(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゼラチン水溶液を風乾させることを経た粒子の平均粒子径が２５〜２００μｍの粉末を含有する層を基板上に形成する工程ａ；及び工程ａで形成した層に対して、沸点１２０℃以下のアルコール類を含有する水溶液の液滴をノズル部から吐出し飛翔させ、前記液滴を前記工程ａで形成した層に対して着弾させることによりゼラチン成形体を形成する工程ｂ；
を含むゼラチン成形体の製造方法。
【請求項２】
前記工程ａにおけるゼラチンが動物ゼラチン又はリコンビナントゼラチンである、請求項１に記載のゼラチン成形体の製造方法。
【請求項３】
前記工程ｂにおける沸点１２０℃以下のアルコール類がエタノールである、請求項１又は２に記載のゼラチン成形体の製造方法。
【請求項４】
前記工程ｂの後に、ゼラチン水溶液を風乾させることを経た粒子の平均粒子径が２５〜２００μｍの粉末を含有する層を、工程ａで形成した層及び工程ｂで形成したゼラチン成形体の上に形成する工程ｃ；及び沸点１２０℃以下のアルコール類を含有する水溶液の液滴をノズル部から吐出し飛翔させ、前記液滴を前記工程ｃで形成した層に対して着弾させることによりゼラチン成形体を製造する工程ｄ；
をさらに含む、請求項１から３の何れか一項に記載のゼラチン成形体の製造方法。
【請求項５】
前記工程ｃにおけるゼラチンが動物ゼラチン又はリコンビナントゼラチンである、請求項４に記載のゼラチン成形体の製造方法。
【請求項６】
前記工程ｄにおける沸点１２０℃以下のアルコール類がエタノールである、請求項４又は５に記載のゼラチン成形体の製造方法。
【請求項７】
工程ｂにおいて、製造されたゼラチン成形体が、前記基板に接触している、請求項１から６の何れか一項に記載のゼラチン成形体の製造方法。
【請求項８】
工程ｂにおいて、製造されたゼラチン成形体が、前記基板に接触しており、
前記工程ｂの後に、ゼラチン水溶液を風乾させることを経た粒子の平均粒子径が２５〜２００μｍの粉末を含有する層を、工程ａで形成した層及び工程ｂで形成したゼラチン成形体の上に形成する工程ｃ１；及び沸点１２０℃以下のアルコール類を含有する水溶液の液滴をノズル部から吐出し飛翔させ、前記液滴を前記工程ｃ１で形成した層に対して着弾させることによりゼラチン成形体を製造する工程ｄ１を含み、
前記工程ｄ１において、前記液滴は、工程ｂで形成したゼラチン成形体の上面の外周領域に対応する領域に着弾され、
前記工程ｄ１の後に、ゼラチン水溶液を風乾させることを経た粒子の平均粒子径が２５〜２００μｍの粉末を含有する層を、工程ｃ１で形成した層及び工程ｄ１で形成したゼラチン成形体の上に形成する工程ｅ；及び沸点１２０℃以下のアルコール類を含有する水溶液の液滴をノズル部から吐出し飛翔させ、前記液滴を上記工程ｅで形成した層に対して着弾させることによりゼラチン成形体を製造する工程ｆを含み、前記工程ｆにおいて、前記液滴は、工程ｄ１で形成したゼラチン成形体の上面の外周領域に対応する領域、並びに工程ｄ１で形成したゼラチン成形体で囲まれる領域の内部の領域に着弾される、
請求項１から３の何れか一項に記載のゼラチン成形体の製造方法。
【請求項９】
ゼラチン成形体の形成に使用されなかった粉末を除去する工程ｇをさらに含む、請求項１から８のいずれか一項に記載のゼラチン成形体の製造方法。
【請求項１０】
前記工程ｇの後、成形体を加熱することにより成形体を硬化させる工程ｈを含む、請求項９に記載のゼラチン成形体の製造方法。
【請求項１１】
成形体を１時間から７２時間加熱する、請求項１０に記載のゼラチン成形体の製造方法。
【請求項１２】
前記ゼラチン成形体を支持体で包む工程ｉをさらに含む、請求項１から１１の何れか一項に記載のゼラチン成形体の製造方法。
【請求項１３】
前記ゼラチン成形体に細胞を播種する工程ｊをさらに含む、請求項１から１２の何れか一項に記載のゼラチン成形体の製造方法。
【請求項１４】
ゼラチン成形体が、再生医療用足場材又は組織修復材である、請求項１から１３のいずれか一項に記載のゼラチン成形体の製造方法。
【請求項１５】
ゼラチン成形体が、骨再生用組織修復材である、請求項１から１４のいずれか一項に記載のゼラチン成形体の製造方法。
【請求項１６】
ゼラチン成形体の空隙率が２０〜４０％である、請求項１から１５のいずれか一項に記載のゼラチン成形体の製造方法。
【請求項１７】
ゼラチン成形体が、外部空間と連通している孔を有している、請求項１から１６のいずれか一項に記載のゼラチン成形体の製造方法。
【請求項１８】
外部空間と連通している孔が、成形体の内部を貫通し、孔の両端において外部空間と連通している、請求項１７に記載のゼラチン成形体の製造方法。
【請求項１９】
外部空間と連通している孔の代表直径が３００μｍ〜２０００μｍである、請求項１７又は１８に記載のゼラチン成形体の製造方法。
【請求項２０】
ゼラチン成形体の表面が支持体で包まれている請求項１から１９のいずれか一項に記載のゼラチン成形体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、所定のアルコール水溶液の液滴をノズル部から吐出し飛翔させて、ゼラチン粉末を含有する層に対して着弾させることにより、ゼラチン成形体を製造する方法に関する。本発明はさらに、上記方法で製造されるゼラチン成形体に関する。
【背景技術】
【０００２】
機能障害又は機能不全に陥った生体組織又は臓器の再生を計る再生医療の実用化が進められている。再生医療は、生体が持っている自然治癒能力だけでは回復できなくなった生体組織において、細胞、足場及び成長因子の一種以上を使って元の組織と同じような形態及び機能を再生する医療技術である。再生医療においては、ゼラチンなどを用いて作製した三次元成形体を使用する場合がある。【０００３】
特許文献１には、結合剤及び粉末材料を含み、結合剤は、少なくとも１つの重合性基を有する重合性化合物を含有し、粉末材料又は重合性化合物の一方が、カチオン性基及び／又はカチオン性基になりうる基を有し、他の一方が、有機酸残基及び／又はその塩を有する三次元造形用材料が記載されている。特許文献２には、（i）支持体上に粉末材料を所定の厚さを有する層に形成する層形成工程、（ii）造形対象物を平行な断面で切断した断面形状になるように上記層における粉末材料を結合剤により結合させる結合工程、（iii）（i）及び（ii）の工程を順次繰り返すことによって三次元造形物を作製する作製工程、（iv）作製された三次元造形物の表面を、（１）エチレン性不飽和化合物、及び、（２）光重合開始剤、を含有する光硬化性組成物により被覆する被覆工程、及び、（v）被覆した光硬化性組成物を光硬化する硬化工程を含む、表面層を有する三次元造形物の製造方法が記載されている。特許文献３には、粉末材料及び結合剤を含み、結合剤が複素芳香環基を有する単量体単位を有する重合体を含有する、三次元造形用材料が記載されている。【０００４】
特許文献４には、樹脂により結着した所定形状の粉末材料層を複数積層して立体物を造形する立体造形に用いる粉末材料であって、複数の芯材が水溶性樹脂により固定化された粒子を含む立体造形用粉末材料が記載されている。また、特許文献５には、層を積層することにより、三次元造形物を製造する三次元造形物の製造方法であって、表面にイソシアネート基を有する粒子と、水酸基を有する水溶性樹脂と、水系溶媒と、を含む三次元造形用組成物を用いて上記の層を形成する層形成工程と、上記の層に、硬化性インクを吐出するインク吐出工程と、を有する三次元造形物の製造方法が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００９−１０２５２６号公報
【特許文献２】特開２０１０−２２８３１６号公報
【特許文献３】特開２０１０−２２８１０３号公報
【特許文献４】特開２０１６−３７０４１号公報
【特許文献５】特開２０１６−５５５３１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
Ｚ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社のＺプリンターシリーズのように、石膏粉末又はでんぷん粉末を用いて三次元成形体を製造することや、上記特許文献にあるような有機物による三次元プリントの報告はある。しかし、再生医療に用いるためのゼラチン成形体、特に生体適性を阻害する有害な成分を含まないことにより生体適性が高く、かつ高い造形精度のゼラチン成形体を製造する方法の開発が望まれている。【０００７】
本発明は、生体に有害な成分をなるべく含むことなく生体適性が高いゼラチン成形体を高い造形精度で製造する方法、並びに上記方法で製造されるゼラチン成形体を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、ゼラチン水溶液を風乾させることを経た粒子の平均粒子径が２５〜２００μｍの粉末を含有する層を基板上に形成した後に、沸点１２０℃以下のアルコール類を含有する水溶液の液滴をノズル部から吐出し飛翔させ、上記の層に対して着弾させることにより、生体適性が高いゼラチン成形体を高い造形精度で製造できることを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。【０００９】
即ち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）  ゼラチン水溶液を風乾させることを経た粒子の平均粒子径が２５〜２００μｍの粉末を含有する層を基板上に形成する工程ａ；及び工程ａで形成した層に対して、沸点１２０℃以下のアルコール類を含有する水溶液の液滴をノズル部から吐出し飛翔させ、上記液滴を上記工程ａで形成した層に対して着弾させることによりゼラチン成形体を形成する工程ｂ；
を含むゼラチン成形体の製造方法。
（２）  上記工程ａにおけるゼラチンが動物ゼラチン又はリコンビナントゼラチンである、（１）に記載のゼラチン成形体の製造方法。
（３）  上記工程ｂにおける沸点１２０℃以下のアルコール類がエタノールである、（１）又は（２）に記載のゼラチン成形体の製造方法。
（４）  上記工程ｂの後に、ゼラチン水溶液を風乾させることを経た粒子の平均粒子径が２５〜２００μｍの粉末を含有する層を、工程ａで形成した層及び工程ｂで形成したゼラチン成形体の上に形成する工程ｃ；及び沸点１２０℃以下のアルコール類を含有する水溶液の液滴をノズル部から吐出し飛翔させ、上記液滴を上記工程ｃで形成した層に対して着弾させることによりゼラチン成形体を製造する工程ｄ；
をさらに含む、（１）から（３）の何れか一に記載のゼラチン成形体の製造方法。【００１０】
（５）  上記工程ｃにおけるゼラチンが動物ゼラチン又はリコンビナントゼラチンである、（４）に記載のゼラチン成形体の製造方法。
（６）  上記工程ｄにおける沸点１２０℃以下のアルコール類がエタノールである、（４）又は（５）に記載のゼラチン成形体の製造方法。
（７）  工程ｂにおいて、製造されたゼラチン成形体が、上記基板に接触している、（１）から（６）の何れか一に記載のゼラチン成形体の製造方法。
（８）  工程ｂにおいて、製造されたゼラチン成形体が、上記基板に接触しており、
上記工程ｂの後に、ゼラチン水溶液を風乾させることを経た粒子の平均粒子径が２５〜２００μｍの粉末を含有する層を、工程ａで形成した層及び工程ｂで形成したゼラチン成形体の上に形成する工程ｃ１；及び沸点１２０℃以下のアルコール類を含有する水溶液の液滴をノズル部から吐出し飛翔させ、上記液滴を上記工程ｃ１で形成した層に対して着弾させることによりゼラチン成形体を製造する工程ｄ１を含み、
上記工程ｄ１において、上記液滴は、工程ｂで形成したゼラチン成形体の上面の外周領域に対応する領域に着弾され、
上記工程ｄ１の後に、ゼラチン水溶液を風乾させることを経た粒子の平均粒子径が２５〜２００μｍの粉末を含有する層を、工程ｃ１で形成した層及び工程ｄ１で形成したゼラチン成形体の上に形成する工程ｅ；及び沸点１２０℃以下のアルコール類を含有する水溶液の液滴をノズル部から吐出し飛翔させ、上記液滴を上記工程ｅで形成した層に対して着弾させることによりゼラチン成形体を製造する工程ｆを含み、上記工程ｆにおいて、上記液滴は、工程ｄ１で形成したゼラチン成形体の上面の外周領域に対応する領域、並びに工程ｄ１で形成したゼラチン成形体で囲まれる領域の内部の領域に着弾される、
（１）から（３）の何れか一に記載のゼラチン成形体の製造方法。【００１１】
（９）  ゼラチン成形体の形成に使用されなかった粉末を除去する工程ｇをさらに含む、（１）から（８）のいずれか一に記載のゼラチン成形体の製造方法。
（１０）  上記工程ｇの後、成形体を加熱することにより成形体を硬化させる工程ｈを含む、（９）に記載のゼラチン成形体の製造方法。
