(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＢＶタンパク質に由来し、最大４０アミノ酸長であり、配列番号５１、５５、６０、６３、６４、６８、７１、７４、７５、７６、７７、１１４２及び１４６９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチド。
【請求項２】
修飾アミノ酸、非天然アミノ酸、共有結合した官能基、ヒトｔｏｌｌ様受容体リガンド及び／若しくはアゴニスト、オリゴヌクレオチドコンジュゲート、ＰＳＡ、糖鎖若しくはグリカン、ｐａｍ３ｃｙｓ及び／若しくはその誘導体、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ−ＯＤＮ）、環状ジヌクレオチド（ＣＤＮ）、２−アミノイソ酪酸（Ａｂｕ）、ムラミールジペプチド（ＭＤＰ）、ＤＣパルスカセット、並びに／又は破傷風毒素由来ペプチドを更に含む、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
請求項１に記載のペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項１若しくは２に記載のペプチド及び／又は請求項３に記載のポリヌクレオチド、並びに薬学的に許容できる担体を含む組成物。
【請求項５】
請求項１若しくは２に記載の少なくとも２つの異なるペプチド及び／又は請求項３に記載の少なくとも２つの異なるポリヌクレオチド、並びに薬学的に許容できる担体を含む組成物。
【請求項６】
少なくとも１種のアジュバントを更に含む、請求項４又は５に記載の組成物。
【請求項７】
請求項１若しくは２に記載のペプチド及び／又は請求項３に記載のポリヌクレオチド及び／又は請求項４〜６のいずれか一項に記載の組成物の有効量を、ヒト以外の対象に投与するステップを含む、ＨＢＶ関連疾患の予防及び／又は治療のための方法。
【請求項８】
体内における肝炎ウイルスの存在によって特徴づけられるＨＢＶ関連疾患又は症状の治療及び／又は予防用組成物である、請求項４〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
体内における肝炎ウイルスの存在によって特徴づけられるＨＢＶ関連疾患又は症状を治療及び／又は予防するための医薬品を製造するための、請求項１若しくは２に記載のペプチド及び／又は請求項３に記載のポリヌクレオチド及び／又は請求項４〜６のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［発明の分野］
本発明は、薬及び免疫学の分野に関する。特に、Ｂ型肝炎ウイルス感染及び／又はＢ型肝炎関連疾患若しくは症状の治療及び／又は予防に使用することができる新規ペプチドに関する。
【０００２】
［発明の背景］
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）による慢性感染は、主要な世界的な健康問題である。ＨＢＶは、ヘパドナウイルス科（Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ）ファミリーの原型メンバーであり、肝細胞に感染する強い選好を有する（Ｇａｎｅｍら、２００４年）。この３０年、Ｂ型肝炎からの保護のための有効な予防ワクチンが利用可能であったにもかかわらず、推定２０億人がそれでもなおＨＢＶに感染しており、２億４千万人超が現在慢性（長期）Ｂ型肝炎に感染しており、地理的には西ヨーロッパ及び北アメリカ以外の地域で優性である（世界保健機構、２０１３年７月）。
【０００３】
人同士のウイルスの伝染は、血液から血液への直接の接触又は感染者の精液又は膣液を介して起こる。流行地域では、感染は、母親から子への周産期伝染により特徴的に起こる。したがって、ＨＢＶは偶然には伝染しないが、ウイルスは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）と類似の侵入様式だが少なくとも５０倍の感染性である周産期、経皮的又は性的曝露により容易に伝染し得る。感染者との人対人の頻繁な接触には、したがって公衆衛生従事者の様な集団に深刻なリスクが有る。
【０００４】
ＨＢＶによる感染は、急性ウイルス性肝炎、即ち一般的な健康障害、食欲不振、悪心、嘔吐、体の痛み、軽い発熱及び暗色尿で始まる病気として発症することがあり、次いで黄疸の発症へと進行する。病気は数週間続き、次いで罹患した殆どの成人において徐々に改善される。少数の人々は、より重症の肝疾患（劇症肝炎）になる場合があり、その結果死亡する場合がある。感染は全く無症状である場合があり、認識されないまま進む場合がある。Ｂ型肝炎ウイルスによる慢性感染は、無症状であるか又は肝臓の慢性炎症（慢性肝炎）を伴い、長年かけて肝硬変に至る可能性がある。慢性型の感染は、また長年潜伏しながら肝細胞癌（肝癌）の発生率を劇的に高める。
【０００５】
抗ウイルス薬物、例えばヌクレオシド／ヌクレオチド類似体（例えばエンテカビル及びテノホビル）又はインターフェロン（ＩＦＮ）αによる慢性的なＨＢＶ感染者の治療は、血清ウイルス量を効率的に低下させる。しかしながら、抗ウイルス療法は、持続的なウイルス学的応答をまれにもたらし、薬物耐性が起こる（Ｚｏｕｌｉｍら、２０１２年）。更に、ＨＢＶ保因者の大多数は、無治療のままである。
【０００６】
慢性ＨＢＶ保因者のおよそ１５〜４０％は、肝硬変及び関連する肝不全又は肝細胞癌（ＨＣＣ）による死亡リスクが高い臨床的に重篤な肝疾患を一生のうちに発症することになる（Ｌｏｋ、２００２年；及びＨｕａｎｇら、２０１１年）。毎年、最大１００万人が、Ｂ型肝炎の急性又は慢性転機のため、世界的に死亡する（Ｍｉｃｈｅｌら、２００１年；Ｇｒｉｍｍら、２０１３年）。抗ウイルス薬物の感染根絶の失敗、その結果一生ではないにせよ欠点、例えば有毒な副作用及び高い経費、を伴う長期の抗ウイルス療法を必要とするため、新規の治療手法の必要性が差し迫っている（Ｇｒｉｍｍら、２０１３）。
【０００７】
本発明は、慢性ＨＢＶ感染に対して有効な治療ワクチン接種を可能にすることを意図する。治療ワクチン接種は、慢性Ｂ型肝炎を治療するための有望な戦略を構成する（Ｍｉｃｈｅｌら、２０１１年）。
【０００８】
現在の予防的ワクチンによるＨＢＶ感染に対する保護に主に含まれる、ＨＢＶに対する液性免疫応答（Ｌｏｋ、２００２年）の次に、細胞性免疫応答が、ＨＢＶ感染に対する天然耐性に明白に含まれる。
【０００９】
母親から新生児へのＨＢＶの周産期感染及び生まれて２〜３年の間における感染は、９０％超の子供に持続感染をもたらす。それに対し、成人期における感染は、９０％以上の症例において自然に消失し、生涯にわたる防御免疫をもたらす（Ｒｅｈｅｒｍａｎｎら、２００５年）。
【００１０】
急性、自己限定性Ｂ型肝炎ウイルス感染における、活発なポリクローナル並びに多重特異的ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）及びＣＤ４＋Ｔ−ヘルパー（Ｔｈ）細胞が多くのＨＢＶ抗原に応答することは、末梢血において容易に実証される（Ｍｉｃｈｅｌら、２０１１年）。
【００１１】
これらのＴ細胞応答は、ＨＢＶクリアランス及び制御に不可欠である。ＨＢＶ感染チンパンジーにおける実験は、この過程におけるエフェクター細胞としてのＨＢＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の基本的な役割を示した（Ｔｈｉｍｍｅら、２００３年）。ＨＢＶ感染を治癒した患者における応答とは対照的に、慢性Ｂ型肝炎患者において、Ｔ細胞応答は、通常非常に弱く、わずかなエピトープにしか集中せず、機能的に不十分である（Ｍｉｃｈｅｌら、２０１１年）。治療ワクチン接種の目的は、多くのＨＢＶ抗原を対象とする活発で、強力な多価ＣＴＬ及びヘルパーＴ細胞応答を導入し、それによってウイルスクリアランス、肝炎制御及び治癒を探究することである。
【００１２】
疾患の病因論及び疫学論の理解に大きな進展があったという事実にもかかわらず、有効な治療用ＨＢＶワクチンが今なお必要とされている。
【００１３】
［発明の詳細な説明］
本発明者らは、有効な治療ワクチン接種に使用されるＨＢＶ抗原の選択を同定した。ＨＢＶタンパク質由来ペプチドのＨＬＡクラスＩ及びクラスＩＩ結合能並びにプロテアソームによって切断されることによるＨＢＶタンパク質由来のＨＬＡクラスＩ結合ペプチドの生成の分析に基づいて、世界的なＢ型肝炎患者集団において可能性のある全てのＴ細胞エピトープの非常に高いパーセンテージを網羅する最も免疫原性の高い領域が、ＨＢＶポリメラーゼタンパク質、コアタンパク質、Ｘタンパク質及び大表面タンパク質（ｌａｒｇｅ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）中に発見された。これらの領域はＴ細胞エピトープを多く含有し、化学合成された長鎖ペプチドとしてか又は遺伝子的手法によるかいずれかでＢ型肝炎患者に投与された場合、そのようなワクチン接種は、活発なＴ細胞応答を誘発し、ＨＢＶ感染を治癒させると想定される。
【００１４】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで効率的に合成することができるので、比較的短いペプチドの使用は、医療用途として非常に好ましく、およそ１００個超の、すなわち９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５個のアミノ酸の天然のタンパク質では不可能又は不経済である。ペプチドの化学合成は日常的な実践であり、適切な様々な方法が当業者に公知である。ペプチドの化学合成は、標準化が困難であり、大規模な精製及び品質管理手段を必要とする完全なタンパク質の組換え産生に付随する問題も解決する。ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）クラスＩ及びクラスＩＩエピトープの長さを超える長さを持つペプチド（例えば、ここで下に示す長さを有する）は、プロフェッショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ）、特に国際公開第０２／０７０００６号に説明されている樹状細胞（ＤＣ）に取り込まれ、ＤＣ内でプロセッシングされ、その後に含有されるＨＬＡクラスＩ提示及びＨＬＡクラスＩＩ提示エピトープの細胞表面提示を起こすのに十分大きいので、ワクチン成分としての使用に特に有利である。したがって、非抗原提示細胞における最小の、ＨＬＡクラスＩ提示エピトープの全身的な提示によるＴ細胞免疫寛容の不都合な誘導（Ｔｏｅｓら、１９９６年ａ及びＴｏｅｓら、１９９６年ｂに示される）は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）クラスＩ及びクラスＩＩエピトープの長さを超えるペプチドの適用により妨げられる（Ｚｗａｖｅｌｉｎｇら、２００２年に示される）。
【００１５】
本発明は、ここで長鎖ペプチドとも命名される約１５〜約１００アミノ酸長の新規ペプチドに関し、新規ペプチドのそれぞれは、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）クラスＩ及びクラスＩＩ提示エピトープの長さを超えており、治療的に成功し、高いパーセンテージの患者において治癒を誘導するＣＤ４＋とＣＤ８＋Ｔ細胞の同時応答を誘導する。本発明の長鎖ペプチドは合成ペプチドであることが好ましく、合成長鎖ペプチド（ＳＬＰ）とここで命名される。本発明のペプチドによるワクチン接種と比較して、完全長ＨＢＶタンパク質による治療ワクチン接種はそれほど効力がない可能性がある（Ｒｏｓａｌｉａら、２０１３年）。製造及び患者へのペプチドの投与の視点から、完全長ＨＢＶポリメラーゼ、ＨＢＶコアタンパク質、ＨＢＶ  Ｘタンパク質及びＨＢＶ大表面タンパク質に及ぶ、重なり合っている長鎖ペプチド又はＳＬＰ一式による免疫化は、実現不可能である。ワクチン中のペプチドの数を削減するために、最も高いパーセンテージの患者によって認識される最も免疫原性のＳＬＰを組み込むことが必要である。本発明は、この必要性を満たすペプチド及びペプチドワクチンを提供する。実験的に支持されているバイオインフォマティクス分析に基づく段階的で高度な選択手順を使用して、ＨＬＡクラスＩ拘束性細胞傷害性Ｔリンパ球エピトープ及びＨＬＡクラスＩＩ拘束性ヘルパーＴエピトープの最も高い網羅範囲を持つ長鎖ペプチド及び／又はＳＬＰ配列を同定した。ここで記載の選択は、支配的に発現される全てのＨＬＡクラスＩ及びクラスＩＩ対立遺伝子で提示されるＨＢＶ由来Ｔ細胞エピトープを組み込む長鎖ペプチド及び／又はＳＬＰ配列を同定する。世界中で発現しているＨＬＡハプロタイプの大多数を網羅することにより（Ｂｕｉら、２００６年）、長鎖ペプチド及び／又はＳＬＰワクチン組成物を、全てのＨＢＶ感染者に使用することができる。本発明は、患者にワクチン組成物として投与した場合に、効力があるＨＢＶに対して向けられたＣＤ４＋ヘルパーＴとＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞の強力な同時応答を誘導することができるＨＢＶ由来長鎖ペプチド、好ましくはＳＬＰの同定及び選択について記述する。ＨＢＶ由来のそのような免疫原性の高い長鎖ペプチドについては、先行技術に開示されていない。本発明のＨＢＶ由来長鎖ペプチドは、本発明者らにより開発され、検証され、ここで開示される推定の免疫原性スコアに基づいて同定された。推定の免疫原性は、Ｔ細胞局所的免疫原性評価（Ｒｅｇｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ）（ＴＲＩＡ）スコアを使用してここで定量化される。ＴＲＩＡスコアは、免疫原性ＣＴＬ活性化能力の指標となる上記ペプチドの累積クラスＩ−ＢＣＩスコア及び免疫原性Ｔｈ細胞活性化能力の指標となる上記ペプチドの累積クラスＩＩ−Ｂスコアに基づく。累積クラスＩ−ＢＣＩスコア及び累積クラスＩＩ−Ｂスコアの算出については、ここで実施例の項において詳述される。ＴＲＩＡスコアは、累積クラスＩ−ＢＣＩスコア及び累積クラスＩＩ−Ｂスコアの合計として算出される。強い相関が、このＴＲＩＡスコアとＨＢＶ免疫ドナーのＰＢＭＣに見られるＴ細胞応答との間に見られた。したがって、ＴＲＩＡスコアは、最適な免疫原性長鎖ペプチドの選択を可能にする。
【００１６】
第１の態様において、本発明は、ＨＢＶタンパク質由来ペプチドを提供する。本発明のペプチドは、配列番号５１〜７９、１１４２〜１１４５及び１４６８〜１４７１からなる群から選択されるペプチドを含む又は当該ペプチドからなることが好ましく、本発明のペプチドは、配列番号５１、５５、６０、６３、６４、６８、７１、７４、７５、７６、７７、１１４２及び１４６９からなる群から選択されるペプチドを含む又は当該ペプチドからなることがより好ましく、配列番号５１、５５、６０、６３、６４、６８、７１、７４、７５、７７、１１４２及び１４６９からなる群から選択されることがより好ましく、配列番号５５、６０、６３、６４、６８、７１、７４、７５、７６、７７及び１４６９からなる群から選択されることが更により好ましく、配列番号５５、６０、６３、６４、６８、７１、７４、７５、７７及び１４６９からなる群から選択されることが更により好ましく、配列番号６０、６３、７１、７４、７５及び１４６９からなる群から選択されることが更により好ましく、配列番号７５、１４６９及び６３の群から選択されることが最も好ましい。配列番号５１、６０、６３、６４、６８、７１、７４〜７７からなる群から選択されるペプチドを含む又は当該ペプチドからなる本発明のペプチドが、更に好ましい。配列番号６３、７１及び７５からなる群から選択されるペプチドを含む又は当該ペプチドからなる本発明のペプチドも好ましい。本発明のペプチドは、少なくとも約７０個の予測されたＴ細胞エピトープを含むことが好ましい。本発明のペプチドは、少なくとも約７０個の予測されたＴ細胞エピトープ及び少なくとも約３個のプロテアソーム切断部位を含むことがより好ましい。本発明のペプチドは、少なくとも約７０個の予測されたＨＬＡクラスＩ拘束性ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞エピトープ、少なくとも約１個の予測されたＨＬＡクラスＩＩ拘束性ＣＤ４＋ヘルパーＴエピトープを含むことが好ましい。本発明のペプチドは、少なくとも約７０個の予測されたＨＬＡクラスＩ拘束性ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞エピトープ、少なくとも約１個の予測されたＨＬＡクラスＩＩ拘束性ＣＤ４＋ヘルパーＴエピトープ及び少なくとも約３個のプロテアソーム切断部位を含むことがより好ましい。ＨＬＡクラスＩ拘束性ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞エピトープは、ここでＣＴＬエピトープとも命名され、ここでＨＬＡクラスＩＩ拘束性ＣＤ４＋ヘルパーＴエピトープはＴｈ細胞エピトープとも命名される。本発明のペプチドは、少なくとも約７０個の予測されたＣＴＬエピトープ、少なくとも約１５個の予測されたＴｈ細胞エピトープを含むことが好ましい。本発明のペプチドは、少なくとも約７０個の予測されたＣＴＬエピトープ、少なくとも約１５個の予測されたＴｈ細胞エピトープ及び少なくとも約３個のプロテアソーム切断部位を含むことがより好ましい。本発明のペプチドは、少なくとも約９５個の予測されたＣＴＬエピトープ、少なくとも約２５個の予測されたＴｈ細胞エピトープを含むことが好ましい。本発明のペプチドは、少なくとも約９５個の予測されたＣＴＬエピトープ、少なくとも約２５個の予測されたＴｈ細胞エピトープ及び少なくとも約３個のプロテアソーム切断部位を含むことがより好ましい。本発明のペプチドは、少なくとも約１２５個の予測されたＣＴＬエピトープ、少なくとも約５０個の予測されたＴｈ細胞エピトープを含むことが好ましい。本発明のペプチドは、少なくとも約１２５個の予測されたＣＴＬエピトープ、少なくとも約５０個の予測されたＴｈ細胞エピトープ及び少なくとも約３個のプロテアソーム切断部位を含むことがより好ましい。本発明のペプチドは、少なくとも約６３００、少なくとも約８０００、少なくとも約９０００、少なくとも約１００００、又は好ましくは少なくとも約１４０００のＴＲＩＡスコアを有することが好ましい。
【００１７】
本発明のペプチドは、対象、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトにおけるＨＢＶ関連疾患若しくは症状の予防及び／又は治療に有利に使用することができる。本発明のペプチドは、ＨＢＶタンパク質ポリメラーゼ、ＨＢＶコアタンパク質、ＨＢＶ  Ｘタンパク質及びＨＢＶ大表面タンパク質からなる群から選択されるいずれかのタンパク質のアミノ酸配列、好ましくは連続するアミノ酸配列を含む又は当該アミノ酸配列からなることが好ましい。上記ペプチドは、配列番号５１〜７９、１１４２〜１１４５及び１４６８〜１４７１からなる群から選択されるペプチドを含む又は当該ペプチドからなることが好ましい。この群のペプチドが、少なくとも６３００のＴＲＩＡスコアを有することを特徴とすることは、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化に対する高い免疫原性能力を示している。更に、この群のペプチドは、少なくとも７０個の予測されたＨＬＡクラスＩ拘束性ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞エピトープ、少なくとも１個の予測されたＨＬＡクラスＩＩ拘束性ＣＤ４＋ヘルパーＴエピトープを含むことを特徴とする。この群のペプチドは、少なくとも３個のプロテアソーム切断部位を含むことが好ましい。
【００１８】
本発明のペプチドは、配列番号５１〜５３、５５〜５７、６０〜６６、６８〜７８、１１４２〜１１４５及び１４６８〜１４７１からなる群から選択されるペプチドを含む又は当該ペプチドからなることがより好ましい。この群のペプチドは、少なくとも８０００のＴＲＩＡスコアを有することを特徴とする。
【００１９】
本発明のペプチドは、配列番号５１〜５３、５５〜５７、６０〜６６、６８、６９、７１〜７９、１１４２〜１１４５及び１４６８〜１４７１からなる群から選択されるペプチドを含む又は当該ペプチドからなることがより好ましい。この群のペプチドは、少なくとも７０個の予測されたＣＴＬエピトープ、少なくとも１５個の予測されたＴｈ細胞エピトープを含むことを特徴とする。この群のペプチドは、少なくとも３個のプロテアソーム切断部位を含むことが好ましい。本発明のペプチドは、配列番号５１〜５３、５５、５７、６０、６３、６４、６６、６８、７１、７２、７４〜７８、１１４２、１１４５、１４６８〜１４７１からなる群から選択されるペプチドを含む又は当該ペプチドからなることが好ましい。
【００２０】
本発明のペプチドは、配列番号５３、５５〜５７、６０〜６６、６８、６９、７１、７３〜７８、１１４２〜１１４５、１４６８〜１４７１からなる群から選択されるペプチドを含む又は当該ペプチドからなることがより好ましい。この群のペプチドは、少なくとも９０００のＴＲＩＡスコアを有することを特徴とする。
【００２１】
本発明のペプチドは、配列番号５５〜５７、６０〜６５、６８、６９、７１、７４、７５、７７、７８、１１４２〜１１４５、１４６８、１４６９及び１４７１からなる群から選択されるペプチドを含む又は当該ペプチドからなるペプチドであることが更により好ましい。この群のペプチドは、少なくとも１００００のＴＲＩＡスコアを有することを特徴とする。
【００２２】
本発明のペプチドは、配列番号５２、５３、５５、５７、６０、６１、６３、６４、６８、６９、７１、７２、７５、７７、７８、１１４２〜１１４５、１４６８、１４６９及び１４７１からなる群から選択されるペプチドを含む又は当該ペプチドからなることが更により好ましい。この群のペプチドは、少なくとも９５個の予測されたＣＴＬエピトープ、少なくとも２５個の予測されたＴｈ細胞エピトープを含むことを特徴とする。この群のペプチドは、少なくとも３個のプロテアソーム切断部位を含むことが好ましい。本発明のペプチドは、配列番号５５、６０、６３、６４、６８、７１、７５、７７、１１４２、１４６９からなる群から選択されるペプチドを含む又は当該ペプチドからなることが好ましい。
【００２３】
本発明のペプチドは、配列番号６３、７５、１１４３〜１１４５、１４６８及び１４６９からなる群から選択されるペプチドを含む又は当該ペプチドからなることが最も好ましい。この群のペプチドは、少なくとも１４０００のＴＲＩＡスコアを有することを特徴とする。更に、この群のペプチドは、少なくとも１２５個の予測されたＣＴＬエピトープ、少なくとも５０個の予測されたＴｈ細胞エピトープを含むことを特徴とする。この群のペプチドは、少なくとも３個のプロテアソーム切断部位を含むことが好ましい。
【００２４】
