(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離された哺乳動物の原始的網膜幹細胞(primitive  retinal  stem  cells、pRSCs)を生産するためのin  vitro方法であって、
(a)フィーダー細胞、フィーダー馴化培地又は血清を含まない細胞培養培地中で哺乳動物由来の単離された胚性幹細胞(embryonic  stem  cells、ESCs)、多能性幹細胞(pluripotent  stem  cells、PSCs)、又は人工多能性幹細胞(induced  pluripotent  stem  cells、iPSCs)を培養し、単離ESCs、PSCs又はiPSCsの接着単層培養物を生産し、増殖させるステップ、
及び
(b)そのように増殖させた単離ESCs、PSCs又はiPSCsの接着単層培養物を、Wnt生産-2の特異的阻害剤、TGF-βシグナル伝達の阻害剤、及びBMPシグナル伝達の阻害剤を含む小分子阻害剤の組み合わせと接触させ、(a)の単離ESCs、PSCs又はiPSCsを原始的網膜幹細胞に分化させ、それによって単離哺乳動物pRSCsを生産するステップ
を含む、方法。
【請求項２】
ステップ(a)において、そのように生産された培養物が、ステップ(b)の前にコンフルエンシー近くまで増殖される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
哺乳動物が、ヒト、サル、クマ、ラット、マウス、ミンク、ウサギ、モルモット、ブタ、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、ウマ又はウシである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
単離された哺乳動物の原始的網膜幹細胞(pRSCs)が、典型的な初期眼領域転写因子であるPAX6、LHX2、RAX、OTX2、SIX3及び/又はSIX6の発現について陽性である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
幹細胞性因子SOX2、及びSTAT3の発現について陽性である、単離された哺乳動物の原始的網膜幹細胞(pRSCs)をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
Ki67の発現について陽性である、単離された哺乳動物の原始的網膜幹細胞をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
Wnt生産-2の小分子特異的阻害剤が、C22H18N4O2S3の化学式及び以下の化学構造:
【化１】
0006651440.tif 000015
を有する、N-(6-メチル-1,3-ベンゾチアゾール-2-イル)-2-[(4-オキソ-3-フェニル-6,7-ジヒドロチエノ[3,2-d]ピリミジン-2-イル)スルファニル]アセトアミドである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
TGF-βシグナル伝達の阻害剤が、以下からなる群から選択される小分子阻害剤である、請求項１に記載の方法:
SB431542(4-[4-(1,3-ベンゾジオキソール-5-イル)-5-(2-ピリジニル)-1H-イミダゾール-2-イル]ベンズアミド)、A83-01(3-(6-メチル-2-ピリジニル)-N-フェニル-4-(4-キノリニル)-1H-ピラゾール-1-カルボチオアミド)、SJN2511(2-(3-(6-メチルピリジン-2-イル)-1H-ピラゾール-4-イル)-1,5-ナフチリジン)、D4476(4-[4-(2,3-ジヒドロ-1,4-ベンゾジオキシン-6-イル)-5-(2-ピリジニル)-1H-イミダゾール-2-イル]ベンズアミド)、LY364947(4-[3-(2-ピリジニル)-1H-ピラゾール-4-イル]-キノリン)、SB525334(6-[2-(1,1-ジメチルエチル)-5-(6-メチル-2-ピリジニル)-1H-イミダゾール-4-イル]キノキサリン)、及びSD208(2-(5-クロロ-2-フルオロフェニル)-4-[(4-ピリジル)アミノ]プテリジン)。
【請求項９】
TGF-βシグナル伝達の阻害剤が、トランスフォーミング増殖因子-ベータ(TGF-β)スーパーファミリーI型アクチビン受容体様キナーゼALK-4、-5、及び-7の小分子阻害剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
トランスフォーミング増殖因子-ベータ(TGF-β)スーパーファミリーI型アクチビン受容体様キナーゼALK-4、-5、及び-7の小分子阻害剤が、C22H16N4O3の化学式及び以下の化学構造:
【化２】
0006651440.tif 000016
を有する、4-[4-(1,3-ベンゾジオキソール-5-イル)-5-(2-ピリジニル)-1H-イミダゾール-2-イル]ベンズアミドである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
BMPシグナル伝達の阻害剤が、BMPI型受容体ALK-2及びALK-3の小分子阻害剤又はノギン(noggin)アナログである、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
BMP I型受容体ALK-2及びALK-3の小分子阻害剤又はノギンアナログが、C25H22N6の化学式及び以下の化学構造:
【化３】
0006651440.tif 000017
を有する、4-(6-(4-(ピペラジン-1-イル)フェニル)ピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-3-イル)キノリンである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
小分子阻害剤の組み合わせが、IWP2(CAS番号686770-61-6)、SB431542(CAS番号301836-41-9)、及びLDN-193189(CAS番号1062368-24-4)を含み、ここで、該組み合わせは、Wnt及びTGF-β/BMPシグナル伝達活性の相乗的阻害を生じる、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
ステップ(a)の培養細胞が、固体支持体上で培養される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
固体支持体が、増殖因子が低減されたMatrigel(登録商標)で被覆されているか、又は増殖因子が低減された基底膜で被覆されている、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
単離されたヒト胚性幹細胞(human  embryonic  stem  cells、hESCs)、ヒト多能性幹細胞(human  pluripotent  stem  cells、hPSCs)、又はヒト人工多能性幹細胞(iPSCs)から、単離されたヒト原始的網膜幹細胞(human  primitive  retinal  stem  cells、hpRSCs)を生産する方法であって、
(a)フィーダー細胞、フィーダー馴化培地又は血清の非存在下で、培養培地を用いて、固体支持体上で、ほぼコンフルエントに、好ましくは80％の細胞コンフルエンスまで増殖するために十分な時間、単離されたhESCs、hPSCs又はiPSCsを培養するステップ、
(b)そのように増殖させた単離hESCs、hPSCs又はiPSCsを、塩基性FGF(bFGF)を含む培養培地中で、固体支持体上で、ほぼコンフルエントに増殖するために十分な時間培養するステップ、
(c)ステップ(b)の単離hESCs、hPSCs又はiPSCsを、Wnt生産-2の特異的阻害剤、TGF-βシグナル伝達の阻害剤、及びBMPシグナル伝達の阻害剤を含む小分子阻害剤の組み合わせを含む培養培地を用いて、固体支持体上で培養し、単離hESCs、hPSCs又はiPSCsを単離ヒト原始的網膜幹細胞に分化させ、それによって単離hpRSCsを生産するステップ
を含む、方法。
【請求項１７】
小分子阻害剤の組み合わせが、SB 431542、LDN193189及びIWP2(Inhibitor  of  Wnt  Production-2)を含み、ここで、該組み合わせは、Wnt及びTGF-β/BMPシグナル伝達活性の相乗的阻害を生じる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１に記載の哺乳動物の原始的網膜幹細胞(pRSCs)を生産するためのキットであって、フィーダー細胞、フィーダー馴化培地若しくは血清を含まない化学的に規定された培地中で哺乳動物由来の胚性幹細胞(ESCs)、多能性幹細胞(PSCs)若しくは人工多能性幹細胞(iPSC)を培養するための説明書、Wnt生産-2の特異的阻害剤、TGF-βシグナル伝達の阻害剤、及びBMPシグナル伝達の阻害剤を含む小分子阻害剤の組み合わせの使用のための説明書、並びにWnt生産-2の特異的阻害剤、TGF-βシグナル伝達の阻害剤、及びBMPシグナル伝達の阻害剤を含む小分子阻害剤の組み合わせを含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、NIHによって授与された助成金番号R01 EY021374及びR01 EY018660の下で政府支援によってなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。
【０００２】
本出願を通じて、様々な刊行物が参照されている。その全体におけるこれらの刊行物の開示は、本発明が関連する技術の状態をより完全に記述するために、本出願に参照により組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
不可逆的な失明の主要な原因は、加齢性黄斑変性症(AMD)、網膜色素変性症、緑内障、並びに網膜におけるRPE、光受容細胞、網膜神経節細胞(RGCs)及び支持細胞の損失を引き起こす網膜血管疾患を含む。一つの潜在的な治療アプローチは、健康な網膜細胞を移植し、失われた網膜細胞を置き換えることによって、視覚機能を回復させることである。過去数十年の間に、ヒト胎児又は成人の網膜組織から単離された初代網膜始原細胞を使用しての試みは、成人の始原細胞の低い増殖能力及び分化能、又は倫理的な問題を生じる、十分なヒト胎児網膜始原細胞を得ることの困難性のいずれかに起因して、限定的な成功しかもたらしていない1。ヒト胚性幹細胞(hESCs)及び人工多能性幹細胞(iPSCs)を含むヒト多能性幹細胞(hPSCs)は、細胞ベースの置換療法のための有望な再生可能なドナー供給源を表す。それにもかかわらず、hPSCs自体は、奇形腫を形成するそれらの傾向、及びin vivoでの望ましい再プログラム細胞型を有する宿主組織を再増殖させるそれらの低効率に起因して、臨床応用における直接移植に適していない。
【０００４】
したがって、主要な努力は、hPSCsの分化した誘導体、例えば、神経網膜前始原細胞2、3、網膜色素上皮(RPE)4〜6、及び光受容細胞7〜9の生産に集中させてきた。hESC由来RPE移植は、シュタルガルト黄斑ジストロフィー及びAMDを有する患者の治療についての臨床試験に現在進んでいるが10、光受容細胞の大部分が既に失われている場合、RPE移植片の有効性は限定的かもしれない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Seiler, M. J. & Aramant, R. B. Cell replacement and visual restoration by retinal sheet transplants. Prog Retin Eye Res 31, 661-687, doi:10.1016/j.preteyeres.2012.06.003 (2012).
【非特許文献２】Banin, E. et al. Retinal incorporation and differentiation of neural precursors derived from human embryonic stem cells. Stem Cells 24, 246-257 (2006).
【非特許文献３】Lamba, D. A., Karl, M. O., Ware, C. B. & Reh, T. A. Efficient generation of retinal progenitor cells from human embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A 103, 12769-12774 (2006).
【非特許文献４】Klimanskaya, I. et al. Derivation and comparative assessment of retinal pigment epithelium from human embryonic stem cells using transcriptomics. Cloning Stem Cells 6, 217-245, doi:10.1089/clo.2004.6.217 (2004).
【非特許文献５】Vugler, A. et al. Elucidating the phenomenon of HESC-derived RPE: anatomy of cell genesis, expansion and retinal transplantation. Exp Neurol 214, 347-361, doi:10.1016/j.expneurol.2008.09.007 (2008).
【非特許文献６】Ukrohne, T. U. et al. Generation of retinal pigment epithelial cells from small molecules and OCT4 reprogrammed human induced pluripotent stem cells. Stem cells translational medicine 1, 96-109, doi:10.5966/sctm.2011-0057 (2012).
【非特許文献７】Osakada, F. et al. Toward the generation of rod and cone photoreceptors from mouse, monkey and human embryonic stem cells. Nat Biotechnol 26, 215-224 (2008).
【非特許文献８】Gonzalez-Cordero, A. et al. Photoreceptor precursors derived from three-dimensional embryonic stem cell cultures integrate and mature within adult degenerate retina. Nat Biotechnol, doi:10.1038/nbt.2643 (2013).
【非特許文献９】Lamba, D. A. et al. Generation, Purification and Transplantation of Photoreceptors Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells. PLoS ONE 5, e8763, doi:10.1371/journal.pone.0008763 (2010).
【非特許文献１０】Schwartz, S. D. et al. Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report. Lancet 379, 713-720, doi:10.1016/S0140-6736(12)60028-2 (2012).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、変性した網膜においてRPE及び光受容細胞の両方を再増殖する潜在力を有するが、腫瘍を形成するリスクをもたらさない、再生可能な網膜幹細胞製生産物を開発することが強く望まれている。そのような生産物は、複数の細胞型が罹患している状況において、損傷した細胞を置換し、視覚回路を回復させる。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、単離された哺乳動物の原始的網膜幹細胞(primitive retinal stem cells、pRSCs)を生産するためのin vitro方法であって、(a)フィーダー細胞、フィーダー馴化培地又は血清を含まない細胞培養培地中で哺乳動物由来の単離された胚性幹細胞(embryonic stem cells、ESCs)を培養し、単離ESCsの培養物を生産し、増殖させるステップ、及び(b)そのように増殖させた単離ESCsの培養物を、Wnt又はTGF-β/BMPシグナル伝達の阻害剤の1つ以上と接触させ、(a)の単離ESCsを原始的網膜幹細胞に分化させ、それによって単離哺乳動物pRSCsを生産するステップを含む方法を提供する。
【０００８】
本発明はさらに、単離された哺乳動物の原始的網膜幹細胞(pRSCs)を生産するためのin vitro方法であって、(a)フィーダー細胞、フィーダー馴化培地又は血清を含まない細胞培養培地中で哺乳動物由来の単離された多能性幹細胞(pluripotent stem cells、PSCs)を培養し、単離PSCsの培養物を生産し、増殖させるステップ、及び(b)そのように増殖させた単離PSCsの培養物を、Wnt又はTGF-β/BMPシグナル伝達の阻害剤の1つ以上と接触させ、単離PSCsを原始的網膜幹細胞に分化させ、それによって単離哺乳動物pRSCsを生産するステップを含む方法を提供する。
【０００９】
本発明はさらにまた、単離された哺乳動物の原始的網膜幹細胞(pRSCs)を生産するためのin vitro方法であって、(a)フィーダー細胞、フィーダー馴化培地又は血清を含まない細胞培養培地中で哺乳動物由来の単離された人工多能性幹細胞(induced pluripotent stem cells、iPSCs)を培養し、単離iPSCsの培養物を生産し、増殖させるステップ、及び(b)そのように増殖させた単離iPSCsの培養物を、Wnt又はTGF-β/BMPシグナル伝達の阻害剤の1つ以上と接触させ、単離iPSCsを原始的網膜幹細胞に分化させ、それによって単離哺乳動物pRSCsを生産するステップを含む方法を提供する。
【００１０】
本発明はさらに、単離された哺乳動物の網膜神経節細胞(retinal ganglion cells、RGCs)を生産するためのin vitro方法であって、(a)フィーダー細胞、フィーダー馴化培地又は血清を含まない細胞培養培地中で哺乳動物由来の単離された原始的網膜幹細胞(pRSCs)を培養し、単離pRSCsの培養物を生産し、増殖させるステップ、及び(b)そのように増殖させた単離pRSCsの培養物を、Wnt、Notch、又はVEGFRシグナル伝達の阻害剤の1つ以上と接触させ、単離pRSCsを単離哺乳動物RGCsに分化させ、それによって単離哺乳動物RGCsを生産するステップを含む方法を提供する。
【００１１】
また、本発明は、単離された哺乳動物pRSCsから、単離された哺乳動物光受容細胞を生産する方法であって、(a)TGF-β/アクチビン受容体様キナーゼALK-4、-5若しくは-7、グリコーゲンシンターゼキナーゼ-3(GSK-3)、Notch若しくはWntシグナル伝達の阻害剤の1つ以上、又はヘッジホッグシグナル伝達の活性化因子を含む神経誘導培地中で、目に見える形態的変化又は光受容細胞特異的マーカーの発現なしに、pRSCsを光受容細胞系列の運命に誘導するために十分な時間、哺乳動物由来の解離されたpRSCsを培養し、増殖させるステップ、及び(b)次いで、レチノイン酸又はタウリン又はその両方を含む神経誘導培地中でステップ(a)のpRSCsを培養し、増殖させ、哺乳動物pRSCsを光受容細胞に分化させ、それによって単離哺乳動物光受容細胞を生産するステップを含み、ここで、培養培地は、フィーダー細胞、フィーダー馴化培地又は血清を含まない、方法を提供する。
【００１２】
さらに加えて、本発明は、非神経の単離された哺乳動物の網膜色素上皮(retinal pigment epithelium、RPE)又は単離された哺乳動物の網膜色素上皮細胞(retinal pigment epithelial cells、RPEs)を生産する方法であって、(a)SMADシグナル伝達阻害剤の非存在下で、ニコチンアミド又はアクチビンA又はその両方を含む培地中で、pRSCsをRPEの運命に向かって方向付けるために十分な時間、哺乳動物由来のpRSCsを培養するステップ、及び(b)N1培地補充物、タウリン、ヒドロコルチゾン、又はトリヨードサイロニンの1つ以上を含む培養培地中でpRSCsを培養し、哺乳動物pRSCsを哺乳動物RPE又はRPEsに分化させ、それによって単離哺乳動物RPE又はRPEsを生産するステップを含み、ここで、培地は、フィーダー細胞又はフィーダー馴化培地を含まない、方法を提供する。
【００１３】
本発明はさらに、単離されたヒト胚性幹細胞(human embryonic stem cells、hESCs)から、単離されたヒト原始的網膜幹細胞(human primitive retinal stem cells、hpRSCs)を生産する方法であって、(a)フィーダー細胞、フィーダー馴化培地又は血清の非存在下で、培養培地を用いて、固体支持体上で、ほぼコンフルエントに、好ましくは約80％の細胞コンフルエンスまで増殖するために十分な時間、単離されたhESCsを培養するステップ、(b)そのように増殖させた単離hESCsを、塩基性FGF(bFGF)を含む培養培地中で、固体支持体上で、ほぼコンフルエントに増殖するために十分な時間培養するステップ、(c)ステップ(b)の単離hESCsを、Wnt及びTGF-β/BMPシグナル伝達活性の小分子阻害剤の組み合わせを含む培養培地を用いて、固体支持体上で培養し、単離hESCsを単離ヒト原始的網膜幹細胞に分化させ、それによって単離hpRSCsを生産するステップを含む方法を提供する。
