(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１個の修飾ヌクレオチドを含有するＭＹＨ７Ｂのアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤であって、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１４〜１８ヌクレオチドの長さを有し、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドの配列は、配列番号６のヌクレオチド５１１〜５３８、ヌクレオチド１２２６〜１２４３、ヌクレオチド４２８０〜４３００、またはヌクレオチド４３００〜４３３５からの配列に完全に相補的である、アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤。
【請求項２】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、１４ヌクレオチドの長さを有し、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドの配列が、配列番号６のヌクレオチド４３００〜４３１７からの配列に完全に相補的である、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤。
【請求項３】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、１４ヌクレオチドの長さを有し、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドの配列が、配列番号６のヌクレオチド４３０２〜４３１５からの配列に完全に相補的である、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤。
【請求項４】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、１４ヌクレオチドの長さを有し、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドの配列が、配列番号６のヌクレオチド４３１８〜４３３１からの配列に完全に相補的である、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤。
【請求項５】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、１４ヌクレオチドの長さを有し、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドの配列が、配列番号６のヌクレオチド４３１６〜４３３３からの配列に完全に相補的である、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤。
【請求項６】
前記修飾ヌクレオチドが、糖、塩基または骨格の修飾を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤。
【請求項７】
前記修飾ヌクレオチドが、ロックトヌクレオチドである、請求項１〜６のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤。
【請求項８】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、１〜６個のロックトヌクレオチドを含有する、請求項１〜７に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤。
【請求項９】
５’末端側の少なくとも最初の３個のヌクレオチドが、ロックトヌクレオチドである、請求項１〜８のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤。
【請求項１０】
３’末端側の少なくとも最初の３個のヌクレオチドが、ロックトヌクレオチドである、請求項１〜９のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤。
【請求項１１】
前記少なくとも３個のロックトヌクレオチドが、リボヌクレオチドである、請求項９に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤。
【請求項１２】
前記少なくとも３個のロックトヌクレオチドが、リボヌクレオチドである、請求項１０に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤。
【請求項１３】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、少なくとも１個のデオキシリボヌクレオチドを含有する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤。
【請求項１４】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、２〜８個のデオキシリボヌクレオチドを含有する、請求項１３に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤。
【請求項１５】
前記糖の修飾が、２’−Ｏ，４’−Ｃメチレン架橋、２’−Ｏ，４’−Ｃエチレン架橋、２’−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２−４’架橋、２’−デオキシ、２’−Ｏ−アルキルおよび２’−ハロ修飾からなる群より選択される、請求項６に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤。
【請求項１６】
前記骨格の修飾が、ホスホロチオエート結合である、請求項６に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤。
【請求項１７】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、２個またはそれより多くのホスホロチオエート結合を含有する、請求項１６に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤。
【請求項１８】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、全体にわたってホスホロチオエート結合されている、請求項１６に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤。
【請求項１９】
前記修飾ヌクレオチドが、５’−メチルシチジンである、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤。
【請求項２０】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、表１〜５から選択される配列を含む、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤。
【請求項２１】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、５’−ｌＴｓｌＴｓｌＧｓｄＡｓｄＴｓｄＣｓｄＴｓｄＴｓｄＧｓｄＧｓｄＣｓｌＣｓｌＴｓｌＣ−３’（配列番号１４６）または５’−ｌＣｓｌＴｓｌＧｓｄＣｓｄＡｓｄＧｓｄＣｓｄＴｓｄＣｓｄＣｓｄＴｓｌＣｓｌＣｓｌＡ−３’（配列番号１４８）の配列を含む、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤。
【請求項２２】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、５’−ｌＣｓｌＣｓｌＡｓｄＧｓｄＧｓｄＡｓｄＧｓｍｄＣｓｍｄＣｓｄＴｓｄＡｓｌＴｓｌＴｓｌＣ−３’（配列番号４９４）の配列を含む、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤。
【請求項２３】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤が、５’−ｌＧｓｌＴｓｌＴｓｍｄＣｓｄＡｓｍｄＣｓｄＴｓｍｄＣｓｄＡｓｍｄＣｓｄＡｓｌＴｓｌＣｓｌＣ−３’（配列番号１８８）の配列を含む、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤。
【請求項２４】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、５’−ｌＡｓｌＧｓｌＴｓｄＴｓｍｄＣｓｄＡｓｍｄＣｓｄＴｓｍｄＣｓｄＡｓｍｄＣｓｌＡｓｌＴｓｌＣ−３’（配列番号１９０）を含む、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤。
【請求項２５】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤が、５’−ｌＡｓｌＧｓｌＴｓｄＴｓｄＡｓｄＴｓｍｄＣｓｄＡｓｄＴｓｄＴｓｍｄＣｓｌＣｓｌＴｓｌＣ−３’（配列番号３７０）を含む、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤。
【請求項２６】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤が、５’−ｌＣｓｌＴｓｌＴｓｄＡｓｄＧｓｍｄＣｓｄＴｓｄＧｓｄＡｓｄＴｓｍｄＣｓｌＣｓｌＴｓｌＣ−３’（配列番号５６８）を含む、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤。
【請求項２７】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤が、５’−ｌＴｓｌＴｓｌＧｓｄＡｓｄＴｓｄＣｓｄＴｓｄＴｓｄＧｓｄＧｓｄＣｓｌＣｓｌＴｓｌＣ−３’（配列番号１４６）を含む、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤。
【請求項２８】
請求項１〜２７のいずれか一項に記載のＭＹＨ７Ｂのアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤と、薬学的に許容される賦形剤とを含む薬学的組成物。
【請求項２９】
前記薬学的組成物が、第２の治療剤をさらに含み、前記第２の治療剤は、ｍｉＲ−２０８ａ、ｍｉＲ−２０８ｂ、ｍｉＲ−４９９、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−１９５またはこれらの混合物のアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤である、請求項２８に記載の薬学的組成物。
【請求項３０】
病的心肥大、心筋梗塞または心不全の処置または予防を必要とする被験体における病的心肥大、心筋梗塞または心不全を処置または予防するための、請求項２８または２９に記載の薬学的組成物。
【請求項３１】
前記病的心肥大が、肥大型心筋症である、請求項３０に記載の薬学的組成物。
【請求項３２】
前記被験体に、病的心肥大のリスクがある、請求項３０に記載の薬学的組成物。
【請求項３３】
前記被験体が、ベータミオシン重鎖遺伝子に変異を有する、請求項３０に記載の薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本願は、２０１４年８月４日に出願された米国仮特許出願第６２／０３３，０１８号への優先権の利益を主張し、その内容全体が本明細書中に参照によって組み込まれる。
【０００２】
本発明は、ミオシン重鎖遺伝子、ＭＹＨ７Ｂの阻害剤およびその組成物に関する。本発明は、ＭＹＨ７Ｂの阻害剤を投与することにより、心肥大、心筋梗塞および心不全等の心臓障害を処置または予防するための方法も提供する。特に、本発明は、ＭＹＨ７Ｂの核酸阻害剤およびその組成物、ならびにそれを必要とする被験体におけるＭＹＨ７Ｂの発現または活性を阻害することにより、心臓障害を処置または予防するための方法を開示する。
【背景技術】
【０００３】
心疾患は、米国における主な死因であり、世界中の数百万名の人々にとっての主要な健康リスクを示す。肥大型心筋症、心筋梗塞および心不全等の様々な種類の心疾患を患う患者を診断、処置および支援するための費用は、非常に高く、医療制度に重大な負担を課す。
【０００４】
肥大型心筋症（ＨＣＭ）は、予期せぬ突然の心臓死の顕著な原因であり、多くの場合、心停止開始に先立ち無症候性であるため、特に懸念される。ＨＣＭは、心室機能に影響を与え、心不整脈を生じ得る、心筋細胞の肥厚によって特徴付けられる。ＨＣＭは、そのうち８種が幅広く研究されている多数の筋節遺伝子における優性変異に起因する、心臓の原発性遺伝疾患である（Ｔｅｅｋａｋｉｒｉｋｕｌら、「Ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｉｃ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ：  ｔｒａｎｓｌａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｒｏｓｓ  ｔａｌｋ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」、Ｊ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．、２０１２年、１９９巻（３号）、４１７〜４２１頁）。ＨＣＭにおけるこれらの優性変異のうち、概して４０％が、β−ミオシン遺伝子、ＭＹＨ７におけるミスセンス変異である。遺伝学および薬理学研究は、この優性アレルの発現の低下が、わずかな程度であっても、頑強な表現型効果を有し得ることを示した（Ｊｉａｎｇら、「Ａｌｌｅｌｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｏｆ  ｍｕｔａｎｔ  ＭＹＨ６  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ  ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｉｃ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０１３年、３４２巻（６１５４号）、１１１〜１１４頁）。
【０００５】
ミオシンは、心筋細胞および骨格筋細胞の主要な収縮タンパク質である。心筋収縮は、２種のミオシン重鎖（ＭＨＣ）タンパク質、α−ＭＨＣ（ＭＹＨ６）およびβ−ＭＨＣ（ＭＹＨ７）の発現および相対比に依存する。齧歯類において、速く単収縮するＭＨＣであるα−ＭＨＣが、成体心臓における優勢ミオシンアイソフォームである一方、遅く単収縮するＭＨＣであるβ−ＭＨＣは、発生中の心臓において優勢に発現され、出生後に下方調節される（Ｍｏｒｋｉｎ，  Ｅ．「Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｃａｒｄｉａｃ  ｍｙｏｓｉｎ  ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」、Ｍｉｃｒｏｓｃ．  Ｒｅｓ．  Ｔｅｃｈ．、２０００年、５０巻、５２２〜５３１頁）。対照的に、ヒト心臓においては、β−ＭＨＣアイソフォームが重度に発現され、α−ＭＨＣアイソフォームは、総心室ＭＨＣの８％未満を占める（Ｍｉｙａｔａら、「Ｍｙｏｓｉｎ  ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ  ｉｓｏｆｏｒｍ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｆａｉｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｎｏｎｆａｉｌｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ｈｅａｒｔ」、Ｃｉｒｃ．  Ｒｅｓ．、２０００年、８６巻（４号）：３８６〜９０頁）。様々な種におけるアルファ−およびベータ−ミオシンの発現の差とは無関係に、研究は、ベータ−ミオシンの発現が、ヒト、ラットおよびウサギを含むこれらの種の心臓障害において上方調節されることを示す。例えば、不全の成体マウス心臓において、正常に優勢なアルファ−ＭＨＣからベータ−ＭＨＣへのシフトが観察されることが多い（Ｈａｒａｄａら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、１９９９年、１００巻、２０９３〜２０９９頁）。同様に、ラットにおいて、うっ血性心不全は、ベータ−ミオシンの発現増加およびアルファ−ＭＨＣの発現減少に関連した。齧歯類研究と一貫して、不全のヒト心臓において、ベータ−ミオシン発現は、上方調節され、アルファ−ミオシン発現は、有意に下方調節された（Ｍｉｙａｔａら、「Ｍｙｏｓｉｎ  ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ  ｉｓｏｆｏｒｍ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｆａｉｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｎｏｎｆａｉｌｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ｈｅａｒｔ」、Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ．２０００年３月３日；８６巻（４号）：３８６〜９０頁）。これらの研究は、アルファ−およびベータ−ミオシンの発現は、種依存性であるが、ベータ−ミオシンの発現の下方調節は、様々な種において心保護的役割を果たす可能性があることを示す。例えば、β−ＭＨＣ発現の増加の鈍化およびα−ＭＨＣ発現の増加は、ウサギにおいて心保護的であることを示した（Ｊａｍｅｓら、「Ｆｏｒｃｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａｌｐｈａ−ｍｙｏｓｉｎ  ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒａｂｂｉｔ  ｖｅｎｔｒｉｃｌｅ  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｉｎ  ｃａｒｄｉｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｕｎｄｅｒ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｉｃ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ」、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、２００５年、１１１巻（１８号）、２３３９〜２３４６頁）。
【０００６】
α−ＭＨＣ（ＭＹＨ６）、β−ＭＨＣ（ＭＹＨ７）および関連ミオシン、ＭＹＨ７Ｂをコードする遺伝子は、それぞれイントロンｍｉＲＮＡ、ｍｉＲ−２０８ａ、ｍｉＲ−２０８ｂおよびｍｉＲ−４９９のファミリーもコードする。これら３種のｍｉＲは、配列相同性を共有し、「ＭｙｏｍｉＲ」と呼ばれる（ｖａｎ  Ｒｏｏｊｉら、「Ａ  ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ  ｅｎｃｏｄｅｄ  ｂｙ  ｍｙｏｓｉｎ  ｇｅｎｅｓ  ｇｏｖｅｒｎｓ  ｍｙｏｓｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｕｓｃｌｅ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ」、Ｄｅｖ．  Ｃｅｌｌ、２００９年、１７巻、６６２〜６７３頁）。ＭｙｏｍｉＲは、病的心臓リモデリング、筋肉ミオシン含量、筋線維の正体および筋肉性能を制御することが示された（ＬｉｕおよびＯｌｓｏｎ、「ＭｉｃｒｏＲＮＡ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｎｅｔｗｏｒｋｓ  ｉｎ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ」、Ｄｅｖ．  Ｃｅｌｌ、２０１０年、５１０〜５２５頁）。
