(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
非小細胞肺ガン（ＮＳＣＬＣ）を患っている被験体の生存時間を予測するための方法であって、
ｉ）該被験体から得られた腫瘍組織サンプルにおける制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞の密度を定量する工程、
ｉｉ）前記腫瘍組織サンプルにおけるＴＬＳ−成熟ＤＣ又はＴＬＳ−Ｂ細胞又はＴｃｏｎｖ細胞又はＣＤ８＋Ｔ細胞又はＣＤ８＋Ｇｒａｎ−Ｂ＋Ｔ細胞からなる群より選択される免疫細胞の１つのさらなる集団の密度を定量する工程、
ｉｉｉ）工程ｉ）及びｉｉ）において定量した密度と、それらの対応する所定の基準値とを比較する工程、並びに
ｉｖ）Ｔｒｅｇ細胞の密度がその対応する所定の基準値よりも高く、免疫細胞のさらなる集団の密度がその対応する所定の基準値よりも低い場合には、該被験体が短い生存時間を有すると結論するか、又はＴｒｅｇ細胞の密度がその対応する所定の基準値よりも低く、免疫細胞のさらなる集団の密度がその対応する所定の基準値よりも高い場合には、該被験体が長い生存時間を有すると結論する工程
を含む、方法。
【請求項２】
それぞれ工程ｉ）及びｉｉ）において、制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞の密度及びＴＬＳ−成熟ＤＣの密度を定量する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
それぞれ工程ｉ）及びｉｉ）において、制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞の密度及びＴＬＳ−Ｂ細胞の密度を定量する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
それぞれ工程ｉ）及びｉｉ）において、制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞の密度及びＴｃｏｎｖ細胞の密度を定量する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
それぞれ工程ｉ）及びｉｉ）において、制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞の密度及びＣＤ８＋Ｔ細胞の密度を定量する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
それぞれ工程ｉ）及びｉｉ）において、制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞の密度及びＣＤ８＋グランザイム−Ｂ＋Ｔ細胞の密度を定量する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ＩＨＣによって密度の定量を決定する、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、肺ガンを患っている患者の生存時間を予測するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景：
Dieu-Nosjean et al. (J Clin Oncol 26:4410-4417. 2008)に示されているように、肺ガンは、世界で最も一般的なガン関連死の原因である。症例の約８０％〜９０％は、腺ガン及び扁平上皮細胞ガンを含む非小細胞肺ガン（ＮＳＣＬＣ）を伴う。その腫瘍を完全に切除し得る患者のみが、生存増加の有意な可能性を有する。しかしながら、ステージＩの疾患を有する患者の３０％もの数が、術後に再発を経験する。腫瘍浸潤免疫細胞と、肺ガンを有する患者の予後との間の相関関係は議論の余地がある。腫瘍は、不均一なネットワークを形成して複雑な相互作用を示す悪性細胞、間質細胞、内皮細胞及び免疫細胞から構成される。多くの場合、免疫系による腫瘍根絶は非効率であるが、多くの発達中のガンは免疫系から無視されないという証拠がある。自己免疫の発現と同時に起こる自然腫瘍退縮と、免疫抑制患者におけるより高い腫瘍発生率とは、腫瘍拒絶における免疫系の関与を示すものである。免疫機能欠損マウスは、自然に腫瘍を発達させる。細胞傷害性表現型及び記憶表現型を有する腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の密度は、多くの固形腫瘍における臨床転帰良好をよく予測するものである。
【０００３】
免疫応答が二次リンパ器官から離れた場所（すなわち、三次リンパ系構造（ＴＬＳ））において起こり得ることは、今日では十分に立証されている。Dieu-Nosjeanらは、肺ガン患者では、これらのリンパ節様構造が発達し得ることを観察した。それらは、ＮＳＣＬＣ患者の非腫瘍組織では全く見られなかったので、「腫瘍誘導性気管支関連リンパ組織（Tumor-induced Bronchus-Associated Lymphoid Tissues）」（Ｔｉ−ＢＡＬＴ）と当初は命名された。今日では、最新の用語は、「三次リンパ系構造（ＴＬＳ）」又は「三次リンパ系器官（ＴＬＯ）」である。Dieu-Nosjeanらは、ＴＬＳ中に選択的に検出された集団である成熟ＤＣの密度が、初期ＮＳＣＬＣを有する患者における（Dieu-Nosjean et al., J. Clin. Oncol., 2008）及び転移期（Remark et al., Clin Cancer Res. 2013 Jun 19）における臨床転帰良好に関連することを実証したが、これは、肺ガン関連ＴＬＳが、腫瘍特異的Ｔ細胞の活性化部位に相当することを示唆している。
【０００４】
より最近では、Dieu-Nosjeanのチームはまた、ＴＬＳにおける高密度のＢ細胞（「ＴＬＳ−Ｂ細胞」又は「濾胞性Ｂ細胞」と命名された）が、ＴＬＳにおける進行中の体液性免疫応答にしたがって、初期及び進行期ＮＳＣＬＣを有する患者の長い生存と相関することを実証している（Germain et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med., 2014）。ＴＬＳ−Ｂ細胞とＴＬＳ成熟ＤＣとの組み合わせは、最良の臨床転帰を有するＮＳＣＬＣ患者の同定を可能にした。また、ＴＬＳでは、胚中心Ｂ細胞の密度もまた、内因性腫瘍関連抗原に対する抗体を分泌し得る形質細胞の密度と相関する。これらのデータは、ＴＬＳが、肺ガン患者における体液性免疫応答を促進することによって、腫瘍に対して保護的な役割を果たすことを強く示唆している（Germain et al., Frontiers Immunol., 2015）。
【０００５】
限定されないが、結腸直腸ガン(Coppola et al., Am J Pathol., 2011;179(1):37-45 ; McMullen et al., Clin Exp Immunol. 2010;161(1):81-8 ;)、乳ガン(Gobert et al., Cancer Res 2009; 69(5) 2000-2009; Martinet et al., Cancer Res. 2011;71(17) 5678-87 ; Gu-Trantien et al., J Clin Invest. 2013 ;123(7) :2873-92)及びメラノーマ(Martinet et al., Cancer Res. 2011;71(17) 5678-87 ; Cipponi et al., Cancer Res. 2012;72(16):3997-4007)を含む他のヒト腫瘍においてＴＬＳの存在が報告されており、これは、多くの固形腫瘍において、異所性リンパ系構造が生じることを示している（Dieu-Nosjean et al., Trends Immunol., 2014）。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、肺ガンを患っている患者の生存時間を予測するための方法に関する。特に、本発明は、特許請求の範囲によって定義される。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
発明の詳細な説明
本発明の第１の目的は、肺ガンを患っている被験体の生存時間を予測するための方法であって、ｉ）該被験体から得られた腫瘍組織サンプルにおける制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞の密度を定量する工程、ｉｉ）前記腫瘍組織サンプルにおけるＴＬＳ−成熟ＤＣ又はＴＬＳ−Ｂ細胞又はＣＤ３＋Ｔｃｏｎｖ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞又はＣＤ８＋グランザイム−Ｂ＋Ｔ細胞からなる群より選択される免疫細胞の１つのさらなる集団の密度を定量する工程、ｉｉｉ）工程ｉ）及びｉｉ）において定量した密度と、それらの対応する所定の基準値とを比較する工程、並びにｉｖ）Ｔｒｅｇ細胞の密度がその対応する所定の基準値よりも高く、免疫細胞のさらなる集団の密度がその対応する所定の基準値よりも低い場合には、該被験体が短い生存時間を有すると結論するか、又はＴｒｅｇ細胞の密度がその対応する所定の基準値よりも低く、免疫細胞のさらなる集団の密度がその対応する所定の基準値よりも高い場合には、該被験体が長い生存時間を有すると結論する工程を含む方法に関する。
【０００８】
本明細書で使用される用語「肺ガン」は、限定されないが、肺ガン腫、転移性肺ガン、例えば肺腺ガン、扁平上皮細胞ガンのような非小細胞肺ガン（ＮＳＣＬＣ）又は小細胞肺ガン（ＳＣＬＣ）のような全ての進行期の全ての種類の肺ガンを含む。いくつかの実施態様では、被験体は、非小細胞肺ガン（ＮＳＣＬＣ）を患っている。
【０００９】
前記方法は、ガン被験体の全生存（ＯＳ）、無増悪生存（ＰＦＳ）及び／又は無病生存（ＤＦＳ）の期間を予測するために特に適切である。当業者であれば、ＯＳ生存時間は、一般に、特定の種類のガンから特定の時間克服した者の割合に基づくものであり、前記割合として表されることを認識するであろう。ガン統計は、多くの場合、５年全生存率を使用する。一般に、ＯＳ率は、ガン克服者が５年時点で依然として処置を受けているか否か、又は彼らが無ガン状態になった（寛解を達成した）かを規定していない。ＤＳＦは、より具体的な情報を与えるものであり、特定のガンを有する者であって、寛解を達成している者の数である。また、無増悪生存（ＰＦＳ）率（依然としてガンを有するが、疾患が進行していない者の数）は、処置がいくらか成功した可能性があるが、ガンが完全に消失していない者を含む。本明細書で使用される表現「短い生存時間」は、被験体が、前記ガンを患っている被験体の一般集団において観察される中央値（又は平均値）よりも短い生存時間を有することを示す。被験体が短い生存時間を有する場合、それは、被験体が「予後不良」を有することを意味する。反対に、表現「長い生存時間」は、被験体が、前記ガンを患っている被験体の一般集団において観察される中央値（又は平均値）よりも長い生存時間を有することを示す。被験体が長い生存時間を有する場合、それは、被験体が「予後良好」を有することを意味する。
【００１０】
本明細書で使用される用語「腫瘍組織サンプル」は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、摘出されている組織片又は組織切片（外科的腫瘍切除後を含む）を包含する。細胞密度を決定する前に、腫瘍組織サンプルは、様々な周知の採取後調製保存技術（例えば、固定、貯蔵、凍結など）に供され得る。典型的には、腫瘍組織サンプルをホルマリンで固定し、パラフィン（ワックス）又はエポキシなどのリジッドな固定液に包埋し、これを金型に入れ、その後に硬化させて、容易に切断される塊を生産する。次いで、ミクロトームを使用して材料の薄切片を調製し、ガラススライド上に置き、例えば、（染色スライドを得るためのＩＨＣ自動機器、例えばBenchMark（登録商標）XT又はAutostainer Dakoを使用した）免疫組織化学（ＩＨＣ）に付す。
【００１１】
本明細書で使用される用語「腫瘍誘導性リンパ系構造」は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、腫瘍塊の間質における、リンパ節様構造（ＴＬＳ又はＴＬＯとも称される）への腫瘍浸潤白血球の組織化を指し、成熟ＤＣ−Ｔ細胞クラスタ（Ｔ細胞領域）及びＢ細胞濾胞（Ｂ細胞領域）から構成される。典型的には、腫瘍切片に応じて、２つの領域の一方のみ又は両方の領域が観察され得る。この組織化は、肺ガンにおけるＴｉ−ＢＡＬＴ（腫瘍誘導性気管支関連リンパ組織（Tumor-induced Bronchus-Associated Lymphoid Tissues））と称された（Dieu-Nosjean et al., J. Clin. Oncol., 2008）。
【００１２】
