(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌検出用のプローブの組合せであって、
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の一部を標的とするプローブのセットを１つ以上含み、
ＨＢＶの一部を標的とするプローブの前記セットそれぞれの配列をアライメントしたとき、ＨＢＶの一部を標的とするプローブの前記アライメントしたセットの配列全体が、ＨＢＶ遺伝子型のゲノムにおける直接反復配列（ＤＲ）領域の参照配列と一致し、
ＨＢＶの一部を標的とするプローブの前記アライメントしたセットにおいて、前記ＨＢＶの一部を標的とするプローブはそれぞれ、前記ＨＢＶの一部を標的とするプローブの長さの一部分だけ、１つまたは２つの隣接するＨＢＶの一部を標的とするプローブと重複し、
前記ＤＲ領域の参照配列は配列番号３〜３２のいずれかに示される配列である、プローブの組合せ。
【請求項２】
前記ＨＢＶ遺伝子型が、遺伝子型Ａ、遺伝子型Ｂ、遺伝子型Ｃ、遺伝子型Ｄ、遺伝子型Ｅ、遺伝子型Ｆ、遺伝子型Ｇ、遺伝子型Ｈ、遺伝子型Ｉまたは遺伝子型Ｊである、請求項１に記載のプローブの組合せ。
【請求項３】
ＨＢＶの全長を標的とするプローブのセットを１つ以上さらに含み、
ＨＢＶの全長を標的とするプローブの前記セットそれぞれの配列をアライメントしたとき、ＨＢＶの全長を標的とするプローブの前記アライメントしたセットの配列全体が、ＨＢＶ遺伝子型のゲノムの参照配列と一致し、
ＨＢＶの全長を標的とするプローブの前記アライメントしたセットにおいて、前記ＨＢＶの全長を標的とするプローブはそれぞれ、前記ＨＢＶの全長を標的とするプローブの長さの一部分だけ、１つまたは２つの隣接するＨＢＶの全長を標的とするプローブと重複し、
前記ＨＢＶ遺伝子型のゲノムの参照配列は、遺伝子型Ａ、遺伝子型Ｂ、遺伝子型Ｃ、遺伝子型Ｄ、遺伝子型Ｅ、遺伝子型Ｆ、遺伝子型Ｇ、遺伝子型Ｈ、遺伝子型Ｉまたは遺伝子型Ｊから選択される遺伝子型の配列の全長である、請求項１に記載のプローブの組合せ。
【請求項４】
ホットスポット遺伝子標的プローブのセットを１つ以上さらに含み、
ホットスポット遺伝子標的プローブの前記セットそれぞれの配列をアライメントしたとき、ホットスポット遺伝子標的プローブの前記アライメントしたセットの配列全体が、癌ホットスポット遺伝子の参照配列と一致し、
ホットスポット遺伝子標的プローブの前記アライメントしたセットにおいて、前記ホットスポット遺伝子標的プローブはそれぞれ、前記ホットスポット遺伝子標的プローブの長さの一部分だけ、１つまたは２つの隣接するホットスポット遺伝子標的プローブと重複し、
前記癌ホットスポット遺伝子の参照配列は、前記癌ホットスポット遺伝子のエクソンまたはプロモーターである、
請求項３に記載のプローブの組合せ。
【請求項５】
前記癌ホットスポット遺伝子が、ＣＴＮＮＢ１遺伝子、ＴＥＲＴ遺伝子、またはＴＰ５３遺伝子である、請求項４に記載のプローブの組合せ。
【請求項６】
前記癌ホットスポット遺伝子の参照配列が配列番号３３〜４１のいずれかに示される配列である、請求項４に記載のプローブの組合せ。
【請求項７】
外来遺伝子標的プローブのセットを１つ以上さらに含み、
外来遺伝子標的プローブの前記セットそれぞれの配列をアライメントしたとき、外来遺伝子標的プローブの前記アライメントしたセットの配列全体が、外来遺伝子の参照配列と一致し、
外来遺伝子標的プローブの前記アライメントしたセットにおいて、前記外来遺伝子標的プローブはそれぞれ、前記外来遺伝子標的プローブの長さの一部分だけ、１つまたは２つの隣接する外来遺伝子標的プローブと重複し、
前記外来遺伝子の参照配列は、以下のａ）〜ｅ）の要件を満たす、請求項４に記載のプローブの組合せ：
ａ）ヒトまたはＨＢＶゲノムと相同性がない；
ｂ）前記外来遺伝子のゲノムにおいてユニークである；
ｃ）配列内のＧＣ含有量が０．３〜０．７である；
ｄ）同じ塩基が５つ以上並んだ配列がない；
ｅ）プライマー設計アルゴリズムによって予測される二次構造がない。
【請求項８】
前記外来遺伝子がλファージ由来である、請求項７に記載のプローブの組合せ。
【請求項９】
前記外来遺伝子の参照配列が配列番号４２〜５４のいずれかに示される配列である、請求項７に記載のプローブの組合せ。
【請求項１０】
内在遺伝子標的プローブのセットを１つ以上さらに含み、
内在遺伝子標的プローブの前記セットそれぞれの配列をアライメントしたとき、内在遺伝子標的プローブの前記アライメントしたセットの配列全体が、内在遺伝子の参照配列と一致し、
内在遺伝子標的プローブの前記アライメントしたセットにおいて、前記内在遺伝子標的プローブはそれぞれ、前記内在遺伝子標的プローブの長さの一部分だけ、１つまたは２つの隣接する内在遺伝子標的プローブと重複し、
前記内在遺伝子の参照配列は、以下のｆ）〜ｈ）の要件を満たす、請求項７に記載のプローブの組合せ：
ｆ）ＨＢＶゲノムと相同性がない；
ｇ）同じ塩基が５つ以上並んだ配列がない；
ｈ）プライマー設計アルゴリズムによって予測される二次構造がない。
【請求項１１】
前記内在遺伝子が、ＧＡＰＤＨ遺伝子またはＧｄＸ遺伝子である、請求項１０に記載のプローブの組合せ。
【請求項１２】
前記内在遺伝子の参照配列が、配列番号５５または配列番号５６に示される配列である、請求項１０に記載のプローブの組合せ。
【請求項１３】
前記癌が肝細胞癌である、請求項１に記載のプローブの組合せ。
【請求項１４】
ＨＢＶに感染した対象の試料として得られたＤＮＡから、ウイルス−宿主接合部を有する標的ヌクレオチド断片を捕捉するために使用される、請求項１に記載のプローブの組合せ。
【請求項１５】
前記ＤＮＡが、前記対象のゲノムＤＮＡまたは血中循環腫瘍ＤＮＡである、請求項１４に記載のプローブの組合せ。
【請求項１６】
前記試料が、体液または肝臓組織である、請求項１４に記載のプローブの組合せ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本開示は２０１７年２月７日に出願された米国仮特許出願第６２／４５６０８７号の優先権を主張し、その全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本開示はプローブの組合せに関し、より詳細には、癌の検出用の配列特異的プローブの組合せに関する。
【背景技術】
【０００３】
ヘパドナウイルス科は、肝炎、肝細胞癌（ＨＣＣ）および肝硬変の病因と関連することが報告されているウイルスのファミリーである。Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）はヘパドナウイルスファミリーのもっとも一般的なウイルスであり、遺伝子型Ａ〜Ｊに分類され得る小型ＤＮＡウイルスである。ＨＢＶに感染したほとんどの成人は回復することができるが、ＨＢＶに感染した患者の約５〜１０％はウイルスを除去することができず、慢性的に感染する。慢性ＨＢＶ感染の患者は、ＨＢＶが宿主ゲノムに組み込まれ、肝細胞に遺伝的改変およびエピジェネティック改変を引き起こし得るため、ＨＣＣを発症するリスクが高い。
【０００４】
ＨＢＶの組込みを検出する方法が少数報告されている。例えば、Ｊｉａｎｇによる「The effects of hepatitis B virus integration into the genomes of hepatocellular carcinoma patients」（Genome Res. (2012) 22, 593-601）およびＳｕｎｇによる「Genome-wide survey of recurrent HBV integration in hepatocellular carcinoma」（Nature Genetics (2012) 44, 765-769）は、肝細胞癌試料におけるＨＢＶ組込みを検出するために全ゲノムシークエンシングを利用することを開示した。しかし、これらのダイレクトシークエンシング法の有効性は低かった。Ｊｉａｎｇによって報告されているように、２５００〜３５００万個もの、平均して７５ｂｐのリードが各データセットについて生成され、ＪｉａｎｇのデータセットについてのＨＢＶおよび接合部リードの典型的な数は、それぞれ６００万およびわずか４００のリードであった。さらに、血中循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）試料からＨＢＶ組込みを検出し得る、ダイレクトシークエンシングに基づく研究がまだ存在する。
【０００５】
