(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
８０％（ｗ／ｗ）を超えるＩ型コラーゲン線維または束の第１および第２の群を含むコラーゲン膜であって、ここで、第１の群におけるＩ型コラーゲン線維または束は第１の方向に優勢に伸展し、第２の群におけるＩ型コラーゲン線維または束は第２の方向に優勢に伸展し、ここで、第１および第２の方向は互いに異なっており、第１の群における線維または束は第２の群における線維または束と交互配置になっている、または混在しており；ここで、前記コラーゲン膜は、２０Ｎを超える最大引張荷重強度を有し、ここで、前記膜は２つの区別可能な表面である第１の表面と第２の表面を有し；ここで、前記第１の表面は緻密なコラーゲン束と前記第２の表面と比較して滑らかなテクスチャ−を含み、前記第２の表面は疎性コラーゲン線維の粗く多孔質の表面を含み；ここで、前記膜は下記の工程（ｉ）〜（ｉｖ）を含む方法、すなわち、
（ｉ）コラーゲン含有組織を単離し、それをエタノール溶液中でインキュベートする工程と；
（ｉｉ）工程（ｉ）からのコラーゲン含有組織を、無機塩およびアニオン性界面活性剤を含む第１の溶液中でインキュベートして、その中に含有される非コラーゲン性タンパク質を変性させる工程と；
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）において生成されたコラーゲン含有組織を、無機酸を含む第２の溶液中で、前記材料中のコラーゲンが変性するまでインキュベートする工程と；
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）において生成されたコラーゲン含有組織を、無機酸を含む第３の溶液中で、同時に機械的刺激を加えて、前記コラーゲン含有組織中のコラーゲン束を整列させるのに十分な時間にわたってインキュベートする工程と；を含み、ここで、前記機械的刺激は、前記コラーゲン含有組織に対して周期的に張力を印加すること、を含む方法によって生成された、コラーゲン膜。
【請求項２】
前記第１と第２の方向は互いに約９０°である、請求項１に記載のコラーゲン膜。
【請求項３】
前記膜は、厚さ約１０μｍ乃至４００μｍである、請求項１または請求項２に記載のコラーゲン膜。
【請求項４】
前記膜は、厚さ約５０μｍ乃至２００μｍである、請求項１〜３の何れか一項に記載のコラーゲン膜。
【請求項５】
前記膜は、厚さ約１００μｍである、請求項１〜４の何れか一項に記載のコラーゲン膜。
【請求項６】
２５Ｎを超える最大引張荷重強度を有する、請求項１〜５の何れか一項に記載のコラーゲン膜。
【請求項７】
４０Ｎを超える最大引張荷重強度を有する、請求項１〜６の何れか一項に記載のコラーゲン膜。
【請求項８】
８０Ｎを超える最大引張荷重強度を有する、請求項１〜７の何れか一項に記載のコラーゲン膜。
【請求項９】
１００Ｎを超える最大引張荷重強度を有する、請求項１〜８の何れか一項に記載のコラーゲン膜。
【請求項１０】
１４０Ｎを超える最大引張荷重強度を有する、請求項１〜９の何れか一項に記載のコラーゲン膜。
【請求項１１】
３００ＭＰａを超える弾性率を有する、請求項１〜１０の何れか一項に記載のコラーゲン膜。
【請求項１２】
５００ＭＰａを超える弾性率を有する、請求項１〜１１の何れか一項に記載のコラーゲンン膜。
【請求項１３】
８５％未満の最大負荷で伸展を有する、請求項１〜１２の何れか一項に記載のコラーゲン膜。
【請求項１４】
８０％未満の最大負荷で伸展を有する、請求項１〜１３の何れか一項に記載のコラーゲン膜。
【請求項１５】
８５％（ｗ／ｗ）を超えるＩ型コラーゲン線維または束を含む、請求項１〜１４の何れか一項に記載のコラーゲン膜。
【請求項１６】
９０％（ｗ／ｗ）を超えるＩ型コラーゲン線維または束を含む、請求項１〜１５の何れか一項に記載のコラーゲン膜。
【請求項１７】
請求項１〜１６の何れか一項に記載のコラーゲン膜を含むデバイス。
【請求項１８】
請求項１〜１６の何れか一項に記載のコラーゲン膜を密閉して含む容器であって、前記コラーゲン膜が無菌である容器。
【請求項１９】
請求項１７に記載のデバイスを密閉して含む容器であって、前記デバイスが無菌である容器。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定の機械的特性を有するコラーゲン膜を生成する方法に関する。特に、本発明は、コラーゲン膜を生成する方法であって、具体的な機械的特性を生成するために十分な無機塩およびアニオン性界面活性剤でコラーゲン含有組織を処置することを含む方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
コラーゲンおよびその派生製品は、コラーゲン含有の埋め込み可能な足場の生成において広範囲にわたり使用されている。コラーゲンは、低抗原性を有し、生分解性であり、良好な、機械的、止血および細胞結合特性を有する材料として、よく認識されており（Ｓｈｅｕら、（２００１）、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、２２（１３）：１７１３〜９；Ｐｉｅｐｅｒら、（２００２）、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、２３（１５）：３１８３〜９２；Ｃｈｖａｐｉｌら、（１９７３）、Ｉｎｔ  Ｒｅｖ  Ｃｏｎｎｅｃｔ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓ．、６：１〜６１；Ｐａｃｈｅｎｃｅ（１９９６）、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．；３３（１）：３５〜４０；およびＬｅｅら、（２００１）、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ．；２２１（１〜２）：１〜２２）、これを使用して、組織を一時的にまたは恒久的に置きかえるまたは修復することが可能になる。コラーゲン足場は、日常的に使用される基質であり、この上で、細胞は増殖し分化することができ、最終的には正常組織によって置きかえられる。
【０００３】
しかしながら、コラーゲン含有足場は、埋め込まれた際に炎症および／または線維症を誘発し得ることも周知である。たとえば、Ｗｉｓｎｉｅｗｓｋｉら、（２０００）、Ｊ．Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ．；３６６（６〜７）（６１１〜６２１頁）を参照されたい。結果として、コラーゲン含有足場は、典型的には、化学的にまたは物理的に処置されて（架橋されて）、機械的強度および酵素的（コラゲナーゼ）分解への耐性を与える。コラーゲン含有材料に使用されてきた数種の架橋戦略がある。グルタルアルデヒドが最も広く使用されている架橋剤である（Ｓｈｅｕら、（２００１）上記；Ｂａｒｂａｎｉら、（１９９５）、Ｊ  Ｂｉｏｍａｔｅｒ．Ｓｃｉ．Ｐｏｌｙｍ編；７（６）：４６１〜９）。しかしながら、グルタルアルデヒドおよびその反応生成物はインビボでの細胞毒性に関連し、これは、架橋副産物の存在および酵素的分解中におけるグルタルアルデヒド連結コラーゲンペプチドの放出に起因するものである（Ｈｕａｎｇ−Ｌｅｅら、（１９９０）、Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍａｔｅｒ  Ｒｅｓ．、２４（９）：１１８５〜２０１；ｖａｎ  Ｌｕｙｎら、（１９９２）、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、１３（１４）：１０１７〜２４。
【０００４】
グルタルアルデヒド架橋コラーゲンのインビボ細胞毒性を回避するために、数種の代替化合物が、潜在的なコラーゲン架橋剤として検討されており（Ｋｈｏｒ（１９９７）、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、１８（２）：９５〜１０５；Ｓｕｎｇら（１９９６）、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ；１７（１４）：１４０５〜１０）、たとえばポリエポキシ、ヘキサメチレンジイソシアネート（ＨＭＤＩ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノ−プロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）および紫外線（ＵＶ）またはガンマ線照射である。Ｋｏｏｂら、（２００１）、Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍａｔｅｒ  Ｒｅｓ．、５６（１）：３１〜４８は、ノルジヒドログアヤレト酸（ＮＤＧＡ）が合成コラーゲン線維の機械的特性を著しく改善させることを示した。加えて、彼らは、ＮＤＧＡ架橋コラーゲン線維が異物応答を引き出さず、免疫反応を６週間インビボで刺激しないことを示した。
【０００５】
しかしながら、これらのすべての進歩にもかかわらず、架橋コラーゲンおよびネイティブコラーゲンを使用することの問題は残っている。したがって、下記の特性：ａ）組織の集積および血管新生に有利に働くような手法で相互接続する細孔；ｂ）正常組織が足場を最後には置きかえるような生分解性および／または生体再吸収性（bioresorbability）；
ｃ）細胞接着、増殖および分化を促進する表面化学；
ｄ）強度および柔軟性；ならびに
ｅ）低抗原性
を有するコラーゲン含有足場の必要性は依然としてある。
【０００６】
置きかえコラーゲン含有組織の必要性が特にある１つの分野は、鼓膜（ＴＭ）穿孔の修復である。治療しないまま放置すると、ＴＭ穿孔は、難聴、再発性耳漏、中耳炎の可能性および仮性真珠腫をもたらし得る（Ｐａｒｅｋｈら、（２００９）、Ｔｈｅ  Ｌａｒｙｎｇｏｓｃｏｐｅ；１１９：１２０６〜１２１３）。ほとんどの急性ＴＭ穿孔は自然に治癒するが、大きなまたは慢性ＴＭ穿孔、とりわけ慢性化膿性中耳炎由来のものは、多くの場合、治癒に失敗し、移植術を必要とする場合がある（Ｌｉｎｄｅｍａｎら、（１９８７）、Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌｏｇｙ−Ｈｅａｄ  ａｎｄ  Ｎｅｃｋ  Ｓｕｒｇｅｒｙ；１１３：１２８５）。
【０００７】
