(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉ）Ｃ１−Ｃ１０−アルキルシアノアクリレート及びＣ１−Ｃ６−アルコキシ−Ｃ１−Ｃ１０−アルキルシアノアクリレートから選択される一又は複数の重合性モノマーを含む疎水性の液相を準備する工程と、
ｉｉ）エマルジョンが形成されるように前記疎水性の液相を親水性の液相中に微細分散させる工程と、ここで、前記エマルジョンのｐＨは４．０以下である、
ｉｉｉ）前記一又は複数の重合性モノマーの重合が加速されるように前記エマルジョンのｐＨを４．０〜６．０の範囲の値まで上げる工程と、
ｉｖ）次いで、少なくとも１つの免疫グロブリン軽鎖可変ドメインと少なくとも１つの免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含む一又は複数の抗原結合性分子を添加する工程と、
ｖ）最後に、重合を、ｐＨをｐＨ８．０を超えない値までさらに上げることにより継続させる工程と
を含み、これにより、ナノスフェア懸濁液を形成し、前記一又は複数の抗原結合性分子は、前記一又は複数の重合性モノマーの重合によって形成された高分子マトリックス中に組み込まれる、ナノスフェアの調製方法。
【請求項２】
一又は複数の抗原結合性分子が、ガンマグロブリン、ダイマー抗体、Ｆａｂ断片及びＦ（ａｂ）２断片から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
一又は複数の抗原結合性分子の少なくとも２０％が、ナノスフェアからの放出後もなお、その抗原に結合し得る、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
ナノスフェアから放出された抗原結合性分子が、細胞アッセイなどの生物学的アッセイでの測定時、元の生物学的活性の少なくとも２０％を保持している、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
マトリックスを形成する一又は複数のポリマーの主モノマー成分が、メチル２−シアノアクリレート、２−メトキシエチル２−シアノアクリレート、エチル２−シアノアクリレート、ｎ−ブチル２−シアノアクリレート、２−オクチル２−シアノアクリレート及びイソブチル２−シアノアクリレートのうちの一又は複数から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
一又は複数のマトリックス形成ポリマーが、ポリ（ｎ−ブチル２−シアノアクリレート）、ポリ（エチル２−シアノアクリレート）及びそれらの混合物から選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ナノスフェアが、ＩＳＯ１３３２１及びＩＳＯ２２４１２に従うキュムラント解析による測定時、０．５以下の範囲の多分散度を有し、光子相関分光法による測定時、２０〜３００ｎｍの範囲の平均直径を有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
工程（ｉｉ）が、加圧下での均質化及び／又は超音波処理により行なわれる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
工程（ｉｉｉ）においてｐＨを４．８〜５．５の範囲の値まで上げる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
一又は複数の抗原結合性分子の添加後、エマルジョンを室温で５〜２０分間インキュベートする、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
工程（ｖ）においてエマルジョンのｐＨを６．８〜７．５の範囲になるまで上げる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
疎水性の液相の量が、親水性の液相と疎水性の液相の総重量に対して１〜４０ｗｔ％である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
親水性の液相、疎水性の液相、又は親水性の液相と疎水性の液相の両方に、一又は複数の安定剤が含有されている、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
一又は複数の安定剤の量が、重合性モノマーの総重量に対して５〜２５ｗｔ％である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
一又は複数の安定剤が、ポロキサマー、ｎ−Ｃ１２−Ｃ１６−アルキル硫酸ナトリウム、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポロキサミン、ポリ（オキシエチレン）エーテル、ポリ（オキシエチレン）エステル、ポリエチレングリコール及びそれらの混合物から選択される、請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項１６】
一又は複数の重合性モノマーが、メチル２−シアノアクリレート、２−メトキシエチル２−シアノアクリレート、エチル２−シアノアクリレート、ｎ−ブチル２−シアノアクリレート、２−オクチル２−シアノアクリレート及びイソブチル２−シアノアクリレートから選択される、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
一又は複数の抗原結合性分子が、ガンマグロブリン、ダイマー抗体、Ｆａｂ断片及びＦ（ａｂ）２断片から選択される、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高分子マトリックスおよびこれにエステラーゼ放出可能に組み込まれた抗原結合性分子を含むものであるナノスフェアに関する。本発明はさらに、かかるナノスフェアの調製方法およびかかるナノスフェアを含む組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ナノ粒子は薬物送達システムとして、特に、薬物を患者の特定の作用部位に標的化するための考えられ得る徐放システムとして研究されている。用語「ナノ粒子」は一般的に、ナノメートル範囲の直径を有するポリマーベースの粒子を表すのに使用される。ナノ粒子には種々の構造粒子、例えば、ナノスフェアおよびナノカプセルが包含される。ポリ（アルキルシアノアクリレート）などの生体適合性で生分解性のポリマーベースのナノ粒子は、ここ３０年間にわたって研究されており、生物医学的用途のために特に重要である（Ｃｏｕｖｒｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，１９７９，３１：３３１−３３２；Ｖａｕｔｈｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．２００３，５５：５１９−５４８参照）。このナノ粒子は、ミニエマルジョン重合（例えば、Ｒｅｉｍｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｐｈａｒｍ．