(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号４４または配列番号４０に記載のアミノ酸配列を有する改変殺虫タンパク質であって、前記改変殺虫タンパク質が、鱗翅目昆虫種に対して阻害活性を示す、改変殺虫タンパク質。
【請求項２】
前記鱗翅目が、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ及びＨｅｌｉｃｏｖｅｒｐａからなる群から選択される、請求項１に記載の改変殺虫タンパク質。
【請求項３】
前記鱗翅目が、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ｚｅａ及びＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａからなる群から選択される、請求項１に記載の改変殺虫タンパク質。
【請求項４】
改変殺虫タンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、前記ポリヌクレオチドが、異種プロモーターに作動可能に連結し、前記改変殺虫タンパク質が、配列番号４４または配列番号４０に記載のアミノ酸配列を含む、前記ポリヌクレオチド。
【請求項５】
改変殺虫タンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、前記ポリヌクレオチドが：
ａ．配列番号４３または配列番号３９に記載の；または、
ｂ．配列番号４４または配列番号４０に記載のアミノ酸配列を含む改変殺虫タンパク質をコードする
ヌクレオチド配列を含む、前記ポリヌクレオチド。
【請求項６】
配列番号４３または配列番号３９に記載のポリヌクレオチドを含む宿主細胞であって、細菌宿主細胞または植物宿主細胞からなる群から選択される、前記宿主細胞。
【請求項７】
前記細菌宿主細胞が、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、及びＥｒｗｉｎｉａからなる群から選択される、請求項６に記載の宿主細胞。
【請求項８】
配列番号４４または配列番号４０に記載のアミノ酸配列を有する改変殺虫タンパク質を含有する昆虫阻害性組成物。
【請求項９】
昆虫阻害有効量の：
ａ．配列番号４４または配列番号４０に記載のアミノ酸配列を含む改変殺虫タンパク質；または、
ｂ．配列番号４３または配列番号３９に記載のポリヌクレオチドによってコードされる改変殺虫タンパク質
を保有する種子。
【請求項１０】
前記鱗翅目害虫を、請求項１に記載の阻害量の改変殺虫タンパク質に接触させることを含む、鱗翅目害虫の防除方法。
【請求項１１】
請求項１に記載の改変殺虫タンパク質を保有するトランスジェニック植物細胞、植物または植物部分。
【請求項１２】
請求項１１に記載のトランスジェニック植物細胞、植物または植物部分に前記害虫を曝露することを含む、鱗翅目害虫の防除方法であり、前記植物細胞、植物または植物部分が、鱗翅目阻害量の改変殺虫タンパク質を発現する、前記防除方法。
【請求項１３】
請求項５に記載のポリヌクレオチドを保有する種子の産生方法であって、前記方法が、
ａ．請求項５に記載のポリヌクレオチドを保有する少なくとも１種の種子を植え付け；
ｂ．前記種子から植物を生長させ；及び、
ｃ．前記植物から種子を収穫することを含み、
前記収穫した種子が、請求項５に記載のポリヌクレオチドを保有する、前記産生方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１４年１０月１６日に出願された米国仮出願第６２／０６４，９９４号、及び２０１４年１０月１７日に出願された米国仮出願第６２／０６５，０１７号の利益を主張し、それらの全体を参照として本明細書にそれぞれ援用する。
【０００２】
配列表の登録
本明細書とともに、コンピュータ可読形式の配列表を電子提出によって提出する。前記配列表は、参照としてその全体を援用するとともに、これを２０１５年１０月１３日に作成したファイル名Ｐ３４２２３ＷＯ００＿ＳＥＱ＿ＰＣＴ．ｔｘｔ、及び３２７，２３５バイトのサイズ（ＭＳ‐Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）オペレーティングシステムで測定）のファイルに格納する。
【０００３】
本発明は、一般に、昆虫阻害性タンパク質の分野に関する。作物植物及び種子の農業関連害虫に対する昆虫阻害活性を示す新規クラスの改変タンパク質を開示する。特に、開示するクラスの改変阻害タンパク質は、害虫の鱗翅目に対する殺虫活性を有する。開示する改変阻害タンパク質の１つ以上をコードするポリヌクレオチド構築物を含有する植物、植物部分及び種子を提供する。
【背景技術】
【０００４】
Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ｚｅａ（アメリカタバコガ）は、トウモロコシ、ワタ、及びダイズを含む主要な農作物に対する重大な鱗翅目の害虫である。コーンイヤーワーム（ＣＥＷ）、コットンボールワーム（ＣＢＷ）、ソイポッドワーム（ＳＰＷ）として知られるこの多食性昆虫種は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ（Ｂｔ）または他の細菌種由来の殺虫タンパク質で防除することが特に困難である。Ｈ．ｚｅａが多くの異なる作物を摂食する能力を有しており、高用量で防除する戦略が現時点で欠如していることから、現在の昆虫防除形質に対してＨ．ｚｅａが耐性を備えるリスクがあると考えられている。したがって、Ｈ．ｚｅａによる食害から保護するトランスジェニック植物の耐久性を確実にするための新規作用様式（ＭｏＡ）が必要である。
【０００５】
Ｃｒｙ１Ｄａ１タンパク質は、鱗翅類活性タンパク質であり、Ｈｏｆｔｅ，ｅｔ  ａｌ．  “Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｄｅｄｕｃｅｄ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ａ  ｎｅｗ  Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ‐ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｒｙｓｔａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｇｅｎｅ  ｆｒｏｍ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ．”  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８（１８）（１９９０）：５５４５に初めて記載された。このタンパク質は、トウモロコシ、ワタ、及びダイズを含むいくつかの条植え作物の害虫であるＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（ツマジロクサヨトウ，ＦＡＷ）を含むＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ種に対して優れた殺虫活性を示す。しかしながら、Ｃｒｙ１Ｄａ１は、ボールワーム（例えば、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ａｒｍｉｇｅｒａ及びＨ．ｚｅａ）、ボーラー（Ｏｓｔｒｉｎｉａ  ｎｕｂｉｌａｌｉｓ及びＤｉａｔｒａｅａ  ｇｒａｎｄｉｏｓｅｌｌａ）ならびにダイズシャクトリムシ（Ｐｓｅｕｄｏｐｌｕｓｉａ  ｉｎｃｌｕｄｅｎｓ）を含む、様々な他の主要な鱗翅目の害虫に対して低〜中程度の活性を示す。Ｃｒｙ１Ｄａ１殺虫タンパク質は、その狭い殺虫スペクトルと、ＣＥＷなどの重要な鱗翅目の農業害虫に対する商業レベルでの保護を提供できないことから、トランスジェニック植物の昆虫防除形質としては、その価値は限定的である。その結果、現在商業的に栽培されている昆虫防除作物はＣｒｙ１Ｄａ１を植物組込み保護剤として利用していない。
【０００６】
その狭い殺虫スペクトルにもかかわらず、Ｃｒｙ１Ｄａ１タンパク質は興味深い殺虫タンパク質である。なぜならば、Ｃｒｙ１Ｄａ１タンパク質がある種の鱗翅目害虫を防除するために別のＭｏＡを使用すると思われるからである。その証拠は、多剤耐性昆虫コロニーを用いた研究から得られる。例えば、Ｃｒｙ１Ａｃ中毒に耐性であるＰｌｕｔｅｌｌａ  ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ（コナガ）及びＰｅｃｔｉｎｏｐｈｏｒａ  ｇｏｓｓｙｐｉｅｌｌａ（ワタアカミムシ）の野生株由来のコロニーは、Ｃｒｙ１Ｄａ１タンパク質に対して完全な感受性を保持する（Ｔａｂａｓｈｎｉｋ，ｅｔ  ａｌ．“Ｃｒｏｓｓ‐Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｏｆ  Ｐｉｎｋ  Ｂｏｌｌｗｏｒｍ（Ｐｅｃｔｉｎｏｐｈｏｒａ  ｇｏｓｓｙｐｉｅｌｌａ）  ｔｏ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ  ｔｏｘｉｎｓ．”  Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６６（２０００）：４５８２‐４５８４；Ｔａｂａｓｈｎｉｋ，ｅｔ  ａｌ．“Ｃｒｏｓｓ‐Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ  Ｔｏｘｉｎ  Ｃｒｙ１Ｊａ  ｉｎ  ａ  Ｓｔｒａｉｎ  ｏｆ  Ｄｉａｍｏｎｄｂａｃｋ  Ｍｏｔｈ  Ａｄａｐｔｅｄ  ｔｏ  Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｄｉｅｔ．”  Ｊ．Ｉｎｖｅｒｔ．Ｐａｔｈｏｌ．７６：（２０００）：８１‐８３．）。これらの一連の証拠は、Ｃｒｙ１Ｄａ１が、トランスジェニック作物に現在導入されているＣｒｙ１Ａｃ、Ｃｒｙ１Ａｂ、Ｃｒｙ１Ａ．１０５、Ｃｒｙ１Ｆａ、Ｃｒｙ２Ａｅ、及びＣｒｙ２Ａｂ２を含む鱗翅類活性タンパク質が認識するものとは異なる鱗翅類中腸受容体を認識することを示している。この見かけ上の新規ＭｏＡに鑑み、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａに対する殺虫活性を維持または増加させる一方で、より広いスペクトルのＨｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ種に対して、活性を向上させるようにＣｒｙ１Ｄａ１様タンパク質を最適化することにより、耐虫性管理のための高価値の植物組み込み保護剤を作り出すことができると考えられる。
【発明の概要】
【０００７】
本発明では、Ｓ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａに対する優れた活性を保持する一方で、Ｈ．ｚｅａに対する（Ｃｒｙ１Ｄａ１野生型トキシンと比較して）顕著に向上した活性を示すＴＩＣ８４４及びＣｒｙ１Ｄａ骨格タンパク質のいくつかのアミノ酸配列変異体を同定した。ＴＩＣ８４４及びＣｒｙ１Ｄａの改良型変異体は、作物植物（例えば、トウモロコシ、ダイズ、ワタ、サトウキビ）において発現するように改変されており、Ｃｒｙ１Ｄａの見かけ上のユニークな作用様式ならびにＨ．ｚｅａに対する活性の改良という観点から、植物内耐性管理及び鱗翅目害虫防除のための新規選択肢を提供する。
【０００８】
本明細書に記載の改変鱗翅類毒性タンパク質（「改変トキシンタンパク質」、「改変毒性タンパク質」または「改変殺虫タンパク質」とも呼ぶ）は、天然に存在するＢａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ殺虫トキシンＣｒｙ１Ｄａ１（配列番号２）の誘導体、またはＣｒｙ１Ｄａ１コアトキシンを含むが野生型Ｃｒｙ１Ｄａ１プロトキシンドメインをＣｒｙ１Ａｂ３プロトキシンに置換したＣｒｙ１Ｄａ１キメラ相同体のＴＩＣ８４４（配列番号１４）である。本発明の改変殺虫タンパク質は、それぞれ、配列番号２または配列番号１４のいずれかに示す骨格タンパク質と比較して、少なくとも１つのアミノ酸置換、１つのアミノ酸付加、または１つのアミノ酸欠失を含む。本発明の改変殺虫タンパク質は、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ｚｅａ（コーンイヤーワーム、ソイポッドワーム、コットンボールワーム）及びＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（ツマジロクサヨトウ）種の昆虫に対して特に有毒である。骨格タンパク質ＴＩＣ８４４（配列番号１４）及びＣｒｙ１Ｄａ１（配列番号２）がＨ．ｚｅａに対して低い毒性を示す一方で、本発明の改変殺虫タンパク質は、Ｈ．ｚｅａを含む鱗翅目の害虫に対し、驚くほど予想外の殺虫活性の向上及び殺虫スペクトルの拡張を示す。