現在のところ、外科的方法、たとえば鼓膜形成術が、ＴＭ穿孔に最も有効かつ信頼できる治療とみなされている（Ｓｈｅｅｈｙら、（１９８０）、Ｔｈｅ  Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ
ｏｔｏｌｏｇｙ，ｒｈｉｎｏｌｏｇｙ，ａｎｄ  ｌａｒｙｎｇｏｌｏｇｙ；８９：３３１；Ｋａｒｅｌａら、（２００８）、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｏｔｏ−Ｒｈｉｎｏ−Ｌａｒｙｎｇｏｌｏｇｙ；２６５：１０３９〜１０４２）。種々の自家移植片および同種移植片、たとえば筋膜、軟骨、軟骨膜およびアロダームが使用されてきたが、何れも特有の限界がある（Ｌｅｖｉｎら、（２００９）、Ｅｘｐｅｒｔ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｍｅｄｉｃａｌ  ｄｅｖｉｃｅｓ；６：６５３〜６６４）。たとえば、「ゴールドスタンダード」とみなされている側頭筋膜は、ドナー部位罹患率、追加の切開、長い手術時間および再手術症例における材料の不足に関連する（Ｌｅｖｉｎら、（２００９）、上記）。現時点では、Ｇｅｌｆｏａｍ（登録商標）（Ａｂｂｅｎｈａｕｓ、（１９７８）、Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌｏｇｙ；８６：ＯＲＬ４８５）、紙パッチ（Ｇｏｌｚら、（２００３）、Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌｏｇｙ−−Ｈｅａｄ  ａｎｄ  Ｎｅｃｋ  Ｓｕｒｇｅｒｙ；１２８：５６５）およびヒアルロン酸誘導体（Ｔｅｈら、（２０１１）、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｏｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ；１〜１４）を包含する様々な異種移植片および合成材料が、ＴＭの再生を支援するための好適な足場として調査されている。しかしながら、これらの何れかを各種の穿孔のための最適な材料であると裏付けるための証拠はほとんどない。その上、数種の市販の異種移植片、たとえばブタ小腸粘膜下組織は、異種ＤＮＡ材料を含有し、セロトニンを包含する残存異種細胞（xenocellular）成分に起因する炎症応答を呼び起こす。加えて、合成材料は非生分解性であり、それらの生物力学的および材料特性は、正常なＴＭと比較すると異なり、これは長期にわたる聴覚機能に影響を及ぼし得る（Ｌｅｖｉｎら、（２００９）、上記）。それ故、治癒および聴覚の改善を達成するより良好な材料が絶えず探し求められている。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、埋め込まれた際に、他のコラーゲン含有組織と比較して炎症および／または線維症が低減されたコラーゲン含有組織を生成する方法を提供する。いくつかの態様において、コラーゲン含有組織は架橋されていない。
【０００９】
したがって、第１の側面において、本発明は、コラーゲン膜を生成する方法であって、（ｉ）コラーゲン含有組織を単離し、それをエタノール溶液中でインキュベートする工程と；
（ｉｉ）工程（ｉ）からのコラーゲン含有組織を、無機塩およびアニオン性界面活性剤を含む第１の溶液中でインキュベートして、その中に含有される非コラーゲン性タンパク質を変性させる工程と；
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）において生成されたコラーゲン含有組織を、無機酸を含む第２の溶液中で、前記材料中のコラーゲンが変性するまでインキュベートする工程と；（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）において生成されたコラーゲン含有組織を、無機酸を含む第３の溶液中で、同時に機械的刺激を加えて、前記コラーゲン含有組織中のコラーゲン束を整列させるのに十分な時間にわたってインキュベートする工程と
を含み、
ここで、機械的刺激は、コラーゲン含有組織に対して周期的に張力を印加することを含む、方法を提供する。
【００１０】
ルイス酸と複合体を形成することができる限り、いかなる無機塩を第１の溶液において使用してもよいことが分かるであろう。いくつかの態様において、無機塩は、塩化トリメチルアンモニウム、塩化テトラメチルアンモニウム、塩化ナトリウム、塩化リチウム、過塩素酸塩およびトリフルオロメタンスルホン酸塩からなる群から選択される。他の態様において、無機塩は塩化リチウム（ＬｉＣｌ）である。
【００１１】
任意の数のアニオン性界面活性剤を第１の溶液において使用してもよいが、いくつかの態様において、アニオン性界面活性剤は、アルキルサルフェート、アルキルエーテルサルフェート、アルキルスルホネートおよびアルキルアリールスルホネートからなる群から選択される。特に有用なアニオン性界面活性剤は、アルキルスルホネート、たとえばドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を包含する。
【００１２】
いくつかの態様において、第１の溶液は、約１％（ｖ／ｖ）のＳＤＳおよび約０．２％（ｖ／ｖ）のＬｉＣｌを含む。
【００１３】
いくつかの態様において、第２の溶液中の無機酸は約０．５％（ｖ／ｖ）のＨＣｌを含み、一方、第３の溶液中の無機酸は約１％（ｖ／ｖ）のＨＣｌを含む。
【００１４】
３つの工程のそれぞれにおけるインキュベーション期間は、（ｉ）コラーゲン含有組織の種類；（ｉｉ）無機塩／酸および／またはアニオン性界面活性剤の種類；（ｉｉｉ）使用される各無機塩／酸および／またはアニオン性界面活性剤の強度（濃度）ならびに（ｉｖ）インキュベーションの温度に応じて変動することが、当業者には分かるであろう。いくつかの態様において、工程（ｉ）におけるインキュベーション期間は少なくとも８時間である。他の態様において、工程（ｉｉ）におけるインキュベーション期間は６０分未満であり、一方、他の態様において、工程（ｉｉｉ）におけるインキュベーション期間は少なくとも２０時間である。
【００１５】
いくつかの態様において、工程（ｉｉ）におけるインキュベーションは約４℃である。
他の態様において、工程（ｉｉ）におけるインキュベーションを少なくとも１２時間にわたって行う。
【００１６】
いくつかの態様において、第２の溶液は約０．５％（ｖ／ｖ）のＨＣｌを含む。
【００１７】
いくつかの態様において、工程（ｉｉｉ）におけるインキュベーションを約３０分間にわたって行う。他の態様において、工程（ｉｉｉ）におけるインキュベーションを振盪しながら行う。
【００１８】
いくつかの態様において、第３の溶液は約１％（ｖ／ｖ）のＨＣｌ溶液を含む。
【００１９】
いくつかの態様において、工程（ｉｖ）におけるインキュベーションを、約１２から３６時間にわたって、好ましくは約２４時間にわたって行う。他の態様において、工程（ｉｖ）におけるインキュベーションを振盪しながら行う。
【００２０】
いくつかの態様において、本発明の方法は、前記コラーゲン含有組織の約０．５％（ｖ／ｖ）のＮａＯＨとのインキュベーションを含む、工程（ｉｉｉ）と工程（ｉｖ）との間の中和工程をさらに含む。
【００２１】
いくつかの態様において、本発明の方法は、工程（ｉｖ）からのコラーゲン含有組織をアセトンとともにインキュベートし、次いでコラーゲン含有組織を乾燥させることを含む工程（ｖ）をさらに含む。
【００２２】
いくつかの態様において、本発明の方法は、工程（ｉｉ）と（ｉｉｉ）との間および／または工程（ｉｉｉ）と（ｉｖ）との間に、コラーゲン含有組織をグリセロールと接触させて、脂肪および／または血管の除去を視覚化し促進する工程をさらに含む。
【００２３】
グリセロールを、コラーゲン含有組織と、脂肪および／または血管の除去を容易にするであろう任意の時間にわたって接触させてもよい。いくつかの態様において、接触時間は少なくとも１０分間である。
【００２４】
いくつかの態様において、本発明の方法は、工程（ｉｉ）と（ｉｉｉ）との間および／または工程（ｉｉｉ）と（ｉｖ）との間に、コラーゲン含有組織の洗浄工程をさらに含む。工程（ｉｉ）と（ｉｉｉ）との間に使用される洗浄工程の目的は、変性タンパク質を除去することである。したがって、変性タンパク質を除去することができる任意の洗浄溶液が使用され得る。いくつかの態様において、工程（ｉｉ）と（ｉｉｉ）との間に使用される洗浄溶液は、アセトンである。
【００２５】
アセトンによる洗浄の後、コラーゲン含有組織を滅菌水でさらに洗浄する。
【００２６】
いくつかの態様において、コラーゲン含有組織を、ＮａＯＨ：ＮａＣｌ溶液中でさらに洗浄する。コラーゲン含有組織をＮａＯＨ：ＮａＣｌで洗浄したら、次いで好ましくはそれを滅菌水で洗浄する。
【００２７】
いくつかの態様において、工程（ｉｖ）の後、コラーゲン含有組織を第１の溶液でさらに洗浄する。
【００２８】
コラーゲン含有組織は、哺乳類動物から単離された任意の組織であってよいことが、当業者には分かるであろう。しかしながら、コラーゲン含有組織が強靱結合組織を含むことも分かるであろう。いくつかの態様において、コラーゲン含有組織を、ヒツジ、雌ウシ、ブタまたはヒトから単離する。好ましくは、コラーゲン含有組織をヒトから単離する。
【００２９】
いくつかの態様において、コラーゲン含有組織は自家性である。
【００３０】
第２の側面において、本発明は、第１の側面の方法によって生成されたコラーゲン膜であって、編み構造および３００ＭＰａを超える弾性率を有する、８０％（ｗ／ｗ）を超えるＩ型コラーゲン線維または束を含む、方法によって生成された膜を提供する。
【００３１】
いくつかの態様において、コラーゲン膜は、４００ＭＰａを超える、好ましくは５００ＭＰａを超える弾性率を有するであろう。
【００３２】
コラーゲン膜はまた、８５％未満、好ましくは８０％未満の最大負荷で伸展を有するであろう。
【００３３】
第３の側面において、本発明は、人間または動物の体または組織への埋め込み用のデバイスを調製するための方法であって、コラーゲン膜を前記デバイス上に載置することを含み、前記コラーゲン膜は、
（ｉ）コラーゲン含有組織を単離し、それをエタノール溶液中でインキュベートすること；
（ｉｉ）工程（ｉ）からのコラーゲン含有組織を、無機塩およびアニオン性界面活性剤を含む第１の溶液中でインキュベートして、その中に含有される非コラーゲン性タンパク質を変性させること；
