(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２のアミノ酸配列のＮ末端から１２３番目のアミノ酸がシステインに置換、２４３番目のアミノ酸がバリンに置換、３８７番目のアミノ酸がトレオニンに置換、４０５番目のアミノ酸がチロシンに置換、４１３番目のアミノ酸がトレオニンに置換、４５８番目のアミノ酸がリジンに置換、または前記置換を組み合わせたアミノ酸配列からなる、５’−イノシン酸を排出するタンパク質変異体。
【請求項２】
前記５’−イノシン酸を排出するタンパク質変異体が、さらに、配列番号２のアミノ酸配列のＮ末端から２番目のアミノ酸がイソロイシンに置換、６４番目のアミノ酸がグルタミン酸、アスパラギン酸に置換、または前記置換を組み合わせたアミノ酸配列からなる、請求項１に記載の５’−イノシン酸を排出するタンパク質変異体。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のタンパク質変異体をコードするポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項３に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項５】
請求項１又は２に記載のタンパク質変異体、請求項1又は２に記載のタンパク質変異体をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含有する、５’−イノシン酸を生産するコリネバクテリウム属微生物。
【請求項６】
前記コリネバクテリウム属微生物が、コリネバクテリウム・スタティオニス（Corynebacterium stationis）である、請求項５に記載の５’−イノシン酸を生産するコリネバクテリウム属微生物。
【請求項７】
請求項５に記載のコリネバクテリウム属微生物を培地で培養する段階、及び、前記微生物または培地から５’−イノシン酸を回収する段階を含む、５’−イノシン酸の製造方法。
【請求項８】
前記コリネバクテリウム属微生物が、コリネバクテリウム・スタティオニス（Corynebacterium stationis）である、請求項７に記載の５’−イノシン酸の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、５’−イノシン酸排出能を有する新規タンパク質変異体、これを含む微生物、これを用いた５’−イノシン酸の製造方法及び５’−イノシン酸の排出増加方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸系物質の１つである５’−イノシン酸（5'-inosine monophosphate；以下ＩＭＰ）は、核酸代謝経路の中間物質であって、食品、医薬品及び各種医療的利用などの多方面に利用されており、５’−グアニル酸（5'-guanine monophosphate；以下ＧＭＰ）と共に食品調味添加剤または食品用として広く利用されている物質である。ＩＭＰは、それ自体で牛肉の味を出すことが知られているが、ＧＭＰのようにグルタミン酸一ナトリウム（ＭＳＧ）の風味を強化することが知られて、呈味性核酸系の調味料として脚光を浴びている。
ＩＭＰを製造する方法としては、酵母細胞から抽出したリボ核酸を酵素的に分解する方法（特許文献１）、発酵によって生産されたイノシンを化学的にリン酸化する方法（非特許文献１など）及びＩＭＰを直接的に生産する微生物を培養して、培養液内のＩＭＰを回収する方法などがある。これらの方法の中で、現在最も多く使われている方法は、ＩＭＰを直接生産が可能な微生物を用いた方法である。
一方、自然な状態での酵素は、産業的な利用において要求される活性、安定性、光学異性体に対する基質特異性などにおいて、常に最適の特性を示すものではないため、アミノ酸配列の変異などを介して目的とする用途に適するように酵素を改良する様々な試みがなされてきた。その中、酵素の合理的デザイン（rational design）及び部分変異（site-directed mutagenesis）方法が酵素機能を向上するために適用された例があるが、多くの場合、目的酵素の構造に関する情報が不足したり、構造−機能の相関関係が明確ではなく、効果的に適用できないという欠点がある。また、酵素遺伝子のランダム変異を介して構築された変異酵素ライブラリから目的の形質の酵素をスクリーニングする方向的進化（directed evolution）方法により酵素の改良を試みて活性を改善する方法も報告されていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】日本特許公告第１６１４／１９５７号
【特許文献２】韓国登録特許第１０−０９２４０６５号
【特許文献３】国際公開特許第２００８−０３３００１号
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Agri. Biol. Chem., 36, 1511 (1972)
【非特許文献２】Pearspm et al (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444
【非特許文献３】Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277
【非特許文献４】Needleman and Wunsch、1970、J. Mol. Biol. 48: 443−453
【非特許文献５】Smith and Waterman、Adv. Appl. Math （1981） 2:482
【非特許文献６】Schwartz and Dayhoff、eds.、Atlas Of Protein Sequence And Structure、National Biomedical Research Foundation、pp. 353−358 （1979）
【非特許文献７】Gribskov et al（1986） Nucl. Acids Res. 14: 6745
【非特許文献８】Sambrook et al.、supra、9.50−9.51、11.7−１1.8
【非特許文献９】van der Rest et al. 1999
【非特許文献１０】Appl. Microbiol. Biothcenol.,1999,52:541−545
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
微生物発酵を介して直接ＩＭＰを生産する方法で高収率のＩＭＰを生産するためには、ＩＭＰの排出がスムーズに行われる必要がある。本目的を達成するために、発明者らは広範な研究を行い、ＩＭＰ排出能に関与するタンパク質を究明しただけではなく、より高いＩＭＰ排出能を有するタンパク質変異体を発掘することにより、本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の一つの目的は、５’−イノシン酸を排出するタンパク質変異体を提供することにある。
本発明の他の目的は、前記本発明のタンパク質変異体をコードするポリヌクレオチドを提供することにある。
本発明の別の目的は、前記本発明のポリヌクレオチドを含むベクターを提供することにある。
本発明の別の目的は、前記本発明のタンパク質変異体及び前記本発明のベクターを含む５’−イノシン酸を生産する微生物を提供することにある。
本発明の別の目的は、前記本発明のコリネバクテリウム属微生物を培地で培養する段階；及び前記微生物または前記培地から５’−イノシン酸を回収する段階を含む、５’−イノシン酸の製造方法を提供することにある。
本発明の別の目的は、前記本発明の５’−イノシン酸排出タンパク質をコリネバクテリウム属微生物で強化する段階を含む、５’−イノシン酸の排出増加方法を提供することにある。
【発明の効果】
【０００７】
本発明のＩＭＰを排出するタンパク質変異体を用いて５’−イノシン酸を生産するコリネバクテリウム属微生物を培養する場合、高収率の５’−イノシン酸の生産が可能である。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
これを具体的に説明すると、次のとおりである。一方、本明細書で開示された各説明及び実施形態は、それぞれの他の説明及び実施形態にも適用できる。すなわち、本明細書で開示された様々な要素のすべての組み合わせが本発明のカテゴリに属する。また、下記記述された具体的な叙述によって、本発明のカテゴリは制限されるものではない。
【０００９】
前記目的を達成するための本発明の一つの様態は、５’−イノシン酸を排出するタンパク質変異体を提供することにある。
【００１０】
本明細書において、用語、「５’−イノシン酸を排出するタンパク質」は、５’−イノシン酸（5'-inosine monophosphate;ＩＭＰ）を細胞外に排出するのに関与するタンパク質を意味する。本発明の目的上、前記用語はＩＭＰ排出能を有するタンパク質、ＩＭＰ排出タンパク質、５’−イノシン酸排出能を有するタンパク質、５’−イノシン酸排出タンパク質などと混用して使用してもよい。具体的には、前記タンパク質はＩｍｐＥで示してもよく、より具体的には、ＩｍｐＥ１またはＩｍｐＥ２で示してもよい。さらに具体的には、本発明の５’−イノシン酸を排出するタンパク質はＩｍｐＥ２で示してもよいが、これに制限されるものではない。また、前記タンパク質は、コリネバクテリウム属由来であってもよく、具体的には、コリネバクテリウム・スタティオニス由来であってもよいが、これに制限されない。
前記タンパク質は、配列番号２で記載されたアミノ酸配列を含むか、配列番号２で記載されたアミノ酸配列で構成されたタンパク質であってもよいが、前記タンパク質と同様の活性を有する配列は制限なく含み、当業者は、公知のデータベースであるＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋなどから配列情報を得ることができる。また、本出発明のＩＭＰ排出タンパク質は、配列番号２及び前記配列番号２と少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の相同性または同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質であってもよい。また、このような相同性または同一性を有しながら、前記タンパク質に相応する効能を示すアミノ酸配列であれば、一部の配列が欠失、変形、置換、または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質も、本発明のタンパク質として使用できることは自明である。
すなわち、本明細書で「特定配列番号で記載されたアミノ酸配列を有するタンパク質」または「特定配列番号のアミノ酸配列からなるタンパク質」と記載されていても、該当配列番号のアミノ酸配列からなるタンパク質と同一もしくは相応する活性を有する場合であれば、一部の配列が欠失、変形、置換、保存的置換または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質も、本発明で使用できることは自明である。例えば、本発明のタンパク質変異体と同一あるいは相応する活性を有する場合であれば、前記アミノ酸配列の前後に、タンパク質の機能を変更しない配列の追加、自然に発生しうる突然変異、そのサイレント突然変異（silent mutation）または保存的置換は除外せず、これらの配列の追加、あるいは突然変異を有する場合でも、本発明の範囲内に属することは自明である。
