(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
通性嫌気性であり、Geobacillus属に属する、遺伝子操作された好熱細菌細胞であって、下記：
ａ）内在性の（Ｓ）−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の不活化または欠損；
ｂ）（Ｒ）−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の導入、ここで、該（Ｒ）−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子は、配列番号３８のアミノ酸配列若しくは配列番号３８のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする、Lactobacillus  delbrueckii由来のｈｄｈＤ遺伝子、又は配列番号３６のアミノ酸配列若しくは配列番号３６のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする、Lactobacillus  delbrueckii由来のｌｄｈＡ遺伝子から選択される；
ｃ）内在性のピルビン酸ギ酸リアーゼＡおよび／またはＢ遺伝子の及びアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の不活化または欠損
を含む細胞。
【請求項２】
さらに、内在性のメチルグリオキサールシンターゼ遺伝子ｍｇｓＡが不活化されまたは欠損している、請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
前記ｈｄｈＤ遺伝子が、配列番号３８のアミノ酸配列をコードする、請求項１に記載の細胞。
【請求項４】
前記ｌｄｈＡ遺伝子が、配列番号３６のアミノ酸配列をコードする、請求項１に記載の細胞。
【請求項５】
さらに、内在性のホスホトランスアセチラーゼ遺伝子（ｐｔａ）が不活化されまたは欠損している、請求項１〜４のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項６】
内在性の胞子形成遺伝子の不活化または欠損故の胞子形成欠損誘導体である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項７】
前記胞子形成遺伝子がｓｉｇＦである、請求項６に記載の細胞。
【請求項８】
前記ピルビン酸ギ酸リアーゼＡおよび／またはＢ遺伝子が、内在性のピルビン酸ギ酸リアーゼ／アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子座ｐｆｌＢＡ−ａｄｈＥの不活化または欠損によって不活化されている、請求項１〜７のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項９】
少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％、９９．５％、９９．８％または９９．９％のエナンチオマー純度を有する（Ｒ）−乳酸を産生する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項１０】
前記遺伝子が、相同組換えによって改変されている、請求項１〜９のいずれか１項に記載の細菌細胞。
【請求項１１】
前記Geobacillus属の種がGeobacillus  thermoglucosidansである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項１２】
エナンチオマー的に純粋な（Ｒ）−乳酸の産生方法であって、適切な発酵性炭素含有供給原料を用いて、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の好熱細菌細胞を培養すること、そして（Ｒ）−乳酸を単離することを含む方法。
【請求項１３】
前記炭素含有供給原料が、キシロース、グルコースまたはスクロースを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記培養が、５０℃〜７０℃の温度で行われる、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
産生された乳酸の総重量に対する副産物の総重量に基づいて、１５重量％以下、特に１０重量％以下、または５重量％、４重量％、３重量％もしくは２重量％以下の副産物が形成される、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
ギ酸、エタノールおよび酢酸の少なくとも１つの形成量が、産生された乳酸の総重量に対するギ酸、エタノールまたは酢酸の総重量に基づいて、５重量％以下、特に２重量％、１重量％、０．２５重量％または０．１重量％以下である、請求項１２〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ホモ乳酸型の、エナンチオピュアな（Ｒ）−乳酸の産生のための好熱細菌細胞の改変、遺伝子改変された細胞、およびエナンチオピュアな（Ｒ）−乳酸の産生方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
乳酸およびその塩（ラクテートとして知られている）は、医薬、生物分解性ポリマーおよび食品加工を含む種々の分野において有用な、商業的に採算の取れる産物である。通性嫌気性である好熱性細菌、例えばGeobacillus属の種は、乳酸の工業生産にとって理想的な生物であると思われる。それらは、３７〜７５℃の温度で増殖することができ、最適温度は５５〜６５℃であり（Nazinaら、2001、Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 51:433-446）、５０℃を超える温度で嫌気性の工業的発酵を許す。この高い温度は、工業規模で発酵させる場合に、いくつかの利点を有する。すなわち、感染のリスクがより低く、したがってエナンチオマー純度がより高い、反応がより速い、冷却コストがより低い等である。Geobacillus属の通性嫌気性は、嫌気性条件下での、または少なくとも低酸素分圧下での発酵を可能にし、このことは、工業的規模にとって望ましい。なぜなら、比較的安価な装置および加工を可能にするからである。さらに、これらの細菌の栄養要求量は、これもまた比較的安価な工業プロセスを可能にする乳酸菌、例えばLactobacillus属の種の栄養要求量よりも少ない。
【０００３】
通性嫌気性であるGeobacillus属の種は、嫌気性条件下で、または少なくとも低酸素分圧下で増殖される場合に乳酸を産生することが知られている。例として、G. caldotenax、G. caldoxylosilyticus、G. debilis、G. kaustophilus、G. pallidus、G. stearothermophilus、G. tepidimans、G. thermodenitrificans、G. thermoglucosidans、G. thermoleovorans、G. toebii、G. tropicalisが挙げられる。
【０００４】
G. thermoglucosidansは、キシロース、アラビノース、グルコース、フルクトース、スクロースおよびセロビオースから乳酸を産生することが知られている（Greenら、2003、国際公開第０３／００８６０１号）。工業用途にとって、スクロース、グルコース、キシロースもしくはアラビノース、またはそれらの混合物を含有する供給原料が最も関係する。グルコースおよびキシロースを同時に利用する能力（Greenら、2003、国際公開第０３／００８６０１号）は、リグノセルロース系供給原料に由来する発酵性の糖を用いる場合に、G. thermoglucosidansの重要な利点である。
【０００５】
通性嫌気性である公知のGeobacillus属の種の１の不利な点は、主に（Ｓ）−乳酸を産生し、（Ｒ）−乳酸をほんの少ししか産生しないという事実である。生物分解性の乳酸ポリマーの適用の成否は、安価な（Ｓ）−乳酸および安価な（Ｒ）−乳酸の両方の入手可能性に依存するので、両方のエナンチオマーの対費用効果の高い産生が必要とされる。現在知られている（Ｒ）−乳酸産生菌は、中温性の細菌（例えばBacillus laevolacticus）であるか、栄養要求量が大きい細菌（例えばLactobacillus delbrueckii）であり、これらは、（Ｒ）−乳酸の製造を（Ｓ）−乳酸の製造よりもかなり高価にする。
【０００６】
通性嫌気性である公知のGeobacillus属の種の別の不利な点は、それらが通常、混合酸発酵を行って、乳酸、エタノール、酢酸およびギ酸を主な発酵産物として産生するという事実である。本願において、有機酸の用語が意味するところは、その対応する塩も含む。
【０００７】
工業用途にとって魅力的な特性、例えば低い栄養要求、広い糖の消費能力、炭水化物加水分解（ｃａｒｂｏｈｙｄｒｏｌｙｔｉｃ）酵素を産生する能力、高い増殖速度、高い生産性、浸透圧ストレスに対する耐性および遺伝的アクセシビリティを有する細菌株（例えばGeobacillus株）を、ホモ乳酸型の、エナンチオピュアな乳酸の産生に用いることができることが、明らかに必要とされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的の１つは、通性嫌気性であり、かつホモ乳酸発酵によって（Ｒ）−乳酸を産生する好熱細菌株を作出することである。（Ｒ）−乳酸のための他の用語が、Ｄ−乳酸またはＤ（−）−乳酸であると理解されるべきである。本願において、これらの用語は互換的に用いられる。同様に、用語（Ｓ）−乳酸、Ｌ−乳酸およびＬ（＋）−乳酸が互換的に用いられる。
【０００９】
本発明の別の目的は、通性嫌気性であり、かつエナンチオピュアな（Ｒ）−乳酸を産生する好熱細菌株を作出することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
