(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＦＧＦ−１８、キシログルカン、及び緩衝液を含むか又はそれらから成る、関節内注射に適した液体製剤であって、
前記キシログルカンが部分的に脱ガラクトシル化されており、
前記キシログルカンが４４〜４５％の脱ガラクトシル化度を有し、
前記キシログルカンの濃度が２〜３重量％の濃度である、前記液体製剤。
【請求項２】
前記緩衝液がリン酸緩衝液である、請求項１に記載の液体製剤。
【請求項３】
ＦＧＦ−１８が、
ａ．配列番号１のアミノ酸残基２８〜２０７を含むか又はそれから成るポリペプチド、
ｂ．配列番号１のアミノ酸残基２８〜１９６を含むか又はそれから成るポリペプチド、及び
ｃ．配列番号２を含むか又はそれから成るポリペプチド
から成る群から選択される、請求項１又は２に記載の液体製剤。
【請求項４】
前記キシログルカンが２〜３重量％の濃度であり、前記緩衝液が９７〜９８重量％の濃度である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の液体製剤。
【請求項５】
キシログルカン：ＦＧＦ−１８の比率が９：１である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の液体製剤。
【請求項６】
前記製剤が、３７℃又は約３７℃の温度に曝露された時にヒドロゲルを形成する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の液体製剤。
【請求項７】
ヒドロゲルを形成する方法であって、
ａ．請求項１〜６のいずれか１項に記載の液体製剤を調製する工程と、
ｂ．前記液体製剤を３７℃又は約３７℃の温度に曝露してゲルを形成する工程(人体への注入を除く)と、
を含む、方法。
【請求項８】
容器および請求項１〜６のいずれか１項に記載の液体製剤を含む、軟骨修復における使用のための、または軟骨障害の治療のための製品であって、前記液体製剤が前記容器に収容されている前記製品。
【請求項９】
軟骨修復における使用のための、または軟骨障害の治療のための、請求項１〜６のいずれか１項に記載の液体製剤。
【請求項１０】
前記軟骨障害は、骨関節炎又は軟骨損傷である、請求項９に記載の液体製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬製剤の分野に関する。より具体的には本発明は、キシログルカンゲル中の線維芽細胞増殖因子１８（ＦＧＦ−１８）タンパク質製剤と、このような製剤の製造方法と、に関する。
【背景技術】
【０００２】
線維芽細胞増殖因子１８（ＦＧＦ−１８）は、ＦＧＦ−８及びＦＧＦ−１７に密接に関連するタンパク質の線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）ファミリーのメンバーである。ＦＧＦファミリーのメンバーは、ヘパリン結合ドメインにより性状解析される。このような推定されるヘパリン結合ドメインは、ＦＧＦ−１８について同定されている。受容体を介したシグナル伝達は、細胞表面のヘパリン硫酸プロテオグリカンと複合体を形成したＦＧＦリガンドの結合により開始されると、言われている。
【０００３】
ＦＧＦ−１８は、軟骨細胞及び骨芽細胞の増殖剤であることが示されている（Ellsworth et al., 2002; Shimoaka et al., 2002）。ＦＧＦ−１８は、骨関節炎（ＯＡ）及び軟骨損傷（ＣＩ）などの軟骨障害の治療の、単独の治療（国際公開第２００８／０２３０６３号）又はヒアルロン酸との組み合わせ治療（国際公開第２００４／０３２８４９号）について、提唱されている。
【０００４】
ＦＧＦポリペプチドを含む医薬組成物は、当該分野で公知である。国際公開第２０１２１７２０７２号は、ＦＧＦ−１８を含有する凍結乾燥製剤を記載し、ここで、前記組成物は、ＦＧＦ−１８、緩衝液、ポロキサマー界面活性剤、及び安定化剤としての糖を含む。前記ＦＧＦ−１８の凍結乾燥製剤は、ＯＡ又はＣＩの治療で有望な結果を示している。前記凍結乾燥製剤を使用する現在の投薬処方は、週１回で３週間の注射の治療サイクルである。治療サイクルは繰り返すことができる。
【０００５】
ＣＩの場合、現在の製剤の主要な欠点は、関節内（ｉ.ａ.）にいったん注射すると、滑液中のＦＧＦ−１８の存在が、健康な領域でも軟骨の制御不能な増殖を誘導し得ることである。これは当然ながら、関節の可動性の低下などの望ましくない作用を誘導することがある。標的部位のレベルでのＦＧＦ−１８の選択的送達は、損傷部位においてのみ軟骨の成長を促進するであろう。具体的には損傷部位のレベルでのＦＧＦ−１８の送達は、微小破壊技術と組合せるとＣＩの治療のために極めて有益であろう。微小破壊は、下層の骨に小さな骨折を作成することにより作用する、関節軟骨の修復手術技術である。これは、骨髄由来の多能性間葉系幹細胞の放出を引き起こす（Ringe J. et al., 2012）。ＦＧＦ−１８を含有する注射可能なゲルで軟骨穴を充填することは、細胞をゲル内に導き、これは次に、細胞増殖及び同時に薬物貯蔵のための機械的支持体として作用するであろう。このため、ＦＧＦ−１８はゲルから放出されず、マトリックス内に捕捉されたままであることが好ましいであろう。
【０００６】
組織工学における典型的な手法は、受容体部位の形状とするための、機械的特性に応じて移植又は注入することができる３Ｄマトリックス、すなわち足場への、増殖因子の閉じ込めである。足場の必須特性は、生体適合性と吸収性である。さらに足場は、細胞が成長し、増殖し、損傷組織を修正するための理想的な環境を、細胞に提供することができなければならない。理想的にはマトリックスは、元の組織と同じ機械的性質に似ており、細胞を収容できる微空隙率（充分な大きさの連通する空孔）を提示しなければならない（Tessmar and Gopferich, 2007）。
【０００７】
ヒドロゲルは、大量の水を吸収し保持できる親水性ポリマー鎖の３次元ネットワークである。これらの主要な特徴は、これらは膨潤又は縮小することができるが、水性媒体に溶解しないことである。従って、これらのマトリックス中に活性分子（活性医薬成分、すなわちＡＰＩ）を捕捉することが可能であり、次にこれは、マトリックスとＡＰＩとの特異的相互作用の有無に応じて、ゆっくりと放出又は保持される（Lo Presti et al., 2011）。軟骨障害を治療するために注射可能なヒドロゲルを使用する利点は、固体の足場を利用するいかなる侵襲的手術も必要とせずに、軟骨欠損において関節鏡検査によって足場を注入できる可能性である。
【０００８】
既に知られている多様なヒドロゲルの中で、一部の製剤は、特定の物理的又は化学的刺激に応答して、ゲル化プロセスを受けることができるポリマーに基づいている。これらはいったん注入されると、温度、ｐＨ、又はイオン強度の変化などの注射部位の環境刺激に応答して巨視的なゲルに変わる、粘性の注入可能な液体として存在する。製剤の組成は、粘弾性、微空隙率などの異なる特性を有するヒドロゲルを得るために調整することができる（国際公開第２００８０６３４１８号；Lo Presti et al., 2001; C. Dispenza et al, 2011）。
【０００９】
天然ポリマー、特に多糖類のヒドロゲルは、非毒性、生体適合性、生分解性、及び豊富な量などのユニークな利点のために、広く使用されている。コラーゲン、ゼラチン、グリコサミノグリカン、及びこれらの誘導体を含む天然のポリマーは、しばしばタンパク質に対して高い親和性を有する。大多数のバイオポリマーは、温度又はイオンの変化で、自己構成する特性を有する。
【００１０】
キシログルカン類は、高等植物の１次細胞壁に見出される構造多糖類の主要なクラスである。キシログルカンが部分的に脱ガラクトシル化（Ｄｅｇ−ＸＧ）されると、これは温度応答性（感熱性）となる。これは、水溶液中で温度変化により物理的可逆的ゲルを形成することができる。キシログルカンの脱ガラクトシル化は、β−ガラクトシダーゼを用いて達成される（Rilton et al., 2011）。脱ガラクトシル化されたキシログルカンは、他の現在利用可能なイン・サイチュ（in situ）ゲル化システムに対していくつかの利点を示す：このゲル化は２価陽イオンの存在を必要とせず、これは薬物の荷電性質により影響されない；溶液中のポリマーの濃度と温度に応じて、このゲルは数分で形成される（Shirakawa et al., 1998）。
【００１１】