その後、Ｌｉによる「HIVID: An efficient method to detect HBV integration using low coverage sequencing」（Genomics (2013) 102:4, 338-344）およびＺｈａｏによる「Genomic and oncogenic preference of HBV integration in hepatocellular carcinoma」（Nature Communications (2016) 7:12992）は、ＨＢＶ組込み検出用である、ＨＢＶゲノム配列に従って設計された配列キャプチャプローブの使用を開示した。しかし、ＬｉもＺｈａｏも、そのプローブの設計理論的根拠に関する明確なアイデアが提供されていなかった。さらに、ＬｉおよびＺｈａｏによって報告されたプローブの有効性は低かった。ＬｉおよびＺｈａｏの両方において、平均ヒト比率は８３．７％と高く、平均ＨＢＶアライメント比および平均組込み率はそれぞれ０．０８％および０．０１％と低かった。このことは、プローブがＨＢＶ組込みを検出するのに依然として非効率的かつ効率的でないことを示唆している。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、ウイルスＤＮＡおよびウイルス−宿主接合部（viral-host junction）を捕捉する際に高感度かつ高効率であるプローブの組合せのパネル、およびそれと共に使用される分析方法を提供する。
【０００７】
本発明の実施形態は、癌検出用のプローブの組合せを提供する。プローブの組合せは、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の一部を標的とするプローブのセットを１つ以上含む。ＨＢＶの一部を標的とするプローブのセットそれぞれの配列をアライメントしたとき、ＨＢＶの一部を標的とするプローブのアライメントしたセットの配列全体が、ＨＢＶ遺伝子型のゲノムにおける直接反復配列（ＤＲ）領域の参照配列と一致する。ＨＢＶの一部を標的とするプローブのアライメントしたセットにおいて、ＨＢＶの一部を標的とするプローブはそれぞれ、ＨＢＶの一部を標的とするプローブの長さの一部分だけ、１つまたは２つの隣接するＨＢＶの一部を標的とするプローブと重複する。
【０００８】
好ましい実施形態において、ＨＢＶ遺伝子型は、遺伝子型Ａ、遺伝子型Ｂ、遺伝子型Ｃ、遺伝子型Ｄ、遺伝子型Ｅ、遺伝子型Ｆ、遺伝子型Ｇ、遺伝子型Ｈ、遺伝子型Ｉおよび遺伝子型Ｊを含む。
【０００９】
好ましい実施形態において、ＤＲ領域の参照配列は配列番号３〜３２を含む。
【００１０】
好ましい実施形態において、プローブの組合せは、ＨＢＶの全長を標的とするプローブのセットを１つ以上含む、または、さらに含む。ＨＢＶの全長を標的とするプローブのセットそれぞれの配列をアライメントしたとき、ＨＢＶの全長を標的とするプローブのアライメントしたセットの配列全体が、ＨＢＶ遺伝子型のゲノムの参照配列と一致する。ＨＢＶの全長を標的とするプローブのアライメントしたセットにおいて、ＨＢＶの全長を標的とするプローブはそれぞれ、ＨＢＶの全長を標的とするプローブの長さの一部分だけ、１つまたは２つの隣接するＨＢＶの全長を標的とするプローブと重複する。
【００１１】
好ましい実施形態において、プローブの組合せは、ホットスポット遺伝子標的プローブのセットを１つ以上さらに含む。ホットスポット遺伝子標的プローブのセットそれぞれの配列をアライメントしたとき、ホットスポット遺伝子標的プローブのアライメントしたセットの配列全体が、癌ホットスポット遺伝子の参照配列と一致する。ホットスポット遺伝子標的プローブのアライメントしたセットにおいて、ホットスポット遺伝子標的プローブはそれぞれ、ホットスポット遺伝子標的プローブの長さの一部分だけ、１つまたは２つの隣接するホットスポット遺伝子標的プローブと重複する。
【００１２】
好ましい実施形態において、癌ホットスポット遺伝子は、ＣＴＮＮＢ１、ＴＥＲＴ、およびＴＰ５３遺伝子を含む。
【００１３】
好ましい実施形態において、癌ホットスポット遺伝子の参照配列は配列番号３３〜４１を含む。
【００１４】
好ましい実施形態において、プローブの組合せは、外来遺伝子標的プローブのセットを１つ以上さらに含む。外来遺伝子標的プローブのセットそれぞれの配列をアライメントしたとき、外来遺伝子標的プローブのアライメントしたセットの配列全体が、外来遺伝子の参照配列と一致する。外来遺伝子標的プローブのアライメントしたセットにおいて、外来遺伝子標的プローブはそれぞれ、外来遺伝子標的プローブの長さの一部分だけ、１つまたは２つの隣接する外来遺伝子標的プローブと重複する。
【００１５】
好ましい実施形態において、外来遺伝子はλファージ由来である。
【００１６】
好ましい実施形態において、外来遺伝子の参照配列は配列番号４２〜５４を含む。
【００１７】
好ましい実施形態において、プローブの組合せは、内在遺伝子標的プローブのセットを１つ以上さらに含む。内在遺伝子標的プローブのセットそれぞれの配列をアライメントしたとき、内在遺伝子標的プローブのアライメントしたセットの配列全体が、内在遺伝子の参照配列と一致する。内在遺伝子標的プローブのアライメントしたセットにおいて、内在遺伝子標的プローブはそれぞれ、内在遺伝子標的プローブの長さの一部分だけ、１つまたは２つの隣接する内在遺伝子標的プローブと重複する。
【００１８】
好ましい実施形態において、内在遺伝子は、ＧＡＰＤＨおよびＧｄＸ遺伝子を含む。
【００１９】
好ましい実施形態において、内在遺伝子の参照配列は、配列番号５５および配列番号５６を含む。
【００２０】
好ましくは、種々の実施形態のプローブの組合せによって検出される癌は、肝細胞癌を含む。
【００２１】
好ましくは、種々の実施形態のプローブの組合せは、ＨＢＶに感染した対象の試料として得られたＤＮＡから、ウイルス−宿主接合部を有する標的ヌクレオチド断片を捕捉するために使用される。
【００２２】
好ましくは、試料から得られるＤＮＡは、対象のゲノムＤＮＡおよび血中循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）を含む。
【００２３】
好ましくは、試料は体液および肝臓組織を含む。
【００２４】
要するに、前述の実施形態に係る本発明は、ウイルス感染およびウイルス感染誘発癌の検出用の強力かつ汎用性のあるツールを提供する。本発明の実施形態は、様々な種類のＤＮＡウイルスの存在およびウイルス組込みを検出するために適用され得る。本実施形態によって設計されたプローブの組合せは、最適なウイルス／宿主配列カバレッジを確実にし、遺伝的安定性を考慮し、したがって、高感度、高効率、および高信頼性であることが証明される。
【００２５】
添付の図面は１つ以上の本発明の実施形態を示し、本明細書とともに、本発明の原理を説明する。できる限り、実施形態の同じまたは同様の要素を示すために、図面全体にわたって同じ符号が使用される。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】本発明の実施形態における、参照配列を取得する工程を示すフローチャートである。
【図２Ａ】本発明の実施形態における、プローブの設計コンセプトを示す模式図である。
【図２Ｂ】本発明の実施形態における、プローブの設計コンセプトを示す模式図である。
【図３】本発明の実施形態において設計されたプローブの選択的ハイブリダイゼーションを示す実験結果である。
【図４Ａ】本発明の実施形態において設計されたプローブの特異性を示す実験結果である。
【図４Ｂ】本発明の実施形態において設計されたプローブの特異性を示す実験結果である。
【図５Ａ】本発明の実施形態における、プローブの組合せを用いた、ペア腫瘍ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）試料における様々な遺伝子領域での次世代シークエンシング（ＮＧＳ）結果を示す、ヒートマップ変換棒グラフである。
【図５Ｂ】本発明の実施形態における、プローブの組合せを用いた、ペア血漿循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）試料における様々な遺伝子領域でのＮＧＳの結果を示す、ヒートマップ変換棒グラフである。
【図６】本発明の実施形態における、プローブの組合せを用いた、腫瘍ｇＤＮＡ試料における様々な遺伝子領域でのＮＧＳの結果を示す、ヒートマップ変換棒グラフである。
【図７】本発明の実施形態のプローブの組合せによってハイブリダイズされたＤＮＡ試料のＮＧＳ統計を示す、実験結果である。
【００２７】
