(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイクロ流路中のクレゾールレッドを含む液体からの光を受光するステップと、
前記受光した光について、３４０ｎｍ以上６４０ｎｍ以下の波長範囲のうち４７０ｎｍの波長を除く少なくとも１点の波長の光の強度を計測するステップと、
前記計測した光強度に基づいて前記マイクロ流路中の液体の温度を算出するステップと、
を含み、
前記マイクロ流路は、クレゾールレッド担持部を備え、
さらに、前記受光するステップの前に、前記クレゾールレッド担持部によって、前記マイクロ流路中の液体に、前記クレゾールレッドを供給するステップを含む、
マイクロ流路中の液体の温度測定方法。
【請求項２】
前記液体の温度を算出するステップでは、前記計測した光強度から吸光度を算出し、算出した前記吸光度に基づいて前記マイクロ流路中の前記液体の温度を算出する、請求項１に記載のマイクロ流路中の液体の温度測定方法。
【請求項３】
前記少なくとも１つの波長の光の強度を計測するステップでは、３４０ｎｍ以上、４７０ｎｍ未満の波長範囲の２点以上の波長の光強度を計測し、
前記マイクロ流路中の液体の温度を算出するステップでは、３４０ｎｍ以上、４７０ｎｍ未満の波長範囲の前記２点以上の波長の光強度の和又は平均に基づいて前記マイクロ流路中の液体の温度を算出する、請求項１に記載のマイクロ流路中の液体の温度測定方法。
【請求項４】
前記少なくとも１つの波長の光の強度を計測するステップでは、４７０ｎｍを越えて、６４０ｎｍ以下の波長範囲の２点以上の波長の光強度を計測し、
前記マイクロ流路中の液体の温度を算出するステップでは、４７０ｎｍを越えて、６４０ｎｍ以下の波長範囲の前記２点以上の波長の光強度の和又は平均に基づいて前記マイクロ流路中の液体の温度を算出する、請求項１に記載のマイクロ流路中の液体の温度測定方法。
【請求項５】
前記少なくとも１つの波長の光の強度を計測するステップでは、３４０ｎｍ以上、４７０ｎｍ未満の波長範囲の１点の波長の光強度と、４７０ｎｍを越えて、６４０ｎｍ以下の波長範囲の１点の波長の光強度と、を計測し、
前記マイクロ流路中の液体の温度を算出するステップでは、３４０ｎｍ以上、４７０ｎｍ未満の波長範囲の前記１点の波長の光強度と、４７０ｎｍを越えて、６４０ｎｍ以下の波長範囲の前記１点の波長の光強度と、の差に基づいて前記マイクロ流路中の液体の温度を算出する、請求項１に記載のマイクロ流路中の液体の温度測定方法。
【請求項６】
前記マイクロ流路中の液体の温度を算出するステップでは、算出した吸光度に基づく数値について、あらかじめ記憶している吸光度と温度との関係を示す温度基準に基づいて、
前記マイクロ流路中の液体の温度を算出する、請求項２に記載のマイクロ流路中の液体の温度測定方法。
【請求項７】
さらに、前記吸光度と温度との関係を示す温度基準について、算出した吸光度に基づく数値と、別途計測した前記マイクロ流路中の液体の温度とに基づいて、前記吸光度と温度との関係を示す温度基準を較正するステップを含む、請求項６に記載のマイクロ流路中の液体の温度測定方法。
【請求項８】
少なくとも１点の波長の光の強度を計測するステップは、前記受光した光について、少なくとも４７０ｎｍ以下の波長範囲の光を透過させない赤色フィルタを透過した光の強度を計測する、請求項１、２、４、６、７のいずれか一項に記載のマイクロ流路中の液体の温度測定方法。
【請求項９】
請求項１に記載のマイクロ流路中の液体の温度測定方法を２回行って、１回目の前記マイクロ流路中の液体の温度と、２回目の前記マイクロ流路中の液体の温度と、を算出し、
前記マイクロ流路中の液体の温度変化を検出する、マイクロ流路中の液体の温度変化検出方法。
【請求項１０】
前記クレゾールレッド担持部は、前記供給するステップにおいて、単位時間当たり一定量の前記クレゾールレッドを供給する、
請求項１に記載のマイクロ流路中の液体の温度測定方法。
【請求項１１】
前記液体の温度を算出するステップでは、前記計測した光強度から吸光度を算出し、算出した吸光度に基づく数値について、あらかじめ記憶している吸光度と温度との関係を示す温度基準に基づいて、前記マイクロ流路中の液体の温度を算出し、
前記温度基準は、前記クレゾールレッド担持部が供給する前記単位時間当たりの一定量に対応している、
請求項１０に記載のマイクロ流路中の液体の温度測定方法。
【請求項１２】
前記クレゾールレッド担持部は、前記液体に溶解性を有する膜で囲まれたクレゾールレッドを有し、
前記供給するステップにおいて、前記マイクロ流路中に、前記液体が供給されることにより、前記膜が溶解することで、前記クレゾールレッドが前記マイクロ流路中の液体に供給される、
請求項１に記載のマイクロ流路中の液体の温度測定方法。
【請求項１３】
液体を保持するマイクロ流路を有するマイクロ流路チップであって、
少なくとも一つの面が３４０ｎｍ以上６４０ｎｍ以下の波長範囲のうち４７０ｎｍの波長を除く少なくとも１点の波長の光を透過させる材料からなり、加熱又は冷却可能な流路を含むマイクロ流路と、
前記マイクロ流路中の液体に供給するクレゾールレッドを担持したクレゾールレッド担持部と、
を有する、マイクロ流路チップ。
【請求項１４】
前記クレゾールレッド担持部は、前記マイクロ流路を流れる液体へクレゾールレッドを単位時間当たり一定量供給するようにクレゾールレッドが配置されている、請求項１３に記載のマイクロ流路チップ。
【請求項１５】
マイクロ流路中のクレゾールレッドを含む液体からの光を受光する受光部と、
前記受光した光について、３４０ｎｍ以上６４０ｎｍ以下の波長範囲のうち４７０ｎｍの波長を除く少なくとも１点の波長の光の強度を計測する光強度計測部と、
前記計測した光強度に基づいて前記マイクロ流路中の液体の温度を算出する液体温度算出部と、
を含み、
前記液体温度算出部は、前記計測した光強度から吸光度を算出し、算出した前記吸光度に基づいて前記マイクロ流路中の前記液体の温度を算出し、
前記液体温度算出部は、算出した吸光度について、あらかじめ記憶している吸光度と温度との関係を示す温度基準に基づいて、前記マイクロ流路中の液体の温度を算出し、
前記温度基準は、前記マイクロ流路に位置するクレゾールレッド担持部が前記マイクロ流路に単位時間当たりに供給するクレゾールレッドの一定量に対応している、
マイクロ流路中の液体の温度測定装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、マイクロ流路中の液体の温度測定方法に関する。詳細には、マイクロ流路チップ内のサーマルリアクタ、特に遺伝子の増幅工程に用いられるポリメラーゼ・チェイン・リアクション（ＰＣＲ）工程における温度測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
マイクロ流路内の液体の温度測定に対して、流路内に熱電対となる金属薄膜を配置して温度を測定する方法が開示されている（例えば、特許文献１参照。）。
【０００３】
