(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゲノムＤＮＡを標的とするガイド化合物であって、ｃｒＲＮＡと結合している１４〜２４個の連続するモノマーの標的ガイド鎖を含み、ゲノムＤＮＡのＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集を導き、モノマーがＵＮＡモノマーおよび核酸モノマーを含み、ガイド化合物が、ゲノムＤＮＡのＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集を導くことを標的とする塩基配列を含む、ガイド化合物。
【請求項２】
ガイド化合物が、ヒト遺伝子ＴＴＲに二本鎖切断を導き、標的ガイド鎖が、５’−ＵＧＣＡＵＧＧＣＣＡＣＡＵＵＧＡＵＧＧＣ−３’（配列番号１３）の１６〜２０個の連続するモノマーを含み、ｃｒＲＮＡが、標的ガイド鎖の３’末端において結合している、請求項１に記載のガイド化合物。
【請求項３】
配列番号３２を含む、請求項２に記載のガイド化合物。
【請求項４】
ガイド化合物が、ヒト遺伝子ＴＴＲに二本鎖切断を導き、標的ガイド鎖が、５’−ＣＡＣＡＵＧＣＡＵＧＧＣＣＡＣＡＵＵＧＡ−３’（配列番号４０）の１６〜２０個の連続するモノマーを含み、ｃｒＲＮＡが、標的ガイド鎖の３’末端において結合している、請求項１に記載のガイド化合物。
【請求項５】
配列番号６１を含む、請求項４に記載のガイド化合物。
【請求項６】
ｃｒＲＮＡが、５’−ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵ−３’（配列番号６０５）である、請求項１に記載のガイド化合物。
【請求項７】
標的ガイド鎖の塩基配列が、ゲノムＤＮＡから最大で３つのミスマッチを有する、請求項１に記載のガイド化合物。
【請求項８】
１〜５個のＵＮＡモノマーを含む、請求項１に記載のガイド化合物。
【請求項９】
１以上の核酸モノマーが、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロリボヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチド、２’−デオキシリボヌクレオチド、２’−デオキシプリンヌクレオチド、ユニバーサル塩基ヌクレオチド、５−Ｃ−メチルヌクレオチド、逆位デオキシ脱塩基モノマー残基、３’末端が安定化されたヌクレオチド、３’−グリセリルヌクレオチド、３’−逆位脱塩基ヌクレオチド、３’−逆位チミジン、ロックド核酸ヌクレオチド（ＬＮＡ）、２’−Ｏ，４’−Ｃ−メチレン−（Ｄ−リボフラノシル）ヌクレオチド、２’−メトキシエトキシ（ＭＯＥ）ヌクレオチド、２’−メチル−チオ−エチル、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、２’，４’−拘束２’−Ｏ−メトキシエチル（ｃＭＯＥ）、２’−Ｏ−エチル（ｃＥｔ）、２’−アミノヌクレオチド、２’−Ｏ−アミノヌクレオチド、２’−Ｃ−アリルヌクレオチド、２’−Ｏ−アリルヌクレオチド、Ｎ６−メチルアデノシンヌクレオチド、修飾された塩基５−（３−アミノ）プロピルウリジンを有するヌクレオチド、修飾された塩基５−（２−メルカプト）エチルウリジンを有するヌクレオチド、修飾された塩基５−ブロモウリジンを有するヌクレオチド、修飾された塩基８−ブロモグアノシンを有するヌクレオチド、修飾された塩基７−デアザアデノシンを有するヌクレオチド、２’−Ｏ−アミノプロピル置換されたヌクレオチド、または２’−ＯＨ基を、２’−Ｒ、２’−ＯＲ、２’−ハロゲン、２’−ＳＲもしくは２’−アミノに置換したヌクレオチド（ここでＲは、Ｈ、アルキル、アルケニル、またはアルキニルであり得る）である、請求項１に記載のガイド化合物。
【請求項１０】
ガイド化合物の各末端における、最後の３つのモノマーのうちの１つ以上が、ホスホロチオエート結合、キラルなホスホロチオエート結合またはホスホロジチオエート結合で連結されている、請求項１に記載のガイド化合物。
【請求項１１】
ＴＴＲ、ＢＩＲＣ５、ＣＤＫ１６、ＳＴＡＴ３、ＣＦＴＲ、Ｆ９、ＫＲＡＳおよびＣＡＲから選択される遺伝子において、二本鎖切断を導く、請求項１に記載のガイド化合物。
【請求項１２】
ゲノムＤＮＡが標的疾患に関連する一塩基多型を含む、請求項１に記載のガイド化合物。
【請求項１３】
疾患関連アレルにおいて二本鎖切断を導く、請求項１に記載のガイド化合物。
【請求項１４】
Ｖ３０Ｍ ＴＴＲ、Ｇ２８４Ｒ ＣｏｌＡ１、Ｌ１３２Ｐケラチン１２、Ｒ１３５Ｔケラチン１２、Ｇ８５Ｒ ＳＯＤ１、Ｇ２７２Ｖ Ｔａｕ、Ｐ３０１Ｌ Ｔａｕ、Ｖ３３７Ｍ Ｔａｕ、Ｒ４０６Ｗ Ｔａｕ、Ｑ３９ＳＴＯＰベータ−グロビン、Ｔ８９９３Ｇ／Ｃ ｍｔＤＮＡ、Ｇ７１９Ｓ ＥＧＦＲ、およびＧ１２Ｃ Ｋｒａｓから選択される疾患関連アレルにおいて、二本鎖切断を導く、請求項１に記載のガイド化合物。
【請求項１５】
３０〜３００個の連続するモノマーを含む、請求項１に記載のガイド化合物。
【請求項１６】
ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集がＣａｓ９を用いる、請求項１に記載のガイド化合物。
【請求項１７】
疾患関連アレルにおいて、野生型としての同一のアレルよりも多くの二本鎖切断を導く、請求項１に記載のガイド化合物。
【請求項１８】
ｔｒａｃｒＲＮＡとアニールした、請求項１に記載のガイド化合物。
【請求項１９】
ｔｒａｃｒＲＮＡが、肺炎レンサ球菌、化膿レンサ球菌、髄膜炎菌またはサーモフィラス菌由来である、請求項１８に記載のガイド化合物。
【請求項２０】
ｔｒａｃｒＲＮＡが配列番号６０６である、請求項１８に記載のガイド化合物。
【請求項２１】
ｔｒａｃｒＲＮＡとアニールし、ＣＲＩＳＰＲ関連遺伝子編集タンパク質と複合体を形成している、請求項１に記載のガイド化合物。
【請求項２２】
ＣＲＩＳＰＲ関連遺伝子編集タンパク質がＣａｓ９である、請求項２１に記載のガイド化合物。
【請求項２３】
請求項１８に記載の１以上のガイド化合物および薬学的に許容し得る担体を含む、医薬組成物。
【請求項２４】
薬学的に許容し得る担体が、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターを含む、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
薬学的に許容し得る担体がリポソームを含む、請求項２３に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子編集および遺伝子発現制御における、バイオ医薬品および治療学の分野に関する。特に本発明は、ポリヌクレオチド（ゲノムのポリヌクレオチドを含む）を編集し、または変化させる、方法および組成物、ならびに最終的に、インビボ(in vivo)で遺伝子を編集し、遺伝子発現を調節、破壊、活性化または抑制する方法および組成物に関する。
【０００２】
配列表
本願は、ARC5237WO_SL.txtという名前のＡＳＣＩＩファイルとして、電子的に提出された配列表を含む。
【背景技術】
【０００３】
所定の部位に特異的な遺伝子編集を、標的誘導ヌクレアーゼＣａｓ９およびポリヌクレオチド修復法を用いて、実行できる。標的誘導Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを用いて、二本鎖ＤＮＡの両方の鎖を標的部位付近で切断し、二本鎖切断を生成できる。
【０００４】
Ｃａｓ９の標的特異性は、ガイド分子によって決定し、この分子はＣａｓ９をポリヌクレオチド標的と組み合わせる。ポリヌクレオチド標的配列（典型的に１７〜２０塩基長）は、３’プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と隣接していなければならない。ＰＡＭの構造は、Ｃａｓ９が由来する細菌種によって決定される。偶然にも、ＰＡＭを含む適切な標的配列は、ほとんどの種の、興味の対象となるほとんどの遺伝子において、発見できる。ある変形型において、ガイド分子を、標的に相補的な配列を有する一本鎖ＲＮＡとして作成してもよく、これは、Ｃａｓ９と複合体形成する、細菌由来のｃｒｉｓｐｒ−ｔｒａｃｒＲＮＡ分子と結合する。
【０００５】
いくつかの様式において、特異的な部位におけるｄｓＤＮＡの二本鎖切断の形成後、切断は修復され、ＤＮＡの編集が達成され得る。二本鎖切断は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によって修復され、ランダムな挿入および欠失を生成し得る。二本鎖切断はまた、外来性鋳型ＤＮＡを用いて、相同組換え修復（ＨＤＲ）によって修復され、制御された挿入、欠失および置換を生成し得る。
【０００６】
Ｃａｓ９を用いた遺伝子編集の主な欠点は、標的ポリヌクレオチドに対するガイド分子の有効性が限定され得ることである。ガイド分子の特異性および活性は予測不可能であり得る。Ｃａｓ９編集のためのガイド分子は、有効性のばらつきが大きく、構造式に従う、他のいくつかのガイドは無効性であり得る。
【０００７】
Ｃａｓ９を用いた遺伝子編集のさらなる欠点は、ガイド分子が、標的アレルに対する選択性を持たない場合があることである。ゲノムにおける変異は、病状に寄与し得る。疾患の表現型に関連するいくつかのアレルが、遺伝医学において同定されている。特定のアレルを標的とできないことは、遺伝子編集における現在の方法の重要な欠点である。
【０００８】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムを用いた遺伝子編集の他の欠点は、オフターゲット変異の発生を含む。
【０００９】
遺伝子編集において、安定で有効なガイド分子、ならびに疾患の処置に使用する組成物および方法が必要とされている。
【００１０】
Ｃａｓ９を用いた遺伝子編集を誘導する新規分子、ならびにアレル選択性およびオフターゲット活性の減少に対して、緊急の必要性がある。
【発明の概要】
【００１１】
本発明は、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集に非常に効果的であり得るガイド分子を提供する。本発明の組成物および方法は、インビボ、エクスビボ(ex vivo)およびインビボ(in vitro)での遺伝子編集に使用され得る。
【００１２】
本発明はさらに、新規なアレル選択的ガイド分子によって誘導されたＣａｓ酵素を用いて、遺伝子を編集する方法を想定する。いくつかの実施態様において、本発明のガイド分子を用いて、オフターゲット変異の発生の減少を伴う、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムでの遺伝子編集を実行できる。
【００１３】
本発明のガイド分子は、Ｃａｓ９を用いた効率的な遺伝子編集を提供し得る。本発明のガイド分子は、遺伝子編集が、１以上のヌクレオチド多型に基づくアレル変異間を選択するのに有効であり得る。本開示のガイド分子のさらなる利点は、オフターゲット効果の減少を含む。
【００１４】
いくつかの実施態様において、本発明のガイド分子は、ゲノムＤＮＡの標的化、およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集を介する二本鎖切断の生成において、並外れた、驚くべきレベルのアレル選択性を示し得る。ある実施態様において、本発明のガイド分子は、オフターゲット活性の減少および遺伝子編集のより高い効率を提供し得る。
【００１５】
本発明はまた、任意の機構（ＮＨＥＪおよびＨＤＲ修復機構を含む）による遺伝子修復と共に、ガイド分子によって誘導されたＣａｓを用いて、遺伝子を編集する方法を想定する。
【００１６】
本発明のガイド分子は、Ｃａｓによって導かれる遺伝子工学の効率を、有利に増加し得る。
【００１７】
いくつかの実施態様において、本発明のガイド分子は、Ｃａｓ９によって導かれる遺伝子工学の効率を有利に増加し、ＮＨＥＪを介する標的変異を高頻度で提供し得る。
【００１８】
さらなる実施態様において、本発明のガイド分子は、Ｃａｓ９によって導かれる遺伝子工学の効率を有利に増加し、任意のゲノム標的において、ＨＤＲを用いて正確なＤＮＡ組み込みを提供し得る。
【００１９】
いくつかの態様において、本発明のガイド分子は、インビボにおけるＣａｓ９結合およびＤＮＡ切断を増強し得る。
【００２０】
本発明はさらに、様々な疾患および症状の治療薬として使用される、新規分子を提供する。本発明の分子は、様々な疾患および症状を改善、予防または処置する組成物における、医薬品有効成分として使用され得る。
【００２１】
いくつかの態様において、本発明は、リンカー基、鎖形成モノマー、非天然ヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、または化学修飾ヌクレオチドおよび特定の天然ヌクレオチドの様々な組合せを含み得る構造を有するガイド分子を提供する。これらのガイド分子は、ゲノムＤＮＡの標的化において、アレル選択性を示し得る。本開示は、オフターゲット変異の減少を伴うＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ遺伝子編集を実行するのに使用され得る、ガイド分子を提供する。
【００２２】
本発明の実施態様は、以下を含む：
【００２３】
ゲノムＤＮＡを標的とするガイド化合物であって、ｃｒＲＮＡと結合する１４〜２４個の連続するモノマーの標的ガイド鎖を含み、ゲノムＤＮＡのＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集を導く、ガイド化合物。
【００２４】
モノマーが、ＵＮＡモノマーおよび核酸モノマーを含み、ガイド化合物が、ゲノムＤＮＡのＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集を導くことを標的とする塩基配列を含む、上記ガイド化合物。
【００２５】
標的ガイド鎖の塩基配列が、ゲノムＤＮＡから最大で３つのミスマッチを有する、上記ガイド化合物。
【００２６】
１〜５個のＵＮＡモノマーを含む、上記ガイド化合物。
【００２７】
核酸モノマーが、天然ヌクレオチド、非天然ヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、化学修飾ヌクレオチドおよびそれらの組合せから選択される、上記ガイド化合物。
【００２８】
１以上の核酸モノマーが、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロリボヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチド、２’−デオキシリボヌクレオチド、２’−デオキシプリンヌクレオチド、ユニバーサル塩基ヌクレオチド、５−Ｃ−メチルヌクレオチド、逆位デオキシ脱塩基モノマー残基(inverted deoxyabasic monomer residue)、３’末端が安定化したヌクレオチド、３’−グリセリルヌクレオチド、３’−逆位脱塩基ヌクレオチド、３’−逆位チミジン、ロックド核酸ヌクレオチド（ＬＮＡ）、２’−Ｏ，４’−Ｃ−メチレン−（Ｄ−リボフラノシル）ヌクレオチド、２’−メトキシエトキシ（ＭＯＥ）ヌクレオチド、２’−メチル−チオ−エチル、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、２’，４’−拘束(Constrained)２’−Ｏ−メトキシエチル（ｃＭＯＥ）、２’−Ｏ−エチル（ｃＥｔ）、２’−アミノヌクレオチド、２’−Ｏ−アミノヌクレオチド、２’−Ｃ−アリルヌクレオチド、２’−Ｏ−アリルヌクレオチド、Ｎ６−メチルアデノシンヌクレオチド、修飾された塩基５−（３−アミノ）プロピルウリジンを有するヌクレオチド、修飾された塩基５−（２−メルカプト）エチルウリジンを有するヌクレオチド、修飾された塩基５−ブロモウリジンを有するヌクレオチド、修飾された塩基８−ブロモグアノシンを有するヌクレオチド、修飾された塩基７−デアザアデノシンを有するヌクレオチド、２’−Ｏ−アミノプロピル置換されたヌクレオチド、または２’−ＯＨ基を、２’−Ｒ、２’−ＯＲ、２’−ハロゲン、２’−ＳＲもしくは２’−アミノに置換したヌクレオチド（ここでＲは、Ｈ、アルキル、アルケニル、またはアルキニルであり得る）である、上記ガイド化合物。
