(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨移植領域のコンピュータ断層撮影法、前記コンピュータ断層撮影法のデータに基づいた骨欠損又は骨移植部位のモデル化、生体適合性足場又は生体適合性足場を作製するための型の三次元印刷を含む、哺乳動物における骨欠損補填材のための個別適合型遺伝子活性化インプラントを構築するための方法であって、
前記個別適合型遺伝子活性化インプラントを構築するための方法は、
コンピュータ断層撮影法を用いて骨欠損又は骨移植部位の形状及び大きさを決定するステップ、
三次元印刷を用いて生体再吸収性材料から所定の形状及び大きさの生体適合性足場又は生体適合性足場を作製するための型を作製するステップ、
作製された生体適合性足場を核酸によって活性化するステップ、
を含み、
前記作製された生体適合性足場を核酸によって活性化するステップは、
前記生体適合性足場を洗浄するステップ、
前記生体適合性足場を平衡化するステップ、
前記生体適合性足場を乾燥させるステップ、
前記核酸を前記生体適合性足場に添加するステップ、
前記生体適合性足場から非結合核酸を洗浄除去するステップ、
前記非結合核酸を洗浄除去した後にさらに前記生体適合性足場を乾燥させるステップ、
をさらに含むことを特徴とする、方法。
【請求項２】
前記生体適合性足場の作製中に、移植領域に製品を後で固定化するための要素として、金属及び生体再吸収性材料のプレート、ミニプレート、ネジ、ミニネジ、ピン、針、ロッド及びこれらの類似物、のうち少なくとも１つを前記生体適合性足場に組み込むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法によって作製された、哺乳動物の骨欠損を補填するための個別適合型遺伝子活性化インプラント。
【請求項４】
前記個別適合型遺伝子活性化インプラントは、骨移植領域への移植後に前記個別適合型遺伝子活性化インプラントの表面と前記骨移植領域の周囲の骨壁との間の距離が１ｍｍ未満になるように構築されることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は骨組織修復のための個別適合型遺伝子活性化インプラントの構築法に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨欠損又は骨萎縮を有する患者を処置する際の問題は、外傷学、整形術及び顎顔面口腔手術の実施において、極めて悩ましいものである（非特許文献１−３）。大きさの小さい骨欠損の治癒には種々の骨補填材（骨形成材料）が存在し、方法としては、これらの骨補填材が自家骨組織、血小板に富む血漿、成長因子が豊富な血漿などと混ざることによって最適化される（非特許文献１）。
【０００３】
しかしながら、特に問題であり、社会的に重要なのは、先天性奇形及び発達異常、外傷、炎症性疾患、腫瘍病理学及びその第１段階の外科的処置に関連する大規模な骨欠損（１ｃｍ３を超えるもの）を有する患者の有効的治療法が未解決の問題となっていることである。身体器官としての骨機能が相当な範囲で損なわれているか、又は完全に失われているような臨床状況において、市販の骨補填材を使用して骨連続性を再建することは、骨形成性が十分でないことが明らかであることから、不可能である。遊離であれ、血管柄付であれ、自家骨のみが骨移植の「ゴールドスタンダード」であり、これらの場合においても有効であり得る（非特許文献４，５）。
【０００４】
自家移植片を用いる骨移植は、更なる損傷をもたらし、追加の外科的アプローチへの発展又は原因となり、手術時間、合併症発生率及び採骨部位の罹病率が大幅に増大することに関係する。加えて、微小血管外科技術を用いる自家骨移植は、当該手術を実施するために必要な設備だけでなく、血管吻合の適合性及び再視覚化手順の適宜実施を管理するために必要な設備を有する専門医療機関の場において、高度に熟練した専門医によってのみ実施することができる。同時に、全ての問題点、費やされる資源及び資金にもかかわらず、血栓症及び血管吻合不全の可能性が高く、自家移植が失敗することもある（非特許文献６）。
【０００５】
