(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ワクチン非存在下で用いられる、ビフィドバクテリウム  ビフィダム  Ｇ９−１（Bifidobacterium bifidum  Ｇ９−１、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−８１７）を含有するロタウイルス感染症の予防及び／又は治療剤。
【請求項２】
ロタウイルス感染症治療剤である請求項１に記載の剤。
【請求項３】
ロタウイルス感染症による症状が、下痢、吐き気、嘔吐、発熱、腹痛、腹部膨満感、鼓腸、脱水症状、及び脳症からなる群より選択される１以上である請求項１又は２に記載の剤。
【請求項４】
さらに、ロタウイルスの感染によって引き起こされる腸管上皮の損傷を緩和することを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の剤。
【請求項５】
さらに、ロタウイルスが存在する糞便を介した経口及び／又は接触による二次感染を予防することを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウイルス感染症の予防及び／又は治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
病原性ウイルスによる感染症は、発展途上国においても、先進国においても、毎年多数の患者が発生しており、特に、乳児、小児においても主な死亡原因になっている。例えば、ロタウイルス下痢症は６ヶ月〜２歳の乳幼児に多発する疾病で、それが原因で発展途上国では毎年６０万人が死亡する。また、ロタウイルス下痢症は糞便を介して、乳幼児の親や保育所の職員等に感染する。さらに、ロタウイルス下痢症は豚等の家畜でも発症し、経済的な打撃が大きい。
【０００３】
これまでに、ワクチンの効果を増強させるビフィドバクテリウム属菌体等のウイルス感染症の予防に有効な菌が報告されている（特許文献１、２）。また、ロタウイルスによる下痢発症の予防に効果的な菌体として特定の納豆菌株が知られている（特許文献３）。しかし、これまでに、ワクチンの非存在下、ウイルス感染症の治療に有効な乳酸菌は報告されていない。また、現在ロタウイルスに効果のある抗ウイルス剤や治療方法は存在しない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許第３２６９８９０号公報
【特許文献２】特許第５３２４２８３号公報
【特許文献３】特許第５７５３９９０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、新規なウイルス感染症の治療剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決するために検討した結果、乳酸菌がウイルス感染症の治療に有効であることを見出し、さらに検討を重ねて、種々の新知見を得て、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の発明に関する。
〔１〕ワクチン非存在下で用いられる、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属、ストレプトコッカス（Streptococcus）属、ラクトバシラス  アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）種、ラクトバシラス  ガセリ（Lactobacillus gasseri）種、ラクトバシラス  ジョンソニイ（Lactobacillus johnsonii）種、ラクトバシラス  パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）種又はラクトバシラス  ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）種に属する乳酸菌を含有するウイルス感染症の予防及び／又は治療剤。
〔２〕ウイルス感染症治療剤である前記〔１〕に記載の剤。
〔３〕乳酸菌が、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属に属する乳酸菌である前記〔１〕又は〔２〕に記載の剤。
〔４〕ウイルスが、ロタウイルス、ポリオウイルス、インフルエンザウイルス、エイズウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、ノロウイルス、アデノウイルス、サポウイルス、アストロウイルス、アイチウイルス、及びパレコウイルスからなる群より選択される１以上である前記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の剤。
〔５〕乳酸菌がビフィドバクテリウム  ビフィダム  Ｇ９−１（Bifidobacterium bifidum  Ｇ９−１、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−８１７）であり、ウイルスがロタウイルスである前記〔２〕に記載の剤。