生物活性タンパク質を含む医薬組成物を調製する場合、この組成物は、タンパク質の活性が適切な時間維持されるように、調製しなければならない。タンパク質の活性／安定性の喪失は、タンパク質の化学的又は物理的不安定性、特に変性、凝集、又は酸化により生じることがある。従って得られる生成物は、薬学的に許容されない場合がある。賦形剤及び／又はヒドロゲルの使用は、特定のタンパク質の安定性を上昇させることが知られているが、これらの賦形剤の安定化作用は、ゲル中のポリマー、賦形剤の性質、及び生物活性タンパク質自体に、大きく依存する。
【００１２】
活性成分としてＦＧＦ−１８を含む製剤であって、活性成分の生物活性を保持し、注射、好ましくは関節内注射での使用に適し、治療に必要な注射の回数を減らすことを可能にする、更なる製剤に対するニーズが、いまだに存在する。このような特徴は、感染症のリスクの低減を可能にし、患者の利便性を高めることになるであろう。前記製剤は、骨関節炎や軟骨損傷などの患者の軟骨障害の治療における投与に有用であろう。
【発明の概要】
【００１３】
発明の概要
本発明の目的は、ＦＧＦ−１８タンパク質を含む新規製剤を提供することである。さらに詳しくは、前記製剤はＦＧＦ−１８を含有するヒドロゲルであり、このヒドロゲルは好ましくは感熱性ヒドロゲル、より好ましくはキシログルカンゲルである、本発明はまた、液体配合物から出発して、本発明のヒドロゲルを調製するための方法を提供する。本明細書に記載のＦＧＦ−１８を含有するヒドロゲルは、骨関節炎又は軟骨損傷などの軟骨障害の治療での投与に有用であり得る。特に関係するものは、ＦＧＦ−１８タンパク質をさらに含むキシログルカンヒドロゲルである。注入前、又はゲル化温度に供される前に、本発明のヒドロゲルは液体形態であることに留意されたい。
【００１４】
第１の態様において本発明は、キシログルカン、緩衝液、及び活性成分としてのＦＧＦ−１８を含むか又はそれらから成る液体製剤を提供する。この製剤は、５℃で保存した時に液体形態であり、３７℃で、すなわちいったん体内に注入されるとゲル（又はヒドロゲル）になるゲル化システムとして提供される。好ましくは、前記キシログルカンは、脱ガラクトシル化キシログルカン、さらに好ましくは約４４又は約４５％の脱ガラクトシル化度を有するＤｅｇ−キシログルカンであり、前記緩衝液はリン酸緩衝液、例えばＰＢＳである。好適な実施態様において、前記キシログルカン中の濃度は、１〜５重量％又は約１〜約５重量％、好ましくは３〜４重量％又は約３〜約４重量％、又は更により好ましくは４％又は約４％であり、前記緩衝液の濃度は、９５〜９９重量％又は約９５〜約９９重量％、好ましくは９６％重量又は約９６％重量である。好ましくは、ＦＧＦ−１８は、以下からなる群から選択される：１）配列番号１の残基２８（Ｇｌｕ）〜残基２０７（Ａｌａ）を含むか又はそれから成る配列に対応する、ヒトＦＧＦ−１８の成熟型を含むか又はそれから成るポリペプチド、２）配列番号１の残基２８（Ｇｌｕ）〜残基１９６（Ｌｙｓ）を含むか又はそれから成る、ヒトＦＧＦ−１８の切断型を含むか又はそれから成るポリペプチド、及び３）配列番号２を含むか又はそれから成るポリペプチド。より好ましくは、ＦＧＦ−１８は、後に定義されるスプリフェルミン（sprifermin）である。
【００１５】
第２の態様において本発明は、ＦＧＦ−１８のヒドロゲルを調製するための方法であって、
１）キシログルカン及び緩衝液と一緒にＦＧＦ−１８を含むか又はそれから成る溶液を調製する工程と、
２）ゲルを３７℃又は約３７℃の温度に曝露してゲルを形成する工程と、
を含み、
ここで、前記キシログルカンは、好ましく脱ガラクトシル化キシログルカン、さらにより好ましくは約４４又は約４５％の脱ガラクトシル化度を有するＤｅｇ−キシログルカンであり、前記緩衝液はＰＢＳなどのリン酸緩衝液である、方法を提供する。好ましくは最終製剤のｐＨは、５〜８又は約５〜約８、さらに詳しくは５．５〜７．５又は約５．５〜約７．５、例えば５．５、６、６．５、７、７．３、若しくは７．５、又は約５．５、約６、約６．５、約７、約７．３、又は約７．５、さらにより好ましくは５．５〜６又は約５．５〜約６で維持される。好適な実施態様において、ＦＧＦ−１８は、以下からなる群から選択される：１）配列番号１の残基２８（Ｇｌｕ）〜残基２０７（Ａｌａ）を含むか又はそれから成る配列に対応する、ヒトＦＧＦ−１８の成熟型を含むか又はそれから成るポリペプチド、２）配列番号１の残基２８（Ｇｌｕ）〜残基１９６（Ｌｙｓ）を含むか又はそれから成る、ヒトＦＧＦ−１８の切断型を含むか又はそれから成るポリペプチド、及び３）配列番号２を含むか又はそれから成るポリペプチド。より好ましくは、ＦＧＦ−１８は、後に定義されるスプリフェルミンである。好適な実施態様において、ヒトへの注入時、すなわちイン・サイチュで、ゲル化温度に供される。
【００１６】
第３の態様において本発明は、第２の実施態様の方法によって得られるヒドロゲルを提供する。
【００１７】
第４の態様において本発明は、キシログルカン、ＦＧＦ−１８、及び緩衝液を含む容器を含む、医薬的又は獣医学的使用（pharmaceutical or veterinary use）のための製品であって、ここで、前記キシログルカンは、好ましくは脱ガラクトシル化キシログルカン、さらにより好ましくは約４４又は約４５％の脱ガラクトシル化度を有するＤｅｇ−キシログルカンであり、前記緩衝液はＰＢＳなどのリン酸緩衝液である、上記製品を提供する。好ましくは、ＦＧＦ−１８は、以下からなる群から選択される：１）配列番号１の残基２８（Ｇｌｕ）〜残基２０７（Ａｌａ）を含むか又はそれから成る配列に対応する、ヒトＦＧＦ−１８の成熟型を含むか又はそれから成るポリペプチド、２）配列番号１の残基２８（Ｇｌｕ）〜残基１９６（Ｌｙｓ）を含むか又はそれから成る、ヒトＦＧＦ−１８の切断型を含むか又はそれから成るポリペプチド、及び３）配列番号２を含むか又はそれから成るポリペプチド。より好ましくは、ＦＧＦ−１８は、後に定義されるスプリフェルミンである。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】水中で調製されたＤｅｇ−ＸＧシステムについて、（ａ）剪断速度に対する剪断粘度と、（ｂ）剪断応力に対する剪断速度とを示す。
【図２】Ｄ−ＰＢＳ中で調製されたＤｅｇ−ＸＧシステムについて、剪断速度に対する剪断粘度を示す。
【図３】（ａ）ＦＧＦ−１８を含むＤｅｇ−ＸＧ  ３重量％と、（ｂ）ＦＧＦ−１８を含むＤ−ＰＢＳ中のＤｅｇ−ＸＧ  ４重量％について、２５℃で異なるインキュベーション時間後の、剪断粘度測定値を示す。
【図４】Ｄ−ＰＢＳ中の、Ｄｅｇ−ＸＧ  ４．４重量％と５４ｍｃｇ／ｍｌのＦＧＦ−１８を含むＤｅｇ−ＸＧ  ４重量％について、２５℃及び１Ｈｚでの時間掃引測定値を示す。
【図５】Ｄｅｇ−ＸＧ／水システム（４及び５重量％）の剪断粘度に対するオートクレーブの影響を示す。
【図６】（ａ）Ｄｅｇ−ＸＧ／Ｄ−ＰＢＳシステム（３．３、４．４、５．５重量％）の剪断粘度に対するオートクレーブの影響、及び（ｂ）いずれもオートクレーブされた、Ｄｅｇ−ＸＧ／水（４及び５重量％）とＤｅｇ−ＸＧ／Ｄ−ＰＢＳシステム（４．４及び５．５重量％）との比較を示す。
【図７】３７℃で（ａ）５分間、及び（ｂ）３０分間、インキュベーション後のＤｅｇ−ＸＧ／水システムの歪み掃引プロットを示す。
【図８】（ａ）ＦＧＦ−１８有り及び無しの３重量％の、（ｂ）ＦＧＦ−１８有り及び無しの４重量％の、（ｃ）ＦＧＦ−１８有り及び無しの５重量％の、Ｄｅｇ−ＸＧ／Ｄ−ＰＢＳシステムについての歪み掃引プロットを示す。
【図９】（ａ）３７℃で５分間インキュベーショントした、及び（ｂ）３７℃で３０分間インキュベートした、Ｄｅｇ−ＸＧ／水システムについての周波数掃引プロットを示す。
【図１０】（ａ）ＦＧＦ−１８有り及び無しの３重量％の、（ｂ）ＦＧＦ−１８有り及び無しの４重量％の、（ｃ）ＦＧＦ−１８有り及び無しの５重量％の、Ｄｅｇ−ＸＧ／Ｄ−ＰＢＳシステムについての周波数掃引プロットを示す。
【図１１】Ｄｅｇ−ＸＧ／水システムについての、時間に対する１ＨｚのＧ’及びＧ”を示す。
【図１２】Ｄｅｇ−ＸＧ／Ｄ−ＰＢＳ  ４．４重量％システムに対する凍結融解の影響を示す。
【図１３】いずれもゾル及びゲル形態の、凍結乾燥され再構成されたＤ−ＰＢＳ中のＤｅｇ−ＸＧ  ４．４重量％を示す。
【図１４】新鮮な及び浸食された試料（ａ）５４０μｇ／ｍｌのＦＧＦ−１８を含むＤｅｇ−ＸＧ  ４重量％、（ｂ）５４μｇ／ｍｌのＦＧＦ−１８を含むＤｅｇ−ＸＧ  ４重量％、（ｃ）５４０μｇ／ｍｌのＦＧＦ−１８を含むＤｅｇ−ＸＧ  ５重量％、（ｄ）５４μｇ／ｍｌのＦＧＦ−１８を含むＤｅｇ−ＸＧ  ５重量％、についての周波数掃引プロットを示す。
