(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号６又は配列番号２５のペプチド配列のみからなることを特徴とする、ポリミキシンＥ変異体合成に関与するＰｍｘＡシンセターゼであって、前記変異体が、ロイシン、イソロイシン又はバリン残基を７位に、Ｄ−Ｄａｂ残基を３位に有する、ＰｍｘＡシンセターゼ。
【請求項２】
配列番号１４のペプチド配列のみからなることを特徴とする、ポリミキシンＥ変異体合成に関与するＰｍｘＥシンセターゼであって、前記変異体が、ロイシン、イソロイシン又はバリン残基を７位に、Ｄ−Ｄａｂ残基を３位に有する、ＰｍｘＥシンセターゼ。
【請求項３】
配列番号７のヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有する、請求項１に記載のポリミキシンＥ変異体合成に関与するシンセターゼをコードする、オープンリーディングフレームを含む核酸であって、ただし、配列番号１：
0006637904.tif 000012
の配列の前記下線が施されたアミノ酸ＤＧＦＦＬＧＶＶＹＫをコードするヌクレオチドが保存されている、核酸。
【請求項４】
請求項１に記載のＰｍｘＡシンセターゼをコードする遺伝子と、請求項２に記載のＰｍｘＥシンセターゼをコードする遺伝子と、配列番号１１のＰｍｘＢシンセターゼをコードする遺伝子とを含む、ポリミキシンＥ変異体合成に関与する酵素をコードする遺伝子群であって、前記変異体が、ロイシン、イソロイシン又はバリン残基を７位に、Ｄ−Ｄａｂ残基を３位に有する、遺伝子群。
【請求項５】
配列番号１２のＰｍｘＣ輸送タンパク質及び配列番号１３のＰｍｘＤ輸送タンパク質をそれぞれコードする遺伝子も含むことを特徴とする、請求項４に記載の遺伝子群。
【請求項６】
配列番号７の配列と少なくとも９０％の同一性を有するｐｍｘＡ遺伝子であって、ただし、配列番号１：
0006637904.tif 000013
の配列の下線が施されたアミノ酸ＤＧＦＦＬＧＶＶＹＫをコードするヌクレオチドが保存されている、ｐｍｘＡ遺伝子と、
配列番号８の配列と少なくとも９０％の同一性を有するｐｍｘＢ遺伝子と、
配列番号９の配列と少なくとも９０％の同一性を有するｐｍｘＥ遺伝子と
を含む、請求項４に記載の遺伝子群。
【請求項７】
ポリミキシンＥ変異体合成に関与する遺伝子群を含む、配列番号１０の配列又は配列番号２９の配列の核酸であって、前記変異体が、ロイシン、イソロイシン又はバリン残基を７位に、Ｄ−Ｄａｂ残基を３位に有する、核酸。
【請求項８】
請求項１に記載のＰｍｘＡシンセターゼをコードする遺伝子、又は請求項３に記載の核酸、及び／又は請求項２に記載のＰｍｘＥシンセターゼをコードする遺伝子を含む発現ベクター。
【請求項９】
請求項４〜６のいずれか一項に記載の遺伝子群又は請求項７に記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項１０】
請求項１に記載のＰｍｘＡシンセターゼをコードする遺伝子、又は請求項２に記載のＰｍｘＥシンセターゼをコードする遺伝子、又は請求項３に記載の核酸、又は請求項８に記載のベクターを導入することにより形質転換された微生物。
【請求項１１】
請求項４〜６のいずれか一項に記載の遺伝子群、又は請求項７に記載の核酸、又は請求項９に記載の少なくとも１つのベクターを導入することにより形質転換された微生物。
【請求項１２】
前記遺伝子又は前記遺伝子群が過剰発現することを特徴とする、請求項１０又は１１に記載の形質転換された微生物。
【請求項１３】
バチルス属又はパエニバチルス属に属することを特徴とする、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の形質転換された微生物。
【請求項１４】
ポリミキシンＥ変異体を生産するための方法であって、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の微生物を適当な無機培地中で培養する工程、及びその培養培地から、生産されたポリミキシンＥを精製する工程を含み、前記変異体が、ロイシン、イソロイシン又はバリン残基を７位に、Ｄ−Ｄａｂ残基を３位に有する、方法。
【請求項１５】
前記培養が３０℃の温度で行われ、少なくとも２５時間継続することを特徴とする、請求項１４に記載のポリミキシンＥ変異体生産方法。
【請求項１６】
ポリミキシンＥ変異体を生産するための方法であって、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の微生物を適当な無機培地中で培養する工程、及びその培養培地から、ポリミキシンＥ変異体（単数又は複数）を精製する工程を含み、前記変異体が、ロイシン、イソロイシン又はバリン残基を７位に、Ｄ−Ｄａｂ残基を３位に有する、方法。
【請求項１７】
イソロイシン又はバリン残基を７位に、Ｄ−Ｄａｂ残基を３位に有することを特徴とする、ポリミキシンＥ変異体。
【請求項１８】
グラム陰性菌による細菌感染症の治療におけるポリミキシンＥ変異体の使用のための、請求項１７に記載のポリミキシンＥ変異体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリミキシンＥの合成に関与する細菌の遺伝子及び酵素、グラム陰性菌による感染症に対する療法に使用される抗生物質分子に関する。
【背景技術】
【０００２】
先行技術
ポリミキシン類は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種又はパエニバチルス属（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）種から単離された抗生物質分子である。これらの分子は、
・環状ヘプタペプチドと３個のアミノ酸の側鎖で構成された、１０個のアミノ酸を含むペプチド鎖と、
・そのペプチドのＮ末端に結合した脂肪酸と
からなるリポペプチドである。
【０００３】
１９４７年のポリミキシンＢの発見以来、少なくとも１６種類のポリミキシン類が同定されている。中でも、ポリミキシンＢ及びＥは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）及び緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の菌株の大部分に対してだけでなく、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｅ）及びシゲラ属（Ｓｈｉｇｅｌｌａｅ）、並びに数多くのグラム陰性菌の全ての菌株に対しても抗微生物活性を有する。そのため、これらの抗生物質は、多くの場合、治療薬として使用されている。残念ながら、それらの毒性作用のため、それらは徐々に忍容性がより高い抗生物質に置き換えられている。
【０００４】
図３は、ポリミキシン類の一般的な構造を示し、２個の特異的アミノ酸の存在がＸ及びＹで示される。示されるように、ポリミキシンＢ及びＥは単一個のアミノ酸によって異なり、「Ｘ」残基は、ポリミキシンＢではフェニルアラニン、ポリミキシンＥではロイシンであり、「Ｙ」残基は、ロイシン、イソロイシン又はバリンであり得る。
【０００５】
集団において耐性がまだない新しい抗生物質の需要の高まりから、新しい抗生物質製剤が求められており、多耐性グラム陰性菌との戦いにポリミキシン類が再び臨床的に使用されている。
【０００６】
ＣＡＳ番号１２６４−７２−８で識別される、国際特許出願第ＷＯ１９９８／０２０８３６号に記載されている、コリスチン又はポリミキシンＥは、ポリミキシン群の抗生物質であり、多耐性グラム陰性菌に起因する感染症の治療が可能である。そのペプチド構造を図１に示している。注射により投与される場合、コリスチンは、神経髄膜感染症、尿路感染症、泌尿生殖器感染症、敗血症並びに創傷、火傷及び潰瘍の二次感染の治療に使用される。吸入により投与される場合、コリスチンは、肺感染症、特に、嚢胞性繊維症に関連するものの治療に使用される。最後に、ヒドロコルチゾン及びバシトラシンと組み合わせて、コリスチンは、眼の細菌感染症及び炎症性感染症、並びに眼科手術における感染症を治療するために使用される。
【０００７】
コリスチンは、数多くの望ましくない作用、特に、腎毒性作用及び神経毒性作用の原因となる。これらの毒性作用は、５個の正電荷を含むこの分子の陽イオン性だけでなく、それを合成する原細菌株を培養することにより発酵槽中で生産され、その発酵培地から精製されたその分子の低純度にも起因する。
