(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の式で示される修飾リボ−オリゴヌクレオチドであって：
【化Ｄ−Ｒ】
0006799918.tif 000008
ここにＤ／ＨはＤまたはＨであることができ、Ｄは重水素であり、そしてＨは水素であり；Ｂは核酸塩基であり；ｎは１以上１９９以下の前記オリゴヌクレオチド内のヌクレオチドの数を示し；Ｗは酸素または硫黄であり；Ｙは酸素またはＣ１−Ｃ１８アルコキシ、Ｃ１−１８アルキル；Ｒ３がＣ１−Ｃ１８アルキルまたはＣ１−Ｃ４アルコキシ−Ｃ１−Ｃ６−アルキルであるＮＨＲ３；ＮＲ３Ｒ４であってＲ３が前記Ｒ３と同一に定義され、Ｒ４がＣ１−Ｃ１８アルキルであるか、またはＲ３とＲ４がそれらを担持する窒素原子と共に５−６員の複素環を形成し、前記複素環がＯ、ＳおよびＮから構成されるグループから選択されるもう１つの複素原子を追加的に含むことが出来る，ＮＲ３Ｒ４である、
ことを特徴とする修飾リボ−オリゴヌクレオチド。
【請求項２】
Ｗが酸素であり、そしてＹが酸素であることを特徴とする請求項１に記載の修飾リボ−オリゴヌクレオチド。
【請求項３】
Ｗが硫黄であり、そしてＹが酸素であることを特徴とする請求項１に記載の修飾リボ−オリゴヌクレオチド。
【請求項４】
それぞれの個々の糖に対応する前記Ｂがプリンまたはピリミジンである、ことを特徴とする請求項１に記載の修飾リボ−オリゴヌクレオチド。
【請求項５】
それぞれの個々の糖に対応する前記Ｂが１つまたはそれ以上の重水素分子を含む、ことを特徴とする請求項４に記載の修飾リボ−オリゴヌクレオチド。
【請求項６】
それぞれの個々の糖に対応する前記Ｂが重水素化アデニン、重水素化シトシン、重水素化グアニンまたは重水素化ウラシルである、ことを特徴とする請求項５に記載の修飾リボ−オリゴヌクレオチド。
【請求項７】
前記修飾リボ−オリゴヌクレオチドは、ホスホジエステル  ヌクレオチド結合またはホスホロチオエート結合を有する、ことを特徴とする請求項１に記載の修飾リボ−オリゴヌクレオチド。
【請求項８】
前記Ｂは、天然に発生する核酸塩基または修飾核酸塩基である、ことを特徴とする請求項７に記載の修飾リボ−オリゴヌクレオチド。
【請求項９】
前記Ｂは、プリンまたはピリミジンである、ことを特徴とする請求項７に記載の修飾リボ−オリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
前記Ｂは、１つまたはそれ以上の重水素分子を含む、ことを特徴とする請求項８に記載の修飾リボ−オリゴヌクレオチド。
【請求項１１】
ヌクレオチド配列が、下記の表３−２の配列ＩＤ番号４、配列ＩＤ番号５、配列ＩＤ番号６、配列ＩＤ番号７、配列ＩＤ番号８、配列ＩＤ番号９、配列ＩＤ番号１０、配列ＩＤ番号１１、または配列ＩＤ番号１２である、ことを特徴とする請求項１に記載の修飾リボ−オリゴヌクレオチド：
【表３−２】
0006799918.tif 000009
【請求項１２】
リボースが部分的に重水素化されている、ことを特徴とする請求項１０に記載の修飾リボ−オリゴヌクレオチド。
【請求項１３】
ヌクレオチド結合はホスホロチオエート結合である、ことを特徴とする請求項１０に記載の修飾リボ−オリゴヌクレオチド。
【請求項１４】
請求項１に記載の化学式を有する修飾リボ−オリゴヌクレオチドを合成する方法であって、
１つのリボース構造の多重の位置に重水素を取り込み、少なくとも、１つの重水素を２位に、１つの重水素を３位に、２つの重水素を５位に有する重水素化リボース構造を形成するステップと；
窒素を含む塩基構造を前記重水素化リボース構造に取り込み、それにより第１の重水素化ヌクレオシドを形成するステップと；
別の１つのリボース構造の多重の位置に重水素を取り込み、少なくとも、１つの重水素を２位に、１つの重水素を３位に、２つの重水素を５位に有する第２の重水素化リボース構造を形成するステップと；
窒素を含む塩基構造を前記第２の重水素化リボース構造に取り込み、それにより第２の重水素化ヌクレオシドを形成するステップと；
前記第１の重水素化ヌクレオシドと前記第２の重水素化ヌクレオシドを化学的に結合させるステップと；
を有することを特徴とする方法。
【請求項１５】
前記重水素化ヌクレオシドは天然核酸塩基または修飾核酸塩基を含む、ことを特徴とする請求項１４に記載の修飾リボ−オリゴヌクレオチドを合成する方法。
【請求項１６】
前記天然核酸塩基は、アデニン、シトシン、グアニン、またはウラシルである、ことを特徴とする請求項１５に記載の修飾リボ−オリゴヌクレオチドを合成する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド合成に関し、詳細には修飾ＲＮＡ，ホスホロアミダイトおよびＲＮＡオリゴヌクレオチド、および、部分的または完全に飽和した重水素化糖および／または核酸塩基を含むＲＮＡを合成するプロセス、および修飾オリゴヌクレオチドの合成のための重水素化ホスホロアミダイトに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
本発明は高純度重水素化糖、重水素化核酸塩基、重水素化ヌクレオシド、および定義された配列の重水素化ＲＮＡであって、生化学的に有用なそして生物学的に価値のある特性を示し、従って治療的な用途への可能性を有するものの合成に向けられている。過去数十年間において治療、診断、薬剤設計、細胞環境内におけるあるＲＮＡ配列の選択的阻害、および細胞内に存在する異なるタイプのＲＮＡの機能の遮断、に使用される多くのＲＮＡおよびＤＮＡ配列が開発された。１つのアプローチはアンチセンス技術の使用であった。アンチセンスオリゴヌクレオチドは哺乳類細胞において望まれない遺伝子の発現を特異的に阻害するのに有用である。アンチセンスオリゴヌクレオチドはＲＮＡ、一般的にはメッセンジャーＲＮＡにハイブリッド化し、またその機能をリボヌクレアーゼＨの活性化により阻害するのに使用可能である。主にオリゴヌクレオチドは標的ＲＮＡのレベルにリボヌクレアーゼＨの活性化により影響を及ぼし、それがＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドのＲＮＡ鎖を切断する。その結果、アンチセンスオリゴヌクレオチドは疾病の治療に提案されてきた。このような技術は全ての疾病に対する強力な道具である可能性がありながら、分子安定性を含む幾つかの問題点がこの技術が主要な疾病治療法となることを妨げてきた。
【０００３】
もう１つのアプローチは、核酸ベースの分子によるｍＲＮＡレベルの遺伝子発現のサイレンジングに焦点を当てている。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は選択的遺伝子阻害に対して大きな可能性を示し、そして種々の生化学的および薬理学的プロセスの制御と管理に対し大きな期待を提供する。初期の研究は線虫におけるＲＮＡ干渉は２１および２２ヌクレオチドＲＮＡ配列により媒介されることを示した。Ｆｉｒｅ氏他、ネイチャー、３９１，８０６−８１１，１９９８参照。このことは、小ＲＮＡ２重鎖による、２１および２２ヌクレオチドＲＮＡ配列により媒介される、遺伝子発現の特異的阻害の一般的現象を示す研究によりさらに確認された。Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，１８８−２００，２００１参照。同時研究が無脊椎動物および脊椎動物における小２重鎖（ｄＳ）ＲＮＡによるこのような特異的遺伝子発現の現象を確認した。種々の研究がまた、選択的および特異的遺伝子阻害および調節に対する強力な道具としてＲＮＡ干渉の使用を示した。西倉，Ｋ．，Ｃｅｌｌ，１０７，４１５−４１８，２００１；  Ｎｙｋａｎｅｎ他，Ｃｅｌｌ，１０７，３０９−３２１，２００１；Ｔｕｓｃｈｌ，Ｔ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０，４４６−４４８，２００２；Ｍｉｔｔａｌ，Ｖ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．，５，３５５−３６５，２００４；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９９，６０４７−６０５２，２００２；Ｄｏｎｚｅ，Ｏ．＆Ｐｉｃａｒｄ，Ｄ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，３０，ｅ４６，２００２；Ｓｕｉ，Ｇ他，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９９，５５１５−５５２０，２００２；Ｐａｄｄｉｓｏｎ他，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，１６，９４８−９５９，２００２；参照。
【０００４】
天然２重鎖（ｄｓ）ＲＮＡ配列の使用に加えて、化学的に修飾されたＲＮＡが哺乳類細胞において類似のまたはより強いＲＮＡ干渉を引き起こすことが、２´−デオキシ−２´−フルオロ−β−Ｄ−アラビノ核酸（ＦＡＮＡ）をｓｉＲＮＡ活性に対する配列の中に使用して示されてきた。Ｄｏｗｌｅｒ他，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ３４，１６６９−１６７５，２００６参照。ＳｉＲＮＡの特性を改良するためのさまざまな他の修飾が追求されてきた、それには骨格化学組成における変更、２´−糖修飾、核酸塩基修飾、を含む。Ｎａｗｒｏｔ，Ｂ他，Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，６，９１３−９２５，２００６およびＭａｎｏｈａｒａｎ，Ｍ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，８，５７０−５７９，２００４参照。ＳｉＲＮＡの修飾は許容されてきたが、幾つかの研究は毒性の増大と有効性の減少をしめした。Ｈａｒｂｏｒｔｈ他，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．，１３，８３−１０５，２００３参照。Ｃｈｉｕ他は２´−Ｏ−メチル修飾が、Ａ型ＲＮＡ様らせん構造を維持しながら、ＳｉＲＮＡ活性を保持し、または場合によっては配列内のこのような修飾の数に依存してＳｉＲＮＡ活性を減少させることを示した。ＲＮＡ，９，１０３４−１０４８，２００３参照。
【０００５】
配列の大規模な２´−Ｏ−メチル修飾がＳｉＲＮＡ活性を失うことなくセンス鎖において起こりうることもまた示された。Ｋｒａｙｎａｃｋ，Ｂ．Ａ．，Ｂａｋｅｒ，Ｂ．Ｆ．ＲＮＡ，１２，１６３−１７６，２００６参照。高い結合親和性を付与する二環ロックド核酸（ＬＮＡ）が、ｓｉＲＮＡ配列の中央領域が忌避される場合は特に、ｓｉＲＮＡ配列中に導入されてきた。Ｂｒａａｓｈ他、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４２、７９６７−７９９５、２００３参照。同様に強固な立体構造を含むアルトリトール糖修飾オリゴヌクレオチド（ＡＮＡ）が配列特異的な様式でＲＮＡと分解性二重鎖を形成することが示されている。また、ＡＮＡはＡ型らせん構造（ＲＮＡ型）に留まることが示されている。Ｆｉｓｈｅｒ，Ｍ．他，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３５，１０６４−１０７４，２００７は、ＭＤＲ１遺伝子を標的とするＡＮＡ修飾ｓｉＲＮＡが、未修飾対照と比較して改善された有効性を示し、修飾がセンスまたはアンチセンス鎖の３´−末端の近くにあったときに特異的に有効であることを明らかにした。
【０００６】
いくつかの研究は、様々な送達システムによるｓｉＲＮＡ取り込みに対する可能性を示した。このような送達システムは、次に治療薬の開発に利用することができる。コレステロール結合ｓｉＲＮＡは、細胞への送達と遺伝子発現抑制を達成することができる。加えて、脂質結合ｓｉＲＮＡ、胆汁酸、および長鎖脂肪酸は、インビボでの細胞へのｓｉＲＮＡの取り込みおよび遺伝子発現抑制を媒介することができる。組織におけるｓｉＲＮＡ複合体の効率的かつ選択的な取り込みは、リポタンパク質粒子との最大結合、リポタンパク質／受容体相互作用および膜貫通タンパク質媒介性取り込みに依存している。高密度リポタンパク質は、ｓｉＲＮＡの送達を肝臓、腸、腎臓およびステロイドを含有する臓器へ仕向ける。また、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）はｓｉＲＮＡを主に肝臓に仕向ける。研究は、ＬＤＬ受容体がｓｉＲＮＡの送達に関与していることを示した。したがって、ｓｉＲＮＡは、化学修飾により、ヌクレアーゼ分解から保護し、炎症を抑制し、非特異的遺伝子発現抑制を減少させ、それにより標的遺伝子への有効性を改善するために設計できると提案されてきた。増大した細胞取り込みを可能にする、送達媒体や脂質および他の親油性分子の複合体は、治療薬の開発のために不可欠である。このようなｓｉＲＮＡは、現在、ヒト標的検証、疾患経路との干渉に対して開発され、そして薬剤開発のための新たなフロンティアを開拓している。
【０００７】
ｓｉＲＮＡのセンス鎖の３´−末端は、修飾でき、またリガンドの結合は、この端部での結合が最も適している。例えば、Ｙａ−Ｌｉｎ  ＣｈｉｕおよびＴａｒｉｑ  Ｒａｎａ，ＲＮＡ，９，１０３４−１０４８，２００３；Ｍ．Ｍａｎｏｈａｒａｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ，６，５７０−５７９，２００４；Ｎａｗｒｏｔ，  Ｂ．およびＳｉｐａ，Ｋ．，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，６，９１３−９２５，２００６；Ｓｃａｒｉｎｇｅ，Ｓ．他．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２２，３２６−３０，２００４参照。親油性または疎水性基の導入とｓｉＲＮＡ送達の強化および標的の最適化は、指摘されてきて、そして生体分子結合により達成された。一般に、結合は、センス鎖の３´−末端で行われるが、アンチセンス鎖の３´−末端でも行われうる。ヌクレアーゼ耐性ｓｉＲＮＡの設計は、効果的な治療法を開発する試みのなかで鋭意の研究と開発の主題であった。従って、例えば、２−チオウリジン、シュードウリジン、およびジヒドロウリジンなどの塩基の修飾は、ＲＮＡ分子の立体構造と関連する生物学的活性に対する影響を示した。Ｓｉｐａ他、ＲＮＡ、１３、１３０１−１３１６、２００７参照。Ｌａｙｚｅｒ他、ＲＮＡ、１０、７６６−７７１、２００４は、２´−修飾ＲＮＡ、特に２´−フルオロがインビボでヌクレアーゼに対して大きな耐性を有し、そして生物学的に活性であることを示した。Ｄａｎｄｅ他、Ｍｅｄ．，Ｃｈｅｍ．，４９、１６２４−１６３４、２００６は、ｓｉＲＮＡの特性の向上とＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の増強のため、２´−Ｏアルキル修飾と組み合わせて４´−チオ修飾糖ヌクレオシドを使用した。Ｌｉ他、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．、３２９、１０２６−１０３０、２００５およびＨａｌｌ他、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、３２、５９９１−６０００、２００４は、インビボでのｓｉＲＮＡのヌクレオチド間リン酸塩のホスホロチオエートおよびボラノリン酸との置換を示している。
【０００８】
インビボでの安定性およびヌクレオシドの適切な修飾に加えて、ｓｉＲＮＡ分子、ＲＮＡ分子、アプタマーおよび合成ＤＮＡ分子の生体結合は、細胞膜透過性に対する重要な機能を必要とする。不十分な膜通過による細胞内取り込みはｓｉＲＮＡ、他の一本鎖ＲＮＡ、あるいは様々なＤＮＡ分子に対してさえその有用性を制限する。このように、ｓｉＲＮＡの３´−末端に結合したコレステロールは、インビボの細胞内輸送及び遺伝子の治療的発現抑制を改善することが示されている。Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋ他、Ｎａｔｕｒｅ、４３２、１７３−０１７８、２００４参照。コレステロールに加えて、天然および合成のタンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）、細胞膜透過性ペプチド（ＣＰＰ）、または膜透過性ペプチド（ＭＰＰ）とも呼ばれる、を含む様々な接合体が開発されてきた。ＰＴＤは、細胞膜と相互作用することができる短いアミノ酸配列である。ＭＰＰ−ｓｉＲＮＡ接合体の取り込みは急速に起こる。このようなペプチドは、好適には鎖の３´−末端に接合されうる。ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）−オリゴヌクレオチド接合体は、様々な接合複合体で使用されてきて、標的細胞内への取り込み後に大きな遺伝子発現抑制効果を有する。大石他、Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，１２７，１６２４−１６２５，２００５参照。
【０００９】
アプタマーは、ｓｉＲＮＡの部位特異的送達のために使用されてきた。アプタマーがその標的に対して高い親和性を有することを考慮すると、ｓｉＲＮＡとの接合は優れた送達システムとして作用し、そして標的遺伝子発現の効率的な阻害をもたらす。Ｃｈｕ他，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３４（１０），ｅ７３，２００６参照。これらの分子は、ｓｉＲＮＡまたは他の生物学的に活性なオリゴヌクレオチドの３´−末端に接合させることができる。３´−末端での様々な脂質接合体は、本発明で記載された方法によって合成されたオリゴヌクレオチドに結合することができ、そしてオリゴヌクレオチドの効率的な内部移行のために利用することができる。親油性部分は、ホスホロアミダイトを合成するためのヒドロキシル官能基で構成されている。同様に、親油性部分は、終端にカルボキシル官能基を持つことができる。後者は、ＤＣＣＤ（ジシクロヘキシルカルボジイミド）または類似のカップリング試薬を使用して、逆末端方向に合成されたオリゴヌクレオチドの、Ｃ−６アミノリンカーアミダイトなどのアミノ酸リンカーを、カルボキシル部分に最後に付加することによって合成された、スペーサーを有する３´−アミノ基に結合することができる。Ｐａｕｌａ他，ＲＮＡ，１３，４３１−４５６，２００７参照。
【００１０】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡは）遺伝子調節において役割を果たすことが示されている非翻訳ＲＮＡの大分類である。Ｂａｒｔｅｌ，Ｄ．Ｐ．Ｃｅｌｌ，１１６，２８１−２９７；Ｈｅ他、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ，５：５２２−５３１，２００４；Ｌａｇｏｓ−Ｑｕｉｎｔａｎａ他，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０４：８５３−８５８，２００１参照。少なくとも１０００個のｍｉＲＮＡがヒトゲノム全体に散らばって存在すると推定されている。これらｍｉＲＮＡの多くは、多数の標的遺伝子を減少させることが示されている。Ｌｉｍ他，Ｎａｔｕｒｅ，４３３：７６９−７７３，２００５参照。マイクロＲＮＡの異なる組み合わせが哺乳動物細胞における標的遺伝子の調節に関与する可能性がある。ｓｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡとして機能することが示されてきた。Ｋｒｅｋ他，  Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，３７：４９５−５００，２００５；Ｄｏｅｎｃｈ他，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，１７：４３８−４４２，２００３参照。マイクロＲＮＡは、治療薬として及び遺伝子調節に大きな可能性を有している。Ｈａｍｍｏｎｄ，Ｓ．Ｍ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．１２：９９−１０１，２００６参照。膨大な努力が現在、ｍｉＲＮＡ経路、疾患の発症におけるそれらの役割、および癌におけるそれらの役割を理解することに対して向けられている。さらに、ｍｉＲＮＡ標的は、治療および診断の開発のために開発されている。多数のｍｉＲＮＡが特定され、そしてそれらの役割はマイクロアレイ、ＰＣＲおよび情報科学を通じて決定されている。ｍｉＲＮＡを標的とするように設計されたＲＮＡの合成はまた、ＲＮＡ合成および、ＲＮＡの安定性とよりよい細胞内取り込みをもたらす生体分子結合のためにｓｉＲＮＡの場合に必要とされるものと同様の修飾を必要とする。本発明は、この研究と開発のペースを大幅に加速させるであろう。
【００１１】
治療グレードのＲＮＡとｓｉＲＮＡの合成は、オリゴヌクレオチドの３´−末端の修飾または標識化を必要とする。ｓｉＲＮＡの場合、一般的には、センス鎖の３´−末端である。３´−から５´−合成法を使用した、親油性長鎖リガンドまたは発色団を必要とする、３´−末端修飾ＲＮＡの合成は、困難であり、そして対応する固体支持体が必要である。そのような合成は、所望の疎水性修飾を含む大量の短縮型配列に起因して、一般的に低いカップリング効率と最終オリゴヌクレオチドの全体的に低い純度をもたらす。本発明者らは、５´−から３´−方向におけるＲＮＡ合成のためのリバースＲＮＡモノマーホスホロアミダイトを開発することにより、この問題にアプローチした。このアプローチは、不純物の非常に少ないオリゴヌクレオチドの合成につながり、それにより３´−末端での様々な修飾が不純物無くかつ効率的に導入可能となる。
【００１２】