G. thermoglucosidansは、好熱性のBacillus属の種として記載されている（Suzukiら、1983、Syst. Appl. Microbiol. 4:487-495；Nazinaら、2001、Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 51:433-446；Coorevitsら、2012、Int. Syst. Evol. Microbiol. 62:14770-1485）。G. thermoglucosidansは以前、Bacillus thermoglucosidasiusとして知られており（Suzukiら、1983、Syst. Appl. Microbiol. 4:487-495）、２００１年にＮａｚｉｎａらによってG. thermoglucosidasiusに改名され（Nazinaら、2001、Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 51:433-446）、後にＣｏｏｒｅｖｉｔｓらによってG. thermoglucosidansに改名された（Coorevitsら、2012、Int. Syst. Evol. Microbiol. 62:14770-1485）。基準株は、土壌から単離された（Suzukiら、1976、Appl. Environ. Microbiol. 31:807-812）。当初は絶対好気性と報告されていたが、後の研究が通性嫌気性増殖および（Ｓ）−乳酸産生を報告している（Greenら、2003、国際公開第０３／００８６０１号；Fongら、2006、Extremophiles 10:363-372）。温度範囲は４２〜６９℃であり、最適温度は６２℃である（Suzukiら、1983、Syst. Appl. Microbiol. 4:487-495）。エタノール産生のためのG. thermoglucosidans株の遺伝的改変が報告されている（Greenら、2001、国際公開第０１／４９８６５号；Atkinsonら、2008、国際公開第０８／０３８０１９号）。これは、G. thermoglucosidans  ＤＳＭ  ２５４２Ｔのための遺伝的ツール、およびＬ−乳酸デヒドロゲナーゼ（ｌｄｈ）遺伝子を破壊する方法の記載を含む（Atkinsonら、2006、国際公開第２００６／１１７５３６号、および2008、国際公開第２００８／０３８０１９号）。キシロースおよびグルコース上で増殖された細胞についての代謝経路および流量が、G. thermoglucosidans  Ｍ１０ＥＸＧについて報告されている（Tangら、2009、Biotechnol. Lett. 102:  1377-1386）。
【００１１】
Geobacillus属の種における乳酸デヒドロゲナーゼ（ｌｄｈＬ）の不活化が、エタノール産生を最適化することが示された（Paytonら、1985、FEMS Microbiol. Lett. 26:333-336；Greenら、2001；Atkinsonら、2006、国際公開第２００６／１１７５３６号；Crippsら、2009、Metab. Eng.11:398-408）。Ｃｒｉｐｐｓらは、G. thermoglucosidans  ＮＣＩＭＢ  １１９５５のｌｄｈＬ−誘導体が、バッチ発酵における乳酸産生の激減を示すが、完全な排除を示さない一方で、エタノール、ギ酸およびピルビン酸の産生が増大することを示している。ｌｄｈＬおよびｐｆｌＢ（ピルビン酸ギ酸リアーゼをコードする）の一緒にされた突然変異が、ギ酸産生を排除する（Crippsら、2009、Metab. Eng.11:398-408）。
【００１２】
異種遺伝子発現は、G. thermoglucosidansにおいて問題があると思われる。Zymomonasmobilisピルビン酸デカルボキシラーゼの機能的酵素は、G.  thermoglucosidansにとって最適状態に及ばない温度である５２℃にて増殖される場合にのみ産生され、５４℃、５６℃または５８℃では産生されない（Thompsonら、2008、Biotechnol. Lett. 30:1359-1365）。Gluconobacter oxydansピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子の異種発現は、G. thermoglucosidansにおいて４５℃にて活性を得るのにコドン調和（ｃｏｄｏｎ  ｈａｒｍｏｎｉｚａｔｉｏｎ）を必要とするが、５２℃では活性を実現できない（van  Zylら、2014、Appl. Microbiol. Biotechnol. 98:1247-1259）。
【００１３】
ｖａｎ  Ｋｒａｎｅｎｂｕｒｇらは、中程度に好熱性のBacillus coagulansは、天然のＬ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を欠損させ、そしてLactobacillus delbrueckiiから得られた異種Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子で置き換えることによって、４５℃〜５４℃の温度での（Ｒ）−乳酸産生に用いられ得ることを示している（van  Kranenburgら、2007、国際公開第２００７／０８５４４３号）。しかしながら、５２℃を超える温度で活性である異種タンパク質の例は、G. thermoglucosidansにおけるピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子の異種発現実験において見出されることができず、一方、この種に最適の温度は通常、およそ６０℃である。さらに、L. delbrueckii由来のＤ−乳酸デヒドロゲナーゼが６０℃で活性があるかどうかは、知られていない。
【００１４】
本発明者らは、内在性Ｌ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子ｌｄｈＬを破壊し、そしてＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ活性をコードする遺伝子を導入することによって、好熱細菌細胞が（Ｒ）−乳酸の産生に用いられることができることを今見出した。本発明者らは、L. delbrueckii単離体のｌｄｈＡ遺伝子（配列番号３５）およびｈｄｈＤ遺伝子（配列番号３７）（双方ともＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ活性をコードする）を独立して導入した。当業者は、その代わりとして、G. thermoglucosidansにおいて機能的に発現される、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ活性をコードする他の遺伝子が用いられ得ることを知っている。
【００１５】
通性嫌気性であるGeobacillus属の種は、主な産物としての乳酸、エタノール、酢酸およびギ酸を伴う混合酸発酵を示す。副産物の産生における必須酵素をコードする遺伝子の破壊が、所望の産物の産生を向上させる一般的なアプローチである。しかしながら、特定の遺伝子の破壊の影響は、宿主の代謝全体に応じて、様々な副作用を有し得る。ピルビン酸ギ酸リアーゼ活性化酵素をコードするEscherichia  coli  ｐｆｌＡ、および二機能性アセトアルデヒド−ＣｏＡ／アルコールデヒドロゲナーゼ複合体をコードするａｄｈＥにおける単一突然変異が、改善された乳酸産生を、増加されたピルビン酸副産物形成、残留酢酸およびエタノール産生、ならびに非常に低下されたバイオマス収率と共に結果し（ｐｆｌＡ−）、または主な発酵産物としての酢酸を伴う改善された乳酸産生を結果する（ａｄｈＥ−）（Zhu & Shimizu, 2005, Metab. Eng. 7:104-115）。いくつかのE. coli株では、ｆｏｃＡ−ｐｆｌＡＢ遺伝子座が破壊されて、ギ酸の産生を排除している（Zhouら、2003、Appl. Environ. Microbiol. 69:2237-2244；Liuら、2011、Appl. Biochem. Biotechnol. 164:162-169）。培地中での乳酸蓄積における、ギ酸チャネルタンパク質をコードするｆｏｃＡの重要性が、最近示されたので（Beyerら、2013、J. Bacteriol. 195:1428-1435）、それは、ｆｏｃＡ−ｐｆｌＡＢ欠損を有するE. coli株の表現型に寄与しているだろう。緑藻類Chlamydomonas reinhardtiiでは、ピルビン酸ギ酸リアーゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子のノックアウトが、乳酸発酵を向上させたが、細胞外グリセリンおよび酢酸の濃度をも増大させた（Catalanottiら、2012、PlantCell 24:692-707）。
【００１６】
G. thermoglucosidansにおいて、ｐｆｌＢＡ遺伝子は集中的にａｄｈＥ遺伝子に向けられている。実際的な理由のために、本発明者らは、一改変において、ｐｆｌＢＡとａｄｈＥの一部とを欠損させることによって、ｐｆｌＡ、ｐｆｌＢおよびａｄｈＥを破壊することに決めた。驚くべきことに、本発明者らは、他の副産物に影響を与えることなく、そして乳酸発酵性能に影響を与えることなく、エタノール、酢酸およびギ酸副産物の形成をほぼ排除することができた。例えば、本願において、副産物形成がほぼ排除されるとは、本明細書中に記載されているように遺伝子操作された細胞を発酵させることによって、産生された乳酸の総量に対する副産物（例えばエタノール、酢酸およびギ酸）の重量が、１０％（ｗ／ｗ）以下、特に５％、４％、３％または２％（ｗ／ｗ）以下であることを意味する。乳酸および副産物の量は、当該技術分野において公知の方法によって、例えば気液クロマトグラフィー（ＧＬＣ）または高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による誘導体化および分析によって決定され得る。
【００１７】
文献に記載された乳酸産生においてキラル不純度をもたらし得るいくつかのオプションがある。（Ｒ）−乳酸は、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼの活性によってピルビン酸から形成されることができ、乳酸ラセマーゼの活性によって（Ｓ）−乳酸から形成されることができ、またはメチルグリオキサール経路を介して形成されることができる。（Ｓ）−乳酸は、Ｌ−乳酸デヒドロゲナーゼの活性によってピルビン酸から形成されることができ、乳酸ラセマーゼの活性によって（Ｒ）−乳酸から形成されることができ、またはメチルグリオキサール経路を介して形成されることができる。
【００１８】