自家骨移植が完全に適応した場合であっても、移植片の維持及び移植部位への完全な一体化、処置の長期的転帰は、必ずしも成功するものではない。第１に、これは、後続して生じる、移植した材料の高度な生体再吸収によって説明される（最大４０％及び更にそれ以上）。第２に、骨欠損又は骨萎縮領域が不規則な形状を有する場合、自家移植片（腓骨、肋骨、肩甲骨、頭蓋骨）を補填対象の欠損形状に正確にモデル化すること、すなわち、導入する材料の全表面と骨欠損部（骨移植部位）の側面との間の分離が１ｍｍを超えないようにすることは不可能である。これにより、移植面領域における移植片の不十分な固定化が生じ、また、自家移植の術後変形、癒着不能又は過剰な生体再吸収が起こる。
【０００６】
このように、骨補填材料の「ゴールドスタンダード」であるにもかかわらず、自家骨移植は、使用が限られており、必ずしも有効ではなく、高頻度の合併症に関連している。自家骨移植の使用の主な欠点の１つ及びその有効性の欠如の理由の１つは、骨欠損の形状及び大きさを正確にモデル化できないことである。同時に、骨欠損の表面全体又は骨萎縮領域にわたって任意の骨補填材を密着させること及び完全な固定化は、骨移植の基本原則である（非特許文献１）。自家骨移植が実行不可能であるか、又は効果のないことがわかった場合、医師は、伸延骨形成法、補綴術を用いるか、患者の生活の質を相当に低下させるこの種の処置を諦めざるを得ない。
【０００７】
この点において、血管柄付骨移植を含む自家骨移植の使用の有効性に関して、これに取って代わることができるか、又は少なくとも代替となることができる、より有効な新しい骨補填材の開発が非常に求められている。本発明者らの研究による所見によれば、この問題は、補填する骨欠損部の形状及び大きさに正確に適合することを特徴とし、利用可能な任意の三次元（３Ｄ）印刷技術を用いて作製する、遺伝子活性化多孔質生体適合性生分解性物質を構築することによって解決することができる。
【０００８】
（最新技術）
従来の骨補填材には種々のものが知られており、例えば、各種加工技術（脱灰、脱タンパクなど）による同種及び異種骨基質、リン酸カルシウム、セラミックス、ケイ酸塩、有機酸ポリマー並びに骨基質の有機及び無機物質の合成類似体又は天然成分などがある。しかしながら、これらは全て、その中に生物活性成分を含んでいないため、骨伝導作用だけを有している。このため、従来の骨補填材は、修復骨形成を最適化する能力のみを有し、骨誘導をもたらすことができないことから、大きさの小さい（低体積の）骨欠損を補填するためにのみ使用されている（非特許文献７）。上記群の製品は、大規模な骨欠損修復のための個別適合型ブロックの形態では、臨床現場でほとんど使用されていない。
【０００９】
別の種類には、活性化骨補填材があり、成長因子（タンパク質）を含有する材料群と、生細胞又は遺伝子構築物（核酸）を含有する材料群とに分けることができる。
【００１０】
成長因子を有する骨補填材は、適度な骨誘導作用を有しているため、修復骨形成を活性化することができる。しかしながら、成長因子は、短命かつ短距離であり、手術創の炎症状態下では急速に低下することが知られているので、製品の全体的な有効性は、大規模な骨欠損を補填するには不十分であると思われる。この点に関して、成長因子を有する所定の大きさ及び形状の骨補填材を構築するために三次元印刷技術を使用する研究は多くなく、全ての場合において、作製された製品は、大きさの小さいものであり（約１ｃｍ３）、最適な有効性とはかけ離れている（非特許文献８）。
【００１１】
より有効なアプローチの別の例は、組織工学による個別適合型骨移植の開発に関するものである。研究者らは、所定の大きさ及び形状を有する足場を構築するための各種技術を用いて、個別適合型基質を作製した後、その基質を生細胞と合わせることを行っている。この方法によって、所定の大きさ及び形状の足場は、いくらかの骨形成能を獲得し、理論上は、修復骨形成の顕著な誘導をもたらすことができる。ただし、個別適合型骨移植片の一部を形成する生細胞の治療上の可能性は、酸素要求量によって制限される。言い換えれば、多くの研究により、このような３Ｄ印刷の組織工学による小さな骨移植（最大１ｃｍ３）は、従来材料と比較してより有効であることが証明されている。しかしながら、大規模な骨欠損の補填の場合、欠損形状に合った足場形状及び大きさを理想化したモデルであっても、十分な血管供給がなければ細胞の死は不可避であることから、いかなる有効性も実現されていなかった。
【００１２】