「Ｔ細胞エピトープ」は、ここでポリペプチド抗原の直鎖断片と定義され、ポリペプチド抗原の細胞内タンパク質分解プロセッシング及びその後のＨＬＡクラスＩ又はＨＬＡクラスＩＩ分子による抗原提示細胞の細胞表面上への提示によってＴ細胞受容体が接近可能になった後に、Ｔ細胞受容体、好ましくはヒトＴ細胞受容体により認識され、結合される。「予測されたＴ細胞エピトープ」は、ＨＬＡクラスＩ及びＩＩペプチドの結合並びにＨＢＶタンパク質に含有される可能性のある全てのＨＬＡクラスＩ結合ペプチド（ＨＬＡクラスＩリガンドの長さ；８〜１２ａａ）のプロテアソームによるＣ末端生成を予測するアルゴリズムに基づくバイオインフォマティクス分析を使用して、タンパク質分解切断による供給源タンパク質若しくはペプチドからの遊離並びにＴ細胞受容体認識及び／又は結合が予測されているポリペプチド抗原の直鎖断片とここで理解されるものとする。「確認済みのＴ細胞エピトープ」は、タンパク質分解切断による供給源タンパク質又は供給源ポリペプチドからの遊離並びにＴ細胞受容体認識及び／又は結合、より好ましくはＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞活性化能力をここで開示する通りすでに実験的に確定されているポリペプチド抗原の直鎖断片とここで理解されるものとする。「直鎖断片」は、ポリペプチド抗原の連続するアミノ酸配列であるとここで理解され、上記ポリペプチド抗原は、好ましくはＨＢＶタンパク質であり、より好ましくはＨＢＶタンパク質ポリメラーゼ、ＨＢＶコアタンパク質、ＨＢＶ  Ｘタンパク質及びＨＢＶ大表面タンパク質からなる群から選択されるタンパク質である。ＨＬＡクラスＩ又はＨＬＡクラスＩＩ分子の第２の又は別の型に対する結合親和性を示すポリペプチド抗原の同一の直鎖断片は、第２の又は更なるＴ細胞エピトープとここで理解されることになる。換言すると、２つの型のＨＬＡ分子に結合可能なポリペプチド抗原の特定の直鎖断片は、２つの別々の又は異なったＴ細胞エピトープであるとここで理解され、累積ＢＣＩクラスＩ及び／又はクラスＩＩ−Ｂスコア内で２回得点される。Ｔ細胞エピトープは、少なくとも８〜２０個のアミノ酸若しくは（例外的に）より多くのアミノ酸を一般に含む又は少なくとも８〜２０個のアミノ酸若しくは（例外的に）より多くのアミノ酸からなる。Ｔ細胞エピトープは、ＨＬＡクラスＩ拘束性ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）エピトープ又はＨＬＡクラスＩＩ拘束性ＣＤ４＋ヘルパーＴ（Ｔｈ）細胞エピトープであることができる。ＨＬＡクラスＩ拘束性エピトープ（ＣＴＬエピトープとも称する）は、古典的なプロテアソーム依存的ＨＬＡクラスＩプロセッシング経路によって一般に提示されるが、ＨＬＡクラスＩＩ分子は、後期エンドソームの区画において直鎖断片を一般に載せられる。本発明によるペプチドは、配列番号８０〜２７６、２７８〜３１４、３１６〜４２９、４３２〜４８３、４８６〜５４５、５４８〜６３６、６３８〜１１４０及び１１４６〜１４６６からなる群から選択されるＴ細胞エピトープを含むことが好ましい（表４−７を参照のこと）。本発明による好ましいペプチドは、少なくとも７０、７１、７２、７３、７４、７５、７９、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１���０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５又は約２３０〜約２３３個の、ＨＢＶコアタンパク質、ＨＢＶポリメラーゼ、ＨＢＶ  Ｘタンパク質及び／又はＨＢＶ大表面タンパク質由来の予測されたＴ細胞エピトープを含む。本発明によるより好ましいペプチドは、少なくとも９５、９６、９７、９８、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５又は約２３０〜約２３３個の、ＨＢＶコアタンパク質、ＨＢＶポリメラーゼ、ＨＢＶ  Ｘタンパク質及び／又はＨＢＶ大表面タンパク質由来の予測されたＴ細胞エピトープを含む。本発明による更により好ましいペプチドは、少なくとも７０、７１、７２、７３、７４、７５、７９、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５又は約２３０〜約２３３個の、配列番号８０〜２７６、２７８〜３１４、３１６〜４２９、４３２〜４８３、４８６〜５４５、５４８〜６３６、６３８〜１１４０及び１１４６〜１４６６からなる群から選択される予測されたＴ細胞エピトープを含む。本発明による更により好ましいペプチドは、少なくとも９５、９６、９７、９８、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５又は約２３０〜約２３３個の、配列番号８０〜２７６、２７８〜３１４、３１６〜４２９、４３２〜４８３、４８６〜５４５、５４８〜６３６、６３８〜１１４０及び１１４６〜１４６６からなる群から選択される予測されたＴ細胞エピトープを含む。本発明の予測されたＴ細胞エピトープは、ここで開示する通り実験的に確認されることが好ましい。本発明による好ましいペプチドは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５又は７０個の、ＨＢＶコアタンパク質、ＨＢＶポリメラーゼ、ＨＢＶ  Ｘタンパク質及び／又はＨＢＶ大表面タンパク質由来の確認済みのＴ細胞エピトープを含む。本発明によるより好ましいペプチドは、少なくとも２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０又は９５個の、ＨＢＶコアタンパク質、ＨＢＶポリメラーゼ、ＨＢＶ  Ｘタンパク質及び／又はＨＢＶ大表面タンパク質由来の確認済みのＴ細胞エピトープを含む。本発明による更により好ましいペプチドは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６��１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５又は７０個の、配列番号８０〜２７６、２７８〜３１４、３１６〜４２９、４３２〜４８３、４８６〜５４５、５４８〜６３６、６３８〜１１４０及び１１４６〜１４６６からなる群から選択される確認済みのＴ細胞エピトープを含む。本発明による更により好ましいペプチドは、少なくとも２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０又は９５個の、配列番号８０〜２７６、２７８〜３１４、３１６〜４２９、４３２〜４８３、４８６〜５４５、５４８〜６３６、６３８〜１１４０及び１１４６〜１４６６からなる群から選択される確認済みのＴ細胞エピトープを含む。
【００２５】
「プロテアソーム切断部位」は、プロテアソーム、好ましくはヒトプロテアソーム／ヒト細胞に天然に存在するプロテアソームにより切断されるタンパク質又はポリペプチド中の部位とここで理解される。エピトープのＣ末端を遊離させる特定のプロテアソーム切断部位は、好ましくはエピトープアミノ酸配列のＣ末端の厳密に後に存在して、エピトープのＣ末端残基がより大きなペプチドから遊離され、ＨＬＡクラスＩ分子により提示されることを可能にする。ＨＬＡクラスＩ拘束性ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）エピトープを定義する第１の重要な事象は、細胞質ペプチダーゼによる酵素的切断による隣接するタンパク質領域からのエピトープ（又はエピトープ前駆体）の放出である。多触媒性プロテアソームは、殆どのＣＴＬエピトープの正確なＣ末端の生成に必要とされる主な酵素複合体である（Ｒｏｃｋら、２００４年）。プロテアソームは細胞内に豊富に存在する多触媒性酵素複合体であり、殆どのＣＴＬエピトープのＣ末端の生成に関与すると考えられる（Ｃｒａｉｕら、１９９７年；Ｓｔｏｌｔｚｅら、１９９８年；Ｍｏら、１９９９年）。他方で、いくつかのアミノ末端エキソペプチダーゼ（ＥＲＡＰ１、ピューロマイシン感受性アミノペプチダーゼ、ブレオマイシン加水分解酵素などのような）が細胞質ゾル及び小胞体にあり、これらのトリミング酵素は、Ｎ末端伸長したエピトープ前駆体を正確な長さのＣＴＬエピトープに短縮する能力を有するので、ＣＴＬエピトープのアミノ末端の生成はより柔軟性がある。対照的に、Ｃ末端トリミングについては報告されていない。したがって、プロテアソーム切断が、Ｃ末端エピトープ生成を決定し、可能にするので、タンパク質又は本発明のペプチドの様なポリペプチド中のプロテアソーム媒介切断部位の同定を、殆ど全てのＣＴＬエピトープの重要な識別子として使用することができる（Ｋｅｓｓｌｅｒら、２００１年；Ｋｅｓｓｌｅｒ及びＭｅｌｉｅｆ、２００７年）。ＨＢＶコアタンパク質、ＨＢＶポリメラーゼ、ＨＢＶ  Ｘタンパク質及び／又はＨＢＶ大表面タンパク質中にあるプロテアソーム切断部位の評価は、細胞内産生されたＨＢＶペプチド断片の、特にＨＬＡクラスＩ提示ペプチド断片のためのＣ末端を同定する。ＨＬＡクラスＩＩにペプチド断片を載せるための長さ要件は、それほど厳しくない。したがって、ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチド断片の正確な酵素的生成は、不要である。これらのＴ細胞エピトープ要件を本発明において使用して、好ましいＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）及びＣＤ４＋ヘルパーＴ（Ｔｈ）細胞エピトープ並びに／又はその組み合わせを含むＨＢＶタンパク質の完全長配列に由来し、したがって免疫原性が高く、したがって合成及び（治療的）ワクチン接種用途に適したペプチドである長鎖ペプチドを限局し、設計した。
【００２６】
プロテアソーム媒介タンパク質分解切断は、予測アルゴリズムを使用してｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで予測することができる。プロテアソームにより実行される切断は、ここで開示するプロテアソーム媒介切断アッセイにおいて検証することができ、そのアッセイにより、エピトープの隣接領域からのエピトープのＣ末端遊離が測定される（Ｋｅｓｓｌｅｒら、２００１年；Ｋｅｓｓｌｅｒ及びＭｅｌｉｅｆ、２００７年）。ポリペプチド中にある、プロテアソームによる切断のアミノ酸（ａａ）位置及び存在量を同定し、定量的に測定する無細胞プロテアソーム切断アッセイを使用して、どのペプチドが供給源タンパク質（又は供給源ポリペプチド）から生成されるか決定し、それによってエピトープ生成に利用可能なペプチドプールを確立することができる。無細胞プロテアソーム切断アッセイは、適当な緩衝液中でのポリペプチド（好ましくは長さ２８〜４０ａａを有し、より好ましくは長さ３０〜３９ａａを有する）と精製したプロテアソームの調製物との同時インキュベーションを含む。プロテアソームには主に２つの形態、例えば樹状細胞の様なプロフェッショナル抗原提示細胞において主に発現される免疫プロテアソーム、及び他の細胞型において主に発現される構成的プロテアソームが存在する。これらの型は、わずかに異なる触媒活性を持つバリアント触媒サブユニットを含有する。殆どのエピトープは、両方の型のプロテアソームによって遊離されるが、プロテアソーム型に依存して差異的なエピトープ生成が起こる場合もある（Ｍｏｒｅｌら、２０００年；Ｃｈａｐｉｒｏら、２００６年）。したがってプロテアソーム媒介切断アッセイは、これら２つのプロテアソーム型で別々に実行することができる。ここで開示する構成的２０Ｓプロテアソーム又は免疫２０Ｓプロテアソームを使用することが好ましい。ここで実施例に詳述するように、切断しようとするペプチド及び２つのプロテアソーム型（精製したプロテアソーム調製物）のいずれかを含む反応混合物を３７℃でインキュベートし、サンプルを１時間、３時間、６時間及び２４時間の時点で採取する。その後、生成したペプチド切断断片及び残りの供給源ポリペプチドを、質量分析により同定し、定量化する（Ｋｅｓｓｌｅｒら、２００１年）。プロテアソーム媒介切断アッセイにより、プロテアソームが切断するポリペプチド中の（したがって供給源タンパク質中の）位置及びこれらの位置における切断効率（存在量）が明らかになる。切断部位は、構成的プロテアソームによる消化と免疫プロテアソームによる消化の両方において質量スペクトルの断片ピークの強度（２４時間インキュベーション時に、好ましくは＞１％存在し、より好ましくは≧７％存在する）から算出される、ＣＯＯＨ末端として切断部位由来の残基ＮＨ２末端を（可能性のある）相補的断片（複数可）と共に含有する断片を検出することにより確認できる。本発明のペプチドは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個又はより多く、好ましくは少なくとも３個の、ここで定義されたプロテアソーム切断部位を含むことが好ましい。本発明のペプチドは、少なくとも１、２、３、４、５、６、���、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個又はより多く、好ましくは少なくとも３個の、上記のプロテアソーム切断アッセイで推定され検証されたプロテアソーム切断部位を含むことがより好ましい。
【００２７】
前述の通り、Ｔ細胞エピトープの例は、ＨＬＡクラスＩ拘束性ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）エピトープ及びＨＬＡクラスＩＩ拘束性ＣＤ４＋ヘルパーＴ（Ｔｈ）細胞エピトープである。「ＣＴＬエピトープ」は、プロテアソーム媒介タンパク質分解切断により供給源タンパク質から遊離され、その後ＨＬＡクラスＩ分子により抗原提示細胞（ＡＰＣ）、好ましくはヒト抗原提示細胞の細胞表面に提示されるポリペプチド抗原の直鎖断片とここで理解される。「予測されたＣＴＬエピトープ」は、ＨＬＡクラスＩペプチドの結合及びＨＢＶタンパク質に含有される全てのＨＬＡクラスＩ結合短鎖ペプチド（ＣＴＬエピトープの長さ；８〜１２ａａ）のプロテアソームによるＣ末端生成を予測するアルゴリズムに基づくバイオインフォマティクス分析を使用して、タンパク質分解切断による供給源タンパク質からの遊離及びＨＬＡクラスＩ分子結合がすでに予測されているポリペプチド抗原の直鎖断片とここで理解される。本発明の予測されたＣＴＬエピトープは、ここで開示する通り実験的に確認されることが好ましい。本発明のＣＴＬエピトープは、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を活性化できることが好ましい。「確認済みのＣＴＬエピトープ」は、タンパク質分解切断による遊離及びＨＬＡクラスＩ分子結合、より好ましくはＣＤ８＋Ｔ細胞活性化がここで開示する通りにすでに実験的に確定されているポリペプチド抗原の直鎖断片とここで理解される。本発明のＣＴＬエピトープは、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を活性化できることが好ましい。ＣＴＬエピトープは、少なくとも８〜１２個まで、又は例外的に１３若しくは１４個までのアミノ酸を一般に含む。ＣＴＬエピトープは、８〜１４個のアミノ酸からなり、すなわち少なくとも８〜１４個までのアミノ酸長を有することが好ましい。
【００２８】
ＣＴＬエピトープは、（ｉ）プロテアソーム媒介タンパク質分解切断及び（ｉｉ）小胞体（ＥＲ）において起こるＨＬＡクラスＩ分子に対する結合という２つの重要な細胞内事象により定義される。直鎖ペプチド断片が強く結合し、解離速度が遅いほど、この直鎖ペプチド断片が細胞表面提示免疫原性ＣＴＬエピトープになる可能性がより高くなる（Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｂｕｒｇら、１９９６年）。プロテアソーム媒介タンパク質分解切断の分析は、上で示す通りに実行できる。ＨＬＡクラスＩ分子に対する特異的結合は、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ予測アルゴリズムを使用して予測され、当業者に公知のＨＬＡクラスＩペプチド結合アッセイを使用することにより確定されることが好ましい（Ｋｅｓｓｌｅｒ及びＭｅｌｉｅｆ、２００７年；Ｋｅｓｓｌｅｒら、２００３年）。本発明による長鎖ペプチド中のＨＬＡクラスＩ拘束性エピトープは、プロテアソームによってエピトープのＣ末端で生成されると予測されることが好ましく、ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｂｕｒｇら、１９９５年及びＫｅｓｓｌｅｒら、２００３年に記載のアッセイを使用して予測した、ＨＬＡクラスＩ分子に対する高親和性結合能力を有することが好ましく；例えば、ＩＣ５０≦約５μＭは、高親和性結合であると考えることができ、約５μＭ＜ＩＣ５０≦約１５μＭは、中程度の親和性結合であると考えることができ、約１５μＭ＜ＩＣ５０≦１００μＭは、低親和性結合であると考えることができ、ＩＣ５０＞約１００μＭは、結合が無いと考えることができる。ペプチド又はその断片のクラスＩ結合親和性を測定するために、様々なＨＬＡクラスＩ結合アッセイが利用できる。アッセイは、無細胞アッセイ（可溶性ＨＬＡを使用する）対細胞アッセイ（細胞表面上のＨＬＡクラスＩ分子を使用する）、及び競合アッセイ（半定量的データを得られる）対標識された参照ペプチドを使用しない、したがって定量的であるアッセイに分けることができる（Ｋｅｓｓｌｅｒ及びＭｅｌｉｅｆ、２００７年；Ｖｉａｔｔｅら、２００６年）。アッセイは同様に、ＨＬＡクラスＩペプチド結合親和性が確実に評価される。
【００２９】
細胞表面におけるＣＴＬエピトープの実際の提示、すなわちプロテアソーム切断、Ｎ末端トリミングの様な可能性のある他のタンパク質分解事象であって上で示したＣＴＬエピトープを共に定義する事象、及び結合とＨＬＡクラスＩ分子による提示の両方の正味の結果は、当業者に公知の、生化学的手法により又はエピトープ及びＨＬＡクラスＩ分子（遺伝子）型に特異的なＴ細胞受容体を持つ細胞傷害性Ｔ細胞を使用する機能的手法により実証され得る（Ｋｅｓｓｌｅｒ及びＭｅｌｉｅｆ、２００７年）。
【００３０】
生化学的手法は、本発明のＨＢＶ抗原を発現している細胞から、提示しているＨＬＡクラスＩ分子（遺伝子）型と一緒にＨＬＡ−エピトープ複合体を生化学的に精製し、続けて当業者に公知の溶出されたＨＬＡクラスＩ結合ＣＴＬ受容体リガンド中にあるエピトープを質量分析探索することを含む（Ｓｃｈｉｒｌｅら、２０００年；Ｓｃｈｉｒｌｅら、２００１年）。
【００３１】
機能的手法は、ＨＬＡ−エピトープを特異的に認識するＣＴＬ系又はクローンを含み、機能的手法は天然のプロセッシング及びＨＬＡクラスＩ分子によるエピトープの実際の提示を実証する道具として使用される。この方法論において、当技術分野で公知のＣＴＬ誘導アッセイを使用して、合成によって生成された最小の（すなわち正確な長さの）エピトープか又はエピトープ、例えばここで定義されたペプチド、長鎖ペプチド及び／又はＳＬＰを包含する対象のペプチド配列のいずれかを使用して、ＨＬＡ−エピトープ特異的細胞傷害性Ｔ細胞を刺激し、選択する。そのために、手短に言うと、多価のＣＤ８＋Ｔ細胞集団、又は多価ＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞混合集団は、細胞表面上のＨＬＡクラスＩ分子が、精密な合成エピトープを外生的に載せられたか又は抗原提示標的細胞による本発明の長鎖ペプチドの取り込み後に外生的に載せられた本発明の長鎖ペプチドに由来する細胞内で生成されたＣＴＬエピトープを内生的に載せられたかいずれかの自己の標的細胞により刺激される。自己の標的細胞が、エピトープを包含しているペプチド、例えば本発明の合成長鎖ペプチド又はその断片を載せられている場合、エピトープは、ペプチドの細胞取り込み及びプロテアソームと他のＮ末端トリミングペプチダーゼによるペプチドの細胞内プロセッシングの後に生成される。その後、Ｔ細胞認識アッセイを使用し、ＨＬＡ−エピトープ特異的ＣＴＬを使用して、ＨＢＶ感染細胞の表面にあるＨＬＡクラスＩ分子による本発明のエピトープの細胞内生成及び天然の提示を実証する。ＣＴＬによるＨＬＡクラスＩ拘束性エピトープの特異的認識は、エピトープの細胞表面発現を実証し、エピトープの免疫原性、すなわち選択されたドナーの（Ｔ細胞受容体）レパートリー中のエピトープ特異的Ｔ細胞の存在を示す。ＣＤ８＋Ｔ細胞活性化能力は、ヒト健常対照者由来のＴ細胞において、更により好ましくはＨＢＶ関連疾患若しくは症状があるヒト患者及び／若しくは健常対照由来のＴ細胞においてｅｘ  ｖｉｖｏ及び／又はｉｎ  ｖｉｖｏで実証されることが好ましい。活性化は、ｅｘ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏで、より好ましくはＨＢＶ関連疾患があるヒト患者において評価されることが好ましい。タンパク質分解切断による遊離及びＨＬＡクラスＩ分子提示、又は好ましくはＣＤ８＋Ｔ細胞活性化能力が実験的に実証されたＣＴＬエピトープを、確認済みのＣＴＬエピトープとここで命名する。
【００３２】
本発明のペプチドは、少なくとも７０、７１、７２、７３、７４、７５、７９、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０及び２３３個までのここで定義された予測されたＣＴＬエピトープを含むことが好ましい。本発明のペプチドは、少なくとも７０、７１、７２、７３、７４、７５、７９、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０及び２３３個までのここで定義された予測されたＣＴＬエピトープを含むことが好ましい。本発明によるペプチドは、少なくとも７０、７１、７２、７３、７４、７５、７９、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０及び２３３個までの、ＨＢＶコアタンパク質、ＨＢＶポリメラーゼ、ＨＢＶ  Ｘタンパク質及び／又はＨＢＶ大表面タンパク質由来の予測されたＣＴＬエピトープを含むことが好ましい。本発明によるペプチドは、少なくとも７０、７１、７２、７３、７４、７５、７９、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０及び２３３個までの、ＨＢＶコアタンパク質、ＨＢＶポリメラーゼ、ＨＢＶ  Ｘタンパク質又はＨＢＶ大表面タンパク質由来の予測されたＣＴＬエピトープを含むことがより好ましい。本発明によるペプチドは、ＨＢＶコアタンパク質、ＨＢＶポリメラーゼ、ＨＢＶ  Ｘタンパク質及びＨＢＶ大表面タンパク質からなる群から選択されるいずれかのタンパク質の連続するアミノ酸配列を含む又は当該連続するアミノ酸配列からなることが更により好ましく、上記連続するアミノ酸配列は、少なくとも７０、７１、７２、７３、７４、７５、７９、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０及び２３３個までの予測されたＣＴＬエピトープを含む。本発明によるペプチドは、少なくとも７０、７１、７２、７３、７４、７５、７９、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０及び２３３個までの、配列番号８０〜２７６、２７８〜３１４、３１６〜４２９、４３２〜４８３、４８６〜５４５、５４８〜６３６、６３８〜６８５；８４６〜９２３、９５９〜１０９０及び１１４６〜１３９５からなる群から選択されるＣＴＬ予測されたエピトープを含むことが好ましい（表４ａ、５ａ、６ａ及び７ａを参照のこと）。本発明のペプチドは、好ましくは少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０個、好ましくは少なくとも９５個の、ここで定義され上記の生化学的又は機能的アッセイを使用して検証された確認済みのＣＴＬエピトープを含むことが更により好ましい。少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５又は７０個、好ましくは少なくとも２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０又は９５個の、ここで定義され上記の機能的アッセイを使用して検証された確認済みのＣＴＬエピトープを含む本発明のペプチドが最も好ましい。本発明のペプチドは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５又は７０、好ましくは少なくとも２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０又は９５個の、配列番号８０〜２７６、２７８〜３１４、３１６〜４２９、４３２〜４８３、４８６〜５４５、５４８〜６３６、６３８〜６８５；８４６〜９２３、９５９〜１０９０及び１１４６〜１３９５からなる群から選択される確認済みのＣＴＬエピトープを含むことが好ましい。