（１１）  成形体を１時間から７２時間加熱する、（１０）に記載のゼラチン成形体の製造方法。
（１２）  上記ゼラチン成形体を支持体で包む工程ｉをさらに含む、（１）から（１１）の何れか一に記載のゼラチン成形体の製造方法。
（１３）  上記ゼラチン成形体に細胞を播種する工程ｊをさらに含む、（１）から（１２）の何れか一に記載のゼラチン成形体の製造方法。
（１４）  ゼラチン成形体が、再生医療用足場材又は組織修復材である、（１）から（１３）のいずれか一に記載のゼラチン成形体の製造方法。【００１２】
（１５）  （１）から（１４）の何れか一に記載のゼラチン成形体の製造方法により製造されるゼラチン成形体。
（１６）  再生医療用足場材又は組織修復材である、（１５）に記載のゼラチン成形体。
（１７）  骨再生用組織修復材である、（１５）又は（１６）に記載のゼラチン成形体。
（１８）  空隙率が２０〜４０％である、（１５）から（１７）の何れか一に記載のゼラチン成形体。【００１３】
（１９）  外部空間と連通している孔を有している、（１５）から（１８）の何れか一に記載のゼラチン成形体。
（２０）  外部空間と連通している孔が、成形体の内部を貫通し、孔の両端において外部空間と連通している、（１９）に記載のゼラチン成形体。
（２１）  外部空間と連通している孔の代表直径が３００μｍ〜２０００μｍである、（１９）又は（２０）に記載のゼラチン成形体。
（２２）  表面が支持体で包まれている（１５）から（２１）の何れか一に記載のゼラチン成形体。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によるゼラチン成形体の製造方法によれば、生体に有害な成分をなるべく含むことなく生体適性が高いゼラチン成形体を高い造形精度で製造することができる。本発明のゼラチン成形体は、生体適性が高く、かつ高い造形精度を有する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、風乾を経たゼラチン粉末を使用して製造した成形体を示す。
【図２】図２は、凍結乾燥を経たゼラチン粉末を使用して製造した成形体を示す。
【図３】図３は、粉末の平均粒子径及び水溶液組成と、膜厚及び収縮率との関係について評価した結果を示す。
【図４】図４は、吐出液として水又はエタノール水溶液を用いて製造したゼラチン成形体を示す。
【図５】図５は、空隙を有する成形体と空隙を有さない成形体の３Ｄ（三次元）設計図と、製造した空隙を有する成形体を示す。
【図６】図６は、空隙を有する成形体の３Ｄ（三次元）設計図と、製造した空隙を有する成形体を示す。
【図７】図７は、骨再生の評価のためのマイクロＣＴ解析の結果を示す。
【図８】図８は、骨再生の評価のための病理解析の結果を示す（連通孔ありの成形物）。
【図９】図９は、骨再生の評価のための病理解析の結果を示す（連通孔なしの成形物）。
【図１０】図１０は、骨再生の評価のための病理解析の結果を示す（凍結乾燥スポンジ）。
【図１１】図１１は、ゼラチン成形体の充填率の測定方法に関する図である。
【図１２】図１２は、ゼラチン成形体の充填率の測定結果を示す。
【図１３】図１３は、ゼラチン成形体の充填率の測定結果を示す。
【図１４】図１４は、ゼラチン成形体の充填率の測定結果を示す。
【図１５】図１５は、二次元において、パスのもとになるドットが５０％の場合に縦方向でも横方向でもパスが生じることを示す図である。
【図１６】図１６は、ゼラチン粉末を積層した成形体では、マイクロＣＴ解析において、空隙率が３０％で、１００μｍ径程度の孔が立体的に結ばれた連通孔構造になっていることを示す図である。
【図１７】図１７は、通常の方法による成形体の製造方法を示す。
【図１８】図１８は、本発明の第一の積層方法による成形体の製造方法を示す。
【図１９】図１９は、本発明の第二の積層方法による成形体の製造方法を示す。
【図２０】図２０は、水又は５０質量％エタノール水溶液の液滴をゼラチン粉末に着弾した後の様子を示す。
【図２１】図２１は、吐出液として水を用いて積層体からなる成形体を製造した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
［１］ゼラチン成形体の製造方法
本発明によるゼラチン成形体の製造方法は、
ゼラチン水溶液を風乾させることを経た粒子の平均粒子径が２５〜２００μｍの粉末を含有する層を基板上に形成する工程ａ；及び工程ａで形成した層に対して、沸点１２０℃以下のアルコール類を含有する水溶液の液滴をノズル部から吐出し飛翔させ、上記液滴を上記工程ａで形成した層に対して着弾させることによりゼラチン成形体を形成する工程ｂ；
を含む。
【００１７】
本発明においては、ゼラチン水溶液を風乾させることを経た粒子の平均粒子径が２５〜２００μｍの粉末を使用すること、並びに沸点１２０℃以下のアルコール類を含有する水溶液を使用することによって、反りや縮みがほぼ無く、上下の層がしっかり結着した高精度なゼラチン成形体を高い造形制度で製造することができる。
【００１８】
＜１＞ゼラチン水溶液を風乾させることを経た粒子の平均粒子径が２５〜２００μｍの粉末
本発明で用いる粉末は、ゼラチン水溶液を風乾させることにより得られる粉末、または風乾させることにより得られた固体を加工した粉末である。
本明細書でいう風乾とは、０℃以上６０℃以下の温度で乾燥させるプロセスであり、大気圧中、又は減圧乾燥で行う。ゼラチンは乾燥温度により乾燥後の分子構造が異なるため、乾燥温度を変更することにより粉末の膨潤性を調整することができる。乾燥温度が高すぎると、インクジェット描画時の膨潤によるサイズ変化が大きくなるため好ましくない。一方、乾燥温度が低すぎると溶解速度が遅くなり、積層による造形の製造効率の観点より好ましくない。このため、乾燥温度としては、１０℃〜４０℃が好ましく、２０℃から３０℃がより好ましい。また、乾燥を促進するために減圧又は送風などの方法を併用することができる。圧力としては、１気圧〜各温度での水の蒸気圧以上の範囲が好ましい。
【００１９】
ゼラチン水溶液を風乾させる代わりに、凍結乾燥することによって粉末を製造した場合、凍結乾燥の粉末にアルコール水溶液をインクジェット描画すると、粉末がインクに溶けてしまい、造形することができなくなる。凍結乾燥した場合には、１個の粉粒子が多数の穴が開いた状態であり、密度が小さく、アルコール水溶液に容易に溶解するためと考えられる。ゼラチン水溶液を風乾させることを経た粒子の平均粒子径２５〜２００μｍの粉末は、粒子表面にほとんど空隙がないため、粒子の比表面積が小さく、インクジェットにより描画しても、粉粒子の一部、粉粒子の表面しか溶けない。
【００２０】
本発明で用いる粉末の平均粒子径は２５〜２００μｍである。平均粒子径が２５μｍ未満、又は平均粒子径が２００μｍより大きい場合には、所望の立体的な粉末積層物（成形体）を形成できなくなる。
【００２１】
（粉末の平均粒子径の測定方法）
本発明で用いる粉末の平均粒子径は、通常知られている方法で測定することができ、具体的には、直接観察法（光学顕微鏡、電子顕微鏡）、レーザー回折・散乱法、遠心沈降法、電気的検知帯法、光子相関法等を用いて測定することができる。測定法としては、測定の際に空気又は他のガス中で測定する乾式法、適当な溶媒中に粒子を分散させて測定する湿式法がある。直接観察法は乾式法により測定を行うことができ、レーザー回折・散乱法は乾式法又は湿式法により測定を行うことができ、遠心沈降法、電気的検知帯法及び光子相関法は湿式法により測定を行うことができる。
【００２２】
上記の測定法の中で、湿式のレーザー回折・散乱法が、精度、再現性及び測定の簡便さにおいて優れている。湿式のレーザー回折・散乱法を用いた粒度分布測定器は市販されており、例えば、レーザー回折式粒子径分布測定装置ＳＡＬＤ（島津製作所）、マスターサイザー（マルバーン）、マイクロトラックＭＴ（マイクトラックベル）、レーザー回折散乱法粒度分布測定装置ＬＳ１３（ベックマンコールター）、レーザーマイクロンサイザー（セイシン企業）、レーザー回折/散乱式粒子径分布測定装置ＬＡシリーズ（ＨＯＲＩＢＡ）などが挙げられる。本発明の実施例では、主として、レーザー回折/散乱式粒子径分布測定装置ＬＡ９２０（ＨＯＲＩＢＡ）を用いた。
【００２３】
湿式粒子径分布測定に用いる溶媒は、ゼラチンを溶解する溶媒やゼラチンを膨潤させる溶媒以外の溶媒を選択する必要がある。適した溶媒としては、アルコール類、ケトン類、エステル類、炭化水素類、シリコン油類などを用いることができるが、安全性、屈折率等の理由で、アルコール類が好ましく、なかでもエタノール、イソプロパノールが特に好ましい。測定温度は特に表記しない限り、２５℃（±３℃）である。
【００２４】
湿式レーザー回折・散乱法で測定される粒子径は、球相当径に換算した粒子径分布の形で表される。本発明における平均粒子径とは、特に説明が無い限りメジアン径（５０％径）を表している。また、メジアン径の他に１０％径、９０％径も粒子の特性に用いる場合があるが、これらはいずれも湿式レーザー回折・散乱法で測定された粒子径分布から求めたものである。
【００２５】
（粉末の平均粒子径の上限及び下限について）
粉末の平均粒子径を２００μｍより大きくすると、ＸＹＺ方向ともに、粉末積層物（成形体）の最小単位も２００μｍとなるため、高精度な成形体が作製できなくなる。また、本発明のような粉末積層の場合、主に以下に記載する二つの理由（理由１及び理由２）により、粉末の平均粒子径には下限が存在する。
【００２６】
理由１：粉末の流動性の悪化及び凝集性の増加によるリコート不良
平均粒子径を小さくすると、粒子の集合体である粉末の流動性が悪化したり、凝集塊が生じる傾向があることが一般的に知られている。平均粒子径が小さくなり、流動性が悪化し、凝集塊が生じると、リコートが難しくなる。魚ゼラチンの場合でも平均粒子径が２１μｍの場合には、粉末がローラーに付着したり、リコート面の一部に目視可能な凹凸が生じて高精度なリコートができなかった。
【００２７】
理由２：膜厚の増大と膜応力の抑制を両立し、高精度な構造物を作製する。
本発明の実施態様の一例として、ローラー又はブレードなどを使用して、粉粒子の集合体であるゼラチン粉末を平坦化した後に、インクジェットヘッドなどから吐出液を吐出して、粉末の表面の上から下に向けて、吐出液を飛翔させ、粉末表面に吐出液を着弾させながら、インクジェットヘッドなどを、粉末と水平方向であるＸＹ方向に走査させて、面状の塗布面を形成する場合を想定する。この場合、着弾した吐出液が、粉末の構成要素である粒子と粒子の隙間に入り込み、隣り合った二つ以上の粒子と粒子の間に吐出液が位置し、粉末の粒子の表面が吐出液により溶けたのち、吐出液の乾燥が進み、粉末の粒子と粒子が仮接着する。上記系において１層分の膜を形成する粉末積層の場合、以下の傾向がある。
ここでの粉末の表面とは、粉末を構成するひとつひとつの粉粒子の表面ではなく、粒子の集合体である粉末の上部の空気層側という意味である。ここでの粒子の表面とは、粉末の構成要素である粒子の表面のことである。
【００２８】
単位面積当たりの打滴量を増やして描画すると、粉末表面から内部へ吐出液が浸透する量が増えて膜厚が大きくなるが、膜応力（膜の縮みと反り）が大きくなる。単位面積あたりの打滴量を少なくすると、膜応力は小さくなるが、膜厚が小さくなる。粉末積層においては、Ｚ方向の積層ピッチに下限がある関係上、膜厚はある一定以上のものが要求される。
【００２９】
Ｚ方向の積層ピッチは、以下の２つの理由などから下限がある。
理由２−１：粉末積層の造形時間の増加抑制
Ｚ方向の積層ピッチを小さく設定すると、その分、所望の厚みを得るためには積層回数が増えて立体物の造形速度が遅くなる。必要以上の精度は造形速度に不要である。
【００３０】
理由２−２：機械的制精度
リコートにおける水平度を保って揺らぎなく走査するための機械的精度からの要求。
現状の粉末積層においては、１層分の積層ピッチは１００μｍ程度である。
１層分の積層ピッチは１００μｍ、１層を形成するのに必要とされる膜厚は、上下層が密着することを考えると、１５０μｍから２００μｍ程度の膜厚を得る必要がある。
【００３１】
粉末積層による成形体を製造するにあたっては、所定の膜厚を得ることは重要である。
しかし、ある所定の膜厚を得るため、単位体積あたりの打滴量を大きくすると、膜応力により適切な構造物を得ることができず、膜応力を下げるため、単位体積あたりの打滴量を小さくすると、上下の膜が密着せず、立体的な構造物を得ることができない。
単位体積当たりの打滴量の増減を設計事項として、膜厚を大きくしようすることと、膜応力を抑制することの関係は、トレードオフであって、本発明のような粉末積層物を形成するには障害となる。
【００３２】