【００１４】
さらにまた、本発明は、単離されたヒト多能性幹細胞(human pluripotent stem cells、hPSCs)から、単離されたヒト原始的網膜幹細胞(hpRSCs)を生産する方法であって、(a)フィーダー細胞、フィーダー馴化培地又は血清の非存在下で、培養培地を用いて、固体支持体上で、ほぼコンフルエントに、好ましくは約80％の細胞コンフルエンスまで増殖するために十分な時間、単離されたhPSCsを培養するステップ、(b)そのように増殖させた単離hPSCsを、bFGFを含む培養培地中で、固体支持体上で、ほぼコンフルエントに増殖するために十分な時間培養するステップ、(c)ステップ(b)の単離hPSCsを、Wnt及びTGF-β/BMPシグナル伝達活性の小分子阻害剤の組み合わせを含む培養培地を用いて、固体支持体上で培養し、単離hPSCsを単離ヒト原始的網膜幹細胞に分化させ、それによって単離hpRSCsを生産するステップを含む方法を提供する。
【００１５】
本発明はまた、単離されたヒト人工多能性幹細胞(iPSCs)から、単離されたヒト原始的網膜幹細胞(hpRSCs)を生産する方法であって、(a)フィーダー細胞、フィーダー馴化培地又は血清の非存在下で、培養培地を用いて、固体支持体上で、ほぼコンフルエントに、好ましくは約80％の細胞コンフルエンスまで増殖するために十分な時間、単離されたヒトiPSCsを培養するステップ、(b)そのように増殖させた単離iPSCsを、bFGFを含む培養培地中で、固体支持体上で、ほぼコンフルエントに増殖するために十分な時間培養するステップ、(c)ステップ(b)の単離iPSCsを、Wnt及びTGF-β/BMPシグナル伝達活性の小分子阻害剤の組み合わせを含む培養培地を用いて、固体支持体上で培養し、単離iPSCsを単離ヒト原始的網膜幹細胞に分化させ、それによって単離hpRSCsを生産するステップを含む方法を提供する。
【００１６】
本発明はさらに、哺乳動物原始的網膜幹細胞(pRSCs)を生産するためのキットであって、フィーダー細胞、フィーダー馴化培地若しくは血清を含まない化学的に規定された培地中で哺乳動物由来の胚性幹細胞(ESCs)、多能性幹細胞(PSCs)若しくは人工多能性幹細胞(iPSC)を培養するための説明書、並びにWntシグナル伝達若しくはTGF-β/BMPシグナル伝達の小分子阻害剤、又はWnt及びTGF-β/BMPシグナル伝達の両方の阻害剤の使用のための説明書を含む、キットを提供する。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
単離された哺乳動物の原始的網膜幹細胞(primitive  retinal  stem  cells、pRSCs)を生産するためのin  vitro方法であって、
(a)フィーダー細胞、フィーダー馴化培地又は血清を含まない細胞培養培地中で哺乳動物由来の単離された胚性幹細胞(embryonic  stem  cells、ESCs)を培養し、単離ESCsの培養物を生産し、増殖させるステップ、及び
(b)そのように増殖させた単離ESCsの培養物を、Wnt又はTGF-β/BMPシグナル伝達の阻害剤の1つ以上と接触させ、(b)の単離ESCsを原始的網膜幹細胞に分化させ、それによって単離哺乳動物pRSCsを生産するステップ
を含む、方法。
（項目２）
単離された哺乳動物の原始的網膜幹細胞(pRSCs)を生産するためのin  vitro方法であって、
(a)フィーダー細胞、フィーダー馴化培地又は血清を含まない細胞培養培地中で哺乳動物由来の単離された多能性幹細胞(pluripotent  stem  cells、PSCs)を培養し、単離PSCsの培養物を生産し、増殖させるステップ、及び
(b)そのように増殖させた単離PSCsの培養物を、Wnt又はTGF-β/BMPシグナル伝達の阻害剤の1つ以上と接触させ、単離PSCsを原始的網膜幹細胞に分化させ、それによって単離哺乳動物pRSCsを生産するステップ
を含む、方法。
（項目３）
単離された哺乳動物の原始的網膜幹細胞(pRSCs)を生産するためのin  vitro方法であって、
(a)フィーダー細胞、フィーダー馴化培地又は血清を含まない細胞培養培地中で哺乳動物由来の単離された人工多能性幹細胞(induced  pluripotent  stem  cells、iPSCs)を培養し、単離iPSCsの培養物を生産し、増殖させるステップ、及び
(b)そのように増殖させた単離iPSCsの培養物を、Wnt又はTGF-β/BMPシグナル伝達の阻害剤の1つ以上と接触させ、単離iPSCsを原始的網膜幹細胞に分化させ、それによって単離哺乳動物pRSCsを生産するステップ
を含む、方法。
（項目４）
ステップ(a)において、そのように生産された単離ESCsの培養物が、単層培養物である、項目１に記載の方法。
（項目５）
ステップ(a)において、そのように生産された単離PSCsの培養物が、単層培養物である、項目２に記載の方法。
（項目６）
ステップ(a)において、そのように生産された単離iPSCsの培養物が、単層培養物である、項目３に記載の方法。
（項目７）
ステップ(b)において、Wnt又はTGF-β/BMPシグナル伝達の阻害剤の1つ以上が、Wnt及びTGF-β/BMPシグナル伝達の阻害剤の組み合わせである、項目１、２又は３に記載の方法。
（項目８）
ステップ(a)において、そのように生産された培養物が、ステップ(b)の前にコンフルエンシー近くまで増殖される、項目１、２又は３に記載の方法。
（項目９）
哺乳動物が、ヒト、サル、クマ、ラット、マウス、ミンク、ウサギ、モルモット、ブタ、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、ウマ又はウシである、項目１、２又は３に記載の方法。
（項目１０）
単離された哺乳動物の原始的網膜幹細胞(pRSCs)が、典型的な初期眼領域転写因子であるPAX6、LHX2、RAX、OTX2、SIX3及び/又はSIX6の発現について陽性である、項目１、２又は３に記載の方法。
（項目１１）
幹細胞性因子SOX2、及びSTAT3の発現について陽性である、単離された哺乳動物の原始的網膜幹細胞(pRSCs)をさらに含む、項目１、２又は３に記載の方法。
（項目１２）
Ki67の発現について陽性である、単離された哺乳動物の原始的網膜幹細胞をさらに含む、項目１、２又は３に記載の方法。
（項目１３）
Wntシグナル伝達の阻害剤が、以下からなる群から選択されるWntシグナル伝達の小分子阻害剤である、項目１、２又は３に記載の方法:Wnt生産-1の阻害剤(Inhibitor  of  Wnt  Production-1、IWP-1)、Wnt生産-2の阻害剤(Inhibitor  of  Wnt  Production-2、IWP2)、JW55、JW74、オカダ酸、トートマイシン(tautomycin)、SB239063、SB203580、ADP-HPD、2-[4-(4-フルオロフェニル)ピペラジン-1-イル]-6-メチルピリミジン-4(3H)-オン、PJ34、カンビノール(cambinol)、スリンダク(sulindac)、3289-8625、ディシェベルド(Dishevelled)タンパク質を阻害するように設計された一連のアナログについてのスキャフォールドA、ディシェベルドタンパク質を阻害するように設計された一連のアナログについてのスキャフォールドB、J01-017a、NSC668036、フィリピン(filipin)、IC261、PF670462、ボスチニブ(Bosutinib)、PHA665752、イマチニブ(Imatinib)、ICG-001、エタクリン酸、エタクリン酸誘導体、PKF115-584、PNU-74654、PKF118-744、CGP049090、PKF118-310、ZTM000990、BC21、GDC-0941、Rp-8-Br-cAMP、LGK974、C59、Ant1.4Br/Ant 1.4CI、ニクロサミド(niclosamide)、アピクラレン(apicularen)、バフィロマイシン(bafilomycin)、XAV939、IWR1、ピルビニウム(pyrvinium)、NSC668036、2,4-ジアミノ-キナゾリン、クエルセチン(quercetin)、及びPKF115-584、並びにそれらの同等物及び組み合わせ。
（項目１４）
Wntシグナル伝達の阻害剤が、Wnt生産-2(Wnt  Production-2)の小分子阻害剤又はDkk1アナログである、項目１、２又は３に記載の方法。
（項目１５）
Wnt生産-2の小分子阻害剤又はDkk1アナログが、C22H18N4O2S3の化学式及び以下の化学構造:
【化１】
0006651440.tif 000002
を有する、Wnt生産-2の阻害剤(Inhibitor  of  Wnt  Production-2、IWP2;CAS番号686770-61-6)又はN-(6-メチル-1,3-ベンゾチアゾール-2-イル)-2-[(4-オキソ-3-フェニル-6,7-ジヒドロチエノ[3,2-d]ピリミジン-2-イル)スルファニル]アセトアミドである、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
TGF-β/BMPシグナル伝達の阻害剤が、以下からなる群から選択されるTGF-β/BMPシグナル伝達の小分子阻害剤である、項目１、２又は３に記載の方法:SB431542(4-[4-(1,3-ベンゾジオキソール-5-イル)-5-(2-ピリジニル)-1H-イミダゾール-2-イル]ベンズアミド)、A83-01(3-(6-メチル-2-ピリジニル)-N-フェニル-4-(4-キノリニル)-1H-ピラゾール-1-カルボチオアミド)、SJN2511(2-(3-(6-メチルピリジン-2-イル)-1H-ピラゾール-4-イル)-1,5-ナフチリジン)、D 4476(4-[4-(2,3-ジヒドロ-1,4-ベンゾジオキシン-6-イル)-5-(2-ピリジニル)-1H-イミダゾール-2-イル]ベンズアミド)、LY364947(4-[3-(2-ピリジニル)-1H-ピラゾール-4-イル]-キノリン)、SB 525334(6-[2-(1,1-ジメチルエチル)-5-(6-メチル-2-ピリジニル)-1H-イミダゾール-4-イル]キノキサリン)、SD208(2-(5-クロロ-2-フルオロフェニル)-4-[(4-ピリジル)アミノ]プテリジン)、及びLDN-193189(4-(6-(4-(ピペラジン-1-イル)フェニル)ピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-3-イル)キノリン)並びにそれらの同等物及び組み合わせ。
（項目１７）
TGF-β/BMPシグナル伝達の阻害剤が、トランスフォーミング増殖因子-ベータ(TGF-β)スーパーファミリーI型アクチビン受容体様キナーゼALK-4、-5、及び-7の小分子阻害剤である、項目１、２又は３に記載の方法。
（項目１８）
トランスフォーミング増殖因子-ベータ(TGF-β)スーパーファミリーI型アクチビン受容体様キナーゼALK-4、-5、及び-7の小分子阻害剤が、C22H16N4O3の化学式及び以下の化学構造:
【化２】
0006651440.tif 000003
を有する、SB431542(CAS番号301836-41-9)又は4-[4-(1,3-ベンゾジオキソール-5-イル)-5-(2-ピリジニル)-1H-イミダゾール-2-イル]ベンズアミドである、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
TGF-β/BMPシグナル伝達の阻害剤が、BMPI型受容体ALK-2及びALK-3の小分子阻害剤又はノギン(noggin)アナログである、項目１、２又は３に記載の方法。
（項目２０）
BMP I型受容体ALK-2及びALK-3の小分子阻害剤又はノギンアナログが、C25H22N6の化学式及び以下の化学構造:
【化３】
0006651440.tif 000004
を有する、LDN-193189(CAS番号1062368-24-4)又は4-(6-(4-(ピペラジン-1-イル)フェニル)ピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-3-イル)キノリンである、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
Wnt及びTGF-β/BMPシグナル伝達の阻害剤の組み合わせが、(a)Wnt生産-2の1つ以上の阻害剤又はDkk1アナログ;(b)トランスフォーミング増殖因子-ベータ(TGF-β)スーパーファミリーI型アクチビン受容体様キナーゼALK-4、-5、及び-7の1つ以上の阻害剤; 及び(c)BMPI型受容体ALK-2及びALK-3の1つ以上の阻害剤又はノギンアナログの組み合わせであり、ここで、該組み合わせは、少なくとも2つのシグナル伝達経路の阻害剤又は好ましくは3つ全てのシグナル伝達経路の阻害剤を含む、項目７に記載の方法。
（項目２２）
阻害剤が、小分子である、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
Wnt及びTGF-β/BMPシグナル伝達活性の阻害剤の組み合わせが、IWP2(CAS番号686770-61-6)、SB431542(CAS番号301836-41-9)、及びLDN-193189(CAS番号1062368-24-4)の少なくとも2つ、好ましくは3つ全ての組み合わせ、若しくは同等の組み合わせであり、ここで、該組み合わせは、Wnt及びTGF-β/BMPシグナル伝達活性の相乗的阻害を生じるか、又は、IWP2(CAS番号686770-61-6)、SB431542(CAS番号301836-41-9)、及びLDN-193189(CAS番号1062368-24-4)の少なくとも2つ、好ましくは3つ全てを含む組み合わせ、若しくは同等の組み合わせであり、ここで、該組み合わせは、Wnt及びTGF-β/BMPシグナル伝達活性の相乗的阻害を生じる、項目２１に記載の方法。
（項目２４）
ステップ(a)の培養細胞が、固体支持体上で培養される、項目１、２又は３に記載の方法。
（項目２５）
固体支持体が、増殖因子が低減されたMatrigel(登録商標)で被覆されているか、又は増殖因子が低減された基底膜で被覆されている、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
単離された哺乳動物の網膜神経節細胞(retinal  ganglion  cells、RGCs)を生産するためのin  vitro方法であって、
(a)フィーダー細胞、フィーダー馴化培地又は血清を含まない細胞培養培地中で哺乳動物由来の単離された原始的網膜幹細胞(pRSCs)を培養し、単離pRSCsの培養物を生産し、増殖させるステップ、及び
(b)そのように培養された単離pRSCsを、Wnt、Notch、又はVEGFRシグナル伝達の阻害剤の1つ以上と接触させ、単離pRSCsを単離哺乳動物RGCsに分化させ、それによって単離哺乳動物RGCsを生産するステップ
を含む、方法。
（項目２７）
ステップ(a)において、そのように培養されたpRSCsが、固体支持体上で増殖される、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
固体支持体が、Matrigel(登録商標)又は基底膜で被覆されている、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
Matrigel(登録商標)又は基底膜が、増殖因子が低減されたMatrigel(登録商標)又は増殖因子が低減された基底膜である、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
ステップ(b)において、Wnt、Notch、又はVEGFRシグナル伝達の阻害剤の1つ以上が、Wnt、Notch、及びVEGFRシグナル伝達の阻害剤の組み合わせであり、ここで、該組み合わせは、少なくとも2つのシグナル伝達経路の阻害剤、又は好ましくは3つ全てのシグナル伝達経路の阻害剤を含む、項目２６に記載の方法。
（項目３１）
Wnt、Notch、又はVEGFRシグナル伝達の阻害剤が、小分子阻害剤である、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
Wnt、Notch、及びVEGFRシグナル伝達の阻害剤の組み合わせが、それぞれ、IWP2、DAPT、及びPD173074である、項目３０に記載の方法。
（項目３３）
RGC前駆細胞特異的転写因子遺伝子の上方制御が、BRN3A、BRN3B、ISL-1及びMATH5のいずれか1つ以上を含む、項目２６に記載の方法。
（項目３４）
培養物中の細胞の大部分が、RGCsのマーカーについて陽性である、項目２６に記載の方法。
（項目３５）
培養物中の細胞の大部分が、RGCsのマーカーについて陽性であり、さらに、TUJ1及びBRN3について陽性である、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
単離された哺乳動物pRSCsから、単離された哺乳動物光受容細胞を生産する方法であって、
(a)TGF-β/アクチビン受容体様キナーゼALK-4、-5若しくは-7、グリコーゲンシンターゼキナーゼ-3(GSK-3)、Notch若しくはWntシグナル伝達の阻害剤の1つ以上、又はヘッジホッグシグナル伝達の活性化因子を含む神経誘導培地中で、目に見える形態的変化又は光受容細胞特異的マーカーの発現なしに、pRSCsを光受容細胞系列の運命に誘導するために十分な時間、哺乳動物由来の解離されたpRSCsを培養し、増殖させるステップ、及び
(b)次いで、レチノイン酸又はタウリン又はその両方を含む神経誘導培地中でステップ(a)のpRSCsを培養し、増殖させ、哺乳動物pRSCsを光受容細胞に分化させ、それによって単離哺乳動物光受容細胞を生産するステップ
を含み、ここで、培養培地は、フィーダー細胞、フィーダー馴化培地又は血清を含まない、方法。
（項目３７）
単離された哺乳動物pRSCsから、単離された哺乳動物光受容細胞を生産する方法であって、
(a)TGF-β/アクチビン受容体様キナーゼALK-4、-5若しくは-7、グリコーゲンシンターゼキナーゼ-3(GSK-3)、Notch若しくはWntシグナル伝達の阻害剤の1つ以上、又はヘッジホッグシグナル伝達の活性化因子を含む神経誘導培地中で、目に見える形態的変化又は光受容細胞特異的マーカーの発現なしに、pRSCsを光受容細胞系列の運命に誘導するために十分な時間、哺乳動物由来の解離されたpRSCsを培養し、増殖させるステップ、及び
(b)ステップ(a)の培養され増殖されたpRSCsを、レチノイン酸又はタウリン又はその両方と接触させ、哺乳動物pRSCsを光受容細胞に分化させ、それによって単離哺乳動物光受容細胞を生産するステップ
を含み、ここで、培養培地は、フィーダー細胞、フィーダー馴化培地又は血清を含まない、方法。
（項目３８）
ステップ(a)において、そのように培養されたpRSCsが、固体支持体上で増殖される、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
固体支持体が、Matrigel(登録商標)又は基底膜で被覆されている、項目３８に記載の方法。
（項目４０）
Matrigel(登録商標)又は基底膜が、増殖因子が低減されたMatrigel(登録商標)又は増殖因子が低減された基底膜である、項目３９に記載の方法。
（項目４１）
ステップ(a)において、TGF-β/アクチビン受容体様キナーゼALK-4、-5若しくは-7、グリコーゲンシンターゼキナーゼ-3(GSK-3)、Notch若しくはWntシグナル伝達の阻害剤の1つ以上が、TGF-β/アクチビン受容体様キナーゼALK-4、-5及び-7、グリコーゲンシンターゼキナーゼ-3(GSK-3)、Notch及びWntシグナル伝達の阻害剤の組み合わせであり、ここで、該組み合わせは、少なくとも2つのシグナル伝達経路の阻害剤、又は好ましくは4つ全てのシグナル伝達経路の阻害剤を含む、項目３６に記載の方法。
（項目４２）
ステップ(a)において、TGF-β/アクチビン受容体様キナーゼALK-4、-5若しくは-7、グリコーゲンシンターゼキナーゼ-3(GSK-3)、Notch若しくはWntシグナル伝達の阻害剤の1つ以上、又はヘッジホッグシグナル伝達の活性化因子が、TGF-β/アクチビン受容体様キナーゼALK-4、-5及び-7、グリコーゲンシンターゼキナーゼ-3(GSK-3)、Notch及びWntシグナル伝達の阻害剤、並びにヘッジホッグシグナル伝達の活性化因子の組み合わせであり、ここで、該組み合わせは、少なくとも2つのシグナル伝達経路のモジュレーター、又は好ましくは5つ全てのシグナル伝達経路のモジュレーターを含む、項目３６に記載の方法。
（項目４３）
TGF-β/アクチビン受容体様キナーゼALK-4、-5若しくは-7、グリコーゲンシンターゼキナーゼ-3(GSK-3)、Notch若しくはWntシグナル伝達の阻害剤が、小分子阻害剤である、項目３６に記載の方法。
（項目４４）
ヘッジホッグシグナル伝達の活性化因子が、小分子活性化因子である、項目３６に記載の方法。
（項目４５）
単離された哺乳動物の光受容細胞が、ロドプシン、ロドプシンキナーゼ及び/又はトランスムチン(transmucin)について陽性である、項目３６に記載の方法。
（項目４６）
TGF-β/アクチビン受容体様キナーゼALK-4、-5及び-7、グリコーゲンシンターゼキナーゼ-3(GSK-3)、Notch及びWntシグナル伝達の阻害剤、並びにヘッジホッグシグナル伝達の活性化因子が、それぞれ、SB431542(CAS番号301836-41-9)若しくは同等物、CHIR99021(CAS番号252917-06-9)若しくは同等物、DAPT(CAS番号208255-80-5)若しくは同等物、IWP2(CAS番号686770-61-6)若しくは同等物、並びにプルモルファミン(purmorphamine、CAS番号483367-10-8)若しくは同等物である、項目４２に記載の方法。