【００２９】
ガイド化合物の各末端における、最後の３つのモノマーのうちの１つ以上が、ホスホロチオエート結合、キラルなホスホロチオエート結合またはホスホロジチオエート結合で連結されている、上記ガイド化合物。
【００３０】
ＴＴＲ、ＢＩＲＣ５、ＣＤＫ１６、ＳＴＡＴ３、ＣＦＴＲ、Ｆ９、ＫＲＡＳおよびＣＡＲから選択される遺伝子において、二本鎖切断を導く、上記ガイド化合物。
【００３１】
ゲノムＤＮＡが、標的疾患に関連する一塩基多型を含む、上記ガイド化合物。
【００３２】
疾患関連アレルにおいて、二本鎖切断を導く、上記ガイド化合物。
【００３３】
Ｖ３０Ｍ ＴＴＲ、Ｇ２８４Ｒ ＣｏｌＡ１、Ｌ１３２Ｐケラチン１２、Ｒ１３５Ｔケラチン１２、Ｇ８５Ｒ ＳＯＤ１、Ｇ２７２Ｖ Ｔａｕ、Ｐ３０１Ｌ Ｔａｕ、Ｖ３３７Ｍ Ｔａｕ、Ｒ４０６Ｗ Ｔａｕ、Ｑ３９ＳＴＯＰベータ−グロビン、Ｔ８９９３Ｇ／Ｃ ｍｔＤＮＡ、Ｇ７１９Ｓ ＥＧＦＲ、およびＧ１２Ｃ Ｋｒａｓから選択される疾患関連アレルにおいて、二本鎖切断を導く、上記ガイド化合物。
【００３４】
３０〜３００個の連続するモノマーを含む、上記ガイド化合物。
【００３５】
ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集がＣａｓ９を用いる、上記ガイド化合物。
【００３６】
オフターゲット活性の減少を伴って、遺伝子編集を導く、上記ガイド化合物。
【００３７】
疾患関連アレルにおいて、野生型としての同一のアレルよりも多くの二本鎖切断を導く、上記ガイド化合物。
【００３８】
ｔｒａｃｒＲＮＡとアニールした、上記ガイド化合物。
【００３９】
ｔｒａｃｒＲＮＡが、肺炎レンサ球菌(S. pneumonia)、化膿レンサ球菌(S.pyogenes)、髄膜炎菌(N.menigiditis)またはサーモフィラス菌(S.thermophiles)由来である、上記ガイド化合物。
【００４０】
ｔｒａｃｒＲＮＡとアニールし、ＣＲＩＳＰＲ関連遺伝子編集タンパク質と複合体を形成している、上記ガイド化合物。
【００４１】
ＣＲＩＳＰＲ関連遺伝子編集タンパク質がＣａｓ９である、上記ガイド化合物。
【００４２】
ゲノムＤＮＡを標的とするガイド化合物であって、ガイド化合物が、モノマー鎖であり、ゲノムＤＮＡのＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集を導き、ガイド化合物が標的ガイド鎖、ＣＲＩＳＰＲ ｃｒＤＮＡ、およびＣＲＩＳＰＲ ｔｒａｃｒＲＮＡを一本鎖として含み、ここで標的ガイド鎖が１４〜２４個の長さの連続するモノマーであり、モノマーがＵＮＡモノマーおよび核酸モノマーを含み、ガイド化合物が、ゲノムＤＮＡのＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集を導くことを標的とする塩基配列を含む、ガイド化合物。
【００４３】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体内において、遺伝子編集を導く、上記ガイド化合物。
【００４４】
１以上の上記ガイド化合物および薬学的に許容し得る担体を含む、医薬組成物。薬学的に許容し得る担体は、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターを含み得る。薬学的に許容し得る担体は、リポソームを含み得る。
【００４５】
本発明の実施態様は、細胞内ゲノムＤＮＡを編集する方法を含み、ここで細胞は、誘導性または構成的ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集酵素を含み、該方法は、細胞を上記組成物と接触させることを含む。
【００４６】
編集が、ＤＮＡを破壊し、またはＤＮＡの転写を抑制する、上記方法。編集が、オフターゲット活性の減少を伴って達成される、上記方法。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集酵素が、上記組成物と同時に導入される、上記方法。
【００４７】
本発明は、インビボにおいて、対象におけるゲノムＤＮＡを編集する方法を含み、ここで対象は、誘導性または構成的ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集酵素を含み、該方法は、対象に上記組成物を投与することを含む。編集は、ＤＮＡを破壊し得、またはＤＮＡの転写を抑制し得る。編集は、オフターゲット活性の減少を伴って達成され得る。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集酵素は、上記組成物と同時に導入され得る。
【００４８】
本発明はさらに、それを必要とする対象において、標的ゲノムＤＮＡに関連する疾患を予防、処置または改善する方法を想定し、ここで対象は、誘導性または構成的ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集酵素を含み、該方法は、対象に上記組成物を投与することを含む。
【００４９】
いくつかの実施態様において、本方法は、それを必要とする対象における、疾患もしくは症状の予防、改善もしくは処置のための、上記組成物の使用、医学療法における使用、ヒトもしくは動物の身体の処置における使用、またはそれを必要とする対象における疾患もしくは症状を予防、改善もしくは処置する薬物の調製もしくは製造のための上記組成物の使用、を記述する。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】図１は、「単一のガイド」構造体を含む、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ遺伝子編集複合体を示す。
【００５１】
【図２】図２は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ遺伝子編集複合体を示す。
【００５２】
【図３】ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９におけるＵ−ガイド分子を用いた、トランスサイレチン（ＴＴＲ）ゲノム部位の、アレル選択的遺伝子編集。図３は、Ｕ−ガイド分子ＵＮＡ１およびＵＮＡ２が、２７５ｂｐおよび８２ｂｐの生成物の出現によって示される所定の位置において、３５７ｂｐのゲノムＴＴＲ ＤＮＡの切断を導いたことを示す。図３に示されるように、本発明のＵ−ガイド分子は、野生型ＴＴＲと比較して、ヒトＶ３０Ｍ ＴＴＲの、驚くほど高いアレル選択性の遺伝子編集を示した。これは、オフターゲット活性を減少させる能力を示す。さらに、同様の条件下において、Ｕ−ガイド分子と同一の核酸塩基配列および構造を持つが、ＵＮＡモノマーを持たない、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ｃｒ／ｔｒａｃｒ比較ガイド（ｇＲＮＡ）は、野生型ＴＴＲと比較して、ヒトＶ３０Ｍ ＴＴＲにおける、いくらかの選択性を示した。
【００５３】
【図４】図４は、本発明のＵ−ガイド分子ＵＮＡ１およびＵＮＡ２が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムにおいて、野生型ＴＴＲと比較して、Ｖ３０Ｍ ＴＴＲの選択的な編集を与えたことを示す。Ｕ−ガイド分子ＵＮＡ１およびＵＮＡ２は、Ｖ３０Ｍ ＴＴＲ（模様のあるバー）において、高いレベルの二本鎖切断を生成したが、野生型ＴＴＲ（黒色のバー）では、驚くほどわずかな二本鎖切断を生じた。したがって、本発明のＵ−ガイド分子ＵＮＡ１およびＵＮＡ２は、ヒトＴＴＲのアレル選択的な遺伝子編集に非常に有効であった。これは、オフターゲット活性を減少させる能力を示す。負の対照は、ＣＲＩＳＰＲ／ｔｒａｃｒガイドを含んでいなかった。
【００５４】
【図５】本発明のＵ−ガイド分子は、ヒトＴＴＲのアレル選択的な遺伝子編集に使用され得る。ヒトＴＴＲの遺伝子編集における、驚くべきレベルのアレル選択性を、図５に示す。Ｕ−ガイド分子ＵＮＡ１およびＵＮＡ２はそれぞれ、８．７および９．５の高い選択性比を与えた。これは、オフターゲット活性を減少させる能力を示す。さらに、同様の条件下において、Ｕ−ガイド分子と同一の核酸塩基配列および構造を有するが、いかなるＵＮＡモノマーも持たない、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ｃｒ／ｔｒａｃｒガイド（ｇＲＮＡ）は、１．４の選択性比を示した。したがって、Ｕ−ガイド分子ＵＮＡ１およびＵＮＡ２は、野生型ＴＴＲと比較して、Ｖ３０Ｍ ＴＴＲのアレル選択性を有する、ヒトＴＴＲの遺伝子編集に、非常に有効であった。
【００５５】
【図６】図６は、配列トレース分解(sequence trace decomposition)（ＴＩＤＥ）によるＶ３０Ｍ ＴＴＲのゲノム編集の評価のための、比較用ｇＲＮＡガイド（非ＵＮＡガイド構造）のインデルスペクトルを示す。
【００５６】
【図７】図７は、配列トレース分解（ＴＩＤＥ）によるＶ３０Ｍ ＴＴＲのゲノム編集の評価のための、ＵＮＡガイド（ＵＮＡ１）のインデルスペクトルを示す。
【００５７】
【図８】図８は、配列トレース分解（ＴＩＤＥ）による野生型ＴＴＲのゲノム編集の評価のための、比較用ｇＲＮＡガイド（非ＵＮＡガイド構造）のインデルスペクトルを示す。
【００５８】
【図９】図９は、配列トレース分解（ＴＩＤＥ）による野生型ＴＴＲのゲノム編集の評価のための、ＵＮＡガイド（ＵＮＡ１）におけるインデルスペクトルを示す。
【００５９】
【図１０】ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９におけるＵ−ガイド分子を用いた、トランスサイレチン（ＴＴＲ）ゲノム部位のアレル選択的遺伝子編集。図１０は、Ｕ−ガイド分子ＵＮＡ３が、２７１ｂｐおよび８６ｂｐの生成物の出現によって示される所定の位置において、３５７ｂｐのゲノムＴＴＲ ＤＮＡの切断を導いたことを示す。図１０に示されるように、本発明のＵ−ガイド分子は、野生型ＴＴＲと比較して、ヒトＶ３０Ｍ ＴＴＲのアレル選択的な遺伝子編集を示した。これは、オフターゲット活性を減少させる能力を示す。さらに、同様の条件下において、Ｕ−ガイド分子と同一の核酸塩基配列および構造を持つが、いかなるＵＮＡモノマーも持たない、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓガイド（ｇＲＮＡ）は、いくらかの選択性を示した。
【００６０】
【図１１】図１１は、本発明のＵ−ガイド分子ＵＮＡ３が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムにおいて、野生型ＴＴＲと比較して、Ｖ３０Ｍ ＴＴＲの選択的な編集を与えたことを示す。Ｕ−ガイド分子ＵＮＡ３は、Ｖ３０Ｍ ＴＴＲ（模様のあるバー）において、高いレベルの二本鎖切断を生成したが、野生型ＴＴＲ（黒色のバー）では、驚くほどわずかな二本鎖切断を生じた。したがって、本発明のＵ−ガイド分子ＵＮＡ３は、ヒトＴＴＲのアレル選択的な遺伝子編集に非常に有効であった。これは、オフターゲット活性を減少させる能力を示す。負の対照は、ＣＲＩＳＰＲ／ｔｒａｃｒガイドを含んでいなかった。
【００６１】
【図１２】本発明のＵ−ガイド分子は、ヒトＴＴＲのアレル選択的な遺伝子編集に使用され得る。ヒトＴＴＲの遺伝子編集における、驚くべきレベルのアレル選択性を、図１２に示す。Ｕ−ガイド分子ＵＮＡ３は、４．７の高い選択性比を与えた。これは、オフターゲット活性を減少させる能力を示す。さらに、同様の条件下において、Ｕ−ガイド分子と同一の核酸塩基配列および構造を有するが、いかなるＵＮＡモノマーも持たない、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ガイド（ｇＲＮＡ）は、１．３の選択性比を示した。したがって、Ｕ−ガイド分子ＵＮＡ３は、野生型ＴＴＲと比較して、Ｖ３０Ｍ ＴＴＲのアレル選択性を有する、ヒトＴＴＲの遺伝子編集に、非常に有効であった。
【００６２】
【図１３】図１３は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の構造の略図を示す。ＳｃＦｖは単鎖可変フラグメントである。ＶＨは重鎖可変領域である。ＶＬは軽鎖可変領域である。ＴＭは膜貫通ドメインである。ＳＤはシグナル伝達ドメインである。
【００６３】
【図１４】図１４は、ＣＡＲ遺伝子を、Ｔ細胞の構成的ＣＤ２遺伝子内に導入する方法の模式図を示し、ＣＡＲはＣＤ２の下流にある。二本鎖切断を、本発明のＵ−ガイド分子を用いて作成する。相同組換えで挿入した遺伝子は、Ｐ２ＡおよびＣＡＲの区分と共に、ＣＤ２の区分から構成され得る。Ｐ２Ａペプチドは、２つの別々の遺伝子産物であるＣＤ２タンパク質およびＣＡＲタンパク質を生成するのに使用され得る、自己切断ペプチドである。ＣＡＲタンパク質受容体は、養子免疫療法の戦略において、対象のがん細胞に対するｍＡｂの特異性を保有し、対象のがん細胞を死滅させ得る。
【００６４】
【図１５】図１５は、ＣＡＲ遺伝子を、Ｔ細胞の構成的ＣＤ２遺伝子内に導入する方法の模式図を示し、ＣＡＲはＣＤ２の上流にある。
【発明を実施するための形態】
【００６５】
本発明は、遺伝子編集および治療応用に用いられる、様々な新規薬剤および組成物を提供する。本発明の分子は、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集様式を考慮した組成物のための、ガイド成分として使用され得る。本発明の分子および組成物は、遺伝子およびその機能性に関連する様々な疾患を改善、予防または処置するのに使用され得る。
【００６６】
本発明のガイド分子は、Ｃａｓ９、Ｃａｓ９および他の遺伝子編集酵素を用いた、効率的な遺伝子編集を提供し得る。
【００６７】
本発明のガイド分子は、ヒト遺伝子を遺伝子編集するのに有効であり得る。ガイド分子は、ｔｒａｃｒＲＮＡと結合またはアニールし、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集におけるガイド／ｔｒａｃｒ分子を提供し得る。
【００６８】
本発明のガイド／ｔｒａｃｒ分子は、ゲノムＤＮＡの編集において、インビトロ、インビボまたはエクスビボで、細胞内に送達および遺伝子導入され得る。
【００６９】
本発明のガイド分子は、アレル選択的な結果を伴う、ヒト遺伝子の遺伝子編集に驚くほど活性であり得る。
【００７０】
いくつかの実施態様において、本発明のガイド分子は、ゲノムＤＮＡの遺伝子編集および二本鎖切断の生成において、並外れた、驚くべきレベルのアレル選択性を示す。これは、オフターゲット活性を有利に減少させる能力を示す。
【００７１】
いくつかの態様において、ゲノムＤＮＡに二本鎖切断を生成する能力は、細胞内のＤＮＡ発現を変化、調節または減少させる能力を含む。
【００７２】
細胞は、真核細胞、哺乳類細胞またはヒト細胞であり得る。
【００７３】
本発明のガイド分子は、ヒトゲノムＤＮＡのアレル選択的遺伝子編集に使用され得る。本開示は、オフターゲット変異の減少を伴うＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ遺伝子編集を実行するのに使用され得る、ガイド分子を提供する。
【００７４】
ある実施態様において、本発明のガイド分子は、オフターゲット効果の減少を伴う、対応野生型アレルより優先されるヒトバリアントアレルのアレル選択的な遺伝子編集に、使用され得る。