【０００７】
心臓および筋肉発生におけるα−ＭＨＣ、β−ＭＨＣおよびｍｙｏｍｉＲ（ｍｉＲ−２０８ａ、ｍｉＲ−２０８ｂおよびｍｉＲ−４９９）の役割は、幅広く研究されているが、第３のミオシン、ＭＹＨ７Ｂの役割は、大部分が不明である。ＭＹＨ７Ｂ遺伝子は、骨格筋、心臓において、また、脳における細胞のサブセットにおいて発現され、脳においては、シナプス構造および機能を調節する（Ｙｅｕｎｇら、「Ｍｙｈ７ｂ／ｍｉＲ−４９９  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｓ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｌｙ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｂｙ  ＭＲＦｓ  ａｎｄ  Ｅｏｓ」、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２０１２年、４０巻（１５号）：７３０３〜１８頁）。近年の報告は、ＭＹＨ７ｂタンパク質が、遅筋線維（ｓｌｏｗ−ｔｏｎｉｃ  ｆｉｂｒｅ）に相当する、外眼筋における僅かな線維集団と、筋紡錘の袋状の線維において検出されることを示唆する（Ｒｏｓｓｉら、「Ｔｗｏ  ｎｏｖｅｌ／ａｎｃｉｅｎｔ  ｍｙｏｓｉｎｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｕｓｃｌｅｓ：  ＭＹＨ１４／７ｂ  ａｎｄ  ＭＹＨ１５  ａｒｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｅｘｔｒａｏｃｕｌａｒ  ｍｕｓｃｌｅｓ  ａｎｄ  ｍｕｓｃｌｅ  ｓｐｉｎｄｌｅｓ」、Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．、２０１０年１月１５日；５８８巻（２部）：３５３〜６４頁）。しかし、ヒト心臓において、ＭＹＨ７Ｂ遺伝子は、非生産的スプライシングを受け、機能的ＭＹＨ７Ｂタンパク質をコードしない場合があるＲＮＡをもたらすと考えられる（Ｂｅｌｌら、「Ｕｎｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｏｆ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ｉｎｔｒｏｎｉｃ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｍｙｏｓｉｎ  ｈｏｓｔ  ｇｅｎｅ  ｂｙ  ｅｘｏｎ  ｓｋｉｐｐｉｎｇ」、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．、３０巻、１９３７〜１９４５頁）。興味深いことに、心臓細胞におけるＭＹＨ７Ｂ  ｍＲＮＡの非生産的スプライシングは、イントロンｍｉＲ−４９９の発現変更に関連しなかった。よって、本発明より前には、ＭＹＨ７Ｂは、心細胞におけるｍｉＲ−４９９の非機能性担体であると考えられた（Ｇｅｒａｌｄ  Ｄｏｒｎ，  ＩＩ、「ＭｉｃｒｏＲＮＡｓ：  ｒｅｄｅｆｉｎｉｎｇ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｉｎ  ｃａｒｄｉａｃ  ｄｉｓｅａｓｅ」、Ｊ．  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、２０１０年、５６巻（６号）、５８９〜５９５頁）。さらに、ｍｉＲ−４９９とは異なり、ＭＹＨ７Ｂは、心筋生物学および骨格筋生物学において重要な役割を果たさないと考えられる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｔｅｅｋａｋｉｒｉｋｕｌら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（２０１２年）１９９巻（３号）、４１７〜４２１頁
【非特許文献２】Ｊｉａｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１３年）３４２巻（６１５４号）、１１１〜１１４頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、一部には、ＭＹＨ７Ｂが、心細胞におけるβ−ＭＨＣの発現を調節し、これにより、心収縮力およびストレス誘導性心臓リモデリングを調節するという驚くべき発見に基づく。特に、ＭＹＨ７Ｂの阻害は、心細胞におけるβ−ＭＨＣ  ｍＲＮＡおよびタンパク質の下方調節をもたらす。したがって、一実施形態では、本発明は、ＭＹＨ７Ｂの阻害剤、その組成物、ならびにそれを必要とする被験体におけるβ−ＭＨＣの発現および／または活性をモジュレートするための方法であって、ＭＹＨ７Ｂの阻害剤を被験体に投与するステップを含む、方法を提供する。一実施形態では、被験体へのＭＹＨ７Ｂの阻害剤の投与は、投与後の被験体の心細胞におけるＭＹＨ７Ｂの発現または活性を下方調節する。実施形態では、被験体へのＭＹＨ７Ｂの阻害剤の投与は、投与後の被験体の心細胞におけるβ−ＭＨＣ（ＭＹＨ７）の発現または活性を下方調節する。別の実施形態では、被験体へのＭＹＨ７Ｂの阻害剤の投与は、投与後の被験体の心細胞におけるα−ＭＨＣ（ＭＹＨ６）の発現または活性を上方調節する。さらに別の実施形態では、被験体へのＭＹＨ７Ｂの阻害剤の投与は、ミオシンにおける「スイッチ」を誘導し、それにより、投与後の被験体におけるβ−ＭＨＣの発現または活性が、下方調節され、α−ＭＨＣの発現または活性が、上方調節される。一実施形態では、被験体へのＭＹＨ７Ｂの阻害剤の投与は、被験体の心細胞におけるｍｉＲ−２０８ａ、ｍｉＲ−２０８ｂまたはｍｉＲ−４９９の発現または活性を変化させない。
【００１０】
別の実施形態では、本発明は、被験体にＭＹＨ７Ｂの阻害剤を投与するステップを含む、それを必要とする被験体における病的心肥大、心筋梗塞、心不全または肥大型心筋症等、心臓障害を処置または予防するための組成物および方法を提供する。一実施形態では、心臓障害を有する被験体は、健康な被験体と比較して、心細胞における増加したレベルのβ−ＭＨＣを有する。別の実施形態では、心臓障害を有する被験体は、健康な被験体と比較して、心細胞における変更された比のβ−ＭＨＣ／α−ＭＨＣを有する。一実施形態では、心臓障害を有する被験体へのＭＹＨ７Ｂの阻害剤の投与は、投与後の被験体の心細胞におけるＭＹＨ７Ｂの発現もしくは活性および／またはＭＹＨ７の発現もしくは活性を阻害する。別の実施形態では、心臓障害を有する被験体へのＭＹＨ７Ｂ阻害剤の投与は、被験体の心細胞におけるβ−ＭＨＣ／α−ＭＨＣ比を、投与後に正常レベルまで完全にまたは部分的に回復させる。一実施形態では、心臓障害は、心肥大、心筋梗塞、心不全または肥大型心筋症である。
【００１１】
一実施形態では、ＭＹＨ７Ｂの阻害剤は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アプタマー、リボザイム、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）または低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）から選択される核酸阻害剤である。別の実施形態では、ＭＹＨ７Ｂの阻害剤は、ＭＹＨ７Ｂタンパク質に特異的に結合する抗体またはその結合性断片である。特定の実施形態では、ＭＹＨ７Ｂの阻害剤は、ＭＹＨ７Ｂコード配列に少なくとも部分的に相補的な配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドである。本発明の組成物および方法において使用されるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、約６〜約２２ヌクレオチドの長さを有することができる。一部の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、糖、骨格および／または塩基修飾等、１種または複数の化学修飾を含む。
【００１２】
一実施形態では、ＭＹＨ７Ｂのアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤は、８〜１８ヌクレオチドの長さを有し、アンチセンスオリゴヌクレオチドの配列は、配列番号６の配列に実質的に相補的である。
【００１３】
一部の実施形態では、ＭＹＨ７Ｂのアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤は、８〜１８ヌクレオチドの長さを有し、アンチセンスオリゴヌクレオチドの配列は、配列番号６のヌクレオチド４３００〜４３３５からの配列に実質的に相補的である。
【００１４】
一部の他の実施形態では、ＭＹＨ７Ｂのアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤は、１２〜１８ヌクレオチドの長さを有し、アンチセンスオリゴヌクレオチドの配列は、配列番号６のヌクレオチド４３００〜４３１７からの配列に実質的に相補的である。
【００１５】
さらに他の実施形態では、ＭＹＨ７Ｂのアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤は、１２〜１８ヌクレオチドの長さを有し、アンチセンスオリゴヌクレオチドの配列は、配列番号６のヌクレオチド４３１６〜４３３３からの配列に実質的に相補的である。
【００１６】
一実施形態では、ＭＹＨ７Ｂのアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤は、１４ヌクレオチドの長さを有し、アンチセンスオリゴヌクレオチドの配列は、配列番号６のヌクレオチド４３０２〜４３１５からの配列に実質的に相補的である。
【００１７】
別の実施形態では、ＭＹＨ７Ｂのアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤は、１４ヌクレオチドの長さを有し、アンチセンスオリゴヌクレオチドの配列は、配列番号６のヌクレオチド４３１８〜４３３１からの配列に実質的に相補的である。
【００１８】
一部の実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤は、少なくとも１個の修飾ヌクレオチドを含有する。修飾ヌクレオチドは、糖、塩基および／または骨格の修飾を含むことができる。
【００１９】
一実施形態では、修飾ヌクレオチドは、ロックトヌクレオチドである。一部の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤は、１〜６個のロックトヌクレオチドを含有する。一部の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤の５’末端における少なくとも最初の３個のヌクレオチドは、ロックトヌクレオチドである。別の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤の３’末端における少なくとも最初の３個のヌクレオチドは、ロックトヌクレオチドである。
【００２０】
一部の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤の５’末端における少なくとも最初の３個のヌクレオチドは、ロックトまたは非ロックトリボヌクレオチドである。一部の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤の３’末端における少なくとも最初の３個のヌクレオチドは、ロックトまたは非ロックトリボヌクレオチドである。
【００２１】
一実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤は、少なくとも１個のデオキシリボヌクレオチドを含有する。他の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤は、２〜８個のデオキシリボヌクレオチドを含有する。
【００２２】
様々な実施形態では、ＭＹＨ７Ｂのアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤は、２’−Ｏ，４’−Ｃメチレン架橋、２’−Ｏ，４’−Ｃエチレン架橋、２’−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２−４’架橋、２’−デオキシ、２’−Ｏ−アルキルおよび２’−ハロ修飾からなる群より選択される糖の修飾を含むことができる。
【００２３】
様々な実施形態では、ＭＹＨ７Ｂのアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤は、骨格の修飾を含むことができる。一実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤は、少なくとも１個のホスホロチオエート結合を含有する。別の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤は、２個またはそれより多くのホスホロチオエート結合を含有する。さらに他の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、全体にわたってホスホロチオエート結合されている。
【００２４】
一実施形態では、ＭＹＨ７Ｂのアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤は、リンカーを介して接続されたペプチドまたは糖部分をさらに含む。リンカーは、３’チオール修飾されたＣ３−ジスルフィドリンカー、（Ｃ６）２ジスルフィドリンカーまたは１−３ホスホジエステル結合である場合がある。
【００２５】
ある特定の実施形態では、ＭＹＨ７Ｂのアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤は、表１〜５から選択される配列を含む。
【００２６】
一実施形態では、ＭＹＨ７Ｂのアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤は、５’−ｌＴｓｌＴｓｌＧｓｄＡｓｄＴｓｄＣｓｄＴｓｄＴｓｄＧｓｄＧｓｄＣｓｌＣｓｌＴｓｌＣ−３’（配列番号１４６）または５’−ｌＣｓｌＴｓｌＧｓｄＣｓｄＡｓｄＧｓｄＣｓｄＴｓｄＣｓｄＣｓｄＴｓｌＣｓｌＣｓｌＡ−３’（配列番号１４８）の配列を含む。
【００２７】
本発明は、ＭＹＨ７Ｂの阻害剤と、薬学的に許容される賦形剤とを含む薬学的組成物も提供する。一実施形態では、ＭＹＨ７Ｂの阻害剤は、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。一態様では、薬学的組成物は、第２の治療剤をさらに含み、第２の治療剤は、ｍｉＲ−２０８ａ、ｍｉＲ−２０８ｂ、ｍｉＲ−４９９、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−１９５またはこれらの混合物のアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤である。
【００２８】
本発明は、それを必要とする被験体における病的心肥大、心筋梗塞または心不全を処置または予防するための方法であって、ＭＹＨ７Ｂのアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤を被験体に投与するステップを含む、方法をさらに提供する。一実施形態では、病的心肥大は、肥大型心筋症である。一部の実施形態では、本発明に係る方法は、ｍｉＲ−２０８ａ、ｍｉＲ−２０８ｂ、ｍｉＲ−４９９、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−１９５またはこれらの組み合わせのアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤等、第２の心臓治療剤を投与するステップを含むことができる。
【００２９】
一部の実施形態では、本発明は、病的心肥大のリスクがある被験体を処置する方法を提供する。一実施形態では、病的心肥大のリスクがある被験体は、ベータミオシン重鎖遺伝子に変異を有する。
【００３０】
一態様では、ＭＹＨ７Ｂのアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤の投与は、投与後の被験体の心細胞におけるＭＹＨ７Ｂの発現または活性を低下させる。別の態様では、ＭＹＨ７Ｂのアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤の投与は、投与後の被験体の心細胞におけるベータミオシン重鎖の発現を低下させる。さらに別の態様では、ＭＹＨ７Ｂのアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤の投与は、投与後の被験体の心細胞におけるｍｉＲ−４９９、ｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂの発現を有意に変更しない。
【００３１】
一部の実施形態では、本発明は、それを必要とする被験体における病的心肥大、心筋梗塞または心不全を処置または予防するための方法であって、ＭＹＨ７Ｂの阻害剤を被験体に投与するステップを含む、方法を提供する。様々な実施形態では、ＭＹＨ７Ｂの阻害剤は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アプタマー、リボザイム、低分子干渉ＲＮＡまたは低分子ヘアピン型ＲＮＡから選択される核酸阻害剤である。
【００３２】
一実施形態では、ＭＹＨ７Ｂの核酸阻害剤は、約１０〜約３０ヌクレオチドの二本鎖領域を含む低分子干渉ＲＮＡまたは低分子ヘアピン型ＲＮＡであり、前記二本鎖領域は、（ｉ）ヒトＭｙｈ７ｂ遺伝子の配列と少なくとも７０％同一である配列を有する第１のＲＮＡ鎖、および（ｉｉ）第１のＲＮＡ鎖に部分的に、実質的にまたは完全に相補的である第２のＲＮＡ鎖を含む。一態様では、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡの第１のＲＮＡ鎖は、５’−ＧＡＧＧＣＣＡＡＧＡＴＣＡＡ−３’（配列番号４）の配列と少なくとも７０％同一である配列を有する。別の態様では、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡの第１のＲＮＡ鎖は、５’−ＴＧＧＡＧＧＡＧＣＴＧＣＡＧ−３’（配列番号５）の配列と少なくとも７０％同一である配列を有する。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
ＭＹＨ７Ｂのアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤であって、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、８〜１８ヌクレオチドの長さを有し、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドの配列は、配列番号６の配列に実質的に相補的である、アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤。
（項目２）
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドの配列が、配列番号６のヌクレオチド４３００〜４３３５からの配列に実質的に相補的である、項目１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤。
（項目３）
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、１２〜１８ヌクレオチドの長さを有し、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドの配列が、配列番号６のヌクレオチド４３００〜４３１７からの配列に実質的に相補的である、項目２に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤。
（項目４）