【図１５】アラマーブルー（Alamar Blue）試薬による細胞増殖アッセイを示す（Ｘ軸：インキュベーション時間（日数）、Ｙ軸：細胞生存率）。これは、ＦＧＦ−１８を持たない（対照）か、又は３つの異なる濃度（５４ｍｃｇ／ｍｌ、６．７ｍｃｇ／ｍｌ、６．７ｎｇ／ｍｌ）のＦＧＦ−１８を含む、Ｄｅｇ−ＸＧヒドロゲル（３．３重量％）試料で培養された軟骨細胞を用いて行われた、細胞増殖についてのアラマーブルーアッセイ（５０００個の軟骨細胞／ウェル）の結果を示す。
【図１６】Ｄｅｇ−ＸＧ（左上）；Ｄｅｇ−ＸＧ＋ＦＧＦ−１８  ６．７ｎｇ／ｍｌ（右上）；Ｄｅｇ−ＸＧ＋のＦＧＦ−１８  ６．７μｇ／ｍｌ（左下）；Ｄｅｇ−ＸＧ＋のＦＧＦ−１８  ５４μｇ／ｍｌ（右下）で１２日間培養した軟骨細胞のアクリジンオレンジ染色を示す。
【図１７ａ】配列番号１に対応するヒトＦＧＦ−１８の配列を示す。
【図１７ｂ】配列番号２に対応するスプリフェルミンの配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
定義
−  本明細書において用語「ＦＧＦ−１８タンパク質」又は「ＦＧＦ−１８」は、ヒトＦＧＦ−１８タンパク質の少なくとも１つの生物活性を維持しているタンパク質であることが意図される。ＦＧＦ−１８は、未変性でも、成熟型でも、切断型でもよい。ヒトＦＧＦ−１８タンパク質の生物活性は、特に骨芽細胞活性（国際公開第９８／１６６４４号を参照）又は軟骨形成（国際公開第２００８／０２３０６３号を参照）の上昇を含む。未変性の又は野生型のヒトＦＧＦ−１８は、関節軟骨の軟骨細胞により発現されるタンパク質である。ヒトＦＧＦ−１８は最初ｚＦＧＦ−５と呼ばれ、国際公開第９８／１６６４４号に詳細に記載されている。配列番号１は未変性のヒトＦＧＦ−１８のアミノ酸配列に対応し、アミノ酸残基１（Ｍｅｔ）〜２７（Ａｌａ）からなるシグナルペプチドを有する。ヒトＦＧＦ−１８の成熟型は、配列番号１の残基２８（Ｇｌｕ）〜残基２０７（Ａｌａ）からのアミノ酸配列（１８０アミノ酸）に対応する。
【００２０】
本発明においてＦＧＦ−１８は、例えば国際公開第２００６／０６３３６２号に教示された組換え法により製造することができる。その発現系及び条件に応じて、本発明のＦＧＦ−１８は、出発メチオニン（Ｍｅｔ）残基又は分泌のためのシグナル配列を有する組換え宿主細胞で発現される。大腸菌（E. coli）などの原核生物宿主中で発現される時、ＦＧＦ−１８は、その配列のＮ末端に追加のＭｅｔ残基を含む。例えばヒトＦＧＦ−１８のアミノ酸配列は、大腸菌（E. coli）で発現される時、配列番号１のＮ末端のＭｅｔ残基（１位）で開始され、残基２８（Ｇｌｕ）〜残基２０７（Ａｌａ）が続く。
【００２１】
−  本明細書において用語ＦＧＦ−１８の「切断型（truncated form）」は、配列番号１の残基２８（ＧＬｕ）〜１９６（Ｌｙｓ）を含むか又はそれから成るタンパク質を指す。好ましくはＦＧＦ−１８タンパク質の切断型は、「ｔｒＦＧＦ−１８」と呼ばれるポリペプチド（１７０アミノ酸）であり、これは、野生型ヒトＦＧＦ−１８のＭｅｔ残基（Ｎ末端中）から始まり、アミノ酸残基２８（ＧＬｕ）〜１９６（Ｌｙｓ）が続く。ｔｒＦＧＦ−１８のアミノ酸配列は配列番号２に示される（配列番号２のアミノ酸残基２〜１７０は、配列番号１のアミノ酸残基２８〜１９６に対応する）。ｔｒＦＧＦ−１８はヒトＦＧＦ−１８の組換え切断型であり、大腸菌（E. coli）により産生される（国際公開第２００６／０６３３６２号を参照）。この特殊な型のＦＧＦ−１８の国際一般名（The International Nonproprietary Name：ＩＮＮ）はスプリフェルミンである。スプリフェルミンは、成熟ヒトＦＧＦ−１８と同様の活性を示すことが証明されており、例えばこれは、軟骨細胞増殖と軟骨沈着を上昇させて、種々の軟骨組織の修復と再建につながる（国際公開第２００８／０２３０６３号を参照）。
【００２２】
−  用語「活性分子」又は「活性成分」は、活性医薬成分（Active Pharmaceutical Ingredient）、すなわちＡＰＩに関する。好適なＡＰＩは、本発明の文脈において、ＦＧＦ−１８である。
【００２３】
−  用語「ゲル」又は「ヒドロゲル (hydrogel)」は、本出願において互換的に使用される。これらは、医薬製剤として有用な３Ｄマトリックス、又は足場を指す。
【００２４】
−  本明細書で用いられる用語「液体製剤 (liquid solution)」は、いったん人体に投与されると、温度変化によりゲル自体が生成するため、注入前のヒドロゲル配合物を指す。
【００２５】
−  用語「キシログルカン」は、任意の形態のキシログルカン、すなわち、維管束植物の１次細胞壁において産生されるヘミセルロースを指す。これは、特に約３７℃の温度に供される時、周知のゲル化剤である。本発明の文脈において使用することができる好ましい形態の一つは、脱ガラクトシル化型、より好ましくは約４４又は約４５％の脱ガラクトシル化度を有する形態である。脱ガラクトシル化キシログルカンは、本明細書ではＤｅｇ−キシログルカン、Ｄ−キシログルカン、又はＤｅｇ−ＸＧとして報告される。
【００２６】
−  本明細書において用語「緩衝液」は、医薬的又は獣医学的使用のための製剤中で安全であることが知られており、製剤のｐＨを製剤について所望されるｐＨ範囲に維持又は制御する作用を有する、化合物の溶液を指す。ｐＨを中程度に酸性のｐＨ〜中程度に塩基性のｐＨに制御する許容される緩衝液は、特に限定されないが、リン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、アルギニン、ＴＲＩＳ、及びヒスチジン緩衝液を含む。「ＴＲＩＳ」は、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール、及びその任意の医薬的に許容し得る塩を指す。本発明の好適な緩衝液は、例えばＰＢＳのようなリン酸緩衝液である。
【００２７】
−  本明細書において用語「バイアル」又は「容器」は、製剤を液体の形態で保持するのに適した広義のリザーバーを指す。本発明において使用し得るバイアルの例は、シリンジ、アンプル、カートリッジ、又は、注射、好ましくは関節内注射を介して患者にＦＧＦ−１８製剤を送達するのに適した他のリザーバーを含む。関節内投与のための製品をパッケージするのに適したバイアルは、当該分野で公知であり認識されている。
【００２８】
−  本明細書において用語「軟骨障害」は、外傷又は軟骨疾患に起因する損傷から生じる障害を包含する。本明細書に記載のＦＧＦ−１８製剤の投与により治療し得る軟骨障害の例は、特に限定されないが、骨関節炎又は関節リウマチなどの関節炎、及び軟骨損傷を含む。
【００２９】
−  用語「骨関節炎」は、関節炎の最も一般的な形態を意味するのに使用される。これは、軟骨の破壊によって引き起こされることがある。軟骨の破片は割れて、骨の間の関節の痛みや腫れを引き起こすことがある。時間が経つにつれて、軟骨は完全に摩耗し、骨が一緒にこすれるであろう。骨関節炎はすべての関節に影響を与え得るが、通常は手や体重を支える関節（例えば股関節、膝関節、足、背骨）に影響を与える。好適な例において骨関節炎は、膝骨関節炎又は股関節骨関節炎でもよい。当業者は、当該分野で使用される骨関節炎分類法、特にＯＡＲＳＩ評価システム（例えば、Custers et al., 2007を参照）を充分認識している。骨関節炎は、本発明のＦＧＦ−１８化合物を投与することによって治療することができる好適な軟骨障害の一つである。
【００３０】
−  本明細書において用語「軟骨損傷」は、特に外傷から生じる軟骨障害又は軟骨損傷である。外傷性機械的破壊の結果として、特に事故又は手術により、軟骨損傷が発生することがある。また関節組織のスポーツ関連の損傷又はスポーツ関連の摩耗も、この定義の範囲内であると考えられる。
−  用語「μｇ」又は「ｍｃｇ」は互換的に使用され、質量のＳＩ単位の一部を指す。
【００３１】
発明の詳細な説明
本発明の主要な目的は、キシログルカン、ＦＧＦ−１８タンパク質、及び緩衝液を含むか又はそれらから成るキシログルカンゲル製剤（又はヒドロゲル）である。前記ヒドロゲルは、イン・サイチュで注射前に又はゲル化温度に曝露される前に液体の形態であるため、本発明の別の主要な目的は、キシログルカン、ＦＧＦ−１８タンパク質、及び緩衝液を含むか又はそれらから成るキシログルカンゲル液体製剤である。好適な実施態様において、キシログルカンは脱ガラクトシル化キシログルカンであり、さらにより好ましくは、脱ガラクトシル化度が約４４又は約４５％であるＤｅｇ−キシログルカンであり、緩衝液は、ＰＢＳなどのリン酸緩衝液である。