特許請求する本発明の直近の先行技術は、足場と、核酸、すなわち、成長因子をコードする遺伝子構築物とからなる遺伝子活性化骨補填材である（非特許文献９）。
【００１３】
遺伝子活性化骨補填材は、「足場−核酸」複合体を含み、各構成成分については、各種技術：化学結合（非特許文献７）、補助剤の使用（例えば、ゲルバイオポリマー）（非特許文献１０）、足場合成プロセス中の足場への核酸の即時添加などによる複合体化が行われた。
【００１４】
このような製品は、骨誘導作用を有し、生細胞を含んでいないので、酸素要求量による制限を受けない。しかしながら、多くの研究者は、骨欠損を補填するために用いた際のその骨誘導作用の強さ、その結果としての有効性は、組織工学による骨移植の場合よりも低いだろうと考えている。この理由は、組織工学的材料の細胞がより広範な作用機序を有していることに対して、遺伝子構築物による移植部位細胞のトランスフェクション効率が低いこと、及び修復プロセスを誘導する遺伝子構築物によってコードされる因子が実に１つ又は２つという「治療上の強さ」を使用していることである。
【００１５】
上述した技術的アプローチの無効性及び欠点のため、多くの研究グループが、複雑な担体及び生物活性成分の組み合わせ（遺伝子構築物と細胞、細胞と成長因子、成長因子と遺伝子構築物、更には成長因子と遺伝子構築物と細胞を単一品として）を含む骨補填材を製造することによって、製品を複雑化する道を進んでいる。しかしながら、このような材料の作製は、過度に高価であり、大規模な骨欠損を補填する際の有効性は、未だに不十分である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Ｋｕｌａｋｏｖ  Ｌ．Ａ．，Ｒｏｂｕｓｔｏｖａ  Ｔ．Ｇ．，Ｎｅｒｏｂｅｅｖ  Ｌ．Ｉ．，ｅｄｉｔｏｒｓ．Ｄｅｎｔａｌ  Ｓｕｒｇｅｒｙ  ａｎｄ  Ｍａｘｉｌｌｏｆａｃｉａｌ  Ｓｕｒｇｅｒｙ．Ｎａｔｉｏｎａｌ  ｇｕｉｄａｎｃｅ．Ｍｏｓｃｏｗ，ＧＥＯＴＡＲ−Ｍｅｄｉａ，２０１０；９２８ｐ．
【非特許文献２】Ｐｉｐｉｔｏｎｅ  ＰＳ，Ｒｅｈｍａｎ  Ｓ．Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｒａｕｍａｔｉｃ  ｂｏｎｅ  ｌｏｓｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｌｏｗｅｒ  ｅｘｔｒｅｍｉｔｙ．Ｏｒｔｈｏｐ  Ｃｌｉｎ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍ．２０１４  Ｏｃｔ；４５（４）：４６９−８２
【非特許文献３】Ｔｅｖｌｉｎ  Ｒ，ＭｃＡｒｄｌｅ  Ａ，Ａｔａｓｈｒｏｏ  Ｄ，Ｗａｌｍｓｌｅｙ  ＧＧ，Ｓｅｎａｒａｔｈ−Ｙａｐａ  Ｋ，Ｚｉｅｌｉｎｓ  ＥＲ，Ｐａｉｋ  ＫＪ，Ｌｏｎｇａｋｅｒ  ＭＴ，Ｗａｎ  ＤＣ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ｆｏｒ  ｃｒａｎｉｏｆａｃｉａｌ  ｂｏｎｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｊ  Ｄｅｎｔ  Ｒｅｓ．２０１４  Ｄｅｃ；９３（１２）：１１８７−９５
【非特許文献４】Ａｌ−Ｎａｗａｓ  Ｂ，Ｓｃｈｉｅｇｎｉｔｚ  Ｅ．Ａｕｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｂｏｎｅ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅ  ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ｏｒ  ａｕｔｏｇｅｎｏｕｓ  ｂｏｎｅ  −  ａ  ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｒｅｖｉｅｗ  ａｎｄ  ｍｅｔａ−ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｏｒａｌ  Ｉｍｐｌａｎｔｏｌ．２０１４  Ｓｕｍｍｅｒ；７  Ｓｕｐｐｌ  ２：Ｓ２１９−３４
