(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
炎症の治療及び／又は予防への使用のための、１．５〜５ｇ／Ｌの範囲の濃度のヒドロキシチロソール及び１〜６ｇ／Ｌの範囲の濃度の３，４−ＤＨＰＥＡ−ＥＤＡを含む、オリーブ植物水及び／又はオリーブ搾りかすの濃縮物であって、当該「ｇ／Ｌ」が、１リットルの濃縮物あたりのグラムを表し、当該濃縮物が、以下の工程：
（ｉ）マイクロ濾過の濃縮物及び透過物を得るために、オリーブ植物水及び／又はオリーブ搾りかすのサンプルをマイクロ濾過する工程、ここで当該マイクロ濾過工程が、１）酸化アルミニウム及びジルコニア製、及び２）管状形状、によって特徴付けられる、少なくとも１つのセラミック膜の使用を包含する；及び
（ｉｉ）工程（ｉ）のマイクロ濾過透過物を逆浸透により濃縮する工程、ここで当該逆浸透はポリアミド製のポリマー膜を用いて実施される；
を含む方法を用いて取得される、当該濃縮物。
【請求項２】
前記ヒドロキシチロソールの含有量が２〜３ｇ／Ｌの範囲であり、前記３，４−ＤＨＰＥＡ−ＥＤＡの含有量が１．５〜２．５ｇ／Ｌの範囲である、請求項１に記載の濃縮物。
【請求項３】
好ましくは、チロソール、クロロゲン酸、β‐ヒドロキシベルバスコシド、ルチン、ベルバスコシド、及びルテオリンから選択された少なくとも１つのフェノール化合物；及び／又は好ましくは、ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びカリウムから選択された少なくとも１つの金属；及び／又は好ましくは、塩化物、硫酸塩、リン酸塩及び硝酸塩から選択された少なくとも１つのアニオン；及び又はグルコース、フルクトース、マンニトール及びスクロースから選択された少なくとも１つの炭水化物；及び／又は窒素をさらに含む、請求項１又は２のいずれか１項に記載の濃縮物。
【請求項４】
前記膜が、以下の特徴：
約３０〜約４０ｍｍ、好ましくは約２５ｍｍの外径；及び
約５００〜約１５００ｍｍ、好ましくは約１２００ｍｍの長さ；及び
約２．５〜約５ｍｍ、好ましくは約３．５ｍｍの直径、好ましくは水力直径を有する一連のチャネル；及び
約０．１５〜０．７ｍ２、好ましくは約０．３５ｍｍ２の濾過面；及び
約０．１ミクロン〜約３００ｋＤａの範囲の分子カットオフ；
を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の濃縮物。
【請求項５】
前記ポリマー膜が螺旋形状により特徴付けられる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の濃縮物。
【請求項６】
炎症の治療及び／又は予防への使用のための、請求項１〜５のいずれか１項に記載の濃縮物を含有する飲料。
【請求項７】
水及び／又は果実及び又は／乳を基礎とし、好ましくはグレープジュース及び／又はブドウ液を基礎とする、請求項６に記載の飲料。
【請求項８】
炎症の治療及び／又は予防への使用のための、請求項１〜５のいずれか１項に記載の濃縮物を含有する経口製剤。
【請求項９】
前記炎症が腫瘍性又は非腫瘍性炎症である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の濃縮物、又は請求項６若しくは７のいずれか１項に記載の飲料、又は請求項８に記載の経口製剤。
【請求項１０】
前記非腫瘍性炎症が、リウマチ性疾患、好ましくはリウマチ性関節炎及び痛風; 結腸直腸の炎症性疾患、好ましくは、クローン病、過敏性及び潰瘍性腸症候群；気管支の病変、好ましくは気管支慢性閉塞性肺疾患及び喘息; 肝疾患、好ましくは、線維症及び肝硬変; 前立腺の疾患、好ましくは、良性前立腺肥大症及び急性/慢性前立腺炎; 粘膜炎;皮膚炎又は前腫瘍性病変、好ましくは、乳房、子宮、肺又は口の病変に関連付けられる、請求項９に記載の濃縮物又は飲料又は経口製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オイル保有オリーブの圧縮に起因する水（通常、植物水として知られている）、又はオリーブ製粉工程に起因する残留オリーブ搾りかす由来のポリフェノール化合物に富んでいる、特にヒドロキシチロソース及び３，４−ＤＨＰＡ−ＥＤＡに富んでいる天然の植物複合体の血管新生及び／又は炎症の予防及び治療への使用に関する。
【０００２】
特に、参照される血管新生及び炎症は、例えば腫瘍の進行及び広がり、又は非腫瘍病理に結び付けられる血管新生及び炎症を維持する病理型のものである。
【背景技術】
【０００３】
血管新生は、個人の成長及び発育の段階で起こる生理的工程であり、そしてそれは、既存の血管区画のものからの新しい血管の形成を包含する。血管新生は、種々の病理学的現象、例えば腫瘍を特徴づける工程である。
【０００４】
腫瘍（又は新生物）塊状物は、約１−２ｍｍ３の大きさまで、自律的に成長し、そして発育するが、しかしながら、さらに成長するためには、それ自体に栄養分及び酸素の不可欠な供給を確保すべきであり、そして従って、それ自体の血管区画を創造する必要がある。
【０００５】
腫瘍は、血管新生因子、例えばＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子）、ｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞増殖因子）及びＰＤＧＦ（血小板由来増殖因子）を分泌することができ、それらは、血管の発達を促進することができる。腫瘍により分泌される血管新生因子は、内皮細胞を活性化し、それに応答して、周囲の組織に移動し、そして侵入するために、細胞マトリックス及び基底膜（例えば、マトリックスメタロプロテアーゼ−ＭＭＰ）を分解する物質を増殖し、そして分泌し始める。続いて、内皮細胞は、周皮細胞、すなわち新しく形成された血管を取り囲み、そして血流を変更でき、そして血管透過性を調節できる収縮性細胞の存在により安定化される管状構造を形成するよう組織化する。腫瘍由来の血管は、不規則であり、そして「正常」血管とそれらとを区別する構造要素により特徴づけられる。例えば、それらは周皮細胞の不在、大きな卵円窓及び顕著な血管拡張により特徴づけられる。それらの特徴は、血管の透過性及び圧力レベルを変更し、そして従ってまた、抗腫瘍薬剤の送達を妨げ、薬剤は腫瘍に達する代わりに、間質液中に分散され、そして従って、それらの機能を実行することができない。
【０００６】
腫瘍の発生、成長及び転移の工程における血管新生の重要性を考慮して、多くの研究が、腫瘍血管の不規則的発生を阻止でき、そして従って、腫瘍部位への薬剤の送達を改善できる物質を同定する目的で行われて来た。特に、大きな努力が、血管の異常発生を防止することができる分子を同定するために行われており；これは、「血管予防（angioprevention）」（すなわち、腫瘍関連血管新生の予防）の概念の策走を導いて来た。
【０００７】
それらの分子の大部分は、天然起源のものであり（又は、何れかの場合でも、合成類似体である）。非常に興味深い例としては、オリーブ油由来の分子である。
【０００８】
