(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離された多能性幹細胞の細胞潜在力を拡張するための細胞培養培地組成物であって、以下の群の各々
（１）サイトカイン、
（２）グリコーゲンシンターゼキナーゼ（ＧＳＫ）阻害剤、
（３）Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）阻害剤
（４）ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ−１（ＰＡＲＰ１）阻害剤、および
（５）任意選択で、Ｒｈｏ関連コイルドコイル含有タンパク質キナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤
に由来する多能性の化学的拡張剤（ＣＥＰ）を、未処置細胞の拡張された多能性幹細胞への再プログラミングを誘導するのに有効な量で含み、
前記サイトカインが、ヒト白血病抑制因子（Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔ）（ＬＩＦ、「Ｌ」）、インターロイキン（ＩＬ）−６、ＩＬ−１１、ＩＬ−２７、ＩＬ−３１、白血病抑制因子、オンコスタチンＭ、カルジオトロフィン−１、ニューロポイエチンおよびカルジオトロフィン様サイトカイン因子１からなる群から選択され、
前記ＧＳＫ阻害剤が、ＣＨＩＲ９９０２１（「Ｃ」）［６−［［２−［［４−（２，４−ジクロロフェニル）−５−（５−メチル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２−ピリミジニル］アミノ］エチル］アミノ］−３−ピリジンカルボニトリル］、ＢＩＯ−アセトオキシム、ＧＳＫ  ３Ｉ阻害剤ＸＶ、ＳＢ−２１６７６３、ＣＨＩＲ９９０２１トリヒドロクロリド、ＧＳＫ−３阻害剤ＩＸ［（（２Ｚ，３Ｅ）−６’−ブロモ−３−（ヒドロキシイミノ）−［２，３’−ビインドリニリデン］−２’−オン］、ＧＳＫ３ＩＸ［６−ブロモインジルビン−３’−オキシム］、ＧＳＫ−３β阻害剤ＸＩＩ［３−［［６−（３−アミノフェニル）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル］オキシ］フェノール］、ＧＳＫ−３阻害剤ＸＶＩ［６−（２−（４−（２，４−ジクロロフェニル）−５−（４−メチル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−ピリミジン−２−イルアミノ）エチル−アミノ）−ニコチノニトリル］、ＳＢ−４１５２８６［３−［（３−クロロ−４−ヒドロキシフェニル）アミノ］−４−（２−ニトロフェニル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン］およびビオ［（２’Ｚ，３’Ｅ）−６−ブロモインジルビン−３’−オキシム］からなる群から選択され、
前記ＧＰＣＲ阻害剤が、ＤｉＭ（（Ｓ）−（＋）−ジメチンデンマレエート）（「Ｄ」）であり、
前記ＰＡＲＰ１阻害剤が、ＭｉＨ（ミノサイクリンヒドロクロリド）（「Ｍ」）、ＢＳＩ−２０１（４−ヨード−３−ニトロベンズアミド）、ＮＡＭ（ニコチンアミド）、ＰＪ３４（Ｎ−（６−オキソ−５，６−ジヒドロ−フェナントリジン−２−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、ＰＡＲＰ阻害剤ＸＩＶ、４−［（１−メチル−１Ｈ−ピロール−２−イル）メチレン］−１，３（２Ｈ，４Ｈ）−イソキノリンジオン、ベリパリブ、２−［（２Ｒ）−２−メチルピロリジン−２−イル］−１Ｈ−ベンズイミダゾール−４−カルボキサミドジヒドロクロリド、オラパリブ（Ｏｌａｐａｒｉｄｂ）（１−（シクロプロピルカルボニル）−４−［５−［（３，４−ジヒドロ−４−オキソ−１−フタラジニル）メチル］−２−フルオロベンゾイル］ピペラジン）、６−アミノ−１Ｈ−ベンゾ［ｄｅ］イソキノリン−１およびＩＮＨ２ＢＰ（５−ヨード−６−アミノ−１，２−ベンゾピロン）からなる群から選択される、組成物。
【請求項２】
サイトカインが、ヒト白血病抑制因子（Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔ）（ＬＩＦ、「Ｌ」）であり、
ＧＳＫ阻害剤が、［６−［［２−［［４−（２，４−ジクロロフェニル）−５−（５−メチル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２−ピリミジニル］アミノ］エチル］アミノ］−３−ピリジンカルボニトリル］（「Ｃ」）であり、
ＧＰＣＲ阻害剤が、ＤｉＭ（（Ｓ）−（＋）−ジメチンデンマレエート）（「Ｄ」）であり、
ＰＡＲＰ１阻害剤が、ＭｉＨ（ミノサイクリンヒドロクロリド）（「Ｍ」）である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
Ｌが、１〜１００ｎｇ／ｍｌの濃度範囲にあり、Ｃが、０．５〜５μＭの濃度範囲にあり、Ｄが、１〜５μＭの濃度範囲にあり、Ｍが、０．５〜５μＭの濃度範囲にある、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
ＲＯＣＫ阻害剤が、０．２〜２０μＭの範囲の濃度で存在する、Ｙ２７６３２［（＋）−（Ｒ）−トランス−４−（１−アミノエチル）−Ｎ−（４−ピリジル）シクロヘキサンカルボキサミド＋＋  ＋ジヒドロクロリド）］またはフサジル（ｆｕｓａｄｉｌ）である、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
細胞培養培地を含み、任意選択で、エンド−ＩＷＲ１（４−［（３ａＲ，４Ｓ，７Ｒ，７ａＳ）−１，３，３ａ，４，７，７ａ−ヘキサヒドロ−１，３−ジオキソ−４，７−メタノ−２Ｈ−イソインドール−２−イル］−Ｎ−８−キノリニル−ベンズアミド）またはＸＡＶ９３９（３，５，７，８−テトラヒドロ−２−［４−（トリフルオロメチル）フェニル］−４Ｈ−チオピラノ［４，３−ｄ］ピリミジン−４−オンを含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
マウス胚幹細胞、ヒト胚幹細胞および誘導多能性幹細胞からなる群から選択されるドナー細胞において拡張された多能性を誘導する方法であって、
ドナー細胞を、請求項１から５のいずれかに記載の組成物とともに、拡張された多能性を誘導するのに有効な期間培養することを含む、方法。
【請求項７】
ドナー細胞が、ＣＥＰを含む再プログラミング培地中で９〜２０日の範囲の期間培養される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ドナー細胞が、単細胞または小コロニーとして播種される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ドナー細胞が、単細胞として播種され、細胞を、ＬＣＤＭを含む培地における培養の前にＲＯＣＫ阻害剤を含む細胞培養培地中で１２〜４８時間の範囲の期間培養することをさらに含む、請求項８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養された多能性幹細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ多能性を拡張するための組成物および方法を対象とする。
【背景技術】
【０００２】
初期胚中の全能性細胞は、すべての幹細胞の前駆細胞であり、胎盤などの胚外組織を含む全生物に発達可能である。内部細胞塊（ＩＣＭ）中の多能性細胞は、全能性細胞の子孫であり、胚外組織以外の身体の任意の細胞種に分化し得る。
【０００３】
動物の発達は、卵子の精子との受精によって開始され、これに、有糸分裂性細胞分裂または卵割が直ちに続き、卵割球を作り出す。ほとんどの動物では、細胞種多様化の第１のステップは、一次胚葉、すなわち、内胚葉、中胚葉および外胚葉の生成である。一般に、内胚葉は、胃腸管の前駆体であり、これは、栄養吸収にとって必須であり、中胚葉は、筋肉および血液細胞を生じさせ、これらはそれぞれ、歩行運動および心血管循環に関与しており、外胚葉は、表皮およびニューロンに発達し、これらはそれぞれ、環境からの保護および環境の感知にとって重要である。したがって、三胚葉の形成は、動物の生命にとって必須である種々の組織を作り出すための基礎を築くものであり、動物の発生の最初に起こる進化上保存されている事象である。
【０００４】
しかし、状況は、哺乳動物、具体的には、マウスおよびヒトなどの真獣類の発生についてはわずかに異なっている。哺乳類発生における第１の細胞分化事象は、三胚葉の形成ではなく、２つの別個の細胞系統：栄養外胚葉（ＴＥ）および内部細胞塊（ＩＣＭ）の確立である。ＴＥは、母の子宮と直接相互作用することによって着床に関与し、胎盤中に組織を生じさせる。ＩＣＭから三胚葉が形成するのは着床後のみであり、最終的に動物身体中のすべての組織を作り出す。非特許文献１に概説されている。
【０００５】
ＥＳＣ（胚幹細胞）は、胚盤胞のＩＣＭ中に存在する多能性細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ対応物である。発達中の胚中の天然多能性細胞は、一過性に存在するが、ＥＳＣは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで維持され、未分化細胞の無制限の供給源を提供し得る。（非特許文献２）。単離されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養された多能性幹細胞の下流適用は、その潜在力、すなわち、その他の細胞種に分化するその能力およびそれを用いる容易性／ｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞を迅速に増殖する能力に応じて変わる。奇形腫およびキメラの両方を形成する細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ分化は、細胞の発達潜在力を評価するための基本的であるが、信頼のおけるツールである。いくつかの研究が、培養された多能性幹細胞の、３種の胚性胚葉すべてを作り出す能力を実証している（非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６、非特許文献７；非特許文献８；および非特許文献９）。しかし、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養された多能性幹細胞は、例えば、キメラを形成できないことおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏで胚外系統を作り出せないことによって決定されるような、制限された／制約のある細胞潜在力、キメラの形成における不能／非効率性および／またはｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞を迅速に増殖させ、培養で細胞を安定に維持する能力に関して制限を伴って存在することによって決定される制限された発達潜在力を示し、これらの細胞の下流適用を制限する。例えば、研究によって、ナイーブ型ＮＨＳＭ（ナイーブ型ヒト幹細胞培養液）−ｈＥＳ（ヒト胚性幹）細胞などの多能性細胞は、キメラマウス胚においてＴＥ（栄養外胚葉）およびＩＣＭ（内部細胞塊）の両方に寄与できないことが示されている（非特許文献１０）。エピブラスト幹細胞（ＥｐｉＳＣ）は、奇形腫を容易に形成するが、それらはキメラを稀にしか形成しない。非特許文献１１には、培養物中の約９９％（ＥｐｉＳＣ）を構成し、キメラ寄与を示さないＥｐｉＳＣの亜集団が記載されている。さらなる例として、細胞解離後のヒト胚幹細胞の不十分な生存が、さらなる操作および発達を妨げる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｍａｒｉｋａｗａら、Ｍｏｌ．  Ｒｅｐｒｏｄ．  Ｄｅｖ．、第７６巻（１１号）：１０１９〜１０３２頁（２００９年）
【非特許文献２】Ｔａｃｈｉｂａｎら、Ｃｅｌｌ、第１４８巻（１〜２号）：２８５〜２９５頁（２０１２年）
【非特許文献３】Ｔａｋａｓｈｉｍａら、Ｃｅｌｌ、第１５８巻：１２５４〜１２６９頁（２０１４年）
【非特許文献４】Ｃｈａｎら、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ、第１３巻：６６３〜６７５頁（２０１３年）
【非特許文献５】Ｔｈｅｕｎｉｓｓｅｎら、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ第１５巻：４７１〜４８７頁（２０１４年）
【非特許文献６】Ｅｖａｎｓら、Ｎａｔｕｒｅ、第２９２巻：１５４〜１５６頁（１９８１年）
【非特許文献７】Ｌｉら、Ｃｅｌｌ、第１３５巻：１２９９〜１３１０頁（２００８年）
【非特許文献８】Ｂｕｅｈｒら、Ｃｅｌｌ、第１３５巻：１２８７〜１２９８頁（２００８年）
【非特許文献９】Ｔｈｏｍｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２８２巻：１１４５〜１１４７頁（１９９８年）
【非特許文献１０】Ｇａｆｎｉら、Ｎａｔｕｒｅ、第５０４巻（７４７９号）：２８２〜６頁（２０１３年）
【非特許文献１１】Ｈａｎら（Ｃｅｌｌ、第１４３巻：６１７〜６２７頁（２０１０年））
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、ｉｎ  ｖｉｖｏで多能性幹細胞の細胞潜在力を拡張する方法およびｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞を迅速に増殖させ、安定に維持する方法が必要である。
【０００８】
したがって、ｉｎ  ｖｉｖｏで拡張された細胞潜在力を有する多能性幹細胞を提供することが、本発明の目的である。
【０００９】
また、ｉｎ  ｖｉｖｏで単離された多能性幹細胞の細胞潜在力を拡張するための組成物を提供することが、本発明の目的である。
【００１０】
ｉｎ  ｖｉｖｏで単離された多能性幹細胞の細胞潜在力を拡張する方法を提供することが、さらに本発明の目的である。
【００１１】
拡張された細胞潜在力を有する多能性幹細胞を使用する方法を提供することが、さらなる本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
同定された因子のカクテル、本明細書において、多能性の化学的拡張剤（ＣＥＰ）ととものｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養後に、ｉｎ  ｖｉｖｏで単離された多能性細胞（ｉｓＰＳＣ）の細胞潜在力を拡張するために使用できる因子のカクテルを同定した。ＣＥＰは、例えば、ｉｓＰＳＣに、ｉｎ  ｖｉｖｏで胚外系統を作り出す能力を付与することによって、同一生物から得られた未処置の対応する細胞と比較した場合に、ｉｓＰＳＣの細胞潜在力を拡張する。
【００１３】
ＣＥＰとして、（１）サイトカイン、（２）グリコーゲンシンターゼキナーゼ（ＧＳＫ）阻害剤、（３）Ｇタンパク質共役受容体阻害剤アセチルコリン受容体アンタゴニストおよび（４）ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ−１（ＰＡＲＰ１）阻害剤が挙げられる。好ましい実施形態では、サイトカインは、白血病抑制因子（ＬＩＦ）（「Ｌ」）であり、ＧＳＫ阻害剤は、アミノピリミジン、化学名［６−［［２−［［４−（２，４−ジクロロフェニル）−５−（５−メチル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２−ピリミジニル］アミノ］エチル］アミノ］−３−ピリジンカルボニトリル］を有するＣＨＩＲ９９０２１（「Ｃ」）であり、Ｇタンパク質共役受容体阻害剤は、アセチルコリン受容体アンタゴニスト、より好ましくは、ｍＡＣｈＲ（ムスカリン性アセチルコリン受容体）、例えば、Ｍ２、ＤｉＭ（（Ｓ）−（＋）−ジメチンデンマレエート）（「Ｄ」）であり、ＰＡＲＰ１阻害剤は、ＭｉＨ（ミノサイクリンヒドロクロリド）（「Ｍ」）である。ＣＥＰのこの好ましいカクテル、本明細書において、ＬＣＤＭは、有効量で、胚性および胚外系統を作り出すその能力を拡張するようにｉｎ  ｖｉｔｒｏで多能性細胞をコンディショニングするために使用され得る。
【００１４】
また、本明細書において開示されるＣＥＰを使用してドナー細胞を再プログラムすることによって、単離された多能性幹細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ細胞潜在力を拡張する方法も提供される。再プログラムされるべき細胞（すなわち、ドナー細胞）が、細胞を、化学的に誘導された／再プログラムされた拡張された多能性幹細胞（ＣｉＥＰＳＣ）に再プログラムするのに十分な期間ＣＥＰと接触される。好ましい実施形態では、細胞は、ＣＥＰを含有する再プログラム培地において、１４〜３０日の間の期間、最初に培養される。いくつかの実施形態では、細胞は、Ｒｈｏ関連コイルドコイル含有タンパク質キナーゼ（ＲＯＣＫ）の選択的阻害剤、例えば、Ｙ２７６３２［（＋）−（Ｒ）−トランス−４−（１−アミノエチル）−Ｎ−（４−ピリジル）シクロヘキサンカルボキサミド＋＋  ＋ジヒドロクロリド］を含有する培地において、１２〜４８時間、好ましくは、２４〜４８時間の範囲の期間、最も好ましくは、２４時間培養され、その後、細胞はＣＥＰＳと接触させられる。ｃｉＥＰＳＣは、単離され、さらに培養され得る。この実施形態では、ＲＯＣＫキナーゼ阻害剤は、継代前の最初の１２時間および継代後の１２時間の間に細胞培養培地に添加され得る。その他の実施形態ではさらに、ＲＯＣＫ阻害剤は、最初の２、３回の継代、例えば、２〜６回、好ましくは、最初の３〜５回の継代の間、細胞培養培地中に存在し得る。
【００１５】
ｃｉＥＰＳＣも開示されている。本明細書において開示されるようなＣＥＰと接触させられた再プログラムされた細胞は、（ｉ）形態学的に、（ｉｉ）機能的に、（ａ）細胞の、三胚性胚葉の組織に分化する能力、（ｂ）ＣＤＸ２、ＧＡＴＡ６、ＨＡＮＤ１およびＥＯＭＥＳなどの１種以上の胚外マーカーの上方制御された発現、（ｃ）ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＫＬ２、ＳＯＸ２およびＵＴＦ１（未分化胚性細胞転写因子）などの多能性の１種以上のマーカーの下方制御、（ｄ）ＴＢＸ３およびＧＢＸ２などの多能性の１種以上のマーカーの上方制御ならびに（ｅ）ｉｎ  ｖｉｖｏで胚性および胚外キメラ化の両方を形成する能力を含む特性に基づいて拡張された多能性幹細胞として同定される。ｃｉＥＰＳＣは、非ＣＥＰ処理細胞と比較した場合に、これらの特性のうち少なくとも１つの、好ましくは、２つ、３つ、４つまたはすべてを有する点で、本明細書において開示されるＣＥＰに曝露されていない細胞とは異なる。上方制御または下方制御は、ｃｉＥＰＳＣが得られた対応する多能性幹細胞において測定された因子のレベルを比較することによって決定される。
【００１６】
本明細書において開示されるｃｉＥＰＳＣは、少なくとも、それらを作り出すために使用される方法によって、すなわち、その起源によって、ヒトまたはマウスＥＳＣまたはｉＰＳＣと区別され得る。ｃｉＥＰＳＣが、多能性細胞を、本明細書において記載されるような小分子の組合せを用いて処理することによって得られる場合には、ＥＳＣは、天然に存在する細胞であるが、他方、ｃｉＥＰＳＣは、天然に存在しない（それらが得られる対応する天然に存在するＥＳＣには見られない特徴を有することによって証明されるように）。
【００１７】
ＣＥＰＳＣは、所望の種類の細胞に分化するように培養または誘導され得る。ＣＥＰＳＣおよびその後代は、それだけには限らないが、細胞療法および組織工学を含むいくつかの適用において使用され得る。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１Ａ】図１Ａは、化合物をスクリーニングするために使用される戦略を示す模式図である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、Ｅ１０．５でのキメラアッセイの概要を示す棒グラフである。総受胎産物：回収されたＥ１０．５受胎産物の総数；Ｅｍ（胚性）＆ＥｘＥｍ（胚外）：ヒト細胞がＥｍおよびＥｘＥＭ組織の両方に組み込まれた受胎産物の数。
【図２Ａ】図２Ａは、プライム型ｈＥＳ（ｎ＝４、生物学的複製物）、ナイーブ型ＮＨＳＭ−ｈＥＳ（ｎ＝４、生物学的複製物）およびｈＥＰＳ（ｎ＝４、生物学的複製物）細胞中の胚外遺伝子の代表的な相対転写レベルを示す図である。各サンプルについて、ＲＮＡ−ｓｅｑに由来する遺伝子発現値は、プライム型ｈＥＳ細胞中の対応する遺伝子の平均値に対して正規化されている。中心値は、平均を示す。エラーバーは、標準偏差を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂおよび２Ｃは、ｈＥＰＳ細胞（Ｈ１−ＥＰＳ、Ｈ９−ＥＰＳ）、プライム型ｈＥＳ細胞（Ｈ１、Ｈ９）およびナイーブ型ｈＥＳ細胞（Ｈ１−ＮＨＳＭ、Ｈ９−ＮＨＳＭ）における選択された胚外遺伝子発現のＱ−ＰＣＲ解析を示す図である。各サンプルについて、遺伝子発現値は、元のプライム型Ｈ１およびＨ９細胞それぞれにおけるものに対して正規化されている。中心値は、平均を示す。エラーバーは、標準偏差（ｎ＝２、技術的複製物）を示す。
【図２Ｃ】同上。
【図２Ｄ】図２Ｄは、ｈＥＰＳ細胞における、およびｈＥＰＳ細胞由来の分化したＥＢ（配様体）細胞における胚外遺伝子の発現を示すＱ−ＰＣＲ（定量的ポリメラーゼ連鎖反応）解析を表す図である。Ｄ０：ＥＢ形成アッセイ前に集められたｈＥＰＳ細胞、Ｄ３：ＥＢ形成の３日目に集められたｈＥＰＳ由来細胞。遺伝子発現値は、Ｄ０細胞に対して正規化されている。中心値は、平均を示す。エラーバーは、標準偏差を示す（ｎ＝２、技術的複製物）。
【図３Ａ】図３Ａは、プライム型ｈＥＳ（ｎ＝４、生物学的複製物）、ｈＥＰＳ（ｎ＝４、生物学的複製物）およびナイーブ型ＮＨＳＭ−ｈＥＳ（ｎ＝４、生物学的複製物）細胞における代表的な多能性関連遺伝子の相対転写物レベルを示す図である。各サンプルについて、ＲＮＡ−ｓｅｑに由来する発現値は、プライム型ｈＥＳ細胞における平均発現値に対して正規化されている。中心値は、平均を示す。エラーバーは、標準偏差を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂおよび３Ｃは、ｈＥＰＳ細胞（Ｈ１−ＥＰＳ、Ｈ９−ＥＰＳ）、プライム型ｈＥＳ細胞（Ｈ１、Ｈ９）およびナイーブ型ＮＨＳＭ−ｈＥＳ細胞（Ｈ１−ＮＨＳＭ、Ｈ９−ＮＨＳＭ）における選択された多能性遺伝子発現のＱ−ＰＣＲ解析を示す図である。各サンプルについて、遺伝子発現値は、別個に元のプライム型Ｈ１およびＨ９細胞におけるものに対して正規化されている。中心値は、平均を示す。エラーバーは、標準偏差（ｎ＝３、技術的複製物）を示す。
【図３Ｃ】同上。
【図３Ｄ】図３Ｄおよび３Ｅは、各々示された遺伝子のバイオリンプロットとして示されるｈＥＰＳ（ｎ＝１６、生物学的複製物）およびプライム型ｈＥＳ細胞（ｎ＝２５、生物学的複製物）の単一細胞ｑＰＣＲ解析から得られた発現値の頻度分布を示す図である。比較のために、発現値は、ΔＣＴ値＋２０として表されている。白丸は、各サンプルの遺伝子発現値の平均値を示す。
【図３Ｅ】同上。
【図４Ａ】図４Ａおよび図４Ｂは、プライム型ｈＥＳ（ｎ＝２、技術的複製物）およびｈＥＰＳ（ｎ＝２、技術的複製物）細胞におけるすべての遺伝子にわたるＨ３Ｋ４ｍｅ３およびＨ３Ｋ２７ｍｅ３クロマチンマークのプロファイルを示す図である。領域にわたる平均の標準誤差（ＳＥＭ）が算出され、平均曲線の周囲の半透明の影として示されている。
【図４Ｂ】同上。
【図４Ｃ】図４Ｃ〜Ｄは、継代７で種々の条件下でのｈＥＰＳ細胞における選択された遺伝子発現のＱ−ＰＣＲ解析を示す棒グラフを示す図である。ＤｉＭ（（（Ｓ）−（＋）−ジメチンデンマレエート）（図４Ｃ）およびＭｉＨ（ミノサイクリンヒドロクロリド）（図４Ｄ）を、［ｈＬＩＦ（ヒト白血病抑制因子）、ＣＨＩＲ９９０２１、ＤｉＭおよびＭｉＨ］条件において、ＬＣＤＭ中の同一標的を標的とする小分子と置き換えた。ｈＥＰＳ細胞を、それぞれ、ＬＣＭ条件下で、ＤｉＭ（２μＭ）、ＴＨ（５μＭ）、ＤＥＳ（５μＭ）から選択される追加の小分子とともに培養した、もしくはＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）とともに培養した（図４Ｃ）、またはＬＣＤ条件下で、ＭｉＨ、ＢＳＩ−２０１（５μＭ）、ＮＡＭ（１００μＭ）、ＰＪ３４（Ｎ−（６−オキソ−５，６−ジヒドロ−フェナントリジン−２−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミドＨＣｌ）（５μＭ）もしくはＤＭＳＯから選択されるさらなる小分子とともに（図４Ｄ）培養した。発現値は、ＬＣＭ＋ＤｉＭ（図４Ｃ）およびＬＣＤ＋ＭｉＨ（図４Ｄ）サンプルの平均値に対して正規化されている。ＬＣＭ：ヒトＬＩＦ＋ＣＨＩＲ９９０２１＋ＭｉＨ；ＬＣＤ：ヒトＬＩＦ＋ＣＨＩＲ９９０２１＋ＤｉＭ。中心値は、平均を示す。エラーバーは、標準偏差を示す（ｎ＝３、技術的複製物）。ＴＨ：トリペレナミンＨＣＬ；ＤＥＳ：デスロラタジン；ＢＳＩ：ＢＳＩ−２０１；ＮＡＭ：ニコチンアミド。