【非特許文献５】Ｎｋｅｎｋｅ  Ｅ，Ｎｅｕｋａｍ  ＦＷ．Ａｕｔｏｇｅｎｏｕｓ  ｂｏｎｅ  ｈａｒｖｅｓｔｉｎｇ  ａｎｄ  ｇｒａｆｔｉｎｇ  ｉｎ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｊａｗ  ｒｅｓｏｒｐｔｉｏｎ：ｍｏｒｂｉｄｉｔｙ，ｒｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｍｐｌａｎｔ  ｓｕｒｖｉｖａｌ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｏｒａｌ  Ｉｍｐｌａｎｔｏｌ．２０１４  Ｓｕｍｍｅｒ；７  Ｓｕｐｐｌ  ２：Ｓ２０３−１７
【非特許文献６】Ｈａｎ  Ｚ，Ｌｉ  Ｊ，Ｌｉ  Ｈ，Ｓｕ  Ｍ，Ｑｉｎ  Ｌ．Ｓｉｎｇｌｅ  ｖｅｒｓｕｓ  ｄｕａｌ  ｖｅｎｏｕｓ  ａｎａｓｔｏｍｏｓｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆｒｅｅ  ｆｉｂｕｌａ  ｏｓｔｅｏｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ｆｌａｐ  ｉｎ  ｍａｎｄｉｂｕｌａｒ  ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ：Ａ  ｒｅｔｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  ｓｔｕｄｙ．Ｍｉｃｒｏｓｕｒｇｅｒｙ．２０１３  Ｓｅｐ  ３．ｄｏｉ：１０．１００２／ｍｉｃｒ．２２１７６．［Ｅｐｕｂ  ａｈｅａｄ  ｏｆ  ｐｒｉｎｔ］
【非特許文献７】Ｄｅｅｖ  Ｒ．Ｖ．，Ｄｒｏｂｙｓｈｅｖ  Ａ．Ｙｕ．，Ｂｏｚｏ  Ｉ．Ｙａ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｅｆｆｅｃｔ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｏｓｔｅｏｐｌａｓｔｉｃ  ｍａｔｅｒｉａｌ  ｗｉｔｈ  ｈｕｍａｎ  ＶＥＧＦ  ｇｅｎｅ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２０１３；ＶＩＩＩ（３）：７８−８５
【非特許文献８】Ｓｔｒｏｂｅｌ  ＬＡ，Ｒａｔｈ  ＳＮ，Ｍａｉｅｒ  ＡＫ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｏｎｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｂｉｐｈａｓｉｃ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｓｃａｆｆｏｌｄｓ  ｂｙ  ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ−２  ａｎｄ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｓ．Ｊ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ  Ｒｅｇｅｎ  Ｍｅｄ．２０１４  Ｍａｒ；８（３）：１７６−８５
【非特許文献９】Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ  Ｓ．Ａ．Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｗｏｕｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇ，ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．２１７０１０４，１０．０７．２００１
【非特許文献１０】Ｗｅｇｍａｎ  Ｆ．，Ｂｉｊｅｎｈｏｆ  Ａ．，Ｓｃｈｕｉｊｆｆ  Ｌ．ｅｔ  ａｌ．Ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ａｓ  ａ  ｒｅｓｕｌｔ  ｏｆ  ＢＭＰ−２  ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ  ｂａｓｅｄ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｅｕｒ．Ｃｅｌｌ  Ｍａｔｅｒ．２０１１；２１：２３０−４２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