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）において生成されたコラーゲン含有組織を、無機酸を含む第２の溶液中で、前記材料中のコラーゲンが変性するまでインキュベートすること；ならびに（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）において生成されたコラーゲン含有組織を、無機酸を含む第３の溶液中で、同時に機械的刺激を加えて、前記コラーゲン含有組織中のコラーゲン束を整列させるのに十分な時間にわたってインキュベートすること
を含み、
ここで、機械的刺激は、コラーゲン含有組織に対して周期的に張力を印加することを含む方法によって生成される、方法を提供する。
【００３４】
第４の側面において、本発明は、人間または動物の体または組織への埋め込みのために生体適合性が強化されたデバイスであって、
（ｉ）コラーゲン含有組織を単離し、それをエタノール溶液中でインキュベートすること；
（ｉｉ）工程（ｉ）からのコラーゲン含有組織を、無機塩およびアニオン性界面活性剤を含む第１の溶液中でインキュベートして、その中に含有される非コラーゲン性タンパク質を変性させること；
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）において生成されたコラーゲン含有組織を、無機酸を含む第２の溶液中で、前記材料中のコラーゲンが変性するまでインキュベートすること；ならびに（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）において生成されたコラーゲン含有組織を、無機酸を含む第３の溶液中で、同時に機械的刺激を加えて、前記コラーゲン含有組織中のコラーゲン束を整列させるのに十分な時間にわたってインキュベートすること
を含み、
ここで、機械的刺激は、コラーゲン含有組織に対して周期的に張力を印加することを含む方法によって生成されたコラーゲン膜を含む、デバイスを提供する。
【００３５】
生成されたら、本発明の方法によって生成されたコラーゲン膜を使用して、種々の組織欠損を修復することができる。
【００３６】
したがって、第５の側面において、本発明は、哺乳類動物における組織欠損の修復のための、第１もしくは第２の側面によるコラーゲン膜または第４の側面によるデバイスの使用を提供する。
【００３７】
第６の側面において、本発明は、哺乳類動物対象における組織欠損を治療する方法であって、第１もしくは第２の側面によるコラーゲン膜または第４の側面によるデバイスを前記組織欠損に挿入する工程を含む方法を提供する。
【００３８】
本発明の方法を使用して、最終用途に応じて種々の厚さのコラーゲン膜を生成することができる。たとえば、非ヒト動物における鼓膜の修復において使用するための膜は厚さ５０μｍであるかもしれず、一方、ヒトにおける鼓膜の修復は厚さ１００μｍであるかもしれない。したがって、種々の膜厚が想定される。
【００３９】
第７の側面において、本発明は、少なくとも１０μｍである、第１の側面の方法によって生成されたコラーゲン膜を提供する。好ましくは、膜は、厚さ約１０μｍ乃至４００μｍである。より好ましくは、厚さ５０μｍ乃至２００μｍである。いくつかの態様において、本発明のコラーゲン膜は、厚さ約１００μｍである。
【００４０】
第８の側面において、本発明は、鼓膜穿孔を修復する方法であって、第１もしくは第２の側面によるコラーゲン膜または第４の側面によるデバイスを、前記鼓膜穿孔内にまたは隣接して挿入する工程を含む方法を提供する。
【００４１】
いくつかの態様において、第１または第２の側面の方法は、コラーゲン含有組織の架橋が起こらないという但し書きを有する。いくつかの態様において、第１または第２の側面の方法は、グルタルアルデヒドが本発明の方法において使用されないという但し書きを有する。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】図１は、本発明の方法によって生成されたコラーゲン膜（ここではＡＣＳと称されるＴｙｍｐａｃｏｌ（商標））の表面モルフォロジーを他の膜と比較して示す。走査電子顕微鏡は、３つの膜の表面モルフォロジーを示す（パネルＡ〜Ｃ；×５００、Ｄ；×２００）。Ｔｙｍｐａｃｏｌ（商標）（図１においてはＡＣＳと称される）は、２つの区別可能な表面、緻密なコラーゲン束を特色とする滑らかな表面（パネルＡ）および疎性コラーゲン線維の粗く多孔質の表面（パネルＢ）を保有する。紙パッチ（膜）表面は、小細孔がほとんどなく不均等である（パネルＣ）。Ｇｅｌｆｏａｍ（登録商標）は、様々なサイズの実質的な細孔を示す（パネルＤ）。尺度：５００μｍ。
【図２】図２は、本発明の方法によって生成されたコラーゲン膜の走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像（×１００）を示す。
【図３】図３は、市販の生体足場（「Ｂｉｏ−ｇｉｄｅ（商標）」）Ｌｕｉｔｐｏｌｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ、Ｓｈｉｒｌｅｙ、ＮＹ、ＵＳＡの走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像（×２００）を示す。
【図４】図４は、本発明の方法によって生成されたコラーゲン膜および商業的には（commercially）Ｂｉｏ−ｇｉｄｅ（商標）について比較平均最大負荷を示す棒グラフを示す。
【図５】図５は、本発明の方法によって生成されたコラーゲン膜および商業的にはＢｉｏ−ｇｉｄｅ（商標）について最大負荷での比較平均伸展を示す棒グラフを示す。
【図６】図６は、本発明の方法によって生成されたコラーゲン膜および商業的にはＢｉｏ−ｇｉｄｅ（商標）について降伏点での比較平均負荷を示す棒グラフを示す。
【図７】図７は、本発明の方法によって生成されたコラーゲン膜および商業的にはＢｉｏ−ｇｉｄｅ（商標）について降伏点での比較平均伸展を示す棒グラフを示す。
【図８】図８は、本発明の方法によって生成されたコラーゲン膜の移植術２８日後の治癒した鼓膜（ＴＭ）の顕微鏡写真を、他の市販の膜と比較して示す。２８日で、Ｔｙｍｐａｃｏｌ（商標）（ＡＣＳ（パネルＢおよびＤ））で処置したＴＭは、ＣＴ層中の高密度でよく組織化されたコラーゲン束からなる正常な三層構造を有していた。紙パッチ（パネルＥ、Ｈ）およびＧｅｌｆｏａｍ（商標）（Ｐｆｉｚｅｒ、Ｐｕｕｒｓ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）（パネルＦ、Ｉ）で処置したＴＭは、治癒エリアは肥厚したままであり、中間層には疎性で無秩序なコラーゲン線維があった。対照群（パネルＧ、Ｊ）におけるＴＭは、厚いままであり、非定型構造および不規則なコラーゲン線維の領域があった。１４日で、すべてのＴＭが正常なＴＭと比較して著しく肥厚した（パネルＫ）。２８日目まで、ＡＣＳ群におけるＴＭ厚さは、正常なＴＭと比較して有意な差異を示さなかった（パネルＬ）。（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１）。矢印は残存する足場を指示している。Ｈ＆Ｅおよびマッソントリクローム染色。尺度：５０μｍ。
【図９】図９は、移植術後の聴覚回復の聴性脳幹応答評定を示す。聴覚回復は、穿孔直後（修復前）と移植術後の具体的な時点（修復後）との間の可聴閾値の差異として定義された。値は、平均±標準誤差（ＳＥＭ）（ｎ＝５）を表す。各群における移植術後の聴覚回復は、多重線形回帰分析を使用して実施した。すべてのラットの可聴閾値は時間とともに回復し、異なる処置間で比較すると有意な差異が観察された（ｐ＜０．０１）。ＡＣＳによって処置したラットにおける聴覚は、紙パッチ、Ｇｅｌｆｏａｍ（登録商標）で処置したものおよび自然治癒（対照）と比較して、著しく速く回復した。群間の統計的有意性は：ＡＣＳおよび自然治癒（ｐ＜０．０１）；ＡＣＳおよび紙（ｐ＜０．０１）；ＡＣＳおよびＧｅｌｆｏａｍ（登録商標）（ｐ＜０．０１）であった。
【図１０】図１０は、移植術後の異なる時点における鼓膜穿孔の治癒を示す。
【００４３】
本発明のさらなる特徴、利点および詳細が、当業者には、図の読み取りおよびこの後の態様の詳細な説明から分かるであろうし、そのような説明は、本発明を例示しているにすぎない。
【発明の好ましい態様の詳細な説明】
【００４４】
概説するならば、主題発明の態様は、埋め込み可能な医療デバイスに特に好適である、コラーゲン膜、被覆、コーティングおよび／または足場、ならびに、それを作製し、動物またはヒト患者において使用する方法を対象としている。患者は、ヒトまたは他の動物、たとえば霊長類、ウマ、ウシ、ヒツジ、イヌまたはネコ科の動物であってよい。コラーゲン膜、コーティング、被覆および／または足場は、組織接触表面として提供され得、埋め込み可能なデバイスの全部または一部を封入して、それによって、埋め込みデバイスの免疫原性応答の低減および／または長寿命のインビボ機能性を提供していてもよい。
【００４５】
ここで使用される術語は、特定の態様を説明することのみを目的としており、本発明の限定であることは意図されない。ここで使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上明らかに別段の指示がある場合を除き、複数形も包含することが意図されている。用語「を含む（comprises）」および／または「を含む（comprising）」は、本明細書において使用する場合、挙げられている特徴部、整数、工程、操作、要素および／または成分の存在を指定するが、１つ以上の他の特徴部、整数、工程、操作、要素、成分および／またはそれらの群の存在または追加を除外しないことがさらに理解されるであろう。ここで使用される場合、用語「および／または」は、関連する収載されている項目の１つ以上のありとあらゆる組合せを包含する。ここで使用される場合、語句、たとえば「Ｘ乃至Ｙ」および「約Ｘ乃至Ｙ」は、ＸおよびＹを包含すると解釈すべきである。
ここで使用される場合、語句、たとえば「約Ｘ乃至Ｙ」は、「約Ｘ乃至約Ｙ」を意味する。ここで使用される場合、語句、たとえば「約ＸからＹまで」は、「約Ｘから約Ｙまで」を意味する。
【００４６】
用語「約」は、ここで使用される場合、用語の後の値の上下１０％までの偏差を指す。
たとえば、約７０％のエタノールへの言及は、６３％乃至７７％、すなわち７０％の値の上下１０％の範囲である。これは、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％および７７％のエタノールを包含する。
