(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
マッサージ用皮膚外用剤に含有させるタルミ改善剤をｉｎ ｖｉｔｒｏでスクリーニン
グする方法であって、皮下脂肪細胞の接着分子を構成するタンパク質をコードする遺伝子又は前記タンパク質の、成熟皮下脂肪細胞における発現量を指標とすることを特徴とし、
前記皮下脂肪細胞の接着分子が、インテグリンα５、インテグリンα６、インテグリンαＶ、及びインテグリンβ１から選択され、
被験物質を添加した成熟皮下脂肪細胞における前記発現量が、被験物質を添加しなかった成熟皮下脂肪細胞における発現量と比較して大きい場合に、前記被験物質はタルミ改善作用を有すると判定する、方法。
【請求項２】
前記被検物質を添加した成熟皮下脂肪細胞における前記発現量が、被検物質を添加しなかった成熟皮下脂肪細胞における発現量の１２０％以上である場合に、前記被検物質はタルミ改善作用を有すると判定する、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マッサージ用皮膚外用剤に含有させるタルミ改善剤をスクリーニングする方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タルミは、見た目の印象に大きな影響を与える老化症状である。そのため、その改善への関心は高く、タルミの改善を目的として抗老化剤や保湿剤等の開発が盛んに行われている。
タルミは、皮膚の真皮でのコラーゲンやエラスチンなどの細胞外マトリクスの変性により、弾力性が低下することが原因の１つと考えられており、コラーゲン産生促進作用又はコラゲナーゼ阻害作用を有する成分などがタルミ改善剤として提案されてきた。
【０００３】
また近年、真皮細胞や表皮細胞と上記細胞外マトリクスとの接着・結合も皮膚構造保持に重要であることが明らかにされてきており、その接着機能を担う細胞接着分子であるインテグリンが注目されている。インテグリンはα１〜α６等のα鎖とβ１〜β４等のβ鎖との２量体構造をとるタンパク質ファミリーの総称であり、α鎖とβ鎖との組み合わせによる様々なサブタイプが存在することが報告されている。これまでに、線維芽細胞の細胞膜表面に存在するインテグリンα２β１（特許文献１）や表皮基底細胞の細胞膜表面に存在するインテグリンα６β４（特許文献２）を産生促進する成分が皮膚のタルミやシワの改善剤となり得ることが提案されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１１−２１９４５４号公報
【特許文献２】特開２００３−１７１２２５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従来の線維芽細胞や表皮基底細胞におけるインテグリン産生促進剤では、ある程度のタルミ改善効果は認められるものの、十分に満足のいく効果が得られているとは言い難い。
また、化粧料等の皮膚外用剤を用いるスキンケアの他にも、顔面をマッサージすることによりタルミを整える手法も、個人で行うのに手軽であったり、エステサロン等で行うのに満足感が得られたりすることから人気がある。そのため、マッサージの際に用いるとより効果的な皮膚外用剤の需要もある。
本発明は、かかる状況に鑑み、マッサージ用皮膚外用剤に含有させるのに好適なタルミ改善剤として有効な成分を探索することを目的とし、そのための新たなスクリーニング法を確立することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、皮膚の下に存在する脂肪細胞の集合体であるＦａｔ Ｐａｄの下垂や変形も皮膚のタルミの一因であると考え、皮下脂肪細胞どうしの接着や皮下脂肪細胞と皮下脂肪細胞間にある基底膜との接着に着目し、かかる接着を活性化することによりタルミを改善することができるという知見を得た。そして、皮下脂肪細胞の接着分子を活性化させ、さらに肌のマッサージを行うと、優れたタルミ改善効果が得られることを見出して、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は以下の通りである。