【０００８】
実際、ポリミキシン類は現在、これらの分子を生産する細菌株、特に、パエニバチルス・ポリミキサ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｙｘａ）の菌株の培養培地からの単離及び精製により得られる。発酵培地からのその分子の精製は不十分であり、これが新しい生産技術を企図する理由である。具体的には、ポリミキシンシンセターゼをコードする遺伝子を同定し、クローニングするために研究が行われている。
【０００９】
ポリミキシンシンセターゼは、「非リボソームペプチドシンセターゼ」（ＮＲＰＳ：Ｎｏｎ−Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）ファミリーの一部である。これらのシンセターゼをコードする遺伝子は、いくつかのモジュールを含むクラスターで構成され、それらの順序及び特異性がペプチド産物の構造を決定する。ＮＲＰＳは、これらのペプチドがリボソームによってメッセンジャーＲＮＡから翻訳された場合に得られ得るものよりも幅広い構造的多様性を示すペプチドの合成を可能にする。更に、そのように生産されるペプチドは、特に、ヒドロキシ酸との結合形成、及び環状構造を得ることが可能になるペプチド鎖中での酸化だけでなく、それらの残基のアシル化、グリコシル化、及びＮ−メチル化によっても修飾を受ける可能性がある。
【００１０】
そのようなＮＲＰＳ複合体は多くの微生物で記載されており、チロシジン、グラミシジン、バンコマイシン、ペニシリン、及びフサリシジン類の生産に関与している。
【００１１】
ＮＲＰＳシンセターゼは様々なモジュールからなる。各モジュールは、アミノ酸を活性化すること、必要に応じて、それを修飾すること、及びペプチドを構成するために、続いてそれを隣接するモジュール中の活性化されたアミノ酸上に転写することが可能である。各モジュールは、いくつかのドメインで構成され、伸長を受けているペプチド中への特定のアミノ酸の組込みを可能にする。各モジュールは、少なくとも３つのドメインを含む：
・アデニル化ドメイン（Ａ）：ペプチドシンセターゼの作用において中心的なドメイン。このドメインは、特異的アミノ酸の結合及びそのアミノ酸のアデニル化反応（そのアミノ酸のアデニル化アミノアシルへの変換）によるその活性化を可能にする；
・チオール化ドメイン（Ｔ又はペプチジル担体タンパク質についてはＰＣＰ：Ｐｅｐｔｉｄｙｌ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）：このドメインは、チオエステル結合による伸長過程を通じてシンセターゼに結合したままペプチドが合成されることを可能にする；
・縮合ドメイン（Ｃ）：このドメインは、隣接するモジュールの２個のアミノ酸間のペプチド結合の形成を可能にする。
【００１２】
ペプチドの放出は、特異的ドメイン、Ｔｅ（チオエステラーゼ）ドメインによって誘導される。このドメインは、合成されたペプチドを最後のＴドメインと連結するチオエステル結合を切断する。このドメインはまた、特定のペプチドの環化も可能にする。
【００１３】
また、アミノ酸への修飾、例えば、エピマー化（Ｌ型アミノ酸のＤ型異性体への変換）、メチル化（メチル基の付加）、そうでなければホルミル化（ホルミル基の付加）などの実行を可能にする副次ドメインも必要に応じて存在する。
【００１４】
ポリミキシン類の場合、図２に示されるように、ペプチド鎖の合成には３つのシンセターゼが必須である：
・ＰｍｘＡモジュールは、各々がポリミキシン分子中へ特異的アミノ酸を組み込む「結合ポケット」として三次元的に構成された、４つのアデニル化ドメインを有する；
・ＰｍｘＢモジュールは、１つのアデニル化ドメインを有し、単一個のアミノ酸の組込みを担う；
・ＰｍｘＥモジュールは、ポリミキシンのペプチド鎖を構成する５個の他のアミノ酸を組み込む５つのアデニル化ドメインを有する。
【００１５】
Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．による論文（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，  ２００９）、並びに米国特許第８３２９４３０号明細書には、ポリミキシンＡを分泌するグラム陽性菌株パエニバチルス・ポリミキサＥ６８１の遺伝子クラスター（群）の単離が記載されている。５個の遺伝子がこのクラスターを構成する：ｐｍｘＡ、ｐｍｘＢ、ｐｍｘＣ、ｐｍｘＤ及びｐｍｘＥ。ｐｍｘＣ及びｐｍｘＤ遺伝子は輸送タンパク質をコードし、一方、それ以外の３個の遺伝子、ｐｍｘＡ、ｐｍｘＢ及びｐｍｘＥはシンセターゼをコードする。これは、特に、ｐｍｘＥ遺伝子への挿入により突然変異を受けた突然変異株によって実証される：この菌株はもはやポリミキシンを生産しない。逆に、この遺伝子クラスターの導入により形質転換された枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の菌株は、Ｌ−２，４−ジアミノ酪酸（Ｄａｂ、ポリミキシンペプチド鎖の主要な残基）の存在下でのみ、ポリミキシンＡを生産することが可能になる。
【００１６】
文献に記載されたポリミキシン類では、ポリミキシンＡ、Ｃ及びＰを除き、Ｄ−Ｄａｂ残基の存在を観察することは非常に稀である。
【００１７】
Ｓｈａｈｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２０１１）には、パエニバチルス・ポリミキサＰＫＢ１株由来の遺伝子クラスターの同定及び配列決定が記載された。ポリミキシンＢ生合成へのこの遺伝子の関与は、ｐｍｘＥ遺伝子への挿入突然変異によって実証される：突然変異を受けた菌株はもはやポリミキシンを生産しない。遺伝子クラスターの特性評価中に、Ｓｈａｈｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．は、ｐｍｘクラスターの第３のモジュールでエピマー化ドメインを同定した。これは３位におけるＤ−Ｄａｂの組込みを示唆する。従って、これらの遺伝子は、３位において、Ｄ−２，４−ジアミノ酪酸残基ではなく、その鏡像異性体であるＬ−２，４−ジアミノ酪酸を含むポリミキシンＢ変異体の生合成に関与する。
【００１８】
パエニバチルス・ポリミキサ株由来の他の遺伝子クラスターは単離されたが、それらの機能及び特異性は予測にすぎず、機能的には全く実証されていない。
【００１９】
更に、既知ポリミキシン類とのわずかな構造差と、より少ない毒性作用を示す「変異体」分子は報告されている。従って、国際特許出願第ＷＯ２００９／０９８３５７号並びにＶａａｒａ  ａｎｄ  Ｖａａｒａによる論文（Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，  ２０１０）には、３個の正電荷だけを含む、毒性作用が低減したポリミキシンＢ変異体が記載されている。ポリミキシンＢ変異体はまた、Ｓｈａｈｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．による論文（２０１１）にも記載されている。
【００２０】
富栄養培地での生産細菌株の発酵に基づいた、コリスチンを生産するために現在使用される技術は、特に、その分子の純度の点で満足できるものではなく、その分子は発酵培地から精製しなければならない。
【００２１】
コリスチン合成に関与する遺伝子の同定により、遺伝子工学的な処理を用いて、より純粋なポリミキシンＥ分子を生産し、更に、有害な副作用がより少なくかつ／又は活性がより良好な誘導合成分子を作製することが可能になるであろう。
【発明の概要】
【００２２】
本発明は、ポリミキシンＥを生産する、自然環境から単離されたパエニバチルス・アルベイの菌株由来の遺伝子クラスターの単離、及びその使用を記載する。
【００２３】
本発明は、４つのアデニル化ドメインを含む、ポリミキシンＥ合成に関与するＰｍｘＡシンセターゼであって、その第２のアデニル化ドメインは配列番号１で表される特定のペプチド配列を含む又は有することを特徴とし、この配列は、ロイシン、イソロイシン又はバリン残基に特異的な結合ポケットを形成している、ＰｍｘＡシンセターゼに関する。
【００２４】
本発明はまた、５つのアデニル化ドメイン及び１つのエピマー化ドメインを含む、ポリミキシンＥ合成に関与するＰｍｘＥシンセターゼに関する。