メチルグリオキサールシンターゼ（Ｅ．Ｃ．  ４．２．９９．１１）は、メチルグリオキサール経路の最初の工程におけるジヒドロキシアセトンリン酸のメチルグリオキサールおよびオルトリン酸への転化を触媒する。次に、メチルグリオキサールは、２つの異なる経路を介して（Ｓ）−乳酸または（Ｒ）−乳酸に転化され得る。したがって、メチルグリオキサール経路は、（Ｓ）−乳酸および（Ｒ）−乳酸双方の産生に関してキラル不純物の源であり得る。グラム陰性中温細菌Escherichia coliでは、メチルグリオキサールシンターゼをコードするｍｇｓＡ遺伝子の破壊が、（Ｓ）−乳酸および（Ｒ）−乳酸双方の産生に関してキラル純度を向上させた（Grabarら、2006、Biotechnol. Lett. 28:1527-1535）。グラム陽性菌では、メチルグリオキサール経路の活性に関してはほとんど知られていない。中温性のBacillus subtilisでは、ｍｇｓＡ遺伝子が、バシリチオール生合成における最初の２つの酵素をコードする遺伝子と一緒にオペロン中にコードされている（Gaballaら、2010、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 107:6482-6486；Helmann、2011、Antioxidants & Redox signaling 15:123-133）。最近、Ｃｈａｎｄｒａｎｇｓｕらは、バシリチオールがメチルグリオキサールの無毒化に関与していることを実証した（Chandrangsuら、2014、Mol. Microbiol. 91:706-715）。バシリチオール依存性メチルグリオキサール経路は、グリオキサラーゼＩ（ＧｌｘＡ）およびグリオキサラーゼＩＩ（ＦｌｘＢ）を利用して、メチルグリオキサールを（Ｒ）−乳酸に転化する（Chandrangsuら、2014）。また、メチルグリオキサールは、グリオキサラーゼＩＩＩの予測される相同物であるＹｄｅＡ、ＹｒａＡおよびＹｆｋＭの活性によって、（Ｒ）−乳酸に転化されることができる（Chandrangsuら、2014、Mol. Microbiol. 91:706-715）。グラム陽性細菌におけるメチルグリオキサール経路による（Ｓ）−乳酸の産生についての報告はない。
【００１９】
ゲノム情報に基づくと、（Ｓ）−乳酸産生は、乳酸ラセマーゼ（この相同物は見出されていない）によっても、またメチルグリオキサール経路（これは、グラム陽性生物において、不完全であると考えられ、かつ（Ｓ）−乳酸を産生することが知られていない）によっても引き起こされないと予想されるであろう。驚くべきことに、内在性Ｌ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子ｌｄｈＬを破壊し、そしてＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ活性をコードする遺伝子を導入することによって改変された（Ｒ）−乳酸産生Geobacillus株において産生される微量の（Ｓ）−乳酸は、メチルグリオキサールシンターゼをコードすると予測されるｍｇｓＡ遺伝子を破壊することによってさらに低減されることができた。
【００２０】
胞子形成の欠損が、Bacillus属の種の工業用途に所望される特性である。遺伝子改変された微生物の封じ込め使用に関する２００９年５月６日の欧州議会および理事会の指令２００９／４１／ＥＣによれば、遺伝子改変された微生物の封じ込め使用は、上記微生物がヒトの健康および環境に対して呈するリスクに関して分類されるべきである。Bacillus属の種が胞子形成欠損表現型を有することは、環境中に広がるリスクを最小にする手段と考えられる。胞子形成欠損表現型を得るための様々な方法が知られており、例えば、自然発生的な胞子形成欠損誘導体を選択すること（Greenら、2001、国際公開第０１／４９８６５号）、または、例えばｓｐｏ０Ａ（Gonzy-Treboulら、1992、J.Mol. Biol. 244:967-979；Atkinsonら、2010、国際公開第２０１０／０５２４９９号）もしくはｓｉｇＦ（Flemingら、1995、Appl. Environ. Microbiol. 61:3775-3780；Wangら、2005、J. Appl. Microbiol. 98:761-767；Kovacsら、2010、Appl. Environ. Microbiol. 76:4085-4088）を破壊することにより胞子形成経路の破壊に向けることが挙げられる。
【００２１】
すなわち、本発明は、第１の局面において、通性嫌気性である、遺伝子操作された好熱細菌細胞であって、
ａ）内在性（Ｓ）−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の不活化または欠損；
ｂ）（Ｒ）−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の導入；
ｃ）内在性ピルビン酸ギ酸リアーゼＡおよび／またはＢ遺伝子の不活化または欠損
を含む細胞を開示する。
【００２２】
内在性遺伝子は、微生物中に存在する遺伝子である。言うまでもなく、遺伝子が不活化されまたは欠損しているところの、本明細書中に記載される細菌は、上記遺伝子が上記細菌中に本来は存在することを必要とする。反対の指摘が無ければ、本願において、遺伝子へのあらゆる言及は、内在性遺伝子を意味する。微生物中に導入される遺伝子、例えば本明細書中に記載される細菌細胞に導入される（Ｒ）−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子は、内在性遺伝子でない。
【００２３】
本明細書において、（Ｓ）−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｌｄｈＬ）のヌクレオチド配列は、Geobacillus thermoglucosidansについて、配列番号４７で提供される。コードされるアミノ酸配列は、配列番号４８で提供される。
【００２４】
ｌｄｈＬに隣接するヌクレオチド領域は、Geobacillus thermoglucosidansについて、下流プライマー配列番号１１および１２、ならびに上流プライマー配列番号１３および１４によって同定されることができる。
【００２５】
（Ｒ）−乳酸デヒドロゲナーゼ活性をコードする適切な遺伝子は、配列番号３６もしくは３８のアミノ酸配列をコードする遺伝子、または、配列番号３６もしくは３８のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性、好ましくは９５％、より好ましくは少なくとも９８％、さらにより好ましくは少なくとも９９％の同一性を示すアミノ酸配列をコードする相同遺伝子である。（Ｒ）−乳酸活性は、適切な宿主における上記遺伝子の過剰発現およびその後の、酵素アッセイを用いた細胞抽出物中の（Ｒ）−乳酸酵素活性の定量化によって実証され得、または、E. coli ｌｄｈＡ−突然変異体、例えばE. coli ＦＭＪ１４４を補完する能力によって実証され得る。そのような相同配列は、種々の集団に由来する複数の細胞に存在し得る、または自然の変異もしくは株内変異故にある集団内に存在しうる多型を包含しうる。相同体はさらに、特定のＤＮＡまたはアミノ酸配列が由来するところの種以外の種に由来してもよいし、人工的に設計されかつ合成されてもよい。配列番号３６および３８によって同定されるタンパク質は、Lactobacillus delbrueckiiのｌｄｈＡ遺伝子およびｈｄｈＤ遺伝子によってコードされる。双方の遺伝子は、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ活性をコードする。
【００２６】
本発明に従う一実施形態では、遺伝子操作された細胞が、配列番号３８のアミノ酸配列、または少なくとも９０％、好ましくは９５％の同一性、より好ましくは少なくとも９８％、さらにより好ましくは少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする、Lactobacillus delbrueckii由来のｈｄｈＤ遺伝子である（Ｒ）−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含む。
【００２７】
本発明に従う別の実施形態では、遺伝子操作された細胞が、配列番号３６のアミノ酸配列、または少なくとも９０％、好ましくは９５％、より好ましくは少なくとも９８％、さらにより好ましくは少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする、Lactobacillus delbrueckii由来のｌｄｈＡ遺伝子である（Ｒ）−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含む。
【００２８】
さらに別の実施形態では、本発明に従う細胞中のｈｄｈＤ遺伝子が、配列番号３８のアミノ酸配列をコードする。
【００２９】
別の実施形態では、本発明に従う細胞中のｌｄｈＡ遺伝子が、配列番号３６のアミノ酸配列をコードする。
【００３０】
本発明に従う別の実施形態では、遺伝子操作された細胞が、配列番号３７のヌクレオチド配列に従うｈｄｈＤ遺伝子を含む。
【００３１】
また別の実施形態では、遺伝子操作された細胞が、配列番号３５におけるヌクレオチド配列に従うｌｄｈＡ遺伝子を含む。
【００３２】
好ましい実施形態では、内在性ピルビン酸ギ酸リアーゼ遺伝子が、ピルビン酸ギ酸リアーゼ／アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子座ｐｆｌＢＡ−ａｄｈＥの不活化または欠損によって不活化される。あるいは、内在性ピルビン酸リアーゼＡおよび／またはＢ遺伝子と内在性アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子ａｄｈＥが、別々の工程において不活化または欠損されることができる。ｐｆｌＢＡ−ａｄｈＥに隣接するヌクレオチド領域は、配列番号１９〜２１のＰＣＲプライマーによって同定されることができる。
【００３３】
本明細書において、ｐｆｌＢＡは、ピルビン酸ギ酸リアーゼ活性化酵素およびピルビン酸ギ酸リアーゼをそれぞれコードするピルビン酸ギ酸リアーゼ遺伝子ＡおよびＢを意味する。
【００３４】
ｐｌｆＡは、ピルビン酸ギ酸リアーゼＡ遺伝子（ピルビン酸ギ酸リアーゼ活性化酵素をコードする）を指し、その配列は、Geobacillus thermoglucosidansについて、配列番号３９で提供される。コードされるアミノ酸配列は、配列番号４０で提供される。ｐｌｆＢは、ピルビン酸ギ酸リアーゼＢ遺伝子（ピルビン酸ギ酸リアーゼをコードする）を指し、そのヌクレオチド配列は、配列番号４１で提供される。コードされるアミノ酸配列は、配列番号４２で提供される。本発明において、ａｄｈＥは、二機能性アセトアルデヒド−ＣｏＡ／アルコールデヒドロゲナーゼ複合体をコードするアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子Ｅを指し、そのヌクレオチド配列は、Geobacillus thermoglucosidansについて、配列番号４３で提供される。コードされるアミノ酸配列は、配列番号４４で提供される。