また、非接触に流体の温度を測定する方法として、蛍光色素を含んだ流体に対する蛍光強度の温度依存性を利用した測定方法が開示されている（例えば、非特許文献１参照。）。この測定方法では、モルキュラービーコン型の分子プローブが、温度変化によって分子内の結合状態が変化するため蛍光強度が変化する。また、プロトン交換型の分子プローブでは、蛍光色素は温度変化により、プロトン授受が起こり、その量子効率が変化するため、蛍光強度が変化する。この測定方法では、蛍光強度を測定することにより流体の温度を推定することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００６−１３０５９９号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｔ．  Ｂａｒｉｌｅｒｏ，  Ｔ．  Ｌｅ  Ｓａｕｘ，  Ｃ．  Ｇｏｓｓｅ，  ａｎｄ  Ｌ．  Ｊｕｌｌｉｅｎ，  “Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｔｈｅｒｍｏｍｅｔｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｄｕａｌ−Ｅｍｉｓｓｉｏｎ−Ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ：  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ｉｎ  ａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍ”  Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２００９，  ８１，  ７９８８−８０００
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、上記のように金属薄膜をマイクロ流路内に配置する方法においては、製造工程が複雑になり、且つ、特殊な製造装置が必要になるという課題がある。
【０００７】
また、上記のように蛍光色素の発光強度を利用した温度測定方法では、特定波長の励起光（例えばレーザ光等）と蛍光検出のための感度の高い撮像素子を含む高価な光学機器が必要となり、装置構成も複雑になるという課題がある。
【０００８】
本開示は、マイクロ流路チップのマイクロ流路中の液体の温度を、複雑な製造工程を経ることのなく、高価な光学機器を導入することなく、簡便に測定できる方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本開示に係るマイクロ流路中の液体の温度測定方法は、マイクロ流路中のクレゾールレッドを含む液体からの光を受光するステップと、
前記受光した光について、３４０ｎｍ以上６４０ｎｍ以下の波長範囲のうち４７０ｎｍの波長を除く少なくとも１点の波長の光の強度を計測するステップと、
前記計測した光強度に基づいて前記マイクロ流路中の液体の温度を算出するステップと、
を含む。
【発明の効果】
【００１０】
本開示のマイクロ流路中の液体の温度測定方法によれば、マイクロ流路中の液体の温度を、複雑な製造工程を経ることなく、且つ、高価な光学機器を導入することなく、簡便に測定できる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】実施の形態１に係るマイクロ流路中の液体の温度測定装置を含む温度測定システムの構成を示す概略図である。
【図２Ａ】マイクロ流路チップの一例を示す平面図である。
【図２Ｂ】図２ＡのＡ−Ａ方向からみた断面構造を示す断面図である。
【図３】吸光度と温度とが対応付けられた温度基準の他の一例である。
【図４】光強度と温度とが対応付けられた温度基準の他の一例である。
【図５】液体温度算出部の物理的な構成の一例を示すブロック図である。
【図６】色素材料であるクレゾールレッドを添加した液体を透過した光の波長に対する吸収率の関係を示すグラフである。
【図７】色素材料であるキセノンシアノールを添加した液体を透過した光の波長に対する吸収率の関係を示すグラフである。
【図８】色素材料であるブロモフェノールブルーを添加した液体を透過した光の波長に対する吸収率の関係を示すグラフである。
【図９】色素材料であるオレンジＧを添加した液体を透過した光の波長に対する吸収率の関係を示すグラフである。
【図１０】実施例１において、４種類の色素材料をそれぞれ添加した各液体について、所定波長の光の吸収率と温度との関係を示すグラフである。
【図１１】計測した光強度と温度基準とを用いて温度を出力する温度測定方法のフローチャートの一例である。
【図１２】算出した吸光度と温度基準とを用いて温度を出力する温度測定方法のフローチャートの一例である。
【図１３】実施の形態２に係るマイクロ流路中の液体の温度測定装置を含む温度測定システムの構成を示す概略図である。
【図１４Ａ】実施の形態２に係る温度測定装置の固体撮像素子でマイクロ流路中のクレゾールレッドを含む液体を撮像した画像について、２５℃での赤色フィルタを介した画像のグレースケール図面である。
【図１４Ｂ】実施の形態２に係る温度測定装置の固体撮像素子でマイクロ流路中のクレゾールレッドを含む液体を撮像した画像について、６０℃での赤色フィルタを介した画像のグレースケール図面である。
【図１４Ｃ】実施の形態２に係る温度測定装置の固体撮像素子でマイクロ流路中のクレゾールレッドを含む液体を撮像した画像について、６８℃での赤色フィルタを介した画像のグレースケール図面である。
【図１４Ｄ】実施の形態２に係る温度測定装置の固体撮像素子でマイクロ流路中のクレゾールレッドを含む液体を撮像した画像について、９８℃での赤色フィルタを介した画像のグレースケール図面である。
【図１５】実施の形態２に係る温度測定方法で、検知率と温度との関係を示すグラフである。
【図１６】実施例３の温度測定方法を用いてＰＣＲされた増幅産物およびその比較例の増幅産物の電気泳動写真のグレースケール図面である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
第１の態様に係るマイクロ流路中の液体の温度測定方法は、マイクロ流路中のクレゾールレッドを含む液体からの光を受光するステップと、
前記受光した光について、３４０ｎｍ以上６４０ｎｍ以下の波長範囲のうち４７０ｎｍの波長を除く少なくとも１点の波長の光の強度を計測するステップと、
前記計測した光強度に基づいて前記マイクロ流路中の液体の温度を算出するステップと、
を含む。
上記構成によって、マイクロ流路チップ内のマイクロ流路中の液体の温度を複雑な製造工程を経ることなく、高価な光学機器を導入することなく精度よく測定できる。これによって、加熱工程及び冷却工程を繰り返すポリメラーゼ・チェイン・リアクション（ＰＣＲ）の温度制御を精度よく行うことができる。
【００１３】
第２の態様に係るマイクロ流路中の液体の温度測定方法は、上記第１の態様において、前記液体の温度を算出するステップでは、前記計測した光強度から吸光度を算出し、算出した前記吸光度に基づいて前記マイクロ流路中の液体の温度を算出してもよい。
【００１４】
第３の態様に係るマイクロ流路中の液体の温度測定方法は、上記第１の態様において、前記少なくとも１つの波長の光の強度を計測するステップでは、３４０ｎｍ以上、４７０ｎｍ未満の波長範囲の２点以上の波長の光強度を計測し、
