(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）被験者から得た喀痰サンプルにおける、ＩＬ−１Ｒａ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３
、ＩＬ−１５、ＦＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ及びＶＥＧＦから成る群より選択される１以上の宿主
免疫系バイオマーカーのレベルを決定し、
（ｂ）喀痰サンプルにおけるバイオマーカーのレベルを１以上の基準値と比較すること
を含む、
被験者において結核を検出するための方法であって、
基準値と比較された喀痰サンプルにおけるバイオマーカーのレベルが被験者における結
核の存在または非存在を示し、
基準値と比較して減少したＩＬ−１Ｒａ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、Ｇ−
ＣＳＦ及び／又はＶＥＧＦのレベルが被験者における結核の存在を示し、及び／又は、基
準値と比較して増加したＦＧＦのレベルが被験者における結核の存在を示す、方法。
【請求項２】
バイオマーカーが更に１以上のＴｈ１サイトカインを含み、基準値と比較して減少した
Ｔｈ１サイトカインバイオマーカーのレベルが被験者における結核の存在を示す、請求項
１記載の方法。
【請求項３】
Ｔｈ１サイトカインがＩＦＮ−γを含む、請求項２記載の方法。
【請求項４】
バイオマーカーがＩＬ−１３、ＦＧＦおよびＩＦＮ−γを含む、請求項１〜３のいずれ
か１項記載の方法。
【請求項５】
被験者が肺疾患に罹患している疑いがあり、被験者が、慢性咳、体重減少および発熱か
ら選択される１以上の症状を示す、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
基準値と比較された喀痰サンプルにおけるバイオマーカーのレベルが、被験者が結核に
罹患しているのか、あるいは別の呼吸器障害、例えば肺炎、喘息または慢性閉塞性肺疾患
に罹患しているかの指標である、請求項５記載の方法。
【請求項７】
基準値が、結核に罹患していない被験者からの喀痰サンプルにおけるバイオマーカーの
レベルを含む、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
バイオマーカーのレベルを側方流動イムノアッセイ、多重サイトカインアッセイまたは
抗体アレイにより決定する、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
被験者から得られた喀痰サンプルにおけるＩＬ−１Ｒａ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、Ｉ
Ｌ−１５、ＦＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ及びＶＥＧＦから成る群より選択される１以上の宿主免疫
系バイオマーカーを検出するのに適した１以上の試薬を含む、請求項１〜８のいずれか１
項に記載の方法を用いて被験者における結核を検出するための側方流動イムノアッセイ装
置。
【請求項１０】
該装置が、前記１以上のバイオマーカーに特異的に結合する１以上の抗体を含む、請求項９記載の装置。
【請求項１１】
バイオマーカーがＩＬ−１３、ＦＧＦおよびＩＦＮ−γを含む、請求項９又は１０記載の装置。
【請求項１２】
該装置が、標識抗体および固定化抗体を含み、標識抗体および固定化抗体のそれぞれがバイオマーカー上の異なるエピトープに結合する、請求項９〜１１のいずれか１項記載の装置。
【請求項１３】
固定化抗体がクロマトグラフィー担体物質上に結合している、請求項１２記載の装置。
【請求項１４】
該装置が試験ストリップまたはディップスティックの形態である、請求項９〜１３のいずれか１項記載の装置。
【請求項１５】
被験者における結核の存在が、該装置を喀痰サンプルと接触させた後、該装置の試験領域において、視認可能なシグナルにより示される、請求項９〜１４のいずれか１項記載の装置。
【請求項１６】
被験者において結核を検出するための、請求項９〜１５のいずれか１項記載の側方流動イムノアッセイ装置の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は疾患のバイオマーカーの分野に関する。１つの態様においては、本発明は、そのようなバイオマーカーを使用して被験者において結核を検出または診断するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発展途上国においては、人口過密、劣悪なインフラおよび高いＨＩＶ感染率ゆえに、結核は重大な公衆衛生上の問題である［１］。結核（ＴＢ）感染を減少させることにおける大きな障害の１つは、初期診療所（プライマリーヘルスクリニック）において使用される正確な診断試験が存在しないことである。そのような診療所が結核患者の大多数（６０％）を診察するが、検査により確認された結核の診断を提供することができないのである［２］。時を得た且つ正確な診断が無ければ、患者１人当たり１年当たり１５回の割合の密接な接触で感染が生じる［３］。
【０００３】
現在の結核診断試験は喀痰サンプルにおける細菌の検出を要する。しかし、これらは、非生産的な又は少菌性の喀痰ゆえにＨＩＶ陽性被験者においては特に、感度および特異性において相当な変動を示す。現在の代表的な診断試験である喀痰培養は長時間を要し、高価であり、汚染を受けやすく、基盤設備を要する。分子に基づく新規試験、例えばＧｅｎｅＸｐｅｒｔ（登録商標）は結核およびリファンピシン耐性の迅速な検出をもたらすが、高価であり、基盤設備を要し、塗抹試験陰性被験者（小児およびＨＩＶ陽性者を含む）においては感度不足である。
【０００４】
マイクロフルイディクス（側方流動試験）に基づく迅速な試験は結核診断に著しく有望である。それらは使用し易く、安価であり、数分以内に結果を示し、特別な設備を要さず、室温で安定であり、これらのことは高い結核負荷、資材に乏しい状況における使用にそれらを理想的なものとする。側方流動試験は体液（尿および血液が最も一般的である）のサンプル中のマーカーを検出する。しかし、現在のところ、そのような試験は、マーカーおよび／またはサンプル型に関連した感度不足ゆえに、結核用には開発されていない。
【０００５】
血液に基づく現在のＩＦＮ−γ放出アッセイ（ＩＧＲＡ）の低い感度［４］は結核の活動期中における血液から肺への結核特異的細胞の遊走によるものでありうる。なぜなら、胸水中には、同じ被験者の血液と比べて有意に高いレベルの細胞性および可溶性宿主免疫マーカーが存在するからである［５］。分析は、ＨＩＶの状態には無関係に、結核または他の呼吸器疾患の、９６％の正確な分類をもたらした［５］。更に、高レベルのマーカーが直接的にエクスビボで存在しており、分析は抗原刺激を要しなかった。Ｍｔｂ抗原は感染の段階によって相当に変動し、このことは、抗原非依存的試験が特異性を増強することを示唆している。
【０００６】
微生物学的検査による結核の診断が喀痰サンプルの収集に依存しているにもかかわらず、他の呼吸器疾患、例えば喘息［６］、嚢胞性線維症［７］および慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）［７］で見られるのとは異なり、可溶性画分（すなわち、宿主バイオマーカー）の診断可能性は評価されていない。
【０００７】
したがって、被験者において結核を検出するための改良された方法が尚も必要とされている。特に、正確であるが迅速で経済的でありポイントオブケア（すなわち、検査施設以外の状況）での使用に適した方法が必要とされている。
【発明の概要】
【０００８】
発明の概括
したがって、本発明は、（ａ）被験者から得た喀痰サンプルにおける１以上の宿主免疫系バイオマーカーのレベルを決定し、（ｂ）喀痰サンプルにおけるバイオマーカーのレベルを１以上の基準値と比較することを含む、被験者において結核を検出するための方法であって、基準値と比較された喀痰サンプルにおけるバイオマーカーのレベルが被験者における結核の存在または非存在を示す、方法を提供する。
【０００９】
１つの実施形態においては、バイオマーカーは可溶性タンパク質を含む。例えば、バイオマーカーは１以上のサイトカイン、ケモカインおよび／または増殖因子を含みうる。
【００１０】
１つの実施形態においては、バイオマーカーは１以上のＴｈ２サイトカインを含む。好ましくは、基準値と比較して減少したＴｈ２サイトカインのレベルは被験者における結核の存在を示す。１つの実施形態においては、Ｔｈ２サイトカインはインターロイキン−１０（ＩＬ−１０）および／またはインターロイキン−１３（ＩＬ−１３）を含む。
【００１１】
もう１つの実施形態においては、バイオマーカーは、インターロイキン−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１Ｒａ）、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＡ）および血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）から選択される１以上のサイトカインを含む。好ましくは、基準値と比較して減少したＩＬ−ＩＲａ、ＩＬ−１５、Ｇ−ＣＳＦおよび／またはＶＥＧＦのレベルは被験者における結核の存在を示す。
【００１２】
もう１つの実施形態においては、バイオマーカーは線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）を含む。好ましくは、基準値と比較して増加したＦＧＦのレベルは被験者における結核の存在を示す。
【００１３】
もう１つの実施形態においては、バイオマーカーは更に１以上のＴｈ１サイトカインを含む。好ましくは、基準値と比較して減少したＴｈ１サイトカインのレベルは被験者における結核の存在を示す。１つの実施形態においては、Ｔｈ１サイトカインはＩＦＮ−γを含む。
【００１４】
もう１つの実施形態においては、バイオマーカーは、ＩＬ−１Ｒａ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＦＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＶＥＧＦおよびＩＦＮ−γからなる群から選択される。好ましくは、バイオマーカーはＩＬ−１３、ＦＧＦおよび／またはＩＦＮ−γを含む。
【００１５】
１つの実施形態においては、被験者は肺疾患（または呼吸器障害）に罹患している疑いがあり、被験者は、慢性咳、胸痛および発熱から選択される１以上の症状を示す。好ましくは、基準値と比較された喀痰サンプルにおけるバイオマーカーのレベルは、被験者が結核に罹患しているのか、あるいは別の呼吸器疾患（例えば、肺炎、喘息または慢性閉塞性肺疾患）に罹患しているのかを示す。すなわち、バイオマーカーレベルは、被験者において結核が他の呼吸器疾患（例えば、肺炎、喘息または慢性閉塞性肺疾患）から識別されることを可能にする。
【００１６】
１つの実施形態においては、基準値は、結核に罹患していない被験者からの喀痰サンプルにおけるバイオマーカーのレベルを含む。したがって、喀痰サンプルにおけるバイオマーカーレベルは、好ましくは、対照サンプルにおける（それぞれの個々のバイオマーカーに関する）対応バイオマーカーレベルと比較される。１つの実施形態においては、対照サンプルは、他の肺疾患（または呼吸器障害）、例えば肺炎に罹患していない被験者を含みうる。
【００１７】
１つの実施形態においては、バイオマーカーのレベルはイムノアッセイにより決定される（例えば、各バイオマーカーは、抗体またはそのフラグメントを使用して検出される）。好ましくは、バイオマーカーレベルは、ＥＬＩＳＡアッセイを用いて決定される。１つの実施形態においては、検出は、側方流動イムノアッセイを用いて行われる。もう１つの実施形態においては、バイオマーカーは、例えばＬｕｍｉｎｅｘ（商標）ミクロスフェアを使用する多重（マルチプレックス）サイトカインアッセイを用いて検出される。