【００３３】
「Ｔｈ細胞エピトープ」は、ＨＬＡクラスＩＩ分子により認識される直鎖ペプチド断片であるとここで理解される。「予測されたＴｈ細胞エピトープ」は、実験的に支持されている高度なバイオインフォマティクス分析を使用してＨＬＡクラスＩＩ分子認識が予測されたポリペプチド抗原の直鎖断片であるとここで理解される。本発明の予測されたＴｈ細胞エピトープは、ここで開示する通り実験的に確認されることが好ましい。本発明のＴｈ細胞エピトープは、ＣＤ４＋Ｔ細胞応答を誘導できることが好ましい。「確認済みのＴｈ細胞エピトープ」は、ＨＬＡクラスＩＩ分子認識が当業者に公知の通り実験的に確定され、ここで更に詳述されているポリペプチド抗原の直鎖断片であるとここで理解される。
【００３４】
ＨＬＡクラスＩＩ拘束性ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ細胞）エピトープは、１５〜２０個まで又は例外的に更に多くのアミノ酸を一般に含む。ＨＬＡクラスＩＩ拘束性ヘルパーＴ細胞エピトープは、１０〜２０又は１０〜１５個のアミノ酸を含むことが好ましい。予測されたＨＢＶ由来Ｔｈ細胞エピトープの特異的認識は、Ｔｈ細胞誘導アッセイにおいて試験し及び／又は検証することができる。この目的のために、予測されたＴｈ細胞エピトープを含む対象のペプチド若しくはその断片、長鎖ペプチド及び／又はＳＬＰ配列は、標的細胞の表面に外生的に載せられ、その後これらのペプチドを載せた標的細胞を、多価の自己のヘルパーＴ細胞集団と同時インキュベートする。数回刺激した後に、エピトープ特異的ヘルパーＴ細胞を選択することができ、ペプチド又はＳＬＰに含有されるヘルパーＴ細胞エピトープの認識についてバックテストし、それによってヘルパーＴ細胞エピトープの天然の細胞表面提示を証明することができる。本発明によるペプチドに含まれるＨＬＡクラスＩＩ拘束性ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞エピトープは、ＨＢＶ関連疾患又は症状があるヒト患者においてＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞を誘導又は活性化できることが好ましい。誘導又は活性化は、ｅｘ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏで、より好ましくはＨＢＶ関連疾患があるヒト患者において評価されることが好ましい。ＨＬＡクラスＩＩ拘束性エピトープは、ＣＤ４＋ヘルパーＴ記憶及び／又はＣＤ４＋ヘルパーＴエフェクター応答を活性化する、すなわちＣＤ４５ＲＯ陽性ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞を活性化できることが最も好ましい。ＣＤ４５ＲＯ陽性ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞の活性化は、ＤＣのＣＤ４０誘発（Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ、１９９８年）による「ライセンストゥキル（ｌｉｃｅｎｓｅ  ｔｏ  ｋｉｌｌ）」シグナルによってより強力なＣＤ８＋エフェクター及び記憶細胞傷害性Ｔ細胞応答をもたらすことになる。別の設定において、活性化型のＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞は、免疫系の非ＨＬＡ拘束性キラー細胞を活性化することができる。ＨＬＡクラスＩＩ分子による認識、又は好ましくはＣＤ４＋活性化能力が実験的に実証されたＴｈ細胞エピトープを、確認済みのＴｈ細胞エピトープとここで命名する。
【００３５】
本発明によるペプチドは、少なくとも１個の、ＨＢＶコアタンパク質、ＨＢＶポリメラーゼ、ＨＢＶ  Ｘタンパク質及び／又はＨＢＶ大表面タンパク質由来の予測されたＴｈ細胞エピトープを含むことが好ましい。本発明のペプチドは、少なくとも１、２、３、４、５、６、８、７、８、９、１０個、好ましくは少なくとも１５個の、ここで定義され予測されたＴｈ細胞エピトープ（複数可）を含むことが好ましい。本発明によるペプチドは、少なくとも１、２、３、４、５、６、８、７、８、９、１０個、好ましくは少なくとも１５個の、ＨＢＶコアタンパク質、ＨＢＶポリメラーゼ、ＨＢＶ  Ｘタンパク質及び／又はＨＢＶ大表面タンパク質由来の予測されたＴｈ細胞エピトープ（複数可）を含むことが好ましい。本発明によるペプチドは、ＨＢＶコアタンパク質、ＨＢＶポリメラーゼ、ＨＢＶ  Ｘタンパク質及びＨＢＶ大表面タンパク質からなる群から選択されるいずれかのタンパク質の連続するアミノ酸配列を含む又は当該連続するアミノ酸配列からなることが更により好ましく、上記連続するアミノ酸配列は、少なくとも１、２、３、４、５、６、８、７、８、９、１０個、好ましくは少なくとも１５個の予測されたＴｈ細胞エピトープ（複数可）を含む。本発明によるペプチドは、少なくとも１、２、３、４、５、６、８、７、８、９、１０個、好ましくは少なくとも１５個の、配列番号６８６〜８４５；９２４〜９５８、１０９１〜１１４０及び１３９６〜１４６６からなる群から選択される予測されたＴｈ細胞エピトープ（複数可）を含むことが好ましい（表４ｂ、５ｂ、６ｂ及び７ｂを参照のこと）。本発明のペプチドは、少なくとも１、２、３、４、５、６、８、７、８、９、１０個、好ましくは少なくとも１５個の、ここで定義された通り確認済みのＴｈ細胞エピトープ（複数可）を含むことがより好ましい。本発明のペプチドは、少なくとも１、２、３、４、５、６、８、７、８、９、１０個、好ましくは少なくとも１５個の、ここで定義され、上記のヘルパーＴ細胞誘導アッセイを使用して検証された、確認済みのＴｈ細胞エピトープ（複数可）を含むことが更により好ましい。本発明のペプチドは、少なくとも１、２、３、４、５、６、８、７、８、９、１０個、好ましくは少なくとも１５個の、配列番号６８６〜８４５；９２４〜９５８、１０９１〜１１４０及び１３９６〜１４６６からなる群から選択される確認済みのＴｈ細胞エピトープを含むことが好ましい。
【００３６】
本発明によるペプチドは、ＨＢＶコアタンパク質、ＨＢＶポリメラーゼ、少なくとも７０個の、ＨＢＶ  Ｘタンパク質及び／又はＨＢＶ大表面タンパク質由来の予測されたＣＴＬエピトープ及び少なくとも１個の予測されたＴｈ細胞エピトープを両方含むことが好ましい。本発明によるペプチドは、ＨＢＶコアタンパク質、ＨＢＶポリメラーゼ、ＨＢＶ  Ｘタンパク質及び／又はＨＢＶ大表面タンパク質に由来するペプチドであり、好ましくはＨＢＶコアタンパク質、ＨＢＶポリメラーゼ、ＨＢＶ  Ｘタンパク質及び／又はＨＢＶ大表面タンパク質の断片であり、少なくとも７０個の予測されたＣＴＬエピトープ、少なくとも１個の予測されたＴｈ細胞エピトープ及び少なくとも３個のプロテアソーム切断部位含むことがより好ましい。対象とする抗原タンパク質の連続したアミノ酸断片である、本発明による単一のペプチド内の少なくとも３個のプロテアソーム切断部位、少なくとも７０個の予測されたＣＴＬエピトープ及び少なくとも１個のＴｈエピトープの存在が、Ｔｈ応答とＣＴＬ応答の相乗効果によって有効なＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞応答を開始し、維持するのに特に有利であることが観察された。いくつかの公開された研究は、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞が、ＨＬＡクラスＩＩエピトープ提示樹状細胞（ＤＣ）と相互作用すると同時にＣＤ４０リガンドを上方制御することを実証している。ＤＣのＣＤ４０リガンドによる、Ｔｈ細胞とＤＣ上のＣＤ４０分子との相互作用は、ＤＣの活性化をもたらす。活性化型ＤＣは、上方制御された共刺激分子を表し、ＣＴＬ促進サイトカインを分泌する。これは、ＨＬＡクラスＩ拘束性エピトープを提示するそのような活性化型ＤＣによって誘導されるより強力なＣＤ８＋ＣＴＬ応答となお一層強力なＣＴＬ記憶応答の両方を可能にする（Ｒｉｄｇｅら、１９９８年；Ｓｃｈｏｅｎｂｅｒｇｅｒら、１９９８年；Ｓｕｎら、２００４年）。合成長鎖ペプチド（長さ３５ａａ）によるワクチン接種後の強力なＣＤ８＋ＣＴＬ応答のためにＤＣ上でのＣＤ４０発現が必要なことは、Ｚｗａｖｅｌｉｎｇら（２００２年）において実証されている。
【００３７】
したがって、本発明による好ましいペプチドは、少なくとも７０個の予測されたＣＴＬエピトープ及び少なくとも１個の予測されたＴｈ細胞エピトープ；好ましくは配列番号８０〜２７６、２７８〜３１４、３１６〜４２９、４３２〜４８３、４８６〜５４５、５４８〜６３６、６３８〜６８５；８４６〜９２３、９５９〜１０９０及び１１４６〜１３９５からなる群から選択される、少なくとも７０個の予測されたＣＴＬエピトープ、並びに配列番号６８６〜８４５；９２４〜９５８、１０９１〜１１４０及び１３９６〜１４６６からなる群から選択される、少なくとも１個の予測されたＴｈ細胞エピトープを含む。本発明によるより好ましいペプチドは、少なくとも７０個の予測されたＣＴＬエピトープ及び少なくとも１５個の予測されたＴｈ細胞エピトープ；好ましくは配列番号８０〜２７６、２７８〜３１４、３１６〜４２９、４３２〜４８３、４８６〜５４５、５４８〜６３６、６３８〜６８５；８４６〜９２３、９５９〜１０９０及び１１４６〜１３９５からなる群から選択される、少なくとも７０個の予測されたＣＴＬエピトープ、並びに配列番号６８６〜８４５；９２４〜９５、１０９１〜１１４０及び１３９６〜１４６６からなる群から選択される、少なくとも１５個の予測されたＴｈ細胞エピトープを含む。本発明によるペプチドは、少なくとも７１、７２、７３、７４、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５個までの、配列番号８０〜２７６、２７８〜３１４、３１６〜４２９、４３２〜４８３、４８６〜５４５、５４８〜６３６、６３８〜６８５；８４６〜９２３、９５９〜１０９０及び１１４６〜１３９５からなる群から選択される予測されたＣＴＬエピトープ、並びに少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６個までの配列番号６８６〜８４５；９２４〜９５８、１０９１〜１１４０及び１３９６〜１４６６からなる群から選択される予測されたＴｈ細胞エピトープを含むことがより好ましい。本発明によるペプチドは、少なくとも９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５個までの、配列番号８０〜２７６、２７８〜３１４、３１６〜４２９、４３２〜４８３、４８６〜５４５、５４８〜６３６、６３８〜６８５；８４６〜９２３、９５９〜１０９０及び１１４６〜１３９５からなる群から選択される予測されたＣＴＬエピトープ、並びに少なくとも２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６個までの、配列番号６８６〜８４５；９２４〜９５８、１０９１〜１１４０及び１３９６〜１４６６からなる群から選択される予測されたＴｈ細胞エピトープを含むことが更により好ましい。本発明によるペプチドは、少なくとも９５個のここで定義され予測されたＣＴＬエピトープ、及び少なくとも２５個のここで定義され予測されたＴｈ細胞エピトープを含むことが好ましい。
【００３８】
本発明による好ましいペプチドは、少なくとも５個の確認済みのＣＴＬエピトープ及び少なくとも１個の確認済みのＴｈ細胞エピトープ；好ましくは、配列番号８０〜２７６、２７８〜３１４、３１６〜４２９、４３２〜４８３、４８６〜５４５、５４８〜６３６、６３８〜６８５；８４６〜９２３、９５９〜１０９０及び１１４６〜１３９５からなる群から選択される、少なくとも５個の確認済みのＣＴＬエピトープ、並びに配列番号６８６〜８４５；９２４〜９５８、１０９１〜１１４０及び１３９６〜１４６６からなる群から選択される、少なくとも１個の確認済みのＴｈ細胞エピトープを含むことがより好ましい。本発明によるより好ましいペプチドは、少なくとも１５個の確認済みのＣＴＬエピトープ及び少なくとも１個の確認済みのＴｈ細胞エピトープ；好ましくは配列番号８０〜２７６、２７８〜３１４、３１６〜４２９、４３２〜４８３、４８６〜５４５、５４８〜６３６、６３８〜６８５；８４６〜９２３、９５９〜１０９０及び１１４６〜１３９５からなる群から選択される、少なくとも１５個の確認済みのＣＴＬエピトープ並びに配列番号６８６〜８４５；９２４〜９５、１０９１〜１１４０及び１３９６〜１４６６からなる群から選択される、少なくとも１個の確認済みのＴｈ細胞エピトープを含む。本発明によるペプチドは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５又は７０個の、配列番号８０〜２７６、２７８〜３１４、３１６〜４２９、４３２〜４８３、４８６〜５４５、５４８〜６３６、６３８〜６８５；８４６〜９２３、９５９〜１０９０及び１１４６〜１３９５からなる群から選択される確認済みのＣＴＬエピトープ、並びに少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個の、配列番号６８６〜８４５；９２４〜９５８、１０９１〜１１４０及び１３９６〜１４６６からなる群から選択される確認済みのＴｈ細胞エピトープを含むことがより好ましい。本発明によるペプチドは、少なくとも２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０又は９５個の、配列番号８０〜２７６、２７８〜３１４、３１６〜４２９、４３２〜４８３、４８６〜５４５、５４８〜６３６、６３８〜６８５；８４６〜９２３、９５９〜１０９０及び１１４６〜１３９５からなる群から選択される確認済みのＣＴＬエピトープ、並びに少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個の、配列番号６８６〜８４５；９２４〜９５８、１０９１〜１１４０及び１３９６〜１４６６からなる群から選択される確認済みのＴｈ細胞エピトープを含むことが更により好ましい。本発明によるペプチドは、少なくとも１５個のここで定義された確認済みのＣＴＬエピトープ及び少なくとも５個のここで定義された確認済みのＴｈ細胞エピトープを含むことが好ましい。
【００３９】
本発明によるペプチド中のＨＬＡクラスＩエピトープは、治療しようとするヒト対象の集団において支配的なＨＬＡ対立遺伝子にコードされるＨＬＡ分子に対して提示され得ることが好ましい。本発明によるペプチド中の好ましいＨＬＡクラスＩエピトープは、ＨＬＡ−Ａ０１０１；ＨＬＡ−Ａ０２０１；ＨＬＡ−Ａ０２０６；ＨＬＡ−Ａ０３０１；ＨＬＡ−Ａ１１０１；ＨＬＡ−Ａ２３０１；ＨＬＡ−Ａ２４０２；ＨＬＡ−Ａ２５０１；ＨＬＡ−Ａ２６０１；ＨＬＡ−Ａ２９０２；ＨＬＡ−Ａ３００１；ＨＬＡ−Ａ３００２；ＨＬＡ−Ａ３１０１；ＨＬＡ−Ａ３２０１；ＨＬＡ−Ａ３３０３；ＨＬＡ−Ａ６８０１；ＨＬＡ−Ａ６８０２；ＨＬＡ−Ａ７４０１；ＨＬＡ−Ｂ０７０２；ＨＬＡ−Ｂ０８０１；ＨＬＡ−Ｂ１３０１；ＨＬＡ−Ｂ１３０２；ＨＬＡ−Ｂ１４０２；ＨＬＡ−Ｂ１５０１；ＨＬＡ−Ｂ１５０２；ＨＬＡ−Ｂ１５２５；ＨＬＡ−Ｂ１８０１；ＨＬＡ−Ｂ２７０２；ＨＬＡ−Ｂ２７０５；ＨＬＡ−Ｂ３５０１；ＨＬＡ−Ｂ３５０３；ＨＬＡ−Ｂ３７０１；ＨＬＡ−Ｂ３８０１；ＨＬＡ−Ｂ３９０１；ＨＬＡ−Ｂ４００１；ＨＬＡ−Ｂ４００２；ＨＬＡ−Ｂ４４０２；ＨＬＡ−Ｂ４４０３；ＨＬＡ−Ｂ４６０１；ＨＬＡ−Ｂ４８０１；ＨＬＡ−Ｂ４９０１；ＨＬＡ−Ｂ５００１；ＨＬＡ−Ｂ５１０１；ＨＬＡ−Ｂ５２０１；ＨＬＡ−Ｂ５３０１；ＨＬＡ−Ｂ５５０１；ＨＬＡ−Ｂ５６０１；ＨＬＡ−Ｂ５７０１；ＨＬＡ−Ｂ５８０１及びＨＬＡ−Ｂ５８０２に結合することができるエピトープである。好ましい実施形態において、本発明のペプチドは、治療しようとするヒト対象の集団において支配的なＨＬＡ対立遺伝子にコードされるＨＬＡクラスＩ分子の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％を網羅し、「ＨＬＡクラスＩ分子を網羅する」とは、上記ＨＬＡクラスＩ分子に対する結合親和性、好ましくは中程度の結合親和性、より好ましくは高い結合親和性を示すＣＴＬエピトープを含むこととここで理解される。本発明のペプチドは、ＨＬＡ−Ａ０１０１；ＨＬＡ−Ａ０２０１；ＨＬＡ−Ａ０２０６；ＨＬＡ−Ａ０３０１；ＨＬＡ−Ａ１１０１；ＨＬＡ−Ａ２３０１；ＨＬＡ−Ａ２４０２；ＨＬＡ−Ａ２５０１；ＨＬＡ−Ａ２６０１；ＨＬＡ−Ａ２９０２；ＨＬＡ−Ａ３００１；ＨＬＡ−Ａ３００２；ＨＬＡ−Ａ３１０１；ＨＬＡ−Ａ３２０１；ＨＬＡ−Ａ３３０３；ＨＬＡ−Ａ６８０１；ＨＬＡ−Ａ６８０２；ＨＬＡ−Ａ７４０１；ＨＬＡ−Ｂ０７０２；ＨＬＡ−Ｂ０８０１；ＨＬＡ−Ｂ１３０１；ＨＬＡ−Ｂ１３０２；ＨＬＡ−Ｂ１４０２；ＨＬＡ−Ｂ１５０１；ＨＬＡ−Ｂ１５０２；ＨＬＡ−Ｂ１５２５；ＨＬＡ−Ｂ１８０１；ＨＬＡ−Ｂ２７０２；ＨＬＡ−Ｂ２７０５；ＨＬＡ−Ｂ３５０１；ＨＬＡ−Ｂ３５０３；ＨＬＡ−Ｂ３７０１；ＨＬＡ−Ｂ３８０１；ＨＬＡ−Ｂ３９０１；ＨＬＡ−Ｂ４００１；ＨＬＡ−Ｂ４００２；ＨＬＡ−Ｂ４４０２；ＨＬＡ−Ｂ４４０３；ＨＬＡ−Ｂ４６０１；ＨＬＡ−Ｂ４８０１；ＨＬＡ−Ｂ４９０１；ＨＬＡ−Ｂ５００１；ＨＬＡ−Ｂ５１０１；ＨＬＡ−Ｂ５２０１；ＨＬＡ−Ｂ５３０１；ＨＬＡ−Ｂ５５０１；ＨＬＡ−Ｂ５６０１；ＨＬＡ−Ｂ５７０１；ＨＬＡ−Ｂ５８０１及びＨＬＡ−Ｂ５８０２からなるＨＬＡクラスＩ分子の群の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％を網羅することが好ましい。
【００４０】
ＨＢＶゲノム（配列番号３；表１を参照のこと）は、複数のインフレーム開始コドンを使用して異なる７つのＢ型肝炎タンパク質の転写及び発現に関与する重なり合った４つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有する部分的に二本鎖の環状ＤＮＡ分子からなる。ＨＢＶタンパク質は、Ｃ遺伝子にコードされるコアタンパク質及びｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）、Ｐ遺伝子にコードされるＨＢＶポリメラーゼ、Ｓ遺伝子にコードされるウイルス表面タンパク質［小（Ｓ）、中（Ｍ）及び大（Ｌ）］、並びにＸ遺伝子にコードされるＸタンパク質である。総称してＨＢ又は表面タンパク質として公知のいくつかのタンパク質で構成される外殻（又はエンベロープ）がある。この外殻は、外被としばしば称される。外側の外被は、ＨＢｃタンパク質で構成される内殻タンパク質を取り囲む。この内殻は、コア粒子又はカプシドと称される。最終的にコア粒子は、ウイルスＤＮＡ及び酵素ＤＮＡポリメラーゼを取り囲む。
【００４１】
ＨＢＶコアタンパク質は、ウイルスヌクレオカプシドの主要な構成要素である。ＨＢＶポリメラーゼ、ＨＢＶコアタンパク質、ＨＢＶ  Ｘタンパク質及びＨＢＶ大表面タンパク質のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１、４、４５及び１１４１により表される（表１を参照のこと）。
【００４２】
ヒトＨＢＶポリメラーゼタンパク質の好ましいアミノ酸配列は、配列番号１に記載される配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％の同一性を有する配列であり；好ましいコード配列は、配列番号２に記載される配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％の同一性を有する配列である。ＨＢＶコアタンパク質の好ましいアミノ酸配列は、配列番号４に記載される配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％の同一性を有する配列であり；好ましいコード配列は、配列番号５に記載される配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％の同一性を有する配列である。ＨＢＶ大表面タンパク質の好ましいアミノ酸配列は、配列番号１１４１に記載される配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％の同一性を有する配列であり；好ましいコード配列は、配列番号１４６７に記載される配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％の同一性を有する配列である。
【００４３】
Ｘタンパク質の完全長コンセンサスアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔデータベース（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）中で公開され、精査されている３９個の完全長（１５４個のアミノ酸）ＨＢＶ  Ｘタンパク質アミノ酸配列から最適配列を推定することにより得た。これら３９個の配列を先ず整列させ、その後各ａａ位置について最も頻度が高く存在するａａをコンセンサス配列中の位置に選択した。以下の見出し：Ｐ６９７１３；Ｐ０３１６５；Ｐ０Ｃ６８６；Ｐ６９７１４；Ｑ８ＪＭＹ５；Ｑ６９６０４；Ｑ０５４９９；Ｏ９１５３１；Ｑ９ＰＸ７５；Ｐ２０９７６；Ｐ２０９７５；Ｐ２０９７７；Ｐ２４０２６；Ｑ９ＰＸＡ２；Ｑ６７９２３；Ｐ０Ｃ６８５；Ｐ０Ｃ６７８；Ｏ９３１９５；Ｑ９Ｅ６Ｓ８；Ｐ１２９３６；Ｑ９１Ｃ３８；Ｑ９１３Ａ９；Ｑ８ＪＭＹ３；Ｑ８ＪＮ０６；Ｑ８ＪＭＺ５；Ｑ６９６０７；Ｑ９ＩＢＩ５；Ｑ８０ＩＵ５；Ｑ４Ｒ１Ｓ９；Ｑ４Ｒ１Ｓ１；Ｑ９ＹＺＲ６；Ｐ０Ｃ６８７；Ｑ９ＱＭＩ３；Ｐ０Ｃ６８１；Ｑ８０ＩＵ８；Ｑ９９ＨＲ６；Ｐ１７１０２；Ｑ６７８７７；及びＱ６９０２７を持つ３９個の配列を、分析に含めた（表２を参照のこと）。ヒトＨＢＶ  Ｘタンパク質の好ましいコンセンサスアミノ酸配列は、配列番号４５に記載される配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％の同一性を有する配列である。コンセンサスアミノ酸配列は、公知の又は設計される任意のコード配列にコードされることができ；当業者は、公知のアミノ酸配列からコード配列を設計する方法を知っており；そのようなコード配列は、コドンが最適化された配列であることができる。用語「ＨＢＶ  Ｘタンパク質」及び「コンセンサスＨＢＶ  Ｘタンパク質」は、ここで互換的に使用される。
【００４４】
同一性のパーセンテージは、配列中の同一のヌクレオチド／アミノ酸の数を上記配列の全ヌクレオチド／アミノ酸の長さから任意のギャップの長さを引いた数で割った比率を算出することによりここで決定される。所与の配列番号との同一性は、上記配列の完全長に基づく同一性を意味する（即ち上記配列の全体の長さにわたる又は全体として）。
【００４５】