心血管病変及び腫瘍の発生率は、オリーブ油の消費に基づいている地中海式ダイエットを採用する集団において有意に低いことが、実際、十分に知られている。科学的証拠は、その組成を定義する目的で、及び特に、医学−薬理学的可能性のある物質を同定する目的でオリーブ油の研究にかなりのインセンティブを提供して来た。
【０００９】
特に関心を呼んでいるオリーブ油の１つの特徴は、それに含まれるポリフェノールの高レベルである。それらの化合物は、遊離基の形成を阻害できる、植物起源の天然抗酸化物質である。
【００１０】
オリーブ油の有益な特性が、オリーブの栽培とオリーブ油の生産において、中でもイタリアで相当な増加を誘発している。結果的に、我々はまた、高度に汚染し、そして従って、相当な環境的影響を生む、オリーブ油生産の副産物、主に植物水及び搾りかすの強い増加を目撃して来た。
【００１１】
この物質の廃棄は、国家及び地域レベルでイタリアで厳格に規制されており、そして法律（１１／１９９６の法５７４）の実施は、高い医学的及び医薬的可能性を有する分子に富んでいる、それらの廃棄物から何れの利点も引き出すことができない生産者に多額の費用をもたらしている。
【００１２】
ヒドロキシチロソールは、最も研究されて来た植物水に含まれるポリフェノールである。それは植物水及び搾りかすに存在し、そしてまた、中でも、オリーブの木の葉に存在する物質であるオレウロペインの加水分解により形成される。
【００１３】
最近の研究は、ヒドロキシチロソースは、単独で、ＰＣ１２細胞（褐色細胞腫細胞系）に対する細胞保護効果を有し、Ｕ９３７細胞（ヒト骨髄単球系）及びＣ２Ｃ１２細胞（マウス筋芽細胞系）に投与される場合、抗アポトーシスであり、誘発された腫瘍の場合、インビボで乳房腫瘍増殖を阻害し、ＨＬ６０及びＨＬ６０Ｒ腫瘍細胞系（ヒト前骨髄性白血病系及びその多剤耐性誘導体）に対する研究における化学予防剤であり、そして月経前症候群及び骨粗鬆症の予防剤であることを実証している。
【００１４】
さらに、ヒドロキシチロソールのインビボ投与（また、高濃度での）は毒性効果を有さないことが、実証されている。
【００１５】
他の研究は、オレウロペインが単独で投与される場合、それは抗微生物活性を行い、結腸直腸腫瘍細胞系、転移性乳房腫瘍及びＥＲ−陰性細胞系において抗腫瘍能力を有し、そして細胞骨格レベルで細胞安定性を変える能力を有することを実証した。多くの研究が植物水に対して行われて来たが、単に、生産者の費用であり、そして環境に危険であるこの廃棄物に価値を与えることができる新規特性を同定するために、大幅な切実な必要性がまだ存在する。この廃棄物に特性を与えることができる新規の栄養及び医学−薬理学的特性を同定するために特に切実な必要性がある。
【発明の概要】
【００１６】
この点に関して、本出願人は、驚くべきことには、植物水が、血管新生及び炎症、特に腫瘍の発生及び広がりを維持する病理学的血管新生及び炎症、又は非腫瘍病理に関連した血管新生及び炎症を、インビトロ及びインビボで阻止し／予防することができることを見出した。特に、本出願人は、マイクロ濾過にゆだねられる植物水の透過物を、逆浸透を介して濃縮することにより、血管新生及び炎症、特に病理学的血管新生及び炎症、例えば腫瘍に関連するそれら又は非腫瘍病理に関連するそれらを予防でき、且つ阻止できるポリフェノール化合物に富んでいる植物複合体を入手し、ある方法においては、これは、同じ化合物が、個別に採取される場合、すなわち精製技術により、植物水及び搾りかすから単離される場合に達成できるものに比較して、より効果的であることを見出した。
【００１７】
この効果は、中でも、血管予防の点で、ヒト健康のために特に好都合である。実際、このためには、本発明の植物水濃縮物は、単独で又はさらなる抗腫瘍及び抗血管新生及び抗炎症物質と組合して、例えば血管新生及び炎症、特に、腫瘍に関連する病理学的血管新生及び炎症、又は非腫瘍疾患に関連する病理学的血管新生及び炎症を治療するか、又は予防するために、飲料の形で使用され得る。
【００１８】
本発明のさらなる利点は、添付される図面の助けにより行われる、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、Ａ）本発明のポリフェノール濃縮物（サンプルＡ００９）；Ｂ）ブランク（サンプルＡ０１２）；Ｃ）精製されたヒドロキシチロソール（ＨｙＴ）；及びＤ）精製されたヒドロキシチロソールブランク（すなわち、エタノール−ＥｔＯＨ）の漸進的希釈液による処理に続いて、ＨＵＶＥ細胞の増殖の評価を目的とするＭＴＴアッセイの結果を示す。
【００２０】
【図２】図２は、処理の２４及び４８時間後、Ａ、Ｃ）本発明のポリフェノール濃縮物（サンプルＡ００９）；Ｂ、Ｄ）ブランク（サンプルＡ０１２）の漸進的希釈による処理に続いて、アポトーシス及びＨＵＶＥ細胞死に対するアッセイの結果を示す。
【００２１】
【図３】図３は、処理の２４及び４８時間後、Ａ、Ｃ）精製されたヒドロキシチロソール（ＨｙＴ）；Ｂ、Ｄ）精製されたヒドロキシチロソールブランク（すなわち、エタノール−ＥｔＯＨ）の漸進的希釈による処理に続いて、アポトーシス及びＨＵＶＥ細胞死に対するアッセイの結果を示す。
【００２２】
【図４】図４は、Ａ）血清フリー培養培地（ＳＦＭ）、完全培養培地（ＣＴＲＬ）、本発明のポリフェノール濃縮物の１：５００及び１：２５０希釈液（サンプルＡ０１２０）；Ｂ）血清フリー培養培地（ＳＦＭ）、完全培養培地（ＣＴＲＬ）、精製されたヒドロキシチロソール（ＨｙＴ）の１：５００及び１：２５０希釈液、精製されたヒドロキシチロソールブランク（すなわち、エタノール−ＥｔＯＨ）の１：５００及び１：２５０希釈液による処理に続いて、マトリゲルにおいて毛細管型管状構造を形成するＨＵＶＥ細胞の能力の評価に基いての形態形成アッセイの結果を示す。
【００２３】
【図５】図５は、Ａ）完全培養培地（ＣＴＲＬ）、血清フリー培養培地（ＳＦＭ）、本発明のポリフェノール濃縮物の漸進的希釈液（サンプルＡ００９）、ブランク（サンプルＡ０１２）；Ｂ）完全培養培地（Ｃ＋）、血清フリー培養培地（ＳＦＭ）、精製されたヒドロキシチロソール（ＨｙＴ）及び精製されたヒドロキシチロソールブランク（すなわち、エタノール−ＥｔＯＨ）の漸進的希釈液による処理に続いてのＨＵＶＥ細胞に対する走化性アッセイの結果を示す。
【００２４】
【図６】図６は、Ａ）完全培養培地（ＣＴＲＬ）、血清フリー培養培地（ＳＦＭ）、本発明のポリフェノール濃縮物の漸進的希釈液（サンプルＡ００９）、ブランク（サンプルＡ０１２）；Ｂ）完全培養培地（ＣＴＲＬ）、血清フリー培養培地（Ｃ−）、精製されたヒドロキシチロソール（ＨｙＴ）及び精製されたヒドロキシチロソールブランク（すなわち、エタノール−ＥｔＯＨ）の漸進的希釈液による処理に続いてのＨＵＶＥ細胞に対する化学浸潤アッセイの結果を示す。
【００２５】
【図７】図７は、Ｈ２Ｏ２により処理された後に、Ａ）本発明のポリフェノール濃縮物の漸進的希釈液（サンプルＡ００９）及びそれぞれのブランク（サンプルＡ０１２）；Ｂ）精製されたヒドロキシチロソール（ＨｙＴ）の漸進的希釈液及びそれぞれのブランク（すなわち、エタノール−ＥｔＯＨ）により処理した場合の、ＨＵＶＥ細胞に影響を及ぼす酸化ストレス（ＤＣＦＨ−ＤＡ＋細胞の％として側定される）についての結果を示す。
