(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）のうちの１つである望ましくないｍｉＲＮＡが逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）に関与することを防止する方法であって、前記望ましくないｍｉＲＮＡが、５’末端及び３’末端を有し、前記方法が、
（Ａ）ブロッキング核酸の相補領域を、前記望ましくないｍｉＲＮＡの第１の末端の結合部位にアニールすることと、ここで、前記望ましくないｍｉＲＮＡの前記第１の末端が、前記５’末端または前記３’末端のうちの一方であり、
前記ブロッキング核酸が、
（ａ）前記ブロッキング核酸の５’末端及び前記ブロッキング核酸の３’末端と、
（ｂ）Ｔｍを１０〜２０℃下回る温度で前記望ましくないｍｉＲＮＡの前記第１の末端の結合領域とアニールする、前記ブロッキング核酸の前記５’末端または前記ブロッキング核酸の前記３’末端のうちの一方の一本鎖相補領域であって、前記相補領域が末端を有する、一本鎖相補領域と、
（ｃ）前記望ましくないｍｉＲＮＡの前記第１の末端にライゲーションするためのライゲーション末端を有するヘアピンループ形成領域であって、前記相補領域に隣接するヘアピンループ形成領域と、
（ｄ）前記相補領域の前記末端に連結される第１のブロッキング部分であって、リガーゼの基質としての役割を果たすことができない、第１のブロッキング部分と、を含むか、又は
（ａ）３’末端及び５’末端を有するＣｒｉｃｋ鎖と、
（ｂ）Ｔｍを１０〜２０℃下回る温度で前記望ましくないｍｉＲＮＡの前記第１の末端の結合領域とアニールする、前記Ｃｒｉｃｋ鎖の前記５’末端または前記Ｃｒｉｃｋ鎖の前記３’末端のうちの一方の一本鎖相補領域であって、一本鎖相補領域と、
（ｃ）前記相補領域に隣接する前記Ｃｒｉｃｋ鎖上の二本鎖領域であって、前記二本鎖領域が前記Ｃｒｉｃｋ鎖にアニールされるＷａｔｓｏｎ鎖を含み、前記Ｗａｔｓｏｎ鎖が５’末端及び３’末端を有する、二本鎖領域と、
（ｄ）前記Ｃｒｉｃｋ鎖の前記３’末端に連結される第１のブロッキング部分であって、リガーゼの基質としての役割を果たすことができない、第１のブロッキング部分と、
（ｅ）前記Ｃｒｉｃｋ鎖の前記５’末端に連結される第２のブロッキング部分であって、リガーゼの基質としての役割を果たすことができない、第２のブロッキング部分と、
（ｆ）前記相補領域が前記Ｃｒｉｃｋ鎖の前記３’末端にある場合、前記Ｗａｔｓｏｎ鎖の前記３’末端に連結される、または前記相補領域が前記Ｃｒｉｃｋ鎖の前記５’末端にある場合、前記Ｗａｔｓｏｎ鎖の前記５’末端に連結される第３のブロッキング部分であって、リガーゼの基質としての役割を果たすことができない、第３のブロッキング部分と、
（ｇ）前記Ｗａｔｓｏｎ鎖上の前記望ましくないｍｉＲＮＡの前記第１の末端にライゲーションするためのライゲーション末端であって、前記相補領域が前記Ｃｒｉｃｋ鎖の前記５’末端にある場合、前記Ｗａｔｓｏｎ鎖の前記３’末端に、または前記相補領域が前記Ｃｒｉｃｋ鎖の前記３’末端にある場合、前記Ｗａｔｓｏｎ鎖の前記５’末端に位置する、前記ライゲーション末端と、を含む、
（Ｂ）前記工程（Ａ）の前又は後に、アデニル化核酸アダプターを前記複数のｍｉＲＮＡにライゲーションすることと、
（Ｃ）前記複数のｍｉＲＮＡに対してＲＴ−ＰＣＲを行うことと、
を含む、方法。
【請求項２】
アニーリングが、Ｔｍを１０〜２０℃下回る温度で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
アニーリングが、Ｔｍを５℃下回る温度またはそれ以上で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ブロッキング核酸を、前記望ましくないｍｉＲＮＡの前記第１の末端にライゲーションすることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記望ましくないｍｉＲＮＡの前記第１の末端が、前記５’末端であり、前記相補領域が、前記ブロッキング核酸の前記５’末端にある、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記望ましくないｍｉＲＮＡの前記第１の末端が、前記３’末端であり、前記相補領域が、前記ブロッキング核酸の前記３’末端にある、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ブロッキング核酸を、前記望ましくないｍｉＲＮＡの前記第１の末端にライゲーションすることを含み、前記ライゲーションステップが、ＤＮＡ／ＲＮＡリガーゼを用いて行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記望ましくないｍｉＲＮＡが、ｍｉｒ−１６、ｍｉｒ−１５ａ、ｍｉｒ−１５ｂ、ｍｉｒ−１９５、ｍｉｒ−４２４、ｍｉｒ−４９７、ｍｉｒ−４８６、ｍｉｒ−４５１、及びｍｉｒ−２６からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、概して、分子生物学の分野に関する。特に、本開示は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）のシークエンシングライブラリーを生成することに関する。より具体的には、本開示は、シークエンシングライブラリーにおける特定のｍｉＲＮＡの頻度を低下させることに関する。
【背景技術】
【０００２】
マイクロＲＮＡは、それらの生物学的に活性な形態で、約１７〜２５のヌクレオチド塩基長である天然に存在する低分子非コードＲＮＡである。ｍｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡの翻訳を抑制し、分解のために転写物を標的化することによって、転写後に、遺伝子発現を調節する。ｍｉＲＮＡは、負の調節因子として機能し、そのため、より多量の特異的ｍｉＲＮＡほど、より低レベルの標的遺伝子発現と相関するであろうと考えられている。
【０００３】
遺伝子調節、ひいてはヒトの健康におけるそれらの重要な役割を考えると、ｍｉＲＮＡの大規模なシークエンシングは、ヒト疾患の研究において非常に価値が高い科学的ツールになる。シークエンシングされるｍｉＲＮＡライブラリーを作成する、当該技術分野で既知の様々な方法がある。
【０００４】
低分子ＲＮＡは、とりわけ、ｑＰＣＲ、マイクロアレイ、及び溶液系のハイブリダイゼーションを含む、様々な技術で測定することができる。次世代ＤＮＡシークエンシング（ＮＧＳ）はまた、その技術的性能、低費用、超高スループット、及び新種を不可知論的に検出し、測定する能力のため、低分子ＲＮＡの発見及び定量化における強力な方法である。
【０００５】
例えば、図１に概して示されるように、ｍｉＲＮＡシークエンシングライブラリーを作成するためのイルミナ適合性キットを作製するＩｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．及び他の営利会社によって使用されるプロトコルでは、ブロックされた３’末端を有するアデニル化ＤＮＡ  ３’アダプター４０は、先端を切断したＴ４  ＲＮＡリガーゼ２  ５０を用いて、ＲＮＡ分子１０の３’末端２０にライゲーションされる。この先端を切断したＴ４  ＲＮＡリガーゼ２  ５０は、アデニル化された３’アダプター４０基質を必要とする。この結果は、全ＲＮＡ試料中の他のＲＮＡ種の断片がこの反応において一緒にライゲーションされず、プレアデニル化されたオリゴヌクレオチドのみが、そこにライゲートされた３’アダプター６０を用いてｍｉＲＮＡ分子をもたらす遊離な３’ＲＮＡ  ２０末端にライゲートされ得るというものである。さらに、３’アダプター２０が３’でブロックされるため、自己ライゲーションのための基質として役割を果たすことができない。次のステップでは、５’アダプター７０は、ＲＮＡリガーゼ１  ８０と共に付加される。５’末端３０がリン酸化されるＲＮＡ分子１０のみが、その後のライゲーション反応のために有効な基質であろう。この第２のライゲーション後、そこにライゲーションした３’及び５’アダプター９０の両方を有するｍｉＲＮＡが形成される。次に、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）増幅１００が形成される。ＲＴ−ＰＣＲ増幅１００後、ライブラリーは、配列決定され、分析され得る１１０。このライブラリー調製方法は、シークエンシングは常に、元のＲＮＡ分子１０の５’末端３０から３’末端２０までを読み取るように、配向したライブラリーをもたらす。
【０００６】
しかしながら、低分子ＲＮＡのＮＧＳは、いくつかの技術的な問題を有する。これらの中で、シークエンシングライブラリーの生成プロトコルにおいて一般に使用されるＴ４  ＲＮＡリガーゼ２の修正された形態のよく報告された偏向挙動である。この偏向は、ある特定の種の過剰提示及び他の過少提示を生成する、差次的なライゲーションとして低分子ＲＮＡライブラリーにおいて明示する。低分子ＲＮＡライブラリーが多くの試料タイプで構成されるとき、固有の豊富な差異と組み合わせたライゲーションの有効性においてこれらの偏向は、不正確な結果を生じ得る。高度に豊富な低分子ＲＮＡ種は、優先的にライゲートされ得、そのため、ライブラリーにおけるそれらの提示は、異常に高くなり、他の豊富でない種を測定する能力を減退させる。これらの過少提示された種の正確な検出は、それ故に、非常に高いシークエンシングの深さ及び比例的に高い費用を必要とし得る。さらに、高度に豊富な種は、多くの正規化技術を妨げ、回収された読み取りの効用を限定する。
【０００７】
ヒト血漿及び血清から作製された低分子ＲＮＡライブラリーでは、多くの最も高度に豊富な種は、恐らく、血液細胞集団から生じる。これらはいくつかの適用への対象となり得るが、癌及び神経変性疾患等の多くの疾患のためのバイオマーカーとしての機能を果たす、ｍｉＲＮＡ及び他の低分子ＲＮＡは、罹患した患者の血液中の少量であり得る。したがって、血液に基づいたｍｉＲＮＡバイオマーカーが対象である問題に直面する研究者は、シークエンシングライブラリーにおいて読み取りの大部分を含む高度に豊富であり、かつあまり有益でない種の背景において少量の種を正確に測定する方法である。
【０００８】
したがって、ｍｉＲＮＡシークエンシングライブラリーにおいて、過剰定義または豊富なｍｉＲＮＡ  １０の頻度を低下させるための有効な方法に対する必要性がある。
【発明の概要】
【０００９】
上の問題（ならびにその他）は、本明細書に開示された全ての実施形態が、上に開示された全ての問題に対処しないであろうが、本開示に提供された本発明によって対処される。
【００１０】
第１の態様では、ｍｉＲＮＡライブラリーにおける望ましくないマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の存在量を低下させるために用いるブロッキング核酸が提供され、ブロッキング核酸は、ブロッキング核酸の５’末端及びブロッキング核酸の３’末端と、ストリンジェントな条件下で望ましくないｍｉＲＮＡの第１の末端の結合領域とアニールする、ブロッキング核酸の５’末端及びブロッキング核酸の３’末端のうちの一方の一本鎖の相補領域であって、当該第１の末端は、望ましくないｍｉＲＮＡの５’末端または３’末端のいずれかであり、相補領域が終末末端を有する、一本鎖の相補領域と、ライゲーション末端を有するヘアピンループ形成領域であって、該相補領域に隣接するヘアピンループ形成領域と、ヘアピンループ形成領域の末端に連結される第１のブロッキング部分であって、リガーゼの基質としての役割を果たすことができない、第１のブロッキング部分と、を含む。
【００１１】
第２の態様では、ｍｉＲＮＡライブラリーにおける望ましくないｍｉＲＮＡの存在量を低下させるのに用いるブロッキング核酸が提供され、ブロッキング核酸は、３’末端及び５’末端を有するＣｒｉｃｋ鎖と、ストリンジェントな条件下で望ましくないｍｉＲＮＡの第１の末端の結合領域とアニールする、Ｃｒｉｃｋ鎖の５’末端またはＣｒｉｃｋ鎖の３’末端のうちの一方の一本鎖相補領域であって、当該第１の末端が望ましくないｍｉＲＮＡの５’末端または３’末端である、一本鎖相補領域と、相補領域に隣接するＣｒｉｃｋ鎖上の二本鎖領域であって、当該二本鎖領域がＣｒｉｃｋ鎖にアニールされるＷａｔｓｏｎ鎖を含み、Ｗａｔｓｏｎ鎖が５’末端及び３’末端を有する、二本鎖領域と、Ｃｒｉｃｋ鎖の３’末端に連結される第１のブロッキング部分であって、リガーゼの基質としての役割を果たすことができない、第１のブロッキング部分と、Ｃｒｉｃｋ鎖の５’末端に連結される第２のブロッキング部分であって、リガーゼの基質としての役割を果たすことができない、第２のブロッキング部分と、相補領域がＣｒｉｃｋ鎖の３’末端にある場合、Ｗａｔｓｏｎ鎖の３’末端に連結される、または相補領域がＣｒｉｃｋ鎖の５’末端にある場合、Ｗａｔｓｏｎ鎖の５’末端に連結される第３のブロッキング部分であって、リガーゼの基質としての役割を果たすことができない、第３のブロッキング部分と、Ｗａｔｓｏｎ鎖上のライゲーション末端であって、相補領域がＣｒｉｃｋ鎖の５’末端にある場合、Ｗａｔｓｏｎ鎖の３’末端に、または相補領域がＣｒｉｃｋ鎖の３’末端にある場合、Ｗａｔｓｏｎ鎖の５’末端に位置する、ライゲーション末端と、を含む。
【００１２】
第３の態様では、望ましくないｍｉＲＮＡが逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）に関与することを防止する方法が提供され、望ましくないｍｉＲＮＡは、５’末端及び３’末端を有し、本方法は、上のブロッキング核酸のいずれかの相補領域を、望ましくないｍｉＲＮＡの第１の末端の結合部位にアニールすることを含み、望ましくないｍｉＲＮＡの第１の末端は、５’末端または３’末端のうちの一方である。本方法の生成物も、提供される。
【００１３】
第４の態様では、ｍｉＲＮＡライブラリーにおける望ましくないｍｉＲＮＡの存在量を低下させる方法が提供され、望ましくないｍｉＲＮＡは、５’末端及び３’末端を有し、本方法は、複数のｍｉＲＮＡを含む試料からＲＮＡを精製することと、アデニル化核酸アダプター及び第１のＤＮＡ／ＲＮＡリガーゼを、該アデニル化核酸アダプターを複数のｍｉＲＮＡの３’末端にライゲーションすることができる条件下で導入することと、上のブロッキング核酸のいずれかを、該ブロッキング核酸の相補領域を望ましくないｍｉＲＮＡの結合領域とアニールすることができる条件下でブロックされた試料を生成するために導入することと、ＲＮＡアダプター及びＲＮＡリガーゼを、該ＲＮＡアダプターを複数のｍｉＲＮＡの５’末端にライゲーションすることができる条件下で導入することと、複数のｍｉＲＮＡの逆転写を可能にする条件下で、逆転写酵素をブロックされた試料に導入して、ｃＤＮＡ試料を生成することと、望ましくないｍｉＲＮＡの存在量が低下したｍｉＲＮＡライブラリーを生成するために、ｃＤＮＡ試料上でポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うことと、を含む。本方法の生成物である非標的ｍｉＲＮＡの存在量が低下したｍｉＲＮＡライブラリーもまた、提供される。
【００１４】
第５の態様では、ｍｉＲＮＡライブラリーにおいてｍｉＲＮＡの頻度を低下させるためのキットが提供され、このキットは、上のブロッキング核酸のいずれかを含む。
【００１５】
第６の態様では、ブロックされたｍｉＲＮＡ複合体が提供され、このブロックされたｍｉＲＮＡ複合体は、ｍｉＲＮＡと、ｍｉＲＮＡの第１の末端の結合領域にアニールされる上のブロッキング核酸のいずれかと、を含み、第１の末端は、５’末端または３’末端のうちの一方である。
【００１６】
第７の態様では、配列番号１〜４及び１３のうちの１つと少なくともある特定のレベルの同一性を有する配列を含む核酸が提供される。第８の態様では、第７の態様の核酸を有する高度にストリンジェントな条件下でアニールする核酸が提供される。第９の態様では、第７及び第８の態様の核酸のうちのいずれかを含む、生物またはベクターが提供される。
【００１７】
上の要約は、請求される主題のいくつかの態様の基本的な理解を提供するために、簡易化した要約を提示する。この要約は、包括的な概要ではない。請求される主題の主要なまたは不可欠な要素を識別すること、またはその範囲を詳細に説明することを意図するものではない。その唯一の目的は、後述するより詳細な説明の前置きとして、いくつかの概念を簡易な形式で提示することである。
【００１８】
本発明のさらに詳細な説明は、図面に示された特定の実施形態を参照することにより与えられる。これらの図面が、特許請求の範囲を制限することが意図されないことが理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】プレアデニル化アダプターが、先端を切断したＴ４  ＲＮＡリガーゼ２を用いて、低分子ＲＮＡプールの３’末端にライゲーションされる、早期のプロトコルのフローチャート。続いて、第２のアダプターを、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ１を用いてｍｉＲＮＡの５’末端に付加し、続いて、逆転写及びＰＣＲを行う。
【００２０】
【図２】標的ｍｉＲＮＡの５’末端に対してオーバーハング相補体を有するヘアピンオリゴヌクレオチドが、ｍｉＲＮＡの５’末端へのＴ４  ＤＮＡリガーゼを用いたライゲーション、続いて、３’末端へのアダプターのライゲーションを介して結合する、本方法の例示的な実施形態におけるフローチャート。これは、ｍｉＲＮＡの５’末端への第２のアダプターのライゲーションを防ぎ、ＰＣＲ中に増幅しない生成物を得る。
【００２１】
【図３】ブロックされていないライブラリーと比較して、ｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐを標的とするブロッキングオリゴヌクレオチドの滴定を用いて、ヒト心臓全ＲＮＡから生成されるブロックされたライブラリー中に存在するｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐの画分を示すグラフを、ｙ軸上に示す。
【００２２】
【図４Ａ】ヒト血漿試料中のｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐのブロッキング。（Ａ〜Ｃ）５つの異なるヒト血漿試料からのシークエンシング結果をＡ〜Ｅに示す。平均化した（材料及び方法を参照されたい）複製のブロックされていない及びｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐでブロックされたライブラリーからの読み取り計数を、それぞれ、ｘ及びｙ軸上に示す。全てのライブラリーが、プロッティング及び分析の前に６００万の整列させたｍｉＲＮＡの読み取りにダウンサンプリングされた。ｍｉＲＮＡは、ＤＥＳｅｑ２によって計算されるように調節されたＰ値が０．０１未満である場合、２つの条件の間で有意に差次的に発現されるとみなされる。有意に差次的に発現されないｍｉＲＮＡを、白丸で示す。有意に差次的に発現されるｍｉＲＮＡを、黒丸で示す。
【図４Ｂ】ヒト血漿試料中のｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐのブロッキング。（Ａ〜Ｃ）５つの異なるヒト血漿試料からのシークエンシング結果をＡ〜Ｅに示す。平均化した（材料及び方法を参照されたい）複製のブロックされていない及びｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐでブロックされたライブラリーからの読み取り計数を、それぞれ、ｘ及びｙ軸上に示す。全てのライブラリーが、プロッティング及び分析の前に６００万の整列させたｍｉＲＮＡの読み取りにダウンサンプリングされた。ｍｉＲＮＡは、ＤＥＳｅｑ２によって計算されるように調節されたＰ値が０．０１未満である場合、２つの条件の間で有意に差次的に発現されるとみなされる。有意に差次的に発現されないｍｉＲＮＡを、白丸で示す。有意に差次的に発現されるｍｉＲＮＡを、黒丸で示す。
【図４Ｃ】ヒト血漿試料中のｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐのブロッキング。（Ａ〜Ｃ）５つの異なるヒト血漿試料からのシークエンシング結果をＡ〜Ｅに示す。平均化した（材料及び方法を参照されたい）複製のブロックされていない及びｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐでブロックされたライブラリーからの読み取り計数を、それぞれ、ｘ及びｙ軸上に示す。全てのライブラリーが、プロッティング及び分析の前に６００万の整列させたｍｉＲＮＡの読み取りにダウンサンプリングされた。ｍｉＲＮＡは、ＤＥＳｅｑ２によって計算されるように調節されたＰ値が０．０１未満である場合、２つの条件の間で有意に差次的に発現されるとみなされる。有意に差次的に発現されないｍｉＲＮＡを、白丸で示す。有意に差次的に発現されるｍｉＲＮＡを、黒丸で示す。
【図４Ｄ】ヒト血漿試料中のｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐのブロッキング。（Ａ〜Ｃ）５つの異なるヒト血漿試料からのシークエンシング結果をＡ〜Ｅに示す。平均化した（材料及び方法を参照されたい）複製のブロックされていない及びｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐでブロックされたライブラリーからの読み取り計数を、それぞれ、ｘ及びｙ軸上に示す。全てのライブラリーが、プロッティング及び分析の前に６００万の整列させたｍｉＲＮＡの読み取りにダウンサンプリングされた。ｍｉＲＮＡは、ＤＥＳｅｑ２によって計算されるように調節されたＰ値が０．０１未満である場合、２つの条件の間で有意に差次的に発現されるとみなされる。有意に差次的に発現されないｍｉＲＮＡを、白丸で示す。有意に差次的に発現されるｍｉＲＮＡを、黒丸で示す。（Ｆ）ｍｉｒ−１６ファミリーメンバーの配列を、シード領域（塩基２−８）を灰色で強調表示して示す。
【図４Ｅ】ヒト血漿試料中のｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐのブロッキング。（Ａ〜Ｃ）５つの異なるヒト血漿試料からのシークエンシング結果をＡ〜Ｅに示す。平均化した（材料及び方法を参照されたい）複製のブロックされていない及びｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐでブロックされたライブラリーからの読み取り計数を、それぞれ、ｘ及びｙ軸上に示す。全てのライブラリーが、プロッティング及び分析の前に６００万の整列させたｍｉＲＮＡの読み取りにダウンサンプリングされた。ｍｉＲＮＡは、ＤＥＳｅｑ２によって計算されるように調節されたＰ値が０．０１未満である場合、２つの条件の間で有意に差次的に発現されるとみなされる。有意に差次的に発現されないｍｉＲＮＡを、白丸で示す。有意に差次的に発現されるｍｉＲＮＡを、黒丸で示す。（Ｆ）ｍｉｒ−１６ファミリーメンバーの配列を、シード領域（塩基２−８）を灰色で強調表示して示す。
【図４Ｆ】ヒト血漿試料中のｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐのブロッキング。（Ｆ）ｍｉｒ−１６ファミリーメンバーの配列を、シード領域（塩基２−８）を灰色で強調表示して示す。
【００２３】
【図５】ヒト血漿試料中の読みの深さにおけるｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐブロッキングの効果。一連のカウント閾値を、ｘ軸上にプロットし、それに対して、ｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐでブロックされた試料対ブロックされない試料における閾値を通過するｍｉＲＮＡの数の間の差を、ｙ軸上にプロットする。個々の試料の間の差を、灰色の点線で示す。平均差を、黒色の実線で示す。全てのライブラリーが、プロッティングの前に６００万の整列させたｍｉＲＮＡの読み取りにダウンサンプリングされた。
【００２４】
【図６Ａ】ヒト血漿試料中の再現性及び差次的発現の測定におけるｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐブロッキングの効果。（Ａ）分散は、ＤＥＳｅｑ２を用いて、複製のブロックされていないライブラリー及び複製のｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐでブロックされたライブラリーに基づいた血漿試料ライブラリーの各セットについて計算した。分散値は、ｙ軸上にプロットし、それに対して、またＤＥＳｅｑ２によって計算された、基礎平均の読み取り計数を、ｘ軸上にプロットする。ブロックされていない分散体は、灰色でプロットされ、一方、ブロックされた分散体は、黒色でプロットされる。
【図６Ｂ】ヒト血漿試料中の再現性及び差次的発現の測定におけるｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐブロッキングの効果。（Ｂ）倍率変化は、ブロックされていないライブラリー及びｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐライブラリーの両方において全ての可能な試料対（１０）の間で計算された。これらの対の全てに対するｌｏｇ２（倍率変化）は、ブロックされていないライブラリーに対するｌｏｇ２（倍率変化）をｘ軸上、及びｍｉＲ−１６−５ｐでブロックされたライブラリーに対するｌｏｇ２（倍率変化）をｙ軸上の、同じ軸上にプロットされる。それ故に、それぞれの点は、固有のｍｉＲＮＡ試料の対の組み合わせを表す。両方の試料が１０超のＤＥＳｅｑ２で計算された基礎平均を有するようなｍｉＲＮＡのみが、プロットされた。ブロックされないライブラリーとｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐでブロックされたライブラリーとの間での倍率変化の相関関係の一連の１０  スピアマンρの平均及び標準偏差が、プロット上に列挙される。