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、１２〜１８ヌクレオチドの長さを有し、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドの配列が、配列番号６のヌクレオチド４３１６〜４３３３からの配列に実質的に相補的である、項目２に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤。
（項目５）
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、１４ヌクレオチドの長さを有し、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドの配列が、配列番号６のヌクレオチド４３０２〜４３１５からの配列に実質的に相補的である、項目３に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤。
（項目６）
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、１４ヌクレオチドの長さを有し、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドの配列が、配列番号６のヌクレオチド４３１８〜４３３１からの配列に実質的に相補的である、項目４に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤。
（項目７）
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、少なくとも１個の修飾ヌクレオチドを含有する、項目１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤。
（項目８）
前記修飾ヌクレオチドが、糖、塩基および／または骨格の修飾を含む、項目７に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤。
（項目９）
前記修飾ヌクレオチドが、ロックトヌクレオチドである、項目７に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤。
（項目１０）
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、１〜６個のロックトヌクレオチドを含有する、項目１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤。
（項目１１）
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、５’末端に少なくとも３個のロックトヌクレオチドを含有する、項目１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤。
（項目１２）
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、３’末端に少なくとも３個のロックトヌクレオチドを含有する、項目１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤。
（項目１３）
５’末端における前記少なくとも３個のロックトヌクレオチドが、リボヌクレオチドである、項目１１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤。
（項目１４）
３’末端における前記少なくとも３個のロックトヌクレオチドが、リボヌクレオチドである、項目１２に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤。
（項目１５）
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、少なくとも１個のデオキシリボヌクレオチドを含有する、項目１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤。
（項目１６）
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、２〜８個のデオキシリボヌクレオチドを含有する、項目１５に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤。
（項目１７）
前記糖の修飾が、２’−Ｏ，４’−Ｃメチレン架橋、２’−Ｏ，４’−Ｃエチレン架橋、２’−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２−４’架橋、２’−デオキシ、２’−Ｏ−アルキルおよび２’−ハロ修飾からなる群より選択される、項目８に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤。
（項目１８）
前記骨格の修飾が、ホスホロチオエート結合である、項目８に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤。
（項目１９）
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、２個またはそれより多くのホスホロチオエート結合を含有する、項目１８に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤。
（項目２０）
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、全体にわたってホスホロチオエート結合されている、項目１９に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤。
（項目２１）
前記修飾ヌクレオチドが、５’−メチルシチジンである、項目７に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤。
（項目２２）
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、表１〜５から選択される配列を含む、項目１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤。
（項目２３）
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、５’−ｌＴｓｌＴｓｌＧｓｄＡｓｄＴｓｄＣｓｄＴｓｄＴｓｄＧｓｄＧｓｄＣｓｌＣｓｌＴｓｌＣ−３’（配列番号１４６）または５’−ｌＣｓｌＴｓｌＧｓｄＣｓｄＡｓｄＧｓｄＣｓｄＴｓｄＣｓｄＣｓｄＴｓｌＣｓｌＣｓｌＡ−３’（配列番号１４８）の配列を含む、項目１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤。
（項目２４）
項目１〜２３のいずれか一項に記載のＭＹＨ７Ｂのアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤と、薬学的に許容される賦形剤とを含む薬学的組成物。
（項目２５）
前記薬学的組成物が、第２の治療剤をさらに含み、前記第２の治療剤は、ｍｉＲ−２０８ａ、ｍｉＲ−２０８ｂ、ｍｉＲ−４９９、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−１９５またはこれらの混合物のアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤である、項目２４に記載の薬学的組成物。
（項目２６）
病的心肥大、心筋梗塞または心不全の処置または予防を必要とする被験体における病的心肥大、心筋梗塞または心不全を処置または予防するための方法であって、項目１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤を前記被験体に投与するステップを含む、方法。
（項目２７）
前記病的心肥大が、肥大型心筋症である、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
前記被験体に、病的心肥大のリスクがある、項目２６に記載の方法。
（項目２９）
リスクがある前記被験体が、ベータミオシン重鎖遺伝子に変異を有する、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
前記阻害剤の投与後に、前記被験体の心細胞においてＭＹＨ７Ｂの発現または活性が低下する、項目２６に記載の方法。
（項目３１）
前記阻害剤の投与後に、前記被験体の心細胞においてベータミオシン重鎖の発現が低下する、項目２６に記載の方法。
（項目３２）
前記阻害剤の投与後に、前記被験体の心細胞におけるｍｉＲ−４９９の発現が、統計的に異なっていない、項目２６に記載の方法。
（項目３３）
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、５’−ｌＴｓｌＴｓｌＧｓｄＡｓｄＴｓｄＣｓｄＴｓｄＴｓｄＧｓｄＧｓｄＣｓｌＣｓｌＴｓｌＣ−３’（配列番号１４６）または５’−ｌＣｓｌＴｓｌＧｓｄＣｓｄＡｓｄＧｓｄＣｓｄＴｓｄＣｓｄＣｓｄＴｓｌＣｓｌＣｓｌＡ−３’（配列番号１４８）の配列を含む、項目２６に記載の方法。
（項目３４）
第２の心臓治療薬を投与するステップをさらに含む、項目２６に記載の方法。
（項目３５）
前記第２の心臓治療薬が、ｍｉＲ−２０８ａ、ｍｉＲ−２０８ｂ、ｍｉＲ−４９９、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−１９５またはこれらの組み合わせのアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤である、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
前記被験体が、ヒトである、項目２６に記載の方法。
（項目３７）
病的心肥大、心筋梗塞または心不全の処置または予防を必要とする被験体における病的心肥大、心筋梗塞または心不全を処置または予防するための方法であって、ＭＹＨ７Ｂの阻害剤を前記被験体に投与するステップを含む、方法。
（項目３８）
前記ＭＹＨ７Ｂの阻害剤が、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アプタマー、リボザイム、低分子干渉ＲＮＡまたは低分子ヘアピン型ＲＮＡから選択される核酸阻害剤である、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
前記核酸阻害剤が、約１０〜約３０ヌクレオチドの二本鎖領域を含む低分子干渉ＲＮＡまたは低分子ヘアピン型ＲＮＡであり、前記二本鎖領域が、（ｉ）ヒトＭｙｈ７ｂ遺伝子の配列と少なくとも７０％同一である配列を有する第１のＲＮＡ鎖、および（ｉｉ）前記第１のＲＮＡ鎖に部分的に、実質的にまたは完全に相補的である第２のＲＮＡ鎖を含む、項目３８に記載の方法。
（項目４０）
前記第１のＲＮＡ鎖が、５’−ＧＡＧＧＣＣＡＡＧＡＴＣＡＡ−３’（配列番号４）の配列と少なくとも７０％同一である配列を有する、項目３９に記載の方法。
（項目４１）
前記第１のＲＮＡ鎖が、５’−ＴＧＧＡＧＧＡＧＣＴＧＣＡＧ−３’（配列番号５）の配列と少なくとも７０％同一である配列を有する、項目３９に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】図１Ａは、ＭＹＨ７Ｂに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドによるトランスフェクション４８時間後のヒトｉＰＳ心筋細胞におけるＭＹＨ７Ｂ  ｍＲＮＡのレベルを示す。図１Ｂは、ＭＹＨ７Ｂに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドによるトランスフェクション４８時間後のヒトｉＰＳ心筋細胞におけるＭＹＨ７（β−ＭＨＣ）ｍＲＮＡのレベルを示す。
【００３４】
【図２】図２Ａは、ＭＹＨ７Ｂに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドによるトランスフェクション４８時間後のヒトｉＰＳ心筋細胞におけるｍｉＲ−２０８ａのレベルを示す。図２Ｂは、ＭＹＨ７Ｂに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドによるトランスフェクション４８時間後のヒトｉＰＳ心筋細胞におけるｍｉＲ−４９９のレベルを示す。図２Ｃは、ＭＹＨ７Ｂに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドによるトランスフェクション４８時間後のヒトｉＰＳ心筋細胞におけるｍｉＲ−２０８ｂのレベルを示す。
【００３５】
【図３】図３Ａは、ＭＹＨ７Ｂに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドによるトランスフェクション４８時間後の対照およびＨＣＭ−Ｒ６６３Ｈ心筋細胞におけるＭＹＨ７（β−ＭＨＣ）ｍＲＮＡのレベルを示す。図３Ｂは、ＭＹＨ７Ｂに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドによるトランスフェクション１６８時間（１週間）後の対照およびＨＣＭ−Ｒ６６３Ｈ心筋細胞におけるＭＹＨ７（β−ＭＨＣ）ｍＲＮＡのレベルを示す。
【００３６】
【図４】図４は、処理後９６時間目の対照およびＨＣＭ  ｉＰＳ心筋細胞由来のＭＹＨ７（β−ＭＨＣ）またはＧＡＰＤＨのウエスタンブロット解析を示す。
【００３７】
【図５】図５は、ＭＹＨ７Ｂに対する被験ＡＳＯ化合物によるトランスフェクション４８時間後のヒトｉＰＳ心筋細胞におけるＭＹＨ７Ｂ  ｍＲＮＡのレベルを示す。
【００３８】
【図６】図６Ａは、ＭＹＨ７Ｂに標的化された１、５または１０μＭ被験ＡＳＯ化合物（配列番号９２、１４６、３２、４６および３０）の受動的投与１６８時間後の、ヒトｉＰＳ心筋細胞におけるＭＹＨ７Ｂ  ｍＲＮＡのレベルを示す。図６Ｂは、１、５または１０μＭ被験ＡＳＯ化合物の受動的投与１６８時間後のヒトｉＰＳ心筋細胞におけるＭＹＨ７（β−ＭＨＣ）ｍＲＮＡのレベルを示す。図６Ｃは、１、５または１０μＭの被験ＡＳＯ化合物の受動的投与１６８時間後のヒトｉＰＳ心筋細胞におけるＭＹＨ６（α−ＭＨＣ）ｍＲＮＡのレベルを示す。
【００３９】
【図７】図７は、配列番号１４８の配列を有する５μＭ被験ＡＳＯの受動的投与１６８時間後のヒトｉＰＳ心筋細胞におけるＭＹＨ７Ｂ、ＭＹＨ７（β−ＭＨＣ）およびＭＹＨ６（α−ＭＨＣ）ｍＲＮＡのレベルを示す。
【００４０】
【図８】図８は、１日当たり２５ｍｇ／ｋｇの被験ＡＳＯを３日連続注射し、最後の用量の４８時間後に屠殺したラットの左心室におけるＭＹＨ７Ｂ  ｍＲＮＡのレベルを示す。
【００４１】
【図９】図９Ａは、配列番号１４６および１４８の配列を含むＡＳＯ化合物で処置したウサギの左心室におけるＭＹＨ７Ｂ  ｍＲＮＡのレベルを示す。図９Ｂは、配列番号１４６および１４８の配列を含むＡＳＯ化合物で処置したウサギの右心室におけるＭＹＨ７Ｂ  ｍＲＮＡのレベルを示す。図９Ｃは、配列番号１４６および１４８の配列を含むＡＳＯ化合物で処置したウサギの左心室におけるＭＹＨ７（β−ＭＨＣ）ｍＲＮＡのレベルを示す。図９Ｄは、配列番号１４６および１４８の配列を含むＡＳＯ化合物で処置したウサギの右心室におけるＭＹＨ７（β−ＭＨＣ）ｍＲＮＡのレベルを示す。
【００４２】
【図１０】図１０Ａは、配列番号１４６の配列を含む化合物に基づくＥＮＡ修飾ＡＳＯの受動的投与４８時間後のヒトｉＰＳ心筋細胞におけるＭＹＨ７Ｂ  ｍＲＮＡのレベルを示す。図１０Ｂは、配列番号１４６の配列を含む化合物の５−メチルシチジンおよび２’−Ｏ−メチル修飾ＡＳＯの受動的投与４８時間後のヒトｉＰＳ心筋細胞におけるＭＹＨ７Ｂ  ｍＲＮＡのレベルを示す。図１０Ｃは、配列番号１４６の配列を含む化合物の骨格修飾ＡＳＯの受動的投与４８時間後のヒトｉＰＳ心筋細胞におけるＭＹＨ７Ｂ  ｍＲＮＡのレベルを示す。
【００４３】
【図１１Ａ】図１１Ａ〜図１１Ｄは、ＭＹＨ７Ｂに対する被験ＡＳＯ化合物の受動的投与４８時間後のヒトｉＰＳ心筋細胞におけるＭＹＨ７Ｂ  ｍＲＮＡのレベルを示す。
【図１１Ｂ】図１１Ａ〜図１１Ｄは、ＭＹＨ７Ｂに対する被験ＡＳＯ化合物の受動的投与４８時間後のヒトｉＰＳ心筋細胞におけるＭＹＨ７Ｂ  ｍＲＮＡのレベルを示す。
【図１１Ｃ】図１１Ａ〜図１１Ｄは、ＭＹＨ７Ｂに対する被験ＡＳＯ化合物の受動的投与４８時間後のヒトｉＰＳ心筋細胞におけるＭＹＨ７Ｂ  ｍＲＮＡのレベルを示す。
【図１１Ｄ】図１１Ａ〜図１１Ｄは、ＭＹＨ７Ｂに対する被験ＡＳＯ化合物の受動的投与４８時間後のヒトｉＰＳ心筋細胞におけるＭＹＨ７Ｂ  ｍＲＮＡのレベルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
本発明者らは、単にｍｉＲ−４９９の非機能性担体として作用するものとこれまで考えられていたＭＹＨ７Ｂが、心細胞におけるβ−ＭＨＣの発現の調節において重要な役割を果たすことを見出した。特に、本発明者らは、ＭＹＨ７Ｂの阻害が、心細胞におけるβ−ＭＨＣ  ｍＲＮＡおよびタンパク質の発現を下方調節することを見出した。よって、本発明は、心臓障害、特に、心筋障害の治療介入のための新たな標的としてのＭＹＨ７Ｂを提供する。
【００４５】
本発明は、ＭＹＨ７Ｂの発現または活性を阻害する薬剤を提供する。様々な実施形態では、ＭＹＨ７Ｂを阻害する薬剤は、ＭＹＨ７Ｂ遺伝子、ｍＲＮＡもしくはプレｍＲＮＡに標的化された核酸阻害剤またはＭＹＨ７Ｂタンパク質に標的化された抗体もしくはその結合性断片である。ある特定の実施形態では、ＭＹＨ７Ｂの核酸阻害剤は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アプタマー、リボザイム、低分子干渉ＲＮＡまたは低分子ヘアピン型ＲＮＡから選択される。
【００４６】
一実施形態では、ＭＹＨ７Ｂの阻害剤は、アンチセンスオリゴヌクレオチド（「ＡＳＯ」）である。本発明の文脈において、用語「アンチセンスオリゴヌクレオチド」または「ＡＳＯ」は、広範に使用されており、遺伝子からタンパク質への情報伝達を阻害する、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド、修飾デオキシリボヌクレオチドまたはこれらの組み合わせを含むオリゴマーを包含する。用語「アンチセンスオリゴヌクレオチド」または「ＡＳＯ」は、本明細書において、転写停止；キャッピング、スプライシング、核から細胞質への輸送を含む様々なステージにおけるプレｍＲＮＡからのｍＲＮＡ合成の破壊；ギャップマーＡＳＯもしくは他のＲＮＡｓｅ  Ｈ誘導ＡＳＯによって媒介されるもの等、ｍＲＮＡの分解；ＡＳＯが標的ｍＲＮＡに結合し、これを翻訳に利用できなくする翻訳停止；または標的ｍＲＮＡにハイブリダイズすることによる標的ｍＲＮＡの立体的遮断を容易にする、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド、修飾デオキシリボヌクレオチドまたはこれらの組み合わせを含むオリゴマーも含む。用語「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は、本明細書において、リンカーを介してペプチドまたは糖にコンジュゲートまたは接続された天然および／または修飾ヌクレオチドを含有するオリゴマーを含むアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートも含む。アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートの調製に使用することができるペプチドまたは糖部分およびリンカーは、より詳細に後述されている。
【００４７】
様々な実施形態では、ＭＹＨ７Ｂの活性の阻害に有用なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、約５〜約２５ヌクレオチドの長さ、約６〜約２２ヌクレオチドの長さ、約１０〜約３０ヌクレオチドの長さ、約１２〜約２０ヌクレオチドの長さまたは約２０〜約２５ヌクレオチドの長さである。ある特定の実施形態では、ＭＹＨ７Ｂを標的化するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、約８〜約１８ヌクレオチドの長さであり、他の実施形態では、約１２〜約１８ヌクレオチドの長さであり、さらに他の実施形態では、約１２〜約１６ヌクレオチドの長さである。一部の実施形態では、ＭＹＨ７Ｂを標的化するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、約８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５ヌクレオチドの長さである。
