(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
未分化多能性細胞を低減または除去する方法であって、有効量のＮＡＭＰＴ阻害剤を、異種細胞集団または、分化した細胞種及び未分化多能性幹細胞を含むか含むことが疑われるサンプルに接触することを含むことにより、前記ＮＡＭＰＴ阻害剤が、前記細胞集団またはサンプルからの未分化幹細胞を、選択的に低減または除去する方法。
【請求項２】
前記ＮＡＭＰＴ阻害剤が、ＳＴＦ−３１、ＦＫ８６６、ＧＭＸ−１７７８、ＧＮＥ−６１７、及びＧＮＥ−６１８からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記有効量が１ナノモル（ｎＭ）から１００マイクロモル（μΜ）の間である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記有効量が５μΜのＳＴＦ−３１である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記有効量が２５ｎＭのＦＫ８６６である、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
以下の（ａ）〜（ｃ）を含む、実質的に未分化多能性幹細胞を含まない幹細胞由来の細胞集団を得るための方法。
（ａ）未分化多能性幹細胞の１つ以上の幹細胞由来細胞種への分化または、部分的に分化誘導すること、
（ｂ）有効量のＮＡＭＰＴ阻害剤を前記誘導された細胞集団に接触することにより、前記誘導された細胞種から、選択的に未分化多能性幹細胞を低減または除去すること、及び
（ｃ）１つ以上の細胞種及び幹細胞由来細胞種の集団を得るために接触した細胞を分離すること、ここで前記集団は実質的に未分化多能性幹細胞を含まない。
【請求項７】
前記ＮＡＭＰＴ阻害剤がＳＴＦ−３１、ＦＫ８６６、ＧＭＸ−１７７８、ＧＮＥ−６１７、及びＧＮＥ−６１８からなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記有効量が１ｎＭから１００μΜの間である、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記有効量が５μΜのＳＴＦ−３１である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記有効量が２５ｎＭのＦＫ８６６である、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記１つまたは複数の幹細胞由来細胞種が、心筋細胞神経前駆細胞、神経細胞、網膜色素上皮細胞、肝細胞、及び間葉系幹細胞からなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項１２】
単細胞クローンとして前記単離された幹細胞由来細胞種を拡大することを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１３】
以下の（ａ）、及び（ｂ）を含む、奇形腫形成の可能性が低減された細胞組成物を得る方法。
（ａ）多能性幹細胞由来の細胞集団を提供すること、及び
（ｂ）未分化多能性幹細胞または部分的に分化した多能性幹細胞由来の子孫を、選択的に低減するかまたは除去する有効量のＮＡＭＰＴ阻害剤と、前記集団を接触することにより、前記接触した集団は、前記ＮＡＭＰＴ阻害剤に接触していない多能性幹細胞由来細胞集団と比較して低減された細胞の奇形腫形成の可能性を有し、かつ前記接触した集団を使用すること。
【請求項１４】
前記ＮＡＭＰＴ阻害剤はＳＴＦ−３１、ＦＫ８６６、ＧＭＸ−１７７８、ＧＮＥ−６１７、及びＧＮＥ−６１８からなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記有効量が１ｎＭから１００μΜの間である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記有効量が５μΜのＳＴＦ−３１である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記有効量が２５ｎＭのＦＫ８６６である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記細胞がヒトにとって同種異系または自源性である、請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年１月２１日に出願された米国仮出願第６１／９２９，６５９号（これは、すべての目的のために参照により組み込まれる）の優先権を主張する。
連邦政府支援研究に関する声明
【０００２】
本発明は、米国国立心臓・肺・血液研究所と米国国立衛生研究所によって認められた補助金番号４Ｒ００ＨＬ０９４７０８−０３の下で米国政府の支援によってなされた。米国政府は、本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
多能性幹細胞は人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣｓ）と胚幹細胞（ＥＳＣｓ）を含み、自己再生する能力と体内でどのような機能性細胞にも分化する能力によって特徴づけられる。従って多能性幹細胞は、研究と臨床応用のための分化体細胞種の貴重な原料である。定義済み転写制御因子の外生の発現によって体細胞に由来するヒトｉＰＳＣｓ（ｈｉＰＳＣｓ）の出現は、ヒトのＥＳＣｓ（ｈＥＳＣｓ）と関連した倫理問題を解決し、患者から抽出されたとき、免疫学的合併症を防ぐかもしれない。前途有望ではあるものの、ｈｉＰＳＣｓの治療的な使用にはかなりの制限が未解決のままである。これらは、一貫性のない転写制御因子発現と特異的ＤＮＡメチル化から、インビトロでの分化、腫瘍形成性と潜在的臨床応用に影響を及ぼす散発的な点変異と染色体欠損にわたっている（Ｌｅｅら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．１９（８）：ｐ．９９８−１００４（２０１３）；Ｒｏｂｉｎｔｏｎ及びＤａｌｅｙ，Ｎａｔｕｒｅ  ４８１  ：２９５−３０５（２０１２）；Ｆｅｎｇら、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２８：７０４−７１２（２０１０）；Ｇｏｒｅら、Ｎａｔｕｒｅ  ４７１：６３−６７（２０１１））。さらに、ｈｉＰＳＣｓ有効性に関する現在の試験は、広範囲なインビトロでの分化テスト、齧歯動物における、または生物情報科学（bioinformatic）の生体内奇形腫分析（Ｒｏｂｉｎｔｏｎ及びＤａｌｅｙ，Ｎａｔｕｒｅ  ４８１２９５−３０５（２０１２）；Ｍａｈｅｒａｌｉ及びＨｏｃｈｅｄｌｉｎｇｅｒ，Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ３：５９５−６０５（２００８））、及び遺伝子発現分析（Ｂｏｃｋら、Ｃｅｌｌ  １４４：４３９−４５２（２０１１）；Ｍｕｌｌｅｒら、Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ８：３１５−３１７（２０１１））に依存しており、インターライン変動（interline variability）を限定するためのハイスループットｈｉＰＳＣｓ株発生の実用的な手段とはなり得ない。
【発明の概要】
【０００４】
一の態様において、本発明は未分化多能性幹細胞を低減するか、または除去する方法を提供する。ある実施態様において、この方法は、有効量の化合物と異質な細胞集団あるいは分化細胞株と、未分化多能性肝細胞を含んでいるか含んでいるであろうサンプルと接触することから成り、それに従ってその接触は選択的に細胞集団またはサンプルからの未分化多能性細胞を低減するか、除去する。化合物は、ＳＴＦ−３１、ＦＫ８６６またはニコチンアミド・ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡＭＰＴ）の他の阻害剤である。有効量は、約０．１μΜから約１００μΜの間である。
【０００５】
さらなる態様において、本発明は、未分化多能性幹細胞をほぼ含まない幹細胞由来の細胞種の集団を得る方法を提供する。一の実施態様において、この方法は（ａ）未分化多能性幹細胞を、一つ以上の幹細胞由来の細胞種へと分化または部分的に分化するために誘導すること；（ｂ）それにより、細胞集団から未分化多能性細胞を選択的に低減するか除去するように、有効量の化合物を誘導した細胞集団と接触すること；そして、（ｃ）一つ以上の幹細胞由来の細胞種の未分化多能性幹細胞をほぼ含まない集団を得るために、接触した細胞を単離すること、を含む。前記化合物はＳＴＦ−３１である。有効量は、約０．１μΜから約１００μΜの間である。いくつかのケースにおいて、有効量は２．５μΜである。一つ以上の幹細胞由来の細胞種は、心筋細胞、神経前駆細胞、ニューロン、網膜色素性上皮細胞、肝細胞または間葉系幹細胞である。
【０００６】
いくつかの実施態様では、単細胞クローンとして単離した幹細胞由来の細胞種を更に含んでもよい。
【０００７】
他の態様において、本発明は、本明細書で提供される方法によって得られる未分化多能性幹細胞をほぼ含まない、幹細胞由来の細胞種の集団を提供する。
【０００８】
本発明の、これらの及び他の特性、態様及び長所は、続く記載からより詳しく理解されよう。本記載において、添付の図面を参照するが、これは、本明細書の一部を形成し、限定ではなく説明のために本発明の実施態様が示される。好ましい実施態様の記載は、本発明を限定するものではなく、全ての変更、同等物及び代替物を包含するものとする。したがって、本発明の範囲を解釈するために本明細書中で記載される特許請求の範囲を参照すべきである。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１Ａ】図１Ａは、低分子で処理したヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣｓ）のために収集されたデータを提示する。２．５μΜのＳＴＦ−３１、３０μΜのＷＺＢ１１７、２０μΜのＰｌｕｒｉＳＩｎで２４時間から７２時間処理した、コンフルエントなヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣｓ）（ＤＦ６−９−９Ｔ）の典型的な明視野像。スケールバーは５０μｍである。
【図１Ｂ】２０μΜのＰｌｕｒｉＳＩｎ、３０μΜのＷＺＢ１１７、２．５μΜのＳＴＦ−３１で処理したｈｉＰＳＣｓのＳＹＴＯＸｇｒｅｅｎアッセイにより測定した細胞生存率（Ｎ＝３）。
【図１Ｃ】２０μΜのＰｌｕｒｉＳＩｎ、３０μΜのＷＺＢ１１７、２．５μΜのＳＴＦ−３１で処理したｈｉＰＳＣｓの典型的な生（クマリンＡＭ−ｇｒｅｅｎ）／死（エチジウムホモダイマー１−ｒｅｄ）画像。スケールバーは１００μｍ。
【図１Ｄ】ニュートラルレッドアッセイによるコンフルエントｈｉＰＳＣｓの２４時間から７２時間におけるＳＴＦ−３１による滴定。
【図１Ｅ】２０μΜのＰｌｕｒｉＳＩｎ、３０μΜのＷＺＢ１１７、２．５μΜのＳＴＦ−３１で処理した様々な密度のｈｉＰＳＣｓのニュートラルレッドアッセイによる細胞生存率（Ｎ＝３）。細胞形態学の典型的なイメージとプレート後２４時間と９６時間における密度は、それぞれの棒グラフと対になっている。スケールバーは２００μｍ。
【図１Ｆ】プレート後、２４時間から７２時間の細胞周期の各段階における生存ｈｉＰＳＣｓの割合（Ｎ＝３）。棒グラフはそれぞれの処理スキームのプレート毎のコロニー数の平均を示す（Ｎ＝３）。データは平均±ＳＥＭとして表される。ＤＭＳＯコントロールに対して、＊＊＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．００１である。
【図１Ｇ】細胞形成アッセイの概略図及び結果。アルカリホスファターゼ染色前の６日間培養の前に継代した（passaged）もの。矢印は個々のコロニーを示している。
【図１Ｈ】細胞形成アッセイの概略図及び結果。アルカリホスファターゼ染色前の６日間培養の前に洗浄したもの。
【図２Ａ】図２は、ｈｉＰＳＣのインビトロでの選択的な除去のために２４時間のパルス処理で得られたデータを提示する。滴定（Ａ）とコンフルエントな、及びサブコンフルエントなｈｉＰＳＣ（ＤＦ６−９−９Ｔ）、線維芽細胞、ＤＦ６−９−９ＴｈｉＰＳＣ由来心筋細胞、のＳＴＦ−３１（０．０１〜１００μΜ）、３０μΜのＷＺＢ１１７、２０μΜのＰｌｕｒｉＳＩｎ処理から２４時間後の低分子の比較（Ｂ）。平均生存率は処理開始７２時間後ニュートラルレッドアッセイで測定した（Ｎ＝３）。
【図２Ｃ】５μΜのＳＴＦ−３１で２４時間処理後７２時間における心筋細胞でのＴＮＮＩ３とＩＲＸ４の発生量の典型的なフローサイトメトリーヒストグラム（Ｃ）（Ｎ＝３）。
【図２Ｄ】分化１０日目に５μΜのＳＴＦ−３１で２４時間処理後１５日目の心筋細胞ＴＮＮＴ２の免疫蛍光検出の典型的なイメージ（Ｄ）。上部のパネルは４０倍で画像化される細胞集塊を示し、下部のパネルは１００倍で画像化される構造組織を示している。上部のスケールバーは５０μｍ、下部のスケールバーは２０μｍである（Ｎ＝３）。
【図２Ｅ】１０日目心筋細胞に５μΜのＳＴＦ−３１でパルス処理開始後２４時間から７２時間でのＴＮＮＩ３、ＴＮＮＴ２、ＮＫＸ２．５のｑＰＣＲの棒グラフ（Ｅ）。データは平均±ＳＥＭとして表される。ＤＭＳＯコントロールに対して、＊＊ｐ＜０．０１である。
【図２Ｆ】１０日目心筋細胞との共培養におけるＤＦ６−９−９Ｔ  ｈｉＰＳＣｓコロニー検出アルカリホスファターゼ染色の典型的イメージ。
【図２Ｇ】１０日目ヒト繊維芽細胞との共培養におけるＤＦ６−９−９Ｔ  ｈｉＰＳＣｓコロニー検出アルカリホスファターゼ染色の典型的イメージ。
