(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のステップを含む、サンプル内のＶδ２−ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞を増殖する方法：
（１）インターロイキン４、およびＴ細胞マイトージェンを含む第１の培地中のサンプル中の細胞を、インターロイキン１５、インターロイキン−２およびインターロイキン−７の非存在下で培養すること；および
（２）インターロイキン４の非存在下で、インターロイキン１５、インターロイキン−２およびインターロイキン−７から選択される成長因子およびＴ細胞マイトージェンを含む第２の培地中で、ステップ（１）で得られた細胞を培養すること。
【請求項２】
前記ステップ（２）で使用される成長因子が、インターロイキン１５である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
第１または第２の培地、または両方の培地が、さらに第２の成長因子を含み、好ましくは該第２の成長因子がインターフェロン−γまたはそのミメティック、または機能的な等価物である、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
第１または第２の培地、または両方の培地が、さらに第２および第３の成長因子を含み、好ましくは該第３の成長因子がインターフェロン−γ、インターロイキン−２１、またはそれらのミメティック、または機能的な等価物である、請求項１または２記載の方法。
【請求項５】
第１または第２の培地、または両方の培地が、さらに第２、第３および第４の成長因子を含み、好ましくは該第４の成長因子がインターフェロン−γ、インターロイキン−２１、インターロイキン−１β、またはそれらのミメティック、または機能的な等価物である、請求項１または２記載の方法。
【請求項６】
第１または第２の培地、または両方の培地が、さらにＶδ２−ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞の共刺激性分子を含み、好ましくは該共刺激性分子が、ＳＬＡＭレセプターの分子リガンドまたはアゴニスト、またはＣＤ２７レセプターの分子リガンドまたはアゴニスト、またはＣＤ７レセプターの分子リガンドまたはアゴニストのいずれかである、請求項１または２記載の方法。
【請求項７】
第１および第２の培地がさらに血清または血漿を含む、請求項１から６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
ステップ（１）に先立って、サンプル中の細胞のＴ細胞が富化される、請求項１から７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
ステップ（１）に先立って、サンプル中の細胞のＴＣＲγδ＋Ｔ細胞が富化される、請求項１から８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
ステップ（１）に先立って、サンプル中の細胞のＴＣＲαβ＋Ｔ細胞を消耗させる、請求項１から９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
ステップ（１）に先立って、サンプル中の細胞のＴＣＲαβ＋Ｔ細胞を最初に消耗させ、次にＣＤ３＋細胞が富化される、請求項１から１０のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
ステップ（１）に先立って、サンプル中の細胞の非ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞を消耗させる、請求項１から１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
サンプルが血液または組織またはそのフラクションであり、好ましくはサンプルが、末梢血、臍帯血、リンパ組織、上皮、胸腺、骨髄、ひ臓、肝臓、ガン組織、感染した組織、リンパ節組織またはそのフラクションから選ばれ、より好ましくは出発サンプルが人間の末梢血またはそのフラクションである、請求項１から１２のいずれか１項記載の方法。
【請求項１４】
サンプルが低密度単核細胞（ＬＤＭＣ）または末梢血単核細胞（ＰＢＭＣｓ）から成る、請求項１から１３のいずれか１項記載の方法。
【請求項１５】
第１の培地中に、Ｔ細胞マイトージェンが約１０から約５０００ナノグラム／ｍｌの量で存在し、インターロイキン４が約１から約１０００ナノグラム／ｍｌの量で存在し、好ましくは第１の培地中に、Ｔ細胞マイトージェンが約２０から約２０００ナノグラム／ｍｌの量で存在し、インターロイキン４が約５から約５００ナノグラム／ｍｌの量で存在し、より好ましくは第１の培地中に、Ｔ細胞マイトージェンが約５０から約１０００ナノグラム／ｍｌの量で存在し、インターロイキン４が約２０から約２００ナノグラム／ｍｌの量で存在し、さらに好ましくは第１の培地が、Ｔ細胞マイトージェンを７０ナノグラム／ｍｌで含み、インターロイキン４を１００ナノグラム／ｍｌで含む、請求項１から１４のいずれか１項記載の方法。
【請求項１６】
第２の培地中に、Ｔ細胞マイトージェンが約０．１から約５０μｇ／ｍｌの量、およびインターロイキン１５が約１から約１０００ナノグラム／ｍｌの量で存在し、好ましくは第２の培地中に、Ｔ細胞マイトージェンが約０．３から約１０μｇ／ｍｌの量、およびインターロイキン１５が約２から約５００ナノグラム／ｍｌの量で存在し、より好ましくは第２の培地中に、Ｔ細胞マイトージェンが約０．５から約５μｇ／ｍｌの量、およびインターロイキン１５が約２０から約２００ナノグラム／ｍｌの量で存在し、さらに好ましくは第２の培地が、Ｔ細胞マイトージェンを１μｇ／ｍｌで含み、およびインターロイキン１５を７０ナノグラム／ｍｌの量で含む、請求項１から１５のいずれか１項記載の方法。
【請求項１７】
第１または第２の培地、または両方の培地中に、インターフェロン−γ−様活性を有する成長因子が約１から約１０００ナノグラム／ｍｌの量で存在し、インターロイキン−１β−様活性を有する成長因子およびインターロイキン−２１−様活性を有する成長因子が１から約５００ナノグラム／ｍｌの量で存在し、好ましくは第１または第２の培地、または両方の培地中に、インターフェロン−γ−様活性を有する成長因子が約２から約５００ナノグラム／ｍｌの量で存在し、インターロイキン−１β−様活性を有する成長因子およびインターロイキン−２１−様活性を有する成長因子が２から約２００ナノグラム／ｍｌの量で存在し、より好ましくは第１または第２の培地、または両方の培地中に、インターフェロン−γ−様活性を有する成長因子が約２０から約２００ナノグラム／ｍｌの量で存在し、インターロイキン−１β−様活性を有する成長因子およびインターロイキン−２１−様活性を有する成長因子が５から約１００ナノグラム／ｍｌの量で存在し、さらに好ましくは第１または第２の培地、または両方の培地がさらに、インターフェロン−γ−様活性を有する成長因子を７０ナノグラム／ｍｌ、インターロイキン−２１−様活性を有する成長因子をが２から１５ナノグラム／ｍｌ、インターロイキン−１β−様活性を有する成長因子を１５ナノグラム／ｍｌで含む、請求項１から１２のいずれか１項記載の方法。
【請求項１８】
Ｔ細胞マイトージェンが抗体またはそのフラグメントであり、好ましくは抗体がＣＤ３またはそのフラグメントに結合する、請求項１から１７のいずれか１項記載の方法。
【請求項１９】
血清または血漿が約０．５から約２５体積％の量で存在し、好ましくは血清または血漿が約２から約２０体積％の量で存在し、より好ましくは血清または血漿が約２．５から約１０体積％の量で存在し、さらに好ましくは血清または血漿が約５体積％の量で存在する、請求項７から１８のいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の分野
本発明は、Ｖδ２−ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞の分離および選択的な生体外のエクスパンジョンのための新規な方法およびそれらの臨床応用に関する。
【０００２】
本発明の背景
ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞
有顎脊椎動物の免疫系は、腫瘍細胞を認識および除去することができる様々なリンパ球集団(lymphocyte populations)を含んでいる。それは癌の免疫療法の基礎を構成する。１つの集団は、ガンマ（γ）鎖およびデルタ（δ）鎖の結合によって形成されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の発現により特徴づけられる。ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞（ここでγδＴ細胞と指定される）は人間の末梢血リンパ球（ＰＢＬｓ）の１−１０％を構成できるが、健康な個体の上皮組織の中で本質的に富化され、最大５０％のＴ細胞となる１。ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞は悪性および感染細胞に対する主要組織適合遺伝子複合体（Major Histcoompatibility Complex:MHC)−無制限の細胞毒性を潜在的に有するが、正常細胞および組織には無害である。したがって、それらは感染と腫瘍に対する第１ラインの監視機構と通常考えられる１。人間では、ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞の異なるサブセット（subsets）または亜集団（subpopulations）はそれらのδ鎖をコード化する遺伝子に基づいて、同定され分類される。ほとんどの残りのＴＣＲγδ＋Ｔ細胞が様々なＶγ要素、Ｖγ２、Ｖγ３、Ｖγ４、Ｖγ５またはＶγ８とともにＶδ１鎖を発現する一方、末梢血中のＴＣＲγδ＋Ｔ細胞の約６０−９５％は、Ｖγ９鎖とともにＶδ２鎖を発現する：他の（よりまれな）ヒトＴＣＲγδ＋Ｔ細胞集団はＶδ３、Ｖδ５、Ｖδ６、Ｖδ７およびＶδ８鎖を発現する２−４。
【０００３】
Ｖδ２＋ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞
ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞に基づいた現在の養子免疫療法アプローチは、Ｖδ２＋ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞亜集団（ここでＶδ２＋Ｔ細胞と指定される）に制限されている５，６。ほとんどのＶδ２＋Ｔ細胞は、特異的に非ペプチド・アルキルリン酸エステル塩（たとえばイソペンテニルピロ燐酸（ＩＰＰ））に応答する。それは腫瘍細胞内で異常なレベルまで生産される。個体においては骨を強くするアミノビスフォスフォネート（たとえばゾレドロネートおよびパミドロネート）に暴露される。これらの化合物は、インターロイキン−２と組み合わされた時、Ｖδ２＋Ｔ細胞の増殖および抗腫瘍の細胞毒性の機能を生体外で刺激する。また臨床応用のための清浄化された細胞集団を生成する５−７。しかしながら、現在まで終了した臨床試験は、癌患者における低い割合の奏効を示した８。したがって、現在のγδＴ細胞に基づいた治療は、実現可能で、安全であるが、明白な制限を有している６。
【０００４】
Ｖδ１＋ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞
ヒトＶδ１＋ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞（ここでＶδ１＋Ｔ細胞として指定される）は、すべてのＴＣＲγδ＋  ＰＢＬｓの１−４０％を構成するが、上皮部位（たとえば腸と皮膚）でのメジャーγδＴ細胞集団である。それは臨床試験で評価されていないが、この細胞サブセットはさらに強い抗腫瘍活性を示すことができる。皮膚、結腸、腎臓および肺腫瘍に浸透しているＶδ１＋Ｔ細胞は、自己由来および同種異型の両方の癌細胞に対して細胞毒性だった９−１３。興味深い相関が、ドナー由来の末梢血Ｖδ１＋Ｔ細胞の数の増加と、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）での骨髄移植に続く５−１０の−年無病生存の改善の間に見られた１４。重要なことには、しみこんだＶδ１＋Ｔ細胞は、数年間これらの患者内で生き続けた１４，１５。別のセッティングでは、高いＶδ１＋Ｔ細胞カウントを有する低グレード−非ホジキンリンパ腫患者は、１年の追跡で安定した疾病を経験し、Ｖδ１＋Ｔ細胞のより低いカウントを有する患者と比較され、改善された臨床経過を示した１６。Ｖδ１＋Ｔ細胞の循環も、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）患者１７の中で典型的に増加し１７、低リスクのＢ−ＣＬＬ患者での非進行に関係している１８。最後に、循環Ｖδ１＋Ｔ細胞の量的増加は、腎移植術に続くヒト−サイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）感染と同様にヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）１９およびマラリア２０感染でも観察された４，２１。異なる状況では、しかしながら、Ｖδ１＋Ｔ細胞の亜集団は免疫抑制および調整（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ）特性、治療目的のために発現することができる機能を示す場合がある２２。生体外のＶδ１＋Ｔ細胞が特異的に増殖する少数の方法が述べられてきたが、それらのどれは臨床応用に適していなかった（Ｓｉｅｇｅｒｓ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，２０１４，ｒｅｆ．２２）。Ｍｅｅｈらは、健康なドナーからのＶδ１＋Ｔ細胞がＡＬＬ白血病のブラストに応じて生体外で増殖することを最初に示した２３。Ｋｎｉｇｈｔ，Ａ．と同僚およびＭｅｒｉｍｓ，Ｓ．と同僚は、末梢血Ｖδ１＋Ｔ細胞を分離し、３週間、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）または抗ＣＤ３モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、ＩＬ−２および照射された同種異型（allogeneic）の末梢血単核細胞（peripheral blood mononuclear cells：ＰＢＭＣｓ）が存在する状態でそれらを処理した２４，２５。より最近の研究では、ＰＨＡはインターロイキン７（ＩＬ−７）と共同して使用された２６。Ｓｉｅｇｅｒｓ，Ｇ．らは、ツーステップ培養プロトコルを報告した。ここでソートされたＴＣＲγδ＋Ｔ細胞は、６−８日間コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）、ＩＬ−２およびＩＬ−４で最初に処理され、さらに１０日間、ＩＬ−２およびＩＬ−４で刺激された２７。培養期間の後、Ｖδ１＋Ｔ細胞は５９％増大されて、培養の半分で優勢なサブセット（Ｖδ１＋Ｔ細胞の平均７０％）だった；しかしながら、この方法でＶδ１＋Ｔ細胞の最大の２５倍増加を達成することができるかもしれない２７。この２ステップの培養方法は、国際特許出願第ＰＣＴ／ＣＡ９９／０１０２４（ＷＯ  ００／２６３４７として公表された）にも述べられていた。それらの発明者によれば、継続的な細胞増殖と引き続く有系分裂促進物質の除去について、第２の培地中のＩＬ−２および���Ｌ−４の両方は不可欠だった。このプロトコルの変形がその後開発された。その中でＰＢＭＣｓの合計は、ＣｏｎＡ、ＩＬ−２およびＩＬ−４が存在する状態で最初に６−１３日間培養され、次いで汚染物質ＴＣＲαβ＋Ｔ細胞の磁気消耗をし、さらに１０日間、ＩＬ−２、ＩＬ−４およびＣｏｎＡで残りの細胞を刺激した。２１日後に、Ｖδ１＋Ｔ細胞は１３６から２４，３８４まで増殖した。非常に低い純度レベル（培養中の細胞の３０％未満がＶδ１＋Ｔ細胞だった）であり、ほとんどの汚染物質細胞（細胞の約５５％）がＶδ２＋Ｔ細胞だった２８。最後に、我々のグループは、以前に、白血病細胞株およびＣＬＬ患者新生細胞の改善された死滅を媒介することができる天然細胞毒性レセプター（natural cytotoxicity receptors：ＮＣＲｓ）を発現するＶδ１＋Ｔ細胞が富化された細胞集団を選択的に増殖し分化する方法について記述した２９。この特許の方法は、一般的なγ−鎖サイトカイン（たとえばＩＬ−２またはＩＬ−１５）およびＴＣＲアゴニスト（例えばＰＨＡまたは抗ＣＤ３  ｍＡｂ）で刺激した際に、培地中のＴＣＲγδ＋Ｔ細胞またはその前駆物質の２−３週間の培養からなる（ＷＯ２０１２／１５６９５８として公表された国際特許出願第ＰＣＴ／ＩＢ２０１２／０５２５４５）。この方法の重要な１つの制限は得られる細胞数が少なく、臨床応用に不適当であることである。
【０００５】
他のヒトＴＣＲγδ＋Ｔ細胞サブセット
ヒトの中の大多数の非Ｖδ１＋および非Ｖδ２＋ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞は、Ｖδ３  ＴＣＲ鎖を発現する。ヒトＴＣＲγδ＋  Ｖδ３＋Ｔ細胞は、循環するＴ細胞の−０．２％を占める３０。しかしＣＭＶ活性を持った腎と幹細胞移植レシピエントの末梢血４，２１、ＨＩＶ感染者３１、またはＢ−ＣＬＬ感染者１７、および健康な肝臓３２において富化されている。活性化されたＴＣＲγδ＋  Ｖδ３＋Ｔ細胞はＣＤ１ｄ＋細胞および上皮性腫瘍を生体外で殺すことができた４。しかしながら、利用可能な細胞培養方法は、臨床応用用の多くのＴＣＲγδ＋  Ｖδ３＋Ｔ細胞を生産することができない。
【０００６】
ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞富化集団の生産のための他の方法
いくつかの方法は、ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞集団のいくつかのサブセットの同時のエクスパンジョンに生体外で使用された。ＰＢＭＣｓの合計は、３週間、プレート−バウンド抗ＴＣＲγδｍＡｂおよびＩＬ−２で処理され、約９０％のＴＣＲγδ＋Ｔ細胞を得た。それらの大部分はＶδ２＋Ｔ細胞であり、数パーセントがＶδ１＋Ｔ細胞だった３３。Ｌｏｐｅｚらは、ＩＬ−２が存在する状態で、高投与量のインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、ＩＬ−１２および抗ＣＤ２  ｍＡｂおよび可溶性の抗ＣＤ３  ｍＡｂで処理することにより耐アポトーシス性のＴＣＲγδ＋Ｔ細胞を生成した。Ｖδ２＋Ｔ細胞は細胞エクスパンジョンの後の主要なサブセットだった３４。最近、ポリクローナルＴＣＲγδ＋Ｔ細胞が、ＣＤ１９、ＣＤ６４、ＣＤ８６、ＣＤ１３７Ｌ、および細胞膜結合されたＩＬ−１５に、遺伝子組み換えされた腫瘍起源のγ−線照射された人工抗原（ａＡＰＣ）の存在下でエクスパンジョンされた３，３５。細胞は可溶性のＩＬ−２およびＩＬ−２１が存在する状態でさらに培養された。
【０００７】
生体外でのＶδ２−ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞の増殖のための改良方法の必要
最近の研究は、Ｖδ１鎖を有しＶδ１鎖もＶδ２鎖も含まないＴＣＲγδ＋Ｔ細胞が、養子免疫療法の中でそれらをより魅力的な抗癌性エフェクターにする特性を持っていることを実証した３６。Ｖδ２−ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞（ここでＶδ２−γδＴ細胞とも指定される）は、生体外・生体内の両方でＶδ２＋Ｔ細胞より高い抗腫瘍細胞毒性および増加した生存キャパシティーを示した２６、２９、３７。従って、Ｖδ２−γδ  Ｔ細胞が高度に富化された医薬製造品が、より有力な抗腫瘍結果を生成し、治療された患者に改善された効果を与えると予想される。過去５年において、腫瘍ターゲティングＶδ２−γδ Ｔ細胞の実質的な数を生体外で生成することができるいくつかの方法が述べられているが、重要な未決着の問題がこれらの細胞の臨床応用を除外している：
１）  製造工程中の安全でない試薬および材料の使用；
２）  特に異なるドナーから得られたか、癌患者から得られた細胞生成物における、最終細胞生成物の組成物における大きな変化；および／または
３）最終生産物の低い抗腫瘍活性２２、２７、２８、３８。
【０００８】
特に癌患者からのものである、異なるドナーからの類似する一貫した効能を示す、生体内または生体外における本質的に純粋なＶδ２−γδＴ細胞（つまりこれらの細胞を＞９０％で含む）を生成することができる、信頼できる臨床グレードの細胞培養方法に対する必要がある。注入されたＶδ２＋Ｔ細胞の従来の臨床データは、疾病を治療するためのＴＣＲγδ＋Ｔ細胞の臨床的に適切な投与量は、少なくとも１ｘ１０９の生細胞を含むことを示唆した３９。従って、臨床用途用のＶδ２−γδＴ細胞を生成することを目標とする方法は、少なくとも１．０００倍に生体外でこれらの細胞を増殖しなければならない。
