(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＢＣＭＡ（Ｂ細胞成熟抗原）ポリペプチドの１種または複数のエピトープに結合するヒト化抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖと、ＣＴＬＡ−４ヒンジおよび膜貫通ドメイン、または、ＰＤ−１ヒンジおよび膜貫通ドメインと、ＣＤ１３７細胞内共刺激シグナル伝達ドメインと、ＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインとを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、前記ヒンジおよび膜貫通ドメインは、前記ＣＡＲの抗原非依存的サイトカイン放出を減少させる、ＣＡＲ。
【請求項２】
（ａ）前記ヒト化抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖが、配列番号１〜３のいずれか１つに表記されている１個または複数のＣＤＲを含む、
（ｂ）前記ヒト化抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖが、配列番号４〜６のいずれか１つに表記されている１個または複数のＣＤＲを含む、
（ｃ）前記ヒト化抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖが、配列番号７〜９のいずれか１つに表記されている可変軽鎖配列を含む、
（ｄ）前記ヒト化抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖが、配列番号７〜９のいずれか１つに表記されている可変軽鎖配列を含み、可変軽鎖配列が、前記配列番号１〜３に表記されているＣＤＲ配列を含む、
（ｅ）前記ヒト化抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖが、配列番号１０〜１４のいずれか１つに表記されている可変重鎖配列を含む、
（ｆ）前記ヒト化抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖが、配列番号１０〜１４のいずれか１つに表記されている可変重鎖配列を含み、前記可変重鎖配列が、配列番号４〜６に表記されているＣＤＲ配列を含む、
（ｇ）シグナルペプチドをさらに含む、
（ｈ）ＩｇＧ１重鎖シグナルポリペプチド、ＣＤ８αシグナルポリペプチドまたはヒトＧＭ−ＣＳＦ受容体アルファシグナルポリペプチドをさらに含む、または
（ｉ）配列番号７１または配列番号７３に表記されているアミノ酸配列を含む、
請求項１に記載のＣＡＲ。
【請求項３】
請求項１または請求項２に記載のＣＡＲをコードするポリヌクレオチド。
【請求項４】
ポリヌクレオチド配列が、配列番号７０または配列番号７２に表記されている、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項３または請求項４に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項６】
（ａ）発現ベクターである、
（ｂ）エピソームベクターである、
（ｃ）ウイルスベクターである、
（ｄ）レトロウイルスベクターである、
（ｅ）レンチウイルスベクターである、または
（ｆ）ヒト免疫不全ウイルス１（ＨＩＶ−１）；ヒト免疫不全ウイルス２（ＨＩＶ−２）、ビスナ・マエディウイルス（ＶＭＶ）ウイルス；ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）；ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）；ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）；ウシ免疫欠損ウイルス（ＢＩＶ）；およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）からなる群より選択される、レンチウイルスベクターである、
請求項５に記載のベクター。
【請求項７】
前記ベクターが、左（５’）レトロウイルスＬＴＲと、プシー（Ψ）パッケージングシグナルと、中心ポリプリントラクト／ＤＮＡフラップ（ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ）と、レトロウイルス輸送エレメントと、請求項３または請求項４に記載のポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターと、右（３’）レトロウイルスＬＴＲとを含むウイルスベクター、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターである、請求項６に記載のベクター。
【請求項８】
（ａ）異種ポリアデニル化配列をさらに含む、
（ｂ）Ｂ型肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＨＰＲＥ）またはウッドチャック転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）をさらに含む、