【００１８】
もう１つの態様においては、本発明は、（ａ）被験者からの喀痰サンプルにおけるバイオマーカーのレベルが被験者における結核の存在または非存在を示すかどうかを前記方法により決定し、（ｂ）喀痰サンプルにおけるバイオマーカーのレベルが結核の存在を示す場合には、結核に対して被験者を治療することを含む、肺疾患に罹患している疑いのある被験者の治療方法を提供する。
【００１９】
１つの実施形態においては、結核の治療は、抗結核剤の治療的有効量を被験者に投与することを含む。好ましくは、治療は、イソニアジド（ｉｓｏｎｉａｚｉｄ）、リファンピシン（ｒｉｆａｍｐｉｃｉｎ）、エタンブトール（ｅｔｈａｍｂｕｔｏｌ）および／またはピラジナミド（ｐｙｒａｚｉｎａｍｉｄｅ）を被験者に投与することを含む。もう１つの好ましい実施形態においては、結核の治療は少なくとも２カ月間、少なくとも４カ月間または少なくとも６カ月間投与される。
【００２０】
もう１つの実施形態においては、喀痰サンプルにおけるバイオマーカーのレベルが結核の非存在を示す場合には、該方法は、異なる呼吸器状態、例えば肺炎、喘息または慢性閉塞性肺疾患に対して被験者を治療することを含む。例えば、肺炎の治療は、アモキシシリン（ａｍｏｘｉｃｉｌｌｉｎ）、ドキシサイクリン（ｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅ）、クラリスロマイシン（ｃｌａｒｉｔｈｒｏｍｙｃｉｎ）、アジスロマイシン（ａｚｉｔｈｒｏｍｙｃｉｎ）および／またはエリスロマイシン（ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎ）を被験者に投与することを含みうる。
【００２１】
もう１つの態様においては、本発明は、被験者から得られた喀痰サンプルにおける１以上の宿主免疫系バイオマーカーを検出するのに適した１以上の試薬を含む、被験者における結核を検出するための側方流動イムノアッセイ装置を提供する。
【００２２】
１つの実施形態においては、該装置は、１以上の宿主免疫系バイオマーカーに特異的に結合する１以上の抗体を含む。好ましくは、該抗体は１以上のサイトカイン、ケモカインおよび／または増殖因子に結合する。より好ましくは、該抗体はＩＬ−１Ｒａ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＦＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＶＥＧＦおよびＩＦＮ−γの１以上に特異的に結合する。最も好ましくは、該抗体はＩＬ−１３、ＦＧＦおよび／またはＩＦＮ−γに結合する。
【００２３】
１つの実施形態においては、該装置は、標識抗体（例えば、検出可能なマーカー部分、例えば蛍光標識または放射能標識で標識された抗体）および固定化抗体（例えば、固相上に固定化された抗体）を含む。好ましくは、標識抗体および固定化抗体のそれぞれはバイオマーカー上の異なるエピトープに結合し、すなわち、該抗体はバイオマーカーへの結合に関して競合しない。したがって、標識抗体および固定化抗体は典型的にはバイオマーカーに同時に結合しうる。
【００２４】
好ましくは、固定化抗体はクロマトグラフィー担体物質上に固定化されている。クロマトグラフィー担体物質は典型的には毛管活性物質、例えば、喀痰サンプルの流体成分の移動（遊走）を可能にする物質である。
【００２５】
好ましい実施形態においては、該装置は試験ストリップまたはディップスティック、例えばクロマトグラフィー試験ストリップの形態である。１つの実施形態においては、試験ストリップとのサンプルの接触は固定化抗体へのサンプル中の液体の移動を可能にする。幾つかの実施形態においては、標識化抗体はクロマトグラフィー担体物質上に沈着しており、好ましくは、試験ストリップへのサンプルの添加の後で固定化抗体へと同様に移動する。好ましい実施形態においては、標識化抗体およびバイオマーカーは、クロマトグラフィーストリップの試験領域において固定化抗体により捕捉される複合体を形成する。被験者における結核の存在は、好ましくは、該装置を喀痰サンプルと接触させた後、該装置の試験領域において、視認可能なシグナル（例えば、変色）により示される。
【００２６】
もう１つの態様においては、本発明は、被験者において結核を検出するための、前記の側方流動イムノアッセイ装置の使用を提供する。
【００２７】
発明の詳細な説明
本発明は、被験者において結核を検出するための新規方法を提供する。結核抗原（これは動的であり、該細菌の状態、存在量、株および毒性によって変化する）を検出することを試みるのではなく、該方法は、結核に特異的なタンパク質識別特性を示す宿主バイオマーカーを有利に使用する。この識別特性は、感染の原因であるマイコバクテリウムの株によっては影響されず、このことは、該方法を、抗原に基づく既存方法より広範に適用可能なものとする。更に、該方法は、結核を他の肺状態、例えば肺炎から識別するために使用されうる。該方法は喀痰サンプルに対して行われるが、抗原刺激も培養も必要としないため、該方法は迅速であり、検査施設以外の状況において実施可能である。したがって、該方法は、針の使用も血液採取も伴うことなく、高度な診断技術を要することなく、そして基盤設備、例えば医療施設、電気などを要することなく行われうる。これは、発展途上国において該方法の使用を促進させる際に特に重要である。
【００２８】
結核の検出
１つの態様においては、本発明は、被験者において結核を検出するための方法を提供する。「結核を検出する」は、典型的には、該方法が、被験者が結核に罹患しているかどうかを決定するために使用されうることを意味する。したがって、特定の実施形態においては、該方法は、結核を診断するために、結核の存在に関して患者集団をスクリーニングするために、活動性結核感染を検出するために、肺のマイコバクテリア（例えば、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ））感染の存在を検出するために、および／または被験者における結核感染の進行をモニタリングするために使用されうる。
【００２９】
結核（ＴＢ）は、マイコバクテリウム、例えばマイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）による感染により一般に引き起こされる慢性感染症である。１つの実施形態においては、結核の検出はマイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）複合体の細菌による感染の検出を意味する。マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）複合体は、マイコバクテリウム・ツベルクローシス・センス・ストリクト（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｓｅｎｓｕ  ｓｔｒｉｃｔｏ）、マイコバクテリウム・アフリカヌム（Ｍ．ａｆｒｉｃａｎｕｍ）、マイコバクテリウム・ベイジン（Ｍ．Ｂｅｉｊｉｎｇ）などからなる。幾つかの場合に結核に関連づけられうるマイコバクテリウムの他の種には、マイコバクテリウム・ボビス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ）、マイコバクテリウム・カネッティ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃａｎｅｔｔｉ）およびマイコバクテリウム・ミクロティ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｉｃｒｏｔｉ）が含まれる。典型的には、そのようなマイコバクテリアに感染した被験者の約１０％のみが活動性（すなわち、症候性）結核を発生する。活動性結核感染は通常、主として肺を冒して、胸痛、発熱、および痰を産生する慢性咳のような症状を引き起こす。肺以外の症状も例えば中枢神経およびリンパ系において生じうる。したがって、本方法は、典型的には、例えば前記症状の１以上を被験者が示す活動性結核感染を検出するために使用される。
【００３０】
本方法は、結核を他の肺疾患または呼吸器障害、特に肺炎から識別するためにも使用されうる。該方法は、結核を非感染性肺疾患、例えば慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）および喘息から識別するためにも使用されうる。
【００３１】
肺炎は、ウイルスまたは細菌による感染により典型的に引き起こされる肺の炎症状態である。肺炎の症状は咳、体重減少、胸痛および発熱をも含みうる。したがって、多くの場合、被験者にＸ線撮影をすることなく肺炎を結核から識別することは困難である。しかし、肺炎および結核は典型的には全く異なる治療レジメンでの治療を要し、誤診の結果は非常に重大となりうる。例えば、個々の被験者に関する治療効力の低減だけでなく、不正確な診断は感染症伝播の増強および経時的な薬物耐性の増強につながりうる。したがって、１つの態様において、本発明は、肺疾患に罹患している疑いのある（例えば、結核および／または肺炎の指標となる１以上の症状を示す）被験者が結核に罹患しているのか又は肺炎のような別の肺疾患に罹患しているのかを決定するための改良方法を提供する。
【００３２】
被験者
１つの実施形態においては、被験者（対象）はヒトである。しかし、本発明の方法はヒトには限定されず、例えば非ヒト哺乳動物に対しても実施されうる。好ましい実施形態においては、被験者は成人であるが、幾つかの実施形態においては、該方法は小児または乳児に対して実施されうる。
【００３３】
典型的には、被験者は肺疾患に罹患している疑いがある。したがって、被験者は、肺疾患、例えば慢性咳（典型的には痰の産生を伴うもの）、胸痛、呼吸困難、発熱および／または体重減少に関連した１以上の症状を示しうる。
【００３４】
サンプル
本発明の幾つかの実施形態においては、バイオマーカーは、被験者からの喀痰サンプルにおいて検出される。喀痰（または痰）は、肺に由来する濃厚粘性流体である。喀痰サンプルは典型的には咳により肺から排出される。喀痰は唾液からは区別されるべきであり、唾液はかなり希薄であり、肺ではなく口に由来する。
【００３５】
結核のような肺疾患に罹患している疑いのある被験者は典型的には、本明細書に記載されている方法を使用して分析されうる相当量の喀痰を産生する。被験者から喀痰サンプルを得るための方法はよく知られている。例えば、幾つかの場合には、被験者は、１回または２回深く息を吸い、ついで濃厚粘性喀痰サンプルを吐き出しうるまで咳をするように指示されうる。
【００３６】
必要に応じて、喀痰サンプルを得る際に被験者を補助するために更に幾つかの手段が講じられうる。温かい湿った空気を吸うことは気道の粘液を薄めて、喀痰サンプルを喀出することをより容易にしうる。例えば、被験者は、３〜１５％の塩溶液を含む霧状物（例えば、ジェット携帯ネブライザーまたは超音波ネブライザーにより供給されるもの）を、咳をする前に５〜１５分間吸うことが可能である。
【００３７】
宿主免疫系バイオマーカー
本発明の幾つかの実施形態においては、１以上の宿主免疫系バイオマーカーが検出される。「宿主バイオマーカー」は、典型的には、該バイオマーカーが（例えば、被験者に感染した病原体ではなく）被験者自体に由来することを意味する。例えば、宿主バイオマーカーは、感染因子の遺伝物質ではなく被験者のゲノムによりコードされうる。したがって、典型的には、宿主バイオマーカーはヒトタンパク質バイオマーカーである。
【００３８】
「免疫系バイオマーカー」は、典型的には、該バイオマーカーが被験者の免疫系において発現されることを意味する。例えば、該バイオマーカーは免疫系の細胞（例えば白血球、例えばリンパ球、好中球またはマクロファージ）により発現されることが可能であり、あるいは該バイオマーカーは免疫系の細胞に生物学的効果をもたらしうる。好ましい実施形態においては、該バイオマーカーの１以上は免疫調節物質である。