本明細書で使用される用語「制御性Ｔ細胞」又は「Ｔｒｅｇ細胞」は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、それが発現するＴＣＲによってインプリントされた所定の抗原特異性を備えるＴヘルパー細胞のサブセットであって、従来型Ｔリンパ球又は他の免疫細胞の応答を抑制する能力によって定義される調節特性を有するＴヘルパー細胞のサブセットを指す。このような応答は当技術分野で公知であり、限定されないが、抗原提示ターゲット細胞に対する細胞傷害活性及び異なるサイトカインの分泌が挙げられる。異なる種類のＴｒｅｇ細胞が存在し、限定されないが、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋／高、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋／高ＣＤ１２７−／低などの異なる表現型を単独で、又は限定されないが、ＦｏｘＰ３、ニューロピリン−１（ＣＤ３０４）、グルココルチコイド誘導性ＴＮＦＲ関連タンパク質（ＧＩＴＲ）、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ−４、ＣＤ１５２）を含むさらなるマーカーと組み合わせて特徴とする誘導性及び胸腺由来Ｔｒｅｇ細胞が挙げられる。典型的には、本発明のＴｒｅｇ細胞は、ＣＤ３＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞である。典型的には、Ｔｒｅｇ細胞の密度は、いくつかの腫瘍領域：腫瘍全体、ＴＬＳ及び非ＴＬＳ領域で測定され得る。
【００１３】
本明細書で使用される用語「ＴＬＳ成熟樹状細胞」又は「ＴＬＳ成熟ＤＣ」又は「成熟ＤＣ」は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、プロセシングされた抗原をＴ細胞に提示することを専門にする細胞の集団を指す。腫瘍に浸潤する成熟樹状細胞は、腫瘍誘導性リンパ系構造のＴ細胞リッチ領域において、Ｔ細胞と接触した状態で選択的に存在する。典型的には、成熟ＤＣは、それらの細胞表面におけるマーカー、例えばＤＣ−ＬＡＭＰ（すなわち、ＣＤ２０８）の古典的な発現を特徴とする。典型的には、本発明の樹状細胞は、ＤＣ−ＬＡＭＰ＋成熟ＤＣである。
【００１４】
本明細書で使用される用語「濾胞性Ｂ細胞」又は「ＴＬＳ−Ｂ細胞」は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、ＴＬＳのＢ細胞濾胞にクラスタリングされるＢ細胞サブセットを指す。それらは主に、ナイーブ及び胚中心表現型のものである。
【００１５】
本明細書で使用される用語「従来型Ｔ細胞」又は「Ｔｃｏｎｖ  Ｔ細胞」は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、Ｔｒｅｇ細胞を除くＣＤ３＋Ｔ細胞（ＣＤ４＋細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞を含む）を指す。それらは、ＣＤ３の発現及びＦｏｘＰ３の無発現／低発現によって定義される（ＣＤ３＋ＦｏｘＰ３−細胞）。いくつかの実施態様では、Ｔｃｏｎｖ細胞は、ＣＤ３＋Ｔ細胞である。
【００１６】
本明細書で使用される用語「ＣＤ８＋グランザイム−Ｂ＋Ｔ細胞」又は「ＣＤ８＋Ｇｒａｎ−Ｂ＋Ｔ細胞」は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、細胞溶解分子グランザイムＢを発現するＣＤ８＋ＣＤ３＋Ｔ細胞のサブセットであって、グランザイムＢ依存的にターゲット細胞を殺傷する能力を有するＣＤ８＋ＣＤ３＋Ｔ細胞のサブセットを指す。それらは、エフェクター表現型のものである。
【００１７】
いくつかの実施態様では、それぞれ工程ｉ）及びｉｉ）において、制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞の密度及びＴＬＳ−成熟ＤＣの密度を定量する。
【００１８】
いくつかの実施態様では、それぞれ工程ｉ）及びｉｉ）において、制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞の密度及びＴＬＳ−Ｂ細胞の密度を定量する。
【００１９】
いくつかの実施態様では、それぞれ工程ｉ）及びｉｉ）において、制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞の密度及びＴｃｏｎｖ細胞の密度を定量する。
【００２０】
いくつかの実施態様では、それぞれ工程ｉ）及びｉｉ）において、制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞の密度及びＣＤ８＋Ｔ細胞の密度を定量する。
【００２１】
いくつかの実施態様では、それぞれ工程ｉ）及びｉｉ）において、制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞の密度及びＣＤ８＋Ｇｒａｎ−Ｂ＋Ｔ細胞の密度を定量する。
【００２２】
いくつかの実施態様では、ＩＨＣによって密度の定量を決定する。
【００２３】
例えば、腫瘍組織サンプルと、前記細胞の細胞マーカーに特異的な結合パートナー（例えば、抗体）とを接触させることによって、Ｔｒｅｇ細胞の密度の定量を実施する。典型的には、組織腫瘍組織サンプルと、それぞれＦｏｘＰ３（核内マーカー）及びＣＤ３（細胞表面マーカー）に特異的な両方の結合パートナー（例えば、抗体）とを接触させることによって、Ｔｒｅｇ細胞の密度の定量を実施する。
【００２４】
例えば、腫瘍組織サンプルと、前記細胞の細胞質内細胞マーカーに特異的な結合パートナー（例えば、抗体）とを接触させることによって、ＴＬＳ−成熟ＤＣの密度の定量を実施する。典型的には、組織腫瘍組織サンプルと、ＤＣ−ＬＡＭＰ（ＣＤ２０８、ドット染色）に特異的な結合パートナー（例えば、抗体）とを接触させることによって、ＴＬＳ−成熟ＤＣの密度の定量を実施する。
【００２５】
例えば、腫瘍組織サンプルと、前記細胞の細胞表面マーカーに特異的な結合パートナー（例えば、抗体）とを接触させることによって、ＴＬＳ−Ｂ細胞の密度の定量を実施する。典型的には、腫瘍組織サンプルと、ＣＤ２０に特異的な結合パートナー（例えば、抗体）とを接触させることによって、ＴＬＳ−Ｂ細胞の密度の定量を実施する。
【００２６】
例えば、腫瘍組織サンプルと、Ｔｒｅｇ細胞を除く前記細胞の細胞マーカーに特異的な結合パートナー（例えば、抗体）とを接触させることによって、Ｔｃｏｎｖ細胞の密度の定量を実施する。典型的には、腫瘍組織サンプルと、それぞれＣＤ３（細胞表面マーカー）及びＦｏｘＰ３（核内マーカー）に特異的な両方の結合パートナー（例えば、抗体）とを接触させることによって、Ｔｃｏｎｖ細胞（ＣＤ３＋ＦｏｘＰ３−）の密度の定量を実施する。
【００２７】
例えば、腫瘍組織サンプルと、前記細胞の細胞表面マーカーに特異的な結合パートナー（例えば、抗体）とを接触させることによって、ＣＤ８＋Ｔ細胞の密度の定量を実施する。典型的には、腫瘍組織サンプルと、ＣＤ８に特異的な結合パートナー（例えば、抗体）とを接触させることによって、ＣＤ８＋Ｔ細胞の密度の定量を実施する。
【００２８】
例えば、腫瘍組織サンプルと、前記細胞の細胞マーカーに特異的な結合パートナー（例えば、抗体）とを接触させることによって、ＣＤ８＋Ｇｒａｎ−Ｂ＋細胞の密度の定量を実施する。典型的には、腫瘍組織サンプルと、それぞれＣＤ８（細胞表面マーカー）及びグランザイム−Ｂ（細胞質内マーカー）に特異的な両方の結合パートナー（例えば、抗体）とを接触させることによって、ＣＤ８＋Ｇｒａｎ−Ｂ＋細胞の密度の定量を実施する。
【００２９】
典型的には、Ｔｒｅｇ細胞又はＴＬＳ−成熟ＤＣ又はＴｃｏｎｖ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞又はＣＤ８＋Ｇｒａｎ−Ｂ＋Ｔ細胞の密度は、組織サンプルの表面積１単位当たりで計数されたこれらの細胞の数（例えば、腫瘍組織サンプルの表面積１mm2当たりで計数された細胞の数）として表される。いくつかの実施態様では、細胞の密度はまた、全細胞（１００％に設定）当たりの特定細胞の割合からなり得る。ＴＬＳ−Ｂ細胞は、ＴＬＳのＢ細胞濾胞において細胞凝集体に組織化されるので、ＴＬＳ−Ｂ細胞の密度は、腫瘍の表面積１単位当たりのＢ細胞濾胞の総表面として（例えば、中倍率視野（元の倍率の１００倍）１mm2又は腫瘍の表面積１mm2当たりのＢ細胞濾胞の表面積として）測定され得る。
【００３０】
免疫組織化学は、典型的には、以下ｉ）腫瘍組織サンプルをホルマリンで固定する工程、ｉｉ）前記腫瘍組織サンプルをパラフィンに包埋する工程、ｉｉｉ）染色のために、前記腫瘍組織サンプルを切片に切断する工程、ｉｖ）マーカーに特異的な結合パートナーと共に前記切片をインキュベーションする工程、ｖ）前記切片をリンスする工程、ｖｉ）典型的にはビオチン化された二次抗体と共に前記切片をインキュベーションする工程、及びｖｉｉ）典型的にはアビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ複合体を用いて、抗原−抗体複合体を可視化する工程を含む。したがって、最初に、結合パートナーと共に腫瘍組織サンプルをインキュベーションする。洗浄後、目的のマーカーに結合した標識抗体を、標識抗体が有する標識の種類、例えば放射性標識、蛍光標識又は酵素標識に応じて、適切な技術によって可視化する。多重標識を同時に実施し得る。あるいは、本発明の方法は、（染色シグナルを強化するための）増幅系及び酵素分子にカップリングされた二次抗体を使用し得る。このようなカップリング二次抗体は、例えばDako, EnVision systemから市販されている。対比染色、例えばエマトキシリン及びエオシン、ＤＡＰＩ、ヘキストを使用し得る。当業者に明らかであるように、自動システム、半自動システム又は手動システムを含む任意の適切な方法又はシステムを使用して、他の染色方法を達成し得る。例えば、１つ以上の標識を抗体に付着させ、それにより、ターゲットタンパク質（すなわち、マーカー）の検出を可能にし得る。例示的な標識としては、放射性同位体、フルオロフォア、リガンド、化学発光剤、酵素及びそれらの組み合わせが挙げられる。いくつかの実施態様では、標識は、量子ドットである。一次及び／又は二次アフィニティーリガンドにコンジュゲートされ得る標識の非限定的な例としては、蛍光色素又は金属（例えば、フルオレセイン、ローダミン、フィコエリトリン、フルオレサミン）、発色色素（例えば、ロドプシン）、化学発光化合物（例えば、ルミノール、イミダゾール）及び生物発光タンパク質（例えば、ルシフェリン、ルシフェラーゼ）、ハプテン（例えば、ビオチン）が挙げられる。様々な他の有用な蛍光剤及び発色団が、Stryer L (1968) Science 162:526-533及びBrand L and Gohlke J R (1972) Annu. Rev. Biochem. 41:843-868に記載されている。アフィニティーリガンドはまた、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ラクタマーゼ）、放射性同位体（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ又は１２５Ｉ）及び粒子（例えば、金）で標識され得る。様々な化学反応、例えばアミン反応又はチオール反応を使用して、異なる種類の標識がアフィニティーリガンドにコンジュゲートされ得る。しかしながら、アミン及びチオール以外の反応基、例えばアルデヒド、カルボン酸及びグルタミンが使用され得る。目的のタンパク質を検出するために、様々な酵素染色方法が当技術分野で公知である。例えば、酵素相互作用は、異なる酵素、例えばペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ又は異なる色素原、例えばＤＡＢ、ＡＥＣ若しくはＦａｓｔ  Ｒｅｄを使用して視覚化され得る。他の例では、抗体は、標識結合パートナー又は抗体を介して検出され得るペプチド又はタンパク質にコンジュゲートされ得る。間接ＩＨＣアッセイでは、第１の結合パートナーは標識されないので、その結合を検出するために、二次抗体又は第２の結合パートナーが必要である。得られた染色標本は、検出可能なシグナルを表示し、画像（例えば、染色のデジタル画像）を取得するためのシステムを使用してそれぞれイメージングされる。画像取得のための方法は、当業者に周知である。例えば、サンプルを染色したら、任意の光学イメージングデバイス又は非光学イメージングデバイス、例えば正立光学顕微鏡又は倒立光学顕微鏡、走査型共焦点顕微鏡、カメラ、走査型電子顕微鏡又はトンネル型電子顕微鏡、走査型プローブ顕微鏡及びイメージング赤外検出器などを使用して、染色又はバイオマーカー標識を検出し得る。いくつかの例では、画像をデジタル的にキャプチャし得る。次いで、得られた画像を使用して、サンプルにおけるマーカーの量、又は目的のマーカー（maker）について陽性の細胞の絶対数、又は目的のマーカー（maker）について陽性の細胞の表面を定量的に又は半定量的に決定し得る。ＩＨＣと共に使用するために適切な様々な自動サンプル処理システム、スキャニングシステム及び分析システムが当技術分野で利用可能である。このようなシステムは、自動染色及び顕微鏡走査、コンピューター画像分析、連続切片比較（サンプルの方向及びサイズの変動をコントロールするため）、デジタル報告作成、並びにサンプルのアーカイビング及びトラッキング（例えば、組織切片が配置されたスライド）を含み得る。