本発明の文脈の中で、「ＨＢＶタンパク質に由来するペプチド」は、ペプチドが、ＨＢＶコアタンパク質、ＨＢＶポリメラーゼ、ＨＢＶ  Ｘコンセンサスタンパク質及び／又はＨＢＶ大表面タンパク質に由来する、少なくとも１５個、最大１００個の連続したアミノ酸を含むことを意味する。言い換えれば、「ＨＢＶポリメラーゼタンパク質に由来するペプチド」は、配列番号１の連続したアミノ酸を最大１００個含み、「ＨＢＶコアタンパク質に由来するペプチド」は、配列番号４の連続したアミノ酸を最大１００個含み、「ＨＢＶ  Ｘコンセンサスタンパク質に由来するペプチド」は、配列番号４５の連続したアミノ酸を最大１００個含み、「ＨＢＶ大表面タンパク質に由来するペプチド」は、配列番号１１４１の連続したアミノ酸を最大１００個含む。「ＨＢＶポリメラーゼタンパク質に由来するペプチド」は、配列番号１の連続したアミノ酸最大１００個からなり、「ＨＢＶコアタンパク質に由来するペプチド」は、配列番号４の連続したアミノ酸最大１００個からなり、「ＨＢＶ  Ｘコンセンサスタンパク質に由来するペプチド」は、配列番号４５の連続したアミノ酸最大１００個からなり、「ＨＢＶ大表面タンパク質に由来するペプチド」は、配列番号１１４１の連続したアミノ酸最大１００個からなることが好ましい。したがって、定義により、ＨＢＶコアタンパク質、ＨＢＶポリメラーゼ、ＨＢＶ  Ｘタンパク質及び／又はＨＢＶ大表面タンパク質の完全長タンパク質は、全て１００個超のアミノ酸なので、本発明によるペプチドは、完全長ＨＢＶコアタンパク質、ＨＢＶポリメラーゼ、ＨＢＶ  Ｘタンパク質及び／又はＨＢＶ大表面タンパク質と異なっている。本発明のペプチドは約１５〜約１００アミノ酸長であることが好ましい。ペプチドの長さは、ペプチドの長さが１５〜１００アミノ酸である、又は好ましくはペプチドの長さが１５〜９５アミノ酸、若しくは１５〜９０アミノ酸、若しくは１５〜８５アミノ酸、若しくは１５〜７０アミノ酸、若しくは１５〜６５アミノ酸、若しくは１５〜６０アミノ酸、若しくは１５〜５５アミノ酸、若しくは１５〜５０アミノ酸、更により好ましくは１５〜４５アミノ酸、更により好ましくは１５〜４０アミノ酸、更により好ましくは１７〜３９、更により好ましくは１９〜４３アミノ酸、更により好ましくは２２〜４０アミノ酸、更により好ましくは２８〜４０及び更により好ましくは３０〜３９アミノ酸とここで示される１５〜１００アミノ酸長まであることがより好ましい。本発明の文脈の中で、「ＨＢＶタンパク質に由来する最大１００個のアミノ酸を含むペプチド」とは、ＨＢＶタンパク質に由来し、好ましくはＨＢＶコアタンパク質、ＨＢＶポリメラーゼ、ＨＢＶ  Ｘコンセンサスタンパク質及びＨＢＶ大表面タンパク質からなる群から選択されるタンパク質でありここで定義されたペプチドに存在する連続したアミノ酸の数が、１００、９９、９８、９７、９６、９５、９４、９３、９２、９１、９０、８９、８８、８７、８６、８５、８４、８３、８２、８１、８０、７９、７８、７７、７６、７５、７４、７３、７２、７１、７０、６９、６８、６７、６６、６５、６４、６３、６２、６１、６０、５９、５８、５７、５６、５５、５４、５３、５２、５１、５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、又は３０個のアミノ酸以下であることを好ましくは意味する。本発明の文脈の中で、「ＨＢＶタンパク質に由来する少なくとも１５個のアミノ酸を含むペプチド」とは、ＨＢＶコアタンパク質、ＨＢＶポリメラーゼ、ＨＢＶ  Ｘコンセンサスタンパク質及びＨＢＶ大表面タンパク質からなる群から選択されるタンパク質に由来し、ここで定義されたペプチドに存在する連続したアミノ酸の数が、少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４又は４５個のアミノ酸であることを好ましくは意味する。本発明の文脈の中で、「ＨＢＶタンパク質に由来する１５〜１００個のアミノ酸を含むペプチド」とは、ＨＢＶコアタンパク質、ＨＢＶポリメラーゼ、ＨＢＶ  Ｘコンセンサスタンパク質及びＨＢＶ大表面タンパク質からなる群から選択されるタンパク質に由来し、ここで定義されたペプチドに存在する連続したアミノ酸の数が、少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４若しくは４５個のアミノ酸であり、１００、９９、９８、９７、９６、９５、９４、９３、９２、９１、９０、８９、８８、８７、８６、８５、８４、８３、８２、８１、８０、７９、７８、７７、７６、７５、７４、７３、７２、７１、７０、６９、６８、６７、６６、６５、６４、６３、６２、６１、６０、５９、５８、５７、５６、５５、５４、５３、５２、５１、５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、又は３０個以下のアミノ酸であることを好ましくは意味する。本発明の文脈の中で、「ＨＢＶタンパク質に由来する１５〜１００個のアミノ酸を含むペプチド」とは、配列番号１、４、４５及び１１４１からなる群から選択されるタンパク質に由来し、ここで定義されたペプチドに存在する連続したアミノ酸の数が、少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４若しくは４５個のアミノ酸であり、約１００、９９、９８、９７、９６、９５、９４、９３、９２、９１、９０、８９、８８、８７、８６、８５、８４、８３、８２、８１、８０、７９、７８、７７、７６、７５、７４、７３、７２、７１、７０、６９、６８、６７、６６、６５、６４、６３、６２、６１、６０、５９、５８、５７、５６、５５、５４、５３、５２、５１、５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、又は３０個以下のアミノ酸であることを好ましくは意味する。ペプチドに含まれるＨＢＶコアタンパク質、ＨＢＶポリメラーゼ、ＨＢＶ  Ｘタンパク質及び／又はＨＢＶ大表面タンパク質由来の連続するアミノ酸配列の長さは、１５〜１００アミノ酸、好ましくは１５〜９５アミノ酸、又は１５〜９０アミノ酸、又は１５〜８５アミノ酸、又は１５〜７０アミノ酸、又は１５〜６５アミノ酸、又は１５〜６０アミノ酸、又は１５〜５５アミノ酸、又は１５〜５０アミノ酸、更により好ましくは１５〜４５アミノ酸、更により好ましくは１５〜４０アミノ酸、更により好ましくは１７〜３９、更により好ましくは１９〜４３アミノ酸、更により好ましくは２２〜４０アミノ酸、更により好ましくは２８〜４０、更により好ましくは３０〜３９アミノ酸であることがより好ましい。ペプチドに含まれる配列番号１、４、４５及び１１４１からなる群から選択される配列由来の連続するアミノ酸配列の長さは、１５〜１００アミノ酸、又は好ましくは１５〜９５アミノ酸、又は１５〜９０アミノ酸、又は１５〜８５アミノ酸、又は１５〜７０アミノ酸、又は１５〜６５アミノ酸、又は１５〜６０アミノ酸、又は１５〜５５アミノ酸、又は１５〜５０アミノ酸、更により好ましくは１５〜４５アミノ酸、更により好ましくは１５〜４０アミノ酸、更により好ましくは１７〜３９、更により好ましくは１９〜４３アミノ酸、更により好ましくは２２〜４０アミノ酸、更により好ましくは２８〜４０、更により好ましくは３０〜３９アミノ酸であることが更により好ましい。本発明によるペプチドは、ＨＢＶコアタンパク質、ＨＢＶポリメラーゼ、ＨＢＶ  Ｘタンパク質及び／若しくはＨＢＶ大表面タンパク質に由来する１個以上の追加のアミノ酸を含むことができ、又はＨＢＶコアタンパク質、ＨＢＶポリメラーゼ、ＨＢＶ  Ｘタンパク質及び／若しくはＨＢＶ大表面タンパク質からなる群から選択されるタンパク質に由来するアミノ酸配列で完全に作られる又は当該アミノ酸配列からなることができる。本発明によるペプチドは、ＨＢＶコアタンパク質、ＨＢＶポリメラーゼ、ＨＢＶ  Ｘタンパク質及び／又はＨＢＶ大表面タンパク質由来の連続しないアミノ酸配列のいくつかの部分を含むことができ、上記ペプチドは、ここで定義された長さ、ＴＲＩＡスコア及び／又は量並びにＴ細胞エピトープの型を有すると理解されることになる。
【００４６】
一実施形態によると、本発明によるペプチドは、ここで定義され、それを表す配列番号によって示されるＨＢＶコアタンパク質、ＨＢＶポリメラーゼ、ＨＢＶ  Ｘタンパク質及び／又はＨＢＶ大表面タンパク質由来の連続するアミノ酸配列のいずれかからなり、それによりアミノ酸が、上記ペプチドのどちらの末端にも追加されないものと理解される。
【００４７】
別の実施形態によると、本発明によるペプチドは、ここで定義され、それを表す配列番号によって示されるＨＢＶコアタンパク質、ＨＢＶポリメラーゼ、ＨＢＶ  Ｘタンパク質及び／又はＨＢＶ大表面タンパク質由来の連続するアミノ酸配列のいずれかを含み、修飾アミノ酸及び／又は共有結合した官能基、例えばフッ素化基、ヒトｔｏｌｌ様受容体リガンド及び／又はアゴニスト、オリゴヌクレオチドコンジュゲート、ＰＳＡ、糖鎖又はグリカン、ｐａｍ３ｃｙｓ及び／又はその誘導体、好ましくはｐａｍ３ｃｙｓリポペプチド又はそのバリアント若しくは誘導体、好ましくは例えば国際公開第２０１３０５１９３６号に記載されるＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ−ＯＤＮ）、環状ジヌクレオチド（ＣＤＮ）、２−アミノイソ酪酸（Ａｂｕ）、ムラミールジペプチド（ＭＤＰ）、ＤＣパルスカセット（ＤＣ  ｐｕｌｓｅ  ｃａｓｓｅｔｔｅ）、破傷風毒素由来ペプチドなどを更に含むことができる。
【００４８】
一実施形態において、本発明のペプチドは、天然でない長さの合成の結果として、又はＨＢＶコアタンパク質、ＨＢＶポリメラーゼ、ＨＢＶ  Ｘタンパク質及び／若しくはＨＢＶ大表面タンパク質に由来しない追加のアミノ酸を含む結果として、又はＨＢＶコアタンパク質、ＨＢＶポリメラーゼ、ＨＢＶ  Ｘタンパク質及び／若しくはＨＢＶ大表面タンパク質由来の連続していないアミノ酸配列を含む結果として、並びに／又は修飾アミノ酸及び／若しくは非天然アミノ酸及び／若しくは共有結合した官能基、例えばフッ素化基、フッ化炭素基、ヒトｔｏｌｌ様受容体リガンド及び／若しくはアゴニスト、オリゴヌクレオチドコンジュゲート、ＰＳＡ、糖鎖若しくはグリカン、ｐａｍ３ｃｙｓ及び／若しくはその誘導体、好ましくは例えば国際公開第２０１３０５１９３６号に記載されるＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ−ＯＤＮ）、環状ジヌクレオチド（ＣＤＮ）、ＤＣパルスカセット、破傷風毒素由来ペプチド、ヒトＨＭＧＢ１由来ペプチドを含む結果として；上で示す通り、ペプチド内か又はペプチドに追加されるかのいずれかで、非天然配列を含む又は当該非天然配列からなる。本発明のペプチドは、２−アミノイソ酪酸［Ａｂｕ、システインのイソステレオマー（isostereomer）］を含むことができる。本発明のペプチドのシステインは、Ａｂｕにより置き換えることができる。配列番号７７のペプチドが、本発明に包含され、Ｎ末端システインは、Ａｂｕに置き換えられている。
【００４９】
本発明のペプチドは、単離されたペプチドであることが好ましく、「単離された」は、ペプチドが精製される程度を反映しないが、ペプチドが天然の環境から取り出されている（すなわち、ペプチドがヒトの操作に供されている）ことを示し、組換え的に生成されたペプチド又は合成的に生成されたペプチドであることができる。本発明は、
免疫系の活性化若しくは誘導及び／若しくは末梢血中のＨＢＶ特異的活性化型ＣＤ４＋及び／若しくはＣＤ８＋Ｔ細胞の増加、若しくは治療の少なくとも１週間後にこれらＴ細胞によって産生されるサイトカインの増加；並びに／又は
ＨＢＶ感染の増殖の阻害若しくはＨＢＶ感染細胞の検出可能な減少若しくはＨＢＶ感染細胞の細胞生存度の減少；並びに／又は
ＨＢＶ感染性細胞死の誘導若しくは誘導の増加；並びに／又は
ＨＢＶ感染細胞の増加の阻害若しくは予防により好ましくは検出可能である、対象におけるＨＢＶ関連疾患若しくは症状の予防、部分的クリアランス及び／若しくは治療又は完全なクリアランスに効果的に使用できるペプチドに関することが好ましい。
【００５０】
本発明の全ての実施形態において、対象は好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトである。対象は、動物モデル、好ましくはヒト化ＨＬＡクラスＩ及びクラスＩＩ分子を持つヒト以外の哺乳動物モデル、又は哺乳動物、好ましくはヒト、器官、例えば肝臓であることができる。
【００５１】
本発明の全ての実施形態において、用語「ＨＢＶ関連疾患又は症状」は、急性ＨＢＶ感染、慢性ＨＢＶ感染及び他の症状として好ましくは定義され、肝炎ウイルスは、血液中、又は対象、例えば肝硬変及び肝癌の、若しくは任意選択で対象の体内におけるウイルスの存在によって特徴づけられる無症状な上記対象の血液を含有する体液中に発見される。
【００５２】
本発明の文脈において、患者は生存していてもよく、本発明による治療の結果として無疾患であると考えられる場合もある。或いは、疾患又は症状を、止める又は消失させることができる（すなわち感染を除去した又は部分的に除去した）。ワクチン接種の少なくとも１週間後の末梢血におけるＨＢＶ特異的活性化型ＣＤ４＋又はＣＤ８＋細胞の有意な増加は、好ましくは少なくとも５％、１０％、２０％、３０％又はそれ超の増加である。ＨＢＶ感染細胞の増殖の阻害は、好ましくは少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％又はそれ超の阻害である。ＨＢＶ感染細胞死の誘導は、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、又はそれ超であることができる。ＨＢＶ感染は、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％又は７５％又はそれ超の誘導が阻害され得る。ＨＢＶ感染細胞を、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％又は１００％まで減少させることができる。
【００５３】
各実施形態において、ここで開示するこの又は別の態様において、本発明によるペプチドの効果、本発明による組成物、本発明によるポリヌクレオチド、本発明によるポリヌクレオチドを含むウイルスベクター並びに／又は本発明による細胞及び／若しくは本発明による方法によって得られた若しくは得ることができる細胞が、定量化され、アッセイは、治療無しの対象又は治療前の同じ対象との比較により実施できる。
【００５４】
急性及び慢性ＨＢＶ感染を、本発明を使用して治療することができる。ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞及び／又はＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞のＴ細胞受容体に提示されることになるエピトープを含む本発明によるペプチドは、ここで定義されたいくつかの構造要件を好ましくは満たす。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｅｘ  ｖｉｖｏＴ細胞実験を好ましくは使用して、本発明によるペプチドが、ＣＤ４＋ヘルパーＴ及びＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞の実質的な応答を誘導する能力を確認する。それにより本発明のペプチドは、化学的に合成することができ、最も効力があり最も広く適用できる、ＨＢＶに由来するＨＬＡクラスＩ及び／又はクラスＩＩ提示Ｔ細胞エピトープを含む比較的短いペプチドの選択に著しい改善を実現する。
【００５５】
一実施形態において、ペプチドは、ＨＢＶコアタンパク質、ＨＢＶポリメラーゼ、ＨＢＶ  Ｘタンパク質及び／又はＨＢＶ大表面タンパク質のアミノ酸の連続する配列と異なっている。
【００５６】
ＨＢＶコアタンパク質、ＨＢＶポリメラーゼ、ＨＢＶ  Ｘタンパク質及び／又はＨＢＶ大表面タンパク質由来のＴ細胞エピトープを含む本発明によるペプチドを、１つ若しくは複数のアミノ酸の欠失若しくは置換によって、追加のアミノ酸若しくは官能基によるＮ及び／若しくはＣ末端における伸長によって修飾することができ、その修飾は、生物学的利用能、Ｔ細胞への標的を改善し、又はアジュバント若しくは（共）刺激機能をもたらす免疫調節物質を含む若しくは遊離することができる。Ｎ及び／又はＣ末端における任意の追加のアミノ酸は、ＨＢＶコアタンパク質、ＨＢＶポリメラーゼ、ＨＢＶ  Ｘタンパク質及び／又はＨＢＶ大表面タンパク質の天然のアミノ酸配列中の対応する位置に好ましくは存在しない。
【００５７】
Ｔ細胞エピトープを含む本発明によるペプチドは、当技術分野において周知の方法による化学合成及びその後の精製によって得ることができる。（例えばＡｔｈｅｒｔｏｎら、１９８９年；Ｂａｒａｎｙら、１９７９年；Ｆｉｅｌｄｓら、１９９７年を参照のこと）。本発明によるペプチドは、３５、２０、１０、５又は０％以下のＤＭＳＯを含む生理的に許容できる水溶液（例えばＰＢＳ）に好ましくは可溶性である。そのような溶液において、本発明によるペプチドは、１ｍｌ当たり少なくとも０．５、１、２、４又は８ｍｇペプチドの濃度で好ましくは可溶性である。本発明による２つ以上の異なるペプチドの混合物は、生理的に許容できる水溶液に１ｍｌ当たり少なくとも０．５、１、２、４又は８ｍｇペプチドの濃度で可溶性であることがより好ましい。
【００５８】
本発明によるペプチドは、容易に合成することができ、プロフェッショナル抗原提示細胞、特に樹状細胞（ＤＣ）によって取り込まれ、プロテアソーム及び／又はエンドソーム／リソソーム分解及び抗原プロセッシング系によってプロセッシングされるのに十分に大きく、ここで定義されたＣＴＬエピトープを少なくとも１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７３、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、好ましくは１７５個まで及び／又はＴｈ細胞エピトープを少なくとも１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５個好ましくは９６個まで含有するのに充分な長さを好ましくは有する。任意選択で、本発明によるペプチドは、Ｎ又はＣ末端伸長を含むことができ、その伸長は、例えば生物学的利用能、細胞取り込み、プロセッシング及び／又は溶解度を増大させ得るアミノ酸、修飾アミノ酸又は他の官能基であることができる。
【００５９】
本発明によるペプチドは、
配列番号５１の１５〜３０個のアミノ酸、好ましくは連続するアミノ酸の断片
配列番号５２の１５〜３５個のアミノ酸、好ましくは連続するアミノ酸の断片
配列番号５３の１５〜３３個のアミノ酸、好ましくは連続するアミノ酸の断片
配列番号５４の１５〜３３個のアミノ酸、好ましくは連続するアミノ酸の断片
配列番号５５の１５〜３９個のアミノ酸、好ましくは連続するアミノ酸の断片
配列番号５６の１５〜３５個のアミノ酸、好ましくは連続するアミノ酸の断片
配列番号５７の１５〜３４個のアミノ酸、好ましくは連続するアミノ酸の断片
配列番号５８の１５〜３２個のアミノ酸、好ましくは連続するアミノ酸の断片
配列番号５９の１５〜３３個のアミノ酸、好ましくは連続するアミノ酸の断片
配列番号６０の１５〜３８個のアミノ酸、好ましくは連続するアミノ酸の断片
配列番号６１の１５〜３８個のアミノ酸、好ましくは連続するアミノ酸の断片
配列番号６２の１５〜３３個のアミノ酸、好ましくは連続するアミノ酸の断片
配列番号６３の１５〜３４個のアミノ酸、好ましくは連続するアミノ酸の断片
配列番号６４の１５〜３６個のアミノ酸、好ましくは連続するアミノ酸の断片
配列番号６５の１５〜３４個のアミノ酸、好ましくは連続するアミノ酸の断片
配列番号６６の１５〜３４個のアミノ酸、好ましくは連続するアミノ酸の断片
配列番号６７の１５〜３４個のアミノ酸、好ましくは連続するアミノ酸の断片
配列番号６８の１５〜３９個のアミノ酸、好ましくは連続するアミノ酸の断片
配列番号６９の１５〜３５個のアミノ酸、好ましくは連続するアミノ酸の断片
配列番号７０の１５〜３２個のアミノ酸、好ましくは連続するアミノ酸の断片
配列番号７１の１５〜３８個のアミノ酸、好ましくは連続するアミノ酸の断片
配列番号７２の１５〜３６個のアミノ酸、好ましくは連続するアミノ酸の断片
配列番号７３の１５〜３６個のアミノ酸、好ましくは連続するアミノ酸の断片
配列番号７４の１５〜３５個のアミノ酸、好ましくは連続するアミノ酸の断片
配列番号７５の１５〜３４個のアミノ酸、好ましくは連続するアミノ酸の断片
配列番号７６の１５〜３３個のアミノ酸、好ましくは連続するアミノ酸の断片
配列番号７７の１５〜３５個のアミノ酸、好ましくは連続するアミノ酸の断片
配列番号７８の１５〜３５個のアミノ酸、好ましくは連続するアミノ酸の断片
配列番号７９の１５〜３４個のアミノ酸、好ましくは連続するアミノ酸の断片
配列番号１１４２の１５〜３４個のアミノ酸、好ましくは連続するアミノ酸の断片
配列番号１１４３の１５〜３４個のアミノ酸、好ましくは連続するアミノ酸の断片
配列番号１１４４の１５〜３４個のアミノ酸、好ましくは連続するアミノ酸の断片
配列番号１１４５の１５〜３６個のアミノ酸、好ましくは連続するアミノ酸の断片
配列番号１４６８の１５〜３２個のアミノ酸、好ましくは連続するアミノ酸の断片
配列番号１４６９の１５〜３１個のアミノ酸、好ましくは連続するアミノ酸の断片
配列番号１４７０の１５〜３０個のアミノ酸、好ましくは連続するアミノ酸の断片
配列番号１４７１の１５〜３１個のアミノ酸、好ましくは連続するアミノ酸の断片からなる群から選択されるアミノ酸配列を持つペプチドを含むペプチドであることが好ましく；好ましい連続するアミノ酸配列の長さは、好ましくは少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２若しくは３３個のアミノ酸及び／又は好ましくは４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５個のアミノ酸以下、最も好ましくは３０〜３９アミノ酸長である。
【００６０】
第２の態様において、本発明は、本発明によるペプチド、好ましくは上で定義されるペプチドをコードしているポリヌクレオチドを提供する。ポリヌクレオチドは、例えばＲＮＡ、ＤＮＡ及び／又はｃＤＮＡを含む任意のポリヌクレオチドであることができ；ポリヌクレオチドは、一本鎖又は二本鎖であることができ、ヌクレオチド類似体及び／又はヌクレオチド等価物、例えばペプチド核酸（ＰＮＡ）及びモルホリノヌクレオチド類似体を含むことができる。ポリヌクレオチドは、選んだ宿主に対してコドンを最適化されて、コードされている内容の発現を促進することができる。
【００６１】
本発明によるポリヌクレオチドは、野生型の完全長ＨＢＶコアタンパク質、ＨＢＶポリメラーゼ、ＨＢＶ  Ｘタンパク質及び／又はＨＢＶ大表面タンパク質をコードしないが、野生型ＨＢＶコアタンパク質、ＨＢＶポリメラーゼ、ＨＢＶ  Ｘタンパク質及び／又はＨＢＶ大表面タンパク質に連続しないアミノ酸配列それ自体又はそれらに隣接される本発明によるペプチドをむしろコードする。そのような隣接するアミノ酸は、野生型ＨＢＶ以外のタンパク質由来であることができ、並びに／又は隣接するペプチドに連続していない野生型ＨＢＶコアタンパク質、ＨＢＶポリメラーゼ、ＨＢＶ  Ｘタンパク質及び／若しくはＨＢＶ大表面タンパク質内の他の位置由来あることができる。ポリヌクレオチドは、数珠玉構造として配置された本発明によるペプチドを２つ以上コードすることが好ましく、それによって、本発明によるペプチド（ビーズ）は、直接一緒に連結される、並びに／又は野生型ＨＢＶコアタンパク質、ＨＢＶポリメラーゼ、ＨＢＶ  Ｘタンパク質及び／若しくはＨＢＶ大表面タンパク質以外のタンパク質に由来する、及び／若しくは野生型ＨＢＶコアタンパク質、ＨＢＶポリメラーゼ、ＨＢＶ  Ｘタンパク質及び／若しくはＨＢＶ大表面タンパク質内の隣接するペプチドに連続していない他の位置に由来するリンカー配列を介して連結される。ペプチドに隣接する又はそれを連結しているアミノ酸配列は、タンパク質分解切断部位を含むことができる。本発明によるポリヌクレオチドを適用して、様々な方法で本発明によるペプチドを送達することができる。本発明によるポリヌクレオチドは、組換えタンパク質又はペプチドを精製することができる適切な宿主細胞［例えば、細菌性宿主細胞、例えばＥ．コリ（Ｅ．  ｃｏｌｉ）、適切な酵母宿主細胞、例えばＳ．セレビシエ（Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、適切な糸状菌、例えばアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）又は哺乳動物宿主細胞］において、例えば、組換えタンパク質又はペプチドの産生に使用することができる。或いは、ポリヌクレオチドは、発現調節配列（プロモーターなど）に作動可能に連結することができ、ヒト細胞用の発現構築物に組み込むことができる。そのような（自己の）細胞を、ｅｘ  ｖｉｖｏでトランスフェクト又は形質導入して、そのポリペプチドを必要とする対象に（再）投与することができる。或いは、本発明によるそのような発現構築物は、適切な遺伝子治療ベクターに組み込むことができる。ウイルスベクター（欠損ウイルスに基づく）は、非ウイルス薬剤と比較して遺伝子導入に一層効果的な薬剤である。適切なウイルス発現構築物には、例えばアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス又は修飾牛痘アンカラ（ＭＶＡ）に基づくベクターがある。本発明によるポリヌクレオチドを、アジュバント、例えばＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）リガンド、ＮＯＤリガンド、又はＲＩＧ−Ｉリガンドをコードする配列に作動可能に連結することもできる。