【図４Ｄ】同上。
【図４Ｅ】図４Ｅは、ノックダウン後、継代３でのｈＥＰＳ細胞における選択された遺伝子の発現に対するＰＡＲＰ１ノックダウンの効果を示す。ｈＥＰＳ細胞は、ＬＣＤ条件下で培養した。発現値は、スクランブル対照の平均値に対して正規化されている。中心値は、平均を示す。エラーバーは、標準偏差を示す（ｎ＝３、技術的複製物）。
【図４Ｆ】図４Ｆは、Ｅ１２．５でのキメラアッセイの概要を示す棒グラフである。棒グラフ（ｂａｒ  ｃｈａｒｔ）は、キメラ（灰色、胚性組織（Ｅｍ）への組込み；黒色、回収されたＥ１２．５受胎産物の中での胚性および胚外胎盤組織（Ｅｍ＆ＥｘＥｍ））両方への組込みのパーセンテージを示す。
【図４Ｇ】図４Ｇは、８細胞胚期での単一細胞注入のキメラアッセイの概要を示す棒グラフである。棒グラフ（ｂａｒ  ｃｈａｒｔ）は、回収された胚盤胞の中でのキメラのパーセンテージを示す。ＩＣＭ＆ＴＥ、ＩＣＭおよびＴＥ両方中にマウス細胞が組み込まれた胚。
【図５Ａ】図５Ａは、伝統的なＴＳ培地において培養された細胞における代表的なＴＳマーカー遺伝子の相対発現を示す図である。ＬＣＤＭ条件（ＴＴ２−６  ｐ０およびｍｃ６−１  ｐ０）で培養されたｍＥＰＳ細胞または２ｉ条件（ＴＴ２−２ｉ  ｐ０およびｍｃ２ｉ−１  ｐ０）で培養されたｍＥＳ細胞を、別個に対照として使用した。少なくとも３回の独立した実験において同様の結果が得られた。エラーバーは、標準偏差を示す（ｎ＝３）。
【図５Ｂ】図５Ｂは、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌベースの浸潤アッセイの模式図である。
【図５Ｃ】図５Ｃは、Ｅ１７．５胎盤組織中のｍＥＰＳ由来細胞における栄養膜細胞マーカー遺伝子の発現を示す図である。サンプルの２つのバッチを解析した。ＦＡＣＳを使用してＴｄｔｏｍａｔｏ（Ｔｄ）陽性細胞を精製した。これらの細胞における栄養膜細胞マーカーの発現を解析し、元のＥＰＳ細胞（ＴＴ２−６）およびＴｄ陰性宿主胎盤細胞と比較した。
【図５Ｄ】図５Ｄは、ヒトミトコンドリアＤＮＡの定量的ＰＣＲ解析を示し、Ｅ１０．５マウス胚中のｈＥＰＳ由来細胞の存在を示した図である。ヒトＤＮＡ対照（Ｈ、赤色バー）およびヒト−マウス細胞希釈（青色バー）を使用して、ヒト細胞寄与の程度を推定した。破線は、１０，０００個のマウス細胞中の１個のヒト細胞の希釈と同等のヒトミトコンドリアＤＮＡの検出レベルを示す。Ｍ、注入されていないマウス胚。
【図５Ｅ】図５Ｅは、ヒトミトコンドリアＤＮＡの定量的ＰＣＲ解析を示し、８細胞または胚盤胞期でのｈＥＰＳ細胞の注入後のＥ１０．５でのマウス胚盤中のヒト細胞の存在を示した図である。ヒトＤＮＡ対照（Ｈ、赤色バー）および一連のヒト−マウス細胞希釈（青色バー）を、並行して実施して、ヒト細胞寄与の程度を推定した。破線は、１０，０００個のマウス細胞中の１個のヒト細胞の希釈と同等のヒトミトコンドリアＤＮＡの検出レベルを示す。Ｍ、注入されていないマウス胎盤。
【図６Ａ】図６Ａおよび６Ｂは、ＥＰＳ細胞および既知多能性細胞種から得たＲＮＡ−ｓｅｑのＰＣＡおよびマイクロアレイデータを示す図である。（６Ａ）については、ｍＥＰＳ細胞（本研究）、ｍＥＳ細胞、２Ｃ様細胞（Ｍａｃｆａｒｌａｎら（２０１２年））およびエピブラスト幹細胞（Ｎａｊｍら（２０１１年））から得たデータを解析した。データは、各研究におけるｍＥＳ細胞に対して正規化された。（ａ）では、合計１７，２４３種の遺伝子を選択した。（６Ｂ）について、ｈＥＰＳ細胞（本研究）、ナイーブ型ｈＰＳＣ（Ｔａｋａｓｈｉｍａら（２０１４年）、Ｃｈａｎら（２０１３年）、Ｇａｆｎｉら（２０１３年）およびＴｈｅｕｎｉｓｓｅｎら（２０１４年））およびプライム型ｈＰＳＣから得たデータを解析した。データは、各研究におけるプライム型ｈＰＳＣに対して正規化された。（６Ｂ）では、合計１５，９５８種の遺伝子を選択した。丸：ＲＮＡ−ｓｅｑデータ；三角：マイクロアレイデータ。
【図６Ｂ】同上。
【図６Ｃ】図６Ｃは、ｍＥＰＳ細胞のキメラ能力に対するＤｉＭまたはＭｉＨ置換の影響の解析を示す図である。Ｐａｒｐ１ノックアウトｍＥＰＳ細胞（Ｐａｒｐ１−ＫＯ）を、ＬＣＤＭ条件において、ＭｉＨを伴わずに培養した（−ＭｉＨ）。ｍＥＰＳ細胞を、注入前に、種々の条件下で少なくとも５継代の間培養した。８細胞胚中に複数の細胞を注入し、これをさらなる解析の前にさらに６０時間培養した。棒グラフ（ｂａｒ  ｃｈａｒｔ）は、回収された胚盤胞の中でのキメラのパーセンテージを示す。ＩＣＭ＆ＴＥ、マウス細胞がＩＣＭおよびＴＥの両方に組み込まれた胚。
【図６Ｄ】図６Ｄは、ｈＥＰＳのキメラ能力に対するＤｉＭまたはＭｉＨ置換の影響の解析を示す図である。ｈＥＰＳ細胞を、種々の条件下で少なくとも５継代の間培養し、次いで、８細胞胚中に複数の細胞を注入し、これをさらなる解析の前にさらに６０時間培養した。棒グラフ（ｂａｒ  ｃｈａｒｔ）は、回収された胚盤胞の中でのキメラのパーセンテージを示す。ＩＣＭ＆ＴＥ、マウス細胞がＩＣＭおよびＴＥの両方に組み込まれた胚。ＴＨ：トリペレナミンＨＣＬ；ＤＥＳ：デスロラタジン；ＮＡＭ：ニコチンアミド。ＰＤ：ＰＤ０３２５９０１；ＳＢ：ＳＢ２０３５８０；ＳＰ：ＳＰ６００１２５。
【図７Ａ】図７Ａおよび７Ｂは、ｍＥＳ（ＴＴ２−２ｉ、ｍｃ２ｉ−１）およびｍＥＰＳ細胞（ＴＴ２−６、ｍｃ６−１）（図７Ａ）ならびにｈＥＰＳ細胞およびプライム型ｈＰＳＣ（図７Ｂ）においてＭＡＰＫシグナル伝達に関与するタンパク質の総およびリン酸化レベルのウエスタンブロット解析を示す図である。３回の独立した実験において同様の結果が得られた。
【図７Ｂ】同上。
【図７Ｃ】図７Ｃは、Ｐａｒｐ１ノックアウトｍＥＰＳ細胞株の作製を示す模式図である。ｇＲＮＡは、それぞれ、Ｐａｒｐ１遺伝子座中のエキソン１および２内の配列にターゲッティングされ、これが、ｍＥＰＳ細胞中に同時トランスフェクトされた。Ｃａｓ９タンパク質の発現後、エキソン１からエキソン２のゲノム断片が、Ｐａｒｐ１遺伝子座から欠失された。
【図７Ｄ】図７Ｄは、ゲノムＰＣＲ解析を示し、ｍＥＰＳ細胞株ＴＴ２−６の３種のサブクローン（２Ｂ１、２Ａ１および１Ａ５）中のＰａｒｐ１遺伝子座が成功裏にターゲッティングされたことを確認した図である。野生型ｍＥＳ  ＴＴ２−２ｉおよびｍＥＰＳ  ＴＴ２−６を対照として使用した。
【図７Ｅ】図７Ｅおよび７Ｆは、ゲノムＱ−ＰＣＲおよびＱＲＴ−ＰＣＲ解析を示し、Ｐａｒｐ１ノックアウトｍＥＰＳサブクローン（Ｐａｒｐ１  ＫＯ）においてＰａｒｐ１エキソン（７Ｅ）およびｍＲＮＡ発現（７Ｆ）がないことを確認した図である。野生型ｍＥＰＳ細胞株ＴＴ２−６を対照として使用した。
【図７Ｆ】同上。
【図７Ｇ】図７Ｇは、Ｐａｒｐ１ノックアウトｍＥＰＳクローン（２Ｂ１、２Ａ１および１Ａ５）においてＰＡＲＰ１タンパク質発現がないことを確認するウエスタンブロット解析を示す図である。野生型ｍＥＰＳ細胞株ＴＴ２−６を対照として使用した。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
胚性および胚外系統の両方を作り出す能力が改善／拡張された、拡張された多能性幹（ＥＰＳ）細胞と呼ばれる、ヒトにおける新規幹細胞の誘導を可能にする化学カクテルを同定した。重要なことに、単一ヒトＥＰＳ（ｈＥＰＳ）細胞は、マウスキメラ胚において胚性および胚外系統（特に、胎盤における系統）の両方に寄与する能力を有する。本明細書において記載された研究によって確立されたように、ｈＥＰＳ細胞は、プライム型ヒト胚性幹（プライム型ｈＥＳ）細胞またはＮＨＳＭ（ナイーブ型ヒト幹細胞培地）条件によって支持されるナイーブ型ヒトＥＳ細胞（ナイーブ型ＮＨＳＭ−ｈＥＳ細胞）と比較して複数の胚外遺伝子の基礎ｍＲＮＡ活性の上方制御を示した（Ｇａｆｎｉら、Ｎａｔｕｒｅ、第５０４巻（７４７９号）：２８２〜６頁（２０１３年））。注目すべきことに、ｈＥＰＳ細胞は、プライム型ｈＥＳ細胞を変換すること、体細胞再プログラムによって、または直接、胚盤胞から作り出すことができる。より重要なことに、ブタＥＰＳ、ラットＥＰＳおよびマウスＥＰＳ（ｍＥＰＳ）細胞は、同一培養条件を使用して成功裏に確立され、単一ｍＥＰＳ細胞は、胚性期１０．５（Ｅ１０．５）およびＥ１２．５でキメラ受胎産物において胚外および胚性組織に寄与し得る。
【００２０】
本明細書において記載された研究は、培養された細胞、例えば、多能性幹細胞の細胞潜在力は、既存のレベルを超えて、すなわち、本明細書において開示される因子と接触されていない同一生物から得た対応する細胞におけるレベルを超えてｉｎ  ｖｉｖｏで拡張され得ることを実証する。さらに、ＥＰＳ細胞は、迅速に拡張され、安定に維持され得る。したがって、ＥＰＳ細胞は、例えば、早期発症を研究するヒト化動物モデルを使用する再生医療のための患者特異的細胞を作り出す疾患モデリングの新規細胞供給源を提供する。
【００２１】
Ｉ．定義
用語「細胞潜在力」とは本明細書において、その他の細胞種に分化する細胞の能力。細胞が分化できる細胞種が多いほど、その潜在力は大きい。
【００２２】
用語「化学的に誘導された多能性幹細胞」（ＣｉＰＳＣ）とは本明細書において、非多能性細胞を化学化合物と接触させることによって、１種以上のトランスフェクトされた遺伝子の発現によってではなく、多能性ではない細胞、すなわち、複能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）または分化した細胞から導かれた多能性細胞を指す。
【００２３】
用語「化学的に誘導された拡張された多能性幹細胞（「ｃｉＥＰＳＣ」）」とは、本明細書において、ドナー細胞を化学化合物と接触させることによって、それが由来する多能性幹細胞の種類と比較した場合に、ｉｎ  ｖｉｖｏで胚外系統を作り出す能力が改善された多能性幹細胞を指す。例えば、プライム型ヒトＥＳＣに由来するｃｉＥＰＳＣは、非ＣＥＰＳ処理プライム型ヒト胚幹細胞と比較した場合に、ＣＥＰＳとの接触後にｉｎ  ｖｉｖｏで胚外組織を作り出す、改善された能力を示す。
【００２４】
用語「対応する細胞」とは、ｃｉＥＰＳＣが得られるドナー細胞と同一種類の、同一生物に由来する細胞を指すように使用される。例えば、マウス胚幹細胞から得られたｃｉＥＰＳＣの対応する細胞は、ＣＥＰと接触されていない／ＣＥＰを用いて再プログラムされていないマウス胚幹細胞である。
【００２５】
用語「ドナー細胞」とは、本明細書において、拡張された細胞潜在力を誘導／付与するためにＣＥＰと接触される予定の細胞を指す。
【００２６】
用語「拡張された細胞潜在力」とは、本明細書において、ｃｉＥＰＳＣに関連して、対応する細胞よりもさらに少なくとも１種の細胞種に分化するｃｉＥＰＳＣの能力を指す。
【００２７】
用語「エピジェネティック」とは、本明細書において、突然変異ベースではないが、いくつかの場合には、それでもなお世代から世代へと受け渡され得るＤＮＡの共有結合修飾を指す。活性化される、または抑制される遺伝子は、ＤＮＡ配列の何らかの変化を伴わずにエピジェネティック的に制御される。エピジェネティック修飾は、安定であるが、ＤＮＡ配列の永久変化を伴わずに生じる遺伝子発現の可逆的な変更である可能性がある。多数の種類のエピジェネティックプロセスが同定されており、それらとして、ヒストンのメチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化およびＳＵＭＯ化（ｓｕｍｏｌｙａｔｉｏｎ）ならびにＤＮＡメチル化が挙げられる。
【００２８】
用語「誘導多能性幹細胞」（ｉＰＳＣ）とは、本明細書において、非多能性細胞から人工的に導かれた多能性幹細胞の種類である。ＣｉＰＳＣは、ｉＰＳＣであるが、それらは、多能性を付与するように遺伝子操作されていないという点でいくつかのｉＰＳＣとは異なる。
【００２９】
用語「ヒト化動物モデル」は、本明細書において、機能的ヒト細胞もしくは組織が移植された、またはヒト導入遺伝子を発現する非ヒト哺乳類を指すように使用される。
【００３０】
「ｉｎ  ｖｉｖｏで胚外系統を作り出す、改善された能力」は、本明細書において、例えば、材料および方法のもとで本明細書において記載されるようなキメラアッセイにおける微量注入後の、栄養外胚葉マーカーの発現ならびに／または栄養外胚葉（ＴＥ）およびＩＣＭ（内部細胞塊）両方への寄与を測定することによって決定され得る。
【００３１】
ｃｉＥＰＳＣに言及する場合には、用語「単離された」または「精製された」は、拡張されていない多能性細胞である混入細胞種を少なくとも１０％、２０％  ３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％含まない化学的に誘導された拡張された多能性幹細胞を意味する。単離されたＥＰＳＣまた、可溶性の天然に存在する分子を実質的に含まない場合もある。
【００３２】
「培地」および「培養培地」とは、本明細書において、細胞培養環境を指す。培地は、通常、等張性溶液であり、例えば、細胞間接着のためのマトリックスまたは支持体を提供するために、液体、ゼラチン状または半固体であり得る。本明細書において、培地は、細胞を培養するために必要な、栄養的、化学的および構造的支持体の成分を含み得る。
【００３３】
用語「多能性」（または多能性の）とは、本明細書において、三胚葉：内胚葉（例えば、内部胃の内壁、胃腸管、肺）、中胚葉（例えば、筋肉、骨、血液、泌尿生殖器）または外胚葉（例えば、上皮組織および神経系）のいずれかに分化する潜在力を有する幹細胞を指す。複能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞は、あまり可塑性ではなく、より分化しており、所与の臓器内のいくつかの種類の細胞のうち１種になり得る。例えば、複能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）血液幹細胞は、赤血球前駆細胞、白血球細胞または血小板生成細胞に発達し得る。成体幹細胞は、複能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞である。脂肪由来幹細胞は、複能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）である。
【００３４】
「多能性細胞」は本明細書において、「多能性幹細胞」と同義的に使用される。
【００３５】
「再プログラミング」とは、本明細書において、ある特定の細胞種から、さらなる／異なる機能的および／または構造的特徴を有する別のものへの変換を指す。例えば、本明細書において定義されるようなｃｉＥＰＳＣではない細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養後にｉｎ  ｖｉｖｏで胚外系統を作り出す、拡張された能力を有する細胞に再プログラムされ得る。
【００３６】
用語「小分子」とは、２，０００ダルトン未満の、より好ましくは、１，５００ダルトン未満の、最も好ましくは、１，０００ダルトン未満の分子量を有する有機または有機金属化合物などの分子を指す。
【００３７】
「トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）受容体阻害剤」とは、本明細書において、ＴＧＦβ受容体を阻害する薬剤を指す。ＴＧＦβ受容体は、１回型セリン／トレオニンキナーゼ受容体である。３種のＴＧＦ−β受容体の種類として、受容体Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩ型、すなわち、ＴＧＦ−β受容体１、ＴＧＦ−β受容体２およびＴＧＦ−β受容体３が挙げられる。
【００３８】
本明細書において使用されるような「２ｉ」とは、グリコーゲンシンターゼキナーゼ−３およびマイトジェン活性化タンパク質キナーゼシグナル伝達が二重阻害されたＥＳＣ培養培地、例えば、２ｉ（ＣＨＩＲ９９０２１およびＰＤ０３２５９０１）を補給したＥＳＣ培養培地を指す。
【００３９】
ＩＩ．組成物
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養後にｉｎ  ｖｉｖｏで単離された多能性幹細胞の細胞潜在力を拡張するために使用され得る因子のカクテル、多能性の化学的拡張剤（ＣＥＰ）を同定した。ＣＥＰは、例えば、ｉｓＰＳＣに、ｉｎ  ｖｉｖｏで胚外系統を作り出す能力を付与することによって、未処置の対応する細胞と比較した場合に、ｉｓＰＳＣの細胞潜在力を拡張する。ＣＥＰは、拡張されていない多能性細胞などの混入細胞種を少なくとも１０％、２０％  ３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％含まないｃｉＥＰＳＣの単離された集団を提供するために使用され得る。
【００４０】
ＣＥＰとして、（１）サイトカイン、（１）グリコーゲンシンターゼキナーゼ（ＧＳＫ）阻害剤、（２）Ｇタンパク質共役受容体阻害剤アセチルコリン受容体アンタゴニストおよび（３）ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ−１（ＰＡＲＰ１）阻害剤を含む小分子が挙げられる。組成物は、多能性細胞を好ましくは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、ドナー多能性細胞から得られた多能性細胞と比較した場合に、胚性および胚外系統を作り出すための拡張された／増強された能力を有する細胞に再プログラムするために、有効量のＣＥＰを含む。例えば、ＭｉＨまたはＤＩＭを、同様の活性の小分子と置換する実験において、本明細書において例示されるようなｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを使用して、属内の特定の種について開示された有効濃度に基づいて、サイトカイン、ＧＳＫ阻害剤、ＧＰＣＲアンタゴニストまたはＰＡＲＰ１阻害剤の群内のその他のメンバーの同等に有効な濃度を決定することは、当業者の能力内である（図４ＣおよびＤ）。
【００４１】
本明細書において開示される方法において有用な任意選択の化合物は、０．５〜２０μＭ、好ましくは、５〜１５μＭ、最も好ましくは、１０μＭの範囲の濃度のＲｈｏ関連コイルドコイル含有タンパク質キナーゼ（ＲＯＣＫ）の選択的阻害剤、例えば、Ｙ２７６３２［（＋）−（Ｒ）−トランス−４−（１−アミノエチル）−Ｎ−（４−ピリジル）シクロヘキサンカルボキサミド＋＋＋ジヒドロクロリド）］または同等の濃度のファスジルである。
【００４２】
さらにより好ましい実施形態は、アキシン−βカテニン複合体を安定化し得る少なくとも１種の小分子を含む。好ましい分子として、エンド−ＩＷＲ１（４−［（３ａＲ，４Ｓ，７Ｒ，７ａＳ）−１，３，３ａ，４，７，７ａ−ヘキサヒドロ−１，３−ジオキソ−４，７−メタノ−２Ｈ−イソインドール−２−イル］−Ｎ−８−キノリニル−ベンズアミド；ＣＡＳ番号１１２７４４２−８２−３）およびＸＡＶ９３９（３，５，７，８−テトラヒドロ−２−［４−（トリフルオロメチル）フェニル］−４Ｈ−チオピラノ［４，３−ｄ］ピリミジン−４−オン；ＣＡＳ番号２８４０２８−８９−３）が挙げられる。
【００４３】
Ａ．多能性の化学的拡張剤
１．サイトカイン
好ましいサイトカインは、１〜１００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは、１〜５０、さらにより好ましくは、１〜３０ｎｇ／ｍｌの濃度範囲で使用される、ヒト白血病抑制因子（ＬＩＦ）（「Ｌ」）、インターロイキン６クラスサイトカインである。ＩＬ−６は、ニューロポイエチン類、ＩＬ−６、ＩＬ−１１、ＩＬ−２７、ＩＬ−３１、白血病抑制因子、オンコスタチンＭ、カルジオトロフィン−１、ニューロポイエチンおよびカルジオトロフィン様サイトカイン因子１（新規ニューロトロフィン１およびＢ細胞刺激因子−３としても知られる）ならびにＩＬ−６の２種のウイルス性類似体を含む構造的に関連するサイトカインの群の創始者メンバーである、プロトタイプの４へリックスバンドルサイトカインである。サイトカインのインターロイキン６ファミリーのこれらのメンバーは、ＬＩＦについて開示される同等の濃度で、本明細書において開示される組成物において使用され得る。
【００４４】
２．小分子
多能性を拡張する化学化合物、すなわち、多能性の化学拡張剤（ＣＥＰ）として、単独の、またはタンパク質と組み合わせた、２，０００ダルトン未満、より好ましくは、１，５００ダルトン未満、最も好ましくは、１，０００ダルトン未満の分子量を有する小分子が挙げられる。小分子は、９００ダルトン以下または５００ダルトン以下の分子量を有し得る。化学的に誘導される再プログラムにおいて、好ましくは、本明細書において同定された小分子と同一の経路を標的とする、より大きな分子が使用され得る。
【００４５】
（ｉ）ＰＡＲＰ１阻害剤
ＰＡＲＰ１阻害剤は、好ましくは、ＭｉＨ（ミノサイクリンヒドロクロリド）（「Ｍ」）、０．５〜５μＭの、より好ましくは、の範囲の濃度で使用される強力なＰＡＲＰ１選択的阻害剤である。例えば、組成物中のＭｉＨの濃度は、０．５、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５または５μＭであり得る。さらなるＰＡＲＰ１阻害剤として、それだけには限らないが、ＢＳＩ−２０１（４−ヨード−３−ニトロベンズアミド）、ＮＡＭ（ニコチンアミド）およびＰＪ３４（Ｎ−（６−オキソ−５，６−ジヒドロ−フェナントリジン−２−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ｐＰＡＲＰ１およびＰＡＲＰ２阻害剤））、ＰＡＲＰ阻害剤ＸＩＶ、４−［（１−メチル−１Ｈ−ピロール−２−イル）メチレン］−１，３（２Ｈ，４Ｈ）−イソキノリンジオン（強力なＰＡＲＰ１阻害剤）、ベリパリブ、２−［（２Ｒ）−２−メチルピロリジン−２−イル］−１Ｈ−ベンズイミダゾール−４−カルボキサミドジヒドロクロリド（強力なＰＡＲＰ−１およびＰＡＲＰ−２阻害剤）、オラパリブ（Ｏｌａｐａｒｉｄｂ）（１−（シクロプロピルカルボニル）−４−［５−［（３，４−ジヒドロ−４−オキソ−１−フタラジニル）メチル］−２−フルオロベンゾイル］ピペラジン）；６−アミノ−１Ｈ−ベンゾ［ｄｅ］イソキノリン−１およびＩＮＨ２ＢＰ（５−ヨード−６−アミノ−１，２−ベンゾピロン；ＰＡＲＰ阻害剤ＩＩ）が挙げられる。ＰＡＲＰ１および／またはＰＡＲＰ２阻害剤を含むその他の既知ＰＡＲＰ阻害剤は、市販されており、細胞をｃｉＥＰＳＣに再プログラムするのに有効な量で本明細書において開示されるＣＥＰ組成物中に含まれ得る。ＭｉＨをＴＨと、ＤＥＳまたはＤＩＭをＮＡＭと置換する実験などにおいて、例えば、本明細書において例示されるようなｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを使用して、その他のＰＡＲＰ１阻害剤の同等濃度を決定することは、当業者の能力内である。
【００４６】
（ｉｉ）ＧＳＫ阻害剤
ＧＳＫ阻害剤は、好ましくは、ＧＳＫ３を阻害し、好ましくは、ＧＳＫ３に対して選択的である。適したＧＳＫ阻害剤として、アミノピリミジン、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３阻害剤であるＣＨＩＲ９９０２１（「Ｃ」）がある。ＣＥＰ組成物は、０．１〜５μＭの、好ましくは、１から３の間の、さらにより好ましくは、１．５から３μＭの間の濃度範囲のＣＨＩＲ９９０２１を含む。例えば、ＣＥＰは、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５または５μＭの濃度のＣＨＩＲ９９０２１を含み得る。当業者ならば、必要な有効量を容易に微調整できるので、これらの数の間に入る濃度が考慮される。
【００４７】
しかし、その他のＧＳＫ阻害剤は市販されており、本明細書において開示される組成物において使用され得る。例として、それだけには限らないが、ＢＩＯ−アセトオキシム、ＧＳＫ３Ｉ阻害剤ＸＶ、ＳＢ−２１６７６３、ＣＨＩＲ９９０２１のヒドロクロリド塩であるＣＨＩＲ９９０２１トリヒドロクロリド、ＧＳＫ−３阻害剤ＩＸ［（（２Ｚ，３Ｅ）−６’−ブロモ−３−（ヒドロキシイミノ）−［２，３’−ビインドリニリデン］−２’−オン］、ＧＳＫ３ＩＸ［６−ブロモインジルビン−３’−オキシム］、ＧＳＫ−３β阻害剤ＸＩＩ［３−［［６−（３−アミノフェニル）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イル］オキシ］フェノール］、ＧＳＫ−３阻害剤ＸＶＩ［６−（２−（４−（２，４−ジクロロフェニル）−５−（４−メチル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−ピリミジン−２−イルアミノ）エチル−アミノ）−ニコチノニトリル］、ＳＢ−４１５２８６［３−［（３−クロロ−４−ヒドロキシフェニル）アミノ］−４−（２−ニトロフェニル）−１  Ｈ−ピロール−２，５−ジオン］およびビオ［（２’Ｚ，３’Ｅ）−６−ブロモインジルビン−３’−オキシム］が挙げられる。
【００４８】
（ｉｉｉ）Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）阻害剤