（項目４７）
非神経の単離された哺乳動物の網膜色素上皮(retinal  pigment  epithelium、RPE)又は単離された哺乳動物の網膜色素上皮細胞(retinal  pigment  epithelial  cells、RPEs)を生産する方法であって、
(a)SMADシグナル伝達阻害剤の非存在下で、ニコチンアミド又はアクチビンA又はその両方を含む培養培地中で、pRSCsをRPEの運命に向かって方向付けるために十分な時間、哺乳動物由来のpRSCsを培養するステップ、及び
(b)N1培地補充物、タウリン、ヒドロコルチゾン、又はトリヨードサイロニンの1つ以上を含む培養培地中でpRSCsを培養し、哺乳動物pRSCsを哺乳動物RPE又はRPEsに分化させ、それによって単離哺乳動物RPE又はRPEsを生産するステップ
を含み、ここで、培地は、フィーダー細胞又はフィーダー馴化培地を含まない、方法。
（項目４８）
非神経の単離された哺乳動物の網膜色素上皮(RPE)又は単離された哺乳動物の網膜色素上皮細胞(RPEs)を生産する方法であって、
(a)SMADシグナル伝達阻害剤の非存在下で、ニコチンアミド又はアクチビンA又はその両方を含む培養培地中で、pRSCsをRPEの運命に向かって方向付けるために十分な時間、哺乳動物由来のpRSCsを培養するステップ、及び
(b)ステップ(a)においてそのように培養されたpRSCsを、N1培地補充物、タウリン、ヒドロコルチゾン、又はトリヨードサイロニンの1つ以上と接触させ、哺乳動物pRSCsを哺乳動物RPE又はRPEsに分化させ、それによって単離哺乳動物RPE又はRPEsを生産するステップを含み、ここで、培地は、フィーダー細胞又はフィーダー馴化培地を含まない、方法。
（項目４９）
ステップ(b)において、培養培地が、N1培地補充物、タウリン、ヒドロコルチゾン、及びトリヨードサイロニンを含むRPE培養培地である、項目４７に記載の方法。
（項目５０）
RPE又はRPEsが、RPE65を発現し、多角形のアクチン束を形成し、着色している、項目４７に記載の方法。
（項目５１）
哺乳動物が、ヒト、サル、クマ、ラット、マウス、ミンク、ウサギ、モルモット、ブタ、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、ウマ又はウシである、項目２６、３６又は４７に記載の方法。
（項目５２）
単離されたヒト胚性幹細胞(human  embryonic  stem  cells、hESCs)から、単離されたヒト原始的網膜幹細胞(human  primitive  retinal  stem  cells、hpRSCs)を生産する方法であって、
(a)フィーダー細胞、フィーダー馴化培地又は血清の非存在下で、培養培地を用いて、固体支持体上で、ほぼコンフルエントに、好ましくは80％の細胞コンフルエンスまで増殖するために十分な時間、単離されたhESCsを培養するステップ、
(b)そのように増殖させた単離hESCsを、塩基性FGF(bFGF)を含む培養培地中で、固体支持体上で、ほぼコンフルエントに増殖するために十分な時間培養するステップ、
(c)ステップ(b)の単離hESCsを、Wnt及びTGF-β/BMPシグナル伝達の小分子阻害剤の組み合わせを含む培養培地を用いて、固体支持体上で培養し、単離hESCsを単離ヒト原始的網膜幹細胞に分化させ、それによって単離hpRSCsを生産するステップ
を含む、方法。
（項目５３）
単離されたヒト多能性幹細胞(human  pluripotent  stem  cells、hPSCs)から、単離されたヒト原始的網膜幹細胞(hpRSCs)を生産する方法であって、
(a)フィーダー細胞、フィーダー馴化培地又は血清の非存在下で、培養培地を用いて、固体支持体上で、ほぼコンフルエントに、好ましくは80％の細胞コンフルエンスまで増殖するために十分な時間、単離されたhPSCsを培養するステップ、
(b)そのように増殖させた単離hPSCsを、bFGFを含む培養培地中で、固体支持体上で、ほぼコンフルエントに増殖するために十分な時間培養するステップ、
(c)ステップ(b)の単離hPSCsを、Wnt及びTGF-β/BMPシグナル伝達の小分子阻害剤の組み合わせを含む培養培地を用いて、固体支持体上で培養し、単離hPSCsを単離ヒト原始的網膜幹細胞に分化させ、それによって単離hpRSCsを生産するステップ
を含む、方法。
（項目５４）
単離されたヒト人工多能性幹細胞(iPSCs)から、単離されたヒト原始的網膜幹細胞(hpRSCs)を生産する方法であって、
(a)フィーダー細胞、フィーダー馴化培地又は血清の非存在下で、培養培地を用いて、固体支持体上で、ほぼコンフルエントに、好ましくは80％の細胞コンフルエンスまで増殖するために十分な時間、単離されたヒトiPSCsを培養するステップ、
(b)そのように増殖させた単離iPSCsを、bFGFを含む培養培地中で、固体支持体上で、ほぼコンフルエントに増殖するために十分な時間培養するステップ、
(c)ステップ(b)の単離iPSCsを、Wnt及びTGF-β/BMPシグナル伝達の小分子阻害剤の組み合わせを含む培養培地を用いて、固体支持体上で培養し、単離iPSCsを単離ヒト原始的網膜幹細胞に分化させ、それによって単離hpRSCsを生産するステップ
を含む、方法。
（項目５５）
ステップ(c)におけるWnt及びTGF-β/BMPシグナル伝達活性の小分子阻害剤の組み合わせが、SB431542、LDN193189及びIWP2(Inhibitor  of  Wnt  Production-2)の組み合わせ; SB 431542、ノギンアナログ及びIWP2の組み合わせ;SB 431542、LDN193189及びDkk1アナログの組み合わせ; SB 431542、ノギンアナログ及びDkk1アナログの組み合わせ; 又は同等の組み合わせであり、ここで、該組み合わせは、Wnt及びTGF-β/BMPシグナル伝達活性の相乗的阻害を生じる、項目５２、５３又は５４に記載の方法。
（項目５６）
SB431542、LDN193189及びIWP2の組み合わせが、5μM  SB 431542、50nM  LDN193189、及び1μM  IWP2を含む、項目５５に記載の方法。
（項目５７）
単離されたヒト原始的網膜幹細胞が、典型的な初期眼領域転写因子であるPAX6、LHX2、RAX、OTX2、SIX3及び/又はSIX6について陽性である、項目５２、５３又は５４に記載の方法。
（項目５８）
単離されたヒト原始的網膜幹細胞が、幹細胞性因子SOX2、ネスチン及びSTAT3の発現について陽性である、項目５７に記載の方法。
（項目５９）
単離されたヒト原始的網膜幹細胞が、Ki67の発現について陽性である、項目５７に記載の方法。
（項目６０）
単離されたヒト原始的網膜幹細胞が、hESC多能性転写因子、POU5F1(OCT4)、NANOG、KLF4及びTBX3遺伝子、並びにTBF-βスーパーファミリー遺伝子、SMAD1、SMAD2、TGFβ3、BMP3、BMP6、TGFBR1、及びBMPR1Bの転写を下方制御する、項目５７に記載の方法。
（項目６１）
単離されたヒト原始的網膜幹細胞が、BMP4及びBMP7遺伝子、並びにOTX2、RAX、LHX2、SIX3、及びSIX6遺伝子の転写を上方制御する、項目５７に記載の方法。
（項目６２）
単離されたヒト原始的網膜幹細胞が、SRFP1及びFZD3/5遺伝子の転写について陽性である、項目５７に記載の方法。
（項目６３）
単離されたヒト原始的網膜幹細胞が、FGFR1/2/3及びFGF3/8遺伝子の転写を下方制御する、項目５７に記載の方法。
（項目６４）
それを必要とする被験体において網膜変性を治療する方法であって、被験体における網膜変性を治療するために十分な量で、被験体の眼に原始的網膜幹細胞(pRSCs)を投与するステップを含み、ここで、pRSCsは、項目１、２、３、５２、５３又は５４に記載の方法によって生産される、方法。
（項目６５）
それを必要とする被験体において網膜変性を治療する方法であって、
(a)被験体から組織又は細胞サンプルを得て、それから単離されたPSCs又は単離されたiPSCsを得る又は生産するステップ、
(b)ステップ(a)の単離PSCs又は単離iPSCsを培養して、項目２、３、５３又は５４に記載の方法によって生産するステップ、
(c)被験体における網膜変性を治療するために十分な量で、被験体の眼に原始的網膜幹細胞(pRSCs)を投与するステップ
を含む、方法。
（項目６６）
それを必要とする被験体において網膜変性を治療する方法であって、被験体における網膜変性を治療するために十分な量で、被験体の眼に哺乳動物の網膜神経節細胞(RGCs)を投与するステップを含み、ここで、RGCsは、項目２６に記載の方法によって生産される、方法。
（項目６７）
それを必要とする被験体において網膜変性を治療する方法であって、
(a)被験体から組織又は細胞サンプルを得て、それから単離されたPSCs又は単離されたiPSCsを得る又は生産するステップ、
(b)ステップ(a)の単離PSCs又は単離iPSCsを培養して、単離されたpRSCsを生産するステップ、
(c)単離pRSCsを培養して、項目２６に記載の方法によって、単離されたRGCsを生産するステップ、
(d)被験体における網膜変性を治療するために十分な量で、被験体の眼にステップ(c)において生産された哺乳動物の網膜神経節細胞(RGCs)を投与するステップ
を含む、方法。
（項目６８）
それを必要とする被験体において網膜変性を治療する方法であって、被験体における網膜変性を治療するために十分な量で、被験体の眼に哺乳動物の光受容細胞を投与するステップを含み、ここで、哺乳動物の光受容細胞は、項目３６に記載の方法によって生産される、方法。
（項目６９）
それを必要とする被験体において網膜変性を治療する方法であって、
(a)被験体から組織又は細胞サンプルを得て、それから単離されたPSCs又は単離されたiPSCsを得る又は生産するステップ、
(b)ステップ(a)の単離PSCs又は単離iPSCsを培養して、単離されたpRSCsを生産するステップ、
(c)単離pRSCsを培養して、項目３６に記載の方法によって、単離された光受容細胞を生産するステップ、
(d)被験体における網膜変性を治療するために十分な量で、被験体の眼にステップ(c)の光受容細胞を投与するステップ
を含む、方法。
（項目７０）
それを必要とする被験体において網膜変性を治療する方法であって、被験体における網膜変性を治療するために十分な量で、被験体の眼に哺乳動物の網膜色素上皮細胞(RPEs)を投与するステップを含み、ここで、RPEsは、項目４７に記載の方法によって生産される、方法。
（項目７１）
それを必要とする被験体において網膜変性を治療する方法であって、
(a)被験体から組織又は細胞サンプルを得て、それから単離されたPSCs又は単離されたiPSCsを得る又は生産するステップ、
(b)ステップ(a)の単離PSCs又は単離iPSCsを培養して、単離されたpRSCsを生産するステップ、
(c)単離pRSCsを培養して、項目４７に記載の方法によって、単離されたRPEsを生産するステップ、
(d)被験体における網膜変性を治療するために十分な量で、被験体の眼にステップ(c)の哺乳動物網膜色素上皮細胞(RPEs)を投与するステップ
を含む、方法。
（項目７２）
投与される細胞が、マトリックス中若しくはマトリックス上にあるか、又は患者の眼への送達の前にマトリックスと混合される、項目６４、６６、６８又は７０に記載の方法。
（項目７３）
マトリックスが、ヒアルロン酸及びメチルセルロース又はそれらの塩及び誘導体を含むヒドロゲル、生物活性ペプチドを有するヒドロゲル、移植された細胞の細胞生存性及び機能性を支持する生体適合性ポリマー又は生体適合性ポリマーの混合物、人工生体模倣マトリックス、組織又は器官マトリックスに由来する生物活性足場、コラーゲン及びN-イソプロピルアクリルアミド共重合体に基づく生合成細胞外マトリックス、又は接着分子、ラミン、増殖因子、形態形成因子、生存因子、細胞外マトリックス若しくは断片若しくは誘導体で修飾された足場である、項目７２に記載の方法。
（項目７４）
細胞が、被験体の眼の網膜下腔に投与される、項目６４、６６、６８又は７０に記載の方法。
（項目７５）
網膜変性が、加齢性黄斑変性症(AMD)、シュタルガルト黄斑ジストロフィー、網膜色素変性症、緑内障、網膜血管疾患、眼のウイルス感染、又は公知若しくは未知の病因の他の網膜/眼疾患と関連している、項目６４、６６、６８又は７０に記載の方法。
（項目７６）
被験体がヒトである、項目６４、６６、６８又は７０に記載の方法。
（項目７７）
それを必要とする被験体にヒト原始的網膜幹細胞(hpRSCs)を送達する方法であって、被験体の網膜下腔に、マトリックス溶液又はマトリックス懸濁液中の、項目１、２、３、５２、５３又は５４に記載の方法によって生産されたhpRSCsの単層又は単一細胞懸濁液を投与するステップを含む、方法。
（項目７８）
それを必要とする被験体にヒト原始的網膜神経節細胞(hpRGCs)を送達する方法であって、被験体の網膜下腔に、マトリックス溶液又はマトリックス懸濁液中の、項目２６に記載の方法によって生産されたhpRGCsの単層又は単一細胞懸濁液を投与するステップを含む、方法。
（項目７９）
それを必要とする被験体にヒト光受容細胞を送達する方法であって、被験体の網膜下腔に、マトリックス溶液又はマトリックス懸濁液中の、項目３６に記載の方法によって生産されたヒト光受容細胞の単層又は単一細胞懸濁液を投与するステップを含む、方法。
（項目８０）
それを必要とする被験体にヒト網膜色素上皮細胞(hRPEs)を送達する方法であって、被験体の網膜下腔に、マトリックス溶液又はマトリックス懸濁液中の、項目４７に記載の方法によって生産されたhRPEsの単層又は単一細胞懸濁液を投与するステップを含む、方法。
（項目８１）
網膜変性に罹患している被験体を治療するための多能性幹細胞の使用に関連した腫瘍を予防又は阻害する方法であって、
(a)単離された多能性幹細胞を、項目１、２、３、５２、５３又は５４に記載の方法によって、単離されたヒト原始的網膜幹細胞(hpRSCs)に誘導するステップ、及び
(b)(a)において生産された単離hpRSCsを被験体に投与するステップ
を含む、方法。
（項目８２）
網膜変性に罹患している被験体を治療するための多能性幹細胞の使用に関連した腫瘍を予防又は阻害する方法であって、
(a)単離された多能性幹細胞を、項目１、２、３、５２、５３又は５４に記載の方法によって、単離されたhPRSCsに誘導するステップ、
(b)単離hPRSCsを、項目２６に記載の方法によって生産される、単離されたヒト原始的網膜神経節細胞(hpRGCs)にさらに分化させるステップ、
(c)(b)において生産された単離hpRGCsを被験体に投与するステップ
を含む、方法。
（項目８３）
網膜変性に罹患している被験体を治療するための多能性幹細胞の使用に関連した腫瘍を予防又は阻害する方法であって、
(a)単離された多能性幹細胞を、項目１、２、３、５２、５３又は５４に記載の方法によってhPRSCsに誘導するステップ、
(b)単離hPRSCsを、項目３６に記載の方法によって生産される、単離されたヒト光受容細胞にさらに分化させるステップ、
(c)(b)において生産された単離ヒト光受容細胞を被験体に投与するステップ
を含む、方法。
（項目８４）
網膜変性に罹患している被験体を治療するための多能性幹細胞の使用に関連した腫瘍を予防又は阻害する方法であって、
(a)単離された多能性幹細胞を、項目１、２、３、５２、５３又は５４に記載の方法によってhPRSCsに誘導するステップ、
(b)単離hPRSCsを、項目４７に記載の方法によって生産される、単離されたヒト網膜色素上皮(hRPE)又は単離されたヒト網膜色素上皮細胞(hRPEs)にさらに分化させるステップ、
(c)(b)において生産された単離hRPE又はhRPEsを被験体に投与するステップ
を含む、方法。
（項目８５）
網膜変性が、加齢性黄斑変性症(AMD)、シュタルガルト黄斑ジストロフィー、網膜色素変性症、緑内障、網膜血管疾患、眼のウイルス感染、又は公知若しくは未知の病因の他の網膜/眼疾患と関連している、項目８１、８２、８３又は８４に記載の方法。
（項目８６）
項目１、２、３、５２、５３又は５４に記載の方法によって生産された哺乳動物の原始的網膜幹細胞(hpRSCs)と好適な担体とを含む組成物。
（項目８７）
項目２６に記載の方法によって生産された哺乳動物の網膜神経節細胞(RGCs)と好適な担体とを含む組成物。
（項目８８）
項目３６に記載の方法によって生産された哺乳動物の光受容細胞と好適な担体とを含む組成物。
（項目８９）
項目４７に記載の方法によって生産された哺乳動物の網膜色素上皮(RPE)又は哺乳動物の網膜色素上皮細胞(RPEs)と好適な担体とを含む組成物。
（項目９０）
哺乳動物の原始的網膜幹細胞(pRSCs)を生産するためのキットであって、フィーダー細胞、フィーダー馴化培地若しくは血清を含まない化学的に規定された培地中で哺乳動物由来の胚性幹細胞(ESCs)、多能性幹細胞(PSCs)若しくは人工多能性幹細胞(iPSC)を培養するための説明書、並びにWntシグナル伝達若しくはTGF-β/BMPシグナル伝達の小分子阻害剤、又はWnt及びTGF-β/BMPシグナル伝達の両方の阻害剤の使用のための説明書を含む、キット。
（項目９１）
Wntシグナル伝達若しくはTGF-β/BMPシグナル伝達の小分子阻害剤、又はWnt及びTGF-β/BMPシグナル伝達の両方の小分子阻害剤をさらに含む、項目９０に記載のキット。
（項目９２）
Wntシグナル伝達の小分子阻害剤が、C22H18N402S3の化学式を有するWnt生産-2の阻害剤(Inhibitor  of  Wnt  Production-2、IWP2;CAS番号686770-61-6)又はN-(6-メチル-1,3-ベンゾチアゾール-2-イル)-2-[(4-オキソ-3-フェニル-6,7-ジヒドロチエノ[3,2-d]ピリミジン-2-イル)スルファニル]アセトアミドであるか、又はそれを含む、項目９１に記載のキット。
（項目９３）
TGF-β/BMPシグナル伝達の小分子阻害剤が、トランスフォーミング増殖因子-ベータ(TGF-β)スーパーファミリーI型アクチビン受容体様キナーゼALK-4、-5、及び-7の小分子阻害剤である、項目９１に記載のキット。
（項目９４）
トランスフォーミング増殖因子-ベータ(TGF-β)スーパーファミリーI型アクチビン受容体様キナーゼALK-4、-5、及び-7の小分子阻害剤が、C22H16N403の化学式を有するSB431542(CAS番号301836-41-9)又は4-[4-(1,3-ベンゾジオキソール-5-イル)-5-(2-ピリジニル)-1H-イミダゾール-2-イル]ベンズアミドであるか、又はそれを含む、項目９３に記載のキット。
（項目９５）
TGF-β/BMPシグナル伝達の小分子阻害剤が、BMPI型受容体ALK-2及びALK-3の小分子阻害剤又はノギンアナログである、項目９１に記載のキット。
（項目９６）
BMP I型受容体ALK-2及びALK-3の小分子阻害剤又はノギンアナログが、C25H22N6の化学式を有するLDN-193189(CAS番号1062368-24-4)又は4-(6-(4-(ピペラジン-1-イル)フェニル)ピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-3-イル)キノリンであるか、又はそれを含む、項目９５に記載のキット。
（項目９７）
Wnt及びTGF-β/BMPシグナル伝達の両方の小分子阻害剤が、IWP2(CAS番号686770-61-6)、SB431542(CAS番号301836-41-9)、及びLDN-193189(CAS番号1062368-24-4)の組み合わせ、若しくは同等の組み合わせであり、ここで、この組み合わせは、Wnt及びTGF-β/BMPシグナル伝達活性の相乗的阻害を生じるか、又は、IWP2(CAS番号686770-61-6)、SB431542(CAS番号301836-41-9)、及びLDN-193189(CAS番号1062368-24-4)を含む組み合わせ、若しくは同等の組合せであり、ここで、この組み合わせは、Wnt及びTGF-β/BMPシグナル伝達活性の相乗的阻害を生じる、項目９１に記載のキット。
（項目９８）
哺乳動物に由来する胚性幹細胞(ESCs)、多能性幹細胞(PSCs)又は人工多能性幹細胞(iPSC)をさらに含む、項目９０又は９１に記載のキット。
（項目９９）
化学的に規定された培養培地及び/又は補充物をさらに含む、項目９０、９１又は９８に記載のキット。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】hESCsからhpRSCsの誘導。(a)in vitroにおけるヒト多能性幹細胞からヒト網膜細胞運命の方向付けられた誘導の略図。(b)誘導1週間後のhESCsに由来するhpRSCsにおける典型的な初期の眼領域転写因子PAX6(緑)及びLHX2(赤)の免疫蛍光標識の共焦点画像。細胞核を、ヘキスト33342(青)で対比染色した。(c)hpRSCsを、神経始原細胞/幹細胞マーカーネスチン(白)及び増殖マーカーKi67(緑)について染色した。(d)典型的な初期の眼領域転写因子の誘導発現のリアルタイムqPCR解析。スケールバー＝30μm。
【図２】hESCに由来するhpRSCsのトランスクリプトーム解析。hfRPCs、hpRSCs、及びhESC株HuES9において異なって制御される遺伝子の発現のヒートマップ。細胞型の教師なし(unsupervised)クラスタリングは、hfRPCsと親hESC株HuES9の間のhESC由来hpRSCsの過渡的な状態を示す。(a)ゲノムワイドトランスクリプトーム解析。(b)多能性制御。(c)TGF-βスーパーファミリーシグナル伝達経路。(d)Wntシグナル伝達経路。赤、高発現; 青、他の2つの細胞型と比較した低発現。(e)hpRSCsとhfRPCsの間のペアワイズ散布図解析。シグナル強度が、hfRPCs対hpRSCsにおいて転写産物について示される。対角線は、2つの細胞型間の遺伝子における等しい発現レベルを示す。*で示された遺伝子は、hpRSCの幹細胞性(stemness)及び特定化(specification)のために重要である。