しかしながら、Ｖδ２−γδＴ細胞はアルキルリン酸エステル塩に応答しない。また、それらが認識する抗原に関する非常に制限された知識はそれらの生体外でのエクスパンジョンを制限する。植物レクチン（たとえばＰＨＡおよびＣｏｎ−Ａ）は、前臨床のスケールで、これらの細胞を生体外で増殖し富化する（非常に高純度レベルで）ために使用された。従って、まだ未知の理由のために、これらの一般の有系分裂促進物質は、汚染物質Ｖδ２＋Ｔ細胞の成長を阻害（あるいは、アポトーシスを引き起こして）するが、Ｖδ２−γδＴ細胞には著しく選択的であり、培養中のそれらの増殖を促進する２７，２９。しかしながら、ヒトに不注意に注入された場合、植物レクチンは有毒かもしれない。また、取り締まり機関は、安全性の観点から臨床応用のための使用を勧めないかもしれない。さらに、我々のデータによれば、少数の細胞を生成するので、植物レクチンは、Ｖδ２−γδＴ細胞のエクスパンジョンを生体外で引き起こすことではモノクローナル抗体ほど効率的ではない。いくつかのグループはＰＨＡの代わりに、抗ＣＤ３モノクローナル抗体が存在する状態でＴＣＲγδ＋Ｔ細胞を培養した。しかしながら、ＣＤ３分子への抗ＣＤ３  ｍＡｂ結合はさらに汚染物質ＣＤ３＋ＴＣＲαβ＋Ｔ細胞およびＣＤ３＋  Ｖδ２＋Ｔ細胞を発現し、その結果最終細胞生成物の純度レベルの減少を引き起こした。従って、抗ＣＤ３  ｍＡｂによる刺激に先立って、磁気活性化された細胞選別（magnetic-activated cell sorting：ＭＡＣＳ）、または蛍光活性化細胞分類（fluorescence-activated cell sorting：ＦＡＣＳ）によってＶδ２−γδＴ細胞を分離しなければならない２５，４０。事態をさらに複雑にすることに、重要な試薬（たとえば抗ＴＣＲγδｍＡｂ、抗ＴＣＲＶδ１  ｍＡｂおよび抗ＴＣＲＶδ３  ｍＡｂ）が、合計のＴＣＲγδ＋Ｔ細胞、ＴＣＲγδ＋  Ｖδ１＋Ｔ細胞およびＴＣＲγδ＋  Ｖδ３＋Ｔ細胞をそれぞれ分離するために使用されていたが、現在製造されないか、臨床使用が承認されていない（取り締まり機関によって）。したがって、ヒトへの直接の投与に適している清浄化されたＶδ２−γδＴ細胞の十分な数を生成することは可能ではなかった２２。純粋なＶδ２−γδＴ細胞集団の生産のための、植物レクチンおよび他の安全でない試薬に依存しない方法への必要がある。従来の研究では、Ｄｅｎｉｇｅｒらは、γおよびδＴＣＲ鎖のポリクローナルレパートリーを発現するＴＣＲγδ＋Ｔ細胞を多量に増殖させる細胞を提供する、腫瘍由来の人工抗原細胞（artificial antigen presenting cells：ａＡＰＣｓ）を開発した３７。しかしながら、著者によって指摘されたように４１、この方法は、ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞の臨床応用に関連した重大な障害を解決することができなかった。例えば、ほとんどの成分はＧＭＰ品質では現在生産されていない。また、さらなる開発は、まだ異なる試薬でおよび癌患者から同じ細胞生成物を得ることができると仮定しても、メーカーの将来の興味および複雑な規定による承認に依存する。
更に、生成された細胞生成物の正確な組成（およびその変化）に関する重要な詳細はこの研究の中で失われ、この方法の潜在的な適用を妨害する。インターロイキン−２、インターロイキン−７およびインターロイキン−１５は、ＴＣＲαβ＋ＴおよびＶδ２＋Ｔ細胞を含む、多数の免疫細胞に対する強い刺激的な影響を有する多面発現性分子である。従って、汚染細胞がさらに培養中で増殖し細胞純度を損うので、これらの試薬はＶδ２−γδＴ細胞の生体外での増殖に適切ではない。更に、γδＴＣＲアゴニストとこれらの炎症促進性のサイトカインの典型的な組み合わせは、しばしば刺激された細胞の活性化誘導細胞死（ＡＩＣＤ）に結びつき、少数の細胞しか得られない。非常に純度の低いスタートサンプルから増殖させたＶδ２−γδＴ細胞のための、より選択的な試薬に依存する方法の技術への必要がある。
【０００９】
Ｖδ１＋Ｔ細胞を生体外で増殖するために、ＩＬ−２およびＩＬ−４の組み合わせはある程度成功して使用された。しかしながら、我々は、培地中のＩＬ−４の存在がそれらの非腫瘍性反応を弱めるＶδ２−γδＴ細胞の上でナチュラルキラー（ＮＫ）活性化レセプター（たとえばＮＫＧ２ＤとＮＣＲ）の強いダウンレギュレーションを引き起こすことを見いだした。ＩＬ−２が存在した時さえ、Ｖδ２−γδＴ細胞に対するＩＬ−４の阻害作用が生じた。同じラインに沿って、独立した研究では、Ｍａｏ，Ｙ．および同僚は、ＩＬ−４および抗ＴＣＲＶδ１  ｍＡｂで処理され培養されたＶδ１＋Ｔ細胞は、Ｖδ２＋Ｔ細胞に比較して著しく少ないＩＦＮ−Ｖδ２＋Ｔ細胞、γおよびより多くのＩＬ−１０を分泌することを示した。更に、ＩＬ−４−処理されたＶδ１＋Ｔ細胞はより少ない量のＮＫＧ２Ｄを発現した。またＩＬ−４がＴＣＲγδ＋Ｔ細胞を媒介とした抗腫瘍免疫反応を弱めることをさらに示した４２。これらの観察は、インターロイキン−１７を生産するＶδ１＋Ｔ細胞の腫瘍を促進する影響に関する最近の発見（ｒｅｆ．４３、４４）とともに、それらの用途に対する懸念を投げかけており、養子関係の細胞治療のために考慮されるかもしれないエフェクターＶδ１＋リンパ球の詳細な特性記述の必要を強調した。ＩＬ−４の免疫抑制性または阻害作用なしで、生体外のＶδ２−γδＴ細胞を増殖することができる方法への必要が明らかにある。
【００１０】
最後に、生体外のＶδ２−γδＴ細胞増殖することを目標とするいくつかの公表された方法は、通常、ウイルス感染した、あるいは形質転換細胞または細胞株、バクテリアおよび寄生生物の形式である自然または人工フィーダー細胞の存在を要求する。これらの増殖方法はより複雑で、微生物汚染をしがちで、臨床応用にはそれほど適していない。
【００１１】
発明の要約
本発明は、フィーダー細胞または微生物又はウイルス成分の使用の必要なしで、生体外でヒトＶδ２−ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞を増殖および分化させる新規な方法を提供する。最初に、発明者は、培養されたＶδ２−ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞のエクスパンジョンと純度のレベルを改善することを目的とする。培地中でこれらの細胞を増殖する、新規で、より効率的・より選択的な方法は、Ｔ細胞マイトージェン（T cell mitogen）およびＩＬ−４が存在する状態、およびＩＬ−２、ＩＬ−７およびＩＬ−１５がない状態で開発された。最後に、得られたＶδ２−ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞は、追加の生体外の最適化ステップを通じてより細胞毒性の表現型へ分化した。ＩＬ−４の除去、およびＴ細胞マイトージェンとＩＬ−１５、ＩＬ−２、あるいはＩＬ−７の培地への追加の後、先に得られたＶδ２−ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞は炎症促進性のサイトカインを生成し、生体外で腫瘍細胞の死滅を媒介する、活性化ナチュラルキラー・レセプター（Natural Killer receptors：ＮＫＲ）をハイ・レベルで発現した。重要なことには、ハツカネズミ中への注入に際して、分化したＴＣＲγδ＋Ｔ細胞はそれらの細胞毒性の表現型を維持し、腫瘍成長を生体内で阻害した。本明細書に記載された細胞培養方法は非常に確固としており、高度に再現可能で、大規模臨床応用に完全に適合する。それは、癌の養子免疫療法および様々な実験・治療および商用用途で使用される分化したＶδ２−ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞の十分な数を生成する。
【００１２】
従って、第１の態様では、本発明は、以下を含む、サンプル中のＶδ２−ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞を増殖し分化させる方法を提供する：
（１）インターロイキン４−様活性（interleukin-4-like activity）を有する少なくとも１つの成長因子、およびＴ細胞マイトージェンを含む第１の培地中のサンプル中の細胞を、インターロイキン１５−様活性を有する成長因子の非存在下で培養すること；および
（２）インターロイキン４−様活性を有する成長因子の非存在下で、インターロイキン１５−様活性を有する少なくとも１つの成長因子およびＴ細胞マイトージェンを含む第２の培地中で、ステップ（１）で得られた細胞を培養すること。
【００１３】
好ましくは、本発明は、以下を含む、サンプル中のＶδ２−ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞を増殖し分化させる方法を提供する：
（１）Ｔ細胞マイトージェンとインターロイキン４を含む第１の培地中のサンプル中の細胞を、インターロイキン１５、インターロイキン２およびインターロイキン７の非存在下で培養すること；および
（２）インターロイキン４の非存在下で、Ｔ細胞マイトージェンとインターロイキン１５を含む第２の培地中で、ステップ（１）で得られた細胞を培養すること。
新しく得られた方法（ここに詳述される）は、Ｖδ２−ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞の、以前に未確認であった生物学の特性に基づき、これまでどこにも記載されていないものである。
【００１４】
本発明の詳細な記述
本発明は、Ｖδ２−ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞の分離および選択的な生体外／体外エクスパンジョン（in vitro lex vivo expansion）および分化のための新規の方法、およびそれらの臨床応用に関する。発明者は、培地中の末梢血Ｖδ２−ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞を増殖および分化させる（２−３週で）キャパシティーに関して、臨床グレードのアゴニスト抗体およびサイトカインの多数の組み合わせをテストした。ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞は、微生物の起源の分子およびフィーダー細胞がない培地中で分離され増殖した。発明者はそのＶδ２−ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞（ここでＶδ２−γδＴ細胞としても指定された）が、Ｔ細胞マイトージェンとインターロイキン４を含み、インターロイキン２、インターロイキン７およびインターロイキン１５が非存在である第１の培地中でこれらの細胞を培養し、さらにこれらの細胞を、Ｔ細胞マイトージェンおよびインターロイキン１５、インターロイキン２、あるいはインターロイキン７を含み、インターロイキン４が非存在であるサブ培地中で培養することにより、生体外で選択的に増殖できることを示した。他の重要な成長因子（たとえばインターフェロンγ、インターロイキン−２１およびインターロイキン−１β）も１または両方の培地に加えられ、培養されたＶδ２−γδＴ細胞のエクスパンジョンと純度のレベルを増加させた。
【００１５】
第１の培地は、Ｖδ２−γδＴ細胞（１４日でのＶδ１＋Ｔ細胞の８．０００倍までの増加；表３）の選択的な生存およびエクスパンジョンを支援した。重要なことには、培養の第１の時期中のインターロイキン２、インターロイキン７およびインターロイキン１５の非存在は、汚染物質細胞（ＴＣＲαβ＋ＴおよびＶδ２＋Ｔ細胞を含む）の飢餓およびアポトーシスに寄与した。それは決定的に生存をこれらのサイトカインに依存する。
【００１６】
最後に第２の培地中のＩＬ−２、ＩＬ−７またはＩＬ−１５の存在、およびＩＬ−４の非存在は、先に選択されたＶδ２−γδＴ細胞集団の分化を可能にした。生体外での増殖は、２１日間の培養（表３および７）の後、合計数千倍になり、また細胞の合計の＞９０％に達した。この第２の培養ステップは抗腫瘍または抗ウイルスの治療の使用のためにより適切な表現型（phenotype）へ、細胞の生理学的性質を変化させるのに必要である。第２の培養ステップの後に得られた増殖されて分化したＶδ２−γδＴ  ＰＢＬｓは、ハイ・レベルの、ＮＫｐ３０およびＮＫｐ４４（これらは正常細胞をターゲットとしていない一方、生体外でターゲットとする腫瘍細胞を媒介するためにＴ細胞受容体と相乗作用する）を含む活性化ナチュラルキラー・レセプター（ＮＫＲ）をハイレベルで発現した。癌を持った免疫不全のハツカネズミ中への増殖されて分化したＶδ２−γδＴ  ＰＢＬ細胞の注入は、治療されていない動物と比較して、腫瘍成長を阻害し、多数の器官への腫瘍内転移を制限した。生化学・組織学の分析での治療に関連する毒性の証拠は見つからなかった。重要なことには、増殖されて分化したＶδ２−γδＴ  ＰＢＬｓは、同様の効率で健康なドナーおよび白血病患者の血液サンプルから得られた。最後に、本発明は、完全に産業および臨床応用に適合性である試薬および材料を使用して、細胞を分離し培養する方法を開示する。ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞は、臨床グレードの細胞選別機械（ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，ＧｍｂＨ；Ｇｅｒｍａｎｙ）の中で使用されることが適切なツーステップ・プロトコルの中で最初にソートされた。その後、細胞は血清遊離細胞培養メディア中で最小の操作で培養された。閉鎖系の、大規模およびガス浸透性のプラスチック細胞培養バッグが、開放培地プレートまたはフラスコの代わりに、レシピエントとして細胞培養に使用された。用いられた試薬および材料（あるいは等価な試薬および材料）は、すべて現在利用可能で、臨床グレードの品質で製造されるか、あるいは製造及び品質管理に関する基準（ＧＭＰ）品質で、動物性の成分を含まないものが利用可能である。したがって、この方法によって生成された細胞は、様々な実験・治療および商用用途で使用することができる。
【００１７】
第１の態様では、本発明は、以下を含む、ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞またはその前駆物質を含むサンプルから、Ｖδ２−ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞を増殖し分化させる方法を提供する：
（１）インターロイキン４−様活性がある少なくとも１つの成長因子、およびＴ細胞マイトージェンを含み、インターロイキン１５−様活性がある成長因子が非存在の第１の培地中でサンプル中の細胞を培養すること；および
（２）ステップ（１）で得た細胞を、インターロイキン１５−様活性がある少なくとも１つの成長因子、およびＴ細胞マイトージェンを含み、インターロイキン４−様活性がある成長因子が非存在の、第２の培地中で培養すること。
【００１８】
本発明の第１の態様の方法はＶδ２−ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞の増殖された細胞集団に帰着する。「増殖した」の用語は、最終生成物中の望まれたまたは標的とされた細胞の数が、最初または出発細胞集団の中のそれらの数より大きいことを意味する。
【００１９】
用語「Ｔ細胞マイトージェン」は、ＴＣＲシグナリングによってＴ細胞を刺激することができるあらゆる作用薬を意味し、たとえば植物レクチン、たとえばフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）およびコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）、および非プラント起源のレクチン、Ｔ細胞を活性化する抗体、および他の非レクチン／非抗体有系分裂促進物質を含むが、これらに限定されない。好ましい抗体クローンとしては、抗ＣＤ３抗体、たとえばＯＫＴ−３およびＵＣＨＴ−１クローン、抗ＴＣＲγδ抗体、たとえばＢ１およびＩＭＭＵ５１０、または抗ＴＣＲＶδ１抗体、たとえばδＴＣＳ１を含む。本発明のコンテキスト内では、抗体はモノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）、ポリクローナル性抗体、抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ、およびＦ（ａｂ’）２）、単一鎖抗体、一本鎖抗体（ＳｃＦｖ）および組み換えにより生成された結合パートナーを含むものと理解される。１つの実施態様では、抗体は抗ＣＤ３モノクローナル抗体（ｍＡｂ）である。他の有系分裂促進物質はホルボール１２−ミリステート−１３−酢酸塩（ＴＰＡ）、その関連化合物（たとえばメゼレイン（ｍｅｚｅｒｅｉｎ））またはバクテリアの化合物（例えばブドウ球菌腸毒素Ａ（ＳＥＡ）および連鎖球菌プロテインＡ）を含む。Ｔ細胞マイトージェンは可溶性で、または不動化されることができる。１以上のＴ細胞マイトージェンを、本発明の方法の中で使用することができる。
【００２０】
本発明では、サイトカインの２つの別個のグループ、一方はインターロイキン４であり、他方はインターロイキン−１５、インターロイキン２およびインターロイキン７であるものが、非常に特定の目的のために各培養ステップで使用されなくてはならず、培養されたＶδ２−γδＴ細胞に反対の作用を有する。Ｖδ２−γδＴ細胞に対するＩＬ−４およびＩＬ−１５／ＩＬ−２／ＩＬ−７の影響に関する本研究に基づいて、サイトカインのこれらの２つのグループは成長因子の２つのグループの代表的なメンバーであることは当該技術分野の当業者には明白であり、「インターロイキン４−様活性」または「インターロイキン１５−様活性」を持っており、それは本発明の範囲の下で使用することができる。用語「インターロイキン４−様活性がある成長因子」は、培養中のＶδ２−γδＴ細胞に対して同様の生理的効果を促進するその能力に関して、ＩＬ−４と同じ活性を持つすべての化合物を意味し、非制限的に、ＩＬ−４およびＩＬ−４ミメティックまたはＩＬ−４のすべての機能的な相当物を含む。本発明に述べられているように、Ｖδ２−γδＴ細胞に対してＩＬ−４によって促進された生理的効果は、ＮＫＧ２ＤとＮＣＲの発現レベルの減少、細胞毒性の機能の抑制および改善された選択的な生存を含んでいる。Ｖδ２−γδＴ細胞に対するＩＬ−４の言及された活性のうちのいくつかは、別のグループによっても独立して報告された。その研究では、ＩＬ−４は特異的に炎症促進性のサイトカイン、たとえば活性化されたＴＣＲγδ＋Ｔ細胞からのＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αの分泌を阻害した４５。
【００２１】
用語「インターロイキン１５−様活性がある成長因子」は、培養中のＶδ２−γδＴ細胞に対して同様の生理的効果を促進するその能力に関して、ＩＬ−１５と同じ活性を持つ全ての化合物を意味し、非制限的に、ＩＬ−１５およびＩＬ−１５ミメティックまたはＩＬ−２およびＩＬ−７を含むＩＬ−１５の任意の機能的な相当物を含む。本発明に述べられていたように、培養されたＶδ２−γδＴ細胞に対するＩＬ−１５、ＩＬ−２およびＩＬ−７によって促進された生理的効果は、本質的に等価だった。すなわち、ＮＫＧ２ＤおよびＮＣＲ（ＮＫｐ３０とＮＫｐ４４）の発現レベルのアップレギュレーションを含む、より細胞毒性の表現型への細胞分化の誘導は、炎症促進性のサイトカイン（たとえばＩＦＮ−γ）の抗腫瘍の細胞毒性の機能を増加し、および増加した生産を与えた。
【００２２】
用語「インターロイキン１５、インターロイキン２およびインターロイキン７の非存在」および「インターロイキン４の非存在」は、培地中のこれらのサイトカインの完全な非存在だけでなく、それらが標的細胞の測定可能な反応や生理的な効力を起こすことができず、このように実際的な目的には不在であると考えることができるような低い濃度水準でのそのようなサイトカインの使用を含んでいる。更に、「標的細胞の測定可能な生理的な結果」は、細胞の生理的な状態の、本発明の範囲内の、および標準定義による任意の測定可能な変化を指す。例えば、細胞の生理的な状態の変化は、それらの活性化状態（早期活性化細胞マーカＣＤ６９の発現レベルのアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションによって認識された）の変化によって検知することができる；または、そのようなサイトカインとの接触の数時間または数日後に、それらの分化状態（ＮＫＧ２ＤまたはＮＣＲのアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションによって認識された）の変化によって検知される。ＣＦＳＥ染色、または当該技術分野で公知の他の技術によって測定されるように、測定可能な生理的な結果は細胞の増殖速度の変化であることができる。ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５成長因子または機能的に同様の成長因子によって、第１培地中で培養された細胞が機能的に適切な刺激を受け取ってはならないことは全ての当業者に明白に違いない。さらに、第２の培地中の細胞はＩＬ−４成長因子または機能的に同様の成長因子によって機能的に適切な刺激を受け取ってはならない。好ましくは、これらのサイトカインは、２ナノグラム／ｍｌを超える最終濃度で細胞培養培地の中にあってはならない；より好ましくは１ナノグラム／ｍｌ以下、より好ましくは０．１ナノグラム／ｍｌ以下、より好ましくは、それらは存在しない。
【００２３】
好ましくは、本発明は、以下を含む、サンプル中のＶδ２−γδＴ細胞を増殖させ、分化させる方法を提供する：
（１）Ｔ細胞マイトージェンとインターロイキン４を含み、インターロイキン１５、インターロイキン２およびインターロイキン７が非存在である第１の培地中で、サンプル中の細胞を培養すること；および
（２）インターロイキン４の非存在下で、Ｔ細胞マイトージェンとインターロイキン１５を含む第２の培地中で、ステップ（１）で得られた細胞を培養すること。
【００２４】
別の実施態様では、本発明は、以下を含む、サンプル中のＶδ２−γδＴ細胞を増殖させ、分化させる方法を提供する：
（１）Ｔ細胞マイトージェンとインターロイキン４を含み、インターロイキン１５、インターロイキン２およびインターロイキン７が非存在である第１の培地中で、サンプル中の細胞を培養すること；および
（２）インターロイキン４の非存在下で、Ｔ細胞マイトージェンとインターロイキン２を含む第２の培地中で、ステップ（１）で得られた細胞を培養すること。
【００２５】
さらに、別の実施態様では、本発明は、以下を含む、サンプル中のＶδ２−γδＴ細胞を増殖させ、分化させる方法を提供する：
（１）Ｔ細胞マイトージェンとインターロイキン４を含み、インターロイキン１５、インターロイキン２およびインターロイキン７が非存在である第１の培地中で、サンプル中の細胞を培養すること；および
（２）インターロイキン４の非存在下で、Ｔ細胞マイトージェンとインターロイキン７を含む第２の培地中で、ステップ（１）で得られた細胞を培養すること。
【００２６】
第１または第２培地、または両方の培地は、Ｖδ２−γδＴ細胞の成長およびエクスパンジョンを助けることができる他の成分をさらに含んでいてもよい。加えられることができる他の成分の例としては、非制限的に、血漿、血清、純粋なタンパク質（たとえばアルブミン）、脂質源（たとえば低密度リポタンパク質（ＬＤＬ））、ビタミン、アミノ酸、ステロイド、および細胞増殖および／または生存を支援するかまたは促進する他のサプリメントが挙げられる。
【００２７】
