(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナンノクロロプシスオキュラータ（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｏｃｕｌａｔａ）を培養する培養ステップと、
前記ナンノクロロプシスオキュラータの４９０ｎｍにおける第１の吸光度及び６８０ｎｍにおける第２の吸光度を複数の時点で測定する測定ステップと、
前記第１の吸光度を前記第２の吸光度で除した値が下降から上昇に転じてから２日以内又は前記第２の吸光度を前記第１の吸光度で除した値が上昇から下降に転じてから２日以内に前記ナンノクロロプシスオキュラータを収穫する収穫ステップと、
を含む、微細藻類の培養方法。
【請求項２】
前記測定ステップでは、
前記ナンノクロロプシスオキュラータを含む培養液の４９０ｎｍにおける第３の吸光度と６８０ｎｍにおける第４の吸光度とを測定し、
前記ナンノクロロプシスオキュラータが除去された前記培養液の４９０ｎｍにおける第５の吸光度と６８０ｎｍにおける第６の吸光度とを測定し、
前記収穫ステップにおける前記第１の吸光度は、前記第３の吸光度から前記第５の吸光度を減じた値であって、
前記収穫ステップにおける前記第２の吸光度は、前記第４の吸光度から前記第６の吸光度を減じた値である、
請求項１に記載の微細藻類の培養方法。
【請求項３】
ナンノクロロプシスオキュラータ（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｏｃｕｌａｔａ）の４９０ｎｍにおける第１の吸光度及び６８０ｎｍにおける第２の吸光度を複数の時点で測定する測定部と、
前記第１の吸光度を前記第２の吸光度で除した値が下降から上昇に転じてから２日以内又は前記第２の吸光度を前記第１の吸光度で除した値が上昇から下降に転じてから２日以内にユーザーに通知を行う通知部と、
を備えるデータ解析装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微細藻類の培養方法及びデータ解析装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
真正眼点藻類ナンノクロロプシスオキュラータ（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｏｃｕｌａｔａ）は、海産魚類種苗の生産で使用される有用な微細藻類である。ナンノクロロプシスオキュラータは、海産魚類仔稚魚の餌料である海産ツボワムシ類の餌料用あるいは栄養強化用藻類として利用される。さらに、ナンノクロロプシスオキュラータは、飼育水に添加されている餌料生物の栄養価劣化の防止、及び仔稚魚の遊泳行動の安定化、といった所謂グリーンウォーター効果をもたらす微細藻類として、魚類仔稚魚の飼育水に添加される。
【０００３】
ナンノクロロプシスオキュラータの培養には、硝酸塩並びにリン酸塩等の栄養塩、ミネラル類、及びビタミン類を含む培養液が用いられる。ナンノクロロプシスオキュラータは、培養液中に接種され、最大密度になるまで培養され、その後収穫される。接種から最大密度に達する期間は、培養時の環境によって異なる。達する最大密度も培養環境によって異なるため、培養中の細胞密度のみを目安に収穫時期を決めることは難しい。
【０００４】
また、ナンノクロロプシスオキュラータは、細胞内に高度不飽和脂肪酸であるエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）を含有している。ＥＰＡは海産魚類仔魚の必須脂肪酸の一つであり、前述の海産ツボワムシ類はＥＰＡが欠乏しているため、仔魚の餌として給餌する前にＥＰＡを強化する必要がある。
【０００５】
ナンノクロロプシスオキュラータ中のＥＰＡ含量は培養中に変化する。海産ツボワムシ類の餌料用あるいは栄養強化用藻類として利用する場合、ＥＰＡ含量が最大になる時期にナンノクロロプシスオキュラータを収穫することが望ましい。しかし、ＥＰＡ含量の従来法での測定にはサンプルの調製及び分析等に時間を要するため、ＥＰＡ含量に基づいて収穫のタイミングを即時判断することは困難である。
【０００６】
微細藻類の収穫のタイミングを決定する方法に関して、例えば、特許文献１には、培養液における赤色光の吸光度と緑色光の吸光度との比が、微細藻類の比増殖速度と相関することを利用して、微細藻類の培養状態を判断する方法が開示されている。当該方法によれば、培養状態に応じて微細藻類の収穫のタイミングを決定することができる。
【０００７】
特許文献２には、脂溶性成分が微細藻類に十分に蓄積したタイミングで微細藻類を収穫するために、微細藻類を含む培養液から検出した２つ以上の波長域の光に関する吸光度比に基づいて、微細藻類の脂溶性成分含量の多寡を判断する方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２０１４−１４３９２１号公報
