(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Glechoma longituba (Nakai) Kupr.の抽出物であって、
化合物Ｉ：ルテオリン−７−Ｏ−［β−グルクロノシル（１→２）β−グルクロン酸］
【化１】
0006651498.tif 000013
および
化合物ＩＩ：アピゲニン−７−Ｏ−［β−グルクロノシル（１→２）β−グルクロン酸］
【化２】
0006651498.tif 000014
を含んでなり、
化合物Ｉおよび化合物ＩＩの双方の重量が、前記抽出物全重量の１％〜７５％を占める、前記抽出物。
【請求項２】
化合物Ｉおよび化合物ＩＩの双方の重量が、前記抽出物全重量の１％〜２５％を占める、請求項１に記載の抽出物。
【請求項３】
化合物Ｉおよび化合物ＩＩの双方の重量が、前記抽出物全重量の２０％〜６０％を占める、請求項１に記載の抽出物。
【請求項４】
化合物Ｉおよび化合物ＩＩの双方の重量が、前記抽出物全重量の５０％〜７５％を占める、請求項１に記載の抽出物。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の抽出物を製造する方法であって、
ａ）Glechoma longituba (Nakai) Kupr.を水溶液で１または複数回抽出し、Glechoma longituba (Nakai) Kupr.の水溶性抽出液を得ること、および、任意で、得られた抽出液を濃縮すること、
ｂ）任意で濃縮したGlechoma longituba (Nakai) Kupr.の水溶性抽出液に、ある体積のアルコール溶液を添加して沈殿物を作製すること、および、
ｃ）工程ｂ）で作製した前記沈殿物を分離すること
を含んでなる、前記方法。
【請求項６】
前記抽出物における化合物Ｉの含量が０．６％超であり、前記抽出物における化合物ＩＩの含量が０．６％超である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記抽出物における化合物Ｉの含量が２５％超である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記抽出物における化合物Ｉの含量が３９％超である、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記抽出物における化合物ＩＩの含量が２５％超である、請求項６〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記抽出物における化合物ＩＩの含量が３２％超である、請求項６〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記抽出物におけるコーヒー酸およびロスマリン酸の含量が０．５％未満である、請求項５〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記抽出物におけるコーヒー酸およびロスマリン酸の含量が０．１％未満である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
工程ａ）における前記水溶液が、４０％超の水含量を有する、請求項５〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
工程ａ）における前記水溶液が、８０％超の水含量を有する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
工程ａ）における前記水溶液が、水である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
工程ａ）における前記抽出が、加熱還流による抽出または超音波抽出である、請求項５〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
工程ａ）における前記抽出が、２〜５回実施される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
工程ａ）で得られたGlechoma longituba (Nakai) Kupr.の前記水溶性抽出液が、有機溶媒によって抽出されてもよく、有機相は廃棄され、処置したGlechoma longituba (Nakai) Kupr.の水溶性抽出液をさらなる操作のために残す、請求項５〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記有機溶媒が酢酸エチルまたはジクロロメタンである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
工程ａ）で得られたGlechoma longituba (Nakai) Kupr.の前記水溶性抽出液が、さらに冷却され得る、請求項５〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記冷却が、４〜６℃で行われる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記冷却が、濃縮の後に行われる、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記濃縮が、減圧下での濃縮である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
工程ｂ）における前記アルコール溶液が、エタノールと水の混合系である、請求項５〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記エタノールと水の混合系が、９０％エタノールである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記エタノールと水の混合系が、９５％エタノールである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
工程ｂ）における前記アルコール溶液が、前記任意で濃縮したGlechoma longituba (Nakai) Kupr.の水溶性抽出液の体積の２〜４倍の体積を有する、請求項５〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
工程ｃ）における分離によって得られる前記沈殿物が、任意で凍結乾燥され得る、請求項５〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
工程ｃ）における分離によって得られる前記沈殿物が、マクロ孔質吸着樹脂で任意で精製され得、ここで、マクロ孔質吸着樹脂での前記精製が、
ｉ）工程ｃ）における分離によって得られた前記沈殿物を水性溶媒で溶解し、水溶液を作製すること、および、任意で残渣アルコールを除去すること、
ｉｉ）前記マクロ孔質樹脂上に、任意で残渣アルコールを除去した前記水溶液を添加すること、
ｉｉｉ）水性溶離液で、タンパク質および多糖類の成分を除去すること、および、
ｉｖ）アルコール溶離液で溶離し、得られた溶出液を濃縮してGlechoma longituba (Nakai) Kupr.の精製抽出物を作製することによって実施される、請求項５〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
工程ｉ）における前記水溶液が、４０％超の水含量を有する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
工程ｉ）における前記水溶液が、８０％超の水含量を有する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
工程ｉ）における前記水溶液が、水である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
工程ｉｉ）における前記マクロ孔質樹脂が、Ｄ−１０１、Ｄ−１０１−Ｉ、ＤＡ−２０１、ＤＭ−３０１、ＤＭ−１３０、ＡＢ−８、ＨＰＤ−１００、ＨＰＤ−３００、ＨＰＤ−４００、ＨＰＤ−６００、ＨＰＤ−８２６またはこれらの樹脂に類似した充填剤である、請求項２９〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
工程ｉｉ）における前記マクロ孔質樹脂が、Ｄ−１０１である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
工程ｉｉｉ）における前記水性溶離液が、９０％超の水含量を有する、請求項２９〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
工程ｉｉｉ）における前記水性溶離液が、９５％超の水含量を有する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
工程ｉｉｉ）における前記水性溶離液が、水である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
工程ｉｖ）における前記アルコール溶離液が、エタノールと水の混合系である、請求項２９〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記エタノールと水の混合系が、５〜２０％エタノールである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記エタノールと水の混合系が、１０〜１５％エタノールである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
血糖を低下させる医薬の製造のための、請求項１〜４のいずれか一項に記載のGlechoma longituba (Nakai) Kupr.の抽出物の使用。
【請求項４２】
血液脂質を低下させる医薬の製造のための、請求項１〜４のいずれか一項に記載のGlechoma longituba (Nakai) Kupr.の抽出物の使用。
【請求項４３】
体重を減量させる医薬の製造のための、請求項１〜４のいずれか一項に記載のGlechoma longituba (Nakai) Kupr.の抽出物の使用。
【請求項４４】
腎臓疾患を治療する医薬の製造のための、請求項１〜４のいずれか一項に記載のGlechoma longituba (Nakai) Kupr.の抽出物の使用。
【請求項４５】
ジペプチジルペプチダーゼＩＶの活性を阻害する医薬の製造のための、請求項１〜４のいずれか一項に記載のGlechoma longituba (Nakai) Kupr.の抽出物の使用。
【請求項４６】
前記ジペプチジルペプチダーゼＩＶの活性の阻害が糖尿病を治療することである、請求項４５に記載の使用。
【請求項４７】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のGlechoma longituba (Nakai) Kupr.の抽出物および薬剤的に許容できる担体を含んでなる医薬組成物。
【請求項４８】
化合物Ｉおよび化合物ＩＩが、前記医薬組成物中の活性成分の総重量の５０％超を占める、請求項４７に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医学の技術分野に関する。本発明は、血糖低下、血液脂質低下、体重減量もしくは腎臓疾患の治療のためのGlechoma longituba (Nakai) Kupr.の抽出物、当該抽出物を調製する方法、血糖低下、血液脂質低下、体重減量もしくは腎臓疾患の治療のための医薬の製造において当該抽出物を使用すること、または、前記疾患の治療のために当該抽出物を使用する方法、ならびに、当該抽出物を含んでなる組成物を開示する。本発明はまた、血糖低下、血液脂質低下、体重減量もしくは腎臓疾患の治療のための化合物Ｉおよび化合物ＩＩ、当該化合物を調製する方法、血糖低下、血液脂質低下、体重減量もしくは腎臓疾患の治療のための医薬の製造において当該化合物を使用すること、または、前記疾患の治療のために当該化合物を使用する方法、ならびに、当該化合物を含んでなる組成物を開示する。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病（ＤＭ）は、インスリン分泌の欠陥および（または）正常な生理作用におけるインスリンの機能不全に起因する血糖上昇によって特徴付けられる全身性代謝障害である。現代の医学研究によって、血液脂質上昇と糖尿病との間には、明らかな疫学上の関連性があることが分かっている。肥満の人の血液脂質を調節することで、高血糖が防止され得る。糖尿病患者にとって、体重の減少と血液脂質の調節は、糖尿病患者の死亡率および障害率を低下するための重要なキーである。
【０００３】
