(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）Ｅ２ｂ遺伝子領域の欠失、Ｅ１遺伝子領域の欠失、およびＭＵＣ１抗原をコードするヌクレオチド配列を含む組換え型複製欠損性アデノウイルス５型ウイルスベクター；
（ｂ）Ｅ２ｂ遺伝子領域の欠失、Ｅ１遺伝子領域の欠失、およびブラキュリ抗原をコードするヌクレオチド配列を含む組換え型複製欠損性アデノウイルス５型ウイルスベクター；および
（ｃ）Ｅ２ｂ遺伝子領域の欠失、Ｅ１遺伝子領域の欠失、およびＣＥＡ抗原をコードするヌクレオチド配列を含む組換え型複製欠損性アデノウイルス５型ウイルスベクター
を含み、前記ＭＵＣ１抗原はＭＵＣ１−Ｃ抗原である、組成物。
【請求項２】
前記ＭＵＣ１−Ｃ抗原のアミノ酸配列は、配列番号９またはその断片に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ブラキュリ抗原をコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号８またはその断片に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記ＣＥＡ抗原をコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号１またはその断片に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記ＭＵＣ１−Ｃ抗原をコードする前記ヌクレオチド配列を含むウイルスベクター、前記ブラキュリ抗原をコードする前記ヌクレオチド配列を含むウイルスベクター、および前記ＣＥＡ抗原をコードする前記ヌクレオチド配列を含むウイルスベクターが、Ｅ３遺伝子領域、Ｅ４遺伝子領域、またはそれらの任意の組み合わせにおける欠失を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
免疫原性成分をさらに含む、請求項１に記載の組成物であって、前記免疫原性成分は、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦα、ＩＬ−２、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＩＬ−７、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、およびＩＬ−１３の群より選択されるサイトカインを含む、組成物。
【請求項７】
ウイルスベクターが、前記ＭＵＣ１抗原、前記ブラキュリ抗原および前記ＣＥＡ抗原からなる群から選択される少なくとも２つの抗原をコードする配列を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記ＣＥＡ抗原のアミノ酸配列が、配列番号１０を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
処置を必要とする被験体を処置するための組成物であって、
前記組成物は、Ｅ２ｂ遺伝子領域の欠失、Ｅ１遺伝子領域の欠失、およびＭＵＣ１抗原をコードするヌクレオチド配列を含む組換え型複製欠損性アデノウイルス５型ウイルスベクター、Ｅ２ｂ遺伝子領域の欠失、Ｅ１遺伝子領域の欠失、およびブラキュリ抗原をコードするヌクレオチド配列を含む組換え型複製欠損性アデノウイルス５型ウイルスベクター、ならびにＥ２ｂ遺伝子領域の欠失、Ｅ１遺伝子領域の欠失、およびＣＥＡ抗原をコードするヌクレオチド配列を含む組換え型複製欠損性アデノウイルス５型ウイルスベクターを含み、前記組成物は、処置を必要とする前記被験体に投与されることを特徴とし、そして、
前記組成物は、前記ＭＵＣ１抗原、前記ブラキュリ抗原、または前記ＣＥＡ抗原、あるいは、前記ＭＵＣ１抗原、前記ブラキュリ抗原、または前記ＣＥＡ抗原を発現する細胞に対する免疫応答を誘導し、
処置を必要とする前記被験体はがんを有し、
前記ＭＵＣ１抗原はＭＵＣ１−Ｃ抗原である、組成物。
【請求項１０】
前記組成物は、５×１０１１ウイルス粒子（ＶＰ）の前記ＭＵＣ１−Ｃ抗原をコードするヌクレオチド配列を含む前記ウイルスベクター、少なくとも５×１０１１ウイルス粒子（ＶＰ）の前記ブラキュリ抗原をコードするヌクレオチド配列を含む前記ウイルスベクター、および少なくとも５×１０１１ウイルス粒子（ＶＰ）の前記ＣＥＡ抗原をコードするヌクレオチド配列を含む前記ウイルスベクターを含む、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記免疫応答が、基底の少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、または２５倍である、請求項９に記載の組成物。
【請求項１２】
前記免疫応答が、抗原特異的抗体応答として、抗原特異的細胞媒介性免疫（ＣＭＩ）として、抗原特異的ＩＦＮ−γ分泌として、抗原特異的ＩＬ−２分泌として、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって、またはこれらの任意の組み合わせによって測定される、請求項９に記載の組成物。
【請求項１３】
前記投与が皮下投与を含む、請求項９に記載の組成物。
【請求項１４】
前記被験体が、結腸直腸腺癌、転移性結腸直腸がん、進行ＭＵＣ１−Ｃ、ブラキュリ、もしくはＣＥＡ発現結腸直腸がん、乳がん、肺がん、膀胱がん、または膵がんを有する、請求項９に記載の組成物。
【請求項１５】
処置を必要とする前記被験体がヒトである、請求項９に記載の組成物。
【請求項１６】
前記ＭＵＣ１−Ｃ抗原のアミノ酸配列が、配列番号９またはその断片に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するか、前記ブラキュリ抗原をコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号８またはその断片に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するか、前記ＣＥＡ抗原をコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号１またはその断片に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するか、前記ＣＥＡ抗原のアミノ酸配列が、配列番号１０を含むか、またはそれらの任意の組み合わせである、請求項９に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
この出願は、２０１５年１月９日に出願された米国仮出願第６２／１０１，９６９号および２０１５年４月２０日に出願された米国仮出願第６２／１５０，２３６号に対する優先権（これは、それらの全体が参考として本明細書に援用される）を主張する。
【０００２】
関連出願
この出願は、２０１３年３月１５日に出願されたＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３２６８８号（この内容は、その全体が参考として本明細書に援用される）に関する。
【０００３】
連邦政府により資金供与された研究についての陳述
この発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＮＣＩ）によって付与された契約第ＨＨＳＮ  ２６１２００９０００５９Ｃ号；およびＮＣＩによって付与された契約第ＨＨＳＮ  ２６１２０１１０００９７Ｃ号；ＮＣＩによって付与された助成金第１Ｒ４３ＣＡ１３４０６３号；ＮＣＩによって付与された助成金第２Ｒ４４ＣＡ１３４０６３号；ＮＣＩによって付与された助成金第１Ｒ４３ＣＡ１８６３５７号；Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｄｅｎｔａｌ  ａｎｄ  Ｃｒａｎｉｏｆａｃｉａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＮＩＤＣＲ）によって付与された助成金第１Ｒ４３ＤＥ０２１９７３号；およびＮＩＤＣＲによって付与された助成金第２Ｒ４４ＤＥ０２１９７３号の下、政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明に一定の権利を有し得る。
【背景技術】
【０００４】
ワクチンは、有害な物質および疾患細胞を認識し、破壊するように免疫系を訓練することにより、身体が疾患と闘うのを助ける。ワクチンは、防止ワクチンと処置ワクチンの２つの型に大きく群分けすることができる。防止ワクチンは、健康な人に、特定の疾患の発生を防止するために施されるものであり、一方、処置ワクチンは、免疫療法とも称され、疾患の診断がなされた人に、疾患の増殖および拡散の阻止を助けるため、または防止薬として与えられるものである。感染症およびがんと闘うのを助けるためのウイルスワクチンが現在開発されている。これらのウイルスワクチンは、宿主の細胞内の疾患に関連する遺伝子のごく一部の発現を誘導することによって働き、それにより今度は、宿主の免疫系を増強して疾患細胞を同定し破壊する。したがって、ウイルスワクチンの臨床応答は、ワクチンの、高レベルの免疫原性を得、長期間発現を持続する能力に左右され得る。免疫原性の基礎をなす生理的免疫応答の持続時間および広さの調節においては免疫阻害経路などの免疫チェックポイントが重要な役割を果たし得る。ワクチンと免疫チェックポイント免疫阻害経路を阻害する薬物の投与を組み合わせることにより、患者におけるワクチンの有効性および効果を増強することができ得る。
【０００５】
腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を送達することによって達成されるがん免疫療法には生存利益があり得るが、これらの戦略には限界があり、免疫学的により強力なワクチンが必要とされている。アジュバントと免疫賦活性サイトカインの同時投与を含めた種々のワクチン接種戦略が自己腫瘍抗原の免疫原性が低いことに対処するために使用されている。代替として、生得的な炎症促進性シグナルを本質的にもたらし、目的の抗原を発現する組換え型ウイルスベクターの使用が挙げられる。アデノウイルス血清型５（Ａｄ５）をベースとした免疫療法薬が、ヒトにおいて、安全性を残しながら強固なＴ細胞媒介性免疫（Ｔ−ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｍｍｕｎｅ）（ＣＭＩ）応答を誘導するために繰り返し使用されている。Ａｄ５ベクターは多量に製造されており、また、保管および外来患者への投与のための送達に関して安定であるが、第１世代（Ｅ１欠失）のＡｄ５をベースとしたベクターの使用の主要な障害は、既存する抗Ａｄ５中和抗体（ＮＡｂ）の発生頻度が高いことであり、これらは、標的ＴＡＡに対する不十分な免疫賦活をそれぞれもたらす以前の野生型アデノウイルス感染またはＡｄ５をベースとしたワクチンを用いた注射を繰り返すことによるＡｄ５  ＮＡｂの誘導により、宿主に存在する可能性がある。
【０００６】
アデノウイルス（Ａｄ）ベクターに伴う主要な問題は、免疫コンピテントな被験体におけるＡｄベクターおよびウイルスにより形質導入された細胞を排除する宿主の免疫応答に主に起因して、それらが導入遺伝子発現を長期間持続させることができないことである。第１世代Ａｄベクターワクチンの使用は、Ａｄに対するワクチンの既存のまたは誘導された免疫によって重度に限定される。大多数のヒトがＡｄ５  ＮＡｂを有し、３分の２がＡｄに対するリンパ球増殖性応答を有する。ＨＩＶ−１エンベロープ遺伝子を有するＡｄベクターワクチンでは、アジュバントを伴わずにＤＮＡを使用して初回刺激された免疫応答を再免疫することができなかった。非ヒト霊長類の単回免疫では、ＨＩＶタンパク質に対する導入遺伝子特異的抗体を産生させること、または全体的なＴ細胞応答を変化させることはできなかった。
【０００７】
既存の免疫がＡｄベクターワクチンに干渉する複数の機構が存在するが、１つの主要な懸念は、ＮＡｂの存在、およびその後の、Ａｄ感染抗原を有する細胞のＣＭＩ排除である。これらの応答は両方とも、いくつかのＡｄタンパク質に対するものであり得る。ワクチン用量を増加させることにより、Ａｄ免疫動物における所望のＣＭＩ応答の誘導を増大させることができるが、多くの場合、許容されない有害作用が動物およびヒトにおいて生じる。第１世代Ａｄ５ベクターを使用すると、初回刺激ワクチン接種として裸の（非ベクター化）ＤＮＡ、その後、Ａｄ５ベクターによる免疫を使用した異種初回刺激−追加刺激レジメンではその後のＡｄ５に対する免疫応答が生じる可能性があり、したがって、同じウイルス骨格を利用する同じ（または異なる）Ａｄベクターワクチンを用いたさらなる再免疫（追加刺激）を施行することができない。したがって、現行の第１世代Ａｄ５ベクターを用いたこのアプローチを使用すると、Ａｄ５ベクターによる免疫のさらなる使用が抑止される可能性がある。
【０００８】
第１世代（Ｅ１欠失）Ａｄベクターワクチンは、レベルは低下しているがＡｄ後期遺伝子を発現し、これは野生型Ａｄウイルスよりも長い期間にわたる。またワクチン抗原は、免疫原性が高いＡｄカプシドタンパク質と同時に免疫系に提示される。抗原性の競合に起因して、生じる免疫応答は所望のワクチンエピトープに指向される可能性が低く、Ａｄ由来の抗原に指向される可能性が高い。Ａｄ５をベースとしたベクターで直面する主要な問題のうちの１つは、ヒト集団におけるＡｄに対する既存の免疫の傾向が高いこと、およびこれにより、あらゆる追加的なワクチン適用に関して、大多数のヒト集団における従来のＡｄ５［Ｅ１−］欠失（第１世代Ａｄ）の使用がどれほど妨げられるかである。第１世代（Ｅ１欠失）のＡｄ５をベースとしたベクターの使用の主要な障害は、既存する抗アデノウイルス５型中和抗体の発生頻度が高いことである。これらの抗体は、標的ＴＡＡに対する不十分な免疫賦活をそれぞれもたらす以前の野生型アデノウイルス感染および／またはＡｄ５をベースとしたワクチンを用いた注射を繰り返すことによるアデノウイルス中和抗体の誘導に起因して、潜在的なワクチンにおいて存在する可能性がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、より有効ながんワクチンベクター候補が依然として必要とされている。複数回のワクチン接種、およびＡｄに対する既存の免疫を有する個体におけるワクチン接種を可能にする、がんを標的とするＡｄワクチンベクターが必要とされている。腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を送達することによって達成されるがん免疫療法により生存利益がもたらされるが、これらの戦略には限界があり、免疫学的により強力なワクチンが必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
これらの難題を克服するために、本発明は、感染症およびがんなどの複雑な疾患に対する治療応答を増強するための組み合わせ多標的化ワクチン、免疫療法および方法を提供する。本開示は、個体において感染症およびがんと闘うための免疫応答を生じさせるための組成物、方法およびキットに関する。本開示は、標的抗原、または標的抗原もしくは少なくとも１つの標的抗原を含む標的抗原シグネチャを発現または提示している細胞に対する免疫応答を生じさせるための組成物、方法およびキットを提供する。
【００１１】
Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］ベクターは、Ａｄ５［Ｅ１−］ベクターよりも安全であるだけでなく、抗原特異的な免疫応答の誘導に関してＡｄ５［Ｅ１−］ベクターよりも優れていると思われ、それにより、臨床応答をもたらすことができるＭＵＣ１、Ｔおよび／またはＣＥＡワクチンを送達するためのプラットフォームとしてはるかに適したものになることが発見されている。他の場合では、免疫誘導には数カ月かかる可能性がある。Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］ベクターは、Ａｄ５［Ｅ１−］ベクターよりも安全であるだけでなく、抗原特異的な免疫応答の誘導に関してＡｄ５［Ｅ１−］ベクターよりも優れていると思われ、それにより、臨床応答をもたらすことができるＭＵＣ１ｃ、Ｔおよび／またはＣＥＡワクチンを送達するためのプラットフォームとしてはるかに適したものになる。
【００１２】
本発明の種々の実施形態では、開発の必要性が長く探求されてきたＭＵＣ１、Ｔおよび／またはＣＥＡに対する治療ワクチン（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｖａｃｃｉｎｅ）の送達に新しいＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］ベクター系を利用することにより、他のＡｄ５系で見られる障壁を克服し、また、以前にＡｄ５に曝露している人の免疫を可能にする。本発明の他の実施形態では、開発の必要性が長く探求されてきたＭＵＣ１ｃ、Ｔおよび／またはＣＥＡに対する治療ワクチンの送達に新しいＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］ベクター系を利用することにより、他のＡｄ５系で見られる障壁を克服し、また、以前にＡｄ５に曝露している人の免疫を可能にする。本発明の他の実施形態では、開発の必要性が長く探求されてきたＭＵＣ１ｎ、ＴまたはＣＥＡに対する治療ワクチンの送達に新しいＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］ベクター系を利用することにより、他のＡｄ５系で見られる障壁を克服し、また、以前にＡｄ５に曝露している人の免疫を可能にする。
【００１３】
自己腫瘍抗原の免疫原性が低いことに対処するために、アジュバントと免疫賦活性サイトカインの同時投与を含めた、種々の進歩した多成分ワクチン接種戦略が提供される。本発明は、生得的な炎症促進性シグナルをもたらす一方で、目的の抗原を発現するように同時に工学的に操作された組換え型ウイルスベクターに関する。ヒトにおいて広範囲にわたる安全性プロファイルをずっと維持しながら強固なＴ細胞媒介性免疫（ＣＭＩ）応答を誘導するために繰り返し使用されているアデノウイルス血清型５（Ａｄ５）をベースとした免疫療法薬が特に興味深い。
【００１４】
一態様では、ＭＵＣ１−Ｃ抗原をコードする配列を含む組換え型複製欠損性ウイルスベクターを含む組成物であって、ＭＵＣ１−Ｃ抗原をコードする配列が配列番号５または配列番号６に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する、組成物が提供される。一部の実施形態では、ＭＵＣ１−Ｃ抗原は、配列番号９に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む。
【００１５】
一態様では、ブラキュリ抗原をコードする配列を含む組換え型複製欠損性ウイルスベクターを含む組成物であって、ブラキュリ抗原をコードする配列が配列番号７または配列番号８に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する組成物が提供される。一部の実施形態では、ウイルスベクターを投与されたヒトにおいて、抗原または抗原を発現する細胞に対する免疫応答が誘導される。
【００１６】
一態様では、ＭＵＣ１−Ｃ抗原、ブラキュリ抗原、およびＣＥＡ抗原からなる群より選択される少なくとも２つの抗原をコードする配列を含む組換え型複製欠損性ウイルスベクターを含む組成物が提供される。一部の実施形態では、ウイルスベクターを投与されたヒトにおいて少なくとも２つの抗原または少なくとも２つの抗原を発現する細胞に対する免疫応答が誘導される。
【００１７】
一部の実施形態では、免疫応答は、抗原に対する抗体の産生を含む。一部の実施形態では、免疫応答は、細胞媒介性免疫（ＣＭＩ）を含む。一部の実施形態では、ＭＵＣ１−Ｃ抗原をコードする配列は、配列番号５または配列番号６に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ブラキュリ抗原をコードする配列は、配列番号７または配列番号８に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ＣＥＡ抗原をコードする配列は、配列番号１、配列番号２、または配列番号３に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、抗原は、２５、１５、１０、５、またはそれ未満のアミノ酸の改変を含む。一部の実施形態では、抗原は、１アミノ酸の改変を含む。一部の実施形態では、組換え型ウイルスベクターは、レトロウイルス、レンチウイルス、サイトメガロウイルス、センダイウイルス、ＨＰＶウイルス、およびアデノウイルスからなる群より選択される。一部の実施形態では、組換え型ウイルスベクターは、複製欠損性アデノウイルスベクターを含む。一部の実施形態では、組換え型ウイルスベクターは、複製欠損性アデノウイルス５型ベクターを含む。一部の実施形態では、複製欠損性アデノウイルスベクターは、Ｅ２ｂ遺伝子領域の欠失を含む。一部の実施形態では、複製欠損性アデノウイルスベクターは、Ｅ１遺伝子領域の欠失を含む。一部の実施形態では、複製欠損性アデノウイルスベクターは、Ｅ３遺伝子領域の欠失を含む。一部の実施形態では、複製欠損性アデノウイルスベクターは、Ｅ４遺伝子領域の欠失を含む。一部の実施形態では、組換え型ウイルスベクターは、トランスフェクトされた細胞において抗原の過剰発現をもたらす。一部の実施形態では、組換え型ウイルスベクターは、ヒトにおいて抗原を発現する細胞に対して基底の少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、または２５倍の特異的な免疫応答を誘導する。一部の実施形態では、ヒトは、５０超、７５超、１００超、１２５超、１５０超、１６０超、１７５超、または２００超のＡｄ５中和抗体力価の逆数を有する。一部の実施形態では、ヒトは、２５０超、５００超、７５０超、１０００超、１５００超、２０００超、２５００超、３０００超、３５００超、４０００超、４５００超、または４７６７超のＡｄ５中和抗体力価の逆数を有する。一部の実施形態では、免疫応答は、抗原特異的抗体応答として測定される。
【００１８】
一部の実施形態では、免疫応答は、抗原特異的細胞媒介性免疫（ＣＭＩ）として測定される。一部の実施形態では、免疫応答は、抗原特異的ＩＦＮ−γ分泌として測定される。一部の実施形態では、免疫応答は、抗原特異的ＩＬ−２分泌として測定される。一部の実施形態では、抗原に対する免疫応答は、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって測定される。一部の実施形態では、抗原特異的ＣＭＩは、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）１０６個当たり２５超、５０超、７５超、１００超、１５０超、２００超、２５０超、または３００超のＩＦＮ−γスポット形成細胞（ＳＦＣ）である。一部の実施形態では、免疫応答は、ＣＡＰ−１でパルスした抗原提示細胞、腫瘍細胞株由来または自己腫瘍由来の、同種抗原を発現する細胞のＴ細胞溶解によって測定される。一部の実施形態では、組成物は、免疫原性成分をさらに含む。一部の実施形態では、免疫原性成分は、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦα、ＩＬ−２、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＩＬ−７、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、およびＩＬ−１３の群より選択されるサイトカインを含む。一部の実施形態では、免疫原性成分は、ＩＬ−７、ＩＬ−７をコードする核酸、ＩＬ−７に対して実質的な同一性を有するタンパク質、およびＩＬ−７に対して実質的な同一性を有するタンパク質をコードする核酸からなる群より選択される。一部の実施形態では、ＣＥＡ抗原は、配列番号３の６１０位に対応する位置におけるアスパラギン酸の置換を含む改変を含む。一部の実施形態では、組成物は、免疫経路チェックポイントモジュレーターを含む分子組成物をさらに含む。一部の実施形態では、免疫経路チェックポイントモジュレーターは、免疫応答を活性化または強化する。一部の実施形態では、免疫経路チェックポイントモジュレーターは、免疫応答阻害因子を阻害する。一部の実施形態では、免疫経路チェックポイントは、免疫応答を阻害する。一部の実施形態では、免疫経路チェックポイントモジュレーターは、ＰＤ１、ＰＤＬ１、ＰＤＬ２、ＣＤ２８、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＴＬＡ４、Ｂ７ＲＰ１、ＩＣＯＳ、Ｂ７ＲＰＩ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＨＶＥＭ、ＫＩＲ、ＴＣＲ、ＬＡＧ３、ＣＤ１３７、ＣＤ１３７Ｌ、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ２７、ＣＤ７０、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＴＩＭ３、ＧＡＬ９、ＡＤＯＲＡ、ＣＤ２７６、ＶＴＣＮ１、ＩＤＯ１、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＨＡＶＣＲ２、ＶＩＳＴＡ、およびＣＤ２４４からなる群より選択される内在性免疫経路チェックポイントタンパク質またはその断片を標的とする。一部の実施形態では、免疫経路チェックポイントモジュレーターは、ＰＤ１タンパク質を標的とする。一部の実施形態では、分子組成物は、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス、小分子、模倣物（ｍｉｍｉｃ）、リガンドの組換え型、受容体の組換え型、抗体、またはこれらの組み合わせを含む。
【００１９】
一態様では、組成物の投与についてヒトを選択する方法であって、ヒトのＨＬＡ亜型を決定するステップと、ＨＬＡ亜型が予め選択されたＨＬＡ亜型のサブグループのうちの１つであると決定された場合に、ヒトに組成物を投与するステップとを含む方法が提供される。一部の実施形態では、予め選択されたＨＬＡ亜型のサブグループは、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ａ３、およびＨＬＡ−Ａ２４のうちの１つまたは複数を含む。
【００２０】
一態様では、がんまたは感染症についてヒトを処置する方法であって、ヒトに組換え型ウイルスベクターを投与するステップを含む方法が提供される。
【００２１】
一態様では、ヒトにおいてＭＵＣ１−Ｃ、ブラキュリ、ＣＥＡ、またはそれらの任意の組み合わせに対する免疫応答を生じさせる方法であって、ヒトに組成物を投与するステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、投与するステップを少なくとも１回繰り返す。一部の実施形態では、投与するステップを前回の投与するステップの約２週間後、約３週間後、約４週間後、約５週間後、または約６週間後に繰り返す。一部の実施形態では、投与するステップを前回の投与するステップの約２カ月後、約３カ月後、約４カ月後、約５カ月後、または約６カ月後に繰り返す。一部の実施形態では、投与するステップを２回繰り返す。
【００２２】
一態様では、処置の第１の相と処置の第２の相を選択するステップと、第１の相の間に、ヒトに、ＭＵＣ１−Ｃ抗原をコードする第１の複製欠損性アデノウイルスベクターを含む第１の組成物を合計３回、約３週間の間隔で投与するステップと、第２の相の間に、ヒトに、ヒトにおいてＭＵＣ１−Ｃ抗原を発現する細胞に対する免疫応答を誘導する抗原をコードする第２の複製欠損性アデノウイルスベクターを含む第２の組成物を合計３回、約３カ月の間隔で投与するステップとを含む処置方法が提供される。
【００２３】
一態様では、処置の第１の相と第２の相を選択するステップと、第１の相の間に、ヒトに、ブラキュリ抗原をコードする第１の複製欠損性アデノウイルスベクターを含む第１の組成物を合計３回、約３週間の間隔で投与するステップと、第２の相の間に、ヒトに、ヒトにおいてブラキュリ抗原を発現する細胞に対する免疫応答を誘導する抗原をコードする第２の複製欠損性アデノウイルスベクターを含む第２の組成物を合計３回、約３カ月の間隔で投与するステップとを含む処置方法が提供される。
【００２４】
一態様では、処置の第１の相と処置の第２の相を選択するステップと、第１の相の間に、ヒトに、ＭＵＣ１−Ｃ抗原、ブラキュリ抗原、およびＣＥＡ抗原からなる群より選択される少なくとも２つの抗原をコードする第１の複製欠損性アデノウイルスベクターを含む第１の組成物を合計３回、約３週間の間隔で投与するステップと、第２の相の間に、ヒトに、ヒトにおいて上記少なくとも２つの抗原を発現する細胞に対する免疫応答を誘導する抗原をコードする第２の複製欠損性アデノウイルスベクターを含む第２の組成物を合計３回、約３カ月の間隔で投与するステップとを含む処置方法が提供される。一部の実施形態では、第２の相を第１の相の終了から約３カ月後に開始する。
【００２５】
一態様では、処置の第１の相と処置の第２の相を選択するステップと、第１の相の間に、ヒトに、ブラキュリ抗原をコードする第１の複製欠損性アデノウイルスベクターを含む第１の組成物を合計ｎ回投与するステップと、第２の相の間に、ヒトに、ヒトにおいてブラキュリ抗原を発現する細胞に対する免疫応答を誘導する抗原をコードする第２の複製欠損性アデノウイルスベクターを含む第２の組成物を合計ｍ回投与するステップとを含む処置方法が提供される。
【００２６】
一態様では、処置の第１の相と処置の第２の相を選択するステップと、第１の相の間に、ヒトに、ＭＵＣ１−Ｃ抗原をコードする第１の複製欠損性アデノウイルスベクターを含む第１の組成物を合計ｎ回投与するステップと、第２の相の間に、ヒトに、ヒトにおいてＭＵＣ１−Ｃ抗原を発現する細胞に対する免疫応答を誘導する抗原をコードする第２の複製欠損性アデノウイルスベクターを含む第２の組成物を合計ｍ回投与するステップとを含む処置方法が提供される。
【００２７】
一態様では、処置の第１の相と処置の第２の相を選択するステップと、第１の相の間に、ヒトに、ＭＵＣ１−Ｃ抗原、ブラキュリ抗原、およびＣＥＡ抗原からなる群より選択される少なくとも２つの抗原をコードする第１の複製欠損性アデノウイルスベクターを含む第１の組成物を合計ｎ回投与するステップと、第２の相の間に、ヒトに、ヒトにおいて上記少なくとも２つの抗原を発現する細胞に対する免疫応答を誘導する上記少なくとも２つの抗原をコードする第２の複製欠損性アデノウイルスベクターを含む第２の組成物を合計ｍ回投与するステップとを含む処置方法が提供される。一部の実施形態では、ｎは１より大きい。一部の実施形態では、ｎは３である。一部の実施形態では、ｍは１より大きい。一部の実施形態では、ｍは３である。一部の実施形態では、第１の相は、少なくとも２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、または８週間である。一部の実施形態では、第２の相は、少なくとも２カ月、３カ月、４カ月、５カ月、６カ月、７カ月、または８カ月である。一部の実施形態では、第２の相を、第１の相の終了から３〜１６週間後に開始する。一部の実施形態では、第１の相において、複製欠損性アデノウイルスの２回の投与は少なくとも１８日間離れている。一部の実施形態では、第１の相において、複製欠損性アデノウイルスの２回の投与は約２１日間離れている。一部の実施形態では、第１の相において、複製欠損性アデノウイルスの２回の投与は最大２４日間離れている。一部の実施形態では、第２の相において、複製欠損性アデノウイルスの２回の投与は少なくとも１０週間離れている。一部の実施形態では、第２の相において、複製欠損性アデノウイルスの２回の投与は約１３週間離れている。一部の実施形態では、第２の相において、複製欠損性アデノウイルスの２回の投与は最大１６週間離れている。一部の実施形態では、方法は、免疫経路チェックポイントモジュレーターを含む分子組成物を投与するステップをさらに含む。
【００２８】
一態様では、処置の第１の相と処置の第２の相を選択するステップと、第１の相の間に、ヒトに、ヒトにおいてＭＵＣ１−Ｃ、ブラキュリ、またはＣＥＡ抗原を発現する細胞に対する免疫応答を誘導する抗原をコードする第１の複製欠損性アデノウイルスベクターを含む第１の組成物を合計ｎ回投与するステップと、第２の相の間に、ヒトに、ヒトにおいてＭＵＣ１−Ｃ、ブラキュリ、またはＣＥＡ抗原を発現する細胞に指向される免疫応答を誘導することができる抗原をコードする第２の複製欠損性アデノウイルスベクターを含む第２の組成物を合計ｍ回投与するステップとを含み、免疫経路チェックポイントモジュレーターを含む分子組成物を第１の相、第２の相、またはその両方の間に投与する、処置方法が提供される。
【００２９】
一態様では、処置を必要とする被験体を処置する方法であって、被験体に、（ａ）（ｉ）ＭＵＣ１−Ｃ抗原、（ｉｉ）ブラキュリ抗原、または（ｉｉｉ）ＭＵＣ１−Ｃ抗原、ブラキュリ抗原、およびＣＥＡ抗原からなる群より選択される少なくとも２つの抗原をコードする組換え型複製欠損性アデノウイルスベクターと、（ｂ）免疫経路チェックポイントモジュレーターを含む分子組成物とを投与し、それにより、被験体において免疫応答を生じさせるステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、（ａ）および（ｂ）を逐次に投与する。一部の実施形態では、（ａ）および（ｂ）を同時に投与する。一部の実施形態では、（ａ）および（ｂ）を、１カ月の間隔を空けて投与する。
【００３０】
一部の実施形態では、免疫経路チェックポイントモジュレーターにより、免疫応答が活性化または強化される。一部の実施形態では、免疫経路チェックポイントモジュレーターにより、免疫応答阻害因子が阻害される。一部の実施形態では、免疫経路チェックポイントは、免疫応答を阻害する。一部の実施形態では、免疫経路チェックポイントモジュレーターは、ＰＤ１、ＰＤＬ１、ＰＤＬ２、ＣＤ２８、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＴＬＡ４、Ｂ７ＲＰ１、ＩＣＯＳ、Ｂ７ＲＰＩ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＨＶＥＭ、ＫＩＲ、ＴＣＲ、ＬＡＧ３、ＣＤ１３７、ＣＤ１３７Ｌ、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ２７、ＣＤ７０、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＴＩＭ３、ＧＡＬ９、ＡＤＯＲＡ、ＣＤ２７６、ＶＴＣＮ１、ＩＤＯ１、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＨＡＶＣＲ２、ＶＩＳＴＡ、およびＣＤ２４４からなる群より選択される内在性免疫経路チェックポイントタンパク質またはその断片を標的とする。一部の実施形態では、免疫経路チェックポイントモジュレーターは、ＰＤ１タンパク質を標的とする。一部の実施形態では、分子組成物は、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス、小分子、模倣物、リガンドの組換え型、受容体の組換え型、抗体、またはこれらの組み合わせを含む。
【００３１】
一部の実施形態では、免疫応答は少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、または２５倍に増大する。一部の実施形態では、第１の複製欠損性アデノウイルスベクターと第２の複製欠損性アデノウイルスベクターは同じものである。一部の実施形態では、第１の複製欠損性アデノウイルスベクターは、複製欠損性アデノウイルス５型ベクターを含む。一部の実施形態では、第２の複製欠損性アデノウイルスベクターは、複製欠損性アデノウイルス５型ベクターを含む。一部の実施形態では、ヒトは、血清型ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ａ３、またはＨＬＡ−Ａ２４のヒト白血球抗原を発現する。一部の実施形態では、第１の複製欠損性アデノウイルスベクターは、Ｅ２ｂ遺伝子領域の欠失を含む。一部の実施形態では、第１の複製欠損性アデノウイルスベクターは、Ｅ１遺伝子領域の欠失をさらに含む。一部の実施形態では、第１の複製欠損性アデノウイルスベクターは、Ｅ３遺伝子領域の欠失をさらに含む。一部の実施形態では、第１の複製欠損性アデノウイルスベクターは、Ｅ４遺伝子領域の欠失をさらに含む。一部の実施形態では、第２の複製欠損性アデノウイルスベクターは、Ｅ２ｂ遺伝子領域の欠失を含む。一部の実施形態では、第２の複製欠損性アデノウイルスベクターは、Ｅ１遺伝子領域の欠失をさらに含む。一部の実施形態では、第２の複製欠損性アデノウイルスベクターは、Ｅ３遺伝子領域の欠失をさらに含む。一部の実施形態では、第２の複製欠損性アデノウイルスベクターは、Ｅ４遺伝子領域の欠失をさらに含む。一部の実施形態では、第１の組成物、第２の組成物、またはその両方は、組換え型核酸ベクターを含むウイルス粒子を少なくとも１．０×１０１１個、２．０×１０１１個、３．０×１０１１個、３．５×１０１１個、４．０×１０１１個、４．５×１０１１個、４．８×１０１１個、４．９×１０１１個、４．９５×１０１１個、または４．９９×１０１１個含む。一部の実施形態では、第１の組成物、第２の組成物、またはその両方は、ウイルス粒子を最大７．０×１０１１個、６．５×１０１１個、６．０×１０１１個、５．５×１０１１個、５．２×１０１１個、５．１×１０１１個、５．０５×１０１１個、または５．０１×１０１１個含む。一部の実施形態では、第１の組成物、第２の組成物、またはその両方は、ウイルス粒子を１．０〜７．０×１０１１個または１．０〜５．５×１０１１個含む。一部の実施形態では、第１の組成物、第２の組成物、またはその両方は、ウイルス粒子を４．５〜５．５×１０１１個含む。一部の実施形態では、第１の組成物、第２の組成物、またはその両方は、ウイルス粒子を４．８〜５．２×１０１１個含む。一部の実施形態では、第１の組成物、第２の組成物、またはその両方は、ウイルス粒子を４．９〜５．１×１０１１個含む。一部の実施形態では、第１の組成物、第２の組成物、またはその両方は、ウイルス粒子を４．９５〜５．０５×１０１１個含む。一部の実施形態では、第１の組成物、第２の組成物、またはその両方は、ウイルス粒子を４．９９〜５．０１×１０１１個含む。一部の実施形態では、第１の相は、少なくとも２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、または８週間である。一���の実施形態では、第２の相は、少なくとも２カ月、３カ月、４カ月、５カ月、６カ月、７カ月、または８カ月である。一部の実施形態では、免疫応答は、抗原特異的抗体応答として測定される。一部の実施形態では、免疫応答は、抗原特異的細胞媒介性免疫（ＣＭＩ）として測定される。一部の実施形態では、免疫応答は、抗原特異的ＩＦＮ−γ分泌として測定される。一部の実施形態では、免疫応答は、抗原特異的ＩＬ−２分泌として測定される。一部の実施形態では、抗原に対する免疫応答は、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって測定される。一部の実施形態では、抗原特異的ＣＭＩは、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）１０６個当たり２５超、５０超、７５超、１００超、１５０超、２００超、２５０超、または３００超のＩＦＮ−γスポット形成細胞（ＳＦＣ）である。一部の実施形態では、免疫応答は、ＣＡＰ−１でパルスした抗原提示細胞、腫瘍細胞株由来または自己腫瘍由来の、同種抗原を発現する細胞のＴ細胞溶解によって測定される。一部の実施形態では、第１の複製欠損性アデノウイルスまたは第２の複製欠損性アデノウイルスはヒトにおいて樹状細胞に感染し、感染した樹状細胞は抗原を提示し、それにより、免疫応答が誘導される。一部の実施形態では、投与するステップは、皮下（ｓｃ）投与を含む。一部の実施形態では、ヒトは、投与するステップの前に、５０超、７５超、１００超、１２５超、１５０超、１６０超、１７５超、２００超、２２５超、２５０超、２７５超、または３００超のＡｄ５中和抗体力価の逆数を有する。一部の実施形態では、ヒトは、２５０超、５００超、７５０超、１０００超、１５００超、２０００超、２５００超、３０００超、３５００超、４０００超、４５００超、または４７６７超のＡｄ５中和抗体力価の逆数を有する。一部の実施形態では、ヒトは、ステロイド、コルチコステロイド、および免疫抑制剤のいずれか１つによる処置を同時に受けていない。一部の実施形態では、ヒトは、自己免疫疾患を有さない。一部の実施形態では、ヒトは、炎症性腸疾患、全身性エリテマトーデス、強直性脊椎炎、強皮症、多発性硬化症、ウイルス性肝炎、またはＨＩＶを有さない。一部の実施形態では、ヒトは、感染症を有するまたは今後有する可能性がある。一部の実施形態では、ヒトは、自己免疫関連甲状腺疾患または白斑を有する。一部の実施形態では、ヒトは、増殖性疾患であるがんを有するまたは今後有する可能性がある。一部の実施形態では、ヒトは、結腸直腸腺癌、転移性結腸直腸がん、進行ＭＵＣ１−Ｃ、ブラキュリ、またはＣＥＡ発現結腸直腸がん、乳がん、肺がん、膀胱がん、または膵がん（ｐａｎｃｒｅａｓ  ｃａｎｃｅｒ）を有する。一部の実施形態では、ヒトは、少なくとも１部位、２部位、または３部位の転移性疾患を有する。一部の実施形態では、ヒトは、ＭＵＣ１−Ｃ、ブラキュリ、またはＣＥＡを過剰発現する細胞を含む。一部の実施形態では、ＭＵＣ１−Ｃ、ブラキュリ、またはＣＥＡを過剰発現する細胞は、ＭＵＣ１−Ｃ、ブラキュリ、またはＣＥＡを非がん細胞におけるベースラインのＭＵＣ１−Ｃ、ブラキュリ、またはＣＥＡの発現の少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、または１０倍過剰発現する。一部の���施形態では、ＭＵＣ１−Ｃ、ブラキュリ、またはＣＥＡを過剰発現する細胞は、がん細胞を含む。一部の実施形態では、被験体は、診断された疾患素因を有する。一部の実施形態では、被験体は、安定病態を有する。一部の実施形態では、被験体は、疾患に対する遺伝的素因を有する。一部の実施形態では、疾患は、がんである。一部の実施形態では、がんは、前立腺がん、結腸がん、乳がん、または胃がんからなる群より選択される。一部の実施形態では、がんは、前立腺がんである。一部の実施形態では、被験体のグリーソンスコアは６またはそれ未満である。一部の実施形態では、被験体のグリーソンスコアは６超である。一部の実施形態では、第１の複製欠損性アデノウイルスベクターまたは第２の複製欠損性アデノウイルスベクターは、配列番号３に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、第１の複製欠損性アデノウイルスベクターまたは第２の複製欠損性アデノウイルスベクターは、配列番号３内の２６０４８〜２６１７７、２６０６３〜２６１４１、１〜１０３、５４〜１０３、３２２１４〜３２３１５、および３２２１４〜３２２６２から選択される領域に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する領域を含む。一部の実施形態では、第１の複製欠損性アデノウイルスベクターまたは第２の複製欠損性アデノウイルスベクターは、配列番号３内の１０５７位から３１６５位の間の領域に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する領域を含む。一部の実施形態では、第１または第２の複製欠損性アデノウイルスベクターは、ＭＵＣ１−Ｃ、ブラキュリ、またはＣＥＡ抗原をコードする配列を含み、ＭＵＣ１−Ｃ抗原は、配列番号５または配列番号６に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列によりコードされ、ブラキュリ抗原は、配列番号７または配列番号８に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列によりコードされ、ＣＥＡ抗原は、配列番号１、配列番号２、または配列番号３に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列によりコードされる。
【００３２】
一態様では、ヒトにおいて免疫応答を誘導するためのキットであって、組換え型複製欠損性アデノウイルスベクターを含むウイルス粒子を少なくとも１．０×１０１１個含む治療用溶液を０．８〜１．２ｍＬの範囲の体積で含む組成物、免疫経路チェックポイントモジュレーターを含む分子組成物の治療用溶液を含む組成物、および指示を含むキットが提供される。
【００３３】
一部の実施形態では、治療用溶液は、ウイルス粒子を１．０〜５．５×１０１１個含む。一部の実施形態では、アデノウイルスベクターは、トランスフェクトされた細胞において改変されたＭＵＣ１−Ｃ、ブラキュリ、またはＣＥＡの過剰発現をもたらすことができる。一部の実施形態では、治療用溶液は、第１の複製欠損性アデノウイルスベクター、第２の複製欠損性アデノウイルスベクター、および第３の複製欠損性アデノウイルスベクターを含み、そのそれぞれが、ＭＵＣ１−Ｃ抗原、ブラキュリ抗原、ＣＥＡ抗原からなる群より選択される抗原、およびこれらの組み合わせを含む。一部の実施形態では、アデノウイルスベクターは、ヒトにおいてＭＵＣ１−Ｃ、ブラキュリ、またはＣＥＡ発現細胞に対する特異的な免疫応答を誘導する抗原をコードする核酸配列を含む。一部の実施形態では、免疫経路チェックポイントモジュレーターは、ＰＤ１、ＰＤＬ１、ＰＤＬ２、ＣＤ２８、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＴＬＡ４、Ｂ７ＲＰ１、ＩＣＯＳ、Ｂ７ＲＰＩ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＨＶＥＭ、ＫＩＲ、ＴＣＲ、ＬＡＧ３、ＣＤ１３７、ＣＤ１３７Ｌ、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ２７、ＣＤ７０、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＴＩＭ３、ＧＡＬ９、ＡＤＯＲＡ、ＣＤ２７６、ＶＴＣＮ１、ＩＤＯ１、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＨＡＶＣＲ２、ＶＩＳＴＡ、およびＣＤ２４４からなる群より選択される内在性免疫経路チェックポイントタンパク質またはその断片を標的とする。一部の実施形態では、分子組成物は、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス、小分子、模倣物、リガンドの組換え型、受容体の組換え型、抗体、またはこれらの組み合わせを含む。一部の実施形態では、指示は、増殖性疾患またはがんの処置に関する。一部の実施形態では、指示は、感染症の処置に関する。一部の実施形態では、アデノウイルスベクターは、複製欠損性アデノウイルス５型ベクターを含む。一部の実施形態では、治療用溶液は、組換え型核酸ベクターを含むウイルス粒子を少なくとも１．０×１０１１個、２．０×１０１１個、３．０×１０１１個、３．５×１０１１個、４．０×１０１１個、４．５×１０１１個、４．８×１０１１個、４．９×１０１１個、４．９５×１０１１個、または４．９９×１０１１個含む。一部の実施形態では、治療用溶液は、ウイルス粒子を最大７．０×１０１１個、６．５×１０１１個、６．０×１０１１個、５．５×１０１１個、５．２×１０１１個、５．１×１０１１個、５．０５×１０１１個、または５．０１×１０１１個含む。一部の実施形態では、治療用溶液は、ウイルス粒子を１．０〜７．０×１０１１個または１．０〜５．５×１０１１個含む。一部の実施形態では、治療用溶液は、ウイルス粒子を４．５〜５．５×１０１１個含む。一部の実施形態では、治療用溶液は、ウイルス粒子を４．８〜５．２×１０１１個含む。一部の実施形態では、治療用溶液は、ウイルス粒子を４．９〜５．１×１０１１個含む。一部の実施形態では、治療用溶液は、ウイルス粒子を４．９５〜５．０５×１０１１個含む。一部の実施形態では、治療用溶液は、ウイルス粒子を４．９９〜５．０１×１０１１個含む。一部の実施形態では、キットは、免疫原性成分をさらに含む。一部の実施形態では、免疫原性成分は、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦα、ＩＬ−２、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＩＬ−７、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、およびＩＬ−１３の群より選択されるサイトカインを含む。一部の実施形態では、免疫原性成分は、ＩＬ−７、ＩＬ−７をコードする核酸、ＩＬ−７に対して実質的な同一性を有するタンパク質、およびＩＬ−７に対して実質的な同一性を有するタンパク質をコードする核酸からなる群より選択される。
【００３４】
参照による組み込み
本明細書において言及されている全ての刊行物、特許および特許出願は、個々の刊行物、特許、または特許出願が、具体的にかつ個別に参照により組み込まれることが示されたものと同じく参照により本明細書に組み込まれる。
例えば、本発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
ＭＵＣ１−Ｃ抗原をコードする配列を含む組換え型複製欠損性ウイルスベクターを含む組成物であって、前記ＭＵＣ１−Ｃ抗原をコードする配列が、配列番号５または配列番号６に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する、組成物。
（項目２）
前記ＭＵＣ１−Ｃ抗原が、配列番号９に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、項目１に記載の組成物。
（項目３）
ブラキュリ抗原をコードする配列を含む組換え型複製欠損性ウイルスベクターを含む組成物であって、前記ブラキュリ抗原をコードする配列が、配列番号７または配列番号８に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する、組成物。
（項目４）
前記ウイルスベクターを投与されたヒトにおいて前記抗原または前記抗原を発現する細胞に対する免疫応答が誘導される、項目１から３までのいずれか一項に記載の組成物。
（項目５）
ＭＵＣ１−Ｃ抗原、ブラキュリ抗原、およびＣＥＡ抗原からなる群より選択される少なくとも２つの抗原をコードする配列を含む組換え型複製欠損性ウイルスベクターを含む組成物。
（項目６）
前記ウイルスベクターを投与されたヒトにおいて前記少なくとも２つの抗原または前記少なくとも２つの抗原を発現する細胞に対する免疫応答が誘導される、項目５に記載の組成物。
（項目７）
前記免疫応答が、前記抗原に対する抗体の産生を含む、項目１から６までのいずれか一項に記載の組成物。
（項目８）
前記免疫応答が、細胞媒介性免疫（ＣＭＩ）を含む、項目１から７までのいずれか一項に記載の組成物。
（項目９）
前記ＭＵＣ１−Ｃ抗原をコードする配列が、配列番号５または配列番号６に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する、項目１、２および５から８までのいずれか一項に記載の組成物。
（項目１０）
前記ブラキュリ抗原をコードする配列が、配列番号７または配列番号８に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する、項目３から９までのいずれか一項に記載の組成物。
（項目１１）
前記ＣＥＡ抗原をコードする配列が、配列番号１、配列番号２、または配列番号３に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する、項目５から１０までのいずれか一項に記載の組成物。
（項目１２）
前記抗原が、２５、１５、１０、５、またはそれ未満のアミノ酸の改変を含む、項目１から１１までのいずれか一項に記載の組成物。
（項目１３）
前記抗原が、１アミノ酸の改変を含む、項目１２に記載の組成物。
（項目１４）
前記組換え型ウイルスベクターが、レトロウイルス、レンチウイルス、サイトメガロウイルス、センダイウイルス、ＨＰＶウイルス、およびアデノウイルスからなる群より選択される、項目１から１３までのいずれか一項に記載の組成物。
（項目１５）
前記組換え型ウイルスベクターが、複製欠損性アデノウイルスベクターを含む、項目１から１４までのいずれか一項に記載の組成物。
（項目１６）
前記組換え型ウイルスベクターが、複製欠損性アデノウイルス５型ベクターを含む、項目１から１５までのいずれか一項に記載の組成物。
（項目１７）
前記複製欠損性アデノウイルスベクターが、Ｅ２ｂ遺伝子領域の欠失を含む、項目１４から１６までのいずれか一項に記載の組成物。
（項目１８）
前記複製欠損性アデノウイルスベクターが、Ｅ１遺伝子領域の欠失を含む、項目１４から１７までのいずれか一項に記載の組成物。
（項目１９）
前記複製欠損性アデノウイルスベクターが、Ｅ３遺伝子領域の欠失を含む、項目１４から１８までのいずれか一項に記載の組成物。
（項目２０）
前記複製欠損性アデノウイルスベクターが、Ｅ４遺伝子領域の欠失を含む、項目１４から１９までのいずれか一項に記載の組成物。
（項目２１）
前記組換え型ウイルスベクターが、トランスフェクトされた細胞において前記抗原の過剰発現をもたらす、項目１から２０までのいずれか一項に記載の組成物。
（項目２２）
前記組換え型ウイルスベクターが、ヒトにおいて前記抗原を発現する細胞に対して基底の少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、または２５倍の特異的な免疫応答を誘導する、項目１から２１までのいずれか一項に記載の組成物。
（項目２３）
前記ヒトが、５０超、７５超、１００超、１２５超、１５０超、１６０超、１７５超、または２００超のＡｄ５中和抗体力価の逆数を有する、項目２２に記載の組成物。
（項目２４）
前記ヒトが、２５０超、５００超、７５０超、１０００超、１５００超、２０００超、２５００超、３０００超、３５００超、４０００超、４５００超、または４７６７超のＡｄ５中和抗体力価の逆数を有する、項目２２に記載の組成物。
（項目２５）
前記免疫応答が、抗原特異的抗体応答として測定される、項目１７に記載の組成物。
（項目２６）
前記免疫応答が、抗原特異的細胞媒介性免疫（ＣＭＩ）として測定される、項目２２に記載の組成物。
（項目２７）
前記免疫応答が、抗原特異的ＩＦＮ−γ分泌として測定される、項目２２に記載の組成物。
（項目２８）
前記免疫応答が、抗原特異的ＩＬ−２分泌として測定される、項目２２に記載の組成物。
（項目２９）
前記抗原に対する免疫応答が、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって測定される、項目２４に記載の組成物。
（項目３０）
前記抗原特異的ＣＭＩが、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）１０６個当たり、２５超、５０超、７５超、１００超、１５０超、２００超、２５０超、または３００超のＩＦＮ−γスポット形成細胞（ＳＦＣ）である、項目２９に記載の組成物。
（項目３１）
前記免疫応答が、ＣＡＰ−１でパルスした抗原提示細胞、腫瘍細胞株由来または自己腫瘍由来の、同種抗原を発現する細胞のＴ細胞溶解によって測定される、項目２２に記載の組成物。
（項目３２）
免疫原性成分をさらに含む、項目１から３１までのいずれか一項に記載の組成物。
（項目３３）
前記免疫原性成分が、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦα、ＩＬ−２、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＩＬ−７、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、およびＩＬ−１３の群より選択されるサイトカインを含む、項目３２に記載の組成物。
（項目３４）
前記免疫原性成分が、ＩＬ−７、ＩＬ−７をコードする核酸、ＩＬ−７に対して実質的な同一性を有するタンパク質、およびＩＬ−７に対して実質的な同一性を有するタンパク質をコードする核酸からなる群より選択される、項目３２に記載の組成物。
（項目３５）
前記ＣＥＡ抗原が、配列番号３の６１０位に対応する位置におけるアスパラギン酸の置換を含む改変を含む、項目５から３４までのいずれか一項に記載の組成物。
（項目３６）
免疫経路チェックポイントモジュレーターを含む分子組成物をさらに含む、項目１から３５までのいずれか一項に記載の組成物。
（項目３７）
前記免疫経路チェックポイントモジュレーターが、免疫応答を活性化または強化する、項目３６に記載の組成物。
（項目３８）
前記免疫経路チェックポイントが、免疫応答を阻害する、項目３６または３７に記載の組成物。
（項目３９）
前記免疫経路チェックポイントモジュレーターが、ＰＤ１、ＰＤＬ１、ＰＤＬ２、ＣＤ２８、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＴＬＡ４、Ｂ７ＲＰ１、ＩＣＯＳ、Ｂ７ＲＰＩ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＨＶＥＭ、ＫＩＲ、ＴＣＲ、ＬＡＧ３、ＣＤ１３７、ＣＤ１３７Ｌ、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ２７、ＣＤ７０、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＴＩＭ３、ＧＡＬ９、ＡＤＯＲＡ、ＣＤ２７６、ＶＴＣＮ１、ＩＤＯ１、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＨＡＶＣＲ２、ＶＩＳＴＡ、およびＣＤ２４４からなる群より選択される内在性免疫経路チェックポイントタンパク質またはその断片を標的とする、項目３６から３８までのいずれか一項に記載の組成物。
（項目４０）
前記免疫経路チェックポイントモジュレーターが、ＰＤ１タンパク質を標的とする、項目３６から３９までのいずれか一項に記載の組成物。
（項目４１）
前記分子組成物が、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス、小分子、模倣物、リガンドの組換え型、受容体の組換え型、抗体、またはこれらの組み合わせを含む、項目３６から４０までのいずれか一項に記載の組成物。
（項目４２）
項目１から４１までのいずれか一項に記載の組成物の投与についてヒトを選択する方法であって、
（ａ）前記ヒトのＨＬＡ亜型を決定するステップと、
（ｂ）前記ＨＬＡ亜型が予め選択されたＨＬＡ亜型のサブグループのうちの１つであると決定された場合に、前記ヒトに前記組成物を投与するステップと
を含む、方法。
（項目４３）
前記予め選択されたＨＬＡ亜型のサブグループが、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ａ３、およびＨＬＡ−Ａ２４のうちの１つまたは複数を含む、項目４２に記載の方法。
（項目４４）
がんまたは感染症についてヒトを処置する方法であって、項目１から４１までのいずれか一項に記載の組換え型ウイルスベクターを投与するステップを含む、方法。
（項目４５）
ヒトにおいてＭＵＣ１−Ｃ、ブラキュリ、ＣＥＡ、またはそれらの任意の組み合わせに対する免疫応答を生じさせる方法であって、前記ヒトに項目１から４１までのいずれか一項に記載の組成物を投与するステップを含む、方法。
（項目４６）
前記投与するステップを少なくとも１回繰り返す、項目４２から４５までのいずれか一項に記載の方法。
（項目４７）
前記投与するステップを前回の投与するステップの約２週間後、約３週間後、約４週間後、約５週間後、または約６週間後に繰り返す、項目４６に記載の方法。
（項目４８）
前記投与するステップを前回の投与するステップの約２カ月後、約３カ月後、約４カ月後、約５カ月後、または約６カ月後に繰り返す、項目４６に記載の方法。
（項目４９）
前記投与するステップを２回繰り返す、項目４６に記載の方法。
（項目５０）
（ａ）処置の第１の相と処置の第２の相を選択するステップと、
（ｂ）前記第１の相の間に、ヒトに、ＭＵＣ１−Ｃ抗原をコードする第１の複製欠損性アデノウイルスベクターを含む第１の組成物を合計３回、約３週間の間隔で投与するステップと、
（ｃ）前記第２の相の間に、前記ヒトに、ヒトにおいて前記ＭＵＣ１−Ｃ抗原を発現する細胞に対する免疫応答を誘導する抗原をコードする第２の複製欠損性アデノウイルスベクターを含む第２の組成物を合計３回、約３カ月の間隔で投与するステップと
を含む、処置方法。
（項目５１）
（ａ）処置の第１の相と第２の相を選択するステップと、
（ｂ）前記第１の相の間に、ヒトに、ブラキュリ抗原をコードする第１の複製欠損性アデノウイルスベクターを含む第１の組成物を合計３回、約３週間の間隔で投与するステップと、
（ｃ）前記第２の相の間に、前記ヒトに、ヒトにおいて前記ブラキュリ抗原を発現する細胞に対する免疫応答を誘導する抗原をコードする第２の複製欠損性アデノウイルスベクターを含む第２の組成物を合計３回、約３カ月の間隔で投与するステップと
を含む、処置方法。
（項目５２）
（ａ）処置の第１の相と処置の第２の相を選択するステップと、
（ｂ）前記第１の相の間に、ヒトに、ＭＵＣ１−Ｃ抗原、ブラキュリ抗原、およびＣＥＡ抗原からなる群より選択される少なくとも２つの抗原をコードする第１の複製欠損性アデノウイルスベクターを含む第１の組成物を合計３回、約３週間の間隔で投与するステップと、
（ｃ）前記第２の相の間に、前記ヒトに、ヒトにおいて前記少なくとも２つの抗原を発現する細胞に対する免疫応答を誘導する抗原をコードする第２の複製欠損性アデノウイルスベクターを含む第２の組成物を合計３回、約３カ月の間隔で投与するステップと
を含む、処置方法。
（項目５３）
前記第２の相を前記第１の相の終了から約３カ月後に開始する、項目５０から５２までのいずれか一項に記載の方法。
（項目５４）
（ａ）処置の第１の相と処置の第２の相を選択するステップと、
（ｂ）前記第１の相の間に、ヒトに、ブラキュリ抗原をコードする第１の複製欠損性アデノウイルスベクターを含む第１の組成物を合計ｎ回投与するステップと、
（ｃ）前記第２の相の間に、前記ヒトに、ヒトにおいて前記ブラキュリ抗原を発現する細胞に対する免疫応答を誘導する抗原をコードする第２の複製欠損性アデノウイルスベクターを含む第２の組成物を合計ｍ回投与するステップと
を含む、処置方法。
（項目５５）
（ａ）処置の第１の相と処置の第２の相を選択するステップと、
（ｂ）前記第１の相の間に、ヒトに、ＭＵＣ１−Ｃ抗原をコードする第１の複製欠損性アデノウイルスベクターを含む第１の組成物を合計ｎ回投与するステップと、
（ｃ）前記第２の相の間に、前記ヒトに、ヒトにおいて前記ＭＵＣ１−Ｃ抗原を発現する細胞に対する免疫応答を誘導する抗原をコードする第２の複製欠損性アデノウイルスベクターを含む第２の組成物を合計ｍ回投与するステップと
を含む、処置方法。
（項目５６）
（ａ）処置の第１の相と処置の第２の相を選択するステップと、
（ｂ）前記第１の相の間に、ヒトに、ＭＵＣ１−Ｃ抗原、ブラキュリ抗原、およびＣＥＡ抗原からなる群より選択される少なくとも２つの抗原をコードする第１の複製欠損性アデノウイルスベクターを含む第１の組成物を合計ｎ回投与するステップと、
（ｃ）前記第２の相の間に、前記ヒトに、ヒトにおいて前記少なくとも２つの抗原を発現する細胞に対する免疫応答を誘導する前記少なくとも２つの抗原をコードする第２の複製欠損性アデノウイルスベクターを含む第２の組成物を合計ｍ回投与するステップと
を含む、処置方法。
（項目５７）
ｎが１より大きい、項目５４から５６までのいずれか一項に記載の方法。
（項目５８）
ｎが３である、項目５７に記載の方法。
（項目５９）
ｍが１より大きい、項目５４から５８までのいずれか一項に記載の方法。
（項目６０）
ｍが３である、項目５９に記載の方法。
（項目６１）
前記第１の相が、少なくとも２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、または８週間である、項目５４から６０までのいずれか一項に記載の方法。
（項目６２）
前記第２の相が、少なくとも２カ月、３カ月、４カ月、５カ月、６カ月、７カ月、または８カ月である、項目５４から６１までのいずれか一項に記載の方法。
（項目６３）
前記第２の相を、第１の相の終了から３〜１６週間後に開始する、項目５４から６２までのいずれか一項に記載の方法。
（項目６４）
前記第１の相において、前記複製欠損性アデノウイルスの２回の投与が少なくとも１８日間離れている、項目５４から６３までのいずれか一項に記載の方法。
（項目６５）
前記第１の相において、前記複製欠損性アデノウイルスの２回の投与が約２１日間離れている、項目５４から６４までのいずれか一項に記載の方法。
（項目６６）
前記第１の相において、前記複製欠損性アデノウイルスの２回の投与が最大２４日間離れている、項目５４から６５までのいずれか一項に記載の方法。
（項目６７）
前記第２の相において、前記複製欠損性アデノウイルスの２回の投与が少なくとも１０週間離れている、項目５４から６６までのいずれか一項に記載の方法。
（項目６８）
前記第２の相において、前記複製欠損性アデノウイルスの２回の投与が約１３週間離れている、項目５４から６７までのいずれか一項に記載の方法。
（項目６９）
前記第２の相において、前記複製欠損性アデノウイルスの２回の投与が最大１６週間離れている、項目５４から６８までのいずれか一項に記載の方法。
（項目７０）
免疫経路チェックポイントモジュレーターを含む分子組成物を投与するステップをさらに含む、項目４４から６９までのいずれか一項に記載の方法。
（項目７１）
（ａ）処置の第１の相と処置の第２の相を選択するステップと、
（ｂ）前記第１の相の間に、ヒトに、ヒトにおいてＭＵＣ１−Ｃ、ブラキュリ、またはＣＥＡ抗原を発現する細胞に対する免疫応答を誘導する抗原をコードする第１の複製欠損性アデノウイルスベクターを含む第１の組成物を合計ｎ回投与するステップと、
（ｃ）前記第２の相の間に、前記ヒトに、ヒトにおいてＭＵＣ１−Ｃ、ブラキュリ、またはＣＥＡ抗原を発現する細胞に指向される免疫応答を誘導することができる抗原をコードする第２の複製欠損性アデノウイルスベクターを含む第２の組成物を合計ｍ回投与するステップと
を含む、処置方法であって、
免疫経路チェックポイントモジュレーターを含む分子組成物を前記第１の相、前記第２の相、またはその両方の間に投与する、
処置方法。
（項目７２）
処置を必要とする被験体を処置するための方法であって、前記被験体に、
（ａ）（ｉ）ＭＵＣ１−Ｃ抗原、（ｉｉ）ブラキュリ抗原、または（ｉｉｉ）ＭＵＣ１−Ｃ抗原、ブラキュリ抗原、およびＣＥＡ抗原からなる群より選択される少なくとも２つの抗原をコードする組換え型複製欠損性アデノウイルスベクターと、
（ｂ）免疫経路チェックポイントモジュレーターを含む分子組成物と
を投与し、それにより、前記被験体において免疫応答を生じさせるステップを含む、方法。
（項目７３）
（ａ）および（ｂ）を逐次に投与する、項目７２に記載の方法。
（項目７４）
（ａ）および（ｂ）を同時に投与する、項目７２に記載の方法。
（項目７５）
（ａ）および（ｂ）を、１カ月の間隔を空けて投与する、項目７２に記載の方法。
（項目７６）
前記免疫経路チェックポイントモジュレーターが、免疫応答を活性化または強化する、項目７０から７５までのいずれか一項に記載の方法。
（項目７７）
前記免疫経路チェックポイントが、免疫応答を阻害する、項目７０から７６までのいずれか一項に記載の方法。
（項目７８）
前記免疫経路チェックポイントモジュレーターが、ＰＤ１、ＰＤＬ１、ＰＤＬ２、ＣＤ２８、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＴＬＡ４、Ｂ７ＲＰ１、ＩＣＯＳ、Ｂ７ＲＰＩ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＨＶＥＭ、ＫＩＲ、ＴＣＲ、ＬＡＧ３、ＣＤ１３７、ＣＤ１３７Ｌ、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ２７、ＣＤ７０、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＴＩＭ３、ＧＡＬ９、ＡＤＯＲＡ、ＣＤ２７６、ＶＴＣＮ１、ＩＤＯ１、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＨＡＶＣＲ２、ＶＩＳＴＡ、およびＣＤ２４４からなる群より選択される内在性免疫経路チェックポイントタンパク質またはその断片を標的とする、項目７０から７７までのいずれか一項に記載の方法。
（項目７９）
前記免疫経路チェックポイントモジュレーターが、ＰＤ１タンパク質を標的とする、項目７０から７８までのいずれか一項に記載の方法。
（項目８０）
前記分子組成物が、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス、小分子、模倣物、リガンドの組換え型、受容体の組換え型、抗体、またはこれらの組み合わせを含む、項目７０から７９までのいずれか一項に記載の方法。
（項目８１）
前記免疫応答が少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、または２５倍に増大する、項目４５から８０までのいずれか一項に記載の方法。
（項目８２）
前記第１の複製欠損性アデノウイルスベクターと前記第２の複製欠損性アデノウイルスベクターが同じものである、項目５０から８０までのいずれか一項に記載の方法。
（項目８３）
前記第１の複製欠損性アデノウイルスベクターが、複製欠損性アデノウイルス５型ベクターを含む、項目５０から８２までのいずれか一項に記載の方法。
（項目８４）
前記第２の複製欠損性アデノウイルスベクターが、複製欠損性アデノウイルス５型ベクターを含む、項目５０から８３までのいずれか一項に記載の方法。
（項目８５）
前記ヒトが、血清型ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ａ３、またはＨＬＡ−Ａ２４のヒト白血球抗原を発現する、項目４２から８４までのいずれか一項に記載の方法。
（項目８６）
前記第１の複製欠損性アデノウイルスベクターが、Ｅ２ｂ遺伝子領域の欠失を含む、項目５０から８５までのいずれか一項に記載の方法。
（項目８７）
前記第１の複製欠損性アデノウイルスベクターが、Ｅ１遺伝子領域の欠失をさらに含む、項目８６に記載の方法。
（項目８８）
前記第１の複製欠損性アデノウイルスベクターが、Ｅ３遺伝子領域の欠失をさらに含む、項目８６または８７のいずれかに記載の方法。
（項目８９）
前記第１の複製欠損性アデノウイルスベクターが、Ｅ４遺伝子領域の欠失をさらに含む、項目８６から８８までのいずれか一項に記載の方法。
（項目９０）
前記第２の複製欠損性アデノウイルスベクターが、Ｅ２ｂ遺伝子領域の欠失を含む、項目５０から８９までのいずれか一項に記載の方法。
（項目９１）
前記第２の複製欠損性アデノウイルスベクターが、Ｅ１遺伝子領域の欠失をさらに含む、項目９０に記載の方法。
（項目９２）
前記第２の複製欠損性アデノウイルスベクターが、Ｅ３遺伝子領域の欠失をさらに含む、項目９０または９１に記載の方法。
（項目９３）
前記第２の複製欠損性アデノウイルスベクターが、Ｅ４遺伝子領域の欠失をさらに含む、項目９０から９２までのいずれか一項に記載の方法。
（項目９４）
前記第１の組成物、前記第２の組成物、またはその両方が、前記組換え型核酸ベクターを含むウイルス粒子を少なくとも１．０×１０１１個、２．０×１０１１個、３．０×１０１１個、３．５×１０１１個、４．０×１０１１個、４．５×１０１１個、４．８×１０１１個、４．９×１０１１個、４．９５×１０１１個、または４．９９×１０１１個含む、項目５０から９３までのいずれか一項に記載の方法。
（項目９５）
前記第１の組成物、前記第２の組成物、またはその両方が、ウイルス粒子を最大７．０×１０１１個、６．５×１０１１個、６．０×１０１１個、５．５×１０１１個、５．２×１０１１個、５．１×１０１１個、５．０５×１０１１個、または５．０１×１０１１個含む、項目５０から９４までのいずれか一項に記載の方法。
（項目９６）
前記第１の組成物、前記第２の組成物、またはその両方が、ウイルス粒子を１．０〜７．０×１０１１個または１．０〜５．５×１０１１個含む、項目９４または９５に記載の方法。
（項目９７）
前記第１の組成物、前記第２の組成物、またはその両方が、ウイルス粒子を４．５〜５．５×１０１１個含む、項目９４または９５に記載の方法。
（項目９８）
前記第１の組成物、前記第２の組成物、またはその両方が、ウイルス粒子を４．８〜５．２×１０１１個含む、項目９４または９５に記載の方法。
（項目９９）
前記第１の組成物、前記第２の組成物、またはその両方が、ウイルス粒子を４．９〜５．１×１０１１個含む、項目９４または９５に記載の方法。
（項目１００）