【００２５】
【図７Ａ】ヒト血漿試料中のｈｓａ−ｍｉＲ−４５１ａ単独で及びブロッキングｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐと組み合わせたブロッキング。（Ａ〜Ｂ）２つのヒト血漿試料からのシークエンシングの結果を示す。ブロックされていないライブラリー及びｈｓａ−ｍｉＲ−４５１ａでブロックされたライブラリーからの読み取り計数を、それぞれ、ｘ及びｙ軸上に示す。
【図７Ｂ】ヒト血漿試料中のｈｓａ−ｍｉＲ−４５１ａ単独で及びブロッキングｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐと組み合わせたブロッキング。（Ａ〜Ｂ）２つのヒト血漿試料からのシークエンシングの結果を示す。ブロックされていないライブラリー及びｈｓａ−ｍｉＲ−４５１ａでブロックされたライブラリーからの読み取り計数を、それぞれ、ｘ及びｙ軸上に示す。
【図７Ｃ】ヒト血漿試料中のｈｓａ−ｍｉＲ−４５１ａ単独で及びブロッキングｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐと組み合わせたブロッキング。（Ｃ〜Ｄ）同じ２つのヒト血漿試料からのシークエンシングの結果を示す。ブロックされていないライブラリーならびにｈｓａ−ｍｉＲ−４５１ａ及びｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐで同時にブロックされたライブラリーからの読み取り計数を、それぞれ、ｘ及びｙ軸上に示す。ｍｉＲＮＡは、ＤＥＳｅｑ２によって計算されるように調節されたＰ値が０．０１未満である場合、及びその基礎平均計数が５０を上回る場合、２つの条件の間で有意に差次的に発現されるとみなされる。有意に差次的に発現されないｍｉＲＮＡを、白丸で示す。有意に差次的に発現されるｍｉＲＮＡを、黒丸で示す。全てのライブラリーが、プロッティング及び分析の前に６００万の整列させたｍｉＲＮＡの読み取りにダウンサンプリングされた。
【図７Ｄ】ヒト血漿試料中のｈｓａ−ｍｉＲ−４５１ａ単独で及びブロッキングｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐと組み合わせたブロッキング。（Ｃ〜Ｄ）同じ２つのヒト血漿試料からのシークエンシングの結果を示す。ブロックされていないライブラリーならびにｈｓａ−ｍｉＲ−４５１ａ及びｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐで同時にブロックされたライブラリーからの読み取り計数を、それぞれ、ｘ及びｙ軸上に示す。ｍｉＲＮＡは、ＤＥＳｅｑ２によって計算されるように調節されたＰ値が０．０１未満である場合、及びその基礎平均計数が５０を上回る場合、２つの条件の間で有意に差次的に発現されるとみなされる。有意に差次的に発現されないｍｉＲＮＡを、白丸で示す。有意に差次的に発現されるｍｉＲＮＡを、黒丸で示す。全てのライブラリーが、プロッティング及び分析の前に６００万の整列させたｍｉＲＮＡの読み取りにダウンサンプリングされた。
【００２６】
【図８】一連のブロックされない血漿ライブラリーからの読み取りの分類別分布。ヒト血漿試料に由来する２７のライブラリーに対して６つの分類に分かれる読み取りの画分を示す。実線の横線は、ｍｉＲＮＡに整列するが、ｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐに整列しない読み取りを示す。破線の垂直線は、ｍｉＲＮＡではないヒトゲノムにマッピングする読み取りを示す。実線の垂直線は、ｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐに整列する読み取りを示す。横線クロスハッチングは、スパイクに整列する読み取りを示す。チェックは、ｍｉＲＮＡまたはヒトゲノムに整列できない読み取りである。破線の横線は、アダプター二量体である読み取りである。
【００２７】
【図９】一連のｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐをブロックされたヒト血漿ライブラリーからの読み取りの分類別分布。ｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐをブロックされたヒト血漿試料に由来する２３のライブラリーに対して６つの分類に分かれる読み取りの画分を示す。実線の横線は、ｍｉＲＮＡに整列するが、ｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐに整列しない読み取りを示す。破線の垂直線は、ｍｉＲＮＡではないヒトゲノムにマッピングする読み取りを示す。実線の垂直線は、ｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐに整列する読み取りを示す。横線クロスハッチングは、スパイクに整列する読み取りを示す。チェックは、ｍｉＲＮＡまたはヒトゲノムに整列できない読み取りである。破線の横線は、アダプター二量体である読み取りである。
【００２８】
【図１０】５’末端を標的とすることと３’末端を標的とすることとを対比した場合のブロッキングライゲーション反応の効果。ライブラリー定量化キット−Ｉｌｌｕｍｉｎａ／ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ（ＫＡＰＡ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて決定される、ライブラリー濃度全体が、プロット化される。点状の棒は、偽のブロッキングライゲーション（全ての試薬は、ブロッキングオリゴヌクレオチドを除く）が、標的ｍｉＲＮＡの５’末端をブロックするように行われ得るように、実行されたライブラリーである。クロスハッチングの棒は、偽のブロッキングライゲーションが、標的ｍｉＲＮＡの３’末端をブロックするように行われ得るように、実行されたライブラリーである。
【００２９】
【図１１】３’末端を標的とするブロッカーによるブロッキングの有効性へのｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐの効果における３’末端の変形の例示。最左の配列として示される正準形を有する、様々な配列変化のｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐを示す。一緒に、ここに６つのプロット化は、この実験においてｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐに整列する９１％超の配列を含む。棒の高さは、ブロックされていないライブラリーと比較してブロックされたライブラリーにおいて残りの画分を示す。
【００３０】
【図１２Ａ】ｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐのブロッキングを用いる及びそれを用いないライブラリーにおける読み取り計数の再現性。（Ａ〜Ｅ）５つのヒト血漿試料からの複製のブロックされていないライブラリーにおける読み取り計数を、互いに対してプロット化する。
【図１２Ｂ】ｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐのブロッキングを用いる及びそれを用いないライブラリーにおける読み取り計数の再現性。（Ａ〜Ｅ）５つのヒト血漿試料からの複製のブロックされていないライブラリーにおける読み取り計数を、互いに対してプロット化する。
【図１２Ｃ】ｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐのブロッキングを用いる及びそれを用いないライブラリーにおける読み取り計数の再現性。（Ａ〜Ｅ）５つのヒト血漿試料からの複製のブロックされていないライブラリーにおける読み取り計数を、互いに対してプロット化する。
【図１２Ｄ】ｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐのブロッキングを用いる及びそれを用いないライブラリーにおける読み取り計数の再現性。（Ａ〜Ｅ）５つのヒト血漿試料からの複製のブロックされていないライブラリーにおける読み取り計数を、互いに対してプロット化する。
【図１２Ｅ】ｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐのブロッキングを用いる及びそれを用いないライブラリーにおける読み取り計数の再現性。（Ａ〜Ｅ）５つのヒト血漿試料からの複製のブロックされていないライブラリーにおける読み取り計数を、互いに対してプロット化する。
【図１２Ｆ】ｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐのブロッキングを用いる及びそれを用いないライブラリーにおける読み取り計数の再現性。（Ｆ〜Ｊ）５つのヒト血漿試料からの複製のｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐをブロックしたライブラリーにおける読み取り計数を、互いに対してプロット化する。全ての実験については、プロッティングの前に６００万の整列させた読み取りが、ダウンサンプリングされた。相関関係のスピアマンρ係数を、それぞれの複製対に対して示す。
【図１２Ｇ】ｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐのブロッキングを用いる及びそれを用いないライブラリーにおける読み取り計数の再現性。（Ｆ〜Ｊ）５つのヒト血漿試料からの複製のｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐをブロックしたライブラリーにおける読み取り計数を、互いに対してプロット化する。全ての実験については、プロッティングの前に６００万の整列させた読み取りが、ダウンサンプリングされた。相関関係のスピアマンρ係数を、それぞれの複製対に対して示す。
【図１２Ｈ】ｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐのブロッキングを用いる及びそれを用いないライブラリーにおける読み取り計数の再現性。（Ｆ〜Ｊ）５つのヒト血漿試料からの複製のｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐをブロックしたライブラリーにおける読み取り計数を、互いに対してプロット化する。全ての実験については、プロッティングの前に６００万の整列させた読み取りが、ダウンサンプリングされた。相関関係のスピアマンρ係数を、それぞれの複製対に対して示す。
【図１２Ｉ】ｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐのブロッキングを用いる及びそれを用いないライブラリーにおける読み取り計数の再現性。（Ｆ〜Ｊ）５つのヒト血漿試料からの複製のｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐをブロックしたライブラリーにおける読み取り計数を、互いに対してプロット化する。全ての実験については、プロッティングの前に６００万の整列させた読み取りが、ダウンサンプリングされた。相関関係のスピアマンρ係数を、それぞれの複製対に対して示す。
【図１２Ｊ】ｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐのブロッキングを用いる及びそれを用いないライブラリーにおける読み取り計数の再現性。（Ｆ〜Ｊ）５つのヒト血漿試料からの複製のｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐをブロックしたライブラリーにおける読み取り計数を、互いに対してプロット化する。全ての実験については、プロッティングの前に６００万の整列させた読み取りが、ダウンサンプリングされた。相関関係のスピアマンρ係数を、それぞれの複製対に対して示す。
【００３１】
【図１３】５’末端を標的とするブロッカーによるブロッキングの有効性へのｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐの効果における５’末端の変形の例示。最左の配列として示される正準形を有する、様々な配列変化のｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐを示す。下線は、正準形からの「欠失している」塩基を表す。正準形よりも短い変異体、ある特定の長い形態は、ブロッキングの有効性の減少を示す。これらの変異体が読み取り全体の非常に少量の画分（＜２％）を表すため、塩基の決定が、真の変異体またはシークエンシングの誤りを表す場合、明らかではない。
【００３２】
【図１４】ｈｓａ−ｍｉＲ−１５−５ｐ  ３’ブロッカーを用いた、ブロックされていないライブラリー及びブロックされたライブラリーにおけるｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐの存在量の並行比較。
【００３３】
【図１５】ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ−５ｐ  ５’ブロッカーを用いた、ブロックされていないライブラリー及びブロックされたライブラリーにおけるｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ−５ｐの存在量の並行比較。
【００３４】
【図１６】ｈｓａ−ｍｉＲ−４８６−５ｐ  ５’ブロッカーを用いた、ブロックされていないライブラリー及びブロックされたライブラリーにおけるｈｓａ−ｍｉＲ−４８６−５ｐの存在量の並行比較。
【００３５】
【図１７】ブロッカーのプールを用いた、ブロックされていないライブラリー及びブロックされたライブラリーにおけるｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐの存在量の並行比較。
【００３６】
【図１８】ブロッカーのプールを用いた、ブロックされていないライブラリー及びブロックされたライブラリーにおけるｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ−５ｐの存在量の並行比較。
【００３７】
【図１９】ブロッカーのプールを用いた、ブロックされていないライブラリー及びブロックされたライブラリーにおけるｈｓａ−ｍｉＲ−４５１ａ−５ｐの存在量の並行比較。
【００３８】
【図２０】ブロッカーのプールを用いた、ブロックされていないライブラリー及びブロックされたライブラリーにおけるｈｓａ−ｍｉＲ−４８６−５ｐの存在量の並行比較。
【００３９】
【図２１】ヒト血漿試料中の再現性及び差次的発現の測定におけるｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐブロッキングの効果。倍率変化は、ブロックされていないライブラリー及びｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐライブラリーの両方において全ての可能な試料対（１０）の間で計算された。これらの対の全てに対するｌｏｇ２（倍率変化）は、ブロックされていないライブラリーに対するｌｏｇ２（倍率変化）をｘ軸上、及びｍｉＲ−１６−５ｐでブロックされたライブラリーに対するｌｏｇ２（倍率変化）をｙ軸上の、同じ軸上にプロットされる。それ故に、それぞれの点は、固有のｍｉＲＮＡ試料の対の組み合わせを表す。両方の試料が１０超のＤＥＳｅｑ２で計算された基礎平均を有するようなｍｉＲＮＡのみが、プロットされた。ブロックされないライブラリーとｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐでブロックされたライブラリーとの間での倍率変化の相関関係の一連の１０  スピアマンρの平均及び標準偏差が、プロット上に列挙される。
【００４０】
【図２２Ａ】ｍｉＲＮＡをブロックする方法におけるヘアピンループを含まないブロッキング核酸の実施形態。図２２Ａは、５’ブロッキング核酸を示す。
【図２２Ｂ】ｍｉＲＮＡをブロックする方法におけるヘアピンループを含まないブロッキング核酸の実施形態。図２２Ｂは、３’ブロッキング核酸を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
Ａ．定義
別途定義されない限り、本明細書に使用される全ての用語（技術的及び科学的用語を含む）は、本明細書の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。一般に使用される辞書で定義されるような用語は、本明細書の文脈におけるそれらの意味と一致する意味を有するものと解釈されるべきであり、本明細書で明確に定義しない限り、理想的または過度に形式的な意味で解釈されないことがさらに理解されよう。周知の機能または構築物は、簡潔さまたは明確さのために詳述されない場合がある。
【００４２】
本明細書で使用される専門用語は、特定の実施形態のみの目的のものであり、限定されることが意図されない。本明細書で使用される、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、別途文脈に明確な指示がない限り、複数形も同様に含めるように意図されている。
【００４３】
「第１の」、「第２の」等のような用語は、様々な特性または要素を記載するために本明細書に使用されるが、これらの特性または要素は、これらの用語によって限定されるべきではない。これらの用語は、ある特性または要素を別の特性または要素と区別するためにのみ使用される。それ故に、以下に論じられる第１の特性または要素は、第２の特性または要素と称され得、同様に、以下に論じられる第２の特性または要素は、本開示の教示の範囲を逸脱することなく、第１の特性または要素と称され得る。
【００４４】
上述の説明及び／または以下の特許請求の範囲における、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という単語（複数可）の使用に関しては、これらの言語は、排他的ではなく、包括的に解釈されるべきであり、これらの単語の各々が、上述の説明及び／または以下の特許請求の範囲を理解する上でそのように解釈されるべきであることを基礎的かつ明確な理解として使用されている。
【００４５】
「本質的に〜からなる」という用語は、引用された要素に加えて、特許請求の範囲はまた、本開示に述べられたように、その意図された目的のために特許請求の範囲の実施可能性に悪影響を及ぼさない他の要素（ステップ、構造、構成要素、成分等）も含み得る。重要なことには、この用語は、たとえ、かかる他の要素がいくつかの他の目的のために特許請求の範囲の実施可能性を増強し得るとしても、本開示に述べられたように、その意図された目的のために特許請求の範囲の実施可能性に悪影響を及ぼす、かかる他の要素を除外する。
【００４６】
本明細書に使用される「個体」、「対象」、または「患者」という用語は、哺乳動物、例えば、マウス、ラット、他の齧歯動物、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウマ、または霊長類、及びヒトのような任意の動物を指す。この用語は、男性または女性またはその両方を特定しても、男性または女性を除外してもよい。
【００４７】
「約」及び「およそ」という用語は、一般には、測定の性質または精度を想定して、測定された量に対する誤差または変動の許容可能な程度を意味するべきである。誤差または変動の典型的な例示的程度は、所定の値または値の範囲の２０パーセント（％）以内、好ましくは１０％以内、より好ましくは５％以内である。生物系において、「約」という用語は、誤差の許容可能な標準偏差、好ましくは所定の値の２倍以内を指す。本明細書に与えられた数量は、別途明記されない限り、およそのものであり、「約」または「およそ」という用語が、明示されなくても黙示され得る。
【００４８】
本明細書に使用される「ヌクレオチド」という用語は、任意のかかる既知の基、天然、及び合成を指す。それは、従来のＤＮＡまたはＲＮＡ塩基（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、Ｕ）、塩基類縁体、例えば、イノシン、５−ニトロインダゾール、その他、イミダゾール−４−カルボキサミド、ピリミジンまたはプリン誘導体、例えば、ピリミジン塩基修飾体６Ｈ，８Ｈ−３，４−ジヒドロピリミド［４，５−ｃ］［１，２］オキサジン−７−オン（ＡまたはＧに結合する「Ｐ」塩基と表示されることがある）、及びプリン塩基修飾体Ｎ６−メトキシ−２，６−ジアミンプリン（ＣまたはＴに結合する「Ｋ」塩基と表示されることがある）、ヒポキサンチン、Ｎ−４−メチルデオキシグアノシン、４−エチル−２’−デオキシシチジン、４，６−ジフルオロベンジミダゾール、及び２，４−ジフルオロベンゼンヌクレオシド類縁体、ピレン官能基ＬＮＡヌクレオシド類縁体、デアザ−またはアザ−修飾プリン及びピリミジン、５または６位に置換基を有するピリミジン、及び２、６、または８位に置換基を有するプリン、２−アミノアデニン（ｎＡ）、２−チオウラシル（ｓＵ）、２−アミノ−６−メチルアミノプリン、Ｏ−６−メチルグアニン、４−チオ−ピリミジン、４−アミノ−ピリミジン、４−ジメチルヒドラジン−ピリミジン、Ｏ−４−アルキル−ピリミジン、及び水素結合なしに２本鎖ＤＮＡを形成する疎水性核酸塩基を含む。核酸塩基は、ホスホジエステル、ホスホチオエート、またはメチルホスホネート連結、ペプチド−核酸連結を含む、様々な連結または配座によって一緒に連結され得る。
【００４９】
本明細書に使用される「ポリヌクレオチド」という用語は、従来のＲＮＡ、ＤＮＡ、ＬＮＡ、ＢＮＡ、前述のいずれかのコポリマー、及びそれらの類似体を含む、ポリマーを形成するために一緒に連結されたヌクレオチドを含む多重結合化合物を指す。
【００５０】
本明細書に使用される「核酸」という用語は、一本鎖ポリヌクレオチドまたは二本鎖の２つのポリヌクレオチドを指す。かかる二本鎖は、全ての位置でアニールされる必要はなく、ギャップまたはオーバーハングを含有し得る。
【００５１】
本明細書に使用される「ニック」という用語は、一方の鎖の隣接したヌクレオチド間でリン酸ジエステル結合がない二本鎖核酸分子における不連続性を指す。
【００５２】
「ｍｉＲＮＡ」という用語は、当該技術分野でその普通かつ単純な意味に従って、本明細書に使用され、真核生物において見出され、ＲＮＡに基づく遺伝子調節に関与するマイクロＲＮＡ分子を指す。その用語は、前駆体からプロセスされる一本鎖ＲＮＡ分子を指すために使用されるであろう。個々のｍｉＲＮＡは、異なる生物において同定されかつシークエンスされており、それらには名称が与えられている。本方法及び組成物は、必ずしも本発明の限定としてではなく、例として提供されるので、本出願において同定されるｍｉＲＮＡに限定されるべきではない。
【００５３】
核酸は、本明細書に使用されるように、核酸の一方の鎖のヌクレオチド配列が、そのヌクレオチドの水素原子の配向により、反対側の核酸の鎖上で別の配列に水素結合するとき、互いに「相補的」である（当然ながら、核酸の鎖もまた、自己相補的であり得る）。相補的塩基は、典型的には、ＤＮＡにおいては、ＡとＴ、及びＣとＧであり、ＲＮＡにおいては、ＣとＧ、及びＵとＡである。相補性は、完全または実質的／十分であり得る。２つの核酸間の完全な相補性は、２つの核酸が、二本鎖における全ての塩基をＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ対合により相補的塩基に結合する二本鎖を形成することができることを意味する。「実質的な」または「十分な」相補性は、一方の鎖の配列が反対側の鎖の配列に対して完全に相補的ではないが、十分な結合が、与えられた一連のハイブリダイゼーション条件（例えば、塩濃度及び温度）下で安定したハイブリッド複合体を形成するために、２本の鎖上の塩基間で生じることを意味する。そのような条件は、配列及び標準モデルを用いて、ハイブリダイズされた鎖のＴｍを予測することによって、または構築された方法を用いることによるＴｍの経験的決定によって予測することができる。Ｔｍは、２つの核酸鎖間に形成されるハイブリダイゼーション複合体の集団が、５０％変性する温度を指す。Ｔｍ未満の温度では、ハイブリダイゼーション複合体の形成が好ましく、一方、Ｔｍより高い温度では、ハイブリダイゼーション複合体における鎖の溶解または分離が好ましい。
【００５４】
本明細書に使用される「リガーゼ」という用語は、２つのポリヌクレオチド間または単一のポリヌクレオチドの末端間でリン酸ジエステル結合の形成を触媒する酵素を指す。リガーゼとしては、ＡＴＰ依存性二本鎖ポリヌクレオチドリガーゼ、ＮＡＤ＋依存性二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡリガーゼ、及び一本鎖ポリヌクレオチドリガーゼが挙げられる。リガーゼの特定の例としては、細菌性リガーゼ、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡリガーゼ及びＴａｑ  ＤＮＡリガーゼ、Ａｍｐｌｉｇａｓｅ（登録商標）熱安定性ＤＮＡリガーゼ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ（登録商標）Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐ．、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）の一部、Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）、ファージリガーゼ、例えば、Ｔ３  ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、及びＴ７  ＤＮＡリガーゼ、及びこれらの突然変異体、ならびにＴ４  ＲＮＡリガーゼ１及びＴ４  ＲＮＡリガーゼ２及びこれらの突然変異体、例えばＳｓｏ７融合タンパク質、Ｔ４の先端を切断し、突然変異した（Ｋ２２７Ｑ）ＲＮＡリガーゼ２が挙げられるが、これらに限定されない。本開示では、「ＤＮＡ／ＲＮＡリガーゼ」または「ＲＮＡ／ＤＮＡリガーゼ」という用語は、ＲＮＡ分子とＤＮＡ分子との間でリン酸ジエステル結合の形成を触媒するリガーゼを指す。ＤＮＡ／ＲＮＡリガーゼの例は、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ及びＴ４  ＲＮＡリガーゼ２を含む。