第１または第２の培地、あるいは、両方の培地はさらに他の成長因子、たとえばＶδ２−γδＴ細胞のエクスパンジョンをさらに高めることができるサイトカインを含むことができる。そのようなサイトカインの例としては以下のものを含むが、これらに制限されない。（ｉ）  インターフェロン−γ、およびインターフェロン−γ−様活性のある任意の成長因子、（ｉｉ）インターロイキン−２１、およびインターロイキン−２１−様活性のある任意の成長因子、並びに（ｉｉｉ）ＩＬ−１β、およびインターロイキン−１β−様活性のある任意の成長因子。加えることができる他の成長因子の例は、共同刺激生分子（たとえばヒト抗ＳＬＡＭ抗体）、ＣＤ２７の任意の可溶性のリガンドまたはＣＤ７の任意の可溶性のリガンドを含んでいる。これらの成長因子のどんな組み合わせも、第１または第２の培地、または両方のメディアに含まれることができる。
【００２８】
用語「インターフェロン−γ−様活性のある成長因子」は、培地中のＶδ２−γδＴ細胞の生存または増殖をプロモートする能力に関して、ＩＦＮ−γと同じ活性を有する全ての化合物を意味し、非制限的に、ＩＦＮ−γおよびＩＦＮ−γミメティック、あるいはＩＦＮ−γの任意の機能的な相当物を含む。
【００２９】
用語「インターロイキン−２１−様活性がある成長因子」は、培地中のＶδ２−γδＴ細胞の生存または増殖をプロモートする能力に関して、ＩＬ−２１と同じ活性を有する全ての化合物を意味し、非制限的に、ＩＬ−２１およびＩＬ−２１ミメティック、あるいはＩＬ−２１の任意の機能的な相当物を含む。
【００３０】
用語「インターロイキン−１β−様活性がある成長因子」は、培地中のＶδ２−γδＴ細胞の生存または増殖をプロモートする能力に関して、ＩＬ−１βと同じ活性を有する全ての化合物を意味し、非制限的に、ＩＬ−１βおよびＩＬ−１βミメティック、あるいはＩＬ−１βの任意の機能的な相当物を含む。
【００３１】
特に、発明者は、第１または第２の培地、または両方の培地へのインターフェロン−γ−様活性のある成長因子の添加は、１つの成長因子を使用した場合と比較してＶδ２−γδＴ細胞の高められたエクスパンジョンに帰着することを見いだした。
【００３２】
従って、１つの実施態様では、本発明の第１の態様の方法は次のものを含む：
（１）Ｔ細胞マイトージェン、インターロイキン４およびインターフェロン−γを含み、インターロイキン２、インターロイキン−７およびインターロイキン−１５を含まない第１の培地中でのサンプル中の細胞を培養すること；および
（２）ステップ（１）で得られた細胞を、Ｔ細胞マイトージェン、インターロイキン−１５およびインターフェロン−γを含み、インターロイキン−４を含まない第２の培地中で増殖し、Ｖδ２−γδＴ細胞を増殖し、分化させること。
【００３３】
好ましくはＩＦＮ−γ−様活性を有する成長因子は、約１から約１０００ナノグラム／ｍｌの量で存在する。より好ましくは、この成長因子は、約２から約５００ナノグラム／ｍｌまでの量で存在する。より好ましくは、この成長因子は、約２０から約２００ナノグラム／ｍｌまでの量で存在する。最も好ましくは、第２の培地はＩＦＮ−γ−様活性を有する成長因子、たとえばＩＦＮ−γを約７０ナノグラム／ｍＬで含む。
【００３４】
発明者は、発明者は、第１または第２の培地、または両方の培地への、インターフェロン−γ−様活性のある第２の成長因子、およびインターロイキン−２１−様活性がある第３の成長因子の添加は、１つまたは２つの成長因子を使用した場合と比較してＶδ２−γδＴ細胞の高められたエクスパンジョンに帰着することを見いだした。
【００３５】
従って、１つの実施態様では、本発明の第１の態様の方法は次のものを含む：
（１）Ｔ細胞マイトージェン、インターロイキン−４、インターフェロン−γおよびインターロイキン−２１を含み、インターロイキン−２、インターロイキン−７およびインターロイキン−１５を含まない第１の培地中でサンプル中の細胞を培養すること：および
（２）ステップ（１）で得られた細胞を、Ｔ細胞マイトージェン、インターロイキン−１５およびインターフェロン−γを含み、インターロイキン−４を含まない第２の培地中で培養し、Ｖδ２−γδＴ細胞を増殖し、分化させること。
【００３６】
好ましくは、ＩＬ−２１−様活性のある成長因子は、約１から約５００ナノグラム／ｍｌまでの量で存在する。より好ましくは、この成長因子は、約２から約２００ナノグラム／ｍｌまでの量で存在する。より好ましくは、この成長因子は、約５から約１００ナノグラム／ｍｌまでの量で存在する。最も好ましくは、第２の培地はＩＬ−２１−様活性のある成長因子、たとえばＩＬ−２１を約１５ナノグラム／ｍＬで含む。
【００３７】
発明者は、ＩＦＮ−γ−様活性のある第２の成長因子、ＩＬ−２１−様活性がある第３の成長因子、およびＩＬ−１β−様活性がある第４の成長因子の、第１または第２の培地、または両方の培地への添加は、１つ、２つのまたは３つの成長因子を使用して得られたものと比較して、Ｖδ２−γδＴ細胞の高められたエクスパンジョンに帰着することを見いだした。
【００３８】
従って、１つの実施態様では、本発明の第１の態様の方法は次のものを含む：
（１）Ｔ細胞マイトージェン、インターロイキン−４、インターフェロン−γ、インターロイキン−２１、およびインターロイキン−１βを含み、インターロイキン−２、インターロイキン−７およびインターロイキン−１５を含まない第１の培地中でサンプル中の細胞を培養すること：および
（２）ステップ（１）で得られた細胞を、Ｔ細胞マイトージェン、インターロイキン−１５、インターロイキン−γおよびインターフェロン−２１を含み、インターロイキン−４を含まない第２の培地中で培養し、Ｖδ２−γδＴ細胞を増殖すること。
【００３９】
好ましくはＩＬ−１β−様活性がある成長因子は、約１から約５００ナノグラム／ｍｌまでの量で存在する。より好ましくは、この成長因子は、約２から約２００ナノグラム／ｍｌまでの量で存在する。より好ましくは、この成長因子は、約５から約１００ナノグラム／ｍｌまでの量で存在する。最も好ましくは、第２の培地はＩＬ−１β−様活性がある成長因子、たとえばＩＬ−１βを、約１５ナノグラム／ｍＬで含む。
【００４０】
発明者は、第１または第２の培地、または両方の培地への共同刺激的な分子の追加は、そのような分子を使用せずに得たエクスパンジョンと比較して、Ｖδ２−γδＴ細胞の高められたエクスパンジョンに帰着することを見いだした。
【００４１】
従って、１つの実施態様では、本発明の第１の態様の方法は次のものを含む：
（１）Ｔ細胞マイトージェン、インターロイキン−４、ＣＤ２７の任意の分子リガンド、ＳＬＡＭの任意の分子リガンド、またはＣＤ７レセプターの任意の分子リガンドを含み、インターロイキン−２、インターロイキン−７およびインターロイキン−１５を含まない第１の培地中でサンプル中の細胞を培養すること：および
（２）ステップ（１）で得られた細胞を、Ｔ細胞マイトージェン、およびインターロイキン−１５を含み、インターロイキン−４を含まない第２の培地中で培養し、Ｖδ２−γδＴ細胞を増殖すること。
【００４２】
用語「分子リガンド」は、特定の目標レセプターと結合するあらゆる分子または化合物を意味する。特に、発明者は、ＣＤ２７の可溶性のリガンド、ＣＤ７の可溶性のリガンドまたはＳＬＡＭの可溶性のリガンドの追加は、Ｖδ２−γδＴ細胞の高められたエクスパンジョンに帰着することを見いだした。これらの可溶性のリガンドは、これらの分子のレセプターのそれぞれの機能的なアゴニストを構成する。また、これらのレセプターに結合するすべての同様なアゴニストは、例えばアゴニスティック抗体、たとえばヒト抗ＳＬＡＭ抗体、ヒト抗ＣＤ２７抗体およびヒト抗ＣＤ７抗体は、Ｖδ２−γδＴ細胞に対して同じ影響を引き起こすことができる。
【００４３】
１以上の二次培養ステップは培養期間内に行なうことができる。例えば、先に記述された二次培養ステップの各々は、さらに二次培養ステップ（１ａ）、（１ｂ）、（２ａ）および（２ｂ）に分割することができる。述べられた方法に従い、成分の異なる組み合わせを使用することができる。
【００４４】
従って、１つの実施態様では、本発明の第１の態様の方法は次のものを含む：
（１）Ｔ細胞マイトージェン、インターロイキン−４、インターフェロン−γ、インターロイキン−１βおよびインターロイキン−２１を含み、インターロイキン−２、インターロイキン−７およびインターロイキン−１５を含まない第１の培地中でサンプル中の細胞を培養すること：および
（２ａ）ステップ（１）で得られた細胞を、Ｔ細胞マイトージェン、インターロイキン−１５およびインターロイキン−２１を含み、インターロイキン−４を含まない第２の培地中で培養すること；および
（２ｂ）ステップ（２ａ）で得られた細胞を、Ｔ細胞マイトージェン、インターロイキン−１５およびインターロイキン−γを含み、インターロイキン−４を含まない第３の培地中で培養し、Ｖδ２−γδＴ細胞を増殖すること。
【００４５】
別の実施態様では、本発明の第１の態様の方法は次のものを含む：
（１ａ）Ｔ細胞マイトージェン、インターロイキン−４、インターフェロン−γ、およびインターロイキン−２１を含み、インターロイキン−２、インターロイキン−７およびインターロイキン−１５を含まない第１の培地中でサンプル中の細胞を培養すること：および
（１ｂ）Ｔ細胞マイトージェン、インターロイキン−４、インターフェロン−γ、およびインターロイキン−１βを含み、インターロイキン−２、インターロイキン−７およびインターロイキン−１５を含まない第２の培地中でサンプル（１ａ）で得られた細胞を培養すること：および
（２）ステップ（１ｂ）で得られた細胞を、Ｔ細胞マイトージェン、およびインターロイキン−１５を含み、インターロイキン−４を含まない第３の培地中で培養し、Ｖδ２−γδＴ細胞を増殖すること。
【００４６】
本発明の方法によって得られたＴＣＲγδ＋Ｔ細胞は、様々な実験・治療および商用用途で使用することができる。非制限的に、これはそのような細胞の引き続く遺伝子変化または遺伝編集を含み、たとえばそれらの治療の可能性を改善することを目的とするものである。例えば、これらの細胞上のキメラ的な抗原リセプター（chimeric antigen receptor：ＣＡＲ）またはＴＣＲの発現によるＴＣＲγδ＋Ｔ細胞の特異性をリダイレクトすることを目的とする。ＣＡＲ発現は、遺伝物質の挿入のためのＴＣＲγδ＋細胞の電気穿孔、またはウイルス・ベクター（たとえば希望の遺伝物質を含んでいるレンチウイルスまたはレトロウイルス）をこれらの細胞に感染させることによって引き起こされる場合がある。そのような遺伝編集は、ホーミング、サイトカイン生産、リサイクルキリング（ｒｅｃｙｃｌｅ  ｋｉｌｌｉｎｇ）、および／または改良されたエングラフトメント（ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ）によりＴＣＲγδ＋Ｔ細胞の潜在能を改善することができる。
【００４７】
本発明は、培養中のＶδ２−ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞を選択的に増殖するのための新規な方法を提供する。本発明の第１の態様の方法は、サンプルに対して実行される。このサンプルは「出発サンプル」とも呼ばれる。方法は分画されていないサンプル、またはＴＣＲγδ＋Ｔ細胞が富化されたサンプルのいずれかを使用することができる。
【００４８】
サンプルは非制限的に、血液、骨髄、リンパ組織、上皮、胸腺、肝臓、ひ臓、ガン組織、リンパ節組織、感染した組織、胎児の組織およびそれらのフラクションまたは、富化された部分を含む、ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞またはそれらの前駆物質を含む任意のサンプルであることができる。サンプルは、好ましくは被膜形成細胞、白血球除去血輸血生成物、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣｓ）および低密度単核細胞（ＬＤＭＣ）を含む、末梢血または臍帯血、又はそれらのフラクションを含む血液である。いくつかの実施態様では、サンプルはヒト血液またはそのフラクションである。細胞は、密度勾配遠心分離のような当該技術分野で既知の技術を使用して、血液のサンプルから得られることができる。例えば、全血はＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（登録商標）の等しい体積上に層にされ、室温で１５−３０分間４００ｘｇで遠心分離されることができる。インターフェース材料は低密度単核細胞を含むだろう。これは培地中で集められ洗うことができ、そして、室温で１０分間２００ｘｇで遠心分離機にかけることができる。
【００４９】
分離されたかまたは精製されていないＴＣＲγδ＋Ｔ細胞は、血清または血漿が存在する状態で、ＡＩＭ−Ｖ（登録商標）、ＲＰＭＩ  １６４０、ＯＰＴＭＩＺＥＲ  ＣＴＳ（登録商標）（Ｇｉｂｃｏ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＥＸＶＩＶＯ−１０、ＥＸＶＩＶＯ−１５またはＥＸＶＩＶＯ−２０（Ｌｏｎｚａ）のような、任意の適当な哺乳動物細胞培地中で培養するか、維持することができる。細胞は、たとえばＶｕｅＬｉｆｅ（登録商標）臨床グレードのガス浸透性の細胞培養静電気シールドバッグ（Ｓａｉｎｔ  Ｇｏｂａｉｎ）、またはＭｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃの臨床グレードの細胞培養バッグに転送することができる。細胞バッグは細胞を含み、培地は、暗やみの中で３７℃および５％のＣＯ２でインキュベータに置くことができる。
【００５０】
サンプルまたはそのフラクション（たとえばＰＢＭＣｓ）を第１培地中で培養する前に、サンプルまたはそのフラクションはある細胞タイプには富化され、および／または、他の細胞タイプについて消耗されることができる。特に、サンプルまたはそのフラクションは、Ｔ細胞が富化されるか、またはＴＣＲγδ＋Ｔ細胞が富化されるか、あるいはＴＣＲαβ＋Ｔ細胞を消耗（ｄｅｐｌｅｔｅ）するか、あるいは非ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞を消耗することができる。好ましい実施態様では、サンプルは、最初にＴＣＲαβ＋Ｔ細胞を消耗し、次に、ＣＤ３＋細胞が富化される。
【００５１】
サンプルは当該技術分野で既知の技術を使用して、特定の細胞タイプに富化されるか消耗されてもよい。１つの実施態様では、特定の表現型の細胞は、サンプルまたはそのフラクションの、消耗される細胞上の特定の分子と結合する抗体を含む抗体カクテルでの培養により消耗されることができる。好ましくは、カクテル中の抗体は、これらの細胞が磁気カラムを通過することを強いられる場合に、磁気的に標的細胞を消耗するか富化するために使用することができる磁気微小ビーズと組み合わされる。
【００５２】
一旦サンプル中の細胞が分画され富化されたならば、もし望まれれば、細胞は、インターロイキン１５−様活性がある成長因子（たとえばインターロイキン１５、インターロイキン２およびインターロイキン７）がない状態で、インターロイキン４−様活性を持っている少なくとも１つの成長因子（たとえばインターロイキン４）、およびＴ細胞マイトージェンを含む第１の培地中で培養される。
【００５３】
好ましくは、第１の培地中のＴ細胞マイトージェンは、約１０から約５０００ナノグラム／ｍｌまでの量で存在する。より好ましくは、Ｔ細胞マイトージェンは、約２０から約２０００年ナノグラム／ｍｌまでの量で存在する。より好ましくは、Ｔ細胞マイトージェンは、約５０から約１０００ナノグラム／ｍｌまでの量で存在する。最も好ましくは、メディアは７０ナノグラム／ｍＬのＴ細胞マイトージェンを含む。
【００５４】
好ましくは、インターロイキン４−様活性がある成長因子は、約１から約１０００ナノグラム／ｍｌまでの量で存在する。より好ましくは、この成長因子は、約５から約５００ナノグラム／ｍｌまでの量で存在する。より好ましくは、この成長因子は、約２０から約２００ナノグラム／ｍｌまでの量で存在する。最も好ましくは、メディアは、インターロイキン４−様活性のある成長因子（たとえばＩＬ−４）を１００ナノグラム／ｍＬで含む。
【００５５】
細胞は、約２日から約２１日までの期間で第１の培地中で好ましくは培養される。より好ましくは、約３日から約１４日までである。より好ましくは約４日から８日までである。
【００５６】
第１培地中の培養に続いて、細胞は、Ｔ細胞マイトージェンおよびインターロイキン１５−様活性がある少なくとも１つの成長因子、たとえばＩＬ−１５、ＩＬ−２またはＩＬ−７を含み、インターロイキン４−様活性がある成長因子、たとえばＩＬ−４のない第２の培地中で二次培養される。例えば、細胞がＩＬ−１５およびＩＬ−４の両方が存在する状態で二次培養される場合、増殖は継続する。しかし、細胞の生存率は減少する。また、細胞表面にある重要なＮＫレセプター（たとえばＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０およびＮＫｐ４４）は、細胞の内部に吸収される。従って、これらのレセプターは、もはや腫瘍細胞上に発現されたそれらのリガンドに結合することができない。それはこれらの細胞の抗腫瘍細胞毒性活性を低減する。
【００５７】
二次培養ステップは、ステップ１で得られた細胞の新しい培地での培養である。これは、第１培地への新鮮な培地の追加を通じて達成することができ、好ましくは第１の培地部分は除去される。細胞をデカントすることおよび／または遠心分離機にかけることにより第１の培地部分を除去し、第２の培地中に細胞を再懸濁することによりできる。好ましくは、二次培養ステップは、少なくとも第１の培地の３／４の除去を含んでいる。インターロイキン４−様活性がある成長因子が二次培養ステップの間に取り除かれることが、Ｖδ２−γδＴ細胞のエクスパンジョンおよび分化にとって重要であるので、二次培養ステップが行なわれるべきである。好ましくは、第２の培地では、Ｔ細胞マイトージェンは、約０．１から約５０μｇ／ｍｌまでの量で存在する。より好ましくは、Ｔ細胞マイトージェンは、約０．３から約１０μｇ／ｍｌまでの量で存在する。より好ましくは、Ｔ細胞マイトージェンは、約０．５から約５μｇ／ｍｌまでの量で存在する。最も好ましくは、培地は、Ｔ細胞マイトージェンを１μｇ／ｍＬで含む。
【００５８】
好ましくは、インターロイキン１５−様活性がある成長因子（たとえばＩＬ−１５、ＩＬ−２またはＩＬ−７）は、約１から約１０００ナノグラム／ｍｌまでの量で存在する。より好ましくは、この成長因子は、約２から約５００ナノグラム／ｍｌまでの量で存在する。より好ましくは、この成長因子は、約２０から約２００ナノグラム／ｍｌまでの量で存在する。最も好ましくは、第２の培地は、インターロイキン１５−様活性がある成長因子（たとえばＩＬ−１５、ＩＬ−２またはＩＬ−７）を約７０ナノグラム／ｍＬで含む。
【００５９】
細胞は、好ましくは約２日から約３０日までの期間で第２の培地中で培養される。より好ましくは約５日から約２１日まで、さらに好ましくは約１０日から１５日までである。
【００６０】
好ましくは、本発明の第１の態様では、第１および第２の培地の両方は血清または血漿で補われる。第１および第２の培地の血漿の量は、体積で好ましくは約０．５％から約２５％まで、例えば、体積で約２％から約２０％まで、または体積で約２．５から約１０％、たとえば約５体積％である。血清または血漿は、別の哺乳類の種由来のヒト末梢血、臍帯血または血液を含み、これらに限定されない任意の源から得ることができる。血漿は一人のドナーからか、または数人のドナーから得られたものでもよい。自己由来のＴＣＲγδ＋Ｔ細胞が臨床的に使用されることになっている場合、つまり、元のサンプルが得られたのと同じ患者に再注入される場合、その患者への危険な生成物（例えばウイルス）の導入を回避するために同様に（つまり同じ患者からの）自己由来の血漿を使用することが望ましい。血漿は患者への動物由来物の適用を回避するのに人間由来のものであるべきである。
【００６１】
本発明の第１の態様の方法によって得られたＴＣＲγδ＋Ｔ細胞は、蛍光活性化細胞分類、免疫磁気的分離法、アフィニティカム・クロマトグラフィー、密度勾配遠心分離および細胞パンニングを含む、当該技術分野で既知の技術を使用して、最終の培地中にある他の細胞から分離することができる。
【００６２】
本発明の第１の態様の方法によって得られたＴＣＲγδ＋Ｔ細胞も、使用できる。従って、発明者は、ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞の細胞調製について記述する。
【００６３】
第２の態様では、本発明は、本発明の第１の態様の方法によって調製されたＴＣＲγδ＋Ｔ細胞が富化された細胞調製を提供する。
【００６４】
第３の態様では、本発明は、細胞の合計の８０％以上がＴＣＲγδ＋Ｔ細胞であることを特徴とするＴＣＲγδ＋Ｔ細胞が富化された細胞調製を提供する。
【００６５】
好ましくは、本発明の第２および第３の態様では、ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞は富化された集団中の細胞の合計の８０％以上を構成し、より好ましくは９０％以上、、最も好ましくは９５％以上を構成する。本発明の第１および第２の態様によって得られたＴＣＲγδ＋Ｔ細胞は、全ての用途で使用されてもよい。ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞は伝染性の病原体に対する第１の防衛線であると思われる。さらに、ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞は、Ｂ細胞リンパ腫、肉腫および癌を含む様々な起源の形質転換細胞に対する内因性の細胞崩壊の活性を有する。その結果、本発明の方法によって生体外で培養して得られたＴＣＲγδ＋Ｔ細胞は、免疫抑制に起因する感染、癌または疾病の治療または予防のために患者へ注入することができる。
【００６６】
従って、第４の態様は、本発明は免疫反応を調整する方法を提供する。この方法は、本発明の第１または第２の態様の方法によって調製された、あるいは本発明の第２または第３の態様による細胞調製から得られたＴＣＲγδ＋Ｔ細胞の有効な量を、必要とする動物に適用することを含む。
【００６７】
用語「有効な量」は、希望の結果を達成するのに必要な期間の間に投与された際に、有効な量をいう。
【００６８】
ここに使用されるような用語「動物」は、動物界の全メンバーを含んでいる。好ましくは、動物は哺乳動物であり、より好ましくはヒトである。
【００６９】
第５の態様は、本発明は感染を治療する方法を提供する。この方法は、本発明の第１または第２の態様の方法によって調製された、あるいは本発明の第２または第３の態様による細胞調製から得られたＴＣＲγδ＋Ｔ細胞の有効な量を、必要とする動物に適用することを含む。