【特許文献２】特開２０１４−１７４０３４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上記特許文献１に係る方法では、微細藻類としてイカダモで検討した結果、比増殖速度が減少に転じたタイミングでイカダモを収穫する。しかし、比増殖速度が減少したときにイカダモが最大密度となっているかは不明である。また、イカダモとナンノクロロプシスオキュラータとでは吸光度特性が異なるため、上記特許文献１に係る方法を、ナンノクロロプシスオキュラータの収穫のタイミングの判断に適用することはできない。
【００１０】
上記特許文献２では、脂溶性成分と吸光度比との相関関係はイカダモとクロレラとで異なることが示されている。このため、当然ながらナンノクロロプシスオキュラータにおける脂溶性成分の含量と吸光度特性との関係については研究が必要である。また、脂溶性成分には、ＥＰＡ以外の脂質、ワックス成分及びトリテルペン系炭化水素等が含まれており、ＥＰＡ含量と吸光度比との相関については明らかにされていない。
【００１１】
本発明は、上記実情に鑑みてなされたものであり、最適な時期にナンノクロロプシスオキュラータを収穫することができる微細藻類の培養方法及びデータ解析装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の第１の観点に係る微細藻類の培養方法は、
ナンノクロロプシスオキュラータ（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｏｃｕｌａｔａ）を培養する培養ステップと、
前記ナンノクロロプシスオキュラータの４９０ｎｍにおける第１の吸光度及び６８０ｎｍにおける第２の吸光度を複数の時点で測定する測定ステップと、
前記第１の吸光度を前記第２の吸光度で除した値が下降から上昇に転じてから２日以内又は前記第２の吸光度を前記第１の吸光度で除した値が上昇から下降に転じてから２日以内に前記ナンノクロロプシスオキュラータを収穫する収穫ステップと、
を含む。
【００１４】
また、前記測定ステップでは、
前記ナンノクロロプシスオキュラータを含む培養液の４９０ｎｍにおける第３の吸光度と６８０ｎｍにおける第４の吸光度とを測定し、
前記ナンノクロロプシスオキュラータが除去された前記培養液の４９０ｎｍにおける第５の吸光度と６８０ｎｍにおける第６の吸光度とを測定し、
前記収穫ステップにおける前記第１の吸光度は、前記第３の吸光度から前記第５の吸光度を減じた値であって、
前記収穫ステップにおける前記第２の吸光度は、前記第４の吸光度から前記第６の吸光度を減じた値である、
こととしてもよい。
【００１６】
本発明の第２の観点に係るデータ解析装置は、
ナンノクロロプシスオキュラータ（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｏｃｕｌａｔａ）の４９０ｎｍにおける第１の吸光度及び６８０ｎｍにおける第２の吸光度を複数の時点で測定する測定部と、
前記第１の吸光度を前記第２の吸光度で除した値が下降から上昇に転じてから２日以内又は前記第２の吸光度を前記第１の吸光度で除した値が上昇から下降に転じてから２日以内にユーザーに通知を行う通知部と、
を備える。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、最適な時期にナンノクロロプシスオキュラータを収穫することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】実施の形態に係るデータ解析装置の構成を示す図である。
【図２】通知処理のフローチャートを示す図である。
【図３】ナンノクロロプシスオキュラータの細胞密度の経時変化を示す図である。
【図４】ナンノクロロプシスオキュラータの吸光度を示す図である。（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）は、それぞれ初期細胞密度が低密度、中密度及び高密度の場合の吸光度を示す図である。
【図５】ナンノクロロプシスオキュラータの４９０ｎｍと６８０ｎｍとの吸光度比の経時変化を示す図である。
【図６】ナンノクロロプシスオキュラータの培養液中の硝酸態窒素濃度の経時変化を示す図である。（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）は、それぞれ初期細胞密度が低密度、中密度及び高密度の場合の硝酸態窒素濃度の経時変化を示す。
【図７】ナンノクロロプシスオキュラータの培養液中のリン酸濃度の経時変化を示す図である。（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）は、それぞれ初期細胞密度が低密度、中密度及び高密度の場合のリン酸濃度の経時変化を示す。