【図３Ａ】図３はＳＴＦ−３１がＮＡＤ＋サルベージ経路を阻害するデータを示している。図３Ａはサブコンフルエント細胞とコンフルエント細胞での、ニュートラルレッド法で測定したｈｉＰＳＣ（ＤＦ６−９−９Ｔ）生存率におけるグルコース欠乏の影響（Ｎ＝３）。
【図３Ｂ】２．５μΜのＳＴＦ−３１、３０μΜのＷＺＢ１１７で処理した後のｈｉＰＳＣにおけるＥＣＡＲとＯＣＲ（Ｎ＝３）。
【図３Ｃ】Ｅ８培地中で２．５μΜのＳＴＦ−３１、３０μΜのＷＺＢ１１７、２０μΜのサイトカラシンＢで１、１５、１８、２４時間処理したｈｉＰＳＣの溶媒対照群のパーセンテージとしてグルコース取込みを示す棒グラフ（Ｎ＝３）。
【図３Ｄ】グルコース欠乏、３０μΜのＷＺＢ１１７、あるいは２．５μΜのＳＴＦ−３１で処理されたサブコンフルエントなｈｉＰＳＣの、完全な及び切断型カスパーゼ９、切断型カスパーゼ３、ＧＡＰＤＨの典型的なイムノブロット。イムノブロッティングのポジティブコントロールとして、ｈｉＰＳＣを１μΜカンプトテシンで３時間処理した。
【図３Ｅ】２０ｍＭの２−ＤＧで２４時間、あるいは２．５μΜのＳＴＦ−３１で３〜２４時間処理した後のｈｉＰＳＣにおけるヌクレオチド濃度（Ｎ＝３）。
【図３Ｆ】ＳＴＦ−３１単独または、１または１０μΜニコチン酸の存在下で処理した細胞におけるニュートラルレッド法で測定したｈｉＰＳＣ生存率（Ｎ＝３）。各々のバーの上部は、それぞれの条件４８時間処理された、細胞密度と形態を示す典型的な明視野画像である。データは平均±ＳＥＭとして表される。ＤＭＳＯコントロールに対して、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００１である。
【図４Ａ】図４ＡはｈＰＳＣｓのＳＴＦ−３１処理における処理時間の影響を示す図である。
【図４Ｂ】図４ＢはｈＰＳＣｓの解糖阻害処理における処理時間の影響を示す図である。
【図５Ａ】図５は、ＳＴＦ−３１がヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣｓ）に対して、細胞線維芽細胞の存在下で培養した時、有毒であることを示すデータを提示している。２．５μΜのＳＴＦ−３１で９６時間連続処理後の、有糸分裂不活性化ヒト線維芽細胞フィーダー上でのＨ１ｈＥＳＣコロニー生育の（Ａ）アルカリホスファターゼ染色（上のパネル）と明視野画像（中央のパネル）の典型的なイメ−ジ。Ｈ１コロニーのアルカリホスファターゼ活性の染色の典型的なイメージ画像。継代後７２時間で、溶媒対照群あるいは、２．５μΜのＳＴＦ−３１で９６時間処理（Ｎ＝３）。
【図５Ｂ】プレート後２４から９６時間の不連続的に増殖しているｈｉＰＳＣにおける、ＢｒＤＵ取込みと７−ＡＡＤの共染色の典型的な密度プロット。ＤＭＳＯコントロ−ルに対して、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００１である。
【図５Ｃ】１０日目の心筋細胞との共培養におけるＤＦ６−９−９Ｔ  ｈｉＰＳＣコロニーを検出するアルカリホスファターゼ染色の典型的な画像。ＤＦ６−９−９Ｔは１ｅ２から１ｅ４細胞数の間でプレートされ、プレート後２４時間で、５μΜのＳＴＦ−３１により２４時間処理した（Ｎ＝２）。
【図６Ａ】図６は、ＰｌｕｒｉＳＩｎとＳＴＦ−３１に仲介される毒性において、培地、タイミング、濃度の効果を示す。２０〜４０μΜのＰｌｕｒｉＳＩｎと５μΜのＳＴＦ−３１で処理後２４から９６時間におけるＥ８培地でのコンフルエントｈｉＰＳＣ（ＤＦ６−９−９Ｔ）のニュートラルレッドアッセイで測定された細胞生存能を表す棒グラフ（Ｎ＝３）。ＤＭＳＯコントロールに対して、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１である。
【図６Ｂ】２０〜４０μΜのＰｌｕｒｉＳＩｎと２．５μΜのＳＴＦ−３１で処理後２４から９６時間におけるＥ８培地でのｈＥＳＣ（Ｈ１）のニュートラルレッドアッセイで測定された細胞生存能を表す棒グラフ（Ｎ＝３）。ＤＭＳＯコントロールに対して、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１である。
【図６Ｃ】２０μΜのＰｌｕｒｉＳＩｎと２．５μΜのＳＴＦ−３１で処理後２４から９６時間におけるＴｅＳＲ培地でのコンフルエントｈｉＰＳＣｓのニュートラルレッドアッセイで測定した細胞生存能を表す棒グラフ（Ｎ＝３）。ＤＭＳＯコントロールに対して、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１である。
【図６Ｄ】２０μΜのＰｌｕｒｉＳＩｎと２．５μΜのＳＴＦ−３１で処理後２４から９６時間におけるＴｅＳＲ培地でのｈＥＳＣｓのニュートラルレッドアッセイで測定された細胞生存能を表す棒グラフ（Ｎ＝３）。ＤＭＳＯコントロールに対して、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１である。
【図７Ａ】図７は代謝フラックスとアポトーシスマーカーの発現においての、グルコース欠乏、ＳＴＦ−３１、ＷＺＢ１１７の影響を示す。図７Ａは２０ｍＭの２−デオキシ−ｄ−グルコース（２−ＤＧ）で処理したｈｉＰＳＣ（ＤＦ６−９−９Ｔ）のＥＣＡＲとＯＣＲ。
【図７Ｂ】２．５μΜのＳＴＦ−３１、３０μΜのＷＺＢ１１７、グルコース欠乏で６〜３６時間処理されたサブコンフルエントなｈｉＰＳＣのｐ−ＡＭＰＫとＡＭＰＫレベルの典型的なイムノブロット（Ｎ＝３）。
【図７Ｃ】２．５μΜのＳＴＦ−３１、３０μΜのＷＺＢ１１７、グルコース欠乏で６から２４時間処理されたサブコンフルエントなｈｉＰＳＣのカスパーゼ３／７活性を表す、蛍光ベースのカスパーゼ３／７活性により測定された棒グラフ。ＤＭＳＯコントロ−ルに対して、＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１である。
【図７Ｄ】サブコンフルエントな細胞でのｐ−ＡＭＰＫ、切断型カスパーゼ３、切断型カスパーゼ９の、図３Ｄに対応しているイムノブロットのデンシトメトリー。ｈｉＰＳＣの６から３６時間グルコース欠乏におけるデンシトメトリー（Ｎ＝３）。
【図７Ｅ】サブコンフルエントな細胞でのｐ−ＡＭＰＫ、切断型カスパーゼ３、切断型カスパーゼ９の、図３Ｄに対応しているイムノブロットのデンシトメトリー。ｈｉＰＳＣの２．５μΜのＳＴＦ−３１と３０μΜのＷＺＢ１１７の６３６時間処理におけるデンシトメトリー（Ｎ＝３）。
【図８Ａ】図８はＳＴＦ−３１が多能性幹細胞に有毒なことを証明するが、ｈｉＰＳＣ由来の子孫と最終的に分化した細胞はＳＴＦ−３１の毒性に抵抗する。図８ＡはＳＴＦ−３１処理（７２時間、２．５μΜ）したｈＥＳＣｓ、ｈｉＰＳＣｓ、及び分化した細胞の段階的なコントラスト・イメージ。
【図８Ｂ】ヒトｉＰＳＣ由来心筋細胞を、分化１０日目に２．５μΜのＳＴＦ−３１で処理し、心筋細胞マーカーのタンパク質とｍＲＮＡ濃度は、７２時間後にフローサイトメトリー（上部）、免疫蛍光（中央）で、２４から７２時間後にｑＲＴ−ＰＣＲ（下部）により評価した。
【図８Ｃ】ヒトｉＰＳＣ由来神経前駆細胞は７２時間、２．５μΜで処理し、ＭＴＴアッセイ（上部、１０日目と１２日目の前駆細胞）と免疫蛍光（下部、１２日目前駆細胞を示す）で評価した。いずれの場合にも、ＳＴＦ−３１で処理した心筋細胞と前駆細胞はコントロールとの区別がつかなかった。
【図９Ａ】図９Ａは、ＳＴＦ−３１の化学構造を示す。
【図９Ｂ】図９Ｂは、ＦＫ８６６（ＮＡＭＰＴの非拮抗阻害剤）の化学構造を示す。
【図１０Ａ】図１０は、ヒト多能性幹細胞のＦＫ８６６毒性に関するデータを提示する。棒グラフはＦＫ８６６がヒト多能性幹細胞に対して有毒であることを示している。最大７２時間ＦＫ８６６で処理したｈｉＰＳＣの細胞生存率のデータが示された。このＮＡＭＰＴ阻害剤による細胞死のタイミングは、ＳＴＦ−３１で観察されたものと類似していて、濃度に依存していなかった。
【図１０Ｂ】ヒト多能性幹細胞ＦＫ８６６処理開始７２時間後の細胞生存率。細胞は、連続的または２４時間間隔で１ｎＭから１０μΜの濃度範囲で扱われた。
【図１１Ａ】図１１は、成人網膜色素上皮細胞（ＡＲＰＥ）とＰＡＸ６陽性神経前駆細胞がＳＴＦ−３１処理に抵抗することを示しているデータを提示する。図１１Ａは、２．５μΜのＳＴＦ−３１で最大７２時間処理したヒト胚幹細胞（ｈＥＳＣ）、ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＣＳ）及びＡＲＰ１９の明視野画像。ＡＲＰＥ細胞において、形態学または生存能力に対する逆効果は示さなかった。５μΜＳＴＦ−３１で同様の効果が示された（図示せず）。
【図１１Ｂ】２．５μΜのＳＴＦ−３１で２４時間処理したＨ７ｈＥＳＣ、神経前駆細胞（分化１０、１２、１４日目）、ＡＰＲＥ１９の細胞生存率。データは平均±ＳＥＭとして表される。（Ｎ＝４）、ＤＭＳＯコントロ−ルに対して、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１である。
【図１１Ｃ】ＳＴＦ−３１、及びニコチン酸（ＮＡ）で７２時間処理したＰＡＸ６陽性神経前駆細胞の細胞生存率。データは７２時間連続のＳＴＦ−３１処理で観察された神経前駆細胞の細胞死を外因のＮＡの追加で救われることを示す。そして、多能性幹細胞で観察されるＮＡＭＰＴ阻害のメカニズムと一致している。データは平均±ＳＥＭとして表される。ＤＭＳＯコントロールに対して、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１である。要するに、これらのデータは神経前駆細胞とＡＲＰＥ細胞における短期処理（２４時間）が重要な毒性ではないことを示している。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本願で言及される刊行物、特許及び特許出願は全て、それぞれ個々の刊行物、特許及び特許出願が具体的に及び個々に参照により組み込まれることが示されるかのように、それらの全体において参照により本明細書に組み込まれる。
【００１１】
本明細書に記述される発明は、多能性幹細胞が、分化多能性幹細胞と未分化多能性幹細胞の混合集団から選択的に除去されることができるという発明者の発見に、少なくとも一部は、基づく。最終分化した成人細胞と部分的に分化したＥＳＣｓとｉＰＳＣｓは、一般的に細胞代謝と成長を酸化的リン酸化に依存しているのに対し、未分化ＥＳＣｓとｉＰＳＣｓは、糖分解依存的であり、グルコース取込みを仲介するための種々のグルコース輸送体蛋白質をコードするいくつかの遺伝子を発現する。マイクロアレイとプロテオミクスを用いて、本発明者らは、転写のいくつかのグルコース輸送体蛋白質の細胞表面局在化との間の相関関係の不一致を確認した（例えば、ＧＬＵＴｌ、ＧＬＵＴ３、及びＧＬＵＴ４）。ＷＺＢ１１７がＧＬＵＴｌの阻害を通して、本発明者らは、これまでＧＬＵＴｌ阻害剤であると考えられていたＳＴＦ−３１は、このようには機能せず。その代わりに、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ+）サルベージ経路の阻害を通してｈＰＳＣを取り除くことを発見した。これらの発見は、後に続く二つの報告と一致し、支持されている。Ａｄａｍｓら、ＡＣＳ  Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．９（１０）：２２４７−２２５４（２０１４）；Ｄｒａｇｏｖｉｃｈら、Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔ  ２４：９５４−９６２（２０１４）。これらの発見に基づいて、我々は、分化した子孫を助ける（spares）プロセスの培養条件の範囲内で効果的にヒト多能性幹細胞を除去するためにＳＴＦ−３１を使用する新しい戦略を開発した。これらの結果は、臨床的に安全なｈＰＳＣ由来の子孫に基づくヒト幹細胞治療法の開発に向けての重要な進歩を提供する。
【００１２】
よって本発明は、分化した細胞の様々な細胞集団から多能性幹細胞を除去する方法を提供する。第１の態様において、本発明の未分化多能性細胞を欠く細胞集団を得るための方法を提供する。特に、本明細書に記載される発明は、多能性幹細胞から分化した、分化細胞と潜在的発癌性多能性幹細胞を含まない、あるいは実質的に含まない細胞集団を得るための方法を提供する。本発明の方法は、分化及び未分化細胞種を含む細胞集団からそのような未分化多能性幹細胞を低減する、あるいは除去する方法を含む。本明細書において、細胞集団について「含まない（free）」と「実質的に含まない（substantially free）」という語は、得られた細胞集団と比較して、単位体積当たり、約５％未満、好ましくは約１％未満、より好ましくは約０．１％未満（例えば、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、０．００１％、０％）の未分化多能性幹細胞を含むことを示す。本明細書で提供される方法によって得られる細胞集団は、例えば、目視試験（例えば、接触細胞集団における未分化多能性細胞を視覚的に識別すること）、リアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）（例えば、多能性マ−カ−の遺伝子発現の不在または減少を観測すること）、またはフローサイトメトリー（例えば、多能性マーカー蛋白質レベルの不在または減少を観測すること）を用いて、未分化多能性幹細胞を含まないあるいは実質的に含まないと、評価及び同定されうる。本明細書において、「実質的に分化した」細胞集団という語は、少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、７０％、または８０％、及びさらに好ましくは少なくとも約９０％の、一または二以上の幹細胞由来細胞種を示す分化細胞を含む細胞集団を意味する。