２００８，７０：６２７−６３２；Ｖａｕｔｈｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．２００３，５５：５１９−５４８参照）によって調製され得、この表面は、ナノ粒子が特定の標的器官または組織に蓄積されることを可能にする種々の様式で修飾され得る（Ｖａｕｔｈｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．２００３，５５：５１９−５４８参照）。例えば、ナノ粒子表面への抗体の結合が報告されている（例えば、Ｈａｓａｄｓｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏ  Ｃｈｅｍ，２００９，２８４：６９７２−６９８１参照）。さらに、ポリソルベート８０で被覆されたナノ粒子は、通常は血液脳関門を通過することができない薬物をこの関門を越えて輸送することが示されている（ＷＯ２００７／０８８０６６；Ｋｒｅｕｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔ．２００２，１０（４）：３１７−３２５；Ｒｅｉｍｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｐｈａｒｍ．２００８，７０：６２７−６３２参照）。
【０００３】
ナノ粒子分野における豊富な研究にもかかわらず、ナノスフェアの高分子マトリックス中への組込みによる抗体の封入に関しては、ほとんど知られていない。抗体は、大きな治療的潜在性を有する比較的大型の分子（ＩｇＧで約１５０ｋＤａまで）である。このサイズのため、抗体は通常、血液脳関門などの生物学的関門を通過することができない。さらに、抗体などのタンパク質は潜在的に、ヒト体内などの環境においてタンパク質分解性の分解を受けやすい。従って、抗体および他の抗原結合性分子のための送達システムが提供されることが望ましい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２００７／０８８０６６号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｃｏｕｖｒｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，１９７９，３１：３３１−３３２
【非特許文献２】Ｖａｕｔｈｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．２００３，５５：５１９−５４８
【非特許文献３】Ｒｅｉｍｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｐｈａｒｍ．２００８，７０：６２７−６３２
【非特許文献４】Ｈａｓａｄｓｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏ  Ｃｈｅｍ，２００９，２８４：６９７２−６９８１
【非特許文献５】Ｋｒｅｕｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔ．２００２，１０（４）：３１７−３２５
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、抗体などの抗原結合性分子を、抗原結合活性および生物学的活性を保ったまま、ナノスフェアの高分子マトリックス中にどのようにして組み込むかを示す。かくして封入された抗原結合性分子は、酵素による分解から保護され、ナノスフェア表面は、標的化分子または被験体の体内でのナノスフェアの半減期を長くする分子によるものなどのさらなる修飾がないままである。
【０００７】
従って、本発明により：
ａ）Ｃ１−Ｃ１０−アルキルシアノアクリレートおよびＣ１−Ｃ６−アルコキシ−Ｃ１−Ｃ１０−アルキルシアノアクリレートのうちの１以上から選択される主モノマー成分を含むものである１以上のポリマーによって形成された高分子マトリックス；ならびに
ｂ）少なくとも１つの免疫グロブリン軽鎖可変ドメインと少なくとも１つの免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含む１以上の抗原結合性分子
を含み、
該１以上の抗原結合性分子が、該高分子マトリックス中にエステラーゼ放出可能に組み込まれている、
ナノスフェアを提供する。
【０００８】
本発明により、さらに、光子相関分光法による測定時、０．５以下の多分散度および３００ｎｍ以下の平均直径を有する本明細書に記載のような複数のナノスフェアを提供する。
【０００９】
本発明によりまた：
ｉ）Ｃ１−Ｃ１０−アルキルシアノアクリレートおよびＣ１−Ｃ６−アルコキシ−Ｃ１−Ｃ１０−アルキルシアノアクリレートから選択される１以上の重合性モノマーを含む疎水性の液相を準備すること；
ｉｉ）エマルジョンが形成されるように該疎水性の液相を親水性の液相中に微細分散させること、ここで、該エマルジョンのｐＨは４．０以下である；
ｉｉｉ）１以上の該重合性モノマーの重合が加速されるように該エマルジョンのｐＨを４．０から６．０の範囲の値まで上げること；
ｉｖ）次いで、少なくとも１つの免疫グロブリン軽鎖可変ドメインと少なくとも１つの免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含む１以上の抗原結合性分子を添加すること；ならびに
ｖ）最後に、該重合を、該ｐＨをｐＨ８．０を超えない値までさらに上げることにより継続させること
を含み；
これにより、ナノスフェア懸濁液を形成し、ここで、該１以上の抗原結合性分子は、１以上の該重合性モノマーの重合によって形成された高分子マトリックス中に組み込まれる、
ナノスフェアの調製方法を提供する。
【００１０】
本発明によりまた、本明細書に記載の複数のナノスフェアおよび医薬として許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１Ａ】実施例１に記載のようにして調製したＰＢＣＡおよびＰＥＣＡのナノスフェア懸濁液の平均粒子サイズ（Ｚ−平均直径，縦棒）および多分散度（ＰＤＩ，点）を示す。測定はゼータサイザーデバイスを用いて行なった。
【図１Ｂ】懸濁液の透過型電子顕微鏡検査（ＴＥＭ）画像を図１Ｂに示す。
【図２】実施例４に記載の非精製，抗ＲＧＭａ  ｍａｂ負荷，エステラーゼ処理ナノスフェア（「遊離＋封入」）、精製，抗ＲＧＭａ  ｍａｂ負荷，エステラーゼ処理ナノスフェア（「封入」）、抗ＲＧＭａ  ｍａｂなしのエステラーゼ処理ナノ粒子（「空ＮＰ」）およびエステラーゼのみ（「エステラーゼ」）の異なる希釈液の存在下でのルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイにおいて測定された発光値としてのＢＭＰ（骨形成タンパク質）シグナル伝達を示す。
【図３】図２に示した希釈液４から６の発光値から計算した、ナノスフェア試料の平均発光値および対応する標準偏差を示す。「空ＮＰ」で測定された平均発光を１００％に正規化した。