【００２５】
本出願はまた、ＰｍｘＡシンセターゼをコードする遺伝子と、ＰｍｘＢ及びＰｍｘＥのシンセターゼをコードする遺伝子と、ＰｍｘＣ及びＰｍｘＤの輸送タンパク質をコードする遺伝子とを含む、ポリミキシンＥ合成に関与する酵素をコードする遺伝子群に関する。
【００２６】
本発明はまた、ポリミキシンＥ又はこのポリミキシンの変異体分子を生産する、少なくとも修飾又は非修飾のｐｍｘＡ、ｐｍｘＢ及びｐｍｘＥ遺伝子を発現する形質転換された微生物に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】ポリミキシンＥのペプチド構造。
【図２】ポリミキシンＥ合成に関与するＮＲＰＳクラスターの構造。
【図３】Ｇｏｖａｅｒｔｓ及び共同研究者らによる様々なポリミキシンＢ及びＥの化学構造（Ｇｏｖａｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．、２００２ａ；Ｇｏｖａｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．、２００２ｂ）。
【図４】Ｂ−ＬＲ菌及び突然変異体５の培養上清２０μｌの、緑膿菌の細菌層に対する抗微生物効果。
【図５】ＰｍｘＡペプチド配列；太字：アデニル化ドメイン配列；太字及び下線付き：結合ポケットの特異的モチーフ。
【図６】（Ａ）２価プリカーサーイオンのフラグメンテーションに対応するＭＳ／ＭＳスペクトル（ｍ／ｚ  ５８５．３９）。（Ｂ）対応するペプチド：コリスチンＥ１について提案された構造。ＦＡ：脂肪酸（Ｃ9Ｈ17Ｏ）；Ｌ−Ｄａｂ：Ｌ−２，４−ジアミノ酪酸；Ｔｈｒ：トレオニン；Ｌｅｕ：ロイシン。四角囲みの数字は、第１の系で生成されたイオンに相当し、丸囲みの数字は、第２の系で生成されたイオンに相当する。
【図７】（Ａ）２価プリカーサーイオンのフラグメンテーションに対応するＭＳ／ＭＳスペクトル（ｍ／ｚ  ５７８．３８）。（Ｂ）対応するペプチド：コリスチンＥ２について提案された構造。ＦＡ：脂肪酸（Ｃ8Ｈ15Ｏ）；Ｌ−Ｄａｂ：Ｌ−２，４−ジアミノ酪酸；Ｔｈｒ：トレオニン；Ｌｅｕ：ロイシン。四角囲みの数字は、第１の系で生成されたイオンに相当する。
【図８】（Ａ）２価プリカーサーイオンのフラグメンテーションに対応するＭＳ／ＭＳスペクトル（ｍ／ｚ  ５７１．３８）。（Ｂ）対応するペプチド：Ｖａｌ−Ｅ２について提案された構造。ＦＡ：脂肪酸（Ｃ8Ｈ15Ｏ）；Ｌ−Ｄａｂ：Ｌ−２，４−ジアミノ酪酸；Ｔｈｒ：トレオニン；Ｉｌｅ：イソロイシン；Ｌｅｕ：ロイシン；Ｖａｌ：バリン。四角囲みの数字は、第１の系で生成されたイオンに相当し、丸囲みの数字は、第２の系で生成されたイオンに相当する。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
詳細な説明
ポリペプチド及びポリヌクレオチド
本発明は、ポリミキシンＥシンセターゼをコードする新規遺伝子、特に、ロイシン又はイソロイシン残基の、ポリミキシン分子中への組込みを可能にする特異的な結合ポケットを形成する特定のアデニル化部位を有する「ＰｍｘＡ」シンセターゼをコードする遺伝子の単離及び同定に関する。
【００２９】
本出願において使用される全ての技術用語は、当業者に周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．による参考書籍「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」に定義されている。
【００３０】
用語「ポリヌクレオチド」とは、共有結合したヌクレオチドの鎖を意味する。本発明の目的では、この用語は、リボ核酸（ＲＮＡ）及びデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）などの核酸を意味する。
【００３１】
本発明の目的では、２つの核酸配列間の「同一性パーセンテージ」は、比較ウインドウを通じて、最適にアラインメントされた２つの配列を比較することにより決定される。
【００３２】
比較ウインドウ内のヌクレオチド配列の一部は、２つの配列間で最適なアラインメントを得るために、参照配列（これらの付加又はこれらの欠失含まない）と比較して、付加又は欠失（例えば、ギャップ）を含み得る。
【００３３】
同一性パーセンテージは、比較される２つの配列について同一の核酸塩基が観察される位置の数を決定し、その後、２つの核酸塩基間で同一性が存在する位置の数を比較ウインドウ内の位置の総数で割り、次いで、その結果に１００を掛けて、２つの配列相互のヌクレオチド同一性パーセンテージを得ることにより計算される。
【００３４】
比較のための配列の最適なアラインメントは、既知のアルゴリズムを使用してコンピュータによって行い得る。
【００３５】
もっぱら好ましくは、配列同一性パーセンテージは、ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗソフトウェア（バージョン１．８２）を使用して決定され、パラメーターは以下のとおり設定される：（１）ＣＰＵ  ＭＯＤＥ＝ＣｌｕｓｔａｌＷ  ｍｐ；（２）ＡＬＩＧＮＭＥＮＴ＝「ｆｕｌｌ」；（３）ＯＵＴＰＵＴ  ＦＯＲＭＡＴ＝「ａｌｎ  ｗ／ｎｕｍｂｅｒｓ」；（４）ＯＵＴＰＵＴ  ＯＲＤＥＲ＝「ａｌｉｇｎｅｄ」；（５）ＣＯＬＯＲ  ＡＬＩＧＮＭＥＮＴ＝「ｎｏ」；（６）ＫＴＵＰ（ワードサイズ）＝「ｄｅｆａｕｌｔ」；（７）ＷＩＮＤＯＷ  ＬＥＮＧＴＨ＝「ｄｅｆａｕｌｔ」；（８）ＳＣＯＲＥ  ＴＹＰＥ＝「ｐｅｒｃｅｎｔ」；（９）ＴＯＰＤＩＡＧ＝「ｄｅｆａｕｌｔ」；（１０）ＰＡＩＲＧＡＰ＝「ｄｅｆａｕｌｔ」；（１１）ＰＨＹＬＯＧＥＮＥＴＩＣ  ＴＲＥＥ／ＴＲＥＥ  ＴＹＰＥ＝「ｎｏｎｅ」；（１２）ＭＡＴＲＩＸ＝「ｄｅｆａｕｌｔ」；（１３）ＧＡＰ  ＯＰＥＮ＝「ｄｅｆａｕｌｔ」；（１４）ＥＮＤ  ＧＡＰＳ＝「ｄｅｆａｕｌｔ」；（１５）ＧＡＰ  ＥＸＴＥＮＳＩＯＮ＝「ｄｅｆａｕｌｔ」；（１６）ＧＡＰ  ＤＩＳＴＡＮＣＥＳ＝「ｄｅｆａｕｌｔ」；（１７）ＴＲＥＥ  ＴＹＰＥ＝「ｃｌａｄｏｇｒａｍ」及び（１８）ＴＲＥＥ  ＧＡＰ  ＤＩＳＴＡＮＣＥＳ＝「ｈｉｄｅ」。
【００３６】
用語「ポリペプチド」とは、共有結合したアミノ酸の鎖を意味する。
【００３７】
用語「ポリミキシンＥシンセターゼ」とは、ポリミキシンＥを形成するアミノ酸の鎖中へ特異的アミノ酸を組み込み、必要に応じて、環状構造を形成するためにそのアミノ酸を変換することが可能な酵素を意味する。
【００３８】
用語「アデニル化部位」又は「アデニル化ドメイン」とは、ポリミキシンシンセターゼ分子において、アミノ酸の選択及び活性化において役割を果たすドメインを意味し、一方、「縮合ドメイン」はペプチド結合の形成を触媒し、「チオール化ドメイン」はモジュール間で形成された化合物の輸送を担う。
【００３９】
用語「エピマー化部位」とは、シンセターゼにおいて、左旋性「Ｌ」を有する残基を右旋性「Ｄ」のその鏡像異性体へ、特に、Ｌ−α，γ−ジアミノ酪酸（Ｌ−Ｄａｂ）をＤ−α，γ−ジアミノ酪酸（Ｄ−Ｄａｂ）へ変換することを可能にするドメインを意味する。
【００４０】
用語「結合ポケット」とは、「ポケット」の形態で三次元構造を有するタンパク質のゾーンを意味し、このポケットでは、基質又は、この場合では、アミノ酸、との高特異性の相互作用により、このアミノ酸を選択しかつ活性化することが可能になる。
【００４１】
表現「下線が施されたアミノ酸は保存される」とは、同じ触媒活性を有する２つのタンパク質の間でわずかな配列変化が観察され得る場合でも、示されたアミノ酸は、このタンパク質の特異性及び活性に不可欠であり、従って、このタンパク質の特異性及び／又は活性の喪失又は低減の危険なしに変更することができないということを意味する。
【００４２】
本発明は、４つのアデニル化部位を含む、ポリミキシンＥ合成に関与するＰｍｘＡシンセターゼであって、その第２のアデニル化部位は、次のペプチド配列：