【００３５】
好ましい実施形態では、ピルビン酸ギ酸リアーゼ遺伝子による不活化が、ピルビン酸ギ酸リアーゼ／アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子座ｐｆｌＢＡ−ａｄｈＥの不活化または欠損によって不活化される。あるいは、ピルビン酸リアーゼＡおよび／またはＢ遺伝子、ならびにアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子ａｄｈＥは、別々の工程において不活化または欠損され得る。
【００３６】
本発明において、ａｄｈＥに隣接するヌクレオチド領域は、Geobacillus thermoglucosidansについて、ＰＣＲプライマー配列番号９および１０によって同定されることができる。
【００３７】
本発明に従う別の実施形態では、遺伝子操作された細胞において、内在性メチルグリオキサールシンターゼ遺伝子（ｍｇｓＡ）もまた、不活化されまたは欠損している。
【００３８】
本明細書において、ｍｇｓＡに隣接するヌクレオチド領域は、Geobacillus thermoglucosidansについて、ＰＣＲプライマー配列番号２１〜２４によって同定されることができる。
【００３９】
ｍｇｓＡのヌクレオチド配列は、Geobacillus thermoglucosidansについて、配列番号４５で提供される。コードされるアミノ酸配列は、配列番号４６で提供される。
【００４０】
本発明に従うさらに別の実施形態では、遺伝子操作された細胞において、ホスホトランスアセチラーゼ遺伝子（ｐｔａ）もまた、不活化されまたは欠損している。ｐｔａのヌクレオチド配列は、Geobacillus thermoglucosidansについて、配列番号４９で提供される。コードされるアミノ酸配列は、配列番号５０で提供される。ｐｔａ（ホスホトランスアセチラーゼをコードする）の不活化または欠損はさらに、内在性ｐｔａ活性に関連するレムナント（ｒｅｍｎａｎｔ）酢酸産生を最小にする。得られた株（ｐｔａが不活化されまたは欠損している）は、酢酸について栄養要求性である。したがって、この遺伝子操作された細胞を発酵させる場合には、酢酸が増殖培地に補われなければならない。
【００４１】
本発明に従うさらに別の実施形態では、遺伝子操作された好熱細菌細胞がまた、内在性胞子形成遺伝子の不活化または欠損によって、胞子形成欠損型にされている。
【００４２】
別の実施形態では、不活化または欠損された胞子形成遺伝子が、ｓｉｇＦである。
【００４３】
ｓｉｇＦは、胞子形成遺伝子を指し、そのヌクレオチド配列は、Geobacillus thermoglucosidansについて、配列番号５１で提供される。コードされるアミノ酸配列は、配列番号５２で提供される。ｓｉｇＦに隣接するヌクレオチド配列は、配列番号３〜６のＰＣＲプライマーによって同定されることができる。
【００４４】
さらに別の実施形態では、本発明に従う遺伝子操作された好熱細菌細胞が、グラム陽性細菌細胞である。好ましくは、該細胞は、Bacillus属、より好ましくはGeobacillus属に属する。
【００４５】
また別の実施形態では、本発明に従う遺伝子操作された好熱細菌細胞が、Geobacillus thermoglucosidansである。
【００４６】
本発明の目的の１つは、通性嫌気性であり、かつ、ホモ乳酸発酵によって（Ｒ）−乳酸を産生するGeobacillus株を作出することである。
【００４７】
すなわち、本発明は、一局面において、通性嫌気性かつホモ乳酸型である中程度に好熱性のGeobacillus属の種を遺伝子工学によって遺伝子改変する方法を開示する。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
本発明において、ホモ乳酸発酵とは、炭化水素源から乳酸を、１５％（ｗ／ｗ）（％（ｗ／ｗ）：重量％）以下、好ましくは１０％（ｗ／ｗ）以下、より好ましくは５％、４％、３％または２％（ｗ／ｗ）以下の副産物、例えばギ酸、酢酸およびエタノールの形成を伴って産生することと定義される。このパーセンテージは、乳酸（（Ｒ）−乳酸および存在しうる（Ｓ）−乳酸を含む）の総重量に対する副産物の総重量に関する。乳酸と、エタノール、酢酸およびギ酸の量は、当該技術分野において公知の方法によって、例えば気液クロマトグラフィー（ＧＬＣ）または高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による誘導体化および分析によって決定され得る。
【００４９】
いくつかの実施形態では、ギ酸、エタノールおよび酢酸の少なくとも１つの形成量が、産生された乳酸の総重量に対するギ酸、エタノールまたは酢酸の総重量に基づいて、５％（ｗ／ｗ）以下、特に２％、１％、０．２５％または０．１％（ｗ／ｗ）以下である。言い換えると、ホモ乳酸発酵において形成されるギ酸の重量は、乳酸の総重量に対して、例えば、５％（ｗ／ｗ）以下、より特に２％、１％、０．２５％または０．１％（ｗ／ｗ）以下でありうる。同様に、エタノールの重量は、５％、２％、１％、０．２５％または０．１％（ｗ／ｗ）以下であり得、また、酢酸の量は、５％、２％、１％、０．２５％または０．１％（ｗ／ｗ）以下でありうる。
【００５０】
キラル純度は、ポリ乳酸ポリマーの製造にとって重要な局面である。したがって、商業的な用途のためにエナンチオピュアな（Ｒ）−乳酸を産生することが不可欠である。
【００５１】
すなわち、本発明はまた、少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９．５％、９９．８％または９９．９％のエナンチオマー純度を有する（Ｒ）−乳酸を産生する遺伝子操作された好熱細菌細胞を提供する。
【００５２】
本発明の一局面において、エナンチオピュアな乳酸を産生する方法が提供される。該方法は、適切な発酵性炭素含有供給原料を用いて本発明に従う好熱細菌細胞を培養する工程と、（Ｒ）−乳酸を単離する工程とを含む。
【００５３】
別の局面では、本発明は、エナンチオピュアな乳酸の産生方法であって、炭素含有供給原料がキシロース、グルコースまたはスクロースを含むところの方法を提供する。
【００５４】
培養の温度は好ましくは、５０℃〜７０℃、より好ましくは５５〜６５℃の温度で実行される。
【００５５】
本発明の文脈において、遺伝子の不活化または欠損は、上記細胞によって産生され得る所望のポリペプチドをコードする遺伝子、および／または上記細胞による一次代謝物もしくは二次代謝物の産生に関与するポリペプチドをコードする遺伝子の改変でありうる。原則として、これは、コードされるタンパク質の細胞レベルを引き下げることによってなされることができる。細胞レベルの引下げは、例えば、関心のある酵素をコードする遺伝子の標的不活化によって達成され得る。遺伝子は、その全体が除去されることができる。しかしながら、代替案として、遺伝子の一部の欠損もまた、コードされるタンパク質の活性の低減をもたらしうる。代わりに、または追加的に、遺伝子の調節または発現の原因となるヌクレオチド配列、例えばプロモーター、エンハンサーおよび翻訳開始部位などが改変または除去されることができる。関心のあるタンパク質の活性に影響を与える別の方法が、必要であるならば、輸送シグナルの改変、またはアンチセンスＲＮＡの導入でありうる。
【００５６】
染色体改変は、子孫細胞にわたって遺伝子の機能性の安定した分布を確実にするので、好ましい。染色体における所望の機能性の欠損は、非相同組換えによってならびに相同組換えによってなされることができる。相同組換えは、機能性を導入するための、除去するための、または同時に導入かつ除去するための機会を開いているので、好ましい。
【００５７】
相同組換えが意図される場合には、形質転換ＤＮＡはさらに、操作される特定の細胞のゲノム標的配列に相同であるＤＮＡ配列を含有する。当業者であれば、相同組換えを得るのに１００％の同一性は必要とされないことを理解するであろう。８０％、好ましくは９０％、９５％または９８％の同一性も十分であろう。最も好ましいのは９９％である。通常、相同組換えによって染色体中に挿入され得る、関心のあるＤＮＡ配列は、相同組換えを可能にするのに十分な長さを有する相同配列によって隣接される。そのような長さは、少なくとも約２００ｂｐ、例えば約２００〜約１５００ｂｐ、好ましくは約２００〜約１０００ｂｐでありうる。
【００５８】
本発明の目的のために、２つのアミノ酸配列間の同一性は、上記２つの配列間で同じであるアミノ酸のパーセンテージを指す。同一性は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いて決定され、これは、Altschulら、J. Mol. Biol. 215:403-410(1990)に記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を実行するためのソフトウェアが、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを通じて一般に利用可能である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）。Ｂｌａｓｔｐアルゴリズムパラメーターのデフォルト設定は、Ｅｘｐｅｃｔ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄが１０、Ｗｏｒｄ  ｓｉｚｅが３、Ｍａｘ  ｍａｔｃｈｅｓ  ｉｎ  ａ  ｑｕｅｒｙ  ｒａｎｇｅが０であり、ＭａｔｒｉｘがＢＬＯＳＵＭ６２であり、Ｇａｐ  Ｃｏｓｔｓが１１のＥｘｉｓｔｅｎｃｅおよび１のＥｘｔｅｎｓｉｏｎであり、Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ  ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔｓがＣｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ  ｓｃｏｒｅ  ｍａｔｒｉｘ  ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔである。