【０００９】
特定の実施形態において、配列番号４４、配列番号４０、配列番号１２、配列番号２６、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８もしくは配列番号４２のいずれかに記載のアミノ酸配列を含む改変殺虫タンパク質またはその昆虫阻害性フラグメントを開示する。特定の実施形態において、改変殺虫タンパク質は、鱗翅目の昆虫種に対して阻害活性を示す。本発明の鱗翅目毒性タンパク質によって阻害される、標的とする鱗翅目害虫種としては、少なくともツマジロクサヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、ビートアワヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｅｘｉｇｕａ）、ベルタアワヨトウ（Ｍａｍｅｓｔｒａ  ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔａ）、タマナヤガ幼虫（Ａｇｒｏｔｉｓ  ｉｐｓｉｌｏｎ）、イラクサギンウワバ幼虫（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ）、ダイズシャクトリムシ（Ｃｈｒｙｓｏｄｅｉｘｉｓ  ｉｎｃｌｕｄｅｎｓ）、ビロードマメケムシ（Ａｎｔｉｃａｒｓｉａ  ｇｅｍｍａｔａｌｉｓ）、グリーンクローバーワーム（Ｈｙｐｅｎａ  ｓｃａｂｒａ）、ニセアメリカタバコガ幼虫（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ  ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）、グラニュレートカットワーム（Ａｇｒｏｔｉｓ  ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅａ）、アワヨトウ（Ｐｓｅｕｄａｌｅｔｉａ  ｕｎｉｐｕｎｃｔａ）、ウェスタンカットワーム（Ａｇｒｏｔｉｓ  ｏｒｔｈｏｇｏｎｉａ）、セイヨウアワノメイガ幼虫（Ｏｓｔｒｉｎｉａ  ｎｕｂｉｌａｌｉｓ）、クルミマダラメイガ幼虫（Ａｍｙｅｌｏｉｓ  ｔｒａｎｓｉｔｅｌｌａ）、ハムシモドキ幼虫（Ｃｒａｍｂｕｓ  ｃａｌｉｇｉｎｏｓｅｌｌｕｓ）、クロオビクロノメイガ幼虫（Ｈｅｒｐｅｔｏｇｒａｍｍａ  ｌｉｃａｒｓｉｓａｌｉｓ）、ヒマワリガ（Ｈｏｍｏｅｏｓｏｍａ  ｅｌｅｃｔｅｌｌｕｍ）、モロコシマダラメイガ幼虫（Ｅｌａｓｍｏｐａｌｐｕｓ  ｌｉｇｎｏｓｅｌｌｕｓ）、コドリンガ（Ｃｙｄｉａ  ｐｏｍｏｎｅｌｌａ）、ブドウヒメハマキ（Ｅｎｄｏｐｉｚａ  ｖｉｔｅａｎａ）、ナシヒメシンクイ（Ｇｒａｐｈｏｌｉｔａ  ｍｏｌｅｓｔａ）、ヒマワリハマキガ（Ｓｕｌｅｉｍａ  ｈｅｌｉａｎｔｈａｎａ）、コナガ（Ｐｌｕｔｅｌｌａ  ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ）、ワタアカミムシ（Ｐｅｃｔｉｎｏｐｈｏｒａ  ｇｏｓｓｙｐｉｅｌｌａ）、イネヨトウ（Ｓｅｓａｍｉａ  ｉｎｆｅｒｅｎｓ）、マイマイガ（Ｌｙｍａｎｔｒｉａ  ｄｉｓｐａｒ）、コットンリーフワーム（Ａｌａｂａｍａ  ａｒｇｉｌｌａｃｅａ）、果樹ハマキムシ（Ａｒｃｈｉｐｓ  ａｒｇｙｒｏｓｐｉｌａ）、セイヨウハマキムシ（Ａｒｃｈｉｐｓ  ｒｏｓａｎａ）、ニカメイガ幼虫、またはイネノズイムシ（Ｃｈｉｌｏ  ｓｕｐｐｒｅｓｓａｌｉｓ）、コブノメイガ幼虫（Ｃｎａｐｈａｌｏｃｒｏｃｉｓ  ｍｅｄｉｎａｌｉｓ）、ハムシモドキ幼虫（Ｃｒａｍｂｕｓ  ｃａｌｉｇｉｎｏｓｅｌｌｕｓ）、シバツトガ幼虫（Ｃｒａｍｂｕｓ  ｔｅｔｅｒｒｅｌｌｕｓ）、南西部アワノメイガ幼虫（Ｄｉａｔｒａｅａ  ｇｒａｎｄｉｏｓｅｌｌａ））、サトウキビメイガ幼虫（Ｄｉａｔｒａｅａ  ｓａｃｃｈａｒａｌｉｓ）、ミスジアオリンガ幼虫（Ｅａｒｉ��ｓ  ｉｎｓｕｌａｎａ）、クサオビリンガ幼虫（Ｅａｒｉａｓ  ｖｉｔｔｅｌｌａ）、オオタバコガ幼虫（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ａｒｍｉｇｅｒａ）、コーンイヤーワーム、ソイポッドワームまたはコットンボールワーム（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ｚｅａ）、クロオビクロノメイガ幼虫（Ｈｅｒｐｅｔｏｇｒａｍｍａ  ｌｉｃａｒｓｉｓａｌｉｓ）、ホソバヒメハマキ（Ｌｏｂｅｓｉａ  ｂｏｔｒａｎａ）、ミカンハモグリガ（Ｐｈｙｌｌｏｃｎｉｓｔｉｓ  ｃｉｔｒｅｌｌａ）、オオモンシロチョウ（Ｐｉｅｒｉｓ  ｂｒａｓｓｉｃａｅ）、アオムシ、またはモンシロチョウ（Ｐｉｅｒｉｓ  ｒａｐａｅ）、ハスモンヨトウ、またはクラスターキャタピラー（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｌｉｔｕｒａ）、及びトマトキバガ（Ｔｕｔａ  ａｂｓｏｌｕｔａ）が挙げられる。
【００１０】
本明細書においてまた、改変殺虫タンパク質またはその殺害虫性フラグメントをコードするポリヌクレオチドを開示し、そこにおいて、ポリヌクレオチドは異種プロモーターに作動可能に連結し、改変殺虫タンパク質は、配列番号４４、配列番号４０、配列番号１２、配列番号２６、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８または配列番号４２のいずれかに記載のアミノ酸配列を有する。
【００１１】
別の実施形態では、本明細書に開示するものは、改変殺虫タンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、そこにおいて、ポリヌクレオチドは、必要に応じてストリンジェントな条件下で、配列番号４３、配列番号３９、配列番号１１、配列番号１１、配列番号２５、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７または配列番号４１のいずれかに記載のポリヌクレオチド配列の逆相補配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列であるか；または、配列番号４４、配列番号４０、配列番号１２、配列番号２６、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８または配列番号４２のいずれかに記載のアミノ酸配列を有する改変殺虫タンパク質をコードする。
【００１２】
本明細書ではまた、配列番号４３、配列番号３９、配列番号１１、配列番号１１、配列番号２５、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７または配列番号４１のいずれかに記載のポリヌクレオチドを保有する宿主細胞を提供し、そこにおいて、宿主細胞は、細菌宿主細胞または植物宿主細胞からなる群から選択される。想定する細菌宿主細胞として、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、及びＥｒｗｉｎｉａからなる群から選択される細菌宿主細胞が挙げられ、前記Ｂａｃｉｌｌｕｓ種はＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓまたはＢａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓであり、前記ＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓはＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｔｅｒｏｓｐｅｒｏｕｓであり、前記ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉである。さらに、想定する植物宿主細胞として、単子葉植物または双子葉植物が挙げられる。
【００１３】
さらに別の実施形態において、本明細書において提供するものは、配列番号４４、配列番号４０、配列番号１２、配列番号２６、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８もしくは配列番号４２に記載のアミノ酸配列を有する改変殺虫タンパク質またはその昆虫阻害性フラグメントを含有する昆虫阻害性組成物である。この昆虫阻害性組成物は、改変殺虫タンパク質とは異なる少なくとも１種の昆虫阻害剤をさらに含むことができると考えられる。想定する昆虫阻害剤としては、昆虫阻害タンパク質、昆虫阻害性ｄｓＲＮＡ分子、及び昆虫阻害化学剤が挙げられる。少なくとも１種の他の殺害虫剤は、鱗翅目、鞘翅目、半翅目、同翅亜目、またはアザミウマ目の１種以上の害虫種に対して活性を示すことができると考えられる。
【００１４】
本明細書においてまた、配列番号４４、配列番号４０、配列番号１２、配列番号２６、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８もしくは配列番号４２のいずれかに記載のアミノ酸配列を有する昆虫阻害有効量の改変殺虫タンパク質を保有するか；または配列番号４３、配列番号３９、配列番号１１、配列番号１１、配列番号２５、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７もしくは配列番号４１のいずれかに記載のポリヌクレオチドを保有する種子も開示する。
【００１５】
本明細書の別の実施形態では、鱗翅目害虫に阻害量の改変殺虫タンパク質を接触させることを含む、鱗翅目害虫の防除方法についても開示する。
【００１６】
さらに別の実施形態において、本明細書に開示するものは、改変殺虫タンパク質を保有するトランスジェニック植物細胞、植物または植物部分である。前記改変殺虫タンパク質を保有するトランスジェニック植物細胞、植物または植物部分に害虫を曝露することを含む鱗翅目害虫の防除方法を提供する。改変殺虫タンパク質を検出可能な量で含有する植物細胞、植物または植物部分に由来するコモディティ製品もまた想定する。想定するコモディティ製品として、例えば植物バイオマス、油、粗びき粉、動物飼料、粒粉、フレーク、糠、リント、穀、及び加工種子が挙げられる。
【００１７】
本明細書に開示する別の方法は、改変殺虫タンパク質を保有する種子の産生方法であって、前記方法は、改変殺虫タンパク質を保有する少なくとも１種の種子を植え付け；種子から植物を生長させ；及び植物から種子を収穫することを含み、そこにおいて前記収穫した種子は、改変殺虫タンパク質を保有する。
【００１８】
本願で開示するさらに別の方法は、鱗翅目害虫による作物植物の摂食を阻害する方法であって、配列番号２または配列番号１４の１残基以上のアミノ酸残基（複数可）に対し、１残基以上のアミノ酸残基（複数可）を置換することによって改変し、改変型の配列番号２または配列番号１４を生成し、鱗翅類阻害量の改変型配列番号２または配列番号１４を、前記作物植物の組織内、表面またはその近傍において利用可能にすることを含み、そこにおいて、配列番号２または配列番号１４の改変アミノ酸残基は、リジンもしくはバリンに置換した２８２位のセリン、セリンに置換した３１６位のチロシン、プロリンもしくはアルギニンに置換した３６８位のイソロイシン、アルギニンに置換した３７４位のセリン、ヒスチジンに置換した３７５位のアスパラギン、及びロイシンに置換した４３２位のイソロイシンからなるグループから選択する。
【００１９】
本発明の改変殺虫タンパク質をコードする組換えポリヌクレオチド分子もまた提供する。想定する組換えポリヌクレオチド分子は、配列番号４３、配列番号３９、配列番号１１、配列番号１１、配列番号２５、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７または配列番号４１からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列を有し；及び、必要に応じて、改変殺虫タンパク質とは異なる昆虫阻害剤をコードするポリヌクレオチド配列を含む。
【００２０】