【図４】実施例６に記載のようにして調製したＰＢＣＡ−ヤギＩｇＧナノ粒子懸濁液の平均粒子サイズ（ｚ−平均直径として測定）および多分散度値（ＰＤＩ）を示す。サイズおよびＰＤＩ値はゼータサイザーデバイスを用いて測定した。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
ナノスフェアは、ナノメートル範囲内（即ち、数ナノメートルから数百ナノメートル）の直径を有し、高分子マトリックスを含む固形のサブミクロン粒子であって、さらなる構成要素、例えば、積み荷分子（例えば、抗原結合性分子）が組み込まれ（例えば、溶解または分散され）得るサブミクロン粒子である。本発明のナノスフェアは、３００ｎｍ以下、特に２００ｎｍ以下、例えば２０から３００ｎｍの範囲または好ましくは５０から２００ｎｍの範囲のサイズを有するものであり得る。
【００１３】
特に記載のない限り、用語「サイズ」および「直径」は、ナノ粒子（例えば、ナノスフェアもしくはナノカプセル）または液滴などの基本的に丸い物体に言及している場合、互換的に用いている。
【００１４】
ナノ粒子調製物のサイズおよび多分散指数（ＰＤＩ）は、例えば、光子相関分光法（ＰＣＳ）ならびに動的光散乱法における国際規格（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  ｏｎ  Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）ＩＳＯ１３３２１（１９９６）およびＩＳＯ２２４１２（２００８）に従うキュムラント解析（これにより平均直径（ｚ−平均直径）および分布の幅の推定値（ＰＤＩ）が得られる。）により、例えばゼータサイザーデバイス（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ；ソフトウェアバージョン「Ｎａｎｏ  ＺＳ」）を用いて測定され得る。
【００１５】
用語「約」は、本明細書で使用されている文脈において当業者によって理解される。特に、「約」は、±２０％、±１０％、好ましくは±５％、より好ましくは±１％、さらにより好ましくは±０．１％の変動を示していることを意図する。
【００１６】
本発明のナノスフェアの高分子マトリックスは、１以上のポリマーによって形成されている。１以上のマトリックス形成ポリマーの主モノマー成分は、Ｃ１−Ｃ１０−アルキルシアノアクリレート、例えば、Ｃ１−Ｃ８−アルキルシアノアクリレートおよびＣ１−Ｃ６−アルコキシ−Ｃ１−Ｃ１０−アルキルシアノアクリレート（例えばＣ１−Ｃ３−アルコキシ−Ｃ１−Ｃ３−アルキルシアノアクリレート）のうちの１以上から選択される。例えば、シェル形成ポリマーの主モノマー成分は、メチル２−シアノアクリレート、２−メトキシエチル２−シアノアクリレート、エチル２−シアノアクリレート、ｎ−ブチル２−シアノアクリレート、２−オクチル２−シアノアクリレートおよびイソブチル２−シアノアクリレートのうちの１以上から、好ましくはエチル２−シアノアクリレートおよびｎ−ブチル２−シアノアクリレートから選択される。
【００１７】
用語「高分子マトリックス」は、本明細書で用いる場合、１以上のポリマーによって形成されている３次元固形物を示す。さらなる成分、例えば、小分子薬物および大型分子薬物、例えばポリペプチド（例えば、抗体および抗原結合断片、この二量体および多量体またはコンジュゲート）などが、かかる高分子マトリックス中に組み込まれ得る（例えば、溶解または分散され得る。）。
【００１８】
用語「主モノマー成分」は、ポリマーの特徴表示のために本明細書で用いる場合、ポリマーの少なくとも８０ｗｔ−％、少なくとも９０ｗｔ−％、少なくとも９５ｗｔ−％、少なくとも９８ｗｔ−％、好ましくは少なくとも９９ｗｔ−％から１００ｗｔ−％までを構成している構成要素モノマーを表す。
【００１９】
本発明のナノスフェアのマトリックスを形成する好適なポリマーとしては、限定されないが、ポリ（メチル２−シアノアクリレート）、ポリ（２−メトキシエチル２−シアノアクリレート）、ポリ（エチル２−シアノアクリレート）、ポリ（ｎ−ブチル２−シアノアクリレート）、ポリ（２−オクチル２−シアノアクリレート）、ポリ（イソブチル２−シアノアクリレート）およびこの混合物が挙げられ、ポリ（ｎ−ブチル２−シアノアクリレート）、ポリ（エチル２−シアノアクリレート）およびこの混合物が好ましい。
【００２０】
マトリックス形成ポリマーの重量平均分子量は、典型的には、１，０００から１０，０００，０００ｇ／ｍｏｌ、例えば５，０００から５，０００，０００ｇ／ｍｏｌまたは１０，０００から１，０００，０００ｇ／ｍｏｌの範囲である。
【００２１】
本発明のナノスフェアは抗原結合性分子の送達に適している。本発明のナノスフェアは、標的部位（例えば、標的細胞）に向かっている抗原結合性分子を、タンパク質分解性酵素および他の酵素による分解および／または修飾から保護することで、この生物学的（例えば、医薬的）活性の低下から保護する。従って、本発明はまた、酵素によるかかる分解および／または修飾を受けやすい抗原結合分子（特に、経口経路によって投与される場合）を封入するためにも特に有用である。
【００２２】
用語「抗原結合性分子」は、本明細書で用いる場合、抗体、この抗原結合断片、抗体の少なくとも１つの抗原結合領域を含む分子ならびに抗体模倣物をいう。抗原結合性分子は典型的には、少なくとも２０ｋＤａ、特に少なくとも４０ｋＤａ、例えば２０から３５０ｋＤａまたは４０から３１０ｋＤａの分子量を有するものである。好ましくは、本発明のナノスフェアに使用される抗原結合性分子は、少なくとも１つの免疫グロブリンドメインまたは免疫グロブリン様フォールディングを有するドメインを含むものである。
【００２３】
本発明のナノスフェアに含まれる抗原結合性分子はポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよいが、モノクローナル抗体が好ましい。抗体は、天然に存在する抗体であってもこの遺伝子操作バリアントであってもよい。抗体は、トリ（例えば、ニワトリ）抗体および哺乳動物抗体（例えば、ヒト、マウス、ラットまたはカニクイザルの抗体）から選択され得、ヒト抗体が好ましい。抗体はキメラ、例えば、非抗原結合領域の一部または全部を対応するヒト抗体の領域で交換することによるマウス抗体由来のキメラ抗体などであり得る。抗体が哺乳動物抗体である場合、これは、幾つかの主要クラス、例えばＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭおよび重鎖抗体（ラクダ科に見られる）のうちの１つに属するものであり得る。哺乳動物抗体の場合はＩｇＧ（ガンマグロブリン）が好ましいクラスである。これは、哺乳動物において最も多く見られる抗体であり、Ｆｃγ受容体によって特異的に認識され、一般的にインビトロで容易に調製され得るためである。抗体がＩｇＧである場合、これは、幾つかのアイソタイプ、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４のうちの１つに属するものであり得る。抗体は、例えば、動物の免疫処置、ハイブリドーマ技術または組換えによって調製され得る。