前記第１の組成物、前記第２の組成物、またはその両方が、ウイルス粒子を４．９５〜５．０５×１０１１個含む、項目９４または９５に記載の方法。
（項目１０１）
前記第１の組成物、前記第２の組成物、またはその両方が、ウイルス粒子を４．９９〜５．０１×１０１１個含む、項目９４または９５に記載の方法。
（項目１０２）
前記第１の相が、少なくとも２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、または８週間である、項目５０から１０１までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１０３）
前記第２の相が、少なくとも２カ月、３カ月、４カ月、５カ月、６カ月、７カ月、または８カ月である、項目５０から１０２までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１０４）
前記免疫応答が、抗原特異的抗体応答として測定される、項目４５から１０３までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１０５）
前記免疫応答が、抗原特異的細胞媒介性免疫（ＣＭＩ）として測定される、項目４５から１０３までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１０６）
前記免疫応答が、抗原特異的ＩＦＮ−γ分泌として測定される、項目４５から１０３までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１０７）
前記免疫応答が、抗原特異的ＩＬ−２分泌として測定される、項目４５から１０３までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１０８）
前記抗原に対する免疫応答が、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって測定される、項目４５から１０３までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１０９）
前記抗原特異的ＣＭＩが、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）１０６個当たり、２５超、５０超、７５超、１００超、１５０超、２００超、２５０超、または３００超のＩＦＮ−γスポット形成細胞（ＳＦＣ）である、項目１０８に記載の方法。
（項目１１０）
前記免疫応答が、ＣＡＰ−１でパルスした抗原提示細胞、腫瘍細胞株由来または自己腫瘍由来の、同種抗原を発現する細胞のＴ細胞溶解によって測定される、項目４５から１０３までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１１１）
第１の複製欠損性アデノウイルスまたは第２の複製欠損性アデノウイルスが前記ヒトにおいて樹状細胞に感染し、感染した前記樹状細胞が前記抗原を提示し、それにより、前記免疫応答が誘導される、項目４５から１１０までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１１２）
前記投与するステップが、皮下（ｓｃ）投与を含む、項目４２から１１１までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１１３）
前記ヒトが、前記投与するステップの前に、５０超、７５超、１００超、１２５超、１５０超、１６０超、１７５超、２００超、２２５超、２５０超、２７５超、または３００超のＡｄ５中和抗体力価の逆数を有する、項目４２から１１２までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１１４）
前記ヒトが、２５０超、５００超、７５０超、１０００超、１５００超、２０００超、２５００超、３０００超、３５００超、４０００超、４５００超、または４７６７超のＡｄ５中和抗体力価の逆数を有する、項目４２から１１３までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１１５）
前記ヒトが、ステロイド、コルチコステロイド、および免疫抑制剤のいずれか１つによる処置を同時に受けていない、項目４２から１１４までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１１６）
前記ヒトが、自己免疫疾患を有さない、項目４２から１１５までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１１７）
前記ヒトが、炎症性腸疾患、全身性エリテマトーデス、強直性脊椎炎、強皮症、多発性硬化症、ウイルス性肝炎、またはＨＩＶを有さない、項目４２から１１６までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１１８）
前記ヒトが、感染症を有するまたは今後有する可能性がある、項目４２から１１７までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１１９）
前記ヒトが、自己免疫関連甲状腺疾患または白斑を有する、項目４２から１１８までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１２０）
前記ヒトが、増殖性疾患であるがんを有するまたは今後有する可能性がある、項目４２から１１９までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１２１）
前記ヒトが、結腸直腸腺癌、転移性結腸直腸がん、進行ＭＵＣ１−Ｃ、ブラキュリ、またはＣＥＡ発現結腸直腸がん、乳がん、肺がん、膀胱がん、または膵がんを有する、項目４２から１２０までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１２２）
前記ヒトが、少なくとも１部位、２部位、または３部位の転移性疾患を有する、項目４２から１２１までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１２３）
前記ヒトが、ＭＵＣ１−Ｃ、ブラキュリ、またはＣＥＡを過剰発現する細胞を含む、項目４２から１２２までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１２４）
ＭＵＣ１−Ｃ、ブラキュリ、またはＣＥＡを過剰発現する前記細胞が、ＭＵＣ１−Ｃ、ブラキュリ、またはＣＥＡを非がん細胞におけるベースラインのＭＵＣ１−Ｃ、ブラキュリ、またはＣＥＡの発現の少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、または１０倍過剰発現する、項目１２３に記載の方法。
（項目１２５）
ＭＵＣ１−Ｃ、ブラキュリ、またはＣＥＡを過剰発現する細胞が、がん細胞を含む、項目１２３に記載の方法。
（項目１２６）
前記被験体が、診断された疾患素因を有する、項目４２から１２５までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１２７）
前記被験体が、安定病態を有する、項目４２から１２６までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１２８）
前記被験体が、疾患に対する遺伝的素因を有する、項目４２から１２７までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１２９）
前記疾患が、がんである、項目１２６から１２８までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１３０）
前記がんが、前立腺がん、結腸がん、乳がん、または胃がんからなる群より選択される、項目１２９に記載の方法。
（項目１３１）
前記がんが、前立腺がんである、項目１３０に記載の方法。
（項目１３２）
前記被験体のグリーソンスコアが６またはそれ未満である、項目４２から１３１までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１３３）
前記被験体のグリーソンスコアが６超である、項目４２から１３１までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１３４）
前記第１の複製欠損性アデノウイルスベクターまたは前記第２の複製欠損性アデノウイルスベクターが、配列番号３に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、項目５０から１３３までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１３５）
前記第１の複製欠損性アデノウイルスベクターまたは前記第２の複製欠損性アデノウイルスベクターが、配列番号３内の２６０４８〜２６１７７、２６０６３〜２６１４１、１〜１０３、５４〜１０３、３２２１４〜３２３１５、および３２２１４〜３２２６２から選択される領域に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する領域を含む、項目５０から１３４までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１３６）
前記第１の複製欠損性アデノウイルスベクターまたは前記第２の複製欠損性アデノウイルスベクターが、配列番号３内の１０５７位から３１６５位の間の領域に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する領域を含む、項目５０から１３５までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１３７）
前記第１の複製欠損性アデノウイルスベクターまたは第２の複製欠損性アデノウイルスベクターが、ＭＵＣ１−Ｃ、ブラキュリ、またはＣＥＡ抗原をコードする配列を含み、前記ＭＵＣ１−Ｃ抗原が、配列番号５または配列番号６に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列によりコードされ、前記ブラキュリ抗原が、配列番号７または配列番号８に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列によりコードされ、前記ＣＥＡ抗原が、配列番号１、配列番号２、または配列番号３に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列によりコードされる、項目５０から１３６までのいずれか一項に記載の方法。
（項目１３８）
ヒトにおいて免疫応答を誘導するためのキットであって、
（ａ）組換え型複製欠損性アデノウイルスベクターを含むウイルス粒子を少なくとも１．０×１０１１個含む治療用溶液を０．８〜１．２ｍＬの範囲の体積で含む組成物、
（ｂ）免疫経路チェックポイントモジュレーターを含む分子組成物の治療用溶液を含む組成物、および
（ｃ）指示
を含む、キット。
（項目１３９）
前記治療用溶液が、ウイルス粒子を１．０〜５．５×１０１１個含む、項目１３８に記載のキット。
（項目１４０）
アデノウイルスベクターが、トランスフェクトされた細胞において改変されたＭＵＣ１−Ｃ、ブラキュリ、またはＣＥＡの過剰発現をもたらすことができる、項目１３８または１４０に記載のキット。
（項目１４１）
治療用溶液が、第１の複製欠損性アデノウイルスベクター、第２の複製欠損性アデノウイルスベクター、および第３の複製欠損性アデノウイルスベクターを含み、そのそれぞれが、ＭＵＣ１−Ｃ抗原、ブラキュリ抗原、ＣＥＡ抗原からなる群より選択される抗原、およびこれらの組み合わせを含む、項目１３８から１４０までのいずれか一項に記載のキット。
（項目１４２）
前記アデノウイルスベクターが、ヒトにおいてＭＵＣ１−Ｃ、ブラキュリ、またはＣＥＡ発現細胞に対する特異的な免疫応答を誘導する抗原をコードする核酸配列を含む、項目１３８から１４１までのいずれか一項に記載のキット。
（項目１４３）
前記免疫経路チェックポイントモジュレーターが、ＰＤ１、ＰＤＬ１、ＰＤＬ２、ＣＤ２８、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＴＬＡ４、Ｂ７ＲＰ１、ＩＣＯＳ、Ｂ７ＲＰＩ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＨＶＥＭ、ＫＩＲ、ＴＣＲ、ＬＡＧ３、ＣＤ１３７、ＣＤ１３７Ｌ、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ２７、ＣＤ７０、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＴＩＭ３、ＧＡＬ９、ＡＤＯＲＡ、ＣＤ２７６、ＶＴＣＮ１、ＩＤＯ１、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＨＡＶＣＲ２、ＶＩＳＴＡ、およびＣＤ２４４からなる群より選択される内在性免疫経路チェックポイントタンパク質またはその断片を標的とする、項目１３８から１４２までのいずれか一項に記載のキット。
（項目１４４）
前記分子組成物が、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス、小分子、模倣物、リガンドの組換え型、受容体の組換え型、抗体、またはこれらの組み合わせを含む、項目１３８から１４３までのいずれか一項に記載のキット。
（項目１４５）
前記指示が、増殖性疾患またはがんの処置に関する、項目１３８から１４４までのいずれか一項に記載のキット。
（項目１４６）
前記指示が、感染症の処置に関する、項目１３８から１４４までのいずれか一項に記載のキット。
（項目１４７）
前記アデノウイルスベクターが、複製欠損性アデノウイルス５型ベクターを含む、項目１３８から１４６までのいずれか一項に記載のキット。
（項目１４８）
前記治療用溶液が、前記組換え型核酸ベクターを含むウイルス粒子を少なくとも１．０×１０１１個、２．０×１０１１個、３．０×１０１１個、３．５×１０１１個、４．０×１０１１個、４．５×１０１１個、４．８×１０１１個、４．９×１０１１個、４．９５×１０１１個、または４．９９×１０１１個含む、項目１３８から１４７までのいずれか一項に記載のキット。
（項目１４９）
前記治療用溶液が、ウイルス粒子を最大７．０×１０１１個、６．５×１０１１個、６．０×１０１１個、５．５×１０１１個、５．２×１０１１個、５．１×１０１１個、５．０５×１０１１個、または５．０１×１０１１個含む、項目１３８から１４８までのいずれか一項に記載のキット。
（項目１５０）
前記治療用溶液が、ウイルス粒子を１．０〜７．０×１０１１個または１．０〜５．５×１０１１個含む、項目１４８または１４９に記載のキット。
（項目１５１）
前記治療用溶液が、ウイルス粒子を４．５〜５．５×１０１１個含む、項目１４８または１４９に記載のキット。
（項目１５２）
前記治療用溶液が、ウイルス粒子を４．８〜５．２×１０１１個含む、項目１４８または１４９に記載のキット。
（項目１５３）
前記治療用溶液が、ウイルス粒子を４．９〜５．１×１０１１個含む、項目１４８または１４９に記載のキット。
（項目１５４）
前記治療用溶液が、ウイルス粒子を４．９５〜５．０５×１０１１個含む、項目１４８または１４９に記載のキット。
（項目１５５）
前記治療用溶液が、ウイルス粒子を４．９９〜５．０１×１０１１個含む、項目１４８または１４９に記載のキット。
（項目１５６）
免疫原性成分をさらに含む、項目１３８から１５５までのいずれか一項に記載のキット。
（項目１５７）
前記免疫原性成分が、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦα、ＩＬ−２、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＩＬ−７、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、およびＩＬ−１３の群より選択されるサイトカインを含む、項目１５６に記載のキット。
（項目１５８）
前記免疫原性成分が、ＩＬ−７、ＩＬ−７をコードする核酸、ＩＬ−７に対して実質的な同一性を有するタンパク質、およびＩＬ−７に対して実質的な同一性を有するタンパク質をコードする核酸からなる群より選択される、項目１５６に記載のキット。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】図１は、Ａｄ５−ヌル（空のベクター）で免疫したマウスからの抗体レベルを示す棒グラフを例示する。マウスは、Ａｄ５−ヌルウイルス粒子（ＶＰ）により１４日間隔で３回免疫した。抗Ａｄ抗体（中和抗体）レベルは、各免疫の後に増加した。
【００３６】
【図２】図２は、Ａｄ５−ヌルで免疫したマウスからの中和抗体（ＮＡｂ）レベルを示す棒グラフを例示する。マウスは、Ａｄ５−ヌルＶＰにより１４日間隔で３回免疫した。中和抗体レベルは、各免疫の後に増加した。光学濃度読取値は、生存能力のある標的細胞の存在を示す。
【００３７】
【図３】図３は、Ａｄ５−ヌルベクタープラットフォームによる注射の後のＣ５７Ｂｌ／６マウスにおけるＮＡｂの誘導を示す棒グラフを例示する。Ａｄ粒子による反復注射の後に、マウスでＮＡｂレベルの増加が誘導された。
【００３８】
【図４】図４Ａは、Ａｄ５［Ｅ１−］−ＣＥＡまたはＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＣＥＡにより免疫したＡｄ５免疫マウスからの脾細胞から分泌されたＩＮＦ−γレベルを示す棒グラフを例示する。Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＣＥＡで免疫された群で、有意に上昇した応答が示される。図４Ｂは、Ａｄ５［Ｅ１−］−ＣＥＡまたはＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＣＥＡにより免疫したＡｄ５免疫マウスからの脾細胞から分泌されたＩＬ−２を示す棒グラフを例示する。Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＣＥＡで免疫された群で、有意に上昇した応答が示される。
【００３９】
【図５】図５は、対照マウスおよび１×１０１０のＡｄ５［Ｅ１−］−ＣＥＡ  ＶＰまたはＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＣＥＡ  ＶＰをワクチン接種したマウスにおける血清中アスパラギン酸アミノ基転移酵素（ＡＳＴ）レベルを示す棒グラフを例示する。
【００４０】
【図６】図６は、ＭＣ３８  ＣＥＡ発現腫瘍細胞を注射し、その後Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＣＥＡワクチンで処置した（Ｖａｃ）Ａｄ５免疫Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにおける腫瘍体積を経時的に示す折れ線グラフを例示する。未処置の腫瘍保持マウスと比較して１９〜２１日目までに腫瘍サイズが有意に低減されることが示される。
【００４１】
【図７】図７は、処置した７匹のおよび未処置の７匹のＡｄ５免疫ＭＣ３８腫瘍保持マウスからの腫瘍重量を示すグラフを例示する。Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＣＥＡで処置したマウスにおける腫瘍重量の有意な（ｐ＝０．０１２４）低減が示される。
【００４２】
【図８】図８は、Ｇａｇに対するマウスモノクローナル抗体を使用したイムノブロットであり、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−Ｇａｇに感染したＡ５４９細胞によるＧａｇ生産を例示する。Ａ５４９全細胞溶解物に、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ｇａｇまたはＡｄ５−ヌルを感染多重度（ＭＯＩ）２００で４４時間感染させた。上のバンド（５５ｋＤａ）は、ｇａｇ前駆体を含む。下のバンド（４１ｋＤａ）は、ｐ１７／ｐ２４ｇａｇ複合体を含む。
【００４３】
【図９】図９は、より大きな細胞媒介性免疫（ＣＭＩ）応答の誘導への複数回の免疫の効果を例示するグラフである。Ａｄ５−ナイーブＢＡＬＢ／Ｃマウス（ｎ＝５／群）を、１×１０１０のＡｄ５［Ｅ１−］−ヌルＶＰ、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ヌルＶＰ、Ａｄ５［Ｅ１−］−Ｇａｇ  ＶＰ、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−Ｇａｇ  ＶＰまたは緩衝液単独で、１回または１４日間隔で３回免疫した。脾細胞からのＩＦＮ−γ分泌は、最終免疫の１４日後にＥＬＩＳｐｏｔ分析によって評価した。陽性対照脾細胞を、コンカナバリンＡ（Ｃｏｎ  Ａ）に曝露させた。
【００４４】
【図１０】図１０Ａは、野生型Ａｄ５に対して前免疫したＣｙｎｏｍｏｌｇｕｓ  Ｍａｃａｑｕｅｓ（ｎ＝３）からの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）のＥＬＩＳｐｏｔ  ＩＮＦ−γ分析の結果を例示する。ＩＮＦ−γ誘導のレベルの上昇（Ｐ＜０．０５）が示される。陽性対照脾細胞を、Ｃｏｎ  Ａに曝露させた。図１０Ｂは、図１０ＡからのＥＬＩＳｐｏｔ  ＩＬ−２分析の結果を例示する。
【００４５】
【図１１】図１１は、ＩＦＮ−γを分泌する組換え型Ａｄ５  ＣＥＡ発現ベクターをワクチン接種したマウスからのスポット形成細胞（ＳＦＣ）の数を表すグラフを例示する。Ａｄ５［Ｅ１−］−ＣＥＡをワクチン接種したマウスからのＳＦＣの低減と比較した、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＣＥＡをワクチン接種したマウスからのＳＦＣの低減を示す。
【００４６】
【図１２】図１２Ａは、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＣＥＡ（６Ｄ）で処置したコホート１および２の７人の患者のカプラン−マイヤー生存プロットを例示する。図１２Ｂは、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＣＥＡ（６Ｄ）で処置したコホート３およびＰｈ  ＩＩの２１人の患者のカプラン−マイヤー生存プロットを例示する。図１２Ｃは、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＣＥＡ（６Ｄ）で処置したコホート５の６人の患者のカプラン−マイヤー生存プロットを例示する。図１２Ｄは、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＣＥＡ（６Ｄ）で処置した全３４人の患者のカプラン−マイヤー生存プロットを例示する。
【００４７】
【図１３】図１３Ａは、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＣＥＡ（６Ｄ）で３回処置した２８人のがん患者のカプラン−マイヤー生存プロットを例示する。図１３Ｂは、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＣＥＡ（６Ｄ）で処置した２７人の結腸直腸がん患者のカプラン−マイヤー生存プロットを例示する。
【００４８】
【図１４】図１４は、処置した患者におけるＣＥＡ誘導性ＣＭＩ応答を例示する。ＣＭＩ（ＩＦＮ−γ分泌）をベースライン時（Ｐｒｅ）およびＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＣＥＡ（６Ｄ）の投与の後（Ｐｏｓｔ）に評価した。処置後に患者で観察された最も高いＣＭＩ応答（時点に関係なく）は、用量応答を示した。５×１０１１ＶＰ（コホート５）の最高用量を受けた患者で、最も高いＣＭＩレベルが生じた。ＣＭＩ応答は、それらのベースライン（Ｐｒｅ）値と比較してコホート３／フェーズＩＩ（ｐ＝０．０００２；マン−ホイットニー検定法）およびコホート５（ｐ＝０．０３１７；マン−ホイットニー検定法）で有意に上昇した。無関係な抗原β−ガラクトシダーゼおよびＨＩＶ−ｇａｇとの反応性の欠如によって、応答特異性が示された。陽性対照ＰＢＭＣを、Ｃｏｎ  Ａに曝露させた。
【００４９】
【図１５】図１５は、処置した患者におけるＣＥＡ誘導性ＣＭＩ応答を例示する。全４用量コホートの患者について、ＣＭＩ（ＩＦＮ−γ分泌）をベースライン時（０週目）および最後の免疫療法の３週後（９週目）に評価した。最高用量を受けた患者において、用量応答が示され、最も高いＣＭＩレベルが生じた。最高用量によるＣＭＩ応答は、有意に上昇した（Ｐ＜０．０２；マン−ホイットニー検定法）。無関係な抗原β−ガラクトシダーゼおよびＨＩＶ−ｇａｇとの反応性の欠如によって、応答特異性が示された。陽性対照ＰＢＭＣを、Ｃｏｎ  Ａに曝露させた。
【００５０】
【図１６】図１６Ａは、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＣＥＡ（６Ｄ）ワクチンによる免疫を受けた患者でのＡｄ５免疫応答を例示する。Ａｄ５に対するＡｄ５  ＮＡｂの力価は、ベースライン時（０週目）および第３の免疫の３週後（９週目）に患者において決定した。Ａｄ５に特異的な患者からのＩＦＮ−γ分泌ＰＢＭＣの数は、ＥＬＩＳｐｏｔによって決定した。Ａｄ５  ＮＡｂの力価は、９週目に有意に上昇した（ｐ＜０．０００１；マン−ホイットニー検定法）。図１６Ｂは、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＣＥＡ（６Ｄ）ワクチンによる免疫を受けた患者でのＡｄ５免疫応答を例示する。ＣＭＩ応答は、ベースライン時（０週目）および第３の免疫の３週後（９週目）に患者において決定した。Ａｄ５に特異的な患者からのＩＦＮ−γ分泌ＰＢＭＣの数は、ＥＬＩＳｐｏｔによって決定した。Ａｄ５  ＣＭＩ応答は、９週目に有意に上昇した（ｐ＜０．０１；マン−ホイットニー検定法）。
【００５１】
【図１７】図１７Ａは、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＣＥＡ（６Ｄ）ワクチンによる免疫を受けた患者でのＣＥＡ特異的免疫およびＡｄ５免疫との比較を例示する。既存のＡｄ５免疫がないか低い（ＮＡｂ＜２００）患者でのＰＢＭＣのＩＦＮ−γ分泌によって測定したときの、１×１０１１ＶＰのＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＣＥＡ（６Ｄ）を受けた患者（ｎ＝１９）での平均のＣＥＡ特異的免疫応答を、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＣＥＡ（６Ｄ）による処置の開始の前に既存の高いＡｄ５免疫（ＮＡｂ≧２００）を有する患者のＣＥＡ特異的免疫応答と比較して示す。試験したいかなる時点でも、２つの群の間に有意差がなかった（ｐ＞０．４、マン−ホイットニー検定法）。図１７Ｂは、既存のＡｄ５  ＮＡｂ活性と誘導されたＣＥＡ  ＣＭＩ応答の最も高いレベルの間の相関のプロットを例示する。ｒ２値（０．０１５５）は、既存のＡｄ５  ＮＡｂ活性とＣＥＡ  ＣＭＩ  ＥＬＩＳｐｏｔ応答の間に相関がないことを示す。図１７Ｃは、ベクターによって誘導されたＡｄ５  ＮＡｂ活性とＣＥＡ  ＣＭＩ応答の間の相関のプロットを例示する。ｒ２値（０．００６９）は、ベクターによって誘導されたＡｄ５  ＮＡｂ活性とＣＥＡ  ＣＭＩ  ＥＬＩＳｐｏｔ応答の間に相関がないことを示す。
【００５２】
【図１８】図１８は、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＣＥＡ（６Ｄ）で処置した３２人の転移性結腸直腸がん（ｍＣＲＣ）患者におけるＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＣＥＡ（６Ｄ）免疫療法の影響を実証するカプラン−マイヤー生存プロットを例示する。
【００５３】
【図１９】図１９は、ｍＣＲＣ患者におけるベースライン時（免疫前（ｐｒｅ−ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ））およびＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＣＥＡ（６Ｄ）の投与の後（免疫後）のＣＭＩ応答（ＩＦＮ−γ分泌）を例示する。処置後に患者で観察された最も高いＣＭＩ応答（時点に関係なく）は、用量応答を明らかにした。最も高いＣＭＩレベルは、最高用量（コホート５）を受けた患者で起こり、有意に上昇していた（Ｐ＜０．０２；マン−ホイットニー検定法）。無関係な抗原β−ガラクトシダーゼおよびＨＩＶ−ｇａｇとの反応性の欠如によって、応答特異性が示される。陽性対照のために、ＰＢＭＣをＣｏｎ  Ａに曝露させた。
【００５４】
【図２０】図２０は、０、３、６および９週目に評価した免疫されたｍＣＲＣ患者におけるＣＭＩ応答（ＥＬＩＳｐｏｔ  ＩＦＮ−γ  ＳＦＣ）を例示する。ＣＭＩ応答は、免疫の間に増加した。
【００５５】
【図２１】図２１は、免疫前（０週目）および免疫後（６〜９週目）の処置について評価した細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）媒介細胞傷害性応答（ＥＬＩＳｐｏｔグランザイムＢ分泌ＳＦＣ）を例示する。免疫の後、応答は増加した（Ｐ＜０．０５、ウィルコクソン検定）。
【００５６】
【図２２】図２２は、ＥＬＩＳｐｏｔ  ＩＦＮ−γ  ＳＦＣによって評価したときの５人の免疫ｍＣＲＣ患者からの追跡調査ＰＢＭＣ試料におけるＣＭＩ応答を例示する。ＣＭＩ応答は９週目にピークに達し、処置を停止した後の２６週目まで減少した。
【００５７】
【図２３】図２３は、脾細胞からのＩＦＮ−γ分泌（ＩＦＮ−γ  ＳＦＣ）のためのＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって評価したときのＣＥＡ、ＭＵＣ１およびブラキュリに対して免疫したマウスにおけるＣＭＩ応答を例示する。ＩＦＮ−γ  ＳＦＣは多標的化免疫マウス（ＣＥＡ（６Ｄ）、ｍＭＵＣ１−Ｃおよびブラキュリ）では検出されたが、Ａｄ５−ヌル（空のベクター）を注射した対照マウスでは検出されなかった。ＥＬＩＳｐｏｔアッセイの応答特異性は、無関係なＳＩＶ−ｎｅｆまたはＳＩＶ−ｖｉｆペプチド抗原への反応性の欠如によって確認された。陽性対照には、Ｃｏｎ  Ａに曝露させた細胞が含まれた。
【００５８】
【図２４】図２４Ａは、Ａｄ５−ヌルを注射した対照ではなく、ＣＥＡ（６Ｄ）、ｍＭＵＣ１−Ｃおよびブラキュリで免疫したマウスにおいてＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αを発現する多機能性ＣＤ８α＋脾細胞でのフローサイトメトリーからの結果の棒グラフを例示する。応答の特異性は、培地単独または無関係なＳＩＶ−ｎｅｆもしくはＳＩＶ−ｖｉｆペプチドへの反応性の欠如によって確認された。図２４Ｂは、Ａｄ５−ヌルを注射した対照ではなく、ＣＥＡ（６Ｄ）、ｍＭＵＣ１−Ｃおよびブラキュリで免疫したマウスにおいてＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αを発現する多機能性ＣＤ４＋脾細胞でのフローサイトメトリーからの結果の棒グラフを例示する。応答の特異性は、培地単独または無関係なＳＩＶ−ｎｅｆもしくはＳＩＶ−ｖｉｆペプチドへの反応性の欠如によって確認された。
【００５９】
【図２５】図２５Ａは、対照マウスではなく、ＣＥＡ（６Ｄ）、ｍＭＵＣ１−Ｃおよびブラキュリで免疫したマウスで誘導されたＣＥＡ抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の応答の統計的有意性（ｐ＜０．０００１）を示す棒グラフを例示する。図２５Ｂは、対照マウスではなく、ＣＥＡ（６Ｄ）、ｍＭＵＣ１−Ｃおよびブラキュリで免疫したマウスで誘導されたＣＥＡ補体依存性細胞傷害（ＣＤＣＣ）の応答の統計的有意性（ｐ＜０．０００１）を示す棒グラフを例示する。
【００６０】
【図２６】図２６Ａは、ＭＵＣ１腫瘍細胞を発現するＭＣ３８腫瘍細胞を左側腹部に皮下接種し、０、７、１４日目に右側腹部に１×１０１０のＡｄ５−ヌルＶＰまたは１×１０１０のＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ｍＭＵＣ１−Ｃ  ＶＰを投与した、Ｃ５７Ｂｌ／６マウス（ｎ＝７／群）からの結果を例示する。Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ｍＭＵＣ１−Ｃで処置したマウスは、対照と比較して１５および１８日目に有意に（Ｐ＜０．０５）より小さい腫瘍を有し、生存が有意により長かった。実験は、３６日目に終了した。図２６Ｂは、図２６Ａで記載したようにＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ｍＭＵＣ１−Ｃで処置したマウスは、対照と比較して１５および１８日目に生存が有意に（Ｐ＜０．０５）より長かったことを例示する。
【００６１】
【図２７】図２７は、ブラキュリを発現するＭＣ３８腫瘍細胞を左側腹部に皮下接種し、５、１１および１７日目に右側腹部に１×１０１０のＡｄ５−ヌルＶＰ（ｎ＝４）または１×１０１０のＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ブラキュリＶＰ（ｎ＝５）を投与した、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスからの結果を例示する。１５、１９および２２日目に、処置されたマウスで腫瘍はより小さかった。
【００６２】
【図２８】図２８は、ＨＰＶ−Ｅ６／Ｅ７を発現するＴＣ−１腫瘍細胞を移植し（０日目）、１×１０１０のＡｄ５−ヌルＶＰと１００μｇの対照ＩｇＧ（腹腔内）、１×１０１０のＡｄ５−ヌルＶＰと１００μｇの抗ＰＤ１、１×１０１０のＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＨＰＶ−Ｅ６／Ｅ７  ＶＰと１００μｇのマウスＩｇＧ、または１×１０１０のＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＨＰＶ−Ｅ６／Ｅ７  ＶＰと１００μｇの抗ＰＤ１による免疫療法によって１０、１７、２４日目に処置した、Ｃ５７Ｂｌ／６マウス（ｎ＝７／群）におけるＨＰＶ免疫療法の影響を例示する。抗ＰＤ１有り無しの免疫療法は、２３日目までに腫瘍増殖の有意な阻害をもたらした（Ｐ＜０．０５）。全ての対照マウスは、腫瘍塊のために２３日目までに終了した。
【００６３】
【図２９】図２９は、図２８の抗ＰＤ１注射による免疫療法で処置された２匹のマウスにおける、腫瘍の増殖および退縮に及ぼす組み合わせ多標的化ＨＰＶ免疫療法の影響を例示する。腫瘍増殖は２０日目と２７日目にそれぞれピークに達し、次にその後退縮した。
【００６４】
【図３０】図３０Ａは、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ブラキュリに感染したヒト樹状細胞（ＤＣ）でのブラキュリタンパク質の発現を例示する。陽性対照として、ＳＷ６２０腫瘍細胞を使用した。アクチンを、ローディング対照として使用した。Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ブラキュリに感染したＤＣで、ブラキュリの発現は強固であった。図３０Ｂは、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＭＵＣ１に感染したヒトＤＣでのＭＵＣ１タンパク質の発現を例示する。陽性対照として、ＳＷ６２０腫瘍細胞を使用した。アクチンは、ローディング対照として使用した。Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ヌルに感染したＤＣと比較してＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＭＵＣ１ベクターに感染したヒトＤＣで、ＭＵＣ１の発現が観察された。
【００６５】
【図３１】図３１Ａは、１×１０１０  Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ブラキュリＶＰ、１×１０１０  Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＣＥＡ  ＶＰ、１×１０１０  Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＭＵＣ１  ＶＰまたはＴｒｉ−Ａｄ５（１×１０１０  Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ブラキュリＶＰ、１×１０１０  Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＣＥＡ  ＶＰおよび１×１０１０  Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＭＵＣ１  ＶＰの１：１：１混合物）により２週間隔で３回ワクチン接種したＣ５７Ｂｌ／６マウス（ｎ＝５／群）からの脾細胞から分泌されたＩＦＮ−γの分析を例示する。対照は、３×１０１０のＡｄ５−ヌルＶＰを受けた。脾細胞は最終ワクチン接種の１４日後に収集し、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイによってＩＦＮ−γ分泌について評価した。陽性対照脾細胞を、Ｃｏｎ  Ａに曝露させた。カラム間の有意差（ｐ＜０．０５）は、ｐ値で報告される。有意でない＝ｎｓ。図３１Ｂは、図３１Ａに記載されるワクチン接種マウスからの脾細胞から分泌されたＩＬ−２の分析を例示する。脾細胞を、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイによってＩＬ−２分泌について評価した。
【００６６】
【図３２−１】図３２Ａは、１×１０１０  Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ブラキュリＶＰ、１×１０１０  Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＣＥＡ  ＶＰ、１×１０１０  Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＭＵＣ１  ＶＰまたはＴｒｉ−Ａｄ５（１×１０１０  Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ブラキュリＶＰ、１×１０１０  Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＣＥＡ  ＶＰおよび１×１０１０  Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＭＵＣ１  ＶＰの１：１：１混合物）により２週間隔で３回ワクチン接種したＣ５７Ｂｌ／６マウス（ｎ＝５／群）のワクチン接種後のＣＤ８＋および多機能性細胞集団の分析のグラフを例示する。対照は、３×１０１０のＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ヌルＶＰを受けた。脾細胞を最終ワクチン接種の１４日後に収集し、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αを分泌するＣＤ８α＋細胞についてＦＡＣＳによって評価した。陽性対照脾細胞を、Ｃｏｎ  Ａに曝露させた。図３２Ｂは、図３２Ａに記載されるワクチン接種マウスからのＣＤ４＋細胞および多機能性細胞集団のＦＡＣＳ分析のグラフを例示する。
【００６７】
【図３２−２】図３２Ｃは、図３２Ａに記載されるワクチン接種マウスからのＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αを分泌するＣＤ８α＋細胞のＦＡＣＳ分析のグラフを例示する。図３２Ｄは、図３２Ａに記載されるワクチン接種マウスからのＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αを分泌するＣＤ４＋細胞のＦＡＣＳ分析のグラフを例示する。
【００６８】
【図３３】図３３Ａは、１×１０１０のＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＣＥＡ  ＶＰ、Ｔｒｉ−Ａｄ５（１×１０１０のＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ブラキュリＶＰ、１×１０１０のＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＣＥＡ  ＶＰおよび１×１０１０のＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＭＵＣ１  ＶＰの１：１：１混合物）または３×１０１０のＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ヌルＶＰで３回ワクチン接種をしたマウスでのＣＥＡ  ＩｇＧレベルのＥＬＩＳＡ分析を例示する。図３３Ｂは、図３３Ａに記載されるマウスを使用したＭＣ３８−ＣＥＡ２細胞に対するＣＤＣアッセイを例示する。
【００６９】
【図３４】図３４は、１×１０６個のＭＣ−３８−ＭＵＣ１細胞および１×１０１０のＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＭＵＣ１  ＶＰまたはＴｒｉ−Ａｄ５（１×１０１０のＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＣＥＡ  ＶＰ、１×１０１０のＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＭＵＣ１  ＶＰおよび１×１０１０のＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ブラキュリＶＰの１：１：１混合物（合計３×１０１０ＶＰ））によって左側腹部に皮下接種したＣ５７Ｂｌ／６マウス（ｎ＝７／群）における腫瘍体積に及ぼす免疫療法の効果を例示する。対照マウスは、３×１０１０のＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ヌルＶＰを受けた。（＊）は、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＭＵＣ１で処置されたマウスが対照マウスより有意に小さい（ｐ＜０．０５）腫瘍を有していた日数を示し、（＾）は、Ｔｒｉ−Ａｄ５で処置されたマウスが対照マウスより有意に小さい（ｐ＜０．０５）腫瘍を有していた日数を示す。Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＭＵＣ１で処置されたマウスとＴｒｉ−Ａｄ５で処置されたマウスの間の有意差（ｐ＞０．１）は、見られなかった。
【００７０】
【図３５】図３５は、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＣＥＡに感染したＡ５４９細胞でのＣＥＡの発現を示すイムノブロットを例示する。（Ａ）陰性対照。（Ｂ）タンパク質分子量マーカー。（Ｃ）陰性。（Ｄ）ＣＥＡ参照材料（３０ｎｇ）。（Ｅ）Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＣＥＡ溶解物（２０μＬ）。（Ｆ）Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＣＥＡ溶解物（２０μＬ）。（Ｇ）陰性Ａ５４９細胞。陽性対照として組換え型ＣＥＡを使用し、未感染Ａ５４９細胞が陰性対照の役目を果した。
【００７１】
【図３６】図３６は、１×１０８、１×１０９または１×１０１０のＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−Ｅ６／Ｅ７  ＶＰの用量により１４日間隔で３回免疫し、最終免疫の１４日に評価した、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝５／群）からの脾細胞のＥＬＩＳｐｏｔによって測定したＣＭＩ用量応答を例示する。ＣＭＩの最大の誘導は、１×１０１０ＶＰの用量で達成された。陽性対照脾細胞を、Ｃｏｎ  Ａに曝露させた。
【００７２】
【図３７】図３７Ａは、１×１０１０ＶＰのＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−Ｅ６／Ｅ７  ＶＰにより２週間隔で３回免疫したＣ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝５／群）の免疫の後の、ＣＤ８−α＋／ＩＦＮ−γ＋脾細胞の活性化を例示する。対照は、１×１０１０のＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ヌルＶＰを受けた。最終免疫の１４日後に収集した脾細胞は、フローサイトメトリーによって評価した。陽性対照のために、脾細胞をＰＭＡ／イオノマイシンに曝露させた。図３７Ｂは、図３７Ａに記載のマウスの免疫の後の、ＣＤ８−α＋／ＩＦＮ−γ＋／ＴＮＦ−α＋脾細胞の活性化を例示する。
【００７３】
【図３８】図３８Ａは、２×１０５個の触知不可能なＨＰＶ−Ｅ６／Ｅ７  ＴＣ−１腫瘍細胞を０日目に移植し、１、８および１５日目に１×１０１０のＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ヌルＶＰまたは１×１０１０のＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−Ｅ６／Ｅ７  ＶＰを投与した、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝５／群）の免疫療法からの腫瘍サイズの変化を例示する。腫瘍サイズを決定し、式Ｖ＝（ａ２×ｂ）／２によって体積を計算した。対応のないｔ検定を使用して実験およびベクター対照群の間で有意性の分析を実行し、有意性は＊（ｐ＜０．０５）および＊＊（ｐ＜０．０１）で表す。図３８Ｂは、マンテル−コックス検定を使用してプロットし、比較した、図３８Ａに記載されるマウスの生存曲線を例示する。有意性は、＊＊（ｐ＜０．０１）で表す。
【００７４】
【図３９】図３９Ａは、２×１０５個の小さな触知可能なＨＰＶ−Ｅ６／Ｅ７  ＴＣ−１腫瘍細胞を０日目に移植し、６、１３および２０日目に１×１０１０のＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ヌルＶＰまたは１×１０１０のＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−Ｅ６／Ｅ７  ＶＰを投与した、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝４／群）の免疫療法からの腫瘍サイズの変化を例示する。腫瘍サイズを決定し、式Ｖ＝（ａ２×ｂ）／２によって体積を計算した。対応のないｔ検定を使用して実験およびベクター対照群の間で有意性の分析を実行し、有意性は＊＊（ｐ＜０．０１）で表す。図３９Ｂは、マンテル−コックス検定を使用してプロットし、比較した、図３９Ａに記載されるマウスの生存曲線を例示する。有意性は、＊＊（ｐ＜０．０１）で表す。
【００７５】
【図４０】図４０Ａは、２×１０５個の大きな確立したＨＰＶ−Ｅ６／Ｅ７  ＴＣ−１腫瘍細胞を０日目に移植し、１３、２０および２７日目に１×１０１０のＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ヌルＶＰまたは１×１０１０のＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−Ｅ６／Ｅ７  ＶＰを投与した、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝４／群）の免疫療法からの腫瘍サイズの変化を例示する。腫瘍サイズを決定し、式Ｖ＝（ａ２×ｂ）／２によって体積を計算した。対応のないｔ検定を使用して実験およびベクター対照群の間で有意性の分析を実行し、有意性は＊＊（ｐ＜０．０１）で表す。図４０Ｂは、マンテル−コックス検定を使用してプロットし、比較した、図４０Ａに記載されるマウスの生存曲線を例示する。有意性は、＊＊（ｐ＜０．０１）で表す。
【００７６】
【図４１−１】図４１Ａは、２×１０５個のＴＣ−１腫瘍細胞を０日目に接種し、１×１０１０のＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ヌルＶＰと１００μｇのアイソタイプ対照ラットＩｇＧによる処置を１０、１７および２４日目に投与した、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝７／群）からの腫瘍サイズの変化を例示する。腫瘍サイズを決定し、式Ｖ＝（ａ２×ｂ）／２によって体積を計算した。腫瘍増殖動態は、各群の個々のマウスを表す。図４１Ｂは、２×１０５個のＴＣ−１腫瘍細胞を０日目に接種し、１×１０１０のＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ヌルＶＰと１００μｇの抗ＰＤ１抗体による処置を１０、１７および２４日目に投与した、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝７／群）からの腫瘍サイズの変化を例示する。
【００７７】
【図４１−２】図４１Ｃは、２×１０５個のＴＣ−１腫瘍細胞を０日目に接種し、１×１０１０のＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−Ｅ６／Ｅ７  ＶＰと１００μｇのアイソタイプ対照ラットＩｇＧによる処置を１０、１７および２４日目に投与した、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝７／群）からの腫瘍サイズの変化を例示する。図４１Ｄは、２×１０５個のＴＣ−１腫瘍細胞を０日目に接種し、１×１０１０のＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−Ｅ６／Ｅ７  ＶＰと１００μｇの抗ＰＤ１による処置を１０、１７および２４日目に投与した、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝７／群）からの腫瘍サイズの変化を例示する。
【００７８】
【図４２】図４２は、図４１Ａ〜Ｄにおけるもののように処置されたＣ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝７／群）の生存曲線を例示する。実験は、腫瘍移植後の５２日目に終了した。Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−Ｅ６／Ｅ７および対照抗体で処置したマウスは、対照マウスの両群（Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ヌルおよび対照抗体またはＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ヌルおよび抗ＰＤ１抗体）と比較して有意に（ｐ＜０．００８）より長い生存を示した。７匹のＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−Ｅ６／Ｅ７および対照抗体処置マウスのうちの２匹（２９％）は、５２日目にまだ生きていた。Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−Ｅ６／Ｅ７と抗ＰＤ１抗体で処置したマウスは、対照の両群と比較して有意に（ｐ＜０．０００６）より長い生存を示した。７匹のＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−Ｅ６／Ｅ７と抗ＰＤ１抗体で処置したマウスのうちの４匹（５７％）は、５２日目にまだ生きていた。
【００７９】
【図４３】図４３Ａは、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−Ｅ６／Ｅ７がＴＣ−１腫瘍へのＣＤ８＋腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の動員を促進することを例示する。Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝５／群）に、２×１０５個のＴＣ−１腫瘍細胞を移植した。移植の１２日後に、マウスは、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ヌルの空のベクターと対照ＩｇＧ、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ヌルと抗ＰＤ１、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−Ｅ６／Ｅ７と対照ＩｇＧまたはＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−Ｅ６／Ｅ７と抗Ｐ−１による処置を開始した。ワクチンを毎週皮下投与し、体壁内注射（ｉｎｔｒａｐａｒｉｅｔａｌ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）を通して抗ＰＤ１抗体を３〜４日毎に投与し、２７日目に腫瘍を分析した。Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−Ｅ６／Ｅ７処置は、Ｔｒｅｇ／ＣＤ８＋ＴＩＬの比を有意に減少させる。対応のないｔ検定を使用して有意性の分析を実行し、有意性はｎｓ（ｐ＞０．０５）、＊（ｐ＜０．０５）、＊＊（ｐ＜０．０１）、＊＊＊（ｐ＜０．００１）または＊＊＊＊（ｐ＜０．０００１）で表す。図４３Ｂは、図４３ＡのＴｒｅｇ／ＣＤ８＋ＴＩＬの比の低減が、Ｔｒｅｇの数の低減によって引き起こされるのではないことを例示する。図４３Ｃは、図４３ＡのＴｒｅｇ／ＣＤ８＋ＴＩＬの比の低減が、ＣＤ８＋ＴＩＬの数の増加によって引き起こされることを例示する。
【００８０】
【図４４】図４４Ａは、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−Ｅ６／Ｅ７と抗ＰＤ１抗体の組み合わせ療法が炎症促進性腫瘍微小環境を促進することを例示する。Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝５／群）に腫瘍を移植し、処置し、腫瘍を図４３Ａ〜Ｃのように分析した。Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−Ｅ６／Ｅ７で処置したマウスからの腫瘍で、ＰＤ１＋ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ＴＩＬの頻度が増加する。Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−Ｅ６／Ｅ７および抗ＰＤ１の組み合わせで処置したマウスからの腫瘍は、ＰＤ１＋ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ＴＩＬ（Ａ）、ＬＡＧ−３＋ＣＤ８＋ＴＩＬ（Ｂ）および（Ｃ）の有意により低い頻度を有する。対応のないｔ検定を使用して有意性の分析を実行し、有意性はｎｓ（ｐ＞０．０５）、＊（ｐ＜０．０５）、＊＊（ｐ＜０．０１）または＊＊＊（ｐ＜０．００１）で表す。図４４Ｂは、図４４ＡのようなＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−Ｅ６／Ｅ７および抗ＰＤ１の組み合わせで処置したマウスからの腫瘍がＬＡＧ−３＋ＣＤ８＋ＴＩＬの有意により低い頻度を有し、これらのレベルを対照マウスからの腫瘍により一致させることを例示する。図４４Ｃは、図４４ＡのようなＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−Ｅ６／Ｅ７および抗ＰＤ１の組み合わせで処置したマウスからの腫瘍がＰＤＬ１の有意に低減された発現レベルを有することを例示する。
【発明を実施するための形態】
【００８１】
以下の節に本発明の種々の態様をより詳細に記載する。本発明の各態様は、相反することが明確に示されていない限り、本発明の任意の他の態様（複数可）と組み合わせることができる。特に、好ましいまたは有利であると示されている任意の特徴を、好ましいまたは有利であると示されている特徴のうちの任意の他の特徴と組み合わせることができる。
【００８２】
別段の指定のない限り、任意の実施形態を任意の他の実施形態と組み合わせることができる。本発明の種々の態様は、範囲形式で示すことができる。範囲形式での説明は、単に便宜および簡潔さのためだけのものであり、本発明の範囲に対する柔軟さのない限定と解釈されるべきではないことが理解されるべきである。したがって、範囲についての記載は、全ての可能性のある部分範囲ならびにその範囲内に入る個々の数値が、明確に記載されたものと同じく具体的に開示されたものとみなされるべきである。例えば、１から６までなどの範囲についての記載は、例えば１から３まで、１から４まで、１から５まで、２から４まで、２から６まで、３から６までなどの部分範囲、ならびに、その範囲内に入る個々の数、例えば、１、２、３、４、５、および６が具体的に開示されたものとみなされるべきである。これは、範囲の広さにかかわらず当てはまる。複数の範囲（ｒａｎｇｅｓ）が存在する場合、それらの範囲には範囲の終点が含まれる。
【００８３】
第１世代アデノウイルスベクターと比較して、本発明の第２世代Ｅ２ｂ欠失アデノウイルスベクターのある特定の実施形態は、追加的なＤＮＡポリメラーゼ遺伝子（ｐｏｌ）の欠失および末端タンパク質前駆体（ｐｒｅｔｅｒｍｉｎａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ）（ｐＴＰ）の欠失を含有する。第１世代アデノウイルスベクターの遺伝子運搬能が５〜６ｋｂであるのと比較して、Ｅ２ｂ欠失ベクターの遺伝子運搬能は最大１３ｋｂであり、種々の標的抗原のいずれかをコードする核酸配列のための空間が容易にもたらされる。Ｅ２ｂ欠失アデノウイルスベクターはまた、第１世代アデノウイルスベクターと比較して有害反応も低減する。
【００８４】
野生型Ａｄに対する生得免疫応答は複雑であり得、アデノウイルスベクターから発現されるＡｄタンパク質が重要な役割を果たすと思われる。詳細には、Ｅ２ｂ欠失ベクターにおける末端タンパク質前駆体およびＤＮＡポリメラーゼの欠失により、注射後最初の２４〜７２時間の間の炎症が低減すると思われるが、第１世代アデノウイルスベクターでは、この期間中の炎症が刺激される。さらに、Ｅ２ｂ欠失により生じる追加的な複製遮断により、Ａｄ後期遺伝子の発現の１０，０００分の１の低下も導かれ、これは、Ｅ１、Ｅ３単独の欠失によってもたらされる低下をはるかに超えることが報告されている。Ｅ２ｂ欠失アデノウイルスベクターによって産生されるＡｄタンパク質のレベルの低下により、Ａｄによる免疫または曝露を受けた個体における当該プラットフォームの反復使用を妨げる応答である、競合する望ましくないＡｄ抗原に対する免疫応答の潜在性が有効に減少する。第２世代Ｅ２ｂ欠失ベクターによる炎症反応の誘導の低減により、当該ベクターが、抗原提示細胞（すなわち、樹状細胞）への感染中に所望のワクチン抗原を発現し、抗原性の競合の潜在性を減少させ、その結果、第１世代アデノウイルスベクターを用いた同一の試みと比較して、所望の抗原に対するワクチンのより大きな免疫をもたらす潜在性が増大する。Ｅ２ｂ欠失アデノウイルスベクターにより、第１世代アデノウイルスベクターを使用した前述のワクチン候補よりも安全であり、有効であり、かつ用途の多い、改善されたＡｄをベースとしたワクチン候補がもたらされる。したがって、第１世代Ｅ１欠失アデノウイルス亜型５（Ａｄ５）をベースとしたベクターは、がんワクチンとして使用するための有望なプラットフォームではあるが、天然に存在するまたは誘導されたＡｄ特異的中和抗体によって活性が妨害される。理論に束縛されることなく、Ｅ１領域、ならびに、ＤＮＡポリメラーゼおよび末端タンパク質前駆体をコードするＥ２ｂ領域の欠失を伴うＡｄ５をベースとしたベクター（Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］）では、例えば、後期ウイルスタンパク質発現が低減することにより、Ａｄ免疫宿主において、免疫学的クリアランスを回避し、コードされる腫瘍抗原導入遺伝子に対するより強力な免疫応答を誘導することができる。
【００８５】
本発明は、標的抗原、特に、感染症またはがんなどの増殖性細胞疾患に付随するまたは関連する抗原に対する免疫応答を生じさせるための方法および組成物（例えば、ウイルスベクター）に関する。本発明は、個体において標的抗原、特に、がんなどの細胞増殖疾患に関連する抗原に対する免疫応答を生じさせるための方法および組成物に関する。本発明の種々の態様では、本明細書に記載されている組成物および方法は、個体において、標的抗原または少なくとも１つの標的抗原を含む標的抗原シグネチャを発現および／または提示する細胞に対する免疫応答を生じさせることに関する。本発明は、ＨＰＶ遺伝子Ｅ６およびＥ７に対する免疫のためのウイルス遺伝子送達プラットフォームをＰＤ１チェックポイント遮断と組み合わせて使用する、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）に対する免疫療法のための組成物および方法を提供する。これらの組成物および方法では、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−Ｅ６／Ｅ７ワクチンを免疫経路チェックポイントモジュレーターと組み合わせて利用する。
【００８６】
当該組成物および方法は、細胞により発現および／または提示された標的抗原に対する免疫応答を生じさせるために使用することができる。例えば、当該組成物および方法は、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、例えば、細胞により発現または提示されたＣＥＡなどに対する免疫応答を生じさせるために使用することができる。例えば、当該組成物および方法は、細胞により発現または提示されたＣＥＡ（６Ｄ）に対する免疫応答を生じさせるために使用することができる。例えば、当該組成物および方法は、細胞により発現および／または提示されたムチン１（ＭＵＣ１）に対する免疫応答を生じさせるために使用することができる。例えば、当該組成物および方法は、細胞により発現および／または提示されたＭＵＣ１ｃに対する免疫応答を生じさせるために使用することができる。例えば、当該組成物および方法は、細胞により発現および／または提示されたブラキュリ（Ｔタンパク質（Ｔ））に対する免疫応答を生じさせるために使用することができる。
【００８７】
当該組成物および方法は、細胞により発現および／または提示された複数の標的抗原に対する免疫応答を生じさせるために使用することができる。例えば、当該組成物および方法は、ＭＵＣ１ｃ、Ｔ、またはそれらの任意の組み合わせに対する免疫応答を生じさせるために使用することができる。例えば、当該組成物および方法は、ＴおよびＣＥＡに対する免疫応答を生じさせるために使用することができる。例えば、当該組成物および方法は、ＭＵＣ１ｃおよびＣＥＡに対する免疫応答を生じさせるために使用することができる。例えば、当該組成物および方法は、ＭＵＣ１およびＴに対する免疫応答を生じさせるために使用することができる。例えば、当該組成物および方法は、ＭＵＣ１ｃ、Ｔ、およびＣＥＡに対する免疫応答を生じさせるために使用することができる。
【００８８】
ＣＥＡ、ＭＵＣ１ｃ、もしくはＴ、または、ＣＥＡ、ＭＵＣ１ｃ、もしくはＴを発現および／もしくは提示する細胞に対する免疫応答を生じさせることを目的としたワクチンにＣＥＡ、ＭＵＣ１ｃ、またはＴの改変型を使用することができる。特に、本発明は、１つまたは複数の抗原性標的実体に対する複数回のワクチン接種を達成することができるように改善されたＡｄをベースとしたワクチンを提供する。一部の実施形態では、改善されたＡｄをベースとしたワクチンは、標的抗原、その断片、バリアントまたはバリアント断片を有する複製欠損性アデノウイルス、例えばＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＣＥＡ（６Ｄ）などを含む。ＣＥＡ、ＭＵＣ１ｃ、またはＴなどの標的抗原のバリアントまたは断片は、免疫原性の潜在性を含めた種々の因子に基づいて選択することができる。変異体ＣＥＡであるＣＥＡ（６Ｄ）は、ＣＥＡ（ＷＴ）と比較して免疫応答を生じさせる能力が増大しているので利用することができる。重要なことに、ワクチン接種は、Ａｄに対する既存の免疫の存在下で実施すること、または以前に本発明のＡｄベクターまたは他のＡｄベクターを用いた免疫を複数回受けた被験体に投与することができる。Ａｄベクターは、これだけに限定されないが、１つまたは複数の標的抗原に対する抗体の産生およびＣＭＩ応答を含めた、ＣＥＡ、ＭＵＣ１ｃ、またはＴなどの目的の抗原に対する免疫応答を誘導するために、被験体に複数回投与することができる。
【００８９】
以下の節に本発明の種々の態様をより詳細に記載する。本発明の各態様は、相反することが明確に示されていない限り、本発明の任意の他の態様（複数可）と組み合わせることができる。特に、好ましいまたは有利であると示されている任意の特徴を、好ましいまたは有利であると示されている特徴のうちの任意の他の特徴と組み合わせることができる。本明細書で使用される場合、別段の指定のない限り、「１つの（ａ）」という冠詞は、別段明確な定めがない限り、１つまたは複数を意味する。本明細書で使用される場合、別段の指定のない限り、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などの用語は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」を意味する。本明細書で使用される場合、別段の指定のない限り、「または（ｏｒ）」という用語は、接続的でも離接的でもあり得る。本明細書で使用される場合、別段の指定のない限り、任意の実施形態を任意の他の実施形態と組み合わせることができる。
【００９０】
「アデノウイルス」（Ａｄ）とは、Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ科に由来する、エンベロープを有さないＤＮＡウイルスを指す。これらのウイルスは、これらに限定されないが、ヒト、トリ、ウシ、ブタおよびイヌの種において見いだすことができる。本発明は、Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ科の４つの属（例えば、Ａｖｉａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ、Ｍａｓｔａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ、ＡｔａｄｅｎｏｖｉｒｕｓおよびＳｉａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）のいずれかに由来する任意のＡｄの、Ｅ２ｂ欠失ウイルスベクター、または本明細書に記載されている他の欠失を含有するベクターの基礎としての使用を意図している。さらに、それぞれの種にいくつかの血清型が見いだされる。Ａｄはまた、これだけに限定されないが、遺伝子変異、欠失または転位を含めた、これらのウイルス血清型のいずれかの遺伝学的派生物に関する。
【００９１】
「ヘルパーアデノウイルス」または「ヘルパーウイルス」とは、特定の宿主細胞がなすことができないウイルスの機能をもたらすことができるＡｄを指す（宿主によりＥ１タンパク質などのＡｄ遺伝子産物がもたらされ得る）。このウイルスは、第２のウイルス、またはヘルパー依存性ウイルス（例えば、ｇｕｔｔｅｄまたはｇｕｔｌｅｓｓウイルス、またはＥ２ｂまたは本明細書に記載されている他の領域などの特定の領域が欠失したウイルス）では欠如している機能（例えば、タンパク質）をトランスにもたらすために使用される。第１の複製不能ウイルスは、第２のヘルパー依存性ウイルスを「助け」、それにより、細胞における第２のウイルスのゲノムの産生を可能にするといえる。
【００９２】
「アデノウイルス５型ヌル（Ａｄ５−ヌル）」とは、発現のためのいかなる異種核酸配列も含有しない非複製性Ａｄを指す。
【００９３】
「第１世代アデノウイルス」とは、初期領域１（Ｅ１）を欠失させたＡｄを指す。追加的な場合では、初期領域３（Ｅ３）も欠失させることができる。
【００９４】
「ｇｕｔｔｅｄ」または「ｇｕｔｌｅｓｓ」とは、ウイルスのコード領域を全て欠失させたＡｄベクターを指す。
【００９５】
「トランスフェクション」とは、真核細胞への外来核酸の導入を指す。トランスフェクションの例示的な手段としては、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈澱、ＤＥＡＥデキストラン媒介性トランスフェクション、ポリブレン媒介性トランスフェクション、電気穿孔、微量注射、リポソーム融合、リポフェクション、プロトプラスト融合、レトロウイルス感染、および微粒子銃が挙げられる。
【００９６】
「安定なトランスフェクション」または「安定にトランスフェクトされた」とは、トランスフェクトされた細胞のゲノムに外来核酸、ＤＮＡまたはＲＮＡが導入され組み込まれたことを指す。「安定なトランスフェクタント」という用語は、ゲノムＤＮＡに外来ＤＮＡが安定に組み込まれた細胞を指す。
【００９７】
「レポーター遺伝子」とは、レポーター分子（例えば、酵素）をコードするヌクレオチド配列を示す。「レポーター分子」は、これだけに限定されないが、酵素に基づく検出アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ、組織化学的アッセイ）、蛍光系、放射性系、および発光系を含めた種々の検出系のいずれかで検出可能である。Ｅ．ｃｏｌｉ  β−ガラクトシダーゼ遺伝子、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ヒト胎盤アルカリホスファターゼ遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子；および他のレポーター遺伝子を使用することができる。
【００９８】
「異種配列」とは、天然ではライゲーションしていない、または天然では異なる位置でライゲーションしている核酸配列とライゲーションされる、またはライゲーションするように操作されるヌクレオチド配列を指す。異種核酸は、天然に存在するヌクレオチド配列または天然に存在する配列に対するいくらかの改変を含み得る。
【００９９】
「導入遺伝子」とは、被験体の細胞またはゲノムに導入された天然の核酸配列または異種核酸配列または融合した相同な核酸配列または異種核酸配列のいずれかの任意の遺伝子コード領域を指す。導入遺伝子は、被験体の細胞に導入遺伝子を導入するために使用される任意のウイルスベクターに保有させることができる。
【０１００】
「第２世代アデノウイルス」とは、ウイルスからＥ１、Ｅ２、Ｅ３、および、ある特定の実施形態では、Ｅ４  ＤＮＡ遺伝子配列の全部または一部を欠失させた（除去した）Ａｄを指す。
【０１０１】
「被験体」とは、これだけに限定されないが、ヒト、非ヒト霊長類（例えば、アカゲザルまたは他の型のマカク）、マウス、ブタ、ウマ、ロバ、ウシ、ヒツジ、ラットおよび家禽を含めた任意の動物を指す。
【０１０２】
「免疫原性断片」とは、Ｂ細胞および／またはＴ細胞表面抗原受容体により特異的に認識され（すなわち、それと特異的に結合し）、その結果、断片を対して特異的である免疫応答を生じさせるポリペプチドの断片を指す。
【０１０３】
「標的抗原」または「標的タンパク質」とは、免疫応答がそれに対するものであるタンパク質などの分子を指す。
【０１０４】
「Ｅ２ｂ欠失」とは、少なくとも１つのＥ２ｂ遺伝子産物の発現および／または機能が妨げられるように変異させたＤＮＡ配列を指す。したがって、ある特定の実施形態では、「Ｅ２ｂ欠失」は、Ａｄゲノムから欠失（除去）させる特定のＤＮＡ配列と関連して使用される。Ｅ２ｂ欠失または「Ｅ２ｂ領域内に欠失を含有する」とは、ＡｄゲノムのＥ２ｂ領域内の少なくとも１つの塩基対の欠失を指す。したがって、ある特定の実施形態では、１つ超の塩基対が欠失しており、さらなる実施形態では、少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、または１５０塩基対が欠失している。別の実施形態では、ＡｄゲノムのＥ２ｂ領域内の１５０超、１６０超、１７０超、１８０超、１９０超、２００超、２５０超、または３００超の塩基対が欠失している。Ｅ２ｂ欠失は、少なくとも１つのＥ２ｂ遺伝子産物の発現および／または機能を妨げる欠失であってよく、したがって、Ｅ２ｂ特異的タンパク質のコード部分のエクソン内の欠失ならびにプロモーターおよびリーダー配列内の欠失を包含する。ある特定の実施形態では、Ｅ２ｂ欠失は、ＤＮＡポリメラーゼおよびＥ２ｂ領域の末端タンパク質前駆体の一方またはその両方の発現および／または機能を妨げる欠失である。さらなる実施形態では、「Ｅ２ｂ欠失」とは、１つまたは複数のコードされるタンパク質が非機能性になるような、Ａｄゲノムのこの領域のＤＮＡ配列の１つまたは複数の点変異を指す。そのような変異は、非機能性タンパク質をもたらすアミノ酸配列の変化を導く、異なる残基で置き換えられる残基を含む。