しかし、上記のような、単位体積当たりの打滴量の増減を設計事項として、膜厚を大きくしようすることと、膜応力を抑制することの関係が、トレードオフである場合でも、粉末の平均粒子径を大きくすると、トレードオフ関係の調整といった消極的なことではなく、トレードオフの関係が解消され、膜厚を大きくしようすることと、膜応力を抑制することが両立される。
【００３３】
さらに粉末の平均粒子径の大きさに応じて、両立する程度が高まる。
単位面積あたりの塗布量の調整は、一つのノズルから吐出する一つの液滴の量を調整したり、着弾する液滴と液滴の距離、着弾密度を調整することにより制御できる。
【００３４】
（粉末の調製方法について）
粒子の平均粒子径が２５〜２００μｍの粉末は、例えば、ゼラチンを風乾した固体を粉砕することによって調製することができる。
風乾したゼラチン固体の粉砕は、既知の機械的粉砕装置を用いて微粒子化することができる。粉砕方法としては、乾式粉砕法と湿式粉砕法とがあるが、本発明の場合には乾式粉砕法が好ましい。乾式粉砕装置の代表例としては、高速回転型衝撃式ミル，ローラーミル、ジェットミル、及び媒体攪拌型ミル等が挙げられる。
【００３５】
高速回転型衝撃式ミルは高速回転するハンマー、ピン、ディスクなどで固体塊に衝撃を与えることで粉砕するもので、粉砕前後の平均粒子径の大きさに応じて様々な装置が市販されている。例えば、粉砕後の平均粒子径がｃｍレベルではジョークラッシャーやハンマーミル等があり、粉砕後の平均粒子径が数ｍｍレベルではロッドミルやピンミル等が使われる。粉砕後の平均粒子径が数十μｍレベルでは、更に高速撹拌のディスクやインペラーを備えたミルが用いられる。また高速回転体とその外周部にスクリーンを備えることで、せん断力による微細化と一部分級機能を発揮することで粉砕粒子の均一性を高める工夫をしたものも好ましく用いられる。
【００３６】
ローラーミルは回転するロール間に粉砕したい固体を入れて、ローラー間の圧力でつぶして粉砕するものである。粉砕後の平均粒子径が数ｃｍレベルのものとしてはロールクラッシャーがあり、粉砕後の平均粒子径が数ｍｍレベルのものとしてはローラーミルがある。
【００３７】
ジェットミルは高速気流による粒子同士あるいは壁等への衝突、摩砕によって、微細化するもので、主に１０μｍ以下の微細粒子を作るのに適している。この方式の一種で、粒子同士の衝突ではなく、高速気流を専用の衝突板にぶつけることで粉砕する方式である。衝突型ジェットミルという装置も市販されており、比重の軽いゼラチンの粒子の粉砕には、この衝突型ジェットミルも適している。
【００３８】
媒体撹拌型ミルの代表はボールミルである。ボールミルは、金属、磁性、金属酸化物のボールによる衝撃、圧縮、摩砕により微細化するもので、試料とボールを一つのポットに入れてこれを長時間回転させることで微細化するものであるが、回転ではなく高周波数に振動させて粉砕するものもある。
【００３９】
風乾したゼラチン固体の粉砕には、上記した粉砕方法を用いることが可能であるが、ゼラチンを粉砕する場合には、特に粉砕中の温度が高くなり過ぎないことが重要である。粉砕中の粒子の温度は、８０℃以下、好ましくは６０℃以下に保つことが望ましい。そのため、粉砕機には空冷あるいは水冷などの冷却機構を備えていることが好ましい。また、液体窒素等で積極的に冷凍して粉砕する方法も有効である。また、粉砕効率、製造された粒子の平均粒子径分布を狭くするために、粉砕装置に分級機構を備えていることが好ましい。分級機構としては、スクリーンや遠心分離が一般的である。さらに、風乾したゼラチン固体を一回の操作で数十μｍレベルまで粉砕することは粉砕機の性能上難しい。一般的には粉砕レベルに応じたいくつかの粉砕機を段階的に使用することで、平均粒子径の揃った微細粉末を得ることができる。
【００４０】
＜２＞ゼラチン水溶液を風乾させることを経た粉末を含有する層を基板上に形成する工程ａ
本発明における工程ａは、ゼラチン水溶液を風乾させることを経た粒子の平均粒子径が２５〜２００μｍの粉末（ゼラチン粉末とも言う）を含有する層を基板上に形成する工程である。基板は、昇降ステージの上に設けられていてもよい。
基板の材質、形状、及び大きさは、特に限定されず、目的に応じて適切な基板を使用することができる。基板としては、所定の面積の平面を有する基板が好ましい。基板の表面の大きさは特に限定されないが、好ましくは０．５ｃｍ×０．５ｃｍ〜５０ｃｍ×５０ｃｍであり、より好ましくは３ｃｍ×３ｃｍ〜１５ｃｍ×１５ｃｍ程度である。基板の表面の形状は正方形でも長方形でもよい。
【００４１】
基板の材質としては、ステンレス鋼、アルミニウム、銅、鉄などの金属素材、ガラス、セラミックスなどの無機素材、アクリル、メタクリル（ポリメタクリル酸メチル樹脂など）、ポリスチレン、ポリプロピレン、テフロン（登録商標）等のプラスチック素材が挙げられる。
【００４２】
ゼラチン粉末を含有する層を基板上に形成する工程は、任意の方法で行うことができ、その方法は特に限定されないが、例えば、３Ｄプリンタ（三次元プリンタ）を用いて行うことができる。３Ｄプリンタの一例としては、Ｚ−Ｐｒｉｎｔｅｒ３１０ｐｌｕｓ（３Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（旧  Ｚ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）等を使用できるが、特に限定されない。
【００４３】
＜３＞アルコール類を含有する水溶液
本発明においては、沸点１２０℃以下のアルコール類を含有する水溶液を使用する。
成形体を形成するための吐出液として、水を使用する理由は、以下の２つである。
理由１−１：体内には水は豊富にあり、基本的に無害で安全性が高い。
理由１−２：ゼラチン粉末を溶解し、粉末の粒子と粒子を仮接着することができるため。
【００４４】
本発明のゼラチン粉末の成形体は、粉末積層により造形することができる。  粉末積層により造形の一例としては、本明細書上記した通りであるが、ローラー又はブレードなどを使用して、粉粒子の集合体であるゼラチン粉末を平坦化した後に、１ノズルから３０００ノズル、より良くは、１００ノズル〜３０００ノズルを持つ、インクジェットヘッドなどから、１ｐＬ〜１０００ｐＬ程度、より良くは、１０ｐＬ〜１００ｐＬの吐出液を吐出して、粉末の表面の上から下に向けて、吐出液を０．５ｍｍから５ｍｍ程度、より良くは２ｍｍ〜３ｍｍ程度飛翔させ、粉末表面に吐出液を、０．５ｋＨｚ〜５０ＫＨＺ、より良くは、３ｋＨｚ〜２０ｋＨｚで着弾させながら、インクジェットヘッドなどを、粉末と水平方向であるＸＹ方向に走査させて、面状の塗布面を形成することができる。ここで着弾した吐出液は、粉末の構成要素である粒子と粒子の隙間に入り込み、隣り合った二つ以上の粒子と粒子の間に吐出液が位置し、粉末の粒子の表面が吐出液により溶けたのち、吐出液の乾燥が進み、粉末の粒子と粒子が仮接着する。インクジェットヘッド以外には、ジェットディスペンサー、なども考えられる。ジェットディスペンサーの場合は通常１ノズルである。
【００４５】
水はゼラチンを溶解し、少量の水は容易に乾燥する。インクジェットのような微小液滴（２ｐＬ〜３００ｐＬ程度）を粉末に面状に均一に塗布すると、粉末形成後で、１０分程度以内で、室温でも容易に、ほぼ乾燥する。しかし、水には以下に記載する問題があることから、本発明においてはアルコール類を含有する水溶液を使用する。アルコール類を含有する水溶液を使用する理由は以下の４つである。
【００４６】
（アルコール類を含有する水溶液を使用する理由）
理由２−１：膜厚の増大と膜応力の抑制を両立し、高精度な構造物を作製する。
粉末の粒子の表面が吐出液により溶けて、吐出液の乾燥が進むと、粉末の粒子と粒子が仮接着するような系において、インクジェットにより描画して一層の膜を形成する場合、膜厚を大きくするため、設計事項として単位体積当たりの打滴量を増やすと、膜応力（膜の縮みと反り）が大きくなり、逆に膜応力の発生を抑制するため、設計事項として単位体積あたりの打滴量を少なくすると、膜厚が小さくなる。
【００４７】
単位体積当たりの打滴量の増減を設計事項として、膜厚を大きくしようすることと、膜応力を抑制することは、トレードオフの関係にあり、高精度な粉末積層物を形成するには障害となる。しかし、上記のような、単位体積当たりの打滴量の増減を設計事項として、膜厚を大きくしようすることと、膜応力を抑制することがトレードオフである場合でも、アルコール類を含有する水溶液を用いると、トレードオフの関係が解消され、膜厚を大きくしようすることと、膜応力を抑制することが両立される（図３を参照）。
【００４８】
これは以下のようなメカニズムと推定される。
ゼラチン粉末の粒子は水に溶解するが、ゼラチン粉末の粒子の最表面は親水性でなく、疎水性の可能性が高いことが想定される。従って、水とアルコール類との混合液では、吐出液の表面張力が下がる効果と、疎水性の表面とアルコール類水溶液との相溶性が上昇し、粒子の表面に濡れやすくなる効果により、粉末の奥まで液が浸透する。粉末への浸透が容易なことより、単位面積当たりの打滴量が少ない場合でも、水と同じ膜厚の粉末積層物を得ることができる。粉末の粒子の表面が吐出液により溶けて、その後、吐出液が蒸発し乾燥が進むと、粉末の粒子と粒子は、ゼラチン成分により仮接着する。粒子と粒子の間に液が位置すると、液架橋状態となり、粒子と粒子の間の引き寄せる力が発生し、粉末の膜体を収縮させる。アルコール類を含有する水溶液を使用すると、面積あたりに少ない打滴量で同じ膜厚となることから、粒子と粒子の間に位置する吐出液の量が少なく、粒子と粒子を引き寄せる力が弱く、粉末の膜の縮みが小さくなる。
【００４９】
ゼラチン粒子の最表面は親水性でないと想定される理由は、ゼラチン粉末の造粒の乾燥過程で、ゼラチン水溶液から水分が蒸発していくとき、ゼラチン分子とゼラチン分子、又はゼラチン分子内の親水性の基が向かい合い、疎水的な基が反対を向いて、安定化するため、並びに、最表面の外側に向いている親水基が少なくなり、相対的に疎水的になるためである。また、ゼラチン水溶液から作製した大きなひと塊りの固体ゼラチンを粉砕した場合でも、固体ゼラチンは、結合力の弱い疎水的な面から分かれて、二つ以上の微細な粒子になり、粒子の最表面は疎水的であると考えられる。
【００５０】
図２０は、水とエタノール水溶液５０質量％をゼラチンに滴下着弾させて浸透するかどうかを観察したものである。インクジェットの液滴が２０μｍであるのに対し、図２０では、２ｍｍくらいの大きな液滴についての実験である。図２０に示す通り、水は着弾直後から２分後、１時間後でもゼラチン粉末に浸透しないが、エタノール水溶液は着弾後１秒以内で浸透していることから、上記の内容が推測できる。
【００５１】
理由２−２：高周波での多数ノズル、高周波数での高速描画が可能となり、造形速度が上昇し、高精度な成形体を製造しやすい。
一般的なインクジェットヘッドは、一次元的に並んだ３００ｄｐｉ〜６００ｄｐｉ程度のノズル列、吐出周波数５〜２０ｋＨｚくらいの高速吐出能力で、高速に塗布面を形成する。多数のノズルから高速の周波数で描画すると、非常に短時間に多数の液滴がゼラチン粉末に対して打滴される。例えば、３００ｄｐｉ×５ｋＨｚと比較的低速で、１ｃｍ×１ｃｍの範囲に描画したとしても、０．０２秒程度の時間で描画される。
【００５２】
Ｚ−Ｐｒｉｎｔｅｒ３１０ｐｌｕｓ（３００ｄｐｉ、周波数は５ｋＨｚ以上と推測）を用いて、吐出液を水にして、約１ｃｍ×約１ｃｍ〜約３ｃｍ×約３ｃｍのゼラチン粉末に描画すると、目視で数ｍｍサイズの液滴が形成される様子が観察される。描画直後、少なくとも目視レベルでは粉末は乾燥しており、水が浸透している様子はなく、粉末上に打滴された吐出液である水が全て合体して、一つの大きな液滴になっていると推測できる。これは、ゼラチン粉末のように最表面が親水でなく、疎水的で、粒子サイズに応じた凹凸があるよう系では、水に対して、ハスの葉が水滴をはじくような、ロータス効果と呼ばれる現状が生じて、超撥水状態となり、簡単には水が浸透しないためと推測できる。
【００５３】
同様に、水で１ｃｍ×１ｃｍ程度を描画すること、１００μｍ厚みとなるようローラーでリコートすることを１回の操作（１層分）として、５回分（５層分）程度を繰り返す。
通常、３Ｄプリンタでは、５層分程度は、所望の成形体を得ることはできない。５層分、５回程度、ローラーのリコート操作が繰り返されることにより、粉末上の数ｍｍサイズの水が粉末に押しつぶされたり、押し込まれたりして、粉末が濡れはじめる。粉末が濡れはじめると、濡れたところを起点として、粉末積層物ができ始めるが、以下の２つの問題点があり、高精度な成形体は製造できない。
【００５４】