【００７０】
治療されることができる感染の例としては、非制限的に、細菌感染（たとえばミコバクテリア（例えば結核）によって引き起こされたもの）、ウイルス感染（たとえば単純性疱疹ウィルス（ＨＳＶ）、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）または肝炎ウイルスによって引き起こされたもの）、および寄生虫感染（たとえば変形体（例えばマラリア）によって引き起こされたもの）を含む。
【００７１】
第６の態様では、本発明は癌を治療する方法を提供する。この方法は、本発明の第１または第２の態様の方法によって調製された、あるいは本発明の第２または第３の態様による細胞調製から得られたＴＣＲγδ＋Ｔ細胞の有効な量を、必要とする動物に適用することを含む。
【００７２】
治療することができる癌の例としては、非制限的に、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病およびＴ細胞とＢ細胞の白血病を含む白血病、リンパ腫（ホジキンおよび非ホジキン）、リンパ増殖性障害、形質細胞腫、組織球腫、黒色腫、腺腫、肉腫、健全な組織、低酸素性の腫瘍、りん状細胞癌、尿生殖器の癌（頚部および膀胱癌）、造血器癌、頭頸部癌および神経系癌の癌を含む。
【００７３】
１つの実施態様では、治療される癌は慢性リンパ球性白血病である。そのような実施態様では、ＰＢＭＣｓは、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）の患者から得ることができる。ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞を培養し増殖した後に、増殖された細胞は癌のＣＬＬ細胞を有意に含まず、それらを患者に再注入するのに適合させる。本発明のこれらの態様は、免疫反応を調整する方法、感染を治療する方法、または癌の治療方法での使用のための、第１の方法または本発明の第２の態様によって得られたか、第２または本発明の第３の態様による細胞調製から得られたＴＣＲγδ＋Ｔ細胞に及ぶ。本発明は、さらに第１の方法または本発明の第２の態様によって得られたか、第２または本発明の第３の態様による細胞調製から得られたＴＣＲγδ＋Ｔ細胞の、免疫反応の調整、感染の治療、または癌の治療のための医薬品の製造のための使用を含む。
【００７４】
本発明によって得られたＴＣＲγδ＋Ｔ細胞は、さらに例えば、細胞の機能を検討し解明するために実験モデルの中で使用することができる。さらに、これらの細胞は、ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞によって認識された抗原／エピトープの同定へ企図された研究およびワクチン剤のデザインおよび開発に使用されることができる。
【００７５】
従って、第７の態様では、本発明は、さらに第１の態様の方法または本発明の第２の態様によって得られたか、本発明の第２または第３の態様による細胞調製から得られたＴＣＲγδ＋Ｔ細胞の有効な量を必要な動物に適用することを含む、動物に予防注射をする方法を提供する。そのようなワクチンは、感染症または癌にかかる高い危険を持った、免疫無防備の患者または個人に与えることができる。
【００７６】
本発明のこの態様は、さらに本発明の第１の態様によって調製されたか、第２または本発明の第３の態様による細胞調製から得られたＴＣＲγδ＋Ｔ細胞のワクチンの製造のための使用、および本発明の第１の態様の方法によって調製されたか、本発明の第２または第３の態様による細胞調製から得られたＴＣＲγδ＋Ｔ細胞の動物に予防注射をする方法での使用まで及ぶ。
【００７７】
本発明により得られたＴＣＲγδ＋Ｔ細胞は、上記治療、実験または、商用用途に直ちに使用されることができ、または細胞は後日の使用のために凍結保存されることができる。
【００７８】
本発明の第２および引き続く態様での好ましい特徴は、本発明の第１の態様のために記載されたものが準用される。本発明の他の特徴および利点はこの詳細な記述から明白になる。しかしながら、詳細な説明および具体的な例は、本発明の好ましい実施態様を示すが、これらは例示のためのみに記載され、様々な変更および改良は当業者には詳細な記述から明白になるであろう。
【００７９】
本発明は、以前にこの分野に述べられていた他の発明とは完全に異なる。特許出願、ＰＣＴ／ＣＡ１９９９／００１０２４（ＷＯ／２０００／０２６３４７；  出願日０４．１１．１９９９）は、ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞の生産のための方法について記述する。この方法は２ステップを含んでいる。出発サンプル中のＴＣＲγδ＋Ｔ細胞は、Ｔ細胞マイトージェンおよび少なくとも２つのサイトカイン、好ましくはインターロイキン２およびインターロイキン４を含む第１の培地中で培養される。その後、第１ステップで得られた細胞は、少なくとも２つのサイトカイン、好ましくはインターロイキン２とインターロイキン４を含む第２の培地中で培養される。重要なことには、各ステップで使用されるサイトカインは、同じか異なることができる。対照的に、本発明は、培養中のＶδ２−γδＴ細胞を選択的に増殖し、分化させる２ステップの方法を開示する。ここで第１および第２の培養ステップは、互いに必ず異なる。第一ステップは、ＩＬ−４−様活性を有する成長因子（好ましくはインターロイキン４）およびＴ細胞マイトージェンを含み、インターロイキン２、インターロイキン７およびインターロイキン１５がない培地中で、出発サンプル中のＴＣＲγδ＋Ｔ細胞を培養することを含む。本発明では、ＩＬ−４およびＩＬ−２（あるいはＩＬ−７またはＩＬ−１５）が、各培養ステップで非常に特異的な機能を発揮し、反対の活性があることが明白に実証された。第１培地は、ＩＬ−４−様活性を有する成長因子を含み、それは（ＩＬ−２／ＩＬ−７／ＩＬ−１５−様）成長因子と混合されず、そうでなければ細胞の生存率と増殖は減少するだろう。また、予期された細胞生成物は生産されないだろう。第１細胞培養ステップは、例外的な短期間で多数倍にＴＣＲγδ＋Ｔ細胞を増殖するために使用され、Ｖδ２−γδＴ細胞が高度に富化された細胞生成物を生成する。実際、ＩＬ−２／ＩＬ−７／ＩＬ−１５−様成長因子の培地中の非存在は、この革新なしでは除去されない多くの不純物（他の細胞タイプ）の消失を許容する。それらがインターロイキン２／−１５／−７−様の成長因子と接触していないので、増殖されたＶδ２−γδＴ細胞はほとんど分化していない状態である。その後、より細胞毒性・より炎症促進性の表現型の方へ細胞を分化させるために、第１ステップで得られたＶδ２−γδＴ細胞は、インターロイキン４−様活性がある成長因子がない状態で、インターロイキン１５−様活性がある成長因子とＴ細胞マイトージェンを含む第２の培地において培養されなければならない。再び、第２の培地中のＩＬ−４の存在が細胞の生存率および細胞毒性の機能を減少させるので、これらの異なる成長因子が混合されないことは重大である。第２の培養ステップはさらに培養中のＶδ２−γδＴ細胞をさらに増殖させ、また多くの治療目的に使用することができる特殊な細胞生成物を生成して、よりよい作動細胞（effector cells）を作る。ＵＳ出願番号２００３／０１５７０６０  Ａ１（ＵＳ特許１０２３９８５４）：出願日０３．０４．２０００は、培養により増殖するＴＣＲγδ＋Ｔ細胞のための別の方法について記述する。この方法も２ステップを含んでいる。ここで出発サンプル中のＴＣＲγδ＋Ｔ細胞は、（１）Ｔ細胞マイトージェン、（２）インターロイキン２−様活性がある成長因子、および（３）インターロイキン７−様活性がある成長因子を含む第１の培地中で培養される。その後、第１ステップで得られた細胞は、（１）インターロイキン２−様活性がある成長因子、および（２）インターロイキン７−様活性を持っている成長因子を含む第２の培地中で培養され、ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞を増殖する。
【００８０】
対照的に、２つの培地は別個の目的に役立つので、２つの培養ステップは必ず異なるので、本発明は異なる。本発明は、明白に既に説明されていた理由により、第１培養ステップに対してインターロイキン２−様活性またはインターロイキン７−様活性を持っている成長因子の使用を除外する（上記参照）。本発明は第１のおよび／または第２の培地中での異なる成長因子の存在について記述するが、たとえば、インターフェロン−γ、ＩＬ−１βおよびＩＬ−２１のようなサイトカインをはじめとする、これらのサイトカインは、Ｖδ２−γδＴ細胞にそれらが及ぼす生理的効果が非常に異なるので、インターロイキン２−様またはインターロイキン７−様活性を持つと考えられない。例えば、インターフェロンγ、ＩＬ−１βおよびＩＬ−２１が存在し、ＩＬ−２、ＩＬ−７およびＩＬ−１５が非存在の状態で培養された細胞は、それらの十分な細胞毒性の機能および分化した状態を得ることができなかった。したがって、インターフェロン−γ、ＩＬ−１βおよびＩＬ−２１は、培養されたＶδ２−γδＴ細胞に対して、ＩＬ−２、ＩＬ−７およびＩＬ−１５によって引き起こされた高い炎症促進性の結果を模倣することができなかった（表２）。これらのサイトカインのうちのいくつか、たとえばインターフェロン−γおよびＩＬ−１βは、サイトカインの構造上異なるファミリーに属する。
本発明は今、次の例および図を参照して記述される。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１】図１は、磁気活性化された細胞選別（ＭＡＣＳ）前後の、健康なドナーから集められた末梢血サンプル中のＴＣＲγδ＋Ｔ  ＰＢＬｓのパーセンテージを示す。新鮮な末梢血の５０−１５０ｍｌが健康なボランティアから得られ、ＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｇｉｂｃｏ）で１：１比率（体積対体積）で薄められた。また１．５００毎分回転数および２５℃で３５分間、１：３（３部の薄められた血液と１部のフィコール）の体積比中でＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）中で遠心分離機にかけられた。単核細胞（ＰＢＭＣｓ）を含む中間層が集められ洗われた（ＰＢＳの中で）。合計のＴＣＲγδ＋Ｔ細胞は、磁気微小ビーズと結合された抗ＴＣＲγδｍＡｂで標識付けされ、ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞は、磁気カラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ｇｅｒｍａｎ）で分離された（７５％の純度以上に）。細胞は次の蛍光性のモノクローナル抗体で標識付けされた：抗ＣＤ３−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；ｃｌｏｎｅＳＫ７）；抗−ＴＣＲＶδ１−ＡＰＣ；（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、ｃｌｏｎｅ  ＲＥＡ１７３）抗マウスＩｇＧ１κ−ＡＰＣアイソタイプＣｔｒｌ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ；ｃｌｏｎｅＩＳ５−２１Ｆ５）。細胞はＦｏｒｔｅｓｓａ  ＩＩフローサイトメーター（BD Biosciences）上で分析された。６つの独立した実験の代表的結果を示す。
【００８２】
【図２】図２は、２ステップのＭＡＣＳ選別手続きの前後の、先に選ばれた健康なドナーから集められた末梢血サンプル中のＴＣＲγδ＋Ｔ  ＰＢＬｓのパーセンテージを示す。新鮮な末梢血の５０−１５０ｍｌが健康なボランティアから得られ、ＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｇｉｂｃｏ）で１：１比率（体積対体積）で薄められた。また１．５００毎分回転数および２５℃で３５分間、１：３（３部の薄められた血液と１部のフィコール）の体積比中でＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）中で遠心分離機にかけられた。単核細胞（ＰＢＭＣｓ）を含んでいる中間層は集められ洗われた（ＰＢＳの中で）。その後、望まれないＴＣＲαβ＋Ｔリンパ球は、ビオチン（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  Ｒｅｆ＃７０１−４８，ｃｌｏｎｅ  ＢＷ２４２／４１２）に結合した、ネズミ科の抗ヒトＴＣＲαβモノクローナル抗体（ｍＡｂ）が存在する状態でインキュベーションによって標識付けされた。その後、細胞は、磁気微小ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  Ｒｅｆ＃１７３−０１）に結合されたネズミ科の抗ビオチンｍＡｂで再び標識付けされた。最後に、細胞懸濁液は磁気カラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ｇｅｒｍａｎｙ）にロードされた。ＴＣＲαβ＋Ｔリンパ球は磁気的に消耗された（そして廃棄された）。それらのうちのほとんどはＴＣＲγδ＋Ｔ細胞である、残りの細胞集団の中にあるＣＤ３＋細胞は、超常磁性の鉄デキストラン粒子状物質に結合した、ネズミ科の抗ヒトＣＤ３  ｍＡｂ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  Ｒｅｆ＃２７３−０１、ＣＤ３ｅｐｓｉｌｏｎ鎖上に位置するエピトープをターゲットとした、ｃｌｏｎｅ  ＯＫＴ−３）で標識付けされた。細胞は磁気ＭＡＣＳ分離カラムにロードされた。また、ＣＤ３＋細胞は成功裏に選択された（純粋にされた）。細胞はＴＣＲγδ、ＣＤ３、ＴＣＲＶδ１およびＴＣＲＶδ２マーカーについて染色され、Ｆｏｒｔｅｓｓａ  ＩＩフローサイトメーター（BD Biosciences）で分析した。６つの独立した実験の代表的結果を示す。
【００８３】
【図３】図３は、試験された培養条件の要約を示す。Ａ−Ｃ．健康なドナーからのＴＣＲγδ＋  ＰＢＬｓは先に記載されたようにＭＡＣＳによって分離され、３７℃および５％のＣＯ２で、５％のヒト血清、１ｍＭ  Ｌ−グルタミンで補われた完全培地（Ｏｐｔｍｉｚｅｒ  ＣＴＳ、ＧＩＢＣＯ）中で、１００万個の細胞／ｍｌで９６−ウエルプレート中で培養した。細胞は、複数ウエルに等しく分配され、抗ＣＤ３  ｍＡｂおよびＩＬ−４、さらにＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５またはＩＦＮ−γの様々な濃度で補足したの３つの固定の組み合わせが存在する状態で培養された。同じ成長因子で補われた新鮮なメディアが５−６日ごとに加えられた。培養期間の終わりに、細胞が数えられた。また、細胞表現型は流動細胞計測法によって分析された。成長因子はそれぞれ、５００ナノグラム／ｍｌから０．１ナノグラム／ｍｌまで階段希釈で別々に使用された。グラフは、各サイトカイン（ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５およびＩＦＮ−γ）について、得られた最良の培養条件（つまりＶδ１＋細胞の中で最も高い倍率のエクスパンジョン）を示す。対照試料はＩＬ−４および抗ＣＤ３  ｍＡｂのみを含んでいた。Ｄ．  合計のＣＤ３＋  ＰＢＬｓは、同じドナーの末梢血から抗ヒトＣＤ３  ｍＡｂ（常磁性のビーズと組み合わされた）でＭＡＣＳによって分離され培養され、先に記載されたように分析した。３つの技術的繰り返しの±ＳＤの平均を示す。統計分析はＧｒａｐｈｐａｄ−Ｐｒｉｓｍ  ソフトウェアを使用して行なわれた。亜集団間の違いはステューデントｔ検定を使用して、評価され、有意の場合には、＊Ｐ＜．０５；＊＊Ｐ＜．０１；および＊＊＊Ｐ＜．００１として、図中に示される。
【００８４】
【図４】図４は、１５日間生体外の培養前後のＶδ１＋Ｔ  ＰＢＬｓのパーセンテージを示す。健康なドナーからのＴＣＲγδ＋  ＰＢＬｓは先に記載されたようにＭＡＣＳによって分離され、２００ナノグラム／ｍｌのＩＦＮ−γ、１μｇ／ｍｌのα−ＣＤ３、および１００ナノグラム／ｍｌのＩＬ−４が存在する状態で培養された。成長因子の同じ組み合わせを含む新鮮なメディアが５−６日ごとに加えられた。１５日目でのＦＡＣＳプロット分析を示す。３つの独立した実験の代表的結果を示す。
【００８５】
【図５】図５は、試験された細胞培養メディアのパネルを示す。健康なドナーからのＴＣＲγδ＋Ｔ  ＰＢＬｓは先に記載されたようにＭＡＣＳによって分離され、異なる市販の血清なしの臨床グレードの細胞培養メディア中で培養された。細胞は、７０ナノグラム／ｍｌのＩＦＮ−γ、１μｇ／ｍｌのα−ＣＤ３、および１００ナノグラム／ｍｌのＩＬ−４が存在する状態で第１の培地において培養された。次いで１００ナノグラム／ｍｌのＩＬ−１５および２μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３  ｍＡｂ（ＩＬ−４の非存在中の）が存在する状態で第２の培地で培養された。細胞最終数、および１５日目のＦＡＣＳ分析の後の細胞のパーセンテージを示す。３つの技術的繰り返しの±ＳＤの平均を示す。
【００８６】
【図６】図６は、Ｖδ１＋Ｔ細胞を生体外で増殖させ、培養中で優性の細胞サブセットになることを示す。７０ｍｌの濃縮末梢血（４５０ｍｌの末梢血に相当する）が、８人の健康なドナーから集められた８つの軟膜ユニットから得られた。血液は、希釈されずに、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で、１．６００毎分回転数および２５℃で３５分間、１：３（３部の血液と１部のフィコール）の体積比で遠心分離機にかけられた。単核細胞（ＰＢＭＣｓ）を含む中間層が集められ、洗われた（塩性のバッファー中で）。ＴＣＲγδ＋  ＰＢＬｓは先に記述された２ステップのＭＡＣＳによって分離され、５％の自己由来の血漿および１ｍＭ  Ｌ−グルタミンで補われた無血清培地（ＯＰＴＭＩＺＥＲ、ＧＩＢＣＯ）中で再懸濁された。細胞は０、５ｘ１０６細胞／ｍｌの濃度で接種され、ガス浸透性の閉じられた１Ｌの細胞培養プラスチック袋内で、３７℃および５％のＣＯ２のインキュベータ中で増殖された。成長因子は、先に記述された２ステップのプロトコルにより細胞培養メディアに加えられた：７０ナノグラム／ｍｌの抗ＣＤ３  ｍＡｂ、１００ナノグラム／ｍｌのＩＬ−４、７０ナノグラム／ｍｌのＩＦＮ−γ、７ナノグラム／ｍｌのＩＬ−２１および１５ナノグラム／ｍｌのＩＬ−１βが第１培地に加えられ、７０ナノグラム／ｍｌのＩＬ−１５、１００ナノグラム／ｍｌのＩＦＮ−γ、１５ナノグラム／ｍｌのＩＬ−２１および１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３  ｍＡｂが第２の培地に加えられた。古いメディアの部分は除去され、成長因子で補われた新鮮なメディアが、５−６日ごとに加えられた。アクセサリー「フィーダー」細胞はこのシステムで必要ではなかった。流動細胞計測法によって分析された合計の生存細胞間の、ＣＤ３＋Ｖδ１＋細胞のパーセンテージを左のパネルに示す。右のパネルは、最初の細胞数に対するＣＤ３＋Ｖδ１＋Ｔ細胞の絶対数の増加倍数を示す。生存細胞は、血球計数器でトリパンブルー色素排除試験法を使用して数えられた。細胞の数の３つの平均の測定値を示す。
【００８７】
【図７】図７は、生体外で増殖されたＶδ１＋Ｔ細胞での、いくつかの細胞表面マーカーの発現を示す。１６日間の培養の後の、ＣＤ３＋Ｖδ１＋Ｔ細胞の中の活性化レセプターＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４およびＮＫＧ２Ｄの発現（表８）。アイソタイプｍＡｂコントロール染色も示される（ＮＫｐ３０およびＮＫｐ４４発現のためのコントロールが同じであることに留意）。
【００８８】
【図８】図８は、生体外の増殖されたＴＣＲγδ＋Ｔ細胞が自己由来のＰＢＭＣｓに対してではなくＣＬＬ細胞に対して細胞毒性であることを示す。２１日間のエクスパンジョンおよび分化（図６に述べられていたように）の後、結果として生じたＴＣＲγδ＋Ｔ細胞は、３７℃で３時間、標的細胞（ラベルは、ＤＤＡＯ−ＳＥであらかじめ付けられた）とともに培養され、標的細胞死がＡｎｎｅｘｉｎ  Ｖ染色によって評価された。（Ａ）  敏感なＭＥＣ−１  ＣＬＬ細胞（上のパネル）および非敏感な自己由来のＰＢＭＣｓ（下のパネル）の流動細胞計測法分析。３つの技術的繰り返しの代表的なプロットを示す。（Ｂ）  異なる目標：作動細胞比率、およびＭＥＣ−１白血病細胞死滅でのＮＫＧ２ＤまたはＮＫｐ３０に対する阻止抗体のインパクト。エラーバーはＳＤ（ｎ＝３、＊Ｐ＜．０５）を表わす。（Ｃ）  増殖した（そして分化した）ドナーＡのＴＣＲγδ＋Ｔ細胞（「ＤＯＴ細胞」と呼ばれる）は、３つのＢ−ＣＬＬ主細胞サンプル（ＣＬＬ／ＳＬＬ患者の末梢血から集められ、ＭＡＣＳによってＣＤ１９が富化された）と、または自己由来の健康なＰＢＭＣｓと培養された。３つの技術的繰り返しの±ＳＤの平均を示す。
【００８９】
詳細な方法：
ＭＥＣ−１  ＣＬＬ細胞ｌｉｎｅ４６はＧｅｒｍａｎ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃ  Ｍａｔｅｒｉａｌ（ＤＳＭＺ）から得られた。ＭＥＣ−１腫瘍細胞は、１０％のＲＰＭＩ  １６４０、１０％のウシ胎児血清、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン中で、Ｔ２５フラスコにおいて培養されて、稀釈および１：３比率に３−４日ごとに分割することで、１０５から１０６の細胞／ｍＬで維持した。細胞毒性について、生体外で増殖されたＴＣＲγδ＋Ｔ細胞が、９６−ウエル丸底プレート内でプレートされた。腫瘍細胞株または白血病一次サンプルは、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ  Ｆａｒ  Ｒｅｄ  ＤＤＡＯ−ＳＥ（１μＭ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色され、示されたターゲット：エフェクター比率でＲＰＭＩ  １６４０媒体中のＴＣＲγδ＋Ｔ細胞と、３７℃で３時間、５％ＣＯ２で、７０ナノグラム／ｍｌのＩＬ−１５が存在する状態で培養した。その後、細胞はすべてＡｎｎｅｘｉｎ  Ｖ−ＦＩＴＣ（BD Biosciences）で染色され、流動細胞計測法によって分析された。