従来の光学顕微鏡とデジタル画像処理システムとを組み合わせて、免疫染色サンプルを含む細胞及び組織の定量分析を実施する細胞イメージングシステムが市販されている。例えば、CAS-200 system (Becton, Dickinson & Co.)を参照のこと。特に、検出は手動で行われ得るか、又はコンピュータプロセッサ及びソフトウェアを伴う画像処理技術によって行われ得る。このようなソフトウェアを使用して、例えば、画像は、当業者に公知の手順を使用して、例えば染色品質又は染色強度を含む因子に基づいて、構成、較正、正規化及び／又は検証され得る（例えば、公開された米国特許出願公開第２０１００１３６５４９号を参照のこと）。画像は、定量的又は半定量的に分析され、サンプルの染色強度に基づいてスコアリングされ得る。定量的又は半定量的な組織化学は、組織化学を受けたサンプルをスキャニング及びスコアリングして、特定のバイオマーカー（すなわち、マーカー）の存在を同定及び定量する方法を指す。定量的又は半定量的な方法は、染色密度若しくは染色量を検出するためのイメージングソフトウェア、又は人間の目によって染色を検出する方法であって、熟練操作者が結果を数値的にランキングする方法を用い得る。例えば、画像は、ピクセルカウントアルゴリズム及び組織認識パターン（例えば、Aperio Spectrum Software、Automated QUantitatative Analysis platform (AQUA（登録商標）platform)又はIlastic及びCalopix softwareを備えるTribvn）及び染色の程度を測定又は定量又は半定量する他の標準的な方法を使用して定量的に分析され得る；例えば、米国特許第８，０２３，７１４号；米国特許第７，２５７，２６８号；米国特許第７，２１９，０１６号；米国特許第７，６４６，９０５号；公開され��米国特許出願公開第２０１００１３６５４９号及び米国特許出願公開第２０１１０１１１４３５号；Camp et al. (2002) Nature Medicine, 8:1323-1327; Bacus et al. (1997) Analyt Quant Cytol Histol, 19:316-328)を参照のこと。強い陽性染色（例えば、褐色染色）と総染色面積の合計との比が計算及びスコアリングされ得る。検出されたバイオマーカー（すなわち、マーカー）の量は定量され、陽性ピクセル及び／又はスコアの割合として示される。例えば、量は、陽性ピクセルの割合として定量され得る。いくつかの例では、量は、染色面積の割合、例えば陽性ピクセルの割合として定量される。例えば、サンプルは、総染色面積と比較して、少なくとも又は約少なくとも又は約０、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又はそれ以上の陽性ピクセルを有し得る。例えば、量は、目的のマーカー（maker）について陽性の細胞の絶対数として定量され得る。いくつかの実施態様では、サンプルの組織化学染色の強度又は量の数値表示であり、サンプル中に存在するターゲットバイオマーカー（例えば、マーカー）の量を表すスコアがサンプルに与えられる。光学密度又は面積率の値は、スケーリングされたスコア、例えば整数スケールで示され得る。したがって、いくつかの実施態様では、本発明の方法は、ｉ）マーカーと選択的に相互作用することができる結合パートナー（例えば、上記抗体）を使用することによって、自動スライド染色システムによって得られた組織切片の１つ以上の免疫染色片を提供すること、ｉｉ）高解像度スキャンキャプチャによって、工程ｉ）のスライドのデジタル化を進めること、ｉｉｉ）デジタル画像上で組織切片を検出すること、ｉｖ）同じ表面を有する等分布単位のサイズ基準グリッドであって、分析すべき組織切片のサイズに適合されたサイズ基準グリッドを提供すること、並びにｖ）各ユニットにおける染色細胞の強度又は絶対数を検出、定量及び測定し、それにより、各ユニットの染色細胞の数又は密度を評価することからなる工程を含む。
【００３１】
典型的には、所定の基準値は、閾値又はカットオフ値である。典型的には、「閾値」又は「カットオフ値」は、実験的に、経験的に又は理論的に決定され得る。当業者によって認識されるように、閾値はまた、既存の実験条件及び／又は臨床条件に基づいて任意に選択され得る。例えば、適切に保存された歴史的被験体サンプルにおける細胞密度のレトロスペクティブ測定は、所定の基準値を確立する際に使用され得る。閾値は、試験の機能及びベネフィット／リスクバランス（偽陽性及び偽陰性の臨床結果）に応じて最適な感度及び特異性を得るために決定されなければならない。典型的には、最適な感度及び特異性（及びそれ故に閾値）は、実験データに基づいて受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を使用して決定され得る。例えば、参照群における細胞密度を定量した後、試験すべきサンプルにおける測定密度の統計処理のためにアルゴリズム的分析を使用して、サンプル分類のための有意性を有する分類基準を得ることができる。ＲＯＣ曲線の正式名称は受信者動作特性曲線であり、受信者操作特性曲線としても公知である。それは、臨床生化学診断検査に主に使用される。ＲＯＣ曲線は、真陽性率（感度）及び偽陽性率（１−特異性）の連続変数を反映する包括的な指標である。それは、画像合成法を用いて、感度と特異性の間の関係を明らかにする。一連の異なるカットオフ値（閾値又は臨界値、すなわち、診断検査の正常結果と異常結果との間の境界値）を、一連の感度及び特異性の値を計算するための連続変数として設定する。次いで、感度を垂直座標として使用し、特異性を水平座標として使用して曲線を描写する。曲線下面積（ＡＵＣ）が多いほど、診断の正確性が高い。ＲＯＣ曲線上では、座標図の左上端に最も近い点は、高感度の値及び高特異性の値の両方を有する臨界点である。ＲＯＣ曲線のＡＵＣ値は、１．０〜０．５である。ＡＵＣ＞０．５である場合、ＡＵＣが１に近づくにつれて、診断結果は良好になる。ＡＵＣが０．５〜０．７である場合、正確性は低い。ＡＵＣが０．７〜０．９である場合、正確性は中程度である。ＡＵＣが０．９よりも高い場合、正確性は非常に高い。このアルゴリズム的方法は、好ましくは、コンピューターを用いて行われる。当技術分野における既存のソフトウェア又はシステム、例えば：MedCalc 9.2.0.1医療統計ソフトウェア、SPSS 9.0、ROCPOWER.SAS、DESIGNROC.FOR、MULTIREADER POWER.SAS、CREATE-ROC.SAS、GB STAT VI0.0 (Dynamic Microsystems, Inc. Silver Spring, Md., USA)が、ＲＯＣ曲線の描写に使用され得る。
【００３２】
いくつかの実施態様では、所定の基準値は、
ａ）肺ガンを患っている被験体由来の腫瘍組織サンプルのコレクションを提供する工程；
ｂ）工程ａ）において提供した各腫瘍組織サンプルについて、対応する被験体の実際の臨床転帰に関する情報（すなわち、無病生存（ＤＦＳ）及び／又は全生存（ＯＳ）の期間）を提供する工程；
ｃ）一連の任意の定量値を提供する工程；
ｄ）工程ａ）において提供したコレクションに含まれる各腫瘍組織サンプルの細胞密度を定量する工程；
ｅ）工程ｃ）において提供した１つの特定の任意の定量値について、前記腫瘍組織サンプルを２つの群（（ｉ）前記一連の定量値に含まれる前記任意の定量値よりも低いレベルで定量値を示す腫瘍組織サンプルを含む第１の群；（ｉｉ）前記一連の定量値に含まれる前記任意の定量値よりも高い前記レベルについての定量値を示す腫瘍組織サンプルを含む第２の群）にそれぞれ分類し、それにより、前記特定の定量値について、２つの腫瘍組織サンプル群を得、各群の腫瘍組織サンプルを別々に計数する工程；
ｆ）（ｉ）工程ｅ）において得た定量値と（ｉｉ）工程ｆ）において定義した第１の群及び第２の群に含まれる腫瘍組織サンプルが由来する被験体の実際の臨床転帰との間の統計的有意性を計算する工程；
ｇ）工程ｄ）において提供したあらゆる任意の定量値を試験するまで、工程ｆ）及びｇ）を反復する工程；
ｈ）前記所定の基準値を、工程ｇ）において最も高い統計的有意性（ログランク検定で得られた最も有意なＰ値、Ｐ＜０．０５の場合に有意）が計算された任意の定量値からなるように設定する工程
を含む方法を行うことによって決定され得る。
【００３３】
例えば、被験体１００人の腫瘍組織サンプル１００個について、細胞密度が評価されている。細胞密度にしたがって、サンプル１００個をランキングする。サンプル１は最も高い密度を有し、サンプル１００は最も低い密度を有する。第１のグルーピングは、２つのサブセット（一方ではサンプルＮｒ１及び他方では他のサンプル９９個）を提供する。最後のグルーピング（一方ではサンプル１〜９９及び他方ではサンプルＮｒ１００）まで、次のグルーピングは、一方ではサンプル１及び２を提供し、他方では残りのサンプル９８個などを提供する。対応するガン被験体の実際の臨床転帰に関する情報にしたがって、２つのサブセットの各９９群について、カプラン・マイヤー曲線を作成する。また、各９９群について、両サブセット間のｐ値を計算した（ログランク検定）。次いで、最小Ｐ値の基準に基づく識別が最も強くなるように、所定の基準値を選択する。換言すれば、Ｐ値が最小である両サブセット間の境界に対応する細胞密度を、所定の基準値として見なす。所定の基準値は、必ずしも細胞密度の中央値ではないことに留意すべきである。したがって、いくつかの実施態様では、所定の基準値は、被験体のＤＦＳ及びＯＳに関して、予後不良と予後良好との間の識別を可能にする。実際、高い統計的有意値（例えば、低いＰ値）は、一般に、単一の任意の定量値についてだけではなく、一定範囲の連続する任意の定量値について得られる。したがって、本発明の代替的な一実施態様では、明確な所定の基準値を使用する代わりに、一定範囲の値を提供する。したがって、最小の統計的有意値（有意性の最小閾値、例えば最大閾値のＰ値）を任意に設定し、工程ｇ）において計算された統計的有意値がより高い（より有意である、例えば、より低いＰ値）一定範囲の複数の任意の定量値を保持し、一定範囲の定量値が提供される。この範囲の定量値は、上記「カットオフ」値を含む。例えば、「カットオフ」値のこの特定の実施態様によれば、転帰は、細胞密度と、特定された値域とを比較することによって決定され得る。したがって、いくつかの実施態様では、カットオフ値は、例えば、最高の統計的有意値が見られる定量値（例えば、一般に、見られる最小Ｐ値）を中心とする一定範囲の定量値からなる。
【００３４】
いくつかの実施態様では、本発明の方法は、以下のように、２つの群における各細胞密度について測定された定量値の分類を含む比較工程を含む：（ｉ）細胞密度の定量値が、対応する所定の基準値よりも高い場合、第１の群は「Ｈｉ」と称され、（ｉｉ）細胞密度の定量値が、対応する所定の基準値よりも低い場合、第２の群は「Ｌｏ」と称される。それは、例から、比較工程の結果が、Ｔｒｅｇ細胞に関する「Ｈｉ（高）」値と、免疫細胞の１つのさらなる集団に関する「Ｌｏ（低）」値とからなる場合、予後不良が提供される。反対に、比較工程の結果が、Ｔｒｅｇ細胞に関する「Ｌｏ」値と、免疫細胞の１つのさらなる集団に関する「Ｈｉ」値とからなる場合、予後良好が提供される。Ｔｒｅｇ細胞の密度と、免疫細胞のさらなる集団の密度との複合であるスコアは、以下の表にしたがって計算され得る。
【表１】
0006791951.tif 000002
【００３５】
いくつかの実施態様では、本発明の方法は、患者が処置、特に免疫療法剤に適格であるか否かを決定するために適切である。例えば、患者が予後不良を有すると結論された場合、医師は、処置を患者に投与する選択をとり得る。典型的には、処置としては、化学療法、放射線療法及び免疫療法が挙げられる。
【００３６】