【００５９】
本発明の目的のために、２つのヌクレオチド配列間の同一性は、上記２つの配列間で同じであるヌクレオチドのパーセンテージを指す。同一性は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いて決定され、これは、Altschulら、J. Mol. Biol. 215:403-410(1990)に記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を実行するためのソフトウェアが、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを通じて一般に利用可能である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）。Ｂｌａｓｔｎアルゴリズムパラメーターのデフォルト設定は、Ｅｘｐｅｃｔ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄが１０、Ｗｏｒｄ  ｓｉｚｅが２８、Ｍａｘ  ｍａｔｃｈｅｓ  ｉｎ  ａ  ｑｕｅｒｙ  ｒａｎｇｅが０、Ｍａｔｃｈ／Ｍｉｓｍａｔｃｈ  Ｓｃｏｒｅｓが１、−２、Ｇａｐ  ＣｏｓｔｓがＬｉｎｅａｒである。
【００６０】
上述したように、Geobacillus thermoglucosidansにおける上記遺伝子を同定する配列はいずれも、関心のある遺伝子を遺伝子工学によって改変するのに１００％同じである必要はない。さらに、他の種に由来する関連する好熱細菌細胞において、遺伝子はこれらの配列から逸脱しうる。しかしながら、Geobacillus thermoglucosidans遺伝子を使用することにより、これらの遺伝子と相同でありかつ同じ機能性を有する配列が当業者によって容易に同定されることができ、そして相同組換えをこれらの菌株において実行するための対応するプライマーが作製され得る。したがって、たとえ上記同定された遺伝子の配列からの逸脱が、ある特定の菌株に存在しても、相同遺伝子は容易に同定されることができる。そのヌクレオチド配列は、当該技術分野において公知の技術を用いて決定されることができ、そして必要ならば、隣接する遺伝子配列と同じであるまたは相補的である新しいプライマーセットが定義されることができる。
【００６１】
本発明に従う細胞は、当該技術分野において公知の技術を用いて作製され得る。特に、エレクトロポレーションによる好熱細菌中へのＤＮＡ導入方法が、Van Kranenburgら、2007、国際公開第２００７／０８５４３３号、およびCrippsら、2009、Metab. Eng. 11:398-408に記載されている。
【００６２】
エレクトロポレーションによるこれらBacillus属の種の形質転換は、通性嫌気性かつホモ乳酸型である中程度に好熱性のBacillus属の種と、所望の機能性および／または特定のBacilliのゲノム配列に相同であるＤＮＡ配列を含む適切な形質転換ＤＮＡとを含有する懸濁物を通る高電圧放電によって達成されることができる。
【００６３】
（Ｒ）−乳酸は、本明細書に記載された遺伝子操作された好熱細菌細胞を、炭水化物源（例えばグルコースおよび／またはキシロース）の存在下で、当該技術分野において公知の方法によって発酵させることによって得られることができる。発酵の間に、微生物によって分泌された乳酸は通常、塩基、例えばアルカリ金属またはアルカリ土類金属の塩基性塩、例えばナトリウム、カリウム、マグネシウムおよび／またはカルシウムの水酸化物、炭酸塩および／または炭酸水素塩を用いて中和される。マグネシウム塩基、例えば水酸化マグネシウム、炭酸マグネシウムおよび／または炭酸水素マグネシウムが通常好ましい。したがって、いくつかの局面では、本発明は特に、エナンチオピュアな（Ｒ）−乳酸の産生方法に関し、上記方法は、本明細書に記載された好熱細菌細胞を、マグネシウム塩基（例えば、水酸化マグネシウム、炭酸マグネシウムおよび炭酸水素マグネシウムの少なくとも１つから選択される）の存在下で、適切な発酵性炭素含有供給原料を用いて培養すること、そして（Ｒ）−乳酸を単離することを含む。
【００６４】
発酵後、（Ｒ）−乳酸（またはその塩）は、乳酸および／またはラクテートを水性溶液から分離するために知られている多くの従来技術のいずれかによって発酵ブロスから分離される。分離効率を高めるために、分離前に、基質または微生物（バイオマス）の粒子が除去され得る。上記分離は、遠心分離、濾過、フロキュレーション（ｆｌｏｃｃｕｌａｔｉｏｎ）、フロテーション（ｆｌｏｔａｔｉｏｎ）または膜濾過によって行われうる。これは、例えば、発酵による乳酸の調製のための連続方法が記載されている国際公開第０１／３８２８３号から知られている。本明細書における発酵の検討は通常、バッチ法を指すが、方法全体の一部または全てが連続的に実行されうる。
【００６５】
発酵ブロスからの（Ｒ）−乳酸（またはその塩）の分離後、上記産物は、１つまたは複数の精製工程、例えば抽出、蒸留、結晶化、電気透析、濾過、活性炭による処理、イオン交換等にかけられうる。種々の残留物流は、任意的に処理された後に、発酵容器へまたは先に実行された任意の精製工程へリサイクルされうる。
【実施例】
【００６６】
材料および方法
菌株およびプラスミド
本研究において用いられた菌株およびプラスミドが、表１に記載される。
【００６７】
Escherichia coliが、好気的条件下で３７℃にてＬＢブロス（Sambrook & Russell, 2001, Molecular Cloning, a laboratory manual. 3rd edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York）中でルーチン的に培養された。適切な場合には、クロラムフェニコールおよび／またはアンピシリンが、それぞれ２０ｍｇ／Ｌおよび１００ｍｇ／Ｌの濃度で用いられた。
【００６８】
L. lactisが、嫌気的条件下で３０℃にて、０．５％グルコースで補充されたＭ１７ブロス（登録商標）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中でルーチン的に培養された。適切な場合には、クロラムフェニコールが、５ｍｇ／Ｌの濃度で用いられた。
【００６９】
G. thermoglucosidansが、特に明記されない限り、好気的条件下で５２℃、５５℃または６０℃にて、ＴＧＰ培地中でルーチン的に増殖された。ＴＧＰ培地（Taylorら、2008、Plasmid 60:45-52）は、１７ｇ／Ｌのトリプトン、３ｇ／Ｌのダイズペプトン、５ｇ／ＬのＮａＣｌ、２．５ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４をｐＨ７．０にて含有し、そしてオートクレーブ後に４ｍｌ／Ｌのグリセリンおよび４ｇ／Ｌのピルビン酸Ｎａが添加された。ＴＧＰプレートについて、１０ｇ／Ｌのアガーが用いられた。適切な場合には、培地がクロラムフェニコール（８μｇ／ｍＬ）で補充された。
【００７０】
【表１】
0006637026.tif 000002
0006637026.tif 000003
【００７１】
ＤＮＡ操作技術
標準的なＤＮＡ操作技術が、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ（Sambrook & Russell, 2001, Molecular Cloning, a laboratory manual. 3rd edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York）によって記載されているように実行された。
【００７２】
ｐＮＷ３３Ｎ誘導体の構築が、E. coliにおいて実行された。
【００７３】
１００ｍＬ培養物からの大規模E. coliプラスミドＤＮＡ単離が、Ｊｅｔｓｔａｒ  ２．０  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（登録商標）（Ｇｅｎｏｍｅｄ）を用いて、メーカーの説明書に従って実行された。１ｍＬ培養物からの小規模E. coliプラスミドＤＮＡ単離が、Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｑｕｉｃｋ  Ｐｕｒｅ（登録商標）（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）キットを用いて、メーカーの説明書に従って実行された。
【００７４】
E. coliコンピテント細胞が、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ（Sambrook & Russell, 2001, Molecular Cloning, a laboratory manual. 3rd edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York）によって記載されているように、塩化カルシウムを用いて作製され、そしてヒートショックによって形質転換された。
【００７５】
ｐＮＺ１２４誘導体の構築が、L. lactisにおいて実行された。
【００７６】
１００ｍＬ培養物からのL. lactisプラスミドＤＮＡ単離が、Ｊｅｔｓｔａｒ  ２．０  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（登録商標）（Ｇｅｎｏｍｅｄ）を用いて実行された。細胞ペレットが、１０ｍｌの改質されたＥ１バッファー（１０ｍＭのトリス／ＨＣＬ  ｐＨ８；５０ｍＭのＮａＣｌ；１０ｍＭのＥＤＴＡ；２０％スクロース；４ｇ／Ｌのリゾチーム（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ））中に再懸濁され、そして５０℃にて１時間インキュベートされた。続いて、メーカーの説明書にしたがって、細胞溶解から先が行われた。
【００７７】
L. lactisが、ＨｏｌｏおよびＮｅｓ（Holo, H., and I. F. Nes. 1989. Appl. Environ. Microbiol. 55:3119-3123）によって記載されたエレクトロポレーションによって形質転換された。
【００７８】
クローニング目的のＰＣＲ反応が、ハイフィデリティＰｗｏポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて、メーカーの説明書に従って実行された。
【００７９】