【０１０５】
「Ｅ１欠失」とは、少なくとも１つのＥ１遺伝子産物の発現および／または機能が妨げられるように変異させたＤＮＡ配列を指す。したがって、ある特定の実施形態では、「Ｅ１欠失」は、Ａｄゲノムから欠失（除去）させる特定のＤＮＡ配列と関連して使用される。Ｅ１欠失または「Ｅ１領域内の欠失を含有する」とは、ＡｄゲノムのＥ１領域内の少なくとも１つの塩基対の欠失を指す。したがって、ある特定の実施形態では、１つ超の塩基対が欠失しており、さらなる実施形態では、少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、または１５０塩基対が欠失している。別の実施形態では、ＡｄゲノムのＥ１領域内の１５０超、１６０超、１７０超、１８０超、１９０超、２００超、２５０超、または３００超の塩基対が欠失している。Ｅ１欠失は、少なくとも１つのＥ１遺伝子産物の発現および／または機能を妨げる欠失であってよく、したがって、Ｅ１特異的タンパク質のコード部分のエクソン内の欠失ならびにプロモーターおよびリーダー配列内の欠失を包含する。ある特定の実施形態では、Ｅ１欠失は、Ｅ１領域のトランス作用性転写調節因子の一方または両方の発現および／または機能を妨げる欠失である。さらなる実施形態では、「Ｅ１欠失」とは、１つまたは複数のコードされるタンパク質が非機能性になるようなＡｄゲノムのこの領域のＤＮＡ配列の１つまたは複数の点変異を指す。そのような変異は、非機能性タンパク質をもたらすアミノ酸配列の変化を導く、異なる残基で置き換えられる残基を含む。
【０１０６】
「免疫応答を生じさせる（ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  ａｎ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）」または「免疫応答を誘導する（ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ａｎ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）」とは、１つもしくは複数の免疫細胞（Ｔ細胞、Ｂ細胞、抗原提示細胞、樹状細胞、好中球など）の数またはこれらの免疫細胞の１つもしくは複数の活性（ＣＴＬ活性、ＨＴＬ活性、サイトカイン分泌、サイトカイン分泌のプロファイルの変化など）の統計的に有意な変化、例えば、増大または低下を指す。
【０１０７】
「核酸」および「ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書では基本的に互換的に使用される。本発明のポリヌクレオチドは、一本鎖（コード鎖またはアンチセンス鎖）であっても二本鎖であってもよく、ＤＮＡ（例えば、ゲノム、ｃＤＮＡ、または合成）分子であってもＲＮＡ分子であってもよい。ＲＮＡ分子は、イントロンを含有し、ＤＮＡ分子に１対１で対応するＨｎＲＮＡ分子、およびイントロンを含有しないｍＲＮＡ分子を含み得る。必ずしもではないが、追加的なコード配列または非コード配列が本発明のポリヌクレオチド内に存在してよく、また、必ずしもではないが、ポリヌクレオチドは、他の分子および／または支持材料と連結していてよい。単離されたポリヌクレオチドとは、本明細書で使用される場合、ポリヌクレオチドが他のコード配列から実質的に離れていることを意味する。例えば、単離されたＤＮＡ分子は、本明細書で使用される場合、大きな染色体断片または他の機能的な遺伝子もしくはポリペプチドコード領域などの無関係のコードＤＮＡの大部分を含有しない。これは、もともと単離されたＤＮＡ分子を指し、後で実験室において組換えによってセグメントに付加された遺伝子またはコード領域は排除されない。
【０１０８】
当業者には理解される通り、本発明のポリヌクレオチドは、本明細書に記載されている標的抗原、抗原の断片、ペプチドなどを発現する、またはそれを発現するように適合させることができるゲノム配列、ゲノム外配列およびプラスミドによりコードされる配列、ならびに、より小さな工学的に操作された遺伝子セグメントを含み得る。そのようなセグメントは、天然に単離されたものであってもよく、人間の手によって合成的に改変されたものであってもよい。
【０１０９】
一般には、ポリヌクレオチドバリアントは、好ましくは、バリアントポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドのエピトープの免疫原性または異種標的タンパク質の免疫原性が、ネイティブなポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドと比較して実質的に低下しないような、１つまたは複数の置換、付加、欠失および／または挿入を含有する。一部の場合では、１つまたは複数の置換、付加、欠失および／または挿入により、バリアントポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドのエピトープの免疫原性の増大がもたらされる。本明細書の他の箇所に記載の通り、ポリヌクレオチドバリアントは、標的抗原のバリアントまたはその断片（例えば、エピトープ）をコードし得、ここで、バリアントポリペプチドまたはその断片（例えば、エピトープ）の抗原特異的抗血清および／またはＴ細胞株またはクローンと反応する傾向は、ネイティブなポリペプチドと比較して実質的に低減しない。ポリヌクレオチドバリアントは、標的抗原のバリアントまたはその断片をコードし得、ここで、バリアントポリペプチドまたはその断片の抗原特異的抗血清および／またはＴ細胞株またはクローンと反応する傾向は、ネイティブなポリペプチドと比較して実質的に増大する。
【０１１０】
「バリアント」という用語はまた、異種起源の相同な遺伝子を包含するものと理解されるべきである。特定の実施形態では、標的抗原のバリアントまたは断片は、１つまたは複数の生物活性が低下するように改変されたものである。例えば、腫瘍形成タンパク質標的抗原を、タンパク質の腫瘍形成活性が低下するまたは排除されるように改変することもでき、ウイルスタンパク質を、ウイルスタンパク質の１つまたは複数の活性が低下するまたは排除されるように改変することもできる。改変されたＣＥＡタンパク質の例は、免疫原性が増大したバリアントタンパク質がもたらされるＮ６１０Ｄ変異を有するＣＥＡである。
【０１１１】
ポリヌクレオチド配列を比較する場合、下記の通り、最大の対応でアラインメントした場合に２つの配列内のヌクレオチドの配列が同じであれば、２つの配列は「同一」である。２つの配列間の比較は、一般には、比較ウインドウにわたって配列を比較して、局所的な配列の領域類似性を同定し、比較することによって実施される。「比較ウインドウ」とは、本明細書で使用される場合、少なくとも約２０、通常３０〜約７５、４０〜約５０の連続した位置のセグメントを指し、ここで、配列は、連続した位置の数が同じ参照配列と、２つの配列を最適にアラインメントした後に比較することができる。比較のための配列の最適なアラインメントは、バイオインフォマティクスソフトウェアのＬａｓｅｒｇｅｎｅスイート中のＭｅｇａｌｉｇｎプログラムを使用して、初期パラメータを使用して行うことができる。あるいは、比較のための配列の最適なアラインメントは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｄ．  ＡＰＬ．  Ｍａｔｈ  ２巻：４８２頁（１９８１年）の局所同一性アルゴリズムによって、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４８巻：４４３頁（１９７０年）の同一性アラインメントアルゴリズムによって、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５巻：２４４４頁（１９８８年）の類似性検索法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実行（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）によって、または検査によって行うことができる。パーセント配列同一性および配列類似性を決定するために適したアルゴリズムの１つの例は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ  ２．０アルゴリズムである。ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ  ２．０は、例えば、本明細書に記載されているパラメータを用いて、本発明のポリヌクレオチドについてのパーセント配列同一性を決定するために使用することができる。ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを通じて公的に入手可能である。例示的な一例では、ヌクレオチド配列に関しては、パラメータＭ（マッチする残基の対についてのリワードスコア（ｒｅｗａｒｄ  ｓｃｏｒｅ）；常に０超）およびＮ（ミスマッチ残基についてのペナルティスコア（ｐｅｎａｌｔｙ  ｓｃｏｒｅ）；常に０未満）を使用して累積スコアを算出することができる。累積アラインメントスコアがその最大達成値から数量Ｘだけ減少した時；１つまたは複数の負スコア残基（ｎｅｇａｔｉｖｅ−ｓｃｏｒｉｎｇ  ｒｅｓｉｄｕｅ）アラインメントの蓄積により累積スコアがゼロまたはそれ未満になった時；またはいずれかの配列の末端に達した時に各方向へのワードヒット（ｗｏｒｄ  ｈｉｔ）の伸長を停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、ＴおよびＸにより、アラインメントの感度およびスピードが決定される。ＢＬＡＳＴＮプログラムでは、初期値としてワード長（ｗｏｒｄ  ｌｅｎｇｔｈ）（Ｗ）１１、および期待値（ｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ）（Ｅ）１０、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリング行列アラインメント、（Ｂ）５０、期待値（���ｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ）（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、ならびに両方の鎖の比較を使用する。
【０１１２】
「配列同一性の百分率」は、少なくとも２０の位置の比較のウインドウにわたって最適にアラインメントされた２つの配列を比較することによって決定することができ、ここで、比較ウインドウ内のポリヌクレオチド配列の部分は、２つの配列を最適にアラインメントするために、参照配列（付加または欠失を含まない）と比較して２０パーセントまたはそれ未満、通常５〜１５パーセント、または１０〜１２パーセントの付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。百分率は、両方の配列内に同一の核酸塩基が存在する位置の数を決定してマッチする位置の数を得、マッチする位置の数を参照配列内の位置の総数で割り、その結果に１００を掛けて配列同一性の百分率を得ることによって算出する。
【０１１３】
遺伝暗号の縮重の結果として、本明細書に記載されている特定の目的の抗原またはその断片をコードするヌクレオチド配列が多く存在することが当業者には理解されよう。これらのポリヌクレオチドの一部は、任意のネイティブな遺伝子のヌクレオチド配列に対して最小の相同性を有する。それにもかかわらず、コドン使用の差異に起因して変動するポリヌクレオチドは、本発明により具体的に意図されている。さらに、本発明で提供されるポリヌクレオチド配列を含む遺伝子の対立遺伝子は本発明の範囲内に入る。対立遺伝子は、ヌクレオチドの欠失、付加および／または置換などの１つまたは複数の変異の結果として変化する内因性遺伝子である。得られるｍＲＮＡおよびタンパク質は、必ずしもではないが、構造または機能が変化している。対立遺伝子は、標準の技法（例えば、ハイブリダイゼーション、増幅および／またはデータベース配列比較など）を使用して同定することができる。
【０１１４】
組成物
免疫療法およびワクチンのためのウイルスベクター
組換え型ウイルスベクターを使用して、タンパク質をコードする遺伝子または抗原（例えば、ＴＡＡおよび／またはＩＤＡＡ）を発現させることができる。組換え型ウイルスベクターをベースとしたワクチンおよび免疫療法の利点として、遺伝子形質導入の効率が高いこと、標的細胞への遺伝子の送達が高度に特異的であること、強固な免疫応答が誘導されること、および細胞性免疫（ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ）が増大することが挙げられる。本開示は、ウイルスのゲノムの極めて重要な領域の欠失または挿入を含む組換え型アデノウイルスベクターを提供する。本開示により提供されるウイルスベクターは、それに対する免疫応答を生じさせることが望まれる１つまたは複数の目的の標的抗原、またはそのバリアント、断片もしくは融合物をコードする異種核酸配列を含み得る。
【０１１５】
本開示の方法および組成物で使用することができる適切なウイルスベクターとしては、これだけに限定されないが、レトロウイルス、レンチウイルス、プロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、自己相補性アデノ随伴ウイルス、サイトメガロウイルス、またはセンダイウイルスが挙げられる。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、複製コンピテントであってよい。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、複製欠損性であってよい。複製欠損性ウイルスベクターに関しては、ウイルスのゲノムは、複製の追加的なラウンドおよびパッケージングに必要なコード領域が他の遺伝子で置き換えられ得るか、または欠失され得る。これらのウイルスは、それらの標的細胞に感染し、それらのウイルスペイロードを送達することはできるが、その後、細胞溶解および死を導く典型的な溶解経路を続けることができない。ウイルスベクターに応じて、複製欠損性ウイルスベクターにおいて許容されるＤＮＡまたはｃＤＮＡ挿入断片の典型的な最大長は、約８〜１０キロベース（ｋＢ）であり得る。
【０１１６】
レトロウイルス（例えば、逆転写酵素を含有する、エンベロープを有する一本鎖ＲＮＡウイルスなど）は、抗原を発現させるために使用されてきた。レトロウイルスベクターは、複製欠損性であってよい。レトロウイルスベクターは、マウス起源またはトリ起源のものであってよい。レトロウイルスベクターは、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）に由来するものであってよい。遺伝子発現のためにゲノムへの組み込みが必要であるレトロウイルスベクターを使用することができる。レトロウイルスベクターは、長期間遺伝子発現をもたらすために使用することができる。例えば、レトロウイルスベクターは、ゲノムサイズがおよそ７〜１１ｋｂであってよく、また、ベクターは、７〜８ｋｂ長の外来ＤＮＡ挿入断片を有してよい。レトロウイルスベクターは、低免疫原性を示すように使用することができ、大多数の患者は、レトロウイルスベクターに対する既存の免疫を示さない。レトロウイルスベクターは、分裂細胞を感染させるために使用することができる。レトロウイルスベクターは、非分裂細胞は感染させないために使用することができる。
【０１１７】
レンチウイルスベクターは、抗原を発現させるために使用されてきた。レンチウイルスは、レトロウイルスのサブクラスを構成する。レンチウイルスベクターは、非分裂細胞を感染させるために使用することができる。レンチウイルスベクターは、分裂細胞を感染させるために使用することができる。レンチウイルスベクターは、非分裂細胞と分裂細胞の両方を感染させるために使用することができる。レンチウイルスは、一般に、レトロウイルスよりも広範な親和性（ｔｒｏｐｉｓｍ）を示す。ｔａｔおよびｒｅｖなどのいくつかのタンパク質により、レンチウイルスの複製が調節される。これらの調節タンパク質は、一般には、レトロウイルスには存在しない。導入遺伝子送達ベクターに工学的に操作することができる例示的なレンチウイルスは、ＨＩＶである。レンチウイルスベクターの利点は、レトロウイルスベクターの利点と同様である。レンチウイルスにより腫瘍形成が潜在的に誘発される可能性があるが、レンチウイルスの組み込み部位は細胞性プロモーターを有する部位から離れているので、このリスクはレトロウイルスベクターよりも低い。ＨＩＶをベースとしたベクターは、例えば、ＨＩＶウイルスエンベロープおよびベクター作製中に必要でない調節遺伝子の一部を欠失させることによって生成することができる。エンベロープにより細胞および組織特異性が決定されるので、親エンベロープの代わりに、いくつかのキメラまたは改変エンベロープベクターを生成する。
【０１１８】
サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ベクターは、抗原を発現させるために使用されており、また、ヘルペスウイルスのメンバーである。種特異的ＣＭＶを使用することができる（例えば、ヒトＣＭＶ（ＨＣＭＶ）、例えば、ヒトヘルペスウイルス５型）。ＨＣＭＶは、カプシドで囲まれた２３５ｋｂの二本鎖直鎖ＤＮＡゲノムを含有する。エンベロープは、細胞受容体に結合する糖タンパク質ｇＢおよびｇＨを含有する。
【０１１９】
センダイウイルス（ＳｅＶ）ベクターは、抗原を発現させるために使用されてきた。ＳｅＶは、Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ科の、エンベロープを有する一本鎖ＲＮＡウイルスである。ＳｅＶゲノムは、６種のタンパク質、および細胞への侵入を媒介し、その親和性を決定する２種のエンベロープ糖タンパク質、ＨＮタンパク質およびＦタンパク質をコードする。ベクターの安全性を改善するために、Ｆタンパク質を欠くＳｅＶベクターを複製欠損性ウイルスとして使用することができる。パッケージング細胞中に作製したＳｅＶベクターを使用してＦタンパク質を発現させることができる。Ｆ遺伝子を欠失させ、導入遺伝子を挿入したゲノムをパッケージング細胞にトランスフェクトすることができる。ＳｅＶは、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを含有し、ウイルスのゲノムは細胞質に局在化する。これにより、感染後すぐに起こる、ＳｅＶの速い遺伝子発現および遺伝毒性的利点が確実になる。ＳｅＶベクターは、高度に効率的な遺伝子移入を示すために使用することができる。ＳｅＶベクターは、分裂細胞と非分裂細胞の両方への形質導入に使用することができる。ＳｅＶベクターは、非分裂細胞への形質導入に使用することができる。ＳｅＶベクターは、分裂細胞への形質導入に使用することができる。ＳｅＶベクターは、例えば、ヒト気道上皮細胞に効率的に形質導入するために使用することができる。ＳｅＶベクターは、例えば、粘膜（例えば、経口および経鼻）経路によって投与することができる。鼻腔内投与を使用して、ＳｅＶに対する既存の免疫の影響を筋肉内投与と比較して潜在的に低減することができる。他のウイルスベクターと比較して、導入遺伝子容量（３．４ｋｂ）は低い。ＳｅＶは、ヒトパラインフルエンザ１型（ｈＰＩＶ−１）ウイルスと高度に相同であり、したがって、ＳｅＶの使用に対してｈＰＩＶ−１に対する既存の免疫が作用し得る。
【０１２０】
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）ベクターは、抗原を発現させるために使用することができる。例えば、ゲノム内の癌遺伝子を、ＨＰＶウイルスのゲノムの極めて重要な領域の欠失または挿入によってなどで改変することにより、組換え型ベクターを、感染の予測可能性が増大し、望ましくない副作用が低下するように工学的に操作することができる。例示的なＨＰＶベクターは、アデノウイルスベクターとの融合ベクターである。例示的なＨＰＶベクターは、改変された非腫瘍形成性の融合ＨＰＶ−Ｅ６／Ｅ７を含むＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＨＰＶ−Ｅ６／Ｅ７ウイルスベクターである。
【０１２１】
アデノウイルスベクター
一般に、アデノウイルスは、広範な親和性を有し得、種々の分裂細胞型および非分裂細胞型に感染することができ、また、全身的にも哺乳動物の体内のより選択的な粘膜表面を通じても使用することができるので、臨床的に魅力的なものである。さらに、相対的な熱安定性により、それらの臨床使用がさらに容易になる。アデノウイルスは、直鎖二本鎖ゲノムを含有する、正二十面体の、エンベロープを有さないカプシドを特徴とするＤＮＡウイルスのファミリーである。一般に、アデノウイルスは、サイズが約３０〜３５キロベースと概算される二本鎖ＤＮＡゲノムを含む、エンベロープを有さないウイルスとして見いだされる。ヒトＡｄの中でいかなる新生物疾患にも関連するものはなく、免疫適格性の個体において比較的軽度の自己限定性疾病が引き起こされるだけである。このウイルスによって発現される第１の遺伝子はＥ１遺伝子であり、これは、野生型ゲノムに存在する他のＡｄ５遺伝子プロモーターからの高レベルの遺伝子発現が開始されるように作用する。ウイルスＤＮＡ複製および後代ビリオンの組み立ては感染細胞の核内で起こり、生活環全体は約３６時間かかり、細胞当たりビリオンおよそ１０４個の出現が伴う。野生型Ａｄ５ゲノムは、およそ３６ｋｂであり、ＤＮＡ複製の前に発現されるか後に発現されるかに応じて初期ウイルス機能および後期ウイルス機能に分けられる遺伝子をコードする。初期／後期の線引きは、Ａｄ５を予め感染させた細胞への重感染により、重感染ウイルス自体のゲノムが複製された後まで、重感染ウイルスからの後期遺伝子発現の欠如がもたらされることが実証されているので、ほぼ絶対的なものである。理論に縛られることなく、これは、おそらく、被包される複製されたゲノムが存在するまで後期遺伝子（主にＡｄ５カプシドタンパク質）の発現を妨げる、Ａｄ５主要後期プロモーター（ＭＬＰ）の複製依存性シス活性化に起因する。本発明の組成物および方法では、進歩した世代のＡｄベクター／ワクチン開発の特徴を活用する。アデノウイルスの直鎖状ゲノムは、一般に、２つのＤＮＡ複製起点（ＩＴＲ）に挟まれており、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ媒介性転写のための８単位を有する。このゲノムは、５種の初期単位Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４、およびＥ５、ウイルス複製の開始後に遅れて発現される２種の単位（ＩＸおよびＩＶａ２）、ならびにＬ１〜Ｌ５に細分される１つの後期単位（Ｌ）を有する。一部のアデノウイルスは、ウイルス関連（ＶＡ）ＲＮＡと称される１種または２種のＲＮＡにさらにコードし得る。
【０１２２】
ヒト患者において生得免疫および適応免疫応答を誘導するアデノウイルスが提供される。ウイルスのゲノムの極めて重要な領域の欠失または挿入により、予測可能性が増大し、望ましくない副作用が低減されるように工学的に操作された組換え型ベクターが提供される。一部の態様では、本発明は、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４、Ｅ５、ＩＸ、ＩＶａ２、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、およびＬ５、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択されるゲノム欠失または挿入を含むアデノウイルスベクターを提供する。
【０１２３】
本開示は、変化したカプシドを有する組換え型アデノウイルスベクターを提供する。一般に、アデノウイルスのカプシドは、２０面体の２０個の三角形の切子面を主に含み、各２０面体は、１２コピーのヘキソン三量体を含有する。さらに、他のいくつかの追加的なマイナーカプシドタンパク質、ＩＩＩａ、ＶＩ、ＶＩＩＩ、およびＩＸも存在する。
【０１２４】
本開示は、１つまたは複数の変化したファイバータンパク質を含む組換え型アデノウイルスベクターを提供する。一般に、三量体も形成するファイバータンパク質が１２カ所の頂点において五量体ペントンベースに挿入される。ファイバーは、細いＮ末端尾部、シャフト、およびノブドメイン（ｋｎｏｂ  ｄｏｍａｉｎ）を含み得る。シャフトは、様々な数のβストランド反復を含み得る。ノブは、１つまたは複数のループＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊを含み得る。ファイバーノブループは、細胞受容体に結合し得る。本開示は、がんおよび感染症を処置するためのワクチン系に使用するためのアデノウイルスベクターを提供する。
【０１２５】
本開示の方法および組成物で使用することができる適切なアデノウイルスとしては、これだけに限定されないが、ヒトサブグループＡ、Ｂ１、Ｂ２、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦを含めた種特異的アデノウイルスまたは本明細書において提示されるそれらの極めて重要なゲノム領域が挙げられ、サブグループは、免疫学的に別個の血清型にさらに分類することができる。さらに、本開示の方法および組成物で使用することができる適切なアデノウイルスとして、これだけに限定されないが、霊長類、ウシ、家禽、は虫類、またはカエルから同定される種特異的アデノウイルスまたはそれらの極めて重要なゲノム領域が挙げられる。
【０１２６】
一部のアデノウイルス血清型は、別個の器官を優先的に標的とする。ＡｄＨｕ１、ＡｄＨｕ２、およびＡｄＨｕ５（亜属Ｃ）などの血清型は、一般に、上気道に感染するが、亜属ＡおよびＦは胃腸器官に感染する。本開示は、臓器特異的がんまたは臓器特異的感染症を処置するために別個の器官を優先的に標的とすることにおいて使用するための組換え型アデノウイルスベクターを提供する。一部の適用では、組換え型アデノウイルスベクターを、哺乳動物における特異的な器官に対する親和性が低下するように変化させる。一部の適用では、組換え型アデノウイルスベクターを、哺乳動物における特異的な器官に対する親和性が増大するように変化させる。
【０１２７】
アデノウイルスの親和性は、宿主細胞受容体に付着するそれらの能力によって決定することができる。一部の例では、宿主細胞への付着のプロセスは、ファイバーの遠位ノブドメインの宿主細胞表面分子への最初の結合、その後、ペントンベース内のＲＧＤモチーフのαＶインテグリンとの結合を伴い得る。本開示は、宿主の特定の細胞型に感染するように遺伝子工学的に操作することができるように親和性を変化させた組換え型アデノウイルスベクターを提供する。本開示は、細胞特異的がんまたは細胞特異的感染症を処置するために親和性を変化させた組換え型アデノウイルスベクターを提供する。本開示は、サブグループＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、もしくはＦ、もしくはこれらの組み合わせの１つまたは複数のアデノウイルスに由来する変化させたファイバーノブまたはＲＧＤ配列の挿入を有する組換え型アデノウイルスベクターを提供する。一部の適用では、変化させたファイバーノブを含む組換え型アデノウイルスベクターにより、１つまたは複数の特定の細胞型に対する親和性が低下したベクターがもたらされる。一部の適用では、変化させたファイバーノブを含む組換え型アデノウイルスベクターにより、１つまたは複数の特定の細胞型に対する親和性が増強されたベクターがもたらされる。一部の適用では、変化させたファイバーノブを含む組換え型アデノウイルスベクターにより、産物特異的Ｂ細胞応答またはＴ細胞応答が低下したベクターがもたらされる。一部の適用では、変化させたファイバーノブを含む組換え型アデノウイルスベクターにより、産物特異的Ｂ細胞応答またはＴ細胞応答が増強されたベクターがもたらされる。
【０１２８】
本開示は、ウイルス中和抗体の影響を回避するためまたは宿主細胞への形質導入を改善するために他の分子でコーティングされた組換え型アデノウイルスベクターを提供する。本開示は、ベクターの宿主細胞受容体への付着を補助するアダプター分子でコーティングされた組換え型アデノウイルスベクターを提供する。例として、アデノウイルスベクターを、コクサッキーＡｄ受容体（ＣＡＲ）とＣＤ４０Ｌを接続し、その結果、樹状細胞への形質導入をもたらし、それにより、被験体における免疫応答を増強するアダプター分子でコーティングすることができる。他の標的細胞型への付着を増強するために同様に工学的に操作された他のアデノウイルスベクターも本開示に含まれる。
【０１２９】
Ａｄ５ベクター
ヒトおよび動物における試験により、Ａｄ５に対する既存の免疫がＡｄをベースとしたワクチンの商業用途に対する阻害因子になり得ることが実証されている。大半のヒトは、ヒトワクチンに最も広く使用されている亜型であるＡｄ５に対する抗体を有し、試験されたヒトの３分の２がＡｄ５に対するリンパ球増殖性応答を有する。この既存の免疫により、典型的なＡｄ５ワクチンを使用した免疫または再免疫が阻害される可能性があり、また、後の時点における、Ａｄ５ベクターを使用した、第２の抗原に対するワクチンによる免疫が妨げられる可能性がある。既存の抗ベクター免疫の問題を克服することが、熱心な調査の対象になっている。代替ヒト（Ａｄ５をベースとするものではない）Ａｄ５亜型または、さらには非ヒト形態のＡｄ５を使用した調査が考察されている。これらのアプローチでは、最初の免疫には成功したとしても、その後のワクチン接種に、新規のＡｄ５亜型に対する免疫応答に起因して問題が生じる可能性がある。Ａｄ５免疫という障壁を回避するため、および第１世代Ａｄ５［Ｅ１−］ベクターの限られた有効性を改善して最適な免疫応答を誘導するために、本発明の種々の実施形態は、次世代Ａｄ５ベクターをベースとしたワクチンプラットフォームに関する。
【０１３０】
第１世代、またはＥ１欠失アデノウイルスベクターＡｄ５［Ｅ１−］は、導入遺伝子により遺伝子のＥ１領域のみが置き換えられるように構築される。一般には、野生型Ａｄ５ゲノムの約９０％がベクター内に保持される。Ａｄ５［Ｅ１−］ベクターは、複製する能力が低下しており、Ａｄ５  Ｅ１遺伝子を発現しない細胞への感染後に感染性ウイルスを産生することができない。組換え型Ａｄ５［Ｅ１−］ベクターは、Ａｄ５［Ｅ１−］ベクターの複製およびパッケージングが可能になるヒト細胞（例えば、２９３細胞）において繁殖する。Ａｄ５［Ｅ１−］ベクターは、ポジティブな特質をいくつも有し、最も重要なものの１つは、スケールアップおよびｃＧＭＰ生産が比較的容易であることである。現在、２２０件をはるかに超えるヒト臨床試験でＡｄ５［Ｅ１−］ベクターが利用されており、２千名超の被験体がウイルスをｓｃ、ｉｍ、またはｉｖで与えられている。さらに、Ａｄ５ベクターは組み込まれず、それらのゲノムはエピソームのままである。一般に、宿主ゲノム内に組み込まれないベクターに関しては、挿入性の変異誘発および／または生殖細胞系伝達のリスクは、仮にあったとしても非常に低い。従来のＡｄ５［Ｅ１−］ベクターの運搬能は、７ｋｂに達する。
【０１３１】
Ｅ１領域、ならびに、ＤＮＡポリメラーゼおよび末端タンパク質前駆体をコードするＥ２ｂ領域の欠失を伴うＡｄ５をベースとしたベクター（Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］）は、後期ウイルスタンパク質発現が低減することにより、Ａｄ免疫宿主において免疫学的クリアランスを回避し、コードされる腫瘍抗原導入遺伝子に対するより強力な免疫応答を誘導する機会がもたらされる。新しいＡｄ５プラットフォームはＥ２ｂ領域の追加的な欠失を有し、それによりＤＮＡポリメラーゼおよび末端タンパク質前駆体遺伝子が除去されている。Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］プラットフォームは、多くの可能性のある遺伝子を含めることを可能にするのに十分である増大したクローニング能力を有する。Ａｄ５［Ｅ１−］ベクターの遺伝子運搬能が７ｋｂであるのと比較して、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］ベクターの遺伝子運搬能は最大約１２ｋｂであり、必要に応じて複数の遺伝子のための空間がもたらされる。一部の実施形態では、１ｋｂ超、２ｋｂ超、３ｋｂ超、４ｋｂ超、５ｋｂ超、６ｋｂ超、７ｋｂ超、８ｋｂ超、９ｋｂ超、１０ｋｂ超、または１１ｋｂ超の挿入断片をＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］ベクターなどのＡｄ５ベクターに導入する。Ｅ２ｂ領域の欠失により、本発明のＡｄ５ベクターに有利な免疫性質が付与され、多くの場合、Ａｄウイルスタンパク質に対する免疫応答は最小化しながら、標的導入遺伝子抗原に対する強力な免疫応答が引き出される。
【０１３２】
種々の実施形態では、本発明のＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］ベクターにより、Ａｄ免疫の存在下であっても、ベクターにより発現されるワクチン抗原に対する強力なＣＭＩ、ならびに抗体が誘導される。Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］ベクターではまた、Ａｄ５［Ｅ１−］ベクターと比較して、有害反応、特に、肝毒性および組織傷害の出現も低下する。これらのＡｄ５ベクターの重要な面は、Ａｄ後期遺伝子の発現が著しく低減することである。例えば、Ａｄ５［Ｅ１−］ベクターに関してはカプシドファイバータンパク質の産生をｉｎ  ｖｉｖｏで検出することができたが、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］ベクターワクチンからはファイバーの発現が消失（ａｂｌａｔｅ）していた。野生型Ａｄに対する生得免疫応答は複雑である。Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］ベクターから欠失したタンパク質は、一般に、重要な役割を果たすものである。詳細には、末端タンパク質前駆体またはＤＮＡポリメラーゼの欠失を伴うＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］ベクターでは、注射後最初の２４〜７２時間の炎症がＡｄ５［Ｅ１−］ベクターと比較して低減したことを示した。種々の実施形態では、Ａｄ５遺伝子発現の欠如により、感染細胞が抗Ａｄ活性から見えなくなり、感染細胞が導入遺伝子を長期間にわたって発現することが可能になり、それにより、標的に対する免疫が発生する。
【０１３３】
本発明の種々の実施形態は、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］ベクターの、樹状細胞に形質導入する能力を増大させること、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］ベクターウイルスタンパク質に対する炎症反応の低減および結果としての既存のＡｄ免疫の回避を利用することによってワクチン中の抗原特異的免疫応答を改善することを意図している。
【０１３４】
複製欠損性Ａｄ５ベクター
抗Ａｄ免疫を克服するための試みは、代替Ａｄ血清型および／またはＡｄ５ウイルスカプシドタンパク質の交代の使用を含むものであり、どちらも成功は限られており、また、得られるワクチンの体内分布を大きく変化させる潜在性を伴う。したがって、既存のＡｄ免疫の標的であることが公知であるタンパク質であるＥ１欠失Ａｄ５ベクター由来のウイルスタンパク質の発現をさらに低下させることによる完全に新規のアプローチを試みた。詳細には、初期１（Ｅ１）遺伝子領域の欠失および初期２ｂ（Ｅ２ｂ）遺伝子領域の追加的な欠失を伴う新規の組換え型Ａｄ５プラットフォームが記載されている（Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］）。Ｅ２ｂ領域（ＤＮＡポリメラーゼおよび末端タンパク質前駆体をコードする）の欠失により、ウイルスＤＮＡ複製および後期ウイルスタンパク質発現が低下する。このベクタープラットフォームを使用して、がんおよび感染症の動物モデルにおいてＣＭＩ応答を誘導することができ、また、より重要なことに、この組換え型Ａｄ５遺伝子送達プラットフォームはＡｄ５免疫の障壁を克服し、既存のＡｄ免疫および／またはベクターにより誘導されるＡｄ免疫の状況下で使用することができ、したがって、ワクチンの複数回の同種投与を可能にするものである。特定の実施形態では、本発明は、免疫原性ポリペプチドをコードする配列を含む、血清型５の複製欠損性アデノウイルスベクターに関する。免疫原性ポリペプチドは、変異体、天然のバリアントまたはその断片であってよい。
【０１３５】
一部の実施形態では、複製欠損性アデノウイルスベクターは、野生型免疫原性ポリペプチドまたはその断片に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％の同一性を有するポリペプチドをコードする改変された配列を含む。一部の実施形態では、複製欠損性アデノウイルスベクターは、野生型ポリペプチドのサブユニットをコードする改変された配列を含む。本発明の組成物および方法は、一部の実施形態では、配列番号３に対して少なくとも６０％の配列同一性を含むアデノウイルス由来ベクターに関する。
【０１３６】
一部の実施形態では、場合によって複製欠損性アデノウイルスに関するアデノウイルス由来ベクターは、配列番号３に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％、９９．９％の同一性を有する配列、または配列番号３から代替コドンの置き換えにより生じる配列を含む。種々の実施形態では、本明細書に記載されているアデノウイルス由来ベクターは、Ｅ２ｂ領域、および場合によってＥ１領域の欠失を有し、当該欠失により、本明細書に記載されている通り免疫療法におけるベクターの使用に種々の利点が付与される。
【０１３７】
アデノウイルスゲノム内のある特定の領域は、必須の機能を果たすものであり、本発明の複製欠損性アデノウイルスベクターを構築する際に実質的に保存される必要があり得る。これらの領域は、それらの全体が参照により組み込まれる、Ｌａｕｅｒら、Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ．、８５巻、２６１５〜２５頁（２００４年）、Ｌｅｚａら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、３００３〜１３頁（１９８８年）、およびＭｉｒａｌｌｅｓら、Ｊ．  Ｂｉｏ  Ｃｈｅｍ．、２６４巻、１８号、１０７６３〜７２頁（１９８３年）にさらに記載されている。配列番号３の一部、例えば、配列番号３の少なくとも約１００塩基、約２５０塩基、約５００塩基、約１０００塩基またはそれ超を含む部分などに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％、９９．９％の同一性値を有する配列を含む組換え型核酸ベクターは、本発明の範囲内に入る。
【０１３８】
本発明は、それぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，０６３，６２２号；同第６，４５１，５９６号；同第６，０５７，１５８号；同第６，０８３，７５０号；および同第８，２９８，５４９号に記載されているものなどのＥ２ｂ欠失アデノウイルスベクターの使用を意図している。Ｅ２ｂ領域の欠失を伴うベクターでは、多くの場合、ウイルスタンパク質発現が損なわれ、かつ／または複製コンピテントＡｄ（ＲＣＡ）が生じる頻度が低下する。これらのＥ２ｂ欠失アデノウイルスベクターの繁殖は、欠失したＥ２ｂ遺伝子産物を発現する細胞株を利用して行うことができる。そのようなパッケージング細胞株は本明細書において提示される；例えば、ＨＥＫ−２ｐ３細胞株に由来するＥ．Ｃ７（正式にはＣ−７と称される）。
【０１３９】
さらに、Ｅ２ｂ遺伝子産物であるＤＮＡポリメラーゼおよび末端タンパク質前駆体を、Ｅ．Ｃ７、または同様の細胞においてＥ１遺伝子産物と一緒に構成的に発現させることができる。Ａｄゲノムから産生細胞株への遺伝子セグメントの移行には、直接の利点がある：（１）運搬能の増大、および、（２）ＲＣＡが生じる潜在性の低減（一般には、ＲＣＡを生じさせるのに２つまたはそれ超の独立した組換え事象が必要とされる）。本発明において使用されるＥ１、Ａｄ  ＤＮＡポリメラーゼおよび／または末端タンパク質前駆体発現細胞株により、ヘルパーウイルスの混入を必要とせずに、１３ｋｂに達する運搬能を有するアデノウイルスベクターの繁殖が可能になる。さらに、ウイルスの生活環に欠かせない遺伝子（例えば、Ｅ２ｂ遺伝子）を欠失させる場合、複製または他のウイルス遺伝子タンパク質の発現のためのＡｄがさらに損なわれる。これにより、感染細胞の免疫認識を低下させることができ、および外来導入遺伝子発現の持続時間を延長させることができる。
【０１４０】
Ｅ１、ＤＮＡポリメラーゼ、および末端タンパク質前駆体が欠失したベクターは、一般には、Ｅ１領域およびＥ２ｂ領域からそれぞれのタンパク質を発現させることができない。さらに、当該ベクターは、ウイルス構造タンパク質の大部分の発現の欠如を示し得る。例えば、Ａｄの主要後期プロモーター（ＭＬＰ）は、後期構造タンパク質Ｌ１からＬ５までの転写に関与する。ＭＬＰはＡｄゲノム複製前には活性が最小であるが、毒性が強いＡｄ後期遺伝子は、ウイルスのゲノム複製が起こった後にのみ、ｍＬＰから主に転写および翻訳される。この後期遺伝子転写のシス依存性活性化は、一般に、例えばポリオーマおよびＳＶ−４０の成長におけるＤＮＡウイルスの特徴である。ＤＮＡポリメラーゼおよび末端タンパク質前駆体はＡｄ複製のために重要である（Ｅ４またはタンパク質ＩＸタンパク質とは異なる）。それらの欠失は、ＡＰＣなどの細胞におけるアデノウイルスベクター後期遺伝子発現、およびその発現の毒性作用に対して非常に有害であり得る。
【０１４１】
アデノウイルスベクターは、ＡｄゲノムのＥ２ｂ領域、および場合によってＥ１領域の欠失を含み得る。一部の場合では、そのようなベクターは、Ａｄゲノムの他の領域のいずれの欠失も有さない。アデノウイルスベクターは、ＡｄゲノムのＥ２ｂ領域の欠失ならびにＥ１領域およびＥ３領域の欠失を含み得る。一部の場合では、そのようなベクターは他の領域の欠失を有さない。アデノウイルスベクターは、ＡｄゲノムのＥ２ｂ領域の欠失およびＥ１、Ｅ３の欠失およびＥ４領域の部分的または完全な除去を含み得る。一部の場合では、そのようなベクターは他の欠失を有さない。アデノウイルスベクターは、ＡｄゲノムのＥ２ｂ領域の欠失およびＥ１領域および／またはＥ４領域の欠失を含み得る。一部の場合では、そのようなベクターは、他の欠失を含有しない。アデノウイルスベクターは、ＡｄゲノムのＥ２ａ領域、Ｅ２ｂ領域および／またはＥ４領域の欠失を含み得る。一部の場合では、そのようなベクターは他の欠失を有さない。アデノウイルスベクターは、Ｅ１および／またはＥ２ｂ領域のＤＮＡポリメラーゼ機能の欠失を有してよい。一部の場合では、そのようなベクターは他の欠失を有さない。アデノウイルスベクターは、Ｅ１および／またはＥ２ｂ領域の末端タンパク質前駆体機能の欠失を有してよい。一部の場合では、そのようなベクターは他の欠失を有さない。アデノウイルスベクターは、Ｅ１、ＤＮＡポリメラーゼおよび／または末端タンパク質前駆体機能の欠失を有してよい。一部の場合では、そのようなベクターは他の欠失を有さない。アデノウイルスベクターは、Ｅ２ｂ領域および／またはＥ１領域の少なくとも一部分を有してよい。一部の場合では、そのようなベクターは、ｇｕｔｔｅｄアデノウイルスベクターではない。この点について、ベクターは、Ｅ２ｂ領域のＤＮＡポリメラーゼと末端タンパク質前駆体機能の両方が欠失していてよい。アデノウイルスベクターは、アデノウイルスゲノムのＥ１、Ｅ２ｂおよび／または１００Ｋ領域の欠失を有してよい。アデノウイルスベクターは、Ｅ１、Ｅ２ｂおよび／またはプロテアーゼ機能の欠失を有するベクターを含み得る。一部の場合では、そのようなベクターは他の欠失を有さない。アデノウイルスベクターは、Ｅ１および／またはＥ２ｂ領域の欠失を有し得、一方、ファイバー遺伝子は変異または他の変化によって改変されている（例えば、Ａｄ親和性を変化させるために）。言及されているアデノウイルスベクターのいずれかにＥ３領域またはＥ４領域からの遺伝子の除去を追加することができる。ある特定の実施形態では、アデノウイルスベクターは、ｇｕｔｔｅｄアデノウイルスベクターであってよい。
【０１４２】
Ａｄゲノムの他の領域を欠失させることができる。Ａｄゲノムの特定の領域の「欠失」とは、その領域によりコードされる少なくとも１つの遺伝子産物の発現および／または機能（例えば、ＤＮＡポリメラーゼまたは末端タンパク質前駆体機能であるＥ２ｂ機能）が妨げられるように変異させたまたは除去された特定のＤＮＡ配列を指す。欠失は、タンパク質のエクソンコード部分内の欠失ならびにプロモーターおよびリーダー配列内の欠失を包含する。特定の領域内の欠失とは、Ａｄゲノムのその領域内の少なくとも１つの塩基対の欠失を指す。１つ超の塩基対を欠失させることができる。例えば、少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、または１５０塩基対を特定の領域から欠失させることができる。欠失は、Ａｄゲノムの特定の領域内の１５０超、１６０超、１７０超、１８０超、１９０超、２００超、２５０超、または３００超の塩基対であり得る。これらの欠失により、その領域によりコードされる遺伝子産物の発現および／または機能を妨げることができる。例えば、Ａｄゲノムの特定の領域は、１つまたは複数のコードされるタンパク質が非機能性になるような１つまたは複数の点変異を含んでよい。そのような変異は、非機能性タンパク質をもたらすアミノ酸配列の変化を導く、異なる残基で置き換えられる残基を含む。Ａｄゲノムにおける例示的な欠失または変異としては、Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａ、Ｅ２ｂ、Ｅ３、Ｅ４、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、ＴＰ、ＰＯＬ、ＩＶ、およびＶＡ領域のうちの１つまたは複数が挙げられる。欠失アデノウイルスベクターは、例えば、組換え技法を使用して作出することができる。
【０１４３】
本発明において使用するためのＡｄベクターは、Ｅ２ｂ遺伝子産物、および、欠失している可能性がある必要な遺伝子のいずれかの産物を構成的に発現する適切なパッケージング細胞株を使用して、高力価まで首尾よく成長させることができる。Ｅ１およびＤＮＡポリメラーゼタンパク質だけでなく、Ａｄ−末端タンパク質前駆体も構成的に発現するＨＥＫ−２９３由来の細胞を使用することができる。例えば、アデノウイルスベクターの高力価ストックを成長させるために、Ｅ．Ｃ７細胞を使用することができる。
【０１４４】
自己繁殖性アデノウイルスベクターから重大な遺伝子を欠失させるために、標的とされる遺伝子によりコードされるタンパク質をまずＨＥＫ−２９３細胞または同様の細胞において、Ｅ１タンパク質と同時発現させることができる。例えば、構成的に同時発現させた場合に無毒性であるタンパク質（または誘導的に発現させる毒性のタンパク質）を選択的に利用することができる。ＨＥＫ−２９３細胞におけるＥ１遺伝子とＥ４遺伝子の同時発現が可能である（例えば、誘導性の、構成的でないプロモーターを利用する）。Ｅ１遺伝子と、ビリオン構造タンパク質であるタンパク質ＩＸ遺伝子を同時発現させることができる。さらに、Ｅ１遺伝子、Ｅ４遺伝子、およびタンパク質ＩＸ遺伝子の同時発現も可能である。Ｅ１遺伝子および１００Ｋ遺伝子は、Ｅ１遺伝子およびプロテアーゼ遺伝子で可能であるのと同様に、トランス相補性細胞株において発現させることができる。
【０１４５】
高力価のＥ２ｂ欠失Ａｄ粒子の成長において使用するためのＥ１遺伝子産物とＥ２ｂ遺伝子産物を同時発現する細胞株を使用することができる。有用な細胞株は、およそ１４０ｋＤａのＡｄ−ＤＮＡポリメラーゼおよび／またはおよそ９０ｋＤａの末端タンパク質前駆体を構成的に発現する。毒性を伴わずに、Ｅ１、ＤＮＡポリメラーゼ、および末端タンパク質前駆体を高レベルで構成的に同時発現する細胞株（例えば、Ｅ．Ｃ７）が、複数回のワクチン接種において使用するためのＡｄの繁殖に使用するのに望ましい。これらの細胞株により、Ｅ１、ＤＮＡポリメラーゼ、および末端タンパク質前駆体が欠失したアデノウイルスベクターの繁殖が可能になる。
【０１４６】
本発明の組換え型Ａｄは、例えば、Ａｄベクターウイルスストックを適切なＭＯＩ（例えば、５）で感染させ、３７℃で４０〜９６時間インキュベートしたＥ．Ｃ７細胞を含有する組織培養プレートを使用して繁殖させることができる。感染細胞を回収し、１０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．０）に再懸濁させ、超音波処理することができ、２ラウンドの塩化セシウム密度遠心分離によってウイルスを精製することができる。ウイルスを含有するバンドをカラムにわたって脱塩することができ、スクロースまたはグリセロールを添加することができ、アリコートを−８０℃で保管することができる。ウイルスを、Ａ１９５などの、その安定性が増強するように設計された溶液に入れることができる。ストックの力価を測定することができる（例えば、溶解後にウイルスのアリコートの２６０ｎｍにおける光学濃度を測定することによって）。組換え型Ｅ２ｂ欠失アデノウイルスベクター全体を包含する直鎖状または環状のプラスミドＤＮＡをＥ．Ｃ７、または同様の細胞にトランスフェクトし、３７℃で、ウイルス産生の証拠（例えば、細胞変性効果）が示されるまでインキュベートすることができる。精製前に、産生されるウイルスの量を増大させるために、細胞からの馴化培地を使用してより多くの細胞に感染させることができる。精製は、例えば、２ラウンドの塩化セシウム密度遠心分離または選択的濾過によって達成することができる。市販の製品または特注のクロマトグラフィーカラムを使用して、クロマトグラフィーによってウイルスを精製することができる。
【０１４７】
本発明の組成物は、感染させる細胞がある特定の数のウイルスに直面することを確実にするために十分なウイルスを含み得る。したがって、種々の実施形態では、本発明は、組換え型ＡｄのＲＣＡフリーストックなどの、組換え型Ａｄのストックを提供する。ウイルスストックは、主にウイルス遺伝子型およびプロトコールおよびそれらを調製するために使用される細胞株に応じて、力価が相当に変動し得る。ウイルスストックの力価は、少なくとも約１０６ｐｆｕ／ｍＬ、１０７ｐｆｕ／ｍＬ、または１０８ｐｆｕ／ｍＬ、またはそれ超、例えば、少なくとも約１０９ｐｆｕ／ｍＬ、１０１０ｐｆｕ／ｍＬ、１０１１ｐｆｕ／ｍＬ、または１０１２ｐｆｕ／ｍＬなどであり得る。組換え型ウイルスおよびパッケージング細胞株の性質に応じて、本発明のウイルスストックの力価は、１ｍｌ当たり粒子約１０１３個またはそれ超でさえあり得る。
【０１４８】
複製欠損性アデノウイルスベクター（例えば、配列番号３）は、標的抗原、その断片、またはそのバリアントをコードする配列を適切な位置に含んでよい。一部の実施形態では、複製欠損性アデノウイルスベクター（例えば、配列番号３）は、本明細書に記載されている標的抗原、またはその断片、バリアント、またはバリアント断片をコードする配列を、ＣＥＡまたはバリアントＣＥＡをコードする核酸配列と置き換わる位置に含んでよい（例えば、配列番号１）。一部の実施形態では、複製欠損性アデノウイルスベクター（例えば、配列番号３）は、本明細書に記載されている標的抗原、またはその断片、バリアント、またはバリアント断片をコードする配列を、ＣＥＡまたはバリアントＣＥＡをコードする核酸配列と置き換わる位置に含んでよい（例えば、配列番号２）。一部の実施形態では、複製欠損性アデノウイルスベクター（例えば、配列番号３）は、本明細書に記載されている標的抗原、またはその断片、バリアント、またはバリアント断片をコードする配列を、ＭＵＣ１またはバリアントＭＵＣ１をコードする核酸配列と置き換わる位置に含んでよい（例えば、配列番号５、配列番号６または配列番号９）。一部の実施形態では、複製欠損性アデノウイルスベクター（例えば、配列番号３）は、本明細書に記載されている標的抗原、またはその断片、バリアント、またはバリアント断片をコードする配列を、ＴまたはバリアントＴをコードする核酸配列と置き換わる位置に含んでよい（例えば、配列番号７または配列番号８）。
【０１４９】
抗原標的をコードするポリヌクレオチドおよびバリアント
本開示は、さらに、本明細書では１つまたは複数の目的の標的抗原、またはそれらの断片もしくはバリアントをコードするポリヌクレオチドとも称される核酸配列を提供する。したがって、本発明は、本明細書にさらに記載されている任意の供給源に由来する標的抗原をコードするポリヌクレオチド、そのようなポリヌクレオチドを含むベクター、および、そのような発現ベクターを形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。所望の標的抗原ポリペプチドを発現させるために、ポリペプチドまたは機能的等価物をコードするヌクレオチド配列を適切なＡｄベクターに挿入することができる（例えば、組換え技法を使用して）。適切なアデノウイルスベクターは、挿入されるコード配列の転写および翻訳に必要なエレメントならびに任意の所望のリンカーを含有し得る。当業者に周知の方法は、目的のポリペプチドおよび適切な転写制御エレメントおよび翻訳制御エレメントをコードする配列を含有するこれらのアデノウイルスベクターを構築するために使用することができる。これらの方法としては、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ技法、合成技法、およびｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子組換えが挙げられる。
【０１５０】
ポリヌクレオチドは、ネイティブな配列（すなわち、本発明の標的抗原ポリペプチド／タンパク質／エピトープまたはその一部をコードする内因性配列）を含んでもよく、そのような配列のバリアント、断片、または誘導体をコードする配列を含んでもよい。ポリヌクレオチド配列は、標的抗原タンパク質をコードするものであってよい。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ネイティブなヌクレオチド配列またはバリアントからは実質的に変動し得るが同様のタンパク質抗原をコードする、特定の細胞型における発現のために最適化された新規の遺伝子配列を表す。
【０１５１】
他の関連する実施形態では、ポリヌクレオチドバリアントは、タンパク質（例えば、目的の標的抗原）をコードするネイティブな配列に対して実質的な同一性を有し、例えば、ポリペプチドをコードするネイティブなポリヌクレオチド配列と比較して少なくとも７０％の配列同一性、好ましくは少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％またはそれ超の配列同一性を有する（例えば、標準のパラメータを使用したＢＬＡＳＴ解析）。これらの値は、２つのヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質の対応する同一性を、コドンの縮重、アミノ酸の類似性、読み枠の位置決めなどを考慮に入れることによって決定するために適切に補正することができる。ポリヌクレオチドは、例えば、ネイティブなポリヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質配列と比較して少なくとも７０％の配列同一性、好ましくは少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％またはそれ超の配列同一性を含むタンパク質をコードするものであってよい。
【０１５２】
ポリヌクレオチドは、ポリペプチド（例えば、標的タンパク質抗原）をコードする少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、または１０００またはそれ超の連続したヌクレオチド、およびその間の全ての中間の長さのヌクレオチドを含み得る。「中間の長さ」とは、この場合、例として出された値の任意の長さ、例えば、１６、１７、１８、１９など；２１、２２、２３など；３０、３１、３２など；５０、５１、５２、５３など；１００、１０１、１０２、１０３など；１５０、１５１、１５２、１５３など；２００から５００まで、５００から１，０００までの全ての整数を含むなどを指す。ポリヌクレオチド配列は、一方または両方の末端において、エピトープまたは異種標的タンパク質などのポリペプチドをコードするネイティブな配列には見いだされない追加的なヌクレオチドによって延長することができる。この追加的な配列は、開示された配列のいずれかの末端または開示された配列の両末端の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ヌクレオチドまたはそれ超からなっていてよい。
【０１５３】
ポリヌクレオチドは、それ自体のコード配列の長さにかかわらず、例えばプロモーター、発現制御配列、ポリアデニル化シグナル、追加的な制限酵素部位、多重クローニング部位、他のコードセグメントなどの他のＤＮＡ配列と組み合わせることができ、したがって、それらの全体の長さは相当に変動し得る。したがって、ほぼ全ての長さの核酸断片を使用することができ、全長は意図された組換えＤＮＡプロトコールにおける調製および使用のしやすさによって限定されることが好ましいことが意図されている。全長が約１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００、約５００、約２００、約１００、約５０塩基対長など（全ての中間の長さを含む）の例示的なポリヌクレオチドセグメントが本発明の多くの実行に有用であることが意図されている。
【０１５４】
標的抗原配列を調製するために、部位特異的変異誘発などの変異誘発アプローチを使用することができる。ポリペプチド配列の特定の改変は、それらをコードする、基礎をなすポリヌクレオチドの変異誘発によって行うことができる。所望の変異のＤＮＡ配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、ならびにそれが跨がる欠失接合部の両側に安定な２重鎖を形成するためのサイズおよび配列の複雑さが十分であるプライマー配列をもたらすために十分な数の隣接するヌクレオチドを使用することによって変異体を作出するために、部位特異的変異誘発を使用することができる。例えば、約１４〜約２５ヌクレオチドほどの長さのプライマーを、配列の接合部の両側の約５〜約１０残基の変化を伴って使用することができる。変異は、選択されたポリヌクレオチド配列において、ポリヌクレオチドの性質を改善する、変化させる、低減する、改変する、または他の点で変化させるため、および／または、コードされるポリペプチドの性質、活性、組成、安定性、または一次配列を変化させるために行うことができる。
【０１５５】
ポリヌクレオチド配列の変異誘発を使用して、ポリペプチドに含まれるエピトープの免疫原性または標的抗原の腫瘍原性などの、コードされるポリペプチドの１つまたは複数の性質を変化させることができる。ポリペプチドの免疫原性を試験するためのアッセイとしては、これだけに限定されないが、Ｔ細胞傷害性アッセイ（ＣＴＬ／クロム放出アッセイ）、Ｔ細胞増殖アッセイ、細胞内サイトカイン染色、ＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＳｐｏｔなどが挙げられる。ペプチドの配列バリアントおよびそれらをコードするＤＮＡ配列を得るための他のやり方を使用することができる。例えば、所望のペプチド配列をコードする組換え型ベクターをヒドロキシルアミンなどの変異原性作用物質で処理して配列バリアントを得ることができる。
【０１５６】
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドセグメントまたは断片は、例えば、化学的手段によって断片を直接合成することにより、容易に調製することができる。断片は、ＰＣＲなどの核酸再生技術を適用することによって、組換えによる産生のために、選択された配列を組換え型ベクターに導入することによって得ることができる。
【０１５７】
ポリヌクレオチド配列を含有させ、産生させるために、種々のベクター／宿主系を利用することができる。例示的な系としては、組換え型バクテリオファージ、プラスミド、またはコスミドＤＮＡベクターで形質転換した細菌などの微生物；酵母ベクターで形質転換した酵母；ウイルスベクター（例えば、バキュロウイルス）を感染させた昆虫細胞系；ウイルスベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）、または細菌ベクター（例えば、ＴｉもしくはｐＢＲ３２２プラスミド）で形質転換した植物細胞系；または動物細胞系が挙げられる。
【０１５８】
Ａｄベクター内に存在する制御エレメントまたは調節配列は、ベクターの非翻訳領域（ｎｏｎ−ｔｒａｎｓｌａｔｅｄ  ｒｅｇｉｏｎ）−エンハンサー、プロモーター、および５’および３’非翻訳領域（ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ  ｒｅｇｉｏｎ）を含み得る。そのようなエレメントは、それらの強度および特異性が変動し得る。利用するベクター系および宿主に応じて、構成的プロモーターおよび誘導性プロモーターを含めた、さまざまな適切な転写エレメントおよび翻訳エレメントを使用することができる。例えば、目的のポリペプチドをコードする配列を、後期プロモーターおよび三部分リーダー（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ  ｌｅａｄｅｒ）配列からなるＡｄ転写／翻訳複合体にライゲーションすることができる。感染した宿主細胞においてポリペプチドを発現することが可能な生存可能なウイルスを得るために、ウイルスのゲノムの必須ではないＥ１領域またはＥ３領域の挿入を使用することができる。さらに、哺乳動物宿主細胞における発現を増大させるために、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）エンハンサーなどの転写エンハンサーを使用することができる。
【０１５９】
目的のポリペプチドをコードする配列のより効率的な翻訳を達成するために、特定の開始シグナルを使用することもできる（例えば、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接する配列）。外因性翻訳エレメントおよび開始コドンは、天然および合成の両方の種々の起源のものであってよい。発現の効率は、使用される特定の細胞系に適したエンハンサーを含めることによって増強することができる。選択されたポリペプチドをコードする配列の効率的な翻訳を達成するために、転写または翻訳のいずれかに対して特定の終結配列を組み入れることもできる。
【０１６０】
ポリヌクレオチドにコードされる産物（例えば、標的抗原）の発現を検出および測定するための種々のプロトコールを使用することができる（例えば、産物に特異的なポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を使用する）。例としては、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、および蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）が挙げられる。一部の適用には、所与のポリペプチド上の２つの非干渉性エピトープに対して反応性であるモノクローナル抗体を利用する、２部位、モノクローナルに基づくイムノアッセイが好ましい場合があるが、競合結合アッセイも使用することができる。
【０１６１】
Ａｄベクターは、その産物を蛍光、発色基質もしくは蛍光基質などに対する酵素活性によってなどで検出することができる、または成長条件によって選択することができるレポーター遺伝子などの、検出または選択することができる生成物を含み得る。例示的なレポーター遺伝子としては、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼ、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）、およびヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）が挙げられる。例示的な選択マーカーとしては、例えば、ネオマイシン（Ｇ４１８）、ハイグロマイシンなどの薬物耐性が挙げられる。
【０１６２】
Ａｄベクターは、プロモーターまたは発現制御配列も含んでよい。プロモーターの選択は、一部において、標的とされる細胞型および所望の制御の程度または型に依存する。本発明に関して適切なプロモーターとしては、限定することなく、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、組織特異的プロモーター、細胞型特異的プロモーター、時間特異的プロモーター、または事象特異的プロモーターが挙げられる。構成的または非特異的プロモーターの例としては、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、ＣＭＶ初期遺伝子プロモーター、ウシパピローマウイルスプロモーター、およびアデノウイルスプロモーターが挙げられる。本発明に関しては、ウイルスプロモーターに加えて、細胞性プロモーターも適用できる。特に、いわゆるハウスキーピング遺伝子に対する細胞性プロモーターが有用である（例えば、β−アクチン）。ウイルスプロモーターは、一般に、細胞性プロモーターよりも強力なプロモーターである。誘導性プロモーターも使用することができる。これらのプロモーターとしては、デキサメタゾンによって誘導されるＭＭＴＶ  ＬＴＲ、重金属によって誘導されるメタロチオネイン、およびｃＡＭＰ反応エレメントを有し、ｃＡＭＰによって誘導されるプロモーター、熱ショックプロモーターが挙げられる。誘導性プロモーターを使用することにより、核酸を細胞に送達し、誘導因子が添加されるまで静止したままにすることができる。これにより、目的のタンパク質の産生のタイミングをさらに制御することが可能になる。事象、例えば、腫瘍形成能またはウイルス感染などが出現した際にのみ活性になるまたは上方制御される、事象型特異的プロモーター（例えば、ＨＩＶ  ＬＴＲ）を使用することができる。ＨＩＶ  ＬＴＲプロモーターは、ウイルス感染時に生じるｔａｔ遺伝子産物が存在しなければ不活性である。一部の事象型プロモーターは、組織特異的でもある。好ましい事象型特異的プロモーターとしては、ウイルス感染時に活性化されるプロモーターが挙げられる。
【０１６３】
プロモーターの例としては、α−フェトプロテイン、α−アクチン、ｍｙｏ  Ｄ、癌胎児性抗原、ＶＥＧＦ受容体；ＦＧＦ受容体；ＴＥＫまたはｔｉｅ  ２；ｔｉｅ；ウロキナーゼ受容体；Ｅ−セレクチンおよびＰ−セレクチン；ＶＣＡＭ−１；エンドグリン；エンドシアリン；αＶ−β３インテグリン；エンドセリン−１；ＩＣＡＭ−３；Ｅ９抗原；フォン・ヴィルブランド因子；ＣＤ４４；ＣＤ４０；血管内皮カドヘリン；ノッチ４、高分子量黒色腫関連抗原；前立腺特異的抗原−１、プロバシン、ＦＧＦ受容体、ＶＥＧＦ受容体、ｅｒｂ  Ｂ２；ｅｒｂ  Ｂ３；ｅｒｂ  Ｂ４；ＭＵＣ−１；ＨＳＰ−２７；ｉｎｔ−１；ｉｎｔ−２、ＣＥＡ、ＨＢＥＧＦ受容体；ＥＧＦ受容体；チロシナーゼ、ＭＡＧＥ、ＩＬ−２受容体；前立腺酸性ホスファターゼ、プロバシン、前立腺特異的膜抗原、α−クリスタリン、ＰＤＧＦ受容体、インテグリン受容体、α−アクチン、ＳＭ１およびＳＭ２ミオシン重鎖、カルポニン−ｈ１、ＳＭ２２α−アンジオテンシン受容体、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、免疫グロブリン重鎖、免疫グロブリン軽鎖、およびＣＤ４に対するプロモーターが挙げられる。
【０１６４】
ポリヌクレオチドの非特異的発現を低下させるためにリプレッサー配列、負のレギュレーター、または組織特異的サイレンサーを挿入することができる。複数のリプレッサーエレメントをプロモーター領域に挿入することができる。転写の抑制は、リプレッサーエレメントの方向またはプロモーターからの距離には左右されない。リプレッサー配列の１つの型は、インスレーター配列である。そのような配列は、転写を阻害し、バックグラウンド転写をサイレンシングすることが可能なものである。負の調節エレメントは、いくつもの異なる遺伝子のプロモーター領域に位置していてよい。リプレッサーエレメントは、オボアルブミン遺伝子のプロモーター領域内のＮＳＥと同様に、ステロイドなどの因子の非存在下で、転写のリプレッサーとして機能し得る。これらの負の調節エレメントは、輸卵管由来の特定のタンパク質複合体に結合し得、いずれもステロイドに対して感受性ではない。オボアルブミン遺伝子のプロモーターには３つの異なるエレメントが位置している。これらのエレメントの部分に対応するオリゴヌクレオチドは、ＴＫレポーターのウイルスによる転写を抑制し得る。サイレンサーエレメントのうちの１つは、他の遺伝子内のサイレンサー（ＴＣＴＣＴＣＣＮＡ（配列番号１１））と配列同一性を共有する。
【０１６５】
所望の標的抗原の発現を増大させるエレメントを本明細書に記載されているＡｄベクターの核酸配列に組み入れることができる。例示的なエレメントとしては、内部リボソーム結合性部位（ＩＲＥＳ）が挙げられる。ＩＲＥＳにより、翻訳効率を上昇させることができる。その上、他の配列によっても発現を増強することができる。一部の遺伝子に関しては、特に５’末端の配列により、転写および／または翻訳が阻害され得る。これらの配列は、通常、ヘアピン構造を形成し得るパリンドロームである。一部の場合では、送達される核酸内のそのような配列を欠失させる。転写物または翻訳産物の発現レベルをアッセイして、いずれの配列が発現に影響を及ぼすかを確証または確認することができる。転写レベルは、ノーザンブロットハイブリダイゼーション、ＲＮａｓｅプローブ保護などを含めた任意の公知の方法によってアッセイすることができる。タンパク質レベルは、ＥＬＩＳＡを含めた任意の公知の方法によってアッセイすることができる。
【０１６６】
抗原特異的免疫療法およびワクチン
本開示は、本明細書で提供されるベクターおよび他のベクターを利用した、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１ｃ、ＭＵＣ１ｎ、Ｔ、またはＣＥＡに対する単一の抗原または組み合わせ抗原による免疫を提供する。本開示は、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１ｃ、ＭＵＣ１ｎ、Ｔ、またはＣＥＡに対する治療ワクチンを提供する。本開示は、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１ｃ、ＭＵＣ１ｎ、Ｔ、またはＣＥＡに対する予防ワクチン（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ  ｖａｃｃｉｎｅ）を提供する。さらに、種々の実施形態では、本明細書で提供される組成物および方法により、疾患の進行または平均余命の変化などの臨床応答を導くことができる。
【０１６７】
種々の抗原をコードするＡｄ５［Ｅ１−］ベクターを使用して、ｅｘ  ｖｉｖｏで曝露したＤＣの９５％に効率的に高力価のベクターで形質導入することができる。重要なことに、本発明者らは、ベクターを用いた感染多重度（ＭＯＩ）の増大に伴ってＤＣにおける外来遺伝子発現のレベルが上昇することを発見した。Ａｄ５［Ｅ１−］ベクターを感染させたＤＣは、種々の抗原（腫瘍抗原ＭＡＲＴ−１、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＤＦ３／ＭＵＣ１、ｐ５３、ｈｕｇｐ１００黒色腫抗原、ポリオーマウイルスミドルＴ抗原を含む）をコードし得、抗原特異的ＣＴＬ応答を誘導する傾向があり、抗原提示能力が増強しており、かつ／または、混合リンパ球反応においてＴ細胞増殖を開始する能力が改善されている。腫瘍特異的抗原をコードするＡｄ５ベクターによって予め形質導入した樹状細胞（ＤＣ）を用いた動物の免疫を使用して、その動物に対して、それぞれの抗原を発現する腫瘍細胞によるチャレンジの際に有意なレベルの保護を誘導することができる。興味深いことに、ＩＬ−７をコードするＡｄの腫瘍内注射は、ＩＬ−７をコードするＡｄ５ベクターを用いて形質導入したＤＣの注射よりも抗腫瘍免疫の誘導において効果が低い。Ａｄ５ベクターによるＤＣへのｅｘ  ｖｉｖｏ形質導入は本開示により意図されている。ｅｘ  ｖｉｖｏ  ＤＣ形質導入戦略を使用してレシピエント宿主耐容性を誘導することができる。例えば、ＤＣへのＣＴＬＡ４ＩｇのＡｄ５媒介性送達により、ＤＣ  ＣＤ８０とＴ細胞上に存在するＣＤ２８分子の相互作用を遮断することができる。