【図８】極性脂質及び非極性脂質の細胞中含量の経時変化を示す図である。（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）は、それぞれ初期細胞密度が低密度、中密度及び高密度の場合の極性脂質及び非極性脂質の細胞中含量の経時変化を示す図である。
【図９】総脂質における極性脂質及び非極性脂質の割合の経時変化を示す図である。（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）は、それぞれ初期細胞密度が低密度、中密度及び高密度の場合の総脂質における極性脂質及び非極性脂質の割合の経時変化を示す図である。
【図１０】極性脂質及び非極性脂質に占めるＥＰＡの含有量の経時変化を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明に係る実施の形態について図面を参照して説明する。なお、本発明は下記の実施の形態および図面によって限定されるものではない。
【００２０】
（実施の形態）
本実施の形態に係る微細藻類の培養方法は、培養ステップと、測定ステップと、収穫ステップと、を含む。
【００２１】
まず、培養ステップについて説明する。培養ステップでは、ナンノクロロプシスオキュラータを培養する。ナンノクロロプシスオキュラータは培養液中で培養される。培養液は特に限定されず、ナンノクロロプシスオキュラータが増殖可能な任意の培養液を用いることができる。好ましくは、培養液としてｆ培地が用いられる。ｆ培地は、例えば、海水に対して、硝酸ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、珪酸ナトリウム九水和物、Ｆｅ−ＥＤＴＡ、塩化マンガン四水和物、硫酸銅五水和物、硫酸亜鉛七水和物、塩化コバルト（ＩＩ）六水和物、モリブデン酸ナトリウム二水和物、ビタミンＢ１２、ビオチン及びチアミン塩酸塩等を適量添加することで調製できる。好ましくは、培地に使用する海水は濾過滅菌してから用いる。培地として市販のギラード（Ｆ／２）海水栄養液又は各種ビタミン及びアミノ酸を配合した微細藻類用培養液等を用いてもよい。
【００２２】
ナンノクロロプシスオキュラータは、培養液の温度を１８〜２５℃程度、好ましくは２０℃に維持し、通気下で培養すればよい。通気される空気は、好ましくは、濾過フィルター等で無菌にされる。
【００２３】
好ましくは、ナンノクロロプシスオキュラータは、光照射下で培養される。光の強さは任意であるが、例えば、光量子束密度が５０〜３００μｍｏｌ  ｐｈｏｔｏｎｓ／ｍ２／ｓ、１００〜２００μｍｏｌ  ｐｈｏｔｏｎｓ／ｍ２／ｓ、好ましくは１５０μｍｏｌ  ｐｈｏｔｏｎｓ／ｍ２／ｓの光である。
【００２４】
上記培養ステップには、ナンノクロロプシスオキュラータの予備培養を含んでもよい。予備培養では、例えば、ナンノクロロプシスオキュラータを培養してから３日目の対数増殖期と推定される細胞を新しい培養液に接種することを複数回繰り返せばよい。
【００２５】
次に、測定ステップについて説明する。測定ステップでは、ナンノクロロプシスオキュラータの所定の波長における吸光度を複数の時点で測定する。吸光度の測定では、例えば、光源から発せられた光をナンノクロロプシスオキュラータの細胞に当て、透過した光の放射照度を分光放射照度計で測定すればよい。
【００２６】
ナンノクロロプシスオキュラータは、４４０ｎｍ、４９０ｎｍ及び６８０ｎｍ付近の吸光度が比較的大きい。測定ステップでは、好ましくは、４８０〜５２０ｎｍの範囲内の波長λ１（第１の波長）における吸光度Ｄ１（第１の吸光度）及び６６０〜７００ｎｍの範囲内の波長λ２（第２の波長）における吸光度Ｄ２（第２の吸光度）を測定すればよい。より好ましくは、λ１は４８５〜５００ｎｍの範囲内、好適には４９０ｎｍである。λ２は６７０〜６９０ｎｍの範囲内、好適には６８０ｎｍである。以下では、λ１として４９０ｎｍを、λ２として６８０ｎｍを採用した場合について説明する。
【００２７】
当該測定ステップでは、培養液を測定対象とすることでもＤ１及びＤ２を測定することができる。例えば、当該測定ステップでは、ナンノクロロプシスオキュラータを含む培養液の４９０ｎｍにおける吸光度Ｄ３（第３の吸光度）と６８０ｎｍおける吸光度Ｄ４（第４の吸光度）とを測定する。さらに、ナンノクロロプシスオキュラータが除去された培養液の４９０ｎｍにおける吸光度Ｄ５（第５の吸光度）と６８０ｎｍにおける吸光度Ｄ６（第６の吸光度）とを測定する。この場合、Ｄ１はＤ３からＤ５を減じた値となり、Ｄ２はＤ４からＤ６を減じた値となる。
【００２８】
培養期間中、吸光度は、少なくとも２回、好ましくは３回以上、異なる時点で測定すればよい。好適には、吸光度は、培養期間が終わるまでに所定時間間隔で複数回測定される。時間間隔は、増殖速度に応じて適宜調整されるが、２時間、３時間、４時間、５時間、１０時間、１２時間、好ましくは２４時間である。好適には、当該測定ステップでは、毎日同じ時刻に吸光度が測定される。