いくつかの実施態様では、被験体は、化学療法剤を投与される。用語「化学療法剤」は、腫瘍成長の阻害において有効な化合物を指す。化学療法剤の例としては、アルキル化剤、例えばチオテパ及びシクロホスファミド；アルキルスルホナート、例えばブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファン；アジリジン、例えばベンゾドーパ、カルボクオン、メツレドーパ及びウレドーパ；エチレンイミン及びメチラメラミン（アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミド及びトリメチロメラミンを含む）；アセトゲニン（特に、ブラタシン及びブラタシノン）；カンプトセシン（合成類似体トポテカンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン、カルゼルシン及びビゼレシン合成類似体を含む）；クリプトフィシン（特に、クリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成類似体、ＫＷ−２１８９及びＣＢ１−ＴＭ１を含む）；エリュテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチイン；スポンギスタチン；ナイトロジェンマスタード、例えばクロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベンビチン、フェネステリン、プレドニマスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード；ニトロソウレア、例えばカルマスティン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチン；抗生物質、例えばエンジイン抗生物質（例えば、カリケアマイシン、特にカリケアマイシン（１１及びカリケアマイシン２１１、例えばAgnew Chem Intl. Ed. Engl. 33:183-186 (1994)を参照のこと）；ジネマイシン（ジネマイシンＡを含む）；エスペラミシン；並びにネオカルジノスタチン発色団及び関連色素タンパク質のエンジイン抗生物質発色団）、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オースラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カルミノマイシン（canninomycin）、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン（モルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシン及びデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポルフィロマイシン、ピューロマイシン、クエラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン（streptomgrin）、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；代謝拮抗物質、例えばメトトレキサート及び５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）；葉酸類似体、例えばデノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサート；プリン類似体、例えばフルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジン類似体、例えばアンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、���ノシタビン、フロキシウリジン、５−ＦＵ；アンドロゲン、例えばカルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン；抗副腎物質、例えばアミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；葉酸補充薬、例えばフロリン酸；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル；ビスアントレン；エダトレキサート；デフォファミン；デメコルシン；ジアジクオン；エルフォルニチン；酢酸エリプチニウム；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダイニン；メイタンシノイド、例えばメイタンシン及びアンサマイトシン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラエリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；PSK（登録商標）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２’，２”−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特に、Ｔ−２毒素、ベラクリンＡ、ロリジンＡ及びアングイジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えばパクリタキセル（TAXOL（登録商標）、Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.].）及びドセタキセル（TAXOTERE（登録商標）、Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France）；クロランブシル；ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；白金類似体、例えばシスプラチン及びカルボプラチン；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン；ノバントロン；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；ＣＰＴ−１  １；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸；カペシタビン；及び上記のいずれかの薬学的に許容し得る塩、酸又は誘導体が挙げられる。また、腫瘍に対するホルモン作用をレギュレーション又は阻害するように作用する抗ホルモン剤、例えば抗エストロゲン薬（例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害性４（５）−イミダゾール、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン及びトレミフェン（Ｆａｒｅｓｔｏｎ）を含む）；並びに抗アンドロゲン薬、例えばフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド及びゴセレリン；並びに上記のいずれかの薬学的に許容し得る塩、酸又は誘導体もこの定義に含まれる。
【００３７】
いくつかの実施態様では、被験体は、ターゲティングガン療法を投与される。ターゲティングガン療法は、ガンの成長、進行及び転移に関与する特定の分子（「分子ターゲット」）に干渉することによって、ガンの成長及び転移を遮断する薬物又は他の物質である。ターゲティングガン療法は、「分子ターゲティング薬物」、「分子ターゲティング療法」、「高精度医療」又は類似の名称で称されることもある。いくつかの実施態様では、ターゲティング療法は、チロシンキナーゼ阻害剤を被験体に投与することからなる。用語「チロシンキナーゼ阻害剤」は、レセプターチロシンキナーゼ及び／又は非レセプターチロシンキナーゼの選択的阻害剤又は非選択的阻害剤として作用する様々な治療剤又は薬物のいずれかを指す。チロシンキナーゼ阻害剤及び関連化合物は当技術分野で周知であり、米国特許出願公開第２００７／０２５４２９５号（これは、その全体が参照により本明細書に組み入れられる）に記載されている。当業者であれば、チロシンキナーゼ阻害剤に関連する化合物は、チロシンキナーゼ阻害剤の効果を再現するであろう（例えば、関連化合物は、チロシンキナーゼシグナル伝達経路の異なるメンバーに対して作用して、そのチロシンキナーゼのチロシンキナーゼ阻害剤と同じ効果をもたらすであろう）ことを認識するであろう。本発明の実施態様の方法において使用するために適切なチロシンキナーゼ阻害剤及び関連化合物の例として、限定されないが、ダサチニブ（ＢＭＳ−３５４８２５）、ＰＰ２、ＢＥＺ２３５、サラカチニブ、ゲフィチニブ（Iressa）、スニチニブ（Sutent；ＳＵ１１２４８）、エルロチニブ（Tarceva；ＯＳＩ−１７７４）、ラパチニブ（ＧＷ５７２０１６；ＧＷ２０１６）、カネルチニブ（ＣＩ  １０３３）、セマキシニブ（ＳＵ５４１６）、バタラニブ（ＰＴＫ７８７／ＺＫ２２２５８４）、ソラフェニブ（ＢＡＹ  ４３−９００６）、イマチニブ（Gleevec；ＳＴＩ５７１）、レフルノミド（ＳＵ１０１）、バンデタニブ（Zactima；ＺＤ６４７４）、ＭＫ−２２０６（８−［４−アミノシクロブチル）フェニル］−９−フェニル−１，２，４−トリアゾロ［３，４−ｆ］［１，６］ナフチリジン−３（２Ｈ）−オン塩酸塩）、それらの誘導体、それらの類似体及びそれらの組み合わせが挙げられる。本発明において使用するために適切なさらなるチロシンキナーゼ阻害剤及び関連化合物は、例えば、米国特許出願公開第２００７／０２５４２９５号、米国特許第５，６１８，８２９号、米国特許第５，６３９，７５７号、米国特許第５，７２８，８６８号、米国特許第５，８０４，３９６号、米国特許第６，１００，２５４号、米国特許第６，１２７，３７４号、米国特許第６，２４５，７５９号、米国特許第６，３０６，８７４号、米国特許第６，３１３，１３８号、米国特許第６，３１６，４４４号、米国特許第６，３２９，３８０号、米国特許第６，３４４，４５９号、米国特許第６，４２０，３８２号、米国特許第６，４７９，５１２号、米国特許第６，４９８，１６５号、米国特許第６，５４４，９８８号、米国特許第６，５６２，８１８号、米国特許第６，５８６，４２３号、米国特許第６，５８６，４２４号、米国特許第６，７４０，６６５号、米国特許第６，７９４，３９３��、米国特許第６，８７５，７６７号、米国特許第６，９２７，２９３号及び米国特許第６，９５８，３４０号（これらは全て、その全体が参照により本明細書に組み入れられる）に記載されている。特定の実施態様では、チロシンキナーゼ阻害剤は、経口投与されている低分子キナーゼ阻害剤であって、少なくとも１つの第Ｉ相臨床試験、より好ましくは少なくとも１つの第ＩＩ相臨床試験、さらにより好ましくは少なくとも１つの第ＩＩＩ相臨床試験の対象であり、最も好ましくは少なくとも１つの血液学的又は腫瘍学的適応についてＦＤＡによって承認されている低分子キナーゼ阻害剤である。このような阻害剤の例として、限定されないが、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ラパチニブ、カネルチニブ、ＢＭＳ−５９９６２６（ＡＣ−４８０）、ネラチニブ、ＫＲＮ−６３３、ＣＥＰ−１１９８１、イマチニブ、ニロチニブ、ダサチニブ、ＡＺＭ−４７５２７１、ＣＰ−７２４７１４、ＴＡＫ−１６５、スニチニブ、バタラニブ、ＣＰ−５４７６３２、バンデタニブ、ボスチニブ、レスタウルチニブ、タンズチニブ、ミドスタウリン、エンザスタウリン、ＡＥＥ−７８８、パゾパニブ、アキシチニブ、モテサニブ（Motasenib）、ＯＳＩ−９３０、セジラニブ、ＫＲＮ−９５１、ドビチニブ、セリシクリブ、ＳＮＳ−０３２、ＰＤ−０３３２９９１、ＭＫＣ−Ｉ（Ｒｏ−３１７４５３；Ｒ−４４０）、ソラフェニブ、ＡＢＴ−８６９、ブリバニブ（ＢＭＳ−５８２６６４）、ＳＵ−１４８１３、テラチニブ、ＳＵ−６６６８、（ＴＳＵ−６８）、Ｌ−２１６４９、ＭＬＮ−８０５４、ＡＥＷ−５４１及びＰＤ−０３２５９０１が挙げられる。
【００３８】
いくつかの実施態様では、被験体は、免疫療法剤を投与される。本明細書で使用される用語「免疫療法剤」は、ガン細胞に対する体の免疫応答を間接的若しくは直接的に増強し、刺激し若しくは増加させ、及び／又は他の抗ガン療法の副作用を減少させる化合物、組成物又は処置を指す。したがって、免疫療法は、ガン細胞に対する免疫系の応答を直接的若しくは間接的に刺激若しくは増強し、及び／又は他の抗ガン剤によって引き起こされ得る副作用を緩和する治療である。免疫療法はまた、当技術分野では免疫学的療法、生物学的療法、生物学的応答改変物質療法及び生物療法と称される。当技術分野で公知の一般的な免疫療法剤の例としては、限定されないが、サイトカイン、ガンワクチン、モノクローナル抗体及び非サイトカインアジュバントが挙げられる。あるいは、免疫療法処置は、一定量の免疫細胞（Ｔ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞、Ｂ細胞．．．）を被験体に投与することからなり得る。
【００３９】
免疫療法剤は非特異的であり得るか（すなわち、一般には、ヒトの体が、ガン細胞の成長及び／又は転移と闘う上でより有効になるように免疫系を高め得る）、又はそれらは特異的であり得（すなわち、ガン細胞それ自体にターゲティングされ得る）、免疫療法レジメンは、非特異的免疫療法剤及び特異的免疫療法剤の使用を組み合わせ得る。
【００４０】
非特異的免疫療法剤は、免疫系を刺激するか又は間接的に改善する物質である。非特異的免疫療法剤は、ガン処置の主要療法として単独で使用されており、それに加えて、非特異的免疫療法剤が他の治療（例えば、ガンワクチン）の有効性を増強するアジュバントとして機能する場合の主要療法においても使用されている。非特異的免疫療法剤はまた、この後者の状況では、他の治療の副作用（例えば、特定の化学療法剤によって誘導される骨髄抑制）を軽減するように機能し得る。非特異的免疫療法剤は、重要な免疫系細胞に対して作用し、二次応答（例えば、サイトカイン及び免疫グロブリンの産生増加）を引き起こし得る。あるいは、この薬剤は、それ自体サイトカインを含み得る。非特異的免疫療法剤は、一般に、サイトカインアジュバント又は非サイトカインアジュバントとして分類される。
【００４１】
免疫系を高めるように設計された一般的な非特異的免疫療法として、又は他の治療と共に提供されるアジュバントとして、多くのサイトカインがガンの処置において適用されている。適切なサイトカインとしては、限定されないが、インターフェロン、インターロイキン及びコロニー刺激因子が挙げられる。
【００４２】