【図３】hpRSCsは、化学的に規定された培養条件下で網膜神経節細胞(RGCs)の運命に特定され得る。(a)hpRSCsは、高効率でRGCsに分化することができる。RGC誘導のための条件下での2週間の培養後、分化した細胞は、長い神経突起を示し、BRN3(赤)及びTUJ1(緑)などの典型的なRGCマーカーを発現した。細胞核を、ヘキスト33342(青)で対比染色した。(b)hpRSCsから分化した細胞におけるRGC特異的転写因子の発現についてのリアルタイムqPCR解析。
【図４】規定された培養条件下での神経又は非神経網膜細胞の運命のいずれかへのhpRSC分化の特徴付け。(a〜d)リカバリン(a)、青オプシン(OPN1SW)(b)、及びロドプシン(c)の免疫細胞化学的検出、並びに光受容細胞特異的レポーターIRBP-GFPの発現(d)によって証明される光受容細胞誘導; 十分に分化した光受容細胞は、長い外部突起及び短い内部突起(d、挿入図)を有する典型的な形態を示した。(e〜g)RPE誘導; (e)RPE65(緑)の初期発現及びRPE細胞の多角形型を染色するファロイジン(赤)によって実証されるRPE形成; (f)培養の3週間後に観察された上昇したRPE65発現(赤); (g)培養の長期成熟後に現れた色素性RPE。(a〜f)細胞核を、ヘキスト33342(青)で対比染色した。
【図５】新生ヌードラットにおける移植されたhpRSCsのin vivo融合(integration)及び分化。hpRSCsの移植後の網膜の免疫組織化学的に染色された凍結切片の共焦点画像。移植されたGFP(緑)発現ヒト細胞の顕著な融合が、レシピエントの神経網膜で観察された。一部のGFP発現細胞は、リカバリン(白)陽性細胞と共局在した(a、c、e); 網膜始原細胞マーカーネスチン(赤)の免疫染色は、多くの移植されたGFP発現細胞において検出された(b、d、f)。細胞核を、ヘキスト33342(青)で対比染色した。スケールバー: a〜d＝30μm; e〜f＝15μm。
【図６】移植2ヶ月後のRCSラットの光受容細胞層における移植されたhpRSCsの融合及び分化。(a)移植された細胞は、HSA抗体による免疫細胞化学的標識を受けた(赤)。移植された細胞の一部は、リカバリン(緑)発現光受容細胞の運命を取った(矢頭)。(b)hpRSCに由来する錐体視細胞(矢頭)は、赤/緑オプシン(緑)及びHSA(赤)の両方について陽性であった。細胞核を、ヘキスト33342(青)で対比染色した。スケールバー＝20μm。
【図７】hfRPCs、HuES9、及びHuES9由来hpRSCsにおけるFGF(a)、Notch(b)、及びヘッジホッグシグナル伝達経路(c)に関与する遺伝子についての発現の代表的なヒートマップ。*で標識された遺伝子は、網膜形成(retinogenesis)に重要であることが知られている。
【図８】P21でのヌードラットにおけるHAMCヒドロゲルの非存在下(a)又は存在下(b)におけるhpRSCsのin vivo移植。網膜切片は、移植6週後に処理した。ヒドロゲルの非存在下では、より少ないhpRSCsが生存し、多くの場合、網膜下腔で瘢痕組織に囲まれていた。HAMCヒドロゲルの存在下では、移植されたhpRSCsは、網膜下腔にわたり、かつ神経網膜層において広がった。移植されたhpRSCsは、ヒト核抗原染色(緑)で標識された。細胞核を、ヘキスト33342(青)で対比染色した。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
別途定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で言及される全ての特許、出願、公開された出願及び他の刊行物は、その全体が参照により組み込まれる。
【００１９】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形の「1つの(a)」、「1つの(an)」、及び「その(the)」は、文脈が明確に他に指示しない限り、複数の言及を含むことに留意する必要がある。したがって、例えば、「製剤(a formulation)」への言及は、複数の化合物を含む。
【００２０】
本明細書で使用される場合、用語「約」は、数字表示、例えば温度、時間、量、濃度等(範囲を含む)の前に使用される場合、(＋)又は(−)10％、5％又は1％変化し得る近似値を示す。
【００２１】
本発明の方法
単離された哺乳動物の原始的網膜幹細胞(pRSCs)を生産する方法
本発明は、単離された哺乳動物pRSCsを生産するためのin vitro方法を提供する。本発明の方法の利点は、細胞移植又はグラフティングの前に細胞分画又は細胞精製の必要なしに、被験体の眼への細胞移植又はグラフティングに好適であるのに十分な量及び質の単離された哺乳動物原始的網膜幹細胞を生産できることを含む。
【００２２】
本明細書で使用される場合、単離されたpRSCsは、例えば、混入物(例えば、pRSCsではない細胞など)から実質的に分離されたpRSCsを意味する。
【００２３】
本発明の一実施形態では、この方法は、フィーダー細胞、フィーダー馴化培地又は血清を含まない細胞培養培地中で哺乳動物由来の単離された胚性幹細胞(ESCs)を培養し、単離ESCsの培養物を生産し、増殖させるステップ、及び単離ESCsの培養物を、Wnt又はTGFβ/BMPシグナル伝達の阻害剤の1つ以上と接触させ、単離ESCsを原始的網膜幹細胞に分化させ、それによって単離哺乳動物pRSCsを生産するステップを含む。一実施形態では、Wnt又はTGFβ/BMPシグナル伝達の阻害剤の1つ以上は、Wnt及びTGF-β/BMPシグナル伝達の阻害剤の組み合わせである。単離PSCsの培養物は、接着培養物であってもよい。好ましい実施形態では、単離ESCsの培養物は、単層培養物である。一実施形態では、単離ESCsの培養物の培養は、Wnt若しくはTGFβ/BMPシグナル伝達の阻害剤の1つ以上、又はWnt及びTGF-β/BMPシグナル伝達の阻害剤の組み合わせと接触させる前に、コンフルエンス近くまで増殖される。好ましい実施形態では、Wnt又はTGFβ/BMPシグナル伝達の阻害剤は、小分子阻害剤である。
【００２４】
本明細書で使用される場合、単離されたESCsは、混入物(例えば、ESCsではない細胞など)から実質的に分離されたESCsを意味する。
【００２５】
本発明の文脈において使用される場合、シグナル伝達は、細胞タンパク質の群が、1つ以上の細胞機能を制御するために関与する、シグナル伝達経路(1つ又は複数)を指す。シグナル、例えばリガンドは、経路の最初のメンバーとして機能する、シグナルの受容体を介してシグナル伝達経路を活性化させる; シグナルとその受容体との間のこの相互作用は、一連のイベントを開始し、これが、下流メンバーの生物活性又は生物学的状態にその後の変化を引き起こし、最終的に細胞機能の変化につながる。したがって、細胞機能の変化は、シグナルに関連するシグナル伝達経路を活性化するシグナルの結果である。シグナルはまた、例えばWnt又はTGF-βシグナル伝達などにおける、2つ以上のシグナル伝達経路を活性化し得る。さらに、シグナル伝達経路は、2つ以上の経路内の共有メンバーを介してクロストークを示し得る。
【００２６】
多くの場合、シグナル伝達経路は、Wnt、TGF-β、BMP又はヘッジホッグシグナル伝達におけるそれぞれWnt、TGF-β、骨形成タンパク質(BMP)又はヘッジホッグリガンドなどの、経路を活性化するリガンドタンパク質又はシグナルにちなんで命名される。例えば、Wntタンパク質リガンドは、その受容体フリズルド(Frizzled)に結合するとWntシグナル伝達を開始し得る; TGF-βタンパク質リガンド又はリガンドのTGF-βスーパーファミリーのメンバー(アクチビン及びBMPを含む)は、TGF-βII型受容体に結合すると、TGF-βシグナル伝達を開始することができ、I型受容体との組み合わせで、リガンドのTGF-βスーパーファミリーのためのリガンド特異的シグナル伝達に関与する; BMPは、骨形成タンパク質受容体2型(BMPR2)に結合すると、BMPシグナル伝達を開始し得る; ヘッジホッグタンパク質リガンドは、その受容体パッチド(Patched)に結合すると、ヘッジホッグシグナル伝達を開始し得る。代替的に、シグナル伝達経路は、活性化すると遺伝子発現の制御などの1つ以上の細胞機能を制御するためにその活性化状態を下流に伝達する、Notchシグナル伝達におけるNotch受容体など、シグナル又はリガンドのレシピエントにちなんで命名され得る。
【００２７】
さらに、TGF-βシグナル伝達では、リガンドのTGF-βスーパーファミリー(例えばTGF-β、アクチビン又はBMP)の、そのそれぞれのII型受容体(例えばTGF-β受容体II型、アクチビン受容体II型又はBMP受容体II型)への結合は、受容体活性化、及び7つのI型受容体のうちの1つの続く活性化をもたらすことができ、これらの7つのI型受容体は、2つの異なる群に分類される: TGF-β/アクチビンサブグループ(TGF-βスーパーファミリーI型受容体アクチビン受容体様キナーゼ、ALK-4、ALK-5及びALK-7を含む); 及びBMPサブグループ(ALK-1、ALK-2、ALK-3、及びALK-6I型受容体を含む)。これらの異なるサブグループの両方は、転写因子のSMADファミリーの制御に関与し、遺伝子転写を制御する。
【００２８】
本発明の文脈において同等物(equivalent)は、置換される化合物又は物質と同じ又は類似の機能を果たし得る同等の化合物又は物質を指す。そのような同等性は、化合物を特徴付けするために使用した同様のアッセイを用いて、特定のシグナル伝達経路を阻害又は活性化する能力に基づいて決定し得る(化合物が置換される、又は好ましい若しくは最も好ましい化合物が置換されるため)。本発明の最も好ましい化合物は、以下である: Wntシグナル伝達を阻害するためのIWP2、TGF-βスーパーファミリーI型アクチビン受容体様キナーゼALK-4、ALK-5及びALK-7の阻害のためのSB431542、BMP I型受容体ALK-2及びALK-3の阻害のためのLDN-193189、Notchシグナル伝達の阻害のためのDAPT、VEGFRシグナル伝達の阻害のためのPD173074、グリコーゲンシンターゼキナーゼ-3の阻害のためのCHIR99021、ヘッジホッグシグナル伝達の活性化のためのプルモルファミン(purmorphamine)、又はレチノイン酸シグナル伝達(RAR複合体を介するものなど)を活性化するためのレチノイン酸。
【００２９】
規定された培地又は化学的に規定された培地は、培地が、血清及びフィーダー馴化培地などの、明確に定義されない成分を実質的に含まないという事実を指す。化学的に規定された培地は、脱イオン水又は蒸留水を含む、化学成分を用いて製造し得る。これは、精製されたタンパク質、例えば増殖因子、及び血清タンパク質、例えばアルブミン、好ましくは組換えタンパク質、アミノ酸(必須及び/又は非必須)、ビタミン、塩、脂質、糖、ピルビン酸、緩衝剤、微量金属、還元剤、及び指示色素を含み得る。さらに、培地には、ホルモン、受容体リガンド、代謝産物、アミノスルホン酸、阻害因子、モルフォゲン、細胞シグナル伝達分子、並びに細胞シグナル伝達若しくはキナーゼ活性の活性化因子若しくは阻害剤を補充してもよい。細胞を培養するための、規定された培地又は化学的に規定された培地の使用は、細胞ベースの置換療法に有利である。
【００３０】
本発明の実施において、単層培養物を、ほぼコンフルエント、コンフルエンシー近く、又はコンフルエントまで増殖させてもよい。一実施形態では、ほぼコンフルエント又はコンフルエンシー近くは、約70％のコンフルエンス又はコンフルエンシー、好ましくは約80％のコンフルエンス又はコンフルエンシーであってもよい。約80％コンフルエントな細胞培養物のさらなる培養及びそのような培養物の増殖は、ほぼコンフルエント又はコンフルエンシー近くと記載してよく、ここで、コンフルエンスは、約90％又はそれ以上であってもよい。コンフルエンスでは、細胞は、培養表面全体が細胞で覆われて詰め込まれ、全ての細胞が互いに接触している。さらに、本発明の一実施形態では、培養された細胞は、固体支持体を使用して培養又は増殖させてもよい。場合により、固体支持体は、Matrigel(登録商標)又は基底膜で被覆されてもよい。さらに、Matrigel(登録商標)又は基底膜は、増殖因子が低減されたMatrigel(登録商標)又は増殖因子が低減された基底膜であってもよい。代替的実施形態では、固体支持体は、増殖因子が低減された基底膜で被覆され、増殖因子が低減されたMatrigel(登録商標)(BD Biosciences)、Geltrex(登録商標)LDEVフリーのhESCに適した、増殖因子低減基底膜マトリックス(Geltrex LDEV-Free hESC-qualified Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix)又はそれらの同等物若しくは混合物で被覆された組織培養プレート、トレー、フラスコ、又はマイクロビーズにおいて増殖させてもよい。
【００３１】
本発明の一実施形態では、本方法は、フィーダー細胞、フィーダー馴化培地又は血清を含まない細胞培養培地中で哺乳動物由来の単離された多能性幹細胞(PSCs)を培養し、単離PSCsの培養物を生産し、増殖させるステップ、及び単離PSCsの培養物を、Wnt又はTGF-β/BMPシグナル伝達の阻害剤の1つ以上と接触させ、単離PSCsをpRSCsに分化させ、それによって単離哺乳動物pRSCsを生産するステップを含む。一実施形態では、Wnt又はTGFβ/BMPシグナル伝達の阻害剤の1つ以上は、Wnt及びTGF-β/BMPシグナル伝達の阻害剤の組み合わせである。単離PSCsの培養物は、接着培養物であってもよい。好ましい実施形態では、単離ESCsの培養物は、単層培養物である。一実施形態では、単離PSCsの培養物の培養は、Wnt若しくはTGFβ/BMPシグナル伝達の阻害剤の1つ以上、又はWnt及びTGF-β/BMPシグナル伝達の阻害剤の組み合わせと接触させる前に、コンフルエンス近くまで増殖される。好ましい実施形態では、Wnt又はTGFβ/BMPシグナル伝達の阻害剤は、小分子阻害剤である。本発明の実施では、哺乳動物由来の人工多能性幹細胞(iPSCs)を、単離PSCsの代わりに同様に処理し、単離哺乳動物pRSCsを生産してもよい。
【００３２】
本明細書で使用される場合、単離されたPSCsは、例えば、混入物(例えば、PSCsではない細胞など)から実質的に分離されたPSCsを意味する。
【００３３】
本明細書で使用される場合、単離されたiPSCsは、例えば、混入物(例えば、iPSCsではない細胞など)から実質的に分離されたiPSCsを意味する。
【００３４】
一実施形態では、本発明の方法は、Wnt若しくはTGF-β/BMPシグナル伝達の阻害剤の1つ以上、又はWnt及びTGF-β/BMPシグナル伝達の阻害剤の組み合わせによる処理の例えば約7日以内に、約90％を超える効率で、単離された哺乳動物の原始的網膜幹細胞を生産する。好ましい実施形態では、Wnt又はTGF-β/BMPシグナル伝達の阻害剤は、小分子阻害剤である。
【００３５】
小分子は、900ダルトン未満、好ましくは約500ダルトン以下である低分子量有機化合物である。例えば、いくつかの実施形態では、本発明で使用される低分子は、IWP2について466.6ダルトン、SB431542について384.39ダルトン、LDN-193189について406.48ダルトン、CHIR-99021について465.34ダルトン、DAPTについて432.46ダルトン、PD173074について523.67、又はプルモルファミンについて520.62ダルトンの分子量を有する。小分子は、特定のタンパク質又は核酸に結合し、タンパク質又は核酸の活性又は機能を変化させる。このように、小分子は、生物学的活性を有し、生物学的過程を制御し得る。
【００３６】
本発明の文脈において使用される場合、小分子阻害剤は、細胞シグナル伝達経路の阻害剤である。小分子阻害剤は、リガンド又はタンパク質リガンドのその受容体への結合など、活性化シグナルと競合することにより機能し得る。これは、活性化シグナルの伝播に必要なタンパク質-タンパク質相互作用を阻止することによって機能し得る。これは、経路を介する活性化シグナルの伝達を破壊するように、シグナル伝達経路のメンバーのいずれか1つの活性を阻害するために機能し得る。例えば、アクチビン又はTGF-βが結合するII型受容体の下流である、TGF-βスーパーファミリーI型ALK-4、-5、及び-7受容体の活性を選択的かつ強力に阻害することによる、SB431542などの小分子阻害剤は、アクチビン又はTGF-βのSMAD2及びSMAD3転写因子へのシグナル伝達をさらにブロックする。
【００３７】
小分子阻害剤とは異なり、シグナル伝達経路の小分子活性化因子は、シグナル伝達(例えば、Wnt、TGF-β/BMP、Notch、VEGFR、ヘッジホッグ、又はSMADシグナル伝達)の小分子活性化因子とも呼ばれ、経路を活性化することによってシグナル伝達経路を調節する。シグナル伝達又はシグナル伝達経路の小分子阻害剤と同様に、シグナル伝達又はシグナル伝達経路の小分子活性化因子は、経路の様々なメンバーを介して経路の任意のステップ又は位置で経路を活性化し得る。多くの場合、特定の受容体とのアゴニストリガンド相互作用を介して、経路の開始時のシグナル伝達経路を活性化することが望ましいかもしれないが、必ずしもそうである必要はない。ヘッジホッグシグナル伝達の小分子活性化因子の場合には、プルモルファミンは、ヘッジホッグシグナル伝達における重要なコンポーネントであるスムーズンド(Smoothened)のアゴニストとして作用することにより、ヘッジホッグシグナル伝達経路の下流を活性化する。
【００３８】
シグナル伝達経路のモジュレーターは、シグナル伝達経路の活性化因子又は阻害剤であってよい。これは小分子であってもよい。
【００３９】
本発明の実施では、シグナル伝達又はキナーゼの阻害剤、活性化因子又はモジュレーターの好ましい実施形態は、シグナル伝達又はキナーゼの小分子阻害剤、小分子活性化因子又は小分子モジュレーターである。
【００４０】
Wnt及びTGF-β/BMPシグナル伝達又はシグナル伝達活性の相乗的阻害は、Wntシグナル伝達を阻害し、TGF-β及びBMPシグナル伝達を阻害する結果を指し、ここで、この結果は、Wntシグナル伝達のみを阻害する結果と、TGF-β及びBMPシグナル伝達のみを阻害する結果との単なる相加的結果を超えるものである。相乗作用は、Wntシグナル伝達のコンポーネントとTGF-β及びBMPシグナル伝達のコンポーネントとの間の相互作用、例えば、標的遺伝子の相乗的活性化をもたらす、β-カテニン及びLefl/Tcf(Wntシグナル伝達の下流コンポーネント)と、Smad4(coSMAD、及びTGF-β及びBMPシグナル伝達の重要なメディエーター)との間の転写因子複合体の形成、に起因して生じ得る(Nishita et al., Nature 403, 781-785 (2000))。
【００４１】
Wntシグナル伝達の小分子阻害剤の例としては、限定されないが、以下が挙げられる: Wnt生産-1の阻害剤(inhibitor of Wnt Production-1、IWP-1)、Wnt生産-2の阻害剤(Inhibitor of Wnt Production-2、IWP2)、JW55、JW74、オカダ酸、トートマイシン(tautomycin)、SB239063、SB203580、ADP-HPD、2-[4-(4-フルオロフェニル)ピペラジン-1-イル]-6-メチルピリミジン-4(3H)-オン、PJ34、カンビノール(cambinol)、スリンダク(sulindac)、3289-8625、ディシェベルド(Dishevelled)タンパク質を阻害するように設計された一連のアナログについてのスキャフォールドA、ディシェベルドタンパク質を阻害するように設計された一連のアナログについてのスキャフォールドB、J01-017a、NSC668036、フィリピン(filipin)、IC261、PF670462、ボスチニブ(Bosutinib)、PHA665752、イマチニブ(Imatinib)、ICG-001、エタクリン酸、エタクリン酸誘導体、PKF115-584、PNU-74654、PKF118-744、CGP049090、PKF118-310、ZTM000990、BC21、GDC-0941、Rp-8-Br-cAMP、LGK974、C59、Ant 1.4Br/Ant 1.4CI、ニクロサミド(niclosamide)、アピクラレン(apicularen)、バフィロマイシン(bafilomycin)、XAV939、IWR1、ピルビニウム(pyrvinium)、NSC668036、2,4-ジアミノ-キナゾリン、クエルセチン(quercetin)、及びPKF115-584、並びにそれらの同等物及び組み合わせ。
【００４２】
単なる例として、Wntシグナル伝達の阻害剤は、Wnt生産-2(Wnt Production-2)の小分子阻害剤又はDkk1アナログであってもよい。Wnt生産-2の小分子阻害剤又はDkk1アナログの好適な例としては、限定されないが、C22H18N4O2S3の化学式及び以下の化学構造:
【化１】
0006651440.tif 000005
を有する、Wnt生産-2の阻害剤(Inhibitor of Wnt Production-2、IWP2; CAS番号686770-61-6)又はN-(6-メチル-1,3-ベンゾチアゾール-2-イル)-2-[(4-オキソ-3-フェニル-6,7-ジヒドロチエノ[3,2-d]ピリミジン-2-イル)スルファニル]アセトアミドが挙げられる。
【００４３】