［１］マッサージ用皮膚外用剤に含有させるタルミ改善剤をスクリーニングする方法で
あって、皮下脂肪細胞の接着分子の活性を指標とすることを特徴とする方法。
［２］前記皮下脂肪細胞の接着分子の活性が、該接着分子を構成するタンパク質をコードする遺伝子又は前記タンパク質の発現量であり、被験物質を添加した細胞における前記発現量が、被験物質を添加しなかった細胞における発現量と比較して大きい場合に、前記被験物質はタルミ改善作用を有すると判定する、［１］に記載の方法。
［３］前記被検物質を添加した細胞における前記発現量が、被検物質を添加しなかった細胞における発現量の１２０％以上である場合に、前記被検物質はタルミ改善作用を有すると判定する、［２］に記載の方法。
［４］前記皮下脂肪細胞の接着分子が、インテグリンα５、インテグリンα６、インテグリンαＶ、及びインテグリンβ１から選択される、［１］〜［３］の何れかに記載の方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、マッサージ用皮膚外用剤に含有させるのに好適なタルミ改善剤として有効な成分を探索することができる、スクリーニング法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】試験例のタルミ感の変化を表すグラフ（マッサージなし）。
【図２】試験例のタルミ感の変化を表すグラフ（マッサージあり）。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明のスクリーニング方法は、マッサージ用皮膚外用剤に含有させるタルミ改善剤をスクリーニングする方法であって、皮下脂肪細胞の接着分子の活性を指標とすることを特徴とする。
本発明における皮下脂肪細胞の接着分子とは、皮下脂肪細胞の細胞膜に存在し、皮下脂肪細胞どうしの接着又は皮下脂肪細胞と皮下脂肪細胞間にある基底膜との接着に関与するタンパク質をいう。このような接着分子としては、インテグリンスーパーファミリーのタンパク質（以降、単に「インテグリン」と記す場合もある）が好ましく挙げられ、具体的には、特に限定されるものではないが、インテグリンα５、インテグリンα６、インテグリンαＶ、及びインテグリンβ１からなる群が選択されることがより好ましい。本発明のスクリーニング方法においてその活性を指標とする皮下脂肪細胞の接着分子は、一種でもよいし、二種以上を組み合わせてもよい。スクリーニングの精度の観点から二種以上の皮下脂肪細胞の接着分子を組み合わせることが好ましい。
【００１１】
本発明の好ましい態様において、前記皮下脂肪細胞の接着分子の活性とは、皮下脂肪細胞の接着分子の発現量である。ここで、発現量とは、該遺伝子のｍＲＮＡの転写量と、該遺伝子がコードするタンパク質の翻訳量との何れかを指すものとする。
【００１２】
本発明のスクリーニング方法の好ましい態様においては、被験物質を添加した細胞における皮下脂肪細胞の接着分子の発現量が、被験物質を添加しなかった細胞における発現量と比較して大きい場合に、前記被験物質はタルミ改善作用を有すると判定される。
なお、本発明において「タルミ」は、皮膚の重力方向の変形であるタルミや、表情によるものとは異なる表面上認められる肌の変形を広く意味する語句である。
【００１３】
皮下脂肪細胞の接着分子であるタンパク質をコードする遺伝子の発現量は、任意の方法を用いて測定することができる。例えば、当該遺伝子の配列に特異的に結合する配列を有するＤＮＡ断片をプライマーとして用いてＰＣＲを行い、定量的な検出を行う。なお、上述したインテグリンをコードするヒトの遺伝子配列はそれぞれ公開されており、当業者は適宜プライマーを設計してＰＣＲに供することができる。
また、例えば、当該タンパク質の細胞膜上の量を、常法で、例えば抗体を用いる免疫学的手法等で測定して、遺伝子の発現量としてもよい。
【００１４】
本発明のスクリーニング方法に用いる細胞としては、皮下脂肪細胞を用いる。
細胞の培養の条件としては、通常の培養条件の他、本発明のスクリーニング方法の実行を妨げない、具体的に皮下脂肪細胞の接着分子の発現量の測定を妨げない培養条件であれば、特段の限定なく適用することができる。
【００１５】