（ｃ）前記５’ＬＴＲのプロモーターが、異種プロモーターに置き換えられている、
（ｄ）前記５’ＬＴＲのプロモーターが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターまたはサルウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーターからなる群より選択される前記異種プロモーターに置き換えられている、
（ｅ）前記５’ＬＴＲまたは前記３’ＬＴＲが、レンチウイルスＬＴＲである、
（ｆ）前記３’ＬＴＲが、１個または複数の改変を含む、
（ｇ）前記３’ＬＴＲが、１個または複数の欠失を含む、
（ｈ）前記３’ＬＴＲが、自己不活性化（ＳＩＮ）ＬＴＲである、
（ｉ）前記ポリアデニル化配列が、ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列またはシグナルウサギβ−グロビンポリアデニル化配列である、
（ｊ）請求項３または４に記載のポリヌクレオチドが、最適化されたコザック配列を含む、または
（ｋ）請求項３または４に記載のポリヌクレオチドに作動可能に連結された前記プロモーターが、サイトメガロウイルス最初期遺伝子プロモーター（ＣＭＶ）、伸長因子１アルファプロモーター（ＥＦ１−α）、ホスホグリセリン酸キナーゼ−１プロモーター（ＰＧＫ）、ユビキチン−Ｃプロモーター（ＵＢＱ−Ｃ）、サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリベータ−アクチンプロモーター（ＣＡＧ）、ポリオーマエンハンサー／単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（ＭＣ１）、ベータアクチンプロモーター（β−ＡＣＴ）、サルウイルス４０プロモーター（ＳＶ４０）および骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、負の制御領域欠失、ｄｌ５８７ｒｅｖプライマー結合性部位置換（ＭＮＤ）プロモーターからなる群より選択される、
請求項７に記載のベクター。
【請求項９】
請求項６〜８のいずれか一項に記載のベクターを含む免疫エフェクター細胞。
【請求項１０】
Ｔリンパ球およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞からなる群より選択される、請求項９に記載の免疫エフェクター細胞。
【請求項１１】
請求項９または請求項１０に記載の免疫エフェクター細胞と、生理的に許容される賦形剤とを含む組成物。
【請求項１２】
請求項１または請求項２に記載のＣＡＲを含む免疫エフェクター細胞を生成する方法であって、請求項６〜８のいずれか一項に記載のベクターを免疫エフェクター細胞に導入するステップを含む、方法。
【請求項１３】
Ｂ細胞関連状態の治療を必要とする被験体におけるＢ細胞関連状態の治療に使用するための、治療有効量の請求項１１に記載の組成物。
【請求項１４】
（ａ）前記Ｂ細胞関連状態が、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、不確定悪性度のＢ細胞増殖、リンパ腫様肉芽腫症、移植後リンパ増殖性障害、免疫調節性障害、関節リウマチ、重症筋無力症、特発性血小板減少性紫斑病、抗リン脂質抗体症候群、シャーガス病、グレーブス病、ウェゲナー肉芽腫症、結節性多発動脈炎、シェーグレン症候群、尋常性天疱瘡、強皮症、多発性硬化症、抗リン脂質抗体症候群、ＡＮＣＡ関連血管炎、グッドパスチャー病、川崎病、自己免疫性溶血性貧血および急速進行性糸球体腎炎、重鎖病、原発性もしくは免疫細胞関連アミロイドーシスまたは意義未確定の単クローン性ガンマグロブリン血症である、
（ｂ）前記Ｂ細胞関連状態が、Ｂ細胞悪性疾患である、
（ｃ）前記Ｂ細胞悪性疾患が、多発性骨髄腫（ＭＭ）または非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）からなる群より選択されるＢ細胞悪性疾患である、
（ｄ）前記Ｂ細胞関連状態が、形質細胞悪性疾患である、
（ｅ）前記Ｂ細胞関連状態が、自己免疫性疾患である、
（ｆ）前記Ｂ細胞関連状態が、自己免疫性疾患全身性エリテマトーデスである、
（ｇ）前記Ｂ細胞関連状態が、関節リウマチである、または
（ｈ）前記Ｂ細胞関連状態が、特発性血小板減少性紫斑病または重症筋無力症または自己免疫性溶血性貧血である、