【００３９】
典型的には、該バイオマーカーは可溶性タンパク質またはペプチドである。例えば、該バイオマーカーは、免疫系の細胞により分泌される及び／又は免疫系の細胞上の細胞表面受容体に結合するシグナリング分子でありうる。
【００４０】
好ましい実施形態においては、該バイオマーカーは１以上のサイトカイン、ケモカインおよび／または増殖因子を含む。サイトカインは、しばしば免疫系の細胞（例えば、白血球）上の受容体に結合することによる免疫調節作用を典型的に有するシグナリング分子（通常はタンパク質またはペプチド）の一群である。サイトカインの亜群の例には、リンホカイン、インターロイキンおよびインターフェロンが含まれる。
【００４１】
ヘルパーＴ細胞応答は一般にはＴｈ１またはＴｈ２として分類され、Ｔｈ１は細胞内病原体に対する細胞性（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞およびマクロファージ）応答に古典的に関連しており、Ｔｈ２は細胞外病原体に対する体液性（例えば、Ｂ細胞による分泌抗体産生）応答に関連している。Ｔｈ１およびＴｈ２応答は典型的には特定のサイトカインに関連しており、これらはそれに応じて分類されうる。
【００４２】
１つの実施形態においては、バイオマーカーの１以上はＴｈ２サイトカインである。本明細書に示されているとおり、Ｔｈ２サイトカインのレベルは、結核を有する被験者からの喀痰サンプルにおいては、結核に罹患していない被験者の場合と比較して低い。したがって、Ｔｈ２サイトカインは、好ましくは、インターロイキン−４、インターロイキン−１０またはインターロイキン−１３である。より好ましくは、バイオマーカーの１以上はＩＬ−１０またはＩＬ−１３を含む。そのような実施形態においては、基準値と比較して減少した１以上のＴｈ２サイトカインのレベルは典型的には被験者における結核の存在を示す。
【００４３】
あるいは、幾つかの実施形態においては、バイオマーカーの１以上はＴｈ１サイトカインである。Ｔｈ１サイトカインには、例えばインターフェロン−γが含まれる。幾つかの実施形態においては、実施例において示されているとおり、特定のＴｈ１サイトカインのレベルが結核患者と非結核患者との間で統計的に異ならないことがある場合であっても、Ｔｈ１サイトカイン、例えばＩＦＮ−γは、他のバイオマーカーと組合せて使用される場合には、診断のための潜在能力を有しうる。したがって、好ましい実施形態においては、バイオマーカーの１以上がＴｈ１サイトカインである場合、少なくとも１つの他の宿主免疫系バイオマーカー（例えば、Ｔｈ２サイトカインおよび／または増殖因子）が測定される。そのような実施形態においては、基準値と比較して減少した１以上のＴｈ１サイトカインのレベルは典型的には被験者における結核の存在を示す。
【００４４】
前記のものに加えて、種々の他のサイトカインが本発明の個々の実施形態において使用されうる。例えば、追加的サイトカインには、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７およびＴＮＦ−αが含まれる。特に好ましいサイトカインには、インターロイキン−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１Ｒａ）、インターロイキン−１５、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）および顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）が含まれる。基準値と比較して減少したそのようなサイトカインのレベルは典型的には被験者における結核の存在を示す。
【００４５】
ケモカインは、細胞間の化学誘引（走化性）を媒介するシグナリング分子である。ケモカインは、典型的には、炎症部位への白血球（例えば、好中球、単球／マクロファージまたはリンパ球）のような細胞のリクルートを、例えばそのような細胞上の細胞表面受容体への結合によりもたらす。ケモカインは一般には可溶性タンパク質またはペプチドであり、幾つかの場合にはサイトカインの亜群として分類されうる。ケモカインの例には、単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）、マクロファージ炎症性タンパク質−１α（ＭＩＰ−１α）、マクロファージ炎症性タンパク質−１β（ＭＩＰ−１β）、インターフェロンガンマ誘導性タンパク質１０（ＩＰ−１０）、ＲＡＮＴＥＳ（Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｏｎ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，Ｎｏｒｍａｌ  Ｔ  ｃｅｌｌ  Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ａｎｄ  Ｓｅｃｒｅｔｅｄ）およびエオタキシンが含まれる。
【００４６】
増殖因子は、典型的には細胞の成長、増殖および／または分化（血管新生を含む）を刺激しうるシグナリング分子である。サイトカインとして分類される幾つかの物質、例えばＶＥＧＦ、Ｇ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦは増殖因子とみなされることも可能であり、その逆も言える。増殖因子は一般にはタンパク質またはペプチドまたはステロイドである。本発明の幾つかの実施形態においては、バイオマーカーの１以上は線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）を含む。典型的には、基準値と比較して増加した、喀痰サンプルにおけるそのような増殖因子のレベルは、被験者における結核の存在を示す。
【００４７】
バイオマーカーの組合せ
好ましい実施形態においては、複数（例えば、２、３、４、５、６個以上）の宿主免疫系マーカーのレベルが喀痰サンプルにおいて決定される。
【００４８】
１つの実施形態においては、該方法は、少なくとも１つのＴｈ２サイトカインおよび少なくとも１つの増殖因子のレベルを決定することを含む。もう１つの実施形態においては、該方法は、少なくとも１つのＴｈ１サイトカインおよび少なくとも１つのＴｈ２サイトカインのレベルを決定することを含む。好ましくは、該方法は、少なくとも１つのＴｈ１サイトカイン、少なくとも１つのＴｈ２サイトカインおよび少なくとも１つの増殖因子のレベルを決定することを含む。
【００４９】
特に好ましい実施形態においては、バイオマーカーは、ＩＬ−１Ｒａ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＦＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＶＥＧＦおよび／またはＩＦＮ−γからなる群から選択される。より好ましくは、バイオマーカーはＩＬ−１３、ＦＧＦおよび／またはＩＦＮ−γを含む。例えば、特定の実施形態においては、バイオマーカーは（ｉ）ＩＬ−１３およびＦＧＦ、（ｉｉ）ＩＬ−１３およびＩＦＮ−γ、（ｉｉｉ）ＦＧＦおよびＩＦＮ−γ、または（ｉｖ）ＩＬ−１３、ＦＧＦおよびＩＦＮ−γを含みうる。
【００５０】
バイオマーカーレベルの決定
本方法においては、バイオマーカーレベルは被験者からの喀痰サンプルにおいて決定される。サンプル中の個々のバイオマーカーの量はいずれかの適当な方法により測定されうる。例えば、タンパク質バイオマーカーを検出するための方法は、該タンパク質に選択的に結合する抗体、捕捉分子、受容体またはそれらの断片の使用を含みうる。本明細書に記載されているバイオマーカーに結合する抗体は公知であり、あるいは、動物の免疫化および血清（ポリクローナル抗体を製造するため）または脾臓細胞（モノクローナル抗体を得るために不死化細胞系との融合によりハイブリドーマを製造するため）の収集を含む当技術分野で公知の方法により製造されうる。本明細書に記載されているバイオマーカーのアミノ酸配列は公知であり、公にアクセス可能なデータベースから入手可能であり、抗体製造のために適当な免疫原を作製するために使用されうる。抗体のような検出分子は、所望により、固体支持体、例えばプラスチック表面もしくはビーズに、またはアレイにおいて結合されうる。タンパク質レベルを検出するための適当な試験形態には、イムノアッセイ、例えば酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ウエスタンブロット法、抗体アレイ、多重（マルチプレックス）サイトカインアッセイおよび免疫沈降が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００５１】
好ましい実施形態においては、バイオマーカーは、多重サイトカインアッセイを使用して、例えばＬｕｍｉｎｅｘ（商標）ミクロスフェアを使用して検出されうる。例えば、各サイトカインバイオマーカーに特異的に結合する抗体は、ミクロスフェア、例えば、Ｌｕｍｉｎｅｘ（商標）装置と共に使用されるように設計されたＬｕｍｉｎｅｘ（商標）ミクロスフェアに結合されうる。多数（例えば、１００個まで）の異なるタイプのミクロスフェアが混合され、一緒に分析されうる。１つの実施形態においては、該方法は単一の反応容器内で行われる。ミクロスフェアの各集団はその特有の蛍光識別特性または色により識別されうる。
【００５２】
典型的な多重サイトカインアッセイ形態においては、異なるビーズタイプは、異なるサイトカインバイオマーカーに対する抗体を含む。ビーズのアリコートを小容量の試験喀痰サンプルと共にインキュベートする。ついで該ビーズを洗浄して未結合サンプルを除去する。ついで、検出可能なマーカー（例えば、ストレプトアビジン−フィコエリトリンの添加により検出可能なビオチン）に結合した検出抗体を加える。ついで該サンプルを、例えば流動分析装置において、種々のビーズタイプの分離により分析し、該マーカーの存在に関して検出する。各ビーズからのシグナル強度を、ビーズ調製物中に含まれる陰性対照ビーズのシグナル強度と比較して、該ビーズが各サイトカインに関して陽性であるか陰性であるかを決定する。
【００５３】
もう１つの実施形態においては、バイオマーカーは、抗体アレイを使用して検出されうる。抗体アレイは、典型的には、固体支持体の別個の領域に固定化された免疫グロブリン分子またはその機能的誘導体もしくは等価体のアレイを含んでいて、異なる別個の領域は、異なるバイオマーカーに対する特異性を有する。固定化免疫グロブリンの、それらのそれぞれの抗原への結合パターンは、サンプルにおける個々のバイオマーカーの存在を示す。適当な抗体アレイは例えばＣｈａｎｇ（１９８３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ６５，２１７  ２２３およびＷＯ００／３９５８０に開示されている。
【００５４】
あるいは、バイオマーカータンパク質のレベルは質量分析により決定されうる。質量分析はアナライトの分子量によりアナライトの検出および定量を可能にする。当技術分野で公知の質量分析の分野におけるいずれかの適当なイオン化方法が使用可能であり、電子衝撃（ＥＩ）、化学イオン化（ＣＩ）、フィールドイオン化（ＦＤＩ）、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）、レーザー脱離イオン化（ＬＤＩ）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）および表面増強レーザー脱離イオン化（ＳＥＬＤＩ）を包含するが、これらに限定されるものではない。いずれかの適当な質量分析検出方法、例えば四重極質量分析（ＱＭＳ）、フーリエ変換質量分析（ＦＴ−ＭＳ）および飛行時間型質量分析（ＴＯＦ−ＭＳ）が使用されうる。
【００５５】
側方流動イムノアッセイ