他の研究者らの経験及び先行技術を鑑みれば、従来の材料、及び成長因子又は細胞又は遺伝子構築物のいずれかを含む活性化材料はいずれも、小規模及び中程度の大きさの欠損を補填する際の製品の作用機序及び予測不可能な有効性に関する上述の側面から、大規模な骨欠損修復に十分であり得ないと仮定することは論理的であろう。
【００１８】
しかし、一般的意見及び開発の傾向（より複雑でかつ多成分の骨形成材料の作製に向かっている）に反して、当研究グループは、最適な結果を達成するために、外科的アプローチと生物医学的アプローチを組み合わせるという異なる方法を採ってきた。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明において提案する製品及びその作製方法の主旨は、生体適合性及び生体再吸収性材料の個別適合型基質を構築することと、その基質を生物活性成分である遺伝子構築物と合わせることである。直近の先行技術（非特許文献９）とは異なる本発明の主な側面は、移植部位、すなわち、骨欠損又は骨萎縮の領域に形状及び大きさが正確に適合する個別適合型製品を作製するために、３Ｄ印刷プロセスを使用することである。言い換えれば、製品は、移植領域への移植後、材料と対応する骨壁との間の分離が１ｍｍを超えないように作製される。３Ｄ印刷プロセスを用いて、大きさ及び形状に関する個別のパラメータと正確な一致を達成する。更なる製品構成要素は、インプラントのいくつかの作製段階で材料に組み込まれる固定化構造部材（再建プレート、ネジ、ミニプレート、ミニネジ、ワイヤ、ピンなど）であり得る。この構成要素の存在は、任意の標準技術（金属製構造など）を用いた移植部位への確実な固定を回避するために、機械的特性が十分でない生体再吸収性材料を遺伝子構築物の足場として選択した場合、必須である。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】ウサギの頭蓋骨欠損を補填するのに適した個別適合型遺伝子活性化材料を概略的に示す。Ａ：上面図、Ｂ：前面中央から見た断面図。
【図２】ウサギの頭蓋骨欠損を補填するのに適した、構築済み個別適合型遺伝子活性化材料を示す。
【図３】骨欠損を補填した個別適合型遺伝子活性化材料を示す。移植後６．５ヶ月後；１：インプラント、２：新しく形成された骨組織、Ａ：コンピュータ断層撮影法、３Ｄ再構築、Ｂ：組織学的画像（染色：ヘマトキシリン、エオシン）。
【図４】遺伝子構築物によって活性化されていない、骨欠損を補填した個別適合型材料を示す。移植後６．５ヶ月；１：インプラント、２：新しく形成された骨組織。組織学的画像（染色：ヘマトキシリン、エオシン）。
【図５】ウサギの脛骨の大規模な欠損を補填するのに適した、位置決め取付具を備える個別適合型遺伝子活性化材料を概略的に示す。
【図６】ミニプレート及びミニネジを用いて骨欠損部に固定した個別適合型遺伝子活性化インプラントを示す。
【図７】骨欠損を補填した、位置決め取付具を備える個別適合型遺伝子活性化材料を示す。移植後３ヶ月；１：インプラント、２：新しく形成された骨組織。組織学的画像（染色：ヘマトキシリン、エオシン）。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
個別適合型遺伝子活性化材料を構築するための提案方法は、以下の段階を含み、その順序は、変えてもよい。
１．骨欠損又は骨萎縮領域の正確な形状及び大きさを決定すること。この目的のために、コンピュータ断層撮影法、Ｘ線検査、ラジオグラフィーなどの標準的な放射線学的方法を用いることができる。
２．光造形法、光重合法などを含む、任意の３Ｄ印刷プロセスを用いて、生体再吸収性材料から所定の形状及び大きさの個別適合型足場を作製すること。
３．個別適合型足場の任意の作製段階又は足場作製後に、足場と遺伝子構築物とを合わせること。
【００２２】
第１の段階は、作製する製品の形態測定パラメータを計画することに関し、外科的介入の計画の際に通常用いられる調査方法と同じ方法が必要とされる。最も好ましい選択肢は、骨格骨病理学的診断の重要な部分であるコンピュータ断層撮影法であり、骨修復手順を計画するためのデータを提供する。標準的なコンピュータ断層撮影法によって得られた情報を使用して、特別に構成されたソフトウェア（例えば、ＮＨＩ，ＵＳＡから入手可能な「３Ｄ  Ｓｌｉｃｅｒ」）を用いて、骨欠損の形状及び大きさ、したがって、個別適合型遺伝子活性化インプラントの形状及び大きさをモデル化することができる。