本発明によって企図されるインターフェロン（ＩＦＮ）としては、一般的な種類のＩＦＮ、ＩＦＮ−アルファ（ＩＦＮ−α）、ＩＦＮ−ベータ（ＩＦＮ−β）及びＩＦＮ−ガンマ（ＩＦＮ−γ）が挙げられる。ＩＦＮは、例えば、ガン細胞の成長を遅延させること、挙動がより正常な細胞への発達を促進すること、並びに／又はガン細胞の抗原産生を増加させて、免疫系によるガン細胞の認識及び破壊を容易にすることによって、ガン細胞に対して直接的に作用し得る。ＩＦＮはまた、例えば、血管新生を遅延させること、免疫系を高めること、並びに／又はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｔ細胞及びマクロファージを刺激することによって、ガン細胞に対して間接的に作用し得る。リコンビナントＩＦＮ−アルファは、ロフェロン（Roche Pharmaceuticals）及びイントロンＡ（Schering Corporation）として市販されている。
【００４３】
本発明によって企図されるインターロイキンとしては、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１１及びＩＬ−１２が挙げられる。市販のリコンビナントインターロイキンの例としては、Proleukin（登録商標）(IL-2; Chiron Corporation)及びNeumega（登録商標）(IL-12; Wyeth Pharmaceuticals)が挙げられる。Zymogenetics, Inc. (Seattle, Wash.)は、現在、リコンビナント型のＩＬ−２１を試験しており、これも、本発明の組み合わせにおける使用に企図される。
【００４４】
本発明によって企図されるコロニー刺激因子（ＣＳＦ）としては、顆粒コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ又はフィルグラスチム）、顆粒マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ又はサルグラモスチム）及びエリスロポエチン（エポエチンアルファ、ダルベポエチン）が挙げられる。１つ以上の成長因子による処置は、伝統的な化学療法を受けている被験体における新たな血液細胞の生成の刺激を支援し得る。したがって、ＣＳＦによる処置は、化学療法に関連する副作用の低減において有用であり得、より高用量の化学療法剤の使用を可能にし得る。様々なリコンビナントコロニー刺激因子、例えば、Neupogen（登録商標）(Ｇ−ＣＳＦ; Amgen)、Neulasta (ペグフィルグラスチム; Amgen)、Leukine (ＧＭ−ＣＳＦ; Berlex)、Procrit (エリスロポエチン; Ortho Biotech)、Epogen (エリスロポエチン; Amgen)、Arnesp (エリスロポエチン)が市販されている。
【００４５】
特異的ターゲット又は非特異的ターゲットを有することに加えて、免疫療法剤は能動的であり得るか（すなわち、体自体の免疫応答を刺激し得る）、又はそれらは受動的であり得る（すなわち、体外に生成された免疫系成分を含み得る）。
【００４６】
受動的特異的免疫療法は、典型的には、ガン細胞において発現される特定の抗原に特異的な、又は特定の細胞成長因子に特異的な１つ以上のモノクローナル抗体の使用を伴う。モノクローナル抗体は、例えば、特定の種類のガンに対する被験体の免疫応答を増強するために、特定の細胞成長因子（例えば、血管新生に関与するもの）をターゲティングすることによって、又は化学療法剤、放射性粒子若しくは毒素などの薬剤に連結若しくはコンジュゲートされる場合には、ガン細胞への他の抗ガン剤の送達を増強することによってガン細胞の成長を妨害するために、ガンの処置において多くの方法で使用され得る。
【００４７】
いくつかの実施態様では、免疫療法剤は、免疫チェックポイント阻害剤である。本明細書で使用される用語「免疫チェックポイント阻害剤」は、１つ以上のチェックポイントタンパク質を完全に又は部分的に低減、阻害、干渉又はモデュレーションする分子を指す。チェックポイントタンパク質は、Ｔ細胞の活性化又は機能をレギュレーションする。ＣＴＬＡ−４及びそのリガンドＣＤ８０及びＣＤ８６；並びにＰＤ１とそのリガンドＰＤＬｌ及びＰＤＬ２などの多数のチェックポイントタンパク質が公知である（Pardoll, Nature Reviews Cancer 12: 252-264, 2012）。これらのタンパク質は、Ｔ細胞応答の共刺激相互作用又は阻害相互作用に関与する。免疫チェックポイントタンパク質は、自己寛容と、生理学的免疫応答の持続時間及び振幅とをレギュレーション及び維持する。免疫チェックポイント阻害剤は抗体を含むか、又は抗体に由来する。いくつかの実施態様では、免疫チェックポイント阻害剤は、抗ＣＴＬＡ４抗体（例えば、イピリムマブ）、抗ＰＤ１抗体（例えば、ニボルマブ、ペンブロリズマブ）、抗ＰＤＬ１抗体、抗ＴＩＭ３抗体、抗ＬＡＧ３抗体、抗Ｂ７Ｈ３抗体、抗Ｂ７Ｈ４抗体、抗ＢＴＬＡ抗体及び抗Ｂ７Ｈ６抗体からなる群より選択される抗体である。抗ＣＴＬＡ−４抗体の例は、米国特許第５，８１１，０９７号；米国特許第５，８１１，０９７号；米国特許第５，８５５，８８７号；米国特許第６，０５１，２２７号；米国特許第６，２０７，１５７号；米国特許第６，６８２，７３６号；米国特許第６，９８４，７２０号；及び米国特許第７，６０５，２３８号に記載されている。１つの抗ＣＴＬＡ−４抗体は、トレメリムマブ（チシリムマブ、ＣＰ−６７５，２０６）である。いくつかの実施態様では、抗ＣＴＬＡ−４抗体は、イピリムマブ（１０Ｄ１、ＭＤＸ−Ｄ０１０としても公知である）（ＣＴＬＡ−４に結合する完全ヒトモノクローナルＩｇＧ抗体）である。別の免疫チェックポイントタンパク質は、Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ１（ＰＤ−１）である。ＰＤ−１及びＰＤ−Ｌ１遮断薬の例は、米国特許第７，４８８，８０２号；米国特許第７，９４３，７４３号；米国特許第８，００８，４４９号；米国特許第８，１６８，７５７号；米国特許第８，２１７，１４９号並びに国際公開公報第０３０４２４０２号、国際公開公報第２００８１５６７１２号、国際公開公報第２０１００８９４１１号、国際公開公報第２０１００３６９５９号、国際公開公報第２０１１０６６３４２号、国際公開公報第２０１１１５９８７７号、国際公開公報第２０１１０８２４００号及び国際公開公報第２０１１１６１６９９号に記載されている。いくつかの実施態様では、ＰＤ−１遮断薬は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含む。特定の他の実施態様では、ＰＤ−１遮断薬は、抗ＰＤ−１抗体及び類似結合タンパク質、例えばニボルマブ（ＭＤＸ  １１０６、ＢＭＳ  ９３６５５８、ＯＮＯ  ４５３８）（ＰＤ−１に結合して、そのリガンドＰＤ−Ｌｌ及びＰＤ−Ｌ２によるその活性化を遮断する完全ヒトＩｇＧ４抗体）；ランブロリズマブ（ＭＫ−３４７５又はＳＣＨ  ９００４７５）（ＰＤ−１に対するヒト化モノクローナルＩｇＧ４抗体；ＣＴ−０１１（ＰＤ−１に結合するヒト化抗体）；ＡＭＰ−２２４（Ｂ７−ＤＣの融合タンパク質）；抗体Ｆｃ部分；ＰＤ−Ｌｌ（Ｂ７−Ｈ１）遮断のためのＢＭＳ−９３６５５９（ＭＤＸ−１１０５−０１）を含む。他の免疫チェックポイント阻害剤は、リンパ球活性化遺伝子−３（ＬＡＧ−３）阻害剤、例えばＩＭＰ３２１（可溶性Ｉｇ融合タンパク質）を含む（Brignone et al., 2007, J. Immunol. 179:4202-4211）。他の免疫チェックポイント阻害剤は、Ｂ７阻害剤、例えばＢ７−Ｈ３及びＢ７−Ｈ４阻害剤を含む。特に、抗Ｂ７−Ｈ３抗体ＭＧＡ２７１（Loo et al., 2012, Clin. Cancer Res. July 15 (18) 3834）。ＴＩＭ３（Ｔ細胞免疫グロブリンドメイン及びムチンドメイン３）阻害剤（Fourcade et al., 2010, J. Exp. Med. 207:2175-86及びSakuishi et al., 2010, J. Exp. Med. 207:2187-94）も含まれる。いくつかの実施態様では、Nicholas P. Restifo, Mark E. Dudley and Steven A. Rosenberg (“Adoptive immunotherapy for cancer: harnessing the T cell response, Nature Reviews Immunology, Volume 12, April 2012)に記載されているように、免疫療法処置は、養子免疫療法からなる。養子免疫療法では、患者の循環リンパ球又は腫瘍浸潤リンパ球をin vitroで単離し、ＩＬ−２などのリンフォカインによって活性化し、再投与する（Rosenberg et al., 1988; 1989）。活性化リンパ球は、最も好ましくは、血液サンプルから早期に単離されてin vitroで活性化された（又は「エクスパンションされた」）患者自身の細胞である。
【００４８】
免疫療法処置は、特に造血幹細胞ＨＳＣを有する同種移植片を同種移植することからなり得る。Nicholas P. Restifo, Mark E. Dudley and Steven A. Rosenberg (“Adoptive immunotherapy for cancer: harnessing the T cell response, Nature Reviews Immunology, Volume 12, April 2012)に記載されているように、免疫療法処置はまた、養子免疫療法からなり得る。養子免疫療法では、被験体の循環リンパ球、ＮＫ細胞を単離し、ex vivoで増幅し、被験体に再投与する。活性化リンパ球又はＮＫ細胞は、最も好ましくは、血液又は腫瘍サンプルから事前に単離されてex vivoで活性化された（又は「エクスパンションされた」）被験体自身の細胞である。
【００４９】
いくつかの実施態様では、被験体は、放射線療法剤を投与される。本明細書で使用される用語「放射線療法剤」は、限定されないが、ガンを処置又は改善するために有効であることが当業者に公知の任意の放射線療法剤を指すことを意図する。例えば、放射線療法剤は、小線源治療又は放射性核種治療において投与されるものなどの薬剤であり得る。このような方法は、場合により、１つ以上のさらなるガン治療、例えば限定されないが、化学療法及び／又は別の放射線療法の投与をさらに含み得る。
【００５０】
以下の図面及び実施例によって、本発明をさらに説明する。しかしながら、これらの実施例及び図面は、本発明の範囲を限定するものとして決して解釈されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】高密度の腫瘍浸潤Ｔｒｅｇは、肺ガン患者の臨床転帰不良に関連する。パラフィン包埋ＮＳＣＬＣ腫瘍切片２４３個に対して、免疫染色を実施した。染色及びスキャンした組織画像に対して、自動計数を実施した。ＮＳＣＬＣ患者のＯＳ率を決定するために、カプラン・マイヤー生存グラフをプロットした。ログランク検定を使用して、データの統計的有意性を決定した。Ａ：グラフは、ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇの密度に基づく生存曲線を示す。高密度のＴｒｅｇは、患者の生存不良に関係する（Ｐ＝０．００４９）。Ｂ：ｎ＝患者１００人について、腫瘍のＴＬＳ領域において別々に計数したＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇ。ＴＬＳ領域におけるＴｒｅｇを有する患者を高群及び低群によって分類し、生存を決定した。ＴＬＳにおける高密度のＴｒｅｇは、患者の生存不良に関連する（Ｐ＝０．０２４５）。Ｃ、Ｅ、Ｇ；組織の連続切片を使用して、Ｄｃ−ｌａｍｐ＋成熟ＤＣ、ＣＤ２０＋Ｂ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞の密度を決定したところ、密度は、患者の臨床転帰良好に関連することが見出された（それぞれＰ＝０．０００２、Ｐ＝０．００２０及びＰ＝０．００２７）。Ｄ、Ｆ、Ｈ；ＤＣ−Ｌａｍｐ＋成熟ＤＣ、ＣＤ２０＋Ｂ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞の密度とＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇの密度とを組み合わせると、患者を４つの異なる群に分類することができた（それぞれＰ＜０．０００１、Ｐ＜０．０００１及びＰ＝０．０００２）。
【図２】ＣＤ３＋Ｔ細胞、ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇの密度、ＣＤ３＋Ｔ細胞又はＣＤ８＋Ｔ細胞又は成熟ＤＣとＴｒｅｇとの比率、及び最後にＴＬＳ−Ｔｒｅｇの密度に基づいて高群及び低群を識別するための最適なカットオフ値の決定。最適なカットオフ値は、８９８．７９３  ＣＤ３＋ＦｏｘＰ３−Ｔｃｏｎｖ（Ａ）、２１．９９７  ＣＤ３＋ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇ（Ｂ）、１７．９４１１７  ＣＤ３＋Ｔｃｏｎｖ／Ｔｒｅｇ（Ｃ）、１２．４１５０６  ＣＤ８＋Ｔ細胞／Ｔｒｅｇ（Ｄ）、０．０６２９７１６２  ＤＣ−Ｌａｍｐ＋成熟ＤＣ／Ｔｒｅｇ（Ｅ）及び１２７．０３４８  ＴＬＳ−Ｔｒｅｇ（Ｆ）である。