一般的な慣行に従い、様々な説明した特徴は、一定の縮尺で描かれておらず、本開示に関連する特徴を強調するために描いている。同様の参照符号は、図面および本文全体を通して同様の要素を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
以下、本発明の様々な例示的な実施形態を示す添付の図面を参照しながら、本発明をより完全に説明する。しかしながら、本発明は多くの様々な形態で実施することができ、本明細書に記載の実施形態に限定されると解釈されるべきではない。むしろ、これらの実施形態は本開示が徹底的かつ完全であり、本開示の範囲を当業者に完全に伝えるように提供される。全体を通して、同様の参照番号は同様の要素を示す。
【００２９】
本明細書で使用する用語は特定の実施形態のみを説明するためのものであり、本発明を限定することを意図するものではない。本明細書で使用するように、単数形「a」、「an」および「the」は文脈が明確にそわないことを示さない限り、複数形も含むことが意図される。用語「含む（comprises）」および／もしくは「含む（comprising）」、または「含む（includes）」および／もしくは「含む（including）」、または「有する（has）」および／もしくは「有する（having）」を本明細書で使用する場合、説明した特徴、領域、整数、工程、動作、要素、および／または構成要素の存在を特定するが、１つ以上の他の特徴、領域、整数、工程、動作、要素、構成要素、および／またはその群の存在または追加を排除しないことがさらに理解されるのであろう。
【００３０】
用語「および／または」および「少なくとも１つ」は、関連する列挙された項目のうちの１つ以上の任意の組合せおよびすべての組合せを含むことが理解されるのであろう。第１、第２、第３などの用語は様々な要素、構成要素、領域、部品および／または部分を説明するために本明細書で使用され得るが、これらの要素、構成要素、領域、部品および／または部分はこれらの用語によって限定されるべきではないことも理解されるのであろう。これらの用語は、１つの要素、構成要素、領域、部品または部分を、別の要素、構成要素、領域、層または部分と区別するためにのみ使用される。したがって、以下で説明する第１の要素、構成要素、領域、部品または部分は、本開示の教示から逸脱することなく、第２の要素、構成要素、領域、層、または部分と呼ぶことができる。
【００３１】
他に定義されない限り、本明細書で使用するすべての用語（技術用語および科学用語を含む）は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。さらに、一般に使用される辞書で定義される用語などの用語は、関連技術および本開示の文脈におけるそれらの意味と一致する意味を有するものとして解釈されるべきであり、本明細書で明示的に定義されない限り、理想的な意味または過度に正式的な意味で解釈されないことが理解されるのであろう。
【００３２】
本発明の一態様は、配列標的プローブのセットを１つ以上含むプローブの組合せを提供する。一本鎖デオキシリボ核酸（ｓｓＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）および人工ヌクレオチド等の一本鎖オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドを含み得る。プローブの組合せは、ウイルス感染またはウイルス感染誘発癌、特にＤＮＡウイルスによって引き起こされるかまたはそれに関連する癌の検出に使用してもよい。いくつかの実施形態において、プローブの組合せは、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、ヘルペスウイルス８（ＨＨＶ−８）、ヒトＴリンパ球向性ウイルス（ＨＴＬＶ）、メルケル細胞ポリオーマウイルス（ＭＣＶ）、または他のＤＮＡウイルスによる感染を検出するために使用され得る。他の実施形態において、プローブの組合せは、肝細胞癌、肝臓癌、子宮頸癌、陰茎癌、肛門癌、膣癌、外陰癌、口腔癌、口腔咽頭癌、鼻咽頭癌、頭頸部癌、リンパ腫、原発性滲出液リンパ腫、胃癌、カポジ肉腫、メルケル細胞癌、またはＤＮＡウイルスによる感染に関連する他の癌の検出のために使用され得る。
【００３３】
本発明の実施形態によれば、プローブの組合せは、ウイルス配列の全長を標的とするプローブのセットを１つ以上含む。ウイルス配列の全長を標的とするプローブのセットそれぞれの配列をアライメントしたとき、ウイルス配列の全長を標的とするプローブのアライメントしたセットの配列全体が、標的ウイルスの遺伝子型のゲノムの参照配列と一致する。標的ウイルスは、上述の様々なＤＮＡウイルスの遺伝子型を含んでいてもよい。例えば、ＨＢＶが標的ウイルスの場合、その遺伝子型には、遺伝子型Ａ、遺伝子型Ｂ、遺伝子型Ｃ、遺伝子型Ｄ、遺伝子型Ｅ、遺伝子型Ｆ、遺伝子型Ｇ、遺伝子型Ｈ、遺伝子型Ｉおよび遺伝子型Ｊが含まれていてもよい。ウイルスゲノムの参照配列は、ＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋから検索してもよいし、臨床試料から得られた配列から算出してもよい。例えば、ＨＢＶ遺伝子型Ａの参照配列は、ＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋ（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/GenBank/）アクセッション番号AP007263、HE974383またはHE974381から検索してもよい。ＨＢＶ遺伝子型Ｂの参照配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号AB981581、AB602818またはAB554017から検索してもよい。ＨＢＶ遺伝子型Ｃの参照配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号LC360507、AB644287またはAB113879から検索してもよい。ＨＢＶ遺伝子型Ｄの参照配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号HE815465、HE974382またはAB554024から検索してもよい。ＨＢＶ遺伝子型Ｅの参照配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号HE974380、HE974384、AP007262から検索してもよい。ＨＢＶ遺伝子型Ｆの参照配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号DQ823095、AB036909またはAB036920から検索してもよい。ＨＢＶ遺伝子型Ｇの参照配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号AB625342、HE981176またはGU563559から検索してもよい。ＨＢＶ遺伝子型Ｈの参照配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号AB298362、AB846650、AB516395から検索してもよい。ＨＢＶ遺伝子型Ｉの参照配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号EU833891、KF214680またはKU950741から検索してもよい。ＨＢＶ遺伝子型Ｊの参照配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号AB486012から検索してもよい。
【００３４】