【００１３】
概して本発明の方法は、本発明の化学物質またな化合物と共に、細胞、細胞集団、あるいはサンプルと接触することによって達成される。より詳しくは、本発明の方法は、有効量の化学物質または化合物を、未分化多能性幹細胞または多能性幹細胞から誘導される分化した細胞種及びを含む異種細胞集団に接触させることを含み、それによって、その接触は、前記細胞集団またはサンプルからの未分化多能性幹細胞を選択的に低減または除去する。本発明が提供する方法で用いるために適当な化学物質と化合物は、他の（例えば、分化した）細胞種に損傷を与えずに、多能性幹細胞を阻害することまたは除去することにおいて選択性を示す。「選択的に」未分化多能性幹細胞を阻害するあるいは除去する化学物質または化合物は、未分化多能性幹細胞の、生存能力を阻害または細胞死を促進する化学物質または化合物であるが、実質的に分化細胞種の生存能力を阻害せず、あるいはその細胞死を促進しない。本明細書において、「阻害する（inhibits）」、「阻害（inhibition）」または「阻害すること（inhibiting）」という語は、任意の数値の１０％と９０％の間、任意の整数値の３０％と６０％の間、または１００％以上の減少、あるいは、１倍、２倍、５倍、１０倍もしくはそれ以上の減少を示す。本明細書において、「促進」または「促進すること」という語は、任意の数値の１０％と９０％の間、任意の整数値の３０％と６０％の間、または１００％以上の増加、あるいは、１倍、２倍、５倍、１０倍もしくはそれ以上の増加を示す。
【００１４】
任意の適切な化学物質または化合物は、本明細書に記載の方法により使用することができる。いくつかの態様において、本明細書に記載の方法での使用に適した化学物質または化合物は、多くの生理的に重要なプロセスにおいて重要な役割を果たしている補酵素であるＮＡＤ+（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）（Ｚｉｅｇｋｅｌ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６７：１５５０−１５６４（２０００））の活性または発現を抑制することができる。ＮＡＤ+合成は、ニコチンアミドをニコチンアミド・モノヌクレオチドに変える酵素であり、哺乳類の生合成経路でニコチンアミド・モノヌクレオチド・アデニリルトランスフェラーゼによってニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ+）に変換されるＮＡＭＰＴ（ニコチンアミド・ホスホリボシルトランスフェラ−ゼ）によって仲介される。ＮＡＭＰＴはＮＡＤ+生合成の速度制限因子であるので、ＮＡＭＰＴ阻害剤は細胞内ＮＡＤ+レベルを激減する。低分子ＮＡＭＰＴ阻害剤は、特に限定されないが、ＳＴＦ−３１（Ｃｈａｎら、Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ．３：９４ｒａ７０（２０１１））；ＦＫ８６６（別名ＡＰＯ８６６）；ＧＮＥ−６１７（Ｎ−｛［４−（３  ５−ジフルオロベンゼンサルフォニル）フェニル］メチル｝イミダゾ［１，２−ａ］ピリジン−６−カルボキサミド）；ＧＮＥ−６１８（Ｎ−（４−（（３−（トリフルオロメチル）フェニル）−スルホニル）ベンジル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−５−カルボキサミド）、及びＧＭＸ−１７７８（別名ＣＨＳ８２８）を含む。
【００１５】
ＦＫ８６６は、選択的に活性化Ｔ細胞の増殖をブロックしアポトーシスを誘導することが示されている（Ｂｕｓｓｏら、Ｐｌｏｓ  Ｏｎｅ  ３：ｅ２２６７（２００８））。ＳＴＦ−３１（別名４−［［［［４−（ｌ，ｌ−ジメチルエチル）フェニル］スルフホニル］アミノ］メチル］−Ｎ−３−ピリジニル−ベンズアミド）は、実験式Ｃ23Ｈ25Ｎ3Ｏ3Ｓで示され、ＤＭＳＯに可溶であり、Ｔｏｃｒｉｓ、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ）などの卸売業者から市販されている。ＧＮＥ−６１７は、前にＺｈｅｎｇらによって、Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．５６：６４１３−６４３３（２０１３）に記載された。ＧＮＥ−６１７に構造的に関連しているＧＮＥ−６１８は、前にＺｈｅｎｇらによってＢｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔ．２３：５４８８−５４９７（２０１３）に記載された。ＧＭＸ−１７７８はＮＡＤ+生合成酵素ＮＡＭＰＴの強力かつ特異的な阻害剤として記載されている（Ｗａｔｓｏｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌ．２９（２１）：５８７２−５８８８（２００９））。ｖｏｎ  Ｈｅｉｄｅｍａｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６５（６）：１１６５−７２（２０１０）も参照のこと。本明細書に記載される方法のための適切な他のＮＡＭＰＴ阻害剤は、特に限定されないが、ＳＴＦ−３１（ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２２１１３参照）に類似の構造を有する化合物、またはＤｒａｇｏｖｉｃｈら、Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔ．２４（３）：９５４−６２（２０１４）；Ｚｈｅｎｇら、Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ，５６（１６）：６４１３−３３（２０１３）；Ｚｈｅｎｇら、Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔ，２３（２０）：５４８８−９７（２０１３）に記載されているようなＧＮＥ−６１７／６１８（参照）を含む。例えば、本明細書に記載される方法のための適切なＳＴＦ−３１に類似の構造を有する化合物は、特に限定されないが、４−（フェニルスルフォンアミドメチル）−Ｎ−（キノリン−５−イル）ベンズアミド（Ｖｉｔａｓ，ＳＴＫ６４７０８２）；４−ｔｅｒｔ−ブチル−Ｎ−（４−（ピリジン−３−イルカルバモイル）ベンジル）ベンズアミド（Ｏｔａｖａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，６３６００２３）；及び４−（（４−メトキシフェニルスルフォンアミド）メチル）−Ｎ−（ピリジン−３−イル）ベンズアミド（Ｖｉｔａｓ，ＳＴＫ６４３６４０）を含む。
【００１６】
本明細書に記載の方法に適用可能な化学物質または化合物の有効量は、約１ナノモル（ｎＭ）から約１００マイクロモル（μΜ）の間の濃度（例えば、約０．５ｎＭ、１ｎＭ、５ｎＭ、１０ｎＭ、１５ｎＭ、２０ｎＭ、２５ｎＭ、３０ｎＭ、５０ｎＭ、７５ｎＭ、９０ｎＭ、０．１μΜ、０．５μΜ、１μΜ、１．５μΜ、２μΜ、２．５μΜ、３μΜ、３．５μΜ、４μΜ、４．５μΜ、５μΜ、１０μΜ、１５μΜ、２０μΜ、３０μΜ、４０μΜ、５０μΜ、６０μΜ、７０μΜ、８０μΜ、９０μΜ、１００μΜ）である。ある態様においては、本明細書に記載の方法に適用可能な化学物質または化合物の有効量は、約１μΜから約２．５μΜの間の濃度（例えば、約１、約１．５、約２、約２．５μΜ）である。本明細書において、有効量は、多能性幹細胞（例えば、ｈＰＳＣｓ）を除去することが可能な化学物質または化合物の量である。半数効果濃度は、ＥＣ50値と表現することができる。ＳＴＦ−３１の有効量は約２．５μΜであり、塩化ベンゼトニウム及び塩化メチルベンゼトニウムのいずれの有効量よりも実質的に少ない（例えば、１μΜのＳＴＦ−３１と比較すると５μΜより多い）。ＦＫ８６６の有効量は、約１．０ｎΜから約２５ｎΜ（例えば、０．５ｎΜ、１ｎΜ、５ｎΜ、１０ｎΜ、１５ｎΜ、２０ｎΜ、２５ｎΜ）である。２０μΜのＰｌｕｒｉＳｉｎ＃１への暴露に続いて、多能性幹細胞の選択的阻害が説明されている（Ｂｅｎ−Ｄａｖｉｄら、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  １２（２）：１６７−１７９（２０１３））。
【００１７】
本明細書に記載の方法に適用可能な化学物質及び化合物は、細胞、細胞集団、あるいはサンプルと、任意に適切な時間接触させることができる。例えば、多能性幹細胞を排除する有効量の化学物質または化合物は、細胞、細胞集団、またはサンプルから、全ての多能性幹細胞の除去を確実にするために十分な時間接触させることができる。ある実施態様においては、十分な時間の長さは少なくとも１時間、２時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、６０時間、７２時間、または９６時間である。例えば、細胞は、ＳＴＦ−３１またはＦＫ８６６のような化学物質あるいは化合物に、２４時間おきに新しい培養液中に化合物を補給されながら７２時間暴露することができる。化学物質または化合物の有効量と、多能性幹細胞を選択的に除去するために必要な時間の長さは、反比例の関係にある。言い換えると、暴露の長さは、例えば化合物（例えば、ＳＴＦ−３１、ＦＫ８６６）の有効量を増やせば、短縮することが可能である。
【００１８】
細胞集団から未分化多能性幹細胞を除去する化学物質や化合物の有効性は、未分化多能性幹細胞の存在の有無を検出すること、区別された細胞種に特有のマーカーの発現を評価すること、あるいは、未分化多能性幹細胞を選択的に除去または阻害する化学物質あるいは化合物への接触もしくは露出後の細胞生存率の決定によって、確認する（定性的または定量的）ことができる。ＲＮＡやタンパク質は細胞から抽出され、所望の表現型を示すマーカーの存在の分析することができる（ノーザンハイブリダイゼーション、ＲＴ−ＰＣＲ法、ウエスタンブロット分析などを介して）。例えば、多能性幹細胞はＳＳＥＡ−３、Ｔｒａ−１−６０、Ｔｒａ−１−８１を含むさまざまな細胞表面マーカーで検出した。ＳＳＥＡ−３+細胞は、その特定の抗原に選択性がある発色団抱合型抗体を使って見つけることができる。いくつかのケースでは、１つ以上の細胞表面マーカーは未分化の状態（例えば、ＳＳＥＡ−３、Ｔｒａ−１−６０、Ｔｒａ−１−８１）、ならびに、多能性幹細胞転写因子Ｏｃｔ−４と相関しており、検出することができる。また、未分化多能性幹細胞は典型的な幹細胞の形態を有しており、それらは文献に記載されている。
【００１９】
心筋細胞などの分化した細胞種はＮＫＸ２．５またはＴＮＮＴ２などの心臓マーカーの発現を検出するためのｑＲＴ−ＰＣＲを用いて識別することができる。成人多能性幹細胞は、アルデヒド脱水素酵素（ＡＬＤＨ）の高発現レベルに基づいて識別することができる。もちろん、細胞は免疫組織化学的に分析することができるか、組織特異染色を使用して染色することができる。他のケースでは、テロメアの長さを分化の指標として用いることができる。一般的には、未分化幹細胞は分化した細胞よりも長いテロメアを持っているので、細胞はテロメラーゼ活性のレベルで評価することができる。
【００２０】
細胞生存能は、ＳＴＦ−３１などの化合物を１回以上露出させた後の生存細胞のパーセンテージを測定して評価することができる。細胞生存能は、種々の方法により示されることができ、トリパンブルーまたは７−アミノ−アクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）のような生体染色の排除、ニュートラルレッド（３−アミノ−７−ジメチルアミノ−２−メチルフェナジンハイドロクロライド）の吸収の減少、またはテトラゾリウム染料ＭＴＴ３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムのホルマザンへの還元を含むがこれに制限されない。
【００２１】
いくつかの態様において、本明細書で提供される方法によって得られる細胞集団は、未分化多能性幹細胞が欠けているか、実質上欠けている幹細胞由来の細胞集団である。多能性幹細胞は、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞と胚幹（ＥＳ）細胞を含み、その両方は研究と臨床応用のための分化した体細胞種の貴重なソースである。本明細書で提供され方法によって得られる細胞集団は、例えば多能性、オリゴ能性（oligopotent）、単能性、または最終分化細胞種である。本明細書において、「多能性細胞」は細胞とその子孫を含み、多能性細胞に由来する成熟した、あるいは部分的に成熟した細胞は特定の組織、器官あるいは器官システムの細胞に制限されることを除き、多能性、オリゴ能性（oligopotent）、及び単能性細胞に分化するか、またはそれを引き起こしうる。多能性幹細胞は、造血幹細胞、神経幹細胞、骨髄幹細胞を含むがこれに限定されない。オリゴ能性（oligopotent）幹細胞は腸幹細胞、乳腺幹細胞、骨髄あるいはリンパ球前駆細胞、羊水由来の細胞、間葉系前駆細胞／多能性間質細胞／間葉系幹細胞（ＭＳＣｓ）、グリア限定前駆細胞、胎児肝臓からの二分化能前駆細胞、末梢血単核細胞、肥満細胞前駆細胞、衛星細胞、皮膚幹細胞、毛包幹細胞、基底幹細胞、造血細胞、骨髄前駆細胞、間葉系前駆細胞、グリア限定前駆細胞、胎児肝臓からの二分化能前駆細胞、臍帯血細胞、末梢血幹細胞、羊水由来の細胞、骨髄幹細胞、肥満細胞前駆細胞を含むがこれに限定されない。
【００２２】