【００２６】
【図８】図８は、Ａ）本発明のポリフェノール濃縮物の漸進的希釈液（サンプルＡ００９）及びそれぞれのブランク（サンプルＡ０１２）；Ｂ）精製されたヒドロキシチロソール（ＨｙＴ）の漸進的希釈液及びそれぞれのブランク（すなわち、エタノール−ＥｔＯＨ）による処理の後、Ｈ２Ｏ２により処理された場合の、ＨＵＶＥ細胞に影響を及ぼす酸化ストレス（ＤＣＦＨ−ＤＡ＋細胞の％として側定される）についての結果を示す。
【００２７】
【図９】図９は、Ａ）処理なしでの（マトリゲルのみ）、ＶＴＨ−ＶＥＧＦ、ＴＧＦ、ＨＧＦ（正の対照Ｃ＋）の存在下での処理、ＶＴＨ、及び本発明のポリフェノール濃縮物（サンプルＡ００９）及びそれぞれのブランク（サンプルＡ０１２）の１：５００希釈液の存在下での処理と伴って；Ｂ）処理なしでの（マトリゲルのみ）、ＶＴＨ−ＶＥＧＦ、ＴＧＦ、ＨＧＦ（正の対照Ｃ＋）の存在下での処理、ＶＴＨ、及び精製されたヒドロキシチロソール（ＨｙＴ）の１：５００希釈液の存在下での処理を伴って、マウスの皮膚下に移植されたマトリゲル接種物の肉眼での比色分析の結果を示す。
【００２８】
【図１０】図１０は、図９の外植マトリゲル接種物中のヘモグロビンのアッセイを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本発明は、血管新生及び炎症の治療及び予防への使用のための、ポリフェノール化合物、好ましくはヒドロキシチロソール及び３，４−ＤＨＰＡ−ＥＤＡを含む、植物水及び搾りかすの植物複合体又は濃縮物に関する。
【００３０】
好ましくは、参照される血管新生及び炎症は、病理学的血管新生及び炎症、より好ましくは腫瘍関連の血管新生及び炎症である。他方では、血管新生及び炎症は、腫瘍ではなく、むしろ病理、例えばリウマチ性疾患、好ましくはリウマチ性関節炎及び痛風; 結腸直腸の炎症性疾患、好ましくは、クローン病、過敏性及び潰瘍性腸症候群；気管支の病変、好ましくは気管支慢性閉塞性肺疾患及び喘息; 肝疾患、好ましくは、線維症及び肝硬変; 前立腺の疾患、好ましくは、良性前立腺肥大症及び急性/慢性前立腺炎; 粘膜炎;皮膚炎又は前腫瘍性病変、好ましくは、乳房、子宮、肺又は口の病変に関連され得る。
【００３１】
実際、本発明の植物水及び／又はオリーブ搾りかすの濃縮物は驚くべきことには、腫瘍血管の新形成（すなわち、血管新生）の予防において、特に効果的であることが実証されている。それらの血管は、正常血管に比較して、独特の物理化学的構造、及び従って、生物学的機能を有する。それらは主として窓状化され、そしてしばしば、周皮細胞を欠いており、そしてこのために、変更された血管透過性を有する。この構造はしばしば、薬剤が血管を通して腫瘍に送達する間、間隙空間に失われ、そして従って、目標に到達することができないか、又は無効的量でそれに到達するので、多くの薬理学的治療の失敗や困難性の基礎である。このタイプの血管構造の形成の阻害が明確に、腫瘍への物質の良好な送達、及び従って、腫瘍治療を改善する可能性を可能にする。
【００３２】
植物水は好ましくは、三相（油、植物水及び搾りかす）及び二相（油及び搾りかす＋植物水）を有するオリーブ粉砕工程に由来する。好ましくは、粉砕により生成される植物水は、例えば強酸の添加を通して、酸性ｐＨ、好ましくは３〜５、好ましくは４〜５の範囲のｐＨを有する溶液、及びタンパク質分解酵素、すなわちオリーブ皮のセルロースマトリックスを加水分解する酵素により処理され得る。
【００３３】
搾りかすは好ましくは、ピットされ（穴を開けられ）、希釈され、そして前濾過される。搾りかすは好ましくは、０．５〜１ｍｍの範囲の、より好ましくは約0.7ｍｍのサイズ又はカットオフを有する。カットオフの例は、振動篩を用いて得られたものである。
【００３４】
必要なら、ピットされた搾りかすは、３〜５、好ましくは３．５〜４のｐＨを有する水性マトリックスに溶解されるか又は分散され得る。可溶化工程は、オリーブ皮の固形マトリックスに捕捉されたままで存在するポリフェノールの可溶化のためである。本発明の好ましい実施形態によれば、植物水及びオリーブ搾りかすの濃縮物（この後、「濃縮物」と称す）はさらに、チロソール、クロロゲン酸、βヒドロキシベルバスコシド、ルチン、ベルバスコシド、及びルテオリンから選択された少なくとも１つのフェノール化合物；及び好ましくは、ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びカリウムから選択された少なくとも１つの金属；及び好ましくは、塩化物、硫酸塩、リン酸塩及び硝酸塩から選択された少なくとも１つのアニオン；及び又はグルコース、フルクトース、マンニトール及びスクロースから選択された少なくとも１つの糖質を含む。
【００３５】
本発明のさらなる実施形態によれば、濃縮物は、窒素含有物質（タンパク質、アミノ酸）を、好ましくは１５〜６０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは２０〜４０ｍｇ／ｋｇ（活性溶液１Ｌ当たりの窒素のｍｇ）の量で含む。何れの場合でも、最大量で濃縮物に存在するフェノール化合物は、ヒドロキシチロソール及び３，４−ＤＨＰＡ−ＥＤＡである。
【００３６】
好ましくは、ヒドロキシチロソールの量は、植物水１Ｌ当たり１〜１０ｇ（ｇ／Ｌ）、より好ましくは１．５〜５ｇ／Ｌ、さらにより好ましくは２〜３ｇ／Ｌの範囲である。
【００３７】
好ましくは、４−ＤＨＰＡ−ＥＤＡの量は、０．５〜８ｇ／Ｌ、より好ましくは１〜６ｇ／Ｌ、さらにより好ましくは、１．５〜２．５ｇ／Ｌである。
【００３８】
好ましくは、チロソールの量は、０．１〜０．４ｇ／Ｌ、より好ましくは０．１５〜０．２５ｇ／Ｌである。
【００３９】
好ましくは、クロロゲン酸の量は、０．０６〜０．２４ｇ／Ｌ、より好ましくは０．８〜０．１６ｇ／Ｌである。
【００４０】
好ましくは、β−ヒドロキシベルバスコシドの量は、０．３〜１．５ｇ／Ｌ、より好ましくは０．５〜１ｇ／Ｌである。
【００４１】
好ましくは、ルチンの量は、０．０５〜０．２ｇ／Ｌ、より好ましくは０．０８〜０．１５ｇ／Ｌである。
【００４２】
好ましくは、ベルバスコシドの量は、０．４〜１．７ｇ／Ｌ、より好ましくは０．６〜１ｇ／Ｌである。
【００４３】
好ましくは、ルテオリンの量は、０．１〜０．５ｇ／Ｌ、より好ましくは０．１５〜０．２８ｇ／Ｌである。
【００４４】
好ましくは、ナトリウムの量は、７５〜３００ｍｇ／Ｌ、より好ましくは１２０〜１８０ｍｇ／Ｌである。
【００４５】
好ましくは、カルシウムの量は、５〜１０ｇ／Ｌ、より好ましくは２〜５ｇ／Ｌである。
【００４６】
好ましくは、マグネシウムの量は、２２０〜９００ｍｇ／Ｌ、より好ましくは４００〜５００ｍｇ／Ｌである。
【００４７】
好ましくは、カリウムの量は、３〜１５ｇ／Ｌ、より好ましくは６〜９ｇ／Ｌである。
【００４８】
好ましくは、塩化物の量は、１．５〜７ｇ／Ｌ、より好ましくは２．５〜４．５ｇ／Ｌである。
【００４９】
好ましくは、硫酸塩の量は、１２〜４５ｇ／Ｌ、より好ましくは１８〜２８ｇ／Ｌである。