【００６２】
第３の態様において、本発明は、本発明の第２の態様によるポリヌクレオチドを含む細胞を提供する。そのような細胞は、例えば本発明によるペプチドの産生又は医療用途、例えばここの他の場所で定義したＨＢＶ関連疾患の予防及び／又は治療に使用できる。上記細胞は、任意の宿主細胞であることができる。特定の適用、例えばここで上述されるものの場合、宿主細胞の選択は、そのような使用に従って行うことができる。宿主細胞は原核生物であることができ又は真核生物であることができる。好ましい原核生物細胞は、Ｅ．コリである。細胞が真核生物である場合、細胞は、好ましくは哺乳動物、昆虫、植物、真菌又は藻細胞である。好ましい哺乳動物細胞には、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＯＳ細胞、２９３細胞、ＰｅｒＣ６細胞、及び抗原提示細胞、例えば樹状細胞がある。好ましい昆虫細胞には、例えばＳｆ９及びＳｆ２１細胞並びにその誘導体がある。好ましい真菌細胞には、カンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、クルイヴェロマイシス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）及び糸状菌細胞がある。真核細胞はヒト抗原提示細胞、好ましくは樹状細胞であることが最も好ましい。
【００６３】
細胞にポリヌクレオチドを導入する方法は、当業者に公知である。ポリヌクレオチドの発現が望ましい場合、当業者は、それを実現する方法を知っており；ポリヌクレオチドを、例えば適当な制御配列、例えばプロモーター及び終了配列と伴に提供することができ、適当なベクター、例えばプラスミドに挿入することができ、又は本発明の第２の態様に記述される方法を使用することができる。
【００６４】
本発明は、本発明によるペプチド、好ましくは本発明の第１の態様によるペプチドと接触させた及び／又はそれを載せた抗原提示細胞、例えば以前にここで定義された樹状細胞も提供する。そのような好ましくは自己の樹状細胞は、それを必要とする対象の免疫療法治療に使用することができる。そのような樹状細胞を対象から単離し、本発明によるペプチドを少なくとも１つ載せ、治療に使用することができる。
【００６５】
第４の態様において、本発明は、ＨＢＶ特異的Ｔ細胞の調製方法であって、Ｔ細胞を本発明によるポリヌクレオチドを発現している抗原提示細胞と接触させるステップ及び／又はＴ細胞を本発明によるペプチドを載せた抗原提示細胞と接触させるステップと；任意選択で上記Ｔ細胞を培養するステップとを含む上記方法を提供する。Ｔ細胞は、好ましくはＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞又はＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞である。
【００６６】
細胞とポリヌクレオチドとの接触は、当業者に公知の任意の方法を使用して実行することができ、好ましくは本発明によるポリヌクレオチドは、トランスフェクションを使用して抗原提示細胞（ＡＰＣ）、好ましくは樹状細胞に導入される。接触させる前に、本発明によるポリヌクレオチドを、適当な制御配列と共に用意する、又は例えばここで他の場所に記述される適当なベクターに含めることができる。
【００６７】
Ｔ細胞と本発明によるペプチドとの接触は、当業者に公知の任意の方法により実行することができる。ペプチド又はペプチドに含まれるエピトープは、抗原提示細胞、好ましくは樹状細胞の表面にあるＨＬＡクラスＩ又はＨＬＡクラスＩＩ分子によってＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞又はＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞に提示されることが好ましい。当業者は、ペプチドを抗原提示細胞に載せる方法を知っている。
【００６８】
上記Ｔ細胞の培養は、当業者に公知の任意の方法を使用して実行することができる。細胞を生存させておく条件下でのＴ細胞の維持はまた、培養であるとここで解釈されるべきである。
【００６９】
本発明のこの態様によるＴ細胞を、本発明の第１の態様に定義した本発明によるペプチドと接触させることが好ましい。
【００７０】
第５の態様において、本発明は、本発明の第４の態様に記載される方法によって得られるＴ細胞を提供する。そのようなＴ細胞は、本発明の第４の態様による方法によって得られるＴ細胞であるであることが好ましい。Ｔ細胞は、好ましくはＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞又はＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞である。
【００７１】
本発明のこの態様によるＴ細胞を、本発明の第１の態様において定義した本発明によるペプチドと接触させることが好ましい。
【００７２】
第６の態様において、本発明は、本発明によるペプチド及び／若しくは本発明によるポリヌクレオチド及び／若しくは本発明による細胞、好ましくはＴ細胞、及び／若しくは本発明の第４の態様による方法によって得られた細胞、好ましくはＴ細胞、並びに薬学的に許容できる担体を含む、ＨＢＶ関連疾患若しくは関連症状の予防並びに／又は治療に有用な組成物を提供する。
【００７３】
本発明によるペプチドを含む場合、本発明による組成物は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２及び３３個までの本発明による異なるペプチドを含むことが好ましい。本発明による組成物は、本発明の第１の態様において定義した本発明によるペプチドを含むことが好ましい。好ましい実施形態において、本発明の組成物は、ペプチドの組み合わせを含み、ペプチドの上記組み合わせは、上で定義する治療しようとするヒト対象の集団において支配的なＨＬＡ対立遺伝子にコードされるＨＬＡクラスＩ分子の少なくとも７０％、８０％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％を網羅する。
【００７４】
本発明によるポリヌクレオチドを含む場合、本発明による組成物は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２及び３３個までの本発明による異なるポリヌクレオチドを含むことが好ましい。本発明による組成物は、本発明の第２の態様において定義した本発明によるポリヌクレオチドを含むことが好ましい。
【００７５】
本発明による細胞を含む場合、本発明による組成物は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２及び３３個までの、異なる細胞、好ましくは本発明によるペプチドと接触させたＴ細胞を含むことが好ましい。上記Ｔ細胞を、本発明の第１の態様において定義した本発明によるペプチドと接触させることが好ましい。Ｔ細胞は、好ましくはＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞又はＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞である。
【００７６】
好ましい実施形態において、本発明の組成物は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２並びに３３個までの、配列番号５１〜７９、１１４２〜１１４５及び１４６８〜１４７１からなる群から選択され、より好ましくは配列番号５１、５５、６０、６３、６４、６８、７１、７４、７５、７６、７７、１１４２及び１４６９からなる群から選択され、より好ましくは配列番号５１、５５、６０、６３、６４、６８、７１、７４、７５、７７、１１４２及び１４６９からなる群から選択され、更により好ましくは配列番号５５、６０、６３、６４、６８、７１、７４、７５、７６、７７及び１４６９からなる群から選択され、更により好ましくは配列番号５５、６０、６３、６４、６８、７１、７４、７５、７７及び１４６９からなる群から選択され、更により好ましくは配列番号６０、６３、７１、７４、７５及び１４６９からなる群から選択され、最も好ましくは配列番号７５、１４６９及び６３の群から選択されるペプチドからなる又は当該ペプチドを含むペプチドの異なるペプチドを含む。少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２及び３３個までの、配列番号５１、６０、６３、６４、６８、７１、７４〜７７からなる群から選択される、より好ましくは配列番号６３、７１及び７５からなる群から選択されるペプチドからなる又は当該ペプチドを含むペプチドの異なるペプチドを含む組成物が更に好ましい。
【００７７】
好ましい実施形態において、本発明の組成物は、配列番号６３のペプチドを含む又は当該ペプチドからなるペプチド及び配列番号１１４３のペプチドを含む若しくは当該ペプチドからなるペプチドを少なくとも含む。
【００７８】
配列番号６３のペプチドを含む又は当該ペプチドからなるペプチド及び配列番号７５のペプチドを含む又は当該ペプチドからなるペプチドを少なくとも含む組成物も好ましい。
【００７９】
配列番号１１４３のペプチドを含む又は当該ペプチドからなるペプチド及び配列番号７５のペプチドを含む又は当該ペプチドからなるペプチドを少なくとも含む組成物も好ましい。
【００８０】
配列番号７１のペプチドを含む又は当該ペプチドからなるペプチド及び配列番号７５のペプチドを含む又は当該ペプチドからなるペプチドを少なくとも含む組成物も好ましい。
【００８１】
配列番号７１のペプチドを含む又は当該ペプチドからなるペプチド及び配列番号６３のペプチドを含む又は当該ペプチドからなるペプチドを少なくとも含む組成物も好ましい。
【００８２】
配列番号１１４４のペプチドを含む又は当該ペプチドからなるペプチド及び配列番号６３のペプチドを含む又は当該ペプチドからなるペプチドを少なくとも含む組成物も好ましい。
【００８３】
配列番号１１４４のペプチドを含む又は当該ペプチドからなるペプチド及び配列番号７５のペプチドを含む又は当該ペプチドからなるペプチドを少なくとも含む組成物も好ましい。
【００８４】
配列番号１１４４のペプチドを含む又は当該ペプチドからなるペプチド及び配列番号１１４３のペプチドを含む又は当該ペプチドからなるペプチドを少なくとも含む組成物も好ましい。
【００８５】
配列番号６３のペプチドを含む又は当該ペプチドからなるペプチド、配列番号１１４３のペプチドを含む又は当該ペプチドからなるペプチド及び配列番号７５のペプチドを含む又は当該ペプチドからなるペプチドを少なくとも含む組成物も好ましい。
【００８６】
配列番号６３のペプチドを含む又は当該ペプチドからなるペプチド、配列番号１１４３のペプチドを含む又は当該ペプチドからなるペプチド、配列番号７５のペプチドを含む又は当該ペプチドからなるペプチド及び配列番号１１４４のペプチドを含む又は当該ペプチドからなるペプチドを少なくとも含む組成物も好ましい。
【００８７】
配列番号７５のペプチドを含む又は当該ペプチドからなるペプチド及び配列番号１４６９のペプチドを含む又は当該ペプチドからなるペプチドを少なくとも含む組成物も好ましい。配列番号６３のペプチドを含む又は当該ペプチドからなるペプチド及び配列番号１４６９のペプチドを含む又は当該ペプチドからなるペプチドを少なくとも含む組成物も好ましい。
【００８８】
配列番号７５のペプチドを含む又は当該ペプチドからなるペプチド、配列番号１４６９のペプチドを含む又は当該ペプチドからなるペプチド及び配列番号６３のペプチドを含む又は当該ペプチドからなるペプチドを少なくとも含む組成物も好ましい。上記組成物は、配列番号６０のペプチドを含む若しくは当該ペプチドからなる、及び／又は配列番号７１のペプチドを含む若しくは当該ペプチドからなる、及び／又は配列番号７４のペプチドを含む若しくは当該ペプチドからなるペプチドを更に含むことが好ましい。
【００８９】
本発明の好ましい組成物は、配列番号７５のペプチドからなる又は当該ペプチドを含むペプチド、配列番号６３のペプチドからなる又は当該ペプチドを含むペプチド及び配列番号１４６９のペプチドからなる又は当該ペプチドを含むペプチドを含む。
【００９０】
本発明の好ましい組成物は、配列番号７５のペプチドからなる又は当該ペプチドを含むペプチド、配列番号６３のペプチドからなる又は当該ペプチドを含むペプチド及び配列番号７１のペプチドからなる又は当該ペプチドを含むペプチドを含む。
【００９１】
薬学的に許容できる担体は、当業者に公知の任意の薬学的に許容できる担体、例えば生理的イオン強度及び／又はモル浸透圧濃度で緩衝された水溶液（例えばＰＢＳなど）であることができる。
【００９２】
本発明による組成物は、少なくとも１種のアジュバントを更に含むことが好ましい。そのようなアジュバントは、当業者に公知の任意のアジュバントであることができる。好ましいアジュバントは、ここで後に定義する。
【００９３】
本発明によるペプチド、ポリヌクレオチド、組成物、細胞及び／若しくはＴ細胞又は本発明による方法によって得られる若しくは得られたＴ細胞の好ましい使用は、医薬品としての使用である。本発明によるペプチド、ポリヌクレオチド、組成物、細胞及び／若しくはＴ細胞又は本発明による方法によって得られる若しくは得られたＴ細胞の特に好ましい使用は、ＨＢＶ関連疾患若しくは症状の治療及び／又は予防用としてである。したがって、本発明は、ＨＢＶ関連疾患の治療及び／又は予防のための医薬品を製造するための、本発明によるペプチド、ポリヌクレオチド、組成物、細胞及び／若しくはＴ細胞又は本発明による方法によって得られる若しくは得られたＴ細胞の使用を提供する。
【００９４】
本発明は、本発明によるペプチド、ポリヌクレオチド、組成物、細胞若しくはＴ細胞及び／又は本発明による方法によって得られる若しくは得られたＴ細胞の有効量を対象に投与するステップを含む、ＨＢＶ関連疾患若しくは症状の予防並びに／又は治療のための方法を更に提供する。
【００９５】
医薬品の製剤、投与の方法及び薬学的に許容できる賦形剤の使用は、当技術分野で公知であり、慣習的であり、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ；Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２１版  ２００５年、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａに記述されている。本発明による医薬組成物及び医薬品は、静脈又は皮下、又は筋肉内投与に適するように好ましくは製剤化されるが、他の投与経路、例えば粘膜投与又は例えば注射による真皮内及び／若しくは皮内投与を想定することもできる。真皮内投与が、ここで好ましい。真皮内投与に特に関連する利点及び／又は好ましい実施形態については、「真皮内投与」と題される別の部分において後ほど定義する。
【００９６】
本発明によるペプチド、ポリヌクレオチド、組成物及び／若しくは細胞並びに／又は本発明による方法によって得られる若しくは得られた細胞、加えて適当な医薬賦形剤、例えばアジュバント及び／若しくは担体の投与を、単回投与として実施できることが本発明により更に包含される。或いは、投与は、必要に応じて繰り返すことができ、並びに／又は本発明による異なるペプチド、ポリヌクレオチド、組成物及び／若しくは細胞並びに／又は本発明による方法によって得られる若しくは得られた細胞、加えて適当な医薬賦形剤、例えばアジュバント及び／若しくは担体を順次投与することができる。
【００９７】
本発明によるペプチド、ポリヌクレオチド、組成物及び／若しくは細胞並びに／又は本発明による方法により得られる若しくは得られた細胞（本発明による医薬品とも称される）は、少なくとも１種の免疫応答刺激化合物又はアジュバントを好ましくは含むことができる。本発明による医薬品は、１種又は複数の合成アジュバントを更に含むことが有利になり得る。１種又は複数の合成アジュバントは、本発明による医薬品と混ぜることができ、又は治療しようとする対象、哺乳動物若しくはヒトへ別々に投与することができる。Ｔｏｌｌ様受容体及び／若しくはＲＩＧ−Ｉ（レチノイン酸誘導性遺伝子−１）タンパク質並びに／又はエンドセリン受容体を介して作用することが公知のアジュバントが特に好ましい。自然免疫系を活性化することができる免疫修飾化合物は、ＴＬＲ１〜１０を含めたＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）によって特によく活性化され得る。ＴＬＲ受容体を活性化できる化合物並びにその修飾体及び誘導体は、当技術分野において文書で十分に裏付けられている。ＴＬＲ１は、細菌性リポタンパク質及びそのアセチル化形態により活性化され、加えてＴＬＲ２は、細菌又は宿主由来のグラム陽性細菌糖脂質、ＬＰＳ、ＬＰＡ、ＬＴＡ、フィムブリエ、外膜タンパク質、熱ショックタンパク質及びマイコバクテリアリポアラビノマンナンによって活性化され得る。ＴＬＲ３は、特にウイルス起源のｄｓＲＮＡにより、又は化合物ポリ（Ｉ：Ｃ）により活性化され得る。ＴＬＲ４は、宿主由来又は細菌起源のグラム陰性ＬＰＳ、ＬＴＡ、熱ショックタンパク質、ウイルス外被若しくはエンベロープタンパク質、タキソール若しくはその誘導体、オリゴ糖含有ヒアルロン酸及びフィブロネクチンにより活性化され得る。ＴＬＲ５は、細菌の鞭毛又はフラジェリンにより活性化され得る。ＴＬＲ６は、マイコバクテリウムリポタンパク質及びＢ群ストレプトコッカス熱不安性可溶性因子（ＧＢＳ−Ｆ）又はスタフィロコッカスのモジュリンにより活性化され得る。ＴＬＲ７は、イミダゾキノリン、例えばイミキモド、レジキモド及び誘導体イミキモド又はレジキモドにより活性化され得る。ＴＬＲ９は、非メチル化ＣｐＧ  ＤＮＡ又はクロマチン−ＩｇＧ複合体により活性化され得る。特にＴＬＲ３、ＴＬＲ７及びＴＬＲ９は、ウイルス感染に対する自然免疫応答の媒介において重要な役割を果たしており、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７及びＴＬＲ９を活性化することができる化合物は、治療の方法及び本発明による組成物又は医薬品の使用に特に好ましい。特に好ましいアジュバントは、それだけには限らないが、ＴＬＲ３及びＴＬＲ９受容体を起動させるｄｓＲＮＡ、ポリ（Ｉ：Ｃ）、非メチル化ＣｐＧ  ＤＮＡ、ＩＣ３１、ＴＬＲ９アゴニスト、ＩＭＳＡＶＡＣ、ＴＬＲ４アゴニスト、モンタニドＩＳＡ−５１、モンタニドＩＳＡ  ７２０（Ｓｅｐｐｉｃ  ７、フランスにより製造されるアジュバント）を含めた合成的に生成される化合物を含む。ＲＩＧ−Ｉタンパク質は、ＴＬＲ３と同様にｄｓＲＮＡにより活性化されることが公知である（Ｋａｔｏら、２００５年）。特に好ましいＴＬＲリガンドは、ｐａｍ３ｃｙｓ及び／若しくはその誘導体、好ましくはｐａｍ３ｃｙｓリポペプチド又はそのバリアント若しくは誘導体���好ましくは国際公開第２０１３０５１９３６号に記載のものである。更なる好ましいアジュバントは、環状ジヌクレオチド（ＣＤＮ）、ムラミールジペプチド（ＭＤＰ）及びポリ−ＩＣＬＣである。好ましい実施形態において、本発明のアジュバントは、天然に存在しないアジュバント、例えば国際公開第２０１３０５１９３６号に記載のｐａｍ３ｃｙｓリポペプチド誘導体、Ｐｏｌｙ−ＩＣＬＣ、イミダゾキノリン、例えばイミキモド、レジキモド又はその誘導体、非天然配列を有するＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ−ＯＤＮ）、及びペプチド性アジュバント、例えば非天然アミノ酸を含むムラミールジペプチド（ＭＤＰ）又は破傷風トキソイドペプチドである。
【００９８】
別の好ましい実施形態において、合成アジュバント化合物は、本発明のペプチドに物理的に連結される。ペプチドを含むＨＬＡクラスＩ及びＨＬＡクラスＩＩエピトープへのアジュバント並びに共刺激化合物又は官能基の物理的連結は、抗原を内部に取り込み、代謝し、提示する抗原提示細胞、特に樹状細胞への標的化を改善し、抗原提示細胞を同時に刺激して様々な共刺激分子の発現を上方制御し、その結果効果的なＴ細胞応答が細胞を誘導し増大させることによって免疫応答の増大をもたらす。別の好ましい免疫修飾化合物は、エンドセリン受容体、例えばＢＱ−７８８の阻害剤である（Ｂｕｃｋａｎｏｖｉｃｈ  ＲＪら、２００８年；Ｉｓｈｉｋａｗａ  Ｋ、１９９４年）。ＢＱ−７８８は、Ｎ−ｃｉｓ−２，６−ジメチルピペリジノカルボニル−Ｌ−γ−メチルロイシル−Ｄ−１−メトキシカルボニルトリプトファニル−Ｄ−ノルロイシンである。しかしながら、ＢＱ−７８８のどんな誘導体又は修飾ＢＱ−７８８化合物も、本発明の範囲に包含される。別の好ましい免疫応答刺激化合物又はアジュバントは、インターフェロンα（ＩＦＮα）、より好ましくはペグ化インターフェロンαであり、インターフェロンαは、本発明による医薬品に混ぜることができ、又は免疫調節薬剤として対象に別々に投与することができる。免疫応答刺激化合物が、本発明による医薬品に混ぜられる場合、免疫応答刺激化合物は、アジュバントと記載され；別々に投与される場合、免疫応答刺激化合物は、免疫調節薬剤又は免疫調節物質と記載され、それらの用語はここで互換的に使用されるものと解釈される。更にまた、国際公開第９９／６１０６５号及び国際公開第０３／０８４９９９号に述べられる通り、抗原提示細胞（共）刺激分子を本発明のペプチド及び組成物と併用して使用することが好ましい。特に４−１ＢＢ及び／若しくはＣＤ４０リガンド、アゴニスト抗体、ＯＸ４０リガンド、ＣＤ２７リガンド又はその機能的断片及び誘導体、並びに類似のアゴニスト活性を持つ合成化合物の使用は、治療しようとする対象へ本発明のペプチドと別々に又は同時に好ましくは投与されて、対象において最適な免疫応答の開始を更に刺激する。
【００９９】
加えて、好ましい実施形態は、徐放媒体、例えば鉱油（例えばモンタニドＩＳＡ５１）若しくはＰＬＧＡ中の追加の免疫刺激剤、例えばＴＬＲリガンド及び／若しくは抗ＣＤ４０／抗４−１ＢＢ／抗ＯＸ−４０若しくは抗ＣＤ２７抗体が有る又は無い本発明による医薬品の送達を含む。或いは、本発明による医薬品を、免疫刺激剤（アジュバント及び／若しくは免疫調節物質）の有り又は無しで真皮内に、例えば注射により送達することができる。真皮内送達の場合、本発明による医薬品は、医薬品及び１種又は複数の免疫学的に不活性な薬学的に許容できる担体、例えば生理的イオン強度及び／又はモル浸透圧濃度で緩衝された水溶液（例えばＰＢＳなど）からなる組成物で投与されることが好ましい。
【０１００】