安定性を高めるために、脂質を含有するオリゴヌクレオチドが合成されてきた。脂質の結合は、ＲＮＡの効率的な送達と、オリゴヌクレオチドの細胞内濃度の増加を提供する。コレステロールなどの疎水性分子はＬＤＬ粒子および脂肪タンパク質に結合し、オリゴヌクレオチドを輸送するためのこれらのタンパク質に関する送達プロセスを活性化することができる。脂質性核酸はまた、オリゴヌクレオチドの親水性を減少させることもできる。また脂質性核酸がオリゴヌクレオチドの有効性を改善することが示されている。Ｓｈｅａ他，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６，６５５３，１９８９；Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ，Ｂ．，およびＷａｇｎｅｒ，Ｅ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２０，５３３，１９９２；Ｓａｉｓｏｎ，−Ｂｅｈｍｏａｒａｓ他、Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ，１０，１１１１，１９９１；Ｒｅｅｄ他，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，２，２１７，１９９１；Ｐｏｌｕｓｈｉｎ他，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ＆  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１２，８５３，  １９９３；Ｍａｒａｓｃｏ他，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，３５，３０２９，  １９９４参照。アダマンタン、エイコセン酸、コレステロール、およびジヘキサデシルグリセロールのような一連の疎水性グループは、３´−末端でオリゴデオキシ核酸に結合され、そして相補的ＲＮＡ配列にハイブリダイズされた。融解温度（Ｔｍ）が影響を受けないことが発見され、そのことは、このようなグループがオリゴハイブリダイゼーション特性に干渉しないことを示した。Ｍａｎｏｈａｒａｎ他，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，  ３６，１９９５；Ｍａｎｏｈａｒａｎ他，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，３６，  ３６５１−３６５４，１９９５；Ｇｅｒｌｔ，Ｊ．Ａ．，Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｌｉｎｎ，Ｓ．Ｍ．，Ｌｌｏｙｄ  Ｒ．Ｓ．，Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｒ．Ｊ．，Ｅｄｓ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ｐ−１０，１９９３参照。
【００１３】
合成ＲＮＡ分子の効率的な送達に関して、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の種々のオリゴヌクレオチドへの結合は良好な特性を示した。ＰＥＧ−オリゴマーは、高速消化を防止することにより、酵素の安定を示した。熱融解反応は影響を受けず、それにより二本鎖構成の特性を保持した。  Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ他，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ，２００８，５２，１０３−１０４は、最近、親油性大分子の合成ＲＮＡへのクリーンな結合のための逆端末方向ＲＮＡ合成プロセスを開発した。
【００１４】
（従来技術の記載）
多くのヌクレオシド及びオリゴヌクレオチドに対して重水素標識化研究およびＮＭＲ分析が行われてきた。ＤＮＡとＲＮＡの構造とダイナミクスは、それらの生物学的機能を理解するために不可欠である。これは種々の物理化学的技術によって研究されてきた。これらの技術の中で、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法は、生物学的条件下での局所構造とダイナミクスの変化の意味づけに対する立体構造の情報を提供するため、強力なツールとして広く利用されている。これは、強力なコンピュータおよび高共鳴エネルギー機器を用いてリファインされている。磁場の増加に伴い、より高い感度が、良好な品質のスペクトルを得るために必要とされるオリゴマーの量を減少させ、そして共鳴信号の分散を増大させ、それが一次に対する二次のＪ結合による共振重複に起因するスペクトルの複雑さを減少させる。
【００１５】
デオキシヌクレオシド、リボヌクレオシド、および修飾ヌクレオシドの特定の位置への重水素の取り込みを記述する研究のほとんどは、オリゴヌクレオシドの構造および立体構造の詳細を決定しようとする努力のなかでプロトン核磁気共鳴（ＮＭＲ）により実行された。オリゴヌクレオチドのプロトンＮＭＲスペクトルは、一般的には非常に複雑で、立体構造＆構造的情報を明らかにしない。オリゴヌクレオチドがかなりの重複ＮＭＲ共鳴を有する結果として、重水素化オリゴヌクレオチドの構造決定は、生物学的に機能的なＤＮＡまたはＲＮＡ分子のＮＭＲ構造決定のために使用されてきた。共鳴に関連する問題を克服するために、研究者らは、不均一な重水素標識化技術を開発した。Ｆｏｌｄｅｓｉ他，Ｊ．  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，１９９２，４８，９０３３；Ｆｏｌｄｅｓｉ他，Ｊ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９９３，２６参照。重水素標識化されたオリゴヌクレオチドは、ＮＭＲスペクトルを簡素化し、大きな分子の小さな領域から明白な態様でＪ結合及びＮＯＥボリュームの両方の決定を可能にする。Ｇｌｅｍａｒｅｃ他，Ｊ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９６，２４，２００２、およびＬｕｄｗｉｇ，Ｊ．Ａｃｔａ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．，１９８１，１６，１３１参照。
【００１６】
同様に、多数のオリゴＤＮＡおよびＲＮＡの部位特異的重水素化は、オリゴヌクレオチドのわずかなセグメントだけがＮＭＲで可視である「ＮＭＲウィンドウ」概念によってＮＭＲ構造を研究するために使用されてきた。このアプローチは２１−塩基長のＲＮＡヘアピンループ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｌ９９６  ２４：１１８７およびＮｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  １９９７，５＆６，７４３参照、および３１−塩基長のステム内部、ループ−ステム内部、ループ−ステム−ヘアピンループＲＮＡのＮＭＲ構造を解明するために使用された。ジアステレオ特異的にＣ−２´（オリゴＤＮＡ内重水素ラベル化ヌクレオシドブロック、Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，１９９５、５１、１００６５）が正常にＮＭＲの解釈、減少したスピン拡散のコレクション、および、３ＪＨ１´、Ｈ２´´および３ＪＨ１´、Ｈ２´´カップリング定数の抽出に成功裏に使用された。
【００１７】
Ｈｕａｎｇ他、Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９７，２５，４７５８−４７６３は、オリゴヌクレオチドの２次元（２Ｄ）核オーバーハウザー効果分光分析（ＮＯＥＳＹ）スペクトルにおいて、もしプリンのＨ−８、およびピリミジンのＨ−６が重水素で置換される場合、核酸塩基を糖のプロトンと互いに関係させるクロスピークが全て消滅することを示した。同様に、研究者は２Ｈ  ＮＭＲによるＤＮＡとタンパク質の相互作用のダイナミクスの役割研究に興味を持ってきた。ソリッドステート２Ｄ  ＮＭＲは、オリゴヌクレオチド中の種々の官能基の動きについての貴重な情報を提供する。Ｃｈｉｒｕｋｕｌおよび共同研究者らは、特定の重水素化がそのような構造的特徴を決定する上で非常に重要な役割を果たしていることを示した。Ｃｈｉｒａｋｕｌ他，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ，２００１，２０，１９０３−１９１３参照。
【００１８】
酵素認識は水素に代わる重水素置換または酵素結合では悪影響を受けない。特定の配列の酵素認識は、オリゴヌクレオチドの特定の役割のためのオリゴヌクレオチドの生化学的相互作用の最初のステップであり、そして重水素標識化は部位認識の生化学的プロセスを変更しない。同様に、重水素と水素の原子半径が認識パターンの任意の破壊にとって非常に近似しているため、二本鎖のハイブリダイゼーションは、重水素標識化により影響されないことが知られている。
【００１９】
オリゴヌクレオチドの糖部分において、水素に代わる重水素（炭素−水素結合を炭素−重水素結合にする）の多重の共有結合標識化は、エキソおよびエンドヌクレアーゼにより細胞環境中で急速に起こるオリゴヌクレオチドの消化速度を低めることが期待される。オリゴヌクレオチドの迅速な消化は、オリゴヌクレオチドの短い半減期および身体からの排出により証明される。これは、ＤＮＡ分子と比較して、ＲＮＡ分子でずっと顕著である。治療用オリゴヌクレオチドの遅い消化は、他の物理的または生化学的特性に影響を与えないが、治療上の候補に追加の利点を加えることが期待されている。重水素化リボ−オリゴヌクレオチドの様々な生化学的効果が予測され、重水素化オリゴはオリゴヌクレオチドの小さな断片への消化を遅らせ、そして、水素結合、リボヌクレアーゼＨ（ＲＮＡｓｅ  Ｈ）編集活性、またはＲＮＡ誘導発現抑制複合体（ＲＩＳＣ複合体）による認識に関して影響を与えないことが期待される。細胞内加水分解または重水素交換は重水（Ｄ２Ｏ）を遊離する結果となる可能性がある。
【００２０】
重水素交換の酵素的方法は、重水素標識化のために日常的に行われてきた。しかし交換方法は酵素反応に存在する平衡に起因して完全ではない。重水素標識化されたオリゴヌクレオチドは、同様に細胞環境内で重水素を水素と交換し、その結果細胞環境内に重水を放出することが予想される。重水は、栄養剤として知られているので、本発明のオリゴヌクレオチドは、栄養的価値を提供することができる。
【００２１】
ヌクレオシド及びオリゴヌクレオチドのスペクトル割り当てのための重水素交換の使用は非常に広範に行われてきた。核酸塩基残基の重水素化は、デオキシオリゴマー内におけるｐＨ７．８での亜硫酸水素重水素アンモニウムとＣ８−プリンとＣ５−シトシンのプロトンとの交換において記載され、それは９０−９５％の原子２Ｈを取り込んだ。Ｂｒｕｓｈ  他、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９８８，２７，１１５；Ｂｒｕｓｈ他、Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９８，１１０，４４０５は２Ｈ２Ｏ内の白金触媒によるチミジンのＣ５−メチルの交換を記載した。
【００２２】
重水素取り込みの高いレベル（Ｄ／Ｈ比）を提供するために、糖およびヌクレオシドの両方のレベルでの重水素の取り込みのための多種多様な酵素的および化学的方法が開発されてきた。重水素交換の酵素的方法は、一般に組み込みのレベルが低く、そして有意のレベルの浮遊共鳴を提供する。酵素による取り込みは、重水素化モノヌクレオチドブロックの単離のために必要とされる煩雑な分離技術に起因するさらなる複雑さを有する。Ｓｃｈｍｉｄｔ他，Ａｎｎ．Ｃｈｅｍ．１９７４，１８５６；Ｓｃｈｍｉｄｔ他，Ｃｈｅｍ．Ｂｅｒ．，１９６８，１０１，５９０は、２´，３´−Ｏ−イソプロピリデンアデノシン−５´カルボン酸またはメチル−２，３−イソプロピリデン−β−Ｄ−リボフラノシドウロン酸から調製される、５´，５´´−２Ｈ２−アデノシンの合成を記載している。Ｄｕｐｒｅ，Ｍ．およびＧａｕｄｅｍｅｒ，Ａ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．１９７８，２７８３参照。Ｋｉｎｔａｎａｒ他，Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９８，１１０，６３６７は５´−重水素アデノシン及び５´（Ｒ／Ｓ）−重水素化チミジンのジアステレオ異性体の混合物は、重水素化ホウ素ナトリウムまたは重水素化リチウムアルミニウム（９８原子％の２Ｈ取り込み）を使用して、適切な５´−アルデヒドの還元により得ることができることを報告した。Ｂｅｒｇｅｒ他，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ＆  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  １９８７，６，３９５は、２Ｈ２Ｏ／ピリジン混合物（１：１）中のアルデヒドを加熱し、その後そのアルデヒドをＮａＢＤ４で還元することによる、２´−デオキシグアノシンの５´−アルデヒド誘導体を５´または４´−重水素−２´−デオキシグアノシンに変換することを記載した。
【００２３】
Ａｊｍｅｒａ他，Ｌａｂｅｌｌｅｄ  Ｃｏｍｐｄ．１９８６，２３，９６３は４´−重水素で標識化したウリジンおよびチミジン（９８原子％の２Ｈ）を得るための手順を記載した。Ｓｉｎｈａｂａｂｕ他，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９８５，１０７，７６２８は、ナトリウムホウ重水素を使用し、１，２：５，６−ジ−０−イソプロピリデン−Ｂ−Ｄ−ヘキソフラノース−３−ウロースの１，２：５，６−ジ−０−イソプロピリデン−３−重水素−Ｂ−Ｄ−リボヘキソフラノースへの立体選択的還元に際しての糖合成の間のアデノシンのＣ３´における重水素の取り込みを示し、その後さらにヌクレオシド合成に進んだ。Ｒｏｂｉｎｓ，他，Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９９０，５５，４１０は、酢酸中の重水素化ホウ素ナトリウムによる、２´−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）３−ケトヌクレオシドの還元時に、実質的に完全な立体選択性で、アデノシンのＣ３´における９５％以上の原子２Ｈの取り込みの合成を報告した。Ｄａｖｉｄ，Ｓ．およびＥｕｓｔａｃｈｅ，Ｊ．，Ｃａｒｂｏｈｙｄ．Ｒｅｓ．１９７１，１６，４６；およびＤａｖｉｄ，Ｓ．およびＥｕｓｔａｃｈｅ，Ｊ．，Ｃａｒｂｏｈｙｄ．Ｒｅｓ．１９７１，２０，３１９は、２´−デオキシ−２´（Ｓ）−重水素−ウリジンおよびシチジンの合成を記載した。合成は１−メチル−２−デオキシ−２´−（Ｓ）−重水素化リボフラノシドを用いて行った。
【００２４】
Ｒａｄａｔｕｓ他、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．ＳＯＣ．１９７１，９３，３０８６は、２´−モノ重水素化（ＲまたはＳ）−２´−デオキシシチジンを合成するための化学的手順を記載した。これらの構造は、２−モノ重水素化−２−デオキシ−Ｄ−リボースから合成され、それは重水素化リチウムアルミニウムでの２，３−デヒドロ−ヘキソピラノースを立体特異的に還元し、そしてその結果物のグリカールを酸化して得られた。Ｗｏｎｇ他、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９７８，１００，３５４８は、ケテンジチオアセタール誘導体の形成とＬｉＡｌＤ４還元を含む反応順序により、Ｄ−アラビノースから、デオキシ−１−重水素化−Ｄ−エリスロ−ペントース，２−デオキシ−２（Ｓ）−重水素化−Ｄ−エリスロ−ペントース、及び２−デオキシ−１，２（Ｓ）−ジ重水素化−Ｄ−エリスロ−ペントースを獲得することを報告した。
【００２５】
Ｐａｔｈａｋ他、Ｊ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  １９８６，４２，５４２７は、適切なメチル２，３−アンヒドロ−β−Ｄ−リボまたはβ−Ｄ−リクソフラノシドのＬｉＡｌＤ４での還元的開環による、８個全ての２´または２´´−重水素化−２´−デオキシヌクレオシドの立体特異的合成を報告した。Ｗｕ他、Ｊ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  １９８７，４３，２３５５は、デオキシヌクレオシドおよびリボヌクレオシドの両方に対し全ての２´または２´´−重水素化−２´−デオキシヌクレオシドの合成を報告し、それは糖のＣ２´の酸化で始まり、そしてその後ＮａＢＤ４またはＬｉＡｌＤ４で還元し、それに続いて重水素化トリブチルスズにより脱酸素した。Ｒｏｙ他、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９８６，１０８，１６７５は、２´または２´´−重水素化−２´−デオキシグアノシンまたはチミジンが２Ｈ２Ｏ内の２−デオキシリボース−５−リン酸塩アルドラーゼ酵素を使用して２−デオキシリボース−５−リン酸塩から調製可能であり、およそ９０原子％の重水素化を達成することを報告した。
【００２６】
したがって、糖残基の各位置を選択的に標識化可能であることは明らかである。これらの重水素化されたヌクレオシドの多くが、ヌクレオシドおよびオリゴヌクレオチドの内部動作に関する固体２Ｈ−ＮＭＲの研究に使用されている。桧山他、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９８９，１１１，８６０９；Ａｌａｍ，ＴおよびＤｒｏｂｎｙ，Ｇ．  Ｐ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９０，２９，３４２１；Ａｌａｍ他、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９０，２９，９６１０；Ｈｕａｎｇ他、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．１９９０，１１２，９０５９；Ｄｒｏｂｎｙ，Ｇ．Ｐ．他、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９１，３０，９２２９参照。固体２Ｈ−ＮＭＲ分光法における温度依存線形状解析では、２´対２´´標識化の立体選択性または重水素化レベルは有意の役割を果たしていない。溶液研究における１Ｄおよび２Ｄ１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの単純化のための特異的に重水素標識化されたヌクレオチドの使用は、スペクトル情報にとって非常に有用ではなかった。
【００２７】
しかし、１Ｄ  ＮＭＲ研究における重水素化の最も広範な使用はＤａｎｙｌｕｋ他により行われた。これらの研究者は２Ｈ２Ｏ内で増殖させた藍藻類のＲＮＡダイジェストから、面倒な方法で事前重水素化２Ｈ−標識化モノヌクレオチド（約９０原子％の２Ｈ取り込み）を単離した。これらの事前重水素化ヌクレオシドブロックは、その後、１Ｄ１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（２００−３００メガヘルツ）における共鳴割り当てのための多種多様な部分重水素化二量体および三量体を得るために使用された。４，５´，５´´−２Ｈ３アデノシンの合成が行われ、それは適切にブロックされたアデノシン３リン酸に結合され、ＡｐＡ＊（ｐＡ＊４，５´，５´´−２Ｈ３−ｐＡ）を得た。この二量体は、リン酸およびＨ−３´の間の違いの明確な測定を可能にした。近藤他，Ａｍ．Ｃｅｍ．Ｓｏｃ．１９７２，９４，５１２１；近藤，  Ｌａｂｅｌｅｄ  Ｃｏｍｐｄ．１９７３，９，４９７；Ｅｚｒａ他，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９７５，５３，２１３；近藤およびＤａｎｙｌｉｋ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９７６，１５，３６２７；Ｌｅｅ他，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９７６，  １５，３６２７；Ｅｚｒａ他，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９７７，１６，１９７７参照。同様に４，５´，５´´−２Ｈ３グアノシンの合成は、グアノシンが豊富なオリゴヌクレオチドを合成するために実施可能である。
【００２８】
立体特異的重水素化の有用な代替的方法は多重に重水素化された糖を合成するために開発された。この方法は、２Ｈ２０中で重水素化ラネーニッケル触媒を使用して、ヒドロキシル含有炭素（即ち、ヒドロキシル含有炭素のメチレン及びメチンのプロトン）における重水素と水素の交換を採用した。詳細な研究は、交換比率の構造依存的な差異、ハイレベルなエピ化、脱酸素の有意に低い程度、および重水素化レベルの再現の困難さを明らかにした。（Ｂａｌｚａ他，Ｒｅｓ．，１９８２，１０７，２７０；Ａｎｇｙａｌ  他．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．１９８６，１５７，８３；Ｋｏｃｈ他、Ｒｅｓ．１９７８，５９，３４１；Ｗｕほか、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９８３，４８，１７５０；  およびＡｎｇｙａｌ他、Ｒｅｓ．１９８６，１５７，８３参照。）
【００２９】