TGF-β/BMPシグナル伝達の小分子阻害剤の好適な例としては、限定されないが、以下が挙げられる: SB431542(4-[4-(1,3-ベンゾジオキソール-5-イル)-5-(2-ピリジニル)-1H-イミダゾール-2-イル]ベンズアミド)、A 83-01(3-(6-メチル-2-ピリジニル)-N-フェニル-4-(4-キノリニル)-1H-ピラゾール-1-カルボチオアミド)、SJN 2511(2-(3-(6-メチルピリジン-2-イル)-1H-ピラゾール-4-イル)-1,5-ナフチリジン)、D 4476(4-[4-(2,3-ジヒドロ-1,4-ベンゾジオキシン-6-イル)-5-(2-ピリジニル)-1H-イミダゾール-2-イル]ベンズアミド)、LY 364947(4-[3-(2-ピリジニル)-1H-ピラゾール-4-イル]-キノリン)、SB 525334(6-[2-(1,1-ジメチルエチル)-5-(6-メチル-2-ピリジニル)-1H-イミダゾール-4-イル]キノキサリン)、SD 208(2-(5-クロロ-2-フルオロフェニル)-4-[(4-ピリジル)アミノ]プテリジン)、及びLDN-193189(4-(6-(4-(ピペラジン-1-イル)フェニル)ピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-3-イル)キノリン)並びにそれらの同等物及び組み合わせ。
【００４４】
一実施形態では、TGF-β/BMPシグナル伝達の阻害剤はまた、トランスフォーミング増殖因子-ベータ(TGF-β)スーパーファミリーI型アクチビン受容体様キナーゼALK-4、-5、又は-7の小分子阻害剤であってもよい。好ましい実施形態では、TGF-β/BMPシグナル伝達の阻害剤はまた、トランスフォーミング増殖因子-ベータ(TGF-β)スーパーファミリーI型アクチビン受容体様キナーゼALK-4、-5、及び-7の小分子阻害剤であってもよい。
【００４５】
さらに、トランスフォーミング増殖因子-ベータ(TGF-β)スーパーファミリーI型アクチビン受容体様キナーゼALK-4、-5、及び-7の小分子阻害剤は、C22H16N4O3の化学式及び以下の化学構造:
【化２】
0006651440.tif 000006
を有する、SB431542(CAS番号301836-41-9)又は4-[4-(1,3-ベンゾジオキソール-5-イル)-5-(2-ピリジニル)-1H-イミダゾール-2-イル]ベンズアミドであってもよく、又はそれを含んでもよい。
【００４６】
さらに、TGF-β/BMPシグナル伝達の阻害剤は、BMP I型受容体ALK-2若しくはALK-3の小分子阻害剤又はノギン(noggin)アナログであってよく、又はそれを含んでよい。好ましい実施形態では、TGF-β/BMPシグナル伝達の阻害剤は、BMP I型受容体ALK-2及びALK-3の小分子阻害剤又はノギンアナログであってよく、又はそれを含んでよい。
【００４７】
また、BMP I型受容体ALK-2及びALK-3の小分子阻害剤又はノギンアナログは、C25H22N6の化学式及び以下の化学構造:
【化３】
0006651440.tif 000007
を有する、LDN-193189(CAS番号1062368-24-4)又は4-(6-(4-(ピペラジン-1-イル)フェニル)ピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-3-イル)キノリンであってよく、又はそれを含んでもよい。
【００４８】
さらに、Wnt及びTGF-β/BMPシグナル伝達の阻害剤の組み合わせは、(a)Wnt生産-2の1つ以上の阻害剤又はDkk1アナログ; (b)トランスフォーミング増殖因子-ベータ(TGF-β)スーパーファミリーI型アクチビン受容体様キナーゼALK-4、-5、及び-7の1つ以上の阻害剤; 及び(c)BMP I型受容体ALK-2及びALK-3の1つ以上の阻害剤又はノギンアナログの組み合わせであってよく、又はそれを含んでもよく、ここで、該組み合わせは、少なくとも2つのシグナル伝達経路の阻害剤又は好ましくは3つ全てのシグナル伝達経路の阻害剤を含む。阻害剤は、小分子であり得る。
【００４９】
さらにまた、Wnt及びTGF-β/BMPシグナル伝達活性の阻害剤の組み合わせは、IWP2(CAS番号686770-61-6)、SB431542(CAS番号301836-41-9)、及びLDN-193189(CAS番号1062368-24-4)の少なくとも2つ、好ましくは3つ全ての組み合わせ、又は同等の組み合わせであってよく、ここで、該組み合わせは、Wnt及びTGF-β/BMPシグナル伝達活性の相乗的阻害を生じ、あるいは、IWP2(CAS番号686770-61-6)、SB431542(CAS番号301836-41-9)、及びLDN-193189(CAS番号1062368-24-4)の少なくとも2つ、好ましくは3つ全てを含む組み合わせ、又は同等の組み合わせであってもよく、ここで、該組み合わせは、Wnt及びTGF-β/BMPシグナル伝達活性の相乗的阻害を生じる。
【００５０】
本発明の一実施形態では、単離された哺乳動物の原始的網膜幹細胞は、全細胞集団の約90％を超えてもよく、及び眼領域始原細胞によって発現されるPAX6及びLHX2転写因子の両方について陽性である。
【００５１】
別の実施形態では、単離された哺乳動物の原始的網膜幹細胞は、典型的な初期眼領域転写因子であるPAX6、LHX2、RAX、OTX2、SIX3及び/又はSIX6の発現について陽性であってよい。
【００５２】
さらなる実施形態では、単離された哺乳動物の原始的網膜幹細胞は、原始的神経上皮幹細胞の典型的なマーカーである幹細胞性因子SOX2、ネスチン及びSTAT3の発現について陽性であってもよい。
【００５３】
またさらなる実施形態では、単離された哺乳動物の原始的網膜幹細胞は、細胞増殖のマーカーであるKi67の発現について陽性であってよい。
【００５４】
さらなる実施形態では、単離された哺乳動物の原始的網膜幹細胞は、ESCsと比較して、ESC多能性転写因子、POU5F1(OCT4)、NANOG、KLF4及びTBX3遺伝子、並びにTBF-βスーパーファミリー遺伝子、SMAD1、SMAD2、TGFβ3、BMP3、BMP6、TGFBR1、及びBMPR1Bの転写を下方制御する。
【００５５】
さらなる実施形態では、単離された哺乳動物の原始的網膜幹細胞は、ESCsにおけるのと同じレベルであるが、胎児網膜始原細胞におけるよりも顕著に高いレベルで、LIN28及びSALL4転写因子遺伝子の転写を維持する。
【００５６】
さらなる実施形態では、単離された哺乳動物の原始的網膜幹細胞は、胎児網膜始原細胞と比較して、BMP4及びBMP7遺伝子、並びにOTX2、RAX、LHX2、SIX3、及びSIX6遺伝子の転写を上方制御する。
【００５７】
さらなる実施形態では、単離された哺乳動物の原始的網膜幹細胞は、SRFP1及びFZD3/5遺伝子の転写について強く陽性である。
【００５８】
さらなる実施形態では、単離された哺乳動物の原始的網膜幹細胞は、胎児網膜始原細胞と比較して、FGFR1/2/3及びFGF3/8遺伝子の転写を下方制御する。
【００５９】
さらなる実施形態では、単離された哺乳動物pRSCsは、分化の小分子誘導剤を用いてin vitroで特定の網膜細胞運命に向かって分化するように方向付けられる。
【００６０】
さらなる実施形態では、特定の網膜細胞運命は、神経網膜細胞及び非神経細胞を含む。
【００６１】
さらなる実施形態では、神経網膜細胞は、網膜神経節細胞(RGCs)及び光受容細胞を含む。
【００６２】
さらなる実施形態では、非神経細胞は、網膜色素上皮(RPE)又は網膜色素上皮細胞(RPEs)の細胞を含む。
【００６３】
好適な細胞培養培地の例
一実施形態では、補充物(複数可)あり又はなしの1つ以上の規定された培地は、以下を含む： DMEM/F12若しくは同等の培地; グルタミン若しくはL-アラニル-L-グルタミン(GlutaMAX(登録商標)); StemPro(登録商標) hESC補充物若しくは同等物; ウシ血清アルブミン若しくは同等物; 塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF-塩基性)若しくは同等物; 並びに2-メルカプトエタノール若しくは同等物。
【００６４】
別の実施形態では、補充物(複数可)あり又はなしの1つ以上の規定された培地は、以下を含む： DMEM/F12若しくは同等の培地; 約2.3mM グルタミン若しくはL-アラニル-L-グルタミン(GlutaMAX(登録商標)); 1×StemPro(登録商標) hESC補充物若しくは同等物; 約1.8％ウシ血清アルブミン若しくは同等物; 約8ng/mL 塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF-塩基性)若しくは同等物; 並びに約0.1mM 2-メルカプトエタノール若しくは同等物。
【００６５】
またさらなる実施形態では、補充物(複数可)あり又はなしの1つ以上の規定された培地は、以下を含む、無血清N2B27プライミング培地であってよい： DMEM/F12若しくは同等の培地; N-2補充物若しくは同等物; B-27無血清補充物若しくは同等物; グルタミン若しくはL-アラニル-L-グルタミン(GlutaMAX(登録商標)); ウシ血清アルブミン若しくは同等物; MEM非必須アミノ酸若しくは同等物; 並びに2-メルカプトエタノール若しくは同等物。さらに、培地の一実施形態は、塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF-塩基性)又は同等物を補充した無血清N2B27プライミング培地である。さらに、別の実施形態では、培地は、以下を含んでよい: DMEM/F12若しくは同等の培地; 1×N-2補充物若しくは同等物; 1×B-27無血清補充物若しくは同等物; 約2mM グルタミン若しくはL-アラニル-L-グルタミン(GlutaMAX(登録商標)); 約0.2％ウシ血清アルブミン若しくは同等物; 約0.1mM MEM非必須アミノ酸若しくは同等物; 並びに約0.1mM 2-メルカプトエタノール若しくは同等物。さらに、培地の別の実施形態は、約20ng/mL 塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF-塩基性)又は同等物を補充した無血清N2B27プライミング培地である。
【００６６】
一実施形態では、補充物(複数可)あり又はなしの規定された培地は、IWP2(CAS番号686770-61-6)、SB431542(CAS番号301836-41-9)、又はLDN-193189(CAS番号1062368-24-4)又は同等物をさらに含み得る。好ましい実施形態では、補充物(複数可)あり又はなしの規定された培地は、IWP2(CAS番号686770-61-6)、SB431542(CAS番号301836-41-9)、又はLDN-193189(CAS番号1062368-24-4)又は同等物の少なくとも2つ、好ましくは3つ全てをさらに含んでよい。
【００６７】
一実施形態では、補充物(複数可)あり又はなしの1つ以上の規定された培地は、約1μM IWP2、約5μM SB431542又は約50nM LDN193189をさらに含み得る。好ましい実施形態では、補充物(複数可)あり又はなしの1つ以上の規定された培地は、約1μM IWP2、約5μM SB431542及び約50nM LDN193189の少なくとも2つ、好ましくは3つ全てをさらに含んでもよい。
【００６８】
別の実施形態では、規定された培地は、Wnt又はTGF-β/BMPシグナル伝達の阻害剤の1つ以上、又はより好ましくはWnt及びTGF-β/BMPシグナル伝達の小分子阻害剤の組み合わせを補充した、無血清N2B27プライミング培地であってよい。さらに、培地は、補充物(複数可)を含有してもよく、又は含有しなくてもよく、フィーダー細胞、フィーダー馴化培地又は血清を含有しない。さらにまた、培地は、Wnt及びTGF-β/BMPシグナル伝達の小分子阻害剤の組み合わせをさらに含んでもよい。好ましい実施形態では、培地は以下を含んでもよい: DMEM/F12若しくは同等の培地; N-2補充物若しくは同等物; B-27無血清補充物若しくは同等物; グルタミン若しくはL-アラニル-L-グルタミン(GlutaMAX(登録商標)); ウシ血清アルブミン若しくは同等物; MEM非必須アミノ酸若しくは同等物; 2-メルカプトエタノール若しくは同等物; 並びに以下の1つ以上、好ましくは少なくとも2つ、最も好ましくは3つ全ての組み合わせ: IWP2(CAS番号686770-61-6)若しくは同等物; SB431542(CAS番号301836-41-9)若しくは同等物; 及びLDN-193189(CAS番号1062368-24-4)若しくは同等物。
【００６９】
より好ましい実施形態では、規定された培地は、Wnt又はTGF-β/BMPシグナル伝達の阻害剤の1つ以上、又はより好ましくはWnt及びTGF-β/BMPシグナル伝達活性の小分子阻害剤の組み合わせを補充したプライミング培地であり、かつ、以下をさらに含む: DMEM/F1若しくは同等の培地; 1×N-2補充物若しくは同等物; 1×B-27無血清補充物若しくは同等物; 約2mM グルタミン若しくはL-アラニル-L-グルタミン(GlutaMAX(登録商標)); 約0.2％ウシ血清アルブミン若しくは同等物; 約0.1mM MEM非必須アミノ酸若しくは同等物; 約0.1mM 2-メルカプトエタノール若しくは同等物; 並びに以下の1つ以上、好ましくは少なくとも2つ、最も好ましくは3つ全ての組み合わせ: 約1μM IWP2(CAS番号686770-61-6)若しくは同等物; 約5μM SB431542(CAS番号301836-41-9)若しくは同等物; 及び約50nM LDN-193189(CAS番号1062368-24-4)若しくは同等物。
【００７０】
一実施形態では、単離された哺乳動物pRSCsは、本発明のWnt及びTGF-β/BMPシグナル伝達活性の小分子阻害剤の組み合わせを補充した無血清N2B27プライミング培地中で維持及び/又は増殖し得る。
【００７１】
単離された哺乳動物の網膜神経節細胞(RGCs)の生産のためのin vitro方法
本発明はさらに、単離された哺乳動物の網膜神経節細胞(RGCs)を生産するためのin vitro方法を提供する。この方法は、フィーダー細胞、フィーダー馴化培地又は血清を含まない細胞培養培地中で哺乳動物由来の単離された原始的網膜幹細胞(pRSCs)を培養し、単離pRSCsの単層培養物を生産し、増殖させるステップ、及び単離pRSCsの培養物を、Wnt、Notch、又はVEGFRシグナル伝達の阻害剤の1つ以上と接触させ、単離pRSCsを単離哺乳動物RGCsに分化させるステップを含む。一実施形態では、細胞は、固体支持体上で培養され得る。固体支持体は、例えばMatrigel(登録商標)又は基底膜又は同等物で被覆され得る。Matrigel(登録商標)又は基底膜は、増殖因子が低減されたMatrigel(登録商標)又は増殖因子が低減された基底膜であってもよい。本発明の一実施形態では、細胞は、2週間を超えて培養され、成長及び増殖させてもよい。
【００７２】
本明細書で使用される場合、単離されたRGCsは、例えば、混入物(例えば、RGCsではない細胞など)から実質的に分離されたRGCsを意味する。
【００７３】
Wnt、Notch、又はVEGFRシグナル伝達の阻害剤は、小分子阻害剤であってもよい。一実施形態では、Wnt、Notch、又はVEGFRシグナル伝達の阻害剤の1つ以上は、少なくとも2つのシグナル伝達経路の阻害剤の組み合わせである。場合により、組み合わせは、3つ全てのシグナル伝達経路の阻害剤を含んでよい。
【００７４】
一実施形態では、単離されたpRSCsの培養物は、単層培養物である。さらに、単層培養物は、ほぼコンフルエント、又はコンフルエントであってもよい。
【００７５】
一実施形態では、フィーダー細胞、フィーダー馴化培地又は血清を含まない細胞培養培地は、化学的に規定された培地である。化学的に規定された培地は、フィーダー細胞、フィーダー馴化培地又は血清を含まない、N2B27プライミング培地又は同等物であってもよい。
【００７６】
一実施形態では、Wnt、Notch、及びVEGFRシグナル伝達の阻害剤の組み合わせは、それぞれ、IWP2、DAPT、及びPD173074であってもよい。IWP2、DAPT、及びPD173074は、約1μM IWP2、約10μM DAPT、及び約200nM PD173074の濃度で使用し得る。
【００７７】
一実施形態では、単離された哺乳動物pRSCsは、単離された哺乳動物のRGCsを得るために、Wnt、Notch、及びVEGFRシグナル伝達の小分子阻害剤を補充した化学的に規定された培地中で、2週間を超えて培養され得る。
【００７８】
一実施形態では、RGC前駆細胞特異的転写因子遺伝子の上方制御は、Wnt、Notch、及びVEGFRシグナル伝達の小分子阻害剤を補充した化学的に規定された培地中で、培養の最初の約6日後に生じ得る。RGC前駆細胞特異的転写因子遺伝子の上方制御は、ESCsと比較して、BRN3A、BRN3B、ISL-1及びMATH5を含み得る。
【００７９】
一実施形態では、培養物中の細胞の大部分は、Wnt、Notch、及びVEGFRシグナル伝達の小分子阻害剤を補充した化学的に規定された培地中で、2週間後にRGCsのマーカーについて陽性であり得る。さらに、RGCsのマーカーについて陽性である培養物中の細胞の大部分は、TUJ1及びBRN3について陽性であり得る。
【００８０】
単離された哺乳動物の光受容細胞を生産する方法
本発明はまた、フィーダー細胞、フィーダー馴化培地又は血清を含まないin vitroにおける化学的に規定された条件下で、単離哺乳動物pRSCsから単離哺乳動物光受容細胞を生産する方法であって、TGF-β/アクチビン受容体様キナーゼALK-4、-5若しくは-7、グリコーゲンシンターゼキナーゼ-3(GSK-3)、Notch若しくはWntシグナル伝達の阻害剤の1つ以上、又はヘッジホッグシグナル伝達の活性化因子を補充した神経誘導培地中で、哺乳動物由来の解離されたpRSCsを培養し、増殖させるステップを含む、方法を提供する。例えば、十分な時間、神経誘導培地中で、解離されたpRSCsを培養し、増殖させるステップは、目に見える形態的変化又は光受容細胞特異的マーカーの発現なしに、pRSCsを光受容細胞系列の運命に誘導し得る。一実施形態では、細胞は、固体支持体上で培養され得る。固体支持体は、例えばMatrigel(登録商標)又は基底膜又は同等物で被覆され得る。Matrigel(登録商標)又は基底膜は、増殖因子が低減されたMatrigel(登録商標)又は増殖因子が低減された基底膜であってもよい。本発明の一実施形態では、細胞は、約6日間培養され、成長及び増殖させてもよい。
【００８１】
本明細書で使用される場合、単離された光受容細胞は、例えば、混入物(例えば、光受容細胞ではない細胞など)から実質的に分離された光受容細胞を意味する。
【００８２】
例えば、TGF-β/アクチビン受容体様キナーゼALK-4、-5若しくは-7、グリコーゲンシンターゼキナーゼ-3(GSK-3)、Notch若しくはWntシグナル伝達の阻害剤の1つ以上、又はヘッジホッグシグナル伝達の活性化因子は、少なくとも2つのシグナル伝達経路のモジュレーターを含み得る、TGF-β/アクチビン受容体様キナーゼALK-4、-5及び-7、グリコーゲンシンターゼキナーゼ-3(GSK-3)、Notch及びWntシグナル伝達の阻害剤、並びにヘッジホッグシグナル伝達の活性化因子の組み合わせであってよい。場合により、及びより好ましくは、組み合わせは、5つ全てのシグナル伝達経路のモジュレーターを含み得る。TGF-β/アクチビン受容体様キナーゼALK-4、-5若しくは-7、グリコーゲンシンターゼキナーゼ-3(GSK-3)、Notch若しくはWntシグナル伝達の阻害剤の1つ以上の場合、阻害剤の1つ以上は、TGF-β/アクチビン受容体様キナーゼALK-4、-5及び-7、グリコーゲンシンターゼキナーゼ-3(GSK-3)、Notch及びWntシグナル伝達の阻害剤の組み合わせであってもよく、ここで、該組み合わせは、少なくとも2つのシグナル伝達経路の阻害剤、又は好ましくは4つ全てのシグナル伝達経路の阻害剤を含む。TGF-β/アクチビン受容体様キナーゼALK-4、-5及び-7、グリコーゲンシンターゼキナーゼ-3(GSK-3)、Notch若しくはWntシグナル伝達の阻害剤、又はヘッジホッグシグナル伝達の活性化因子は、小分子阻害剤であってもよい。
【００８３】
この最初の培養ステップに続いて、本方法は、レチノイン酸若しくは同等物、又はタウリン若しくは同等物、又はその両方を補充した神経誘導培地中で細胞を培養し、哺乳動物pRSCsを光受容細胞に分化させ、それによって、フィーダー細胞、フィーダー馴化培地又は血清を含まないin vitroにおける規定された細胞培養条件下で哺乳動物に由来する単離されたpRSCsから単離哺乳動物光受容細胞を生産するステップをさらに含む。さらなる実施形態では、細胞は、約7日以上、又はpRSCsの光受容細胞への分化を可能にする期間、培養され得る。
【００８４】
好ましい実施形態では、フィーダー細胞、フィーダー馴化培地又は血清を含まないin vitroにおける化学的に規定された条件下で単離哺乳動物pRSCsから単離哺乳動物光受容細胞を生産する方法は、TGF-β/アクチビン受容体様キナーゼALK-4、-5及び-7、グリコーゲンシンターゼキナーゼ-3(GSK-3)、Notch及びWntシグナル伝達の小分子阻害剤、並びにヘッジホッグシグナル伝達の小分子活性化因子を補充した神経誘導培地中で、Matrigel(登録商標)又は基底膜(ここで、Matrigel(登録商標)又は基底膜は増殖因子が低減されている)又は同等物で被覆された固体支持体上でpRSCsを培養するステップ、及び続いて、レチノイン酸若しくは同等物、及びタウリン若しくは同等物を補充した神経誘導培地中で培養し、哺乳動物pRSCsを光受容細胞に分化させ、それによって、フィーダー細胞、フィーダー馴化培地又は血清を含まないin vitroにおける規定された細胞培養条件下で哺乳動物に由来する単離されたpRSCsから単離哺乳動物光受容細胞を生産するステップを含み得る。
【００８５】
さらなる好ましい実施形態では、細胞は、約6日間培養されてよく、その後、約7日以上の細胞培養が続き、哺乳動物pRSCsが光受容細胞に分化する。培養後、光受容細胞は、pRSCsから得られ得る。このようにして得られた光受容細胞は、パン光受容細胞(pan-photoreceptor)マーカーであるリカバリン、錐体細胞特異的マーカーであるOPN1SW又は青オプシン、桿体細胞特異的マーカーであるロドプシン、並びに/又は光受容体間レチノイド結合タンパク質(IRBP)を発現し得る。さらに、光受容細胞は、細胞突起、短い内部突起及び/又は長い伸長した外部突起を示し得る。