本発明のスクリーニング方法が対象とする被験物質は、純物質、動植物由来の抽出物、またはそれらの混合物等のいずれであってもよい。
動植物由来の抽出物は、動物又は植物由来の抽出物自体のみならず、抽出物の画分、精製した画分、抽出物又は画分、精製物の溶媒除去物の総称を意味するものとし、植物由来の抽出物は、自生若しくは生育された植物、漢方生薬原料等として販売されるものを用いた抽出物、市販されている抽出物等が挙げられる。
抽出操作は、植物部位の全草を用いるほか、植物体、地上部、根茎部、木幹部、葉部、茎部、花、花蕾、果実等の部位を使用することできるが、予めこれらを粉砕あるいは細切して抽出効率を向上させることが好ましい。抽出溶媒としては、水、エタノール、イソプロピルアルコール、ブタノールなどのアルコール類、１，３−ブタンジオール、ポリプロピレングリコールなどの多価アルコール類、アセトン、メチルエチルケトンなどのケトン類、ジエチルエーテル、テトラヒドロフランなどのエーテル類等の極性溶媒から選択される一種又は二種以上が好適なものとして例示することができる。具体的な抽出方法としては、例えば、植物体等の抽出に用いる部位又はその乾燥物１質量部に対して、溶媒を１〜３０質量部加え、室温であれば数日間、沸点付近の温度であれば数時間浸漬し、室温まで冷却した後、所望により不溶物及び／又は溶媒除去し、カラムクロマトグラフィー等で分画精製する方法が挙げられる。
【００１６】
本発明のスクリーニング方法における手順の一例を以下に挙げるが、本発明の趣旨を逸脱しない限り以下の内容に限定されるものではなく、適宜変更して実施することができる。
まず、皮下脂肪細胞に被検物質を添加し、２４時間インキュベーションする。その後、該細胞からｍＲＮＡを抽出し、指標とする皮下脂肪細胞の接着分子であるタンパク質（インテグリン等）をコードする遺伝子の発現量を、該遺伝子を特異的に検出するプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲを行い、定量的に測定する。コントロールとして被検物質を添加しなかった細胞においても該遺伝子の発現量を測定する。被検物質を添加した細胞における該遺伝子の発現量が、被検物質を添加しなかった細胞における該遺伝子の発現量（コントロール）に対して大きくなった場合、好ましくはコントロールに対して１２０％以上、より好ましくは１３５％以上、さらに好ましくは１５０％以上となった場合に、前記被検物質はタルミ改善作用を有すると判定する。該判定された物質は、マッサージ用皮膚外用剤に好適に含有し得るタルミ改善剤となり得る。
【００１７】
皮膚のタルミが改善されたことは、例えば、タルミ改善剤を適用した際のタルミ感の自覚による評価や、直立姿勢での顔面と斜めに傾斜した姿勢での顔面とを撮影し、ＶＥＣＴＲＡ Ｍ３（ＣＡＮＦＩＥＬＤ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）等の画像処理システムを用いて姿勢の違いによる顔面形状の差分の解析や、皮膚の粘弾物性の評価等によって確認することができる。
【００１８】
本発明のスクリーニング方法によりタルミを改善する作用を有すると判定された物質（タルミ改善剤）は、任意の調製方法によりマッサージ用皮膚外用剤に好適に含有させることができる。かかる皮膚外用剤は、肌への塗布の際にマッサージを併用することにより、優れたタルミ改善作用を示す。
従来のタルミの予防又は改善用の皮膚外用剤は、コラーゲンやエラスチン等の細胞外マトリックスの補充、産生促進、又は分解抑制によるものであったり、上皮や真皮の細胞の
接着をターゲットにするものであった。これに対して、本発明のスクリーニングによりタルミを改善する作用を有すると判定された物質（タルミ改善剤）は、皮下脂肪細胞の接着をターゲットとする新たな機序でタルミを改善する点、またマッサージとの併用で優れた効果を奏する点で、新たなアプローチによる有効な皮膚外用剤の配合成分となり得る。
【００１９】