請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記ＭＭが、顕性多発性骨髄腫、くすぶり型多発性骨髄腫、形質細胞白血病、非分泌性骨髄腫、ＩｇＤ骨髄腫、骨硬化性骨髄腫、骨の孤立性形質細胞腫および髄外性形質細胞腫からなる群より選択される、または前記ＮＨＬが、バーキットリンパ腫、慢性リンパ球性白血病／小リンパ球性リンパ腫（ＣＬＬ／ＳＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、免疫芽球性大細胞型リンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫およびマントル細胞リンパ腫からなる群より選択される、請求項１４に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、米国特許法§１１９（ｅ）の下、２０１４年７月２４日に出願された米国仮出願第６２／０２８，６６４号、２０１４年８月２９日に出願された米国仮出願第６２／０４４，１０３号および２０１５年４月２４日に出願された米国仮出願第６２／１５２，５７５号、（これらは、その全体が参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。
【０００２】
配列表に関する記載
本願に関連する配列表は、紙コピーの代わりにテキスト形式で提供されており、これにより、参照により本明細書に組み込まれる。配列表を含有するテキストファイルの名称は、ＢＬＢＤ＿０３７＿０３ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔである。テキストファイルは、１２４ＫＢであり、２０１５年７月２３日に作成され、本明細書の出願と同時に、ＥＦＳ−Ｗｅｂを経由して電子的に提出されている。
【０００３】
本発明は、Ｂ細胞関連状態を治療するための改善された組成物および方法に関する。より詳細には、本発明は、ヒト化抗ＢＣＭＡ抗体またはその抗原結合性断片を含む改善されたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、これらのＣＡＲを発現するように遺伝子改変された免疫エフェクター細胞、およびＢ細胞関連状態を有効に治療するためのこれらの組成物の使用に関する。
【背景技術】
【０００４】
いくつかの重大な疾患は、Ｂリンパ球、すなわち、Ｂ細胞に関与する。異常なＢ細胞生理は、これに限定されないが、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）を含めた自己免疫性疾患の発症をもたらすこともできる。Ｂ細胞の悪性形質転換は、これらに限定されないが、リンパ腫、例えば、多発性骨髄腫および非ホジキンリンパ腫を含めたがんをもたらす。
【０００５】
非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）および多発性骨髄腫（ＭＭ）を含むＢ細胞悪性疾患を有する大多数の患者は、がん死亡率に対する有意な寄与要因である。種々の形態の治療に対するＢ細胞悪性疾患の応答は、混合型である。化学療法および放射線療法を含む、Ｂ細胞悪性疾患を治療する伝統的な方法は、有毒な副作用のために有用性が限られていた。抗ＣＤ１９、抗ＣＤ２０、抗ＣＤ２２、抗ＣＤ２３、抗ＣＤ５２、抗ＣＤ８０および抗ＨＬＡ−ＤＲ治療用抗体による免疫療法は、一部には、不十分な薬物動態プロファイル、血清プロテアーゼおよび糸球体における濾過による抗体の急速な排除、ならびに腫瘍部位への限定的な浸透およびがん細胞における標的抗原の発現レベルのために、限定的な成功をもたらした。キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する遺伝子改変された細胞を使用する試みもまた、ＣＡＲ  Ｔ細胞の不十分なｉｎ  ｖｉｖｏ増大、注入後の細胞の急速な消失および期待外れの臨床活性のために、限定的な成功をもたらした。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、一般に、Ｔ細胞療法を生成するための改善されたベクターおよびこれを使用する方法を提供する。より具体的には、本発明は、ヒト化抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ分子、およびＢ細胞関連状態の治療、予防または好転におけるその使用を提供する。
【０００７】
いかなる特定の理論にも縛られることを望むことなく、本発明者らは、ある特定のヒト化抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲが、ヒト化抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲをＴ細胞療法における使用に不適切なものとする特徴である、抗原非依存的（「強壮性（ｔｏｎｉｃ）」）サイトカイン放出を誘発することを発見した。驚くべきことに、本発明者らは、ある特定のヒト化抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞による強壮性サイトカイン放出は、ヒト化抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲの少なくとも膜貫通ドメインの１種または複数の特徴を変更することにより、抗原依存的にすることができることを発見した。
【０００８】
種々の実施形態では、ヒトＢＣＭＡ（Ｂ細胞成熟抗原）ポリペプチドの１種または複数のエピトープに結合するヒト化抗ＢＣＭＡ抗体またはその抗原結合性断片を含む細胞外ドメインと、膜貫通ドメインと、１個または複数の細胞内共刺激シグナル伝達ドメインと、一次シグナル伝達ドメインとを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が提供される。