【００８６】
一実施形態では、単離された哺乳動物の光受容細胞は、ロドプシン、ロドプシンキナーゼ及び/又はトランスムチン(transmucin)について陽性である。
【００８７】
別の実施形態では、単離された哺乳動物の光受容細胞は、TGF-b/アクチビン受容体様キナーゼALK-4、-5若しくは-7、グリコーゲンシンターゼキナーゼ-3(GSK-3)、Notch若しくはWntシグナル伝達の阻害剤の1つ以上、又はヘッジホッグシグナル伝達の活性化因子を含む神経誘導培地中で、目に見える形態的変化又は光受容細胞特異的マーカーの発現なしに、pRSCsを光受容細胞系列の運命に誘導するために十分な時間、哺乳動物由来の解離されたpRSCsを培養し、増殖させることによって、単離された哺乳動物pRSCsから得てよい。培養物中の細胞は、レチノイン酸又はタウリン又はその両方と接触させ、哺乳動物pRSCsを光受容細胞に分化させる。培養培地は、フィーダー細胞、フィーダー馴化培地又は血清を含まない。細胞は、Matrigel(登録商標)又は基底膜、好ましくは増殖因子が低減されたMatrigel(登録商標)又は増殖因子が低減された基底膜で被覆されてもよい、固体支持体上で増殖される。
【００８８】
神経誘導培養培地の好適な例は、以下を含む: 神経誘導培地は、アドバンスト(Advanced)DMEM/F12培地若しくは同等物; Neurobasal(登録商標)培地若しくは同等物; N2補充物若しくは同等物; B-27無血清補充物若しくは同等物; グルタミン若しくはL-アラニル-L-グルタミン(例えば、GlutaMAX(登録商標)); ウシ血清アルブミン若しくは同等物; 並びにヒト白血病阻害因子(hLIF)若しくは同等物を含み得る。
【００８９】
好ましい神経誘導培地は、アドバンストDMEM/F12:Neurobasal(約1:1)培地若しくは同等物; N2補充物(例えば、約1×N2補充物)若しくは同等物; B-27無血清補充物(例えば、約1×B-27無血清補充物)若しくは同等物; グルタミン(例えば、約1％グルタミン)若しくはL-アラニル-L-グルタミン(GlutaMAX(登録商標)); ウシ血清アルブミン(例えば、約5ug/ml ウシ血清アルブミン)若しくは同等物; 並びにヒト白血病阻害因子(hLIF)(例えば、約10ng/mL hLIF)若しくは同等物を含み得る。
【００９０】
培地中で、TGF-β/アクチビン受容体様キナーゼALK-4、-5及び-7、グリコーゲンシンターゼキナーゼ-3(GSK-3)、Notch及びWntシグナル伝達の小分子阻害剤、並びにヘッジホッグシグナル伝達の小分子活性化因子の例は、限定されないが、それぞれ、SB431542(CAS番号301836-41-9)若しくは同等物、CHIR99021(CAS番号252917-06-9)若しくは同等物、DAPT(CAS番号208255-80-5)若しくは同等物、IWP2(CAS番号686770-61-6)若しくは同等物、並びにプルモルファミン(CAS番号483367-10-8)若しくは同等物を含む。
【００９１】
神経誘導培地の補充物として、次のいずれか1つ以上を添加してよい: SB431542(CAS番号301836-41-9)若しくは同等物、CHIR99021(CAS番号252917-06-9)若しくは同等物、DAPT(CAS番号208255-80-5)若しくは同等物、IWP2(CAS番号686770-61-6)若しくは同等物、並びにプルモルファミン(CAS番号483367-10-8)若しくは同等物。単なる例として、補充物は、約2μM SB431542(CAS番号301836-41-9)若しくは同等物; 約3μM CHIR99021(CAS番号252917-06-9)若しくは同等物; 約10μM DAPT(CAS番号208255-80-5)若しくは同等物; 約1μM IWP2(CAS番号686770-61-6)若しくは同等物; 並びに約100nM プルモルファミン(CAS番号483367-10-8)若しくは同等物の濃度で添加してもよい。
【００９２】
さらなる実施形態では、レチノイン酸若しくは同等物、並びにタウリン若しくは同等物を、約500nM レチノイン酸若しくは同等物、並びに/又は約100μM タウリン若しくは同等物の濃度で神経誘導培地を補充するために使用してもよい。
【００９３】
非神経の単離された哺乳動物の網膜色素上皮(RPE)又は単離された哺乳動物の網膜色素上皮細胞(RPEs)の生産方法
本発明はさらに、フィーダー細胞又はフィーダー馴化培地を含まない、in vitroにおける単離された哺乳動物pRSCsから非神経の単離された哺乳動物の網膜色素上皮(RPE)を生産する方法を提供する。場合により、この方法は、フィーダー細胞及びフィーダー馴化培地を含まない、in vitroにおける単離された哺乳動物pRSCsから単離された哺乳動物の網膜色素上皮細胞(RPEs)を得るために使用し得る。本発明の一実施形態では、この方法は、ニコチンアミド若しくは同等物、又はアクチビンA若しくは同等物、又はその両方を補充したRPE誘導培地中で哺乳動物に由来するpRSCsの単層を培養するステップ、及び続いて、N1培地補充物若しくは同等物、タウリン若しくは同等物、ヒドロコルチゾン若しくは同等物、又はトリヨードサイロニン若しくは同等物を補充した培養培地中でpRSCsを培養し、哺乳動物pRSCsを、フィーダー細胞又はフィーダー馴化培地を含まずに、in vitroにおいて単離された哺乳動物のpRSCから哺乳動物RPE又はRPEsに分化させるステップを含む。例えば、哺乳動物pRSCsは、pRSCsをRPE運命に向かって方向付けるために十分な時間、SMADシグナル伝達阻害の非存在下で、ニコチンアミド又はアクチビンA又はその両方を有する培地中で培養されてよい。
【００９４】
本明細書で使用される場合、単離されたRPEsは、例えば、混入物(例えば、RPEsではない細胞など)から実質的に分離されたRPEsを意味する。
【００９５】
一実施形態では、pRSCは、N1培地補充物、タウリン、ヒドロコルチゾン、及びトリヨードサイロニンを補充したRPE培地中で培養され得る。
【００９６】
本方法の一実施形態では、pRSC細胞(例えば、哺乳動物に由来する)は、固体支持体上で培養され得る。固体支持体は、Matrigel(登録商標)又は基底膜又は同等物で被覆されてもよい。
【００９７】
Matrigel(登録商標)又は基底膜は、増殖因子が低減されたMatrigel(登録商標)又は増殖因子が低減された基底膜であってもよい。培養に用いる培地は、RPEの運命に向かってpRSCsを方向付けるために約7日間、SMADのシグナル伝達阻害剤の非存在下で、ニコチンアミド若しくは同等物、又はアクチビンA若しくは同等物、又はその両方を補充したRPE誘導培地であってもよい。
【００９８】
別の実施形態では、細胞は、N1培地補充物若しくは同等物、タウリン若しくは同等物、ヒドロコルチゾン若しくは同等物、又はトリヨードサイロニン若しくは同等物を補充したRPE培地中で約12日間以上培養され得る。次いで、pRSCsは、RPE運命に分化する。さらに別の実施形態では、細胞は、ニコチンアミド若しくは同等物、並びにアクチビンA若しくは同等物を補充したRPE誘導培地中で約7日間培養されてよく、続いて、N1培地補充物若しくは同等物、タウリン若しくは同等物、ヒドロコルチゾン若しくは同等物、並びにトリヨードサイロニン若しくは同等物を補充したRPE培地中で約12日間以上培養され得る。N1培地補充物若しくは同等物、タウリン若しくは同等物、ヒドロコルチゾン若しくは同等物、並びにトリヨードサイロニン若しくは同等物を補充したRPE培地中で約12日間以上の培養後、RPE又はRPEsを、pRSCsから得てよい。RPE又はRPEsは、RPE65を発現し、多角形のアクチン束を形成し、着色し得る。
【００９９】
好ましい実施形態では、フィーダー細胞及びフィーダー馴化培地を含まない、in vitroにおける単離された哺乳動物pRSCsから非神経の単離された哺乳動物の網膜色素上皮(RPE)又は単離された哺乳動物の網膜色素上皮細胞(RPEs)を生産する方法は、ニコチンアミド若しくは同等物、並びにアクチビンA若しくは同等物を補充したRPE誘導培地中でpRSCsの単層を培養するステップ、及び続いて、N1培地補充物若しくは同等物、タウリン若しくは同等物、ヒドロコルチゾン若しくは同等物、並びにトリヨードサイロニン若しくは同等物を補充したRPE成熟培地中で培養し、哺乳動物pRSCsを哺乳動物RPE又はRPEsに分化させ、それによって、フィーダー細胞及びフィーダー馴化培地を含まずに、in vitroにおいて哺乳動物の単離されたpRSCsから単離された哺乳動物のRPE又はRPEsを生産するステップを含み得る。
【０１００】
別の実施形態では、フィーダー細胞及びフィーダー馴化培地を含まない、in vitroにおける単離された哺乳動物pRSCsから非神経の単離された哺乳動物RPE又はRPEsを生産する方法は、SMADシグナル伝達阻害剤の非存在下で、ニコチンアミド又はアクチビンA又はその両方を含む培養培地中で哺乳動物由来のpRSCsを培養するステップ、及びN1培地補充物、タウリン、ヒドロコルチゾン又はトリヨードサイロニンの1つ以上とpRSCsを接触させ、哺乳動物pRSCsを哺乳動物RPE又はRPEsに分化させ、それによって、フィーダー細胞及びフィーダー馴化培地を含まずに、in vitroにおいて哺乳動物の単離されたpRSCsから単離された哺乳動物のRPE又はRPEsを生産するステップを含み得る。
【０１０１】
RPE誘導培養培地及びRPE培地の好適な例は、以下を含む: RPE誘導培地は、グラスゴー最小必須培地(Glasgow Minimum Essential Medium、GMEM)若しくは同等物; KnockOut(商標)血清代替物若しくは同等物; MEM非必須アミノ酸若しくは同等物; ピルビン酸ナトリウム若しくは同等物; 並びにβ-メルカプトエタノール若しくは同等物を含み得る。
【０１０２】
RPE誘導培地の好ましい例は、グラスゴー最小必須培地(GMEM)若しくは同等物; KnockOut(商標)血清代替物(例えば、約10％ KnockOut(商標)血清代替物)若しくは同等物; MEM非必須アミノ酸(例えば、約0.1mM MEM非必須アミノ酸)若しくは同等物; ピルビン酸ナトリウム(例えば、約1mM ピルビン酸ナトリウム)若しくは同等物; 並びにβ-メルカプトエタノール(例えば、約0.1mM β-メルカプトエタノール)若しくは同等物を含む。
【０１０３】
ニコチンアミド若しくは同等物、並びに/又はアクチビンA若しくは同等物は、例えば、約10mM ニコチンアミド若しくは同等物、並びに/又は約100ng/mL アクチビンA若しくは同等物の濃度でRPE誘導培地中に存在してもよい。
【０１０４】
RPE培地は、最小必須培地(αMEM)アルファ改変培地若しくは同等物; ウシ胎児血清若しくは同等物; L-グルタミン若しくはL-アラニル-L-グルタミン(GlutaMAX(登録商標)); MEM非必須アミノ酸若しくは同等物; 並びにピルビン酸ナトリウム若しくは同等物を含んでよい。
【０１０５】
RPE培地の好ましい例は、最小必須培地(αMEM)アルファ改変培地若しくは同等物; 約5％ ウシ胎児血清若しくは同等物; 約2mM L-グルタミン若しくはL-アラニル-L-グルタミン(GlutaMAX(登録商標)); 約0.1mM MEM非必須アミノ酸若しくは同等物; 並びに約1mM ピルビン酸ナトリウム若しくは同等物を含み得る。
【０１０６】
一実施形態では、RPE培地は、N1培地補充物若しくは同等物、タウリン若しくは同等物、ヒドロコルチゾン若しくは同等物、並びにトリヨードサイロニン若しくは同等物を含み得る。さらに、好ましい実施形態では、RPE培地は、1×N1培地補充物若しくは同等物; 約0.25mg/mL タウリン若しくは同等物; 約20ng/mL ヒドロコルチゾン若しくは同等物; 並びに約0.013ng/mL トリヨードサイロニン若しくは同等物を含み得る。
【０１０７】
単離されたヒトの原始的網膜幹細胞(hpRSCs)の生産方法
本発明はさらに、フィーダー細胞、フィーダー馴化培地又は血清を含まない、in vitroにおける規定された細胞培養条件下で、単離されたヒト胚性幹細胞(hESCs)、単離されたヒト多能性幹細胞(hPSCs)、又は単離されたヒト人工多能性幹細胞(iPSCs)から、単離されたヒトの原始的網膜幹細胞(hpRSCs)を生産する方法を提供する。一実施形態では、この方法は、(a)フィーダー細胞、フィーダー馴化培地又は血清の非存在下で、StemPro hESC SFM培地(Invitrogen)又はその同等物中で、増殖因子が低減されたMatrigel(BD Bioscience)又はその同等物で被覆された固体支持体上で、コンフルエント近くまで、好ましくは約80％の細胞コンフルエンスまで、単離hESCs、単離hPSCs、又は単離ヒトiPSCsを培養するステップ、(b)ほぼコンフルエントに増殖するために十分な時間、塩基性FGF(bFGF)を補充したプライミング培地中で培養するステップ、(c)Wnt及びTGF-β/BMPシグナル伝達活性の小分子阻害剤の組み合わせを補充したプライミング培地中で培養し、単離hESCs、単離hPSCs、又は単離ヒトiPSCsを単離ヒト原始的網膜幹細胞に分化させるステップを含む。
【０１０８】
好ましい実施形態では、単離されたヒトの原始的網膜幹細胞(hpRSCs)を生産する方法は、フィーダー細胞、フィーダー馴化培地又は血清の非存在下で、StemPro hESC SFM培地(Invitrogen)又はその同等物中で、増殖因子が低減されたMatrigel(BD Bioscience)又はその同等物で被覆された固体支持体上で、単離hESCs、単離hPSCs、又は単離ヒトiPSCsを培養するステップ、約80％の細胞コンフルエンス近くで、StemPro hESC SFM培地を、約20ng/mL bFGFを補充した無血清N2B27プライミング培地に切り替えるステップ(ここで、無血清N2B27プライミング培地は、DMEM/F12若しくは同等物、1×N-2補充物若しくは同等物、1×B-27無血清補充物若しくは同等物、約0.2％ BSA若しくは同等物、約2mM L-GlutaMAX(登録商標)若しくは同等物、約0.1mM MEM非必須アミノ酸若しくは同等物、並びに約0.1mM β-メルカプトエタノール若しくは同等物を含み得る)、bFGFを補充したN2B27プライミング培地中で約1〜2日間培養するステップ、ほぼコンフルエントなhESCsの単層培養物について、N2B27プライミング培地におけるbFGFを補充した培地を、Wnt及びTGF-β/BMPシグナル伝達活性の小分子阻害剤の組み合わせを補充したN2B27プライミング培地に切り替え、単離hESCs、単離hPSCs、又は単離ヒトiPSCsを、単離されたヒトの原始的網膜幹細胞に分化させ、それによって、フィーダー細胞、フィーダー馴化培地又は血清を含まない、in vitroにおける規定された細胞培養条件下で単離hESCs、単離hPSCs、又は単離ヒトiPSCsから単離hpRSCsを生産するステップを含み得る。
【０１０９】
一実施形態では、培地におけるWnt及びTGF-β/BMPシグナル伝達活性の小分子阻害剤の組み合わせは、SB 431542、LDN193189及びIWP2(Inhibitor of Wnt Production-2)の組み合わせ; SB 431542、ノギンアナログ及びIWP2の組み合わせ; SB 431542、LDN193189及びDkk1アナログの組み合わせ; SB 431542、ノギンアナログ及びDkk1アナログの組み合わせ; 又は同等の組み合わせであってもよく、ここで、該組み合わせは、Wnt及びTGF-β/BMPシグナル伝達活性の相乗的阻害を生じる。好ましい実施形態では、SB 431542、LDN193189及びIWP2の組み合わせは、約5μM SB 431542、約50nM LDN193189、及び約1μM IWP2を含んでもよい。
【０１１０】
一実施形態では、全細胞集団の約90％を超える単離されたヒト原始的網膜幹細胞は、眼領域始原細胞によって発現される典型的な初期の眼領域転写因子であるPAX6、LHX2、RAX、OTX2、SIX3及びSIX6について陽性であってよい。別の実施形態では、単離されたヒト原始的網膜幹細胞は、原始的神経上皮幹細胞の典型的なマーカーである、幹細胞性因子のSOX2、ネスチン及びSTAT3の発現について陽性であってよい。さらに別の実施形態では、単離されたヒト原始的網膜幹細胞は、細胞増殖のマーカーであるKi67の発現について陽性であってよい。
【０１１１】
一実施形態では、単離されたヒト原始的網膜幹細胞は、hESCsと比較して、hESCの多能性転写因子、POU5F1(OCT4)、NANOG、KLF4及びTBX3遺伝子、並びにTBF-βスーパーファミリー遺伝子、SMAD1、SMAD2、TGFβ3、BMP3、BMP6、TGFBR1、及びBMPR1Bの転写を下方制御し得る。
【０１１２】
本発明の一実施形態では、単離されたヒト原始的網膜幹細胞は、hESCsにおけるのと同じレベルであるが、ヒト胎児網膜始原細胞におけるよりも顕著に高いレベルで、LIN28及びSALL4転写因子遺伝子の転写を維持し得る。
【０１１３】
別の実施形態では、単離されたヒト原始的網膜幹細胞は、ヒト胎児網膜始原細胞と比較して、BMP4及びBMP7遺伝子並びにOTX2、RAX、LHX2、SIX3、及びSIX6遺伝子の転写を上方制御し得る。
【０１１４】
本発明の一実施形態では、単離されたヒト原始的網膜幹細胞は、SRFP1及びFZD3/5遺伝子の転写について強く陽性であってもよい。
【０１１５】
一実施形態では、単離されたヒト原始的網膜幹細胞は、ヒト胎児網膜始原細胞と比較して、FGFR1/2/3及びFGF3/8遺伝子の転写を下方制御し得る。
【０１１６】
一実施形態では、単離されたヒトpRSCsは、本発明のWnt及びTGF-β/BMPシグナル伝達活性の小分子阻害剤の組み合わせを補充した無血清N2B27プライミング培地中で維持及び/又は増殖し得る。
【０１１７】
別の実施形態では、単離されたヒトpRSCsは、分化の小分子誘導剤を用いてin vitroで特定の網膜細胞運命に向かって分化するように方向付けられてよい。
【０１１８】
一実施形態では、特定の網膜細胞運命は、神経網膜細胞及び非神経細胞を含み得る。神経網膜細胞は、網膜神経節細胞(RGCs)及び光受容細胞を含み得る。非神経細胞は、網膜色素上皮(RPE)細胞を含み得る。
【０１１９】
哺乳動物の原始的網膜幹細胞(hpRSCs)、より分化した網膜始原細胞、網膜ニューロン、網膜神経節細胞、光受容細胞前駆細胞、又は網膜色素上皮(RPE)を生成する方法
本発明はさらに、被験体から、哺乳動物の原始的網膜幹細胞(hpRSCs)、より分化した網膜始原細胞、網膜ニューロン、網膜神経節細胞、光受容細胞前駆細胞、又は網膜色素上皮(RPE)を生成する方法であって、該被験体由来の人工多能性幹細胞(iPSC)の生産、及び本発明の方法によるiPSCからのpRSCsの生成、及び/又は追加的に本発明の方法による分化のさらなる誘導を必要とする方法を提供する。
【０１２０】
被験体において網膜変性を治療する方法
本発明はさらに、それを必要とする被験体において網膜変性を治療する方法であって、患者の眼に、原始的網膜幹細胞、網膜神経節細胞、光受容細胞、網膜色素上皮細胞及び/又はそれらの組合せを投与することを含む方法を提供する。原始的網膜幹細胞、網膜神経節細胞、光受容細胞、網膜色素上皮細胞は、被験体における網膜変性を治療するために十分な量で投与されてよく、本発明の方法によって生産されてよい。
【０１２１】
本明細書で使用される場合、用語「被験体」又は「患者」は、互換的に使用されてよく、本発明のいずれか由来の組成物を投与することができる任意の生物を指す。この用語は、限定されないが、ヒト、非ヒト動物、例えば非ヒト霊長類、例えばチンパンジー及び他の類人猿及びサル種; 家畜、例えばウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、及びウマ、人になれた被験体、例えばイヌ及びネコ、実験動物、例えばげっ歯類、例えばマウス、ラット及びモルモットなどを含む。したがって、成体及び新生被験体、並びに胎児は、雄性であろうが雌性であろうが、含まれることが意図される。
【０１２２】
本明細書で使用される場合、用語「有効量」は、眼に関連する疾患又は障害、例えば網膜変性の少なくとも1つの症状を遅らせる、低減する又は改善するのに要する、例えば本発明の細胞及び/又は組成物の量を指す。例えば、本発明の細胞のいずれかの有効量は、本発明の細胞の網膜変性を低減又は阻害するのに有効な量である。したがって、有効量はまた、眼に関連する疾患の症状の発症を阻止する、又は症状を低減する、又は症状の進行の速度を低下させるのに十分な量である。
【０１２３】
本明細書で使用される場合、用語「投与する」及び「導入する」は、本明細書において互換的に使用され、所望の部位での細胞又は組成物の少なくとも部分的な局在化をもたらす方法又は経路によって、本明細書に開示される本発明の細胞又は組成物を被験体内に配置することを指す。本発明の細胞又は組成物は、被験体において効果的な治療をもたらす任意の適切な経路によって投与することができる。
【０１２４】
一実施形態では、送達される細胞は、患者の眼への送達の前に、マトリックス、例えばヒドロゲルと組み合わせてもよく、又はその上若しくはその中に含有されてもよい。
【０１２５】
一実施形態では、ヒドロゲルは、ヒアルロン酸及びメチルセルロース又はそれらの塩及び誘導体を含み得る。さらに、ヒドロゲルは、生物活性ペプチドを有するヒドロゲルを含み得る。一実施形態では、マトリックスは、移植された細胞の細胞生存性及び機能性を支持する生体適合性ポリマー又は生体適合性ポリマーの混合物、人工生体模倣マトリックス、組織又は器官マトリックスに由来する生物活性足場、コラーゲン及びN-イソプロピルアクリルアミド共重合体に基づく生合成細胞外マトリックス、又は接着分子、ラミン、増殖因子、形態形成因子、生存因子、細胞外マトリックス若しくはその断片若しくは誘導体で修飾された足場であってもよい。ヒドロゲルは、平衡塩溶液中に約0.5％ヒアルロン酸ナトリウム(1400〜1800kDa)及び約0.5％メチルセルロース(100kDa)又はそれらの同等物を含み得る。