本願に開示する別の方法は、骨格タンパク質の鱗翅類活性を増強し、鱗翅類阻害スペクトルを拡張する方法であって、前記方法は、配列番号２または配列番号１４の１残基以上のアミノ酸残基（複数可）に対し、アミノ酸残基（複数可）を置換することによって改変し、改変型殺虫タンパク質を生成することを含み、そこにおいて、配列番号２または配列番号１４の改変アミノ酸残基は、リジンもしくはバリンに置換した２８２位のセリン、セリンに置換した３１６位のチロシン、プロリンもしくはアルギニンに置換した３６８位のイソロイシン、アルギニンに置換した３７４位のセリン、ヒスチジンに置換した３７５位のアスパラギン、及びロイシンに置換した４３２位のイソロイシンからなる群から選ばれる。本方法の特定の実施形態において、改変殺虫タンパク質は、骨格タンパク質に比べ、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ｚｅａにおいて少なくとも８倍の致死性の増大を有する。
【００２１】
本発明の他の実施形態、特徴及び利点は、以下の詳細な説明、実施例、及び請求の範囲から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】２つの異なるＨｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ｚｅａ（ＣＥＷ）コロニー、ユニオンシティー及びベンツォンについての骨格タンパク質ＴＩＣ８４４（配列番号１４）のＭＩＣ５０値を、改変殺虫タンパク質ＴＩＣ８４４＿８（配列番号２６）と比較して示す。
【００２３】
配列の簡単な説明
配列番号１は、Ｃｒｙ１Ｄａ１タンパク質をコードするヌクレオチド配列である。
【００２４】
配列番号２は、Ｃｒｙ１Ｄａ１タンパク質トキシンのアミノ酸配列である。
【００２５】
配列番号３は、Ｃｒｙ１Ｄａ１＿３タンパク質をコードするヌクレオチド配列である。
【００２６】
配列番号４は、Ｃｒｙ１Ｄａ１＿３タンパク質トキシンのアミノ酸配列である。
【００２７】
配列番号５は、Ｃｒｙ１Ｄａ１＿４タンパク質をコードするヌクレオチド配列である。
【００２８】
配列番号６は、Ｃｒｙ１Ｄａ１＿４タンパク質トキシンのアミノ酸配列である。
【００２９】
配列番号７は、Ｃｒｙ１Ｄａ１＿５タンパク質をコードするヌクレオチド配列である。
【００３０】
配列番号８は、Ｃｒｙ１Ｄａ１＿５タンパク質トキシンのアミノ酸配列である。
【００３１】
配列番号９は、Ｃｒｙ１Ｄａ１＿６タンパク質をコードするヌクレオチド配列である。
【００３２】
配列番号１０は、Ｃｒｙ１Ｄａ１＿６タンパク質トキシンのアミノ酸配列である。
【００３３】
配列番号１１は、Ｃｒｙ１Ｄａ１＿７タンパク質をコードするヌクレオチド配列である。
【００３４】
配列番号１２は、Ｃｒｙ１Ｄａ１＿７タンパク質トキシンのアミノ酸配列である。
【００３５】
配列番号１３は、ＴＩＣ８４４タンパク質をコードするヌクレオチド配列である。
【００３６】
配列番号１４は、ＴＩＣ８４４タンパク質トキシンのアミノ酸配列である。
【００３７】
配列番号１５は、ＴＩＣ８４４＿２タンパク質をコードするヌクレオチド配列である。
【００３８】
配列番号１６は、ＴＩＣ８４４＿２タンパク質トキシンのアミノ酸配列である。
【００３９】
配列番号１７は、ＴＩＣ８４４＿４タンパク質をコードするヌクレオチド配列である。
【００４０】
配列番号１８は、ＴＩＣ８４４＿４タンパク質トキシンのアミノ酸配列である。
【００４１】
配列番号１９は、ＴＩＣ８４４＿５タンパク質をコードするヌクレオチド配列である。
【００４２】
配列番号２０は、ＴＩＣ８４４＿５タンパク質トキシンのアミノ酸配列である。
【００４３】
配列番号２１は、ＴＩＣ８４４＿６タンパク質をコードするヌクレオチド配列である。
【００４４】
配列番号２２は、ＴＩＣ８４４＿６タンパク質トキシンのアミノ酸配列である。
【００４５】
配列番号２３は、ＴＩＣ８４４＿７タンパク質をコードするヌクレオチド配列である。
【００４６】
配列番号２４は、ＴＩＣ８４４＿７タンパク質トキシンのアミノ酸配列である。
【００４７】
配列番号２５は、ＴＩＣ８４４＿８タンパク質をコードするヌクレオチド配列である。
【００４８】
配列番号２６は、ＴＩＣ８４４＿８タンパク質トキシンのアミノ酸配列である。
【００４９】
配列番号２７は、植物内でのＣｒｙ１Ｄａ１タンパク質の発現に使用するために設計したポリヌクレオチド配列である。
【００５０】
配列番号２８は、Ｃｒｙ１Ｄａ１タンパク質トキシンのアミノ酸配列である。
【００５１】
配列番号２９は、植物内でのＣｒｙ１Ｄａ１＿２．ｎｎｏタンパク質の発現に使用するために設計したポリヌクレオチド配列である。
【００５２】
配列番号３０は、Ｃｒｙ１Ｄａ１＿２．ｎｎｏタンパク質トキシンのアミノ酸配列である。
【００５３】
配列番号３１は、植物内でのＣｒｙ１Ｄａ１＿３．ｎｎｏタンパク質の発現に使用するために設計したポリヌクレオチド配列である。
【００５４】
配列番号３２は、Ｃｒｙ１Ｄａ１＿３．ｎｎｏタンパク質トキシンのアミノ酸配列である。
【００５５】
配列番号３３は、植物内でのＣｒｙ１Ｄａ１＿４．ｎｎｏタンパク質の発現に使用するために設計したポリヌクレオチド配列である。
【００５６】
配列番号３４は、Ｃｒｙ１Ｄａ１＿４．ｎｎｏタンパク質トキシンのアミノ酸配列である。
【００５７】
配列番号３５は、植物内でのＣｒｙ１Ｄａ１＿５．ｎｎｏタンパク質の発現に使用するために設計したポリヌクレオチド配列である。
【００５８】
配列番号３６は、Ｃｒｙ１Ｄａ１＿５．ｎｎｏタンパク質トキシンのアミノ酸配列である。
【００５９】
配列番号３７は、植物内でのＣｒｙ１Ｄａ１＿６．ｎｎｏタンパク質の発現に使用するために設計したポリヌクレオチド配列である。
【００６０】
配列番号３８は、Ｃｒｙ１Ｄａ１＿６．ｎｎｏタンパク質トキシンのアミノ酸配列である。
【００６１】
配列番号３９は、植物内でのＣｒｙ１Ｄａ１＿７．ｎｎｏタンパク質の発現に使用するために設計したポリヌクレオチド配列である。
【００６２】
配列番号４０は、Ｃｒｙ１Ｄａ１＿７．ｎｎｏタンパク質トキシンのアミノ酸配列である。
【００６３】
配列番号４１は、植物内でのＴＩＣ８４４＿９．ｎｎｏタンパク質の発現に使用するために設計したポリヌクレオチド配列である。
【００６４】
配列番号４２は、ＴＩＣ８４４＿９．ｎｎｏタンパク質トキシンのアミノ酸配列である。
【００６５】
配列番号４３は、植物内でのＴＩＣ８４４＿１１．ｎｎｏタンパク質の発現に使用するために設計したポリヌクレオチド配列である。
【００６６】
配列番号４４は、ＴＩＣ８４４＿１１．ｎｎｏタンパク質トキシンのアミノ酸配列である。
【００６７】
発明の詳細な説明
本明細書において、他の公知の鱗翅類殺虫タンパク質に比べて、鱗翅目種に対して驚くほど高レベルの毒性活性及び広範な殺虫スペクトルを示す改変殺虫タンパク質を提供する。これらの改変殺虫タンパク質は、様々なアミノ酸改変の鋳型として役立つ殺虫性骨格タンパク質に由来する。そのような殺虫性骨格タンパク質の例としては、Ｃｒｙ１Ｄａ１及びＴＩＣ８４４（Ｃｒｙ１Ｄａ１相同体）が挙げられるが、必ずしもこれらに限定するものではない。ＴＩＣ８４４は、Ｃｒｙ１Ｄａ１コアトキシン（すなわち、ドメインＩ、ＩＩ及びＩＩＩ）を含む一方で、Ｃｒｙ１Ａｂ３プロトキシンドメインを利用することにより、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ（Ｂｔ）において良好な発現を確保している。野生型のＣｒｙ１Ｄａ１プロトキシンドメインを利用した場合、Ｃｒｙ１Ｄａ１はＢｔ中でほとんど発現しない。しかしながら、本願で示すように、野生型のプロトキシンドメインを除去し、Ｃｒｙ１Ｄａ１コアトキシンコードセグメントとＣｒｙ１Ａｂ３プロトキシンドメインコードセグメントとをインフレームで融合させると、Ｂｔの結晶非産生株においてＣｒｙ１Ｄａ１コアトキシンの発現は顕著に改善する。注目すべき点として、骨格タンパク質ＴＩＣ８４４（配列番号１４）及びＣｒｙ１Ｄａ１（配列番号２）は、改変殺虫タンパク質において認められるような商業的に有用な鱗翅類阻害スペクトル及び向上した鱗翅類阻害活性を示さない。
【００６８】
本明細書中に開示する改変殺虫タンパク質は、親骨格タンパク質であるＴＩＣ８４４またはＣｒｙ１Ｄａ１に比べて、改変タンパク質が鱗翅類阻害スペクトルの拡張及び／または鱗翅類阻害活性の向上を示すようなアミノ酸改変と関連する。「より活性な」、「向上した活性」、「増加した特異性」、「増大した毒性強度」、「増強した毒性」、「向上した鱗翅類阻害活性」、「より高い鱗翅類阻害活性」、及び「拡張した鱗翅類阻害スペクトル」とは、鱗翅目昆虫に対する改変殺虫タンパク質の活性と骨格タンパク質（ＴＩＣ８４４またはＣｒｙ１Ｄａ１）の活性との比較についての言及であって、ここで、改変殺虫タンパク質に起因する活性が骨格タンパク質に起因する活性より高いことを意味している。特定の実施形態では、本明細書で提供する改変殺虫タンパク質は、骨格ＴＩＣ８４４またはＣｒｙ１Ｄａ１タンパク質の活性に比べて、拡張した鱗翅類阻害スペクトル及び／または向上したもしくはより高い鱗翅類阻害活性を示し、ここで、鱗翅目害虫種は、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ｚｅａ及びＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａを含むが、必ずしもこれらに限定するものではない。
【００６９】
本明細書中で使用する場合、用語及び語句「活性な」もしくは「活性」；「殺害虫活性」もしくは「殺害虫性」；または「殺虫活性」、「昆虫阻害性」、「殺虫性」もしくは「昆虫阻害量」とは、害虫の阻害（生育、摂食、繁殖、または生存性の阻害）、抑制（生育、摂食、繁殖、または生存性の抑制）、防除（害虫の侵襲防除、有効量の開示した改変殺虫タンパク質を保有する特定の作物に対する害虫の摂食行動の防除）または駆除（疾病状態、致死、もしくは生存率の低下を引き起こすこと）においての殺虫タンパク質などの毒性剤の効率を指す。同様に、「鱗翅類阻害量」とは、鱗翅類の生存能力、鱗翅類の生育、鱗翅類の発達、鱗翅類の生殖、鱗翅類の摂食行動、鱗翅類の交尾行動の測定可能な阻害、及び／または鱗翅目害虫の摂食行動によって植物に及ぼされる有害作用の測定可能な低減をもたらす毒性剤、例えば殺虫タンパク質の量を指す。これらの用語は、害虫に殺害虫有効量の毒性剤を与え、毒性剤への曝露によって害虫に、疾病状態、致死、繁殖力の低下、または発育阻止をもたらす結果を含むことを意図している。これらの用語はまた、植物内または植物表面に殺害虫有効量の毒性剤を与える結果として、植物、植物部分、種子、植物細胞、または植物が生長する可能性のある特定の地理的区域から害虫を撃退することを含む。一般に、殺害虫活性とは、鱗翅目の害虫を含むがこれに限定されない特定の標的害虫によるこのタンパク質、タンパク質フラグメント、タンパク質セグメントまたはポリヌクレオチドの摂食により引き起こされる、生育、発生、生存能力、摂食行動、交尾行動、繁殖力の阻害、または有害作用の測定可能な低減に有効な毒性剤の能力を指す。毒性剤は、植物によって産生可能であるか、または植物もしくは植物が位置する区域内の環境に散布可能である。
【００７０】
殺害虫有効量の毒性剤を標的害虫の食餌中に含ませた場合、毒性剤は、害虫がそれを摂取した時に殺害虫活性を示す。毒性剤は、殺害虫タンパク質または当該分野で公知の１種以上の化学剤であり得る。殺害虫性または殺虫性化学剤及び殺害虫または殺虫タンパク質剤は、単独で、または互いに組み合わせて使用することができる。化学剤としては、標的害虫の特定の遺伝子を標的として抑制するｄｓＲＮＡ分子、有機塩化物、有機リン酸、カルバミン酸、ピレスロイド、ネオニコチノイド、及びリアノイドが挙げられるが、必ずしもこれらに限定するものではない。殺害虫または殺虫タンパク質剤としては、本願に記載の改変殺虫タンパク質、ならびに鱗翅目害虫種を標的とするものを含む他のタンパク質性毒性剤、ならびに他の植物害虫を防除するために使用するタンパク質トキシン、例えば鞘翅目、半翅目及び同翅亜目種の防除に使用するための技術において利用可能なＣｒｙタンパク質などが挙げられる。
【００７１】
用語「セグメント」または「フラグメント」は、本明細書においては、改変殺虫タンパク質を表す完全長のアミノ酸または核酸配列よりも短い連続アミノ酸または核酸配列を表すために使用する。
【００７２】
害虫、特に作物植物の害虫とは、作物植物に対する昆虫類の害虫、特に開示する改変殺虫タンパク質によって防除される鱗翅目害虫を表すことを意図している。しかしながら、鞘翅目、半翅目及び同翅亜目の植物害虫、ならびに線虫及び菌類についても、開示する改変殺虫タンパク質とともにこれらの害虫を標的とする有毒物質を共局在または共に存在させる場合には、害虫に含めることができる。
【００７３】