特に好ましい実施形態においては、バイオマーカーのレベルは、側方流動イムノアッセイを用いて検出される。側方流動イムノアッセイは単一工程のポイントオブケア試験（ＰＯＣＴ）に特に適しており、標的分子の検出のための高感度かつ迅速な手段を提供する。側方流動イムノアッセイはサンドイッチまたは競合試験形態において使用されうる。一般に、幾つかの利用可能なエピトープを有する高分子量アナライトはサンドイッチ形態で分析可能であり、一方、単一の利用可能なエピトープのみを提示する、より小さい分子は、競合アッセイにより検出されうる。
【００５６】
適当な側方流動イムノアッセイ装置は例えばＵＳ  ２００５／０１７５９９２およびＵＳ  ２００７／００５９６８２に開示されている。典型的には、側方流動装置は試験ストリップまたはディップスティック（これはサンプル中に浸される）の形態でありうる。サンプル中の液体が適用域から試薬域へと側方に移動するように、該装置はクロマトグラフィー担体物質から形成されうる。典型的には、ついでアナライトの分子は、該アナライトに特異的な標識抗体と遭遇し、アナライト−抗体複合体を形成する。ついで、この複合体は試験線域に向かって更に側方に移動し続け、該試験線域においては、（例えば、サンドイッチアッセイ形態においては）もう１つの抗体がクロマトグラフィー担体物質上に固定化されている。この第２の（固定化）抗体は、典型的には、第１（標識）抗体と比較してアナライト上の異なるエピトープに結合する。したがって、サンプル中のアナライトの存在は、固定化抗体による標識抗体−アナライト複合体の捕捉により、該試験線域におけるシグナルの可視化（例えば、変色）により検出される。幾つかの場合には、アナライトの存在下および非存在下の両方において標識抗体に結合するもう１つの抗体（例えば、標識抗体のＦｃ領域に結合する抗免疫グロブリン抗体）が、試験ストリップ上にも存在する対照線域において固定化されうる。該試験が正しく機能すれば、アナライトがサンプル中に存在するかどうかに無関係に、シグナルは対照線域において可視化されるはずである。
【００５７】
代替的実施形態においては、バイオマーカーは競合側方流動イムノアッセイにより検出されうる。そのようなアッセイ形態においては、サンプルは典型的には、まず、（前記のサンドイッチアッセイ形態の場合のような標識抗体ではなく）標識アナライトまたはその類似体と遭遇する。ついで、サンプルに由来するアナライトは標識アナライトと一緒に試験線（この位置に、該アナライトに対する抗体が固定化されている）へと移動する。サンプル中の非標識アナライトは該抗体への結合に関して標識アナライトと競合し、その結果、該試験線における視認可能なバンドの非存在はサンプル中のアナライトの存在を示す。このアッセイ形態は、例えば、結核の存在の指標として陽性視覚的シグナルを得たい場合（例えば、バイオマーカーが、該疾患を有する被験者からの喀痰サンプルにおいては減少するＴｈ２サイトカインである場合）に使用されうる。
【００５８】
抗体
本明細書に記載されている検出方法は、好ましくは、本明細書に記載されている宿主免疫系バイオマーカーに結合する１以上の抗体を使用する。適当な抗体は商業的に入手可能であり、あるいは公知技術を用いて製造されうる。
【００５９】
抗体は免疫グロブリン分子を含む。免疫グロブリン分子は、最も広い意味においては、２つのβシートと通常は保存ジスルフィド結合とを含有する、抗体分子に特徴的な免疫グロブリンフォールドを含むポリペプチドのファミリーである免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである。本明細書中で用いる抗体は、選択された標的バイオマーカーに結合しうる完全抗体または抗体フラグメントを意味し、Ｆｖ、ＳｃＦｖ、Ｆ（ａｂ’）およびＦ（ａｂ’）２、モノクローナルおよびポリクローナル抗体、操作された抗体、例えばキメラ抗体、ＣＤＲグラフト化抗体およびヒト化抗体、ならびにファージディスプレイまたは代替技術を用いて製造された人工的に選択された抗体を包含する。
【００６０】
抗体は動物血清から入手可能であり、あるいはモノクローナル抗体またはそのフラグメントの場合には細胞培養内で製造されうる。細菌、酵母、昆虫または好ましくは哺乳類細胞培養において、確立された方法に従い抗体を製造するために、組換えＤＮＡ技術が用いられうる。選択される細胞培養系は、好ましくは、抗体産物を分泌する。
【００６１】
ハイブリドーマまたは哺乳類宿主細胞のインビトロでの増殖は、通常の標準的な培養培地である適当な培地、例えばダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）またはＲＰＭＩ  １６４０培地内で行われ、該培地は、所望により、哺乳類血清、例えばウシ胎児血清または微量元素および成長維持サプリメント、例えばフィーダー細胞、例えば正常マウス腹腔滲出細胞、脾臓細胞、骨髄マクロファージ、２−アミノエタノール、インスリン、トランスフェリン、低密度リポタンパク質、オレイン酸などにより補充されうる。動物由来汚染を最小にするために、該培地は無血清または動物産物非含有培地、例えば化学規定培地でありうる。細菌細胞または酵母細胞である宿主細胞の増殖は、当技術分野で公知の適当な培養培地において、例えば、細菌の場合には培地ＬＢ、ＮＺＣＹＭ、ＮＺＹＭ、ＮＺＭ、テリフィックブロス、ＳＯＢ、ＳＯＣ、２×ＹＴまたはＭ９最小培地において、そして酵母の場合には培地ＹＰＤ、ＹＥＰＤ、最小培地または完全最小ドロップアウト培地において同様に行われる。
【００６２】
昆虫細胞は、血清含有培地と比較して安価であり安全である無血清培地内で培養されうる。組換えバキュロウイルスは、当技術分野で公知の幾つかの鱗翅目細胞系のいずれか、例えばスポドプテラ・フルジペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）Ｓｆ９細胞でありうる宿主細胞系をトランスフェクトするための構築物および発現ベクターとして使用されうる。昆虫宿主細胞における組換えタンパク質の発現の総説はＡｌｔｍａｎｎら（１９９９），Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ  Ｊ  １９９９，１６，１０９−２３ならびにＫｏｓｔおよびＣｏｎｄｒｅａｙ（１９９９），Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１０，４２８−３３に記載されている。
【００６３】
インビトロ製造は比較的純粋な抗体調製物を提供し、大量の所望の抗体を得るための大規模化を可能にする。細菌細胞、酵母、昆虫および哺乳類細胞の培養のための技術は当技術分野で公知であり、均一懸濁培養（例えば、エアリフトリアクターまたは連続撹拌反応器におけるもの）、または固定化もしくは捕捉細胞培養（例えば、中空糸、マイクロカプセルにおけるもの、アガロースマイクロビーズまたはセラミックカートリッジ上のもの）を包含する。
【００６４】
大量の所望の抗体は、哺乳類細胞をインビボで増殖させることによっても得られうる。この目的のために、所望の抗体を産生するハイブリドーマ細胞を組織適合性哺乳動物内に注入して、抗体産生腫瘍の成長を引き起こさせる。所望により、該注射の前に、該動物を炭化水素、特に鉱油、例えばプリスタン（テトラメチルペンタデカン）でプライミングする。１〜３週間後、それらの哺乳動物の体液から該抗体を単離する。例えば、Ｂａｌｂ／ｃマウスからの抗体産生脾臓細胞との適当な骨髄腫細胞の融合により得られたハイブリドーマ細胞、または所望の抗体を産生するハイブリドーマ細胞系Ｓｐ２／０に由来するトランスフェクト化細胞を、プリスタンで所望により前処理されていてもよいＢａｌｂ／ｃマウスの腹腔内に注入し、１〜２週間後、該動物から腹水を採取する。
【００６５】
前記の及び他の技術は、例えばＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７；ＵＳ  ４，３７６，１１０；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（１９８８）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ（これらを参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されている。組換え抗体分子の製造のための技術は前記参考文献、そしてまた、例えばＥＰ  ０６２３６７９、ＥＰ  ０３６８６８４およびＥＰ  ０４３６５９７（これらを参照により本明細書に組み入れることとする）にも記載されている。
【００６６】
細胞培養上清を、主に、所望の標的を発現する細胞の免疫蛍光染色、免疫ブロット法、酵素イムノアッセイ、例えばサンドイッチアッセイもしくはドットアッセイ、またはラジオイムノアッセイにより、所望の抗体に関してスクリーニングする。
【００６７】
抗体の単離のために、培養上清中または腹水中の免疫グロブリンは、例えば硫酸アンモニウムでの沈殿、吸湿性材、例えばポリエチレングリコールに対する透析、選択膜による濾過などにより濃縮されうる。必要に応じて、および／または所望により、通常のクロマトグラフィー法、例えばゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、ＤＥＡＥ−セルロース上のクロマトグラフィー、および／またはイムノアフィニティクロマトグラフィー、例えば標的含有タンパク質もしくはプロテインＡでのアフィニティクロマトグラフィーにより、該抗体を精製する。
【００６８】
前記方法により産生された抗体は、標準的な方法に従い、細胞からの核酸の単離によりクローニングされうる。通常、抗体の核酸可変ドメインを単離し、それを使用して、抗体フラグメント、例えばｓｃＦｖを構築することが可能である。
【００６９】
本明細書に記載されている方法は、抗体の重鎖可変ドメインおよび／または軽鎖可変ドメインをコードするインサートを含む組換え核酸を使用しうる。本質的に、そのような核酸は、コード化一本鎖核酸、コード化核酸とそれに対する相補的核酸とからなる二本鎖核酸、またはこれらの相補的（一本鎖）核酸自体を含む。
【００７０】
更に、抗体は、抗体の人工レパートリーを得るために抗体遺伝子の突然変異誘発により製造されうる。この技術は抗体ライブラリーの製造を可能にし、抗体ライブラリーはまた、商業的に入手可能である。したがって、免疫グロブリンｍｐ人工レパートリー、好ましくは人工ＳｃＦｖレパートリーは免疫グロブリン源として使用されうる。
【００７１】
単離された又はクローニングされた抗体は、当技術分野で公知の方法を用いる化学的カップリングにより、他の分子、例えば核酸またはタンパク質結合手段に連結されうる（例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（１９８８）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ならびにＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．およびＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．（１９９１），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）。そのような方法は、標識抗体を製造するために、または抗体を固相上に固定化するために使用されうる。
【００７２】
幾つかの実施形態（例えば、側方流動イムノアッセイを含む）においては、抗体は標識されうる。典型的には、標識抗体は検出可能なシグナルを生成しうる。該シグナルは、例えば酵素活性、例えばプロテアーゼ活性、転写活性または発光誘導活性の生成でありうる。しかし、好ましくは、該シグナルは電磁放射、例えば光の放出または吸収である。より好ましくは、該シグナルは視認可能なシグナルであり、例えば、該シグナルは肉眼で検出可能である。該シグナルは、例えば、標識抗体が存在する場合に生じる変色でありうる。
【００７３】
