２ｍｌ）に再分散し、２５０×１０6個の細胞／ｍｌで、分散されたＳＫ−Ｎ−ＢＥ（２）細胞を有するバイオインク溶液を得た。
細胞印刷条件：
【０１１６】
最初に、プリンターを、エタノール（水中、７０％v/v）による拭き取りにより滅菌し、空気乾燥し、そしてバイオセーフティキャビネット内に配置した。流体ライン及び液滴分配システムをまた、エタノール、水、滅菌ＭｉｌｌｉＱ水、及び組織培養培地パージを用いて、この順に滅菌した。次に、細胞を含む細胞インク、バイオインク、及び活性化剤を、それらのそれぞれのバイアルに装填した。次に、液滴分配システムを、印刷ルーチンを開始する前、流体供給ラインから空気をパージすることによりプライムした。
【０１１７】
各流体についての液滴分配システムは、異なるノズル直径、及びリザーバ内の供給圧力を使用した。バイオインク、活性化剤、及び細胞インク＋細胞についてのノズル直径は、それぞれ、０．００７”、０．００３”及び０．００７”であった。バイオインク、活性化剤、及び細胞インク＋細胞についての供給圧力は、それぞれ、４０、５及び１２ｐｓｉであった。
【０１１８】
ハイドロゲルモールドは、図２に示されるように、円筒状のパターン内にバイオインク及び活性化剤液滴の複数の層を含んでいた。ハイドロゲルモールド内の各層を、バイオインクの液滴、次に活性化剤の液滴を上部に直接又はその逆に付着させ、そしてこの工程を反復し、円筒状の構造を形成することにより印刷した。最初の２つの層の後、バイオインク又は活性化剤は、円筒構造の中心に付着させず、構造の中心で窪み又はカップを残した。この工程を、複数の続く層について反復した。細胞を含む細胞インクの１〜５つの液滴を、ハイドロゲルモールド中の中心又はカップに付着させた。最後に、ハイドロゲルの追加の層を、同じ様式で印刷し、ハイドロゲルモールド内の細胞を封入した。
【０１１９】
印刷が完結された後、マイクロタイタープレートを、インキュベーター（３７℃及び５％ＣＯ2）に７２時間、置いた。
細胞濃度：
【０１２０】
２５０×１０6個の細胞/ｍｌでＳＫ−Ｎ−ＢＥ（２）を有する細胞インクを、実験に使用した。
細胞生存性：
【０１２１】
９５％以上か又はそれに等しい細胞生存率を得た。
実施例２
【０１２２】
ハイドロゲルモールド又はカップを、実施例１に記載のようにして、それぞれ４０ｐｓｉ、１２ｐｓｉ及び５ｐｓｉの供給圧力で、バイオインク、細胞インク及び活性化剤を用いて印刷した。細胞インク中のＳＫ−Ｎ−ＢＥ（２）細胞を、１億個の細胞／ｍｌの濃度でハイドロゲルカップの中心に印刷した。印刷された３Ｄ細胞培養モデルの顕微鏡画像は、２４、４８及び１２０時間のインキュベーションの後、細胞スフェロイド形成を示した。
実施例３
【０１２３】
ハイドロゲルモールド又はカップを、実施例１に記載のように、それぞれ４０ｐｓｉ及び５ｐｓｉの供給圧力で、バイオインク及び活性化剤を用いて印刷した。細胞インクは、１６．５％ｗ／ｖを得るためにＰＢＳに溶解されたフィコール（商標）（Sigma Aldrich, １．６５ｇ）であった。細胞インク中のＳＫ−Ｎ−ＢＥ（２）細胞を、２０ｐｓｉの供給圧力で、２億５，０００万個の細胞／ｍｌの濃度でハイドロゲルカップの中心に印刷した。印刷された３Ｄ細胞培養モデルの顕微鏡画像は、２４、４８及び７２時間のインキュベーションの後、細胞スフェロイド形成を示した。
実施例４
【０１２４】
ハイドロゲルモールド又はカップを、実施例３に記載のように、それぞれ４０ｐｓｉ、２０ｐｓｉ及び５ｐｓｉの供給圧力で、バイオインク、細胞インク及び活性化剤を用いて印刷した。細胞インク中のｐ５３R127H細胞を、２億５，０００万個の細胞／ｍｌの濃度でハイドロゲルカップの中心に印刷した。印刷されたモデルの顕微鏡画像は、２４、４８及び７２時間のインキュベーションの後、細胞スフェロイド形成を示した。
実施例５
【０１２５】
ハイドロゲルモールド又はカップを、実施例３に記載のようにして、それぞれ４０ｐｓｉ及び５ｐｓｉの供給圧力で、バイオインク、細胞インク及び活性化剤を用いて印刷した。細胞インクは、１０％w/vを得るためにＰＢＳに溶解されたフィコール（商標）（Sigma Aldrich, １ｇ）であった。細胞インク中のｐ５３R127H細胞を、２０ｐｓｉの供給圧力で、２億５，０００万個の細胞／ｍｌの濃度でハイドロゲルカップの中心に印刷した。細胞の液滴を封入するモールドを、３７℃でインキュベートし、２４〜４８時間のインキュベーションの後、細胞増殖及びスフェロイド形成を可能にした。
実施例６
【０１２６】
ハイドロゲルモールド又はカップを、実施例５に記載のように、それぞれ４０ｐｓｉ、２０ｐｓｉ及び５ｐｓｉの供給圧力で、バイオインク、細胞インク及び活性化剤を用いて印刷した。細胞インク中のＤＡＯＹ細胞を、２億５，０００万個の細胞／ｍｌの濃度でハイドロゲルカップの中心に印刷した。細胞の液滴を封入するモールドを、３７℃でインキュベートし、２４〜４８時間のインキュベーションの後、細胞増殖及びスフェロイド形成を可能にした。
実施例７
【０１２７】