【００３２】
前記液体製剤（又はヒドロゲル）は、軟骨レベルでの注射に適している。好ましくは、ＦＧＦ−１８タンパク質は、以下からなる群から選択される：１）配列番号１の残基２８（Ｇｌｕ）〜残基２０７（Ａｌａ）を含むか又はそれから成る配列に対応する、ヒトＦＧＦ−１８の成熟型を含むか又はそれから成るポリペプチド、２）配列番号１の残基２８（Ｇｌｕ）〜残基１９６（Ｌｙｓ）を含むか又はそれから成る、ヒトＦＧＦ−１８の切断型を含むか又はそれから成るポリペプチド、及び３）配列番号２を含むか又はそれから成るポリペプチド。より好ましくは、ＦＧＦ−１８は、スプリフェルミンである。
【００３３】
注射可能なヒドロゲルを使用することの利点は、固体足場を使用する侵襲的手術の必要性無しで、軟骨欠損に、すでにＦＧＦ−１８を含有する足場（又は足場の成分：前記足場はゲル化温度に曝露される前に液体の形態である）を注射できる可能性である。好ましくは、この注射は関節鏡により行われる。
【００３４】
最も好ましくは本発明のヒドロゲルは、注入時にイン・サイチュで形成される。
【００３５】
好適な実施態様において本発明は、いったん患者に投与されると、温度変化によりゲル化過程を受けることができる液体ポリマー溶液（又は液体製剤）の使用に関する。
【００３６】
液体製剤及びヒドロゲルは、本発明の文脈において、同じ製剤を指すことに留意されたい。しかし液体製剤は、特にゲル化前の製剤の形態に関し、一方ヒドロゲルは、同じ製剤を指すが、ゲル化プロセスに供されているものである。従って、両製剤の成分は同じである。
【００３７】
液体製剤（又はヒドロゲル）中のＦＧＦ−１８の濃度は、好ましくは１ｎｇ／ｍｌ〜６００ｍｃｇ／ｍｌ又は約１ｎｇ／ｍｌ〜約６００ｍｃｇ／ｍｌ、好ましくは０．００１、０．００６、０．０１、０．１、１、５、６．５、１０、２０、３０、４０、５０、５４、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、若しくは３００、５４０ｍｃｇ／ｍｌ、又は約０．００１、約０．００６、約０．０１、約０．１、約１、５、約６．５、約１０、約２０、約３０、約４０、約５０、約５４、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約１５０、約２００、約２５０、又は約３００、約５４０ｍｃｇ／ｍｌである。より好ましくは、ＦＧＦ−１８は、０．１〜１００ｍｃｇ／ｍｌ又は約０．１〜約１００ｍｃｇ／ｍｌ、さらにより好ましくは０．１〜５４ｍｃｇ／ｍｌ又は約０．１〜約５４ｍｃｇ／ｍｌである。
【００３８】
液体製剤中又はヒドロゲル中の、ゲル化成分すなわちキシログルカンは、１〜５重量％又は約１〜約５重量％、好ましくは２〜４重量％又は約２〜約４重量％、さらに好ましくは３若しくは４重量％、又は約３若しくは約４重量％である。好ましくは、前記キシログルカンは脱ガラクトシル化キシログルカンであり、さらにより好ましくは前記Ｄｅｇ−キシログルカンは、約４４又は約４５％の脱ガラクトシル化度を有する。前記Ｄｅｇ−キシログルカンの具体的な利点は、遷移可溶性ゲルが約３７℃、すなわち人体の温度であり、一方遷移ゲル−ゾルは約７０℃である。従って、いったんゲルが人体中で形成されると、これはゲル状態のままである；これは可溶性の状態に戻するリスクは無い。
【００３９】
ＰＢＳなどの緩衝液は、９５〜９９重量％又は約９５〜約９９重量％、より好ましくは９６〜９７重量％又は約９６〜約９７重量％である。
【００４０】
好適な実施態様において、液体製剤又はヒドロゲル（いったん体内に注入されると、前記液体製剤はヒドロゲルを形成する）は、０．１〜１００ｍｃｇ／ｍｌ又は約０．１〜約１００ｍｃｇ／ｍｌのＦＧＦ−１８、３又は４重量％のキシログルカン、９６又は９７重量％の緩衝液を含むか又はそれらから成る。好ましくはポリマー（すなわちキシログルカン）とＦＧＦ−１８との比は、２０：１〜１：１、より好ましくは９：１である。
【００４１】
いったん混合されると、各成分の最終濃度は好ましくは以下の通りである：
−  ＦＧＦ−１８：  ０．００００１〜０．６重量％、例えば０．００５４重量％；
−  キシログルカン：  １〜５重量％、例えば３又は４重量％；
−  緩衝液：  ９５〜９９重量％、例えば９６又は９７重量％。
【００４２】
好適な実施態様においては、最終製剤のｐＨは、５〜８又は約５〜約８、さらに詳しくは５．５〜７又は約５．５〜約７、例えば５．５、６、６．５、７、７．３、若しくは７．５、又は約５．５、約６、約６．５、約７、約７．３、又は約７．５であり、さらにより好ましくは５．５〜６又は約５．５〜約６である。
【００４３】
本発明はさらに、ＦＧＦ−１８のヒドロゲルを調製するための方法であって、以下の工程：
１）キシログルカン及び緩衝液と一緒に、ＦＧＦ−１８を含むか又はそれらから成る液体製剤を調製する工程、及び
２）ゲルを３７℃又は約３７℃の温度に曝露して、ゲルを形成する工程、
を含み、
ここで、前記キシログルカンは、好ましくは脱ガラクトシル化キシログルカン、さらにより好ましくは約４４又は約４５％の脱ガラクトシル化度を有するＤｅｇ−キシログルカンであり、緩衝液はＰＢＳなどのリン酸緩衝液である、上記方法を提供する。好ましくは最終製剤のｐＨは、５〜８又は約５〜約８、さらに詳しくは５．５〜７又は約５．５〜約７、例えば５．５、６、６．５、７、７．３、若しくは７．５、又は約５．５、約６、約６．５、約７、約７．３、若しく約７．５であり、さらにより好ましくは５．５〜６又は約５．５〜約６である。好適な実施態様においてＦＧＦ−１８は、以下からなる群から選択される：１）配列番号１の残基２８（Ｇｌｕ）〜残基２０７（Ａｌａ）を含むか又はそれから成る配列に対応する、ヒトＦＧＦ−１８の成熟型を含むか又はそれから成るポリペプチド、２）配列番号１の残基２８（Ｇｌｕ）〜残基１９６（Ｌｙｓ）を含むか又はそれから成る、ヒトＦＧＦ−１８の切断型を含むか又はそれから成るポリペプチド、及び３）配列番号２を含むか又はそれから成るポリペプチド。より好ましくは、ＦＧＦ−１８は、後に定義されるスプリフェルミンである。好適な実施態様において液体製剤は、人体へ注入時に、すなわちイン・サイチュで、ゲル化温度に供され、こうしてゲル（又はヒドロゲル）を形成する。
【００４４】
好ましくは、ポリマー（すなわちキシログルカン）とＦＧＦ−１８との比は、２０：１〜１：１、より好ましくは９：１である。化合物の各々（すなわち、ＦＧＦ−１８、キシログルカン、及び緩衝液）は、上記した濃度、ｐＨ、及び／又は比率のいずれかに従って使用することができる。
【００４５】
第３の態様において本発明は、本発明の液体製剤を含むか又はそれから成る容器を含む、医薬的又は獣医学的使用のための製品を提供する。前記液体製剤は、キシログルカンは、ＦＧＦ−１８タンパク質、及び緩衝液を含むか又はそれらから成り、ここで、キシログルカンは好ましくは脱ガラクトシル化キシログルカン、さらにより好ましくは約４４又は約４５％の脱ガラクトシル化度を有するＤｅｇ−キシログルカンであり、緩衝液はＰＢＳなどのリン酸緩衝液である。好ましくは、ＦＧＦ−１８は、以下からなる群から選択される：１）配列番号１の残基２８（Ｇｌｕ）〜残基２０７（Ａｌａ）を含むか又はそれから成る配列に対応する、ヒトＦＧＦ−１８の成熟型を含むか又はそれから成るポリペプチド、２）配列番号１の残基２８（Ｇｌｕ）〜残基１９６（Ｌｙｓ）を含むか又はそれから成る、ヒトＦＧＦ−１８の切断型を含むか又はそれから成るポリペプチド、及び３）配列番号２を含むか又はそれから成るポリペプチド。より好ましくは、ＦＧＦ−１８は、後に定義されるスプリフェルミンである。好ましくは、ポリマー（すなわちキシログルカン）とＦＧＦ−１８との比は、２０：１〜１：１、より好ましくは９：１である。化合物（すなわち、ＦＧＦ−１８、キシログルカン、及び緩衝液）の各々は、本明細書に開示された濃度に従って使用することができる。
【００４６】
本発明はさらに、上記の方法によって得られるヒドロゲルに関する。
【００４７】
また、好ましくはイン・サイチュで本発明のヒドロゲルを形成するための説明書を提供する包装材料も記載される。
【００４８】
本発明のヒドロゲルを形成することができる液体製剤は、少なくとも約１２ヶ月〜約２４ヵ月保存することができる。好適な保存条件下では、最初に使用する前に、製剤は、明るい光を避けて（好ましくは暗所で）、好ましくは冷蔵温度（２〜８℃又は約２〜約８℃）で保持される。
【００４９】
本発明は、特に単回使用のための、医薬的又は獣医学的使用に適した、ＦＧＦ−１８を含む液体製剤又はヒドロゲルを提供する。本発明のＦＧＦ−１８を含む液体製剤又はヒドロゲル（液体製剤はゲル化温度に曝露されると、ヒドロゲルを形成することができるため）は、軟骨修復を改善するための、又は骨関節炎又は軟骨損傷などなどの軟骨疾患の治療のための、投与に使用することができる。