【図３】全ＣＤ３＋Ｔ細胞のカプラン・マイヤー曲線、及びそれぞれＣＤ３＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞及び成熟ＤＣとＴｒｅｇとの比率。パラフィン包埋ＮＳＣＬＣ腫瘍切片２４３個に対して、免疫染色を実施した。染色及びスキャンした組織画像に対して、自動計数を実施した。患者のＯＳ率を決定するために、カプラン・マイヤー生存グラフをプロットした。ログランク検定を使用して、データの統計的有意性を決定した。Ａ：グラフは、全ＣＤ３＋Ｔ細胞の密度に基づく生存曲線を示す。高密度のＣＤ３＋Ｔ細胞は、患者の生存良好に関係する（ＣＤ３高のＯＳ９２カ月間対ＣＤ３低のＯＳ４１カ月間  Ｐ＝０．００７３）。Ｂ：高比率のＣＤ３＋Ｔ細胞／ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇは、低比率（ＯＳ＝４０カ月間、Ｐ＝０．０００８）と対比して、患者に有益である（ＯＳ＝９２カ月間）。Ｃ；高比率の成熟ＤＣ細胞／ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇは、低比率（ＯＳ＝４６カ月間、Ｐ＝０．０００３）と対比して、患者の予後良好を示す。Ｄ；高比率のＣＤ８＋Ｔ細胞／ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇは、低比率（ＯＳ＝４１カ月間、Ｐ＝０．０００５）と対比して、患者の予後良好を示す。
【図４】高密度の腫瘍浸潤Ｔｒｅｇは、肺ガン患者の臨床転帰不良に関連し、ＤＣ−Ｌａｍｐ＋ＤＣ及びＣＤ８＋Ｔ細胞と組み合わせると、高い死亡リスクを有する患者の同定を可能にする。パラフィン包埋ＮＳＣＬＣ腫瘍切片３３８個に対して、免疫染色を実施した。ＮＳＣＬＣ患者のＯＳを決定するために、カプラン・マイヤー生存グラフをプロットした。ログランク検定を使用して、データの統計的有意性を決定した。（Ａ）腫瘍領域において、ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇを計数した（ｎ＝患者３３８人）。（Ｂ）腫瘍のＴＬＳ領域においても、ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇを別々に計数した（ｎ＝１００）。Ｔｒｅｇの密度によって患者を高群及び低群に分類し、生存を決定した。（Ｃ、Ｅ、Ｇ）組織の連続切片を使用して、ＣＤ３＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＤＣ−Ｌａｍｐ＋成熟ＤＣの密度も決定した。（Ｄ、Ｆ、Ｈ）ＣＤ３＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＤＣ−Ｌａｍｐ＋成熟ＤＣの密度とＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇの密度とを組み合わせると、患者を４つの異なる群に分類することができた（全ての場合においてＰ＜０．００１）。各カプラン・マイヤー曲線グラフの下の表は、リスクを有する患者の数、イベントの数、及び細胞密度群に応じた打ち切りを示す。表はまた、患者群に応じたそれぞれ２４カ月間、６０カ月間及び１２０カ月間のＯＳ率（％）を示す。
【図５】高密度の腫瘍浸潤Ｔｒｅｇは、肺ガン患者の臨床転帰不良に関連し、ＴＬＳ−Ｂ細胞又はＣＤ８＋グランザイム−Ｂ＋Ｔ細胞と組み合わせると、高い死亡リスクを有する患者の同定を可能にする。パラフィン包埋ＮＳＣＬＣ腫瘍切片３３８個に対して、免疫染色を実施した。ＮＳＣＬＣ患者のＯＳを決定するために、カプラン・マイヤー生存グラフをプロットした。ログランク検定を使用して、データの統計的有意性を決定した。全ＦｏｘＰ３＋ＣＤ３＋Ｔｒｅｇを、全腫瘍切片（Ａ、Ｃ；ｎ＝腫瘍３３８個）に対して、又は選択的にＴＬＳ（「ＴＬＳ−Ｔｒｅｇ」と称される、Ｂ、Ｄ；ｎ＝腫瘍１００個）に対して計数した。組織の連続切片を使用して、選択的にＴＬＳにおいて腫瘍浸潤ＣＤ２０＋Ｂ細胞（ＴＬＳ−Ｂ細胞）を計数し、全腫瘍切片において腫瘍浸潤ＣＤ８＋グランザイム−Ｂ＋Ｔ細胞を計数した。免疫集団の密度によって患者を高（Ｈｉ）群及び低（Ｌｏ）群に分類し、生存を決定した。ＴＬＳ−Ｂ細胞と全Ｔｒｅｇとの組み合わせ（Ａ）、ＴＬＳ−Ｂ細胞とＴＬＳ−Ｔｒｅｇとの組み合わせ（Ｂ）、ＣＤ８＋グランザイム−Ｂ＋Ｔ細胞と全Ｔｒｅｇとの組み合わせ（Ｃ）、及びＣＤ８＋グランザイム−Ｂ＋Ｔ細胞とＴＬＳ−Ｔｒｅｇとの組み合わせ（Ｄ）により、４つのＮＳＣＬＣ患者群が生じる。１群当たりの患者数は、括弧内に記載されている。
【実施例】
【００５２】
材料及び方法：
患者：
外科的完全切除後、Institut Mutualiste Montsouris, Hotel Dieu and Cochin hospitals (Paris, France)のＮＳＣＬＣ患者から、原発性肺腫瘍サンプルを得た。２００１〜２００５年に手術を受けたHotel Dieu Hospital (Paris)のＮＳＣＬＣ患者２４３人のレトロスペクティブコホートが本研究に参加した。ネオアジュバント化学療法及び放射線療法で処置された患者は、このコホートから除外した。手術と最終経過観察又は死亡との間の時間をこのコホートの観察時間とみなす。対話後に、当局の記録簿又は患者の家族から、長期転帰のデータを得た。このプロトコールは、フランス国法の第Ｌ．１１２１−１条を適用して地方倫理委員会（n° 2008-133及びn° 2012-0612）によって承認された。プロスペクティブコホートについては、ＮＳＣＬＣ患者５５人から、新鮮腫瘍生検を得た。手術を受けた患者から、非腫瘍遠隔肺標本（ＮＴＤＬ）及びリンパ節（ＬＮ）標本も得た。書面による同意を得た患者から、サンプルを得た。レトロスペクティブコホート及びプロスペクティブコホートの患者の主な臨床的及び病理学的特徴は、それぞれ表２及び３に示されている。
【表２】
0006791951.tif 000003
表２：レトロスペクティブコホートのＮＳＣＬＣ患者の臨床的及び病理学的特徴。ＮＳＣＬＣ患者２４３人において、全てのパラメータを評価した。新たなＴＮＭ病期分類４６にしたがって、肺ガンの病期を決定した。ＷＨＯ４７の分類にしたがって、組織学的サブタイプを決定した。略語：ＡＤＣ、腺ガン；ＮＤ、未決定；ＳＣＣ、扁平上皮細胞ガン
【表３】
0006791951.tif 000004
表２：プロスペクティブコホートのＮＳＣＬＣ患者の臨床的及び病理学的特徴。ＮＳＣＬＣ患者５５人において、全てのパラメータを評価した。新たなＴＮＭ病期分類４６にしたがって、肺ガンの病期を決定した。ＷＨＯ４７の分類にしたがって、組織学的サブタイプを決定した。略語：ＡＤＣ、腺ガン；ＮＤ、未決定；ＳＣＣ、扁平上皮細胞ガン
【００５３】
免疫組織化学：
ＣＤ３、ＦｏｘＰ３、ＤＣ−Ｌａｍｐ、ＣＤ８、ＣＤ２０、ＣＤ２１及びパンサイトケラチンの免疫組織化学二重染色のために、厚さ５μmのホルマリン固定パラフィン包埋連続組織切片を使用した。簡潔に言えば、組織切片を脱パラフィン処理し、水で元に戻し、抗原回復バッファーＴＲＳ（Dako）で処置した。protein bloc (Dako)中で切片を３０分間インキュベーションしてから、適切な一次抗体及び二次抗体を追加した。基質キットを使用して、酵素活性を実施した。NDPviewソフトウェアを備えるNanozoomer (Hamamatsu)を使用して、画像を取得した。
【００５４】
細胞の定量：
Calopixソフトウェア(Tribvn)を使用して全腫瘍切片において、免疫細胞を定量し、目的の領域１mm2当たりの細胞数として表した。同じソフトウェアを使用して、目的の領域の表面積も決定した。二重ＤＣ−Ｌａｍｐ／ＣＤ３（ＴＬＳのＴ細胞領域）及びＣＤ２０／ＣＤ２１（ＴＬＳのＢ細胞領域）染色を参照して、ＴＬＳの領域を手動で決定した。自動計数を用いて、ＴＬＳにおけるＣＤ３＋ＦｏｘＰ３＋細胞の密度を決定した。以前に記載されているように７，（２２）、ＴＬＳ−ＤＣ−Ｌａｍｐ＋ＤＣ、ＣＤ３＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＴＬＳ−ＣＤ２０＋Ｂ細胞の定量を決定した。
【００５５】
フローサイトメトリー：
合計３４個のＮＳＣＬＣ新鮮腫瘍サンプルが本研究に参加した。腫瘍組織標本及び非腫瘍組織標本を機械的に細断し、非酵素溶液（細胞回収溶液、BD Biosciences）で消化した。フィコール勾配の後、全単核細胞を得た。蛍光標識抗体及びそれらのマッチアイソタイプコントロールの複数のパネルで、単核細胞を染色した。さらに、細胞内染色のための固定／パーマキット（ebioscience）を使用して、細胞を固定及び透過処理した。細胞を洗浄し、Fortessa cytometer (BD Biosciences)によってデータを取得した。flow Jo 9.7.6 (Tree Star Inc, Ashland, OR)及びSpice 5.3.5 (Mario Roederer, Vaccine Research Center, NIAID, NIHによる開発)ソフトウェアプログラムを使用して、データを分析した。
【００５６】
細胞選別：
４つの細胞集団（すなわち、ＣＤ６２Ｌ＋及びＣＤ６２Ｌ−Ｔｒｅｇ、ＣＤ６２Ｌ＋及びＣＤ６２Ｌ−ＣＤ４＋従来型Ｔ細胞（Ｔｃｏｎｖ））について、インハウス設計のプロトコールを使用して、新鮮腫瘍標本及び非腫瘍組織標本（ｎ＝２０）からを選別した。簡潔に言えば、Easysep（商標）untouched human CD4+ T cell kit (stem cell technologies Ref. No.)とフローサイトメトリー細胞選別との組み合わせを使用して、高純度の細胞サブセットを達成した。最高の品質及び量のｍＲＮＡを得るために、ＲＬＴ＋１０％β−メルカプトエタノールを含有するバイアルに細胞を直接選別した。
【００５７】
ＲＮＡ抽出及び逆転写：
製造業者の説明書にしたがってRNeasy micro kit (Qiagen)を用いて、選別細胞由来の全ｍＲＮＡを抽出し、2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies)を使用してＲＮＡの量及び品質を決定した。superscript VILO kit (Life Technologies)を使用して、ｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。Taqman PreAmp 2x及びMTEプライマー(NanoString technologies, Seatle, USA)を使用して、ｍＲＮＡが１ng未満のサンプルを９サイクル増幅し、ｍＲＮＡ １ng超を有するサンプルを７サイクルのＰＣＲによって増幅した。
【００５８】
遺伝子発現分析：
nCounter analysis system (Nanostring Technologies)を使用して、遺伝子発現を実施した。目的の各遺伝子のための２つの特異的プローブ（キャプチャ及びレポーター）を適用した。製造業者の説明書（Nanostring Technologies, Seattle, USA）にしたがって、５つのハウスキーピングコントロール（β−アクチン、ＧＡＰＤＨ、ＥＥＦ１Ｇ、ＯＡＺ１及びＲＰＬ１９）及び細胞系統コントロール（ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ１３８及びＥｐＣＡＭ）を含む選択遺伝子１２５個の特注レポータープローブ及びキャプチャプローブコードセットをハイブリダイゼーションに使用した。水をネガティブコントロールとして使用して、バックグラウンドノイズをチェックした。NanoString Prep-stationを使用して、ハイブリダイゼーションしたサンプルを回収し、デジタルnCounterを用いてｍＲＮＡ分子を計数した。計数の数は、遺伝子の発現を表していた。ポジティブコントロール及びネガティブコントロールと、内部コントロールとして１つの患者ＲＮＡサンプルとを使用して、異なるバッチの実験中の技術的整合性をチェックした。
【００５９】
統計分析：
マンホイットニーＵ検定及びウィルコクスン順位検定（Ｐ＜０．０５＊、Ｐ＜０．０１＊＊、Ｐ＜０．００１＊＊＊）を使用して、異なる腫瘍における細胞の密度を比較した。カプラン・マイヤー法によって全生存（ＯＳ）曲線を推定し、ログランク検定を使用して患者群間の差異を計算した。以前に公開されているように（７、２２）、「最小Ｐ値」アプローチを使用して、高密度及び低密度の免疫細胞によって患者を２つの群に分類した。最適なカットオフ値は、８９８．７９３  ＣＤ３＋ＦｏｘＰ３−Ｔｃｏｎｖ、２１．９９７  ＣＤ３＋ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇ、１２７．０３４８  ＴＬＳ  Ｔｒｅｇ、１．２４８  ＤＣ−Ｌａｍｐ＋ＤＣ、２２６．５  ＣＤ８＋Ｔ細胞／mm2であり、腫瘍領域のＴＬＳ−ＣＤ２０＋Ｂ細胞は０．３２５６％である（図２）。Prism 5 (GraphPad)、Statview (Abacus system)及びR (http: //www.r-project.org/)ソフトウェアを用いて、全ての分析を実施した。遺伝子発現研究及びヒートマップデモンストレーションのために、ソフトウェア「nSolver」(Nanostring Technologies)及びRを使用した。「nSolver」ソフトウェアを使用して、５つのハウスキーピング遺伝子の平均数によって、生データを正規化した。スチューデントＴ検定及びＡＮＯＶＡ検定を使用して、それぞれデータ群間の遺伝子発現を比較した。偽陽性結果が含まれることを回避するために、本発明者らは、偽発見率（ＦＤＲ）法を用いてＰ値を算出した。ヒートマップ、ボルケーノプロット及び相関マトリックス形式で、データを表した。