【００４７】
別段の定義がない限り、ここで使用されるすべての用語（技術および科学用語を包含する）は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されているのと同じ意味を有する。用語、たとえば一般に使用される辞書において定義されているものは、本明細書および関連技術分野の文脈におけるそれらの意味と一致する意味を有するものとして解釈すべきであること、ならびに、ここでそうであると明白に定義されていない限り、理想化されたまたは過度に形式ばった意味で解釈されるべきではないことがさらに理解されるであろう。公知の機能または構築物は、簡潔さおよび／または明瞭さのために、詳細に説明されていなくてもよい。
【００４８】
ある要素が、別の要素「の上に」ある、に「付着している」、と「接続されている」、と「カップリングされている」、「と接触している」等として言及されている場合、直接的に、他の要素の上にあるか、付着しているか、接続されているか、カップリングされているか、または接触していてもよいし、または介在要素が存在していてもよいことが理解されるであろう。対照的に、ある要素が、たとえば、別の要素「の上に直接的にある」、に「直接的に付着している」、と「直接的に接続されている」、と「直接的にカップリングされている」または「と直接的に接触している」として言及されている場合、介在要素は存在しない。当業者には、別の特徴部に「隣接して」配置されている構造体または特徴部への言及が、隣接する特徴部と重複するまたはその下にある部分を有していてもよいことも理解されるであろう。
【００４９】
第１、第２等の用語は、ここで、種々の要素、成分、領域、層および／または断面を説明するために使用されていてもよいが、これらの要素、成分、領域、層および／または断面は、これらの用語によって限定されるべきではないことが、理解されるであろう。これらの用語は、１つの要素、成分、領域、層または断面を、別の領域、層または断面から区別するためにのみ使用される。したがって、以下で論じる第１の要素、成分、領域、層または断面は、本発明の教示から逸脱することなく、第２の要素、成分、領域、層または断面と称され得る。操作（または工程）のシーケンスは、具体的に別段の指示がない限り、請求項または図において提示されている順序に限定されない。
【００５０】
用語「埋め込み可能な」は、「コラーゲン含有組織」、「コラーゲン膜」、「デバイス」または「足場」が、患者の体表または体内に、挿入、埋設、移植、または別様に、急性的にもしくは慢性的に付着もしくは載置され得ることを意味する。用語「コラーゲン含有組織」は、コラーゲンを含有する哺乳類の体から単離することができる、皮膚、筋肉等を意味する。用語「コラーゲン含有組織」は、コラーゲンまたはコラーゲン含有材料が体外で組み立てまたは製造された、「合成的に」生成された組織も包括する。
【００５１】
用語「コラーゲン膜」は、これに関係して、主にコラーゲンに基づく膜を意味すると理解されることが意図されている。「膜」は、典型的に、ここで記述されている通りの成分を含む。
【００５２】
用語「慢性的に」は、「コラーゲン含有組織」、「コラーゲン膜」、「デバイス」または「足場」が、少なくとも２か月、典型的には少なくとも６か月、いくつかの態様において、１年以上にわたって埋め込まれたままでありながら、その意図された機能を依然として操作可能であるように構成されていることを意味する。用語「コーティング」または「被覆」は、膜、デバイスまたは足場の標的表面上の材料を指す。コーティングは、下層の膜、デバイスまたは足場の細胞および組織ファウリングを阻害することができる多孔質コーティングであってよい。コーティングは、組織成長を促進してはならない。コーティングは、薄もしくは厚フィルム、泡状物、または組織ファウリングおよび生分解に対する他の障壁であってよい。用語「足場」は、細胞、組織、血管等が、成長してなる、コロニーを作るまたは密集することができる、多孔質材料および／または構造を指す。
【００５３】
コラーゲン束はコラーゲン線維から構成される。コラーゲン線維は、３つのポリペプチド鎖から構成され、これらが絡み合って右巻きの三重らせんを形成している。各コラーゲンポリペプチド鎖はα鎖と指定されており、グリシン、プロリンおよびヒドロキシプロリンに富んでいる。若干数の異なるα鎖があり、これらのα鎖の異なる組合せは、異なる型のコラーゲンに対応している。いくつかの態様において、本発明のコラーゲン膜は、Ｉ型コラーゲンを含む。Ｉ型コラーゲンは、２つのα１鎖および１つのα２鎖から構成される。
【００５４】
いくつかの態様において、コラーゲン線維または束は、供給源から単離された強靱結合組織から提供される。用語「強靱結合組織」は、ここで使用される場合、すべての哺乳動物の腱、靭帯および真皮において見られる、主にＩ型コラーゲン線維または束から構成されるマトリックスを指す。強靱結合組織は「疎性結合組織」とは区別される。疎性結合組織は、緩く配列された線維および豊富な細胞を特徴とし、たとえば、体表および内臓の内側を覆っている上皮の下に存在する。
【００５５】
強靱結合組織は、規則的であっても不規則であってもよい。密性規則性結合組織は、異なる組織間に強い関係性を提供し、腱および靭帯において見られる。密性規則性結合組織中のコラーゲン線維は、平行の態様で束ねられている。密性不規則性結合組織は、密性規則性結合組織に見られるような平行な束に配列されていない線維を有し、皮膚の真皮層の大部分を含む。本発明のコラーゲン膜は、規則性強靱結合組織もしくは密性不規則性結合組織の何れか、または両方の組合せから構成されていてもよい。
【００５６】
コラーゲン「ミクロフィブリル」、「原線維」、「線維」および「天然線維」は、腱において見られる自然発生的な構造を指す。ミクロフィブリルは、直径約３．５から５０ｎｍである。原線維は、直径約５０ｎｍから５０μｍである。天然線維は、直径約５０μｍである。「合成線維」は、その自然発生的な状況から、形成および／または化学的にもしくは物理的に作成もしくは改変された、任意の線維様材料を指す。たとえば、消化された腱から形成された原線維の押し出された線維は合成線維であるが、哺乳動物から新たに収穫された腱線維は天然線維である。当然ながら、合成コラーゲン線維は、非コラーゲン性成分、たとえばヒドロキシアパタイト、または組織成長を容易にする薬物を包含し得る。
たとえば、組成物は、成長因子、たとえば塩基性線維芽細胞成長因子、腫瘍成長因子ベータ、骨形態形成タンパク質、血小板由来成長因子およびインスリン様成長因子；化学走化性因子、たとえば（such）フィブロネクチンおよびヒアルロナン；ならびに細胞外マトリックス分子、たとえばアグレカン、ビグリカンおよびデコリンを含有し得る。当然ながら、合成コラーゲン線維は、非コラーゲン性成分、たとえば粒子、ヒドロキシアパタイトおよび他の鉱物相、または組織成長を容易にする薬物を包含し得る。たとえば、組成物は、カーボンナノチューブ、亜鉛ナノワイヤ、ナノ結晶性ダイヤモンド、または他のナノスケール粒子；より大きい結晶性および非結晶性粒子、たとえばリン酸カルシウム、硫酸カルシウム、アパタイト鉱物を含有し得る。たとえば、組成物は、治療剤、たとえばビスホスホネート、抗炎症ステロイド薬、成長因子、たとえば塩基性線維芽細胞成長因子、腫瘍成長因子ベータ、骨形態形成タンパク質、血小板由来成長因子およびインスリン様成長因子；化学走化性因子、たとえばフィブロネクチンおよびヒアルロナン；ならびに細胞外マトリックス分子、たとえばアグレカン、ビグリカンおよびデコリンを含有し得る。
【００５７】
用語「供給源」は、ここで使用される場合、任意の哺乳動物において強靱結合組織を含有する任意のコラーゲン組織を指す。いくつかの態様において、強靱結合組織を含有する組織は、腱である。腱は、哺乳動物において筋肉を骨と結合させる組織である。
【００５８】
いくつかの態様において、コラーゲン含有組織を、ヒツジ、雌ウシ、ブタまたはヒトを包含するがこれらに限定されない、任意の哺乳類動物から単離してもよい。他の態様において、コラーゲン含有組織はヒトから単離される。
【００５９】
いくつかの態様において、コラーゲン含有組織は「自家性」である、すなわち、治療を必要としている対象の体から単離される。
【００６０】
いくつかの態様において、本発明は、８０％を超えるＩ型コラーゲンを含むコラーゲン膜を提供する。他の態様において、コラーゲン膜は少なくとも８５％のＩ型コラーゲンを含む。さらに他の態様において、コラーゲン膜は９０％を超えるＩ型コラーゲンを含む。
【００６１】
コラーゲン膜のコラーゲン線維または束は、編み構造を形成する。用語「編み構造」は、ここで使用される場合、線維または束の第１および第２の群を含む構造を指し、ここで、第１の群における線維または束は第１の方向に優勢に伸展し、第２の群における線維または束は第２の方向に優勢に伸展し、ここで、第１および第２の方向は互いに異なっており、第１の群における線維または束は第２の群における線維または束と交互配置になっている、または混在している。方向の差異は約９０°であってもよい。
【００６２】
用語「最大引張荷重強度」は、ここで使用される場合、コラーゲン膜が担持し得る最大引張荷重を指す。荷重伸展曲線において、これは曲線上のピーク荷重によって表される。
【００６３】
いくつかの態様において、コラーゲン膜は、２０Ｎを超える最大引張荷重強度を有する。いくつかの態様において、本発明のコラーゲン膜は、２５Ｎ、４０Ｎ、６０Ｎ、８０Ｎ、１００Ｎ、１２０Ｎまたは１４０Ｎを超える最大引張荷重強度を有する。
【００６４】
さらに、コラーゲン膜の態様の編み構造は、生体足場の最大負荷での伸展の低減を提供しながら、弾性率の増大を提供すると考えられている。
【００６５】
用語「弾性率」は、ここで使用される場合、ヤング弾性率を意味し、応力と歪みとの比として決定される。これは、コラーゲン膜の剛性の指標を提供するものである。
【００６６】
いくつかの態様において、コラーゲン膜は、１００ＭＰａを超える弾性率を有する。他の態様において、コラーゲン膜は、２００ＭＰａ、３００ＭＰａ、４００ＭＰａまたは５００ＭＰａを超える弾性率を有する。
【００６７】
用語「最大負荷での伸展」は、ここで使用される場合、非荷重条件におけるコラーゲン膜の原長を参照した、最大引張荷重強度におけるコラーゲン膜の伸展を意味する。これを、さらに大きいであろう最大伸展と対比する。
【００６８】
いくつかの態様において、コラーゲン膜は、原長の８５％未満の最大負荷で伸展を有する。