【００９０】
【図９】図９は、活性化されたＴＣＲγδ＋Ｔ細胞がハイ・レベルのＩＦＮ−γを生産することを示す。ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞は先に記載されたように、２ステップの培養プロトコルに従って、２１日間細胞培養バッグ中で２人の健康なドナーから生産された。細胞は洗われ、９６のウェルプレートにプレートされ、１００ナノグラム／ｍｌのＩＬ−１５および２μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３  ｍＡｂで補われた新鮮なメディアで再度刺激された。４８時間の後、細胞培養上澄みは血球計算ビーズ・アレイ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）による流動細胞計測法によって分析された。ＯｐＴｍｉｚｅｒは、活性化する化合物で補われないメディア中で維持された細胞を指す。３つの技術的繰り返しの±ＳＤの平均を示す。エラーバーはＳＤ（ｎ＝３、＊＊Ｐ＜．０１）を表わす。
【００９１】
【図１０】図１０は、ＣＬＬ／ＳＬＬ患者からのＴＣＲγδ＋Ｔ細胞が強健に生体外で増殖し、ＣＬＬ／ＳＬＬ細胞およびＣＭＶ感染細胞に対して高度に細胞毒性であることを示す。３人のＣＬＬ／ＳＬＬ患者からのＭＡＣＳでソートされたＴＣＲγδ＋  ＰＢＬｓは、先に記載されたように、サイトカインおよびｍＡｂで２１日間培養された。左のパネル：細胞はＴＣＲＶδ１／ＣＤ３共発現について流動細胞計測法によって分析された。また、ＣＤ３＋Ｖδ１＋Ｔ細胞の増加倍率が計算された。生存細胞は生存度染料（Ｚｏｍｂｉｅ  Ｖｉｏｌｅｔ；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を使用して流動細胞計測法によって同定され、血球計算器で数えられた。右のパネル：ＣＬＬ／ＳＬＬ患者からのＴＣＲγδ＋Ｔ細胞は、１：１０の目標−エフェクター比率で３時間、９６−ウエルプレートで、ＣＬＬ／ＳＬＬ由来のＭＥＣ−１細胞、または健康か、ＹＦＰ＋サイトメガロウィルス株ＡＤ１６９に感染したもののいずれかのヒト包皮繊維芽細胞（ＦＦＢ）と共培養された。（ｍ．ｏ．ｉ  ０．００５；エラーバーはＳＤ（各グループのｎ＝３）を表わす）。ＤＯＴ細胞とのインキュベーションの前の死んでいる腫瘍細胞のパーセンテージは各グループの中で約２０％だった。ＳＬＬは小リンパ球性リンパ腫である。
【００９２】
【図１１】図１１は、生体外の増殖されたＴＣＲγδ＋Ｔ細胞が、種々の組織起源の癌細胞に対して細胞毒性であることを示す。１人の健康なドナーからの末梢血ＴＣＲγδ＋Ｔリンパ球は、記述されたツーステップ培養プロトコルに従って、ＭＡＣＳソートされ、２１日間サイトカインおよび抗ＣＤ３ｍＡｂが存在する状態で生体外で刺激した。細胞は、腫瘍細胞株のパネルと９６−ウエルプレート中で３時間共培養された：ＭＯＬＴ−４（急性リンパ芽球性白血病；ＡＬＬ）；ＨＬ−６０（急性骨髄白血病；ＡＭＬ）；Ｋ５６２（慢性骨髄白血病；ＣＭＬ）；ＭＥＣ−１（慢性リンパ球性白血病；ＣＬＬ）；ＨＥＬＡ（子宮頚癌）；Ｄａｕｄｉ（バーキットリンパ腫）；ＴＨＰ−１（急性単球性白血病；ＡＭｏＬ）；ＭＤＡ−２３１（乳癌）、ＰＡ−１（卵巣癌）；ＰＣ３（前立腺癌）およびＨＣＴ１１６（結腸癌）。腫瘍細胞死はＡｎｎｅｘｉｎ−Ｖ染色（ｎ＝３、技術的な繰り返し）によって評価された。
【００９３】
【図１２】図１２は異種移植片腫瘍モデル中での注入されたＴＣＲγδ＋Ｔ細胞ホームおよび残存を示す（ｈｏｍｅ  ａｎｄ  ｓｕｒｖｉｖｅ）。Ａ．  ２ｘ１０７  ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞は、癌を持った（ＭＥＣ−１  ＣＬＬ＼ＳＬＬ細胞株）ＮＳＧの免疫不全の宿主へ転送された。ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞の転送の３０日後に、動物を殺した。ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞−後代（ｐｒｏｇｅｎｃｙ）は示された組織中のＦＡＣＳによって評価された。ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞が分析されたすべての組織に存在し、さらにそのＣＤ３＋Ｖδ１＋Ｔ細胞は高度に富化され、ＣＬＬ腫瘍が存在する状態での優先的な適合性および／または活性化を示唆した。ドット・プロットは分析された６匹の動物の代表的な動物からのものである。Ｂ．  注入されたＴＣＲγδ＋Ｔ細胞はＮＣＲを生体内で発現する。転送の後３０日目で肝臓から回収されたＴＣＲγδ＋Ｔ細胞は、ＮＣＲ発現についてＦＡＣＳによって分析された。ＮＫｐ３０とＮＫＧ２Ｄの高い発現に留意。トップのドット・プロットはアイソタイプ・コントロールである。分析された３匹の動物の代表的な動物のものが示される。Ｃ．  注入されたＴＣＲγδ＋Ｔ細胞はＢＲＧの免疫不全の宿主のホームとなることができる。異なるドナーからの１０７のＴＣＲγδ＋Ｔ細胞は、ＣＬＬ癌を持ったＢＲＧ宿主へ転送され、転送の７２時間後にＦＡＣＳによって定量された。ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞は肺および肝臓から回収され、最初のトランスファーに類似する比率でＴＣＲＶδ１＋−発現細胞が見いだされた。２匹の動物のうちの１匹が示される。
【００９４】
【図１３】図１３は、ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞が腫瘍増殖を生体内で制限することができることを示す。１０７  ルシフェラーゼ−発現ＭＥＣ−１  ＣＬＬ／ＳＬＬ腫瘍細胞は、免疫不全のＢＲＧ宿主へ皮下に転送された。転送の１０および１５日後に、１０７のＴＣＲγδ＋Ｔ細胞またはコントロールＰＢＳは、ルミネセンス分析によって検証されたＣＬＬ腫瘍を有する宿主にｉ．ｖ．で転送された。ＣＬＬ／ＳＬＬ腫瘍増殖はカリパスを使用して、周期的に測定された。腫瘍サイズが示される。ＣＬＬ腫瘍サイズ（１つのグループ当たりｎ＝８のハツカネズミ）においてＴＣＲγδ＋Ｔ細胞の影響をみることができる。
【００９５】
【図１４】図１４は、ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞がＣＬＬ腫瘍の広がりを制限することを示す。Ａ．  １０７個のルシフェラーゼを発現するＭＥＣ−１  ＣＬＬ／ＳＬＬ腫瘍細胞が、免疫不全のＮＳＧ宿主へ皮下に転送された。転送の１０および１５日後に、２ｘ１０７のＴＣＲγδ＋Ｔ細胞またはコントロールＰＢＳは、ルミネセンス分析によって検証されたＣＬＬ／ＳＬＬ腫瘍を有する宿主にｉ．ｖ．で転送された。ＣＬＬ／ＳＬＬ腫瘍増殖はカリパスを使用して、周期的に測定された。腫瘍サイズが示される。治療の初期の部分的・一時的な傾向に初期に注意したが、ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞はこれらの宿主の中のより速い大量のＣＬＬ／ＳＬＬ腫瘍増殖を制限することができなかった。Ｂ−Ｄ．  ＣＬＬ／ＳＬＬ腫瘍ラインはこれらの実験中で他の器官に広がることができる。Ｂの中で示されるプロットは、ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞あるいはコントロールＰＢＳの転送を受け取ったＮＳＧ宿主から実験の終わりに回収された器官のＦＡＣＳ分析を表す。我々は、異なる器官で回収されたＣＬＬ／ＳＬＬ腫瘍細胞の一般的な低減を観察した。しかし、この結果は、肝臓（このモデル中で腫瘍拡散の主な器官）においてより明白だった。Ｃ．  各グループからの代表的な動物の組織学（Ｈ＆Ｅ）分析は、ＰＢＳ処理された動物の示された解剖の部位でのＣＬＬ／ＳＬＬ腫瘍転移、および処理された動物での腫瘍浸潤細胞の非存在を示す。（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１）。  図中、「ｔｕｍｏｕｒ」は「腫瘍」、「ｒｅｎａｌ  ｐａｐｉｌｌａ」は「腎乳頭」、「ｇｏｎａｄａｌ  ａｄｉｐｏｓｅ  ｔｉｓｓｕｅ」は「生殖腺脂肪組織」、「ｐａｎｃｒｅａｓ」は「膵臓」である。Ｄ．  組織学の分析の要約は、ＣＬＬ／ＳＬＬ腫瘍浸潤細胞が腫瘍浸潤細胞がない動物に対して見つかった、各グループからの動物を示す。スコアリングは、図１５に表された実験中の動物からの示された組織からのＨ＆Ｅ染色された組織学のサンプルについて病理学者によってブラインドで行なわれた。結果は分析されたすべての動物について示され、生体外で増殖されたＴＣＲγδ＋Ｔ細胞で処理された動物のグループ中での、全面的な腫瘍の転移の明瞭な低減を示す。
【００９６】
【図１５】図１５は、ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞が主腫瘍に浸透することができ生体内で活性化されることを示す。Ａ．  ＭＥＣ−１腫瘍細胞が転送され、ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞で処理されたＮＳＧ動物からの主ＣＬＬ／ＳＬＬ腫瘍のＣＤ３染色された部分のＩＨＣ分析が示される。図中、「ｔｕｍｏｕｒ  ｍａｒｇｉｎ」は「腫瘍境界」である。Ｂ．  我々は異なる器官において生体内のＣＤ６９（ｎ＝３、代表的なドット・プロットが示される）、Ｎｋｐ３０およびＮＫＧ２Ｄ発現（ｎ＝２）を分析し、ＣＬＬ／ＳＬＬ腫瘍から回収されたＴＣＲγδ＋Ｔ細胞の中のこれらの活性化マーカーの主な発現と共に、近時に活性化されたＴＣＲγδ＋Ｔ細胞を見つけた。
【００９７】
【図１６】図１６は、血液サンプルの生化学分析を示す。（Ａ）  血液は図１４および実験からの動物から検死の時に集められ、アラニン−アミノ基転移酵素（ＡＬＴ／ＧＰＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ／ＧＯＴ）、血液尿素性窒素（ＢＵＮ）、クレアチニン、クレアチンホスホキナーゼ活性値（ＣＰＫ）および乳酸塩脱水素酵素（ＬＤＨ）について、生化学分析が行なわれた。（Ｂ）  図１１に示される動物について、Ａと同様に行われた。我々は、毒性を立証する証拠をＤＯＴ細胞治療に関係して見つけなれなかった。
【００９８】
生体内の研究の詳細な方法：Ｂａｌｂ／ｃ、Ｒａｇ−／−、γｃ−／−４７の動物がＴａｃｏｎｉｃ（アメリカ）から得られた；ＮＯＤ−ＳＣＩＤγｃ−／−４８のハツカネズミがＪａｃｋｓｏｎ研究所（アメリカ）から得られた。ＢＲＧまたはＮＳＧのハツカネズミはＭＥＣ−１細胞で皮下注射され、１０７または２ｘ１０７  ＤＯＴ細胞の２つの静脈内への転送の６および１１日後に処理された。そして次に、詳述されるように分析された（腫瘍サイズ、組織学、腫瘍または器官の浸潤細胞の流動細胞計測法および血液生化学）動物手続きはすべて、Ｄｉｒｅｃａｏ  Ｇｅｒａｌ  ｄｅ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｉａからの全国ガイドラインへ一致して行なわれ、適切な倫理委員会によって承認された。生体内でのＤＯＴ細胞転送後に表現型で表すために、心臓破裂による血液収集のために動物はＥｕｔａｓｉｌを使用して安楽死させられた。そして、迅速にＰＢＳ＋ヘパリンで覆われた。器官は均質化され、７０μＭ細胞ストレーナ中で洗われた。大腿骨はフラッシュされ、次に、ろ過した。その後、細胞はｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，Ｍｙｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  またはＢｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏからの次の抗体で染色された：抗マウスＣＤ４５（３０−Ｆ１１）、および抗ヒト：ＣＤ４５（ＨＩ３０）。使用される他の抗体は、生体外の研究で一般的である。抗体は、ＦＩＴＣ、ＰＥ、ＰｅｒＣＰ、ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５、ＰＥ−Ｃｙ７、ＡＰＣ、ＡＰＣ−Ｃｙ７パシフィック・ブルー、ブリリアントバイオレット４２１およびブリリアントバイオレット５１０蛍光色素に結合された。統計分析はＧｒａｐｈｐａｄ−Ｐｒｉｓｍ  ソフトウェアを使用して行なわれた。サンプル平均は、アンペアードスチューデントのｔ検定を使用して比較された。Ｆ検定を使用して、２つのサンプルの変化が異なる場合、データは対数変換された。また、その後、変化が異ならないと分かった場合、アンペアードｔ検定が対数変換されたデータに適用された。生存データについては、ログランク（マントルピース・コックス）テストが使用された。
【００９９】
生体内の実験計画：
我々は、ＣＬＬ／ＳＳＬ由来のＭＥＣ−１細胞の、ＮＯＤ−ＳＣＩＤγｃ−／−（ＮＳＧ）動物を宿主として使用してさらに応用される、Ｂａｌｂ／ｃＲａｇ−／−γｃ−／−（ＢＲＧ）の、皮膚下の養子免疫細胞移入の際に異種移植されたヒトＣＬＬの以前に記述されたモデルを使用した。治療またはＰＢＳコントロールを受ける動物が担癌動物であることを保証するために、我々は、治療細胞に帰着する前の初期の時間ポイントで腫瘍移植を検知し測定するために、ホタルルシフェラーゼでＭＥＣ−１  ＣＬＬ細胞を変換した。７日か４日（異なる研究で）後に、我々はルシフェリンをｉ．ｐ注射し、治療（あるいはＰＢＳコントロール）を帰着する前に、動物へのルミネセンスの機能としての腫瘍ロードを決定した。動物は、かごの中で任意に分配され、最も高いルミネセンスを備えた動物が治療を受け、第２の最も高いものがＰＢＳ処理され、第３に高いものが治療を受けるように、７日目で測定されたルミネセンスによって各治療（ＰＢＳまたはＤＯＴ細胞）に割り当てられた。これは、無作為化されていない分布のグループ化だが、異なるかごの中での無作為化の分布に帰着する。２匹の追加の動物が最初のホーミング分析のための示された実験でＤＯＴ細胞を受け取った。我々は１つの実験当たり１つの異なるドナーからの細胞を使用して、２つの１０７または２ｘ１０７  ＤＯＴ細胞トランスファー（５日以内）を行なった。腫瘍はカリパスを使用し、３つの垂直の測定により測定された。使用される式は１／２  ｘ  Ｌ  ｘ  Ｗ  ｘ  Ｈだった４９。腫瘍測定が１０００ｍｍ３に達した時、動物を殺した。
【０１００】
ルミネセンス分析：
ＧＦＰホタルルシフェラーゼでのＭＥＣ−１細胞株の形質導入の後、細胞成長が、ＦＡＣＳ−Ａｒｉａ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（アメリカ））を使用して、ＧＦＰ陽性細胞の最大＞９５％まで、ＧＦＰ発現によってスリーニングされソートされた。その後、宿主動物へ皮下で転送される（５０μｌ  ＰＢＳ中）まで、これらの細胞は培養中で維持された。転送後の示された時間ポイントでは、動物は麻酔をかけられ（Ｋｅｔａｍｉｎ／Ｍｅｄｅｔｏｍｉｄｉｎｅ）。また、ルシフェリンが注射された（ｉ．ｐ．）。４分後のルシフェラーゼ活性が、ＩＭＭバイオ画像診断設備でＩＶＩＳ管腔（カリパスＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、検知され得られた。その後、麻酔から覚め、動物は前のハウジングに返された。
【０１０１】
リンパ球数：
細胞数は血球計数器で数えられたか、またはＡｃｃｕｒｉフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（アメリカ））を使用して数えられた。器官の部品を組織学の分析のためにサンプリングし、サンプルの分裂の前後に器官を秤量することにより、１つの器官当たりの数が評価された。その後、示された数は、全体の器官に対して修正される。骨髄データでは、絶対数が計算され、１つの大腿骨について表示される。
【０１０２】
組織病理学と免疫組織化学：
麻酔の過剰服用でハツカネズミを殺した。検死が行なわれ選択された器官（肺、心臓、腸、ひ臓、肝臓、腎臓、生殖器官、脳、小脳、脊髄および大腿骨）を採取し、１０％の中性緩衝ホルマリン中で固定されて、パラフィン中に埋められ、３μｍのセクションがヘマトキシリン‐エオジン（Ｈ＆Ｅ）で染色された。骨はさらにＣａｌｃｉ−Ｃｌｅａｒ（登録商標）中で脱灰された後、埋められた。組織セクションは、ライカＭＣ１７０  ＨＤ顕微鏡カメラにつながれたライカＤＭ２５００顕微鏡の中で実験群に対してブラインドで病理学者によって考察された。ＣＤ３（Ｄａｋｏ，ｃａｔ．ｎｏ．Ａ０４５２）のための免疫組織化学の染色は、Ｄａｋｏ  Ａｕｔｏｓｔａｉｎｅｒ  Ｌｉｎｋ  ４８で、標準プロトコルを使用して、ＩＭＭのＨｉｓｔｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙによって行なわれた。抗原熱検索は低ｐＨ溶液（ｐＨ  ６）とＤＡＫＯ  ＰＴリンク中で行なわれ、ＥＮＶＩＳＩＯＮキット（ペルオキシダーゼ／ＤＡＢ検出システム、ＤＡＫＯ、Ｓａｎｔａ  Ｂａｒｂａｒａ、ＣＡ）でインキュベーションし、ついでＨａｒｒｉのヘマトキシリンカウンター染色（Ｂｉｏ  Ｏｔｉｃａ，Ｍｉｌａｎ，ＩＴ）をした。負の対照では、主抗体が非存在だった；また、ＣＤ３染色は負の対照では観察されなかった。イメージはライカＭＣ１７０  ＨＤ顕微鏡カメラに取り付けられたライカＤＭ２５００顕微鏡で得られた。
【０１０３】
マウス血液生化学：ハツカネズミは深く麻酔をかけられた。また、血液は心臓からヘパリンコートされたチューブに集められ、独立した研究所で示された生化学のパラメーターの分析のために送られた。生化学パラメーターはＲＸ  ｍｏｎａｃｏ臨床化学アナライザー（ＲＡＮＤＯＸ）で血清中で測定された。
【０１０４】
【図１７】図１７はツーステップＭＡＣＳソートの後のＴＣＲγδ＋  ＰＢＬｓ富化を示す。末梢血（軟膜から得られた）は４人の健康なボランティアから集められた。また、合計のＴＣＲγδ＋Ｔ細胞はＭＡＣＳによって分離された：最初に、ＴＣＲαβ消耗が行なわれた。次に、ＣＤ３＋細胞はポジティブに選択された。細胞はＴＣＲγδ、ＣＤ３およびＴＣＲＶδ１について染色され、流動細胞計測法によって分析された。ドット・プロットは、各ＭＡＣＳソートステップの前後のＴＣＲγδ＋  ＰＢＬｓのフラクションを示す（左のパネル）；またＶδ１＋Ｔ細胞の最初と最終パーセンテージを示す（右のパネル）。
【０１０５】
【図１８】図１８は、得られたＶδ１＋Ｔ細胞の活性化および成熟表現型の特性を示す。（Ａ）  培養（以前に記述された２ステップの培養プロトコルを使用して）の２１日目のＶδ１＋Ｔ細胞の細胞表面表現型の流動細胞計測法比較；ＬＥＧＥＮＤＳｃｒｅｅｎキット（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を使用して分析された時（実線）、および新鮮に分離したＶδ１＋Ｔ細胞（点線）。リンパ球活性化と分化と関係するいくつかのマーカーのためのヒストグラム・オーバーレイ、および接着と移動に関与するマーカーが示される。１人の健康なドナーからの細胞が示される。（Ｂ）  ヒートマップは新鮮分離したＶδ１＋Ｔ細胞（ドナー１および２から）と比較した、４人の異なる健康なドナー（Ｃｕｌｔｕｒ．１−４）から生産された、培養されたＶδ１＋Ｔ細胞（培養の２１日目）にわたる各表面マーカーの陽性細胞のパーセンテージを示す。カラー・コードは右側に示される。
【０１０６】
細胞生産の後の表現型について：
細胞は、ＬｅｇｅｎｄＳｃｒｅｅｎキット（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を使用して、抗−ＣＤ３−ＡＰＣ（ｃｌｏｎｅＵＣＨＴ１）、抗ＴＣＲＶδ１ＦＩＴＣ、およびレセプターのパネルが染色された。
【０１０７】
【図１９】図１９は、白血病患者（健康でない）細胞に対するＴＣＲγδ＋Ｔ細胞のＴＣＲ／ＮＣＲ依存の細胞毒性を示す。２人の健康なドナー（以前に記述された２ステップの培養プロトコルを使用して）から生産された増殖されて分化したＴＣＲγδ＋Ｔ細胞は、示された（α、ａｎｔｉ−）分子に関するブロッキング抗体の存在下で、エフェクター／目標割合（左プロット、灰色の棒）の増加についてＭＥＣ−１（ＣＬＬ）標的細胞に対する異なる実験が、個々（実験１）にまたは組み合わせ（実験２）でテストされた。最も高いエフェクター／目標割合（１０：１）が実験をブロッキングするのに使用された。また、この比率（ＩｇＧアイソタイプ抗体を備えた）の灰色の棒はコントロールとして示された。死んでいる（Ａｎｎｅｘｉｎ−Ｖ＋）ＭＥＣ−１標的細胞のパーセンテージが示される。＊  および＃は、ＩｇＧアイソタイプ・コントロールまたはα−ＴＣＲＶδ１に関する有意差を示す（平均＋ＳＤ；＊，＃  ｐ＜０．０５；＊＊，＃＃ｐ＜０．０１；スチューデントｔ検定）。
【０１０８】
細胞毒性について、ＭＥＣ−１腫瘍細胞は、１０％のウシ胎児血清および２ｍＭ  Ｌ−グルタミンを備えた完全な１０％のＲＰＭＩ  １６４０の中でＴ２５フラスコに内において培養された。稀釈によって１０５から１０６細胞／ｍＬで維持し、３−４日ごとに１：３の比率で分けられた。生体外の増殖されたＴＣＲγδ＋Ｔ細胞は９６ウェル丸底プレート中で培養された。腫瘍細胞は、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ  Ｆａｒ  Ｒｅｄ  ＤＤＡＯ−ＳＥ（１  μＭ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色され、示された目標：エフェクター比率で、３７℃で３時間、５％のＣＯ２で、７０ナノグラム／ｍｌのＩＬ−１５が存在する状態で、ＲＰＭＩ  １６４０培地中でＴＣＲγδ＋Ｔ細胞をインキュベートした。レセプター・ブロッキングについては、γδＰＢＬｓは、以下の阻止抗体で１時間あらかじめインキュベートされた：ヒト抗ＴＣＲγδ；（ｃｌｏｎｅＢ１）ヒト抗ＮＫＧ２Ｄ（ｃｌｏｎｅ１Ｄ１１）；ヒト抗ＣＤ２（ｃｌｏｎｅＲＰＡ−２．１０）；ヒト抗ＣＤ３（ｃｌｏｎｅＯＫＴ−３）；ヒト抗ＮＫｐ３０（ｃｌｏｎｅＰ３０−１５）；ヒト抗ＮＫｐ４４（ｃｌｏｎｅＰ４４−８）、マウスＩｇＧ１、ｋ（ｃｌｏｎｅＭＯＰＣ−２１）、マウスＩｇＧ２ｂ（ｃｌｏｎｅＭＰＣ−１１）、マウスＩｇＧ３ｋ（ｃｌｏｎｅＭＧ３−３５）、すべてはＢｉｏｌｅｇｅｎｄから得られた。ヒト抗ＣＤ２２６（ｃｌｏｎｅＤＸ１１）はＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから得られた。ヒト抗Ｖδ１  ＴＣＲ（ｃｌｏｎｅＴＣＳ−１またはＴＳ８．２）はＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから得られた。また、ヒト抗ＴＣＲγδ（ｃｌｏｎｅＩＭＭＵ５１０）はＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから得られた。阻止抗体はキリング分析中に培地中で維持された。その後、最後に、細胞はすべてＡｎｎｅｘｉｎ  Ｖ−ＦＩＴＣ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で染色され、流動細胞計測法によって分析された。