いくつかの態様において、本明細書に提供される方法によって得られる細胞集団は、本質的に均一で、基本的に１つの幹細胞由来の細胞種（例えば、心筋細胞、神経細胞、肝細胞、神経幹細胞、造血幹細胞）を含む。本明細書で提供される方法により得られた細胞集団から未分化多能性細胞の存在を検出するために、いかなる適切な方法も適用可能である。例えば、細胞集団またはサブセットがすべての３つの胚葉（例えば、奇形腫、胚葉性奇形腫、あるいは他の胚細胞腫瘍）に由来する細胞を含む腫瘍を作る可能性を評価するために、分析を行うことができる。いくつかの態様において、奇形腫分析は、１ｅ３〜５ｅ６個のヒト細胞を動物の組織または器官、腎臓、精巣、筋肉内または皮下に注射することを含む。いくつかの奇形腫分析プロトコルに従って、継代または一旦腫瘍直径が定義済みのエンドポイントに達した後の６〜１２週後に、注射により生じている腫瘍は公認病理学者によって評価される。参考（Ｗｅｓｓｅｌｓｃｈｍｉｄｔ，Ｒ．Ｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．７６７：２３１−４１（２０１１）；Ｚｈａｎｇら、Ｔｅｒａｔｏｍａ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ：Ａ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ  ｉｎ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｉｎ  Ｓｔｅｍ  Ｂｏｏｋ  ２００８：Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ（ＭＡ））。
【００２３】
本発明の細胞集団のための適切な分化細胞種は、３つの胚葉、内胚葉、中胚葉、及び外胚葉のうちの分化した細胞種のいずれかを含む。いくつかの態様では、分化した細胞としては、特に限定されないが、幹細胞由来心筋細胞、神経前駆細胞、神経細胞、血管平滑筋細胞（複数の系統から得られる）、内皮細胞、神経細胞、網膜色素上皮細胞、肝細胞、及び間葉系幹細胞が挙げられる。
【００２４】
他の態様において、本発明は、本明細書に記載の方法によって得られた幹細胞由来の孤立した個体群を提供する。未分化多能性幹細胞を含まない、あるいは実質的に含まない幹細胞由来の細胞腫の集団は、組織工学を含む研究と臨床応用のために有用である。
【００２５】
さらなる態様において、本発明は、細胞集団から選択的に未分化多能性幹細胞を低減または除去する１つ以上の化合物を含む治療製剤を提供する。好ましくは、本明細書における治療製剤は、良い医療行為と一致した方法で処方、服用、及び投与される。ここで考慮される諸要因としては、治療されている特定の障害、扱われている特定の哺乳類（例えばヒト）、個々の患者の臨床症状、障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与のスケジューリング、及び医師が認識している他の要因が挙げられる。化合物（例えば、ＮＡＭＰＴ阻害剤）は、そうである必要はないが、癌を防止するか治療する、あるいはもう１つの臨床疾患または障害を治療するか防止するために一般に用いられている１つ以上の薬品とともに任意に処方される。好ましくは、本明細書で提供される治療製剤は、細胞集団から選択的に未分化多能性細胞を低減するあるいは除去する１以上の化合物を生理的に許容できるキャリアー、賦形剤、あるいは安定剤と混合することにより調製される。代表的な態様においては、治療製剤は凍結乾燥製剤または水溶液の形で調製される。
【００２６】
本明細書は、必要に応じて、対象に化合物あるいは治療製剤の治療的有効量を投与することを含む方法も提供する。本明細書において、投与される化合物または治療製剤の「治療的有効量」は、複合的な混合物から、実質的にすべての多能性細胞を消滅させるのに必要な量であるか、対象の奇形腫細胞の数を減少させるのに必要な量である。代表的な態様において、本発明の化学物質、化合物、及び製剤は、インビトロ及びインビボで、本明細書において提供される幹細胞由来の細胞集団の投与において奇形腫形成の予防を含む、多能性幹細胞の除去のために有用である。
【００２７】
許容できる担体、賦形剤、または安定剤は、その投与量と濃度において受容者に対して非毒性であり、リン酸塩、クエン酸塩、及びその他の有機酸等の緩衝剤；アスコルビン酸、及びメチオニンを含む酸化防止剤；防腐剤（オクタデシジメチルベンジル塩化アンモニウム、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル、ベンジルアルコール；メチルまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン類；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンの様なタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンまたはリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む単糖類、二糖類と他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース、またはソルビトール等の糖；ナトリウム等の塩形成反イオン；金属錯体（例えば亜鉛蛋白質複合体）；及び／またはＴＷＥＥＮ（ＴＭ）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（ＴＭ）、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン界面活性剤を含む。インビボ投与のために用いられる製剤は、無菌である必要がある。これは無菌ろ過膜を通したろ過により容易に達成される。
【００２８】
治療量は、少なくとも約０．０１μｇ／体重ｋｇ、少なくとも約０．０５ｇ／体重ｋｇ、少なくとも約０．１ｇ／体重ｋｇ、少なくとも約０．５ｇ／体重ｋｇ、少なくとも約１μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約２．５ｇ／体重ｋｇ、少なくとも約５μｇ／ｋｇ体重とすることができ、約１００μｇ／ｋｇ体重を超えることはない。当業者であれば、このような基準で有効成分の分子量を調整することを理解しうる。投与量もまた、局所投与、例えば全身投与、例えば筋肉内投与、腹腔内投与、経静脈投与などにより調整しうる。
【００２９】
他の態様において、本明細書は、対象に投与された細胞の腫瘍形成性を抑える方法を提供する。本明細書において、「腫瘍形成性」と「腫瘍形成の性質」という語は、腫瘍を引き起こす（cause）、作り出す（produce）、または発達させる（develop）能力（ability）、傾向（tendency）または潜在能力（capability）を示す。腫瘍は、良性腫瘍（癌ではない）、悪性の可能性がある腫瘍、潜在的な悪性腫瘍（前癌性腫瘍）、または悪性腫瘍である場合がある。本明細書において、良性腫瘍、悪性の可能性がある腫瘍、潜在的な悪性腫瘍としては、特に限定されないが、腺腫、ポリープ、及び奇形腫を挙げることができる。腫瘍形成性を抑制する、あるいは低減することは、細胞の１つ以上の腫瘍形成の特性を低減するか、予防することを含む。好ましくは、腫瘍形成性を抑える方法は、必要に応じて対象に、未分化多能性幹細胞あるいは部分的に分化した多能性幹細胞由来の子孫を、選択的に低減させるか除去する有効量の化合物（例えば、ＮＡＭＰＴ阻害剤）に接触させた、多能性幹細胞を含む細胞組成物を投与することを含む。化合物との接触は、投与した細胞組成物の腫瘍形成性（例えば、奇形腫形成への可能性）を抑えるために、対象への細胞組成物の投与前、投与時、あるいは投与後に起こりうる。細胞組成物の対象への投与時または投与後に、化合物を細胞に接触させるための、化合物の有効量は、約０．１から０．１２６ｍｇ／ｍ2／時間の間とすることができる。好ましくは、対象はヒトである。細胞組成物の細胞は、対象に対して同種異系または自源性とすることができる。好ましくは、腫瘍形成性を抑制または低減することは、細胞組成物の中の任意の細胞の１つ以上の腫瘍形成性あるいは潜在的腫瘍形成の特性を低減するか、弱めるか、予防することを含む。例えば本発明の方法は、本明細書で提供される方法による細胞集団の処理と同時に行えば、細胞組成物の腫瘍形成性の特性を阻害、抑制、または低減するために有効であり、細胞組成物は、同種の非腫瘍形成性の細胞を含む細胞組成物の特性に、より類似した特性を示す。
【００３０】
さらなる態様において、本発明は、対象への移植（transplantation）のための腫瘍形成性が低減された細胞組成物を得るための方法を提供する。代表的な態様において、この方法は、多能性幹細胞由来の集団を提供すること；集団と未分化多能性幹細胞あるいは部分的に分化した多能性幹細胞由来の子孫を選択的に低減するかまたは除去する化合物（例えば、ＮＡＭＰＴ阻害剤）の有効量を接触させることを含み、それによって、接触させた集団は、対象への移植のための細胞集団として用いられ、化合物と接触させていない多能性幹細胞と比較して腫瘍形成性を減少させた。好ましくは、この対象はヒトである。細胞組成物の細胞は、対象にとって同種異系または自源性であり得る。
【００３１】
製品
【００３２】
本発明の他の態様においては、インビトロまたはインビボで未分化多能性幹細胞を選択的に除去または低減の方法に役立つ材料を含む製品を提供する。製品は、容器とラベルを備えている。適当な容器として例えば、ボトル、ガラス瓶、注射器、及び試験管を挙げることができる。いくつかの態様において、容器は、ガラスやプラスチックなどの様々な材料で形成することができる。いくつかの態様において、容器は本明細書で提供される治療的製剤を保持し、無菌のアクセスポートを有してもよい（例えば、容器は、静注液バッグまたは皮下注射針による突き刺しストッパーを有するバイアルでもよい）。組成物中の活性成分は、選択的に未分化多能性幹細胞を低減するかまたは除去する化学物質または化合物、またはその化合物の２つ以上の混合物である。容器に付した、または容器と関連するラベルは、その組成物が、本明細書に記載のインビトロまたはインビボ投与のために使われることを示す。製品は、さらにリン酸緩衝生理食塩水、リンガー溶液、及びデキストロースなどの薬学的に許容されるバッファを含む第２の容器を含んでもよい。さらに、他の緩衝剤、希釈剤、フィルタ、針、注射器、及び使用のための指示を記載した添付文書等の材料を含んでも良い。
【００３３】
本発明が様々な変更及び代替的な形態を受け入れる余地がある一方で、その具体的な実施態様が図面において例として示されており、本明細書中で詳述する。しかし、具体的な実施態様の本明細書中の記載は、開示される特定の形態に本発明を限定するものではないが、それどころか、添付の特許請求の範囲により定められるような本発明の精神及び範囲内に入る全ての変更、同等物及び代替物を包含することを理解されたい。
【００３４】
本発明は、次の非限定的な実施例を考慮するとより詳細に理解される。
【実施例】
【００３５】
［実施例１］ＮＡＤ+サルベージ経路の阻害はヒト多能性幹細胞への効率的かつ選択的な毒性を提供する
【００３６】
ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）と人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）は、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）と呼ばれ、ほぼすべてのヒトの細胞種に分化することができる。薬物毒性テストとヒトの病気モデリング［１−４］に有用な子孫に対する、ｈＰＳＣの分化への効果的な戦略の開発は目覚ましい進歩を遂げたが、依然として未解決の安全性に関する問題により、ヒトへの汎用が妨げられている。細胞異質性、純度、及び移植の方法は技術的な問題を含むが、移植部位での潜在的な奇形腫形成は、臨床応用のための重大な障害である。奇形腫形成は、少ない回数のマウスとヒトのＰＳＣ［５、６］の移植後、及びｈＰＳＣ由来細胞の注射の後［７−１０］の動物モデルで報告されている。Ｇｅｒｏｎ試験のｈＥＳＣ由来の神経前駆細胞の前臨床試験も、マウスの脊柱で嚢胞形成に終わり、ヒト対象におけるｈＥＳＣ製品の移植のためのさらなる限界を提した［１１］。したがって、ｈＰＳＣに基づく治療法が広く利用されるようになる前に、移植前の潜在的な腫瘍形成性多能性幹細胞の除去が必要とされる。
【００３７】
ここでは、我々はＳＴＦ−３１（図９（Ａ）に示す化学構造）が、分化した子孫を助けるプロセスによって、培養条件の範囲内で、これらの潜在的腫瘍形成性細胞を効果的に除去することを証明しているデータを提示する。これらの結果は、ヒト幹細胞治療法のための、臨床的に安全なヒト幹細胞に基づく治療のためのｈＰＳＣ由来の子孫の開発に向けて重要な進歩を提供する。
【００３８】
ＳＴＦ−３１とＷＺＢ１１７が仲介するｈＰＳＣでの毒性を、以前報告されたｈＰＳＣ除去のための低分子であるＰｌｕｒｉＳＩｎと直接比較した。ＳＴＦ−３１による処理は、２４時間培養後のｈｉＰＳＣの形態を変更しなかった（図１Ａ）。しかしながら、消失した断片、非接着細胞、及び全体の細胞数の減少が、４８時間処理後に観察された（図１Ａ）。７２時間の曝露後、ＳＴＦ−３１は限られた数の残存細胞と共に、高毒性であった。ＳＴＦ−３１とは対照的に、細胞腫脹などの形態学的変化を引き起こすために、ＷＺＢ１１７による処理に７２時間を要した、と同時にＰｌｕｒｉＳＩｎ処理細胞の形態において、最小限の変化が認められた。これらの形態的な変化は、細胞生存能力の生化学分析と一致している。ＳＴＦ−３１は、７２時間の処理の後、ＳＹＴＯＸ（登録商標）グリーン核酸着色（図１Ｂ）による測定による細胞生存能力を１０％に低減した。これに対して、ＰｌｕｒｉＳＩｎまたはＷＺＢ１１７で処理した細胞の生存能力には有意な縮小はなかった。ＳＹＴＯＸ（登録商標）分析は死んだ細胞の存在に依存するので、カルセインＡＭとエチジウムホモダイマー１による生細胞／死細胞染色も行った（図１Ｃ）。４８時間のＳＴＦ−３１処理の後、生細胞の小さな断片（patches）が残った。これらの生細胞は７２時間処理の後は目視で確認出来なかった。対照的に、ＷＺＢ１１７及びＰｌｕｒｉＳＩｎはコンフルエントｈＰＳＣに対して有毒ではなかった。ＳＴＦ−３１がこれらの状況の下で培養されるｈＰＳＣの除去のために最も強い低分子であるように見えたので、継続的処理の４８時間後のＳＴＦ−３１のｈｉＰＳＣに対する５０％致死量（ＬＤ50）は１８２ｎＭであると決定した（図１Ｄ）。ＳＴＦ−３１濃度を１００μΜに増加させることは、ニュートラルレッド分析で観察された有意な毒性が観察される時間を早めなかった（図１Ｄ；図５Ａ）。