コロニー−ＰＣＲ分析のために、コロニーが爪楊枝で採集され、そして少量の細胞物質がＰＣＲ反応チューブに移された。細胞が、電子レンジにおける１０００Ｗでの１分間のインキュベーションによって破壊された。ＤｒｅａｍＴａｑ（商標）ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標））を有する２５μＬのＰＣＲ反応混合物が、メーカーによって推奨されるように調製され、そして破壊された細胞を有する上記反応チューブに加えられた。
【００８０】
G. thermoglucosidansのエレクトロポレーション
G. thermoglucosidansが、Ｃｒｉｐｐｓら（Crippsら、2009、Metab. Eng.11:398-408）によって記載されたプロトコルに基づいて、エレクトロポレーションによって形質転換された。G. thermoglucosidansは、５５℃で一晩増殖され、そして１ｍＬが、バッフルを備えた２５０ｍｌ三角フラスコ中の予め温められた５０ｍｌのＴＧＰ培地に接種するために用いられた。ＯＤ６００が約１．０となるまで、細胞が６０℃（１８０ｒｐｍ）にてインキュベートされた。フラスコは１０分間氷上で冷却され、そして細胞が遠心分離（４℃）によってペレット化された。次に、細胞が、氷冷されたエレクトロポレーションバッファー（０．５Ｍソルビトール、０．５Ｍマンニトール、１０％（ｖ／ｖ）グリセリン）で４回洗浄された。洗浄工程の容量は、５０ｍｌ、２５ｍｌ、１０ｍｌおよび１０ｍｌであった。最終ペレットは、１．３ｍｌの氷冷されたエレクトロポレーションバッファー中に再懸濁され、そしてエレクトロコンピテントセルの６０μｌのアリコートが−８０℃にて貯蔵され、またはエレクトロポレーションに直接用いられた。
【００８１】
エレクトロコンピテントセルの６０μｌのアリコート（解凍済み）が、１〜２μｇのプラスミドＤＮＡと混合され、次いで、冷却されたエレクトロポレーションキュベット（ギャップ幅０．１ｃｍ）に移された。Ｂｉｏ−Ｒａｄ遺伝子パルサーエレクトロポレーターを用いたエレクトロポレーション条件は、２．５ｋＶ、１０μＦおよび６００Ωであった。エレクトロポレーション後に、細胞は、５０ｍｌプラスチックチューブ中の１ｍｌの予め温められた（５２℃）ＴＧＰに移され、そして５２℃で１８０ｒｐｍにて２時間、回収された。回収された細胞懸濁物はペレット化され、そして１５０μｌを除く全ての上清が破棄された。ペレットは、残りの上清中に再懸濁された。１／１０および９／１０の容量が、８μｇ／Ｌのクロラムフェニコールを含有するＴＧＰプレート上にプレーティングされた。プレートは、５２℃で２４〜４８時間インキュベートされた。プレート上に現れたコロニーは、８μｇ／Ｌのクロラムフェニコールを含有する新鮮なＴＧＰプレートに移され、そして５５℃にて一晩インキュベートされた。増殖したものが、プライマー１およびプライマー２（表２）を用いたコロニーＰＣＲによって、プラスミドの存在について試験された。
【００８２】
組込み
Geobacillus-E.coliシャトルベクターｐＮＷ３３ｎが、先に記載されたように（Crippsら、2009、Metab. Eng.11:398-408）、G. thermoglucosidansにおける組込み型ベクターとして用いられた。８μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを含有する２０ｍＬのＴＧＰに、グリセリンストックからの形質転換された菌株が接種された。５５℃、１８０ｒｐｍにて一晩の増殖後、適切な希釈物が、８μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを含有するＴＧＰプレート上にプレーティングされた。その後、これらのプレートは、６８℃にて２４時間インキュベートされた。シングルコロニーが、新鮮なプレート（５２℃でインキュベートされた）に画線され、これらのコロニーにおいてコロニーＰＣＲが行われて、シングルクロスオーバーを有するコロニーを同定した。適切なプライマー組合せが、上流断片または下流断片を介したシングルクロスオーバーを同定するのに用いられた（表２；それぞれ、ｐＲＭ３の組込みのための６５５−１７０および６５６−５７１のプライマー組合せ、ｐＲＭ１２の組込みのための７４４−１７０および８０８−５７１のプライマー組合せ、ｐＦＳ３の組込みのための６２９−１７０および６３０−５７１のプライマー組合せ、ｐＪＳ４３の組込みのための７５４−１７０および９９１−５７１のプライマー組合せ）。次に、陽性コロニーの染色体ＤＮＡが、Ｍａｓｔｅｒｐｕｒｅ  Ｇｒａｍ  Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて単離され、そして、コロニーＰＣＲの結果を確かめるために、上記ＰＣＲが、単離された染色体ＤＮＡに関して繰り返された。上流隣接領域を介したシングルクロスオーバーおよび下流隣接領域を介したシングルクロスオーバーが、第２の組換え工程のために選択された。
【００８３】
ダブルクロスオーバーを得るために、一次組込み体が、クロラムフェニコールを有しないＴＧＰ中で複数回継代培養された。適切な希釈物（１０−４、１０−５、１０−６）がＴＧＰプレート上にプレーティングされた。単離されたコロニーが、８μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを有するＴＧＰプレートおよび有しないＴＧＰプレートに移された。ダブルクロスオーバー突然変異体は、クロラムフェニコール感受性である。適切なプライマー組合せ（表２；ΔｓｉｇＦのための６５５−６５６、ΔｐｆｌＢＡ−ａｄｈＥのための７４４−８０８およびΔｍｇｓＡのための７５４−９９１のプライマー組合せ）を用いたＰＣＲ分析を使用して、野生型を欠損突然変異体から識別し、そしてプラスミドの不在を確認した。全ての改変が、ＰＣＲ産物の配列決定によって確かめられた。
【００８４】
LactococcusクローニングベクターｐＮＺ１２４が、ｌｄｈＡのためのG. thermoglucosidansにおける組込み型ベクターとして用いられた。形質転換効率が比較的高い（ｐＮＷ３３ｎ１μｇにつき少なくとも１０３ＣＦＵ）、新しく作製されたG. thermoglucosidansコンピテント細胞が、２μｇのｐＪＳ６５プラスミドＤＮＡで形質転換された。形質転換プレートは、６０℃にて１６時間、６８℃にて８時間、および５５℃にて２０時間インキュベートされた。シングルコロニーが、新鮮なプレート（５２℃でインキュベートされた）に画線され、これらのコロニーについてコロニーＰＣＲが行われて、シングルクロスオーバーを有するコロニーを同定した。適切なプライマー組合せが、上流断片または下流断片を介したシングルクロスオーバーを同定するのに用いられた（表２；１５３９−２０５および２０４−６３０のプライマー組合せ）。
【００８５】
【表２】
0006637026.tif 000004
【００８６】
発酵
ＴＭＭ培地は、Ｆｏｎｇら（Fongら、2006）から改変され、そして１Ｌにつき、６０ｇ／Ｌのグルコース；３０ｇ／Ｌのキシロース；８．３７ｇのＭＯＰＳ、０．２３ｇのＫ２ＨＰＯ４；０．５１ｇのＮＨ４Ｃｌ；０．５０ｇのＮａＣｌ；１．４７ｇのＮａ２ＳＯ４；０．０８ｇのＮａＨＣＯ３；０．２５ｇのＫＣｌ；１．８７ｇのＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ；０．４１ｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ；１６．０ｍｇのＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ；１．０ｍｇのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；２．０ｍｇのＨ３ＢＯ３；０．１ｍｇのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ；０．１ｍｇのＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ；１．０ｍｇのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ；７．０ｍｇのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；０．１ｍｇのチアミン；０．１ｍｇのリボフラビン；０．５ｍｇのニコチン酸；０．１ｍｇのパントテン酸；０．５ｍｇのピリドキサミンＨＣｌ；０．５ｍｇのピリドキサールＨＣｌ；０．１ｍｇのＤ−ビオチン；０．１ｍｇの葉酸；０．１ｍｇのｐ−アミノ安息香酸；０．１ｍｇのコバラミンを含んでいた。ｐＨはｐＨ７．２に調整された。グルコース、キシロース、金属およびビタミンは、フィルター滅菌された。培地はオートクレーブ処理された。ＴＭＭ１、ＴＭＭ２．５およびＴＭＭ５はそれぞれ、１ｇ／Ｌ、２．５ｇ／Ｌおよび５ｇ／Ｌの酵母抽出物（Ｏｘｏｉｄ）で補充されていた。
【００８７】
ＳＴＭＭは、Ｋ２ＨＰＯ４（１．００ｇ／Ｌ）、ＮＨ４Ｃｌ（２．５０ｇ／Ｌ）、ＮａＣｌ（５．００ｇ／Ｌ）およびＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ（５０ｍｇ／Ｌ）の濃度がＴＭＭと異なり、そしてＤ，Ｌ−メチオニン（６８．５ｍｇ／Ｌ）およびベタイン（０．１４ｇ／Ｌ）で補充された。スクロース（９０ｇ／Ｌ）が、グルコースおよびキシロースの代わりに用いられた。ＳＴＭＭ５は、５ｇ／Ｌの酵母抽出物（Ｂｉｏｓｐｒｉｎｇｅｒ）で補充されていた。
【００８８】
ＴＭＭ５またはＳＴＭＭ５中の１００ｍＬの前培養物が、コンデンサー（おおよそ１５℃の水道水を流すことにより冷却される）を装備した０．７５ＬのＭｕｌｔｉｆｏｒｓ発酵装置（Ｉｎｆｏｒｓ）において、（１０ｖ／ｖ％）４００ｍＬのＴＭＭ１、ＴＭＭ２．５またはＳＴＭＭ５に接種するために用いられた。ｐＨは、滅菌した２．５ＭのＫＯＨまたは滅菌した７５ｇ／ＬのＣａ（ＯＨ）２の添加によって、ｐＨ７．２に調整された。温度は６０℃であった。撹拌速度は３００ｒｐｍであった。
【００８９】
サンプルが、（Ｒ）−乳酸および（Ｓ）−乳酸ならびに生じうる副産物の測定のために、上記発酵物から抜き出された。サンプルは遠心分離され、そして残渣が、Ｍｉｌｌｅｘ  ＧＰ  ０．２２μｍフィルター（登録商標）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いた濾過によって除去された。濾液が、さらなる分析まで−２１℃にて貯蔵された。
【００９０】