様々な技術が完全に重水素化されたデオキシヌクレオシドおよびリボヌクレオシドの合成に使用できる。したがって、１つの方法、糖と重水素化ラネーニッケル−２Ｈ２０の交換反応では、２，３´および４´位置で特異的に標識化された多くの重水素化ヌクレオシドが調製された。手順はラネーニッケル−２Ｈ２０の交換反応によるメチルβ−Ｄ−アラビノピラノシドの２，３、４位置の重水素化の後、重水素化トリブチルスズによる２−水酸基の還元的消滅によりメチルβ−Ｄ−２，２´，３，４−２Ｈ４−２−デオキシリボピラノシドを得、それはメチルβ−Ｄ−２，２´，３，４−２Ｈ４−２−デオキシリボフラノシドに変換され、そしてグリコシル化されて種々の２，２´，３，４−２Ｈ４−ヌクレオシド（Ｈ３´とＨ４´に対して９７原子％超の２Ｈ取り込み；Ｈ２とＨ２´に対して約９４原子％の２Ｈ取り込み）を得る。（Ｐａｔｈａｋ，Ｔ．，Ｃｈａｔｔｏｐａｄｈｙａｙａ，Ｊ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  １９８７，４３，４２２７；Ｋｏｃｈ，Ｈ．  Ｊ．，Ｓｔｕａｒｔ，Ｒ．Ｓ．，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．１９７７，５９．Ｃ１；Ｂａｌｚａ，Ｆ．，Ｃｙｒ，Ｎ．，Ｈａｍｅｒ，Ｇ．Ｋ．，Ｐｅｒｌｉｎ，Ａ．Ｓ．，  Ｋｏｃｈ，Ｈ．Ｊ．，Ｓｔｕａｒｔ，Ｒ．Ｓ．，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．１９７７，５９，Ｃ７；Ｋｏｃｈ，Ｈ．Ｊ．，Ｓｔｕａｒｔ，Ｒ．Ｓ．，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．  Ｒｅｓ．１９７８，６４，１２７；Ｋｏｃｈ，Ｈ．Ｊ．，Ｓｔｕａｒｔ，Ｒ．Ｓ．，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．１９７８，５９，３４１；Ｂａｌｚａ，Ｒ，Ｐｅｒｌｉｎ，  Ａ．Ｓ．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．，１９８２，１０７，２７０；Ａｎｇｙａｌ，  Ｓ．Ｊ．，Ｏｄｉｅｒ，Ｌ．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．，１９８３，１２３，１３；  Ｗｕ，Ｇ．Ｄ．，Ｓｅｒｉａｎｎｉ，Ａ．Ｓ．，Ｂａｒｋｅｒ，Ｒ．Ｊ．，Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９８３，４８，１７５０；Ａｎｇｙａｌ，Ｓ．Ｊ．，Ｓｔｅｖｅｎｓ，Ｊ．Ｄ．，Ｏｄｉｅｒ，Ｌ．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．１９８６，１５７，８３；Ｋｌｉｎｅ，Ｐ．Ｃ，Ｓｅｒｉａｎｎｉ，Ａ．Ｓ．Ｍａｇｎ．Ｒｅｓｏｎ．Ｃｈｅｍ．，１９８８，２６，１２０；Ｋｌｉｎｅ，Ｐ．Ｃ．，Ｓｅｒｉａｎｎｉ，Ａ．Ｓ．Ｍａｇｎ．  Ｒｅｓｏｎ．Ｃｈｅｍ．，１９９０，２８，３２４；Ｒｏｂｉｎｓ，Ｍ．Ｊ．，Ｗｉｌｓｏｎ，Ｊ．Ｓ．，Ｈａｎｓｓｋｅ，Ｒ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９８３，１０５，４０５９．参照。）
【００３０】
重水素化ラネーニッケルで処理したメチルβ−Ｄ−エリトロフラノシドは、メチルβ−Ｄ−２，３，４（Ｓ）−２Ｈ３−エリトロフラノシド（Ｃ２およびＣ４位置において約７５原子％の２Ｈ取り込み；そしてＣ３において１００原子％の２Ｈ取り込み）を生産した（Ｋｌｉｎｅ，Ｐ．Ｃ；Ｓｅｒｉａｎｎｉ，Ａ．Ｓ．Ｍａｇｎ．Ｒｅｓｏｎ．Ｃｈｅｍ．，１９８８，２６，１２０参照）。この糖は、Ｄ−３，４，５（Ｓ）−２Ｈ３−リボースに変換された。これらのヌクレオシドはその後対応する３´、４´、５´（Ｓ）−２Ｈ３−２´−デオキシヌクレオシドに還元された（Ｋｏｃｈ，Ｈ．Ｊ．；Ｓｔｕａｒｔ，Ｒ．Ｓ．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．１９７８，６４，１２７；Ｋｌｉｎｅ，  Ｐ．Ｃ．，Ｓｅｒｉａｎｎｉ，Ａ．Ｓ．，Ｍａｇｎ．Ｒｅｓｏｎ．Ｃｈｅｍ．，１９９０，２８，３２４参照）。化合物３´、４´、５´（Ｓ）−２Ｈ３−リボヌクレオシドと同様に、１´，２´，３´，４´，５´，５´´（Ｓ）−２Ｈ６−リボヌクレオシドは完全に重水素化され適切に保護されたリボースから出発して合成可能である。
【発明の概要】
【００３１】
オリゴヌクレオチドによる治療薬は、合理的な薬物設計アプローチの強力な構成要素であり、多くのオリゴヌクレオチドが、市販されているかまたは臨床試験の様々な段階にある。以前は、重水素修飾ヌクレオシドは、デオキシ糖およびプリンおよびピリミジン塩基の特定の位置において合成されてきた。リン酸トリエステル技術またはホスホロアミダイトに基づく重水素化ＤＮＡシントンが合成され、そして規定された配列のオリゴヌクレオチドの合成のために使用されてきた。これらの研究は、ＤＮＡおよびＲＮＡの立体構造の研究、酵素補助触媒反応の活性部位の決定を唯一の目的としてきた。しかし重水素化オリゴヌクレオチドは、ヒトにおける治療用途、または、それらが生物学的および生化学的な薬剤として引き出すことができる役割について調べられて来なかった。
【００３２】
本発明は、重水素標識化ホスホロアミダイト、固体支持体キャップを有するリボースユニット、オリゴヌクレオチド、重水素標識化ヌクレオシドおよびオリゴヌクレオチドを合成するプロセスについて記載し、そして位置毎に０．１％−９８％の範囲で重水素を含む重水素化ヌクレオシドおよびオリゴヌクレオチドを合成するプロセスが想定される。一度既知のパーセントの重水素がヌクレオシドに組み込まれると、そのようなヌクレオシドはさらに、ホスホロアミダイトの合成、または固体相オリゴヌクレオチド合成のための固体支持体に結合したヌクレオシドの合成、が起こるまで、その後のステップで修飾されることができる。後続のステップにおいて０．１−９８％の重水素比が維持される。このような特定のかつ制御された重水素化は、我々の知る限り、過去に提案または実施されていない。形成された重水素化リボ−オリゴヌクレオチドは、増強された安定性を有するＲＮＡ配列を提供する。
【００３３】
オリゴヌクレオチドの重水素標識化は、毒性効果を提示すると予想されない。糖、プリン、ピリミジン塩基の選択された位置における重水素化、または、糖位置と核酸塩基の全体的重水素化のいずれかの選択的重水素修飾オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの生物学的特性の改善に貢献する。リボースの糖部分の様々な位置において特異的に重水素化されたオリゴヌクレオシドは、酵素安定性を増加させ、治療用オリゴヌクレオチドの安定性を有意に高めることが期待される。重水素置換は、酵素認識または酵素結合に影響を与えることが知られていない。部位特異的な原子移動が特異的に重水素標識化された十二量体の切断の構造的情報に利用されてきた。Ｖｏｓｓ，他，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，１９９０，１１２，９６６９−９６７０参照。特定の配列の酵素認識は、オリゴヌクレオチドの生化学的相互作用において、その特定の役割のための最初のステップであり、そして重水素標識化は部位認識の生化学的プロセスを変更しない。同様に、二本鎖のハイブリダイゼーションは、重水素標識化により影響を受けない。
【００３４】
重水素標識化されたオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリダイゼーション、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリダイゼーション、ＲＮＡ／ＲＮＡハイブリダイゼーションに適用可能な、ワトソンクリック塩基対形成メカニズム、またはＨｏｏｇｓｔｅｎまたは他のハイブリダイゼーションメカニズムのいずれかによる、相補鎖との水素結合に影響を与えないことが予想される。アンチセンスベースのオリゴ治療アプローチに関与している、重水素化ＤＮＡと相補的ＲＮＡとの間のリボヌクレアーゼ（ＲＮＡｓｅ）Ｈによる切断は、糖骨格または核酸塩基に共有結合する重水素の存在によって影響されないと予想される。したがって、重水素標識化オリゴヌクレオチドは、治療作用のアンチセンスモードで役割を果たすべきである。加えて、治療用途の重水素化ｓｉＲＮＡを開発することが可能であるべきである。オリゴヌクレオチド鎖の１つのヌクレオシド内に１つまたは複数の重水素を有するリボヌクレオシド及びオリゴヌクレオチドの合成のために提示された様々なスキームに基づいて、選択的または完全に重水素化されたＲＮＡ配列を有するアプタマーの設計が達成されることが予想される。ヌクレオシドにおける合成および重水素標識化の化学的方法は、糖と核酸塩基において、炭素水素結合（Ｃ−Ｈ）の位置のような、一般的に安定で、交換不可能な位置で行われる。
【００３５】
しかし細胞内では、わずかに塩基性のｐＨにおいて水素と重水素のゆっくりとした交換があると期待されている。インビボでの交換メカニズム（Ｃ−ＤからＣ−Ｈへ）による重水素の遅い放出により、そのような重水素標識化されたオリゴヌクレオチドは、栄養的に有益な効果という利点を提供する。したがって重水素標識化されたオリゴヌクレオチドは、ヌクレオシドおよびオリゴヌクレオチド中の様々なイオン化不可能な位置に天然の水素原子を有する、治療用オリゴヌクレオチドに置き換わる大きな潜在的可能性を有している。１つのオリゴヌクレオチドのヌクレオシドにおける特定の重水素化レベルの効果を測定するため、特定の炭素水素共有結合の、０．１％のような非常に低レベルの重水素化から９８％に至るまでの重水素化が実施され、そしてそのようなオリゴヌクレオチドは、その生化学的および生物学的効果と役割について研究されよう。このような体系的な生物学的研究は、薬や治療薬の開発により優れた指針を提供しよう。このような研究は、我々の知る限りにおいて提案または実施されていない。
【００３６】
本明細書で使用する用語「オリゴヌクレオチド」は、天然または修飾された複素環塩基部分により定義される特定の配列の中で接合する複数のヌクレオチドを指す。代表的な複素環塩基部分としては、限定されないが、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシルのような核酸塩基、ならびに、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、２，６−ジアミノプリン、アデニンおよびグアニンの６−メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよび他のアルキル誘導体、５−ハロウラシルおよびシトシン、６−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル（擬似ウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、オキサ、アミノ、チオール、チオアルキル、ヒドロキシルおよび他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニン、７−デアザアデニン、７−デアザグアニンなどの、自然発生しないおよび天然の他の核酸塩基を含む。本明細書で使用する修飾核酸塩基は、合成核酸塩基または、重水素化アデニン、重水素化シトシン、重水素化グアニンおよび重水素化ウラシルのような天然に存在する状態から変化した核酸塩基を定義する。
【００３７】
したがって、重水素化ヌクレオシド、ホスホロアミダイトおよびオリゴヌクレオチド、完全に重水素化されたホスホロアミダイトとオリゴヌクレオチドを合成するプロセス、および、種々の位置に０．１％−９８％の重水素を含む重水素化ホスホロアミダイトとオリゴヌクレオチドを合成するプロセス、を教示することが本発明の主な目的である。
また、ヌクレオシドの様々な位置に共有結合標識化された重水素を有する誘導体化されたリボヌクレオシド及びホスホロアミダイト、およびそれらから作られる製品を製造する方法を教示することが、本発明のさらなる目的である。
ヌクレオシドの様々な位置に共有結合的に標識化された重水素を有するリボヌクレオシドおよびホスホロアミダイトを教示することが本発明のさらなる目的である。
天然のリン酸ジエステル骨格を有する重水素標識化オリゴリボヌクレオチド、およびそれから作られる製品を製造するプロセスを教示することが本発明のさらなる目的である。
【００３８】
天然のリン酸ジエステル骨格を有する重水素標識化オリゴリボヌクレオチドを教示することが本発明のさらなる目的である。
ホスホロチオエート骨格を有する重水素標識化オリゴリボヌクレオチド、およびそれから作られる製品を製造するプロセスを教示することが本発明の別の目的である。
変異体骨格を有する重水素標識化したオリゴリボヌクレオチドを教示することが本発明のさらなる目的である。
ホスホロチオエート骨格を有する重水素標識化オリゴリボヌクレオチドを教示することが、本発明の別の目的である。
安定性を増強する重水素化骨格を持つオリゴヌクレオチドを教示することが本発明の別の目的である。
治療的処置に有用な重水素化オリゴヌクレオチドを教示することが本発明の別の目的である。
治療的処置に有用な重水素化ＲＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドを教示することが本発明の別の目的である。
本発明の他の目的および利点は、本発明の特定の実施形態により記載される、付随の図面と併せた以下の説明から明らかになるであろう。本明細書に含まれる全ての図面は、本明細書の一部を構成し、本発明の例示的な実施形態を含み、それらの様々な目的および特徴を例示する。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１Ａ−Ｄ】修飾された核酸塩基の化学構造を示す図であり、図１Ａは重水素化アデニン、図１Ｂは重水素化グアニン、図１Ｃは重水素化シトシン、図１Ｄは重水素化ウラシルをしめす。
【図２】スキーム１：１−Ｏ−アセテート−α／β２，３，５−Ｏ−トリベンゾイル−１−２，３，４，５，５´ペンタ重水素−Ｄ−リボフラノシドの合成を示す図である。
【図３】スキーム２：５´−Ｏ−ジメトキシトリチル２´−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル２´，３´，４´，５´，５´´ペンタ重水素３´−シアノエチルｎ，ｎ−ジイソプロピル  ホスホロアミダイト−β−Ｄリボフラノシル−ウリジンの合成を示す図である。
【図４】スキーム３：５´−Ｏ−ジメトキシトリチル２´−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル３´−スクシニルＩｃａａ−ＣＰＧ−２´，３´，４´，５´，５´´−ペンタ重水素−β−Ｄリボフラノシル−ウリジンの合成を示す図である。
【図５】スキーム４：５´−Ｏ−ジメトキシトリチル２´−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル３´−Ｎ、Ｎ−ジイソプロピル  シアノエチル  ホスホロアミダイト−２´，３´，４´，５´，５´´−ペンタ重水素−β−Ｄリボフラノシル−Ν４ベンゾイルシチジンの合成を示す図である。
【図６】スキーム５：５´−Ｏ−ジメトキシトリチル２´−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル３´−スクシニルＩｃａａ−ＣＰＧ−２´，３´，４´，５´，５´´−ペンタ重水素−β−Ｄリボフラノシル−Ν４ベンゾイルシチジンの合成を示す図である。
【図７】スキーム６：５´−Ｏ−ジメトキシトリチル２´，３´，４´，５´，５´´−ペンタ重水素−β−Ｄリボフラノシル−Ν６ベンゾイルアデノシンとして示される、本発明に従って修飾されたホスホロアミダイトの代替的な実施形態の合成を示す図である。
【図８】構造Ｃ−１：本発明に従った重水素化オリゴヌクレオチドの特定の実施形態の代表的な図である。
【図９Ａ−Ｂ】図９Ａは、構造Ｄ−１を示し、ホスホジエステル、ヌクレオチド間リンケージを持つ重水素化オリゴヌクレオチドの別の代替的実施形態を示す図である。図９Ｂは、構造Ｄ−２を示し、ホスホロチオエート、ヌクレオチド間リンケージとして示される、リン酸塩骨格変異体を有する重水素化オリゴヌクレオチドの別の代替的実施形態を示す図である。
【図１０】重水素化ヌクレオシドおよびホスホロアミダイトのＨＰＬＣ分析の総括図である。使用機材：Ｓｈｉｍａｚｄｕ、モデル、ＨＰＬＣカラム：ＣｈｒｏｓｅｐガードカラムＯｍｎｉｓｐｈｅｒｅ５ＣＩ８を備えるＣｈｒｏｍｓｅｐ  ＳＳ（４．６ｘ２５０ｍｍ）。
【図１１Ａ】１−Ｏ−アセテート−α／β２，３，５−トリベンゾイルリボフラノシドの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図１１Ｂ】１−Ｏ−アセテート−α／β２，３，５−トリベンゾイルリボフラノシドの陽イオン質量分析スペクトルである。ロット番号：ＳＫ３８−３８、計算質量：５０４．１４；観測質量：５２２．４０。
【図１２Ａ】１−Ｏ−アセテート−α／β２，３，５−トリベンゾイル−２，３，４，５，５´ペンタ重水素−Ｄリボフラノシド（構造ＶＩ）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。Ｈ−４プロトンは、約５０％の強度で示され、これにより、この位置での約５０％の重水素取り込みを示す。
【図１２Ｂ】１−Ｏ−アセテート−α／β２，３，５−トリベンゾイル−２，３，４，５，５´ペンタ重水素−Ｄリボフラノシド（構造ＶＩ）の陽イオン質量スペクトルである。計算質量：５０９．１７；観測質量：５２６．８０（Ｍ＋ナトリウム）。
【図１３Ａ】２´，３´，５´−トリヒドロキシ−２´，３´，４´，５´，５´´ペンタ重水素β−Ｄリボフラノシル−ウリジン（構造ＩＸ）のＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図１３Ｂ】２´，３´，５´−トリヒドロキシ−２´，３´，４´，５´，５´´ペンタ重水素β−Ｄリボフラノシル−ウリジン（構造ＩＸ）のＨＰＬＣレポートである。
【図１３Ｃ】２´，３´，５´−トリヒドロキシ−２´，３´，４´，５´，５´´ペンタ重水素β−Ｄリボフラノシル−ウリジン（構造ＩＸ）の陽イオン質量スペクトルである。計算質量：２４９．１０；観測質量：２４７．３０。
【図１４Ａ】５´−Ｏ−ジメトキシトリチル２´，３´，４´，５´，５´´−ペンタ重水素β−Ｄリボフラノシル−ウリジン（構造Ｘ）のＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図１４Ｂ】５´−Ｏ−ジメトキシトリチル２´，３´，４´，５´，５´´−ペンタ重水素β−Ｄリボフラノシル−ウリジン（構造Ｘ）のＨＰＬＣレポートである。
【図１４Ｃ】５´−Ｏ−ジメトキシトリチル２´，３´，４´，５´，５´´−ペンタ重水素β−Ｄリボフラノシル−ウリジン（構造Ｘ）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【図１４Ｄ】５´−Ｏ−ジメトキシトリチル２´−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル３´−Ｏ−スクシニルピリジニウム塩−２´，３´，４´，５´，５´´−ペンタ重水素−β−Ｄリボフラノシル−Ν４ベンゾイルシチジン（化合物構造ＸＸＩＩＩ）の陽イオン質量スペクトルである。
【図１５Ａ】５´−Ｏ−ジメトキシトリチル２´−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル２´，３´，４´，５´，５´´−ペンタ重水素−β−Ｄリボフラノシル−ウリジン（構造ＸＩ）のＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図１５Ｂ】５´−Ｏ−ジメトキシトリチル２´−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル２´，３´，４´，５´，５´´−ペンタ重水素−β−Ｄリボフラノシル−ウリジン（構造ＸＩ）のＨＰＬＣレポートである。
【図１５Ｃ】５´−Ｏ−ジメトキシトリチル２´−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル２´，３´，４´，５´，５´´−ペンタ重水素−β−Ｄリボフラノシル−ウリジン（構造ＸＩ）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【図１５Ｄ】５´−Ｏ−ジメトキシトリチル−２´−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル２´，３´，４´，５´，５´´−ペンタ重水素−β−Ｄリボフラノシル−ウリジン（構造ＸＩ）の陽イオン質量スペクトルである。計算質量：６６５．３２；観測質量：６６４．００。
【図１６Ａ】５´−Ｏ−ジメトキシトリチル−２´−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル３´−Ｎ、Ｎ−ジイソプロピル  シアノエチル  ホスホロアミダイト−２´，３´，４´，５´，５´´−ペンタ重水素β−Ｄリボフラノシルウリジン（構造ＸＩＩＩ）のＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図１６Ｂ】５´−Ｏ−ジメトキシトリチル−２´−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル３´−Ｎ、Ｎ−ジイソプロピル  シアノエチル  ホスホロアミダイト−２´，３´，４´，５´，５´´−ペンタ重水素β−Ｄリボフラノシルウリジン（構造ＸＩＩＩ）のＨＰＬＣレポートである。純度：９６．７２％。
【図１６Ｃ】５´−Ｏ−ジメトキシトリチル−２´−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル３´−Ｎ、Ｎ−ジイソプロピル  シアノエチル  ホスホロアミダイト−２´，３´，４´，５´，５´´−ペンタ重水素β−Ｄリボフラノシルウリジン（構造ＸＩＩＩ）のＵＶ分析である。