ＶＴＥＡＥＫＡＤＬＬＧＲＦＮＤＴＴＴＥＦＰＲＧＫＴＬＩＱＬＦＥＥＱＶＥＲＩＰＤＡＡＡＩＴＬＮＥＱＥＬＴＹＲＥＬＮＥＲＶＮＲＬＡＲＴＬＲＳＨＧＩＳＫＧＲＬＶＡＩＬＡＥＲＳＩＥＭＶＶＧＭＬＡＡＨＫＡＧＡＡＹＶＰＩＤＰＥＹＰＥＥＲＩＲＦＬＩＥＤＳＧＧＱＶＭＬＴＱＳＲＬＲＥＲＬＡＧＳＤＰＶＩＬＬＤＤＥＳＦＹＨＥＤＧＴＮＬＮＴＧＩＥＡＴＤＬＡＣＶＩＹＴＳＧＴＴＧＫＰＫＧＮＰＶＳＨＲＮＩＶＲＶＶＱＮＴＮＹＩＤＩＴＥＲＤＨＶＬＱＬＳＳＹＳＦＤＧＡＴＦＤＩＦＧＡＬＴＮＧＡＲＬＶＬＶＰＹＥＴＬＬＥＩＧＲＬＡＤＬＩＱＲＥＲＩＳＶＭＦＩＴＴＡＦＦＮＩＬＶＤＶＮＶＤＣＬＲＤＶＲＡＩＬＦＧＧＥＲＶＳＶＧＨＶＲＫＡＬＡＨＩＧＰＧＲＬＮＨＶＹＧＰＴＥＳＴＶＹＴＴＹＬＰＶＤＦＶＤＥＬＡＶＴＶＰＩＧＲＰＩＳＮＴＴＶＹＩＶＤＳＲＮＫＬＬＰＩＧＶＡＧＥＬＣＶＧＧＥＧＬＶＲＧＹＮＮＲＰＥＬＴＡＥＫＦＶＤＮＰＦＶＰＧＥＲＭＹＲＴＧＤＬＡＫＷＬＰＤＧＴＩＥＹＶＧＲＴＤＤＱＶＫＩＲＧＦＲＩＥＬＧＥＩＥＡＱＬＱＫＶＥＧＩＲＫＴＴＶＦＡＲＥＮＡＳＧＥＫＱＬＣＡＹＹＥＡＤＣＥＬＰＡＡＥＬＫＳＶＬＳＫＥＬＰＡＹＭＩＰＡＹＬＩＱＬＥＲＬＰＬＴＴＮＧＫＶＤＲＲＳＬＰＡＰＥＥＳＬＱＰＧＧＧ（配列番号１）
と少なくとも９０％の同一性を有することを特徴とし、
下線が施されたアミノ酸ＤＧＦＦＬＧＶＶＹＫは保存され、かつロイシン、イソロイシン又はバリン残基に特異的な結合ポケットを形成している、ＰｍｘＡシンセターゼに関する。
【００４３】
本発明の１つの特定の態様によれば、ＰｍｘＡの第２のアデニル化部位は、配列番号１のペプチド配列と、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有し、下線が施されたアミノ酸ＤＧＦＦＬＧＶＶＹＫは、保存され、かつロイシン、イソロイシン又はバリン残基に特異的な結合ポケットを形成している。
【００４４】
本発明の１つの特定の態様によれば、ＰｍｘＡの第２のアデニル化部位は、配列番号２７のペプチド配列を含む又はからなるペプチド配列を有し、下線が施されたアミノ酸ＤＧＦＦＬＧＶＶＹＫは、保存され、かつロイシン、イソロイシン又はバリン残基に特異的な結合ポケットを形成している。
【００４５】
本発明の１つの特定の態様によれば、ＰｍｘＡシンセターゼは、次のアミノ酸：
・ロイシン残基に特異的な、ＤＡＷＩＶＧＡＩＶＫ（配列番号２）、
・ロイシン、イソロイシン又はバリン残基に特異的な、ＤＧＦＦＬＧＶＶＹＫ（配列番号３）、
・ジアミノ酪酸残基に特異的な、ＤＶＧＥＩＳＡＩＤＫ（配列番号４）、
・ジアミノ酪酸残基に特異的な、ＤＶＧＥＩＳＡＩＤＫ（配列番号５）、
を含む４つの特異的な結合ポケットを含む。
【００４６】
配列番号２、３、４及び５のこれらの配列は、ペプチド配列中の連続したアミノ酸ではなく、必須アミノ酸をグループ化して三次元構造で機能的な結合ポケットを形成することがはっきりと理解される。
【００４７】
本発明の１つの特定の態様によれば、ＰｍｘＡシンセターゼは、図５で示される、配列番号６に示されるポリペプチド配列を含み、アデニル化ドメインは太字で示され、結合ポケットを形成するアミノ酸は下線が施されている。具体的には、この配列は、配列番号６に示される配列に加えて、Ｎ末端及びＣ末端に追加のアミノ酸を含み得る。
【００４８】
１つの特定の態様によれば、ＰｍｘＡシンセターゼのポリペプチド配列は配列番号６に示されるポリペプチド配列からなる。
【００４９】
本発明の別の態様によれば、ＰｍｘＡシンセターゼは、配列番号２５に示されるペプチド配列を含む又はからなる配列を有する。
【００５０】
ＰｍｘＡシンセターゼは次の位置：
・残基２３４Ｌから残基７５１Ｙまで；
・残基１７４１Ｖから残基２２６３Ｇまで；
・残基２８１５Ｐから残基３３４５Ｔまで；
・残基３９００Ｅから残基４４２８Ｇまで。
に４つのアデニル化部位を有する。
【００５１】
これらの位置は、特定のペプチド配列に従って、この場合、４９６７個のアミノ酸を含む配列番号６に従って特定され、より大きなサイズの配列については再定義され得ることは理解される。
【００５２】
具体的には、ＰｍｘＡシンセターゼが配列番号２５の配列からなる配列を有する場合には、４つのアデニル化部位は次の位置：
・残基２６５Ｌから残基７８２Ｙまで；
・残基１７７２Ｖから残基２２９４Ｇまで；
・残基２８４６Ｐから残基３３７６Ｔまで；
・残基３９３１Ｅから残基４４５９Ｇまで。
に存在する。
【００５３】
本発明はまた、５つのアデニル化部位及び１つのエピマー化部位を含む、ポリミキシンＥ合成に関与するＰｍｘＥシンセターゼであって、そのエピマー化部位は配列番号３０に示されるペプチド配列と少なくとも９０％の同一性を有することを特徴とする、ＰｍｘＥシンセターゼに関する。
【００５４】
本発明の１つの特定の態様によれば、ＰｍｘＥシンセターゼのペプチド配列は、配列番号１４の配列で表される配列を含む又はからなる。
【００５５】
このシンセターゼは、ポリミキシンＥ分子のペプチド鎖中への残基１〜５（付番については図１を参照）の組込みを担う。このシンセターゼは、Ｌ−Ｄａｂ残基をその立体異性体Ｄ−Ｄａｂへ変換することが可能であり、かつ上記立体異性体をポリミキシンＥペプチド鎖の３位に組み込むという機能特性を有する。このような変異体ポリミキシン分子は、文献（Ｈｏｎｇ  ＳＹ  ｅｔ  ａｌ．、１９９９；Ｌｅｅ  ＤＬ  ｅｔ  ａｌ．、２００４）で提示されているように、改善された抗微生物特性を有し得た。
【００５６】
本発明はまた、配列番号１の配列の下線が施されたアミノ酸ＤＧＦＦＬＧＶＶＹＫをコードするヌクレオチドは保存されるという条件で、配列番号７のヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有する、ポリミキシンＥ合成に関与するシンセターゼをコードする、オープンリーディングフレームを含む核酸に関する。
【００５７】
本発明の１つの特定の態様によれば、ポリミキシンＥ合成に関与するシンセターゼをコードする核酸は、配列番号１の配列の下線が施されたアミノ酸ＤＧＦＦＬＧＶＶＹＫをコードするヌクレオチドは保存されるという条件で、配列番号７のヌクレオチド配列と、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有する。
【００５８】
表現「ヌクレオチド［…］は保存される」は、これらのヌクレオチドによって形成されるコドンが、配列番号１の配列において下線が施されたアミノ酸ＤＧＦＦＬＧＶＶＹＫをコードするという条件でのみ、配列番号１の配列のアミノ酸ＤＧＦＦＬＧＶＶＹＫをコードするこれらのヌクレオチドは、配列番号７の配列の同じ位置で観察されるものと同一であるか、又は異なっていなければならないことを示す。
【００５９】
これは、上に示したように、これらのアミノ酸はこのシンセターゼの特異性及び活性に不可欠であり、従って、この結合ポケットの特異性の喪失又は低減の危険なしに変更することができないことが理由である。
【００６０】
本発明の別の特定の態様によれば、ポリミキシンＥ合成に関与するＰｍｘＡシンセターゼをコードする核酸は、配列番号２８の配列に示されるヌクレオチド配列からなる、このＰｍｘＡシンセターゼの第２のアデニル化部位をコードするヌクレオチド配列を含む。この配列は、配列番号２７で表されるペプチド配列をコードし、また、そのドメインのＣ末端で配列番号２７よりも２個アミノ酸が少ない、配列番号１で表されるペプチド配列もコードする。
【００６１】
本発明はまた、特に、
・上に定義されるＰｍｘＡシンセターゼをコードする遺伝子、及び
・ＰｍｘＢ及びＰｍｘＥのシンセターゼそれぞれをコードする遺伝子
を含む、ポリミキシンＥ合成に関与する酵素をコードする遺伝子群に関する。
【００６２】
本発明の１つの好ましい態様によれば、この遺伝子群は、そのペプチド配列が配列番号３０で表される配列を含む又はからなるエピマー化ドメインを含むＰｍｘＥシンセターゼをコードするｐｍｘＥ遺伝子を含む。
【００６３】
本発明の１つの好ましい態様によれば、この遺伝子群はまた、ＰｍｘＣ及びＰｍｘＤの輸送タンパク質それぞれをコードする遺伝子を含む。パエニバチルス・アルベイ株から単離されたＰｍｘＣ及びＰｍｘＤのタンパク質の配列は、それぞれ、配列番号１２及び１３の配列で示される。
【００６４】
本発明の別の特定の態様によれば、ポリミキシンＥ合成に関与するこの遺伝子群は、
・配列番号１の配列の下線が施されたアミノ酸ＤＧＦＦＬＧＶＶＹＫをコードするヌクレオチドは保存されるという条件で、配列番号７の配列と少なくとも９０％の同一性を有するｐｍｘＡ遺伝子と、
・配列番号８の配列と少なくとも９０％の同一性を有するｐｍｘＢ遺伝子と、
・配列番号９の配列と少なくとも９０％の同一性を有するｐｍｘＥ遺伝子と
を含む。
【００６５】
本発明の別の態様によれば、ポリミキシンＥ合成に関与するこの遺伝子群は、