【００７５】
ある実施態様において、本発明のガイド分子は、編集効率によって測定される少なくとも３０％の選択性を伴う、対応野生型アレルより優先される、ヒト遺伝子バリアントアレルのアレル選択的な遺伝子編集に、使用され得る。
【００７６】
ある実施態様において、本発明のガイド分子は、編集効率によって測定される少なくとも４０％の選択性を伴う、対応野生型アレルより優先される、ヒト遺伝子バリアントアレルのアレル選択的な遺伝子編集に、使用され得る。
【００７７】
ある実施態様において、本発明のガイド分子は、編集効率によって測定される少なくとも２の選択性比を伴う、対応野生型アレルより優先される、ヒト遺伝子バリアントアレルのアレル選択的な遺伝子編集に、使用され得る。
【００７８】
ある実施態様において、本発明のガイド分子は、編集効率によって測定される少なくとも３の選択性比を伴う、対応野生型アレルより優先される、ヒト遺伝子バリアントアレルのアレル選択的な遺伝子編集に、使用され得る。
【００７９】
ある実施態様において、本発明のガイド分子は、編集効率によって測定される少なくとも５の選択性比を伴う、対応野生型アレルより優先される、ヒト遺伝子バリアントアレルのアレル選択的な遺伝子編集に、使用され得る。
【００８０】
ある実施態様において、本発明のガイド分子は、編集効率によって測定される少なくとも８の選択性比を伴う、対応野生型アレルより優先される、ヒト遺伝子バリアントアレルのアレル選択的な遺伝子編集に、使用され得る。
【００８１】
比較において、同一の条件下で、１の選択性比を有するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ガイドは、選択性を持たないことを示す。
【００８２】
ある実施態様において、本発明のガイド分子は、野生型アレルに対するオフターゲット活性を本質的に有さない、対応野生型アレルに対してヒト遺伝子バリアントアレルにアレル選択的な遺伝子編集に、使用され得る。
【００８３】
ある実施態様において、本発明のガイド分子は、野生型アレルに対する１％未満のオフターゲット活性を有する、対応野生型アレルに対してヒト遺伝子バリアントアレルにアレル選択的な遺伝子編集に、使用され得る。
【００８４】
ある実施態様において、本発明のガイド分子は、野生型アレルに対する３％未満のオフターゲット活性を有する、対応野生型アレルに対してヒト遺伝子バリアントアレルにアレル選択的な遺伝子編集に、使用され得る。
【００８５】
本発明のガイド化合物の性質は、その分子構造に従って生じ、その分子構造全体は、全体として、その性質に基づく実質的な利益を提供し得る。本発明の実施態様は、Ｃａｓ９を用いた遺伝子編集における有効性の増強を有利に与える、１以上の性質を有するガイド分子、ならびに様々な疾患および症状の治療薬における組成物または製剤を提供し得、これらは臨床薬を提供し得る。
【００８６】
広範な新規ガイド分子を本明細書において提供し、これらはそれぞれ、特殊なリンカー基を包含し得る。リンカー基は、ガイド分子内の鎖に結合し得る。各リンカー基はまた、核酸塩基に結合し得る。
【００８７】
いくつかの態様において、リンカー基はモノマーであり得る。モノマーは結合し、鎖状分子を形成し得る。本発明の鎖状分子において、リンカー基のモノマーは、鎖内の任意の点において結合し得る。
【００８８】
ある態様において、リンカー基のモノマーを、鎖の末端付近に存在するように、本発明の鎖状分子と結合させてもよい。鎖状分子の末端を、リンカー基のモノマーで形成してもよい。
【００８９】
本明細書において、鎖状分子はオリゴマーとも呼ばれ得る。
【００９０】
さらなる態様において、鎖状分子の各リンカー基を、核酸塩基と結合させてもよい。鎖状分子内の核酸塩基の存在は、核酸塩基配列を提供し得る。
【００９１】
ある実施態様において、本発明は、リンカー基のモノマーと、特定の天然ヌクレオチド、非天然ヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、または化学修飾ヌクレオチドとの、新規の組合せを包含する鎖状構造を有する、オリゴマーガイド分子を提供する。
【００９２】
本発明のオリゴマーガイド分子は、遺伝子の少なくとも一部を標的とする、核酸塩基配列を示し得る。いくつかの実施態様において、オリゴマーは、多数のバリアント間で保存または高度に保存された、遺伝子の少なくとも一部を標的とし得る。
【００９３】
いくつかの態様において、本発明は、核酸分子の少なくともフラグメントに対応し、または相補的であり、細胞内に存在する少なくともそのようなフラグメントの編集を与える、有効なオリゴマーガイド分子を提供する。
【００９４】
いくつかの実施態様において、細胞は、真核細胞、哺乳類細胞またはヒト細胞であり得る。
【００９５】
本発明は、リンカー基モノマーを包含する、オリゴマーガイド薬の構造、方法および組成物を提供する。本発明のオリゴマーガイド分子は、遺伝子編集治療の製剤における有効成分として使用され得る。
【００９６】
本発明は、遺伝子編集におけるその活性のために、治療効果を与えるのに有用な、多様なガイド分子を提供する。本発明のガイド分子は、インビトロ、エクスビボおよびインビボにおいて遺伝子編集活性を与えるように、構築される。
【００９７】
本発明のガイド分子は、あらゆるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに使用され得る。
【００９８】
ある実施態様において、有効なガイド分子は、モノマーから構成されるオリゴマーとして構築され得る。本発明のオリゴマー構造は、特定のヌクレオチドと共に、１以上のリンカー基モノマーを含み得る。
【００９９】
いくつかの態様において、本発明は、Ｃａｓ９タンパク質および真核細胞の遺伝子を標的とする１以上のガイド分子を有する、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを提供する。
【０１００】
本発明のガイド分子は、ｃｒｉｓｐｒ−ｔｒａｃｒ配列と融合したガイド配列を有し得る。
【０１０１】
さらなる態様において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、遺伝子標的のＤＮＡの一方または両方の鎖を切断するのに使用され得る。
【０１０２】
ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集酵素（例えばＣａｓ９タンパク質）は、特に、肺炎レンサ球菌、化膿レンサ球菌（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ９９ＺＷ２；ＣＡＳ９＿ＳＴＲＰ１）、髄膜炎菌およびサーモフィラス菌(S.thermophilus)に由来し得る。
【０１０３】
ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集酵素は、コリネバクテリウム属、ステレラ属、レジオネラ属、トレポネーマ(Treponemna)属、フィリファクター属(Filifactor)、ユーバクテリウム属、ストレプトコッカス属、ラクトバチルス属、マイコプラズマ属、バクテロイデス属、フラビイボラ属(Flaviivola)、フラボバクテリウム属、スフェロケタ属(Sphaerochaeta)、アゾスピリルム属(Azospirillumn)、グルコンアセトバクター属、ナイセリア属、ロゼブリア属、パルビバクラム属(Parvibaculum)、スタフィロコッカス属、ニトラティフラクター属(Nitratifractor)、マイコプラズマ属およびカンピロバクター属を含む属に由来し得る。
【０１０４】
本発明の実施態様は、遺伝子産物の発現を変化、調節または減少させる方法を含み得る。いくつかの実施態様において、真核細胞は、標的配列を有するＤＮＡ分子を含んでもよく、発現していてもよく、このＤＮＡは遺伝子産物をコードするものである。細胞に、遺伝子操作された、天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）システム（標的配列とハイブリダイズしている、本発明の誘導性または構成的ガイド分子を含む）を遺伝子導入してもよい。ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）システムはさらに、誘導性または構成的ＩＩ型Ｃａｓ９タンパク質を含み得る。ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）システムはさらに、１以上の核局在シグナルを含み得る。ガイド分子は、標的配列の場所を見つけ出し、Ｃａｓタンパク質がＤＮＡを切断するのを導き得、遺伝子産物の発現を変化させ得る。Ｃａｓタンパク質およびガイド分子は共に、天然に存在しない。
【０１０５】
哺乳類細胞において１以上の配列の発現を与えるベクターは、当分野で公知である。
【０１０６】
Ｃａｓタンパク質のいくつかの例は、Ｃａｓ１、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、およびＣａｓ９を含む。
【０１０７】
ＣＲＩＳＰＲ関連遺伝子編集タンパク質は、Ｃａｓタンパク質を含み得る。
【０１０８】
ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集システムは、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質をコードする遺伝子、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびガイド鎖の発現に関与し、またはこれらの活性を導く、ポリヌクレオチド、転写物および部分を含み得る。ＣＲＩＳＰＲシステムは、内在性ＣＲＩＳＰＲシステムを有する特定の生物（化膿レンサ球菌など）に由来し得る。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集システムは、標的ＤＮＡ配列の部位において、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進し得る。
【０１０９】
Ｃａｓ９タンパク質は、修飾もしくは変異されてもよく、または真核細胞における発現が改善された、ホモログもしくはオーソログであってもよい。Ｃａｓ９タンパク質は、ヒトコドン最適化され得る。いくつかの実施態様において、対形成したガイド分子を用いて、対形成したＣａｓ９ニッカーゼと共に、ｄｓＤＮＡの異なる鎖を標的としてもよい。Ｃａｓニッカーゼの対による両方のＤＮＡ鎖の切断を用いて、部位特異的な二本鎖切断を作成することができ、これは編集の効率を減少させることなく、オフターゲット効果を減少させ得る。
【０１１０】
本発明のガイド分子は、ガイド鎖を含み得、これは標的ガイド鎖とも呼ばれ得る。ガイド鎖は、モノマー鎖から構成され得、各モノマーは、結合した核酸塩基を有し得る。ガイド鎖は塩基配列を有し得、これは標的配列とハイブリダイズするのに十分な標的ポリヌクレオチド配列に対する相補性を有する。ガイド鎖は、ＣＲＩＳＰＲ複合体と標的配列との配列特異的な結合を導き得る。
【０１１１】
本発明のガイド分子は、標的配列とハイブリダイズするのに十分な標的ポリヌクレオチド配列に対する相補性を有する塩基配列を有する、ガイド鎖を含み得る。ガイド分子はさらに、ガイド鎖と結合したＣＲＩＳＰＲの一部またはｃｒＲＮＡを含み得、ｃｒＲＮＡはｔｒａｃｒＲＮＡと結合し、ＣＲＩＳＰＲ複合体の標的配列への配列特異的な結合を導き得る。したがって、ガイド分子は、ガイド分子を形成する、ｃｒＲＮＡと結合したガイド鎖であり得る。
【０１１２】
いくつかの実施態様において、本発明は「単一ガイド」の実施態様を含む。この実施態様では、標的配列とハイブリダイズするのに十分な標的ポリヌクレオチド配列に対する相補性を有するガイド鎖が、ｃｒＲＮＡ配列と結合し、これがさらにｔｒａｃｒＲＮＡ配列と結合して「単一ガイド分子」を形成している。ここで、単一ガイド分子は、ＣＲＩＳＰＲ複合体の標的配列への配列特異的な結合を導き得る。「単一ガイド」の実施態様の例を図１に示す。
【０１１３】
本発明のガイド分子、ｃｒＲＮＡ、ガイド鎖またはｔｒａｃｒＲＮＡは、１以上の非天然ヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、または化学修飾ヌクレオチドを含み得る。
【０１１４】
いくつかの実施態様において、ガイド分子は、２０〜１２０塩基またはそれ以上の長さであり得る。ある実施態様において、ガイド分子は、２０〜６０塩基、２０〜５０塩基、３０〜５０塩基または３９〜４６塩基であり得る。
【０１１５】
ある実施態様において、ポリヌクレオチド標的配列は、５〜１００塩基、５〜５０塩基、５〜３０塩基、５〜２５塩基、５〜２４塩基、５〜２３塩基、５〜２２塩基、５〜２１塩基、５〜２０塩基、５〜１９塩基、または５〜１８塩基であり得る。
【０１１６】
ある実施態様において、ポリヌクレオチド標的配列は、１８〜３０塩基、１８〜２４塩基または１８〜２２塩基であり得る。
【０１１７】
さらなる実施態様において、ポリヌクレオチド標的配列は、１６塩基、１７塩基、１８塩基、１９塩基、２０塩基、２１塩基、２２塩基、２３塩基、２４塩基、２５塩基、２６塩基、２７塩基、２８塩基、２９塩基、３０塩基、３１塩基、３２塩基、３３塩基、３４塩基または３５塩基であり得る。
【０１１８】
さらなる実施態様において、単一ガイド分子は、４０〜２００塩基またはそれ以上の長さであり得る。
【０１１９】
ガイド配列が、ＣＲＩＳＰＲ複合体の標的配列への配列特異的な結合を導く性質は、当分野で公知の任意のアッセイで決定され得る。
【０１２０】
本発明はさらに、１以上のベクターまたは１以上のその転写物を、細胞ならびに作製した細胞および生物に送達する方法を想定する。
【０１２１】
いくつかの実施態様において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体の成分（ガイド分子を含む）は、インビトロ、エクスビボまたはインビボにおいて、細胞に送達され得る。当分野で公知のウイルスおよび非ウイルス導入法を用いて、核酸を哺乳類細胞に導入してもよい。核酸を、薬学的に許容し得る担体を用いて送達してもよく、または例えば、リポソームに封入してもよい。
【０１２２】
標的配列は、真核生物において内在性または外来性の、任意のポリヌクレオチド配列であり得る。標的ポリヌクレオチドは、コード配列または非コード配列であり得る。標的配列は、当分野で公知のように、ＰＡＭ配列を伴ってもよい。
【０１２３】
標的配列は、当分野で確立されているように、任意の疾患関連ポリヌクレオチドまたは遺伝子であり得る。
【０１２４】
本発明はさらに、ポリヌクレオチドまたは遺伝子における切断を修復する方法および組成物を想定する。
【０１２５】
いくつかの実施態様において、ポリヌクレオチドまたは遺伝子における切断を、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によって修復し、ランダムな挿入および欠失を生成してもよい。この方法は、修復された標的遺伝子から発現するタンパク質の構造において、１以上の変化をもたらし得る。
【０１２６】
さらなる実施態様において、ポリヌクレオチドまたは遺伝子における切断を、外来性鋳型ポリヌクレオチドを用いて、相同組換え修復（ＨＤＲ）によって修復し、制御された挿入、欠失および置換を生成してもよい。この方法は、修復された標的遺伝子から発現するタンパク質の構造において、１以上の変化をもたらし得る。
【０１２７】
ポリヌクレオチドまたは遺伝子における切断の修復を、当分野で公知のように、センスまたはアンチセンスの一本鎖オリゴヌクレオチドを修復の鋳型として用いて、実行してもよい。
【０１２８】