【００６９】
本発明の態様によって企図された、コラーゲン膜、コラーゲンコーティングおよび／または足場から利益を得ることができるデバイスの例は、心臓、動脈、神経（脳）、泌尿器および他のステントを包含する埋め込み可能なステント、埋め込み可能な発電機（ＩＰＧ）、脳、中枢神経系（ＣＮＳ）もしくは末梢神経系、心臓または他の生体系のための、ペースメーカー、除細動器、心臓除細動器、刺激装置および／またはリードシステム、心臓置換弁、グルコースセンサー、心臓センサー、同定または追跡センサー（たとえば、ＲＦＩＤ）、Ｏ2、ｐＨ、温度、イオン等を検出するまたは測定するためのセンサーを包含する埋め込み可能なセンサー、組織インプラント、たとえば顎、頬、顎骨および鼻のための顔面インプラントを包含する整形外科用インプラント、埋め込み可能な皮下または経皮アクセスポート、排液チューブ、たとえば耳排液チューブ、カテーテル、たとえば尿路カテーテル、呼吸補助チューブ等を包含するがこれらに限定されない。
【００７０】
コラーゲン膜、足場または線維の被覆は、標的埋め込み可能デバイスを実質的に包み込むように構成され得、または、その一部のみを覆っていてもよい。
【００７１】
コラーゲン膜、足場または被覆は、圧縮もしくは押し出し時に一緒に貼り付けるための自然親和性による、粘着性コーティングもしくは接着剤、たとえばゼラチン状コーティングを使用することによる、または線維を別様に付着させてアレイを形成することによるものを包含する任意の好適な様式で、一緒にまたはデバイス上に保持された、線維またはフィブリルの３次元アレイであってよい。
【００７２】
ここで記述されている方法において使用される用語「同時機械的刺激」は、コラーゲン含有組織の化学処理中にコラーゲン膜を引き伸ばすプロセスを指す。膜は、静的および／または周期的引き伸ばしを受けていてもよい。したがって、いくつかの態様において、同時機械的刺激は：
（ｉ）予め設定された期間にわたる膜の引き伸ばし；
（ｉｉ）予め設定された期間にわたる膜の弛緩；ならびに
（ｉｉｉ）工程（ｉ）および（ｉｉ）のｎ倍繰り返し、ここで、ｎは１以上の整数であるを含んでいてもよい。
【００７３】
機械的刺激が膜を引き伸ばすことによって行われるならば、膜は、好ましくはその長軸に沿って引き伸ばされる。
【００７４】
いくつかの態様において、同時機械的刺激は、張力をコラーゲン含有組織に対して周期的に印加することを含み、ここで、張力の周期性は、約１０秒から約２０秒の引き伸ばし期間および約１０秒の弛緩期間を含み、それによって生じる歪みはおよそ１０％であり、機械的刺激は、コラーゲン含有組織中のコラーゲン束が、ここで記述されている通りに整列するまで続く。
【００７５】
主題発明は、生物活性化合物、薬物、成長因子、タンパク質、ペプチド、核酸、無機または有機分子等のインビトロまたはインビボ送達のための、本発明のコラーゲン膜または足場の使用にも関係している。本発明のコラーゲン含有組織または足場に生物活性化合物等を充填することができ、次いで、充填された足場を、人間または動物の、体、組織、細胞等に、埋め込むまたは接触させることができる。次いで、化合物は、足場から、体、組織、細胞等へ放出されることが可能になる。コラーゲン膜または足場は、生分解性または非分解性支持構造またはマトリックス上に提供され得る。
【００７６】
本発明において使用されるコラーゲンは、合成であってもよいし、または任意の好適な動物種に由来するものであってもよい。コラーゲンは、脊椎動物または無脊椎動物（たとえば、ヒトデ、ウニ、海綿動物等）由来のものであってよい。いくつかの態様において、コラーゲンは、魚、サメ、ガンギエイまたは鰭条コラーゲンである。別の態様において、コラーゲンは、ヒト、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、イヌまたはネココラーゲンである。例示されている態様において、コラーゲンはウシコラーゲンである。
【００７７】
本発明のコラーゲン含有組織または足場は、インビトロとインビボの両方において、体温で少なくとも４週間にわたって安定である。
【００７８】
用語「修復すること」もしくは「修復」またはその文法的等価物は、ここで、哺乳類動物、好ましくはヒトにおける組織欠損の修復を網羅するために使用される。「修復」は、組織欠損部位における空隙または構造的不連続を少なくとも部分的に満たすのに十分である新たな組織の形成を指す。しかしながら、修復は、組織欠損をその欠損前の生理学的／構造的／機械的状況に回復させる際に１００％有効である、完全な治癒または治療のプロセスを意味することも別様に余儀なくさせることもない。
【００７９】
用語「組織欠損」または「組織欠損部位」は、上皮、結合または筋肉組織の破壊を指す。組織欠損は、組織に準最適レベルで機能させるまたは準最適条件にさせる。たとえば、組織欠損は、腱における部分層もしくは全層断裂または心筋における梗塞による局所的細胞死の結果であってもよい。組織欠損は、「空隙」の立体配置であると推測することができ、これは、３次元欠損、たとえば、間隙、空洞、穴、または上皮、結合もしくは筋肉組織の構造的完全性における他の実質的破壊を意味すると理解されている。ある特定の態様において、組織欠損は、内因性または自然修復ができないようなものである。組織欠損は、事故、疾患および／または外科的処置の結果であり得る。たとえば、軟骨欠損は、関節への外傷、たとえば断裂した半月板組織の関節への移動の結果であってもよい。組織欠損は、変性疾患、たとえば変形性関節炎の結果であってもよい。
【００８０】
典型的には、本発明のコラーゲン膜は、組織欠損の部位において埋め込まれ、当業者に公知である任意の従来の手段、たとえば、縫合、縫合線アンカー、骨固定デバイスおよび骨または生分解性ポリマースクリューによって、適所に固定されることになる。
【００８１】
ここで言及または引用されているすべての特許、特許出願、仮出願および公報は、参照により、すべての図および表を包含するその全体が、本明細書の明白な教示と矛盾しない程度まで、組み込まれる。
【００８２】
下記は、本発明を実践するための手順を例証する例である。これらの例は、限定として解釈されるべきではない。別段の注記がない限り、すべてのパーセンテージは重量によるものであり、すべての溶媒混合割合は体積によるものである。
【実施例】
【００８３】
例１  コラーゲン膜の製造のための方法
コラーゲン切片をブタ内臓内側から慎重に分離し、約７０％のエタノールを含む溶液に入れ、室温で短時間インキュベートした。次いで、コラーゲン含有組織を作業面の上で脂肪側を上にして引き伸ばし、可能な限り多くの脂肪組織および血管を除去した。
【００８４】
存在する脂肪組織を視覚化するために、コラーゲン含有組織をグリセロールで１０分間コーティングした。この時点で、コラーゲンは透明であったが、脂肪組織は白色であった。鉗子を使用して、本発明人らは、白色脂肪組織をコラーゲンから解剖顕微鏡下で分離した。
【００８５】
完了したら、コラーゲン含有組織を密閉容器に慎重に移し、約１％（ｖ／ｖ）のＳＤＳおよび０．２％（ｖ／ｖ）のＬｉＣｌを含む溶液中でインキュベートして、非コラーゲン性タンパク質を変性させた。インキュベーションを４℃で終夜放置した。
【００８６】
次いで、コラーゲン含有組織を１００％アセトン中で２回慎重に洗浄して、変性した非コラーゲン性タンパク質を除去した。次いで、組織を２００ｍｌの容器内、１００ＲＰＭで遠心分離して、残存する溶液、非コラーゲン性タンパク質および核酸を、コラーゲン含有組織から穏やかに沈降させた。
【００８７】
コラーゲン含有組織を慎重に除去し、膜Ｓｔｅｒｉｐｕｒｅ（商標）水中で３回、再び洗浄した。
【００８８】
時折、本発明人らはコラーゲン含有組織を、ＮａＯＨ：ＮａＣｌを含む溶液中でも洗浄し、その後、組織を１００ＲＰＭで９０分間遠心分離した。
【００８９】
次いで、コラーゲン含有組織を０．５％（ｖ／ｖ）のＨＣｌに浸漬し、シェーカーに３０分間載置して、コラーゲンを変性させた。本発明人らは、ＨＣｌの濃度およびインキュベーション時間が、得られる組織の機械的構造を損傷するのを回避するために重要であることを見出した。
【００９０】
次いで、コラーゲン含有組織を除去し、Ｓｔｅｒｉｐｕｒｅ（商標）中で３回、再び洗浄した。
【００９１】
次いで、コラーゲン含有組織を、０．５％（ｖ／ｖ）のＮａＯＨを使用して中和した。
この段階で、得られたコラーゲン含有組織の機械的特性の予備試験を行ってよい。
【００９２】
次いで、コラーゲン含有組織を、機械力（圧縮および伸展）を使用し、ステンレス鋼枠を使用して扱った。コラーゲン含有組織が、ちょうどよいサイズ、厚さ等に引き伸ばされたら、組織をインサイチューで変性させた、すなわち、枠内で、１％（ｖ／ｖ）のＨＣｌを含む溶液に浸漬した。典型的には、組織を１００ＲＰＭで２２〜２５時間、コラーゲン線維束が整列するまで、振盪しながらインキュベートした。
【００９３】
次いで、コラーゲン含有組織を水で洗浄し、１％（ｖ／ｖ）のＳＤＳおよび０．２％（ｖ／ｖ）のＬｉＣｌの混合物ですすいだ。
【００９４】
最終用途に応じ、次いでコラーゲン含有組織をグリセロールで１０分間再コーティングして、あらゆる残存する脂肪組織を視覚化した。上記の通り、鉗子を使用して、残りの白色脂肪組織をコラーゲンから解剖顕微鏡下で分離した。いかなる余分なコラーゲン束もこの段階で除去して、コラーゲン含有組織の厚さを制御した。
【００９５】
最後に、コラーゲン含有組織をアセトンで処置し、風乾させ、枠内でさらに引き伸ばすと、整列したコラーゲン束は固定された。次いで、コラーゲン含有組織を引き伸ばし、圧縮し、および／または圧延して、滑らかな表面を作成した。次いで、仕上がったコラーゲン膜組織を検査し、レーザーカッターを使用してサイズに切断した。
【００９６】
ＳＥＭを実施して、コラーゲン膜の表面モルフォロジーを、他の種類の膜と比較して特徴付けた。手短に述べると、組織試料を厚さ５ｎｍの白金（ＳＥＭコーティングユニット、Ｅ１０２０、株式会社日立サイエンスシステムズ、日本）でスパッタコーティングし、両面を、走査型電子顕微鏡（Ｓ２６０、Ｌｅｉｃａ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｅｎｇｌａｎｄ）下、低電圧（２０ｋＶ）で見た。
【００９７】