【００５０】
好ましくは、リン酸塩の量は、１．５〜７ｇ／Ｌ、より好ましくは２．５〜５ｇ／Ｌである。
【００５１】
好ましくは、硝酸塩の量は、１２〜５０ｍｇ／Ｌ、より好ましくは１８〜３０ｍｇ／Ｌである。
【００５２】
好ましくは、グルコースの量は、１５〜６０ｇ／Ｌ、より好ましくは２５〜３５ｇ／Ｌである。
【００５３】
好ましくは、フルクトースの量は、３．５〜１５ｇ／Ｌ、より好ましくは５〜９ｇ／Ｌである。
【００５４】
好ましくは、マンニトールの量は、１〜４ｇ／Ｌ、より好ましくは１．５〜３ｇ／Ｌである。
【００５５】
好ましくは、スクロースの量は、４〜１６ｇ／Ｌ、より好ましくは６〜１０ｇ／Ｌである。
【００５６】
本発明の好ましい実施形態によれば、濃縮物は、（ｉ）マイクロ濾過の濃縮物及び透過物を得るために、植物水及び／又はオリーブ搾りかすのサンプルをマイクロ濾過する工程；及び（ii）工程（ｉ）のマイクロ濾過透過物を逆浸透により濃縮する工程を含んでなる方法により得られる／得ることができる。好ましくは、マトリックス濾過は、前述のような可溶化工程の後、行われる。
【００５７】
マイクロ濾過は、濃縮物、すなわち、植物水／搾りかすの懸濁液における内容物の濃縮画分、例えばマイクロフラグメント、繊維及び赤血球材料、例えば細胞及び細菌を分離するためである。それは、このタイプのマトリックスのための標準条件下で行われる。
【００５８】
濃縮物の他に、マイクロ濾過工程に続いて、浸透物、すなわち、出発材料に応じて変化する色により特徴づけられ、そして植物水／搾りかすの溶解成分を含む透明画分、例えばタンパク質、糖、塩、ポリフェノール、有機酸及び種々の可溶性有機分子を得る。
【００５９】
好ましくは、マイクロ濾過は、少なくとも１つの及び好ましくは２つのセラミック製膜により行われる。前記膜は好ましくは、管状形状により特徴づけられる。
【００６０】
好ましい実施形態によれば、膜は、酸化アルミニウム及びジルコニアから製造される。
【００６１】
好ましくは、膜は、次の特性を有する：約３０〜約４０ｍｍ、好ましくは約２５ｍｍの外径；及び約５００〜約１５００ｍｍ、好ましくは約１２００ｍｍの長さ；及び約２．５〜約５ｍｍ、好ましくは約３．５ｍｍの直径、好ましくは水力直径を有する一連のチャネル；及び約０．１５〜０．７ｍ２、好ましくは約０．３５ｍｍ２の濾過面；及び約０．１μｍ〜約３００ｋＤａの範囲の分子カットオフ。
【００６２】
前述のように植物水／搾りかすのマイクロ濾過から得られる浸透物を濃縮するための逆浸透工程は、ポリマー膜、より好ましくはポリアミドから製造された膜を用いることにより、このタイプのマトリックスのための標準条件下で行われる。特に、前記膜は、屈曲したスパイラル形状、及び高い塩拒絶を有する、すなわち塩化ナトリウム分子を、９９．９％の百分率で拒絶できる分子カットオフを有する。これは、浸透膜が生物医学的目的の分子を捕捉し、そして水分のみの通過を可能にすることを意味する。
【００６３】
好ましくは、ポリマー膜は、約５〜約１５ｍ２の範囲であり、そしてより好ましくは、約７ｍ２である濾過面を有する。
【００６４】
逆浸透工程は、マイクロ濾過から得られた透過物を、約４倍、濃縮するよう作用し；これは、１００Ｌのマイクロ濾過透過物から、２５Ｌの濃縮物を得るであろうことを意味する。
【００６５】
この場合、体積濃度比（ＶＣＲ）は、４、すなわち１００／２５である。
【００６６】
ＶＣＲは、逆浸透工程が、濃縮されるマトリックスの浸透圧を打ち消すので、出発マトリックス（植物水）及び中でも、その塩含有物に基づいて変化することができる。
【００６７】
本発明はさらに、上記方法により得ることができる／得られる植物水／搾りかすの濃縮物（又は植物複合体）に関する。
【００６８】
濃縮物は好ましくは、フェノール化合物、金属、炭水化物、アニオン及び窒素の含有量に関して、以前に記載された組成を有する。それは、血管新生及び炎症、好ましくは病理学的血管新生及び炎症、特に腫瘍に関連する血管新生及び炎症、又は非腫瘍性病理学、例えばリウマチ性疾患、好ましくはリウマチ性関節炎及び痛風; 結腸直腸の炎症性疾患、好ましくは、クローン病、過敏性及び潰瘍性腸症候群；気管支の病変、好ましくは気管支慢性閉塞性肺疾患及び喘息; 肝疾患、好ましくは、線維症及び肝硬変; 前立腺の疾患、好ましくは、良性前立腺肥大症及び急性/慢性前立腺炎; 粘膜炎;皮膚炎又は前腫瘍性病変、好ましくは、乳房、子宮、肺又は口の病変に関連する血管新生及び炎症の治療及び予防のために、単独で、又は他の物質、分子又は抗腫瘍及び抗血管新生及び抗炎症療法と組合して使用され得る。好ましくは、本発明の濃縮物は、腫瘍血管の形成を阻害するために、好ましくは予防的に、単独で又は他の物質／分子と組合して使用され得る。
【００６９】
本発明が参照する腫瘍は好ましくは、結腸直腸、乳房及び前立腺癌、皮膚癌（黒色腫など）、膵臓、肺、卵巣、膀胱、腎臓、肝臓の癌である。
【００７０】
本発明が参照する血管新生に関連する炎病状態は、リウマチ性関節炎及び痛風; 結腸直腸の炎症性疾患、好ましくは、クローン病、過敏性及び潰瘍性腸症候群；気管支の病変、好ましくは気管支慢性閉塞性肺疾患及び喘息; 肝疾患、好ましくは、線維症及び肝硬変; 前立腺の疾患、好ましくは、良性前立腺肥大症及び急性/慢性前立腺炎; 粘膜炎;皮膚炎又は前腫瘍性病変、好ましくは、乳房、子宮、肺又は口の病変である。
【００７１】
本発明のさらなる側面は、前に記載された植物水/搾りかすの濃縮物、及び種々のタイプの飲料の製造のために通常添加される賦形剤を含む飲料に関する。
【００７２】
飲料は、水及び果実及び乳を基礎とし得る。本発明の特に好ましい実施形態によれば、飲料は、果実を基礎とし、好ましくはそれは、グレープジュースを基礎とする。グレープジュースが特に好ましく、そしてグレープは好ましくは、有機グレープからであるべきである。飲料は任意には、凍結乾燥され得る。
【００７３】
他方では、前に記載された植物水／搾りかすの濃縮物を、経口使用のためのピル、ロゼンジ剤、又は錠剤として製剤化され得る。
【００７４】
実際上は、飲料又は経口製剤は、特に血管新生及び炎症、好ましくは病理学的血管新生及び炎症、特に腫瘍に関連するか、又は非腫瘍病理学、例えばリウマチ性関節炎及び痛風; 結腸直腸の炎症性疾患、好ましくは、クローン病、過敏性及び潰瘍性腸症候群；気管支の病変、好ましくは気管支慢性閉塞性肺疾患及び喘息; 肝疾患、好ましくは、線維症及び肝硬変; 前立腺の疾患、好ましくは、良性前立腺肥大症及び急性/慢性前立腺炎; 粘膜炎;皮膚炎又は前腫瘍性病変、好ましくは、乳房、子宮、肺又は口の病変に関連する血管新生及び炎症を予防するために、食品サプリメントとして摂取され得る。
【００７５】
好ましくは、飲料又は経口製剤は、腫瘍血管の形成を阻害するために、好ましくは予防するために、食品サプリメントとして摂取される。
【００７６】
任意には、飲料は、抗腫瘍及び抗血管新生及び抗炎症物質、分子、薬剤又は治療法に関連して摂取され得る。
【００７７】
本発明のさらなる側面は、前に記載された植物水／搾りかすの濃縮物及び可能な賦形剤を含む、クリーム、オイル、軟膏、ミスト、シャンプー又はゲルに関する。