【００５５】
「ライゲーティブ」という用語は、ライゲーション反応に利用可能であること、またはリガーゼに好適な基質を意味する。
【００５６】
Ｂ．ブロッキング核酸
ｍｉＲＮＡライブラリーにおける非標的マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の存在量を低下させるために用いるブロッキング核酸１２０が提供され、ブロッキング核酸１２０は、望ましくないｍｉＲＮＡ  １０の第１の末端の結合領域とアニールする、ブロッキング核酸１２０の５’末端またはブロッキング核酸１２０の３’末端のうちの一方の一本鎖相補領域１３０と、ヘアピンループ形成領域１４０または相補領域１３０に隣接した他の二本鎖領域１７０と、を含み、１つを除くブロッキング核酸１２０の末端の全てが、リガーゼ反応に関与することはできない。利用可能な末端は、ｍｉＲＮＡが相補領域１３０にアニールされるとき、適切なリガーゼを用いて綴じ込まれ得るニックを離れる、ｍｉＲＮＡに直接隣接するであろう。この末端は、４’リン酸基または３’ヒドロキシル基を取り除くまたはマスキングすることによってリガーゼ反応に関与することができなくなる。本開示では、ブロッキング核酸１２０の相補領域１３０が問題になっている望ましくないｍｉＲＮＡ３０の５’末端に相補的である場合、「５’ブロッキング核酸」と称される。同様に、ブロッキング核酸の相補領域１３０が問題になっている望ましくないｍｉＲＮＡ２０の３’末端に相補的である場合、「３’ブロッキング核酸」と称される。
【００５７】
ブロッキング核酸１２０の第１の態様は、ヘアピンループ形成領域１４０を含む。第１の態様の実施形態は、ストリンジェントな条件下で望ましくないｍｉＲＮＡ  １０の第１の末端の結合領域とアニールする、ブロッキング核酸１２０の５’末端またはブロッキング核酸１２０の３’末端のうちの一方の一本鎖相補領域１３０であって、当該第１の末端は、望ましくないｍｉＲＮＡ２０の５’末端または３’末端のいずれかであり、相補領域１３０は末端１３２を有する、一本鎖相補領域１３０と、ライゲーション末端１３６を有するヘアピンループ形成領域１４０であって、該相補領域に隣接するヘアピンループ形成領域１４０と、ヘアピンループ形成領域１４０の末端に連結され、リガーゼの基質としての役割を果たすことができない、第１のブロッキング部分１８０と、を含む。ヘアピンループの存在は、リガーゼ反応ができなくならなければならない末端の数を減少させる。したがって、プロトコルを単純化することの利点を有する。ブロッキング核酸１２０の第１の態様の実施形態を図２に示す。
【００５８】
ブロッキング核酸１２０の第２の態様は、ヘアピンループ形成領域１４０を有する必要はないが、第２の鎖によって（またはヘアピンループもしくは第１の鎖の他の構造によって）形成され得る二本鎖領域１７０を有する。ブロッキング核酸１２０の第２の態様の実施形態は、Ｃｒｉｃｋ鎖２２０と、ストリンジェントな条件下で望ましくないｍｉＲＮＡ  １０の第１の末端の結合領域とアニールする、Ｃｒｉｃｋ鎖２２０の５’末端またはＣｒｉｃｋ鎖２２０の３’末端のうちの一方の一本鎖相補領域１３０であって、当該第１の末端は、望ましくないｍｉＲＮＡの５’末端または３’末端（それぞれ、３０及び２０）である、一本鎖相補領域１３０と、相補領域１３０に隣接するＣｒｉｃｋ鎖２２０上の二本鎖領域１７０であって、二本鎖領域１７０が、Ｃｒｉｃｋ鎖２２０にアニールされるＷａｔｓｏｎ鎖２３０を含む、二本鎖領域１７０と、Ｃｒｉｃｋ鎖２２０の３’末端に連結される第１のブロッキング部分１８０であって、リガーゼの基質としての役割を果たすことができない、第１のブロッキング部分１８０と、Ｃｒｉｃｋ鎖２２０の５’末端に連結される第２のブロッキング部分１９０であって、リガーゼの基質としての役割を果たすことができない、第２のブロッキング部分１９０と、相補領域１３０がＣｒｉｃｋ鎖２２０の３’末端にある場合、Ｗａｔｓｏｎ鎖２３０の３’末端に連結される、または相補領域１３０がＣｒｉｃｋ鎖２２０の５’末端にある場合、Ｗａｔｓｏｎ鎖２３０の５’末端に連結される第３のブロッキング部分２００であって、リガーゼの基質としての役割を果たすことができない、第３のブロッキング部分２００と、Ｗａｔｓｏｎ鎖２３０上のライゲーション末端２１０であって、相補領域１３０がＣｒｉｃｋ鎖２２０の５’末端にある場合、Ｗａｔｓｏｎ鎖２３０の３’末端に、または相補領域１３０がＣｒｉｃｋ鎖２２０の３’末端にある場合、Ｗａｔｓｏｎ鎖２３０の５’末端に位置する、ライゲーション末端２１０と、を含む。ブロッキング核酸１２０の第２の態様の実施形態を図２２に示す。
【００５９】
ｍｉＲＮＡは、ブロッキング核酸１２０のある有用な適用が、ｍｉＲＮＡライブラリーにおいて過剰提示されたｍｉＲＮＡの存在量を低下する場合に「望ましくない」と称されるが、ブロッキング核酸１２０は、様々な適用において任意のＲＮＡ分子の一方の端に結合するために使用することができる。記述子「望ましくない」は、ブロッキング核酸１２０が任意の与えられたＲＮＡまたはＲＮＡのタイプで使用することができない、または使用すべきではないという表示として見られるべきではない。
【００６０】
相補領域１３０は、それが機能するのに極めて重要である、ｍｉＲＮＡにアニールするためにアニールされるべきではない場合に一本鎖として記載される。当然ながら、ブロッキング核酸１２０は、（例えば、保存中の安定性に役立つ、二量化を防ぐために）相補領域１３０が使用前に別のポリヌクレオチドとアニールされるように調製され、次いで、使用のための調製において変性され得る。相補領域１３０は、その意図された標的（複数可）に特異的であるように十分な長さがあり、アニーリング温度で結合領域に容易に結合するのに十分短くなるように設計されるであろう。相補領域１３０のいくつかの実施形態は、約５〜５０ヌクレオチド長である。相補領域１３０のさらなる実施形態は、約８〜２０ヌクレオチド長である。相補領域１３０のなおさらなる実施形態は、約１０〜１５ヌクレオチド長である。ブロッキング核酸１２０の特定の実施形態では、相補領域１３０は、１２ヌクレオチド長である。
【００６１】
それぞれの末端２１０がライゲーションのために利用可能であることを確実にするために、その関連ポリヌクレオチドの５’末端または３’末端にあるような相補領域１３０が、記載されている。しかしながら、ブロッキングポリヌクレオチドが、３’または５’末端に近接するが、末端２１０それ自体には隣接しない相補領域１３０に置くように設計され得ることが可能であり、そのような実施形態では、望ましくないｍｉＲＮＡ  １０とアニールした後に、アニールされない尾部が、エンドヌクレアーゼで切断され得る。そのようなエンドヌクレアーゼの除去後、ライゲーションの前に、相補領域１３０は、実際には、ポリヌクレオチドの５’または３’末端にあり得る。
【００６２】
相補領域１３０は、過度な実験を行わずに、当業者によって、ｍｉＲＮＡの３’または５’末端の既知の配列とアニールするように設計することができる。何千ものｍｉＲＮＡが知られており、それらの配列は、ＰＨＥＮＯＭＩＲ  ２．０等のオンライン情報源（Ｈｅｌｍｈｏｌｔｚ  Ｚｅｎｔｒｕｍ  Ｍｕｎｃｈｅｎ−Ｇｅｒｍａｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｈｅａｌｔｈ  ＩＢＩＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ及びＳｙｓｔｅｍｓ  Ｂｉｏｌｏｇｙによって提供され、ｈｔｔｐ：／／ｍｉｐｓ．ｈｅｌｍｈｏｌｔｚ−ｍｕｅｎｃｈｅｎ．ｄｅ／ｐｈｅｎｏｍｉｒ／ｍａｉｎ／ｌｉｓｔ？ｑｕｅｒｙ＝＆ｄｅｔａｉｌｅｄｑｕｅｒｙ１＝＆ｄｅｔａｉｌｅｄｑｕｅｒｙ２＝＆ｓｅａｒｃｈｓｃｏｐｅ１＝＆ｓｅａｒｃｈｓｃｏｐｅ２＝＆ｌｏｇｉｃ＝＆ｓｅｌｅｃｔｅｄｖｉｅｗ＝ｍｉｒｓ＆ｓｏｒｔ＝ｐｍ．ｍｉｒ．ｎａｍｅ＆ｍａｎｏｒｄｅｒ＝ａｓｃ＆ｏｆｆｓｅｔ＝１１８５０＆ｍａｘ＝３０で入手可能）、及びＬｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ学部のＧｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓ実験室（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ）によって管理された、ＭＩＲＢＡＳＥ．ｏｒｇを用いて検索され得る。
【００６３】
例えば、ｍｉＲＮＡシークエンシングライブラリーにおいて一般に過剰提示されるｍｉＲＮＡ  １０分子のうちの１つは、乳癌、結腸癌、脳癌、肺癌、前立腺癌、及び胃癌に加えて、Ｂ細胞リンパ球性白血病の発症に関与するとされているｍｉＲＮＡである、ｍｉｒ−１６である。ｍｉｒ−１６は、多くの組織タイプにおいて発現し、ｍｉＲＮＡシークエンシングライブラリーにおいて過剰提示される場合がある。したがって、シークエンシングライブラリーにおいてｍｉｒ−１６の全体的な頻度を減少させる能力は有益であり得る。他の過剰提示されたまたは豊富なｍｉＲＮＡとしては、ｍｉｒ−４８６、ｍｉｒ−４５１ａ、及びｍｉｒ−２６が挙げられるが、これらに限定されない。表１は、いくつかのブロッキング核酸（ＤＮＡ）１２０のヌクレオチド配列及びそれらのそれぞれの標的ｍｉＲＮＡ  １０を示す。それぞれの相補領域１３０を、黒色背景の白抜き文字で示す。それぞれのステムアンドループ形成領域を、下線を付して示す。１３〜５８位（配列番号５）の表１中の４つ全てのブロッキング核酸間のコンセンサス配列に留意されたい。配列番号１〜４の全てがステムアンドループ形成領域を有し、そのため、１つの鎖のみを有するブロッキング核酸を形成することも留意されたい。場合によっては、単一のブロッキング核酸１２０が、１つを超える望ましくない、過剰提示された、または豊富なｍｉＲＮＡ  １０の頻度を同時に有効に減少させ得ることに留意するべきである。
【表１】
0006791875.tif 000002
【００６４】
５’ブロッキング核酸１２０のうちのいずれかの相補領域１３０は、配列番号１〜４の１〜１２位とのある特定のレベルの同一性を共有するであろうことが企図される。ある特定のレベルの同一性は、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、及び１００％から選択され得る。さらなる実施形態では、ある特定のレベルの同一性は、９５％超である。なおさらなる特定の実施形態では、ブロッキングヌクレオチドは、配列番号１〜４のうちの１つを含む。
【００６５】
ｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐに特異的な３’核酸ブロッカーのいくつかの実施形態は、配列番号１３とある特定のレベルの同一性を有する配列を含む。ある特定のレベルの同一性は、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、及び１００％から選択され得る。さらなる実施形態では、ある特定のレベルの同一性は、９５％超である。配列番号１３の３’末端は、ｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐの３’末端上の結合領域への相補領域１３０である。
【００６６】
相補領域１３０は、ストリンジェントな条件下で、望ましくないｍｉＲＮＡ  １０の第１の末端の結合領域とアニールするであろう。そのようなストリンジェンシーは、Ｂｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｋｉｍｍｅｌ（１９８７，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５２，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  Ｃａｌｉｆ．）において教示されるように、核酸結合複合体の融解温度（Ｔｍ）に基づいている。アニールされた二本鎖のＴｍは、二本鎖の塩基組成、塩基ミスマッチの頻度、及び反応媒体のイオン強度に応じて異なる。二本鎖のＴｍは、認められたアルゴリズムを用いてこれらの２つの要因に基づいて当業者によって計算され得る。最大のストリンジェンシーは、典型的には、Ｔｍを約５℃下回る温度で、高ストリンジェンシーは、Ｔｍを約５〜１０℃下回る温度で、中程度のストリンジェンシーは、Ｔｍを約１０〜２０℃下回る温度で、低ストリンジェンシーは、Ｔｍを約２０〜２５℃下回る温度で生じる。当業者によって理解されるように、最大のストリンジェンシーのハイブリダイゼーションは、同一のヌクレオチド配列を特定または検出するために使用することができるが、一方、中程度の（または低）ストリンジェンシーのハイブリダイゼーションは、同等のまたは関連配列を特定または検出するために使用することができる。この文脈において「ストリンジェント」という用語は、それ自体で、中程度のストリンジェンシーを指す。最大のストリンジェント、高度にストリンジェント、及び不十分なストリンジェント等の用語は、それぞれ、最大のストリンジェンシー、高ストリンジェンシー、及び低ストリンジェンシーの条件を指す。
【００６７】
最大限ストリンジェントな条件の例は、以下の実施例において提供される。具体的には、ストリンジェントな条件は、実施例１の「補助方法」の項に記載される、「ブロッキングライゲーション」下での条件であり得る。この実施例におけるハイブリダイゼーション温度は３０℃であったが、一方、ブロッキング核酸１２０とｍｉＲＮＡとの間の二本鎖の計算されたＴｍは３５℃であったことに留意されたい。
【００６８】
相補領域１３０は、概して、ストリンジェントな条件下で、ｍｉＲＮＡにおいて少なくとも５つの連続する塩基とアニールする役割を果たすであろう。ｍｉＲＮＡライブラリーにおいて過剰提示されたｍｉＲＮＡの配列の例は、配列番号６〜１１に提供される。これらのｍｉＲＮＡをブロックするのに有用なブロッキング核酸１２０の実施形態では、相補領域１３０は、ストリンジェントな条件下で配列番号６〜１１のうちの少なくとも１つの少なくとも５つの連続する塩基とアニールし得る。いくつかのかかる実施形態では、相補領域１３０は、ストリンジェントな条件下で配列番号６〜１１のうちの少なくとも１つの少なくとも８つの連続する塩基とアニールし得る。さらなる実施形態では、相補領域１３０は、ストリンジェントな条件下で配列番号６〜１１のうちの少なくとも１つの少なくとも１０の連続する塩基とアニールし得る。さらなる実施形態では、相補領域１３０は、ストリンジェントな条件下で配列番号６〜１１（配列番号１２）のうちの少なくとも１つの２〜８位とアニールし得る。特定の実施形態では、相補領域１３０は、ストリンジェントな条件下で配列番号６〜１１のうちの少なくとも１つの１〜９位とアニールし得る。
【００６９】
ブロッキング核酸１２０のさらなる実施形態では、相補領域１３０は、高度にストリンジェントな条件下で、望ましくないｍｉＲＮＡ  １０の第１の末端の結合領域とアニールするであろう。ブロッキング核酸１２０のなおさらなる実施形態では、相補領域１３０は、最大限ストリンジェントな条件下で、望ましくないｍｉＲＮＡ  １０の第１の末端の結合領域とアニールするであろう。
【００７０】
ブロッキング部分は、ライゲーション反応に利用できない部分である、すなわち、それらは、リガーゼの基質としての役割を果たすことができない。様々な既知のリガーゼは、特定の核酸をライゲーションすることができるが、その他は、ライゲーションすることができない。リガーゼは全て、利用可能な３’ヒドロキシル基及び利用可能な５’リン酸基を有するライゲーションされたヌクレオチドを必要とする。ブロッキング部分のいくつかの実施形態は、３’ヒドロキシル基が除去されているか、または５’リン酸基が除去されている（または場合により両方である）ヌクレオチドである。ブロッキング部分はまた、鎖中の末端ヌクレオチドに結合した非ヌクレオチド基であり得る。そのような非ヌクレオチド基には、Ｃ３スペーサー（ホスホラミダイト）、スペーサー９（トリエチレングリコール）、及びスペーサー１８（ヘキサ−エチレングリコール）等の「スペーサー」が含まれる。他の非ヌクレオチド基は、プロピル基、プロパノール基、他の有機アルコール、及び他のグリコール化合物を含むことができる。ヌクレオチドブロッキング部分の例には、反転デオキシヌクレオチド、ジデオキシヌクレオチド、及び反転ジデオキシヌクレオチドが含まれる。第１、第２、及び第３のブロッキング部分は、存在する場合、同じ部分であってもよく、それぞれが、関連ポリヌクレオチドがライゲーションを行うことを効果的に防ぐのであれば、それらは、独立して選択してもよい。
【００７１】
ブロッキング部分は、ブロッキング核酸１２０に直接または間接的に連結してもよい。間接的に連結される場合、リンカー基は、ブロッキング基と末端ヌクレオチドとの間に存在してもよい。そのようなリンカー基は、例えば、スペーサー９（トリエチレングリコール）及びスペーサー１８（ヘキサ−エチレングリコール）を含むことができる。
【００７２】
対照的に、ブロッキング核酸１２０はまた、ライゲーション末端（１３６または２１０）も有する。核酸の第１の態様（ヘアピンループ）では、ライゲーション末端１３６は、ヘアピンループ形成領域１４０の末端で見出される。第２の態様では、ライゲーション末端２１０は、Ｗａｔｓｏｎ鎖２３０のうちの一方で見出される。ライゲーション末端（１３６または２１０）は、ｍｉＲＮＡの末端のうちの一方にライゲーションされることを目的としている。ライゲーション末端（１３６または２１０）は、多くの実施形態では、利用可能な３’ヒドロキシル基、利用可能な５’リン酸基、またはそれらの両方を有する末端ヌクレオチドであろう。ブロッキング核酸１２０のいくつかの実施形態では、ライゲーション末端（１３６または２１０）は、利用可能な３’ヒドロキシル基、利用可能な５’リン酸基、またはそれらの両方を有する天然ヌクレオチド（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ）である。さらなる実施形態では、ライゲーション末端（１３６または２１０）は、利用可能な３’ヒドロキシル基、利用可能な５’リン酸基、またはそれらの両方を有する非天然ヌクレオチドである。基は、リン酸ジエステル結合を形成することができる少なくとも１つの酸素原子を有し、立体的に妨げない（またはそうでなければそうすることから妨げる）場合、「利用可能」である。
【００７３】
ブロッキング核酸１２０のいくつかの実施形態は、ヘアピン形成領域を含む。望ましくないライゲーションを避けるためにブロッキングを必要とする末端の数を低下させるヘアピン形成領域の存在。ヘアピンループは、同じ鎖の２つの領域であるときに生じ、不対ループに終わる二重らせんを形成するための塩基対を反対方向に読み取るとき、通常、ヌクレオチド配列において相補的である。ステム−ループ構造の形成は、結果として生じるらせんアンドループ領域の安定性に応じて異なる。第１の必要条件は、それ自体で折り畳んで、対形成した二重らせんを形成することができる配列の存在である。このらせんの安定性は、その長さ、含まれるミスマッチまたはバルジの数（少ない数は、特に、長いらせんでは許容される）、及び対形成した領域の塩基組成によって決まる。ループの安定性もまた、ステム−ループ構造の形成に影響を及ぼす。長さが３塩基未満の「ループ」は立体的に不可能であり、形成しない。それら自体の第２の構造（シュードノット対形成等）を有しない大きなループはまた、不安定である。最適なループ長さは、約４〜８塩基長である傾向がある。一般に使用される４つの塩基対ループ（「テトラループ」）には、ＡＮＹＡ、ＣＵＹＧ、ＧＮＲＡ、ＵＭＡＣ、及びＵＮＣＧが含まれる。好適なヘアピンループ構造は、当該技術分野で当業者によって設計され得る。ヘアピンループ形成領域１４０の特定の実施形態は、配列番号５とある特定のレベルの同一性を有する配列を含む。ある特定のレベルの同一性は、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、及び１００％から選択され得る。さらなる実施形態では、ある特定のレベルの同一性は、９５％超である。
【００７４】
核酸ブロッカーの第２の態様では、必ずしもヘアピンループ形成構造ではない二本鎖領域が存在する。Ｗａｔｓｏｎ鎖２３０及びＣｒｉｃｋ鎖２２０を有するように記載されているが、場合によっては、これはそれ自体で折り畳まれて同じ鎖であり得る。「Ｗａｔｓｏｎ」及び「Ｃｒｉｃｋ」という用語は、２本の鎖が互いに少なくとも部分的にアニールされることを意味することを除いては、記述的または制限的な意味を持たない。ヘアピンループの不在下で、上に記載されるブロッキング部分は、Ｃｒｉｃｋ鎖２２０の両端に存在する。ブロッキング部分はまた、一本鎖領域から最も遠いＷａｔｓｏｎ鎖２３０の末端に存在するであろう。この特定の文脈において、一本鎖領域から最も遠い２つの末端（Ｗａｔｓｏｎ及びＣｒｉｃｋ）におけるブロッキング部分は、ポリヌクレオチドを連結するＷａｔｓｏｎ及びＣｒｉｃｋにおいて実装され得る。上に記載されるように、ヘアピンループは、この機能に役立ち得るが、ポリヌクレオチドを連結するＷａｔｓｏｎ及びＣｒｉｃｋは、ライゲーションに利用できない一本鎖相補領域１３０から最も遠い２つの末端を作製する目的に役目を果たすためのヘアピンループ構造を有する必要がない。
【００７５】
ブロッキングヌクレオチドの第２の態様では、Ｗａｔｓｏｎ鎖２３０は、１つのブロッキング部分のみを有し、「第３のブロッキング部分」（２００）と称される。図２２に示されるように、第３のブロッキング部分２００は、一本鎖相補領域１３０から最も遠いＷａｔｓｏｎの末端上にあるであろう。相補領域１３０に最も近いＷａｔｓｏｎの末端がｍｉＲＮＡでライゲーションでなければならないため、ブロックされないであろう。
【００７６】
Ｃ．ＲＴ−ＰＣＲからｍｉＲＮＡを排除する方法
望ましくないｍｉＲＮＡ  １０がＲＴ−ＰＣＲに関与することから防ぐ方法が提供される。一般の実施形態では、本方法は、上に記載のブロッキング核酸１２０のうちのいずれかを望ましくないｍｉＲＮＡ  １６０の結合領域にアニールすることを含む。アニーリング後、ブロッキング核酸１２０は、結合領域１６０が位置付けられるｍｉＲＮＡの「第１の末端」にライゲーションされ得る。図２及び２２に示されるスキームから明らかであるように、相補領域１３０がブロッキング核酸１２０の５’である場合、結合領域１６０は、ｍｉＲＮＡの５’末端にあり、相補領域１３０がブロッキング核酸１２０の３’末端である場合、結合領域１６０は、ｍｉＲＮＡの３’末端にあるであろう。
【００７７】
アニーリングステップは、概して、少なくとも中等度のストリンジェントな条件下で、行われるであろう。ストリンジェンシーが高度であるほど、相補領域１３０が意図的でないｍｉＲＮＡに結合する可能性が高くない。本方法のいくつかの実施形態では、アニーリングステップは、高度にストリンジェントな条件または最大限ストリンジェントな条件下で行われるだろう。
【００７８】
ライゲーションステップは、適切なリガーゼを用いて行われる。ブロッキング核酸１２０がＲＮＡである場合、ＲＮＡ／ＲＮＡリガーゼは使用しなければならない。ブロッキング核酸１２０がＤＮＡである場合、ＤＮＡ／ＲＮＡリガーゼは使用しなければならない。両タイプの多くのリガーゼが市販されており、それらの使用のためのそれらの特性及びプロトコルは、当業者には既知である。ブロッキング核酸１２０がＤＮＡである場合、リガーゼは、例えば、ＲＮＡ／ＤＮＡの二本鎖が形成されている場合、ＲＮＡからＤＮＡにライゲートされるＴ４  ＤＮＡリガーゼであり得る。
【００７９】
本方法は、任意のＲＮＡにおいて行われ得、上に説明されるように、ｍｉＲＮＡを特徴付けるための「望ましくない」という用語は、本方法のある意図される使用のみを指し、関連したＲＮＡの構造または源を制限しない。本方法のいくつかの実施形態は、１つ以上の望ましくないｍｉＲＮＡ  １０がＲＴ−ＰＣＲに関与するのを防ぐ目的のものであり、かかる実施形態では、ｍｉＲＮＡは、試料中の非常に豊富なまたは過剰提示されたｍｉＲＮＡであるため、「望ましくない」ものであり得る。かかる豊富なｍｉＲＮＡの例には、ｍｉｒ−１６、ｍｉｒ−４８６、ｍｉｒ−４５１、及びｍｉｒ−２６が含まれる。したがって、本方法のいくつかの実施形態では、望ましくないｍｉＲＮＡ  １０は、これらのｍｉＲＮＡから選択される。場合によっては、相補領域１３０及びアニーリング条件は、相補領域１３０が１つを超えるｍｉＲＮＡとアニールすることが可能であるように設計され得、任意のかかるさらなるｍｉＲＮＡは、それら自体で本方法に好適であるように任意に教示され得る。
【００８０】
本方法の生成物は、ブロッキングポリヌクレオチドにアニールされるｍｉＲＮＡ（「ブロックされたｍｉＲＮＡ複合体」５００）であろう。そのようなブロックされたｍｉＲＮＡ複合体５００は、５’ライゲーション反応または３’ライゲーション反応の少なくとも１つに関与することができないであろう。
【００８１】
Ｄ．ｍｉＲＮＡライブラリーにおける望ましくないｍｉＲＮＡの存在量を低下させること
上に提供されるブロッキング核酸１２０のいずれかを用いて、ｍｉＲＮＡライブラリーにおける望ましくないｍｉＲＮＡ  １０の存在量を低下させる方法が提供される。本方法の一般の実施形態は、特定の順序のない以下のステップ：（ａ）複数のｍｉＲＮＡを含む試料からＲＮＡを精製するステップと、（ｂ）アデニル化核酸アダプター４０が複数のｍｉＲＮＡの３’末端にライゲーション可能な条件下で、複数のｍｉＲＮＡのアデニル化核酸アダプター４０及び第１のＤＮＡ／ＲＮＡリガーゼ５０を導入するステップと、（ｃ）ブロッキング核酸１２０の相補領域１３０が望ましくないｍｉＲＮＡ  １６０の結合領域にアニールすることが可能な条件下で、ブロックされた試料４５０を生成するために、上に開示されるブロッキング核酸１２０のうちのいずれかを導入するステップと、（ｄ）ＲＮＡアダプター７０が複数のｍｉＲＮＡの５’末端にライゲーション可能な条件下で、ＲＮＡアダプター７０及びＲＮＡリガーゼ８０を導入するステップと、（ｅ）複数のｍｉＲＮＡの逆転写を可能にする条件下で、逆転写酵素をブロックされた試料４５０に導入して、ｃＤＮＡ試料を生成するステップと、（ｆ）望ましくないｍｉＲＮＡ  １０の存在量を低下させるｍｉＲＮＡライブラリーを生成するために、ｃＤＮＡ試料におけるＰＣＲを行うステップと、を含む。