【００３９】
我々はヒト多能性幹細胞で、以前報告されたＰｌｕｒｉＳＩｎの毒性効果を完全に再現することができなかったので、代わりの培養条件をテストした。サブコンフルエント及びコンフルエントな細胞は、同じ密度でプレートし、異なる長さの時間（２４時間、９６時間）生育させることによっても、２つの異なる密度（１．５ｅ５、７．５ｅ５細胞／ｃｍ２）でプレートし２４時間生育させることによっても生成した（図１Ｅ）。それぞれの細胞密度条件において、細胞をＳＴＦ−３１、ＷＺＢ１１７、またはＰｌｕｒｉＳＩｎで７２時間処理した。これらの比較において、ＳＴＦ−３１による毒性を検出するのに必要な時間は、コンフルエント及びサブコンフルエントな細胞の両方で類似しており、処理開始後７２時間での残細胞は２％足らずであった。対照的に、ＷＺＢ１１７とＰｌｕｒｉＳＩｎの毒性は、状況により異なった（図１Ｅ）。ＷＺＢ１１７は、プレート後２４時間処理されたサブコンフルエント細胞及びコンフルエント細胞に毒性があったが、それはプレート後９６時間処理されたコンフルエント細胞に対するより有意に低い毒性であった。ＰｌｕｒｉＳＩｎはサブコンフルエント細胞にのみ効果があり、コンフルエント細胞では有意な毒性を引き起こさなかった。また、ＰｌｕｒｉＳＩｎの濃度を上げることは、コンフルエント細胞においては細胞死を起こさなかった（図６）。重要なことに、３つのｈＥＳＣ（ＨＩ、Ｈ７、Ｈ９）（データなし）と２つのｈｉＰＳＣ（ＫＢ３、ＤＦ６−９−９Ｔ）株（図１；いくつかはデータなし）の間で、ならびにＥ８あるいはｍＴｅｓＲ培地組成物（図６）で培養されたｈＰＳＣの間で、化合物の各々に応じての細胞死は、類似していた。その上、ＳＴＦ−３１は、ヒト繊維芽細胞フィーダー細胞上で生育しているｈＥＳＣコロニーに、４８〜７２時間の間に起こっている毒性によって有毒であった。９６時間処理の後、毒性は明視野顕微鏡検査及びアルカリホスファターゼ染色で評価された。コロニーは、アルカリホスファターゼ染色では見つけられなかった。陽性染色は非接着性細胞と無細胞破片から成っている（図５Ａ、上のパネル）。明視野顕微鏡検査は減らされた形態により非接着細胞でのコロニーの欠如を確認した（図５Ａ、真ん中のパネル）。ｈＥＳＣの除去を確認するために、コロニーは処理開始９６時間後に継代され、加えて、７２時間培養された。コロニーの生育、もしくは、アルカリホスファターゼ活性は継代された細胞では検出されず、ｈＥＳＣの除去が示された（図５Ａ、下のパネル）。
【００４０】
細胞密度は、ｈＰＳＣから組織特異的後継者を生み出すために利用される多くのインビトロの分化プロトコルのための重要な変数である（例えば神経細胞、肝細胞、心筋細胞［１９、２２、２４、３４］）。さらに、細胞増殖率は、共通のｈＰＳＣ培養条件とｈＰＳＣ株の間で変化させることもできる。ＳＴＦ−３１がいろいろな細胞増殖率で有毒なことを確かめるために、ｈｉＰＳＣはプレート後２４〜９６時間、５−ブロモ−２−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）（１０μΜ）とともにインキュベートされ、そして、細胞周期は調べられた（図１Ｆ；図５Ｂ）。プレート後２４時間（低密度）ではＧ０／Ｇ１期の細胞は８％で、プレート後９６時間（高密度）ではＧ０／Ｇ１期の細胞は４７％であった。したがって、ここでテストされる除去のすべての方法が、急速に増殖しているｈＰＳＣに有毒であると同時に、ＳＴＦ−３１は、ｈＰＳＣの幅広い密度範囲と増殖率でｈＰＳＣに有毒なただ一つの薬剤だった。よってＳＴＦ−３１による毒性は、ｈＰＳＣが増殖率を変えたであろうコンフルエントな培養系で有利な可能性がある。
【００４１】
ｈＰＳＣ自己再生と腫瘍形成性の防止のためのＳＴＦ−３１の効果は、コロニー形成アッセイにより、ＷＺＢ１１７及びＰｌｕｒｉＳＩｎ処理ともにインビトロで評価した。我々は、２４時間がｈＰＳＣの完全な毒性を成し遂げるＳＴＦ−３１による最小の処理時間であると決定した（図示せず）。２４時間のパルス処理スキームを使って、ＳＴＦ−３１がコンフルエントｈｉＰＳＣからのアルカリホスファターゼ陽性のコロニー形成を妨げることを見出したが、ＰｌｕｒｉＳＩｎ及びＷＺＢ１１７は、コロニー成長（図１Ｇ）を防げなかった。ｈｉＰＳＣの除去のためのＳＴＦ−３１の効果のより厳しい評価として、細胞の分離と再プレートの間のストレスに起因する誇張された細胞死を排除するために、細胞の継代なしにコロニー構造分析を実行した（図１Ｈ）。この戦略では、ＳＴＦ−３１、ＷＺＢ１１７、及びＰｌｕｒｉＳＩｎを、コンフルエントなｈｉＰＳＣに２４時間適用し、培地を６日間毎日交換した。ＤＭＳＯ、ＷＺＢ１１７、及びＰｌｕｒｉＳＩｎで処理したｈｉＰＳＣにおいて、同様のレベルのアルカリホスファターゼ陽性細胞が観察された。対照的に、２．５μΜのＳＴＦ−３１で処理したｈｉＰＳＣでは、限られた数のコロニーが観察され、５μΜのＳＴＦ−３１で処理したｈｉＰＳＣではコロニーは観察されなかった。これらの知見は、コンフルエントなｈｉＰＳＣでは、ＳＴＦ−３１での２４時間の処理はアルカリホスファターゼ陽性細胞の再形成を防止するが、ＷＺＢ１１７及びＰｌｕｒｉＳＩｎはコンフルエントな単層ｈＰＳＣに対して効果がないことを証明する。
【００４２】
さらにＳＴＦ−３１の有用性を評価するために、我々は分化細胞だけでなく、サブコンフルエン及びコンフルエントｈｉＰＳＣ上でＳＴＦ−３１の２４時間のパルス処理の効果を調べた。サブコンフルエント及びコンフルエント細胞でのＳＴＦ−３１処理のＬＤ50は、それぞれ１．３５μΜ及び１．７８μΜであると決定された（図２Ａ）。図１中のデータと一致して、ＷＺＢ１１７とＰｌｕｒｉＳＩｎによる２４時間の処理は、サブコンフルエントｈｉＰＳＣを除去したが、コンフルエントｈｉＰＳＣを除去しなかった（図２Ｂ）。ＳＴＦ−３１による２４時間の処理は、１００μΜの濃度では線維芽細胞の生存能力を３０％低減するだけだったので、ヒト線維芽細胞に毒性を示さなかった。これらの２４時間処理のデータは、連続的に７２時間線維芽細胞をＳＴＦ−３１にさらした我々の前のレポート［１９］と一致している。この２４時間のパルス処理を用いたｈｉＰＳＣ由来の心筋細胞培養物に対するＳＴＦ−３１のＬＤ50は４０μΜであり、ｈｉＰＳＣに対するＬＤ50より２２倍高濃度であった（図２Ａ）。処理時間を７２時間まで延長することは、完全にコミットした網膜色素上皮細胞（ＡＲＰＥ−１９株；データ表示なし）あるいは繊維芽細胞の細胞生存能力を減少させなかった［１９］。
【００４３】
ｈＰＳＣ除去のために確立された条件を使用し、ＳＴＦ−３１（２４時間、５μΜ）の１０日目心筋細胞の機能及びマーカーに対する効果を調べた。ＳＴＦ−３１処理は、心筋細胞の自然発生的な収縮性（データ表示なし）に影響を及ぼさなかった。フローサイトメトリーで測定されるように（図２Ｃ）、ＳＴＦ−３１によるパルス処理は、心臓マーカーＴＮＮＩ３とＩＲＸ４に影響を及ぼさず、そして処理された心筋細胞は、処理開始７２時間後に、心臓筋節で見られるＴＮＮＴ２の同じ規模の構造組織を維持した（図２Ｄ）。ｑ−ＰＣＲで測定される心臓遺伝子の発現は、ＳＴＦ−３１処理開始の後、有意に変化しなった（図２Ｅ）。
【００４４】
分化細胞の存在下での選択的毒性を確認するために、１０日目心筋細胞（図２Ｆ）またはヒト線維芽細胞（図２Ｇ）とともにｈｉＰＳＣの量を滴定することで、コロニー形成アッセイを実行した。まず最初に、２４時間のパルス処理を使用し、１０日目心筋細胞から大多数のｈｉＰＳＣコロニーを除去する結果となったが、若干のコロニーが処理後に残った（図５Ｃ）。５μΜのＳＴＦ−３１による４８時間のパルス処理が、完全にｈｉＰＳＣを除去することが確認された。処理後に線維芽細胞及び心筋細胞が残存しており、アルカリホスファターゼ染色の時点（データ表示なし）、及び処理開始後１０日目までの間（データ表示なし）に、心筋細胞で自然収縮が観察された。結局、これらの発見は、ＳＴＦ−３１によるパルス処理が、広範囲な子孫で、残存するｈＰＳＣの選択的な除去のための効果的な戦略であることを示す。
【００４５】
癌細胞において、ＳＴＦ−３１は当初、壊死を誘発するＧＬＵＴ１阻害剤だと言われていた［３５］。しかし、ＳＴＦ−３１とＷＺＢ１１７（不可逆的ＧＬＵＴ１阻害剤）の間で観察するタイミング及び有効性の違いにより、ｈＰＳＣにおけるＳＴＦ−３１の動作メカニズムをさらなる調査に乗り出した。これらの研究において、ｈＰＳＣ除去のための方法として以前に報告されたように、グルコース欠乏を比較のために使用した［１６］。ＷＺＢ１１７で観察される結果と同様に、グルコース欠乏はサブコンフルエント細胞に対して毒性を示したが、毒性は、コンフルエント細胞では後発性であり減少した（図３Ａ）。細胞外フラックス解析を使って、糖分解の情報を提供するため細胞外酸性化率（ＥＣＡＲ）を測定し、ミトコンドリア呼吸を精査するために酸素の消費率（ＯＣＲ）をモニターした。ＧＬＵＴ１阻害剤ＷＺＢ１１７によるｈｉＰＳＣの処理は、糖代謝の阻害剤（図７Ａ）である、２−デオキシグルコース（２−ＤＧ）による処理で観察されたのと同様に最初の測定時までＥＣＡＲの減少をもたらした（図３Ｂ）。対照的に、ＳＴＦ−３１処理に続くＥＣＡＲの減少は、グルコース酸化の阻害剤と比較して最高１５時間、有意に遅延した（図３Ｂ）。ＳＴＦ−３１処理されたｈｉＰＳＣは、ＯＣＲの縮小が観察されるまでに１５時間を要したので、ＯＣＲの結果はＥＣＡＲと類似する。この発見は、ＷＺＢ１１７の影響と対照的であり、それは最初の測定時点（８時間）でＯＣＲを減少させていた（図３Ｂ）。
【００４６】
糖代謝に対する影響と一致して、ＳＴＦ−３１は、１時間の処理の後ｈｉＰＳＣでのグルコース取込みに変化させなかった、これに対しＷＺＢ１１７による１時間の処理では２０％の取り込みの減少という結果であった（図３Ｃ）。ＳＴＦ−３１がグルコース取込みにおいて減少を引き起こした最初の時点は処理の後の１８時間だった、そしてそれはＥＣＡＲの減少の３時間後だった。このように、以前癌で報告されている結果［３５］と一致するグルコース取込みの有意な減少は、糖分解とミトコンドリア酸化性代謝のＳＴＦ−３１による阻害後に起きた。グルコース取込みにおけるＳＴＦ−３１遅延効果は、グルコース輸送あるいはＧＬＵＴ１生合成に影響する阻害剤にとっては予想外であり、ＧＬＵＴ１阻害剤として報告されたＳＴＦ−３１の作用メカニズムと一致していない。
【００４７】
ＷＺＢ１１７とＳＴＦ−３１はそれぞれ、２４〜４８時間と２４〜７２時間のアネキシン染色処理で癌細胞での壊死を誘発することが報告されが、他のレポートはアポトーシスでのグルコース飢餓によるＡＴＰの減少を関連づけた［３６−３８］。ＷＺＢ１１７とＳＴＦ−３１がどのようにｈｉＰＳＣ死を促進するかを決定するために、サブコンフルエント細胞でＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ（ｐ−ＡＭＰＫ）のリン酸化を測定することによって、エネルギー検知経路に対する影響が調べられた。ＷＺＢ１１７処理とグルコース欠乏に対応して、ｐ−ＡＭＰＫは処理後１２時間という早い時期に見つけられ、そして、ＡＭＰＫの総レベルはｈｉＰＳＣでのＷＺＢ１１７の処理後、２４時間で減少した（図７Ｂ）。ＳＴＦ−３１処理に応じて、ｐ−ＡＭＰＫが２４時間後、ＥＣＡＲとＯＣＲの減少の約８時間後に増加した。ＡＭＰＫ起動のタイミングは、ＳＴＦ−３１及びグルコース欠乏及びＷＺＢ１１７処理の両方の間でまったく別であるということを証明した。さらに、ＷＺＢ１１７処理及びグルコース欠乏細胞において、切断型カスパーゼ−３及びカスパーゼ−９は、１２時間で観察され、３６時間まで上がったままだった、そしてその時に、切断型カスパーゼ−３及びカスパーゼ−９レベルの減少が観察される（図３Ｄ）。カスパーゼ３／７活性の誘導も、１２時間と同様の時期に観察された（図７Ｃ）。これとは対照的に、ＳＴＦ−３１はかなり後でカスパーゼ３と−９の切断を引き起こし（図３Ｄ）、そして、これは処理の開始の後２４時間のカスパーゼ３／７活性と同時だった（図７Ｃ）。このように、カスパーゼによる細胞死経路の活性化を通して、ＷＺＢ１１７とＳＴＦ−３１はｈｉＰＳＣに作用するように見える。
【００４８】
代謝、グルコース取込み、及びカスパーゼ活性化の中の時間的な不一致は、我々にアデニン及びピリジン・ヌクレオチド・レベルを測定することを促した（図４）、なぜならそれらは、解糖及び酸化的代謝、及び細胞生存能に作用することが知られているからである［３３］。これらの分析は、ＳＴＦ−３１による処理で、ＮＡＤ+レベルが３時間で５０％まで、１８時間で１％以下まで減少することを明らかにした。ＡＴＰレベルは１８時間まで減少しない（図３Ｅ）。これらのデータは、ＳＴＦ−３１が、ＮＡＤ+新規（de novo）合成またはサルベージ経路の阻害を導くことを示唆する。どのＮＡＤ+経路がターゲットとされているかを調査するために、ＳＴＦ−３１の存在下で、加えられる代謝物質を使って救出実験を行った。１及び１０μΜのニコチン酸の追加により、ｈＰＳＣの生存能は、それぞれ７８％及び９７％に回復した（図３Ｆ）。ニコチン酸は、ｈＰＳＣの培養条件中には存在せず、三つのＮＡＤ＋サルベージ経路のうちの一つにおいて、ニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡＰＲＴ）により利用されうる。その代わりに、１０及び１００μΜニコチンアミド（ニコチンアミド・ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡＭＰＴ）の基質）の追加は、ＳＴＦ−３１による毒性を救うことができなかった（データ表示なし）。要するに、これらのデータは、ＳＴＦ−３１がＮＡＭＰＴ依存的なＮＡＤ+サルベージ経路を妨げることを示唆する。