図１は、本発明の方法によって生成されたコラーゲン膜（ここではＡＣＳと称されるＴｙｍｐａｃｏｌ（商標））の表面モルフォロジーを他の膜と比較して示す。走査電子顕微鏡画像は、３つの足場の表面モルフォロジーを示す（パネルＡ〜Ｃ；×５００、Ｄ；×２００）。Ｔｙｍｐａｃｏｌ（商標）（図１においてはＡＣＳと称される）は、２つの区別可能な表面、緻密なコラーゲン束を特色とする滑らかな表面（パネルＡ）および疎性コラーゲン線維の粗く多孔質の表面（パネルＢ）を保有する。紙パッチ（膜）表面は、小細孔がほとんどなく不均等である（パネルＣ）。Ｇｅｌｆｏａｍ（登録商標）は、様々なサイズの実質的な細孔を示す（パネルＤ）。尺度：５００μｍ。
【００９８】
図２は、上記の方法によって生成されたコラーゲン膜の走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像（×１００）を示す。
【００９９】
図３は、市販の生体足場（「Ｂｉｏ−ｇｉｄｅ（商標）」）Ｌｕｉｔｐｏｌｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ、Ｓｈｉｒｌｅｙ、ＮＹ、ＵＳＡの走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像（×２００）を示す。Ｂｉｏ−ｇｉｄｅ（商標）中におけるコラーゲン束配列は、Ｔｙｍｐａｃｏｌ（商標）よりも均一でないことが分かる。
【０１００】
図４は、本発明の方法によって生成されたコラーゲン膜および商業的にはＢｉｏ−ｇｉｄｅ（商標）について比較平均最大負荷を示す棒グラフを示す。
【０１０１】
図５は、本発明の方法によって生成されたコラーゲン膜および商業的にはＢｉｏ−ｇｉｄｅ（商標）について最大負荷での比較平均伸展を示す棒グラフを示す。
【０１０２】
図６は、本発明の方法によって生成されたコラーゲン膜および商業的にはＢｉｏ−ｇｉｄｅ（商標）について降伏点での比較平均負荷を示す棒グラフを示す。
【０１０３】
図７は、本発明の方法によって生成されたコラーゲン膜および商業的にはＢｉｏ−ｇｉｄｅ（商標）について降伏点での比較平均伸展を示す棒グラフを示す。
【０１０４】
結論
本発明人らは、上記の方法が、下記の通り、コラーゲン含有組織を治療する慣習的なアルカリ性−酸方法を上回る利益を有することを見出した：
１）１％のＳＤＳおよび０．２％のＬｉＣｌを含む溶液を用いるインキュベーションは、他の埋め込み可能な膜との炎症応答を引き起こすことが公知である非コラーゲン性タンパク質および核酸の変性および除去を可能にする。
【０１０５】
２）グリシンコーティングは、コラーゲン含有組織からの脂肪組織の分離を可能にし、これは、除去しなければ、組織の柔軟性の問題を引き起こす。
【０１０６】
３）インキュベーション時間と一緒にしたＨＣｌの使用により、本発明人らは、架橋剤、たとえばグルタルアルデヒドを使用することなく、適切な機械的特性を持つ膜を生成することができた。
【０１０７】
４）枠に固定している間にコラーゲン膜に印加した機械力により、本発明人らは、特殊構造の形成に必要なコラーゲン束および線維を再配列させることができた。
【０１０８】
５）コラーゲン含有組織中のコラーゲン束の方向についてのマクロおよび顕微鏡検査は、組織を埋め込み研究においてより有用なものにするコラーゲン束の構造的配向を示す。
【０１０９】
例２  他の膜と比較したコラーゲン膜の特徴付け
例１における方法によって生成したＴｙｍｐｏｃｏｌ（商標）の厚さ４０μｍの試料を、臨床治験において、市販の膜と比較して使用した。市販製品は：
１）．紙パッチ、これは、シガレットペーパー（Ｔａｌｌｙ  Ｈｏ、Ｉｍｐｅｒｉａｌ  Ｔｏｂａｃｃｏ  Ａｕｓｔｒａｌｉａ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）から取得されたものであり、厚さおよそ２０μｍ、白色かつ不透明である；
２）．Ｇｅｌｆｏａｍ（登録商標）（吸収性のゼラチンスポンジ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ＆Ｕｐｊｏｈｎ  Ｉｎｃ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＵＳＡ）は、細孔径が３０乃至７００μｍで変動する厚さ４ｍｍ前後の吸収性の高い非弾性スポンジ（Ｒｏｈａｎｉｚａｄｅｈら、（２００８）、Ｊ．Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｓｃｉｅｎｃｅ；１９：１１７３〜１１８２）を包含していた。
【０１１０】
重量２５０〜３００グラムの雄スプラーグ・ドーリー系ラットを、協会の動物倫理承認に従い、臨床治験に使用した。研究の前に、すべての動物を、Ｓ５モデル顕微鏡写真機（otomicroscope）（Ｚｅｉｓｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して調査して、中耳病理がないことを確実にした。動物を、４つの足場修復群、すなわち、Ｔｙｍｐｏｃｏｌ（商標）（ｎ＝３０）、紙パッチ（ｎ＝３０）、Ｇｅｌｆｏａｍ（登録商標）（ｎ＝３０）および対照（自然治癒）（ｎ＝３０）に、無作為に分割した。加えて、１０匹のラットの群（ｎ＝１０）を正常対照（いかなる穿孔も足場もなし）に割り付けた。
【０１１１】
すべての外科的手順は、筋肉内ケタミン（８０ｍｇ／ｋｇ）およびメデトミジン（０．５ｍｇ／ｋｇ）による全身麻酔下で実施した。外耳道からの破片を、３．０ｍｍの耳鏡を使用して除去し、外耳道をポビドンヨード溶液で前処理した。直径およそ１．８ｍｍの両側性鼓膜（ＴＭ）穿孔を、滅菌２３ゲージ針を使用し、緊張部の後ろ半分に、経外耳道的アプローチを介して作成した。次いで、４つの異なる材料を細かく切り刻み（直径２．４ｍｍ）、１×リン酸緩衝生理食塩液（ｐＨ７．４）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓｈａｎｇｈａｉ、Ｃｈｉｎａ）ですすぎ、オンレイ鼓膜形成術を使用して右のＴＭ穿孔上に移植した。左耳は、穿孔したＴＭ上に移植材料が載置されていない内部対照として役立った。すべてのラットに、術後鎮痛のための皮下ブプレノルフィン（０．０２〜０．０８ｍｇ／ｋｇ）を与えた。
【０１１２】
異なる処置群のＴＭ治癒を、耳鏡検査法、走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）、組織学および透過電子顕微鏡法（ＴＥＭ）によって評価し、一方、聴覚機能を聴性脳幹応答（ＡＢＲ）によって分析した。各群において、同じ５匹のラット（ｎ＝５）を、術後３、５、７、９、１４および２８日における耳鏡とＡＢＲ評定の両方のために無作為に選択した。５匹のラットのこれらの亜群において、３匹を組織学的評価に、ＳＥＭおよびＴＥＭに１匹ずつ使用した。
【０１１３】
耳鏡観察
ＴＭ治癒を調査するために、ＴＭ穿孔の急性ラットモデルを確立した。各群から５匹のラットを各時点で無作為に選択し、デジタルビデオ耳鏡（ＭｅｄＲＸ、Ｌａｒｇｏ、ＦＬ）を使用して、全身麻酔下で耳鏡観察した。ＴＭを、２人の独立した観察者により、穿孔閉鎖、感染症、鼓膜硬化症、肉芽組織および肥厚に関して見た。各ＴＭ穿孔を、完全に閉鎖しているまたは未閉鎖の何れかに格付けした。完全に閉鎖しているＴＭのみを治癒したとみなした。デジタル画像は、Ａｕｒｉｓｖｉｅｗソフトウェア（Ｅａｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ａｕｓｔｒａｌｉａ、Ｓｕｂｉａｃｏ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を使用して記録した。
【０１１４】
ＳＥＭを実施して、ＴＭの治癒プロセス、続いて足場による修復を評価した。簡潔に述べると、ラットＴＭ検体を、２．５％グルタルアルデヒドを用い４℃で終夜固定し、エタノール溶液中で脱水し、続いて臨界点乾燥させた（ＨＣＰ−２、株式会社日立サイエンスシステムズ、東京、日本）。最後に、試料を厚さ５ｎｍの白金でコーティングし、ここで、ＴＭの内側面をＳＥＭ下で観察した。
【０１１５】
すべてのラットは、術後の合併症なしに、外科的手順に耐えて生き延びた。ＴＭの外側面を、耳鏡を介して観察して、各時点における移植術の効果を評価した。感染症または異常の兆候は、何れのラットにおいても観察されなかった。
【０１１６】
対照群において、ＴＭは、穿孔後、より厚く不透明に見え、穿孔縁付近に可視の隆起した微小血管があった。１４日目までに、ＴＭは次第に透明になり、穿孔の大半は完全に閉鎖した。２８日で、すべての穿孔が完全に治癒したが、乳白色の環に類似している可視の瘢痕が穿孔部位において観察された。Ｔｙｍｐｏｃｏｌ（商標）の半透明性は、ＴＭ治癒の直接観察を可能にした。治癒プロセス全体を通して、Ｔｙｍｐｏｃｏｌ（商標）はその構造的安定性を保持しており、ＴＭ残部に良好に接着した。ＴＭおよび微小血管の混濁化は、対照群におけるものと比較してあまり顕著ではなかった。穿孔は、移植術後早ければ７日で治癒し、ここで、治癒したＴＭは正常に見えた。対照的に、紙パッチおよびＧｅｌｆｏａｍ（登録商標）は不透明であり、治癒中に中耳を検査することを困難にしていた。
その上、これらの材料は、治癒ＴＭから簡単に離脱する傾向があった。特に、Ｇｅｌｆｏａｍ（登録商標）の容積は収縮し、その多孔質構造は時間とともに失われた。２８日で、紙パッチおよびＧｅｌｆｏａｍ（登録商標）群におけるＴＭは治癒したように見えたが、若干の瘢痕化があった。
【０１１７】
個々の時点における屠殺後、穿孔の閉鎖は、顕微鏡写真機を使用して、収穫されたＴＭの内面を観察することによって確認した。Ｔｙｍｐｏｃｏｌ（商標）群におけるＴＭ治癒は、他の群と比較して際立って速かった（図１０）。Ｔｙｍｐｏｃｏｌ（商標）で処置した耳の６０％（３／５）は完全に治癒したが、対照群では何れも治癒しなかった（０／５）（ｐ＜０．０５）。９日後、Ｔｙｍｐｏｃｏｌ（商標）および紙パッチ群の５匹すべてのラットにおいてＴＭは完全に治癒し、これは、対照群（２／５）（ｐ＜０．０５）と比較して著しく異なっていた。１４日で、対照群における１つのＴＭを除き、すべての耳が完全に治癒した（４／５）。外科手術後２８日目までに、すべてのＴＭが完全に治癒した。
【０１１８】
組織学的評価