理由２−２−１：  ヘッドからインクを吐出して描画するときに、走査する方向に伸びた１ｍｍ弱の棒状の束が集まった成形体となり、高精度な成形体を得ることはできない。これは一列に並んだ隣り合うノズルから、吐出された吐出液が粉末の表面上にて、着弾直後にゼラチン粉末に浸透せず、粉末の表面上にて、ノズル数列から１０列程度の吐出集まる、着弾干渉と考えられる。通常のインクジェット描画では着弾干渉を防ぐため、界面活性剤により吐出液の表面張力を下げたり、シリカの微粒子をポリビニルアルコールの高分子で複合化させた専用のインクジェット用紙を使用したり、石膏やデンプンの粉末積層などにおいても、ポリビニルアルコール高分子を混合したりする。この場合のように、ゼラチン粉末への浸透が遅い場合、着弾干渉が極端に起こり、棒状の束ができると考えている。また、棒状の束は、手でつかむと簡単にはがれてしまう。しかし、アルコール類を含有する水溶液を使用すると、ゼラチン粉末への速やかな浸透がおこり、水でみられたような着弾干渉による棒状の束ができることなく、所望の３Ｄ構造物に近いものができる。
【００５５】
理由２−２−２：  水では極端な積層ずれが生じるが（図２１を参照）、アルコール類を混合した水溶液なら大幅に緩和される。
【００５６】
理由２−３：吐出液滴状態の安定
水とエタノールを混合すると、表面張力が下がり、粘性度がアップする。これにより、最適なインクジェットの吐出条件に近づき、理想的な吐出、飛翔形状に近づき、先滴の後滴の分裂距離が小さくなり、着弾したときに分裂して着弾しない。また、後滴の速度が早くなるため、後滴の飛翔曲がりの発生頻度が下がり、描画精度が上がる。また、水の場合は、複雑な波形で精密に調整した波形で初めて吐出可能となるが、エタノールなどアルコール類を混合した水溶液だと、単純な矩形波で吐出可能となり、吐出が安定する吐出速度の範囲も広げることが可能となる。例として、水とエタノールを５０質量％ずつ混合すると、水の場合と比較して、粘性度は１ｃｐから２．８ｃｐまで上昇し（１００ｃＰ＝０．１Ｐａ・ｓ）、表面張力は７２ｍＮ／ｍから２８ｍＮ／ｍまで低下する。インクジェットヘッドにより最適な粘性度、表面張力はかわるが、一般的に３ｃｐから１２ｃｐ、２５から３５ｍＮ／ｍ程度であり、適正な物性に近づく。エタノールの添加により、一般的なインクジェットインクに大量に添加されている界面活性剤や増粘剤を添加しなくても、最適な吐出液の物性に近づくことができるため、吐出安定化につながる。このため、先滴と後滴の分裂距離が小さくなり、液滴が着弾したときに、分裂して着弾することがなくなる。後滴の速度が早くなるため、後滴の飛翔曲がりの発生頻度が下がり、描画精度が向上する。
【００５７】
理由２−４：
安全性を重視し、水以外を用いないことも想定されるが、沸点が低いアルコール類であれば、造形後の粉末積層物から蒸発させることが可能であり、安全性の高い構造物を得ることができる。ゼラチン構造物の再生医療物への用い方や、ゼラチンの種類にもよるが、１３５℃程度の温度で熱架橋してから生体に移植することが多く、アルコール類の沸点が１２０℃以下であれば、アルコール類がゼラチン構造物から取り除くことが可能である。
【００５８】
（アルコール類の具体例）
沸点１２０℃以下のアルコール類の具体例としては以下のアルコールを挙げることができるが、特に限定されない。
メタノール：  沸点６５℃エタノール：  沸点７８℃
１−プロパノール：沸点９７℃
２−プロパノール：沸点８２℃
１−ブタノール：沸点１１７℃
２−ブタノール：沸点９９℃
２−ペンタノール：沸点１１９℃
ｔｅｒｔ−ブチルアルコール：沸点８２℃
沸点１２０℃以下のアルコール類としては、エタノールが特に好ましい。
【００５９】
アルコール水溶液におけるアルコール類と水との混合比率は特に限定されないが、一般的には質量比で１０：９０〜９０：１０であり、好ましくは２０：８０〜８０：２０であり、より好ましくは３０：７０〜７０：３０であり、さらに好ましくは４０：６０〜６０：４０である。一例としては、アルコール類と水との混合比率は５０：５０でもよい。
【００６０】
＜４＞アルコール水溶液の吐出を含むゼラチン成形体を製造する工程ｂ
本発明においては、工程ａで形成した層に対して、沸点１２０℃以下のアルコール類を含有する水溶液の液滴をノズル部から吐出し飛翔させて、上記液滴を工程ａで形成した層に対して着弾させることによりゼラチン成形体を形成する。
【００６１】
本発明においては、アルコール水溶液の液滴が吐出させる。ノズル部から吐出したアルコール水溶液の液滴は、ノズル部と基板上のゼラチン粉末を含有する層のいずれにも接触せずに、空間中を移動する。
【００６２】
本発明においては、アルコール水溶液の液滴で吐出させる際、ヘッド内ノズル付近の温度は特に限定されないが、好ましくは１５℃〜３５℃であり、より好ましくは２０℃〜３０℃である。環境的及び機械的に制御せずに、室温に装置を置いた場合、アクチュエータが駆動して温度が上昇し、ヘッド内ノズル付近の温度は、実験室の２３℃環境よりやや高い２８℃程度になる。
【００６３】
アルコール水溶液の吐出は、ノズル部を有するインクジェットヘッドを用いて行うことができる。インク液滴をピエゾ素子のアクチュエータ等によりノズル部から吐出し、媒体に着弾させて媒体上に画像を形成するインクジェット記録装置が知られている。インクジェット記録装置では、ノズル部の配列ピッチが高密度化されるとともに、数ピコリットル〜１００ピコリットルの微小なインク液滴を吐出することが可能である。特開２０１２−４５５５号公報には、インクジェット方式による機能材料の製造方法及び装置が記載されているが、アルコール水溶液の吐出は、特開２０１２−４５５５号公報に記載されているようなインクジェットヘッドを用いて行うことができる。特開２０１２−４５５５号公報に記載の内容は全て本明細書に引用されるものとする。
【００６４】
インクジェット装置は、基板が載置されるステージ、及び基板に向けてアルコール水溶液を吐出するインクジェットヘッドを含むように構成することができる。
【００６５】
ステージは、移動機構により垂直方向に自在に移動可能に構成されていってもよく、さらに水平方向の移動機構があってもよい。  移動機構としては、例えば、ラックアンドピニオン機構、ボールネジ機構等を用いることができる。移動機構を制御することによりステージを所望の位置に移動させることができる。
【００６６】
インクジェットヘッドは、インクタンクから供給されるアルコール水溶液を基板の所望の位置に対して吐出するものである。インクジェットヘッドとしては、ピエゾ方式のアクチュエータを持つヘッドを用いることができるが、特に限定されない。
【００６７】
粉体積層の場合、ＸＹ方向の移動は、基板を固定して、インクジェットヘッドをＸＹ方向に稼働させるのが一般的だが、インクジェットヘッドと基板とが相対的に移動すれば、よく、インクジェットヘッドを固定して基板を稼動するよう構成しても構わない。
【００６８】
アルコール水溶液の描画方式は、シリアルプリンタ方式でもよいし、ラインプリンタ方式でもよい。大面積を効率よく描画するためには、シングルパスによるラインプリンタ方式の装置が適している。シングルパスであれば、インクジェットヘッドとインクが打滴される基板の各領域とが１回通過するだけで、各領域の全面にインクを吐出することができる。
【００６９】
インクジェットの方式としては、コンティニュアス型、オンデマンド型のいずれでもよい。数１０ｃｍ四方以上の大面積に描画する場合には、ノズルが複数あるオンデマンド型が好ましい。
【００７０】
オンデマンド型の吐出方式を特徴付けるアクチュエータは、ピエゾ方式、サーマル方式、ソリッド方式、静電吸引方式等の種々の方式を用いることができる。ピエゾ方式は、水系以外に、有機剤系を吐出することも可能であり、アルコール水溶液の吐出に適している。また、ノズルの並びについても、単列に配置、複数列に配置、千鳥格子状に配置のいずれでも構わない。
【００７１】
粉体が舞う場合は、１０ｍｍ以上と飛翔距離の長いコンティニュアス型が適している。なお、飛翔距離が比較的短くなるピエゾ方式でも、ヘッドと基板の間に静電界を併用することで、飛翔距離を確保して描画することも可能である。
【００７２】
１ピコリットル以下の微小な液滴量をコントロールして吐出する場合は、静電吸引方式の一種の、ニードル先端からインクを吐出するタイプが好ましい。
【００７３】
インクタンクからインクジェットヘッドまでの供給路の間に、脱気モジュールを設けることもできる。脱気処理したアルコール水溶液を用いることにより、インクジェットヘッドからの吐出を安定させることができる。 脱気方法としては、脱気フィルターを通す方法や、超音波処理を行う方法等を採用することができる。
【００７４】
アルコール水溶液の吐出を含むゼラチン成形体を製造する工程ｂは、例えば、上記したようなインクジェットヘッドを備えた３Ｄプリンタ（三次元プリンター）を用いて行うことができる。３Ｄプリンタの一例としては、Ｚ−Ｐｒｉｎｔｅｒ３１０ｐｌｕｓ（３Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（旧  Ｚ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）等を使用できるが、特に限定されない。
【００７５】
本発明の方法で製造されるゼラチン成形体の大きさは特に限定されないが、ゼラチン成形体を直方体に近似した場合で、直方体の縦、横及び高さはそれぞれ、好ましくは０．１ｍｍ〜２００ｍｍであり、より好ましくは１ｍｍ〜１００ｍｍである。
【００７６】
＜５＞ゼラチン
本発明で用いるゼラチンとしては、好ましくは、天然ゼラチン、リコンビナントゼラチン又は化学合成ゼラチンである。天然ゼラチンとは天然由来のコラーゲンより作られたゼラチンを意味する。ゼラチンが由来する生物は特に限定されず、例えば、動物（哺乳類、魚類など）由来のゼラチンを使用することができる。本発明で用いるゼラチンは、動物ゼラチン又はリコンビナントゼラチンである。
【００７７】
化学合成ゼラチンとは、人工的に合成したゼラチンを意味する。ゼラチン等のペプチドの合成は、固相合成でも液相合成でもよいが、好ましくは固相合成である。ペプチドの固相合成は当業者に公知であり、例えば、アミノ基の保護としてＦｍｏｃ基（Fluorenyl-Methoxy-Carbonyl基）を使用するＦｍｏｃ基合成法、並びにアミノ基の保護としてＢｏｃ基（tert-Butyl Oxy Carbonyl基）を使用するＢｏｃ基合成法などが挙げられる。なお、化学合成ゼラチンの好ましい態様は、本明細書中後記のリコンビナントゼラチンに記載した内容を当てはめることができる。リコンビナントゼラチンについては、本明細書中後記する。
【００７８】
ゼラチンの親水性値「１／ＩＯＢ」値は、０から１．０が好ましい。より好ましくは、０から０．６であり、さらに好ましくは０から０．４である。ＩＯＢとは、藤田穆により提案された有機化合物の極性/非極性を表す有機概念図に基づく、親疎水性の指標であり、その詳細は、例えば、"Pharmaceutical Bulletin", vol.2, 2, pp.163-173（1954）、「化学の領域」vol.11, 10, pp.719-725（1957）、「フレグランスジャーナル」, vol.50, pp.79-82（1981）等で説明されている。簡潔に言えば、全ての有機化合物の根源をメタン（ＣＨ4）とし、他の化合物はすべてメタンの誘導体とみなして、その炭素数、置換基、変態部、環等にそれぞれ一定の数値を設定し、そのスコアを加算して有機性値（ＯＶ）、無機性値（ＩＶ）を求め、この値を、有機性値をＸ軸、無機性値をＹ軸にとった図上にプロットしていくものである。有機概念図におけるＩＯＢとは、有機概念図における有機性値（ＯＶ）に対する無機性値（ＩＶ）の比、すなわち「無機性値（ＩＶ）／有機性値（ＯＶ）」をいう。有機概念図の詳細については、「新版有機概念図−基礎と応用−」（甲田善生等著、三共出版、２００８）を参照されたい。本明細書中では、ＩＯＢの逆数をとった「１／ＩＯＢ」値で親疎水性を表している。「１／ＩＯＢ」値が小さい（０に近づく）程、親水性であることを表す表記である。
【００７９】
ゼラチンは、Grand average of hydropathicity（GRAVY）値で表される親疎水性指標において、０．３以下、マイナス９．０以上であることが好ましく、０．０以下、マイナス７．０以上であることがさらに好ましい。Grand average of hydropathicity（GRAVY）値は、『Gasteiger E., Hoogland C., Gattiker A., Duvaud S., Wilkins M.R., Appel R.D., Bairoch A.;Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server;(In) John M. Walker (ed): The Proteomics Protocols Handbook, Humana Press (2005). pp. 571-607』及び『Gasteiger E., Gattiker A., Hoogland C., Ivanyi I., Appel R.D., Bairoch A.; ExPASy: the proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis.; Nucleic Acids Res. 31:3784-3788(2003).』の方法により得ることができる。