【図１６Ｄ】５´−Ｏ−ジメトキシトリチル−２´−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル３´−Ｎ、Ｎ−ジイソプロピル  シアノエチル  ホスホロアミダイト−２´，３´，４´，５´，５´´−ペンタ重水素β−Ｄリボフラノシルウリジン（構造ＸＩＩＩ）のＵＶ分析レポートである。
【図１６Ｅ】５´−Ｏ−ジメトキシトリチル−２´−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル３´−Ｎ、Ｎ−ジイソプロピル  シアノエチル  ホスホロアミダイト−２´，３´，４´，５´，５´´−ペンタ重水素β−Ｄリボフラノシルウリジン（構造ＸＩＩＩ）の質量スペクトルである。計算質量：８６５．４３；観測質量：８６６．５０；質量＋ナトリウムイオン（８８８．４）。
【図１６Ｆ】５´−Ｏ−ジメトキシトリチル−２´−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル３´−Ｎ、Ｎ−ジイソプロピル  シアノエチル  ホスホロアミダイト−２´，３´，４´，５´，５´´−ペンタ重水素β−Ｄリボフラノシルウリジン（構造ＸＩＩＩ）の３１Ｐ  ＮＭＲスペクトルである。ロット番号：ＳＫ１８８−３８。１５０．５６０および１５０．０６９ｐｐｍに鋭い２重線；純度：１００％；Δ＝０．４９１。
【図１７Ａ】５´−Ｏ−ジメトキシトリチル−２´−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−２´，３´，４´，５´，５´´−ペンタ重水素β−Ｄリボフラノシル−Ν４ベンゾイルシチジン（構造ＸＸ）のＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図１７Ｂ】５´−Ｏ−ジメトキシトリチル−２´−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−２´，３´，４´，５´，５´´−ペンタ重水素β−Ｄリボフラノシル−Ν４ベンゾイルシチジン（構造ＸＸ）のＨＰＬＣレポートである。
【図１７Ｃ】５´−Ｏ−ジメトキシトリチル−２´−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−２´，３´，４´，５´，５´´−ペンタ重水素β−Ｄリボフラノシル−Ν４ベンゾイルシチジン（構造ＸＸ）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【図１７Ｄ】５´−Ｏ−ジメトキシトリチル−２´−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−２´，３´，４´，５´，５´´−ペンタ重水素β−Ｄリボフラノシル−Ν４ベンゾイルシチジン（構造ＸＸ）の質量スペクトルである。計算値質量：７６８．３６；質量観測：７６９．３０。
【図１７Ｅ】５´−Ｏ−ジメトキシトリチル−２´−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−３´−Ｏ−スクシニルピリジニウム塩−２´，３´，４´，５´，５´´−ペンタ重水素−β−Ｄリボフラノシル−ウリジン（構造ＸＩＶ）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【図１７Ｆ】５´−Ｏ−ジメトキシトリチル−２´−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−３´−Ｏ−スクシニルピリジニウム塩−２´，３´，４´，５´，５´´−ペンタ重水素−β−Ｄリボフラノシル−ウリジン（構造ＸＩＶ）のポジティブモードの質量スペクトルである。計算値質量：７６４．８３、観察された質量：７８８．１０（＋ナトリウムイオン）。
【図１８Ａ】２´，３´，５´−トリヒドロキシ−２´，３´，４´，５´，５´´ペンタ重水素β−Ｄリボフラノシル−Ν４ベンゾイルシチジン（構造ＸＶＩＩＩ）のＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図１８Ｂ】２´，３´，５´−トリヒドロキシ−２´，３´，４´，５´，５´´ペンタ重水素β−Ｄリボフラノシル−Ν４ベンゾイルシチジン（構造ＸＶＩＩＩ）のＨＰＬＣレポートである。
【図１８Ｃ】２´，３´，５´−トリヒドロキシ−２´，３´，４´，５´，５´´ペンタ重水素β−Ｄリボフラノシル−Ν４ベンゾイルシチジン（構造ＸＶＩＩＩ）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【図１８Ｄ】２´，３´，５´−トリヒドロキシ−２´，３´，４´，５´，５´´ペンタ重水素β−Ｄリボフラノシル−Ν４ベンゾイルシチジン（構造ＸＶＩＩＩ）の質量スペクトルである。計算質量：３５２．１４；観測質量：３５２．５０。
【図１９Ａ】５´−Ｏ−ジメトキシトリチル−２´，３´，４´，５´，５´´−ペンタ重水素β−Ｄリボフラノシル−Ν４ベンゾイルシチジン（化合物ＸＩＸ）のＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図１９Ｂ】５´−Ｏ−ジメトキシトリチル−２´，３´，４´，５´，５´´−ペンタ重水素β−Ｄリボフラノシル−Ν４ベンゾイルシチジン（化合物ＸＩＸ）のＨＰＬＣレポートである。
【図１９Ｃ】５´−Ｏ−ジメトキシトリチル−２´，３´，４´，５´，５´´−ペンタ重水素β−Ｄリボフラノシル−Ν４ベンゾイルシチジン（化合物ＸＩＸ）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【図１９Ｄ】５´−Ｏ−ジメトキシトリチル−２´，３´，４´，５´，５´´−ペンタ重水素β−Ｄリボフラノシル−Ν４ベンゾイルシチジン（化合物ＸＩＸ）の陽イオン質量スペクトルである。
【図２０Ａ】５´−Ｏ−ジメトキシトリチル−２´−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−３´−Ｎ、Ｎ−ジイソプロピル  シアノエチル  ホスホロアミダイト−２´，３´，４´，５´，５´´−ペンタ重水素β−Ｄリボフラノシル−Ν４ベンゾイルシチジン（構造ＸＸＩＩ）のＨＰＬＣクロマトグラムである。純度：７８．８８パーセント。
【図２０Ｂ】５´−Ｏ−ジメトキシトリチル−２´−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−３´−Ｎ、Ｎ−ジイソプロピル  シアノエチル  ホスホロアミダイト−２´，３´，４´，５´，５´´−ペンタ重水素β−Ｄリボフラノシル−Ν４ベンゾイルシチジン（構造ＸＸＩＩ）のＨＰＬＣレポートである。純度：７８．８８パーセント。
【図２０Ｃ】５´−Ｏ−ジメトキシトリチル−２´−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−３´−Ｎ、Ｎ−ジイソプロピル  シアノエチル  ホスホロアミダイト−２´，３´，４´，５´，５´´−ペンタ重水素β−Ｄリボフラノシル−Ν４ベンゾイルシチジン（構造ＸＸＩＩ）のＵＶ分析レポートである。
【図２０Ｄ】５´−Ｏ−ジメトキシトリチル−２´−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−３´−Ｎ、Ｎ−ジイソプロピル  シアノエチル  ホスホロアミダイト−２´，３´，４´，５´，５´´−ペンタ重水素β−Ｄリボフラノシル−Ν４ベンゾイルシチジン（構造ＸＸＩＩ）のＵＶ分析レポートである。
【図２０Ｅ】５´−Ｏ−ジメトキシトリチル−２´−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−３´−Ｎ、Ｎ−ジイソプロピル  シアノエチル  ホスホロアミダイト−２´，３´，４´，５´，５´´−ペンタ重水素β−Ｄリボフラノシル−Ν４ベンゾイルシチジン（構造ＸＸＩＩ）の３１Ｐ  ＮＭＲスペクトルである。１５０．５７６と１４９．８５２ｐｐｍに鋭い２重線；純度９５％；Δ＝０．７２４。
【図２０Ｆ】５´−Ｏ−ジメトキシトリチル−２´−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−３´−Ｎ、Ｎ−ジイソプロピル  シアノエチル  ホスホロアミダイト−２´，３´，４´，５´，５´´−ペンタ重水素β−Ｄリボフラノシル−Ν４ベンゾイルシチジン（構造ＸＸＩＩ）の陽イオン質量スペクトルである。
【図２１Ａ】５´−Ｏ−ジメトキシトリチル−２´−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−３´−Ｏ−スクシニルピリジニウム塩−２´，３´，４´，５´，５´´−ペンタ重水素−β−Ｄリボフラノシル−Ν４ベンゾイルシチジン（化合物構造のΧΧＩＩＩ）の３１Ｐ  ＮＭＲスペクトルである。
【図２１Ｂ】５´−Ｏ−ジメトキシトリチル−２´−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−３´−Ｏ−スクシニルピリジニウム塩−２´，３´，４´，５´，５´´−ペンタ重水素−β−Ｄリボフラノシル−Ν４ベンゾイルシチジン（化合物構造のΧΧＩＩＩ）の質量スペクトルである；計算質量：８６７．９５；観測質量：８６９．２０。
【図２２Ａ】５´−Ｏ−ジメトキシトリチル−２´，３´，４´，５´，５´´−ペンタ重水素β−Ｄリボフラノシル−Ｎ６ベンゾイルアデノシン（構造ＸＸＶＩＩＩ）のＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図２２Ｂ】５´−Ｏ−ジメトキシトリチル−２´，３´，４´，５´，５´´−ペンタ重水素β−Ｄリボフラノシル−Ｎ６ベンゾイルアデノシン（構造ＸＸＶＩＩＩ）のＨＰＬＣレポートである。
【図２２Ｃ】５´−Ｏ−ジメトキシトリチル−２´，３´，４´，５´，５´´−ペンタ重水素β−Ｄリボフラノシル−Ｎ６ベンゾイルアデノシン（構造ＸＸＶＩＩＩ）の質量スペクトルである。ロット＃０９０１５ＲＤＶ；計算質量：６７８．２８；観測質量：６７９．２。
【図２３Ａ】順番ＩＤ  Ｎｏ．１の精製されたオリゴヌクレオチド、完全に重水素化されたＲＮＡのキャピラリー電気泳動分析である。
【図２３Ｂ】順番ＩＤ  Ｎｏ．１の精製されたオリゴヌクレオチド、完全に重水素化されたＲＮＡのキャピラリー電気泳動レポートである。
【図２３Ｃ】順番ＩＤ  Ｎｏ．１の精製されたオリゴヌクレオチド、完全に重水素化されたＲＮＡのＵＶ分析レポートである。
【図２４Ａ】順番ＩＤ  Ｎｏ．２の精製されたオリゴヌクレオチド、約２５％重水素化されたＲＮＡのキャピラリー電気泳動分析である。
【図２４Ｂ】順番ＩＤ  Ｎｏ．２の精製されたオリゴヌクレオチド、約２５％重水素化されたＲＮＡのキャピラリー電気泳動レポートである。
【図２４Ｃ】順番ＩＤ  Ｎｏ．２の精製されたオリゴヌクレオチド、約２５％重水素化されたＲＮＡのＵＶ分析レポートである。
【図２５Ａ】順番ＩＤ  Ｎｏ．３の精製されたオリゴヌクレオチド、天然ＲＮＡのキャピラリー電気泳動分析である。
【図２５Ｂ】順番ＩＤ  Ｎｏ．３の精製されたオリゴヌクレオチド、天然ＲＮＡのキャピラリー電気泳動レポートである。
【図２５Ｃ】順番ＩＤ  Ｎｏ．３の精製されたオリゴヌクレオチド、天然ＲＮＡのＵＶ分析レポートである。
【図２６Ａ】順番ＩＤ  Ｎｏ．４の精製されたオリゴヌクレオチド、天然ＲＮＡのキャピラリー電気泳動分析である。
【図２６Ｂ】順番ＩＤ  Ｎｏ．４の精製されたオリゴヌクレオチド、天然ＲＮＡのキャピラリー電気泳動レポートである。
【図２６Ｃ】順番ＩＤ  Ｎｏ．４の精製されたオリゴヌクレオチド、天然ＲＮＡのＵＶ分析レポートである。
【図２７Ａ】順番ＩＤ  Ｎｏ．５の精製されたオリゴヌクレオチド、天然ＲＮＡのキャピラリー電気泳動分析である。
【図２７Ｂ】順番ＩＤ  Ｎｏ．５の精製されたオリゴヌクレオチド、天然ＲＮＡのキャピラリー電気泳動レポートである。
【図２７Ｃ】順番ＩＤ  Ｎｏ．５の精製されたオリゴヌクレオチド、天然ＲＮＡのＵＶ分析レポートである。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
本発明は、治療で使用するための、高純度の重水素化リボース及び糖、重水素化リボースベースヌクレオチド、重水素化ＲＮＡオリゴヌクレオチド、および重水素組み込みオリゴヌクレオチドを合成するための制御されたプロセスについて記載する。制御されたプロセスは、０．１％−９８％の範囲の様々な選択された重水素化の開発方法、および反応条件を確認するための分析方法を伴う。合成プロセスは、位置ごとに０．１％から９８％までの範囲の重水素を含む重水素化オリゴヌクレオチドを提供する。ヌクレオシド内への異なる割合の重水素の取り込み後に、ホスホロアミダイトを生成するためにさらなる化学合成が行われ、その合成はホスホロアミダイトのステップまでの各ステップで重水素パーセントを維持する。その後、固定比Ｄ／Ｈのオリゴヌクレオチド出発原料が、オリゴヌクレオチドを生成するために使用される。プロトンＮＭＲおよび質量分析などの様々な分析方法により重水素の取り込み率が一度決定されると、反応条件の適切な選択が維持されれば、重水素／水素の比は影響を受けない。本発明はさらに、重水素標識化ヌクレオシド−３´−コハク酸塩ヌクレオシドの制御された合成の選択された事例を記載し、そのヌクレオシドは固相オリゴヌクレオチド合成に使用するため、糖とプリン／ピリミジン塩基の特定の位置において０．１％−９８％重水素で変化する重水素標識の部分的または完全な飽和を有する。したがって、本発明のオリゴヌクレオチド合成プロセスは、従来のオリゴヌクレオチド合成に類似して行われる、すなわち３´−末端から５´−末端の方向である。
【００４１】
従って、本発明の重水素化リボースおよび糖、重水素化リボースベースのヌクレオチド、重水素化ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、治療的利益のために使用することができる。オリゴヌクレオチド療法、すなわち、特定の遺伝子の発現を調節するためのオリゴヌクレオチドの使用は、より伝統的な治療薬の望ましくない非特異的な毒性効果なしに、遺伝子の発現を選択的に修飾する機会を提供する。例示的な実施例において、本発明の重水素化リボースおよび糖、重水素化リボースベースのヌクレオチド、重水素化ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、アンチセンス療法において使用することができる。したがって、本発明は、安定した容易に消化されないアンチセンスＲＮＡを提供するための、強化された保護を有する修飾アンチセンスＲＮＡを提供するために使用され得る。したがって本発明のオリゴヌクレオチドは、アンチセンス療法が現在好適であることが分かっている任意の疾患および、これから同定される任意の標的ＲＮＡに対する臨床診療に使用することができる。本発明の重水素化オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ干渉のような、核酸ベース分子によるｍＲＮＡレベルの遺伝子発現の抑制を含む、他の核ベース分子治療用に使用することができる。
【００４２】
重水素化ヌクレオシドの合成、糖および塩基の保護、ホスホロアミダイトと考察された対応するオリゴヌクレオチドのためのいくつかの例示的なステップを以下に説明する。糖重水素保護ヌクレオシドの合成は、β−Ｄ−リボースのＨ−１、Ｈ−２、Ｈ−３、Ｈ−４、Ｈ−５、５´のような交換不可能プロトンの選択的な重水素化を伴う。Ｈ−１´とＨ−４´プロトンは、それらがヌクレオシドの一部となる場合、本質的にわずかに酸性であり、そしてある程度まで水素と交換される傾向がある。結果として、これら二つのプロトンは９０％以上のＤ／Ｈ比を与えない。プロトンＨ−２´、Ｈ−３´、Ｈ−５´、５´´は高いｐＫを有し、従ってＤ／Ｈ比が９５％を超えるまで重水素化され得るが、それらは反応時にプロトン性媒体の中で、またはわずかに塩基性のｐＨ条件と接触している場合、容易に交換されて水素に戻ることはない。
【００４３】
本発明は、構造Ａの構造を有する修飾ホスホロアミダイトを開示している：
【化Ａ】
0006799918.tif 000002
ここにＸまたはＸ１は重水素または水素を表し、Ｒ１はブロッキング基を表し、Ｒ２は、独立してブロッキング基を表し、Ｒ３はリン酸保護基、好ましくはシアノエチルジアルキルアミノであり、そしてＲ４は独立して保護基で、好適には３´Ｂ−シアノエチル保護基であり、そしてＢは核酸塩基を表す。リボース糖の１´位置も重水素化されているが、この位置の重水素の程度は可変であり、重水素化された後、Ｈに交換され得る。したがって、１´位置は、図中ではＤ／Ｈとして表示されている。我々のデータから、この位置における重水素の取り込みは約５０：５０：重水素：水素である。そのため本明細書の以降の議論において、重水素の取り込みが我々の処方において低い重水素に減少される場合、１´位置の重水素濃度はリボース環の他の位置の重水素化と比較して残りの位置のほぼ５０％になる。４´位置の重水素も同様に可変である。
【００４４】
ブロッキング基または保護基は、一般に、分子の化学的官能性を特定の反応条件に対して不活性にし、そして後に、実質的に分子の残りの部分を損傷することなく、分子中のそのような官能性から除去され得る。オリゴヌクレオチドプロセスの一部として、核酸塩基上の官能基及び２´糖基はブロックされ得る。本発明の水酸保護基には、広範囲の基を含む。好ましくは、保護基は、塩基性条件下で安定であるが、酸性条件下では除去され得る。好ましくは、Ｒ１（５´水酸基）は、ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）である。他の代表的な水酸保護基には、これらに限定されないが、トリチル、モノメトキシトリチル、トリメトキシトリチル、９−フェニルキサンテン−９−イル（Ｐｉｘｙｌ）および９−（ｐ−メトキシフェニル）キサンテン−９−イル（Ｍｏｘ）を含む。好ましくは、Ｒ２（２´水酸基）はｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）で保護される。ｔ−ブチルジメチルシリルオキシメチル（ＴＯＭ）基などの他の基も同様に使用することができる。リン酸塩保護基は、例えば、固相オリゴヌクレオチド合成レジームの間、リン含有ヌクレオチド間結合を保護するように機能する。リン保護基を持つヌクレオチド間結合の水性水酸化アンモニウムなどの脱保護剤による処置は、リン保護基の除去をもたらし、その場所に水酸基またはチオール基を残す。上記に追加して、限定されないが、ジフェニルシリルエチル、デルタ−シアノブテニル、シアノパラキシリル（ＣＰＸ）、メチル−Ｎ−トリフルオロアセチルエチル（ＭＥＴＡ）及びアセトキシフェノキシエチル（ＡＰＯＥ）基のような保護基も同様に使用できる。
【００４５】
核酸塩基Ｂは、アデニン、グアニン、シトシン、またはウラシルなどの天然の塩基であってよい。Ｂはまた、重水素アデニン、図１Ａ参照、重水素グアニン、図１Ｂ参照、重水素シトシン、図１Ｃ参照、重水素ウラシル、図１Ｄ参照、のような修飾塩基、または天然の塩基類似体、合成塩基、および修飾塩基を含む当業者に公知の他の修飾塩基でよい。それらは限定されないが例えば、やはり重水素化された、ヒポキサンチン（イノシン）、５−メチルシトシン、５−アザシトシン、５−ハロゲン化ウラシルおよびシトシン、及びＣ−５プロピンウラシルおよびＣ−５プロピンシトシンなどの５−アルキル置換核酸塩基を含む。Ｂはまた、ベンゾイル保護基またはイソブチリル保護基、アセチル保護基、フェノキシアセチル保護基、４−イソプロピルフェノキシアセチル保護基、またはジメチルホルムアミジノ、ジメチルアセトアミジン保護基、を含んでもよい。
【００４６】
図２は、重水素化ＲＮＡヌクレオシド、ｎ−保護ホスホロアミダイト、およびオリゴヌクレオチドを合成する過程における出発材料の例示的な例の合成を示す。１−Ｏ−アセテート−α／β２，３，５−トリベンゾイル−２，３，４，５，５´ペンタ重水素−Ｄリボフラノシド（構造ＶＩ）の合成は、スキームに従って実施され、α／β−Ｄリボフラノシド（−Ｄ−リボース；構造１）で始まる。重水素はＡ．Ｆｏｌｄｅｓｉ，Ｆ．Ｒ．Ｎｉｌｓｏｎ，Ｃ．Ｇｌｅｍａｒｅｃ，Ｃ．ＧｉｏｅｌｉおよびＪ．Ｃｈａｔｔｏｐａｄｈｙａｙａ著，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，９０３３，１９９２に記載された手順のわずかな変更によって導入された。重水素化ラネーニッケルの合成の手順も同じ著者からの上記参照文献から採用され、重水素取り込みの効率を改善するため若干の修正が加えられた。ステップは、Ｄ−リボース（Ｉ）から１−Ｏ−メチル−α／β−Ｄリボフラノシド（ＩＩ）の合成を含んだ。１−Ｏ−メチル−α／β−２，３，４，５，５´ペンタ重水素−Ｄリボフラノシド（ＩＩＩ）は、化合物ＩＩから重水素化ラネーニッケルで合成された。１−Ｏ−メチル−α／β−２，３，５−トリベンゾイル−２，３，４，５，５´ペンタ重水素−Ｄリボフラノシド（ＩＶ）は、マイルドな条件下でベンゾイル化を行うことにより、構造ＩＩＩを有する化合物から合成された。１−ブロモ−α／β−Ｄ２，３，５−トリベンゾイル−２，３，４，５，５´ペンタ重水素−Ｄリボフラノシド（Ｖ）は化合物ＩＶから、第一に１−Ｏ−メチル基の選択的除去により、１−水酸基を含む糖を生成し、それはその後、中間体１−水酸基を含む糖を単離することなく臭素によって置換された。化合物Ｖは、１−Ｏ−アセテート−α／β−２，３，５−トリベンゾイル−２，３，４，５，５´ペンタ重水素−Ｄリボフラノシド（ＶＩ）の合成のために精製することなく直接進められた。化合物ＶＩは結晶化され、１Ｈ  ＮＭＲにより完全に特徴付けられた。図１２Ａ参照。各糖の位置で組み込まれた重水素のパーセントは、この分析から確認され、そして糖は、さらに、質量スペクトル分析により特徴付けられた。図１２Ｂ参照。