糖が、Ｔｈｅｒｍｏ  ＣａｒｂｏＰａｃ  ＳＡ−１０カラム（Ｄｉｏｎｅｘ）を用いたＨＰＬＣによって測定された。ギ酸が、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ａｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ−８７Ｃカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いたＨＰＬＣによって測定された。他の有機酸（乳酸、酢酸、コハク酸、フマル酸、ピルビン酸）およびエタノールが、誘導体化および気液クロマトグラフィー（ＧＬＣ）を用いて測定された。（Ｒ）−ラクテートおよび（Ｓ）−ラクテートが乳酸メチルにメチル化され、そしてキラルカラム上でのヘッドスペース分析によって測定された。
【００９１】
実施例１
G. thermoglucosidansによるホモ乳酸型の乳酸産生
G. thermoglucosidans中のｓｉｇＦ遺伝子を欠損させるために、組込み型プラスミドｐＲＭ３が構築された。ｓｉｇＦ遺伝子の上流および下流隣接領域は、鋳型としてのＤＳＭ  ２５４２のゲノムＤＮＡ、ならびに上流断片を得るための６５３と６５４のプライマー組合せ（表２）および下流断片を得るための６５１と６５２のプライマー組合せ（表２）を用いたＰＣＲによって生成された。最初に、下流断片が、ＫｐｎＩ−ＳａｌＩ断片として、同じ酵素で切断されたｐＮＷ３３ｎ中にクローニングされた。次に、上流断片が、ＳａｌＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片として、同じ酵素で切断されたこの構築物中にクローニングされて、プラスミドｐＲＭ３を結果した。ｐＲＭ３の構築は、E. coli ＴＧ９０においてなされた。ｐＲＭ３配列の完全性（ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）は、ＤＮＡ配列決定によって確かめられた。
【００９２】
プラスミドｐＲＭ３が、G. thermoglucosidans  ＤＳＭ  ２５４２にエレクトロポレーションされた。シングルクロスオーバー突然変異体を得るために、材料および方法に記載されたように、シングル形質転換体コロニーが選択され、そして用いられた。２つのコロニーが、さらなる研究のために選択された。一方が、上流隣接領域を介したシングルクロスオーバーを有し、他方が、下流隣接領域を介したシングルクロスオーバーを有した。
【００９３】
ダブルクロスオーバー突然変異体が、材料および方法に記載された手順に従って得られた。クロラムフェニコールを有しないＴＧＰ中でのシングルクロスオーバー組込み体の継代培養後に得られた６０のコロニーが、クロラムフェニコールを有するＴＧＰプレートおよび有しないＴＧＰプレートに移された。１５のコロニーが、クロラムフェニコールに感受性であった。１２のコロニーが所望の改変を有し、３のコロニーが野生型に戻っていた。１のコロニーが選択され、そしてG. thermoglucosidans  ＤＳＭ  ２５４２  ΔｓｉｇＦと命名された。欠損が、配列決定によって確かめられた。
【００９４】
【表３】
0006637026.tif 000005
【００９５】
G. thermoglucosidans  ＤＳＭ  ２５４２  ΔｓｉｇＦが、ＴＭＭ２．５を用いたｐＨ制御された（ＫＯＨ）発酵において評価された。発酵物が４回移され、そして最終発酵物が分析された。結果が表３に要約されている。G. thermoglucosidans  ＤＳＭ  ２５４２  ΔｓｉｇＦは、キシロースおよびグルコースを同時に消費した。
【００９６】
実施例２
ｈｄｈＤを用いた（Ｒ）−乳酸産生G. thermoglucosidans誘導体の構築
L. delbrueckiiに由来し、かつＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ活性をコードするｈｄｈＤ遺伝子による、天然のｌｄｈＬ遺伝子の遺伝子置き換えを促進するためのプラスミドｐＦＳ３が構築された。構築物は、ｈｄｈＤ開始コドンおよび終止コドンが、元のｌｄｈＬ開始コドンおよび終止コドンの位置に取って代わり、そしてｌｄｈＬプロモーターへのｈｄｈＤの翻訳融合を結果するものであった。ｌｄｈＬ遺伝子の下流隣接領域は、鋳型としてのＤＳＭ  ２５４２のゲノムＤＮＡ、および６２４と６３１のプライマー組合せを用いたＰＣＲによって生成された。産物は、ＳａｌＩおよびＳｐｈＩで切断され、そしてＳａｌＩおよびＳｐｈＩで切断されたｐＮＷ３３ｎ中に連結された。得られたプラスミドは、ｐＦＳ２と命名された。ｐＦＳ２の構築は、E. coli  ＤＨ５αにおいてなされた。
【００９７】
ｌｄｈＬ遺伝子の上流隣接領域は、鋳型としてのＤＳＭ  ２５４２のゲノムＤＮＡ、および１０５７と１２０３のプライマー組合せを用いたＰＣＲによって生成された。ｈｄｈＤ遺伝子（配列番号３７）は、鋳型としてのL. delbrueckiiゲノムＤＮＡ、および１２０２と１１８９のプライマー組合せを用いたＰＣＲによって生成された。上記遺伝子はまた、配列番号３７に基づいて合成され得る。得られた２つのＰＣＲ産物は、続いて、これらを一緒に融合するために、１０５７と１１８９のプライマー組合せを用いたオーバーラップＰＣＲにおいて鋳型として用いられる。産物は、ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩで切断され、そしてＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで切断されたｐＦＳ２中に連結された。得られたプラスミドは、ｐＦＳ３と命名された。ｐＦＳ３の構築は、E. coli  ＴＧ９０においてなされた。ｐＦＳ３ヌクレオチド配列の完全性は、配列決定によって確かめられた。
【００９８】
プラスミドｐＦＳ３が、G. thermoglucosidans  ＤＳＭ  ２５４２  ΔｓｉｇＦにエレクトロポレーションされた。材料および方法に記載されたシングルクロスオーバー突然変異体を得るために、シングル形質転換体コロニーが選択され、そして用いられた。試験された多数のコロニーにおいて、下流隣接領域を介したシングルクロスオーバー突然変異体のみが得られた。これらの１つが、さらなる研究のために選択された。
【００９９】
ダブルクロスオーバー突然変異体が、材料および方法に記載された手順に従って得られた。クロラムフェニコールを有しないＴＧＰ中でのシングルクロスオーバー組込み体の継代培養後に得られたコロニーが、クロラムフェニコールを有するＴＧＰプレートおよび有しないＴＧＰプレートに移された。クロラムフェニコールに感受性の１７のコロニーが、ＰＣＲによってチェックされた。１のコロニーが所望の改変を有し、１６のコロニーが野生型に戻っていた。ｌｄｈＬがｈｄｈＤによって交換されたコロニーが選択され、そしてG. thermoglucosidans  ＤＳＭ  ２５４２  ΔｓｉｇＦ，ΔｌｄｈＬ：：ｈｄｈＤと命名された。
【０１００】
G. thermoglucosidans  ＤＳＭ  ２５４２  ΔｓｉｇＦ，ΔｌｄｈＬ：：ｈｄｈＤをさらに最適化するために、ギ酸、酢酸およびエタノール副産物の形成を排除したいという願望があった。ｐｆｌＡおよび／またはｐｆｌＢならびにａｄｈＥの突然変異が、多くの細菌においてギ酸およびエタノールの産生に影響を与えることが知られているが、これらの遺伝子を破壊することの副作用は予測できない。
【０１０１】
これらの遺伝子の破壊の影響を評価するために、G. thermoglucosidansにおける遺伝子ｐｆｌＢ、ｐｆｌＡおよびａｄｈＥを（部分的に）欠損させるためのプラスミド（ｐＲＭ１２）が構築された。ｐｆｌＢＡの上流隣接領域、および収束的に向きを定められるａｄｈＥの上流隣接領域が、鋳型としてのＤＳＭ  ２５４２のゲノムＤＮＡ、ならびに上流ｐｆｌＢＡ断片を得るための７３９と８０５のプライマー組合せおよび上流ａｄｈＥ断片を獲得するための８０６と８０７のプライマー組合せを用いたＰＣＲによって生成された。続いて、得られた２つのＰＣＲ産物は、これらを一緒に融合するために、７３９と８０７のプライマー組合せを用いたオーバーラップＰＣＲにおいて、鋳型として用いられた。産物は、ＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩ断片として、ＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩで切断されたプラスミドｐＮＷ３３ｎ中にクローニングされて、プラスミドｐＲＭ１２を結果した。ｐＲＭ１２の構築は、E. coli  ＴＧ９０においてなされた。ｐＲＭ１２ヌクレオチド配列の完全性は、配列決定によって確かめられた。
【０１０２】
プラスミドｐＲＭ１２が、G. thermoglucosidans  ＤＳＭ  ２５４２  ΔｓｉｇＦ，ΔｌｄｈＬ：：ｈｄｈＤにエレクトロポレーションされた。材料および方法に記載されたように、シングル形質転換体コロニーが選択され、そして用いられて、シングルクロスオーバー突然変異体を得た。２つのコロニーが、さらなる研究のために選択された。一方が、上流ｐｆｌＢＡ隣接領域を介したシングルクロスオーバーを有し、他方が、上流ａｄｈＥ隣接領域を介したシングルクロスオーバーを有した。
【０１０３】
ダブルクロスオーバー突然変異体が、材料および方法に記載された手順に従って得られた。クロラムフェニコールを有しないＴＧＰ中でのシングルクロスオーバー組込み体の継代培養後に得られた１２０のコロニーが、クロラムフェニコールを有するＴＧＰプレートおよび有しないＴＧＰプレートに移された。クロラムフェニコールに感受性の５のコロニーが、ＰＣＲによってチェックされた。２のコロニーが所望の改変を有し、３のコロニーが野生型に戻っていた。所望の改変を有する１のコロニーが選択され、そしてG. thermoglucosidans  ＤＳＭ  ２５４２  ΔｓｉｇＦ，ΔｌｄｈＬ：：ｈｄｈＤ，ΔｐｆｌＢＡ−ΔａｄｈＥと命名された。
【０１０４】
G. thermoglucosidans  ＤＳＭ  ２５４２  ΔｓｉｇＦ，ΔｌｄｈＬ：：ｈｄｈＤ，ΔｐｆｌＢＡ−ΔａｄｈＥが、５ｇ／Ｌの酵母抽出物および９０ｇ／Ｌのスクロースを含有するＳＴＭＭ５培地を用いた、ｐＨ制御された（Ｃａ（ＯＨ）２）発酵において評価された。発酵物が移され、そして第二の発酵物が、ホモ乳酸型の（Ｒ）−乳酸の産生について分析された。G. thermoglucosidans  ＤＳＭ  ２５４２  ΔｓｉｇＦ，ΔｌｄｈＬ：：ｈｄｈＤ，ΔｐｆｌＢＡ−ΔａｄｈＥは、限られた量のエタノール、ギ酸および酢酸副産物を伴って、ホモ乳酸型の（Ｒ）−乳酸を産生することができた。すなわち、ピルビン酸ギ酸リアーゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼ複合遺伝子の破壊と組み合わせた、ＨｄｈＤ  Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼの導入が、限られた量のエタノール、ギ酸および酢酸副産物を伴って、６０℃でのホモ乳酸型（Ｒ）−乳酸発酵を結果する。