〔６〕ウイルス感染症による症状が、下痢、吐き気、嘔吐、発熱、腹痛、腹部膨満感、鼓腸、脱水症状、及び脳症からなる群より選択される１以上である前記〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の剤。
【０００７】
本発明は、さらに以下の発明を包含する。
〔７〕ウイルス感染症の予防及び／又は治療用医薬製造のための前記〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の剤の使用。
〔８〕ウイルス感染症の予防及び／又は治療のために使用される前記〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の剤。
〔９〕前記〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の剤を、ヒトを含む哺乳動物に投与するウイルス感染症の予防及び／又は治療方法。
〔１０〕ウイルス感染症の予防及び／又は治療のための前記〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の剤の使用。
【発明の効果】
【０００８】
本発明は、新規なウイルス感染症の予防及び／又は治療剤を提供することができる。本発明の剤は、ロタウイルス感染症の治療が可能であり、ロタウイルスの二次感染予防も可能である点において、特に顕著な効果を有する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、噴霧乾燥装置の概略を示す図である。
【図２】図２は、実施例３の試験スケジュールを示す説明図である。
【図３】図３は、乳酸菌によるロタウイルス感染症の予防効果（下痢発症率減少効果）を示す図である。
【図４】図４は、乳酸菌によるロタウイルス感染症の予防効果（糞便スコア改善効果）を示す図である。
【図５】図５は、実施例４の試験スケジュールを示す説明図である。
【図６】図６は、乳酸菌によるロタウイルス感染症の治療効果（下痢発症率減少効果）を示す図である。
【図７】図７は、乳酸菌によるロタウイルス感染症の治療効果（糞便スコア改善効果）を示す図である。
【図８】図８は、乳酸菌の治療的投与によるロタウイルス感染価の減弱効果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属、ストレプトコッカス（Streptococcus）属、ラクトバシラス  アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）種、ラクトバシラス  ガセリ（Lactobacillus gasseri）種、ラクトバシラス  ジョンソニイ（Lactobacillus johnsonii）種、ラクトバシラス  パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）種又はラクトバシラス  ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）種に属する乳酸菌を含有するウイルス感染症の予防及び／又は治療剤（以下、本発明の剤という）を提供する。本発明の剤は、上記乳酸菌を含有していればよく、さらに他の成分を含有していてもよい。上記乳酸菌は、１種単独で使用してもよく、２種以上を混合して用いてもよい。本発明の剤は、ワクチン非存在下で用いられる。
【００１１】
本発明において、乳酸菌は、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属、ラクトバシラス  アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）種、ラクトバシラス  ガセリ（Lactobacillus gasseri）種、ラクトバシラス  ジョンソニイ（Lactobacillus johnsonii）種、ラクトバシラス  パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）種、ラクトバシラス  ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）種又はストレプトコッカス（Streptococcus）属に属する菌である。ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属に属する乳酸菌としては、ビフィドバクテリウム  ビフィダム（Bifidobacterium bifidum）またはビフィドバクテリウム  ロンガム（Bifidobacterium longum）が好ましく、ビフィドバクテリウム  ビフィダム  Ｇ９−１（Bifidobacterium bifidum  G9-1、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−８１７）またはビフィドバクテリウム  ロンガム  ＭＭ−２（Bifidobacterium longum  MM-2）がさらに好ましい。