【００４９】
ｈｉＰＳＣ由来の子孫と最終分化細胞に対するＳＴＦ−３１の毒性を評価するために、ＳＴＦ−３１の存在下で、間葉系幹細胞、線維芽細胞、網膜色素上皮細胞、ｈｉＰＳＣ由来心筋細胞、指定された肝内胚葉細胞、及び神経前駆細胞を培養した。これらの細胞種のどれもが、ＳＴＦ−３１処理で、形態または明らかな細胞死において目に見える変化を示さなかった（図８Ａ）。生存能測定は、これらの目視観察と一致していた。心筋細胞、神経前駆細胞及び線維芽細胞については、図８Ｂ−Ｃのデータを参照のこと。重要なことに、ＳＴＦ−３１で処理した心筋細胞は、分化の５日目（前駆体）及び１０日目（コミットした（committed）；最終分化ではない）において、自然周期的な縮小、心筋細胞マーカーのタンパク質及びｍＲＮＡのレベル、及びコントロールと見分けがつかない構造的特徴を示す（図８Ｂに１０日目処理細胞のデータを示す）。Ｂｏｈｅｌｅｒら、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ３，１８５−２０３（２０１４）を参照のこと。要するに、これらの調査結果はＳＴＦ−３１が広範囲にわたるｈＰＳＣ派生物にふさわしいことを示唆する。
【００５０】
この研究は、ｈＰＳＣの選択的毒性に対する効果的な戦略を確立し、定義する。多能性幹細胞代謝は、酸素を使う糖分解によって特徴づけられ、ミトコンドリア膜電位を減少させ、かつ同化作用プロセスに対する依存を増やした［３９］。前述のように、ＧＬＵＴｌの強化された発現、及び解糖代謝に対する依存は、グルコース欠乏［１６］あるいはｈＰＳＣの選択的な除去に対する戦略を裏付けるＧＬＵＴｌの阻害を構成する。Ｂｏｈｅｌｅｒら、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ３，１８５−２０３（２０１４）を参照のこと。しかし、我々の培養システムでは、グルコース欠乏、ＷＺＢ１１７ｈ、及びＰｌｕｒｉＳＩｎは、コンフルエントな単層ｈＰＳＣに毒性を示さず、５種のｈＰＳＣ種及び２つの異なる培地組成物の間で矛盾が無かった。したがって、これらの戦略は、細胞がコンフルエントな単層を必要とするアプリケーションに理想的でない場合があるか、あるいはｈＰＳＣ由来細胞、例えば心筋細胞、肝細胞及び神経細胞の培養［１９、２２、２４、３４］の増殖率を変えた。
【００５１】
我々はｈＰＳＣがＳＴＦ−３１を使って選択的にターゲットとしうることを示す。そして、ＳＴＦ−３１は、分化のために細胞のコンフルエントな単層を必要とし、あるいは分化細胞のコンフルエント単層を生じる培養系に対して、理想的な毒性特徴を提供する。組織、足場あるいは他の立体的な細胞プロダクトを必要とする再生医療戦略は、ゆえに、これらの調査結果から利益を得られるだろう。ＳＴＦ−３１は、２４または４８時間のパルス処理の後、継続した毒性を示し、現在のアプローチに勝る利点を提供する。この毒性は細胞密度に依存せず、コンフルエントｈＰＳＣとｈＰＳＣ由来心筋細胞のＬＤ50の間に、２２倍の違いを提供する。さらに、心筋細胞とｈｉＰＳＣによる共培養の処理は、心筋細胞を助けながら、ｈＰＳＣの選択的な除去を提供した。最後に、５μΜのＳＴＦ−３１は、インビトロでｈＰＳＣコロニー自己再生及び７日間の再生を防ぐのに十分であった；しかし、ｈＰＳＣの分離と再プレートを含む従来のコロニー形成アッセイ法は、低濃度のＳＴＦ−３１が効果的な場合もあることを示す。
【００５２】
ＳＴＦ−３１は、癌細胞でＧＬＵＴｌを阻害することが報告され［３５］、現在ＧＬＵＴｌ阻害剤として上市されている。しかし、我々のＳＴＦ−３１が媒介する毒性と、代謝フラックスでの影響に対するデータは、このアクションのメカニズムをサポートしない。むしろ、これらのデータは、解糖代謝に対する影響は、ＮＡＤ+の減少によることを示す。ＳＴＦ−３１が媒介する代謝（糖分解と酸化的リン酸化）における時間的効果は、グルコース欠乏及びＷＺＢ１１７によるものとは異なる。さらに、解糖フラックスの阻害の前にグルコース取込みのブロックに失敗することは、ｈＰＳＣでのＳＴＦ−３１が媒介する毒性はＧＬＵＴｌ阻害によらないことを示す。これら調査の結果、我々はＳＴＦ−３１の動作のメカニズムを定義しようと試みた。我々のデータは、ＳＴＦ−３１が、ＮＡＤ+サルベージ経路の一つにおけるＮＡＤ+のニコチンアミドへの変換において、律速段階を触媒する酵素である、ＮＡＭＰＴをターゲットとすることを明らかにする。このメカニズムのさらなるサポートは、我々の原稿が準備される間に発表された別の研究で明らかになる。Ｄｒａｇｏｖｉｃｈらは、組織的に６７の異なる３−アミノピリジン由来のアミドを合成して、それらにＮＡＭＰＴを妨げる能力の検査をした［４０］。このスクリ−ンから、ＳＴＦ−３１と同じ化学構造を持つ、化合物５１が、精製された酵素分析において直接ＮＡＭＰＴを妨げるとわかった（ＩＣ50＝１９ｎＭ）。Ｘ線結晶学によって、ＳＴＦ−３１は、ＮＡＭＰＴのポケットを結びつけているリガンドで結合することが示された。これらのデータはＳＴＦ−３１によって媒介される毒性がＮＡＭＰＴをターゲットとすることによってＮＡＤ+サルベージ経路の阻害に起因することを確認した。さらに我々の研究は、ｈＰＳＣにおいてＳＴＦ−３１によってもたらされる毒性作用がＮＡＤ+（グルコース輸送の阻害でない）の減少に起因しうるという証拠を提供する。この発見は、多能性の基礎代謝のプロファイルに対する基本的な洞察を提供する、なぜならこれらの細胞は、分化した子孫よりＮＡＤ+サルベージ経路の損失を補償することができないからである。本明細書が示すＮＡＤ+サルベージ経路に対する信頼性は、十分なＮＡＤ+濃度は、再プログラミングの間、多能性を確立・維持するために必要とされることを示した、ＮＡＭＰＴを阻害する化合物ＦＫ８６６を用いた最近の報告と一致する［４１］。しかし、Ｓｏｎらによるレポートは、試験済の条件で、ｈＰＳＣの完全な細胞死を示さなかった。今後、より強力で水溶性のＮＡＭＰＴ阻害剤が、ｈＰＳＣに由来する臨床的に関連した細胞と組織の製造のための重要な試薬になるであろう。
【００５３】
要約するとこの研究は、ＮＡＭＰＴによって媒介されるＮＡＤ+サルベージ経路をターゲットとすることが、選択的なｈＰＳＣ毒性に対する効果的で効率的な戦略であることを立証する。細胞代謝イベントの我々の詳細な分析は、培養においてｈＰＳＣの除去のためにグルコース飢餓あるいはＧＬＵＴ１阻害に関するＮＡＭＰＴ阻害剤の使用を、さらにサポートする。２４または４８時間のパルス処理スキームで、ＮＡＭＰＴを阻害するためにＳＴＦ−３１を使用すると、ｈＰＳＣの除去は多くの培養条件において、最終分化細胞及びｈＰＳＣ由来の子孫に対する細胞毒性効果なしに達成可能である。
【００５４】
材料及び実験的手法
【００５５】
細胞培養と試薬：ｈｉＰＳＣ（ＤＦ６−９−９Ｔ、ＫＢ３［１９、２０］）とｈＥＳＣ（ＨＩ、Ｈ７、Ｈ９［２１］）は、前述のとおり［６、１９］、Ｅ８またはｍＴｅＳＲ培地でマトリゲルの上で単層培養において培養した。すべての実験において、ｈＰＳＣは特に明記しない限り、２ｃｍ2表面被覆につき１．５ｅ５細胞でプレートし、連日の継代の間の明確な数の細胞は、実験を通して再生産性を強化し、多能性細胞の高品質な単層培養組織を維持する。低分子阻害剤での処理は、プレート後２４から９６時間の間で始めた。これらの時点は、細胞が典型的に１５−２０％及び１００％コンフルエントである辞典を示した。ｈｉＰＳＣ由来の心筋細胞は分化し、前述のとおり［２２］、維持された。フィーダー細胞層の上で大きくなったｈＥＳＣコロニーのために、ＨＩコロニーを、Ｅ８培地で有糸分裂的に不活性ヒト線維芽細胞フィーダー上で培養し、コロニーはコラゲナーゼＩＶとともに３７℃で４０分間、継代した［２３］。前述［２４］のように、ＰＡＸ６陽性ニューロンが分化した。ヒト線維芽細胞は、じ前述［１９］のとおり培養した。低分子ＳＴＦ−３１（４−［［［［４−（ｌ，ｌ−ジメチルエチル）フェニル］スルホニル］アミノ］メチル］−Ｎ−３−ピリジニル−ベンズアミド、Ｔｏｃｒｉｓ）、ＷＺＢ１１７（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ＰｌｕｒｉＳＩｎ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、ニコチン酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、及びニコチンアミド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）は、細胞を処理するために用いた。グルコース剥奪のために、グルコースを含まないＤＭＥＭ  Ｆ−１２（ＵＳ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）を用いる変更条件により、前述［１９］のとおりＥ８培地を調製した。グルコース剥奪培地をコントロールするため、１７．５ｍＭのグルコース（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を、グルコースを含まないＥ８培地に加えた。
【００５６】
インビトロ毒性分析：低分子またはグルコース剥奪による処理は、プレート後２４時間及び９６時間で、ｈＥＳＣあるいはｈｉＰＳＣで開始し、インビトロの毒性分析は、処理開始の２４〜９６時間後に指定された処理の終点で実行した。パルス処理のために、ｈｉＰＳＣは２４時間ＳＴＦ−３１で処理し、Ｄ−ＰＢＳで２回洗浄して、さらに４８時間、培地中で培養した。細胞生存能のためのニュートラルレッド分析は、前述［２５］のとおり実行した。インビトロでの細胞死は、ＳＹＴＯＸ（登録商標）グリーン核酸着色（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｅｓ）を使って決定した。細胞は、５％のＣＯ2で湿らされた細胞インキュベーター内で、３７℃で３０分間５μΜのＳＹＴＯＸ（登録商標）グリーン中でインキュベートした。細胞生存率を、１２０μΜジギトニン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、及び５μΜのＳＹＴＯＸ（登録商標）グリーンと共にインキュベートした細胞の複製のため統一して決定した。細胞生存能の画像化は、Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ（登録商標）、哺乳動物細胞のための生存能／細胞毒性キット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｅｓ）を用いて行った。細胞を、生細胞検出のためには４μΜのＣａｌｃｅｉｎ  ＡＭで、損なわれた膜により細胞を検出するためには２μΜのＥｔｈｉｄｉｕｍ  Ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ  １で、室温で２０分の間染色した。細胞形態学の変更の典型的なイメージは、処理開始の２４から７２時間後に、コンフルエントｈＰＳＣの上で得られた。画像化は、倒立顕微鏡Ｎｉｋｏｎ  Ｔｉ−Ｕで行った。
【００５７】
ＢｒｄＵ取込み、及びフローサイトメトリー：細胞を９．６ｃｍ2あたり７．５ｅ５個でプレートし、１０μΜの５−ブロモ−２−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）はプレート後２４から９６時間のｈｉＰＳＣに、５％のＣＯ2で湿らされた細胞インキュベーター内で３７℃で１時間、取り込んだ。取込みの後、細胞は、メーカーのガイドライン（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に従い、ＦＩＴＣ  ＢｒｄＵフロー・キットを用いて集め、染色した。細胞生存能は、Ｆｉｘａｂｌｅ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｄｙｅ  ｅｋＦｌｕｏｒ（登録商標）４５０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により決定した。ＢＤ  ＬＳＲＩＩフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で得られる３０，０００の事象について、ＦＣＳＥｘｐｒｅｓｓ  Ｖ３（ＤｅＮｏｖｏ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて分析を行った。細胞周期の各段階の細胞の割合は、生細胞集団の各段階にある集団をゲーティングすることにより測定した。
【００５８】