【００４８】
一部の実施形態では、ＭＹＨ７Ｂに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤は、約５０〜約１５０ヌクレオチドの長さ、約６０〜約１４０ヌクレオチドの長さ、約７０〜約１３０ヌクレオチドの長さ、約８０〜約１２０ヌクレオチドの長さ、約９０〜約１１０ヌクレオチドの長さまたは約１００〜約１２０ヌクレオチドの長さである。一実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤は、約１００〜約１２０ヌクレオチドの長さである。ある特定の実施形態では、ＭＹＨ７Ｂを標的化するアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤は、約８０、９０、１００、１１０または１２０ヌクレオチドの長さである。
【００４９】
ＭＹＨ７Ｂを標的化するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、生理的条件下でＭＹＨ７Ｂにハイブリダイズし、被験体の細胞におけるＭＹＨ７Ｂの発現または活性を阻害するように、ＭＹＨ７Ｂ配列（ＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはプレｍＲＮＡ）に少なくとも部分的にまたは実質的に相補的である配列を含む。例えば、一部の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＭＹＨ７Ｂ遺伝子、ｍＲＮＡまたはプレｍＲＮＡ配列に少なくとも部分的に相補的であり、例えば、ＭＹＨ７Ｂ遺伝子、ｍＲＮＡまたはプレｍＲＮＡ配列に少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％相補的である配列を含む。一部の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＭＹＨ７Ｂ遺伝子、ｍＲＮＡまたはプレｍＲＮＡ配列に実質的に相補的となることができる、すなわち、標的ポリヌクレオチド配列に少なくとも約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％相補的となることができる。一実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＭＹＨ７Ｂ遺伝子、ｍＲＮＡまたはプレｍＲＮＡ配列に１００％または完全に相補的である配列を含む。ある特定の実施形態では、ＭＹＨ７Ｂを標的化するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒトＭＹＨ７Ｂ遺伝子の配列に少なくとも部分的に、実質的にまたは完全に相補的である配列を含む。一部の実施形態では、ＭＹＨ７Ｂを標的化するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒトＭＹＨ７Ｂ遺伝子（Ｇｅｎｅｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿０２０８８４．４；配列番号６）のコード配列に少なくとも部分的に、実質的にまたは完全に相補的である配列を含む。
【化１】
0006637961.tif 000002
【化２】
0006637961.tif 000003
【化３】
0006637961.tif 000004
【化４】
0006637961.tif 000005
【化５】
0006637961.tif 000006
【００５０】
アンチセンスオリゴヌクレオチド配列が、天然に存在するヌクレオチドの代わりに修飾ヌクレオチドを含む場合であっても、アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤の配列は、ＭＹＨ７Ｂ遺伝子、ｍＲＮＡまたはプレｍＲＮＡ配列に相補的であると考えられることが理解される。例えば、ＭＹＨ７Ｂ遺伝子、ｍＲＮＡまたはプレｍＲＮＡ配列が、特異的な位置にグアノシンヌクレオチドを含む場合、アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤は、対応する位置にロックトシチジンヌクレオチドまたは２’−フルオロ−シチジン等、修飾シチジンヌクレオチドを含むことができる。
【００５１】
一実施形態では、本発明は、ＭＹＨ７Ｂのアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤であって、アンチセンスオリゴヌクレオチドが、８〜１８ヌクレオチドの長さを有し、アンチセンスオリゴヌクレオチドの配列が、配列番号６の配列に実質的に相補的である、アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤を提供する。
【００５２】
一実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤は、８〜１８ヌクレオチドの長さを有し、配列番号６のヌクレオチド４３００〜４３３５からの配列に実質的に相補的である配列を含む。
【００５３】
ある特定の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤は、１２〜１８ヌクレオチドの長さを有し、配列番号６のヌクレオチド４３００〜４３１７、４３００〜４３１６、４３０１〜４３１６、４３０１〜４３１５、４３０２〜４３１７、４３０２〜４３１６または４３０２〜４３１５からの配列に実質的に相補的である配列を含む。一実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤は、１２〜１４ヌクレオチドの長さを有し、配列番号６のヌクレオチド４３０２〜４３１５からの配列に実質的に相補的である配列を含む。一部の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤は、１４ヌクレオチドの長さを有し、アンチセンスオリゴヌクレオチドの配列は、配列番号６のヌクレオチド４３０２〜４３１５からの配列に実質的に相補的である。一実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤は、５’−ｌＴｓｌＴｓｌＧｓｄＡｓｄＴｓｄＣｓｄＴｓｄＴｓｄＧｓｄＧｓｄＣｓｌＣｓｌＴｓｌＣ−３’（配列番号１４６）（配列中、ｌ＝ロックト核酸修飾、ｄ＝デオキシヌクレオチドおよびｓ＝ホスホロチオエート結合）の配列を含む。
【００５４】
ある特定の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤は、１２〜１８ヌクレオチドの長さを有し、配列番号６のヌクレオチド４３１６〜４３３３、４３１６〜４３３２、４３１７〜４３３２、４３１７〜４３３１、４３１８〜４３３３、４３１８〜４３３２または４３１８〜４３３１からの配列に実質的に相補的である配列を含む。一実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤は、１２〜１４ヌクレオチドの長さを有し、配列番号６のヌクレオチド４３１８〜４３３１からの配列に実質的に相補的である配列を含む。一部の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１４ヌクレオチドの長さを有し、アンチセンスオリゴヌクレオチドの配列は、配列番号６のヌクレオチド４３１８〜４３３１からの配列に実質的に相補的である。一実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤は、５’−ｌＣｓｌＴｓｌＧｓｄＣｓｄＡｓｄＧｓｄＣｓｄＴｓｄＣｓｄＣｓｄＴｓｌＣｓｌＣｓｌＡ−３’（配列番号１４８）の配列を含む。
【００５５】
一部の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤は、８〜１８ヌクレオチドの長さを有し、配列番号６のヌクレオチド１７６２〜１７８３からの配列に実質的に相補的である配列を含む。一実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤は、１２〜１８ヌクレオチドの長さを有し、配列番号６のヌクレオチド１７６２〜１７７９、１７６３〜１７７９、１７６４〜１７８１、１７６５〜１７８０または１７６６〜１７７９からの配列に実質的に相補的である配列を含む。一実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤は、１２〜１４ヌクレオチドの長さを有し、配列番号６のヌクレオチド１７６４〜１７７７または１７６６〜１７７９からの配列に実質的に相補的である配列を含む。一実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤は、５’−ｌＡｓｌＣｓｌＣｓｄＴｓｄＧｓｄＣｓｄＴｓｄＣｓｄＣｓｄＡｓｄＣｓｌＡｓｌＣｓｌＴ−３’（配列番号６２）の配列を含む。別の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤は、５’−ｌＣｓｌＣｓｌＡｓｄＣｓｄＣｓｄＴｓｄＧｓｄＣｓｄＴｓｄＣｓｄＣｓｌＡｓｌＣｓｌＡ−３’（配列番号６４）の配列を含む。
【００５６】
一部の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤は、８〜１８ヌクレオチドの長さを有し、配列番号６のヌクレオチド５１１〜５３８からの配列に実質的に相補的である配列を含む。一実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤は、１２〜１８ヌクレオチドの長さを有し、配列番号６のヌクレオチド５１１〜５３２、５１２〜５３０、５１３〜５２６、５１４〜５２８、５１４〜５２７、５１５〜５３０、５１５〜５２９または５１５〜５２８からの配列に実質的に相補的である配列を含む。一実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤は、１２〜１４ヌクレオチドの長さを有し、配列番号６のヌクレオチド５１３〜５２６、５１４〜５２７または５１５〜５２８からの配列に実質的に相補的である配列を含む。さらに別の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤は、１２〜１８ヌクレオチドの長さを有し、配列番号６のヌクレオチド５２１〜５３８、５２２〜５３８、５２２〜５３７、５２３〜５３８、５２３〜５３７または５２３〜５３６からの配列に実質的に相補的である配列を含む。さらに別の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤は、１２〜１４ヌクレオチドの長さを有し、配列番号６のヌクレオチド５２２〜５３７または５２３〜５３６からの配列に実質的に相補的である配列を含む。一実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤は、５’−ｌＴｓｌＣｓｌＡｓｍｄＣｓｄＴｓｍｄＣｓｄＡｓｍｄＣｓｄＡｓｄＴｓｍｄＣｓｌＣｓｌＡｓｌＴ−３’（配列番号１８４）（配列中、ｍｄ＝５−メチルシトシン）の配列を含む。別の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤は、５’−ｌＴｓｌＴｓｌＣｓｄＡｓｍｄＣｓｄＴｓｍｄＣｓｄＡｓｍｄＣｓｄＡｓｄＴｓｌＣｓｌＣｓｌＡ−３’（配列番号１８６）の配列を含む。さらに別の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤は、５’−ｌＧｓｌＴｓｌＴｓｍｄＣｓｄＡｓｍｄＣｓｄＴｓｍｄＣｓｄＡｓｍｄＣｓｄＡｓｌＴｓｌＣｓｌＣ−３’（配列番号１８８）の配列を含む。さらに他の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤は、５’−ｌＣｓｌＴｓｌＣｓｍｄＣｓｍｄＣｓｍｄＣｓｄＡｓｄＡｓｄＧｓｄＴｓｄＴｓｌＣｓｌＡｓｌＣ−３’（配列番号２０４）の配列を含む。
【００５７】
ある特定の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤は、８〜１８ヌクレオチドの長さを有し、配列番号６のヌクレオチド１６４０〜１７０１からの配列に実質的に相補的である配列を含む。一実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤は、１２〜１８ヌクレオチドの長さを有し、配列番号６のヌクレオチド１６４３〜１６６０、１６４８〜１６６５、１６５３〜１６７０または１６９４〜１７１１からの配列に実質的に相補的である配列を含む。一部の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤は、１２〜１４ヌクレオチドの長さを有し、配列番号６のヌクレオチド１６４５〜１６５８、１６５０〜１６６３、１６５５〜１６６８または１６９６〜１７０９からの配列に実質的に相補的である配列を含む。一実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤は、５’−ｌＡｓｌＣｓｌＴｓｍｄＣｓｄＴｓｍｄＣｓｄＡｓｄＧｓｄＴｓｄＧｓｍｄＣｓｌＣｓｌＡｓｌＴ−３’（配列番号２３０）の配列を含む。別の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤は、５’−ｌＴｓｌＣｓｌＡｓｄＧｓｍｄＣｓｄＡｓｍｄＣｓｄＴｓｍｄＣｓｄＴｓｍｄＣｓｌＡｓｌＧｓｌＴ−３’（配列番号２３８）の配列を含む。さらに別の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤は、５’−ｌＣｓｌＣｓｌＴｓｄＴｓｄＧｓｄＴｓｍｄＣｓｄＡｓｄＧｓｍｄＣｓｄＡｓｌＣｓｌＴｓｌＣ−３’（配列番号２４４）の配列を含む。さらに別の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤は、５’−ｌＴｓｌＴｓｌＴｓｄＧｓｄＡｓｄＧｓｄＧｓｄＡｓｄＧｓｄＧｓｄＴｓｌＣｓｌＣｓｌＣ−３’（配列番号２７２）の配列を含む。
【００５８】
一部の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤は、１２〜１８ヌクレオチドの長さを有し、配列番号６のヌクレオチド４２８０〜４３００からの配列に実質的に相補的である配列を含む。一実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤は、１２〜１８ヌクレオチドの長さを有し、配列番号６のヌクレオチド４２８０〜４２９７、４２８２〜４２９５、４２８３〜４３００または４２８３〜４２９６からの配列に実質的に相補的である配列を含む。一実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤は、５’−ｌＣｓｌＴｓｌＧｓｄＡｓｄＴｓｍｄＣｓｍｄＣｓｄＴｓｍｄＣｓｄＡｓｄＴｓｌＡｓｌＧｓｌＧ−３’（配列番号３０４）の配列を含む。別の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤は、５’−ｌＧｓｌＣｓｌＴｓｄＧｓｄＡｓｄＴｓｍｄＣｓｍｄＣｓｄＴｓｍｄＣｓｄＡｓｌＴｓｌＡｓｌＧ−３’（配列番号３０６）の配列を含む。
【００５９】
一部の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤は、１２〜１８ヌクレオチドの長さを有し、配列番号６のヌクレオチド６８８〜７０５、６８９〜７０６、６９０〜７０７または６９０〜７０３からの配列に実質的に相補的である配列を含む。一実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤は、５’−ｌＴｓｌＧｓｌＧｓｄＴｓｍｄＣｓｄＴｓｄＴｓｄＴｓｄＧｓｄＧｓｄＴｓｌＣｓｌＴｓｌＣ−３’（配列番号３４４）の配列を含む。他の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤は、１２〜１８ヌクレオチドの長さを有し、配列番号６のヌクレオチド８９０〜９０７、８９２〜９０９または８９２〜９０５からの配列に実質的に相補的である配列を含む。一実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤は、５’−ｌＧｓｌＡｓｌＣｓｄＴｓｄＧｓｄＧｓｄＧｓｄＡｓｄＧｓｍｄＣｓｍｄＣｓｌＡｓｌＴｓｌＴ−３’（配列番号３５０）の配列を含む。
【００６０】
一部の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤は、１２〜１８ヌクレオチドの長さを有し、配列番号６のヌクレオチド１２１７〜１２３４、１２１８〜１２３５、１２１９〜１２３６または１２１９〜１２３２からの配列に実質的に相補的である配列を含む。一実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤は、５’−ｌＡｓｌＴｓｌＴｓｍｄＣｓｍｄＣｓｄＴｓｍｄＣｓｄＡｓｄＧｓｄＧｓｄＧｓｌＴｓｌＣｓｌＴ−３’（配列番号３６２）の配列を含む。他の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤は、１２〜１８ヌクレオチドの長さを有し、配列番号６のヌクレオチド１２２４〜１２４１、１２２５〜１２４２、１２２６〜１２４３または１２２６〜１２３９からの配列に実質的に相補的である配列を含む。一実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤は、５’−ｌＡｓｌＧｓｌＴｓｄＴｓｄＡｓｄＴｓｍｄＣｓｄＡｓｄＴｓｄＴｓｍｄＣｓｌＣｓｌＴｓｌＣ−３’（配列番号３７０）の配列を含む。
【００６１】
一部の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤は、１２〜１８ヌクレオチドの長さを有し、配列番号６のヌクレオチド１４１５〜１４４１からの配列に実質的に相補的である配列を含む。一部の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤は、１２〜１８ヌクレオチドの長さを有し、配列番号６のヌクレオチド１４１５〜１４３２、１４１６〜１４３３、１４１７〜１４３４または１４１７〜１４３０からの配列に実質的に相補的である配列を含む。一実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤は、５’−ｌＡｓｌＧｓｌＡｓｍｄＣｓｄＡｓｄＧｓｄＡｓｄＡｓｄＧｓｍｄＣｓｄＡｓｌＧｓｌＣｓｌＡ−３’（配列番号３９６）の配列を含む。一部の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤は、１２〜１８ヌクレオチドの長さを有し、配列番号６のヌクレオチド１４２２〜１４３９、１４２３〜１４４０、１４２４〜１４４１または１４２４〜１４３７からの配列に実質的に相補的である配列を含む。一実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤は、５’−ｌＧｓｌＧｓｌＴｓｄＴｓｍｄＣｓｄＡｓｄＴｓｄＡｓｄＧｓｄＡｓｍｄＣｓｌＡｓｌＧｓｌＡ−３’（配列番号４１０）の配列を含む。
【００６２】