【００５０】
これらの液体製剤又はヒドロゲルは、注入及び代替送達システムにおける使用に適している。特に好適な実施態様において、本発明の製剤は関節内注入のためである。これらは欠陥部への直接注入によって投与することができ、ここで、ゲルは好ましくはイン・サイチュで形成される。本発明の好適な実施態様において、関節内投与は、股関節、膝、肘、手首、足首、脊椎、脚、指、つま先、手、肩、肋骨、肩甲骨、大腿、すね、かかとの関節から選択される関節に、及び背骨の骨張った点に沿って行われる。さらに別の好適な実施態様において、関節内投与は、股関節又は膝関節で行われる。
【００５１】
以下の実施例は、本発明の液体製剤及びヒドロゲルの調製をさらに例示するために提供される。本発明の範囲は、単に以下の実施例からなるものと解釈してはならない。
【実施例】
【００５２】
材料
本実施例の組換え切断型ＦＧＦ−１８（ｔｒＦＧＦ−１８又はスプリフェルミン）は、国際公開第２００６／０６３３６２号に記載された技術に従って、大腸菌（E. coli）での発現により自家調製された。以下の実施例では、スプリフェルミンとＦＧＦ−１８は交換可能に使用される。
【００５３】
本実施例で使用されるその他の主要な物質は、以下のとおりである：
−  タマリンド（Tamarind）種子からキシログルカンは、Megazyme International (Ireland) から得た。それは、Rilton et al., 2011 により報告されたプロトコールに従って脱ガラクトシル化された。
−  ＢＳＡ、ＨＳＡ、及びポロキサマーＦ６８は、Sigma Aldrich から得た。
−  ペニシリンストレプトマイシン（Pen-Strep）及びダルベッコーＰＢＳ  １０×は Gibco から得た。
−  キトサン７５％  ＤＤ  ＨＭＷ、Sigma Aldrich 419419、
−  キトサン９５％  ＤＤ  ＬＭＷ、Faravelli 43000、
−  キトサン９５％  ＤＤ  ＨＭＷ、Heppe medical 24711。
【００５４】
異なる製剤の最初の迅速なスクリーニングを行うために、キシログルカンの脱ガラクトシル化変種（Ｄｅｇ−ＸＧ）の溶液について定性的性状解析を行なった。具体的にはそれらの性状解析は、室温でのシリンジ可能性試験(syringability tests)と、３７℃での傾き挙動試験(tilting behavior test)であった。選択されたシステムについて、これも適宜ＦＧＦ−１８の存在下で、さらなる性状解析と実験を行なった。
【００５５】
ゲル化プロセスの前と後の製剤を明確に区別するために、本項では、それぞれ前者を「液体溶液」そして後者を「ゲル」と呼ぶ。
【００５６】
方法
ＦＧＦ−１８溶液の調製
５．４１ｍｇ／ｍｌのＦＧＦ−１８を、個々の３ｍｌのバイアル中で−８０℃にて保存し、室温で溶解後、それを直接ポリマー溶液（ポリマー溶液とＦＧＦ−１８との比は９：１）に添加して目標の最終濃度５４０ｍｃｇ／ｍｌを達成するか、又は「タンパク質バルク」で希釈して５４ｍｃｇ／ｍｌの目標最終濃度を達成した後、ポリマー溶液に加える。「タンパク質バルク」は、Ｎａ2ＨＰＯ4（７ｍＭ）、ＫＨ2ＰＯ4（１ｍＭ）、及びＫＣｌ（２．７ｍＭ）から調製したｐＨ７．３のＰＢＳ溶液である。この緩衝液のイオン強度は約２５ｍＭである。
【００５７】
ポリマーの溶媒と放出媒体（修正されたモック滑液）の調製：
タイプＩ（またＤ−ＰＢＳとも呼ぶ）：ダルベッコーＰＢＳ  １０×、ミリポア水で１０倍希釈、０．１重量％  Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ；ｐＨ５．５。Ｄ−ＰＢＳ  １Ｘイオン強度は約１６６ｍＭであり、その組成は以下の通りである：ＣａＣｌ2（０．９ｍＭ）、ＭｇＣｌ2（０．４９ｍＭ）、ＫＣｌ（２．６６ｍＭ）、ＫＨ2ＰＯ4（１．４７ｍＭ）、ＮａＣｌ（１３７．９ｍＭ）、のＮａ2ＨＰＯ4（８．０６ｍＭ）。
タイプＩＩ：０．１重量％  ＢＳＡを含むタイプＩ。
タイプＩＩＩ：０．２５ｇ／Ｌポロキサマー、１重量％Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ、及び１重量％  ＨＳＡを含む「タンパク質バルク」として；ｐＨ７．３。
【００５８】
ＦＧＦ−１８充填プロトコール
タイプＩ溶媒（Ｄ−ＰＢＳ）又はＰＢＳ  ｐＨ７．３（「タンパク質バルク」として調製された）中で調製されたＤｅｇ−ＸＧ溶液について、システムにＦＧＦ−１８溶液を重量比９：１で充填した時と同じポリマー最終濃度を得るために、ポリマー濃度を１０％で増分させた。
【００５９】
シリンジを用いて、試料中で針をシャッフルして、タンパク質溶液を充填し、均一な分布を確実した。充填ゲルは、常に５℃で一晩保存し、使用前は撹拌しなかった。
【００６０】
ポリマー溶液：調製と保存
Ｄｅｇ−ＸＧ溶液は、ミリポア水とタイプＩ溶媒（ｐＨ５．５）の両方で調製した。４．４重量％のＤｅｇ−ＸＧ溶液も、ｐＨ７．３の「タンパク質バルク」中で調製した。
【００６１】
溶解手順は次の通りである：
・固体ポリマーを冷水又は所望濃度の冷ＰＢＳに添加、
・５℃及び１３５００ｒｐｍで５時間ホモジナイズ、
・１２０℃で２０分間オートクレーブ、
・５℃で保存。
【００６２】
予備調製作業中に、ｉ.ａ.注射液について許容されるオスモル濃度（目標：３５０ｍＯｓｍ／ｋｇ）を有する水溶液を得るために、キトサンに他の賦形剤を混合した。次に液体溶液を、それらのゲル化時間と温度について試験した。
【００６３】
シリンジ可能性 (syringability)、剪断粘度 (shear viscosity)、及び傾き挙動試験 (tlting behavior tests)
シリンジ可能性：シリンジ可能性は、Ｇ２５針を有するシリンジにより１ｍｌを注入することにより室温で試験した。注入時間とシリンジ中の残量を評価した。
剪断粘度：剪断粘度測定は、２５℃でレオメーター Ar 1000（TA Instruments）を用いて行った。
傾き挙動試験：２〜３ｍｌの溶液を透明な円筒管中で３７℃にてインキュベートし、異なる時間後に観察した。管を傾けて、物質が液体様（「流れる（flow）」）であるか又はゲル状（「流れない(no flow)」）であるかを評価した。
【００６４】
動的機械的応力レオメトリー (dynamic mechanical stress rheometry)
Ｄｅｇ−ＸＧゲルの動的機械的特性 (dynamic-mechanical properties)は、（応力制御された (stress controlled)）小振幅の剪断実験により評価した。試験は、アクリル板形状（直径４ｃｍ）と５００μｍのギャップを有する応力制御されたレオメーター Ar 1000（TA Instruments）を使用して行なった。
【００６５】
・歪み掃引試験 (strain sweep test)は１Ｈｚの周波数で実施し、周波数掃引試験 (frequency sweeping test)は４．１０-3 歪みで行なった。歪み掃引試験と周波数掃引試験の両方とも、３７℃で５分間と３０分間インキュベーション後に行なった。
・３７℃でのゲル化速度は、４．１０-3 の繰り返し周波数掃引試験により検討した。
・２５℃でのゲル化速度は、１Ｈｚの固定周波数と４．１０-3 の歪みの時間掃引試験 (time sweep test)で検討した。
【００６６】
ＳＥＭ顕微鏡
表面形態は、１０ｋＶの加速電圧で電界放射型走査電子顕微鏡（ＦＥＳＥＭ）システム（JEOL）により画像化した。ＦＥＳＥＭ用試料は、走査前に３０ｍＡで５０秒間、JFC-1300金コーター（JEOL）を用いて金層で被覆した。凍結乾燥された試料は、黒鉛接着剤層によりＳＥＭアルミニウムスタブ上に取り付けた。
【００６７】
膨潤−浸食試験 (swelling-erosion studies)
水の中で調製されたＤｅｇ−ＸＧゲルを用いる予備試験のために、ゲル試料（各システムで４〜６個）を、多孔質底部（空隙率Ｇ０／Ｇ１の焼結ガラス）を有する予め秤量した円筒形ガラスバイアルに入れ、大過剰量の放出媒体タイプＩに浸漬し、３７℃に設定した恒温槽に入れた。ＦＧＦ−１８を含むＤｅｇ−ＸＧゲルの場合は、ゲル試料は、底部に多孔質膜（０．４μｍ）を有するマルチウェルプレートの予め秤量したインサートの上に置き、放出媒体タイプＩＩに浸漬し、３７℃に設定した恒温槽に入れた。１００ｒｐｍで回転振盪を行なった。放出媒体は２〜３日毎に交換した。ゲル試料は、インキュベーション前と３７℃で異なる時間インキュベートしたに秤量した。Ｗｓ（ｔ）は、時刻ｔにおける膨潤試料の重量であり、Ｗｓ（０）は時間＝０における試料の重量である。