【００２９】
続いて、収穫ステップについて説明する。収穫ステップでは、Ｄ１とＤ２との吸光度比の複数の時点間での比較に基づいて、ナンノクロロプシスオキュラータを収穫する。収穫ステップでは、例えば、Ｄ１とＤ２との吸光度比（Ｄ１／Ｄ２）に基づいてナンノクロロプシスオキュラータを収穫する。Ｄ１／Ｄ２は、Ｄ１をＤ２で除した値であるもといえる。具体的には、収穫ステップでは、Ｄ１／Ｄ２が下降から上昇に転じてからナンノクロロプシスオキュラータを収穫する。例えば、測定ステップで２４時間毎に測定されたＤ１／Ｄ２を記録し、収穫ステップでは、当該記録を参照し、下降していたＤ１／Ｄ２が上昇したときにナンノクロロプシスオキュラータを収穫すればよい。
【００３０】
Ｄ１／Ｄ２が下降から上昇に転じてからすぐに収穫する必要はなく、Ｄ１／Ｄ２が下降から上昇に転じてから、例えば、１時間後、２時間後、３時間後、５時間後、１２時間後、２４時間後、３６時間後又は４８時間後に収穫してもよい。好適には、収穫ステップでは、Ｄ１／Ｄ２が下降から上昇に転じてから２日以内にナンノクロロプシスオキュラータが収穫される。
【００３１】
なお、収穫ステップでは、Ｄ１とＤ２との比としてＤ２／Ｄ１を用いてもよい。Ｄ２／Ｄ１を複数の時点で比較する場合は、上昇していたＤ２／Ｄ１が下降したときにナンノクロロプシスオキュラータを収穫すればよい。
【００３２】
上述のように培養液を測定対象とした場合、具体的には、収穫ステップでは、Ｄ３からＤ５を減じた値と、Ｄ４からＤ６を減じた値との比に基づいて、ナンノクロロプシスオキュラータを収穫すればよい。
【００３３】
ナンノクロロプシスオキュラータの収穫の方法は特に限定されない。ナンノクロロプシスオキュラータは、例えば、培養を停止し、培養液の遠心分離等の公知の方法でナンノクロロプシスオキュラータを濃縮することで収穫できる。
【００３４】
ここで、本実施の形態に係る微細藻類の培養方法に好適なデータ解析装置の一例としてデータ解析装置１００について説明する。図１は、データ解析装置１００の構成を示す機能ブロック図である。データ解析装置１００は、測定部１と、通知部２と、記憶部３と、表示部４と、を備える。
【００３５】
データ解析装置１００は、ＣＰＵ（Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｕｎｉｔ）と、外部記憶装置と、ＲＡＭ（Ｒａｎｄｏｍ  Ａｃｃｅｓｓ  Ｍｅｍｏｒｙ）と、を備える。データ解析装置１００では、ＣＰＵが外部記憶装置に記憶されたソフトウェアプログラムをＲＡＭに読み出して、ソフトウェアプログラムを実行制御することにより、以下に説明する測定部１、通知部２、記憶部３及び表示部４の機能を実現する。
【００３６】
測定部１は、入力装置と、光源と、分光放射照度計と、タイマーと、を備える。測定部１は、ナンノクロロプシスオキュラータのＤ１及びＤ２を測定するために、上述のＤ３〜Ｄ６を測定する。具体的には、測定部１は、入力装置を介して入力されたユーザーの指示に応じて、透明シャーレ等に保持されたナンノクロロプシスオキュラータを含む培養液又はナンノクロロプシスオキュラータが除去された培養液に対して光源から光を照射し、分光放射照度計でＤ３〜Ｄ６を測定する。測定部１は、タイマーを参照し、測定した時刻とともにＤ３〜Ｄ６を通知部２に出力する。ここでは、ユーザーは、毎日同時刻における培養液についてＤ３〜Ｄ６の測定を測定部１に指示するものとする。
【００３７】
通知部２は、測定部１によって入力されたＤ３〜Ｄ６から上述のようにＤ１／Ｄ２を算出する。通知部２は、測定部１によって入力された時刻とともにＤ１／Ｄ２を記憶部３に記憶させる。記憶部３は、測定部１によって入力されたＤ１／Ｄ２を時刻に関連付けて記憶する。
【００３８】
通知部２は、Ｄ１／Ｄ２の複数の時点間での比較に基づいて、ユーザーに通知を行う。より詳細には、通知部２は、記憶部３を参照し、測定部１によって入力されたＤ３〜Ｄ６から算出したＤ１／Ｄ２と前日までのＤ１／Ｄ２とを比較し、下降していたＤ１／Ｄ２が上昇したときに表示部４に通知指示を入力する。
【００３９】
表示部４は、ディスプレイを備え、通知部２によって入力された通知指示に応じて、例えば、「収穫開始」等をディスプレイに表示する。これにより、ユーザーは培養中のナンノクロロプシスオキュラータの収穫のタイミングを把握できる。
【００４０】
続いて、データ解析装置１００による通知処理を図２に示すフローチャートを参照して説明する。通知部２は、ナンノクロロプシスオキュラータの培養を開始したユーザーの指示によって通知処理が開始されると、記憶部３に記憶されたフラグ（Ｆ）を「０」に設定する（ステップＳ１）。測定部１は、ユーザーによってセットされた培養液についてＤ３〜Ｄ６の測定指示を待つ（ステップＳ２；Ｎｏ）。測定指示があると（ステップＳ２；Ｙｅｓ）、測定部１は、Ｄ３〜Ｄ６を測定する（ステップＳ３）。