好ましい実施形態において、ここで定義する本発明による医薬品は、真皮内投与又は適用に適するように製剤化される。真皮内投与は当業者に公知である。本発明の文脈において、真皮内は、真皮内と同義であり、皮下とは異なる。物質の最も表層の適用は、経皮的（表皮上）であり、次いで真皮内適用（表皮内又は内へ）、次いで皮下適用（皮膚直下の組織中）、次いで筋肉内適用（筋肉本体中へ）である。真皮内適用は、注射により通常投与される。物質の真皮内注射を行って、その物質に対して起こり得る応答、アレルギー及び／又は細胞性免疫を試験することができるが、特異的抗体又はＴ細胞免疫応答を引き起こすこともできる。皮下適用はまた、注射によって通常投与され：注射針は、皮下組織に注射される。
【０１０１】
真皮内投与の長所は、製剤手順を単純化し、より強力にできることである。更に、従来通りの投与方法、例えば筋肉内及び皮下投与と比較した場合、真皮内ワクチン送達は、ワクチン誘導抗体又はＴ細胞応答を引き起こすための用量を有意に節約できることが繰り返し示された。この効果は、表皮に存在する免疫細胞の比較的密集したネットワークに起因している。この効果は、Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｂｕｒｇら（２００７年）により発表されたヒト研究において、ＨＰＶ１６合成長鎖ペプチドでも示された。本研究において、ＨＰＶ１６合成長鎖ペプチドのプールの真皮内注射は安全であり、ＨＰＶ１６特異的Ｔ細胞を表皮へ移動させ、血中を循環するＨＰＶ１６特異的Ｔ細胞の数を増加させることが示された。
【０１０２】
一実施形態において、本発明による医薬品は、どんなアジュバント、例えばモンタニドＩＳＡ−５１、特にモンタニドＩＳＡ−５１も含まない。これは、医薬品の製剤がより単純であることを意味し：油−水を主成分とする乳剤も、本発明による医薬品に好ましくは存在しない。したがって、本発明による医薬品は、アジュバント、例えばモンタニドＩＳＡ−５１、特にモンタニドＩＳＡ−５１を好ましくは含まず及び／又は水中油型を主成分とする乳剤を含まず；より好ましくは本発明による医薬品は、これらのいずれもアジュバントに含まず、更により好ましくはアジュバントを全く含まない。したがって、一実施形態において、本発明による医薬品は、以前にここで定義された医薬品を１種若しくは複数含む又は当該医薬品の１種若しくは複数からなる好ましくは生理的イオン強度及び／又は浸透圧の、好ましくは緩衝された水溶液、例えばＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）又は注射用蒸留水（ＷＦＩ）などである。当業者は、そのような溶液を調製する方法を知っている。
【０１０３】
本発明による医薬品は、別の長所を有し、その長所とは、少量の医薬品、好ましくは以前にここで定義されたペプチドを真皮内に投与することにより免疫原性の効果が更に達成され得ることである。使用される各ペプチドの量は、好ましくは１〜１０００μｇ、より好ましくは５〜５００μｇ、更により好ましくは１０〜１００μｇである。
【０１０４】
一実施形態において、本発明による医薬品は、以前にここで定義されたペプチド及び少なくとも１種のアジュバントを含み、上記アジュバントは、水中油型を主成分とする乳剤中に製剤化されず及び／又は以前にここで定義された水中油型エマルジョン型のものではない。本発明によるこの種の医薬品は、単回投与として投与することができる。或いは、以前にここで定義されたペプチド及び／又はアジュバントの投与は、必要に応じて繰り返すことができ並びに／又は異なるペプチド及び／若しくは異なるアジュバントを順次投与することができる。本発明によるペプチドを真皮内に投与する一方で、ここで定義されたアジュバントを順次投与することが本発明により更に包含される。アジュバントは、真皮内に投与され得る。しかしながら、他の任意の投与方法を、アジュバントに使用することができる。一般に及び疾患に応じて、ワクチンの注射は、疾患流入領域リンパ節の局所的活性化をもたらし、免疫系のより強い局所的活性化をもたらす疾患の部位又は可能な限り近くで実現されるので、ペプチドの真皮内投与は魅力的であり得る。真皮内投与に好ましい免疫応答刺激化合物（免疫調節物質）又はアジュバントはインターフェロンα（ＩＦＮα）、より好ましくはペグ化インターフェロンαであり、そのインターフェロンは本発明による医薬品に混ぜられてもよく、又は例えば皮下注射により対象に別々に投与されてもよい。別々に投与する場合、インターフェロンαも、皮下に好ましくは投与され、本発明による医薬品が投与される部位の近傍１０ｃｍ以内に１μｇ／ｋｇ体重の用量で好ましくは投与され、これについてはＺｅｅｓｔｒａｔｅｎら、２０１３年に記述されている。
【０１０５】
本発明による医薬品の別の典型的な長所は、比較的少量のペプチドを、単回注射で、単純な製剤で、モンタニドＩＳＡ−５１のような望ましくない副作用をもたらすことが公知のどんなアジュバントも含まずに使用できるということである。
【０１０６】
真皮内投与用の医薬品は、ここで定義された本発明による任意の医薬品であることができる。皮下投与に使用される本発明による医薬品は、真皮内投与に使用されるものと同じであることができ、したがってここで定義された本発明による任意の医薬品であることができる。当業者は、皮下投与に適している医薬品を製剤化する方法を知っている。
【０１０７】
皮下投与用の本発明による医薬品は、すでにここで定義されたペプチドをアジュバントと一緒に含むことが好ましい。好ましいアジュバント又は免疫変調成分については、既にここで言及した。他の好ましいアジュバントは、水中油型乳剤、例えば不完全フロイントアジュバント又はＩＦＡ、モンタニドＩＳＡ−５１若しくはモンタニドＩＳＡ  ７２０（Ｓｅｐｐｉｃ  Ｆｒａｎｃｅ）の型のものである。更に好ましい実施形態において、皮下投与に適する本発明による医薬品は、本発明による１種若しくは複数のペプチド、アジュバント又は以前にここで定義された免疫変調成分並びに以前にここで全て定義した不活性な薬学的に許容できる担体及び／若しくは賦形剤を含む。医薬品の製剤及び薬学的に許容できる賦形剤の使用は、当業者に公知であり、慣習的であり、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ；Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２１版  ２００５年、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａに例えば記述されている。皮下投与に好ましい免疫応答刺激化合物又はアジュバントは、インターフェロンα（ＩＦＮα）、より好ましくはペグ化インターフェロンαであり、インターフェロンαは、本発明による医薬品に混ぜることができ、又は対象に別々に投与することができる。別々に投与する場合、インターフェロンαも、皮下にも好ましくは投与され、本発明による医薬品が投与される部位の近傍１０ｃｍ以内に１μｇ／ｋｇ体重の用量で好ましくは投与され、これについてはＺｅｅｓｔｒａｔｅｎら、２０１３年に記述されている。
【０１０８】
一実施形態において、真皮内投与に適する本発明による医薬品は、皮下投与に適する本発明による医薬品と同時に投与することができる。或いは、両方の医薬品は順次真皮内に及び順次皮下に又はその逆（最初に皮下投与続いて真皮内投与）に投与することができる。本実施形態において、真皮内投与に専念した以前に記述した実施形態のように、本発明による医薬品、好ましくは本発明によるペプチド及び／若しくはアジュバントの真皮内及び／若しくは皮下投与は、必要に応じて繰り返すことができ、並びに／又は固有の医薬品、好ましくはペプチド及び／若しくは固有のアジュバントの真皮内及び／若しくは皮下投与は、順次真皮内及び／若しくは皮下に投与することができる。本発明による医薬品、好ましくはペプチドを真皮内及び／又は皮下に投与する一方で、免疫変調成分としてここで定義されたアジュバントを順次投与することが本発明により更に包含される。アジュバント又は免疫変調成分は、真皮内及び／又は皮下に投与することができる。しかしながら、他の任意の投与方法を、アジュバント又は免疫変調成分に使用することができる。
【０１０９】
本発明による医薬品の真皮内及び皮下投与の組み合わせが有利であると期待される。表皮中のＤＣは、真皮及び皮下組織中のＤＣと明らかに異なる。皮内（真皮内）免疫化は、抗原プロセッシング及び樹状ネットワークを介してケラチノサイトと密接に関わる表皮ＤＣ（ランゲリン陽性ランゲルハンス細胞）の活性化を引き起こすことになる。この活性化はまた、ランゲルハンス細胞とケラチノサイトとの相互作用における炎症経路を最適に活性化し、その後抗原を載せ、活性化されたランゲルハンス細胞は表皮−流入領域リンパ節へ輸送されることになる。皮下投与は、他のＤＣサブセットを活性化することになり、他のＤＣサブセットも抗原を載せ、表皮−流入領域リンパ節へそれぞれ独立に移動することになる。おそらく、真皮内と皮下の両方で投与することができる医薬品の使用は、異なるＤＣサブセットによりこれらの流入リンパ節においてＴ細胞の相乗的な刺激をもたらし得る。
【０１１０】
本発明による医薬品並びに本発明による医薬品を使用するここで記述した治療方法は、他の医薬品及び治療方法と組み合わせると有利になり得る。したがって、本発明による医薬品若しくは本発明による治療方法は、例えばＨＢＶ関連疾患に対する療法及び／若しくは抗体療法と組み合わせることができ、若しくは例えばＨＢＶ関連疾患以外に対する免疫療法並びに／若しくは抗体療法と組み合わせることができ、又はＨＢＶ以外の抗原に対する免疫療法と組み合わせてＨＢＶ関連疾患を治療することができる。
【０１１１】
本文書及びその請求において、動詞「含む（ｔｏ  ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及びその活用型は、単語の後ろの項目が含まれるが、特に言及していない項目が除外されるものではないことを意味する非限定的な意味で使用される。加えて、文脈が、唯一の要素であることを明らかに定めない限り、不定冠詞「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」による要素への言及は複数の要素が存在する可能性を除外しない。したがって、不定冠詞「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」は、「少なくとも１つ」を通常意味する。単語「約」又は「およそ」は、数値との関連で使用される場合（例えば約１０）、値が所与の値（１０の）上下０．１％の値であり得ることを好ましくは意味する。
【０１１２】
ここで提供される配列情報は、誤って同定された塩基の包含を必要とするほど狭く解釈されるべきでない。当業者は、これらの誤って同定された塩基を同定することができ、これらの誤りを修正する方法を知っている。配列の誤り場合、ポリペプチドをコードするそれぞれの核酸配列を含有する配列番号５、２及び１４６７に存在する遺伝子の発現により入手できるＨＢＶコア、ＨＢＶポリメラーゼ及びＨＢＶ大表面タンパク質ポリペプチドの配列は、優先するべきである。
【０１１３】
本明細書に引用した特許及び文献参照の全ては、その全体を参照により本明細書に組み込む。
【０１１４】
特に明記しない限り、本発明の実行は、分子生物学、ウイルス学、細菌学又は生化学の標準的な従来方法を利用することになる。これらの技術については、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９年）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌｌ（２００１年）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ；Ａｕｓｕｂｅｌら（１９９４年）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、ＵＳＡの第１巻及び第２巻；並びにＢｒｏｗｎ（１９９８年）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ＬａｂＦａｘ、第２版、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（ＵＫ）の第Ｉ巻及び第ＩＩ巻；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｎ．Ｇａｉｔ編）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｈａｍｅｓ及びＨｉｇｇｉｎｓ、編）に記述されている。
【図面の簡単な説明】
【０１１５】
【図１ａ】ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで予測し、実験的なｉｎ  ｖｉｔｒｏ消化で観察した長鎖ワクチンペプチドのプロテアソーム媒介切断パターンを示す図である。各ＳＬＰについて、観察された切断部位を矢印により示す（ここで更に詳述する通り、主要な及び少ない切断部位をそれぞれ太い及び細い矢印により示す）。更に、消化実験において試験した１０個のＳＬＰのそれぞれについて（図１ＡのＳＬＰ１、ＳＬＰ１０及びＳＬＰ２１；図１ＢのＳＬＰ１４、ＳＬＰ１８及びＳＬＰ２１；図１ＣのＳＬＰ２４、ＳＬＰ２５及びＳＬＰ２６；並びに図１ＤのＳＬＰ２７）予測されたＣスコアを、１行目に示し、確認済みの予測された切断部位を、２行目に示し（「＋」で示す）、供給源タンパク質内のアミノ酸位置を３行目に示し、配列中のそれぞれのアミノ酸を４行目に示し、ＳＬＰ内のアミノ酸数を５行目に示す。ＳＬＰ２７場合、Ｃ＊はＡｂｕによるシステイン置き換えを示す。
【図１ｂ】ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで予測し、実験的なｉｎ  ｖｉｔｒｏ消化で観察した長鎖ワクチンペプチドのプロテアソーム媒介切断パターンを示す図である。各ＳＬＰについて、観察された切断部位を矢印により示す（ここで更に詳述する通り、主要な及び少ない切断部位をそれぞれ太い及び細い矢印により示す）。更に、消化実験において試験した１０個のＳＬＰのそれぞれについて（図１ＡのＳＬＰ１、ＳＬＰ１０及びＳＬＰ２１；図１ＢのＳＬＰ１４、ＳＬＰ１８及びＳＬＰ２１；図１ＣのＳＬＰ２４、ＳＬＰ２５及びＳＬＰ２６；並びに図１ＤのＳＬＰ２７）予測されたＣスコアを、１行目に示し、確認済みの予測された切断部位を、２行目に示し（「＋」で示す）、供給源タンパク質内のアミノ酸位置を３行目に示し、配列中のそれぞれのアミノ酸を４行目に示し、ＳＬＰ内のアミノ酸数を５行目に示す。ＳＬＰ２７場合、Ｃ＊はＡｂｕによるシステイン置き換えを示す。
【図１ｃ】ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで予測し、実験的なｉｎ  ｖｉｔｒｏ消化で観察した長鎖ワクチンペプチドのプロテアソーム媒介切断パターンを示す図である。各ＳＬＰについて、観察された切断部位を矢印により示す（ここで更に詳述する通り、主要な及び少ない切断部位をそれぞれ太い及び細い矢印により示す）。更に、消化実験において試験した１０個のＳＬＰのそれぞれについて（図１ＡのＳＬＰ１、ＳＬＰ１０及びＳＬＰ２１；図１ＢのＳＬＰ１４、ＳＬＰ１８及びＳＬＰ２１；図１ＣのＳＬＰ２４、ＳＬＰ２５及びＳＬＰ２６；並びに図１ＤのＳＬＰ２７）予測されたＣスコアを、１行目に示し、確認済みの予測された切断部位を、２行目に示し（「＋」で示す）、供給源タンパク質内のアミノ酸位置を３行目に示し、配列中のそれぞれのアミノ酸を４行目に示し、ＳＬＰ内のアミノ酸数を５行目に示す。ＳＬＰ２７場合、Ｃ＊はＡｂｕによるシステイン置き換えを示す。
【図１ｄ】ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで予測し、実験的なｉｎ  ｖｉｔｒｏ消化で観察した長鎖ワクチンペプチドのプロテアソーム媒介切断パターンを示す図である。各ＳＬＰについて、観察された切断部位を矢印により示す（ここで更に詳述する通り、主要な及び少ない切断部位をそれぞれ太い及び細い矢印により示す）。更に、消化実験において試験した１０個のＳＬＰのそれぞれについて（図１ＡのＳＬＰ１、ＳＬＰ１０及びＳＬＰ２１；図１ＢのＳＬＰ１４、ＳＬＰ１８及びＳＬＰ２１；図１ＣのＳＬＰ２４、ＳＬＰ２５及びＳＬＰ２６；並びに図１ＤのＳＬＰ２７）予測されたＣスコアを、１行目に示し、確認済みの予測された切断部位を、２行目に示し（「＋」で示す）、供給源タンパク質内のアミノ酸位置を３行目に示し、配列中のそれぞれのアミノ酸を４行目に示し、ＳＬＰ内のアミノ酸数を５行目に示す。ＳＬＰ２７場合、Ｃ＊はＡｂｕによるシステイン置き換えを示す。
【図２】ＨＢＶ由来長鎖ペプチドによるＴ細胞誘導後に応答しているナイーブドナーの概要。ＥＬＩＳＡ（「ＥＬＩＳＡ」）により測定したＩＦＮγ産生の統合データ；斜線囲みＳＩ（刺激指数）＞１．５、及び３Ｈチミジン取り込みにより測定したＴ細胞増殖（「Ｐｒｏｌｉｆ」）；斜線囲みＳＩ＞１．５。Ｎ．ｔ．無試験
【図３】ＨＢＶ由来長鎖ペプチドによる刺激後に応答しているＨＢＶ免疫ドナーの概要。データはＩＦＮγ−ＥＬＩＳｐｏｔ結果を表し、斜線囲みはＳＩ（刺激指数）＞３の陽性応答を示す、白い囲みＳＩ＜３。
【図４】ＩＦＮγＥＬＩＳｐｏｔアッセイにおいて測定し、対応するペプチドの予測されたＴＲＩＡスコアについて描画した各ペプチドの平均刺激指数（ＳＩ）。Ａｂｕ−ＳＬＰ２７を示す（φ）。
【０１１６】
本発明を、以下の実施例において更に説明する。これらの実施例は、本発明の範囲を制限するものではなく、単に本発明を明確にするのに役立つ。
【実施例】
【０１１７】
イントロダクション
本発明において、慢性的なＨＢＶ感染患者を治療するための合成長鎖ペプチドからなる最適なＴ細胞誘導ワクチン組成物を開発した。最も高い推定のＴ細胞免疫誘導能力を持つＨＢＶポリメラーゼ、コアタンパク質、表面抗原及びＸタンパク質の領域を包含する３７個の長鎖ペプチド（表３；３０〜３９アミノ酸の配列）の選択を行った。この目的のために、ＨＬＡクラスＩ及びＩＩペプチド結合並びにＨＢＶタンパク質に含有される全てのＨＬＡクラスＩ結合短鎖ペプチド（ＣＴＬエピトープの長さ；８〜１２ａａ）のプロテアソームによるＣ末端生成を予測するアルゴリズムを使用して、第１の推定のＨＬＡクラスＩ拘束性細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）エピトープ及び推定のＨＬＡクラスＩＩ拘束性ヘルパーＴエピトープをこれらのタンパク質において同定した。数値を、免疫原性品質を反映している推定のＣＴＬエピトープ及びヘルパーＴエピトープ全てに指定した。プロテアソームによる供給源タンパク質からのそのＣ末端遊離の可能性と関連するエピトープのＨＬＡクラスＩ結合能力との組み合わせを組み込んだいわゆるクラスＩ−ＢＣＩスコア（クラスＩ−結合−切断−免疫原性スコア）を使用して、任意のＣＴＬエピトープの品質を評価した。推定のヘルパーＴエピトープを、推定のヘルパーＴエピトープの結合能力を反映するいわゆるクラスＩＩ−Ｂスコア（クラスＩＩ−結合スコア）を使用して評価し、したがって免疫原性品質を予測した。全てのＣＴＬエピトープ及びヘルパーＴエピトープの累積量及び質を反映する統合累積値、すなわち累積クラスＩ−ＢＣＩスコアと累積クラスＩＩ−Ｂスコアの合計を、可能性のある全ての長鎖ペプチドについて算出し、Ｔ細胞局所的免疫原性評価（ＴＲＩＡ）スコアで表す。したがって、ＴＲＩＡスコアにより、ＨＢＶタンパク質中の可能性のあるあらゆる長鎖ペプチド（長さ３０〜３９ａａ）の全体のＴ細胞免疫原性の評価が可能になった。最も高いＴＲＩＡスコアを持つ３７個のＨＢＶ由来長鎖ペプチドを、選択した。次に、ナイーブドナー及び過去にＨＢＶ感染が除去されたドナーが、３７個の長鎖ペプチドの広い組から選択した、様々なＴＲＩＡスコアを持つ１３個の長鎖ペプチドの１つ又は複数のサブセットに応答できるかどうか評価した。
【０１１８】
ＰＢＭＣを、１２名の健康なドナー、１２名のうち６名はＨＢＶナイーブであり、他の６名は過去にＨＢＶ感染を除去している、の白血球層から得た。長期Ｔ細胞誘導アッセイを使用して、ナイーブドナーにおいて１３個のペプチドのうち１２個に対する応答が判明した（１２個のうち１１個は、複数のドナーにおいて応答を誘導した）ことにより、以前に抗原を受けていない大多数の者においてＴ細胞応答を誘導する１３個のＳＬＰの能力が確認された。ＴＲＩＡスコアで表される、ＨＢＶ免疫ドナーのＰＢＭＣに見られるこれらの１３個の長鎖ワクチンペプチドに対するＴ細胞応答の強さが、Ｔ細胞免疫原性全体の予測された強さと相関したことにより、免疫原性のペプチドを選択するためのＴＲＩＡスコアの予測値が検証された。したがって、ＴＲＩＡスコアは、最適な免疫原性長鎖ペプチドの選択に関して信頼性の高い基準であり、最も高いＴＲＩＡスコアを持つ長鎖ペプチドをＨＢＶ  ＳＬＰに基づくワクチンに選択することを活発にする。
【０１１９】
材料及び方法
ペプチド合成
ペプチドを、ＰＴＩ  Ｐｒｅｌｕｄｅペプチド合成装置のよって固相Ｆｍｏｃ／ｔＢｕ化学を使用して合成し、Ｇｉｌｓｏｎ分取ＨＰＬＣシステムによって純度＞９５％に精製した。ペプチドの同一性及び純度を、Ｗａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ／ＴＱＤシステムによってＵＰＬＣ−ＭＳで確認した。
【０１２０】
インターネットを利用したアルゴリズムによる選択したＨＢＶ由来ＳＬＰにおけるＣＴＬ及びヘルパーＴ細胞免疫誘導容量の予測
ＳＬＰ当たりの推定のＣＴＬ免疫誘導容量を、ＳＬＰ当たりの累積クラスＩ−ＢＣＩスコアを算出することにより予測した。下で詳述する通り、累積ＢＣＩスコアは、ＨＬＡクラスＩペプチド結合の尺度であるクラスＩ−Ｂスコア及びプロテアソームエピトープ遊離の尺度であるＣスコアに基づく。
【０１２１】
ＳＬＰ当たりの推定のヘルパーＴ細胞免疫誘導容量を、ＳＬＰ当たりの累積クラスＩＩＢスコアを算出することにより予測した。下で詳述する通り、累積クラスＩＩ−Ｂスコアは、ＨＬＡクラスＩＩペプチド結合の尺度であるクラスＩＩ−Ｂスコアに基づく。
【０１２２】
ＳＬＰ当たりの全体の推定の免疫誘導容量を、累積クラスＩ−ＢＣＩスコアと累積クラスＩＩ−Ｂスコアの和によって予測し、和の値をＴＲＩＡスコアとここで命名する。
【０１２３】
クラスＩ−Ｂスコア
ＨＢＶポリメラーゼ由来ペプチド、ＨＢＶコアタンパク質由来ペプチド、ＨＢＶ表面抗原由来ペプチド及びＨＢＶ  Ｘタンパク質由来ペプチドの５０個のＨＬＡクラスＩ分子（テキストを参照のこと）に結合するペプチドを、独自のアルゴリズムを使用してｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで評価した。各ＨＬＡクラスＩ分子に対して予測した結合ペプチドの上位１．５パーセンタイルを選択した。「クラスＩ−結合スコア（クラスＩＢスコア）」は、ペプチドの予測した結合親和性の順位から得られる。簡潔には、最も良く結合すると予測されたペプチドがスコア１００になるように、順位を最初に逆転させ、その後１００に対して正規化した。例：５つのペプチドを選択した（１．５パーセンタイル内の５つ）。ペプチドに、「逆順位スコア」５〜１（最良の結合ペプチドに対して５）を最初に割り当てた。その後、最良の結合が１００を記録するように、各逆順位スコアを、上位１．５パーセンタイル内のペプチドの数に対して正規化する。その目的で、各ペプチドに対する順位スコアを１００／５（＝２０）で乗算する。次いで最良の結合が、クラスＩ−Ｂスコアを求める：５ｘ２０＝１００、２番目に良い結合は、４×２０＝８０のクラスＩ−Ｂスコアを有するなどである。一般に、順位スコアは、１００／ｎ（ｎ＝１．５パーセンタイル内のペプチドの数）で乗算される。結果として、選択される１．５パーセンタイル内のペプチドの正確な数に関係なく、予測された最良の結合（特定のＨＬＡクラスＩ分子に対する）は、常に１００を記録する。
【０１２４】
Ｃスコア