【０００９】
特定の実施形態では、ヒトＢＣＭＡポリペプチドに結合するヒト化抗ＢＣＭＡ抗体または抗原結合性断片は、ラクダＩｇ、Ｉｇ  ＮＡＲ、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）’２断片、Ｆ（ａｂ）’３断片、Ｆｖ、単鎖Ｆｖ抗体（「ｓｃＦｖ」）、ビス−ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ）、テトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）、ジスルフィド安定化Ｆｖタンパク質（「ｄｓＦｖ」）および単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ、ナノボディ）からなる群より選択される。
【００１０】
追加的な実施形態では、ヒトＢＣＭＡポリペプチドに結合するヒト化抗ＢＣＭＡ抗体または抗原結合性断片は、ｓｃＦｖである。
【００１１】
一部の実施形態では、ヒト化抗ＢＣＭＡ抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号１〜３のいずれか１つに表記されている１個または複数のＣＤＲを含む。
【００１２】
特定の実施形態では、ヒト化抗ＢＣＭＡ抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号４〜６のいずれか１つに表記されている１個または複数のＣＤＲを含む。
【００１３】
ある特定の実施形態では、ヒト化抗ＢＣＭＡ抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号７〜９のいずれか１つに表記されている可変軽鎖配列を含む。
【００１４】
特定の実施形態では、可変軽鎖配列は、配列番号１〜３に表記されているＣＤＲ配列を含む。
【００１５】
他の実施形態では、ヒト化抗ＢＣＭＡ抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号１０〜１４のいずれか１つに表記されている可変重鎖配列を含む。
【００１６】
追加的な実施形態では、可変重鎖配列は、配列番号４〜６に表記されているＣＤＲ配列を含む。
【００１７】
さらなる実施形態では、膜貫通ドメインは、Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータまたはゼータ鎖、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４およびＰＤ１からなる群より選択されるポリペプチド由来である。
【００１８】
一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８α、ＣＤ４、ＣＤ４５、ＰＤ１およびＣＤ１５２からなる群より選択されるポリペプチド由来である。
【００１９】
一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＰＤ１由来である。
【００２０】
一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ１５２由来である。
【００２１】
ある特定の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８α由来である。
【００２２】
特定の実施形態では、１個または複数の共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ１５０（ＳＬＡＭＦ１）、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ４）、ＣＤ２２３（ＬＡＧ３）、ＣＤ２７０（ＨＶＥＭ）、ＣＤ２７３（ＰＤ−Ｌ２）、ＣＤ２７４（ＰＤ−Ｌ１）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＤＡＰ１０、ＬＡＴ、ＮＫＤ２Ｃ  ＳＬＰ７６、ＴＲＩＭおよびＺＡＰ７０からなる群より選択される共刺激分子由来である。
【００２３】
特定の実施形態では、１個または複数の共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８、ＣＤ１３４およびＣＤ１３７からなる群より選択される共刺激分子由来である。
【００２４】
追加的な実施形態では、１個または複数の共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８、ＣＤ１３４およびＣＤ１３７からなる群より選択される共刺激分子由来である。
【００２５】
追加的な実施形態では、１個または複数の共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８由来である。
【００２６】
特定の実施形態では、１個または複数の共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ１３４由来である。
【００２７】