【００８０】
ゼラチンは、架橋されているものでもよいし、架橋されていないものでもよい。一般的な架橋方法としては、熱架橋、アルデヒド類（例えば、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドなど）による架橋、縮合剤（カルボジイミド、シアナミドなど）による架橋、酵素架橋、光架橋、紫外線架橋、疎水性相互作用、水素結合、イオン性相互作用などが知られており、本発明においても上記の架橋方法を使用することができる。本発明で使用する架橋方法としては、さらに好ましくは熱架橋、紫外線架橋、又は酵素架橋であり、特に好ましくは熱架橋である。
【００８１】
酵素による架橋を行う場合、酵素としては、高分子材料間の架橋作用を有するものであれば特に限定されないが、好ましくはトランスグルタミナーゼ及びラッカーゼ、最も好ましくはトランスグルタミナーゼを用いて架橋を行うことができる。トランスグルタミナーゼで酵素架橋するタンパク質の具体例としては、リジン残基及びグルタミン残基を有するタンパク質であれば特に制限されない。トランスグルタミナーゼは、哺乳類由来のものであっても、微生物由来のものであってもよく、具体的には、味の素（株）製アクティバシリーズ、試薬として販売されている哺乳類由来のトランスグルタミナーゼ、例えば、オリエンタル酵母工業（株）製、Upstate USA Inc.製、Biodesign International製などのモルモット肝臓由来トランスグルタミナーゼ、ヤギ由来トランスグルタミナーゼ、ウサギ由来トランスグルタミナーゼなど、ヒト由来の血液凝固因子（Factor XIIIa、Haematologic Technologies， Inc.社）などが挙げられる。
【００８２】
架橋（例えば、熱架橋）を行う際の反応温度は、架橋ができる限り特に限定されないが、好ましくは、−１００℃〜５００℃であり、より好ましくは０℃〜３００℃であり、更に好ましくは５０℃〜３００℃であり、更に好ましくは１００℃〜２５０℃であり、更に好ましくは１２０℃〜２００℃である。
【００８３】
本発明で用いるゼラチンとしては、リコンビナントゼラチンが特に好ましい。
リコンビナントゼラチンとは、遺伝子組み換え技術により作られたゼラチン類似のアミノ酸配列を有するポリペプチドもしくは蛋白様物質を意味する。本発明で用いることができるリコンビナントゼラチンは、コラーゲンに特徴的なＧｌｙ−Ｘ−Ｙで示される配列（Ｘ及びＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す）の繰り返しを有するものが好ましい。ここで、複数個のＧｌｙ−Ｘ−Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。好ましくは、細胞接着シグナルが一分子中に２配列以上含まれている。本発明で用いるリコンビナントゼラチンとしては、コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有するリコンビナントゼラチンを用いることができる。例えばＥＰ１０１４１７６、米国特許６９９２１７２号、国際公開ＷＯ２００４／８５４７３、国際公開ＷＯ２００８／１０３０４１等に記載のものを用いることができるが、これらに限定されるものではない。本発明で用いるリコンビナントゼラチンとして好ましいものは、以下の態様のリコンビナントゼラチンである。
【００８４】
リコンビナントゼラチンは、天然のゼラチン本来の性能から、生体親和性に優れ、且つ天然由来ではないことで牛海綿状脳症（ＢＳＥ）などの懸念がなく、非感染性に優れている。また、リコンビナントゼラチンは天然ゼラチンと比べて均一であり、配列が決定されているので、強度及び分解性においても架橋等によってブレを少なく精密に設計することが可能である。
【００８５】
リコンビナントゼラチンの分子量は、特に限定されないが、好ましくは２０００以上１０００００以下（２ｋＤａ（キロダルトン）以上１００ｋＤａ以下）であり、より好ましくは２５００以上９５０００以下（２．５ｋＤａ以上９５ｋＤａ以下）であり、さらに好ましくは５０００以上９００００以下（５ｋＤａ以上９０ｋＤａ以下）であり、最も好ましくは１００００以上９００００以下（１０ｋＤａ以上９０ｋＤａ以下）である。
【００８６】
リコンビナントゼラチンは、コラーゲンに特徴的なＧｌｙ−Ｘ−Ｙで示される配列の繰り返しを有することが好ましい。ここで、複数個のＧｌｙ−Ｘ−Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ において、Ｇｌｙはグリシンを表し、Ｘ及びＹは、任意のアミノ酸（好ましくは、グリシン以外の任意のアミノ酸）を表す。コラーゲンに特徴的なＧｌｙ−Ｘ−Ｙで示される配列とは、ゼラチン及びコラーゲンのアミノ酸組成及び配列における、他のタンパク質と比較して非常に特異的な部分構造である。この部分においてはグリシンが全体の約３分の１を占め、アミノ酸配列では３個に１個の繰り返しとなっている。グリシンは最も簡単なアミノ酸であり、分子鎖の配置への束縛も少なく、ゲル化に際してのヘリックス構造の再生に大きく寄与している。Ｘ及びＹで表されるアミノ酸はイミノ酸（プロリン、オキシプロリン）が多く含まれ、全体の１０％〜４５％を占めることが好ましい。好ましくは、リコンビナントゼラチンの配列の８０％以上、更に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上のアミノ酸が、Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙの繰り返し構造である。
【００８７】
一般的なゼラチンは、極性アミノ酸のうち電荷を持つものと無電荷のものが１：１で存在する。ここで、極性アミノ酸とは具体的にシステイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、リジン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン及びアルギニンを指し、このうち極性無電荷アミノ酸とはシステイン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン及びチロシンを指す。本発明で用いるリコンビナントゼラチンにおいては、構成する全アミノ酸のうち、極性アミノ酸の割合が１０〜４０％であり、好ましくは２０〜３０％である。上記極性アミノ酸中の無電荷アミノ酸の割合が好ましくは５％以上２０％未満であり、より好ましくは５％以上１０％未満である。さらに、セリン、スレオニン、アスパラギン、チロシン及びシステインのうちいずれか１アミノ酸を配列上に含まないことが好ましく、セリン、スレオニン、アスパラギン、チロシン及びシステインのうち２以上のアミノ酸を配列上に含まないことがより好ましい。
【００８８】
一般にポリペプチドにおいて、細胞接着シグナルとして働く最小アミノ酸配列が知られている（例えば、株式会社永井出版発行「病態生理」Ｖｏｌ．９、Ｎｏ．７（１９９０年）５２７頁）。本発明で用いるリコンビナントゼラチンは、これらの細胞接着シグナルを一分子中に２以上有することが好ましい。具体的な配列としては、接着する細胞の種類が多いという点で、アミノ酸一文字表記で現わされる、ＲＧＤ配列、ＬＤＶ配列、ＲＥＤＶ配列、ＹＩＧＳＲ配列、ＰＤＳＧＲ配列、ＲＹＶＶＬＰＲ配列、ＬＧＴＩＰＧ配列、ＲＮＩＡＥＩＩＫＤＩ配列、ＩＫＶＡＶ配列、ＬＲＥ配列、ＤＧＥＡ配列、及びＨＡＶ配列の配列が好ましい。さらに好ましくはＲＧＤ配列、ＹＩＧＳＲ配列、ＰＤＳＧＲ配列、ＬＧＴＩＰＧ配列、ＩＫＶＡＶ配列及びＨＡＶ配列、特に好ましくはＲＧＤ配列である。ＲＧＤ配列のうち、好ましくはＥＲＧＤ配列である。細胞接着シグナルを有するリコンビナントゼラチンを用いることにより、細胞の基質産生量を向上させることができる。
【００８９】
本発明で用いるリコンビナントゼラチンにおけるＲＧＤ配列の配置としては、ＲＧＤ間のアミノ酸数が０〜１００の間で均一でないことが好ましく、ＲＧＤ間のアミノ酸数が２５〜６０の間で均一でないことがより好ましい。
この最小アミノ酸配列の含有量は、細胞接着及び増殖性の観点から、タンパク質１分子中３〜５０個が好ましく、さらに好ましくは４〜３０個、特に好ましくは５〜２０個である。最も好ましくは１２個である。
【００９０】
本発明で用いるリコンビナントゼラチンにおいて、アミノ酸総数に対するＲＧＤモチーフの割合は少なくとも０．４％であることが好ましい。リコンビナントゼラチンが３５０以上のアミノ酸を含む場合、３５０のアミノ酸の各ストレッチが少なくとも１つのＲＧＤモチーフを含むことが好ましい。アミノ酸総数に対するＲＧＤモチーフの割合は、より好ましくは少なくとも０．６％であり、更に好ましくは少なくとも０．８％であり、更に一層好ましくは少なくとも１．０％であり、特に好ましくは少なくとも１．２％であり、最も好ましくは少なくとも１．５％である。リコンビナントペプチド内のＲＧＤモチーフの数は、２５０のアミノ酸あたり、好ましくは少なくとも４、より好ましくは６、更に好ましくは８、特に好ましくは１２以上１６以下である。ＲＧＤモチーフの０．４％という割合は、２５０のアミノ酸あたり、少なくとも１つのＲＧＤ配列に対応する。ＲＧＤモチーフの数は整数であるので、０．４％の特徴を満たすには、２５１のアミノ酸からなるゼラチンは、少なくとも２つのＲＧＤ配列を含まなければならない。好ましくは、本発明のリコンビナントゼラチンは、２５０のアミノ酸あたり、少なくとも２つのＲＧＤ配列を含み、より好ましくは２５０のアミノ酸あたり、少なくとも３つのＲＧＤ配列を含み、さらに好ましくは２５０のアミノ酸あたり、少なくとも４つのＲＧＤ配列を含む。本発明のリコンビナントゼラチンのさらなる態様としては、少なくとも４つのＲＧＤモチーフ、好ましくは６つ、より好ましくは８つ、さらに好ましくは１２以上１６以下のＲＧＤモチーフを含む。
【００９１】
リコンビナントゼラチンは部分的に加水分解されていてもよい。
【００９２】
好ましくは、本発明で用いるリコンビナントゼラチンは、Ａ−［（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）n］m−Ｂで示されるものである。ｎ個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎ個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す。ｍは好ましくは２〜１０の整数を示し、より好ましくは３〜５の整数を示す。ｎは３〜１００の整数が好ましく、１５〜７０の整数がさらに好ましく、５０〜６５の整数が最も好ましい。Ａは任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を示し、Ｂは任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を示す。なお、ｎ個のＧｌｙ−Ｘ−Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。
【００９３】
より好ましくは、本発明で用いるリコンビナントゼラチンは、Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−［（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）63］3−Ｇｌｙ（式中、６３個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、６３個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す。なお、６３個のＧｌｙ−Ｘ−Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。）で示されるものである。
【００９４】
繰り返し単位には天然に存在するコラーゲンの配列単位を複数結合することが好ましい。ここで言う天然に存在するコラーゲンとは天然に存在するものであればいずれでも構わないが、好ましくはＩ型、II型、III型、IV型、又はV型コラーゲンである。より好ましくは、I型、II型、又はIII型コラーゲンである。別の形態によると、上記コラーゲンの由来は好ましくは、ヒト、ウシ、ブタ、マウス又はラットであり、より好ましくはヒトである。