アレル選択的な実施態様およびオフターゲットの減少
【０１２９】
本発明はさらに、ゲノムＤＮＡの遺伝子編集および二本鎖切断の生成のための、アレル選択的であるガイド分子を想定する。
【０１３０】
いくつかの態様において、本発明のガイド分子は、オフターゲット活性の減少を伴う、遺伝子編集に使用され得る。
【０１３１】
さらなる態様において、本発明のガイド分子は、野生型アレルに対するオフターゲット活性を本質的に伴わない、対応野生型アレルより優先されるヒト遺伝子バリアントアレルの遺伝子編集に、使用され得る。
【０１３２】
ある実施態様において、本発明のガイド分子は、野生型アレルに対する１％未満のオフターゲット活性を伴う、対応野生型アレルより優先されるヒト遺伝子バリアントアレルのアレル選択的な遺伝子編集に、使用され得る。
【０１３３】
ある実施態様において、本発明のガイド分子は、野生型アレルに対する３％未満のオフターゲット活性を伴う、対応野生型アレルより優先されるヒト遺伝子バリアントアレルのアレル選択的な遺伝子編集に、使用され得る。
【０１３４】
本発明のアレル選択的なガイド分子は、ガイド鎖を含み得る。ガイド鎖は、モノマー鎖から構成され得、各モノマーは、結合した核酸塩基を有し得る。ガイド鎖は塩基配列を有し得、これは標的配列とハイブリダイズするのに十分な標的ポリヌクレオチド配列に対する相補性を有する。ガイド鎖は、ＣＲＩＳＰＲ複合体の標的配列への配列特異的な結合を導き得る。
【０１３５】
オフターゲット効果の減少を有する、本発明のガイド分子は、ガイド鎖を含み得る。ガイド鎖は、モノマー鎖から構成され得、各モノマーは、結合した核酸塩基を有し得る。ガイド鎖は塩基配列を有し得、これは標的配列とハイブリダイズするのに十分な標的ポリヌクレオチド配列に対する相補性を有する。ガイド鎖は、ＣＲＩＳＰＲ複合体の標的配列への配列特異的な結合を導き得る。
【０１３６】
本発明のアレル選択的なガイド分子は、標的配列とハイブリダイズするのに十分な標的ポリヌクレオチド配列に対する相補性を有する塩基配列を有する、ガイド鎖を含み得る。ガイド分子はさらに、ガイド鎖と結合した、ＣＲＩＳＰＲの一部またはｃｒＲＮＡを含み得、ｃｒＲＮＡはｔｒａｃｒＲＮＡと結合し得、ＣＲＩＳＰＲ複合体と標的配列との配列特異的な結合を導き得る。したがって、ガイド分子は、ガイド分子を形成する、ｃｒＲＮＡと結合したガイド鎖であり得る。
【０１３７】
オフターゲット効果の減少を示す、本発明のガイド分子は、標的配列とハイブリダイズするのに十分な標的ポリヌクレオチド配列に対する相補性を有する塩基配列を有する、ガイド鎖を含み得る。ガイド分子はさらに、ガイド鎖と結合した、ＣＲＩＳＰＲの一部またはｃｒＲＮＡを含み得、ｃｒＲＮＡはｔｒａｃｒＲＮＡと結合し得、ＣＲＩＳＰＲ複合体と標的配列との配列特異的な結合を導き得る。したがって、ガイド分子は、ガイド分子を形成する、ｃｒＲＮＡと結合したガイド鎖であり得る。
【０１３８】
いくつかの実施態様において、本発明はアレル選択的な「単一ガイド」の実施態様を含む。この実施態様では、標的配列とハイブリダイズするのに十分な標的ポリヌクレオチド配列に対する相補性を有するガイド鎖が、ｃｒＲＮＡ配列と結合し、これがさらにｔｒａｃｒＲＮＡ配列と結合して「単一ガイド分子」を形成している。ここで、単一ガイド分子は、ＣＲＩＳＰＲ複合体の標的配列への配列特異的な結合を導き得る。
【０１３９】
本発明のガイド分子の標的ポリヌクレオチド配列の例を表１に示す。表１の標的ポリヌクレオチド配列は、特定のヒト遺伝子における一塩基多型を示し、これは疾患に関連する。
【表１−１】
0006799058.tif 000002
【表１−２】
0006799058.tif 000003
【０１４０】
表１において、単一のヌクレオチドアレル変異の位置に下線を引く。
【表２】
0006799058.tif 000004
【０１４１】
本発明は、ヒト遺伝子の疾患に関連した一塩基多型の遺伝子編集および二本鎖切断の生成のための、アレル選択的なガイド分子を想定する。
【０１４２】
本発明はさらに、オフターゲット活性の減少を伴う、ヒト遺伝子の疾患に関連した一塩基多型の遺伝子編集および二本鎖切断の生成のための、ガイド分子を想定する。
【０１４３】
本発明のアレル選択的なガイド分子は、ガイド鎖を含み得る。ガイド鎖は、モノマー鎖から構成され得、各モノマーは、結合した核酸塩基を有し得る。ガイド鎖は塩基配列を有し得、これは、一塩基多型を含む標的ポリヌクレオチド配列と十分な相補性を有し、標的配列とハイブリダイズする。ガイド鎖は、ＣＲＩＳＰＲ複合体の標的配列への配列特異的な結合を導き得る。
【０１４４】
本発明のアレル選択的ガイド分子は、標的配列とハイブリダイズするのに十分な一塩基多型を含む標的ポリヌクレオチド配列に対する相補性を有する塩基配列を有する、ガイド鎖を含み得る。ガイド分子はさらに、ガイド鎖と結合した、ＣＲＩＳＰＲの一部またはｃｒＲＮＡを含み得、ｃｒＲＮＡはｔｒａｃｒＲＮＡと結合し得、ＣＲＩＳＰＲ複合体と標的配列との配列特異的な結合を導き得る。したがって、ガイド分子は、ガイド分子を形成する、ｃｒＲＮＡと結合したガイド鎖であり得る。
【０１４５】
いくつかの実施態様において、本発明はアレル選択的な「単一ガイド」の実施態様を含む。この実施態様では、標的配列とハイブリダイズするのに十分な、一塩基多型を含む標的ポリヌクレオチド配列に対する相補性を有するガイド鎖が、ｃｒＲＮＡ配列と結合し、これがさらにｔｒａｃｒＲＮＡ配列と結合して「単一ガイド分子」を形成している。ここで、単一ガイド分子は、ＣＲＩＳＰＲ複合体の標的配列への配列特異的な結合を導き得る。
【０１４６】
ＴＴＲの実施態様
【０１４７】
トランスサイレチンに関連するアミロイドーシス（ＡＴＴＲ）は、様々な臓器および組織（末梢神経系、自律神経系および中枢神経系を含む）におけるアミロイド線維タンパク質の沈着を含む。トランスサイレチンは、血漿および脳脊髄液中の血清サイロキシンおよびレチノール結合タンパク質を結合および輸送する、分泌型チラコイドホルモン結合タンパク質である。
【０１４８】
ＡＴＴＲの病態は、多くのＴＴＲ変異を含み得る。ＡＴＴＲの症状は、神経障害および／または心筋症を含むことが多い。末梢神経障害は、運動感覚性神経障害を伴って、脚において始まり得、腕まで進行し得る。自律神経障害は、胃腸症状および起立性低血圧によって現れ得る。
【０１４９】
最も一般的な変異である、ＴＴＲ遺伝子Ｖａｌ−３０−Ｍｅｔを有する患者は、正常な心エコー図を有する。しかしながら、この患者は、伝導系の異常を有し得、ペースメーカーを必要とし得る。ＡＴＴＲ Ｖ３０Ｍバリアントは、脚の衰弱、疼痛および感覚障害ならびに自律神経機能障害を生じ得る。硝子体および不透明体のアミロイド沈着は、ＡＴＴＲの特徴であり得る。
【０１５０】
本発明のＵ−ガイド分子は、ヒトＴＴＲの遺伝子編集に有効であり得る。Ｕ−ガイド分子は、ｔｒａｃｒＲＮＡと結合またはアニールし、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集におけるＵ−ガイド／ｔｒａｃｒ分子を与え得る。
【０１５１】
本発明のＵ−ガイド／ｔｒａｃｒ分子は、ゲノムＤＮＡの編集において、インビトロ、インビボまたはエクスビボで、細胞に送達および遺伝子導入され得る。
【０１５２】
本発明のＵ−ガイド分子は、アレル選択的な結果を伴うヒトＴＴＲの遺伝子編集に驚くほど有効であり得る。
【０１５３】
いくつかの実施態様において、本発明のＵ−ガイド分子は、オフターゲット活性の減少を伴うヒトＴＴＲの遺伝子編集に有効であり得る。
【０１５４】
いくつかの実施態様において、本発明のＵ−ガイド分子は、野生型ＴＴＲと比較して、Ｖ３０Ｍ ＴＴＲにおける二本鎖切断の生成について、並外れた、驚くべきレベルのアレル選択性を示す。
【０１５５】
本発明のＵ−ガイド分子は、ヒトＴＴＲのアレル選択的な遺伝子編集に用いられ得る。
【０１５６】
さらなる実施態様において、本発明のＵ−ガイド分子は、少なくとも３の選択性比を伴う、野生型ＴＴＲより優先されるヒトＶ３０Ｍ ＴＴＲのアレル選択的な遺伝子編集に、使用され得る。
【０１５７】
さらなる実施態様において、本発明のＵ−ガイド分子は、少なくとも５の選択性比を伴う、野生型ＴＴＲより優先されるヒトＶ３０Ｍ ＴＴＲのアレル選択的な遺伝子編集に、使用され得る。
【０１５８】
さらなる実施態様において、本発明のＵ−ガイド分子は、少なくとも８の選択性比を伴う、野生型ＴＴＲより優先されるヒトＶ３０Ｍ ＴＴＲのアレル選択的な遺伝子編集に、使用され得る。
【０１５９】
直接的な比較において、同一の条件下で、Ｕ−ガイド分子と同一の核酸塩基配列および構造を有するが、いかなるＵＮＡモノマーも持たない、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ガイドは、約１、または２未満の選択性比を有し得る。
【０１６０】
さらなる態様において、本発明のＵ−ガイド分子は、野生型アレルに対するオフターゲット活性を本質的に有さない、野生型ＴＴＲより優先されるヒトＶ３０Ｍ ＴＴＲの遺伝子編集に、使用され得る。
【０１６１】
ある実施態様において、本発明のＵ−ガイド分子は、野生型アレルに対する１％未満のオフターゲット活性を有する、野生型ＴＴＲより優先されるヒトＶ３０Ｍ ＴＴＲの遺伝子編集に、使用され得る。
【０１６２】
ある実施態様において、本発明のＵ−ガイド分子は、野生型アレルに対する３％未満のオフターゲット活性を有する、野生型ＴＴＲより優先されるヒトＶ３０Ｍ ＴＴＲの遺伝子編集に、使用され得る。
【０１６３】
Ｕ−ガイド分子
【０１６４】
本発明はさらに、Ｃａｓ９を用いた遺伝子編集に非常に有効であり得る、Ｕ−ガイド分子を提供する。本発明の組成物および方法は、インビボ、エクスビボまたはインビトロにおいて、Ｃａｓ９を用いた遺伝子編集に使用され得る。
【０１６５】
本発明は、新規Ｕ−ガイド分子によって誘導される、Ｃａｓ９を用いて遺伝子を編集する方法を想定する。
【０１６６】
本発明のＵ−ガイド分子は、Ｃａｓ９を用いた効率的な遺伝子編集を提供し得る。
【０１６７】
本発明のＵ−ガイド分子は、ＴＴＲ遺伝子を遺伝子編集するのに有効であり得る。本発明のＵ−ガイド分子は、アレル選択的な結果を伴うヒトＴＴＲの遺伝子編集に驚くほど有効であり得、オフターゲット効果の減少を示し得る。
【０１６８】
いくつかの実施態様において、本発明のＵ−ガイド分子は、野生型ＴＴＲと比較して、Ｖ３０Ｍ ＴＴＲにおける二本鎖切断の生成について、並外れた、驚くべきレベルのアレル選択性を示し、オフターゲット効果の減少を示す。
【０１６９】
本発明はさらに、ＮＨＥＪおよびＨＤＲ修復機構による遺伝子修復と共に、新規Ｕ−ガイド分子によって誘導される、Ｃａｓ９を用いた遺伝子を編集する方法を想定する。
【０１７０】
本発明のＵ−ガイド分子は、Ｃａｓ９によって導かれる遺伝子操作の効率を有利に増加させ得る。
【０１７１】
いくつかの実施態様において、本発明のＵ−ガイド分子は、Ｃａｓ９によって導かれる遺伝子操作の効率を有利に増加させ得、ＮＨＥＪを介する高頻度の標的変異を与え得る。
【０１７２】
さらなる実施態様において、本発明のＵ−ガイド分子は、Ｃａｓ９によって導かれる遺伝子操作の効率を有利に増加させ得、任意のゲノム標的において、ＨＤＲを用いた正確なＤＮＡ組み込みを与え得る。
【０１７３】
いくつかの態様において、本発明のＵ−ガイド分子は、インビボにおけるＣａｓ９結合およびＤＮＡ切断を増強し得る。
【０１７４】
本発明は、様々な疾患および症状の治療薬として用いられる、新規分子を提供する。本発明の分子は、様々な疾患および症状を改善、予防または処置する組成物における、医薬品有効成分として用いられ得る。
【０１７５】
いくつかの実施態様において、本発明の分子は、アミロイドーシスおよび関連するアミロイド関連疾患またはアルツハイマー病の改善および／または処置に使用され得る。
【０１７６】
本発明の実施態様は、Ｃａｓ９を用いた有効な遺伝子編集を有利に提供するガイド分子ならびに治療薬のための組成物または製剤を提供し得、これは臨床薬を提供し得る。
【０１７７】
本発明のガイド分子の性質は、その構造に従って生じ、その分子構造全体は、全体として、実質的な利益および性質を提供し得る。
【０１７８】
いくつかの実施態様において、広範な新規Ｕ−ガイド分子を提供し、これらは１以上のリンカー基を包含し得る。リンカー基は、ガイド分子内の鎖に結合し得る。各リンカー基はまた、核酸塩基に結合し得る。
【０１７９】
いくつかの態様において、リンカー基はモノマーであり得る。モノマーは結合し、鎖状分子を形成し得る。本発明の鎖状分子において、リンカー基のモノマーを、鎖内の任意の点において結合させてもよい。
【０１８０】
ある態様において、リンカー基のモノマーを、鎖の末端付近に存在するように、本発明の鎖状分子と結合させてもよい。鎖状分子の末端を、リンカー基のモノマーで形成してもよい。
【０１８１】
さらなる態様において、鎖状分子の各リンカー基を、核酸塩基と結合させてもよい。鎖状分子内の核酸塩基の存在は、核酸塩基配列を提供し得る。
【０１８２】
ある実施態様において、本発明は、リンカー基のモノマーと、特定の天然ヌクレオチド、非天然ヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、または化学修飾ヌクレオチドとの、新規の組合せを包含する鎖状構造を有する、オリゴマー分子を提供する。
【０１８３】
本発明のオリゴマーガイド分子は、ポリヌクレオチドまたはゲノムの少なくとも一部を標的とする、核酸塩基配列を示し得る。
【０１８４】
本発明は、リンカー基のモノマーを包含するオリゴマー薬についての構造、方法および組成物を提供する。本発明のオリゴマー分子は、遺伝子編集治療の製剤における有効成分として使用できる。
【０１８５】
作用様式
【０１８６】
本発明の実施態様は、有効なガイド分子を提供し得、これは細胞内の遺伝子を変化させ、または編集するのに使用され得、それによって遺伝子の機能性、遺伝子発現または遺伝子発現産物を調節する。
【０１８７】
本発明は、広範な治療応用を伴う、遺伝子編集における頑強で効率的な方法を提供し得る。
【０１８８】
一般に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、ガイド分子を用いて、特定のＤＮＡ標的を認識し得る。Ｃａｓ酵素は、ガイド分子の作用によって、特定のＤＮＡ標的に供給され得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、本発明のガイド分子を用いた、効率的で効果的な遺伝子編集に使用され得る。
【０１８９】
いくつかの態様において、本発明は、１以上の遺伝子産物の発現を変化させ、または調節する方法を提供する。
【０１９０】
本発明の方法は、真核生物に、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９誘導エンドヌクレアーゼ遺伝子編集システムの成分を導入するベクターを利用し得る。ベクターは、遺伝子内の標的配列とハイブリダイズできるガイド分子と動作可能に連結した調節配列、およびＩＩ型Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと動作可能に連結したさらなる調節配列を有し得る。ガイド分子は、遺伝子標的を切断するＣａｓ９タンパク質を供給し得る。ある実施態様において、ベクターは核局在シグナルを含み得る。
【０１９１】
ベクターに関するいくつかの情報が、例えばGoeddel (Editor), Methods in Enzymology, Volume 185: Gene Expression Technology, Academic Press, 1990に与えられている。
【０１９２】
いくつかの実施態様において、ガイド分子は、ｃｒｉｓｐｒ−ｔｒａｃｒ配列と結合したガイド配列を有し得る。ガイド配列は、遺伝子標的とハイブリダイズすることを標的とし得、ｃｒｉｓｐｒ−ｔｒａｃｒ配列はＣａｓ９と結合し得る。