【００６８】
浸食−放出試験 (erosion-release studies)
ｐＨ７．３のＰＢＳ（「タンパク質のバルク」として）で調製され、ＦＧＦ−１８を含む４重量％のＤｅｇ−ＸＧ上で行われた放出試験について、ゲル試料は、底部に多孔質膜（０．４μｍ）を有するマルチウェルプレートの予め秤量したインサートの上に置き、放出媒体のタイプＩＩＩに浸漬し、３７℃に設定した回転振盪機に入れた。この試験（各々について４試料）に供されたシステムは、
・Ｄｅｇ−ＸＧ  ４重量％、
・５４０μｇ／ｍｌのＦＧＦ−１８を含むＤｅｇ−ＸＧ  ４重量％、
・５４μｇ／ｍｌのＦＧＦ−１８を含むＤｅｇ−ＸＧ  ４重量％。
【００６９】
放出媒体は、２４時間後、４８時間後、次に３〜４日毎に変更した。２４時間後、４８時間後、及び７日後に収集された受容相を、ビアコア（Biacore）とＲＰ−ＨＰＬＣ分析に供した。
【００７０】
インビトロ放出試験
膨潤試験に使用したものと同じ試料を、インビトロ放出試験についても分析した。具体的には、受容相をＨＰＬＣにより分析した。選択された試料はまた、ビアコアでも分析した（データは示していない）。
【００７１】
実施例１
Ｄｅｇ−ＸＧ系の温度応答性ゲル化システム
Ｄｅｇ−ＸＧ溶液を水で、１、２、３、４、５重量％で調製した。Ｄｅｇ−ＸＧはＤ−ＰＢＳ中で、３．３重量％及び４．４重量％で調製し、それらにはまた５４μｇ／ｍｌのＦＧＦ−１８を充填した。すべてのシステムは、５℃で一晩保存した後（時間＝０）及びさらに３７℃で１、２、及び３時間インキュベーション後、シリンジ可能性試験 (syringability test)に供した。
【００７２】
シリンジ可能性 (syringability)（表１と２）。ある容量（１ｍｌ）のポリマー溶液を注入するための時間は、ポリマー濃度とともに上昇する。シリンジ中の残量は、最大４重量％の濃度まで５〜８％で、一方、５重量％については約１５％まで大幅に上昇する。ＦＧＦ−１８の存在は、性状解析された両方のシステム（３及び４重量％）の挙動に大きな影響は与えない。２５℃で保存後のシリンジ中の残量は、３重量％システムでは４時間後にのみ上昇し、一方４重量％システムについてはシリンジ中の残量は、２５℃でインキュベーション時間とともにより顕著に増加し、注入時間は２時間後にほとんど２倍になる。これらの結果は、両方のシステムで及び異なる速度（より高ポリマー濃度ではより速い）で、２５℃でゲル化が起きることを示唆する。
【００７３】
傾き挙動 (tilting behaviour)（表１）。４及び５重量％  Ｄｅｇ−ＸＧは、３７℃で５分間のインキュベーション前でさえゲルになり、より低い濃度の溶液は、３０分間のインキュベーション前にはゲル化しなかった。１重量％については、肉眼で見えるゲル化は観察されなかった。
【００７４】
剪断粘度測定（２５℃での流動性挙動）。水中で調製されオートクレーブされたＤｅｇ−ＸＧゲルについての結果は、図１（ａ〜ｂ）に報告されている。剪断粘度はポリマー濃度とともに上昇し、非ニュートン挙動がより顕著になる。
【００７５】
（オートクレーブされた）Ｄｅｇ−ＸＧ／Ｄ−ＰＢＳシステムについて、剪断粘度と剪断速度が検査された（図２）。同様に、剪断粘度はポリマー濃度とともに上昇し、非ニュートン挙動がより顕著になる。２５℃で異なる時間（１、２、４時間）インキュベーション後、ＦＧＦ−１８の存在下で、３及び４重量％について測定を繰り返した（図３）。予想通り、低剪断速度範囲で剪断粘度は２５℃でのインキュベーション時間とともに上昇し、曲線の傾きも上昇した。これらの結果は、すでに２５℃でゲル化に向かう材料の漸進的な修飾の仮説を支持する。
【００７６】
４．４重量％で、かつ５４μｇ／ｍｌのＦＧＦ−１８（４重量％）を有するＤｅｇ−ＸＧ／Ｄ−ＰＢＳに対して、１Ｈｚの固定周波数で時間掃引試験により実施した動的試験 (kinetic study)により、この挙動はさらに確認される（図４）。
【００７７】
オートクレーブ処理の影響。オートクレーブの前及び後に、４及び５重量％で水中にて調製されたＤｅｇ−ＸＧゲルを、剪断粘度測定に供した。オートクレーブは５重量％溶液の粘度に大きな影響を与えないが、４重量％について低剪断速度で剪断粘度を低下させる（図５）。１２０℃での熱処理が、水中のポリマー解離に有利であったと仮定することができる。
【００７８】
Ｄ−ＰＢＳ中で調製されたＤｅｇ−ＸＧについて、これらのシステムにＦＧＦ−１８の溶液を充填（ポリマー／ＦＧＦ−１８溶液の重量比＝９：１）した時、同じ最終ポリマー濃度を有するために、ポリマー濃度は１０％で増分された。オートクレーブされた溶液は、オートクレーブをしていないものに比較してわずかな黄変を示した。また、これらのシステムについて、オートクレーブ処理の影響は、低濃度でより顕著である（図６ａ）。Ｄ−ＰＢＳの存在下でのオートクレーブ処理は、水で調製された同様のシステムと比較して、剪断粘度の低下を誘導する（図６ｂを参照）。実際にはこの図から、さらに１０％濃縮されているが緩衝液の存在下でオートクレーブ処理されたシステムについての曲線は、あまり濃縮されていないポリマーであるが水溶液としてオートクレーブ処理されたものに重なることが明らかである。
【００７９】
実施例２
Ｄｅｇ−ＸＧ系の温度応答性ゲル化システムの動的機械的挙動 (dynamic mechanical behaviour)
３７℃で異なる時間インキュベートしたゲルの動的機械的挙動を、歪み掃引試験 (strain sweep test）及び周波数掃引試験 (frequency sweep test）により調べた。
【００８０】
３７℃で５分間及び３０分間インキュベーション後の、水系のゲルシステムの１Ｈｚの周波数での歪み掃引からのＧ’曲線が、図７に示される。Ｇ' は濃度の上昇とともに顕著に上昇するが、材料が弾性になるほど、完全性を喪失（Ｇ’の急激な低下により検出される状態）する前に耐えることができる歪みが小さくなる。３７℃で３０分間コンディショニング後の歪み掃引試験は、貯蔵弾性率の一般的なさらなる上昇を示し、４重量％Ｄｅｇ−ＸＧ／水システムと５重量％Ｄｅｇ−ＸＧ／水システムとの差を証明する。５４０μｇ／ｍｌと５４μｇ／ｍｌのＧＦを有するＤ−ＰＢＳゲル、及び「プラセボ」システム（ＧＦの無いＤ−ＰＢＳゲル）について、類似の試験を実施した（図８ａ〜ｃ）。
【００８１】
希釈とＦＧＦ−１８添加の複合作用は、Ｇ’を減少させる方向である。１０倍濃縮されたＧＦは、Ｇ’の更なるわずかな低下を誘発するのみであり、従ってＧ’の観察された低下は、主に希釈に起因するようである。
【００８２】
周波数掃引試験は、すべてのシステムについて３７℃で行なった。３７℃で５分間又は３０分間インキュベーション後の、Ｄｅｇ−ＸＧ／水システムのＧ’、Ｇ”プロットが、図９に示される。１重量％を除くすべてのシステムでは、Ｇ’＞Ｇ”であり、Ｇ’は周波数が変わってもほぼ不変である。Ｇ”は、より高濃度の場合のみ、周波数が変わっても不変になる。Ｇ’及びＧ”曲線の両方とも、ポリマー濃度とともに上昇する。
【００８３】
５４０μｇ／ｍｌと５４μｇ／ｍｌのＦＧＦ−１８を含むＤ−ＰＢＳゲル及び「プラセボ」システム（ＦＧＦ−１８の無いＤ−ＰＢＳゲル）についても、周波数掃引試験を行なった（図１０ａ〜ｃ）。
【００８４】
これらの結果は、システムを希釈してＧＦが充填された時、すでに観察されたＧ’の低下を確認し、ＦＧＦ−１８濃度上昇の明らかな作用は認められない。
【００８５】
実施例３
ゲル化速度試験 (gelation kinetics study)
Ｄｅｇ−ＸＧ／水システムについて３７℃で所定の時間間隔で繰り返し周波数掃引により、ゲル化速度の試験を行なった。１Ｈｚでの貯蔵弾性率と損失弾性率の値は、時間の関数としてプロットされる（図１１）。
【００８６】
１重量％のＤｅｇ−ＸＧシステムは、最初に上昇しその後減少するＧ’及びＧ”の経時的な安定した上昇を示しているが、すべての他のシステムは、検討した時間枠で複素弾性率の両成分のほぼ一定した値を示す。これらの結果はまた、傾斜試験による流動挙動の定性的予備試験とよく一致している。
【００８７】
Ｄ−ＰＢＳと水システムとの間の観察された類似性の観点から、２種類のゲルが同じ定性的挙動を有すると推定することができる。
【００８８】
実施例４
凍結融解 (freezing-thawing)及び凍結乾燥の影響