また、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属に属する乳酸菌は、B. breve、B. adolescentis、B. infantis、B.pseudolongum、B.thermophilum等であってもよい。ラクトバシラス  アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）種に属する乳酸菌としては、例えばラクトバシラス  アシドフィルス  ＫＳ−１３（Lactobacillus acidophilus  KS-13）が好ましい。ストレプトコッカス（Streptococcus）属に属する乳酸菌としては、ストレプトコッカス  フェーカリス（Streptococcus(Enterococcus) faecalis）が好ましく、ストレプトコッカス  フェーカリス１２９  ＢＩＯ  ３Ｂ（Streptococcus(Enterococcus) faecalis 129 BIO 3B）またはストレプトコッカス  フェーカリス１２９  ＢＩＯ  ３Ｂ−Ｒ（Streptococcus(Enterococcus) faecalis 129 BIO 3B-R）がさらに好ましい。また、ストレプトコッカス（Streptococcus）属に属する乳酸菌は、Streptococcus(Enterococcus) faecium、 Streptococcus(Enterococcus) hirae、Streptococcus(Enterococcus) thermophilus等であってもよい。  これらの菌体は、例えばＡＴＣＣ又はＩＦＯ等の機関や財団法人  日本ビフィズス菌センターなどから容易に入手することができる。また、市販されているものを適宜使用することもできる。
なお、本明細書中においては、ストレプトコッカス（Streptococcus）属とは、ストレプトコッカス（Streptococcus）属及びエンテロコッカス(Enterococcus)属を包含する。
【００１２】
本発明の効果を奏する限り、上記乳酸菌以外の有用菌を含んでもよい。例えば、Bacillus subtilis 129 BIO H(α)等のBacillus subtilis、Bacillus mesentericus、Bacillus polyformenticus等の糖化菌；例えば、Bacillus coagulans等の有胞子性乳酸菌； Bacillus  toyoi、B．licheniformis、Clostridium  butyricum等の酪酸菌；Leuconostoc mesenteroides等のリューコノストック属、Lactococcus lactis、L. cremoris等のラクトコッカス（Lactococcus）属、Tetragenococcus halophilus等のテトラジェノコッカス（Tetragenococcus）属、Pediococcus acidilactici、P. pentosaceus等のペディオコッカス（Pediococcus）属、Oenococcus oeni等のオエノコッカス（Oenococcus）属等の乳酸球菌；その他の有用菌が挙げられる。
これらの菌体は、例えばＡＴＣＣ又はＩＦＯなどの機関から容易に入手することができる。また、市販されているものを適宜使用することもできる。
【００１３】
上記菌体は、公知の条件又はそれに準じる条件で培養することにより得ることができる。例えば、通常、グルコ−ス、酵母エキス、ペプトン等を含む液体培地で上記乳酸菌の１種又は２種以上を通常約２５〜４５℃程度で約４〜７２時間程度、好気又は嫌気培養し、培養液から菌体を集菌し、洗浄し、湿菌体を得る。また、糖化菌の場合は、通常、肉エキス、カゼイン製ペプトン、塩化ナトリウム等を含む寒天培地で１種又は２種以上を通常約２５〜４５℃程度で約４〜７２時間程度、好気培養し、培地から菌体を集菌し、洗浄し、湿菌体を得る。
【００１４】
本発明において用いる乳酸菌は、生菌が好ましいが、菌の処理物を用いてもよい。菌の処理物とは、乳酸菌に何らかの処理を加えたものをいい、その処理は特に限定されない。該処理物として具体的には、該菌体の超音波などによる破砕液、該菌体の培養液又は培養上清、それらを濾過又は遠心分離など固液分離手段によって分離した固体残渣などが挙げられる。また、細胞壁を酵素又は機械的手段により除去した処理液、トリクロロ酢酸処理又は塩析処理などして得られるタンパク質複合体（タンパク質、リポタンパク質、糖タンパク質など）又はペプチド複合体（ペプチド、糖ペプチド等）なども該処理物として挙げられる。さらに、これらの濃縮物、これらの希釈物又はこれらの乾燥物なども該処理物に含まれる。また、該菌体の超音波などによる破砕液、該細胞の培養液又は培養上清などに対し、例えば各種クロマトグラフィーによる分離などの処理をさらに加えたものも本発明における該処理物に含まれる。乳酸菌の死菌体も本発明における該処理物に含まれる。上記死菌体は、例えば、酵素処理、約１００℃程度の熱をかける加熱処理、抗生物質などの薬物による処理、ホルマリンなどの化学物質による処理、γ線などの放射線による処理などにより得ることができる。これらの技術は従来充分に確立されていて、本発明において、そのような技術に従ってよい。