【００１１】
本明細書において、用語、「相同性（homology）」または「同一性（identity）」は、２つの与えられたアミノ酸配列または塩基配列と互いに関連する程度を意味し、パーセンテージで表示されうる。
用語、相同性及び同一性は、多くの場合、相互交換的に用いられる。
保存された（conserved）ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列相同性または同一性は、標準配列アルゴリズムによって決定され、用いられるプログラムによって確立されたデフォルトのギャップペナルティが一緒に利用されてもよい。実質的に、相同性を有するか（homologous）または同一（identical）の配列は、中間または高い厳しい条件（stringent conditions）で、一般的に、配列全体または全長の少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％または９０％以上でハイブリッドしてもよい。ハイブリッド化はポリヌクレオチドでコドンの代わりに縮退コドンを含有するポリヌクレオチドも考慮される。
【００１２】
任意の２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列が相同性、類似性または同一性を有するかどうかは、例えば、非特許文献２と同じデフォルトのパラメータを用いて「ＦＡＳＴＡ」プログラムのような公知のコンピュータアルゴリズムを利用して決定してもよい。または、ＥＭＢＯＳＳパッケージのニードルマンプログラム（EMBOSS：The European Molecular Biology Open Software Suite、非特許文献３）（バージョン５．０．０またはそれ以降のバージョン）で実行されるような、ニードルマン−ウンシュ（Needleman-Wunsch）アルゴリズム（非特許文献４）を使用して決定してもよい。（ＧＣＧプログラムパッケージ（Devereux、J.、et al、Nucleic Acids Research 12: 387 （1984））、BLASTP、BLASTN、FASTA（Atschul、[S.] [F.,] [ET AL、J MOLEC BIOL 215]: 403 （1990）；Guide to Huge Computers、Martin J. Bishop、[ED.,] Academic Press、San Diego,1994、及び[CARILLO ETA/.]（1988） SIAM J Applied Math 48: 1073を含む）。例えば、国立生物工学情報データベースセンターのＢＬＡＳＴ、またはＣｌｕｓｔａｌＷを用いて相同性、類似性または同一性を決定してもよい。
【００１３】
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの相同性、類似性または同一性は、例えば、非特許文献５に開示されたように、例えば、非特許文献４のようなＧＡＰコンピュータープログラムを利用して配列情報を比較することによって決定してもよい。要約すると、ＧＡＰプログラムは、２つの配列のうち、より短いものからのシンボルの全体数で類似の配列されたシンボル（つまり、ヌクレオチドまたはアミノ酸）の数を割った値として定義する。ＧＡＰプログラムのためのデフォルトパラメータは、（１）一進法の比較マトリックス（同一性のための１及び非同一性のための０の値を含有する）及び非特許文献６に開示されたように、非特許文献７の加重された比較マトリックス（またはＥＤＮＡＦＵＬＬ（ＮＣＢＩ ＮＵＣ４．４のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックス）；（２）各ギャップのための３．０のペナルティ及び各ギャップで各記号のための追加の０．１０ペナルティ（またはギャップ開放ペナルティ１０、ギャップ伸長ペナルティ０．５）；及び（３）末端ギャップのための無ペナルティを含んでもよい。したがって、本明細書で使用されるものとして、用語、「相同性」または「同一性」は、配列間の関連性（relevance）を示す。
【００１４】
本明細書において、用語、「変異体（variant）」は、一つ以上のアミノ酸が保存的置換（conservative substitution）及び／または変形（modification）において、前記列挙された配列（the recited sequence）と相異するが、前記タンパク質の機能（functions）または特性（properties）が維持されるポリペプチドを指す。変異型ポリペプチドは、数個のアミノ酸置換、欠失または付加によって識別される配列（identified sequence）と異なる。このような変異型は、一般的に前記ポリペプチド配列のいずれかを変形し、前記変形されたポリペプチドの特性を評価して識別されうる。つまり、変異型の能力は本来のタンパク質（native protein）に比べて増加したり、変わらなかったり、または減少されうる。また、一部の変異型は、Ｎ末端のリーダー配列または膜転移ドメイン（transmembrane domain）のような一つ以上の部分が除去された変異型を含んでもよい。他の変異型は、成熟タンパク質（mature protein）のＮ及び／またはＣ末端から一部が除去された変異型を含んでもよい。
【００１５】
本明細書において、用語、「保存的置換（conservative substitution）」は、１つのアミノ酸を類似の構造的及び／または化学的性質を有する別のアミノ酸に置換させることを意味する。前記変異型は一つ以上の生物学的活性を依然として保有しながら、例えば、一つ以上の保存的置換を有してもよい。このようなアミノ酸置換は、一般的に残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、及び／または両親媒性（amphipathic nature）での類似性に基づいて発生しうる。例えば、正で荷電された（塩基性）アミノ酸は、アルギニン、リジン、及びヒスチジンを含み；負で荷電された（酸性）アミノ酸は、グルタミン酸及びアスパラギン酸を含み；芳香族アミノ酸は、フェニルアラニン、トリプトファン、及びチロシンを含み；疎水性アミノ酸は、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、グリシン及びトリプトファンを含む。
【００１６】
また、変異型はポリペプチドの特性と２次構造に最小限の影響を有するアミノ酸の欠失または付加を含んでもよい。例えば、ポリペプチドは翻訳同時に（co−translationally）または翻訳後に（post−translationally）、タンパク質の転移（transfer）に関与するタンパク質Ｎ末端のシグナル（またはリーダー）配列とコンジュゲートしうる。また、前記ポリペプチドはポリペプチドを確認、精製、または合成できるように、他の配列またはリンカーとコンジュゲートされうる。
【００１７】
具体的には、本発明の５’−イノシン酸を排出するタンパク質変異体は、配列番号２のアミノ酸配列のＮ末端から、１２３番目のアミノ酸、２４３番目のアミノ酸、３８７番目のアミノ酸、４０５番目のアミノ酸、４１３番目のアミノ酸または４５８番目のアミノ酸からなる群から選択される１つ以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有するタンパク質変異体であってもよいが、これらに限定されない。
例えば、本発明の５’−イノシン酸排出能を有するタンパク質変異体は配列番号２のアミノ酸配列のＮ末端から１２３番目のアミノ酸がシステインに置換（Ｆ１２３Ｃ）、２４３番目のアミノ酸がバリンに置換（Ｉ２４３Ｖ）、３８７番目のアミノ酸がトレオニンに置換（Ｓ３８７Ｔ）、４０５番目のアミノ酸がチロシンに置換（Ｆ４０５Ｙ）、４１３番目のアミノ酸がトレオニンに置換（Ｍ４１３Ｔ）、４５８番目のアミノ酸がリジンに置換（Ｎ４５８Ｋ）、または前記置換を組み合わせたアミノ酸配列を有する５’−イノシン酸を排出するタンパク質変異体であってもよいが、これに制限されない。より具体的には、前記５’−イノシン酸排出能を有するタンパク質変異体は、配列番号７３、７４、７５、７６、７７、７８、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、 １２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、または１５５を有するアミノ酸配列、またはこれと少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。さらに、このような相同性を有し、前記タンパク質に相応する効能を示すアミノ酸配列を有するタンパク質であれば、一部の配列が欠失、変形、置換、または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質も、本発明のタンパク質として使用されることは自明である。
【００１８】
また、本発明の５’−イノシン酸を排出するタンパク質変異体は、さらに、配列番号２のアミノ酸配列のＮ末端から２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換、６４番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換、または前記置換が組み合わせされたアミノ酸配列からなる、５’−イノシン酸を排出するタンパク質変異体であってもよい。具体的には、本発明の５’−イノシン酸を排出するタンパク質変異体は、さらに、配列番号２のアミノ酸配列のＮ末端から２番目のアミノ酸がイソロイシンに置換、６４番目のアミノ酸がグルタミン酸またはアスパラギン酸に置換、または前記置換が組み合わせされたアミノ酸配列からなる、５’−イノシン酸を排出するタンパク質変異体であってもよい。
【００１９】
前記「他のアミノ酸に置換」は、置換前のアミノ酸と異なるアミノ酸であれば、制限されない。例えば、配列番号２のアミノ酸配列のＮ末端から２番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換される場合、前記他のアミノ酸は、バリン以外のアミノ酸であれば制限されず、６４番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換される場合、前記他のアミノ酸はグリシン以外のアミノ酸であれば、制限されない。
【００２０】
本発明の他の一つの様態は、本発明のタンパク質変異体をコードするポリヌクレオチド、または本発明のポリヌクレオチドを含むベクターを提供することにある。