【００４７】
（スキーム１：１−Ｏ−アセテート−α／β  ２，３，５−Ｏ−トリベンゾイル−２，３，４，５，５´ペンタ重水素−Ｄ−リボフラノシドの合成）
重水素ラネーニッケル触媒の調製：脱イオン水１９２ｍＬを温度計およびテフロン（登録商標）被覆した磁気攪拌機を備える５００ｍｌの三角フラスコに入れた。三角フラスコを、半分まで水を充填し、ホットプレート／磁気撹拌機の上に配置されたプラスチックビーカーの内側に配置した。水酸化ナトリウムペレット（５１．２グラム）をフラスコ内の水にゆっくりと穏やかに攪拌しながら添加した。穏やかな攪拌は水の温度を約摂氏５０℃に維持した。混合物をすべての水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）ペレットが溶解するまで撹拌した。追加の化学物質を添加する前に、フラスコ内の温度を約５０℃に維持した。続いてラネーニッケル合金（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社）４０グラムを徐々に３０分の時間枠内で少しずつ加えた。外の水、すなわちビーカー内の水の温度を、約５０℃＋／−４℃に維持した。ラネーニッケル合金を添加した後、内部温度を維持しながら組成物を約６０分間撹拌した。次いで、約１時間かけて反応フラスコを室温までゆっくりと冷却した。脱イオン水を一度に１リットルずつフラスコに添加し、慎重にデカントした。このプロセスを、さらに２回、合計３回、繰り返した。水の追加とデカントのそれぞれの間、全ての固体材料をフラスコ内に放置した。３回の加水とデカントの完了後、固体を５００ｍｌのろ過フラスコに移した。脱イオン水をろ過フラスコの最上部に追加する間に作成されるオーバーフロー水を除去するために、ろ過フラスコに管を接続した。濾過フラスコの内容物を連続的に洗浄し、すべての濁りがなくなるまで攪拌した。濁りが消えた後、脱イオン水約２０リットルを用いて脱イオン水による洗浄をさらに続けた。洗浄を、水が、ｐＨ６．５−７．０の時に終了し、上清は透明であった。
【００４８】
重水素化されたラネーニッケル触媒をその後に調製した。洗浄後の触媒粒子は、セプタムキャップ付きボトルに移した。テフロン（登録商標）コーティングした磁気撹拌器をボトルに入れ、ゴム栓をセプタムボトルの頂部に置いた。ボトルをアルゴンでパージした。懸濁液を１分間撹拌し、その後、粒子の沈降を許した。パスツールピペットを用いて水を注意深く除去した。このプロセスを４回行い、各回では１．５ｍｌの脱イオン水を添加し、撹拌し、水を注意深く除去した。その後、重水（Ｄ２Ｏ、１．５ミリリットル；Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅ  Ｌａｂｓ社、マサチューセッツ州、９８％超の純度）を添加した。混合物を３０分間撹拌した。固体が底に沈降した後、液体を注意深くピペットで除去した。このプロセスをさらに２回、追加の重水（Ｄ２Ｏ１．５ｍｌ）を添加し、３０分間攪拌して、繰り返した。セプタムキャップ付きボトルを開け、試薬を添加するたびに、ボトルをアルゴンでフラッシュし、そして迅速にセプタムで密封した。三回の後、３ｍｌのＤ２Ｏを加えた。その後、混合物を１時間撹拌し、上清を除去した。このプロセスを、さらに１２回繰り返し、その都度アルゴンでボトルをパージした。混合物を、Ｄ２Ｏ（１０ｍｌ）で処理し、アルゴンでパージした後、一晩密封したまま保持した。上清を注意深く除去し、その後、新鮮なＤ２Ｏ（１０ｍｌ）を同様のやり方で加えた。上清をデカントした。
【００４９】
１−Ｏ−メチル  α／β  ２，３，４，５，５´ペンタ重水素−Ｄリボフラノシド（構造ＩＩＩ）の合成：
１の８グラムの１−Ｏ−メチル−α／β−Ｄリボフラノシドに１０ｍｌのＤ２Ｏを添加した。溶液は、ロータリ蒸発器上で蒸発させた。このプロセスを、各回１０ｍｌのＤ２Ｏを使用して、２回追加して繰り返した。残渣を、１６０ｍｌのＤ２Ｏに溶解した。重水素化ラネーニッケル（４０ｍｌ）を溶液に移した。アルゴンを反応混合物の中で１０分間泡立たせた。次いで、反応混合物をアルゴン雰囲気下で、１１０℃の油浴上で７日間維持した。反応混合物を室温に冷却し、セライトの床に通して濾過し、少量の脱イオン水で洗浄した。ろ液をロータリ蒸発器上で蒸発させた。残渣をピリジンで三回共蒸発させ、そして直接真空ラインを使用して、追加の６時間乾燥した。プロセスは、油状生成物６．８グラムを得た。
【００５０】
１−Ｏ−メチル−α／β  ２，３，５−トリベンゾイル−２，３，４，５，５´ペンタ重水素−Ｄリボフラノシド（構造ＩＶ）の合成：
乾燥した１−Ｏ−メチル−α／β  ２、３，４，５，５´ペンタ重水素−Ｄリボフラノシド（構造ＩＩＩ、６．８ｇ）を丸底３口フラスコに入れ、圧力均等化漏斗および磁気撹拌機を設置した。乾燥蒸留ジクロロメタン（３４．１ｍｌ）を加えた。反応混合物を撹拌した。その後、乾燥ピリジン（６８．２ｍｌ）を添加した。溶液をゼロ℃で撹拌した。続いて、塩化ベンゾイル（２１．２ｍｌ）を密閉した反応フラスコ内で、圧力均等化漏斗を通して滴下した。塩化ベンゾイルを加えた後、圧力均等化漏斗を除去し、止め栓に置き換えた。混合物を密封ポリエチレン袋内で０〜４℃で、冷蔵庫に４８時間保管した。反応物を氷と水の混合物上に注ぎ、反応混合物を１時間保持した。ゴム状物質をクロロホルムで抽出し、冷却した（０〜５℃）飽和炭酸水素ナトリウム溶液で洗浄し、その後かん水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウム中を通過させ、そして溶液をロータリ蒸発器で蒸発させた。残留物をピリジンで共蒸発させ、その後乾燥トルエンを加えた。さらに乾燥が直接真空ラインで６時間行われた。油状生成物が得られ、１−ブロモ−α／β  ２，３，５−トリベンゾイル−２，３，４，５，５´ペンタ重水素−Ｄリボフラノシドを合成するのに使用した。
【００５１】
１−ブロモ−α／β  Ｄ  ２，３，５−トリベンゾイル−２，３，４，５，５´ペンタ重水素−Ｄリボフラノシド（構造Ｖ）の合成：
トルエンで乾燥した１−Ｏ−メチル−α／β  ２，３，５−トリベンゾイル−２，３，４，５，５´ペンタ重水素−Ｄリボフラノシド（構造ＩＶ）を、氷酢酸中で作られた臭化水素（ＨＢｒ）の３３％溶液に溶解し、密封した。溶液を室温で撹拌した。３０分後、反応混合物を８−１０℃に冷却した。続いて、氷酢酸（２００ｍｌ）を反応混合物に添加した。脱イオン水（１３０ミリリットル）を滴下様式で添加した。反応混合物を２３分間撹拌した。反応混合物を５−１０℃に冷却した脱イオン水に注いだ。ガム状塊をクロロホルムで抽出した。冷却した（０〜５℃）炭酸水素ナトリウム水溶液を有機層のｐＨが塩基性（ｐＨ＞８）になるまで有機層に添加した。その後、再び有機層を分離し、冷却した炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄した。その後有機層を無水硫酸ナトリウムの上を通過させた。濾過した溶液をロータリ蒸発器で蒸発させた。ゴム状固体を乾燥ピリジンで２回共蒸発させた。油状生成物を得、次の工程で使用した。
【００５２】
１−Ｏ−アセテート−α／β  ２，３，５−トリベンゾイル−２，３，４，５，５´ペンタ重水素−Ｄリボフラノシド（構造ＶＩ）の合成：
前の工程で得た乾燥した生成物、１−ブロモ−α／β  Ｄ  ２，３，５−トリベンゾイル−２，３，４，５，５´ペンタ重水素−Ｄリボフラノシド（構造Ｖ）を乾燥ピリジン（４０ｍｌ）中にとり、そしてクロロホルム（４０ｍｌ）中で乾燥蒸留した。反応混合物に、無水酢酸（１３．９ｍｌ）を加えた。この溶液を、穏やかに混合し、密封し、７２時間室温で保存した。次いで、この溶液をクロロホルムで希釈した。全有機層を分液漏斗に入れ、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で１回洗浄し、その後飽和かん水溶液で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウム上を通過させ、その後ロータリ蒸発器で蒸発させた。残渣をトルエンで３回共蒸発させた。直接真空ラインを使用してガム状の塊を２時間乾燥させた。無水エタノールをゴム状の塊に添加した。溶液を２時間４℃に維持した。得られた固体を濾過し、そして冷エタノールで洗浄した。固体を丸底フラスコに移し、そして直接高真空ライン上で３７℃で１２時間乾燥させた。プロセスは、４．５ｇのオフホワイト生成物をもたらした。生成物を１Ｈ  ＮＭＲおよび質量スペクトル分析により分析した。
【００５３】
図３、図５および図７を参照して、修飾ホスホロアミダイトの合成が、それぞれスキーム２，４と６および以下に概説する個々の工程に従って示され、実施される。図３、図５および図７は核酸塩基のウラシル、シトシン、およびアデニンを有するホスホロアミダイトの図解的事例を示している。グアニンまたは修飾核酸塩基などの他の核酸塩基を有するホスホロアミダイトは、同一又は類似の手順を用いて合成することができる。従って、以下の実施例は例示にすぎず、限定することを意図していない。
【００５４】
２´，３´，５´−トリヒドロキシ−２´，３´，４´，５´，５´´ペンタ重水素β−Ｄリボフラノシル−ウリジン（構造ＩＸ）の合成：
ウラシル（化合物ＶＩＩ；０．５ｇ；４．４６ｍｍｏｌ）、ヘキサメチルジシラザン（１５ｍｌ）および硫酸アンモニウム（２０ｍｇ；０．１５ｍｍｏｌ）をウラシルが溶解するまで、約ｌ５時間、還流下で沸騰させた。その後ヘキサメチルジシラザンを真空下で蒸発させ、そしてトルエンを添加した。混合物を振盪し、そして溶媒を蒸発させ、トリメチルシリル化ウラシルからなる残留固体を得た。固体残渣を精製せずに結合に使用した。新たに蒸留した１、２ジクロロエタン（新たにＣａＨ２上で蒸留、１６ｍｌ）を残渣に加えた。混合物を４０℃で攪拌し、その後塩化第二スズ（１．１３ｍｌ；１．４６ｍｍｏｌ）を４０℃の温度で添加した。反応を４０℃で１５分間継続した。１、２ジクロロエタン（新たにＣａＨ２上で蒸留）中の重水素化１−アセテート  α／β−Ｄリボフラノシド（構造ＶＩ；１．８１ｇ；１３．５６ｍｍｏｌ）の溶液を、圧力均等化漏斗に入れ、反応フラスコの上部に取り付けた。その溶液を滴下して加え、反応物を２．５時間還流下で沸騰させた。反応混合物を冷却し、そして１．５時間、飽和炭酸水素ナトリウム溶液中で撹拌した。反応混合物をセライト粉末の床を通して濾過した。有機層を分離し、無水硫酸ナトリウムを通過させた。反応混合物を真空下で蒸発させ、クロロホルム：メタノール（８：２）中で薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）をチェックした。  得られたガム状塊をシリカ（７０：２３０メッシュ）（１００ｇ）のカラム（１．５´´Ｘ１４ｃｍ）上で酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）：ヘキサン（６：４）を溶離液としてクロマトグラフィー分析した。分画をＴＬＣでモニターした。Ｒｆ値はクロロホルム：メタノール（８：２）中で０．４６だった。純粋な画分をＵＶ可視化によってモニターし、組み合わせ、ロータリ蒸発器で蒸発させ、そして構造ＶＩＩＩを有する化合物を泡状物質（収量：１．７グラム）として得た。
【００５５】
ピリジン（２０ｍｌ）中の構造ＶＩＩＩ（１．７ｇｍ）および水溶性アンモニア水溶液（３７％ｗ／ｖ、２０ｍｌ）の混合物を密封フラスコ中に３７℃で４８時間維持した。次いで、混合物を真空中で蒸発させ、乾燥するまでイソプロピルアルコールと共蒸発させた。残渣のジクロロメタン中の溶液をシリカゲルと共に（７０：２３０）（１００ｇ）クロロホルム中で、続いてクロロホルム：メタノール：８５：１５（Ｖ：Ｖ）中で充填したカラム（２×１５ｃｍ）に適用した。純粋な画分をＵＶにより可視化し、そして蒸発させて、構造ＩＸ、２´，３´，５´−トリヒドロキシ−２´，３´，４´，５´，５´´ペンタ重水素β−Ｄリボフラノシル−ウリジンの化合物粉体を産生した（収量；７００ｍｇ；９３．３％）。図１３Ａ−１３Ｃ参照。Ｒｆ；０．４  溶媒系；クロロホルム：メタノール（８５：１５）．ＵＶ；２６０（０．４９４）で最大、Ｅｍａｘ；７８２６．２２。
【００５６】
５´−Ｏ−ジメトキシトリチル２´，３´，４´，５´，５´´−ペンタ重水素β−Ｄリボフラノシル−ウリジン（構造Ｘ）の合成：
２´，３´，５´−トリヒドロキシ−２´，３´，４´，５´，５´´ペンタ重水素β−Ｄリボフラノシル−ウリジン（構造ＩＸ；０．７ｇｍ、０．１７５ｍｍｏｌ）を乾燥ピリジンにより２回乾燥し、乾燥ピリジン（１０ｍｌ）を加えた。乾燥管を取り付けた状態で溶液を攪拌し、０℃に冷却した。その溶液に４，４、ジメトキシトリチルクロライド（ＤＭＴ−Ｃｌ；１．１６ｇ；３．４２ｍｍｏｌ）を１時間間隔で２回に分けて添加した。反応の進行をクロロホルム内の（８５：１５）薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によってモニターした。反応終了（約４時間）後、反応混合物を冷却メタノール（５ｍｌ）で急冷し、その後ロータリ蒸発器上で溶媒を除去した。残留ガム状塊をクロロホルム中に取り、飽和炭酸水素ナトリウム溶液で一回洗浄し、その後かん水溶液で一回洗浄した。溶媒の除去後得られた粗生成物を、シリカゲルカラム（７０：２３０メッシュサイズ）（１５０ｇ）上でクロロホルム：メタノール（９５：５）を溶離剤として使用してクロマトグラフ分析した。画分をＴＬＣによってモニターし、ＵＶにより可視化した。クロロホルム：メタノール（９５：０５）中でＲｆは０．４であった。純粋な画分を合わせ、そして蒸発させて、ほとんど無色の泡状物質を得た、収量；１．３ｇ；８６．６％、２５０ｎｍでＵＶｍａｘ；１１，６７１のＥｍａｘ。生成物は、一つまたはそれ以上のＨＰＬＣ、ＵＶ、１Ｈ  ＮＭＲ、質量スペクトルデータおよび／または３１Ｐ  ＮＭＲにより分析した。図１４Ａ−１４Ｄ参照。
【００５７】
５´−Ｏ−ジメトキシトリチル−２´−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル２´，３´，４´，５´，５´´−ペンタ重水素β−Ｄリボフラノシル−ウリジン（構造ＸＩ）および５´−Ｏ−ジメトキシトリチル３´−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル２´，３´，４´，５´，５´´−ペンタ重水素β−Ｄリボフラノシル−ウリジン（構造ＸＩＩ）の合成：
化合物５´−Ｏ−ジメトキシトリチル２´，３´，４´，５´，５´´−ペンタ重水素β−Ｄリボフラノシル−ウリジン（構造Ｘ；１．３ｇ；２．３６ｍｍｏｌ）を無水アセトニトリルとの共蒸発により、真空下で数時間乾燥した。乾燥物を無水テトラヒドロフラン（ＴＨＦ、１３ｍｍｏｌ）に加えた。その溶液に硝酸銀（ＡｇＮＯ３；０．５ｇ；２．９４ｍｍｏｌ）を無水条件下、反応フラスコの上に乾燥管を装着した状態で、加えた。その混合物に乾燥ピリジン（０．６９ｍｌ；８．５４ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で１０分間攪拌した。その後ｔｅｒｔブチルジメチルシリルクロリド（ＴＢＤＭＳ−クロリド；０．５３ｇ；３．５２ｍｍｏｌ）を無水条件下で添加した。反応混合物を密閉し、２．５時間室温で撹拌した。反応の進行をＴＬＣによってモニターし、ＵＶ下で可視化した。ＴＬＣ溶媒系はクロロホルム：ヘキサン：アセトン（６５：２５：１０）であった。粗生成物は２´異性体（構造ＸＩ）および３´異性体の両方の構造を示した。非修飾の２´および３´−異性体のＴＬＣ上での比較分析を行い、そしてスポットは共遊走した。
【００５８】
通常のワークアップ後、粗生成物をシリカゲルのカラム（２３０：４００メッシュ）上でクロロホルム：ヘキサン：アセトン（６５：２５：１０）から構成される溶媒系でクロマトグラフィー分析した。画分をＴＬＣによってモニターし、ＵＶにより可視化した。Ｒｆ値は、同じ溶媒系内で０．３８であった。合わせた純粋な画分を蒸発させて、８００ｍｇの収量の泡状物質を得た；５´−Ｏ−ジメトキシトリチル２´−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル２´，３´，４´，５´，５´´−ペンタ重水素−β−Ｄリボフラノシル−ウリジン、５０．９％；２５０ｎｍでのＵＶλｍａｘ（０．３５０）；Ｅｍａｘ１６３４。３´−異性体の１−（５−Ｏ−ジメトキシトリチル３−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル２，３，４，５，５´−ペンタ重水素−β−Ｄリボフラノシル）−ウリジン（構造ＸＩＩ）は単離されなかった。生成物は、一つまたはそれ以上のＨＰＬＣ、ＵＶ、１  Ｈ  ＮＭＲ、質量スペクトルデータおよび／または３１Ｐ  ＮＭＲにより分析した。図１５Ａ−１５Ｄ参照。
【００５９】
５´−Ｏ−ジメトキシトリチル２´−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−３´−Ｎ、Ｎ−ジイソプロピル  シアノエチル  ホスホロアミダイト−２´，３´，４´，５´，５´´−ペンタ重水素β−Ｄリボフラノシル−ウリジン（構造ＸＩＩＩ）の合成：
５´−Ｏ−ジメトキシトリチル２´−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−２´，３´，４´，５´，５´´−ペンタ重水素−β−Ｄリボフラノシル−ウリジン（構造ＸＩ）および５´−Ｏ−ジメトキシトリチル３´−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−２´，３´，４´，５´，５´´−ペンタ重水素−β−Ｄリボフラノシル−ウリジン（構造ＸＩＩ）の合成から、２´−ＴＢＤＭシリル異性体（構造ＸＩ；４３０ｍｇ）を完全に無水アセトニトリルで乾燥させ、そして丸底フラスコに入れた。無水テトラヒドロフラン（４．３ｍｌ）を添加し、そして溶液をアルゴンでパージし、そして栓に置き換えた。撹拌下の溶液に、２，４，６−コリジン（４３０ｍｌ；５当量）を加え、その後、１−メチルイミダゾールを加えた（５１μｌ、１．０当量）。溶液を室温で攪拌し、そしてＮ、Ｎ−ジイソプロピルアミノ  シアノエチル  ホスホンアミド  クロライド（リン酸化試薬、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓカタログ番号ＲＮ−１５０５；２９０μｌ；２当量）を素早く添加した。７０分後、反応は完結し、そしてクロロホルムで希釈することによりワークアップした。有機層を分液漏斗に入れ、そして飽和水溶性炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄し、その後有機層をさらにかん水溶液で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウム上を通過させた。溶液をロータリ蒸発器上で濃縮した。ＴＬＣを酢酸エチル：ヘキサン：トリエチルアミン（３０：６０：１０）の溶媒系でチェックした。粗生成物をカラム直径（３０ｃｍＸ１．５ｃｍ）のシリカゲルカラム（２３０−４００メッシュ）上で精製した。純粋な画分をＴＬＣでモニターし、合わせ、その後、濃縮した。３００ｍｇの乾燥重量を有する無色の泡状物質を得た。製品は、ＨＰＬＣ、ＵＶ、１Ｈ  ＮＭＲ、質量スペクトルデータおよび３１Ｐ  ＮＭＲにより分析した。図１６Ａ−１６Ｆ参照。
【００６０】
重水素標識化ヌクレオシドに結合した固体支持体は、オリゴヌクレオチドの合成に必要とされる。オリゴヌクレオチド合成後の重水素標識化ヌクレオシドに結合した固体支持体は、結果的にオリゴヌクレオチドの３´−末端における重水素標識化ヌクレオシドとなる。このプロセスでは、オリゴヌクレオチド合成は、３´−末端から５´−末端への方向（従来のオリゴヌクレオチド合成）に行われる。本発明は、糖およびプリン／ピリミジン塩基の特定の位置において、０．１％−９８％重水素で変化し得る、制御された重水素標識を有する、重水素標識化ヌクレオシド−３´−コハク酸塩ヌクレオシドを合成するための方法を開示する。本発明は重水素を含むホスホロアミダイトおよび固体支持体を組み込むプロセスを開示し、それは２０：９８の範囲の重水素と水素との比で変化する重水素の濃縮の割合を有している。
【００６１】
構造Ｂは、以下の化学構造を有する重水素化された固体支持構造の構造を示す：
【化Ｂ】
0006799918.tif 000003
ここでＸは重水素または水素を表し、Ｒ１は１つのブロッキング基を表し、Ｒ２は独立して１つのブロッキング基を表し、Ｒ３は連結分子を表し、Ｒ４は固体支持構造を表し、そしてＢは核酸塩基を表す。前述のように、Ｂは、天然塩基、修飾塩基、またはそれらの組み合わせであってもよい。連結分子は、一般に、官能基を固体支持構造に接続するように機能する小分子として当技術分野で知られている。好ましい連結分子はスクシニル−Ｉｃａａ（長鎖アルキルアミノ）であるが、当業者に公知の他の連結分子を使用することができる。固体支持構造は、一般に、第１のヌクレオシドに接続するように使用される。好ましい実施形態では、固体支持構造は制御細孔ガラス（ＣＰＧ）である。しかし、限定されないが、オキサリル制御細孔ガラス、マクロ多孔性ポリスチレン（ＭＰＰＳ）、アミノポリエチレングリコールのような他の固体支持構造も同様に使用できる。
【００６２】
図４は、スキーム３：本明細書では５´−Ｏ−ジメトキシトリチル−２´−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−３´−スクシニルＩｃａａ−ＣＰＧ−２´，３´，４´，５´，５´´−ペンタ重水素−β−Ｄリボフラノシル−ウリジンで示される、固体支持構造に結合した重水素化リボヌクレオシドの合成を示す図である。
５´−Ｏ−ジメトキシトリチル２´−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−３´−Ｏ−スクシニルピリジニウム塩−２´，３´，４´，５´，５´´−ペンタ重水素β−Ｄリボフラノシル−ウリジン（化合物構造ＸＩＶ）の合成：