最も好ましいＧＰＣＲ阻害剤として、１〜５μＭの濃度範囲で使用される（Ｓ）−（＋）−ジメチンデンマレエート（「Ｄ」）がある。ジメチンデンマレエートは、サブタイプ選択的ｍＡＣｈＲ（ムスカリン性アセチルコリン受容体）Ｍ２、ｍＡＣｈＲ  Ｍ１、ｍＡＣｈＲ  Ｍ３およびｍＡＣｈＲ  Ｍ４アンタゴニストならびにヒスタミンＨ１受容体アンタゴニストであるエナンチオマーである。しかし、その他のＧＰＣＲ阻害剤は、本明細書において開示されるＣＥＰ組成物中に含まれ得、それらとして、それだけには限らないが、エチレンジアミン、例えば、トリペレナミンＨＣＬ、（中枢および末梢ヒスタミンＨ１受容体（ｒｅｃｅｐｔｏｒｓｓ）を競合的に遮断するヒスタミンＨ１アンタゴニスト）、メピラミンおよびアンタゾリン；ロラチジン（ｌｏｒａｔｉｄｉｎｅ）またはその代謝産物、デスロラタジン（選択的ヒスタミンＨ１アンタゴニスト）などの三環系または四環系が挙げられる。その他のものは当技術分野で公知であり、それだけには限らないが、レボセチリジン、フェキソフェナジン、アステミゾール、ケトチフェン、セチリジン、ロラタジン、ルパタジン、ミゾラスチン、アクリバスチン、エバスチン、ビラスチン、ベポタスチン、テルフェナジン、キフェナジン（Ｑｕｉｆｅｎａｄｉｎｅ）、シクリジン、クロルシクリジン、ヒドロキシン（ｈｙｄｒｏｘｉｎｅ）、ペニラミン（ｐｅｎｉｒａｍｉｎｅ）、クロルフェナミン、トリポリジン（ｔｒｉｐｏｌｉｄｉｎｅ）、ジフェンヒドラミン、カルビノキサミン、ブロマジンなどが挙げられる。
【００４９】
特に好ましいカクテルとして、（１）サイトカイン；（１）グリコーゲンシンターゼキナーゼ（ＧＳＫ）阻害剤、（２）Ｇタンパク質共役受容体阻害剤アセチルコリン受容体アンタゴニスト、（３）ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ−１（ＰＡＲＰ１）阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤を含む小分子およびアキシン−βカテニン複合体を安定化し得る小分子の組合せが挙げられる。この実施形態では、カクテルは、好ましくは、ＬＣＤＭおよびエンド−ＩＷＲ１（０．５〜１０μＭの好ましい濃度範囲で）およびＹ２７６３２（２〜５μＭの好ましい濃度範囲で）またはＬＣＤＭおよびＸＡＶ９３９（０．５〜１０μＭの好ましい濃度範囲で）およびＹ２７６３２（２〜５μＭ）を含む。
【００５０】
Ｂ．誘導される予定の細胞（ドナー細胞）
拡張された多能性幹細胞は、任意の哺乳類（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ネコ、ウマ、霊長類）、好ましくは、ヒトなどの哺乳類から得られた多能性細胞、または部分的もしくは完全に分化した細胞を誘導することによって得られる。供給源として、骨髄、線維芽細胞、胎児組織（例えば、胎児肝臓組織）、末梢血、臍帯血、膵臓、皮膚または任意の臓器もしくは組織が挙げられる。
【００５１】
好ましい実施形態では、ｃｉＥＰＳＣは、多能性細胞、例えば、胚幹細胞または誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から得られる。ｉＰＳＣは、遺伝子工学および／または純粋な化学的再プログラムによって得られる細胞を含む。その他の実施形態では、ｃｉＥＰＳＣは、胚盤胞（ｂｌａｃｔｏｃｙｔｓ）から得られる。
【００５２】
好ましくは、ｉＰＳＣは、化学的に誘導された線維芽細胞、脂肪由来幹細胞、神経幹細胞または腸管上皮に由来する細胞から得られる。いくつかの実施形態では、ＣｉＰＳＣは、化学的に誘導された新生児（例えば、包皮）または成体線維芽細胞から得られる。しかし、ｉＰＳＣは、それだけには限らないが、複能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞、血液学的起源の細胞、胚性起源の細胞、皮膚由来細胞、線維芽細胞、脂肪細胞、上皮細胞、内皮細胞、間葉系細胞、実質細胞、神経学的細胞および結合組織細胞を含むその他の細胞種から得られ得る。
【００５３】
本明細書において開示される方法において使用され得る多能性細胞は、当技術分野で公知であり、記載されており、細胞を培養で維持する方法を含む。マウス胚性幹（ＥＳ）細胞は、胚盤胞の内部細胞塊から単離され、白血病抑制因子（ＬＩＦ）を用いる外因性刺激ならびにＥＲＫ１／ＥＲＫ２およびＧＳＫ３βシグナル伝達の小分子阻害（２ｉ／ＬＩＦ条件と呼ばれる）を提供することによって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでナイーブ型内部細胞塊様立体配置で保たれ得る。ナイーブ型多能性の特徴として、その遠位エンハンサーによってＯｃｔ４（Ｐｏｕ５ｆ１としても知られる）転写を駆動すること、事前不活性化Ｘ染色体状態を保持することならびに発達調節遺伝子プロモーター上へのＤＮＡメチル化およびＨ３Ｋ２７ｍｅ３抑制クロマチンマーク沈着の全体的な低減が挙げられる。２ｉ／ＬＩＦを退薬すると、ナイーブ型マウスＥＳ細胞は、着床後エピブラストのものと類似するプライム型多能性状態に向かい得る。ヒトES細胞は、ナイーブ型マウスES細胞といくつかの分子特徴を共有するが、それらはまた、プライム型マウスエピブラスト幹細胞（ＥｐｉＳＣ）と種々のエピジェネティック特性を共有する。これらとして、ＯＣＴ４発現を維持するための近位エンハンサーエレメントの主な使用、ほとんどの女性のヒトＥＳ細胞におけるＸ染色体不活性化の明白な傾向、系統調節遺伝子でのＤＮＡメチル化の増大およびＨ３Ｋ２７ｍｅ３の顕著な沈着および二価ドメイン獲得が挙げられる。すでに確立されたプライム型ヒトＥＳ細胞からの、誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞再プログラミングによる体細胞からの、または直接胚盤胞からの遺伝子修飾されていないヒトナイーブ型多能性幹細胞の誘導が、Ｇａｆｎｉら、Ｎａｔｕｒｅ、第５０４巻（７４７９号）：２８２〜２８６頁（２０１３年）に開示されている。
【００５４】
ドナー細胞は、当業者に公知の技術を使用して細胞供給源として働く適当な臓器または組織を脱凝集することによって単離され得る。例えば、組織または臓器は、機械的に脱凝集され得る、ならびに／または隣接する細胞間の接合を弱める消化酵素および／もしくはキレート化剤で処理され得、その結果、組織は、明らかな細胞破損を伴わずに個々の細胞の懸濁液を形成するように分散され得る。酵素的解離は、組織を刻むことおよび刻んだ組織を、トリプシン、キモトリプシン、コラゲナーゼ、エラスターゼおよび／またはヒアルロニダーゼ、ＤＮアーゼ、プロナーゼ、ディスパーゼなどといった１種以上の酵素で処理することによって達成され得る。機械的破壊はまた、それだけには限らないが、グラインダー、ブレンダー、篩、ホモジナイザー、プレッシャーセルまたはインソネーターの使用を含むいくつかの方法によって達成され得る。
【００５５】
Ｃ．化学的に誘導された拡張された多能性幹細胞（ｃｉＥＰＳＣ）
ＣｉＥＰＳＣは、（ｉ）形態学的に−マウスＥＳＣ様形態学および（ｉｉ）（ａ）細胞の、３種の胚性胚葉の組織に分化する能力、（ｂ）１種以上の胚外マーカーの上方制御された発現、（ｃ）１種または複数の多能性のマーカーの上方制御および／または下方制御ならびに（ｄ）ｉｎ  ｖｉｖｏでのＴＥおよびＩＣＭ両方への寄与に基づいて機能的に、を含め特性に基づいて拡張された多能性細胞として同定される。ｃｉＥＰＳＣは、対応する細胞と比較した場合にｉｎ  ｖｉｖｏで拡張された細胞潜在力を示す。好ましい実施形態では、ｃｉＥＰＳＣは、ｉｎ  ｖｉｖｏで１種以上の胚外系統を作り出す／それに寄与する。ｉｎ  ｖｉｖｏでの１種以上の系統へのｃｉＥＰＳＣ寄与は、当技術分野で公知の、実施例に記載されるような方法を使用するｉｎ  ｖｉｖｏ移植後に、胚外マーカー（以下に論じられる）のうち１種以上のマーカーの存在を調べることによって決定され得る。
【００５６】
１．形態学
ヒトドナー細胞から得られたｃｉＥＰＳＣは、マウス胚性幹（ＥＳ）細胞と形態学的に似ている。ヒトＥＰＳ細胞は、マウス胚幹細胞と似ているドーム型コロニーを形成する。マウスＥＰＳ細胞は、マウス胚幹細胞と形態学的に同一である。
【００５７】
２．三胚葉の組織に分化する能力
ｃｉＥＰＳＣは、当技術分野で公知の方法を使用して、三胚葉の各々、外胚葉、中胚葉および内胚葉に由来する１種以上の細胞／組織に分化する能力を有する。
【００５８】
外胚葉は、胚の外層を作り出し、胚のエピブラストから形成する。外胚葉は、表面外胚葉、神経冠および神経管に発達する。表面外胚葉は、表皮、毛、爪、眼のレンズ、皮脂腺、角膜、歯のエナメル質、口および鼻の上皮に発達する。外胚葉の神経冠は、末梢神経系、副腎髄質、メラノサイト、顔の軟骨に発達する。外胚葉の神経管は、脳、脊髄、下垂体後葉、運動ニューロンおよび網膜に発達する。
【００５９】
内胚葉は、最初は、扁平な細胞からなり、これが、その後、円柱状になる。口および咽頭の一部および直腸の末端部分（外胚葉の巻き込みによって覆われている）を除いて、消化管のすべての上皮内層を形成する。また、肝臓および膵臓のものを含む消化管中に開く腺の内壁細胞、耳管および鼓室の上皮、肺の気管、気管支および気胞、膀胱および尿道の一部ならびに甲状腺および胸腺の濾胞内壁も形成する。内胚葉は、胃、結腸、肝臓、膵臓、膀胱、気管、肺、咽頭、甲状腺、上皮小体および腸の上皮を形成する。
【００６０】
中胚葉は、結合組織、筋肉（平滑および横紋）、リンパ系、骨、漿膜、軟骨、脂肪組織、循環系、真皮、泌尿生殖器系および脊索を形成する。
【００６１】
３．ｉｎ  ｖｉｖｏでのＴＥおよびＩＣＭの両方／胚外マーカーの上方制御への寄与
対応する細胞はそのように寄与できない、ｉｎ  ｖｉｖｏでＴＥおよびＩＣＭの両方へ寄与する能力は、ｉｎ  ｖｉｖｏで胚外系統を作り出す／それに寄与する改善された能力のしるしである。例えば、三胚葉の各々から１種以上の細胞／組織へ分化し得る、ヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞の細胞潜在力は、本明細書において開示されるようなＣＥＰＳと接触されたｈＥＳに、ｉｎ  ｖｉｖｏでＴＥおよびＩＣＭの両方に寄与する能力を付与することによって改善される／拡張される。ｉｎ  ｖｉｖｏでＴＥおよびＩＣＭに寄与する細胞の能力は、当技術分野で公知の方法を使用して決定され得る。いくつかの実施形態では、ＴＥおよびＩＣＭに寄与する能力は、実施例において開示されるように、ｃｉＥＰＳＣをマウスＥ２．５またはＥ３．５胚に微量注入し、ｉｎ  ｖｉｖｏでＥ１０．５胚に発達させることおよび注入された細胞のＴＥおよびＩＣＭへの寄与を調べることによって決定される。
【００６２】
ｃｉＥＰＳＣは、対応する生物から単離された、未処置のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養された対応する細胞と比較した場合に、ＣＤＸ２、ＧＡＴＡ６、ＨＡＮＤ１およびＥＯＭＥＳなどの１種以上の胚外マーカーの上方制御された発現を示す。例えば、プライム型ｈＥＳＣから作り出される場合には、ｃｉＥＰＳＣは、プライム型ｈＥＳＣと比較した場合に１種以上の胚外マーカーの上方制御を示し、ナイーブ型ｈＥＳＣから作り出される場合には、ｃｉＥＰＳＣは、ナイーブ型ｈＥＳＣと比較した場合に、１種以上の胚外マーカーの上方制御を示すなど。１種以上の胚外マーカーの上方制御は、ｉｎ  ｖｉｖｏで胚外系統を作り出す改善された能力の指標である。好ましい実施形態では、胚外遺伝子のｍＲＮＡ基礎活性は、ＣｉＥＰＳＣにおいて上方制御される。
【００６３】
４．多能性のマーカーの上方制御および／または下方制御
ｃｉＥＰＳＣは、対応する生物から単離された、未処置の対応する細胞（すなわち、本明細書において開示されるようなＣＥＰＳと接触されていない対応する細胞）と比較した場合に、ＴＢＸ３およびＧＢＸ２などの多能性の１種または複数のマーカーの上方制御を示す。ＯＣＴ４、ＲＥＸ１、ＤＰＰＡ３、ＴＢＸ３およびＧＢＸ２を含むいくつかの多能性マーカー遺伝子のｍＲＮＡ発現は、ｈＥＰＳ細胞において、ＣＥＰ処理されていないプライム型ｈＥＳ細胞におけるものよりも均一であった。
【００６４】
ｃｉＥＰＳＣは、同一生物から単離された、未処置の対応する細胞と比較した場合に、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＫＬ２、ＳＯＸ２およびＵＴＦ１（未分化胚性細胞転写因子）などの多能性の１種または複数のマーカーの下方制御を示す。これは、ｉＰＳＣＳ、例えば、ＮＡＮＯＧ、ＵＴＦ１およびＳＯＸ２などのマーカーの上方制御を示す、Ｈｏｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第３４１巻（６１４６号）：６５１〜４頁（２０１３年）に開示される細胞と対照的である。
【００６５】
ｃｉＥＰＳＣは、ＣＥＰＳで処置されていない対応する細胞と比較した場合に、これらの特性のうち少なくとも１つ、好ましくは、２つ、３つ、４つまたはすべてを有する点で未処置の対応するｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養された細胞とは異なる。例えば、ｃｉＥＰＳＣは、本明細書において開示される形態学を有し、すべての三胚葉から１種以上の細胞／組織に分化する能力を有し、１種以上の胚外マーカーの上方制御を示し、またはさらに、ｉｎ  ｖｉｖｏでＴＥおよびＩＣＭの両方に寄与し得る、またはさらに、本明細書において開示されるような多能性の１種以上のマーカーの上方制御および／または下方制御を示す。例えば、２ｉ条件におけるマウス胚幹細胞培養物と比較して、マウスＥＰＳ細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏで胚性および胚外（特に、胎盤）両方のキメラ化、ＯＣＴ４のタンパク質発現の下方制御、Ｃｄｘ２およびＥｏｍｅｓなどの胚外遺伝子の遺伝子座中の抑制的エピジェネティックマーカーＨ３Ｋ２７ｍｅ３の下方制御に寄与すると示す。ＬＩＦシグナル伝達および／またはＧＳＫ３βリン酸化などのさらなる特徴は、ｃｉＥＰＳＣのような細胞をさらに同定および区別するために使用され得る。例えば、プライム型ｈＥＳ細胞と比較した場合には、ｈＥＰＳ細胞は、ＬＩＦシグナル伝達の活性化を示し、これは、例えば、ＧＰ１３０、ＳＴＡＴ３および−ｐ−ＳＴＡＴ３のレベルを測定して決定され得る。さらに、ＧＳＫ３βリン酸化は、ｈＥＳと比較した場合に、ｈＥＰＳ細胞では減少される。ＬＩＦシグナル伝達の活性化およびＧＳＫ３βシグナル伝達のレベルは、任意の生物から得られたｃｉＥＰＳＣをさらに同定するために、およびｉＥＰＳＣを、その他の単離された多能性幹細胞から区別するために使用され得る。
【００６６】
プライム型ｈＰＳＣと比較してｈＥＰＳ細胞において上方制御されるさらなる遺伝子として、ＨＯＸＡ１（ホメオボックスＡ１）、ＭＩＸＬ１（Ｍｉｘ１ホメオボックス様１）およびＤＥＲＡ（デオキシリボースリン酸アルドラーゼ）遺伝子が挙げられる。ｈＥＰＳ細胞においてもっぱら上方制御され、その他のｈＰＳＣ種では上方制御されない遺伝子として、例えば、ＣＨＤ７（クロモドメインヘリカーゼＤＮＡ結合タンパク質７））、ＣＨＤ４（クロモドメインヘリカーゼＤＮＡ結合タンパク質４）、ＭＩＸＬ１およびＬＥＦ１（リンパ球エンハンサー結合因子１）が挙げられる。
【００６７】
ＩＩＩ．作製方法
Ａ．多能性幹細胞における拡張された多能性の誘導
ｃｉＥＰＳＣは、誘導／再プログラムされる予定の細胞（本明細書において、ドナー細胞）を、ＣＥＰを含有する培養培地と、細胞の化学的に誘導された拡張された多能性幹細胞（ｃｉＥＰＳＣ）への再プログラミングをもたらすのに十分な時間接触させることによって製造される。
【００６８】
ドナー細胞は、細胞の拡張された多能性幹細胞への再プログラミングを誘導および／または増強するのに有効な量の、本明細書において開示されるＣＥＰと接触させられる。当業者ならば、以下の実施例において概説される方法または当技術分野で公知のその他の方法を使用することによって、完全な再プログラミングを提供するのに必要な、本明細書において開示されるＣＥＰ化合物の濃度を容易に決定できる。好ましい実施形態では、ドナーは、例えば、胚幹細胞または誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）のような多能性幹細胞である。ｉＰＳＣは、遺伝子工学および／または純粋な化学的再プログラミングによって得られる細胞を含む。その他の実施形態では、ｃｉＥＰＳＣは、胚盤胞（ｂｌａｃｔｏｃｙｔｓ）から得られる。
【００６９】
ドナー細胞がプライム型ヒト胚幹細胞（ｈＥＳＣ）である例示的方法では、細胞は、単細胞として、または小さいコロニーとしてフィーダー細胞上に播種され得る。ｈＥＳＣは、好ましくは、従来のｈＥＳ培養培地上で、３〜６日間、例えば、最後の継代後３日、４日、５日または６日間培養され、その後ＣＥＰＳと接触させられる。細胞が単細胞として播種される実施形態では、Ｒｈｏ関連コイルドコイル含有タンパク質キナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤の選択的阻害剤は、例えば、Ｙ２７６３２が、任意選択で、変換の前に、５〜２０μＭ、好ましくは、５〜１５μＭの濃度範囲、より好ましくは、１０μＭで培養培地に１２〜４８時間、好ましくは、２４〜４８時間、最も好ましくは、２４時間添加される。この実施形態では、ＲＯＣＫキナーゼ阻害剤は、継代前の最初の１２時間および継代後の１２時間の間に細胞培養培地に添加され得る。さらにその他の実施形態では、ＲＯＣＫ阻害剤は、最初の数継代、例えば、２〜６、好ましくは、３〜５継代の間に細胞培養培地中に存在し得る。
【００７０】
細胞は、本明細書において開示される濃度のＣＥＰＳ、好ましくは、ＬＣＤＭ中で１〜５継代、好ましくは、３〜５、本明細書において開示されるように形態学的におよび機能的に決定される拡張された多能性を誘導するのに有効である時間枠の間、培養される。
【００７１】
継代の前に３〜４日の培養を必要とする細胞については、この時間枠は、３〜２０日、最も好ましくは、９〜２０日のＬＣＤＭ中での培養になる。いくつかの実施形態では、ドナー細胞は、ナイーブ型ＥＳＣである。これらの実施形態では、細胞は、ＬＣＤＭと播種後１２または２４時間接触され得る。その他の実施形態では、ドナー細胞は、胚盤胞として提供される。これらの実施形態では、当技術分野で公知の従来の方法を使用して、胚盤胞が播種され、その後、細胞は、ＬＣＤＭを含有する細胞培養培地中で４〜７日の範囲の期間培養され（好ましくは、透明帯が除去された後）、その後、最初の成長が目に見える。例えば、胚盤胞は、ＬＣＤＭ中で、４日、５日、６日または７日間培養され得、その後、最初の成長が目に見える。
【００７２】
ＬＣＤＭ中の培養は、本明細書において開示されるような拡張された多能性を誘導するのに有効な時間の間、継続される。いくつかの好ましい実施形態では、細胞は、ＬＣＤＭ中で少なくとも１０継代（約４０日）の間培養される。培養された胚盤胞は、小さい部分または単細胞に解離され得、フィーダー細胞上に再播種され、例えば、トリプシン−ＥＤＴＡを使用して継代される。新たに確立された細胞系統は、ＥＰＳＣを培養するための本明細書において開示される方法を使用して維持される。
【００７３】
得られた細胞は、細胞の３種の胚性胚葉の組織に分化する能力、（ｂ）ＣＤＸ２、ＧＡＴＡ６、ＨＡＮＤ１およびＥＯＭＥＳなどの１種以上の胚外マーカーの上方制御された発現、（ｃ）ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＫＬ２、ＳＯＸ２およびＵＴＦ１（未分化胚性細胞転写因子）などの多能性の１種または複数のマーカーの下方制御、（ｄ）ＴＢＸ３およびＧＢＸ２などの多能性の１種または複数のマーカーの上方制御および（ｅ）キメラ胚を形成する能力などの特徴を使用して、ｃｉＥＰＳＣとして形態学的に、および機能的に同定される。
【００７４】
線維芽細胞などの体細胞からＥＰＳ細胞を作り出すためのいくつかの実施形態では、体細胞は、細胞をＬＣＤＭ中でドーム形のコロニーを得るのに十分な期間培養することによってＥＰＳ細胞に直接誘導され得、これは、本明細書において記載されるようなＬＣＤＭ条件においてさらに拡張される。
【００７５】
Ｂ．ｃｉＥＰＳＣの単離
ｃｉＥＰＳＣの実質的に精製された集団は、培養供給源から例えば、抽出によって（例えば、密度勾配遠心分離および／またはフローサイトメトリーによる）得られ得る。純度は、任意の適当な方法によって測定され得る。多能性細胞は、例えば、フローサイトメトリー（例えば、ＦＡＣＳ解析）によって精製された９９％〜１００％であり得る。ヒトの誘導された拡張された多能性幹細胞は、例えば、誘導多能性幹細胞上のマーカーまたはマーカーの組合せと結合する分子（例えば、抗体、抗体誘導体、リガンドまたはＦｃ−ペプチド融合分子）を利用し、それによって、分子と結合する細胞を正に選択すること（すなわち、正の選択）によって単離され得る。正の選択方法のその他の例として、所望のおよび望ましくない細胞種の混合集団において、所望の細胞種の成長を優先的に促進する方法が挙げられる。あるいは、所望の細胞種上に存在しないが、望ましくない細胞種上に存在するマーカーと結合する分子を使用することによって、このようなマーカーを含有する望ましくない細胞が、所望の細胞から除去され得る（すなわち、負の選択）。その他の負の選択方法は、所望のおよび望ましくない細胞種の混合集団において、望ましくない細胞種を優先的に死滅させることまたはその成長を阻害することを含む。したがって、負の選択、正の選択またはそれらの組合せを使用することによって、幹細胞の濃縮された集団が作製され得る。
【００７６】
分離するための手順は、抗体がコーティングされた磁性ビーズを使用する磁性分離、アフィニティークロマトグラフィー、モノクローナル抗体と結合された細胞傷害性薬剤、またはモノクローナル抗体と組み合わせて使用されるこのような薬剤、例えば、補体および細胞毒ならびに固体マトリックス（例えば、プレート）と結合している抗体を用いる「パニング」またはその他の好都合な技術を含み得る。正確な分離を提供する技術として、種々の程度の精巧さ、例えば、複数のカラーチャンネル、小角および鈍角光散乱検出チャネルならびにインピーダンスチャンネルを有し得る蛍光活性化セルソーターが挙げられる。抗体は、直接分離を可能にする磁性ビーズ、支持体と結合しているアビジンまたはストレプトアビジンを用いて除去され得るビオチン、蛍光活性化セルソーターとともに使用され得、特定の細胞種の分離のしやすさを可能にする蛍光色素などのマーカーとコンジュゲートされ得る。誘導多能性幹細胞の生存力に対して過度に有害ではない任意の技術が使用され得る。一実施形態では、細胞は、マーカー（例えば、ＴＲＡ−１−８１抗体）に対する抗体とともにインキュベートされ、マーカーについて陽性に染まる細胞が手作業で選択され、継代培養される。
【００７７】
精製または濃縮の時間または効率を改善するために濃縮方法の組合せが使用され得る。例えば、対象の細胞種を示さないマーカーを有する細胞を除去する濃縮ステップ後に、細胞は、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）または高い特異性を有するその他の方法論によってさらに分離または濃縮され得る。ＦＡＣＳとともにマルチカラー解析が使用され得る。細胞は、特定の抗原についての染色のレベルまたはそれがないことに基づいて分離され得る。特定の抗原に対して特異的な抗体を標識するために、蛍光色素が使用され得る。このような蛍光色素として、フィコビリタンパク質、例えば、フィコエリトリンおよびアロフィコシアニン、フルオレセインおよびテキサスレッドが挙げられる。
【００７８】
Ｃ．ｃｉＥＰＳＣ（およびその後代）の培養および保存
ｃｉＥＰＳＣは培養で増殖され、後の回収および使用のために貯蔵され得る。細胞の培養物または幹細胞の混合培養物が確立されると、細胞の集団は、組織形成をともなって、または伴わずに、細胞増殖を促す条件下で細胞密度が示すように新鮮培地へ継代することによってｉｎ  ｖｉｔｒｏで有糸分裂的に増殖される。このような培養方法は、例えば、分化を誘導する特定の増殖因子（例えば、ＩＧＦ、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＶＥＧＦおよび／またはその他の増殖因子）を欠く培養培地中で細胞を継代することを含み得る。培養細胞は、十分な細胞密度が到達されたときに新鮮培地に移され得る。
【００７９】