【０１９３】
いかなる特定の理論に拘束されることも意図しないが、原核生物のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲおよびＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ）システムは、遺伝子編集に使用され得る。原核生物において、このシステムは免疫防御システムとして機能する。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子は、標的外来遺伝子に属するスペーサー配列によって分離された、特定の反復配列からなり得る。ＣＲＩＳＰＲからの一次転写物は、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）にプロセシングされる。ｃｒＲＮＡは、保存された反復配列、および標的遺伝子配列に相補的な可変スペーサー配列またはガイドからなり得る。トランス活性化ｃｒｉｓｐｅｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）は、ＣＲＩＳＰＲ反復に相補的であり、ｃｒＲＮＡをプロセシングするのに役立つ、短いＲＮＡ配列であり得る。ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびＣａｓ９によって形成される複合体は、塩基対形成によって標的配列に結合し、配列特異的な二本鎖ＤＮＡ切断を生じる。
【０１９４】
さらなる実施態様において、本発明のガイド分子は、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡに関連する配列を包含する構造を包含し得る。
【０１９５】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体は、標的配列とハイブリダイズし、Ｃａｓタンパク質と複合体形成する、ガイド配列を含み得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体は、標的配列、標的配列の数塩基対内または標的配列付近における、一方または両方の鎖の切断をもたらし得る。
【０１９６】
Ｃａｓタンパク質、ガイド配列およびｔｒａｃｒ配列を含む、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体の各成分は、別々のベクター上の別々の調節配列と動作可能に連結していてもよい。
【０１９７】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体の成分は、同一または異なる調節配列から発現されてもよく、単一のベクターに組み合わされていてもよい。
【０１９８】
ベクターは、１以上のガイド配列を提供するのに用いられ得る。
【０１９９】
本明細書において、用語「Ｃａｓ」は、ガイド分子を用いた遺伝子編集において動作可能な、当分野で公知の任意のＣａｓタンパク質を指す。
【０２００】
いくつかの実施態様において、１以上のガイド分子を、遺伝子編集のために同時に使用してもよい。
【０２０１】
いくつかの実施態様において、本発明は、遺伝子をノックアウトする方法および組成物、遺伝子を増幅する方法および組成物、ゲノムの不安定性に関連する変異を修復する方法および組成物、およびゲノムにおける公知の欠損を修正する方法および組成物を提供する。
【０２０２】
いくつかの実施態様において、標的遺伝子の１以上の遺伝子産物の発現が減少し得る。
【０２０３】
いくつかの実施態様において、標的遺伝子の１以上の遺伝子産物の発現が増加し得る。
【０２０４】
いくつかの様式において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、ＣＲＩＳＰＲゲノム干渉のために、本発明のガイド分子を利用できる。
【０２０５】
ある態様において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、本発明のガイド分子を用いて、遺伝子発現を抑制できる。触媒不活性のＣａｓ９を用いて、遺伝子の転写に干渉することによって、遺伝子発現を抑制できる。本発明のガイド分子は、不活性Ｃａｓ９をゲノム配列に与え、これはリプレッサーとして作用し得る。ガイド分子は共発現され得る。
【０２０６】
ある実施態様において、調節機能を有するエフェクタードメインの、不活性Ｃａｓ９への付着は、安定で効率的な転写抑制を与え得る。転写リプレッサードメインまたは調節機能を有する調節ドメインの、不活性Ｃａｓ９への付着は、標的内在性遺伝子の発現を抑制し得る。
【０２０７】
いくつかの実施態様において、本発明のガイド分子は、有効なＣａｓ９が、ＤＮＡを切断することなく、特定の標的配列に結合することを可能にするために、相対的に短くてもよく（最大で１４または１６ｎｔ長）、したがってこれはリプレッサーとして作用し得る。
【０２０８】
さらなる態様において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、本発明のガイド分子を用いて、遺伝子発現を活性化できる。転写活性化因子を、不活性Ｃａｓ９に結合させ得る。転写活性化因子は、遺伝子発現を増加させ得、一方、不活性Ｃａｓ９は本発明のガイド分子に標的とされ得る。
【０２０９】
ＵＮＡモノマー
いくつかの実施態様において、リンカー基のモノマーは、アンロックドヌクレオモノマー（ＵＮＡモノマー）であってもよく、これは、以下に示される、プロパン−１，２，３−トリ−イル−トリスオキシ構造に基づく、有機小分子である。
【化１】
0006799058.tif 000005
式中、Ｒ１およびＲ２はＨであり、Ｒ１およびＲ２はホスホジエステル結合であってもよく、Ｂａｓｅは核酸塩基であってもよく、Ｒ３は後述する官能基である。
【０２１０】
別の観点において、ＵＮＡモノマーの主原子を、ＩＵＰＡＣ命名法で以下のように表し得る：
【化２】
0006799058.tif 000006
式中、オリゴマー鎖の進行方向は、プロパン残基の１末端から３末端である。
【０２１１】
核酸塩基の例には、ウラシル、チミン、シトシン、５−メチルシトシン、アデニン、グアニン、イノシン、ならびに天然および非天然の核酸塩基アナログが含まれる。
【０２１２】
一般に、ＵＮＡモノマーはヌクレオチドでないため、オリゴマーにおいて少なくとも４つの形態を示し得る。第一に、ＵＮＡモノマーはオリゴマーにおける内部モノマーであり得、このＵＮＡモノマーは両側において他のモノマーと隣接する。この形態において、ＵＮＡモノマーは、オリゴマーが二本鎖であり、例えば二本鎖中に核酸塩基を有する他のモノマーが存在する場合に、塩基対形成に関与し得る。
【０２１３】
プロパン−１−イル位およびプロパン−３−イル位の両方に隣接する内部モノマーとしてのＵＮＡモノマーの例（Ｒ３が−ＯＨの場合）を以下に示す。
【化３】
0006799058.tif 000007
【０２１４】
第二に、ＵＮＡモノマーは、オリゴマー二本鎖のオーバーハング内のモノマーであり得、このＵＮＡモノマーは両側において他のモノマーと隣接する。この形態において、ＵＮＡモノマーは塩基対形成に関与しない。ＵＮＡモノマーは、ヌクレオチドとは異なり、柔軟な有機構造であるため、ＵＮＡモノマーを含むオーバーハングは、オリゴマーにおける柔軟なターミネーターである。
【０２１５】
ＵＮＡモノマーは、オリゴマーのオーバーハング内の末端モノマーであり得、このＵＮＡモノマーはプロパン−１−イル位またはプロパン−３−イル位のいずれかにおいて、１つのモノマーのみと結合している。この形態において、ＵＮＡモノマーは、塩基対形成に関与しない。ＵＮＡモノマーはヌクレオチドとは異なり、柔軟な有機構造であるため、ＵＮＡモノマーを含むオーバーハングは、オリゴマーにおいて柔軟なターミネーターであり得る。
【０２１６】
プロパン−３−イル位に結合した末端モノマーとしてのＵＮＡモノマーの例を以下に示
す。
【化４】
0006799058.tif 000008
【０２１７】
ＵＮＡモノマーは柔軟な分子であり得るため、末端モノマーとしてのＵＮＡモノマーは、多様な立体構造が想定され得る。プロパン−３−イル位に結合した末端モノマーとして、エネルギーを最小化したＵＮＡモノマーの立体構造の例を以下に示す。
【化５】
0006799058.tif 000009
したがって、末端ＵＮＡモノマーを有するＵＮＡオリゴマーは、従来の核酸物質とは、構造が著しく異なる。対照的に、末端ＵＮＡモノマーの可動性(conformability)は、種々の性質を有するＵＮＡオリゴマーを与え得る。
【０２１８】
特に、ＵＮＡモノマーの構造は、それが天然に存在するヌクレオチドに結合することを可能にする。ＵＮＡオリゴマーは、ＵＮＡモノマー、および天然に存在するヌクレオシドに基づき得る、様々なヌクレオチドから構成された鎖であり得る。
【０２１９】
いくつかの実施態様において、ＵＮＡモノマーの官能基Ｒ３は−ＯＲ４、−ＳＲ４、−ＮＲ４２、−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）Ｒ４、モルホリノ、モルホリン−１−イル、ピペラジン−１−イル、または４−アルカノイル−ピペラジン−１−イルであり得、Ｒ４は各Ｒ４において同一または異なってもよく、Ｈ、アルキル、コレステロール、脂質分子、ポリアミン、アミノ酸、またはポリペプチドであり得る。
【０２２０】
ＵＮＡモノマーは有機分子である。ＵＮＡモノマーは、核酸モノマーまたはヌクレオチドではなく、天然に存在するヌクレオシドまたは修飾された天然に存在するヌクレオシドでもない。
【０２２１】
本発明のＵＮＡオリゴマーは合成鎖状分子である。本発明のＵＮＡオリゴマーは核酸ではなく、オリゴヌクレオチドでもない。
【０２２２】
いくつかの実施態様において、上記に示したように、ＵＮＡモノマーは、ＵＮＡ−Ａ（Ａ~と命名）、ＵＮＡ−Ｕ（Ｕ~と命名）、ＵＮＡ−Ｃ（Ｃ~と命名）、およびＵＮＡ−Ｇ（Ｇ~と命名）であり得る。
【０２２３】
本明細書で使用され得る記号には、ｍＡ、ｍＧ、ｍＣ、およびｍＵが含まれ、これらは２’−Ｏ−メチル修飾されたリボヌクレオチドを指す。
【０２２４】
本明細書で使用され得る記号には、小文字のｃおよびｕが含まれ、これらは２’−Ｏ−メチル修飾されたリボヌクレオチドを指す。
【０２２５】
本明細書で使用され得る記号にはｄＴが含まれ、これは２'−デオキシＴヌクレオチドを指す。
【０２２６】
ガイド化合物におけるさらなるモノマー
【０２２７】
本明細書において、オリゴマー配列に関して、記号ＸはＵＮＡモノマーを表す。
【０２２８】
本明細書において、オリゴマー配列に関して、記号Ｎは任意の天然ヌクレオチドモノマーまたは修飾されたヌクレオチドモノマーを表す。
【０２２９】
本明細書において、オリゴマー配列に関して、記号Ｑは非天然ヌクレオチドモノマー、修飾ヌクレオチドモノマー、または化学修飾ヌクレオチドモノマーを表す。
【０２３０】
Ｑモノマーが二本鎖の一方の鎖に存在し、他方の鎖と対形成しない場合、モノマーには任意の塩基が結合していてよい。Ｑモノマーが二本鎖の一方の鎖に存在し、他方の鎖のモノマーと対形成する場合、Ｑモノマーは、他方の鎖の対応する対形成する位置の、モノマーと相補的な任意の塩基が結合していてよい。
【０２３１】
核酸モノマーの例は、非天然ヌクレオチド、修飾ヌクレオチドおよび化学修飾ヌクレオチドを含み、当分野で公知のそのような任意のヌクレオチドを含む。
【０２３２】
非天然ヌクレオチドモノマー、修飾ヌクレオチドモノマー、および化学修飾ヌクレオチドモノマーの例は、当分野で公知のそのような任意のヌクレオチドを含み、例えば、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロリボヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチド、２’−デオキシリボヌクレオチド、２’−デオキシプリンヌクレオチド、ユニバーサル塩基ヌクレオチド、５−Ｃ−メチル−ヌクレオチドおよび逆位デオキシ脱塩基モノマー残基を含む。
【０２３３】
非天然ヌクレオチドモノマー、修飾ヌクレオチドモノマー、および化学修飾ヌクレオチドモノマーの例は、３’末端が安定化したヌクレオチド、３’−グリセリルヌクレオチド、３’−逆位脱塩基ヌクレオチド、および３’−逆位チミジンを含む。
【０２３４】
非天然ヌクレオチドモノマー、修飾ヌクレオチドモノマー、および化学修飾ヌクレオチドモノマーの例は、ロックド核酸ヌクレオチド（ＬＮＡ）、２’−Ｏ，４’−Ｃ−メチレン−（Ｄ−リボフラノシル）ヌクレオチド、２’−メトキシエトキシ（ＭＯＥ）ヌクレオチド、２’−メチル−チオ−エチル、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチド、および２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを含む。
【０２３５】
非天然ヌクレオチドモノマー、修飾ヌクレオチドモノマー、および化学修飾ヌクレオチドモノマーの例は、２’，４’−拘束２’−Ｏ−メトキシエチル（ｃＭＯＥ）および２’−Ｏ−エチル（ｃＥｔ）修飾されたＤＮＡを含む。
【０２３６】
非天然ヌクレオチドモノマー、修飾ヌクレオチドモノマー、および化学修飾ヌクレオチドモノマーの例は、２’−アミノヌクレオチド、２’−Ｏ−アミノヌクレオチド、２’−Ｃ−アリルヌクレオチド、および２’−Ｏ−アリルヌクレオチドを含む。
【０２３７】
非天然ヌクレオチドモノマー、修飾ヌクレオチドモノマー、および化学修飾ヌクレオチドモノマーの例は、Ｎ６−メチルアデノシンヌクレオチドを含む。
【０２３８】
非天然ヌクレオチドモノマー、修飾ヌクレオチドモノマー、および化学修飾ヌクレオチドモノマーの例は、修飾された塩基５−（３−アミノ）プロピルウリジン、５−（２−メルカプト）エチルウリジン、５−ブロモウリジン；８−ブロモグアノシン、または７−デアザアデノシンを有するヌクレオチドモノマーを含む。
【０２３９】
非天然ヌクレオチドモノマー、修飾ヌクレオチドモノマー、および化学修飾ヌクレオチドモノマーの例は、２’−Ｏ−アミノプロピル置換されたヌクレオチドを含む。
【０２４０】
非天然ヌクレオチドモノマー、修飾ヌクレオチドモノマー、および化学修飾ヌクレオチドモノマーの例は、ヌクレオチドの２’−ＯＨ基の、２’−Ｒ、２’−ＯＲ、２’−ハロゲン、２’−ＳＲ、または２’−アミノへの置換を含み、ここでＲは、Ｈ、アルキル、アルケニル、またはアルキニルであり得る。
【０２４１】
本発明のガイド分子、ｃｒＲＮＡ、ガイド鎖またはｔｒａｃｒＲＮＡは、上記で示される、１以上の任意の、非天然ヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、または化学修飾ヌクレオチドを含み得る。
【０２４２】
いくつかの態様において、本発明のガイド化合物は、結合している塩基の配列によって記述され得、その置換体または修飾体であり得る。本明細書において、置換体または修飾体は、本明細書でさらに記述されるように、異なって置換されたＵＮＡモノマーおよび異なって置換または修飾された核酸モノマーを含む。
【０２４３】
修飾ヌクレオチドのいくつかの例は、Saenger, Principles of Nucleic Acid Structure, Springer-Verlag, 1984において与えられる。
【０２４４】
ＵＮＡモノマーから構成されるＵ−ガイド化合物
【０２４５】
本発明の態様は、ＵＮＡモノマーを含むオリゴマー化合物である、遺伝子編集用のＵ−ガイド分子についての構造および組成物を提供し得る。
【０２４６】
オリゴマーＵ−ガイド物質は、１以上のＵＮＡモノマーを包含し得る。本発明のオリゴマー分子を、遺伝子編集治療の製剤における有効成分として用いてもよい。