屠殺後、両方の外耳を骨軟骨接合部で分離し、ＴＭを骨性輪（bony annulus）とともに鼓室胞から除去した。収穫された検体を、１０％中性緩衝ホルマリン中で２４時間にわたって固定させ、続いて１０％エチレンジアミン四酢酸溶液（ＥＤＴＡ）（ｐＨ７．４）中で２から３週間にわたって脱灰した。脱灰されたＴＭを、一連の段階的アルコール中で脱水し、パラフィンロウに埋設し、４μｍの厚さで横方向に切開した。すべての断面を、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色を使用して評価した。マッソントリクローム染色を実施して、コラーゲン線維のモルフォロジーを検査した。すべての染色されたスライドを、Ａｐｅｒｉｏ  ＳｃａｎＳｃｏｐｅ  ＸＴ自動スライドスキャナー（Ａｐｅｒｉｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｖｉｓｔａ、ＣＡ；４０×／０．７５  Ｐｌａｎ  Ａｐｏ対物レンズ）を使用してデジタルスキャンした。画像を、組織学的評価のためにＴＩＦＦとして保存した。１４および２８日目の治癒したＴＭ断面のＴＭ厚さを、Ａｐｅｒｉｏ  ＩｍａｇｅＳｃｏｐｅ  Ｖｉｅｗｅｒソフトウェアを使用して測定した。
【０１１９】
ＴＭ治癒の組織学および４つの足場の効果を２８日間かけて検査した。他の群と比較して、対照群におけるＴＭ治癒は、比較的緩慢であった。第１週、穿孔は開存しているままであったが、ＴＭの上皮および結合組織（ＣＴ）層において過形成が観察された。５日目、ケラチン骨棘（spur）が見られ、穿孔は９日で閉鎖し始め、３つのＴＭ層全体にわたって有意な肥厚があった。２８日目までに、治癒したＴＭは薄くなったが、先の穿孔部位には肥厚が残存していた。ＣＴ層は、緩く詰まったコラーゲン線維があり無秩序であることが判明した（図８）。
【０１２０】
Ｔｙｍｐｏｃｏｌ（商標）処置群において、上皮過形成および血管増殖は初期段階で明確であった。線維芽細胞に類似している浸潤細胞はＣＴ層において豊富であり、移植片周囲には偶発的なリンパ球があった。２８日で、治癒したＴＭは三層構造を持ち、正常に見えた（図８）。
【０１２１】
対照的に、多数の炎症細胞（主にリンパ球）および隆起した滲出物が、紙パッチの周囲に観察された。ＴＭ穿孔は最終的には治癒したが、ＴＭは肥厚したままであり、新たに合成された線維の無秩序があった（図８）。同様に、Ｇｅｌｆｏａｍ（登録商標）は、埋め込まれた部位において炎症細胞の浸潤を誘導した。他の材料とは違い、隆起した線維芽細胞増殖および赤血球で満たされた血管がＣＴ層において見られた。２８日後、治癒したＴＭは肥厚したままであり、非定型の無秩序なコラーゲン線維がＣＴ層にあった（図８）。
【０１２２】
ＴＭ横断面を使用して、処置後のＴＭ厚さにおける変化を定量化した（図８）。１４日で、すべての群におけるＴＭは、ＳＦＳで処置したＴＭを除き、正常なＴＭ（ｐ＜０．０５）と比較して実質的に肥厚しており、ＳＦＳで処置したＴＭは、正常なＴＭ（ｐ＞０．０５）と同様の厚さ（１４．１３±４．０４μｍ）を有していた。２８日目までに、ＴＭ厚さにおける統計的に有意な差異が、対照、紙パッチおよびＧｅｌｆｏａｍ（登録商標）群（ｐ＜０．０５）において見られた。しかしながら、Ｔｙｍｐｏｃｏｌ（商標）群間においては（８．５５±４．２５μｍ）、正常なＴＭ（ｐ＞０．０５）と比較して、ＴＭ厚さにおける統計的に有意な差異は見られなかった。
【０１２３】
透過電子顕微鏡法（ＴＥＭ）
ＴＥＭを実施して、修復後２８日目における治癒したＴＭの微細構造を調査した。簡潔に述べると、解離後、収穫されたＴＭ試料の穿孔部位を２．５％グルタルアルデヒド中に固定し、４℃で終夜貯蔵した。組織検体を洗浄し、後固定（postfix）し（１％オスミウム酸）、脱水し、透過観察のために埋設した。薄い横方向断面を切断し、ＴＥＭ（ＴＥＣＮＡＩ  １０、Ｐｈｉｌｉｐｓ  Ｃｏ．、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）で８０ｋＶにて検査した。
【０１２４】
ＴＥＭ観察を実施して、外科手術２８日後における治癒したＴＭの超微細構造を調査した。Ｔｙｍｐｏｃｏｌ（商標）で処置したおよび自然に治癒したＴＭにおいて、ＣＴ層は適度に肥厚しており、線維芽細胞蓄積は正常なＴＭと比較して明らかであった。Ｔｙｍｐｏｃｏｌ（商標）群において、ＴＭの３層は容易に同定され、ＣＴ層はコラーゲン束が良好に配向された緻密なものであった。しかしながら、紙パッチおよびＧｅｌｆｏａｍ（登録商標）群においては、コラーゲン線維は線維層中に緩く不規則に配列されており、明らかな浮腫が見られた。
【０１２５】
ＴＭの内側面をＳＥＭで観察して、足場接着、足場による細胞集積および穿孔閉鎖を評価した。Ｔｙｍｐｏｃｏｌ（商標）は、治癒プロセス全体を通して穿孔縁との確固とした接着を示し、それによって足場機能を保護していた。ＴＭ上皮細胞は、創縁を越えて移動し、５日目にＴｙｍｐｏｃｏｌ（商標）の内面に接着した。９日目までに、Ｔｙｍｐｏｃｏｌ（商標）群のＴＭは治癒し、偽膜の内面は滑らかになった。対照的に、紙パッチは、ＴＭ表面からの初期部分離脱を実証したが、その足場機能は部分的に失われた。滲出物形成および炎症細胞浸潤は、紙群の穿孔部位において明確であった。Ｇｅｌｆｏａｍ（登録商標）は、そのスポンジ構造の初期崩壊を示した。収縮および吸収が進行するにつれて、Ｇｅｌｆｏａｍ（登録商標）のほとんどが溶解し、その支持機能の喪失をもたらした。紙およびＧｅｌｆｏａｍ（登録商標）群における治癒したＴＭは、１４日で若干の瘢痕化を示した。足場埋め込みのない対照群において、治癒していないＴＭの圧延穿孔縁部は９日で可視となった。ＴＭは最終的には１４日目までには治癒したが、明らかな瘢痕があった。
【０１２６】
聴性脳幹応答（ＡＢＲ）
移植術後のラットの聴覚を評定するために、ＡＢＲを、日本光電工業株式会社ニューロパック−μ測定システム（ＭＥＢ−９１００、日本光電工業株式会社、日本）を使用し、防音室内で実施した。ラットを試験前に既述の通りに麻酔した。白金皮下針電極を、頭頂（活性電極、両方の乳様突起（基準電極）および鼻尖部に（接地電極）挿入した。０．１ｍｓ持続時間での試験刺激（クリック）を、挿入イヤホンを経由して提示した。動物に、１０ｄＢ減衰で９０から０ｄＢまでの音圧レベル（ＳＰＬ）の刺激強度シリーズを提示した。合計５１２の応答を、刺激の各シリーズにおいて、１０ｍｓの分析期間にわたって平均した。閾値は、典型的な波ＩＩＩまたは波ＩＶモルフォロジーを持つ再現可能なＡＢＲ波形を引き出すための最低強度として定義した。クリック刺激の可聴閾値を、ＴＭ穿孔の前および後、すべてのラットの右耳において、鼓膜形成術後の各時点に、各群から５匹の動物について測定した。正常な耳および材料なしにＴＭ穿孔のある耳は、対照として役立った。
【０１２７】
聴覚閾値は、穿孔前（ｐ＞０．０５）および穿孔後（ｐ＞０．０５）に計測されたすべての処置群におけるものと同様であった。正常なラットの平均可聴閾値は１５．０ｄＢであり、これは穿孔後に著しく増大して２９．５ｄＢとなり、ＴＭ穿孔が有意な難聴（ｐ＜０．０１）を引き起こしたことを指示していた。ＡＢＲを使用する聴力評定は、処置後のすべての群について聴覚回復を実証した（図９）。聴覚回復は、穿孔直後（修復前）と移植術後の具体的な時点（修復後）との間の可聴閾値の差異として定義された。すべてのラットの可聴閾値は時間とともに回復し、異なる処置間で比較すると有意な差異が観察された（ｐ＜０．０１）。最も明らかなことには、Ｔｙｍｐｏｃｏｌ（商標）で処置した動物における聴覚は、紙パッチ（ｐ＜０．０１）、Ｇｅｌｆｏａｍ（登録商標）（ｐ＜０．０１）で処置したものおよび自然治癒（ｐ＜０．０１）と比較して、著しく速く回復した。
【０１２８】
統計的分析
耳鏡観察によって決定された治癒率を、カイ二乗（χ2）試験を使用して比較した。ＡＢＲおよびＴＭ厚さについての統計的分析は一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用して評価し、一方、時間に伴う各群における聴覚回復は重回帰分析を使用して実施した。すべての分析は、統計ソフトウェアＲ（バージョン２．１１．１、パッケージメタ）を使用して実施した。統計的有意性はｐ＜０．０５として定義した。
【０１２９】
結論
この研究は、本発明のコラーゲン膜（Ｔｙｍｐｏｃｏｌ（商標））が、ラットモデルにおいて、２つの一般に使用される足場（紙パッチおよびＧｅｌｆｏａｍ（登録商標））および自然治癒と比較して、穿孔閉鎖時間を著しく短縮し、ＴＭ創傷治癒を促進することを実証した。Ｔｙｍｐｏｃｏｌ（商標）群における治癒したＴＭは、他の群と比較して、緻密なコラーゲン線維の再生を伴うモルフォロジーの改善、正常なＴＭ厚さへの急速な復帰、およびより早い段階における完全な聴覚回復を示した。ＴＭ穿孔のための外科治療の目標は、穿孔の完全な閉鎖および聴覚の回復を達成することであるため、これらの結果は、Ｔｙｍｐｏｃｏｌ（商標）が効率的であり、ＴＭ治癒と聴覚の両方を回復させるための理想的な足場として役立つであろうことを示唆している。
【０１３０】
足場の生体適合性は考慮すべき重要な要素であり、何故なら、生体材料の適用後の炎症応答が外科手術の失敗につながり得るからである。コラーゲンは、最小の炎症および抗原性応答を引き出すことも公知である（Ｐａｃｈｅｎｃｅ、（１９９６）、Ｊ．ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔ．Ｒｅｓ．；３３：３５〜４０）。この研究において、Ｔｙｍｐｏｃｏｌ（商標）は、ＴＭ治癒を加速および改善させ、これは埋め込み部位における最小の炎症応答に部分的に起因していた。
【０１３１】
この研究において、本発明者らは、Ｔｙｍｐｏｃｏｌ（商標）が、他の群と比較して著しく速く聴覚回復を達成したことを示した。本発明者らは、これらの改善が、治癒したＴＭのコラーゲン線維の秩序改善および正常なＴＭに相当する厚さを達成するための初期リモデリングによって生じるものであると仮定している。
【０１３２】
Ｔｙｍｐｏｃｏｌ（商標）は、紙ほど脆弱でもなく、Ｇｅｌｆｏａｍ（登録商標）ほどかさばるスポンジ状でもないため、外科手術中に扱いやすいことが判明した。その上、Ｔｙｍｐｏｃｏｌ（商標）の透明性がＴＭの直接観察を可能にしたのに対し、紙およびＧｅｌｆｏａｍ（登録商標）の不透明性はＴＭ治癒の直接可視性を妨害した。臨床的観点から、これらの特徴は、Ｔｙｍｐｏｃｏｌ（商標）を、紙およびＧｅｌｆｏａｍ（登録商標）と比較してより好都合なものにしている。
以下に、出願当初の特許請求の範囲に記載された発明を付記する。
［１］
コラーゲン膜を生成する方法であって、
（ｉ）コラーゲン含有組織を単離し、それをエタノール溶液中でインキュベートする工程と；
（ｉｉ）工程（ｉ）からのコラーゲン含有組織を、無機塩およびアニオン性界面活性剤を含む第１の溶液中でインキュベートして、その中に含有される非コラーゲン性タンパク質を変性させる工程と；