好ましい実施形態では、ｃｉＥＰＳＣを維持するための細胞培養培地は、例えば、本明細書において開示されるＣＥＰＳ、好ましくは、拡張された多能性を誘導するために使用される同一濃度のＬＣＤＭを補給したＮ２Ｂ２７培地であり、すなわち、本明細書において開示されるＣＥＰは、細胞において多能性を拡張するために、また拡張された多能性を維持するために使用される。例えば、ｃｉＥＰＳＣを維持するための細胞培養培地は、Ｎ２Ｂ２７培地（ＢＳＡを含まない）、５％  ＫＳＲ（ノックアウト血清置換）を補給したＮ２Ｂ２７培地（ＢＳＡを含まない）であり得る。その他の基本培地、例えば、２０％  ＫＳＲを補給したＤＦ１２培地もまた使用され得る。これらの基本培地は、上記で開示されるようなＣＥＰが補給される。本発明のいくつかの実施形態によれば、ＬＣＤＭは、ｃｉＥＰＳＣを、未分化の拡張された多能性状態に、培養で２〜１００継代を越えて維持し得る。例えば、ＬＣＤＭは、ｃｉＥＰＳＣを、未分化の、拡張された多能性に、２継代、培養で継代された３、４、５、６、７、８、９または１０の間、好ましくは、１０継代超の間、例えば、培養で約２０継代の間、例えば、培養しながら少なくとも約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約５５、約６０、約６５、約７０、約７５および約８０継代の間維持し得る。好ましい実施形態では、ｃｉＥＰＳＣは、培養で２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１０超、例えば、約２０継代の間、例えば、培養で少なくとも約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約５５、約６０、約６５、約７０、約７５および約８０継代の間、正常な核型を維持する。いくつかの実施形態では、ＣｉＥＰＳＣ増殖および単一コロニー形成を促進するための細胞培養培地は、低濃度のＲＯＣＫ阻害剤、例えば、２〜５μＭのＹ２７６３２を含む。
【００８０】
細胞は、Ｄｏｙｌｅら（編）、１９９５年、Ｃｅｌｌ  ＆  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒに記載されるものなどの公知の方法に従って貯蔵のために低温保存され得る。例えば、細胞は、１５〜２０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含有し、５〜１０％グリセロールを含むか含まない培養培地などの「凍結培地」に、例えば、約４〜１０×１０６個細胞／ｍｌの密度で懸濁され得る。細胞は、ガラスまたはプラスチックバイアル中に分配され、次いで、密閉され、プログラム可能なフリーザーまたはパッシブフリーザーの凍結チャンバーに移される。凍結の最適速度は、経験的に決定され得る。例えば、融合の熱によって−１℃／分の温度の変化をもたらす凍結プログラムが使用され得る。細胞を含有するバイアルが−８０℃に到達すると、それらは液体窒素貯蔵領域に移される。低温保存細胞は、数年の期間貯蔵され得る。
【００８１】
ＩＶ．使用の方法
所望の細胞種または形態学を生じさせ得る幹細胞の容易に入手可能な供給源の同定は、治療的処置、組織工学および研究にとって重要である。幹細胞を入手可能であることは、移植、組織工学、血管新生の調節、脈管形成、臓器再生、ヒト化動物モデル、細胞置換または細胞療法ならびに疾患の予防などにおいて極めて有用となる。このような幹細胞は、遺伝子療法レジメンの一部として対象中に遺伝子を導入するために使用され得る。
【００８２】
Ａ．分化した体細胞（再分化細胞）を提供すること
幹細胞の培養物は、ひとたび確立されると、新規組織を生成可能な後代細胞、例えば、線維芽細胞を生成するために使用され得る。ｃｉＥＰＳＣは、三胚葉のいずれかから細胞、例えば、上皮細胞を含む皮膚および有毛細胞、ケラチノサイト、メラノサイト、脂肪細胞、骨、筋肉および結合組織を形成する細胞、例えば、筋細胞、軟骨細胞、骨細胞、肺胞細胞、実質細胞、例えば、肝細胞、腎細胞、副腎細胞および島細胞、血液細胞、網膜細胞（および耳中の有毛細胞または舌上の味蕾を形成するものなどの知覚に関与するその他の細胞）および神経を含む神経組織に分化するように導入され得る。
【００８３】
一実施形態では、ｃｉＥＰＳＣは、細胞を「外胚葉分化性」培地に曝露することによって外胚葉起源の細胞に分化するように誘導される。別の実施形態では、ｃｉＥＰＳＣは、細胞を「中胚葉分化性培地」に曝露することによって中胚葉起源の細胞に分化するように誘導される。さらに別の実施形態では、ｃｉＥＰＳＣは、細胞を「内胚葉性培地」に曝露することによって内胚葉起源の細胞に分化するように誘導される。「内胚葉性」、「中胚葉性」および「外胚葉性」培地の成分は、当業者には公知である。細胞が実際に、対応する細胞培養培地の系統の細胞に分化していることを検証するために、既知細胞表面マーカーが使用され得る。三胚葉の分化を確認するために最も一般的に許容されるマーカーは、内胚葉性細胞についてはα胎児タンパク質、中胚葉についてはα平滑筋アクチンおよび外胚葉についてはβ−ＩＩＩチュブリンの発現であり、そのすべてが普通、これらの組織の発生において極めて早期に発現される。
【００８４】
幹細胞の線維芽細胞またはその他の細胞種への分化と、それに続く、それからの組織の生成は、特定の外因性増殖因子によって、または幹細胞培養の培養条件（例えば、密度）を変更することによって引き起こされ得る。所望の細胞種の細胞への細胞の分化を誘導する方法は、当技術分野で公知である。例えば、ｃｉＥＰＳＣは、細胞の環境に物質（例えば、増殖因子、酵素、ホルモンまたはその他のシグナル伝達分子）を添加することによって分化するように誘導され得る。分化を誘導するために使用され得る因子の例として、エリスロポエチン、コロニー刺激因子、例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦまたはＭ−ＣＳＦ、インターロイキン、例えば、ＩＬ−１、−２、−３、−４、−５、−６、−７、−８、白血病抑制因子（Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  Ｆａｃｔｏｒｙ）（ＬＩＦ）または造血幹細胞因子（Ｓｔｌ）、幹細胞を特定の系統にコミットされるようになるように誘導するための組織コミット細胞またはその他の系統コミット細胞の種類との共培養が挙げられる。
【００８５】
再分化細胞は、培養で増殖され、後の回収および使用のために貯蔵され得る。
【００８６】
Ｂ．細胞療法
誘導多能性幹細胞の治療的使用は、癌、創傷、新生物、傷害、ウイルス感染、糖尿病などに起因する疾患および障害を含む種々の病理学的状態を治療するために、誘導多能性幹細胞、幹細胞集団またはその後代を個体中に移植することを含む。治療は、現在当技術分野で公知の任意の方法に従って、新規組織を生成するための細胞の使用およびこのように生成された組織の使用を伴い得る。細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏで新規組織を生成するように組織損傷の部位に移植、注入またはそうでなければ直接投与され得る。一実施形態では、投与は、遺伝子改変されたｃｉＥＰＳＣまたはその後代の投与を含む。
【００８７】
好ましい実施形態では、ｃｉＥＰＳＣは、自己細胞から得られる、すなわち、ドナー細胞は、自己である。しかし、細胞は、異種細胞から得られ得る。一実施形態では、ドナー細胞は、レシピエントと遺伝的に関連するドナーから得られる。別の実施形態では、ドナー細胞は、レシピエントと遺伝的に関連のないドナーから得られる。
【００８８】
ヒトｃｉＥＰＳＣが、レシピエント対象と比較して異種（非自己／同種）供給源に由来する場合には、併用免疫抑制療法が通常投与される、例えば、免疫抑制剤シクロスポリンまたはＦＫ５０６の投与。しかし、ヒト誘導多能性幹細胞の未熟状態のために、このような免疫抑制療法は必要ではない場合がある。したがって、一実施形態では、ヒト誘導多能性幹細胞は、免疫調節（例えば、免疫抑制（ｉｍｍｕｎｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ））療法の不在下でレシピエントに投与され得る。あるいは、細胞は、流体の交換を可能にするが、細胞／細胞接触を防ぐ膜中にカプセル化され得る。マイクロカプセル化された細胞の移植は、当技術分野で公知である、例えば、Ｂａｌｌａｄｕｒら、Ｓｕｒｇｅｒｙ、第１１７巻：１８９〜９４頁、１９９５年；およびＤｉｘｉｔら、Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ第１巻：２７５〜７９頁（１９９２年）。
【００８９】
（ｉ）糖尿病
糖尿病（ＤＭ）は、膵臓が十分なインスリンを産生しないため、または細胞が産生されるインスリンに応答しないためのいずれかのために対象が高血糖を有する一群の代謝疾患である。
【００９０】
インスリン療法の有望な代替法は、インスリンを必要とする患者への島細胞の提供である。Ｓｈａｐｉｒｏら、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．、第３４３巻（４号）：２３０〜８頁（２０００年）は、β細胞／島の移植は、糖尿病を有する患者のための療法を提供することを実証した。多数のインスリンの種類が市販されているが、これらの製剤は、注射剤として提供されている。ヒト誘導多能性幹細胞は、糖尿病を予防または治療するための島細胞の代替供給源を提供する。例えば、誘導多能性幹細胞は、単離され、膵臓細胞種に分化され、対象に送達され得る。あるいは、誘導多能性幹細胞は、対象の膵臓に送達され、ｉｎ  ｖｉｖｏで島細胞に分化され得る。したがって、細胞は、糖尿病の発生を予防または治療するための移植にとって有用である。膵島細胞の生存力および潜在力に影響を及ぼすことなく、サイトカイン曝露後の炎症を低減するための方法が、例えば、Ｎａｚｉｒｕｄｄｉｎらの米国特許第８，６３７，４９４号に開示されている。
【００９１】
（ｉｉ）神経変性障害
神経変性障害は、疾患の結果としてニューロンの変質、遺伝性の状態または外傷性もしくは虚血性脊髄もしくは脳傷害などの傷害が関与する状態を特徴とする。神経変性状態として、ニューロンの損傷または変質が関与する任意の疾患または障害またはその症状または原因または効果が挙げられる。神経変性状態として、それだけには限らないが、アレキサンダー病、アルパース病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、毛細血管拡張性運動失調症、カナバン病、コケイン症候群、大脳皮質基底核変性症、クロイツフェルト・ヤコブ病、ハンチントン病、ケネディ病、クラッベ病、レビー小体認知症、マシャド・ジョセフ病、多発性硬化症、パーキンソン病、ペリツェウス・メルツバッハ病、ニーマン−ピック病、原発性側索硬化症、レフサム病、サンドホフ病、シルダー病、スティール・リチャードソン・オルゼウスキー病、脊髄ろうまたは損傷を受けたニューロンと関連する任意のその他の状態を挙げることができる。その他の神経変性状態として、外傷性脊髄損傷、虚血性脊髄損傷、卒中、外傷性脳損傷および遺伝性の状態を挙げることができる、またはそれによって引き起こされ得る。
【００９２】
特に、開示される方法は、それを必要とする対象に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖されたＮＳＣ、神経前駆細胞または神経前駆体を移植し、その結果、細胞が神経変性状態を回復させ得ることを含む。増殖された神経幹細胞の移植は、痙縮、硬直、発作、麻痺の症状または筋肉の任意のその他の運動亢進を伴う種々の形態の脊髄症を患っている対象において歩行機能を改善するために使用され得る。種々の神経変性状態の治療のための、神経細胞および神経前駆体細胞を増殖させ、移植するための方法は、例えば、Ｊｏｈｅらの米国特許第８，２３６，２９９号に開示されている。
【００９３】
（ｉｉｉ）癌療法
ｃｉＥＰＳＣおよびその後代の治療的使用は、癌と関連する症状を治療および／または回復させるために誘導多能性幹細胞、幹細胞集団またはその後代を個体に移植することを含む。例えば、一実施形態では、ｃｉＥＰＳＣは、対象の細胞を死滅させ、低減させ、または損傷を与えた化学療法を受けている癌患者に投与され得る。癌のための通常の幹細胞移植では、すべての癌細胞を破壊しようとして、しばしば、放射線療法とともに極めて高用量の化学療法が使用される。この治療はまた、骨髄中の幹細胞を死滅させる。治療の直後に、破壊されたものと置き換えるために幹細胞が与えられる。
【００９４】
別の実施形態では、ｃｉＥＰＳＣは、少なくとも１種のさらなる治療因子を用いてトランスフェクトまたは形質転換され得る（脱分化因子に加えて）。例えば、ひとたび、ｃｉＥＰＳＣが単離されると、細胞は、治療用ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを用いて形質転換され、次いで、対象に移植もしくは投与され得る、または所望の細胞種に分化され、対象に移植され、送達され得る。このような条件下では、ポリペプチド産物の送達のためにポリヌクレオチドは、対象内で発現される。
【００９５】
（ｉｉｉ）組織工学
ｃｉＥＰＳＣおよびその後代は、当技術分野で公知の方法を使用して組織工学によって作製される構築物を作製するために使用され得る。組織工学によって作製された構築物は、損傷を受けた臓器または組織を修復するまたはそれに取って代わるための人工デバイスとして、を含む種々の目的のために使用され得る。一般に、それらはまた、構築物の細胞によって分泌されるタンパク質またはその他の分子のｉｎ  ｖｉｖｏ  送達システムとして、または薬物送達システムとして役立ち得る。組織工学によって作製された構築物はまた、組織機能のｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルとして、または種々の治療もしくは医薬品の効果を試験するためのモデルとして用途がある。幹細胞の移植のための最もよく使用される生体材料足場は、Ｗｉｌｌｅｒｔｈ，Ｓ．Ｍ．およびＳａｋｉｙａｍａ−Ｅｌｂｅｒｔ，Ｓ．Ｅ．、Ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌ  ｓｃａｆｆｏｌｄｓ  ｆｏｒ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ  ｔｉｓｓｕｅｓ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ（２００８年７月９日）、ＳｔｅｍＢｏｏｋ編Ｔｈｅ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ、ＳｔｅｍＢｏｏｋに概説されている、幹細胞の移植のための最もよく使用される生体材料足場に概説されている。組織工学技術は、組織成長を持続し、促進するために適当な培養基質の選択を頻繁に含む。一般に、これらの基質は、三次元でなくてはならず、対象の組織の所望の形状の足場を形成するように処理可能でなくてはならない。
【００９６】
米国特許第６，９６２，８１４号は、概して、組織工学によって作製される構築物および設培養天然組織（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｎａｔｉｖｅ  ｔｉｓｓｕｅ）を製造するための方法を開示する。特定の例に関して、Ｖａｃａｎｔｉらの米国特許第７，９１４，５７９号には、組織工学によって作製された靭帯および腱が開示されている。米国特許第５，７１６，４０４号には、ポリマーマトリックスと組み合わせて移植された解離した筋肉細胞を使用して、乳房組織を再構築または増大するための方法および組成物が開示されている。米国特許第８，７２８，４９５号には、自己皮膚線維芽細胞を使用する軟骨の修復が開示されている。Ｄｕａｉｌｉｂｉらによる米国特許出願公開第２００９００２９３２２号には、代替歯の作製において使用するための歯の組織を形成するための幹細胞の使用が開示されている。米国特許出願公開第２００６／００１９３２６号には、頭蓋内動脈瘤の治療のための細胞シード組織工学によって作製されたポリマーが開示されている。Ａｔａｌａによる米国特許出願公開第２００７／００５９２９３号には、損傷を受けた臓器、例えば、腎臓、心臓、肝臓、脾臓、膵臓、膀胱、尿管および尿道を置換するために使用され得る組織工学によって作製された構築物（およびこのような構築物を作製するための方法）が開示されている。
【００９７】
（ｉｉ）ｃｉＥＰＳＣ（後代）から生成された細胞
ｃｉＥＰＳＣは、三胚葉のいずれかから細胞、例えば、上皮細胞を含む皮膚および有毛細胞、ケラチノサイト、メラノサイト、脂肪細胞、骨、筋肉および結合組織を形成する細胞、例えば、筋細胞、軟骨細胞、骨細胞、肺胞細胞、実質細胞、例えば、肝細胞、腎細胞、副腎細胞および島細胞（例えば、α細胞、δ細胞、ＰＰ細胞およびβ細胞）、血液細胞（例えば、白血球、赤血球、マクロファージおよびリンパ球）、網膜細胞（および耳中の有毛細胞または舌上の味蕾を形成するものなどの知覚に関与するその他の細胞）および神経を含む神経組織に分化するように誘導され得る。
【００９８】
（ｉｉｉ）治療用組成物
ｃｉＥＰＳＣは、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏ／ｅｘ  ｖｉｖｏで脱分化を促進するために、投与、送達または対象、組織もしくは細胞との接触のために製剤化され得る。増殖因子、分化または脱分化を誘導するその他の因子、分泌産物、免疫調節物質、抗炎症剤、退縮因子、神経支配、血管新生を促進する、またはリンパネットワークを増強する生物学的に活性な化合物などのさらなる因子ならびに薬物が組み込まれ得る。
【００９９】
誘導多能性細胞は、患者に、ｃｉＥＰＳＣまたはｃｉＥＰＳＣ後代の集団を単独で、または担体もしくは支持構造上もしくはその中に含む組成物によって投与され得る。多数の実施形態では、担体は、必要ではない。細胞は、細胞が必要とされる部位上またはその中に注入によって投与され得る。これらの場合には、細胞は、通常、細胞培養培地を除去するために洗浄されたものとなり、生理学的バッファーに懸濁される。
【０１００】
その他の実施形態では、細胞は、支持構造とともに提供される、または支持構造上もしくは支持構造中に組み込まれる。支持構造は、メッシュ、固相支持体、足場、チューブ、多孔性構造および／またはヒドロゲルであり得る。支持構造は、全体でまたは部分的に生分解性である場合も、非生分解性である場合もある。支持体は、天然または合成ポリマー、チタンなどの金属、骨またはヒドロキシアパタイトまたはセラミックから形成され得る。天然ポリマーとして、コラーゲン、ヒアルロン酸、多糖およびグリコサミノグリカンが挙げられる。合成ポリマーとして、ポリ乳酸、ポリグリコール酸などのポリヒドロキシ酸およびそれらの共重合体、ポリヒドロキシブチレートなどのポリヒドロキシアルカノエート、ポリオルトエステル、ポリ酸無水物、ポリウレタン、ポリカーボネートおよびポリエステルが挙げられる。これらは、移植片、チューブ、メッシュまたはヒドロゲルの形態であり得る。
【０１０１】
固相支持体
支持構造は、緩い織ったメッシュまたは不織メッシュであり得、これでは、細胞はメッシュ中またはメッシュ上に播種される。構造は、固体構造支持体を含み得る。支持体は、チューブ、例えば、神経軸索の再成長のための神経管であり得る。支持体は、ステントまたは弁であり得る。支持体は、多孔質構造中への細胞の内殖および／または細胞の播種を可能にする多孔質界面を有する膝または臀部またはその一部などの関節人口装具であり得る。多数のその他の種類の指示構造もあり得る。例えば、支持構造は、スポンジ、発泡体、サンゴまたは内部孔を有する生体適合性無機構造または織り合わされたポリマー繊維のメッシュシートから形成され得る。これらの支持構造は、既知方法を使用して調製され得る。
【０１０２】
支持構造は、ヒドロゲル細胞混合物を形作り、支持する孔様空洞または間隙を有する透過性構造であり得る。例えば、支持構造は、多孔質ポリマーメッシュ、天然もしくは合成スポンジまたは金属もしくは骨もしくはヒドロキシアパタイトなどの材料から形成される支持構造であり得る。支持構造の多孔度は、栄養分が構造中に拡散し、それによって、内側の細胞に効率的に到達し得、細胞によって産生される廃棄物が構造から拡散し得るようなものでなくてはならない。
【０１０３】
支持構造は、新規組織が望まれる空間に適合するように形作られ得る。例えば、支持構造は、火傷を負った皮膚の領域または失われた軟骨もしくは骨の一部の形状と適合するように形作られ得る。支持構造は、作製される材料に応じて、切断、成形、鋳造または所望の形状を製造する任意のその他の方法によって形作られ得る。支持体は、以下に記載されるように、支持構造が細胞とともに播種される、またはヒドロゲル−細胞混合物で満たされる前もしくは後のいずれかで形作られ得る。
【０１０４】
適したポリマーの一例として、グリコリドおよびラクチドの９０：１０共重合体であり、ＶＩＣＲＹＬ（商標）ブレイド吸収性縫合糸（Ｅｔｈｉｃｏｎ  Ｃｏ．、Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ、Ｎ．Ｊ．）として製造されているポリグラクチンがある。ポリマー繊維（ＶＩＣＲＹＬ（商標）など）は、フェルト様ポリマーシートに織られ得る、または圧縮され得、次いで、これが任意の所望の形状に切断され得る。あるいは、ポリマー繊維は、それらを支持構造として望まれる形状に鋳造する型中に一緒に圧縮され得る。いくつかの場合には、さらなるポリマーが、繊維メッシュを修正する、またはそれにさらなる構造を与えるように成形されるので、ポリマー繊維にさらなるポリマーが付加され得る。例えば、ポリ乳酸溶液が、このポリグリコリック（ｐｏｌｙｇｌｙｃｏｌｉｃ）繊維メッシュのシートに付加され得、組合せが一緒に成形されて多孔質支持構造を形成し得る。ポリ乳酸は、ポリグリコール酸繊維の架橋と結合し、それによって、これらの個々の繊維をコーティングし、成形された繊維の形状を固定する。ポリ乳酸はまた、繊維間の空間を満たす。したがって、多孔度は、支持体中に導入されるポリ乳酸の量に従って変えられ得る。繊維メッシュを望ましい形状に成形するのに必要な圧力は、全く抑えられ得る。必要なすべてのことは、繊維が、ポリ乳酸の結合およびコーティング作用が生じるのに十分に長く適所に保たれることである。
【０１０５】
あるいはまたはさらに、支持構造は、当技術分野で公知の技術によって製造されたその他の種類のポリマー繊維またはポリマー構造を含み得る。例えば、ポリマー溶液から溶媒を蒸発させることによって薄いポリマーフィルムが得られ得る。これらのフィルムは、ポリマー溶液が、所望の形状のレリーフパターンを有する型から蒸発される場合に、所望の形状に鋳造され得る。ポリマーゲルはまた、当技術分野で公知の圧縮成形技術を使用して薄い透過性ポリマー構造に成形され得る。
【０１０６】
ヒドロゲル
別の実施形態では、細胞は、ヒドロゲルと混合されて、細胞−ヒドロゲル混合物を形成する。ヒドロゲルは、注入もしくはカテーテルによって、またはその他の支持構造の移植の時点で投与され得る。架橋は、投与に先立って、その間に、またはその後に起こり得る。
【０１０７】
Ｄ．動物モデルおよび臓器再生
単離されたｃｉＥＰＳＣは、所望の種（ドナー）に由来するｃｉＥＰＳＣを同一または異なる種の第２の動物（レシピエント）中に組み込む動物モデルを作り出すために使用され得る。ドナー動物は、ヒト、マウス、ラット、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、チンパンジー、ゴリラ、オランウータン、サル、マーモセットなどといった哺乳類であり得る。いくつかの好ましい実施形態では、ドナー哺乳類は、ヒトであり、レシピエント哺乳類は、ヒト化動物モデルを提供するために使用される非ヒトである。その他の実施形態では、ドナーおよびレシピエント動物は、大きさが対応している。レシピエントは、ブタ、ラット、マウス、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、チンパンジー、ゴリラ、オランウータン、サル、マーモセットおよびボノボなどのヒト以外の任意の動物であり得る。ｃｉＥＰＳＣは、ヒトではない哺乳類において臓器再生のために使用され得、ｃｉＥＰＳＣは、哺乳類において所望の臓器を生成するために使用され得、これでは、哺乳類は、発生段階におけるその臓器の発達の欠如と関連する異常を有する。
【０１０８】
方法は、ｃｉＥＰＳＣを、レシピエント非ヒト哺乳類の胚盤胞期受精卵に移植すること、非ヒト代理親哺乳類の子宮中で発達させて同腹仔を得ることおよび当技術分野で公知の方法を使用して同腹仔から臓器を得ることを含む。生成され得る臓器の例として、それだけには限らないが、腎臓、心臓、膵臓、小脳、肺、甲状腺、毛および胸腺などの固定形状を有する実質臓器が挙げられる。レシピエント胚は、ブタ、ラット、マウス、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、チンパンジー、ゴリラ、オランウータン、サル、マーモセットなどといったヒト以外の任意の動物に由来し得る。
【０１０９】