【００４１】
続いて、通知部２は、Ｄ１／Ｄ２を算出し、記憶部３にＤ１／Ｄ２を時刻に関連付けて記憶させる（ステップＳ４）。通知部２は、記憶部３を参照し、算出したＤ１／Ｄ２が前日のＤ１／Ｄ２より下降したか否かを判定する（ステップＳ５）。算出したＤ１／Ｄ２が前日のＤ１／Ｄ２より下降した場合（ステップＳ５；Ｙｅｓ）、通知部２は、記憶部３に記憶されたＦを「１」に更新し（ステップＳ６）、ステップＳ２に戻る。
【００４２】
一方、算出したＤ１／Ｄ２が前日のＤ１／Ｄ２より下降していない場合（ステップＳ５；Ｎｏ）、通知部２は、算出したＤ１／Ｄ２が前日のＤ１／Ｄ２より上昇したか否かを判定する（ステップＳ７）。算出したＤ１／Ｄ２が前日のＤ１／Ｄ２より上昇していない場合（ステップＳ７；Ｎｏ）、通知部２はステップＳ２に戻る。なお、前日のＤ１／Ｄ２が記憶部３に記憶されてない場合も、算出したＤ１／Ｄ２は前日のＤ１／Ｄ２より下降していないため、ステップＳ５は「Ｎｏ」である。
【００４３】
算出したＤ１／Ｄ２が前日のＤ１／Ｄ２より上昇した場合（ステップＳ７；Ｙｅｓ）、通知部２は、Ｆが「１」であるか否かを判定する（ステップＳ８）。Ｆが「１」でない場合（ステップＳ８；Ｎｏ）、通知部２はステップＳ２に戻る。一方、Ｆが「１」である場合（ステップＳ８；Ｙｅｓ）、通知部２は、表示部４を介して「収穫開始」をユーザーに通知し（ステップＳ９）、通知処理を終了する。
【００４４】
これにより、データ解析装置１００は、ナンノクロロプシスオキュラータの培養開始後、下降していたＤ１／Ｄ２が上昇したときにユーザーに「収穫開始」を通知することができる。
【００４５】
以上詳細に説明したように、本実施の形態に係る培養方法及びデータ解析装置１００によれば、下降していたＤ１／Ｄ２が上昇したときにナンノクロロプシスオキュラータを収穫することができる。下記実施例に示すように、下降していたＤ１／Ｄ２が上昇したときから２日後までは、培養液中のナンノクロロプシスオキュラータの細胞密度が大きく、ＥＰＡ含量が高い。このため、ナンノクロロプシスオキュラータを最適な時期に収穫することができる。
【００４６】
なお、データ解析装置１００の通知部２は、収穫の時期を通知するようにしたが、これに限らない。通知部２は、下降していたＤ１／Ｄ２が上昇した時刻と該時刻から２時間までといった時間の範囲を、収穫に適した時期として通知してもよい。また、下記実施例に示すように、下降していたＤ１／Ｄ２が上昇するタイミングは、培養液中の栄養塩が枯渇した日とほぼ一致する。このため、通知部２は、下降していたＤ１／Ｄ２が上昇した場合に、栄養塩又は培地をさらに補充すること等を通知するようにしてもよい。
【００４７】
なお、通知部２は、測定又は記憶されたＤ３〜Ｄ６及び算出又は記憶されたＤ１／Ｄ２を、表示部４を介して表示してもよい。また、通知部２は、Ｄ１／Ｄ２を時間に対してプロットした経時変化を示すグラフを、表示部４を介して表示してもよい。
【００４８】
また、収穫ステップでは、Ｄ１／Ｄ２が所定の閾値以上に変化した場合に、Ｄ１／Ｄ２が下降又は上昇したとしてもよい。また、測定ステップにおいて、ナンノクロロプシスオキュラータの培養液から採取した複数のサンプルについてＤ３〜Ｄ６を測定し、収穫ステップでは、各時点における複数のＤ１／Ｄ２に基づいて統計的な有意差がある場合にＤ１／Ｄ２の下降又は上昇したとしてもよい。なお、収穫ステップでは、所定期間におけるＤ１／Ｄ２の平均を算出し、該平均の比較に基づいて、ナンノクロロプシスオキュラータを収穫してもよい。
【００４９】
なお、収穫ステップでは、Ｄ１／Ｄ２の経時変化を示すグラフの所定の時点での接線を求め、接線の傾きが負から０を経て正になったとき、若しくはその２時間以内にナンノクロロプシスオキュラータを収穫するようにしてもよい。
【００５０】
また、本実施の形態に係る培養方法は、ナンノクロロプシスオキュラータの収穫方法であってもよい。また、当該培養方法によれば、ＥＰＡ含量が高いナンノクロロプシスオキュラータを収穫できるため、当該培養方法はＥＰＡの製造方法としても利用できる。
【００５１】
なお、上記実施の形態において、実行されるソフトウェアプログラムは、フレキシブルディスク、ＣＤ−ＲＯＭ（Ｃｏｍｐａｃｔ  Ｄｉｓｃ  Ｒｅａｄ−Ｏｎｌｙ  Ｍｅｍｏｒｙ）、ＤＶＤ（Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｖｅｒｓａｔｉｌｅ  Ｄｉｓｃ）、ＭＯ（Ｍａｇｎｅｔｏ−Ｏｐｔｉｃａｌ  ｄｉｓｃ）などのコンピュータで読み取り可能な記録媒体に格納して配布し、そのプログラムをインストールすることにより、上述の動作を実行するシステムを構成することとしてもよい。
【実施例】
【００５２】
以下の実施例により、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【００５３】