例示的な実施形態において、プローブの組合せは、ＨＢＶの全長を標的とするプローブのセットを２つ含む。ＨＢＶの全長を標的とするプローブの一方のセットの配列をアライメントしたとき、アライメントしたＨＢＶの全長を標的とするプローブの配列全体が、ＨＢＶ遺伝子型Ｂのゲノムの参照配列（配列番号１）と一致する。同様に、ＨＢＶの全長を標的とするプローブの他方のセットの配列をアライメントしたとき、ＨＢＶの全長を標的とするプローブのアライメントしたセットの配列全体が、ＨＢＶ遺伝子型Ｃのゲノムの参照配列（配列番号２）と一致する。例示的な実施形態において、ＨＢＶゲノムの参照配列は、図１に示されるようにして得られる。工程Ｓ１のように、ＤＮＡは慢性ＨＢＶ患者の体液（例えば、血液、リンパ液、尿、汗、唾液、涙、または腸液）および組織（例えば、肝臓組織）等の試料から抽出した。抽出したＤＮＡには、患者のゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）および／または血中循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ、circulating tumor DNA）が含まれる。工程Ｓ２のように、抽出したＤＮＡは、ＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋから検索された種々のＨＢＶ遺伝子型の既知の配列によって配列決定および分類される。例示的な実施形態において、ＨＢＶ遺伝子型ＢおよびＨＢＶ遺伝子型Ｃは台湾における肝細胞癌（ＨＣＣ）患者の有病率で選択された；しかし、本発明の実施形態は、ＨＢＶの遺伝子型ＢおよびＣのみに限定されず、持続感染を引き起こし得るすべてのＤＮＡウイルスの種々の遺伝子型を包含する。工程Ｓ３のように、選択した各遺伝子型の配列をアライメントし、Clustalアルゴリズムによって計算し、配列の各位置における主要対立遺伝子（すなわち、もっとも共通であるヌクレオチド）によって、ウイルス遺伝子型のコンセンサス配列を得た。最後に、コンセンサス配列をウイルス遺伝子型の参照配列として使用する。例示的な実施形態では、ＨＢＶゲノムの参照配列にはＨＢＶ遺伝子型Ｂおよび遺伝子型Ｃのコンセンサス配列を含み、それぞれはＨＢＶ遺伝子型ＢまたはＣゲノムの３１９１塩基対（ｂｐ）のすべてをカバーする。
【００３５】
本実施形態において、ウイルス配列標的プローブは、ウイルス配列の全長を標的とするプローブの配列をアライメントしたとき、ウイルス配列の全長を標的とするプローブはそれぞれ、ウイルス配列の全長を標的とするプローブの長さの一部分だけ、すぐ隣接するＨＢＶの全長を標的とするプローブと重複するように設計される。図２Ａに例示されるような例示的な実施形態において、ＨＢＶの全長を標的とするプローブはそれぞれ、ＨＢＶの全長を標的とするプローブの長さの一部分だけ、１つまたは２つのすぐ隣接するＨＢＶの全長を標的とするプローブと重複する。図２Ｂに示すように、重複する配列の部分は変化してもよく、好ましくは５０％（２×タイリング密度と示す）または７５％（４×タイリング密度と示す。）であり、プローブそれぞれはすぐ隣接するプローブと６０ｂｐ重複してもよい。２×タイリング密度で長さ１２０ｂｐに伸長するようにプローブが設計されている例示的な実施形態において、プローブそれぞれはすぐ隣接するプローブと６０ｂｐ重複してもよい。同様に、プローブの長さが１２０ｂｐであり、４×タイリング密度を有する場合、プローブそれぞれはすぐ隣接するプローブと９０ｂｐ重複してもよい。
【００３６】
さらに、ウイルスゲノムの構造もまた、プローブを設計する際に考慮され得る。例示的な実施形態において、ＨＢＶゲノムが実際は環状であることを考慮すると、ＨＢＶゲノムの参照配列の末端の３１９１番目を超えて伸長するＨＢＶの全長を標的とするプローブの最後のプローブは、参照配列の開始（すなわち、１番目）に続くように設計される。例えば、１２０ｂｐの長さを有し、ＨＢＶゲノムの参照配列の３１２１番目で開始するプローブは、３１２１〜３１９１番目に対応する７１ｂｐの領域から成り、続いて１〜４９番目に対応する４９ｂｐの領域からなる。
【００３７】
本発明の実施形態はプローブの長さを限定するものではない。プローブの長さは、費用、キャプチャ効率、感度、特異性、または他の特定の事柄に従って設計され得ることが理解されるのであろう。いくつかの実施形態では、任意の所定の参照配列のプローブの考えられる数または量Ｎが式（１）によって計算され得る。
【００３８】
【数１】
0006799175.tif 000002
【００３９】
式１において、Ｌは参照配列の長さを表し、Ｐはプローブの長さを表し、最小長（ｍｉｎと示す）から最大長（ｍａｘで示す）までの範囲であり得る。例えば、ＨＢＶの遺伝子型ＢまたはＣのゲノムの３１９１ｂｐ長の参照配列に対して、５０ｂｐ〜１２０ｂｐの範囲である総数が２２０，５９７であるプローブを設計し得る。
【００４０】
本発明の実施形態によれば、プローブの組合せは、ウイルスの一部を標的とするプローブのセットを１つ以上含む。ウイルスの一部を標的とするプローブの配列をアライメントしたとき、ウイルスの一部を標的とするプローブの前記アライメントしたセットの配列全体が、標的ウイルスのゲノムにおける特徴的な領域の参照配列と一致する。ウイルスの一部を標的とするプローブのアライメントしたセットにおいて、ウイルスの一部を標的とするプローブはそれぞれ、ウイルスの一部を標的とするプローブの長さの一部分だけ、すぐ隣接するウイルスの一部を標的とするプローブと重複する。いくつかの実施形態において、上記特徴的な領域は、ＨＢＶゲノムの直接反復配列１（ＤＲ１）と直接反復配列２（ＤＲ２）との間の領域を含み得る。他の実施形態では、特徴的な領域がＤＲ１とＤＲ２との間の領域に、領域の２つの末端から伸長して所定の長さに達する２つの伸長領域を加えたものであってもよい。例えば、直接反復配列（ＤＲ）領域の９６０ｂｐ長の参照配列を規定する際に、ＤＲ１およびＤＲ２がウイルスゲノムの３６０〜３７０番目および５９４〜６０４番目に位置すると仮定すると、ＤＲ領域の参照配列は、ＤＲ１とＤＲ２との間の領域の２つの末端から３６０ｂｐのさらなる伸長を有するＤＲ１とＤＲ２との間の領域として規定され得る。結果として、ＨＢＶ遺伝子型ＡゲノムのＤＲ領域の参照配列は、配列番号３〜５であり得る。ＨＢＶ遺伝子型ＢゲノムのＤＲ領域の参照配列は、配列番号６〜９であり得る。ＨＢＶ遺伝子型ＣゲノムのＤＲ領域の参照配列は、配列番号１０〜１３であり得る。ＨＢＶ遺伝子型ＤゲノムのＤＲ領域の参照配列は、配列番号１４〜１６であり得る。ＨＢＶ遺伝子型ＥゲノムのＤＲ領域の参照配列は、配列番号１７〜１９であり得る。ＨＢＶ遺伝子型ＦゲノムのＤＲ領域の参照配列は、配列番号２０〜２２であり得る。ＨＢＶ遺伝子型ＧゲノムのＤＲ領域の参照配列は、配列番号２３〜２５であり得る。ＨＢＶ遺伝子型ＨゲノムのＤＲ領域の参照配列は、配列番号２６〜２８であり得る。ＨＢＶ遺伝子型ＩゲノムのＤＲ領域の参照配列は、配列番号２９〜３１であり得る。ＨＢＶ遺伝子型ＪゲノムのＤＲ領域の参照配列は、配列番号３２であり得る。
【００４１】
例示的な実施形態では、プローブの組合せは、ＨＢＶの一部を標的とするプローブのセットを２つ含む。ＨＢＶの一部を標的とするプローブの一方のセットの配列をアライメントしたとき、アライメントしたＨＢＶの一部を標的とするプローブの配列全体が、ＨＢＶ遺伝子型Ｂのゲノムの直接反復配列（ＤＲ）領域の参照配列（配列番号９）またはＨＢＶ遺伝子型ＣのゲノムのＤＲ領域の参照配列と一致する（配列番号１３）。ＤＲ領域は、ＨＢＶゲノムにおける１１９０〜２２３４番目、１２３１〜２１９０番目、または他の特徴的な領域として定義され得る。上記と同様に、ＨＢＶの一部を標的とするプローブはそれぞれ、ＨＢＶの一部を標的とするプローブの長さの一部分だけ、１つまたは２つのすぐ隣接するＨＢＶの一部を標的とするプローブと重複する。重複する配列の部分は５０％（すなわち、２×タイリング密度）または７５％（すなわち、４×タイリング密度）であってもよいが、これらに限定されない。
【００４２】
ＤＲ領域の参照配列（配列番号９、１３）に対する、ＨＢＶを一部標的とするプローブの考えられる数は、前述の式（１）に従って計算してもよい。例えば、５０ｂｐ〜１２０ｂｐの範囲である総数が６２，１９６のプローブを、ＨＢＶゲノムＤＲ領域の９６０ｂｐ長の参照配列に対して設計し得る。
【００４３】
本発明の一実施形態によれば、プローブの組合せは、ウイルス全長配列のプローブのセットと、ウイルス部分配列のプローブのセットとを含む。ウイルス全長配列のプローブおよびウイルス部分配列を組み合わせて、ウイルスゲノムの参照配列にわたる配列カバレッジを高める。例示的な実施形態において、ＨＢＶの一部を標的とするプローブが、ＤＲ領域においてＨＢＶの全長を標的とするプローブ間をカバーするように設計される。例えば、ＨＢＶの全長を標的とするプローブの長さが１２０ｂｐであり、１、６１、および１２１番目（２×タイリング密度）で開始すると仮定すると、２×タイリングを有するＨＢＶの一部を標的とするプローブは、３１、９１、および１５１番目で開始する。換言すれば、ＤＲ領域は４×タイリング密度（すなわち、それぞれの鎖はそのすぐ隣の鎖の７５％と重複する）を有する２組のプローブ（すなわち、ＨＢＶの全長を標的とするプローブおよびＨＢＶの一部を標的とするプローブ）によってカバーされる。
【００４４】