他の実施形態では、１個または複数の共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ１３７由来である。
【００２８】
ある特定の実施形態では、ＣＡＲは、ヒンジ領域ポリペプチドを含む。
【００２９】
さらなる実施形態では、ヒンジ領域は、ＣＤ８α、ＰＤ１およびＣＤ１５２からなる群より選択されるポリペプチド由来である。
さらなる実施形態では、ヒンジ領域ポリペプチドは、ＰＤ１のヒンジ領域を含む。
【００３０】
さらなる実施形態では、ヒンジ領域ポリペプチドは、ＣＤ１５２のヒンジ領域を含む。
【００３１】
さらなる実施形態では、ヒンジ領域ポリペプチドは、ＣＤ８αのヒンジ領域を含む。
さらなる実施形態では、ＣＡＲは、ＰＤ１由来のヒンジ領域ポリペプチドおよび膜貫通ドメインを含む。
【００３２】
さらなる実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ１５２由来のヒンジ領域ポリペプチドおよび膜貫通ドメインを含む。
【００３３】
さらなる実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ８α由来のヒンジ領域ポリペプチドおよび膜貫通ドメインを含む。
【００３４】
一部の実施形態では、ＣＡＲは、スペーサー領域を含む。
【００３５】
追加的な実施形態では、スペーサー領域ポリペプチドは、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４のＣＨ２およびＣＨ３領域を含む。
【００３６】
特定の実施形態では、ＣＡＲは、シグナルペプチドを含む。
【００３７】
さらなる実施形態では、シグナルペプチドは、ＩｇＧ１重鎖シグナルポリペプチド、ＣＤ８αシグナルポリペプチドまたはヒトＧＭ−ＣＳＦ受容体アルファシグナルペプチドを含む。
【００３８】
一実施形態では、ＣＡＲは、配列番号１５〜２９、７１および７３のいずれか１つに表記されているアミノ酸配列を含む。
【００３９】
別の実施形態では、ＣＡＲは、配列番号１５に表記されているアミノ酸配列を含む。
【００４０】
特定の実施形態では、ＣＡＲは、配列番号１６に表記されているアミノ酸配列を含む。
【００４１】
ある特定の実施形態では、ＣＡＲは、配列番号１７に表記されているアミノ酸配列を含む。
【００４２】
追加的な実施形態では、ＣＡＲは、配列番号１８に表記されているアミノ酸配列を含む。
【００４３】
さらなる実施形態では、ＣＡＲは、配列番号１９に表記されているアミノ酸配列を含む。
【００４４】
特定の一実施形態では、ＣＡＲは、配列番号２０に表記されているアミノ酸配列を含む。
【００４５】
一実施形態では、ＣＡＲは、配列番号２１に表記されているアミノ酸配列を含む。
【００４６】
別の実施形態では、ＣＡＲは、配列番号２２に表記されているアミノ酸配列を含む。
【００４７】
さらに別の実施形態では、ＣＡＲは、配列番号２３に表記されているアミノ酸配列を含む。
【００４８】
さらになお別の実施形態では、ＣＡＲは、配列番号２４に表記されているアミノ酸配列を含む。
【００４９】
特定の一実施形態では、ＣＡＲは、配列番号２５に表記されているアミノ酸配列を含む。
【００５０】
ある特定の一実施形態では、ＣＡＲは、配列番号２６に表記されているアミノ酸配列を含む。
【００５１】
追加的な一実施形態では、ＣＡＲは、配列番号２７に表記されているアミノ酸配列を含む。
【００５２】
さらなる一実施形態では、ＣＡＲは、配列番号２８に表記されているアミノ酸配列を含む。
【００５３】
別の実施形態では、ＣＡＲは、配列番号２９に表記されているアミノ酸配列を含む。
【００５４】
別の実施形態では、ＣＡＲは、配列番号７１に表記されているアミノ酸配列を含む。
【００５５】
別の実施形態では、ＣＡＲは、配列番号７３に表記されているアミノ酸配列を含む。
【００５６】
種々の実施形態では、本明細書において意図されているＣＡＲをコードするポリヌクレオチドが提供される。
【００５７】
種々の特定の実施形態では、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドが提供され、このポリヌクレオチド配列は、配列番号３０〜４４、７０および７２のいずれか１つに表記されている。
【００５８】
種々のある特定の実施形態では、本明細書において意図されているＣＡＲをコードするまたは配列番号３０〜４４、７０および７２のいずれか１つに表記されているポリヌクレオチドを含むベクターが提供される。
【００５９】
ある特定の実施形態では、ベクターは、発現ベクターである。
【００６０】
追加的な実施形態では、ベクターは、エピソームベクターである。
【００６１】
特定の実施形態では、ベクターは、ウイルスベクターである。
【００６２】
さらなる実施形態では、ベクターは、レトロウイルスベクターである。
【００６３】
他の実施形態では、ベクターは、レンチウイルスベクターである。
【００６４】