本発明において、用語、「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチド単位体（monomer）が共有結合によって長く鎖状につながったヌクレオチドのポリマー（polymer）であって、一定の長さ以上のＤＮＡまたはＲＮＡ鎖を意味する。
【００２１】
本発明のポリヌクレオチドは、コドン縮退性（codon degeneracy）によって前記配列番号７３、７４、７５、７６、７７、７８、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３または１５５のアミノ酸配列からなるタンパク質またはこれと相同性を有するタンパク質に翻訳されうるポリヌクレオチドも含まれることは自明である。例えば、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号７９、８０、８１、８２、８３、８４、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４または１５６の塩基配列を有するポリヌクレオチドであってもよく、より具体的には、配列番号７９、８０、８１、８２、８３、８４、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４または１５６の塩基配列で構成されたポリヌクレオチドであってもよい。また、公知の遺伝子配列から調製されうるプローブ、例えば、前記塩基配列の全体または一部に対する相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリッド化し、配列番号７３、７４、７５、７６、７７、７８、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、 １２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３または１５５のアミノ酸配列を有するタンパク質の活性を有するタンパク質をコードする配列であれば、制限なく含まれてもよい。
【００２２】
前記「ストリンジェントな条件」とは、ポリヌクレオチド間の特異的ハイブリダイズを可能にする条件を意味する。これらの条件は、文献（例えば、J. Sambrook et al.、同上）に具体的に記載されている。例えば、相同性が高い遺伝子同士、４０％以上、具体的には、９０％以上、より具体的には、９５％以上、さらに具体的には、９７％以上、特に具体的には、９９％以上の相同性を有する遺伝子同士でハイブリッド化し、それより相同性が低い遺伝子同士はハイブリッド化しない条件、または通常のサザンハイブリッド化の洗浄条件である６０℃、１×ＳＳＣ 、０．１％ＳＤＳ、具体的には、６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、より具体的には、６８℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度及び温度で、１回、具体的には、２回〜３回洗浄する条件が挙げられる。
【００２３】
ハイブリダイズは、たとえハイブリッド化の厳密度に応じて塩基間のミスマッチ（mismatch）が可能であっても、２つの核酸が相補的配列を有することを要求する。用語、「相補的」は、互いにハイブリッド化が可能なヌクレオチド塩基間の関係を記述するために使用される。例えば、ＤＮＡに関すると、アデノシンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。したがって、本発明は、また、実質的に類似の核酸配列だけでなく、全体配列に相補的な単離された核酸断片を含みうる。
具体的には、相同性を有するポリヌクレオチドは、５５℃のＴｍ値でハイブリダイズ段階を含むハイブリダイズ化条件を用い、上述した条件を用いて探知することができる。また、前記Ｔｍ値は、６０℃、６３℃または６５℃であってもよいが、これに制限されるものではなく、その目的に応じて当業者によって適切に調節されうる。
ポリヌクレオチドをハイブリッド化する適切な厳密度は、ポリヌクレオチドの長さ及び相補性の程度に依存し、変数は当該技術分野でよく知られている（非特許文献８参照）。
本発明で５’−イノシン酸の排出能を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドは、ｉｍｐＥ２遺伝子であってもよく、前記ポリヌクレオチドについての説明は前述した通りである。
本発明で５’−イノシン酸の排出能を有するタンパク質変異体をコードするポリヌクレオチドも、前述した通りである。
本発明で使用する用語、「ベクター」は、適切な宿主内で目的のタンパク質を発現できるように、適切な調節配列に作動可能に連結された前記目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列を含有するＤＮＡ製造物を意味する。前記調節配列は、転写を開始しうるプロモーター、このような転写を調節するための任意のオペレーター配列、適合したｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、及び転写及び解読の終結を調節する配列を含んでもよい。ベクターは、適当な宿主細胞内に形質転換された後、宿主ゲノムとは無関係に複製または機能することができ、ゲノムそのものに統合されてもよい。
本発明で用いられるベクターは、宿主細胞内で複製可能なものであれば、特に限定されず、当業界に知られている任意のベクターを用いてもよい。通常用いられるベクターの例としては、天然の状態であるか、組換えされた状態のプラスミド、コスミド、ウイルス及びバクテリオファージが挙げられる。例えば、ファージベクターまたはコスミドベクターとして、ｐＷＥ１５、Ｍ１３、ＭＢＬ３、ＭＢＬ4、ＩＸＩＩ、ＡＳＨＩＩ、ＡＰＩＩ、ｔ１０、ｔ１１、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、及びＣｈａｒｏｎ２１Ａなどを用いてもよく、プラスミドベクターとして、ｐＢＲ系、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ系、ｐＧＥＭ系、ｐＴＺ系、ｐＣＬ系とｐＥＴ系などを用いてもよい。具体的には、ｐＤＺ、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＣＬ、ｐＥＣＣＧ１１７、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＷ１１８、ｐＣＣ１ＢＡＣベクターなどを用いてもよい。
【００２４】
一例として、細胞内の染色体挿入用ベクターを介して、染色体内に目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを変異されたポリヌクレオチドに交替してもよい。前記ポリヌクレオチドの染色体内への挿入は、当業界で知られている任意の方法、例えば、相同組換えによって行われてもよいが、これに限定されない。前記染色体が挿入されたかどうかを確認するための選別マーカー（selection marker）をさらに含んでもよい。選別マーカーは、ベクターで形質転換された細胞を選別、すなわち目的核酸分子が挿入されたかどうかを確認するためのものであり、薬物耐性、栄養要求性、細胞毒性剤に対する耐性または表面タンパク質の発現のような選択可能の表現型を付与するマーカーが使用されてもよい。選択剤（selective agent）が処理された環境では、選別マーカーを発現する細胞のみ生存するか、または他の表現形質を示すので、形質転換された細胞を選別することができる。
【００２５】
本発明のもう一つの様態として、本発明は、本発明のタンパク質変異体を含むか、本発明のタンパク質変異体をコードするポリヌクレオチドまたは本発明のベクターを含む、５’−イノシン酸を生産する微生物を提供する。具体的には、本発明の微生物は、本発明のタンパク質変異体をコードするポリヌクレオチドを含むベクターで形質転換によって製造される微生物であってもよいが、これに制限されない。
本明細書において、用語、「形質転換」は、標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを宿主細胞内に導入して、宿主細胞内で前記ポリヌクレオチドがコードするタンパク質が発現できるようにすることを意味する。形質転換されたポリヌクレオチドは宿主細胞内で発現することさえできれば、宿主細胞の染色体内に挿入され位置するか、染色体外に位置するかに関係なく、これらをすべて含んでもよい。また、前記ポリヌクレオチドは、標的タンパク質をコードするＤＮＡ及びＲＮＡを含む。前記ポリヌクレオチドは、宿主細胞内に導入されて発現できるものであれば、あらゆる形態で導入されるものであっても構わない。例えば、前記ポリヌクレオチドは、それ自体で発現されるのに必要なすべての要素を含む遺伝子構造体である発現カセット（expression cassette）の形態で宿主細胞に導入されることができる。前記発現カセットは、通常、前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されているプロモーター（promoter）、転写終結シグナル、リボソーム結合部位、及び翻訳終結シグナルを含んでもよい。前記発現カセットは、それ自体の複製が可能な発現ベクターの形態であってもよい。また、前記ポリヌクレオチドは、それ自体の形態で宿主細胞に導入されて宿主細胞で発現に必要な配列と作動可能に連結されているものであってもよく、これに限定されない。
【００２６】
また、前記で用語、「作動可能に連結された」ものとは、本発明の目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドの転写を開始及び媒介するようにするプロモーター配列と前記遺伝子配列が機能的に連結されていることを意味する。
本明細書で使用される用語、「５’−イノシン酸を生産する微生物」とは、自然的に５’−イノシン酸生産能を有している微生物または５’−イノシン酸の生産能及び／または排出能のない親菌株に５’−イノシン酸の生産能及び排出能付与された微生物を意味する。本発明において、前記５’−イノシン酸を生産する微生物は、５’−イノシン酸を排出する微生物または５’−イノシン酸排出能を有する微生物と混用して使用してもよい。
前記５’−イノシン酸を生産する微生物は、本発明の５’−イノシン酸を排出するタンパク質変異体を含むか、前記タンパク質変異体をコードするポリヌクレオチドを含むか、または前記タンパク質変異体をコードするポリヌクレオチドを含むベクターで形質転換されて、タンパク質変異体を発現できる宿主細胞または微生物を含んでもよい。具体的には、本発明の微生物には、エシェリキア（Escherichia）属、セラチア（Serratia）属、エルウィニア（Erwinia）属、エンテロバクテリア（Enterobacteria）属、サルモネラ（Salmonella）属、ストレプトマイセス（Streptomyces）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属またはコリネバクテリウム（Corynebacterium）属などの微生物菌株が含まれてもよく、より具体的には、本発明の微生物はコリネバクテリウム属微生物であってもよい。