【００６０】
結果
Ｔｒｅｇは、ＴＬＳを含む異なる肺腫瘍領域に浸潤し、活性化記憶表現型を示す。
本発明者らは、ＮＳＣＬＣ患者における腫瘍浸潤Ｔｒｅｇの存在、局在性及び頻度を評価した。免疫組織化学によって、ＣＤ３＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞の存在が異なる腫瘍領域において検出された。ＣＤ８＋Ｔ細胞のような他のＴ細胞サブセットについては、珍しいＣＤ３＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞が腫瘍母地において観察された。実際、腫瘍間質では、Ｔ細胞の大部分は、ＣＤ３＋ＦｏｘＰ３＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞と共に検出された。間質反応によるより深い特性評価により、本発明者らは、ＤＣ−Ｌａｍｐ＋成熟ＤＣ及びＣＤ３＋Ｔ細胞クラスタの存在によって実証されているように、ＴＬＳのＴ細胞リッチ領域におけるＴｒｅｇを視覚化することができた。
【００６１】
次に、本発明者らは、マルチカラーフローサイトメトリーによって、腫瘍及び非腫瘍遠隔部位に浸潤するＣＤ３＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞の表現型を解明した。本発明者らは、この集団がＣＤ４（ＣＤ８ではなく）、高レベルのＣＤ２５を専ら発現し、ＣＤ１２７−／Ｌｏであったことを観察した。この観察結果は、文献（２３、２４）において実証されているヒト天然ＣＤ４＋Ｔｒｅｇの表現型と一致していた。ＮＳＣＬＣ患者間のＣＤ３＋ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇが不均一であっても、全ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＴｒｅｇの割合は、腫瘍（１４．４９＋１．３４％）では常に、ＮＴＤＬ（４．９８＋０．６３％）、ＬＮ（８．２４＋０．９５％）及び末梢血（６．２６＋１．４８％）におけるそれらの割合と比較して高かったが、これは、腫瘍におけるこのＴ細胞サブセットの能動的なリクルートを示唆している。ＣＤ６２ＬはＴＬＳ−Ｔ細胞の特異的マーカーであるので（７、２５）、本発明者らは次に、ＴｒｅｇとＣＤ４＋Ｔｃｏｎｖとについて、腫瘍のＴＬＳ領域（ＣＤ６２Ｌ＋）と非ＴＬＳ領域（ＣＤ６２Ｌ−）とにおける分化段階を研究及び比較した。ＣＤ４＋Ｔｃｏｎｖ（ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌ＋／全ＣＤ４＋Ｔｃｏｎｖ（Ｔｒｅｇを除く）の１６．０７＋４．５８％）について観察されるように、Ｔｒｅｇの一部は、腫瘍誘導性ＴＬＳにホーミングする（ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋＋ＦｏｘＰ３＋ＣＤ６２Ｌ＋／全Ｔｒｅｇの２８．９０＋４．５８％）。ＣＣＲ７、ＣＤ４５ｒａ、ＣＤ２７及びＣＤ２８のディファレンシャルな発現に基づくと、ＴＬＳ−Ｔｒｅｇは主に、中心記憶（ＣＭ）及びエフェクター記憶型１（ＥＭ１）表現型のものであった；非常に珍しいことに、ＣＤ４＋Ｔｃｏｎｖについて観察されるように、ナイーブＴｒｅｇは全て、ＴＬＳにおいて検出された。しかしながら、ＣＤ４＋Ｔｃｏｎｖと比較したＴｒｅｇの頻度に関して、実質的な差異が観察され、ＴＬＳでは、ＣＤ４＋ＴｃｏｎｖよりもナイーブＴｒｅｇ及びＣＭ  Ｔｒｅｇが少なく、ＥＭ１  Ｔｒｅｇが多かった。非ＴＬＳ領域では、Ｔｒｅｇ及びＣＤ４＋Ｔｃｏｎｖについて、同じ優勢な分化段階が検出されたが、分布は異なっていた。実際、非ＴＬＳ  Ｔｒｅｇは主にＥＭ１表現型であり、そして比較的程度は少ないがＣＭ及びＥＭ４であったのに対して、ＣＤ４＋Ｔ  ｃｏｎｖでは、これら３つの段階が等しく分布していた。注目すべきことに、腫瘍では、ターミナルＥＭ（ＴＥＭＲＡ）Ｔｒｅｇ（ＣＣＲ７−ＣＤ４５ｒａ＋）は検出されなかった。興味深いことに、腫瘍及び非腫瘍遠隔部位（ＮＴＤＬ、ＬＮ及び血液）における４つのＴ細胞段階の分布分析により、腫瘍及びＮＴＤＬ（これは、ＬＮ及び血液と区別される）では、Ｔｒｅｇの表現型は同じものであり、主な差異は、ＣＭ集団及びＥＭ集団の頻度であったことが示された。
【００６２】
要するに、Ｔｒｅｇは、異なる分化段階で、ＴＬＳと一緒に異なる腫瘍領域に浸潤するが、これは、それに応じて、それらが異なる機能を示し得ることを示唆している。
【００６３】
Ｔｒｅｇは、腫瘍における従来型ＣＤ４＋Ｔ細胞と比較して、活性化表現型及び異なる遺伝子シグネチャーを示す
異なる分化段階のＴｒｅｇが異なる腫瘍領域に存在することから、本発明者らは、それらの活性化、免疫抑制及び免疫チェックポイント（ＩＣＰ）状態の性質を調査した。したがって、Ｔｒｅｇにおいて分子（ｎ＝１６９）及びタンパク質（ｎ＝１４）レベルで、活性化マーカー及び免疫調節マーカーの発現を調査し、それらの表現型と、腫瘍におけるＣＤ４＋Ｔｃｏｎｖのものとを比較した。ＦｏｘＰ３、ＩＬ２Ｒα及びＩＬ２Ｒβと一緒に、腫瘍浸潤Ｔｒｅｇは、ＣＤ４＋Ｔｃｏｎｖと比較して、いくつかの転写因子（Ｈｅｌｉｏｓ及びＩＲＦ４）、ケモカイン（ＣＣＬ２２）及びレセプター（ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ４及びＣＣＲ８）、サイトカイン（ＩＬ１０、ＩＬ２７及びＩＦＮα）及びレセプター（ＴＮＦＲ２、ＩＬ１Ｒ１及びＩＬ１Ｒ２）、活性化レセプター（ＧＩＴＲ、４−１ＢＢ、ＩＣＯＳ及びＯＸ４０）及びいくつかのＩＣＰ分子（膜及び可溶性ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ−３、Ｔｉｍ−３、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ３９、Ｂ７Ｈ３、ＧＡＲＰ及びＰＤＬ２）を有意に過剰発現していた。遺伝子発現レベルによれば、タンパク質レベルでＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＴＬＡ−４、Ｔｉｍ−３及びＴＩＧＩＴについて陽性のＴｒｅｇの割合は、ＣＤ４＋Ｔｃｏｎｖよりも顕著に高かったのに対して、２つのＴ細胞サブセット間では、ＬＡＧ−３に関する統計的差異は測定されなかった。
【００６４】
ＴＬＳは、Ｔ細胞の活性化のための特権部位と考えられるので、本発明者らは次に、ＴＬＳの存在にしたがって、ＴｒｅｇとＣＤ４＋Ｔｃｏｎｖとの遺伝子発現プロファイルを比較した。ＴＬＳ及び非ＴＬＳでは、Ｔｒｅｇ上で有意に過剰発現されている遺伝子は同様であった。しかしながら、ＴＬＳ（Ｔｉｍ−３、ＩＬ６、ＣＣＲ５及びＣＸＣＲ３）及び非ＴＬＳ（ＩＣＯＳ−Ｌ、ＰＤＬ２、Ｂ７Ｈ３、ＧＡＴＡ３及びＦｏｘＡ１）で、わずかな特異性を認めることができるのみであり、これは、ＴＬＳ及び非ＴＬＳにおけるＴｒｅｇが共通の調節機能を共有し得ることを示唆している。
【００６５】
結論として、Ｔｒｅｇは、腫瘍におけるＣＤ４＋Ｔｃｏｎｖと比較して、活性化及びＩＣＰ分子を含む特異的な分子パターンを示す。
【００６６】
腫瘍浸潤Ｔｒｅｇの機能的配向は、ＮＴＤＬ由来ではなく血液由来のそれらのカウンターパートと顕著に異なる
ほとんどのＴｒｅｇは、異なる部位において推定エフェクター機能を有する記憶表現型であったが、それらは腫瘍に広く浸潤していたので、本発明者らは、それらの局在性が何であっても、それらが同じ分子パターンを示すかを決定した。以前に実施されているように、本発明者らは、ＮＳＣＬＣ患者のＴｒｅｇ浸潤腫瘍、ＮＴＤＬ、ＬＮ及び血液における活性化マーカー、免疫抑制マーカー及びＩＣＰマーカーの遺伝子及びタンパク質発現レベルを比較した。驚くべきことに、腫瘍では、ＮＴＤＬと対比して、非常にわずかな遺伝子（試験した遺伝子１２０個のうちの１１個）がＴｒｅｇによってディファレンシャルに発現されていたが、これは、それらが、腫瘍性肺及び非腫瘍性肺において同様の遺伝子発現シグネチャーを示すことを示している。これらの遺伝子のほとんどは、走化性及びＩＣＰ（ＰＤ−１、ＢＴＬＡ、Ｂ７−Ｈ３、ＩＬ−２７、ＢＣＬ６、ＳＴＡＴ４、ＣＤ４４）に関係する。腫瘍及びＬＮにおけるＴｒｅｇを比較したところ、本発明者らは、より過剰発現されている遺伝子を観察し（ｎ＝２１、そのうち腫瘍において１７個及びＬＮにおいて４個）、それらのほとんどは腫瘍におけるＴｒｅｇ及びＣＤ４＋Ｔｃｏｎｖを比較したときに既に同定されていた。Ｔｒｅｇ上でディファレンシャルに発現される最も重要な遺伝子の数は、腫瘍と血液との間であった。１個を除いて、それらの全てが腫瘍において過剰発現されており、以前に強調されていた遺伝子を含む（腫瘍とＬＮとの対比）。腫瘍Ｔｒｅｇにおける腫瘍関連遺伝子は、転写因子（ＦｏｘＰ３、ＦｏｘＡ１、ＳＴＡＴ４）、活性化（ＩＣＯＳ、ＧＩＴＲ、Ｏｘ−４０、４−１ＢＢ、ＴＮＦＲ２、ＣＤ２６）、ＩＣＰ（ｍＣＴＬＡ４、ＰＤ１、ＰＤＬ１、Ｂ７−Ｈ３、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、Ｔｉｍ３、ＬＡＧ−３）、走化性（ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２２、ＣＸＣＬ５、ＣＸ３ＣＬ１、ＣＸＣＲ３、ＣＤ２００、ＣＸ３ＣＲ１、ＬＴβＲ）、免疫抑制（ＩＬ−１０、ＣＤ３９、ＧＡＲＰ）及び細胞傷害性（グランザイムＢ、グラニュリシン、ＦａｓＬ）分子に関係する。タンパク質レベルにおいて、本発明者らは、異なる部位におけるＴｒｅｇが、活性化分子及びＩＣＰ分子の同じセットを発現せず、血液が、腫瘍と最も重要な差異を示すことを確認した。フローサイトメトリー分析により、本発明者らは、研究したマーカーの潜在的な同時発現を研究することができた。したがって、ＣＤ３８、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ６９及びＧＩＴＲ発現の多重分析は、これらの分子全てについて陰性のＴｒｅｇの割合が、血液における８０％から腫瘍における８％に大きく減少したことを示している。１個又は２個のマーカーを発現するＴｒｅｇの割合は、それが２０％に低下した血液を除いて、全ての部位において非常に安定していた（約６０％）。したがって、３〜４個のマーカーについて陽性のＴｒｅｇの頻度は、血液における０％から腫瘍における３５％に劇的に増加した。少なくとも２個の分子を発現する細胞の分析は、ほとんどの場合において、単一陽性細胞が主にＣＤ６９であり（優先的ＣＤ３８発現を有する血液を除く）、二重陽性細胞がＣＤ６９及びＧＩＴＲであり、三重陽性細胞がＣＤ６９、ＧＩＴＲ及びＣＤ３８であることを示している。４．���ＢＢ、ＩＣＯＳ及びＯＸ４０の発現についても、同じ状況が生じた。三重陰性Ｔｒｅｇの割合は、血液における６５％から腫瘍における２６％に有意に減少したのに対して、三重陽性Ｔｒｅｇについては、それは２％から２２％に増加した。ほとんどの場合において、単一陽性細胞から三重陽性細胞に、最初にＩＣＯＳが発現され、続いてＯＸ４０が発現され、次いで４．１ＢＢが発現された。活性化マーカーについては、ＩＣＰを全く発現しないＴｒｅｇの割合は、血液における５６％から腫瘍における１０％に劇的に低下した。１個のマーカーのみを発現するＴｒｅｇについても同じ結果である。対照的に、少なくとも２個のマーカーについて陽性の細胞の頻度は、血液における８％から腫瘍における７０％に有意に増加した。ＴＩＧＩＴ、次いでＴｉｍ−３又はＣＴＬＡ−４がＴｒｅｇによって連続的に発現された。
【００６７】
要するに、肺Ｔｒｅｇは、遠隔部位（すなわち、ＬＮ及び血液）と比較して、特異的な遺伝子パターンを示す。そして、肺ガン微小環境は主に、活性化分子及びＩＣＰ分子を発現するＴｒｅｇによって浸潤されるのに対して、血液Ｔｒｅｇは、むしろ休止状態を示す。
【００６８】
高密度の腫瘍浸潤Ｔｒｅｇは短い生存に関連し、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＴＬＳ−成熟ＤＣ又はＴＬＳ−Ｂ細胞との組み合わせは、最悪の臨床転帰を有する患者の同定を可能にした