【００８２】
生物学的試料からのＲＮＡの精製、ｍｉＲＮＡの３’末端及び５’末端へのアダプターのライゲーション、インビトロでの逆転写、及びＰＣＲ等のステップは、当該技術分野で既知の任意の好適なプロトコルに従って行われ得る。いくつかの例示的なプロトコルは、ＴｒｕＳｅｑ（登録商標）ＲＮＡ  Ａｃｃｅｓｓ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｐｒｅｐ  Ｇｕｉｄｅ，Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（２０１４）において見出すことができる。
【００８３】
本方法のいくつかの実施形態は、ブロッキング核酸１２０が望ましくないｍｉＲＮＡの５’末端及び３’末端（それぞれ、３０及び２０）の一方にライゲーションすることが可能な条件下で、第２のＤＮＡ／ＲＮＡリガーゼ１５０を導入することを含む。図２及び２２から明らかであるように、ブロッキング核酸１２０は、結合領域１６０が位置付けられるｍｉＲＮＡの末端にライゲーションされるであろう。
【００８４】
アデニル化核酸アダプター４０は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含むが、これらに限定されない、任意のタイプの核酸であり得る。アデニル化ＤＮＡアダプター４０は、優れた安定性の利点を有し、ユビキタスＲＮＡ分解酵素に対して脆弱ではない。アデニル化核酸アダプター４０のいくつかの実施形態は、逆転写酵素プライマー結合部位を含む。当該技術分野で既知であるように、逆転写酵素は、ＲＮＡを逆転写する前に、プライマーの結合を必要とする。最も既知の逆転写酵素は、プライマーとしてｔＲＮＡを使用する。レトロウイルス、植物パラレトロウイルス、及び長い末端反復を含むトランスポゾンでは、逆転写は、特定のｔＲＮＡによってプライムされる。全てのこれらのレトロ要素は、プライマーｔＲＮＡに対して相補的であるプライマー結合部位を含む。プライマーとして最も広く使用されているｔＲＮＡは、ｔＲＮＡ（Ｔｒｐ）、ｔＲＮＡ（Ｐｒｏ）、ｔＲＮＡ（１，２Ｌｙｓ）、ｔＲＮＡ（３Ｌｙｓ）、ｔＲＮＡ（ｉＭｅｔ）である。ｔＲＮＡ（Ｇｌｎ）、ｔＲＮＡ（Ｌｅｕ）、ｔＲＮＡ（Ｓｅｒ）、ｔＲＮＡ（Ａｓｎ）、及びｔＲＮＡ（Ａｒｇ）等の他のｔＲＮＡはまた、時には、プライマーとしても使用される。レトロウイルス及び植物パラレトロウイルスでは、プライマー結合部位は、プライマーｔＲＮＡの３’末端に対して相補的である。レトロトランスポゾンの場合、プライマー結合部位は、プライマーｔＲＮＡの３’末端または内部領域のいずれかに対して相補的である。当業者は、方法に対して選択されている逆転写酵素で機能することが知られているプライマーのいずれかを結合するために、アデニル化核酸アダプター４０において逆転写酵素プライマー結合部位を選択するであろう。
【００８５】
５’ブロッキング核酸１２０が使用される場合、アデニル化核酸アダプター４０は、それをブロッキング核酸１２０にアニールする前またはその後に、ｍｉＲＮＡにライゲーションすることができる。この状況では、アデニル化核酸アダプター４０は、しばしば、前のステップから残りのＡＴＰを低下させる必要を避けるために、ブロッキング核酸１２０をライゲーションする前に、ｍｉＲＮＡの３’末端にライゲーションされるであろう。５’ブロッキング核酸１２０を使用するとき、ブロッキング核酸１２０をｍｉＲＮＡにライゲーションするステップは、ＲＮＡアダプター７０をｍｉＲＮＡの５’末端にライゲーションする前に来るであろう、そうでなければ、ブロッキングは、効果がないだろう。
【００８６】
３’ブロッキング核酸１２０が使用される場合、アデニル化核酸アダプター４０は、それをブロッキング核酸１２０にアニールした後に、ｍｉＲＮＡの３’末端にライゲーションしなければならない、さもないと、ブロッキングは、効果がないだろう。そのような場合、アデニル化核酸アダプター４０をｍｉＲＮＡの３’末端にライゲーションする前に、ブロッキング核酸１２０のライゲーションからの使い残しの過剰なＡＴＰを除去することが望ましいものであり得る。これは、いくつかの方法のうちのいずれかによって行われ得る。例えば、試料は、ブロッキング核酸１２０をｍｉＲＮＡの３’末端にライゲーションした後、及びアデニル化核酸アダプター４０をｍｉＲＮＡの３’末端にライゲーションする前に、クロマトグラフィーカラムを通過させてもよい。過剰なＡＴＰはまた、化学反応、電気泳動、または他の方法によって除去され得る。３’ブロッキング核酸１２０が使用される場合、ＲＮＡアダプター７０のｍｉＲＮＡの５’末端へのライゲーションは、ブロッキング核酸１２０のｍｉＲＮＡの３’末端へのライゲーション前またはその後に起こり得る。
【００８７】
ブロックされた試料４５０を逆転写するステップ及びｃＤＮＡ試料を増幅するＰＣＲステップは、その順序で起こり、上の（ａ）〜（ｄ）を特徴とするステップの後に起こるであろう。
【００８８】
アニーリングは、本開示の上述の項に記載される、ストリンジェントな条件下で行われるであろう。本方法のいくつかの実施形態では、アニーリングは、高度にストリンジェントな条件または最大限ストリンジェントな条件下で行われるだろう。ブロッキング核酸とｍｉＲＮＡとの間の二本鎖の形成により、ＤＮＡ／ＲＮＡリガーゼによって連結されるであろうそれらの間のニックを残すであろう。
【００８９】
第１のＤＮＡ／ＲＮＡリガーゼ５０は、アデニル化核酸アダプター４０をＲＮＡにライゲーションすることができるリガーゼであろう。一例は、先端を切断したＴ４  ＲＮＡリガーゼ２である。先端を切断した変形例は、ＤＮＡがアデニル化５’末端を有することを必要とする所望の特性を有し、そのため、アデニル化核酸アダプター４０をｍｉＲＮＡの３’末端に特異的に結合する役割を果たすであろう。望ましくないライゲーションの生成を防ぐため、アデニル化核酸アダプター４０は、その３’末端にブロッキング部分を有し得る。ブロッキング部分は、ブロッキング核酸１２０で用いるのに好適である上述される任意のものであり得る。
【００９０】
第２のＤＮＡ／ＲＮＡリガーゼ１５０は、ｍｉＲＮＡの結合領域１６０をブロッキング核酸１２０の二本鎖領域１７０にライゲーションすることができるリガーゼであろう。したがって、オーバーハングが存在する、ＤＮＡポリヌクレオチドとＲＮＡポリヌクレオチドとの間の二本鎖におけるニックをライゲーションすることができることが好ましい。そのようなＤＮＡ／ＲＮＡリガーゼの特定の例は、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼである。
【００９１】
ＲＮＡリガーゼ８０は、ｍｉＲＮＡの５’末端をＲＮＡアダプター７０の３’末端にライゲーションすることができるリガーゼであろう。当該技術分野で既知の任意のかかるリガーゼが、使用され得る。本方法のいくつかの実施形態では、ＲＮＡリガーゼ８０は、一本鎖ＲＮＡ及びＤＮＡならびにピロリン酸ジヌクレオチドをライゲーションすることができるＴ４  ＲＮＡリガーゼ１であろう。
【００９２】
ＲＮＡアダプター７０は、ＰＣＲ時に、既知のプライマー結合部位を提供するのに役立つ。それ故に、プライマー結合部位のために好適な長さに対する長さに対応し得る。ＲＮＡアダプター７０の様々な実施形態は、５〜３０の塩基及び１８〜２２の塩基から選択される長さを有し得る。
【００９３】
本方法の生成物である望ましくないｍｉＲＮＡ  １０の存在量が低下したｍｉＲＮＡライブラリーもまた、提供される。この文脈において、「存在量を低下させた」は、ブロッカーを使用しない、同じ試料または同様の試料のライブラリーにおいて観察され得るよりも、ｍｉＲＮＡライブラリーにおける望ましくないｍｉＲＮＡが有意に少ないことを指す。図１４〜２０は、そのような存在量の低下の明らかな例示である。ｍｉＲＮＡライブラリーのいくつかの実施形態では、望ましくないｍｉＲＮＡの存在量は、少なくとも５０％低下する。ｍｉＲＮＡライブラリーのさらなる実施形態では、望ましくないｍｉＲＮＡの存在量は、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％、９８％、９９％、９９．５％、９９％、及び１００％からなる群から選択される量で少なくとも低下する。換言すれば、存在量の低下は、存在量の少なくとも２倍の低下であり得る。本方法のいくつかの実施形態では、存在量の低下は、少なくとも４倍の低下、少なくとも６倍の低下、または少なくとも８倍の低下であり得る。
【００９４】
Ｅ．キット
上に開示されているブロッキング核酸１２０のうちのいずれかを含む、ｍｉＲＮＡライブラリーにおいてｍｉＲＮＡの頻度を低下させるためのキットが、提供される。このキットは、試薬、緩衝液、酵素、取扱説明書の小冊子、陽性及び陰性対照、ならびに本明細書に記載される方法を行うのに有用なまたは必要なその他の材料をさらに含み得る。そのようなさらなる材料は、ＲＮＡ／ＲＮＡライゲーション、ＲＮＡ／ＤＮＡライゲーション、ＰＣＲ、逆転写、インサイツハイブリダイゼーション、及びＲＮＡ精製に有用なものを含み得る。さらなるキット要素の特定の非限定的な例には、アニールされるとき、ＤＮＡをＲＮＡにライゲーションすることができるＤＮＡ／ＲＮＡリガーゼ６１０（例えばＴ４  ＤＮＡリガーゼ６２０）；ＲＮＡ／ＲＮＡリガーゼ６３０（例えばＴ４  ＲＮＡリガーゼ１（６４０））；ＲＮＡ／ＤＮＡリガーゼ６５０（例えば先端を切断されたＴ４  ＲＮＡリガーゼ２（６６０））；複数のＤＮＡプライマー６８０；ヌクレオチド溶液６９０；ＰＣＲ緩衝液７００；好熱性ＤＮＡポリメラーゼ７１０、アデニル化核酸アダプター７２０、及びＲＮＡアダプター７３０、のうちのいずれかの容器が含まれる。列挙されたさらなるキット要素は、上の方法に好適であるように記載されるいずれかであり得る。列挙された要素「の容器」は、当業者によって容易に設計され得るあらゆる種類の容器であり得る。この容器は、１つを超える要素を含んでも、列挙されるものを除いたその他の要素を含んでもよい。キットのいくつかの実施形態では、この容器は、その他を除外するために列挙された要素のみを含む（緩衝液、溶媒等のような不活性物質を必ずしも除外しないが）。結果として、「Ｘの容器及びＹの容器」を含むキットへの言及は、Ｘ及びｙをそれぞれ含む２つの別々の容器を含むキットならびにＸ及びＹを含む１つの容器を含むキットを包含するように読み取らなければならない。キットのいくつかの実施形態では、所与の要素は、それ自体の容器を有し得る。
【００９５】
Ｆ．核酸
核酸分子は、ブロッキング核酸１２０、上の方法、及びキットで用いるために提供される。これらは、配列番号１〜４及び１３のうちのいずれか１つと少なくともある特定のレベルの同一性を有する配列を含む核酸を含む。同一性のレベルは、５０％以上、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、及び１００％であり得る。特定の実施形態では、同一性のレベルは、９５％超である。核酸はまた、ストリンジェントな条件下で、前述のうちのいずれかとアニールする核酸も含まれる。核酸のいくつかの実施形態は、高度にストリンジェントな条件下で前述のうちのいずれかにアニールする。核酸のいくつかのさらなる実施形態では、核酸は、最大限ストリンジェントな条件下で、前述のうちのいずれかとアニールする。核酸の特定の実施形態では、核酸は、前述の核酸のうちのいずれかに正確な相補体である。これらの分子は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＬＮＡ、ＢＮＡ、前述のいずれかのコポリマー、及びそれらの類似体を含む任意のタイプの核酸であり得る。特定の実施形態では、核酸は、ＤＮＡである。
【００９６】
上に開示されているブロッキング核酸１２０、及び相補領域１３０にアニールされる望ましくないｍｉＲＮＡ  １０のうちのいずれかを含む、ブロックされたｍｉＲＮＡ複合体５００も、提供される。ブロックされたｍｉＲＮＡ複合体のいずれかの実施形態では、ブロッキング核酸１２０を、ｍｉＲＮＡの第１の末端にライゲーションする。ブロックされたｍｉＲＮＡ複合体５００のいくつかの実施形態は、望ましくないマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）が上に定義されるＲＴ−ＰＣＲに関与することから防ぐ方法のうちのいずれかの生成物である。かかる方法が、試料中の非常に豊富なまたは過剰提示されたｍｉＲＮＡを防ぐために使用され得、ｍｉＲＮＡは、ｍｉｒ−１６、ｍｉｒ−１５ａ、ｍｉｒ−１５ｂ、ｍｉｒ−１９５、ｍｉｒ−４２４、ｍｉｒ−４９７、ｍｉｒ−４８６、ｍｉｒ−４５１、及びｍｉｒ−２６のうちのいずれかであり得る。ｍｉＲＮＡは、配列番号６（ｍｉＲ−１６）、７（ｍｉＲ−１５ａ）、８（ｍｉＲ−１５ｂ）、９（ｍｉＲ−１９５）、１０（ｍｉＲ−４２４）、１１（ｍｉＲ−４９７）、及び１２（前述のコンセンサス２〜８位）から選択される配列を含み得る。
【００９７】
上の核酸のうちのいずれかを含む生物及びベクターも、提供される。かかる生物及びベクターのための使用の例は、核酸の生成、核酸のクリーニング、及びその安定した保存である。多くの好適なベクターは、ウイルス、プラスミド、コスミド、フォスミド、ファグミド、人工染色体、酵母人工染色体、ヒト人工染色体、植物形成転換ベクター、及びリポソーム等、当該技術分野で既知である。単細胞生物は、対象となる核酸のクローニング、複製、及び維持において特に有用である。この目的のために一般的に使用されるモデル単細胞生物は、酵母、他の菌類、細菌、原生生物、及び古細菌を含む。特定のモデル生物は、当該技術分野で周知であり、これには、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ、及び様々なＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．等の細菌、Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ  ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ、Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ、Ｅｍｉｌｉａｎｉａ  ｈｕｘｌｅｙｉ、及びＴｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ等の原生生物、ならびにＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ．、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、及びＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ等の菌類が含まれる。
【実施例】
【００９８】
Ｇ．実施例
１．実施例１：ｍｉＲＮＡの５’末端へのブロッキング核酸のライゲーション
材料及び方法
全ＲＮＡ単離
末梢血試料の収集のためのプロトコルは、アラバマ大学（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ）の施設内治験審査委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄ）によって承認され、全てのドナーに書面のインフォームドコンセントが提供された。血液は、ＥＤＴＡ管内に収集された。収集してから３０分以内に、血漿を単離し（約５ｍｌ）、−８０℃で保存した。１ミリリットルの血漿を、１４，０００の相対遠心力で１５分間遠心分離し、全ＲＮＡを、製造業者の取扱説明書に従って、血漿／血清循環及びエキソソームＲＮＡ精製キット（Ｓｌｕｒｒｙ  Ｆｏｒｍａｔ）（Ｎｏｒｇｅｎ  Ｂｉｏｔｅｋ）を用いて上清から単離した。このキットからの溶出液を、ＲＮＡ浄化及び濃縮キット（Ｎｏｒｇｅｎ  Ｂｉｏｔｅｋ）を用いてさらに濃縮し、２０μｌの溶出緩衝液を用いて、ＲＮＡを収集した。
【００９９】
低分子ＲＮＡシークエンシング及びｍｉＲＮＡブロッキング
単離した全ＲＮＡを含有するｍｉＲＮＡを、Ｖｉｇｎｅａｕｌｔら（２０１２）及びＥｍｉｎａｇａら（２０１３）に記載される方法に従って、修正しながら、ｃＤＮＡシークエンシングライブラリーに変換した（完全なプロトコルは、補助方法において見出すことができる）。簡潔には、それぞれのライブラリーに対して、４μｌの単離ＲＮＡを、適切な緩衝液中で、１０μｌの３’アダプターのうちの１μｌ及び先端を切断された１μｌのＴ４  ＲＮＡリガーゼ２（ＮＥＢ）と１時間混合した。同時に、１μｌの０．５μＭ  ｍｉＲＮＡブロッキングオリゴヌクレオチドを、９５℃、６５℃、５５℃、４５℃、及び３５℃の温度で、それぞれ、５分間インキュベートして、ヘアピン構造の適切な形成を確実に行った。次に、インキュベートしたブロッキングオリゴヌクレオチドを、３’アダプターのライゲーション生成物に付加し、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）の存在下で、適切な緩衝液中で、３０℃で１時間、及び６５℃で１５分間インキュベートし、アニールして、さらなる反応から標的ｍｉＲＮＡをブロックした。１マイクロリットルの１０μＭ  逆転写プライマーを、３’アダプターのライゲーション生成物に７５℃で５分間、３７℃で３０分間、２５℃で１５分間アニールし、その後、アダプター二量体生成物の形成を軽減するために、５’アダプターを付加した。１マイクロリットルの２０μＭ  プールした５’アダプターを、７０℃で２分間インキュベートし、次いで、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ１（ＮＥＢ）でそれぞれの反応生成物に２５℃で１時間ライゲーションした。ライゲーションされた反応生成物を、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて逆転写し、Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ−  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ＮＥＢ）を用いてＰＣＲを介して増幅した。熱サイクル条件は、９４℃で３０秒間、続いて、９４℃で１０秒間、７２℃で４５秒間の１５サイクルであり、６５℃で５分間の最終伸長を行った。
【０１００】
ライブラリーは、製造業者の取扱説明書に従って、ＭｉｎＥｌｕｔｅ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて浄化し、濃縮し、２０μｌの最終体積に溶出した。ライブラリーは、５０分間加温した緩衝液を用いて、ＴＢＥ−Ｕｒｅａ  １０％  アクリルアミドゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）上で分離した。ｍｉＲＮＡ（約１３５〜１４５の塩基対）に対応するバンドを切除し、ゲルから溶出し、沈殿させ、１０μｌのＥＢ緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ）中で再懸濁した。低分子ＲＮＡライブラリー濃度は、ライブラリー定量化キット−Ｉｌｌｕｍｉｎａ／ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ（ＫＡＰＡ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって定量化し、標準的なＩｌｌｕｍｉｎａプロトコルに従って、ＨｉＳｅｑ２０００またはＭｉＳｅｑにおいて配列決定した。
【０１０１】
データ処理及び分析
アダプター配列を、Ｃｕｔａｄａｐｔ（３７）を用いて生のｆａｓｔｑファイルからトリムした。トリムした読み取りを、Ｂｏｗｔｉｅ２（３９）を用いて、プレｍｉＲＮＡ配列（ｍｉＲＢａｓｅバージョン１９）（３８）に整列させた。このアライメントを濾過して、２以下の塩基ミスマッチを有し、Ｂｏｗｔｉｅ２アライメントスコアによって測定されるように、個々の最良アライメントを得たアライメントのみ保持した。次いで、残りのアライメントされていない読み取りを、Ｂｏｗｔｉｅ２を用いて、ｈｇ１９参照ゲノムに整列させた。再度、固有の最良の読み取りを必要とした。ｍｉＲＮＡについては、読み取り計数は、ＢＥＤｔｏｏｌｓ（４０）を用いて、標準的な成熟形態の境界（ｍｉＲＢａｓｅバージョン１９）を用いてプレｍｉＲＮＡに整列させた読み取りのオーバーラップを計数することによって得た。成熟領域を有するあらゆるオーバーラップを計数した。それぞれの実験におけるｍｉＲＮＡ読み取り計数は、Ｒ（基準パッケージ）において実装されたランダムサンプリングを用いて、通常のレベルまでダウンサンプリングされた。２つの複製の「平均」が、（通常、プロッティングのために）得られた場合、以下の手順を使用した：２つのライブラリーを、一般の全計数値までダウンサンプリングされ、次いで、それぞれの種における計数を合計した。次いで、この合計したライブラリーを、元の一般の全計数値までダウンサンプリングした。このプロセスは、データの計数性質を保ち、それ故に、基礎的な分布であるため、複製ライブラリーを平均化するために好ましい。差次的発現は、「局所的」分散の予測及び「ＬＲＴ」試験を用いて、Ｒ中のパッケージＤＥＳｅｑ２（４１）を用いて計算した。有意な結果は、Ｐ値を０．０１未満に調節したＢｅｎｊａｍｉｎｉ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇを用いたものとして定義した。分散の予測は、ＤＥＳｅｑ２及び「局所的」モードを用いて計算した。図６Ａ中のプロッティングの前に、予測は、Ｒ（基本パッケージ）中のスプライン関数を用いて平滑化した。
【０１０２】
結果
シークエンシングライブラリーにおけるブロッキングｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐ
Ａｌｏｎら（２８）によって記載される若干修正されたバージョンのプロトコルを用いることによって調製された２７のヒト血漿試料からの一連の低分子ＲＮＡシークエンシングライブラリーでは、ｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐに対してマッピングされた読み取りは、ライブラリーにおける整列させた読み取り全体の２０〜６０％を含んだ（図８）。さらに、他の報告（３２、３３）と一致して、ｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐレベルは、試料中に存在する溶血度と相関した。これらのライブラリーにおけるｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐの大量の存在量は、非常に高価な低度の豊富なｍｉＲＮＡを検出するのに十分な深さにシークエンシングを形成する。１つまたは少数の種が読み取りの優位を占めるライブラリーの適切な正規化は、問題になる。また、ｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐレベルが異なるため、非ｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐの読み取りに関して、一般の深さに対する複数の試料の配列決定は、困難である。
【０１０３】
これらの問題を解決するために、５’末端へのアダプターのライゲーション中、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ１の基質としてそれをブロッキングすることによって、シークエンシングライブラリーからｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐを除去するように、あるアプローチが考案された（図２）。標準的なプロトコル（図１）では、プレアデニル化ＤＮＡオリゴヌクレオチドアダプターを、先端を切断したＴ４  ＲＮＡリガーゼ２を用いて、低分子ＲＮＡ種のプールの３’末端にライゲーションする。続いて、ＲＮＡオリゴヌクレオチドアダプターを、修正されていないＴ４  ＲＮＡリガーゼ１を用いて、５’末端にライゲーションする。得られた生成物を、逆転写し、ＰＣＲで増幅する。修正されたプロトコル（図２）では、標的ｍｉＲＮＡの標準的配列の５’末端の初めの１２塩基の逆要素である、その５’末端上に１２塩基オーバーハングを有する自己相補的ヘアピンからなるオリゴヌクレオチドを使用した。オリゴヌクレオチドの５’末端を、Ｃ３スペーサー（プロピル基）で修飾して、任意の望ましくないライゲーション反応におけるその関与を示す。低分子ＲＮＡプールの３’末端へのプレアデニル化アダプターのライゲーション後であるが、５’末端へのアダプターのライゲーション前に、この「ブロッカー」オリゴヌクレオチドを、導入する。標的ｍｉＲＮＡ種の相補的部分及びブロッカーは、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対に関与して、「ニック」を含む、ブロッカーの３’末端と標的ｍｉＲＮＡの５’末端との間で欠失しているリン酸ジエステル結合により、二本鎖ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドを形成する。Ｔ４  ＤＮＡリガーゼは、このハイブリッド分子を認識し、ニック（ＮＥＢ生成文献）を密封し、標的ｍｉＲＮＡの５’末端に共有結合しているブロッカーをもたらす。ヘアピン及びＣ３ブロッカーの存在は、この生成物の５’末端へのアダプターのその後のライゲーションを防ぐ。アダプターに含まれるプライマー結合配列を用いずに、この「ブロックされた」生成物は、下流ＰＣＲにおいて増幅されず、それを最終ライブラリーから有効に除去する。
【０１０４】