【０１０９】
【図２０】図２０は、生体外の増殖されたＶδ１＋およびＶδ１Ｖδ２−Ｔ細胞の中の活性化細胞表面ＮＫレセプターの発現を示す。増殖されて分化したＴＣＲγδ＋Ｔ細胞は以前に記述された２ステップの培養プロトコルを使用して、健康なドナーから生産された。２１日間の培養の後の、ＣＤ３＋  Ｖδ１＋細胞、およびＣＤ３＋  Ｖδ１−  Ｖδ２−  Ｔ細胞中の活性化レセプターＮＫｐ３０およびＮＫｐ４４の発現を示す。最初に、ＣＤ３＋Ｖδ２＋細胞は同定され（蛍光色素に結合した抗ＣＤ３および抗Ｖδ２  ｍＡｂｓで）、分析から除外された。残るＣＤ３＋細胞は、Ｖδ１、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４およびアイソタイプ・コントロールの発現について分析された。４つの異なるドナーの４つの独立した実験の代表的結果を示す。
【０１１０】
【図２１】図２１は、ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞の増殖されたＶδ１Ｖδ２−Ｔ細胞サブセットの白血病細胞に対する細胞毒性を示す。１人の健康なドナー（以前に記述された２ステップの培養プロトコルを使用して）から生産された、増殖されて分化したＴＣＲγδ＋Ｔ細胞は、ＣＤ３、Ｖδ１およびＶδ２  Ｔ細胞マーカーについて蛍光色素に結合したモノクローナル抗体で染色され、ＣＤ３＋Ｖδ１−Ｖδ２−Ｔ細胞集団は流動細胞計測法によって分離された。その後、分離された細胞は、１０：１のエフェクター／目標割合で急性骨髄白血病（ＡＭＬ）標的細胞株（ＫＧ−１、ＴＨＰ−１、ＨＬ−６０およびＮＢ−４）に対して、生体外のキリング分析でテストされた。キリング分析は、先に記載されたように行なわれた。
【０１１１】
表１は、最適化段階中にＶδ１＋Ｔ細胞の増殖を刺激するために使用された分子を示す。試薬は、０．１ナノグラム／ｍｌから８０μｇ／ｍｌまでの濃度範囲で使用された。
右欄は試薬の供給者またはメーカーを示す。
【０１１２】
表２は、試験された培養状態の要約を示す。ＴＣＲγδ＋  ＰＢＬｓは健康なドナーからＭＡＣＳによって分離され、９６ウェルプレート中、１００万個の細胞／ｍｌで、３７℃および５％のＣＯ２で培養された。細胞は、５％の自己由来の血漿、１ｍＭ  Ｌ−グルタミン、および記述された成長因子で補われた完全培地（Ｏｐｔｍｉｚｅｒ  ＣＴＳ、ＧＩＢＣＯ）で増殖された。培養期間の終わりに、細胞は数えられた。また、細胞表現型は流動細胞計測法によって分析された。連続した４つの実験の選択された結果を示す。各実験での最良の培養状態は増加倍数によって格付けされる。Ｖδ１＋Ｔ細胞の増加倍率は次のように計算された：（培養の終わりのＶδ１＋Ｔ細胞の絶対数）／（培養の０日目のＶδ１＋Ｔ細胞の絶対数）
２つの独立した実験の代表的結果を示す。
【０１１３】
表３は、試験された培養状態の要約を示す。ＴＣＲγδ＋  ＰＢＬｓは健康なドナーからＭＡＣＳによって分離され、記述された成長因子が存在する状態で１４日間培養された。培養の１４日目で、細胞は分けられた：細胞の１つのフラクションは前のように培養された。一方で細胞の別のフラクションは、ＩＬ−４がない状態および示された成長因子が存在する状態で培養された。２１日目で、細胞は数えられた。また、細胞表現型はＦＡＣＳによって分析された。２つの独立した実験からの代表的結果を示す。細胞毒性分析も、ＭＯＬＴ−４白血病目標に対する生成されたＴＣＲγδ＋細胞を使用して、２１日目で行なわれた（方法は図８に述べられている）。アポトーシス（死滅）標的細胞はＦｏｒｔｅｓｓａ  ＩＩ流動細胞計測法機械（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によりＡｎｎｅｘｉｎ−Ｖ試薬で陽染色によって検知された。基礎の腫瘍細胞死（つまりＴＣＲγδ＋細胞と共同培養されなかった腫瘍サンプル中のアポトーシスの腫瘍細胞のパーセンテージ）は、１０±３％だった。２つの技術的な複製の平均を示す。
【０１１４】
表４は、試験された培養状態の要約を示す。ＴＣＲγδ＋  ＰＢＬｓは健康なドナーからＭＡＣＳによって分離され、記述された成長因子が存在する状態で２ステップおよび３ステップの培養プロトコルで１５日間培養された。培養期間の終わりに細胞は数えられ、また細胞表現型はにＦＡＣＳによって分析された。２つの独立した実験の代表的結果を示す。
【０１１５】
表５は、試験された培養状態の要約を示す。ＴＣＲγδ＋ＰＢＬｓは健康なドナーから２ステップ・プロトコルでＭＡＣＳによって分離され、記述された成長因子が存在する状態で２１日間培養された。培養期間の終わりに細胞は数えられ、また細胞表現型はにＦＡＣＳによって分析された。２つの独立した実験の代表的結果を示す。
【０１１６】
表６は、ツーステップＭＡＣＳプロトコルによって分離されたＴＣＲγδ＋  ＰＢＬｓの純度および表現型を示す。ＰＢＭＣｓはフィコール中の密度勾配遠心法によって８人の健康なドナーから集められた軟膜生成物から得られた。ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞は、図２に述べられているようなツーステップＭＡＣＳプロトコルによってさらに分離された。細胞表現型は、細胞表面抗原の流動細胞計測法分析によってキャラクタライズされた。データは合計の生存細胞のパーセンテージに相当する。
【０１１７】
表７は、生体外の増殖されたＴＣＲγδ＋Ｔ細胞の純度および表現型を示す。健康なドナー（表６と同じ）からのＭＡＣＳソートされたＴＣＲγδ＋Ｔ細胞は、以前に記述されたツーステップ培養プロトコルにより細胞培養バッグの中で２１日間培養された。細胞集団は流動細胞計測法によってキャラクタライズされた。培地の中にある合計の生存細胞に対する、ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞および汚染細胞のパーセンテージを示す。
【０１１８】
表８は、新鮮に分離されたものと培養されたＶδ１＋Ｔ細胞における、ＮＣＲとＮＫＧ２Ｄの発現を示す。１６日か２１日間のサイトカインおよび抗ＣＤ３  ｍＡｂ処理の後の、ＣＤ３＋Ｖδ１＋Ｔ細胞中の活性化レセプターＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４およびＮＫＧ２Ｄの発現。この表の中のデータは、１０の独立したドナーから得られたデータを示す。ＮＫｐ３０およびＮＫｐ４４の発現は、様々なドナーの間で約１０％と７０％の間で変化する一方、ＮＫＧ２Ｄがすべての試験されたドナーのＶδ１＋ＰＢＬｓの８０％以上で発現された。
【０１１９】
表９は、ＣＬＬ／ＳＬＬ患者からの、プレ−およびポスト−ＭＡＣＳソートされたＴＣＲγδ＋  ＰＢＬｓの純度および表現型を示す。Ｂ細胞性慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）細胞は説明と同意および施設内治験審査委員会承認の後に第１のプレゼンテーションで患者の末梢血から得られた。ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞は３つのＣＬＬ患者（ＣＬＬ−１−３）の末梢血からＭＡＣＳソートされた。また、細胞集団表現型は、細胞表面抗原の流動細胞計測法分析によりキャラクタライズされた。２ステップ磁気分離の直前およびその後に得られたＴＣＲγδ＋Ｔ細胞および汚染物質細胞のパーセンテージを示す。細胞サブセットはそれぞれ合計の生存細胞上でゲーティッド（ｇａｔｅｄ）された。
【０１２０】
表１０は、汚染物質の自己由来のＢ−ＣＬＬ細胞が培養中の残余の集団になることを示す。ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞は、３つのＣＬＬ／ＳＬＬ患者（ＣＬＬ−１−３；表９にのように）の末梢血からＭＡＣＳソートされ、先に記載されたように１６日間生体外で培養された。細胞集団表現型は、細胞表面抗原の流動細胞計測法分析によりキャラクタライズされた。ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞および汚染物質細胞のパーセンテージを示す。Ｖδ１＋Ｔ細胞の上でゲーティッドされたＮＫｐ３０およびＮＫＧ２Ｄ発現以外の、細胞サブセットはそれぞれ合計の実際の細胞上でゲーティッドされる。
【０１２１】
表１１は、前の出願の表２に示された試験された培養状態をより詳細に示す。ＴＣＲγδ＋ＰＢＬｓは健康なドナーからＭＡＣＳによって分離され、９６ウェルプレート中で１００万個の細胞／ｍｌ、および３７℃および５％のＣＯ２で培養された。細胞は、５％の自己由来の血漿、１ｍＭ  Ｌ−グルタミン、そして記述された成長因子で補われた完全培地（Ｏｐｔｍｉｚｅｒ  ＣＴＳ、ＧＩＢＣＯ）において増殖された。培養期間の終わりに、細胞は数えられた。また、細胞表現型は流動細胞計測法によって分析された。連続４つの実験（前の出願の表２に述べられていたものと同じ実験、さらに結果についてのより完全な理解のために星印で印をつけて並列のコントロール培養状態の結果を開示する）の選択された結果を示す。さらに、それは、各条件で得られたＮＫｐ３０＋Ｖδ１＋Ｔ細胞のパーセンテージを示す。各実験中の培養状態は増加倍率によって格付けされた。Ｖδ１＋Ｔ細胞の増加倍率は次のように計算された：
（培養の終わりのＶδ１＋Ｔ細胞の絶対数）／（培養の０日目のＶδ１＋Ｔ細胞の絶対数）
２つの独立した実験の代表的結果を示す。
【０１２２】
表１２は、試験された培養状態の要約を示す。示された成長因子が存在する状態で、以前に述べられていたように、ＴＣＲγδ＋  ＰＢＬｓは健康なドナーから分離され増殖された。多数の培養状態の１つの実験の選択された結果を示す。ＩＬ−１５／ＩＬ−２／ＩＬ−７およびＩＦＮ−γの培養されたＴＣＲγδ＋細胞への影響をより理解するために、ＴＣＲγδ＋細胞は、ＩＬ−１５／ＩＬ−２／ＩＬ−７およびＩＦＮが存在する状態または存在しない状態で、ＩＬ−４および抗ＣＤ３  ｍＡｂの３つの異なる濃度の培地で培養された。これらの細胞がＩＬ−４およびＩＦＮが存在する状態で培養された時、ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞発現へのＩＬ−１５、ＩＬ−２およびＩＬ−７の有害作用を示す。２つの独立した実験の代表的結果を示す。
【０１２３】
表１３は、大規模２ステップの細胞培養プロトコル前後に得られたＴＣＲγδ＋細胞の絶対数の合計を示す。健康なドナー（図６に表わされた）から得られた、ＭＡＣＳソートされた末梢血ＴＣＲγδ＋細胞は、細胞培養エクスパンジョン／分化前後に血球計数器で数えられた。軟膜はそれぞれ４５０ｍｌの末梢血から濃縮され、約４５０−５５０ｘ１００万のＰＢＭＣｓを含んでいた。平均では、各軟膜からＭＡＣＳによって１７００万のＴＣＲγδ＋Ｔ細胞を集めることができる。しかしながら、将来の臨床応用では、出発サンプルは多くの細胞を含み、アフェレーシス機械によって集められる白血球除去血輸血生成物だろう。従来の研究では、白血病患者から集められた非刺激白血球除去血輸血生成物（unstimulated leukapheresis products）は、平均で１３．４ｘ１０９（４．４−２０．６ｘ１０９の範囲）の末梢血赤血球を含み、および約１億６０００万のＴＣＲγδ＋Ｔ細胞（１．０−３．０ｘ１０８の範囲）がＭＡＣＳの後に得られた（Ｗｉｌｈｅｌｍ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ  ａｄｏｐｔｉｖｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈａｐｌｏｉｄｅｎｔｉｃａｌ  ｇａｍｍａｄｅｌｔａ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ，２０１４．１２：ｐ．４５．）。これは、平均で、軟膜で得られた最初の細胞の約９倍である。従って、もし白血球除去血輸血生成物が出発サンプルとして使用されれば、同じ培養系で生成される細胞の平均概算数は、約１０、２ｘ１０９細胞（３．９ｘ１０９−１４．４ｘ１０９細胞）である。
【０１２４】
表１４は、製薬等級ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞を生産するのに使用した試薬と材料を示す。
【０１２５】
実施例
ヒトＶδ１＋ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞の生体外のエクスパンジョンの最適化
発明者は、生体外で培養されたＶδ２−γδＴ細胞のエクスパンジョンと純度のレベルを改善することを目標とする一連の実験を行なった。ＴＣＲのＶδ３＋鎖に対して市販の抗体がなかったので、抗ＴＣＲＶδ１  ｍＡｂは細胞サンプル中のＶδ１＋Ｔ細胞を同定するために培養最適化段階中に使用された。健康なドナーのパネルからのＴＣＲγδ＋Ｔ  ＰＢＬｓはＭＡＣＳによって分離され、ＩＬ−２およびＰＨＡでの生体外の刺激へのそれらの反応（つまり細胞活性化および増殖の検知できる変化）についてテストした。反応性のＶδ１＋  ＰＢＬｓを持った１つのドナーは残りの最適化研究に血液サンプルを提供するために選ばれた。より信頼できる比較が異なる実験中で得られた結果間で行なわれることができるので、固定の健康なドナーに対する偏好は重要だった。選ばれたドナーは、末梢血中のＴＣＲγδ＋Ｔ細胞の正常な（しかし高い）割合（ＰＢＬｓの合計の１０％−１２％）を持っていた。しかし、Ｖδ１＋  ＰＢＬｓの割合は非常に低かった（ＰＢＬｓの合計の０．３％、または合計のＴＣＲγδ＋Ｔ  ＰＢＬｓの３．０％；図１）。彼は、培養されたＶδ１＋Ｔ細胞の最終の数および純度レベルでのすべての少しの改善が、流動細胞計測法によって容易に検知されることができるので、これらの実験の中で使用する適切なドナーと考えられた。
【０１２６】
ＰＢＭＣｓからＴＣＲγδ＋Ｔ細胞を分離するために使用されたシングル・ステップＭＡＣＳプロトコルは、非常に効率的で、非常に純粋な細胞集団を生成した（図１）。しかしながら、１つの重大な試薬（つまりＭｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃからの磁気微小ビーズと結合したヒト抗ＴＣＲγδｍＡｂ）は、臨床応用のために現在承認されない。そのような試薬の臨床等級の生産、確認および規定による承認は、長年かかる場合がある。また、この問題は、臨床応用中での記述されたプロトコルの即時の使用を防ぐだろう。異なるが、ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞を分離する等価な方法がその後開発され採用された。図２に述べられているように、そのプロセスは２ステップの磁気細胞分離から成った。得られたＴＣＲγδ＋Ｔ細胞の最終の純度レベルは前の（シングル・ステップ）方法よりも低かったが、細胞培養にはまだ受理可能だった。重要なことには、この新しい細胞単離方法は、臨床応用のために既に承認されていた試薬だけを使用した（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＧｍｂＨ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。
【０１２７】
その後、発明者は、末梢血からＶδ１＋Ｔ細胞を増殖し分化する（２−３週以上）キャパシティーに関して、臨床等級のアゴニスト抗体およびサイトカインの多数の組み合わせをテストした。以前に選ばれた健康なドナーから集められた、ＭＡＣＳにソートされたＴＣＲγδ＋  ＰＢＬｓは、分子を活性化する５８の異なるＴ／ＮＫ細胞が存在する状態で、３７℃および５％ＣＯ２で９６−ウエルプレート中で２−３週間培地中でインキュベートした。これらは１３の異なるＴＣＲアゴニスト、２３の異なるコレセプター・アゴニストおよび２２の異なるサイトカインを含んでいた。それは２．４８８の異なる組み合わせおよび濃度でテストされた。抗体は可溶性の、プラスチック結合プレゼンテーションの中で使用された。サイトカインは、０．１ナノグラム／ｍｌから１０００ナノグラム／ｍｌまでの濃度範囲でテストされた；ＴＣＲアゴニストは、０．１ｎｇ／ｍｌから４０μｇ／ｍｌで使用された。また、コレセプター・アゴニストは、終末濃度０．５μｇ／ｍｌから８０μｇ／ｍｌで使用された。
【０１２８】
いくつかの連続する細胞分離および細胞培養エクスパンジョン実験は同じドナーから行なわれた；各実験は活性化分子の約１００−４００の異なる組み合わせの影響をテストする。最適化は、基礎的な、非最適化カクテル（つまりＩＬ−２およびＰＨＡが存在する状態でのＴＣＲγδ＋Ｔ細胞培養）から始められた。同じ選択された活性化分子のカクテルを含む新鮮なメディアが、５日ごとに加えられた。１４日後に、細胞は集められた、それらの表現型は流動細胞計測法によって分析された。各実験の最良の培養条件は同定され（Ｖδ１＋Ｔ細胞の最も高いエクスパンジョン倍率について）、最適化のために選択され、利用可能な試薬が組み合わされ、様々な濃度でテストされた。上の培養条件がそれぞれ得られた後、最適化段階中にＶδ１＋Ｔ細胞のエクスパンジョン倍率と純度のレベルが徐々に増加された。
【０１２９】
実験１−４の結果は表２に要約される。実験ｎｏ．１は、ＩＬ−４が培養中のＶδ１＋Ｔ細胞分裂反応および富化を促進する際に重要な成長因子であるという先の観察を確認した２７，４２。この実験では、発明者は、Ｔ細胞マイトージェンおよびＩＬ−２が存在する状態で、培養されたＴＣＲγδ＋Ｔ細胞への２２の異なるサイトカインの活性をテストした。明白に、ＩＬ−４は、これらの細胞の強い富化およびエクスパンジョンを引き起こす能力において独特だった。対照的に、ＩＬ−２の濃度を増加させる使用、または異なるＴ細胞マイトージェンとＩＬ−２の組み合わせは等価な結果を生まなかった。これはたぶん培養細胞の増加した活性化誘導細胞死（ＡＩＣＤ）のためであろう（条件２、３；表２）。
【０１３０】
【表１−１】
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【０１３１】
【表１−２】
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【０１３２】
【表１−３】
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【０１３３】
【表２】
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【０１３４】
実験ｎｏ．２の結果は、ＩＬ−２（ＩＬ−４およびＰＨＡの存在している場合）は、培養（条件３−７；表２）中のＶδ１＋Ｔ細胞の増加した増殖および富化のために低濃度で使用されなければならないことを実証した。この結果は、ＩＬ−４がない状態で、ＰＨＡの存在およびハイ・レベルのＩＬ−２の存在下でより増殖倍率が高かった、前の実験（実験ｎｏ．１）では観察されなかった。更に、抗ＣＤ３  ｍＡｂは、培養中のＶδ１＋Ｔ細胞の生存および増殖を促進する最も有効な有系分裂促進物質であることが示された（条件１対条件２、表２を参照）。
【０１３５】
実験ｎｏ．３（表２）の結果は前の観察を確認した。またＩＬ−２（ＩＬ−４およびＴ細胞マイトージェンの存在下で）のさらに低い（以前に使用されたよりも低い）濃度水準であっても、培養中のさらに高いＶδ１＋Ｔ細胞増殖、生存および富化を促進することを示した。さらに、同じ濃度で使用された時、ＩＬ−１５はＶδ１＋Ｔ細胞生存、富化および増殖の促進においてＩＬ−２より有効だった。再び、抗ＣＤ３  ｍＡｂは、我々のテストでは最も有効な有系分裂促進物質であることを示した。
【０１３６】
実験ｎｏ．４の結果は、培地中のハイ・レベルのＩＬ−１５の存在がＶδ１＋Ｔ細胞の増殖には不利益であることをさらに示した。確かに、ＩＬ−４およびα−ＣＤ３が存在している時、ＩＬ−１５のさらに低い（以前に使用されたよりも低い）濃度水準でも、Ｖδ１＋Ｔ細胞のさらに高いエクスパンジョン・レベルを促進した（条件３−５；表２）。全く予期しない発見において、ＩＮＦ−γによるＩＬ−１５の置換（つまり培地中のＩＬ−１５の非存在およびＩＦＮ−γの存在）は、培養されたＶδ１＋Ｔ細胞の増加したエクスパンジョン・レベルを生成することが示された。様々な濃度、およびＩＬ−２、ＩＬ−７およびＩＬ−１５の組み合わせはが平行してテストされたが、ＩＦＮ−γは、培養（ＩＬ−４およびＴ細胞マイトージェン、たとえば抗ＣＤ３  ｍＡｂが存在する状態；図３）中のＶδ１＋Ｔ細胞の選択的なエクスパンジョンを促進するためにはるかにより有効な試薬であると分かった。これらの培養中のＩＦＮ−γのより高いパフォーマンスは、使用されたＩＬ−４および抗ＣＤ３  ｍＡｂの濃度に依存しなかった（図３Ａ−Ｃおよび図４）。重要なことには、ＩＦＮ−γの使用（しかしＩＬ−２、ＩＬ−１５またはＩＬ−７の非使用）は、ＣＤ３＋Ｔ細胞（図３Ｄ）の大量の培養中のＶδ１＋Ｔ細胞の富化とエクスパンジョンのレベルの劇的な増加を引き起こした。これらの培養では、出発サンプルの中にあるＴＣＲαβ＋Ｔ細胞の汚染は、ＩＦＮ−γが存在していなく、ＩＬ−２、ＩＬ−１５およびＩＬ−７の存在での増殖に応答し、Ｖδ１＋Ｔ細胞のより選択的な活性化体であるように見える。これらの実験は次のことを示した。ＩＦＮ−γとＩＬ−４およびＴ細胞マイトージェンとの組み合わせとＩＬ−２、ＩＬ−１５およびＩＬ−７の非存在は、Ｖδ１＋Ｔ細胞の生成について特異的（そして以前に記述されていなかった）であり、様々な新規の治療および商用アプリケーションに使用できるというユニークな利点を有する。
【０１３７】
ＩＦＮ−γは二量化した可溶性のサイトカインで、タイプＩＩクラスのインターフェロンのただ一つのメンバーである５０。それは、一般のγ−鎖サイトカイン、たとえばＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７またはＩＬ−１５とは構造上および機能的に異なり、また血清学的に、Ｉ型インターフェロンとは異なる。それは酸不安定性であり、一方、タイプ−Ｉ変形は酸安定性である。