（培養）
本実施例に用いる真正眼点藻類ナンノクロロプシスオキュラータは、国立大学法人長崎大学より入手した。ナンノクロロプシスオキュラータの培養には、ガラス繊維フィルター（ＧＦ／Ｃ、Ｗｈａｔｍａｎ社製）で濾過し、塩分２３ＰＳＵになるように蒸留水で希釈した後、高圧滅菌を行った海水を用いた。ナンノクロロプシスオキュラータは、当該希釈した海水にＫｗ２１培地（第一製網社製）を添加し、水温２０°Ｃ、１５０μｍｏｌ  ｐｈｏｔｏｎｓ／ｍ２／ｓの光を２４時間連続照射し通気下で、１Ｌフラスコ内でバッチ培養によって維持した。このナンノクロロプシスオキュラータを、１週間に一度新しい培地に接種した。予備培養のために、ナンノクロロプシスオキュラータを培養してから３日目の対数増殖期と推定される細胞を新しいｆ培地に３回接種した。ｆ培地に用いる海水は、ＧＦ／Ｃフィルターを通して濾過した後、メンブレンフィルター（孔径０．２２μｍ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）で濾過滅菌を行った。
【００５４】
ナンノクロロプシスオキュラータの培養には、濾過フィルター（マイレクス、孔径０．２２μｍ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を通した無菌の空気で曝気しながら通気を行った。３回の予備培養を経た培養液を採集してから遠心分離した（３６００ｒｐｍ、２０分間）。新しい培地の栄養塩が希釈されるのを防ぐため、できる限り上澄み液を取り除いた。乾熱滅菌したパスツールピペットを用いて細胞群を新しい培地が入っている３Ｌ三角フラスコ内に植え継ぎ、培養実験を開始した。なお、初期細胞密度がそれぞれ異なる低密度（１．０×１０５細胞／ｍｌ）、中密度（１．０×１０６細胞／ｍｌ）及び高密度（１．０×１０７細胞／ｍｌ）で培養実験を行った。各培養液を、予備培養と同じ環境条件下で１２日間維持した。
【００５５】
（採集と保存）
３つの培養液からそれぞれ毎日同じ時刻にクリーンベンチ内でコニカルビーカーへサンプルを取り出した。ナンノクロロプシスオキュラータの密度、吸光度、及び培養液中の栄養塩濃度を測定するために、それぞれ約５ｍｌ、２０ｍｌ、及び５０ｍｌのサンプルを、遠沈管に分注した。各脂質中の脂肪酸組成の測定のために、残りの培養液から１００〜４５０ｍｌを取り出した。
【００５６】
吸光度を測定するための培養液の内、半分はＧＦ／Ｃフィルターで濾過し、ブランクとして濾過液を別の遠沈管で回収した。もう半分はサンプルとして測定するまで固定せず残した。各脂質中の脂肪酸組成を測定するために、培養液を遠心分離し（３６００ｒｐｍ、２０分間）、上澄み液を取り除いた後、細胞群をガラス製ねじ口試験管にパスツールピペットを用いて移した。脱塩のために０．５Ｍギ酸アンモニウム溶液を加えて撹拌して細胞群を洗った後、遠心分離して上澄み液を取り除いた。細胞の脱塩操作と遠心分離を二度行った。細胞群を−８０°Ｃで凍結した後、凍結乾燥し、脂質を抽出するまで−８０°Ｃで保存した。栄養塩濃度を測定するための培養液については、遠心分離した後（３６００ｒｐｍ、２０分間）、上澄み液をＧＦ／Ｃフィルターで濾過した。その濾過液を５０ｍｌ遠沈管へ取り出し、測定するまで−２０°Ｃで保存した。
【００５７】
（細胞密度）
細胞は倍率２００倍の生物顕微鏡（ＥＣＬＩＰＳＥ  ５５ｉ、ニコン社製）及び血球計算盤（０．１ｍｍ  ｄｅｐｔｈ、サンリード硝子社製）を用いて４回計数した。増殖速度（μ、／日）は、対数増殖期における細胞密度を以下の式１で算出した。
【００５８】
μ＝ｌｎ（Ｎ１／Ｎ０）／（ｔ１−ｔ０）    （式１）
【００５９】
ここで、Ｎ０とＮ１はそれぞれｔ０時およびｔ１時における細胞数を示す。
【００６０】
（吸光度）
サンプルの細胞密度が各日でできる限り一定になるように濃縮または希釈した。ブランクをプラスチックシャーレ（φ、４０ｍｍ）に５ｍｌ乗せた後、白色ハロゲンランプから発せられた白色光をブランクに対して垂直に当てた。ブランクを透過した光の放射照度（３６０〜７８０ｎｍ）を、分光放射照度計（ＣＬ−５００Ａ、コニカミノルタ社製）を用いて暗所下で１０回測定した。同じシャーレに乗せたサンプルを透過した光の放射照度も同様に測定した。それぞれの測定値を以下の式２により細胞の吸光度（Ａλ）を算出した。
【００６１】
Ａλ＝−ｌｏｇ１０（Ｉ／Ｉ０）    （式２）
【００６２】
ここで、ＩとＩ０はそれぞれサンプルおよびブランクを透過した光の放射照度を示す。
【００６３】
（培養液中の栄養塩濃度の測定）
硝酸態窒素とリン酸の濃度を測定するために、公知の比色定量法に従ってＨａｃｈの既製試薬（Ｈａｃｈ社製）を用いて培養液を発色させた。硝酸態窒素の測定には培養液１５ｍｌを使用して、リン酸の測定には培養液１０ｍｌを使用した。それぞれの培養液は１インチの丸型ガラスセルに入れ、吸光度をポータブル吸光光度計（Ｈａｃｈ社製、ＤＲ  ９００）によってそれぞれ３回ずつ測定した。ブランクには蒸留水を用いた。硝酸態窒素およびリン酸の濃度を決定するための検量線を、標準物質としてそれぞれ硝酸ナトリウムおよびリン酸二水素ナトリウムを用いて作成した。