このアプローチの有効性を実証するために、様々な濃度の、ｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐを標的とするブロッカーを、インプット量としてヒト心臓全ＲＮＡを用いて、ライブラリー生成の反応物に滴定した。ヒト心臓全ＲＮＡは、ｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐが、それに由来するライブラリーにおいて豊富であるため、ｍｉＲＮＡ読み取りの約１０％を含む、好適な試験試料である。最終の配列決定されたライブラリーにおけるｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐの読み取りの存在量への効果は、５〜２０ｎＭの範囲で最大限の効果を有する、用量反応性挙動（図３）を示す。さらに、ブロッキング法は、２３のヒト血漿試料に由来する一連のライブラリーにおいて、２０ｎＭのｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐブロッキングオリゴヌクレオチドを使用することによって適用された。シークエンシングライブラリーにおいて、ｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐは、全ての場合において、読み取りの１％未満減少し（図９）、ブロッキングすることなく、前のセットよりもはるかに低かった（図８）。
【０１０５】
それらの５’末端での標的ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡファミリー内の配列相同性により、的外れの活性をもたらし得ることが予想されたため、３’末端からのｍｉＲＮＡを標的とし、ブロックすることが、最初に試みられた。５’アプローチと同様に、ヘアピンオリゴヌクレオチドは、相補的な３’オーバーハング、５’リン酸塩、及び３’Ｃ３ブロッカーと共に使用した。Ｔ４  ＤＮＡリガーゼによるブロッキングライゲーションは、まず、低分子ＲＮＡプールの３’末端へのアダプターのライゲーション前に起こる。このアプローチは、ヒト心臓全ＲＮＡにおいてｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐを有効にブロックしたが（データを示さず）、最終のライブラリー産出において悪影響を及ぼした。実際には、ブロッカーオリゴヌクレオチドを除く全ての試薬を含んだ偽のブロッキングライゲーション反応に供されたライブラリーにおいてでさえ、この３’アプローチは、５’アプローチよりも約５倍低い最終的なライブラリー濃度をもたらした（図１０）。３’アプローチにおける産出の低下は、低分子ＲＮＡプールの３’末端へのアダプターのその後のライゲーションにおいて先端を切断されたＴ４  ＲＮＡリガーゼ２を阻害する、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼによる初期ブロッキングライゲーションからの残りのＡＴＰによる可能性が高い。先端を切断されたＴ４  ＲＮＡリガーゼ２は、ＡＴＰをターンオーバーすることができないが、ＡＴＰは、依然として、活性部位の残部に結合することができ、酵素の阻害をもたらす（ＮＥＢによるパーソナル通信）。それ故に、３’アプローチは、ブロッキングライゲーションの反応要素がカラム精製またはいくつかの他の好適な方法によって除去された場合、望ましくない結果を有することなく、実装される可能性が高い。しかしながら、これらの方法からの低分子ＲＮＡの画分回収は、低くなることがあり得る。ＲＮＡ濃度が既に低い、ヒト血漿試料に対してこの方法の意図された適用を考慮すると、有効なＲＮＡのインプット量のさらなる低下は望ましくない。さらに、ｍｉＲＮＡは、Ｄｉｃｅｒによる切断部位と非テンプレート型ヌクレオチド付加の違いにより、それらの３’末端にかなりの変動を有することが知られている（４２、４３）。このアプローチは、塩基対ミスマッチ及びギャップに対して感受性が高いＴ４  ＤＮＡリガーゼに依存しているため（４４）、これらの変形は、ブロッキングの有効性に悪影響を及ぼし得る（図１１）。５’末端での変形が、５’ブロッキングのアプローチに同様の効果を有する（図１３）が、５’末端の変異は、概して、全体のうちのより小さい画分を提示する。３’アプローチのこれらの制限を考慮すると、さらなる研究では５’アプローチに焦点を合わせることが決定された。
【０１０６】
ブロックされたライブラリーの定量性能の評価
ライブラリーにおける非標的ｍｉＲＮＡ種の測定においてブロッキングｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐの効果を厳密に評価するために、５つのヒト血漿試料からライブラリーを生成した。各試料に関して、ブロックされていなかった、つまりブロッキングオリゴヌクレオチドを用いないブロッキングライゲーション反応に供された２つのライブラリーを生成した。さらに、２つのライブラリーを、ｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐを標的とするブロッキングオリゴヌクレオチドを用いて生成し、試料１つ当たり合計４つのライブラリーを生成した。ｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐのブロッキングが必ず大きな効果を有するように、高い溶血度を有する血漿試料を選択した。
【０１０７】
各試料に関して、ブロックされていない複製及びｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐでブロックされたライブラリーを、本出願のＤＥＳｅｑ２（材料及び方法を参照されたい）を用いて、ブロッキングによって差次的に影響を及ぼされるこれらのｍｉＲＮＡを構築することによって分析した。非ｍｉＲＮＡ種の正確なアライメントは、普遍的には、有意義な比較を可能にするには十分に正確ではなかったため、分析をｍｉＲＮＡ種のみに限定した。予想通り、ｍｉｒ−１６ファミリーメンバーはまた、それらの５’末端における配列類似性により、このアプローチによってブロックされる（図４Ａ〜Ｅ）。興味深いことに、ｍｉｒ−１６ファミリーメンバーのｈａｓ−ｍｉＲ−４２４−５ｐ及びｈｓａ−ｍｉＲ−４９７−５ｐは、それらが、他の４つのメンバーが有するウラシルではなく、第１の位置におけるサイトシンを有する可能性があるためブロックされない（図４Ｄ）。これは、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼが、塩基対ミスマッチがニック部位（４４）で存在する位置においてニックを密封できない能力と相関する。５つの試料のうちの２つにおいて、少量の非標的ｍｉＲＮＡは、ブロックされたライブラリーにおいても有意により低いことが観察された（図４Ａ〜Ｃ）。これらのｍｉＲＮＡのいくつかは、ブロッカーオリゴヌクレオチドとの配列類似性のいくつかの塩基を有し、ブロッキングオリゴヌクレオチドの５’末端と３’末端との間に１つの塩基性ギャップを有する二本鎖を形成するであろう。これらのギャップを密封する無効性は、中程度の倍率変化を説明する。他の低下した種は、明白な配列類似性を有しない。それらは、１つの試料においてのみ有意により低く（図４Ｃ）、わずかな倍率変化を有し、これは、ＤＥＳｅｑ２によって使用されたＦＤＲ補正が複数の仮定の効果を十分に補正しなかった可能性があることを呈する。いくつかのｍｉＲＮＡは、実際に、ブロックされたライブラリーにおいて有意により高い（図４Ｂ及びＣ）。おそらく、高度に豊富で、かつ好ましいライゲーション基質ｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐの不在下で５’アダプターをライゲーションする間、これらのｍｉＲＮＡをより有効にライゲートすることが可能であった。
【０１０８】
これらの試料中でｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐをブロックするための重要な動機づけは、少量の種の検出を増加させることであった。整列させた読み取りの当量数をもとに、ブロックされていないライブラリーとブロックされたライブラリーとの比較は、５つ全ての血漿試料中の様々なカウント閾値において検出されたｍｉＲＮＡ種の数の顕著な増加を示す（図５）。一般に選択される１０カウントのカットオフにおいて、ブロックされていない試料と比較してブロックされた試料中のこの閾値においてより１８０〜４５０多いｍｉＲＮＡが検出される。少量の種の検出におけるこの改善は、ライブラリー生成費用はほんのわずかに増加したが、シークエンシング費用は増加することなく達成された。
【０１０９】
重要な懸念は、ブロッキングプロトコルが、豊富でないｍｉＲＮＡの測定の再現性、及び伸長によって差次的発現を正確に測定する能力に悪影響を与えることである。測定されたｍｉＲＮＡの大量の存在量がブロッキングプロトコルによって影響を及ぼされていないこと再確認するが（図４）、ライブラリー生成プロトコルにおいて使用されるＲＮＡリガーゼによって引き起こされる既知の偏向を考慮すると、ライブラリー中のｍｉＲＮＡの絶対的な存在量が、試料中の実際の存在量の厳正に有意義な測定を表さないことを留意することが重要である。それにもかかわらず、多くの研究の目的は、試料群間の差次的発現を測定することである。このような場合、ｍｉＲＮＡの存在量は、再現的に測定されることだけを必要とする。
【０１１０】
５つのヒト血漿試料ライブラリーの再現性を査定するために、相関関係のスピアマンρ係数を複製ライブラリー間で計算した（図１２）。５つ全ての試料に関して、ブロックされたスピアマンρがより高かった。しかしながら、ＲＮＡリガーゼによって導入された偏向が一貫しているため、相関関係がこれらのライブラリーにおける再現性の最良の測定ではない可能性があるという懸念があった。それ故に、相関関係は、一連の２つのライブラリーに課せられ得るが、それは単に、それらが同じ偏向に供されたためであった。代替として、複製に基づいて各ライブラリーの分散を予測するためにＤＥＳｅｑ２を使用した（材料及び方法を参照されたい）。ＤＥＳｅｑ２は、計数データ（４１）の適切な分布として負の二項分布を提示し、読みの深さの関数として分散を予測する。データで見られるように、分散は、概して、低計数で最も高く、読みの深さが増加するにつれて減少する（図６Ａ）。ブロックされたライブラリーは、いずれの計数領域においてもより大きな分散を示さず、特に中から高の計数範囲において分散がより少ない場合がある。
【０１１１】
最後に、血液に基づいたバイオマーカー研究に関して、差次的発現を測定する能力が最重要である。ＤＥＳｅｑ２を用いて、試料の全ての可能な対（１０対）間の倍率変化を、ブロックされていないライブラリー及びｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐでブロックされたライブラリーの両方において別個に計算した。２つの試料間のｍｉＲＮＡの倍率変化の測定は、ブロックされていないライブラリー及びｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐでブロックされたライブラリーにおいて非常に類似している（図２１）。いくつかの異常値を除いて、倍率変化の大多数は、単一傾斜線の周辺に散乱している（図２１の破線）。１０対の各々に関して、相関関係のスピアマン係数を、ブロックされていないライブラリーとｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐでブロックされたライブラリーとの間で計算した。係数値は、非常に高く、平均は０．８６であった（図２１）。これらのデータは、ｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐのブロッキングがこの試料セットにおける差次的発現の測定に対して非常にわずかな効果を有することを示す。
【０１１２】
他のｍｉＲＮＡに対するブロッキング技術の延長及び
多重化
ブロッキング方法がｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐ以外の種をブロックする能力を構築するために、一連の２つのヒト血漿試料中で適切に設計されたブロッカーオリゴヌクレオチドを用いてｈｓａ−ｍｉＲ−４５１ａをブロックした。ｈｓａ−ｍｉＲ−４５１ａを選択したのは、それも、ヒト血漿試料から調製されたライブラリーが豊富であるため、かつｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐ（３２）のような血液細胞に由来していることに関与しているためである。分析は、最小の的外れ効果を有するこのアプローチによって有効にブロックされたｈｓａ−ｍｉＲ−４５１ａを見出した（図７Ａ及びＢ）。意図的な標的であるｈｓａ−ｍｉＲ−４５１ａ以外にｈｓａ−ｍｉＲ−４５１ｂだけが、ブロッキングによって有意に影響を及ぼされた。ｈｓａ−ｍｉＲ−４５１ｂの正準成熟形態は、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５１ａに対して有意な配列類似性を欠くが、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５１ｂヘアピンに対する読み取りマッピングが、実際に、そのステムーループ部分の近くに整列し、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５１ａの正準成熟形態の５’部分との配列類似性を示すことが見出された。
【０１１３】
ブロッキングオリゴヌクレオチドを単一ブロッキング反応に組み合わせる能力は、選択された一連のｍｉＲＮＡの減少を可能にするであろう。ｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐとｈｓａ−ｍｉＲ−４５１ａを標的とするブロッキングオリゴヌクレオチドを、単一ブロッキング反応に組み合わせた。この組み合わせは、単離されたときに取るような、両方のブロッキングオリゴヌクレオチドの挙動をもたらした（図７Ｃ及びＤ）。単一のブロッカー実験に基づいて変化すると予想されたｍｉＲＮＡ以外に、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０３−５ｐだけが、わずかな倍率変化を伴ってではあるが有意に下方調節された。ｈｓａ−ｍｉＲ−５０３−５ｐは、５’末端上でｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐと同一の配列の７つの塩基を共有する。ブロッキングオリゴヌクレオチドの組み合わせは、総ライブラリー産出に対する認識可能な効果を有しなかった。総括的に、複数のブロッキングオリゴヌクレオチドを組み合わせることは、実行可能な方策であると考えられる。ブロッキングオリゴヌクレオチドが多重化され得る程度は、今後の研究の主題である。
【０１１４】
考察
ヒト血清または血漿からのＮＧＳデータセット中の高度に豊富で、かつおそらくほんのわずかに有益であるｍｉＲＮＡは、バイオマーカーとして機能する真に低分子のＲＮＡ種を発見する能力を妨げる。この問題は、シークエンシングライブラリーにおける提示からｍｉＲＮＡをブロックする方法を実証することによって改善されている。この方法は、安価な試薬を使用し、さらなる浄化ステップを必要としない。ヒト血漿試料における本方法の適用は、豊富な血液細胞汚染物質であるｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐの強力なブロッキングをもたらした。
【０１１５】
このブロッキングの結果として、少量のｍｉＲＮＡの読みの深さが劇的に増加し、大量の種の検出及び差次的発現のより正確な測定をもたらした。的外れ効果は、特に、ｍｉＲＮＡファミリーメンバー内のｍｉＲＮＡの標的末端、この場合、５’末端における配列相同性に基づいて生じる。しかしながら、これらの的外れ効果は、限定され、かつ予測可能である。本方法は、少量のｍｉＲＮＡの測定の再現性を減少せず、差次的発現の測定に対して悪影響を有しない。
【０１１６】
本アプローチは、第２のｍｉＲＮＡ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５１ａを標的とすることによって一般化されている。再度、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５１ａに対するブロッキング方法の性能は、特異的であり、非標的種に対して非常にわずかな効果を有する。さらに、１つのブロッキングライゲーション反応においてｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐ及びｈｓａ−ｍｉＲ−４５１ａを標的とする２つのブロッキングオリゴヌクレオチドの組み合わせは、別個にそれぞれ１つで見られ、かつ一切の相互作用効果がない状態で同じ結果を生成した。この結果は、いくつかのブロッキングオリゴヌクレオチドを組み合わせて単一の反応にする能力を呈するが、引き続き試験が行われる。
【０１１７】
この技術は、リボソームＲＮＡ及びグロビンＲＮＡの低下方法が伝令ＲＮＡシークエンシングにおいて有するものと同様の低分子ＲＮＡシークエンシングにおいて役割を果たし得ることが予想される。この研究はヒト血漿試料中の低分子ＲＮＡシークエンシングに焦点を合わせるが、本方法は、他の組織タイプでも有用であり得る。ブロッキングオリゴヌクレオチドのカスタムプールは、特定の適用に適合されて、シークエンシング源の使用を最大限にし得る。また、たとえ、実験がＩｌｌｕｍｉｎａプラットホームの使用に焦点を合わせたとしても、ライブラリー生成方法が直接的に低分子ＲＮＡに対するアダプターのライゲーションに依存する限り、この方法が他のプラットホームに適用可能であることが予想される。対象となる低分子ＲＮＡがほとんど発現されず、かつ低度に発現されると予想されるとき、多くの適用において事実である可能性があるように、本方法は、それらを正確に測定するための堅調かつ費用対効果のある方法を供する。
【０１１８】
補足方法
概要
このプロトコルは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ及びＧＡＩＩプラットホームにおけるシークエンシングに好適な総ＲＮＡ試料からのｍｉＲＮＡの多重化された（バーコード付けた）ライブラリーの調製を記載する。総ＲＮＡは、短いＲＮＡ種（１５ｎｔ〜２５ｎｔ）を捕捉する技術によって調製される必要がある。許容可能な技術は、フェノール−クロロホルムの摘出であり、その後、とりわけエタノール沈殿またはＮｏｒＧｅｎカラムが続く。試料中のマイクロＲＮＡ種は、それらの３’末端にライゲートされたアダプターオリゴ（３’アダプターと称される）を有する。次に、異なるオリゴ（５’アダプターと称される）が５’末端にライゲートされる。３’アダプターは、相補的なＲＴプライマーの結合部位を提供する。これは、ｃＤＮＡが逆転写を介してｍｉＲＮＡ−アダプター複合体から作製されることを可能にする。次いで、ｃＤＮＡは、複数回のＰＣＲのためのテンプレートとして使用される。ＰＣＲプライマーは、生成物の長さに伸長する長い尾部（約３０ｎｔ）を有する。尾部は、バーコード配列（指数読み取りプライマー結合部位を有する）、Ｉｌｌｕｍｉｎａシークエンシングプライマー部位、及びＩｌｌｕｍｉｎａクラスター生成配列を含む。
【０１１９】
考慮点
第１のステップである３’ライゲーションは、おそらく、プロトコルにおいて最も重要なステップである。それは、先端を切断した形態のＴ４  ＲＮＡリガーゼの使用に依る。先端の切断は、エネルギーのためのＡＴＰを使用できなくなる酵素を与え、代わりに既にアデニル化されたオリゴを基質として使用する必要がある。それ故に、３’アダプターオリゴは、その３’末端でアデニル化される。ＡＴＰを用いることができる完全に機能するＲＮＡリガーゼがこのステップにおいて使用される場合、それは、アダプターを標的ＲＮＡ種のみにライゲーションする代わりに、存在する様々なＲＮＡ種をコンカテマー中にライゲーションするであろう。しかしながら、ｍｉＲＮＡだけでなく全てのＲＮＡ種が標的であり、これが、多くの意図的でないライゲーション生成物の形成をもたらすことを理解されたい。これらの生成物がシークエンシング前に除去される必要があるだけでなく、他のＲＮＡ種がアダプターをｍｉＲＮＡ集団から引き離すべきである。直接計算することは難しいが、実際に３’アダプターにライゲートされるｍｉＲＮＡのパーセントに関して、存在するｍｉＲＮＡのライゲーションの効果的な有効性は、低くなる可能性が高い。３’アダプターはまた、その５’末端で３−炭素スペーサーを有する。これは、ＲＮＡが、完全長Ｔ４  ＲＮＡリガーゼを使用するその後の５’ライゲーション反応においてその５’末端にライゲーションするのを防ぐためである。
【０１２０】
試料中に存在するｍｉＲＮＡ以外のＲＮＡ分子がライゲートされるときに生じる意図的でないライゲーション生成物は、多少なりとも問題であるが、このプロトコルで形成される最も問題である生成物は、ライゲートされていない３’アダプターが、５’アダプターにライゲートされて第２のライゲーションステップにおいてアダプター二量体を形成するときに生じる。
【０１２１】
これは、ＰＣＲ後に意図的なｍｉＲＮＡライゲーション生成物に対して高度に相補的である短い生成物を形成する。実際には、それらは、ｍｉＲＮＡの内部の約２２ｂｐが異なるだけである。アダプター二量体は、意図的なｍｉＲＮＡ生成物に効率的にハイブリダイズし、２つの分離を困難にするであろう。この問題は、ＲＴプライマーを３’ライゲーション生成物にハイブリダイズすることによって多少なりとも助けられる。ＲＴプライマーが３’アダプターの全体長さに対して相補的であるため、ハイブリダイゼーションは、ライゲートされていない３’アダプターのいくつかに結合する役割を果たし、これは、５’ライゲーション反応においてアダプター二量体の形成を防ぐ。この技術は、アダプター二量体の形成を軽減する一方で、依然として多くが残存し、ＰＣＲ後に存在する。それは、ゲル電気泳動によって意図的な生成物から分離される必要がある。しかしながら、アダプター二量体と意図的なｍｉＲＮＡ生成物との間の強力なハイブリダイゼーションにより、ゲルは、極端に変性する条件下で実行されるべきである。これを達成するために、１０％アクリルアミドＴＢＥ−Ｕｒｅａゲルが使用される。さらに、ゲルは、事前に加熱した緩衝液（９０℃）中で実行される。熱いゲルを実行するのは不便ではあるが、この研究は、室温で実行された１０％アクリルアミドＴＢＥ−Ｕｒｅａゲルが、この適用に対して十分に変性していないことを示した。
【０１２２】
詳細な手順
一般留意事項
複数の成分が反応に付加されるこれらのステップに関して、最良の実践は、行われる全ての反応に十分な成分の「マスター混合物」を作製することである。プロトコルの間中、試料は、インキュベートしない場合、常に氷上、または氷温度で保持されるべきである。このプロトコルを確立する上で、試料を使用しない場合、冷蔵庫内で冷えた状態に保たれた金属ブロック内で保持した。（しかしながら、プロトコルでは、簡潔にするため「氷上に」と述べる）さらに、先端を切断したＴ４  ＲＮＡリガーゼ２；ＲＮＡｓｅ阻害剤、マウス；Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ１、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ；及びＰｈｕｓｉｏｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘは全て氷上で保持されるべきである。以下のステップにおいて、「停止点」は、プロトコルが一晩で停止され得る点に記載される。このプロトコルは、３日以内に完了され得る。−３０℃で一晩のインキュベーションの沈殿が−８０℃での２時間のインキュベーションに短縮される場合、プロトコルは、２日以内に完了され得る。
【０１２３】
３’ライゲーション
１．「２Ｘ３’ライゲーション緩衝液」と呼ばれる以下の保存緩衝液を調製する。この処方は、多くの反応に対して十分であり、プロトコルが実行される度に新しく調製する必要がない。使用の合間、−２０℃で保存する。
２５０μＬの５０％ＰＥＧ８０００（Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ１キットから）
２００μＬの１０Ｘ  Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ緩衝液（Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ１キットから）、５５０μＬのＤＮＡｓｅ、ＲＮＡｓｅ遊離水
２．スパイクイン対照の保存溶液を作製する。このプロトコルの複数の実行に好適な大量のバッチを作製する。−８０℃で保存する。ここに列挙される濃度は、ヒト血漿試料に好適である。しかしながら、スパイクインの総インプット量は異なる試料タイプに対して調節される必要があることが予想される。
最終濃度：
２０ｐＭのｍｉＲＮＡＳｅｑマルチプレックス、２２ｂｐのスパイクイン、２ｐＭのｍｉＲＮＡＳｅｑマルチプレックス、２５ｂｐのスパイクイン、
０．２ｐＭのｍｉＲＮＡＳｅｑマルチプレックス、２０ｂｐのスパイクイン
３．０．２ｍＬのＰＣＲ管内で以下を組み合わせる。
１μＬの１０ｕＭ  ｍｉＲＮＡＳｅｑマルチプレックス３’アダプター、１μＬのスパイクイン保存液（ステップ２から）
４μＬの総ＲＮＡ
４．管を少し動かすことによってゆっくりと混合し、テーブル上の小型遠心分離機内で管を回転沈殿させる。事前に加熱した熱サイクル装置内で、７０℃で２分間インキュベートする。インキュベーション後、氷上ですぐに冷やす。
５．各試料に以下の１０μＬの２Ｘ  ３’ライゲーション緩衝液、
２μＬのＴ４  ＲＮＡリガーゼ２、先端を切断した１μＬのＲＮＡｓｅ阻害剤、マウスを付加する。
６．成分をゆっくりと混合し、回転沈殿する。熱サイクル装置内で、２５℃で１時間インキュベートする。（留意点：１時間より長いインキュベーション時間により、不要な生成物が生成されることが示された。）
ブロッキングライゲーション
１．ブロッキングオリゴヌクレオチドを事前にアニールする（これを毎回行う）。以下の通り、１ＸＴ４  ＤＮＡリガーゼ緩衝液中で０．５μＭのブロッキングオリゴヌクレオチド保存液をインキュベートする。
９５℃で５分間、６５℃で５分間、５５℃で５分間、４５℃で５分間、３５℃で５分間、２５℃で５分間、４℃で無限