【０１６８】
Ａｄ５ベクターのカプシドとＤＣの相互作用により、いくつかの有益な応答が誘発され得、これにより、ＤＣの、Ａｄ５ベクターによりコードされる抗原を提示する傾向が増強され得る。例えば、未成熟のＤＣは、抗原の取り込みに特殊化されているが、Ｔ細胞活性化の比較的非効率的なエフェクターである。ＤＣ成熟化と同時にＴ細胞免疫を駆動するＤＣの能力が増強される。一部の例では、本発明の組成物および方法はＤＣ成熟化の直接誘導をもたらすＡｄ５感染を活用する。マウス由来の未成熟の骨髄由来ＤＣへのＡｄベクター感染により、ＤＣ成熟化に通常関連する細胞表面マーカー（ＭＨＣ  ＩおよびＩＩ、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、およびＩＣＡＭ−１）が上方制御され得、ならびに、骨髄ＤＣ成熟化の際に下方制御されるインテグリンであるＣＤ１１ｃが下方制御され得る。一部の例では、Ａｄベクター感染により、ＤＣによる、ＤＣ成熟化のマーカーであるＩＬ−１２の産生が誘発される。理論に束縛されることなく、これらの事象は、おそらく、Ａｄ５により誘発されるＮＦ−κＢ経路の活性化に起因し得る。成熟ＤＣは、Ａｄベクターにより効率的に形質導入することができ、また、成熟ＣＤ８３＋ヒトＤＣ（末梢血単球に由来する）によって実証される通り、低ＭＯＩにおいてナイーブなＴ細胞の増殖を刺激するそれらの機能的潜在性は失われない。しかし、成熟ＤＣはまた、未成熟ＤＣよりも感染しにくい可能性がある。通常のＣＡＲ受容体感染機構を使用するのではなく、例えば、ＣＤ４０Ｌ受容体をウイルスベクター受容体として使用して、ＡｄベクターによるＤＣの感染を最適化するため、ならびに機能的成熟を増強するための戦略として、カプシドタンパク質の改変を使用することができる。
【０１６９】
種々の実施形態では、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］ベクター（複数可）ＭＵＣ１、ＴおよびＣＥＡワクチンを含む本発明の組成物および方法により、技術的安全性の範囲内で全生存（ＯＳ）の増大がもたらされる。種々の実施形態では、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］ベクター（複数可）ＭＵＣ１ｃ、ＴおよびＣＥＡワクチンを含む本発明の組成物および方法により、技術的安全性の範囲内で全生存（ＯＳ）の増大がもたらされる。種々の実施形態では、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］ベクター（複数可）ＭＵＣ１ｎ、ＴおよびＣＥＡワクチンを含む本発明の組成物および方法により、技術的安全性の範囲内で全生存（ＯＳ）の増大がもたらされる。
【０１７０】
一部の実施形態では、抗原標的は、良性腫瘍に付随するものである。一部の実施形態では、標的とされる抗原は、前がん腫瘍に付随するものである。
【０１７１】
一部の実施形態では、標的とされる抗原は、癌腫、上皮内癌、転移性腫瘍、神経芽細胞腫、肉腫、筋肉腫、平滑筋肉腫、網膜芽細胞腫、ヘパトーマ、横紋筋肉腫、形質細胞腫、腺腫、神経膠腫、胸腺腫、または骨肉腫に付随するものである。一部の実施形態では、標的とされる抗原は、神経がん、脳がん、甲状腺がん、頭頸部がん、黒色腫、白血病、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、および慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、ホジキン病、乳がん、膀胱がん、前立腺がん、結腸直腸がん、結腸がん、腎がん、腎細胞癌、膵がん（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）、食道がん、肺がん、中皮腫、卵巣がん、子宮頸がん、子宮体がん、子宮がん、胚細胞性腫瘍、精巣がん、胃がん、または他のがんなどの特定の型のがん、またはその任意の臨床的亜型（例えば、ＴＮＭ、病理組織学的、病期分類またはグレード分類系またはこれらの組み合わせ）または分子亜型に付随するものである。一部の実施形態では、標的とされる抗原は、特定の臨床的亜型または分子亜型のがんに付随するものである。例として、乳がんは、ルミナルＡ型、ルミナルＢ型、トリプルネガティブ／基底様、およびＨＥＲ２型を含めた少なくとも４つの分子亜型に分けることができる。例として、前立腺がんは、ＴＮＭ、グリーソンスコア、またはＰＳＡタンパク質の分子発現に関して細分することができる。
【０１７２】
上記の通り、本発明のアデノウイルスベクターは、目的の１つまたは複数の標的タンパク質または抗原をコードする核酸配列を含む。この点について、ベクターは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれ超の異なる目的の標的抗原をコードする核酸を含有し得る。標的抗原は、全長のタンパク質であってもよく、その断片（例えば、エピトープ）であってもよい。アデノウイルスベクターは、１つの目的の標的タンパク質に由来する複数の断片またはエピトープをコードする核酸配列を含有してもよく、複数の異なる目的の標的タンパク質に由来する１つまたは複数の断片またはエピトープを含有してもよい。標的抗原は、それに対する免疫応答が生じることが望ましい任意の物質であってよいが、一般に、標的抗原はタンパク質である。標的抗原は、免疫応答を誘導する全長のタンパク質、タンパク質のサブユニット、タンパク質のアイソフォームまたはその断片（すなわち、免疫原性断片）を含むものであってよい。標的抗原またはその断片は、例えば、標的抗原の１つまたは複数の生物活性が低下するように、または、その免疫原性が増強されるように、改変することができる。標的抗原または標的タンパク質は、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１ｃ、ＭＵＣ１ｎ、Ｔ、ＣＥＡ、またはそれらの任意の組み合わせであってよい。
【０１７３】
ある特定の実施形態では、免疫原性断片は、ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ分子に結合する。免疫原性断片は、ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ分子への結合が当技術分野で公知の任意のアッセイを使用して検出可能であれば、ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ分子に「結合する」ことができるものである。例えば、ポリペプチドのＭＨＣクラスＩに結合する能力は、ＭＨＣクラスＩ／β２ｍ／ペプチドヘテロ三量体複合体への１２５Ｉ標識されたβ−２−ミクログロブリン（β−２ｍ）の組み入れを促進する能力をモニターすることによって間接的に評価することができる。あるいは、当技術分野で公知である機能性ペプチド競合アッセイを使用することができる。ポリペプチドの免疫原性断片は、一般に、周知の技法を使用して同定することができる。免疫原性断片を同定するための代表的な技法としては、ポリペプチドを、抗原特異的抗血清および／またはＴ細胞株またはクローンと反応する能力についてスクリーニングすることが挙げられる。特定の標的ポリペプチドの免疫原性断片は、そのような抗血清および／またはＴ細胞と、全長標的ポリペプチドの反応性よりも実質的に低くないレベルで反応する断片である（例えば、ＥＬＩＳＡおよび／またはＴ細胞反応性アッセイにおいて）。言い換えれば、免疫原性断片は、そのようなアッセイ内で、全長ポリペプチドの反応性と同様であるかまたはそれを超えるレベルで反応し得る。そのようなスクリーニングは、当技術分野で公知の方法を使用して実施することができる。
【０１７４】
一部の実施形態では、本発明のウイルスベクターは、免疫応答を調節することができる、１つまたは複数のタンパク質、そのバリアント、その融合物またはその断片をコードする異種核酸配列を含む。一部の実施形態では、本発明のウイルスベクターは、炭疽防御抗原などの特定の抗原に対する１つまたは複数の抗体をコードし、受動免疫療法を可能にするものである。一部の実施形態では、本発明のウイルスベクターは、治療効果（例えば、抗ウイルス機能、抗細菌機能、駆虫機能、または抗腫瘍機能）を有する１つまたは複数のタンパク質をコードする異種核酸配列を含む。一部の実施形態では、第２世代Ｅ２ｂ欠失アデノウイルスベクターは、異種核酸配列を含む。一部の実施形態では、異種核酸配列は、ＣＥＡ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１ｃ、ＭＵＣ１ｎ、Ｔ、バリアント、部分、またはそれらの任意の組み合わせである。
【０１７５】
標的抗原としては、これだけに限定されないが、種々の腫瘍タンパク質に由来する抗原が挙げられる。一部の実施形態では、腫瘍タンパク質の一部またはバリアントを標的抗原として使用する。一部の実施形態では、標的抗原として使用される腫瘍タンパク質の一部またはバリアントは改変されたもの、例えば、腫瘍タンパク質またはそれを含有する細胞に対する免疫応答をもたらす能力が増大したものである。本発明のワクチンにより、抗原に対してワクチン接種することができる。ワクチンは、エピトープを標的とするものであってもよい。抗原は、腫瘍細胞抗原であってよい。エピトープは、腫瘍細胞エピトープであってよい。そのような腫瘍細胞エピトープは、変異から生じた腫瘍に由来する抗原、共有される腫瘍特異的抗原、分化抗原、および腫瘍において過剰発現される抗原などの多種多様な腫瘍抗原に由来するものであってよい。腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）は、宿主によって通常は発現されない抗原であってよい；それらは、宿主によって通常発現される分子の、変異した、短縮された、ミスフォールディングされた、または他の点で異常な顕在化であってよい；それらは、通常発現される分子と同一であるが、異常に高レベルで発現されるものであってよい；または、それらは、異常な状況または環境において発現されるものであってよい。腫瘍関連抗原は、例えば、タンパク質またはタンパク質断片、複合炭水化物、ガングリオシド、ハプテン、核酸、他の生体分子またはそれらの任意の組み合わせであってよい。
【０１７６】
本発明において有用な例示的な腫瘍タンパク質としては、これだけに限定されないが、ＷＴ１、ＨＰＶ  Ｅ６、ＨＰＶ  Ｅ７、ｐ５３、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＭＡＧＥ−Ａ６、ＭＡＧＥ−Ａ１０、ＭＡＧＥ−Ａ１２、ＢＡＧＥ、ＤＡＭ−６、ＤＡＭ−１０、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ＧＡＧＥ−８、ＧＡＧＥ−３、ＧＡＧＥ−４、ＧＡＧＥ−５、ＧＡＧＥ−６、ＧＡＧＥ−７Ｂ、ＮＡ８８−Ａ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭＡＲＴ−１、ＭＣ１Ｒ、Ｇｐ１００、ＰＳＡ、ＰＳＭ、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、ＡＲＴ−４、ＣＡＭＥＬ、ＣＥＡ、Ｃｙｐ−Ｂ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＢＲＣＡ１、ブラキュリ、ブラキュリ（ＴＩＶＳ７−２、多型）、ブラキュリ（ＩＶＳ７  Ｔ／Ｃ多型）、Ｔブラキュリ、Ｔ、ｈＴＥＲＴ、ｈＴＲＴ、ｉＣＥ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１（ＶＮＴＲ多型）、ＭＵＣ１ｃ、ＭＵＣ１ｎ、ＭＵＣ２、ＰＲＡＭＥ、Ｐ１５、ＲＵ１、ＲＵ２、ＳＡＲＴ−１、ＳＡＲＴ−３、ＷＴ１、ＡＦＰ、β−カテニン／ｍ、カスパーゼ−８／ｍ、ＣＥＡ、ＣＤＫ−４／ｍ、ＥＬＦ２Ｍ、ＧｎＴ−Ｖ、Ｇ２５０、ＨＳＰ７０−２Ｍ、ＨＳＴ−２、ＫＩＡＡ０２０５、ＭＵＭ−１、ＭＵＭ−２、ＭＵＭ−３、ミオシン／ｍ、ＲＡＧＥ、ＳＡＲＴ−２、ＴＲＰ−２／ＩＮＴ２、７０７−ＡＰ、アネキシンＩＩ、ＣＤＣ２７／ｍ、ＴＰＩ／ｍｂｃｒ−ａｂｌ、ＥＴＶ６／ＡＭＬ、ＬＤＬＲ／ＦＵＴ、Ｐｍｌ／ＲＡＲα、およびＴＥＬ／ＡＭＬ１のうちの任意の１つまたは複数が挙げられる。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、ＷＴ１、ＨＰＶ  Ｅ６、ＨＰＶ  Ｅ７、ｐ５３、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＭＡＧＥ−Ａ６、ＭＡＧＥ−Ａ１０、ＭＡＧＥ−Ａ１２、ＢＡＧＥ、ＤＡＭ−６、ＤＡＭ−１０、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ＧＡＧＥ−８、ＧＡＧＥ−３、ＧＡＧＥ−４、ＧＡＧＥ−５、ＧＡＧＥ−６、ＧＡＧＥ−７Ｂ、ＮＡ８８−Ａ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭＡＲＴ−１、ＭＣ１Ｒ、Ｇｐ１００、ＰＳＡ、ＰＳＭ、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、ＡＲＴ−４、ＣＡＭＥＬ、ＣＥＡ、Ｃｙｐ−Ｂ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＢＲＣＡ１、ブラキュリ、ブラキュリ（ＴＩＶＳ７−２、多型）、ブラキュリ（ＩＶＳ７  Ｔ／Ｃ多型）、Ｔブラキュリ、Ｔ、ｈＴＥＲＴ、ｈＴＲＴ、ｉＣＥ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１（ＶＮＴＲ多型）、ＭＵＣ１ｃ、ＭＵＣ１ｎ、ＭＵＣ２、ＰＲＡＭＥ、Ｐ１５、ＲＵ１、ＲＵ２、ＳＡＲＴ−１、ＳＡＲＴ−３、ＷＴ１、ＡＦＰ、β−カテニン／ｍ、カスパーゼ−８／ｍ、ＣＥＡ、ＣＤＫ−４／ｍ、ＥＬＦ２Ｍ、ＧｎＴ−Ｖ、Ｇ２５０、ＨＳＰ７０−２Ｍ、ＨＳＴ−２、ＫＩＡＡ０２０５、ＭＵＭ−１、ＭＵＭ−２、ＭＵＭ−３、ミオシン／ｍ、ＲＡＧＥ、ＳＡＲＴ−２、ＴＲＰ−２／ＩＮＴ２、７０７−ＡＰ、アネキシンＩＩ、ＣＤＣ２７／ｍ、ＴＰＩ／ｍｂｃｒ−ａｂｌ、ＥＴＶ６／ＡＭＬ、ＬＤＬＲ／ＦＵＴ、Ｐｍｌ／ＲＡＲα、およびＴＥＬ／ＡＭＬ１から選択される改変ポリペプチドをコードする標的抗原配列を含み、ここで、ポリペプチドまたはその断片は、記載の配列に対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．５％、９９���９％の同一性を有する。
【０１７７】
本発明において有用な例示的な腫瘍タンパク質としては、これだけに限定されないが、ＣＥＡ、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２／ｎｅｕ）、ヒト上皮増殖因子受容体３（ＨＥＲ３）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、ＭＵＣ１、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、アルファ−アクチニン−４、ＡＲＴＣ１、ＣＡＲ−ＡＢＬ融合タンパク質（ｂ３ａ２）、Ｂ−ＲＡＦ、ＣＡＳＰ−５、ＣＡＳＰ−８、ベータ−カテニン、Ｃｄｃ２７、ＣＤＫ４、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＯＡ−１、ｄｅｋ−ｃａｎ融合タンパク質、ＥＦＴＵＤ２、伸長因子２、ＥＴＶ６−ＡＭＬ１融合タンパク質、ＦＬＴ３−ＩＴＤ、ＦＮ１、ＧＰＮＭＢ、ＬＤＬＲ−フコシルトランスフェラーゼ融合タンパク質、ＨＬＡ−Ａ２ｄ、ＨＬＡ−Ａ１１ｄ、ｈｓｐ７０−２、ＫＩＡＡＯ２０５、ＭＡＲＴ２、ＭＥ１、ＭＵＭ−１ｆ、ＭＵＭ−２、ＭＵＭ−３、ｎｅｏ−ＰＡＰ、ミオシンクラスＩ、ＮＦＹＣ、ＯＧＴ、ＯＳ−９、ｐ５３、ｐｍｌ−ＲＡＲアルファ融合タンパク質、ＰＲＤＸ５、ＰＴＰＲＫ、Ｋ−ｒａｓ、Ｎ−ｒａｓ、ＲＢＡＦ６００、ＳＩＲＴ２、ＳＮＲＰＤ１、ＳＹＴ−ＳＳＸ１融合タンパク質もしくはＳＹＴ−ＳＳＸ２融合タンパク質、ＴＧＦ−ベータＲＩＩ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ＢＡＧＥ−１、ＧｎＴＶｆ、ＨＥＲＶ−Ｋ−ＭＥＬ、ＫＫ−ＬＣ−１、ＫＭ−ＨＮ−１、ＬＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−Ａ９、ＭＡＧＥ−Ｃ２、ｍｕｃｉｎｋ、ＮＡ−８８、ＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−２、ＳＡＧＥ、Ｓｐ１７、ＳＳＸ−２、ＳＳＸ−４、ＴＡＧ−１、ＴＡＧ−２、ＴＲＡＧ−３、ＴＲＰ２−ＩＮＴ２ｇ、ＸＡＧＥ−１ｂ、ｇｐ１００／Ｐｍｅｌ１７、カリクレイン４、マンマグロビン−Ａ、メラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１、ＮＹ−ＢＲ−１、ＯＡ１、ＰＳＡ、ＲＡＢ３８／ＮＹ−ＭＥＬ−１、ＴＲＰ−１／ｇｐ７５、ＴＲＰ−２、チロシナーゼ、アディポフィリン、ＡＩＭ−２、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＢＣＬＸ（Ｌ）、ＢＣＭＡ、ＢＩＮＧ−４、ＣＰＳＦ、サイクリンＤ１、ＤＫＫ１、ＥＮＡＨ（ｈＭｅｎａ）、ＥＰ−ＣＡＭ、ＥｐｈＡ３、ＥＺＨ２、ＦＧＦ５、Ｇ２５０／ＭＮ／ＣＡＩＸ、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＩＬ１３Ｒアルファ２、腸カルボキシルエステラーゼ、アルファフェトプロテイン、Ｍ−ＣＳＦＴ、ＭＣＳＰ、ｍｄｍ−２、ＭＭＰ−２、ＭＵＣ１、ｐ５３、ＰＢＦ、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＭＡ、ＲＡＧＥ−１、ＲＧＳ５、ＲＮＦ４３、ＲＵ２ＡＳ、セセルニン（ｓｅｃｅｒｎｉｎ）１、ＳＯＸ１０、ＳＴＥＡＰ１、サバイビン、テロメラーゼ、および／またはＶＥＧＦのうちの任意の１つまたは複数が挙げられる。
【０１７８】
腫瘍関連抗原は、ヒト悪性疾患に関連する感染因子に由来する抗原であってよい。ヒト悪性疾患に関連する感染因子の例としては、エプスタイン・バーウイルス、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ヒトヘルペスウイルス（ｈｅｒｅｓｖｉｒｕｓ）−８、ヒト免疫不全ウイルス、ヒトパピローマウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス、肝吸虫、およびＳｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｈａｅｍａｔｏｂｉｕｍが挙げられる。
【０１７９】
ＣＥＡ抗原標的
ＣＥＡは、ほぼ全ての結腸直腸がんおよび膵がん（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）において過剰発現され、一部の肺がんおよび乳がん、および甲状腺髄様がんなどのまれな腫瘍でも発現されるが、胃腸上皮において低レベルで発現している以外は体の他の細胞では発現されないので、免疫療法のための魅力的な標的抗原である。ＣＥＡは、Ｔ細胞によってＭＨＣにより拘束された様式で認識され得るエピトープを含有する。
【０１８０】
本発明者らは、腫瘍抗原ＣＥＡをコードするＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＣＥＡ（６Ｄ）を用いた複数の同種免疫により、マウスにおいて、既存のまたは誘導されたＡｄ５中和抗体が存在するにもかかわらず、抗腫瘍活性を伴うＣＥＡに特異的な細胞媒介性免疫（ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｍｍｕｎｅ）（ＣＭＩ）応答が誘導されることを発見した。現在の第Ｉ／ＩＩ相試験では、進行結腸直腸がんの患者のコホートを、漸増用量のＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＣＥＡ（６Ｄ）を用いて免疫した。患者の大多数（６１．３％）において、既存のＡｄ５に対する免疫が存在していたにもかかわらず、ＣＥＡ特異的ＣＭＩ応答が観察された。重要なことに、毒性は最小であり、患者全生存（１２カ月において４８％）は、既存のＡｄ５中和抗体力価にかかわらず同様であった。結果から、がん患者において、新規のＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］遺伝子送達プラットフォームにより、Ａｄ５特異的免疫が自然に獲得された状況と免疫により誘導された状況のどちらにおいても、腫瘍抗原ＣＥＡに対する有意なＣＭＩ応答が生じることが実証される。
【０１８１】
ＣＥＡ抗原特異的ＣＭＩは、例えば、１０超、２０超、３０超、４０超、５０超、１００超、２００超、３００超、４００超、５００超、６００超、７００超、８００超、９００超、１０００超、５０００超、１００００超、またはそれ超の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）１０６個当たりのＩＦＮ−γスポット形成細胞（ＳＦＣ）であり得る。一部の実施形態では、免疫応答は、既存のＡｄ５中和抗体力価の逆数が５０超、１００超、１５０超、２００超、３００超、４００超、５００超、６００超、７００超、８００超、９００超、１０００超、１５００超、２０００超、２５００超、３０００超、３５００超、４０００超、４５００超、５０００超、６０００超、７０００超、８０００超、９０００超、１０００超、１２０００超、１５０００超またはそれ超であるヒト被験体において生じる。免疫応答は、本明細書に記載されている通り細胞媒介性免疫（ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ）および／または体液性免疫を含み得る。免疫応答は、本明細書に記載されている通り、および当業者が利用可能である限りでは、細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）、ＥＬＩＳｐｏｔ、増殖アッセイ、クロムの放出または等価のアッセイを含めた細胞傷害性Ｔ細胞アッセイ、およびさまざまなポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）またはＲＴ−ＰＣＲに基づくアッセイを使用した遺伝子発現解析のうちの１つまたは複数、ならびに、免疫応答を測定するための当技術分野で公知の任意の他の適切なアッセイによって測定することができる。
【０１８２】
一部の実施形態では、複製欠損性アデノウイルスベクターは、ポリペプチドの野生型サブユニットに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％の同一性を有するサブユニットをコードする改変された配列を含む。
【０１８３】
免疫原性ポリペプチドは、変異体ＣＥＡまたはその断片であってよい。一部の実施形態では、免疫原性ポリペプチドは、６１０位におけるＡｓｎからＡｓｐへの置換を伴う変異体ＣＥＡを含む。一部の実施形態では、複製欠損性アデノウイルスベクターは、免疫原性ポリペプチドに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％の同一性を有するポリペプチドをコードする配列を含む。一部の実施形態では、免疫原性ポリペプチドをコードする配列は、配列番号１の配列を含む。
【０１８４】
一部の実施形態では、免疫原性ポリペプチドをコードする配列は、配列番号１に対して少なくとも７０％  ７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％の同一性を有する配列、または配列番号１から代替コドンによる置き換えによって生じた配列を含む。一部の実施形態では、アデノウイルスベクターによりコードされる免疫原性ポリペプチドは、野生型ヒトＣＥＡ配列と比較して、単一のアミノ酸の置換または欠失などの点変異を、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、またはそれ超含む。
【０１８５】
一部の実施形態では、免疫原性ポリペプチドは、配列番号２、または、例えば、配列番号２の単一のアミノ酸の置換または欠失などの点変異を最大１カ所、２カ所、３カ所、４カ所、５カ所、６カ所、７カ所、８カ所、９カ所、１０カ所、１１カ所、１２カ所、１３カ所、１４カ所、１５カ所、１６カ所、１７カ所、１８カ所、１９カ所、２０カ所、２５カ所、３０カ所、３５カ所、４０カ所、またはそれ超含む改変バージョンに由来する配列を含む。
【０１８６】
ＣＥＡ遺伝子ファミリーのメンバーは、配列類似性、発生上の発現パターンおよびそれらの生物学的機能に基づいて、３つのサブグループ：１２種の遺伝子（ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＥＡＣＡＭ３〜ＣＥＡＣＡＭ８、ＣＥＡＣＡＭ１６およびＣＥＡＣＡＭ１８〜ＣＥＡＣＡＭ２１）を含有するＣＥＡ関連細胞接着分子（ＣＥＡＣＡＭ）サブグループ、１１種の密接に関連する遺伝子（ＰＳＧ１〜ＰＳＧ１１）を含有する妊娠特異的糖タンパク質（ＰＳＧ）サブグループ、ならびに１１種の偽遺伝子（ＣＥＡＣＡＭＰ１〜ＣＥＡＣＡＭＰ１１）のサブグループに細分される。ＣＥＡＣＡＭサブグループの大多数のメンバーは、免疫グロブリン可変ドメインに対して構造的相同性を有する単一のＮ末端Ｖセットドメイン、その後の様々な数のＡ亜型またはＢ亜型のＣ２−セットドメインで構成される細胞外Ｉｇ様ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインからなる類似した構造を有する。ＣＥＡＣＡＭサブグループには、それらの構造の組織化においていくらかの例外を示すメンバーが２種存在する（ＣＥＡＣＡＭ１６およびＣＥＡＣＡＭ２０）。ＣＥＡＣＡＭ１６は、Ｎ末端およびＣ末端に２つのＩｇ様Ｖ型ドメインを含有し、ＣＥＡＣＡＭ２０は、短縮されたＩｇ様Ｖ−１型ドメインを含有する。ＣＥＡＣＡＭ分子は、それらの膜貫通ドメインを通じて細胞表面に係留することもでき（ＣＥＡＣＡＭ５〜ＣＥＡＣＡＭ８）、グリコホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）脂質部分に直接連結することもできる（ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＥＡＣＡＭ１８〜ＣＥＡＣＡＭ２１）。
【０１８７】
ＣＥＡファミリーメンバーは、異なる細胞型において発現され、広範囲の生物学的機能を有する。ＣＥＡＣＡＭは大多数の上皮細胞上に顕著に見いだされ、また、種々の白血球上に存在する。ヒトでは、ＣＥＡファミリーの祖先メンバーであるＣＥＡＣＡＭ１は、上皮細胞および内皮細胞の頂端側ならびにリンパ系細胞および骨髄細胞上に発現する。ＣＥＡＣＡＭ１は、ホモフィリック（ｈｅｍｏｐｈｉｌｉｃ）相互作用（ＣＥＡＣＡＭ１とＣＥＡＣＡＭ１）ならびにヘテロフィリック（ｈｅｔｅｒｏｔｈａｌｌｉｃ）相互作用（例えば、ＣＥＡＣＡＭ１とＣＥＡＣＡＭ５）を通じて細胞間接着を媒介する。さらに、ＣＥＡＣＡＭ１は、血管新生、細胞遊走、および免疫機能などの多くの他の生物学的プロセスに関与する。ＣＥＡＣＡＭ３およびＣＥＡＣＡＭ４の発現は、顆粒球に大きく限定され、また、これらは、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ、およびＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ種を含めたいくつかの細菌性病原体の取り込みおよび破壊を伝達することができる。
【０１８８】
したがって、種々の実施形態では、本発明の組成物および方法は、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＥＡＣＡＭ３、ＣＥＡＣＡＭ４、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＥＡＣＡＭ６、ＣＥＡＣＡＭ７、ＣＥＡＣＡＭ８、ＣＥＡＣＡＭ１６、ＣＥＡＣＡＭ１８、ＣＥＡＣＡＭ１９、ＣＥＡＣＡＭ２０、ＣＥＡＣＡＭ２１、ＰＳＧ１、ＰＳＧ２、ＰＳＧ３、ＰＳＧ４、ＰＳＧ５、ＰＳＧ６、ＰＳＧ７、ＰＳＧ８、ＰＳＧ９、およびＰＳＧ１１からなる群より選択されるＣＥＡに対する免疫応答を生じさせることに関する。本発明の方法および組成物を使用して、ＣＥＡのうちの１つまたは複数を発現または過剰発現する細胞、例えばがん細胞に対する免疫応答を生じさせることができる。一部の実施形態では、そのようながん細胞における１つまたは複数のＣＥＡの過剰発現は、非がん細胞と比較して５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍またはそれ超を超えるものである。
【０１８９】
ムチンファミリー抗原標的
ヒトムチンファミリー（ＭＵＣ１〜ＭＵＣ２１）は、体内の上皮表面上に保護的な粘液障壁を形成する役割を果たす分泌型膜貫通ムチンを含む。これらのタンパク質は、呼吸器を裏打ちする上皮、胃腸管、および、例えば、乳腺、肝臓、胃、膵臓、および腎臓などの重要な器官を裏打ちする管の保護において機能する。
【０１９０】
ＭＵＣ１（ＣＤ２２７）は、大多数のヒト癌腫およびいくつかの血液悪性疾患において過剰発現されるＴＡＡである。ＭＵＣ１（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｘ８０７６１．１、ＮＣＢＩ：ＮＭ＿００１２０４２８５．１）は、ヒト疾患に関与することが公知の多くの重要な細胞経路を活性化する。ＭＵＣ１は、一般に、いくつかのヒトがんにおいて過剰発現される２つのサブユニットによって形成されるヘテロ二量体タンパク質である。ＭＵＣ１は自己タンパク質分解を受けて２つのサブユニット、ＭＵＣ１ｎおよびＭＵＣ１ｃが生成し、それらが今度は安定な非共有結合性ヘテロ二量体を形成する。
【０１９１】
ＭＵＣ１  Ｃ末端サブユニット（ＭＵＣ１ｃ）は、５８アミノ酸の細胞外ドメイン（ＥＤ）、２８アミノ酸の膜貫通ドメイン（ＴＭ）および７２アミノ酸の細胞質ドメイン（ＣＤ）を含み得る。ＭＵＣ１ｃはまた、ＭＵＣ１の二量体化を可能にし得、また、細胞に腫瘍形成機能を付与し得る「ＣＱＣ」モチーフも含有し得る。一部の場合では、ＭＵＣ１は、ＭＵＣ１ｃを介して細胞シグナル伝達を誘導することにより、一部において腫瘍形成機能をなす。ＭＵＣ１ｃは、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２および他の受容体チロシンキナーゼと相互作用し得、ＰＩ３Ｋ→ＡＫＴおよびＭＥＫ→ＥＲＫ細胞経路の活性化に寄与する。核では、ＭＵＣ１ｃは、Ｗｎｔ／β−カテニン、ＳＴＡＴおよびＮＦ−κＢ  ＲｅｌＡ細胞経路を活性化する。一部の場合では、ＭＵＣ１は、ＭＵＣ１ｎを介した細胞シグナル伝達を誘導することにより、腫瘍形成機能を付与し得る。ＭＵＣ１  Ｎ末端サブユニット（ＭＵＣ１ｎ）は、グリコシル化することができる２０アミノ酸縦列反復を様々な数で含み得る。ＭＵＣ１は、通常、腺上皮細胞の表面上で発現され、また、癌腫において過剰発現され、異常にグリコシル化される。ＭＵＣ１は、腫瘍免疫療法の標的として利用することができるＴＡＡである。免疫療法薬ワクチンへのＭＵＣ１の使用を評価するために、いくつかの臨床試験が実施されてきており、現在も実施されている。重要なことに、これらの試験により、ＭＵＣ１標的化を用いた免疫療法が安全であり、生存利益をもたらし得ることが示されている。
【０１９２】
しかし、臨床試験により、ＭＵＣ１が比較的不十分な免疫原であることも示されている。これを克服するために、本発明者らは、ＭＵＣ１腫瘍性タンパク質（ＭＵＣ１−ＣまたはＭＵＣ１ｃ）のＣ末端領域内のＴリンパ球免疫エンハンサーペプチド配列を同定した。ネイティブなペプチド配列と比較して、それらの改変されたＭＵＣ１−Ｃのアゴニストは、（ａ）ＨＬＡ−Ａ２に、より低いペプチド濃度で結合し、（ｂ）ＨＬＡ−Ａ２に対してより高いアビディティを示し、（ｃ）抗原提示細胞と共に使用した場合に、ネイティブなペプチドを使用した場合よりも多くの、Ｔ細胞によるＩＦＮ−γの産生が誘導され、かつ（ｄ）がん患者からＭＵＣ１特異的ヒトＴ細胞株をより効率的に生じさせることができた。重要なことに、アゴニストエピトープを使用して生成されたＴ細胞株は、ネイティブなエピトープを用いて生成されたものよりも、ネイティブなエピトープでパルスした標的の溶解について、およびＭＵＣ１を発現するＨＬＡ−Ａ２ヒト腫瘍細胞の溶解において効率的であった。さらに、本発明者らは、ＭＵＣ１−ＣのさらなるＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球免疫エンハンサーアゴニスト配列エピトープを同定した。
【０１９３】
本開示は、免疫エンハンサー能力に関して改変された強力なＭＵＣ１−Ｃ（ｍＭＵＣ１−ＣまたはＭＵＣ１−ＣまたはＭＵＣ１ｃ）を提供する。本開示は、新しい、より強力な免疫療法薬ワクチンを作製するために、組換え型Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］プラットフォームに組み入れられた、免疫エンハンサー能力に関して改変された強力なＭＵＣ１−Ｃを提供する。例えば、免疫療法薬ワクチンは、ＭＵＣ１が発現されるがんまたは感染症を処置するための、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ｍＭＵＣ１−Ｃであり得る。
【０１９４】
翻訳後修飾は、体内およびヒト疾患におけるタンパク質機能の制御において重要な役割を果たす。例えば、上記のタンパク質分解による切断に加えて、ＭＵＣ１は、特定のアミノ酸残基におけるグリコシル化、シアリル化、パルミトイル化、またはこれらの組み合わせなどのいくつかの翻訳後修飾を有し得る。本明細書では、ＭＵＣ１のグリコシル化、シアリル化、リン酸化、またはパルミトイル化修飾を標的とする免疫療法が提供される。
【０１９５】
ＭＵＣ１は、高度にグリコシル化され得る（モノグリコシル化からペンタグリコシル化までにわたる、各縦列反復内のセリン残基およびトレオニン残基上、様々な程度でのＮ結合およびＯ結合炭水化物およびシアル酸、）。３，４連結ＧｌｃＮＡｃを有する乳癌では差次的にＯ−グリコシル化される。Ｎ−グリコシル化は、分泌型ＭＵＣ１／ＳＥＣにおける高マンノース、酸性複合体型およびハイブリッドグリカン、および膜貫通型ＭＵＣ１／ＴＭ．４における中性の複合型からなる。本開示は、差次的にＯ−グリコシル化された形態のＭＵＣ１を標的とする免疫療法を提供する。
【０１９６】
さらに、ＭＵＣ１は、シアリル化され得る。腎がん細胞および乳がん細胞由来の膜脱落糖タンパク質は、優先的にシアリル化されたコア１構造を有するが、同じ組織に由来する分泌型は、主にコア２構造を示す。Ｏ−グリコシル化の内容は、これらの組織の両方で重複しており、末端フコースおよびガラクトース、２−および３−連結ガラクトース、３−および３，６−連結ＧａｌＮＡｃ−ｏｌおよび４−連結ＧｌｃＮＡｃが優勢である。本開示は、種々のシアリル化形態のＭＵＣ１を標的とする免疫療法を提供する。エンドソームからまた原形質膜への再利用のためには、ＣＱＣモチーフ内のシステイン残基における二重パルミトイル化が必要である。本開示は、種々のパルミトイル化形態のＭＵＣ１を標的とする免疫療法を提供する。
【０１９７】
リン酸化は、ヒトの健康に重要である特異的な細胞シグナル伝達応答を誘導するＭＵＣ１の能力に影響を及ぼし得る。本開示は、種々のリン酸化形態のＭＵＣ１を標的とする免疫療法を提供する。例えば、ＭＵＣ１は、Ｃ末端ドメイン内のチロシン残基およびセリン残基においてリン酸化され得る。Ｃ末端ドメイン内のチロシンにおけるリン酸化により、ＭＵＣ１およびβ−カテニンが核内により多く位置するようになり得る。ＰＫＣデルタによるリン酸化により、ＭＵＣ１のβ−カテニン／ＣＴＮＮＢ１への結合が誘導され得、また、β−カテニン／Ｅ−カドヘリン複合体の形成が減少し得る。ＭＵＣ１のＳｒｃ媒介性リン酸化により、ＧＳＫ３Ｂとの相互作用が阻害され得る。Ｔｙｒ−１２２９におけるＭＵＣ１のＳｒｃ媒介性リン酸化およびＥＧＦＲ媒介性リン酸化により、β−カテニン／ＣＴＮＮＢ１への結合が増大し得る。Ｓｅｒ−１２２７におけるＭＵＣ１のＧＳＫ３Ｂ媒介性リン酸化により、この相互作用が低減し得るが、β−カドヘリン／Ｅ−カドヘリン複合体の形成が回復する。ＭＵＣ１のＰＤＧＦＲ媒介性リン酸化により、ＭＵＣ１ＣＴとＣＴＮＮＢ１の核内共局在が増大し得る。本開示は、ＭＵＣ１の細胞シグナル伝達能を調節することが公知の種々のリン酸化形態のＭＵＣ１、ＭＵＣ１ｃおよびＭＵＣ１ｎを標的とする免疫療法を提供する。
【０１９８】
本開示は、ＭＵＣ１ｃ細胞質ドメインおよび細胞におけるその機能を調節する免疫療法を提供する。本開示は、ＭＵＣ１ｃのＣＱＣモチーフを調節することを含む免疫療法を提供する。本開示は、ＭＵＣ１ｃの細胞外ドメイン（ＥＤ）、膜貫通ドメイン（ＴＭ）、細胞質ドメイン（ＣＤ）、またはこれらの組み合わせを調節することを含む免疫療法を提供する。本開示は、ＭＵＣ１ｃの、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２または他の受容体チロシンキナーゼを通じた細胞シグナル伝達を誘導する能力を調節することを含む免疫療法を提供する。本開示は、ＭＵＣ１ｃの、ＰＩ３Ｋ→ＡＫＴ、ＭＥＫ→ＥＲＫ、Ｗｎｔ／β−カテニン、ＳＴＡＴ、ＮＦ−κＢ  ＲｅｌＡ細胞経路、またはその組み合わせを誘導する能力を調節することを含む免疫療法を提供する。一部の実施形態では、ＭＵＣ１ｃ免疫療法は、ＣＥＡをさらに含んでよい。
【０１９９】
本開示は、ＭＵＣ１ｎおよびその細胞機能を調節する免疫療法も提供する。本開示は、ＭＵＣ１ｎの縦列反復、ＭＵＣ１ｎの縦列反復上のグリコシル化部位、またはこれらの組み合わせを含む免疫療法も提供する。一部の実施形態では、ＭＵＣ１ｎ免疫療法は、ＣＥＡをさらに含む。
【０２００】
本開示は、ＭＵＣ１ｎ、ＭＵＣ１ｃ、ＣＥＡ、またはこれらの組み合わせを含むワクチンも提供する。本開示は、ＭＵＣ１ｃおよびＣＥＡを含むワクチンを提供する。本開示は、ＭＵＣ１ｎおよびＣＥＡを標的とするワクチンも提供する。一部の実施形態では、抗原の組み合わせは、本明細書において提示される１つのベクターに含有される。一部の実施形態では、抗原の組み合わせは、本明細書において提示される別々のベクターに含有される。
【０２０１】
本発明は、免疫原性ポリペプチドをコードする配列を含む、血清型５の複製欠損性アデノウイルスベクターに関する。免疫原性ポリペプチドは、ＭＵＣ１のアイソフォームまたはそのサブユニットもしくは断片であってよい。一部の実施形態では、複製欠損性アデノウイルスベクターは、免疫原性ポリペプチドに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％の同一性を有するポリペプチドをコードする配列を含む。一部の実施形態では、免疫原性ポリペプチドをコードする配列は、配列番号５の配列を含む。一部の実施形態では、免疫原性ポリペプチドをコードする配列は、以下の配列番号６により識別される配列を含む。一部の実施形態では、免疫原性ポリペプチドをコードする配列は、以下の配列番号９により識別される配列を含む。一部の実施形態では、免疫原性ポリペプチドをコードする配列は、配列番号５、配列番号６、配列番号９に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％の同一性を有する配列、または配列番号５、配列番号６、配列番号９から、代替コドンによる置き換えによって生じた配列を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載されているアデノウイルスベクターによりコードされる免疫原性ポリペプチドは、野生型ヒトＭＵＣ１配列と比較して、単一のアミノ酸の置換または欠失などの点変異を最大１カ所、２カ所、３カ所、４カ所、５カ所、６カ所、７カ所、８カ所、９カ所、１０カ所、１１カ所、１２カ所、１３カ所、１４カ所、１５カ所、１６カ所、１７カ所、１８カ所、１９カ所、２０カ所、２５カ所、３０カ所、３５カ所、４０カ所、またはそれ超含む。
【０２０２】
ブラキュリ標的抗原
本開示は、ブラキュリに対する１つまたは複数の抗原を含む免疫療法も提供する。ブラキュリ（ヒトにおいて「Ｔ」タンパク質としても公知）は、初期発生の間に、大部分は正常な中胚葉の形成および分化において重要な役割を果たし、Ｔ−ドメインと称される高度に保存されたＤＮＡ結合性ドメインを特徴とする、転写因子のＴ−ボックスファミリーのメンバーである。上皮間葉転換（ＥＭＴ）は、ブラキュリが極めて重要な役割を果たす、原発腫瘍が転移性の状態に進行する間の重要なステップである。ヒト癌細胞におけるブラキュリの発現により、間葉系マーカーの上方制御、上皮マーカーの下方制御、ならびに細胞遊走および浸潤の増大を含めたＥＭＴの特性の変化が誘導される。逆に、ブラキュリの阻害により、間葉系マーカーの下方制御ならびに細胞遊走および浸潤の喪失ならびにヒト腫瘍細胞の転移を形成する能力の低下がもたらされる。ブラキュリは、上皮間葉転換を媒介し、浸潤を促進するように機能し得る。
【０２０３】
本開示は、がんなどの細胞増殖疾患における上皮間葉転換機能に対するブラキュリの影響を調節する免疫療法も提供する。本開示は、がんなどの細胞増殖疾患における浸潤を促進するブラキュリの能力を調節する免疫療法も提供する。本開示は、ブラキュリのＴ−ボックスドメインのＤＮＡ結合機能を調節する免疫療法も提供する。一部の実施形態では、ブラキュリ免疫療法は、ＣＥＡまたはＭＵＣ１、ＭＵＣ１ｃまたはＭＵＣ１ｎに対する１つまたは複数の抗原をさらに含んでよい。
【０２０４】
ブラキュリ発現は、大多数の正常なヒト組織ではほぼ検出不可能であり、ヒト腫瘍に高度に限定され、また、多くの場合、過剰発現され、それにより、ブラキュリが免疫療法のための魅力的な標的抗原となる。ヒトでは、ブラキュリは、Ｔ遺伝子によりコードされる（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＪ００１６９９．１、ＮＣＢＩ：ＮＭ＿００３１８１．３）。ヒトでは、代替スプライシングによって産生される異なるアイソフォームが少なくとも２つ見いだされる。各アイソフォームは、いくつもの天然のバリアントを有する。
【０２０５】
ブラキュリは、免疫原性であり、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて拡大増殖させたブラキュリ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞により、ブラキュリ発現腫瘍細胞を溶解させることができる。ブラキュリは、これらの特徴により、免疫療法のための魅力的なＴＡＡになっている。ブラキュリタンパク質は、Ｔ−ボックス転写因子である。ブラキュリタンパク質は、特定のＤＮＡエレメント、ほぼパリンドロームの配列「ＴＣＡＣＡＣＣＴ」に、Ｔ−ボックスと称されるＮ末端の領域を通じて結合して、そのような部位に結合した際に遺伝子転写を活性化することができる。
【０２０６】
本開示は、ブラキュリ、ＣＥＡ、またはこれらの組み合わせを含むワクチンも提供する。一部の実施形態では、抗原の組み合わせは、本明細書において提示される１つのベクターに含有される。一部の実施形態では、抗原の組み合わせは、本明細書において提示される別々のベクターに含有される。
【０２０７】
特定の実施形態では、本発明は、免疫原性ポリペプチドをコードする配列を含む血清型５の複製欠損性アデノウイルスベクターに関する。免疫原性ポリペプチドは、ブラキュリのアイソフォームまたはそのサブユニットもしくは断片であってよい。一部の実施形態では、複製欠損性アデノウイルスベクターは、免疫原性ポリペプチドに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％の同一性を有するポリペプチドをコードする配列を含む。一部の実施形態では、免疫原性ポリペプチドをコードする配列は、以下の配列番号７により識別される配列を含む。一部の実施形態では、複製欠損性アデノウイルスベクターは、免疫原性ポリペプチドに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％の同一性を有するポリペプチドをコードする配列を含む。一部の実施形態では、免疫原性ポリペプチドをコードする配列は、配列番号８の配列を含む。一部の実施形態では、免疫原性ポリペプチドをコードする配列は、配列番号７、配列番号８に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％の同一性を有する配列、または配列番号７、配列番号８から、代替コドンによる置き換えによって生じた配列を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載されているアデノウイルスベクターによりコードされる免疫原性ポリペプチドは、野生型ヒトブラキュリ配列と比較して、単一のアミノ酸の置換または欠失などの点変異を最大１カ所、２カ所、３カ所、４カ所、５カ所、６カ所、７カ所、８カ所、９カ所、１０カ所、１１カ所、１２カ所、１３カ所、１４カ所、１５カ所、１６カ所、１７カ所、１８カ所、１９カ所、２０カ所、２５カ所、３０カ所、３５カ所、４０カ所、またはそれ超含む。
【０２０８】
感染症関連抗原標的
本開示の標的抗原としては、これだけに限定されないが、例えば寄生生物、細菌、ウイルス、プリオンなどの種々の感染因子のいずれかに由来する抗原が挙げられる。感染因子とは、宿主に感染することが可能な任意の生きている生物体を指し得る。感染因子としては、例えば、細菌、一本鎖ＲＮＡウイルス、一本鎖ＤＮＡウイルスなどの任意の種類のウイルス、真菌、寄生生物、および原生生物が挙げられる。
【０２０９】
本開示の組成物および方法で使用することができる感染症関連標的抗原の例は、以下に由来するものであってよい：Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．、アデノウイルス（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）（１型、２型、３型、４型、５型および７型）、アデノウイルス（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）（４０型および４１型）、Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ、Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ  ｄｕｏｄｅｎａｌｅ、Ａｎｇｉｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ  ｃａｎｔｏｎｅｎｓｉｓ、Ａｓｃａｒｉｓ  ｌｕｍｂｒｉｃｏｉｄｅｓ、Ａｓｃａｒｉｓ  ｓｐｐ．、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．、Ｂａｂｅｓｉａ  ｓｐｐ、Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｓｐｐ．、Ｂａｌａｎｔｉｄｉｕｍ  ｃｏｌｉ、Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ  ｂａｃｉｌｌｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ、ブルータングウイルス（Ｂｌｕｅｔｏｎｇｕｅ  ｖｉｒｕｓ）、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ａｆｚｅｌｉｉ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｇａｒｉｎｉｉ、Ｂｒａｎｈａｍｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｓｐｐ．（Ｂ．ａｂｏｒｔｕｓ、Ｂ．ｃａｎｉｓ、Ｂ．ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ、Ｂ．ｓｕｉｓ）、Ｂｒｕｇｉａ  ｓｐｐ．、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ、（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）ｍａｌｌｅｉ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ｓｅｒｏｇｒｏｕｐ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｆｅｔｕｓ  ｓｕｂｓｐ．Ｆｅｔｕｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ、Ｃ．ｃｏｌｉ、Ｃ．ｆｅｔｕｓ  ｓｕｂｓｐ．Ｊｅｊｕｎｉ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ  ｓｐｐ．、Ｃｈｉｋｕｎｇｕｎｙａ  ｖｉｒｕｓ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｓｉｔｔａｃｉ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．、Ｃｌｏｎｏｒｃｈｉｓ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｐ．（上に列挙されている種を例外として）、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｉｍｍｉｔｉｓ、コロラドダニ熱ウイルス（Ｃｏｌｏｒａｄｏ  ｔｉｃｋ  ｆｅｖｅｒ  ｖｉｒｕｓ）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、Ｃｏｘｉｅｌｌａ  ｂｕｒｎｅｔｉｉ、コクサッキーウイルス（Ｃｏｘｓａｃｋｉｅｖｉｒｕｓ）、クロイツフェルト・ヤコブ病原体（Ｃｒｅｕｔｚｆｅｌｄｔ−Ｊａｋｏｂ  ａｇｅｎｔ）、クールー病原体（Ｋｕｒｕ  ａｇｅｎｔ）、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス（Ｃｒｉｍｅａｎ−Ｃｏｎｇｏ  ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ  ｆｅｖｅｒ  ｖｉｒｕｓ）、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ���サイトメガロウイルス（Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）、Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒａ  ｃａｙａｔａｎｅｓｉｓ、デングウイルス（Ｄｅｎｇｕｅ  ｖｉｒｕｓ）（１、２、３、４）、類ジフテリア菌（Ｄｉｐｈｔｈｅｒｏｉｄｓ）、東部（西部）ウマ脳炎ウイルス（Ｅａｓｔｅｒｎ（Ｗｅｓｔｅｒｎ）ｅｑｕｉｎｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）、エボラウイルス（Ｅｂｏｌａ  ｖｉｒｕｓ）、Ｅｃｈｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｒａｎｕｌｏｓｕｓ、Ｅｃｈｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｌｔｉｌｏｃｕｌａｒｉｓ、エコーウイルス（Ｅｃｈｏｖｉｒｕｓ）、Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ  ｔａｒｄａ、Ｅｎｔａｍｏｅｂａ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．、エンテロウイルス７０（Ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ  ７０）、Ｅｐｉｄｅｒｍｏｐｈｙｔｏｎ  ｆｌｏｃｃｏｓｕｍ、Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ  ｓｐｐ、Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ  ｓｅｎｎｅｔｓｕ、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ  ｓｐｐ．、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｓｐｐ．、エプスタイン・バーウイルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ）、腸管出血性大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、ｅｎｔｅｒｏｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ）、腸管侵入性大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、ｅｎｔｅｒｏｉｎｖａｓｉｖｅ）、腸管病原性大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、ｅｎｔｅｒｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ）、毒素原性大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ）、Ｆａｓｃｉｏｌａ  ｈｅｐａｔｉｃａ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．、Ｇｅｍｅｌｌａ  ｈａｅｍｏｌｙｓａｎｓ、Ｇｉａｒｄｉａ  ｌａｍｂｌｉａ、グアナリトウイルス（Ｇｕａｎａｒｉｔｏ  ｖｉｒｕｓ）、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｄｕｃｒｅｙｉ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ｂ群）、ハンタウイルス（Ｈａｎｔａｖｉｒｕｓ）、Ａ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ａ  ｖｉｒｕｓ）、Ｂ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｖｉｒｕｓ）、Ｃ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ）、Ｄ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｄ  ｖｉｒｕｓ）、Ｅ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｅ  ｖｉｒｕｓ）、単純ヘルペスウイルス（Ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ）、Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ  ｓｉｍｉａｅ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ、ヒトコロナウイルス（Ｈｕｍａｎ  ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ）、ヒト免疫不全ウイルス（Ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ）、ヒトパピローマウイルス（Ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ）、ヒトロタウイルス（Ｈｕｍａｎ  ｒｏｔａｖｉｒｕｓ）、ヒトＴリンパ増殖性ウイルス（Ｈｕｍａｎ  Ｔ−ｌｙｍｐｈｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｖｉｒｕｓ）、Ｈ５Ｎ１を含めたインフルエンザウイルス（Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ）、フニンウイルス（Ｊｕｎｉｎ  ｖｉｒｕｓ）／マチュポウイルス（Ｍａｃｈｕｐｏ  ｖｉｒｕｓ）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐｐ．、キャサヌール森林病ウイルス（Ｋｙａｓａｎｕｒ  Ｆｏｒｅｓｔ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｖｉｒｕｓ）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．、ラッサ��イルス（Ｌａｓｓａ  ｖｉｒｕｓ）、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍａｊｏｒ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｉｎｆａｎｔｕｍ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｓｐｐ．、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ  ｃｈｏｒｉｏｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）、マチュポウイルス（Ｍａｃｈｕｐｏ  ｖｉｒｕｓ）、マールブルグウイルス（Ｍａｒｂｕｒｇ  ｖｉｒｕｓ）、麻疹ウイルス（Ｍｅａｓｌｅｓ  ｖｉｒｕｓ）、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｓｐｐ．、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．（Ｍ．ｂｏｖｉｓ、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．ａｖｉｕｍ、Ｍ．ｌｅｐｒａｅ以外）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．ｂｏｖｉｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｉｎｉｓ、Ｍ．ｏｒａｌｅ、Ｍ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｍ、Ｍ．ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｎａｅｇｌｅｒｉａ  ｆｏｗｌｅｒｉ、Ｎｅｃａｔｏｒ  ａｍｅｒｉｃａｎｕｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｓｐｐ．（Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅおよびＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ以外）、Ｎｏｃａｒｄｉａ  ｓｐｐ．、ノーウォークウイルス（Ｎｏｒｗａｌｋ  ｖｉｒｕｓ）、オムスク出血熱ウイルス（Ｏｍｓｋ  ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ  ｆｅｖｅｒ  ｖｉｒｕｓ）、Ｏｎｃｈｏｃｅｒｃａ  ｖｏｌｖｕｌｕｓ、Ｏｐｉｓｔｈｏｒｃｈｉｓ  ｓｐｐ．、パルボウイルスＢ１９（Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ  Ｂ１９）、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｓｐｐ．、Ｐｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｖｉｖａｘ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｓｐｐ．、Ｐｌｅｓｉｏｍｏｎａｓ  ｓｈｉｇｅｌｌｏｉｄｅｓ、ポワッサン脳炎ウイルス（Ｐｏｗａｓｓａｎ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）、Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｓｐｐ．、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．（Ｐ．ｍａｌｌｅｉ、Ｐ．ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ以外）、狂犬病ウイルス（Ｒａｂｉｅｓ  ｖｉｒｕｓ）、呼吸器多核体ウイルス（Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ）、ライノウイルス（Ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ）、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ａｋａｒｉ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｐｒｏｗａｚｅｋｉｉ、Ｒ．Ｃａｎａｄａ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｉ、リフトバレーウイルス（Ｒｉｆｔ  Ｖａｌｌｅｙ  ｖｉｒｕｓ）、ロスリバーウイルス（Ｒｏｓｓ  ｒｉｖｅｒ  ｖｉｒｕｓ）／オニョンニョンウイルス（Ｏ’Ｎｙｏｎｇ−Ｎｙｏｎｇ  ｖｉｒｕｓ）、風疹ウイルス（Ｒｕｂｅｌｌａ  ｖｉｒｕｓ）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｐａｒａｔｙｐｈｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．（上に列挙されている種を例外として）、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｓｐｐ．、スクレイピー病原体（Ｓｃｒａｐｉｅ  ａｇｅｎｔ）、Ｓ��ｒｒａｔｉａ  ｓｐｐ．、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｐｐ．、シンドビスウイルス（Ｓｉｎｄｂｉｓ  ｖｉｒｕｓ）、Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ  ｓｃｈｅｎｃｋｉｉ、セントルイス脳炎ウイルス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）、マレー渓谷脳炎ウイルス（Ｍｕｒｒａｙ  Ｖａｌｌｅｙ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｔａｅｎｉａ  ｓａｇｉｎａｔａ、Ｔａｅｎｉａ  ｓｏｌｉｕｍ、Ｔｏｘｏｃａｒａ  ｃａｎｉｓ、Ｔ．ｃａｔｉ、Ｔ．ｃｒｕｚｉ、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ、Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．、Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ、Ｔｒｉｃｈｕｒｉｓ  ｔｒｉｃｈｉｕｒａ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉ、Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ  ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ、ワクシニアウイルス
（Ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ）、水痘帯状疱疹ウイルス（Ｖａｒｉｃｅｌｌａ−ｚｏｓｔｅｒ  ｖｉｒｕｓ）、東部ウマ脳炎ウイルス（ｅａｓｔｅｒｎ  ｅｑｕｉｎｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）（ＥＥＥＶ）、重症急性呼吸器症候群ウイルス（ｓｅｖｅｒｅ  ａｃｕｔｅ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｖｉｒｕｓ）（ＳＡＲＳ）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（Ｖｅｎｅｚｕｅｌａｎ  ｅｑｕｉｎｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）（ＶＥＥＶ）、水疱性口内炎ウイルス（Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ、血液型亜型０１、Ｖｉｂｒｉｏ  ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、ウエストナイルウイルス（Ｗｅｓｔ  Ｎｉｌｅ  ｖｉｒｕｓ）、Ｗｕｃｈｅｒｅｒｉａ  ｂａｎｃｒｏｆｔｉ、Ｙｅｌｌｏｗ  ｆｅｖｅｒ  ｖｉｒｕｓ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、およびＹｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ。標的抗原としては、感染性生物のいずれかによって産生されるタンパク質、またはそのバリアントもしくは断片を挙げることができる。
【０２１０】
フィロウイルス（例えば、エボラ（Ｅｂｏｌａ）、マーブルグ（Ｍａｒｂｕｒｇ）、およびレストン（Ｒｅｓｔｏｎ））、アレナウイルス（例えば、ラッサ（Ｌａｓｓａ）、フニン（Ｊｕｎｉｎ）、およびマチュポ（Ｍａｃｈｕｐｏ））、およびブニヤウイルスを含めたいくつものウイルスがウイルス性出血熱に関連付けられている。さらに、例えばリフトバレー熱ウイルスを含めたフレボウイルスがウイルス性出血熱の病原因子として同定されている。出血熱および付随する炎症の病原因子としては、パラミクソウイルス、特に呼吸器合胞体ウイルスも挙げることができる。さらに、人間における出血熱を引き起こす他のウイルスが、以下のウイルス群に属すると同定されている：トガウイルス（チクングニア）、フラビウイルス（デング、黄熱病、キャサヌール森林病、オムスク出血熱）、ナイロウイルス（クリミア・コンゴ出血熱）およびハンタウイルス（腎症候群、流行性腎症（ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｉｃ  ｅｐｉｄｅｍｉａ）を伴う出血熱）。さらに、シンノンブルウイルスが、１９９３年のアメリカ南西部におけるハンタウイルス肺症候群の大流行の病原因子として同定された。
【０２１１】
標的抗原としては、ウイルスコートタンパク質、すなわちインフルエンザノイラミニダーゼ、および赤血球凝集素、ＨＩＶ  ｇｐ１６０またはその誘導体、ＨＩＶ  Ｇａｇ、ＨＩＶ  Ｎｅｆ、ＨＩＶ  Ｐｏｌ、ＳＡＲＳコートタンパク質、ヘルペスビリオンタンパク質、ＷＮＶタンパク質などを挙げることができる。標的抗原として、肺炎球菌ＰｓａＡ、ＰｓｐＡ、ＬｙｔＡを含めた細菌表面タンパク質、Ｎｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｎｏｒｈｅａなどの細菌性病原体の表面または毒力関連タンパク質、外膜タンパク質または表面プロテアーゼも挙げることができる。
【０２１２】
ＨＰＶ抗原標的
標的抗原として、腫瘍性タンパク質Ｅ６およびＥ７などの、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）に関連するタンパク質、またはそのバリアントもしくは断片も挙げることができる。ある特定の実施形態では、腫瘍性タンパク質を改変して、非腫瘍形成バリアントまたは野生型タンパク質と比較して腫瘍原性が低下したバリアントを作製することができる。例えば、腫瘍抑制因子タンパク質（例えば、ｐ５３およびｐＲｂ）との結合に関与するペプチドの部分を欠失させるかまたは改変し、その結果もはや腫瘍抑制因子タンパク質と相互作用しないようにすることができる。別の例として、Ｈｅｒ２／ｎｅｕなどのキナーゼである腫瘍性タンパク質を、例えば点変異によってキナーゼ不活性化することができる。一部の例では、免疫の間に２つまたはそれ超の標的抗原を使用することができる。例えば、Ｅ６抗原とＥ７抗原を組み合わせて融合タンパク質にすることもでき、改変されたまたは改変されていないＥ６標的抗原およびＥ７標的抗原をコードする異種ヌクレオチドを含有する別々のベクターを組み合わせて使用する。例えば、Ａｄ５−Ｅ６ベクターをＡｄ５−Ｅ７ベクターと共に投与することができる。本実施例では、Ａｄ５−Ｅ６ベクターおよびＡｄ５−Ｅ７ベクターは、同時に投与することもでき、逐次的に投与することもできる。
【０２１３】
ＨＰＶ１６型などの高リスクヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）は、子宮頸部癌およびＨＰＶ関連頭頸部扁平上皮細胞癌の９０％超の病因に関連付けられる。ヒトパピローマウイルス二価［１６型および１８型］ワクチンおよび組換え型ヒトパピローマウイルス四価［６型、１１型、１６型、および１８型］ワクチンなどの防止ワクチンは、ウイルスの感染を防止することにより、ＨＰＶ関連がんに対する一次防御になり得るが、複数の報告により、確立された疾患の能動免疫療法には有効でないことが示されている。ＨＰＶ初期６（Ｅ６）遺伝子およびＨＰＶ初期７（Ｅ７）遺伝子は、ＨＰＶにより誘導されるがんにおいて高レベルで発現し、原発性ヒト表皮細胞の不死化に関与する。したがって、これらのウイルス抗原は、多くの他の腫瘍関連抗原とは異なり、「非自己」であり、したがって、自己免疫が誘導される潜在性がないので、腫瘍に特異的な免疫療法の理想的な標的である。
【０２１４】
本明細書には、ＨＰＶ１６遺伝子Ｅ６およびＥ７に対する免疫のためのウイルス遺伝子送達プラットフォーム（Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−Ｅ６／Ｅ７）をプログラム死−リガンド１（ＰＤ１）遮断と組み合わせて使用する、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）に対する免疫療法が開示されている。本明細書には、ＨＰＶ１６型Ｅ６およびＥ７の改変遺伝子を有する遺伝子送達ビヒクル（Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］）で構成される免疫療法薬も開示されている。ＨＰＶ  Ｅ６およびＥ７遺伝子は、それらが、ＨＰＶにより誘導される腫瘍に対する免疫応答を生じさせるのに必要な抗原性は保持しながら、非腫瘍形成性になるように改変することができる。改変遺伝子は、ｐ５３、ｐＲｂ、およびＰＴＰＮ１３を分解する能力を欠き得る。改変遺伝子をワクチン（Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−Ｅ６／Ｅ７）に組み入れることができる。Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−Ｅ６／Ｅ７ワクチンは、ＨＰＶに特異的な細胞媒介性免疫（ＣＭＩ）応答を誘導する能力を保持し得、また、標準の臨床療法と協同し、それにより、ＨＰＶ−Ｅ６／Ｅ７発現腫瘍の免疫媒介性クリアランスを増強し得る。
【０２１５】
活性化シグナルと阻害シグナルの平衡によりＴリンパ球と腫瘍細胞の相互作用が調節され、ここで、Ｔ細胞応答はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）による抗原認識によって開始される。一部の場合では、ＨＰＶ−Ｅ６／Ｅ７発現腫瘍を有するマウスにおいてＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−Ｅ６／Ｅ７を用いた免疫療法処置と化学療法／放射線処置を組み合わせることにより、化学療法／放射線を単独で受ける被験体と比較して、全生存の有意な改善がもたらされ得る。
【０２１６】
個人向けの腫瘍関連抗原
ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法で使用する腫瘍関連抗原は、増殖性疾患またはがんを有する個体から直接同定することができる。ある特定の実施形態では、がんは、良性腫瘍、転移性腫瘍、癌腫、または肉腫などを含み得る。一部の実施形態では、個人向けの腫瘍抗原は、患者から特徴付けられ、標的抗原として、全体として、一部、またはバリアントとしてさらに利用されるＭＵＣ１、ＭＵＣ１ｃ、ＭＵＣ１ｎ、Ｔ、またはＣＥＡを含み得る。
【０２１７】
この点について、個体から腫瘍標的抗原を同定するための種々の公知の技術を使用してスクリーニングを行うことができる。例えば、一実施形態では、腫瘍の生検材料を患者から取得し、腫瘍細胞からＲＮＡを単離し、遺伝子チップ（例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、Ｃａｌｉｆからのもの）を使用してスクリーニングし、腫瘍抗原を同定する。腫瘍標的抗原が同定されたら、次いで、それを、当技術分野で公知の技法を使用してクローニングし、発現させ、精製することができる。