【０２４７】
いくつかの実施態様において、本発明は、ＵＮＡモノマーと、特定の天然ヌクレオチド、非天然ヌクレオチド、修飾ヌクレオチドまたは化学修飾ヌクレオチドとの新規な組合せを包含する構造を有する、オリゴマーＵ−ガイド化合物を提供する。
【０２４８】
さらなる態様において、本発明のオリゴマーＵ−ガイド化合物は、薬理活性分子であり得る。本発明のＵ−ガイドを、遺伝子編集における有効医薬成分として用いてもよい。
本発明のＵ−ガイド分子は、式Ｉの構造を有し得る。
【化６】
0006799058.tif 000010
式中、Ｌ１は結合であり、ｎは３９〜４６であり、各Ｌ２において、Ｌ２は化学式−Ｃ１−Ｃ２−Ｃ３−を有するＵＮＡリンカー基であり、ここでＲはＣ２に結合し、化学式−ＯＣＨ（ＣＨ２Ｒ３）Ｒ５を有し、Ｒ３は−ＯＲ４、−ＳＲ４、−ＮＲ４２、−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）Ｒ４、モルホリノ、モルホリン−１−イル、ピペラジン−１−イルまたは４−アルカノイル−ピペラジン−１−イルであり、Ｒ４は、各Ｒ４において同一または異なっており、Ｈ、アルキル、コレステロール、脂質分子、ポリアミン、アミノ酸またはポリペプチドであり、Ｒ５は核酸塩基であり、またはＬ２（Ｒ）は、リボースなどの糖であり、Ｒは核酸塩基であり、または、Ｌ２は修飾されたリボースなどの修飾された糖であり、Ｒは核酸塩基である。ある実施態様において、アルキルは、メチル、エチル、プロピルまたはイソプロピルである。ある実施態様において、核酸塩基は、修飾された核酸塩基であり得る。Ｌ１は、ホスホジエステル結合であり得る。さらなる実施態様において、−ＯＣＨ（ＣＨ２Ｒ３）Ｒ５は、−ＳＣＨ（ＣＨ２Ｒ３）Ｒ５、−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ２Ｒ３）Ｒ５、または−（ＳＯ２）ＣＨ（ＣＨ２Ｒ３）Ｒ５であり得る。
【０２４９】
本発明のＵ−ガイド分子は、ゲノムの標的配列と相補的なガイド配列を有し得、ここで最大で３つのミスマッチが生じ得る。
【０２５０】
Ｕ−ガイド分子の標的は、標的核酸であり得る。いくつかの実施態様において、標的は、対象の任意のゲノムＤＮＡであり得る。Ｕ−ガイド分子は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを用いた遺伝子編集に有効であり得る。
【０２５１】
いくつかの態様において、本発明のＵ−ガイド分子は、任意の鎖の任意の位置において、任意の数のモノマー間ホスホロチオエート結合を有し得る。
【０２５２】
いくつかの実施態様において、Ｕ−ガイド分子の任意の１以上のモノマー間結合は、ホスホジエステル、ホスホロチオエート（ジチオアートを含む）、キラルなホスホロチオエート、および他の化学的に修飾された形態であり得る。
【０２５３】
例えば、記号「Ｎ」は、標的におけるモノマーに相補的な、任意のヌクレオチドを示し得る。
【０２５４】
鎖またはオリゴマー内の記号「Ｘ」は、ＵＮＡモノマーを示す。ＵＮＡモノマーがＵ−ガイド分子の鎖に存在し、標的と対形成する場合、ＵＮＡモノマーは、標的の鎖における、モノマーと相補的な任意の塩基と結合し得る。
【０２５５】
Ｕ−ガイド分子がＵＮＡモノマーで終わる場合、上記で示した位置の番号付けに従って、末端位置は１末端となり、または末端位置は３末端となる。例えば、配列番号１のＵ−ガイド分子１−Ｕ~Ｇ~ＣＡＣＧＧＣＣＡＣＡＵＵＧＡＵＧＧＣＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＵＣＣＵ~Ｕ~−３は、左側にＵＮＡ−Ｕモノマーの１末端、および右側にＵＮＡ−Ｕモノマーの３末端を有する。
【０２５６】
いくつかの実施態様において、本発明のＵ−ガイド分子は、鎖の１末端において、１以上のＵＮＡモノマーを有し得、鎖の３末端において、１以上のＵＮＡモノマーを有し得る。
【０２５７】
ある実施態様において、本発明のＵ−ガイド分子は、３９〜４６モノマー長であり得る。
【０２５８】
遺伝子編集における本発明のＵ−ガイド分子は、３９〜４６モノマー長の鎖を有し得、モノマーは、ＵＮＡモノマーおよび核酸モノマーであり得る。
【０２５９】
Ｕ−ガイド分子は、標的遺伝子を標的とし得、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集用の従来のガイドＲＮＡと比較して、オフターゲット効果の減少を示し得る。
【０２６０】
標的との配列相同性に基づくオフターゲット部位を、標的またはオフターゲット配列のいずれかを用いてエピソームとして複製されるレポータープラスミドを構築することによって、決定してもよい。レポーターを、Ｕ−ガイド分子と共に、哺乳類細胞に同時導入してもよい。プラスミドを単離し、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩアッセイを行ってもよい。あるいは、オフターゲットの配列決定を、潜在的なオフターゲット部位に隣接するプライマーセットを用いて、ＰＣＲで行ってもよい。
【０２６１】
Ｕ−ガイド分子は、標的遺伝子を標的とし得、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集用の従来のガイドＲＮＡと比較して、遺伝子編集の効率の増加を示し得る。
【０２６２】
本発明のＵ−ガイド分子について、ゲノム標的の平均変異率は、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％であり得る。
【０２６３】
本開示のＵ−ガイド分子は、天然に存在する核酸ヌクレオチド、および遺伝子編集活性に適合する、その修飾物を含み得る。
【０２６４】
本明細書において、鎖という用語は、モノマーの単一の連鎖を指し、この鎖は任意の数の内部モノマーおよび２つの末端モノマーを有し、各末端モノマーは、鎖が終結するように、一方の側において１つの内部モノマーと結合し、他方の側ではモノマーと結合しない。
【０２６５】
Ｕ−ガイド分子のモノマーは、ホスホジエステル結合、ホスホロチオエート結合、ギャップ結合(gapped linkage)、および他の変形を介して結合し得る。
【０２６６】
いくつかの実施態様において、Ｕ−ガイド分子は、ガイド配列と標的配列との間の相補性において、ミスマッチを含み得る。さらなる実施態様において、Ｕ−ガイド分子は、標的に対する１つ、２つ、または３つのミスマッチを含み得る。
【０２６７】
Ｕ−ガイド分子の標的は、標的遺伝子の標的核酸であり得る。
【０２６８】
ある実施態様において、Ｕ−ガイド分子は、自身でフォールドし、自身とハイブリダイズし、一方の末端に結合ループを有する２本鎖領域を形成する、単一鎖であり得る。
【０２６９】
いくつかの実施態様において、本発明のＵ−ガイド分子は、３９〜４６モノマー長の鎖を有し得、ＵＮＡモノマーでない任意のモノマーは、Ｑモノマーであり得る。
【０２７０】
いくつかの実施態様において、本発明のＵ−ガイド分子は、３９〜４６モノマー長の鎖を有し得、ＵＮＡモノマーでない任意のモノマーは、Ｑモノマーであり得、Ｑモノマーの数は、２０個未満である。
【０２７１】
いくつかの実施態様において、本発明のＵ−ガイド分子は、３９〜４６モノマー長の鎖を有し得、ＵＮＡモノマーでない任意のモノマーは、Ｑモノマーであり得、Ｑモノマーの数は、１２個未満である。
【０２７２】
いくつかの実施態様において、本発明のＵ−ガイド分子は、３９〜４６モノマー長の鎖を有し得、ＵＮＡモノマーでない任意のモノマーは、Ｑモノマーであり得、Ｑモノマーの数は、１０個未満である。
【０２７３】
いくつかの実施態様において、本発明のＵ−ガイド分子は、３９〜４６モノマー長の鎖を有し得、ＵＮＡモノマーでない任意のモノマーは、２’−Ｏ−メチル修飾されたリボヌクレオチドであり得る。
【０２７４】
遺伝子編集
【０２７５】
いくつかの実施態様において、標的が３’プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に隣接する場合、本発明のガイド分子を用いて、ＴＴＲ遺伝子の任意の標的部分を編集できる。
【０２７６】
本発明のガイド分子で編集され得る遺伝子および／またはポリヌクレオチドの例は、ＴＴＲを含み、これはアミロイド神経障害およびアミロイドーシスに関連し得る。
【０２７７】
ある実施態様において、本発明はさらに、トランスサイレチン関連遺伝性アミロイドーシスを予防、処置または改善する方法を想定する。
【０２７８】
医薬組成物
【０２７９】
いくつかの態様において、本発明は、オリゴマー化合物および薬学的に許容し得る担体を含む、医薬組成物を提供する。
【０２８０】
医薬組成物は、局所投与または全身投与が可能であり得る。いくつかの態様において、医薬組成物は、任意の投与様式が可能であり得る。ある態様において、投与は、静脈内、皮下、肺内、筋肉内、腹腔内、経皮的、経口的または鼻腔投与であり得る。
【０２８１】
本発明の実施態様は、脂質製剤におけるオリゴマー化合物を含む、医薬組成物を含む。
【０２８２】
いくつかの実施態様において、医薬組成物は、カチオン性脂質、アニオン性脂質、ステロール、ペグ化脂質、および前記の任意の組合せから選択される、１以上の脂質を含み得る。
【０２８３】
ある実施態様において、医薬組成物は、リポソームを実質的に含まなくてもよい。
【０２８４】
さらなる実施態様において、医薬組成物は、リポソームまたはナノ粒子を含んでもよい。
【０２８５】
本発明の有効な分子を送達するための脂質および脂質組成物のいくつかの例は、WO/2015/074085に与えられ、これは、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
【０２８６】
さらなる実施態様において、医薬組成物は、ウイルスベクターまたは細菌ベクター内のオリゴマー化合物を含み得る。
【０２８７】
本開示の医薬組成物は、当分野で公知の、担体、希釈剤または賦形剤を含み得る。医薬組成物の例は、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A.R. Gennaro ed. 1985)に記述されている。
【０２８８】
医薬組成物における賦形剤の例は、抗酸化剤、懸濁剤、分散剤、保存剤、緩衝剤、等張化剤および界面活性剤を含む。
【０２８９】
本発明の薬剤または医薬品製剤の有効投与量は、インビボにおいて遺伝子編集を引き起こすのに十分な量であり得る。
【０２９０】
本発明の薬剤または医薬品製剤の有効投与量は、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％の、インビボにおけるゲノム標的の平均変異率を引き起こすのに十分な量であり得る。
【０２９１】
治療上有効な投与量は、治療効果を引き起こすのに十分な薬剤または製剤の量であり得る。治療上有効な投与量は、１回またはそれ以上に分割された投与において、および種々の経路によって、投与され得る。
【０２９２】
投与に際して、治療上有効な投与量は、１〜１０００ｐｇ／ｍｌ、１〜１０００ｎｇ／ｍｌ、１〜１０００μｇ／ｍｌまたはそれ以上の、有効成分の血清レベルをもたらし得る。
【０２９３】
インビボにおける有効成分の治療上有効な投与量は、０．００１〜０．０１ｍｇ／ｋｇ体重、０．０１〜０．１ｍｇ／ｋｇ、０．１〜１ｍｇ／ｋｇ、１〜１０ｍｇ／ｋｇ、または１０〜１００ｍｇ／ｋｇの投与量であり得る。
【０２９４】
インビボにおける有効成分の治療上有効な投与量は、０．００１ｍｇ／ｋｇ体重、０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇまたはそれ以上の投与量であり得る。
【０２９５】
常染色体優性遺伝疾患
【０２９６】
本発明のガイド分子を利用できる、疾患および／または症状の例は、表３の疾患および／または症状を含む。
【表３−１】
0006799058.tif 000011
【表３−２】
0006799058.tif 000012
【表３−３】
0006799058.tif 000013
【表３−４】
0006799058.tif 000014
【表３−５】
0006799058.tif 000015
【０２９７】
Ｔ７アッセイによるｍＴＴＲ遺伝子編集の評価のためのプロトコル
【０２９８】
ＷＴマウスＴＴＲを発現するＨｅｐａ１−６細胞に、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡをLIPOFECTAMINE MESSENGERMAX試薬で遺伝子導入し、その４時間後に、ＵＮＡガイドまたは比較ガイド（これらはそれぞれ、ｍＴＴＲのエクソン２を標的とする、プレアニールしたｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡユニットであった）を遺伝子導入した。遺伝子導入の４８時間後に、ゲノムＤＮＡを単離し、ｍＴＴＲの４５９ｂｐのフラグメントをプライマー
配列番号２
５’ＣＴＧＧＴＧＣＡＣＡＧＣＡＧＴＧＣＡＴＣＴ３’
および
配列番号３
５’ＣＣＴＣＴＣＴＣＴＧＡＧＣＣＣＴＣＴＡＧＣＴＧＧＴＡ３’
を用いて増幅した。
【０２９９】
その後、ＰＣＲ産物を９８℃で５分間加熱し、次いでヘテロ二本鎖形成のために、室温までゆっくりと冷却させた。その後、Ｔ７エンドヌクレアーゼアッセイを行い、遺伝子編集を評価した。ＩｍａｇｅＪ分析ソフトウェアを用いて、式％インデル＝１００ｘ（１−（１−切断されたＤＮＡフラグメントの面積／全体の面積）１／２）で生成した、インデルの割合を決定した。
【０３００】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集による、分泌ｍＴＴＲタンパク質のノックダウンのＥＬＩＳＡ評価
【０３０１】
ＷＴマウスＴＴＲを発現するＨｅｐａ１−６細胞に、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡをLIPOFECTAMINE MESSENGERMAX試薬で遺伝子導入し、その４時間後に、ＵＮＡガイドまたは比較ガイド（これらはそれぞれ、ｍＴＴＲのエクソン２を標的とする、プレアニールしたｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡであった）を遺伝子導入した。遺伝子導入の４８時間後に、上清を回収し、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）（マウスプレアルブミンＥＬＩＳＡキット、Genway）を行い、分泌マウスＴＴＲタンパク質の量を定量化した。
【０３０２】
Ｔ７アッセイによる、遺伝子編集のインビボにおける評価
【０３０３】
Ｃａｓ９ ｍＲＮＡおよびＵＮＡガイドまたは比較ガイド（これらはそれぞれ、ｍＴＴＲのエクソン２を標的とする、プレアニールしたｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡであった）を、脂質ナノ粒子に別々に封入し、次いで１０ｍｇ／ｋｇ全ＲＮＡにおける、尾静脈注射による単回投与のために、混合した。投与の６日後、メスの６〜８週齢のＢａｌｂ／ｃマウスを屠殺し、ゲノムＤＮＡを単離し、ｍＴＴＲの４５９ｂｐのフラグメントを、プライマー
配列番号４
５’ＣＴＧＧＴＧＣＡＣＡＧＣＡＧＴＧＣＡＴＣＴ３’
および
配列番号５
５’ＣＣＴＣＴＣＴＣＴＧＡＧＣＣＣＴＣＴＡＧＣＴＧＧＴＡ３’
を用いて増幅した。
【０３０４】
その後、ＰＣＲ産物を９８℃で５分間加熱し、次いで、ヘテロ二本鎖形成のために、室温までゆっくりと冷却させた。その後、Ｔ７エンドヌクレアーゼアッセイを行い、遺伝子編集を評価した。ＩｍａｇｅＪ分析ソフトウェアを用いて、式％インデル＝１００ｘ（１−（１−切断されたＤＮＡフラグメントの面積／全体の面積）１／２）で生成した、インデルの割合を決定した。