開示する改変殺虫タンパク質は、成虫、蛹、幼虫及び新生幼虫を含む鱗翅目昆虫種由来の昆虫類の害虫に対して、殺虫活性を示す。鱗翅目の昆虫としては、例えば、ツマジロクサヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、ビートアワヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｅｘｉｇｕａ）、ベルタアワヨトウ（Ｍａｍｅｓｔｒａ  ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔａ）、タマナヤガ幼虫（Ａｇｒｏｔｉｓ  ｉｐｓｉｌｏｎ）、イラクサギンウワバ幼虫（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ）、ダイズシャクトリムシ（Ｐｓｅｕｄｏｐｌｕｓｉａ  ｉｎｃｌｕｄｅｎｓ）、ビロードマメケムシ（Ａｎｔｉｃａｒｓｉａ  ｇｅｍｍａｔａｌｉｓ）、グリーンクローバーワーム（Ｈｙｐｅｎａ  ｓｃａｂｒａ）、ニセアメリカタバコガ幼虫（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ  ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）、グラニュレートカットワーム（Ａｇｒｏｔｉｓ  ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅａ）、アワヨトウ（Ｐｓｅｕｄａｌｅｔｉａ  ｕｎｉｐｕｎｃｔａ）、ウェスタンカットワーム（Ａｇｒｏｔｉｓ  ｏｒｔｈｏｇｏｎｉａ）などのヤガ科のアワヨトウ、カットワーム、シャクトリムシ及びタバコガ幼虫；例えば、セイヨウアワノメイガ幼虫（Ｏｓｔｒｉｎｉａ  ｎｕｂｉｌａｌｉｓ）、クルミマダラメイガ幼虫（Ａｍｙｅｌｏｉｓ  ｔｒａｎｓｉｔｅｌｌａ）、ハムシモドキ幼虫（Ｃｒａｍｂｕｓ  ｃａｌｉｇｉｎｏｓｅｌｌｕｓ）、クロオビクロノメイガ幼虫（Ｈｅｒｐｅｔｏｇｒａｍｍａ  ｌｉｃａｒｓｉｓａｌｉｓ）、ヒマワリガ（Ｈｏｍｏｅｏｓｏｍａ  ｅｌｅｃｔｅｌｌｕｍ）、モロコシマダラメイガ幼虫（Ｅｌａｓｍｏｐａｌｐｕｓ  ｌｉｇｎｏｓｅｌｌｕｓ）などのメイガ科のボーラー、ケースベアラー、ウェブワーム、コーンワーム、キャベッジワーム及びスケルトナイザー；例えば、コドリンガ（Ｃｙｄｉａ  ｐｏｍｏｎｅｌｌａ）、ブドウヒメハマキ（Ｅｎｄｏｐｉｚａ  ｖｉｔｅａｎａ）、ナシヒメシンクイ（Ｇｒａｐｈｏｌｉｔａ  ｍｏｌｅｓｔａ）、ヒマワリハマキガ（Ｓｕｌｅｉｍａ  ｈｅｌｉａｎｔｈａｎａ）などのハマキガ科のリーフローラー、バドワーム、シードワーム、及びフルーツワーム；ならびに例えば、コナガ（Ｐｌｕｔｅｌｌａ  ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ）、ワタアカミムシ（Ｐｅｃｔｉｎｏｐｈｏｒａ  ｇｏｓｓｙｐｉｅｌｌａ）、及びマイマイガ（Ｌｙｍａｎｔｒｉａ  ｄｉｓｐａｒ）などの経済的に重要な他の多くの鱗翅目が挙げられるが、必ずしもこれらに限定するものではない。鱗翅目の他の害虫としては、例えば、Ａｌａｂａｍａ  ａｒｇｉｌｌａｃｅａ（コットンリーフワーム）、Ａｒｃｈｉｐｓ  ａｒｇｙｒｏｓｐｉｌａ（果樹ハマキムシ）、Ａｒｃｈｉｐｓ  ｒｏｓａｎａ（セイヨウハマキムシ）及び他のＡｒｃｈｉｐｓ種、Ｃｈｉｌｏ  ｓｕｐｐｒｅｓｓａｌｉｓ（ニカメイガ幼虫、またはイネノズイムシ）、Ｃｎａｐｈａｌｏｃｒｏｃｉｓ  ｍｅｄｉｎａｌｉｓ（コブノメイガ幼虫）、Ｃｒａｍｂｕｓ  ｃａｌｉｇｉｎｏｓｅｌｌｕｓ（ハムシモドキ幼虫）、Ｃｒａｍｂｕｓ  ｔｅｔｅｒｒｅｌｌｕｓ（シバツトガ幼虫）、Ｄｉａｔｒａｅａ  ｇｒａｎｄｉｏｓｅｌｌａ（南西部アワノメイガ幼虫）、Ｄｉａｔｒａｅａ  ｓａｃｃｈａｒａｌｉｓ（サトウキビメイガ幼虫）、Ｅａｒｉａｓ  ｉｎｓｕｌａｎａ（ミスジアオ��ンガ幼虫）、Ｅａｒｉａｓ  ｖｉｔｔｅｌｌａ（クサオビリンガ幼虫）、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ａｒｍｉｇｅｒａ（オオタバコガ幼虫）、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ｚｅａ（コーンイヤーワームまたはコットンボールワーム）、Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ  ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ（ニセアメリカタバコガ幼虫）、Ｈｅｒｐｅｔｏｇｒａｍｍａ  ｌｉｃａｒｓｉｓａｌｉｓ（クロオビクロノメイガ幼虫）、Ｌｏｂｅｓｉａ  ｂｏｔｒａｎａ（ホソバヒメハマキ）、Ｐｈｙｌｌｏｃｎｉｓｔｉｓ  ｃｉｔｒｅｌｌａ（ミカンハモグリガ）、Ｐｉｅｒｉｓ  ｂｒａｓｓｉｃａｅ（オオモンシロチョウ）、Ｐｉｅｒｉｓ  ｒａｐａｅ（アオムシ、またはモンシロチョウ）、Ｐｌｕｔｅｌｌａ  ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ（コナガ）、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｅｘｉｇｕａ（ビートアワヨトウ）、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｌｉｔｕｒａ（ハスモンヨトウ、またはクラスターキャタピラー）、及びＴｕｔａ  ａｂｓｏｌｕｔａ（トマトキバガ）が挙げられる。
【００７４】
本願において、「単離したＤＮＡ分子」または同等の用語もしくは語句は、そのＤＮＡ分子が単独でまたは他の組成物との組合せで存在するがその天然の環境内には存在しないものを表すことを意図する。例えば、生物のゲノムＤＮＡ内に天然に見出されるコード配列、イントロン配列、非翻訳リーダー配列、プロモーター配列、転写終結配列などのような核酸要素は、その要素が生物ゲノム内にあり、それが天然に見出されるゲノム内の場所に存在する限り、「単離した」とはみなされない。しかしながら、これらの各要素及びこれらの要素の一部分は、その要素が生物ゲノム内及びそれが自然に見出されるゲノム内の位置にない限りにおいて、本開示の範囲内では「単離」されている。同様に、殺虫タンパク質またはそのタンパク質の天然起源殺虫性変異体をコードするヌクレオチド配列は、タンパク質をコードする天然起源の前記ヌクレオチド配列が細菌のＤＮＡ内に存在しない限りにおいて、単離したヌクレオチド配列である。天然の殺虫タンパク質のアミノ酸配列をコードする合成ヌクレオチド配列は、本開示の目的のために単離したものとみなされる。本開示の目的のために、植物もしくは細菌のゲノム内で細胞を形質転換するために使用するプラスミドもしくは同様の構造内に存在していても、または植物もしくは細菌に由来する組織、子孫、生物学的試料もしくはコモディティ製品中において検出可能な量で存在していても、任意のトランスジェニックヌクレオチド配列、すなわち、植物もしくは細菌の細胞ゲノム内に挿入されている、または染色体外ベクターに存在するＤＮＡのヌクレオチド配列は、単離したヌクレオチド配列であるとみなされる。
【００７５】
実施例にさらに記載するように、ＴＩＣ８４４及びＣｒｙ１Ｄａ１の２０００種（２０００）を超えるアミノ酸配列変異体の改変、試験及び選択の繰り返しラウンドの結果、所与の骨格タンパク質から置換、挿入または欠失させてもよい特定のアミノ酸残基を同定し、ベースラインの骨格タンパク質であるＴＩＣ８４４またはＣｒｙ１Ｄａ１のスペクトル及び活性に比べて、鱗翅類阻害スペクトルの拡張及び／または鱗翅類阻害活性の向上を示す（すなわち、毒性がより高く；同レベルの致死率を得るために必要な殺虫タンパク質がより少なくて済む）改変殺虫タンパク質を生成した。これらの改変、試験及び選択の繰り返しの結果、ＴＩＣ８４４及びＣｒｙ１Ｄａ１骨格タンパク質中における、タンパク質の昆虫阻害スペクトルまたは活性に変化を及ぼさない中立的アミノ酸残基置換、挿入または欠失を同定した。ＴＩＣ８４４またはＣｒｙ１Ｄａ１と比べて鱗翅類阻害スペクトルの拡張及び／または鱗翅類阻害活性の向上を生じるように改変可能なＴＩＣ８４４及びＣｒｙ１Ｄａ１骨格中の特定のアミノ酸残基を本明細書において同定する。特定の実施形態では、本明細書において提供する改変殺虫タンパク質は、配列番号１４（ＴＩＣ８４４）または配列番号２（Ｃｒｙ１Ｄａ１）の骨格タンパク質よりも鱗翅目害虫種に対して約８倍以上の鱗翅類阻害活性を示すことができる。
【００７６】
これらの繰り返しラウンドにおける「改変」は、骨格タンパク質中の関連する残基を同定し、これを改変して、改変試験タンパク質を作製し、得られた改変試験タンパク質をクローニングし、発現させることを含む。改変のために変化させるアミノ酸残基を選ぶ準ランダムアプローチのガイド及び補完のために、骨格タンパク質の原子構造を用いた。これらの繰り返しラウンドにおける「試験」は、改変試験タンパク質とその親骨格タンパク質の鱗翅類活性を比較することを含んでいた。これらの繰り返しラウンドにおける「選択」は、活性が向上した改変試験タンパク質（改良変異体）及びこれらの改良変異体を作製するように改変した関連残基を同定することを含む（本明細書において、これら改良変異体を「改変殺虫タンパク質」と呼ぶ）。
【００７７】
改変殺虫タンパク質を試験及び選択する方法は、例えば、同一量の改変試験タンパク質及び骨格タンパク質（ＴＩＣ８４４またはＣｒｙ１Ｄａ１）を、制御されたアッセイ条件の下で害虫に投与し、改変試験タンパク質及び骨格タンパク質の効力を測定及び比較することを含む。改変殺虫タンパク質を試験及び選択する別の方法は、改変試験タンパク質のタンパク質容量（例えば、食餌中のタンパク質濃度）及び、制御されたアッセイ条件下で同等の昆虫集団応答を誘発する骨格タンパク質（ＴＩＣ８４４またはＣｒｙ１Ｄａ１）のタンパク質用量を決定すること（すなわち、用量反応曲線を得ること）を含む。比較のために使用する統計的にロバストな用量反応値は、試験集団の５０％を死滅させるのに必要な致死濃度の中央値（ＬＣ５０）、または脱皮を５０％阻害するのに必要な中央濃度である脱皮阻害濃度（「ＭＩＣ５０」）であると考えられる。
【００７８】
特定の実施形態では、本明細書に記載の改変殺虫タンパク質は、ＴＩＣ８４４（配列番号１４）またはＣｒｙ１Ｄａ１（配列番号２）の下記の相対位置の少なくとも１つのアミノ酸改変を含む：２８２位のセリンからリジンまたはバリンへの置換、３１６位のチロシンからセリンへの置換、３６８位のイソロイシンからプロリンまたはアルギニンへの置換、３７４位のセリンからアルギニンへの置換、３７５位のアスパラギンからヒスチジンへの置換、及び４３２位のイソロイシンからロイシンへの置換。改変殺虫タンパク質はまた、同一の改変殺虫タンパク質配列内にこれらのアミノ酸置換または欠失を、少なくとも２、３、４個またはそれ以上含むことができる。
【００７９】
これらのアミノ酸改変を含む改変殺虫タンパク質としては、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、及び配列番号４４に記載のタンパク質、及びその昆虫阻害性フラグメントが挙げられる。これらの改変殺虫タンパク質は、それぞれ約１３２ｋダルトンの測定質量を有する。殺虫性骨格タンパク質ＴＩＣ８４４及びＣｒｙ１Ｄａ１ならびにそれらに由来する改変殺虫タンパク質の個々の特徴を表１に報告する。
【表１−１】
0006648127.tif 000002
【表１−２】
0006648127.tif 000003
【００８０】
本明細書に記載の改変殺虫タンパク質のフラグメントは、前記タンパク質のＮ末端、Ｃ末端、中央部、またはそれらの組み合わせから、昆虫阻害活性を失わせずに１残基以上のアミノ酸を欠失させたトランケート型であり得る。これらのフラグメントは、元となる改変殺虫タンパク質の昆虫阻害活性を保持している必要がある。
【００８１】
改変殺虫タンパク質に類似のタンパク質を、当該分野で公知の様々なコンピュータベースのアルゴリズムを用いて互いに比較することによって同定することができる。例えば、改変殺虫タンパク質に関連するタンパク質のアミノ酸配列相同性を、以下のデフォルトパラメーターを用いたＣｌｕｓｔａｌ  Ｗアライメントを使用して分析することができる：重量マトリックス：ｂｌｏｓｕｍ、ギャップ開始ペナルティ：１０．０、ギャップ伸長ペナルティ：０．０５、親水性ギャップ：有り、親水性残基：ＧＰＳＮＤＱＥＲＫ、残基特異的ギャップペナルティ：有り（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ（１９９４）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２：４６７３‐４６８０）。さらに、アミノ酸相同性の割合を、１００％に（アミノ酸相同数／対象タンパク質の全長）を掛けた積によって計算する。当技術分野における他のアライメントアルゴリズムも利用可能であり、それらは、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアライメントを用いて得られたものと同様の結果を提供する。