【０１２６】
一実施形態では、細胞は、被験体の眼の網膜下腔に投与され得る。
【０１２７】
一実施形態では、網膜変性は、加齢性黄斑変性症(AMD)、シュタルガルト黄斑ジストロフィー、網膜色素変性症、緑内障、網膜血管疾患、眼のウイルス感染、及び公知若しくは未知の病因の他の網膜/眼疾患と関連し得る。
【０１２８】
本発明の実施において、被験体は、ヒトなどの哺乳動物であってもよい。被験体はまた、サル、クマ、ラット、マウス、ミンク、ウサギ、モルモット、ブタ、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、ウマ又はウシなどの哺乳動物であってよい。
【０１２９】
一実施形態では、それを必要とする被験体において網膜変性を治療する方法は、(a)被験体からPSCs及び体細胞を含有する組織又は細胞サンプルを得るステップ、(b)サンプルからPSCs及び体細胞を分離し、単離されたPSCs及び単離された体細胞を得るステップ、(c)単離されたPSCsを培養し、単離されたPSCsを増殖させるステップ、又は単離された体細胞を再プログラミングし、iPSCsを得て、iPSCsを単離し、単離されたiPSCsを得るステップ、(d)単離されたPSCs又は単離されたiPSCsを培養し、本発明の方法によりpRSCsを生産するステップ、及び(e)被験体における網膜変性を治療するために十分な量で、被験体の眼に原始的網膜幹細胞(pRSCs)を投与するステップを含む。
【０１３０】
別の実施形態では、それを必要とする被験体において網膜変性を治療する方法は、(a)被験体からPSCs及び体細胞を含有する組織又は細胞サンプルを得るステップ、(b)サンプルからPSCs及び体細胞を分離し、単離されたPSCs及び単離された体細胞を得るステップ、(c)単離されたPSCsを培養し、単離されたPSCsを増殖させるステップ、又は単離された体細胞を再プログラミングし、iPSCsを得て、iPSCsを単離し、単離されたiPSCsを得るステップ、(d)単離されたPSCs又は単離されたiPSCsを培養し、pRSCsを生産するステップ、(e)単離されたpRSCsを培養し、本発明の方法により単離されたRGCsを生産するステップ、及び(f)そのようにして生産された哺乳動物網膜神経節細胞(RGCs)を、被験体における網膜変性を治療するために十分な量で、被験体の眼に投与するステップを含む。
【０１３１】
さらなる実施形態では、それを必要とする被験体において網膜変性を治療する方法は、(a)被験体からPSCs及び体細胞を含有する組織又は細胞サンプルを得るステップ、(b)サンプルからPSCs及び体細胞を分離し、単離されたPSCs及び単離された体細胞を得るステップ、(c)単離されたPSCsを培養し、単離されたPSCsを増殖させるステップ、又は単離された体細胞を再プログラミングし、iPSCsを得て、iPSCsを単離し、単離されたiPSCsを得るステップ、(d)単離されたPSCs又は単離されたiPSCsを培養し、pRSCsを生産するステップ、(e)単離されたpRSCsを培養し、本発明の方法により単離された光受容細胞を生産するステップ、及び(f)ステップ(e)の光受容細胞を、被験体における網膜変性を治療するために十分な量で、被験体の眼に投与するステップを含む。
【０１３２】
またさらなる実施形態では、それを必要とする被験体において網膜変性を治療する方法は、(a)被験体からPSCs及び体細胞を含有する組織又は細胞サンプルを得るステップ、(b)サンプルからPSCs及び体細胞を分離し、単離されたPSCs及び単離された体細胞を得るステップ、(c)単離されたPSCsを培養し、単離されたPSCsを増殖させるステップ、又は単離された体細胞を再プログラミングし、iPSCsを得て、iPSCsを単離し、単離されたiPSCsを得るステップ、(d)単離されたPSCs又は単離されたiPSCsを培養し、pRSCsを生産するステップ、(e)単離されたpRSCsを培養し、本発明の方法により単離されたRPE'sを生産するステップ、及び(f)そのようにして生産された哺乳動物の網膜色素上皮細胞(RPEs)を、被験体における網膜変性を治療するために十分な量で、被験体の眼に投与するステップを含む。
【０１３３】
ヒト原始的網膜幹細胞(hpRSCs)、ヒト原始的網膜神経節細胞(hpRGCs)、ヒト光受容細胞又はヒト網膜色素上皮細胞(hRPEs)の被験体への送達方法
本発明はさらに、ヒト原始的網膜幹細胞(hpRSCs)、ヒト原始的網膜神経節細胞(hpRGCs)、ヒト光受容細胞又はヒト網膜色素上皮細胞(hRPEs)の、必要とする患者又は被験体への送達方法であって、例えばBSS/HAMC(約0.5/0.5％ w/w)ヒドロゲル溶液中の、hpRSCs、hpRGCs、ヒト光受容細胞又はhRPEsの単一細胞懸濁液が、被験者の網膜下腔に投与される、方法を提供する。
【０１３４】
一実施形態では、本発明は、それを必要とする患者又は被験体において網膜変性を治療する方法であって、それを必要とする患者又は被験体の眼に原始的網膜幹細胞(pRSCs)の送達を必要とし、pRSCsが本発明の方法によって生産され得る、前記方法を提供する。
【０１３５】
一実施形態では、本発明は、それを必要とする患者又は被験体において網膜変性を治療する方法であって、それを必要とする患者又は被験体の眼に哺乳動物の網膜神経節細胞(RGCs)の送達を必要とし、RGCsが本発明の方法によって生産され得る、前記方法を提供する。
【０１３６】
一実施形態では、本発明は、それを必要とする患者又は被験体において網膜変性を治療する方法であって、それを必要とする患者又は被験体の眼に哺乳動物の光受容細胞の送達を必要とし、光受容細胞が本発明の方法によって生産され得る、前記方法を提供する。
【０１３７】
一実施形態では、本発明は、それを必要とする患者又は被験体において網膜変性を治療する方法であって、それを必要とする患者又は被験体の眼に哺乳動物の網膜色素上皮(RPE)又は哺乳動物の網膜色素上皮細胞(RPEs)の送達を必要とし、RPEsが本発明の方法によって生産され得る、前記方法を提供する。
【０１３８】
哺乳動物は、ヒト、サル、クマ、ラット、マウス、ミンク、ウサギ、モルモット、ブタ、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、ウマ又はウシであってもよい。
【０１３９】
被験体又は患者は、ヒトであってもよい。一実施形態では、被験体又は患者は、ヒト、サル、クマ、ラット、マウス、ミンク、ウサギ、モルモット、ブタ、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、ウマ又はウシなどの哺乳動物であってよい。
【０１４０】
本発明はまた、ヒト原始的網膜幹細胞(hpRSCs)、ヒト網膜神経節細胞(hpRGCs)、ヒト光受容細胞、ヒト網膜色素上皮(hRPE)又はヒト網膜色素上皮細胞(hRPEs)の患者への送達方法を提供する。一実施形態では、hpRSCs、hpRGCs、ヒト光受容細胞、hRPE又はhRPEsは、マトリックス溶液又はマトリックス懸濁液中の単層又は単一細胞懸濁液として被験体の網膜下腔に投与され得る。細胞は、本発明の方法によって生産され得る。一実施形態では、BSS/HAMC(約0.5/0.5％ w/w)ヒドロゲル溶液中のhpRSCsの単一細胞懸濁液が、患者の網膜下腔に投与され得る。細胞の送達は、それを必要とする被験体へのものであってよく、網膜変性を治療するためのものであってよい。
【０１４１】
一実施形態では、マトリックスは、ヒアルロン酸及びメチルセルロース又はそれらの塩及び誘導体を含むヒドロゲル、生物活性ペプチドを有するヒドロゲル、移植された細胞の細胞生存性及び機能性を支持する生体適合性ポリマー又は生体適合性ポリマーの混合物、人工生体模倣マトリックス、組織又は器官マトリックスに由来する生物活性足場、コラーゲン及びN-イソプロピルアクリルアミド共重合体に基づく生合成細胞外マトリックス、又は接着分子、ラミン、増殖因子、形態形成因子、生存因子、細胞外マトリックス若しくはその断片若しくは誘導体で修飾された足場である。
【０１４２】
一実施形態では、本発明は、被験体の網膜変性の病因の根底にある分子的及び細胞的事象を決定する方法であって、被験体における網膜変性の病因の根底にある分子的及び細胞的事象を決定することができるように、「ディッシュ中の疾患(disease in a dish)」モデルを得るために、本発明の方法によって、被験体からヒト原始的網膜幹細胞(hpRSCs)、より分化した網膜始原細胞、網膜ニューロン、網膜神経節細胞、光受容細胞前駆細胞、又は網膜色素上皮(RPE)を生成することを要する方法を提供する。
【０１４３】
一実施形態では、被験体は、哺乳動物、ヒト、サル、クマ、ラット、マウス、ミンク、ウサギ、モルモット、ブタ、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、ウマ又はウシである。
【０１４４】
一実施形態では、本発明は、網膜変性に罹患している被験体を治療するための多能性幹細胞の使用に関連した腫瘍を予防又は阻害する方法を提供する。この方法は、単離された多能性幹細胞を単離されたhpRSCsに誘導し、生産された単離hpRSCsを被験体に投与することを含み、ここで、単離されたpRSCは、被験体の眼に幹細胞を投与する前に、本発明の方法によって生産され得る。
【０１４５】
別の実施形態では、この方法は、単離された多能性幹細胞を単離されたhpRSCsに誘導し、単離されたhPRSCsを単離されたhpRGCs、単離されたヒト光受容細胞又は単離されたhRPEsにさらに分化させ、生産された単離hpRSCs、単離ヒト光受容細胞又は単離hRPEsを被験体に投与することを含む。
【０１４６】
本発明の組成物
本発明は、本発明の方法によって生産された哺乳動物の原始的網膜幹細胞(hpRSCs)と好適な担体とを含む組成物を提供する。
【０１４７】
本明細書で使用される語句「好適な担体」は、1つの器官又は体の一部から別の器官又は体の一部へ対象薬剤を運ぶ又は輸送することに関与する、液体又は固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒又はカプセル化材料などの、薬学的に許容される材料、組成物又はビヒクルを意味する。各担体は、製剤の他の成分と適合するという意味で「許容され」、又は生物学的に不活性でなければならない。
【０１４８】
さらに、本発明は、本発明の方法によって生産される哺乳動物の網膜神経節細胞(RGCs)と好適な担体とを含む組成物を提供する。
【０１４９】
さらにまた、本発明は、本発明の方法によって生産される哺乳動物の光受容細胞と好適な担体とを含む組成物を提供する。
【０１５０】
本発明はまた、本発明の方法によって生産される哺乳動物の網膜色素上皮(RPE)若しくは哺乳動物の網膜色素上皮細胞(RPEs)と好適な担体とを含む組成物を提供する。
【０１５１】
一実施形態では、Wnt及びTGF-β/BMPシグナル伝達活性の小分子阻害剤の組み合わせは、IWP2(CAS番号686770-61-6)、SB431542(CAS番号301836-41-9)及びLDN-193189(CAS番号1062368-24-4)の組み合わせ、又は同等の組み合わせであってよく、ここで、この組み合わせは、Wnt及びTGF-β/BMPシグナル伝達活性の相乗的阻害を生じ得る。あるいは、この組み合わせは、IWP2(CAS番号686770-61-6)、SB431542(CAS番号301836-41-9)、及び/又はLDN-193189(CAS番号1062368-24-4)又は同等の組み合わせを含んでよく、ここで、この組み合わせは、Wnt及びTGF-β/BMPシグナル伝達活性の相乗的阻害を生じ得る。
【０１５２】
一実施形態では、哺乳動物は、ヒト、サル、クマ、ラット、マウス、ミンク、ウサギ、モルモット、ブタ、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、ウマ又はウシである。
【０１５３】
本発明の別の態様では、キットが提供される。本発明のキットは、本発明の化合物又は組成物を含むパッケージ(複数可)を含む。
【０１５４】
語句「パッケージ」は、本明細書に示される化合物又は組成物を含有する任意の容器を意味する。好ましい実施形態では、パッケージは、箱又はラッピングであってよい。医薬品の包装に使用するための包装材料は、当業者に周知である。
【０１５５】
キットはまた、パッケージ内に含まれていないが、パッケージ、例えばピペットの外側に取り付けられているアイテムを含有し得る。
【０１５６】
キットは、場合により、治療を必要とする状態を有する被験体に本発明の組成物を投与するための説明書を含有し得る。キットはまた、米国食品医薬品局(FDA)などの規制当局による本明細書中の化合物の承認用途のための説明書を含み得る。キットは、場合により、本化合物のためのラベリング又は製品添付文書を含有し得る。パッケージ(複数可)及び/又は任意の製品添付文書(複数可)は、それ自体、規制当局によって承認されていてもよい。キットは、パッケージ内に固相中又は液相(例えば、提供される緩衝液)中の化合物を含むことができる。キットはまた、本方法を実施するための溶液を調製するための緩衝液、及び1つの容器から別の容器へ液体を移すためのピペットを含むことができる。
【０１５７】
キットはまた、場合により、本明細書中に記載の組み合わせ療法に使用するための1つ以上の他の化合物を含有してもよい。特定の実施形態では、パッケージ(複数可)は、静脈内投与のための容器である。他の実施形態では、化合物は、吸入器中に提供される。さらに他の実施形態では、化合物は、ポリマーマトリックスにおいて又はリポソームの形態で提供される。
【０１５８】
一実施形態では、本発明は、被験体の哺乳動物原始的網膜幹細胞(pRSCs)を生産するためのキットであって、フィーダー細胞、フィーダー馴化培地又は血清を含まないが、Wnt又はTGF-β/BMPシグナル伝達の阻害剤の1つ以上を補充した、又はより好ましくはWnt及びTGF-β/BMPシグナル伝達の小分子阻害剤の組み合せを補充した、化学的に規定される培地を用いた、in vitroにおける被験体からの多能性幹細胞(PSCs)又は人工多能性幹細胞(iPSC)の接着単層の処理を必要とする、キットを提供する。
【０１５９】
本発明はさらに、哺乳動物の原始的網膜幹細胞(pRSCs)を生産するためのキットであって、フィーダー細胞、フィーダー馴化培地又は血清を含まない、化学的に規定される培地中で、哺乳動物に由来する胚性幹細胞(ESCs)、多能性幹細胞(PSCs)又は人工多能性幹細胞(iPSCs)を培養するための説明書、並びにWntシグナル伝達若しくはTGF-β/BMPシグナル伝達の小分子阻害剤又はWnt及びTGF-β/BMPシグナル伝達の両方の阻害剤の使用のための説明書を含むキットを提供する。
【０１６０】
一実施形態では、キットはさらに、Wntシグナル伝達若しくはTGF-β/BMPシグナル伝達の小分子阻害剤、又はWnt及びTGF-β/BMPシグナル伝達の両方の小分子阻害剤を含む。
【０１６１】
一実施形態では、Wntシグナル伝達の小分子阻害剤は、C22H18N402S3の化学式を有するWnt生産-2の阻害剤(Inhibitor of Wnt Production-2、IWP2; CAS番号686770-61-6)又はN-(6-メチル-1,3-ベンゾチアゾール-2-イル)-2-[(4-オキソ-3-フェニル-6,7-ジヒドロチエノ[3,2-d]ピリミジン-2-イル)スルファニル]アセトアミドを含み得る。
【０１６２】
一実施形態では、TGF-β/BMPシグナル伝達の小分子阻害剤は、トランスフォーミング増殖因子-ベータ(TGF-β)スーパーファミリーI型アクチビン受容体様キナーゼALK-4、-5、及び-7の小分子阻害剤であってよい。トランスフォーミング増殖因子-ベータ(TGF-β)スーパーファミリーI型アクチビン受容体様キナーゼALK-4、-5、及び-7の小分子阻害剤は、C22H16N403の化学式を有するSB431542(CAS番号301836-41-9)又は4-[4-(1,3-ベンゾジオキソール-5-イル)-5-(2-ピリジニル)-1H-イミダゾール-2-イル]ベンズアミドであってよい。
【０１６３】
一実施形態では、TGF-β/BMPシグナル伝達の小分子阻害剤は、BMP I型受容体ALK-2及びALK-3の小分子阻害剤又はノギンアナログであってもよい。BMP I型受容体ALK-2及びALK-3の小分子阻害剤又はノギンアナログは、C25H22N6の化学式を有するLDN-193189(CAS番号1062368-24-4)又は4-(6-(4-(ピペラジン-1-イル)フェニル)ピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-3-イル)キノリンであってよい。
【０１６４】
一実施形態では、Wnt及びTGF-β/BMPシグナル伝達の両方の小分子阻害剤は、IWP2(CAS番号686770-61-6)、SB431542(CAS番号301836-41-9)、及びLDN-193189(CAS番号1062368-24-4)の組み合わせ又は同等の組み合わせであってもよく、ここで、この組み合わせは、Wnt及びTGF-β/BMPシグナル伝達活性の相乗的阻害を生じ得る。あるいは、この組み合わせは、IWP2(CAS番号686770-61-6)、SB431542(CAS番号301836-41-9)、及びLDN-193189(CAS番号1062368-24-4)、又は同等の組合せを含んでよく、ここで、この組み合わせは、Wnt及びTGF-β/BMPシグナル伝達活性の相乗的阻害を生じ得る。
【０１６５】
一実施形態では、キットはさらに、哺乳動物に由来する胚性幹細胞(ESCs)、多能性幹細胞(PSCs)又は人工多能性幹細胞(iPSC)を含んでよい。キットはさらに、化学的に規定された培養培地及び/又は補充物を含み得る。
【０１６６】
一実施形態では、キットは、本出願又は特許請求の範囲に開示されているような本発明で使用される方法又は組成物のいずれかで使用するための又はこれらに基づく指示シートを含んで製造されてよい。このようなキットは、本発明のpRGCsからのRPGs、光受容細胞、RPE又はRPEsの生産のためのキットを含んでよく、培地、補充物(複数可)、小分子阻害剤(複数可)及び/又は小分子活性化因子(複数可)を含んでよい。
【実施例】
【０１６７】
以下の実施例は、本発明を例示することが意図され、いかなる方法でも本発明の範囲を限定するものではない。
【０１６８】
[実施例1]
方法
細胞培養及び分化
ヒト胚性幹細胞、H9(WA9, WiCell)及びHuES9(http://grants.nih.gov/stem_cells/registry/current.htm?id=40)(継代25〜40)を、増殖因子が低減されたMatrigel(BD Biosciences)で被覆されたプレート上で、StemPro hESC SFM培地(Invitrogen)中でフィーダーフリーの、無血清条件下で培養した。ヒト初代胎児網膜始原細胞を、インフォームドコンセント及びIRB承認を持って得られた17週のヒト胎児網膜から単離し、以前45に記載された手順に従って培養した。未分化hESCsが培養において約80％コンフルエンスに達した後、培地を、20ng/ml bFGFを補充した無血清N2B27プライミング培地(DMEM/F12、N2、B27、0.2％ BSA、2mM L-GlutaMAX、0.1mM MEM非必須アミノ酸、及び0.1mM β-メルカプトエタノール)に1〜2日間切り替えた。hESCsのほぼコンフルエントな単層培養物を、小分子阻害剤(5μM SB431542、50nM LDN193189、及び1μM IWP2)を補充したN2B27プライミング培地中でさらに培養した。培地を、6日間毎日変えた。hESC由来のhpRSCsは、この無血清の阻害剤を補充したプライミング培地中で維持し、増殖させてもよい。hpRSCsからRGC分化を誘導するために、細胞を、1μM IWP2、10μM DAPT、及び200nM PD173074を含む小分子阻害剤の新しい組み合わせを補充したプライミング培地中で2週を超えて培養した。光受容細胞前駆細胞の分化のために、解離したhpRSCsを、Matrigel被覆プレート上に播種し、以前18に記載されたように、かつ1μM IWP2、10μM DAPT、及び100nM プルモルファミンを補充した神経誘導培地中で6日間培養した。その後、培養物を、500nM レチノイン酸及び100μM タウリンを補充した神経誘導培地にさらに1週間シフトさせた。RPE分化のために、10mM ニコチンアミド及び100ng/ml アクチビンAを補充したRPE誘導培地(GMEM、10％ ノックアウト血清代替物(knockout serum replacement)、0.1mM MEM非必須アミノ酸、1mMピルビン酸ナトリウム、及び0.1mM β-メルカプトエタノール)を、hpRSCsの単層培養物に1週間添加した。その後、RPE前駆細胞を、N1及びTHT(タウリン、ヒドロコルチゾン、トリヨードサイロニン)46を補充した、MEM改変培地、5％ウシ胎児血清、2mM L-グルタミン、0.1mM MEM非必須アミノ酸、及び1mM ピルビン酸ナトリウムからなる、RPE培地中で成熟させた。
【０１６９】
PCR分析
全RNAをRNeasyキット(Qiagen)を用いて細胞から抽出し、cDNAをiScript cDNA合成キット(Bio-Rad)を用いて逆転写した(両者とも製造業者の説明書に従った)。転写産物を、40サイクル増幅し、それらのレベルを、遺伝子特異的プライマー(表1)及びPower SYBR Green PCRマスターミックスを用いて、7500リアルタイムPCRシステム(Applied Biosystems)で定量した。測定を3重で実施し、β-アクチンレベルに対して正規化した。