【００２３】
取得した形態測定情報に基づいて、必要な生体再吸収性材料から所定のパラメータを用いて三次元インプラントを作製することができる３Ｄプリンタ又は任意の他の装置のためのマスタファイルを形成する。形態的及び機能的組織化並びに骨組織の再生を考慮すると、足場を構築するのに最も好ましい材料は、リン酸カルシウム、ヒドロキシアパタイト、コラーゲン、生物活性ガラスセラミックス、有機酸ポリマー及びこれらの組み合わせを含む他の材料が含まれ得る。個別適合型遺伝子活性化インプラントを構築するために選択される生体再吸収性材料は、特定の３Ｄ印刷プロセスの選択にのみ影響する、いかなる凝集状態及び物性を有していてもよい。
【００２４】
足場の３Ｄ印刷は、基本的に異なる２つの方法によって実施することができる。最初の方法は、選択した材料から足場を直接印刷することである。２つ目の方法は、成形要素であるガイドを（好適な材料から）印刷した後、それを所定の形状及び大きさの足場を「キャスト」（合成）するための型として使用することを伴う。
【００２５】
個別適合型遺伝子活性化材料の重要な作製段階は、足場と遺伝子構築物（例えば、プラスミドＤＮＡ）とを合わせることである。プロセスのこの部分は、足場を作製するために選択した生体再吸収性材料の性質によって部分的に定義することができる、多数の方法によって実施することができる。担体が液体材料（ゲル、ゾル、溶液）又は一時的に液相状態である材料から作製される場合、遺伝子構築物は、３Ｄ印刷の前又は最中に当該材料中に導入することができる。固体材料（例えば、顆粒状）を使用する場合、遺伝子構築物は、３Ｄ印刷の前又は最中に液体溶液中に加えてもよいし、遺伝子構築物を含有する任意のゲル材料の一部としてもよい。大多数の場合において最も単純で最も実行可能な方法は、作製した個別適合型足場を、３Ｄ印刷の後に、遺伝子構築物と合わせることである。この目的のために、溶液の形態又はゲルの一部である、種々の濃度の遺伝子構築物を、異なる条件（温度、暴露時間、機械的衝撃）下で「印刷した」足場とともにインキュベートすることができる。
【００２６】
足場の３Ｄ印刷の前又は最中に遺伝子構築物と足場とを合わせる場合、３Ｄ印刷は、滅菌条件下、すなわち、クラスＡ又はＢのクリーンルームで実施することが好ましい。しかしながら、足場を作製した後に、遺伝子構築物と足場とを合わせる場合、得られた個別適合型足場を続けて殺菌し、その後、滅菌条件下で遺伝子構築物と合わせるのであれば、３Ｄ印刷は、いかなるクラスの部屋で実施してもよい。
【００２７】
驚くべきことに、実施例にて部分的に記載する当研究において、３Ｄ印刷プロセスによって作製した個別適合型遺伝子活性化材料を用いると、大規模な骨欠損修復の場合であっても、最適な結果を達成できることがわかった。言い換えれば、遺伝子活性化材料が移植部位の全表面に正確に一致し、しっかりと密着して、その有効性を得ることができる。また、遺伝子構築物を含まない同一の個別適合型足場は、全く有効性がなく、同じ材料で製造した標準的な大きさ及び形状の非個別適合型遺伝子活性化インプラントも十分に有効ではなかった。
【００２８】
本発明者らが得た有利な効果については、標準的な形状及び大きさの非個別適合型遺伝子活性化材料の遺伝子構築物は、大規模な骨欠損の領域に移植した場合、移植側の細胞に直接接触せず、標的細胞に到達することがなかったという事実によって説明されると思われる。更に、骨壁と遺伝子活性化材料との間が１ｍｍを超えて分離すると、放出された遺伝子構築物のほとんどが血液凝固酵素及びその場の炎症性滲出液によって破壊され、迅速に除去される。同時に、製品表面と骨欠損部側面との間に大きな空間があると、常在細胞のインプラントへの移動が十分に活性化しない。その結果、トランスフェクション効率が低いことを考慮すると、特にプラスミドＤＮＡの場合、核酸は、治療効果を得るのに十分な量で、細胞に進入しない。
【００２９】
これと反対に、個別適合型遺伝子活性化材料は、移植面の全表面にしっかりと密着し、「自由空間」は、１ｍｍ未満の長さである。これにより、一方では、より迅速かつより大量の細胞が製品構造へと移動するのを促進し、他方では、遺伝子構築物が辿らなければならない標的細胞へ向かうまでの距離が短くなる。遺伝子活性化材料と骨欠損部側面との間の空間がないことから、その距離が短くなり、より多くの遺伝子構築物が維持される。これは、治療効果を達成するために非常に重要である。