【００７８】
前記クリーム、オイル、軟膏又はゲルは、高められた及び／又は変更された血管新生、及び炎症により引起される生理病理学的状態の治療、好ましくは局部治療、及び／又は予防のために使用され得る。
【実施例】
【００７９】
実施例
オリーブの植物水／搾りかすからの濃縮されたポリフェノールの製造
全体の製造工程は、膜ベースの接線流濾過及び分離技法の使用を中心とする。
【００８０】
オリーブ植物水／搾りかすからポリフェノール濃縮物の製造のために行われる膜工程は、次のわずか２つの濾過段階を使用した：マイクロ濾過及び逆浸透。しかしながら、所望の生成物に依存して、限界濾過及びナノ濾過段階により、前記工程を完結することが可能である。
【００８１】
マイクロ濾過は、懸濁された固形物、細菌及び脂肪の分離を可能にし、一方、逆浸透は、存在する物質、例えばイオン、また単価のイオンのすべてをトラップし、そして水のみの浸透を可能にする。
【００８２】
前記工程は、三相のオリーブ粉砕工程に由来する植物水から出発して行われたが、しかしそれはまた、前処理の後、二相工程に由来する湿潤搾りかすにも適用され得る。
【００８３】
湿潤搾りかすは、ピットされ、希釈され、そして約０．７ｍｍのカットオフにより前濾過され（例えば、振盪節による）、そして次に、膜システムにより処理され；又は他方では、それは、可能な希釈液により三相デカンターにおいて処理され、そして膜工程による処理の前、三相デカンターにおいて再処理され得る。
【００８４】
実施されるマイクロ濾過工程は、植物水／搾りかすに存在する、懸濁液下の全内容物（マイクロフラグメント、繊維及び赤血球材料、例えば細胞及び細菌）の濃縮された画分を分離することを目的とする。
【００８５】
マイクロ濾過透過物は、その色が処理されたオリーブの栽培品種に応じて異なり、そして植物水／搾りかすの溶解された成分、例えばタンパク質、糖、塩、ポリフェノール、有機酸及び種々の溶解性有機分子のすべてを含む透明画分である。
【００８６】
マイクロ濾過に関しては、次の特性を有する酸化ジルコニウムの選択層と共に２つの管状酸化アルミニウムセラミック製膜から製造される：２５ｍｍの外径、１１７８ｍｍの長さ、３．５ｍｍのチャネル水力直径を有する２３のチャネル、０．３５ｍ２の濾過面、及びそれぞれ０．１４μｍ−３００ｋＤａの分子カットオフ。
【００８７】
マイクロ濾過においては、３．５ｍｍの水力直径を有する２３のチャネルを有する膜を用いることにより、約１２％の全固形分を有する濃縮された画分を得るまで、植物水／搾りかすを濃縮することが可能である。
【００８８】
約７％の全固形分と共に、処理された植物水を考慮して、４倍に濃縮することが可能であり、従って、５５％の全固形分を有する浸透物及び１２．１％の全固形分を有する濃縮物を得る。
【００８９】
本発明のポリフェノール濃縮物は、逆浸透により植物水をマイクロ濾過することにより得られる浸透物を濃縮することにより製造された。
【００９０】
屈曲したらせん形状、高い塩拒絶及び７ｍ２の濾過面を有する、ポリアミドから製造されたポリマー膜を使用するが、しかしまた、低い塩拒絶及び浸透物におけるポリフェノールのマイナーな損失を有する膜も使用することができる。
【００９１】
逆浸透においては、約３．６の比で処理された植物のマイクロ濾過浸透物を濃縮することが可能である。
【００９２】
明らかに、体積濃縮比は、初期開始マトリックス、及び中でも、その塩含有量及び従って、浸透圧に依存して変化することができる。
【００９３】
試験される植物水の組成
ポリフェノール濃縮物の組成が、下記表Ｉに示される：
【００９４】
【表１】
0006741581.tif 000002
【００９５】
表Ｉに示される物質は、識別コードＡ００９でサンプルに含まれ、ところがブランク（すなわち、負の対照）は、コードＡ０１２により識別される。
【００９６】
ブランクは、ＸＡＤ７樹脂によるポリフェノール濃縮物のバッチクロマトグラフィー分離により得られた。
【００９７】
詳細には、約５０ｃｃの体積のＸＡＤ７樹脂を、蒸留水によりすすぎ、エタノールで再生し、そして再び蒸留水によりすすいだ。
【００９８】
樹脂を、０．４５μｍのフィルターを用いて真空濾過により回収し、そしてビーカーにおける植物水中の約７５ｍｌの濃縮物に添加した。樹脂は、室温で振盪下で約３０分間、濃縮物と接触せしめた。
【００９９】
真空濾過は、２３．４ｍＳ／ｃｍの導電性を有するＸＡＤ７樹脂により処理された植物水の濃縮物の回収を可能にした。
【０１００】
ＸＡＤ７樹脂による処理の後、回収された植物水濃縮物を再び、ＸＡＤ７樹脂により処理し、エタノールにおいて再生し、そして蒸留水によりすすいだ。
【０１０１】
真空濾過の後、１６．９２ｍＳ／ｃｍの導電性を有するＸＡＤ７樹脂により２度、処理された植物水濃縮物のブランクの第３サンプルを回収した。
【０１０２】
ＨＵＶＥＣ（ヒト臍帯静脈内皮細胞）を、内皮細胞が血管新生の工程の基本的単位を構成する事実の考慮から、本発明のポリフェノール濃縮物の標的細胞のモデルとして使用した。
【０１０３】
ポリフェノール濃縮物により行われた分析から得られた結果を、ヒドロキシチロソールのみにより、同じ条件下でＨＵＶＥＣを処理する場合に得られたそれらの結果と比較した。ヒドロキシチロソールは、それがサンプルＡ００９において最も表されるポリフェノール（２．７０ｇ／Ｌ）であるので、比較のための物質として選択された。
【０１０４】
目的は、植物水（記載されるような濃縮物の形で）は、抗血管新生効果を有する他に、１つの物質のみよりも、より良好な阻害能力を示すことを実証することである。
【０１０５】
効果が、実際的に、ヒドロキシチロソールによるものであり、そしてそれが溶解されているエタノール溶液にはよらないかどうかを評価するために、分析を、ヒドロキシチロソールがブランクサンプルとして溶解されている、同じ濃度でエタノールを含む培地を用いて実施した。
【０１０６】
植物水の抗血管新生性質の評価
サンプルの希釈度は、以下の表IIに存在するｍｇ／ｍｌ及びμＭの値に対応する：
【０１０７】
【表２】
0006741581.tif 000003
【０１０８】
内皮細胞に対する植物水の抗増殖効果の評価
ヒト内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の増殖に対するサンプルＡ００９及びＡ０１２の効果を、ＭＴＴ生存性アッセイ（テトラゾイル塩、［３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）］−２，５−ジフェニルテトラゾリウム臭化物）により評価した。アッセイは、ミトコンドリア酵素琥珀酸デヒドロゲナーゼにより代謝されるＭＴＴ化合物の能力を基礎とする。塩の還元は、水に不溶性である青色生成物ホルマザンの結晶の形成を導く。生存細胞は、非生存性細胞とは異なって、塩を還元し、そして生成されるホルマザンの量は、存在する細胞の数に比例する。形成される結晶は、溶解され、そして５７０ｎｍの波長での吸光度値を、分光光度計により読み取る。
【０１０９】