化合物５´−Ｏ−ジメトキシトリチル２´−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−２´，３´，４´，５´，５´´−ペンタ重水素β−Ｄリボフラノシル−ウリジン（構造ＸＩ；３５０  ｍｇ）を乾燥ピリジン３．５ｍｌ中に入れ攪拌した。撹拌した溶液に無水コハク酸（１５８ｍｇ；１．５８ｍｍｏｌ）を添加し，その後４−ジメチルアミノピリジン（２０ｍｇ；０．１６３ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を密封し、水浴中で維持し、１４時間３７℃に維持した。反応混合物をＴＬＣで確認し、完了していることがわかった。その後、反応混合物を冷メタノール（２００μｌ）で急冷し、その後ロータリ蒸発器で溶媒を除去した。粗反応混合物をクロロホルム中に置き、有機層を飽和かん水溶液で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで濾過し、そしてクロロホルム溶液を真空下で除去した。粗化合物をクロロホルム：メタノール（９５：５）溶媒系を用いた短いカラムクロマトグラフィーにより精製した。純粋な画分を合わせ、蒸発させた。泡状生成物を６時間、高真空で乾燥させた。この溶媒系での製品のＲｆ値は０．３であった。プロセスは１２０ｍｇを得た。生成物は、一つまたはそれ以上のＨＰＬＣ、ＵＶ、１  Ｈ  ＮＭＲ、質量スペクトルデータおよび／または３１Ｐ  ＮＭＲにより分析した。Ｅおよび１７Ｆ参照。図１７
【００６３】
５´−Ｏ−ジメトキシトリチル−２´−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−３´−スクシニルＩｃａａ−制御細孔ガラス（ＣＰＧ）−２´，３´，４´，５´，５´´−ペンタ重水素−β−Ｄリボフラノシル−ウリジン（化合物構造ＸＶ）の合成：
前のステップのヌクレオシド、５´−Ｏ−ジメトキシトリチル−２´−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−３´−Ｏ−スクシニルピリジニウム塩−２´，３´，４´，５´，５´´−ペンタ重水素β−Ｄリボフラノシル−ウリジン（化合物構造ＸＩＶ；８５  ｍｇ）を丸底フラスコに入れ、完全に無水アセトニトリルで乾燥し、その後直接ラインを使用して高真空下で６時間乾燥した。固体に無水アセトニトリル（６ｍｌ）を加え、その後Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ´，Ｎ´−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート、ＨＢＴＵ（４７ｍｇ、１．１等量）を加えた。その後ジイソプロピルエチルアミン（３９μｌ；２当量）を追加した。その溶液に、アミノリンカーＩｃａａ  ＣＰＧ（長鎖アルキルアミン制御細孔ガラス；５００Ａ粒径、Ｐｒｉｍｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ社、ペンシルベニア州の製品；１．５ｇ）を添加した。混合物を完全に密封し、１２時間３７℃に維持した。制御細孔ガラス（ＣＰＧ）を濾過し、ジエチルエーテル、続いて、アセトニトリルで洗浄した。ＣＰＧを一晩空気乾燥した。
【００６４】
残留アミノ基をブロックした。乾燥したＣＰＧは、三角フラスコに入れ、ＣＡＰ  Ａ溶液（ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ製品、カタログ番号ＲＮ−１４５８、無水酢酸：ピリジン：テトラヒドロフラン（Ｌ０：１０：８０）で構成、１０ｍｌ）を加えた。懸濁液を良く密封して２時間室温に保った。ＣＰＧを濾過し、イソプロパノールで洗浄し、その後ジエチルエーテルで洗浄した。残留アミノ官能基の完全なブロッキングの完了はニンヒドリン試験により確認した。ネガティブなニンヒドリン試験は、残留アミノ官能基の完全なキャップ形成を示している。ロードされたＣＰＧのトリチル量定を行った。トリチル値は４４μｍｏｌ／ｇであった。
【００６５】
図５を参照して、スキーム４は、本発明に従った、そして構造ＸＸＩＩの核酸塩基シトシンを有するホスホロアミダイトの代替実施形態の合成の一例を示している。合成に関与する個々のステップの詳細を以下に概説する。
【００６６】
２´，３´，５´−トリ−Ｏ−ベンゾイル−２´，３´，５´，５´´−ペンタ重水素β−Ｄリボフラノシル−Ν４ベンゾイルシチジン（構造ＸＶＩＩ）の合成：
Ｎ４ベンゾイルシトシン（化合物構造ＸＶＩ；７５０ｍｇ；３．４７ｍｍｏｌ）、ヘキサメチルジシラザン（ＨＭＤＳ；１９ｍｌ）および硫酸アンモニウム（３２ｍｇ；０．２４ｍｍｏｌ）の混合物を還流下でＮ４ベンゾイルシトシンが溶解するまで約１５時間沸騰させた。ヘキサメチルジシラザンをその後真空下で蒸発させ、そしてトルエンを加えた。混合物を振盪し、溶媒を蒸発させ、トリメチルシリル化Ｎ４ベンゾイルシトシンからなる残留固体を得た。固体残渣を精製せずに結合に使用した。新たに蒸留した、１，２ジクロロエタン（新たにＣａＨ２上で蒸留）１６ｍｌを固体残渣に加えた。混合物を４０℃で攪拌した。塩化第二錫（０．８６ｍｌ；３．２９ｍｍｏｌ）を４０℃の温度で添加した。反応を４０℃の温度で１５分間続けた。１，２ジクロロエタン（４．３ｍｌ；新たにＣａＨ２上で蒸留）中の重水素化β−Ｄリボース−１−アセテート（構造ＶＩ；１．４２ｇｍ；２．７９ｍｍｏｌ）溶液を圧力均等化漏斗に入れ、そして反応フラスコの頂部に取り付けた。溶液を滴下し、反応物を還流下で２．５時間沸騰させた。反応混合物を冷却し、飽和炭酸水素ナトリウム溶液中で１．５時間攪拌した。反応物をセライト粉末床で濾過した。有機層を分離し、そして無水硫酸ナトリウムを通過させた。反応混合物を真空下で蒸発させ、クロロホルム：メタノール（９８：０２）中のＴＬＣを使用してチェックした。Ｒｆ値は０．４６だった。反応は収量２．１４グラムを得た。
【００６７】
２´，３´，５´−トリヒドロキシ−２´，３´，４´，５´，５´´−ペンタ重水素β−Ｄリボフラノシル−Ν４ベンゾイルシチジン（構造ＸＶＩＩＩの化合物）の合成：
２´，３´，５´−Ｏ−ベンゾイル−２´，３´，４´，５´，５´´−ペンタ重水素β−Ｄリボフラノシル−Ν４ベンゾイルシチジン（構造ＸＶＩＩＩ；２．１４ｇ；３．２２ｍｍｏｌ）のピリジン（２０．５ｍｌ）内の混合物を溶解するまで撹拌した。その後メタノール（５ｍｌ）を加えた。溶液を０℃に冷却し、そしてＯ−ベンゾイル基の選択的水酸化のための２Ｎ水溶性水酸化ナトリウム溶液（６．２６ｍｌ）を加えた。攪拌を続けながら加水分解反応を０℃で２０分間行った。反応混合物を慎重に２Ｎ  ＨＣｌ水溶液（７ｍｌ）でｐＨ７．５に中和した。ピリジン（１０ｍｌ）を添加した後、この溶液を蒸発させた。残留物をイソプロピルアルコールと共蒸発させ乾燥させた。残留物を蒸留水で滴定し無色の固体を得た。固体を濾過し、ジエチルエーテルで洗浄し、高真空下で乾燥させた。構造ＸＩＩを有する化合物を粉末として得た（収量１．０ｇ；８８．４９％）。Ｒｆ値はクロロホルム：メタノール（８５：１５）中で０．５だった。ＵＶｍａｘ．は２６０において（０．９０３）、およびＥｍａｘ１６０００。生成物は、一つまたはそれ以上の以下のＨＰＬＣ、ＵＶ、１Ｈ  ＮＭＲ、質量スペクトルデータおよび／または３１Ｐ  ＮＭＲにより分析した。図１８Ａ−１８Ｄ参照。
【００６８】
５´−Ｏ−ジメトキシトリチル−２´，３´，４´，５´，５´´−ペンタ重水素β−Ｄリボフラノシル−Ν４ベンゾイルシチジン（化合物ＸＩＸ）の合成：
２´，３´，４´，５´，５´´−ペンタ重水素β−Ｄリボフラノシル−Ν４ベンゾイルシチジン（構造ＸＶＩＩＩ；１．０ｇ；２．８８ｍｍｏｌ）を乾燥ピリジンで２回乾燥し、その後、乾燥ピリジン（１０ｍｌ）を加えた。溶液を乾燥管を取り付けた状態で攪拌し、０℃に冷却した。４，４−ジメトキシトリチルクロリド（ＤＭＴ−Ｃｌ；１．１５ｇ、３．３９ｍｍｏｌ）を１時間間隔で２回に分けて溶液に添加した。反応の進行は、クロロホルム：メタノール（８５：１５）中でのＴＬＣによってモニタリングした。反応終了後（約４時間）、反応混合物を冷却メタノール（５ｍｌ）で急冷し、そしてロータリ蒸発器上で溶媒を除去した。残留ガム状物質をクロロホルム中に入れ、一回飽和炭酸水素ナトリウム溶液で洗浄し、その後、かん水溶液で洗浄した。溶媒の除去後に得られた粗生成物をシリカゲルのカラム（メッシュサイズ７０：２３０）（１５０ｇ）上でクロロホルム：ヘキサン：アセトン（５０：３０：２０）の溶媒系を使用したクロマトグラフィーに付した。画分をＴＬＣによってモニターし、ＵＶにより可視化した。Ｒｆはメタノール：クロロホルム（９４：０６）中で０．４であった。純粋な画分を合わせ、蒸発させて、ほぼ無色の泡状物質を得た（収量；１．５ｇ；８１．０８％）、ＵＶλｍａｘは２６０ｎｍにおいて得られた；Ｅｍａｘは、１６６０９．６６（２６０ｎｍ）。生成物を、一つまたはそれ以上のＨＰＬＣ、ＵＶ、１Ｈ  ＮＭＲ、質量スペクトルデータおよび／または３１Ｐ  ＮＭＲにより分析した。図１９Ａ−１９Ｄ参照。
【００６９】
５´−Ｏ−ジメトキシトリチル２´−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−２´，３´，４´，５´，５´´−ペンタ重水素β−Ｄリボフラノシル−Ν４ベンゾイルシチジン（構造ＸＸ）および５´−Ｏ−ジメトキシトリチル−３´−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−２´，３´，４´，５´，５´´−ペンタ重水素β−Ｄリボフラノシル−Ν４ベンゾイルシチジン（構造ＸＸＩ）の合成：
化合物５´−Ｏ−ジメトキシトリチル−２´，３´，４´，５´，５´´−ペンタ重水素β−Ｄリボフラノシル−Ν４ベンゾイルシチジン（化合物ＸＩＸ；１．５ｇ；１．９５ｍｍｏｌ）を無水アセトニトリル共蒸発によって真空下で数時間乾燥させた。乾燥物を無水テトラヒドロフラン（ＴＨＦ：１５ｍｌ）中に入れた。反応フラスコの上に乾燥管を付けた状態で無水条件下で、溶液に硝酸銀（ＡｇＮＯ３；０．４９ｇ；２．９４ｍｍｏｌ）を加えた。混合物に乾燥ピリジン（０．６０ｍｌ；７．２６ｍｍｏｌ）を加え、そして室温で１０分間撹拌した。次いで、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルクロリド（ＴＢＤＭＳ−クロリド；０．５２ｇ；３．５２ｍｍｏｌ）を無水条件下で加え、反応混合物を密封した。混合物を室温で２．５時間撹拌した。反応の進行をＴＬＣによってモニターし、ＵＶ下で可視化した。ＴＬＣ溶媒系は、最初にクロロホルム：ヘキサン：アセトン（６５：２５：１０）を使用してチェックし（Ｒｆ値が０．３８だった）、次いで、酢酸エチル：ヘキサン（５０：５０）を使用した。粗生成物は、２´異性体（構造ＸＸ）および３´異性体（構造ＸＸＩ）の両方の形成を示した。非修飾２´および３´−異性体とのＴＬＣ上での比較分析を行った、そしてスポットは共遊走した。
【００７０】
粗生成物をシリカゲルのカラム（２３０：４００メッシュ）上で、クロロホルム：ヘキサン：アセトン（６５：２５：１０）からなる溶媒系を使用して、クロマトグラフィーにかけた。画分をＴＬＣによってモニターし、ＵＶにより可視化した。Ｒｆは同じ溶媒系で０．３８だった。合わせた純粋な画分を蒸発させ８００ｍｇの収量の泡状物質を得た：５´−Ｏ−ジメトキシトリチル２´−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−２´，３´，４´，５´，５´´−ペンタ重水素β−Ｄリボフラノシル−Ν４ベンゾイルシチジン、５０．９％。ＵＶλｍａｘは２５０ｎｍで得られた（０．３５０）；Ｅｍａｘ１６３４。３´異性体、５´−Ｏ−ジメトキシトリチル３´−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−２´，３´，４´，５´，５´´−ペンタ重水素β−Ｄリボフラノシル−Ν４ベンゾイルシチジン（構造ＸＸＩ）を単離しなかった。
【００７１】
５´−Ｏ−ジメトキシトリチル−２´−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−３´−Ｎ、Ｎ−ジイソプロピル  シアノエチル  ホスホロアミダイト−２´，３´，４´，５´，５´´−ペンタ重水素β−Ｄリボフラノシル−Ν４ベンゾイルシチジン（構造ＸＸＩＩ）の合成：前の段階からの２´−ＴＢＤＭシリル異性体（化合物ＸＸ；４３０ｍｇ）を無水アセトニトリルで十分に乾燥させ、そして丸底フラスコに入れた。無水テトラヒドロフラン（２．０ｍｌ）を添加し、溶液をアルゴンでパージし、栓と交換した。攪拌下の溶液に、２，４，６−コリジン（１７６μｌ；５当量）を加え、その後１−メチルイミダゾール（２１μｌ；１．０当量）を加えた。室温で撹拌した溶液にＮ、Ｎ−ジイソプロピルアミノ  シアノエチル  ホスホンアミド  クロライド（リン酸化試薬、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓカタログ番号ＲＮ−１５０５；１１９μｌ；２当量）を加えた。７５分後、反応が完了したことを見出し、それをクロロホルムで希釈することにより後処理した。有機層を分液漏斗に入れ、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄し、その後かん水溶液で有機層をさらに洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウム上を通過させた。溶液をロータリ蒸発器で濃縮し、そして酢酸エチル：ヘキサン：トリエチルアミン（５０：４０：１０）および酢酸エチル：ヘキサン：トリエチルアミン（３０：６０：１０）の溶媒系を使用したＴＬＣでチェックした。
【００７２】
粗生成物をカラム直径３０ｃｍＸ１．５ｃｍのシリカゲル（２３０−４００メッシュ）カラムで精製した。カラムを最初に酢酸エチル：ヘキサン：トリエチルアミン（３０：６０：１０）を用いた溶媒系で使用し、その後上側の不純物を除去し、その後溶媒系を、酢酸エチル：ヘキサン：トリエチルアミン（５０：４０：１０）に変更した。純粋な画分をＴＬＣによってモニターし、合わせ、濃縮した。１２５ｍｇの乾燥重量の無色の泡状物質を得た。生成物を、ＨＰＬＣ、ＵＶ、１Ｈ  ＮＭＲ、質量スペクトルデータおよび３１Ｐ  ＮＭＲにより分析した。図２０Ａ−２０Ｆ参照。
【００７３】
図６を参照して、スキーム５は、５´−Ｏ−ジメトキシトリチル−２´−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−３´−スクシニルＩｃａａ−ＣＰＧ−２´，３´，４´，５´，５´´−ペンタ重水素β−Ｄリボフラノシル−Ν４ベンゾイルシチジンとして本明細書に示す重水素化固体支持構造体の代替的実施形態の合成例を示す。
【００７４】
５´−Ｏ−ジメトキシトリチル−２´−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−３´−Ｏ−スクシニルピリジニウム塩−２´，３´，４´，５´，５´´−ペンタ重水素β−Ｄリボフラノシル−Ν４ベンゾイルシチジン（化合物構造のΧΧＩＩＩ）の合成：
化合物５´−Ｏ−ジメトキシトリチル−２´−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−２´，３´，４´，５´，５´´−ペンタ重水素β−Ｄリボフラノシル−Ν４ベンゾイルシチジン（化合物構造のΧΧ）（３００ｍｇ）を３．０ｍｌの乾燥ピリジン中に入れた。攪拌した溶液に無水コハク酸（１２０ｍｇ；１．９９ｍｍｏｌ）を加え、その後４−ジメチルアミノピリジン（１４ｍｇ；０．１１５ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を密封し、３７℃に維持された水浴中に１４時間保持した。反応混合物をＴＬＣで確認し、完了したと決定した。その後、反応混合物を冷メタノール（１８０ｍｌ）で急冷し，その後ロータリ蒸発器で溶媒を除去した。粗反応混合物をクロロホルムに入れ、有機層を飽和かん水溶液で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムを通して濾過し、クロロホルム溶液を真空下で濃縮した。粗化合物を短いカラムクロマトグラフィーによりクロロホルム：メタノール（９５：５）溶媒系を用いて精製した。純粋な画分を合わせ、蒸発させた。泡状物を高真空下で６時間乾燥させた。この溶媒系での生成物のＲｆ値は０．３５であった。プロセスは収量８０ｍｇを得た。生成物を、一つまたはそれ以上のＨＰＬＣ、ＵＶ、１Ｈ  ＮＭＲ、質量スペクトルデータおよび／または３１Ｐ  ＮＭＲにより分析した。図２１Ａ−２１Ｂ参照。
【００７５】
５´−Ｏ−ジメトキシトリチル−２´−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−３´−スクシニルＩｃａａ−ＣＰＧ−２´，３´，４´，５´，５´´−ペンタ重水素−β−Ｄリボフラノシル−Ν４ベンゾイルシチジン（化合物構造ＸＸＩＶ）の合成：
前のステップの５´−Ｏ−ジメトキシトリチル−２´−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−３´−Ｏ−スクシニルピリジニウム塩−２´，３´，４´，５´，５´´−ペンタ重水素β−Ｄリボフラノシル−Ν４ベンゾイルシチジン（化合物構造ＸＸＩＩＩ；４０ｍｇ）を丸底フラスコに入れ、無水アセトニトリルで完全に乾燥させ、そして直接ラインを使用して高真空下で６時間乾燥した。乾燥した材料に無水アセトニトリル（６ｍｌ）を添加し、その後ＨＢＴＵ（１９．２  ｍｇ；１．１当量）を加え、続いてジイソプロピルエチルアミン（１６μｌ；２当量）を添加した。溶液に、アミノリンカーＩＣＡＡ  ＣＰＧ（長鎖アルキルアミン制御細孔ガラス；５００Ａ粒径；Ｐｒｉｍｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ社、ペンシルベニア州製；６８０ｍｇ）を添加した。混合物を完全に密封し、３７℃で１２時間維持した。ＣＰＧを濾過し、アセトニトリルで洗浄し、その後ジエチルエーテルで洗浄した。ＣＰＧを一晩空気乾燥した。
【００７６】
残存アミノ基を遮断した。乾燥したＣＰＧを三角フラスコに入れ、ＣＡＰ  Ａ溶液（ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ製品、カタログ番号ＲＮ−１４５８、無水酢酸：ピリジン：テトラヒドロフラン（１０：１０：８０））１０ｍｌを添加した。懸濁液を密閉し室温で２時間維持した。その後、ＣＰＧを濾過し、イソプロパノールで洗浄し、その後ジエチルエーテルで洗浄した。残留アミノ官能基の完全なブロッキングの完了は、ニンヒドリン試験によりチェックした。ネガティブなニンヒドリン試験は、残余アミノ官能基の完全なキャッピングを示した。トリチル値は３０μｍｏｌ／ｇの負荷を示した。
【００７７】
図７を参照して、スキーム６は構造ＸＸＶＩＩＩの核酸塩基アデニンを有する、ホスホロアミダイトの本発明に基づく代替的実施例の合成例を示す。合成に関係する個々のステップの詳細を以下に概説する。
【００７８】
２´，３´，５´−トリ−Ｏ−ベンゾイル−２´，３´，４´，５´，５´´−ペンタ重水素β−Ｄリボフラノシル−Ν６ベンゾイルアデノシン（構造ＸＸＶＩ）の合成：
Ν６ベンゾイルアデニンの混合物（ＸＸＶ；７６０ｍｇ、３．１８ｍｍｏｌ）を蒸留１，２−ジクロロエタン中に入れ、撹拌した。ビスシリルアセトアミダイト（ＢＳＡ、３．１１６ｍｌ、１５．２９ｍｍｏｌ）を添加して、Ν６ベンゾイルアデニンが溶解するまで還流下で沸騰させた（１５時間）。続いて、ＢＳＡを真空下で蒸発させ、そしてトルエンを添加した。混合物を振盪し、溶媒を蒸発させてシリル化Ν６ベンゾイルアデニンからなる残留固形物を得た。固形物を精製せずに結合に使用した。残渣に，新たに蒸留した１，２ジクロロエタン（５０ｍｌ；新たにＣａＨ２上で蒸留）を加えた。混合物を４０℃で攪拌し、その後塩化第二スズ（０．５５ｍｌ；０．７３ｍｍｏｌ）をこの温度で添加した。反応を４０℃で１５分間続けた。１，２ジクロロエタン（４．３ｍｌ；新たにＣａＨ２上で蒸留）中の重水素化β−Ｄリボース−１−アセテート（構造ＶＩ；１．２９ｇ；２．５３ｍｍｏｌ）の溶液を均圧漏斗に入れ、そして上方の反応フラスコの上部に取り付けた。上記溶液を滴下し、反応物を還流下で２．５時間沸騰させた。
【００７９】
反応混合物を冷却した。飽和炭酸水素ナトリウム溶液を１．５時間攪拌した。反応物をセライト粉末床を通して濾過した。有機層を分離し、無水硫酸ナトリウムを通過させた。反応混合物を真空下で蒸発させ、クロロホルム：酢酸エチル：トリエチルアミン（４７：４７：８）溶媒系を使用したＴＬＣを用いてチェックした。Ｒｆ値を０．５３であると決定した。
【００８０】
粗生成物をクロロホルム：酢酸エチル：トリエチルアミン（４７：４７：６）の溶媒系を使用して、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル；２３０−４００メッシュ）により精製した。純粋な画分を、ＴＬＣによってモニターし、合わせ、ロータリ蒸発器で濃縮した。収量４００ｍｇの純粋な泡状物質を得た。
【００８１】
２´，３´，５´−トリヒドロキシ−２´，３´，４´，５´，５´´−ペンタ重水素β−Ｄリボフラノシル−Ν６ベンゾイルアデノシン（構造ＸＸＶＩＩ）の合成：
上記のトリベンゾイル化合物、２´，３´，５´−トリ−Ｏ−ベンゾイル−２´，３´，４´，５´，５´´−ペンタ重水素β−Ｄリボフラノシル−Ν６ベンゾイルアデノシン（構造ＸＸＶＩ；４００  ｍｇ）をピリジン（４．８ｍｌ）およびメタノール（１．２ｍｌ）の中に入れた。この混合物を撹拌し、化合物を溶液にした。次いで、溶液を外側のアイスバケットで０℃に冷却した。この溶液に、２ＮのＮａＯＨ（１．１６ｍｌ）を加え、そして塩基性反応混合物をＯ−ベンゾイル基を除去するために２０分間加水分解した。次いで、反応混合物に２ＮのＨＣｌ（０℃に冷却した）を添加した。塩基性溶液を（１．０ｍｌ２Ｎ  ＨＣ１を使用して）ｐＨ７．５に中和するために慎重に添加を行った。反応混合物に、ピリジン（５ｍｌ）を添加し、溶液を濃縮した。濃縮工程の後、ピリジン（２×５ｍｌ）と共蒸発させた。残留物を水の添加により結晶化によって精製した。得られた固体を濾過し、ジエチルエーテルで洗浄した。溶液をクロロホルム：メタノール（８５：１５）の溶媒系を使用したＴＬＣを用いてチェックした。真空乾燥生成物は、Ｒｆ値０．４および収量２００ｍｇであった。