【０１３８】
培養中のＶδ１＋Ｔ細胞の集団の増殖および富化のために新しい改良方法を得たが、さらに、我々は生体外で、生成された細胞の抗腫瘍機能を分析しようと努力した。我々は、培地中のＩＬ−４の存在が活性化レセプター（たとえばナチュラル細胞毒性レセプター（ＮＣＲ、すなわちＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４））の発現、および増殖されたＶδ１＋Ｔ細胞上のＮＫＧ２Ｄの発現を強く禁止するか減少させることを見いだした（表３）。
【０１３９】
ナチュラルキラー（ＮＫ）レセプター（たとえばＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４およびＮＫＧ２Ｄ）の活性化は、腫瘍または感染細胞の表面上で発現されたそれらの分子のリガンドに結合することによって、Ｖδ１＋Ｔ細胞の抗腫瘍・抗ウイルスの機能に重大な役割を果たすことが知られている。レセプター・リガンド結合は、Ｖδ１＋Ｔ細胞によるグランザイムとパーフォリンの生産および放出を引き起こし、標的細胞の死に導く２９。我々の研究では、我々は、培地中のＩＬ−４の存在が培養されたＴＣＲγδ＋Ｔ細胞の表面にある活性化ＮＫレセプターのレベルの減少を引き起こし、それによって、ＭＯＬＴ−４白血病細胞に対するそれらの細胞毒性の機能を減少させることを見いだした（表３）。ＩＬ−４によって引き起こされた抑制は、Ｖδ１−とＶδ１＋ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞の両方を含めて、最終の細胞の生成物の中に存在するＴＣＲγδ＋Ｔ細胞サブセットすべてに影響するように見える（表３）。
【０１４０】
【表３】
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【０１４１】
これは、ＩＬ−１０生産によってＩＬ−４が調整されたＶδ１＋Ｔ細胞の生成を促進することを示す最近の研究に従う。ＩＬ−４−処理されたＶδ１＋Ｔ細胞は、Ｖδ２＋Ｔ細胞に比較して著しく少ないＩＦＮ−γとより多くのＩＬ−１０を分泌した。更に、Ｖδ１＋Ｔ細胞は、ＩＬ−４が存在する状態で比較的低レベルのＮＫＧ２Ｄ発現を示した。これはＶδ１＋Ｔ細胞がＴＣＲγδ＋Ｔ細胞を媒介とした抗腫瘍の免疫の応答を弱めることを示唆する４２。
【０１４２】
Ｖδ１＋Ｔ細胞の抗腫瘍エフェクター機能を改善する目的で新規の増殖方法を捜していたので、我々はさらにＩＬ−４−処理された細胞上の活性化ＮＫレセプターの発現を回復し、これらの細胞の細胞毒性の表現型を回復することを試みた。これは従来試みられていなかったものである。ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞はツーステップ・プロトコルにおいて培養された。第一ステップは、Ｔ細胞マイトージェン（たとえば抗ＣＤ３  ｍＡｂまたはＰＨＡ）およびＩＬ−４が存在する状態、およびＩＬ−２、ＩＬ−１５およびＩＬ−７がない状態で培地中の細胞を処理すること、およびＶδ１＋Ｔ細胞の選択的なエクスパンジョンを促進することから成る。第２の培養ステップは、ＩＬ−４がない状態、およびＴ細胞マイトージェンおよびＩＬ−２あるいはＩＬ−７またはＩＬ−１５が存在する状態で培地中の細胞を処理すること、および細胞分化およびＮＫＲ発現を促進することから成る（表３および表４）。
【０１４３】
条件１−５は従来の結果を確認し（表３）、ＩＬ−４が存在する状態で培養されたＶδ１＋Ｔ細胞は培養中に数千倍に増殖するかもしれないが、分化することができず、腫瘍細胞の非能率的な死滅になる。対照的に、細胞がＩＬ−４がない状態、およびＴ細胞マイトージェンおよびＩＬ−２、ＩＬ−７、またはＩＬ−１５が存在する状態での第２の培地中で二次培養された時、条件６−１３で見られるように、腫瘍細胞を除去する能力は根本的に増加した。これらの３つのサイトカイン（ＩＬ−２、ＩＬ−７およびＩＬ−１５）の各１つの単独でまたは組み合わせられた存在は、培養された時、Ｖδ１＋Ｔ細胞の表現型に振り向けることができ、この目的に使用することができる。
【０１４４】
ｎｏ．６および７が示した実験の結果（表４）は、Ｖδ１＋Ｔ細胞の増殖および分化を刺激するために２−ステッププロトコルおよび３ステップのプロトコルさえもより効率的に使用することができることを示す。３ステップのプロトコルの場合には、細胞が３つの異なる培地（たとえば表４の実験ｎｏ７の条件２を参照）において培養された時、ＩＬ−２またはＩＬ−７またはＩＬ−５を含む培地から、ＩＬ−４を含む培地を分離することが非常に重要だった。これらの結果から、改善された細胞増殖のために、古い培地のフラクションを各二次培養ステップの間に除去するべきであると結論付けることができる；しかも、第２の培地では、ＩＬ−１５は、Ｖδ１＋Ｔ細胞分裂反応の促進においてＩＬ−２よりわずかに効率的である。３ステップおよび４ステップの培養プロトコルを使用する追加の実験は、他の成長因子をこれらの細胞上のＮＫレセプターの発現およびＶδ１＋Ｔ細胞の増加したエクスパンジョンのために、第１および／または第２の培地に加えることができることをさらに実証した（表３および表４）。ＩＮＦ−γ、ＩＬ−２１およびＩＬ−１βは、Ｖδ１＋Ｔ細胞エクスパンジョンおよび生存の効率的なインデューサーであると確認された（表５）。第１または第２の培地の中でこれらの成長因子を使用することができる。
【０１４５】
最後に、ＣＤ２７レセプターの可溶性のリガンド、ＣＤ７レセプターの可溶性のリガンドまたはＳＬＡＭレセプターの可溶性のリガンドの追加は、Ｖδ１＋Ｔ細胞の高められたエクスパンジョンに帰着した（表５の条件３−６）。ＣＤ２７レセプターは、Ｔ細胞免疫の生成および長期的なメンテナンスに典型的に必要である。それはそのリガンドＣＤ７０に結合し、Ｂ細胞活性化および免疫グロブリン合成を規制する際に重要な役割を果たす。ＣＤ７レセプターは免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである。このタンパク質は胸腺細胞および成熟型のＴ細胞上で見つかる。それは、早期リンパの発育の間にＴ細胞相互作用、およびさらにＴ細胞／Ｂ細胞相互作用に本質的な役割を果たす。ＳＬＡＭレセプターは、免疫修飾物質のレセプターのシグナリングリンパ球の活性化分子ファミリーのメンバーである。
【０１４６】
【表４】
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【０１４７】
いくつかの異なるメディアがテストされた（図５）。これらのテストは次のことを示した。本発明は商業的に利用可能な、血清を含まない、異なるメーカーによって作られた臨床等級メディアを含む異なるメディアで非常によく作用し、臨床応用に適している。
【０１４８】
【表５】
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【０１４９】
大規模の増殖されたＴＣＲγδ＋Ｔ細胞の生体外のキャラクタリゼーション
培地中のＶδ１＋Ｔ細胞の分離およびエクスパンジョンのための有効なプロトコルを確立して、我々は、多くの健康なドナーおよびさらに癌患者から集められた血液サンプルでテストしようと努力した。これは新しい培養方法の強健さおよび一般的な適用可能性をテストするのに必要だった。さらに、プラスチックプレートまたはフラスコの代わりに、臨床応用のために開発された閉じた、大規模のガス浸透性の細胞バッグ内で細胞は培養された。
【０１５０】
磁気を伴う細胞選別（ＭＡＣＳ）の２ステップ法により、８つの異なるドナーからＴＣＲγδ＋Ｔ細胞が富化された、生細胞集団を生成した。Ｖδ１＋ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞は、ＭＡＣＳの後に最初に存在していた生細胞の合計の約１％から４４％のみを構成する。しかしながら、最適化された２ステップの増殖方法に続く、サイトカインとＴ細胞マイトージェンの記述されたカクテルが存在する状態での１１−２１日間の処理では、Ｖδ１＋Ｔ細胞は培養中の優性の細胞サブセットになり、ドナー間で細胞の合計の６０−８０％の間で変わった（図６）。非常に複製可能なエクスパンジョンは達成された。また、最終の細胞の生成物の組成物は多数のドナーにわたり著しく類似した（図６、表７）。重要なことには、最終生産物中の非Ｖδ１＋ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞は、ほとんどＶδ１−Ｖδ２−ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞であると分かった（それらは細胞の合計のほぼ１７％−３７％を構成する。これが末梢血で第３の最も豊富なＴＣＲγδ＋Ｔ細胞サブセットであるので、これらの細胞は恐らくＶδ３＋ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞から成った。合計のＴＣＲγδ＋Ｔ細胞のパーセンテージからＶδ１＋Ｔ細胞およびＶδ２＋Ｔ細胞のパーセンテージを引くことによって、最終の細胞生成物中のＶδ１−Ｖδ２−ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞のパーセンテージを計算することが可能である。これらのプラスチックバック中のエクスパンジョン倍率は、期待されたように、プレートからのものより低かったが、臨床の翻訳のための適切な数が生成された。
【０１５１】
活性ナチュラル細胞毒性レセプター（ＮＣＲ；ＮＫｐ３０とＮＫｐ４４を含む）およびＮＫＧ２Ｄの発現は、すべての試験されたドナーにおいて、長期間培養されたＶδ１＋Ｔ細胞において、強健に引き起こされた（表８および図７）。得られたＴＣＲγδ＋Ｔ細胞（それらはＶδ１＋およびＶδ１−Ｖδ２細胞サブセットの両方を含んでいた）は、ＣＬＬ細胞（ＭＥＣ−１細胞株および主ＣＬＬ患者サンプルの両方）に対して高度に細胞毒性だったが、健康な自己由来のＰＢＭＣｓをターゲットとしなかった（図８Ａおよび図８Ｃ）。ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞活性化レセプターに対する阻止抗体を使用した予備実験は、抗腫瘍細胞毒性がＮＫＧ２ＤとＮＫｐ３０のレセプターに部分的に頼っていたことを示した（図８Ｂ）。更に、増殖されて分化したＴＣＲγδ＋Ｔ細胞はハイ・レベルの炎症促進性のサイトカインＩＦＮ−γを生産した（図９）。最後に、Ｖδ２−ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞を、非常に多くの腫瘍を有する初老のＣＬＬ患者のＰＢＬｓから効率的に増殖し、分離することに有効であるかもしれないし（表９および表１０および図１０Ａ）、有力な抗腫瘍および抗ウイルス活性を示した（図１０Ｂ）。自己由来の白血病のＢ細胞の汚染は、ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞の生体外の培養中に除去された（表１０）。
【０１５２】
データのこの収集は、自己由来か同種異型の養子関係の細胞治療のために、本発明の機能的なＶδ２−γδＴ細胞（すなわち癌患者からの）を生成するユニークな能力を完全に実証する。方法はＣＬＬ患者から得られた高度には浄化されていないサンプルから、Ｖδ１＋Ｔ細胞を富化（＞６０％）し、増殖（２，０００倍まで）するに十分に堅固であり、ＮＫＲ−発現性および非常に細胞毒性のＴＣＲγδ＋Ｔ細胞に分化させる。
【０１５３】
重要なことには、予備試験は、さらに他の組織起源の腫瘍細胞に対する培養されたＴＣＲγδ＋Ｔ細胞の生体外の反応性を実証した（図１１）。それは、増殖し、分化したＶδ２−γδＴ細胞も、これらの症状の治療のために使用することができることを示唆する。
【０１５４】
【表６】
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【０１５５】
【表７】
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【０１５６】
【表８】
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【０１５７】
【表９】
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【０１５８】
【表１０】
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【０１５９】
増殖されたＴＣＲγδ＋Ｔ細胞に関する生体内の研究
多くの機能的なＴＣＲγδ＋Ｔ細胞を生成する方法を成功裡に開発して、我々はそれを「ＤＯＴ細胞」と呼んだ。我々は次にそれらのホーミング（ｈｏｍｉｎｇ）および白血病治療活性を生体内で調査した。我々は、以前にその病気のいくつかの態様を再生すると示され、ＣＡＲＴ細胞を含む他の細胞療法の効能をテストするために使用されるヒトＣＬＬの異種移植片モデルを利用した５１，５２。モデルは、ＣＬＬ／ＳＬＬ−由来  ＭＥＣ−１  細胞の、Ｂａｌｂ／ｃ  Ｒａｇ−／−γｃ−／−（ＢＲＧ）動物（それらはリンパ球をすべて欠き、したがって直ちにヒト細胞を拒絶しない）への養子免疫細胞移入に依存する。しかしながら、ヒト異種移植片の骨髄性のリネッジを媒介とした拒絶が依然幾分か生じる。この拒絶はＳＩＲＰ−αをコード化する異なる対立遺伝子のため、使用されるマウス株によりその大きさが異なる５３。宿主としてＮＯＤ−ＳＣＩＤγｃ−／−（ＮＳＧ）動物を使用して、我々は、トランスファーの後の遅い時間ポイントでＴＣＲγδ＋Ｔ細胞を特徴づけるためにモデルを適応させた。確かに、腫瘍を有するＮＳＧ宿主へのトランスファーに際して、我々は、トランスファーの３０日後に、ＣＤ３＋Ｖδ１＋Ｔ細胞の強い富化と共に、分析されたすべての組織中でＴＣＲγδ＋Ｔ細胞を回収することができた（図１２）。重要なことには、我々は、回収されたＴＣＲγδ＋Ｔ細胞のＮＫｐ３０とＮＫＧ２Ｄの発現を発見し、これは安定して生体内で特性を保存することを実証する。ＢＲＧ動物の中へのトランスファーに際して、我々はそのような遅い時間ポイントでＴＣＲγδ＋Ｔ細胞を回収することができなかった。しかし、我々はトランスファーの後に７２時間後において肺および肝臓の両方の中でそれらを観察した（図１２）。これらの実験は、ＮＳＧ動物中のヒト異種移植細胞のよりよい適合性を確認する。また我々が増殖されたＶδ２−γδＴ細胞の抗腫瘍特性を生体内でテストするために２つの異なるモデルを持つことを可能にする。
【０１６０】
生物発光を使用して、腫瘍増殖をダイナミックにフォローするために、我々はホタルルシフェラーゼ−ＧＦＰ（firefly luciferase-GFP）をＭＥＣ−１細胞でトランスフェクトし、ＢＲＧ動物へＭＥＣ−１細胞の１０７個を皮下で転送した。７日後に、我々はルシフェリンをｉ．ｐ注射し、動物への処理（あるいはＰＢＳコントロール）に帰着する前に、ルミネセンスの関数として腫瘍ロードを決定した。我々は、５日以内にＴＣＲγδ＋Ｔ細胞の２回のトランスファーを行なった。その後、我々はカリパスを使用して、時間の関数として腫瘍サイズを測定した；重要なことには、コントロールと比較された時、我々は、治療された動物内の主な腫瘍サイズの明瞭な低減を検知した。ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞の第２のトランスファーの９日後、この低減は顕著だった。この結果は、それらの抗腫瘍特性のより広範囲な特性記述がＢＲＧ宿主の中のヒト細胞の短い半減期によって排除されたとしても、ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞が生体内で有効であることを実証した。この制限を克服するために、我々は次に宿主としてＮＳＧ動物を使用して、同様の実験を行なった。
【０１６１】
腫瘍進行増殖はＮＳＧ宿主においてより速かった。それは、ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞の主腫瘍増殖の妨害を防いだ（図１４）。しかしながら、このモデルでは、腫瘍は遅い時間ポイントで様々な器官に播種される。また、我々は多くの組織の流動細胞計測および組織学分析によって示されるように、ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞が腫瘍の転移を著しく制限することができることを見いだした（図１４Ｂ−Ｄ）。これは内転移部位（たとえば骨髄と肝臓）を含んでいた。２つの異種移植片モデルで得られたデータは、ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞の主腫瘍サイズ（ＢＲＧ宿主中；図１３）を低減すること、および標的器官（ＮＳＧ宿主中；図１４）への腫瘍内転移をコントロールすることの生体内の効能を実証する。
【０１６２】
ＮＳＧモデルの実験の終わりでのＴＣＲγδ＋Ｔ細胞後代の検査は、腫瘍組織（図１５Ａ）への堅固な浸潤を確認した；またＴＣＲγδ＋Ｔ細胞上のＮＫｐ３０およびＮＫＧ２Ｄの安定した発現を確認した（図１５Ｂ）。興味深いことには、我々は、特異的に腫瘍に浸透するＴＣＲγδ＋Ｔ細胞の早期活性化マーカーＣＤ６９の高い発現を発見した。これは腫瘍内のＴＣＲγδ＋Ｔ細胞の最適な活性化を示唆する（図１５Ｂ）。重要なことには、我々は、組織学の分析（多数の器官の）、あるいは検死の時に集められた血液の生化学分析（図１６）では、治療に伴う毒性を観察しなかった。
【０１６３】
集合的に、これらの生体内のデータは、ＣＬＬ治療のための生成されたＴＣＲγδ＋Ｔ細胞の安全性および効能に対する大きな信頼を提供し、それにより、それらの臨床応用を着想する。
【０１６４】
結論として、我々は、細胞毒性のＶδ２−γδＴ細胞の選択的な大規模エクスパンジョンおよび分化のための、フィーダー細胞が欠けた、新しく堅固な（高度に複製可能な）臨床等級の方法を開発した；また、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）の前臨床のモデル中のそれらの治療の可能性をテストした。ＤＯＴ細胞という命名された我々の細胞生成物は遺伝子操作を含んでいない；また生体外の正常細胞ではなく目標白血病に特異的である；そして、健全な組織への損傷なしで、辺縁の器官への広範囲の腫瘍転移を生体内で防ぐ。我々の結果は、癌の養子免疫療法中のＤＯＴ細胞の臨床応用のために新しい手段および原理の証拠を提供する。
【０１６５】
補足的データ
次のセクションは、先に記述された発明の使用で生成された追加データを開示する。ここに示されるデータは前の結果を確認し、前の観察に広げられ、主題についてのよりよい理解のためのサポート情報として使用されるべきである。
【０１６６】
先に説明されたように、Ｖδ１＋Ｔ細胞を生体外で増殖するために、インターロイキン２（ＩＬ−２）およびインターロイキン４（ＩＬ−４）の組み合わせは、ある程度の成功として使用された。しかしながら、我々は、培地中のＩＬ−４の存在が培養されたＴＣＲγδ＋Ｔ細胞のナチュラルキラー（ＮＫ）活性化レセプター（たとえばＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０およびＮＫｐ４４）の強いダウンレギュレーションを引き起こし、それらの抗腫瘍性反応を弱めることを知った。
【０１６７】
実験１−４の我々の前の結果はここで再びより詳細に示される（表１１を参照）。平行培養状態（星印で印をつけられた）中で得られた追加の結果が、結果についてのより完全な理解のために示される。さらに、各条件での細胞培養の後に観察されたＮＫｐ３０＋Ｖδ１＋Ｔ細胞のパーセンテージをここに開示する。培養細胞上のＮＫｐ３０の発現の観察されたダウンレギュレーションは、ＩＬ−２が培地の中にあった時（つまり培地がＩＬ−２およびＩＬ−４の両方を含んでいた時）、Ｖδ２−γδＴ細胞に対するＩＬ−４の有力な妨害作用も生じることをさらに確認した。これらのデータは、ＩＬ−４の妨害作用が培養されたＴＣＲγδ＋Ｔ細胞に対するＩＬ−２の活性化の影響に対して優性であることを確認し、第２の培養ステップ中でのＩＬ−４を除去することの重要性を強調した。
【０１６８】
以前に説明されたように、様々な濃度およびＩＬ−２、ＩＬ−７およびＩＬ−１５の組み合わせが平行してテストされたが、ＩＦＮ−γは、培地（ＩＬ−４およびＴ細胞マイトージェン（たとえば抗ＣＤ３  ｍＡｂ）が存在する状態で使用された時）中のＶδ１＋Ｔ細胞の選択的なエクスパンジョンを促進するため、より有効な試薬であることが一貫して分かった。以前に示唆されたように（形式的には示されていないが）、ＩＦＮ−γの単独での使用は（培養中の細胞増殖を促進することにおいて）、ＩＦＮ−γとＩＬ−２、ＩＬ−７またはＩＬ−１５のいずれかとの組み合わせ、またはＩＬ−２とＩＬ−１５またはＩＬ−７との組み合わせよりも有効である（表１２）。これらのデータは、細胞がＩＬ−４およびＩＦＮ−γが存在する状態で培養された場合、ＩＬ−１５、ＩＬ−２およびＩＬ−７はＴＣＲγδ＋Ｔ細胞のエクスパンジョンに有害作用を持っていることを確認した。
【０１６９】
以前に説明されたように、大きな細胞培養バッグ中のエクスパンジョンの倍数は、予想通りに、９６−ウエルプレートの場合よりも小さいが、臨床の翻訳のためには適正な数が生成された。臨床等級の細胞バッグ中の大規模細胞培養の後に得られた合計の絶対的な細胞数は、表１３に詳述される。
【０１７０】
以前に説明されたように、先に記載された方法により得られた細胞培養プロトコルは、臨床応用で使用するに適切である。実際、いくつかの材料および試薬は、臨床応用で使用するために少なくとも１つの取り締まり機関（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ  ＡｇｅｎｃｙまたはＦｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎのような）によって承認された。全リストは表１４に詳述される。
【０１７１】
先に記載されたように、記述された発明によって提案された細胞分離の２ステップの方法は、生存可能で、さらに培養することができるＴＣＲγδ＋Ｔ細胞が富化された細胞サンプルを生成する。図１７はツーステップＭＡＣＳソーティング後の、ＴＣＲγδ＋ＰＢＬｓ富化のより詳細なＦＡＣＳプロットを示す。
【０１７２】