【０３０５】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集による、分泌ｍＴＴＲタンパク質ノックダウンのインビボにおけるＥＬＩＳＡ評価
【０３０６】
Ｃａｓ９ ｍＲＮＡおよびＵＮＡガイドまたは比較ガイド（これらはそれぞれ、ｍＴＴＲのエクソン２を標的とする、プレアニールしたｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡであった）を、脂質ナノ粒子に別々に封入し、次いで１０ｍｇ／ｋｇ全ＲＮＡにおける、尾静脈注射による単回投与のために、混合した。投与の２、４および６日後、血清をメスの６〜８週齢のＢａｌｂ／ｃマウスから回収し、分泌マウスＴＴＲタンパク質の量を、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）（マウスプレアルブミンＥＬＩＳＡキット、Genway）によって決定した。
【０３０７】
マウスＴＴＲを標的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集
【０３０８】
Ｖ３０Ｍ ｍＴＴＲ用の２０塩基長のガイド配列を、表４に示す。
【表４】
0006799058.tif 000016
【０３０９】
表４の下線が引かれたＣＡＴは、Ｖ３０Ｍ変異を示す。
【０３１０】
Ｕ−ガイド分子を合成し、ここでこの分子は、Ｖ３０Ｍのための２０塩基長のガイド配列および化膿レンサ球菌のＣＲＩＳＰＲ配列を含んでいた。
【０３１１】
ｍＴＴＲのＶ３０Ｍ領域のための、標的の長さが２０塩基長のＵ−ガイド分子の例を、表５に示す。表５の分子は、図２に示すように、ｃｒＲＮＡと結合する標的Ｕ−ガイドを含む。
【表５】
0006799058.tif 000017
【０３１２】
表５において、Ｎ（＝Ａ、Ｕ、Ｃ、Ｇ）はＲＮＡモノマーを指し、ｍＮは２’−Ｏ−メチル−ＲＮＡモノマーを指し、＊は３’−ホスホロチオエート結合を指し、Ａ~、Ｕ~、Ｃ~、Ｇ~はＵＮＡモノマーを指す。
【実施例】
【０３１３】
実施例１：ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９用のＵ−ガイド分子を用いた、ＴＴＲゲノム部位のアレル選択的な編集。
【０３１４】
本実験において、３５７ｂｐのＰＣＲ産物を、以下のプライマーを用いて、ヒトＴＴＲゲノムＤＮＡ（アクセッション番号ＮＣ＿００００１８．１０）から生成した：
【０３１５】
配列番号１１
順方向（イントロン１）：５’−ｔｇｔｃｔｔｃｔｃｔａｃａｃｃｃａｇｇｇｃａｃ−３’
【０３１６】
配列番号１２
逆方向（エクソン２）：５’−ｇｃａａａｃｃａｃａｇｃｔａｇａｇｇａｇａｇｇａ−３’。
【０３１７】
２０塩基長のガイド配列を、ヒトＴＴＲコード領域２６９〜２８８および２６９〜２８６をそれぞれ標的とするように、同定した。
【０３１８】
Ｖ３０Ｍ ｈＴＴＲ用の２０塩基長のガイド配列を、表６に示す。
【表６】
0006799058.tif 000018
【０３１９】
表６において、下線が引かれた位置は、Ｖ３０Ｍ変異を示す。表６において、配列番号１３はまた、５’から３’方向に記載され得、５’から３’方向に記載された表７のＵ−ガイド分子内に現れる。
【０３２０】
Ｕ−ガイド分子を合成し、ここでこの分子は、Ｖ３０Ｍ用の２０塩基長のガイド配列および化膿レンサ球菌のＣＲＩＳＰＲ配列を含んでいた。
【０３２１】
ｈＴＴＲのＶ３０Ｍ領域のための標的の長さが２０塩基長のＵ−ガイド分子の例を、表７に示す。表７の分子は、図２に示すように、ｃｒＲＮＡと結合する標的Ｕ−ガイドを含む。
【表７】
0006799058.tif 000019
【０３２２】
表７において、Ｎ（＝Ａ、Ｕ、Ｃ、Ｇ）はＲＮＡモノマーを指し、ｍＮは２’−Ｏ−メチル−ＲＮＡモノマーを指し、＊は３’−ホスホロチオエート結合を指し、Ａ~、Ｕ~、Ｃ~、Ｇ~はＵＮＡモノマーを指す。
【０３２３】
表７におけるＵ−ガイド分子は、ヒトＴＴＲを遺伝子編集するのに有効であった。ヒトＴＴＲの遺伝子編集のためのアッセイを、３５７ｂｐのＰＣＲ産物で行った。このアッセイにおいて、Ｕ−ガイド分子をｔｒａｃｒＲＮＡとプレアニールし、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集用のＵ−ガイド／ｔｒａｃｒを提供する。
【０３２４】
このアッセイにおいて、Ｖ３０ＭヒトＴＴＲを発現する２９３個の細胞、およびＷＴヒトＴＴＲを発現する２９３個の細胞それぞれに、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡをLIPOFECTAMINE MESSENGER MAX試薬を用いて遺伝子導入し、その４時間後に、Ｕ−ガイド／ｔｒａｃｒを遺伝子導入した。遺伝子導入の４８時間後に、ゲノムＤＮＡを単離し、Ｔ７エンドヌクレアーゼアッセイを行った。
【０３２５】
図３は、Ｕ−ガイド分子ＵＮＡ１（配列番号３２）およびＵＮＡ２（配列番号３５）を用いて、二本鎖切断を３５７ｂｐのＰＣＲ産物に生成し、２７５ｂｐおよび８２ｂｐの切断産物を与えたことを示す。
【０３２６】
配列番号３２のＵ−ガイド分子は、アレル選択的な結果を伴う、ヒトＴＴＲの遺伝子編集に驚くほど有効であった。配列番号３２のＵ−ガイド分子は、野生型ＴＴＲと比較して、Ｖ３０Ｍ ＴＴＲにおける二本鎖切断の生成について、並外れたレベルのアレル選択性を示した。
【０３２７】
図４に示すように、配列番号３２のＵ−ガイド分子は、Ｖ３０Ｍ ＴＴＲの２６％の編集、および野生型ＴＴＲのわずか約３％の編集を与えた。ここで編集は二本鎖切断の程度を示す。したがって、配列番号３２のＵ−ガイド分子は、アレル選択的な結果を伴う、ヒトＴＴＲの遺伝子編集に並外れて、驚くほど有効であった。この実施例は、オフターゲット活性を減少させる能力を示す。
【０３２８】
配列番号３５のＵ−ガイド分子は、アレル選択的な結果を伴う、ヒトＴＴＲの遺伝子編集に驚くほど有効であった。配列番号３５のＵ−ガイド分子は、野生型ＴＴＲと比較して、Ｖ３０Ｍ ＴＴＲにおける二本鎖切断の生成について、並外れたレベルのアレル選択性を示した。
【０３２９】
図４に示すように、配列番号３５のＵ−ガイド分子は、Ｖ３０Ｍ ＴＴＲの１９％の編集、および野生型ＴＴＲのわずか約２％の編集を与え、ここで編集は二本鎖切断の程度を示す。したがって、配列番号３５のＵ−ガイド分子は、アレル選択的な結果を伴う、ヒトＴＴＲの遺伝子編集に並外れて、驚くほど有効であった。この実施例は、オフターゲット活性を減少させる能力を示す。
【０３３０】
これらの結果は、本発明のＵ−ガイド分子を、ヒトＴＴＲのアレル選択的な遺伝子編集に使用できることを示す。ヒトＴＴＲの遺伝子編集における、驚くべきレベルのアレル選択性を、図５に示す。配列番号３２のＵ−ガイド分子は、８．７の高い選択性比を与えた。さらに配列番号３５のＵ−ガイド分子は、９．５の高い選択性比を与えた。
【０３３１】
さらに、同一の条件において、配列番号３２および３５のＵ−ガイド分子と同一の核酸塩基配列および構造を有するが、いかなるＵＮＡモノマーも持たない、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ガイドは、１．４３の選択性比であった。
【０３３２】
また、配列トレース分解による、ゲノム編集の評価を行った。Ｖ３０ＭヒトＴＴＲまたはＷＴヒトＴＴＲのいずれかを発現する２９３個の細胞に、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡをLIPOFECTAMINE MESSENGERMAX試薬で遺伝子導入し、その４時間後に、比較ガイドまたはＵＮＡガイド（ＵＮＡ１）（これらをそれぞれ、ｔｒａｃｒＲＮＡとプレアニールし、ｈＴＴＲのＶ３０Ｍ変異を標的とした）を遺伝子導入した。遺伝子導入の４８時間後に、ゲノムＤＮＡを単離し、ｈＴＴＲの１０４８ｂｐのフラグメントを増幅した。ＰＣＲ産物を精製し、次いでサンガーシークエンスした。
【０３３３】
配列決定のデータファイルを、ＴＩＤＥ（分解によるインデルのトラッキング(Tracking of Indels by Decomposition)）（例えば、Brinkman, 2014, Nucl. Acids Res., Vol. 42, No. 22, pp. 1-8参照）に取り込み、制御配列を整列させ、予想される切断部位後の、異常なヌクレオチドの相対的な存在量を決定し、挿入および欠失（インデル）ならびにその頻度のスペクトルを作製した。
【０３３４】
図６は、配列トレース分解（ＴＩＤＥ）による、Ｖ３０Ｍ ＴＴＲのゲノム編集の評価のための、比較ｇＲＮＡガイド（非ＵＮＡガイド構造）のインデルスペクトルを示す。全体の効率は、３８．５％であった。
【０３３５】
図７は、配列トレース分解（ＴＩＤＥ）による、Ｖ３０Ｍ ＴＴＲのゲノム編集の評価のための、ＵＮＡガイド（ＵＮＡ１）のインデルスペクトルを示す。全体の効率は、３３．４％であった。
【０３３６】
図８は、配列トレース分解（ＴＩＤＥ）による、野生型ＴＴＲのゲノム編集の評価のための、比較ｇＲＮＡガイド（非ＵＮＡガイド構造）のインデルスペクトルを示す。全体の効率は、２６．６％であった。したがって、比較ｇＲＮＡガイドの選択性は、Ｖ３０Ｍ ＴＴＲについて、野生型ＴＴＲに対して、３８．５／２６．６＝１．４であった。
【０３３７】
図９は、配列トレース分解（ＴＩＤＥ）による、野生型ＴＴＲのゲノム編集の評価のための、ＵＮＡガイド（ＵＮＡ１）のインデルスペクトルを示す。全体の効率は、２．１％であった。したがって、ＵＮＡガイド（ＵＮＡ１）の選択性は、Ｖ３０Ｍ ＴＴＲについて、野生型ＴＴＲに対して、３３．４／２．１＝１５．９であった。
【０３３８】
これらの結果は、本発明のＵ−ガイド分子を、ヒトＴＴＲのアレル選択的な遺伝子編集に使用できることを示す。本発明のＵ−ガイド分子は、ヒトＴＴＲの遺伝子編集に、驚くほど高いレベルのアレル選択性を示した。
【０３３９】
実施例２．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９用のＵ−ガイド分子を用いた、ＴＴＲゲノム部位のアレル選択的な編集
【０３４０】
Ｖ３０Ｍ ｈＴＴＲ用の２０塩基長のガイド配列を、表８に示す。
【表８】
0006799058.tif 000020
【０３４１】
表８において、配列番号４０はまた、５’から３’方向に記載され得、５’から３’方向に記載された表９のＵ−ガイド分子内に現れる。
【０３４２】
本明細書において、用語「１または５’から３’」は、最左端にＵＮＡモノマー（１から３’、例えば配列番号４３）、または最左端にヌクレオチド（５’から３’、例えば配列番号４４）のいずれかを有する、Ｕ−ガイドを指す。
【０３４３】
Ｕ−ガイド分子を合成し、ここでこの分子は、Ｖ３０Ｍ用の２０塩基長のガイド配列および化膿レンサ球菌のＣＲＩＳＰＲ配列を含んでいた。
【０３４４】
ｈＴＴＲのＶ３０Ｍ領域のための、標的の長さが２０塩基長のＵ−ガイド分子の例を、表９に示す。
【表９】
0006799058.tif 000021
【０３４５】
表９において、Ｎ（＝Ａ、Ｕ、Ｃ、Ｇ）はＲＮＡモノマーを指し、ｍＮは２’−Ｏ−メチル−ＲＮＡモノマーを指し、＊は３’−ホスホロチオエート結合を指し、Ａ~、Ｕ~、Ｃ~、Ｇ~はＵＮＡモノマーを指す。
【０３４６】
表９におけるＵ−ガイド分子は、ヒトＴＴＲを遺伝子編集するのに有効であった。ヒトＴＴＲの遺伝子編集のためのアッセイを、３５７ｂｐのＰＣＲ産物で行った。このアッセイにおいて、Ｕ−ガイド分子をｔｒａｃｒＲＮＡとプレアニールし、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集のためのＵ−ガイド／ｔｒａｃｒを提供する。
【０３４７】
このアッセイにおいて、Ｖ３０ＭヒトＴＴＲを発現する２９３個の細胞、およびＷＴヒトＴＴＲを発現する２９３個の細胞それぞれに、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡをLIPOFECTAMINE MESSENGER MAX試薬を用いて遺伝子導入し、その４時間後に、Ｕ−ガイド／ｔｒａｃｒを遺伝子導入した。遺伝子導入の４８時間後に、ゲノムＤＮＡを単離し、Ｔ７エンドヌクレアーゼアッセイを行った。
【０３４８】
図１０は、Ｕ−ガイド分子ＵＮＡ３（配列番号６１）を用いて、二本鎖切断を３５７ｂｐのＰＣＲ産物に生成し、２７１ｂｐおよび８６ｂｐの切断産物を与えたことを示す。
【０３４９】
配列番号６１のＵ−ガイド分子は、アレル選択的な結果を伴う、ヒトＴＴＲの遺伝子編集に驚くほど有効であった。配列番号６１のＵ−ガイド分子は、野生型ＴＴＲと比較して、Ｖ３０Ｍ ＴＴＲにおける二本鎖切断の生成について、並外れたレベルのアレル選択性を示した。
【０３５０】
図１１に示すように、配列番号６１のＵ−ガイド分子は、Ｖ３０Ｍ ＴＴＲの１４％の編集、および野生型ＴＴＲのわずか約３％の編集を与えた。ここで編集は二本鎖切断の程度を示す。したがって、配列番号６２のＵ−ガイド分子は、アレル選択的な結果を伴う、ヒトＴＴＲの遺伝子編集に並外れて、驚くほど有効であった。この実施例は、オフターゲット活性を減少させる能力を示す。
【０３５１】
これらの結果は、本発明のＵ−ガイド分子を、ヒトＴＴＲのアレル選択的な遺伝子編集に使用できることを示す。ヒトＴＴＲの遺伝子編集における、驚くべきレベルのアレル選択性を、図１２に示す。配列番号６１のＵ−ガイド分子は、４．７の高い選択性比を与えた。
【０３５２】
したがって、配列番号６２のＵ−ガイド分子は、野生型ＴＴＲに対するＶ３０Ｍ ＴＴＲのアレル選択性を伴う、ヒトＴＴＲの遺伝子編集に並外れて有効であった。この実施例は、オフターゲット活性を減少させる能力を示す。
【０３５３】
実施例３：ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９用のＵ−ガイド分子を用いた、ＢＩＲＣ５ゲノム部位の編集
【０３５４】
サバイビン（バキュロウイルスアポトーシス阻害剤リピート含有５(baculoviral inhibitor of apoptosis repeat-containing 5)、ヒトＢＩＲＣ５、ＮＧ＿０２９０６９．１）は、腫瘍細胞（特に乳がんおよび肺がん）において発現し得、一般的に正常細胞には存在しない。サバイビンは、がん遺伝子であり得、がん細胞におけるその過剰発現は、アポトーシス抵抗性および生存の増加を導き得る。
【０３５５】
２０塩基長のガイド配列を、ヒトＢＩＲＣ５の特定の領域を標的とするように、同定した。これらの配列のＥｎｔｒｅＺ遺伝子ＩＤは３３２である。
【０３５６】
ＢＩＲＣ５のための２０塩基長のガイド配列を、表１０に示す。
【表１０】
0006799058.tif 000022
【０３５７】
Ｕ−ガイド分子を合成し、ここでこの分子は、２０塩基長の標的配列および化膿レンサ球菌のＣＲＩＳＰＲ配列を含む。
【０３５８】
ＢＩＲＣ５のための、標的の長さが２０塩基長のＵ−ガイド分子の例を、表１１に示す。
【表１１−１】
0006799058.tif 000023
【表１１−２】
0006799058.tif 000024
【０３５９】
表１１において、ＮはＲＮＡモノマーを指し、ｍＮは２’−Ｏ−メチル−ＲＮＡモノマーを指し、＊は３’−ホスホロチオエート結合を指し、Ｕ~はＵＮＡ−Ｕモノマーを指し、Ｇ~はＵＮＡ−Ｇモノマーを指す。
【０３６０】
実施例４：ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９用のＵ−ガイド分子を用いた、ＣＤＫ１６ゲノム部位の編集
【０３６１】
ＣＤＫ１６によってコードされるタンパク質は、タンパク質キナーゼのｓｅｒ／ｔｈｒファミリーのｃｄｃ２／ｃｄｋｘサブファミリーに属する（ヒトＣＤＫ１６、ＮＧ＿０１２５１７．１）。ＣＤＫ１６は、最終分化細胞におけるシグナル伝達カスケード、エクソサイトーシス、および小胞体からの分泌カーゴの輸送に関連し得る。ＣＤＫ１６の欠損およびコピー数バリアントは、様々な疾患（知的障害および関連障害を含む）に関連している。