【００６４】
（極性脂質と非極性脂質の分離及び脂質含量の測定）
細胞中の総脂質を次のように抽出した。凍結乾燥させた細胞が入った１５ｍｌガラス製ねじ口試験管にクロロホルム−メタノール−水混合液（１：２：１．８）を９．５ｍｌ加え、３０分間超音波洗浄機（ＡＳＵ−３、ＡＳ  ＯＮＥ社製）を用いて１５°Ｃ以下で細胞を破砕した。その後、クロロホルム：メタノール：水の比が２：２：１．８になるようにクロロホルムと水とを２．５ｍｌずつ加えてから溶液を２層に遠心分離させた（２０００ｒｐｍ、５分間）。総脂質が含まれている下層のクロロホルムを、別の１５ｍｌガラス製ねじ口試験管にパスツールピペットを用いて移した後、３７℃で窒素ガスを吹き付けながら有機溶媒を飛ばした。その後、真空デシケーター内で吸引しながら試験管中の水分を十分に飛ばした。
【００６５】
総脂質を１ｍｌ（０．２ｍｌ×５回）のクロロホルム−メタノール混合溶液（９８：２）に溶かしてパスツールピペットを用いてＳｅｐ−Ｐａｋシリカカートリッジ（Ｗａｔｅｒｓ社製）に移した。非極性脂質（以下、単に「ＮＬ」という）は、Ｓｅｐ−Ｐａｋシリカカートリッジに３０ｍｌのクロロホルム−メタノール混合溶液（９８：２）を１分間に約１滴の速度で流し落としながらナスフラスコに回収した。その後、極性脂質（以下、単に「ＰＬ」という）はＳｅｐ−Ｐａｋシリカカートリッジに３０ｍｌのメタノールを流し落としながらナスフラスコに回収した。それぞれの脂質が溶けている有機溶媒を、ロータリーエバポレーター（Ｎ−１１１０Ｅ、ＥＹＥＬＡ社製）を用いて３７℃で吸引しながら飛ばした。さらに、デシケーター内で吸引しながらナスフラスコ中の水分を飛ばした。各脂質を３ｍｌ（０．５ｍｌ×６回）のクロロホルム−メタノール混合溶液（１：１）に溶かして、それぞれ重量測定済みのガラス試験管に移した。それぞれの試験管内の有機溶媒を、総脂質と同様に３７℃で窒素ガスを吹き付けながら飛ばした。ＮＬとＰＬの含量を重量測定によって算出した。
【００６６】
（各脂質中の脂肪酸組成の測定）
抽出後分離したＮＬとＰＬとを、内部標準物質のノナデカン酸（Ｃ１９：０）が１ｍｇ／ｍｌの濃度で溶けたクロロホルム０．５ｍｌ、及び５％塩化水素メタノール溶液１ｍｌに溶かした後に、３時間８０°Ｃで加熱することでメチルエステル化させた。その後、有機溶媒を常温に戻し、１ｍｌのヘキサンと５．５ｍｌの水を加え、２層に遠心分離させた（２０００ｒｐｍ、５分間）。脂肪酸が溶けている上層を、１．５ｍＬ褐色バイアル瓶に入れ、水素炎イオン化型検出器（２６０℃）が装着されたガスクロマトグラフィー（ＧＣ−１７Ａ、島津製作所製）に注入し、Ｃ２０：５（ＥＰＡ）等の脂肪酸組成を測定した。キャリアーガスにはヘリウムを用い、キャピラリーカラムにはＯｍｅｇａｗａｘ（商標）  ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ＧＣ  ｃｏｌｕｍｎ（シグマアルドリッチ社製、３０ｍ×０．３２ｍｍ×０．２５μｍ）を用いた。
【００６７】
（統計解析）
細胞の密度、吸光度、各脂質中の脂肪酸組成、及び培養液中の栄養塩濃度は、Ｓｉｇｍａｐｌｏｔ（ｖｅｒｓｉｏｎ  １１．０、Ｓｙｓｔａｔ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ社製）内のＳｔｕｄｅｎｔのｔ−テスト、そしてＳｔａｔｖｉｅｗ（ｖｅｒｓｉｏｎ  ５．０、Ａｂａｃｕｓ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ社製）内の二元配置分散分析を用いて解析した。
【００６８】
（結果）
増殖特性
図３は、ナンノクロロプシスオキュラータの増殖曲線を示す。初期細胞密度に関わらず、誘導期が培養してから１日目まで続き、その後対数増殖期が続いた。対数増殖期は初期細胞密度が低いほど長かった。対数増殖期は、低密度では６日目、中密度では４日目、及び高密度では２日目まで続いた。定常期は低密度では１０日目から、中密度及び高密度では７日目から始まり培養期間の終わりまで続いた。増殖速度は３つの培養液の間で有意差が無かった（低密度が０．９３、中密度が０．９１、高密度が０．７８）。最大細胞密度は、低密度が１．８０×１０８個／ｍｌ、中密度が１．８４×１０８個／ｍｌ、及び高密度が２．３１×１０８個／ｍｌであった。
【００６９】
吸光度