カプラン・マイヤー曲線は、高密度の腫瘍内Ｔｒｅｇが、ＮＳＣＬＣ患者の臨床転帰不良と相関していたことを表している（「Ｔｒｅｇ低」では、平均ＯＳが達成されなかったのに対して、「Ｔｒｅｇ高」患者では、それは５１カ月間であった。Ｐ＝０．００４９、図１Ａ）。高密度のＴＬＳ−成熟ＤＣ、ＴＬＳ−Ｂ細胞及びエフェクターＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＮＳＣＬＣを有する患者の長い生存に関連していたので（４、７、２２、図１Ｃ、Ｅ、Ｇ）、本発明者らはさらに患者の生存に対するこれらの免疫細胞とＴｒｅｇとの複合的な影響を試験した。本発明者らは、成熟ＤＣ、ＴＬＳ−Ｂ細胞又はＣＤ８＋Ｔ細胞の密度が何であっても、低密度のＴｒｅｇが好ましい臨床転帰に関連していたことを観察した。対照的に、高密度のＴｒｅｇと、低密度の成熟ＤＣ（平均ＯＳ＝２５カ月間；Ｐ＜０．０００１、図１Ｄ）、ＴＬＳ−Ｂ細胞（平均ＯＳ＝２４カ月間；Ｐ＜０．０００１、図１Ｆ）又はＣＤ８＋Ｔ細胞（平均ＯＳ＝４０カ月間；Ｐ＝０．０００２、図１Ｈ）とを有する患者は最悪の転帰を有しており、各変数のみの場合と比較して、平均生存が最短であった。「Ｔｒｅｇ高／成熟ＤＣ、ＴＬＳ−Ｂ又はＣＤ８＋Ｔ高」の患者は、中程度の死亡リスクを有していたが、これは、一方では成熟ＤＣ、ＴＬＳ−Ｂ及びＣＤ８＋Ｔ細胞、そして他方ではＴｒｅｇが、ＮＳＣＬＣ患者の転帰に対して二重の影響を有することを示唆している。異なる腫瘍領域におけるＴｒｅｇが、乳ガン患者の生存に対して異なる影響を有することが示されているので（１６）、本発明者らは、ＮＳＣＬＣ患者１００人のＴＬＳ領域及び非ＴＬＳ領域におけるＴｒｅｇを別々に計算した。高密度のＴＬＳ−Ｔｒｅｇ及び非ＴＬＳ−Ｔｒｅｇは、全Ｔｒｅｇと同様に、臨床転帰不良と相関していたことが観察された（それぞれ「ＴＬＳ−Ｔｒｅｇ低」及び「ＴＬＳ−Ｔｒｅｇ高」患者について、平均ＯＳ＝５７カ月間対３４カ月間；Ｐ＝０．０２４５、図１Ｂ）。本発明者らはまた、全ＣＤ３＋Ｔ細胞又はＣＤ８＋Ｔ細胞又は成熟ＤＣ／Ｔｒｅｇの密度の比率を決定したところ、「高比率」のこれらのマーカーは全て、「低比率」と比較してＮＳＣＬＣ患者に有益であったことが見出された（図３）。
【００６９】
結論として、Ｔｒｅｇと、成熟ＤＣ、ＴＬＳ−Ｂ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞のような他の免疫細胞とのバランスは、ＮＳＣＬＣ患者の性質に重要である。Ｔｒｅｇと他の免疫サブセットの１つとの組み合わせは、各サブセットのみの場合よりも、生存に関する優れた患者分類を可能にし、高い死亡リスクを有するＮＳＣＬＣ患者群の同定を可能にする。
【００７０】
本発明者らは、より多くの患者を用いて、特に２００１〜２００５年に手術を受けたＮＳＣＬＣ患者３３８人のコホートを用いて研究を継続している。図４及び５に示されているように、本発明者らは、Ｔｒｅｇと、ＣＤ３＋Ｔ細胞のような他の免疫細胞とが、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋グランザイム−Ｂ＋Ｔ細胞、ＴＬＳ−Ｂ細胞及びＴＬＳ−成熟ＤＣと一緒に存在することが、ＮＳＣＬＣ患者の生存に重要であることを確認した。Ｔｒｅｇと他の免疫サブセットとの組み合わせは、各サブセットのみの場合よりも、生存に関する優れたＮＳＣＬＣ患者分類を可能にし、高い死亡リスクを有する患者のサブグループの同定を可能にした。
【００７１】
考察
文献には、異なる固形ガンにおけるＴｒｅｇの予後関連性について議論されている多くの研究があるが、不一致の原因となる様々な要因により、それは常に論争中であった。腫瘍の種類、病期及び組織型に応じて、Ｔｒｅｇの予後的重要性が異なることが見出された（１５）。それらの局所性に基づいて、Ｔｒｅｇは、抗腫瘍応答を抑制又は支援し得る。最近、胚中心において、Ｔｒｅｇは、Ｔｆｈ分化を支援し得ることが観察されている（２６）。したがって、異なる腫瘍領域におけるＴｒｅｇの異なる役割及び表現型を推測することは興味深いものであった。利用可能な先進技術を用いて、本発明者らは、総数としての、さらには、異なる肺腫瘍サブ領域におけるそれらの局在性に応じたＴｒｅｇの予後的価値を再検討した。
【００７２】
本発明者らは、異なるＮＳＣＬＣ腫瘍領域におけるＣＤ３＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞の存在を初めて実証した。本発明者らは、ＣＤ３＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞が、腫瘍間質（特に、間質におけるＴＬＳ）において主に見られることを観察した；癌巣では、ＣＤ３＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞はほとんどない。文献（２７、２８）で言及されているように、本発明者らは、ＣＤ３＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞が、ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉＣＤ１２７−／ｌｏＦｏｘＰ３＋という表現型によるＴｒｅｇであることをフローサイトメトリーによって確認した。
【００７３】
本発明者らは、Ｔｒｅｇが、非腫瘍組織と比較して肺腫瘍（ＴＬＳ領域及び非ＴＬＳ領域の両方）に多く浸潤することを観察したので、本発明者らは、それらの表現型を初めて詳細に研究した。本発明者らは、一般に、Ｔｒｅｇが、ＣＤ４＋Ｔｃｏｎｖと比較して同じ分化状態を有することを観察した（７）。腫瘍浸潤Ｔｒｅｇは主に、ＣＭ表現型及びＥＭ表現型を示す。非常にわずかなナイーブＴｒｅｇが腫瘍に浸潤するが、興味深いことに、それらは全てＴＬＳにホーミングする。重要なことに、ＴＬＳ  ＴｒｅｇはＣＭ及びＥＭ１である；それに対して、非ＴＬＳ  Ｔｒｅｇは、ＥＭ１及びＥＭ４のようなさらなる分化段階を示した。Ｔｒｅｇの分化状態は、腫瘍では、血液又はリンパ節と比較して、同じものではなかった。Ｔｒｅｇは、遠位肺及び腫瘍では同様の表現型を示したが、血液及びリンパ節では、エフェクター記憶細胞がより少なかった。これらの結果により、本発明者らは、Ｔｒｅｇの活性化状態のさらなる研究を開始した。
【００７４】
（ＮＴＤＬ、ＬＮ及び血液と比較した）肺腫瘍におけるＴｒｅｇの高浸潤は、腫瘍内ＴｒｅｇによるケモカインＣＣＬ２２及びレセプター、例えばＣＣＲ８、ＣＣＲ４及びＣＸ３ＣＬ１の高発現に反映される。本発明者らはまた、ＴＬＳ  ＴｒｅｇにおけるＣＸＣＲ３のより高い発現（これは、それらを炎症部位にリクルートするための可能な方法であり得る）を観察した（２９）。成熟ＤＣは、ＣＣＲ４＋Ｔｒｅｇをリクルートし得るＣＣＬ２２を産生し得る（３０）。炎症部位へのＴｒｅｇの化学誘引におけるＣＣＲ４、ＣＣＬ１７及びＣＣＬ２２の役割は、マウス研究及びヒト研究において十分に議論されている（１６、３１）。
【００７５】
全腫瘍内Ｔｒｅｇの約２５％がＴＬＳに浸潤するので、ＴＬＳ−Ｔｒｅｇは、腫瘍のＴＬＳ領域及び非ＴＬＳ領域におけるＴＡＡ特異的Ｔ細胞を抑制し得ると推測され得る。腫瘍のＴＬＳ領域及び非ＴＬＳ領域におけるＴｒｅｇの遺伝子発現を比較したところ、本発明者らは、全Ｔｒｅｇについて同様のプロファイルを見出した。ＴＬＳ  Ｔｒｅｇは、より多くの転写因子ＧＡＴＡ３、ＰＤＬ２、Ｂ７Ｈ３及びＩＣＯＳＬを過剰発現していた非ＴＬＳ  Ｔｒｅｇと比較して、Ｔｉｍ３、ＩＬ６、ＣＣＲ５及びＣＸＣＲ３のような分子を選択的に発現していた。驚くべきことに、本発明者らは、ＣＤ４＋Ｔｃｏｎｖと比較して、ＴｒｅｇにおけるＩＬ−２  Ｒα及びＩＬ−２Ｒβ、共刺激（ＩＣＯＳ、ＯＸ４０、４−１ＢＢ及びＧＩＴＲ）並びにＩＣＰ（ＣＴＬＡ４、ＴＩＧＩＴ、ＰＤ１及びＰＤＬ２）分子の過剰発現を観察した。これは、タンパク質レベルで確認された。過去数年間に、ＴｒｅｇによるＩＬ−１０産生におけるＩＣＯＳの役割が実証されている（３２）。形質細胞様ＤＣによるＩＣＯＳＬ及びＯＸ−４０の発現は、メラノーマ及び乳ガンにおけるＴｒｅｇのリクルートに関与する（３３、３４）。メラノーマにおけるＩＬ−２処置は、ＩＣＯＳ＋Ｔｒｅｇ集団をエクスパンションすることが見出された（３５）。ＴｒｅｇにおけるＧＩＴＲの役割は議論の余地があるが、ＴｒｅｇはＧＩＴＲを構成的に発現することが見出された。全てのＴｉ−ＴｒｅｇがＨＬＡ−ＤＲを発現していたが（データは示さず）、これは、Ｔｒｅｇが接触依存的な抑制機構を使用することを示唆している。ＴＮＦＲ２、４−１ＢＢ及びＯｘ−４０のようなＴＮＦスーパーファミリーレセプターは、それらの抑制能力を支援し得る。ＧＩＴＲ、ＯＸ−４０及びＴＮＦＲ２とＴＣＲシグナリングとの共発現は、Ｔｒｅｇの胸腺分化を促すことが見出された（３６）。
【００７６】
最も重要なことに、Ｔｒｅｇの一部はＩＣＰを発現する。本発明者らは、腫瘍におけるＴｒｅｇが、高レベルのＣＴＬＡ４、ＴＩＧＩＴ、Ｔｉｍ−３、Ｂ７−Ｈ３、ＰＤ１並びにそのリガンドＰＤＬ１及びＰＤＬ２を発現することを見出した。ＴｒｅｇにおけるＣＴＬＡ４の発現、並びにＡＰＣにおけるＣＤ８０分子及びＣＤ８６分子とのその相互作用（３７）が大いに議論されている。ＣＴＬＡ４は、ＣＤ８０及びＣＤ８６と相互作用することによって、ＤＣにおける酵素ＩＤＯの誘導をトリガーし得る（３８）。ＣＴＬＡ４遮断薬及びＰＤ１遮断薬は、メラノーマにおいて有効であることが見出されており（３９）、おそらくは、ＣＤ４＋Ｔｃｏｎｖと比較して高レベルを発現するＴｒｅｇに対して作用するので、ＮＳＣＬＣにおいて有望な結果も示している。本発明者らの研究では、ＣＴＬＡ４及びＴＩＧＩＴの発現は、Ｔｉ−Ｔｒｅｇにおいて常に相関することが見出された。Ｔｒｅｇに対するＴＩＧＩＴのライゲーションは、Ｔｈ１及びＴｈ１７による炎症促進性応答を阻害し得る（４０）。ＴＩＧＩＴ及びＦＣＲＬ３を発現するＨｅｌｉｏｓ＋記憶Ｔｒｅｇは、非常に抑制的なＴｒｅｇであることも観察されている（４１、４２）。本発明者らは、肺腫瘍におけるＴｒｅｇがＨｅｌｉｏｓ陽性であり、それらがＦｏｘＡ１及びＧＡＴＡ３のような他の転写因子も発現することを観察した。ＣＤ８＋Ｔ細胞において観察されるように、ＴｒｅｇのＩＲＦ４発現は、Ｔｒｅｇの増殖及び活性化の維持におけるその役割を示唆している可能性がある（４３）。
【００７７】
本発明者らは、ＣＤ４＋Ｔｃｏｎｖ（特に、ＴＬＳ  ＣＤ４＋Ｔｃｏｎｖ）が、Ｔｒｅｇと対比してＣＤ４０Ｌを過剰発現することを観察したが、これは、ＴＬＳにおける成熟ＤＣとの相互作用後のＴ細胞活性化の結果（すなわち、Ｔｒｅｇによる免疫抑制の反作用）である可能性がある。驚くべきことに、本発明者らは、Ｔｉ−Ｔｒｅｇ、特にＴＬＳ  Ｔｒｅｇが、ＮＴＤＬ及び血液とは異なって、リンパ節Ｔｒｅｇと比較してＰＤＬ２を過剰発現することを見出した。胚中心において、ＰＤ１−ＰＤＬ１のライゲーションは、ＣＸＣＲ５＋濾胞性Ｔｒｅｇ及びin vivo抗体産生を阻害することが見出されたが（４４）、ＰＤＬ２を介したレギュレーションはほとんど研究されていない。
【００７８】
腫瘍内ＴｒｅｇはＩＬ−６、ＩＬ−１０及びＴＧＦ−βを発現し、これが、Ｔ細胞機能の抑制並びにＤＣの分化及び活性化につながり得る。本発明者らは、ＴｒｅｇがＩＬ−２７（これは、腫瘍微小環境におけるＴｈ１７分化のネガティブレギュレーターであると推測された）を高発現することを観察した。ＮＳＣＬＣ患者における別の研究では、ＩＬ−２７は、Ｔｈ１７細胞及びＲＯＲγｔ発現と負に相関していたことが観察されている（４５）。
【００７９】
本発明者らは、高密度のＴｒｅｇが、ＮＳＣＬＣ患者におけるより短い全生存と相関していたことを観察した。文献ではほとんどの場合において、Ｔｒｅｇが臨床転帰良好、臨床転帰不良に関連することも臨床転帰に関連しないことも示されていない。乳ガン患者では、リンパ球凝集体におけるＴｒｅｇの存在は生存不良に関連するのに対して、腫瘍におけるそれらの存在は患者の生存に関連しないが（１６）、これらの証拠では、これらのリンパ球凝集体が機能的ＴＬＳであることが示されていない。本発明者らは、ＴＬＳ及び全腫瘍における多数のＴｒｅｇの存在が患者の生存に影響を及ぼし、これが、異なる腫瘍領域（主に、ＴＬＳ及び間質領域）におけるＴｒｅｇの排他的浸潤と、ＴＬＳにおけるＴｒｅｇの分化及び活性化と、Ｔｃｏｎｖ及びＡＰＣに対するそれらの免疫抑制機能とによるものであり得ることを示す。本発明者らは、Ｔｒｅｇが、ＮＴＤＬ、ＬＮ及び血液と比較して腫瘍において活性化される証拠を提供する。
【００８０】
本発明者らは、肺ガン患者において、ＴＬＳが存在し、抗免疫応答生成において好ましい役割を果たすことを既に実証した（４、７、２２）。ＨＥＶは、Ｔ細胞のリクルートに関与することが見出され、成熟ＤＣは、ＴＬＳにおけるＴ細胞の活性化に関与することが見出された。ＴＬＳは、Ｔｈ１及び細胞傷害性遺伝子シグネチャーの組織化に関与することが見出されている。本発明者らは、ＴｒｅｇがＴ−ｂｅｔを発現し、おそらくはＴｈ１細胞の転写因子発現を利用して、Ｔｈ１応答を抑制し得ることを観察した。
【００８１】
Ｔｒｅｇの密度と、ＤＣ−Ｌａｍｐ＋成熟ＤＣ、ＣＤ２０＋ＴＬＳ−Ｂ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞とを組み合わせると、最高の生存を有する群の分類を決定することができた。ＣＤ３＋Ｔ細胞又は成熟ＤＣ又はＣＤ８＋Ｔ細胞とＴｒｅｇとの比率は、各変数のみの場合よりも強力な予後因子であることが見出され、Ｔｒｅｇと比較して高割合のＴ細胞又は成熟ＤＣは、肺ガン患者のより良好な生存をインプリントすることが示された。
【００８２】
参考文献：
本出願を通して、様々な参考文献が、本発明が関係する技術水準について説明している。これらの参考文献の開示は、参照により本開示に組み入れられる。
【表４】
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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