【００２４】
本発明のナノスフェアに含まれる抗原結合性分子は抗体の抗原結合断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２およびＦｖ断片などであってもよい。
【００２５】
本発明のナノスフェアに含まれる抗原結合性分子は、抗体の少なくとも１つの抗原結合領域を有する分子であってもよく、これは、限定されないが、抗体の二量体および多量体；二重特異性抗体；単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）ならびにジスルフィド連結Ｆｖ断片（ｄｓＦｖ）から選択され得る。
【００２６】
また、本発明のナノスフェアに含まれる抗原結合性分子は、抗体模倣物であってもよい。用語「抗体模倣物」は、本明細書で用いる場合、抗原に特異的に結合し得るが抗体とは構造的に関連していない人工のポリペプチドまたはタンパク質をいう。例えば、かかるポリペプチドおよびタンパク質は、プロテインＡのＺドメイン（即ち、アフィボディ）、γ−Ｂ結晶性（即ち、アフィリン）、ユビキチン（即ち、アフィチン（ａｆｆｉｔｉｎ））、リプカリン（ｌｉｐｃａｌｉｎ）（即ち、アンチカリン）、膜受容体のドメイン（即ち、アビマー）、アンキリンリピートモチーフ（即ち、ＤＡＲＰｉｎ）、フィブレクション（ｆｉｂｒｅｃｔｉｏｎ）の１０番目のＩＩＩ型ドメイン（即ち、モノボディ）などの骨格を主体とするものであり得る。また、用語「抗体模倣物」は、かかるポリペプチドまたはタンパク質の二量体および多量体も包含している。
【００２７】
用語「抗原結合性分子」はまた、抗体または抗体の少なくとも１つの抗原結合領域を含む別の分子または抗体模倣物と、例えば、少なくとも１つの検出可能な部分（例えば、フルオロフォアもしくは酵素）または巨大分子（ＰＥＧもしくは血清タンパク質（例えば、ＢＳＡ）など）とのコンジュゲートも包含している。
【００２８】
本発明のナノスフェアは、該ナノスフェアの１以上のマトリックス形成ポリマーと１以上の抗原結合性分子の総重量に対して、少なくとも０．５ｗｔ−％、特に少なくとも５ｗｔ−％、好ましくは少なくとも１０ｗｔ−％、より好ましくは少なくとも１５ｗｔ−％の１以上の抗原結合性分子を含むものであり得る。１以上の抗原結合性分子の量は、１以上のマトリックス形成ポリマーと１以上の抗原結合性分子の総重量に対して、１０ｗｔ−％まで、１５ｗｔ−％まで、２０ｗｔ−％までまたはこれ以上であり得る。
【００２９】
抗原結合性分子は、本発明のナノスフェアの高分子マトリックス中にエステラーゼ放出可能に組み込まれる。用語「エステラーゼ−放出可能」とは、抗原結合性分子がエステラーゼの触媒活性によってナノ粒子から放出され得ることを意味する。エステラーゼは、ポリマー、例えば本明細書に記載のマトリックス形成ポリマーのアルキルまたはアルコキシアルキル側鎖の加水分解を触媒し、アルカノールまたはアルコキシアルカノールを放出させるものであり得る。該ポリマーがエステラーゼの作用によって水溶性となり、この結果、抗原結合性分子が体液などの水性液によって浸出され得ると考えられる。「高分子マトリックス中に組み込まれる」とは、抗原結合性分子が高分子マトリックス中に溶解または分散され得ることを意味する。
【００３０】
語句「ナノスフェアの高分子マトリックス中に組み込まれる」および「ナノスフェア内に封入される」は本明細書において互換的に用いている。同様に、用語［本発明のナノスフェア内への抗原結合性分子の］「封入」は、ナノスフェアの高分子マトリックス中への抗原結合性分子の組込みをいう。対照的に、ナノスフェア表面に結合しているだけの分子（例えば、抗体）は、ナノスフェアの高分子マトリックス中に「封入され」ていない、または「組み込まれ」ていない。
【００３１】
有利には、本発明のナノスフェア内に封入された抗原結合性分子は、有意な割合の元の抗原結合活性および生物学的活性を保持している。本発明のナノスフェア内に封入された抗原結合性分子の少なくとも２０％、特に少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％から４５％までまたはこれ以上が、ナノスフェアからの放出後、依然として１以上の抗原に結合し得る。同様に、本発明のナノスフェア内に封入された抗原結合性分子は、元の生物学的（例えば、医薬的）活性の少なくとも２０％、特に少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％から４５％までまたはこれ以上を保持したものであり得る。
【００３２】
用語「生物学的活性」は、生物学的系（例えば、細胞、組織または生物体）に対する化合物（例えば、抗原結合性分子）の効果をいう。生物学的活性は、生物活性化合物によって影響される過程、例えば、特定の（レポーター）遺伝子の発現、細胞シグナル伝達経路の一部であるタンパク質のリン酸化、細胞バイアビリティおよび細胞増殖などを調べることにより測定され得る。
【００３３】
化合物の生物学的活性および１以上の特異的抗原への結合の測定方法は当該技術分野でよく知られている。かかる方法の例としては、限定されないが、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）およびフローサイトメトリーが挙げられる。
【００３４】
本発明により、さらに、サイズに関して比較的高い均一性を有する本明細書に記載のような複数のナノスフェアを提供する。特に、本発明の方法で得られるナノスフェア調製物は、光子相関分光法（ＰＣＳ）による測定時、０．５以下、０．３以下、好ましくは０．２以下、またはさらには０．１以下、例えば０．０５から０．５の範囲のＰＤＩ（多分散指数）値を有するものであり得る。ナノスフェアの平均直径は３００ｎｍ以下、特に２００ｎｍ以下、例えば２０から３００ｎｍの範囲または、好ましくは５０から２００ｎｍの範囲であり得る。
【００３５】
用語「複数のナノカプセル」は２個以上のナノカプセル、例えば、少なくとも１０個、少なくとも１００個、少なくとも１，０００個、少なくとも５，０００個、少なくとも１０，０００個、少なくとも５０，０００個、少なくとも１００，０００個、少なくとも５００，０００個もしくは少なくとも１，０００，０００個以上のナノカプセルをいう。
【００３６】
場合により、本発明のナノスフェアにさらに、本明細書に記載のような１以上の安定剤を含めてもよい。
【００３７】
本発明のナノスフェアの構成要素、特に１以上のマトリックス形成ポリマーならびに本発明による組成物の成分、特に担体は、好都合には医薬として許容されるものである。
【００３８】
用語「医薬として許容される」は、本明細書で用いる場合、化合物もしくは物質が、本発明のナノスフェアまたはこの組成物を医療的処置または予防のために必要とされる量で投与した場合に急性毒性を引き起こさないことをいう。
【００３９】
本発明のナノスフェアは、改良ミニエマルジョン重合法によって、特に：
ｉ）Ｃ１−Ｃ１０−アルキルシアノアクリレートおよびＣ１−Ｃ６−アルコキシ−Ｃ１−Ｃ１０−アルキルシアノアクリレートから選択される１以上の重合性モノマーを含む疎水性の液相を準備すること；