視認可能標識または蛍光標識を種々の物質、例えばペプチド、ポリペプチドおよび抗体にコンジュゲート化する方法は当技術分野でよく知られている。ある実施形態においては、抗体と標識との間にスペーサー手段を含有させることが望ましいかもしれない。スペーサー手段は、種々の長さの重合体（その長さは重合度の制御により制御されうる）であるリンカーまたはスペーサーを含みうる。多数のスペーサーおよびリンカーが当技術分野で公知であり、用途に応じたこれらの選択および使用方法が当業者に知られるであろう。どの程度のスペーサー長を用いるべきかも当業者に知られるであろう。
【００７４】
基準値との比較
本発明の幾つかの実施形態においては、喀痰サンプルにおけるバイオマーカーのレベルは１以上の基準値と比較される。基準値は、例えば、正常被験者（すなわち、結核に罹患していない被験者）からの喀痰サンプル中に存在するバイオマーカーのレベルの、予め決定された測定値でありうる。幾つかの実施形態においては、基準値は、結核以外の肺疾患、例えば肺炎に罹患している被験者（または被験者の集団）から誘導されうる。基準値は、例えば、結核の症状を示さない（試験被験者に対して年齢および／または性別が釣り合わされた又は釣り合わされていない）被験者の対照集団、例えば５、１０、１００、１０００名以上の被験者におけるバイオマーカーの平均値または中央値に基づくものでありうる。好ましくは、試験サンプルにおけるバイオマーカーのレベルは、対照値と比較して少なくとも１％、５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％または少なくとも５０％異なる。
【００７５】
対照値は、例えば、被験者の対照集団から採取された１以上のサンプルを使用して、試験サンプル中の脂質レベルの決定の対応方法を用いて決定されうる。例えば、幾つかの実施形態においては、対照サンプルにおけるバイオマーカーレベルは試験サンプルに対する並行アッセイにおいて決定されうる。代替的実施形態においては、対照値は既に決定されていてもよく、あるいは得られた各試験サンプルに関して対照サンプルに対する対応決定を行うことを要することなく計算または推定されうる。
【００７６】
側方流動アッセイの場合、サンプルにおけるバイオマーカーの存在または非存在は、典型的には、側方流動装置上の試験線における視認可能なシグナル（例えば、変色）の存在または非存在により決定可能であり、すなわち、結果は通常、肉眼により決定可能である。個々のバイオマーカーのレベルが個々のカットオフ値（これは本明細書に記載の基準値に対応しうる）を上回るか下回るかを決定するためにも側方流動装置が使用されうる、と当業者により認識されるであろう。カットオフおよび基準値は一般に、後記実施例に記載されているとおり、受診者動作特性曲線分析を含む種々の統計技術を用いて決定されうる。
【００７７】
例えば、アッセイの準備および条件ならびに標識抗体、固定化抗体および対照抗体の相対量は、バイオマーカーのレベルが基準値を上回るか下回るかの指標を得るために試験線における視覚的シグナルの強度が対照線における視覚的シグナルと比較されうるように選択されうる。あるいは、側方流動試験は、結核に罹患していないことが知られている被験者からのサンプルに関する別の（対照）試験と並行して、被験者からのサンプルに関して行われうる。対照はまた、患者に由来しないが一定量のバイオマーカーを含有するサンプルでありうる。いずれの場合も、試験ストリップから結果を対照ストリップの場合と比較することは、基準値と比較された、被験者からの喀痰サンプルにおけるバイオマーカーのレベルの指標を与えうる。
【００７８】
もう１つの代替的実施形態においては、側方流動装置上のシグナルを定量して、バイオマーカーレベルの、より正確な指標を得ることが可能である。例えば、試験線におけるシグナルの強度は、サンプル中のアナライトの量を定量するために決定されうる。側方流動リーダーのような携帯診断装置が、例えば、試験線を明らかにし、標識の指標となる光の特異的波長を測定するために使用されうる。そのようなリーダーにおいては、シグナルをアナライト濃度と相関させるために、イメージ・プロセシング・アルゴリズムが組込まれうる。
【００７９】
肺疾患の治療
もう１つの態様においては、本発明は、肺疾患または呼吸器障害に罹患している疑いのある被験者の治療方法を提供する。典型的には、該方法は、前記の検出方法を行い、その結果に基づいて被験者を治療する工程を含む。特に、喀痰サンプルにおけるバイオマーカーのレベルが被験者における結核の存在を示す場合には、該方法は、典型的には、抗結核治療（例えば、１以上の治療剤を含む）の治療的有効量を該被験者に投与する工程を含む。典型的には、結核に対するそのような治療は長期にわたって、例えば少なくとも１カ月間、少なくとも２カ月間、少なくとも３カ月間、少なくとも４カ月間または少なくとも６カ月間、継続される。
【００８０】
他の実施形態においては、喀痰サンプルにおけるバイオマーカのレベルが被験者における結核の非存在を示す場合には、該方法は、肺疾患に対する代替療法を該被験者に投与する工程を含みうる。該代替療法は例えば肺炎、喘息または慢性閉塞性肺疾患に対する治療でありうる。例えば、幾つかの場合には、抗肺炎治療剤が被験者に投与されうる。一般には、結核以外の肺疾患に対するそのような治療は結核治療に対するものより短期間でありうる。したがって、そのような実施形態においては、治療は１週間まで、２週間まで、３週間まで、または１カ月間まで継続されうる。
【００８１】
結核を治療するのに有用な治療剤および方法は当業者によく知られている。例えば、抗結核療法は投与を、イソニアジド（ｉｓｏｎｉａｚｉｄ）、リファンピシン（ｒｉｆａｍｐｉｃｉｎ）、エタンブトール（ｅｔｈａｍｂｕｔｏｌ）および／またはピラジナミド（ｐｙｒａｚｉｎａｍｉｄｅ）から選択される１以上の物質の投与を含みうる。典型的には、活動性結核感染は、２以上の治療剤の組合せを使用して治療される。該治療は、好ましくは、少なくとも６カ月間投与されるが、これは初期集中治療期間およびそれに続く長期継続期間に分けられうる。したがって、活動性結核感染に対する標準的な短期治療はイソニアジド（ｉｓｏｎｉａｚｉｄ）、リファンピシン（ｒｉｆａｍｐｉｃｉｎ）、ピラジナミド（ｐｙｒａｚｉｎａｍｉｄｅ）およびエタンブトール（ｅｔｈａｍｂｕｔｏｌ）の２カ月間、ならびにそれに続くイソニアジド（ｉｓｏｎｉａｚｉｄ）およびリファンピシン（ｒｉｆａｍｐｉｃｉｎ）のみの更に４カ月間である。そのような一次治療が失敗した場合には、二次治療が幾つかの場合に用いられうる。二次治療はアミノグリコシド（例えば、アミカシン（ａｍｉｋａｃｉｎ）、カナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ））；フルオロキノロン（例えば、シプロフロキサシン（ｃｉｐｒｏｆｌｏｘａｃｉｎ）、レボフロキサシン（ｌｅｖｏｆｌｏｘａｃｉｎ））；チオアミド（例えば、エチオンアミド（ｅｔｈｉｏｎａｍｉｄｅ）、プロチオンアミド（ｐｒｏｔｈｉｏｎａｍｉｄｅ））；シクロセリン（例えば、クロセリン（ｃｌｏｓｅｒｉｎ））；テリジドン（ｔｅｒｉｚｉｄｏｎｅ）、カプレオマイシン（ｃａｐｒｅｏｍｙｃｉｎ）、ビオマイシン（ｖｉｏｍｙｃｉｎ）またはエンビオマイシン（ｅｎｖｉｏｍｙｃｉｎ）を含みうる。
【００８２】
一方、肺炎（特に細菌性肺炎）を治療するために使用される治療剤は一般には広域スペクトル抗生物質である。例えば、適当な抗生物質には、アモキシシリン（ａｍｏｘｉｃｉｌｌｉｎ）、ドキシサイクリン（ｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅ）、クラリスロマイシン（ｃｌａｒｉｔｈｒｏｍｙｃｉｎ）、マクロライド（例えば、アジスロマイシン（ａｚｉｔｈｒｏｍｙｃｉｎ）またはエリスロマイシン（ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎ））が含まれる。幾つかの場合には、セファロスポリン（ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｎ）、カルバペネム（ｃａｒｂａｐｅｎｅｍ）およびバンコマイシン（ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ）も使用可能であり、例えば、静脈内投与され、特に院内感染の場合には組合せて使用されうる。典型的には、該治療は例えば３〜５日間、７〜１０日間または２週間まで投与されうる。
【００８３】
治療剤は、種々の技術を用いて被験者に投与されうる。例えば、治療剤は全身投与可能であり、これは、筋肉内または静脈内注射を含む注射、経口、舌下、経皮、皮下または鼻腔内投与を含む。好ましくは、治療剤は経口投与される。投与される治療剤の濃度および量は典型的には、疾患の性質、投与される治療剤のタイプ、投与方式ならびに被験者の年齢および健康状態に応じて変動するであろう。
【００８４】
治療剤は、例えば医薬上許容される希釈剤と共に、例えば固体もしくは錠剤形態または液体形態の医薬組成物中に製剤化されうる。該組成物は通常、医薬上許容される量の希釈剤、賦形剤および他の適当な担体を含有しうる。適当な担体および製剤は、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，ＵＳＡ  １９８５）に記載されている。
【００８５】
キット
他の実施形態においては、本発明は、前記方法を実施するのに適したキットを提供する。特に、該キットは、前記バイオマーカー、例えば１以上の宿主免疫系バイオマーカーまたは本明細書に記載されているバイオマーカーの組合せを検出するのに適した試薬を含みうる。典型的には、該試薬は、本明細書に記載されているバイオマーカーまたはバイオマーカーの組合せに特異的に結合する抗体を含みうる。例えば、該キットは１個、２個、３個または４個の異なる抗体を含むことが可能であり、それらのそれぞれは、前記のものから選択される異なるバイオマーカーに結合する。
【００８６】
そのようなキットは、所望により、１以上の追加的成分、例えば、バイオマーカーに結合する抗体を使用してＥＬＩＳＡアッセイを行うのに適した試薬を更に含みうる。例えば、該キットは、各バイオマーカーのための捕捉および検出抗体、二次抗体、検出試薬、固相（例えば、反応プレートまたはビーズ）、標準物（例えば、組換えタンパク質の形態の既知濃度の各バイオマーカー）およびＥＬＩＳＡ法のいずれかの工程を行うのに適したバッファーを含みうる。該キットは、前記試薬を貯蔵するためのバイアル、容器および他のパッケージング材ならびに本明細書に記載されている方法を実施するための説明を更に含みうる。
【００８７】
特に好ましい実施形態においては、該キットは側方イムノアッセイ装置の形態であり、または側方イムノアッセイ装置を含む。そのような装置は、本明細書に記載されている宿主免疫系バイオマーカーまたはバイオマーカーの組合せに特異的に結合する１以上の抗体を含みうる。適当な抗体は商業的に入手可能であり、または公知技術を用いて製造されうる。
【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１】患者の人口統計。ＴＢ＝結核；非ＴＢ＝他の呼吸器疾患；ＷＢＡ＝全血アッセイ；ＣＯＰＤ＝慢性閉塞性肺疾患；ＲＴＩ＝気道感染症（未決定）；ＩＱＲ＝四分位範囲。
【図２】抗原刺激の非存在下の２４時間のインキュベーションの後のサイトカインレベル（皆無（Ｎｉｌ）対照）。２４時間のインキュベーションの後のサイトカインレベルに関する２０個のＴＢおよび２６個の非ＴＢ（他の呼吸器障害）の分析。長方形は四分位範囲を示し、線は中央値を示し、棒は５〜９５％の範囲を示し、点は外れ値を示す。ＴＢおよび非ＴＢの比較のためにマン−ホイットニーＵ検定を用いてデータを分析した。Ｐ値＜０．０３５が有意とみなされ、示されている。