本発明の一実施形態によれば、プローブの組合せは、ホットスポット遺伝子標的プローブのセットを１つ以上さらに含む。ホットスポット遺伝子標的プローブのセットそれぞれの配列をアライメントしたとき、ホットスポット遺伝子標的プローブをアライメントしたセットの配列全体が、癌ホットスポット遺伝子の参照配列と一致する。ホットスポット遺伝子標的プローブをアライメントしたセットにおいて、ホットスポット遺伝子標的プローブのそれぞれは、ホットスポット遺伝子標的プローブの長さの一部分だけ、すぐ隣接するホットスポット遺伝子標的プローブと重複する。配列重複の部分は５０％（すなわち、２×タイリング密度）または７５％（すなわち、４×タイリング密度）であり得るが、これらに限定されない。
【００４５】
癌ホットスポット遺伝子の参照配列は、ＮＣＢＩ遺伝子データベースから検索可能である。癌ホットスポット遺伝子は、ＮＣＢＩ遺伝子データベース(www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez/query.fcgIDb=Gene)のEntrez Gene IDによって識別される、以下の遺伝子のうちの少なくとも１つを含み得るが、これらに限定されない：ABL1 (Entrez Gene ID: 25), ABL2 (Entrez Gene ID: 27), ACSL3 (Entrez Gene ID: 2181), AF15Q14 (Entrez Gene ID: 57082), AF1Q (Entrez Gene ID: 10962), AF3p21 (Entrez Gene ID: 51517), AF5q31 (Entrez Gene ID: 27125), AKAP9 (Entrez Gene ID: 10142), AKT1 (Entrez Gene ID: 207), AKT2 (Entrez Gene ID: 208), ALDH2 (Entrez Gene ID: 217), ALK (Entrez Gene ID: 238), ALO17 (Entrez Gene ID: 57674), APC (Entrez Gene ID: 11789), ARHGEF12 (Entrez Gene ID: 23365), ARHH (Entrez Gene ID: 399), ARID1A (Entrez Gene ID: 8289), ARID2 (Entrez Gene ID: 196528), ARNT (Entrez Gene ID: 405), ASPSCR1 (Entrez Gene ID: 79058), ASXL1 (Entrez Gene ID: 171023), ATF1 (Entrez Gene ID: 466), ATIC (Entrez Gene ID: 471), ATM (Entrez Gene ID: 472), ATRX (Entrez Gene ID: 546), BAP1 (Entrez Gene ID: 8314), BCL10 (Entrez Gene ID: 8915), BCL11A (Entrez Gene ID: 53335), BCL11B (Entrez Gene ID: 64919), BCL2 (Entrez Gene ID: 596), BCL3 (Entrez Gene ID: 602), BCL5 (Entrez Gene ID: 603), BCL6 (Entrez Gene ID: 604), BCL7A (Entrez Gene ID: 605), BCL9 (Entrez Gene ID: 607), BCOR (Entrez Gene ID: 54880), BCR (Entrez Gene ID: 613), BHD (Entrez Gene ID: 50947), BIRC3 (Entrez Gene ID: 330), BLM (Entrez Gene ID: 641), BMPRIA (Entrez Gene ID: 12166), BRAF (Entrez Gene ID: 673), BRCA1 (Entrez Gene ID: 672), BRCA2 (Entrez Gene ID: 675), BRD3 (Entrez Gene ID: 8019), BRD4 (Entrez Gene ID: 23476), BRIP1 (Entrez Gene ID: 83990), BTG1 (Entrez Gene ID: 694), BUB1B (Entrez Gene ID: 701), C15orf55 (Entrez Gene ID: 144535), C16orf75 (Entrez Gene ID: 387882), CANT1 (Entrez Gene ID: 124583), CARD11 (Entrez Gene ID: 84433), CARs (Entrez Gene ID: 833), CBFB (Entrez Gene ID: 865), CBL (Entrez Gene ID: 867), CBLB (Entrez Gene ID: 868), CBLC (Entrez Gene ID: 23624), CCNB1IP1 (Entrez Gene ID: 57820), CCND1 (Entrez Gene ID: 595), CCND2 (Entrez Gene ID: 894), CCND3 (Entrez Gene ID: 896), CCNE1 (Entrez Gene ID: 898), CD273 (Entrez Gene ID: 80380), CD274 (Entrez Gene ID: 29126), CD74 (Entrez Gene ID: 972), CD79A (Entrez Gene ID: 973), CD79B (Entrez Gene ID: 974), CDH1 (Entrez Gene ID: 999), CDH11 (Entrez Gene ID: 1009), CDK12 (Entrez Gene ID: 51755), CDK4 (Entrez Gene ID: 1019), CDK6 (Entrez Gene ID: 1021), CDKN2A (Entrez Gene ID: 1029), CDKN2C (Entrez Gene ID: 1031), CDX2 (Entrez Gene ID: 1045), CEBPA (Entrez Gene ID: 1050), CEP1 (Entrez Gene ID: 11064), CHCHD7 (Entrez Gene ID: 79145), CHEK2 (Entrez Gene ID: 11200), CHIC2 (Entrez Gene ID: 26511), CHN1 (Entrez Gene ID: 1123), CIC (Entrez Gene ID: 23152), CIITA (Entrez Gene ID: 4261), CLTC (Entrez Gene ID: 1213), CLTCL1 (Entrez Gene ID: 8218), CMKOR1 (Entrez Gene ID: 57007), CoL1A1 (Entrez Gene ID: 1277), CPBP (Entrez Gene ID: 1316), COX6C (Entrez Gene ID: 1345), CREB1 (Entrez Gene ID: 1385), CREB3L1 (Entrez Gene ID: 90993), CREB3L2 (Entrez Gene ID: 64764), CREBBP (Entrez Gene ID: 1387), CRLF2 (Entrez Gene 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【００４６】
実施形態において、選択した癌ホットスポット遺伝子の参照配列の末端領域（例えば、最初の６０ｂｐおよび最後の６０ｂｐ）は単一のプローブによってのみカバーされ、２×タイリングの場合において２つのプローブによってカバーされる非末端領域と比較して低キャプチャ効率を生じ得ることを考慮すると、癌ホットスポット遺伝子の参照配列は配列の両末端を越えて伸長され得る。例えば、ＣＴＮＮＢ１遺伝子のエクソン３は２２８ｂｐの長さであり、配列の両末端での７５ｂｐの伸長は、ＣＴＮＮＢ１のエクソン３の３７８ｂｐ長の参照配列（配列番号３３）を生じる。癌ホットスポット遺伝子の他の参照配列もまた、同様の様式で設計され得る。さらに、エクソンの伸長領域が隣接するエクソンまたはその伸長領域と重複する場合、２つの伸長参照配列は、エクソンとすべての伸長領域との両方をカバーする単一の参照配列に組み込まれ得る。
【００４７】