【０２１８】
次いで、この標的抗原を、１つもしくは複数のエピトープに連結するか、または、本明細書に記載されているカセットまたはウイルスベクターに組み入れるかもしくはそれに連結し、腫瘍から単離された標的分子に対する免疫応答を変化させるために、患者に投与する。このように、本発明に関しては、「個人向けの」免疫療法およびワクチンが意図されている。がんが遺伝的、すなわち遺伝性である、例えば、患者がＢＲＡＣ１またはＢＲＡＣ２変異を有することが同定されている場合、ワクチンを予防的に使用することができる。がんが散発性である場合、被験体において、腫瘍のサイズを縮小させるため、全生存を増強するため、およびがんの再発を低下するために、免疫療法を使用することができる。
【０２１９】
組み合わせ免疫療法およびワクチン
本開示は、がんおよび感染症を処置するための組み合わせ免疫療法およびワクチン組成物を提供する。一部の態様では、本明細書において提示される組み合わせ免疫療法およびワクチンは、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）などのがんの発生に関連する抗原、または、感染症関連抗原（ＩＤＡＡ）などの特定の感染症に関与することが公知の抗原に対する多標的化免疫療法薬アプローチを含み得る。一部の態様では、本明細書において提示される組み合わせ免疫療法およびワクチンは、がんまたは感染症の発生に関連する抗原に対する多標的化抗原シグネチャ免疫療法薬アプローチを含み得る。種々の実施形態では、本発明の組成物および方法は、本明細書において提示される疾患の免疫のための、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１ｃ、ＭＵＣ１ｎ、Ｔ、および／またはＣＥＡのバリアントを発現する、ウイルスをベースとしたベクターを提供する。これらのベクターにより、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１ｃ、ＭＵＣ１ｎ、Ｔ、および／またはＣＥＡに対する免疫応答を生じさせることができる。
【０２２０】
一部の態様では、ベクターは、少なくとも１つの抗原を含む。一部の態様では、ベクターは、少なくとも２つの抗原を含む。一部の態様では、ベクターは、少なくとも３つの抗原を含む。一部の態様では、ベクターは、３つ超の抗原を含む。一部の態様では、ワクチン製剤は、ベクターと抗原を１：１の比率で含む。一部の態様では、ワクチンは、ベクターと抗原を１：２の比率で含む。一部の態様では、ワクチンは、ベクターと抗原を１：３の比率で含む。一部の態様では、ワクチンは、ベクターと抗原を１：４の比率で含む。一部の態様では、ワクチンは、ベクターと抗原を１：５の比率で含む。一部の態様では、ワクチンは、ベクターと抗原を１：６の比率で含む。一部の態様では、ワクチンは、ベクターと抗原を１：７の比率で含む。一部の態様では、ワクチンは、ベクターと抗原を１：８の比率で含む。一部の態様では、ワクチンは、ベクターと抗原を１：９の比率で含む。一部の態様では、ワクチンは、ベクターと抗原を１：１０の比率で含む。
【０２２１】
一部の態様では、ワクチンは、混合ワクチンであり、ワクチンは、それぞれが少なくとも単一の抗原を含有する少なくとも２つのベクターを含む。一部の態様では、ワクチンは、混合ワクチンであり、ワクチンは、それぞれが少なくとも単一の抗原標的を含有する少なくとも３つのベクターを含む。一部の態様では、ワクチンは、混合ワクチンであり、ワクチンは、それぞれが少なくとも単一の抗原を含有する３つ超のベクターを含む。
【０２２２】
一部の態様では、ワクチンは、混合ワクチンであり、ワクチンは、少なくとも２つのベクターを含み、少なくとも２つのベクターの第１のベクターは少なくとも単一の抗原を含み、少なくとも２つのベクターの第２のベクターは、少なくとも２つの抗原を含む。一部の態様では、ワクチンは、混合ワクチンであり、ワクチンは、少なくとも３つのベクターを含み、少なくとも３つのベクターの第１のベクターは少なくとも単一の抗原を含み、少なくとも３つのベクターの第２のベクターは少なくとも２つの抗原を含む。一部の態様では、ワクチンは、混合ワクチンであり、ワクチンは、３つまたはそれ超のベクターを含み、３つまたはそれ超のベクターの第１のベクターは少なくとも単一の抗原を含み、３つまたはそれ超のベクターの第２のベクターは、少なくとも２つの抗原を含む。一部の態様では、ワクチンは、混合ワクチンであり、ワクチンは、それぞれが少なくとも２つの抗原を含有する３つ超のベクターを含む。
【０２２３】
種々の抗原の混合物を同時に投与する、または個体において同じベクターもしくは異なるベクターから発現させる場合、これらは互いと競合し得る。結果として、組み合わせ免疫療法またはワクチン中の発現された抗原を異なる濃度および比率で含む製剤は、投与後に有効かつ持続的な免疫応答が生じることを確実にするために、評価し、個体または個体の群に合わせて調整しなければならない。
【０２２４】
複数の抗原を含む組成物は、種々の比率で存在し得る。例えば、１つ超のベクターを伴う製剤は、種々の比率を有し得る。例えば、免疫療法またはワクチンは、２つの異なるベクターを以下の化学量論で有し得る：１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１５、１：２０、１：３０、２：１、２：３、２：４、２：５、２：６、２：７、２：８、３：１、３：３、３：４、３：５、３：６、３：７、３：８、３：１、３：３、３：４、３：５、３：６、３：７、３：８、４：１、４：３、４：５、４：６、４：７、４：８、５：１、５：３、５：４、５：６、５：７、５：８、６：１、６：３、６：４、６：５、６：７、６：８、７：１、７：３、７：４、７：５、７：６、７：８、８：１、８：３、８：４、８：５、８：６、または８：７。例えば、免疫療法またはワクチンは、３つの異なるベクターを以下の化学量論で有し得る：１：１：１、１：２：１、１：３：１、１：４：１、１：５：１、１：６：１、１：７：１、１：８：１、２：１：１、２：３：１、２：４：１、２：５：１、２：６：１、２：７：１、２：８：１、３：１、３：３：１、３：４：１、３：５：１、３：６：１、３：７：１、３：８：１、３：１：１、３：３：１、３：４：１、３：５：１、３：６：１、３：７：１、３：８：１、４：１：１、４：３：１、４：４：１、４：５：１、４：６：１、４：７：１、４：８：１、５：１：１、５：３：１、５：４：１、５：５：１、５：６：１、５：７：１、５：８：１、６：１：１、６：３：１、６：４：１、６：５：１、６：６：１、６：７：１、６：８：１、７：１：１、７：３：１、７：４：１、７：５：１、７：６：１、７：７：１、７：８：１、８：１：１、８：３：１、８：４：１、８：５：１、８：６：１、８：７：１、８：８：１、１：１：２、１：２：２、１：３：２、１：４：２、１：５：２、１：６：２、１：７：２、１：８：２、２：１：２、２：３：２、２：４：２、２：５：２、２：６：２、２：７：２、２：８：２、３：１：２、３：３：２、３：４：２、３：５：２、３：６：２、３：７：２、３：８：２、３：１：２、３：３：２、３：４：２、３：５：２、３：６：２、３：７：２、３：８：２、４：１：２、４：３：２、４：４：２、４：５：２、４：６：２、４：７：２、４：８：２、５：１：２、５：３：２、５：４：２、５：５：２、５：６：２、５：７：２、５：８：２、６：１：２、６：３：２、６：４：２、６：５：２、６：６：２、６：７：２、６：８：２、７：１：２、７：３：２、７：４：２、７：５：２、７：６：２、７：７：２、７：８：２、８：１：２、８：３：２、８：４：２、８：５：２、８：６：２、８：７：２、８：８：２、１：１：３、１：２：３、１：３：３、１：４：３、１：５：３、１：６：３、１：７：３、１：８：３、２：１：３、２：３：３、２：４：３、２：５：３、２：６：３、２：７：３、２：８：３、３：１：３、３：３：３、３：４：３、３：５：３、３：６：３、３：７：３、３：８：３、３：１：３、３：３：３、３：４：３、３：５：３、３：６：３、３：７：３、３：８：３、４：１：３、４：３：３、４：４：３、４：５：３、４：６：３、４：７：３、４：８：３、５：１：３、５：３：３、５：４：３、５：５：３、５：６：３、５：７：３、５：８：３、６：１：３、６：３：３、６：４：３、６：５：３、６：６：３、６：７：３、６：８：３、７：１：３、７：３：３、７：４：３、７：５：３、７：６：３、７：７：３、７：８：３、８：１：３、８：３：３、８：４：３、８：５：３、８：６：３、８：７：３、８：８：３、１：１：４、１：２：４、１：３：４、１：４：４、１：５：４、１：６：４、１：７：４、１：８：４、２：１：４、２：３：４、２：４：４、２：５：４、２：６：４、２：７：４、２：８：４、３：１：４、３：３：４、３：４：４、３：５：４、３：６：４、３：７：４、３：８：４、３：１：４、３：３：４、３：４：４、３：５：４、３：６：４、３：７：４、３：８：４、４：１：４、４：３：４、４：４：４、４：５：４、４：６：４、４：７：４、４：８：４、５：１：４、５：３：４、５：４：４、５：５：４、５：６：４、５：７：４、５：８：４、６：１：４、６：３：４、６：４：４、６：５：４、６：６：４、６：７：４、６：８：４、７：１：４、７：３：４、７：４：４、７：５：４、７：６：４、７：７：４、７：８：４、８：１：４、８：３：４、８：４：３、８：５：４、８：６：４、８：７：４、８：８：４、１：１：５、１：２：５、１：３：５、１：４：５、１：５：５、１：６：５、１：７：５、１：８：５、２：１：５、２：３：５、２：４：５、２：５：５、２：６：５、２：７：５、２：８：５、３：１：５、３：３：５、３：４：５、３：５：５、３：６：５、３：７：５、３：８：５、３：１：５、３：３：５、３：４：５、３：５：５、３：６：５、３：７：５、３：８：５、４：１：５、４：３：５、４：４：５、４：５：５、４：６：５、４：７：５、４：８：５、５：１：５、５：３：５、５：４：５、５：５：５、５：６：５、５：７：５、５：８：５、６：１：５、６：３：５、６：４：５、６：５：５、６：６：５、６：７：５、６：８：５、７：１：５、７：３：５、７：４：５、７：５：５、７：６：５、７：７：５、７：８：５、８：１：５、８：３：５、８：４：５、８：５：５、８：６：５、８：７：５、８：８：５、１：１：６、１：２：６、１：３：６、１：４：６、１：５：６、１：６：６、１：７：６、１：８：６、２：１：６、２：３：６、２：４：６、２：５：６、２：６：６、２：７：６、２：８：６、３：１：６、３：３：６、３：４：６、３：５：６、３：６：６、３：７：６、３：８：６、３：１：６、３：３：６、３：４：６、３：５：６、３：６：６、３：７：６、３：８：６、４：１：６、４：３：６、４：４：６、４：５：６、４：６：６、４：７：６、４：８：６、５：１：６、５：３：６、５：４：６、５：５：６、５：６：６、５：７：６、５：８：６、６：１：６、６：３：６、６：４：６、６：５：６、６：６：６、６：７：６、６：８：６、７：１：６、７：３：６、７：４：６、７：５：６、７：６：６、７：７：６、７：８：６、８：１：６、８：３：６、８：４：６、８：５：６、８：６：５、８：７：６、８：８：６、１：１：７、１：２：７、１：３：７、１：４：７、１：５：７、１：６：７、１：７：７、１：８：７、２：１：７、２：３：７、２：４：７、２：５：７、２：６：７、２：７：７、２：８：７、３：１：７、３：３：７、３：４：７、３：５：７、３：６：７、３：７：７、３：８：７、３：１：７、３：３：７、３：４：７、３：５：７、３：６：７、３：７：７、３：８：７、４：１：７、４：３：７、４：４：７、４：５：７、４：６：７、４：７：７、４：８：７、５：１：７、５：３：７、５：４：７、５：５：７、５：６：７、５：７：７、５：８：７、６：１：７、６：３：７、６：４：７、６：５：７、６：６：７、６：７：７、６：８：７、７：１：７、７：３：７、７：４：７、７：５：７、７：６：７、７：７：７、７：８：７、８：１：７、８：３：７、８：４：７、８：５：７、８：６：５、８：７：７、または８：８：７。
【０２２５】
一部の態様では、本開示は、ＴＡＡに指向される多標的化免疫療法薬を含む組み合わせ免疫療法を提供する。一部の態様では、本開示は、ＩＤＡＡに指向される多標的化免疫療法薬を含む組み合わせ免疫療法を提供する。
【０２２６】
本開示は、改変されたＣＥＡ、ＭＵＣ１ｃ、および／またはブラキュリをコードする配列を含む、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または３つ超の異なる標的抗原を含む組み合わせ免疫療法またはワクチンを提供する。例えば、組み合わせ免疫療法またはワクチンは、改変されたＣＥＡ、ＭＵＣ１ｃ、および／またはブラキュリをコードする配列を含む、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または３つ超の異なる標的抗原を含んでよく、ここで、改変されたＣＥＡは、配列番号１または配列番号２に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．５％、または９９．９％の同一性値を有する配列を含み、改変されたＭＵＣ１ｃは、配列番号５または配列番号６に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．５％、または９９．９％の同一性値を有する配列を含み、改変されたブラキュリは、配列番号７または配列番号８に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％、９９．５％、９９．９％の同一性値を有する配列を含む。一部の実施形態では、改変されたＣＥＡは、配列番号１または配列番号２に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％または１００％の同一性値を有する配列を含み、６１０位におけるＡｓｎからＡｓｐへの置換を有する。
【０２２７】
一部の態様では、本開示は、ＴＡＡに指向される多標的化免疫療法薬と、免疫阻害経路の少なくとも１つの免疫チェックポイントタンパク質を標的とする免疫経路チェックポイントモジュレーターを含む分子組成物とを含む組み合わせ免疫療法を提供する。一部の態様では、本開示は、ＩＤＡＡに指向される多標的化免疫療法薬と、免疫阻害経路の少なくとも１つの免疫チェックポイントタンパク質を標的とする免疫経路チェックポイントモジュレーターを含む分子組成物とを含む組み合わせ免疫療法を提供する。本開示は、改変されたＣＥＡ、ＭＵＣ１ｃ、および／またはブラキュリをコードする配列を含む、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または３つ超の異なる標的抗原と、免疫経路チェックポイントモジュレーターを含む少なくとも１つの分子組成物とを含む組み合わせ免疫療法またはワクチンを提供する。例えば、組み合わせ免疫療法またはワクチンは、改変されたＣＥＡ、ＭＵＣ１ｃ、および／またはブラキュリをコードする配列を含む、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または３つ超の異なる標的抗原と、免疫経路チェックポイントモジュレーターを含む少なくとも１つの分子組成物とを含んでよく、ここで、改変されたＣＥＡは、配列番号１または配列番号２に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．５％、または９９．９％の同一性値を有する配列を含み、改変されたＭＵＣ１ｃは、配列番号５または配列番号６に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．５％、または９９．９％の同一性値を有する配列を含み、改変されたブラキュリは、配列番号７または配列番号８に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％、９９．５％、９９．９％の同一性値を有する配列を含む。一部の実施形態では、改変されたＣＥＡは、配列番号１または配列番号２に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％または１００％の同一性値を有する配列を含み、６１０位におけるＡｓｎからＡｓｐへの置換を有する。
【０２２８】
一部の実施形態では、免疫経路チェックポイントモジュレーターは、ＣＴＬＡ４を標的とする。一部の実施形態では、免疫経路チェックポイントモジュレーターは、ＰＤ１を標的とする。一部の実施形態では、免疫経路チェックポイントモジュレーターは、ＰＤＬ１を標的とする。一部の実施形態では、免疫経路チェックポイントモジュレーターは、ＬＡＧ３を標的とする。一部の実施形態では、免疫経路チェックポイントモジュレーターは、Ｂ７−Ｈ３を標的とする。一部の実施形態では、免疫経路チェックポイントモジュレーターは、Ｂ７−Ｈ４を標的とする。一部の実施形態では、免疫経路チェックポイントモジュレーターは、ＴＩＭ３を標的とする。一部の実施形態では、免疫経路チェックポイントモジュレーターは、ＰＤ１、ＰＤＬ１、ＰＤＬ２、ＣＤ２８、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＴＬＡ４、Ｂ７ＲＰ１、ＩＣＯＳ、Ｂ７ＲＰＩ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＨＶＥＭ、ＫＩＲ、ＴＣＲ、ＬＡＧ３、ＣＤ１３７、ＣＤ１３７Ｌ、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ２７、ＣＤ７０、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＴＩＭ３（すなわち、ＨＡＶｃｒ２）、ＧＡＬ９、およびＡ２ａＲに指向されるモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である。
【０２２９】
一部の実施形態では、組換え型核酸ベクターの少なくとも１つは、第１の同一性値を含む複製欠損性アデノウイルス５型ベクターを含む複製欠損性アデノウイルスベクターである。一部の実施形態では、複製欠損性アデノウイルスベクターは、Ｅ２ｂ領域の欠失を含む。一部の実施形態では、複製欠損性アデノウイルスベクターは、Ｅ１領域の欠失をさらに含む。一部の実施形態では、第１の同一性値は、少なくとも９０％である。一部の実施形態では、第１の同一性値は、少なくとも９５％である。一部の実施形態では、第１の同一性値は、少なくとも９９％である。一部の実施形態では、第１の同一性値は、１００％である。一部の実施形態では、第１の同一性値は、少なくとも９０％である。一部の実施形態では、第１の同一性値は、少なくとも９５％である。一部の実施形態では、第１の同一性値は、少なくとも９９％である。一部の実施形態では、第１の同一性値は、１００％である。一部の実施形態では、第１の同一性値は、少なくとも９０％である。一部の実施形態では、第１の同一性値は、少なくとも９５％である。一部の実施形態では、第１の同一性値は、少なくとも９９％である。一部の実施形態では、第１の同一性値は、１００％である。
【０２３０】
一部の実施形態では、組換え型核酸ベクターの少なくとも１つは、配列番号３に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、組換え型核酸ベクターは、配列番号３内の領域に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有する領域を含み、ここで、領域は、２６０４８〜２６１７７、２６０６３〜２６１４１、１〜１０３、５４〜１０３、３２２１４〜３２３１５、および３２２１４〜３２２６２から選択される。一部の実施形態では、組換え型核酸ベクターは、配列番号３内の１０５７位から３１６５位の間の領域によりコードされるペプチドに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有するペプチドをコードする領域をさらに含む。
【０２３１】
免疫学的融合パートナー抗原標的
本発明のウイルスベクターは、標的抗原の免疫原性を増大させるタンパク質をコードする核酸配列も含み得る。この点について、そのようなタンパク質を含有するウイルスベクターを用いた免疫後に産生されるタンパク質は、目的の標的抗原と目的の標的抗原の免疫原性を増大させるタンパク質が融合した融合タンパク質であり得る。
【０２３２】
一実施形態では、そのような免疫学的融合パートナーは、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ由来のＲａ１２断片などの、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．に由来するものである。Ｒａ１２組成物、および異種ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列の発現および／または免疫原性の増強においてそれらを使用する方法は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第６０／１５８，５８５号および米国特許第７，００９，０４２号に記載されている。簡単に述べると、Ｒａ１２とは、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ＭＴＢ３２Ａ核酸の部分配列であるポリヌクレオチド領域を指す。ＭＴＢ３２Ａは、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの毒性株および無毒性株の遺伝子によりコードされる３２ｋＤａのセリンプロテアーゼである。ＭＴＢ３２Ａのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列が記載されている（例えば、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第６０／１５８，５８５号；Ｓｋｅｉｋｙら、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎ．、６７巻：３９９８〜４００７頁（１９９９年）を参照されたい）。ＭＴＢ３２Ａコード配列のＣ末端断片は、高レベルで発現し、精製プロセス全体を通して可溶性ポリペプチドとして残る。さらに、Ｒａ１２は、それが融合している異種免疫原性ポリペプチドの免疫原性を増強し得る。１つのＲａ１２融合ポリペプチドは、ＭＴＢ３２Ａのアミノ酸残基１９２〜３２３に対応する１４ｋＤａのＣ末端断片を含む。他のＲａ１２ポリヌクレオチドは、一般に、Ｒａ１２ポリペプチドの一部をコードする少なくとも約１５、３０、６０、１００、２００、３００、またはそれ超のヌクレオチドを含む。Ｒａ１２ポリヌクレオチドは、ネイティブな配列（すなわち、Ｒａ１２ポリペプチドまたはその一部をコードする内因性配列）を含んでもよく、そのような配列のバリアントを含んでもよい。Ｒａ１２ポリヌクレオチドバリアントは、コードされる融合ポリペプチドの生物活性が、ネイティブなＲａ１２ポリペプチドを含む融合ポリペプチドと比較して実質的に低下しないような１つまたは複数の置換、付加、欠失および／または挿入を含有し得る。バリアントは、ネイティブなＲａ１２ポリペプチドまたはその一部をコードするポリヌクレオチド配列に対して少なくとも約７０％、８０％、または９０％、またはそれ超の同一性を有し得る。
【０２３３】
免疫学的融合パートナーは、グラム陰性菌Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｂの表面タンパク質であるタンパク質Ｄに由来するものであってよい。一部の場合では、タンパク質Ｄ誘導体は、およそタンパク質の最初の３分の１（例えば、最初のＮ末端の１００〜１１０アミノ酸）を含む。タンパク質Ｄ誘導体は、脂質付加されたものであってよい。ある特定の実施形態の範囲内では、リポタンパク質Ｄ融合パートナーの最初の１０９残基をＮ末端に含めて、ポリペプチドに、Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現レベルを上昇させることができ、発現エンハンサーとして機能し得る追加的な外因性Ｔ細胞エピトープをもたらす。脂質尾部により、抗原提示細胞への最適な抗原の提示を確実にすることができる。他の融合パートナーとしては、インフルエンザウイルス由来の非構造タンパク質であるＮＳ１（赤血球凝集素）が挙げられる。一般には、Ｎ末端の８１アミノ酸を使用するが、Ｔ−ヘルパーエピトープを含む異なる断片を使用することができる。
【０２３４】
免疫学的融合パートナーは、ＬＹＴＡとして公知のタンパク質、またはその一部（好ましくは、Ｃ末端部分）であってよい。ＬＹＴＡは、アミダーゼＬＹＴＡ（ＬｙｔＡ遺伝子によりコードされる）として公知のＮ−アセチル−Ｌ−アラニンアミダーゼを合成するＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに由来する。ＬＹＴＡは、ペプチドグリカン骨格内のある特定の結合を特異的に分解する自己溶解素である。ＬＹＴＡタンパク質のＣ末端ドメインは、コリンまたはＤＥＡＥなどの一部のコリン類似体に対する親和性に関与する。この性質は、融合タンパク質を発現させるために有用なＥ．ｃｏｌｉ  Ｃ−ＬＹＴＡ発現プラスミドの開発に活用されている。アミノ末端にＣ−ＬＹＴＡ断片を含有するハイブリッドタンパク質の精製を使用することができる。別の実施形態の範囲内では、ＬＹＴＡの反復部分を融合ポリペプチドに組み入れることができる。反復部分は、例えば、残基１７８で始まるＣ末端領域において見いだすことができる。１つの特定の反復部分には残基１８８〜３０５が組み入れられる。
【０２３５】
一部の実施形態では、抗原標的は、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦα、ＩＬ−２、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＩＬ−７、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、およびＩＬ−１３の群より選択されるサイトカインを含む免疫原性成分を含む。一部の実施形態では、抗原標的は、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦα、ＩＬ−２、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＩＬ−７、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、およびＩＬ−１３の群より選択されるサイトカインを含む１つまたは複数の免疫原性成分をさらに含む。一部の実施形態では、抗原標的は、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦα、ＩＬ−２、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＩＬ−７、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、およびＩＬ−１３をコードする核酸、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦα、ＩＬ−２、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＩＬ−７、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、およびＩＬ−１３に対して実質的な同一性を有するタンパク質、ならびに、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦα、ＩＬ−２、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＩＬ−７、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、およびＩＬ−１３に対して実質的な同一性を有するタンパク質をコードする核酸を含む免疫原性成分を含む。
【０２３６】
一部の実施形態では、抗原標的は、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦα、ＩＬ−２、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＩＬ−７、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、およびＩＬ−１３の群より選択されるサイトカインを含む免疫原性成分と融合または連結している。一部の実施形態では、抗原標的を細胞においてＩＦＮ−γ、ＴＮＦα、ＩＬ−２、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＩＬ−７、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、およびＩＬ−１３の群より選択されるサイトカインを含む免疫原性成分と同時発現させる。
【０２３７】
免疫経路チェックポイントモジュレーター
一部の実施形態では、本発明の組成物を１つまたは複数の免疫チェックポイントモジュレーターと一緒に投与する。活性化シグナルと阻害シグナルの平衡によりＴリンパ球と疾患細胞の相互作用が調節され、ここで、Ｔ細胞応答は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）による抗原認識によって開始される。阻害性の経路およびシグナルは、免疫チェックポイントと称される。正常な状況では、免疫チェックポイントは、自己免疫の制御および防止において重大な役割を果たし、また、病原性感染に応答して組織傷害からの保護も行う。
【０２３８】
本開示は、がんおよび感染症を処置するための、免疫チェックポイント阻害性経路を調節するためのウイルスベクターをベースとしたワクチンおよび組成物を含む組み合わせ免疫療法を提供する。一部の実施形態では、調節とは、遺伝子またはタンパク質の発現または活性を増大させることである。一部の実施形態では、調節とは、遺伝子またはタンパク質の発現または活性を低下させることである。一部の実施形態では、調節とは、遺伝子またはタンパク質のファミリーに影響を及ぼすものである。
【０２３９】
一般に、免疫阻害経路は、リガンド−受容体相互作用によって開始される。現在では、疾患において、疾患が、被験体において免疫耐性を誘導するための機構として免疫チェックポイント経路を利用することが明らかになっている。
【０２４０】
所与の疾患による被験体における免疫耐性または免疫阻害経路の誘導は、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス、小分子、模倣物、リガンド、受容体もしくはタンパク質の組換え型などの分子組成物、または免疫阻害経路の１つまたは複数を調節することが公知である抗体（Ｉｇ融合タンパク質であり得る）によって遮断することができる。例えば、細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ４）およびプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ１）などの、免疫チェックポイントタンパク質の遮断薬を用いた予備臨床所見から、抗腫瘍免疫の増強の見込みが示されている。
【０２４１】
疾患細胞は複数の阻害性リガンドを発現することが可能であり、また、疾患浸潤性リンパ球は複数の阻害性受容体を発現するので、免疫チェックポイントタンパク質の二重または三重の遮断により、抗疾患免疫を増強することができる。本明細書で提示される組み合わせ免疫療法は、以下の免疫チェックポイントタンパク質の分子組成物を１つまたは複数含み得る：ＰＤ１、ＰＤＬ１、ＰＤＬ２、ＣＤ２８、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＴＬＡ４、Ｂ７ＲＰ１、ＩＣＯＳ、Ｂ７ＲＰＩ、Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６としても公知）、Ｂ７−Ｈ４（Ｂ７−Ｓ１、Ｂ７ｘおよびＶＣＴＮ１としても公知）、ＢＴＬＡ（ＣＤ２７２としても公知）、ＨＶＥＭ、ＫＩＲ、ＴＣＲ、ＬＡＧ３（ＣＤ２２３としても公知）、ＣＤ１３７、ＣＤ１３７Ｌ、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ２７、ＣＤ７０、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＴＩＭ３（ＨＡＶｃｒ２としても公知）、ＧＡＬ９、およびＡ２ａＲ。一部の実施形態では、分子組成物は、ｓｉＲＮＡを含む。一部の実施形態では、分子組成物は、小分子を含む。一部の実施形態では、分子組成物は、リガンドの組換え型を含む。一部の実施形態では、分子組成物は、受容体の組換え型を含む。一部の実施形態では、分子組成物は、抗体を含む。一部の実施形態では、組み合わせ療法は、１つ超の分子組成物および／または１つ超の型の分子組成物を含む。当業者には理解される通り、今後発見される免疫チェックポイント阻害性経路のタンパク質も、本開示に包含されるように企図される。
【０２４２】
一部の実施形態では、組み合わせ免疫療法は、ＣＴＬＡ４を調節するための分子組成物を含む。一部の実施形態では、組み合わせ免疫療法は、ＰＤ１を調節するための分子組成物を含む。一部の実施形態では、組み合わせ免疫療法は、ＰＤＬ１を調節するための分子組成物を含む。一部の実施形態では、組み合わせ免疫療法は、ＬＡＧ３を調節するための分子組成物を含む。一部の実施形態では、組み合わせ免疫療法は、Ｂ７−Ｈ３を調節するための分子組成物を含む。一部の実施形態では、組み合わせ免疫療法は、Ｂ７−Ｈ４を調節するための分子組成物を含む。一部の実施形態では、組み合わせ免疫療法は、ＴＩＭ３を調節するための分子組成物を含む。一部の実施形態では、調節は、発現の増大または増強である。他の実施形態では、調節は、発現の減少または欠如である。
【０２４３】
２つの例示的な免疫チェックポイント阻害剤として、細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原−４（ＣＴＬＡ−４）およびプログラム細胞死タンパク質−１（ＰＤ１）が挙げられる。ＣＴＬＡ−４は、Ｔ細胞において排他的に発現することが可能であり、そこでＴ細胞活性化の初期段階を調節する。ＣＴＬＡ−４は、共刺激性Ｔ細胞受容体ＣＤ２８と相互作用し、それにより、Ｔ細胞活性を阻害するシグナル伝達がもたらされ得る。ＴＣＲ抗原認識が起こったら、ＣＤ２８シグナル伝達によりＴＣＲシグナル伝達が増強され得、一部の場合では、活性化Ｔ細胞が導かれ、ＣＴＬＡ−４によりＣＤ２８のシグナル伝達活性が阻害される。本開示は、増殖性疾患およびがんを処置するための、本明細書において提示される免疫療法と抗ＣＴＬＡ−４モノクローナル抗体の組み合わせを提供する。本開示は、増殖性疾患およびがんを処置するための、本明細書において提示される免疫療法とＣＴＬＡ−４分子組成物の組み合わせを提供する。
【０２４４】
プログラム死細胞タンパク質リガンド−１（ＰＤＬ１）は、Ｂ７ファミリーのメンバーであり、様々な組織および細胞型に分布している。ＰＤＬ１は、ＰＤ１阻害性Ｔ細胞活性化およびＣＴＬ媒介性溶解と相互作用し得る。ＰＤＬ１の有意な発現は種々のヒト腫瘍において実証されており、ＰＤＬ１発現は、腫瘍が宿主の抗腫瘍免疫応答から逃れる重要な機構の１つである。プログラム死−リガンド１（ＰＤＬ１）とプログラム細胞死タンパク質−１（ＰＤ１）は、免疫チェックポイントとして相互作用する。この相互作用は、抗腫瘍免疫応答の鈍化およびその後の腫瘍の進行をもたらす主要な寛容機構であり得る。ＰＤ１は、活性化Ｔ細胞上に存在し、ＰＤ１の主要なリガンドであるＰＤＬ１は、多くの場合、腫瘍細胞および抗原提示細胞（ＡＰＣ）ならびにＢ細胞を含めた他の細胞上に発現する。ＰＤＬ１の有意な発現がＨＰＶ関連頭頸部がんを含めた種々のヒト腫瘍において実証されている。ＰＤＬ１は、Ｔ細胞上でＰＤ１と相互作用し、それによりＴ細胞活性化および細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）媒介性溶解を阻害する。本開示は、増殖性疾患およびがんを処置するための、本明細書において提示される免疫療法と抗ＰＤ１または抗ＰＤＬ１モノクローナル抗体の組み合わせを提供する。本開示は、増殖性疾患およびがんを処置するための、本明細書において提示される免疫療法とＰＤ１または抗ＰＤＬ１分子組成物の組み合わせを提供する。本開示は、増殖性疾患およびがんを処置するための、本明細書において提示される免疫療法と抗ＣＴＬＡ−４および抗ＰＤ１モノクローナル抗体の組み合わせを提供する。本開示は、増殖性疾患およびがんを処置するための、本明細書において提示される免疫療法と抗ＣＴＬＡ−４およびＰＤＬ１モノクローナル抗体の組み合わせを提供する。本開示は、増殖性疾患およびがんを処置するための、本明細書において提示される免疫療法と抗ＣＴＬＡ−４、抗ＰＤ１、ＰＤＬ１、モノクローナル抗体、またはこれらの組み合わせの組み合わせを提供する。
【０２４５】
本明細書では、抗腫瘍効果を増大させることができる、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−Ｅ６／Ｅ７免疫とＰＤ１遮断の組み合わせが提供される。本発明者らは、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−Ｅ６／Ｅ７ワクチンによって誘導されるＣＭＩ応答を特徴付け、確立された小さな腫瘍と大きな腫瘍を処置する治療能力を評価するために、抗腫瘍応答の動態を示す。
【０２４６】
免疫チェックポイント分子は、Ｔ細胞によって発現され得る。免疫チェックポイント分子は、免疫応答を下方調節または阻害するための「ブレーキ」として有効に機能し得る。免疫チェックポイント分子としては、これだけに限定されないが、免疫細胞を直接阻害する、プログラム死１（ＰＤ１、ＰＤＣＤ１またはＣＤ２７９としても公知、受託番号：ＮＭ＿００５０１８）、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ−４、ＣＤ１５２としても公知、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＡＦ４１４１２０．１）、ＬＡＧ３（ＣＤ２２３としても公知、受託番号：ＮＭ＿００２２８６．５）、Ｔｉｍ３（ＨＡＶＣＲ２としても公知、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＪＸ０４９９７９．１）、ＢＴＬＡ（ＣＤ２７２としても公知、受託番号：ＮＭ＿１８１７８０．３）、ＢＹ５５（ＣＤ１６０としても公知、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＣＲ５４１８８８．１）、ＴＩＧＩＴ（ＩＶＳＴＭ３としても公知、受託番号：ＮＭ＿１７３７９９）、ＬＡＩＲ１（ＣＤ３０５としても公知、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＣＲ５４２０５１．１）、ＳＩＧＬＥＣＩＯ（ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号：ＡＹ３５８３３７．１）、２Ｂ４（ＣＤ２４４としても公知、受託番号：ＮＭ＿００１１６６６６４．１）、ＰＰＰ２ＣＡ、ＰＰＰ２ＣＢ、ＰＴＰＮ６、ＰＴＰＮ２２、ＣＤ９６、ＣＲＴＡＭ、ＳＩＧＬＥＣ７、ＳＩＧＬＥＣ９、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＣＡＳＰ８、ＣＡＳＰ１０、ＣＡＳＰ３、ＣＡＳＰ６、ＣＡＳＰ７、ＦＡＤＤ、ＦＡＳ、ＴＧＦＢＲＩＩ、ＴＧＦＲＢＲＩ、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＤ１０、ＳＫＩ、ＳＫＩＬ、ＴＧＩＦｌ、ＩＬＩＯＲＡ、ＩＬ１０ＲＢ、ＨＭＯＸ２、ＩＬ６Ｒ、ＩＬ６ＳＴ、ＥＩＦ２ＡＫ４、ＣＳＫ、ＰＡＧ１、ＳＩＴ１、ＦＯＸＰ３、ＰＲＤＭ１、ＢＡＴＦ、ＧＵＣＹ１Ａ２、ＧＵＣＹ１Ａ３、ＧＵＣＹ１Ｂ２、ＧＵＣＹ１Ｂ３が挙げられる。例えば、それを必要とする患者を処置するために、ＰＤ１を本発明のアデノウイルスワクチンと組み合わせることができる。表１は、網羅的なものではなく、本発明のアデノウイルスワクチンの効率を改善するために不活性化することができる例示的な免疫チェックポイント遺伝子を示す。免疫チェックポイント遺伝子は、表１に列挙されている遺伝子、ならびに共阻害性受容体機能、細胞死、サイトカインシグナル伝達、アルギニントリプトファン飢餓、ＴＣＲシグナル伝達、誘導性Ｔ−ｒｅｇ抑制、転写因子制御性消耗またはアネルギー、および低酸素症媒介性寛容性に関与するその他の遺伝子から選択することができる。
【表１】
0006647315.tif 000002
【０２４７】
アデノウイルスをベースとしたワクチンと免疫経路チェックポイントモジュレーターの組み合わせにより、いずれかの薬剤単独と比較して、処置を受ける患者におけるがん再発の減少がもたらされ得る。本発明のさらに別の実施形態では、アデノウイルスをベースとしたワクチンと免疫経路チェックポイントモジュレーターの組み合わせにより、いずれかの薬剤単独と比較して、処置を受ける患者における転移または微小転移の存在または出現の減少がもたらされ得る。別の実施形態では、アデノウイルスをベースとしたワクチンと免疫経路チェックポイントモジュレーターの組み合わせにより、いずれかの薬剤単独と比較して、処置を受ける患者の改善された全生存がもたらされ得る。一部の場合では、アデノウイルスワクチンと免疫経路チェックポイントモジュレーターの組み合わせにより、いずれかの薬剤単独と比較して、患者における腫瘍特異的Ｔ細胞応答の頻度または強度が増大し得る。
【０２４８】
本発明には、アデノウイルスベクターをベースとしたワクチンの性能を改善するための、免疫チェックポイント阻害の使用も開示されている。免疫チェックポイント阻害は、ワクチン時に施行することができる。免疫チェックポイント阻害は、ワクチン後に施行することもできる。免疫チェックポイント阻害は、アデノウイルスワクチン投与と同時に起こり得る。免疫チェックポイント阻害は、ワクチン接種の１分後、２分後、３分後、４分後、５分後、６分後、７分後、８分後、９分後、１０分後、１５分後、２０分後、３０分後、４０分後、５０分後、または６０分後に起こり得る。免疫チェックポイント阻害はまた、ワクチン接種の１時間後、２時間後、３時間後、４時間後、５時間後、６時間後、７時間後、８時間後、９時間後、１０時間後、１１時間後、１２時間後、１３時間後、１４時間後、１５時間後、１６時間後、１７時間後、１８時間後、１９時間後、２０時間後、２１時間後、２２時間後、２３時間後、または２４時間後に起こり得る。一部の場合では、免疫阻害は、ワクチン接種の１日後、２日後、３日後、４日後、５日後、６日後、または７日後に起こり得る。免疫チェックポイント阻害は、ワクチン接種の前後の任意の時点で起こり得る。
【０２４９】
別の態様では、本発明は、抗原と免疫経路チェックポイントモジュレーターとを含むワクチンに関する。本発明は、被験体の細胞における免疫チェックポイント、例えばＰＤ１、およびその天然の結合パートナー（複数可）の下方制御が有益であると思われる状態を有する被験体を処置するための方法に関し得る。
【０２５０】
免疫経路チェックポイントモジュレーターは、任意の抗原を含むアデノウイルスワクチンと組み合わせることができる。例えば、抗原は、ＭＵＣ１ｃ、ＨＥＲ３、ブラキュリ、ＨＥＲ２ＮＥＵ、ＣＥＡ、またはＰＳＡであってよい。免疫経路チェックポイントモジュレーターをワクチンと組み合わせると、相乗効果が生じ得る。免疫経路チェックポイントモジュレーターをワクチンと組み合わせると、相加効果も生じ得る。
【０２５１】
製剤
本発明は、単独で、または薬学的に許容される担体または賦形剤と共に、任意の経路によって投与することができるワクチン接種レジメンを含む医薬組成物を提供し、そのような投与は、単回投薬および複数回投薬のどちらでも行うことができる。より詳細には、医薬組成物は、種々の薬学的に許容される不活性な担体と、錠剤、カプセル剤、ロゼンジ、トローチ剤、手持ちキャンディ（ｈａｎｄ  ｃａｎｄｙ）、散剤、噴霧剤、水性懸濁剤、注射溶液、エリキシル剤、シロップ剤などの形態で組み合わせることができる。そのような担体としては、固体希釈剤または充填剤、滅菌水性媒体および種々の無毒性の有機溶媒などが挙げられる。さらに、そのような経口医薬製剤は、当該目的のために一般に使用される種々の型の薬剤を用いて適切に甘味および／または風味を付けることができる。全体を通して記載されている組成物は、医薬品として製剤化することができ、疾患、例えば、がんと診断された、それを必要とするヒトまたは哺乳動物を処置するために使用することができる。
【０２５２】
投与に関して、ウイルスベクターストックを適切な緩衝液、生理的に許容される担体、賦形剤などと組み合わせることができる。ある特定の実施形態では、適切な数のウイルスベクター粒子（ＶＰ）を、滅菌ＰＢＳまたは食塩水などの適切な緩衝液中で投与する。本明細書に開示されているある特定の実施形態のウイルスベクター組成物は、皮下投与、非経口投与、静脈内投与、筋肉内投与、または、さらには腹腔内投与のための特定の製剤として提供される。ある特定の実施形態では、遊離塩基または薬理学的に許容される塩としての活性化合物の溶液の製剤は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性物質と適切に混合した水中に調製することができる。グリセロール、液体ポリエチレングリコール、スクアレンをベースとしたエマルション、スクアレンをベースとした水中油エマルション、油中水エマルション、水中油エマルション、非水性エマルション、パラフィン油中水エマルション、ならびにそれらの混合物ならびに油中の分散物も調製することができる。他の実施形態では、ウイルスベクターは、嚥下によってまたは坐薬として投与する丸剤形態のための特定の製剤として提供することができる。
【０２５３】
注射による使用に適した例示的な医薬形態としては、滅菌された注射溶液または分散物を即時調製するための滅菌水溶液または分散物および滅菌粉末が挙げられる（例えば、米国特許第５，４６６，４６８号を参照されたい）。容易な注射可能性（ｓｙｒｉｎｇａｂｉｌｉｔｙ）が存在する限りでは、流体形態が好ましい場合がある。製造および保管の条件下で安定な形態は本発明の範囲内に入る。種々の実施形態では、形態を、細菌、カビおよび真菌などの微生物の混入作用から保護する。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、適切なそれらの混合物、および／または植物油を含有する溶媒または分散媒であってよい。妥当な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングを使用することによって、分散物の場合では必要な粒子サイズを維持することによって、および／または界面活性物質を使用することによって維持することができる。微生物の作用の防止は、種々の抗細菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、およびチメロサールによって容易にすることができる。等張化剤（ｉｓｏｔｏｎｉｃ  ａｇｅｎｔ）、例えば、糖または塩化ナトリウムを含めることが好ましい場合がある。注射用組成物の持続的な吸収は、吸収を遅らせる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物に使用することによってもたらすことができる。
【０２５４】
一実施形態では、水溶液として非経口投与するために、溶液を必要に応じて適切に緩衝し、液体希釈剤をまず十分な食塩水またはグルコースを用いて等張性にすることができる。これらの特定の水溶液は、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与および腹腔内投与に特に適する。これに関連して、使用することができる滅菌水性媒体は、本開示を考慮すれば当業者には分かるであろう。例えば、１回投薬量を等張性ＮａＣｌ溶液１ｍＬに溶解させ、皮下注入用流体１０００ｍＬに添加するかまたは提唱される注入部位に注射することができる（例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、第１５版、１０３５〜１０３８頁および１５７０〜１５８０頁）。処置を受ける被験体の状態に応じて投薬量のいくらかの変動が生じ得る。
【０２５５】
製剤の担体は、任意のかつ全ての溶媒、分散媒、ビヒクル、コーティング、希釈剤、抗細菌剤および抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤、緩衝液、担体溶液、懸濁液、コロイドなどを含んでよい。任意の従来の媒体または薬剤は、活性成分と適合しない場合を除く限りでは、治療用組成物への使用が意図されている。補足的な活性成分も組成物に組み入れることができる。
【０２５６】
ある特定の実施形態では、本発明のウイルスベクターは、アジュバントなどの１つまたは複数の免疫賦活薬と併せて投与することができる。免疫賦活薬とは、抗原に対する免疫応答（抗体および／または細胞媒介性）を増強または強化する基本的にあらゆる物質を指す。免疫賦活薬の１つの型は、アジュバントを含む。多くのアジュバントが、抗原を迅速な異化から保護するように設計された物質、例えば、水酸化アルミニウムまたは鉱油など、および免疫応答の刺激物質、例えば、リピドＡ、Ｂｏｒｔａｄｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓまたはＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓに由来するタンパク質などを含有する。ある特定のアジュバント、例えば、フロイント不完全アジュバントおよび完全アジュバント（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）；Ｍｅｒｃｋ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  ６５（Ｍｅｒｃｋ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．）ＡＳ−２（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ）；水酸化アルミニウムゲル（ミョウバン）またはリン酸アルミニウムなどのアルミニウム塩；カルシウム、鉄または亜鉛の塩；アシル化チロシンの不溶性懸濁液；アシル化糖；陽イオン性にまたは陰イオン性に誘導体化された多糖；ポリホスファゼン；生分解性マイクロスフェア；モノホスホリルリピドＡおよびｑｕｉｌ  Ａなどが市販されている。ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦα、ＩＬ−２、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＩＬ−７、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、および／またはＩＬ−１３などのサイトカイン、および増殖因子のようなその他のものもアジュバントとして使用することができる。
【０２５７】
本発明のある特定の実施形態の範囲内では、アジュバント組成物は、主にＴｈ１型の免疫応答を誘導するものであってよい。高レベルのＴｈ１型サイトカイン（例えば、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦα、ＩＬ−２およびＩＬ−１２）は、投与された抗原に対する細胞媒介性免疫（ｃｅｌｌ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｍｍｕｎｅ）応答の誘導に有利な傾向がある。対照的に、高レベルのＴｈ２型サイトカイン（例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６およびＩＬ−１０）は、体液性免疫応答の誘導に有利な傾向がある。本明細書において提示されるワクチンの適用後、患者においてＴｈ１型応答および／またはＴｈ２型応答を含む免疫応答が支持され得る。応答が主にＴｈ１型であるある特定の実施形態の範囲内では、Ｔｈ１型サイトカインのレベルがＴｈ２型サイトカインのレベルよりも大きな程度まで上昇する。これらのサイトカインのレベルは、標準のアッセイを使用して容易に評価することができる。したがって、本発明の種々の実施形態は、複製欠損性ウイルスベクターによる処置と同時に供給されるサイトカイン、例えば、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦα、ＩＬ−２、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＩＬ−７、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、および／またはＩＬ−１３を使用して、標的抗原、例えば、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１ｃ、ＭＵＣ１ｎ、Ｔ、またはＣＥＡに対する免疫応答を生じさせる治療に関する。一部の実施形態では、サイトカインまたはサイトカインをコードする核酸を、本明細書に記載されている複製欠損性ウイルスベクターと共に投与する。一部の実施形態では、サイトカイン投与をウイルスベクター投与の前またはその後に実施する。一部の実施形態では、標的抗原、例えば、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１ｃ、ＭＵＣ１ｎ、Ｔ、および／またはＣＥＡに対する免疫応答を生じさせることが可能な複製欠損性ウイルスベクターは、サイトカインをコードする配列をさらに含む。
【０２５８】
主にＴｈ１型応答を引き出すためのある特定の例示的なアジュバントとしては、例えば、３−ｄｅ−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡなどのモノホスホリルリピドＡとアルミニウム塩との組み合わせが挙げられる。ＭＰＬ（登録商標）アジュバントが市販されている（例えば、米国特許第４，４３６，７２７号；同第４，８７７，６１１号；同第４，８６６，０３４号および同第４，９１２，０９４号）。ＣｐＧを含有するオリゴヌクレオチド（ＣｐＧジヌクレオチドはメチル化されていない）によっても主にＴｈ１応答が誘導される（例えば、ＷＯ９６／０２５５５、ＷＯ９９／３３４８８および米国特許第６，００８，２００号および同第５，８５６，４６２号を参照されたい）。免疫賦活性ＤＮＡ配列も使用することができる。本発明において使用するための別のアジュバントは、Ｑｕｉｌ  Ａ、または、ＱＳ２１およびＱＳ７（Ａｑｕｉｌａ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．）、エスチン（Ｅｓｃｉｎ）；ジギトニン（Ｄｉｇｉｔｏｎｉｎ）；またはＧｙｐｓｏｐｈｉｌａまたはＣｈｅｎｏｐｏｄｉｕｍ  ｑｕｉｎｏａサポニンを含めたその誘導体などのサポニンを含む。他の製剤は、１つ超のサポニンを本発明のアジュバント組み合わせで、例えば、以下のＱＳ２１、ＱＳ７、Ｑｕｉｌ  Ａ、β−エスチン、またはジギトニンを含む群のうちの少なくとも２つの組み合わせで含んでよい。
【０２５９】
一部の実施形態では、組成物は、鼻腔内噴霧剤、吸入剤、および／または他のエアロゾル送達ビヒクルによって送達することができる。鼻腔内微小粒子樹脂およびリゾホスファチジル−グリセロール化合物を使用した薬物の送達を使用することができる（例えば、米国特許第５，７２５，８７１号を参照されたい）。同様に、ポリテトラフルオロエチレン（ｐｏｌｙｔｅｔｒａｆｌｕｏｒｏｅｔｈｅｙｌｅｎｅ）支持マトリックスの形態の例示的な経粘膜薬物送達を使用することができる（例えば、米国特許第５，７８０，０４５号を参照されたい）。
【０２６０】
本発明の組成物を適切な宿主細胞／生物体に導入するために、リポソーム、ナノカプセル、微小粒子、脂質粒子、小胞などを使用することができる。本発明の組成物は、脂質粒子、リポソーム、小胞、ナノスフェア、またはナノ粒子などのいずれかに封入して送達するために製剤化することができる。あるいは、本発明の組成物を、そのような担体ビヒクルの表面に共有結合または非共有結合のいずれかによって結合させることができる。遺伝子、種々の薬物、放射線療法剤、酵素、ウイルス、転写因子、アロステリックエフェクターなどを種々の培養細胞株および動物に導入するために、リポソームを有効に使用することができる。さらに、リポソームの使用には、全身送達後に自己免疫応答も許容されない毒性も付随しないと思われる。一部の実施形態では、リポソームは、水性媒体中に分散させたリン脂質から形成され、これは多重膜同心二重層小胞（ｍｕｌｔｉｌａｍｅｌｌａｒ  ｃｏｎｃｅｎｔｒｉｃ  ｂｉｌａｙｅｒ  ｖｅｓｉｃｌｅ）（すなわち、多重膜小胞（ｍｕｌｔｉｌａｍｅｌｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅ）（ＭＬＶ）を自然に形成する。
【０２６１】
一部の実施形態では、本発明は、本発明の組成物の薬学的に許容されるナノカプセル製剤を提供する。ナノカプセルには、一般に、化合物を安定かつ再現性がある方式で捕捉することができる。細胞内ポリマー過負荷に起因する副作用を回避するために、そのような超微細粒子（約０．１μｍのサイズ）をｉｎ  ｖｉｖｏにおいて分解可能なポリマーを使用して設計することができる。
【０２６２】
全体を通して記載されている組成物は、化学療法剤（例えば、がんの処置において有用な化学化合物）を含んでもよく、それと共に投与することもできる。開示されているＴ細胞と組み合わせて使用することができるがん化学療法剤としては、これだけに限定されないが、有糸分裂阻害剤（ビンカアルカロイド）、例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシンおよびＮａｖｅｌｂｉｎｅ（商標）（ビノレルビン、５’−ノルアンヒドロブラスチン（５’−ｎｏｒａｎｈｙｄｒｏｂｌａｓｔｉｎｅ））など；トポイソメラーゼＩ阻害剤、例えば、カンプトテシン化合物（例えば、Ｃａｍｐｔｏｓａｒ（商標）（イリノテカンＨＣＬ）、Ｈｙｃａｍｔｉｎ（商標）（トポテカンＨＣＬ）およびカンプトテシンに由来する他の化合物およびその類似体）など；ポドフィロトキシン誘導体、例えば、エトポシド、テニポシドおよびミトポドジド（ｍｉｔｏｐｏｄｏｚｉｄｅ）など；アルキル化剤、例えば、シスプラチン、シクロホスファミド、ナイトロジェンマスタード、トリメチレンチオホスホラミド、カルムスチン、ブスルファン、クロラムブシル、ベルスチン（ｂｅｌｕｓｔｉｎｅ）、ウラシルマスタード、クロマファジン（ｃｈｌｏｍａｐｈａｚｉｎ）、およびダカルバジンなど；代謝拮抗薬、例えば、シトシンアラビノシド、フルオロウラシル、メトトレキサート、メルカプトプリン、アザチオプリン（ａｚａｔｈｉｏｐｒｉｍｅ）、およびプロカルバジンなど；抗生物質、例えば、ドキソルビシン、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ミトラマイシン、マイトマイシン、マイトマイシンＣ（ｍｙｔｏｍｙｃｉｎ  Ｃ）、およびダウノマイシンなど；抗腫瘍抗体；ダカルバジン；アザシチジン；アムサクリン；メルファラン；イホスファミド；およびミトキサントロンが挙げられる。
【０２６３】
本明細書に開示されている組成物は、細胞傷害／抗腫瘍性薬剤および抗血管新生剤を含めた他の抗腫瘍剤と組み合わせて投与することができる。細胞傷害／抗腫瘍性薬剤は、がん細胞を攻撃し、死滅させる薬剤と定義することができる。いくつかの細胞傷害／抗腫瘍性薬剤は、腫瘍細胞内の遺伝物質をアルキル化するアルキル化剤、例えば、シスプラチン、シクロホスファミド、ナイトロジェンマスタード、トリメチレンチオホスホラミド（ｔｈｉｏｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｅ）、カルムスチン、ブスルファン、クロラムブシル、ベルスチン、ウラシルマスタード、クロマファジン、およびダカルバジン（ｄａｃａｂａｚｉｎｅ）であってよい。他の細胞傷害／抗腫瘍性薬剤は、腫瘍細胞に対する代謝拮抗薬、例えば、シトシンアラビノシド、フルオロウラシル、メトトレキサート、メルカプトプリン、アザチオプリン、およびプロカルバジンであってよい。他の細胞傷害／抗腫瘍性薬剤は、抗生物質、例えば、ドキソルビシン、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ミトラマイシン、マイトマイシン、マイトマイシンＣ、およびダウノマイシンであってよい。これらの化合物に関しては複数のリポソーム製剤が市販されている。さらに他の細胞傷害／抗腫瘍性薬剤は、有糸分裂阻害剤（ビンカアルカロイド）であってよい。これらとしては、ビンクリスチン、ビンブラスチンおよびエトポシドが挙げられる。種々の細胞傷害／抗腫瘍性薬剤として、タキソールおよびその誘導体、Ｌ−アスパラギナーゼ、抗腫瘍抗体、ダカルバジン、アザシチジン、アムサクリン、メルファラン、ＶＭ−２６、イホスファミド、ミトキサントロン、およびビンデシンが挙げられる。
【０２６４】
抗血管新生剤も使用することができる。本開示の方法および組成物において使用するために適した抗血管新生剤としては、ヒト化抗体およびキメラ抗体を含めた抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＶＥＧＦアプタマーおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドが挙げられる。血管新生の他の阻害剤としては、アンジオスタチン、エンドスタチン、インターフェロン、インターロイキン１（αおよびβを含む）インターロイキン１２、レチノイン酸、ならびにメタロプロテイナーゼ−１およびメタロプロテイナーゼ−２の組織阻害剤（ＴＩＭＰ−１およびＴＩＭＰ−２）が挙げられる。抗血管新生活性を有するトポイソメラーゼＩＩ阻害剤であるラゾキサンなどのトポイソメラーゼを含めた小分子も使用することができる。
【０２６５】
開示されている発明と組み合わせて使用することができる他の抗がん剤としては、これだけに限定されないが、アシビシン；アクラルビシン；塩酸アコダゾール（ａｃｏｄａｚｏｌｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）；アクロニン；アドゼレシン；アルデスロイキン；アルトレタミン；アンボマイシン（ａｍｂｏｍｙｃｉｎ）；酢酸アメタントロン（ａｍｅｔａｎｔｒｏｎｅ  ａｃｅｔａｔｅ）；アミノグルテチミド；アムサクリン；アナストロゾール；アントラマイシン；アスパラギナーゼ；アスペルリン（ａｓｐｅｒｌｉｎ）；アバスチン；アザシチジン；アゼテパ；アゾトマイシン；バチマスタット；ベンゾデパ（ｂｅｎｚｏｄｅｐａ）；ビカルタミド；塩酸ビサントレン；ジメシル酸ビスナフィド（ｂｉｓｎａｆｉｄｅ  ｄｉｍｅｓｙｌａｔｅ）；ビゼレシン；硫酸ブレオマイシン；ブレキナルナトリウム；ブロピリミン；ブスルファン；カクチノマイシン；カルステロン（ｃａｌｕｓｔｅｒｏｎｅ）；カラセミド（ｃａｒａｃｅｍｉｄｅ）；カルベチマー（ｃａｒｂｅｔｉｍｅｒ）；カルボプラチン；カルムスチン；塩酸カルビシン；カルゼレシン（ｃａｒｚｅｌｅｓｉｎ）；セデフィンゴール（ｃｅｄｅｆｉｎｇｏｌ）；クロラムブシル；シロレマイシン（ｃｉｒｏｌｅｍｙｃｉｎ）；シスプラチン；クラドリビン；メシル酸クリスナトール（ｃｒｉｓｎａｔｏｌ  ｍｅｓｙｌａｔｅ）；シクロホスファミド；シタラビン；ダカルバジン；ダクチノマイシン；塩酸ダウノルビシン；デシタビン；デキソルマプラチン（ｄｅｘｏｒｍａｐｌａｔｉｎ）；デザグアニン（ｄｅｚａｇｕａｎｉｎｅ）；メシル酸デザグアニン；ジアジクオン；ドセタキセル；ドキソルビシン；塩酸ドキソルビシン；ドロロキシフェン（ｄｒｏｌｏｘｉｆｅｎｅ）；クエン酸ドロロキシフェン；プロピオン酸ドロモスタノロン；デュアゾマイシン（ｄｕａｚｏｍｙｃｉｎ）；エダトレキサート；塩酸エフロルニチン；エルサミトルシン（ｅｌｓａｍｉｔｒｕｃｉｎ）；エンロプラチン（ｅｎｌｏｐｌａｔｉｎ）；エンプロマート（ｅｎｐｒｏｍａｔｅ）；エピプロピジン（ｅｐｉｐｒｏｐｉｄｉｎｅ）；塩酸エピルビシン；エルブロゾール（ｅｒｂｕｌｏｚｏｌｅ）；塩酸エソルビシン（ｅｓｏｒｕｂｉｃｉｎ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）；エストラムスチン；リン酸エストラムスチンナトリウム；エタニダゾール；エトポシド；リン酸エトポシド；エトプリン（ｅｔｏｐｒｉｎｅ）；塩酸ファドロゾール；ファザラビン（ｆａｚａｒａｂｉｎｅ）；フェンレチニド；フロクスウリジン；リン酸フルダラビン；フルオロウラシル；フルロシタビン（ｆｌｕｒｏｃｉｔａｂｉｎｅ）；ホスキドン（ｆｏｓｑｕｉｄｏｎｅ）；ホストリエシンナトリウム；ゲムシタビン；塩酸ゲムシタビン；ヒドロキシウレア；塩酸イダルビシン；イホスファミド；イルモホシン（ｉｌｍｏｆｏｓｉｎｅ）；インターロイキンＩＩ（組換え型インターロイキンＩＩ、またはｒＩＬ２を含む）、インターフェロンアルファ−２ａ；インターフェロンアルファ−２ｂ；インターフェロンアルファ−ｎ１；インターフェロンアルファ−ｎ３；インターフェロンベータ−Ｉａ；インターフェロンガンマ−Ｉｂ；イプロプラチン（ｉｐｒｏｐｌａｔｉｎ）；塩酸イリノテカン；酢��ランレオチド；レトロゾール；酢酸リュープロリド；塩酸リアロゾール（ｌｉａｒｏｚｏｌｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）；ロメテレキソールナトリウム（ｌｏｍｅｔｒｅｘｏｌ  ｓｏｄｉｕｍ）；ロムスチン；塩酸ロソキサントロン（ｌｏｓｏｘａｎｔｒｏｎｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）；マソプロコール；マイタンシン；塩酸メクロレタミン；酢酸メゲストロール；酢酸メレンゲストロール；メルファラン；メノガリル；メルカプトプリン；メトトレキサート；メトトレキサートナトリウム；メトプリン（ｍｅｔｏｐｒｉｎｅ）；メツレデパ（ｍｅｔｕｒｅｄｅｐａ）；ミチンドミド（ｍｉｔｉｎｄｏｍｉｄｅ）；ミトカルシン（ｍｉｔｏｃａｒｃｉｎ）；ミトクロミン（ｍｉｔｏｃｒｏｍｉｎ）；ミトギリン（ｍｉｔｏｇｉｌｌｉｎ）；ミトマルシン（ｍｉｔｏｍａｌｃｉｎ）；マイトマイシン；ミトスペル（ｍｉｔｏｓｐｅｒ）；ミトタン；塩酸ミトキサントロン；ミコフェノール酸；ノコダゾール；ノガラマイシン；オルマプラチン（ｏｒｍａｐｌａｔｉｎ）；オキシスラン（ｏｘｉｓｕｒａｎ）；パクリタキセル；ペグアスパラガーゼ；ペリオマイシン（ｐｅｌｉｏｍｙｃｉｎ）；ペンタムスチン（ｐｅｎｔａｍｕｓｔｉｎｅ）；硫酸ペプロマイシン；ペルホスファミド（ｐｅｒｆｏｓｆａｍｉｄｅ）；ピポブロマン；ピポスルファン（ｐｉｐｏｓｕｌｆａｎ）；塩酸ピロキサントロン（ｐｉｒｏｘａｎｔｒｏｎｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）；プリカマイシン；プロメスタン（ｐｌｏｍｅｓｔａｎｅ）；ポルフィマーナトリウム；ポルフィロマイシン；プレドニムスチン；塩酸プロカルバジン；ピューロマイシン；塩酸ピューロマイシン；ピラゾフリン（ｐｙｒａｚｏｆｕｒｉｎ）；リボプリン（ｒｉｂｏｐｒｉｎｅ）；ログレチミド（ｒｏｇｌｅｔｉｍｉｄｅ）；サフィンゴール；塩酸サフィンゴール；セムスチン；シムトラゼン（ｓｉｍｔｒａｚｅｎｅ）；スパルフォセートナトリウム（ｓｐａｒｆｏｓａｔｅ  ｓｏｄｉｕｍ）；スパルソマイシン；塩酸スピロゲルマニウム；スピロムスチン（ｓｐｉｒｏｍｕｓｔｉｎｅ）；スピロプラチン（ｓｐｉｒｏｐｌａｔｉｎ）；ストレプトニグリン；ストレプトゾシン；スロフェヌル（ｓｕｌｏｆｅｎｕｒ）；タリソマイシン（ｔａｌｉｓｏｍｙｃｉｎ）；テコガランナトリウム（ｔｅｃｏｇａｌａｎ  ｓｏｄｉｕｍ）；テガフール；塩酸テロキサントロン（ｔｅｌｏｘａｎｔｒｏｎｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）；テモポルフィン；テニポシド；テロキシロン（ｔｅｒｏｘｉｒｏｎｅ）；テストラクトン；チアミプリン（ｔｈｉａｍｉｐｒｉｎｅ）；チオグアニン；チオテパ；チアゾフリン；チラパザミン；クエン酸トレミフェン；酢酸トレストロン（ｔｒｅｓｔｏｌｏｎｅ  ａｃｅｔａｔｅ）；リン酸トリシリビン（ｔｒｉｃｉｒｉｂｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）；トリメトレキサート；グルクロン酸トリメトレキサート；トリプトレリン；塩酸ツブロゾール（ｔｕｂｕｌｏｚｏｌｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）；ウラシルマスタード；ウレデパ（ｕｒｅｄｅｐａ）；バプレオチド（ｖａｐｒｅｏｔｉｄｅ）；ベルテポルフィン；硫酸ビンブラスチン；硫酸ビンクリスチン；ビンデシン；硫酸ビンデシン；硫酸ビネピジン（ｖｉｎｅｐｉｄｉｎｅ  ｓｕｌｆａｔｅ）；硫酸ビングリシネート（ｖｉｎｇｌｙｃｉｎａｔｅ  ｓｕｌｆａｔｅ）；硫酸ビンロイロシン（ｖｉｎｌｅｕｒｏｓｉｎｅ  ｓｕｌｆａｔｅ）；酒石酸ビノレルビン；硫酸ビンロシジン（ｖｉｎｒｏｓｉｄｉｎｅ  ｓｕｌｆａｔｅ）；硫酸ビンゾリジン（ｖｉｎｚｏｌｉｄｉｎｅ  ｓｕｌｆａｔｅ）；ボロゾール；ゼニプラチン（ｚｅｎｉｐｌａｔｉｎ）；ジノスタチン；塩酸ゾルビシンが挙げられる。他の抗がん薬としては、これだけに限定されないが：２０−エピ−１，２５ジヒドロキシビタミンＤ３；５−エチニルウラシル；アビラテロン（ａｂｉｒａｔｅｒｏｎｅ）；アクラルビシン；アシルフルベン；アデシペノール（ａｄｅｃｙｐｅｎｏｌ）；アドゼレシン；アルデスロイキン；ＡＬＬ−ＴＫアンタゴニスト；アルトレタミン；アンバムスチン（ａｍｂａｍｕｓｔｉｎｅ）；アミドックス（ａｍｉｄｏｘ）；アミホスチン；アミノレブリン酸；アムルビシン；アムサクリン；アナグレリド；アナストロゾール；アンドログラホリド（ａｎｄｒｏｇｒａｐｈｏｌｉｄｅ）；血管新生阻害剤；アンタゴニストＤ；アンタゴニストＧ；アンタレリックス（ａｎｔａｒｅｌｉｘ）；抗背側化形態形成タンパク質−１（ａｎｔｉ−ｄｏｒｓａｌｉｚｉｎｇ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ−１）；抗アントロゲン薬、前立腺癌；抗エストロゲン薬；アンチネオプラストン（ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｏｎ）；アンチセンスオリゴヌクレオチド；アフィディコリングリシネート；アポトーシス遺伝子モジュレーター；アポトーシスレギュレーター；アプリン酸；ａｒａ−ＣＤＰ−ＤＬ−ＰＴＢＡ；アルギニンデアミナーゼ；アスラクリン（ａｓｕｌａｃｒｉｎｅ）；アタメスタン（ａｔａｍｅｓｔａｎｅ）；アトリムスチン（ａｔｒｉｍｕｓｔｉｎｅ）；アキシナスタチン（ａｘｉｎａｓｔａｔｉｎ）１；アキシナスタチン２；アキシナスタチン３；アザセトロン；アザトキシン；アザチロシン；バッカチンＩＩＩ誘導体；バラノール；バチマスタット；ＢＣＲ／ＡＢＬアンタゴニスト；ベンゾクロリン（ｂｅｎｚｏｃｈｌｏｒｉｎ）；ベンゾイルスタウロスポリン；ベータラクタム誘導体；ベータ−アレチン（ａｌｅｔｈｉｎｅ）；ベータクラマイシン（ｂｅｔａｃｌａｍｙｃｉｎ）Ｂ；ベツリン酸；ｂＦＧＦ阻害剤；ビカルタミド；ビサントレン；ビサジリジニルスペルミン；ビスナフィド；ビストラテン（ｂｉｓｔｒａｔｅｎｅ）Ａ；ビゼレシン；ブレフレート（ｂｒｅｆｌａｔｅ）；ブロピリミン；ブドチタン（ｂｕｄｏｔｉｔａｎｅ）；ブチオニンスルホキシミン；カルシポトリオール；カルホスチンＣ；カンプトテシン誘導体；カナリアポックスＩＬ−２；カペシタビン；カルボキサミド−アミノ−トリアゾール；カルボキシアミドトリアゾール；ＣａＲｅｓｔ  Ｍ３；ＣＡＲＮ７００；軟骨由来阻害剤；カルゼレシン；カゼインキナーゼ阻害剤（ＩＣＯＳ）；カスタノスペルミン；セクロピンＢ；セトロレリクス；クロリン；クロロキノキサリンスルホンアミド；シカプロスト；シス−ポルフィリン；クラドリビン；クロミフェン類似体；クロトリマゾール；コリスマイシンＡ；コリスマイシンＢ；コンブレタスタチンＡ４；コンブレタスタチン類似体；コナゲニン（ｃｏｎａｇｅｎｉ��）；クランベシジン（ｃｒａｍｂｅｓｃｉｄｉｎ）８１６；クリスナトール；クリプトフィシン８；クリプトフィシンＡ誘導体；クラシン（ｃｕｒａｃｉｎ）Ａ；シクロペンタントラキノン（ｃｙｃｌｏｐｅｎｔａｎｔｈｒａｑｕｉｎｏｎｅ）；シクロプラタム（ｃｙｃｌｏｐｌａｔａｍ）；シペマイシン（ｃｙｐｅｍｙｃｉｎ）；シタラビンオクホスフェート；細胞溶解因子；シトスタチン（ｃｙｔｏｓｔａｔｉｎ）；ダクリキシマブ；デシタビン；デヒドロジデムニン（ｄｅｈｙｄｒｏｄｉｄｅｍｎｉｎ）Ｂ；デスロレリン（ｄｅｓｌｏｒｅｌｉｎ）；デキサメタゾン；デキシホスファミド（ｄｅｘｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）；デクスラゾキサン；デクスベラパミル；ジアジクオン；ジデムニンＢ；ジドックス（ｄｉｄｏｘ）；ジエチルノルスペルミン；ジヒドロ−５−アザシチジン；ジヒドロタキソール、９−；ジオキサマイシン（ｄｉｏｘａｍｙｃｉｎ）；ジフェニルスピロムスチン；ドセタキセル；ドコサノール；ドラセトロン；ドキシフルリジン；ドロロキシフェン（ｄｒｏｌｏｘｉｆｅｎｅ）；ドロナビノール；デュオカルマイシンＳＡ；エブセレン；エコムスチン（ｅｃｏｍｕｓｔｉｎｅ）；エデルホシン（ｅｄｅｌｆｏｓｉｎｅ）；エドレコロマブ；エフロルニチン；エレメン（ｅｌｅｍｅｎｅ）；エミテフール（ｅｍｉｔｅｆｕｒ）；エピルビシン；エプリステリド；エストラムスチン類似体；エストロゲンアゴニスト；エストロゲンアンタゴニスト；エタニダゾール；リン酸エトポシド；エキセメスタン；ファドロゾール；ファザラビン；フェンレチニド；フィルグラスチム；フィナステリド；フラボピリドール；フレゼラスチン（ｆｌｅｚｅｌａｓｔｉｎｅ）；フルアステロン（ｆｌｕａｓｔｅｒｏｎｅ）；フルダラビン；塩酸フルオロダウノルニシン（ｆｌｕｏｒｏｄａｕｎｏｒｕｎｉｃｉｎ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）；ホルフェニメックス（ｆｏｒｆｅｎｉｍｅｘ）；ホルメスタン；フォストリエシン；フォテムスチン；ガドリニウムテキサフィリン（ｇａｄｏｌｉｎｉｕｍ  ｔｅｘａｐｈｙｒｉｎ）；硝酸ガリウム；ガロシタビン（ｇａｌｏｃｉｔａｂｉｎｅ）；ガニレリクス；ゼラチナーゼ阻害剤；ゲムシタビン；グルタチオン阻害剤；ヘプスルファム（ｈｅｐｓｕｌｆａｍ）；ヘレグリン；