【０１７０】
【表１】
0006651440.tif 000008
【０１７１】
トランスクリプトーム及び経路データ分析
この研究で作製された遺伝子発現データ(hfRPC及びhpRSC)、GEOデータベース47から得られた遺伝子発現データ(HuES9、GSM100174848)を正規化し、Cluster3.0/Tree Viewソフトウェアパッケージ49を使用して平均連結階層的クラスタリング(average linkage hierarchical clustering)に供した。最高発現及び最低発現を有するサンプル間の最小log2=1.5の距離に基づいて、4359個の遺伝子を用いた。サンプル間の総距離(類似性)を、非中心(uncentered)ピアソン相関係数として算出した。ヒートマップにおける各遺伝子について、赤色及び青色は、それぞれ、他の細胞と比較した高発現及び低発現を示す。個々の経路の分析について、TGFβスーパーファミリー、Wnt経路、Notch経路、hESC多能性、ヘッジホッグ経路、及びFGF経路における遺伝子のサブセットを、以前の研究50〜54に基づいて選択した。クラスタリングを、遺伝子のそれぞれのサブセットを用いて同じパラメータを用いて別々に行った。
【０１７２】
免疫細胞化学
細胞を、4％パラホルムアルデヒドで20分間固定し、0.3％トリトンX-100-PBSで5分間2回透過処理し、5％正常ロバ血清及び0.3％トリトンX-100％を含むPBS溶液中でブロッキングし、続いて、4℃で一次抗体溶液中で一晩インキュベートした。PBS中で3回洗浄した後、細胞をAlexa蛍光結合二次抗体と共にさらに90分間インキュベートした。PBS中ですすぎ、洗浄した後、細胞核を、100ng/ml ヘキスト33342で10分間対比染色した。一次抗体及びそれらの作業希釈液は以下の通りであった: ヒツジ抗ChxlO(1:300、Exalpha)、ウサギ抗Pax6(1:600、Covance)、ヤギ抗Lhx2(1:200、Santa Cruz)、ウサギ抗リカバリン(1:2000、Millipore)、マウス抗ロドプシン(1:250、Millipore)、ウサギ抗赤/緑オプシン(1:300、Millipore)、ヤギ抗OPN1SW(1:300、Santa Cruz)、及びウサギ抗GFP(1:1000、Invitrogen)若しくはニワトリ抗GFP(1:400、Invitrogen)。マウス抗HSA抗体は、ヒト特異的マーカーTRA-1-85(1:100、R＆D Systems)、ヒト核抗原(1:300、Millipore)、及びヒトミトコンドリア(1:100、Millipore)に対するモノクローナル抗体の混合物である。使用した二次抗体は、対応するAlexa-488、-555、-633、又は-647蛍光標識抗体(1:1000、Invitrogen)であった。標識された細胞を、レーザー走査共焦点顕微鏡(Olympus)を用いて画像化した。各抗体の特異的免疫反応性を、同じ条件下で、陽性対照として適当な網膜組織を用いた免疫染色によって確認した。
【０１７３】
細胞移植
ラットの眼への網膜下移植は、以前55に記載された方法から適合させた。簡単に述べると、hpRSCsを、StemPro Accutase(Invitrogen)を用いて単一細胞に解離させ、平衡塩溶液(BSS、Alcon)のみ、又はBSS/HAMC(0.5/0.5％ w/w)ヒドロゲル溶液56のいずれかにおいて5×104/μLの密度まで濃縮した。HAMCヒドロゲル溶液を調製するために、ヒアルロン酸ナトリウム(HA、1400〜1800kDa、製薬グレード150、Novamatrix)を、0.1％ w/vにて水(HyClone、細胞培養グレード、Thermo Scientific)に溶解させ、0.22μmのチューブトップバキュームフィルター(Corning)を通して濾過することによって、滅菌した。次いで、溶液を、0.22μmのPVDFフィルター(Millex GV、Millipore)でチューブを覆うことにより滅菌条件下で凍結乾燥した。メチルセルロース(MC、100kDa、Methocel A4M Premium、Dow Chemical)を、氷浴中で攪拌することにより、0.3％ w/vで水に溶解し、その後、HAと同様に、滅菌濾過し、凍結乾燥した。滅菌HA及びMC粉末を、バイオセーフティーキャビネット内でBSSに再懸濁し(例えば、0.5％/0.5％HAMCについて、30mg HA及び30mg MCを6mL BSS中に溶解する)、次いで懸濁液をボルテックスし、4℃に一晩置いて可溶化させ、使用前に再度ボルテックスした。ガラスマイクロピペットを用いて、懸濁液中の1〜2μlのhpRSCs(5〜10×104細胞)を、ヌードラット又はRCSラットのいずれかの網膜下腔にゆっくり注入した。移植後の異なる時点に、動物を屠殺し、眼を摘出し、組織凍結媒体中に包埋し、凍結切片にし(cryoslice)、上に記載したように共免疫染色した。動物の処置は、カリフォルニア大学サンディエゴ校の施設内動物管理使用委員会の承認を得て、その監督の下で行った。
【０１７４】
結果
小分子を用いた、hESCsからのhpRSCsの誘導
脊椎動物の胚発生の初期段階の間、眼領域特定化(eye field specification)が、Wnt及びBMPシグナル伝達勾配の影響下で誘導される16、17。以前の研究は、Wntシグナル伝達の勾配が初期発生時に前脳及び中脳のアイデンティティの確立に重要であることを示している。Wntシグナル伝達の下方制御は、眼領域が存在する前脳の形成をもたらす。したがって、強力なWnt阻害剤であるDkk1、及びBMPアンタゴニストであるノギンでの、hESC由来胚様体の処理は、眼領域の発生を促進する3、19。加えて、SB431542(トランスフォーミング増殖因子-ベータ(TGF-β)スーパーファミリーI型アクチビン受容体様キナーゼALK-4、-5、及び-7の選択的かつ強力な阻害剤)及びLDN193189(BMP I型受容体ALK-2及びALK-3の選択的阻害剤、ノギンアナログ)への曝露による二重のSMAD阻害の下で、hESCsは、PAX6及びLHX2を強く発現する前脳/眼領域の前駆体となる可能性がある20、21。したがって、本発明者らは、小分子阻害剤IWP2(Inhibitor of Wnt Production-2、Dkk1アナログ)22、LDN193189、及びSB431542(以後、それぞれ、IWP、LDN、及びSBと称する)を用いた、Wnt及びTGF-β/BMPシグナル伝達活性の相乗的阻害の下で、hESCsのhpRSCsへの分化を誘導するための化学的に規定された培養プロトコールを開発した。多能性hESCsを、Matrigel被覆プレート上に播種し、フィーダーフリーかつ無血清条件下でコンフルエンス近くまで培養した。その後、培養物を、IWP-LDN-SB小分子カクテルを補充したhpRSCプライミング培地に1週間切り替えた。この処理の下で、hESCsの大部分は、密に詰まった細胞に変換された。hpRSCsの大規模な誘導が、重要な初期の眼領域転写因子の免疫細胞化学的標識によって確認された3、23。細胞の90％超が、眼領域始原細胞によって発現される2つの重要な転写因子であるPAX6及びLHX2の両方について陽性であった(図1b)。大部分のhESC由来hpRSCsはまた、原始的神経上皮幹細胞の典型的なマーカーであるネスチンを発現した(図1c)。加えて、hESC由来hpRSCsは、Ki67の強発現によって証明されるように、増殖活性を保持した(図1c)。hpRSCsの誘導は、PAX6、RX、LHX2、SIX3、及びSIX6を含む典型的な初期の眼領域転写因子遺伝子の発現を評価するためのリアルタイムPCRによってさらに確認された。本発明者らは、誘導の6日後に、hpRSCsにおけるこれらの網膜始原細胞マーカーの20倍〜1200倍を超える増加した発現を見出した(図1d)。これらの遺伝子の発現レベルは、培養中に少なくとも2回の継代にわたって維持された。
【０１７５】
hpRSCsの転写プロファイル
hpRSCアイデンティティーの全体的な見解を得て、その親細胞、未分化hESC、及びよりコミット(commit)した網膜始原細胞と比較したその分子的特徴を調べるために、本発明者らは、マイクロアレイによって、hpRSCトランスクリプトームを、hESCs、及びヒトの17週胎児網膜始原細胞(hfRPCs)のものと比較した。データは、hpRSCsが、多能性hESCsから神経網膜運命に拘束されたhfRPCsへの分化過程内の過渡的な状態にあることを示した(図2a)。重要なhESC多能性転写因子、例えばPOU5F1(OCT4)、NANOG、KLF4、及びTBX3の顕著な下方制御がhpRSCsで観察された。興味深いことに、胚性幹細胞における幹細胞性だけでなく、いくつかの組織系統を規定する2つの転写因子である24〜26、LIN28及びSALL4は、hESCsにおけるのと同様のレベルでhpRSCsにおいて発現されたが、hfRPCsでは顕著に低減したレベルで発現された(図2b、e)。さらに、上昇したSOX2発現はhpRSCsでのみ検出され(図2b)、hpRSCsの原始的神経外胚葉状態を示す27。眼領域形成に関連した公知の分子的特徴と一致して23、hpRSCsは、TGF-βスーパーファミリーにおけるいくつかの遺伝子、例えばSMAD1、SMAD2、TGFβ3、BMP3、BMP6、TGFBR1、及びBMPR1Bの低下した発現を示した(図2c)。注目すべきことに、in vivoにおいてRPE発生に十分かつ不可欠である28、BMP4及びBMP7は、hpRSCsにおいて、hfRPCsにおけるよりも高い発現レベルを有した。以前の研究17、29と一致して、眼領域では通常抑制されているが、後方の境界を越えて上昇するWNT4及びWNT11の発現は、hpRSCsにおいて減少した(図2d)。同様に、眼領域形成において重要であることが知られている30、SRFP1(内因性Wnt阻害物質)及びFZD3/5(Wntシグナル伝達タンパク質の受容体)は、hpRSCsで強く発現された(図2d)。さらに、hpRSC及びhfRPCトランスクリプトームのペアワイズ比較分析は、眼領域特定化の間のhpRSCsの過渡的状態を確認した。OTX2、RAX、LHX2、SIX3、及びSIX6を含む典型的な初期の眼領域転写因子遺伝子のセットは、全て、網膜形成(retinogenesis)を通じて活性なままであるPAX6を除いて、hpRSCsにおいて、hfRPCsにおけるよりも顕著に発現された(図2e)。網膜神経形成を促進することが知られている31、FGFR1/2/3及びFGF3/8を含めた、FGFシグナル伝達経路のメンバーの下方制御も観察され(図7a)、hpRSCsはRPE又は神経網膜となるようにまだコミットしていないことを示唆する。データは、hESCsからのhpRSCsの誘導が眼領域特定化を再現(recapitulate)し得ること、及びhpRSCsは網膜亜系統分化へ入る準備ができていることを実証する。
【０１７６】
hESC由来hpRSCsからの網膜神経節細胞の方向付けされた分化
hESC由来hpRSCsが、培養において異なる網膜亜系統細胞型を生じる可能性を有するかどうかを調べるために、本発明者らは、初期眼発生の誘導のきっかけ(inductive cue)を模倣する小分子ベースのアプローチを取った。本発明者らは、hpRSCsの分化を、in vitroで特定の網膜細胞運命に向かって方向付けた。網膜神経節細胞(RGCs)は、網膜ニューロンの主要なタイプであり、網膜から脳のいくつかの領域に視覚信号を伝達する際に重要な役割を果たす。本発明者らは、まず、hESC由来hpRSCsが、化学的に規定された条件下でRGCsに分化するように指示され得るかどうかを試験した。以前の結果は、Notch及びVEGFRシグナル伝達の阻害が、RGC特定化のために重要であることを実証した32、33。本発明者らの転写プロファイリング分析は、Notch及びVEGFRシグナル伝達経路のいくつかのメンバー、例えば、NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、DLL1、DLL3、HES5、及びHES1の発現が、hpRSCsにおいて顕著に上方制御されたことを示した(図7b)。したがって、本発明者らは、Wnt、Notch、及びVEGFRシグナル伝達の活性をそれぞれ阻害することができるIWP2、DAPT、及びPD173074を含む小分子阻害剤のカクテルを調合した。その処理は、hpRSCsをRGC運命に迅速にコミットした。これら3つの小分子阻害剤の存在下での誘導の2週後、細胞の大部分は、RGCsのマーカーであるTUJ1及びBRN3両方ついて陽性であった(図3a)。定量的PCR分析は、誘導の最初の6日後に、RGC前駆細胞特異的転写因子遺伝子、例えばBRN3A、BRN3B、ISL-1、及びMATH5の顕著な上方制御を示した(図3b)。
【０１７７】
hESC由来hpRSCsからの光受容細胞の方向付けされた分化
光受容細胞は、網膜における主要な細胞型であり、視覚シグナル伝達の開始を担っている。hpRSCsは、hESCs及びhfRPCSよりも高いレベルで、いくつかのヘッジホッグ(HH)シグナル伝達遺伝子、例えばGLI2、GLI3、及びスムーズンド(SMO)を発現し(図7c)、hpRSCsが、光受容細胞に向かって分化するように傾いたことを示唆する。したがって、本発明者らは、以前の研究7に基づいて、改変したin vitro光受容細胞分化法を開発し、小分子を利用して分化過程を方向付けた。hpRSCsからの光受容細胞運命の拘束は、2ステッププロセスで達成されている7。最初の段階において、ALK4/5/7、GSK-3、Notch、及びWntシグナル伝達活性をそれぞれ抑制するための小分子阻害剤SB、CHIR99021、DAPT及びIWP2で、並びにShhシグナル伝達経路の小分子活性化因子であるプルモルファミンで、hpRSCsを処理した34。以前35記載されたように、この最初の段階において、頑強な細胞成長及び増殖が観察されたが、光受容細胞特異的マーカーの発現は観察されなかった。第二段階において、培養物を、以前の報告7に記載されているように、レチノイン酸及びタウリンを補充した培地にシフトさせ、これは、1週間後、いくつかの細胞における細胞突起の伸長を含めた形態的変化を誘導した。これらの分化した細胞の運命を同定するために、本発明者らは、免疫細胞化学により光受容細胞特異的マーカーの発現を調べた。最初の誘導後14日目までに、パン光受容細胞(pan-photoreceptor)マーカーであるリカバリン(図4a)、錐体細胞特異的マーカーであるOPN1SW若しくは青オプシン(図4b)、並びに桿体細胞特異的マーカーであるロドプシン(図4c)が検出された。in vitroでhpRSCsから分化した光受容細胞が、桿体光受容細胞及び錐体光受容細胞の両方のマーカーである36、ヒト光受容体間レチノイド結合タンパク質(IRBP)も発現するかどうかを決定するために、本発明者らは、IRBP-GFPレンチウイルスをhpRSCsに感染させ、形質導入した細胞を光受容細胞運命に向かって分化させた。このアプローチは、トランスジェニックマウスにおいて、並びにヒト、マウス、及びニワトリの網膜外植片において、光受容細胞を特異的に標識することが示されている37、38。分化の12日後、GFP陽性細胞が現れ始めた。16日目までに、GFPを発現する光受容細胞のクラスターが、はっきりと見えた(図4d)。さらなる成熟後、hpRSC由来の光受容細胞は、外節(outer segment)と類似した、短い内部突起及び長い伸長した外部突起などの典型的な形態的特徴を示した(図4d、挿入図)。
【０１７８】
hpRSCsからのRPEの方向付けされた分化
RPE、神経網膜と脈絡毛細管枝(choriocapillaris)の間の細胞の単層は、初期の眼杯の外側の層に現れる、最初にコミットした網膜細胞型である28。hESC由来hpRSCsが、神経網膜細胞だけでなく、非神経RPE細胞にも分化できるかどうかを試験するために、本発明者らは、hpRSCsの接着単層培養物から小分子阻害剤を除き(withdraw)、以前に記載されたように39、RPE開始培地にシフトさせた。SMADシグナル伝達阻害の除去及びアクチビンAの添加は、アクチビンA及びBMP活性がRPE特定化に必要とされるため、RPE運命に向かってhpRSCsを方向付けるのに重要である28、39、40。12日間のRPE分化後、全トランスレチノールの11-シスレチナールへの変換及び視覚色素再生に必要なRPE特異的イソメラーゼであるRPE65の低い発現レベル、並びに多角形のアクチン束の形成が、上皮様細胞の内側に観察された(図4e)。RPE65の増加した発現(図4f)及びRPEの色素沈着(図4g)は、培養におけるさらなる成熟後に現れた。
【０１７９】
hpRSCsの移植
本発明者らは、次に、hESC由来hpRSCsの、齧歯類の眼の網膜下腔に移植された後の、生存し、光受容細胞へ分化する能力を決定した。ヒト細胞の免疫拒絶を回避するために、本発明者らは、移植のための無胸腺ヌードラットを使用した。約50,000個のhpRSCsでの移植の6週後、移植されたヒト細胞は、レシピエントの眼の網膜下組織で観察されたが、ヒト特異的抗原(HSA)陽性細胞の数は限られ、瘢痕組織に囲まれていることが多かった(図8a)。細胞が凝集する傾向を克服し、網膜下移植後の細胞生存率を増加させるために、本発明者らは、生理食塩水の代わりに、ヒアルロン酸及びメチルセルロース(HAMC)からなるヒドロゲル中で細胞を送達することを選択した。最近、HAMCヒドロゲルを用いた、マウス眼由来の網膜始原細胞の移植が、移植された細胞の生存、分布、及び分化を改善できることが実証されている41、42。本発明者らは、HAMC(0.5/0.5％ w/w)ヒドロゲルと混合したhpRSCsを、ヌードラットの網膜下腔へ注入した。移植6週後に、増加した数の移植ヒト細胞が生存し、網膜下領域にわたって広く分布した(図8b)。したがって、続く移植実験について、本発明者らは、他に指定しない限り、HAMCヒドロゲル中のhpRSCsを送達した。神経網膜は新生動物ではまだ発生中であるため、それは、移植されたhpRSCsの融合及び分化のための許容される環境を提供し得る。この仮説を検証するために、本発明者らは、新生ヌードラットの網膜下腔にGFPタグ化hpRSCsを注入し、移植6日後に、外顆粒層(outer nuclear layer、ONL)及び内顆粒層(inner nuclear layer、INL)を含めた、神経網膜におけるGFP発現hpRSCsの顕著な融合を観察した(図5)。ONLに融合したGFP陽性細胞の一部は、典型的な光受容細胞マーカーリカバリンと共局在した(図5a、e、f)。注目すべきことに、多くの移植されたGFP陽性細胞は、非コミットhpRSCsのマーカーであるネスチンを発現し続け(図5b、d、f)、これらの細胞が、特定の網膜細胞運命にまだコミットされていなかったことを示す。次に、本発明者らは、網膜変性の動物モデルである王立外科医師会(Royal College of Surgeons、RCS)ラットにおいて、hpRSCsが、光受容細胞などの所望の細胞型に分化する能力を有するかどうかを試験した。RCSラットは、Mer受容体チロシンキナーゼ中に突然変異を有し、これは、RPE食作用の欠損を介して光受容細胞変性を引き起こす43、44。本発明者らは、hpRSCsを、生後21日目(P21)でRCSラットの網膜下腔に注入し、2ヶ月後に分化及び融合を調べた。移植された眼の凍結切片を、HSAに対する抗体と、光受容細胞マーカーであるリカバリン(図6a)若しくは赤/緑オプシン(図6b)のいずれかに対する抗体とで共免疫染色した。移植されたヒト細胞の層は、ONLに隣接する領域において検出された。多くのリカバリン陽性及び赤/緑オプシン陽性細胞はまた、HSAについて陽性であった(図6)。二重陽性標識細胞の存在は、いくつかの移植されたhpRSCsが、変性網膜において光受容細胞運命にコミットすることを示した。
【０１８０】
考察
ここで、本発明者らは、未分化hESCsからin vivo網膜発生の過程を再現する小分子ベースのアプローチを使用して、化学的に規定された培養条件下でhpRSCsを生産した。hESC由来hpRSCsは、眼領域の神経上皮細胞の典型的な特徴を示した。誘導は、未分化hESCsにおけるノーダル(Nodal)、BMP、及びWntシグナル伝達の相乗的阻害によって迅速かつ効率的な方法で達成された。hESC由来hpRSCsは、増殖し、典型的な初期の眼領域転写因子(すなわち、PAX6、LHX2、RAX、OTX2、及びSIX3)並びに幹細胞性因子(すなわち、SOX2、LIN28、SALL4、及びSTAT3)を活発に発現した。特定の分化のきっかけ(differentiation cue)が提供されると、これらの原始的網膜幹細胞は、神経細胞運命、例えばRGC若しくは光受容細胞、又は非神経RPEのいずれかにコミットするように方向付けられ得る。さらに、本発明者らは、移植されたhpRSCsが、融合し、生存し、in vivoで所望の細胞型に分化できたことを実証した。心強いことに、いくつかの移植されたhpRSCsは、網膜変性のモデルであるRCSラット(光受容細胞はP14に開始して失われ、ラットが3ヶ月齢の時までに完全になくなる)において、移植2ヶ月後に、残存しているONL中において光受容細胞に見かけ上分化した。さらに、本発明者らは、これまでに本発明者らが調べた移植動物において、移植されたhpRSCsからのいかなる腫瘍形成も観察しなかった。本発明者らの結果は、臨床試験に適したスケールアップした方法で、in vitroでhpRSCsを誘導し、増殖することが実現可能であることを示唆している。加えて、この小分子ベースの方法を使用して、患者iPSC由来hpRSCsだけでなく、より分化した網膜始原細胞若しくは網膜ニューロンを作製でき、このことは、網膜変性の病因の根底にある分子的及び細胞的事象を調べるための「ディッシュ中の疾患(disease in a dish)」モデリングにとって重要な意味を持つ。
【０１８１】
参考文献
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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