癌ホットスポット遺伝子に対するホットスポット遺伝子標的プローブの可能な数は、前述の式（１）に従って計算してもよい。例えば、５０ｂｐ〜１２０ｂｐの範囲である総数が２０，８７４のプローブを、ＣＴＮＮＢ１エクソン３の３７８ｂｐ長の参照配列（配列番号３３）に対して設計し得る。同様に、５０ｂｐ〜１２０ｂｐの範囲である総数が４１，８１９のプローブを、ＴＥＲＴプロモーターの６７３ｂｐ長の参照配列（配列番号３４）に対して設計し得る。５０ｂｐ〜１２０ｂｐの範囲である総数が４９，３４５のプローブを、ＴＰ５３エクソン２／３／４の７７９ｂｐ長の参照配列（配列番号３５）に対して設計し得る。５０ｂｐ〜１２０ｂｐの範囲である総数が３１，５２４のプローブを、ＴＰ５３エクソン５／６の５２８ｂｐ長の参照配列（配列番号３６）に対して設計し得る。５０ｂｐ〜１２０ｂｐの範囲である総数が１２，４９６のプローブを、ＴＰ５３エクソン７の２６０ｂｐ長の参照配列（配列番号３７）に対して設計し得る。５０ｂｐ〜１２０ｂｐの範囲である総数が２６，１９９のプローブを、ＴＰ５３エクソン８／９の４５３ｂｐ長の参照配列（配列番号３９）に対して設計し得る。５０ｂｐ〜１２０ｂｐの範囲である総数が１２，２８３のプローブを、ＴＰ５３エクソン１０の２５７ｂｐ長の参照配列（配列番号４０）に対して設計し得る。５０ｂｐ〜１２０ｂｐの範囲である総数が１０，５０８のプローブを、ＴＰ５３エクソン１１の２３２ｂｐ長の参照配列（配列番号４１）に対して設計し得る。
【００４８】
本発明の一実施形態によれば、プローブの組合せは、陰性対照および定量用の外来遺伝子標的プローブのセットを１つ以上さらに含む。外来遺伝子標的プローブのセットの１つの配列をアライメントしたとき、アライメントしたセットの外来遺伝子標的プローブの配列全体が、外来遺伝子の参照配列と一致する。外来遺伝子標的プローブのアライメントしたセットにおいて、外来遺伝子標的プローブのそれぞれは、外来遺伝子標的プローブの長さの一部分だけ、すぐ隣接する外来遺伝子標的プローブと重複する。配列重複の部分は５０％（すなわち、２×タイリング密度）または７５％（すなわち、４×タイリング密度）であり得るが、これらに限定されない。
【００４９】
外来遺伝子の参照配列は、ＮＣＢＩ遺伝子データベースから検索可能である。外来遺伝子は、λファージ、大腸菌、酵母、φＸ１７４、または他の一般的な微生物に由来してもよい。外来遺伝子に対する外来遺伝子標的プローブの考えられる数は、前述の式（１）によって計算してもよい。例えば、５０ｂｐ〜１２０ｂｐの範囲である総数が４７８，６８２のプローブを、λファージゲノムの４８５０２ｂｐ長の参照配列に対して設計し得る（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号NC_001416）。
【００５０】
本実施形態では、外来遺伝子標的プローブの配列に対応するヌクレオチド断片（例えば、スパイクインＤＮＡ）の外部供給源が必要である。換言すれば、ヒトゲノムはそのＢ型肝炎またはＨＣＣ状態にかかわらず、外来遺伝子標的プローブの配列に類似したゲノム領域を含まないので、外来遺伝子標的プローブの配列に対応するヌクレオチド断片が検出処理の間に外部から加えられない場合、外来遺伝子標的プローブは理論的にはヒト試料のゲノム（ｇＤＮＡ）または血中循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）からのヌクレオチド断片を捕捉しない。外来遺伝子標的プローブによって捕捉されたすべてのヌクレオチド断片は理論的には外的に添加されたヌクレオチド断片であるので、外的に添加されたヌクレオチド断片の量および質を操作することができ、したがって絶対定量用の信頼できる手段を提供する。
【００５１】
例示的な実施形態において、λファージゲノムにおける４つの１２０ｂｐの領域（配列番号４２〜４５）を、λファージ標的プローブを設計するために以下の選択基準に従って選択した：ａ）ヒトまたはＨＢＶゲノムと相同性がない；ｂ）λファージゲノムにおいてユニークである；ｃ）所定の範囲内のＧＣ含有量；ｄ）長いモノマー配列（例えば、ＡＡＡＡＡ）がない；および／またはｅ）primer3、netprimer、および他のプライマー設計アルゴリズムによって予測されるような重要な二次構造がない。表１に示すように、ＨＢＶの全長を標的とするプローブ、ＨＢＶの一部を標的とするプローブ、ホットスポット遺伝子標的プローブ、および外来遺伝子標的プローブは、ウイルス−宿主接合部を有するかまたは有さないＨＢＶ  ＤＮＡを含む標的ヌクレオチド断片を捕捉するために、組み合わせて使用してもよい。
【００５２】
【表１】
0006799175.tif 000003
【００５３】
表２に示す別の例示的な実施形態では、さらなるλファージ標的プローブを、４つの１２０ｂｐ領域（配列番号４６〜４９）のうちの１つの下流の伸長領域を２×または４×タイリング密度でカバーするように設計してもよい。λファージ標的プローブのさらなるセット（またはコピー）を使用して、ＨＢＶ標的プローブの２つのコピー（２Ｎ）（一方は遺伝子型Ｂ、他方は遺伝子型Ｃ）およびホットスポット遺伝子標的プローブの１つのコピー（１Ｎ）をシミュレートしてもよい。その結果、λファージゲノム上の伸長領域に対応する、２×／１Ｎ、２×／２Ｎ、４×／１Ｎ、および４×／２Ｎλファージ標的プローブの組合せが生じる。
【００５４】
【表２】
0006799175.tif 000004
【００５５】
さらに、ＧＣ含有量はシークエンシングカバレッジに影響を及ぼすことが報告されており、低いＧＣ比率（ＧＣ＝０．３、カバレッジ＝０．６×）、最適ＧＣ比率（ＧＣ＝０．４８、カバレッジ＝１．３×）、および高いＧＣ比率（０．７、カバレッジ＝０．４×）の試料において約３倍異なる。したがって、表２に示すように、λファージ標的プローブのさらなるセットはまた、プローブのＧＣ含有量を内部制御するように設計してもよい。λファージゲノムにおける５つの１２０ｂｐの領域（配列番号５０〜５４）を、以下の選択基準に従って選択した：ａ）ヒトまたはＨＢＶゲノムと相同性がない；ｂ）λファージゲノムにおいてユニークである；ｃ）所定の範囲内のＧＣ含有量；ｄ）長いモノマー配列（例えば、ＡＡＡＡＡ）がない；およびｅ）primer3、netprimer、および他のプライマー設計アルゴリズムによって予測されるような重要な二次構造がない。その結果、０．３、０．４、０．５、０．６、および０．６８のＧＣ含有量を有する５つの１２０ｂｐ長領域が、λファージ標的プローブの５つのさらなるセット（１×／１Ｎ）を設計するために選択される。
【００５６】
本発明の一実施形態によれば、プローブの組合せは、陽性内部制御および相対定量用の内在遺伝子標的プローブのセットを１つ以上さらに含む。内在遺伝子標的プローブのセットの１つの配列をアライメントしたとき、アライメントしたセットの内在遺伝子標的プローブの配列全体が、内在遺伝子の参照配列と一致する。内在遺伝子標的プローブのアライメントしたセットにおいて、内在遺伝子標的プローブのそれぞれは、内在遺伝子標的プローブの長さの一部分だけ、すぐ隣接する内在遺伝子標的プローブと重複する。配列重複の部分は５０％（すなわち、２×タイリング密度）または７５％（すなわち、４×タイリング密度）であり得るが、これらに限定されない。
【００５７】
内在遺伝子の参照配列は、ＮＣＢＩ遺伝子データベースから検索可能である。実施形態において、内在遺伝子はヒトゲノムに固有であり、ＮＣＢＩ遺伝子データベース(www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez/query.fcgIDb=Gene)のEntrez Gene IDによって識別される、以下の遺伝子のうちの少なくとも１つを含み得るが、これらに限定されない：GAPDH（グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ; Entrez gene ID: 2597）, UBL4A（ユビキチン様4A; GdX;Entrez gene ID: 8266）, HPRT1 (Entrez Gene ID: 3251), TBP (Entrez Gene ID: 6908), B2M (Entrez Gene ID: 567), RPL13A (Entrez Gene ID: 23521), RN18S1 (Entrez Gene ID: 100008588), C1orf43 (Entrez Gene ID: 25912), CHMP2A (Entrez Gene ID: 27243), EMC7 (Entrez Gene ID: 56851), GPI (Entrez Gene ID: 2821), PSMB2 (Entrez Gene ID: 5690), PSMB4 (Entrez Gene ID: 5692), RAB7A (Entrez Gene ID: 7879), REEP5 (Entrez Gene ID: 7905), SNRPD3 (Entrez Gene ID: 6634), VCP (Entrez Gene ID: 7415), VPS29 (Entrez Gene ID: 51699), ACTB (Entrez Gene ID: 60), PPIA (Entrez Gene ID: 5478), GUSB (Entrez Gene ID: 2990), HSP90AB1 (Entrez Gene ID: 3326), RPLP0 (Entrez Gene ID: 6175), TFRC (Entrez Gene ID: 7037), UBC (Entrez Gene ID: 7316)。