フオクスエダン（HuoXueDan）またはトウグチアオ（TouGuXiao）としても知られるGlechoma longituba (Nakai) Kupr.は、ユーラシアの温度領域で広く分布する、シソ科のGlechoma Linn.の乾燥植物全体であり、北米および南米でも栽培されている。我々の国では、北西および内モンゴルを除いた各地に分布している。Glechoma longituba (Nakai) Kupr.は、Bencao Gangmu Shiyiで初めて言及され、苦味および刺激性を有し、冷たい性質を有し、肝臓、腎臓癌および膀胱のチャネルに寄与し、利尿の促進および有痛性排尿困難の治療、熱の除去および解毒、うっ滞の解消ならびに腫れの解消に効果を有する。臨床上、Glechoma longituba (Nakai) Kupr.は、尿路結石、肝内および胆嚢結石、湿熱黄疸（damp-heat jaundice）、および、落下による損傷の治療のために主に使用される。中国薬局方（２０１０年版）には、シソ植物であるフオクスエダン、Glechoma longituba (Nakai) Kupr.が、Glechoma longituba (Nakai) Kupr.薬用材料としてリストされている。
【０００４】
Glechoma longituba (Nakai) Kupr.の６５％エタノール抽出物の総フラボンは、ストレプトゾトシンで誘発した糖尿病マウスの血糖値を低下させ得ることが報告され、グルコース低下メカニズムは、ストレプトゾトシンに誘発される膵臓ランゲルハンス島β細胞の損傷を阻害し、それによって、ストレプトゾトシンで誘発した糖尿病マウスのβ細胞の数を増大させることであると考えられた（Yuan Chunlin, et al., Pharmacology and Clinics of Chinese Materia Medica, 2008, 24(3), 57-58）。Yang Nianyun, et al., (Journal of China Pharmaceutical University, 2005, 36(3), 210-212)は、抽出およびカラムクロマトグラフィーを用いて、Glechoma longituba (Nakai) Kupr.の８０％エタノール抽出物から、１０個のGlechoma longituba (Nakai) Kupr.フラボン化合物を得、その後、Yang Nianyun, et al., (Chinese Journal of Natural Medicines, 2006, 4(2), 98-100)が、Glechoma longituba (Nakai) Kupr.の８０％エタノール還流抽出液のｎ−ブタノール抽出物から再度１０個の化合物を分離し、ここで、化合物ＩＩの収率は単に約２ｐｐｍである。Yuan Chunling, et al.もYang Nianyun, et al.も、Glechoma longituba (Nakai) Kupr.の抽出物のいずれかの具体的なフラボン化合物の抗糖尿病活性の報告はしなかった。同時に、Yuan Chunling, et al.およびYang Nianyun, et al.が報告した総フラボンの成分は、本発明のルテオリン−７−Ｏ−［β−グルクロノシル（１→２）β−グルクロン酸］を含んでなっていない。
【０００５】
日本人の研究者らが、動物のインビボアッセイにおけるGlechoma hederacea subsp. grandisの煎じ汁によるグルコースの急激な低下をかつて研究した（Shinji I., et al. Nippon Shokuhin Kagaku Kogaku Kaishi, 2007,54(9):412-414）。この参考文献によって、Glechoma hederacea subsp. grandisから得られた抽出液の多糖類成分が、グルコース減少の主要な活性成分であると推定された。しかし、中国薬局方（２０１０年版）は、Glechoma hederacea subsp. grandisを、伝統的な漢方薬である、Glechoma longituba (Nakai) Kupr.の供給源としてリストしていない。さらに、Flora of China (Editorial board of Flora of China of Chinese Academy of Sciences, Flora of China (Volume 65, Fascicle 2), Beijing: Science Press, 1977)では、Glechoma hederacea subsp. grandisがGlechoma Linn.の別の品種として明確にリストされており、Glechoma hederacea subsp. grandisおよびGlechoma longituba (Nakai) Kupr.（Glechoma longituba (Nakai) Kupr.）が同一品種に属さないということを意味する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、血糖低下、血液脂質低下、体重減量もしくは腎臓疾患の治療のためのGlechoma longituba (Nakai) Kupr.の抽出物、当該抽出物を調製する方法、血糖低下、血液脂質低下、体重減量もしくは腎臓疾患の治療のための医薬の製造において当該抽出物を使用すること、または、前記疾患の治療のために当該抽出物を使用する方法、ならびに、当該抽出物を含んでなる組成物を提供することを目的とする。本発明はまた、血糖低下、血液脂質低下、体重減量もしくは腎臓疾患の治療のための化合物ＩおよびＩＩ、当該化合物を調製する方法、血糖低下、血液脂質低下、体重減量もしくは腎臓疾患の治療のための医薬の製造において当該化合物を使用すること、または、前記疾患の治療のために当該化合物を使用する方法、ならびに、当該化合物を含んでなる組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、Glechoma longituba (Nakai) Kupr.の抽出物を提供し、当該抽出物は、
化合物Ｉ：ルテオリン−７−Ｏ−［β−グルクロノシル（１→２）β−グルクロン酸］
【化１】
0006651498.tif 000002
および
化合物ＩＩ：アピゲニン−７−Ｏ−［β−グルクロノシル（１→２）β−グルクロン酸］
【化２】
0006651498.tif 000003
を含んでなり、化合物Ｉおよび化合物ＩＩの双方の重量は、抽出物全重量の１％〜７５％、好ましくは１％〜２５％、２０％〜６０％または５０％〜７５％を占める。
【０００８】
１つの好ましい態様では、本発明のGlechoma longituba (Nakai) Kupr.の抽出物に含まれる化合物Ｉおよび化合物ＩＩの双方は、抽出物全重量の１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６５％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％以上を占める。さらに好ましい態様では、本発明のGlechoma longituba (Nakai) Kupr.の抽出物に含まれる化合物Ｉおよび化合物ＩＩの双方は、抽出物全重量の９９％、９５％、９０％、８５％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、７５％、７４％、７３％、７２％、７１％、７０％、６５％、６０％、５９％、５８％、５７％、５６％、５５％、５４％、５３％、５２％、５１％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２９％、２８％、２７％、２６％、２５％、２４％、２３％、２２％、２１％、２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％以下を占める。さらに好ましい態様では、本発明のGlechoma longituba (Nakai) Kupr.の抽出物に含まれる化合物Ｉおよび化合物ＩＩの双方は、抽出物全重量の１％〜９９％、１％〜２５％、２５％〜５０％、５０％〜７５％、７５％〜９９％、２５％〜９９％、２５％〜７５％、５０％〜９９％、１％〜７５％、１％〜２５％、２０％〜６０％、５０％〜７５％などといった、上記重量含量値のいずれかの組合せの範囲にある重量含量を占める。本発明で開示する範囲は、端点を包含または除外する。
【０００９】
本発明はさらに、Glechoma longituba (Nakai) Kupr.の抽出物を提供し、当該抽出物は、
化合物Ｉ：ルテオリン−７−Ｏ−［β−グルクロノシル（１→２）β−グルクロン酸］
【化３】
0006651498.tif 000004
および
化合物ＩＩ：アピゲニン−７−Ｏ−［β−グルクロノシル（１→２）β−グルクロン酸］
【化４】
0006651498.tif 000005
を含んでなり、そして、
Glechoma longituba (Nakai) Kupr.の抽出物は、
ａ）Glechoma longituba (Nakai) Kupr.を水溶液で１または複数回抽出し、Glechoma longituba (Nakai) Kupr.の水溶性抽出液を得ること、および、任意で、得られた抽出液を濃縮すること、
ｂ）任意で濃縮したGlechoma longituba (Nakai) Kupr.の水溶性抽出液に、ある体積のアルコール溶液を添加して沈殿物を作製すること、および、
ｃ）工程ｂ）で作製した沈殿物を分離すること
を含んでなる方法によって得られる。
【００１０】
本発明の一態様では、本発明のGlechoma longituba (Nakai) Kupr.のあらゆる抽出物は、化合物Ｉを、０．６％超、好ましくは２５％超、より好ましくは３９％超の含量で含んでなり、また、化合物ＩＩを、０．６％超、好ましくは２５％超、より好ましくは３２％超の含量で含んでなる。
【００１１】
本発明はまた、
化合物Ｉ：ルテオリン−７−Ｏ−［β−グルクロノシル（１→２）β−グルクロン酸］
【化５】
0006651498.tif 000006
もしくは薬剤的に許容できるその塩、および／または、
化合物ＩＩ：アピゲニン−７−Ｏ−［β−グルクロノシル（１→２）β−グルクロン酸］
【化６】
0006651498.tif 000007
もしくは薬剤的に許容できるその塩、および／または、
化合物Ｉおよび化合物ＩＩの双方もしくは双方の化合物の薬剤的に許容できるあらゆる塩
を含んでなる混合物を提供する。
【００１２】
本発明の他の態様では、化合物Ｉもしくは薬剤的に許容できるその塩、および／または、化合物ＩＩもしくは薬剤的に許容できるその塩、および／または、化合物Ｉおよび化合物ＩＩの双方もしくは双方の化合物の薬剤的に許容できるあらゆる塩を含んでなる本発明の混合物は、化合物Ｉを、０．６％超、好ましくは２５％超、より好ましくは３９％超の含量で含んでなり、また、化合物ＩＩを、０．６％超、好ましくは２５％超、より好ましくは３２％超の含量で含んでなる。
【００１３】
１つの好ましい態様では、化合物Ｉもしくは薬剤的に許容できるその塩、および／または、化合物ＩＩもしくは薬剤的に許容できるその塩、および／または、化合物Ｉおよび化合物ＩＩの双方もしくは双方の化合物の薬剤的に許容できるあらゆる塩を含んでなる本発明の混合物は、化合物Ｉまたは化合物ＩＩを、それぞれ１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６５％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％以上の含量で含んでなる。さらに好ましい態様では、化合物Ｉもしくは薬剤的に許容できるその塩、および／または、化合物ＩＩもしくは薬剤的に許容できるその塩、および／または、化合物Ｉおよび化合物ＩＩの双方もしくは双方の化合物の薬剤的に許容できるあらゆる塩を含んでなる本発明の混合物は、化合物Ｉまたは化合物ＩＩを、それぞれ９９％、９５％、９０％、８５％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、７５％、７４％、７３％、７２％、７１％、７０％、６５％、６０％、５９％、５８％、５７％、５６％、５５％、５４％、５３％、５２％、５１％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２９％、２８％、２７％、２６％、２５％、２４％、２３％、２２％、２１％、２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％以下の含量で含んでなる。さらに別の好ましい態様では、化合物Ｉもしくは薬剤的に許容できるその塩、および／または、化合物ＩＩもしくは薬剤的に許容できるその塩、および／または、化合物Ｉおよび化合物ＩＩの双方もしくは双方の化合物の薬剤的に許容できるあらゆる塩を含んでなる本発明の混合物は、化合物Ｉまたは化合物ＩＩを１％〜９９％、１％〜２５％、２５％〜５０％、５０％〜７５％、７５％〜９９％、２５％〜９９％、２５％〜７５％、５０％〜９９％、１％〜７５％、１％〜２５％、２０％〜６０％、５０％〜７５％などといった、上記重量含量値のいずれかの組合せの範囲にある含量で含んでなる。本発明で開示する範囲は、端点を包含または除外する。
【００１４】