ｉｉ）エマルジョンが形成されるように該疎水性の液相を親水性の液相中に微細分散させること、ここで、該エマルジョンのｐＨは４．０以下、例えばｐＨ１．０から３．０の範囲である；
ｉｉｉ）１以上の該重合性モノマーの重合が加速されるように該エマルジョンのｐＨを４．０から６．０の範囲の値まで、特に４．８から５．５の範囲のｐＨまで、好ましくは４．９から５．２の範囲のｐＨまで上げること；
ｉｖ）次いで、少なくとも１つの免疫グロブリン軽鎖可変ドメインと少なくとも１つの免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含む１以上の抗原結合性分子を添加すること；ならびに
ｖ）最後に、該重合を、該ｐＨをｐＨ８．０を超えない値まで、特に６．８から７．５の範囲のｐＨまで、好ましくは６．９から７．２の範囲のｐＨまでさらに上げることにより継続させること；
を含み、
これにより、ナノスフェア懸濁液を形成し、該１以上の抗原結合性分子は、１以上の該重合性モノマーの重合によって形成された高分子マトリックス中に組み込まれる、
方法によって調製され得る。
【００４０】
理論に拘束されることを望まないが、工程（ｉ）の疎水性の液相に含まれた１以上の重合性モノマーの重合がヒドロキシルイオンによって開始され、アニオン重合機構により起こると想定される（例えば、Ｖａｕｔｈｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．２００３，５５：５１９−５４８参照）。１以上の重合性モノマーは、Ｃ１−Ｃ１０−アルキルシアノアクリレート（例えば、Ｃ１−Ｃ８−アルキルシアノアクリレート）およびＣ１−Ｃ６−アルコキシ−Ｃ１−Ｃ１０−アルキルシアノアクリレート（例えば、Ｃ１−Ｃ３−アルコキシ−Ｃ１−Ｃ３−アルキルシアノアクリレート）のうちの１以上から選択される。１以上の好適な重合性モノマーの例としては、限定されないが、メチル２−シアノアクリレート、２−メトキシエチル２−シアノアクリレート、エチル２−シアノアクリレート、ｎ−ブチル２−シアノアクリレート、２−オクチル２−シアノアクリレート、イソブチル２−シアノアクリレートおよびこの混合物が挙げられ、エチル２−シアノアクリレート、ｎ−ブチル２−シアノアクリレートおよびこの混合物が好ましい。
【００４１】
場合により、工程（ｉ）の疎水性の液相にはさらに、１以上の油が含められ得る。用語「油」は、本明細書で用いる場合、水より小さい密度を有し、本明細書に記載のような重合性モノマーおよび他の油性物質と混和性（親油性）であり、水と不混和性（疎水性）であり、室温（２５℃）で液状である中性で無極性の物質をいう。本発明の方法の工程（ｉ）に使用される１以上の油は、石油化学起源、動物起源または植物起源のものであり得る。好適な油の例としては、限定されないが、キャノーラ油、コーン油、ヒマワリ油、ピーナッツ油および特にダイズ油が挙げられる。
【００４２】
工程（ｉｉ）に使用される親水性の液相は、典型的には酸性水溶液、例えば無機酸（リン酸または塩酸など）の水溶液である。
【００４３】
疎水性の液相および親水性の液相は、好ましくは室温で調製され、次いで、使用するまで約０℃の温度の氷上で維持される。
【００４４】
疎水性の液相の量は典型的には、親水性の液相と疎水性の液相の総重量に対して１から４０ｗｔ−％の範囲、例えば２から２５ｗｔ−％の範囲である。
【００４５】
親水性の液相または疎水性の液相または両方、好ましくは親水性の相には、本明細書に記載のような１以上の安定剤が含有され得る。用語「安定剤」は、本明細書で用いる場合、本発明の方法の工程（ｉｉ）で調製されるエマルジョンを安定化させ得る化合物をいう。安定剤は、疎水性の液相の個々の液滴を親水性の液相中で互いに離れて分散された状態で維持し、この凝集を実質的に抑制するものである。好適な安定剤の例としては、限定されないが、ポロキサマー、例えば、ポロキサマー１８８、ポロキサマー３３８およびポロキサマー４０７；ｎ−Ｃ１２−Ｃ１６アルキル硫酸ナトリウム、例えば、ドデシル硫酸ナトリウム、ミリスチル硫酸ナトリウムおよびヘキサデシル硫酸ナトリウム；ソルビタン脂肪酸エステル、例えば、一価の不飽和または飽和Ｃ１１−Ｃ１８−脂肪酸、例えば、ラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸およびオレイン酸のソルビタンモノエステル；ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、例えば、一価の不飽和または飽和Ｃ１１−Ｃ１８−脂肪酸、例えば、ラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸およびオレイン酸のポリオキシエチレンソルビタンのモノエステルおよびトリエステル；ポロキサミン、ポリ（オキシエチレン）エーテル、ポリ（オキシエチレン）エステル、ポリエチレングリコールならびにこの混合物が挙げられる。少なくとも１種類のポロキサマー（特に、ポロキサマー１８８）と少なくとも１種類のｎ−Ｃ１２−Ｃ１６アルキル硫酸ナトリウム（特に、ドデシル硫酸ナトリウム）を含む安定剤の混合物が特に好ましい。最も好ましい安定剤は６から１６の範囲のＨＬＢを有するものである。
【００４６】
１以上の安定剤の総量は典型的には、重合性モノマーの総重量に対して５から２５ｗｔ−％の範囲である。例えば、５から２５ｗｔ−％の量の安定剤は、ポロキサマー（例えば、ポロキサマー１８８）とｎ−Ｃ１２−Ｃ１６アルキル硫酸ナトリウム（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム）で、２から３部のポロキサマーに対して１部のｎ−Ｃ１２−Ｃ１６アルキル硫酸ナトリウムの重量比で構成され得る。
【００４７】
本発明の方法の工程（ｉｉ）では、親水性液全体に分布した疎水性液の微細液滴のエマルジョンが形成されるように、疎水性の液相を親水性の液相中に微細分散させる。このエマルジョンは剪断力を負荷することにより、例えば、スタティックミキサーを用いて混合することにより、超音波により、加圧下（例えば、少なくとも５，０００ｋＰａ、例えば２０，０００から２００，０００ｋＰａ、好ましくは５０，０００から１００，０００ｋＰａの圧力下）での均質化により、またはこれらの任意の均質化方法を組み合わせることにより取得可能である。親水性液中の疎水性液のエマルジョンは、２工程の方法で調製され得、この場合、２つの相をまず、例えばスタティックミキサー（ローテータ／ステータ型ミキサー）を用いて、予備エマルジョンが得られるように混合し、この予備エマルジョンを第２工程で、疎水性液の液滴のサイズが縮小されるように超音波処理によりおよび／または高圧ホモジナイザーを用いてさらに均質化する。剪断力は１から１０分、特に２から５分の時間、負荷され得る。例えば、超音波は１から１０分間、特に２から５分間、５０から１００％の範囲の振幅で適用され得る。
【００４８】
工程（ｉｉ）は、約２５℃（室温）または好ましくは約０℃の温度（例えば、氷上）で行なわれ得る。
【００４９】