【００５８】
内在遺伝子に対する内在遺伝子標的プローブの考えられる数は、前述の式（１）に従って計算してもよい。例えば、ＧＡＰＤＨ遺伝子の１６８２ｂｐ長の参照配列に対して、５０ｂｐ〜１２０ｂｐの範囲である総数が１１３，４５８のプローブを設計することができる。同様に、ＧｄＸ遺伝子の３５８３ｂｐ長の参照配列に対して、５０ｂｐ〜１２０ｂｐの範囲である総数が２４８，４２９のプローブを設計することができる。
【００５９】
本実施形態において、内在遺伝子は配列検出の信頼性を高めるように選択される。すなわち、内在遺伝子は、安定して発現し、腫瘍において変異することが見出されていない一般的なハウスキーピング遺伝子に採用される。ＣＴＮＮＢ１、ＴＰ５３、ＴＥＲＴ、および上記に列挙した他の癌関連遺伝子等の癌ホットスポット遺伝子の構造的変異が腫瘍サンプルにおいて報告されており、それらのコピー数が、欠失、重複、または他の構造的変異に起因して腫瘍形成の間に変化し得るので、癌ホットスポット遺伝子のみの検出による定量化は信頼できない可能性があることが理解され得る。したがって、表２に示す例示的な実施形態では、２×タイリング濃度におけるＧＡＰＤＨ遺伝子の２４０ｂｐの領域（配列番号５５）を標的とするプローブ、および２×タイリングにおけるＧｄＸ遺伝子の２４０領域（配列番号５６）を標的とするプローブが内部対照としてプローブの組合せに含まれる。ＧＡＰＤＨおよびＧｄＸ遺伝子の２４０ｂｐの領域は、ＨＢＶゲノム、長いモノマー、重要な二次構造、または所定の領域外のＧＣ含有量に対して相同性を有さない。ＧｄＸ遺伝子を採用することのさらなる利点は、ＧｄＸがまた、試験対象の性別を同定するために使用され得ることである。
【００６０】
本発明のいくつかの実施形態において、プローブはそれぞれマーカー分子で標識され、検出および定量が容易になる。マーカー分子にはビオチン、蛍光タンパク質、発光タンパク質、抗体、放射性化合物、またはそれらの任意の組合せを含み得るが、これらに限定されない。
【００６１】
本発明の別の態様は、ＤＮＡウイルス（例えば、ＨＢＶ、ＨＰＶ、ＥＢＶ、ＨＨＶ−８、ＨＴＬＶ、ＭＣＶ、もしくは他のＤＮＡウイルス）による感染またはウイルス感染関連癌（例えば、肝細胞癌、子宮頸癌、上咽頭癌、リンパ腫、メルケル細胞癌、もしくはＤＮＡウイルスによる感染に関連する他の癌）を検出する方法を提供する。一実施形態において、本方法は、対象の試料から核酸を抽出する工程；核酸を増幅する工程；核酸を上記の種々の実施形態のプローブの組合せとハイブリダイズさせることによって標的ヌクレオチド断片を捕捉する工程；標的ヌクレオチド断片をシークエンシングする工程；および、標的ヌクレオチド断片を分析する工程を含む。
【００６２】
本実施形態において、核酸は、ウイルス核酸、宿主ゲノム核酸、およびウイルス−宿主接合部を有する核酸を含み得、そしてＤＮＡ、ＲＮＡ、またはポリヌクレオチドであり得る。核酸の抽出は、沈殿、クロマトグラフィーおよび／または磁気ビーズキャプチャによって行ってもよい。核酸が抽出される試料は、体液（例えば、血液、汗、唾液、涙、尿、リンパ液、もしくは間質液）または組織（例えば、肝臓組織）であり得る。抽出した核酸の増幅は、ＤＮＡクローニング、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、ネステッドＰＣＲ、定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）および／またはデジタルＰＣＲによって行ってもよい。標的ヌクレオチド断片はハイブリダイゼーション（例えば、サザンブロットハイブリダイゼーション、in situハイブリダイゼーション、もしくはノーザンブロットハイブリダイゼーション）および／またはロックダウン（例えば、ビーズベースの方法またはチップベースの方法）によって、プローブの組合せによって捕捉してもよい。捕捉した標的核酸は、ＮＧＳ（例えば、大規模並列シークエンシング、一分子シークエンシング、またはNanoString）、Maxam-Gilbertシークエンシング、Sangerシークエンシング、パイロシークエンシング、および／またはＤＮＡマイクロアレイによってシークエンシングしてもよい。
【００６３】
別の実施形態では、増幅工程およびハイブリダイゼーション工程を逆にしてもよい。言い換えれば、本発明の別の実施形態による方法は、対象の試料から核酸を抽出する工程；核酸を本発明の種々の実施形態のプローブの組合せとハイブリダイズさせることによって標的ヌクレオチド断片を捕捉する工程；捕捉した標的ヌクレオチド断片を増幅する工程；標的ヌクレオチド断片をシークエンシングする工程；および、標的ヌクレオチド断片を分析する工程を含む。
【００６４】
プローブの組合せによって捕捉された標的核酸の分析および定量は、以下のように行ってもよい。生データのリード（ＲＲ、raw read）は、ＮＧＳシークエンシング機器から直接生成する。生データのリード中の低クオリティリードを除外し、高クオリティリード（ＨＱＲ）を得る。ＨＱＲはユニークなリード（ＵＲ）に圧縮される。すなわち、完全に同一の配列を有するＨＱＲは、単一のユニークなリードに折り畳まれ、そのコピー数（重複）に関する情報が保持される。最後に、低重複であるＵＲを除外し、高重複であるユニークなリード（ＨＲＵＲ）がもたらされる。また、高重複であるユニークなリードに含まれるリード（ＲｉＨＲＵＲ）の総数は、圧縮処理中に保持された重複情報によって算出してもよい。
【００６５】
一実施形態において、ＮＧＳデータセットを分析する際に採用するバイオインフォマティクス分析方法を表３に要約する。
【００６６】
【表３】
0006799175.tif 000005
【００６７】
表３はまた、本実施形態の方法と、Ｚｈａｏによって報告された方法とを比較する。表３に示すように、２つの方法において大きな違いがいくつかある。Ｚｈａｏの方法はすぐ隣接する接合部をマージする。一方、本実施形態の方法は配列類似性に基づいて接合部をマージする。また、Ｚｈａｏの方法は、ユニークな接合部のみを考慮して、重複したリードを除去する。一方、本実施形態の方法は、重複が５未満であるリードを除外し、重複情報を保持し、単一のユニークな接合部に対するリードの総数に基づいて接合部を定量する。
【００６８】
プローブ特異性の検証
本発明の実施形態に従って設計されたＴＰ５３エクソン２〜１１（配列番号３５〜３８、４０〜４１）を標的とするプローブを、ＨＣＣ患者のＨＣＣ腫瘍ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、非腫瘍ｇＤＮＡ、およびｃｔＤＮＡとハイブリダイズさせ、ｑＰＣＲによって定量した。脊椎動物で保存され、肝臓で高発現するマイクロＲＮＡであるｍｉＲ−１２２もまた陰性対照として定量した。
【００６９】
【表４】
0006799175.tif 000006
【００７０】
表４に実証されるように、３つの試料タイプのすべてにおいて、ｍｉＲ−１２２よりも有意に高いＴＰ５３のハイブリダイゼーション後の保持率は、ＴＰ５３断片がＴＰ５３標的プローブによってうまくハイブリダイズ、捕捉および回収されたことを示した。対照的に、ＴＰ５３標的プローブがｍｉＲ−１２２に対して特異性を有さないので、ｍｉＲ−１２２断片は、手順中に洗い流された。表４はまた、ＴＰ５３標的プローブによって捕捉されたゲノムＤＮＡからのＴＰ５３断片の量が、ｍｉＲ−１２２断片の量よりも２５０倍を超えて高く、ｃｔＤＮＡから捕捉されたＴＰ５３断片がｍｉＲ−１２２断片よりも１０倍を超えて濃縮されたことを示す。この結果は、ＴＰ５３標的プローブが配列特異的であり、ＤＮＡ試料からＴＰ５３遺伝子断片を選択的に捕捉し得ることを実証した。
【００７１】