・下線が施されたアミノ酸ＤＧＦＦＬＧＶＶＹＫをコードする核酸の部分は保存されるという条件で、配列番号７の配列と少なくとも９５％の同一性を有するｐｍｘＡ遺伝子と、
・配列番号８の配列と少なくとも９５％の同一性を有するｐｍｘＢ遺伝子と、
・配列番号９の配列と少なくとも９５％の同一性を有するｐｍｘＥ遺伝子と
を含む。
【００６６】
本発明の別の態様によれば、ポリミキシンＥ合成に関与するこの遺伝子群は、
・配列番号７の配列と１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、特に、配列番号２６に示されるヌクレオチド配列を含む、ｐｍｘＡ遺伝子と、
・配列番号８の配列と１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むｐｍｘＢ遺伝子と、
・配列番号９の配列と１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むｐｍｘＥ遺伝子と
を含む。
【００６７】
本発明はまた、ポリミキシンＥ合成に関与するｐｍｘＡ、ｐｍｘＢ、ｐｍｘＣ、ｐｍｘＤ及びｐｍｘＥ遺伝子を含む、パエニバチルス・アルベイ株由来のクラスターの完全配列を表す、配列番号１０の配列、又は配列番号２９の配列を含む又はからなる核酸に関する。
【００６８】
下の表１は、本出願で参照される様々な核酸及びタンパク質の配列を示している：
【００６９】
【表１】
0006637904.tif 000002
0006637904.tif 000003
【００７０】
発現ベクター
本発明はまた、上に定義されるＰｍｘＡシンセターゼをコードする遺伝子、又は上に定義されるＰｍｘＡシンセターゼをコードする核酸、及び／又は上に定義されるＰｍｘＥシンセターゼをコードする遺伝子を含む発現ベクターに関する。
【００７１】
本発明の文脈において、用語「ベクター」、「発現ベクター」及び「プラスミド」は等価であり、分子生物学、遺伝子工学及び微生物学の分野における通常の受け入れに従って使用される。非常に簡単には、宿主細胞に収容された、上記宿主細胞の自然の染色体ＤＮＡとは異なる自己複製可能な非ウイルス性ＤＮＡ分子である。「ベクター」は、分子生物学及び遺伝子工学の従来技術によって得られ、１つ以上の外来ヌクレオチド配列が挿入された（又はクローニングされた）分子である。本発明は、外来ヌクレオチド配列の、宿主細胞による発現のためのベクターであって、
・複製起点、
・導入された遺伝子の発現を可能にする、例えば、適当なプロモーター、エンハンサー等のようなエレメント、
・その発現が望まれる少なくとも１つのヌクレオチド配列
を含むベクターに関する。
【００７２】
ベクター、より詳細には、ベクターが有する複製起点の選択は、それを収容する宿主細胞に依存する。宿主細胞の種類に応じて、ベクターの複数のコピー及び／又は複数の異なるベクターが同じ宿主細胞内に、同時に又は逐次に導入され得る。
【００７３】
ベクターの選択はまた、発現される核酸配列のサイズに依存する。具体的には、２０キロ塩基対より大きい配列では、大きな核酸配列（最大４０キロ塩基対）を含有することが可能なベクターであるフォスミドが好ましいであろう。また、各々が遺伝子セットの一部を含む複数のベクターを使用し、複数のベクターを同じ宿主細胞へ移入することも可能であり、これにより同じ菌株において遺伝子セット全体を発現させることが可能になる。
【００７４】
大きなサイズの配列を含有し得る他のベクターはコスミド及び細菌人工染色体（ＢＡＣ：ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ）である。
【００７５】
本発明の１つの好ましい態様によれば、発現ベクターは上に定義される遺伝子群の全体又は一部を含む。
【００７６】
本発明の別の好ましい態様によれば、発現ベクターは、特に、配列番号１０又は配列番号２９に示される配列を含む、上に定義される核酸の全体又は一部を含む。好ましくは、発現ベクターは、配列番号１０の配列を有する、パエニバチルス・アルベイ由来のｐｍｘＡ、ｐｍｘＢ、ｐｍｘＣ、ｐｍｘＤ及びｐｍｘＥ遺伝子を含む完全クラスターをコードするＤＮＡ配列の全てを含むフォスミドである。
【００７７】
ポリミキシン合成に関与する他の酵素
他の酵素は、ポリミキシン合成、特に、ポリミキシンＥ合成に関与する。これらは、ポリミキシンＥのペプチド鎖に主に組み込まれるＤａｂ残基の生合成を可能にする酵素と、そのペプチド部分への脂肪酸の結合を可能にする酵素である。
【００７８】
α，γ−ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）残基の生合成のための酵素は、同定され、実施例に記載するパエニバチルス・アルベイの細菌株から単離された。具体的には、この酵素のペプチド配列は、配列番号３１の配列に示されるペプチド配列を含む又はからなる。この酵素をコードする核酸は、配列番号３２の配列に示されるヌクレオチド配列を含む又はからなる。
【００７９】
好ましくは、トランスアミナーゼ活性を有するこの酵素は、ＰｍｘＡ、ＰｍｘＢ及びＰｍｘＥのシンセターゼと、好ましくは、更にＰｍｘＣ及びＰｍｘＤの輸送分子と組み合わせて、ポリミキシンＥを生産するように意図された微生物において発現され得る。
【００８０】
４３１個の残基を含むこのトランスアミナーゼは、下の表２で示されるように、他の微生物由来の類似の機能を示す酵素と配列相同性を有する：
【００８１】
【表２】
0006637904.tif 000004
【００８２】
また、ポリミキシンＥのペプチド鎖への脂肪酸の結合を可能にする酵素であり、それゆえにアシルトランスフェラーゼ活性を有する酵素も同定され、上記のパエニバチルス・アルベイの細菌株から単離された。
【００８３】
好ましくは、少なくとも１つのアシルトランスフェラーゼは、ＰｍｘＡ、ＰｍｘＢ及びＰｍｘＥのシンセターゼと、好ましくは、更にＰｍｘＣ及びＰｍｘＤの輸送分子と、より好ましくは、更にα，γ−ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）残基の生合成のための酵素と組み合わせて、ポリミキシンＥを生産するように意図された微生物において発現される。
【００８４】
あるいは、ポリミキシンＥのペプチド鎖への脂肪酸の結合はまた、当業者に周知の技術の１つに従って、化学的結合によって行い得る。
【００８５】
宿主細胞
用語「宿主細胞」又は「宿主微生物」は、形質転換された、すなわち、特に、対象となる配列を含む発現ベクターの形態の外来ＤＮＡが導入された細胞を表すために本発明の文脈において使用され、上記配列は、外来ＤＮＡから、このＤＮＡに対応するメッセンジャーＲＮＡ及びタンパク質を合成することが可能な、宿主細胞の細胞機構によって発現される。
【００８６】
本出願は、特に、上に定義される遺伝子もしくは遺伝子群、又は上に示される１つ以上の発現ベクターを導入することにより形質転換された微生物に関する。
【００８７】
本発明は、特に、
・上に定義されるＰｍｘＡシンセターゼをコードする遺伝子、又は
・上に定義されるＰｍｘＥシンセターゼをコードする遺伝子、又は
・上に定義されるＰｍｘＡシンセターゼをコードするＤＮＡ配列、特に、配列番号７又は配列番号２６に示される配列を含む発現ベクター
を導入することにより移入された微生物に関する。
【００８８】
本発明はまた、上に定義される遺伝子群、又は上に定義される、ｐｍｘＡ、ｐｍｘＢ及びｐｍｘＥ遺伝子の全てもしくは一部をコードする核酸、又は上に定義される、ｐｍｘＡ、ｐｍｘＢ及びｐｍｘＥ遺伝子の全てもしくは一部をコードする遺伝子を含む少なくとも１つの発現ベクターを導入することにより形質転換された微生物に関する。
【００８９】
本発明の１つの特定の態様によれば、微生物は、加えて、Ｄａｂ残基の生合成に関与する酵素をコードする少なくとも１つの核酸、特に、配列番号３２の配列を含む又はからなる配列を含む核酸を含むように形質転換される。
【００９０】
本発明の別の態様によれば、微生物は、加えて、ポリミキシンＥのペプチド鎖への脂肪酸の結合を触媒する、アシルトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする少なくとも１つの核酸を含むように形質転換される。
【００９１】