重合性モノマーの重合は、親水性の液相と接触すると開始されるが、アルカリ性の環境でなければ非常にゆっくり進行する。従って、本発明の方法の工程（ｉｉｉ）では、エマルジョンにおける重合を、該エマルジョンのｐＨを４．０から６．０の範囲の値まで上げることにより加速させる。これは、塩基またはこの水溶液を添加することにより行なわれ得る。好適な塩基の例としては、限定されないが、水酸化ナトリウム、炭酸カリウム、アンモニアおよびＴｒｉｓ（塩基）が挙げられる。
【００５０】
エマルジョンのｐＨを４．０から６．０に上げた後、本明細書に記載のような１以上の抗原結合性分子を、例えば水溶液の形態でエマルジョンに添加する。かくして、抗原結合性分子が、形成中のナノスフェアの高分子マトリックス中に組み込まれ得る。該方法の工程（ｉｖ）で添加される抗原結合性分子の量は典型的には、１以上のマトリックス形成ポリマーと１以上の抗原結合性分子の総重量に対して、０．０５ｗｔ−％から２０ｗｔ−％、特に０．５ｗｔ−％から１５ｗｔ−％の範囲である。場合により、１以上の抗原結合性分子とエマルジョン混合物を約２５℃（室温）で５から２０分間インキュベートする。
【００５１】
工程（ｖ）におけるｐＨを、ｐＨ８．０を超えないｐＨまで上げながら、重合を継続させる。これにより、残留モノマーが重合することが可能になる。この重合は通常、約１０から１４時間（例えば、一晩のインキュベーション）後に終了し、約４℃の温度で行なわれ得る。
【００５２】
場合により、本発明の方法にさらに精製工程を、例えば、濾過工程および／または得られたナノスフェアの懸濁媒体の一部もしくは完全交換（例えば、透析により）を含めてもよい。
【００５３】
本発明の方法により、本明細書に記載のようなナノスフェアの調製物がもたらされ得る。特に、該方法は、ナノスフェアからの放出後、それぞれ抗原結合活性および元の生物学的活性の少なくとも２０％、特に少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％から４５％までまたはこれ以上を保持している抗原結合性分子を含むナノスフェアの調製に適している。
【００５４】
本発明の方法により、１以上の抗原結合性分子の高い封入効率が可能になる。用語「封入効率」は、ナノスフェアの調製に使用される１以上の抗原結合性分子の総量に対するナノスフェア内に封入された１以上の抗原結合性分子の量をいう。具体的には、本発明の方法により、少なくとも５０％、特に少なくとも７０％、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０ｗｔ−％、少なくとも９５％またはさらには９９％またはこれ以上の封入効率が可能になる。
【００５５】
本発明により、さらに、本明細書に記載の複数のナノスフェアおよび医薬として許容される担体を含む医薬組成物を提供する。担体は、意図される投与様式に適するように選択され、投与様式は、例えば、経口または非経口投与、血管内、皮下もしくは最も一般的には静脈内注射、経皮適用または局所適用（例えば、皮膚、鼻もしくは口内の粘膜または結膜上への）であり得る。
【００５６】
本発明のナノスフェアにより、封入された１以上の活性薬剤が胃腸管内および血中での早期分解から保護され、この徐放が可能になることによって、１以上の前記薬剤のバイオアベイラビリティおよび有効性が高まり得る。経口投与後、本発明のナノスフェアは腸壁およびさらには血液脳関門などの関門を通過し得る。
【００５７】
本発明の液状医薬組成物には、典型的には、１以上の水溶性の塩および／または１以上の水溶性のポリマーを含むものであり得る水溶液から選択される担体を含める。該組成物が注射によって投与されるものである場合、担体は典型的には、等張性水溶液（例えば、１５０ｍＭのＮａＣｌ，５ｗｔ−％のデキストロースまたは両方を含有している溶液）である。また、かかる担体は典型的には、約７．３から７．４の範囲の適切な（生理学的）ｐＨを有するものである。
【００５８】
例えば経口投与されるか、または埋め込みデポ剤として投与される組成物のための固形または半固形の担体は、医薬として許容されるポリマー、例えば限定されないが、Ｎ−ビニルラクタムのホモポリマーおよびコポリマー（特に、Ｎ−ビニルピロリドンのホモポリマーおよびコポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン、Ｎ−ビニルピロリドンと酢酸ビニルもしくはプロピオン酸ビニルとのコポリマー）、セルロースエステルおよびセルロースエーテル（特に、メチルセルロースおよびエチルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、特に、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシルアルキルアルキルセルロース、特に、ヒドロキシルプロピルメチルセルロース、フタル酸セルロースもしくはコハク酸セルロース、特に、酢酸フタル酸セルロースおよびフタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース、コハク酸ヒドロキシプロピルメチルセルロースもしくは酢酸コハク酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース）、高分子量ポリアルキレンオキシド（例えば、ポリエチレンオキシドおよびポリプロピレンオキシドならびにエチレンオキシドとプロピレンオキシドのコポリマー）、ポリビニルアルコール−ポリエチレングリコール−グラフトコポリマー、ポリアクリレートおよびポリメタクリレート（例えば、メタクリル酸／アクリル酸エチルコポリマー、メタクリル酸／メタクリル酸メチルコポリマー、メタクリル酸ブチル／メタクリル酸２−ジメチルアミノエチルコポリマー、ポリ（ヒドロキシアルキルアクリレート）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリレート））、ポリアクリルアミド、酢酸ビニルポリマー（例えば、酢酸ビニルとクロトン酸のコポリマー、部分加水分解ポリ酢酸ビニル）、ポリビニルアルコール、オリゴ糖および多糖、例えば、カラギーナン、ガラクトマンナンおよびキサンタンガム、またはこれらの１以上の混合物から選択され得る。固形担体成分は、本発明のナノスフェアの液状懸濁液中に溶解または懸濁され得、液状懸濁媒体は少なくとも一部が除去され得る。
【実施例】
【００５９】
粒子サイズおよび多分散指数の測定
本明細書に記載の実施例において、調製したナノ粒子のサイズおよび多分散指数（ＰＤＩ）は、動的光散乱法における国際規格（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  ｏｎ  Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）ＩＳＯ１３３２１（１９９６）およびＩＳＯ２２４１２（２００８）に規定されたキュムラント解析により、ゼータサイザーデバイス（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて測定した。これにより、平均粒子サイズ（ｚ−平均直径）および分布の幅の推定値（ＰＤＩ）が得られる。ＰＤＩは、本実施例で示している場合、サイズ分布の幅広さの無次元測定量であり、このゼータサイザーのソフトウェアでは０から１の範囲である。＜０．０５のＰＤＩ値は、単分散試料（即ち、非常に均一な粒子サイズ分布を有する試料）を示すが、高いＰＤＩ値ほど、より多分散の試料を示す。