図４（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）は、それぞれ初期細胞密度が低密度、中密度及び高密度におけるナンノクロロプシスオキュラータの吸光度を示す。ナンノクロロプシスオキュラータの吸光度は、初期細胞密度に関わらず培養期間を通して、４４０ｎｍ、４９０ｎｍ及び６８０ｎｍ付近に比較的大きなピークが確認された。図５に示すように、４９０ｎｍと６８０ｎｍの吸光度比（ＯＤ４９０／ＯＤ６８０）は、３つの培養において対数増殖期が始まる１日目まで増加した。この時低密度と中密度のＯＤ４９０／ＯＤ６８０は、それぞれ最大値の１．２９と１．２５を示す一方、高密度は１１日目に最大値１．１４を示した。
【００７０】
ＯＤ４９０／ＯＤ６８０は、低密度が２〜７日間、中密度が１〜４日間、及び高密度が１〜２日間で減少した。これらの期間は、それぞれの培養液における対数増殖期の期間に類似していた（低密度が１〜６日間、中密度が１〜４日間、高密度が１〜２日間）。ＯＤ４９０／ＯＤ６８０の最小値は、低密度では７日目に０．９３、中密度では５日目に０．９６、及び高密度では３日目に０．９５を示した。その後、ＯＤ４９０／ＯＤ６８０は低密度では９〜１２日間、中密度では７〜１２日間、及び高密度では４〜１２日間で増加した。
【００７１】
栄養塩濃度
図６（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）は、それぞれ初期細胞密度が低密度、中密度及び高密度における培養液中の硝酸態窒素濃度の経時変化を示す。硝酸態窒素濃度は、低密度では５日目から８日目、中密度では２日目から６日目、及び高密度では１日目から４日目にかけて減少し、その後測定限界に至った。
【００７２】
図７（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）は、それぞれ初期細胞密度が低密度、中密度及び高密度における培養液中のリン酸濃度の経時変化を示す。リン酸濃度は、培養開始時から、低密度では６日目、中密度では５日目、及び高密度では３日目までそれぞれ減少した後、測定限界に至った。リン酸は初期細胞密度に関係なく硝酸態窒素よりも早く枯渇した。
【００７３】
極性脂質と非極性脂質の分離及び脂質の脂肪酸組成
図８（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）は、それぞれ初期細胞密度が低密度、中密度及び高密度におけるＰＬ及びＮＬの細胞中含量の経時変化を示す。ＮＬとＰＬの細胞あたりの含量はともに、硝酸態窒素が枯渇する直前の数日間減少する傾向を示した。硝酸態窒素の枯渇後、ＮＬ含量は初期細胞密度に関係なく増加し、ＰＬ含量はほとんど変動しなかった。図９（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）は、それぞれ初期細胞密度が低密度、中密度及び高密度の総脂質におけるＰＬ及びＮＬの割合の経時変化を示す。総脂質中に占めるＮＬの割合は、硝酸態窒素の枯渇下で増加し、ＰＬの割合は減少した。一方、硝酸態窒素の存在下では、ＮＬの割合は培養開始時から一定期間増加した後窒素が枯渇するまで減少した。ＰＬの割合はＮＬとは逆の変動を示した。
【００７４】
図１０は、初期細胞密度が高密度の場合のＰＬ及びＮＬに占めるＥＰＡの含有量の経時変化を示す。ＥＰＡがＮＬに占める割合は、栄養塩が存在する時は誘導期を除いて高く、硝酸態窒素が枯渇してから低くなった。この時、ＥＰＡは硝酸態窒素というよりむしろリン酸が枯渇してから減少した。一方、ＰＬでは、ＥＰＡが占める割合はリン酸が枯渇した後急激に増加し、その後高い値を維持した。
【００７５】
以上の結果より、ＯＤ４９０／ＯＤ６８０が下降から上昇に転じた日、すなわち低密度では７日目、中密度では５日目、高密度では６日目は、栄養塩が枯渇した日とほぼ一致することが示された。栄養塩が枯渇してからは細胞密度が大幅に上昇することはない。また、栄養塩が枯渇した日から１〜２日経過した時点でナンノクロロプシスオキュラータの細胞内のＰＬ中のＥＰＡ含量がほぼ最大となることが示された。したがって、ＯＤ４９０／ＯＤ６８０が下降から上昇に転じた日またはその１〜２日後までが、細胞密度が大きく、ＥＰＡ含量が高い収穫に最適な時期である。
【００７６】
上述した実施の形態は、本発明を説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。すなわち、本発明の範囲は、実施の形態ではなく、特許請求の範囲によって示される。そして、特許請求の範囲内およびそれと同等の発明の意義の範囲内で施される様々な変形が、本発明の範囲内とみなされる。
【産業上の利用可能性】
【００７７】
本発明は、ナンノクロロプシスオキュラータの培養に好適である。
【符号の説明】
【００７８】
１  測定部
２  通知部
３  記憶部
４  表示部
１００  データ解析装置
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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