ヒト化マウスモデルを作り出すための方法は、当技術分野で公知であり（米国特許出願公開第２０１１０２５８７１５号）、例えば、Ｉｔｏら、Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ＆  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第９巻：２０８〜２１４頁（２０１２年に）概説されている。対象の臓器の発生と関連する異常を有し、その臓器を再生するために使用され得るレシピエント胚の例として、発生段階における腎臓の発生の欠如と関連する異常を有するＳａｌｌ１ノックアウト動物（Ｎｉｓｈｉｎａｋａｍｕｒａら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、第１２８巻：３１０５〜３１１５頁（２００１年））、発生段階における膵臓の発生の欠如と関連する異常を有するＰｄｘ１ノックアウト動物（Ｏｆｆｉｅｌｄら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、第１２２巻：９８３〜９９５頁（１９９６年）、発生段階における小脳の発生の欠如と関連する異常を有するＷｎｔ−１（ｉｎｔ−１）ノックアウト動物（ＭｃＭａｈｏｎら、Ｃｅｌｌ、第６２巻：１０７３〜１０８５頁、（１９９０年））、発生段階における肺および甲状腺の発生の欠如と関連する異常を有するＴ／ｅｂｐノックアウト動物（Ｋｉｍｕｒａら、Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、第１０巻：６０〜６９頁、１９９６年）または線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）受容体（ＦＧＦＲ）の細胞内ドメインの欠乏症を過剰発現し、腎臓および肺などの複数の臓器の欠乏を引き起こすドミナントネガティブ型トランスジェニック変異株動物モデル（Ｃｅｌｌｉら、ＥＭＢＯ  Ｊ．、第１７巻：１６４２〜６５５頁、（１９９８年））が挙げられ、使用され得る。あるいは、毛または胸腺を生成するためにヌードマウスが使用され得る。米国特許出願公開第２０１１０２５８７１５号に記載された「創始者」動物も使用され得る。
【０１１０】
Ｖ．キット
本明細書において開示される拡張された多能性（ＣＥＰ）の化学誘導物質を含むキットが提供される。ＣＥＰは、上記で記載される通りである。これらは、所望の濃度をもたらすための細胞培養培地への添加を容易にする既定の濃度を有する形態であり得る。キットは、ドナー細胞種に基づいて所望の濃度範囲および投与時間を提供する指示書を含み得る。キットはまた、拡張された多能性を誘導するためのドナー細胞の培養のための、ＣＥＰと事前混合されている細胞培養培地を含み得る。
【０１１１】
本発明は、以下の限定されない例を参照することによってさらに理解されよう。
【実施例】
【０１１２】
方法
小分子ライブラリー
スクリーニングのために使用される小分子ライブラリーは、表１に記載されるように、購入した、または自家作製した。
【０１１３】
【表１】
0006780870.tif 000002
【０１１４】
ルシフェラーゼリポーターアッセイに基づく化学的スクリーニング
最初の試みは、ヒトにおいてナイーブ型多能性を支持する新規小分子を同定することに焦点を当てた。マウスにおいてナイーブ型多能性を支持する２ｉおよびＬＩＦ条件（ＥＲＫ阻害剤ＰＤ０３２５９０１、ＧＳＫ３β阻害剤ＣＨＩＲ９９０２１およびヒトＬＩＦ（ｈＬＩＦ））に基づいて、プライム型ｈＥＳ細胞（Ｙｅｏｍら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、第１２２巻：８８１〜８９４頁（１９９６年）；Ｔｅｓａｒら、Ｎａｔｕｒｅ、第４４８巻：１９６〜１９９頁（２００７年）を使用して最初のスクリーニングを実施して、ナイーブ型多能性マーカーＯＣＴ４遠位エンハンサー（ＤＥ）を活性化し得る化学化合物を同定した（図１Ａおよび表１）。
【０１１５】
Ｏｃｔ４は、多能性細胞において多能性制御階層の最上部にある。Ｏｃｔ４遺伝子の転写開始部位の上流領域は、遺伝子転写の３種の調節エレメント：遠位エンハンサー（ＤＥ）、近位エンハンサー（ＰＥ）およびＴＡＴＡレス近位プロモーター（ＰＰ）を含有する。各エンハンサーは、Ｏｃｔ４発現を活性化または抑制し得る、転写因子の、複数の潜在的な結合部位を含有する。
【０１１６】
確立されたプライム型ｈＥＳ  Ｈ９細胞（ヒト胚幹細胞株Ｈ９）を使用して第１のスクリーニングを実施して、Ｏｃｔ４ＤＥを活性化する小分子を同定した。プライム型ｈＥＳ／ｈＰＳ（ヒト多能性幹）Ｈ９細胞をＡＣＣＵＴＡＳＥ（登録商標）（細胞剥離溶液）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）中で解離した。次いで、ＯＣＴ４−ＤＥルシフェラーゼプラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ）を、ヌクレオフェクション（４Ｄ−Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）Ｓｙｓｔｅｍ、Ｌｏｎｚａ）によってＨ９細胞中にトランスフェクトした。正規化のために、対照ベクターｐＧＬ４．７４  ［ｈＲｌｕｃ／ＴＫ］（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｅ６９２１）を同時トランスフェクトした。
【０１１７】
トランスフェクション後、プライム型ｈＥＳ／ｈＰＳ  Ｈ９細胞を、ウェルあたり２×１０４個細胞の密度でマトリゲルコーティングされた２４ウェルプレート中に播種し、従来のヒト胚幹細胞（ＥＳ）培地（ＤＦ１２および２０％  ＫＳＲ、詳細な処方は以下に提供される）およびＹ２７６３２［（＋）−（Ｒ）−トランス−４−（１−アミノエチル）−Ｎ−（４−ピリジル）シクロヘキサンカルボキサミド＋＋  ＋ジヒドロクロリド）］、Ｒｈｏ関連コイルドコイル含有タンパク質キナーゼ（ＲＯＣＫ）（１０μｍ）の選択的阻害剤中で培養した。
【０１１８】
１２時間後、培地を、ｈＬＩＦ（ヒト白血病抑制因子）＋２ｉ（１０ｎｇ／ｍＬ  ｈＬＩＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、１μｍ  ＥＲＫ（細胞外シグナル調節キナーゼ）阻害剤ＰＤ０３２５９０１（Ｔｏｃｒｉｓ）および３μｍ  ＧＳＫβ阻害剤ＣＨＩＲ９９０２１（Ｔｏｃｒｉｓ）（Ｎ２Ｂ２７培地の詳細な処方は以下に提供される）を補給したＮ２Ｂ２７培地と置換した。ライブラリーから１種の単一化合物を、それぞれ各ウェルに添加した。表１中のすべての化合物を試験した。６日間処理した後、デュアルルシフェラーゼリポーターアッセイ系（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｅ１９６０）を使用してルシフェラーゼ活性を検出するためにＨ９細胞を溶解した。
【０１１９】
プライム型ｈＥＳ細胞対照と比較したＤＥルシフェラーゼ活性の２倍上方制御に基づいて陽性候補として化学物質を同定した。スクリーニング後、伝統的なプライム型ｈＰＳＣ培地において培養された細胞と比較してＯｃｔ４ＤＥ活性を２倍超増強し得る、１００種を超える候補が得られた。
【０１２０】
ドーム型ｈＥＳ細胞コロニー形成を支持する小分子の同定
プライム型ｈＥＳは、フラットなコロニーである。対照的に、ナイーブ型ヒト多能性細胞は、ドーム型コロニーである。したがって、あらゆる得られたヒトＥＰＳ細胞は、プライム型ヒト多能性幹細胞から形態学的に区別され得る。
【０１２１】
上記の第１のスクリーニングから得られた陽性候補をさらにスクリーニングして、ｈＥＳ細胞のＴＧＦβシグナル伝達非依存性自己再生を支持する小分子を同定した（Ｔｅｓａｒら、Ｄｅｖ．、第４４８巻：１９６〜１９９頁（２００７年）；Ｊａｍｅｓら、Ｄｅｖ．、第１３２巻：１２７３〜１２８２頁（２００５年）；Ｖａｌｌｉｅｒら、Ｊ．  Ｃｅｌｌ．  Ｓｃｉ．、第１１８巻：４４９５〜４５０９頁（２００５年））。処理の後期に化学カクテル（２ｉ＋ＬＩＦ＋候補）にＴＧＦβ阻害剤ＳＢ４３１５４２を添加した（図１Ａ）。
【０１２２】
具体的には、プライム型ｈＥＳ／ｈＰＳ  Ｈ９細胞を、ＡＣＣＵＴＡＳＥ（登録商標）（細胞剥離溶液）中で単細胞に消化し、０日目に従来のｈＥＳ培地およびＹ２７６３２中に、マトリゲルコーティングされた２４ウェルプレート中に播種した（ウェルあたり１×１０４個細胞）。１日目に、従来のｈＥＳ培地を、ｈＬＩＦ＋２ｉ基剤を補給したＮ２Ｂ２７培地によって置換し、第１ラウンドのスクリーニングから得た候補を各ウェルに個別に添加した。培地を２日毎に交換し、ｈＬＩＦ＋２ｉを補給した新鮮Ｎ２Ｂ２７培地と置換した。６日後（すなわち、７日目）、ＴＧＦ（トランスフォーミング増殖因子）β阻害剤、ＳＢ４３１５４２（１０μｍ、Ｔｏｃｒｉｓ）を、未分化細胞を有するウェルにさらに６日間添加した。このスクリーニング後、ＴＧＦβシグナル伝達非依存性自己再生を短期間支持する３０種を超える候補が得られた。
【０１２３】
プライム型ｈＥＳ／ｈＰＳおよびナイーブ型ＮＨＳＭ−ｈＥＳ細胞の培養
以下のすでに確立されたプライム型ｈＥＳ／ｈＰＳ細胞系統を使用した（ＥＰＳ変換のために用いられた細胞株の継代数は、括弧内に示されている）：Ｈ１（継代３０）、０２２７Ｅ（おおよその継代２０）、ＨＳＦ１（おおよその継代５０）およびＨＳＦ６（おおよその継代６０）およびＨ９（継代４０）。ｈＥＳ／ｈＰＳ細胞株Ｈ１（ＷＡ０１）およびＨ９（ＷＡ０９）は、ＷｉＣｅｌｌから入手し、核型解析によって立証した。プライム型ｈＥＳ細胞を、２０％ノックアウト血清置換（ＫＳＲ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１ｍｍグルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）または１％  ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、３５０５０）、１％非必須アミノ酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．１ｍｍ  β−メルカプトエタノール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および４〜１０ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ（塩基性（ｂａｓｉｓ）線維芽細胞増殖因子）（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を補給した従来のｈＥＳ／ｈＰＳ細胞培地：ＤＭＥＭ−Ｆ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中、マイトマイシンＣ不活性化ＭＥＦフィーダー細胞（２×１０４個／ｃｍ２）またはマトリゲルコーティングされたディッシュ上で２０％  Ｏ２、５％  ＣＯ２条件で維持した。細胞株を、ディスパーゼを使用して５〜７日毎に１：３〜１：５の分割比で継代した。ナイーブ型ＮＨＳＭ−ｈＥＳ細胞を、これまでの報告（Ｇａｆｎｉら、Ｎａｔｕｒｅ、第５０４巻（７４７９号）：２８２〜６頁（２０１３年））に従って培養した。
【０１２４】
マウスナイーブ型ＥＳ細胞の培養
マウスナイーブ型ＥＳ細胞を、１０ｎｇ／ｍＬ  ｈＬＩＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、３μｍ  ＣＨＩＲ９９０２１（Ｔｏｃｒｉｓ）および１μｍ  ＰＤ０３２５９０１（Ｔｏｃｒｉｓ）を補給した２ｉ培地含有血清不含Ｎ２Ｂ２７培地中、マイトマイシンＣ不活性化ＭＥＦフィーダー細胞またはゼラチンコーティングされたディッシュ上で２０％  Ｏ２、５％  ＣＯ２条件で維持した。細胞を、０．０５％  トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって２〜４日毎に継代した。
【０１２５】
非ｈＥＰＳ細胞のｈＥＰＳ細胞への変換
Ｎ２Ｂ２７−ＬＣＤＭ培地の調製
５００ｍｌのＮ２Ｂ２７培地を、２４０ｍｌのＤＭＥＭ／Ｆ１２（ダルベッコの改変イーグル培地／栄養混合物Ｆ−１２）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１１３２０）、２４０ｍｌのＮＥＵＲＯＢＡＳＡＬ（登録商標）培地（基礎細胞培養培地）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、２１１０３−０４９）、２．５ｍｌのＮ−２栄養補助剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１７５０２０４８）、５ｍｌのＢ−２７栄養補助剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；  １７５０４０１０）、１ｍｍグルタミンまたはＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１％非必須アミノ酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．１ｍｍ  β−メルカプトエタノール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、（任意選択）５ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）（Ｓｉｇｍａ）および小分子阻害剤を以下のように含めることによって作製した。
【０１２６】
小分子およびサイトカイン（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、ＴｏｃｒｉｓまたはＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚから購入した）を以下の最終濃度で示されるように補給した：ｈＬＩＦ：１０ｎｇ／ｍＬ；ＣＨＩＲ９９０２１：マウスＥＰＳ細胞について３μｍおよびヒトＥＰＳ細胞について１〜１．５μｍ；（Ｓ）−（＋）−ジメチンデンマレエート（ＤｉＭ）：２μｍ；モノサイクリン（Ｍｏｎｏｃｙｃｌｉｎｅ）塩酸塩（ＭｉＨ）：２μｍ。小分子およびサイトカインを補給したＮ２Ｂ２７培地は、Ｎ２Ｂ２７−ＬＣＤＭと呼んだ。ＰＣＲベースのアプローチまたはＭｙｃｏＡｌｅｒｔマイコプラズマ検出キット（Ｌｏｎｚａ）を、製造業者の推奨に従って使用して、すべての細胞株について、マイコプラズマ混入についての試験を実施した。
【０１２７】
（ａ）プライム型ｈＥＳ／ｈＰＳ細胞のｈＥＰＳ細胞への変換
変換は、通常、プライム型ｈＥＳ／ｈＰＳ細胞の最後の継代後３日目または４日目に実施した（それらが５〜６日毎に継代された場合には。コロニーは、通常、６０〜７０％コンフルエンスに到達した。
【０１２８】
変換前に、プライム型ｈＥＳ細胞は未分化状態で維持され、変換当日に過成長しなかった。
【０１２９】
マイトマイシンＣ不活性化マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）フィーダー細胞を、プライム型細胞の継代の前日に播種した（１ｃｍ２あたり３×１０４個細胞）。
【０１３０】
プライム型ｈＥＳ／ｈＰＳ細胞を、０．０５％トリプシン（ｔｙｒｐｓｉｏｎ）−ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して単細胞に消化した。消化後、通常、細胞を１：３〜１：４の分割比でヒトＥＳ培地に播種した。続いて、ヒトＥＳ培地における播種の１２時間後、ヒトＥＳ培地をＮ２Ｂ２７−ＬＣＤＭ培地と置換した。Ｎ２Ｂ２７−ＬＣＤＭ培地を毎日交換した。単細胞継代後にほとんど生存できないプライム型ｈＥＳ細胞株のために、変換の２４時間前に培地にＹ２７６３２（１〜１０μｍ）を添加し、最初の数継代（３〜５継代）ではＬＣＤＭ培地中で維持した。あるいは、ディスパーゼを使用してプライム型ｈＥＳ細胞を小コロニーに消化し、従来のｈＥＳ培地を使用して播種した。１２または２４時間後、ｈＥＳ培地をＬＣＤＭ含有培地と置換した。任意選択で、プライム型ヒトＰＳ細胞が、Ｙ２７６３２処理後に単細胞消化に耐性である場合には、プライム型ヒトＰＳＣは、０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡを使用して単細胞に消化され得る。Ｙ２７６３２は、継代前および継代後の最初の１２時間の間に培地に添加されなければならない。
【０１３１】
ドーム型コロニーは、この期間の間に徐々に出現した。次いで、３〜６日後、０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、２５３００）を使用して、インキュベーター中３７℃で３分間細胞をトリプシン処理した。ＭＥＦ培地を使用して、トリプシン処理を停止した。培地をゆっくりとピペットで上下することによって、細胞をディッシュの表面から洗い落とし、それらを適当な大きさのチューブ中に集め、１２００〜１６００ｒｐｍ（２５０〜４５０ｘｇ）、室温で３分間遠心分離した。細胞を適当な容量のＮ２Ｂ２７−ＬＣＤＭ培地に再懸濁し（細胞株および成長速度に従って）、ＭＥＦフィーダーを有するプレートに播種した。１６ウェルプレートのために、ウェルあたりおよそ５０，０００〜１００，０００個細胞を播種した。分割比は、通常、１：３〜１：１０とした。次いで、細胞を２０％  Ｏ２、５％  ＣＯ２で３７℃でインキュベートした。細胞にとって継代後に生存することが依然として困難であった場合には、最初の数継代（３〜５継代）の間、Ｙ２７６３２を添加し、変換の成功を確実にした：添加は、継代前および継代後の最初の１２時間の間に行った。単細胞継代後に細胞がゆっくりと成長した場合には、最初の数継代（３〜５継代）の間、分割比を低下させること（２：１から１：３）が推奨された。数継代後、ＬＣＤＭ培地中で培養された細胞は、徐々に良好に増殖し得る。
【０１３２】
キメラ実験のためには、ＥＰＳ細胞が拡張された多能性状態に再プログラムされることを確実にするために、より高い継代（変換後、継代＞１０）を有するプライム型ｈＰＳＣ由来ｈＥＰＳ細胞が使用されることが推奨された。本発明者らの実験では、継代１０の変換されたドーム形のコロニーは、キメラ実験において２つの可能性（ｂｉ−ｐｏｔｅｎｔｉａｌｉｔｙ）を示し、これは、変換のための最小培養期間は、１０継代（約４０日）であり得ることを示唆した。ヒトプライム型多能性幹細胞のＥＰＳ細胞への変換は、本発明者らの実験室において６人の異なる同僚によって少なくとも２０回の独立実験において反復された。
【０１３３】
（ｂ）胚盤胞からのヒトＥＰＳ細胞誘導
臨床目的でｉｎ  ｖｉｔｒｏ受精によって生成された胚盤胞期のヒト胚を、書面によるインフォームド・コンセントおよび承認を得て入手した。プロテアーゼ（Ｓｉｇｍａ、Ｐ８８１１）によって透明帯を除去した後、全胚をマイトマイシンＣ不活性化ＭＥＦフィーダー細胞上に播種し（４×１０４個／ｃｍ２）、ＬＣＤＭ培地で培養した。胚が播種される少なくとも３０分前に、ＭＥＦ細胞培養培地をＦＢＳ−ＬＣＤＭ培地に交換した。
【０１３４】
ＦＢＳ−ＬＣＤＭ培地は、１０％ノックアウト血清置換（ＫＳＲ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１０８２８０１０）、１０％  ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ＳＨ３００７０．０３Ｅ）、１％  ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、３５０５０）、１％非必須アミノ酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、２１１０３）および０．１ｍｍ  β−メルカプトエタノール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、２１９８５）を補給したノックアウトＤＭＥＭ（１０８２９−０１８、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ならびにＬＣＤＭ（それぞれ、１０ｎｇ／ｍＬ；１．５μＭ、２μＭ；および２μＭ）を含めることによって調製した。いくつかの実験において胚の生存を増強するために、ＦＢＳ−ＬＣＤＭ  培地にＹ２７６３２（１０μＭ、Ｔｏｃｒｉｓ、１２５４）を添加した。
【０１３５】
孵化していない胚盤胞については、プロテアーゼ（Ｓｉｇｍａ、Ｐ８８１１）によって透明帯を除去した。プロテアーゼの処理の時間は、種々の胚盤胞の間で、３０秒から５分で変動した。透明帯が徐々に消失し始めると、胚盤胞を事前に調製したＧ２  ＰＬＵＳ培地中に移した。残存するプロテアーゼをできる限り除去するために胚を３〜５回洗浄し、次いで、それらを準備したＭＥＦフィーダー上に播種した。２日後、胚がＭＥＦフィーダー細胞上に付着した場合には、ＦＢＳ−ＬＣＤＭ培地をＮ２Ｂ２７−ＬＣＤＭ培地に交換した。そうでなければ、培養されたＦＢＳ−ＬＣＤＭ培地の半量を除去し、Ｎ２Ｂ２７−ＬＣＤＭ培地に交換した。
【０１３６】
４〜７日後に最初の成長が目に見え、小片に機械的に解離し、ＦＢＳ−ＬＣＤＭ培地とともにＭＥＦフィーダー細胞上に再播種した。新規に確立された細胞株を、０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してさらに継代し、次いで、さらなる解析のために凍結または使用した。
【０１３７】
最初の数継代（３〜５継代）の間は、コロニーを機械的に解離し、播種後最初の２日間、Ｙ２７６３２（１０μＭ）を補給したＦＢＳ−ＬＣＤＭ培地で培養しなければならない。後に、ＦＢＳ−ＬＣＤＭ培地を、Ｎ２Ｂ２７−ＬＣＤＭ培地に変更した。マウスＥＳコロニーに形態学的に似ているコロニーが徐々に出現した。これらのコロニーが、生存し、良好に増殖した場合には、細胞を消化するのに０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡを使用できた。新規に確立された細胞株を、０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してさらに継代し、次いで、それらをさらなる解析のために凍結または使用した。
【０１３８】
（ｃ）体細胞の再プログラミングムおよび細胞感染．
書面によるインフォームド・コンセントおよびＣｌｉｎｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによる承認を得て入手した２〜３ヶ月齢の胚からヒト胚性線維芽細胞を単離し、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を作製するために使用した。
【０１３９】
ｏｒｉＰ／ＥＢＮＡ１ベースのエピソーマルベクターを用いる再プログラミングのために、ｐＣＸＬＥ−ｈＯＣＴ３／４（インサート：ヒトＯＣＴ３／４）、ｐＣＸＬＥ−ｈＳＫ（インサート：ヒトＳＯＸ２およびＬＫＦ４）、ｐＣＸＬＥ−ｈＵＬ（インサート：ヒトＬ−ＭＹＣ）およびｐＣＸＬＥ−ＥＧＦＰ（インサート：ｅＧＦＰ）（Ａｄｄｇｅｎｅ２７０７６、２７０７８、２７０８０、２７０８２）を含むエピソーマルプラスミド（Ｏｋｉｔａら、Ｎａｔ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ、第８巻（５号）：４０９〜１２頁（２０１１年））を、ヌクレオフェクション（４Ｄ−Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）システム、Ｌｏｎｚａ）によって線維芽細胞中に同時トランスフェクトした。
【０１４０】
トランスフェクトされた線維芽細胞（ヌクレオフェクションあたりおよそ１．０×１０６個細胞）を、３つの１０ｃｍのフィーダーが播種されたディッシュ中の、１０％ウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有する１ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｈｙｃｌｏｎｅ）中に直接プレーティングした。感染の７日後に線維芽細胞を再プレーティングし、５０ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ（Ｏｒｉｇｅｎｅ）、３μｍ  ＣＨＩＲ９９０２１、１０ｎｇ／ｍｌ  ヒトＬＩＦ（Ｐｅｐｒｏｔｃｈ）、１０μｍフォルスコリン（Ｔｏｃｒｉｓ）を含有する１０％ウシ胎児血清および１０％  ＫＳＲを有するノックアウトＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）中で培養した。培養培地を１日おきに変更した。トランスフェクション後１２日目に、培地をＬＣＤＭ培地と置換した。トランスフェクション後１５日目に、ＥＰＳコロニーと同様の形態学を有するコロニーが目に見えた。コロニーを選び取り、さらなる解析のために０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡによって継代した。
【０１４１】
マウス
すべてのマウスの研究は、動物実験委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）によって承認された。この研究に使用されるマウスの株は、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ−Ｔｇ（ＧＯＦＧＦＰ）１１Ｉｍｅｇ／Ｒｂｒｃ（ＯＧ）、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＣｒｌＶｒ（Ｃ５７）、ＩＣＲおよびＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入したＳＴＯＣＫ  Ｔｇ（Ｓｏｘ２−ｃｒｅ）１Ａｍｃ／ＪとＢ６．Ｃｇ−Ｇｔ（ＲＯＳＡ）２６Ｓｏｒｔｍ１４（ＣＡＧ−ｔｄＴｏｍａｔｏ）Ｈｚｅ／Ｊの間のＦ１ハイブリッドおよびＣ５７ＢＬ／６ＮＣｒｌＶｒ  （Ｃ５７）と１２９の間のＦ１ハイブリッドまたはＣ５７ＢＬ／６ＮＣｒｌＶｒ（Ｃ５７）とＤＢＡの間のＦ１ハイブリッドを含んでいた。奇形腫形成アッセイのために使用された免疫不全マウスは、商業的に購入した。