本発明の一態様では、本発明は、本発明のGlechoma longituba (Nakai) Kupr.のいずれかの抽出物および薬剤的に許容できる担体を含んでなる医薬組成物を提供する。本発明の他の態様では、本発明は、化合物Ｉもしくは薬剤的に許容できるその塩、および／または、化合物ＩＩもしくは薬剤的に許容できるその塩、および／または、化合物Ｉおよび化合物ＩＩの双方もしくは双方の化合物の薬剤的に許容できるあらゆる塩を含んでなる本発明の混合物、ならびに、薬剤的に許容できる担体を含んでなる医薬組成物も提供する。
【００１５】
本発明の一態様では、本発明のGlechoma longituba (Nakai) Kupr.のいずれかの抽出物を含んでなる医薬組成物中の化合物Ｉおよび化合物ＩＩは、医薬組成物中の活性成分の総重量の５０％超を占め；または、ＤＰＰ４阻害活性といった医薬組成物の生物学的活性が、抽出物を含んでなる医薬組成物から化合物ＩおよびＩＩを実質的に除去した後に５０％超で低下する。本発明の他の態様では、化合物Ｉもしくは薬剤的に許容できるその塩、および／または、化合物ＩＩもしくは薬剤的に許容できるその塩、および／または、化合物Ｉおよび化合物ＩＩの双方もしくは双方の化合物の薬剤的に許容できるあらゆる塩を含んでなる本発明の混合物を含んでなる医薬組成物中の化合物Ｉおよび化合物ＩＩは、医薬組成物中の活性成分の総重量の５０％超を占め；または、ＤＰＰ４阻害活性といった医薬組成物の生物学的活性が、混合物を含んでなる医薬組成物から化合物ＩおよびＩＩを実質的に除去した後に５０％超で低下する。
【００１６】
本発明の一態様では、本発明のGlechoma longituba (Nakai) Kupr.のいずれかの抽出物のコーヒー酸およびロスマリン酸の含量は、０．５％未満、好ましくは０．１％未満である。本発明の他の態様では、化合物Ｉもしくは薬剤的に許容できるその塩、および／または、化合物ＩＩもしくは薬剤的に許容できるその塩、および／または、化合物Ｉおよび化合物ＩＩの双方もしくは双方の化合物の薬剤的に許容できるあらゆる塩を含んでなる本発明の混合物中のコーヒー酸およびロスマリン酸の含量は、０．５％未満、好ましくは０．１％未満である。
【００１７】
本発明の一態様では、本発明は、Glechoma longituba (Nakai) Kupr.のどの抽出物も、血糖を低下させる、血液脂質を低下させる、体重を減量させる、または、腎臓疾患を治療する作用を有することを開示する。本発明の他の態様では、化合物Ｉもしくは薬剤的に許容できるその塩、および／または、化合物ＩＩもしくは薬剤的に許容できるその塩、および／または、化合物Ｉおよび化合物ＩＩの双方もしくは双方の化合物の薬剤的に許容できるあらゆる塩を含んでなる本発明の混合物は、血糖を低下させる、血液脂質を低下させる、体重を減量させる、または、腎臓疾患を治療する作用を有する。
【００１８】
したがって、本発明は、血糖を低下させる、血液脂質を低下させる、体重を減量させる、または、腎臓疾患を治療するための抽出物を提供する。本発明の他の態様では、血糖を低下させる、血液脂質を低下させる、体重を減量させる、または、腎臓疾患を治療するための、化合物Ｉもしくは薬剤的に許容できるその塩、および／または、化合物ＩＩもしくは薬剤的に許容できるその塩、および／または、化合物Ｉおよび化合物ＩＩの双方もしくは双方の化合物の薬剤的に許容できるあらゆる塩を含んでなる混合物も提供する。
【００１９】
任意で、本発明は、血糖を低下させる、血液脂質を低下させる、体重を減量させる、または、腎臓疾患を治療するための方法を提供し、当該方法は、本発明のGlechoma longituba (Nakai) Kupr.のいずれかの抽出物をそれが必要な患者に投与することを含んでなる。本発明の他の態様では、本発明は、血糖を低下させる、血液脂質を低下させる、体重を減量させる、または、腎臓疾患を治療するための方法を提供し、当該方法は、化合物Ｉもしくは薬剤的に許容できるその塩、および／または、化合物ＩＩもしくは薬剤的に許容できるその塩、および／または、化合物Ｉおよび化合物ＩＩの双方もしくは双方の化合物の薬剤的に許容できるあらゆる塩を含んでなる本発明の混合物をそれが必要な患者に投与することを含んでなる。
【００２０】
または、さらに任意で、本発明は、血糖低下、血液脂質低下、体重減量または腎臓疾患の治療のための医薬の製造における、いずれかのGlechoma longituba (Nakai) Kupr.の前記抽出物の使用を提供する。本発明は、血糖低下、血液脂質低下、体重減量または腎臓疾患の治療のための医薬の製造における、化合物Ｉもしくは薬剤的に許容できるその塩、および／または、化合物ＩＩもしくは薬剤的に許容できるその塩、および／または、化合物Ｉおよび化合物ＩＩの双方もしくは双方の化合物の薬剤的に許容できるあらゆる塩を含んでなる前記混合物の使用も提供する。
【００２１】
本発明はさらに、Glechoma longituba (Nakai) Kupr.を抽出する方法を提供し、当該方法は、
ａ）Glechoma longituba (Nakai) Kupr.を水溶液で１または複数回抽出し、Glechoma longituba (Nakai) Kupr.の水溶性抽出液を得ること、および、任意で、得られた抽出液を濃縮すること、
ｂ）任意で濃縮したGlechoma longituba (Nakai) Kupr.の水溶性抽出液に、ある体積のアルコール溶液を添加して沈殿物を作製すること、および、
ｃ）工程ｂ）で作製した沈殿物を分離すること
を含んでなる。
【００２２】
本発明の一態様では、本発明のGlechoma longituba (Nakai) Kupr.を抽出する方法の工程ａ）における水溶液は、４０％超、好ましくは８０％超の水含量を有し、最も好ましくは、水溶液は水である。
【００２３】
本発明の一態様では、本発明のGlechoma longituba (Nakai) Kupr.を抽出する方法の工程ａ）における抽出は、加熱還流または超音波抽出であり、好ましくは２〜５回実施される。
【００２４】
本発明の一態様では、本発明のGlechoma longituba (Nakai) Kupr.を抽出する方法の工程ａ）で得られたGlechoma longituba (Nakai) Kupr.の水溶性抽出液は、有機溶媒によって抽出されてもよく、有機相は廃棄され、処置したGlechoma longituba (Nakai) Kupr.の水溶性抽出液をさらなる操作のために残し、ここで、有機溶媒は好ましくは酢酸エチルまたはジクロロメタンである。
【００２５】
本発明の一態様では、本発明のGlechoma longituba (Nakai) Kupr.を抽出する方法の工程ａ）で得られたGlechoma longituba (Nakai) Kupr.の水溶性抽出液は、任意の濃縮の後に、好ましくは減圧下での濃縮後に、好ましくは４〜６℃で、さらに冷却され得る。
【００２６】
本発明の一態様では、本発明のGlechoma longituba (Nakai) Kupr.を抽出する方法の工程ｂ）におけるアルコール溶液は、好ましくはエタノールと水の混合系であり、より好ましくは９０％エタノール、および最も好ましくは９５％エタノールである。
【００２７】
本発明の一態様では、本発明のGlechoma longituba (Nakai) Kupr.を抽出する方法の工程ｂ）におけるアルコール溶液は、任意で濃縮したGlechoma longituba (Nakai) Kupr.の水溶性抽出液の体積の２〜４倍の体積を有する。
【００２８】
本発明の一態様では、本発明のGlechoma longituba (Nakai) Kupr.を抽出する方法の工程ｃ）における分離によって得られる沈殿物は、凍結乾燥され得る。
【００２９】
本発明の一態様では、本発明のGlechoma longituba (Nakai) Kupr.を抽出する方法の工程ｃ）における分離によって得られる沈殿物は、マクロ孔質吸着樹脂で精製してもよく、ここで、マクロ孔質吸着樹脂での精製は、
ｉ）工程ｃ）における分離によって得られた沈殿物を水性溶媒で溶解し、水溶液を作製すること、および、任意で残渣アルコールを除去すること、
ｉｉ）マクロ孔質樹脂上に、任意で残渣アルコールを除去した水溶液を添加すること、
ｉｉｉ）水性溶離液で、タンパク質および多糖類の成分を除去すること、および、
ｉｖ）アルコール溶離液で溶離し、得られた溶出液を濃縮してGlechoma longituba (Nakai) Kupr.の精製抽出物を作製すること
によって実施される。
【００３０】
本発明の一態様では、本発明の工程ｉ）における水溶液は、４０％超、好ましくは８０％超の水含量を有し、および、最も好ましくは、水溶液は水である。
【００３１】
本発明の一態様では、本発明の工程ｉｉ）におけるマクロ孔質樹脂は、Ｄ−１０１、Ｄ−１０１−Ｉ、ＤＡ−２０１、ＤＭ−３０１、ＤＭ−１３０、ＡＢ−８、ＨＰＤ−１００、ＨＰＤ−３００、ＨＰＤ−４００、ＨＰＤ−６００、ＨＰＤ−８２６またはこれらの樹脂に類似した充填剤であり、好ましくはＤ−１０１である。
【００３２】
本発明の一態様では、本発明の工程ｉｉｉ）における水溶液は、９０％超、好ましくは９５％超の水含量を有し、および、最も好ましくは、水溶液は水である。
【００３３】
本発明の一態様では、本発明の工程ｉｖ）におけるアルコール溶離液は、エタノールと水の混合系であり、好ましくは５〜２０％エタノール、および、最も好ましくは１０〜１５％エタノールである。
【００３４】
本発明は、各化合物Ｉおよび化合物ＩＩを調製する好ましいプロセスを提供し、当該プロセスにおいて、工程ｉ）からｉｖ）で得たGlechoma longituba (Nakai) Kupr.の抽出物は、ポリアミド、シリカゲル、ゲルまたは充填剤として逆相充填材、好ましくは逆相充填材を用いたカラムクロマトグラフィーによってすばやく分離および精製され、各化合物に関して最大９６％以上の純度を達成し得ることを特徴とする。
【００３５】
本発明の医薬組成物は、錠剤、硬カプセル剤、柔カプセル剤、腸溶カプセル、ミクロカプセル剤、粒剤、シロップ剤、注射剤、粒剤、乳液、懸濁液、溶剤、および、経口または非経口投与のための徐放製剤の形態である。
【００３６】
本発明の薬剤的に許容できる担体は、当業者には良く知られている薬剤的に許容できる担体を指す。本発明の薬剤的に許容できる担体としては、限定はされないが、充填剤、潤湿剤、接着剤、崩壊剤、潤滑剤、結合剤、滑剤、風味剤、界面活性剤、保存剤などが包含される。充填剤としては、限定はされないが、ラクトール、結晶セルロース、デンプン、粉糖、デキストリン、マンニトール、硫酸カルシウムなどが包含される。潤湿および結合剤としては、限定はされないが、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ゼラチン、スクロース、ポリビニルピロリドンなどが包含される。崩壊剤としては、限定はされないが、デンプングリコール酸ナトリウム、架橋ポリビニルピロリドン、架橋カルボキシルメチルセルロースナトリウム、低置換ヒドロキシプロピルセルロースなどが包含される。潤滑剤としては、限定はされないが、ステアリン酸マグネシウム、ミクロ粉末シリカゲル、タルク、硬化植物油、ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸マグネシウムなどが包含される。結合剤としては、限定はされないが、アラビアゴム、アルギン酸、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、デキストレート（dextrates）、デキストリン、ブドウ糖、エチルセルロース、ゼラチン、液体グルコース、グアーガム、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、マルトデキストリン、メチルセルロース、ポリメタクリレート、ポリビニルピロリドン、アルファ化デンプン、アルギン酸ナトリウム、ソルビトール、デンプン、シロップまたはトラガントが包含される。滑剤としては、限定はされないが、コロイド状二酸化ケイ素、粉末セルロース、三ケイ酸マグネシウム、二酸化ケイ素およびタルクが包含される。風味剤としては、限定はされないが、アスパルテーム、ステビオサイド、フルクトース、グルコース、シロップ、ハチミツ、キシリトール、マンニトール、ラクトール、ソルビトール、マルチトール、グリチルリジンが包含される。界面活性剤としては、限定はされないが、Ｔｗｅｅｎ−８０、ポロクサマーが包含される。保存剤としては、限定はされないが、パラベン、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸カリウムなどが包含される。
【００３７】
本発明の薬剤的に許容できる塩としては、限定はされないが、塩酸、臭化水素酸、フッ化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸といった無機酸と形成された塩；ギ酸、酢酸、プロピオン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、ピクリン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸といった有機酸、および、アスパラギン酸、グルタミン酸といった酸性アミノ酸と形成された酸付加塩；または、例えば、ナトリウム、カリウムといった無機塩基と形成された塩；もしくはリシン、アルギニン、オルチニンといった塩基性アミノ酸と形成された塩基付加塩が包含される。