【０３６２】
２０塩基長のガイド配列を、ヒトＣＤＫ１６の特定の領域を標的とするように、同定した。これらの配列のＥｎｔｒｅＺ遺伝子ＩＤは５１２７である。
【０３６３】
ＣＤＫ１６のための２０塩基長のガイド配列を、表１２に示す。
【表１２】
0006799058.tif 000025
【０３６４】
Ｕ−ガイド分子を合成し、ここでこの分子は、２０塩基長の標的配列および化膿レンサ球菌のＣＲＩＳＰＲ配列を含む。
【０３６５】
ＣＤＫ１６のための標的の長さが２０塩基長のＵ−ガイド分子の例を、表１３に示す。
【０３６６】
【表１３−１】
0006799058.tif 000026
【表１３−２】
0006799058.tif 000027
【０３６７】
表１３において、ＮはＲＮＡモノマーを指し、ｍＮは２’−Ｏ−メチル−ＲＮＡモノマーを指し、＊は３’−ホスホロチオエート結合を指し、Ｕ~はＵＮＡ−Ｕモノマーを指し、Ｇ~はＵＮＡ−Ｇモノマーを指す。
【０３６８】
実施例５：ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９用のＵ−ガイド分子を用いた、ＳＴＡＴ３ゲノム部位の編集
【０３６９】
シグナル伝達兼転写活性化因子３（ＳＴＡＴ３）は、多くのサイトカインにおける転写メディエーターである（ヒトＳＴＡＴ３、ＮＧ＿００７３７０．１）。ＳＴＡＴ３は、ＳＴＡＴタンパク質のファミリーに属し、これは、細胞外シグナル伝達タンパク質（特に、インターロイキン（ＩＬ）−６ファミリー（例えば、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１１）を含む）に応答して活性化する。ＳＴＡＴ３は、様々な自己免疫疾患（炎症性腸疾患（ＩＢＤ）など）、肝疾患、グリオーシス、反応性アストロサイト、ならびに他の疾患および症状に関連し得る。
【０３７０】
２０塩基長のガイド配列を、ヒトＳＴＡＴ３の特定の領域を標的とするように、同定した。これらの配列のＥｎｔｒｅＺ遺伝子ＩＤは６７７４である。
【０３７１】
ＳＴＡＴ３のための２０塩基長のガイド配列を、表１４に示す。
【表１４】
0006799058.tif 000028
【０３７２】
Ｕ−ガイド分子を合成し、ここでこの分子は、２０塩基長の標的配列および化膿レンサ球菌のＣＲＩＳＰＲ配列を含む。
【０３７３】
ＳＴＡＴ３のための標的の長さが２０塩基長のＵ−ガイド分子の例を、表１５に示す。
【０３７４】
【表１５−１】
0006799058.tif 000029
【表１５−２】
0006799058.tif 000030
【０３７５】
表１５において、ＮはＲＮＡモノマーを指し、ｍＮは２’−Ｏ−メチル−ＲＮＡモノマーを指し、＊は３’−ホスホロチオエート結合を指し、Ｕ~はＵＮＡ−Ｕモノマーを指し、Ｇ~はＵＮＡ−Ｇモノマーを指す。
【０３７６】
実施例６：ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９用のＵ−ガイド分子を用いた、ＣＦＴＲゲノム部位の編集
【０３７７】
嚢胞性線維症（ＣＦ）は、呼吸器系に実質的に影響を与える遺伝性疾患であり、肺に異常に厚い粘液内層を生じる。この疾患は致死的な肺感染症を導き得、膵臓の様々な閉塞症をもたらし、消化を妨害し得る。ＣＦの症状は、持続性の咳、喘鳴または息切れ、ならびに食欲の亢進および不十分な体重増加を含む。悪化は避けられず、衰弱および最終的に死に至る。米国において、ＣＦの発症率は、新生児３５００人に１人の割合であると報告されている。
【０３７８】
この疾患を患う個体は、それぞれの親から、異常な嚢胞性線維症ＣＦＴＲ遺伝子を受け継ぐ。異常なＣＦＴＲ遺伝子は、異常なタンパク質嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子を生成し、これは細胞内外の塩および水の移動を正確に制御しない。結果として、呼吸器系、消化器系および生殖器系における厚い、粘着性の粘液、および汗における塩分の増加を与える。ＣＦＴＲ遺伝子には、千を超える変異の可能性がある。
【０３７９】
２０塩基長のガイド配列を、ヒトＣＦＴＲ（ヒトＣＦＴＲ、ＮＧ＿０１６４６５．４）の特定の領域を標的とするように、同定した。これらの配列のＥｎｔｒｅＺ遺伝子ＩＤは１０８０である。
【０３８０】
ＣＦＴＲのための２０塩基長のガイド配列を、表１６に示す。
【表１６】
0006799058.tif 000031
【０３８１】
Ｕ−ガイド分子を合成し、ここでこの分子は、２０塩基長の標的配列および化膿レンサ球菌のＣＲＩＳＰＲ配列を含む。
【０３８２】
ＣＦＴＲのための、標的の長さが２０塩基長のＵ−ガイド分子の例を、表１７に示す。
【０３８３】
【表１７−１】
0006799058.tif 000032
【表１７−２】
0006799058.tif 000033
【０３８４】
表１７において、ＮはＲＮＡモノマーを指し、ｍＮは２’−Ｏ−メチル−ＲＮＡモノマーを指し、＊は３’−ホスホロチオエート結合を指し、Ｕ~はＵＮＡ−Ｕモノマーを指し、Ｇ~はＵＮＡ−Ｇモノマーを指す。
【０３８５】
実施例７：ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９用のＵ−ガイド分子を用いた、第ＩＸ因子（Ｆ９）ゲノム部位の編集
【０３８６】
第ＩＸ因子の欠乏は、血友病Ｂを引き起こす。第ＩＸ因子において、１００を超える公知の変異がある。
【０３８７】
２０塩基長のガイド配列を、ヒトＦ９（ヒトＦ９、ＮＧ＿００７９９４．１）の特定の領域を標的とするように、同定した。これらの配列のＥｎｔｒｅＺ遺伝子ＩＤは２１５８である。
【０３８８】
Ｆ９のための２０塩基長のガイド配列を、表１８に示す。
【表１８】
0006799058.tif 000034
【０３８９】
Ｕ−ガイド分子を合成し、ここでこの分子は、２０塩基長の標的配列および化膿レンサ球菌のＣＲＩＳＰＲ配列を含む。
【０３９０】
Ｆ９のための標的の長さが２０塩基長のＵ−ガイド分子の例を、表１９に示す。
【０３９１】
【表１９−１】
0006799058.tif 000035
【表１９−２】
0006799058.tif 000036
【０３９２】
表１９において、ＮはＲＮＡモノマーを指し、ｍＮは２’−Ｏ−メチル−ＲＮＡモノマーを指し、＊は３’−ホスホロチオエート結合を指し、Ｕ~はＵＮＡ−Ｕモノマーを指し、Ｇ~はＵＮＡ−Ｇモノマーを指す。
【０３９３】
実施例８：ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９用のＵ−ガイド分子を用いた、ＫＲＡＳゲノム部位の編集
【０３９４】
ＫＲＡＳタンパク質は、正常な組織のシグナル伝達に必須であり、ＫＲＡＳ遺伝子の変異は多くのがんに関連する。
【０３９５】
２０塩基長のガイド配列を、ヒトＫＲＡＳ（ヒトＫＲＡＳ、ＮＧ＿００７５２４．１）の特定の領域を標的とするように、同定した。これらの配列のＥｎｔｒｅＺ遺伝子ＩＤは３８４５である。
【０３９６】
ＫＲＡＳのための２０塩基長のガイド配列を、表２０に示す。
【表２０】
0006799058.tif 000037
【０３９７】
Ｕ−ガイド分子を合成し、ここでこの分子は、２０塩基長の標的配列および化膿レンサ球菌のＣＲＩＳＰＲ配列を含む。
【０３９８】
ＫＲＡＳのための標的の長さが２０塩基長のＵ−ガイド分子の例を、表２１に示す。
【０３９９】
【表２１−１】
0006799058.tif 000038
【表２１−２】
0006799058.tif 000039
【０４００】
表２１において、ＮはＲＮＡモノマーを指し、ｍＮは２’−Ｏ−メチル−ＲＮＡモノマーを指し、＊は３’−ホスホロチオエート結合を指し、Ｕ~はＵＮＡ−Ｕモノマーを指し、Ｇ~はＵＮＡ−Ｇモノマーを指す。
【０４０１】
実施例９：ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９用のＵ−ガイド分子を用いた、Ｔ細胞ゲノム部位の編集
【０４０２】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の構造の略図を図１３に示す。ＣＡＲは、Ｔ細胞に挿入され、発現される、人工的なＴ細胞受容体である。ＳｃＦｖは単鎖可変フラグメントである。ＶＨは重鎖可変領域である。ＶＬは軽鎖可変領域である。ＴＭは膜貫通ドメインである。ＳＤはシグナル伝達ドメインである。
【０４０３】
ＣＡＲ遺伝子を、Ｔ細胞において構成的に発現する任意の遺伝子に挿入し得る。
【０４０４】
例えば、ある実施態様において、ＣＡＲ遺伝子をＣＤ２遺伝子（分化クラスター２(cluster of differentiation 2)）に挿入し得る。ＣＤ２は、Ｔ細胞表面上に見出される細胞接着分子であり、Ｔ細胞が抗原提示細胞に接着するのを助ける。
【０４０５】
図１４は、ＣＡＲ遺伝子を、Ｔ細胞の構成的ＣＤ２遺伝子に導入する方法の模式図を示し、ＣＡＲはＣＤ２の下流にある。二本鎖切断を、本発明のＵ−ガイド分子を用いて作成する。相同組換えで挿入した遺伝子は、Ｐ２ＡおよびＣＡＲの区分と共に、ＣＤ２の区分から構成され得る。Ｐ２Ａペプチドは、２つの別々の遺伝子産物である、ＣＤ２タンパク質およびＣＡＲタンパク質を生成するのに使用され得る、自己切断ペプチドである。ＣＡＲタンパク質受容体は、養子免疫療法の戦略において、対象のがん細胞に対するｍＡｂの特異性を保有し、対象のがん細胞を死滅させ得る。
【０４０６】
図１５は、ＣＡＲ遺伝子を、Ｔ細胞の構成的ＣＤ２遺伝子に導入する方法の模式図を示し、ＣＡＲはＣＤ２の上流にある。
【０４０７】
ＣＤ２のための、いくつかの２０塩基長のガイド配列を、表２２に示す。
【表２２】
0006799058.tif 000040
【０４０８】
２０塩基長のガイド配列を、ヒトＣＤ２の特定の領域を標的とするように、同定した。  
【０４０９】
ＣＤ２のための２０塩基長のガイド配列を、表２３に示す。
【表２３】
0006799058.tif 000041
【０４１０】
Ｕ−ガイド分子を合成し、ここでこの分子は、２０塩基長の標的配列および化膿レンサ球菌のＣＲＩＳＰＲ配列を含む。
【０４１１】
ＣＤ２のための標的の長さが２０塩基長のＵ−ガイド分子の例を、表２４に示す。
【０４１２】
【表２４】
0006799058.tif 000042
【０４１３】
表２４において、ＮはＲＮＡモノマーを指し、ｍＮは２’−Ｏ−メチル−ＲＮＡモノマーを指し、＊は３’−ホスホロチオエート結合を指し、Ｕ~はＵＮＡ−Ｕモノマーを指し、Ｇ~はＵＮＡ−Ｇモノマーを指す。
【０４１４】
実施例１０：配列トレース分解（ＴＩＤＥ）のためのプロトコル
【０４１５】
Ｖ３０ＭヒトＴＴＲまたはＷＴヒトＴＴＲのいずれかを発現する２９３個の細胞に、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡをLIPOFECTAMINE MESSENGERMAX試薬で遺伝子導入し、その４時間後に、比較ガイドまたはＵＮＡガイド（ＵＮＡ１）（これらをそれぞれ、ｔｒａｃｒＲＮＡとプレアニールし、ｈＴＴＲのＶ３０Ｍ変異を標的とした）を遺伝子導入した。遺伝子導入の４８時間後に、ゲノムＤＮＡを単離し、ｈＴＴＲの１０４８ｂｐのフラグメントをプライマー：
配列番号５５９
５’ＡＣＡＡＣＴＧＧＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＴＧＡＣ３’および
配列番号５６０
５’ＣＣＴＴＧＧＧＴＴＴＴＧＧＧＴＧＡＴＣＣ３’
を用いて増幅した。
【０４１６】
ＰＣＲ産物を精製し、次いで、
配列番号５６１
５’ＴＣＧＡＣＡＣＴＴＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＴ３’または
配列番号５６２
５’ＣＡＴＡＣＴＴＧＡＣＣＴＣＴＧＣＣＴＡＣ３’
のいずれかのプライマーを用いて、サンガーシークエンスした。
【０４１７】
実施例１１：ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９のためのＵ−ガイド分子を用いた、ＴＴＲゲノム部位の編集
【０４１８】
２０塩基長のガイド配列を、ヒトＴＴＲ（アクセッション番号ＮＣ＿００００１８．１０）の特定の領域を標的とするように、同定した。
【０４１９】
ｈＴＴＲのための２０塩基長のガイド配列を、表２５に示す。
【表２５】
0006799058.tif 000043
【０４２０】
Ｕ−ガイド分子を合成し、ここでこの分子は、２０塩基長の標的配列および化膿レンサ球菌のＣＲＩＳＰＲ配列を含む。
【０４２１】
Ｖ１２２Ｉ ｈＴＴＲのための、標的の長さが２０塩基長のＵ−ガイド分子の例を、表２６に示す。
【表２６】
0006799058.tif 000044
【０４２２】
ｈＴＴＲのＬ５５Ｐ領域のための、標的の長さが２０塩基長のＵ−ガイド分子の例を、表２７に示す。
【表２７】
0006799058.tif 000045
【０４２３】
ｈＴＴＲのＳＰ領域のための、標的の長さが２０塩基長のＵ−ガイド分子の例を、表２８に示す。
【表２８】
0006799058.tif 000046
【０４２４】
実施例１２：ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集のＵ−ガイド分子のための、ｃｒＲＮＡの例は、
配列番号６０５
５’−ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵ−３’である。
【０４２５】
実施例１３：ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集のＵ−ガイドシステムのための、ｔｒａｃｒＲＮＡの例は、上記で用いられるように、
配列番号６０６
５’-ｍＡ＊ｍＧ＊ｍＣ＊ｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣｍＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣｍＵ＊ｍＵ＊ｍＵ-３’である。
【０４２６】
記載された特定の方法論、プロトコル、材料および試薬は様々であり得るため、本明細書はこれらに限定されないことが理解される。また、本明細書中で用いた用語は、特定の実施態様のみを説明することを目的とし、添付の特許請求の範囲によって包含される、本発明の範囲を限定することを意図しないことも理解される。
【０４２７】
本明細書および添付の特許請求の範囲において、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上明らかな他の指示がない限り、複数形を含むことを注記しておく。さらに、用語「ａ」（または「ａｎ」）、「１以上の」および「少なくとも１つの」は、本明細書において交換可能に使用され得る。また、用語「含む」、「含んでいる」、「含有する」、「包含する」および「有する」は、交換可能に使用され得ることも注記しておく。
【０４２８】
さらなる詳述なしに、当業者は、上述の記載に基づいて、本発明を十分な範囲で利用できると考えられる。したがって、以下の具体的な実施態様は、単なる説明として解釈されるべきであり、いかなる方法においても本開示の残部の限定とはならない。
【０４２９】
本明細書に開示される全ての特徴は、任意の組合せで組み合わせてよい。本明細書に開示される各特徴を、同一、等価、または類似の目的を果たす代替の特徴によって、置換してもよい。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
0006799058.tif 000056
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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