微生物の形質転換は、分子生物学実験室で一般的に使用される技術であり、この技術により、外来ＤＮＡを微生物へ導入することが可能である。様々な技術によって、微生物、特に、コンピテント細菌の形質転換が可能であり、それらの技術は全て当業者に周知である。特に、エレクトロポレーション、及び塩化カルシウム使用後の熱ショックを挙げることができる。
【００９２】
本発明の１つの好ましい態様では、形質転換された微生物において、導入された遺伝子又は遺伝子群が過剰発現される。
【００９３】
遺伝子の過剰発現は、この遺伝子の発現の増加、すなわち、細胞中での、この遺伝子によってコードされるメッセンジャーＲＮＡ及びタンパク質のより多くの生産によって定義され得る。そのタンパク質の発現は、特に、形質転換前の、この遺伝子を自然発現する細菌で観察される内因性発現のレベルと比べて、５０％、１００％、１５０％、２００％、又は更に、３００％増加するであろう。
【００９４】
遺伝子の過剰発現は、いくつかの方法で得ることができ、それらの方法は全て当業者に周知である。特に、遺伝子発現レベルを制御し、細胞中での遺伝子のコピー数を増加させるための強力なプロモーターの使用が挙げられる。好ましくは、使用されるベクターは、強力なプロモーターを含み、このプロモーターの制御下で遺伝子が挿入され、上記ベクターは宿主細胞中で高コピー数、特に、１０コピー、２０コピー、５０コピー又は１００コピーで存在するであろう。
【００９５】
当業者は、本発明による遺伝子（単数又は複数）を含むベクターの発現に最も好適な宿主微生物を選択する方法がわかるであろう。具体的には、グラム陽性菌が好ましい。特に好適な微生物は、バチルス属又はパエニバチルス属に属する細菌である。枯草菌及びパエニバチルス・ポリミキサの種がポリミキシンシンセターゼの発現及びポリミキシンＥの生産に特に好適である。パエニバチルス属、特に、パエニバチルス・アルベイの菌株、より詳細には、本発明者らによって自然環境から単離されたパエニバチルス・アルベイ株もまた、上に定義されるベクター又は核酸で形質転換される宿主微生物として使用され得る。最後に、合成細菌もまた、宿主細胞として、本発明の文脈において使用され得る。
【００９６】
ポリミキシンＥを生産するための方法
本出願はまた、ポリミキシンＥを生産するための方法であって、
・上に定義される形質転換された微生物を適当な無機培地中で培養する工程、及び
・その培養培地から、生産されたポリミキシンＥを精製する工程
を含む方法に関する。
【００９７】
用語「適当な無機培地」とは、微生物の増殖を可能にし、かつ特に、無機塩及び栄養素を含む培養培地を意味する。好ましい培地は次の特定の組成を有する：０．４５％（ｗ／ｖ）無水ＫＨ2ＰＯ4、１．１３％（ｗ／ｖ）Ｋ2ＨＰＯ4．３Ｈ2Ｏ、０．６％（ｗ／ｖ）（ＮＨ4）2ＳＯ4、０．６％（ｗ／ｖ）グルコース、０．００１％（ｗ／ｖ）チアミン、０．０２％（ｗ／ｖ）ＭｇＳＯ4．７Ｈ2Ｏ。この培地はまた、必要に応じて、ポリミキシン合成に必要な前駆体、特に、ジアミノ酪酸を含み得る。
【００９８】
本発明の１つの好ましい態様によれば、培養は、３０℃の温度で行われ、少なくとも２５時間継続する。
【００９９】
好ましくは、培養は、１Ｌフラスコ内の無機培地２００ｍｌ中で、振盪しながら、３０℃で３０時間行われる。
【０１００】
本発明はまた、ポリミキシンＥ変異体を生産するための方法であって、上に定義される微生物を適当な無機培地中で培養する工程、及びその培養培地から、ポリミキシンＥ変異体（単数又は複数）を精製する工程を含む方法に関する。
【０１０１】
本発明はまた、上記の生産方法によって得られるポリミキシンＥ変異体に関する。
【０１０２】
「ポリミキシンＥ変異体」は、ポリミキシンＥの構造（図１参照）から誘導された、例えば、１個以上の異なるアミノ酸を有し得るが、別の種類のポリミキシンに属するものとして分類されない分子を意味する。
【０１０３】
具体的には、パエニバチルス・アルベイ株ＢＬ−Ｒの培養培地中で検出される分子の種類は、次の構造差を有するポリミキシンＥ変異体である：３位の残基が、ポリミキシンＥの従来の構造で観察されるＬ−Ｄａｂ残基の代わりにＤ−Ｄａｂ残基であり得る。
【０１０４】
変異体形態は自然又は合成であり得る。用語「自然変異体」は、非形質転換微生物によって合成された変異体を意味することが意図され、用語「合成変異体」は、形質転換微生物によって合成された変異体形態を意味することが意図され、この形質転換微生物は自然状態では同定されていない。
【０１０５】
具体的には、ｐｍｘＡ、ｐｍｘＢ及びｐｍｘＥ遺伝子によってコードされるポリミキシンシンセターゼは、陽イオン性電荷がより低くかつそれゆえに人体への毒性がより低いポリミキシンＥ変異体を合成するために、ポリミキシンＥの組成の一部である特定のアミノ酸の結合に特異的となるように修飾され得る。
【０１０６】
これらのポリミキシンＥ変異体は、利点を有し、特に、ポリミキシンＥと比べて毒性が低い。
【０１０７】
更に、様々なポリミキシンＥ変異体の臨床使用により抗生物質耐性の発生を低減することが可能になる。
【０１０８】
Ｌ−Ｄａｂ残基の代わりにＤ−Ｄａｂ残基を含む変異体では、これらの分子の抗微生物活性が、従来のポリミキシン類で観察される抗微生物特性と比べて増加されることはほぼ確実である。
【０１０９】
本発明は、これらの変異体、更に、グラム陰性菌による細菌感染症の治療におけるこれらの使用に関する。
【０１１０】
以下の実施例により、特許請求する発明を例示するが、限定するものではない。
【実施例】
【０１１１】
実施例１．コリスチンの生産に関する遺伝子系の単離及び配列決定。
パエニバチルス・アルベイ種に属する、コリスチン（ポリミキシンＥ１及びＥ２）を生産する微生物（Ｂ−ＬＲ）を、自然環境から単離し、培養した。ゲノムＤＮＡライブラリーを、フォスミドベクター（９００クローン）を使用して大腸菌で構築した。コリスチンを合成する酵素をコードする遺伝子の探索は、縮重ＰＣＲによって行った。使用したプライマーは、コリスチンの構造を最も表しているアミノ酸（６個のアミノ酸／１２個）であるジアミノ酪酸（Ｄａｂ）の組込みにおいて特定されるドメインの増幅を目的として定義した。配列から対象となる３つのクローンを選択した（Ｒｏｃｈｅ  ＧＳ  ＦＬＸ）。得られた配列は５０ｋｂより大きくアセンブルすることができた。オープンリーディングフレームを求めた。Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥと称するそれらのうちの５つは、Ａ（１４．９ｋｂ）、Ｂ（３．３ｋｂ）、Ｃ（１．８ｋｂ）、Ｄ（１．７ｋｂ）及びＥ（１８．９ｋｂ）を有する約４１ｋｂのクラスターを表し、これは図２に表している。
【０１１２】
Ａ、Ｂ及びＥ遺伝子は、配列相同性により、シンセターゼをコードすると確認された。ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ研究により、これらのシンセターゼがコリスチンのアセンブリに関与することを予測することができた（ｈｔｔｐ：／／ｎｒｐｓ．ｉｎｆｏｒｍａｔｉｋ．ｕｎｉ−ｔｕｅｂｉｎｇｅｎ．ｄｅ／及びｈｔｔｐ：／／ｎｒｐｓ．ｉｇｓ．ｕｍａｒｙｌａｎｄ．ｅｄｕ／ｎｒｐｓ／）。Ｃ及びＤ遺伝子は、それらとしては、コリスチンに関する輸出及び生産微生物の耐性に関与し得た。
【０１１３】
【表３】
0006637904.tif 000005
【０１１４】
実施例２：ポリミキシン群に属する分子を生産する様々なパエニバチルス属菌株のアデニル化ドメインの比較。
ポリミキシン生産に関与する酵素は、非リボソームペプチドシンセターゼ（ＮＲＰＳ）ファミリーに属する。これらのシンセターゼは、ｍＲＮＡ鋳型の翻訳に依存せずに特定のペプチドを生産することが可能である。生産されたペプチド鎖の特異性は、アデニル化ドメインを構成するシンセターゼのアミノ酸の正確な配列に依存する。Ｂ−ＬＲのシンセターゼＡについては４つのアデニル化ドメインがｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで確認され、Ｂについては１つ、Ｅについては５つが確認された。各アデニル化ドメインは、伸長中に非リボソームペプチド中へ正確なアミノ酸を組み込む特異性に与える１０個のアミノ酸の署名を含有する。これらの署名はｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで確認され、次のウェブアドレスで利用可能なプログラムを使用して文献に記載されているものと比較した（表４）：ｈｔｔｐ：／／ｎｒｐｓ．ｉｎｆｏｒｍａｔｉｋ．ｕｎｉ−ｔｕｅｂｉｎｇｅｎ．ｄｅ／。