【００２７】
本明細書において、用語、「５’−イノシン酸を生産するコリネバクテリウム属（the genus Corynebacterium）微生物」とは、天然型または変異を介して５’−イノシン酸生産能を有しているコリネバクテリウム属微生物を意味する。具体的には、本発明で５’−イノシン酸生産能を有するコリネバクテリウム属微生物とは、天然型菌株それ自体または外部５’−イノシン酸の生産メカニズムと関連された遺伝子ガ挿入されたり、内在的遺伝子の活性を強化させたり弱化させて、向上された５’−イノシン酸の生産能を有するようになったコリネバクテリウム属微生物であってもよい。より具体的には、本発明で５’−イノシン酸生産能を有するコリネバクテリウム属微生物は、本発明の５’−イノシン酸を排出するタンパク質変異体を含むか、これをコードするポリヌクレオチドを含むか、または前記タンパク質変異体をコードするポリヌクレオチドを含むベクターで形質転換され、向上された５’−イノシン酸生産能を有するようになったコリネバクテリウム属微生物であってもよい。前記「向上された５’−イノシン酸の生産能を有するようになったコリネバクテリウム属微生物」は、形質転換前の親菌株または非変形微生物より５’−イノシン酸生産能が向上された微生物であってもよい。前記「非変形微生物」は、天然型菌株自体であるか、前記５’−イノシン酸を排出するタンパク質変異体を含まない微生物、または前記５’−イノシン酸を排出するタンパク質変異体をコードするポリヌクレオチドを含むベクターで形質転換されていない微生物であってもよい。
【００２８】
本発明の一具体例として、本発明の微生物は、アデニロコハク酸シンテターゼ（adenylosuccinate synthetase）、及び／またはＩＭＰデヒドロゲナーゼ（IMP dehydrogenase）の活性がさらに弱化されたコリネバクテリウム属微生物であってもよい。
本発明において、コリネバクテリウム属微生物は、具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum ）、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）、ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavum）、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス（Corynebacterium thermoaminogenes）、コリネバクテリウム・エフィシエンス（Corynebacterium efficiens）、またはコリネバクテリウム・スタティオニス（Corynebacterium stationis）であってもよいが、必ずこれに限定されるものではない。
【００２９】
本発明はもう一つの様態として、本発明の５’−イノシン酸を生産するコリネバクテリウム属微生物を培地で培養する段階を含む、５’−イノシン酸の製造方法を提供する。
具体的には、本発明の方法は、本発明の微生物または本発明の培地から５’−イノシン酸を回収する段階をさらに含んでもよい。
本発明の方法において、前記微生物を培養する段階は、特に制限されないが、公知の回分式培養方法、連続式培養方法、流加式培養方法などにより行われてもよい。このとき、培養条件は、特にこれに制限されないが、塩基性化合物（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムまたはアンモニア）または酸性化合物（例えば、リン酸または硫酸）を用いて適正ｐＨ（例えば、ｐＨ５〜９、具体的には、ｐＨ６〜８、最も具体的には、ｐＨ６．８）を調節してもよく、酸素または酸素含有ガス混合物を培養物に導入させて好気性条件を維持してもよい。培養温度は２０〜４５℃、具体的には、２５〜４０℃を維持してもよく、約１０〜１６０時間培養してもよいが、これに制限されるものではない。前記培養によって生産された５’−イノシン酸は、培地中に分泌されるか細胞内に残留しうる。
【００３０】
また、用いられる培養用培地は、炭素供給源としては、糖及び炭水化物（例えば、グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、糖蜜、でん粉及びセルロース）、油脂及び脂肪 （例えば、大豆油、ヒマワリ油、ピーナッツ油及びココナッツ油）、脂肪酸（例えば、パルミチン酸、ステアリン酸及びリノール酸）、アルコール（例えば、グリセロール及びエタノール）及び有機酸（例えば、酢酸）などを個別に用いたり、または混合して用いてもよいが、これに制限されない。窒素供給源としては、窒素含有有機化合物（例えば、ペプトン、酵母抽出液、肉汁、麦芽抽出液、トウモロコシ浸漬液、大豆粕粉及びウレア）、または無機化合物（例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸アンモニウム）などを個別に用いたり、または混合して用いてもよいが、これに制限されない。リン供給源としては、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、これに相応するナトリウム含有塩などを個別に用いたり、または混合して用いてもよいが、これに制限されない。また、培地には他の金属塩（例えば、硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄）、アミノ酸及びビタミンのような必須成長促進物質を含んでもよい。
【００３１】
本発明の前記培養段階で生産された５’−イノシン酸を回収する方法は、培養方法によって当該分野で公知の適切な方法を用いて培養液から目的とする５’−イノシン酸を収集してもよい。例えば、遠心分離、ろ過、陰イオン交換クロマトグラフィー、結晶化及びＨＰＬＣなどが用いられてもよく、当該分野で公知の適切な方法を用いて培地または微生物から目的とする５’−イノシン酸を回収してもよい。
また、前記回収段階は、精製工程を含んでもよく、当該分野で公知の適切な方法を用いて行ってもよい。したがって、前記回収された５’−イノシン酸は、精製された形態または５’−イノシン酸を含有した微生物発酵液であってもよい 。
【００３２】
本発明のもう一つの様態として、本発明の５’−イノシン酸排出タンパク質変異体またはこれをコードするポリヌクレオチドを含む５’−イノシン酸生産用組成物を提供する。
本発明の組成物は、さらに、前記ポリヌクレオチドを作動させることができる構成を制限なく含んでもよい。本発明の組成物で、前記ポリヌクレオチドは、導入された宿主細胞で作動可能に連結された遺伝子を発現させうるようにベクター内に含まれた形態であってもよい。
また、前記組成物は、５’−イノシン酸生産用組成物に通常使用される任意の適切な賦形剤をさらに含んでもよい。これらの賦形剤としては、例えば、保存剤、湿潤剤、分散剤、懸濁化剤、緩衝剤、安定化剤、または等張化剤などであってもよいが、これに限定されるものではない。
【００３３】
本発明は、もう一つの様態として、コリネバクテリウム属微生物の５’−イノシン酸の生産増加のための、本発明のタンパク質変異体の用途を提供する。
本発明は、もう一つの様態として、コリネバクテリウム属微生物で配列番号２のアミノ酸配列で構成されたタンパク質の活性を強化する段階を含む、５’−イノシン酸の排出増加方法を提供する。具体的には、前記配列番号２のアミノ酸配列で構成されたタンパク質の活性の強化は、前記配列番号２のアミノ酸配列のＮ末端から１２３番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換、２４３番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換 、３８７番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換、４０５番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換、４１３番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換、４５８番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換、または前記置換が組み合わせされたアミノ酸配列からなる５’−イノシン酸排出タンパク質変異体を前記コリネバクテリウム属微生物に導入、適用または含めることにより行ってもよい。前記用語、「５’−イノシン酸排出タンパク質」、「５’−イノシン酸排出タンパク質変異体」及び「コリネバクテリウム属微生物」は、前述したとおりである。
本発明は、もう一つの様態として、コリネバクテリウム属微生物の５’−イノシン酸の排出増加のための、本発明のタンパク質変異体の用途を提供する。
【００３４】
以下、本発明を実施例により詳細に説明する。しかし、これらの実施例は、本発明を例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例により制限されるものではなく、本発明が属する技術分野で通常の知識を有する者にとって明らかであろう。
【００３５】
実施例１：ＩＭＰ排出タンパク質の発掘
ＩＭＰ排出に関与するコリネバクテリウム属の膜タンパク質を同定するため、コリネバクテリウム・スタティオニス（Corynebacterium stationis）ＡＴＣＣ６８７２のゲノミックＤＮＡライブラリを製作した。
以後、コリネバクテリウム属野生型の菌株は、ＩＭＰを生産できないか、ＩＭＰを生産しても、非常に極微量が生産されるだけなので、ＩＭＰ生産能を確認するために、ＩＭＰ生産能を有するＡＴＣＣ６８７２由来のＣＪＩ０３２３菌株を製作した。製作されたＣＪＩ０３２３菌株にＡＴＣＣ６８７２のゲノミックＤＮＡライブラリを用いてＩＭＰ排出に関与する膜タンパク質のスクリーニングを行った。具体的な実験は、以下のとおりである。
【００３６】
実施例１−１：ＩＭＰ生産株であるＣＪＩ０３２３菌株の選別
ＡＴＣＣ６８７２由来のＩＭＰ生産株を作製するために、ＡＴＣＣ６８７２をリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．０）、またはクエン酸緩衝液（ｐＨ５．５）に１０７〜１０８細胞／ｍｌで懸濁させた。ここにＵＶを室温または３２℃で２０〜４０分間処理して突然変異を誘発させた。２回にかけて０．８５％食塩水で洗浄して希釈した後、１．７％寒天を含有した最小培地に耐性を付与しようとする物質を適正濃度に含有した培地に塗抹した後コロニーを得た。それぞれのコロニーを栄養培地で培養し、種培地で２４時間培養した。発酵培地で３〜４日間培養した後、培養液に蓄積されたＩＭＰ生産量が最も優れたコロニーを選別した。高濃度ＩＭＰ生産株を製作するために、アデニン要求性、グアニン漏出型、リゾチーム感受性、３,４−デヒドロプロリン耐性、ストレプトマイシン耐性、アゼチジンカルボン酸耐性、チアプロリン耐性、アザセリン耐性、スルファグアニジン耐性、ノルバリン耐性、トリメトプリム耐性を付与するために、前記過程をそれぞれの物質に対して順次行い、前記物質に対する耐性が付与されてＩＭＰ生産能の優れたＣＪＩ０３２３を最終選別した。下記の表１にＡＴＣＣ６８７２に比べたＣＪＩ０３２３の耐性程度を比較して示した。