【００３０】
したがって、遺伝子活性化材料の場合、製品の形状及び大きさと、移植側のパラメータとの間の正確な完全な合致が、製品の治療効果を達成するために極めて重要である。この事実を見極めたことが、大規模な（１ｃｍ３を超える）骨欠損修復に有効な骨補填材を開発することを可能にした、一種の発見となった。しかしながら、正確な個別適合型遺伝子活性化材料について発見された有効性の詳細な機序については、更なる研究と研鑽が必要である。
【００３１】
生物医学的方法の側面における大規模な骨欠損補填材の問題については、部分的に解決したが、本発明者らは、別の問題、すなわち、外科的問題に直面した。この問題は、骨誘導作用を果たす遺伝子活性化材料が、移植直後に全ての移植側表面にしっかりと密着するだけでなく、周囲の骨組織と完全に一体化するまで、その位置に常に留まる必要があることである。言い換えれば、個別適合型骨移植片は、移植部位に確実に固定する必要があり、そうでなければ、ずれの発生は不可避であり、インプラントと移植領域との間に空間が形成されると、生物学的作用が損なわれ、可動性及び脱落さえ生じかねない。この問題は、外科手術中に、インプラントを破壊することなく、任意の取付具をねじこむか、又は直接インプラント中に挿入することができるように、標準的な固定技術（ネジ、ミニネジ、マイクロネジ、ピン、針）を可能にする機械的に強固な材料で足場を構成する場合、簡単に解決される。しかしながら、本発明者らが実施した研究のいくつかと同様に、足場材料は、脆く、十分な強度でないことが多い。例えば、リン酸カルシウムの多孔質足場は、固定化するために孔をあけようとすると、容易に壊れた。このような材料を外科手術中に直接固定するのは、極めて困難であるか、又は全く不可能である。
【００３２】
この点に関して、本発明者らは、更なるプロセス段階、及び機械的強度に欠く足場で作製した個別適合型遺伝子活性化材料の変形を開発した。この解決策は、足場作製段階中に、個別適合型遺伝子活性化骨移植片に固定要素を配置することであり、２つの方法で実施することができる。第１の方法は、金属又は強固な生体再吸収性材料で作製された特別なコアを足場構造内部に導入することを含み、これにより、固定要素（ネジ、ミニネジ、マイクロネジ、ピン、針など）のための孔がもたらされ得る。コア（又はコア内の孔）に通じるチャネルは、製品の固定が想定されるインプラント表面で形成される必要がある。第２の選択肢は、所定の位置に外部固定システム（例えば、ミニネジ付きミニプレート）を配置し、固定要素を既に有する所定の形状及び大きさの足場を得ることである。その結果、個別適合型遺伝子活性化材料は、内部（コア）又は外部のいずれかの取付具を含み得る。
【００３３】
重要な点は、固定要素は、医師が提案する手術計画に基づいて、個別適合型遺伝子活性化インプラント作製の第１の段階で、先に選択する必要があることである。この目的のために、最初に、欠損、萎縮又は病理学的部位の領域を有する３Ｄ骨モデルを作製し、この修正を骨欠損部の形成に反映させる。このモデルは、外科手術を計画する医師が利用できるようにしなければならない。医師は、予定した操作（骨断片の切除、骨欠損部側面のすり合わせなど）を再現し、骨断片及び個別適合型遺伝子活性化インプラントを固定化するために固定要素（金属又は強固な生体再吸収性材料で作製した構造体）をモデルに配置する。位置決め取付具を正しい位置に固定したモデルを用いて、作製用の個別適合型遺伝子活性化インプラントの形態測定パラメータを計算する。
【実施例１】
【００３４】
固定要素を「埋め込まない」個別適合型遺伝子活性化材料
本明細書にて提案する方法によって、取付具を含まない個別適合型遺伝子活性化材料の変形の１つを製造する前に、限界寸法を有する骨欠損部の適切な生物学的モデルを定める必要があった。調査モデルの選定の際には、次の基準に従った。１）骨欠損の寸法が最大であること、２）移植領域にいかなる金属構造も使用せずに、ブロックを容易に固定できること。上記の基準を考慮して、２０ｍｍの直径を有する、ウサギの頭蓋骨欠損の実験モデルを作製した。ドリルを用いて頭蓋骨の切骨を行い、脳硬膜に損傷を与えずに、欠損中央から１時、５時、７時及び１１時の方向に１ｍｍ突出した幅１ｍｍの内部の皮質骨の断片を残して、骨欠損を形成した。骨欠損部の寸法と組み合わせる支持点としての当該位置のこれらの骨断片の保存は、モデル特有の特徴となる。こうしたモデルにより、更なる固定化技術を用いることなく、個別適合型遺伝子活性化インプラントを骨欠損部内に固定化することが可能となった。