【図３】ＰＰＤの存在下の２４時間のインキュベーションの後のサイトカインレベル。ＰＰＤの存在下の２４時間のインキュベーションの後のサイトカインレベルに関する２０個のＴＢおよび２６個の非ＴＢ（他の呼吸器障害）の分析。長方形は四分位範囲を示し、線は中央値を示し、棒は５〜９５％の範囲を示し、点は外れ値を示す。ＴＢおよび非ＴＢの比較のためにマン−ホイットニーＵ検定を用いてデータを分析した。Ｐ値＜０．０３５が有意とみなされ、示されている。
【図４】エクスビボの血清および唾液におけるサイトカインレベル。Ａ：２０名のＴＢ（灰色）被験者および４２名の非ＴＢ（白色）被験者からのエクスビボの唾液の分析。Ｂ：２５名のＴＢ（灰色）被験者および５２名の非ＴＢ（白色）被験者からのエクスビボの血清の分析。長方形は四分位範囲を示し、線は中央値を示し、棒は５〜９５％の範囲を示し、点は外れ値を示す。ＴＢおよび非ＴＢの比較のためにマン−ホイットニーＵ検定を用いてデータを分析した。Ｐ値＜０．０３５が有意とみなされ、示されている。
【図５】喀痰は直接的にエクスビボで高レベルのサイトカインを示す。Ａ：ＴＢ患者からの血清（白色）、唾液（灰色）および喀痰（黒色）（それぞれｎ＝２５、２０および２３）におけるサイトカインレベルの比較。示されている値は、消化中の喀痰サイトカインの希釈度に関して調節されていないことに注意されたい。Ｂ：ＴＢ（ｎ＝２３）被験者および非ＴＢ（ｎ＝２９）被験者の喀痰からのエクスビボサイトカインレベルの分析。長方形は四分位範囲を示し、線は中央値を示し、棒は５〜９５％の範囲を示し、点は外れ値を示す。ＴＢおよび非ＴＢの比較のためにマン−ホイットニーＵ検定を用いてデータを分析した。Ｐ値＜０．０３５が有意とみなされ、示されている。
【図６】エクスビボの喀痰におけるサイトカインレベルのヒートマップ。ＴＢを有する被験者（ｎ＝２３）および他の呼吸器障害を有する被験者（非ＴＢ；ｎ＝２９）に関して中央値が示されている（赤色＝高、青色＝低）。
【００８９】
次に、以下の特定の実施形態に関する単なる例示として本発明を説明することとする。
【００９０】
実施例
本研究においては、結核の診断のための最適な流体およびバイオマーカーの組合せを決定するために、幾つかのサンプル型を分析した。喀痰宿主バイオマーカーは、抗原で刺激された血液におけるレベルより有意に高く、塗抹試験またはＨＩＶ状態には無関係に、結核の、９６％の正確な分類をもたらした。したがって、本発明は、結核の「検査施設を要さない検出」を可能にする試験を提供する。これの利益は明らかである。すなわち、毎年１０００万の新たな診断がなされるが、検査施設により確認されるのは１６％に過ぎず、結核を迅速に検出することができれば結核の負担が大幅に低減されるであろう。
【００９１】
方法
被験者：
被験者をメディカル・リサーチ・カウンシル・ユニット（Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｕｎｃｉｌ  Ｕｎｉｔ）（Ｆａｊａｒａ，Ｔｈｅ  Ｇａｍｂｉａ）において外来および病棟から連続的に募集した。全ての被験者は、２週間を超える咳の持続と、結核を示唆する１つの他の臨床症状（すなわち、体重減少、発熱）とを示す成人（１８歳以上）であった。除外基準には、結核または併存疾患、例えばマラリアに対する過去の治療が含まれた。書面によるインフォームドコンセントの後、全ての被験者は完全な血液学的、微生物学的、生化学的な及び症状の評価を受けた。ＨＩＶ試験を行い、喀痰、唾液、血清およびヘパリン処理血液サンプルを免疫学的評価のために収集した。臨床症状（アンケート、身体検査）、胸部Ｘ線および微生物学的検査（喀痰塗抹試験および培養）を用いて患者を以下の２群に分類した：培養により確認された結核を有する患者、および他の呼吸器疾患を有する患者（図１）。液体培養（ＢＡＣＴＥＣ（商標），Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，ＵＳＡ）を用いて喀痰培養を行い、キャピリア（Ｃａｐｉｌｉａ）迅速ＴＢ試験（Ｔａｕｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｊａｐａｎ）を使用してマイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）複合体（ＭＴＢＣ）の存在を確認した。ガンビア政府／ＭＲＣ共同倫理委員会から倫理的承認を得た。
【００９２】
微生物学的証明
ＬＥＤ顕微鏡法を用いてチール・ニールセン（ＺＮ）染色により喀痰サンプルを分析した。アリコートを除染し、培養した（ＢＡＣＴＥＣ（商標），Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，ＵＳＡ）。陽性培養をキャピリア（Ｃａｐｉｌｉａ）迅速ＴＢ試験（Ｔａｕｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｊａｐａｎ）により確認し、グリセロール中で−７０℃で貯蔵した。
【００９３】
スポリゴタイピング（Ｓｐｏｌｉｇｏｔｙｐｉｎｇ）
貯蔵された単離物を、ＤＮＡ抽出のためにＯＡＤＣ（オレイン酸、アルブミン、デキストロースおよびカタラーゼ）サプリメントを含有するミドルブルック（Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ）７Ｈ９ブロス内で増殖させた。商業的に入手可能な膜（Ｉｓｏｇｅｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を使用するスポリゴタイプ（ｓｐｏｌｉｇｏｔｙｐｅ）分析のために１０ｎｇのＤＮＡを使用した。Ｍａｔｌａｂ（Ｍａｔｈｗｏｒｋｓ，ＵＳＡ）において設計されたソフトウェアを使用して、スポリゴタイプフィルムをスキャンし、分類し、ついで手動での編集および確認を行った。各スポリゴタイプパターンをバイナリーコードに分類し、結果をマイクロソフトアクセス（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ａｃｃｅｓｓ）データベース（Ｒｅｄｍｏｎｄ，ＵＳＡ）に入力した。スポリゴタイプ分析のみによりマイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）またはマイコバクテリウム・アフリカヌム（Ｍ．ａｆｒｉｃａｎｕｍ）として信頼しうる様態で分類することができた単離物に関しては、大きな配列の多型ＲＤ７０２およびＴｂＤ１を定める系統の存在または非存在を、既に記載されているとおりに評価した。
【００９４】
多重サイトカインアッセイ
サンプル調製物
血清および唾液をアリコート化し、必要となるまで−２０℃で凍結した。喀痰を０．１％  ジチオトレイトール（ＤＴＴ）で室温で１５分間消化した。当容量のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を加え、サンプルを遠心分離し（６００ｇｍａｘ、５分間）、上清を集め、−２０℃で貯蔵した。ヘパリン処理血液に関しては、２４ウェルプレートのウェル当たり４５０μｌの未希釈血液を使用した。血液を精製タンパク質誘導体（ＰＰＤ）（１０μｇ／ｍＬ；Ｓｔａｔｅｎｓ  Ｓｅｒｕｍ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ）、ＥＳＡＴ−６／ＣＦＰ−１０（ＥＣ；１０μｇ／ｍＬ）および２つの休眠抗原Ｒｖ００８１およびＲｖ２０２９（共に１０μｇ／ｍＬ）で刺激した。２４時間のインキュベーション（３７℃、５％  ＣＯ２）の後、上清を集め、分析まで−２０℃で貯蔵した。
【００９５】
サイトカイン産生に関する多重分析
カスタム１３プレックス（１３重）（刺激された血液）または２７プレックス・バイオプレックス（Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘ）（血清、唾液および喀痰）予混サイトカイン／ケモカインキットのいずれかを製造業者の説明（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）に従い使用して、サンプルを分析した。フィルタープレートを予め湿らせた後、５０μｌのビーズ懸濁液を各ウェルに加え、２回洗浄した。ついで５０μｌのサンプルおよび標準物を加え、３００ｒｐｍで１時間インキュベートした。該プレートを３回洗浄し、ついで５０μｌの検出抗体を加え、該プレートを３００ｒｐｍで３０分間インキュベートした。洗浄後、２５μｌのストレプトアビジン−ＰＥを各ウェルに加え、１０分間インキュベートした。該プレートを再び洗浄し、１２５μｌのアッセイバッファー中に再懸濁させ、密封し、混合し、バイオプレックス（Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘ）マネージャーソフトウェア（バージョン４．０）を使用して直ちにバイオプレックス（Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘ）分析装置上で読取った。アッセイ間変動を抑制するために、各プレートに対して品質管理を行った。
【００９６】
統計分析
抗原特異的サンプル（全血アッセイのみ）から測定されたアナライトの値からバックグラウンドを除去した（未刺激結果）。唾液、血清および喀痰の値は全て未刺激サンプルから誘導され、したがって、バックグラウンド除去を要しなかった。結核および非結核被験者を、マン・ホイットニーＵ検定を用いて比較し、ロジスティック回帰および受診者動作特性曲線分析を行い、年齢および性別に関して補正した。マッチした喀痰および抗原刺激培養を、フリードマン検定およびそれに続くダンの多重比較検定を用いて分析した。Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍバージョン６．０（Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ＭａｃＫｉｅｖ，ＵＳＡ）およびＳＰＳＳｖ２０（ＩＢＭ，ＵＳＡ）での統計分析を用いてグラフを作成した。偽発見率（ＦＤＲ）の原因となるためには０．０３５以下のＰ値を有意とみなした。
【００９７】
結果
被験者の人口統計
合計で５２名の非結核被験者および２７名の確認された結核被験者を分析した（図１）。結核被験者および非結核被験者の間で年齢の中央値において差はなかったが、結核群は非結核群より有意に高い男性比率を有していた（８１％対４９％）。これはガンビアにおける結核の疫学に適合し、そのようなものとして全ての結果を性別および年齢に関して補正した。非結核群においては、最終診断は臨床評価および治療応答に基づくものであり、５２名中１３名の被験者が慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ；ｎ＝５）、喘息（ｎ＝２）、肺炎（ｎ＝６）と診断され、残りは一般的な気道感染症（ＲＴＩ；確認された診断は無し）に分類された。被験者の数は、サンプルの入手可能性ゆえに、各サンプル型ごとに様々であった（図１）。２０名の結核被験者および２６名の非結核被験者を全血抗原（ＷＢＡ）刺激分析に用い、２５名の結核被験者および５２名の非結核被験者を血清分析に用い、２０名の結核被験者および４２名の非結核被験者を唾液分析に用い、２３名の結核被験者および２９名の非結核被験者を喀痰分析に用いた。
【００９８】
全血２４時間抗原刺激培養上清を使用した結核の分類