Ｄ−ＰＢＳ中で調製した４．４重量％のシステムで、Ｄｅｇ−ＸＧゲルの可能な貯蔵条件に関するいくつかの情報を集めるために、動的機械スペクトル (dynamic mechanical spectrum)に対する１回の凍結融解サイクルの影響を調べた。同じ目的のために、凍結乾燥及び再構成の影響を評価した。この最後の場合に、ゾル状態（５℃の保存温度で）及びゲル状態（３７℃でコンディショニング後）の両方からの材料を凍結乾燥した（図１２及び１３）。
【００８９】
Ｇ’とＧ”の両方とも凍結融解後に上昇するが、５℃で一晩攪拌せずにＤ−ＰＢＳ中で凍結乾燥及び再構成した影響は、材料の初期状態かかわらずＧ’及びＧ”の両方が低下する方向である。これらの両方の結果は、Ｄｅｇ−ＸＧ溶解を好むプロセスはより強いゲルをもたらし、一方、Ｄｅｇ−ＸＧ凝集を好むのプロセスは、ゲル強度を低下させることを証明する。水性媒体中のＤｅｇ−ＸＧ溶解は、３７℃で形成されるネットワークの品質のために重要なパラメータである。
【００９０】
実施例５
凍結乾燥したゲルの走査電子顕微鏡試験
Ｄｅｇ−ＸＧゲルを液体窒素（バイアル内）に浸漬し凍結乾燥することにより迅速に凍結した、水中で調製したＤｅｇ−ＸＧゲルを、走査電子顕微鏡試験により分析した（データは示していない）。すべてのシステムは、数十ミクロンの大きな孔とわずか数ミクロンの小さな孔のある不規則な空隙率を示す。ポリマーの濃度を上昇させると、一般的な作用は、より大きな空洞の寸法を低減させる。しかし、本来の不均一性にもかかわらず、試料の形態は非常に均一であった。
【００９１】
実施例６
膨潤−浸食試験
４重量％と５重量％のＤｅｇ−ＸＧ／水ゲルの膨潤−浸食挙動の予備試験を、６０日間にわたって行った。３７℃でのインキュベーション前及びインキュベーション中にゲル試料を秤量した。Ｗｓ（ｔ）は時間ｔにおける膨潤試料の重量であり、Ｗｓ（０）は、時間ｔ＝０における試料の重量である（表３）。６０日後、カビの増殖が原因で試験を中止した。両方のシステムについて、Ｗｓ（ｔ）／Ｗｓ（０）［％］は、経時的にゆっくり低下する。浸食されたゲルは、液体窒素中で速やかに凍結し凍結乾燥した後、ＳＥＭ顕微鏡試験に供した（データは示していない）。浸食後、ゲル構造は崩壊せず、空隙率はより均一になる。また、空隙率は、５重量％のシステムの場合よりも４重量％のシステムについて、より開いていて相互接続されているように見えた。
【００９２】
５４０μｇ／ｍｌ及び５４μｇ／ｍｌのＦＧＦ−１８を含む４重量％及び及び５重量％のＤｅｇ−ＸＧ／Ｄ−ＰＢＳゲルについて、膨潤−浸食実験を繰り返した（表４）。各システムについて、Ｗｓ（ｔ）／Ｗｓ（０）［％］は経時的にゆっくり低下し、そして水中で作成されたシステムについては、比較的さらに速く低下した。これは、おそらくＰＢＳ塩の直接の作用、又はより可能性の高いのは、オートクレーブ処理の際にポリマーの分子構造に影響を及ぼすＰＢＳの間接的な影響かもしれない。放出媒体中に２２日間滞留後、浸食ゲルに周波数掃引試験を行い、それらの機械的特性を評価した（図１４ａ〜ｄ）。
【００９３】
放出媒体中に２２日間浸漬後、残留ゲルは一般に、より高い貯蔵弾性率Ｇ’と損失弾性率Ｇ”とを示し、従って、より強い構造（これは、材料の少ない架橋部分の腐食に一致する）に向けたネットワークの再配置を示唆している。５４μｇ／ｍｌのＦＧＦ−１８を含むＤｅｇ−ＸＧ  ５重量％は逆の傾向を示した。
【００９４】
実施例７
ゲル浸食／タンパク質放出の試験
ＰＢＳ  ｐＨ７．３中で調製した４重量％  Ｄｅｇ−ＸＧについて試験を行った。２４時間、４８時間、及び７日後に集めた受容相を、ビアコア及びＲＰ−ＨＰＬＣ分析に供した（データは示していない）。ＲＰ−ＨＰＬＣ分析は、ＦＧＦ−１８のバースト放出に起因する明確なクロマトグラフピークを示さなかった。同じ受容相にビアコア分析も行った。同様に、ＦＧＦ−１８は検出されなかった。これは、観察期間中、このタンパク質がゲルマトリックス中に捕捉されたことを示唆している。
【００９５】
実施例８
細胞増殖アッセイ
８．１．  細胞増殖のためのアラマーブルー（Alamar Blue）アッセイ
ＦＧＦ−１８を含まないか、又は３つの異なる濃度（５４ｍｃｇ／ｍｌ、６，７ｍｃｇ／ｍｌ、６，７ｎｇ／ｍｌ）のＦＧＦ−１８を含む、Ｄｅｇ−ＸＧヒドロゲル（３．３重量％で）上で培養した軟骨細胞を用いて、細胞増殖に関するアラマーブルーアッセイ（５０００個の軟骨細胞／ウェル）を行った。対照システム（ＦＧＦ−１８を含まないＤｅｇ−ＸＧゲル）を含むすべてのシステムは、経時的に顕著な細胞増殖を示した（図１５を参照）。増殖因子の存在は、最初の８日間、増殖速度に影響を与えなかったが、延長されたインキュベーション時間のためにわずかに上昇した。増殖因子の試験した濃度範囲内で、ＦＧＦ−１８濃度の影響は観察されなかった。
【００９６】
８．２．  アポトーシスの評価のためのアクリジンオレンジ染色
ＦＧＦ−１８を含むか又は含まないＤｅｇ−ＸＧヒドロゲルで１２日間培養した細胞について、アクリジンオレンジで染色した後、共焦点顕微鏡分析を行った。アクリジンオレンジは、細胞浸透性の核酸結合色素であり、これは２本鎖ＤＮＡに結合すると緑色の蛍光を発し、１本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡに結合すると赤色蛍光を発する。この染色は、生きている（緑の核）細胞とアポトーシス（赤の核）細胞とを区別する。図１６に示されるように、緑色の丸形の核は、細胞がＦＧＦ−１８の存在下と非存在下の両方でＤＮＡ損傷を受けなかったことを示す。
【００９７】
８．３．  インキュベーション時間及びＦＧＦ−１８充填量の関数としての光学顕微鏡試験
ＦＧＦ−１８を含むか又は含まないＤｅｇ−ＸＧゲル上の軟骨細胞の増殖を、光学顕微鏡下で７日間にわたって追跡した。成長因子の含有量は、６．７ｎｇ／ｍｌ〜５４μｇ／ｍｌの範囲であった。すべてのシステムで、軟骨細胞はまずクラスターを形成することが観察された。低濃度（６．７ｎｇ／ｍｌ及び６．７ｍｃｇ／ｍｌ）のＦＧＦ−１８をゲルに充填すると、４８時間インキュベーション後、軟骨細胞はクラスターから移動して離れ、足場の他の部分にコロニー形成した（データは示していない）。
【００９８】
８．４．  共焦点顕微鏡による細胞浸潤試験
全体厚さが約２ｍｍのヒドロゲル試料の２１０μｍ厚の層から採取した異なる切片の共焦点顕微鏡分析を、４日間インキュベーション後のＤｅｇ−ＸＧ＋ＦＧＦ  ６．７ｍｃｇのシステムについて行った。細胞を臭化エチジウムで染色した（赤）。結果は、材料の厚さにわたる軟骨細胞の存在を示す。ヒドロゲル表面に細胞接種を行ったため、厚さにわたる異なる位置における細胞の存在は、増殖細胞がゲルの内層にアクセスすることができることを示唆している（データは示していない）。
【００９９】
実施例９
キトサンゲルの調製
９．１．  総論
キトサン製剤のスクリーニングのために、ポリマー液体溶液の調製は、３種類の異なるキトサンを利用した：高分子量（ＨＭＷ）を有する９５％の脱アセチル化度（ＤＤ）、低ＭＷ（ＬＭＷ）を有する９５％ＤＤ、及び高ＭＷ（ＨＭＷ）を有する７５％ＤＤ。ポリマーの液体溶液は、５℃で又は２５℃で激しく撹拌しながら、酢酸０．１  Ｎ溶液に徐々にキトサンを添加することにより調製した。ポリマーの量は、ポリマー液体溶液中で１重量％、１．５重量％、又は２％重量の最終ポリマー濃度を有するように計算された。いったんキトサンが完全に可溶化された後、ミリＱ水中の１０ｍＭ、１００ｍＭ、又は５００ｍＭの濃度のＫＨ2ＰＯ4の溶液を撹拌しながら添加して、ポリマー液体溶液中の１ｍＭ、１０ｍＭ、又は５０ｍＭのいずれかの最終濃度を得た。最後に、ミリＱ水中２０重量％濃度のβ−グリセロリン酸（β−ＧＰ）の溶液を加えて、最終的な液体溶液のｐＨを６．０、６．５、又は７．０のいずれかに調整した。これは、多すぎる量のβ−ＧＰを必要として、３５０ｍＯｓｍ／ｋｇの目標オスモル濃度値を超えるか、又は既に室温でゲルを得られてしまうため、絶えず所望のｐＨ値に到達することは必ずしも可能ではなかった。ポリマーの液体溶液は適宜、ゲル形成まで３７℃でインキュベートした。すべてのスクリーニングした製剤のオスモル濃度を測定し、３５０ｍＯｓｍ／ｋｇより高いオスモル濃度を有する製剤、すなわち最終β−ＧＰ濃度が２．５重量％超の製剤を捨てた。
【０１００】
９．２．  プラセボ製剤の予備的スクリーニング（表５参照）：
キトサンは、温度変化に伴うゾル−ゲル遷移を受け得ることが報告されているが、このプロセスは、ポリマーの分子量（ＭＷ）、その脱アセチル化度（ＤＤ）、溶液中のポリマー濃度、温度、時間、ポリマーの可溶化中の混合速度、溶液の最終ｐＨ、及び他の賦形剤の存在により大きく影響される。
【０１０１】