追加的な実施形態では、レンチウイルスベクターは、ヒト免疫不全ウイルス１（ＨＩＶ−１）；ヒト免疫不全ウイルス２（ＨＩＶ−２）、ビスナ・マエディウイルス（ＶＭＶ）ウイルス；ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）；ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）；ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）；ウシ免疫欠損ウイルス（ＢＩＶ）；およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）から本質的になる群より選択される。
【００６５】
特定の実施形態では、ベクターは、左（５’）レトロウイルスＬＴＲと、プシー（Ψ）パッケージングシグナルと、中心ポリプリントラクト（ｃｅｎｔｒａｌ  ｐｏｌｙｐｕｒｉｎｅ  ｔｒａｃｔ）／ＤＮＡフラップ（ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ）と、レトロウイルス輸送エレメントと、本明細書において意図されているＣＡＲをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターと、右（３’）レトロウイルスＬＴＲとを含む。
【００６６】
他の実施形態では、ＣＡＲは、異種ポリアデニル化配列を含む。
【００６７】
一部の実施形態では、ＣＡＲは、Ｂ型肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＨＰＲＥ）またはウッドチャック転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を含む。
【００６８】
ある特定の実施形態では、５’ＬＴＲのプロモーターは、異種プロモーターに置き換えられている。
【００６９】
さらなる実施形態では、異種プロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターまたはサルウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーターである。
【００７０】
特定の実施形態では、５’ＬＴＲまたは３’ＬＴＲは、レンチウイルスＬＴＲである。
【００７１】
特定の実施形態では、３’ＬＴＲは、１個または複数の改変を含む。
【００７２】
一部の実施形態では、３’ＬＴＲは、１個または複数の欠失を含む。
【００７３】
ある特定の実施形態では、３’ＬＴＲは、自己不活性化（ＳＩＮ）ＬＴＲである。
【００７４】
一部の実施形態では、ポリアデニル化配列は、ウシ成長ホルモンポリアデニル化またはシグナルウサギβ−グロビンポリアデニル化配列である。
【００７５】
追加的な実施形態では、本明細書において意図されているＣＡＲをコードするポリヌクレオチドは、最適化されたコザック配列を含む。
【００７６】
さらなる実施形態では、本明細書において意図されているＣＡＲをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターは、サイトメガロウイルス最初期遺伝子プロモーター（ＣＭＶ）、伸長因子１アルファプロモーター（ＥＦ１−α）、ホスホグリセリン酸キナーゼ−１プロモーター（ＰＧＫ）、ユビキチン−Ｃプロモーター（ＵＢＱ−Ｃ）、サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリベータ−アクチンプロモーター（ＣＡＧ）、ポリオーマエンハンサー／単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（ＭＣ１）、ベータアクチンプロモーター（β−ＡＣＴ）、サルウイルス４０プロモーター（ＳＶ４０）および骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、負の制御領域欠失、ｄｌ５８７ｒｅｖプライマー結合性部位置換（ＭＮＤ）プロモーターからなる群より選択される。
【００７７】
種々の実施形態では、本明細書において意図されているベクターを含む免疫エフェクター細胞が提供される。
【００７８】
さらなる実施形態では、免疫エフェクター細胞は、Ｔリンパ球およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞からなる群より選択される。
【００７９】
種々の実施形態では、本明細書において意図されている免疫エフェクター細胞と、生理的に許容される賦形剤とを含む組成物が提供される。
【００８０】
種々の実施形態では、本明細書において意図されているＣＡＲを含む免疫エフェクター細胞を生成する方法であって、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを免疫エフェクター細胞に導入するステップを含む方法が提供される。
【００８１】
追加的な実施形態では、本方法は、細胞をＣＤ３に結合する抗体およびＣＤ２８に結合する抗体と接触させることにより、免疫エフェクター細胞を刺激し、細胞を誘導して増殖させ、これにより、免疫エフェクター細胞の集団を生成するステップをさらに含む。
【００８２】
特定の実施形態では、ベクターを導入する前に、免疫エフェクター細胞が刺激され、増殖するように誘導される。