ハイドロゲルモールド又はカップを、実施例５に記載のように、それぞれ４０ｐｓｉ、２０ｐｓｉ及び５ｐｓｉの供給圧力で、バイオインク、細胞インク及び活性化剤を用いて印刷した。細胞インク中のＨ４６０細胞を、２億５，０００万個の細胞／ｍｌの濃度でハイドロゲルカップの中心に印刷した。細胞の液滴を封入するモールドを、３７℃でインキュベートし、２４〜４８時間のインキュベーションの後、細胞増殖及びスフェロイド形成を可能にした。
実施例８
【０１２８】
ハイドロゲルモールド又はカップを、実施例５に記載のように、それぞれ４０ｐｓｉ、２０ｐｓｉ及び５ｐｓｉの供給圧力で、バイオインク、細胞インク及び活性化剤を用いて印刷した。細胞インク中のＳＫＯＶ−３細胞を、２億５，０００万個の細胞／ｍｌの濃度でハイドロゲルカップの中心に印刷した。細胞の液滴を封入するモールドを、３７℃でインキュベートし、２４〜４８時間のインキュベーションの後、細胞増殖及びスフェロイド形成を可能にした。
アプリケーション
３Ｄ組織培養モデルアッセイ：
【０１２９】
３Ｄ組織培養モデルアッセイを、マルチ−ウェルプレート、例えば９６ウェルプレート中のウェルの内部に構築した。第１段階は、３Ｄ組織培養モデルを支持するであろう円筒状ハイドロゲル構造又はモールドの下半分を印刷することであった。これは、バイオインク及び活性化剤を用いたドロップ−オン−ドロップ工程を用いて達成される。次に、高密度の細胞を含む細胞リンク液滴を、図３に示されるように、円筒状ハイドロゲル構造の中心に印刷する。次いで、３Ｄ組織培養モデルを、バイオインク及び活性化剤を用いたドロップ−オン−ドロップ工程を用いて、さらに印刷することにより、ハイドロゲルに封入した。最後に、ウェル上の印刷工程を、薬物又は他の試験剤（５０、１００、１５０又は２００μｌ）を含む増殖培地を置くことにより終了する。
インビトロアプリケーション：
【０１３０】
以下の生物学的表現型の試験は以下を含む（但し、それらだけには制限されない）：細胞運動、細胞遊走、細胞浸潤、経内皮遊走、上皮−間葉移行、間葉−上皮移行、スフェロイド形成及び成長、細胞分化（より具体的には幹細胞分化、細胞分化マーカーのモニタリング）、細胞死（より具体的には細胞アポトーシス；細胞壊死）、細胞オートファジー、細胞増殖、細胞代謝、タンパク質の代謝回転、タンパク質の分布及び位置、細胞シグナル伝達及び下流事象、薬物効力、薬物薬力学、作用の薬物メカニズム、薬物受容体媒介輸送、薬物インターナリゼーションのメカニズム、バイオマーカー評価、細胞−細胞接合、細胞−細胞のシグナル伝達及び下流事象、細胞形態、細胞接着、遺伝子発現、タンパク質発現、細胞ホーミング、細胞周期調節及び制御、サイトカイン放出、インスリン産生、タンパク質分泌及び細胞内輸送（trafficking）および輸送(transport)、受容体−リガンド結合、抗体結合、抗体特異性、タンパク質リン酸化、プロテオソーム機能、酵素機能（より特異的には酵素阻害）、免疫調節、クローン原性、酸化的ストレス、タンパク質フォールディング、細胞細胞骨格、オルガネラの形態学及び機能（より具体的には、ミトコンドリア、葉緑体、ペルオキシソーム、分泌小胞、液胞、リボソーム、核、リソソーム、繊毛、小胞体、ゴルジ体）、膜輸送、低酸素症、血管新生、創傷治癒、神経突起（伸長または形成）、ホスファターゼ機能、ラメリポダイアル形成（lamellipodial formation）及び動態; 接着点（focal contact）／接着斑（focal adhesion）形成、動態及びシグナル伝達; 細胞感知、メカノトランスダクション。
【０１３１】
細胞に送達されるか、又は投与され得る物質のリストは、以下を含むが、但しそれらだけには限定されない：薬物、治療剤、抗体、小分子阻害剤、キナーゼ阻害剤、ホスファターゼ阻害剤、抗原、病原体、血小板、増殖因子、サイトカイン、アミノ酸、栄養素（単糖類及び多糖類）、馴化培地、抗生物質、抗ウイルス剤、ナノ粒子、ＲＮＡ及び関連する変異体（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなど）。
印刷構造型：
【０１３２】
細胞を含まない領域、及び少なくとも１つのスフェロイドを含む少なくとも１つの領域から部分的に構成される構造の印刷。
【０１３３】
少なくとも２つのスフェロイドを含む構造の印刷であって、ここで異なるスフェロイドは、同じか又は異なる細胞型から構成され得る。
【０１３４】
隣接するスフェロイドを含む構造の印刷であって、ここで隣接するスフェロイドは、同じか又は異なる細胞型であり得る。
【０１３５】
上記に列挙される物質の少なくとも１つを含む構造の印刷。
【０１３６】
広範に記載された本発明の精神又は範囲から逸脱することなく、特定の実施形態に示されるように、本発明に対して多くの変更及び／又は修飾を行うことができることは、当業者に理解されるであろう。従って、本実施形態は、すべての点で例示的であり、限定的ではないとしてみなされるべきである。
【０１３７】
参考文献
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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