【００１５】
本発明において使用される乳酸菌は、乾燥物（菌体乾燥物）であってもよく、菌体乾燥物としては、シングルミクロンの菌体乾燥物が好ましい。菌体乾燥物とは、通常は乾燥された個々の菌体又は乾燥された菌体の集合物をいう。また、シングルミクロンとは、小数第１位を四捨五入して１〜１０μｍをいう。本発明に使用される乳酸菌として、シングルミクロンの菌体乾燥物を使用すると、製剤中の生菌率が上がり、その結果、ウイルス感染症の予防及び／又は治療効果が高くなる。シングルミクロンの乳酸菌の製造方法も従来公知であり、本発明の実施においても、公知の方法に従ってよい。
【００１６】
菌体乾燥物の好ましい製造方法について説明する。上記菌体を溶媒に分散して菌体液とする。溶媒は、当業界で用いられる公知の溶媒を用いてよいが、水が好ましい。また、所望によりエタノールを加えてよい。エタノールを加えることによって、最初にエタノールが気化し、ついで水が気化するから、段階的な乾燥が可能となる。さらに、菌体液は、懸濁液であってもよい。溶媒は上記で示したものと同じでよい。また、懸濁させる際、懸濁剤、例えばアルギン酸ナトリウム等を使用してもよい。
また、上記菌体液には、公知技術に従ってさらに賦形剤、結合剤、崩壊剤、静電気防止剤など当業界で一般に用いられている添加剤を通常の配合割合で添加してもよい。
賦形剤としては、例えば、乳糖、白糖、Ｄ−マンニトール、トウモロコシデンプン、粉末セルロース、リン酸水素カルシウム、炭酸カルシウム等が挙げられる。結合剤としては、例えばヒドロキシプロピルセルロース、ポビドン（ポリビニルピロリドン）、キサンタンガム等が挙げられる。崩壊剤としては、例えば、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、カルメロースカルシウム、部分アルファー化デンプン、クロスカルメロースナトリウム、クロスポビドン、カルボキシメチルスターチ等が挙げられる。静電気防止剤としては、例えば微粉または非微粉タルク、コロイド状シリカ、加工シリカ、沈降シリカ等が挙げられる。
【００１７】
上記菌体液を、菌体乾燥物を製造するために噴霧乾燥装置による乾燥操作に付する。噴霧乾燥装置は、シングルミクロンの噴霧液滴を形成できる微粒化装置を備えた噴霧乾燥装置が好ましい。非常に粒径の小さな噴霧液滴にすると、噴霧液滴の単位質量あたりの表面積が大きくなり、乾燥温風との接触が効率よく行われるため、生産性が向上する。
ここでシングルミクロンの液滴とは、好ましくは噴霧液滴の粒径が小数第１位を四捨五入して１〜１０μｍであるものをいう。
【００１８】
噴霧乾燥装置には、微粒化装置が、例えばロータリーアトマイザー（回転円盤）、加圧ノズル、又は圧縮気体の力を利用した２流体ノズルや４流体ノズルである噴霧乾燥装置が挙げられる。
噴霧乾燥装置は、シングルミクロンの噴霧液滴を形成できるものであれば、上記形式のいずれの噴霧乾燥装置であってもよいが、４流体ノズルを有する噴霧乾燥装置を使用するのが好ましい。
【００１９】
４流体ノズルを有する噴霧乾燥装置では、例えば４流体ノズルの構造としては、好ましくは気体流路と液体流路とを１系統として、これを２系統ノズルエッジにおいて対称に設けたもので、ノズルエッジに流体流動面となる斜面を構成している。
また、ノズルエッジの先端の衝突焦点に向かって、両サイドから圧縮気体と液体を一点に集合させる外部混合方式の装置がよい。この方式であれば、ノズル詰まりがなく長時間噴霧することが可能となる。
【００２０】
４流路ノズルを有する噴霧乾燥装置について図１を用いてさらに詳しく説明する。４流路ノズルのノズルエッジにおいて、液体流路３又は４から湧き出るように出た菌体液が、気体流路１又は２から出た高速気体流により流体流動面５で薄く引き伸ばされ、引き伸ばされた液体はノズルエッジ先端の衝突焦点６で発生する衝撃波で微粒化させることにより、シングルミクロンの噴霧液滴７を形成する。
【００２１】
圧縮気体としては、例えば、空気、炭酸ガス、窒素ガス又はアルゴンガス等の不活性ガス等を用いることができる。とくに、酸化されやすいもの等を噴霧乾燥させる場合は、炭酸ガス、窒素ガス又はアルゴンガス等の不活性ガスを用いるのが好ましい。
圧縮気体の圧力としては、通常約１〜１５ｋｇ重／ｃｍ２、好ましくは約３〜８ｋｇ重／ｃｍ２である。
ノズルにおける気体量は、ノズルエッジ１ｍｍあたり、通常約１〜１００Ｌ／分、好ましくは約１０〜２０Ｌ／分である。
【００２２】
通常、その後、乾燥室において、その噴霧液滴に乾燥温風を接触させることで水分を蒸発させ菌体乾燥物を得る。
乾燥室の入り口温度は、通常約２〜４００℃、好ましくは約５〜２５０℃、より好ましくは約５〜１５０℃である。入り口温度が約２００〜４００℃の高温であっても、水分の蒸発による気化熱により乾燥室内の温度はそれほど高くならず、また、乾燥室内の滞留時間を短くすることにより、生菌の死滅や損傷をある程度抑えることができる。
出口温度は、通常約０〜１２０℃、好ましくは約５〜９０℃、より好ましくは約５〜７０℃である。
【００２３】
上記のように菌体乾燥物の粒径を小さくすることにより、生菌率が上がり、生菌率の多い製剤を提供できるという利点がある。