【００３８】
フオクスエダンまたはトウグチアオとしても知られる本発明のGlechoma longituba (Nakai) Kupr.（Glechoma longituba (Nakai) Kupr.）は、Glechoma Linn.の乾燥植物全体であり、中国薬局方（２０１０年版）において、Glechoma longituba (Nakai) Kupr.薬用材料の唯一の合法な供給源の品種である。Glechoma Linn.はさらに、Glechoma hederacea Linn.、Glechoma biondiana (Diels) C. Y. Wu & C. Chen、および、Glechoma sinograndis C. Y. Wuといった品種を包含する。これらの品種は、Glechoma longituba (Nakai) Kupr.と類似した効能を有する。
【００３９】
本発明におけるジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＤＰ４）は、膜貫通型セリンタンパク質であり、プロリルオリゴペプチダーゼファミリーの一員である。ＤＤＰ４は、２型糖尿病治療のための新規のターゲットである。ＤＤＰ４は、インビボおよびインビトロにおいて、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）の分解および不活性化を主に促進する重要な酵素の１つである。現在、ＤＤＰ４阻害剤が新規の抗糖尿病医薬であることが医療上実証されている。臨床結果によって、この種類の医薬は、インスリンまたはスルホニルウレアの抗糖尿病医薬に起因する体重増加および低血糖といった、よく見られる有害な反応が観察されることなく、血糖の低下に良好な効果を有することが示され、よって、ＤＤＰ４阻害剤の研究は抗糖尿病医薬研究で注目されている。
【００４０】
本発明によって、化合物Ｉおよび化合物ＩＩが、ＤＤＰ４活性を効果的に阻害し得、１００μＭの濃度におけるＤＤＰ４の阻害率は、それぞれ４０．８％および３４．１％であることが分かり、したがって、血糖低下効果を有することが分かる。
【００４１】
したがって、本発明は、血糖を低下させる抽出物を提供する。本発明の他の態様では、本発明は、血糖を低下させるための、化合物Ｉもしくは薬剤的に許容できるその塩、および／または、化合物ＩＩもしくは薬剤的に許容できるその塩、および／または、化合物Ｉおよび化合物ＩＩの薬剤的に許容できる塩もしくはその双方のいずれかを含んでなる混合物も提供する。任意で、本発明は血糖を低下させる方法を提供し、当該方法は、本発明のGlechoma longituba (Nakai) Kupr.のいずれかの抽出物をそれが必要な患者に投与することを含んでなる。本発明の他の態様では、本発明は、血糖を低下させる、血液脂質を低下させる、体重を減量させる、または、腎臓疾患を治療するための方法を提供し、当該方法は、化合物Ｉもしくは薬剤的に許容できるその塩、および／または、化合物ＩＩもしくは薬剤的に許容できるその塩、および／または、化合物Ｉおよび化合物ＩＩの薬剤的に許容できる塩もしくはその双方のいずれかを含んでなる本発明の混合物をそれが必要な患者に投与することを含んでなる。または、さらに任意で、本発明は、血糖を低下させる医薬の製造のためのGlechoma longituba (Nakai) Kupr.のあらゆる抽出物の使用を提供する。本発明はまた、血糖を低下させる医薬の製造のための、化合物Ｉもしくは薬剤的に許容できるその塩、および／または、化合物ＩＩもしくは薬剤的に許容できるその塩、および／または、化合物Ｉおよび化合物ＩＩの薬剤的に許容できる塩もしくはその双方のいずれかを含んでなる混合物の使用も提供する。本発明はまた、ＤＤＰ４活性の阻害のための医薬の製造におけるGlechoma longituba (Nakai) Kupr.のあらゆる抽出物の使用も提供する。本発明はまた、ＤＤＰ４活性の阻害のための医薬の製造における、化合物Ｉもしくは薬剤的に許容できるその塩、および／または、化合物ＩＩもしくは薬剤的に許容できるその塩、および／または、化合物Ｉおよび化合物ＩＩの薬剤的に許容できる塩もしくはその双方のいずれかを含んでなる混合物の使用も提供する。本発明の一態様では、本発明におけるジペプチジルペプチダーゼＩＶの活性の阻害は、糖尿病の治療を指す。
【００４２】
グルコースオキシダーゼ（ＧＯＸ）は、補欠分子団（auxiliary group）としてフラビンアデニンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）を有するオキシダーゼであり、グリコール酸からシュウ酸への酸化を触媒する。ＧＯＸの過剰発現は、シュウ酸塩の生産を助長し、それによって、腎臓結石および腎炎のリスクが増大し得る。したがって、腎臓結石および腎炎の治療のための医薬開発において、グルコースオキシダーゼの阻害剤を求めることは重要な方法および試みである。本発明によって、化合物Ｉおよび化合物ＩＩは、ＧＯＸに対して特定の阻害活性を有し、ここで、化合物ＩのＩＣ５０値は０．５ｍＭであり、化合物ＩＩのＩＣ５０値は０．４ｍＭであり、よって、腎臓結石および腎炎の治療において、可能性を有する薬理活性を有することがさらに分かっている。
【００４３】
したがって、本発明は、腎臓疾患を治療する抽出物を提供する。本発明の他の態様では、本発明は、腎臓疾患を治療するための、化合物Ｉもしくは薬剤的に許容できるその塩、および／または、化合物ＩＩもしくは薬剤的に許容できるその塩、および／または、化合物Ｉおよび化合物ＩＩの薬剤的に許容できる塩もしくはその双方のいずれかを含んでなる混合物も提供する。任意で、本発明は腎臓疾患を治療する方法を提供し、当該方法は、本発明のGlechoma longituba (Nakai) Kupr.のあらゆる抽出物をそれが必要な患者に投与することを含んでなる。本発明の他の態様では、本発明は、血糖を低下させる、血液脂質を低下させる、体重を減量させる、または、腎臓疾患を治療するための方法を提供し、当該方法は、化合物Ｉもしくは薬剤的に許容できるその塩、および／または、化合物ＩＩもしくは薬剤的に許容できるその塩、および／または、化合物Ｉおよび化合物ＩＩの薬剤的に許容できる塩もしくはその双方のいずれかを含んでなる本発明の混合物をそれが必要な患者に投与することを含んでなる。または、さらに任意で、本発明は、腎臓疾患を治療する医薬の製造のためのGlechoma longituba (Nakai) Kupr.のあらゆる抽出物の使用を提供する。本発明はまた、腎臓疾患を治療する医薬の製造のための、化合物Ｉもしくは薬剤的に許容できるその塩、および／または、化合物ＩＩもしくは薬剤的に許容できるその塩、および／または、化合物Ｉおよび化合物ＩＩの薬剤的に許容できる塩もしくはその双方のいずれかを含んでなる混合物の使用も提供する。
【００４４】
トリグリセリド（トリアシルグリセロールとしても知られる）は、真核生物においてエネルギーを保管するための主要な形態である。哺乳動物では、トリグリセリドは、小腸、肝臓および脂肪細胞で主に合成される。トリグリセリドの代謝、吸収および新規合成双方の障害および機能不全は、例えば肥満、高脂血症などといった複数の疾患の病変形成に関係する。パンクレリパーゼは、膵腺房細胞によって分泌され、膵管を通って十二指腸に入り、十二指腸および小腸上部の油と水の境界面で、トリグリセリドを吸収可能な２−モノアシルグリセロールおよび遊離脂肪酸に加水分解する。パンクレリパーゼは、５０％〜７０％の食物性脂肪の加水分解を行う。パンクレリパーゼ活性の阻害は、腸内のトリアシルグリセロールが消化および吸収されるのを防止し得、血液のトリグリセリド値を低下し得、組織の脂肪の凝集を減少させ、よって、血液脂質の低下および体重減量に効果を有し得る。ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ１（ＤＧＡＴ１）は、トリアシルグリセロール合成の最終工程である、アシル補酵素Ａのアシルを２−モノアシルグリセロールに転移してトリアシルグリセロールを形成する転移を触媒し、トリアシルグリセロール合成の律速酵素である。ビアシルグリセロールからのトリグリセリドの合成は、ＤＧＡＴ１酵素活性の阻害または低減によって低下され得る。ＤＧＡＴ１酵素の阻害剤を用いて、例えば血液脂質の低下および体重の減量に効果を有することで、トリグリセリドの異常代謝に関連する疾患を治療し得る。
【００４５】
また、本発明によって、化合物Ｉおよび化合物ＩＩは、食物中の脂肪の吸収を阻害するように作用し、それによって、血液脂質を低下および体重を減量するよう機能することが分かっている。本発明によって、化合物Ｉおよび化合物ＩＩはＤＧＡＴ１およびパンクレリパーゼの活性を効果的に阻害し得、それによって、血液脂質を低下および体重を減量するよう機能することが分かっている。５０μＭの濃度である化合物ＩおよびＩＩは、双方ともＤＧＡＴ１に対して５０％超の阻害率を有し；１０μＭの濃度である化合物ＩおよびＩＩは依然としてＤＧＡＴ１に対して約２０％の阻害活性を示す。同濃度の化合物ＩおよびＩＩは双方とも、パンクレリパーゼに対して４０％超の阻害率を有する。
【００４６】
したがって、本発明は、血液脂質を低下させる抽出物を提供する。本発明の他の態様では、本発明は、血液脂質を低下させるための、化合物Ｉもしくは薬剤的に許容できるその塩、および／または、化合物ＩＩもしくは薬剤的に許容できるその塩、および／または、化合物Ｉおよび化合物ＩＩの薬剤的に許容できる塩もしくはその双方のいずれかを含んでなる混合物も提供する。任意で、本発明は血液脂質を低下させる方法を提供し、当該方法は、本発明のGlechoma longituba (Nakai) Kupr.のあらゆる抽出物をそれが必要な患者に投与することを含んでなる。本発明の他の態様では、本発明は、血糖を低下させる、血液脂質を低下させる、体重を減量させる、または、腎臓疾患を治療するための方法を提供し、当該方法は、化合物Ｉもしくは薬剤的に許容できるその塩、および／または、化合物ＩＩもしくは薬剤的に許容できるその塩、および／または、化合物Ｉおよび化合物ＩＩの薬剤的に許容できる塩もしくはその双方のいずれかを含んでなる本発明の混合物をそれが必要な患者に投与することを含んでなる。または、さらに任意で、本発明は、血液脂質を低下させる医薬の製造のためのGlechoma longituba (Nakai) Kupr.のあらゆる抽出物の使用を提供する。本発明はまた、血液脂質を低下させる医薬の製造のための、化合物Ｉもしくは薬剤的に許容できるその塩、および／または、化合物ＩＩもしくは薬剤的に許容できるその塩、および／または、化合物Ｉおよび化合物ＩＩの薬剤的に許容できる塩もしくはその双方のいずれかを含んでなる混合物の使用も提供する。
【００４７】
したがって、本発明は、体重を減量させる抽出物を提供する。本発明の他の態様では、本発明は、体重を減量させるための、化合物Ｉもしくは薬剤的に許容できるその塩、および／または、化合物ＩＩもしくは薬剤的に許容できるその塩、および／または、化合物Ｉおよび化合物ＩＩの薬剤的に許容できる塩もしくはその双方のいずれかを含んでなる混合物も提供する。任意で、本発明は、体重を減量させる方法を提供し、当該方法は、本発明のGlechoma longituba (Nakai) Kupr.のあらゆる抽出物をそれが必要な患者に投与することを含んでなる。本発明の他の態様では、本発明は、血糖を低下させる、血液脂質を低下させる、体重を減量させる、または、腎臓疾患を治療するための方法を提供し、当該方法は、化合物Ｉもしくは薬剤的に許容できるその塩、および／または、化合物ＩＩもしくは薬剤的に許容できるその塩、および／または、化合物Ｉおよび化合物ＩＩの薬剤的に許容できる塩もしくはその双方のいずれかを含んでなる本発明の混合物をそれが必要な患者に投与することを含んでなる。または、さらに任意で、本発明は、体重を減量させる医薬の製造のためのGlechoma longituba (Nakai) Kupr.のあらゆる抽出物の使用を提供する。本発明はまた、体重を減量させる医薬の製造のための、化合物Ｉもしくは薬剤的に許容できるその塩、および／または、化合物ＩＩもしくは薬剤的に許容できるその塩、および／または、化合物Ｉおよび化合物ＩＩの薬剤的に許容できる塩もしくはその双方のいずれかを含んでなる混合物の使用も提供する。
【００４８】
本発明における糖尿病は、１型糖尿病、２型糖尿病、糖尿病の他の特別な種類および妊娠糖尿病を包含する。
【００４９】
本発明における血液脂質の低下とは、血液中のトリグリセリド値の低下を指す。
【００５０】
本発明における腎臓疾患の治療は、腎臓結、腎炎などの治療を指す。
【００５１】