【００８２】
本願の実施例にさらに記載するように、骨格タンパク質及び改変殺虫タンパク質をコードする合成または人工配列を、植物において使用するために設計した。植物での使用のために設計した合成ヌクレオチド配列の例として、配列番号２７（Ｃｒｙ１Ｄａ１．ｎｎｏ）、配列番号２９（Ｃｒｙ１Ｄａ１＿２．ｎｎｏ）、配列番号３１（Ｃｒｙ１Ｄａ１＿３．ｎｎｏ）、配列番号３３（Ｃｒｙ１Ｄａ１＿４．ｎｎｏ）、配列番号３５（Ｃｒｙ１Ｄａ１＿５．ｎｎｏ）、配列番号３７（Ｃｒｙ１Ｄａ１＿６．ｎｎｏ）、配列番号３９（Ｃｒｙ１Ｄａ１＿７．ｎｎｏ）、配列番号４１（ＴＩＣ８４４＿９．ｎｎｏ）及び配列番号４３（ＴＩＣ８４４＿１１．ｎｎｏ）を示す。
【００８３】
これらの合成または人工ヌクレオチド配列を含む発現カセット及びベクターを構築し、当技術分野で公知の形質転換方法及び技術に従ってトウモロコシ、ワタ及びダイズ植物細胞に導入した。形質転換した細胞を形質転換植物へ再生させ、改変殺虫タンパク質または骨格タンパク質が発現していることを観察した。殺害虫活性を試験するために、鱗翅目害虫の幼虫の存在下で、形質転換植物から得られた植物葉ディスクを用いてバイオアッセイを実施した。
【００８４】
改変殺虫タンパク質をコードする組換え核酸分子組成物を企図する。例えば、改変殺虫タンパク質は組換えＤＮＡ構築物を用いて発現させることができ、そこにおいて、改変殺虫タンパク質をコードするＯＲＦを有するポリヌクレオチド分子は、遺伝子発現要素、例えばプロモーター及び当該構築物が意図される系における発現に必要な他の調節要素に作動可能に連結する。非限定的な例として、植物内で改変殺虫タンパク質を発現させるために合成改変殺虫タンパク質をコードする配列に作動可能に連結した植物機能性プロモーター、またはＢｔバクテリアもしくは他のＢａｃｉｌｌｕｓ種においてタンパク質を発現するために改変殺虫タンパク質コード配列に作動可能に連結したＢｔ機能性プロモーターが挙げられる。他の要素を改変殺虫タンパク質コード配列に作動可能に連結することができ、例として、エンハンサー、イントロン、非翻訳リーダー配列、コードタンパク質固定タグ（ＨＩＳタグ）、トランスロケーションペプチド（すなわち、プラスチド輸送ペプチド、シグナルペプチド）、翻訳後修飾酵素のためのポリペプチド配列、リボソーム結合部位、及びＲＮＡｉ標的部位が挙げられるが、必ずしもこれらに限定するものではない。本明細書中に提供する組換えポリヌクレオチド分子の例として、配列番号：４（Ｃｒｙ１Ｄａ１＿３）、配列番号６（Ｃｒｙ１Ｄａ１＿４）、配列番号８（Ｃｒｙ１Ｄａ１＿５）、配列番号１０（Ｃｒｙ１Ｄａ１＿６）、配列番号１２（Ｃｒｙ１Ｄａ１＿７）、配列番号１６（ＴＩＣ８４４＿２）、配列番号１８（ＴＩＣ８４４＿４）、配列番号２０（ＴＩＣ８４４＿５）、配列番号２２（ＴＩＣ８４４＿６）、配列番号２４（ＴＩＣ８４４＿７）、配列番号２６（ＴＩＣ８４４＿８）、配列番号３２（Ｃｒｙ１Ｄａ１＿３．ｎｎｏ）配列番号３４（Ｃｒｙ１Ｄａ１＿４．ｎｎｏ）、配列番号３６（Ｃｒｙ１Ｄａ１＿５．ｎｎｏ）、配列番号３８（Ｃｒｙ１Ｄａ１＿６．ｎｎｏ）、配列番号４０（Ｃｒｙ１Ｄａ１＿７．ｎｎｏ）及び配列番号４４（ＴＩＣ８４４＿１１．ｎｎｏ）に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはタンパク質をコードする配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９及び配列番号４３などのポリヌクレオチドに作動可能に連結した異種プロモーターが挙げられるが、必ずしもこれらに限定するものではない。異種プロモーターはまた、プラスチド標的化した改変殺虫タンパク質及び標的化していない改変殺虫タンパク質をコードする合成ＤＮＡコード配列に作動可能に連結できる。本明細書に開示する改変殺虫タンパク質をコードする組換え核酸分子のコドンは、同義コドン（当該技術分野においてサイレント置換として知られる）によって置換できると考えられる。
【００８５】
改変殺虫タンパク質コード配列を含む組換えＤＮＡ分子または構築物は、改変殺虫タンパク質、改変殺虫タンパク質とは異なるタンパク質、昆虫阻害性ｄｓＲＮＡ分子、または補助的タンパク質をコードするＤＮＡ配列とともに発現または同時発現するように構成可能な１つ以上の毒性剤をコードするＤＮＡ領域をさらに含むことができる。補助的タンパク質の例として、例えば、改変殺虫タンパク質の発現の補助、植物内での安定性への寄与、オリゴマー化に要する自由エネルギーの最適化、毒性の増強、及び活性スペクトルの増加などにより、昆虫阻害剤の有効性を補助するように機能する補因子、酵素、結合パートナー、または他の物質が挙げられるが、必ずしもこれらに限定するものではない。補助的タンパク質は、例えば１種以上の昆虫阻害剤の取り込みを促進するか、または毒性剤の毒性作用を強化するものであってもよい。
【００８６】
組換えＤＮＡ分子もしくは構築物は、すべてのタンパク質もしくはｄｓＲＮＡ分子が１つのプロモーターから発現するように、または各タンパク質もしくはｄｓＲＮＡ分子が別々のプロモーター制御下にあるように、またはそれらのいくつかの組み合わせになるように組み立てることができる。本発明のタンパク質は、多重遺伝子発現系で発現させることができ、他のオープンリーディングフレーム及びプロモーターも含む共通のヌクレオチドセグメントから、選択した発現系のタイプに応じて、改変殺虫タンパク質が発現する。例えば、細菌の多重遺伝子発現系は、単一のプロモーターを利用して、単一のオペロン内からの多重連結／タンデムオープンリーディングフレームの発現（すなわち、ポリシストロニック発現）を駆動することができる。別の例では、植物多重遺伝子発現系は、異なるタンパク質、または１つ以上のｄｓＲＮＡ分子のような他の毒性剤をそれぞれが発現する多重連結していない発現カセットを利用することができる。
【００８７】
改変殺虫タンパク質コード配列を含む組換え核酸分子または組換えＤＮＡ構築物は、例えばプラスミド、バキュロウイルス、合成染色体、ビリオン、コスミド、ファージミド、ファージ、またはウイルスベクターなどのベクターによって宿主細胞に送達できる。このようなベクターを使用して、宿主細胞内での改変殺虫タンパク質コード配列の安定発現もしくは一過性発現、またはコードしたポリペプチドのその後の発現を達成することができる。改変殺虫タンパク質コード配列を有する外来性組換えポリヌクレオチドまたは組換えＤＮＡ構築物であって、宿主細胞に導入するものを、本明細書では「導入遺伝子」と呼ぶ。
【００８８】
本明細書において、改変殺虫タンパク質のいずれか１つ以上をコードするポリヌクレオチドを保有するトランスジェニック細菌、トランスジェニック植物細胞、トランスジェニック植物、及びトランスジェニック植物部分を提供する。用語「細菌細胞」または「細菌」は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、またはＲｈｉｚｏｂｉｕｍ細胞を含み得るが、必ずしもこれらに限定するものではない。用語「植物細胞」または「植物」は、双子葉植物細胞または単子葉植物細胞を含み得るが、必ずしもこれらに限定するものではない。想定する植物及び植物細胞として、アルファルファ、バナナ、オオムギ、マメ、ブロッコリ、キャベツ、アブラナ、ニンジン、キャッサバ、ヒマ、カリフラワー、セロリ、ヒヨコマメ、ハクサイ、シトラス、ココナッツ、コーヒー、トウモロコシ、クローバ、ワタ、ウリ、キュウリ、ベイマツ、ナス、ユーカリ、アマ、ニンニク、ブドウ、ホップ、ニラ、レタス、タエダマツ、アワ、メロン、ナッツ、オートムギ、オリーブ、タマネギ、観賞植物、ヤシ、牧草、エンドウ、ピーナッツ、コショウ、キマメ、マツ、ジャガイモ、ポプラ、カボチャ、ラジアータマツ、ダイコン、ナタネ、コメ、根茎、ライムギ、ベニバナ、灌木、モロコシ、サザンパイン、ダイズ、ホウレンソウ、スカッシュ、イチゴ、サトウダイコン、サトウキビ、ヒマワリ、スイートコーン、モミジバフウ、サツマイモ、スイッチグラス、茶、タバコ、トマト、ライコムギ、芝草、スイカ、及びコムギ植物細胞または植物が挙げられるが、必ずしもこれらに限定するものではない。特定の実施形態において、トランスジェニック植物細胞から再生したトランスジェニック植物及びトランスジェニック植物部分を提供する。特定の実施形態では、トランスジェニック植物は、その部分を植物から切断、折ること、粉砕または他の方法で分離することによって、トランスジェニック種子から得ることができる。特定の実施形態では、植物部分は、種子、実、葉、花、茎、根、もしくはその任意部分、またはトランスジェニック植物部分の再生不能部分であり得る。これに関連して、トランスジェニック植物部分の「再生不能」部分とは、植物全体を形成するように誘導することができない部分、または有性及び／または無性生殖が可能な植物全体を形成するように誘導することができない部分のことである。特定の実施形態では、植物部分の再生不能部分は、トランスジェニック種子、実、葉、花、茎、または根の一部である。
【００８９】
鱗翅類阻害量の改変殺虫タンパク質を保有するトランスジェニック植物を作製する方法を提供する。そのような植物は、本願で提供する改変殺虫タンパク質をコードするポリヌクレオチドを植物細胞に導入し、改変殺虫タンパク質の昆虫または鱗翅類阻害量を発現する植物細胞由来の植物を選択することによって作製することができる。再生、種子、花粉、または分裂組織形質転換技術によって、植物細胞から植物を誘導することができる。植物の形質転換方法は、当技術分野で公知である。
【００９０】
改変殺虫タンパク質を発現する植物は、他の殺虫タンパク質を発現するトランスジェニック事象、及び／または他の昆虫防除形質、除草剤耐性遺伝子、収量もしくはストレス耐性形質を付与する遺伝子などの他のトランスジェニック形質を発現するトランスジェニック事象とともに育種することによって交配することができる。または、そのような形質を単一のベクターに組み合わせて、それら形質をすべて連結することができる。
【００９１】
本願において、検出可能な量の改変殺虫タンパク質、その昆虫阻害セグメントもしくはフラグメント、またはその任意の区別部分を保有する加工植物製品も開示する。特定の実施形態において、加工製品は、植物部分、植物バイオマス、油、粗びき粉、砂糖、動物飼料、粒粉、フレーク、糠、リント、穀、加工種子、及び種子からなる群から選択される。特定の実施形態では、加工製品は再生不能である。植物製品は、トランスジェニック植物またはトランスジェニック植物部分に由来するコモディティまたは他の商業製品を含むことができ、コモディティまたは他の製品は、改変殺虫タンパク質の区別部分をコードするかまたは含むヌクレオチドセグメントまたは発現ＲＮＡもしくはタンパク質を検出することにより商業的に追跡することができる。
【００９２】
本願において、改変殺虫タンパク質を用いて昆虫、特に作物植物の鱗翅目害虫を防除する方法についても開示する。そのような方法は、昆虫または鱗翅類阻害量の改変殺虫タンパク質を保有する植物を栽培することを含み得る。特定の実施形態では、そのような方法はさらに：（ｉ）改変殺虫タンパク質を含むかまたはコードする任意の組成物を、植物または植物に生育する種子に与えること；及び（ｉｉ）植物または植物に生育する植物細胞を、改変殺虫タンパク質をコードするポリヌクレオチドで形質転換することのうちのいずれか１つまたはそれ以上を含み得る。一般に、改変殺虫タンパク質は、組成物中に提供するか、微生物中に提供するか、またはトランスジェニック植物内に提供することにより、鱗翅目昆虫に対する昆虫阻害活性を与えることができると考えられる。
【００９３】
特定の実施形態では、改変殺虫タンパク質は、発現に適した条件下で改変殺虫タンパク質を発現するように形質転換した組換えＢａｃｉｌｌｕｓまたは任意の他の組換え細菌細胞を培養することによって調製される昆虫阻害性組成物の殺虫活性成分である。このような組成物は、改変殺虫タンパク質を発現／産生するそのような組換え細胞の培養物の乾燥、凍結乾燥、均質化、抽出、濾過、遠心分離、沈降、または濃縮によって調製することができる。そのようなプロセスにより、Ｂａｃｉｌｌｕｓまたは他の昆虫病原性細菌の細胞抽出物、細胞懸濁液、細胞ホモジネート、細胞溶解物、細胞上清、細胞濾液、または細胞ペレットを得ることができる。改変殺虫タンパク質をこのように生成して得ることにより、改変殺虫タンパク質を含有する組成物は、細菌細胞、細菌胞子、及び副芽胞封入体を含むことができ、ならびに農業用昆虫阻害スプレー製品または食餌バイオアッセイにおける昆虫阻害製剤を含む様々な用途に向けて製剤化することができる。