【００３７】
【表１】
0006648345.tif 000002
【００３８】
−最小培地：ブドウ糖２％、硫酸ナトリウム０．３％、リン酸第１カリウム０．１％、リン酸第２カリウム０．３％、硫酸マグネシウム０．３％、塩化カルシウム１０ｍｇ／ｌ、硫酸鉄１０ｍｇ／ｌ、硫酸亜鉛１ｍｇ／ｌ、塩化マンガン３．６ｍｇ／ｌ、Ｌ−システイン２０ｍｇ／ｌ、パントテン酸カルシウム１０ｍｇ／ｌ、チアミン塩酸塩５ｍｇ／ｌ、ビオチン３０μｇ／Ｌ、アデニン２０ｍｇ／ｌ、グアニン２０ｍｇ／ｌ、ｐＨ７．３
−栄養培地：ペプトン１％、肉汁１％、塩化ナトリウム０．２５%、酵母エキス１％、寒天２%、ｐＨ７．２
−種培地：ブドウ糖１％、ペプトン１％、肉汁１％、酵母エキス１％、塩化ナトリウム０．２５％、アデニン１００ｍｇ／ｌ、グアニン１００ｍｇ／ｌ、ｐＨ７．５
−発酵培地：グルタミン酸ナトリウム０．１％、塩化アンモニウム１％、硫酸マグネシウム１．２％、塩化カルシウム０．０１％、硫酸鉄２０ｍｇ／ｌ、硫酸マンガン２０ｍｇ／ｌ、硫酸亜鉛２０ｍｇ／ｌ、硫酸銅５ｍｇ／ｌ、Ｌ−システイン２３ｍｇ／ｌ、アラニン２４ｍｇ／ｌ、ニコチン酸８ｍｇ／ｌ、ビオチン４５μｇ／ｌ、チアミン塩酸５ｍｇ／ｌ、アデニン３０ｍｇ／ｌ、リン酸（８５％）１．９％、ブドウ糖２．５５％、果糖１．４５％になるように添加して用いた。
【００３９】
実施例１−２：ＣＪＩ０３２３の発酵力価の実験
種培地２ｍｌを直径１８ｍｍの試験管に分注して加圧殺菌した後、ＡＴＣＣ６８７２及びＣＪＩ０３２３をそれぞれ接種し、３０℃の温度で２４時間振とう培養して種培養液として用いた。発酵培地２９ｍｌを２５０ｍｌの振とう用三角フラスコに分注して１２１℃の温度で１５分間加圧殺菌した後、種培養液２ｍｌを接種して３日間培養した。培養条件は、回転数１７０ｒｐｍ、温度３０℃、ｐＨ７．５に調節した。
培養終了後、ＨＰＬＣ（SHIMAZDU LC20A）を用いた方法によりＩＭＰの生産量を測定し、培養結果は以下の表２のとおりである。
【００４０】
【表２】
0006648345.tif 000003
【００４１】
前記ＣＪＩ０３２３菌株はコリネバクテリウム・スタティオニスＣＮ０１−０３２３と命名し、ブダペスト条約下の国際寄託機関である韓国微生物保存センター（Korean Culture Center of Microorganisms、KCCM）に２０１７年１１月７日付で寄託し、寄託番号ＫＣＣＭ１２１５１Ｐを与えられた。
【００４２】
実施例１−３：排出タンパク質の発掘
１．７％の寒天を添加した最小培地内にさらにＩＭＰを添加してＣＪＩ０３２３菌株の生育低下（growth inhibition）を示すスクリーニング条件を確立した。ＡＴＣＣ６８７２ゲノミックライブラリプラスミドをＣＪＩ０３２３菌株に電気穿孔法で形質転換させて（非特許文献９）、過量のＩＭＰが添加された培地条件で生育低下が解除されるコロニーを選別した。選別されたコロニーからプラスミドを獲得し、シーケンスの技法により塩基配列を分析した。これから、過量のＩＭＰ添加条件で生育低下を解除させるのに関与する膜タンパク質の１種を同定した。
前記１種のコリネバクテリウム膜タンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列、及び配列番号４の塩基配列（NCBI GenBank：NZ_CP014279、WP_066795121、MFS transporter）と確認された。前記膜タンパク質は、ＭＦＳトランスポーターとして知られているが、明確な機能が確認されておらず、さらにＩＭＰ排出に関する機能は知られていない。本明細書では、これをＩｍｐＥ２（ＷＴ）と命名した。
【００４３】
実施例２：ＩｍｐＥ１、ＩｍｐＥ２の同定
実施例２−１：ｉｍｐＥ１、ｉｍｐＥ２の確認
前記膜タンパク質ＩｍｐＥ２の機能を調べるため、ＮＣＢＩから配列番号４の遺伝子構造を確認した（NCBI GenBank：NZ_CP014279、WP_066795121、MFS transporter）。ｉｍｐＥ２（配列番号４）のＯＲＦの開始部分の７ｂｐがそのｉｍｐＥ２上流に位置した他の遺伝子（NCBI GenBank：NZ_CP014279、WP_066795119、transcriptional regulator）と７ｂｐオーバーラップされることを確認した。ｉｍｐＥ２の上流に位置した遺伝子及び該当遺伝子からコードされるタンパク質は、まだ機能が確認されなかったので、本明細書ではこれをＩｍｐＥ１（ＷＴ）と命名した（配列番号１のアミノ酸配列及び配列番号３の塩基配列）。
【００４４】
実施例２−２：ｉｍｐＥ１またはｉｍｐＥ２欠損ベクターの製作
実施例１と２−１を介して同定したＩＭＰによる生育低下を解除させるのに関与するＩｍｐＥ１またはＩｍｐＥ２をＩＭＰ生産菌株で欠損させた場合、ＩＭＰの排出能が減少するのかを確認するために、各遺伝子の欠損ベクターを製作した。
ベクターを製作するための遺伝子断片は、ＡＴＣＣ６８７２ゲノミックＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを介して獲得した。
具体的には、前記ｉｍｐＥ１のＰＣＲは、配列番号５、６のプライマー及び配列番号７、８のプライマーを、ｉｍｐＥ２のＰＣＲは、配列番号９、１０のプライマー及び配列番号１１、１２のプライマーを用いた（表３）。
【００４５】
【表３】
0006648345.tif 000004
【００４６】
この時用いたプライマーは、米国国立衛生研究所ジェンバンク（NIH GenBank）に登録されているコリネバクテリウム・スタティオニス（Corynebacterium stationis、ＡＴＣＣ６８７２）遺伝子（NCBI Genbank：NZ_CP014279）及び周辺塩基配列に対する情報に基づいて製作した。ＰＣＲ法の条件は、９４℃で５分間のを２５回繰り返した後、７２℃で５分間重合反応を行った。配列番号５と６のプライマー、配列番号７と８のプライマーを用いて増幅されたｉｍｐＥ１遺伝子の二つの断片を鋳型として、オーバーラップポリメラーゼ連鎖反応を行い、１．８ｋｂｐのポリヌクレオチド鋳型を得た。得られた遺伝子の断片を制限酵素ＸｂａＩで切断した。Ｔ４リガーゼを用いて前記遺伝子断片をＸｂａＩ制限酵素で切断した線状のｐＤＺ（特許文献２及び３）のベクターにクローニングしてｐＤＺ−△ｉｍｐＥ１を製作した。また、配列番号９と１０のプライマーを用いて増幅されたｉｍｐＥ２遺伝子断片と配列番号１１と１２のプライマーを用いて増幅されたｉｍｐＥ２遺伝子の二つの断片を鋳型として、オーバーラップポリメラーゼ連鎖反応を行い、１．７ｋｂｐのポリヌクレオチド鋳型を得た。得られた遺伝子の断片を制限酵素ＸｂａＩ、ｓｐｅＩで切断した。Ｔ４リガーゼを用いて前記遺伝子断片をＸｂａＩ制限酵素で切断した線状のｐＤＺベクターにクローニングして、ｐＤＺ−△ｉｍｐＥ２を製作した。
【００４７】
実施例２−３：ｉｍｐＥ１、ｉｍｐＥ２統合欠損ベクターの製作
前記ＩＭＰによる生育低下を解除させるのに関与するタンパク質をコードする遺伝子ｉｍｐＥ１とｉｍｐＥ２はオーバーラップされているので、二つの遺伝子は同時に調節されるべく必要がある。したがって、ｉｍｐＥ１とｉｍｐＥ２の両方が欠損したベクターを製作した。
ｉｍｐＥ１とｉｍｐＥ２のＰＣＲは、配列番号５と６５のプライマー及び配列番号６６と１２のプライマーを用いた。この時用いたプライマーは、米国国立衛生研究所ジェンバンク（NIH GenBank）に登録されているコリネバクテリウム・スタティオニス（ＡＴＣＣ６８７２）遺伝子（NCBI Genbank：NZ_CP014279）及び周辺塩基配列に対する情報に基づいて製作した。配列番号５と６５のプライマーを用いて増幅されたｉｍｐＥ１遺伝子断片と配列番号６６と１２のプライマーを用いて増幅されたｉｍｐＥ２遺伝子の二つの断片を鋳型として、オーバーラップポリメラーゼ連鎖反応を行い、２．０ｋｂｐのポリヌクレオチド鋳型を得た。得られた遺伝子の断片を、それぞれＸｂａＩ、ｓｐｅＩで切断した。Ｔ４リガーゼを用いて前記遺伝子断片をＸｂａＩ制限酵素で切断した線状のｐＤＺベクターにクローニングして、ｐＤＺ−△ｉｍｐＥ１Ｅ２を製作した。
【００４８】
実施例２−４：ｉｍｐＥ１、ｉｍｐＥ２欠損菌株の製作
実施例２−２で製作した２種と実施例２−３で製作した１種のプラスミドをそれぞれＣＪＩ０３２３に電気穿孔法で形質転換した後（非特許文献１０による形質転換法利用）、相同性配列の組換えによって染色体上にベクターが挿入された菌株はカナマイシン（kanamycin）２５ｍｇ／Ｌを含有した培地から選別した。選別された１次菌株は再び２次交差（cross−over）を行った。最終的に形質転換された菌株の遺伝子が欠損されたかどうかは、配列番号５、８及び配列番号９、１２及び配列番号５、１２のプライマー対を用いてＰＣＲを行うことにより確認した。
選別された菌株は、ＣＪＩ０３２３＿△ｉｍｐＥ１、ＣＪＩ０３２３＿△ｉｍｐＥ２、ＣＪＩ０３２３＿△ｉｍｐＥ１Ｅ２と命名し、前記菌株のＩＭＰの生産能を評価した。
種培地２ｍｌを直径１８ｍｍの試験管に分注して加圧殺菌した後、ＣＪＩ０３２３、ＣＪＩ０３２３＿△ＩＭＰＥ１、ＣＪＩ０３２３＿△ＩＭＰＥ２、ＣＪＩ０３２３＿△ＩＭＰＥ１Ｅ２を接種し、３０℃の温度で２４時間振とう培養して種培養液として用いた。発酵培地２９ｍｌを２５０ｍｌの振とう用三角フラスコに分注して１２１℃の温度で１５分間加圧殺菌した後、種培養液２ｍｌを接種して３日間培養した。培養条件は、回転数１７０ｒｐｍ、温度３０℃、ｐＨ７．５に調節した。
培養終了後、ＨＰＬＣを用いた方法によりＩＭＰの生産量を測定し、培養結果は以下の表４のとおりである。
【００４９】
【表４】
0006648345.tif 000005
【００５０】
この時、親菌株であるコリネバクテリウム・スタティオニスＣＪＩ０３２３と培地内のＩＭＰ蓄積量を比較した結果、前記表４に示すようにＣＪＩ０３２３＿△ｉｍｐＥ１、ＣＪＩ０３２３＿△ｉｍｐＥ２、ＣＪＩ０３２３＿△ｉｍｐＥ１Ｅ２菌株が、同一の条件下でＣＪＩ０３２３に比べてＩＭＰの濃度が約８ｇ／Ｌ減少したことを確認し、ＩｍｐＥ１、ＩｍｐＥ２がＩＭＰの排出に関与するタンパク質であることを確認した。
【００５１】
実施例３：ＩＭＰ生産株ＣＪＩ０３２３のｉｍｐＥ１、ｉｍｐＥ２の塩基配列の確認
前記実施例１で高濃度ＩＭＰ生産をするＣＪＩ０３２３菌株の場合、高濃度のＩＭＰを生産するためにＩＭＰ排出能が向上した可能性がある。したがって、ＣＪ０３２３菌株のｉｍｐＥ１、ｉｍｐＥ２が変異されたかどうかを確認した。ＣＪＩ０３２３の染色体ＤＮＡをポリメラーゼ連鎖反応の方法（以下「ＰＣＲ方法」という）を介して増幅した。具体的には、まず、前記ＣＪＩ０３２３の染色体ＤＮＡを鋳型として、配列番号１３と１４のプライマーを用いて（表５）９４℃で１分間変性、５８℃で３０秒間結合、７２℃で２分間Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼで重合する条件を２８回繰り返すＰＣＲ方法を通じて、約２．８ｋｂの塩基対の断片を増幅した。