５０００個のＨＵＶＥ細胞を、９６ウェルプレートの各ウェルに播種した。特に、ウェルを１％ゼラチンにより被覆し、そしてアッセイを、異なった処理時間（２４時、４８時、７２時、９６時）で行い、そのたびに、濃縮物の異なった希釈液を試験した（１：１００００〜１：１００の間隔）。
【０１１０】
内皮細胞増殖に対する効果を、濃縮物の次の希釈度について評価した：１：１００００ − １：５０００ − １：２５００ − １：１０００ − １：５００ − １：２５０ − １：１００。
【０１１１】
図１Ａから観察されるように、２４時間の処理の後、特に１：１０００の希釈度から出発して、サンプルＡ００９により処理された内皮細胞の生存性の有意な低下が存在した。
【０１１２】
サンプルＡ０１２（ブランク）は、ＨＵＶＥＣ生存性に対する効果は有さなかった（図１Ｂ）。
【０１１３】
ヒドロキシチロソールはまた、２４時間の処理の後、特に１：２５０の希釈度から出発して、ＨＵＶＥ細胞の生存性の低下を引起す（図１Ｃ）。
【０１１４】
対照として使用される、エタノール含有培地は、細胞生存性に対して何れの効果も与えない（図１Ｄ）。実験は二重反復して実施され、そして２度、反復される。
【０１１５】
従って、サンプルＡ００９は、ヒドロキシチロソールよりも、細胞生存性に対して高い効果を有することが結論づけられ得る。
【０１１６】
アポトーシスの評価
濃縮物により処理された内皮細胞のアポトーシス（プログラムされた細胞死）の誘発を、アネキシンＶ及び７−アミノ−アクチノマイシンＤ（７−ＡＤＤ）によりマーキングすることにより評価した。それらのマーカーの細胞蛍光分析は、同じ細胞集団内で、異なる段階（早期、後期、高度）で細胞死を誘発する処理の能力の区別を可能にする。アネキシンＶは、ホスファチジルセリンを、結合できる分子、すなわち細胞損傷の結果として細胞外側上に露出される、内部細胞質層に通常関連する、細胞膜のグリセロリン脂質である。７−ＡＡＤは、損傷された細胞又はアポトーシスにおいてのみ細胞膜を通過できる化合物であり；従って、このマーカーに対する陽性は、細胞死及び製品の毒性を示す。
【０１１７】
１５０，０００個のＨＵＶＥ細胞を、サンプルの異なった希釈液により処理し（２４及び４８時間）、その後、トリプシンによる処理によりプレートから分離し、そしてアポトーシスのレベルを評価するために、７−ＡＡＤ及びアネキシンＶにより染色した。
【０１１８】
内皮細胞を、サンプルＡ００９、Ａ０１２及びＨｙＴ−ＥｔＯＨの異なった希釈度（希釈度１：２５００−１：２５０の範囲）で、２４及び４８時間、処理し、そして２種のマーカーに対する陽性について分析した。
【０１１９】
図２Ａ及び２Ｃから分かるように、サンプルＡ００９の１：２５０希釈液は、２４時間及び４８時間の処理の後、それぞれ、アポトーシスの後期段階の内皮細胞を、それぞれ５０％及び７５％、誘発した。サンプルＡ０１２の同じ希釈液は、何れのプロ−アポトーシス効果も発揮しない（細胞の約９５％は生存する）。
【０１２０】
対照的に、ヒドロキシチロソール及びエタノール含有培養物による処理は、細胞壊死を高めない（図３）。
【０１２１】
実験を二重反復して実施し、そして２度、反復した。
【０１２２】
従って、ヒドロキシチロソールは、本発明の濃縮物よりも低い活性を示す。
【０１２３】
内皮細胞の形態形成に対する植物水の効果の評価
それらが細胞外マトリックスにおいてインビトロで培養され、そして適切な活性化刺激に暴露される場合、内皮細胞は血管の内腔の構造を模倣する管状構造に組織化することができる。
【０１２４】
マトリゲル（すなわち、ラミニン、コラーゲンＩＶ、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、成長因子（例えば、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、ＴＧＦ−β及びＭＭＰ）から成るポリマー）における形態形成のアッセイを通して、選択された化合物の抗血管新生能力を評価することができる。インビトロで細胞の形成を阻害する本発明の濃縮物の能力を評価するために、２４ウェルプレートの各ウェルを、３００μｌのマトリゲル（１０ｍｇ／ｍｌ）により被覆し、そしてマトリックスの重合に続いて、１ｍｌの完全培地当たり５０，０００個のＨＵＶＥ細胞を、重合されたマトリックスに播種した。細胞を、サンプルＡ００９、Ａ０１２、ＨｙＴ及びＥｔＯＨの異なった希釈液（１：５００及び１：２５０）により、２４時間、前処理した。
【０１２５】
正及び負の対照として、１０ ｎｇ/ｍｌ のａＦＧＦ (酸性線維芽細胞増殖因子)、 １０ ｎｇ/ｍｌの ｂＦＧＦ (塩基性線維芽細胞増殖因子)、 １０ ｎｇ/ｍｌ の ＥＧＦ (上皮成長因子) 、０．１ ｍｇ/ｍｌ のへパリン、０．１０ μｇ/ｍｌのヒドロコルチゾン、１０％ ＦＢＳ (ウシ胎児血清)、１％グルタミン（Ｇｌｎ）、１％アンピシリン/ストレプトマイシン（Ｐ/Ｓ）及び成長因子により補充されたＭ１９９培地、及び血清フリー培地Ｍ１９９（ＳＦＭ）から成る完全培養培地（ＣＭ）をそれぞれ使用した。
【０１２６】
サンプルの阻害効果を、３７℃及び５％ＣＯ２での６時間のインキュベーションの後、管状構造の形成の顕微鏡下での観察により評価した。
【０１２７】
図４Ａにおいて観察され得るように、サンプルＡ００９は、内皮細胞による安定した管状構造の形成を、用量依存性態様で阻害することができる。サンプルＡ０１２（ブランク）の同じ希釈液は、何れの阻害効果も発揮しない。
【０１２８】
ヒドロキシチロソールはまた、内皮細胞による安定した管状構造の形成を、用量依存性態様で阻害することができ、ところが、エタノール（ブランク）の希釈液は、わずかな阻害効果を単に発揮する（図４Ｂ）。実験は二重反復して実施され、そして二度、反復された。
【０１２９】
従って、ヒドロキシチロソールは、サンプルＡ００９、すなわち本発明の濃縮物よりも著しく低い効果を伴って、内皮形態形成を阻害する。
【０１３０】
内皮細胞の移動活性に対する植物水の阻害能力の評価
内皮細胞を、走化性グラジエントに続いて、特定部位の方に移動する能力により特徴づける。ＨＵＶＥＣの移動能力を評価するために、移動アッセイを、Ｂｏｙｄｅｎチャンバー、及びコラーゲン（５０μｇ／ｍｌ）によりソーキングされた、１２μｍのカットオフを有する多孔性フィルターを用いて設定した。
【０１３１】
各チャンバーの低部区画を、１０ ｎｇ/ｍｌ のαＦＧＦ、 １０ ｎｇ/ｍｌの ｂＦＧＦ、 １０ ｎｇ/ｍｌ の ＥＧＦ、０．１ ｍｇ/ｍｌ のへパリン、０．１０ μｇ/ｍｌのヒドロコルチゾン、１０％ ＦＢＳ、１％Ｇｌｎ、１％Ｐ/Ｓ又は成長因子及び血清フリー培地Ｍ１９９（ＳＦＭ）を含むＣＭ２１０μｌにより充填した。
【０１３２】
濃縮物、ブランク、ヒドロキシチロソール、又はエタノール含有培地の多様な溶液（１：２５００、１：１０００、１：５００及び１：２５０）により２４時間、前処理された、５００００個のＨＵＶＥ細胞を、５００μｌの血清フリー培地を含む、チャンバーの上部区画に播種した。
【０１３３】
細胞を、３７℃、５％ＣＯ２で６時間インキュベートした。
【０１３４】