本発明は、以下の実施例を用いて本発明の有益な効果を例示する。当業者であれば、これらの実施例は例示のためのみであり、限定するものではないことが分かるだろう。これらの実施例は、いかなる方法でも本発明の範囲を限定しない。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】図１は、様々な調製プロセスで得たGlechoma longituba (Nakai) Kupr.の抽出物の主要成分のＨＰＬＣ分析結果を示す。
【図２】図２は、本発明のGlechoma longituba (Nakai) Kupr.の抽出物、および、参考文献で報告された抽出プロセスで得た抽出物の主要成分のＨＰＬＣ分析結果を示す。
【図３】図３は、好ましい調製プロセスで得たGlechoma longituba (Nakai) Kupr.の抽出物の化合物ＩおよびＩＩのＨＰＬＣ分析結果を示す。
【図４】図４は、２５０ｍｇ／ｋｇおよび５００ｍｇ／ｋｇの双方であるGlechoma longituba (Nakai) Kupr.の抽出物、ＬＱＣ−Ｈ−１が、マウスの急性経口グルコース耐性を顕著に向上し得、グルコースの経口投与の後、マウスの血中インスリン値を増大したことを示す。留意：図４（Ａ）：ＬＱＣ−Ｈ−１は、マウスの急性経口グルコース耐性を向上し、ここで、横軸はグルコースの投与後の時間を表し、縦軸は血糖濃度を表す；図４（Ｂ）：較正群に照らして較正した経口グルコース耐性の曲線下面積（ＡＵＣ）、＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１、コントロール群と比較；図４（Ｃ）：グルコースの経口投与から２０分後の血清インスリンの濃度、コントロール群と比較、＊＊ｐ＜０．０１。
【図５】図５は、２５０ｍｇ／ｋｇおよび５００ｍｇ／ｋｇの双方であるGlechoma longituba (Nakai) Kupr.の抽出物、ＬＱＣ−Ｈ−２が、マウスの急性経口グルコース耐性を顕著に向上させることができたことを示す。留意：図５（Ａ）：ＬＱＣ−Ｈ−２は、マウスの急性経口グルコース耐性を向上し、ここで、横軸はグルコースの投与後の時間を表し、縦軸は血糖濃度を表す；図５（Ｂ）：較正群に照らして較正した経口グルコース耐性の曲線下面積（ＡＵＣ）、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、コントロール群と比較。
【図６】図６は、水での抽出およびアルコールでの沈殿によるGlechoma longituba (Nakai) Kupr.の抽出物の上澄みならびにアルコール沈殿固形物の粗多糖類のいずれもマウスの急性経口グルコース耐性を向上しなかったことを示す。留意：図６（Ａ）：粗多糖類ならびにGlechoma longituba (Nakai) Kupr.の水での抽出およびアルコールでの沈殿による上澄み成分のいずれもマウスの急性経口グルコース耐性を向上せず、ここで、横軸はグルコースの投与後の時間を表し、縦軸は血糖濃度を表す；図６（Ｂ）：較正群に照らして較正した経口グルコース耐性の曲線下面積であり、ここで、投与群とコントロール群との間の違いには統計的な有意差は一切なかった。
【図７】図７は、Glechoma longituba (Nakai) Kupr.の抽出物、ＬＱＣ−Ｈ−１の長期投与が、特発性２型糖尿病モデルのｄｂ／ｄｂマウスの糖尿病の症状を改善したことを示す。留意：図７（Ａ）：ＬＱＣ−Ｈ−１はマウスの体重に顕著な影響を及ぼさなかった一方で、ロシグリタゾンの長期投与は、マウスの体重を増大し、ここで、横軸は投与時間を表し、縦軸は重量を表す；図７（Ｂ）：ＬＱＣ−Ｈ−１は、ｄｂ／ｄｂマウスの随時血糖を低下し、この効果は陽性薬剤、ロシグリタゾンに類似しており、ここで、横軸は投与時間を表し、縦軸は血糖を表す、２５０ｍｇ／ｋｇ投与量の群およびコントロール群の比較によると＃ｐ＜０．０５、５００ｍｇ／ｋｇ投与量の群およびコントロール群の比較によると＊ｐ＜０．０５；図７（Ｃ）：ＬＱＣ−Ｈ−１は、投与から４週間の時点でマウスの急性経口グルコース耐性を向上し、この効果は陽性薬剤、ロシグリタゾンに類似しており、ここで、横軸はグルコースの投与後の時間を表し、縦軸は血糖濃度を表す；図７（Ｄ）：各群の曲線下面積、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、コントロール群と比較；図７（Ｅ）：ＬＱＣ−Ｈ−１は、グルコースの経口投与から４週間後のｄｂ／ｄｂマウスの血清インスリン値を増加した、＊ｐ＜０．０５、コントロール群と比較。
【図８】図８は、天然生成物由来の効果的なＤＰＰ４阻害剤であるGlechoma longituba (Nakai) Kupr.の抽出物中のそれぞれの主要な活性化合物Ｉおよび化合物ＩＩが単独で作用してマウスの急性経口グルコース耐性を顕著に向上したことを示す。留意：図８（Ａ）：ＤＤＰ４酵素に対する化合物Ｉおよび化合物ＩＩのインビトロ阻害活性、ポジティブコントロールとしてシタグリプチン；図８（Ｂ）：化合物Ｉおよび化合物ＩＩはマウスの急性経口グルコース耐性を向上した、ポジティブコントロールとしてシタグリプチン、ここで、横軸はグルコースの投与後の時間を表し、縦軸は血糖濃度を表す；図（Ｃ）：較正群に照らして較正した経口グルコース耐性の曲線下面積（ＡＵＣ）、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、コントロール群と比較；ｎ．ｓ．は、２００ｍｇ／ｋｇの化合物と１０ｍｇ／ｋｇのシタグリプチンの投与量群の違いに統計的な有意差がなかったことを指す。
【図９】図９は、１００ｍｇ／ｋｇの投与量であるGlechoma longituba (Nakai) Kupr.の抽出物の個別の主要活性化合物Ｉがマウスの急性経口グルコース耐性を顕著に向上したことを示す。留意：図９（Ａ）：マウスの急性経口グルコース耐性試験、ここで、横軸はグルコースの投与後の時間を表し、縦軸は血糖濃度を表す；図９（Ｂ）：マウスの各群の経口グルコース耐性の曲線下面積、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、コントロール群と比較。
【図１０】図１０は、化合物Ｉの長期投与がｄｂ／ｄｂマウスの血糖を効果的に低下させることができたことを示す。留意：図１０（Ａ）：化合物Ｉは、投与から２週間後にマウスの随時血糖を低下し、この効果は陽性薬剤、シタグリプチンに似ていた；図１０（Ｂ）：化合物Ｉは、投与から２週間後にマウスの空腹時血糖を低下し、この効果は陽性薬剤、シタグリプチンに似ていた、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、コントロール群と比較。
【図１１】図１１は、Glechoma longituba (Nakai) Kupr.の抽出物、ＬＱＣ−Ｈ−１が、急性高トリグリセリド血症マウスの血清トリグリセリド値を低下させることができたことを示す。留意：Glechoma longituba (Nakai) Kupr.の抽出物、ＬＱＣ−Ｈ−１は、急性高トリグリセリド血症マウスの血清トリグリセリド値を低下し得、ポジティブコントロールとして１０ｍｇ／ｋｇのＬＣＱ９０８；モデル群は２ｇ／ｋｇのオリーブ油を投与することでモデル化し、ブランク群はオリーブ油を投与しないことでモデル化した。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図１２】図１２は、Glechoma longituba (Nakai) Kupr.の６５％エタノール超音波抽出物（ＬＱＣ−６５％エタノール抽出物）はマウスの急性グルコース耐性に顕著な影響を及ぼさなかったことを示す。留意：図１２（Ａ）：マウスの急性経口グルコース耐性試験、横軸はグルコースの投与後の時間を表し、縦軸は血糖濃度を表す；図１２（Ｂ）：較正群に照らして較正した経口グルコース耐性の曲線下面積、＊＊ｐ＜０．０１、ｎ．ｓ．＝有意差なし。
【発明を実施するための形態】
【００５３】
材料、試薬および装置
Glechoma longituba (Nakai) Kupr.材料：上海、カンチャオ（Kangqiao）の伝統的な漢方薬の煎じ薬有限会社から２０１２年８月に購入；ロット番号：１２０７１３；製造日：２０１２年７月１６日。
【００５４】
試薬：９５％エタノール、蒸留水、酢酸エチル、ジクロロメタン、メタノールなどの試薬は全て分析用である（シノファームケミカルリエージェント（Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd）社）；Ｄ１０１マクロ孔質吸着樹脂（シノファームケミカルリエージェント社）、カラムクロマトグラフィーシリカゲル（Ｈシリーズ、青島オセアンシリカゲルデシカントファクトリー（Qingdao Ocean Silica Gel Desiccant Factory）社）、薄層クロマトグラフィーシリカゲルＧＦ２５４（青島オセアンシリカゲルデシカントファクトリー社）、ＭＣＩクロマトグラフィー充填剤（日本、ＧＥＬ  ＣＨＰ２０Ｐ、７５−１００μ）、ＯＤＳクロマトグラフィー充填剤（日本、ＹＭＣ＊ＧＥＬ、ｓ  ５０μｍ）、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０クロマトグラフィー充填剤（スウェーデン、ＧＥヘルスケア（GE Healthcare）社）。
【００５５】
装置：
回転式エバポレーター：ＥＹＥＬＡ回転式エバポレーターＮ１００１、ＥＹＥＬＡ。
凍結乾燥器：クリスト(Christ)、ＡＬＰＨＡ１−２ＬＤ  ＰＬＵＳ、ドイツ。
電子はかり、ＢＴ  １２５Ｄ、ザルトリウスサイエンティフィックイクイップメント（Sartorius Scientific Equpiment）社（北京）。
写真用密閉箱ＵＶトランスイルミネータ：ＷＦＨ−２０３Ｂ、上海ジンケインダストリアル（Shanghai Jingke Industrial）社。
超音波装置：ＳＫ７２００Ｈ（３５０Ｗ）、上海ケダオウルトラソニックイクイップメント（Shanghai Kedao Ultrasonic Equipment）社。
ＥＳＩ−ＭＳ：フィニガン（Finnigan）社ＬＣＱ−ＤＥＣＡ質量分析器で決定。
ＮＭＲ：バリアン（Varian）社ＩＮＯＶＡ  ４００核磁気共鳴スペクトロメータ、内部基準としてＴＭＳ。
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）：アジレント（Agilent）社１２６０高速液体システム、ＤＡＤ検知器。
【００５６】
実施例１：Glechoma longituba (Nakai) Kupr.の抽出物の調製
本実施例は、Glechoma longituba (Nakai) Kupr.の植物全体の抽出物を調製する方法を３つ提供する。
【００５７】
（１）伝統的な漢方薬であるGlechoma longituba (Nakai) Kupr.の植物全体１００ｇに、還流抽出のために水を２回添加した。１回目に添加した水の量は、薬用材料の重量の１５倍であり、これを１５分間浸漬した後に１００℃で１．５時間、加熱還流にかけた。２回目に添加した水の量は、薬用材料の重量の１０倍であり、これを１００℃で１．５時間、加熱還流にかけた。抽出液をろ過の後にまとめた。まとめた抽出液を、減圧下の５０〜５５℃で、回転式エバポレーターを用いながら４００ｍｌに濃縮し、次いで同体積の酢酸エチルで５回抽出した。酢酸エチル層の抽出液をまとめた。残った水層を減圧下で１９０ｍｌに濃縮し、３〜４時間、４℃の冷却器内で冷却した。次いで、濃縮したものを取り出し、３倍の量の９５％（ｖ／ｖ）エタノール溶液を添加し、充分に攪拌し、１２時間、４℃の冷却器内で冷却およびろ過した。ろ過物および酢酸エチルの抽出液をまとめて減圧下で濃縮し、上澄みサンプル１を得た。残渣のエタノール溶液を、減圧下で乾燥オーブンを用いた５０℃の環境で、アルコール沈殿固形物から取り除き、アルコール沈殿抽出物を得、この抽出物を１２時間、−７０℃の冷凍機で冷凍し、次いで、４８時間、凍結乾燥装置（クリスト凍結乾燥器）を用いて凍結乾燥し、２１．０４ｇの、Glechoma longituba (Nakai) Kupr.の抽出物の乾燥固形粉末（ＬＱＣ−Ｈ−１）を得た。
【００５８】
（２）伝統的な漢方薬であるGlechoma longituba (Nakai) Kupr.の植物全体１００ｇに、還流抽出のために水を２回添加した。１回目に添加した水の量は、薬用材料の重量の１５倍であり、これを１５分間浸漬した後に１００℃で１．５時間、加熱還流にかけた。２回目に添加した水の量は、薬用材料の重量の１０倍であり、これを１００℃で１．５時間、加熱還流にかけた。抽出液をろ過後にまとめ、５０〜５５℃の減圧下で、回転式エバポレーターを用いながら２００ｍｌまで濃縮し、３〜４時間、４℃の冷却器内で冷却した。次いで、濃縮したものを取り出し、３倍の量の９５％（ｖ／ｖ）エタノール溶液を添加し、充分に攪拌し、１２時間、４℃の冷却器内で冷却およびろ過した。上澄みを５０℃の減圧下で回転式エバポレーターを用いながら濃縮し、上澄みサンプル２を得た。残渣のエタノール溶液を、減圧下で乾燥オーブンを用いた５０℃の環境で、アルコール沈殿固形物から取り除いた。結果として得られたものを１２時間、−７０℃の冷凍機で冷凍し、次いで、４８時間、凍結乾燥装置（クリスト凍結乾燥器）を用いて凍結乾燥し、１９．２ｇの、Glechoma longituba (Nakai) Kupr.の抽出物の乾燥固形粉末（ＬＱＣ−Ｈ−２）を得た。