ＨＢＶポリメラーゼ、ＨＢＶコアタンパク質、ＨＢＶ表面抗原及びＨＢＶ  Ｘタンパク質（各ＨＬＡクラスＩ分子ための）の予測された高親和性結合ペプチドの上位１．５パーセンタイルの、プロテアソームによるＣ末端生成を、２つの独自のアルゴリズムを使用して評価した。これらのアルゴリズムは、ＨＢＶポリメラーゼ、ＨＢＶコアタンパク質、ＨＢＶ表面抗原及びＨＢＶ  Ｘタンパク質それぞれにおいて特定のアミノ酸位置の後ろにおけるプロテアソーム切断の尤度を予測し、０から１までの間を記録することができ、より高い値は、アミノ酸の後における切断のより高い尤度を表す。値０．５は、任意の閾値として使用され：＞０．５は切断が起こる可能性が高く、＜０．５は切断が起こる可能性が低い。したがって、１に近い値は、特定の残基の後における切断の高い尤度を示す。異なる両方のアルゴリズムによる予測の間に大きな相違が生じるので、両方の独自のアルゴリズムの予測結果を考慮する切断スコア（Ｃスコア）を開発した。Ｃスコアは、両方の方法による別々のスコアの和である。したがって、ＨＢＶポリメラーゼにおいて各位置に対するＣスコアは、最大２（近く）であり、最小０（近く）であり、２近くは、残基の後における切断が、プロテアソームによって生じることになる両方の方法による非常に高い尤度を反映し、１に近いＣスコアは、（両方のネットワーク方法により平均に対して予測される通り）プロテアソームによる切断について中程度の傾向と考えられる。
【０１２５】
クラスＩ−ＢＣＩスコア
ペプチドが、ＨＬＡクラスＩ分子に高親和性で結合することになり、Ｃ末端で精製されることになる尤度の指標となる尺度であるクラスＩ−ＢスコアとＣスコアの両方を１つの定量的尺度に組み込むために、クラスＩ−結合−切断−免疫原性（クラスＩ−ＢＣＩ）スコアを、開発した。クラスＩ−ＢＣＩスコアは、Ｃスコアで乗算したクラスＩ−Ｂスコアである。したがって、クラスＩ−ＢＣＩは、最大値２００（１００ｘ２）（任意単位）を得ることができる。
【０１２６】
累積クラスＩ−ＢＣＩスコア
本発明による各長鎖ペプチドに対する累積クラスＩ−ＢＣＩスコアを（２のうちの１つの）選択基準として使用して、本発明のペプチドを同定する。累積クラスＩ−ＢＣＩスコアは、本発明による長鎖ペプチドに含有されるＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞エピトープの総数と結合能力及びプロテアソームによる細胞内生成の尤度に関して予測されるその質と両方の定量的反映であり、したがって本発明による各ペプチドのＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞誘導力（ＣＤ８＋Ｔ細胞免疫原性）の指標となる。本発明によるペプチドの比較的高い累積クラスＩ−ＢＣＩスコアは、高いＣＤ８＋Ｔ細胞免疫原性を示す。
【０１２７】
クラスＩＩ−Ｂスコア
ＨＢＶポリメラーゼ由来ペプチド、ＨＢＶコアタンパク質由来ペプチド、ＨＢＶ表面抗原由来ペプチド及びＨＢＶ  Ｘタンパク質由来ペプチドの１３個の一般的なＨＬＡクラスＩＩ分子に結合するペプチドを、独自のアルゴリズムを使用してｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで評価した。「クラスＩＩ−結合スコア（クラスＩＩＢスコア）」は、ペプチドの予測された結合親和性の順位から得られる。簡潔には、最も良く結合すると予測されたペプチドがスコア１００になるように、順位を最初に逆転させ、その後１００に対して正規化した。リスト内のペプチドの数を減らすために、より低い予測された結合（より低いクラスＩＩ−Ｂスコア）で特定のＨＬＡクラスＩＩ分子に結合することが予測されたペプチドの長さバリアントの全てを、リストにおいて破棄する。
【０１２８】
累積クラスＩＩ−Ｂスコア
本発明による各長鎖ペプチドに対する累積クラスＩＩ−Ｂスコアを第２の選択基準として使用して、本発明のペプチドを同定する。累積クラスＩＩ−Ｂスコアは、本発明による長鎖ペプチドに含有されるＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞エピトープの総数と結合能力に関して予測されるその質と両方の定量的反映であり、したがって本発明による各ペプチドのＣＤ４＋Ｔ細胞誘導力（ＣＤ４＋Ｔ細胞免疫原性）指標となる。本発明によるペプチドの比較的高い累積クラスＩＩ−Ｂスコアは、高いＣＤ４＋Ｔ細胞免疫原性を示す。
【０１２９】
Ｔ細胞局所的免疫原性評価（ＴＲＩＡ）スコア
本発明の特定のペプチド（ＳＬＰ）のＴＲＩＡスコアは、本発明の特定の長鎖ペプチド（ＳＬＰ）の累積クラスＩ−ＢＣＩスコア及び累積クラスＩＩ−Ｂスコアの合計である。
【０１３０】
プロテアソーム消化
ジチオトレイトール（ＤＴＴ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を、ＵＰＬＣ品質水に新たに溶解し、終濃度２ｍＭ  ＤＴＴになるように２×濃縮プロテアソーム消化緩衝液（６０ｍＭ  Ｔｒｉｚｍａベース；ｐＨ７．５；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、２０ｍＭ  ＫＣｌ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、１０ｍＭ  ＮａＣｌ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）に添加した。次いで、ＵＰＬＣ−品質水１３０μＬを２ｍＭ  ＤＴＴを含有する２×濃縮プロテアソーム消化緩衝液１５０μＬ、及び試験しようとするペプチド（貯蔵濃度３００ｎｍｏｌ／ｍＬ）１０μＬと一緒に３つの反応バイアルに添加した。バイアルをボルテックスした後、バイアル１に水１０μＬ（対照消化モック）、バイアル２に構成的２０Ｓプロテアソーム１μｇ（１０μＬ）（貯蔵０．１ｍｇ／ｍＬ；Ｅｎｚｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、及びバイアル３に免疫２０Ｓプロテアソーム１μｇ（１０μＬ）（貯蔵０．１ｍｇ／ｍＬ；Ｅｎｚｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を添加した。ボルテックス直後にＴ＝０のサンプル５０μＬを採取し、ギ酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）４μＬを添加して反応を止めた。反応バイアルをボルテックスし、３７℃でインキュベートした。サンプル５０μＬを、インキュベーション１時間、３時間、６時間及び２４時間後に採集した。反応をギ酸４μＬで止め、全てのサンプルを２０℃で保管した。
【０１３１】
消化断片の質量分析
エレクトロスプレーイオン化質量分析にオンラインナノエレクトロスプレーインタフェースを備えたＱ−ＴＯＦ１質量分析計（Ｗａｔｅｒｓ）をおよその流速２５０ｎＬ／分で使用した。ペプチド消化サンプルを、プレカラム（ＭＣＡ−３００−０５−Ｃ１８；Ｄｉｏｎｅｘ）に捕捉し、７０〜９０％緩衝液Ｂの急勾配で１０分間にわたって溶出した［緩衝液Ａ、水、アセトニトリル及びギ酸、９５：３：１（体積／体積／体積）；緩衝液Ｂ、水、アセトニトリル及びギ酸１０：９０：１（体積／体積／体積）］。質量スペクトルを５０〜２０００ダルトンの質量で記録した。タンデム型質量分析モードにおいて、イオンを３ダルトンのウインドウで選択した。衝突ガスは、アルゴン（４×１０−５ｍｂａｒ）であり、衝突電圧は、約３０Ｖであった。精製した構成的プロテアソーム及び免疫プロテアソームによるペプチド消化の場合、質量スペクトルのピークを、ＢｉｏＬｙｎｘソフトウェア（Ｗａｔｅｒｓ）を用いて供給源基質ペプチド中で検索し、特定の消化断片の存在量を、消化されていない基質を含めた全体の合計強度のパーセンテージとして定量的に評価した。
【０１３２】
細胞
健康なドナー由来末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｆｉｃｏｌｌ勾配に対する遠心分離で単離した。樹状細胞（ＤＣ）を生成するために、およそ５０＊１０６個のＰＢＭＣを、３＊１０６個細胞／ｍＬ完全培地（８％  ＨＳ、Ｓｅｒａｌａｂ；ペニシリン／ストレプトマイシン、Ｌｏｎｚａ；Ｌ−グルタミン、Ｌｏｎｚａで補充したＩＭＤＭ、Ｌｏｎｚａ）の濃度にし、６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に３ｍＬ／ウェルで播種した。３７℃で１．５時間インキュベーションした後、非接着細胞を、完全培地を使用して３回の洗浄ステップで洗い流した（０日目）。接着細胞を、８００Ｕ／ｍＬ  ＧＭ−ＣＳＦ及び５００Ｕ／ｍＬ  ＩＬ−４（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を含有する２ｍＬ／ウェルの完全培地中で、３７℃で３日間培養した。３日目に、２４００Ｕ／ｍＬ  ＧＭ−ＣＳＦ及び１５００Ｕ／ｍＬ  ＩＬ−４を含有する完全培地１ｍＬを、各ウェルに添加し、３７℃で更に３日間培養した。
【０１３３】
Ｔ細胞の誘導
６日目に、３つのプールに分配した長鎖ペプチドを、３ｎｍｏｌ／ｍＬ濃度でナイーブドナーの単球由来ＤＣに添加し、３７℃で終夜インキュベートした。プール１は、ＳＬＰ２６（配列番号７６）、ＳＬＰ２４（配列番号７４）、ＳＬＰ１（配列番号５１）及びＳＬＰ３０（配列番号１１４２）を含み；プール２は、Ａｂｕ−ＳＬＰ  ２７（配列番号７７、アミノ酸１位のシステインが、Ａｂｕに置き換えられている）、ＳＬＰ２５（配列番号７５）、ＳＬＰ１０（配列番号６０）及びＳＬＰ３４（配列番号１４６９）を含み；プール３は、ＳＬＰ５（配列番号５５）、ＳＬＰ１３（配列番号６３）、ＳＬＰ１４（配列番号６４）及びＳＬＰ２１（配列番号２１）を含む。７日目に、細胞を完全培地で２回洗浄してペプチドを除去した。ＤＣ及び自己のＰＢＭＣを１：１０の比で、１０ｎｇ／ｍＬ  ＩＬ−７及び１００ｐｇ／ｍＬ  ＩＬ−１２ｐ７０の存在下で、３７℃で１０日間共培養した。この過程により生成されるＴ細胞株を、２〜３日毎に確認し、必要に応じて分割した。
【０１３４】
Ｔ細胞株の再刺激
Ｔ細胞誘導の３日後（１０日目）に、自己のＤＣの第２のバッチを分化させ、上記のペプチドプールを載せた。Ｔ細胞株の開始後１０日目（１７日目）に、ペプチドを載せたＤＣを完全培地で２回洗浄し、１０ｎｇ／ｍＬ  ＩＬ−７及び１００ｐｇ／ｍＬ  ＩＬ−１２ｐ７０の存在下で１：１０の比（ＤＣ：Ｔ細胞）でＴ細胞に添加した。細胞を、７日間共培養した。１７日目に、またＤＣの新たなバッチを分化させ、上記のペプチドプールを載せた。２４日目に開始する第２の再刺激の場合、ＤＣ及びＴ細胞を１：１０の比で共培養した。再刺激の２日後に、３０ＩＵ／ｍＬ  ＩＬ−２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）及び５ｎｇ／ｍＬ  ＩＬ−１５（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を培地に添加した。３１日目に開始する第３の再刺激を、第２の再刺激と同じく実行した。
【０１３５】
Ｔ細胞増殖及びＩＦＮγ産生
Ｔ細胞活性化及び増殖を測定するために、自己のＤＣに、上記のＴ細胞誘導手順の２３、３０及び３７日目に、１３個のＨＢＶ由来ペプチドのそれぞれを別々に６時間載せた。ＤＣを洗浄し、ペプチドを載せたＤＣ  ５０００個をＴ細胞５００００個と４８時間共培養した。次いで、上清をＥＬＩＳＡ（ＩＦＮγＥＬＩＳＡ、Ｄｉａｃｌｏｎｅ）ために採集し、３Ｈチミジンを含有する培地を全てのウェルに添加した。放射性３Ｈチミジンは、新たに形成された（増殖した）細胞のＤＮＡに組み込まれ、インキュベーションの１６時間後にＭｉｃｒｏＢｅｔａ液浸計数装置（Ｗａｌｌａｃ／Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で測定される。
【０１３６】
ＩＦＮγ−ＥＬＩＳｐｏｔ
抗原特異性ＩＦＮγ産生ヒトＴ細胞を検出するために、ＰＢＭＣを、３ｎｍｏｌ／ｍＬの指示するペプチドと３７℃で７２時間最初に予備刺激した。この刺激の間、ＥＬＩＳｐｏｔ  ＰＶＤＦプレート（Ｍａｂｔｅｃｈ）を、ＰＢＳ中の５ｕｇ／ｍＬ抗ヒトＩＦＮγｍＡｂ  １−Ｄ１Ｋコーティング抗体（Ｍａｂｔｅｃｈ）でコーティングし、４℃で終夜インキュベートした。ＰＢＭＣの刺激後に、コーティング抗体をプレートから吸い出し、ＰＢＳで４回洗浄した。非特異的結合をブロッキングするために、８％ＦＣＳを含有するＩＭＤＭ  １００μＬを全てのウェルに添加し、３７℃で１時間インキュベートした。その間に、刺激しＰＢＭＣを採取し、遠心分離し、Ｘ  ｖｉｖｏ１５培地（Ｌｏｎｚａ）に再懸濁し、計数した。全てのＰＢＭＣサンプルを、Ｘ−ｖｉｖｏ１５培地中で１．５＊１０６個細胞／ｍＬの濃度にした。ＰＶＤＦプレートのウェル中の培地を吸い出し、各ＰＢＭＣサンプル１００μＬを４組でプレートに添加した。プレートを、３７℃で終夜インキュベートした。翌日、上清を破棄し、プレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０  ０．０５％で６回洗浄した。ビオチン化抗ヒトＩＦＮγ７−Ｂ６−１  ｍＡｂ（Ｍａｂｔｅｃｈ）を、１％ＦＢＳを含むＰＢＳ中に０．３μｇ／ｍＬの濃度で全てのウェル（１００μＬ／ウェル）に添加し、ＲＴで２時間インキュベートした。次に、プレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０  ０．０５％を使用して、６回洗浄し、１％ＦＢＳを含むＰＢＳ中の１μｇ／ｍＬ  Ｅｘｔｒａｖｉｄｉｎ−アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を、全てのウェルに添加した（１００μＬ／ウェル）。プレートを、ＲＴで１時間インキュベートした。ＡＬＰ基質溶液ＢＣＩＰ／ＮＢＴ−ｐｌｕｓ（Ｍａｂｔｅｃｈ）を調製し、プレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０  ０．０５％で４回洗浄した後に、１００μＬ／ウェルを全てのウェルに添加した。比色反応を停止させるために（１〜２０分後）、水道水を使用してプレートを徹底的に洗浄した。乾燥後、形成された点をＢｉｏｓｙｓ  Ｂｉｏｒｅａｄｅｒ  ５０００で測定した。
【０１３７】
結果
長鎖ペプチドに含有される可能性のある全てのＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープのＨＬＡクラスＩペプチド結合予測及び予測されたＣ末端生成に基づく長鎖ペプチドの選択
ペプチドが結合するＨＬＡクラスＩ分子に対して予測される高親和性を保有し、プロテアソームのタンパク質分解切断によりペプチドのＣ末端で生成されるとも予測される両方のペプチドとして、高品質ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープが定義される。本発明によるペプチドは、最適に多数の高品質のＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを含有するＨＢＶタンパク質領域内で選択された。この目的のために、独自のＨＬＡクラスＩペプチド結合アルゴリズム並びにプロテアソームによる切断を予測する２つの独自のアルゴリズムを使用して、最初にＨＬＡクラスＩ結合及び可能性のある全てのＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープのＣ末端生成を評価した。その後、各短鎖ペプチド（８〜１３アミノ酸）に対して、短鎖ペプチドが結合するＨＬＡクラスＩ分子に対する短鎖ペプチドの予測される結合親和性とペプチドが細胞内でプロテアソームにより生成される尤度の両方を組み込む単一の定量的尺度、いわゆる結合−切断−免疫原性（ＢＣＩ）クラスＩ−スコアを発明した。クラスＩ−ＢＣＩスコアは、（１）上述したアルゴリズムを使用するＨＬＡクラスＩペプチド結合のｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ予測の結果から得られる結合クラスＩ−スコア（クラスＩ−Ｂスコア）、及び（２）上述したアルゴリズムを使用する、プロテアソームによるペプチドのプロテアソーム媒介Ｃ末端生成のｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ予測の結果から得られる切断スコア（Ｃスコア）から算出される。表４ａ、５ａ、６ａ及び７ａは、これらポリメラーゼ、コアタンパク質、表面抗原又はＸタンパク質由来ＳＬＰの可能性のある全てのＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープに対するクラスＩ−ＢＣＩスコアをそれぞれ累積ＢＣＩクラスＩスコアと一緒に示す。表４ｂ、５ｂ、６ｂ及び７ｂは、これらポリメラーゼ、コアタンパク質、表面抗原又はＸタンパク質由来ＳＬＰの可能性のある全てのＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープに対するクラスＩＩ−Ｂスコアをそれぞれ累積クラスＩＩ−Ｂスコアと一緒に示す。累積クラスＩ−ＢＣＩスコア（ＣＴＬエピトープに対する）と累積ＢクラスＩＩ−スコア（ヘルパーＴエピトープに対する）を合わせることにより、１つの定量値、長鎖ワクチンペプチドの全体のＴ細胞免疫原性を反映するいわゆる総局所的免疫原性評価（ＴＲＩＡ）スコアが得られた（表３）。最も高いＴＲＩＡスコア基づいて、ＨＢＶポリメラーゼ、コアタンパク質、表面抗原又はＸタンパク質に由来する３７個のＳＬＰを、更なる評価ための選択した（表３）。３７個のＳＬＰから、ＴＲＩＡスコアの予測能力を検証するために、比較的低い及び高いＴＲＩＡスコアを持つＳＬＰを含めて１３個のＳＬＰの代表的な組を選んで、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ免疫原性を評価した。記述の通り（下記参照）、上記１３個のペプチドをＴ細胞誘導アッセイのために３つのペプチドプールに分けた。
【０１３８】
ＳＬＰのプロテアソーム消化後のペプチド断片分析により、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ予測の高い精度が明らかになる
推定のＣＴＬエピトープの同定に重要な構成要素は、プロテアソーム媒介切断によるＣＴＬエピトープのＣ末端生成の予測である。この予測の信頼性を検証するために、プロテアソーム消化パターンを、機能的に試験した長鎖ワクチンペプチド１３個のうち３個を除いた全てについて実験的に評価した（３個の長鎖ペプチドは、技術的な理由により切断されていなかった）。
【０１３９】
消化実験は、２０Ｓ構成的プロテアソームと２０Ｓ免疫プロテアソーム調製物とで別々に実行した。両方の型のプロテアソームによって作製される切断の統合分析により、免疫プロテアソームを含有する抗原提示細胞（主に樹状細胞）の表面と癌細胞、特に主に構成的プロテアソームを発現する固形腫瘍の表面の両方において発現するＣＴＬエピトープのＣ末端生成の評価が可能になる。ワクチン接種目的の場合、そのようなエピトープを含むワクチン接種は、ワクチン接種によるＣＴＬの誘導及び癌細胞の表面にあるエピトープの認識後にこれらＣＴＬによって癌細胞をその後撲滅できるようにするので、これらのエピトープが好ましい。
【０１４０】
図１に示す通り、１０個の本発明の長鎖ペプチド（長さ３０〜３９ａａ）を、プロテアソーム調製物を含む適当な緩衝液中で、３７℃で０、１、３、６及び２４時間同時インキュベートした。指示した間隔でのインキュベーション後に、反応を止め、消化断片を含有する消化混合物を、ここで記載の質量分析により測定した。質量スペクトルを（半定量的に）分析して、切断部位の位置及び存在量を評価した。２４時間消化の結果を図１に示す。
【０１４１】
２４時間インキュベーション後に観察した観察された切断部位を矢印で示す。構成的プロテアソームによる消化と免疫プロテアソームによる消化の両方において観察された切断部位だけを示す。２４時間消化時の主要な切断部位及び少数の切断部位を、以下の分類に従ってそれぞれ太い及び細い矢印で記載する：
主要な切断部位：ＣＯＯＨ末端として切断部位由来の残基ＮＨ２末端を（可能性のある）相補的断片（複数可）と共に含有する断片が、質量スペクトルにおける断片ピークの強度から算出される通り、２４時間インキュベーション時に≧７％存在する。
少数の切断部位：ＣＯＯＨ末端として切断部位由来の残基ＮＨ２末端を（可能性のある）相補的断片（複数可）と共に含有する断片が、２４時間インキュベーション時に＜７％存在する。累積断片存在量＜１％の切断部位は示さない。
【０１４２】
図１は、プロテアソームの切断予測のＣスコアも示す。このスコアは、Ｃスコア直下の残基の切断Ｃ末端の尤度を示す。Ｃスコア＞１の場合、切断部位は、構成的プロテアソームと免疫プロテアソームの両方によって切断されると予測されたと考えられる。ここで記載の通り、Ｃスコアは、構成的プロテアソームによるプロテアソーム媒介切断及び免疫プロテアソームによる切断を別々に予測する２つのｉｎ  ｓｉｌｉｃｏアルゴリズムによる予測の和である。各別々の予測は、最大値１を得ることができる。したがって、Ｃスコアの最大値は、２である。Ｃスコア＞１は、予測された切断部位の総数として一緒に計数される（この残基の後の切断は試験できないので、長い基質ペプチドのＣ末端は考慮されない）。
【０１４３】
図１は、確認した切断（「＋」で示す）を更に示し、確認した切断は、プロテアソーム媒介消化アッセイにおいて２４時間後に切断されることが確認される予測された切断部位（Ｃスコア＞１）である。
【０１４４】
図１に示す通り、予測された切断部位のＳＬＰ１  ３６％（４／１１）、ＳＬＰ１０  ７１％（１０／１４）、ＳＬＰ１３  ６２％（１０／１６）、ＳＬＰ１４  １００％（１３／１３）、ＳＬＰ１８  ６５％（１３／２０）、ＳＬＰ２１  ８７％（１４／１６）、ＳＬＰ２４  ６２％（１０／１６）、ＳＬＰ２５  ５７％（８／１４）、ＳＬＰ２６  ７２％（８／１１）、及びＳＬＰ２７７５％（９／１２）が、ここで確認された。
【０１４５】
ナイーブ集団中の選択した１３個のうち１２個のペプチドに対するＴ細胞応答の誘導
選択した１３個のペプチドが、ナイーブドナーにおいてＴ細胞応答を誘導できるかどうか評価するために、ＰＢＭＣを、ＨＢＶ感染したことがない６名の健康なドナーから得た白血球層から単離した。これらのＰＢＭＣを３つのペプチドプールのいずれかで再刺激してＴ細胞株を得、１３個の選択したペプチドでその後刺激した。ＩＦＮγの産生及びＴ細胞増殖（３Ｈチミジン取り込み）を、Ｔ細胞活性化の読み出しとして測定した。結果を図２に示し、刺激指数（ＳＩ）１．５以上を持つ陽性Ｔ細胞応答を示すドナーのパーセンテージを示す。ＳＩは、測定したサンプル値を刺激していない対照細胞の値で割ることにより算出される。ナイーブドナーにおいて１３個のうち１２個の予め選択したペプチドに対して誘導された応答を検出し、１１個の予め選択したペプチドが、複数のナイーブドナーにおいて応答を誘導した。
【０１４６】
ＨＢＶ免疫ドナーにおける既存のＴ細胞応答の強度は、ＴＲＩＡスコアと相関する
ＨＢＶ感染を経験し、成功裏にＨＢＶを除去した対象は、ＨＢＶに特異的な循環記憶Ｔ細胞を保有する。天然に存在するＨＢＶ感染の除去に対する選択したワクチンペプチドの妥当性を評価するために、６名のＨＢＶ免疫ドナーから得たＰＢＭＣにおいて、選択した１３個のＨＢＶペプチドに対するＴ細胞応答の存在を試験した。ＰＢＭＣの単離後に、細胞を１３個のペプチドのそれぞれで刺激し、ＩＦＮγ−ＥＬＩＳｐｏｔを実行してＴ細胞応答を検出した。試験したドナー６名のうち３名のＰＢＭＣサンプルが、１３個のペプチドのうちの１個又は複数に対して陽性ＩＦＮγ応答を示した（ＳＩ＞３）。応答を、１３個のペプチドのうち１１個（ＳＬＰ５、１０、１３、１４、１８、２１、２４、２５、２６、２７及び３４、それぞれ配列番号５５、６０、６３、６４、６８、７１、７４、７５、７６、７７及び１４６９で表す）に対して観察し、そのうちの６個（ＳＬＰ１０、１３、２１、２４、２５及び３４、それぞれ配列番号６０、６３、７１、７４、７５及び１４６９により表される）は、複数のドナーにおいて応答を誘導した。結果を図３に要約し、ペプチドに対して陽性ＩＦＮγ＋Ｔ細胞応答を示すドナーを示す。試験した各ＳＬＰについて、ＩＦＮγ応答の平均ＳＩを算出した；ＳＬＰ１で１．２１、ＳＬＰ５で２．１１、ＳＬＰ１０で２．４０、ＳＬＰ１３で２．４４、ＳＬＰ１４で１．９７、ＳＬＰ１８で１．８６、ＳＬＰ２１で２．８７、ＳＬＰ２４で２．５４、ＳＬＰ２５で２．６６、ＳＬＰ２６で１．５６、Ａｂｕ−ＳＬＰ２７で１．６６、ＳＬＰ３０で１．４９及びＳＬＰ３４で３．０２。重要なことに、各ペプチドに対するＩＦＮγ応答の平均ＳＩを、対応するＴＲＩＡスコアに対して描画した場合、Ａｂｕ−ＳＬＰ２７の結果を含む場合（Ｒ２＝０．３７、ｐ＝０．０２８；図４を参照のこと）とＡｂｕ−ＳＬＰ２７の結果を除外した場合（Ｒ２＝０．３４、ｐ＝０．０４８；不掲載）の両方で有意な相関（図４）を見る。これは、免疫原性ペプチドの選択ためのＴＲＩＡスコアの使用を検証する。