【００８２】
５´−Ｏ−ジメトキシトリチル−２´，３´，４´，５´，５´´−ペンタ重水素β−Ｄリボフラノシル−Ｎ６ベンゾイルアデノシン（構造ＸＸＶＩＩＩ）の合成：
上記の２´，３´，５´−トリヒドロキシ−２´，３´，４´，５´，５´´−ペンタ重水素β−Ｄリボフラノシル−Ν６ベンゾイルアデノシン（構造ＸＸＶＩＩ：２００  ｍｇ）を乾燥ピリジンで２回乾燥し、その後、無水条件下で乾燥ピリジン（２Ｍ）を加えた。溶液を攪拌し、乾燥管を取り付けた状態で０℃に冷却した。この溶液に４，４−ジメトキシトリチルクロリド（ＤＭＴ−Ｃｌ；０．２ｌｇ；０．６１９ｍｍｏｌ）を一度に加えた。反応の進行を、クロロホルム：メタノール（９５：０５）を使用したＴＬＣによりモニターした。反応の完了後（約４時間）、反応混合物を冷却メタノール（２ｍｌ）で急冷した。次いで、溶媒をロータリ蒸発器で除去した。残留ガム状物質をクロロホルムに入れ、飽和炭酸水素ナトリウム溶液で１回洗浄し、その後かん水溶液で１回洗浄した。溶媒の除去後に得られた粗生成物をシリカゲルカラム（７０：２３０メッシュサイズ）（１５０ｇ）上で、クロロホルム：メタノール（９５：５）を溶離剤として使用してクロマトグラフィーにかけた。画分をＴＬＣによってモニターし、ＵＶにより可視化した。Ｒｆ値はクロロホルム：メタノール（９５：０５）で０．３８だった。純粋な画分を合わせ、蒸発させて、ほぼ無色の泡状物質を得た。プロセスは収量８０ｍｇ；２５０ｎｍにおけるＵＶｍａｘ；Ｅｍａｘ１１，６７１であった。生成物を、一つまたはそれ以上のＨＰＬＣ、ＵＶ、１Ｈ  ＮＭＲ、質量スペクトルデータおよび／または３１Ｐ  ＮＭＲにより分析した。図２２Ａ−２２Ｃ参照。
【００８３】
オリゴヌクレオチド合成：
必要な化学構造を合成するためのスキーム１−６を使用して、本発明は、重水素化リボヌクレオチドの製造のためのオリゴヌクレオチド合成プロセスを記載している。
図８Ａを参照して、構造Ｃ−１を持つ重水素化リボ−オリゴヌクレオチドの例示的な実施例を示し、ここでｎは、オリゴヌクレオチドのヌクレオシド単位の数（リボース＋核酸塩基）を表し、それによりオリゴヌクレオチドの配列を定義し、Ｂは、天然または修飾核酸塩基を表し、そしてＸは重水素であり、ここでＷは、酸素（Ｏ）または硫黄（Ｓ）の可能性があり；Ｙは酸素（Ｏ−）Ｃ１−Ｃ１８アルコキシ、Ｃｌ−１８アルキル；Ｒ３がＣ１−Ｃ１８アルキル又はＣ１−Ｃ４アルコキシ−Ｃ１−Ｃ６−アルキルであるＮＨＲ３；Ｒ３が上記に定義される通りで、そして、Ｒ４がＣ１−Ｃ１８アルキルであるか、または、Ｒ３が上に定義した通りで、Ｒ４がＣ１−Ｃ１８−アルキルであるか、または、そのＲ３及びＲ４がそれらを担持する窒素原子と共に５〜６員の複素環を形成し、その複素環はさらに０、Ｓ及びＮのシリーズからの別のヘテロ原子を含むことができる、ＮＲ３Ｒ４、の可能性がある。あるいは、オリゴヌクレオチド結合は式ＩＩで表されるＸ−Ｃ−（Ｙ１Ｙ２Ｙ３Ｙ４）で置き換されるＹ基を含むことができる：
【化Ｃ】
0006799918.tif 000004
ここでＷは、酸素（０−）または硫黄（Ｓ−）であってよく；Ｙは、単独または複数の水素、メチル、エチルであってよく；Ｘは、電子吸引性基であってよく、それらは、限定されないが、フッ素、塩素、臭素のようなハロゲン、ＣＮ、ＮＯ２、Ｓ０２、限定されないがフェニルチオ、フェニルスルホキシ、フェニルスルホニルのような芳香族基である。フェニル環基は、ハロゲン、ＣＮ、ＮＯ２で置換することができる。式ＩＩの［Ｘ−Ｃ−（Ｙ１，Ｙ２）］は、ＣＦ、ＣＣｌ、またはＣＢｒ３により置換することも可能である。
【００８４】
オリゴヌクレオチドのヌクレオシド単位の数は、例えば２−２００、好ましくは１００未満であり、最も好ましくは２−５０の間である。オリゴヌクレオチドユニットは、冷たい物質との希釈によって達成される１％−９８％の範囲の重水素レベルを有していてもよい。例えば、１００％重水素化されたオリゴヌクレオチドを冷却ＲＮＡで０．１％−９８％の間の最終濃度に対して連続的に希釈してもよい。図９Ａに示されるように、オリゴヌクレオチドは、好ましくは、ホスホジエステルヌクレオチド間結合を含んでいる。図９Ｂは、図８に示されている重水素化オリゴヌクレオチドの別の実施形態を示し、それはリン酸骨格変異体を有し、限定されないが、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合として示されている。ホスホロチオエート修飾は生物学的に活性なオリゴヌクレオチドを送達するために有用であることが示されてきた。オリゴヌクレオチドおよび類似体のためのプロトコル，編集者，Ｓｕｄｈｉｒ  Ａｇａｒｗａｌ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔａｗａ，ＮＪ，１９９３参照。さらに、ホスホロチオエートのような変異体骨格の使用は、細胞性酵素による分解に対する抵抗性において有用であり得、それにより、安定した修飾オリゴヌクレオチドを提供する。
【００８５】
リン酸化試薬、Ν、Ν−ジイソプロピルアミノ  シアノエチル  ホスホンアミドクロリドまたは２−シアノエチル、Ν、Ν、Ν、Ν−テトライソプロピル  ホスファンは、市販されて容易に手に入り、そしてＣｈｅｍＧｅｎｅｓ社（ウィルミントン、ＭＡ）により製造された。高純度塩化ジメトキシトリフェニル（ＤＭＴ−塩化物）はＥｓｓｃｅｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｄｉａ社から入手した。高純度ピリジンはＣａｌｅｄｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社から入手した。
【００８６】
表１に列挙されたオリゴヌクレオチドは、１μｍｏｌスケールの、３´から５´に向いた重水素化ヌクレオシド−２´−ｔ−ブチルジメチルシリル−３´−シアノエチル  ホスホロアミダイト、ならびに標準または天然ＲＮＡホスホロアミダイト化学を使用して合成した。合成は、標準ＲＮＡ  １μｍｏｌサイクルを使用してＥｘｐｅｄｉｔｅ  ８９００シンセサイザー上で行った。
【表１】
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【００８７】
所望のオリゴヌクレオチドの合成に続いて、制御細孔ガラス（ＣＰＧ）固体支持体を、２ｍｌマイクロチューブに移した。オリゴヌクレオチドをＣＰＧから分割し、４０％メチルアミン水溶液１ｍｌ中で６５℃で３０分間インキュベートすることによって脱保護した。上清を除去し、ＣＰＧを１ｍｌの水で洗浄した。上清をプールし、乾燥させた。  ２５０μｌの新鮮なフッ化無水トリエチルアンモニウム−三水素を使用して超音波浴中で、室温で２時間処理することにより、ｔ−ブチルジメチルシリル保護基をＲＮＡ残基から除去した。オリゴヌクレオチドを１．５ｍｌのｎ−ブタノールにより沈殿させた。サンプルを−２０℃で１時間冷却し、その後１０，０００ｇで１０分間遠心分離した。上清をデカントした後、ペレットをｎ−ブタノールでさらに１回洗浄した。
【００８８】
その後オリゴヌクレオチドを緩衝液Ａ＝（１０．０％、０．５Ｍ  ＴＲＩＳおよび１０．０％ＡＣＮ）、ｐＨ７．５および緩衝液Ｂ＝緩衝液Ａ中の１．０Ｍ塩化リチウム、中の直線グラジエントを使用した、イオン交換ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）により精製した。サンプル全体をＳｏｕｒｃｅ１５Ｑカラム（１．０ｃｍ×２５ｃｍ）上にロードし、そして５％−７５％アセトニトリル線形グラジエントで４０分間溶出した。サンプルを２６０ｎｍでモニターし、所望のオリゴヌクレオチド種に対応するピークを回収し、そして５．０容積の（アセトン中２％ＬｉＣｌＯ４）を加えて沈殿させ、その後１０，０００ｇで１０分間遠心分離した。上清をデカントし、ペレットをエタノールで洗浄した。
【００８９】
オリゴヌクレオチドの１．０μｍｏｌリン酸ジエステルの合成ための一般的な手順を以下に説明する。関心のある特定の配列のために使用するアミダイト（固体）を、２０ｍＬの促進ボトルに入れ、そしてある量の乾燥アセトニトリル量に溶解し溶液０．０７５Ｍを得た。ボトルをアルゴンでフラッシュし、そして素早くスクリューキャップを密閉した後に振とうし、固体を完全に溶解した。その後モノマー溶液ボトルをシンセサイザーにねじで挿入した。さらに、製品５´−Ｏ−ＤＭＴ−２´−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−ウリジン−３´−スクシニルＩｃａａを有する１．０ｕｍ促進カラム−ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ社、カタログ番号Ｎ−６１０４によって生成された支持体。天然ＲＮＡ塩基がロードされた支持体を調製し、シンセサイザーに取り付けた。表２は、自動ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザーを使用した、オリゴヌクレオチドの合成スキームを示す。
【表２】
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【００９０】
表２に示す主要な特徴の要約に従った合成の完了後、制御細孔ガラス（ＣＰＧ）固体支持体を３．０ｍｌのジエチルエーテルで洗浄し、そして２ｍｌのマイクロチューブに移した。オリゴヌクレオチド１をＣＰＧから分断し、水中の４０％メチルアミン溶液１ｍｌ中に６５℃で３０分間インキュベートすることによって脱保護した。上清を除去し、ＣＰＧを１ｍｌの水で洗浄した。上清をプールし、乾燥させた。ＤＭＳＯ中のテトラエチルアンモニウムフルオリドの新鮮な１２．０％水溶液５００μｌを使用して、４５℃で超音波浴中で１時間処理することにより、ｔ−ブチルジメチルシリル保護基をＲＮＡ残基から除去した。オリゴヌクレオチド１を１．５ｍｌのｎ−ブタノールで沈殿させた。沈殿後、サンプルを−２０℃で１時間冷却し、その後１０，０００ｇで１０分間遠心分離した。上清を、デカントし、ペレットをｎ−ブタノールで１回洗浄した。５００μｌエタノールで最終洗浄を行った。サンプルを１００００ｒｐｍで５分間遠心分離した。遠心分離後、上清をデカントした。ペレットを１００００μｌのミリＱ水に溶解した。サンプルの光学密度（ＯＤ）（粗脱塩）を測定した。その後オリゴヌクレオチドを緩衝液Ａ（１０．０％、０．５Ｍ  ＴＲＩＳおよび１０．０％ＡＣＮ）、ｐＨ７．５、および緩衝液Ｂ（緩衝液Ａ中の１．０Ｍ塩化リチウム）中の直線グラジエントを使用した、イオン交換ＨＰＬＣにより精製した。
【００９１】
全体サンプルをＳｏｕｒｃｅ１５Ｑカラム（１．０ｃｍ×２５ｃｍ）上にロードし、そして線形５％−７５％アセトニトリルグラジエントで４０分間溶出した。サンプルを２６０ｎｍでモニターし、所望のオリゴヌクレオチド種に対応するピークを回収し、そしてアセトン中で５．０容積の２％ＬｉＣｌＯ４を加えて沈殿させ、その後１０，０００ｇで１０分間遠心分離した。上清をデカントし、ペレットをエタノールで洗浄した。
【００９２】
オリゴヌクレオチドの合成例１：オリゴヌクレオチド  １Ａ：
オリゴヌクレオチド１Ａを、配列ＩＤ番号１の配列を有するように合成した：ｒＣ＊ｒＵ＊ｒＣ＊ｒＵ＊ｒＣ＊ｒＵ＊ｒＣ＊ｒＵ＊ｒＣ＊ｒＵ＊ｒＣ＊ｒＵ＊、ここでｒはリボース糖であり、＊は合成過程で重水素標識化ホスホロアミダイトを使用することから得られる重水素化リボースを表す。オリゴヌクレオチド１Ａは５´→３´アプローチを用いて、１μｍｏｌスケールでの重水素化ＲＮＡのホスホロアミダイト化学に向けて合成した。合成はＥｘｐｅｄｉｔｅ８９００シンセサイザー上で、標準ＲＮＡ  １μｍｏｌサイクルおよび１０．０分間の単量体と固体支持体とのカップリング時間を使用して行った。
【００９３】
使用アミダイトは：（Ａ）１−（５−Ｏ−ジメトキシトリチル−２−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−３−Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルシアノエチル  ホスホロアミダイト−２，３，４，５，５´−ペンタ重水素β−Ｄリボフラノシル）ウラシル（構造ＸＩＩＩ）、および（Ｂ）１−（５−Ｏ−ジメトキシトリチル−２−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−３−Ｎ、Ｎ−ジイソプロピル  シアノエチル  ホスホロアミダイト−２，３，４，５，５´−ペンタ重水素β−Ｄリボフラノシル）Ν４ベンゾイルシトシン（構造ＸＸＩＩ）。使用された固体支持体は、１−（５−Ｏ−ジメトキシトリチル−２−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−３−スクシニルＩｃａａ−ＣＰＧ−２，３，４，５，５´−ペンタ重水素β−Ｄリボフラノシル）ウラシル（化合物構造ＸＶ）であった。キャピラリー電気泳動分析の結果は、図２３Ａ−２３Ｃに示されている。
【００９４】
オリゴヌクレオチドの合成例２：オリゴヌクレオチド１Ｂ：
オリゴヌクレオチド１Ｂは配列ＩＤ番号１の配列を有するように合成した：ｒＣ＊＊ｒＵ＊＊ｒＣ＊＊ｒＵ＊＊ｒＣ＊＊ｒＵ＊＊ｒＣ＊＊ｒＵ＊＊ｒＣ＊＊ｒＵ＊＊ｒＣ＊＊ｒＵ＊＊、ここでｒはリボース糖であり、そして＊＊は重水素化リボースと天然の未修飾リボースとの混合を表し、修飾は重水素ラベルホルアミダイトと天然の未修飾ヌクレオシドホスホロアミダイトとの２５：７５の比率での混合物の使用の結果である。オリゴヌクレオチド１Ｂは、約２５％の重水素ラベルを有し、５´→３´方向の、１μｍｏｌスケールでのＲＮＡホスホロアミダイト化学を使用して合成した。合成はＥｘｐｅｄｉｔｅ８９００シンセサイザー上で、標準ＲＮＡ  １μｍｏｌサイクルおよび１０．０分間の単量体と固体支持体とのカップリング時間を使用して行った。
【００９５】
使用されたアミダイトは：（Ａ）１−（５−Ｏ−ジメトキシトリチル−２−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−３−Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルシアノエチル  ホスホロアミダイト−２，３，４，５，５´−ペンタ重水素β−Ｄリボフラノシル）ウラシル（構造ＸＩＩＩ）；（Ｂ）１−（５−Ｏ−ジメトキシトリチル２´−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−３´−Ｎ、Ｎ−ジイソプロピル  シアノエチル  ホスホロアミダイト−２，３，４，５，５´−ペンタ重水素β−Ｄリボフラノシル）Ν４ベンゾイルシチジン（構造ＸＸＩＩ）；（Ｃ）１−（５−Ｏ−ジメトキシトリチル２´−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−３´−Ｎ、Ｎ−ジイソプロピル  シアノエチル  ホスホロアミダイト−２，３，４，５，５´−ペンタ重水素β−Ｄリボフラノシル）Ν６アデノシン、配列中に天然ＲＮＡ塩基を混合するための天然ＲＮＡ塩基、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓカタログ製品、ＡＮＰ−５６７４；および（Ｄ）５´−Ｏ−ＤＭＴ−２´−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルシチジンＮｂｚ−３´−Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルシアノエチルホスホロアミダイト、配列中に天然のＲＮＡ塩基を混合するための天然ＲＮＡ塩基、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓカタログ製品、ＡＮＰ−５６７２であった。
使用した固体支持体は、（Ａ）１−（５−Ｏ−ジメトキシトリチル−２´−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−３´−スクシニルＩｃａａ−ＣＰＧ−２，３，４，５，５´−ペンタ重水素β−Ｄリボフラノシル）ウラシル（化合物構造ＸＶ）および（Ｂ）５´−０−ＤＭＴ−３´−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−ウリジン−２´−スクシニルＩｃａａ−ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ社製支持体、カタログ番号Ｎ−６１０４であった。天然Ｕと重水素修飾の３´末端Ｕを７５：２５の比率で有するオリゴヌクレオチド１Ｂ得るため、天然ＲＮＡ塩基がロードされた支持体を上記リストの支持体Ａと２５：７５の割合で混合し、配列内の混合修飾ＲＮＡ塩基に対して、１．０μｍｏｌのカラムを取得した。
【００９６】
オリゴヌクレオチドの合成例３：オリゴヌクレオチド  １Ｃ：
オリゴヌクレオチド１Ｃを、配列ＩＤ番号１の配列を有するように合成した：ｒＣｒＵｒＣｒＵｒＣｒＵｒＣｒＵｒＣｒＵｒＣｒＵ、ここでｒは未修飾天然塩基ウリジンおよびシチジンからなるリボース単位である。オリゴヌクレオチド１Ｃを５´→３´方向の、１μｍｏｌスケールでのＲＮＡホスホロアミダイト化学を使用して合成した。合成はＥｘｐｅｄｉｔｅ８９００シンセサイザー上で、標準ＲＮＡ  １μｍｏｌサイクルおよび１０．０分間の単量体と固体支持体とのカップリング時間を使用して行った。使用したアミダイトは、（Ａ）５´−Ｏ−ジメトキシトリチル−２´−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−３´−Ｎ、Ｎ−ジイソプロピル  シアノエチル  ホスホロアミダイト、天然ＲＮＡ塩基配列のための天然ＲＮＡ塩基、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓカタログ製品、ＡＮＰ−５６７４および（Ｂ）５´−Ｏ−ＤＭＴ−２´−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルシチジンＮｂｚ−３´−Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルシアノエチルホスホロアミダイト、天然ＲＮＡ塩基配列を混合するための天然ＲＮＡ塩基、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓカタログ製品、ＡＮＰ−５６７２であった。使用した固体支持体は、５´−０−ＤＭＴ−３´−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−ウリジン−２´−スクシニルＩｃａａ−ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ社製支持体、カタログ番号Ｎ−６１０４、天然ＲＮＡ塩基をロードした支持体、であった。
【００９７】
オリゴヌクレオチドの合成例４：オリゴヌクレオチド２：
オリゴヌクレオチド２を、未修飾天然塩基配列ウリジン、シチジンおよびアデノシンからなる、配列ＩＤ番号２に従った配列を有するように合成した。オリゴヌクレオチド２を５´→３´方向の、１μｍｏｌスケールでのＲＮＡホスホロアミダイト化学を使用して合成した。合成はＥｘｐｅｄｉｔｅ８９００シンセサイザー上で、標準ＲＮＡ  １μｍｏｌサイクルおよび１０．０分間の単量体と固体支持体とのカップリング時間を使用して行った。使用したアミダイトは、（Ａ）５´−Ｏ−ジメトキシトリチル−２´−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−３´−Ｎ、Ｎ−ジイソプロピル  シアノエチル  ホスホロアミダイト、天然ＲＮＡ塩基配列のための天然ＲＮＡ塩基、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓカタログ製品、ＡＮＰ−５６７４；（Ｂ）５´−Ｏ−ＤＭＴ−２´−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−シチジンＮｂｚ−３´−Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルシアノエチルホスホロアミダイト、天然ＲＮＡ塩基配列を混合するための天然ＲＮＡ塩基、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓカタログ製品、ＡＮＰ−５６７２；（Ｃ）５´−Ｏ−ＤＭＴ−２´−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−アデノシンＮｂｚ−３´−Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルシアノエチルホスホロアミダイト、天然ＲＮＡ塩基配列を混合するための天然ＲＮＡ塩基、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓカタログ製品、ＡＮＰ−５６７１；（Ｄ）５´−Ｏ−ＤＭＴ−２´−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルグアノシンＮｉｂｕ−３´−Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルシアノエチルホスホロアミダイト、天然ＲＮＡ塩基配列を混合するための天然ＲＮＡ塩基、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓカタログ製品、ＡＮＰ−５６７３、を含んだ。使用した固体支持体は、５´−０−ＤＭＴ−３´−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−ウリジン−２´−スクシニルＩｃａａ−ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ社製支持体、カタログ番号Ｎ−６１０４、天然ＲＮＡ塩基をロードした支持体であった。キャピラリー電気泳動分析の結果を図２４Ａ−２４Ｃに示す。