ヘキサメチレンビスアセトアミド；ヒペリシン；イバンドロン酸；イダルビシン；イドキシフェン；イドラマントン（ｉｄｒａｍａｎｔｏｎｅ）；イルモホシン；イロマスタット；イミダゾアクリドン（ｉｍｉｄａｚｏａｃｒｉｄｏｎｅ）；イミキモド；免疫賦活薬ペプチド；インスリン様増殖因子１受容体阻害剤；インターフェロンアゴニスト；インターフェロン；インターロイキン；イオベングアン（ｉｏｂｅｎｇｕａｎｅ）；ヨードドキソルビシン；イポメアノール（ｉｐｏｍｅａｎｏｌ）、４−；イロプラクト（ｉｒｏｐｌａｃｔ）；イルソグラジン；イソベンガゾール（ｉｓｏｂｅｎｇａｚｏｌｅ）；イソホモハリコンドリン（ｉｓｏｈｏｍｏｈａｌｉｃｏｎｄｒｉｎ）Ｂ；イタセトロン；ジャスプラキノリド；カハラリド（ｋａｈａｌａｌｉｄｅ）Ｆ；ラメラリン（ｌａｍｅｌｌａｒｉｎ）−Ｎトリアセテート；ランレオチド；レイナマイシン（ｌｅｉｎａｍｙｃｉｎ）；レノグラスチム；硫酸レンチナン；レプトルスタチン（ｌｅｐｔｏｌｓｔａｔｉｎ）；レトロゾール；白血病抑制因子；白血球アルファインターフェロン；ロイプロリド＋エストロゲン＋プロゲステロン；リュープロレリン；レバミソール；リアロゾール；直鎖ポリアミン類似体；親油性二糖ペプチド；親油性の白金化合物；リソクリンアミド（ｌｉｓｓｏｃｌｉｎａｍｉｄｅ）７；ロバプラチン（ｌｏｂａｐｌａｔｉｎ）；ロムブリシン（ｌｏｍｂｒｉｃｉｎｅ）；ロメテレキソール（ｌｏｍｅｔｒｅｘｏｌ）；ロニダミン；ロソキサントロン（ｌｏｓｏｘａｎｔｒｏｎｅ）；ロバスタチン；ロキソリビン；ラルトテカン（ｌｕｒｔｏｔｅｃａｎ）；ルテチウム  テキサフィリン（ｌｕｔｅｔｉｕｍ  ｔｅｘａｐｈｙｒｉｎ）；リソフィリン（ｌｙｓｏｆｙｌｌｉｎｅ）；溶解性ペプチド；マイタンシン；マンノスタチンＡ；マリマスタット；マソプロコール；マスピン；マトリライシン阻害剤；マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤；メノガリル；メルバロン；メテレリン（ｍｅｔｅｒｅｌｉｎ）；メチオニナーゼ；メトクロプラミド；ＭＩＦ阻害剤；ミフェプリストン；ミルテホシン；ミリモスチム；ミスマッチ二本鎖ＲＮＡ；ミトグアゾン；ミトラクトール；マイトマイシン類似体；ミトナフィド（ｍｉｔｏｎａｆｉｄｅ）；ミトトキシン（ｍｉｔｏｔｏｘｉｎ）線維芽細胞増殖因子−サポリン；ミトキサントロン；モファロテン（ｍｏｆａｒｏｔｅｎｅ）；モルグラモスチム；モノクローナル抗体、ヒト絨毛膜ゴナドトロピン；モノホスホリルリピドＡ＋ミオバクテリウム（ｍｙｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）細胞壁ｓｋ；モピダモール；多剤耐性遺伝子阻害剤；複数の腫瘍抑制因子１に基づく療法；マスタード抗がん剤；ミカペルオキシド（ｍｙｃａｐｅｒｏｘｉｄｅ）Ｂ；マイコバクテリア細胞壁抽出物；ミリアポロン（ｍｙｒｉａｐｏｒｏｎｅ）；Ｎ−アセチルジナリン（ａｃｅｔｙｌｄｉｎａｌｉｎｅ）；Ｎ−置換ベンズアミド；ナファレリン；
ナグレスチップ（ｎａｇｒｅｓｔｉｐ）；ナロキソン＋ペンタゾシン；ナパビン（ｎａｐａｖｉｎ）；ナフテルピン（ｎａｐｈｔｅｒｐｉｎ）；ナルトグラスチム；ネダプラチン；ネモルビシン（ｎｅｍｏｒｕｂｉｃｉｎ）；ネリドロン酸（ｎｅｒｉｄｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）；中性エンドペプチダーゼ；ニルタミド；ニサマイシン（ｎｉｓａｍｙｃｉｎ）；一酸化窒素修飾物質；窒素酸化物  抗酸化剤；ニトルリン（ｎｉｔｒｕｌｌｙｎ）；Ｏ６−ベンジルグアニン；オクトレオチド；オキセノン（ｏｋｉｃｅｎｏｎｅ）；オリゴヌクレオチド；オナプリストン（ｏｎａｐｒｉｓｔｏｎｅ）；オンダンセトロン；オンダンセトロン；オラシン（ｏｒａｃｉｎ）；経口サイトカイン誘導因子；オルマプラチン（ｏｒｍａｐｌａｔｉｎ）；オサテロン（ｏｓａｔｅｒｏｎｅ）；オキサリプラチン；オキサウノマイシン（ｏｘａｕｎｏｍｙｃｉｎ）；パクリタキセル；パクリタキセル類似体；パクリタキセル誘導体；パラウアミン（ｐａｌａｕａｍｉｎｅ）；パルミトイルリゾキシン；パミドロン酸；パナキシトリオール（ｐａｎａｘｙｔｒｉｏｌ）；パノミフェン（ｐａｎｏｍｉｆｅｎｅ）；パラバクチン（ｐａｒａｂａｃｔｉｎ）；パゼリプチン（ｐａｚｅｌｌｉｐｔｉｎｅ）；ペグアスパラガーゼ；ペルデシン（ｐｅｌｄｅｓｉｎｅ）；ペントサンポリ硫酸ナトリウム；ペントスタチン；ペントロゾール（ｐｅｎｔｒｏｚｏｌｅ）；ペルフルブロン；ペルホスファミド（ｐｅｒｆｏｓｆａｍｉｄｅ）；ペリリルアルコール；フェナジノマイシン（ｐｈｅｎａｚｉｎｏｍｙｃｉｎ）；フェニルアセテート；ホスファターゼ阻害剤；ピシバニール；塩酸ピロカルピン；ピラルビシン；ピリトレキシム；プラセチン（ｐｌａｃｅｔｉｎ）Ａ；プラセチンＢ；プラスミノーゲン活性化因子阻害因子；白金複合体；白金化合物；白金−トリアミン複合体；ポルフィマーナトリウム；ポルフィロマイシン；プレドニゾン；プロピルビス−アクリドン；プロスタグランジンＪ２；プロテアソーム阻害剤；プロテインＡをベースとした免疫修飾物質；プロテインキナーゼＣ阻害剤；微細藻類プロテインキナーゼＣ阻害剤；タンパク質チロシンホスファターゼ阻害剤；プリンヌクレオシドホスホリラーゼ阻害剤；プルプリン；ピラゾロアクリジン；ピリドキシル化ヘモグロビンポリオキシエチレンコンジュゲート；ｒａｆアンタゴニスト；ラルチトレキセド；ラモセトロン；ｒａｓファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ阻害剤；ｒａｓ阻害剤；ｒａｓ−ＧＡＰ阻害剤；脱メチル化レテリプチン（ｒｅｔｅｌｌｉｐｔｉｎｅ）；レニウムＲｅ１８６エチドロネート；リゾキシン；リボザイム；ＲＩＩレチンアミド；ログレチミド（ｒｏｇｌｅｔｉｍｉｄｅ）；ロヒツキン（ｒｏｈｉｔｕｋｉｎｅ）；ロムルチド；ロキニメックス；ルビギノン（ｒｕｂｉｇｉｎｏｎｅ）Ｂ１；ルボキシル（ｒｕｂｏｘｙｌ）；サフィンゴール；サイントピン（ｓａｉｎｔｏｐｉｎ）；ＳａｒＣＮＵ；サルコフィトール（ｓａｒｃｏｐｈｙｔｏｌ）Ａ；サルグラモスチム；Ｓｄｉ１模倣物；セムスチン；老化由来阻害剤１；センスオリゴヌクレオチド；シグナルトランスダクション阻害剤；シグナルトランスダクション修飾物質；単鎖抗原結合性タンパク質；シゾフィ��ン；ソブゾキサン；ナトリウムボロカプテート（ｓｏｄｉｕｍ  ｂｏｒｏｃａｐｔａｔｅ）；フェニル酢酸ナトリウム；ソルベロール（ｓｏｌｖｅｒｏｌ）；ソマトメジン結合性タンパク質；ソネルミン（ｓｏｎｅｒｍｉｎ）；スパルホス酸（ｓｐａｒｆｏｓｉｃ  ａｃｉｄ）；スピカマイシン（ｓｐｉｃａｍｙｃｉｎ）Ｄ；スピロムスチン（ｓｐｉｒｏｍｕｓｔｉｎｅ）；スプレノペンチン（ｓｐｌｅｎｏｐｅｎｔｉｎ）；スポンギスタチン（；  ｓｐｏｎｇｉｓｔａｔｉｎ）１；スクアラミン；
幹細胞阻害剤；幹細胞分裂阻害剤；スチピアミド（ｓｔｉｐｉａｍｉｄｅ）；ストロメライシン阻害剤；スルフィノシン（ｓｕｌｆｉｎｏｓｉｎｅ）；超活性血管作用性腸管ペプチドアンタゴニスト；スラジスタ（ｓｕｒａｄｉｓｔａ）；スラミン；スワインソニン；合成グリコサミノグリカン；タリムスチン（ｔａｌｌｉｍｕｓｔｉｎｅ）；タモキシフェンメチオジド（ｔａｍｏｘｉｆｅｎ  ｍｅｔｈｉｏｄｉｄｅ）；タウロムスチン（ｔａｕｒｏｍｕｓｔｉｎｅ）；タザロテン；テコガランナトリウム；テガフール；テルラピリリウム（ｔｅｌｌｕｒａｐｙｒｙｌｉｕｍ）；テロメラーゼ阻害剤；テモポルフィン；テモゾロミド；テニポシド；テトラクロロデカオキシド；テトラゾミン（ｔｅｔｒａｚｏｍｉｎｅ）；タリブラスチン（ｔｈａｌｉｂｌａｓｔｉｎｅ）；チオコラリン（ｔｈｉｏｃｏｒａｌｉｎｅ）；トロンボポエチン；トロンボポエチン模倣物；チマルファシン（ｔｈｙｍａｌｆａｓｉｎ）；チモポイエチン受容体アゴニスト；チモトリナン（ｔｈｙｍｏｔｒｉｎａｎ）；甲状腺刺激ホルモン；エチルエチオプルプリンスズ；チラパザミン；二塩化チタノセン（ｔｉｔａｎｏｃｅｎｅ  ｂｉｃｈｌｏｒｉｄｅ）；トプセンチン（ｔｏｐｓｅｎｔｉｎ）；トレミフェン；全能性幹細胞因子；翻訳阻害剤；トレチノイン；トリアセチルウリジン；トリシリビン（ｔｒｉｃｉｒｉｂｉｎｅ）；トリメトレキサート；トリプトレリン；トロピセトロン；ツロステリド（ｔｕｒｏｓｔｅｒｉｄｅ）；チロシンキナーゼ阻害剤；チロホスチン；ＵＢＣ阻害剤；ウベニメクス；尿生殖洞由来の成長阻害因子；ウロキナーゼ受容体アンタゴニスト；バプレオチド（ｖａｐｒｅｏｔｉｄｅ）；バリオリン（ｖａｒｉｏｌｉｎ）Ｂ；ベクター系、赤血球遺伝子療法；ベラレソール（ｖｅｌａｒｅｓｏｌ）；ベラミン；バーディン（ｖｅｒｄｉｎ）；ベルテポルフィン；ビノレルビン；ビンキサルチン（ｖｉｎｘａｌｔｉｎｅ）；ビタキシン（ｖｉｔａｘｉｎ）；ボロゾール；ザノテロン（ｚａｎｏｔｅｒｏｎｅ）；ゼニプラチン；ジラスコルブ（ｚｉｌａｓｃｏｒｂ）；およびジノスタチンスチマラマーが挙げられる。一実施形態では、抗がん薬は、５−フルオロウラシル、タキソール、またはロイコボリンである。
【０２６６】
方法
本発明の組成物および方法は、種々の実施形態において、選択されたＭＨＣ分子、例えば、ＨＬＡ−Ａ２、Ａ３、およびＡ２４に結合するＭＵＣ１、Ｔ、またはＣＥＡエピトープを認識するものなどの、ヒト細胞溶解性Ｔ細胞（ｃｙｔｏｌｙｔｉｃ  Ｔ−ｃｅｌｌ）（ＣＴＬ）を活用する。ある特定の血清型のＭＨＣ分子、例えば、ＨＬＡ−Ａ２、Ａ３、およびＡ２４を発現する個体を、本発明の方法および組成物を使用する療法に選択することができる。例えば、ある特定の血清型のＭＨＣ分子、例えば、ＨＬＡ−Ａ２、Ａ３、およびＡ２４を発現する個体を、本明細書に記載されている方法および組成物を使用してＭＵＣ１、Ｔ、またはＣＥＡに対する免疫応答を生じさせることを含む療法に選択することができる。
【０２６７】
種々の実施形態では、これらのＴ細胞は、末梢血単核細胞を刺激するために、目的のエピトープでパルスした抗原提示細胞を使用する、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける培養によって生成することができる。さらに、Ｔ細胞株はまた、ＭＵＣ１、Ｔ、もしくはＣＥＡラテックスビーズ、ＭＵＣ１、Ｔ、もしくはＣＥＡタンパク質をパルスしたプラスチック接着性末梢血単核細胞、またはＭＵＣ１、Ｔ、もしくはＣＥＡ  ＲＮＡを用いて感作させたＤＣを用いた刺激後に生成することもできる。Ｔ細胞はまた、ＭＵＣ１、Ｔ、またはＣＥＡ免疫原をコードするワクチンベクターを用いて免疫した患者から生成することもできる。ＨＬＡ  Ａ２により提示されるＭＵＣ１、Ｔ、またはＣＥＡに由来するペプチドは、さらに、原発性胃腸腫瘍において見いだされ得る。種々の実施形態では、本発明は、ワクチン−ＭＵＣ１、Ｔ、またはＣＥＡを用いて免疫されたがん患者由来のＣＴＬを刺激することができる、ＨＬＡ  Ａ２により制限されるＭＵＣ１、Ｔ、またはＣＥＡのエピトープ、ＣＡＰ−１、９アミノ酸配列（ＹＬＳＧＡＮＬＮＬ；配列番号４）に関する。Ｃａｐ−１（６Ｄ）（ＹＬＳＧＡＤＬＮＬ；配列番号１０）は、ＣＡＰ−１のペプチド類似体である。その配列は、ＡｓｎからＡｓｐへのアミノ酸変化をもたらし、Ｔ細胞受容体による認識を増強するヘテロクリティック（非係留位置）変異を含む。ＡｓｎからＡｓｐへの変異では、ペプチドのＨＬＡ  Ａ２との結合にいかなる変化も引き起こされないと思われる。変異していないＣＡＰ−１エピトープと比較して、Ｃａｐ−１（６Ｄ）では、ＣＴＬの感作が１００〜１，０００倍増強され得る。ＣＴＬ株は、健康な志願者の末梢血単核細胞から、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＣａｐ−１（６Ｄ）ペプチドへの感作によって引き出すことができるが、ＣＡＰ−１ペプチドへの感作では有意には引き出されない。これらの細胞株は、内因性ＣＥＡを発現するヒト腫瘍細胞を溶解し得る。したがって、ＣＡＰ−１またはＣＡＰ−１（６Ｄ）を含むポリペプチド配列、そのような配列をコードする核酸配列、そのような核酸配列を含むアデノウイルスベクター、例えば、複製欠損性アデノウイルスベクターは、本発明の範囲内に入る。
【０２６８】
処置の方法
本発明のアデノウイルスベクターは、本明細書に記載されている１つまたは複数の標的抗原に対する免疫応答を生じさせるためのいくつものワクチンの状況で使用することができる。本発明は、本明細書の他の箇所に記載されているものなどの任意の標的抗原に対する免疫応答を生じさせる方法を提供する。アデノウイルスベクターは、特に重要である。なぜなら、Ａｄに対する既存の免疫を有する被験体において免疫応答を生じさせるために使用することができ、また、以前の世代のアデノウイルスベクターを使用すると不可能なレジメンである、アデノウイルスベクターを使用した複数のラウンドの免疫を含むワクチン接種レジメンにおいて使用することができるという予想外の所見のためである。
【０２６９】
一般に、免疫応答を生じさせることとは、体液性応答および／または細胞媒介性応答の誘導を含む。目的の標的抗原に対する免疫応答を増大させることが望ましい場合がある。免疫応答を生じさせることは、ある特定の免疫系の細胞の活性および／もしくは数の低減またはある特定のサイトカインまたは他のエフェクター分子のレベルおよび／または活性の低下を伴い得る。免疫応答の変化（例えば、細胞数、サイトカイン発現、細胞活性）を検出するための種々の方法は当技術分野で公知であり、本発明の状況において有用である。この場合に有用な例示的な方法としては、細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）、ＥＬＩＳｐｏｔ、増殖アッセイ、クロムの放出または等価のアッセイを含めた細胞傷害性Ｔ細胞アッセイ、およびさまざまなポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）またはＲＴ−ＰＣＲに基づくアッセイを使用した遺伝子発現解析が挙げられる。
【０２７０】
免疫応答を生じさせることは、本発明のアデノウイルスベクターを投与された被験体における、対照と比較して１．５倍から５倍の間の標的抗原特異的ＣＴＬ活性の増大を含み得る。別の実施形態では、免疫応答を生じさせることは、アデノウイルスベクターを投与された被験体における、対照と比較して約２倍、約２．５倍、約３倍、約３．５倍、約４倍、約４．５倍、約５倍、約５．５倍、約６倍、約６．５倍、約７倍、約７．５倍、約８倍、約８．５倍、約９倍、約９．５倍、約１０倍、約１０．５倍、約１１倍、約１１．５倍、約１２倍、約１２．５倍、約１５倍、約１６倍、約１７倍、約１８倍、約１９倍、約２０倍、またはそれ超の標的特異的ＣＴＬ活性の増大を含む。
【０２７１】
免疫応答を生じさせることは、標的抗原をコードする核酸を含む本発明のアデノウイルスベクターを投与された被験体における、適切な対照と比較して１．５倍から５倍の間のヘルパーＴ細胞の増殖などの標的抗原特異的ＨＴＬ活性の増大を含み得る。別の実施形態では、免疫応答を生じさせることは、対照と比較して約２倍、約２．５倍、約３倍、約３．５倍、約４倍、約４．５倍、約５倍、約５．５倍、約６倍、約６．５倍、約７倍、約７．５倍、約８倍、約８．５倍、約９倍、約９．５倍、約１０倍、約１０．５倍、約１１倍、約１１．５倍、約１２倍、約１２．５倍、約１５倍、約１６倍、約１７倍、約１８倍、約１９倍、約２０倍、またはそれ超、標的特異的ＨＴＬ活性の増大を含む。この文脈において、ＨＴＬ活性は、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、または他のサイトカインなどの特定のサイトカインの産生の、上記の増大、または減少を含み得る。この点について、免疫応答を生じさせることは、Ｔｈ２型応答からＴｈ１型応答へのシフトまたはある特定の実施形態では、Ｔｈ１型応答からＴｈ２型応答へのシフトを含み得る。他の実施形態では、免疫応答を生じさせることは、主にＴｈ１型応答またはＴｈ２型応答の刺激を含み得る。
【０２７２】
免疫応答を生じさせることは、本発明のアデノウイルスベクターを投与された被験体における、適切な対照と比較して１．５倍から５倍の間の、標的特異的な抗体産生の増大を含み得る。別の実施形態では、免疫応答を生じさせることは、アデノウイルスベクターを投与された被験体における、対照と比較して約２倍、約２．５倍、約３倍、約３．５倍、約４倍、約４．５倍、約５倍、約５．５倍、約６倍、約６．５倍、約７倍、約７．５倍、約８倍、約８．５倍、約９倍、約９．５倍、約１０倍、約１０．５倍、約１１倍、約１１．５倍、約１２倍、約１２．５倍、約１５倍、約１６倍、約１７倍、約１８倍、約１９倍、約２０倍、またはそれ超の、標的特異的な抗体産生の増大を含む。
【０２７３】
したがって、本発明は、目的の標的抗原に対する免疫応答を生じさせるための方法であって、個体に、ａ）Ｅ２ｂ領域の欠失を有する複製欠損性アデノウイルスベクターと、ｂ）標的抗原をコードする核酸とを含むアデノウイルスベクターを投与するステップと、個体にアデノウイルスベクターを少なくとも１回再投与するステップとを含み、それにより、標的抗原に対する免疫応答を生じさせる方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、投与されるベクターが、ｇｕｔｔｅｄベクターではない方法を提供する。特定の実施形態では、標的抗原は、野生型タンパク質、その断片、バリアント、またはバリアント断片であり得る。一部の実施形態では、標的抗原は、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１ｃ、ＭＵＣ１ｎ、Ｔ、またはＣＥＡ、その断片、バリアント、またはバリアント断片を含む。
【０２７４】
さらなる実施形態では、本発明は、Ａｄに対する既存の免疫を有する個体において、個体に、ａ）Ｅ２ｂ領域の欠失を有する複製欠損性アデノウイルスベクターと、ｂ）標的抗原をコードする核酸とを含むアデノウイルスベクターを投与し、個体にアデノウイルスベクターを少なくとも１回再投与し、それにより、標的抗原に対する免疫応答を生じさせることによって標的抗原に対する免疫応答を生じさせるための方法を提供する。特定の実施形態では、標的抗原は、野生型タンパク質、その断片、バリアント、またはバリアント断片であり得る。一部の実施形態では、標的抗原は、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１ｃ、ＭＵＣ１ｎ、Ｔ、またはＣＥＡ、その断片、バリアント、またはバリアント断片を含む。
【０２７５】
Ａｄに対する既存の免疫に関しては、Ａｄ抗体の存在について試験するための抗体に基づくアッセイなどの、当技術分野で公知の方法を使用して決定することができる。さらに、ある特定の実施形態では、本発明の方法は、まず、個体がＡｄに対する既存の免疫を有することを決定し、次いで、本明細書に記載されている本発明のＥ２ｂ欠失アデノウイルスベクターを投与することを含む。
【０２７６】
本発明の一実施形態は、個体において１つまたは複数の標的抗原に対する免疫応答を生じさせる方法であって、個体に、Ｅ２ｂ領域の欠失を有する複製欠損性アデノウイルスベクターと、少なくとも１つの標的抗原をコードする核酸とを含む第１のアデノウイルスベクターを投与するステップと、個体に、Ｅ２ｂ領域の欠失を有する複製欠損性アデノウイルスベクターと、少なくとも１つの標的抗原をコードする核酸とを含む第２のアデノウイルスベクターを投与するステップを含み、第２のアデノウイルスベクターの少なくとも１つの標的抗原が第１のアデノウイルスベクターの少なくとも１つの標的抗原と同じものであるかまたは異なるものである、方法を提供する。特定の実施形態では、標的抗原は、野生型タンパク質、その断片、バリアント、またはバリアント断片であり得る。一部の実施形態では、標的抗原は、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１ｃ、ＭＵＣ１ｎ、Ｔ、またはＣＥＡ、その断片、バリアント、またはバリアント断片を含む。
【０２７７】
したがって、本発明は、同じＥ２ｂ欠失アデノウイルスベクターを用いた複数回の免疫または異なるＥ２ｂ欠失アデノウイルスベクターを用いた複数回の免疫を意図している。それぞれの場合において、アデノウイルスベクターは、本明細書の他の箇所に記載されている１つまたは複数の標的抗原をコードする核酸配列を含んでよい。ある特定の実施形態では、方法は、１つの標的抗原をコードするＥ２ｂ欠失アデノウイルスを用いた複数回の免疫、および同じアデノウイルスベクターの複数回の再投与を含み、それにより、標的抗原に対する免疫応答を誘導する。一部の実施形態では、標的抗原は、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１ｃ、ＭＵＣ１ｎ、Ｔ、またはＣＥＡ、その断片、バリアント、またはバリアント断片を含む。
【０２７８】
さらなる実施形態では、方法は、１つまたは複数の標的抗原をコードする第１のアデノウイルスベクターを用いた免疫、次いで、第１のアデノウイルスベクターによりコードされる抗原と同じであっても異なってもよい１つまたは複数の標的抗原をコードする第２のアデノウイルスベクターの投与を含む。この点について、コードされる標的抗原のうちの１つが異なるものであってもよく、コードされる抗原の全てが異なるものであってもよく、一部が同じものであって一部が異なるものであってもよい。さらに、ある特定の実施形態では、方法は、第１のアデノウイルスベクターを複数回投与するステップと、第２のアデノウイルスを複数回投与するステップとを含む。この点について、当該方法は、第１のアデノウイルスベクターを１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１１回、１２回、１３回、１４回、１５回、またはそれ超投与するステップと、第２のアデノウイルスベクターを１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１１回、１２回、１３回、１４回、１５回、またはそれ超投与するステップとを含む。投与の順序は、第１のアデノウイルスを１回または複数回逐次に投与するステップと、その後、第２のアデノウイルスベクターを１回または複数回逐次に投与するステップを含んでよい。ある特定の実施形態では、方法は、第１のアデノウイルスベクターと第２のアデノウイルスベクターを、それぞれ１回の投与、それぞれ２回の投与、それぞれ３回の投与などで交互に投与するステップを含む。ある特定の実施形態では、第１のアデノウイルスベクターと第２のアデノウイルスベクターを同時に投与する。他の実施形態では、第１のアデノウイルスベクターと第２のアデノウイルスベクターを逐次的に投与する。一部の実施形態では、標的抗原は、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１ｃ、ＭＵＣ１ｎ、Ｔ、またはＣＥＡ、その断片、バリアント、またはバリアント断片を含む。
【０２７９】
当業者には容易に理解される通り、２つ超のアデノウイルスベクターを本発明の方法において使用することができる。３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ超の異なるアデノウイルスベクターを本発明の方法において使用することができる。ある特定の実施形態では、方法は、１つ超のＥ２ｂ欠失アデノウイルスベクターを一度に投与するステップを含む。この点について、複数の目的の標的抗原に対する免疫応答を、それぞれが１つまたは複数の標的抗原をコードする核酸配列を含む複数の異なるアデノウイルスベクターを同時に投与することによって生じさせることができる。
【０２８０】
癌腫または肉腫（例えば、固形腫瘍、リンパ腫および白血病）などのがんに対する免疫応答を生じさせるために、アデノウイルスベクターを使用することができる。神経がん、黒色腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキン病、白血病、形質細胞腫、腺腫、神経膠腫、胸腺腫、乳がん、前立腺がん、結腸直腸がん、腎がん、腎細胞癌、子宮がん、膵がん（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）、食道がん、肺がん、卵巣がん、子宮頸がん、精巣がん、胃がん、多発性骨髄腫、ヘパトーマ、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、および慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、または他のがんなどのがんに対する免疫応答を生じさせるために、アデノウイルスベクターを使用することができる。
【０２８１】
本明細書に記載されている感染症またはがんのいずれかの症状を処置するまたは好転させる（ａｍｅｌｉｏｒａｔｅ）方法も提供される。処置方法は、本明細書に記載されている感染症またはがんに罹患しているまたは罹患するリスクがある個体にアデノウイルスベクターを１回または複数回投与するステップを含む。したがって、本発明は、感染症またはがんなどの疾患が発生するリスクがある個体において感染症またはがんに対するワクチン接種を行うための方法を提供する。リスクがある個体は、感染因子にいつか曝露する可能性があるもしくは以前に曝露しているが感染の症状をまだ有さない個体、または、がんが発生するもしくは感染因子に特にかかりやすい遺伝的素因を有する個体であり得る。本明細書に記載されている感染症またはがんに罹患している個体について、標的抗原を発現し、かつ／または提示していることを決定することができ、それを本明細書における療法をガイドするために使用することができる。例えば、例について、標的抗原を発現し、かつ／または提示していることを見いだし、その後、標的抗原、バリアント、断片またはそのバリアント断片をコードするアデノウイルスベクターを投与することができる。
【０２８２】
本発明は、標的抗原、またはその断片、バリアント、またはバリアント断片をコードする核酸のｉｎ  ｖｉｖｏにおける送達のための、アデノウイルスベクターの使用を意図している。被験体に注射されたら、核酸配列が発現され、その結果、当該配列によりコードされる抗原に対する免疫応答がもたらされる。アデノウイルスベクターワクチンは、「有効量」、すなわち、選択された経路または投与経路で本明細書の他の箇所に記載されている免疫応答を引き出すために有効なアデノウイルスベクターの量で投与することができる。有効量は、宿主の標的感染因子またはがんに対する保護または処置を容易にするために有効な免疫応答を誘導することができるものである。各ワクチン用量中のベクターの量は、一般に典型的なワクチンに付随する有意な有害作用を伴わずに、免疫応答、免疫保護的（ｉｍｍｕｎｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ）応答または他の免疫療法的応答を誘導する量として選択される。ワクチン接種を行ったら、被験体をモニタリングして、ワクチン処置の有効性を決定することができる。ワクチン接種の有効性のモニタリングは、当業者に公知の任意の方法によって実施することができる。一部の実施形態では、血液または体液試料をアッセイして抗体のレベルを検出することができる。他の実施形態では、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイを実施して、循環血液細胞からまたはリンパ組織細胞からの細胞媒介性免疫応答を検出することができる。
【０２８３】
本明細書に記載されている治療用組成物の投与の経路および頻度、ならびに投薬量は、個体によって、および疾患によって変動し得、また、標準の技法を使用して容易に確立され得る。一般に、医薬組成物およびワクチンは、注射によって（例えば、皮内、筋肉内、静脈内または皮下）、鼻腔内に（例えば、吸引によって）、丸剤形態で（例えば、嚥下、膣または直腸への送達用の坐薬）投与することができる。ある特定の実施形態では、１〜１０用量を５２週間にわたって投与することができる。ある特定の実施形態では、６用量を１カ月の間隔で投与し、その後、定期的にさらなる追加刺激ワクチン接種を行う。個々の患者に対して代替プロトコールが適する場合がある。したがって、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ超の用量を、１年間にわたって、または、３５週間、４０週間、４５週間、５０週間、５５週間、６０週間、６５週間、７０週間、７５週間、８０週間、８５週間、９０週間、９５週間または１００週間にわたってなどのより短い期間もしくはより長い期間にわたって投与することができる。用量は、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、または６週間の間隔またはより長い間隔で投与することができる。
【０２８４】
ワクチンは、約４時間未満にわたって、より好ましくは、約３時間未満にわたって注入することができる。例えば、最初の２５〜５０ｍｇを３０分以内、好ましくは、さらには１５分以内に注入し、残りを次の２〜３時間にわたって注入することができる。より一般的には、投与されるワクチン構築物の投薬は、２週間ごとまたは３週間ごとに１回の投薬として、合計少なくとも３回の投薬を繰り返して施行することができる。または、構築物は、週２回、４〜６週間にわたって投与することができる。投薬スケジュールは、場合によって他の間隔で繰り返すことができ、また、投薬は、種々の非経口経路を通じて、用量およびスケジュールの適切な調整を伴ってもたらすことができる。本発明の組成物は、さまざまな関連する処置モダリティと併せて（例えば、その前に、それと同時に、またはその後に）患者に投与することができる。
【０２８５】
適切な用量とは、上記の通り投与した場合に、本明細書の他の箇所に記載されている標的抗原に対する免疫応答を促進することが可能なアデノウイルスベクターの量である。ある特定の実施形態では、免疫応答は、基底（すなわち、無処置）のレベルを少なくとも１０〜５０％上回る。ある特定の実施形態では、免疫応答は、基底レベルを少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、１００、１１０、１２５、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００またはそれ超上回る。そのような応答は、患者における標的抗原（複数可）抗体を測定することによって、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて患者の腫瘍または感染細胞を死滅させることが可能な細胞溶解性エフェクター細胞のワクチン依存性生成によって、または免疫応答をモニタリングするための、当技術分野で公知の他の方法によってモニタリングすることができる。そのようなワクチンはまた、ワクチン接種を受けた患者において、ワクチン接種を受けていない患者と比較して問題の疾患の臨床転帰の改善を導く免疫応答を引き起こすことが可能なものであるべきである。一部の実施形態では、臨床転帰の改善は、疾患の処置、疾患の症状の軽減、疾患の進行の変化、または寿命の延長を含む。
【０２８６】
一般に、適切な投薬量および処置レジメンでは、アデノウイルスベクターが治療的および／または予防的利益をもたらすために十分な量でもたらされる。そのような応答は、処置を受けた患者において、処置を受けていない患者と比較して、処置される特定の疾患についての臨床転帰の改善が確立されることによってモニタリングすることができる。モニタリングデータは経時的に評価することができる。経時的な疾患の進行を変化させることができる。そのような臨床転帰の改善は、処置を行う医師によって容易に認識される。標的タンパク質に対する既存の免疫応答の増大は、一般に、臨床転帰の改善と相関し得る。そのような免疫応答は、一般に、処置前および処置後に患者から得た試料を使用して実施することができる標準の増殖、細胞傷害性またはサイトカインアッセイを使用して評価することができる。
【０２８７】
本発明の１つの利点は、特にＡｄに対する既存の免疫を有する個体において同じまたは異なるアデノウイルスベクターを用いた複数回のワクチン接種を施行することが可能なことであるが、本発明のアデノウイルスワクチンは、初回刺激および追加刺激レジメンの一部としても投与することができる。混合モダリティ初回刺激および追加刺激接種スキームにより、免疫応答の増強がもたらされ得る。したがって、本発明の一態様は、被験体を、目的の標的抗原を含むプラスミドベクターなどのプラスミドワクチンを用いて、プラスミドワクチンを少なくとも１回投与することによって初回刺激し、所定の時間の長さを経過させ、次いで、アデノウイルスベクターを投与することによって追加刺激する方法である。複数回、例えば、１〜４回の初回刺激を使用することができるが、それより多くを使用することもできる。初回刺激と追加刺激の間の時間の長さは、一般には、約４カ月から１年まで変動し得るが、他の時間枠を使用することもできる。ある特定の実施形態では、被験体を、プラスミドワクチンを用いて１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、またはそれ超、初回刺激し、次いで、４カ月後にアデノウイルスベクターを用いて追加刺激することができる。
【０２８８】
本明細書において提示される任意の組成物を個体に投与することができる。「個体」は、「被験体」または「患者」と互換的に使用することができる。個体は、哺乳動物、例えば、ヒトまたは非ヒト霊長類、齧歯類、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ロバ、ヤギ、ネコ、イヌ、ウシ、ブタ、もしくはヒツジなどの動物であってよい。複数の実施形態では、個体は、ヒトである。複数の実施形態では、個体は、胎児、胚、または小児である。一部の場合では、本明細書において提示される組成物を細胞にｅｘ  ｖｉｖｏで投与する。一部の場合では、本明細書において提示される組成物を、個体に、疾患または障害を処置する方法として投与する。一部の実施形態では、個体は、遺伝子疾患を有する。一部の場合では、個体は、本明細書に記載されている疾患のいずれかなどの疾患を有するリスクがある。一部の実施形態では、個体は、タンパク質の量が不十分であることまたはタンパク質の活性が不十分であることによって引き起こされる疾患または障害を有するリスクが高い。個体が疾患または障害を有する「リスクが高い」場合、方法は、防止的または予防的処置を伴う。例えば、個体は、疾患の家族歴が原因でそのような疾患または障害を有するリスクが高い可能性がある。一般には、そのような疾患または障害を有するリスクが高い個体には、予防的処置（例えば、疾患または障害の発症または進行を防止するかまたは遅らせることによる）が有益である。
【０２８９】
一部の場合では、被験体は、疾患を有さない。一部の場合では、本発明の処置は、疾患の発症前に施行する。被験体は、検出されていない疾患を有し得る。被験体は低疾病負荷を有し得る。被験体はまた、高疾病負荷も有し得る。ある場合では、被験体に、グレード分類尺度に従って本発明の処置を施行することができる。グレード分類尺度は、グリーソン分類であってよい。グリーソン分類は、腫瘍組織が正常な前立腺組織とどれほど異なるかを反映するものである。グリーソン分類では、１から５までの尺度が使用される。医師が、がん細胞のパターンおよび成長に基づいて、がんに数字を付す。数字が小さいほど、がん細胞がより正常に見え、グレードが低い。数字が大きいほど、がん細胞がより正常でなく見え、グレードが高い。ある場合では、グリーソンスコアが低い患者に処置を施行することができる。好ましくは、グリーソンスコアが３またはそれ未満の患者に本発明の処置を施行することができる。
【０２９０】
本発明の種々の実施形態は、選択された患者集団において１つまたは複数のＭＵＣ１、ＭＵＣ１ｃ、ＭＵＣ１ｎ、Ｔ、またはＣＥＡ抗原に対する免疫応答を生じさせるための組成物および方法に関する。したがって、本発明の方法および組成物は、これだけに限定されないが、癌腫または肉腫、例えば、神経がん、黒色腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキン病、白血病、形質細胞腫、腺腫、神経膠腫、胸腺腫、乳がん、前立腺がん、結腸直腸がん、腎がん、腎細胞癌、子宮がん、膵がん（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）、食道がん、肺がん、卵巣がん、子宮頸がん、精巣がん、胃がん、多発性骨髄腫、ヘパトーマ、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、および慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）を含めたがんを有する患者を標的とし得るか、または他のがんが、療法の標的となり得る。一部の場合では、標的とされる患者集団を、結腸直腸腺癌、転移性結腸直腸がん、進行したＭＵＣ１、ＭＵＣ１ｃ、ＭＵＣ１ｎ、Ｔ、またはＣＥＡ発現結腸直腸がん、頭頸部がん、肝がん、乳がん、肺がん、膀胱がん、または膵がん（ｐａｎｃｒｅａｓ  ｃａｎｃｅｒ）を有する個体に限定することができる。選択されたがん、例えば、結腸直腸腺癌の、組織学的に確認された診断を使用することができる。特定の疾患の病期または進行を選択することができ、例えば、転移性がん、再発性がん、ＩＩＩ期がん、またはＩＶ期がんのうちの１つまたは複数を有する患者を本発明の方法および組成物を用いた療法に選択することができる。一部の実施形態では、患者は、これだけに限定されないが、フルオロピリミジン、イリノテカン、オキサリプラチン、ベバシズマブ、セツキシマブ、またはパニツムマブを含有する療法を含めた他の療法を受けたことがある、場合によって、それを経て進行したことが必要であり得る。一部の場合では、個体がそのような療法を受けることを拒絶することにより、その患者を、本発明の方法および組成物を用いた療法適格プールに含めることが可能になる。一部の実施形態では、本発明の方法および組成物を使用する療法を受ける個体の推定平均余命が少なくとも、１カ月、２カ月、３カ月、４カ月、５カ月、６カ月、７カ月、８カ月、９カ月、１０カ月、１１カ月、１２カ月、１４カ月、１５カ月、１８カ月、２１カ月、または２４カ月である必要があり得る。本発明の方法および組成物を使用する療法を受ける患者プールは、年齢制限され得る。例えば、２歳超、３歳超、４歳超、５歳超、６歳超、７歳超、８歳超、９歳超、１０歳超、１１歳超、１２歳超、１３歳超、１４歳超、１５歳超、１６歳超、１７歳超、１８歳超、１９歳超、２０歳超、２１歳超、２５歳超、３０歳超、３５歳超、４０歳超、５０歳超、６０歳超、またはそれ超の年齢の個体が、本発明の方法および組成物を用いた療法に適格であり得る。別の例では、７５歳未満、７０歳未満、６５歳未満、６０歳未満、５５歳未満、５０歳未満、４０歳未満、３５歳未満、３０歳未満、２５歳未満、２０歳未満、またはそれ未満の年齢の個体が、本発明の方法および組成物を用いた療法に適格であり得る。
【０２９１】
一部の実施形態では、本発明の方法および組成物を使用する療法を受ける患者は、適切な血液学的機能を有する個体、例えば、１マイクロリットル当たり少なくとも１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００またはそれ超のＷＢＣ数、少なくとも５ｇ／ｄＬ、６ｇ／ｄＬ、７ｇ／ｄＬ、８ｇ／ｄＬ、９ｇ／ｄＬ、１０ｇ／ｄＬ、１１ｇ／ｄＬ、１２ｇ／ｄＬ、１３ｇ／ｄＬ、１４ｇ／ｄＬまたはそれ超のヘモグロビンレベル、１マイクロリットル当たり少なくとも５０，０００；６０，０００；７０，０００；７５，０００；９０，０００；１００，０００；１１０，０００；１２０，０００；１３０，０００；１４０，０００；１５０，０００またはそれ超の血小板数のうちの１つまたは複数を有する個体；０．８を下回るまたはそれと等しい、１．０を下回るまたはそれと等しい、１．２を下回るまたはそれと等しい、１．３を下回るまたはそれと等しい、１．４を下回るまたはそれと等しい、１．５を下回るまたはそれと等しい、１．６を下回るまたはそれと等しい、１．８を下回るまたはそれと等しい、２．０を下回るまたはそれと等しい、２．５を下回るまたはそれと等しい、３．０を下回るまたはそれと等しい、またはそれ超のＰＴ−ＩＮＲ値、１．２×ＵＬＮを下回るまたはそれと等しい、１．４×ＵＬＮを下回るまたはそれと等しい、１．５×ＵＬＮを下回るまたはそれと等しい、１．６×ＵＬＮを下回るまたはそれと等しい、１．８×ＵＬＮを下回るまたはそれと等しい、２．０×ＵＬＮを下回るまたはそれと等しい、またはそれ超のＰＴＴ値を有する個体に限られる。種々の実施形態では、血液学的機能の指標の限度は、異なる性別および年齢群、例えば、０〜５歳、５〜１０歳、１０〜１５歳、１５〜１８歳、１８〜２１歳、２１〜３０歳、３０〜４０歳、４０〜５０歳、５０〜６０歳、６０〜７０歳、７０〜８０歳または８０歳超の個体に対して異なるように選択される。
【０２９２】
一部の実施形態では、本発明の方法および組成物を使用する療法を受ける患者は、適切な腎機能および／または肝機能を有する個体、例えば、０．８ｍｇ／ｄＬを下回るまたはそれと等しい、０．９ｍｇ／ｄＬを下回るまたはそれと等しい、１．０ｍｇ／ｄＬを下回るまたはそれと等しい、１．１ｍｇ／ｄＬを下回るまたはそれと等しい、１．２ｍｇ／ｄＬを下回るまたはそれと等しい、１．３ｍｇ／ｄＬを下回るまたはそれと等しい、１．４ｍｇ／ｄＬを下回るまたはそれと等しい、１．５ｍｇ／ｄＬを下回るまたはそれと等しい、１．６ｍｇ／ｄＬを下回るまたはそれと等しい、１．７ｍｇ／ｄＬを下回るまたはそれと等しい、１．８ｍｇ／ｄＬを下回るまたはそれと等しい、１．９ｍｇ／ｄＬを下回るまたはそれと等しい、２．０ｍｇ／ｄＬを下回るまたはそれと等しい、２．１ｍｇ／ｄＬを下回るまたはそれと等しい、２．２ｍｇ／ｄＬを下回るまたはそれと等しいまたはそれ超の血清クレアチニンレベル、０．８ｍｇ／ｄＬ、０．９ｍｇ／ｄＬ、１．０ｍｇ／ｄＬ、１．１ｍｇ／ｄＬ、１．２ｍｇ／ｄＬ、１．３ｍｇ／ｄＬ、１．４ｍｇ／ｄＬ、１．５ｍｇ／ｄＬ、１．６ｍｇ／ｄＬ、１．７ｍｇ／ｄＬ、１．８ｍｇ／ｄＬ、１．９ｍｇ／ｄＬ、２．０ｍｇ／ｄＬ、２．１ｍｇ／ｄＬ、２．２ｍｇ／ｄＬまたはそれ超のビリルビンレベル、ジルベール症に関しては、より高い限度、例えば、１．５ｍｇ／ｄＬを下回るまたはそれと等しい、１．６ｍｇ／ｄＬを下回るまたはそれと等しい、１．８ｍｇ／ｄＬを下回るまたはそれと等しい、１．９ｍｇ／ｄＬを下回るまたはそれと等しい、２．０ｍｇ／ｄＬを下回るまたはそれと等しい、２．１ｍｇ／ｄＬを下回るまたはそれと等しい、２．２ｍｇ／ｄＬを下回るまたはそれと等しい、２．３ｍｇ／ｄＬを下回るまたはそれと等しい、または２．４ｍｇ／ｄＬを下回るまたはそれと等しいが許容されるビリルビンレベル、１．５×正常値上限（ＵＬＮ）を下回るまたはそれと等しい、２．０×ＵＬＮを下回るまたはそれと等しい、２．５×ＵＬＮを下回るまたはそれと等しい、３．０×ＵＬＮを下回るまたはそれと等しいまたはそれ超のＡＬＴ値およびＡＳＴ値のうちの１つまたは複数を有する個体に限られる。種々の実施形態では、腎機能または肝機能の指標の限度は、異なる性別および年齢群、例えば、０〜５歳、５〜１０歳、１０〜１５歳、１５〜１８歳、１８〜２１歳、２１〜３０歳、３０〜４０歳、４０〜５０歳、５０〜６０歳、６０〜７０歳、７０〜８０歳または８０歳超の個体に対して異なるように選択される。
【０２９３】
一部の実施形態では、本発明の方法および組成物を使用する療法の候補である個体のＫ−ｒａｓ変異の状態を決定することができる。予め選択されたＫ−ｒａｓ変異性の状態を有する個体を、本発明の方法および組成物を使用する療法に対する適格患者プールに含めることができる。
【０２９４】
種々の実施形態では、本発明の方法および組成物を使用する療法を受ける患者は、同時に行われる細胞傷害性化学療法または放射線療法、脳転移の病歴または現在の脳転移、これだけに限定されないが、炎症性腸疾患、全身性エリテマトーデス、強直性脊椎炎、強皮症、多発性硬化症、甲状腺疾患および白斑などの自己免疫疾患、心疾患（ＮＹＨＡクラスＩＩＩもしくはＩＶ）などの重篤な介入性の慢性もしくは急性疾病、または肝疾患の病歴、推定プロトコール遵守に対する医学的または心理学的妨害、同時に発生する（もしくは過去５年以内の）、処置された非黒色腫皮膚がん、子宮頸上皮内癌、制御された表在性膀胱がん、もしくは他の上皮内癌以外の第２の悪性疾患、尿路感染症、ＨＩＶ（例えば、ＥＬＩＳＡによって決定し、ウエスタンブロットによって確認された）、および慢性肝炎を含めた活動性の急性もしくは慢性感染、または同時に行われるステロイド療法（もしくはアザチオプリンもしくはシクロスポリンＡなどの他の免疫抑制剤）を伴わない個体に限られる。一部の場合では、任意のステロイド療法（化学療法または造影試験の予備薬物療法として使用されるもの以外）を少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも５週間、少なくとも６週間、少なくとも７週間、少なくとも８週間、少なくとも９週間、または少なくとも１０週間中止している患者を本発明の方法および組成物を使用する療法に対する適格個体のプールに含めることができる。
【０２９５】
一部の実施形態では、本発明の方法および組成物を使用する療法を受ける患者には、甲状腺疾患および白斑を有する個体が含まれる。
【０２９６】
種々の実施形態では、本発明の方法および組成物を使用する療法のための個体または候補個体から、試料、例えば、血清または尿試料を採取することができる。試料は、療法の前、その間、および／またはその後、例えば、療法の開始前２週間以内、４週間以内、６週間以内、８週間以内、１０週間以内、療法の開始から１週間以内、１０日以内、２週間以内、３週間以内、４週間以内、６週間以内、８週間以内、または１２週間以内、療法の開始前２週間以内、４週間以内、６週間以内、８週間以内、１０週間以内、療法の開始から１週間以内、１０日以内、２週間以内、３週間以内、４週間以内、６週間以内、８週間以内、９週間以内、または１２週間以内、療法の間に１週間、１０日間、２週間、３週間、４週間、６週間、８週間、９週間、または１２週間の間隔で、療法後に１カ月、３カ月、６カ月、１年、２年の間隔で、療法後１カ月以内、３カ月以内、６カ月以内、１年以内、２年以内、またはより長い期間以内、６カ月、１年、２年、３年、４年、５年、６年、７年、８年、９年、１０年またはより長い持続時間にわたって、採取することができる。試料を、本明細書に記載されている血液学的機能の指標、腎機能の指標、または肝機能の指標のいずれか、ならびに当技術分野で公知の他の適切な指標、例えば、出産の潜在性がある女性についてはβ−ＨＣＧについて検査することができる。その点で、分画を伴う血球数、ＰＴ、ＩＮＲおよびＰＴＴを含めた血液検査および生化学検査、Ｎａ、Ｋ、Ｃｌ、ＣＯ２、ＢＵＮ、クレアチニン、Ｃａ、総タンパク質、アルブミン、総ビリルビン、アルカリホスファターゼ、ＡＳＴ、ＡＬＴおよびグルコースを測定する検査は、本発明の範囲内に入る。一部の実施形態では、本発明の方法および組成物を使用する療法のための個体または候補個体由来の試料中のＨＩＶ抗体、Ｂ型肝炎表面抗原（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  ＢｓＡｇ）、またはＣ型肝炎抗体の存在または量を決定する。本発明の方法および組成物を使用する療法のための個体または候補個体由来の血清などの試料中のＭＵＣ１、ＭＵＣ１ｃ、ＭＵＣ１ｎ、Ｔ、もしくはＣＥＡに対する抗体またはＡｄ５ベクターに対する中和抗体などの生物学的マーカーを検査することができる。一部の場合では、本発明の方法および組成物を使用する療法のための個体または候補個体から血液試料などの１つまたは複数の試料を採取し、保管することができる。採取された試料を免疫学的評価についてアッセイすることができる。本発明の方法および組成物を使用する療法のための個体または候補個体を画像化試験で、例えば、胸部、腹部、または骨盤のＣＴスキャンまたはＭＲＩを使用して評価することができる。画像化試験は、本発明の方法および組成物を使用する療法の前、その間、またはその後、療法の間、および／またはその後、例えば、療法の開始前２週間以内、４週間以内、６週間以内、８週間以内、１０週間以内、療法の開始から１週間以内、１０日以内、２週間以内、３週間以内、４週間以内、６週間以内、８週間以内、または１２週間以内、療法の開始前２週間以内、４週間以内、６週間以内、８週間以内、１０週間以内、療法の開始から１週間以内、１０日以内、２週間以内、３週間以内、４週間以内、６週��以内、８週間以内、９週間以内、または１２週間以内、療法の間に１週間、１０日間、２週間、３週間、４週間、６週間、８週間、９週間、または１２週間の間隔で、療法後に１カ月、３カ月、６カ月、１年、２年の間隔で、療法後１カ月以内、３カ月以内、６カ月以内、１年以内、２年以内、またはより長い期間以内、６カ月、１年、２年、３年、４年、５年、６年、７年、８年、９年、１０年またはより長い持続時間にわたって実施することができる。
【０２９７】
投薬量および投与
本発明の組成物および方法は、療法の間の種々の投薬量および投与レジメンを意図している。患者は、個体において、本明細書に記載されている標的抗原に対する免疫応答を生じさせることが可能な１つまたは複数の複製欠損性アデノウイルスまたはアデノウイルスベクター、例えば、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２Ｂ−］−ＣＥＡ（６Ｄ）、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＭＵＣ１、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＭＵＣ１ｃ、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＭＵＣ１ｎ、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−Ｔを受けることができる。種々の実施形態では、複製欠損性アデノウイルスを、そのような免疫応答をもたらすために適した用量で投与する。一部の場合では、複製欠損性アデノウイルスを、免疫当たり、１×１０９個を上回るまたはそれと等しい、２×１０９個を上回るまたはそれと等しい、３×１０９個を上回るまたはそれと等しい、４×１０９個を上回るまたはそれと等しい、５×１０９個を上回るまたはそれと等しい、６×１０９個を上回るまたはそれと等しい、７×１０９個を上回るまたはそれと等しい、８×１０９個を上回るまたはそれと等しい、９×１０９個を上回るまたはそれと等しい、１×１０１０個を上回るまたはそれと等しい、２×１０１０個を上回るまたはそれと等しい、３×１０１０個を上回るまたはそれと等しい、４×１０１０個を上回るまたはそれと等しい、５×１０１０個を上回るまたはそれと等しい、６×１０１０個を上回るまたはそれと等しい、７×１０１０個を上回るまたはそれと等しい、８×１０１０個を上回るまたはそれと等しい、９×１０１０個を上回るまたはそれと等しい、１×１０１１個を上回るまたはそれと等しい、２×１０１１個を上回るまたはそれと等しい、３×１０１１個を上回るまたはそれと等しい、４×１０１１個を上回るまたはそれと等しい、５×１０１１個を上回るまたはそれと等しい、６×１０１１個を上回るまたはそれと等しい、７×１０１１個を上回るまたはそれと等しい、８×１０１１個を上回るまたはそれと等しい、９×１０１１個を上回るまたはそれと等しい、１×１０１２個を上回るまたはそれと等しい、１．５×１０１２個を上回るまたはそれと等しい、２×１０１２個を上回るまたはそれと等しい、３×１０１２個を上回るまたはそれと等しい、またはそれ超のウイルス粒子（ＶＰ）である用量で投与する。一部の場合では、複製欠損性アデノウイルスを、免疫当たり、１×１０９個を下回るまたはそれと等しい、２×１０９個を下回るまたはそれと等しい、３×１０９個を下回るまたはそれと等しい、４×１０９個を下回るまたはそれと等しい、５×１０９個を下回るまたはそれと等しい、６×１０９個を下回るまたはそれと等しい、７×１０９個を下回るまたはそれと等しい、８×１０９個を下回るまたはそれと等しい、９×１０９個を下回るまたはそれと等しい、１×１０１０個を下回るまたはそれと等しい、２×１０１０個を下回るまたはそれと等しい、３×１０１０個を下回るまたはそれと等しい、４×１０１０個を下回るまたはそれと等しい、５×１０１０個を下回るまたはそれと等しい、６×１０１０個を下回るまたはそれと等しい、７×１０１０個を下回るまたはそれと等しい、８×１０１０個を下回るまたはそれと等しい、９×１０１０個を下回るまたはそれと等���い、１×１０１１個を下回るまたはそれと等しい、２×１０１１個を下回るまたはそれと等しい、３×１０１１個を下回るまたはそれと等しい、４×１０１１個を下回るまたはそれと等しい、５×１０１１個を下回るまたはそれと等しい、６×１０１１個を下回るまたはそれと等しい、７×１０１１個を下回るまたはそれと等しい、８×１０１１個を下回るまたはそれと等しい、９×１０１１個を下回るまたはそれと等しい、１×１０１２個を下回るまたはそれと等しい、１．５×１０１２個を下回るまたはそれと等しい、２×１０１２個を下回るまたはそれと等しい、３×１０１２個を下回るまたはそれと等しい、またはそれ超のウイルス粒子である用量で投与する。種々の実施形態では、本明細書に記載されている所望の用量を適切な体積、例えば、約０．１〜１０ｍＬ、０．２〜８ｍＬ、０．３〜７ｍＬ、０．４〜６ｍＬ、０．５〜５ｍＬ、０．６〜４ｍＬ、０．７〜３ｍＬ、０．８〜２ｍＬ、０．９〜１．５ｍＬ、０．９５〜１．２ｍＬ、または１．０〜１．１ｍＬの体積の製剤緩衝液で投与する。体積は、これらの値のいずれかの範囲内の任意の範囲（例えば、約０．５ｍＬ〜約１．１ｍＬ）内に入り得ることが当業者には理解される。ウイルス粒子の投与は、送達のための種々の適切な経路を通じたものであってよく、例えば、注射による投与（例えば、皮内、筋肉内、静脈内または皮下）、鼻腔内投与（例えば、吸引によって）、丸剤形態での投与（例えば、嚥下、膣または直腸への送達用の坐薬）であってよい。一部の実施形態では、皮下送達が好ましい場合があり、それにより樹状細胞へのより大きな接近をもたらすことができる。
【０２９８】
個体へのウイルス粒子の投与を繰り返すことができる。ウイルス粒子の繰り返し送達は、スケジュールに従ったものであってもよく、あるいは、必要に応じて実施することもできる。例えば、標的抗原、例えば、ＭＵＣ１、Ｔおよび／またはＣＥＡに対する個体の免疫を試験し、必要に応じて追加的な送達を補充することができる。一部の実施形態では、送達のスケジュールは、定期的な間隔でウイルス粒子を投与することを含む。スケジュールに従う期間および／または投与前に評価される必要に応じた投与の期間の１つまたは複数を含む共同送達レジメンを設計することができる。例えば、療法レジメンは、３週間に１回の皮下投与などの投与、次いで、死亡を含めた任意の理由で療法から除かれるまで、３カ月ごとの別の免疫療法処置を含んでよい。別のレジメンの例は、３週間ごとに３回の投与、次いで、３カ月ごとに別の３回の免疫療法処置のセット、を含む。別のレジメンの例は、第１の頻度での第１の投与回数を伴う第１の期間、第２の頻度での第２の投与回数を伴う第２の期間、第３の頻度での第３の投与回数を伴う第３の期間など、および場合によって、必要に応じて未決定の投与回数を伴う１つまたは複数の期間を含む。各期間中の投与の回数は、それぞれ独立に選択することができ、例えば、１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１１回、１２回、１３回、１４回、１５回、１６回、１７回、１８回、１９回、２０回またはそれ超であり得る。各期間中の投与の頻度もそれぞれ独立に選択することができ、例えば、およそ毎日、２日に１回、３日に１回、週に２回、週に１回、２週間に１回、３週間に１回、毎月、６週間に１回、２カ月に１回、３カ月に１回、４カ月に１回、５カ月に１回、６カ月に１回、１年に１回などであり得る。療法には最大１カ月、２カ月、３カ月、４カ月、５カ月、６カ月、７カ月、８カ月、９カ月、１０カ月、１１カ月、１２カ月、１３カ月、１４カ月、１５カ月、１６カ月、１７カ月、１８カ月、１９カ月、２０カ月、２１カ月、２２カ月、２３カ月、２４カ月、３０カ月、３６カ月またはそれ超の総期間がかかり得る。免疫間の予定された間隔は、免疫間の間隔が、その間隔の最大５分の１、４分の１、３分の１、または半分だけ修正されるように改変することができる。例えば、３週間間隔スケジュールに関しては、２０日間から２８日間の間（３週間−１日〜３週間＋７日）で免疫を繰り返すことができる。最初の３回の免疫に関して、第２の免疫および／または第３の免疫を遅らせる場合、その後の免疫をシフトさせることができ、それにより、免疫間の緩衝液の量を最小にすることが可能になる。例えば、３週間間隔スケジュールに関しては、免疫を遅らせる場合、その後の免疫を前の免疫の１７日後、１８日後、１９日後、または２０日後以降に行う予定にすることができる。
【０２９９】
Ａｄ  Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２Ｂ−］−ＣＥＡ（６Ｄ）、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２Ｂ−］−ＭＵＣ１、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２Ｂ−］−ＭＵＣ１ｃ、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２Ｂ−］−ＭＵＣ１ｎ、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２Ｂ−］−Ｔウイルス粒子などの本発明の組成物は、種々の状態で、例えば、室温で、氷上で、または凍結させて提供することができる。組成物は、適切なサイズの容器、例えば、２ｍＬのバイアルに入れて提供することができる。一実施形態では、抽出可能なワクチン１．０ｍＬを伴う１  ２ｍｌのバイアルに、１ｍＬ当たり総ウイルス粒子５×１０１１個が含有される。温度および湿度を含めた保管条件は変動し得る。例えば、療法に使用するための組成物は、室温、４℃、−２０℃、またはそれ未満で保管することができる。
【０３００】
種々の実施形態では、本発明の方法および組成物に従った処置を受ける個体に対して一般的な評価を実施する。任意の検査の１つまたは複数を、必要に応じて、または、例えば０週目、３週目、６週目など予定した通りに実施することができる。免疫を伴わない時点に対して、免疫と同時に、異なる検査のセットを実施することができる。
【０３０１】
一般的な評価は、病歴、ＥＣＯＧ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｓｃｏｒｅ、カルノフスキーのパフォーマンスステータス、および主治医による、体重を伴う完全な身体検査のうちの１つまたは複数を含み得る。当該患者が最後の来診以来受けているまたは受けていた任意の他の処置、薬物療法、生物学的製剤、または血液製剤を記録することができる。あらゆる有害反応についてモニタリングするために、患者を診療所においてワクチン接種後、適切な期間にわたって、例えば、およそ３０分にわたって経過観察することができる。ワクチンの各投薬後の局所的なおよび全身性の反応源性を選択された時間にわたって、例えば、３日間（免疫の日およびその後２日間）にわたって毎日評価することができる。症状を報告するために日誌カードを使用することができ、局所的な反応源性を測定するために定規を使用することができる。免疫注射部位を評価することができる。胸部、腹部、および骨盤のＣＴスキャンまたはＭＲＩを実施することができる。
【０３０２】
種々の実施形態では、本発明の方法および組成物に従った処置を受ける個体に対して血液学的評価および生化学的評価を実施する。任意の検査の１つまたは複数を、必要に応じて、または、例えば０週目、３週目、６週目など予定した通りに実施することができる。免疫を伴わない時点に対して、免疫と同時に、異なる検査のセットを実施することができる。血液学的評価および生化学的評価は、化学的検査および血液学的検査のための血液検査、分画を伴うＣＢＣ、Ｎａ、Ｋ、Ｃｌ、ＣＯ２、ＢＵＮ、クレアチニン、Ｃａ、総タンパク質、アルブミン、総ビリルビン、アルカリホスファターゼ、ＡＳＴ、ＡＬＴ、グルコース、およびＡＮＡのうちの１つまたは複数を含み得る。
【０３０３】
種々の実施形態では、本発明の方法および組成物に従った処置を受ける個体に関して生物学的マーカーを評価する。任意の検査の１つまたは複数を、必要に応じて、または、例えば０週目、３週目、６週目など予定した通りに実施することができる。免疫を伴わない時点に対して、免疫と同時に、異なる検査のセットを実施することができる。
【０３０４】
生物学的マーカー評価は、適切な体積、例えば、約５ｍｌの血清試料に由来するＭＵＣ１、ＭＵＣ１ｃ、ＭＵＣ１ｎ、ＣＥＡまたはＡｄ５ベクターに対する抗体の測定の１つまたは複数を含み得る。決定され、利用可能である場合、バイオマーカー（例えば、ＣＥＡまたはＣＡ１５−３）を再調査することができる。
【０３０５】
種々の実施形態では、本発明の方法および組成物に従った処置を受ける個体に対して免疫学的評価を実施する。任意の検査の１つまたは複数を、必要に応じて、または、例えば０週目、３週目、６週目など予定した通りに実施することができる。免疫を伴わない時点に対して、免疫と同時に、異なる検査のセットを実施することができる。
【０３０６】
試験中および／または特定の回数の免疫後の特定の時点で免疫応答に対する影響があるか否かを決定するために、末梢血、例えば、約９０ｍＬを各免疫の前および少なくとも一部の免疫後の時点で採取することができる。免疫学的評価は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をＭＵＣ１、ＭＵＣ１ｃ、ＭＵＣ１ｎ、ＴまたはＣＥＡに対するＴ細胞応答についてＥＬＩＳｐｏｔ、増殖アッセイ、多パラメータフローサイトメトリー分析、および細胞傷害性アッセイを使用してアッセイすることの１つまたは複数を含み得る。各採血からの血清を保管し、送付し、決定することができる。
【０３０７】
種々の実施形態では、本発明の方法および組成物に従った処置を受ける個体に対して腫瘍評価を実施する。任意の検査の１つまたは複数を、必要に応じて、または、例えば処置前、０週目、３週目、６週目などの予定した通りに、実施することができる。免疫を伴わない時点に対して、免疫と同時に、異なる検査のセットを実施することができる。腫瘍評価は、処置前、少なくとも一部の免疫後の時点で、ならびに、選択された回数、例えば２回、３回、または４回の第１の処置の完了後、および例えば処置から除かれるまで、およそ３カ月ごとに実施される、胸部、腹部、または骨盤のＣＴスキャンまたはＭＲＩスキャンのうちの１つまたは複数を含み得る。
【０３０８】
ＣＥＡなどの本明細書に記載されている標的抗原に対する免疫応答を、個体の末梢血試料などの試料から、ＥＬＩＳｐｏｔ、サイトカインフローサイトメトリー、または抗体応答などの免疫応答に関する１つまたは複数の適切な試験を使用して評価することができる。陽性免疫応答は、Ｔ細胞応答を測定することによって決定することができる。Ｔ細胞応答は、バックグラウンドに対して補正した、抗原を伴う６ウェル中のスポットの平均数が、対照の６ウェル中のスポットの数を１０だけ超え、かつ、抗原を含有する６ウェルと対照の６ウェルの単一の値間の差異がスチューデントのｔ検定を使用してｐ≦０．０５のレベルで統計的に有意であれば、陽性とみなすことができる。免疫原性アッセイは、各免疫の前および処置の期間中の予定した時点で行うことができる。例えば、処置の約１週目、約２週目、約３週目、約４週目、約５週目、約６週目、約７週目、約８週目、約９週目、約１０週目、約１１週目、約１２週目、約１３週目、約１４週目、約１５週目、約１８週目、約２０週目、約２４週目、約３０週目、約３６週目、または約４８週目の免疫原性アッセイの時点を、この時に免疫を予定しなくても、予定することができる。一部の場合では、個体が、少なくとも最小数の免疫、例えば、１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、またはそれ超の免疫を受けていれば、その個体を免疫応答について評価可能であるとみなすことができる。
【０３０９】
一部の実施形態では、疾患の進行または臨床応答の決定は、測定可能／評価可能な疾患を有する患者の間で、ＲＥＣＩＳＴ１．１基準に従って行う。一部の実施形態では、本発明の方法および組成物を使用する療法は、療法を受ける個体において完全奏効（ＣＲ；標的病変に関して全ての標的病変の消失、または非標的病変に関して全ての非標的病変の消失および腫瘍マーカーレベルの正常化）に影響を及ぼす。一部の実施形態では、本発明の方法および組成物を使用する療法は、療法を受ける患者において部分奏効（ＰＲ；標的病変のベースライン合計ＬＤを参照としてとり、標的病変の合計ＬＤの少なくとも３０％の減少）に影響を及ぼす。
【０３１０】
一部の実施形態では、本発明の方法および組成物を使用する療法は、療法を受ける個体において安定病態（ＳＤ；標的病変について、処置開始からの最小の合計ＬＤを参照としてとり、ＰＲと認定されるのに十分な縮小もなく、ＰＤと認定されるのに十分な増加もない）に影響を及ぼす。一部の実施形態では、本発明の方法および組成物を使用する療法は、療法を受ける個体において不完全応答／安定病態（ＳＤ；１つもしくは複数の非標的病変の持続または／および非標的病変について正常限界を超える腫瘍マーカーレベルの維持）に影響を及ぼす。一部の実施形態では、本発明の方法および組成物を使用する療法は、療法を受ける個体において進行性疾患（Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  Ｄｉｓｅａｓｅ）（ＰＤ；標的病変について、処置開始から記録された最小の合計ＬＤを参照としてとり、標的病変の合計ＬＤの少なくとも２０％の増加、もしくは１つもしくは複数の新しい病変の出現、または１つもしくは複数の非標的病変の持続もしくは／および非標的病変について正常限界を超える腫瘍マーカーレベルの維持）に影響を及ぼす。
【０３１１】
キット
組成物、免疫療法またはワクチンは、キットの形態で供給することができる。本開示のキットは、処置レジメン情報を含めた投薬量およびまたは投与に関する指示をさらに含み得る。
【０３１２】
一部の実施形態では、キットは、組み合わせ多標的化がん免疫療法をもたらすための組成物および方法を含む。一部の実施形態では、キットは、感染症の組み合わせ多標的化処置のための組成物および方法を含む。一部の実施形態のキットは、キット成分の投与に有用な成分および成分の調製の仕方に関する指示をさらに含み得る。一部の実施形態では、キットは、処置前および処置後に適切な実験室検査を用いて患者のモニタリングを行うため、または結果および患者データを医療従事者に伝達するためのソフトウェアをさらに含み得る。
【０３１３】
キットを構成する成分は、乾燥した形態であっても液体の形態であってもよい。乾燥した形態である場合、キットは、乾燥材料を可溶化するための溶液を含み得る。キットは、液体または乾燥した形態の伝達因子も含み得る。伝達因子が乾燥した形態である場合、キットは、伝達因子を可溶化するための溶液を含む。キットは、成分の混合および調製用の容器も含み得る。キットは、例えば、針、管材料、塗布器、吸入剤、シリンジ、ピペット、鉗子、計量スプーン、点眼器または任意のそのような医学的に承認された送達ビヒクルなどの、投与を補助するための器具も含み得る。本発明のキットまたは薬物送達システムはまた、一般には、商業的販売および配布のために本開示の組成物を密閉する手段も含む。
【実施例】
【０３１４】
ペプチドおよびベクター
以下のＨＬＡ−Ａ２およびＨＬＡ−Ａ２４結合性ペプチドを、このおよび他の実施例で使用した：（ａ）ＨＬＡ−Ａ２結合性ＣＥＡアゴニストペプチドＣＡＰ１−６Ｄ（ＹＬＳＧＡＤＬＮＬ（配列番号１０））、（ｂ）ＨＬＡ−Ａ２  ＭＵＣ１アゴニストペプチドＰ９３Ｌ（ＡＬＷＧＱＤＶＴＳＶ（配列番号１２））、（ｃ）ＨＬＡ−Ａ２４結合性ＭＵＣ１アゴニストペプチドＣ６Ａ（ＫＹＨＰＭＳＥＹＡＬ（配列番号１３））、および（ｄ）ＨＬＡ−Ａ２結合性ブラキュリアゴニストペプチド（ＷＬＬＰＧＴＳＴＶ（配列番号１４））。全てのペプチドは、９６％を超えて純粋であった。
【０３１５】
Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ブラキュリ、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＣＥＡおよびＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＭＵＣ１を構築し、生成した。簡潔には、相同組換えに基づくアプローチを使用して、導入遺伝子をＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］ベクターのＥ１領域にサブクローニングした。複製欠陥ウイルスはＥ．Ｃ７パッケージング細胞株で増殖させ、ＣｓＣｌ２精製し、滴定した。ウイルス感染力価は、Ｅ．Ｃ７細胞単層の上のプラーク形成単位（ＰＦＵ）として決定した。ＶＰ濃度は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）破壊ならびに２６０ｎｍおよび２８０ｎｍでの分光測光によって決定した。ＣＥＡ導入遺伝子は、高度に免疫原性であるエピトープＣＡＰ１−６Ｄを含有する改変されたＣＥＡも含有した。
【０３１６】
ヒトブラキュリタンパク質をコードする配列（Ｔ、ＮＭ＿００３１８１．３）を、エンハンサーＴ細胞ＨＬＡ−Ａ２エピトープ（ＷＬＬＰＧＴＳＴＶ（配列番号１４））の導入、およびＤＮＡ結合に関与した２５アミノ酸断片の除去によって改変した。結果として生じた構築物をＡｄ５ベクターにその後サブクローニングして、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ブラキュリ構築物を生成した。
【０３１７】
ＭＵＣ１分子は、２つの領域：ＭＵＣ１の大きな細胞外ドメインであるＮ末端（ＭＵＣ１−ｎ）と、３つの領域：小さい細胞外ドメイン、単一の膜貫通ドメインおよび細胞質尾部を有するＣ末端（ＭＵＣ１−ｃ）からなった。細胞質尾部はシグナル伝達タンパク質と相互作用するための部位を含有し、がん遺伝子として、ならびにがんの運動性、侵襲性および転移の駆動因子として作用する。Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＭＵＣ１の構築のために、８つのアゴニストエピトープを含むＭＵＣ１導入遺伝子全体を、Ａｄ５ベクターにサブクローニングした。Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＭＵＣ１ベクターに含まれるアゴニストエピトープは、ＨＬＡ−Ａ２（Ｎ末端のエピトープＰ９３Ｌ、ＶＮＴＲ領域のＶ１ＡおよびＶ２Ａ、ならびにＣ末端のＣ１Ａ、Ｃ２ＡおよびＣ３Ａ）、ＨＬＡ−Ａ３（エピトープＣ５Ａ）およびＨＬＡ−Ａ２４（Ｃ末端のエピトープＣ６Ａ）に結合する。１０１０ＶＰのＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ブラキュリ、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＣＥＡおよびＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＭＵＣ１を１：１：１（合計３×１０１０ＶＰ）の比で合わせることによって、Ｔｒｉ−Ａｄ５ワクチンを生成した。
【０３１８】
（実施例１：Ａｄ５ヌルアデノウイルスベクターの複数回の注射は、抗アデノウイルス抗体を生成する）
この実施例は、注射された被験体でＡｄ５−ヌルの複数回の注射が抗アデノウイルス抗体の生成をもたらすことを示す。
【０３１９】