２．以下のマスター混合物を作製する。
１μＬの事前にアニールしたブロッキングオリゴヌクレオチドの希釈保存液、１μＬの１０ｍＭ  ＡＴＰ
１μＬのＴ４  ＤＮＡリガーゼ
３．３μＬの上記のマスター混合物を各３’ライゲーション反応に付加する。
４．３０℃で１時間、続いて、６５℃で１０分間インキュベートし、４℃に保つ。
【０１２４】
ＲＴプライマーハイブリダイゼーション、及び５’ライゲーション
１．３’ライゲーション生成物に、１μＬの１０ｕＭ  ｍｉＲＮＡＳｅｑマルチプレックスＲＴプライマーを付加する。以下の通り、熱サイクル装置内でインキュベートする。
７５℃で５分間、３７℃で３０分間、２５℃で１５分間、４℃で無限
２．試料をインキュベートしている間、２０ｕＭのｍｉＲＮＡＳｅｑマルチプレックス５’アダプターを解凍する。解凍すると、アダプターを７０℃で２分間インキュベートし、次いで、氷上ですぐに冷やす。
３．４  ５’アダプターのプールを次のステップで使用する。これらは、２０ｕＭの総アダプター濃度に対して、各々５ｕＭの最終濃度における、ｍｉＲＮＡＳｅｑマルチプレックス５’アダプターＭｏｄ１、２、３、及び４の等モルの混合物である。
４．試料のインキュベートが終了すると、それらを氷に移す。以下を付加する。
０．６４μＬのＴ４  ＲＮＡリガーゼ１
１μＬのＲＮＡｓｅ阻害剤、マウス
０．８６μＬのＲＮＡｓｅ、ＤＮＡｓｅ遊離水
１μＬの２０ｕＭ  ｍｉＲＮＡＳｅｑマルチプレックス５’アダプターＭｏｄプール、１μＬの１０Ｘ  Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ緩衝液（Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ１キット）、１μＬの１０ｍＭ  ＡＴＰ（Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ１キット）
５．ゆっくりと混合し、簡単に回転沈殿する。熱サイクル装置内で、試料を２５℃で１時間インキュベートする。停止点（試料をこのステップの後−８０℃内に配置し、一晩放置してよいが、停止前に試料を逆転写にかけるのが理想である）
【０１２５】
逆転写及びＰＣＲ
１．以下の反応を準備する。この時点までにプロトコルは、約２６．５μＬのライゲートされた生成物を生成した。１１μＬの生成物だけを先に進め、残りは、反復が必要な場合に利用できるようにした。未使用の生成物は、−８０℃で保存する必要がある。
４μＬの５Ｘ  ＦＳ緩衝液（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩキット）、２μＬの０．１Ｍ  ＤＴＴ（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩキット）
１μＬのデオキシヌクレオチド混合物（各１０ｍＭ）、１μＬのＲＮＡｓｅ阻害剤、マウス
１μＬのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩキット）
１１μＬのライゲーション生成物（前のステップから）
２．熱サイクル装置内で、試料を以下の通りインキュベートする：４２℃で５０分間
７０℃で１５分間、４℃で無限
３．以下を各試料に付加する：
２５μＬのＰｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ
２．５μＬの２０ｕＭ  ｍｉＲＮＡＳｅｑマルチプレックスＲプライマー
各々の個別試料に、２．５μＬの１２個の異なる指標をつけたｍｉＲＮＡＳｅｑマルチプレックスＦプライマーのうちの１つを２０ｕＭで付加し、どの試料がどのバーコード付けしたプライマーを受けたのか必ず記録する。試料を混合し、回転沈殿する。
４．熱サイクル装置内で、試料を以下の通りインキュベートする：９４℃で３０秒間、
９４℃で１０秒間、７２℃で４５秒間の１５サイクル、
６５℃で５分間、４℃で無限
【０１２６】
停止点（試料を−２０℃で保存してよい）、濃度、ゲル分離、及び精製
このプロトコルで実行されるゲルは、ＢｉｏＲａｄからのＭｉｎｉ−ＰＲＯＴＥＡＮ形式であり、Ｍｉｎｉ−ＰＲＯＴＥＡＮ  Ｔｅｔｒａ  Ｃｅｌｌゲルシステムで実行される。異なるゲルシステムを用いることにより、このプロトコルのために広範囲にわたって修正されることが必要になることが予想される。
１．各試料を１．７ｍＬの微量遠心管に移す。２５０μＬの緩衝液ＰＢを付加する（ＭｉｎＥｌｕｔｅキット）。よく混合して、２ｍＬの収集管内に配置されたＭｉｎＥｌｕｔｅカラムに移す。最大速度で１分間遠心分離する。素通り画分を廃棄する。
２．７５０μＬの緩衝液ＰＥ（ＭｉｎＥｌｕｔｅキット、エタノールを確実に付加する）をＭｉｎＥｌｕｔｅカラムに付加する。最大速度で１分間遠心分離する。素通り画分を廃棄し、カラムを同じ収集管内に戻して配置する。再度、最大速度で１分間遠心分離する。
３．カラムを清潔な１．７ｍＬの微量遠心管に移す。１７．５μＬのＲＮＡｓｅ、ＤＮＡｓｅ遊離水を付加する。５分間静置させ、最大速度で１分間遠心分離する。微量遠心管内に素通り画分を保持して、カラムを廃棄する。
４．１７．５μＬの２Ｘ  ＴＢＥ−Ｕｒｅａ試料緩衝液を各試料に付加する。よく混合し、回転沈殿する。試料を室温で置いておく。
５．ＤＮＡ段階希釈溶液を調製する。この処方により、いくつかの実行に対して十分に作製され、新しく調製する必要がない。４℃で保存する。
２０ｂｐの段階
２００μＬの２Ｘ  ＴＢＥ−尿素試料緩衝液、１８０μＬのＤＮＡｓｅ、ＲＮＡｓｅ遊離水
２０μＬの２０ｂｐ  ＤＮＡ段階保存溶液（Ｂａｙｏｕ  ＢｉｏＬａｂｓ）
１００ｂｐの段階
２００μＬの２Ｘ  ＴＢＥ−Ｕｒｅａ試料緩衝液、１９０μＬのＤＮＡｓｅ、ＲＮＡｓｅ遊離水
１０μＬの１００ｂｐ  ＤＮＡ段階保存溶液（ＮＥＢ）
６．プロトコルのこの時点で、熱いゲルを実行する。これは、沸点近傍のＴＢＥ緩衝液を用いることを伴うため、非常に慎重になるべきである。さらに、エプロン及び手袋などの保護用品を着用すべきである。
７．加熱ブロックを９５℃に事前加熱する。
８．１０Ｘ  ＴＢＥ緩衝保存液から１Ｘ  ＴＢＥ緩衝液を作製する。１つまたは２つのゲルに十分な１リットルを作製する。単一のゲルは、試料間にスペーサーレーンを伴わず４つの試料を収容し得る。各試料を分割し、２つのレーンで実行して、アダプター二量体からの干渉を避ける。同時に２つを超えるゲルを実行するのは推奨されない。
９．熱い水道水（蛇口から出てくる水より熱くない）で１０％ＴＢＥ−Ｕｒｅａ  Ｍｉｎｉ−ＰＲＯＴＥＡＮゲル（複数可）を事前に温める。それらを包装内に入れたままにし、浮かんでこないように重みで押し下げる。また、ゲルの入れ物を水中で温める。
１０．電子レンジで、２つの５００ｍＬのＰｙｒｅｘビーカー内の４５０ｍＬの分割量に分割した９００ｍＬの１Ｘ  ＴＢＥ緩衝液を、上部を部分的にサランラップ（登録商標）で覆って８０〜８５℃に加熱する。２〜５分間で熱増加する（電子レンジの出力に応じる）。熱増加の間で、温度計を用いて緩衝液を慎重に攪拌し、温度を確認する。緩衝液を沸騰させない。
１１．緩衝液の加熱が完了間近になると、試料を９５℃で事前に加熱した加熱ブロック内に配置する。また、２０ｂｐ及び１００ｂｐの希釈溶液を加熱ブロック内に配置する。全ての試料を、ゲル上に投入する少なくとも２分前に、９５℃の状態に確実にする。試料を加熱ブロック内に２分間超〜最大約３０分間残すのは有害ではない。
１２．ゲル及びゲルの入れ物を温水から取り出す。ゲルをそれらの包装から取り出し、ゲルの底及びレーンコームの緑色のテープを確実に除去する。ゲルの入れ物内でゲルを集める。
１３．この時点で熱い１Ｘ  ＴＢＥ緩衝液（８０〜８５℃）をゲル集合体に注ぎ、上まで充填する。
１４．ｐ２０を１５μＬに設定して、各ウェルのゲル内で、ピペットで吸入及び排出する。これにより、保存中ウェル中で結晶化する場合がある尿素を一切除去する。ウェル中の気泡を一切除去する。
１５．２つの段階管を取り出す（それらは熱いため慎重に）。テーブル上の小型遠心分離機でそれらを簡単に回転沈殿する。他のレーンを汚染するのを避けるように慎重にピペットで滴下して、１５μＬの２０ｂｐの段階をレーン１のゲルに付加する。管は、開放したときに「ポン」と鳴る場合がある。１５μＬの１００ｂｐの段階をレーン２に付加する。
１６．１対の試料管を加熱ブロックから取り出す。テーブル上の小型遠心分離機でそれらを簡単に回転沈殿する。２つの１５μＬの分割量の各試料を２つの隣接するゲルのレーン中に投入する。試料の全てに対して繰り返す。ゲルが冷えるため素早く、しかし慎重にかつ留意して作業する。
１７．全ての試料を投入すると、ゲル集合体をゲルボックス内にゆっくりと配置する。残りの１Ｘ  ＴＢＥ緩衝液を電子レンジ内で９０℃に再加熱する。残り全ての１Ｘ  ＴＢＥをゲルボックス内に注ぐ（ゲル集合体の内部ではない）。
１８．１０ｍＬピペットで滴下しながら、可能な限り上まで充填するように、ゲルボックス内の緩衝液でゲル集合体の内部に緩衝液を満たす。熱い緩衝液は実行している間に蒸発するため、これは重要である。
１９．ゲルを２００Ｖで実行開始する。電流を注視する。電流が最初の電流から１０ｍＡを超えて上昇し始める場合（これは、発生する可能性が高い）、１０Ｖ〜１９０Ｖまで電圧を下げる。電流を監視し続け、電流が安定するまで電圧をより低く調節する。しかしながら、ゲルを１６０Ｖ未満で実行しない。ゲル及び緩衝液が熱いため、電流は上昇する。システムの伝導性は、室温で実行するときよりはるかに高くなる。増加した伝導性により、より多くの電流が流れ、同様に、ゲルを加熱し、伝導性がさらに増加し、正のフィードバックループの形成が可能になる。それ故に、実行中、電流を注視することが必要である。これらの条件下で、ゲルを４５分間実行するべきである。
２０．電源を切って、ゲルボックスを分解する。プラスチックケースを開ける前に、ベンチトップ上でゲルを冷却する。ゲルを冷却している間、各ゲルに関して、５０ｍＬの１Ｘ  ＴＢＥを好適にサイズ決めされたゲル染色容器に付加する。５μＬのＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ  １０，０００Ｘ保存液を各５０ｍＬのＴＢＥ分割量に付加し、混合する。容器をアルミニウムホイル内に包み、光から保護する。現状冷却したゲルのプラスチックケースを開け、ゲルをＴＢＥ及びＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄを有する染色容器内に配置する。容器をアルミニウムホイルで再度覆い、１０分間ゲル振動装置で振動させる。
２１．ゲルを染色している間、各試料に関して以下を調製する。２０ゲージ針を用いて、０．５ｍＬの微量遠心管の底を突いて穴を開ける。この管を１．７ｍＬの遠心分離管内に配置する。
２２．ＵＶ徹照器に１枚のサランラップを配置する。ゲルを染色溶液からサランラップシート上に移す。適切なゲル可視化システム（すなわち、ＵＶＰ  ＥＣ３撮像システム）を用いて、ＵＶ照明下でゲルの画像を捕捉する。
２３．サランラップを拾い上げることによって、後のゲル切除ステップで利用可能であるＵＶ徹照器（恐らく、撮像したステップと同じ）にゲルを移す。カミソリ刃及び鉗子を用いて、各試料に関して１３５ｂｐのバンドを慎重に切除する。各試料を隣接するレーンに２つの分割量で投入してから、同じ試料からの両方のバンドを切り離す。カミソリ刃及び鉗子を、それらがゲルに触れる度に取り替えて、相互汚染を避ける。ゲル断片を底に穴が開いた０．５ｍＬの微量遠心管内に配置する。
２４．ゲル切片を含む１．７ｍＬの微量遠心管内に入れ子にされた０．５ｍＬの微量遠心管を微量遠心機に移す。最大速度で１分間回転させる。ゲル断片は、１．７ｍＬの微量遠心管の底に小切片の状態であるはずである。ゲル断片のいくつかが０．５ｍＬの管内に残っている場合、最大速度でさらに１分間回転させる。
２５．「浸漬溶液」と呼ばれる以下の保存液を調製する。この処方により、多くの試料に対して十分に作製され、毎回新しく調製する必要はない。室温で保存する。
２ｍＬの５Ｍ  酢酸アンモニウム、２ｍＬの１％ＳＤＳ溶液
４μＬの０．５Ｍ  ＥＤＴＡ
１６ｍＬのＲＮＡｓｅ、ＤＮＡｓｅ遊離水
２６．３００μＬの浸漬溶液を各試料に付加する。攪拌しながら、７０℃で２時間インキュベートする。
２７．各試料（ゲル切片を含む）を回転Ｘ遠心分離管ろ過装置の０．２２ｕＭの酢酸セルロースに移し、その付随する微量遠心管内に置いておく。微量遠心機内で、最大速度で１分間回転させる。
２８．素通り画分を新しい１．７ｍＬの微量遠心管に移す。１μＬの１０ｕｇ／μＬグリコーゲンを付加する。３００μＬの１００％イソプロパノールを付加する。簡単にボルテックス及び回転沈殿する。−３０℃で一晩インキュベートする。停止点（試料を−３℃で数日間沈殿条件に保ってよい。）
２９．冷蔵遠心分離機（４℃）で２０分間、１４，０００ｒｐｍ（最大速度）で試料を回転させる。再度、管の蝶番を、ペレットの位置が予測可能になるように外方向に配置する。
３０．試料を遠心分離している間、氷水に配置することによって、または他のいくつかの好適な方法によって８０％エタノールの分割量を冷やす。
３１．遠心分離後、上清をピペットで取り除く。ｐ２００を用いて、ピペットの先端部を管の底の近くに蝶番から離して配置し、液体をゆっくりと除去する。１００μＬの冷えた８０％エタノールを付加し、冷蔵遠心分離機（４Ｃ）で１０分間、１４，０００ｒｐｍ（最大速度）で再度遠心分離する。
３２．上に記載されるように、ｐ２００を用いて上清を再度慎重に除去する。ｐ２００を用いて可能な限り多く除去した後、ｐ２０を使用して残りを取り、可能な限り残りの液体が少なくなるようにする。
３３．１０μＬのＥＢ緩衝液（ＭｉｎＥｌｕｔｅキット）中でペレットを再懸濁する。好適な方法（１μＬの試料インプット量を有するＱＢｉｔ  ＨＳ  ＤＮＡが好ましい）を用いて、試料の濃度を測定する。試料をシークエンシングのために準備する。典型的には、このプロトコルは、試料のインプット質量及び試料タイプに応じて１０μＬの１〜４ｎｇ／μＬ生成物を産出する。それは多重化レベルに応じるが、０．５ｎｇ／μＬ以上のライブラリーをシークエンシングのために十分に濃縮する。より低い産出が予想される場合、より高い濃度の生成物を産出するように、より低い体積でペレットを再懸濁してよい。
ＫＡＰＡ  ｑＰＣＲを実行して、シークエンシング前にライブラリー濃度を定量化することが強く推奨される。
【０１２７】
参考文献
１．Ｉｖｅｙ，Ｋ．Ｎ．ａｎｄ  Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ，Ｄ．（２０１０）ＭｉｃｒｏＲＮＡｓ  ａｓ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ  ｆａｔｅ  ｄｅｃｉｓｉｏｎｓ．Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ，７，３６−４１．２．Ｈｕ，Ｈ．ａｎｄ  Ｇａｔｔｉ，Ｒ．ａ．（２０１１）ＭｉｃｒｏＲＮＡｓ：ｎｅｗ  ｐｌａｙｅｒｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＤＮＡ  ｄａｍａｇｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，３，１５１−１５８．３．Ｃａｒｌｅｔｏｎ，Ｍ．，Ｃｌｅａｒｙ，Ｍ．Ａ．ａｎｄ  Ｌｉｎｓｌｅｙ，Ｐ．Ｓ．（２００７）ＭｉｃｒｏＲＮＡｓ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ  Ｃｙｃｌｅ，６，２１２７−２１３２．４．Ｗｉｌｓｏｎ，Ｒ．Ｃ．ａｎｄ  Ｄｏｕｄｎａ，Ｊ．Ａ．（２０１３）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，４２，２１７−２３９．５．Ｆａｂｂｒｉ，Ｍ．，Ｐａｏｎｅ，Ａ．，Ｃａｌｏｒｅ，Ｆ．，Ｇａｌｌｉ，Ｒ．，Ｇａｕｄｉｏ，Ｅ．ａｎｄ  Ｓａｎｔｈａｎａｍ，Ｒ．（２０１２）ＭｉｃｒｏＲＮＡｓ  ｂｉｎｄ  ｔｏ  Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｔｏ  ｉｎｄｕｃｅ  ｐｒｏｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１０９，Ｅ２１１０−Ｅ２１１６．６．Ｐｌａｃｅ，Ｒ．Ｆ．，Ｌｉ，Ｌ．−Ｃ．，Ｐｏｏｋｏｔ，Ｄ．，Ｎｏｏｎａｎ，Ｅ．Ｊ．ａｎｄ  Ｄａｈｉｙａ，Ｒ．（２００８）ＭｉｃｒｏＲＮＡ−３７３  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅｓ  ｗｉｔｈ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１０５，１６０８−１６１３．７．Ｄｕｍｏｒｔｉｅｒ，Ｏ．，Ｈｉｎａｕｌｔ，Ｃ．ａｎｄ  Ｖａｎ  Ｏｂｂｅｒｇｈｅｎ，Ｅ．（２０１３）ＭｉｃｒｏＲＮＡｓ  ａｎｄ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｃｒｏｓｓｔａｌｋ  ｉｎ  ｅｎｅｒｇｙ  ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ．Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔａｂ．，１８，３１２−３２４．８．Ｊｉｎ，Ｙ．，Ｙａｎｇ，Ｃ．−Ｊ．，Ｘｕ，Ｘ．，Ｃａｏ，Ｊ．−Ｎ．，Ｆｅｎｇ，Ｑ．−Ｔ．ａｎｄ  Ｙａｎｇ，Ｊ．（２０１５）ＭｉＲ−２１４  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｔｈｅ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｃｏｒｏｎａｒｙ  ａｒｔｅｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｂｙ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ＶＥＧＦ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，４０２，１１１−１２２．９．Ｓａｎｔａ−ｍａｒｉａ，Ｉ．，Ａｌａｎｉｚ，Ｍ．Ｅ．，Ｒｅｎｗｉｃｋ，Ｎ．，Ｃｅｌａ，Ｃ．，Ｆｕｌｇａ，Ｔ．ａ，Ｖａｎ  Ｖａｃｔｏｒ，Ｄ，Ｔｕｓｃｈｌ，Ｔ．，Ｃｌａｒｋ，Ｌ．Ｎ．，Ｓｈｅｌａｎｓｋｉ，Ｍ．Ｌ．，Ｍｃｃａｂｅ，Ｂ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｄｙｓｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ−２１９  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔａｕ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１２５，６８１−６８���．１０．Ｈｅｎｅｇｈａｎ，Ｈ．Ｍ．，Ｍｉｌｌｅｒ，Ｎ．，ＭｃＡｎｅｎａ，Ｏ．Ｊ．，Ｏ’Ｂｒｉｅｎ，Ｔ．ａｎｄ  Ｋｅｒｉｎ，Ｍ．Ｊ．（２０１１）Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｍｉＲＮＡ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｏｍｅｎｔａｌ  ａｄｉｐｏｓｅ  ｔｉｓｓｕｅ  ａｎｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｂｅｓｅ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  ｎｏｖｅｌ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．，９６，８４６−８５０．１１．Ｍａｌｌ，Ｃ．，Ｒｏｃｋｅ，Ｄ．Ｍ．，Ｄｕｒｂｉｎ−Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｂ．ａｎｄ  Ｗｅｉｓｓ，Ｒ．Ｈ．（２０１３）Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｍｉＲＮＡ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｕｒｉｎｅ  ｓｕｐｐｏｒｔｓ  ｉｔｓ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ．Ｂｉｏｍａｒｋ  Ｍｅｄ．，７，１−１７．１２．Ｗａｎｇ，Ｋ．，Ｚｈａｎｇ，Ｓ．，Ｗｅｂｅｒ，Ｊ．，Ｂａｘｔｅｒ，Ｄ．ａｎｄ  Ｇａｌａｓ，Ｄ．Ｊ．（２０１０）Ｅｘｐｏｒｔ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ  ａｎｄ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ−ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｙ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３８，７２４８−７２５９．１３．Ｔｕｒｃｈｉｎｏｖｉｃｈ，Ａ．，Ｗｅｉｚ，Ｌ．，Ｌａｎｇｈｅｉｎｚ，Ａ．ａｎｄ  Ｂｕｒｗｉｎｋｅｌ，Ｂ．（２０１１）Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３９，７２２３−７２３３．１４．Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，Ｐ．Ｓ．，Ｐａｒｋｉｎ，Ｒ．Ｋ．，Ｋｒｏｈ，Ｅ．Ｍ．，Ｆｒｉｔｚ，Ｂ．Ｒ．，Ｗｙｍａｎ，Ｓ．Ｋ．，Ｐｏｇｏｓｏｖａ−Ａｇａｄｊａｎｙａｎ，Ｅ．Ｌ．，Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ａ．，Ｎｏｔｅｂｏｏｍ，Ｊ．，Ｏ’Ｂｒｉａｎｔ，Ｋ．Ｃ．，Ａｌｌｅｎ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ  ａｓ  ｓｔａｂｌｅ  ｂｌｏｏｄ−ｂａｓｅｄ  ｍａｒｋｅｒｓ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１０５，１０５１３−１０５１８．１５．Ｗｅｂｅｒ，Ｊ．，Ｂａｘｔｅｒ，Ｄ．Ｈ．，Ｚｈａｎｇ，Ｓ．，Ｈｕａｎｇ，Ｄ．Ｙ．，Ｈｕａｎｇ，Ｋ．Ｈ．，Ｌｅｅ，Ｍ．Ｊ．，Ｇａｌａｓ，Ｄ．Ｊ．ａｎｄ  Ｗａｎｇ，Ｋ．（２０１０）Ｔｈｅ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ｓｐｅｃｔｒｕｍ  ｉｎ  １２  ｂｏｄｙ  ｆｌｕｉｄｓ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，５６，１７３３−１７４１．１６．Ａｒｒｏｙｏ，Ｊ．Ｄ．，Ｃｈｅｖｉｌｌｅｔ，Ｊ．Ｒ．，Ｋｒｏｈ，Ｅ．Ｍ．，Ｒｕｆ，Ｉ．Ｋ．，Ｐｒｉｔｃｈａｒｄ，Ｃ．Ｃ．，Ｇｉｂｓｏｎ，Ｄ．Ｆ．，Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，Ｐ．Ｓ．，Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｃ．Ｆ．，Ｐｏｇｏｓｏｖａ−Ａｇａｄｊａｎｙａｎ，Ｅ．Ｌ．，Ｓｔｉｒｅｗａｌｔ，Ｄ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ａｒｇｏｎａｕｔｅ２  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ  ｃａｒｒｙ  ａ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｏｆ  ｖｅｓｉｃｌｅｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｐｌａｓｍａ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１０８，５００３−５００８．１７．Ｔｏｉｙａｍａ，Ｙ．，Ｏｋｕｇａｗａ，Ｙ．ａｎｄ  Ｇｏｅｌ，Ａ．（２０１４）ＤＮＡ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｉｃｒｏｒｎａ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  ｆｏｒ  ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇａｓｔｒｉｃ  ａｎｄ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，４５５，４３−５７．１８．Ｘｕ，Ｌ．，Ｌｉ，Ｍ．，Ｗａｎｇ，Ｍ．，Ｙａｎ，Ｄ．，Ｆｅｎｇ，Ｇ．ａｎｄ  Ａｎ，Ｇ．（２０１４）Ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ−３７５  ｉｎ  ｐｌａｓｍａ  ａｎｄ  ｔｉｓｓｕｅ  ｉｓ  ｍａｔｃｈｅｄ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ．ＢＭＣ  Ｃａｎｃｅｒ，１４，７１４．１９．Ｓｃｈｒａｕｄｅｒ，Ｍ．Ｇ．，Ｓｔｒｉｃｋ，Ｒ．，Ｓｃｈｕｌｚ−Ｗｅｎｄｔｌａｎｄ，Ｒ．，Ｓｔｒｉｓｓｅｌ，Ｐ．Ｌ．，Ｋａｈｍａｎｎ，Ｌ．，Ｌｏｅｈｂｅｒｇ，Ｃ．Ｒ．，Ｌｕｘ，Ｍ．Ｐ．，Ｊｕｄ，Ｓ．Ｍ．，Ｈａｒｔｍａｎｎ，Ａ．，Ｈｅｉｎ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｍｉｃｒｏ−ＲＮＡｓ  ａｓ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｂｌｏｏｄ−ｂａｓｅｄ  ｍａｒｋｅｒｓ  ｆｏｒ  ｅａｒｌｙ  ｓｔａｇｅ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，７，ｅ２９７７０．２０．Ｈｅｎｅｇｈａｎ，Ｈ．Ｍ．，Ｍｉｌｌｅｒ，Ｎ．