本発明に係るマッサージ用皮膚外用剤における、タルミ改善剤の含有量（配合量）は、通常、０．００００１質量％以上、好ましくは０．０００１質量％以上、より好ましくは０．００１質量％以上であり、通常１５質量％以下、好ましくは１０質量％以下、より好ましくは５質量％である。タルミ改善剤の含有量（配合量）が少なすぎると所望の効果が得られにくい場合があり、多すぎると効果が頭打ちになるばかりか組成物の処方の自由度を損なう場合があるからである。また、組成物に含有させるタルミ改善剤の種類は、１種類のみでなく２種類以上であってもよい。
【００２０】
本発明に係るマッサージ用皮膚外用剤の製造に際しては、化粧料、医薬部外品、医薬品などの製剤化で通常使用される任意成分を配合することができる。例えば、スクワラン、ワセリン、マイクロクリスタリンワックスなどの炭化水素類、ホホバ油、カルナウバワックス、オレイン酸オクチルドデシルなどのエステル類、オリーブ油、牛脂、椰子油などのトリグリセライド類、ステアリン酸、オレイン酸、レチノイン酸などの脂肪酸、オレイルアルコール、ステアリルアルコール、オクチルドデカノール等の高級アルコール、スルホコハク酸エステルやポリオキシエチレンアルキル硫酸ナトリウム等のアニオン界面活性剤類、アルキルベタイン塩等の両性界面活性剤類、ジアルキルアンモニウム塩等のカチオン界面活性剤類、ソルビタン脂肪酸エステル、脂肪酸モノグリセライド、これらのポリオキシエチレン付加物、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル等の非イオン界面活性剤類、ポリエチレングリコール、グリセリン、１，３−ブタンジオール等の多価アルコール類、増粘・ゲル化剤、酸化防止剤、紫外線吸収剤、色剤、防腐剤、粉体等を任意に配合することができる。
【００２１】
また、本発明に係るマッサージ用皮膚外用剤には、本発明のスクリーニングによりタルミを改善する作用を有すると判定された物質（タルミ改善剤）以外の、タルミ改善用成分や皮膚の老化予防・改善用成分等も配合してもよい。
本発明に係るマッサージ用皮膚外用剤の製造は、常法に従って前述の成分を処理・配合することにより、困難なく行うことができる。その剤型は、ローション剤型、乳化剤型、オイル剤型等特に限定されず、任意のものを採用できる。
【実施例】
【００２２】
以下、本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本発明は、その要旨を超えない限り、以下の実施例に限定されるものではない。
【００２３】
＜実施例＞皮下脂肪細胞の接着分子の活性を指標としたスクリーニング
以下の手順で、インテグリンα５、インテグリンα６、インテグリンαＶ、又はインテグリンβ１のｍＲＮＡ発現量を指標として、タルミ改善剤をスクリーニングした。
ヒト皮下脂肪前駆細胞を、増殖培地とともに２４穴マルチウェルプレートに播種した後、コンフルエントになるまで培養した。その後、分化培地に交換し、３日おきに分化培地を交換しながら１０日間培養して、皮下脂肪細胞へと成熟化させた。そこへ被験物質として表２に示す植物抽出エキスを添加し（１μＬ／ウェル）、２４時間培養した後に培地を除き、細胞をＰＢＳで洗浄した。ＲＮｅａｓｙ Ｌｉｐｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）のＱＩＡｚｏｌ Ｌｙｓｉｓ Ｒｅａｇｅｎｔを添加（１ｍＬ／ウェル）して細胞からｍＲＮＡを抽出し、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＶＩＬＯ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）によりｃＤＮＡとした。ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ Ｐｒｉｍｅｒ Ａｓｓａｙを用いてリアルタイムＰＣＲを行い、インテグ
リンα５（ＩＴＧＡ５）、インテグリンα６（ＩＴＧＡ６）、インテグリンαＶ（ＩＴＧＡＶ）、及びインテグリンβ１（ＩＴＧＢ１）の各ｍＲＮＡ量を測定した（ｎ＝３）。なお、プライマーは表１に記載のもの（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いた。比較のため、被験物質を添加しない点以外は同様に培養した皮下脂肪細胞における上記因子のｍＲＮＡ量（コントロール）も測定した。
【００２４】
【表１】