【０１４７】
考察
ここで示す実験結果は、選択を検証し、したがって支持し、本発明のＨＢＶ由来長鎖ワクチンペプチドの免疫学的妥当性を明白に示す。これらの長鎖ワクチンペプチドは、非近交系集団における高品質のＨＬＡクラスＩ及びＨＬＡクラスＩＩ結合エピトープを最も多数含むＨＢＶタンパク質領域を包含する。好ましい組み合わせのワクチンペプチドを新規のＨＢＶ  ＳＬＰワクチン組成物に組み込んで、慢性的にＨＢＶ感染している患者を治療することになる。一般的なＨＬＡクラスＩ分子全てに対する短鎖ペプチド（８〜１２ａａ）のペプチド結合親和性及びプロテアソームによる切断によるこれら短鎖ペプチドのＣ末端生成の尤度を予測するアルゴリズムを、推定のヘルパーＴエピトープの同定と組み合わせて使用して、最適な３７個の長鎖ワクチンペプチドを選択した免疫原性の高い領域を同定した。
【０１４８】
本発明において長鎖ワクチンペプチドの適当な選択を可能にするために、定量的尺度、ＴＲＩＡスコアを開発した。可能性のある全ての長鎖ＨＢＶペプチドに起因するそのような定量的尺度なしに、最適な長鎖ペプチドの適当な選択はあり得ない。ＴＲＩＡスコアは、長鎖ペプチドに含有される推定のＨＬＡクラスＩ拘束性ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞エピトープ並びにＨＬＡクラスＩＩ拘束性ＣＤ４＋ヘルパーＴエピトープ全ての品質及び量の定量的な表記である。ＴＲＩＡスコアを、ワクチン接種目的には最適なペプチド長である長さ３０〜３９ａａの可能性のある全てのＨＢＶペプチドについて算出し、免疫原性の高い１組の長鎖ワクチンペプチドの合理的な選択を可能にする。
【０１４９】
免疫学的妥当性の更なる試験及び検証のために、様々なＴＲＩＡスコアを持つ１３個のＳＬＰの組を選択した。第１に、構成的プロテアソーム又は免疫プロテアソームを使用してこれらのＳＬＰを実験的に消化した。生成された断片は、ＢＣＩスコアで表される、予測されたＣ末端切断部位と明らかな重なりを示した。
【０１５０】
その後、ナイーブとＨＢＶ免疫ドナーの両方に由来するＰＢＭＣを使用してＴ細胞アッセイを実行した。殆ど全ての１３個の選択したＳＬＰが、ナイーブな健康ドナーから得たＰＢＭＣにおいてＴ細胞応答を誘導することができ、これは選択したＳＬＰの組が、以前に刺激されていないＴ細胞レパートリーによる応答を誘導する可能性が有ることを証明している。同じ組のワクチンペプチドにおいて、強い相関が、特定のワクチンペプチドのＴＲＩＡスコアとＨＢＶ免疫ドナーにおけるＩＦＮγ応答の強度の間に観察されたことは、ＴＲＩＡスコアが、ワクチンペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏにおける免疫原性、したがって機能性の予測値であることを示す。
【０１５１】
表１．ＨＢＶポリメラーゼ、ＨＢＶコア並びにＨＢＶ大表面タンパク質のタンパク質及びＤＮＡ配列。
【表１】
0006780852.tif 000002
【０１５２】
表２．異なるＨＢＶ  Ｘタンパク質バリアント及び推定されるコンセンサスタンパク質配列。
【表２−１】
0006780852.tif 000003
【表２−２】
0006780852.tif 000004
【０１５３】
表３．合成長鎖ペプチド（ＳＬＰ）配列。
【表３−１】
0006780852.tif 000005
【表３−２】
0006780852.tif 000006
Ａ累積クラスＩ−ＢＣＩスコア：材料及び方法（実施例の項）を参照のこと。
Ｂ累積クラスＩＩ−Ｂスコア：材料及び方法（実施例の項）を参照のこと。
ＣＴＲＩＡスコアは、累積クラスＩ−ＢＣＩスコア及び累積クラスＩＩ−Ｂスコアの合計である。
【０１５４】
表４ａ．ＨＢＶポリメラーゼタンパク質由来ＳＬＰ配列に含まれる予測されたＨＬＡクラスＩ拘束性ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞エピトープ。
【表４ａ−１】
0006780852.tif 000007
【表４ａ−２】
0006780852.tif 000008
【表４ａ−３】
0006780852.tif 000009
【表４ａ−４】
0006780852.tif 000010
【表４ａ−５】
0006780852.tif 000011
【表４ａ−６】
0006780852.tif 000012
【表４ａ−７】
0006780852.tif 000013
【表４ａ−８】
0006780852.tif 000014
【表４ａ−９】
0006780852.tif 000015
【表４ａ−１０】
0006780852.tif 000016
【表４ａ−１１】
0006780852.tif 000017
【表４ａ−１２】
0006780852.tif 000018
【表４ａ−１３】
0006780852.tif 000019
【表４ａ−１４】
0006780852.tif 000020
【表４ａ−１５】
0006780852.tif 000021
【表４ａ−１６】
0006780852.tif 000022
【表４ａ−１７】
0006780852.tif 000023
【表４ａ−１８】
0006780852.tif 000024
【表４ａ−１９】
0006780852.tif 000025
【表４ａ−２０】
0006780852.tif 000026
【表４ａ−２１】
0006780852.tif 000027
【表４ａ−２２】
0006780852.tif 000028
【表４ａ−２３】
0006780852.tif 000029
【表４ａ−２４】
0006780852.tif 000030
【表４ａ−２５】
0006780852.tif 000031
【表４ａ−２６】
0006780852.tif 000032
【表４ａ−２７】
0006780852.tif 000033
【表４ａ−２８】
0006780852.tif 000034
【表４ａ−２９】
0006780852.tif 000035
【表４ａ−３０】
0006780852.tif 000036
【表４ａ−３１】
0006780852.tif 000037
【表４ａ−３２】
0006780852.tif 000038
【表４ａ−３３】
0006780852.tif 000039
【表４ａ−３４】
0006780852.tif 000040
【表４ａ−３５】
0006780852.tif 000041
【表４ａ−３６】
0006780852.tif 000042
【表４ａ−３７】
0006780852.tif 000043
【表４ａ−３８】
0006780852.tif 000044
【表４ａ−３９】
0006780852.tif 000045
【表４ａ−４０】
0006780852.tif 000046
【表４ａ−４１】
0006780852.tif 000047
【表４ａ−４２】
0006780852.tif 000048
【表４ａ−４３】
0006780852.tif 000049
【表４ａ−４４】
0006780852.tif 000050
【表４ａ−４５】
0006780852.tif 000051
【表４ａ−４６】
0006780852.tif 000052
【表４ａ−４７】
0006780852.tif 000053
【表４ａ−４８】
0006780852.tif 000054
【表４ａ−４９】
0006780852.tif 000055
【表４ａ−５０】
0006780852.tif 000056
【表４ａ−５１】
0006780852.tif 000057
【表４ａ−５２】
0006780852.tif 000058
【表４ａ−５３】
0006780852.tif 000059
【表４ａ−５４】
0006780852.tif 000060
【表４ａ−５５】
0006780852.tif 000061
【表４ａ−５６】
0006780852.tif 000062
【表４ａ−５７】
0006780852.tif 000063
【表４ａ−５８】
0006780852.tif 000064
【表４ａ−５９】
0006780852.tif 000065
【表４ａ−６０】
0006780852.tif 000066
【表４ａ−６１】
0006780852.tif 000067
【表４ａ−６２】
0006780852.tif 000068
【表４ａ−６３】
0006780852.tif 000069
【表４ａ−６４】
0006780852.tif 000070
【表４ａ−６５】
0006780852.tif 000071
【表４ａ−６６】
0006780852.tif 000072
【表４ａ−６７】
0006780852.tif 000073
【表４ａ−６８】
0006780852.tif 000074
【表４ａ−６９】
0006780852.tif 000075
【表４ａ−７０】
0006780852.tif 000076
【表４ａ−７１】
0006780852.tif 000077
【表４ａ−７２】
0006780852.tif 000078
【表４ａ−７３】
0006780852.tif 000079
【表４ａ−７４】
0006780852.tif 000080
【表４ａ−７５】
0006780852.tif 000081
【表４ａ−７６】
0006780852.tif 000082
【表４ａ−７７】
0006780852.tif 000083
【表４ａ−７８】
0006780852.tif 000084
【表４ａ−７９】
0006780852.tif 000085
【表４ａ−８０】
0006780852.tif 000086
【表４ａ−８１】
0006780852.tif 000087
【表４ａ−８２】
0006780852.tif 000088
【表４ａ−８３】
0006780852.tif 000089
【表４ａ−８４】
0006780852.tif 000090
【表４ａ−８５】
0006780852.tif 000091
【表４ａ−８６】
0006780852.tif 000092
【表４ａ−８７】
0006780852.tif 000093
【表４ａ−８８】
0006780852.tif 000094
「開始」及び「終了」は、配列番号１に記載されるＨＢＶポリメラーゼのアミノ酸配列との対比である
Ａペプチドアミノ酸配列。ＨＢＶポリメラーゼの各ＨＬＡクラスＩ結合ペプチドが、結合することが予測される各ＨＬＡクラスＩ分子につき別々に列挙されているが、その理由により複数回列挙される場合がある。
ＢクラスＩ−Ｂスコア。材料及び方法（実施例の項）を参照のこと。
ＣＣスコア。材料及び方法（実施例の項）を参照のこと。
ＤクラスＩ−ＢＣＩスコア。材料及び方法（実施例の項）を参照のこと。
Ｅ累積クラスＩ−ＢＣＩスコア：材料及び方法（実施例の項）を参照のこと。
【０１５５】
表４ｂ．ＨＢＶポリメラーゼタンパク質由来ＳＬＰ配列に含まれる予測されたＨＬＡクラスＩＩ拘束性ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ。
【表４ｂ−１】
0006780852.tif 000095
【表４ｂ−２】
0006780852.tif 000096
【表４ｂ−３】
0006780852.tif 000097
【表４ｂ−４】
0006780852.tif 000098
【表４ｂ−５】
0006780852.tif 000099
【表４ｂ−６】
0006780852.tif 000100
【表４ｂ−７】
0006780852.tif 000101
【表４ｂ−８】
0006780852.tif 000102
【表４ｂ−９】
0006780852.tif 000103
【表４ｂ−１０】
0006780852.tif 000104
【表４ｂ−１１】
0006780852.tif 000105
「開始」及び「終了」は、配列番号１に記載されるヒトＨＢＶポリメラーゼのアミノ酸配列との対比である
Ａペプチドアミノ酸配列。ＨＢＶポリメラーゼの各ＨＬＡ−ＤＲＢ１結合ペプチドが、結合することが予測される各ＨＬＡクラスＩ分子につき別々に列挙されているが、その理由により各ペプチドが複数回列挙される場合がある。
ＢクラスＩＩ−Ｂスコア。材料及び方法（実施例の項）を参照のこと。Ｃ累積クラスＩＩ−Ｂスコア：材料及び方法（実施例の項）を参照のこと。
【０１５６】
表５ａ．ＨＢＶコアタンパク質由来ＳＬＰ配列に含まれる予測されたＨＬＡクラスＩ拘束性ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞エピトープ。
【表５ａ−１】
0006780852.tif 000106
【表５ａ−２】
0006780852.tif 000107
【表５ａ−３】
0006780852.tif 000108
【表５ａ−４】
0006780852.tif 000109
【表５ａ−５】
0006780852.tif 000110
【表５ａ−６】
0006780852.tif 000111
【表５ａ−７】
0006780852.tif 000112
「開始」及び「終了」は、配列番号４に記載されるＨＢＶコアタンパク質のアミノ酸配列との対比である
Ａペプチドアミノ酸配列。ＨＢＶコアタンパク質の各ＨＬＡクラスＩ結合ペプチドが、結合することが予測される各ＨＬＡクラスＩ分子につき別々に列挙されているが、その理由により複数回列挙される場合がある。
ＢクラスＩ−Ｂスコア。実施例の項の材料及び方法を参照のこと。
ＣＣスコア。実施例の項の材料及び方法を参照のこと。
ＤクラスＩ−ＢＣＩスコア。材料及び方法（実施例の項）を参照のこと。
Ｅ累積クラスＩ−ＢＣＩスコア：材料及び方法（実施例の項）を参照のこと。
【０１５７】
表５ｂ．ＨＢＶコアタンパク質由来ＳＬＰ配列に含まれる予測されたＨＬＡクラスＩＩ拘束性ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ。
【表５ｂ−１】
0006780852.tif 000113
【表５ｂ−２】
0006780852.tif 000114
【表５ｂ−３】
0006780852.tif 000115
【表５ｂ−４】
0006780852.tif 000116
「開始」及び「終了」は、配列番号４に記載されるヒトＨＢＶコアタンパク質のアミノ酸配列との対比である
Ａペプチドアミノ酸配列。ＨＢＶコアの各ＨＬＡ−ＤＲＢ１結合ペプチドが、結合することが予測される各ＨＬＡクラスＩ分子につき別々に列挙されているが、その理由により各ペプチドが複数回列挙される場合がある。
ＢクラスＩＩ−Ｂスコア。材料及び方法（実施例の項）を参照のこと。
Ｃ累積クラスＩＩ−Ｂスコア：材料及び方法（実施例の項）を参照のこと。
【０１５８】
表６ａ．ＨＢＶ  Ｘタンパク質（コンセンサス配列）由来ＳＬＰ配列に含まれる予測されたＨＬＡクラスＩ拘束性ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞エピトープ。
【表６ａ−１】
0006780852.tif 000117
【表６ａ−２】
0006780852.tif 000118
【表６ａ−３】
0006780852.tif 000119
【表６ａ−４】
0006780852.tif 000120
【表６ａ−５】
0006780852.tif 000121
【表６ａ−６】
0006780852.tif 000122
【表６ａ−７】
0006780852.tif 000123
【表６ａ−８】
0006780852.tif 000124
【表６ａ−９】
0006780852.tif 000125
【表６ａ−１０】
0006780852.tif 000126
【表６ａ−１１】
0006780852.tif 000127
「開始」及び「終了」は、配列番号４５に記載されるＨＢＶ  Ｘタンパク質（コンセンサス配列）のアミノ酸配列との対比である
Ａペプチドアミノ酸配列。ＨＢＶ  Ｘタンパク質の各ＨＬＡクラスＩ結合ペプチドが、結合することが予測される各ＨＬＡクラスＩ分子につき別々に列挙されているが、その理由により複数回列挙される場合がある。
ＢクラスＩ−Ｂスコア。材料及び方法（実施例の項）を参照のこと。
ＣＣスコア。材料及び方法（実施例の項）を参照のこと。ＤクラスＩ−ＢＣＩスコア。材料及び方法（実施例の項）を参照のこと。
Ｅ累積クラスＩ−ＢＣＩスコア：材料及び方法（実施例の項）を参照のこと。
【０１５９】
表６ｂ．ＨＢＶ  Ｘタンパク質（コンセンサス配列）由来ＳＬＰ配列に含まれる予測されたＨＬＡクラスＩＩ拘束性ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ。
【表６ｂ−１】
0006780852.tif 000128
【表６ｂ−２】
0006780852.tif 000129
【表６ｂ−３】
0006780852.tif 000130
【表６ｂ−４】
0006780852.tif 000131
【表６ｂ−５】
0006780852.tif 000132
「開始」及び「終了」は、配列番号４５に記載されるヒトＨＢＶ  Ｘタンパク質のアミノ酸配列との対比である
Ａペプチドアミノ酸配列。ＨＢＶ  Ｘタンパク質の各ＨＬＡ−ＤＲＢ１結合ペプチドが、結合することが予測される各ＨＬＡクラスＩ分子につき別々に列挙されているが、その理由により各ペプチドが複数回列挙される場合がある。
ＢクラスＩＩ−Ｂスコア。材料及び方法（実施例の項）を参照のこと。
Ｃ累積クラスＩＩ−Ｂスコア：材料及び方法（実施例の項）を参照のこと。
【０１６０】
表７ａ．ＨＢＶ大表面タンパク質由来ＳＬＰ配列に含まれる予測されたＨＬＡクラスＩ拘束性ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞エピトープ。
【表７ａ−１】
0006780852.tif 000133
【表７ａ−２】
0006780852.tif 000134
【表７ａ−３】
0006780852.tif 000135
【表７ａ−４】
0006780852.tif 000136
【表７ａ−５】
0006780852.tif 000137
【表７ａ−６】
0006780852.tif 000138
【表７ａ−７】
0006780852.tif 000139
【表７ａ−８】
0006780852.tif 000140
【表７ａ−９】
0006780852.tif 000141
【表７ａ−１０】
0006780852.tif 000142
【表７ａ−１１】
0006780852.tif 000143
【表７ａ−１２】
0006780852.tif 000144
【表７ａ−１３】
0006780852.tif 000145
【表７ａ−１４】
0006780852.tif 000146
【表７ａ−１５】
0006780852.tif 000147
【表７ａ−１６】
0006780852.tif 000148
【表７ａ−１７】
0006780852.tif 000149
【表７ａ−１８】
0006780852.tif 000150
【表７ａ−１９】
0006780852.tif 000151
【表７ａ−２０】
0006780852.tif 000152
【表７ａ−２１】
0006780852.tif 000153
【表７ａ−２２】
0006780852.tif 000154
【表７ａ−２３】
0006780852.tif 000155
【表７ａ−２４】
0006780852.tif 000156
【表７ａ−２５】
0006780852.tif 000157
【表７ａ−２６】
0006780852.tif 000158
【表７ａ−２７】
0006780852.tif 000159
【表７ａ−２８】
0006780852.tif 000160
【表７ａ−２９】
0006780852.tif 000161
【表７ａ−３０】
0006780852.tif 000162
【表７ａ−３１】
0006780852.tif 000163
【表７ａ−３２】
0006780852.tif 000164
【表７ａ−３３】
0006780852.tif 000165
【表７ａ−３４】
0006780852.tif 000166
【表７ａ−３５】
0006780852.tif 000167
「開始」及び「終了」は、配列番号１１４１に記載されるＨＢＶ大表面タンパク質のアミノ酸配列との対比である
Ａペプチドアミノ酸配列。ＨＢＶ大表面タンパク質の各ＨＬＡクラスＩ結合ペプチドが、結合することが予測される各ＨＬＡクラスＩ分子につき別々に列挙されているが、その理由により複数回列挙される場合がある。
ＢクラスＩ−Ｂスコア。材料及び方法（実施例の項）を参照のこと。
ＣＣスコア。材料及び方法（実施例の項）を参照のこと。
ＤクラスＩ−ＢＣＩスコア。材料及び方法（実施例の項）を参照のこと。
Ｅ累積クラスＩ−ＢＣＩスコア：材料及び方法（実施例の項）を参照のこと。
【０１６１】
表７ｂ．ＨＢＶ大表面タンパク質由来ＳＬＰ配列に含まれる予測されたＨＬＡクラスＩＩ拘束性ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ。
【表７ｂ−１】
0006780852.tif 000168
【表７ｂ−２】
0006780852.tif 000169
【表７ｂ−３】
0006780852.tif 000170
【表７ｂ−４】
0006780852.tif 000171
【表７ｂ−５】
0006780852.tif 000172
【表７ｂ−６】
0006780852.tif 000173
【表７ｂ−７】
0006780852.tif 000174
【表７ｂ−８】
0006780852.tif 000175
【表７ｂ−９】
0006780852.tif 000176
【表７ｂ−１０】
0006780852.tif 000177
【表７ｂ−１１】
0006780852.tif 000178
【表７ｂ−１２】
0006780852.tif 000179
【表７ｂ−１３】
0006780852.tif 000180
「開始」及び「終了」は、配列番号１１４１に記載されるヒトＨＢＶ大表面タンパク質のアミノ酸配列との対比である
Ａペプチドアミノ酸配列。ＨＢＶ大表面タンパク質の各ＨＬＡ−ＤＲＢ１結合ペプチドが、結合することが予測される各ＨＬＡクラスＩ分子につき別々に列挙されているが、その理由により各ペプチドが複数回列挙される場合がある。
ＢＢスコア。材料及び方法（実施例の項）を参照のこと。
Ｃ累積Ｂスコア。材料及び方法（実施例の項）を参照のこと。
【０１６２】
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【図１ａ】
0006780852.tif 000181
【図１ｂ】
0006780852.tif 000182
【図１ｃ】
0006780852.tif 000183
【図１ｄ】
0006780852.tif 000184
【図２】
0006780852.tif 000185
【図３】
0006780852.tif 000186
【図４】
0006780852.tif 000187
【配列表】
0006780852000001.app