すなわち、シングルミクロンの菌体乾燥物を得るためにはシングルミクロンの噴霧液滴を噴霧するのが好ましい。噴霧液滴の粒径を小さくすると、噴霧液滴の単位質量あたりの表面積が大きくなるので、乾燥温風との接触が効率よく行われ、乾燥温風の熱による菌体の死滅又は損傷を極力抑えることができる。その結果として、生菌率が上がり生菌数の多い菌体乾燥物が得られる。
【００２４】
本発明の剤は、乳酸菌を単独で使用または他の成分を混合することにより容易に製造され得る。他の成分は、本発明の効果を奏する限り特に限定されない。他の成分としては、例えば、Bacillus subtilis、Bacillus mesentericus、Bacillus polyformenticus等の糖化菌；例えば、Bacillus coagulans等の有胞子性乳酸菌； Bacillus  toyoi、B．licheniformis、Clostridium  butyricum等の酪酸菌；その他の有用菌、医薬用の賦形剤等が挙げられる。本発明の剤は、医薬品、医薬部外品、飲食品、飼料等の形態として用いることができる。このような、本発明の剤を含む医薬品も、本発明の好ましい実施態様の１つである。
【００２５】
本発明の剤の剤形は、それぞれの成分の物理化学的性質、生物学的性質等を考慮して投与に好適な剤形とすればよい。医薬品の場合には、経口投与に適しており、内服剤とすることが好ましい。内服剤の剤型としては、例えば、錠剤、ペレット、細粒剤、散剤、顆粒剤、丸剤、チュアブル剤、トローチ剤、液剤、懸濁剤等が挙げられる。中でも、錠剤又は散剤が好ましい。さらに、本発明の剤は、乳酸菌の他に、賦形剤（例えば、乳糖、デンプン、結晶セルロース、リン酸ナトリウム等）、結合剤（例えば、デンプン、ゼラチン、カルメロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン等）、崩壊剤（例えばデンプン、カルメロースナトリウム等）、滑沢剤（例えばタルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、マクロゴール、ショ糖脂肪酸エステル等）、安定剤（亜硫酸水素ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、アスコルビン酸、ジブチルヒドロキシトルエン等）、着色剤、賦香剤、光沢剤等、当業界で使用される公知の添加剤等を適宜含有していてもよい。製剤中に含まれる乳酸菌の合計量は、通常、最終製剤中に約０．０００００１〜９９質量％の範囲から適宜選択して決定することができる。
【００２６】
なお、乳酸菌は、一般に嫌気性で乾燥状態では空気又は酸素に対して弱く、また、高温と湿気に弱いため、組成物の製剤化に際してはできるだけ、不活性ガスの存在下又は真空、低温下で、処理することが好ましい。
【００２７】
乳酸菌を含有する組成物を固形製剤にする場合、乾燥法によって、単に粉末同士を混合してもよいし、またその粉末を圧縮して顆粒にしたり、錠剤にしたりしてもよい。湿式法により顆粒、錠剤を製造する場合は、結合剤の水溶液を用いて練合、乾燥し、目的の固形剤とすることができる。さらに、この様にして得られた粉末又は顆粒をカプセルに充填して、カプセル剤とすることもできる。
【００２８】
例えば、錠剤を製造する場合は、公知の打錠機を用いるとよい。該打錠機としては、例えば単発式打錠機又はロータリー型打錠機等が挙げられる。また、丸剤、チュアブル剤又はトローチ剤の製造方法は、公知の方法に従って行われてよく、例えば錠剤を製造するのと同じ手段で作ることができる。
【００２９】
微量の有効成分（乳酸菌）を大量の他の粉末と混合し均一な混合物を得るためには、いわゆる段階的混合法を採るのがよい。例えば、有効成分をその１００〜２００容量倍の粉末と混合して均一な粉末を得、これを残りの粉末と混合すると均一な粉末を得ることができる。
含水物からの乾燥には、Ｌ−乾燥、凍結乾燥、噴霧乾燥などの手段をとることができる。乳酸菌の乾燥菌体を得るには、適当な安定剤、例えばグルタミン酸モノナトリウム塩、アドニトールなどを加えた中性の緩衝液に菌を懸濁させておき、自体公知の方法で乾燥することもできる。
【００３０】
本発明において、乳酸菌の投与量は、生菌を用いる場合には、生菌の菌数にして通常約１０３〜１０１２個／大人／回、好ましくは１０５〜１０１０個／大人／回、より好ましくは１０６〜１０１０個／大人／回である。本発明において、乳酸菌の投与回数は、１０３〜１０１２個／大人／回の場合において、１日当たり１〜数回が好ましい。ここで、製剤中の生菌数の測定は菌体によって異なるが、例えば日本薬局方外医薬品規格に記載されたそれぞれの菌体の定量方法により容易に測定できる。
【００３１】
本発明におけるウイルスは特に限定されないが、例えば、ロタウイルス、ポリオウイルス、インフルエンザウイルス、エイズウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、ノロウイルス、アデノウイルス、サポウイルス、アストロウイルス、アイチウイルス、パレコウイルス等が挙げられ、中でもロタウイルスが好ましい。
【００３２】