【０１０５】
実施例３
ｌｄｈＡを用いた（Ｒ）−乳酸産生G. thermoglucosidans誘導体の構築
E. coliにおけるLactobacillus属の種に由来するｌｄｈＡ遺伝子のクローニングは、問題があることが知られている（Bernardら、1991、FEBS Lett.290:61-64）。起こりうるクローニング問題を回避するために、本発明者らは、中間宿主としてL. lactisを使用し、クローニングベクターとしてｐＮＺ１２４を使用することに決めた。L. delbrueckiiに由来し、かつＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ活性をコードするｌｄｈＡによる、天然のｌｄｈＬ遺伝子の遺伝子置き換えを促進するために、プラスミドｐＪＳ６５が構築された。構築は、ｌｄｈＡ開始コドンおよび終止コドンが、元のｌｄｈＬ開始コドンおよび終止コドンの位置に取って代わり、そしてｌｄｈＡのｌｄｈＬプロモーターへの翻訳融合をもたらすものであった。
【０１０６】
ｌｄｈＬ遺伝子の下流隣接領域は、鋳型としてのＤＳＭ  ２５４２のゲノムＤＮＡ、および１５８９と９５７のプライマー組合せを用いたＰＣＲによって生成される。産物は、ＳａｃＩおよびＸｈｏＩで切断され、そしてＳａｃＩおよびＸｈｏＩで切断されたｐＮＺ１２４中に連結される。得られたプラスミドは、ｐＪＳ６４と命名される。ｐＪＳ６４の構築は、L. lactis  ＭＧ１３６３においてなされる。
【０１０７】
ｌｄｈＬ遺伝子の上流隣接領域は、鋳型としてのＤＳＭ  ２５４２のゲノムＤＮＡ、および１５３７と６７６のプライマー組合せを用いたＰＣＲによって生成される。ｌｄｈＡ遺伝子（配列番号３５）は、鋳型としてのL. delbrueckiiゲノムＤＮＡ、および６７５と５６４のプライマー組合せを用いたＰＣＲによって生成される。上記遺伝子はまた、合成遺伝子が好ましくは、ｐＮＺ１２４において、およびL. lactisにおいてクローニングされるべきであることを考慮して、配列番号３５に基づいて合成され得る。得られた２つのＰＣＲ産物は次いで、これらを一緒に融合するために、１５３７と５６４のプライマー組合せを用いたオーバーラップＰＣＲにおいて鋳型として用いられる。産物は、ＸｂａＩおよびＳａｌＩで切断され、そしてＸｂａＩで切断されかつＳａｌＩで部分的に切断されたｐＪＳ６４に連結される。得られたプラスミドは、ｐＪＳ６５と命名される。ｐＪＳ６５の構築は、L. lactis  ＭＧ１３６３においてなされる。
【０１０８】
プラスミドｐＪＳ６５は、直接的組込みのために、G. thermoglucosidans  ＤＳＭ  ２５４２  ΔｓｉｇＦ，ΔｌｄｈＬ：：ｈｄｈＤ，ΔｐｆｌＢＡ−ΔａｄｈＥにエレクトロポレーションされた。シングル形質転換体コロニーが、上流ｌｄｈＬ隣接領域を介したシングルクロスオーバーを伴って得られた。G. thermoglucosidansゲノムにおける直接的組込みの達成は、ｐＮＷ３３ｎ１μｇにつき少なくとも１０３ＣＦＵの比較的高い形質転換効率を有する、新しく作製されたコンピテント細胞を用いることを必要とした。
【０１０９】
ダブルクロスオーバー突然変異体は、材料および方法に記載された手順に従って得られた。クロラムフェニコールを有しないＴＧＰ中でのシングルクロスオーバー組込み体の継代培養後に得られた２４０のコロニーが、クロラムフェニコールを有するＴＧＰプレートおよび有しないＴＧＰプレートに移された。クロラムフェニコールに感受性の１３のコロニーが、ＰＣＲによってチェックされた。１０のコロニーが所望の改変を有し、３のコロニーが野生型に戻っていた。ｌｄｈＬがｌｄｈＡによって交換された１のコロニーが選択され、そしてG. thermoglucosidans  ＤＳＭ  ２５４２  ΔｓｉｇＦ，ΔｌｄｈＬ：：ｌｄｈＡ，ΔｐｆｌＢＡ−ΔａｄｈＥと命名された。
【０１１０】
【表４】
0006637026.tif 000006
【０１１１】
G. thermoglucosidans  ＤＳＭ  ２５４２  ΔｓｉｇＦ，ΔｌｄｈＬ：：ｌｄｈＡ，ΔｐｆｌＢＡ−ΔａｄｈＥが、５ｇ／Ｌの酵母抽出物および９０ｇ／Ｌのスクロースを含有するＳＴＭＭ５培地を用いた、ｐＨ制御された（Ｃａ（ＯＨ）２）発酵において評価された。発酵物が移され、そして第二の発酵物が分析された。結果が表４に要約されている。これらのデータは明らかに、ピルビン酸ギ酸リアーゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼ複合遺伝子の破壊と組み合わせた、ＬｄｈＡ  Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼの導入が、限られた量のエタノール、ギ酸および酢酸副産物を伴って、ホモ乳酸型（Ｒ）乳酸発酵を結果することを実証している。
【０１１２】
実施例４
G. thermoglucosidansによるエナンチオピュアのホモ型乳酸産生
G. thermoglucosidans中のｍｇｓＡ遺伝子（４２３ｂｐ）の２６７ｂｐを欠損させるためにプラスミドｐＪＳ４３が構築された。ｍｇｓＡ遺伝子の上流および下流隣接領域は、鋳型としてのＤＳＭ  ２５４２のゲノムＤＮＡ、ならびに、ｍｇｓＡ下流断片を得るための７５０と９９９のプライマー組合せおよび上流ｍｇｓＡ断片を獲得するための１０００と７５３のプライマー組合せを用いたＰＣＲによって生成された。得られた２つのＰＣＲ産物は次いで、これらを一緒に融合するために、７５０と７５３のプライマー組合せを用いたオーバーラップＰＣＲにおいて鋳型として用いられた。産物は、ＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩ断片として、ＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩで切断されたプラスミドｐＮＷ３３ｎ中にクローニングされて、プラスミドｐＪＳ４３を結果した。ｐＪＳ４３の構築は、E. coli  ＴＧ９０においてなされた。ｐＪＳ４３ヌクレオチド配列の完全性は、配列決定によって確かめられた。
【０１１３】
プラスミドｐＪＳ４３が、G. thermoglucosidans  ＤＳＭ  ２５４２  ΔｓｉｇＦ，ΔｌｄｈＬ：：ｈｄｈＤ，ΔｐｆｌＢＡ−ΔａｄｈＥにエレクトロポレーションされた。材料および方法に記載されたように、シングル形質転換体コロニーが選択され、そして用いられて、シングルクロスオーバー突然変異体を得た。２つのコロニーが、さらなる研究のために選択された。一方が、上流隣接領域を介したシングルクロスオーバーを有し、他方が、下流隣接領域を介したシングルクロスオーバーを有した。
【０１１４】
ダブルクロスオーバー突然変異体が、材料および方法に記載された手順に従って得られた。クロラムフェニコールを有しないＴＧＰ中でのシングルクロスオーバー組込み体の継代培養後に得られた４００のコロニーが、クロラムフェニコールを有するＴＧＰプレートおよび有しないＴＧＰプレートに移された。これらのうち、２１３のコロニーがクロラムフェニコールに感受性であり、３９のクロラムフェニコール感受性コロニーが、ダブルクロスオーバーについてＰＣＲによってチェックされた。８のコロニーが所望の改変を有し、３１のコロニーが野生型に戻っていた。所望の改変を有するシングルコロニーが選択され、そしてG. thermoglucosidans  ＤＳＭ  ２５４２  ΔｓｉｇＦ，ΔｌｄｈＬ：：ｈｄｈＤ，ΔｐｆｌＢＡ−ΔａｄｈＥ，ΔｍｇｓＡと命名された。欠損は、配列決定によって確かめられた。
【０１１５】
プラスミドｐＪＳ４３が、G. thermoglucosidans  ＤＳＭ  ２５４２  ΔｓｉｇＦ，ΔｌｄｈＬ：：ｌｄｈＡ，ΔｐｆｌＢＡ−ΔａｄｈＥにエレクトロポレーションされた。材料および方法に記載されたように、シングル形質転換体コロニーが選択され、そして用いられて、シングルクロスオーバー突然変異体を得た。２つのコロニーが、さらなる研究のために選択された。双方とも、上流隣接領域を介したシングルクロスオーバーを有した。下流隣接領域を介したシングルクロスオーバーは得られなかった。
【０１１６】
ダブルクロスオーバー突然変異体が、材料および方法に記載された手順に従って得られた。クロラムフェニコールを有しないＴＧＰ中でのシングルクロスオーバー組込み体の継代培養後に得られた２４０のコロニーが、クロラムフェニコールを有するＴＧＰプレートおよび有しないＴＧＰプレートに移された。２３９のコロニーが、クロラムフェニコールに感受性であり、これらのうちの１３４のコロニーが、ダブルクロスオーバーについてＰＣＲによってチェックされた。１のコロニーが所望の改変を有し、１３３のコロニーが野生型に戻っていた。所望の改変を有するシングルコロニーが選択され、そしてG. thermoglucosidans  ＤＳＭ  ２５４２  ΔｓｉｇＦ，ΔｌｄｈＬ：：ｌｄｈＡ，ΔｐｆｌＢＡ−ΔａｄｈＥ，ΔｍｇｓＡと命名された。欠損は、配列決定によって確かめられた。
【０１１７】
【表５】
0006637026.tif 000007
【０１１８】
G. thermoglucosidans  ＤＳＭ  ２５４２  ΔｓｉｇＦ，ΔｌｄｈＬ：：ｌｄｈＡ，ΔｐｆｌＢＡ−ΔａｄｈＥ，ΔｍｇｓＡが、５ｇ／Ｌの酵母抽出物および９０ｇ／Ｌのスクロースを含有するＳＴＭＭ５培地を用いた、ｐＨ制御された（Ｃａ（ＯＨ）２）発酵において評価された。発酵物が移され、そして第二の発酵物が分析された。結果が表５に要約されている。産生された（Ｒ）−乳酸のキラル純度は、低濃度の乳酸（＜５ｇ／ｋｇ）については＞９９．０％、より高い濃度の乳酸（＞２０ｇ／ｋｇ）については＞９９．７％であった。これは、ｍｇｓＡの破壊のない菌株由来の乳酸よりも純粋である（表５）。これらのデータは明らかに、G. thermoglucosidansにおけるメチルグリオキサール経路の明らかな不完全性にも拘らず、ｍｇｓＡの破壊が、ホモ乳酸型のキラル的に純粋な（Ｒ）−乳酸発酵をもたらすキラル的に純粋な（Ｒ）−乳酸を産生する能力をもたらすことを示す。
【配列表】
0006637026000001.app