コロニー形成アッセイ：コロニー形成アッセイは、コンフルエントｈｉＰＳＣ上で、３つの異なるバリエーションで行い、コンフルエントｈｉＰＳＣは、２．５及び５μΜのＳＴＦ−３１、３０μΜのＷＺＢ１１７、２０μΜのＰｌｕｒｉＳＩｎで２４時間処理した。最初の反復は、前述の方法［２６］が適用され、２４時間の処理後、ｈｉＰＳＣはアクターゼ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で剥離し、Ｅ８で再懸濁し、１２×７５ｍｍ細胞ストレーナー・キャップ（Ｆａｌｃｏｎ）付きのチューブを経て、そして２ｃｍ2あたり５ｅ４細胞でプレートした。培地を４８時間おきに交換し細胞を６日間培養した、この際、アルカリホスファターゼ染色は、白血球アルカリホスファターゼ・キット（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）により、［２７］に記述のように行い、プレート上のホスファターゼ陽性のコロニーを目視で調査した。この戦略は、コロニー形成アッセイで最も一般的な方法である。しかし、継代の際に通常生じる細胞死に関する懸念により、さらに厳しい評価のために別のアプローチへと駆り立てられた。二つ目のアッセイ（second iteration）において、細胞を２４時間処理し、０．５ｍＬのＤ−ＰＢＳで２度洗浄し、培地をＥ８に交換した。その後、培地を６日間毎日交換し、その時点でアルカリホスファターゼ活性のための染色を行った。このアッセイにおいて、細胞は継代のストレス、すなわち化合物の直接的な結果でない誤った低い生存能を引き起こしうるストレスにさらされない；よって、この変更されたアッセイは、最初のアッセイより厳しいｈＰＳＣ除去の評価と考えられる。分化細胞との共培養によるｈｉＰＳＣの除去は、ヒト線維芽細胞及びｈｉＰＳＣ由来の１０日目の心筋細胞により行った。ｈｉＰＳＣ（ＤＦ６−９−９Ｔ）を、ウェルあたり１００〜１０，０００生細胞の濃度範囲で、ヒト繊維芽細胞（１．７５ｅ５細胞個）、または１０日目の分化した心筋細胞（３．７５ｅ５細胞個）とともに、Ｅ８培地、及び９．６ｃｍ2あたりＹ−２７６３２にプレートした。２４時間後に、２４または４８時間５μΜのＳＴＦ−３１で処理し、２回洗浄した、培地は毎日Ｅ８に入れ替えた。プレートの６日後に、アルカリホスファターゼ活性の染色を行った。有糸分裂的に不活性なヒト線維芽細胞フィーダー上で生育したｈＥＳＣコロニーを除去するため、コロニーを、細胞が明視野顕微鏡検査で画像化されてアルカリホスファターゼ活性の染色を行った時点で９６時間２．５μΜＳＴＦ−３１で処理、あるいはコロニーを、コラゲナーゼＩＶ（２ｍｇ／ｍＬで３７℃、４０分間）で継代し、さらに７２時間培養してアルカリホスファターゼ活性の染色をした。ウェルの画像化はＳｏｎｙ  Ｃｙｂｅｒ−ｓｈｏｔ  ＤＳＣ−ＴＸ３０で、個々のコロニーの画像化はニコン立体鏡により行った。
【００５９】
心筋細胞の特性化：すべての実験で、ｈｉＰＳＣ（ＤＦ６−９−９Ｔ）由来の１０日目の心筋細胞分化培養物に、５μΜのＳＴＦ−３１による２４時間のパルス処理を行った。フローサイトメトリーは、前述のとおり、ＳＴＦ−３１処理開始の７２時間後にＴｒｏｐｏｎｉｎ  Ｉタイプ３（ＴＮＮＩ３）とイロコイ−クラス・ホメオドメイン・タンパク質（ＩＲＸ４）に対して行った［１９］。ＴＮＮＩ３、Ｔｒｏｐｏｎｉｎ  Ｔ２（ＴＮＮＴ２）、及びＨｏｍｅｏｂｏｘタンパク質Ｎｋｘ−２．５（ＮＫＸ２−５）の定量リアルタイムＰＣＲは、ＳＴＦ−３１処理開始の２４〜７２時間後にＴａｑｍａｎ（登録商標）Ａｓｓａｙｓ  （Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使って、前述のとおり実行した［１９］。ＴＮＮＴ２の免疫蛍光法検出のために、心筋細胞はＳＴＦ−３１処理開始の７２時間後にカバーグラスに継代し、さらに４８時間培養した。続いて細胞を、４％のパラホルムアルデヒドで固定、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘで透過処理し、ＴｒｏｐｏｎｉｎＴ（ＴＮＮＴ２）の一次抗体（Ａｂｃａｍ：ａｂ８２９５）中で、４℃で一晩インキュベートした。さらに、細胞を二次抗体ヤギ抗マウスＩｇＧｌ−Ａｌｅｘａ  ５６８（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈ：Ａ−２１１２４）でインキュベートし、核をＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈ：Ｈ２１４９２）により検出した。細胞は、倒立顕微鏡Ｎｉｋｏｎ  Ｔｉ−Ｕ、共焦点顕微鏡Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ９０ｉで画像化した。
【００６０】
細胞外フラックス解析：ｈｉＰＳＣを、前述［２８］のとおり、いくつかの例外と共に、特殊なマイクロプレート（Ｓｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）上で、ウェルにつき６ｅ４細胞でプレートした。細胞外フラックス分析はＳｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＸＦ２４  Ａｎａｌｙｚｅｒを使用して、プレート後４８時間のｈｉＰＳＣに対して行った。細胞を、２．５μΜのＳＴＦ−３１、３０μΜのＷＺＢ１１７、２０ｍＭの２−デオキシグルコース（２−ＤＧ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、溶媒対照、または培地対照で５．５時間処理し、７５０μＬの分析培地で２回洗浄し、適切な処理液を含む７５０μＬの分析培地に放置した。
マイクロプレートを、１．５時間の非ＣＯ2インキュベーターで平衡化し、Ｓｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＸＦ２４  Ａｎａｌｙｚｅｒで１６時間、分析した。分析媒体は、以下の例外を除きＥ８試薬を含む：フェノールレッド不含有・基本ＤＭＥＭ  Ｆ−１２（Ｇｉｂｃｏ）、重炭酸ナトリウム不含有・２．５ｍＭ  ＧｌｕｔａＭＡＸTM・基本ＤＭＥＭ  Ｆ−１２（Ｇｉｂｃｏ）、及び１５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ・基本ＤＭＥＭ  Ｆ−１２（Ｇｉｂｃｏ）。分析培地は、使用前に３７℃、ｐＨ７．４に合わせた。細胞外酸性化率（ＥＣＡＲ）、及び基礎酸素消費率（ＯＣＲ）は、ほぼ６０分おきに収集した。処理はベースライン・培地コントロール値まで統一化し、生物学的複製の平均として示す。
【００６１】
グルコース取込みアッセイ：サブコンフルエントｈｉＰＳＣ（プレート後２４時間）を、２．５μΜのＳＴＦ−３１、３０μΜのＷＺＢ１１７、２０μΜのＣｙｔｏｃｈａｌａｓｉｎ  Ｂ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、及び溶媒対照群で、１、１５、１８、及び２４時間処理した。１時間の処理のために、細胞を、５％のＣＯ2で湿らされた３７℃の細胞インキュベーター内のＫｒｅｂｓ−Ｒｉｎｇｅｒ  Ｈｅｐｅｓ（ＫＲＨ）含有処理液（treatment）中に放置した。１５、１８、及び２４時間の処理のために、細胞は、それぞれ１４、１７、及び２３時間Ｅ８培地で処理した、そしてその時点で、１時間にわたり、培地をＫＲＨバッファ含有特異的処理液（treatment）に変更した。特定の処理時間経過後、グルコース取込みを、前述のとおり、３７℃で５分間、０．５μＣｉ［3Ｈ］２−デオキシグルコースで行った［２９］。取込みデータは、ラウリー法で測定されるタンパク質濃度に統一された。
【００６２】
免疫ブロット分析：非接着細胞を遠心分離によって収集し、接着細胞はｄ−ＰＢＳとともに一度洗浄して、Ｌａｅｍｍｌｉバッファで溶解し、非接着細胞ペレットと合わせて９５℃で５分間加熱した。タンパク質濃度を、Ｑｕｂｉｔタンパク質分析（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で測定した。全タンパク質の２５μｇは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ニトロセルロース膜（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に転写して、メーカーの指示に従いブロックした。膜は、一次抗体の以下の希釈液で、４℃で一晩中インキュベートした：Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ製のウサギ抗切断型裂カスパーゼ３（１：５００）、ウサギ抗カスパーゼ９（１：１０００）、ウサギ抗リン酸ＡＭＰＫ（１：１０００）、ウサギ抗ＡＭＰＫ（１：１，０００）、及びＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のマウス抗ＧＡＰＤＨ（１：１０，０００）。次に、膜は以下の濃度で４５分間、二次抗体でインキュベートした：Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．製のロバ抗マウス−ホースラディッシュペルオキシダーゼ（１：５，０００）及びロバ抗−ウサギ−ホースラディッシュペルオキシダーゼ（１：７，０００）、続いて、効果が増強された化学ルミネセンス（enhanced chemiluminescence）［３０］を用いて検出した。
【００６３】
切断型カスパーゼ３／７蛍光ベースの分析：２．５μΜのＳＴＦ−３１、３０μΜのＷＺＢ１１７またはグルコース剥奪による処理を、サブコンフルエントｈｉＰＳＣ（プレート後２４時間）で開始し、６、１２、１８、２４時間の時点で、切断型カスパーゼ３／７活性を、細胞を５００μＬのＥ８培地で培養し、終点で培地に２５０μＬの３×カスパーゼ・バッファを加えたこと以外は前述［３１、３２］のとおり測定した。
【００６４】
ヌクレオチド・プール測定：前に発表された方法［３３］に従って、ＡＴＰ、ＡＤＰ、ＡＭＰ及びＮＡＤ+は過塩素酸降水を使用して抽出されて、ＨＰＬＣを用いて分析された。ＡＴＰ、ＡＤＰ、ＡＭＰ及びＮＡＤ+のピークは、各々のサンプルについて測られて標準と比較しタンパク質レベルに統一された。
【００６５】
統計的解析：すべての実験は３つの生物学的複製の最小で行われた。データ複製のための生物学的平均値の標準誤差を平均として表される。統計的解析は、ＴＵＫＥＹポストホックテストによる一元分散分析を用いて行った。
【００６６】
リファレンス
１．Chong, J.J., et al., Human embryonic-stem-cell-derived cardiomyocytes regenerate non- human primate hearts. Nature, 2014.
２．Ebert, A.D., P. Liang, and J.C. Wu, Induced pluripotent stem cells as a disease modeling and drug screening platform. J Cardiovasc Pharmacol, 2012. 60(4): p. 408-16.
３．Grskovic, M., et al., Induced pluripotent stem cells--opportunities for disease modelling and drug discovery. Nat Rev Drug Discov, 2011. 10(12): p. 915-29.
４．Takahashi, K. and S. Yamanaka, Induced pluripotent stem cells in medicine and biology. Development, 2013. 140(12): p. 2457-61
５．Hentze, H., et al., Teratoma formation by human embryonic stem cells: evaluation of essential parameters for future safety studies. Stem Cell Res, 2009. 2(3): p. 198-210.
６．Lawrenz, B., et al., Highly sensitive biosafety model for stem-cell-derived grafts. Cytotherapy, 2004. 6(3): p. 212-22.
７．Cui, L., et al., WNT signaling determines tumorigenicity and function of ESC-derived retinal progenitors. J Clin Invest, 2013. 123(4): p. 1647-61.
８．Doi, D., et al., Prolonged maturation culture favors a reduction in the tumorigenicity and the dopaminergic function of human ESC-derived neural cells in a primate model of Parkinson's disease. Stem Cells, 2012. 30(5): p. 935-45.
９．Kroon, E., et al., Pancreatic endoderm derived from human embryonic stem cells generates glucose-responsive insulin-secreting cells in vivo. Nat Biotechnol, 2008. 26(4): p. 443-52.
１０．Lee, A.S., et al., Tumorigenicity as a clinical hurdle for pluripotent stem cell therapies.Nat Med, 2013. 19(8): p. 998-1004.
１１．DeFrancesco, L., Fits and starts for Geron. Nat Biotechnol, 2009. 27(877).