ウイルス感染症による症状としては特に限定されず、下痢、吐き気、嘔吐、発熱、腹痛、腹部膨満感、鼓腸、脱水症状、脳症等が挙げられる。
【００３３】
本発明の剤は、ウイルス感染症の治療のために好適に用いられる。中でも、ロタウイルス感染症を発症した後の治療が可能であり、ロタウイルスの二次感染予防も可能である点で、その臨床的意義は計り知れない程大きいものと言える。さらには、本発明の剤は、投与の方法も簡単で、しかも副作用がほとんどないものである。ウイルス感染症の治療効果の有無は、ウイルス感染動物に本発明の剤を、経口投与などの方法により投与し、下痢症状、糞便スコア、その動物の盲腸及び結腸内容物のウイルス価等を対照群と比較することにより確認することができる。
【００３４】
本発明の剤は、上記の通り、ウイルス感染により生じる症状のある個体（動物）に好適に適用することができる。さらに、本発明の剤は、副作用がなく安全であることから、予防目的で長期間投与することもできる。ウイルス感染症の予防効果の有無は、ウイルス感染動物に本発明の剤を、経口投与などの方法により投与し、下痢症状、糞便スコア、その動物の盲腸及び結腸内容物のウイルス価等を対照群と比較することにより確認することができる。このため、本発明の剤は、ウイルス感染した個体だけでなく、健常な個体、該症状を発症するおそれのある個体（動物）等にも好適に適用することができる。個体としてはヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、サル等の哺乳動物が好ましく、特にヒトが好ましい。
【００３５】
本発明の剤は、上述した医薬品として用いることができるほか、機能性食品、特定保健用食品、食品添加物、ドリンク剤などの飲食品として用いることができるものである。本発明の剤を含むウイルス感染症の予防及び／又は治療用飲食品組成物も本発明の１つである。本発明に係る飲食品組成物を、ウイルス感染症を発症した、又はそのおそれのあるヒトを含む哺乳動物に摂取させることにより、ウイルス感染症を予防及び／又は治療することができる。飲食品組成物中に含まれる乳酸菌の合計量は、通常、最終組成物中に約０．０００００１〜９９質量％の範囲から適宜選択して決定することができる。
【００３６】
本発明に係る飲食品組成物の形態は特に限定されないが、例えば、自然流動食、半消化態栄養食若しくは成分栄養食、又はドリンク剤等の加工形態とすることもできる。また、本発明に係る飲食品組成物は、ウイルス感染の予防及び／又は治療、ウイルス感染による下痢、吐き気、嘔吐、発熱、腹痛、脱水症状、腹部膨満感、鼓腸、脳症等の予防及び／又は治療をコンセプトとし、その旨を表示した特定保健用食品、サプリメント、栄養補助食品、機能性食品等が含まれる。また、本発明に係る飲食品組成物は、乳糖、デンプン、結晶セルロース、リン酸ナトリウム等の医薬用賦形剤を含んでいてもよい。さらに、本発明に係る飲食品組成物は、アルコール飲料又はミネラルウォーターに用時添加する易溶性製剤としてもよい。より具体的には、本発明に係る飲食品組成物は、例えばビスケット、クッキー、ケーキ、キャンディー、チョコレート、チューインガム、和菓子などの菓子類；パン、麺類、米飯又はその加工品；清酒、薬用酒などの発酵食品；ヨーグルト、ハム、ベーコン、ソーセージ、マヨネーズなどの畜農食品；果汁飲料、清涼飲料、スポーツ飲料、アルコール飲料、茶などの飲料等の形態とすることができる。
【００３７】
また、本発明に係る飲食品組成物は、例えば、医師の食事箋に基づく栄養士の管理の下に、病院給食の調理の際に任意の食品に本発明の飲食品組成物を加え、その場で調製した食品の形態で患者に与えることもできる。本発明の飲食品組成物は、液状であっても、粉末や顆粒などの固形状であってもよい。
【００３８】
本発明に係る飲食品組成物は、食品分野で慣用の補助成分を含んでいてもよい。上記補助成分としては、例えば乳糖、ショ糖、液糖、蜂蜜、ステアリン酸マグネシウム、オキシプロピルセルロース、各種ビタミン類、微量元素、クエン酸、リンゴ酸、香料、無機塩などが挙げられる。
【００３９】
本発明に係る飲食品組成物の摂取量は、摂取する哺乳動物の生活習慣病の状態、年齢、性別などによって異なるので、一概には言えないが、乳酸菌を、上述した医薬品の場合と同様の量摂取させることが好ましい。
【００４０】
本発明は、本発明の効果を奏する限り、本発明の技術的範囲内において、上記の構成を種々組み合わせた態様を含む。
【実施例】
【００４１】
次に、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではなく、多くの変形が本発明の技術的思想内で当分野において通常の知識を有する者により可能である。本実施例中、「％」は、特に断らない限り「質量％」を意味する。
【００４２】
［実施例１］（乳酸菌菌体乾燥物の調製及び該菌体乾燥物中の生菌数の測定）
１．菌（BBG9-1：Bifidobacterium bifidum G9-1）の調製方法