【００９５】
本発明で用いるリコンビナントゼラチンの等電点は、好ましくは５〜１０であり、より好ましくは６〜１０であり、さらに好ましくは７〜９．５である。リコンビナントゼラチンの等電点の測定は、等電点電気泳動法（Ｍａｘｅｙ，Ｃ．Ｒ．（１９７６；Ｐｈｉｔｏｇｒ．Ｇｅｌａｔｉｎ ２，Ｅｄｉｔｏｒ Ｃｏｘ，Ｐ．Ｊ．Ａｃａｄｅｍｉｃ，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｅｎｇｌ．参照）に記載されたように、１質量％ゼラチン溶液をカチオン及びアニオン交換樹脂の混晶カラムに通したあとのｐＨを測定することで実施することができる。
【００９６】
好ましくは、リコンビナントゼラチンは脱アミン化されていない。
好ましくは、リコンビナントゼラチンはテロペプタイドを有さない。
好ましくは、リコンビナントゼラチンは、アミノ酸配列をコードする核酸により調製された実質的に純粋なポリペプチドである。
【００９７】
本発明で用いるリコンビナントゼラチンとして特に好ましくは、
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド；
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド；又は
（３）配列番号１に記載のアミノ酸配列と８０％以上（さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド；の何れかである。
【００９８】
本発明における配列同一性は、以下の式で計算される値を指す。
％配列同一性＝［（同一残基数）／（アラインメント長）］×１００
２つのアミノ酸配列における配列同一性は当業者に公知の任意の方法で決定することができ、ＢＬＡＳＴ（(Basic Local Alignment Search Tool)）プログラム（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０，１９９０）等を使用して決定することができる。
【００９９】
「１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」における「１若しくは数個」とは、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜３個を意味する。
【０１００】
本発明で用いるリコンビナントゼラチンは、当業者に公知の遺伝子組み換え技術によって製造することができ、例えばＥＰ１０１４１７６Ａ２号公報、米国特許第６９９２１７２号公報、国際公開ＷＯ２００４／８５４７３号、国際公開ＷＯ２００８／１０３０４１号等に記載の方法に準じて製造することができる。具体的には、所定のリコンビナントゼラチンのアミノ酸配列をコードする遺伝子を取得し、これを発現ベクターに組み込んで、組み換え発現ベクターを作製し、これを適当な宿主に導入して形質転換体を作製する。得られた形質転換体を適当な培地で培養することにより、リコンビナントゼラチンが産生されるので、培養物から産生されたリコンビナントゼラチンを回収することにより、本発明で用いるリコンビナントゼラチンを調製することができる。
【０１０１】
＜６＞積層
本発明によるゼラチン成形体の製造方法は、上記の工程ｂの後に、
ゼラチン水溶液を風乾させることを経た粒子の平均粒子径が２５〜２００μｍの粉末を含有する層を、工程ａで形成した層及び工程ｂで形成したゼラチン成形体の上に形成する工程ｃ；及び沸点１２０℃以下のアルコール類を含有する水溶液の液滴をノズル部から吐出し飛翔させ、上記液滴を上記工程ｃで形成した層に対して着弾させることによりゼラチン成形体を製造する工程ｄ；
をさらに含んでいてもよい。
上記の工程ｃ及び工程ｄに記載されるような積層を行う場合、層のずれ、ローラー表面への付着等生じることがあるが、本発明では上記課題を解決でき、優れたリコート性を達成することができる。
【０１０２】
上記の工程ｃは、工程ａと同様に行うことができる。工程ｃで使用する材料の種類は、工程ａのものと同一でもよいし、異なっていてもよいが、好ましくは同一である。工程ｃにおけるゼラチンは動物ゼラチン又はリコンビナントゼラチンが好ましい。
上記の工程ｄは、工程ｂと同様に行うことができる。工程ｄで使用する材料の種類は、工程ｂのものと同一でもよいし、異なっていてもよいが、好ましくは同一である。
工程ｄで使用するアルコール類は、工程ｂの場合と同様に、特に好ましくは、エタノールである。
【０１０３】
工程ｃ及び工程ｄを行う場合、その回数は特に限定されず、１回以上の任意の回数で行うことができ、例えば、１回〜３０００回行うことができる。
【０１０４】
＜７＞積層による成形の方法
（７−１）本発明の第一の積層方法
本発明の好ましい態様によれば、工程ｂにおいて製造されたゼラチン成形体が、基板に接触しているようにして、ゼラチン成形体を製造することができる。
【０１０５】
通常の方法による成形体の製造方法を図１７に示す。図１７のＡは、粉末を含有する層を基板上に形成する工程ａである。図１７のＢは、工程ａで形成した層に対して、アルコール水溶液の液滴をノズル部から吐出し飛翔させ、上記液滴を工程ａで形成した層に対して着弾させることによりゼラチン成形体を形成する工程である。図１７のＢにおいて、第一層目の成形体が形成される。図１７に示す方法では、第一層目の成形体は、基板に接触しておらず、第一層目の成形体（最初に形成された層からなる成形体）の下に粉末が存在する状態となる。この状態において、図１７のＣに示すように、工程ｃとして、第二層目の粉末を含む層を形成すると、第一層目の成形体の位置がずれるようになる。その後に、図１７のＤに示すように、工程ｄを行うと、第一層目の成形体とはずれた位置に、第二層目の成形体が形成されることになる。上記と同様に、図１７のＥに示すように、第三層目以降の成形体の位置も、第一層目の成形体及び第二層目の成形体の位置とはずれることになる。上記のような、成形体の位置がずれる現象は、質量が軽いゼラチン粉末を使用する場合に顕著に生じる。
【０１０６】
これに対し、本発明の第一の積層方法による成形体の製造方法を図１８に示す。図１８のＡは、粉末を含有する層を基板上に形成する工程ａであるが、粉末を含有する層の厚さは、第一層目の成形体の厚さと、実質的に同じ厚さとなるようにする。このように粉末を含有する層を形成することにより、図１８のＢに示す通り、第一層目の成形体（最初に形成された層からなる成形体）を形成した場合（工程ｂ）に、第一層目の成形体は、基板に接触している状態になり、第一層目の成形体の下に粉末が存在しない状態となる。上記の状態とすることにより、図１８のＣに示すように、工程ｃとして、第２層目の粉末を含む層を形成しても、第一層目の成形体の位置がずれることが防止できる。これにより、図１８のＤ及びＥに示す通り、第二層目以降の成形体は、第一層目の成形体と同じ位置に、ずれることなく形成することができる。
【０１０７】
本発明によれば、
粉末を含有する層を基板上に形成する工程ａ；及び
工程ａで形成した層に対して、液滴をノズル部から吐出し飛翔させ、上記液滴を工程ａで形成した層に対して着弾させることにより成形体を形成する工程ｂ（ここで、形成した成形体は、基板に接触している）；
を含む成形体の製造方法が提供される。
【０１０８】
さらに本発明によれば、
粉末を含有する層を基板上に形成する工程ａ；
工程ａで形成した層に対して、液滴をノズル部から吐出し飛翔させ、上記液滴を工程ａで形成した層に対して着弾させることにより成形体を形成する工程ｂ（ここで、形成した成形体は、基板に接触している）；
工程ｂの後に、粉末を含有する層を、工程ａで形成した層及び工程ｂで形成した成形体の上に形成する工程ｃ；及び
液滴をノズル部から吐出し飛翔させ、上記液滴を工程ｃで形成した層に対して着弾させることにより成形体を製造する工程ｄ；
を含む成形体の製造方法が提供される。
【０１０９】
（７−２）本発明の第二の積層方法
さらに好ましい態様において、本発明のゼラチン成形体の製造方法は、工程ｂにおいて、製造されたゼラチン成形体が、基板に接触しており、
工程ｂの後に、ゼラチン水溶液を風乾させることを経た粒子の平均粒子径が２５〜２００μｍの粉末を含有する層を、工程ａで形成した層及び工程ｂで形成したゼラチン成形体の上に形成する工程ｃ１；及び沸点１２０℃以下のアルコール類を含有する水溶液の液滴をノズル部から吐出し飛翔させ、上記液滴を工程ｃ１で形成した層に対して着弾させることによりゼラチン成形体を製造する工程ｄ１を含み、
工程ｄ１において、液滴は、工程ｂで形成したゼラチン成形体の上面の外周領域に対応する領域に着弾され、
工程ｄ１の後に、ゼラチン水溶液を風乾させることを経た粒子の平均粒子径が２５〜２００μｍの粉末を含有する層を、工程ｃ１で形成した層及び工程ｄ１で形成したゼラチン成形体の上に形成する工程ｅ；及び沸点１２０℃以下のアルコール類を含有する水溶液の液滴をノズル部から吐出し飛翔させ、上記液滴を上記工程ｅで形成した層に対して着弾させることによりゼラチン成形体を製造する工程ｆを含み、工程ｆにおいて、上記液滴は、工程ｄ１で形成したゼラチン成形体の上面の外周領域に対応する領域、並びに工程ｄ１で形成したゼラチン成形体で囲まれる領域の内部の領域に着弾される。
【０１１０】
上記の態様の方法においては、箱の形状の成形体、及びその内部に成形体（目的の成形体）を形成することにより、箱の形状の成形体が、内部の成形体のずれを防ぐことができる。箱の形状の成形体は、上記の本発明の第一の積層方法に記載した方法を用いて、第一層目の成形体の位置からずれないように形成されている。また、内部の成形体は、箱の形状の成形体とは繋がっていない（即ち、内部の成形体の底面及び側面は、箱の形状の成形体と接触していない）。上記の本発明の第一の積層方法に記載した方法では、所望の成形体を形成した後に、基板から剥がす操作の際に、操作によっては成形体の形状が崩れるという懸念があり、慎重な操作が必要とされる。しかし、本発明の第二の積層方法によれば、所望の成形体（内部の成形体）を、形状を崩すことなく容易に得ることができる。即ち、内部の成形体を、粉末を含む層から切り離すときに、力がかからないので、全長が数ｍｍといった微小な成形体、多数の孔を有する成形体、数１００μｍといった薄い成形体を製造することができる。また、本発明の第二の積層方法によれば、下層（第一層）の構造として曲面を有する球状の成形体を製造することができる。
【０１１１】
本発明の第二の積層方法による成形体の製造方法を図１９に示す。図１９のＡは、粉末を含有する層を基板上に形成する工程ａであるが、粉末を含有する層の厚さは、箱の形状の成形体の第一層目の成形体の厚さと、実質的に同じ厚さとなるようにする。このように粉末を含有する層を形成することにより、図１９のＢに示す通り、箱の形状の成形体の第一層目の成形体（最初に形成された層からなる成形体）を形成した場合（工程ｂ）に、第一層目の成形体は、基板に接触している状態になり、第一層目の成形体の下に粉末が存在しない状態となる。上記の状態とすることにより、図１９のＣに示すように、工程ｃ１として、箱の形状の成形体の第２層目の粉末を含む層を形成しても、箱の形状の成形体の第一層目の成形体の位置がずれることが防止できる。図１９のＤは、液滴をノズル部から吐出し飛翔させ、液滴を工程ｃ１で形成した層に対して着弾させることによりゼラチン成形体を製造する工程ｄ１を示す。図１９のＤにおいては、液は、成形体の上面の外周領域に対応する領域に着弾される。
【０１１２】
図１９のＥは、粉末を含有する層を、工程ｃ１で形成した層及び工程ｄ１で形成したゼラチン成形体の上に形成する工程ｅを行った後に、液滴をノズル部から吐出し飛翔させて、上記液滴を工程ｅで形成した層に対して着弾させることによりゼラチン成形体を製造する工程ｆを示す。工程ｆにおいて、液は、工程ｄ１で形成したゼラチン成形体で囲まれる領域の内部の領域に着弾され、これにより、内部の成形体を形成することができる。図１９のＦは、工程ｅ及びｆを繰り返すことにより、箱の形状の成形体の内部に、所望の形状を有する（内部の）成形体を形成することを示す。
【０１１３】
本発明によれば、
粉末を含有する層を基板上に形成する工程ａ；工程ａで形成した層に対して、液滴をノズル部から吐出し飛翔させて、上記液滴を工程ａで形成した層に対して着弾させることにより成形体を形成する工程ｂ（工程ｂにおいて製造された成形体が、基板に接触している）；工程ｂの後に、粉末を含有する層を、工程ａで形成した層及び工程ｂで形成した成形体の上に形成する工程ｃ１；液滴をノズル部から吐出し飛翔させて、上記液滴を工程ｃ１で形成した層に対して着弾させることにより成形体を製造する工程ｄ１（工程ｄ１において、上記液は、工程ｂで形成した成形体の上面の外周領域に対応する領域に着弾される）；工程ｄ１の後に、粉末を含有する層を、工程ｃ１で形成した層及び工程ｄ１で形成した成形体の上に形成する工程ｅ；及び液滴をノズル部から吐出し飛翔させて、上記液滴を上記工程ｅで形成した層に対して着弾させることにより成形体を製造する工程ｆ（工程ｆにおいて、上記液は、工程ｄ１で形成したゼラチン成形体の上面の外周領域に対応する領域、並びに工程ｄ１で形成した成形体で囲まれる領域の内部の領域に着弾される）、