Ｎｉｌ（抗原無し）、ＥＣ、ＰＰＤ、Ｒｖ００８１およびＲｖ２０２９での一晩の刺激の後の結核被験者および非結核被験者のサイトカインプロファイルを分析した。プロファイルを各サイトカインに関して抗原刺激（Ａｇ）、Ａｇ−ＮｉｌおよびＮｉｌで比較した。ＩＰ１０およびＭＣＰ−１レベルは全刺激後に両群において高かったが（それぞれ、平均値７５２２ｐｇ／ｍＬおよび６５４７ｐｇ／ｍＬ）、ＴＧＦ−α、ＥＧＦおよびＶＥＧＦは低かった（それぞれ、平均値９ｐｇ／ｍＬ、２６ｐｇ／ｍＬおよび２３ｐｇ／ｍＬ）。Ｎｉｌ培養において、非結核被験者と比較して、確認された結核を有する被験者において有意に高い幾つかの分析が認められ、それらにはＩＰ１０、ＣＤ４０Ｌ、ＴＧＦ−α、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γが含まれた（それぞれ、ｐ＝０．０００５、ｐ＝０．００８９、ｐ＝０．００２０、ｐ＝０．００１６およびｐ＝０．０３１３；図２）。抗原刺激後、バックグラウンド除去前に相違の大部分が観察され、ＣＤ４０ＬおよびＴＧＦ−αのレベルは、使用抗原には無関係に、結核被験者においては非結核被験者と比較して有意に高かった。バックグラウンド除去後、ＰＰＤ刺激培養において相違の大部分が観察され、結核被験者においては非結核被験者と比較して高レベルのＣＤ４０Ｌ、ＩＬ−１０およびＴＧＦ−α（それぞれ、ｐ＝０．００８９、ｐ＝０．００３４およびｐ＜０．０００１）、ならびに低レベルのＩＦＮ−γ、ＩＬ−２およびＭＩＰ−１β（それぞれ、ｐ＝０．０３１３、ｐ＝０．００４０およびｐ＝０．０３５１；図３）が認められた。結核の診断のための最適な抗原−バイオマーカーの組合せを決定するために、ロジスティック回帰分析を行った。ＰＰＤ刺激後には、最良の分類子は、０．８６［９５％ＣＩ  ０．７３〜１．０］のＡＵＣ、９６．２％［９５％ＣＩ  ８０．４〜９９．９］の感度、８０．０％［９５％ＣＩ  ５６．３〜９４．３］の特異性および４．８の尤度比を有するＴＧＦ−αであった。ＥＣ刺激後には、ＴＧＦ−αのレベルは８４．６％の感度［９５％ＣＩ  ６５．１〜９５．６］および８０％の特異性［９５％ＣＩ  ５６．３〜９４．３］をもたらした。最良の分類はＰＰＤ刺激の後で達成され、ＣＤ４０Ｌ、ＴＧＦ−αおよびＩＬ１０の組合せが結核または非結核の８９％の正確な分類を示した（データ非表示）。重要なことに、該抗原のいずれの刺激の後も、異なるＭｔｂ株（マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）またはマイコバクテリウム・アフリカヌム（Ｍ．ａｆｒｉｃａｎｕｍ））に感染した結核被験者の宿主免疫プロファイルにおける相違は認められなかった（データ非表示）。
【００９９】
エクスビボの唾液および血漿サイトカインレベルの分析
発展途上国における有効な診断試験の主要因は診断までの時間である。したがって、直接的にエクスビボでサイトカインレベルに関して体液を評価することを望んだ。唾液は血清より高いレベルのサイトカインを示したが、分析したいずれのサイトカインに関しても結核被験者と非結核被験者との間で相違は認められなかった（図４Ａ）。結核被験者においては血清は比較的低いレベルの全サイトカインを有し、ＭＩＰ−１βが最高レベル（８６ｐｇ／ｍＬ）で検出された。しかし、結核被験者からの血清においては、非結核被験者と比較して有意に高いレベルのＩＬ−６、ＩＬ７およびＧ−ＣＳＦが存在した（それぞれ、ｐ＜０．０００１、ｐ＝０．００１４およびｐ＝０．０００３；図４Ｂ）。
【０１００】
喀痰は直接的にエクスビボで高レベルのサイトカインを示す：
本発明者らは、エクスビボサイトカインレベルに関して、消化された喀痰の可溶性画分を分析したところ、抗原刺激を要することなく、唾液および血清の両方と比較して驚くべき高いレベルを見出した。結核を有することが確認された被験者からのエクスビボサイトカインレベルの横断研究を行った（図５Ａ）。ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１２（ｐ７０）およびＭＩＰ−１βのレベルは全て、唾液および血清の両方と比較して、喀痰においては有意に高かったが（図５ＡにＩＬ−７およびＩＬ−８により示されている）、ＩＬ−１β、ＩＬ−１７、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＭＣＰ−１およびＴＮＦ−αは、血清と比較して、唾液および喀痰の両方において有意に高かった（図５ＡにＧ−ＣＳＦおよびＭＣＰ−１により示されている）。ＩＬ−６は、血清（ｐ＜０．０１）および喀痰（ｐ＜０．０００１）と比較して血清において低い唯一のサイトカインであり、血清と喀痰との間の差は無く（データ非表示）、それらの３つのサンプル型の間でＩＦＮ−γレベルにおける差は認められなかった（図５Ａ）。
【０１０１】
次に、結核被験者および非結核被験者からの喀痰におけるサイトカインレベルを比較した（図６および図５Ｂ）。興味深いことに、炎症性サイトカインにおいては有意な相違は見出されなかったが（すなわち、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＰ−１０；データ非表示）、有意に低いレベルのＩＬ−１０（ｐ＝０．００４）、ＩＬ−１３（ｐ＝０．００３）およびＩＬ−１５（ｐ＝０．０２２）が、非結核被験者の場合と比較して、結核被験者から喀痰において見出された（図６および図５Ｂ）。また、非結核被験者と比較して結核被験者においては、先天性（ｉｎｎａｔｅ）サイトカインＩＬ−１Ｒａ、Ｇ−ＣＳＦおよびＶＥＧＦは全て有意に低かったが（それぞれ、ｐ＝０．００５、ｐ＝０．００４、ｐ＝０．０３０）、ＦＧＦは有意に高かった（結核被験者においては中央値２８７ｐｇ／ｍＬであるのに対し、非結核被験者においては２．２ｐｇ／ｍＬ；ｐ＝０．００７；図６および図５Ｂ）。ＦＧＦのレベルのみは結核の７４％の正確な分類をもたらした（感度７８％［９５％ＣＩ  ５６〜９３］および特異性６７％［９５％ＣＩ  ４７〜８３］）。ロジスティック回帰は、ＩＬ−１３、ＦＧＦおよびＩＦＮ−γの組合せが結核の９６％の正確な分類および非結核の８５％の正確な分類（全体では９０％）をもたらすことを示した。重要なことに、胸水の分析で既に認められていたとおり［５］、ＨＩＶ同時感染を有する被験者において、相違は観察されなかった。
【０１０２】
患者１名当たりに２〜３個のサンプルに関して結核の微生物学的確認を行い、サンプルの収集時期は様々であった（２４時間以内の３個のサンプルがＭＲＣにおける標準である）。塗抹試験の結果においてはサンプルによる変動が認められ、したがって、本発明者らは、同一被験者から得られた複数の喀痰サンプルにおいてサイトカインレベルを決定することを望んだ（ｎ＝１５）。分析したいずれのサイトカインのレベルにおいも相違は見出されなかった（図５Ｃ）。
【０１０３】
考察
結核に関する側方流動に基づくポイントオブケア試験の開発のための重要な基準は、高い感度および特異性に加えて、結果を得るまでの時間である。資材に乏しい状況においては、経過観察の喪失またはケアの不履行が医療提供における主な課題である。したがって、結核試験を受けてから数時間以内に患者が診断され適当なケアを受けることが必要不可欠である［２］。血液由来宿主免疫因子に基づく現在の診断試験は少なくとも２４時間のサンプル加工を要し、その場合にも、レベルは、しばしば、迅速な試験の更なる開発には低すぎる。本発明者らが知る限りにおいては、本発明者らは、結核診断の新規手段として喀痰におけるサイトカインのレベルを調べた最初の研究グループである。本発明者らは、最小のサンプル調製を要するエクスビボの喀痰において極めて高いレベルのサイトカインを見出した。ＦＧＦ、ＩＬ−１３およびＩＦＮ−γの組合せは、類似症状（すなわち、２週間を超える咳の持続）を示す被験者において、結核の９６％の正確な分類をもたらした。これらの知見は結核に関する迅速なポイントオブケア試験の開発を可能にする。
【０１０４】
本発明者らは、結核に関する感度および特異性が、血液と比較して感染部位からのサンプルを分析することにより有意に増加したことを既に示している［５］。これは、結核疾患中の血液から肺へのＣＤ４＋  Ｔ細胞の遊走により、血液中にはこれらの細胞は実質的に存在しないが、肺には優勢な高活性化集団が存在することによるものである［５］。これらの細胞は、該感染と闘うために要求されるＩＦＮ−γおよび他のサイトカインの産生をもたらし、したがって、血液の場合と比較して増加したレベルの、肺由来サンプル中に存在する可溶性因子と直接的に相関する。喀痰はＭｔｂの微生物学的検出のために通常使用される。それは容易に入手可能であり、サイトカインレベルはＨＩＶ同時感染によっては影響されないようであり、したがって、それは結核に関する側方流動試験の開発のための理想的なサンプル型となる。また、感染株の影響は認められず、同一被験者からの異なる喀痰サンプルで再現性は高かった。
【０１０５】
ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−７、ＩＬ−８およびＭＩＰ−１Ｂのレベルは全て、唾液および血清の両方と比較して喀痰においては有意に高かったが、ＩＬ−１ｂ、ＩＬ−１７、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＭＣＰ−１およびＴＮＦ−αは全て、唾液および喀痰と比較して血清においては有意に低く、唾液と喀痰との間で差は無かった。これらの知見は、末梢と比較して局所的に応答することになる免疫サブセットにおける相違を示している。例えば、血液と比較して唾液および喀痰においては先天性およびＴｈ１７サイトカインのレベルの増加が認められ、これはこれらの部位における粘膜関連免疫の増強を示している。興味深いことに、エクスビボサンプル型の間でＴｈ１サイトカインレベルにおける差は観察されず、結核被験者からのエクスビボ喀痰においては、他の呼吸器障害を有する被験者の場合と比較して、ＩＦＮ−γ、ＩＰ−１０およびＴＮＦ−αレベルにおける有意差も認められなかった。逆に、Ｔｈ２サイトカインであるＩＬ−１０およびＩＬ−１３は共に、非結核被験者と比較して結核被験者においては有意に低く、これは、免疫病理の増強をもたらしうる、結核を有する被験者におけるＴｈ１応答に対する偏向を示している。Ｇ−ＣＳＦは好中球のリクルートメントに要求され、結核被験者からの喀痰においては非結核被験者からの場合と比較して有意に低いことが判明した。これは興味深いことである。なぜなら、好中球は結核に対する防御免疫応答における主要成分であり［８］、Ｇ−ＣＳＦの投与は結核治療に対する応答を増強することが示されているからである［９］。ほとんどの因子は、非結核被験者と比較して、結核被験者において低かったが、ＦＧＦは有意に高かった。線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）シグナリング経路は多数の気道疾患の発病ならびに正常な肺の成長および発生に不可欠である［１０］。興味深いことに、Ｍｔｂ感染線維芽細胞はその抗原提示能を喪失し、このことは、Ｍｔｂが、線維芽細胞に感染してＴヘルパー免疫監視を逃れうることにより、細菌の存続をもたらすことを示唆している［１１］。
【０１０６】
ＦＩＮＤ（Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｎｅｗ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）により示唆され決定された診断開発要件は少なくとも７５％、そして理想的には＞９５％の感度（１００％の培養陽性サンプルを含む）を含む。本発明者らは、培養により確認された結核を有する被験者を分析したに過ぎず、これらのうち３名のみが塗抹試験陰性であり（１４％）、したがって、塗抹試験陰性被験者における感度を決定することはこの段階では困難である。しかし、喀痰からのＦＧＦ、ＩＬ−１３およびＩＦＮ−γの組合せを用いる、結核の９６％の正確な分類は、血液、呼気または尿に基づく現在の試験から報告された結果より有意に高い。本発明者らは本発明者らの分析を２７種のサイトカイン／ケモカインに限定したが、検出に利用可能なアナライトが増加すれば、＞９５％の特異性および感度を可能にするマーカーがおそらく決定されるであろう。結論として、本発明者らは、血液の代わりに喀痰を使用することが、免疫に基づく結核試験の診断精度を有意に増加させ、結果を得るまでの時間を短縮させることを示した。これらの知見は、資材が制限された状況における使用に適用可能である、側方流動に基づく迅速な結核診断試験の将来の開発に有望である。
【０１０７】
要約