前記マイクロ流路中の液体の温度を算出するステップでは、３４０ｎｍ以上、４７０ｎｍ未満の波長範囲の前記２点以上の波長の光強度の和又は平均に基づいて前記マイクロ流路中の液体の温度を算出してもよい。
【００１５】
第４の態様に係るマイクロ流路中の液体の温度測定方法は、上記第１の態様において、前記少なくとも１つの波長の光の強度を計測するステップでは、４７０ｎｍを越えて、６４０ｎｍ以下の波長範囲の２点以上の波長の光強度を計測し、
前記マイクロ流路中の液体の温度を算出するステップでは、４７０ｎｍを越えて、６４０ｎｍ以下の波長範囲の前記２点以上の波長の光強度の和又は平均に基づいて前記マイクロ流路中の液体の温度を算出してもよい。
【００１６】
第５の態様に係るマイクロ流路中の液体の温度測定方法は、上記第１の態様において、前記少なくとも１つの波長の光の強度を計測するステップでは、３４０ｎｍ以上、４７０ｎｍ未満の波長範囲の１点の波長の光強度と、４７０ｎｍを越えて、６４０ｎｍ以下の波長範囲の１点の波長の光強度と、を計測し、
前記マイクロ流路中の液体の温度を算出するステップでは、３４０ｎｍ以上、４７０ｎｍ未満の波長範囲の前記１点の波長の光強度と、４７０ｎｍを越えて、６４０ｎｍ以下の波長範囲の１点の波長の光強度と、の差に基づいて前記マイクロ流路中の液体の温度を算出してもよい。
【００１７】
第６の態様に係るマイクロ流路中の液体の温度測定方法は、上記第２の態様において、前記マイクロ流路中の液体の温度を算出するステップでは、算出した吸光度に基づく数値について、あらかじめ記憶している吸光度と温度との関係を示す温度基準に基づいて、前記マイクロ流路中の液体の温度を算出してもよい。
【００１８】
第７の態様に係るマイクロ流路中の液体の温度測定方法は、上記第６の態様において、さらに、前記吸光度と温度との関係を示す温度基準について、算出した吸光度に基づく数値と、別途計測した前記マイクロ流路中の液体の温度とに基づいて、前記吸光度と温度との関係を示す温度基準を較正するステップを含んでもよい。
【００１９】
第８の態様に係るマイクロ流路中の液体の温度測定方法は、上記第１、第２、第４、第６、第７のいずれかの態様において、少なくとも１点の波長の光の強度を計測するステップは、前記受光した光について、少なくとも４７０ｎｍ以下の波長範囲の光を透過させない赤色フィルタを透過した光の強度を計測してもよい。
上記構成によって、特に、Ｒ（赤色波長域）の信号強度のみを得ることができ、他の色域、特にＧ（緑色波長域）からのバックグラウンド信号の影響を除去することができる。これによって、高い温度測定レンジおよび測定精度が得られる。
【００２０】
第９の態様に係るマイクロ流路中の液体の温度変化検出方法は、上記第１の態様に係るマイクロ流路中の液体の温度測定方法を２回行って、１回目の前記マイクロ流路中の液体の温度と、２回目の前記マイクロ流路中の液体の温度と、を算出し、前記マイクロ流路中の液体の温度変化を検出する。
【００２１】
第１０の態様に係るマイクロ流路中の液体の温度変化検出方法は、マイクロ流路中のクレゾールレッドを含む液体からの光を受光するステップと、
前記受光した光について、３４０ｎｍ以上６４０ｎｍ以下の波長範囲のうち４７０ｎｍの波長を除く少なくとも１点の波長の光の強度を計測して１回目の光強度を得るステップと、
前記光を受光するステップと、前記少なくとも１点の波長の光の強度を計測するステップとを繰り返して、２回目の光強度を得るステップと、
前記１回目の光強度と、前記２回目の光強度とを対比して、光強度の変化からマイクロ流路中の液体の温度変化を検出するステップと、
を含む。
【００２２】
第１１の態様に係るマイクロ流路チップは、液体を保持するマイクロ流路を有するマイクロ流路チップであって、
少なくとも一つの面が３４０ｎｍ以上６４０ｎｍ以下の波長範囲のうち４７０ｎｍの波長を除く少なくとも１点の波長の光を透過させる材料からなり、加熱又は冷却可能な流路を含むマイクロ流路と、
前記マイクロ流路中の液体に供給するクレゾールレッドを担持したクレゾールレッド担持部と、
を有する。
【００２３】
第１２の態様に係るマイクロ流路チップは、上記第１１の態様において、前記クレゾールレッド担持部は、前記マイクロ流路を流れる液体へクレゾールレッドを単位時間当たり一定量供給するようにクレゾールレッドが配置されていてもよい。
【００２４】
第１３の態様に係るマイクロ流路中の液体の温度測定装置は、マイクロ流路中のクレゾールレッドを含む液体からの光を受光する受光部と、
前記受光した光について、３４０ｎｍ以上６４０ｎｍ以下の波長範囲のうち４７０ｎｍの波長を除く少なくとも１点の波長の光の強度を計測する光強度計測部と、
前記計測した光強度に基づいて前記マイクロ流路中の液体の温度を算出する液体温度算出部と、
を含む。
【００２５】
第１４の態様に係るマイクロ流路中の液体の温度測定装置は、上記第１３の態様において、前記液体温度算出部は、前記計測した光強度から吸光度を算出し、算出した前記吸光度に基づいて前記マイクロ流路中の前記液体の温度を算出してもよい。
【００２６】
第１５の態様に係るマイクロ流路中の液体の温度測定装置は、上記第１４の態様において、前記液体温度算出部は、算出した吸光度について、あらかじめ記憶している吸光度と温度との関係を示す温度基準に基づいて、前記マイクロ流路中の液体の温度を算出してもよい。
【００２７】
第１６の態様に係るマイクロ流路中の液体の温度測定装置は、上記第１３から第１５のいずれかの態様において、前記光強度計測部は、前記受光した光を波長分離する分光器を含んでもよい。
上記構成によって、高い温度測定レンジおよび測定精度が得られる。
【００２８】
第１７の態様に係るマイクロ流路中の液体の温度測定装置は、上記第１３から第１６のいずれかの態様において、前記光強度計測部は、固体撮像素子を含んでもよい。
上記構成によって、小型で簡便なセットアップでマイクロ流路中の液体の温度を測定できる。
【００２９】
第１８の態様に係るマイクロ流路中の液体の温度測定装置は、上記第１７の態様において、前記光強度計測部は、前記受光した光について、少なくとも４７０ｎｍ以下の波長範囲の光を透過させない赤色フィルタをさらに含んでもよい。
上記構成によって、特に、Ｒ（赤色波長域）の信号強度のみを得ることができ、他の色域、特にＧ（緑色波長域）からのバックグラウンド信号の影響を除去することができる。これによって、高い温度測定レンジおよび測定精度が得られる。
【００３０】
第１９の態様に係る液体の温度測定方法は、クレゾールレッドを含む液体からの光を受光するステップと、
前記受光した光について、３４０ｎｍ以上６４０ｎｍ以下の波長範囲のうち４７０ｎｍの波長の光を除く少なくとも１点の波長の光の強度を計測するステップと、
前記計測した光強度に基づいて前記液体の温度を算出するステップと、
を含む。
【００３１】
第２０の態様に係る液体の温度測定方法は、上記第１９の態様において、前記液体の温度を算出するステップでは、前記計測した光強度から吸光度を算出し、算出した前記吸光度に基づいて前記液体の温度を算出してもよい。
【００３２】