一方、表５に示すように、合計２６個のＨＣＣ腫瘍ｇＤＮＡ試料が、上記の表１に列挙したプローブの組合せによって濃縮し、ＨＢＶゲノム、ＨＢＶ−ヒト接合部（「接合部」と表示）および癌ホットスポット遺伝子（ＣＴＮＮＢ１、ＴＥＲＴ、およびＴＰ５３を含む）の存在の分析のために、次世代配列決定（ＮＧＳ）によってシークエンシングする。ＨＢＶ−ヒト接合部は、ヒトゲノムへのＨＢＶ組込みを示す。表５の宿主ゲノム率は、ヒトゲノムに対する捕捉された配列の計算した長さ比である。表５に示すように、計算した宿主ゲノム比と観察されたＮＧＳリード比との間の有意差は、プローブの組合せによるＨＢＶゲノム、癌ホットスポット遺伝子およびＨＢＶ−ヒト接合部が濃縮していることを示した。
【００７２】
【表５】
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【００７３】
宿主ゲノムにおける推定３ｋｂの接合部の長さは、単一の接合部が１５０ｂｐの検出範囲を有すると推定することによって計算されたことが理解されるのであろう。したがって、２つの接合部をもたらす、単一の組込み事象は、３００ｂｐの接合部領域によって表される。したがって、患者当たり１０個の検出可能な接合部のおおよその推定値を使用することにより、個々の患者の推定接合部の長さを３ｋｂ（すなわち、３００ｂｐ×１０）に設定した。次いで、組込みＨＢＶ（遊離型非組込みＨＢＶを除く）の長さを３２．１５ｋｂ（すなわち、３．２１５ｋｂ×１０）と推定した。本明細書中に示すヒトゲノムにおける接合部およびＨＢＶ率の推定はとても粗く、そしておそらく過大推定であり、これは、接合部およびＨＢＶの濃縮効率の過小評価が生じる。
【００７４】
ここで図３を参照する。本発明の実施形態によって設計された接合部標的プローブが、特異的なウイルス−宿主接合部を有するＤＮＡ断片を選択的に捕捉することが実証されている。ＨＣＣ腫瘍ｇＤＮＡ試料を、３人のＨＣＣ患者（ｐｔ３、ｐｔ１１、およびｐｔ１５と示す）の腫瘍組織（Ｔと示す）および非腫瘍組織（Ｎと示す）から収集し、ｐｔ３およびｐｔ１１それぞれにおけるＨＢＶ−ヒト接合部の配列に従って設計されたプローブ１（ｐｔ３接合部と示す）およびプローブ２（ｐｔ１１接合部と示す）とハイブリダイズさせた。図３に示すウェスタンブロット解析によって、プローブ１が患者ｐｔ３の腫瘍ｇＤＮＡと選択的にハイブリダイズし、プローブ２が患者ｐｔ１１の腫瘍ｇＤＮＡと選択的にハイブリダイズすることを示された。ＮＴＣは「テンプレート対照なし」を示し、実験の陰性対照として使用した；一方、ＰＢＧＤ（すなわち、ポルホビリノーゲンデアミナーゼ遺伝子）およびｍｉＲ−１２２を陽性対照として使用した。
【００７５】
ここで図４Ａおよび４Ｂを参照する。次いで、プローブ１（ｐｔ３接合部と示す）を用いて、患者ｐｔ３のゲノムＤＮＡおよび血清ＤＮＡにおけるＨＢＶ−ヒト接合部の存在を検出した。図４Ａに示すように、患者ｐｔ３の腫瘍ｇＤＮＡと、手術前（ｐｒｅ−ＯＰ）および手術後（ｐｏｓｔ−ＯＰ）血清ＤＮＡとにおいて、ｐｔ３特異的ＨＢＶ−ヒト接合部が観察された。このような接合部は、患者ｐｔ１１または非ＨＣＣ  ＨＢＶ陽性患者（「正常」と示す）では観察されなかった。同様に、図４Ｂに示すように、プローブ２（ｐｔ１１接合部と示す）を用いて、患者ｐｔ１１のゲノムＤＮＡおよび血清ＤＮＡにおけるＨＢＶ−ヒト接合部の存在を検出した場合、ｐｔ１１特異的ＨＢＶ−ヒト接合部は、患者ｐｔ１１の腫瘍ｇＤＮＡと、手術前（ｐｒｅ−ＯＰ）血清ＤＮＡにおいて観察された。このような接合部は、患者ｐｔ１５または非ＨＣＣ  ＨＢＶ陽性患者（「正常」と表示される）では観察されなかった。
【００７６】
キャプチャ効率の検証
上記の表２に列挙したプローブの組合せを用いて、腫瘍ｇＤＮＡおよび血漿ｃｔＤＮＡペア試料（すなわち、１人のＨＣＣ患者由来のＤＮＡ試料）中のＤＮＡ断片を分析し、様々な試料の種類におけるプローブの組合せのキャプチャ効率を決定した。表６のＮＧＳ統計に示すように、ＨＢＶの全長、ＨＢＶの一部、およびＨＢＶ−ヒト接合部リードにおいて、腫瘍ｇＤＮＡは血漿ｃｔＤＮＡよりも１０〜１８倍高く、腫瘍ｇＤＮＡ試料におけるプローブの組合せの高キャプチャ効率を実証した。さらに、腫瘍ｇＤＮＡ試料中で同定した１０の接合部の種類のうち８つは、有意なリード数（＞９４７）を有し、７５％の接合部の回収率を示した。
【００７７】
【表６】
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【００７８】
図５Ａおよび図５Ｂは、各プローブによって捕捉される、配列決定されたＮＧＳリードの予測比を示す、ヒートマップ変換棒グラフである。一方、図６は、同じプローブの組合せを用いた別のＨＣＣ患者の腫瘍ｇＤＮＡ試料のＮＧＳ結果を示す（表２）。
【００７９】
ここで図７を参照する。ＨＢＶ  ＤＮＡの検出およびヒトゲノムへのＨＢＶ組込みに加え、本発明の実施形態のプローブの組合せはまた、癌関連遺伝子変異を検出し得る。図８に示すように、遺伝子型ＢのＨＢＶ感染を有する男女のＨＣＣ患者のＤＮＡ試料のＮＧＳ分析により、患者間において、検出されたユニークなＨＢＶ−ヒト接合部（「接合部の種類」と示す）、ＴＥＲＴまたはＭＬＬ４領域で検出されたユニークな接合部（「ＴＥＲＴ／ＭＬＬ４組込み」と示す）、およびＴＥＲＴプロモーターまたはＣＴＮＮＢ１エクソン３領域における既知の癌ホットスポット変異（「ＴＥＲＴ／ＣＴＮＮＢ１変異」と示す）の数が異なることを示した。
【００８０】
利点および長所
本発明の実施形態であるプローブの組合せおよび分析方法は、従来技術よりも有意に優れた感度および効率を示す。表７に示すように、Ｌｉによって報告された結果と比較して、本発明の好ましい実施形態（表１）のプローブの組合せによって捕捉された標的ヌクレオチド断片は、ＨＢＶ比が有意に高く、接合部リードが高く、そしてヒト比率が低い。
【００８１】
【表７】
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【００８２】
さらに、本発明の実施形態である、ウイルス−宿主接合部を同定するバイオインフォマティクス分析法を用いて、Ｚｈａｏによって報告されたＮＧＳデータセットの分析によって、Ｚｈａｏのリードの９７．５％がヒトであり、ＨＢＶ、ＨＢＶの一部、および接合部はそれぞれわずか、１．４９％、１．４３％、および１％であり、ＨＢＶ断片およびＨＢＶ−ヒト接合部の濃縮において存在するＨＢＶキャプチャプローブの効率の低さを再確認した。さらに、Ｚｈａｏは１５７個の接合部を同定することのみ報告しているが、本発明の実施形態の分析方法によるＺｈａｏのＮＧＳデータセットの分析によって、４６９個の接合部を明らかにし、Ｚｈａｏの接合部のほぼ８０％を回収する。これらの結果は、本発明の実施形態の分析方法がウイルス組込みの検出において高感度であり、既存の技術よりも有意に多くのウイルス−宿主接合部を同定できることを実証する。
【００８３】
さらに、ＪｉａｎｇおよびＳｕｎｇのダイレクトシークエンシングアプローチと比較して、本発明の実施形態であるプローブの組合せおよび分析方法は、典型的なＮＧＳデータセットにおいて約５００万の１５０ｂｐのリード（すなわち、Ｊｉａｎｇよりも、リード数の８０％減少または全ヌクレオチドの６０％減少）を生み出すに過ぎないが、５００万のリードから３０７，１０１ものＨＢＶリードおよび６９，１９８もの接合部リードを同定することができる。これらの結果はまた、本発明の実施形態が、ウイルス組込みの同定において感度が高いだけでなく、高効率であることを実証する。
【００８４】
要するに、上記の本発明の実施形態は、ウイルス感染およびウイルス感染誘発癌の検出に対して、有効かつ汎用性のツールを提供する。本発明の実施形態は、さまざまな種類のＤＮＡウイルスの存在およびウイルス組込みの検出に適用され得る。本実施形態によって設計されたプローブの組合せは、最適なウイルス／宿主配列カバレッジを確実にし、遺伝的安定性を考慮し、したがって、高感度、高効率、および高信頼性であることが実証される。
【００８５】
以上の説明は、本開示の実施形態に過ぎず、本開示の範囲を限定することを意図するものではない。本開示の特許請求の範囲および明細書による多くの変形および改変は依然として、請求される開示の範囲内にある。また、実施形態および特許請求の範囲のそれぞれは、開示されたすべての利点または特徴を達成する必要はない。さらに、要約および発明の名称は、特許文献の検索を容易にするためにのみ役立ち、請求される開示の範囲を限定することを決して意図しない。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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