【００９４】
一実施形態では、耐性発生の可能性を低減するために、改変殺虫タンパク質を含有する昆虫阻害性組成物またはトランスジェニック植物に、同じ鱗翅目昆虫種に対して昆虫阻害活性を示すが前記改変殺虫タンパク質とは異なる少なくとも１種の毒性剤を追加でさらに含ませることができる。このような組成物に追加可能な毒性剤には、昆虫阻害性タンパク質及び昆虫阻害性ｄｓＲＮＡ分子が含まれる。害虫を防除するためのこのようなリボヌクレオチド配列の使用の一例は、Ｂａｕｍ，ｅｔ  ａｌ．（米国特許公開第２００６／００２１０８７Ａ１号）に記載されている。鱗翅目害虫の防除のためのそのような追加のポリペプチド（複数可）は、必ずしも限定するものではないが、Ｃｒｙ１Ａ（米国特許第５，８８０，２７５号）、Ｃｒｙ１Ａｂ、Ｃｒｙ１Ａｃ、Ｃｒｙ１Ａ．１０５、Ｃｒｙ１Ａｅ、Ｃｒｙ１Ｂ（米国特許公開第１０／５２５，３１８号）、Ｃｒｙ１Ｃ（米国特許第６，０３３，８７４号）、Ｃｒｙ１Ｄ、Ｃｒｙ１Ｅ、Ｃｒｙ１Ｆ、及びＣｒｙ１Ａ／Ｆキメラ（米国特許第７，０７０，９８２号；第６，９６２，７０５号；及び第６，７１３，０６３号）、Ｃｒｙ１Ｇ、Ｃｒｙ１Ｈ、Ｃｒｙ１Ｉ、Ｃｒｙ１Ｊ、Ｃｒｙ１Ｋ、Ｃｒｙ１Ｌ、Ｃｒｙ２Ａ、Ｃｒｙ２Ａｂ（米国特許第７，０６４，２４９号）、Ｃｒｙ２Ａｅ、Ｃｒｙ４Ｂ、Ｃｒｙ６、Ｃｒｙ７、Ｃｒｙ８、Ｃｒｙ９、Ｃｒｙ１５、Ｃｒｙ４３Ａ、Ｃｒｙ４３Ｂ、Ｃｒｙ５１Ａａ１、ＥＴ６６、ＴＩＣ４００、ＴＩＣ８００、ＴＩＣ８３４、ＴＩＣ１４１５、Ｖｉｐ３Ａ、ＶＩＰ３Ａｂ、ＶＩＰ３Ｂ、ＡＸＭＩ‐００１、ＡＸＭＩ‐００２、ＡＸＭＩ‐０３０、ＡＸＭＩ‐０３５、及びＡＸＭＩ‐０４５（米国特許公開２０１３‐０１１７８８４Ａ１）、ＡＸＭＩ‐５２、ＡＸＭＩ‐５８、ＡＸＭＩ‐８８、ＡＸＭＩ‐９７、ＡＸＭＩ‐１０２、ＡＸＭＩ‐１１２、ＡＸＭＩ‐１１７、ＡＸＭＩ‐１００（米国特許公開２０１３‐０３１０５４３Ａ１）、ＡＸＭＩ‐１１５、ＡＸＭＩ‐１１３、ＡＸＭＩ‐００５（米国特許公開２０１３‐０１０４２５９Ａ１）、ＡＸＭＩ‐１３４（米国特許公開２０１３‐０１６７２６４Ａ１）、ＡＸＭＩ‐１５０（米国特許公開２０１０‐０１６０２３１Ａ１）、ＡＸＭＩ‐１８４（米国特許公開２０１０‐０００４１７６Ａ１）、ＡＸＭＩ‐１９６、ＡＸＭＩ‐２０４、ＡＸＭＩ‐２０７、ＡＸＭＩ‐２０９（米国特許公開２０１１‐００３００９６Ａ１）、ＡＸＭＩ‐２１８、ＡＸＭＩ‐２２０（米国特許公開２０１４‐０２４５４９１Ａ１）、ＡＸＭＩ‐２２１ｚ、ＡＸＭＩ‐２２２ｚ、ＡＸＭＩ‐２２３ｚ、ＡＸＭＩ‐２２４ｚ、ＡＸＭＩ‐２２５ｚ（米国特許公開２０１４‐０１９６１７５Ａ１）、ＡＸＭＩ‐２３８（米国特許公開２０１４‐００３３３６３Ａ１）、ＡＸＭＩ‐２７０（米国特許公開２０１４‐０２２３５９８Ａ１）、ＡＸＭＩ‐３４５（米国特許公開２０１４‐０３７３１９５Ａ１）、ＤＩＧ‐３（米国特許公開２０１３‐０２１９５７０Ａ１）、ＤＩＧ‐５（米国特許公開２０１０‐０３１７５６９Ａ１）、ＤＩＧ‐１１（米国特許公開２０１０‐０３１９０９３Ａ１）、ＡｆＩＰ‐１Ａ及びその誘導体（米国特許公開２０１４‐００３３３６１Ａ１）、ＡｆＩＰ‐１Ｂ及びその誘導体（���国特許公開２０１４‐００３３３６１Ａ１）、ＰＩＰ‐１ＡＰＩＰ‐１Ｂ（米国特許公開２０１４‐０００７２９２Ａ１）、ＰＳＥＥＮ３１７４（米国特許公開２０１４‐０００７２９２Ａ１）、ＡＥＣＦＧ‐５９２７４０（米国特許公開２０１４‐０００７２９２Ａ１）、Ｐｐｕｔ＿１０６３（米国特許公開２０１４‐０００７２９２Ａ１）、Ｐｐｕｔ＿１０６４（米国特許公開２０１４‐０００７２９２Ａ１）、ＧＳ‐１３５及びその誘導体（米国特許公開２０１２‐０２３３７２６Ａ１）、ＧＳ１５３及びその誘導体（米国特許公開２０１２‐０１９２３１０Ａ１）、ＧＳ１５４及びその誘導体（米国特許公開２０１２‐０１９２３１０Ａ１）、ＧＳ１５５及びその誘導体（米国特許公開２０１２‐０１９２３１０Ａ１）、米国特許公開２０１２‐０１６７２５９Ａ１に記載の配列番号２及びその誘導体、米国特許公開２０１２‐００４７６０６Ａ１に記載の配列番号２及びその誘導体、米国特許公開２０１１‐０１５４５３６Ａ１に記載の配列番号２及びその誘導体、米国特許公開２０１１‐０１１２０１３Ａ１に記載の配列番号２及びその誘導体、米国特許公開２０１０‐０１９２２５６Ａ１に記載の配列番号２及び４ならびにその誘導体、米国特許公開２０１０‐００７７５０７Ａ１に記載の配列番号２及びその誘導体、米国特許公開２０１０‐００７７５０８Ａ１に記載の配列番号２及びその誘導体、米国特許公開２００９‐０３１３７２１Ａ１に記載の配列番号２及びその誘導体、米国特許公開２０１０‐０２６９２２１Ａ１に記載の配列番号２及び４ならびにその誘導体、米国特許７，７７２，４６５（Ｂ２）に記載の配列番号２及びその誘導体、ＷＯ２０１４／００８０５４Ａ２に記載のＣＦ１６１＿００８５及びその誘導体、米国特許公開ＵＳ２００８‐０１７２７６２Ａ１、ＵＳ２０１１‐００５５９６８Ａ１、及びＵＳ２０１２‐０１１７６９０Ａ１に記載の鱗翅類毒性タンパク質及びその誘導体；ＵＳ７５１０８７８（Ｂ２）に記載の配列番号２及びその誘導体、米国特許第７８１２１２９（Ｂ１）号に記載の配列番号２及びその誘導体；などの昆虫阻害タンパク質からなる群から選択してもよい。
【００９５】
他の実施形態では、得られる昆虫阻害スペクトルを拡張するために、昆虫阻害性組成物またはトランスジェニック植物に、本発明の改変殺虫タンパク質では阻害されない害虫（鞘翅目、半翅目及び同翅亜目の害虫など）に対して昆虫阻害活性を示す少なくとも１種の追加の毒性剤をさらに含ませることができる。
【００９６】
鞘翅目害虫の防除のためのそのような追加の毒性剤は、必ずしも限定するものではないが、Ｃｒｙ３Ｂｂ（米国特許第６，５０１，００９号）、Ｃｒｙ１Ｃ変異体、Ｃｒｙ３Ａ変異体、Ｃｒｙ３、Ｃｒｙ３Ｂ、Ｃｒｙ３４／３５、５３０７、ＡＸＭＩ１３４（米国特許公開２０１３‐０１６７２６４Ａ１）ＡＸＭＩ‐１８４（米国特許公開２０１０‐０００４１７６Ａ１）、ＡＸＭＩ‐２０５（米国特許公開２０１４‐０２９８５３８Ａ１）、ａｘｍｉ２０７（米国特許公開２０１３‐０３０３４４０Ａ１）、ＡＸＭＩ‐２１８、ＡＸＭＩ‐２２０（米国特許公開２０１４０２４５４９１Ａ１）、ＡＸＭＩ‐２２１ｚ、ＡＸＭＩ‐２２３ｚ（米国特許公開２０１４‐０１９６１７５Ａ１）、ＡＸＭＩ‐２７９（米国特許公開２０１４‐０２２３５９９Ａ１）、ＡＸＭＩ‐Ｒ１及びその変異体（米国特許公開２０１０‐０１９７５９２Ａ１、ＴＩＣ４０７、ＴＩＣ４１７、ＴＩＣ４３１、ＴＩＣ８０７、ＴＩＣ８５３、ＴＩＣ９０１、ＴＩＣ１２０１、ＴＩＣ３１３１、ＤＩＧ‐１０（米国特許公開２０１０‐０３１９０９２Ａ１）、ｅＨＩＰ（米国特許出願公開第２０１０／００１７９１４号）、ＩＰ３及びその変異体（米国特許公開２０１２‐０２１０４６２Ａ１）、ならびにω‐ヘキサトキシン‐Ｈｖ１ａ（米国特許出願公開ＵＳ２０１４‐０３６６２２７Ａ１）などの昆虫阻害タンパク質からなる群から選択してもよい。
【００９７】
半翅目害虫の防除のためのそのような追加の毒性剤は、必ずしも限定するものではないが、ＴＩＣ１４１５（米国特許公開２０１３‐００９７７３５Ａ１）、ＴＩＣ８０７（米国特許第８６０９９３６号）、ＴＩＣ８３４（米国特許公報２０１３‐０２６９０６０Ａ１）、ＡＸＭＩ‐０３６（米国特許公開２０１０‐０１３７２１６Ａ１）及びＡＸＭＩ‐１７１（米国特許公開２０１３‐００５５４６９Ａ１）などの半翅目活性タンパク質からなる群から選択してもよい。鞘翅目、半翅目及び同翅亜目の害虫の防除のための追加のポリペプチドは、Ｎｅｉｌ  Ｃｒｉｃｋｍｏｒｅによって管理維持されるＢａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓトキシン分類に関するウェブサイト（ワールドワイドウェブアットｂｔｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ．ｉｎｆｏ）において見ることができる。
【００９８】
改変殺虫タンパク質コード配列、及び改変殺虫タンパク質に極めて高い割合で相同性を有する配列は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、熱増幅及びハイブリダイゼーションなどの当業者に公知の方法を用いて同定することができる。例えば、改変殺虫タンパク質を用いて、関連するタンパク質に特異的に結合する抗体を産生することができ、密接に関連する他のタンパク質をスクリーニング及び見出すことができる。
【００９９】
さらに、改変殺虫タンパク質をコードするヌクレオチド配列をスクリーニング用のプローブ及びプライマーとして使用し、熱サイクル増幅または等温増幅及びハイブリダイゼーション法を用いて、クラスの他のメンバーを同定することができる。例えば、配列番号３に記載の配列に由来するオリゴヌクレオチドを用いて、コモディティ製品由来のデオキシリボ核酸試料中に改変殺虫導入遺伝子が存在するか否かを判定することができる。コモディティ製品のほんの一部が、配列番号３のいずれかを保有するトランスジェニック植物に由来する場合において、オリゴヌクレオチドを使用する特定の核酸検出方法の感度が与えられると、配列番号３のいずれかに記載の配列に由来するオリゴヌクレオチドを用いて、プールした供給源に由来するコモディティ製品中のそれぞれの改変殺虫タンパク質を検出することができると考えられる。
【０１００】
本発明の他の特徴及び利点は、以下の実施例及び特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【実施例】
【０１０１】
前述の観点から、当業者は、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、開示する特定の態様において変更を行うことができ、それでもなお類似または同様の結果が得られることを理解すべきである。したがって、本明細書に開示する特定の構造的及び機能的詳細は、それらに限定するものとして解釈すべきではない。本明細書に引用する各参考文献のすべての開示が、本願の開示内に組み込まれることを理解すべきである。
【０１０２】
［実施例１］
改変試験タンパク質の設計及び昆虫バイオアッセイ試験のための試料調製
本実施例は、骨格タンパク質中の関連するアミノ酸残基を同定し、これを改変して、改変試験タンパク質を作製し、得られた改変試験タンパク質のクローニング及び発現を行う方法を示す。
【０１０３】
いくつかの分子工学技術を多段階で使用し、Ｃｒｙ１Ｄａ１及びＣｒｙ１Ｄａ１の相同体であるＴＩＣ８４４骨格タンパク質に比べて、鱗翅類阻害スペクトルの拡張及び／または鱗翅類阻害活性の向上を達成したＣｒｙ１Ｄａ１改良変異体を構築した。第１段階、すなわち初期設計ラウンドは、主に仮説に基づいて実施した。第２及び第３段階は、統計学に基づいて実施した設計ラウンドであった。例えば、設計の第２段階では、統計学的に非有害な突然変異を推定上有益な突然変異と組み合わせて、規定の統計的基準を満たす二重突然変異を生成した。設計の第３段階では、これまでの試験で得られたすべてのデータを複数の統計的手法を用いて分析した。複数の統計的手法において統計学的に有意な改善を示す突然変異のみを選び出し、突然変異の最終プールに残した。この段階での設計変異体は、これまでの段階でポジティブであると確認した変異体に比べ、１つまたは２つ多くのポジティブな変異を含んでいた。したがって、第３段階の設計は、第１及び第２段階に比べて高活性変異体の割合を有意に増加させた。下記の実施例で示すように、３段階設計戦略を用いることにより、ＣＥＷに対するある種の改良変異体の活性を、ＴＩＣ８４４及びＣｒｙ１Ｄａ１骨格に比べて有意に向上させる単一及び相乗的突然変異の両方を同定した。
【０１０４】
改変試験タンパク質を作製するために利用した方法は、セミランダム改変、ＴＩＣ８４４／Ｃｒｙ１Ｄａ１と他の野生型Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｅｎｓｉｓ（Ｂｔ）タンパク質とのアライメントにおける非相同部位の定向性改変、及び構造／機能に基づいたデザインを含んでいたが、必ずしもこれらに限定するものではなかった。利用した分子工学技術の例として、下記のものが挙げられる。
【０１０５】
受容体結合。Ｃｒｙ１Ｄａ１／ＴＩＣ８４４改良変異体に対する鱗翅目害虫、特にコーンイヤーワーム（ＣＥＷ、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ｚｅａ）の感受性は、腸受容体に対する異なったターゲティングに起因する可能性がある。腸内の受容体への結合を改良し、したがって毒性を高めるために利用した設計は：（１）ドメインＩＩの先端ループのすべての位置を全種類のアミノ酸に変異させること；及び（２）ドメインＩＩの先端ループと、他のＣｒｙ１Ｄａ１相同体（Ｃｒｙ１Ｄｂ１、Ｃｒｙ１Ｄｃ１など）及びＣＥＷ活性型３ドメイン型トキシン（Ｃｒｙ１Ｂｂ１、Ｃｒｙ１Ｊａ１及びＣｒｙ２Ａｂ２）の同部分とを、想定されるすべての組み合わせで交換することを含んでいた。