【００５９】
（３）伝統的な漢方薬であるGlechoma longituba (Nakai) Kupr.の植物全体１００ｇに、超音波抽出のために水を２回添加した。１回目に添加した水の量は、薬用材料の重量の１５倍であり、これを１５分間浸漬した後に４５分間、超音波抽出にかけた。抽出液をろ過の後にまとめた。２回目に添加した水の量は、薬用材料の重量の１０倍であり、これを４５分間、超音波抽出にかけた。２つの抽出液をろ過後にまとめ、５０〜５５℃の減圧下で、回転式エバポレーターを用いながら２００ｍｌまで濃縮し、３〜４時間、４℃の冷却器内で冷却した。次いで、濃縮したものを取り出し、３倍の量の９５％（ｖ／ｖ）エタノール溶液を添加し、充分に攪拌し、１２時間、４℃の冷却器内で冷却およびろ過した。上澄みを５０℃の減圧下で回転式エバポレーターを用いながら濃縮し、上澄みサンプル３を得た。残渣のエタノール溶液を、減圧下で乾燥オーブンを用いた５０℃の環境で、アルコール沈殿固形物から取り除いた。結果として得られたものを、−７０℃の冷凍機で１２時間冷凍し、次いで、４８時間、凍結乾燥装置（クリスト凍結乾燥器）を用いて凍結乾燥し、１４．１ｇの、Glechoma longituba (Nakai) Kupr.の抽出物の乾燥固形粉末（ＬＱＣ−Ｈ−３）を得た。
【００６０】
実施例２：Glechoma longituba (Nakai) Kupr.の抽出物を調製するためのプロセスにおいてアルコールでの沈殿後の上澄み中の主要成分の分離および特定
実施例１の上澄みサンプル１の濃縮した抽出物２００ｍｇを少量の蒸留水の添加によって溶解し、ＭＣＩ充填剤で分離および精製、メタノール−水（水、２０％メタノール、４０％メタノール、６０％メタノール、１００％メタノール）で勾配溶離し、ＨＰＬＣで分析した。４０％メタノールおよび６０％メタノールの溶離分画を、次に続く分離に対して選択した。４０％の溶離分画を、５０℃の減圧下で回転式エバポレーターを用いながら抽出物に濃縮し、少量のメタノールで溶解し、ＯＤＳ充填剤で分離および精製し、３０％メタノールで定組成溶離を行った。精製後に、メインピーク１（ｔ＝１３．０４分、５．４ｍｇ）を得た。６０％の溶離分画を、５０℃の減圧下で回転式エバポレーターを用いながら抽出物まで濃縮し、少量のメタノールで溶解し、ＯＤＳ充填剤で分離および精製し、４０％メタノールで定組成溶離を行った。溶出液を減圧下で濃縮し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０充填剤上で、２０％メタノールで定組成溶離を行った。精製後に、メインピーク２（ｔ＝２９．９８分、２．４ｍｇ）を得た。
【００６１】
上澄みサンプル１のメインピーク１（ｔ＝１３．０４分）は、黄色の無晶粉末（メタノール）であった。ＥＳＩ−ＭＳによる決定後、アニオンｍ／ｚ：１７９［Ｍ−Ｈ］−；1H NMR(CD3OD, 400 MHz)δ: 7.35 (1H, d, J = 15.8 Hz, H-7), 7.01 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-2), 6.88 (1H, dd, J = 8.1 , 2.0 Hz, H-6), 6.75 (1H, d, J = 8.1 Hz, H-5), 6.29 (1H, d, J = 15.8 Hz, H-8)、これは、参考文献によって報告されたものと一貫性があり（Wang M F, et al. J Agric Food Chem, 2000, 48: 235-238.）、コーヒー酸として特定された。
【００６２】
ＥＳＩ−ＭＳによる決定後、メインピーク２（ｔ＝２９．９８分）、アニオンｍ／ｚ：３５９［Ｍ−Ｈ］−，７１９［２Ｍ−Ｈ］−；1H NMR(CD3OD, 400 MHz)δ: 7.53 (1H, d, J = 15.8 Hz, H-7), 7.05 (1H, d, J = 1.9 Hz, H-2), 6.94 (1H, dd, J = 8.2 , 1.9 Hz, H-6), 6.79 (1H, d, J = 8.2 Hz, H-5), 6.78 (1H, d, J = 1.8 Hz, H-2’), 6.69 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-5’), 6.65 (1H, dd, J = 8.0, 1.8 Hz, H-6’), 6.28 (1H, d, J = 15.8 Hz, H-8), 5.11 (1H, d, J = 9.3 Hz, H-8’), 3.13 (1H, d, J = 13.6 Hz, H-7’(α)), 2.97 (1H, d, J = 13.6, 9.3 Hz, H-7’(β))；13C NMR(CD3OD, 100 MHz)δ: 173.7 (C-9’), 167.7 (C-9), 148.2 (C-4), 145.5 (C-7), 145.4 (C-3), 144.6 (C-3’), 143.5 (C-4’), 129.5 (C-1’), 126.4 (C-1), 121.6 (C-6), 120.3 (C-6’), 116.1 (C-2’), 115.1 (C-5), 114.8 (C-5’), 114.0 (C-8), 113.6 (C-2)、これは、参考文献によって報告されたものと一貫性があり（Ha T J, et al. Food Chemistry, 2012, 135: 1397-1403.）、ロスマリン酸として特定された。
【００６３】
実施例３：ＨＰＬＣを用いた、Glechoma longituba (Nakai) Kupr.の抽出物の主要成分の分析および検知
Glechoma longituba (Nakai) Kupr.の抽出物、ＬＱＣ−Ｈ−１、ＬＱＣ−Ｈ−２、ＬＱＣ−Ｈ−３ならびに上澄みサンプル１、サンプル２およびサンプル３の主要成分を、ＨＰＬＣを用いた分析のために比較し、抽出物中の化合物Ｉおよび化合物ＩＩの含量を決定した。結果を図１に示す。クロマトグラフィーの条件は次の通りであった：
クロマトグラフィーカラムのモデル：アジレント社ＺＯＲＢＡＸ  ＳＢ−Ｃ１８、５μｍ、４．６×２５０ｍｍ
移動相：アセトニトリル（Ａ）−水（Ｂ、０．２％酢酸含有）；流速：１ｍｌ／分
サンプル濃度：ＬＱＣ−Ｈ−１（２１ｍｇ／ｍｌ）、ＬＱＣ−Ｈ−２（２４ｍｇ／ｍｌ）、ＬＱＣ−Ｈ−３（２０ｍｇ／ｍｌ）、上澄みサンプル１（７．１６ｍｇ／ｍｌ）、サンプル２（７．２０ｍｇ／ｍｌ）、サンプル３（６．８ｍｇ／ｍｌ）
【００６４】
先行技術に従った方法で得たコントロール群（Yuan Chunlin, et al., Pharmacology and Clinics of Chinese Materia Medica, 2008, 24(3), 57-58; Yang Nianyun, et al., Journal of China Pharmaceutical University, 2005, 36(3), 210-212）：６５％エタノール超音波抽出物（１６．２ｍｇ／ｍｌ）、８０％エタノール還流抽出物（１６．５ｍｇ／ｍｌ）。主要成分の検知結果を図２に示す。
【００６５】
注入体積：１０μｌ
検知波長：１９０−４００ｎｍ、内容物決定のために好ましくは３６０ｎｍ
勾配溶離の条件を表１に示す：
【００６６】
【表１】
0006651498.tif 000008
【００６７】
図１に示す分析結果は、３つのプロセスで調製したGlechoma longituba (Nakai) Kupr.の抽出物であるＬＱＣ−Ｈ−１、ＬＱＣ−Ｈ−２およびＬＱＣ−Ｈ−３のメインピークが、一定の高さを有したことを示した。本発明の３つのプロセス全ては、活性化合物Ｉおよび化合物ＩＩを効果的に取得できることを示した。ＬＱＣ−Ｈ−２のプロセスは酢酸エチル試薬との抽出プロセスを省略し、高収率であった。製造の面では、より迅速で、より安全で、コストがより節約でき、Glechoma longituba (Nakai) Kupr.の抽出物を調製するのに好ましいプロセスであった。さらに、３つのプロセスで調製した上澄みサンプル１、サンプル２およびサンプル３の主要成分は、かなり一致しており、コーヒー酸およびロスマリン酸であった。これによって、水での抽出およびアルコールでの沈殿のプロセスの直接的な使用が酢酸エチル抽出物と同一の効果を達成し得ることが示された。
【００６８】
さらに、図１に示す分析結果は、フラボン化合物が、水での抽出およびアルコールでの沈殿のプロセスを用いて固形沈殿物を回収することで効果的に得られたことを示した。沈殿物には化合物Ｉおよび化合物ＩＩが良好に濃縮され、これから、コーヒー酸化合物を迅速に取り除いた。外部標準方法を用いた決定によると、３つの抽出物中の化合物Ｉおよび化合物ＩＩのパーセンテージは次の通りであった：それぞれ、化合物Ｉは０．８７％を占め、化合物ＩＩは０．８１％を占め（ＬＱＣ−Ｈ−１）；化合物Ｉは０．７９％を占め、化合物ＩＩは０．７５％を占め（ＬＱＣ−Ｈ−２）；化合物Ｉは０．５０％を占め、化合物ＩＩは０．５９％を占めていた（ＬＱＣ−Ｈ−３）。固形物中のコーヒー酸およびロスマリン酸双方の含量は０．１％未満であった。
【００６９】
図２に示す分析結果は、本発明と同一の試験条件下で、先行技術に従った抽出方法で得た抽出物（Yuan Chunlin, et al., Pharmacology and Clinics of Chinese Materia Medica, 2008, 24(3), 57-58; Yang Nianyun, et al., Journal of China Pharmaceutical University, 2005, 36(3), 210-212）は、化合物Ｉおよび化合物ＩＩの顕著なＨＰＬＣ吸着ピークを一切示さず、先行技術の参考文献で報告した方法では、化合物Ｉおよび化合物ＩＩを効果的に得るのは失敗したことを意味する。
【００７０】
実施例４：Glechoma longituba (Nakai) Kupr.の抽出物中の主要活性成分、化合物Ｉおよび化合物ＩＩの好ましい調製プロセスおよび構造分析
伝統的な漢方薬であるGlechoma longituba (Nakai) Kupr.の植物全体（既に切断および粉砕されている）２００ｇに、還流抽出のために水を２回添加した。１回目に添加した水の量は、薬用材料の重量の１５倍であり、これを１５分間浸漬した後に１００℃で１．５時間、加熱還流にかけた。２回目に添加した水の量は、薬用材料の重量の１０倍であり、これを１００℃で１．５時間、加熱還流にかけた。抽出液をろ過後にまとめ、５０〜５５℃の減圧下で、回転式エバポレーターを用いながら３８０ｍｌまで濃縮し、３〜４時間、４℃の冷却器内で冷却した。次いで、濃縮したものを取り出し、３倍の量の９５％（ｖ／ｖ）エタノール溶液に添加し、充分に攪拌し、１２時間、４℃の冷却器内で冷却した。ろ過後、アルコール沈殿固形物を回収した。アルコール沈殿固形物を水の添加によって充分に溶解した後、残渣のエタノール溶液を５０℃の減圧下で、回転式エバポレーターを用いた濃縮により除去し、４００ｍｌの水層の濃縮液を得た。この濃縮液を１ｋｇのＤ１０１マクロ孔質吸着樹脂を用いて分離し、次いで、２４００ｍｌの蒸留水でのタンパク質および多糖類成分の溶離、続いて、２０００ｍｌの１５％エタノールで溶離し、次いで、溶出液を回収した。溶出液を５０〜５５℃の減圧下で回転式エバポレーターを用いながら濃縮し、化合物Ｉおよび化合物ＩＩが豊富な抽出物を得た。含量決定のための方法は、実施例３と一貫性を有していた。化合物Ｉおよび化合物ＩＩの含量は、それぞれ１３．７８％および１２．７７％であり、その合計は、抽出物重量の２６．５５％であった。コーヒー酸およびロスマリン酸の含量は０．０１％未満であった（図３を参照）。
【００７１】
前述の抽出物（抽出物全体の２６．５５％を占める化合物ＩおよびＩＩ）を、３００ｇのＤ１０１マクロ孔質吸着樹脂を用いて再度分離し得、続いて、４００ｍｌの蒸留水でのタンパク質および多糖類成分の溶離、続いて、８００ｍｌの蒸留水で溶離し、次いで、溶出液を回収した。溶出液を５０〜５５℃の減圧下で回転式エバポレーターを用いながら濃縮し、化合物Ｉおよび化合物ＩＩが豊富な抽出物を得た。化合物Ｉおよび化合物ＩＩの含量は、それぞれ２９．７０％および２６．９１％であり、その合計は、抽出物の重量の５６．６１％であった（図３参照）。
【００７２】
前述の抽出物（抽出物全体の５６．６１％を占める化合物ＩおよびＩＩ）を、２００ｇのＤ１０１マクロ孔質吸着樹脂を用いて、３回目の分離および精製として分離し得、続いて、２００ｍｌの蒸留水での色素の溶離、続いて、５００ｍｌの蒸留水で溶離し、次いで、溶出液を回収した。溶出液を５０〜５５℃の減圧下で回転式エバポレーターを用いながら濃縮し、化合物Ｉおよび化合物ＩＩが豊富な抽出物を得た。化合物Ｉおよび化合物ＩＩの含量は、それぞれ３９．７５％および３２．７７％であり、その合計は、抽出物重量の７２．５２％であった（図３参照）。