１２．Cao, F., et al., Molecular imaging of embryonic stem cell misbehavior and suicide gene ablation. Cloning Stem Cells, 2007. 9(1): p. 107-17.
１３．Rong, Z., et al., A scalable approach to prevent teratoma formation of human embryonic stem cells. J Biol Chem, 2012. 287(39): p. 32338-45.
１４．Ben-David, U., N. Nudel, and N. Benvenisty, Immunologic and chemical targeting of the tight-junction protein Claudin-6 eliminates tumorigenic human pluripotent stem cells. Nat Commun, 2013. 4: p. 1992.
１５．Tang, C, et al, An antibody against SSEA-5 glycan on human pluripotent stem cells enables removal of teratoma-forming cells. Nat Biotechnol, 2011. 29(9): p. 829-34.
１６．Tohyama, S., et al., Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell, 2013. 12(1): p. 127- 37.
１７．Ben-David, U. and N. Benvenisty, Chemical ablation of tumor-initiating human pluripotent stem cells. Nat Protoc, 2014. 9(3): p. 729-40.
１８．Ben-David, U., et al., Selective elimination of human pluripotent stem cells by an oleate synthesis inhibitor discovered in a high-throughput screen. Cell Stem Cell, 2013. 12(2): p. 167-79.
１９．Boheler, K.R., et al., A human pluripotent stem cell surface N-glycoproteome resource reveals markers, extracellular epitopes, and drug targets. Stem Cell Reports, 2014. 3(1): p. 185-203.
２０．Yu, J., et al., Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science, 2009. 324(5928): p. 797-801.
２１．Thomson, J.A., et al., Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science, 1998. 282(5391): p. 1145-7.
２２．Bhattacharya, S., et al., High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry. J Vis Exp, 2014(91): p. 52010.
２３．Amit, M. and J. Itskovitz-Eldor, Morphology of Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cell Colonies Cultured with Feeders, in Atlas of Human Pluripotent Stem Cells, M. Amit and J. Itskovitz-Eldor, Editors. 2012, Humana Press, p. 15-39.
２４．Shi, Y., et al., Human cerebral cortex development from pluripotent stem cells to functional excitatory synapses. Nat Neurosci, 2012. 15(3): p. 477-86, S1.
２５．Repetto, G., A. del Peso, and J.L. Zurita, Neutral red uptake assay for the estimation of cell viability /cytotoxicity. Nat Protoc, 2008. 3(7): p. 1125-31.
２６．O'Connor, M.D., M.D. Kardel, and C.J. Eaves, Functional assays for human embryonic stem cell pluripotency. Methods Mol Biol, 2011. 690: p. 67-80.
２７．Rao, S., et al., Differential roles of SalU isoforms in embryonic stem cell pluripotency. Mol Cell Biol, 2010. 30(22): p. 5364-80.
２８．Zhang, J., et al, Measuring energy metabolism in cultured cells, including human pluripotent stem cells and differentiated cells. Nat Protoc, 2012. 7(6): p. 1068-85.
２９．Yamamoto, N., et al., Measurement of glucose uptake in cultured cells. Curr Protoc Pharmacol, 2011. Chapter 12: p. Unit 12 14 1-22.
３０．Khan, P., et al., Luminol-Based Chemiluminescent Signals: Clinical and Non-clinical Application and Future Uses. Appl Biochem Biotechnol, 2014. 173(2): p. 333-355.
３１．Meares, G.P., et al., AMP-activated protein kinase attenuates nitric oxide-induced beta-cell death. J Biol Chem, 2010. 285(5): p. 3191-200.
３２．Carrasco, R.A., N.B. Stamm, and B.K. Patel, One-step cellular caspase-3/7 assay.Biotechniques, 2003. 34(5): p. 1064-7.
３３．Broniowska, K.A., et al., Effect of nitric oxide on naphthoquinone toxicity in endothelial cells: role of bio energetic dysfunction and poly (ADP-ribose) polymerase activation. Biochemistry, 2013. 52(25): p. 4364-72.
３４．Mallanna, S.K. and S.A. Duncan, Differentiation ofhepatocytes from pluripotent stem cells. Curr Protoc Stem Cell Biol, 2013. 26: p. Unit 1G 4.
３５．Chan, D.A., et al., Targeting GLUTl and the Warburg effect in renal cell carcinoma by chemical synthetic lethality. Sci Transl Med, 2011. 3(94): p. 94ra70.
３６．Altman, B.J. and J.C. Rathmell, Metabolic stress in autophagy and cell death pathways. Cold Spring Harb Perspect Biol, 2012. 4(9): p. a008763.
３７．Coloff, J.L., et al., Akt requires glucose metabolism to suppress puma expression and prevent apoptosis of leukemic T cells. J Biol Chem, 2011. 286(7): p. 5921-33.
３８．Zhao, Y., et al., Glucose metabolism attenuates p53 and Puma-dependent cell death upon growth factor deprivation. J Biol Chem, 2008. 283(52): p. 36344-53.
３９．Folmes, CD., et al., Energy metabolism plasticity enables sternness programs. Ann N Y Acad Sci, 2012. 1254: p. 82-9.
４０．Dragovich, P.S., et al., Fragment-based design of 3-aminopyridine-derived amides as potent inhibitors of human nicotinamide phosphoribosyltransferase (NAMPT). Bioorg Med Chem Lett, 2014. 24(3): p. 954-62.
４１．Son, M.J., et al., Nicotinamide overcomes pluripotency deficits and reprogramming barriers. Stem Cells, 2013. 31(6): p. 1121-35.
【００６７】
［実施例２］ヒト多能性幹細胞へのＦＫ８６６毒性
【００６８】
図１０は、ＦＫ８６６（図９Ｂ）で最大７２時間の処理をしたｈｉＰＳＣｓの細胞生存率のデータを示す。このＮＡＭＰＴ阻害剤による多能性幹細胞死のタイミングは、ＳＴＦ−３１で観察されたものと同様であった。ＦＫ８６６はＳＴＦ−３１より低い濃度で、ヒト多能性幹細胞対して毒性を有することが観察された。これらのデータは、ＳＴＦ−３１とＦＫ８６６が臨床的に関連すること、及びＳＴＦ−３１が、培養において分化した子孫には影響を及ぼさないという我々の発見と一致している。したがって、多能性幹細胞の選択的除去するための効果的な戦略は、ＮＡＭＰＴ阻害剤を用いてＮＡＤ+濃度を激減することである。また、これらのデータは、ＮＡＭＰＴ阻害が、培地組成、細胞密度、及び細胞系に依存せずに作用する、迅速、測定可能、かつ安価な方法を提供する、これまでの報告よりもさらに一般的に適用可能な戦略である、ことを示す。重要なことに、ＳＴＦ−３１とＦＫ８６６が、インビボで腫瘍集団を低減することができるので、これらの研究は、それらの抗腫瘍特性が多能性細胞に限られていないことを示唆する。このように、これらの化合物は、継代のために用意された細胞における腫瘍細胞を選択的に除去するために有用であり、分化培養における奇形腫を引き起こす細胞が、多能性か、一以上の分化した表現型をどうかには依存しない。
【００６９】
［実施例３］ＳＴＦ−３１はヒト多能性幹細胞由来の子孫と最終分化細胞を助ける（spares）
【００７０】
間葉系幹細胞、線維芽細胞、網膜色素上皮細胞、ヒト多能性幹細胞由来の心筋細胞、指定された肝内胚葉細胞、神経前駆細胞は、ＳＴＦ−３１処理による形態や明らかな細胞死に見える変化を示さず（図８Ａ）、生存率の測定はこれらの観測と一致している（図５Ａ、５Ｂ）。ＳＴＦ−３１処理されたヒト多能性幹細胞由来の心筋細胞と神経前駆細胞はコントロールと区別がつかないマーカーと構造的機能のタンパク質とｍＲＮＡレベルを示す（図８Ｂ−Ｃ）。図１１に示すように、成人網膜色素上皮細胞（ＡＲＰＥ）及びＰＡＸ６陽性神経前駆細胞はまた、ＳＴＦ−３１処理に耐性を示す。７２時間連続ＳＴＦ−３１処理した神経前駆細胞で観察された細胞死は、外因性ＮＡの添加で救出することができ、多能性幹細胞で観察されたＮＡＭＰＴ阻害のメカニズムと一致している。要するに、ＳＴＦ−３１が広範囲にわたるｈＰＳＣ派生物にふさわしいこと、そして神経前駆細胞とＡＲＰＥ細胞の短期処理（２４時間）が重要な毒性ではないことをこれらのデータは証明する。
【００７１】
［実施例４］インビトロ及びインビボでの腫瘍形成性多能性幹細胞由来の子孫の除去
【００７２】
腫瘍は、もはや多能性幹細胞の典型的機能の定義に合わない細胞から生じ得る。例えば、部分的に分化したあるいは前駆細胞が、自己再生し腫瘍化されうるが、３つ全ての胚葉から細胞を生じない可能性がある（よって、真の多能性細胞の機能的定義にフィットするのを妨げる）。この実施例では、多能性幹細胞由来の腫瘍性の子孫は、以下を含む：未熟な前駆細胞、部分的に分化した子孫、胎児のような子孫、最終分化していない子孫、ならびに遺伝子の不安定性または発癌性経路の活性化を通して、多能性腫瘍形成性の調整経路及び／または腫瘍形成性の特徴を保持するか、再活性化する子孫。ここで、前記化合物は、多能性幹細胞由来の子孫の哺乳類への投与と同時に、多能性幹細胞由来の腫瘍形成性の子孫から開始される腫瘍形成を排除するために用いられる（例えば、ヒトへのヒト多能性幹細胞由来の心筋細胞の移植）。前記化合物は、前記細胞または組織製品が送達されるのと同時、または細胞の送達の後に投与される（例えば、細胞の送達の１日から３０日後）。前記化合物は、ＳＴＦ−３１、ＦＫ８６６、他のＮＡＭＰＴ阻害剤、またはＮＡＭＰＴ阻害剤の組み合わせを含んでもよい。例えば、哺乳動物へ送達された細胞または組織プロダクトからの、腫瘍のインビボ形成を妨げるために、化合物は０．１２６ｍｇ／ｍ2／ｈの推薦された適用量で、または、０から０．１２６ｍｇ／ｍ2／ｈの範囲内で、９６時間の持続性点滴として、２８日おきに投与される。ヒトへのＦＫ８６６の無毒投与量は、Ｈｏｌｅｎら、Ｉｎｖｅｓｔ  Ｎｅｗ  Ｄｒｕｇｓ  ２６（ｌ）：４５−５１（２００８）に記載されている。哺乳動物に送達される子孫は任意の多能性幹細胞派生物を含んでもよい（例えば、心筋細胞、神経細胞、肝細胞、網膜色素上皮細胞）。
【００７３】
他の実施態様において使用される化合物は、インビトロ及びインビボでの下流処理の前に、インビトロで、多能性幹細胞由来の腫瘍形成性子孫（上記に定める）からの腫瘍形成性細胞の数を除去または低減するために用いられる。この方法では、化合物は、細胞培養物または組織製品に、２４〜９６時間、ＳＴＦ−３１の濃度０．１〜５０μΜの範囲で、ＦＫ８６６濃度０．００１〜１０μΜの範囲で、適用される。腫瘍形成性集団の除去に必要な時間の処理の後、前記化合物は化合物を含まない適切な培地（例えば、３〜５倍の量の培養培地）での複数の洗浄によって取り除かれ、そして細胞は、下流の適用での利用まで培養される。
【図１Ａ】
0006791756.tif 000002
【図１Ｂ】
0006791756.tif 000003
【図１Ｃ】
0006791756.tif 000004
【図１Ｄ】
0006791756.tif 000005
【図１Ｅ】
0006791756.tif 000006
【図１Ｆ】
0006791756.tif 000007
【図１Ｇ】
0006791756.tif 000008
【図１Ｈ】
0006791756.tif 000009
【図２Ａ】
0006791756.tif 000010
【図２Ｂ】
0006791756.tif 000011
【図２Ｃ】
0006791756.tif 000012
【図２Ｄ】
0006791756.tif 000013
【図２Ｅ】
0006791756.tif 000014
【図２Ｆ】
0006791756.tif 000015
【図２Ｇ】
0006791756.tif 000016
【図３Ａ】
0006791756.tif 000017
【図３Ｂ】
0006791756.tif 000018
【図３Ｃ】
0006791756.tif 000019
【図３Ｄ】
0006791756.tif 000020
【図３Ｅ】
0006791756.tif 000021
【図３Ｆ】
0006791756.tif 000022
【図４Ａ】
0006791756.tif 000023
【図４Ｂ】
0006791756.tif 000024
【図５Ａ】
0006791756.tif 000025
【図５Ｂ】
0006791756.tif 000026
【図５Ｃ】
0006791756.tif 000027
【図６Ａ】
0006791756.tif 000028
【図６Ｂ】
0006791756.tif 000029
【図６Ｃ】
0006791756.tif 000030
【図６Ｄ】
0006791756.tif 000031
【図７Ａ】
0006791756.tif 000032
【図７Ｂ】
0006791756.tif 000033
【図７Ｃ】
0006791756.tif 000034
【図７Ｄ】
0006791756.tif 000035
【図７Ｅ】
0006791756.tif 000036
【図８Ａ】
0006791756.tif 000037
【図８Ｂ】
0006791756.tif 000038
【図８Ｃ】
0006791756.tif 000039
【図９Ａ】
0006791756.tif 000040
【図９Ｂ】
0006791756.tif 000041
【図１０Ａ】
0006791756.tif 000042
【図１０Ｂ】
0006791756.tif 000043
【図１１Ａ】
0006791756.tif 000044
【図１１Ｂ】
0006791756.tif 000045
【図１１Ｃ】
0006791756.tif 000046