アッセイの最後で、フィルターを、機械的に清浄し、上部側の非移動性細胞を排除し；次に、それらを無水エタノールに５分間、固定し、そして続いて、脱水し、そして生存性染色ＤＡＰＩによりマーキングした。各フィルター上に存在する細胞を、蛍光顕微鏡下で計数した。特に、フィルター当たり５つのフィールドを、ランダム態様で分析した。
【０１３５】
図５Ａに示されるように、本発明の濃縮物（サンプルＡ００９）は、１：５００及び１：２５０の希釈度（それぞれ、ｐ値＝０．００５７及びｐ値＝０．０００３）で、内皮細胞の移動能力を、統計学的に有意な程度まで妨げることができ、ところがサンプルＡ０１２（ブランク）は、同じ移動能力を妨げない。
【０１３６】
ヒドロキシチロソールは、ｐ値＝０．０３０２を有する１：２５０の希釈度で使用されるエタノールを含む培地に比較して、内皮細胞の移動能力を低める（図５Ｂ）。ヒドロキシチロソールのより高い希釈度で、内皮細胞は、移動能力の上昇を示し、ところが本発明の濃縮物はそれを阻害することがまた、観察され得る。実験は、二重反復に実施され、そして２度、反復された。
【０１３７】
従って、単一物質として使用されるヒドロキシチロソールは、内皮移動を妨げる低い能力を示し、すなわちそれは無効果である。
【０１３８】
内皮細胞の浸潤活性に対する植物水の阻害能力の評価
現場リクルートされると、内皮細胞は、走化性部位へのそれらの実際の移動に対する物理的バリヤーを構成する、細胞外マトリックスを分解できる因子を生成する、周囲組織に浸潤する能力を有する。
【０１３９】
浸潤アッセイを、Ｂｏｙｄｅｎチャンバー、及びマトリゲル（１ｍｇ／ｍｌ）により被覆された、１２μｍのカットオフを有する多孔性フィルターを用いて設定した。
【０１４０】
１０ ｎｇ/ｍｌ のαＦＧＦ、 １０ ｎｇ/ｍｌの ｂＦＧＦ、 １０ ｎｇ/ｍｌ の ＥＧＦ、０．１ ｍｇ/ｍｌ のへパリン、０．１０ μｇ/ｍｌのヒドロコルチゾン、１０％ ＦＢＳ、１％Ｇｌｎ、１％Ｐ/Ｓ又は２１０μｌの成長因子及び血清フリー培地Ｍ１９９（ＳＦＭ）を含む完全培養培地（ＣＭ）２１０μｌを、各チャンバーの下部区画に注いだ。
【０１４１】
５００μｌのＳＦＭに再懸濁され、そして濃縮物、ブランク、ヒドロキシチロソール、及びヒドロキシチロソールを有さない溶液の異なった希釈液（１：２５００、１：１０００、１：５００、及び１：２５０）により前処理された、５００００個のＨＵＶＥ細胞を、３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。
【０１４２】
アッセイの最後で、フィルターを、機械的に清浄し、マトリックスを越えて浸透しなかった上部側上に存在する細胞を排除した。マトリゲルを浸潤した細胞を含むフィルターを、無水エタノールに５分間、固定し、そして次に、再水和化し、そして生存性染色ＤＡＰＩによりマーキングした。各フィルター上に存在する細胞を、蛍光顕微鏡下で計数し；ランダム態様で選択されたフィルター当たりの５つの光学フィールドを、分析にゆだねた。
【０１４３】
図６Ａに示される結果は、サンプルＡ００９（すなわち、本発明の濃縮物）が、１：５００及び１：２５０の希釈度（それぞれ、ｐ値＝０．０３３５及びｐ値＝０．００１１）で、統計的に有意な程度まで、内皮細胞の浸潤能力を妨げることができ、ところがサンプルＡ０１２（ブランク）はその同じ浸潤能力に影響を及ぼさないことを実証する。
【０１４４】
図６Ｂに示されるように、ヒドロキシチロソールは、ｐ値＝０．００１６及びｐ値＝０．０１５９を有する１：５００及び１：２５０希釈度で使用される、エタノール含有培地に比較して、内皮細胞の浸潤能力を低める。ヒドロキシチロソールは、それが細胞浸潤を阻害するが、しかし移動は阻害しないので、長期を考慮して、より良好な有効性を有する。
【０１４５】
本発明の濃縮物は、移動及び浸潤の両者に対して効果的に機能する。
【０１４６】
Ｈ２Ｏ２による処理の後、酸化ストレスによる損傷に対して植物水による保護役割の評価
反応性酸素種（ＲＯＳ）は、細胞損傷の腫瘍機構の１つを表し、そして炎症工程において、及び結果として、炎症に関する血管新生において基本的役割を演じる。従って、ＤＣＦＨ−ＤＡ（２′、７′−ジクロロフルオレセイン−ジアセテート）によるマーキングにより、Ｈ２Ｏ２による処理の後、植物水濃縮物による処理にゆだねられたＨＵＶＥ細胞に関する抗酸化力による評価が行われた。
【０１４７】
ＤＣＦＨ−ＤＡは、細胞内Ｈ２Ｏ２の濃度を表すことができる物質であり、そしてサイトフルオロメトリーにより検出され得る。
【０１４８】
１５０，０００個のＨＵＶＥ細胞を、１％ゼラチンにより被覆された６−ウェルプレートの各ウェルの完全培地に播種した。続いて、細胞をトリプシン処理し、そして２５０μＭの濃度で完全Ｍ１９９培地において再懸濁した。次に、細胞を、暗室において、１５分間、３７℃及び５％ＣＯ２下でインキュベーターに配置した。続いて、細胞を、ＤＰＢＳにより洗浄し、そして次に、上清液を、１２００ｒｐｍでの５分間の遠心分離により排除した。最終的に、細胞を、１０μＭのＤＣＦＨ−ＤＡ及びＨ２Ｏ２（正の対照）を含むＤＰＢＳ、又は濃縮物（Ａ００９及びＡ０１２）、ヒドロキシチロソール又は溶媒フリーのヒドロキシチロソールの希釈液に再懸濁した。細胞を、暗室において、４５分間、５％ＣＯ２を含む雰囲気下で３７℃でインキュベートした。最後に、結果をＦＡＣＳＣａｎｔを用いて読み取った。
【０１４９】
図７Ａに要約される結果は、サンプルＡ００９（本発明の濃縮物）が、用量依存性態様で及び高い有意な程度まで（p値＝１：２５００＝ ０．０３１０、p値＝１：１０００＝ ０．０００１、 p値＝１：５００＝ ０．０００１、p値＝１：２５０＜ ０．０００１）、保護効果を発揮できることを実証する。
【０１５０】
ヒドロキシチロソールは、抗酸化効果を発揮するが（図７Ｂ）、ところがエタノールが溶解されている培地は、抗酸化効果を有さない。
【０１５１】
その結果は、本発明の濃縮物が、より有意な抗酸化効果を発揮できることを実証する。ヒドロキシチロソールのｐ値は、実際、低い：p値＝ １：２５００＝ ０．０１１５、p値＝１：１０００＝０．００６２、 p値＝１：５００＝ ０．００８２ 及びp値＝１：２５０＝ ０．０２２３。
【０１５２】
実験は、二重反復して実施され、そして２度、反復された。
【０１５３】
Ｈ２Ｏ２による処理の前、酸化ストレスによる損傷に対して植物水による保護役割の評価
１５０，０００個のＨＵＶＥ細胞を、１％ゼラチンにより被覆された６−ウェルプレートの各ウェルにおける完全培地に播種した。続いて、細胞をトリプシン処理し、そして完全Ｍ１９９培地、及び植物水濃縮物（Ａ００９及びＡ０１２）、ヒドロキシチロソール、又はエタノール含有培地（標準希釈素で）に再懸濁した。
【０１５４】
次に、細胞を、暗室において、３７℃及び５％ＣＯ２下で３０分間インキュベーターに配置した。ＤＰＢＳにより洗浄した後、細胞を、分析下で、正の対照及びサンプルの両者において、１０μＭのＤＣＦＨ−ＤＡ及びＨ２Ｏ２を有するＤＰＢＳに再懸濁した。細胞を、暗室において、４５分間、３７℃及び５％ＣＯ２下でインキュベーターに配置した。最終的に、結果を、ＦＡＣＳＣａｎｔを用いて読み取った。