一部の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤は、８〜１８ヌクレオチドの長さを有し、配列番号６のヌクレオチド２３４８〜２３７１からの配列に実質的に相補的である配列を含む。一実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤は、１２〜１８ヌクレオチドの長さを有し、配列番号６のヌクレオチド２３４８〜２３６５、２３４９〜２３６４、２３４８〜２３６１、２３４９〜２３６６、２３５０〜２３６５、２３５１〜２３６６、２３５２〜２３６７、２３５２〜２３６５、２３５３〜２３７０、２３５４〜２３６９または２３５４〜２３６８からの配列に実質的に相補的である配列を含む。一実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤は、１２〜１４ヌクレオチドの長さを有し、配列番号６のヌクレオチド２３４９〜２３６２または２３５０〜２３６３からの配列に実質的に相補的である配列を含む。さらに別の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤は、１２〜１４ヌクレオチドの長さを有し、配列番号６のヌクレオチド２３５０〜２３６３または２３５１〜２３６４からの配列に実質的に相補的である配列を含む。さらに別の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤は、１２〜１４ヌクレオチドの長さを有し、配列番号６のヌクレオチド２３５２〜２３６５からの配列に実質的に相補的である配列を含む。さらに別の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤は、１２〜１４ヌクレオチドの長さを有し、配列番号６のヌクレオチド２３５３〜２３６６または２３５４〜２３６７からの配列に実質的に相補的である配列を含む。一実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤は、５’−ｌＡｓｌＴｓｌＴｓｍｄＣｓｄＴｓｄＧｓｄＴｓｄＧｓｄＡｓｍｄＣｓｄＴｓｌＴｓｌＣｓｌＴ−３’（配列番号４７４）の配列を含む。別の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤は、５’−ｌＴｓｌＡｓｌＴｓｄＴｓｍｄＣｓｄＴｓｄＧｓｄＴｓｄＧｓｄＡｓｍｄＣｓｌＴｓｌＴｓｌＣ−３’（配列番号４７６）の配列を含む。さらに別の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤は、５’−ｌＣｓｌＴｓｌＡｓｄＴｓｄＴｓｍｄＣｓｄＴｓｄＧｓｄＴｓｄＧｓｄＡｓｌＣｓｌＴｓｌＴ−３’（配列番号４７８）の配列を含む。さらに他の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤は、５’−ｌＧｓｌＣｓｌＣｓｄＴｓｄＡｓｄＴｓｄＴｓｍｄＣｓｄＴｓｄＧｓｄＴｓｌＧｓｌＡｓｌＣ−３’（配列番号４８２）の配列を含む。
【００６３】
一部の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤は、１２〜１８ヌクレオチドの長さを有し、配列番号６のヌクレオチド２４４２〜２４６２からの配列に実質的に相補的である配列を含む。ある特定の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤は、１２〜１４ヌクレオチドの長さを有し、配列番号６のヌクレオチド２４４４〜２４５７または２４４５〜２４５８からの配列に実質的に相補的である配列を含む。一実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤は、５’−ｌＡｓｌＴｓｌＧｓｍｄＣｓｄＴｓｄＧｓｍｄＣｓｍｄＣｓｄＴｓｄＴｓｍｄＣｓｌＴｓｌＴｓｌＡ−３’（配列番号５０８）の配列を含む。別の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤は、５’−ｌＧｓｌＡｓｌＴｓｄＧｓｍｄＣｓｄＴｓｄＧｓｍｄＣｓｍｄＣｓｄＴｓｄＴｓｌＣｓｌＴｓｌＴ−３’（配列番号５１０）の配列を含む。
【００６４】
一部の他の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤は、１２〜１８ヌクレオチドの長さを有し、配列番号６のヌクレオチド４４０８〜４４３２からの配列に実質的に相補的である配列を含む。様々な実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤は、１２〜１８ヌクレオチドの長さを有し、配列番号６のヌクレオチド４４０８〜４４２５、４４０９〜４４２６、４４１０〜４４２５、４４１１〜４４２８、４４１１〜４４２７、４４１２〜４４２９、４４１２〜４４２８または４４１３〜４４３０からの配列に実質的に相補的である配列を含む。一実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤は、１２〜１６ヌクレオチドの長さを有し、配列番号６のヌクレオチド４４０９〜４４２４または４４１０〜４４２５からの配列に実質的に相補的である配列を含む。別の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤は、１２〜１６ヌクレオチドの長さを有し、配列番号６のヌクレオチド４４１１〜４４２６または４４１２〜４４２７からの配列に実質的に相補的である配列を含む。さらに別の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤は、１２〜１６ヌクレオチドの長さを有し、配列番号６のヌクレオチド４４１３〜４４２８からの配列に実質的に相補的である配列を含む。一実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤は、５’−ｌＡｓｌＴｓｌＣｓｄＡｓｄＧｓｄＡｓｍｄＣｓｄＡｓｍｄＣｓｄＴｓｍｄＣｓｌＣｓｌＴｓｌＴ−３’（配列番号５７０）の配列を含む。別の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤は、５’−ｌＴｓｌＧｓｌＡｓｄＴｓｍｄＣｓｄＡｓｄＧｓｄＡｓｍｄＣｓｄＡｓｍｄＣｓｌＴｓｌＣｓｌＣ−３’（配列番号５７２）の配列を含む。さらに別の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤は、５’−ｌＣｓｌＴｓｌＧｓｄＡｓｄＴｓｍｄＣｓｄＡｓｄＧｓｄＡｓｍｄＣｓｄＡｓｌＣｓｌＴｓｌＣ−３’（配列番号５７４）の配列を含む。
【００６５】
一部の実施形態では、ＭＹＨ７Ｂを標的化するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号６におけるヌクレオチド１１８２〜１２１３のヒトＭＹＨ７Ｂ遺伝子の配列に少なくとも部分的に相補的または完全に相補的である配列を含む。他の実施形態では、ＭＹＨ７Ｂを標的化するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号６におけるヌクレオチド１３６５〜１３９３のヒトＭＹＨ７Ｂ遺伝子の配列に少なくとも部分的に相補的または完全に相補的である配列を含む。
【００６６】
一実施形態では、ＭＹＨ７Ｂを標的化するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、５’−ＧＴＧＡＡＴＧＣＧＧＡＴＧＡＡ−３’（配列番号１）の配列を有する。別の実施形態では、ＭＹＨ７Ｂのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、５’−ＧＡＡＧＴＧＧＴＡＧＴＣＡＴＡ−３’（配列番号２）の配列を有する。さらに別の実施形態では、ＭＹＨ７Ｂのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、５’−ｌＧｓｌＴｓｌＧｓｄＡｓｄＡｓｄＴｓｄＧｓｄＣｓｄＧｓｄＧｓｄＡｓｄＴｓｄＧｓｌＡｓｌＡ−３’（配列番号３）の配列を有する。
【００６７】
用語「約」は、本明細書において、＋／−１０％、より好ましくは、＋／−５％の変動を包含する。なぜなら、このような変動が本発明の実施に適切であるからである。
【００６８】
一実施形態では、ＭＹＨ７Ｂのアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤は、少なくとも１個のホスホロチオエート、モルホリノまたはホスホノカルボキシレートヌクレオチド間結合等、少なくとも１個の骨格の修飾を含有する（例えば、ここに参照により本明細書にそれらの内容全体が組み込まれる米国特許第６，６９３，１８７号および同第７，０６７，６４１号を参照）。一部の実施形態では、ＭＹＨ７Ｂのアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤は、２個またはそれより多くのホスホロチオエート結合を含有する。ある特定の実施形態では、ＭＹＨ７Ｂのアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤は、全体にわたってホスホロチオエート結合されている。あるいは、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、糖−ホスフェート骨格ではなくペプチドに基づく骨格を含有するペプチド核酸（ＰＮＡ）を含むことができる。
【００６９】
一実施形態では、ＭＹＨ７Ｂのアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤は、ロックトヌクレオチド、または他の糖、塩基および／または骨格の修飾を含有するヌクレオチド等、少なくとも１個の修飾ヌクレオチドを含有する。用語「ロックトヌクレオチド」、「ロックト核酸単位」、「ロックト核酸残基」、「ＬＮＡ単位」、「架橋された核酸」、「架橋されたヌクレオチド」、「ＢＮＡ」は、本開示を通して互換的に使用することができ、二環式ヌクレオシド／ヌクレオチドアナログを指す。具体的には、「架橋された核酸」または「架橋されたヌクレオチド」は、糖残基の２’，４’−位または３’，４’−位に架橋を含有するヌクレオチドを指す。例えば、適したアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤は、架橋されたヌクレオチドを含有するオリゴヌクレオチドとその相補的標的鎖の間に形成された複合体に増強された熱安定性を付与する、１個または複数の「コンフォメーション的に制約された」または２’，４’−架橋されたヌクレオチド修飾で構成され得る。一実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤は、「ロックトヌクレオチド」または「ＬＮＡ」として従来公知の２’−Ｏ，４’−Ｃ−メチレン架橋リボヌクレオシド（構造Ａ）を含有する。別の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤は、少なくとも１個の２’，４’−Ｃ−架橋された２’デオキシリボヌクレオシド（ＣＤＮＡ、構造Ｂ）を含有する。例えば、両者共に参照により本明細書にそれらの内容全体が組み込まれる、米国特許第６，４０３，５６６号およびＷａｎｇら（１９９９年）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、９巻：１１４７〜１１５０頁を参照されたい。さらに別の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤は、構造Ｃに示す構造を有する少なくとも１個の修飾ヌクレオシドを含有する。さらに別の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤は、少なくとも１個の２’Ｏ，４’−Ｃ−エチレン架橋リボヌクレオシド（構造Ｄ）を含有する。２’Ｏ，４’−Ｃ−エチレン架橋を含有する核酸またはオリゴヌクレオチドまたはヌクレオチドは、エチレン架橋された核酸（ＥＮＡ）としても公知である。なお別の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤は、「アミノ−２’−Ｃ−架橋された二環式ヌクレオチド」または「アミノ−ＣＢＢＮ」としても公知の少なくとも１個の２’−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２−４’−架橋されたヌクレオチドを含有する。ＭＹＨ７Ｂを標的化するアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤は、上述の架橋されたヌクレオチドまたは他の修飾ヌクレオチドおよび非修飾リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドの組み合わせを含有することができる。
【化６】
0006637961.tif 000007
【００７０】
本発明の文脈においてＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオチドをその対応する架橋されたヌクレオチドまたはロックトヌクレオチドで置換することについて言及する場合、用語「対応する架橋されたヌクレオチド」または「対応するロックトヌクレオチド」は、ＤＮＡ／ＲＮＡヌクレオチドが、置き換えられたＤＮＡ／ＲＮＡヌクレオチドと同じ天然に存在する窒素含有塩基または化学修飾された同じ窒素含有塩基を含有する架橋されたヌクレオチドまたはロックトヌクレオチドに置き換えられたことを意味することを目的とする。例えば、窒素含有塩基Ｃを含有するＤＮＡヌクレオチドの対応する架橋されたヌクレオチドまたはロックトヌクレオチドは、同じ窒素含有塩基Ｃまたは５−メチルシトシン等の化学修飾された同じ窒素含有塩基Ｃを含有することができる。
【００７１】
用語「架橋されていないヌクレオチド」または「非ロックトヌクレオチド」は、架橋されたヌクレオチドまたはロックトヌクレオチドとは異なるヌクレオチドを指す、すなわち、用語「架橋されていないヌクレオチド」または「非ロックトヌクレオチド」は、ＤＮＡヌクレオチド、ＲＮＡヌクレオチド、ならびに修飾が架橋でもロックト修飾でもないことを除いて塩基および／または糖が修飾された修飾ヌクレオチドを含む。
【００７２】
一実施形態では、ＭＹＨ７Ｂのアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤は、少なくとも１個のロックトヌクレオチドを含有する。一部の実施形態では、ＭＹＨ７Ｂのアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤は、１〜６個のロックトヌクレオチドを含有する。一実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤の３’末端から少なくとも最初の３個のヌクレオチドは、ロックトヌクレオチドである。別の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤の５’末端から少なくとも最初の３個のヌクレオチドは、ロックトヌクレオチドである。
【００７３】
ある特定の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤は、１〜６個の天然または修飾リボヌクレオチドを含有する。一実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤の３’末端から少なくとも最初の３個のヌクレオチドは、天然または修飾リボヌクレオチドである。別の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤の５’末端から少なくとも最初の３個のヌクレオチドは、天然または修飾リボヌクレオチドである。一部の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤の３’末端から最初の３つのヌクレオチドは、ロックトリボヌクレオチドである。他の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤の５’末端から最初の３つのヌクレオチドは、ロックトリボヌクレオチドである。
【００７４】
本発明のオリゴヌクレオチド阻害剤は、塩基修飾または置換を有する修飾ヌクレオチドを含むことができる。天然または非修飾塩基は、プリン塩基アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）ならびにピリミジン塩基シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）およびウラシル（Ｕ）である。複素環式塩基部分とも称される修飾塩基は、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよび他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピニルウラシルおよびシトシンならびにピリミジン塩基の他のアルキニル誘導体、６−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル（プソイドウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシルおよび他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−ハロ（５−ブロモ、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換ウラシルおよびシトシンを含む）、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−アミノ−アデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニンおよび３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニン等、他の合成および天然核酸塩基を含む。一実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤は、１〜５個の５−メチルシチジンまたは５−メチルデオキシシチジンヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤は、塩基修飾（例えば、５−メチルシチジン）と組み合わせた１個または複数の架橋された核酸修飾（例えば、ＬＮＡ、ＥＮＡ等）を含む。
【００７５】
本発明のオリゴヌクレオチド阻害剤は、修飾された糖部分を有するヌクレオチドを含むことができる。代表的な修飾された糖は、炭素環式または非環式糖、その２’、３’または４’位のうち１個または複数に置換基を有する糖、および糖の１個または複数の水素原子の代わりに置換基を有する糖を含む。ある特定の実施形態では、糖は、２’位に置換基を有することにより修飾される。追加的な実施形態では、糖は、３’位に置換基を有することにより修飾される。他の実施形態では、糖は、４’位に置換基を有することにより修飾される。糖が、これらの位置のうち１個より多くに修飾を有することができること、またはオリゴヌクレオチド阻害剤が、ある１個の位置に糖の修飾を有する１個もしくは複数のヌクレオチドと共に、異なる位置に糖の修飾を有する１個もしくは複数のヌクレオチドを有することができることも考慮される。
【００７６】
本発明のオリゴヌクレオチド阻害剤において考慮される糖の修飾として、ＯＨ；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−もしくはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−もしくはＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−もしくはＮ−アルキニル；またはＯ−アルキル−Ｏ−アルキルから選択される置換基が挙げられるがこれらに限定されず、このようなアルキル、アルケニルおよびアルキニルは、Ｃ１〜Ｃ１０アルキルまたはＣ２〜Ｃ１０アルケニルおよびアルキニルにより置換されていても置換されていなくてもよい。一実施形態では、修飾は、２’−メトキシエトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、これは、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）または２’−ＭＯＥとしても公知である）、すなわち、アルコキシアルコキシ基を含む。別の修飾は、２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、Ｏ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基を含み、これは、２’−ＤＭＡＯＥおよび２’−ジメチルアミノエトキシエトキシとしても公知であり（当該技術分野では、２’−Ｏ−ジメチル−アミノ−エトキシ−エチルまたは２’−ＤＭＡＥＯＥとしても公知）、すなわち、２’−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）２である。