【００９８】
オリゴヌクレオチドの合成例５：オリゴヌクレオチド３：
オリゴヌクレオチド３を、未修飾天然塩基ウリジン、シチジン、グアノシンおよびアデノシンからなる、配列ＩＤ番号３の配列を有するように合成した。オリゴヌクレオチド３を５´→３´方向の、１μｍｏｌスケールでのＲＮＡホスホロアミダイト化学を使用して合成した。合成はＥｘｐｅｄｉｔｅ８９００シンセサイザー上で、標準ＲＮＡ  １μｍｏｌサイクルおよび１０．０分間の単量体と固体支持体とのカップリング時間を使用して行った。使用したアミダイトは、（Ａ）５´−Ｏ−ジメトキシトリチル−２´−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−３´−Ｎ、Ｎ−ジイソプロピル  シアノエチル  ホスホロアミダイト、天然ＲＮＡ塩基配列のための天然ＲＮＡ塩基、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓカタログ製品、ＡＮＰ−５６７４；（Ｂ）５´−Ｏ−ＤＭＴ−２´−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−シチジンＮｂｚ−３´−Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルシアノエチルホスホロアミダイト、天然ＲＮＡ塩基配列を混合するための天然ＲＮＡ塩基、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓカタログ製品、ＡＮＰ−５６７２；（Ｃ）５´−Ｏ−ＤＭＴ−２´−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−アデノシンＮｂｚ−３´−Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルシアノエチルホスホロアミダイト、天然ＲＮＡ塩基配列を混合するための天然ＲＮＡ塩基、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓカタログ製品、ＡＮＰ−５６７１；および（Ｄ）５´−Ｏ−ＤＭＴ−２´−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−グアノシンＮｉｂｕ−３´−Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルシアノエチルホスホロアミダイト、天然ＲＮＡ塩基配列を混合するための天然ＲＮＡ塩基、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓカタログ製品、ＡＮＰ−５６７３を含んだ。使用した固体支持体は、５´−０−ＤＭＴ−３´−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−ウリジン−２´−スクシニルＩｃａａ、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ社製支持体、カタログ番号Ｎ−６１０４、天然ＲＮＡ塩基をロードした支持体であった。キャピラリー電気泳動分析の結果を図２５Ａ−２５Ｃに示す。
【００９９】
重水素で標識化された糖を持つ、いくつかの好ましいＲＮＡ配列は、上記の方法に従って合成され、そして生物学的アッセイおよび試験のために使用されるであろう、表３参照。合成に関係するステップは、重水素の任意の損失をもたらすことは予想されず、また重水素／水素比率が維持されることが予想される。
【表３】
0006799918.tif 000007
【０１００】
オリゴヌクレオチド合成例６：オリゴヌクレオチド４：
上記で概説された手順を用いて、配列ＩＤ番号４の配列：ｒ−Ｃ＊Ａ＊Ｕ＊Ｕ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｕ＊Ｕ＊Ｃ＊Ａ＊Ａ＊Ａ＊Ｃ＊Ａ＊Ｕ＊を持つオリゴヌクレオチド４が合成可能である。ここでｒはリボ−オリゴヌクレオチドまたはＲＮＡ配列であり、＊は、図８に示すような、天然ホスホジエステル骨格を有するＲＮＡ分子の各ヌクレオシド単位に結合する２，３，４，５，５´−ペンタ重水素−Ｄリボフラノシドのような、部分的または完全に重水素化したリボースを示す。配列ＩＤ番号４の配列を有するオリゴヌクレオチド４はまた、ｒ−Ｃ＊ｐ（ｓ）Ａ＊ｐ（ｓ）Ｕ＊ｐ（ｓ）Ｕ＊ｐ（ｓ）Ｇ＊ｐ（ｓ）Ｇ＊ｐ（ｓ）Ｕ＊ｐ（ｓ）Ｕ＊ｐ（ｓ）Ｃ＊ｐ（ｓ）Ａ＊ｐ（ｓ）Ａ＊ｐ（ｓ）Ａ＊ｐ（ｓ）Ｃ＊ｐ（ｓ）Ａ＊ｐ（ｓ）Ｕ＊＊の配列を有するように合成可能である。ここでｒはリボ−オリゴヌクレオチドまたはＲＮＡ配列であり、＊はＲＮＡ分子の各ヌクレオシド単位に結合する２，３，４，５，５´−ペンタ重水素−Ｄリボフラノシドのような、部分的または完全に重水素化したリボースを示し、ｐ（ｓ）はヌクレオチド間ホスホロチオエートを示す。さらに、配列ＩＤ番号４の配列を有するオリゴヌクレオチド４は重水素化ホスホロアミダイトおよび天然ホスホロアミダイトを使用して、天然ホスホジエステル結合またはホスホロチオエート結合のような変異体ヌクレオチド結合で核酸塩基に結合する、部分的または完全重水素化リボースと天然リボースの混合から構成されるように合成可能である。本明細書では、部分的という用語は、重水素を含まない糖および／または塩基部分上の１つ以上の位置を指す。さらに、この用語は、骨格の一部として重水素化されているリボースと重水素化されていないリボースの混合を含む合成オリゴヌクレオチドを示すことがある。キャピラリー電気泳動分析の結果を図２６Ａ−２６Ｃに示す。
【０１０１】
オリゴヌクレオチドの合成例７：オリゴヌクレオチド５：
上記で概説された手順を用いて、配列ＩＤ番号５の配列：ｒ−Ｕ＊Ｕ＊Ｇ＊Ａ＊Ｕ＊Ｇ＊Ａ＊Ａ＊Ａ＊Ｃ＊Ａ＊Ｕ＊を持つオリゴヌクレオチド５が合成可能である。ここでｒはリボ−オリゴヌクレオチドまたはＲＮＡ配列であり、＊は、図８に示すような、天然ホスホジエステル骨格を有するＲＮＡ分子の各ヌクレオシド単位に結合する２，３，４，５，５´−ペンタ重水素−Ｄリボフラノシドのような、部分的または完全に重水素化したリボースを示す。配列ＩＤ番号５の配列を有するオリゴヌクレオチド５はまた、ｒ−Ｕ＊ｐ（ｓ）Ｕ＊ｐ（ｓ）Ｇ＊ｐ（ｓ）Ａ＊ｐ（ｓ）Ｕ＊ｐ（ｓ）Ｇ＊ｐ（ｓ）Ａ＊ｐ（ｓ）Ａ＊ｐ（ｓ）Ａ＊ｐ（ｓ）Ｃ＊ｐ（ｓ）Ａ＊ｐ（ｓ）Ｕ＊の配列を有するように合成可能である。ここでｒはリボ−オリゴヌクレオチドまたはＲＮＡ配列であり、＊はＲＮＡ分子の各ヌクレオシド単位に結合する２，３，４，５，５´−ペンタ重水素−Ｄリボフラノシドのような、部分的または完全に重水素化したリボースを示し、ｐ（ｓ）はヌクレオチド間ホスホロチオエートを示す。さらに、配列ＩＤ番号５の配列を有するオリゴヌクレオチド５は、核酸塩基に結合する部分的または完全重水素化リボースと天然リボースの混合から構成され、かつ、天然ホスホジエステル結合またはホスホロチオエート結合のような変異体ヌクレオチド結合を持つ、重水素化ホスホロアミダイトおよび天然ホスホロアミダイトを使用して合成可能である。キャピラリー電気泳動分析の結果を図２５Ａ−２５Ｃに示す。
【０１０２】
オリゴヌクレオチドの合成例８：オリゴヌクレオチド６：
上記で概説された手順を用いて、配列ＩＤ番号６の配列：ｒ−Ｃ＊Ａ＊Ｇ＊Ｕ＊Ｕ＊Ｃ＊Ａ＊Ａ＊Ａ＊Ｃ＊Ａ＊Ｕ＊を持つオリゴヌクレオチド５が合成可能である。ここでｒはリボ−オリゴヌクレオチドまたはＲＮＡ配列であり、＊は、図８に示すような、天然ホスホジエステル骨格を有するＲＮＡ分子の各ヌクレオシド単位に結合する２，３，４，５，５´−ペンタ重水素−Ｄリボフラノシドのような、部分的または完全に重水素化したリボースを示す。配列ＩＤ番号６の配列を有するオリゴヌクレオチド６はまた、ｒ−Ｃ＊ｐ（ｓ）Ａ＊ｐ（ｓ）Ｇ＊ｐ（ｓ）Ｕ＊ｐ（ｓ）Ｕ＊ｐ（ｓ）Ｃ＊ｐ（ｓ）Ａ＊ｐ（ｓ）Ａ＊ｐ（ｓ）Ａ＊ｐ（ｓ）Ｃ＊ｐ（ｓ）Ａ＊ｐ（ｓ）Ｕ＊の配列を有するように合成可能である。ここでｒはリボ−オリゴヌクレオチドまたはＲＮＡ配列であり、＊はＲＮＡ分子の各ヌクレオシド単位に結合する２，３，４，５，５´−ペンタ重水素−Ｄリボフラノシドのような、部分的または完全に重水素化したリボースを示し、ｐ（ｓ）はヌクレオチド間ホスホロチオエートを示す。さらに、配列ＩＤ番号６の配列を有するオリゴヌクレオチド６は、核酸塩基に結合する部分的または完全重水素化リボースと天然リボースの混合から構成され、かつ、天然ホスホジエステル結合またはホスホロチオエート結合のような変異体ヌクレオチド結合を持つ、重水素化ホスホロアミダイトおよび天然ホスホロアミダイトを使用して合成可能である。
【０１０３】
オリゴヌクレオチドの合成例９：オリゴヌクレオチド７：
上記で概説された手順を用いて、配列ＩＤ番号７の配列：ｒ−Ｇ＊Ａ＊Ｃ＊Ｃ＊Ａ＊Ｇ＊Ｕ＊Ｕ＊Ｃ＊Ａ＊Ａ＊Ａ＊Ｕ＊Ｃ＊Ａ＊Ｕ＊を持つオリゴヌクレオチド５が合成可能である。ここでｒはリボ−オリゴヌクレオチドまたはＲＮＡ配列であり、＊は、図８に示すような、天然ホスホジエステル骨格を有するＲＮＡ分子の各ヌクレオシド単位に結合する２，３，４，５，５´−ペンタ重水素−Ｄリボフラノシドのような、部分的または完全に重水素化したリボースを示す。配列ＩＤ番号７の配列を有するオリゴヌクレオチド７はまた、ｒ−Ｇ＊ｐ（ｓ）Ａ＊ｐ（ｓ）Ｃ＊ｐ（ｓ）Ｃ＊ｐ（ｓ）Ａ＊ｐ（ｓ）Ｇ＊ｐ（ｓ）Ｕ＊ｐ（ｓ）Ｕ＊ｐ（ｓ）Ｃ＊ｐ（ｓ）Ａ＊ｐ（ｓ）Ａ＊ｐ（ｓ）Ａ＊ｐ（ｓ）Ｕ＊ｐ（ｓ）Ｃ＊ｐ（ｓ）Ａ＊ｐ（ｓ）Ｕ＊の配列を有するように合成可能である。ここでｒはリボ−オリゴヌクレオチドまたはＲＮＡ配列であり、＊はＲＮＡ分子の各ヌクレオシド単位に結合する２，３，４，５，５´−ペンタ重水素−Ｄリボフラノシドのような、部分的または完全に重水素化したリボースを示し、ｐ（ｓ）はヌクレオチド間ホスホロチオエートを示す。さらに、配列ＩＤ番号７の配列を有するオリゴヌクレオチド７は、核酸塩基に結合する部分的または完全重水素化リボースと天然リボースの混合から構成され、かつ、天然ホスホジエステル結合またはホスホロチオエート結合のような変異体ヌクレオチド結合を持つ、重水素化ホスホロアミダイトおよび天然ホスホロアミダイトを使用して合成可能である。
【０１０４】
オリゴヌクレオチドの合成例１０：オリゴヌクレオチド８：
上記で概説された手順を用いて、配列ＩＤ番号８の配列：ｒ−Ａ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｕ＊Ｕ＊Ｃ＊Ａ＊Ａ＊Ａ＊Ｃ＊Ａ＊Ｕ＊を持つオリゴヌクレオチド８が合成可能である。ここでｒはリボ−オリゴヌクレオチドまたはＲＮＡ配列であり、＊は、図８に示すような、天然ホスホジエステル骨格を有するＲＮＡ分子の各ヌクレオシド単位に結合する２，３，４，５，５´−ペンタ重水素−Ｄリボフラノシドのような、部分的または完全に重水素化したリボースを示す。配列ＩＤ番号８の配列を有するオリゴヌクレオチド８はまた、ｒ−Ａ＊ｐ（ｓ）Ｇ＊ｐ（ｓ）Ｇ＊ｐ（ｓ）Ｕ＊ｐ（ｓ）Ｕ＊ｐ（ｓ）Ｃ＊ｐ（ｓ）Ａ＊ｐ（ｓ）Ａ＊ｐ（ｓ）Ａ＊ｐ（ｓ）Ｃ＊ｐ（ｓ）Ａ＊ｐ（ｓ）Ｕ＊の配列を有するように合成可能である。ここでｒはリボ−オリゴヌクレオチドまたはＲＮＡ配列であり、＊はＲＮＡ分子の各ヌクレオシド単位に結合する２，３，４，５，５´−ペンタ重水素−Ｄリボフラノシドのような、部分的または完全に重水素化したリボースを示し、ｐ（ｓ）はヌクレオチド間ホスホロチオエートを示す。さらに、配列ＩＤ番号８の配列を有するオリゴヌクレオチド８は、核酸塩基に結合する部分的または完全重水素化リボースと天然リボースの混合から構成され、かつ、天然ホスホジエステル結合またはホスホロチオエート結合のような変異体ヌクレオチド結合を持つ、重水素化ホスホロアミダイトおよび天然ホスホロアミダイトを使用して合成可能である。
【０１０５】
オリゴヌクレオチドの合成例１１：オリゴヌクレオチド９：
上記で概説された手順を用いて、配列ＩＤ番号９の配列：ｒ−Ａ＊Ａ＊Ａ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｕ＊Ｃ＊Ｃ＊Ａ＊Ｕ＊を持つオリゴヌクレオチド９が合成可能である。ここでｒはリボ−オリゴヌクレオチドまたはＲＮＡ配列であり、＊は、図８に示すような、天然ホスホジエステル骨格を有するＲＮＡ分子の各ヌクレオシド単位に結合する２，３，４，５，５´−ペンタ重水素−Ｄリボフラノシドのような、部分的または完全に重水素化したリボースを示す。配列ＩＤ番号９の配列を有するオリゴヌクレオチド９はまた、ｒ−Ａ＊ｐ（ｓ）Ａ＊ｐ（ｓ）Ａ＊ｐ（ｓ）Ｃ＊ｐ（ｓ）Ｇ＊ｐ（ｓ）Ｃ＊ｐ（ｓ）Ｃ＊ｐ（ｓ）Ｕ＊ｐ（ｓ）Ｃ＊ｐ（ｓ）Ｃ＊ｐ（ｓ）Ａ＊ｐ（ｓ）Ｕ＊の配列を有するように合成可能である。ここでｒはリボ−オリゴヌクレオチドまたはＲＮＡ配列であり、＊はＲＮＡ分子の各ヌクレオシド単位に結合する２，３，４，５，５´−ペンタ重水素−Ｄリボフラノシドのような、部分的または完全に重水素化したリボースを示し、ｐ（ｓ）はヌクレオチド間ホスホロチオエートを示す。さらに、配列ＩＤ番号９の配列を有するオリゴヌクレオチド９は、核酸塩基に結合する部分的または完全重水素化リボースと天然リボースの混合から構成され、かつ、天然ホスホジエステル結合またはホスホロチオエート結合のような変異体ヌクレオチド結合を持つ、重水素化ホスホロアミダイトおよび天然ホスホロアミダイトを使用して合成可能である。
【０１０６】
オリゴヌクレオチドの合成例１２：オリゴヌクレオチド１０：
上記で概説された手順を用いて、配列ＩＤ番号１０の配列：ｒ−Ａ＊Ａ＊Ａ＊Ｕ＊Ｇ＊Ａ＊Ａ＊Ａ＊Ａ＊Ｕ＊Ｇ＊Ｕ＊Ｃ＊Ａ＊Ｕ＊を持つオリゴヌクレオチド１０が合成可能である。ここでｒはリボ−オリゴヌクレオチドまたはＲＮＡ配列であり、＊は、図８に示すような、天然ホスホジエステル骨格を有するＲＮＡ分子の各ヌクレオシド単位に結合する２，３，４，５，５´−ペンタ重水素−Ｄリボフラノシドのような、部分的または完全に重水素化したリボースを示す。配列ＩＤ番号１０の配列を有するオリゴヌクレオチド１０はまた、ｒ−Ａ＊ｐ（ｓ）Ａ＊ｐ（ｓ）Ａ＊ｐ（ｓ）Ｕ＊ｐ（ｓ）Ｇ＊ｐ（ｓ）Ａ＊ｐ（ｓ）Ａ＊ｐ（ｓ）Ａ＊ｐ（ｓ）Ａ＊ｐ（ｓ）Ｕ＊ｐ（ｓ）Ｇ＊ｐ（ｓ）Ｕ＊ｐ（ｓ）Ｃ＊ｐ（ｓ）Ａ＊ｐ（ｓ）Ｕ＊＊の配列を有するように合成可能である。ここでｒはリボ−オリゴヌクレオチドまたはＲＮＡ配列であり、＊はＲＮＡ分子の各ヌクレオシド単位に結合する２，３，４，５，５´−ペンタ重水素−Ｄリボフラノシドのような、部分的または完全に重水素化したリボースを示し、ｐ（ｓ）はヌクレオチド間ホスホロチオエートを示す。さらに、配列ＩＤ番号１０の配列を有するオリゴヌクレオチド１０は、核酸塩基に結合する部分的または完全重水素化リボースと天然リボースの混合から構成され、かつ、天然ホスホジエステル結合またはホスホロチオエート結合のような変異体ヌクレオチド結合を持つ、重水素化ホスホロアミダイトおよび天然ホスホロアミダイトを使用して合成可能である。
【０１０７】
オリゴヌクレオチドの合成例１３：オリゴヌクレオチド１１：
上記で概説された手順を用いて、配列ＩＤ番号１１の配列：ｒ−Ａ＊Ａ＊Ａ＊Ｕ＊Ｕ＊Ｃ＊Ｕ＊Ａ＊Ａ＊Ｃ＊Ａ＊Ｕ＊を持つオリゴヌクレオチド１１が合成可能である。ここでｒはリボ−オリゴヌクレオチドまたはＲＮＡ配列であり、＊は、図８に示すような、天然ホスホジエステル骨格を有するＲＮＡ分子の各ヌクレオシド単位に結合する２，３，４，５，５´−ペンタ重水素−Ｄリボフラノシドのような、部分的または完全に重水素化したリボースを示す。配列ＩＤ番号１１の配列を有するオリゴヌクレオチド１１はまた、ｒ−Ａ＊ｐ（ｓ）Ａ＊ｐ（ｓ）Ａ＊ｐ（ｓ）Ｕ＊ｐ（ｓ）Ｕ＊ｐ（ｓ）Ｃ＊ｐ（ｓ）Ｕ＊ｐ（ｓ）Ａ＊ｐ（ｓ）Ａ＊ｐ（ｓ）Ｃ＊ｐ（ｓ）Ａ＊ｐ（ｓ）Ｕ＊の配列を有するように合成可能である。ここでｒはリボ−オリゴヌクレオチドまたはＲＮＡ配列であり、＊はＲＮＡ分子の各ヌクレオシド単位に結合する２，３，４，５，５´−ペンタ重水素−Ｄリボフラノシドのような、部分的または完全に重水素化したリボースを示し、ｐ（ｓ）はヌクレオチド間ホスホロチオエートを示す。さらに、配列ＩＤ番号１１の配列を有するオリゴヌクレオチド１１は、核酸塩基に結合する部分的または完全重水素化リボースと天然リボースの混合から構成され、かつ、天然ホスホジエステル結合またはホスホロチオエート結合のような変異体ヌクレオチド結合を持つ、重水素化ホスホロアミダイトおよび天然ホスホロアミダイトを使用して合成可能である。
【０１０８】
オリゴヌクレオチドの合成例１４：オリゴヌクレオチド１２：
上記で概説された手順を用いて、配列ＩＤ番号１２の配列：ｒ−Ｕ＊Ｕ＊Ｃ＊Ａ＊Ａ＊Ａ＊Ｕ＊Ｕ＊Ｃ＊Ｕ＊Ａ＊Ａ＊Ｃ＊Ａ＊Ｕ＊を持つオリゴヌクレオチド１２が合成可能である。ここでｒはリボ−オリゴヌクレオチドまたはＲＮＡ配列であり、＊は、図８に示すような、天然ホスホジエステル骨格を有するＲＮＡ分子の各ヌクレオシド単位に結合する２，３，４，５，５´−ペンタ重水素−Ｄリボフラノシドのような、部分的または完全に重水素化したリボースを示す。配列ＩＤ番号１２の配列を有するオリゴヌクレオチド１２はまた、ｒ−Ｕ＊ｐ（ｓ）Ｕ＊ｐ（ｓ）Ｃ＊ｐ（ｓ）Ａ＊ｐ（ｓ）Ａ＊ｐ（ｓ）Ａ＊ｐ（ｓ）Ｕ＊ｐ（ｓ）Ｕ＊ｐ（ｓ）Ｃ＊ｐ（ｓ）Ｕ＊ｐ（ｓ）Ａ＊ｐ（ｓ）Ａ＊ｐ（ｓ）Ｃ＊ｐ（ｓ）Ａ＊ｐ（ｓ）Ｕ＊の配列を有するように合成可能である。ここでｒはリボ−オリゴヌクレオチドまたはＲＮＡ配列であり、＊はＲＮＡ分子の各ヌクレオシド単位に結合する２，３，４，５，５´−ペンタ重水素−Ｄリボフラノシドのような、部分的または完全に重水素化したリボースを示し、ｐ（ｓ）はヌクレオチド間ホスホロチオエートを示す。さらに、配列ＩＤ番号１２の配列を有するオリゴヌクレオチド１２は、核酸塩基に結合する部分的または完全重水素化リボースと天然リボースの混合から構成され、かつ、天然ホスホジエステル結合またはホスホロチオエート結合のような変異体ヌクレオチド結合を持つ、重水素化ホスホロアミダイトおよび天然ホスホロアミダイトを使用して合成可能である。
【０１０９】
本明細書で言及される全ての特許および刊行物は、本発明が関係する当業者のレベルを示すものである。すべての特許および刊行物は、個々の刊行物のそれぞれ具体的かつ個別に参照により組み入れられることが示されたと同程度に、本明細書参照により組み込まれる。
【０１１０】
本発明の特定の形態が図示されているが、本発明は本明細書に記載され、示された特定の形態または配置に限定されないことが理解されるべきである。さまざまな変更が本発明の範囲から逸脱することなく可能であり、本発明は本明細書および本明細書に含まれる全ての図面／図に示され説明されるものに限定されるものではない、ことは当業者には明らかであろう。
【０１１１】
当業者は、本発明がその目的を実施し、その結果および利点、およびそれらに内在するものを獲得できるように、十分に適応されていることを容易に理解するであろう。本明細書に記載の実施形態、方法、手順および技術は、現時点での好適な実施形態の代表であり、事例紹介を目的としており、本発明の範囲を限定することを意図していない。当業者に想起される変更および他の使用方法は、本発明の精神の範囲内に包含され、添付の特許請求の範囲によって定義される。本発明を特定の好ましい実施形態に関連して説明したが、特許請求された本発明はそのような特定の態様に不当に限定されるべきではないことを理解すべきである。実際、当業者にとって自明である本発明を実施するための記載された様式の様々な改変は、添付の特許請求の範囲の範囲内にあることが意図されている。
【図１Ａ−Ｄ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ−Ｂ】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１６Ｅ】
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【図１６Ｆ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１７Ｅ】
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【図１７Ｆ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１８Ｄ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図１９Ｄ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２０Ｄ】
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【図２０Ｅ】
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【図２０Ｆ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２４Ｃ】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２５Ｃ】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２６Ｃ】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２７Ｃ】
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【配列表】
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