含む成形体の製造方法が提供される。
【０１１４】
＜８＞粉末を除去する工程
本発明においては、ゼラチン成形体の形成に使用されなかった粉末を除去する工程ｇをさらに設けることができる。粉末を除去するとは、粉末を、成形体の表面から除去することである。
成形体の形成に使用されなかったゼラチン粉末を除去することによって、所望の形状に成形された成形体を回収することができる。
【０１１５】
成形体の形成に使用されなかったゼラチン粉末を除去する方法は特に限定されず、例えば、圧縮空気を用いて行ってもよい。
【０１１６】
＜９＞成形体を硬化させる工程
本発明においては、成形体の形成に使用されなかったゼラチン粉末を除去する工程ｇの後に、成形体を加熱することにより成形体を硬化させる工程ｈをさらに設けることができる。
上記の工程ｈを行うことにより、成形体の強度を高めることができる。
【０１１７】
成形体を加熱することにより成形体を硬化させる工程ｈは、成形体を、一般的には５０℃〜３００℃、好ましくは１００℃〜２５０℃、より好ましくは１２０℃〜２００℃の温度で加熱することにより行うことができる。但し、Ｔ〔ケルビン：Ｋ〕＝ｔ〔セルシウス度：℃〕＋２７３．１５である。成形体の加熱は空気、不活性ガス、真空などの環境下で行うことができるが、低酸素環境中で行うことが好ましい。なかでも、加熱均一性の観点より窒素などの不活性ガス中で加熱することが好ましい。
【０１１８】
加熱時間は、特に限定されないが、一般的には１時間から７２時間であり、好ましくは２時間から４８時間であり、より好ましくは４時間から２８時間である。
【０１１９】
本発明においては、加熱により成形体を硬化させる工程ｈの後に、メッシュ等の支持体により成形体を包む工程ｉをさらに設けることが出来る。工程ｉにより湿潤環境における成形体の形状維持が容易になる。
【０１２０】
メッシュ等の支持体の材料は特に限定されないが、生体に適用する場合には生体適性がある材料を使用することが好ましく、例えば、高分子を用いてもよい。
【０１２１】
この成形体においては、成形体が湿潤環境などによって形状を維持することができない場合であっても、メッシュ等の支持体が成形体を囲っていれば、形状を維持することができる。また、メッシュ等の支持体は成形体を外部と連通した状態で支持しており、このメッシュ等の支持体により包まれた成形体を生体に移植した場合に、周りの生体組織が支持体を通して、成形体にアクセスできる。
【０１２２】
＜１０＞成形体に細胞を播種する工程
本発明においては、成形体に細胞を播種する工程ｊをさらに設けることができる。
本発明における成形体の用途は、後記の通り、再生医療用足場材又は組織修復材などが意図されるが、成形体に細胞を播種して使用する場合と、成形体に細胞を播種せずに使用する場合とが想定される。
【０１２３】
播種する細胞の種類は特に限定されず、使用目的に応じて適宜選択することができる。
使用する細胞として、好ましくは、動物細胞であり、より好ましくは脊椎動物由来細胞、特に好ましくはヒト由来細胞である。脊椎動物由来細胞（特に、ヒト由来細胞）の種類は、万能細胞、体性幹細胞、前駆細胞、又は成熟細胞の何れでもよい。万能細胞としては、例えば、胚性幹（ＥＳ）細胞、生殖幹（ＧＳ）細胞、又は人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞を使用することができる。体性幹細胞としては、例えば、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、造血幹細胞、羊膜細胞、臍帯血細胞、骨髄由来細胞、心筋幹細胞、脂肪由来幹細胞、又は神経幹細胞を使用することができる。前駆細胞及び成熟細胞としては、例えば、皮膚、真皮、表皮、筋肉、心筋、神経、骨、軟骨、内皮、脳、上皮、心臓、腎臓、肝臓、膵臓、脾臓、口腔内、角膜、骨髄、臍帯血、羊膜、又は毛に由来する細胞を使用することができる。ヒト由来細胞としては、例えば、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、ＭＳＣ、軟骨細胞、骨芽細胞、骨芽前駆細胞、間充織細胞、筋芽細胞、心筋細胞、心筋芽細胞、神経細胞、肝細胞、ベータ細胞、線維芽細胞、角膜内皮細胞、血管内皮細胞、角膜上皮細胞、羊膜細胞、臍帯血細胞、骨髄由来細胞、又は造血幹細胞を使用することができる。また、細胞の由来は、自家細胞又は他家細胞の何れでも構わない。
【０１２４】
＜１１＞本発明の方法で製造されるゼラチン成形体の用途
本発明によるゼラチン成形体の製造方法で製造されるゼラチン成形体の用途は特に限定されないが、好ましくは再生医療用足場材又は組織修復材である。ゼラチン成形体の用途については本明細書中において後記する。
【０１２５】
［２］ゼラチン成形体
本発明はさらに、上記［１］に記載した本発明によるゼラチン成形体の製造方法により製造されるゼラチン成形体を提供する。
本発明のゼラチン成形体は、高い造形精度で製造することができる。
本発明のゼラチン成形体の用途は、特に限定されないが、例えば、再生医療用足場材、再生医療等製品（体外で組織培養するもの）、又は組織修復材として使用することができ、好ましくは、再生医療用足場材、又は組織修復材として使用することができ、特に好ましくは骨再生用組織修復材として使用することができる。
【０１２６】
本発明における組織修復材とは、生体内に埋植されることにより、この埋植された部位における組織の形成に寄与する材料のことであり、細胞を含んでいても含んでいなくてもよい。また、増殖因子や薬剤のような生体の反応を促す成分を含んでいても含んでいなくてもよい。さらに、本発明のゼラチン成形体は、ハイドロキシアパタイト等の無機材料と混合して使用してもよいし、上記無機材料とのコンポジットとして使用してもよい。本発明における組織修復材とは、埋植部位に通常存在する正常組織の形成に寄与するものだけではなく、瘢痕組織等を含む非正常組織の形成を促進する材料も包含するものである。
【０１２７】
組織修復材の具体例としては、特に限定されないが、軟骨、半月板、皮膚又は骨の修復材を挙げることができる。即ち、本発明のゼラチン成形体は、軟骨、半月板、皮膚又は骨の再生のための治療剤として使用することができる。上記した再生が必要である限り、疾患は限定されるものではないが、一例として、軟骨欠損を伴う疾患としては、変形性関節症、骨軟骨欠損、離断性骨軟骨炎、外傷性軟骨損傷、骨関節炎、再発性多発軟骨炎、軟骨無形成症、椎間板損傷、椎間板ヘルニア等を挙げることができる。
【０１２８】
本発明のゼラチン成形体は、移植細胞や骨誘導薬剤と併用することによっても骨再生治療剤として用いることもできる。骨誘導薬剤としては、例えばＢＭＰ（骨形成因子）やｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞増殖因子）が挙げられるが、特に限定はされない。
【０１２９】
本発明のゼラチン成形体は、組織修復材として使用できることから、組織の修復方法や、組織の損傷を伴う疾患等の治療方法も本発明に包含される。本発明における組織の修復方法は、対象組織が欠損又は損傷した部位に、ゼラチン成形体である組織修復材を適用することを含み、必要に応じて他の工程を含んでいてもよい。他の工程としては、例えば、移植細胞及び／又は骨誘導剤を組織修復材の適用の前後、又は同時に組織修復材を適用する部位へ適用することが挙げられる。
対象組織が欠損又は損傷した部位に、ゼラチン成形体を適用する方法としては、切開、注射、関節鏡、内視鏡などが使用可能である。
【０１３０】
本発明のゼラチン成形体の空隙率は、特に限定されず、一般的には１０〜９０％であるが、好ましくは１０〜７０％であり、より好ましくは２０〜４０％であり、さらに好ましくは２５〜３５％である。空隙率は、ゼラチン成形体について、マイクロフォーカスＣＴ解析を行い、厚み方向で上中下の位置で、それぞれ２点、合計６点の場所に関して、充填率を測定し、測定した充填率から、下記の式により求めることができる。
空隙率＝１００％−充填率
【０１３１】
本発明のゼラチン成形体は、外部空間と連通している孔を有していることが好ましい。上記孔を有するゼラチン成形体を生体に移植した場合、細胞がゼラチン成形体の内部に入り易くなる。外部空間と連通している孔は、成形体の内部を貫通し、孔の両端において外部空間と連通していることがより好ましい。
【０１３２】
外部空間と連通している孔の代表直径は、特に限定されないが、好ましくは３００μｍ〜２０００μｍである。代表直径の定義及び測定方法は以下の通りである。
成形体の外縁部から内部にのびた孔に対して、垂直の断面をとり、その形状が円で近似できる場合は直径、楕円で近似するのが適切な場合は、短辺とする。四角形状の場合も、短いほうの一辺の長さとする。実際の孔は、孔の奥行き方向で揺らぎがあるが、揺らぎが比較的小さい場合は、成形体の外縁部に見える孔の大きさで代表する。設計的に孔径を変えている場合は、最小のところの径を代表直径とする。孔が行き止まりとなっている場合は、行き止まりから100mまでは測定しない。
奥行き行き方向に揺らぎが大きい場合、くびれのあるところの径を測定し代表直径とする。
成形体の外縁部を測定する場合は、測定可能な顕微鏡で測定する。  内部を測定する場合は、成形体を歪ませないよう、ミクロトームなどで切片をきりだし、孔径を顕微鏡で測定する。  マイクロフォーカスＣＴの断面データから測定しても良い。その場合は、マイクロフォーカスＣＴの断面データの長さの絶対精度は低いので、成形体の全長の長さ、目印のある付近を顕微鏡で測定してデータなどを参照して、孔径を求める。
【０１３３】
外部空間と連通している孔とは、孔が、成形体の一か所の表面から成形体の内部の空間に形成されていることを示す。即ち、孔の内部の空間が、外部空間と連通することになる。
「外部空間と連通している孔が、成形体の内部を貫通し、孔の両端において外部空間と連通している」とは、孔が、成形体のある箇所の表面から成形体の内部の空間に形成され、さらに成形体の別の箇所の表面を通じて外部空間と連通していることを示す。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【０１３４】
［リコンビナントゼラチン］
リコンビナントゼラチンとして以下のＣＢＥ３を用意した（国際公開ＷＯ２００８／１０３０４１号公報に記載）。
ＣＢＥ３：分子量：５１．６ｋＤ構造：  ＧＡＰ［（ＧＸＹ）63］3Ｇアミノ酸数：５７１個
ＲＧＤ配列：１２個イミノ酸含量：３３％ほぼ１００％のアミノ酸がＧＸＹの繰り返し構造である。ＣＢＥ３のアミノ酸配列には、セリン、スレオニン、アスパラギン、チロシン及びシステインは含まれていない。ＣＢＥ３はＥＲＧＤ配列を有している。
等電点：９．３４
ＧＲＡＶＹ値：−０．６８２
１／ＩＯＢ値：０．３２３アミノ酸配列（配列表の配列番号１）（国際公開ＷＯ２００８／１０３０４１号公報の配列番号３と同じ。但し末尾のＸは「Ｐ」に修正）
GAP(GAPGLQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGPAGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPP)3G【０１３５】
[実施例における平均粒子径の測定方法]
ゼラチン粉末を、レーザー回折/散乱式粒子径分布測定装置ＬＡ９２０（ＨＯＲＩＢＡ）を用いて粒子径分布を測定した。なお、具体的な手順としては、分散溶媒として無水特級エタノール（和光純薬）をサンプル容器に満たし、超音波をかけながらこの中に測定したいゼラチン粉末を少しずつ加えて分散し、所定の光透過率の範囲になったら測定を開始した。得られた粒子径分布データから、メジアン径を読み取り、この値を平均粒径とした。【０１３６】
（１）ゼラチン粉末の製造
・風乾したゼラチン粉末
上記リコンビナントゼラチンを注射用水中に５０℃で溶解し、２０質量％水溶液を得た。同溶液を減圧下で脱泡したのち、１２．５×８．５ｃｍのポリプロピレン製トレイ中に１４ｍＬずつ分注し、室温下で７２時間乾燥させた。得られた乾燥膜を約２ｃｍ角に裁断した。次いで、上記で得られたゼラチン風乾固体は、先ず一段目の粉砕として、高速回転型ミルの一種であるクアドロコーミルＵ５（パウレック）を用いて１ｍｍ以下に粉砕した後、高速回転型インペラーミルであるドライバーストミニ（スギノマシン）を用いて、数十μｍレベルの所望の平均粒子径になるように粉砕した。【０１３７】