ＢＢＧ９−１の菌体乾燥物の調製は以下のように行った。すなわち、ＢＢＧ９−１の凍結保存菌株（ビオフェルミン製薬社保存菌株）を３７℃で２４時間静置培養後、ビフィズス菌試験用液体培地（１）（日本薬局方外医薬品規格「ビフィズス菌」の項に記載）にこの培養菌液をビフィズス菌試験用液体培地（１）１００に対して１の割合（容量比）で接種し、３７℃で１８時間静置培養した。得られた培養菌液を遠心分離し、水で３回洗浄後、適量の水を加え、湿菌体１ｋｇに対し、グルタミン酸塩０．１ｋｇ及びデキストリン０．５ｋｇの割合で加えて噴霧乾燥装置にて菌体乾燥物とした。なお、ビフィズス菌ＢＢＧ９−１株は、医療用医薬品のビオフェルミン錠剤（商品名、ビオフェルミン製薬社製）等の成分として含まれており、該錠剤等から通常行われる方法で精製することによって入手可能である。
【００４３】
２．菌体乾燥物中の生菌数の測定
日本薬局方外医薬品規格「ビフィズス菌」の項に記載されているビフィズス菌の定量法に準じて測定した。すなわち、菌体乾燥物５ｇを精密に量り、希釈液（２）３０ｍＬ中に加え、強く振り混ぜ、更に同希釈液を加えて正確に５０ｍＬとし、よく振り混ぜ、この菌液１ｍＬを正確に量り、別に正確に分注した同希釈液９ｍＬ中に加える操作（１０倍希釈法）を繰り返し、１ｍＬ中の生菌数が２０〜２００個となるよう希釈した。この液１ｍＬをペトリ皿にとり、ここに５０℃に保ったビフィズス菌試験用カンテン培地を２０ｍＬ加えてすばやく混和し、固化させた。これを３７℃で４８〜７２時間嫌気培養し、出現したコロニー数及び希釈倍率から菌体乾燥物中の生菌数を求めた。これにより求めた上記１．で得られた菌体乾燥物の菌数は、生菌数３．４×１０１１ＣＦＵ／ｇであった。
【００４４】
実施例中で用いた希釈液（２）の調製方法を、以下に示す。
希釈液（２）の調製方法
日本薬局方外医薬品規格「ビフィズス菌」の項に記載された方法に従い、下記の成分を混合し、高圧蒸気滅菌器を用いて１２１℃で１５分間加熱して滅菌して調製した。
無水リン酸一水素ナトリウム    ６．０ｇ
リン酸二水素カリウム          ４．５ｇ
ポリソルベート８０            ０．５ｇ
Ｌ−塩酸システイン            ０．５ｇ
カンテン                      １．０ｇ
精製水                      １０００ｍＬ
ｐＨ  ６．８〜７．０
【００４５】
［実施例２］（使用動物、乳酸菌及びロタウイルス）
１．動物
実施例３〜５の各実施例において、２匹の妊娠ＢＡＬＢ/ｃマウスを日本ＳＬＣ社より購入後、室温２２±５℃、湿度５５±５％、１２時間周期の照明（７〜１９時）条件下で、固形飼料（ＣＥ−２：日本クレア社製）及び上水道を自由に摂取させ飼育した。乳飲みマウスが生後２日齢である日に２群（各群当たり一腹単位、即ち母親マウス１匹及び乳飲みマウス６〜８匹）に分けた。そのうちの乳飲みマウスを実験に供した。
【００４６】
２．乳酸菌
上記ＢＢＧ９−１の菌体乾燥物を、ＰＢＳ（Phosphate Buffered Saline）（−）（日水製薬社）を用いて溶解させることによって得た、ＢＢＧ９−１が６．０×１０８ＣＦＵ（Colony Forming Unit）／ｍＬの乳酸菌溶液を実験に供した。
【００４７】
３．ロタウイルス
サル由来ＳＡ−１１株（藤田保健衛生大学）をＰＢＳ（＋）（シグマアルドリッチジャパン社）で希釈して得た、２．９×１０７（ＰＦＵ（Plaque Forming Unit）／ｍＬ）のロタウイルス溶液を実験に供した。
【００４８】
［実施例３］（乳酸菌によるロタウイルス感染症の予防効果）
１．試験方法
図２は実施例３の試験スケジュールを示す説明図である。即ち、図２は、分娩、群分け、乳飲みマウスへの乳酸菌又はＰＢＳ（−）の投与、ロタウイルス感染及び下痢の症状観察のスケジュールを示す。具体的には、乳飲みマウスが生後２日齢の日に、乳酸菌投与群と対照群とに群分けした。群分け後の各群は乳飲みマウスとその母親マウスからなる。乳飲みマウスが生後５日齢の日から生後１４日齢の日まで乳酸菌投与群の乳飲みマウスに乳酸菌溶液を、対照群の乳飲みマウスにＰＢＳ（−）を、５０μＬずつ一日一回経口投与した。さらに、生後７日齢の両群の乳飲みマウスに５０μＬのロタウイルス溶液を経口投与して、両群の乳飲みマウスをロタウイルス感染させた。ロタウイルス感染後８日間、毎日各乳飲みマウスの腹部を押して、下記表１に示す通り、糞便の性状を４段階でスコア化した。糞便のスコアが２以上のものを下痢と評価して、各腹の下痢発症率を算出した。また、糞便スコアに関しても、各腹の平均値を算出した。なお、下痢の症状観察及び糞便のスコア評価を各群乳飲みマウス６腹ずつ行った。
【００４９】
【表１】
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【００５０】
２．結果及び考察
結果を図３及び４に示す。図３に示す通り、ロタウイルス感染後３日、４日での下痢の発症率が対照群では７４．２％、５２．５％であったのに対して、乳酸菌投与群では３４．８％、１４．６％と、統計学的に有意に下痢の発症率が減少した（ｐ＜０．０５）。さらに、図４に示す通り、ロタウイルス感染３日後、４日後での糞便スコアが対照群では１．９、１．２であったのに対して、乳酸菌投与群では０．８、０．３と、統計学的に有意に糞便スコアが改善した（ｐ＜０．０５）。