【０１１５】
Ｅ６８１株及びＡＴＣＣ２１８３０株は米国特許第８３２９４３０号明細書に記載されている。
【０１１６】
ＰＫＢ１株は、Ｓｈａｈｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．による論文（２０１１）に記載されている。
【０１１７】
Ｍ−１株は、Ｎｉｕ  ｅｔ  ａｌ．による論文（２０１３）に記載されている。
【０１１８】
【表４】
0006637904.tif 000006
0006637904.tif 000007
0006637904.tif 000008
【０１１９】
Ｂ−ＬＲのシンセターゼは、ＰｍｘＡシンセターゼの第２のアデニル化ドメイン及びＰｍｘＥシンセターゼの第３のドメインのレベルで異なる。
【０１２０】
既知タンパク質配列を有するＢＬ−Ｒ株由来のタンパク質配列との比較を下の表５に示している：
【０１２１】
【表５】
0006637904.tif 000009
【０１２２】
実施例３：ｐｍｘＥ突然変異体の構築及びそのコリスチン生産の解析。
ｐｍｘＤの終了部から始まり、ｐｍｘＥの開始部で終わる１６５０ｂｐの配列を選択し、増幅した。この配列は、特有のＳａｃＩＩ酵素制限部位を保有するという特殊性を有する。増幅した配列をｐＧＥＭ（登録商標）７Ｚプラスミドにクローニングした。アプラマイシン耐性をコードする遺伝子をＳａｃＩＩ制限部位に組み込んだ。この構築物をエレクトロポレーションによりＢ−ＬＲに導入した。二重組換えイベントを受けた突然変異体の選択を、アプラマイシンを補給した寒天培地上で培養することにより行った。突然変異体の上清の抗微生物活性(antiomicrobial activity)をＢ−ＬＲのものと比較した。突然変異体５の培養上清は、野生型Ｂ−ＬＲ菌のものよりも緑膿菌に対して活性が低い（図４）。
【０１２３】
実施例４．パエニバチルス属由来のＰｍｘＥシンセターゼの特徴
ＰｍｘＥシンセターゼのペプチド配列は、配列番号１４の配列に示される。エピマー化ドメインの配列は配列番号３０に示され、それは、配列番号１４の配列の残基Ｖａｌ3205〜Ｌｅｕ3665の間に含まれかつそれらを含む少なくとも４６１個の残基を含む。非リボソームペプチドの特徴の１つは、（Ｌ）立体異性を有するアミノ酸が存在することである。通常、（Ｌ）アミノ酸は、Ａドメインによって活性化され、その後、それにＡドメインが直接組み込まれる。しかしながら、この（Ｌ）型アミノ酸は、ペプチド結合形成前に任意のエピマー化ドメインによってその（Ｄ）型へと変換されることがある。ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ予測によれば、２つのエピマー化ドメインがｐｍｘクラスターのモジュール３及び６において確認された。これは、これらの部位に存在するアミノ酸での立体化学的変化が可能であることを示唆する。従って、３位（Ｄａｂ−３）及び６位（Ｌｅｕ−６）に存在するアミノ酸はそれらの（Ｄ）型でペプチド鎖中に組み込まれることになる。これは、全てのポリミキシンＥ類にその（Ｄ）型で組み込まれるＬｅｕ−６については知られているが、Ｄａｂ−３残基では珍しい。
【０１２４】
従って、本発明によるＰｍｘＥシンセターゼは、Ｌ−Ｄａｂ残基をその立体異性体（Ｄ）へ変換し、それを、合成されたポリミキシンＥ分子の３位（図１参照）に組み込むという特性を有する。
【０１２５】
３位にＤ−Ｄａｂ残基を含む上記ポリミキシンＥ分子はポリミキシンＥ変異体である。
【０１２６】
実施例５：前の実施例で特性評価したＰｍｘＡ、ＰｍｘＢ及びＰｍｘＥの組合せを発現する微生物によるポリミキシンＥの生産
微生物（Ｂ−ＬＲ）は、７位にロイシン、イソロイシン又はバリン残基を含むいくつかの種類のポリミキシンＥ分子を生産する。
【０１２７】
これらの様々な種類の分子は、以下に詳述するプロトコールに従って、質量分析により培養培地中で検出することができた。
【０１２８】
０．０００２％の硫酸コリスチン対照溶液は微生物培養培地（Ｍ６３Ｔ培地）で調製した。４つの画分を回収し、超高速液体クロマトグラフィー−タンデム質量分析法（ＵＰＬＣ−ＭＳ：Ｕｌｔｒａ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−ｔａｎｄｅｍ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）により分析した。陽性対照中に存在するポリミキシンＥ１及びＥ２に対応する２つのピークが４番目の抽出画分で見出された。
【０１２９】
Ｂ−ＬＲ株は、培養３０時間で抗微生物活性の最大レベルを示す。この時点で、培養上清を回収し、濾過した（０．２２μｍ）後、固体相抽出工程に供した。４番目の抽出画分のペプチドをＵＰＬＣ−ＭＳにより分析した。この４番目の抽出画分では１７の溶出ピークが観察された。これらの中で、保持時間１．６１分及び１．５２分を示す主ピークはそれぞれ、［Ｍ＋Ｈ］+での分子量１１６９．７７２７及び１１５５．７５５５を有する。これらは、それぞれ、既知ポリミキシンＥ１及びＥ２に対応し、これらのポリミキシンは、同じペプチド構造を有するが式Ｃ9Ｈ17Ｏ及びＣ8Ｈ15Ｏそれぞれのそれらの脂肪酸によって異なる。
【０１３０】
Ｇｏｖａｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）及びＤｅＣｒｅｓｃｅｎｚｏ  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）による論文で既に提示されているこれらの構造を確認するためにＭＳ／ＭＳ分析を行った。タンデム質量分析法（ＭＳ／ＭＳ）を用いて、ペプチド結合のフラグメンテーションを通じて一連のアミノ酸を決定する。この技術は、衝突セルによって分離された２つの分析部を組み合わせることにある。第１の工程は、四重極のイオン化源から得られるイオンを選択することにあり、これは親イオン又はプリカーサーイオンである。このイオンは、衝突セル内でアルゴン原子による衝撃の影響下でフラグメンテーションを受け、「娘」イオン又は「プロダクト」イオンを生じ、このイオンが飛行時間型（ＴＯＦ：ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ）分析部で分析され、保護される。ＴＯＦ分析部は、イオンが所定の距離を進むのにかかる時間を測定することに基づき、これによって、ｍ／ｚ比を検出し、それに従って対応するイオンの質量を決定することが可能になる。
【０１３１】
これらの実験の間、ロイシン残基とイソロイシン残基は分子量が同一であることから区別することはできない。
【０１３２】
Ｂ−ＬＲ上清から、７個のアミノ酸を含有する環を有する３つのデカペプチドを精製した。それらの分子量は１１４０．７４Ｄａ〜１１６８．７７Ｄａの範囲である。これらの分子の比較により、残基１〜６及び８〜１０のレベルでの相同性と、残基７のレベル及び脂肪酸のレベルでの違いが示される。これらの３つの分子は、ポリミキシン（コリスチン）Ｅ1、Ｅ2及びＶａｌ−コリスチンＥ2に相当する。これらの推定化学式を下の表６に示す。
【０１３３】
【表６】
0006637904.tif 000010
【０１３４】
コリスチンＥ1、コリスチンＥ2及びｖａｌ−コリスチンＥ2で得られた質量スペクトルは、それぞれ、［Ｍ＋２Ｈ］2+値５８５．３９、５７８．３８及び５７１．３８である。コリスチンＥ1及びＥ2の親イオンのフラグメンテーションにより、アミノ酸断片の喪失によって生成されるｍ／ｚ  ８２９、７２８、６２８、４２７、３２７及び２２７の娘イオンが生じている（図６及び図７）。ｖａｌ−コリスチンＥ2の親イオンのフラグメンテーションにより、この場合もアミノ酸断片の喪失によって生成されるｍ／ｚ  ８１５、７１４、６１４、５１４、４１３、３１３及び２１３の娘イオンが生じている（図８）。
【０１３５】
得られたこれらの娘イオンは、コリスチンＥ1、Ｅ2及びＶａｌ−Ｅ2のフラグメンテーション中の、文献（Ｇｏｖａｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．、２００２；ＤｅＣｒｅｓｃｅｎｚｏ  ｅｔ  ａｌ．、２００７）に記載されているものと同一である。コリスチンＥ1及びＥ2は同じアミノ酸配列を有するが脂肪酸のレベルでのＣＨ2の喪失に相当する１４Ｄａの分子量差がある。