【００８３】
ある特定の実施形態では、免疫エフェクター細胞は、Ｔリンパ球を含む。
【００８４】
特定の実施形態では、免疫エフェクター細胞は、ＮＫ細胞を含む。
【００８５】
種々の実施形態では、本明細書において意図されている抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞と、任意選択で薬学的に許容される賦形剤とを含む治療有効量の組成物を被験体に投与するステップを含む、それを必要とする被験体におけるＢ細胞関連状態を治療する方法が提供される。
【００８６】
他の実施形態では、Ｂ細胞関連状態は、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、不確定悪性度のＢ細胞増殖、リンパ腫様肉芽腫症、移植後リンパ増殖性障害、免疫調節性障害、関節リウマチ、重症筋無力症、特発性血小板減少性紫斑病、抗リン脂質抗体症候群、シャーガス病、グレーブス病、ウェゲナー肉芽腫症、結節性多発動脈炎、シェーグレン症候群、尋常性天疱瘡、強皮症、多発性硬化症、抗リン脂質抗体症候群、ＡＮＣＡ関連血管炎、グッドパスチャー病、川崎病、自己免疫性溶血性貧血および急速進行性糸球体腎炎、重鎖病、原発性もしくは免疫細胞関連アミロイドーシスまたは意義未確定の単クローン性ガンマグロブリン血症である。
【００８７】
さらなる実施形態では、Ｂ細胞関連状態は、Ｂ細胞悪性疾患である。
【００８８】
ある特定の実施形態では、Ｂ細胞悪性疾患は、多発性骨髄腫（ＭＭ）または非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）である。
【００８９】
ある特定の実施形態では、ＭＭは、顕性多発性骨髄腫、くすぶり型多発性骨髄腫、形質細胞白血病、非分泌性骨髄腫、ＩｇＤ骨髄腫、骨硬化性骨髄腫、骨の孤立性形質細胞腫（ｓｏｌｉｔａｒｙ  ｐｌａｓｍａｃｙｔｏｍａ  ｏｆ  ｂｏｎｅ）および髄外性形質細胞腫からなる群より選択される。
【００９０】
一部の実施形態では、ＮＨＬは、バーキットリンパ腫、慢性リンパ球性白血病／小リンパ球性リンパ腫（ＣＬＬ／ＳＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、免疫芽球性大細胞型リンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫およびマントル細胞リンパ腫からなる群より選択される。
【００９１】
特定の実施形態では、Ｂ細胞関連状態は、形質細胞悪性疾患である。
【００９２】
さらなる実施形態では、Ｂ細胞関連状態は、自己免疫性疾患である。
【００９３】
追加的な実施形態では、自己免疫性疾患は、全身性エリテマトーデスである。
【００９４】
ある特定の実施形態では、Ｂ細胞関連状態は、関節リウマチである。
【００９５】
特定の実施形態では、Ｂ細胞関連状態は、特発性血小板減少性紫斑病または重症筋無力症または自己免疫性溶血性貧血である。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
ヒトＢＣＭＡ（Ｂ細胞成熟抗原）ポリペプチドの１種または複数のエピトープに結合するヒト化抗ＢＣＭＡ抗体またはその抗原結合性断片を含む細胞外ドメインと、膜貫通ドメインと、１個または複数の細胞内共刺激シグナル伝達ドメインと、一次シグナル伝達ドメインとを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
（項目２）
前記ヒトＢＣＭＡポリペプチドに結合する前記ヒト化抗ＢＣＭＡ抗体または抗原結合性断片が、ラクダＩｇ、Ｉｇ  ＮＡＲ、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）’２断片、Ｆ（ａｂ）’３断片、Ｆｖ、単鎖Ｆｖ抗体（「ｓｃＦｖ」）、ビス−ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ジスルフィド安定化Ｆｖタンパク質（「ｄｓＦｖ」）および単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ、ナノボディ）からなる群より選択される、項目１に記載のＣＡＲ。
（項目３）
前記ヒトＢＣＭＡポリペプチドに結合する前記ヒト化抗ＢＣＭＡ抗体または抗原結合性断片が、ｓｃＦｖである、項目２に記載のＣＡＲ。
（項目４）
前記ヒト化抗ＢＣＭＡ抗体またはその抗原結合性断片が、配列番号１〜３のいずれか１つに表記されている１個または複数のＣＤＲを含む、項目１〜３のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
（項目５）
前記ヒト化抗ＢＣＭＡ抗体またはその抗原結合性断片が、配列番号４〜６のいずれか１つに表記されている１個または複数のＣＤＲを含む、項目１〜４のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
（項目６）
前記ヒト化抗ＢＣＭＡ抗体またはその抗原結合性断片が、配列番号７〜９のいずれか１つに表記されている可変軽鎖配列を含む、項目１〜５のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