以上のように、乳飲みマウスに対してロタウイルス感染前２日より乳酸菌株を予防的に経口投与することによって、下痢の発症率の減少および糞便スコアの改善が認められ、乳酸菌がロタウイルス感染症の予防に有効であることが明らかとなった。
【００５１】
［実施例４］（乳酸菌によるロタウイルス感染症の治療効果）
１．試験方法
図５は実施例４の試験スケジュールを示す説明図である。即ち、実施例３における乳酸菌又はＰＢＳ（−）の投与期間を「乳飲みマウスが生後５日齢の日から生後１４日齢の日まで」から「乳飲みマウスが生後８日齢の日から生後１４日齢の日まで」に変更し、下痢の症状観察及び糞便のスコア評価を行う各群乳飲みマウスを「６腹ずつ」から「７腹ずつ」に変更した以外は、実施例３と同じ方法で試験を行った。
【００５２】
２．結果及び考察
結果を図６及び７に示す。図６に示す通り、ロタウイルス感染後３日での下痢の発症率が対照群では９０．５％であったのに対して、乳酸菌投与群では６０．５％と、統計学的に有意に下痢の発症率が減少した（ｐ＜０．０５）。さらに、図７に示す通り、ロタウイルス感染後３日、４日での糞便スコアが対照群では２．０、１．１であったのに対して、乳酸菌投与群では１．３、０．６と、統計学的に有意に糞便スコアが改善した（ｐ＜０．０５）。
以上のように、乳飲みマウスに対してロタウイルス感染後１日より乳酸菌株を経口投与することによって、下痢の発症率の減少および糞便スコアの改善が認められ、乳酸菌がロタウイルス感染症の治療に有効であることが明らかとなった。
【００５３】
［実施例５］（乳酸菌の治療的投与によるロタウイルス感染価の減弱効果）
１．試験方法
乳飲みマウスが生後２日齢の日に、乳酸菌投与群と対照群とに群分けした。群分け後の各群は乳飲みマウスとその母親マウスからなる。生後７日齢の両群の乳飲みマウスにロタウイルス溶液を５０μＬ経口投与して、両群の乳飲みマウスをロタウイルス感染させた。乳飲みマウスが生後８日齢の日に乳酸菌投与群の乳飲みマウスに乳酸菌溶液を、対照群の乳飲みマウスにＰＢＳ（−）を、５０μＬずつ一回経口投与した。生後９日齢の両群の乳飲みマウスから盲腸及び結腸内容物を採取した。なお、盲腸及び結腸内容物の採取を各群乳飲みマウス６腹ずつ行った。
【００５４】
２．プラークアッセイ法
６ウェルプレートに１．０×１０５ｃｅｌｌs／ｍＬに播いたＣＶ−１細胞（理化学研究所）溶液を２日間培養した。盲腸及び結腸内容物５ｍｇを、終濃度３０μｇ／ｍＬのアセチル化トリプシン（シグマアルドリッチジャパン社）を添加したＥ−ＭＥＭ（シグマアルドリッチジャパン社）中で分散させて、３７℃で３０分間盲腸及び結腸内容物に含まれるロタウイルスを活性化させた。ＣＶ−１細胞をＥ−ＭＥＭを用いて二度洗浄した。ＣＶ−１細胞から培地を除いた後、Ｅ−ＭＥＭを用いて１０倍に段階希釈した活性化ロタウイルス溶液を３００μＬ／ウェルになるように添加して、３７℃で１時間感染させた。Ｅ−ＭＥＭを用いて細胞を一度洗浄した後、１．４％ Ｓｅａｋｅｍ  ＭＥアガロース溶液（ロンザジャパン社）と終濃度２μｇ／ｍＬにてブタ膵臓由来トリプシン（シグマアルドリッチジャパン社）を添加した２×Ｅ−ＭＥＭをそれぞれ１：１で混合して、２．５ｍＬ／ウェルになるように添加した。室温で３０分間寒天を凝固させた後、３７℃で３晩インキュベートした。遮光下で、２×Ｅ−ＭＥＭに０．１％ Ｎｅｕｔｒａｌ  ｒｅｄ溶液（シグマアルドリッチジャパン社）および１．４％ Ｓｅａｋｅｍ  ＭＥアガロース溶液をそれぞれ２×Ｅ−ＭＥＭ：０．１％ Ｎｅｕｔｒａｌ  ｒｅｄ溶液：１．４％ Ｓｅａｋｅｍ  ＭＥアガロース溶液が１０：１：１０になるように混合して、２ｍＬ/ウェルになるように添加し、室温で３０分間寒天を凝固させた。３７℃で一晩インキュベーションさせた後、プラークをカウントした。
【００５５】
３．結果及び考察
図８に示す通り、ロタウイルス感染後２日での盲腸及び結腸内容物中のウイルス価は、対照群では中央値９．５（ＰＦＵ／ｍｇ）であったのに対して、乳酸菌投与群では中央値１．７（ＰＦＵ／ｍｇ）であり、統計学的に有意なウイルス価の減少が認められた（ｐ＜０．０１）。したがって、乳酸菌はロタウイルスの感染によって引き起こされる腸管上皮の損傷及び、それに伴う下痢などのロタウイルス感染症状の緩和に有効であることが明らかとなった。
また、ロタウイルスは他のウイルスと比較して、感染性が極めて高く、その感染経路はロタウイルスが多量に存在する糞便を介した経口及び／又は接触感染であることから、ウイルス価の減弱効果を有する乳酸菌はロタウイルスの二次感染を予防する上でも有効であることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
本発明の剤は、ウイルス感染の予防及び／又は治療に有用である。
【符号の説明】
【００５７】
１、２  圧縮気体が供給される気体流路
３、４  被乾燥体を含む液体が供給される液体流路
５      流体流動面
６      衝突焦点
７      噴霧液滴
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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