以下、本開示の実施の形態に係るマイクロ流路中の液体の温度測定装置、及び、マイクロ流路中の液体の温度測定方法について、添付図面を参照しながら説明する。なお、図面において実質的に同一の部材については同一の符号を付している。
【００３３】
（実施の形態１）
＜温度測定システム＞
図１は、実施の形態１に係るマイクロ流路中の液体の温度測定装置１０を含む温度測定システム１００の構成を示す概略図である。温度測定システム１００は、マイクロ流路中の液体の温度測定装置１０と、マイクロ流路チップ１１と、光源１３と、を備える。温度測定システム１００によって、マイクロ流路チップ１１のマイクロ流路１２中のクレゾールレッドを含む液体からの光を受光し、３４０ｎｍ以上６４０ｎｍ以下の波長範囲のうち４７０ｎｍの波長を除く少なくとも１点の波長の光の強度を計測し、計測した光強度から吸光度を算出し、算出した吸光度に基づいて液体の温度を算出する。
温度測定システム１００によれば、マイクロ流路チップ内のマイクロ流路中の液体の温度を複雑な製造工程を経ることなく、高価な光学機器を導入することなく精度よく測定できる。
【００３４】
＜マイクロ流路チップ＞
図２Ａは、マイクロ流路チップ１１の一例の平面図であり、図２Ｂは、図２ＡのＡ−Ａ方向から見た断面構造を示す断面図である。マイクロ流路チップ１１は、液体を保持するマイクロ流路１２を少なくとも備える。図２Ａの平面図に示すマイクロ流路チップ１１は、右上の入口部１９ａと、左下の出口部１９ｂと、入口部１９ａと出口部１９ｂとを接続するマイクロ流路１２と、を有する。なお、入口部１９ａと出口部１９ｂとは逆であってもよい。また、複数の入口部、複数の出口部があってもよい。
【００３５】
マイクロ流路チップ１１の表面は、所定以下の幅を有する流路１２を有する。流路１２の幅は、例えば、１μｍ以上、１ｍｍ以下である。また、流路１２の深さは、例えば、１μｍ以上、１ｍｍ以下である。流路１２は、少なくとも側面と底面とで構成される。流路１２は、流路１２の進行方向に対して垂直なマイクロ流路チップ１１の断面から見て、凹部の形状を有する。なお、流路１２の側面と底面との間に、必ずしも明確な境界が形成されなくてもよい。また、図２Ｂに示すように、流路１２は上面を有していてもよい。さらに、流路１２の側面及び底面は、後述する光源１３から出力される光に対して所定以上の透光性を有する材料で構成することが望ましい。特に、３４０ｎｍ以上６４０ｎｍ以下の波長範囲の光に対して所定以上の透光性を有することが望ましい。流路１２の材料は、例えば、ガラス又はプラスチックなどである。
【００３６】
流路１２には、検知対象とする液体が配置される。具体的には、例えば、入口部１９ａから液体を導入し、内部の蛇行するマイクロ流路１２を経由して左下の出口部１９ｂから液体を導出する。この場合、液体は、マイクロ流路１２内を流通する。なお、液体を導入後、入口部１９ａ及び出口部１９ｂを封止して、マイクロ流路１２内に液体を保持してもよい。
さらに、流路１２には、色素材料としてのクレゾールレッドが配置される。つまり、流路１２には、液体及びクレゾールレッドが流れる。具体的には、マイクロ流路チップ１１に導入する前に、あらかじめクレゾールレッドが液体に添加され、クレゾールレッドを含む液体をマイクロ流路チップ１１に導入してもよい。あるいは、例えば図２Ａに示すように、マイクロ流路チップ１１の蛇行する流路１２の前にクレゾールレッドを担持するクレゾールレッド担持部３０を設けてもよい。クレゾールレッド担持部３０によって、入口部１９ａに導入された液体にクレゾールレッドを供給し、クレゾールレッドを含む液体がマイクロ流路１２を流れるようにしてもよい。さらに、クレゾールレッド担持部３０には、クレゾールレッドを単位時間当たり一定量供給するようにクレゾールレッドを配置してもよい。なお、クレゾールレッドを単位時間当たり一定量供給する手段としては、クレゾールレッド担持部３０として、クレゾールレッドの溶液を含む微少な流路を設け、マイクロ流路１２へ一定量づつ合流させてもよい。あるいは、液体に一定量づつ溶解する膜にクレゾールレッドを包んでおいて液体に露出させてもよい。クレゾールレッド担持部３０の構成は、上記の例に限定されない。
【００３７】
なお、クレゾールレッドは、ｐＨ０．２〜１．８の第１の変色域より低いＰＨに対して赤色を示し、第１の変色域より高いＰＨに対して黄色を示す。また、クレゾールレッドは、ｐＨ７．２〜８．８の第２の変色域より低いｐＨに対して黄色を示し、第２の変色域よりも高いｐＨに対して赤色を示す。
そこで、測定対象の液体は、温度変化させる工程の前後でｐＨ変化が生じない液体であることが好ましい。また、液体自体が緩衝液であるか、あるいは、液体に緩衝液を添加することがさらに好ましい。
【００３８】
なお、液体は、後述する光源１３から出力される光に対して所定以上の透光性を有する材料であることが望ましい。マイクロ流路チップ１１のマイクロ流路１２に保持する液体としては、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及び、これらの断片を含む生体試料、塩化カリウム、トリス塩酸、又はトリシン水酸化カリウムなどを含むバッファ水溶液である。
【００３９】
マイクロ流路チップ１１は、流路１２中の液体を加熱又は冷却して温度を調整する温度調整装置１７を有する。温度調整装置１７として、マイクロ流路チップ１１の流路１２を所定の温度に調整するために、公知の温度調整装置が用いられる。例えば、温度調整装置１７として、ホットプレート又はペルチェ素子などを用いてもよい。さらに、マイクロ流路チップ２１の底面に金属層を作成し、その金属層に電流を流して流路１２を加熱することにより温度を調整してもよい。
【００４０】
＜光源＞
光源１３は、流路１２に向かって光を出力する。より正確には、光源１３から流路１２を流れる流体に向かって、光が出力される。光源１３は、マイクロ流路チップ１１における流路１２を有する表面に対向するように配置される。例えば、光源１３は、マイクロ流路チップ１１に備え付けるように配置されてもよい。また、光源１３は、所定の波長域を有する光を出力する。所定の波長域とは、３４０ｎｍ以上６４０ｎｍ以下の範囲であり、かつ、４７０ｎｍの波長を除く波長域である。また、望ましい所定の波長域は、４７０ｎｍより大きく、６４０ｎｍ以下の波長範囲である。また、所定の波長域は、３８０ｎｍ以上６４０ｎｍ以下の範囲であり、かつ、４７０ｎｍの波長を除く波長域であってもよい。光源１３が３８０ｎｍ以上の可視光の波長範囲の光を出力することで、使用者が眼で光源１３から出力された光を確認できるためである。
光源１３としては、例えば、キセノンランプ、ハロゲンランプ、又は白色ＬＥＤ照明を用いることができる。また、光源１３は、太陽光等の自然光、又は、建物内の照明であってもよい。太陽又は建物内の照明の場合には、流路１２が光を受けられるように配置すればよい。
【００４１】
＜液体温度測定装置＞
液体温度測定装置１０は、分光器１５と、検出器１６と、液体温度算出部１８と、を少なくとも備える。