【０１５５】
図８Ａにおいては、サンプルＡ００９が用量依存性態様で保護効果を発揮することが観察され、ところがＲＯＳの生成は、ブランク（Ａ０１２）により処理されたサンプルにおいて高いままであることが観察される。ＲＯＳの生成の低下は、サンプルＡ００９の場合、非常に有意である：p値＝ １：２５００＝ ０．００５６、p値＝ １：１０００＝ ０．００１５、p値＝ １：５００＜ ０．０００１ 及び p値＝ １：２５０＜ ０．０００１。
【０１５６】
図８Ｂに示される結果は、ヒドロキシチロソールが、Ｈ２Ｏ２による酸化の誘発の後に使用される場合、有意な抗酸化効果を有さないことを実証している。さらに、ヒドロキシチロソールを有さない溶媒は、Ｈ２Ｏ２による前処理の場合に生じるように、細胞に対する有意な効果を生成しないことを観察することが可能である。
【０１５７】
実験は、二重反復して実施され、そして２度、反復された。
【０１５８】
結論としては、本発明の濃縮物よりも低い抗酸化力を有する他に、ヒドロキシチロソールは、酸化の誘発の後、前処理に使用される場合、この力を維持しない。
【０１５９】
マウスモデルにおける植物水の抗血管新生力の評価
インビボでの血管形成を阻害する植物水濃縮物の能力を、Albini et al. in “Angiogenic potential in vivo by Kaposi's sarcoma cell-free supernatants and HIV-1 tat product: inhibition of KS-like lesions by tissue inhibitor of metalloproteinase-2 (AIDS, 1994)”により記載されるように、マトリゲルスポンジアッセイにより評価した。
【０１６０】
特に、Ｃ５７／ＢＬ６株の生後８週の雄マウスを、動物モデルとして使用した。マトリゲルペレットを、異なった希釈度で、サンプルＡ００９、又は対応するブランク（Ａ０１２）と共に、マウス中に皮下注入した。マトリゲルは、４℃で液体形で存在し、そして室温で急速に重合し；この性質は、前−血管新生物質を分泌する皮下腫瘍をシュミレートするために利用される。この実験においては、液体形でのマトリゲルは、血管新生の工程のために必要なすべての要因を含み、そしてＶＥＧＦ（１００ｎｇ／μｌ）、ＴＮＦα（１．２ｎｇ／μｌ）及びヘパリン（２５Ｕ／ｍｌ）から成る、ＶＴＨと呼ばれる混合物と関連していた。
【０１６１】
ＶＥＧＦは内皮細胞のための主要成長因子を表し、ＴＮＦαは炎症性細胞成分のリクルートのために必須であるサイトカインを構成し、そしてヘパリンは内皮のリクルートメント及び活性化の結果としてペレットで形成する血液を保持するよう作用するので、ＶＴＨは正の対照と見なされる。動物の脇腹に皮下注射した後すぐに、マトリゲルは急速に重合し、そしてそれに含まれる因子を放出する。それらは内皮及び炎症細胞のための化学誘引物質として作用し、そしてそれらがマトリゲルに侵入あいた後すぐに、マトリックスにより形成される「微小環境」にトラップされ、そして活性化されたまま存続する。問題のアッセイに関しては、３匹のマウスを各条件のために使用した。使用される条件は次の通りであった：１）マトリゲルのみ（負の対照）、２）マトリゲル及びＶＴＨ（正の対照）、３）植物水濃縮物の２希釈液（１：５００及び１：２５０）（両者は、分析下のサンプル及びブランクサンプルのためである）と組合してのマトリゲル及びＶＴＨ。さらに、同じ希釈液を、ヒドロキシチロソールのために試験した。
【０１６２】
マトリゲルペレットを、日０で注入し；日４で、マウスを殺し、そしてペレットを除いた。移植されたペレットを計量し、そして３００μｌのＰＢＳに配置し、そして次に、次の２種の部分に分割した：半分は、血管新生のインジケーターであるヘモグロビンのアッセイのために使用され（内皮細胞のリクルートメント及びその活性化の結果としてペレットにおける血液の存在下で）、そして他の半分は、内皮及び炎症成分を評価する免疫組織化学的染色を実施するために、ＯＣＴに埋め込まれた。
【０１６３】
ヘモグロビンを定量化するために、ペレットを機械的に崩壊し、１３０００ｇで１２分間、４℃で遠心分離し、そして上清液を除いた。
【０１６４】
次に、２００μｌの上清液を、８００μｌのドラブキン溶液が添加されているエッペンドルフ管に配置した。この物質は、ヘモグロビンに結合し、沈殿する結晶を形成し、従って、分光光度計（５４０ｎｍ）による吸光度の読み取りを可能にする：ヘモグロビン濃度は、形成される結晶の数及び記録された吸光度に正比例する。ヘモグロビンの定量化は、以下の数学的モデルに依存する：
ＨＢ＝（５４０ｎｍでの吸光度／ペレットの重量ｇ）×１００
【０１６５】
図９Ａにおいては、染色が内皮の浸潤及び血液の続く存在に比例することの観察を可能にする。
【０１６６】
図９Ｂにおいては、ヒドロキシチロソールによる１：５００処理のペレットの染色が正の対照のそれよりも強いことの観察を可能にする。
【０１６７】
図１０は、ペレットのヘモグロビン含有量の定量化に関連するデータを示す。ヘモグロビン濃度は、サンプルＡ０１２（ブランク）に関連するペレット及びヒドロキシチロソールに比較して、本発明の濃縮物（Ａ００９）に関連するペレットにおいて、統計学的に有意な程度（ｐ＝０．００５８）まで低下することが注目され得る。
【０１６８】
結論としては、上記に報告される実験結果は、植物水から得られるポリフェノール濃縮物（サンプルＡ００９）が抗血管新生活性化に恵まれていることを明確に示唆する。実際、本発明の濃縮物は、内皮細胞の生存能力を阻害し、そしてそのアポトーシスを高める。さらに、それはまた、細胞外マトリックスをシミュレートするために使用される合成マトリックスの移動及び浸潤を妨げる。最終的に、濃縮物によるＨＵＶＥＣの処理により、血管系の管状構造の形成の阻害を観察することも可能である。
【０１６９】
インビトロ結果の他に、本発明の濃縮物の抗血管新生能力がまた、生理系においても明確に実証された。
【０１７０】
すべての実験は、観察される効果が目的の分子によるものであり、そして実験を妨害している他の要因によるものではないことを確認することができるように、ポリフェノールの精製された同じ濃縮物（ブランクサンプル）と比較して、実施された。
【０１７１】
さらに、ヒドロキシチロソールを独自に試験し、そして実施されるすべての試験の結果は、それが本発明の濃縮物よりも有効且つ活性的ではないことを実証した。
【０１７２】
従って、上記に示される実験の結果は、逆浸透に植物水のマイクロ濾過透過物をゆだねることにより得られるポリフェノール濃縮物が抗血管新生特性を有することを実証する。
【０１７３】
特に、濃縮物は、植物水に含まれる主ポリフェノール化合物を表すヒドロキシチロソールのみに比較して、改良された抗血管新生効果を有する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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