【０１０６】
アライメントに基づくアプローチ。他の相同体（例えば、Ｃｒｙ１Ｄｂ１及びＣｒｙ１Ｄｃ１）とのＣｒｙ１Ｄａ１のアライメントを用いて、可変性領域を同定した。アライメントの結果、１５０（１５０）位及び２９５（２９５）位の位置に、ユニークな単一突然変異を同定した。これらの部位は、３つのドメインの全体にわたって位置していた。アミノ酸同士が互いに４残基（４）以内にある部位をグループ化した。同じ親配列に由来する突然変異のみを各部位グループにノミネートし、１３２種のユニークな変異体を得た。
【０１０７】
表面突然変異誘発アプローチ。骨格タンパク質のドメインＩＩ及びＩＩＩの表面部位をコードするポリヌクレオチドをスキャニング法により突然変異させた。骨格タンパク質中の既にアラニンが存在する部位以外のアミノ酸残基をアラニンに変更した。野生型の残基がリジンである表面位置では、アラニン変異に加えてアルギニン変異を導入した。リジンからアルギニンへの突然変異の合理性は、鱗翅目活性トキシンがリジンをほとんど含まず、アルギニンを多く有するという知見に基づいており、したがって、ドメインＩＩ及びＩＩＩ表面のリジン部位をアルギニンに変化させることにより、改変試験タンパク質の鱗翅目活性が向上すると予想した。
【０１０８】
タンパク質分解事象の改変。タンパク質分解プロセスは、鱗翅目昆虫の腸における３ドメイン型トキシンの活性の重要な局面であると予想した。このことについて試験するために、いくつかの突然変異のセットを作製し、タンパク質切断を潜在的に変化させた。潜在的切断部位は、Ｎ末端、及びドメインＩＩＩとプロトキシンとの間に位置する。突然変異部位は、Ｎ末端からヘリックス４の開始位置まで、及びドメインＩＩＩのＣ末端からプロトキシン内部の約４０アミノ酸までの位置にあたる予想ループ領域を含んでいた。一般に、グリシン残基は、タンパク質分解部位の認識またはタンパク質の柔軟性の増加のいずれかによってタンパク質分解を促進し、それによりタンパク質切断をより受けやすくすると予想した。さらに、トリプシン及びキモトリプシンは、鱗翅類の中腸において有効なプロテアーゼとして広く受け入れられている２つのプロテアーゼである。リジン残基はトリプシンの認識部位を提供し、チロシン残基はキモトリプシンの認識部位を提供する。したがって、潜在的切断部位における選択した変異位置を、グリシン、リジンまたはチロシンのいずれかに突然変異させた。
【０１０９】
他のＣＥＷ活性型トキシンからの潜在的ホットスポット突然変異。多数のタンパク質セット（キメラ、フラグメント及び野生型配列を含む）のＣＥＷに対する活性及び不活性のデータを分析した。このデータの統計解析から得られた情報を利用して、得られた改変試験タンパク質のＣＥＷ活性を増強した可能性のある潜在的な特異的突然変異または突然変異位置を同定した。
【０１１０】
上記の分子工学的方法論で得られた改変試験タンパク質を、当該分野で公知の方法を用いて、組換えＢｔプラスミド発現ベクターの芽胞形成特異的発現プロモーターの下流にクローニングし、結晶性Ｂｔ宿主細胞に形質転換した。
【０１１１】
［実施例２］
鱗翅目害虫に対する食餌バイオアッセイにおける改変試験タンパク質の試験
本実施例は、実施例１に記載した改変の成果として作製した改変試験タンパク質の試験について示す。
【０１１２】
実施例１に記載した改変の成果により、約２３００（２，３００）種の異なる改変試験タンパク質を発現する約２５００（２，５００）種の組換えＢｔ菌株を生成した。これらの改変試験タンパク質をＢｔで発現させ、鱗翅目の様々な種に対する毒性についてアッセイした。コーンイヤーワーム（ＣＥＷ、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ｚｅａ）及びツマジロクサヨトウ（ＦＡＷ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）を含む様々な鱗翅目の種の新生幼虫（孵化後２４時間未満）を用いて給餌アッセイを行った。ＣＥＷ試験用の昆虫の卵は、２つの異なる研究所のコロニーから入手した：ベンソン研究所、カーライル、ペンシルバニア及びモンサント社、ユニオンシティー、テネシー。発現したすべての改変試験タンパク質をＣＥＷで試験し、ＣＥＷに対する活性が親骨格タンパク質に比べて向上した改変試験タンパク質のいくつかについて、追加のバイオアッセイを実施してＣＥＷ活性を確認するとともに、ＦＡＷにおいて試験した。
【０１１３】
致死性及び発育不全性に関する昆虫のバイオアッセイ及び採点のための様々なプロトコールが当該分野で公知である。ＰＣＴ特許出願公開第ＷＯ２０１２／１３９００４号及び米国特許第７，９２７，５９８号に記載されているような方法の変形例を使用した。
【０１１４】
［実施例３］
ＣＥＷ活性の向上を示す改変試験タンパク質
本実施例は、複数回の試験ラウンドにおいて、骨格ＴＩＣ８４４またはＣｒｙ１Ｄａ１タンパク質の活性と比較した場合に、いくつかの改変試験タンパク質について、鱗翅類阻害スペクトルの拡張及び／または鱗翅類阻害活性の向上もしくは増大が認められたことを示す。
【０１１５】
実施例１に記載の改変成果より作製し、実施例２に記載の昆虫バイオアッセイで試験した改変試験タンパク質を、繰り返しのラウンドで試験し、改変試験タンパク質の鱗翅類活性を、それらのそれぞれの親骨格タンパク質（すなわち、ＴＩＣ８４４またはＣｒｙ１Ｄａ１）と比較した。第１ラウンドにおいて、３７０種（３７０）の異なる改変試験タンパク質が、食餌バイオアッセイにおいてＴＩＣ８４４またはＣｒｙ１Ｄａ１に比べてＣＥＷに対する毒性の増加を示した。これらの食餌バイオアッセイにおいては、それぞれ同一量のタンパク質（改変試験タンパク質または骨格タンパク質のいずれか）を、単回用量を調節したアッセイ条件下でＣＥＷに提供した。改変試験タンパク質及び骨格タンパク質の効力は、それぞれの改変試験タンパク質のバイオアッセイにおいて観察した致死性及び発育不全性と、親骨格タンパク質のバイオアッセイにおいて観察した致死性及び発育不全性とを測定及び比較することによって決定した。
【０１１６】
単回用量アッセイスクリーニングにおいて、骨格タンパク質と比較した場合のＣＥＷに対する毒性の増大を示した３７０種（３７０）の改変試験タンパク質のうち、約１８０種（１８０）をさらにＦＡＷバイオアッセイで試験し、これらの改変試験タンパク質が、それらの親骨格タンパク質に比べてＦＡＷ活性を維持したか、または増大を示したかどうかを決定した。これらの改変試験タンパク質の約４０（４０）〜５０（５０）種は、親骨格タンパク質と同等またはより良好なＦＡＷ活性を示した。これらのさらに選抜した改変試験タンパク質については、ＣＥＷ活性を確認するための追加のＣＥＷバイオアッセイでも試験した。ＦＡＷ活性を維持または向上させる一方でＣＥＷ活性の向上を示した改変試験タンパク質の選択及び試験ラウンドを経て、改変した変異体（本明細書では「改変殺虫タンパク質」と呼ぶ）の最終的なリストを得た。表２は、これらの改変殺虫タンパク質、及び各改変殺虫タンパク質におけるアミノ酸突然変異を示す。表２はまた、ＣＥＷ及びＦＡＷに対する骨格及び改変殺虫タンパク質の活性を示す（殺虫活性はＬＣ５０値（一定の曝露期間中に昆虫集団の５０％を死滅させるのに必要なトキシン濃度。ＬＣ５０値が低いほど、毒性はより大きい）及びＭＩＣ５０値（一定の曝露期間中に幼虫の５０％が特定の齢期へ脱皮することを阻害するのに必要な濃度）で示す。この表は、改変殺虫タンパク質が、ＦＡＷ活性を維持または向上させる一方で、向上したＣＥＷ活性を有していることを示す。
【表２】
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【０１１７】
改変殺虫タンパク質の鱗翅類阻害スペクトルの拡張及び鱗翅類阻害活性の向上をさらに示すものとして、改変殺虫タンパク質ＴＩＣ８４４＿８の致死率を親骨格タンパク質と比較して図１に示す。図１の棒グラフは、ユニオンシティー及びベンツォンの２つの異なるＣＥＷコロニーについてのＴＩＣ８４４＿８のＭＩＣ５０値を骨格タンパク質ＴＩＣ８４４と比較して示す。図１に示すバイオアッセイの結果は、スクロース勾配精製バイオアッセイ調製物から計算した。これらの二次バイオアッセイを、タンパク質の芽胞結晶調製物ではなくタンパク質のスクロース勾配精製調製物を用いて行った理由は、ＴＩＣ８４４＿８の活性の向上がより拡張的な精製においても持続することを確かめるためであった。さらに、ユニオンシティーコロニーで試験を行い、ベンツォンコロニーで認められた活性の向上を確認した。図１に示すように、ＴＩＣ８４４＿８の３つの残基の突然変異（Ｓ２８２Ｖ＿Ｙ３１６Ｓ＿Ｉ３６８Ｐ）により、ユニオンシティーコロニーではＴＩＣ８４４に比べてＣＥＷ致死性が８倍向上し、ベンツォンコロニーではＴＩＣ８４４に比べてＣＥＷ致死性が５０倍向上した。
【０１１８】
鱗翅類阻害スペクトルの拡張及び改変殺虫タンパク質の鱗翅類阻害活性の向上をさらに示すために、広範なスペクトルの鱗翅目昆虫種に対して実施した食餌バイオアッセイ研究から得たＴＩＣ８４４及びＴＩＣ８４４＿８の昆虫活性特性を表３に示す。表３のバイオアッセイ研究において試験した昆虫には、タマナヤガ幼虫（ＢＣＷ、Ａｇｒｏｔｉｓ  ｉｐｓｉｌｏｎ）、コーンイヤーワーム（ＣＥＷ、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ｚｅａ）、ツマジロクサヨトウ（ＦＡＷ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、南部アワヨトウ（ＳＡＷ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｅｒｉｄｉａｎｉａ）、イラクサギンウワバ幼虫（ＣＬＷ、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ）、セイヨウアワノメイガ幼虫（ＥＣＢ、Ｏｓｔｒｉｎｉａ  ｎｕｂｉｌａｌｉｓ）、南西部アワノメイガ幼虫（ＳＷＣ、Ｄｉａｔｒａｅａ  ｇｒａｎｄｉｏｓｅｌｌａ）、ニセアメリカタバコガ幼虫（ＴＢＷ、Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ  ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）、ビロードマメケムシ（ＶＢＣ、Ａｎｔｉｃａｒｓｉａ  ｇｅｍｍａｔａｌｉｓ）、ダイズシャクトリムシ（ＳＢＬ、Ｃｈｒｙｓｏｄｅｉｘｉｓ  ｉｎｃｌｕｄｅｓ）、及びサトウキビメイガ幼虫（ＳＣＢ、Ｄｉａｔｒａｅａ  ｓａｃｃｈａｒａｌｉｓ）が含まれる。この表３は、親骨格タンパク質ＴＩＣ８４４と比較してのＴＩＣ８４４＿８の鱗翅類阻害スペクトルの拡張を示すとともに、特にＣＥＷ及びＶＢＣに対しての活性の向上を示している。
【表３】
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【０１１９】
改変殺虫タンパク質の拡張した鱗翅類阻害スペクトルを、表４においてさらに示す。表４は、食餌バイオアッセイ研究から得た特定の改変殺虫タンパク質の昆虫活性特性を示す。表４のバイオアッセイ研究において試験した昆虫には、オオタバコガ幼虫（ＣＢＷ、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ａｒｍｉｇｅｒａ）、ハスモンヨトウ（ＴＣＷ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｌｉｔｕｒａ）、ビートアワヨトウ（ＢＡＷ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｅｘｉｇｕａ）、ワタアカミムシ（ＰＢＷ、Ｐｅｃｔｉｎｏｐｈｏｒａ  ｇｏｓｓｙｐｉｅｌｌａ）、イネヨトウ（ＰＳＢ、Ｓｅｓａｍｉａ  ｉｎｆｅｒｅｎｓ）及びクサオビリンガ幼虫（ＳＢＷ、Ｅａｒｉａｓ  ｖｉｔｔｅｌｌａ）が含まれる。表４に示す結果は、骨格タンパク質Ｃｒｙ１Ｄａ１と比較しての記載した改変殺虫タンパク質の鱗翅類阻害スペクトルの拡張を示すとともに、特にＣＢＷ、ＰＢＷ（Ｃｒｙ１Ａｃ耐性型）、ＰＢＷ（圃場採集型）及びＳＢＷに対しての活性の向上を示している。
【表４】
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【０１２０】
［実施例４］
植物での発現のための改変殺虫タンパク質及び骨格タンパク質をコードする遺伝子の合成