分光器１５は、マイクロ流路１２を透過した光を受光する。上述のようにマイクロ流路１２中にはクレゾールレッドを含む液体が保持されている。つまり、光源分光器１５で受光される光は、マイクロ流路１２中のクレゾールレッドを含む液体を透過した光である。分光器１５は、例えば、マイクロ流路チップ１１を挟んで、光源１３と対向して、配置される。分光器１５では、受光した光を少なくとも３４０ｎｍ以上６４０ｎｍ以下の波長範囲について波長分離する。分光器１５としては、例えば、プリズム、回折格子、フィルタ等を用いた分光器、あるいは干渉分光器等を用いることができる。
検出器１６は、分光器１５により受光した光について、３４０ｎｍ以上６４０ｎｍ以下の波長範囲のうち４７０ｎｍの波長を除く少なくとも１点の波長の光の強度を計測する。検出器１６としては、波長分離後の光の強度を検出できるものであればよい。検出器１６としては、例えば、ＣＣＤアレイ、ＣＭＯＳアレイ、光電子倍増管等を用いることができる。なお、分光器１５と検出器１６とを分光光度計として一体的に構成してもよい。また、分光器１５と検出器１６とを、実施の形態２に示すように固体撮像素子として構成してもよい。
【００４２】
液体温度算出部１８は、計測された光の強度から吸光度を算出する。液体温度算出部１８は、光源１３から出力された光の出力強度を受け付け、光の出力強度に対する計測された光の強度の割合から吸光度を算出する。液体温度算出部１８は、算出された吸光度と、予め保持する温度基準３６とに基づいて、マイクロ流路１２中の液体の温度を出力する。温度基準３６は、計測された光強度に基づいて温度が決定される規則である。温度基準３６の一例は、（温度）＝ａ（係数）＊Ｘ（分光器１５で測定された温度）＋（室温）である。
図３に、予め保持する温度基準３７の他の一例を示す。温度基準３７は、吸光度と温度とが対応付けられたテーブルである。液体温度算出部１８は、温度基準３７を参照して、算出された吸光度に対応する温度を出力する。液体温度算出部１８は、温度基準３７に含まれる吸光度の値に、算出された吸光度の値がない場合には、温度基準３７に含まれる吸光度の値のうち算出された吸光度に最も近い値を有する温度を出力する。または、液体温度算出部１８は、温度基準３７に含まれる吸光度の値に算出された吸光度の値がない場合には、温度を出力しない。
図４に、予め保持する温度基準３８の他の一例を示す。温度基準３８は、計測された光の強度と温度とが対応付けられたテーブルである。液体温度算出部１８は、光源１３から出力された光の出力強度を受け付け、温度基準３８を参照して、計測された光の強度に対応する温度を出力する。温度基準３８は、光強度として、光源１３から出力された光の強度等に基づいて、予め求められる値を含む。つまり、図４に示す温度基準に含まれる光強度は、Ａ、Ｂ及びＣと記載されているが、図４に含まれるＡ、Ｂ、及びＣは、光源１３から出力された光の強度等の値に相当する。
液体温度算出部１８は、温度基準３８に含まれる光強度の値に計測された光強度の値がない場合には、温度基準３８に含まれる光強度の値のうち計測された光強度に最も近い値を有する温度を出力する。または、液体温度算出部１８は、温度基準３８に含まれる光強度の値に計測された光強度の値がない場合には、温度を出力しない。
【００４３】
液体温度算出部１８は、例えば図５に示すコンピュータによって構成される。
図５は、液体温度算出部１８の物理的な構成の一例を示すブロック図である。液体温度算出部１８は、ＣＰＵ３１、メモリ３２、入出力部３３、表示装置３４、記憶装置３５、およびインタフェース３７を備える。また、記憶装置３５は、液体の温度を算出する際に用いられる吸光度と温度との関係を示す温度基準３６を記憶している。例えば、液体温度算出部１８は、算出された吸光度と、予め保持する吸光度と温度との関係を示す温度基準３６とを用いて、液体の温度を算出する。温度基準３６とは、吸光度と温度とが例えば図１０に示すように、所定濃度のクレゾールレッドを含む液体についての、所定波長（５７３ｎｍ）の吸光度と温度とが対応付けられた情報である。
【００４４】
本発明者は、図１０に示す所定波長（５７３ｎｍ）だけでなく、図６に示すクレゾールレッドを添加した液体を透過した光の波長に対する吸収率の関係が温度に対して顕著に変化することを初めて見出して、この吸収率の温度変化を用いて液体の温度を算出するという本発明を完成させたものである。
【００４５】
図６は、色素材料であるクレゾールレッドを添加した液体を透過した光の波長に対する吸収率の関係を示すグラフである。図６では、２５℃、５５℃、７０℃、９５℃の各温度での波長と吸収率との関係をそれぞれ示している。図６に示すように、クレゾールレッドを含む液体の吸収率には、２００ｎｍ以上８００ｎｍ以下の波長範囲で少なくとも４つ以上のピークを有する。吸収率と温度との関係が顕著なピークは約４３０ｎｍのピークと約５７０ｎｍのピークである。また、これらのピークを含む３４０ｎｍ以上６４０ｎｍ以下の波長範囲における光の吸収率が２０℃から１００℃の温度範囲で顕著に変化している。さらに、３４０ｎｍ以上４７０ｎｍ以下の波長範囲では温度上昇につれて吸収率（吸光度も同様）が増加する正の相関を有するのに対して、４７０ｎｍを境にして、４７０ｎｍ以上６４０ｎｍ以下の波長範囲では温度上昇につれて吸収率が低下する負の相関を有する。なお、４７０ｎｍでは温度によらず吸収率がほぼ一定となっている。
【００４６】
液体温度算出部１８は、図１０に示す所定波長（５７３ｎｍ）に限られず、他の波長の光の強度について吸光度を求めて、得られた吸光度に基づいて液体の温度を算出してもよい。例えば、３４０ｎｍ以上６４０ｎｍ以下の波長範囲のうち４７０ｎｍの波長を除く少なくとも１点の波長の光の強度を計測し、計測した光強度から吸光度を算出し、算出した吸光度に基づいて液体の温度を算出してもよい。なお、吸光度を算出することなく、計測した光強度に基づいて液体の温度を算出してもよい。
【００４７】
さらに、３４０ｎｍ以上６４０ｎｍ以下の波長範囲について、複数の波長の光強度を用いる場合としては、以下の３つの場合が挙げられる。
ａ）３４０ｎｍ以上、４７０ｎｍ未満の波長範囲の２点以上の波長について
液体温度算出部１８は、３４０ｎｍ以上、４７０ｎｍ未満の波長範囲の２点以上の波長の光強度を計測し、上記２点以上の波長の光強度からそれぞれの吸光度を算出し、算出した吸光度の和又は平均に基づいて液体の温度を算出してもよい。
上述のように、３４０ｎｍ以上、４７０ｎｍ未満の波長範囲では温度上昇につれて吸収率（吸光度も同様）が増加する正の相関を有する。そこで、上記波長範囲の２点以上の波長の吸光度の和又は平均も同様に温度に対して正の相関を有するので、算出された和又は平均によって温度を算出することができる。
ｂ）４７０ｎｍを越えて、６４０ｎｍ以下の波長範囲の２点以上の波長について
液体温度算出部１８は、４７０ｎｍを越えて、６４０ｎｍ以下の波長範囲の２点以上の波長の光強度を計測し、上記２点以上の波長の光強度からそれぞれの吸光度を算出し、算出した吸光度の和又は平均に基づいて液体の温度を算出してもよい。
上述のように、４７０ｎｍを越えて、６４０ｎｍ以下の波長範囲では温度上昇につれて吸収率が低下する負の相関を有する。上記波長範囲の２点以上の波長の吸光度の和又は平均も同様に温度に対して負の相関を有するので、算出された和又は平均によって温度を算出することができる。
ｃ）４７０ｎｍを境にして短波長側（３４０ｎｍ以上）の１点の波長と、長波長側（６４０ｎｍ以下）の１点の波長とについて