【００６０】
［実施例１］
抗ビオチンヤギＩｇＧを負荷した高分子ナノ粒子の調製
ＩｇＧ負荷ポリ（ｎ−ブチル２−シアノアクリレート）（ＰＢＣＡ）ナノスフェアを以下のようにして調製した：
２５０μｌのｎ−ブチル２−シアノアクリレート（モノマー）を２１．５μｌのダイズ油と、油相が得られるように混合した。１６．２５ｍｇのポロキサマー１８８と６．５ｍｇのドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を１．３ｍｌの０．１Ｍのリン酸と、水相が得られるように混合した。両方の相を氷上で維持した。これらの相を混合し、混合物を、超音波プローブ（Ｈｉｅｌｓｃｈｅｒ  Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ  ＧｍｂＨ，Ｇｅｒｍａｎｙ，振幅７０％，１サイクル）を用いて、なお氷冷下で２分間均質化した。得られたエマルジョンに、０．１Ｎの水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）を撹拌（７００ｒｐｍ）下で滴下した。エマルジョンのｐＨが５．０に達したらすぐに、撹拌を継続したまま、１ｍｇの抗ビオチンヤギＩｇＧをゆっくり添加した。ＩｇＧの添加後、エマルジョンの撹拌を室温で約１０分間継続した。次いで、０．１Ｎ  ＮａＯＨの滴下によってｐＨを７．０まで上げ、試料を４℃で一晩インキュベートし、残留モノマーを重合させた。
【００６１】
ＩｇＧ負荷ポリ（エチル２−シアノアクリレート）（ＰＥＣＡ）ナノスフェアが得られるように、ｎ−ブチル２−シアノアクリレートの代わりにエチル２−シアノアクリレートを用いて同じ手順を繰り返した。
【００６２】
一晩のインキュベーション後、得られたナノスフェア懸濁液を、上記のゼータサイザーデバイスとソフトウェアを用いて分析し、２００ｎｍメンブレンに通して濾過し、再度分析した。これらの分析の結果、即ち、サイズ（ｚ−平均直径として測定）およびＩｇＧ負荷ＰＢＣＡナノスフェア（ＰＢＣＡ  ＮＰ）とＩｇＧ負荷ＰＥＣＡナノスフェア（ＰＥＣＡ  ＮＰ）のＰＤＩを、標準偏差（ｎ＝３）を含めて、図１Ａにまとめる。さらに、ナノスフェアを透過型電子顕微鏡検査（ＴＥＭ，図１Ｂ参照）によって検査した。
【００６３】
［実施例２］
封入効率（ＥＥ）
実施例１のＰＢＣＡナノスフェア懸濁液中の遊離（未封入）の抗ビオチンヤギＩｇＧの量を、サイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ−ＨＰＬＣ）を用いて測定した。遊離である（即ち、ナノスフェア内に封入されているのではなく懸濁媒体中に溶解されている。）ＩｇＧは５．６％だけであることがわかった。［（添加されたＩｇＧの総量）−（未封入のＩｇＧ）］／［添加されたＩｇＧの総量］の商として計算される封入効率は９４．４％であった。
【００６４】
［実施例３］
封入されたＩｇＧの抗原結合活性
２５０μｌのｎ−ブチル２−シアノアクリレート（モノマー）を２１．５μｌのダイズ油と、油相が得られるように混合した。１６．２５ｍｇのポロキサマー１８８と６．５ｍｇのドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を１．３ｍｌの０．１Ｍのリン酸と、水相が得られるように混合した。両方の相を氷上で維持した。これらの相を混合し、混合物を、超音波プローブ（Ｈｉｅｌｓｃｈｅｒ  Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ  ＧｍｂＨ，Ｇｅｒｍａｎｙ，１００％振幅，１サイクル）を用いてなお氷冷下で５分間、エマルジョンが得られるように均質化した。５００μｌのエマルジョンを、上記の組成を有する８００μｌの水相で希釈した。０．１Ｎの水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）を撹拌下（３００から５００ｒｐｍ）で滴下した。エマルジョンのｐＨが５に達したらすぐに、撹拌を継続したまま、１ｍｇの非特異的ヤギＩｇＧ（ビオチンに対する特異的結合活性なし）または１ｍｇの抗ビオチンヤギＩｇＧ（ビオチンに特異的に結合する）をゆっくり添加した。ＩｇＧの添加後、０．１Ｎ  ＮａＯＨの滴下によってｐＨを７まで上げ、試料を４℃で一晩インキュベートし、残留モノマーを重合させた。
【００６５】
各試料（終濃度：１．０８ｍｇ／ｍｌのＰＢＣＡ）の一部を振盪下で、ブタ肝臓エステラーゼ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．，Ｇｅｒｍａｎｙ，カタログ番号Ｅ２８８４，≧１５０Ｕ／ｍｌ，終濃度：０．５ｍｇ／ｍｌ）で３７℃にて４時間処理した。
【００６６】
試料のビオチン結合活性を、ビオチンコートマイクロタイタープレートでのＥＬＩＳＡにより測定した。各試料について６つの異なる希釈液（１：２の連続希釈液）を測定した。すべての抗ビオチンＩｇＧが抗原結合活性を保持しているものとして抗ビオチン抗体の理論値濃度を計算した。抗原結合性抗ビオチンＩｇＧの実際の濃度は、ＥＬＩＳＡ（抗ヤギ抗体ホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲートとテトラメチルベンジジンを用いて検出）により、３．９から１，０００ｎｇ／ｍｌ抗ビオチンＩｇＧ範囲を含む抗ビオチンＩｇＧ検量曲線に基づいて測定した。理論値濃度に対するＥＬＩＳＡ検出可能な抗原結合性抗ビオチンＩｇＧの割合を計算した。結果を表１にまとめる。
【００６７】
【表１】
0006651507.tif 000002
【００６８】
未封入の５．６％の抗ビオチンＩｇＧ（実施例２参照）ならびにバックグラウンドシグナルの非ビオチン特異的ヤギＩｇＧ（対照）を考慮した。この結果、ナノスフェア内にエステラーゼ放出可能に封入された抗原結合ＩｇＧの量は約４０から４５％であった。
【００６９】
［実施例４］
封入されたＩｇＧの生物学的活性
封入されたＩｇＧの生物学的活性を、反発性軸索ガイダンス分子（Ｒｅｐｕｌｓｉｖｅ  Ｇｕｉｄａｎｃｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ）Ａ（ＲＧＭａ）に対するモノクローナル抗体（ｍａｂ）を負荷したＰＢＣＡナノスフェアにおいて、以下のようにして測定した：