本実施例は、植物での発現のための改変殺虫タンパク質及び骨格タンパク質をコードするポリヌクレオチドの合成を示す。
【０１２１】
米国特許第５，５００，３６５号に一般的に記載されている方法に従って、植物内での発現のための骨格タンパク質及び改変殺虫タンパク質をコードするヌクレオチド配列を設計及び合成し、そこにおいて、元の骨格または改変殺虫タンパク質のアミノ酸配列を保持しつつも、ＡＴＴＴＡ及びＡ／Ｔリッチ植物ポリアデニル化配列などの一定の不都合な問題を抱える配列を避けるようにした。植物内での発現のための改変殺虫タンパク質及び骨格タンパク質をコードするこれらの遺伝子のヌクレオチド配列を以下の表５に列挙する。
【表５】
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【０１２２】
［実施例５］
植物内での改変殺虫タンパク質発現用の発現カセット
本実施例は、植物内で使用するために設計した骨格及び改変殺虫タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む発現カセットの構築について述べる。
【０１２３】
表５に示す植物発現用に設計した骨格及び改変殺虫タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を用いて、様々な植物発現カセットを構築した。そのような発現カセットは、植物プロトプラストでの一過性発現または植物細胞の形質転換に有用である。タンパク質の細胞内での最終的な配置に関して一般的な発現カセットを設計した。発現カセットの１つのセットは、タンパク質が翻訳後に細胞質ゾル内に残ることができるように設計した。発現カセットの別のセットは、葉緑体または色素体のような細胞のオルガネラへ標的化することができるように、トキシンタンパク質に輸送ペプチドを隣接させるように設計した。全ての発現カセットは、５′末端側においてプロモーターで開始するように設計し、プロモーターは、作動可能に連結して導入遺伝子の発現を増強する複数のプロモーター要素、エンハンサー要素、または当業者に公知の他の発現要素から構成し得る。プロモーター配列には通常、１つ以上のリーダー配列をプロモーターの３′側に近接してつなげた。リーダー配列の３′側には通常、イントロン配列を設け、導入遺伝子の発現を向上させた。トキシンのコード配列、または輸送ペプチドとトキシンのコード配列は、通常、作動可能に連結したプロモーター、リーダー及びイントロン配置の３′側に位置していた。通常、３′ＵＴＲ配列をコード配列の３′側に提供し、転写の終結を容易にするとともに、得られる転写産物のポリアデニル化に重要な配列を供給した。上記のすべての要素を、しばしば発現カセットの構築のために設けた追加の配列とともに、作動的に連結し、及び連続的に配置した。
【０１２４】
［実施例６］
骨格または改変殺虫タンパク質発現カセットを組み込んだ形質転換ベクター
本実施例は、骨格または改変殺虫タンパク質の植物組織への組み込みについて述べる。
【０１２５】
骨格タンパク質または改変殺虫タンパク質をコードする核酸セグメントを発現するトランスジェニック植物の作製方法は、当技術分野で周知の方法の変形方式を利用して行うことができる。一般に、本方法は、改変殺虫タンパク質または骨格タンパク質の１つ以上をコードするコード領域に、作動式に連結したプロモーターを含むＤＮＡセグメントで適切な宿主細胞を形質転換することを含む。そのようなコード領域は、通常、転写終結領域に作動式に連結しており、それにより、細胞内でプロモーターはコード領域の転写を駆動し、これによって、生体内でポリペプチドを産生する能力を細胞に付与することができる。このような細胞の形質転換に使用するベクター、プラスミド、コスミド及びＤＮＡセグメントは、一般に、天然または合成由来のオペロン、遺伝子、または遺伝子由来配列、特に、開示の改変殺虫タンパク質をコードするものを含む。これらのＤＮＡ構築物には、プロモーター、エンハンサー、ポリリンカー、または目的の特定の遺伝子に対して調節活性を有し得る他の遺伝子配列などの構造体がさらに含まれる。得られるトランスジェニック植物、植物部分及び植物細胞を、コードしたタンパク質の発現及び生物活性に関して試験する。
【０１２６】
鱗翅類活性タンパク質を発現するトランスジェニック植物を得るために改変することができる方法の例として、例えば、Ｃｒｙ１Ａタンパク質（米国特許第５，８８０，２７５号）、Ｃｒｙ１Ｂ（米国特許出願第１０／５２５３１８号）、Ｃｒｙ１Ｃ（米国特許第６，０３３，８７４号）、Ｃｒｙ１Ａ／Ｆキメラ（米国特許第７，０７０，９８２号；第６，９６２，７０５号及び第６，７１３，０６３号）、及びＣｒｙ２Ａｂタンパク質（米国特許第７，０６４，２４９号）に記載の方法が挙げられる。
【０１２７】
［実施例７］
安定に形質転換したトウモロコシにおける遺伝子改変殺虫タンパク質の鱗翅類活性
本実施例は、改変殺虫タンパク質をトウモロコシ植物内で発現させ、それぞれの害虫への食餌として提供した場合に、鱗翅目害虫に対して改変殺虫タンパク質が示す阻害活性について述べる。
【０１２８】
実施例６に記載の発現カセットを組み込んだベクターを用いて、Ｃｒｙ１Ｄａ１及びＣｒｙ１Ｄａ１＿７．ｎｎｏタンパク質を発現するＲ０トランスジェニックトウモロコシ植物を作製した。形質転換していない野生型の商業用生殖質供給源の植物の穂にＲ０形質転換体由来の花粉を授粉することによって産生した種子から、Ｆ１トランスジェニックトウモロコシ植物を生長させた。
【０１２９】
形質転換した細胞を、当該分野で公知の方法によって誘導し、植物を形成させた。米国特許第８，３４４，２０７号に記載されているものと同様の方法で、植物の葉ディスクを用いたバイオアッセイを実施した。形質転換していない植物を用いて、陰性対照用の組織を得た。各バイナリーベクターからの複数の形質転換事象を評価し、その結果を集計した。
【０１３０】
Ｃｒｙ１Ｄａ１及びＣｒｙ１Ｄａ１＿７．ｎｎｏタンパク質を発現するトランスジェニックトウモロコシ植物のＦ１及びＲ０における殺虫活性、ならびに、Ｃｒｙ１Ｄａ１及びＣｒｙ１Ｄａ１＿７．ｎｎｏタンパク質を発現するトランスジェニックトウモロコシ植物のＦ１における圃場での活性を、表６に示す。具体的には、表６は、ＣＥＷ、ＦＡＷ、及びＳＷＣに対して試験した場合のＣｒｙ１Ｄａ１＿７．ｎｎｏの鱗翅類活性特性を、親骨格タンパク質Ｃｒｙ１Ｄａ１と比較して示す。表６に認められるように、Ｃｒｙ１Ｄａ１とは異なり、Ｃｒｙ１Ｄａ１＿７．ｎｎｏは、Ｒ０及びＦ１バイオアッセイならびにＦ１圃場試験において、ＣＥＷ及びＦＡＷの両方に対して活性を示す。
【表６】
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【０１３１】
［実施例８］
安定に形質転換したワタでの改変殺虫タンパク質の鱗翅類活性
本実施例は、改変殺虫タンパク質をワタ植物内で発現させ、それぞれの害虫への食餌として提供した場合に、鱗翅目害虫に対して改変殺虫タンパク質が示す阻害活性について述べる。
【０１３２】
実施例６に記載の発現カセットを組み込んだベクターを用いて、Ｃｒｙ１Ｄａ１＿７．ｎｎｏ及びＴＩＣ８４４＿１１．ｎｎｏタンパク質を発現するワタ植物を作製した。形質転換した細胞を、当該分野で公知の方法により誘導し、植物を形成させた。実施例７に記載したようにワタ葉組織をバイオアッセイに用い、ＣＢＷ、ＦＡＷ、ニセアメリカタバコガ幼虫（ＴＢＷ、Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ  ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）及びＳＢＬに対して試験した。表７は、安定に形質転換したＲ０世代のワタで観察したこれらの鱗翅目種に対する活性を示す。表７に認められるように、安定に形質転換したＲ０世代のワタにおいて、Ｃｒｙ１Ｄａ１＿７．ｎｎｏ及びＴＩＣ８４４＿１１．ｎｎｏは、２種以上の鱗翅目害虫種に対して活性を示した。
【表７】
0006648127.tif 000009
【０１３３】
選択した形質転換事象を用いてＲ１植物を作製した。Ｃｒｙ１Ｄａ１＿７．ｎｎｏを発現するＲ１植物を、ＣＢＷ、ＦＡＷ及びＳＢＬに対する耐性に関してアッセイした。葉、花蕾及び実綿の組織を、バイオアッセイ、ならびにスクリーンハウスで実施した圃場試験に使用した。表８は、これらの試験において観察した活性を示す。表８に示すように、Ｃｒｙ１Ｄａ１＿７．ｎｎｏは、バイオアッセイ及び圃場試験において、ＣＢＷ、ＦＡＷ及びＳＢＬに対する活性を示した。
【表８】
0006648127.tif 000010
【０１３４】
［実施例９］
安定に形質転換したダイズにおける改変殺虫タンパク質の鱗翅類活性
本実施例は、改変殺虫タンパク質をダイズ植物において発現させ、それぞれの害虫への食餌として提供した場合に、鱗翅目害虫に対して改変殺虫タンパク質が示す阻害活性について述べる。
【０１３５】
実施例６に記載の発現カセットを組み込んだベクターを用いて、Ｃｒｙ１Ｄａ１＿７．ｎｎｏ、ＴＩＣ８４４＿９．ｎｎｏ及びＴＩＣ８４４＿１１．ｎｎｏタンパク質を発現するダイズ植物を作製した。葉組織を採取し、実施例７に記載したようにバイオアッセイに用いるか、あるいは凍結乾燥させた組織をバイオアッセイ用の昆虫飼料に使用した。ＳＡＷ、ＳＢＬ及びソイビーンポッドワーム（ＳＰＷ、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ｚｅａ）を含む様々な鱗翅目種に対し、バイオアッセイを実施した。表９は、安定に形質転換したＲ０世代のダイズ中で観察したこれらの鱗翅目害虫に対する活性を示す。表９に認められるように、Ｃｒｙ１Ｄａ１＿７．ｎｎｏ及びＴＩＣ８４４＿１１．ｎｎｏは、ＳＰＷ、ＳＡＷ及びＳＢＬに対して活性を示した。ＴＩＣ８４４＿９．ｎｎｏ（クローニングのためにＴＩＣ８４４にアラニンを追加したもの）はＳＰＷに対して活性を示さなかった。
【表９】
0006648127.tif 000011
【０１３６】
選択した形質転換事象を用いてＲ１植物を作製した。Ｃｒｙ１Ｄａ１＿７．ｎｎｏを発現するＲ１植物を、ＳＡＷ、ＳＢＬ、ＳＰＷ及びビロードマメケムシ（ＶＢＣ、Ａｎｔｉｃａｒｓｉａ  ｇｅｍｍａｔａｌｉｓ）に対する耐性に関してアッセイした。Ｒ１世代の植物から葉組織を収穫し、給餌バイオアッセイに使用した。表１０は、これらの試験で観察した活性を示す。表１０に示すように、Ｃｒｙ１Ｄａ１＿７．ｎｎｏはＳＰＷ、ＳＡＷ及びＳＢＬに対して活性を示した。
【表１０】
0006648127.tif 000012
【０１３７】
表１１は、Ｃｒｙ１Ｄａ１＿７．ｎｎｏを発現する安定に形質転換したＲ１世代のダイズ植物を用いたスクリーニングにおいて実施した圃場試験の結果を示す。スクリーンハウス内での植物への寄生に使用した種には、ブラックアーミーワーム（ＢＬＡＷ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｃｏｓｍｉｏｉｄｅｓ）、ビーンシュートモス（ＢＳＭ、Ｃｒｏｃｉｄｏｓｅｍａ  ａｐｏｒｅｍａ）、南アメリカポッドワーム（ＳＡＰＷ、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ｇｅｌｏｔｏｐｏｅｏｎ）、サンフラワールーパ（ＳＦＬ、Ｒａｃｈｉｐｌｕｓｉａ  ｎｕ）及びＶＢＣが含まれる。表１１は、これらの試験で観察した活性を示す。表１１に示すように、Ｃｒｙ１Ｄａ１＿７．ｎｎｏはＢＬＡＷ、ＳＡＰＷ及びＳＦＬに対して活性を示した。
【表１１】
0006648127.tif 000013
【０１３８】
本明細書に開示し、特許請求するすべての組成物及び方法は、本開示を参照して、過度の実験を重ねることなく作製及び実行することができる。本発明の組成物及び方法は、前述の例示的な実施形態に関して記載したが、本発明の真の概念、精神及び範囲から逸脱することなく、前記組成物、方法、及び方法の各段階または段階順序に対し、変形、変更、改変、及び修正を加えてもよいことは、当業者には明らかである。より具体的には、化学的及び生理学的に類似する特定の薬剤を本明細書に記載の薬剤と置き換えてもよく、それにより同一または同等の結果を達成し得ることは明らかであろう。当業者に明らかなこのような類似の置換及び改変はすべて、添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の精神、範囲及び概念の範囲内であるとみなされる。
【図１】
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【配列表】
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