液体温度算出部１８は、３４０ｎｍ以上、４７０ｎｍ未満の波長範囲の１点の波長の光強度と、４７０ｎｍを越えて、６４０ｎｍ以下の波長範囲の１点の波長の光強度と、を計測し、３４０ｎｍ以上、４７０ｎｍ未満の波長範囲の１点の波長の光強度から算出した吸光度と、４７０ｎｍを越えて、６４０ｎｍ以下の波長範囲の１点の波長の光強度から算出した吸光度と、の差に１を加算した値に基づいて液体の温度を算出してもよい。
なお、上記各場合では、計測した光強度から吸光度を算出したが、吸光度を算出することなく、計測した光強度に基づいて液体の温度を算出してもよい。計測した規格化されていない光強度を直接用いる場合には、ｃ）の場合に、３４０ｎｍ以上、４７０ｎｍ未満の波長範囲の１点の波長の光強度と４７０ｎｍを越えて、６４０ｎｍ以下の波長範囲の１点の波長の光強度から算出した吸光度との差（正負を含む）又は比をそのまま用いてもよい。
【００４８】
上述のように、４７０ｎｍを境にして吸収率（吸光度も同様）の温度変化の傾向が異なる。つまり、４７０ｎｍを境にして短波長側の吸光度と長波長側の吸光度とをそのまま加算すると、温度に対する変化量の正負が減殺されてしまう。そこで、両者の差をとることによって温度に対する変化量を同符号で含むようにする。さらにこの両者の差は、それぞれの値の大小関係によって正又は負となる場合がある。そこで、２５℃の５７３ｎｍでの吸光度の値を１として規格化しているので、両者の差に１を加えて両者の大小関係にかかわらず数値全体を正の値とすることで、算出した値と温度との単純相関の関係を得ることができる。なお、数値全体を正の値にできれば加算する値は１に限られない。
【００４９】
なお、液体温度算出部１８は、上記温度基準３６について、算出した吸光度に基づく数値と、別途計測した液体の温度とに基づいて、温度基準３６を較正してもよい。あらかじめ記憶した温度基準３６に対して実際の温度測定システム１００では吸光度と温度との関係にずれが生じる場合がある。上記のように温度基準の較正を行うことでより精度の高い温度測定を行うことができる。
【００５０】
＜温度測定方法＞
以下、図１１に計測された光強度と温度基準とを用いて温度を出力する温度測定システム１００の温度測定方法の一例を示す。
（ステップ１）
分光器１５は、液体が流れるマイクロ流路１２を透過する光を受光する（Ｓ０１）。
（ステップ２）
検出器１６は、受光された光について、３４０ｎｍ以上６４０ｎｍ以下の波長範囲のうち４７０ｎｍの波長を除く少なくとも１点の波長の光の強度を計測する（Ｓ０２）。
（ステップ３）
液体温度算出部１８は、予め保持する温度基準と、計測された光の強度とを用いて、マイクロ流路１２を流れる液体の温度を出力する（Ｓ０３）。
【００５１】
次に、図１２に算出された吸光度と温度基準とを用いて温度を出力する温度測定システム１００の温度測定方法の他の一例を示す。
（ステップ１１）
マイクロ流路チップ１１のマイクロ流路１２を流れる液体に、色素材料としてクレゾールレッドを加えられる（Ｓ１１）。流体に添加するクレゾールレッドの濃度は、検出器１６の感度に合わせて任意の濃度に設定され得る。マイクロ流路の厚み約２００μｍ以下で使用することを考慮すると、添加するクレゾールレッドの終濃度は２００μＭ以上が好ましい。また、ＰＣＲ用のサンプルに添加するのであれば、ＰＣＲ収量の観点から２００μＭ程度が特に好ましい。なお、クレゾールレッドの濃度によって吸光度が変化する（ランベルト−ベールの法則）ので、温度基準での所定の濃度に設定する。
（ステップ１２）
光源１３は、マイクロ流路１２に向かって、光を出力する（Ｓ１２）。より具体的には、光源１３は、マイクロ流路１２を流れる流体中のクレゾールレッドに向かって、光を出力する。光源１３から出力される光は、２００ｎｍ以上８００ｎｍ以下程度の波長範囲を有する。望ましい光源１３から出力される光は、少なくとも３４０ｎｍ以上６４０ｎｍ以下の波長のうち４７０ｎｍの波長を除く波長域を有する。
（ステップ１３）
分光器１５は、マイクロ流路１２からの光を受光する（Ｓ１３）。
（ステップ１４）
検出器１６は、受光した光について、３４０ｎｍ以上６４０ｎｍ以下の波長範囲のうち４７０ｎｍの波長を除く少なくとも１点の波長の光の強度を計測する（Ｓ１４）。
（ステップ１５）
液体温度算出部１８は、計測した光強度から吸光度を算出し、算出した吸光度に基づいてマイクロ流路１２中の液体の温度を算出する（Ｓ１５）。
【００５２】
高い測定精度を得るためには、事前にクレゾールレッドを添加しない流体を導入した系でバックグラウンドとなる光強度Ｉｂａｓｅを検出しておき、実測定の光強度Ｉとの差分（Ｉ−Ｉｂａｓｅ）を有効光強度とすることが望ましい。また、温度調整装置１７を用いて温度を変化させながら取得した吸収スペクトルのうち、温度に対する変化が大きい波長域を用いることが望ましい。本実施の形態のようにクレゾールレッド由来のスペクトルから温度を算出する場合は、温度測定に用いる波長としては、３４０ｎｍ以上６４０ｎｍ以下の波長範囲のうち４７０ｎｍの波長を除く少なくとも１点の波長であればよい。また、吸収率の温度変化が比較的大きい４３０ｎｍ付近、又は、５７３ｎｍ付近に設定することが好ましく、さらに、５７３ｎｍ付近の吸収率の温度変化が大きく最も好ましい。
【００５３】
（変形例１）
上記マイクロ流路中の液体の温度測定方法では、ある時点での温度を測定している。これに対して、変形例のマイクロ流路中の液体の温度変化検出方法では、２つの異なる時点での温度を測定している。
このマイクロ流路中の液体の温度変化検出方法は、具体的には、上記マイクロ流路１２中の液体の温度測定方法を２回行って、１回目のマイクロ流路１２中の液体の温度と、２回目のマイクロ流路１２中の液体の温度と、を算出し、マイクロ流路１２中の液体の温度変化を検出する。
【００５４】
（変形例２）
変化例２に係るマイクロ流路中の液体の温度変化検出方法は、具体的には、マイクロ流路中の液体の温度変化検出方法は、マイクロ流路中のクレゾールレッドを含む液体からの光を受光するステップと、
受光した光について、３４０ｎｍ以上６４０ｎｍ以下の波長範囲のうち４７０ｎｍの波長を除く少なくとも１点の波長の光の強度を計測して１回目の光強度を得るステップと、
光を受光するステップと、少なくとも１点の波長の光の強度を計測するステップとを繰り返して、２回目の光強度を得るステップと、
１回目の光強度と、２回目の光強度とを対比して、光強度の変化からマイクロ流路中の液体の温度変化を検出するステップと、
を含む。
この変化例２に係るマイクロ流路中の液体の温度変化検出方法では、変化例１に係るマイクロ流路中の液体の温度変化検出方法と対比すると、吸光度を算出せず、１回目の光強度と、２回目の光強度とをそのまま対比して温度変化の有無を検出している点で相違する。このように吸光度を求めないで光強度そのままで対比するので簡易に温度変化の有無を判断できる。これによって加熱工程又は冷却工程でのヒータの接触不良等のエラーを簡易に判定できる。
【００５５】
（実施の形態２）
＜温度測定システム＞