・凍結乾燥したゼラチン粉末
上記リコンビナントゼラチンを注射用水中に５０℃で溶解し、４質量％水溶液を得た。同溶液を減圧下で脱泡したのち、内径４．５ｃｍのポリ（テトラフルオロエチレン）製トレイ中に８ｍＬずつ分注し、均一に凍結させた後、−２０℃下で７２時間凍結乾燥させた。得られた乾燥体をおよそ１ｃｍ角に裁断した。次いで、上記で得られたゼラチン風乾固体は、先ず一段目の粉砕として、高速回転型ミルの一種であるクアドロコーミルＵ５（パウレック）を用いて１ｍｍ以下に粉砕した後、高速回転型インペラーミルであるドライバーストミニ（スギノマシン）を用いて、数十μｍレベルの所望の平均粒子径になるように粉砕した。【０１３８】
（２）吐出液（インク）
吐出液としては、水、又はエタノール水溶液（５０質量％の水及び５０質量％のエタノール）を使用した。【０１３９】
（３）成形体の製造（風乾した粉末と凍結乾燥した粉末との比較）
上記の（１）で製造したゼラチン粉末を、富士フイルム、ダイマティックス社製のダイマティックス・マテリアル・プリンター（DMP-2831機）に導入し、液滴吐出量は約１０pL、ノズルは5本、吐出周波数は4kHzとして、ヘッド主走査方向に、４ｍｍの成形体を製造した。ヘッドを吐出しながら走査移動する方向をヘッド主走査方向とし、ヘッド主走査方向と垂直で、吐出せずに移動走査する方向をヘッド副走査方向とする。ゼラチン粉末の積層ピッチは１０μｍとした。  ※図のX方向とヘッド主走査方向は同じである。上記の成形体の作製においては、ゼラチン粉末を含有する層を基板上に形成する工程と、吐出液をノズル部から液滴状態で吐出させて、ゼラチン粉末を含有する層に対して着弾させることによりゼラチン成形体を製造する工程とを反復することにより、所定の大きさの成形体が製造される。【０１４０】
風乾したゼラチン粉末を使用して製造した成形体を図１に示し、凍結乾燥したゼラチン粉末を使用して製造した成形体を図２に示す。図１に示す成形体では、垂直方向（Ｚ方向）において、粉末の表面より、ほとんど低くなっていない。また、平面の一方向（Ｘ方向）に約２０％縮小している。図２に示す成形体では、容器の底が見えるほど、粉末の表面より、膜全体が約５００μｍほど低くなっている。また、平面の一方向（Ｘ方向）にも半分ほどに（約５０％）縮小している。【０１４１】
（４）粉末の平均粒子径及び水溶液組成と、膜厚及び収縮率との関係についての評価
ゼラチン粒子として、魚ゼラチン粒子（魚から作られたゼラチンを用いてＣＢＥ３の場合と同様に粒子としたもの）（リコンビナントゼラチン模擬粒子）を使用した。平均粒子径が２１μｍ、５４μｍ又は６８μｍの魚ゼラチンと、吐出液として水、又はエタノール水溶液（５０質量％の水及び５０質量％のエタノール）とを用いて、富士フイルム、ダイマティックス社製のダイマティックス・マテリアル・プリンター（DMP-2831機）を使用して、液滴吐出量は約１０pL、ノズルは5本、吐出周波数は4kHzとして、ヘッド主走査方向に、図３に示す各種膜厚の成形体を作製し、収縮率を測定した。
成形体の膜厚は、膜の断面方向を顕微鏡により、5点以上の平均をとり測定した。
収縮率は、膜形成直後に、膜のX方向のエッジからエッジまでの距離と、着弾した跡がのこるエッジからエッジまでを顕微鏡にて測定した。【０１４２】
膜厚と収縮率の関係を図３に示す。図３において、Ａ〜Ｅは以下を示す。
Ａ：平均粒子径が６８μｍの魚ゼラチン粒子、吐出液はエタノール水溶液（５０質量％の水及び５０質量％のエタノール）
Ｂ：平均粒子径が６８μｍの魚ゼラチン粒子、吐出液は水
Ｃ：平均粒子径が５４μｍの魚ゼラチン粒子、吐出液は水
Ｄ：平均粒子径が２１μｍの魚ゼラチン粒子、吐出液は水
Ｅ：市販のデンプン（ＺＰ１２ｅ、Ｚコーポレーション製）、吐出液は水【０１４３】
平均粒子径が２１μｍの粒子を使用した場合には、収縮率が悪化する（大きくなる）ことが分かる。また、平均粒子径が５４μｍ又は６８μｍの粒子を使用して場合であっても吐出液として水を使用した場合には、膜厚の増大とともに収縮率が悪化することが分かる。一方、平均粒子径が５４μｍ又は６８μｍの粒子と、エタノール水溶液とを組み合わせた場合には、膜厚が増大しても収縮率の増大は抑制され、良好な結果が得られた。【０１４４】
（５）リコート性の評価
平均粒子径が２１μｍ、５４μｍ又は６８μｍのリコンビナントゼラチン模擬粒子を用いて、リコート性を評価した。具体的には、粉末流動性試験機（パウダーフローテスター、Ｂｒｏｏｋｆｉｅｌｄ社製）を用い、圧密応力（σ１）と不圧降伏応力（σｃ）の比率により定まる流動性指数（σ１／σｃ）が４以上のものをリコート性が良好と評価した。
リコート性の評価の結果を以下の表１に示す。【０１４５】
【表１】
0006637598.tif 000002
【０１４６】
（６）吐出液による積層時のずれの評価
平均粒子径が４８μｍのＣＢＥ３粒子を使用し、吐出液としては水、又はエタノール水溶液を用いて、Ｚ−Ｐｒｉｎｔｅｒ３１０ｐｌｕｓ（３Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（旧  Ｚ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ））を用いてゼラチン成形体を製造した。製造したゼラチン成形体を図４に示す。
吐出液として水を使用した場合には、積層の際に層のずれが生じているが、吐出液としてエタノール水溶液を使用した場合には、層のずれは生じていない。【０１４７】
（７）空隙を有する成形体の製造
平均粒子径が４８μｍのＣＢＥ３粒子と、吐出液としてエタノール水溶液（５０質量％の水及び５０質量％のエタノール）とを用いて、Ｚ−Ｐｒｉｎｔｅｒ３１０ｐｌｕｓ（３Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（旧  Ｚ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ））を用いて、空隙を有する成形体を製造した。積層ピッチは１００μｍとした。
３Ｄ（三次元）設計図と、製造した成形体の写真を、図５及び図６に示す。【０１４８】
（８）骨再生の評価試験
（８−１）ＣＢＥ３凍結乾燥スポンジの作製
上記の（１）ゼラチン粉末の製造における「凍結乾燥したゼラチン粉末」の記載で得られた凍結乾燥したゼラチン粉末の上下を切除し、厚み１．５ｍｍの多孔質体を得た。これを窒素雰囲気下、１３５℃で２８時間加熱し、埋植評価用のスポンジとした。【０１４９】
（８−２）ＣＢＥ３成形体（孔なし）（熱架橋２８時間：３時間後での酸残存率は７８％）及びＣＢＥ３成形体（孔あり）（熱架橋２８時間、３時間での酸残存率は８２％）の作製
図５に示すような直径4.3mm、厚み1.7mm程度のＣＢＥ３成形体（孔なし）とＣＢＥ３成形体（孔あり）を作製した。【０１５０】
（８−３）骨再生の評価
ＣＢＥ３凍結乾燥スポンジ（熱架橋２８時間：３時間での酸残存率は９５％）、ＣＢＥ３成形体（孔なし）（熱架橋２８時間：３時間後での酸残存率は７８％）、及びＣＢＥ３成形体（孔あり）（熱架橋２８時間、３時間での酸残存率は８２％）を用いて、骨再生の評価試験を行った。【０１５１】
ＣＢＥ３凍結乾燥スポンジ、ＣＢＥ３積層成形体（孔なし）又はＣＢＥ３積層成形体（孔あり）をラットに移植し、４週間経過したあとにマイクロＣＴ（コンピューター断層撮影法：Computed Tomography）解析及び病理解析を行った。
スポンジ又は成形物の移植は、際公開ＷＯ２０１１／０２７８５０号公報の実施例１の記載に準じて以下の通り行った。実験動物としては、ＳＤ（Sprague-Dawley）ラット（雄、10-12週齢、0.3-0.5kg）を用いた。ペントバルビタール（ネンブタール（登録商標）、大日本住友製薬）0.8ml/kgを腹腔内に投与することにより麻酔した。ラットの頭頂骨を露出し、直径5 mmの円形の骨欠損部を作製した。上記のスポンジ又は成形体約10mgを作製した骨欠損部へ充填した後、皮膚を縫合した。【０１５２】
マイクロＣＴ解析の結果を図７に示す。図７のＡ〜Ｄは下記を示す。
Ａ：コントロール（欠損のみ）
Ｂ：ＣＢＥ３凍結乾燥スポンジ（熱架橋２８時間、３時間での酸残存率９５％）
Ｃ：ＣＢＥ３積層成形体（孔なし）（熱架橋２８時間、３時間での酸残存率７８％）
Ｄ：ＣＢＥ３積層成形体（孔あり）（熱架橋２８時間、３時間での酸残存率８２％）
マイクロＣＴ解析において、コントロール（欠損のみ）とＣＢＥ３凍結乾燥スポンジを移植した場合には、移植した外周部からの骨再生は見られるが、ＣＢＥ３粉末積層物の外周部から伸びたような骨再生や、移植物内部の骨再生は見られない。 上記の結果から、ＣＢＥ３粉末積層物の優位性が示された。【０１５３】
（病理標本の作製）
試験期間終了後、放血死させたラットより頭部を回収し、皮膚、眼球、脳等の軟組織を除去したのち塩酸脱灰液中で脱灰した。得られた脱灰標本より埋植部をトリミングし、パラフィン包埋した。同包埋標本からミクロトームにより５μｍ厚の切片を切出し、ヘマトキシリン＆エオジン染色を行った。【０１５４】
病理解析の結果を図８〜図１０に示す。赤紫色に染色されたＣＢＥ３粒子間に軟組織の侵入が認められ、成形体の良好な連通性を示している。また、軟組織中に多数の管腔構造が認められ、良好な血管侵入を示している。病理解析においても、移植したＣＢＥ３粉末積層物の内部において骨再生が確認できる。 再生した形成骨表面の細胞が肥厚しており、骨造成が活性化している様子も認められた。【０１５５】
（９）空隙率の測定
上記（８）の骨再生の評価試験で使用したゼラチン成形体の充填率を以下の通り測定した。
直径２０ｍｍ及び厚み３ｍｍのディスクのＣＢＥ３粉末積層物（ゼラチン成形体）について、マイクロフォーカスＣＴ解析を行い、厚み方向で上中下の位置で、それぞれ２点、合計６点の場所に関して（図１１）、充填率を測定した。充填率の測定結果を図１２〜図１４に示す。測定した充填率から、下記の式により空隙率を求めることができる。
空隙率＝１００％−充填率
ゼラチン成形体の空隙率は約３０％であった。
凍結乾燥スポンジでは、空隙率は、より高くなる。通常、空隙率が高い方が、細胞が成形体の内部まで入り込み易く、評価結果は高くなることが想定される。しかし、本発明の方法で製造したゼラチン成形体は、低い空隙率でも評価結果が優れていた。【０１５６】
二次元の場合、パスのもとになるドット（図１５の場合は着色ドット）が５０％〜６０％以上になると、縦方向でも横方向でもパスが生じることが、数理的なパーコレーション理論として検討されている。
三次元の場合、約３０％でパスができる。
ＣＢＥ３粉末を積層した成形体では、マイクロＣＴ解析において、空隙率が３０％で、１００μｍ径程度の孔が立体的に結ばれた連通孔構造になっていることを確認している（図１６）。これが、ラット試験で、孔を有さない成形体を用いた場合でも細胞が浸透した原因であると考えられる。この空隙は、ＣＢＥ３粒子の付着力と質量とのバランスによって決まるかさ密度によるものと考えられている。【０１５７】
参考例１：
水（見やすくするため微量に着色した）又は５０質量％エタノール水溶液の液滴をゼラチン粉末に着弾させた。液滴落下直後と、液滴の着弾２分後の様子を図２０に示す。
水の場合、２分後でも、１時間経過しても浸透は観察されない。１時間くらい経過すると、ゼラチン粉末から溶解したゼラチンが水滴の中に入り、ゼラチン粉末の表面の上でつまめるゼリー状になった。
５０質量％エタノール水溶液の場合は、液滴着弾後１秒以内に浸透した。浸透は極端に早い。【０１５８】
参考例２：
吐出液（インク）として純水を使用し、粉末として魚ゼラチン粉末（平均粒子径５４μｍ）を使用して、Ｚ−Ｐｒｉｎｔｅｒ３１０ｐｌｕｓにより、以下の条件で成形体を作製した。
塗布量：ドットピッチはヘッドノズルピッチの３００ｄｐｉと推定。ノズルは約３００本。
Ｚピッチ：１００μｍと推定。
パターン：４０ｍｍ（Ｘ：主走査）×３０ｍｍ（Ｙ：副走査）×５ｍｍ（積層）【０１５９】
作製結果を図２１に示す。
５０層中の最初の５層は大きな液滴ができるだけで構造化されなかった。５０層中の最初の１５層くらいはリコートにより、大きくずれた。粉中にアンカー的な下層が形成されると、比較的きれいに描画・積層されるが、ローラー走査方向に、小さいズレが積み重なっていた。成形体は、持ち上げられる程度の強度を有していたが、少し触ると崩れ始めた。
【図１】
0006637598.tif 000003
【図２】
0006637598.tif 000004
【図３】
0006637598.tif 000005
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
0006637598.tif 000022
【図２１】
0006637598.tif 000023
【配列表】
0006637598000001.app