【０１３６】
結論として、これらの結果は、Ｂ−ＬＲ株がコリスチンＥ1、コリスチンＥ2及びバリン−コリスチンＥ2（Ｖａｌ−Ｅ2）を生産することを示している。
【０１３７】
実施例６：枯草菌におけるパエニバチルス属由来のｐｍｘＡ、Ｂ及びＥ遺伝子の異種発現並びにコリスチンの検出
バチルス属はＢ−ＬＲに系統発生的に近い異種発現宿主である。コリスチン生産クラスターの全てを収容するように操作されたフォスミドを、エレクトロポレーションによってレシピエント株に移入する。形質転換株は、抗生物質を補給した寒天培地上で選択する。コリスチン生産は、ジアミノ酪酸（合成前駆体）を補給した液体培地中で行う。培養上清からバイオマスを分離した後、コリスチンが検出される。抽出することにより、質量分析によるその特性評価の前にコリスチンを単離することができる。
【０１３８】
参考文献
特許文献
ＵＳ  ８  ３２９  ４３０
ＷＯ  １９９８／０２０８３６
ＷＯ  ２００９／０９８３５７
非特許文献
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Ｌｅｅ  ＤＬ，  Ｐｏｗｅｒｓ  ＪＰ，  Ｐｆｌｅｇｅｒｌ  Ｋ，  Ｖａｓｉｌ  ＭＬ，Ｈａｎｃｏｃｋ  ＲＥ，Ｈｏｄｇｅｓ  ＲＳ．Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ  Ｄ−ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ  ｏｎ  ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｅｔａ−ｓｈｅｅｔ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙ  ｉｎ  ｃｙｃｌｉｃ  １４−ｒｅｓｉｄｕｅ  ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎａｌｏｇｓ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｏ  ｇｒａｍｉｃｉｄｉｎ  Ｓ．Ｊ  Ｐｅｐｔ  Ｒｅｓ．２００４  Ｆｅｂ；６３（２）：６９−８４．
ＤｅＣｒｅｓｃｅｎｚｏ  Ｈｅｎｒｉｋｓｅｎ，Ｄ．Ｒ．Ｐｈｉｌｌｉｐｓ  ａｎｄ  Ｊ．Ｂ．Ｄｏｒａｎ  Ｐｅｔｅｒｓｏｎ．Ｐｏｌｙｍｙｘｉｎ  Ｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｐ．ａｍｙｌｏｌｙｔｉｃｕｓ  Ｅ．Ｌｅｔｔｅｒｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  ４５，Ｉｓｓｕｅ  ５，ｐａｇｅｓ  ４９１-４９６，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  ２００７．
本発明の好ましい態様は、下記の通りである。
〔１〕４つのアデニル化部位を含む、ポリミキシンＥ合成に関与するＰｍｘＡシンセターゼであって、第２のアデニル化部位が、配列番号１：
0006637904.tif 000011
のペプチド配列と少なくとも９０％の同一性を有することを特徴とし、
下線が施されたアミノ酸ＤＧＦＦＬＧＶＶＹＫは保存され、かつロイシン、イソロイシン又はバリン残基に特異的な結合ポケットを形成している、ＰｍｘＡシンセターゼ。
〔２〕以下のアミノ酸：
ロイシン残基に特異的な、ＤＡＷＩＶＧＡＩＶＫ（配列番号２）、
ロイシン、イソロイシン又はバリン残基に特異的な、ＤＧＦＦＬＧＶＶＹＫ（配列番号３）、
ジアミノ酪酸残基に特異的な、ＤＶＧＥＩＳＡＩＤＫ（配列番号４）、
ジアミノ酪酸残基に特異的な、ＤＶＧＥＩＳＡＩＤＫ（配列番号５）、
を含む４つの特異的な結合ポケットを含むことを特徴とする、前記〔１〕に記載のＰｍｘＡシンセターゼ。
〔３〕配列番号６のペプチド配列を含み、好ましくは、配列番号２５のペプチド配列を含むことを特徴とする、前記〔１〕に記載のＰｍｘＡシンセターゼ。
〔４〕５つのアデニル化部位及び１つのエピマー化部位を含む、ポリミキシンＥ合成に関与するＰｍｘＥシンセターゼであって、前記エピマー化部位が、配列番号３０のペプチド配列と少なくとも９０％の同一性を有することを特徴とする、ＰｍｘＥシンセターゼ。
〔５〕配列番号７のヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有する、前記〔１〕〜〔３〕のいずれか一項に記載のポリミキシンＥ合成に関与するシンセターゼをコードする、オープンリーディングフレームを含む核酸であって、ただし、前記配列番号１の配列の前記下線が施されたアミノ酸ＤＧＦＦＬＧＶＶＹＫをコードするヌクレオチドが保存されている、核酸。
〔６〕前記〔１〕〜〔３〕のいずれか一項に記載のＰｍｘＡシンセターゼをコードする遺伝子と、ＰｍｘＢ及びＰｍｘＥシンセターゼをそれぞれコードする遺伝子とを含む、ポリミキシンＥ合成に関与する酵素をコードする遺伝子群。
〔７〕ＰｍｘＣ及びＰｍｘＤ輸送タンパク質をそれぞれコードする遺伝子も含むことを特徴とする、前記〔６〕に記載の遺伝子群。
〔８〕配列番号７の配列と少なくとも９０％の同一性を有するｐｍｘＡ遺伝子であって、ただし、配列番号１の配列の下線が施されたアミノ酸ＤＧＦＦＬＧＶＶＹＫをコードするヌクレオチドが保存されている、ｐｍｘＡ遺伝子と、
配列番号８の配列と少なくとも９０％の同一性を有するｐｍｘＢ遺伝子と、
配列番号９の配列と少なくとも９０％の同一性を有するｐｍｘＥ遺伝子と
を含む、前記〔６〕に記載の遺伝子群。
〔９〕ポリミキシンＥ合成に関与する遺伝子群を含む、配列番号１０の配列又は配列番号２９の配列の核酸。
〔１０〕前記〔１〕〜〔３〕のいずれか一項に記載のＰｍｘＡシンセターゼをコードする遺伝子、又は前記〔５〕に記載の核酸、及び／又は前記〔４〕に記載のＰｍｘＥシンセターゼをコードする遺伝子を含む発現ベクター。
〔１１〕前記〔６〕〜〔８〕のいずれか一項に記載の遺伝子群又は前記〔９〕に記載の核酸の全体又は一部を含む発現ベクター。
〔１２〕前記〔１〕〜〔３〕のいずれか一項に記載のＰｍｘＡシンセターゼをコードする遺伝子、又は前記〔４〕に記載のＰｍｘＥシンセターゼをコードする遺伝子、又は前記〔５〕に記載の核酸、又は前記〔１０〕に記載のベクターを導入することにより形質転換された微生物。
〔１３〕前記〔６〕〜〔８〕のいずれか一項に記載の遺伝子群、又は前記〔９〕に記載の核酸、又は前記〔１１〕に記載の少なくとも１つのベクターを導入することにより形質転換された微生物。
〔１４〕前記遺伝子又は前記遺伝子群が過剰発現することを特徴とする、前記〔１２〕又は〔１３〕に記載の形質転換された微生物。
〔１５〕バチルス属又はパエニバチルス属に属することを特徴とする、前記〔１２〕〜〔１４〕のいずれか一項に記載の形質転換された微生物。
〔１６〕ポリミキシンＥを生産するための方法であって、前記〔１２〕〜〔１５〕のいずれか一項に記載の微生物を適当な無機培地中で培養する工程、及びその培養培地から、生産されたポリミキシンＥを精製する工程を含む、方法。
〔１７〕前記培養が３０℃の温度で行われ、少なくとも２５時間継続することを特徴とする、前記〔１６〕に記載のポリミキシンＥ生産方法。
〔１８〕ポリミキシンＥ変異体を生産するための方法であって、前記〔１２〕〜〔１５〕のいずれか一項に記載の微生物を適当な無機培地中で培養する工程、及びその培養培地から、ポリミキシンＥ変異体（単数又は複数）を精製する工程を含む、方法。
〔１９〕前記〔１８〕に記載の生産方法によって得られるポリミキシンＥ変異体。
〔２０〕グラム陰性菌による細菌感染症の治療におけるポリミキシンＥ変異体の使用のための、前記〔１９〕に記載のポリミキシンＥ変異体。
【図１】
0006637904.tif 000014
【図２】
0006637904.tif 000015
【図３】
0006637904.tif 000016
【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
0006637904.tif 000019
【図６】
0006637904.tif 000020
【図７】
0006637904.tif 000021
【図８】
0006637904.tif 000022
【配列表】
0006637904000001.app