図１３は、実施の形態２に係るマイクロ流路中の液体の温度測定装置２０を含む温度測定システム１００ａの構成を示す概略図である。温度測定システム１００ａは、実施の形態１に係る温度測定システムと対比すると、マイクロ流路からの透過光ではなく、反射光を受光する点で異なる。このため、マイクロ流路チップ２１もマイクロ流路２２の上面を反射面としている。また、液体温度測定装置２０においても、実施の形態１に係る液体温度測定装置と対比すると、光強度を計測する光強度計測部として固体撮像素子２６を用いている点で異なる。
なお、実施の形態１と同様の事項については説明を省略する。
【００５６】
＜マイクロ流路チップ＞
実施の形態２では、マイクロ流路チップ２１のカバープレート２１１およびマイクロ流路２２に導入される液体で起こる光吸収について、マイクロ流路チップ２１からの反射光を介して検出する。測定で用いるマイクロ流路チップのカバープレート２１１およびマイクロ流路中２２に導入される流体は、光源２３から発せられる光が十分に透過できる材料で構成されることが好ましい。またマイクロ流路チップ２１の上面は、シリコンや金属など可視光を反射する材料が望ましい。この場合、マイクロ流路チップ２１のカバープレート２１１の材料は、例えば、ガラス、プラスチックなど可視光に対して透過率が高い材料が好ましい。また、マイクロ流路２２に導入される液体には、あらかじめクレゾールレッドが添加される。添加するクレゾールレッドの配置及び濃度は、実施の形態１とほぼ同様である。
また、上記マイクロ流路チップ２１では、図１３に示すように、温度調整装置２７を加熱対象のマイクロ流路２２の背面にも配置できるという利点を有する。
【００５７】
＜光源＞
光源２３は、可視光をカバーしている光源が好ましく、キセノンランプ、ハロゲンランプ、自然光、白色ＬＥＤなど、種類は問わない。
【００５８】
＜液体温度測定装置＞
液体温度測定装置２４は、レンズ２５、固体撮像素子２６、液体温度算出部２８と、を備える。
レンズ２５は、測定対象のマイクロ流路２２の領域の画像を固体撮像素子２６に取り込むのに十分な倍率を持つ形態であればよく、材質など種類は特に問わない。
【００５９】
＜固体撮像素子＞
固体撮像素子２６は、ＣＣＤ、ＣＭＯＳなど、種類は問わない。また、任意の波長が検出できるのであれば、２次元面での撮像機能を持たなくてもよく、光電子倍増管でもよい。クレゾールレッド由来のスペクトルの光強度から温度を算出する場合は、例えば、波長５７３ｎｍ付近での検知率が高くなるように、本実施の形態２のように固体撮像素子で取得されたデータを解析すればよい。
【００６０】
特に、前記の３４０ｎｍ以上６４０ｎｍ以下の波長範囲のうち４７０ｎｍの波長を除く少なくとも１点の波長の光の強度を計測するステップにおいて、固体撮像素子で取得されたＲＧＢ情報のうち、特に少なくとも４７０ｎｍ以下の波長範囲の光を透過させない赤色フィルタを用いて、Ｒ（赤色波長域）の信号強度とすることができる。その後、Ｒ（赤色波長域）の信号強度から温度を算出する。これによって、Ｇ（緑色波長域）から生じるバックグラウンド信号（４３０ｎｍ付近）の影響を除去することができる。そこで、高い温度測定レンジおよび測定精度が得られるという観点で好ましい。
【００６１】
また、上記温度測定において、所望の部分への加熱または冷却の工程と、任意の温度になるように加熱または冷却を調整する工程を有することは、マイクロ流路チップの温度制御にこの温度測定方法を用いることができるという観点で好ましい。
また、上記温度測定において、前記温度測定の対象がポリメラーゼ・チェイン・リアクション（ＰＣＲ）であることは、ＰＣＲの制御が精度よく、複雑な製造工程を経ることのなく、高価な光学機器を導入することなく行うことができる、という観点で好ましい。
温度測定システム１００ａは、マイクロ流路１２を反射した光を用いること以外、実施の形態１の温度測定システム１００と同様の温度測定方法により、液体の温度を測定する。
【実施例】
【００６２】
以下、本開示をさらに具体的に説明する。なお、以下の実施例は、本開示をより詳細に説明するための例であって、本開示及び実施の形態は、以下の実施例のみに限定されない。
【００６３】
（実施例１）
実施例１について、図１、図６−図１０を参照しながら説明する。
実施例１では、図１に示すようにマイクロ流路チップ１１およびマイクロ流路１２に導入される流体での透過光の検出を行った。
図１における、マイクロ流路チップ１１は、ガラス基板を加工してマイクロ流路１２を形成し、作製した。
マイクロ流路１２を流れる流体は、濃度５０ｍＭを有するＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）であった。流体の量は、３００μＬであった。
マイクロ流路１２を流れる流体に、６０μＬのクレゾールレッドを添加した。さらに、流体に８４０μＬの超純水８４０μＬを添加して希釈して封入した。また、検出器１６の感度を考慮し、使用する流路厚みに対してクレゾールレッドの濃度を適当な濃度に調整した。流路厚み１０ｍｍのとき、クレゾールレッドの終濃度は５０μＭであった。
比較例として、クレゾールレッド以外にクレゾールレッドと同様にゲル方式の電気泳動でマーカとして一般的に使われる３種類の色素材料を用いた実験を同時に行った。比較のために、終濃度が本実施例と等しくなるように調製した（表１）。
【００６４】
【表１】
0006631867.tif 000002
【００６５】
光源１３には、タングステンランプを用いた。
分光検出器１４には、波長２００ｎｍ以上８００ｎｍ以下の範囲で分光できる回折格子型の分光器１５と、光電子倍増管からなる固体検出素子１６を用いた。
マイクロ流路チップ１１の測定部位以外は、湯浴型の温度調整装置１７で温め、チップの温度が全体的に均一に安定するまで３分間待ってから、分光検出器で吸収スペクトルの測定を行った。また、バックグラウンド信号は、各色素を添加しない状態で吸収スペクトルを測定し、そのデータ値をＩｂａｓｅとして実測定値Ｉとの差分（Ｉ−Ｉｂａｓｅ）をとることで除去した。
【００６６】
予め温度が測定された液体（２５℃、５５℃、７０℃、及び９５℃）に対して、温度測定方法を用いて、温度を測定した。
図６は、色素材料であるクレゾールレッドを添加した液体を透過した光の波長に対する吸収率の関係を測定した結果を示す。図７は、色素材料であるキセノンシアノールを添加した液体を透過した光の波長に対する吸収率の関係を測定した結果を示す。図８は、色素材料であるブロモフェノールブルーを添加した液体を透過した光の波長に対する吸収率の関係を測定した結果を示す。図９は、色素材料であるオレンジＧを添加した液体を透過した光の波長に対する吸収率の関係を測定した結果を示す。
図７〜図９に示すように、比較例１〜３では２５℃〜９５℃の温度範囲で吸光度の変化がほとんど見られなかった。
【００６７】
本実施例、及び比較例１〜３の測定結果から、２５℃における吸収スペクトルについて、以下のことがわかった。色素材料としてクレゾールレッドを用いた本実施例では波長５７３ｎｍ付近で色素由来の最も強い吸収が見られた。色素材料としてキセノンシアノールを用いた比較例１では６２０ｎｍ付近で色素由来の最も強い吸収が見られた。色素材料としてブロモフェノールブルーを用いた比較例２では５９０ｎｍ付近で色素由来の最も強い吸収が見られた。色素材料としてオレンジＧを用いた比較例３では４８１ｎｍ付近で色素由来の最も強い吸収が見られた。