【００５２】
【表５】
0006648345.tif 000006
【００５３】
これを同じプライマーで塩基配列を分析した結果、野生型ＡＴＣＣ６８７２の塩基配列に比べて、ｉｍｐＥ１遺伝子の４９０番目のヌクレオチドであるｇがａに置換されていることを確認した。これはＩｍｐＥ１タンパク質の１６４番目のアミノ酸であるグルタミン酸がリジンに置換される変異であることを意味する。また、ｉｍｐＥ２遺伝子の４番目のヌクレオチドであるｇがａに置換されて（ｉｍｐＥ１遺伝子の６６６番目のヌクレオチドであるｇがａに置換されたことを意味する）、１９１番目のヌクレオチドであるｇがａに置換されていることを確認した。これはＩｍｐＥ２タンパク質の２番目のアミノ酸（ＩｍｐＥ１タンパク質の２２２番目のアミノ酸に該当）であるバリンがイソロイシンに置換され、６４番目のアミノ酸がグリシンからグルタミン酸に置換されていることを意味する。
ＣＪＩ０３２３菌株のｉｍｐＥ１ヌクレオチドはｉｍｐＥ１＿ＣＪＩ０３２３（配列番号８７）、タンパク質はＩｍｐＥ１＿ＣＪＩ０３２３（配列番号８５）と命名し、ＣＪＩ０３２３菌株のｉｍｐＥ２ヌクレオチドはｉｍｐＥ２＿ＣＪＩ０３２３（配列番号８８）、タンパク質はＩｍｐＥ２＿ＣＪＩ０３２３（配列番号８６）と命名した。
【００５４】
実施例４：ｉｍｐＥ１、ｉｍｐＥ２変異の復元
実施例４−１：ｉｍｐＥ１またはｉｍｐＥ２変異の復元ベクターの製作
前記実施例３でＩＭＰ生産菌株であるＣＪＩ０３２３菌株で、ｉｍｐＥ１、ｉｍｐＥ２が変異されたかどうかを確認した結果、ｉｍｐＥ１に１つ、ｉｍｐＥ２に２つの変異が含まれていることを確認した。ＣＪＩ０３２３菌株は高濃度でＩＭＰを生産する菌株であるため、前記変異がＩＭＰ排出能を向上させる変異である可能性が高い。したがって、変異のない天然の野生型であるＩｍｐＥに復元した後、さらに発掘されるタンパク質変異体がより高いＩＭＰ排出能を有するかどうかを確認するために、次の実験を行った。
復元ベクターを製作するために、天然の野生型菌株であるコリネバクテリウム・スタティオニス（Corynebacterium stationis）ＡＴＣＣ６８７２を鋳型としてＰＣＲを行った。配列番号８９と９０のプライマーを用いて増幅されたｉｍｐＥ１ｉｍｐＥ２遺伝子断片をＸｂａＩの制限酵素で処理し、ｐＤＺベクターのＸｂａＩ制限酵素の位置にクローニングして、ｐＤＺ−ｉｍｐＥ１Ｅ２（ＷＴ）を製作した。
【００５５】
実施例４−２：ｉｍｐＥ１またはｉｍｐＥ２変異復元菌株の製作
実施例４−１で製作した１プラスミドをＣＪＩ０３２３に電気穿孔法で形質転換した後（非特許文献１０による形質転換法利用）、相同性配列の組換えによって染色体上にベクターが挿入された菌株はカナマイシン（kanamycin）２５ｍｇ／Ｌを含有した培地から選別した。選別された１次菌株は再び２次交差（cross−over）を行った。最終的に形質転換された菌株の遺伝子変異が復元したかどうかは、配列番号８９、９０のプライマーを用いてＰＣＲを行い、塩基配列を分析することで確認した。以後、製作された菌株をＣＪＩ０３２３＿ｉｍｐＥ１Ｅ２（ＷＴ）と命名した。
【００５６】
実施例５：ｉｍｐＥ２変異の発掘
前記実施例３の結果を通して発掘された３種の変異のうち、最も高い５’−イノシン酸排出能を有する変異を選別し、これより高い排出能を有する変異を発掘するために次の実験を行った。
【００５７】
実施例５−１：ｉｍｐＥ１Ｅ２変異のうち、最も高い５’−イノシン酸排出能を有する変異の選別
ＩｍｐＥ１のＥ１６４Ｋ単独変異のベクターを製作するために、天然の野生型菌株であるコリネバクテリウム・スタティオニス（Corynebacterium stationis）ＡＴＣＣ６８７２を鋳型として配列番号９１と９２のプライマー及び配列番号９３と９４のプライマーを用いた。配列番号９１と９２のプライマーを用いて増幅されたＥ１６４Ｋ−１遺伝子断片と、配列番号９３と９４のプライマーを用いて増幅されたＥ１６４Ｋ−２遺伝子の二つの断片とを鋳型として、オーバーラップポリメラーゼ連鎖反応を行い、１．８ｋｂｐのポリヌクレオチド鋳型を得た。得られた遺伝子の断片を制限酵素ＸｂａＩで切断した。Ｔ４リガーゼを用いて前記遺伝子断片をＸｂａＩ制限酵素で切断した線状のｐＤＺベクターにクローニングして、ｐＤＺ−ｉｍｐＥ１（Ｅ１６４Ｋ）を製作した。
ＩｍｐＥ２のＶ２Ｉ単独変異ベクターを製作するために、ＡＴＣＣ６８７２を鋳型として配列番号９１と９５のプライマーと配列番号９６と９４のプライマーを用いた。配列番号９１と９５のプライマーを用いて増幅されたＶ２Ｉ−１遺伝子断片と、配列番号９６と９４のプライマーを用いて増幅されたＶ２Ｉ−２遺伝子の二つの断片とを鋳型として、オーバーラップポリメラーゼ連鎖反応を行い、１．８ｋｂｐのポリヌクレオチド鋳型を得た。得られた遺伝子の断片を制限酵素ＸｂａＩで切断した。 Ｔ４リガーゼを用いて前記遺伝子断片をＸｂａＩ制限酵素で切断した線状のｐＤＺベクターにクローニングして、ｐＤＺ−ｉｍｐＥ２（Ｖ２Ｉ）を製作した。
ＩｍｐＥ２のＧ６４Ｅ単独変異のベクターを製作するために、ＡＴＣＣ６８７２を鋳型として配列番号９１と９７のプライマー及び配列番号９８と９４のプライマーを用いた。配列番号９１と９７のプライマーを用いて増幅されたＧ６４Ｅ−１遺伝子断片と、配列番号９８と９４のプライマーを用いて増幅されたＧ６４Ｅ−２遺伝子の二つの断片とを鋳型として、オーバーラップポリメラーゼ連鎖反応を行い、１．８ｋｂｐのポリヌクレオチド鋳型を得た。得られた遺伝子の断片を制限酵素ＸｂａＩで切断した。Ｔ４リガーゼを用いて前記遺伝子断片をＸｂａＩ制限酵素で切断した線状のｐＤＺベクターにクローニングして、ｐＤＺ−ｉｍｐＥ２（Ｇ６４Ｅ）を製作した。
【００５８】
【表６】
0006648345.tif 000007
【００５９】
ＣＪＩ０３２３＿ｉｍｐＥ１Ｅ２（ＷＴ）菌株に実施例４−２で製作したプラスミドの３種を形質転換した後（非特許文献１０による形質転換法利用）、相同性配列の組換えによって染色体上にベクターが挿入された菌株はカナマイシン（kanamycin）２５ｍｇ／Ｌを含有した培地から選別した。選別された１次菌株は再び２次交差（cross−over）を行った。最終的に形質転換された菌株の遺伝子変異が導入されたかどうかは、配列番号１３、１４のプライマーを用いてＰＣＲを行い、塩基配列を分析することで確認した。選別された菌株は、ＣＪＩ０３２３＿ｉｍｐＥ１（Ｅ１６４Ｋ）、ＣＪＩ０３２３＿ｉｍｐＥ２（Ｖ２Ｉ）、ＣＪＩ０３２３＿ｉｍｐＥ２（Ｇ６４Ｅ）と命名した。
前記コリネバクテリウム・スタティオニスＣＪＩ０３２３＿ｉｍｐＥ１（Ｅ１６４Ｋ）、コリネバクテリウム・スタティオニスＣＪＩ０３２３＿ｉｍｐＥ２（Ｖ２Ｉ）及びコリネバクテリウム・スタティオニスＣＪＩ０３２３＿ｉｍｐＥ２（Ｇ６４Ｅ）菌株は、ブダペスト条約下の国際寄託機関である韓国微生物保存センター（Korean Culture Center of Microorganisms、KCCM）に２０１８年１１月２日付で寄託し、それぞれ寄託番号ＫＣＣＭ１２３５９Ｐ、ＫＣＣＭ１２３６０Ｐ及びＫＣＣＭ１２３６１Ｐを与えられた。
【００６０】
種培地２ｍｌを直径１８ｍｍの試験管に分注して加圧殺菌した後、ＣＪＩ０３２３＿ｉｍｐＥ１Ｅ２（ＷＴ）、ＣＪＩ０３２３＿ｉｍｐＥ１（Ｅ１６４Ｋ）、ＣＪＩ０３２３＿ｉｍｐＥ２（Ｖ２Ｉ）、ＣＪＩ０３２３＿ｉｍｐＥ２（Ｇ６４Ｅ）を接種し、３０℃の温度で２４時間振とう培養して種培養液として用いた。発酵培地２９ｍｌを２５０ｍｌの振とう用三角フラスコに分注して１２１℃の温度で１５分間加圧殺菌した後、種培養液２ｍｌを接種して３日間培養した。培養条件は、回転数１７０ｒｐｍ、温度３０℃、ｐＨ７．５に調節した。
培養終了後、ＨＰＬＣを用いた方法によりＩＭＰの生産量を測定し、培養結果は以下の表７のとおりである。
【００６１】
【表７】
0006648345.tif 000008
【００６２】
前記結果のように、３種の変異それぞれＩＭＰ排出に関与していることを確認し、その中でもＣＪＩ０３２３＿ｉｍｐＥ２（Ｇ６４Ｅ）のＩＭＰ生産量が最も高いことを確認した。
【００６３】
実施例５−２：ｉｍｐＥ２変異のアミノ酸置換挿入用ベクターの製作
前記結果を通して５’−イノシン酸の生産能の向上された代表的な３種の変異のうち、最も高いイノシン酸の排出能を示すｉｍｐＥ２（Ｇ６４Ｅ）の位置的重要性を確認するために、ｉｍｐＥ２のアミノ酸配列で６４番目のアミノ酸を他のアミノ酸に置換する変異導入用ベクターを製作した。
ＩｍｐＥ２（Ｇ６４Ｅ）変異導入用ベクターの製作過程は次のとおりである。
報告されたポリヌクレオチド配列に基づいてコリネバクテリウム・スタティオニスＣＪＩ０３２３の染色体遺伝子を分離し、これを鋳型として、配列番号１５と配列番号１６〜３３とのそれぞれのプライマー対を用いてポリメラーゼ連鎖反応を介して遺伝子断片を得た。ＰＣＲは、９４℃で５分間変性した後、９４℃で３０秒の変性、５５℃で３０秒のアニーリング、７２℃で１分間の重合を２０回繰り返した後、７２℃で５分間重合反応を行った。その結果、１８種の１ｋｂｐのポリヌクレオチドを獲得した。
【００６４】
次に、コリネバクテリウム・スタティオニスＣＪＩ０３２３の染色体遺伝子を分離して、配列番号３４と配列番号３５〜５２のそれぞれのプライマー対を用いてポリメラーゼ連鎖反応を介してそれぞれの遺伝子断片を得た。ＰＣＲは、９４℃で５分間変性した後、９４℃で３０秒の変性、５５℃で３０秒のアニーリング、７２℃で１分間の重合を２０回繰り返した後、７２℃で５分間重合反応を行った。その結果、１８種の１ｋｂｐのポリヌクレオチドを取得した。
前記結果を介して獲得した二つの断片を鋳型として、オーバーラップ伸長ＰＣＲ法を行い、１８種の２ｋｂｐのポリヌクレオチド鋳型を得た。得られた遺伝子の断片を制限酵素ＸｂａＩで切断し、Ｔ４リガーゼを用いて前記遺伝子断片をＸｂａＩ制限酵素で切断した線状のｐＤＺベクターに連結した後、大腸菌ＤＨ５αに形質転換して、カナマイシン（２５ｍｇ／Ｌ）が含まれたＬＢ固体培地に塗抹した。
ベクター製作のために用いたプライマー配列の情報は、表８のとおりである。
【００６５】
【表８】
0006648345.tif 000009
【００６６】
ＰＣＲを通して目的した遺伝子が挿入されたベクターで形質転換されたコロニーを選別した後、通常知られているプラスミド抽出法を用いてプラスミドを獲得し、獲得されたプラスミドの情報は表９のとおりである。
【００６７】
【表９】
0006648345.tif 000010
【００６８】
実施例５−３：ＩｍｐＥ２変異体の６４番目変異位置のアミノ酸が他のアミノ酸に置換された菌株の製作及び５’−イノシン酸生産能の比較