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【００２５】
コントロールのｍＲＮＡ発現量を「１」としたときの相対発現量を表２に示す。ホホバリーフエキス、ハマナス花エキス、ポンカン果実エキス、ヤナギランエキスの添加により、各皮下脂肪細胞接着分子の遺伝子発現量の増加が認められた。
【００２６】
【表２】
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【００２７】
＜試験例＞皮下脂肪細胞の接着分子を活性化する植物エキスによる、マッサージ併用におけるタルミ改善効果の評価
以下の手順で、上記実施例においてインテグリンα５、インテグリンα６、インテグリンαＶ、又はインテグリンβ１のｍＲＮＡ発現量を増加させることが認められた植物エキスについて、マッサージを併用して使用したときのタルミ改善効果を評価した。
【００２８】
（１）マッサージ用皮膚外用剤の調製
表３の処方に従い、植物エキスを含有する皮膚外用剤を調製した。すなわち、イ、ロ、及びハをそれぞれ８０℃で加熱溶解して、イにロを徐々に加え、さらにハを加え乳化した後、ホモミキサ−により乳化粒子を均一化し、冷却してクリームを得た。なお、温州ミカンエキスについては、インテグリンα５、インテグリンα６、インテグリンαＶ、及びインテグリンβ１のいずれのｍＲＮＡ発現量も増加させない（コントロールに比して１２０
％未満）ことを予め確認した。
【００２９】
【表３】
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【００３０】
【表４】
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【００３１】
（２）タルミ改善試験
２０〜５９歳の女性被験者に、製剤１〜３又はプラセボ製剤を１日２回（朝晩）３ｇずつ、２週間連続で顔面全体に塗布してもらった。各製剤塗布群についてマッサージあり／なしの群をさらに設け、各群５名ずつとした。マッサージありの群では、製剤を顔面に広げた後に、肌を持ち上げるように１分間マッサージしながら塗布してもらった。
試験開始前及び試験開始２週間後に、被験者に肌のタルミ感の自覚をＶＡＳ（Visual Analog Scale）を用いて評価してもらった。すなわち、長さ１０ｃｍの直線の左端を「タルミ感がない」、右端を「これまでに経験した一番強いタルミ感」とし、試験開始前及び試験開始２週間後のそれぞれにおいて「現在のタルミ感」に当てはまる位置に、前記直線に交わるように線を引くことにより印をつけてもらった。前記直線の左端から印との交点までの距離を計測し、各群の被験者の測定値の平均を算出した。試験開始前及び試験開始２週間後の各群の平均値を一対の標本による平均の検定を用いて比較した。検定の有意水準は両側５％とした。
【００３２】
また、試験開始２週間後に、被験者から得たタルミ改善効果についてのアンケート結果を、以下の５段階に分類・スコア化して、各群の平均スコアを算出した。
試験開始前と比べて改善実感が；  ある：５点
ややある：４点
変化なし：３点
あまりない：２点
ない：１点
【００３３】
ＶＡＳ評価によるタルミ感の結果を図１及び２に、タルミ改善効果のアンケート結果を表５に、それぞれ示す。マッサージなしの場合はいずれの製剤においてもタルミ感の優位な改善は見られなかったが、インテグリンを活性化する植物エキスを含有する製剤１及び２をマッサージしながら皮膚外用剤を塗布した場合は、試験開始前に比べて優位にタルミ感が改善した。
【００３４】
【表５】
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【産業上の利用可能性】
【００３５】
本発明のスクリーニング法により、マッサージ用皮膚外用剤に含有させるのに好適なタルミ改善剤として有効な成分を探索することができるため、産業上非常に有用である。
【図１】
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【図２】
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