【００７３】
異なる割合で化合物Ｉおよび化合物ＩＩを含んでなり、マクロ孔質樹脂で精製された３つの上記抽出物をすべて、少量の蒸留水で溶解し得、ＹＭＣ＊ＧＥＬ  ＯＤＳ充填剤で迅速に精製し得、それぞれを水および１０％メタノールで勾配溶離した。回収した分画をＨＰＬＣで分析した。同一成分をまとめ、次いで５０℃の減圧下で、回転式エバポレーターを用いて濃縮し、合計２９６ｍｇの個別の化合物Ｉ（純度９８．６５％、図３参照）および合計２５８ｍｇの個別の化合物ＩＩ（純度９６．５２％超、図３参照）を得た。
【００７４】
化合物Ｉは褐色の無晶粉末（メタノール）であった。アニオンＥＳＩ−ＭＳｍ／ｚ：６３７［Ｍ−Ｈ］−；カチオンＥＳＩ−ＭＳｍ／ｚ：６３９［Ｍ＋Ｈ］＋。1H NMR (DMSO-d6+D2O, 400 MHz ) δ: 7.47 (2H, d, J = 1.9 Hz, H-2’), 7.43 (1H, dd, J = 8.2, 1.9 Hz, H-6’), 6.96 (1H, s, H-3), 6.89 (1H, d, J = 8.2 Hz, H-5’), 6.71 (1H, d, J = 2.2 Hz, H-8), 6.49 (1H, d, J = 2.2 Hz, H-6), 5.20 (1H, d, J = 6.5 Hz, H-1’’) , 4.57 (1H, d, J = 6.3 Hz, H-1’’’) , 3.20-4.1 (m, 隠れている)。13C NMR (DMSO-d6+D2O, 100 MHz) δ: 182.4 (C-4), 172.9 (C-6’’’), 170.2 (C-6’’), 164.9 (C-2), 163.2 (C-7), 161.0 (C-9), 157.2 (C-5), 150.1 (C-4’), 146.0 (C-3’), 121.7 (C-1’), 119.6 (C-6’), 116.5 (C-5’), 113.7 (C-2’), 105.8 (C-1’’’), 104.0 (C-10), 103.4 (C-3), 100.3 (C-6), 98.5 (C-1’’), 96.2 (C-8), 81.8 (C-2’’), 76.2 (C-5’’’), 75.8 (C-3’’’), 75.1 (C-5’’), 74.6 (C-3’’), 74.4 (C-2’’’), 72.2 (C-4’’), 71.6 (C-4’’’)。上記のデータは、参考文献によって報告されたデータと一貫性があった（Berashili D T, et al. Chemistry of Natural Compound, 2006, 42(1): 106-107）。本発明は、初めて、化合物ＩをGlechoma Linn.植物から分離した。
【００７５】
化合物Ｉは褐色の無晶粉末（メタノール）であった。アニオンＥＳＩ−ＭＳｍ／ｚ：６２１［Ｍ−Ｈ］−；カチオンＥＳＩ−ＭＳｍ／ｚ：６４５［Ｍ＋Ｎａ］＋。1H NMR (DMSO-d6+D2O, 400 MHz ) δ: 7.95 (2H, d, J = 8.0 Hz, H-2’,6’), 6.94 (2H, d, J = 8.0 Hz, H-3’,5’), 6.93 (1H, 隠れている, H-3), 6.80 (1H, d, J = 1.9 Hz, H-8), 6.52 (1H, d, J = 1.9 Hz, H-6), 5.21 (1H, d, J = 6.6 Hz, H-1’’) , 4.57 (1H, d, J = 6.4 Hz, H-1’’’) , 3.20-4.10 (m, 隠れている)。13C NMR (DMSO-d6+D2O, 100 MHz) δ: 182.5 (C-4), 172.7 (C-6’’’), 171.8 (C-6’’), 164.8 (C-2), 163.2 (C-7), 161.6 (C-9), 161.1 (C-4’), 157.3 (C-5), 129.2 (C-2’,6’), 121.4 (C-1’), 116.5 (C-3’,5’), 105.8 (C-10), 103.7 (C-1’’’), 103.4 (C-3), 100.3 (C-6), 98.3 (C-1’’), 96.0 (C-8), 81.5 (C-2’’), 76.4 (C-5’’’), 75.9 (C-3’’’), 75.1 (C-5’’), 74.9 (C-3’’), 74.4 (C-2’’’), 72.2 (C-4’’), 71.8 (C-4’’’)。上記のデータは、参考文献によって報告されたデータと一貫性があった（Chen Zenai, et al., Acta Pharmaceutica Sinica, 1988, 23(10): 789-791）。
【００７６】
実施例５：Glechoma longituba (Nakai) Kupr.の抽出物、ＬＱＣ−Ｈ−１はマウスの急性経口グルコース耐性を顕著に向上し、グルコースの経口投与の後、マウスの血中インスリン値を増大した。
経口グルコース耐性試験（ＯＧＴＴ）方法：８週齢のＣ５７ＢＬ／ＫｓＪ雄マウス（上海スラックラボラトリーアニマルカンパニー（Shanghai Slac Laboratory Animal Company）社）、重量２０±２ｇにおいて、各群の８匹のマウスに、ＳＰＦ用操作手順にしたがって餌をやり、実験前に１６時間絶食させた。実験前に、各群のマウスの尻尾の静脈から血液を回収した。Ｒｏｃｈｅ  ＡＣＣＵ−ＣＨＥＫグルコース計量器を用いて血糖濃度を計測し、時間を０で記録した。異なる濃度の化合物を、各投与群のマウスにそれぞれ経胃投与した。同体積の蒸留水をコントロール群のマウスに与えた。投与量の体積は１０ｍｌ／ｋｇであった。投与から３０分後、５ｇ／ｋｇのグルコースを各投与群のマウスに経胃投与した。各群のマウスの血糖濃度を計測し、経胃投与後から２０分、４０分および８０分に記録した。ＯＧＴＴ曲線を記録した。曲線下面積（ＡＵＣ）を、グルコースを与えなかったマウス（較正群）の血糖のデータで較正した。ＯＮＥ−ＷＡＹ−ＡＮＯＶＡを用いて各群の有意差を比較した（留意：次の活性例における急性経口グルコース耐性試験のための実験方法はすべて、別記しない限り実施例５の実験方法と同じである）。マウスのグルコース経口投与から２０分後に各群のマウスの尻尾の静脈から血液を回収した。ＥＬＩＳＡ（米国、ミリポア（Millipore）社からキットを購入）を用いてマウスの血中インスリン値を測定した。
【００７７】
動物のグルーピング：コントロール群；較正群；ＬＱＣ−Ｈ−１低投与量群（２５０ｍｇ／ｋｇ）；ＬＱＣ−Ｈ−１高投与量群（５００ｍｇ／ｋｇ）。
【００７８】
実験結果：Glechoma longituba (Nakai) Kupr.の抽出物、ＬＱＣ−Ｈ−１は、２５０ｍｇ／ｋｇおよび５００ｍｇ／ｋｇの双方で、マウスの急性経口グルコース耐性を顕著に向上し得、グルコースの経口投与の後、マウスの血中インスリン値を増大させることができた（図４）。この効果は濃度に依存しており、この抽出物が作用して膵臓ランゲルハンス島β細胞からのインスリンの分泌を促進し、摂食後の血糖を改善したことを示唆した。
【００７９】
実施例６：Glechoma longituba (Nakai) Kupr.の抽出物、ＬＱＣ−Ｈ−２も、マウスの急性経口グルコース耐性を顕著に向上させることができた。
実験方法は実施例５と同じであった。動物のグルーピング：コントロール群；較正群；ＬＱＣ−Ｈ−２低投与量群（２５０ｍｇ／ｋｇ）；ＬＱＣ−Ｈ−２高投与量群（５００ｍｇ／ｋｇ）。
【００８０】
実験結果： Glechoma longituba (Nakai) Kupr.抽出物、ＬＱＣ−Ｈ−２は、２５０ｍｇ／ｋｇおよび５００ｍｇ／ｋｇの双方で、マウスの急性経口グルコース耐性を顕著に向上した（図５）。
【００８１】
実施例７：水での抽出およびアルコールでの沈殿によるGlechoma longituba (Nakai) Kupr.の抽出物の上澄みならびにアルコール沈殿固形物の粗多糖類のいずれもマウスの急性経口グルコース耐性を向上しなかった。
実験方法は実施例５と同じであった。動物のグルーピング：コントロール群；粗多糖類群（１ｇ／ｋｇ）；アルコール沈殿後の上澄みサンプル１群（３００ｍｇ／ｋｇ）。
【００８２】
上記の活性試験によって、水での抽出およびアルコールでの沈殿によるGlechoma longituba (Nakai) Kupr.の抽出物の上澄みならびにアルコール沈殿粗多糖類成分は、グルコース低下に有効な部分ではなかったことが実証された（図６）。実施例１におけるプロセスの適用は、Glechoma longituba (Nakai) Kupr.の抽出物による血糖低下活性がなくともコーヒー酸成分を効果的に除去し得、よって抽出物の血糖低下効果を改善できた。同時に、水溶性の植物繊維（その多くは多糖類成分）が有効な血糖低下成分であるという、参考文献の仮定（Shinji I., et al. Nippon Shokuhin Kagaku Kogaku Kaishi, 2007,54(9):412-414）は、間違っていることが実証される。水溶性成分における血糖低下活性を担う部分は、化合物Ｉ、化合物ＩＩまたはその混合物に起因するはずである。
【００８３】
実施例８：Glechoma longituba (Nakai) Kupr.の抽出物、ＬＱＣ−Ｈ−１の長期投与は、特発性２型糖尿病モデルのｄｂ／ｄｂマウスの糖尿病の症状を改善した。
実験方法：８週齢の雄である特発性肥満の２型糖尿病モデルｄｂ／ｄｂマウス（バックグラウンド：Ｃ５７ＢＬ／ＫｓＪ、ジャクソンラボ（Jackson Lab）社、米国）、当初の重量３０±２ｇである、各群の８匹のマウスに、ＳＰＦ用操作手順にしたがって餌を与えた。マウスを３つの群に分けた：コントロール群のマウスに同体積の蒸留水を与え；低投与量群（２５０ｍｇ／ｋｇ）および高投与量群（５００ｍｇ／ｋｇ）にそれぞれＬＱＣ−Ｈ−１を経胃投与した；インスリン増感剤であるロシグリタゾン（１０ｍｇ／ｋｇ）を陽性薬剤として用いて同時に投与した；血糖（ｄｂ／ｍ）が正常である同品種のマウスを比較のためにブランク群として用いた。投与の体積は、４週間、１０ｍｌ／ｋｇを１日１回で与えた。マウスの体重、血糖および食事の変化を毎週モニターした。４週間後、各群のマウスのＯＧＴＴを、医薬の急性投与を除いた実施例１の方法に従って決定し、ＡＵＣを算出した。血清を回収してマウスのインスリン含量を計測した。特発性２型糖尿病モデルのｄｂ／ｄｂマウスの、ＬＱＣ−Ｈ−１の長期投与による糖尿病の症状の改善を評価した。
【００８４】
実験結果：ポジティブコントロールであるロシグリタゾンの４週間にわたる投与は、ｄｂ／ｄｂマウスの体重を増大させ、このことは、薬剤の長期投与による血液脂質の増加と関連し得る。Glechoma longituba (Nakai) Kupr.の抽出物、ＬＱＣ−Ｈ−１は、ｄｂ／ｄｂマウスの体重および食事に顕著な影響を及ぼさず（図７Ａ）、ＬＱＣ−Ｈ−１が顕著な毒性を有さなかったことを示した。一方で、２５０ｍｇ／ｋｇおよび５００ｍｇ／ｋｇのＬＱＣ−Ｈ−１はｄｂ／ｄｂマウスの随時血糖を低下し；そのような血糖低下効果は、ロシグリタゾンに似ていた（図７Ｂ）。投与から４週間後、Glechoma longituba (Nakai) Kupr.の抽出物、ＬＱＣ−Ｈ−１は、ｄｂ／ｄｂマウスの経口グルコース耐性を顕著に改善し得、陽性薬剤の効果と類似していた（図７Ｃおよび７Ｄ）。さらに、ＬＱＣ−Ｈ−１投与群のｄｂ／ｄｂマウスとコントロール群を比較して示され得るとおり、血清インスリン値は増加し（図７Ｅ）、ＬＱＣ−Ｈ−１の長期投与がマウスのインスリン値を増加し、ｄｂ／ｄｂマウスの血糖を低下し、２型糖尿病の症状を改善できたことを示す。
【００８５】
本実験では、マウスの食事および重量は、長期投与後、ＬＱＣ−Ｈ−１による顕著な影響を受けなかった一方で、ロシグリタゾンはマウスの体重増加につながった。したがって、ロシグリタゾンの長期投与は、異常な血液脂質といった副作用につながった。したがって、抽出物、ＬＱＣ−Ｈ−１は、血糖低下効果および血液脂質低下効果を同時に達成し得るだけでなく、陽性薬剤、ロシグリタゾンよりもより高水準の安全性を有することが示され得た。
【００８６】
実施例９：天然生成物由来の効果的なＤＰＰ４阻害剤であるGlechoma longituba (Nakai) Kupr.の抽出物中のそれぞれの主要な活性化合物Ｉおよび化合物ＩＩは単独で作用してマウスの急性経口グルコース耐性を顕著に向上した。
実験方法：（１）化合物Ｉおよび化合物ＩＩのＤＤＰ４酵素に対するインビトロの阻害活性の決定：ＤＤＰ４酵素源として、ヒトの結腸癌細胞株Ｃａｃｏ−２の細胞溶解溶液（Thomas, L., et al, 2008, JPET）。１００μＬ／ウェルである９６ウェルプレートの薬剤スクリーニングシステムにおいて、Ｈ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＡＭＣ基質（アナスペック（AnaSpec）社）の最終濃度は２４４μＭであり、異なる濃度の試験化合物を３７℃で３０分のインキュベーションのために添加した。蛍光シグナルを励起波長３８０ｎｍ／蛍光波長４６０ｎｍで検知した。試験サンプルの酵素のＤＤＰ４に対する阻害率（％）を検知で得た蛍光吸収値によって算出した。阻害率（％）は次の式に従って算出される：