前記実施例３−１で製造した変異導入用ベクターの１８種をコリネバクテリウム・スタティオニスＣＪＩ０３２３に形質転換して、相同性配列の組換えによって染色体上にベクターが挿入された菌株はカナマイシン（kanamycin）２５ｍｇ／Ｌを含有した培地から選別した。選別された１次菌株は再び２次交差（cross−over）を行った。最終的に形質転換された菌株の遺伝子変異が導入するかどうかは、配列番号１３、１４のプライマーを用いてＰＣＲを行い、塩基配列を分析することで確認した。挿入された変異による菌株名は次の表１０のとおりである。
【００６９】
【表１０】
0006648345.tif 000011
【００７０】
実施例２と同様の方法で培養して、そこから５’−イノシン酸の濃度を分析した（表１１）。
【００７１】
【表１１】
0006648345.tif 000012
【００７２】
前記の結果のように、すべての変異菌株は、ＣＪＩ０３２３＿ｉｍｐＥ２（ＷＴ）に比べてＩＭＰ生産能が増加したので、前記ｉｍｐＥ２の６４番の変異位置は、ＩｍｐＥタンパク質のＩＭＰ排出能の増加に影響を与える重要な変異位置であることを再確認した。特にＩｍｐＥ２のアミノ酸配列から６４番目のアミノ酸であるグリシンがグルタミン酸から他のアミノ酸であるアスパラギン酸に置換される場合、６４番目のアミノ酸変異がないＣＪＩ０３２３_ｉｍｐＥ１（Ｅ１６４Ｋ）＿ｉｍｐＥ２（Ｖ２Ｉ）菌株に比べて１７２％も増加した。また、５’−イノシン酸生産能が野生型に復元された菌株であるＣＪＩ０３２３＿ｉｍｐＥ１Ｅ２（ＷＴ）に比べ３９７％も向上しており、ＣＪＩ０３２３に比べて２０％向上されることを確認した。
【００７３】
実施例６：人工突然変異法を用いたｉｍｐＥ変異のライブラリ
より高いＩＭＰ排出能を有するタンパク質変異体を獲得するために、下記の方法で染色体内の１次交差挿入用ベクターのライブラリを製作した。
実施例５−３の結果で最も高いＩＭＰ排出能を有するものと確認された菌株ＣＪＩ０３２３：：ｉｍｐＥ２（Ｇ６４Ｄ）のｉｍｐＥ２を対象にＥｒｒｏｒ−Ｐｒｏｎｅ ＰＣＲを行った。ＣＪＩ０３２３：：Ｇ６４Ｄが保有している６４番目のアミノ酸の後のアミノ酸配列に変異を導入するために、ｉｍｐＥ２の１９３番目の塩基配列から下流の約１３０ｂｐの塩基配列まで、塩基置換変異がランダムに導入されたｉｍｐＥ遺伝子変異体（１．６ｋｂｐ）を獲得した。Ｅｒｒｏｒ−Ｐｒｏｎｅ ＰＣＲはＤｉｖｅｒｓｉｆｙ ＰＣＲ Ｒａｎｄｏｍ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Clontech）を使用して行い、ＣＪＩ０３２３：：ｉｍｐＥ２（Ｇ６４Ｄ）のゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号５３、及び配列番号５４のプライマー対（表１２）を用いてポリメラーゼ連鎖反応を介して遺伝子断片を得た。
【００７４】
【表１２】
0006648345.tif 000013
【００７５】
増幅された遺伝子断片に変異が１ｋｂ当り０〜３．５個が導入されるようにし、ＰＣＲは９４℃で５分間変性した後、９４℃で３０秒の変性、６０℃で３０秒のアニーリング、７２℃で１分３６秒間の重合を３０回繰り返しした後、７２℃で５分間重合反応を行った。その結果、１．６ｋｂｐのポリヌクレオチドを獲得した。増幅された遺伝子断片をｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ ＴＡクローニングキット（Invitrogen）を用いてｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクターに連結して大腸菌ＤＨ５αに形質転換してカナマイシン（２５ｍｇ／Ｌ）が含まれたＬＢ固体培地に塗抹した。形質転換されたコロニー２０種を選別した後、プラスミドを獲得してポリヌクレオチド配列を分析した結果、３．５変異／ｋｂの頻度で互いに異なる位置に変異が導入されたことを確認した。約２０，０００個の形質転換された大腸菌コロニーを取ってプラスミドを抽出し、これをｐＴＯＰＯ_ｉｍｐＥ ｌｉｂｒａｒｙと命名した。
【００７６】
実施例７：ｉｍｐＥ ｌｉｂｒａｒｙベクターが挿入された菌株の選別
実施例６で製造したｐＴＯＰＯ_ｉｍｐＥ ｌｉｂｒａｒｙ ベクターをＩＭＰを高濃度で生産する菌株ＣＪＩ０３２３：：ｉｍｐＥ２（Ｇ６４Ｄ）に電気穿孔法で形質転換した後、カナマイシン２５ｍｇ／Ｌを含有した栄養培地に塗抹して変異遺伝子が挿入された菌株、１０，０００個のコロニーを確保し、各コロニーをＣＪＩ０３２３：：ｉｍｐＥ２（Ｇ６４Ｄ）／ｐＴＯＰＯ＿ｉｍｐＥ（ｍｔ）１から ＣＪＩ０３２３：：ｉｍｐＥ２（Ｇ６４Ｄ）／ｐＴＯＰＯ＿ｉｍｐＥ（ｍｔ）１００００までと命名した。
【００７７】
−栄養培地：ペプトン１％、肉汁１％、塩化ナトリウム０．２５%、酵母エキス１％、寒天２%、ｐＨ７．２
−種培地：ブドウ糖１％、ペプトン１％、肉汁１％、酵母エキス１％、塩化ナトリウム０．２５％、アデニン１００ｍｇ／ｌ、グアニン１００ｍｇ／ｌ、ｐＨ７．５
−発酵培地：グルタミン酸ナトリウム０．１％、塩化アンモニウム１％、硫酸マグネシウム１．２％、塩化カルシウム０．０１％、硫酸鉄２０ｍｇ／ｌ、硫酸マンガン２０ｍｇ／ｌ、硫酸亜鉛２０ｍｇ／ｌ、硫酸銅５ｍｇ／ｌ、Ｌ−システイン２３ｍｇ／ｌ、アラニン２４ｍｇ／ｌ、ニコチン酸８ｍｇ／ｌ、ビオチン４５μｇ／ｌ、チアミン塩酸５ｍｇ／ｌ、アデニン３０ｍｇ／ｌ、リン酸（８５％）１．９％、ブドウ糖２．５５％、果糖１．４５％になるように添加して用いた。
【００７８】
確保された１０，０００個のコロニーをそれぞれ加圧殺菌した種培地２００μｌに接種した９６ディープウェルプレートを、マイクロプレート振とう機（Microplate shaker（TAITEC））を用いて３０℃の温度、１２００ｒｐｍで２４時間振とう培養し、種培養液として用いた。加圧殺菌した発酵培地２９０μｌを９６ディープウェルプレートに分注した後、種培養液２０μｌずつ接種し、前記条件と同様に７２時間振とう培養した。
【００７９】
培養液から生産された５’−イノシン酸の生産量を分析するために、培養終了後の培養上澄み液３μlを蒸留水が１９７μlずつ分注された９６ウェルＵＶプレートに移した。次に、マイクロプレートリーダー（Microplate reader）を用いて３０秒間振とうし、２５℃、波長２７０ｎｍで分光光度計で吸光度を測定し、対照区であるＣＪＩ０３２３：：ｉｍｐＥ２（Ｇ６４Ｄ）菌株の吸光度と比較して１０％以上増加した吸光度を示す５０個の変異菌株コロニーを選別した。その他のコロニーは対照区に比べて類似または減少した吸光度を示した。
選別された５０個の菌株は、前記と同様に吸光度を測定し、５’−イノシン酸生産量の確認を繰り返して行った。そして、ＣＪＩ０３２３：：ｉｍｐＥ２（Ｇ６４Ｄ）菌株に比べて５’−イノシン酸の生産能が向上した菌株の上位４種を選別した。
【００８０】
実施例８：ｉｍｐＥ２変異ライブラリ選別株の５’−イノシン酸生産能の確認
前記実施例７で選別した４種の菌株の５’−イノシン酸生産能を比較するために、以下のような方法で培養し、培養液の成分を分析した。
加圧殺菌した直径１８ｍｍの試験管に実施例２と同じ種培地５ｍｌを接種し、３０℃の温度で２４時間振とう培養して種培養液として用いた。実施例２と同じ発酵培地２９ｍｌを２５０ｍｌの振とう用三角フラスコに分注して１２１℃の温度で１５分間加圧殺菌した後、種培養液２ｍｌを接種して４〜５日間培養した。培養条件は、回転数１７０ｒｐｍ、温度３０℃、ｐＨ７．５に調節した。培養終了後、ＨＰＬＣを用いた方法により５’−イノシン酸の生産量を測定した。
５０種の菌株の中で、５’−イノシン酸の上位４種の菌株を選別して、前記培養及び分析を繰り返し行い、分析された５’−イノシン酸の濃度は、表１３の通りである。
【００８１】
【表１３】
0006648345.tif 000014
【００８２】
５’−イノシン酸の濃度分析の結果、４種の選別株の５’−イノシン酸濃度がＣＪＩ０３２３：：ｉｍｐＥ２（Ｇ６４Ｄ）菌株に比べて最大１７％増加することを確認した。
実施例９：選別されたｉｍｐＥ２変異菌株のｉｍｐＥ２遺伝子変異の確認
前記実施例８で選別された４種の菌株のｉｍｐＥ２に導入された変異を確認するために、ｉｍｐＥ２変異体のポリヌクレオチド配列を分析した。ポリヌクレオチド配列を決定するために配列番号１３及び配列番号１４のプライマー対を用いてＰＣＲを行った。
確保された各変異型ｉｍｐＥ２遺伝子断片のポリヌクレオチド配列の分析を行った。ｉｍｐＥ２（ＷＴ）の配列番号４またはｉｍｐＥ２（ＣＪ０３２３：：Ｇ６４Ｄ）の配列番号１００のポリヌクレオチド配列と比較し、これにより変異型ＩｍｐＥ２のアミノ酸配列を確認した。選別された菌株のＩｍｐＥ２アミノ酸配列の変異の情報は、表１４のとおりである。
【００８３】
【表１４】
0006648345.tif 000015
【００８４】
実施例１０：ｉｍｐＥ２変異染色体導入用ベクターの製作
前記実施例９で確認されたｉｍｐＥ２変異適用効果を確認するために、これを染色体上に導入することができるベクターを製作し、製作過程は次の通りである。
ｉｍｐＥ２（Ｇ６４Ｄ）変異が除外された表１４のライブラリ変異のみを含むベクターを製作した。具体的には、コリネバクテリウム・スタティオニスＡＴＣＣ６８７２の染色体遺伝子を分離して、配列番号５６と配列番号５７、５９、６１、６３のプライマー対を用い、ポリメラーゼ連鎖反応を介してそれぞれの遺伝子断片を得た。ＰＣＲ法の条件は、９４℃で５分間変性した後、９４℃で３０秒の変性、５５℃で３０秒のアニーリング、７２℃で１分間の重合を２０回繰り返した後、７２℃で５分間重合反応を行ってＰＣＲ断片を獲得した。
前記選別された４種の染色体をそれぞれ鋳型とし、配列番号５８、６０、６２、６４と配列番号５５のプライマー対を用い、ポリメラーゼ連鎖反応を介して遺伝子断片を得た。ＰＣＲ法の条件は、９４℃で５分間変性した後、９４℃で３０秒の変性、５５℃で３０秒のアニーリング、７２℃で１分３０秒間の重合を２０回繰り返した後、７２℃で５分間重合反応を行ってＰＣＲ断片を獲得した。二つの断片を鋳型として、オーバーラップポリメラーゼ連鎖反応を行い、得られた遺伝子の断片を制限酵素ＸｂａＩで切断した。Ｔ４リガーゼを用いて前記遺伝子断片をＸｂａＩ制限酵素で切断した線状のｐＤＺ（特許文献２及び３）ベクターに連結した後、大腸菌ＤＨ５αに形質転換してカナマイシン（２５ｍｇ／Ｌ）が含まれたＬＢ固体培地に塗抹した。
【００８５】
次に、前記選別された変異体のうち、３種変異が統合されたｉｍｐＥ２（Ｓ３８７Ｔ、Ｍ４１３Ｔ、Ｎ４５８Ｋ）の単独変異の効果を確認するための単独変異のベクターを製作するためにＡＴＣＣ６８７２を鋳型として、配列番号５６と配列番号６７、６９、７１のプライマー対を用い、ポリメラーゼ連鎖反応を介してそれぞれの遺伝子断片を得た。続いてＡＴＣＣ６８７２を鋳型として、配列番号５５と配列番号６８、７０、７２のプライマー対を用い、ポリメラーゼ連鎖反応を介してそれぞれの遺伝子断片を得た。前記製作された二つの断片を鋳型として、オーバーラップポリメラーゼ連鎖反応を行い、得られた遺伝子断片を制限酵素ＸｂａＩで処理した。Ｔ４リガーゼを用いて前記遺伝子断片をＸｂａＩ制限酵素で切断したｐＤＺベクターに連結した後、大腸菌ＤＨ５aに形質転換して、カナマイシンを含むＬＢ固体培地に塗抹した。
【００８６】
【表１５】
0006648345.tif 000016