従って、異なる可能な組み合わせの網羅的スクリーニングが必要とされた。キトサンは、酸性ｐＨの水にのみ可溶化することができることは、注目に値する。ｐＨの上昇は、その凝集及び沈殿を引き起こす。この問題を克服するための方法は、β−ＧＰを使用して、溶液中にキトサンを維持しながらｐＨを上昇させることである。
【０１０２】
本試験は最初に、７５％ＤＤを有するＨＭＷキトサンに注目いた。いくつかのポリマーの液体溶液は、キトサン濃度が１重量％〜２．５重量％で異なり、最終β−ＧＰが１．６重量％〜５０重量％（１．６、５、５．６、８、３０、５０％）で異なり、異なる賦形剤、すなわちゼラチン、グルコサミン、ヒアルロン酸、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、トレハロース、６．０から７．０の異なる最終ｐＨ値、を有する塩酸０．１Ｎ中で調製された。これらの賦形剤は、ゲル形成の誘導において役割を果たすことが報告された（Cheng et al., 2010; Schuetz et al., 2008; Yan et al, 2010）。
【０１０３】
スクリーニングされた製剤の１つのみが３７℃で５分間のインキュベーション後にゲルを形成することができたが、β−ＧＰの量は、それを超えると細胞障害性が記録されている限界値として文献（Ahmadi et al., 2008）に報告されている８重量％より高かった。従って、すべての以下の製剤は、その限界値を考慮して調製された。スクリーニングは、より高いＤＤ値を持つキトサンを得るまで続けた。最初の試験は、９５％ＤＤを有するＬＭＷキトサンに基づいていた。ポリマー溶液は、いつも塩酸０．１Ｎ中で調製し、５℃又は２５℃のいずれかで激しく撹拌してポリマーを溶解した。
【０１０４】
ポリマーの完全な可溶化後、他の賦形剤が添加され、β−ＧＰは最後にのみ添加された。β−ＧＰはｐＨ値の上昇の原因であり、ゲル化プロセスを促進した。最初の試験は、相対濃度の異なる組み合わせのキトサンとβ−ＧＰとのみに基づく製剤に注目した。高濃度（２重量％又は３重量％）のキトサンと、高濃度のβ−ＧＰ（８重量％）を使用すると、すでに室温で、ある場合には５℃でもゲル形成が起きることが観察された。
【０１０５】
いずれかの成分の濃度を減少させると、製剤は液体のままであり、３７℃で長時間のインキュベーション後も液体のままであった。１つの場合でのみ、ゲルが形成されたが、それは３７℃で２時間インキュベーション後であり、この研究の目的のためにはあまりにも長い時間であった。従って賦形剤の添加は、製剤を改良するために必須であった。最も適切な賦形剤としてヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）が選択され、さらなるスクリーニングを行った。この評価中のキトサンの濃度は１．５重量％〜２重量％の範囲であり、開始ＨＥＣ濃度は０．５重量％であったが、これらの条件下では、β−ＧＰの添加中にその濃度が１．８重量％を超えていた場合は、室温でさえポリマー溶液はゲルになった。以下の組成（１．５重量％のキトサン、０．５重量％のＨＥＣ、及び１．７重量％のβ−ＧＰ）を用いて、３７℃で１３分間のインキュベーション後にゲルになることができる液体溶液が得られた。
【０１０６】
９．３．  製剤の最適化（表５を参照）
この製剤を改善するために、β−ＧＰの濃度を１．６５〜１．７重量％の値でほぼ一定に維持し、キトサン濃度を１．５重量％〜１．８重量％に変化させ、及びＨＥＣの量を徐々に０．１重量％まで低下させて、以下の試験を行った。
【０１０７】
いくつかの製剤候補が、この戦略を用いて選択された。しかし、細胞傷害性であり、他方では、キトサンの存在下でゲル化プロセスの調節の原因であると報告された汚染物質をＨＥＣ賦形剤が含み得ることが判明したため、試験はこの方向を継続しなかった（Hoemann et al., 2007）。ゼラチンやグルコサミンなどの以前の実験で試験した他の賦形剤は、有望な結果を与えなかった。
【０１０８】
次に、分子量とＤＤとが異なる３種類のキトサンポリマー（７５％ＤＤを有するＨＭＷキトサン、９５％ＤＤを有するＨＭＷキトサン、及び９５％ＤＤを有するＬＭＷキトサン）を使用して、最終スクリーニング作業を開始した。この作業は８５％ＤＤを有するＬＭＷキトサンでも計画されたが、この試験の終了前に、この材料が入手できなかった。この作業では、各キトサンを３つの固定濃度（１、１．５、及び２重量％）で試験し、最終ｐＨ値を６．０、６．５、及び７．０にするために、ポリマー溶液を調製した。溶液のｐＨ値を上昇させるのに使用されるβ−ＧＰの量を減少させるために、ポリマーは、前の実験で使用した０．１Ｎ塩酸の代わりに０．１Ｎ酢酸に溶解した。最終溶液のオスモル濃度も追跡し、約３５０ｍＯｓｍ／ｋｇの値より低く維持した。従って、、所望のｐＨに達するために多すぎる量のβ−ＧＰを必要とし、高すぎるオスモル濃度の値ももたらす製剤は破棄された。これらのスクリーニング試験において、塩の存在が、ゲル化プロセスに対して陽性の寄与をする可能性があったため（Filion et al., 2007）、イオン強度の寄与もまた試験された。
【０１０９】
ナトリウム塩は、タンパク質との相互作用の可能性があるために避けなければならなかったために、ＫＨ2ＰＯ4が選択され、最終濃度１ｍＭ、１０ｍＭ、又は５０ｍＭでポリマー溶液に添加された。７５％ＤＤを有するキトサンは有望な結果を与えず、それは完全に放棄された。９５％ＤＤを有するＨＭＷキトサンはいずれも有望な結果を与えなかった：１重量％より高いキトサン濃度は、固定ｐＨ値に達するために多すぎる量のβ−ＧＰを必要とし、目標オスモル濃度のを超え、１重量％の製剤は３７℃でゲルを形成することができなかった。２つの製剤候補は３７℃でゾル−ゲル転移を受けたため、９５％ＤＤを有するＬＭＷキトサンを用いてこれらの製剤を選択したが、これらのポリマー溶液の調製は完全には再現性がなかった。実際、ポリマー液体溶液のゲルを得るために及び物理的巨視的特性を得るために必要な時間は、ポリマーを溶解させるのに費やされる時間に応じて、ポリマー溶解中及び賦形剤の混合中の混合速度に応じて、及び最後に、調製される溶液の温度と容量に応じて、顕著に変化することが観察された。
【０１１０】
この試験の大きな変動性は、このポリマーについての試験を中止するという決断につながった。
【０１１１】
【表１】
0006791754.tif 000002
【０１１２】
【表２】
0006791754.tif 000003
【０１１３】
【表３】
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【０１１４】
【表４】
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【０１１５】
【表５】
0006791754.tif 000006
【０１１６】
参考文献
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20.  Hoemann et al., 2007, J. Biomed. Mater Res. 83A:521-529
21.  Filion et al. 2007, Biomacromol. 8:3224-3234
【配列表フリーテキスト】
【０１１７】
配列の説明：
配列番号１：未変性のヒトＦＧＦ−１８のアミノ酸配列。
配列番号２：組換え切断型ＦＧＦ−１８（ｔｒＦＧＦ−１８又はスプリフェルミン）のアミノ酸配列。
【図１】
0006791754.tif 000007
【図２】
0006791754.tif 000008
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
0006791754.tif 000014
【図９】
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【図１０】
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【図１１】
0006791754.tif 000017
【図１２】
0006791754.tif 000018
【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
0006791754.tif 000021
【図１６】
0006791754.tif 000022
【図１７ａ】
0006791754.tif 000023
【図１７ｂ】
0006791754.tif 000024
【配列表】
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