阻害率（％）＝（ＲＦＵブランク−ＲＦＵ化合物）／（ＲＦＵブランク−ＲＦＵネガティブコントロール）＊１００％
【００８７】
ＲＦＵ化合物、ＲＦＵブランクおよびＲＦＵネガティブコントロールは、化合物ウェル、ブランクウェルおよび酵素のないネガティブコントロールの、３０分および０分における蛍光値の違いを意味する；（２）マウスの急性グルコース耐性に対する化合物Ｉおよび化合物ＩＩの効果：ＯＧＴＴ実験方法は実施例５と同じであり、マウスをコントロール群；較正群；化合物Ｉ低投与量群（１００ｍｇ／ｋｇ）；化合物Ｉ高投与量群（２００ｍｇ／ｋｇ）；化合物ＩＩ低投与量群（１００ｍｇ／ｋｇ）；化合物ＩＩ高投与量群（２００ｍｇ／ｋｇ）；および陽性薬剤群（シタグリプチン１０ｍｇ／ｋｇ、メルク（Merck Company）社、米国）に分けた。
【００８８】
実験結果：（１）化合物Ｉおよび化合物ＩＩの双方は、様々な程度でＤＤＰ４に対して阻害活性を有し、１００μＭの時のＤＤＰ４に対する阻害率はそれぞれ４０．８２±３．２６％および３４．０９±３．９１％であり（図８Ａ）、初めて、これら２つの化合物がＤＤＰ４に対して阻害活性を有すると報告された；（２）１００ｍｇ／ｋｇおよび２００ｍｇ／ｋｇ双方の時の化合物Ｉおよび化合物ＩＩは、マウスの急性経口グルコース耐性を顕著に向上させ得（図８Ｂおよび８Ｃ）、ここで、化合物Ｉは化合物ＩＩよりも良好な活性を有していた。より多い投与量（２００ｍｇ／ｋｇ）での化合物Ｉおよび化合物ＩＩは、作業濃度（１０ｍｇ／ｋｇ）の市販の薬剤、シタグリプチンに匹敵する活性を有し（図８Ｂおよび８Ｃ）、グルコースを低下して摂食後の血糖を低下するのに効果的に作用し得、Glechoma longituba (Nakai) Kupr.抽出物の主要な血糖低下活性成分の１つであった。
【００８９】
実施例１０：Glechoma longituba (Nakai) Kupr.抽出物の個別の主要活性化合物Ｉは、特発性２型糖尿病モデルのｄｂ／ｄｂマウスの血糖調節を改善した。
実験方法：８週齢の雄である特発性肥満の２型糖尿病モデルｄｂ／ｄｂマウス（Ｃ５７ＢＬ／ＫｓＪ、ジャクソンラボ、米国）、当初の重量が３０±２ｇである、各群の８匹のマウスに、ＳＰＦ用操作手順にしたがって餌を与えた。ｄｂ／ｄｂマウスにおける急性グルコース耐性に対する化合物Ｉの効果を実施例１の方法に従って試験した。動物のグルーピング：コントロール群；化合物Ｉ群（１００ｍｇ／ｋｇ）；陽性薬剤シタグリプチン群（１０ｍｇ／ｋｇ）。
【００９０】
実験結果：Glechoma longituba (Nakai) Kupr.の抽出物の個別の主要活性化合物Ｉは、１００ｍｇ／ｋｇの投与量で、マウスの急性経口グルコース耐性を顕著に向上させ得、その効果は市販の薬剤、シタグリプチンに類似しており（図９）、天然性生物由来のＤＤＰ４阻害剤として、化合物Ｉも、特発性２型糖尿病モデルｄｂ／ｄｂマウスの急性グルコース耐性を顕著に向上させ得、ｄｂ／ｄｂマウスのグルコースを低下させるよう機能する、Glechoma longituba (Nakai) Kupr.の抽出物、ＬＱＣ−Ｈ−１の主要な血糖低下活性成分の１つであり得る。
【００９１】
急性的な実験の後、各群のマウスに次のグルーピングに従って長期投与実験を行った：コントロール群のマウスに同体積の蒸留水をやり；投与量５０ｍｇ／ｋｇの化合物Ｉを投与群に与えた；１０ｍｇ／ｋｇのＤＤＰ４阻害剤、シタグリプチンをポジティブコントロール群に経胃投与した。投与の体積は、４週間、１０ｍｌ／ｋｇを１日１回与えた。マウスの体重、血糖および食事の変化を毎週モニターした。特発性２型糖尿病モデルｄｂ／ｄｂマウスの、化合物Ｉの長期投与による、糖尿病の症状の改善を評価した。
【００９２】
実験結果：化合物はＩマウスの体重および食事に顕著な影響を及ぼさなかった。投与から２週間後、随時血糖および空腹時血糖の双方は顕著に低下した（図１０）。化合物Ｉの長期投与がｄｂ／ｄｂマウスの血糖を効果的に低下し、２型糖尿病の症状を改善し得ることを示唆した。
【００９３】
実施例１１：Glechoma longituba (Nakai) Kupr.の抽出物、ＬＱＣ−Ｈ−１の急性血液脂質低下活性試験
実験方法：（１）Glechoma longituba (Nakai) Kupr.の抽出物、ＬＱＣ−Ｈ−１の、血清トリグリセリド値に対する効果を、急性高トリグリセリド血症マウスモデルで評価した；６週齢のＣ５７ＢＬ／ＫｓＪ雄マウス（上海スラックラボラトリーアニマルカンパニー）、重量２０±２ｇである、各群の８匹のマウスに、ＳＰＦ用操作手順にしたがって餌を与え、実験前に１６時間、一晩絶食させた。異なる濃度の化合物を、各投与群のマウスにそれぞれ経胃投与した。同体積の水をコントロール群およびブランク群のマウスに与えた。３０分後、２ｇ／ｋｇのオリーブオイルを投与群およびコントロール群のマウスに経胃投与し、一方で同体積の水をブランク群のマウスに与えた。２時間後、各群のマウスの眼窩の静脈から、血清の分離のために血液を回収し、血清のトリグリセリドの濃度を測定した；（２）Glechoma longituba (Nakai) Kupr.の抽出物、ＬＱＣ−Ｈ−１から分離した各化合物のジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）に対する阻害活性：昆虫細胞で発現および精製して得たヒト由来ＤＧＡＴ１を化合物でプリインキュベーションし、基質ジアシルグリセロールを添加して補酵素Ａの存在下で反応を開始させ、生成されたスルフィドリルおよびＣＰＭの組合せによって作製される蛍光シグナルを計測し化合物のＤＧＡＴに対する阻害活性を次の式に従って算出した：
阻害率％＝（ＯＤブランク−ＯＤ化合物）／（ＯＤブランク−ＯＤネガティブコントロール）＊１００％
【００９４】
ＯＤ化合物、ＯＤブランクおよびＯＤネガティブコントロールは、化合物ウェル、ブランクウェルおよびＤＧＡＴ１酵素のないネガティブコントロールの蛍光値を表し、酵素作用阻害率（％）が５０％に到達した際の化合物の濃度をＩＣ５０値として設定した；（３）Glechoma longituba (Nakai) Kupr.の抽出物、ＬＱＣ−Ｈ−１から分離した各化合物のパンクレリパーゼに対する阻害活性：基質酢酸ｐ−ニトロフェニル（シグマ（Sigma）社、米国）をリン酸緩衝剤（２５ｍＭ、ｐＨ６．８）で１．３５ｍＭに製剤化した；ブタのパンクレリパーゼ（シグマ社）をリン酸緩衝剤で１０ｍｇ／ｍｌに製剤化した；臭素付加エンイン化合物を、リン酸緩衝剤で様々な濃度の化合物溶液に製剤化した。次いで、１．３５ｍＭであるｐ−酢酸ｐ−ニトロフェニル（シグマ社、米国）溶液５０μｌおよび１０μｌの異なる濃度の試験化合物を順次９６ウェルプレートに添加し、３７℃で５分プリインキュベートションを行った。最後に、１０ｍｇ／ｍｌのパンクレリパーゼ（ＥＣ３．１．１．３、シグマ社、米国）を５０μｌ添加および混合した。反応を３７℃でさらに２０分進めた。各ウェルの吸収度を４９２ｎｍで測定した。試験サンプルのパンクレリパーゼに対する阻害率（％）を、４９２ｎｍでの吸収度をもとに算出した。酵素活性阻害率（％）が５０％に到達した際の化合物の濃度をＩＣ５０値として設定した。阻害率（％）は次の式に従って算出され得た：
阻害率（％）＝［（Ａ−Ｂ）−（Ｃ−Ｄ）］／（Ａ−Ｂ）×１００
【００９５】
上記の式において、Ａ、Ｂ、ＣおよびＤは、反応後のブランクウェルの吸収度、反応前のブランクウェルの吸収度、反応後のサンプルウェルの吸収度、反応前のサンプルウェルの吸収度を表す。
【００９６】
実験結果：（１）Glechoma longituba (Nakai) Kupr.の抽出物、ＬＱＣ−Ｈ−１は、５００ｍｇ／ｋｇの投与量で、急性高トリグリセリド血症マウスの血清トリグリセリド値を低下し得、その低下効果はＤＧＡＴ阻害剤である、陽性薬剤ＬＣＱ９０８に似ていた（図１１）；（２）Glechoma longituba (Nakai) Kupr.の抽出物、ＬＱＣ−Ｈ−１から分離した各化合物のうち、化合物ＩおよびＩＩは、顕著なＤＧＡＴ阻害活性を有していた（表２を参照）。実験結果は、Glechoma longituba (Nakai) Kupr.の抽出物、ＬＱＣ−Ｈ−１が、急性的に低下する血清トリグリセリドに顕著な効果を有し、ＤＧＡＴ１およびパンクレリパーゼに対して阻害活性を有する化合物（表３参照）はＬＱＣ−Ｈ−１の機能の主要な活性成分であり得る。
【００９７】
【表２】
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【００９８】
【表３】
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【００９９】
実施例１２：化合物ＩおよびＩＩのＧＯＸに対する阻害活性
ＧＯＸは、補欠分子団としてフラビンアデニンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）を有するオキシダーゼであり、グリコール酸からシュウ酸への酸化を触媒する。ＧＯＸの過剰発現は、シュウ酸塩の生産を助長し、それによって、腎臓結石および腎炎のリスクが増大し得る。
【０１００】
実験のメカニズム：酵素カップリング法ではペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）およびその基質を用いて作製されたＨ２Ｏ２と反応させ、グルコースオキシダーゼの触媒反応率を決定するために色の付いた生成物を生成する。ＰＯＤはＨ２Ｏ２がフェノールおよび４−アミノアンチピリンと反応して赤褐色のキノン物質を生成するように触媒する。
【０１０１】
実験方法：試薬を以下の表に従って添加した；基質グリコール酸の最終添加後すぐに反応が開始した；反応の動力学経過をミクロプレートリーダーで検知した；酵素作用は、Ｖｍａｘ、最大反応速度で表した。
【０１０２】
全体のシステム：２００μＬ
【０１０３】
【表４】
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【０１０４】
実験結果：化合物ＩおよびＩＩが次の濃度勾配（１００μＭ〜０．１μＭ；希釈３回）であるときの最大速度および阻害率を測定し、実験結果を以下に示す（表９）：
【０１０５】
【表５】
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【０１０６】
測定結果をＧｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５．０であてはめてＩＣ５０値を算出した。ソフトウェアのあてはめた結果は、化合物Ｉは０．５ｍＭのＩＣ５０、化合物ＩＩは０．４ｍＭのＩＣ５０、および、ケルセチンは２１μＭのＩＣ５０を有することを示した。化合物Ｉおよび化合物ＩＩはグルコースオキシダーゼに対してある程度の阻害活性を有し、腎臓結石および腎炎の治療において、可能性を有する薬理活性を有することが実証された。
【０１０７】
実施例１３：水での抽出およびアルコールでの沈殿による本発明のサンプル、ＬＱＣ−Ｈ−２、および、先行技術の６５％エタノール超音波抽出物（Yuan Chunlin, et al., Pharmacology and Clinics of Chinese Materia Medica, 2008, 24(3), 57-58）の活性の比較
実験方法は実施例５と同じである。動物のグルーピング：コントロール群；ＬＱＣ−Ｈ−２群（５００ｍｇ／ｋｇ）；ＬＱＣ−６５％エタノール抽出物群（５００ｍｇ／ｋｇ）；グルコース投与のない較正群。
【０１０８】
実験結果：Glechoma longituba (Nakai) Kupr.の抽出物、ＬＱＣ−Ｈ−２は、５００ｍｇ／ｋｇの投与量で、マウスの急性経口グルコース耐性を顕著に向上させ得、一方で、同一投与量であるGlechoma longituba (Nakai) Kupr.の６５％エタノール超音波抽出物はマウスの急性グルコース耐性に顕著な効果を一切有さず（図１２）、このことは、本発明で提供した調製方法で得たＬＱＣ−Ｈ−２抽出物の活性成分は、６５％エタノール超音波抽出物プロセスで得られた抽出物全体とは異なり、ＬＱＣ−Ｈ−２が、マウスの急性グルコース耐性を効果的に向上させ得ることが示唆された。
【０１０９】
実験の結論：調製実施例１のGlechoma longituba (Nakai) Kupr.抽出プロセスに従って得た抽出物ＬＱＣ−Ｈ−２は、マウスの急性経口グルコース耐性を顕著に向上させることができたが、一方で同一投与量のGlechoma longituba (Nakai) Kupr.の６５％エタノール超音波抽出物（ＬＱＣ−６５％エタノール抽出物）はマウスの急性グルコース耐性に顕著な効果を一切有さなかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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