以前に説明されたように、非常に複製可能なエクスパンジョンが本発明の増殖方法で達成された。また、最終細胞生成物の組成は多数のドナーにわたり著しく類似した。以前に記述された発明で得られた細胞のより完全なキャラクタリゼーションのため、および方法および結果として生じる細胞の生成物に新規性を与えるため、我々は、３３２の異なる細胞表面マーカーの表現型の大規模なスペクトルを表した（図１８）。Ｖδ１＋Ｔ細胞は、細胞培養プロセスの始め（０日目）および終わり（２１日目）で比較された。我々は、共刺激（ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ）レセプターＣＤ２７、ＣＤ１３４／ＯＸ−４０およびＣＤ１５０／ＳＬＡＭと同様に、活性化マーカーＣＤ６９およびＣＤ２５およびＨＬＡ−ＤＲの驚くべきアップレギュレーションを観察した。これは生体外で生成されたＶδ１＋Ｔ細胞の高められた増殖（それらのベースラインＶδ１＋Ｔ細胞相当物と比較された）の可能性の指標である。さらに、増殖されたＶδ１＋Ｔ細胞は、腫瘍細胞ターゲティングの重要なプレーヤーであることを以前に示された、ナチュラルキラー細胞に関連する活性化／細胞毒性レセプター（すなわちＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫＧ２Ｄ、ＤＮＡＭ−１、２Ｂ４）の発現を増加させた。対照的に、抑制および消耗に関連する重要な分子（たとえばＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４またはＣＤ９４）は、非常に低レベルでのみ発現されたか、または全く発現されなかった。これは刺激的な条件の下の２１日間の培養の後にさえ増殖され分化したＴＣＲγδ＋Ｔ細胞の著しい「適合性（ｆｉｔｎｅｓｓ）」を実証する。顕著に、細胞接着に含まれる多数の分子（例えばＣＤ５６、ＣＤ９６、ＣＤ１７２ａ／ＳＩＲＰα、インテグリン  β７およびＩＣＡＭ−１）、およびケモカインレセプター（ＣＤ１８３／ＣＸＣＲ３、ＣＤ１９６／ＣＣＲ６およびＣＸ３ＣＲ１）のアップレギュレーションは、血液と組織の間を移動し再循環する高い能力を示唆する。ＩＬ−１８ＲαおよびＮｏｔｃｈ１（それはタイプ１（インターフェロン−γ−生産）反応を促進すると知られている）も、増殖され分化したＴＣＲγδ＋Ｔ細胞によって高度に発現された。重要なことには、方法の強健さを支持するために、ヒートマップ（図１８Ｂ）によって説明されるように、我々は４つの試験されたドナーすべてにわたり著しく同様の細胞表現型を見つけた。これらのデータは、増殖されて分化したＴＣＲγδ＋Ｔ細胞が、ミグラトリー可能性（ｍｉｇｒａｔｏｒｙ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）および自然な細胞毒性機構を賦与された、活性化された（消耗されなかった）リンパ球の非常に複製可能な細胞の生成物であることを集合的に示す。
【０１７３】
以前に説明されたように、ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞の上で発現された活性化レセプターに対する阻止抗体を使用する予備実験は、抗腫瘍細胞毒性が増殖されたＴＣＲγδ＋Ｔ細胞によって発現されたＮＫＧ２ＤとＮＫｐ３０レセプターに部分的に頼っていたことを示した。ここに示された追加の実験は、さらに腫瘍細胞認識におけるγδＴＣＲの役割を明らかにした（図１９）。
【０１７４】
以前に説明されたように、活性化ナチュラル細胞毒性レセプター（ＮＣＲ；ＮＫｐ３０とＮＫｐ４４を含む）およびＮＫＧ２Ｄの発現は、長期間培養されたＶδ１＋Ｔ細胞において強く引き起こされた。ここで、我々は、同じ効果がＶδ１Ｖδ２−細胞サブセットで観察されたことを示す。我々が同じ培地で増殖された（そして分化した）ＣＤ３＋Ｖδ１Ｖδ２−細胞サブセットにゲーティッド（ＦＡＣＳプロット分析で）を適用した時、我々は、分化したＶδ１＋細胞によって発現されるＮＣＲとほぼ同じレベルでこれらの細胞が発現されたことを観察した（図２０）。これらのデータは、本発明に述べられた２ステップのプロトコルが、Ｖδ１＋およびＶδ１−  Ｖδ２−ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞サブセットの両方を増殖および分化させることができることをさらに確認した。第１培養ステップで、Ｔ細胞マイトージェンおよびＩＬ−４が存在する状態（およびＩＬ−１５、ＩＬ−２またはＩＬ−７の非存在中で）、Ｖδ１＋およびＶδ１−Ｖδ２−ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞サブセットの両方は、培養中で増殖したが、細胞毒性の表現型の方へ分化することができなかった。得られた細胞が、Ｔ細胞マイトージェンおよびＩＬ−２、あるいはＩＬ−７、あるいはＩＬ−１５が存在する状態（およびＩＬ−４の非存在中で）の培地で二次培養された時、両方の細胞サブセットが分化し、ハイレベルの活性化ＮＫレセプターの発現を示し、これは腫瘍細胞の死滅を媒介した。
【０１７５】
以前に説明したように、本発明の方法で得られた増殖されて分化されたＶδ１＋細胞は、白血病細胞に対して高度に、生体外で細胞毒性だった。ここで、我々はより詳細に、増殖されて分化したＶδ１Ｖδ２−細胞サブセットは、腫瘍目標に対して高度に細胞毒性であることをより詳細に示す。我々はＣＤ３＋Ｖδ１＋細胞およびＣＤ３＋Ｖδ１Ｖδ２を流動細胞計測法により同じ培養細胞サンプルからのソートし、生体外で、標的腫瘍細胞と各サブセットを共同培養した。我々は、両方のサブセットが効率的に標的細胞を除去することができることを観察した。
（図２１）。
【０１７６】
【表１１】
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【０１７７】
【表１２】
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【０１７８】
【表１３】
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【０１７９】
【表１４】
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【０１８０】
注：いくつかの製品はＥＵおよび／または米国での使用のための公認された医療器具として販売されている。他の全ての製品は臨床検査のための細胞−ベースの製品として販売されている。臨床試験用の新医薬品承認制度（ＩＮＤ）または医療機器承認制度（ＩＤＥ）の下で臨床試験用に使用する事ができる。
本発明は以下の実施態様を包含する。
実施態様第１項：  サンプル内のＶδ２−ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞を増殖する方法：
（１）インターロイキン４−様活性（interleukin-4-like activity）を有する少なくとも１つの成長因子、およびＴ細胞マイトージェンを含む第１の培地中のサンプル中の細胞を、インターロイキン１５−様活性を有する成長因子の非存在下で培養すること；および
（２）インターロイキン４−様活性を有する成長因子の非存在下で、インターロイキン１５−様活性を有する少なくとも１つの成長因子およびＴ細胞マイトージェンを含む第２の培地中で、ステップ（１）で得られた細胞を培養すること。
実施態様第２項：  インターロイキン４−様活性を有する成長因子がインターロイキン−４であることを特徴とする実施態様第１項記載の方法。
実施態様第３項：  インターロイキン１５−様活性を有する成長因子が、インターロイキン１５、インターロイキン−２またはインターロイキン−７であることを特徴とする実施態様第１または２項記載の方法。
実施態様第４項：  インターロイキン−１５−様活性を有する成長因子が、インターロイキン−１５であることを特徴とする実施態様第３項記載の方法。
実施態様第５項：  第１または第２の培地、または両方の培地が、さらに第２の成長因子を含む、実施態様第１から４のいずれか１項記載の方法。
実施態様第６項：  前記成長因子がインターフェロン−γまたはそのミメティック、または機能的な等価物であることを特徴とする実施態様第５項記載の方法。
実施態様第７項：  第１または第２の培地、または両方の培地が、さらに第２および第３の成長因子を含む、実施態様第１から４のいずれか１項記載の方法。
実施態様第８項：  前記成長因子がインターフェロン−γ、インターロイキン−２１、またはそれらのミメティック、または機能的な等価物であることを特徴とする実施態様第７項記載の方法。
実施態様第９項：  第１または第２の培地、または両方の培地が、さらに第２、第３および第４の成長因子を含む、実施態様第１から４のいずれか１項記載の方法。
実施態様第１０項：  前記成長因子がインターフェロン−γ、インターロイキン−２１、インターロイキン−１β、またはそれらのミメティック、または機能的な等価物であることを特徴とする実施態様第９項記載の方法。
実施態様第１１項：  第１または第２の培地、または両方の培地、さらにＶδ２−ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞の共刺激性分子を含む、実施態様第１から４のいずれか１項記載の方法。
実施態様第１２項：  共刺激性分子が、ＳＬＡＭレセプターの分子リガンドまたはアゴニスト、またはＣＤ２７レセプターの分子リガンドまたはアゴニスト、またはＣＤ７レセプターの分子リガンドまたはアゴニストのいずれかであることを特徴とする実施態様第１１項記載の方法。
実施態様第１３項：  第１および第２の培地が血清または血漿を含むことを特徴とする実施態様第１から１２のいずれか１項記載の方法。
実施態様第１４項：  ステップ（１）に先立って、サンプル中の細胞のＴ細胞が富化されることを特徴とする実施態様第１から１３のいずれか１項記載の方法。
実施態様第１５項：  ステップ（１）に先立って、サンプル中の細胞のＴＣＲγδ＋Ｔ細胞が富化されることを特徴とする実施態様第１から１４のいずれか１項記載の方法。
実施態様第１６項：  ステップ（１）に先立って、サンプル中の細胞がＴＣＲαβ＋Ｔ細胞を消耗させることを特徴とする実施態様第１から１５のいずれか１項記載の方法。
実施態様第１７項：  ステップ（１）に先立って、サンプル中の細胞がＴＣＲαβ＋Ｔ細胞を最初に消耗され、次にＣＤ３＋細胞が富化されることを特徴とする実施態様第１から１６のいずれか１項記載の方法。
実施態様第１８項：  ステップ（１）に先立って、サンプル中の細胞が非ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞を消耗されることを特徴とする実施態様第１から１７のいずれか１項記載の方法。
実施態様第１９項：  サンプルが血液または組織またはそのフラクションであることを特徴とする実施態様第１から１８のいずれか１項記載の方法。
実施態様第２０項：  サンプルが、末梢血、臍帯血、リンパ組織、上皮、胸腺、骨髄、ひ臓、肝臓、ガン組織、感染した組織、リンパ節組織またはそのフラクションから選ばれることを特徴とする実施態様第１９項記載の方法。
実施態様第２１項：  出発サンプルが人間の末梢血またはそのフラクションであることを特徴とする実施態様第１９または２０項記載の方法。
実施態様第２２項：  サンプルが低密度単核細胞（ＬＤＭＣ）または末梢血単核細胞（ＰＢＭＣｓ）から成ることを特徴とする実施態様第１から２１のいずれか１項記載の方法。
実施態様第２３項：  第１の培地中に、Ｔ細胞マイトージェンが約１０から約５０００ナノグラム／ｍｌの量で存在し、インターロイキン４−様活性を有する成長因子が約１から約１０００ナノグラム／ｍｌの量で存在する、実施態様第１から２２のいずれか１項記載の方法。
実施態様第２４項：  第１の培地中に、Ｔ細胞マイトージェンが約２０から約２０００ナノグラム／ｍｌの量で存在し、インターロイキン４−様活性を有する成長因子が約５から約５００ナノグラム／ｍｌの量で存在する、実施態様第２３記載の方法。
実施態様第２５項：  第１の培地中に、Ｔ細胞マイトージェンが約５０から約１０００ナノグラム／ｍｌの量で存在し、インターロイキン４−様活性を有する成長因子が約２０から約２００ナノグラム／ｍｌの量で存在する、実施態様第２４記載の方法。
実施態様第２６項：  第１の培地が、Ｔ細胞マイトージェンを７０ナノグラム／ｍｌ含み、インターロイキン４−様活性を有する成長因子を１００ナノグラム／ｍｌ含む、実施態様第２５記載の方法。
実施態様第２７項：  第２の培地中に、Ｔ細胞マイトージェンが約０．１から約５０μｇ／ｍｌの量、およびインターロイキン１５−様活性を有する成長因子が約１から約１０００ナノグラム／ｍｌの量で存在する、実施態様第１から２２のいずれか１項記載の方法。
実施態様第２８項：  第２の培地中に、Ｔ細胞マイトージェンが約０．３から約１０μｇ／ｍｌの量、およびインターロイキン１５−様活性を有する成長因子が約２から約５００ナノグラム／ｍｌの量で存在する、実施態様第２７記載の方法。
実施態様第２９項：  第２の培地中に、Ｔ細胞マイトージェンが約０．５から約５μｇ／ｍｌの量、およびインターロイキン１５−様活性を有する成長因子が約２０から約２００ナノグラム／ｍｌの量で存在する、実施態様第２８記載の方法。
実施態様第３０項：  第２の培地が、Ｔ細胞マイトージェンを１μｇ／ｍｌで含み、およびインターロイキン１５−様活性を有する成長因子を７０ナノグラム／ｍｌの量で含む、実施態様第２９記載の方法。
実施態様第３１項：  第１または第２の培地、または両方の培地中に、インターフェロン−γ−様活性を有する成長因子が約１から約１０００ナノグラム／ｍｌの量で存在し、インターロイキン−１β−様活性を有する成長因子およびインターロイキン−２１−様活性を有する成長因子が１から約５００ナノグラム／ｍｌの量で存在する、実施態様第１から３０のいずれか１項記載の方法。
実施態様第３２項：  第１または第２の培地、または両方の培地中に、インターフェロン−γ−様活性を有する成長因子が約２から約５００ナノグラム／ｍｌの量で存在し、インターロイキン−１β−様活性を有する成長因子およびインターロイキン−２１−様活性を有する成長因子が２から約２００ナノグラム／ｍｌの量で存在する、実施態様第３１記載の方法。
実施態様第３３項：  第１または第２の培地、または両方の培地中に、インターフェロン−γ−様活性を有する成長因子が約２０から約２００ナノグラム／ｍｌの量で存在し、インターロイキン−１β−様活性を有する成長因子およびインターロイキン−２１−様活性を有する成長因子が５から約１００ナノグラム／ｍｌの量で存在する、実施態様第３２記載の方法。
実施態様第３４項：  第１または第２の培地、または両方の培地がさらに、インターフェロン−γ−様活性を有する成長因子を７０ナノグラム／ｍｌ、インターロイキン−２１−様活性を有する成長因子をが２から１５ナノグラム／ｍｌ、インターロイキン−１β−様活性を有する成長因子を１５ナノグラム／ｍｌで含む、実施態様第３３記載の方法。
実施態様第３５項：  Ｔ細胞マイトージェンが抗体またはそのフラグメントであることを特徴とする実施態様第１から３４のいずれか１項記載の方法。
実施態様第３６項：  抗体がＣＤ３またはそのフラグメントに結合することを特徴とする実施態様第３５項記載の方法。
実施態様第３７項：  血清または血漿が約２から約２０積％の量で存在することを特徴とする実施態様第１から３６のいずれか１項記載の方法。
実施態様第３８項：  血清または血漿が約０．５から約２５体積％の量で存在することを特徴とする、実施態様第３７記載の方法。
実施態様第３９項：  血清または血漿が約２．５から約１０体積％の量で存在することを特徴とする、実施態様第３８記載の方法。
実施態様第４０項：  血清または血漿が５体積％の量で存在することを特徴とする、実施態様第３９記載の方法。
実施態様第４１項：  実施態様第１から３０のいずれか１項記載の方法によって調製された、ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞が富化された細胞調製物。
実施態様第４２項：  細胞の合計の８０％以上がＴＣＲγδ＋Ｔ細胞であることを特徴とするＴＣＲγδ＋Ｔ細胞が富化された細胞調製物。
実施態様第４３項：  細胞の合計の９０％以上がＴＣＲγδ＋Ｔ細胞であることを特徴とする実施態様第４１または４２項記載の細胞調製物。
実施態様第４４項：  細胞の合計の９５％以上がＴＣＲγδ＋Ｔ細胞であることを特徴とする実施態様第４１から４３のいずれか１項記載の細胞調製物。
実施態様第４５項：  Ｖδ１＋ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞およびＶδ２＋ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞の両方を含む、実施態様第４１から４４のいずれか１項記載の細胞調製物。
実施態様第４６項：  調製物中の合計のＴＣＲγδ＋Ｔ細胞に対して、約５５−９０％のＶδ１＋ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞および約１−１０％のＶδ２＋ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞を含む、実施態様第４５項記載の細胞調製物。
実施態様第４７項：  調製物中の合計のＴＣＲγδ＋Ｔ細胞に対して、約６０−８０％のＶδ１＋ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞および約１−５％のＶδ２＋ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞を含む、実施態様第４５項記載の細胞調製物。
実施態様第４８項：  実施態様第１から４０のいずれか１項記載の方法によって調製されたか、実施態様第４１から４７のいずれか１項記載の細胞調製物から得られたＴＣＲγδ＋Ｔ細胞の、免疫反応を調整するための医薬品の製造のための使用。
実施態様第４９項：  実施態様第１から４０のいずれか１項記載の方法によって調製されたか、実施態様第４１から４７のいずれか１項記載の細胞調製物から得られたＴＣＲγδ＋Ｔ細胞の、感染を治療するための医薬品の製造のための使用。
実施態様第５０項：  実施態様第１から４０のいずれか１項記載の方法によって調製されたか、実施態様第４１から４７のいずれか１項記載の細胞調製物から得られたＴＣＲγδ＋Ｔ細胞の、癌を治療するための医薬品の製造のための使用。
実施態様第５１項：  癌は慢性リンパ球性白血病であることを特徴とする実施態様第５０項記載の使用。
実施態様第５２項：  実施態様第１から４０のいずれか１項記載の方法によって調製されたか、実施態様第４１から４７のいずれか１項記載の細胞調製物から得られたＴＣＲγδ＋Ｔ細胞の、ワクチンの製造のための使用。
実施態様第５３項：  実施態様第１から４０のいずれか１項記載の方法によって調製されたか、実施態様第４１から４７のいずれか１項記載の細胞調製物から得られたＴＣＲγδ＋Ｔ細胞の、抗原認識、活性化、信号伝達または機能を研究するための使用。
実施態様第５４項：  免疫反応を調整する方法において使用するために、実施態様第１から４０のいずれか１項記載の方法によって調製されたか、実施態様第４１から４７のいずれか１項記載の細胞調製物から得られたＴＣＲγδ＋Ｔ細胞。
実施態様第５５項：  感染の治療方法において使用するために、実施態様第１から４０のいずれか１項記載の方法によって調製されたか、実施態様第４１から４７のいずれか１項記載の細胞調製物から得られたＴＣＲγδ＋Ｔ細胞。
実施態様第５６項：  癌の治療方法において使用するために、実施態様第１から４０のいずれか１項記載の方法によって調製されたか、実施態様第４１から４７のいずれか１項記載の細胞調製物から得られたＴＣＲγδ＋Ｔ細胞。
実施態様第５７項：  癌は慢性リンパ球性白血病であることを特徴とする実施態様第５５項記載の使用のためのＴＣＲγδ＋Ｔ細胞。
実施態様第５８項：  動物に予防注射をする方法において使用するための、実施態様第１から４０のいずれか１項記載の方法によって調製されたか、実施態様第４１から４７のいずれか１項記載の細胞調製物から得られたＴＣＲγδ＋Ｔ細胞。
実施態様第５９項：  実施態様第１から４０のいずれか１項記載の方法によって調製されたか、実施態様第４１から４７のいずれか１項記載の細胞調製物から得られたＴＣＲγδ＋Ｔ細胞を、必要とする動物に有効量を投与することを含む、免疫反応を調整する方法。
実施態様第６０項：  実施態様第１から４０のいずれか１項記載の方法によって調製されたか、実施態様第４１から４７のいずれか１項記載の細胞調製物から得られたＴＣＲγδ＋Ｔ細胞を、必要とする動物に有効量を投与することを含む、感染の治療方法。
実施態様第６１項：  実施態様第１から４０のいずれか１項記載の方法によって調製されたか、実施態様第４１から４７のいずれか１項記載の細胞調製物から得られたＴＣＲγδ＋Ｔ細胞を、必要とする動物に有効量を投与することを含む、癌の治療方法。
実施態様第６２項：  癌は慢性リンパ球性白血病である、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、またＴ細胞およびＢ細胞白血病、リンパ腫（ホジキンのおよび非ホジキン）、リンパ増殖性障害、形質細胞腫、組織球腫、黒色腫、腺腫、肉腫、健全な組織の癌、低酸素性の腫瘍、りん状細胞癌、尿生殖器の癌（頚部および膀胱癌）、造血器癌、頭頸部癌、また神経系癌である、実施態様第６０項記載の方法。
実施態様第６３項：  実施態様第１から４０のいずれか１項記載の方法によって調製されたか、実施態様第４１から４７のいずれか１項記載の細胞調製物から得られたＴＣＲγδ＋Ｔ細胞を、必要とする動物に有効量を投与することを含む、動物に予防注射をする方法。
【０１８１】
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【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１２−３】
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【図１３】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１４−３】
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【図１４−４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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