【００７７】
追加的な糖置換基は、アリル（−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２）、−Ｏ−アリル、メトキシ（−Ｏ−ＣＨ３）、アミノプロポキシ（−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）およびフルオロ（Ｆ）を含む。２’位（２’−）における糖置換基は、アラビノ（上）位またはリボ（下）位に存在することもできる。ある１種の２’−アラビノ修飾は、２’−Ｆである。他の同様の修飾は、糖部分の他の位置、特に、３’末端ヌクレオシドまたは２’−５’結合オリゴヌクレオチドにおける糖の３’位、および５’末端ヌクレオチドの５’位において為すこともできる。ある特定の実施形態では、糖の修飾は、２’−Ｏ−アルキル（例えば、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル）、２’−ハロ（例えば、２’−フルオロ、２’−クロロ、２’−ブロモ）および４’チオ修飾である。
【００７８】
ここに参照により本明細書にその内容全体が組み込まれる米国特許第６，８３８，２８３号に記載されている修飾等、安定性を増強し、有効性を改善するためのオリゴヌクレオチド阻害剤の他の修飾は、当該技術分野で公知であり、本発明の方法における使用に適している。例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏ送達および安定性を容易にするために、オリゴヌクレオチド阻害剤は、その３’末端においてコレステロール部分等のステロイド、ビタミン、脂肪酸、炭水化物もしくはグリコシド、ペプチドまたは他の小分子リガンドに連結することができる。一部の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤は、標的細胞による阻害剤の取り込みを増強するために、ペプチドに取り付けられる。例えば、一部の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤の３’末端は、配列「ＷＬＳＥＡＧＰＶＶＴＶＲＡＬＲＧＴＧＳＷ」を有するペプチドに取り付けられる。このペプチドは、参考として本明細書に援用されるＭｃＧｕｉｒｅら（「Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ  ｆｏｒ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ」Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏ、２００４年、３４２巻、１７１〜１８２頁）に記載されている。一実施形態では、ペプチドは、「チオールＣ３」等、リンカーを介してアンチセンスオリゴに取り付けられ、それにより、リンカーおよびオリゴのＳＨ基とペプチドにおけるマレイミドの間にチオエーテル結合が形成される。一部の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤の５’末端は、直接的にまたはリンカーを介して糖部分に取り付けることができる。リンカーは、Ｃ６−ジスルフィドリンカーまたはホスホジエステルｄＴｄＴリンカー等の１−３ホスホジエステルリンカーとなることができる。
【００７９】
様々な実施形態では、ＭＹＨ７Ｂのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、表１〜５から選択される配列を有する。
【表１−１】
0006637961.tif 000008
【表１−２】
0006637961.tif 000009
【表１−３】
0006637961.tif 000010
【表１−４】
0006637961.tif 000011
【表２−１】
0006637961.tif 000012
【表２−２】
0006637961.tif 000013
【表２−３】
0006637961.tif 000014
【表２−４】
0006637961.tif 000015
【表２−５】
0006637961.tif 000016
【表２−６】
0006637961.tif 000017
【表２−７】
0006637961.tif 000018
【表２−８】
0006637961.tif 000019
【表２−９】
0006637961.tif 000020
【表２−１０】
0006637961.tif 000021
【表３−１】
0006637961.tif 000022
【表３−２】
0006637961.tif 000023
【表３−３】
0006637961.tif 000024
【表４−１】
0006637961.tif 000025
【表４−２】
0006637961.tif 000026
【表５】
0006637961.tif 000027
【００８０】
一実施形態では、本発明は、被験体の心細胞におけるβ−ＭＨＣの発現が上方調節される心臓障害を処置または予防するための方法であって、ＭＹＨ７Ｂの阻害剤を含む組成物を被験体に投与するステップを含む、方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、被験体の心細胞におけるβ−ＭＨＣ／α−ＭＨＣの比が変更される心臓障害を処置または予防するための方法であって、ＭＹＨ７Ｂの阻害剤を含む組成物を被験体に投与するステップを含む、方法を提供する。例えば、本発明は、ＭＹＨ７Ｂの阻害剤を使用して、被験体の心細胞におけるβ−ＭＨＣの発現もしくは活性を阻害することにより、および／またはβ−ＭＨＣ／α−ＭＨＣの比を変更することにより、病的心肥大、心筋梗塞、心不全または肥大型心筋症からなる群より選択される心臓障害を処置または予防するための組成物および方法を提供する。被験体へのＭＹＨ７Ｂの阻害剤の投与は、投与後の被験体の心細胞におけるＭＹＨ７Ｂの発現または活性を下方調節する。一実施形態では、ＭＹＨ７Ｂの阻害剤の投与は、被験体の心細胞におけるｍｙｏｍｉＲ、特に、ｍｉＲ−４９９の発現または活性を有意に変更しない。よって、一部の実施形態では、ＭＹＨ７Ｂ阻害剤の投与後に、心細胞におけるｍｉＲ−４９９、ｍｉＲ−２０８ａおよび／またはｍｉＲ−２０８ｂの発現は、統計的に異なっていない。
【００８１】
様々な実施形態では、本発明によって提供される方法は、本明細書に開示されている１種または複数の核酸阻害剤を投与するステップを含む。例えば、一実施形態では、本発明によって提供される方法は、表１〜５から選択されるアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤を投与するステップを含む。別の実施形態では、本発明に係る方法は、配列番号１４６の配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤を投与するステップを含む。さらに別の実施形態では、本発明に係る方法は、配列番号１４８の配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤を投与するステップを含む。
【００８２】
特定の実施形態では、本発明は、ＭＹＨ７Ｂの阻害剤を含む組成物を被験体に投与するステップを含む、それを必要とする被験体における肥大型心筋症を処置または予防するための方法であって、阻害剤の投与後に、被験体の心細胞においてＭＹＨ７Ｂの発現または活性が低下する、方法を提供する。一実施形態では、被験体へのＭＹＨ７Ｂの阻害剤の投与は、投与後に、被験体の心細胞におけるβ−ＭＨＣの発現または活性を低下させる。
【００８３】
一実施形態では、本発明は、病的心肥大または肥大型心筋症を発症するリスクがある被験体における病的心肥大または肥大型心筋症を処置または予防するための方法を提供する。病的心肥大または肥大型心筋症を発症するリスクがある患者は、例えば、長期にわたる制御されない高血圧、矯正されない弁膜疾患、慢性狭心症、最近の心筋梗塞、心疾患または病的肥大の先天性素因を含む１種または複数のリスク因子を示し得る。一部の実施形態では、リスクがある被験体は、病的心肥大または肥大型心筋症の遺伝的素因を有するものとして診断することができる。例えば、ある特定の実施形態では、リスクがある被験体は、筋節遺伝子における１個または複数の変異、例えば、β−ＭＨＣ（ＭＹＨ７）遺伝子における変異を保有する場合がある。一実施形態では、リスクがある被験体は、Ａｒｇ６６３Ｈｉｓ、Ｌｙｓ２０７Ａｓｎ、Ｇｌｙ２５６Ｇｌｕ、Ａｒｇ４０３Ｇｌｎ、Ａｒｇ４５３Ｃｙｓ、Ｇｌｙ５８４Ａｒｇ、Ａｒｇ７１９Ｔｒｐ、Ａｒｇ７２３Ｇｌｙ、Ｉｌｅ７３６Ｔｈｒ、Ｇｌｙ７４１Ａｒｇ、Ａｓｐ７７８Ｇｌｙ、Ａｓｐ７７８Ｖａｌ、Ａｓｐ９０６ＧｌｙおよびＬｅｕ９０８Ｖａｌから選択される、β−ＭＨＣ（ＭＹＨ７）遺伝子における１個または複数の変異を有する。ある特定の実施形態では、リスクがある被験体は、β−ＭＨＣ（ＭＹＨ７）遺伝子におけるＡｒｇ４０３Ｇｌｎ、Ａｒｇ４５３ＣｙｓまたはＡｒｇ７１９Ｔｒｐ変異を有する。肥大型心筋症に関連する筋節遺伝子における他の変異は、当業者に公知であり（例えば、これにより参照により本明細書にその内容全体が組み込まれるＭｏｏｒｅら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１１１巻：３７５〜３８５頁、２０１２年を参照）、病的心肥大または肥大型心筋症を発症するリスクがある被験体の同定に使用することができる。他の特定の実施形態では、リスクがある被験体は、病的心肥大または肥大型心筋症の家族歴を有し得る。
【００８４】
別の実施形態では、本発明は、ＭＹＨ７Ｂの阻害剤を被験体に投与するステップを含む、被験体の心細胞におけるβ−ＭＨＣの発現または活性を阻害するための組成物および方法を提供する。さらに別の実施形態では、本発明は、ＭＹＨ７Ｂの阻害剤を被験体に投与するステップを含む、被験体の心細胞におけるβ−ＭＨＣ／α−ＭＨＣの比をモジュレートするための組成物および方法を提供する。被験体へのＭＹＨ７Ｂの阻害剤の投与は、ＭＹＨ７Ｂの阻害剤による処置に先立つＭＹＨ７Ｂおよびβ−ＭＨＣの発現または活性と比較して、被験体の心細胞におけるＭＹＨ７Ｂの発現もしくは活性および／またはβ−ＭＨＣの発現もしくは活性を低下させる。一実施形態では、被験体へのＭＹＨ７Ｂの阻害剤の投与は、被験体の心細胞におけるβ−ＭＨＣ／α−ＭＨＣ比を、健康な被験体に見出される正常レベルへと完全にまたは部分的に回復させる。
【００８５】
本発明の一態様にしたがって、被験体へのＭＹＨ７Ｂの阻害剤の投与は、心臓障害の１種または複数の症状の改善をもたらす。例えば、一実施形態では、ＭＹＨ７Ｂ阻害剤の投与は、被験体における病的心肥大、心筋梗塞もしくは心不全の１種または複数の症状の改善または病的心肥大から心不全への移行における遅延をもたらす。別の実施形態では、ＭＹＨ７Ｂ阻害剤の投与は、被験体における病的心肥大、心筋梗塞または心不全の発病における遅延をもたらす。１種または複数の改善された症状は、例えば、運動能力の増加、心臓駆出容量の増加、左心室拡張末期圧の減少、肺毛細血管楔入圧の減少、心臓拍出量の増加、心係数の増加、肺動脈圧の低減、左心室収縮末期および拡張末期径の減少、心臓線維症の減少、心筋におけるコラーゲン沈着の減少、左および右心室壁応力の減少、壁張力の減少、生活の質の向上ならびに疾患関連の罹患率または死亡率の減少であってもよい。
【００８６】
一部の実施形態では、ＭＹＨ７Ｂの阻害剤は、アプタマーである。用語「アプタマー」は、本明細書において、古典的ワトソンクリック塩基対形成以外の相互作用により特定の標的分子に対する特異的結合親和性を有する核酸分子を指す。アプタマーは、標的分子に結合することにより標的分子の活性または機能を阻害することができる。一部の実施形態では、本発明のアプタマーは、ＭＹＨ７Ｂタンパク質の１個または複数のエピトープに結合する。ある特定の実施形態では、アプタマーは、ヒトＭＹＨ７Ｂタンパク質に結合する。抗ＭＹＨ７Ｂアプタマーは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、修飾ヌクレオチドまたはこれらの混合物で構成され得る。例えば、アプタマーは、１個または複数の２’−Ｏ−アルキル（例えば、２’−Ｏ−メチル）または２’−ハロ（例えば、２’−フルオロ）修飾を含有することができる。一部の実施形態では、アプタマーは、アプタマーの循環半減期を増強するために、ポリマー、例えば、ＰＥＧポリマーにコンジュゲートすることができる。
【００８７】
ＭＹＨ７Ｂのアプタマーは、米国特許第５，２７０，１６３号に記載されているもの等、試験管内進化法（ＳＥＬＥＸ）（ＴｕｅｒｋおよびＧｏｌｄ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９巻：５０５〜５１０頁、１９９０年；ＥｌｌｉｎｇｔｏｎおよびＳｚｏｓｔａｋ、Ｎａｔｕｒｅ  ３４６巻：８１８〜８２２頁、１９９０年）を使用して同定することができる。核酸のライブラリーを標的ＭＹＨ７Ｂと接触させ、標的に特異的に結合された核酸を、標的に特異的に結合しないライブラリーにおける核酸の残りから分配することができる。分配された核酸を増幅して、リガンド濃縮されたプールを得る。複数サイクルの結合、分配および増幅（すなわち、選択）は、所望の活性を有する１種または複数のアプタマーの同定をもたらす。米国特許出願公開第２００９０２６４５０８号に記載されているレーザーＳＥＬＥＸまたはｄｅＳＥＬＥＸ等、修正された方法を使用することもできる。
【００８８】
ある特定の実施形態では、ＭＹＨ７Ｂの発現または活性の阻害に有用なアプタマーの長さは、約１０〜約３０ヌクレオチド、約１５〜約３５ヌクレオチド、約２０〜約３５ヌクレオチド、約２０〜約４０ヌクレオチドまたは約２５〜約５０ヌクレオチドである。
【００８９】
一部の実施形態では、ＭＹＨ７Ｂの阻害剤は、リボザイムである。用語「リボザイム」は、触媒活性を有するＲＮＡ分子を指す。種々の活性を有するリボザイムが公知である。あるいは、標的特異的ＲＮＡ切断活性を有するリボザイムを設計することができる。ある特定の実施形態では、ＭＹＨ７Ｂの阻害剤として使用することができるリボザイムは、グループＩおよびグループＩＩイントロン型リボザイム、ハンマーヘッド型リボザイムならびにヘアピン型リボザイム等、公知のまたは人工的に作製されたＲＮａｓｅ  Ｐリボザイムを含む。一部の実施形態では、ＭＹＨ７Ｂの阻害剤として使用することができるリボザイムは、約２００〜約５００ヌクレオチドまたは約３００〜約４５０ヌクレオチドの長さを有する。他の実施形態では、ＭＹＨ７Ｂのリボザイム阻害剤は、約３０〜約１００ヌクレオチド、約４０〜約８０ヌクレオチドまたは約４０〜約６０ヌクレオチドの長さを有することができる。
【００９０】
一実施形態では、ＭＹＨ７Ｂの阻害剤は、低分子干渉ＲＮＡである。本明細書において、用語「低分子干渉」または「低分子干渉（ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ）ＲＮＡ」または「ｓｉＲＮＡ」は、ＭＹＨ７Ｂ遺伝子に標的化され、ＭＹＨ７Ｂ遺伝子の発現を阻害することができる、ヌクレオチドのＲＮＡ二重鎖を指す。ある特定の実施形態では、ＭＹＨ７Ｂの阻害剤として使用することができるｓｉＲＮＡは、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５または３０塩基対を形成し、１または２ヌクレオチドの５’および／または３’オーバーハングを保有する、約１０〜約３０ヌクレオチド、特に、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５または３０ヌクレオチドの２本の相補的一本鎖ＲＮＡを含む。ｓｉＲＮＡ二重鎖は、ＭＹＨ７Ｂ遺伝子の配列と実質的に同一である配列を有する第１の鎖と、第１の鎖に部分的に、実質的にまたは完全に相補的である配列を有する第２の鎖とを含む。ある特定の実施形態では、ＭＹＨ７Ｂ  ｓｉＲＮＡの第１の鎖は、ＭＹＨ７Ｂ遺伝子の配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９８％、９９％または１００％同一である配列を含み、第２の鎖は、第１の鎖に実質的にまたは完全に相補的である配列を含む。一部の実施形態では、ＭＹＨ７Ｂ遺伝子に標的化されたｓｉＲＮＡの第１のＲＮＡ鎖は、ヒトＭＹＨ７Ｂ遺伝子（配列番号６）のコード領域と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％同一である。ある特定の実施形態では、ＭＹＨ７Ｂ遺伝子に標的化されたｓｉＲＮＡの第１のＲＮＡ鎖は、５’−ＧＡＧＧＣＣＡＡＧＡＴＣＡＡ−３’（配列番号４）の配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％同一である。他の実施形態では、ＭＹＨ７Ｂ遺伝子に標的化されたｓｉＲＮＡの第１のＲＮＡ鎖は、５’−ＴＧＧＡＧＧＡＧＣＴＧＣＡＧ−３’（配列番号５）の配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％同一である。ＭＹＨ７ＢのｓｉＲＮＡ阻害剤は、心細胞に投与することができる、または１種または複数のベクターから心細胞において発現させることができる。
【００９１】
別の実施形態では、ＭＹＨ７Ｂの阻害剤は、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である。本明細書において、用語「ｓｈＲＮＡ」は、二重鎖の部分がヘアピン構造（ｓｈＲＮＡ）の一部である、ＲＮＡ二重鎖を指す。二重鎖部分に加えて、ヘアピン構造は、二重鎖を形成する２本の第１および第２の鎖の間に配置されたループ部分を含有することができる。ループは、長さが変動し得る。一部の実施形態では、ループは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３ヌクレオチドの長さである。ヘアピン構造は、３’または５’オーバーハング部分を含有することもできる。一部の態様では、オーバーハングは、０、１、２、３、４または５ヌクレオチドの長さの３’または５’オーバーハングである。ＭＹＨ７Ｂを標的化するｓｈＲＮＡの二重鎖部分または二本鎖領域は、約１０〜約３０ヌクレオチドの長さであり、ＭＹＨ７Ｂ遺伝子の配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９８％、９９％または１００％同一である第１のＲＮＡ鎖と、第１の鎖に実質的にまたは完全に相補的である第２のＲＮＡ鎖とを含む。ある特定の実施形態では、ＭＹＨ７Ｂ遺伝子に標的化されたｓｈＲＮＡの二重鎖部分の第１のＲＮＡ鎖は、ヒトＭＹＨ７Ｂ遺伝子（配列番号６）のコード領域と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％同一である。一部の実施形態では、ＭＹＨ７Ｂ遺伝子に標的化されたｓｈＲＮＡの二重鎖部分の第１のＲＮＡ鎖は、５’−ＧＡＧＧＣＣＡＡＧＡＴＣＡＡ−３’（配列番号４）の配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％同一である。他の実施形態では、ＭＹＨ７Ｂ遺伝子に標的化されたｓｈＲＮＡの第１のＲＮＡ鎖は、５’−ＴＧＧＡＧＧＡＧＣＴＧＣＡＧ−３’（配列番号５）の配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％同一である。ＭＹＨ７ＢのｓｈＲＮＡ阻害剤は、心細胞に投与することができる、またはベクターから心細胞において発現させることができる。
【００９２】
アンチセンスオリゴヌクレオチドと同様の、本明細書に記載されている他の阻害性ヌクレオチド分子（アプタマー、リボザイム、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ）は、上述の１個または複数の化学修飾ヌクレオチドを含有することができる。例えば、ＭＹＨ７Ｂに標的化された阻害性ヌクレオチド分子は、二環式糖ヌクレオシド（ＢＳＮ）修飾、ロックト核酸（ＬＮＡ）修飾、糖の修飾、例えば、２’−Ｏ−アルキル（例えば、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル）、２’−ハロ（例えば、２’−フルオロ、２’−クロロ、２’−ブロモ）および４’チオ修飾、骨格の修飾、例えば、１種または複数のホスホロチオエート、モルホリノもしくはホスホノカルボキシレート結合、塩基修飾、例えば、５−メチルシチジンまたは２’−４’架橋された二環式ヌクレオシド修飾を含有することができる。