２５℃での上記各波長での吸収率を１とし、温度を変えながら吸収率の測定を行った。図１０に、各温度の吸収率（吸光度）をプロットした結果を示す。より具体的には、図１０は、実施例１において、４種類の色素材料をそれぞれ添加した各液体について、所定波長の光の吸収率と温度との関係を示す。
この結果より、本発明者は、色素材料としてクレゾールレッドを液体に添加した場合、他の色素材料を用いた比較例１〜３と比べて、室温から１００℃程度までの温度域で、所定波長の光の吸収率が非常に大きな温度応答性を示すことを確認した。つまり、５７３ｎｍの波長を含む３４０ｎｍ以上６４０ｎｍ以下の波長範囲のうち、４７０ｎｍを除く広い波長範囲の少なくとも１点の光の吸収率を測定することで、マイクロ流路１２中の流体の温度を精度よく算出できる。
なお、異なる２点の時間について、この吸収率の時間変化を観測すれば、液体の温度変化を検出できる。
【００６８】
（実施例２）
実施例２について、図１３、図１４Ａ乃至図１４Ｄ、図１５を参照しながら説明する。
実施例２では、図１３に示すように、マイクロ流路チップ２１のカバープレート２１１およびマイクロ流路２２に導入される流体での光の吸収をマイクロ流路チップ２１からの反射光を介して検出した。まず、厚み５００ｎｍのシリコン基板をリアクティブ・イオン・エッチング（ＲＩＥ）で加工を行い、表面側に深さ約２５０μｍ、幅約５００μｍの蛇行状のマイクロ流路２２を形成し、裏面にスルーホールを形成し、マイクロ流路チップ２１を作製した。マイクロ流路２２の表面は、厚み５００ｎｍのパイレックスガラスのカバープレート２２１を陽極酸化法で接着して封止した。裏面のスルーホールは、流体導入後に、シリコーンゴムのシーリングバルブ２１２を１Ｎの力で押し付けて封止した。マイクロ流路２２には、クレゾールレッドの終濃度が２００μＭになるように調製されたＰＣＲ用の液体（組成は表２を参照）を封入した。
【００６９】
【表２】
0006631867.tif 000003
【００７０】
プライマー１の配列は、（５‘−ＡＣＧＧＧＣＴＧＣＡＧＧＣＡＴＡＣＡＣＴ−３‘）、プライマー２の配列は、（５’−  ＧＧＣ  ＡＧＧ  ＴＣＣ  ＴＧＡ  ＡＣＣ  ＴＣ  −３’）であった。
光源２３には、白色ＬＥＤと自然光の混合光を用いた。液体温度測定装置２４には、マイクロ流路チップ１１中で測定したい領域（約６ｍｍ角）を取り込むのに十分な倍率を持ったレンズ２５と、それを撮像するＣＣＤからなる固体撮像素子２６を用いた。任意の温度をマイクロ流路２２に与えられるため、測定領域の裏面には、ペルチェ素子からなる温度調整装置２７を接触させた。
【００７１】
図１４Ａ、図１４Ｂ、図１４Ｃ及び図１４Ｄは、それぞれ温度を２５℃（図１４Ａ）、６０℃（図１４Ｂ）、６８℃（図１４Ｃ）、９８℃（図１４Ｄ）と変化させた場合に、ＣＣＤからなる固体撮像素子２６でマイクロ流路２２を撮像した画像を示す。図１４Ａ〜図１４Ｄは、赤色フィルタを介した画像のグレースケール図面である。温度上昇に応じて、色が変化することが目視でも観測された。さらに、固体撮像素子２５で取得されたＲＧＢ情報のうち、Ｒ（赤色波長域）で得られた信号について、２５５階調の色分布と２５５階調の信号強度分布をマッピングした。色分布のうち任意の１階調（本実施例については、５７３ｎｍ付近に相当する１階調）に注目して、その信号強度について平均信号強度との差分を取った。差分値を検知率とした。図１５に、２５℃で測定したときの検知率を１としたときの検知率と温度と関係を示す。この結果より、このような簡便な測定系においても、室温から１００℃程度までの温度域で、実施例１とほぼ同等の応答が得られることが確認された。すなわち、実施例１と同様、この検知率の変化を測定すれば、マイクロ流路１２中の流体の温度を算出できるということが示された。
【００７２】
（実施例３）
実施例３について、図１６を参照しながら説明する。ここでは、ヒトゲノム検体からアセトアルデヒド脱水素酵素２（ＡＬＤＨ２）遺伝子の第１２エクソンの１１４番目の塩基を含む所望のＤＮＡ断片（断片長１４３ｂｐ）のＰＣＲによる増幅を行った。実験は実施例２と同様の構成で行った。
【００７３】
温度調整装置２７で、９８℃で２分間保持した後、９８℃３０秒、６０℃３０秒、６８℃３０秒の条件で３０サイクルＰＣＲを行った。その後、マイクロ流路２２からアクリルアミドゲルの電気泳動法により、ＤＮＡ増幅の有無を確かめた。結果を図１６に示す。
図１６は、実施例３の温度測定方法を用いてＰＣＲされた増幅産物およびその比較例の増幅産物の電気泳動写真のグレースケール図面である。第１レーンは、参照用のラダーで、ラダー間のピッチは２０ｂｐである。第２レーンは、比較例としてクレゾールレッドを添加しないでＰＣＲを行ったものである。第３レーンは、本実施例としてクレゾールレッドを添加してＰＣＲを行った産物から得られた電気泳動結果である。本実施例においても、十分な増幅産物が得られることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００７４】
本開示に係るマイクロ流路中の液体の温度測定方法によれば、マイクロ流路中の液体の温度を簡便に、且つ、精度よく測定できるので、化学合成、環境分析、臨床検体分析を実施するためのマイクロ流路チップやキャピラリ内の温度測定および温度較正に利用することができる。
【符号の説明】
【００７５】
１０、２０  温度測定装置
１１、２１  マイクロ流路チップ
１２、２２  マイクロ流路
１３、２３  光源
１５、２５  分光器、レンズ（受光部）
１６、２６  固体検出素子、固体撮像素子（光強度計測部）
１７、２７  温度調整装置
１８、２８  液体温度算出部
１９ａ  入口部
１９ｂ  出口部
３０  クレゾールレッド担持部
１００、１００ａ  温度測定システム
２１１  カバープレート
２１２  シーリングバルブ
【図１】
0006631867.tif 000004
【図２Ａ】
0006631867.tif 000005
【図２Ｂ】
0006631867.tif 000006
【図３】
0006631867.tif 000007
【図４】
0006631867.tif 000008
【図５】
0006631867.tif 000009
【図６】
0006631867.tif 000010
【図７】
0006631867.tif 000011
【図８】
0006631867.tif 000012
【図９】
0006631867.tif 000013
【図１０】
0006631867.tif 000014
【図１１】
0006631867.tif 000015
【図１２】
0006631867.tif 000016
【図１３】
0006631867.tif 000017
【図１４Ａ】
0006631867.tif 000018
【図１４Ｂ】
0006631867.tif 000019
【図１４Ｃ】
0006631867.tif 000020
【図１４Ｄ】
0006631867.tif 000021
【図１５】
0006631867.tif 000022
【図１６】
0006631867.tif 000023
【配列表】
0006631867000001.app