結核（ＴＢ）は発展途上国における重大な公衆衛生上の問題であり、毎年９００万の新たな症例および１４０万人の死亡が見られる。結核負荷を減少させることにおける大きな障害は、最低限度の基盤施設を有する診療所で使用される迅速かつ正確な診断試験が存在しないことである。本発明者らは、結核を示唆する症状を示しているが確認前の患者からのサンプルを分析した。臨床的および微生物学的評価の後、彼らは結核または他の呼吸器疾患（非結核）を有すると診断された。本発明者らは、結核の診断のための最適なサンプル型およびバイオマーカーの組合せを決定するために、喀痰、唾液、血清および全血抗原刺激培養における宿主バイオマーカーを評価した。ＥＳＡＴ−６／ＣＦＰ−１０（ＥＣ）またはＰＰＤでの全血の一晩の刺激は高レベルのサイトカインを産生し、ＰＰＤ刺激後、最良の分類子は、０．８６［９５％ＣＩ  ０．７３〜１．０］のＡＵＣ、９６．２％［９５％ＣＩ  ８０．４〜９９．９］の感度、８０．０％［９５％ＣＩ  ５６．３〜９４．３］の特異性および４．８の尤度比を有するＴＧＦ−αであった。ＥＣ刺激後には、ＴＧＦ−αのレベルは８４．６％の感度［９５％ＣＩ  ６５．１〜９５．６］および８０％の特異性［９５％ＣＩ  ５６．３〜９４．３］をもたらした。最良の分類はＰＰＤ刺激の後で達成され、ＣＤ４０Ｌ、ＴＧＦ−αおよびＩＬ１０の組合せが結核または非結核の８９％の正確な分類を示した。しかし、２４時間の刺激は「迅速」な診断試験に理想的ではない。エクスビボの唾液は、エクスビボの血清と比較して有意に高いレベルのサイトカインを有するが、患者群を区別することができなかった。ＩＬ−７、ＩＬ−８およびＧ−ＣＳＦの血清レベルは全て、結核被験者においては、非結核被験者と比較して有意に高かった（それぞれ、ｐ＜０．０００１、ｐ＝０．００１４およびｐ＝０．０００３）。本発明者らは喀痰の可溶性画分におけるサイトカインレベルも分析した。それは通常の微生物学的検査に使用され、成人肺結核患者の大多数から入手可能である。結核被験者からの喀痰においては、非結核被験者の場合と比較して、炎症性サイトカインレベル（ＩＦＮ−γ、ＩＰ−１０、ＴＮＦ−α）における有意差は認められなかったが、有意に低いレベルのＴｈ２サイトカイン（ＩＬ−１０（ｐ＝０．０００４）、ＩＬ−１３（ｐ＝０．０００３）およびＩＬ−１５（ｐ＝０．０２２１））および先天性サイトカイン（ＩＬ−１ｒａ（ｐ＝０．０００５）、ＶＥＧＦ（０．０３０１）およびＧ−ＣＳＦ（ｐ＝０．００４１））ならびにより高いＦＧＦ（ｐ＝０．００７）が認められた。ＩＬ−１３、ＦＧＦおよびＩＦＮ−γの組合せは、ＨＩＶの状態に無関係に、結核の９６％の正確な分類および非結核の８５％の正確な分類（全体で９０％）をもたらした。したがって、本発明は結核に関する迅速なポイントオブケア試験を提供する。
【０１０８】
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３．ＷＨＯ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｆａｃｔ  ｓｈｅｅｔ  ｎｕｍｂｅｒ  １０４．Ｍａｒｃｈ，２０１２。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｗｈｏ．ｉｎｔ／ｍｅｄｉａｃｅｎｔｒｅ／ｆａｃｔｓｈｅｅｔｓ／ｆｓ１０４／ｅｎ／においてアクセスされる。
【０１１１】
４．ＷＨＯ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｓｅｒｉｅｓ．Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ−ｂａｓｅｄ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  １９  ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌｌｙ  ａｖａｉｌａｂｌｅ  ｒａｐｉｄ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｔｅｓｔｓ  ｆｏｒ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ．２００８。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｗｈｏ．ｉｎｔ／ｔｄｒ／ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ／ｄｏｃｕｍｅｎｔｓ／ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ−ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ−２．ｐｄｆにおいてアクセスされる。
【０１１２】
５．Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ  ＪＳ，Ｇａｒｂａ  Ｄ，Ｆｏｍｂａｈ  ＡＥ，Ｍｅｎｄｙ−Ｇｏｍｅｚ  Ａ，Ｍｅｎｄｙ  ＦＳ，Ａｎｔｏｎｉｏ  Ｍ，Ｔｏｗｎｅｎｄ  Ｊ，Ｉｄｅｈ  ＲＣ，Ｃｏｒｒａｈ  Ｔ，Ｏｔａ  ＭＯ．Ｈｉｇｈｌｙ  ａｃｃｕｒａｔｅ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ｐｌｅｕｒａｌ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｂｙ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｌｅｕｒａｌ  ｅｆｆｕｓｉｏｎ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ２０１２；７：ｅ３０３２４。
【０１１３】
６．Ｄｅｎｔｅ  ＦＬ，Ｃａｒｎｅｖａｌｉ  Ｓ，Ｂａｒｔｏｌｉ  ＭＬ，Ｃｉａｎｃｈｅｔｔｉ  Ｓ，Ｂａｃｃｉ  Ｅ，Ｄｉ  Ｆｒａｎｃｏ  Ａ，Ｖａｇａｇｇｉｎｉ  Ｂ，Ｐａｇｇｉａｒｏ  Ｐ．Ｐｒｏｆｉｌｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ｉｎ  ｓｐｕｔｕｍ  ｆｒｏｍ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｇｒｏｕｐｓ  ｏｆ  ｓｅｖｅｒｅ  ａｓｔｈｍａｔｉｃ  ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ａｎｎ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ａｓｔｈｍａ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００６；９７：３１２−３２０。
【０１１４】
７．Ｅｉｃｋｍｅｉｅｒ  Ｏ，Ｈｕｅｂｎｅｒ  Ｍ，Ｈｅｒｒｍａｎｎ  Ｅ，Ｚｉｓｓｌｅｒ  Ｕ，Ｒｏｓｅｗｉｃｈ  Ｍ，Ｂａｅｒ  ＰＣ，Ｂｕｈｌ  Ｒ，Ｓｃｈｍｉｔｔ−Ｇｒｏｈｅ  Ｓ，Ｚｉｅｌｅｎ  Ｓ，Ｓｃｈｕｂｅｒｔ  Ｒ．Ｓｐｕｔｕｍ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  ｐｒｏｆｉｌｅｓ  ｉｎ  ｃｙｓｔｉｃ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ（ＣＦ）ａｎｄ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅ（ＣＯＰＤ）  ａｎｄ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ２０１０；５０：１５２−１５７。
【０１１５】
８．Ｙａｎｇ  ＣＴ，Ｃａｍｂｉｅｒ  ＣＪ，Ｄａｖｉｓ  ＪＭ，Ｈａｌｌ  ＣＪ，Ｃｒｏｓｉｅｒ  ＰＳ，Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａｎ  Ｌ．Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ  ｅｘｅｒｔ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｅａｒｌｙ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｕｓ  ｇｒａｎｕｌｏｍａ  ｂｙ  ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｋｉｌｌｉｎｇ  ｏｆ  ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ  ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｅｄ  ｆｒｏｍ  ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ．Ｃｅｌｌ  Ｈｏｓｔ  Ｍｉｃｒｏｂｅ  ２０１２；１２：３０１−３１２。
【０１１６】
９．Ｃｏｒｍｉｃａｎ  ＬＪ，Ｓｃｈｅｙ  Ｓ，Ｍｉｌｂｕｒｎ  ＨＪ．Ｇ−ＣＳＦ  ｅｎａｂｌｅｓ  ｃｏｍｐｌｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｔｈｅｒａｐｙ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｉａｔｒｏｇｅｎｉｃ  ｎｅｕｔｒｏｐｅｎｉａ．Ｅｕｒ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｊ  ２００４；２３：６４９−６５０。
【０１１７】
１０．Ｄｏｓａｎｊｈ  Ａ．Ｔｈｅ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｐａｔｈｗａｙ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｌｕｎｇ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｊ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｓ  ２０１２；３２：１１１−１１４。
【０１１８】
１１．Ｍａｒｉｏｔｔｉ  Ｓ，Ｓａｒｇｅｎｔｉｎｉ  Ｖ，Ｐａｒｄｉｎｉ  Ｍ，Ｇｉａｎｎｏｎｉ  Ｆ，Ｄｅ  Ｓｐｉｒｉｔｏ  Ｍ，Ｇａｇｌｉａｒｄｉ  ＭＣ，Ｇｒｅｃｏ  Ｅ，Ｔｅｌｏｎｉ  Ｒ，Ｆｒａｚｉａｎｏ  Ｍ，Ｎｉｓｉｎｉ  Ｒ．Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｍａｙ  ｅｓｃａｐｅ  ｈｅｌｐｅｒ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｂｙ  ｉｎｆｅｃｔｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ．Ｈｕｍ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０１３；７４：７２２−７２９。
【０１１９】
本明細書に記載されている全ての参考文献を参照により本明細書に組み入れることとする。本発明は例示として記載されているが、特許請求の範囲に定められている本発明の範囲から逸脱することなく改変および修飾が施されうると理解されるべきである。更に、特定の特徴に対する公知均等物が存在する場合には、本明細書において特に言及されている場合と同様に、そのような均等物も包含される。本発明の更なる利点および特徴は図面および非限定的な実施例から明らかである。
【図１】
0006648023.tif 000002
【図２】
0006648023.tif 000003
【図３】
0006648023.tif 000004
【図４】
0006648023.tif 000005
【図５】
0006648023.tif 000006
【図６】
0006648023.tif 000007