【００９３】
さらに別の実施形態では、ＭＹＨ７Ｂの阻害剤は、ＭＹＨ７Ｂタンパク質の１個または複数のエピトープに特異的に結合する抗体またはその結合性断片である。例えば、ある特定の実施形態では、ＭＹＨ７Ｂの阻害剤は、ＭＹＨ７Ｂタンパク質の１個または複数のエピトープに特異的に結合するモノクローナルまたはポリクローナル抗体である。モノクローナル抗体は、キメラのものであり得るか、またはヒト化され得る。別の実施形態では、ＭＹＨ７Ｂの阻害剤は、ＭＹＨ７Ｂ特異的抗体に由来する断片であり、この断片は、ＭＹＨ７Ｂタンパク質の１個または複数のエピトープに特異的に結合する。このような結合性断片は、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ）、ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）または単一ドメイン抗体等、Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ断片または操作された抗体断片を含むことができる。抗ＭＹＨ７Ｂ抗体は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＥおよびＩｇＡ、またはＩｇＧサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３またはＩｇＧＭ）を含むこれらのサブクラス等、あらゆる免疫グロブリンクラスを包含する。好ましくは、抗ＭＹＨ７Ｂ抗体またはその結合性断片は、約１×１０−７Ｍ〜約１×１０−１２Ｍ、約１×１０−８Ｍ〜約１×１０−１１Ｍまたは約１×１０−９Ｍ〜約５×１０−１０Ｍの範囲内のＭＹＨ７Ｂに対する結合親和性を有する。
【００９４】
本明細書において、用語「被験体」または「患者」は、ヒトおよび他の霊長類（例えば、チンパンジーならびに他の類人猿およびサル種）、農場動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギおよびウマ）、人に慣れた哺乳動物（例えば、イヌおよびネコ）、実験動物（例えば、マウス、ラットおよびモルモット等の齧歯類）および鳥類（例えば、人に慣れた鳥類、野鳥および猟鳥、例えば、ニワトリ、シチメンチョウおよび他の家禽用鳥類、アヒル、ガチョウその他）を限定することなく含むいずれかの脊椎動物を指す。一部の実施形態では、被験体は、哺乳動物である。他の実施形態では、被験体は、ヒトであり、阻害性分子は、ヒトＭＹＨ７Ｂ遺伝子、ｍＲＮＡ、プレｍＲＮＡまたはタンパク質に標的化される。
【００９５】
本明細書に記載されているＭＹＨ７Ｂの核酸阻害剤のいずれかは、ＭＹＨ７Ｂ阻害剤をコードする発現ベクターを細胞に送達することにより、標的細胞（例えば、心細胞および骨格筋細胞）に送達することができる。「ベクター」は、細胞内部への目的の核酸の送達に使用することができる組成物である。直鎖状ポリヌクレオチド、イオン性または両親媒性化合物に会合したポリヌクレオチド、プラスミドおよびウイルスが挙げられるがこれらに限定されない、多数のベクターが当該技術分野で公知である。よって、用語「ベクター」は、自律的に複製するプラスミドまたはウイルスを含む。ウイルスベクターの例として、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクターその他が挙げられるがこれらに限定されない。特定の一実施形態では、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターまたはアデノウイルスベクターである。発現構築物は、生細胞において複製され得る、または合成により作製され得る。本願の目的のため、用語「発現構築物」、「発現ベクター」および「ベクター」は、一般的で説明的な意味での本発明の適用を実証するために互換的に使用され、本発明を限定することを目的としない。
【００９６】
一実施形態では、ＭＹＨ７Ｂの阻害剤を発現するための発現ベクターは、５’−ＴＴＧＡＴＣＴＴＧＧＣＣＴＣ−３’の配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む。別の実施形態では、ＭＹＨ７Ｂの阻害剤を発現するための発現ベクターは、５’−ＣＴＧＣＡＧＣＴＣＣＴＣＣＡ−３’の配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む。語句「作動可能に連結された」または「転写制御下にある」は、本明細書において、ＲＮＡポリメラーゼによる転写開始およびポリヌクレオチドの発現を制御するために、プロモーターが、ポリヌクレオチドに関連して正確な位置および配向性にあることを意味する。
【００９７】
本明細書において、「プロモーター」は、遺伝子の特異的な転写の開始に必要とされる、細胞の合成機構または導入された合成機構によって認識されるＤＮＡ配列を指す。適したプロモーターとして、ＲＮＡ  ｐｏｌ  Ｉ、ｐｏｌ  ＩＩ、ｐｏｌ  ＩＩＩおよびウイルスプロモーター（例えば、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期遺伝子プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーターおよびラウス肉腫ウイルス末端反復配列）が挙げられるがこれらに限定されない。一実施形態では、プロモーターは、組織特異的プロモーターである。筋肉特異的プロモーター、より具体的には、内皮および心臓特異的プロモーターが特に興味深い。そのようなものとして、ミオシン軽鎖−２プロモーター（Ｆｒａｎｚら（１９９４年）Ｃａｒｄｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、５巻（４号）：２３５〜４３頁；Ｋｅｌｌｙら（１９９５年）Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、１２９巻（２号）：３８３〜３９６頁）、アルファアクチンプロモーター（Ｍｏｓｓら（１９９６年）Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２７１巻（４９号）：３１６８８〜３１６９４頁）、トロポニン１プロモーター（Ｂｈａｖｓａｒら（１９９６年）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、３５巻（１号）：１１〜２３頁）；Ｎａ＋／Ｃａ２＋交換体プロモーター（Ｂａｒｎｅｓら（１９９７年）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２７２巻（１７号）：１１５１０〜１１５１７頁）、ジストロフィンプロモーター（Ｋｉｍｕｒａら（１９９７年）Ｄｅｖ．  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．、３９巻（３号）：２５７〜２６５頁）、アルファ７インテグリンプロモーター（ＺｉｏｂｅｒおよびＫｒａｍｅｒ（１９９６年）Ｊ．  Ｂｉｏ．  Ｃｈｅｍ．、２７１巻（３７号）：２２９１５〜２２頁）、脳ナトリウム利尿ペプチドプロモーター（ＬａＰｏｉｎｔｅら（１９９６年）Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ、２７巻（３部２号）：７１５〜２２頁）およびアルファＢ−クリスタリン／低分子量熱ショックタンパク質プロモーター（Ｇｏｐａｌ−Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ（１９９５年）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．、１５巻（１２号）：７０８１〜７０９０頁）、アルファミオシン重鎖プロモーター（Ｙａｍａｕｃｈｉ−Ｔａｋｉｈａｒａら（１９８９年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８６巻（１０号）：３５０４〜３５０８頁）およびＡＮＦプロモーター（ＬａＰｏｉｎｔｅら（１９８８年）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２６３巻（１９号）：９０７５〜９０７８頁）が挙げられる。
【００９８】
ある特定の実施形態では、ＭＹＨ７Ｂ阻害剤をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターは、誘導性プロモーターである場合がある。誘導性プロモーターは、当該技術分野で公知であり、その例として、テトラサイクリンプロモーター、メタロチオネインＩＩＡプロモーター、熱ショックプロモーター、ステロイド／甲状腺ホルモン／レチノイン酸応答エレメント、アデノウイルス後期プロモーターおよび誘導性マウス乳腺癌ウイルスＬＴＲが挙げられるがこれらに限定されない。
【００９９】
細胞に発現構築物および核酸を送達する方法は、当該技術分野で公知であり、例えば、リン酸カルシウム共沈殿、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン、リポフェクション、ポリアミントランスフェクション試薬を用いたトランスフェクション、細胞超音波処理、高速微粒子銃を使用した遺伝子銃（ｇｅｎｅ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）および受容体媒介性トランスフェクションを含むことができる。
【０１００】
本発明は、ＭＹＨ７Ｂの阻害剤（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アプタマー、リボザイム、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたは抗体）と、薬学的に許容される担体または賦形剤とを含む薬学的組成物も含む。例えば、本発明は、ＭＹＨ７Ｂのアンチセンスオリゴヌクレオチドと、薬学的に許容される担体または賦形剤とを含む組成物を提供する。
【０１０１】
一実施形態では、薬学的組成物は、有効用量のＭＹＨ７Ｂ阻害剤と、薬学的に許容される担体とを含む。例えば、薬学的組成物は、本明細書に記載されている通り、有効用量のＭＹＨ７Ｂを標的化するアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは有効用量のＭＹＨ７Ｂを標的化する修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。一実施形態では、薬学的組成物は、５’−ｌＴｓｌＴｓｌＧｓｄＡｓｄＴｓｄＣｓｄＴｓｄＴｓｄＧｓｄＧｓｄＣｓｌＣｓｌＴｓｌＣ−３’（配列番号１４６）の配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。他の実施形態では、薬学的組成物は、５’−ｌＣｓｌＴｓｌＧｓｄＣｓｄＡｓｄＧｓｄＣｓｄＴｓｄＣｓｄＣｓｄＴｓｌＣｓｌＣｓｌＡ−３’（配列番号１４８）の配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。一部の他の実施形態では、薬学的組成物は、表１〜５に列挙されている配列から選択される配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド  修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。
【０１０２】
「有効用量」は、有益なまたは所望の臨床結果をもたらすのに十分な量である。有効用量の本発明のＭＹＨ７Ｂ阻害剤は、約１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、約２．５ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇまたは約５ｍｇ／ｋｇ〜約２５ｍｇ／ｋｇであってもよい。有効用量と考えられるものに関する正確な決定は、患者のサイズ、年齢、障害の種類（例えば、肥大型心筋症、心筋梗塞、心不全または心肥大）および阻害剤の性質（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、発現構築物、抗体等）を含む、各患者それぞれに対する因子に基づくことができる。したがって、当業者であれば、本開示および当該技術分野における知識から、投薬量を容易に確認することができる。
【０１０３】
ある特定の実施形態では、本発明は、病的心肥大、心筋梗塞、心不全または肥大型心筋症を処置または予防するための方法であって、ＭＹＨ７Ｂの阻害剤および第２の治療剤を投与するステップを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、第２の治療剤は、ｍｉＲ−２０８ａ、ｍｉＲ−２０８ｂ、ｍｉＲ−４９９、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−１９５またはこれらの組み合わせのアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤等、心臓治療剤である。このようなｍｉＲＮＡの例示的な阻害剤は、参照により本明細書にそれらの内容全体が組み込まれるＷＯ２０１２／０８３００５およびＷＯ２０１３／１９２４８６に記載されている。第２の治療剤が含まれる実施形態では、第２の薬剤は、同時に、ただし別々の製剤において、または逐次的に投与することができる。他の実施形態では、第２の治療剤は、ＭＹＨ７Ｂ阻害剤の投与前または投与後の異なる時点で投与することができる。事前の投与は、例えば、第２の薬剤の投与の約１週間前〜３０分前までの範囲内の第１の薬剤の投与を含む。事前の投与は、例えば、第２の薬剤の投与の約２週間前〜３０分前までの範囲内の第１の薬剤の投与を含むこともできる。後の投与またはより遅い投与は、例えば、第１の薬剤の投与の約１週間後〜３０分後までの範囲内の第２の薬剤の投与を含む。後の投与またはより遅い投与は、例えば、第１の薬剤の投与の約２週間後〜３０分間後までの範囲内の第２の薬剤の投与を含むこともできる。
【０１０４】
本発明は、ＭＹＨ７Ｂの阻害剤と、第２の治療剤と、薬学的に許容される担体または賦形剤とを含む薬学的組成物を含む。ある特定の実施形態では、薬学的組成物は、ＭＹＨ７Ｂの２種またはそれより多くの阻害剤を含むことができる。一部の実施形態では、第２の治療剤は、ｍｉＲ−２０８ａ、ｍｉＲ−２０８ｂ、ｍｉＲ−４９９、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−１９５またはこれらの組み合わせのアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤等、心臓治療剤である。これらの実施形態では、第２の治療剤は、ＭＹＨ７Ｂの阻害剤と同じ製剤または別々の製剤に含まれ得る。臨床適用が考慮される場合、薬学的組成物は、意図される適用に適切な形態で調製されるであろう。一般に、これは、発熱物質およびヒトまたは動物にとって有害となり得る他の不純物を本質的に含まない組成物の調製を必要とするであろう。
【０１０５】
高分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズ、ならびに水中油型エマルション、ミセル、混合型ミセルおよびリポソームを含む脂質に基づく系等、コロイド分散系は、ＭＹＨ７Ｂのオリゴヌクレオチド阻害剤またはＭＹＨ７Ｂヌクレオチド阻害剤を発現する構築物の送達ビヒクルとして使用することができる。心および骨格筋組織への本発明の核酸の送達に適した市販の脂肪エマルションは、Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（登録商標）、Ｌｉｐｏｓｙｎ（登録商標）、Ｌｉｐｏｓｙｎ（登録商標）ＩＩ、Ｌｉｐｏｓｙｎ（登録商標）ＩＩＩ、Ｎｕｔｒｉｌｉｐｉｄおよび他の同様の脂質エマルションを含む。ｉｎ  ｖｉｖｏでの送達ビヒクルとしての使用にとって好ましいコロイド系は、リポソーム（すなわち、人工膜小胞）である。このような系の調製および使用は、当該技術分野で周知である。例示的な製剤は、参照により本明細書にそれらの内容全体が組み込まれるＵＳ５，９８１，５０５；ＵＳ６，２１７，９００；ＵＳ６，３８３，５１２；ＵＳ５，７８３，５６５；ＵＳ７，２０２，２２７；ＵＳ６，３７９，９６５；ＵＳ６，１２７，１７０；ＵＳ５，８３７，５３３；ＵＳ６，７４７，０１４；およびＷＯ０３／０９３４４９にも開示されている。
【０１０６】
ある特定の実施形態では、送達に使用されるリポソームは、米国特許付与前公開第２０１１００７６３２２号に詳細に記載されているＳＭＡＲＴＩＣＬＥＳ（登録商標）（Ｍａｒｉｎａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）等の両性リポソームである。ＳＭＡＲＴＩＣＬＥＳ（登録商標）における表面電荷は、完全に可逆的であり、そのためこの製品は核酸の送達に特に適したものになっている。ＳＭＡＲＴＩＣＬＥＳ（登録商標）は、注射により送達することができ、安定性を保ち、凝集塊を含まず、細胞膜を通って核酸を送達することができる。
【０１０７】
一部の実施形態では、適切な塩およびバッファーが使用されて、送達ビヒクルを安定的にし、標的細胞による取り込みを可能にする。本発明の水性組成物は、薬学的に許容される担体または水性媒体に溶解または分散された阻害剤ポリヌクレオチド（例えば、リポソームまたは他の複合体もしくは発現ベクター）を含む有効量の送達ビヒクルを含む。語句「薬学的に許容される」または「薬理学的に許容される」は、動物またはヒトに投与されたときに、有害な、アレルギー性のまたは他の望ましくない反応を生じない分子実体および組成物を指す。本明細書において、「薬学的に許容される担体」は、ヒトへの投与に適した医薬品等、医薬品の製剤化における使用に許容される溶媒、バッファー、溶液、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張性剤（ｉｓｏｔｏｎｉｃ  ａｇｅｎｔ）および吸収遅延剤その他を含む。薬学的活性物質のためのこのような媒体および薬剤の使用は、当該技術分野で周知である。何らかの従来の媒体または薬剤が、本発明の活性成分と不適合性ではない限り、治療組成物におけるその使用が考慮される。組成物のベクターまたはポリヌクレオチドを不活性化しないのであれば、補足的活性成分を組成物に取り込むこともできる。
【０１０８】
本発明の活性組成物は、古典的薬学的調製物を含むことができる。標的組織が、いずれか一般的な経路により利用できる限りにおいて、本発明に係るこれらの組成物の投与は、当該経路により行うことができる。これは、経口、経鼻（吸入）または頬側を含む。あるいは、投与は、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内もしくは静脈内注射によるまたは心臓組織への直接注射によるものであってもよい。ＭＹＨ７Ｂ阻害剤またはＭＹＨ７Ｂ阻害剤を含む発現構築物を含む薬学的組成物は、カテーテル系または心臓に治療剤を送達するために冠循環を単離する系によって投与することもできる。心臓および冠血管系に治療剤を送達するための様々なカテーテル系は、当該技術分野で公知である。本発明における使用に適したカテーテルに基づく送達方法または冠血管単離方法の一部の非限定例は、参考としてそれら全体が全て本明細書に援用される米国特許第６，４１６，５１０号；米国特許第６，７１６，１９６号；米国特許第６，９５３，４６６号、ＷＯ２００５／０８２４４０、ＷＯ２００６／０８９３４０、米国特許出願公開第２００７／０２０３４４５号、米国特許出願公開第２００６／０１４８７４２号および米国特許出願公開第２００７／００６０９０７号に開示されている。このような組成物は通常、本明細書に記載されている薬学的に許容される組成物として投与されるであろう。
【０１０９】