いかなる異種核酸配列も含有しないＡｄ５−ヌルアデノウイルスベクターが、マウスで中和免疫応答を生成することが実証された。１つの実験では、５〜７週齢の雌Ｂａｌｂ／ｃマウスを、１４日間隔でＡｄ５ヌルウイルス粒子で免疫した。抗アデノウイルス抗体の存在を決定するために、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）を使用した。このＥＬＩＳＡのために、１０９個のウイルス粒子を１００μＬの０．０５Ｍ炭酸／重炭酸緩衝液ｐＨ９．６でマイクロタイターウェルの上にコーティングし、室温で一晩インキュベートした。標準の免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）参照曲線のために、２００ｎｇ、１００ｎｇ、５０ｎｇ、２５ｎｇおよび０ｎｇの精製マウスＩｇＧを前記のマイクロタイターウェルの上にコーティングした。インキュベーションの後、全てのウェルを、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７．４中の２５０μＬの１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で３回洗浄した。洗浄の後、２５０μＬのＢＳＡ／ＰＢＳを全てに加え、室温で３０分の間インキュベートして未結合の部位をブロックした。インキュベーションの後、全てのウェルを２５０μＬのＢＳＡ／ＰＢＳで３回洗浄した。洗浄の後、ＢＳＡ／ＰＢＳ中の１／１００血清希釈溶液の２００μＬをウェルに加え、室温で１時間インキュベートした。陽性対照のために、ＢＳＡ／ＰＢＳ中の抗アデノウイルス抗血清の１／１００００希釈溶液の２００μＬを、ウェルに加えた。対照ウェルは、ＢＳＡ／ＰＢＳだけを含有した。インキュベーションの後、全てのウェルを２５０μＬのＢＳＡ／ＰＢＳで３回洗浄した。洗浄の後、ＢＳＡ／ＰＢＳ中のペルオキシダーゼコンジュゲートγ−鎖特異的ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）の１／１００００希釈溶液の２００μＬを各ウェルに加え、室温で１時間インキュベートした。インキュベーションの後、全てのウェルを２５０μＬのＢＳＡ／ＰＢＳで３回洗浄した。洗浄の後、２００μＬの発色試薬（０．０６％過酸化水素を含有している０．２Ｍリン酸カリウム緩衝液ｐＨ５．０中の０．５ｍｇ／ｍＬの１，２−フェニレンジアミン）を各ウェルに加え、室温で３０〜４０分の間インキュベートした。インキュベーションの後、各ウェルへの５０μＬの５Ｎ  ＨＣｌの添加によって呈色反応を停止した。次にマイクロウェルプレートリーダーで、全てのウェルを４９２ｎｍで読み取った。読取値が得られた後、未知試料の光学濃度読取値を標準のＩｇＧ曲線と関連付けて、ウェル当たりの結合したＩｇＧのｎｇを得た。これは、ＩＮＳＴＡＴ統計パッケージを使用して実行した。
【０３２０】
ＣＥＡに対する抗体を検出するＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡプレートを０．０５Ｍの炭酸−重炭酸緩衝液ｐＨ９．６中の１００ｎｇのヒトＣＥＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）でコーティングして、室温で一晩インキュベートした。プレートは１％Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳ−Ｔ）を含有するリン酸緩衝食塩水で３回洗浄し、次に１％ＢＳＡを含有するＰＢＳにより室温で６０分間、ブロックした。さらなる３回の洗浄の後、ＰＢＳ−Ｔで１／５０に希釈した血清をウェルに加え、プレートを室温で１時間インキュベートした。洗浄後に１：５０００希釈のペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウス免疫グロブリン（Ｉｇ）Ｇ（γ−鎖特異的）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）抗体をウェルに加え、プレートを１時間インキュベートした。プレートを３回洗浄し、１，２−フェニレンジアミン基質溶液を各ウェルに加えた。１０％リン酸を加えることによって反応を停止した。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ１９０  ＥＬＩＳＡリーダーで、吸光度を４９２ｎｍで測定した。ウェルあたりのＣＥＡと結合したＩｇＧのナノグラム等価物は、精製されたマウスＩｇＧを使用して生成され、ＣＥＡ  ＥＬＩＳＡと同時に作り出した標準曲線を参照して得られた。ＳｏｆｔＭａｘ  Ｐｒｏ６．３ソフトウェアを使用して結果を分析し、定量化した。
【０３２１】
１０１０のＡｄ−５−ヌルによる第１の注射から２週後に、抗アデノウイルスＩｇＧ抗体の有意なレベル（Ｐ＜０．００１）がマウスでは検出された（図１）。１０１０のアデノウイルスによる第２の注射から２週後に、有意により高いレベル（Ｐ＜０．００１）が観察された。１０１０のＡｄ５−ヌルによる第３の注射から２週後に、抗体の有意により高いレベル（Ｐ＜０．００１）が連続して観察された。各値は、各群の５匹のマウスのプールされた血清からの三連の決定の平均を表す。Ａｄ５−ヌルの複数回の注射は、被験体で抗アデノウイルス抗体の生成をもたらした。
【０３２２】
Ａｄに対する中和抗体の存在を決定するために、以下のアッセイを利用した。マイクロウェル組織培養プレート中の１０％ウシ胎仔血清を含有するＤＭＥＭ（ＤＭＥＭ／ＦＣＳ）からなる２００μＬの培養培地で、５％ＣＯ２中の３７℃で２４時間、１ウェル当たり細胞数２×１０３の細胞濃度でＨＥＫ−２９３Ｔ細胞株を培養した。インキュベーションの後、１００μＬの培養培地を三連のウェルから取り出して、ウイルス粒子（ＶＰ）を含有する２０μＬのＤＭＥＭ／ＦＣＳと混合した。混合の後、１２０μＬの混合液をそれぞれのマイクロウェルに戻した。別のセットの三連のウェルでは、１００μＬの培養培地を取り出し、室温で１時間ＶＰと一緒に前にインキュベートした２０μＬの熱不活性化（５６℃で１時間）Ａｄ免疫マウス血清と混合した。混合の後、１２０μＬの混合液をそれぞれのウェルに戻した。三連の細胞対照ウェルでは、２０μＬのＤＭＥＭ／ＦＣＳを全培養培地容積について調整するために加えた。三連の培地のみの対照ウェルは、２２０μＬのＤＭＥＭ／ＦＣＳを含有した。組織培養プレートは、５％ＣＯ２中の３７℃でさらに３日間インキュベートした。インキュベーションの後、４０μＬのＰＲＯＭＥＧＡ細胞生存率試薬（Ｏｗｅｎ試薬）を全ウェルに加え、５％ＣＯ２中の３７℃で７５分の間インキュベートした。このアッセイでは、Ｏｗｅｎ試薬（ＭＴＳテトラゾリウム化合物）は、生存能力のある細胞によって組織培養培地に可溶性である有色のホルマザン生成物に生体内還元される。４９０ｎｍでの吸光度によって測定されるホルマザン生成物の量は、培養物中の生細胞数に直接的に比例する。インキュベーションの後、光学濃度読み取りのために１５０μＬを各ウェルから取り出して、別のマイクロウェルプレートに移した。マイクロウェルプレートリーダーを使用して、４９２ｎｍでの光学濃度読取値がその後得られた。
【０３２３】
Ａｄに対する中和抗体の存在を検出するために、各々５匹のマウスの群に、１０１０のＡｄ５−ヌルを１回、２回または３回、２週間隔で注射した。ウイルスの最終注射の２週後に、マウスを放血させ、プールし、前記のように熱不活性化血清有り無しでインキュベートした４×１０７のＶＰを使用して中和抗体について評価した。単独で培養した細胞は、対照群の役目を果した。通常のマウスおよびＡｄ５ヌルを１回注射したマウスは、有意なレベルの中和抗体を示さなかった（図２）。Ａｄを２回注射したマウスは、ウイルスだけとインキュベートした細胞と比較して有意な（Ｐ＜０．０５）レベルの中和抗体を示した。Ａｄ５−ヌルを３回注射したマウスも、ウイルスだけとインキュベートした細胞と比較して有意な（Ｐ＜０．０１）レベルの中和抗体を示した。
【０３２４】
（実施例２：Ａｄ５［Ｅ１−］−ＣＥＡベクターワクチンは、Ａｄ５免疫マウスで再免疫の際にＣＥＡ特異的免疫応答を誘導する）
この実施例は、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］ベクタープラットフォームが、マウスで既存のＡｄ５免疫の存在下で、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）癌胎児性抗原（ＣＥＡ）に対してＣＭＩ応答を誘導することを示す。
【０３２５】
Ａｄ５  ＣＥＡベクターの特徴付け
２つのＡｄ５−ＣＥＡベクタープラットフォームのＣＥＡ遺伝子発現を確認するために、初期研究を実行した。ワクチンベクタープラットフォームをトランスフェクトした細胞でＣＥＡ抗原が発現され得ることを最初に決定した。Ａ５４９細胞をＡＴＣＣから得、Ａｄ５［Ｅ１−］−ＣＥＡまたはＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＣＥＡをトランスフェクトした。ウェスタンブロット分析は、ベクタープラットフォームをトランスフェクトした細胞がＣＥＡ抗原を発現することを明らかにした。（図３５）
【０３２６】
方法
Ａ５４９細胞に、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＣＥＡを５５５ＶＰ／細胞のＭＯＩで接種した。細胞を、５％ＣＯ２中の３７℃で４８時間インキュベートした。４８時間後に、細胞を収集し、ＰＢＳで洗浄し、３回凍結／解凍した。全細胞溶解物を７０℃で１０分間加熱した後、ゲルにローディングした。組換え型ＣＥＡ対照は３０ｎｇ／レーンで、調製した溶解物は２０μＬ／レーンでローディングした。追加の陰性対照として試料ローディング緩衝液が含まれ、陽性対照はＭａｇｉｃ  Ｍａｒｋ  ＣＰウェスタンマーカーおよび組換え型ＣＥＡであった。ゲルをニトロセルロース膜に転写し、ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋブロッキング溶液で６０分間ブロックした。膜をマウスモノクローナル抗ＣＥＡ一次抗体（１：１０００）および二次抗マウスＨＲＰ（１：２５００）コンジュゲート抗体でプローブした。膜を３回洗浄し、次にＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ化学発光試薬とインキュベートし、Ｘ線フィルムを膜に曝露させた後に発色させることによってバンド形成を可視化した。
【０３２７】
マウスでのＡｄ５免疫の誘導
誘導されるかもしれないＡｄ５免疫のレベルを評価するために、Ａｄ５ナイーブＣ５７Ｂｌ／６マウスの群に、Ａｄ５ベクタープラットフォーム（ＶＰ）を皮下注射した。２８〜４２日後に、血清試料を収集し、エンドポイントＡｄ５  ＮＡｂ力価について評価した。図３に示すように、検出不能なＡｄ５  ＮＡｂ力価（エンドポイントＡｄ５  ＮＡｂ力価＜１／２５）が通常の対照マウスで観察された。１回の注射の後にＡｄ５  ＮＡｂ（１／２５〜１／５０のエンドポイント力価）が検出可能だったが、１０１０のＡｄ５の３回の注射の後に劇的に増加した。したがって、追加のＡｄ５免疫研究では、マウスに１０１０のＡｄ５  ＶＰを２回注射して、これらの動物をＡｄ５免疫にした。
【０３２８】
Ａｄ５［Ｅ１−］−ＣＥＡまたはＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＣＥＡによるＡｄ５免疫マウスの免疫
これらの実験は、Ａｄ５免疫マウスでＡｄ５［Ｅ１−］−ＣＥＡおよびＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＣＥＡワクチンの免疫誘導能力を決定し、比較するように設計した。４〜８週齢の雌Ｃ５７Ｂｌ／６マウスの群を、１０１０のＡｄ５−ヌルＶＰにより２週間隔で２回免疫した。最後のＡｄ５−ヌル免疫の２週後、マウスをＡｄ５［Ｅ１−］−ＣＥＡまたはＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＣＥＡの１０１０ＶＰにより１週間隔で３回免疫した。最後の免疫の２週後、マウスを安楽死させ、それらの脾臓および血清を分析のために収集した。
【０３２９】
インタクトなＣＥＡ抗原に曝露させた脾細胞で実行したＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって、ＣＭＩ応答を評価した。Ａｄ５［Ｅ１−］−ＣＥＡまたはＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＣＥＡにより皮下に免疫したＡｄ５免疫Ｃ５７Ｂｌ／６マウスからの脾細胞を収集し、前記のようにＩＦＮ−γおよびＩＬ−２分泌細胞の数について評価した。免疫されたＡｄ５［Ｅ１−］−ＣＥＡマウスと比較してＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＣＥＡで免疫したマウスからのアッセイした脾臓で、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−２分泌細胞の両方の有意に増加した数が観察された（図４Ａおよび図４Ｂ）。Ａｄ５  ＣＥＡベクターによる免疫は特異的ＣＥＡ関連のＣＭＩ応答を誘導するが、ＨＩＶ−ｇａｇタンパク質またはβ−ガラクトシダーゼなどの他の無関係な抗原に対する応答を誘導しないことを、特異性研究は明らかにした。Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＣＥＡによるＡｄ５免疫マウスの免疫が、有意により高いＣＭＩ応答を誘導することをこれらの結果は実証する。
【０３３０】
免疫されたマウスにおける有害な肝臓効果の欠如
毒性研究は、前記のようにＡｄ５［Ｅ１−］−ＣＥＡ、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＣＥＡで免疫したＡｄ５免疫雌Ｃ５７Ｂｌ／６マウスからの血清で実行した。緩衝液だけを注射したＡｄ５ナイーブまたはＡｄ５免疫マウスが、対照の役目を果した。処置による肝臓毒性を決定するために、第３の免疫の３日後に、アスパラギン酸アミノ基転移酵素（ＡＳＴ）レベルを血液試料で評価した。いずれのベクターによる免疫の後にも、ＡＳＴレベルは対照を超えて上昇しなかった（図５）。アラニンアミノ基転移酵素（ＡＬＴ）レベルも評価し、類似の結果が観察された。
【０３３１】
Ａｄ５免疫腫瘍を有するマウスにおけるＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＣＥＡ免疫療法
上で観察された成功裏の免疫学的結果に基づき、ＭＣ３８腫瘍をマウスで確立し、次に処置した研究を、下記の通りに実行した。これらの研究のために、ＣＥＡ発現ＭＣ３８マウスの細胞株を使用した。この細胞株は、ヒトＣＥＡを発現するように遺伝子改変され、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに移植することができる。腫瘍確立の後、マウスを新規のＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＣＥＡベクタープラットフォームで処置した。Ａｄ５免疫腫瘍を有するマウスをＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＣＥＡベクターで処置できるかどうか決定するために、マウスをＡｄ５免疫にするために、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに、１４日間隔で１０１０のＡｄ５［Ｅ１−］−ヌルＶＰを皮下に２回注射した。最後の注射から２週後に、７匹のＣ５７Ｂｌ／６マウスの２群に、１０６のＣＥＡ発現ＭＣ３８腫瘍細胞を皮下に注射した。７日後、腫瘍が触知可能になったとき、７、１３および１９日目に、１群のマウスを１０１０ＶＰのＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＣＥＡによる遠位皮下注射によって処置した。７匹の注射緩衝液だけで処置したＣ５７Ｂｌ／６マウスの１群が、未処置対照の役割を果たした。全てのマウスを２１日間にわたって腫瘍サイズについてモニタリングし、腫瘍体積は前述の通り決定した。
【０３３２】
１９日目までの腫瘍増殖は、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＣＥＡ処置マウスで有意に低減され、そのままであった（図６）。研究の終わりに（２２日目）、マウスを屠殺し、腫瘍を切除して計量した。腫瘍を測定し、体積を決定した。統計分析は、ＰＲＩＳＭソフトウェアによるボンフェローニ事後検定分析を使用して実行した。Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＣＥＡで処置したマウスの腫瘍は、未処置の対照より重量が有意に小さかった（Ｐ＜０．０５）（図７）。
【０３３３】
研究の終わりに、脾臓をマウスから収集し、ＣＥＡ特異的ＣＭＩ応答をＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって決定した。ＣＥＡ特異的ＩＦＮ−γ分泌応答は、ＭＣ−３８腫瘍細胞を単独で受けたマウスよりもＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＣＥＡで免疫したマウスで有意に高かった。これらの結果は、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＣＥＡワクチンを使用したＡｄ５免疫マウスでのＣＥＡ発現腫瘍の処置が、腫瘍増殖の進行を有意に減少させることができることを示す。
【０３３４】
（実施例３：感染後のＡ５４９細胞でのＣＥＡ発現のための定量的ＥＬＩＳＡ）
この実施例は、ヒトがん性肺細胞株Ａ−５４９を形質導入するためにＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］ＣＥＡベクターを使用した用量応答評価を示す。結果は、ＣＥＡ抗原を用量依存的に発現させることができることを示す。
【０３３５】
実験設計
アッセイの１日目に、ＢＤファルコン組織培養９６ウェルプレートに３日前に継代したＡ５４９細胞を播種し（ロット番号３０Ｊｕｌ０２、継代ｐ＋２３）、（細胞数７．７×１０３／ウェル）、５±２％ＣＯ２雰囲気下の３７±２℃インキュベーターに一晩入れた。
【０３３６】
その翌日、検体の希釈系列を調製し、１ウェルあたりウイルス粒子数１．５６×１０３〜２．５×１０４のレベルで反復ウェルに接種した。モック試料の役割を果たす、未処置のＡ５４９細胞を使用した。アッセイの４日目に、ＣＥＡ濃度を測定するためにＥＬＩＳＡによる分析のためにウェルを１０％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００溶液で処置した。ＥＬＩＳＡのために、マイクロタイタープレートを抗ＣＥＡ捕捉抗体（ａｂｃａｍの癌胎児性抗原ＣＥＡ抗体［（ＮＣＲＣ１６（ＡＫＡ１６１））］）で一晩コーティングした。ウェルを洗浄して未結合の反応体を除去し、標準曲線の範囲内に入るようにプレートを１％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）溶液でブロックした。ブロッキング期間の後、ウェルを洗浄し、試料、対照および標準を割り当てられた三連のウェルでインキュベートした。未結合の反応体を洗浄によって除去し、ＣＥＡ検出抗体に対するウサギポリクローナル抗体を加えた。インキュベーションの後、ウェルを洗浄し、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、ペルオキシダーゼ基質とインキュベートした。基質は酵素の存在下で有色の生成物を形成し、１Ｍリン酸溶液で反応を停止させ、較正したマイクロプレートリーダーで吸光度を決定した。既知濃度のＣＥＡを含有する標準から較正曲線を生成し、曲線は、試料中のＣＥＡの濃度を決定するために使用された。ウイルス粒子当たりの生成されたＣＥＡの量は、希釈および感染多重度（ＭＯＩ）について補正した後に、ＥＬＩＳＡによって測定されたＣＥＡの濃度から計算された。培地に存在するバックグラウンドレベルを相殺するために、培養培地単独と類似の方法で決定された値を引き算した。試料分析を、表２に示す。
【表２−１】
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【表２−２】
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【０３３７】
（実施例４：スケジュール、用量、免疫経路の安全性データ）
Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］ベクタープラットフォームが、トランスフェクトした細胞の上で抗原タンパク質を発現できることを評価、確認するために、初期前臨床研究を実行した。Ａ−５４９細胞をワクチンプラットフォームでトランスフェクトし、ウェスタンブロット分析によって分析した（図８）。それらがＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］ベクタープラットフォームでトランスフェクトされると、ＨＩＶ−ｇａｇ、ＨＩＶ−ｐｏｌまたはＨＩＶ−ｎｅｆなどの抗原タンパク質が細胞で発現されるのが観察された。
【０３３８】
Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］ベクタープラットフォームを使用して用量応答評価を実行し、１０１０のウイルス粒子（ＶＰ）がマウスのモデルで導入遺伝子産物に対する所望のＣＭＩ応答をもたらす用量であることが実証された。マウスの脾臓からインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）およびＩＬ−２分泌細胞（脾細胞）を検出するために、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイを利用することによってＣＭＩ応答を評価した。さらに、マウスおよび非ヒト霊長類（ＮＨＰ）モデルでは、それぞれ２週〜４週の間隔の１０１０ＶＰを使用した３回の免疫は、所望のＣＭＩ応答をもたらした。マウスでは、複数回の免疫の後には１回のみの免疫と比較してより大きな程度のＣＭＩ応答が観察された（図９）。
【０３３９】
ＮＨＰモデルでは、野生型Ａｄ５ウイルスの注射によって動物をＡｄ５免疫にした。Ａｄ５中和抗体力価が、動物がＡｄ５に免疫であることを確認する１：５０またはそれ超に到達したとき、それらを１×１０１０ＶＰの用量のＡｄ５−［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ｇａｇによって３０日間隔で３回皮内に免疫した。最後のワクチン接種から３２日後および第１の免疫（野生型Ａｄ５）から１２４日後に、ＮＡｂ力価は１：１０００またはそれ超であった。免疫の後、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−２分泌細胞について動物の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を評価したとき、確固としたＣＭＩ応答の存在が検出された（図１０）。
【０３４０】
上に示す３ＮＨＰでの初期ワクチン治験で実行した予備的免疫研究に加えて、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＨＩＶ  ｇａｇでワクチン接種をした同じＮＨＰで毒性研究も実行した。試験期間中に、動物の体温および体重を評価した。動物は、それらが試験期間中に成長するにしたがって体重が増加した。試験期間中に、体温差は観察されなかった。ワクチン接種をしたＮＨＰで、血液学研究も実行した。第２のワクチン接種から２週間後に白血球数の小さい増加があったようであるが、それはその後正常化した。
【０３４１】
値の変動以外に、試験中に血液学の値に他のいかなる差もなかったようである。試験中に、ＮＨＰで化学値も決定した。アルカリホスファターゼレベルは試験中にわずかに低下したが、正常範囲内に留まった。アルブミンレベルは試験中にわずかに低下したが、正常の範囲内に留まった。試験中に観察された血液化学の他のいかなる差も、なかった。優勢なＤＣが真皮に存在するので、この臨床試験では免疫経路が選択される。
【０３４２】
ＣＥＡおよび他の導入遺伝子を利用するＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］プラットフォームを使用して、所望のレベルのＣＭＩ応答を誘導した。Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＣＥＡベクタープラットフォームを使用して、非Ａｄ５免疫およびＡｄ５前免疫マウスの両方にワクチンを３回注射した。免疫の後、ＩＦＮ−γ分泌細胞についてマウスからの脾細胞をＥＬＩＳｐｏｔによって評価した。免疫の後に上昇したＣＭＩ応答が観察され、ＣＭＩ応答のレベルは非Ａｄ５免疫およびＡｄ５前免疫マウスの両方で類似していた（図１１）。これらの結果は、既存のＡｄ５免疫の存在にもかかわらず確固としたＣＭＩ応答を誘導することができることを示す。針皮下送達方法による３週間隔の３回の免疫を使用して、ＩＩＩ臨床試験を設計した。
【０３４３】
スケジュール、用量、投与経路の理論的根拠
臨床試験設計は、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］ベクタープラットフォームを使用して、動物およびヒトで前臨床および臨床試験から移行した。Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］ベクタープラットフォームを使用した用量応答評価を実行し、１０１０ＶＰがマウスモデルで導入遺伝子産物に対する所望のＣＭＩ応答をもたらす用量であることが実証された。さらに、マウスおよび非ヒト霊長類（ＮＨＰ）モデルでは、それぞれ２週〜４週の間隔の１０１０ＶＰを使用した３回の免疫は、所望のＣＭＩをもたらした。優勢な樹状細胞（ＤＣ）が真皮に存在するので、免疫経路が選択される。この前提を使用して、複数のマウスおよびＮＨＰ研究を皮下注射プロトコールを使用して実行した。ＣＥＡおよび他の導入遺伝子を用いたＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］プラットフォームを使用して、所望のレベルの循環ＣＭＩを誘導した。針皮下（ＳＱ）送達方法による３週間隔の３回の免疫を使用してフェーズＩＩＩ臨床試験が続き、死亡を含むいかなる理由により研究から排除されるまで、免疫療法処置を３カ月ごとに継続した。
【０３４４】
要約
ＣＡＰ１（６Ｄ）変異を有する改変されたＣＥＡを含有するｃＤＮＡ配列を、生成した。Ｅ．Ｃ７細胞株を使用して、臨床グレードＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＣＥＡ（６Ｄ）を構築、製造した。合計３４人の患者（３２人の結腸直腸がん患者、１人の膀胱がん患者および１人の肺がん患者）を、ＩＮＤ１４３２５の下のフェーズＩ／ＩＩ臨床試験に入れた。大半は、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＣＥＡ（６Ｄ）による全３回の予定の免疫療法処置を受けた。免疫療法を早期に中止した５人の患者は、かなりの疾患進行のためにそうした。ＣＴまたはＭＲＩスキャンを使用するＲＥＣＩＳＴ１．０基準を、ベースライン時および処置が完了した後に得た。毒性は、有害事象のための米国癌研究所一般用語基準（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｏｍｍｏｎ  Ｔｅｒｍｉｎｏｌｏｇｙ  Ｃｒｉｔｅｒｉａ  ｆｏｒ  Ａｄｖｅｒｓｅ  Ｅｖｅｎｔｓ）（ＣＴＣＡＥ）バージョン４．０に従って評価した。末梢血ＣＥＡレベル、血液学、血清化学および抗核抗体力価を、ベースラインと免疫療法の開始から９週後の間で比較した。いかなる原因による死亡まで、第１の免疫の日からの生存を測定した。
【０３４５】
合計９４回の処置を、患者に投与した。いかなる処置用量レベルでも、用量制限毒性も重大な有害事象（ＳＡＥ）も処置中止をもたらさなかった。血液学の値に１つの有意な変化だけがあった。群として、処置終了から３週後の９週目に、好塩基球数が有意により低かった。しかし、この値は好塩基球数の正常範囲内にあり、全体として有意な生物学的作用はないようであった。７．４カ月のメジアン追跡調査で、群（コホート１、２、３／フェーズＩＩおよびコホート５）として全３４人の患者は、４１．４％の１２カ月生存割合を経験した。研究に入れた３４人の患者のうち、２８人の患者は３回の免疫療法処置を受けて、５５％の１２カ月生存割合を経験した。結腸直腸腺癌患者については、２７人の患者が３回の免疫療法処置を受けて、５３％の１２カ月生存割合を経験した。Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＣＥＡ（６Ｄ）の上昇するレベルへの用量応答が観察され、最も高い細胞媒介免疫（ＣＭＩ）応答は、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＣＥＡ（６Ｄ）の５×１０１１ＶＰの最高用量を受けた患者で起きた。最も高いＣＥＡ特異的ＣＭＩ応答を既存のまたはベクターによって誘導されたＡｄ５  ＮＡｂ活性と比較したとき、ＣＥＡ特異的ＣＭＩのレベルとＡｄ５中和抗体（ＮＡｂ）レベルの間に相関はなかった。これらの臨床治験データから、本発明者らは、全生存を臨床エンドポイントとした転移性結腸直腸腺癌の処置のための無作為化フェーズＩＩＩ治験に進むのに十分なデータがあると考えるに至る。
【０３４６】
プロトコールスキームおよび患者処置。
臨床試験はＦＤＡによって承認された治験新薬免除の下で実行し、ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖで登録した。参加者は、Ｄｕｋｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ（ＮＣ）およびＭｅｄｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（ＷＡ）の医学腫瘍学クリニックから募集した。患者は、それぞれの施設内倫理委員会（ＩＲＢ）によって承認されたインフォームドコンセントを提供した。適格性要件には、ＣＥＡを発現する転移がん、ならびに十分な血液学的、腎臓および肝臓の機能が含まれた。治験参加者は、可能な全生存の恩恵を有することが知られている標準療法による処置を受けたか、そのような療法を拒否したことが必要とされた。除外基準には、前の４週以内の化学療法もしくは放射線、自己免疫性疾患、ウイルス性肝炎、ＨＩＶの病歴、または免疫抑制剤の使用が含まれた。登録の前に少なくとも３カ月の間ベバシズマブまたはセツキシマブを受けていた患者は、これらの抗体を受け続けることが許された。前のＣＥＡ免疫療法は許された。本研究は、標準の３＋３用量漸増戦略を用い、用量制限毒性（ＤＬＴ）はグレード３または４の主要器官毒性と規定された。Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＣＥＡ（６Ｄ）用量は、以下の通りに患者に送達された：コホート１：３回の免疫のために３週ごとの同じ大腿への皮下（ＳＱ）による０．５ｍＬ中に１×１０９ＶＰの用量；コホート２：３回の処置のために３週ごとのＳＱによる０．５ｍＬ中に１×１０１０ＶＰの用量；コホート３：３回の処置のために３週ごとのＳＱによる０．５ｍＬ中に１×１０１１の用量。１×１０１１ＶＰの用量が安全であると立証されたのち、さらなる１２人の患者がＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＣＥＡ（６Ｄ）をこの用量およびスケジュールで受けた（フェーズＩＩコホート）。フェーズＩＩコホートを完了した後に、達成可能な最高用量の安全性を決定するために、６人の患者の追加のコホート（コホート５）が、３回の処置のために２．５ｍＬ中のＳＱによる５×１０１１ＶＰの用量を３週毎に受けた。０、３、６週目の免疫の直前および最後の処置の３週後に、ＰＭＢＣを患者から収集した。ＥＬＩＳｐｏｔアッセイを実行するまで、ＰＢＭＣは液体窒素で凍結させた。コホート５では、新鮮なＰＢＭＣを、多機能性ＣＤ８＋Ｔリンパ球のための予備的フローサイトメトリーアッセイで分析した。
【０３４７】
臨床活性の評価。
臨床活性は、ベースライン時および処置の完了後に得られたコンピュータ断層撮影法（ＣＴ）または磁気共鳴画像化（ＭＲＩ）スキャンを使用して、固形腫瘍における応答評価基準（ＲＥＣＩＳＴ  １．０基準）に従って評価した。毒性は、有害事象のための米国癌研究所一般用語基準（ＣＴＣＡＥ）バージョン４に従って評価した。末梢血ＣＥＡレベル、血液学、血清化学および抗核抗体力価を、ベースライン時および最終処置から３週後に比較した。いかなる原因による死亡まで、第１の免疫の日からの生存を測定した。
【０３４８】
ＥＬＩＳｐｏｔアッセイによるＣＭＩ応答の分析。
ＩＦＮ−γ分泌リンパ球のためのＥＬＩＳｐｏｔアッセイを実行した。簡潔には、ＩＦＮ−γ生成Ｔ細胞を刺激するために、個々の患者試料からの単離されたＰＢＭＣ（細胞数２×１０５／ウェル）を、ＣＥＡペプチドプール（６Ｄ改変を有する完全長ＣＥＡを網羅する１１ａａ重複部分を有する１５ｍｅｒ；０．１μｇ／ウェル）と３６〜４０時間インキュベートした。Ａｄ５へのＣＭＩ応答は、Ａｄ５−ヌル（空のベクター）に患者ＰＢＭＣを曝露させた後に決定した。０．２５μｇ／ウェルの濃度のコンカナバリンＡ（Ｃｏｎ  Ａ）で刺激した細胞は、陽性対照の役目を果した。Ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔ  ＥＬＩＳｐｏｔプレートリーダーを使用して有色スポット形成細胞（ＳＦＣ）を数え、陰性対照の減算の後に細胞数１０６当たり５０ＳＦＣが検出され、ＳＦＣが陰性対照ウェルでのそれらより２倍以上高かったならば、応答は陽性であると考えられた。
【０３４９】
Ａｄ５中和抗体（ＮＡｂ）力価の決定。
エンドポイントＡｄ５  ＮＡｂ力価を決定した。簡潔には、１０％ウシ胎仔血清を含有する１００μＬのＤＭＥＭ中の熱不活性化試験血清の希釈溶液を、４×１０７ＶＰのＡｄ５［Ｅ１−］−ヌルと混合し、室温で６０分の間インキュベートした。１０％熱不活性化子ウシ血清を含有するＤＭＥＭで５％ＣＯ２中の３７℃で２４時間培養した、細胞数２×１０３／ウェルのＨＥＫ２９３細胞を含有するマイクロウェルに、試料を追加した。混合物を、５％ＣＯ２中の３７℃でさらに７２時間インキュベートした。細胞の死滅およびエンドポイントＡｄ５  ＮＡｂ力価を測定するために、ＭＴＳテトラゾリウム生体内還元アッセイを使用した。１：２５未満の値を有するエンドポイント力価に、０の値を割り当てた。
【０３５０】
統計。
免疫応答を比較する統計分析を、マン−ホイットニー検定法（ＰＲＩＳＭ、Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ）を用いて実行した。生存比較は、カプラン−マイヤープロット（ＰＲＩＳＭ、Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ）を用いて実行した。Ａｄ５  ＮＡｂ力価およびＣＥＡ特異的ＣＭＩは、連続変数として分析した。ＣＥＡ特異的ＣＭＩの変化とＡｄ５  ＮＡｂ力価の関連は、スピアマン相関係数で検定した。生存とＡｄ５  ＮＡｂ力価の関連は、比例危険モデルのワルド検定で検定した。全ての検定は、０．０５の両側αを使用した。
【０３５１】
人口統計：全患者。
メジアンで３回の事前の化学療法レジメン（範囲：２〜＞５）が失敗し、９０％（範囲７０％〜１００％）のメジアンパフォーマンスステータスを有し、メジアンで３部位の転移性疾患（範囲１〜５）を有していた、メジアン年齢５８（範囲３８〜７７）の、３２名の転移性結腸直腸がん患者、１名の肺がんがん患者および１名の膀胱がん患者を登録した（表２）。大多数の患者は、全３回の免疫を受けることができた。全３回の処置の完了より前に免疫を中止した５人の患者は、かなりの疾患進行のためにそうした。患者人口統計を、表３に示す。
【表３】
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【０３５２】
人口統計：結腸直腸腺癌患者
メジアンで３回の事前の化学療法レジメン（範囲：２〜＞５）が失敗し、９０％（範囲７０％〜１００％）のメジアンパフォーマンスステータスを有し、メジアンで３部位の転移性疾患（範囲１〜５）を有していた、メジアン年齢５７．５（範囲３８〜７７）の転移性結腸直腸がんの３２人の患者が登録された（表２）。大半は、全３回の免疫を受けることができた。免疫を早期に中止した４人の患者は、かなりの疾患進行のためにそうした。結腸直腸腺癌患者の人口統計は、化学療法抗療性の結腸直腸がん患者の以前に公開された研究に比べて遜色がない。
【０３５３】
有害作用
合計９４の免疫処置が、全ての患者に投与された。いかなるワクチン用量レベルでも、処置中止をもたらした用量制限毒性および重大な有害事象はなかった。最も一般的な毒性（表３）は、自己限定性の注射部位反応であった。低頻度で起こった他の反応には、発熱、インフルエンザ様症状、食欲不振、悪寒、吐き気および頭痛が含まれる。これらの症状も自己限定性であって、アセトアミノフェンなどの症候的措置以外の介入を必要としなかった。
【０３５４】
処置前後の血液学、化学およびＡＮＡ値の要約
個々の患者の血液学、化学および抗核抗体（ＡＮＡ）値を症例記録様式（ＣＲＦ）に記録することによって、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＣＥＡ（６Ｄ）注射の生物学的作用をモニタリングした。治験に登録された３４人の合計患者のうち、２８人がＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＣＥＡ（６Ｄ）による全３回の処置を受けた。全３回の処置を受けた２８人の患者について、０週目（第１の処置の前）の血液学、化学およびＡＮＡ値を、９週目（第３の処置の３週後）に得られたそれらと比較した。下の表４に示すように、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＣＥＡ（６Ｄ）による処置後に化学またはＡＮＡ値に有意な変化はなかった。血液学の値に１つの有意な変化だけがあった。処置後９週目に、好塩基球数が有意に（Ｐ＝０．０４０３）より低かった。しかし、この値は好塩基球数の正常範囲内にあり、全体として有意な生物学的作用はなかった。
【０３５５】
臨床転帰
ベースラインおよび９週目のＣＥＡレベルを患者で評価した。ベースラインおよび追跡調査で入手可能なＣＥＡレベルを有する患者の中で、３人（患者０１０、０２０および０２４）は免疫期間の終わりにＣＥＡレベルの増加はなかったが、残りの患者は増加したＣＥＡレベルを示した。安定病態を有する３人の患者がいたが、彼らは９週間の試験期間中そのままだった。全ての他の患者は、多少のレベルの進行性疾患を経験した（表２）。コホート１および２の７人の患者のうち、免疫開始の１２カ月後に５人の死亡があり、２人の患者が生存していた。コホート３およびフェーズＩＩの２１人の患者のうち、１２カ月でそれぞれ、１０人の死亡があり、残りの全１１人の患者は生存していた。コホート５の６人の患者のうち、６、７および８カ月でそれぞれ、３人の死亡があり、３人の患者が生存していた。
【０３５６】
研究に登録された３４人の患者のうち、２人の患者は１回の処置を受け、４人の患者は２回の免疫処置を受け、残りの２８人の患者は全３回の免疫処置を受けた。全ての患者は、実行した生存およびカプラン−マイヤープロットおよび生存割合に関して追跡調査した（ＰＲＩＳＭソフトウェア）。社会保障死亡指数（ｓｏｃｉａｌ  ｓｅｃｕｒｉｔｙ  ｄｅａｔｈ  ｉｎｄｅｘ）（ＳＳＤＩ）データベースおよびカルテから集められた情報によって、患者死亡を決定した。
【０３５７】
コホート１および２の７人の患者は、２９％の１２カ月生存割合を経験した（図１２Ａ）。コホート１および２の患者のうち、患者００４は１１カ月生存し、ベバシズマブ、ｆｏｌｆｏｘおよびｘｅｌｏｄａによる追加の免疫後処置を受けた。患者００３は９カ月生存し、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＣＥＡ（６Ｄ）免疫の後、照射処置を受けた。１２＋カ月で生存していた患者００５は照射処置を受け、免疫の後に別の臨床治験に入った。患者０１０は１２カ月まで生存し、免疫の後に２つの臨床治験に入った。患者００２、００７および００８は免疫の後にさらなる処置を受けず、それぞれ、３、１および１２＋カ月生存した。
【０３５８】
コホート３およびフェーズＩＩの２１人の患者は、４８％の１２カ月生存割合を経験した（図１２Ｂ）。コホート３およびフェーズＩＩの患者のうち、１人の患者（０１７）は、免疫の最中に同時セツキシマブを受けた。患者０２０および０２１は、免疫の最中に同時ベバシズマブを受けた。１２カ月を越えて生存した患者０１１は、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＣＥＡ（６Ｄ）免疫の後、照射処置を受けた。患者０１２および０１６は、それぞれ１２カ月を越えておよび６カ月を越えて生存し、免疫の後に追加の化学療法処置を受けた。患者０１３は４カ月生存し、免疫の後にｎｅｘａｖａｒによる処置を受けた。患者０１５は１０カ月生存し、セツキシマブによる続きの処置を受けた。患者０１９は１２カ月を越えて生存し、プロトコール免疫の後にベバシズマブおよびｘｅｌｉｒｉによる処置を受けた。患者０２０は１２カ月を越えて生存し、免疫の後にベバシズマブによる処置を受けた。患者０２１は１２カ月を越えて生存し、ベバシズマブおよびｘｅｌｏｄａによる続きの処置を受けた。患者５００は１２カ月を越えて生存し、セツキシマブおよびｘｅｌｏｄａによる処置を受け、免疫の後に臨床治験に入った。患者５０１は１２カ月を越えて生存し、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＣＥＡ（６Ｄ）免疫の後にセツキシマブおよびイリノテカンによる処置を受けた。患者５０８は１２カ月を越えて生存した；しかし、この患者の特徴に関するさらなるデータは、得ることができなかった。患者０１７、０２３、０２４、０２５、０２６、５０２、５０４、５０６および５０７は、免疫の後にさらなる処置を受けず、それぞれ、３、４、１２＋、７、４、３、１２＋、３および１２＋カ月生存した（＋は、書き込む時点でなお生存していたことを意味する）。
【０３５９】
コホート５の６人の患者は、５０％の１２カ月生存割合を経験した（図１２Ｃ）。このコホートの患者のうち、１人の患者（０３０）は８カ月で現在生存しており、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＣＥＡ（６Ｄ）免疫の後に、パゾパニブおよび閾値３０２化学療法による処置を受けた。患者０３１は７カ月で現在生存し、免疫の後にさらなる処置を受けていない。患者０３２は同時パニツムマブを受け、６カ月生存し、免疫の後にｆｏｌｆｏｘによる処置を受けた。患者０３３は同時パニツムマブを受け、免疫の後に追加の療法なしで５カ月生存した。患者０３４は、６＋カ月で現在生存し、免疫の後に放射線およびｘｅｌｏｄａによる処置を受けた。患者０３５は２回の処置を受け、２カ月生存した。
【０３６０】
７．４カ月のメジアン生存で、群（コホート１、２、３／フェーズＩＩおよびコホート５）として全３４人の患者は、４１％の１２カ月生存割合を経験した（図１２Ｄ）。研究に入れた３４人の患者のうち、２８人の患者は３回の免疫処置を受け、５５％の１２カ月生存割合（図１３Ａ）を経験し、メジアン生存は１０．６２５カ月であった。結腸直腸腺癌患者については、２７人の患者が３回の免疫処置を受け、５３％の１２カ月生存割合（図１３Ｂ）を経験し、メジアン生存は１０．００カ月であった。
【０３６１】
処置された転移性結腸直腸がん患者の免疫パラメータの評価
二次的目的は、本生成物による免疫処置の後のＣＥＡ特異的免疫応答を評価することであった。
【０３６２】
イピリムマブと併用したＰＳＡ−ＴＲＩＣＯＭワクチンを用いた臨床治験に登録された前立腺がん患者（ＨＬＡ−Ａ２＋および−Ａ２４＋）の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から、樹状細胞を生成した。ワクチン接種後のこの患者からのＰＢＭＣを使用して、ＣＥＡ、ＭＵＣ１およびブラキュリに特異的な個々のＴ細胞株を樹立することができなかった。簡潔には、リンパ球分離培地勾配を使用してＰＢＭＣを単離し、ＡＩＭ−Ｖ培地に再懸濁し（細胞数２×１０７）、６ウェルプレートに２時間接着させた。１００ｎｇ／ｍｌの組換え型ヒト（ｒｈ）ＧＭ−ＣＳＦおよび２０ｎｇ／ｍｌのｒｈＩＬ−４を含有するＡＩＭ−Ｖ培地で、接着細胞を５日間培養した。培養培地は、３日毎に補充した。
【０３６３】
ＥＬＩＳＡによって決定されたように、ＣＥＡに対する抗体活性は観察されなかった。コホート１、コホート２、コホート３／フェーズＩＩおよびコホート５で処置された結腸直腸がん患者でのＣＭＩ応答を評価した。Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＣＥＡ（６Ｄ）処置の前、および全ての処置の後、ならびに最後の処置の３週後に、患者からＰＢＭＣを単離した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＣＥＡペプチドに曝露させた後にインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）分泌リンパ球の数を決定するために、ＣＥＡ特異的ＥＬＩＳｐｏｔアッセイをＰＢＭＣで実行した。コホート１、コホート２、コホート３／フェーズＩＩおよびコホート５で処置された患者において、時点（３、６または９週目）に関係なく、免疫の最中の最も高いＣＭＩ応答を決定した。この分析は、生成物のレベルの増加への用量応答を明らかにした。５×１０１１ＶＰ（コホート５）の最高用量を受けた患者で、最も高いＣＭＩレベルが生じた（図１４）。
【０３６４】
ＣＥＡへの誘導されたＣＭＩ応答の決定。
ＣＥＡ特異的ＣＭＩ応答を評価するために、各免疫の前および最終免疫の完了後に採取した低温保存ＰＢＭＣ試料で、ＥＬＩＳｐｏｔ分析を実行した。Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＣＥＡ（６Ｄ）の最高用量を受けた患者で起きた最大級のＣＥＡ特異的ＣＭＩ応答による用量応答効果が、観察された（図１４）。受けた用量の中で、コホート１の０人／３人（０％）の患者が陽性のＣＥＡ誘導性ＣＭＩ応答を示し、コホート２の１人／４人（２５％）の患者が陽性のＣＥＡ誘導性ＣＭＩ応答を示し、コホート３／フェーズＩＩの１０人／１９人（５３％）の患者が陽性のＣＥＡ誘導性ＣＭＩ応答を示し、コホート５の４人／６人（６７％）の患者が陽性のＣＥＡ誘導性ＣＭＩ応答を示した。ＣＥＡ特異的ＣＭＩの誘導の時間経過（図１５）は、最終用量の前にＣＥＡ  ＣＭＩの大きさにプラトーがある可能性を実証した。同じ用量を受けた患者の最大の群（コホート３およびフェーズＩＩ）では、６週目評価での平均ＣＥＡ誘導性ＣＭＩ応答においてベースラインに対して有意な増加（Ｐ＜０．０５、マン−ホイットニー検定法）が観察され、それは平均で９４ＳＦＣ／１０６ＰＢＭＣであり、９週目評価までにさらに増加した（図１５）。１人の患者（患者ＩＤ１３）は、高度に上昇したベースラインのＣＥＡ特異的免疫応答（１１００ＳＦＣ）、および６週目に上昇したＣＭＩ（２３０５ＳＦＣ）を有していたが、９週目評価では戻らず、ＣＥＡ  ＣＭＩ分析に含まれなかった。
【０３６５】
Ａｄ５  ＮＡｂおよびＡｄ５に対するＣＭＩも測定して、ＣＥＡ特異的ＣＭＩと相関させた。各患者で、ベースライン時（処置前）および３回の処置の完了から９週後に血清およびＰＢＭＣ試料を検査した。この研究で検査した３１人の結腸直腸がん患者のうちの１９人（６１％）は、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＣＥＡ（６Ｄ）による処置の開始の前に、血清試料中にＡｄ５中和活性を有していた。全ての患者の間で得られた平均の処置前Ａｄ５  ＮＡｂ力価値は１：１８９±１：７１  ＳＥＭ（幾何平均１：２１）であって、セロポジティブ患者の間の平均の処置前Ａｄ５  ＮＡｂ力価は１：３０８±１：１０８（幾何平均１：１４６）であった。３回の免疫を受けた患者からの血清試料の分析は、それぞれのベースライン値と比較したときに、９週目までに有意に増加した（Ｐ＜０．０００１、マン−ホイットニー検定法）Ａｄ５  ＮＡｂ力価（平均１：４７６７±１：１２２５  ＳＥＭ（幾何平均１：１５４１））を明らかにした（図１６）。Ａｄ５へのＣＭＩ応答のためのＰＢＭＣの分析は、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＣＥＡ（６Ｄ）による免疫の後にＡｄ５誘導性ＣＭＩ応答の有意な増加（Ｐ＜０．０１、マン−ホイットニー検定法）も明らかにした（図１６）。
【０３６６】
低ベースラインの既存のＡｄ５免疫（Ａｄ５  ＮＡｂ≧２００）を有する患者  対  高ベースラインのＡｄ５免疫（Ａｄ５  ＮＡｂ＞２００）を有する患者からの９週目のＣＥＡ誘導性ＣＭＩ応答の比較は、免疫応答の有意差がない（Ｐ＞０．４、マンホイットニー検定法）ことを明らかにした（図１７）。さらに、最も高いＣＥＡ特異的ＣＭＩ応答を既存のまたはベクターによって誘導されたＡｄ５  ＮＡｂ活性と比較したとき、ＣＥＡ  ＣＭＩのレベルとＡｄ５  ＮＡｂ活性の間に相関はなかった（図１７）。これらのデータは、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＣＥＡ（６Ｄ）による免疫が自己寛容を克服することができただけでなく、既存のおよび／または免疫により誘導されるＡｄ５免疫の存在にもかかわらず結腸直腸がん患者でＣＥＡ特異的免疫応答を誘導することもできたことを示す。合わせて、これらの臨床治験データは、全生存を主要エンドポイントとしたフェーズＩＩＩ臨床治験への前進を支持する。
【０３６７】
有害作用、血液学、化学およびＡＮＡ値
このフェーズＩ／ＩＩ治験では、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＣＥＡ（６Ｄ）は、一定の比率で製造するのに、また、従来の皮下注射技術によって容易におよび繰り返し投与するのに適することが実証された。最も一般的な有害作用は、注射部位の反応ならびに発熱、悪寒、頭痛および吐き気からなるインフルエンザ様の症状であった。血液学または血清化学への影響はなく、全体として、処置は良好な耐容性を示した。具体的には、ＳＡＥは記されず、有害事象のために処置が停止されることはなく、この臨床適用でのＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＣＥＡ（６Ｄ）の使用に対する用量制限に達することはなかったことを示した。
【０３６８】
これらのデータは、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＣＥＡ（６Ｄ）で処置される進行した結腸直腸がん患者が重大な有害作用を有さず、彼らがＡｄ５に対する既存の免疫を有するとしても、生命の延長を経験することができることを示唆する。この治験の結果は、大きな無作為化された単剤治験へ進むのに十分な励みになった。用量依存的であるＣＭＩの増加を患者の一部が経験したことが観察されたことは、これが彼らの臨床転帰で役割を果たすことができることを示す。
【表４−１】
0006647315.tif 000006
【表４−２】
0006647315.tif 000007
【表５】
0006647315.tif 000008
【０３６９】
考察
概して導入遺伝子生成物に特異的な確固とした適応性免疫応答を誘導するそれらの傾向のため、アデノウイルスベクターは、がん治療ワクチンとして使用するためのかなりの可能性を有する。しかし、同種の初回刺激／追加刺激レジメンで使用される組換え型第１世代Ａｄ５［Ｅ１−］ベクターは、既存のＡｄ５免疫ならびにベクターにより誘導される免疫の存在のために、それらの潜在的有効性が大いに制限されている。具体的には、Ａｄ５誘導性免疫は、より早い世代のＡｄ５［Ｅ１−］をベースとしたプラットフォームに組み込まれたＴＡＡへの免疫応答を軽減する。本研究で利用されるＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］プラットフォームは、既存のＡｄ５免疫の標的である抗原の提示を回避することによって、同種の初回刺激−追加刺激レジメンに対応することを意図した。ＣＥＡは米国癌研究所によって優先的がん抗原の１つとして同定されたので、このＴＡＡは、がん治療ワクチンとして使用するための新しいＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］ベクタープラットフォームに組み込まれる導入遺伝子として調査された。成人でのＣＥＡ発現は胃腸上皮では通常低いレベルに制限され、一方、結腸および直腸の腺癌、ならびに多くの乳がん、肺がんおよび膵がんではＣＥＡは過剰発現される。野生型ＣＡＰ１エピトープと比べてＣＡＰ１（６Ｄ）はＣＴＬの感作を増強することができ、近年のＣＥＡをベースとしたワクチン構築物に含まれているので、ＣＥＡのＨＬＡ  Ａ２制限ＣＡＰ１（６Ｄ）改変が選択された。ＨＬＡ制限ではない完全長ＣＥＡが使用されたので、ＨＬＡタイプについて試験されなかったが、Ａ＊０２０１が白人で最も頻繁に観察される対立遺伝子であり（対立遺伝子頻度０．２７１７）、他の集団で一般的である。しかし、ＨＬＡタイプについて患者を試験し、ＨＬＡタイプと臨床および／またはＣＭＩ応答の間の関係を利用することが可能である。
【０３７０】
ＴＡＡ  ＣＥＡを発現するＡｄ５ワクチンのこのクラス（Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＣＥＡ（６Ｄ））の単一用量レベル（１×１０１０ＶＰ）の３回の投与を用いた複数回の皮下免疫を、ＣＥＡを発現するがんの前臨床マウスモデルで試験した。既存のＡｄ５免疫を有するマウスでは、抗腫瘍活性をもたらした強力なＣＥＡ誘導性ＣＭＩ応答の誘導が実証され、これらのＣＭＩおよび抗腫瘍応答が、現行世代のＡｄ５［Ｅ１−］をベースとしたベクターワクチンによって誘導される応答より有意に大きいことを表した。追加の動物モデル（がんおよび感染症の両方が標的）では、新しいＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］プラットフォームに基づくワクチンによる複数回の皮下免疫が、現行世代のＡｄ５［Ｅ１−］をベースとしたワクチンのそれらより優れていたＣＭＩ応答を誘導し、Ａｄ５免疫の障壁を克服することができ、確固としたＣＭＩ応答の発生を必要とする複数回免疫レジメンで利用することができることを実証した。最大級のＣＥＡ誘導性ＣＭＩ応答は、最高用量のベクターを受けた患者で起こった。ＣＥＡ誘導性ＣＭＩ応答は、既存のおよび／またはベクターによって誘導されたＡｄ５免疫の存在にもかかわらず、用量応答的に誘導された。ＥＬＩＳＡ技術を用いて、ワクチン接種の前後にＣＥＡ誘導性抗体応答は観察されなかった。免疫の後の多機能性ＣＤ８＋Ｔ細胞（活性化されるとき１つを超えるサイトカインを分泌するもの）の集団も観察され、これは、ワクチンによって誘導されたＴ細胞のより大きな機能性の徴候である。これらのデータは、進行した結腸直腸腺癌ならびに他の種々のワクチンに適する疾患または適用を有する患者でＣＥＡ誘導性ＣＭＩ応答を誘導し、増加させるように設計された同種の初回刺激−追加刺激レジメンでの、Ａｄ５［Ｅ１、Ｅ２ｂ−］−ＣＥＡ（６Ｄ）ベクターの使用を支持する。
【０３７１】
初期１（Ｅ１）遺伝子領域での欠失を含有するより早い世代のＡｄ５［Ｅ１−］ベクターと比較して、初期２ｂ（Ｅ２ｂ）遺伝子領域での追加の欠失を有するＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］ベクタープラットフォームは、ベクターで誘導される有意に低減された炎症性応答を示す。これは、より長い導入遺伝子発現、および、誘導された炎症性応答のために別途起こり得る導入遺伝子発現細胞（例えば、抗原提示細胞）の排除の低減をもたらすことができる。Ａｄ５後期遺伝子抗原発現はより早い世代のＡｄ５プラットフォームと比較して有意に低減されるので、これは、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］プラットフォームが有意により長い期間の間Ａｄ５免疫媒介中和活性を回避することを可能にし、ＴＡＡ発現のより長い寿命および増幅をもたらすかもしれない。さらに、Ｅ２ｂ遺伝子産物であるポリメラーゼは、Ａｄ５感染へのヒト細胞性記憶免疫応答の標的であり、ワクチンからのその排除は既存のＡｄ５免疫の状況下でその能力を助長しているかもしれない。理論によって縛られることなく、この環境でベクターによるＴＡＡの延長されたおよび／またはより大きな発現は、標的抗原に対するより有効な免疫応答をもたらすかもしれない。しかし、このベクター構成は、既存の免疫から逃れるよりはこのベクターの有効性に影響を与える、より優れた導入遺伝子発現、異なる体内分布または異なる生得的／適応性の免疫効果をもたらす可能性もある。
【０３７２】
この研究の中の処置された患者が良好な生存確率を示したことが観察されたことは、興味深い。全体として、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＣＥＡ（６Ｄ）で少なくとも２回処置された全２５人の患者は、４８％の１２カ月生存確率を示し、これは、既存のＡｄ５中和抗体力価の有意なレベルの存在にもかかわらず達成された。理論によって縛られることなく、患者の免疫系を関与させることによって、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＣＥＡ（６Ｄ）などの活性免疫療法薬は、標準の応答評価によって測定されない腫瘍の急速な成長速度または拡散の特異的態様の「減速」または改変をもたらすかもしれない連続的免疫学的抗腫瘍応答を長期間にわたって誘導するかもしれない。実際、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＣＥＡ（６Ｄ）による処置後に確立されたＣＥＡ発現腫瘍を抱えたＡｄ５免疫マウスで、より遅い腫瘍進行が観察された。さらに、任意の可能ながん（免疫）療法の臨床有効性を決定するために、全生存が唯一の真のパラメータであるかもしれないことが記されている。
【０３７３】
（実施例５：転移性結腸直腸がんでのＣＥＡ（６Ｄ）免疫療法薬の臨床試験）
Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＣＥＡ（６Ｄ）を使用したｍＣＲＣにおけるフェーズＩ／ＩＩ臨床治験：この最初のヒトにおけるフェーズＩ／ＩＩ投薬治験の目的は、安全性を評価すること、ｍＣＲＣ患者でＣＥＡ特異的免疫応答を評価すること、および全生存に関するデータを得ることであった。治験はＦＤＡ承認ＩＮＤ１４３２５の下で実行され、ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ（ＮＣＴ０１１４７９６５）に登録された。Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＣＥＡ（６Ｄ）用量は、以下の通り、３回の処置のために３週ごとに皮下（ｓｃ）投与された：コホート１（３人の患者）は、各処置で１０９ＶＰを受け；コホート２（３人の患者）は、１０１０ＶＰを受け；コホート３／４（２１人の患者）は、１０１１ＶＰを受け；コホート５（５人の患者）は５×１０１１ＶＰを受けた。
【０３７４】
患者人口統計：
ＣＥＡ発現がんを有する３２人のｍＣＲＣ患者が、研究に登録された。登録された３２人のｍＣＲＣ患者は、メジアン年齢５７．５（範囲３８〜７７）、メジアンで３回の事前の化学療法レジメン（範囲：２〜５）が失敗し、９０％（範囲７０％〜１００％）のメジアンパフォーマンスステータスを有し、メジアンで３部位の転移性疾患（範囲１〜５）を有していた。大多数の患者は、全３回の免疫を受けた。免疫を早期に中止した患者は、かなりの疾患進行のためにそうした。ｍＣＲＣ人口統計は、化学療法抗療性ｍＣＲＣの以前に公開された研究に比べて遜色がない。
【０３７５】
有害作用：
いかなる用量レベルでも、処置中止をもたらす用量制限毒性および重大な有害事象はなかった。最も一般的な毒性は、自己限定性の注射部位反応であった。０週目（第１の処置の前）の血液学、化学および抗核抗体（ＡＮＡ）値を、９週目に得られたそれらと比較した。化学、血液学またはＡＮＡ値で生物学的に関連した変化はなかった。
【０３７６】
臨床転帰：
免疫療法より前の３０日間、抗がん処置から患者をウォッシュアウトした。Ｋｒａｓ野生型患者およびＫｒａｓ変異患者の両方が登録された。
【０３７７】
ｍＣＲＣ患者を、実行した長期生存およびカプラン−マイヤー生存プロット（ＰＲＩＳＭソフトウェア）に関して追跡調査した。事象は、社会保障死亡指数データベースおよびカルテから決定した。メジアン全生存は１１カ月であって、全生存は１８カ月時に３０％および２９カ月時に２０％であった（図１８）。
【０３７８】
免疫応答：
二次的目的は、免疫療法中のＣＥＡ特異的免疫応答を評価することであった。再び、ｍＣＲＣ患者は処置した患者の最大数を占めたので、免疫原性研究は彼らで実行した。ＥＬＩＳＡによって決定されたように、血清試料中にＣＥＡに対する検出可能な抗体活性はなかった。
【０３７９】
全てのコホート中の処置されたｍＣＲＣ患者のＣＭＩ応答を評価した。各免疫療法処置の前後ならびに最後の処置の３週後に、患者から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離した。ＣＥＡペプチドに曝露させた後にＩＦＮ−γ分泌細胞（ＳＦＣ）の数を決定するために、前述の通りＣＥＡ特異的ＥＬＩＳｐｏｔアッセイをＰＢＭＣで実行した。免疫の間の最大ＣＭＩ応答を、時点（３、６または９週目）に関係なく決定した。この分析は、ワクチンのレベルの増加との用量応答関係を明らかにした（図１９）。５×１０１１ＶＰ（コホート５）の最高用量を受けた患者で、最も高いＣＭＩレベルが起こり、応答は、既存のＡｄ５免疫の存在にもかかわらず大多数（６１％）の患者で観察された。時間をわたっての逐次的なＰＢＭＣ試料の分析は、ＣＥＡ誘導性ＣＭＩ応答が３回の免疫の過程で誘導され、増加することを示した（図２０）。
【０３８０】
簡潔には、ＣＭＩ（ＩＦＮ−γ分泌）をベースライン時（Ｐｒｅ）およびＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＣＥＡ（６Ｄ）の投与の後（Ｐｏｓｔ）に評価した。処置後に患者で観察された最大ＣＭＩ応答（時点に関係なく）は、用量応答を明らかにした。最も高いＣＭＩレベルは、最高用量（コホート５）を受けた患者で起こり、有意に上昇していた（Ｐ＜０．０２；マン−ホイットニー検定法）。無関係な抗原β−ガラクトシダーゼおよびＨＩＶ−ｇａｇとの反応性の欠如によって、応答の特異性が実証された。陽性対照のために、ＰＢＭＣをコンカナバリンＡに曝露させた。値＝平均±ＳＥＭ（図１９）。
【０３８１】
簡潔には、免疫されたｍＣＲＣ患者におけるＣＭＩ（ＥＬＩＳｐｏｔ  ＩＦＮ−γ  ＳＦＣ）応答を、０、３、６および９週目に評価した。免疫の間のＣＭＩ応答の増加に留意する。値＝平均±ＳＥＭ（図２０）。
【０３８２】
フローサイトメトリーを使用した処置されたｍＣＲＣ患者の追加の免疫分析。
ＣＥＡペプチドに曝露させた後の高いＣＭＩ活性（＞１０００のＥＬＩＳｐｏｔ  ＩＦＮ−γ  ＳＦＣ）を有する患者からのＰＢＭＣでのフローサイトメトリー試験は、ＣＤ８＋／ＩＦＮ−γ＋細胞（３．５％）、ＣＤ８＋／ＩＦＮ−γ＋／ＴＮＦ−α＋細胞（１．０％）、ＣＤ４＋／ＩＦＮ−γ＋細胞（０．４％）およびＣＤ４＋／ＩＦＮ−γ＋／ＴＮＦ−α＋細胞（０．２％）を明らかにし、多機能性細胞の存在を実証した。
【０３８３】
患者ＰＢＭＣ試料はフローサイトメトリーによってＨＬＡ−Ａ２陽性についても試験し、試験した試料の６３％はＨＬＡ−Ａ２陽性であった。患者当たり達成された最も高いＣＭＩ応答レベルをＨＬＡ−Ａ２の存在に関連して評価したとき、ＨＬＡ−Ａ２＋とＨＬＡ−Ａ２−患者の間で観察された有意差はなかった（２６４．６±１１９．０のＩＦＮ−γ  ＳＦＣ対１６５．６±１０８．１のＩＦＮ−γ  ＳＦＣ）。
【０３８４】
細胞溶解性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答の誘導を評価するために、グランザイムＢ活性のためのＥＬＩＳｐｏｔアッセイを実行した。グランザイムＢは顆粒媒介経路を経た標的細胞死の鍵となる媒介因子であり、エフェクター−標的相互作用の際に細胞溶解性リンパ球によるグランザイムＢの放出はＣＴＬの指標である。グランザイムＢ  ＥＬＩＳｐｏｔアッセイは感度が有意により高く、細胞傷害性エフェクター細胞頻度の推定を提供するので、５１Ｃｒ放出アッセイの優れた代替物である。
【０３８５】
ＰＢＭＣで増加したグランザイムＢ活性が、免疫の後に観察された（図１６）。重要なことに、５人のｍＣＲＣ患者からのＰＢＭＣ試料における延長された追跡調査では、免疫（図２２）を停止した後にＣＭＩ応答が減少することが観察され、誘導されたＣＥＡ誘導性ＣＭＩ活性を維持するためにさらなる「追加」免疫が必要とされる場合があることを示している。
【０３８６】
簡潔には、処置の前（０週目）および後（６〜９週目）にＣＴＬ応答（ＥＬＩＳｐｏｔグランザイムＢ分泌ＳＦＣ）を評価した。免疫の後、応答は増加した（Ｐ＜０．０５ｉ）。値＝平均±ＳＥＭ（図２１）。
【０３８７】
簡潔には、５人の患者からのＰＢＭＣ試料をＥＬＩＳｐｏｔ  ＩＦＮ−γ  ＳＦＣによって評価した。ＣＭＩ応答は９週目にピークに達し、処置が停止された後、２６週目まで減少した（図２２）。
【０３８８】
これらのデータは、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＣＥＡ（６Ｄ）による複数回の同種免疫が、既存のＡｄ５中和活性にもかかわらず患者でＣＥＡ特異的ＣＭＩ免疫応答を誘導することを示す。これらのデータは、重要なことに、最小限の毒性があったが、良好な全生存プロファイルが観察されたことをさらに示す。最後に、これらの結果は、新規Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＣＥＡ（６Ｄ）遺伝子送達／発現プラットフォームが、天然の後天性Ａｄ５特異的免疫の場面においてＴＡＡへの耐性に打ち勝つことができ、ＣＥＡへの有意なＣＭＩ応答をもたらすことができることを示す。
【０３８９】
（実施例６：臨床グレードの多標的化ワクチンのＧＬＰ生産）
この実施例は、優良実験室規範（ｇｏｏｄ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｐｒａｃｔｉｃｅ）（ＧＬＰ）を使用した、臨床グレードの多標的化ワクチンの生産を示す。以前に、優良製造実施基準（）に従ってＧＬＰ条件の下で５Ｌ細胞バイオリアクターを使用して、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＣＥＡ（６Ｄ）製品を生産した。この実施例は、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ｍＭＵＣ１−ＣおよびＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ブラキュリ製品を、類似のアプローチを使用して５Ｌ細胞バイオリアクターで生産することができることを示す。
【０３９０】
簡潔には、Ｅ．Ｃ７製造細胞株のバイアルを解凍し、Ｔ２２５フラスコに移し、１０％ＦＢＳ／４ｍＭ  Ｌ−グルタミンを含有するＤＭＥＭで５％ＣＯ２中３７℃で最初に培養する。拡大増殖後、Ｅ．Ｃ７細胞は１０層ＣｅｌｌＳＴＡＣＫＳ（ＣＳ−１０）を使用し拡大増殖させ、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ無血清培地（ＳＦＭ）に移行する。Ｅ．Ｃ７細胞を、細胞バイオリアクター中で細胞数５×１０５／ｍＬの目標密度まで、５％ＣＯ２中の３７℃で２４時間、ＳＦＭで培養する。次に、Ｅ．Ｃ７細胞を、それぞれＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ｍＭＵＣ１−ＣまたはＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ブラキュリに感染させ、４８時間培養する。
【０３９１】
中間プロセシングは、ＩＮＤ１４３２５のもとの臨床グレードのＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＣＥＡ（６Ｄ）製品を調製するために使用されるものと同一の方法で実行される。収集の３０分前に、濃縮のためにより優れた細胞ペレット化を促進するために、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅヌクレアーゼを培養物に追加する。遠心分離によってペレットにした後に、上清を廃棄し、ペレットは室温で９０分の間、１％ポリソルベート２０含有溶解緩衝液に再懸濁する。溶解物はＢｅｎｚｏｎａｓｅで次に処理し、５Ｍ  ＮａＣｌの添加によって反応をクエンチする。スラリーを遠心分離し、ペレットは廃棄する。溶解物を濾過によって透明にし、２カラムイオン交換手順にかける。
【０３９２】
ワクチン生成物を精製するために、２カラム陰イオン交換手順を実行する。第１のカラムにＱセファロースＸＬ樹脂を詰め、衛生化し、ローディング緩衝液で平衡化する。透明にした溶解物をカラムにローディングし、ローディング緩衝液で洗浄する。ワクチン生成物を溶出させ、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ｍＭＵＣ１−ＣまたはＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ブラキュリを含有する主溶出ピーク（溶出液）を次の工程に送る。第２のカラムにＳｏｕｒｃｅ１５Ｑ樹脂を詰め、衛生化し、ローディング緩衝液で平衡化する。第１の陰イオン交換カラムからの溶出液を第２のカラムにローディングし、ワクチン生成物を、１００％緩衝液Ａ（２０ｍＭトリス、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｐＨ８．０）から出発して５０％緩衝液Ｂ（２０ｍＭトリス、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に移行する勾配で溶出させる。Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ｍＭＵＣ１−ＣまたはＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ブラキュリを含有する溶出ピークを収集し、２〜８℃で一晩保存する。ピーク溶出画分は、濃縮および製剤化緩衝液（２０ｍＭトリス、２５ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５％（ｖ／ｖ）グリセロール、ｐＨ８．０）に対するダイアフィルトレーションのための接線流濾過（ＴＦＦ）システムを通して処理される。処理後、最終ワクチン生成物は濾過滅菌され、アリコートに分注され、≦−６０℃で保存される。１００％純度近くの高度に精製された生成物が一般的に生成され、これらの生成物の類似の結果が予測される。
【０３９３】
生成されたＶＰ生成物の濃度および総数は、分光測光法で決定される。生成物純度は、ＨＰＬＣによって評価する。感染性活性は、キットを使用する感染性粒子のためのＡｄ５ヘキソン染色アッセイを実行することによって決定する。
【０３９４】
ｍＭＵＣ１−Ｃまたはブラキュリ発現を検証するために、ベクターをトランスフェクトしたＡ５４９細胞からの溶解物を使用して、ウェスタンブロットを実行する。最終ワクチン生成物がマイコプラズマを含まず、微生物汚染度（ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｂｉｏｂｕｒｄｅｎ）を有さず、１ｍＬに当たり２．５エンドトキシン単位（ＥＵ）未満のエンドトキシンレベルを示すことを決定するために、品質管理試験を実行する。免疫原性を確認するために、下記のようにマウスで個々のベクターを試験する（実施例７）。
【０３９５】
（実施例７：多標的化ＣＥＡ、ＭＵＣ１、Ｔウイルスベクターの免疫原性）
この実施例は、ＣＥＡ、ＭＵＣ１およびＴ（ブラキュリ）に対する多標的化ワクチンを使用した免疫原性結果を示す。本明細書に記載されるように、純度、感染性および抗原発現について各ウイルスベクター生成物を試験し、各々はこれらの基準に合格した。
【０３９６】
ワクチン接種および脾細胞調製
雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝５）に、１０１０ＶＰのＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ブラキュリもしくはＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＣＥＡもしくはＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＭＵＣ１または１：１：１の比の全３つのウイルスの１０１０ＶＰの組み合わせ（Ｔｒｉ−Ａｄ５）を皮下注射した。対照マウスには、３×１０１０ＶＰのＡｄ−ヌル（導入遺伝子挿入断片なし）を注射した。用量は２５μｌの注射緩衝液（３％スクロースを含有する２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ）で投与し、マウスは１４日間隔で３回ワクチン接種をした。最終注射の１４日後に、脾臓および血清を収集した。血清を、−２０℃で冷凍した。７０μＭナイロン細胞ストレーナー（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を通して脾臓を静かに破砕することによって、脾細胞懸濁液を生成した。赤血球溶解緩衝液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）の添加によって赤血球を除去し、脾細胞を２回洗浄し、Ｒ１０（Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、ＨＥＰＥＳ（２０ｍＭ）、ペニシリン１００Ｕ／ｍｌおよびストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌおよび１０％ウシ胎仔血清を追加したＲＰＭＩ１６４０）に再懸濁させた。ＥＬＩＳＰＯＴおよびフローサイトメトリーによって、サイトカイン生産について脾細胞をアッセイした。
【０３９７】
免疫原性研究：
以前の研究は、多標的化ワクチン混合物によって生成される、誘導された免疫を評価する。Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］ベクターによる免疫は用量依存的であり、１用量当たり１×１０１０ＶＰが通常使用された。Ｃ５７Ｂｌ／６マウスの群（Ｎ＝５）が、使用された。
【０３９８】
これは、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスが、３×１０１０のウイルス粒子（ＶＰ）のＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ヌル（空のベクター対照）を含む三免疫、またはＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＣＥＡ（６Ｄ）、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ｍＭＵＣ１−ＣおよびＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ブラキュリの１：１：１の混合物を含有する３×１０１０ＶＰを２週間隔で３回皮下注射された研究である。
【０３９９】
最後の免疫の２週後に、記載されるように、それぞれＣＥＡ、ＭＵＣ１またはブラキュリペプチドプールへの脾細胞の曝露の後に、ＩＦＮ−γ分泌細胞（ＳＦＣ）のためにＥＬＩＳｐｏｔアッセイを用いてＣＭＩ活性を決定した（８〜１２、１４）。
【０４００】
免疫されたマウスで有意なＣＭＩ応答が検出された（図２３）。活性化ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の量を評価するために、ＣＥＡペプチドに曝露させた後の脾細胞で細胞内サイトカイン染色を利用したフローサイトメトリーを実行した。
【０４０１】
簡潔には、ＩＦＮ−γ分泌脾細胞（ＳＦＣ）のためのＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって評価されたＣＥＡ、ＭＵＣ１およびブラキュリに対するＣＭＩ応答は、多標的化免疫されたマウスでは検出されたが、対照マウス（Ａｄ５−ヌル空ベクターを注射した）では検出されなかった。ＥＬＩＳｐｏｔアッセイ応答の特異性は、無関係なＳＩＶ−ｎｅｆまたはＳＩＶ−ｖｉｆペプチド抗原への反応性の欠如によって確認された。陽性対照には、コンカナバリンＡ（Ｃｏｎ  Ａ、データ示さず）に曝露させた細胞が含まれた。値＝平均±ＳＥＭ（図２３）。
【０４０２】
ＥＬＩＳｐｏｔアッセイ
ブラキュリ−、ＣＥＡ−およびＭＵＣ１−特異的ＩＦＮ−γ−またはＩＬ−２−分泌Ｔ細胞は、前記のように新たに単離されたマウス脾細胞からのＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって決定した。簡潔には、ブラキュリまたはＣＥＡまたはＭＵＣ１に由来する単一のプールにおいて、０．２μｇ／ウェルの重複する１５ｍｅｒペプチドで、２×１０５個の脾細胞を刺激した。陽性対照として細胞を１ウェル当たり０．０６２５μｇの濃度のＣｏｎ  Ａで刺激し、ＳＩＶ−ＮｅｆおよびＳＩＶ−Ｖｉｆに由来する重複した１５ｍｅｒ完全ペプチドプールを無関係なペプチド対照として使用した。Ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔ  ＥＬＩＳｐｏｔプレートリーダーを使用してＳＦＣの数を決定し、結果は１０６個の脾細胞当たりのＳＦＣの数として報告した。
【０４０３】
ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γを発現する多機能性ＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞が免疫された脾細胞では検出されたが、対照脾細胞では検出されなかった（図２４）。以前に記載された定量的ＥＬＩＳＡアッセイを精製ＣＥＡタンパク質と使用して誘導されたＣＥＡ抗体を検出するために、試験を血清でも実行した。Ａｄ５−ヌルを注射した対照（左）ではなく多標的化ワクチンで免疫したマウス（右）における、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αを発現する多機能性ＣＤ８＋（上）およびＣＤ４＋（下）細胞。応答の特異性は、培地単独または無関係なＳＩＶ−ｎｅｆもしくはＳＩＶ−ｖｉｆペプチドへの反応性の欠如によって確認された。値＝平均±ＳＥＭ（図２４）。
【０４０４】
ＣＥＡへの有意な抗体応答は、免疫されたマウスでは検出されたが、対照マウスでは検出されなかった（図８）。補体依存性細胞傷害（ＣＤＣＣ）のレベルを決定するために、マウスのＭＣ３８−ＣＥＡ標的細胞を使用してＣＤＣＣ試験を実行した。免疫マウスの血清で有意なＣＤＣＣ活性が検出されたが、対照マウス（Ａｄ５−ヌルを注射した）では検出されなかった（図２５）。多標的化ワクチンで免疫されたマウスで有意な（Ｐ＜０．０００１）ＣＥＡ抗体（左）およびＣＤＣＣ（右）応答が誘導されたが、対照マウスでは誘導されなかった。値＝平均±ＳＥＭ（図２５）。
【０４０５】
細胞内サイトカイン刺激
上のために示した通りに、脾細胞を調製した。９６ウェルＵ底プレート中の１ウェル当たり１×１０６個の生脾細胞を使用して、刺激アッセイを実行した。ブラキュリ、ＣＥＡおよびＭＵＣ１のコード配列全体にわたる重複したペプチドのプールを、１１アミノ酸重複部を有する１５ｍｅｒとして合成し、凍結乾燥したペプチドプールをＤＭＳＯに溶解した。ＳＩＶ−ＶｉｆおよびＳＩＶ−Ｎｅｆに対応する、同じように構築したペプチドプールは、オフターゲット対照の役目を果した。Ｒ１０培地（ＲＰＭＩ  １６４０、１０％ウシ胎仔血清および抗生物質）中の脾細胞を、２μｇ／ｍＬ／ペプチドのペプチドプールの添加によって３７℃および５％ＣＯ２で６時間刺激し、インキュベーションにはタンパク質輸送阻害剤（ＧｏｌｇｉＳｔｏｐ、ＢＤ）を２時間加えた。刺激された脾細胞は、次にリンパ球表面マーカーＣＤ８αおよびＣＤ４について染色し、固定し、透過処理し、次にＩＦＮ−γおよびＴＮＦαの細胞内蓄積について染色した。マウスＣＤ８α、ＣＤ４、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦαに対する抗体が使用され、染色は抗ＣＤ１６／ＣＤ３２の存在下で実行した。フローサイトメトリーを実行し、ＢＤ  Ａｃｃｕｒｉ  Ｃ６ソフトウェアで分析した。
【０４０６】
補体依存性細胞傷害性アッセイ（ＣＤＣ）
９６ウェル組織培養マイクロプレートに、ＭＣ３８−ＣＥＡ２腫瘍細胞を１ウェル当たり細胞数２×１０４の密度で一晩培養した。プールされた熱不活性化マウス血清を１：５０の希釈で追加し、３７℃で１時間インキュベートした。次にウサギ血清を補体の供給源として１：５０の希釈で追加し、細胞を３７℃でさらに２．５時間インキュベートした。製造業者の指示に従ってＰｒｏｍｅｇａ  Ｃｙｔｏｔｏｘ  ９６非放射性細胞傷害性アッセイを使用して、細胞培養上清をアッセイした。ＭＣ３８−ＣＥＡ２細胞のパーセント溶解は、式％溶解＝（実験的−標的自発的）／（標的最大値−標的自発的）×１００％によって計算した。
【０４０７】
抗腫瘍免疫療法研究：
確立されたＣＥＡ、ＭＵＣ１またはブラキュリ発現腫瘍をそれぞれ有するマウスでの免疫療法研究で、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］をベースとした三ワクチンの抗腫瘍能力を試験するために研究を実行した。この研究では、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］をベースとした三ワクチンの個々の成分の抗腫瘍活性を評価した。
【０４０８】
Ｃ５７Ｂｌ／６マウスの群（ｎ＝７）に対して、５×１０５のＣＥＡ、ＭＵＣ１および／またはブラキュリを発現するマウスの腫瘍細胞を右側腹部に皮下注射した。触知可能な腫瘍が検出された後、それぞれＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ヌル（導入遺伝子なし、例えば空のベクター）、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＣＥＡ（６Ｄ）、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ｍＭＵＣ１−Ｃおよび／またはＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ブラキュリの各々の１×１０１０ＶＰによる３回の皮下注射によって、マウスを処置した。腫瘍体積を計算し、腫瘍増殖曲線をプロットした。１群当たり７〜１０匹のマウスが、処置の統計的評価に十分である。
【０４０９】
ｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍処置研究のために、８〜１０週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスに対して、左側腹部に１０６個のＭＣ３８−ＭＵＣ１細胞を皮下移植した。１０１０ＶＰのアデノ−ＭＵＣ１またはＴｒｉ−Ａｄ５により、マウスを７日間隔で３回処置した。対照マウスには、３×１０１０ＶＰのアデノ−ヌルを注射した。２つの対向する寸法（ａ、ｂ）および式Ｖ＝（ａ×ｂ）２／２により計算された体積を測定することによって腫瘍増殖が評価され、ここで、より短い寸法が「ａ」であった。腫瘍が１５００ｍ３に到達したか、激しく潰瘍化したとき、腫瘍研究を終了した。
【０４１０】
免疫療法によって処置されたＭＵＣ１発現腫瘍保持マウスにおける、有意な抗腫瘍活性および増加した生存（図２６）。重要なことに、ＭＣ３８−ＭＵＣ１細胞株がＰＤＬ１を発現し、その存在にもかかわらず抗腫瘍活性が達成されたことを決定するために、フローサイトメトリーが使用された。Ｃ５７Ｂｌ／６マウス（ｎ＝７／群）に対して、ＭＣ３８−ＭＵＣ１発現腫瘍細胞を左側腹部に皮下接種し、１０１０ＶＰのＡｄ５−ヌル（空のベクター）または１０１０ＶＰのＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ｍＭＵＣ１−Ｃを０、７、１４日目に右側腹部に投与した。
【０４１１】
Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ｍＭＵＣ１−Ｃで処置されたマウスは、対照（上）と比較して１５および１８日目に有意に（Ｐ＜０．０５）より小さい腫瘍を有し、生存が有意により長かった（下）。値＝平均±ＳＥＭ。実験は、３６日目に終了した（図２６）。
【０４１２】
Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ブラキュリによるマウスの免疫療法は、より小さい腫瘍をもたらした（図２７）。簡潔には、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに対して、ＭＣ３８−ブラキュリ発現腫瘍細胞を左側腹部に皮下接種し、１０１０ＶＰのＡｄ５−ヌル（空のベクター）（Ｎ＝４）または１０１０ＶＰのＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ブラキュリ（Ｎ＝５）を５、１１および１７日目に右側腹部に投与した。１５、１９および２２日目に、処置されたマウスで腫瘍はより小さかった。値＝平均±ＳＥＭ（図２７）。
【０４１３】
有意な抗腫瘍活性を示し、抗腫瘍活性が増強されるか決定するために、免疫療法を抗チェックポイント阻害剤抗体などの免疫経路チェックポイントモジュレーターと組み合わせるために、より多くのマウスが処置される。
【０４１４】
（実施例８：組換え型ウイルスベクターによるヒトＴ細胞活性化のｉｎ  ｖｉｔｒｏ検証）
腫瘍細胞培養
ヒト結腸癌ＳＷ６２０（ＨＬＡ−Ａ２＋、ＨＬＡ−Ａ２４＋、ブラキュリ＋、ＭＵＣ１＋、ＣＥＡ＋）および膵臓癌ＡＳＰＣ−１（ＨＬＡ−Ａ１＋、ＨＬＡ−Ａ２６＋、ＭＵＣ１＋）細胞株を使用した。細胞培養物はマイコプラズマを含まず、完全培地（１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび２ｍＭ  Ｌ−グルタミンを加えたＲＰＭＩ−１６４０）で維持した。
【０４１５】
サイトカインの検出
無ＩＬ−２培地でアデノウイルスベクターに感染させたＤＣまたはペプチドでパルスしたＤＣで２４時間刺激したＴ細胞の上清を、ＥＬＩＳＡキットを使用してＩＦＮ−γの分泌について評価した。この分析で使用された抗原特異的Ｔ細胞株は、以前に報告されている：（ａ）ＨＬＡ−Ａ２  ＣＥＡ特異的ＣＴＬ、（ｂ）ＨＬＡ−Ａ２  ＭＵＣ１特異的ＣＴＬ、（ｃ）ＨＬＡ−Ａ２４  ＭＵＣ１特異的ＣＴＬ、および（ｄ）ＨＬＡ−Ａ２ブラキュリ特異的ＣＴＬ。
【０４１６】
細胞傷害性アッセイ
簡潔には、５０μＣｉの酸化１１１Ｉｎにより標的細胞を３７℃で２０分間標識し、９６ウェル丸底培養プレートの中で細胞数３，０００／ウェルで使用した。Ｔ細胞を異なる比で加え、３７℃で１６時間インキュベートした。上清を、ガンマ計数のために収集した。決定を三連で実行し、ＳＤを計算した。標的細胞を培地単独とインキュベートすることによって自発的放出を決定し、０．２５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００とインキュベートすることによって完全な溶解を決定した。比溶解は、以下の式を使って計算した：溶解（％）＝［観察された放出（ＣＰＭ）−自発的放出（ＣＰＭ）］／［完全放出（ＣＰＭ）−自発的放出（ＣＰＭ）］×１００。
【０４１７】
Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＣＥＡ（６Ｄ）およびＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ブラキュリベクターを使用して樹状細胞（ＤＣ）機能および抗原特異的Ｔ細胞活性化を評価するために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究を実行した。簡潔には、ヒトＤＣを、ＩＬ−２およびＧＭ−ＣＳＦを有する培地で６〜７日間培養した。ＡＩＭ−Ｖ培地で培養したＤＣに、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＣＥＡ（６Ｄ）またはＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ブラキュリまたはＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ヌル（空のベクター）を感染させ、２日間インキュベートした。未感染ＤＣを、対照として使用した。
【０４１８】
次に、ヒトＤＣ細胞を、平均蛍光強度によって測定したときのＣＤ８０（ＤＣ成熟のマーカー）、ＣＤ８３（ＤＣ成熟のマーカー）、ＣＤ８６（ＤＣマーカー）およびＤＲ（ＤＣマーカー）の発現についてフローサイトメトリーによって分析した。表６に示すように、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］をベースとしたベクターによるＤＣの感染は、ヒトＤＣの活性化および成熟を誘導した。
【表６】
0006647315.tif 000009
【０４１９】
６ウェルプレートにおいて、１ｍＬのＡＩＭ−Ｖ培地中の樹状細胞（２×１０５）に、アデノウイルスベクター（Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＣＥＡ、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＭＵＣ１、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ブラキュリおよびＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ヌルを、指示された感染多重度（１０，０００または２０，０００のＭＯＩ）で１時間感染させた。ＡＩＭ−Ｖ培地（４ｍＬ）を次に各ウェルに加え、さらに２日の間インキュベートした。導入遺伝子発現の有効性を分析するために、ＤＣを収集し、フローサイトメトリーおよびウェスタンブロットを使用して分析した。表現型分析のために、ＢＶ４２１コンジュゲート抗ＣＤ８０、ＰｅｒＣＰ  Ｃｙ５．５コンジュゲート抗ＣＤ８３、ＡＰＣ−Ｃｙ７コンジュゲート抗ＨＬＡ−ＤＲ、ＰＥコンジュゲート抗ＣＤ８６およびＦＩＴＣコンジュゲート抗ＣＥＡを使用して、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＥＡおよびＨＬＡ−ＤＲの発現についてＤＣを染色した。表７に示すように、Ａｄ５ベクターは、ヒトＤＣの成熟および活性化を誘導した。ヒト樹状細胞（ＤＣ）の感染のために、１０，０００または２０，０００の感染多重度（ＭＯＩ）の濃度で、指示されたアデノウイルスベクターを使用した。ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６およびＨＬＡ−ＤＲの発現は、フローサイトメトリーによって分析した。結果は、陽性細胞の％（平均蛍光強度）で表す。
【表７】
0006647315.tif 000010
【０４２０】
感染したヒトＤＣがＩＦＮ−γを分泌するようにヒト抗原特異的Ｔ細胞株を刺激することができるかどうか決定するために、感染したＤＣを抗原特異的Ｔ細胞株とインキュベートし、ＩＦＮ−γ分泌活性について試験した。表８に示すように、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＣＥＡ（６Ｄ）またはＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ブラキュリに感染したそれぞれのＨＬＡ−Ａ２＋ＤＣとインキュベートした、ＣＥＡまたはブラキュリ抗原特異的ＨＬＡ−Ａ２＋Ｔ細胞株だけが刺激されて、ＩＦＮ−γを分泌した。対照では、ＩＦＮ−γ分泌は検出されなかった。Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］をベースとしたベクターによるＨＬＡ−Ａ２＋ＤＣの感染は、ＩＦＮ−γを生成するように抗原特異的Ｔ細胞を活性化することができる。
【表８】
0006647315.tif 000011
【０４２１】
ＨＬＡ−Ａ２＋ＤＣに、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＣＥＡ（６Ｄ）およびＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ブラキュリの混合物を感染させた。自家ＰＢＭＣを使用して特異的細胞傷害性ＨＬＡ−Ａ２＋Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を生成するために、感染したＤＣを使用した。３回のｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激（ＩＶＳ）のためのＡＰＣとして、自家ＤＣを使用した。３回のＩＶＳの後に抗原特異的ＣＴＬを再刺激するために、ＣＥＡまたはブラキュリをパルスした自家Ｂ細胞を使用した。エフェクターＴ細胞対標的腫瘍細胞の比は３０：１であり、パーセント細胞溶解活性を決定した。表９に示すように、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＣＥＡ（６Ｄ）およびＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ブラキュリの混合物によるＨＬＡ−Ａ２＋ＤＣの感染は、抗原特異的細胞溶解性Ｔ細胞を生成することができる。細胞溶解活性は、ＨＬＡ−Ａ２依存的に検出された。
【表９】
0006647315.tif 000012
【０４２２】
感染したヒトＤＣが、標的腫瘍細胞を溶解するようにヒト抗原特異的Ｔ細胞株を刺激することができるかどうか決定するために、ヒトＤＣ（ＩＬ−４および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）で６日間の培養、０．５ｍＬのＡＩＭ−Ｖ中に細胞数２×１０４／ウェル）に、２０，０００の感染多重度（ＭＯＩ）の指示されたアデノウイルスベクターを感染させた。４８時間後に、ＤＣを洗浄し、ヒト抗原特異的Ｔ細胞の刺激のために使用した。結果は、１×１０５個のＴ細胞／ｍｌ当たりのＩＦＮ−γのｐｇ／ｍｌで表す。表１０は、ＣＥＡ、ＭＵＣ１またはブラキュリをコードする組換え型アデノウイルスベクターによるヒトＤＣの感染が、抗原特異的Ｔ細胞株を活性化することができることを実証する。太字の数字は、未感染ＤＣを有する対応ウェルと比較したＩＦＮ−γ分泌の有意な増強を示す。［−−は、アッセイが実行されなかったことを示す。］
【表１０】
0006647315.tif 000013
【０４２３】
ＨＬＡ−Ａ２および−Ａ２４ドナーからのヒトＤＣ（ＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦで６日間培養）に、０．５ｍＬのＡＩＭ−Ｖ中の２×１０４／ウェル（２４ウェルプレート）のＴｒｉ−Ａｄ５ベクターを感染させた。Ｔｒｉ−Ａｄ５ベクターは２０，０００ＭＯＩで１時間使用し、その後１．５ｍＬのＡＩＭ−Ｖを各ウェルに追加した。感染したＤＣを４８時間インキュベートし、次に洗浄し、ヒト抗原特異的Ｔ細胞の刺激のために使用した。結果は、１×１０５個のＴ細胞／ｍｌ当たりのＩＦＮ−γのｐｇで表す。太字の数字は、未感染ＤＣを有する対応ウェルと比較したＩＦＮ−γ分泌の有意な増強を示す。
【０４２４】
ＣＥＡ−、ＭＵＣ１−およびブラキュリ−特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を生成した。前記のように、樹状細胞（１ｍＬのＡＩＭ−Ｖ中に１〜２×１０５／ウェル）に、２０，０００ＭＯＩのＴｒｉ−Ａｄ５を感染させた。感染したＤＣは、１０：１のエフェクター−ＡＰＣ比の自家非接着細胞の刺激のためのＡＰＣとして使用した。５％ＣＯ２を含有する加湿雰囲気中の３７℃で、培養物を３日間インキュベートした。次に、培養物にｒｈＩＬ−２を７日間加えた。ＩＬ−２含有培地を、３日毎に補充した。１０日間の刺激は、１つのｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激（ＩＶＳ）サイクルを構成した。３回のＩＶＳのためのＡＰＣとして、自家ベクター感染ＤＣを使用した。３回のＩＶＳの後に抗原特異的ＣＴＬを再刺激するために、自家のペプチドをパルスしたＢ細胞を使用した。Ｔ細胞株は、ＩＬ−７およびＩＬ−１５（１０ｎｇ／ｍｌ）含有培地で維持した。
【０４２５】
前立腺がん患者からのヒトＤＣ（ＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦで６日間の培養；０．５ｍＬのＡＩＭ−Ｖ中に細胞数２×１０４／ウェル）に、２０，０００ＭＯＩのＴｒｉ−Ａｄ５を感染させた。４８時間の後、感染したＤＣを洗浄し、エフェクターとして自家末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を使用して特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を生成するために使用した。３サイクルのｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激の後、自家のペプチドをパルスしたＢ細胞を抗原提示細胞として使用した。結果は、ＩＦＮ−γのｐｇ／ｍｌで表す。［−−は、アッセイが実行されなかったことを示す。］表１１に示すように、ペプチドをパルスした自家Ｂ細胞で刺激したとき、ヒト樹状細胞の感染はブラキュリ、ＭＵＣ１およびＣＥＡに対する抗原特異的Ｔ細胞を生成し、ＩＦＮ−γを生産することができる。
【表１１】
0006647315.tif 000014
【０４２６】
ＣＥＡ−、ＭＵＣ１−およびブラキュリ−特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を生成した。前記のように、樹状細胞（１ｍＬのＡＩＭ−Ｖ中に１〜２×１０５／ウェル）に、２０，０００ＭＯＩのＴｒｉ−Ａｄ５を感染させた。感染したＤＣは、１０：１のエフェクター−ＡＰＣ比の自家非接着細胞の刺激のためのＡＰＣとして使用した。５％ＣＯ２を含有する加湿雰囲気中の３７℃で、培養物を３日間インキュベートした。次に、培養物にｒｈＩＬ−２を７日間加えた。ＩＬ−２含有培地を、３日毎に補充した。１０日間の刺激が、１つのｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激（ＩＶＳ）サイクルを構成した。３回のＩＶＳのためのＡＰＣとして、自家ベクター感染ＤＣを使用した。３回のＩＶＳの後に抗原特異的ＣＴＬを再刺激するために、自家のペプチドをパルスしたＢ細胞を使用した。Ｔ細胞株は、ＩＬ−７およびＩＬ−１５（１０ｎｇ／ｍｌ）含有培地で維持した。
【０４２７】
ＨＬＡ−Ａ２および−Ａ２４ドナーからのヒトＤＣ（ＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦで６日間培養）に、０．５ｍＬのＡＩＭ−Ｖ中の２×１０４／ウェル（２４ウェルプレート）のＴｒｉ−Ａｄ５ベクターを感染させた。Ｔｒｉ−Ａｄ５ベクターは２０，０００ＭＯＩで１時間使用し、その後１．５ｍＬのＡＩＭ−Ｖを各ウェルに追加した。感染したＤＣを４８時間インキュベートし、次に洗浄し、ヒト抗原特異的Ｔ細胞の刺激のために使用した。結果は、１×１０５個のＴ細胞／ｍｌ当たりのＩＦＮ−γのｐｇで表す。導入遺伝子をコードするＴｒｉ−Ａｄ５ベクターによるヒト樹状細胞の感染は、ＩＦＮ−γを生成するように抗原特異的Ｔ細胞株を活性化することができる。表１２に示すように、対応するペプチドをパルスした自家Ｂ細胞で刺激したとき、Ｔｒｉ−Ａｄ５によるヒト樹状細胞の感染はブラキュリ、ＭＵＣ１およびＣＥＡに対する抗原特異的Ｔ細胞を生成し、ＩＦＮ−γを生産することができる。太字の数字は、未感染ＤＣを有する対応ウェルと比較したＩＦＮ−γ分泌の有意な増強を示す。
【表１２】
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【０４２８】
これらの研究は、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］をベースとしたベクターがｉｎ  ｖｉｔｒｏでヒトＤＣの成熟を誘導することができること、感染したＤＣが抗原特異的ヒトＴ細胞を刺激することができること、および感染したＤＣが抗原特異的ヒトＣＴＬを生成することができることを示す。ここで報告される研究では、異なるＴＡＡを発現する３つのＡｄ５ベクターの混合物からなった多ＴＡＡ標的化免疫療法（Ｔｒｉ−Ａｄ５）は、ヒトＴ細胞の活性化においてアデノウイルスベクターの各々単独の使用と同じくらい効率的であり、軽微な差しか存在しない。９つの異なるｉｎ  ｖｉｖｏパラメータは、Ｔｒｉ−Ａｄ５によるワクチン接種に対して、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＣＥＡ、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＭＵＣ１およびＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ブラキュリベクターの各々個々によりマウスをワクチン接種することを通して測定した。実行した２１回のアッセイの中で、観察された統計的差は、Ｔｒｉ−Ａｄ５ワクチン接種マウスと比べて、１種のベクターでワクチン接種をしたマウスにおける、（ａ）ＭＵＣ１特異的脾細胞およびＣＤ８＋ＩＦＮ生産および多機能性ＣＤ８＋Ｔ細胞の数の増強、および（ｂ）より多くのＣＥＡ特異的ＣＤ８＋ＩＦＮ生産Ｔ細胞であった。他方、Ｔｒｉ−Ａｄ５ワクチン接種マウスは、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＣＥＡワクチン接種マウスより多くのＣＥＡ特異的ＩＬ−２生産細胞を生成した。しかし、他の１６／２１アッセイでは、（ａ）ＩＦＮ−γおよびＩＬ−２生成のための脾細胞、（ｂ）ＩＦＮ−γ生成のためのＣＤ８＋Ｔ細胞、（ｃ）ＩＦＮ−γ生成のためのＣＤ４＋Ｔ細胞、（ｄ）ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−α生成のための多機能性ＣＤ８＋Ｔ細胞、（ｅ）ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−α生成のための多機能性ＣＤ４＋Ｔ細胞、ならびに（ｆ）抗原特異的抗体の生成、の抗原特異的活性化に関して、個々のベクターの使用とＴｒｉ−Ａｄ５の使用の間で結果に統計的差がなかった。単一のベクター（Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＭＵＣ１）対Ｔｒｉ−Ａｄ５ワクチンを使用した抗腫瘍活性にも差がなかった。両ワクチンは腫瘍を削除しなかったが、両ワクチンは腫瘍増殖速度を同じように低減した。Ｔｒｉ−Ａｄ５は一部のアッセイでＴ細胞活性化にそれほど効率的ではなかったが、ヒト固形腫瘍に存在するＴＡＡ不均一性を克服するＴｒｉ−Ａｄ５プラットフォームの潜在的能力は、一部のアッセイでＴｒｉ−Ａｄ５対個々のベクターのＴ細胞活性化の効力における比較的軽微な差よりもはるかに価値がある。
【０４２９】
ＣＥＡ、ＭＵＣ１およびブラキュリは、全てヒトＴＡＡであり、マウスの固形腫瘍では発現されない。さらに、ヒト固形腫瘍は、異なるＴＡＡの発現に関して非常に不均一である。Ｔｒｉ−Ａｄ５対各ベクター単独のワクチン接種の効果を規定するために、マウスの腫瘍細胞株に全３つの導入遺伝子をトランスフェクトすることは極めて困難だろう。マウスＴ細胞アッセイの一部で、Ｔｒｉ−Ａｄ５と比較したＣＥＡおよびブラキュリベクターよりＴｒｉ−Ａｄ５と比較して単独のＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＭＵＣ１ベクターがより強力だったので、ＭＵＣ１を発現するマウス腫瘍の標的化が選択された。したがって、Ｔｒｉ−Ａｄ５プラットフォームを単一のベクタープラットフォームと比較するのに、これが最もストリンジェントなモデルであるようである。本明細書に報告される研究は、Ｔｒｉ−Ａｄ５レジメンで多様なＴＡＡ導入遺伝子を標的にするこの新規アデノウイルスワクチン送達プラットフォーム（Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］）を使用して、ワクチン免疫療法として可能な臨床試験の理論的根拠、または他の療法薬との併用の理論的根拠を提供するように設計された。
【０４３０】
チェックポイント阻害剤抗体は黒色腫および扁平非小細胞肺がん（ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ  ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ）で臨床活性の証拠を示したが、他のがんタイプにおける臨床的利益は少数の患者で観察された。結腸直腸がんおよび前立腺がんなどの一部の腫瘍タイプについては、抗ＰＤＬ１／ＰＤ１チェックポイント阻害剤は臨床活性をほとんど示さなかった。一部の患者でのＰＤＬ１／ＰＤ１治療活性の欠如に関して出された１つの仮説は、腫瘍へのＴ細胞浸潤の欠如である。その結果として、腫瘍のＴＡＡを標的にするワクチンが腫瘍微小環境で抗原特異的Ｔ細胞の存在をもたらすならば、ワクチン接種と併用されるかそれに続いて用いられる免疫経路チェックポイントモジュレーターは、腫瘍浸潤性アネルギー化Ｔ細胞の「ブレーキをはずし」、臨床効果に導くことができるだろう。
【０４３１】
（実施例９：ＨＰＶのための免疫療法）
この実施例は、本明細書で提供される組み合わせ療法が、ＨＰＶ初期６（Ｅ６）および初期７（Ｅ７）がん遺伝子を発現する腫瘍およびＨＰＶ関連がんのマウスモデルを低減することを示す。簡潔には、腫瘍保持ＨＰＶマウスモデルのマウスを、改変された非腫瘍形成および融合ＨＰＶ−Ｅ６／Ｅ７遺伝子を含むＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＨＰＶ−Ｅ６／Ｅ７ワクチンで処置した。マウスで腫瘍を誘導するために使用したＴＣ−１マウス腫瘍細胞株は、ＨＰＶ−Ｅ６／Ｅ７ならびにＰＤＬ１を発現した。
【０４３２】
ＨＰＶ腫瘍保持マウスで腫瘍を検査するためにフローサイトメトリーを使用し、様々な腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の存在度を計算した。腫瘍中のＴＩＬは、以下の細胞型および存在度レベルを有することが観察された：骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）（７．５％±２．４ＳＤ）、ＦｏｘＰ３発現Ｔ調節（Ｔｒｅｇ）リンパ球（７．１％±２．５）、ＰＤ１発現ＣＤ８α＋リンパ球（２５．５％±１６．４）およびＬＡＧ−３発現ＣＤ８α＋リンパ球（４．１％±２．３）。ＴＩＬのこのプロファイルは、抑制性免疫経路が腫瘍に存在することを示す。
【０４３３】
Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＨＰＶ−Ｅ６／Ｅ７免疫療法への抗ＰＤ１抗体などの免疫チェックポイント阻害剤抗体の追加は、より大きな抗腫瘍応答をもたらした（図２８）。この群のさらに２匹のマウスが、事実上完全な腫瘍退縮を有することが観察された（図２９）。簡潔には、Ｃ５７Ｂｌ／６マウス（ｎ＝７／群）に、ＨＰＶ−Ｅ６／Ｅ７を発現するＴＣ−１腫瘍細胞を移植し（０日目）、１０１０ＶＰのＡｄ５−ヌル（空のベクター）と１００μｇの対照ＩｇＧ（腹腔内）、１０１０ＶＰのＡｄ５−ヌル（空のベクター）と１００μｇの抗ＰＤ１、１０１０ＶＰのＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＨＰＶ−Ｅ６／Ｅ７と１００μｇのマウスＩｇＧ、または１０１０ＶＰのＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ＨＰＶ−Ｅ６／Ｅ７と１００μｇの抗ＰＤ１による免疫療法によって１０、１７、２４日目に処置した。抗ＰＤ１有り無しの免疫療法は、２３日目までに腫瘍増殖の有意な阻害をもたらした（Ｐ＜０．０５）。全ての対照マウスは、腫瘍塊のために２３日目までに終了した。値＝平均±ＳＥＭ（図２８）。
【０４３４】
抗ＰＤ１注射による免疫療法で処置された２匹のマウスで、腫瘍の増殖および退縮を分析した（図２９）。腫瘍増殖は２０日目と２７日目にそれぞれピークに達し、次にその後退縮した。この研究は、多標的化ワクチンの使用と組み合わせた免疫チェックポイント阻害剤薬物の組み合わせが、抗腫瘍効果を増強することができることを実証する。
【０４３５】
それが単独のワクチンと比較して治療効果を増加させることができるかどうか決定するために、プログラム死−リガンド１（ＰＤ１）遮断と組み合わせたＨＰＶ１６遺伝子Ｅ６およびＥ７に対して免疫するウイルス遺伝子送達プラットフォーム（Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−Ｅ６／Ｅ７）を使用した、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）に対する免疫療法を調査した。単剤としてのＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−Ｅ６／Ｅ７は、ＨＰＶ−Ｅ６／Ｅ７細胞媒介性免疫を誘導した。Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−Ｅ６／Ｅ７を使用した免疫療法は、小さい腫瘍のクリアランスおよびより大きな確立された腫瘍を有するマウスで全生存利益をもたらした。免疫療法を免疫チェックポイント遮断と組み合わせたとき、大きな腫瘍に対する抗腫瘍活性レベルの増加が観察された。Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−Ｅ６／Ｅ７で処置したマウスでの腫瘍微小環境の分析は、ＣＤ８＋腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の上昇を明らかにした。しかし、腫瘍細胞上のプログラム死−リガンド１（ＰＤＬ１）発現およびＰＤ１＋ＴＩＬの増加などの抑制機構の誘導が見られた。Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−Ｅ６／Ｅ７免疫療法を抗ＰＤ１抗体と組み合わせたとき、ＣＤ８＋ＴＩＬが同じレベルで観察されたが、腫瘍細胞上の腫瘍ＰＤＬ１発現の低減およびＰＤ１＋ＴＩＬの低減は、組み合わせ療法が腫瘍クリアランス状態を有利にする機構および将来の臨床治験で抗原特異的ワクチンを免疫経路チェックポイントモジュレーターと対にする理論的根拠を提供する。
【０４３６】
本明細書で、ＰＤ１遮断と組み合わせたＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−Ｅ６／Ｅ７免疫を抗腫瘍効果の増加について検査した。さらに、小さい対大きい確立された腫瘍を処置する治療能力を評価するために、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−Ｅ６／Ｅ７ワクチンによって誘導されたＣＭＩ応答を特徴付け、抗腫瘍応答の動態を決定した。可能な作用機構を調査するために、腫瘍の実質の中のエフェクターＴ細胞とサプレッサーＴ細胞のレベルの間の関係を評価し、リンパ球集団および観察された抗腫瘍応答で役割を果たすことができる共阻害分子の発現を特徴付けた。
【０４３７】
ウイルスの構築
Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−Ｅ６／Ｅ７を構築し、生成した。簡潔には、相同組換えに基づくアプローチを使用して、導入遺伝子をＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］ベクターにサブクローニングし、複製欠陥ウイルスはＥ．Ｃ７パッケージング細胞株で増殖させ、ＣｓＣｌ２精製し、滴定した。ウイルス感染力価は、Ｅ．Ｃ７細胞単層の上のプラーク形成単位（ＰＦＵ）として決定した。ウイルス粒子（ＶＰ）濃度は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）破壊ならびに２６０ｎｍおよび２８０ｎｍでの分光測光によって決定した。ベクター対照として、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ヌルを用いたが、それは導入遺伝子挿入断片のないＡｄ５プラットフォーム骨格である。
【０４３８】
免疫および脾細胞調製
雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝５／群）に、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−Ｅ６／Ｅ７またはＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ヌルの様々な用量を皮下注射した（ＳＱ）。用量は２５μＬの注射緩衝液（３％スクロースを含有する２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ）で投与し、マウスは１４日間隔で３回免疫した。最終注射の１４日後に、脾臓および血清を収集した。マウスからの血清は、評価まで−２０℃で冷凍した。脾臓被膜を破壊し、７０μｍのナイロン細胞ストレーナーを通して静かに内容物を圧搾することによって、脾細胞の懸濁液を生成した。赤血球溶解緩衝液の添加によって赤血球を溶解し、溶解後、脾細胞をＲ１０（Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、ＨＥＰＥＳ（２０ｍＭ）（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）およびストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）および１０％ウシ胎仔血清を追加したＲＰＭＩ１６４０）で２回洗浄した。ＥＬＩＳｐｏｔおよびフローサイトメトリーによって、サイトカイン生産について脾細胞をアッセイした。
【０４３９】
酵素結合免疫吸着スポット（ＥＬＩＳｐｏｔ）アッセイ
ＨＰＶ  Ｅ６およびＥ７特異的インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）分泌Ｔ細胞は、前記のように調製された新たに単離されたマウス脾細胞を使用してＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって決定した。ＥＬＩＳｐｏｔアッセイを実行した。ＨＰＶ  Ｅ６およびＥ７のコード配列全体にわたる重複したペプチドのプールを、１１アミノ酸重複部を有する１５ｍｅｒとして合成し、凍結乾燥したペプチドプールをＤＭＳＯに溶解した。脾細胞（細胞数２×１０５）を、Ｅ６またはＥ７に由来するプール中の重複する１５ｍｅｒペプチドの２μｇ／ｍＬ／ペプチドで刺激した。陽性対照として、細胞を０．０６μｇ／ウェルの濃度のコンカナバリンＡ（Ｃｏｎ  Ａ）で刺激した。ＳＩＶ−Ｎｅｆ（ＡＩＤＳ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｐｒｏｇｒａｍ、Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  ＡＩＤＳ、ＮＩＡＩＤ、ＮＩＨ）に由来する重複する１５ｍｅｒ完全ペプチドプールを、無関係なペプチド対照として使用した。Ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔ  ＥＬＩＳｐｏｔプレートリーダーを使用してスポット形成細胞（ＳＦＣ）の数を決定し、結果は１０６個の脾細胞当たりのＳＦＣの数として報告した。
【０４４０】
細胞内サイトカイン刺激
上のＥＬＩＳｐｏｔアッセイのために記載した通りに、脾細胞を調製した。９６ウェルＵ底プレート中の１ウェル当たり１０６個の生脾細胞を使用して、刺激アッセイを実行した。２μｇ／ｍＬ／ペプチドのＨＰＶ  Ｅ６、ＨＰＶ  Ｅ７またはＳＩＶ−Ｎｅｆペプチドプールの添加によって、Ｒ１０培地中の脾細胞を５％ＣＯ２中の３７℃で６時間刺激し、インキュベーションの開始から２時間後にタンパク質輸送阻害剤（ＧｏｌｇｉＳｔｏｐ、ＢＤ）を追加した。刺激された脾細胞は、次にリンパ球表面マーカーＣＤ８αおよびＣＤ４について染色し、パラホルムアルデヒドで固定し、透過性化し、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αの細胞内蓄積について染色した。マウスＣＤ８α（クローン５３−６．７）、ＣＤ４（クローンＲＭ４−５）、ＩＦＮ−γ（クローンＸＭＧ１．２）およびＴＮＦ−α（クローンＭＰ６−ＸＴ２２）に対する蛍光コンジュゲート抗体をＢＤから購入し、抗ＣＤ１６／ＣＤ３２（クローン２．４Ｇ２）の存在下で染色を実行した。Ａｃｃｕｒｉ  Ｃ６フローサイトメーター（ＢＤ）を使用してフローサイトメトリーを実行し、ＢＤ  Ａｃｃｕｒｉ  Ｃ６ソフトウェアを使用して分析した。
【０４４１】
腫瘍免疫療法
ｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍免疫療法研究のために、８〜１０週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスに対して、左側腹部に２×１０５のＴＣ−１  ＨＰＶ−Ｅ６／Ｅ７発現腫瘍細胞をＳＱ移植した。マウスを、１０１０ＶＰのＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−Ｅ６／Ｅ７のＳＱ注射により、７日間隔で３回処置した。対照マウスには、同じプロトコールの下で１０１０ＶＰのＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ヌルを注射した。組み合わせ研究では、免疫と同時に１００μｇのラット抗ＰＤ１（クローンＲＭＰ１−１４）またはアイソタイプラット対照抗体（クローン２Ａ３）を、ＩＰでマウスに与えた。ラット抗ＰＤ１抗体およびラットＩｇＧ２ａアイソタイプ対照抗体は、ＢｉｏＸｃｅｌｌから購入した。腫瘍サイズは２つの対向する寸法（ａ、ｂ）によって測定し、体積は式Ｖ＝（ａ２×ｂ）／２に従って計算し、ここで、ａはより短い寸法であった。腫瘍が１５００ｍｍ３に到達したとき、または腫瘍が潰瘍化したとき、動物を安楽死させた。
【０４４２】
フローサイトメトリーによる腫瘍浸潤細胞（ＴＩＬ）の分析
８〜１０週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスの４群（ｎ＝５／群）に対して、０日目に左側腹部に２×１０５のＴＣ−１腫瘍細胞をＳＱ移植した。これらの群のうちの２つを、１０１０ＶＰのＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ヌルベクター対照によりＳＱ免疫し、他の２つの群は１０１０ＶＰのＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−Ｅ６／Ｅ７ワクチンによりＳＱ免疫した。これらの免疫は、１２日目から開始して７日間隔で２回投与した。抗ＰＤ１の有効用量を増加させるために、免疫に加えて、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−Ｅ６／Ｅ７の１群およびＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ヌルの１群のマウスに、１２日目および１６日目に１００μｇのラット抗ＰＤ１（クローンＲＭＰ１−１４）を、１９日目および２３日目に１００μｇのハムスター抗ＰＤ１（クローンＪ４３）をＳＱ投与した。これらの免疫経路チェックポイントモジュレーターによる処置の対照とするために、残りのＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−Ｅ６／Ｅ７およびＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ヌル群のマウスに、関連するラットおよびハムスター対照ＩｇＧ抗体を同じ日に投与した。ハムスター抗ＰＤ１抗体およびアイソタイプ対照は、ＢｉｏＸｃｅｌｌから購入した。２７日目に、腫瘍を測定し、切除し、計量した。腫瘍を細かく切り刻み、８０ｒｐｍで回転させながら室温で３０分間、ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）中のコラゲナーゼＩＶ（１ｍｇ／ｍｌ）、ヒアルロニダーゼ（１００μｇ／ｍｌ）およびＤＮアーゼＩＶ（２００Ｕ／ｍｌ）の混合液で消化した。酵素は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。消化の後、腫瘍懸濁液を７０μｍナイロン細胞ストレーナーに通し、遠心分離した。赤血球溶血緩衝液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の添加によって赤血球を除去し、溶解後、１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンを含有するリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で腫瘍懸濁液を２回洗浄し、染色のために蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）緩衝液（ＰＢＳ  ｐＨ７．２、１％ウシ胎仔血清および２ｍＭ  ＥＤＴＡ）に再懸濁させた。ＣＤ４５（３０−Ｆ１１）、ＣＤ４（ＲＭ４−５）およびＰＤＬ１（ＭＩＨ５）に対する蛍光コンジュゲート抗体は、ＢＤから購入した。ＣＤ８β（Ｈ３５−１７．２）、ＣＤ２５（ＰＣ６１．５）、ＦｏｘＰ３（ＦＪＫ−１６ｓ）、ＰＤ１（ＲＭＰ１−３０）、ＬＡＧ−３（Ｃ９Ｂ７Ｗ）およびＣＴＬＡ４（ＵＣ１０−４Ｂ９）に対する蛍光コンジュゲート抗体は、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから全て購入した。抗ＣＤ１６／ＣＤ３２（クローン２．４Ｇ２）を含有する１００μＬのＦＡＣＳ緩衝液中で、表面染色を４℃で３０分の間実行した。染色された細胞をＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、パラホルムアルデヒドで固定し、（必要ならば）透過処理緩衝液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で透過処理してから、抗ＣＤ１６／ＣＤ３２（クローン２．４Ｇ２）を含有する１００μＬ透過処理緩衝液中で、蛍光コンジュゲート抗ＦｏｘＰ３または抗ＣＴＬＡ４により４℃で６０分の間染色した。細胞を透過処理緩衝液で洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液に洗浄して戻し、ＢＤ  Ａｃｃｕｒｉ  Ｃ６フローサイトメーターを使用して各試料の固定体積をフローサイトメトリーによって分析した。腫瘍細胞は、小さい細胞および大きな細胞を含む散乱ゲート中のＣＤ４５−事象と規定した。ＣＤ４＋ＴＩＬは、リンパ球散乱ゲート中のＣＤ４５＋／ＣＤ４＋事象と規定した。ＣＤ８＋ＴＩＬは、リンパ球散乱ゲート中のＣＤ４５＋／ＣＤ８β＋事象と規定した。調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）は、リンパ球散乱ゲート中のＣＤ４５＋／ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋／ＦｏｘＰ３＋事象と規定した。エフェクターＣＤ４＋Ｔ細胞は、リンパ球散乱ゲート中のＣＤ４５＋／ＣＤ４＋／ＣＤ２５−／ＦｏｘＰ３−事象と規定した。ＦｏｘＰ３、ＰＤＬ１、ＰＤ１、ＬＡＧ−３およびＣＴＬＡ４の陽性発現を決定するために、アイソタイプが一致した対照抗体を使用した。Ａｃｃｕｒｉ  Ｃ６フローサイトメーター（ＢＤ）を使用してフローサイトメトリーを実行し、ＢＤ  Ａｃｃｕｒｉ  Ｃ６ソフトウェアで分析した。
【０４４３】
ＨＰＶ−Ｅ６／Ｅ７特異的細胞は、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−Ｅ６／Ｅ７によって誘導される免疫応答を媒介した
マウスでのＣＭＩ応答の誘導に及ぼすＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−Ｅ６／Ｅ７免疫の用量の増加の影響を決定するために、研究を実行した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスの群（ｎ＝５／群）を、１０８、１０９または１０１０ＶＰのＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−Ｅ６／Ｅ７により１４日間隔で３回ＳＱ免疫した。対照マウスは、１０８ＶＰ、１０９ＶＰまたは１０１０ＶＰのＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ヌル（空のベクター対照）を受けた。最後の免疫から２週後に、ＩＦＮ−γ分泌細胞のためのＥＬＩＳｐｏｔ分析によって脾細胞ＣＭＩ応答を評価した。用量効果が観察され、最も高いＣＭＩ応答レベルは１０１０ＶＰのＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−Ｅ６／Ｅ７による免疫によって得られた。Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ヌルを注射した対照マウスでは、応答が検出されなかった。
【０４４４】
ＣＤ８α＋およびＣＤ４＋の両方の脾細胞集団におけるＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αの細胞内蓄積も、１０１０ＶＰのＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−Ｅ６／Ｅ７で免疫したマウスで決定した。重複するペプチドプールによる刺激の後の細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）は、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−Ｅ６／Ｅ７で免疫した全てのマウスから単離されたＣＤ８α＋リンパ球におけるＥ６およびＥ７抗原特異的ＩＦＮ−γの蓄積を明らかにした。ペプチドで刺激した脾細胞は、ＴＮＦ−αの細胞内蓄積についても染色し、Ｅ６およびＥ７の両方に特異的な多機能性（ＩＦＮ−γ＋／ＴＮＦ−α＋）ＣＤ８α＋脾細胞の有意な集団を検出することができた。
【０４４５】
ＨＰＶ−Ｅ６／Ｅ７発現腫瘍の処置
ＨＰＶ−Ｅ６／Ｅ７  ＴＣ−１腫瘍を有するマウスで、免疫療法処置の抗腫瘍効果を調査した。フローサイトメトリー分析によって評価したとき、これらの腫瘍細胞はＰＤＬ１を発現した。ＰＥコンジュゲート抗ＰＤＬ１で標識したとき、ＴＣ−１細胞は５３７のメジアン蛍光強度（ＭＦＩ）を有したが、ＰＥコンジュゲートアイソタイプ対照抗体で標識した細胞は１８４のＭＦＩを有し、ＴＣ−１細胞の表面での免疫抑制性ＰＤＬ１の存在を実証した（データ示さず）。Ｃ５７ＢＬ／６マウスの２群（ｎ＝５／群）に対して、０日目に右肋骨下領域に２×１０５個のＴＣ−１腫瘍細胞をＳＱ接種した。１、８および１４日目に、マウスを、１０１０ＶＰのＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ヌル（ベクター対照）または１０１０ＶＰのＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−Ｅ６／Ｅ７のＳＱ注射で処置した。全てのマウスを腫瘍サイズについてモニタリングし、腫瘍体積を計算した。Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−Ｅ６／Ｅ７で免疫したマウスは、１２日目から始まって対照マウスより有意に小さい腫瘍を有し（ｐ＜０．０１）、実験の残りの期間中有意により小さいままであり（ｐ＜０．０２）、例えば５匹のうちの３匹のマウスは完全な腫瘍退縮を示した。ベクター対照処置群からのマウスでの腫瘍は、２６日目に始まって安楽死のための閾値に近づき始め、この群の全てのマウスは３３日目までに安楽死させたが、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−Ｅ６／Ｅ７処置群のマウスは、３６日目の実験の終わりに全て生存し、小さい腫瘍（＜１５０ｍｍ３）の完全な腫瘍退縮が見られた。
【０４４６】
Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−Ｅ６／Ｅ７による免疫療法がより大きな腫瘍に対して有効であるかどうか決定するために、ＴＣ−１腫瘍細胞腫瘍をＣ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝４／群）の２群に移植し、その後、腫瘍移植後の６日間、腫瘍が小さかったが触知可能であったとき、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−Ｅ６／Ｅ７による週ごとの処置を遅延させた。６日目に処置を開始したマウスは、対照群と類似の腫瘍増殖を当初示した。しかし、１６日目に始まって、腫瘍退縮が観察された。６日目に処置を開始したマウスの腫瘍は、２０日目に開始した対照群より有意に小さく（ｐ＜０．０５）、４匹のうちの３匹のマウスは２７日目までに完全な退縮を有した。６日目に開始したＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−Ｅ６／Ｅ７投与は、有意な生存利益（ｐ＜０．０１）も付与した。
【０４４７】
最後に、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−Ｅ６／Ｅ７による免疫療法が大きな確立した腫瘍に対して有効であるかどうか決定するために、ＴＣ−１腫瘍細胞をＣ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝４／群）の２群に移植し、その後、腫瘍移植の１３日後、腫瘍が約１００ｍｍ３になるまで、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−Ｅ６／Ｅ７による週ごとの処置を遅延させた。この処置群では、初期の腫瘍増殖は対照群と類似であることが観察されたが、対照群の一部のマウスは２３日目に安楽死基準に到達し、さらなる時点での有意性の分析を阻止した。しかし、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−Ｅ６／Ｅ７処置群での腫瘍体積は２９日目まで安楽死閾値未満であって、その時点ではベクター対照群の全てのマウスからの腫瘍は１５００ｍｍ３を超え、安楽死させられた（図５Ｂ）。これらの結果は、ＴＣ−１腫瘍モデルでは、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−Ｅ６／Ｅ７免疫療法薬が腫瘍増殖の強力な阻害剤であり、有意な全生存利益をもたらしたが、処置がより小さい腫瘍で開始されたときに限り腫瘍の完全なクリアランスが観察されたことを示す。さらに、これらの結果は、腫瘍細胞の上の免疫抑制性ＰＤＬ１の存在にもかかわらず、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−Ｅ６／Ｅ７による免疫療法処置が腫瘍増殖の有意な阻害をもたらしたことを実証する。
【０４４８】
免疫チェックポイント阻害による組み合わせ免疫療法
Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−Ｅ６／Ｅ７の治療効果を大きな腫瘍の場面で向上させることができるかどうか決定するために、抗ＰＤ１抗体を同時投与した。マウスの４群（ｎ＝７／群）に、０日目に２×１０５のＴＣ−１腫瘍細胞を移植し、１０日目から開始して、マウスは、ＳＱの１０１０ＶＰのＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−Ｅ６／Ｅ７とＩＰの１００μｇの抗ＰＤ１、１０１０ＶＰのＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ヌルと１００μｇの抗ＰＤ１、１０１０ＶＰのＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−Ｅ６／Ｅ７と１００μｇのラットＩｇＧ２ａアイソタイプ対照、または１０１０ＶＰのＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ヌルと１００μｇのラットＩｇＧ２ａアイソタイプ対照の週ごとの投与を受けた。腫瘍サイズを経時的にモニタリングし、腫瘍サイズが１５００ｍｍ３を超えたとき、または腫瘍潰瘍化が存在したとき、マウスを安楽死させた。Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ヌルと１００μｇのラットＩｇＧ２ａアイソタイプ対照を受けた対照マウス（図６Ａ）、およびＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ヌルと１００μｇの抗ＰＤ１で処置されたマウス（図６Ｂ）は、類似の腫瘍増殖パターンを示した（図６Ｂ）。これらの２つの群の間で、有意な生存利益は観察されなかった。Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−Ｅ６／Ｅ７とラットＩｇＧ２ａアイソタイプ対照を受けたマウスは、対照と比較して遅延した腫瘍増殖パターンを有し、マウスのうちの２匹は、腫瘍移植から５２日後にベースラインレベルの近くまでの腫瘍退縮を有した（図６Ｃ）。Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−Ｅ６／Ｅ７および抗ＰＤ１を受けた７匹のマウスのうちの４匹は、２５日目から腫瘍退縮を有し、これらのうちの２匹は、５３日目の実験の終わりまでに腫瘍クリアランスをもたらした（図６Ｄ）。
【０４４９】
Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−Ｅ６／Ｅ７とラットＩｇＧ２ａアイソタイプ対照で処置したマウス（図７）も生存利益を経験し、研究の終了時にこの動物の２８．６％が生存していたが、対照マウス（Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ヌルとラットＩｇＧ２ａアイソタイプ対照）およびＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ヌルと抗ＰＤ１で処置したマウスの１００％は、それぞれ２８日目および３２日目までに終了しなければならなかった（図７）。Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−Ｅ６／Ｅ７および抗ＰＤ１抗体の両方で処置したマウスは最大の処置利益を有し（図７）、対照と比較して遅延した腫瘍増殖および生存の有意な改善（Ｐ≦０．０００６）を実証した。
【０４５０】
マウス抗ラットＩｇＧ抗体応答は、ラット抗ＰＤ１抗体による第２の注射によって誘導され（ＥＬＩＳＡによるエンドポイント抗体力価１：２００、データ示さず）、これらの応答は第３の注射によって劇的に増加した（ＥＬＩＳＡによるエンドポイント抗体力価１：４０００〜１：８０００、データ示さず）。この抗ラット抗体応答は、単独の抗ＰＤ１抗体による注射の後に抗腫瘍活性が観察されなかった理由を説明することができる。さらに、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−Ｅ６／Ｅ７免疫療法と組み合わせた抗ＰＤ１抗体の第１のおよびおそらく第２の注射は有効だったが、抗ＰＤ１による第３の注射は、誘導されたマウス抗ラットＩｇＧ応答によって有効に中和された可能性がある。
【０４５１】
組み合わせ免疫療法の後の腫瘍微小環境
Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−Ｅ６／Ｅ７で処置したマウスにおいて遅延した腫瘍増殖および生存に寄与した細胞集団を分析するために、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）をフローサイトメトリーによって分析した。４群のマウスに２×１０５のＴＣ−１細胞を移植し、１０日後に、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−Ｅ６／Ｅ７とＰＤ１抗体の２回の週ごとの免疫による処置を開始した。２７日目に、材料および方法に記載の通り、全腫瘍を収集し、処理した。腫瘍１ｍｇ当たりの浸潤性ＣＤ８＋Ｔ細胞の数は、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ヌルを受けた群と比較して、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−Ｅ６／Ｅ７処置群で有意に増加した（図８Ｃ）。抗ＰＤ１抗体処置は、浸潤性ＣＤ８＋Ｔ細胞の数にほとんどまたは全く影響しなかった（図８Ｃ）。腫瘍１ｍｇ当たりの浸潤性Ｔｒｅｇ（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋）の数に関して、４群のいずれの間にも差はなかった（図８Ｂ）。しかし、マウスをＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−Ｅ６／Ｅ７ワクチンまたはＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−Ｅ６／Ｅ７ワクチンと抗ＰＤ１抗体処置で処置したとき、ＣＤ８＋Ｔ細胞の増加は腫瘍微小環境でのＴｒｅｇ：ＣＤ８＋Ｔ細胞比の低下につながった（図８Ａ）。
【０４５２】
Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−Ｅ６／Ｅ７免疫療法に対する抗ＰＤ１抗体の相乗的／相加的効果をさらに研究するために、ＰＤ１、ＬＡＧ−３およびＣＴＬＡ−４の発現をＴＩＬで検査した。腫瘍微小環境内のＴ細胞の上でのこれらの共阻害分子の発現は、抗原特異的Ｔ細胞の活性化を下方制御することが示された。Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−Ｅ６／Ｅ７と対照抗体処置による免疫は、ＰＤ１＋およびＬＡＧ−３＋ＣＤ８＋ＴＩＬの割合を有意に増加させたが、ＣＤ４＋ＴＩＬの上でのこれらの共阻害分子の発現はこの処置に影響を受けなかった。ＣＴＬＡ−４を発現するＣＤ４＋およびＣＤ８＋ＴＩＬの百分率は、ワクチン処置によって有意に影響されなかった（データ示さず）。抗ＰＤ１抗体注射をＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−Ｅ６／Ｅ７ワクチン処置と組み合わせることは、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−Ｅ６／Ｅ７と対照抗体で処置したマウスからの腫瘍で見出されたものと比較して、ＰＤ１＋ＣＤ８＋およびＣＤ４＋ＴＩＬの割合の有意な低減をもたらした（ＣＤ８＋ＴＩＬの場合はｐ＝０．００８３およびＣＤ４＋ＴＩＬの場合はｐ＝０．００１６）。さらに、ＰＤ１＋ＣＤ８＋ＴＩＬの割合はＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ヌル処置対照群で観察された発現レベルまで減少し、ＰＤ１＋ＣＤ４＋ＴＩＬの割合は対照群で観察されたもの未満まで有意に低減された（ｐ＝０．００１６、図９Ａ）。さらに、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−Ｅ６／Ｅ７免疫を抗ＰＤ１チェックポイント阻害剤と組み合わせたとき、ＬＡＧ−３＋ＣＤ８＋ＴＩＬの百分率が減少することも観察された（ｐ＝０．０３６３、図９Ｂ）。ワクチン処置が腫瘍細胞の上でのＰＤＬ１発現をｅｘ  ｖｉｖｏで増強することができることが以前に示されていたので、ＰＤＬ１の発現を腫瘍細胞で検査した。ワクチン処置の後、腫瘍細胞の上のＰＤＬ１のメジアン蛍光強度の増強があった。しかし、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−Ｅ６／Ｅ７および抗ＰＤ１抗体の組み合わせで処置したマウスではＰＤＬ１発現が低減されたが、このレベルはＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−ヌル処置対照マウスで観察されたものよりなお有意に高く発現された。
【０４５３】
要約すると、データは、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−Ｅ６／Ｅ７がＨＰＶ−Ｅ６／Ｅ７誘導性ＣＭＩ応答を用量依存的に誘導することができることを実証し、それは腫瘍細胞の上でのＰＤＬ１の上方制御をもたらす。腫瘍保持マウスでの最高用量のワクチンによる複数回の同種免疫は、特に小さい腫瘍を有するマウスで、有意な抗腫瘍活性および生存の増加をもたらした。重要なことに、大きな腫瘍を有するマウスでＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−Ｅ６／Ｅ７による免疫療法を抗ＰＤ１と組み合わせたとき、より大きな程度の抗腫瘍活性が達成された。全体として、抗ＰＤ１抗体と組み合わせたＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−Ｅ６／Ｅ７ワクチンによる免疫は、より消耗的／アネルギー性でない表現型を有し、したがって、腫瘍微小環境においてより炎症促進性の状態を相殺することを有利にする、ＣＤ８＋およびＣＤ４＋エフェクター集団の増加をもたらす。組み合わせた処置が大きな腫瘍塊の低減と関連したことが観察されたことは、抗ＰＤ１抗体と組み合わせたＡｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−Ｅ６／Ｅ７による免疫療法が、ＨＰＶ関連の頭頸部または子宮頸がん患者の免疫療法の間の、臨床有効性を増加させるかもしれないことを示す。さらに、データは、Ａｄ５［Ｅ１−、Ｅ２ｂ−］−Ｅ６／Ｅ７ワクチンによる臨床治験はｎｎ免疫経路チェックポイントモジュレーターと組み合わせるべきであることを示唆し、その優先順位は高いままである。
【０４５４】
上記の様々な実施形態は、さらなる実施形態を提供するために組み合わせることができる。この明細書で言及されるおよび／または出願データシートに掲載される米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願および非特許刊行物の全ては、各個々の刊行物、特許または特許出願が参照により組み込まれることが具体的におよび個々に示されるのと同じ程度に、参照により本明細書に完全に組み込まれる。
【０４５５】
実施形態の態様は、さらに他の実施形態を提供するために様々な特許、出願および刊行物の概念を用いるのに必要であるならば、改変されてもよい。
【０４５６】
上の発明を実施するための形態を考慮して、これらのおよび他の変更を実施形態に加えることができる。一般に、以下の特許請求の範囲では、使用される用語は、明細書および特許請求の範囲に開示される具体的な実施形態に特許請求の範囲を限定するものと解釈されるべきでなく、そのような特許請求の範囲が権利を有する同等物の全範囲と一緒に全ての可能な実施形態を含むものと解釈するべきである。したがって、特許請求の範囲は本開示によって制限されない。
【化１】
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【化２】
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【化３】
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【化４】
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【化５】
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【化６】
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【化７】
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【化８】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２−１】
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【図３２−２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１−１】
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【図４１−２】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【配列表】
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