【００３５】
ウサギの頭蓋のマルチスパイラルコンピュータ断層撮影法を外科手術前に実施した。３Ｄ  Ｓｌｉｃｅｒソフトウェア（ＮＨＩ，ＵＳＡ）を用いて、冠状縫合とラムダ縫合から等距離にある矢状縫合を中心にして、計画した骨欠損の手動セグメント化を行った。計画した骨欠損から算出した形態測定パラメータを考慮して、リン酸オクタカルシウムブロックの３Ｄ印刷を実施した。このブロックは、厚さ１．３ｍｍ、直径２０ｍｍの凸面ディスクに形成され、頭蓋骨補填後の開頭減圧のための穿孔を１７個施した（図１、図２）。
【００３６】
予め決定した実験プロトコルに従って、核酸と足場のカルシウムとの化学結合に基づいて、３Ｄ印刷によって作製した足場を遺伝子構築物（血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）をコードする遺伝子を有するプラスミドＤＮＡ）と合わせた。
１）足場の洗浄（５ｍＬ容量の０．５Ｍリン酸緩衝液とともに３７℃で攪拌しながら１２時間インキュベーション）；
２）平衡化（５ｍＬ容量の１０ｍＭリン酸緩衝液を用いて３７℃で攪拌しながら各回１０分間で３回処理）；
３）足場の乾燥（完全に乾燥するまで３７℃で３時間インキュベーション）；
４）遺伝子構築物の添加（１０ｍＭリン酸緩衝液中の濃度１μｇ／μＬのプラスミドＤＮＡ溶液とともに３７℃で攪拌しながら１２時間インキュベーション）；
５）製品からの非結合プラスミドＤＮＡの洗浄除去（５ｍＬ容量の５ｍＭリン酸溶液で３回処理）；
６）乾燥（完全に乾燥するまで３７℃で３時間インキュベーション）。
【００３７】
個別適合型遺伝子活性化補填材での骨移植から６．５ヶ月後、ウサギの頭蓋骨の完全性は、完全に回復した。インプラントは再吸収されなかったが、その周辺領域は周囲の骨組織と完全に一体化していた。更に、個別適合型遺伝子活性化移植片の内側表面及び外側表面に沿って、新しく形成された長さ３〜６ｍｍの骨組織が再生された。コンピュータ断層撮影法及び組織学検査の両方によれば、結合組織の中間膜又は被膜を形成していないインプラントにしっかりと密着した新しく形成された骨組織が確認された（図３）。
【００３８】
遺伝子活性化構築物がないと、新しく形成される骨組織の体積は、大幅に少なく、周辺から続く骨は１〜２ｍｍを超えなかった（図４）。
【実施例２】
【００３９】
固定要素を「埋め込んだ」個別適合型遺伝子活性化材料
個別適合型遺伝子活性化材料のこの変形について検討するために、別のモデル（段階的に離れた近位及び遠位の骨断片を有する長さ３６ｍｍのウサギの脛骨の欠損）を開発した。
【００４０】
個別適合型遺伝子活性化インプラント（図５）を本方法を用いて作製した。
【００４１】
第１の段階で、インプラントを固定するためのミニプレート及びミニネジを配置した形成要素を作製するために、３Ｄ印刷を実施した。得られた型を使用して、型パラメータに正確に適合し、かつ固定要素を含む足場をリン酸三カルシウムから合成した。上記プロトコルに従って、インプラントを遺伝子構築物（ｖｅｇｆ及びｓｄｆ遺伝子（間質細胞成長因子をコードする遺伝子）を有するプラスミドＤＮＡ）と合わせた。この結果得られた固定化システムを「埋め込んだ」個別適合型遺伝子活性化補填材を、インプラントパラメータに正確に適合する、ウサギの脛骨欠損部に移植した（図６）。
【００４２】
３ヶ月後、四肢の支持能力が完全に回復した。インプラントはこの時点までに再吸収されなかったが、その周辺領域は骨断片と完全に一体化していた（図７）。
【００４３】
したがって、個別適合型遺伝子活性化材料及びその変形を構築するために本発明者らが開発した方法は、大規模な補填を含む骨欠損補填に有効な医療製品を作製することを可能にする。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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