，Ｌｏｗｅｒｙ，Ａ．Ｊ．，Ｓｗｅｅｎｅｙ，Ｋ．Ｊ．，Ｎｅｗｅｌｌ，Ｊ．ａｎｄ  Ｋｅｒｉｎ，Ｍ．Ｊ．（２０１０）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ  ａｓ  ｎｏｖｅｌ  ｍｉｎｉｍａｌｌｙ  ｉｎｖａｓｉｖｅ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  ｆｏｒ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ．Ａｎｎ．Ｓｕｒｇ．，２５１，４９９−５０５．２１．Ｚｈｏｕ，Ｗ．，Ｆｏｎｇ，Ｍ．Ｙ．，Ｍｉｎ，Ｙ．，Ｓｏｍｌｏ，Ｇ．，Ｌｉｕ，Ｌ．，Ｐａｌｏｍａｒｅｓ，Ｍ．Ｒ．，Ｙｕ，Ｙ．，Ｃｈｏｗ，Ａ．，Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ，Ｓ．Ｔ．Ｆ．，Ｃｈｉｎ，Ａ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｃａｎｃｅｒ−Ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｍｉＲ−１０５  ｄｅｓｔｒｏｙｓ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｂａｒｒｉｅｒｓ  ｔｏ  ｐｒｏｍｏｔｅ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ，２５，５０１−５１５．２２．Ｋｕｍａｒ，Ｐ．，Ｄｅｚｓｏ，Ｚ．，ＭａｃＫｅｎｚｉｅ，Ｃ．，Ｏｅｓｔｒｅｉｃｈｅｒ，Ｊ．，Ａｇｏｕｌｎｉｋ，Ｓ．，Ｂｙｒｎｅ，Ｍ．，Ｂｅｒｎｉｅｒ，Ｆ．，Ｙａｎａｇｉｍａｃｈｉ，Ｍ．，Ａｏｓｈｉｍａ，Ｋ．ａｎｄ  Ｏｄａ，Ｙ．（２０１３）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｍｉＲＮＡ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  ｆｏｒ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，８，ｅ６９８０７．２３．Ｄｕｏｎｇ  Ｖａｎ  Ｈｕｙｅｎ，Ｊ．−Ｐ．，Ｔｉｂｌｅ，Ｍ．，Ｇａｙ，ａ．，Ｇｕｉｌｌｅｍａｉｎ，Ｒ．，Ａｕｂｅｒｔ，Ｏ．，Ｖａｒｎｏｕｓ，Ｓ．，Ｉｓｅｒｉｎ，Ｆ．，Ｒｏｕｖｉｅｒ，Ｐ．，Ｆｒａｎｃｏｉｓ，ａ．，Ｖｅｒｎｅｒｅｙ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（２０１４）ＭｉｃｒｏＲＮＡｓ  ａｓ  ｎｏｎ−ｉｎｖａｓｉｖｅ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  ｏｆ  ｈｅａｒｔ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ．Ｅｕｒ．Ｈｅａｒｔ  Ｊ．，３５，３１９４−３２０２．２４．Ｗａｎｇ，Ｋ．，Ｚｈａｎｇ，Ｓ．，Ｍａｒｚｏｌｆ，Ｂ．，Ｔｒｏｉｓｃｈ，Ｐ．，Ｂｒｉｇｈｔｍａｎ，Ａ．，Ｈｕ，Ｚ．，Ｈｏｏｄ，Ｌ．Ｅ．ａｎｄ  Ｇａｌａｓ，Ｄ．Ｊ．（２００９）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ，ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  ｆｏｒ  ｄｒｕｇ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｌｉｖｅｒ  ｉｎｊｕｒｙ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１０６，４４０２−４４０７．２５．Ｖｉｃｋｅｒｓ，Ｋ．Ｃ．，Ｐａｌｍｉｓａｎｏ，Ｂ．Ｔ．，Ｓｈｏｕｃｒｉ，Ｂ．Ｍ．，Ｓｈａｍｂｕｒｅｋ，Ｒ．Ｄ．ａｎｄ  Ｒｅｍａｌｅｙ，Ａ．Ｔ．（２０１１）ＭｉｃｒｏＲＮＡｓ  ａｒｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｄ  ｉｎ  ｐｌａｓｍａ  ａｎｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ  ｔｏ  ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｈｉｇｈ−ｄｅｎｓｉｔｙ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１３，４２３−４３３．２６．Ｍｅｓｔｄａｇｈ，Ｐ．，Ｈａｒｔｍａｎｎ，Ｎ．，Ｂａｅｒｉｓｗｙｌ，Ｌ．，Ａｎｄｒｅａｓｅｎ，Ｄ．，Ｂｅｒｎａｒｄ，Ｎ．，Ｃｈｅｎ，Ｃ．，Ｃｈｅｏ，Ｄ．，Ｄ’Ａｎｄｒａｄｅ，Ｐ．，ＤｅＭａｙｏ，Ｍ．，Ｄｅｎｎｉｓ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｍｉＲＮＡ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｌａｔｆｏｒｍｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ｑｕａｌｉｔｙ  ｃｏｎｔｒｏｌ  （ｍｉＲＱＣ）ｓｔｕｄｙ．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１１，８０９−８１５．２７．Ｖｉｇｎｅａｕｌｔ，Ｆ．，Ｓｉｓｍｏｕｒ，ａ  Ｍ．ａｎｄ  Ｃｈｕｒｃｈ，Ｇ．Ｍ．（２００８）Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ｃａｐｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｂａｒ−ｃｏｄｉｎｇ  ｖｉａ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，５，７７７−７７９．２８．Ａｌｏｎ，Ｓ．，Ｖｉｇｎｅａｕｌｔ，Ｆ．，Ｅｍｉｎａｇａ，Ｓ．，Ｃｈｒｉｓｔｏｄｏｕｌｏｕ，Ｄ．Ｃ．，Ｓｅｉｄｍａｎ，Ｊ．Ｇ．，Ｃｈｕｒｃｈ，Ｇ．Ｍ．ａｎｄ  Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ，Ｅ．（２０１１）Ｂａｒｃ
ｏｄｉｎｇ  ｂｉａｓ  ｉｎ  ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｏｆ  ｍｉＲＮＡ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，２１，１５０６−１５１１．２９．Ｅｍｉｎａｇａ，Ｓ．，Ｃｈｒｉｓｔｏｄｏｕｌｏｕ，Ｄ．Ｃ．，Ｖｉｇｎｅａｕｌｔ，Ｆ．，Ｃｈｕｒｃｈ，Ｇ．Ｍ．ａｎｄ  Ｓｅｉｄｍａｎ，Ｊ．Ｇ．（２０１３）Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｎｅｘｔ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔｏｃ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，ｄｏｉ：１０．１００２／０４７１１４２７２７．ｍｂ０４１７ｓ１０３．３０．Ｈａｆｎｅｒ，Ｍ．，Ｒｅｎｗｉｃｋ，Ｎ．，Ｂｒｏｗｎ，Ｍ．，Ｍｉｈａｉｌｏｖｉｃ，Ａ．，Ｈｏｌｏｃｈ，Ｄ．，Ｌｉｎ，Ｃ．，Ｐｅｎａ，Ｊ．Ｔ．Ｇ．，Ｎｕｓｂａｕｍ，Ｊ．Ｄ．，Ｍｏｒｏｚｏｖ，Ｐ．，Ｌｕｄｗｉｇ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（２０１１）ＲＮＡ−ｌｉｇａｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｂｉａｓｅｓ  ｉｎ  ｍｉＲＮＡ  ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｄｅｅｐ−ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ  ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ  ｃＤＮＡ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ．ＲＮＡ，１７，１６９７−１７１２．３１．Ｚｈａｎｇ，Ｚ．，Ｌｅｅ，Ｊ．Ｅ．，Ｒｉｅｍｏｎｄｙ，Ｋ．，Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｅ．Ｍ．ａｎｄ  Ｙｉ，Ｒ．（２０１３）Ｈｉｇｈ−ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ＲＮＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｅｎａｂｌｅｓ  ａｃｃｕｒａｔｅ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉＲＮＡ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｂｙ  ｄｅｅｐ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．，１４，Ｒ１０９．３２．Ｐｒｉｔｃｈａｒｄ，Ｃ．Ｃ．，Ｋｒｏｈ，Ｅ．，Ｗｏｏｄ，Ｂ．，Ａｒｒｏｙｏ，Ｊ．Ｄ．，Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ，Ｋ．Ｊ．，Ｍｉｙａｊｉ，Ｍ．Ｍ．，Ｔａｉｔ，Ｊ．Ｆ．ａｎｄ  Ｔｅｗａｒｉ，Ｍ．（２０１２）Ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌ  ｏｒｉｇｉｎ  ｏｆ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ：ａ  ｃａｕｔｉｏｎａｒｙ  ｎｏｔｅ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  ｓｔｕｄｉｅｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｐｒｅｖ．Ｒｅｓ．，５，４９２−４９７．３３．Ｙａｍａｄａ，Ａ．，Ｃｏｘ，Ｍ．ａ．，Ｇａｆｆｎｅｙ，Ｋ．ａ．，Ｍｏｒｅｌａｎｄ，Ａ．，Ｂｏｌａｎｄ，Ｃ．Ｒ．ａｎｄ  Ｇｏｅｌ，Ａ．（２０１４）Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｎｅｏｐｌａｓｉａ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，９，ｅ１１２４８１．３４．Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｚ．，Ｂｅｎ−Ｄｏｖ，Ｉ．Ｚ．，Ｅｌｉａｓ，Ｒ．，Ｍｉｈａｉｌｏｖｉｃ，Ａ．，Ｂｒｏｗｎ，Ｍ．，Ｒｏｓｅｎｗａｋｓ，Ｚ．ａｎｄ  Ｔｕｓｃｈｌ，Ｔ．（２０１３）Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｏｆ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ｖｉａ  ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ａｎｄ  ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１１��，４２５５−４２６０．３５．Ｌｅｉｄｎｅｒ，Ｒ．Ｓ．，Ｌｉ，Ｌ．ａｎｄ  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｃ．Ｌ．（２０１３）Ｄａｍｐｅｎｉｎｇ  ｅｎｔｈｕｓｉａｓｍ  ｆｏｒ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ｉｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，８，１−１１．３６．Ｗｉｔｗｅｒ，Ｋ．Ｗ．（２０１４）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  ｓｔｕｄｉｅｓ：ｐｉｔｆａｌｌｓ  ａｎｄ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，６１，５６−６３．３７．Ｍａｒｔｉｎ，Ｍ．（２０１１）Ｃｕｔａｄａｐｔ  ｒｅｍｏｖｅｓ  ａｄａｐｔｅｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｆｒｏｍ  ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｒｅａｄｓ．ＥＭＢｎｅｔ．ｊｏｕｒｎａｌ，１７，１０−１２．３８．Ｋｏｚｏｍａｒａ，Ａ．ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓ，Ｓ．（２０１４）ＭｉＲＢａｓｅ：ａｎｎｏｔａｔｉｎｇ  ｈｉｇｈ  ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ  ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ  ｕｓｉｎｇ  ｄｅｅｐ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｄａｔａ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，４２，６８−７３．３９．Ｌａｎｇｍｅａｄ，Ｂ．ａｎｄ  Ｓａｌｚｂｅｒｇ，Ｓ．Ｌ．（２０１２）Ｆａｓｔ  ｇａｐｐｅｄ−ｒｅａｄ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｗｉｔｈ  Ｂｏｗｔｉｅ  ２．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，９，３５７−３５９．４０．Ｑｕｉｎｌａｎ，Ａ．Ｒ．ａｎｄ  Ｈａｌｌ，Ｉ．Ｍ．（２０１０）ＢＥＤＴｏｏｌｓ：ａ  ｆｌｅｘｉｂｌｅ  ｓｕｉｔｅ  ｏｆ  ｕｔｉｌｉｔｉｅｓ  ｆｏｒ  ｃｏｍｐａｒｉｎｇ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｆｅａｔｕｒｅｓ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２６，８４１−８４２．４１．Ａｎｄｅｒｓ，Ｓ．ａｎｄ  Ｈｕｂｅｒ，Ｗ．（２０１０）Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｆｏｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｏｕｎｔ  ｄａｔａ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．，１１，Ｒ１０６．４２．Ｗｙｍａｎ，Ｓ．Ｋ．，Ｋｎｏｕｆ，Ｅ．Ｃ．，Ｐａｒｋｉｎ，Ｒ．Ｋ．，Ｆｒｉｔｚ，Ｂ．Ｒ．，Ｌｉｎ，Ｄ．Ｗ．，Ｄｅｎｎｉｓ，Ｌ．Ｍ．，Ｋｒｏｕｓｅ，Ｍ．ａ．，Ｗｅｂｓｔｅｒ，Ｐ．Ｊ．ａｎｄ  Ｔｅｗａｒｉ，Ｍ．（２０１１）Ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉＲＮＡ  ｖａｒｉａｎｔｓ  ｂｙ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ  ｔｏ  ｍｉＲＮＡ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ  ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，２１，１４５０−１４６１．４３．Ｎｅｗｍａｎ，Ｍ．Ａ．，Ｍａｎｉ，Ｖ．ａｎｄ  Ｈａｍｍｏｎｄ，Ｓ．Ｍ．（２０１１）Ｄｅｅｐ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ  ３’  ｅｎｄ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ．ＲＮＡ，１７，１７９５−１８０３．４４．Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ，Ｕ．，Ｋａｉｓｅｒ，Ｒ．，Ｓａｎｄｅｒｓ，Ｊ．ａｎｄ  Ｈｏｏｄ，Ｌ．（１９８８）Ａ  ｌｉｇａｓｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４１，１０７７−１０８０。
【０１２８】
２．実施例＃２：ブロックされた試料及びブロックされていない試料中の望ましくないｍｉＲＮＡの相対計数の決定
望ましくないｍｉＲＮＡの３’末端にライゲーションするブロッキング核酸を使用する最初の試みは、成功せず、アダプター結合の低い有効性を有するｍｉＲＮＡライブラリーをもたらした。結果的に、Ｔ４  ＤＮＡライゲーション反応において使用された残りのＡＴＰは、先端を切断したＴ４  ＲＮＡリガーゼ２の有効性を阻害していたと仮定される。問題を解決するために、以下のプロトコルを確立した。
【０１２９】
３’ブロッキングプロトコル
最初に、１μＬの０．５μＭ  ｍｉＲＮＡブロッキングオリゴヌクレオチドを、９５℃、６５℃、５５℃、４５℃、及び３５℃の温度で、それぞれ、５分間インキュベートして、ヘアピン構造の適切な形成を確実に行った。インキュベートしたブロッキングオリゴヌクレオチドを、１μＬのＴ４  ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）、１μＬの１０Ｘ  Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ緩衝液（ＮＥＢ）、１μＬのマウスＲＮＡｓｅ阻害剤（ＮＥＢ）、及び２μＬの水と共に４μＬの単離したＲＮＡを含有するマイクロＲＮＡと組み合わせ、３０℃で１時間及び６５℃で１５分間インキュベートしてアニールし、さらなる反応から望ましくないｍｉＲＮＡをブロックした。インキュベーション後、反応生成物を、マイクロＲＮＡを結合することができるカラムを用いて単離し、先端を切断したＴ４  ＲＮＡリガーゼ２に対して阻害性である１０Ｘ  Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ緩衝液から存在するＡＴＰを除去するために２０μＬの水中に溶出した。カラムを浄化した後、１０μＬのカラム溶出液、１μＬの１０μＭ  ３’アダプター、１μＬの先端を切断したＴ４  ＲＮＡリガーゼ２（ＮＥＢ）、１μＬのマウスＲＮＡｓｅ阻害剤（ＮＥＢ）、２．５μＬの５０％ＰＥＧ  ８０００（ＮＥＢ）、２μＬの１０Ｘ  Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ緩衝液（ＲＮＡ）、及び０．５μＬの水を１９μＬの最終体積になるように組み合わせ、２５℃で１時間インキュベートした。１μＬの１０μＭ  逆転写プライマーを、３’アダプターライゲーション生成物に７５℃で５分間、３７℃で３０分間、及び２５℃で１５分間アニールし、その後、アダプター二量体生成物の形成を軽減するために、５’アダプターを付加した。１μＬの２０μＭ  プールした５’アダプターを、７０℃で２分間インキュベートし、次いで、前の反応、ならびに１μＬのＴ４  ＲＮＡリガーゼ１（ＮＥＢ）、１μＬのマウスＲＮＡｓｅ阻害剤（ＮＥＢ）、１μＬの１０ｍＭ  ＡＴＰ、及び１μＬの１０Ｘ  Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ緩衝液と組み合わせ、２５℃で１時間インキュベートした。１１μＬのライゲーション反応を１μＬのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、４μＬの５ＸＦｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２μＬの１００ｍＭ  ＤＴＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１μＬのマウスＲＮＡｓｅ阻害剤（ＮＥＢ）、及び１μＬの１０ｍＭ  ｄＮＴＰの各々と組み合わせることによって、ライゲートした反応生成物を逆転写し、４２℃で５０分間及び７０℃で１５分間インキュベートした。得られたｃＤＮＡを含有する反応物を、２．５μＬの２０μＭ  フォワード及びリバースプライマーの各々と共に、２５μＬの２Ｘ  Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ＮＥＢ）を付加することによってＰＣＲを介して増幅した。熱サイクル条件は、９４℃で３０秒間、続いて、９４℃で１０秒間、７２℃で４５秒間の１５サイクルであり、６５℃で５分間の最終伸長を行った。ライブラリーは、製造業者の取扱説明書に従って、ＭｉｎＥｌｕｔｅ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて浄化し、濃縮し、２０μｌの最終体積に溶出した。ライブラリーを、５０分間加温した緩衝液を用いて、ＴＢＥ−Ｕｒｅａ  １０パーセ���トアクリルアミドゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）上で分離した。ｍｉＲＮＡ（約１３５〜１４５の塩基対）に対応するバンドを切除し、ゲルから溶出し、沈殿させ、１０μｌのＥＢ緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ）中で再懸濁した。低分子ＲＮＡライブラリー濃度を、ライブラリー定量化キット−Ｉｌｌｕｍｉｎａ／ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ（ＫＡＰＡ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって定量化し、標準的なＩｌｌｕｍｉｎａプロトコルに従って、ＨｉＳｅｑ２０００またはＭｉＳｅｑにおいて配列決定した。
【０１３０】
個々のかつプールした５’及び３’ブロッカーを用いるブロッキング有効性の研究
上に記載される同じ方法を用いて、ヒト心臓ｍｉＲＮＡのｍｉＲＮＡライブラリーを、ブロッキングプロトコルを用いて、かつブロッキングプロトコルを用いず構成した。ｍｉＲ−１６に対する３’ブロッカーの有効性を試験するために、上述の項から改善した３’ブロッキングプロトコルを使用した。
【０１３１】
ブロッカーを有しないライブラリーと、ｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐ  ３’ブロッカー（３’Ｃ３ホスホラミダイトスペーサーを有する配列番号１３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ−５ｐ  ５’ブロッカー（５’Ｃ３ホスホラミダイトスペーサーを有する配列番号２）、及びｈｓａ−ｍｉＲ−４８６−５ｐ  ５’ブロッカー（５’Ｃ３ホスホラミダイトスペーサーを有する配列番号１）を用いて作製されたライブラリーとの比較を行った。図１４〜１６にそれぞれ示されるように、各々の場合においてブロックされたｍｉＲＮＡの正規化計数は、対照と比較して有意に低下した。
【０１３２】
次いで、ブロッカーの混合されたプールを用いてブロッキングプロトコルを試験した。ｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐ  ３’ブロッカー（３’Ｃ３ホスホラミダイトスペーサーを有する配列番号１３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ−５ｐ  ５’ブロッカー（５’Ｃ３ホスホラミダイトスペーサーを有する配列番号２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５１−５ｐ  ５’ブロッカー（５’Ｃ３ホスホラミダイトスペーサーを有する配列番号３）、及びｈｓａ−ｍｉＲ−４８６−５ｐ  ５’ブロッカー（５’Ｃ３ホスホラミダイトスペーサーを有する配列番号１）を含有するブロッカーのプールを調製した。ヒト心臓ｍｉＲＮＡのｍｉＲＮＡライブラリーを、プールを有するブロッキングプロトコルを用いて、かつブロッキングプロトコルを用いず構成した。ｈｓａ−ｍｉＲ−１６−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ−５ｐ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−４８６−５ｐの各々の存在量を測定した。図１７〜２０で見ることができるように、プールしたブロッカーは、得られたライブラリー中の望ましくないｍｉＲＮＡの各々の存在量を有意に低下した。
【０１３３】
Ｇ．支持実施形態