抗ＲＧＭａ  ｍａｂ負荷ＰＢＣＡナノスフェアの懸濁液を実施例１に記載の方法（１ｍｇのヤギＩｇＧの代わりに２．２６ｍｇのこのｍａｂを添加）を用いて調製し、これには遊離ｍａｂと封入ｍａｂが含まれていた（エステラーゼ処理後の試料名：「遊離＋封入」）。一部のこの懸濁液のナノスフェアを遊離ｍａｂから限外濾過（Ａｍｉｃｏｎ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍａｘ  ５００ｋＤａフィルターメンブレン）によって分離し、従って、封入ｍａｂのみを含む試料（エステラーゼ処理後の試料名：「封入」）を得た。各試料（９．５５ｍｇ／ｍｌのＰＢＣＡ，１：１０希釈液）の一部をブタ肝臓エステラーゼ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．，Ｇｅｒｍａｎｙ  カタログ番号Ｅ２８８４，≧１５０Ｕ／ｍｌ，終濃度：０．２２ｍｇ／ｍｌ）で、振盪下、３７℃で４時間処理し、封入ｍａｂをナノスフェアから放出させた。対照として、全く抗体の負荷なしのＰＢＣＡナノ粒子を調製し、試料「遊離＋封入」および「封入」について記載のとおりにエステラーゼで処理した（試料名：「空ＮＰ」）。
【００７０】
各試料の抗ＲＧＭａ  ｍａｂの生物学的活性を、ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイによりＯｎｅ−Ｇｌｏ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて測定した。前記のアッセイは、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）のＢＭＰ受容体ＢＭＰＲ  Ｉ／ＩＩ（ヒトＲＧＭａを発現し、ＢＭＰＲ  Ｉ／ＩＩのＢＭＰ誘導性シグナル伝達に応答性のルシフェラーゼレポーターを含むｃ−２９３ＨＥＫ細胞の細胞膜に存在する。）に対する結合に基づいたものである。ＲＧＭａはＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４またはＢＭＰ−６に結合して共受容体としての機能を果たし、ＢＭＰシグナル伝達の向上をもたらす。生物学的に活性な抗ＲＧＭａ  ｍａｂはＲＧＭａがＢＭＰに結合することを妨げ、従ってＢＭＰシグナル伝達を低減させる。
【００７１】
９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，白色アッセイプレート）にウェル１つあたり５０，０００個のｃ−２９３ＨＥＫ細胞（５０μｌの培地中）を播種した。ウェル１つあたり２５μｌの試料希釈液を添加した。希釈液の組成を表２にまとめる。
【００７２】
【表２】
0006651507.tif 000003
【００７３】
９６ウェルプレートを３７℃および５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。次いで、７５μｌ／ウェルのＯｎｅ−Ｇｌｏ基質を添加した。暗所にて７５０ｒｐｍで振盪下、室温での７分間のさらなるインキュベーション後、各ウェルにおける発光を測定した。結果を図２に示す。
【００７４】
エステラーゼ自体（試料名：「エステラーゼ」）は、すべての試験対象濃度において、シグナル伝達能に対して大きな影響を有しなかった。しかしながら、ｍａｂなしのＰＢＣＡナノ粒子（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｕｌｅ）（「空ＮＰ」）、およびエステラーゼ処理により生じたこの分解生成物では、希釈液１から３において細胞シグナル伝達が低下した。従って、希釈液４から６で測定された発光値に基づいて計算を行なった。「空ＮＰ」試料の平均シグナル値を１００％に正規化した（図３参照）。精製したｍａｂ負荷ナノスフェア（「封入」）からの抗ＲＧＭａ  ｍａｂによりＢＭＰシグナル伝達の２５％の減少がもたらされた。試料「遊離＋封入」で観察された４９．５％のＢＭＰシグナル伝達の低減は、２４．５％の抗ＲＧＭａ  ｍａｂが遊離であった（ナノスフェア内に封入されなかった。）ことを示す。この結果は、ナノスフェア内に封入されたｍａｂの少なくとも２５％が元の生物学的活性を保持していたことを示す。
【００７５】
［実施例５］
ヒトＩｇＧ−ＦＩＴＣコンジュゲートを負荷したＰＢＣＡナノ粒子の調製
ヒトＩｇＧ−ＦＩＴＣコンジュゲートを負荷したＰＢＣＡナノスフェアの懸濁液を、エマルジョンのｐＨを７．０に調整した後、（４℃で一晩の代わりに）室温で約４．５時間インキュベートしたこと以外は、実施例１に記載の方法を用いて調製した。
【００７６】
濾過前では、ナノスフェアのｚ−平均直径は１７３ｎｍであり、ＰＤＩは０．１８６であった。濾過（２００ｎｍメンブレン）後では、ナノスフェアのｚ−平均直径は１４４ｎｍであり、ＰＤＩは０．１５７であった。
【００７７】
実施例２に記載のようにして測定した封入効率は９７．６％（即ち、遊離の抗体コンジュゲートは２．４％）であった。
【００７８】
［実施例６］
ヤギＩｇＧを負荷したＰＢＣＡナノ粒子の調製
各試料について、２１．５μｌのダイズ油を表３に示した量のｎ−ブチル２−シアノアクリレート（モノマー）と、油相が得られるように注意深く混合した。１６．２５ｍｇのポロキサマー１８８と６．５ｍｇのドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を１．３ｍｌの０．１Ｍのリン酸と、水相が得られるように混合した。両方の相を氷上で維持した。これらの相を混合し、混合物を、超音波プローブ（Ｈｉｅｌｓｃｈｅｒ  Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ  ＧｍｂＨ，Ｇｅｒｍａｎｙ，１サイクル）を用いて、表３に示した時間と条件下で均質化した。得られたエマルジョンに、撹拌下（３００から５００ｒｐｍ）で０．１Ｎの水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）を滴下した。エマルジョンのｐＨが表３に示した値に達したらすぐに、撹拌を継続したまま、１ｍｇの抗ビオチンヤギＩｇＧをゆっくり添加した。ＩｇＧの添加後、エマルジョンの撹拌を室温で約１０分間継続した。次いで、０．１Ｎ  ＮａＯＨの滴下によってｐＨを約６．０から７．０まで上げ、試料を４℃で一晩インキュベートし、残留モノマーを重合させた。
【００７９】
【表３】
0006651507.tif 000004
0006651507.tif 000005
【００８０】
一晩のインキュベーション後、得られたナノスフェア懸濁液を、上記のゼータサイザーデバイスとソフトウェアを用いて分析し、２００ｎｍメンブレンに通して濾過し、再度分析した。これらの分析の結果、即ち、サイズ（ｚ−平均直径として測定）およびナノスフェアのＰＤＩを、標準偏差（ｎ＝３）を含めて、図４にまとめる。さらに、ナノスフェアを透過型電子顕微鏡検査（ＴＥＭ）によって検査した。
【００８１】
各試料の封入効率（ＥＥ）を実施例２に記載のようにして測定した。結果を表４に示す。
【００８２】
【表４】
0006651507.tif 000006
【図１Ａ】
0006651507.tif 000007
【図１Ｂ】
0006651507.tif 000008
【図２】
0006651507.tif 000009
【図３】
0006651507.tif 000010
【図４】
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