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）において生成されたコラーゲン含有組織を、無機酸を含む第２の溶液中で、前記材料中のコラーゲンが変性するまでインキュベートする工程と；（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）において生成されたコラーゲン含有組織を、無機酸を含む第３の溶液中で、同時に機械的刺激を加えて、前記コラーゲン含有組織中のコラーゲン束を整列させるのに十分な時間にわたってインキュベートする工程と；
を含み、
ここで、前記機械的刺激は、前記コラーゲン含有組織に対して周期的に張力を印加することを含む、方法。
［２］
前記エタノール溶液が、７０％を超えるエタノールを含む、［１］に記載の方法。
［３］
前記第１の溶液中の前記無機塩が、ルイス酸と複合体を形成することができる、［１］または［２］に記載の方法。
［４］
前記無機塩が、塩化トリメチルアンモニウム、塩化テトラメチルアンモニウム、塩化ナトリウム、塩化リチウム、過塩素酸塩およびトリフルオロメタンスルホン酸塩からなる群から選択される、［３］に記載の方法。
［５］
前記無機塩が塩化リチウム（ＬｉＣｌ）である、［３］または［４］に記載の方法。
［６］
前記第１の溶液中の前記アニオン性界面活性剤が、アルキルサルフェート、アルキルエーテルサルフェート、アルキルスルホネートおよびアルキルアリールスルホネートからなる群から選択される、［１］〜［５］の何れか一に記載の方法。
［７］
前記アニオン性界面活性剤がアルキルサルフェートである、［１］〜［６］の何れか一に記載の方法。
［８］
前記アルキルサルフェートがドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）である、［７］に記載の方法。
［９］
前記第１の溶液が、約１％（ｖ／ｖ）のＳＤＳおよび約０．２％（ｖ／ｖ）のＬｉＣｌを含む、［１］〜［８］の何れか一に記載の方法。
［１０］
工程（ｉｉ）におけるインキュベーションが約４℃である、［１］〜［９］の何れか一に記載の方法。
［１１］
工程（ｉｉ）におけるインキュベーションを少なくとも１２時間にわたって行う、［１］〜［１０］の何れか一に記載の方法。
［１２］
前記第２の溶液が約０．５％（ｖ／ｖ）のＨＣｌを含む、［１］〜［１１］の何れか一に記載の方法。
［１３］
工程（ｉｉｉ）におけるインキュベーションを約３０分間にわたって行う、［１］〜［１２］の何れか一に記載の方法。
［１４］
工程（ｉｉｉ）におけるインキュベーションを振盪しながら行う、［１］〜［１３］の何れか一に記載の方法。
［１５］
前記第３の溶液が約１％（ｖ／ｖ）のＨＣｌ溶液を含む、［１］〜［１４］の何れか一に記載の方法。
［１６］
工程（ｉｖ）におけるインキュベーションを約１２から３６時間にわたって行う、［１］〜［１５］の何れか一に記載の方法。
［１７］
工程（ｉｖ）におけるインキュベーションを約２４時間にわたって行う、［１６］に記載の方法。
［１８］
工程（ｉｖ）におけるインキュベーションを振盪しながら行う、［１］〜［１７］の何れか一に記載の方法。
［１９］
前記コラーゲン含有組織の約０．５％（ｖ／ｖ）のＮａＯＨとのインキュベーションを含む、工程（ｉｉｉ）と工程（ｉｖ）との間の中和工程をさらに含む、［１］〜［１８］の何れか一に記載の方法。
［２０］
工程（ｉｖ）からのコラーゲン含有組織をアセトンとともにインキュベートし、次いで前記コラーゲン含有組織を乾燥させることを含む工程（ｖ）をさらに含む、［１］〜［１９］の何れか一に記載の方法。
［２１］
工程（ｉｉ）と（ｉｉｉ）との間および／または工程（ｉｉｉ）と（ｉｖ）との間に、前記コラーゲン含有組織をグリセロールと接触させて、脂肪および／または血管の除去を視覚化し促進する、［１］〜［２０］の何れか一に記載の方法。
［２２］
前記グリセロールを前記コラーゲン含有組織と少なくとも１０分間にわたって接触させる、［２１］に記載の方法。
［２３］
工程（ｉｉ）と（ｉｉｉ）との間および／または工程（ｉｉｉ）と（ｉｖ）との間に、前記コラーゲン含有組織を洗浄する、［１］〜［２２］の何れか一に記載の方法。
［２４］
工程（ｉｉ）と（ｉｉｉ）との間に使用される洗浄液が、変性タンパク質を除去するためのアセトンである、［２３］に記載の方法。
［２５］
前記コラーゲン含有組織を、前記アセトンの後に滅菌水でさらに洗浄する、［２４］に記載の方法。
［２６］
前記コラーゲン含有組織を、ＮａＯＨ：ＮａＣｌ溶液中でさらに洗浄する、［２４］または［２５］に記載の方法。
［２７］
工程（ｉｖ）の後に、前記コラーゲン含有組織を滅菌水で洗浄する、［１］〜［２６］の何れか一に記載の方法。
［２８］
前記コラーゲン含有組織を、前記滅菌水の後に前記第１の溶液でさらに洗浄する、［２７］に記載の方法。
［２９］
前記コラーゲン含有組織が強靱結合組織を含む、［１］〜［２８］の何れか一に記載の方法。
［３０］
前記コラーゲン含有組織を、ヒツジ、雌ウシ、ブタまたはヒトから単離する、［１］〜［２９］の何れか一に記載の方法。
［３１］
前記コラーゲン含有組織をヒトから単離する、［１］〜［３０］の何れか一に記載の方法。
［３２］
前記コラーゲン含有組織が自家性である、［１］〜［３１］の何れか一に記載の方法。
［３３］
前記組織が、編み構造および３００ＭＰａを超える弾性率を有する、８０％（ｗ／ｗ）を超えるＩ型コラーゲン線維または束を含む、［１］〜［３１］の何れか一に記載の方法によって生成されたコラーゲン含有組織。
［３４］
前記組織が４００ＭＰａを超える弾性率を有する、［３３］に記載のコラーゲン含有組織。
［３５］
前記組織が５００ＭＰａを超える弾性率を有する、［３３］または［３４］に記載のコラーゲン含有組織。
［３６］
前記組織が、８５％未満の最大負荷で伸展を有する、［３３］〜［３５］の何れか一に記載のコラーゲン含有組織。
［３７］
前記組織が、８０％未満の最大負荷で伸展を有する、［３３］〜［３６］の何れか一に記載のコラーゲン含有組織。
［３８］
８５％（ｗ／ｗ）を超えるＩ型コラーゲンを含む、［３３］〜［３７］の何れか一に記載のコラーゲン含有組織。
［３９］
９０％（ｗ／ｗ）を超えるＩ型コラーゲンを含む、［３３］〜［３８］の何れか一に記載のコラーゲン含有組織。
［４０］
編み構造を有する、８０％（ｗ／ｗ）を超えるＩ型コラーゲン線維または束を含み、８５％未満の最大負荷で伸展を有する、［３３］〜［３９］の何れか一に記載のコラーゲン含有組織。
［４１］
編み構造を有する、８０％を超えるＩ型コラーゲン線維または束を含み、８０％未満の最大負荷で伸展を有する、［３３］〜［４０］の何れか一に記載のコラーゲン含有組織。
［４２］
人間または動物の体または組織への埋め込み用のデバイスを調製するための方法であって、コラーゲン含有組織を前記デバイス上に載置することを含み、前記コラーゲン足場は、
（ｉ）コラーゲン含有組織を単離し、それをエタノール溶液中でインキュベートすること；
（ｉｉ）工程（ｉ）からのコラーゲン含有組織を、無機塩およびアニオン性界面活性剤を含む第１の溶液中でインキュベートして、その中に含有される非コラーゲン性タンパク質を変性させること；
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）において生成されたコラーゲン含有組織を、無機酸を含む第２の溶液中で、前記材料中のコラーゲンが変性するまでインキュベートすること；ならびに（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）において生成されたコラーゲン含有組織を、無機酸を含む第３の溶液中で、同時に機械的刺激を加えて、前記コラーゲン含有組織中のコラーゲン束を整列させるのに十分な時間にわたってインキュベートすること
を含み、
ここで、前記機械的刺激は、前記コラーゲン含有組織に対して周期的に張力を印加することを含む方法によって生成される、方法。
［４３］
人間または動物の体または組織への埋め込みのために生体適合性が強化されたデバイスであって、
（ｉ）コラーゲン含有組織を単離し、それをエタノール溶液中でインキュベートすること；
（ｉｉ）工程（ｉ）からのコラーゲン含有組織を、無機塩およびアニオン性界面活性剤を含む第１の溶液中でインキュベートして、その中に含有される非コラーゲン性タンパク質を変性させること；
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）において生成されたコラーゲン含有組織を、無機酸を含む第２の溶液中で、前記材料中のコラーゲンが変性するまでインキュベートすること；ならびに（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）において生成されたコラーゲン含有組織を、無機酸を含む第３の溶液中で、同時に機械的刺激を加えて、前記コラーゲン含有組織中のコラーゲン束を整列させるのに十分な時間にわたってインキュベートすること
を含み、
ここで、前記機械的刺激は、前記コラーゲン含有組織に対して周期的に張力を印加することを含む方法によって生成されたコラーゲン足場を含む、デバイス。
［４４］
哺乳類動物における組織欠損の修復のための、［３３］〜［４１］の何れか一に記載のコラーゲン含有組織または［４３］に記載のデバイスの使用。
［４５］
前記哺乳類動物がヒトである、［４４］に記載の使用。
［４６］
哺乳類動物対象における組織欠損を治療する方法であって、［３３］〜［４１］の何れか一に記載のコラーゲン含有組織または［４３］に記載のデバイスを前記組織欠損に挿入する工程を含む、方法。
［４７］
前記コラーゲン含有組織が厚さ約４０μｍである、［４４］〜［４６］４６の何れか一に記載の使用または方法。
［４８］
前記組織欠損が鼓膜穿孔である、［４４］〜［４７］の何れか一に記載の使用または方法。
【図１】
0006648056.tif 000002
【図２】
0006648056.tif 000003
【図３】
0006648056.tif 000004
【図４】
0006648056.tif 000005
【図５】
0006648056.tif 000006
【図６】
0006648056.tif 000007
【図７】
0006648056.tif 000008
【図８】
0006648056.tif 000009
【図９】
0006648056.tif 000010
【図１０】
0006648056.tif 000011