本開示は、具体的ではあるが、非排他的に、以下の実施形態：実施形態１に対する特許請求の範囲を支援する。ｍｉＲＮＡライブラリーにおける望ましくないマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の存在量を低下させるのに用いるブロッキング核酸であって、ブロッキング核酸は、（ａ）３’末端及び５’末端を有するＣｒｉｃｋ鎖と、（ｂ）ストリンジェントな条件下で望ましくないｍｉＲＮＡの第１の末端の結合領域とアニールする、Ｃｒｉｃｋ鎖の５’末端またはＣｒｉｃｋ鎖の３’末端のうちの一方の一本鎖相補領域であって、当該第１の末端が、望ましくないｍｉＲＮＡの５’末端または３’末端である、一本鎖相補領域と、（ｃ）相補領域に隣接するＣｒｉｃｋ鎖上の二本鎖領域であって、二本鎖領域がＣｒｉｃｋ鎖にアニールされるＷａｔｓｏｎ鎖を含み、Ｗａｔｓｏｎ鎖が５’末端及び３’末端を有する、二本鎖領域と、（ｄ）Ｃｒｉｃｋ鎖の３’末端に連結される第１のブロッキング部分であって、リガーゼの基質としての役割を果たすことができない、第１のブロッキング部分と、（ｅ）Ｃｒｉｃｋ鎖の５’末端に連結される第２のブロッキング部分であって、リガーゼの基質としての役割を果たすことができない、第２のブロッキング部分と、（ｆ）相補領域がＣｒｉｃｋ鎖の３’末端にある場合、Ｗａｔｓｏｎ鎖の３’末端に連結される、または相補領域がＣｒｉｃｋ鎖の５’末端にある場合、Ｗａｔｓｏｎ鎖の５’末端に連結される第３のブロッキング部分であって、リガーゼの基質としての役割を果たすことができない、第３のブロッキング部分と、（ｇ）Ｗａｔｓｏｎ鎖上のライゲーション末端であって、相補領域がＣｒｉｃｋ鎖の５’末端にある場合、Ｗａｔｓｏｎ鎖の３’末端に、または相補領域がＣｒｉｃｋ鎖の３’末端にある場合、Ｗａｔｓｏｎ鎖の５’末端に位置する、ライゲーション末端と、を含む、ブロッキング核酸。実施形態２．ｍｉＲＮＡライブラリーにおける望ましくないマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の存在量を低下させるために用いるブロッキング核酸であって、ブロッキング核酸は、（ａ）ブロッキング核酸の５’末端及びブロッキング核酸の３’末端と、（ｂ）ストリンジェントな条件下で望ましくないｍｉＲＮＡの第１の末端の結合領域とアニールする、ブロッキング核酸の５’末端及びブロッキング核酸の３’末端のうちの一方の一本鎖の相補領域であって、当該第１の末端は、望ましくないｍｉＲＮＡの５’末端または３’末端のいずれかであり、相補領域は末端を有する、一本鎖の相補領域と、（ｃ）ライゲーション末端を有するヘアピンループ形成領域であって、該相補領域に隣接するヘアピンループ形成領域と、（ｄ）相補領域の末端に連結される第１のブロッキング部分であって、リガーゼの基質としての役割を果たすことができない、第１のブロッキング部分と、を含む、ブロッキング核酸。実施形態３．相補領域が、高度にストリンジェントな条件下で結合領域とアニールする、実施形態１または２のいずれかに記載のブロッキング核酸。実施形態４．相補領域が、最大限ストリンジェントな条件下で結合領域とアニールする、実施形態１〜３のいずれか１つに記載のブロッキング核酸。実施形態５．ブロッキング核酸が、第１のブロッキング部分と相補領域との間にリンカー基を含む、実施形態１〜４のいずれか１つに記載のブロッキング核酸。実施形態６．ブロッキング核酸が、第１のブロッキング部分と相補領域との間にリンカー基を含み、リンカー基が、スペーサー９（トリエチレングリコール）及びスペーサー１８（ヘキサ−エチレングリコール）からなる群から選択される、実施形態１〜５のいずれか１つに記載のブロッキング核酸。実施形態７．相補領域が、５〜５０ヌクレオチド長である、実施形態１〜６のいずれか１つに記載のブロッキング核酸。実施形態８．相補領域が、８〜２０ヌクレオチド長である、実施形態１〜７のいずれか１つに記載のブロッキング核酸。実施形態９．相補領域が、１０〜１５ヌクレオチド長である、実施形態１〜８のいずれか１つに記載のブロッキング核酸。実施形態１０．相補領域が、配列番号１〜４のうちの１つの１〜１２位と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む、実施形態１〜９のいずれか１つに記載のブロッキング核酸。実施形態１１．相補領域が、配列番号１〜４のうちの１つの１〜１２位と９５％超の同一性を有する配列を含む、実施形態１〜１０のいずれか１つに記載のブロッキング核酸。実施形態１２．相補領域が、配列番号４の配列  １〜１２位と少なくとも９０％の同一性を有する、実施形態１〜１１のいずれか１つに記載のブロッキング核酸。実施形態１３．相補領域が、配列番号４の１〜１２位と９５％超の同一性を有する配列を含む、実施形態１〜１２のいずれか１つに記載のブロッキング核酸。実施形態１４．第１のブロッキング部分が、利用可能な５’リン酸基を欠いている、利用可能な３’ヒドロキシル基を欠いている、またはその両方である、修飾ヌクレオチドである、実施形態１〜１３のいずれか１つに記載のブロッキング核酸。実施形態１５．第１のブロッキング部分が、反転デオキシヌクレオチド、ジデオキシヌクレオチド、反転ジデオキシヌクレオチド、Ｃ３スペーサー（ホスホラミダイト）、スペーサー９（トリエチレングリコール）、プロピル基、プロパノール基、及びスペーサー１８（ヘキサ−エチレングリコール）からなる群から選択される、実施形態１〜１４のいずれか１つに記載のブロッキング核酸。実施形態１６．前記ヘアピンループ形成領域群が、配列番号５と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む、実施形態２に記載のブロッキング核酸。実施形態１７．前記ヘアピンループ形成領域群が、配列番号５と９５％超の同一性を有する配列を含む、実施形態２または１６のいずれかに記載のブロッキング核酸。実施形態１８．相補領域が、ストリンジェントな条件下で配列番号６〜１１のうちの少なくとも１つの少なくとも５つの連続する塩基とアニールする、実施形態１〜１７のいずれか１つに記載のブロッキング核酸。実施形態１９．相補領域が、ストリンジェントな条件下で配列番号６〜１１のうちの少なくとも１つの少なくとも８つの連続する塩基とアニールする、実施形態１〜１８のいずれか１つに記載のブロッキング核酸。実施形態２０．相補領域が、ストリンジェントな条件下で配列番号６〜１１のうちの少なくとも１つの少なくとも１０の連続する塩基とアニールする、実施形態１〜１９のいずれか１つに記載のブロッキング核酸。実施形���２１．相補領域が、ストリンジェントな条件下で配列番号６及び配列番号１０のうちの少なくとも１つの１〜８位とアニールする、実施形態１〜２０のいずれか１つに記載のブロッキング核酸。実施形態２２．相補領域が、ストリンジェントな条件下で配列番号６〜１１のうちの少なくとも１つの１〜９位とアニールする、実施形態１〜２１のいずれか１つに記載のブロッキング核酸。実施形態２３．相補領域が、高度にストリンジェントな条件下で配列番号６〜１１のうちの少なくとも１つの少なくとも５つの連続する塩基とアニールする、実施形態１〜２２のいずれか１つに記載のブロッキング核酸。実施形態２４．相補領域が、高度にストリンジェントな条件下で配列番号６〜１１のうちの少なくとも１つの少なくとも８つの連続する塩基とアニールする、実施形態１〜２３のいずれか１つに記載のブロッキング核酸。実施形態２５．相補領域が、高度にストリンジェントな条件下で配列番号６〜１１のうちの少なくとも１つの少なくとも１０の連続する塩基とアニールする、実施形態１〜２４のいずれか１つに記載のブロッキング核酸。実施形態２６．相補領域が、高度にストリンジェントな条件下で配列番号６及び配列番号１０のうちの少なくとも１つの１〜８位とアニールする、実施形態１〜２５のいずれか１つに記載のブロッキング核酸。実施形態２７．相補領域が、高度にストリンジェントな条件下で配列番号６〜１１のうちの少なくとも１つの１〜９位とアニールする、実施形態１〜２６のいずれか１つに記載のブロッキング核酸。実施形態２８．相補領域が、最大限ストリンジェントな条件下で配列番号６〜１１のうちの少なくとも１つの少なくとも５つの連続する塩基とアニールする、実施形態１〜２７のいずれか１つに記載のブロッキング核酸。実施形態２９．相補領域が、最大限ストリンジェントな条件下で配列番号６〜１１のうちの少なくとも１つの少なくとも８つの連続する塩基とアニールする、実施形態１〜２８のいずれか１つに記載のブロッキング核酸。実施形態３０．相補領域が、最大限ストリンジェントな条件下で配列番号６〜１１のうちの少なくとも１つの少なくとも１０の連続する塩基とアニールする、実施形態１〜２９のいずれか１つに記載のブロッキング核酸。実施形態３１．相補領域が、最大限ストリンジェントな条件下で配列番号６及び配列番号１０のうちの少なくとも１つの１〜８位とアニールする、実施形態１〜３０のいずれか１つに記載のブロッキング核酸。実施形態３２．相補領域が、最大限ストリンジェントな条件下で配列番号６〜１１のうちの少なくとも１つの１〜９位とアニールする、実施形態１〜３１のいずれか１つに記載のブロッキング核酸。実施形態３３．ブロッキング核酸が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ロック核酸、及び架橋核酸からなる群から選択される核酸からなる、実施形態１〜３２のいずれか１つに記載のブロッキング核酸。実施形態３４．ブロッキング核酸が、配列番号１〜４のうちの少なくとも１つと少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むＤＮＡ分子である、実施形態２、１６、及び１７のいずれか１つに記載のブロッキング核酸。実施形態３５．ブロッキング核酸が、配列番号１〜４のうちの少なくとも１つと９５％超の同一性を有する���列を含むＤＮＡ分子である、実施形態２、１６、１７、及び３４のいずれか１つに記載のブロッキング核酸。実施形態３６．ブロッキング核酸が、配列番号４と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むＤＮＡ分子である、実施形態２、１６、１７、３４、及び３５のいずれか１つに記載のブロッキング核酸。実施形態３７．ブロッキング核酸が、配列番号４と９５％超の同一性を有する配列を含むＤＮＡ分子である、実施形態２、１６、１７、及び３４〜３６のいずれか１つに記載のブロッキング核酸。実施形態３８．ブロッキング核酸が、配列番号１３と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むＤＮＡ分子である、実施形態２、１６、及び１７のいずれか１つに記載のブロッキング核酸。実施形態３９．ブロッキング核酸が、配列番号１３と９５％超の同一性を有する配列を含むＤＮＡ分子である、実施形態２、１６、１７、及び３８のいずれか１つに記載のブロッキング核酸。実施形態４０．ライゲーション末端が、利用可能な５’リン酸基または利用可能な３’ヒドロキシル基のうちの１つを有するヌクレオチドである、実施形態１〜３９のいずれか１つに記載のブロッキング核酸。実施形態４１．望ましくないマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）が逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）に関与することを防止する方法であって、望ましくないｍｉＲＮＡが、５’末端及び３’末端を有し、本方法が、実施形態１〜実施形態４０のいずれか１つに記載のブロッキング核酸の相補領域を、望ましくないｍｉＲＮＡの第１の末端の結合部位とアニールすることを含み、望ましくないｍｉＲＮＡの第１の末端が、５’末端または３’末端のうちの一方である、方法。実施形態４２．アニーリングが、ストリンジェントな条件下で行われる、実施形態４１に記載の方法。実施形態４３．アニーリングが、高度にストリンジェントな条件下で行われる、実施形態４１または４２に記載の方法。実施形態４４．アニーリングが、最大限ストリンジェントな条件下で行われる、実施形態４１〜４３のいずれか１つに記載の方法。実施形態４５．ブロッキング核酸を、望ましくないｍｉＲＮＡの第１の末端にライゲーションすることを含む、実施形態４１〜４４のいずれか１つに記載の方法。実施形態４６．望ましくないｍｉＲＮＡの第１の末端が、５’末端であり、相補領域が、ブロッキング核酸の５’末端にある、実施形態４１〜４５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態４７．望ましくないｍｉＲＮＡの第１の末端が、３’末端であり、相補領域が、ブロッキング核酸の３’末端にある、実施形態４１〜４６のいずれか１つに記載の方法。実施形態４８．ブロッキング核酸を、望ましくないｍｉＲＮＡの第１の末端にライゲーションすることを含み、ライゲーションステップは、ＤＮＡ／ＲＮＡリガーゼを用いて行われる、実施形態４１〜４７のいずれか１つに記載の方法。実施形態４９．ブロッキング核酸を、望ましくないｍｉＲＮＡの第１の末端にライゲーションすることを含み、ライゲーションステップは、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いて行われる、実施形態４１〜４８のいずれか１つに記載の方法。実施形態５０．望ましくないｍｉＲＮＡが、ｍｉｒ−１６、ｍｉｒ−１５ａ、ｍｉｒ−１５ｂ、ｍｉｒ−１９５、ｍｉｒ−４２４、ｍｉｒ−４９７、ｍｉｒ−４８６、ｍｉｒ−４５１、及びｍｉｒ−２６からなる群から選択される、実施形態４１〜４９のいずれか１つに記載の方法。実施形態５１．実施形態４１〜５０のいずれか１つに記載の方法の生成物である、ブロックされたマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）複合体。実施形態５２．ｍｉＲＮＡライブラリーにおける望ましくないマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の存在量を低下させる方法であって、望ましくないｍｉＲＮＡが、５’末端及び３’末端を有し、本方法が、（ａ）複数のｍｉＲＮＡを含む試料からＲＮＡを精製することと、（ｂ）アデニル化核酸アダプター及び第１のＤＮＡ／ＲＮＡリガーゼを、該アデニル化核酸アダプターを複数のｍｉＲＮＡの３’末端にライゲーションすることができる条件下で導入することと、（ｃ）実施形態１〜実施形態４０のうちのいずれか１つに記載のブロッキング核酸を、該ブロッキング核酸の相補領域を望ましくないｍｉＲＮＡの結合領域にアニールすることができる条件下で、ブロックされた試料を生成するために導入することと、（ｄ）ＲＮＡアダプター及びＲＮＡリガーゼを、該ＲＮＡアダプターを複数のｍｉＲＮＡの５’末端にライゲーションすることができる条件下で導入することと、（ｅ）複数のｍｉＲＮＡの逆転写を可能にする条件下で、逆転写酵素をブロックされた試料に導入して、ｃＤＮＡ試料を生成することと、（ｆ）望ましくないｍｉＲＮＡの存在量が低下したｍｉＲＮＡライブラリーを生成するために、ｃＤＮＡ試料上でポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うことと、を含む、方法。実施形態５３．第２のＤＮＡ／ＲＮＡリガーゼを、ブロッキング核酸を望ましくないｍｉＲＮＡの５’末端及び３’末端のうちの一方にライゲーションすることができる条件下で導入することと、を含む、実施形態５２に記載の方法。実施形態５４．第２のＤＮＡ／ＲＮＡリガーゼが、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼである、実施形態５３に記載の方法。実施形態５５．ブロッキング核酸を、ブロッキング核酸の相補領域を望ましくないｍｉＲＮＡの結合領域とアニールすることができるストリンジェントな条件下で望ましくないｍｉＲＮＡでインキュベートすることを含む、実施形態５２〜５４のいずれか１つに記載の方法。実施形態５６．ブロッキング核酸を、ブロッキング核酸の相補領域を望ましくないｍｉＲＮＡの結合領域とアニールすることができる高度にストリンジェン��な条件下で望ましくないｍｉＲＮＡでインキュベートすることを含む、実施形態５２〜５５のいずれか１つに記載の方法。実施形態５７．ブロッキング核酸を、ブロッキング核酸の相補領域を望ましくないｍｉＲＮＡの結合領域とアニールすることができる最大限ストリンジェントな条件下で望ましくないｍｉＲＮＡでインキュベートすることを含む、実施形態５２〜５６のいずれか１つに記載の方法。実施形態５８．当該アデニル化核酸アダプターが、逆転写酵素プライマー結合部位を含む、実施形態５２〜５７のいずれか１つに記載の方法。実施形態５９．アデニル化核酸アダプターが、アデニル化ＤＮＡアダプターである、実施形態５２〜５８のいずれか１つに記載の方法。実施形態６０．アデニル化核酸アダプターが、アデニル化  ＲＮＡアダプターである、実施形態５２〜５９のいずれか１つに記載の方法。実施形態６１．第１のＤＮＡ／ＲＮＡリガーゼが、先端を切断したＴ４リガーゼ２である、実施形態５２〜６０のいずれか１つに記載の方法。実施形態６２．ＲＮＡアダプターが、５〜３０塩基対長である、実施形態５２〜６１のいずれか１つに記載の方法。実施形態６３．ＲＮＡアダプターが、１８〜２２塩基対長である、実施形態５２〜６２のいずれか１つに記載の方法。実施形態６４．ＲＮＡリガーゼが、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ１である、実施形態５２〜６３のいずれか１つに記載の方法。実施形態６５．ステップ（ｃ）が、ステップ（ｂ）及び（ｄ）のうちの少なくとも１つの前に行われる、実施形態５２〜６４のいずれか１つに記載の方法。実施形態６６．望ましくないｍｉＲＮＡの結合領域が、望ましくないｍｉＲＮＡの５’末端である、実施形態５２〜６５のいずれか１つに記載の方法。実施形態６７．望ましくないｍｉＲＮＡの結合領域が、望ましくないｍｉＲＮＡの５’末端であり、これらのステップが、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、及び（ｆ）の順序で行われる、実施形態５２〜６６のいずれか１つに記載の方法。実施形態６８．望ましくないｍｉＲＮＡの結合領域が、望ましくないｍｉＲＮＡの３’末端である、実施形態５２〜６７のいずれか１つに記載の方法。実施形態６９．望ましくないｍｉＲＮＡの結合領域が、望ましくないｍｉＲＮＡの３’末端であり、ステップ（ｃ）が、ステップ（ｂ）の前に行われ、ＡＴＰの濃度が、ステップ（ｃ）と（ｂ）との間で低下する、実施形態５２〜６８のいずれか１つに記載の方法。実施形態７０．実施形態５２〜６９のいずれか１つに記載の方法の生成物である、望ましくないｍｉＲＮＡの存在量が低下した、ｍｉＲＮＡライブラリー。実施形態７１．望ましくないｍｉＲＮＡの存在量が、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％、９８％、９９％、９９．５％、９９％、及び１００％からなる群から選択される量で少なくとも低下する、実施形態７０に記載のｍｉＲＮＡライブラリー。実施形態７２．ｍｉＲＮＡライブラリーにおいてｍｉＲＮＡの頻度を低下させるためのキットであって、実施形態１〜４０のいずれか１つに記載の任意のブロッキング核酸を含む、キット。実施形態７３．アニールされるとき、ＤＮＡをＲＮＡにライゲーションすることができるＤＮＡ／ＲＮＡリガー���の容器を含む、実施形態７２に記載のキット。実施形態７４．Ｔ４  ＤＮＡリガーゼの容器を含む、実施形態７２または７３に記載のキット。実施形態７５．ＲＮＡ／ＲＮＡリガーゼの容器を含む、実施形態７２〜７４のいずれか１つに記載のキット。実施形態７６．Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ１の容器を含む、実施形態７２〜７５のいずれか１つに記載のキット。実施形態７７．ＲＮＡ／ＤＮＡリガーゼの容器を含む、実施形態７２〜７５のいずれか１つに記載のキット。実施形態７８．先端を切断したＴ４  ＲＮＡリガーゼ２の容器を含む、実施形態７２〜７７のいずれか１つに記載のキット。実施形態７９．逆転写酵素の容器を含む、実施形態７２〜７８のいずれか１つに記載のキット。実施形態８０．アデニル化核酸アダプターの容器を含む、実施形態７２〜７９のいずれか１つに記載のキット。実施形態８１．アデニル化核酸アダプターの容器を含み、当該アデニル化核酸アダプターが、逆転写酵素プライマー結合部位を含む、実施形態７２〜８０のいずれか１つに記載のキット。実施形態８２．アデニル化核酸アダプターの容器を含み、当該アデニル化核酸アダプターが、アデニル化ＤＮＡアダプターである、実施形態７２〜８１のいずれか１つに記載のキット。実施形態８３．アデニル化核酸アダプターの容器を含み、当該アデニル化核酸アダプターが、アデニル化ＲＮＡアダプターである、実施形態７２〜８２のいずれか１つに記載のキット。実施形態８４．ＲＮＡアダプターの容器を含む、実施形態７２〜８３のいずれか１つに記載のキット。実施形態８５．複数のＤＮＡプライマー、ヌクレオチド溶液、ＰＣＲ緩衝液、及び好熱性ＤＮＡポリメラーゼを含む、実施形態７２〜８４のいずれか１つに記載のキット。実施形態８６．ｍｉＲＮＡの結合領域で、実施形態１〜４０のいずれか１つに記載のブロッキング核酸にアニールされるｍｉＲＮＡを含み、第１の末端が、５’末端または３’末端のうちの一方である、ブロックされたマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）複合体。実施形態８７．第１の末端がｍｉＲＮＡの５’末端である、実施形態８６に記載のブロックされたｍｉＲＮＡ複合体。実施形態８８．第１の末端がｍｉＲＮＡの３’末端である、実施形態８６に記載のブロックされたｍｉＲＮＡ複合体。実施形態８９．ｍｉＲＮＡが、ｍｉｒ−１６、ｍｉｒ−１５ａ、ｍｉｒ−１５ｂ、ｍｉｒ−１９５、ｍｉｒ−４２４、ｍｉｒ−４９７、ｍｉｒ−４８６、ｍｉｒ−４５１、及びｍｉｒ−２６からなる群から選択される、実施形態８６〜８８のいずれか１つに記載のブロックされたｍｉＲＮＡ複合体。実施形態９０．配列番号１〜４及び１３のうちの１つと少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む、核酸分子。実施形態９１．配列番号１〜４及び１３のうちの１つと９５％超の同一性を有する配列を含む、核酸分子。実施形態９２．配列番号１〜４及び１３のうちの１つである配列を含む、核酸分子。実施形態９３．ストリンジェントな条件下で実施形態９０〜９２のうちのいずれか１つに記載の核酸分子とアニールする、核酸分子。実施形態９４．高度にストリンジェントな条件で実施形態９０〜９２のうちのいずれか１つに記載の核酸分子とアニールする、核酸分子。実施形態９５．最大限ストリンジェ���トな条件下で実施形態９０〜９２のうちのいずれか１つに記載の核酸分子とアニールする、核酸分子。実施形態９６．実施形態９０〜９５のうちのいずれか１つに記載の核酸分子のうちのいずれか１つを含む、細胞。実施形態９７．該細胞が、原核細胞である、実施形態９６に記載の細胞。実施形態９７．実施形態９０〜９５のうちのいずれか１つに記載の核酸分子のうちのいずれか１つを含む、ベクター。
【０１３４】
Ｈ．結果
本発明の開示された実施形態の供されるいずれの要素も、単一の構造、単一のステップ、単一の物質などで具体化されてよいことを理解されたい。同様に、開示された実施形態の供される要素は、複数の構造、ステップ、物質などで具体化されてよい。
【０１３５】
上述の説明は、本開示の方法、機械、製造、組成物、及び他の教示を示し、かつ記載する。さらに、本開示は、開示される方法、機械、製造、組成物、及び他の教示のある特定の実施形態のみを示し、かつ記載するが、上で記載されるように、本開示の教示は、様々な他の組み合わせ、修正、及び環境で使用することができ、本明細書で明示されるような教示の範囲内で、当業者の技術及び／または知識と一致するように変更するかまたは修正することができることを理解されたい。本明細書の上に記載される実施形態は、本開示の方法、機械、製造、組成物、及び他の教示を実践することで知られるある特定の最良のモードを説明すること、ならびに当業者が、実施形態のように及び特定の適用もしくは使用によって必要とされる様々な修正をして、本開示の教示またはその他を使用できるようにすることをさらに意図する。したがって、本開示の方法、機械、製造、組成物、及び他の教示は、本明細書に開示される厳密な実施形態及び実施例に限定されることを意図しない。本明細書におけるいずれの項の見出しも、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．７７の提示と一貫性を持つためだけに提供され、そうでない場合、構造化された列を提供する。これらの見出しは、本明細書に記載される発明（複数可）を限定することまた特徴付けることはないであろう。
【表２】
0006791875.tif 000003
【図１】
0006791875.tif 000004
【図２】
0006791875.tif 000005
【図３】
0006791875.tif 000006
【図４Ａ】
0006791875.tif 000007
【図４Ｂ】
0006791875.tif 000008
【図４Ｃ】
0006791875.tif 000009
【図４Ｄ】
0006791875.tif 000010
【図４Ｅ】
0006791875.tif 000011
【図４Ｆ】
0006791875.tif 000012
【図５】
0006791875.tif 000013
【図６Ａ】
0006791875.tif 000014
【図６Ｂ】
0006791875.tif 000015
【図７Ａ】
0006791875.tif 000016
【図７Ｂ】
0006791875.tif 000017
【図７Ｃ】
0006791875.tif 000018
【図７Ｄ】
0006791875.tif 000019
【図８】
0006791875.tif 000020
【図９】
0006791875.tif 000021
【図１０】
0006791875.tif 000022
【図１１】
0006791875.tif 000023
【図１２Ａ】
0006791875.tif 000024
【図１２Ｂ】
0006791875.tif 000025
【図１２Ｃ】
0006791875.tif 000026
【図１２Ｄ】
0006791875.tif 000027
【図１２Ｅ】
0006791875.tif 000028
【図１２Ｆ】
0006791875.tif 000029
【図１２Ｇ】
0006791875.tif 000030
【図１２Ｈ】
0006791875.tif 000031
【図１２Ｉ】
0006791875.tif 000032
【図１２Ｊ】
0006791875.tif 000033
【図１３】
0006791875.tif 000034
【図１４】
0006791875.tif 000035
【図１５】
0006791875.tif 000036
【図１６】
0006791875.tif 000037
【図１７】
0006791875.tif 000038
【図１８】
0006791875.tif 000039
【図１９】
0006791875.tif 000040
【図２０】
0006791875.tif 000041
【図２１】
0006791875.tif 000042
【図２２Ａ】
0006791875.tif 000043
【図２２Ｂ】
0006791875.tif 000044
【配列表】
0006791875000001.app