本発明の別の実施形態では、本明細書に記載されているＭＹＨ７Ｂ阻害剤を含む組成物は、ステント、バルーンまたはカテーテル等、医療デバイスのコーティングとして製剤化することができる。被験体における心臓障害を処置する方法において特に有用なことに、ＭＹＨ７Ｂの阻害剤を金属ステントのコーティングに使用して、薬物溶出ステントを生成することができる。薬物溶出ステントは、狭くなったまたは罹患した動脈を広げるよう保持し、細胞増殖および／または炎症を予防するための化合物を放出する足場である。ＭＹＨ７Ｂの阻害剤は、時間をわたっての阻害剤の放出のための薄いポリマーに包埋された金属ステントに適用することができる。デバイスに基づく送達のための方法およびデバイスをコーティングする方法は、薬物溶出ステントおよび他の植え込み式デバイスと同様に、当該技術分野で周知である。例えば、参照により本明細書にそれらの内容全体が組み込まれる米国特許第７，２９４，３２９号、同第７，２７３，４９３号、同第７，２４７，３１３号、同第７，２３６，８２１号、同第７，２３２，５７３号、同第７，１５６，８６９号、同第７，１４４，４２２号、同第７，１０５，０１８号、同第７，０８７，２６３号、同第７，０８３，６４２号、同第７，０５５，２３７号、同第７，０４１，１２７号、同第６，７１６，２４２号および同第６，５８９，２８６号ならびにＷＯ２００４／００４６０２を参照されたい。よって、本発明は、ＭＹＨ７Ｂ阻害剤でコーティングされたバルーン、カテーテルまたはステント等の医療デバイスを含む。一部の実施形態では、ＭＹＨ７Ｂ阻害剤を他の治療剤（例えば、抗再狭窄化合物）と組み合わせて使用して、薬物溶出ステントへと取り込むための製剤を生成することができる。
【０１１０】
活性化合物は、非経口または腹腔内投与することもできる。実例として、遊離塩基または薬理学的に許容される塩としての活性化合物の溶液は、ヒドロキシプロピルセルロース等、界面活性物質と適切に混合された水において調製することができる。分散物は、グリセロール、液体ポリエチレングリコールおよびこれらの混合物ならびに油において調製することもできる。貯蔵および使用の通常条件下で、このような調製物は一般に、微生物の増殖を予防するための保存薬を含有する。
【０１１１】
注射使用またはカテーテル送達に適した薬学的形態は、例えば、滅菌水性溶液または分散物および滅菌注射用溶液または分散物の即時調製のための滅菌粉末を含む。一般に、このような調製物は、滅菌であり、容易な注射が可能な程度まで流動性である。調製物は、製造および貯蔵の条件下で安定であるべきであり、細菌および真菌等、微生物の夾雑作用から保護されるべきである。適切な溶媒または分散媒は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールその他）、これらの適した混合物および植物油を含有することができる。例えば、レシチン等のコーティングの使用により、分散物の場合は要求される粒子サイズの維持により、また、界面活性物質の使用により、適切な流動性を維持することができる。微生物の作用の予防は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールその他によってもたらすことができる。多くの場合、等張性剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射用組成物の延長された吸収は、組成物における、吸収を遅延する薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの使用によってもたらすことができる。
【０１１２】
滅菌注射用溶液は、必要に応じて他のいずれかの成分（例えば、上に列挙されている）と共に、溶媒に適切な量の活性化合物を取り込み、続いて濾過滅菌することにより調製することができる。一般に、分散物は、基本の分散媒および所望の他の成分、例えば、上に列挙されている成分を含有する滅菌ビヒクルに様々な滅菌された活性成分を取り込むことにより調製される。滅菌注射用溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、その予め滅菌濾過された溶液から活性成分に加えて任意の追加的な所望の成分の粉末を生じる真空乾燥および凍結乾燥技法を含む。
【０１１３】
本発明の組成物は、一般に、中性または塩形態で製剤化することができる。薬学的に許容される塩は、例えば、無機酸（例えば、塩酸またはリン酸）または有機酸（例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸その他）に由来する酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基により形成される）を含む。タンパク質の遊離カルボキシル基により形成される塩は、無機塩基（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウムまたは水酸化第二鉄）または有機塩基（例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインその他）に由来する場合もある。
【０１１４】
製剤化により、溶液は、好ましくは、投薬製剤と適合性の様式で、また、治療的に有効となるような量で投与される。製剤は、注射用溶液、薬物放出カプセル、点眼薬、硝子体内注射、薬物溶出ステントまたは他のコーティングされた血管デバイスその他等、種々の剤形で容易に投与することができる。水溶液における非経口投与のため、例えば、溶液は、一般に、適切に緩衝され、液体希釈剤は先ず、例えば、十分な食塩水またはグルコースにより等張にされる。このような水溶液は、例えば、静脈内、筋肉内、皮下、硝子体内および腹腔内投与に使用することができる。好ましくは、当業者に公知の通り、特に、本開示を踏まえて、滅菌水性媒体が用いられる。実例として、単一用量を１ｍｌの等張ＮａＣｌ溶液に溶解して、１０００ｍｌの皮下注入流体に添加されるか、あるいは提案される注入部位に注射することができる（例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」第１５版、１０３５〜１０３８および１５７０〜１５８０頁を参照）。処置されている被験体の状態に応じて、投薬量にある程度の変動が必然的に生じるであろう。投与責任者は、いずれにせよ、個々の被験体に適切な用量を決定するであろう。さらに、ヒト投与のため、調製物は、規制機関によって要求される無菌性、発熱性、一般的安全性および純度標準を満たすべきである。
【０１１５】
本発明のある特定の実施形態では、本発明の薬学的組成物は、投与のためのデバイスと共に包装されるまたはその中に貯蔵される。注射用製剤のためのデバイスとして、注射ポート、自動注射装置、注射ポンプおよび注射ペンが挙げられるがこれらに限定されない。エアロゾル化されたまたは粉末製剤のためのデバイスとして、インヘラー、吸入器、アスピレーターその他が挙げられるがこれらに限定されない。よって、本発明は、本明細書に記載されている障害のうち１種または複数を処置または予防するための本発明の薬学的組成物を含む投与デバイスを含む。
【０１１６】
本発明は、限定的に解釈するべきではない次の追加的な実施例によってさらに例証される。当業者は、本開示を踏まえて、開示されている特異的な実施形態に多くの変更を為しても、依然として、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、類似または同様の結果を得ることができることを認めるべきである。
【０１１７】
本開示を通して参照されているあらゆる特許および非特許文書は、あらゆる目的のため、参照により本明細書にそれらの内容全体が組み込まれる。
【実施例】
【０１１８】
（実施例１：ＭＹＨ７Ｂの阻害は、ＭＹＨ７を下方調節する）
対照オリゴヌクレオチドまたはＭＹＨ７Ｂに標的化されたアンチセンスオリゴヌクレオチド（抗７ｂ番号１（５’−ＧＴＧＡＡＴＧＣＧＧＡＴＧＡＡ−３’；配列番号１）および抗７ｂ番号２（５’−ＧＡＡＧＴＧＧＴＡＧＴＣＡＴＡ−３’；配列番号２）をヒトｉＰＳ心筋細胞にトランスフェクトした。リアルタイムＰＣＲを使用して、４８時間目にＭＹＨ７ＢおよびＭＹＨ７（β−ＭＨＣ）ｍＲＮＡのレベルを測定した。甲状腺ホルモン、Ｔ３で処理したヒトｉＰＳ心筋細胞を陽性対照として使用した。Ｔ３は、β−ＭＨＣの発現を下方調節することが公知である。トランスフェクトされた細胞から単離されたＲＮＡのリアルタイムＰＣＲ解析は、ＭＹＨ７Ｂの阻害が、ＭＹＨ７Ｂと共にＭＹＨ７（β−ＭＨＣ）の下方調節をもたらしたことを示した（図１）。予想される通り、Ｔ３は、ＭＹＨ７（β−ＭＨＣ）を下方調節した（図１Ｂ）が、ＭＹＨ７ＢまたはｍｉＲ−２０８ａ、ｍｉＲ−２０８ｂおよびｍｉＲ−４９９のレベルに影響を与えなかった（図１Ａおよび図２）。
【０１１９】
ＭＹＨ７Ｂノックダウンが、ミオシンスイッチをもたらすという観察は、一部には、ミオシンのイントロンｍｉＲＮＡ（ＭＹＨ７Ｂ、ｍｉＲ−４９９；ＭＹＨ７、ｍｉＲ−２０８ｂ；ＭＹＨ６、ｍｉＲ−２０８ａ）の調節によるものである可能性がある。したがって、本発明者らは、ヒトｉＰＳ心筋細胞におけるＭＹＨ７Ｂの阻害が、ｍｙｏｍｉＲのｍｉＲ−２０８ａ、ｍｉＲ−２０８ｂまたはｍｉＲ−４９９の発現に影響を与えるか検査した。
【０１２０】
具体的には、ＭＹＨ７Ｂの下方調節が、ｍｙｏｍｉＲ（ｍｉＲ−２０８ａ、ｍｉＲ−４９９およびｍｉＲ−２０８ｂ）の発現に何らかの効果を有したか決定するために、トランスフェクションの４８時間後にｍｉＲ−２０８ａ、ｍｉＲ−４９９およびｍｉＲ−２０８ｂのレベルを測定した。ｍｉＲ−２０８ａ、ｍｉＲ−４９９またはｍｉＲ−２０８ｂの発現に有意な効果は観察されなかった（図２）。時間をわたって、ＭＹＨ７の下方調節のため、ｍｉＲ−２０８ｂの下方調節が生じ得る；しかし、図２におけるデータは、ＭＹＨ７Ｂに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドが、ｍｙｏｍｉＲの発現に直接的にも直ちにも影響を与えないことを示す。したがって、ＭＹＨ７Ｂの阻害によるミオシンスイッチの調節は、心細胞における新規のｍｉＲＮＡ非依存性機構を表す。
【０１２１】
ｍｉＲ−２０８ａが、ｍｉＲ−４９９の上流に作用し、齧歯類における出生後ｍｉＲ−４９９、ＭＹＨ７Ｂおよびβ−ＭＨＣ発現に必要とされることが示された（ｖａｎ  Ｒｏｏｊｉら「Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｓｔｒｅｓｓ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃａｒｄｉａｃ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｂｙ  ａ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ」Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００７年、３１６巻（５８２４号）５７５〜５７９頁；Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙら「Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉＲ−２０８ａ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｃａｒｄｉａｃ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｄｕｒｉｎｇ  ｈｅａｒｔ  ｆａｉｌｕｒｅ」Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、２０１１年、１２４巻（１４号）１５３７〜１５４７頁）。ｍｉＲ−４９９およびＭＹＨ７Ｂの喪失は、齧歯類の心臓におけるβ−ＭＨＣ下方調節に必要とされる（ｖａｎ  Ｒｏｏｊｉら「Ａ  ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ  ｅｎｃｏｄｅｄ  ｂｙ  ｍｙｏｓｉｎ  ｇｅｎｅｓ  ｇｏｖｅｒｎｓ  ｍｙｏｓｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｕｓｃｌｅ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ」Ｄｅｖ．  Ｃｅｌｌ、２００９年、１７巻、６６２〜６７３頁）。これらの研究は、ｍｙｏｍｉＲが、齧歯類等、α−ＭＨＣ優勢種におけるβ−ＭＨＣ発現の調節において重要な役割を果たすことを示すが、ブタ、ウサギおよびヒト等、β−ＭＨＣ優勢種における研究は、代替機構が、β−ＭＨＣ優勢種におけるβ−ＭＨＣの発現の調節に関与する可能性があることを示す。
【０１２２】
（実施例２：肥大型心筋症患者に由来するｉＰＳ心細胞におけるＭＹＨ７Ｂの阻害は、ＭＹＨ７を下方調節する）
対照オリゴヌクレオチドまたはＭＹＨ７Ｂアンチセンスオリゴヌクレオチド（抗７ｂ番号１および抗７ｂ番号２；配列番号１および２）を、対照ｉＰＳ心筋細胞および変異Ｒ６６３Ｈを有する肥大型心筋症（ＨＣＭ）患者に由来するｉＰＳ心筋細胞にトランスフェクトした。リアルタイムＰＣＲを使用して、トランスフェクション後４８時間および１週間（１６８時間）目にＭＹＨ７（β−ＭＨＣ）ｍＲＮＡのレベルを測定した。リアルタイムＰＣＲ解析は、ＭＹＨ７Ｂの阻害が、ＨＣＭ心筋細胞におけるＭＹＨ７（β−ＭＨＣ）発現の下方調節をもたらしたことを示した（図３Ａ）。さらに、ＭＹＨ７（β−ＭＨＣ）の発現の下方調節は、処理後１週間目まで持続した（図３Ｂ）。
【０１２３】
（実施例３：ＭＹＨ７Ｂの阻害は、β−ＭＨＣタンパク質を下方調節する）
ＭＹＨ７Ｂの阻害が、タンパク質レベルでＭＹＨ７の下方調節をもたらすか決定するために、対照オリゴヌクレオチド、ＭＹＨ７Ｂ  ＡＳＯ番号１（配列番号１）、ＭＹＨ７Ｂ  ＡＳＯおよびＴＩＮＹを、対照およびＨＣＭ  Ｒ６６３ＨヒトｉＰＳ心筋細胞にトランスフェクトした。ＴＩＮＹは、ｍｉＲ−２０８ａ、ｍｉＲ−２０８ｂおよびｍｉＲ−４９９のシード領域に相補的な８ｍｅｒのオリゴである。ウエスタンブロット解析によりＭＹＨ７（β−ＭＨＣ）タンパク質のレベルを評価した。結果は、ＭＹＨ７Ｂアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用した対照またはＨＣＭ  ｉＰＳ心筋細胞の処理が、処理後９６時間目にＭＹＨ７（β−ＭＨＣ）タンパク質を有意に下方調節したことを示した（図４）。対照オリゴは、効果を示さなかった。Ｔ３を陽性対照として使用した。
【０１２４】
（実施例４：ＭＹＨ７Ｂに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）のスクリーニング）
対照オリゴヌクレオチド（モック（ｍｏｃｋ））またはＭＹＨ７Ｂに標的化された１．５ｎＭの被験ＡＳＯを、ヒトｉＰＳ心筋細胞にトランスフェクトした。リアルタイムＰＣＲを使用して、４８時間目にＭＹＨ７Ｂ  ｍＲＮＡのレベルを測定した（図５）。多数のＡＳＯが、ＭＹＨ７Ｂレベルの５０％を超える阻害を示した。具体的には、次のＡＳＯ化合物を検査した：
【表６−１】
0006637961.tif 000028
【表６−２】
0006637961.tif 000029
【０１２５】
（実施例５：ＡＳＯの受動的投与時のＭＹＨ７Ｂの阻害）
実施例４においてＭＹＨ７Ｂレベルの５０％を超える阻害を示したＡＳＯを、受動的取り込み時のその阻害潜在力に関してさらに検査した。具体的には、１、５または１０μＭのＡＳＯ濃度で、選択されたＡＳＯをヒトｉＰＳ心筋細胞と共に１６８時間インキュベートした。リアルタイムＰＣＲを使用して、１６８時間目にＭＹＨ７Ｂ、ＭＹＨ７（β−ＭＨＣ）およびＭＹＨ６（α−ＭＨＣ）ｍＲＮＡのレベルを測定した。リアルタイムＰＣＲ解析は、多くのＡＳＯが、ＭＹＨ７Ｂ  ｍＲＮＡレベルを下方調節したことを示した（図６Ａ）。さらに、配列番号１４６の配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ミオシンのレベルにおける「スイッチ」を示し、ここでＭＹＨ７Ｂの阻害後にβ−ＭＨＣは下方調節され、α−ＭＨＣは上方調節される（図６Ｂおよび図６Ｃ）。いくつか他のＡＳＯも、β−およびα−ＭＨＣのレベルにおいて同様の傾向を示した（図６Ｂおよび図６Ｃ）。
【０１２６】
配列番号１４６の配列を有する別のＡＳＯ化合物も、受動的取り込み時のその阻害活性に関して検査した。ヒトｉＰＳ心筋細胞を、配列番号１４６を有する５μＭ濃度の化合物と共に１６８時間インキュベートし、リアルタイムＰＣＲを使用して、ＭＹＨ７Ｂ、ＭＹＨ７（β−ＭＨＣ）およびＭＹＨ６（α−ＭＨＣ）ｍＲＮＡのレベルを測定した。図７に示す通り、配列番号１４６を有する化合物も、ミオシンのレベルにおける「スイッチ」を示し、ここでＭＹＨ７Ｂの阻害後にβ−ＭＨＣは下方調節され、α−ＭＨＣは上方調節される。
【０１２７】
（実施例６：被験ＡＳＯのｉｎ  ｖｉｖｏ活性）
ＭＹＨ７Ｂのｉｎ  ｖｉｔｒｏ阻害を示したＡＳＯを、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるその阻害潜在力に関してさらに検査した。具体的には、１日当たり２５ｍｇ／ｋｇの用量を３日連続で、選択されたＡＳＯをラットに皮下注射し、最後の用量から４８時間後にラットを屠殺した。リアルタイムＰＣＲを使用して、ラットの左心室におけるＭＹＨ７Ｂ  ｍＲＮＡのレベルを測定した（図８）。図８に示す通り、受動的投与により頑強な活性を示したアンチセンスオリゴヌクレオチド化合物（例えば、配列番号１４６）は、ｉｎ  ｖｉｖｏでもＭＹＨ７Ｂの下方調節を示した一方、受動的投与により活性を示さなかった化合物（例えば、配列番号３２）は、ｉｎ  ｖｉｖｏでも活性を示さなかった。
【０１２８】
ラットにおいて頑強な活性を示した配列番号１４６および１４８の配列を有する化合物を、β−ＭＨＣ優勢種における評価のためのウサギ研究のために選択した。１、３、５、１０および１７日目に、配列番号１４６および１４８を有する１０、１５、２０または２５ｍｇ／ｋｇの化合物をウサギに皮下注射し、１８日目に屠殺した。ＭＹＨ７ＢのリアルタイムＰＣＲデータは、両方の心室におけるＭＹＨ７Ｂの用量依存性低下を示す（図９Ａ〜図９Ｂ）。さらに、ＭＹＨ７Ｂの最も頑強な阻害を有するウサギ（５００３）は、β−ＭＨＣ（ＭＹＨ７）の最も頑強な低下も示した。図９Ｃおよび図９Ｄを参照されたい。
【０１２９】
（実施例７：ＭＹＨ７Ｂ  ＡＳＯの活性に対するヌクレオチド修飾の効果）
配列番号１４６を有するＡＳＯ化合物を様々な位置で修飾して、その活性における修飾の効果を評価した。修飾は、対応するＥＮＡヌクレオチドでのＬＮＡヌクレオチドの置換ならびに他の塩基および糖の修飾を含んだ。図１０Ａは、ＬＮＡの代わりにＥＮＡを使用することが、ＭＹＨ７Ｂを標的化する受動的活性を保持したことを示す。同様に、５’−メチルシチジンによるシチジンの置換および２’Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドによるＬＮＡ塩基の置換は、活性を保持する（図１０Ｂ）。図１０Ｃは、骨格の修飾が、化合物の受動的活性に大いに影響を与えることを示す。
【０１３０】
（実施例８：追加的なＡＳＯのスクリーニング）
追加的なアンチセンスオリゴヌクレオチド化合物を、受動的投与時のその阻害潜在力に関してスクリーニングした。ヒトｉＰＳ心筋細胞を５μＭの被験化合物で４８時間受動的に処理した。リアルタイムＰＣＲを使用して、４８時間目にＭＹＨ７Ｂ  ｍＲＮＡのレベルを測定した。多数のＡＳＯが、ＭＹＨ７Ｂレベルの頑強な阻害を示した一方、他の化合物は、ＭＹＨ７Ｂレベルに効果を示さなかった。図１１Ａ〜図１１Ｄは、４種の別々の研究由来の結果を示す。具体的には、次のＡＳＯ化合物を検査した。
【表７−１】
0006637961.tif 000030
【表７−２】
0006637961.tif 000031
【表７−３】
0006637961.tif 000032
【表７−４】
0006637961.tif 000033
【図１】
0006637961.tif 000034
【図２】
0006637961.tif 000035
【図３】
0006637961.tif 000036
【図４】
0006637961.tif 000037
【図５】
0006637961.tif 000038
【図６】
0006637961.tif 000039
【図７】
0006637961.tif 000040
【図８】
0006637961.tif 000041
【図９】
0006637961.tif 000042
【図１０】
0006637961.tif 000043
【図１１Ａ】
0006637961.tif 000044
【図１１Ｂ】
0006637961.tif 000045
【図１１Ｃ】
0006637961.tif 000046
【図１１Ｄ】
0006637961.tif 000047
【配列表】
0006637961000001.app