【０１４２】
マウスＥＰＳ細胞の確立および培養
胚盤胞から直接誘導されるｍＥＰＳ細胞のために、ＯＧ、Ｃ５７、ＩＣＲまたはＳＴＯＣＫ  Ｔｇ（Ｓｏｘ２−ｃｒｅ）１Ａｍｃ／ＪとＢ６．Ｃｇ−Ｇｔ（ＲＯＳＡ）２６Ｓｏｒｔｍ１４（ＣＡＧ−ｔｄＴｏｍａｔｏ）Ｈｚｅ／Ｊマウスの間のＦ１ハイブリッドまたはＣ５７ＢＬ／６ＮＣｒｌＶｒ（Ｃ５７）と１２９の間のＦ１ハイブリッドの胚盤胞を、ＬＣＤＭ培地とともにＭＥＦフィーダー上に播種した。４日後、成長が観察され、単細胞に解体した。ｍＥＰＳ細胞を２〜３日毎に継代し、さらなる解析のために凍結または使用した。
【０１４３】
マウスナイーブ型ＥＳ細胞ＴＴ２−２ｉから直接変換されるｍＥＰＳ細胞のために、マウスナイーブ型ＥＳ細胞２ｉ培地を播種の１２時間後にＬＣＤＭ培地と置換した。２〜３日後、さらなる解析のためにコロニーを継代した。
【０１４４】
ヒトおよびマウスの拡張された多能性幹細胞の培養
ヒトおよびマウスの拡張された多能性幹細胞を、２０％  Ｏ２、５％  ＣＯ２条件で血清不含Ｎ２Ｂ２７−ＬＣＤＭ培地中で培養した。ヒトＥＰＳ細胞を未分化状態で維持するために、以下の基準を使用した：ａ）ヒトＥＰＳ細胞をあまりにも低密度にプレーティングすることを避けること、ｂ）適切な量の新たに準備されたＭＥＦフィーダー細胞の使用およびｃ）ヒトＥＰＳ細胞が過成長すること（例えば、９０％超のコンフルエンスを達成する；好ましくは、細胞は、９０％未満のコンフルエントでなくてはならない）を可能にしないこと。したがって、ヒトおよびマウスＥＰＳ細胞を、マイトマイシンＣ不活性化マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）フィーダー細胞（１ｃｍ２あたり３×１０４個細胞）上で培養し、単細胞トリプシン処理（０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって２〜４日毎に（通常、１：６〜１：１０の分割比で）継代した。ＥＰＳ細胞の継代数は、拡張された多能性状態の獲得後にカウントされた継代の数を示す。Ｎ２Ｂ２７−ＬＣＤＭ培地を新鮮なＬＣＤＭ培地と毎日交換した。
【０１４５】
マウス胚顕微操作、ホールマウント染色および画像処理．
異種間キメラアッセイが、倫理委員会（Ｅｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）によって承認された。
【０１４６】
キメラ実験のために、ヒトおよびマウスＥＰＳ細胞を継代の期限の１日前に使用した；  最適未分化形態学を示したこれらの細胞は、指数関数的に増殖した。この時点で、コロニーは、サブコンフルエント密度（およそ７０％密度）でなくてはならない。
【０１４７】
ｈＥＰＳ細胞注入のために、ｈＥＰＳ細胞をトリプシン処理し（０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡによって）、消化された細胞を、セルストレーナー（４０μｍ）を通して濾過した。その後、細胞を、１，２００〜１，５００ｒｐｍ（２５０〜３９０×ｇ）で室温で３分間遠心分離した。上清を除去し、細胞を適切な密度（２〜６＊１０５個細胞／ｍＬ）で培養培地に再懸濁した。ヒト細胞注入のためには、１０μＭ  Ｙ２７６３２が懸濁液中に添加されることが推奨された。懸濁液を、注入の前に氷上に２０〜３０分間置き、ＩＣＲ２倍体マウス胚のＥ２．５またはＥ３．５胚（胚あたり１０〜１５細胞）中に微量注入した。およそ１５の注入された胚を、性交後０．５または２．５日の偽妊娠雌の各子宮角に移した。
【０１４８】
Ｔｄｔｏｍａｔｏ標識ｍＥＰＳ細胞および従来のナイーブ型マウスＥＳ細胞の注入のために、ｍＥＰＳおよびナイーブ型マウスＥＳ細胞を、トリプシン処理し、懸濁液中にＹ２７６３２が添加されなかった点を除いてｈＥＰＳ細胞についてと同一方法で微量注入した。
【０１４９】
受胎産物を、抗ヒト核抗体（クローン２３５−１、１：３００；  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いるホールマウント染色のためにＥ１０．５発達段階で解体し、Ａｂｃａｍ製のホールマウント染色プロトコールに従って抗ＧＡＴＡ４（ｓｃ−１２３７、１：２００；  Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）または抗ＳＯＸ２（１：２００、ｓｃ−１７３２０；  Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）抗体を用いて同時染色した。
【０１５０】
共焦点解析のために、ＵｌｔｒａＶＩＥＷ  ＶｏＸシステム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）によってマウントされた胚を画像処理した。
【０１５１】
受胎産物を、Ｅ１２．５発達段階で解体し、Ｔｄｔｏｍａｔｏ＋細胞局在性を検出するために免疫蛍光実体顕微鏡を使用して観察した。場合により、いくつかの妊娠中マウスを、これらのマウスからマウス胚が得られなかった場合にさらなる解析から排除した。
【０１５２】
組織切片の免疫染色のために、Ｅ１０．５受胎産物から胚および胚盤を単離し、続いて、包理し、凍結し、矢状側から切片作製した（５μｍ厚）。Ｔｄｔｏｍａｔｏリポーター標識ヒト細胞が注入された胚を、抗ＮＡＮＯＧ（１：２００、ａｂ８０８９２；  Ａｂｃａｍ）および抗Ｔｄｔｏｍａｔｏ／ＲＦＰ（１：４００、ａｂ６２３４１；  Ａｂｃａｍ）を用いて染色し、胚盤を、抗Ｔｄｔｏｍａｔｏ／ＲＦＰ（１：４００、ａｂ６２３４１；  Ａｂｃａｍ）、抗ＣＫ８（１：５０、ｓｃ−５２３２４；  Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）および抗ｈＣＧβ（１：２００、ａｂ１３１１７０；  Ａｂｃａｍ）を用いて染色した。いくつかの胚を、矢状側から切片作製した（５μｍ厚）。胚を、抗ＦＯＸＡ２（ａｂ１０８４２２、１：５０；  Ａｂｃａｍ）および抗ヒト核抗体（クローン２３５−１、１：３００；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて染色した。すべてのこれらのサンプルを、ＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ  Ｍｉｃｒｏ  Ｈｉｇｈ  Ｃｏｎｔｅｎｔ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇシステム（ＭｏｌＤｅｖ）によって画像処理した。
【０１５３】
Ｅ１０．５キメラマウス受胎産物から得た胎盤および卵黄嚢におけるｈＥＰＳ由来細胞の検出
ｈＥＰＳ細胞の胚外キメラ化を検出するために、Ｅ１０．５受胎産物から胎盤および卵黄嚢を単離し、コラゲナーゼＩＶを使用して消化した。単離された一次細胞を２４ウェルプレート中に播種し、さらなる解析の前に、１０％  ＦＢＳおよび１０％  ＫＳＲを補給したノックアウトＤＭＥＭ中で３〜４日間培養した。
【０１５４】
単細胞微量注入のキメラアッセイ
この実験において使用した細胞は、複数細胞微量注入のものと同様である方法で培養し、準備した。細胞懸濁液を注入の前に氷上に２０〜３０分間置いた。氷上に置いた後に、消化された単細胞を１時間以内に注入のために使用した：言い換えれば、全注入プロセスは、３０分超かかってはならない。その後、注入された胚は、３７℃で５％  ＣＯ２を有する加湿インキュベーター中に１〜２時間回復される。細胞を氷上に１時間超置いた場合には、残りの注入のために別のバッチの細胞を消化した。単細胞（Ｔｄｔｏｍａｔｏ標識されたヒト細胞、未標識ヒト細胞、Ｔｄｔｏｍａｔｏ標識ＥＰＳおよびナイーブ型マウスＥＳ細胞）を、８細胞期ＩＣＲ２倍体マウス胚中に微量注入し、Ｅ５．０までｅｘ  ｖｉｖｏで発達させた（補給されたＫＳＯＭ（Ｋ（カリウム）補給された単純最適化培地）；Ｓｕｍｍｅｒｓら、Ｊ．Ａｓｓｉｓｔ  Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｎｅｔ．、第３０巻（８号）：９９５〜９９９頁＊（２０１３年）  中で６０時間）。その他の実験では、キメラ胚盤胞の作製のために、注入された胚を、Ｎ２Ｂ２７−ＬＣＤＭ培地中で最初の４時間培養し（単一ｈＥＰＳ細胞が注入されたキメラ胚の培養には、１０μＭのＹ２７６３２（Ｔｏｃｒｉｓ、１２５４）が添加されることが推奨された）、次いで、それらをＧ２  ＰＬＵＳ培地（Ｖｉｔｒｏｌｉｆｅ、１０１３１）に交換した。６０時間後、胚を固定し、免疫染色した。
【０１５５】
次いで、胚を固定し、免疫染色した。Ｔｄｔｏｍａｔｏ標識されたヒト細胞が注入された胚のために、抗体は、Ｏｃｔ４（ｓｃ−５２７９；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚまたはａｂ１８１５５７；Ａｂｃａｍ）およびＣＤＸ２（ａｂ７４３３９；ＡｂｃａｍまたはＣＤＸ２−８８、ＡＭ３９２；Ｂｉｏｇｅｎｅｘ）を含んでいた。非標識ヒト細胞のためには、抗体は、抗ヒト核抗体（ＭＡＢ１２８１；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ＣＤＸ２（ｓｃ−１９４７８；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）およびＯｃｔ４（Ａｂ１８９７６−１００；Ａｂｃａｍまたはａｂ１８１５５７；Ａｂｃａｍ）を含んでいた。ｍＥＰＳおよびナイーブ型マウスＥＳ細胞の注入のために、細胞を、Ｔｄｔｏｍａｔｏリポーターを用いて構成的に標識した。微量注入および免疫染色を上記と同様に実施した。抗体は、ＣＤＸ２（ＣＤＸ２−８８、ＡＭ３９２；Ｂｉｏｇｅｎｅｘ）、ＯＣＴ４（Ａｂ１８９７６−１００；Ａｂｃａｍ）を含む。
【０１５６】
単一ｍＥＰＳ細胞のｉｎ  ｖｉｖｏキメラ能力を調べるために、単一ｍＥＰＳ細胞を注入したキメラ胚を、３７℃で５％  ＣＯ２を有する加湿インキュベーター中で１〜２時間回復させ、性交後０．５または２．５日の偽妊娠雌の子宮角に移した。受胎産物を、Ｅ１０．５、Ｅ１２．５またはＥ１７．５発達段階のいずれかで解体し、Ｔｄｔｏｍａｔｏ＋細胞局在性を検出するために免疫蛍光実体顕微鏡を使用して観察した。Ｅ１０．５  受胎産物から胎盤を単離し、続いて、包理し、凍結し、矢状側から切片作製し（５μｍ厚）、次いで、ＣＫ８（１：５０、ｓｃ−５２３２４；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、ＰＲＯＬＩＦＥＲＩＮ（１：５０、ｓｃ−４７３４５；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）およびＴＰＢＰＡ（１：１００、ａｂ１０４４０１；Ａｂｃａｍ）を用いて染色した。サンプルをＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ  Ｍｉｃｒｏ  Ｈｉｇｈ  Ｃｏｎｔｅｎｔ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＭｏｌＤｅｖ）によってさらに解析した。
【０１５７】
単一ｍＥＰＳキメラ化胚からの栄養膜細胞幹（ＴＳ）様およびＥＳ様細胞の誘導
単一Ｔｄｔｏｍａｔｏ標識ｍＥＰＳ細胞を、８細胞マウス胚中に注入し、Ｎ２Ｂ２７−ＬＣＤＭ培地中で４時間培養した。注入された胚を、Ｇ２  ＰＬＵＳ培地に移し、さらに５６時間培養した。同一キメラ胚の半分を伝統的なｍＥＳ誘導培地中に播種し、もう一方を、伝統的なＴＳ誘導培地１３に播種したことによって、同一キメラ胚を使用して、ＥＳおよびＴＳ細胞株の両方を作製した。同一キメラ胚からＥＳ様およびＴＳ様コロニーを同時に誘導した。Ｔｄｔｏｍａｔｏ標識された伝統的なマウスＥＳ  ＴＴ２およびｍｃ２ｉ−１を、このアッセイにおいて対照として別個に使用し、各８細胞胚に、１０〜１５個の細胞を注入した。
【０１５８】
ＴＳ様およびＥＳ様細胞のキメラアッセイ
確立されたＴＳ様またはＥＳ様細胞株の１０〜１５個細胞を、８細胞マウス胚中に注入した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏキメラアッセイのために、注入された胚をＧ２  ＰＬＵＳ培地中で６０時間培養した。次いで、それらを固定し、免疫染色した。ｉｎ  ｖｉｖｏキメラアッセイのために、受胎産物を、Ｅ１３．５発達段階で解体し、蛍光陽性細胞の存在を検出するために免疫蛍光実体顕微鏡を使用して観察した。
【０１５９】
免疫蛍光
細胞を、４％パラホルムアルデヒド中、室温で１５分間固定し、０．２％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００および３％正常ロバ血清（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を含有するＰＢＳを用いて、室温で４５分間ブロッキングした。細胞を一次抗体とともに４℃で一晩インキュベートした。二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を室温で１時間インキュベートした。核をＤＡＰＩ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて染色した。抗体の詳細は、以下に提供した。
【０１６０】
ヒト細胞のために、使用した抗体は、抗ＯＣＴ４抗体（Ａｂ１８９７６−１００；Ａｂｃａｍ；ｓｃ−５２７９；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、抗ヒトＮＡＮＯＧ抗体（ＡＦ１９９７；Ｒ＆Ｄ）、抗ＳＯＸ２抗体（ｓｃ−１７３２０；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、抗トリメチルヒストンＨ３（Ｌｙｓ２７）抗体（０７−４４９；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）およびＫＬＦ４（ｓｃ−２０６９１；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）であった。マウス細胞のために、抗体は、抗ＮＡＮＯＧ（ａｂ８０８９２；Ａｂｃａｍ）、抗ＫＬＦ（ｋｒｕｐｐｅｌ様因子）４（ｓｃ−２０６９１；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、ＯＣＴ４（Ａｂ１８９７６−１００；Ａｂｃａｍ）、ＳＡＬＬ４（ａｂ２９１１２；Ａｂｃａｍ）およびＳＯＸ２（ｓｃ−１７３２０；  Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）であった。
【０１６１】
キメラ胚盤胞の免疫蛍光解析のために、使用した抗体は、Ｏｃｔ４（ａｂ１８１５５７；Ａｂｃａｍ）、ＧＡＴＡ３（ａｂ１９９４２８；Ａｂｃａｍ）、ＮＡＮＯＧ（ａｂ８０８９２；Ａｂｃａｍ）およびＣＤＸ２（ＣＤＸ２−８８、ＡＭ３９２；Ｂｉｏｇｅｎｅｘ）を含んでいた。ＴＳ様細胞、ＥＳ様細胞またはＴＳ培地中で培養された細胞の免疫蛍光解析のために、使用した抗体は、ＯＣＴ４（ｓｃ−５２７９；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、ＮＡＮＯＧ  （ａｂ８０８９２；Ａｂｃａｍ）、ＳＯＸ２（ｓｃ−１７３２０；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、ＣＤＸ２（ＣＤＸ２−８８、ＡＭ３９２；Ｂｉｏｇｅｎｅｘ）およびＥＯＭＥＳ（ａｂ２３３４５；Ａｂｃａｍ）を含んでいた。
【０１６２】
フローサイトメトリー
胚、卵黄嚢および胚盤のキメラ組織を単離し、コラゲナーゼＩＶを使用して単細胞に消化した。懸濁液を、セルストレーナー（４０μｍ）を通して濾過した。次いで、サンプルをＢＤ  ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ機器で解析した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ａｓｈｌａｎｄ）を使用してデータ解析を実施した。
【０１６３】
ｍＥＰＳ由来胎盤細胞における栄養膜細胞マーカー遺伝子発現の解析
キメラ胎盤組織を単離し、コラゲナーゼＩＶを使用して消化した。初代Ｔｄｔｏｍａｔｏ＋およびＴｄｔｏｍａｔｏ−胎盤細胞の両方を、ＦＡＣＳを使用して精製した。Ｔｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して精製細胞の全ＲＮＡを抽出した。以前に記載されたようにｃＤＮＡを調製した３１。ｑＰＣＲ鋳型による必要に応じて、増幅されたｃＤＮＡ産物を１０倍希釈した。Ｂｉｏ  ＲＡＤ  ＣＦＸ  Ｃｏｎｎｅｃｔ  Ｒｅａｌ−ＴｉｍｅシステムでＫＡＰＡ  ＳＹＢＲ（登録商標）ＦＡＳＴ  ｑＰＣＲキットを使用して定量的ＰＣＲ解析を実施した。リアルタイムＰＣＲに使用したプライマーは、表２に列挙されている。
【０１６４】
Ｔｒａｎｓｗｅｌｌベースの浸潤アッセイ．
キメラ胎盤組織を単離し、コラゲナーゼＩＶを使用して消化した。キメラ胎盤の１つまたは半分に由来する初代胎盤細胞を、２４ウェルプレート中でマトリゲル（商標）コーティングされたフィルター（８μｍ孔サイズ；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ、ＵＳＡ）上に播種した。手短には、細胞を、血清不含ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中でＴｒａｎｓｗｅｌｌの上側チャンバー上に播種した。Ｔｒａｎｓｗｅｌｌの下部チャンバーは、１０％  ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で満たした。チャンバーを３７℃で５％  ＣＯ２とともに２４時間インキュベートした。インキュベーションの最後に、フィルターの上側表面上の細胞を、コットンスワブを使用して除去した。下側表面にフィルターを通して浸潤する細胞を、４％パラホルムアルデヒドを用いて２０分間固定し、免疫蛍光によってさらに解析した。免疫蛍光に以下の抗体を使用した：ＣＫ８（１：２００、ｓｃ−５２３２４；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、ＣＫ７（１：４０、ＭＡ５−１１９８６；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）およびＴｄｔｏｍａｔｏ／ＲＦＰ（１：４００、ａｂ６２３４１；  Ａｂｃａｍ）。
【０１６５】
ヒトＯＣＴ４転写制御の評価
検出されたヒト細胞株のヒトＯＣＴ４転写制御を評価するために、ＯＣＴ４−ＤＥルシフェラーゼプラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ）を、ヌクレオフェクション（４Ｄ−Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）システム、Ｌｏｎｚａ）によって細胞中にトランスフェクトした。正規化のために、対照ベクターｐＧＬ４．７４［ｈＲｌｕｃ／ＴＫ］（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｅ６９２１）を同時トランスフェクトした。空のベクターを用いるトランスフェクションによってベースライン活性を解析した。トランスフェクション後、細胞株を、ウェルあたり５＊１０３個細胞の密度でマトリゲルコーティングされた９６ウェルプレート中に播種した。次いで、４８時間後、デュアルルシフェラーゼリポーターアッセイ系（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｅ１９６０）を使用してルシフェラーゼ活性を検出するために細胞を溶解した。
【０１６６】
ＥＢ形成アッセイ
マウスおよびヒトＥＰＳ細胞を、単細胞にトリプシン処理し、ゼラチンコーティングしたプレート上にプレプレーティングすることによってＭＥＦフィーダー細胞から分離し、１５％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）を補給したＩＭＤＭ（Ｉｓｃｏｖｅの改変ダルベッコ培地）（Ｇｉｂｃｏ）中、超低接着プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）で６日間培養した。次いで、ＥＢを集め、同一培地中、マトリゲルコーティングされたプレート上に６日間プレーティングし、固定し、検出した。ヒト細胞のために、抗体は、抗ＳＯＸ１７抗体（ＡＦ１９２４；Ｒ＆Ｄ）、抗ＦＯＸＡ２抗体（ａｂ１０８４２２；Ａｂｃａｍ）、抗ＬＨＸ５抗体（ｓｃ−１３０４６９；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、抗α−ＳＭＡ抗体（ＣＢＬ１７１；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、抗ＣＤＸ２抗体（ａｂ７４３３９、Ａｂｃａｍ）および抗ＧＡＴＡ６抗体（ｓｃ−９０５５、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）を含む。マウス細胞のために、抗体は、抗ＦＯＸＡ２抗体（ａｂ６０７２１；Ａｂｃａｍ）、抗β−ＩＩＩチュブリン抗体（ｓｃ−８００１６；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、抗α−ＳＭＡ抗体（ＣＢＬ１７１；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）および抗ＣＤＸ２抗体（ＣＤＸ２−８８、ＡＭ３９２；Ｂｉｏｇｅｎｅｘ）を含む。
【０１６７】
奇形腫アッセイ
ヒトおよびマウスＥＰＳ細胞を、注入前にトリプシン処理によって集めた。およそ１０６個細胞を免疫不全マウス中に皮下注入した。奇形腫は、一般に、２〜６週間以内に発生し、動物は腫瘍の大きさが直径１．５ｃｍを超える前に死亡した。次いで、奇形腫を、パラフィン中に包埋し、ヘマトキシリンおよびエオシン染色のために処理した。
【０１６８】
奇形腫アッセイにおいてｈＥＰＳ細胞の胚外分化潜在力を解析するために、免疫化学アッセイを適用した。ｈＥＰＳ由来またはプライム型ｈＰＳＣ由来奇形腫を固定し、包埋し、５μｍ厚切片を免疫組織化学染色に使用した。脱蝋および水和後、３％  Ｈ２Ｏ２を使用して、内因性ペルオキシダーゼをブロッキングした。続いて、二次抗体動物起源の１０％正常血清によって組織をブロッキングした。サンプルを、一次抗体ｈＣＧβ（ａｂ１３１１７０；Ａｂｃａｍ）とともに４℃でインキュベートし、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）とコンジュゲートしている二次抗体とともに室温で３０分間さらにインキュベートした。ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）によって可視化した後、Ｈａｒｒｉｓヘマトキシリンを用いて組織を染色した。
【０１６９】
比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）解析
ＣＧＨ実験のために、ゲノムＤＮＡを抽出し、参照として初期継代の細胞株を使用してＩｍａｇｅｎｅｓによってＣｕｓｔｏｍ  ＳｕｒｅＰｒｉｎｔ  Ｇ３  ８ｘ６０Ｋヒト全ゲノムＡＧＩ−ＣＧＨアレイとハイブリダイズした。
【０１７０】
核型解析
Ｇバンド染色体解析を、報告されたように（Ｌｏｎｇｏら、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ．、第６巻：３２１〜３２８頁（１９９７年））実施した。
【０１７１】
倍加時間算出
０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してプレートから細胞を回収し、それらをカウントし、フィーダー細胞を、Ｙ２７６３２を含まない適当な培地中でウェルあたり１０，０００個細胞の密度でプレシードした２４ウェルプレート上にプレーティングした。時間の関数として血球計を使用して細胞数をカウントすることによって成長速度を調べた。成長の対数期（４８および７２時間の時点）から得たデータを使用して、対数増殖曲線を得た。倍加時間を、式：ＤＴ＝４８＊［ｌｇ２／（ｌｇＮｔ（４日目の細胞数）−ｌｇＮｏ（２日目の細胞数））］に従って算出した。
【０１７２】
ＲＮＡ配列およびデータ解析
ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、プライム型ｈＥＳ細胞、ｈＥＰＳ細胞およびナイーブ型ＮＳＨＭ−ｈＥＳ細胞、ｍＥＳ細胞およびｍＥＰＳ細胞から全ＲＮＡを単離した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）（ＮＥＢ、ＵＳＡ）のＮＥＢＮｅｘｔ（登録商標）Ｕｌｔｒａ（商標）ＲＮＡ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｐｒｅｐキットを使用して、ＲＮＡシーケンシングライブラリーを構築した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ  ２０００を使用して、断片化されたランダムプライムされた２００ｂｐ対末端ライブラリーをシーケンシングした。遺伝子発現レベルを、ＦＰＫＭ（１００万のマッピングされたリードあたりの１キロベースの転写物の断片）として算出した。その他の実験では、作製されたシーケンシングリードを、ＴｏｐＨａｔアラインメントソフトウェアツールを使用して、ヒトについてヒトゲノムから構築されたｈｇ１９およびマウスについてＧＲＣｍ３８／ｍｍ１０に対してマッピングした。各遺伝子のリードカウントを算出し、ＲＰＫＭ（１００万リードあたりのキロベースあたりのリード）を使用して各遺伝子の発現値を正規化した。
【０１７３】
ＴｏｐＨａｔ２プログラムを使用してトランスクリプトームリードをマッピングした。正規化された差次的に発現された（ＤＥ）遺伝子を検出した。提供されたＰ値（ポワゾン分布）は、差次的遺伝子発現試験に対応する。ＦＤＲ（偽発見率）法を使用して偽陽性（Ｉ型）および偽陰性（ＩＩ型）エラーの補正を実施した。ＦＤＲ＜０．０１およびｌｏｇ２割合の絶対値＞１を、遺伝子発現の差を有意と宣言するための閾値として使用した。
【０１７４】
ＤＥ遺伝子の遺伝子オントロジー解析を、ＤＡＶＩＤプログラムを使用して実施した（Ｈｕａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、第４巻：４４〜５７頁（２００９年）に記載される）。０．０１未満のＰ値を有していた用語を、有意に濃縮されていると定義した。
【０１７５】
種々のサンプル中の転写物の網羅的発現プロファイルのクラスタリングのために、ＦＰＫＭ≧０．１を有する少なくとも１種のサンプルにおいて発現された転写物のすべてを使用した。クラスタリングにおける種々の細胞株の遺伝的背景の潜在的影響を最小化するために、種々の細胞株から得た発現値を、各転写物の発現値を、サンプルにわたる同一転写物内の発現値の平均に対して正規化することによって作成した相対存在量値に変換した。得られた発現マトリックスを、階層的クラスタリング（スペアマン相関、平均連結法）に付した。
【０１７６】
ＥＰＳ細胞をその他の多能性細胞と比較するために、ヒトリセットＰＳＣ、ヒト３ｉＬ  ｈＥＳＣ、ヒトナイーブ型ＰＳＣ、ヒトプライム型ＥＳＣ、マウスＥｐｉＳＣ、マウス２Ｃ様細胞およびマウスＥＳＣの公開されたデータを含めた。生物情報学解析を、各サンプルによって調べられた遺伝子に制限された。ヒトリセットＰＳＣ、３ｉＬ  ｈＥＳＣおよびＴａｋａｓｈｉｍａら（２０１４年）およびＣｈａｎら（２０１３年）において公開された従来のＰＳＣの発現プロファイルのために、ＡｒｒａｙＥｘｐｒｅｓｓデータベースから得た生シーケンシングリード（Ｅ−ＭＴＡＢ−２８５７）および（Ｅ−ＭＴＡＢ−２０３１）を、上記のように再マッピングし、処理した。Ｇａｆｎｉら（２０１３年）およびＴｈｅｕｎｉｓｓｅｎら（２０１４年）に公開されたヒトナイーブ型ＰＳＣおよびヒトプライム型ＥＳＣの発現プロファイルのために、ＮＣＢＩ  ＧＥＯデータベースにおいてＧＳＥ４６８７２およびＧＳＥ５９４３０の元で正規化されたマイクロアレイデータを、それぞれダウンロードし、マージした。Ｎａｊｍら（２０１１年）に公開されたマウスＥＳＣ（ＧＳＭ６５９５４９、ＧＳＭ６５９５５０）およびＥｐｉＳＣ（ＧＳＭ６５９５５１、ＧＳＭ６５９５５２、ＧＳＭ６５９５５３、ＧＳＭ６５９５５４）の発現プロファイルのために、正規化された発現表をダウンロードし、マージした。Ｍａｃｆａｒｌａｎら（２０１２年）に公開された２Ｃ様細胞の発現プロファイルのために、上記と同一方法で、２Ｃ：：ｔｏｍａｔｏ＋細胞および２Ｃ：：ｔｏｍａｔｏ−細胞の正規化された発現データ（ＧＳＭ８３５１９５４、ＧＳＭ８３５１９９８）をダウンロードし、処理した。
【０１７７】
ＥＰＳ細胞を胚性着床前細胞と比較するために、ヒトおよびマウス胚性着床前細胞の公開されたデータを使用した（Ｔａｎｇら、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ、第６巻：ｅ２１２０８（２０１１年）；Ｙａｎら、Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、第２０巻：１１３１−１１３９頁（２０１３年））。同一遺伝子のプローブセットを、平均値をとることによって遺伝子を表す単一値に折り畳んだ。異なるデータベース間のプラットフォームおよびバッチ効果を説明する、元のデータを、そのＥＳ細胞サンプル（ヒトのプライム型ｈＰＳＣおよびマウスのマウスＥＳＣ）の平均値に対して正規化することによって、公開されたデータおよび本発明者らのデータから得た発現値を再算出した。
【０１７８】
遺伝子発現のその後の解析のために、遺伝子が少なくとも１種のサンプル中で発現された場合には、それらをＲＰＫＭ＞５閾値を使用して両データベース中で保持した（Ｂｌａｋｅｌｅｙら、Ｄｅｖ．、第１４２巻：３１５１〜３１５６頁（２０１５年））。差次的に発現された（ＤＥ）遺伝子を、Ｒソフトウェア中のパッケージＤＥＳｅｑ２によって検出した。調整されたｐ値＜０．０５およびｌｏｇ２割合の絶対値＞１を、遺伝子発現の差を有意と宣言するための閾値として使用した。
【０１７９】
主成分解析を、共分散マトリックスに基づくＲ統計パッケージ中のｐｒｉｎｃｏｍｐ関数を使用して実施した。各研究において胚由来ＰＳＣに対して正規化された発現レベルを使用して、上記のような異なる実験およびプラットフォームによって引き起こされる技術的相違を低減した。Ｒソフトウェア中のｐｈｅａｔｍａｐパッケージを使用してヒートマップを作成した。
【０１８０】
ＲＮＡ配列およびＣｈＩＰ配列データは、シリーズ受託番号ＧＳＥ６８７８２の下でＧｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｏｍｎｉｂｕｓに寄託されている。
【０１８１】
クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）、シーケンシングライブラリー調製
シーケンシングおよびデータ解析．
ＥＺ−Ｍａｇｎａ  ＣｈＩＰ  Ａ／Ｇキット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を、製造業者のプロトコールに従って使用してＣｈＩＰを実施した。抗Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３（抗トリメチル−ヒストンＨ（Ｌｙｓ２７）（０７−４４９、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）および抗Ｈ３Ｋ４ｍｅ３（抗ヒストンＨ３（トリメチルＫ４）（ａｂ８５８０、Ａｂｃａｍ）））抗体を使用した。精製ＣｈＩＰ  ＤＮＡを使用して、Ｉｌｌｕｍｉｎａマルチプレックスドシーケンシングライブラリーを調製した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ  １  ＴｒｕＳｅｑ  ＤＮＡサンプル調製ｖ２キットプロトコールに従って、Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシングのライブラリーを調製した。次いで、増幅されたライブラリーを、１００から５００ｂｐの間の断片を捕獲するよう設定された、Ｓａｇｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ製のＰｉｐｐｉｎ  Ｐｒｅｐシステム中の２％ゲルカセットを使用してサイズ選択した。個別のＴｒｕＳｅｑ指数を有するライブラリーを等モル比で混合することおよびペアードリード様式で１００塩基のためのＩｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ  ２５００上のレーンに一緒に流すことによってマルチプレックス化した。Ｂｏｗｔｉｅソフトウェアバージョン２．０を使用して、ヒトリードをヒトリファレンスゲノムｈｇ１９（ＵＣＳＣ、２００９年２月）に対してアラインした。最大で２つ以下のミスマッチを有するゲノムに対して独特にアラインされたリードのみをさらなる解析のために考えた。ｎｇｓｐｌｏｔを使用してすべてのＲｅｆＳｅｑ遺伝子にわたってクロマチンプロファイルを算出して、ＴＳＳの２ｋｂ上流からＴＥＳ  の２ｋｂ下流の間のリード密度を解析した。ヒトサンプルのプロファイルは、プライム型およびｈＥＰＳ細胞の平均およびエラーバーを表す。ＭＡＣＳバージョン２．０（ＣｈＩＰ−Ｓｅｑのモデルベースの解析）ピーク発見アルゴリズムを使用して、バックグラウンドを上回るＣｈＩＰ−Ｓｅｑ濃縮の領域を同定し、ＢＡＭＰＥ配列モデルを使用して、ピークを見い出し、ＦＤＲ＜０．０５を使用して有意なピークを選択した。最後に、ＨｏｍｍｅｒおよびＲを使用して、ピークをアノテートし、ピークと関連する遺伝子機能要素および遺伝子および遺伝子オントロジーならびにＫＥＧＧ（Ｋｙｏｔｏ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（京都遺伝子ゲノム百科事典））ｐａｔｈｗａｙにおけるピークの分布を解析した。
【０１８２】
ウエスタンブロット
プロテアーゼ阻害剤カクテル（７８４４３；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）およびホスファターゼ阻害剤カクテル（７８４２８；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を補給したＲＩＰＡ（放射免疫沈降アッセイ）溶解バッファー（Ｐ００１３Ｂ；Ｂｅｙｏｔｉｍｅ）を使用して、プライム型ｈＥＳ細胞およびｈＥＰＳ細胞から全細胞タンパク質抽出物を単離した。ブロットを２％  ＢＳＡ（Ａ１４７０；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）／ＴＢＳＴ中、室温で１時間インキュベートし、次いで、５％  ＢＳＡまたは５％スキムミルクパウダー（Ｐ１６２２；Ａｐｐｌｙｇｅｎ）／ＴＢＳＴ（０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０を有するＴｒｉｓ塩基理食塩水バッファー）中、４℃で一晩、以下の抗体とともにインキュベートした：抗ｐ−ＳＴＡＴ３（ホスホ−ＳＴＡＴ（シグナルトランスデューサーおよび転写のアクチベーター）３（Ｔｙｒ７０５）（９１４５Ｓ；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｎｇａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗ＳＴＡＴ３（ｓｃ−４８２；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、抗ＧＰ（糖タンパク質）１３０（３７３２Ｓ；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｎｇａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗ＧＳＫ−３β（ＡＧ７５１−１；Ｂｅｙｏｔｉｍｅ）、抗ｐ−ＧＳＫ−３β（Ｓｅｒ９）（９３２２Ｓ；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｎｇａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗ＰＡＲＰ１（ｓｃ−７１５０；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、抗ＴＢＸ３（ａｂ８９２２０、Ａｂｃａｍ）、抗ＧＢＸ２（ｓｃ−２２２３０；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）および抗β−アクチン（Ａ１９７８；Ｓｉｇｍａ））。
【０１８３】
ＭＡＰＫ経路を検出するために、ヒトおよびマウス細胞は、同一抗体：ＥＲＫ１／２（ＡＭ０７６−１；Ｂｅｙｏｔｉｍｅ）、ｐ−ＥＲＫ１／２（ＡＭ０７１−１；Ｂｅｙｏｔｉｍｅ）、ＪＮＫ（ＡＭ７５１８−１；Ｂｅｙｏｔｉｍｅ）、ｐ−ＪＮＫ（ＡＭ７５１６−１；Ｂｅｙｏｔｉｍｅ）、ｐ３８（９２１２Ｓ；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｎｇａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）およびｐ−ｐ３８  （９２１５Ｓ；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｎｇａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用した。
【０１８４】
二次抗体は、抗ウサギＩｇＧ、ＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）が連結された抗体（７０７４Ｓ；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｎｇａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）および抗マウスＩｇＧ、ＨＲＰが連結された抗体（７０７６Ｓ；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｎｇａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）とし、これらを振盪しながら室温で１時間インキュベートした。ブロットを、ＢｅｙｏＥＣＬ  Ｐｌｕｓ（Ｐ００１８；Ｂｅｙｏｔｉｍｅ）を使用して発色させた。
【０１８５】
定量的ＰＣＲ解析
培養細胞の全ウェルから得た全ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌｕｓ  Ｍｉｎｉキット（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して単離した。ＴｒａｎｓＳｃｒｉｐｔ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ＳｕｐｅｒＭｉｘ（ＴｒａｎｓＧｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用してＲＮＡをｃＤＮＡに変換した。ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７３００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ＳｙｓｔｅｍでＰｏｗｅｒ  ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してＰＣＲを実施した。Δ−ΔＣＴ法を使用してデータを解析した。リアルタイムＰＣＲに使用されたプライマーが表２に列挙されている。
【０１８６】
【表２】
0006780870.tif 000003
【０１８７】
ゲノムＰＣＲおよびヒトミトコンドリアＰＣＲアッセイ
細胞、胚および胚盤の総ＤＮＡを、ＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ  ＆  Ｔｉｓｓｕｅキット（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して単離した。ＥａｓｙＴａｑ  ＰＣＲ  ＳｕｐｅｒＭｉｘ（ＴＲＡＮＳＧＥＮ  ＢＩＯＴＥＣＨ）を使用してゲノムＰＣＲを実施した。Ｑ−ＰＣＲによってヒト特異的ミトコンドリアＤＮＡエレメントを検出するために、サンプルあたり  ７０ｎｇの総ＤＮＡを使用した。Δ−ΔＣＴ法を使用してデータを解析し、これらは、ヒト−マウス保存ミトコンドリアＤＮＡエレメントの値に対して最初に正規化した。次いで、相対発現値を、注入されていない野生型マウス組織から単離された対照サンプルから作製された値に対してさらに正規化した。ゲノムＰＣＲに使用したプライマーは、表２に列挙されている。
【０１８８】
単細胞の定量的ＰＣＲ解析
第１に、細胞を０．５％トリプシン−ＥＤＴＡを用いて１単細胞懸濁液（１％  ＢＳＡ−ＰＢＳ）中に脱凝集させ、次いで、各細胞を手作業で選び、０．２ｍｌの、低張溶解バッファーを含有するＰＣＲチューブ中に移した。第２に、単細胞ｃＤＮＡを、以前に記載されたように調製した（Ｐｉｃｅｌｌｉら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、第９巻：（１７１〜１８１頁（２０１４年）））。ｑＰＣＲ鋳型による必要に応じて、増幅されたｃＤＮＡ産物を１０倍希釈した。Ｂｉｏ  ＲＡＤ  ＣＦＸ  Ｃｏｎｎｅｃｔ  Ｒｅａｌ−ＴｉｍｅシステムでＫＡＰＡ  ＳＹＢＲ（登録商標）ＦＡＳＴ  ｑＰＣＲキットを使用して定量的ＰＣＲ解析を実施した。リアルタイムＰＣＲに使用したプライマーは、表２に列挙されている。
【０１８９】
ＲＮＡｉ
ｓｈＲＮＡレンチウイルスベクター（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用してＰＡＲＰ１ノックダウンを達成した。ｓｈＲＮＡ配列は、表２に列挙されている。それぞれこれらのベクターを用いてｈＥＰＳ細胞をトランスフェクトし、解析の前に３継代の間培養した。
【０１９０】
Ｐａｒｐ１ノックアウトｍＥＰＳ細胞株の作製
ガイドＲＮＡ配列を、プラスミドｐｘ３３０（Ａｄｄｇｅｎｅ）中にクローニングした。ｇＲＮＡを含有するＰｘ３３０を、ヌクレオフェクション（４Ｄ−Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）システム、Ｌｏｎｚａ）によって消化された単一ｍＥＰＳ細胞中に同時トランスフェクトした。シングルコロニーを選び、個別に増殖させた。ＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ  ＆  Ｔｉｓｓｕｅキット（ＱＩＡＧＥＮ）を使用してコロニーのゲノムＤＮＡを抽出し、ゲノムＰＣＲによって、これをさらに解析した。Ｐａｒｐ１遺伝子座のエキソン１およびエキソン２が欠失したコロニーを同定した。
【０１９１】
結果および考察
２種の小分子、（Ｓ）−（＋）−ジメチンデンマレエート（ＤｉＭ）およびミノサイクリンヒドロクロリド（ＭｉＨ）は、この条件下で、マウス胚性幹（ＥＳ）細胞に形態学的に似ているドーム型ｈＥＳコロニー形成を支持するとわかった。これらの小分子をさらに組み合わせ、試験した後、ＬＣＤＭと名付けた新規処置組合せが確立され、これは、ｈＬＩＦ、ＣＨＩＲ９９０２１、ＤｉＭおよびＭｉＨを含有していた（図１Ａ）。この処置組合せ下で、プライム型ｈＥＳ細胞の変換によって（示されていないデータ）、胚盤胞から直接誘導される細胞によって（示されていないデータ）、多能性因子を用いる体細胞再プログラミングによって（示されていないデータ）、マウスＥＳ細胞に形態学的に似ている細胞株を作り出すことができる。ＬＣＤＭによって支持された細胞は、ｉｎ−ｖｉｔｒｏ分化およびｉｎ−ｖｉｖｏ奇形腫形成の両方で３種の胚性胚葉に分化する能力を示した（示されていないデータおよび表３）。
【０１９２】
【表３】
0006780870.tif 000004
【０１９３】
これらの細胞は、トリプシン処理後に頑強に増殖させ単細胞にすることができ、５０を超える継代後に正常な核型を示した（示されていないデータおよび表３）。したがって、ＬＣＤＭ条件は、マウスＥＳ細胞と形態学的に似ている、多能性分化潜在力を有するヒト幹細胞の安定な集団の作製を支持した。
【０１９４】
ｈＥＰＳ細胞は、胚外潜在力を示すので、これらの細胞における胚外マーカーの発現を調べた（図２Ａおよび図２Ｂ〜Ｃ）。ｈＥＰＳ細胞において、ＣＤＸ２（２〜３倍に）、ＧＡＴＡ６（２．５倍に）、ＨＡＮＤ１（８倍に）およびＥＯＭＥＳ（１．５倍に）などの複数の胚外遺伝子が、プライム型ｈＥＳまたはナイーブ型ＮＨＳＭ−ｈＥＳ細胞（図２Ｃおよび図２Ｄ〜Ｅ）のいずれかと比較して上方制御された。単細胞解析は、これらの遺伝子の発現における細胞間変動は、プライム型ｈＥＳ細胞におけるものよりもｈＥＰＳ細胞において低い（示されていないデータ）ことを示し、ｈＥＰＳ細胞における胚外遺伝子発現の増大は、細胞のサブセットから生じないことを示唆し、ＥＰＳ細胞が安定に維持されることを示す。さらに、ｈＥＰＳ細胞における代表的な胚外マーカー（ＣＯＸ２、ＥＯＭＥＳおよびＳＯＸ１７）の発現は、ｍＲＮＡレベルでｈＥＰＳ細胞に由来する分化細胞におけるこれらのマーカーの発現よりも数桁低かったが（ＣＤＸ２、３０倍低い；ＥＯＭＥＳ、６０倍低い；ＳＯＸ１７、４１倍低い）（図２Ｄ）、これは、タンパク質レベルでは免疫蛍光を使用して検出され得なかった（示されていないデータ）。したがって、これらのデータは、胚外遺伝子のｍＲＮＡ基礎活性は、ｈＥＰＳ細胞において上方制御されることを示す。ｈＥＰＳ細胞における多能性マーカー遺伝子発現をさらに解析した。免疫蛍光解析は、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧおよびＳＯＸ２などの多能性マーカー遺伝子がｈＥＰＳ細胞において発現されたことを示した（示されていないデータ）。しかし、ｈＥＰＳ細胞では、プライム型ｈＥＳおよびナイーブ型ＮＨＳＭ−ｈＥＳ細胞と比較して、ＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ４およびＵＴＦ１などのいくつかの多能性遺伝子は下方制御された（図３Ａ〜３Ｃ）。一方、ＴＢＸ３およびＧＢＸ２などのその他の多能性遺伝子は、上方制御された（図３Ａ〜３Ｃおよび示されていないデータ）。特に、ＯＣＴ４、ＲＥＸ１、ＤＰＰＡ３、ＴＢＸ３およびＧＢＸ２を含むいくつかの多能性マーカー遺伝子のｍＲＮＡ発現は、プライム型ｈＥＳ細胞におけるものよりもｈＥＰＳ細胞においてより均質であった（図３Ｄ〜３Ｅ）。総合すると、これらのデータは、ｈＥＰＳ細胞が、プライム型ｈＥＳまたはナイーブ型ＮＨＳＭ−ｈＥＳ細胞と比較していくつかの独特の分子特徴を有することを示唆する。
【０１９５】
ｈＥＰＳ細胞のエピジェネティック特徴を、次いで、それぞれ、クロマチンの活性および阻害性エピジェネティック状態を表すＨ３Ｋ４ｍｅ３およびＨ３Ｋ２７ｍｅ３マークのゲノムワイド分布を解析することによって調べた。プライム型ｈＥＳ細胞と比較して、ｈＥＰＳ細胞は、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３およびＨ３Ｋ４ｍｅ３レベルの全体的な低減を示した（図４Ａ〜４Ｂ）。特に、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３の低減は、ＣＤＸ２、ＧＡＴＡ４、ＧＡＴＡ６およびＥＯＭＥＳなどの胚外マーカーのゲノム遺伝子座において観察され（示されていないデータ）、これは、胚外遺伝子の基礎ｍＲＮＡ活性の上方制御と一致する。一方、ＧＢＸ２、ＴＢＸ３およびＬＩＦＲを含むいくつかのナイーブ型多能性関連遺伝子は、ｈＥＰＳ細胞におけるＨ３Ｋ４ｍｅ３の増大およびＨ３Ｋ２７ｍｅ３の低減を示した（示されていないデータ）。興味深いことに、これまでの研究は、ナイーブ型ＮＨＳＭ−ｈＥＳ細胞がまた、プライム型ｈＥＳ細胞と比較してＨ３Ｋ４ｍｅ３およびＨ３Ｋ２７ｍｅ３レベル両方の全体的な低減を示すことを示した（Ｇａｆｎｉら、Ｎａｔｕｒｅ、第５０４巻（７４７９号）：２８２〜６頁（２０１３年））。したがって、ナイーブ型ＮＨＳＭ−ｈＥＳ細胞と同様に、ｈＥＰＳ細胞は、阻害性および活性エピジェネティック目印の両方を全体的に低減する傾向を示し、これは、ｈＥＰＳ細胞のエピジェネティック状態を、プライム型ｈＥＳ細胞のものと区別する。
【０１９６】
プライム型ｈＥＳ細胞と比較した場合に、ｈＥＰＳ細胞は、ウエスタンブロット解析を使用してＧＰ１３０、ＳＴＡＴ３および−ｐ−ＳＴＡＴ３のレベル、タンパク質レベルを測定することによって決定されるＬＩＦシグナル伝達の活性化を示した。データは、プライム型ｈＥＰＳと比較した場合に、ｈＥＰＳ細胞におけるこれらのタンパク質レベルの上方制御を示した。さらに、ウエスタンブロット解析によって決定されるように（示されていないデータ）、ｈＥＰＳ細胞においてＧＳＫ３βリン酸化が低下した。
【０１９７】