【００８７】
ＰＣＲにより目的の遺伝子が挿入されたベクターで形質転換されたコロニーを選別した後、通常知られているプラスミド抽出法を用いてプラスミドを獲得し、このプラスミドのｉｍｐＥ２に挿入された変異に基づいてｐＤＺ−ｉｍｐＥ２（Ｓ３８７Ｔ、Ｍ４１３Ｔ、Ｎ４５８Ｋ ）、ｐＤＺ−ｉｍｐＥ２（Ｆ１２３Ｃ）、ｐＤＺ−ｉｍｐＥ２（Ｉ２４３Ｖ）、ｐＤＺ−ｉｍｐＥ２（Ｆ４０５Ｙ）、ｐＤＺ−ｉｍｐＥ２（Ｓ３８７Ｔ）、ｐＤＺ−ｉｍｐＥ２（Ｍ４１３Ｔ）、ｐＤＺ−ｉｍｐＥ２（Ｎ４５８Ｋ）と命名した。
【００８８】
実施例１１：野生型ｉｍｐＥ１、ｉｍｐＥ２基盤ｉｍｐＥ２変異導入菌株の製作及び５’−イノシン酸生産能の比較
前記実施例１０で製造した新規変異導入用のベクター、ｐＤＺ−ｉｍｐＥ２（Ｓ３８７Ｔ、Ｍ４１３Ｔ、Ｎ４５８Ｋ）、ｐＤＺ−ｉｍｐＥ２（Ｆ１２３Ｃ）、ｐＤＺ−ｉｍｐＥ２（Ｉ２４３Ｖ）、ｐＤＺ−ｉｍｐＥ２（Ｆ４０５Ｙ）の４種を２段階相同染色体の組換えを介して実施例４で製造した５’−イノシン酸生産菌株であるコリネバクテリウム・スタティオニスＣＪＩ０３２３のｉｍｐＥ１Ｅ２がＷＴに復元されたＣＪＩ０３２３＿ｉｍｐＥ１Ｅ２（ＷＴ）に形質転換させた。その後、ポリヌクレオチド配列の分析により、染色体上のｉｍｐＥ２変異が導入された菌株を選別し、それぞれＣＪＩ０３２３＿ｉｍｐＥ１Ｅ２（ＷＴ）＿ｉｍｐＥ２（Ｓ３８７Ｔ、Ｍ４１３Ｔ、Ｎ４５８Ｋ）、ＣＪＩ０３２３＿ｉｍｐＥ１Ｅ２（ＷＴ）＿ｉｍｐＥ２（Ｆ１２３Ｃ）、ＣＪＩ０３２３＿ｉｍｐＥ１Ｅ２（ＷＴ）＿ｉｍｐＥ２（Ｉ２４３Ｖ ）、ＣＪＩ０３２３＿ｉｍｐＥ１Ｅ２（ＷＴ）＿ｉｍｐＥ２（Ｆ４０５Ｙ）と命名した。
【００８９】
前記コリネバクテリウム・スタティオニスＣＪＩ０３２３＿ｉｍｐＥ１Ｅ２（ＷＴ）＿ｉｍｐＥ２（Ｆ１２３Ｃ）、コリネバクテリウム・スタティオニスＣＪＩ０３２３＿ｉｍｐＥ１Ｅ２（ＷＴ）＿ｉｍｐＥ２（Ｉ２４３Ｖ）及びコリネバクテリウム・スタティオニスＣＪＩ０３２３＿ｉｍｐＥ１Ｅ２（ＷＴ）＿ｉｍｐＥ２（Ｆ４０５Ｙ）菌株はブダペスト条約下の国際寄託機関である韓国微生物保存センター（Korean Culture Center of Microorganisms、KCCM）に２０１８年１１月２日付で寄託し、それぞれ寄託番号ＫＣＣＭ１２３６２Ｐ、ＫＣＣＭ１２３６３Ｐ及びＫＣＣＭ１２３６５Ｐを与えられた。
【００９０】
実施例７と同様の方法で培養して、そこから５’−イノシン酸の濃度を分析し、培養時間４８時間後の濃度を測定した（表１６）。
【００９１】
【表１６】
0006648345.tif 000017
【００９２】
新規変異株の４種はＣＪＩ０３２３＿ｉｍｐＥ１Ｅ２（ＷＴ）に比べて５’−イノシン酸の濃度は、最大４４％増加することを確認した。本発明のＩｍｐＥタンパク質変異によるＩＭＰ生産量の増加は、非常に意味のあるものと解釈することができる。
【００９３】
実施例１２：ＣＪＩ０３２３：：ｉｍｐＥ２（Ｇ６４Ｄ）基盤ｉｍｐＥ２変異導入菌株の製作及び５’−イノシン酸生産能の比較
前記実施例１０で製造した新規変異導入用ベクター、ｐＤＺ−ｉｍｐＥ２（Ｓ３８７Ｔ、Ｍ４１３Ｔ、Ｎ４５８Ｋ）、ｐＤＺ−ｉｍｐＥ２（Ｆ１２３Ｃ）、ｐＤＺ−ｉｍｐＥ２（Ｉ２４３Ｖ）、ｐＤＺ−ｉｍｐＥ２（Ｆ４０５Ｙ）の４種を５’−イノシン酸の生産菌株であるコリネバクテリウム・スタティオニスＣＪＩ０３２３：：ｉｍｐＥ２（Ｇ６４Ｄ）に２段階の相同染色体の組換えを介して形質転換させた。その後ポリヌクレオチド配列の分析により、染色体上のｉｍｐＥ２変異が導入された菌株を選別し、挿入されたｉｍｐＥ２変異に応じてＣＪＩ０３２３：：ｉｍｐＥ２（Ｇ６４Ｄ）＿ｉｍｐＥ２（Ｓ３８７Ｔ、Ｍ４１３Ｔ、Ｎ４５８Ｋ）、ＣＪＩ０３２３：：ｉｍｐＥ２（Ｇ６４Ｄ）＿ｉｍｐＥ２（Ｆ１２３Ｃ）、ＣＪＩ０３２３：：ｉｍｐＥ２（Ｇ６４Ｄ）＿ｉｍｐＥ２（Ｉ２４３Ｖ）、ＣＪＩ０３２３：：ｉｍｐＥ２（Ｇ６４Ｄ）＿ｉｍｐＥ２（Ｆ４０５Ｙ）と命名した。
実施例７と同様の方法で培養して、そこから５’−イノシン酸の濃度を分析した（表１７）。
【００９４】
【表１７】
0006648345.tif 000018
【００９５】
新規変異株４種はＣＪＩ０３２３：：ｉｍｐＥ２（Ｇ６４Ｄ）対比５’−イノシン酸の濃度は、最大１７％増加することを確認した。本発明のＩｍｐＥタンパク質変異によるＩＭＰ生産量の増加は、非常に意味のあるものと解釈することができる。
次に、前記製作されたｐＤＺ−ｉｍｐＥ２（Ｓ３８７Ｔ、Ｍ４１３Ｔ、Ｎ４５８Ｋ）、ｐＤＺ−ｉｍｐＥ２（Ｆ１２３Ｃ）、ｐＤＺ−ｉｍｐＥ２（Ｉ２４３Ｖ）、ｐＤＺ−ｉｍｐＥ２（Ｆ４０５Ｙ）、ｐＤＺ−ｉｍｐＥ２（Ｓ３８７Ｔ）、ｐＤＺ−ｉｍｐＥ２（Ｍ４１３Ｔ ）、ｐＤＺ−ｉｍｐＥ２（Ｎ４５８Ｋ）の７種のベクターを単独または組み合わせて、ＣＪＩ０３２３＿ｉｍｐＥ１Ｅ２（ＷＴ）菌株及びＣＪＩ０３２３：：ｉｍｐＥ２（Ｇ６４Ｄ）菌株に形質転換した。製作された菌株は、ＣＪＩ０３２３＿ｉｍｐＥ１Ｅ２（ＷＴ）＿ｉｍｐＥ２（Ｓ３８７Ｔ）、ＣＪＩ０３２３＿ｉｍｐＥ１Ｅ２（ＷＴ）＿ｉｍｐＥ２（Ｍ４１３Ｔ）、ＣＪＩ０３２３＿ｉｍｐＥ１Ｅ２（ＷＴ）＿ｉｍｐＥ２（Ｎ４５８Ｋ）、ＣＪＩ０３２３＿ｉｍｐＥ１Ｅ２（ＷＴ）＿ｉｍｐＥ２（Ｆ１２３Ｃ、Ｉ２４３Ｖ、Ｓ３８７Ｔ、Ｆ４０５Ｙ、Ｍ４１３Ｔ、Ｎ４５８Ｋ））、ＣＪＩ０３２３：：ｉｍｐＥ２（Ｇ６４Ｄ）＿ｉｍｐＥ２（Ｓ３８７Ｔ）、ＣＪＩ０３２３：：ｉｍｐＥ２（Ｇ６４Ｄ）＿ｉｍｐＥ２（Ｍ４１３Ｔ）、ＣＪＩ０３２３：：ｉｍｐＥ２（Ｇ６４Ｄ）＿ｉｍｐＥ２（Ｎ４５８Ｋ）、ＣＪＩ０３２３：：ｉｍｐＥ２（Ｇ６４Ｄ）＿ｉｍｐＥ２（Ｉ２４３Ｖ、Ｓ３８７Ｔ、Ｍ４１３Ｔ 、Ｎ４５８Ｋ）、ＣＪＩ０３２３：：ｉｍｐＥ２（Ｇ６４Ｄ）＿ｉｍｐＥ２（Ｓ３８７Ｔ、Ｆ４０５Ｙ、Ｍ４１３Ｔ、Ｎ４５８Ｋ）、ＣＪＩ０３２３：：ｉｍｐＥ２（Ｇ６４Ｄ）＿ｉｍｐＥ２（Ｉ２４３Ｖ、Ｓ３８７Ｔ、Ｆ４０５Ｙ、Ｍ４１３Ｔ、Ｎ４５８Ｋ）、ＣＪＩ０３２３：：ｉｍｐＥ２（Ｇ６４Ｄ）＿ｉｍｐＥ２ （Ｆ１２３Ｃ、Ｓ３８７Ｔ、Ｍ４１３Ｔ、Ｎ４５８Ｋ）、ＣＪＩ０３２３：：ｉｍｐＥ２（Ｇ６４Ｄ）＿ｉｍｐＥ２（Ｆ１２３Ｃ、Ｉ２４３Ｖ、Ｓ３８７Ｔ、Ｆ４０５Ｙ、Ｍ４１３Ｔ、Ｎ４５８Ｋ）と命名し、前記のような方法で５’−イノシン酸生産能を測定した（表１８）。
【００９６】
前記コリネバクテリウム・スタティオニスＣＪＩ０３２３＿ｉｍｐＥ１Ｅ２（ＷＴ）＿ｉｍｐＥ２（Ｓ３８７Ｔ）、コリネバクテリウム・スタティオニスＣＪＩ０３２３＿ｉｍｐＥ１Ｅ２（ＷＴ）＿ｉｍｐＥ２（Ｍ４１３Ｔ）及びコリネバクテリウム・スタティオニスＣＪＩ０３２３＿ｉｍｐＥ１Ｅ２（ＷＴ）＿ｉｍｐＥ２（Ｎ４５８Ｋ）菌株はブダペスト条約下の国際寄託機関である韓国微生物保存センター（Korean Culture Center of Microorganisms、KCCM）に２０１８年１１月２日付で寄託してそれぞれ寄託番号ＫＣＣＭ１２３６４Ｐ、ＫＣＣＭ１２３６６Ｐ及びＫＣＣＭ１２３６７Ｐを与えられた。
【００９７】
【表１８】
0006648345.tif 000019
【００９８】
前記表に示すように、ｉｍｐＥ２（Ｓ３８７Ｔ）、ｉｍｐＥ２（Ｍ４１３Ｔ）、ｉｍｐＥ２（Ｎ４５８Ｋ）単独の変異は、野生型に比べて最大３３．６％が増加し、新規変異の組み合わせ導入菌株すべては、５’−イノシン酸の濃度が最大１０２．５％増加することを確認した。また、５’−イノシン酸を生産するＣＪＩ０３２３：：ｉｍｐＥ２（Ｇ６４Ｄ）菌株に新規変異を単独で導入した場合、表１７及び表１８に示すようにＩＭＰ排出能が増加し、これらの組み合わせで導入される場合には、より高いＩＭＰ排出能を有することが確認された。特に、ＣＪＩ０３２３：：ｉｍｐＥ２（Ｇ６４Ｄ）菌株の変異と新規変異が両方統合された場合、ＩＭＰ濃度が野生型に比べて約５１５％増加し、ＣＪＩ０３２３：：ｉｍｐＥ２（Ｇ６４Ｄ）対比約２４％増加することを確認した。本発明で発掘した新規変異は単独でもＩＭＰ排出能が増加し、これらの組み合わせで導入される場合、より高いＩＭＰ排出能を有することが確認された。
【００９９】
実施例１３：野生型ＩＭＰ生産株基盤ｉｍｐＥ２の強化
実施例１３−１：野生型ＩＭＰ生産株基盤ｉｍｐＥ２変異導入菌株の製作
野生型のＩＭＰ生産菌株でｉｍｐＥ２の変異導入の効果を確認するために、ＡＴＣＣ６８７２でＩＭＰの分解経路に該当するアデニロコハク酸シンテターゼ （adenylosuccinate synthetase）及びＩＭＰデヒドロゲナーゼ（IMP dehydrogenase）の活性が弱化された菌株を製作した。前記二つの酵素をコードする遺伝子ｐｕｒＡ及びｇｕａＢの各塩基配列から１番目の塩基をａからｔに変更して開始コドンを変更した。ＡＴＣＣ６８７２における前記二つの遺伝子の発現が弱化された菌株はＣＪＩ９０８８と命名した。製造されたＣＪＩ９０８８菌株に、前記実施例１０で製作したｐＤＺ−ｉｍｐＥ２（Ｓ３８７Ｔ、Ｍ４１３Ｔ、Ｎ４５８Ｋ）、ｐＤＺ−ｉｍｐＥ２（Ｆ１２３Ｃ）、ｐＤＺ−ｉｍｐＥ２（Ｉ２４３Ｖ）、ｐＤＺ−ｉｍｐＥ２（Ｆ４０５Ｙ）ベクターを単独または組み合わせて電気穿孔法で形質転換し、相同性配列の組換えによって染色体上にベクターが挿入された菌株は、カナマイシン２５ｍｇ／Ｌを含有した培地から選別した。選別された１次菌株は再び２次交差を行った。最終的に形質転換された菌株の遺伝子が導入されたかどうかは、配列番号１３、１４プライマー対を用いてＰＣＲを行うことにより確認した。
製作されたＣＪＩ９０８８及びＣＪＩ９０８８＿ｉｍｐＥ２（Ｓ３８７Ｔ、Ｍ４１３Ｔ、Ｎ４５８Ｋ）、ＣＪＩ９０８８＿ｉｍｐＥ２（Ｆ１２３Ｃ）、ＣＪＩ９０８８＿ｉｍｐＥ２（Ｉ２４３Ｖ）、ＣＪＩ９０８８＿ｉｍｐＥ２（Ｆ４０５Ｙ）、ＣＪＩ９０８８＿ｉｍｐＥ２（Ｆ１２３Ｃ、Ｉ２４３Ｖ、Ｓ３８７Ｔ、Ｆ４０５Ｙ、Ｍ４１３Ｔ、Ｎ４５８Ｋ）菌株のＩＭＰ生産能を評価した。培養終了後、ＨＰＬＣを用いた方法によりＩＭＰの生産量を測定し、培養結果は以下の表１９の通りである。
【０１００】
【表１９】
0006648345.tif 000020
【０１０１】
培地内に蓄積されたＩＭＰを確認した結果、親菌株であるＣＪＩ９０８８に比べてＩＭＰ生産能が８０％以上、最大７３０％増加することを確認した。したがって、本発明のＩｍｐＥタンパク質変異によるＩＭＰ生産量の増加は、非常に意味のあるものと解釈することができる。
以上の説明から、本発明が属する技術分野の当業者は、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更せず、他の具体的な形態で実施されうることを理解できるだろう。これに関連し、以上で記述した実施例はすべての面で例示的なものであり、限定的なものではないものと理解しなければならない。本発明の範囲は、前記詳細な説明より、後述する特許請求の範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導き出されるすべての変更または変形された形態が本発明の範囲に含まれるものと解釈されるべきである。
【要約】
本発明は、５’−イノシン酸排出能を有する新規タンパク質変異体、これを含む微生物、及び前記微生物を用いた５’−イノシン酸の製造方法に関する。
【選択図】なし【配列表】
0006648345000001.app