ＬＣＤＭ細胞の誘導が種特異的であるか否かを調べるために、マウス（ｍＥＰＳ）、ラットおよびブタにおいてＬＣＤＭ細胞がまた確立され得るか否かを調べるための実験を実施した。マウスＬＣＤＭ細胞を、ＬＣＤＭ条件を使用して胚盤胞から成功裏に確立した（示されていないデータ）。ラットおよびブタからもＬＣＤＭ細胞を成功裏に確立した（示されていないデータ）。多能性マーカーの解析は、マウス由来のＬＣＤＭ細胞が、ＮＡＮＯＧ、ＫＬＦ４、ＳＡＬＬ４およびＳＯＸ２などの多能性マーカー遺伝子を発現した、ブタ由来のＬＣＤＭ細胞は、ＳＯＸ２、ＲＥＸ１およびＯＣＴ４を発現した（示されていないデータ）ことを示す。これらの細胞は、３種の胚性胚葉すべてを作り出す能力を示し（示されていないデータ）、正常な核型を維持した（示されていないデータ）。さらに、マウスＬＣＤＭ細胞はまた、生殖細胞系列伝達を有するキメラを作り出し、四倍体補完法によってマウス作製を可能にした（示されていないデータ）。
【０１９８】
キメラアッセイを使用してマウスＬＣＤＭ細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ発達の潜在力を調べながら、胚性（Ｅｍ）組織に加えて、ＬＣＤＭ−ｍＥＳ由来細胞の、胎盤および卵黄嚢などの胚外（ＥｘＥｍ）組織への組込みが観察された（２４／６０の回収されたＥ１２．５受胎産物）（示されていないデータ）。これは、胚性キメラ化（３１／７８の回収された胚）（示されていないデータおよび図４Ｆ）および卵黄嚢中に組み込むが、胎盤に寄与できない能力（０／７８の回収された受胎産物）を示したｍＥＳ細胞とは対照的であり、結果は、これまでの報告と一致する（Ｂｅｄｄｉｎｇｔｏｎら、Ｄｅｖ．、第１０５巻：７３３〜７３７頁（１９８９年））。これらの結果は、ＬＣＤＭ−ｍＥＳ細胞が、ＥｘＥｍ系統への拡張された発達潜在力を獲得した可能性があることを示唆し、以下、本発明者らは、それらを拡張された多能性幹細胞またはＥＰＳ細胞と呼ぶ。
【０１９９】
ｍＥＰＳ細胞の発達潜在力を明白に実証するために、高度にストリンジェントなアッセイを使用して、単一ドナー細胞のキメラ形成能を調べた。この目的で、単一蛍光標識ｍＥＰＳ細胞を８細胞期マウス胚中に注入し、ｉｎ−ｖｉｔｒｏ培養の６０時間後にそのキメラ寄与を調べた。特に、回収された胚盤胞の３３．２％（８６／２５９）が、キメラ胚盤胞における単一ｍＥＰＳ細胞の、栄養外胚葉（ＴＥ）および内部細胞塊（ＩＣＭ）両方への同時分化を示し（図４Ｇおよび表６）、これは、ｔｄＴｏｍａｔｏの、胚盤胞の外層におけるＴＥマーカーＣＤＸ２またはＧＡＴＡ３との、およびＩＣＭにおける多能性マーカーＯＣＴ４またはＮＡＮＯＧとの同時発現によって証明された（示されていないデータ）。
【０２００】
【表４】
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【０２０１】
一貫して、単一ｍＥＳ誘導体は、ＴＥおよびＩＣＭの両方に寄与しなかった（０／１３８の回収された胚盤胞）。
【０２０２】
Ｅ１０．５、Ｅ１２．５およびＥ１７．５を含む、着床前段階を越えた単一ｍＥＰＳ由来キメラ受胎産物を、別個の実験で解析し、Ｅ１０．５（２１／９０の回収された受胎産物）およびＥ１２．５（１０／６３の回収された受胎産物）受胎産物においてＥｍおよびＥｘＥｍ組織の両方における単一ドナーｍＥＰＳ細胞誘導体の組込みが観察された（表８）。
【０２０３】
【表５】
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【０２０４】
総合すると、これらの結果は、ＬＣＤＭ条件はまた、マウスにおいてＥＰＳ細胞の確立を支持することを示す。
【０２０５】
単一ｍＥＰＳ細胞の胚盤胞誘導体を機能的に評価するために、次いで、ＥＳおよび栄養膜細胞幹（ＴＳ）細胞誘導（Ｔａｎａｋａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２８２巻：２０７２〜２０７５頁（１９９８年））を試験した。この目的で、ＥＳおよびＴＳ細胞株を同時に誘導するために、ｍＥＰＳ由来細胞のＴＥおよびＩＣＭ両方への寄与を有するキメラ胚を使用した。単一ｍＥＰＳ由来細胞のＴＥおよびＩＣＭの両方への寄与を有するキメラ胚盤胞を播種し、２ｉおよびＴＳ培地（上記の方法において論じられたような）中にさらに継代し、これは、Ｔｄｔｏｍａｔｏ＋  ｍＥＰＳ由来ＥＳ（ＥＰＳ−ＥＳ）およびＴＳ（ＥＰＳ−ＴＳ）コロニーを同時に誘導することを成功裏に支持した。同一キメラ胚盤胞からＥＳ（ＥＰＳ−ＥＳ）およびＴＳ（ＥＰＳ−ＴＳ）細胞療法が誘導され得る（示されていないデータおよび表９）。
【０２０６】
【表６】
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【０２０７】
対照として、複数のＴｄｔｏｍａｔｏ＋  ｍＥＳ細胞が注入された８細胞胚から発達したキメラ胚盤胞から、ｍＥＳ細胞株（２ｉ−ＥＳ）も確立された（示されていないデータ）。１０〜１５個のＴｄｔｏｍａｔｏ標識されたｍＥＳ細胞を、１つのマウス８細胞胚中に微量注入し、さらに６０時間培養した。キメラ胚を、それぞれ、ＥＳまたはＴＳ誘導培地中に播種した。ｍＥＰＳ細胞とは対照的に、ｍＥＳ細胞が注入された８細胞胚から誘導された胚盤胞を使用して、Ｔｄｔｏｍａｔｏ＋  ＴＳ様コロニーは確立され得なかった（０／４８）。ＥＳ（２ｉ−ＥＳ）細胞のみが誘導され得た（示されていないデータ）。
【０２０８】
ＥＰＳ−ＥＳ細胞は、多能性マーカーＯＣＴ４およびＮＡＮＯＧを発現したが、ＴＳマーカーＣＤＸ２およびＥＯＭＥＳを発現しなかった（示されていないデータ）；ＥＰＳ−ＥＳ細胞もまた、ＳＯＸ２を発現した。ＥＰＳ−ＥＳ細胞は、胚盤胞のＩＣＭにのみ寄与し（示されていないデータ）、キメラ胚において胚性組織を生じさせたが、胎盤を生じさせなかった（示されていないデータ）。他方、ＥＰＳ−ＴＳ細胞は、通常のＴＳマーカー（ＥＯＭＥＳおよびＣＤＸ２）を発現したが、多能性マーカーＯＣＴ４およびＮＡＮＯＧは発現しなかった（示されていないデータ）。ＥＰＳ−ＴＳはまた、ＳＯＸ２も発現した。ＥＰＳ−ＴＳ細胞は、胚盤胞中のＴＥ層中にのみ組み込まれ（示されていないデータ）、もっぱら、キメラ胚中の胎盤組織にのみ寄与した（示されていないデータ）。
【０２０９】
ＥＰＳ細胞が、ＴＳ培地においてＴＳ細胞に直接変換され得る可能性を排除するために、ｍＥＰＳ細胞をＴＳ培地中で３継代の間培養し、ＴＳマーカーのレベルを調べた。ＬＣＤＭ条件（ＴＴ２−６  ｐ０およびｍｃ６−１  ｐ０）で培養されたｍＥＰＳ細胞または２ｉ条件（ＴＴ２−２ｉ  ｐ０およびｍｃ２ｉ−１  ｐ０）で培養されたｍＥＳ細胞を、別個に対照として使用した。データは、ＴＳ培養されたｍＥＰＳ細胞が、ＴＳマーカーを上方制御せず（図５Ａおよび示されていないデータ）、ＮＡＮＯＧ発現を依然として維持した（示されていないデータ）ことを示す。これらの結果は、ＥＰＳ−ＴＳは、直接変換によってよりもＥＰＳから分化したＴＳ細胞に由来するという結論を支持する。まとめて、これらのデータは、着床前マウス発達の間の単一ｍＥＰＳ細胞のＩＣＭおよびＴＥ系統の両方への発達潜在力を実証する。
【０２１０】
ＦＡＣＳ解析によって、Ｅ１０．５キメラ胚、卵黄嚢および胎盤中の単一ｍＥＰＳ由来細胞の幅広く広がった組込みをさらに確認した（表１０）。
【０２１１】
【表７】
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【０２１２】
一方、単一ｍＥＳ細胞の注入によって作製されたＥ１０．５キメラは得られなかった（０／４４の回収された胚）（表８）。特に、単一ｍＥＰＳ由来細胞は、キメラ胚盤の栄養膜細胞層中に組み込まれ、栄養膜細胞マーカーＣＫ８を発現した（示されていないデータ）。これらの細胞はまた、栄養膜細胞巨大細胞（ＴＧＣ）および海綿状栄養膜細胞の層中に観察され、ＴＧＣマーカーＰＬＦ（ＰＲＯＬＩＦＥＲＩＮ）および海綿状栄養膜細胞マーカーＴＰＢＰＡをそれぞれ発現した（示されていないデータ）。単一ｍＥＰＳ由来細胞はまた、妊娠後期Ｅ１７．５受胎産物においてＥｍおよびＥｘＥｍ組織の両方をキメラ化し（１３／９４の回収された受胎産物）（示されていないデータおよび表８）、Ｅ１７．５キメラ胚盤に寄与した単一ｍＥＰＳ細胞誘導体のパーセンテージは、最大１９％であり得る（示されていないデータ）。栄養膜細胞の最も顕著な機能的特徴の１つは、脱落膜化子宮に浸潤するその能力であるので、単一ＥＰＳ由来栄養膜細胞の機能性をさらに評価するために、ｔｒａｎｓｗｅｌｌベースの浸潤アッセイを使用してその浸潤能力を試験した（図５Ｂ）。栄養膜細胞マーカーＣＫ８またはＣＫ７を発現したＴｄｔｏｍａｔｏ＋単一ｍＥＰＳ由来胎盤細胞は、膜孔を通って遊走し、膜の底表面に到達でき（示されていないデータ）、その浸潤性を強調する。さらに、複数の栄養膜細胞マーカーのｍＲＮＡ発現は、ｍＥＰＳ細胞と比較した場合にｍＥＰＳ由来胎盤細胞において有意に上方制御された（図５Ｃ）。
【０２１３】
さらなる実験によって、単一ｍＥＰＳ由来出生直後キメラマウスを得ることが可能であるか否かを試験し、これは、本物の多能性を実証するための至適基準と見なされる（Ｄｅ  Ｌｏｓ  Ａｎｇｅｌｅｓ、Ｎａｔｕｒｅ、第５２５巻：５６９〜４７８頁（２０１５年））。８７匹の生まれた子のうち、４３匹の単一ｍＥＰＳ由来キメラ（４９．４％）が得られ、そのうち２４匹が、毛色によって判断されるような高度のキメラ化を示した（示されていないデータおよび表１１）。
【０２１４】
【表８】
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【０２１５】
総合すると、これらのデータは、ＥＰＳ細胞の本物の多能性および単細胞レベルでＥｍおよびＥｘＥｍ系統の両方に対するそのキメラ適格性を実証する。
【０２１６】
ｍＥＰＳ細胞のキメラ形成能は、ｈＥＰＳ細胞がまた、種間ヒト−マウス受胎産物を作り出すことができるか否かを調べるためのさらなる実験につながった。単一蛍光標識ｈＥＰＳ細胞を８細胞期マウス胚中に注入し（示されていないデータ）、ＴＥ（ＣＤＸ２、ＧＡＴＡ３）およびＩＣＭ（ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ）マーカーを用いる同時染色によってｉｎ−ｖｉｔｒｏ培養の６０時間後にそのキメラ寄与を調べた。結果は、単一ｈＥＰＳ細胞の、キメラ胚盤胞においてそれぞれＴＥまたはＩＣＭマーカーを発現する細胞への同時分化を示した（５１／３４５の回収された胚、１４．７％）（示されていないデータ、表１２〜１５）。対照として、プライム型ｈＰＳＣは、単細胞注入後にキメラ胚盤胞を形成できず（０／１４３の回収された胚）（示されていないデータ、表１２、１３ａ、１３ｂおよび１３ｃ）、これは、これまでに報告された霊長類プライム型ＰＳＣの不十分なキメラ化と一致する（Ｇａｆｎｉら、Ｎａｔｕｒｅ、第５０４巻：２８２〜（２０１３年）；Ｔａｃｈｉｂａｎａら、Ｃｅｌｌ、第１４８巻：２８５〜２９５頁（２０１２年）；Ｊａｍｅｓら、Ｄｅｖ．  Ｂｉｏｌ．、第２９５巻：９０〜１０２頁（２００６年））。
【０２１７】
【表９】
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【０２１８】
【表１０】
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【０２１９】
【表１１】
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【０２２０】
【表１２】
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【０２２１】
着床後Ｅ１０．５マウス受胎産物におけるｈＥＰＳ細胞のキメラ適格性も調べた。抗ヒト核（ｈＮ）抗体を用いる免疫染色によって、または蛍光標識されたｈＥＰＳ細胞からの蛍光シグナルの検出によってマウス受胎産物におけるヒト細胞の存在を同定した。ｈＥＰＳ細胞を有するＥ１０．５胚において種間キメラ化が観察されたが、プライム型ｈＰＳＣ（示されていないデータ）または注入されていない対照（示されていないデータ）を用いる場合には観察されなかった。４４の回収されたキメラＥ１０．５受胎産物の中で、１７受胎産物（３８．６％）が、胚性および胚外組織の両方へのヒト細胞の組込みを示した（図１Ｂ）。
【０２２２】
キメラ胚中のｈＥＰＳ誘導体は、多能性マーカーＮＡＮＯＧの発現を失い（示されていないデータ）、ＳＯＸ２、ＧＡＴＡ４およびＦＯＸＡ２を含む適当な系統特異的マーカーを発現した（示されていないデータ）。興味深いことに、ｈＥＰＳ由来細胞の胎盤および卵黄嚢などのＥｘＥｍ組織への組込みも観察された（示されていないデータ）。ヒトおよびマウス胚盤は構造的に異なっているので、これは予期しないことであり、期外発生のおよび／または分岐した胎盤発達プログラムの結果としてである可能性が高い（Ｒｏｓｓａｎｔら、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎ．、第２巻：５３８〜５４８頁（２００１年））。これらの細胞は、栄養膜細胞層中に組み込まれるとわかり、栄養膜細胞マーカーＣＫ８を発現した（示されていないデータ）。さらに、ｈＥＰＳ細胞に由来する奇形腫においても検出されるように（示されていないデータ）、これらの細胞では、別のヒト栄養膜細胞特異的マーカーｈＣＧβの発現も観察された（示されていないデータ）。対照的に、プライム型ｈＰＳＣが注入されたマウス胎盤におけるヒト細胞の存在は、観察されなかった（示されていないデータ）。
【０２２３】
種間キメラ化をさらに確認するために、高度に高感度のミトコンドリアＰＣＲアッセイを使用して、ヒト−マウスキメラ受胎産物におけるヒトＥＰＳ細胞の寄与の程度を定量的に解析した（Ｔｈｅｕｓｅｎら、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ、ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｓｔｅｍ．２０１６．０６．１１）。特に、回収されたｈＥＰＳ由来マウス胚の３５．５％（４２／１１８の回収された胚）は、ヒト細胞を含有していた（１０，０００個のマウス細胞中の１個のヒト細胞を閾値として使用した）。ヒト細胞のパーセンテージは変動し、いくつかの場合には、１％超に達した（図５Ｄおよび表１２ａ〜１２ｃ）。さらに、回収されたｈＥＰＳ由来マウス胚盤の１７．６％（２４／１３６の回収された胚盤）が、ヒト細胞寄与を示し（図５Ｅおよび表１２ａ〜１２ｃ）、そのパーセンテージは、０．１％超に到達し得る。５４の解析されたマウス受胎産物の中で、９（１６．６％）は、ｈＥＰＳ誘導体の、マウス胚および胚盤の両方への二重寄与を示した（表１２ａ〜１２ｃ）。対照として、プライム型ｈＰＳＣは、マウス胚または胎盤への寄与を示さなかった（０／５４の解析したマウス受胎産物）（表１２ａ〜１２ｃ）。ｍＥＰＳ細胞と比較して、マウス受胎産物におけるｈＥＰＳ細胞のキメラ効率は、依然として制限されており、これは、幾分かは、発達における種特異的相違に起因し得る（Ｍａｌａｓｓｉｅら、Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｐｒｏｄ．Ｕｐｄａｔｅ、第９巻：５３１〜５３９頁（２００３年））。これらのデータは、ｈＥＰＳ細胞が、種間キメラ適格性を示し、ｉｎ  ｖｉｖｏで栄養膜細胞運命を選び得ることを示す。
【０２２４】
ＥＰＳ細胞の分子特徴を特性決定するために、ｍＥＰＳ細胞、ｍＥＳ細胞、２Ｃ様ｍＥＳ亜集団（Ｍａｃｆａｒｌａｎら、Ｎａｔｕｒｅ、第４８７巻：５７〜６３頁（２０１１年）、ならびにエピブラスト幹細胞（Ｎａｊｍら、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ、第８巻：３１８〜３２５頁（２０１１年））のトランスクリプトームを評価した。主成分分析は、その他の細胞種とは異なるｍＥＰＳ細胞の全体的な遺伝子発現パターンを示した（図６ａ）。同様に、ｈＥＰＳ細胞はまた、ナイーブ型ｈＰＳＣ（Ｔａｋａｓｈｉｍａら、Ｃｅｌｌ、第１５８巻：１２５４〜１２６９頁（２０１４年）；Ｃｈａｎら、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ、第１３巻：６６３〜６７５頁（２０１３年）；Ｔｈｅｕｎｉｓｓｅｎら、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ、第１５巻：４７１〜４８７頁（２０１４年）；およびＧａｆｎｉら、Ｎａｔｕｒｅ、第５０４巻：２８２頁（２０１３年））およびプライム型ｈＰＳＣに対して別個のトランスクリプトームの特徴を示した（図６ｂ）。さらなる実験によって、ｍＥＰＳおよびｍＥＳ細胞間で異なって発現された遺伝子、２種の別個の遺伝子モジュール（モジュールＡおよびＢ）が、ｍＥＰＳ細胞において上方制御された遺伝子よりも目立つか否かを調べた（示されていないデータ）。早期着床前発達から得たマウス胚性細胞と比較して（Ｔａｎｇら、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ、第６巻：ｅ２１２０８（２０１１年）、モジュールＡは、ｍＥＰＳ細胞において独自に提示され、その機能は、クロマチン組織化および転写制御と関与している。特に、モジュールＢに由来する遺伝子はまた、２細胞期の胚性細胞において発現された（示されていないデータ）。興味深いことに、モジュールＢに由来する遺伝子の発現レベルは、２細胞期から胚盤胞期へと徐々に下方制御された。
【０２２５】
同様の解析を実施することによって、プライム型ｈＰＳＣ（示されていないデータ）と比較してｈＥＰＳ細胞において上方制御された遺伝子の中から２種の遺伝子モジュール（モジュールＣおよびＤと呼ばれる）を同定した。モジュールＡと同様に、モジュールＣに由来する遺伝子は、クロマチン組織化および転写制御と関与しており、そのうち相当な数が、調べたナイーブ型ｈＰＳＣの間で共有されていた。特に、ＧＢＸ２（Ｇａｓｔｒｕｌａｔｉｏｎ  Ｂｒａｉｎ  Ｈｏｍｅｏｂｏｘ２（原腸形成脳ホメオボックス２））、ＨＯＸＡ１（ホメオボックスＡ１）、ＭＩＸＬ１（Ｍｉｘ１ホメオボックス様１）およびＤＥＲＡ（デオキシリボースリン酸アルドラーゼ）（示されていないデータ）遺伝子などのモジュールＤに由来する相当な数の遺伝子はまた、卵母細胞から桑実胚期までヒト胚性細胞において見出された（Ｙａｎら、Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、第２０巻：１１３１〜１１３９頁２０１３年）。さらなる解析は、ＣＨＤ７（クロモドメインヘリカーゼＤＮＡ結合タンパク質７））、ＣＨＤ４（クロモドメインヘリカーゼＤＮＡ結合タンパク質４）、ＭＩＸＬ１およびＬＥＦ１（リンパ球エンハンサー結合因子１）（示されていないデータ）などの、もっぱらｈＥＰＳ細胞において上方制御され、その他のｈＰＳＣ種では上方制御されなかったモジュールＥの同定につながった。興味深いことに、ＧＯ解析は、モジュールＥに由来する遺伝子は、転写物制御および細胞周期などの生物学的プロセスに関与していることを示し、これもまた、卵母細胞から４細胞（４Ｃ）期までヒト胚性細胞を特徴付ける（Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、第２０巻：１１３１〜１１３９頁２０１３年））。まとめて、これらのデータは、ＥＰＳ細胞が、既知ＰＳＣ種とは異なる独特の分子的特徴を有することを示唆する。
【０２２６】
最後に、ＥＰＳ細胞の維持におけるＤｉＭおよびＭｉＨの役割を調べた。ＤｉＭまたはＭｉＨのいずれかの退薬は、プレーティング後数日内のｈＥＰＳ細胞の迅速な分化につながり（示されていないデータ）、ｈＥＰＳ細胞の維持にとって両小分子が必要であることを示唆した。ＤｉＭまたはＭｉＨのいずれかの退薬はまた、キメラ胚盤胞におけるｍＥＰＳ細胞の発達潜在力を大幅に損なった（図６Ｃ、示されていないデータ）ＤｉＭは、ヒスタミンおよびムスカリン性受容体を含むＧタンパク質共役受容体を阻害すると報告されており（Ｐｆａｆｆら、Ｅｕｒ．Ｊ．、Ｐｈａｍａｃｏｌ．、２８６−２２９−２４０（１９９５年））、ＭｉＨは、ＰＡＲＰ１を阻害すると知られている（Ａｌａｎｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．，Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ  Ｓ  Ａ、第１０３巻：９６８５〜９６９０頁（２００６年））。特に、ＤｉＭまたはＭｉＨは、ｈＥＰＳ細胞の維持のための同一標的を標的とするその他の阻害剤（トリペレナミンＨＣＬ；デスロラタジン；またはニコチンアミド；ＢＳＩ−２０１（４−ヨード−３−ニトロベンズアミド））と置換され得る（示されていないデータ）。実際、ＤｉＭの、ヒスタミン受容体およびムスカリン性受容体の両方を標的とする阻害剤との置換は、ｈＥＰＳ細胞の形態学および増殖を支えるだけでなく（示されていないデータ）、ＧＢＸ２、ＴＢＸ３、ＣＤＸ２およびＧＡＴＡ６などのｈＥＰＳ細胞において上方制御された遺伝子の発現を維持した（図４Ｃ）。ＭｉＨの、その他のＰＡＲＰ１阻害剤との置換もまた、ｈＥＰＳ増殖およびｈＥＰＳ細胞において上方制御されたマーカー遺伝子を維持した（示されていないデータおよび図４Ｄ）。さらに、ＭｉＨが、ｈＥＰＳ細胞におけるＰＡＲＰ１のノックダウンによって置換された場合に同様の結果が得られた（図４Ｅ）。重要なことに、ｍＥＰＳおよびｈＥＰＳ細胞の両方は、このような条件下で胚盤胞においてＴＥおよびＩＣＭの両方に寄与するその能力を依然として保持していた（図６Ｃ、６Ｄおよび示されていないデータ）。
【０２２７】
次いで、ＥＰＳ細胞においてＤｉＭおよびＭｉＨによって制御される分子標的を調べた。ＭＡＰＫシグナル伝達は、ヒスタミンおよびムスカリン性受容体シグナル伝達の主要な下流であると報告されており（Ｍｏｒｓｅら、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．第２９６巻：１０５８〜１０６６頁（２００１年）およびＯｃｋｅｎｇａら、Ｇｅｎｅｓ（ｂａｓｅｌ）、第４巻：１７１〜７９頁（２０１３年））、ｍＥＰＳおよびｈＥＰＳ細胞の両方においてＭＡＰＫシグナル伝達活性の下方制御が観察された（図７Ａ〜Ｂ）。しかし、ＤｉＭの、ＭＡＰＫシグナル伝達を標的とする阻害剤（ＰＤ０３２５９０１；ＳＢ２０３５８０；ＳＰ６００１２５）との置換は、ｈＥＰＳ細胞を維持できず（示されていないデータ）、ｍＥＰＳ細胞の発達潜在力を保つことができなかった（図６Ｃおよび示されていないデータ）。ＭｉＨの役割をさらに調べるために、Ｐａｒｐ１、ＭｉＨの提案される分子標的を、ｍＥＰＳ細胞株においてノックアウトした（図７Ｃ〜Ｇ）。重要なことに、Ｐａｒｐ１欠損ｍＥＰＳ細胞は、ＭｉＨの不在下でさえ、ＴＥおよびＩＣＭ両方に依然として分化できた（図６Ｃ）。種々の条件下で培養された細胞のキメラ解析のまとめが、表１４に示されている。
【０２２８】
【表１３】
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【０２２９】
これらの結果は、Ｐａｒｐ１が、ＥＰＳ発達潜在力の維持における重要なレギュレーターであることを示唆する。
【０２３０】
これらの研究は、多能性幹細胞の発達潜在力が、胚性および胚外系統の両方に拡張され得るという原理の証明の証拠を提供する。報告された、マウスにおける胚外潜在力を有する不安定な多能性集団とは異なり（Ｍａｃｆａｒｌａｎら、Ｎａｔｕｒｅ、第４８７巻：５７〜６３頁（２０１２年）；Ｍｏｒｇａｎｉら、Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．、第３巻：１９４５〜４９５７頁（２０１２年）；およびＡｂａｄら、Ｎａｔｕｒｅ、第５０２巻：３４０〜３４５頁（２０１３年）、ＥＰＳ細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、その胚性および胚外発達潜在力を維持しながら長期間維持され得る。ＥＰＳ細胞はまた、伝統的な多能性幹細胞を上回るいくつかの潜在的な利点を有する新規幹細胞資源に相当する。３４年前に最初のマウスＥＳ細胞株が確立されたが（Ｅｖａｎｓら、Ｎａｔｕｒｅ、第２９２巻：１５４〜１５６頁（１９８１年）；およびＭａｒｔｉｎら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ、第７８巻：７６３４〜７６３８頁（１９８１年））、その他の哺乳動物に由来するキメラ能力を有する多能性幹細胞の誘導は、依然として大きな課題である。種々の哺乳類種において多能性幹細胞を確立するための頑強な方法は、依然としてほとんどない。ＥＰＳ細胞は、同一培養条件を使用して種々の哺乳類種で作り出され得、これは、哺乳動物の間でのこの新規細胞状態の保存を示唆する。したがって、ＥＰＳ細胞の発見は、哺乳動物において拡張された発達潜在力を有する幹細胞を頑強に確立する１つの普遍的な方法を開発する機会を提供する。さらに、ＥＰＳ細胞の種間キメラ適格性は、それらを、異種間キメラ化および哺乳類早期発達を研究するために特に価値のあるものにする。最後に、ＥＰＳ細胞はまた、疾患モデリング、創薬および再生医療のための機能的細胞の作製のための新規細胞資源を提供する。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図４Ｇ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図７Ｇ】
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