（項目７）
前記可変軽鎖配列が、配列番号１〜３に表記されているＣＤＲ配列を含む、項目６に記載のＣＡＲ。
（項目８）
前記ヒト化抗ＢＣＭＡ抗体またはその抗原結合性断片が、配列番号１０〜１４のいずれか１つに表記されている可変重鎖配列を含む、項目１〜７のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
（項目９）
前記可変重鎖配列が、配列番号４〜６に表記されているＣＤＲ配列を含む、項目８に記載のＣＡＲ。
（項目１０）
前記膜貫通ドメインが、Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータまたはゼータ鎖、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４およびＰＤ１からなる群より選択されるポリペプチド由来である、項目１〜９のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
（項目１１）
前記膜貫通ドメインが、ＣＤ８α、ＣＤ４、ＣＤ４５、ＰＤ１およびＣＤ１５２からなる群より選択されるポリペプチド由来である、項目１〜９のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
（項目１２）
前記膜貫通ドメインが、ＣＤ８α由来である、項目１〜１１のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
（項目１３）
前記膜貫通ドメインが、ＰＤ１由来である、項目１〜１１のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
（項目１４）
前記膜貫通ドメインが、ＣＤ１５２由来である、項目１〜１１のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
（項目１５）
前記１個または複数の共刺激シグナル伝達ドメインが、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ１５０（ＳＬＡＭＦ１）、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ４）、ＣＤ２２３（ＬＡＧ３）、ＣＤ２７０（ＨＶＥＭ）、ＣＤ２７３（ＰＤ−Ｌ２）、ＣＤ２７４（ＰＤ−Ｌ１）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＤＡＰ１０、ＬＡＴ、ＮＫＤ２Ｃ  ＳＬＰ７６、ＴＲＩＭおよびＺＡＰ７０からなる群より選択される共刺激分子由来である、項目１〜１４のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
（項目１６）
前記１個または複数の共刺激シグナル伝達ドメインが、ＣＤ２８、ＣＤ１３４およびＣＤ１３７からなる群より選択される共刺激分子由来である、項目１〜１４のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
（項目１７）
前記１個または複数の共刺激シグナル伝達ドメインが、ＣＤ２８、ＣＤ１３４およびＣＤ１３７からなる群より選択される共刺激分子由来である、項目１〜１４のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
（項目１８）
前記１個または複数の共刺激シグナル伝達ドメインが、ＣＤ２８由来である、項目１〜１４のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
（項目１９）
前記１個または複数の共刺激シグナル伝達ドメインが、ＣＤ１３４由来である、項目１〜１４のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
（項目２０）
前記１個または複数の共刺激シグナル伝達ドメインが、ＣＤ１３７由来である、項目１〜１４のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
（項目２１）
ヒンジ領域ポリペプチドをさらに含む、項目１〜２０のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
（項目２２）
前記ヒンジ領域ポリペプチドが、ＣＤ８αのヒンジ領域を含む、項目２１に記載のＣＡＲ。
（項目２３）
前記ヒンジ領域ポリペプチドが、ＰＤ１のヒンジ領域を含む、項目２１に記載のＣＡＲ。
（項目２４）
前記ヒンジ領域ポリペプチドが、ＣＤ１５２のヒンジ領域を含む、項目２１に記載のＣＡＲ。
（項目２５）
スペーサー領域をさらに含む、項目１〜２４のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
（項目２６）
前記スペーサー領域ポリペプチドが、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４のＣＨ２領域およびＣＨ３領域を含む、項目２５に記載のＣＡＲ。
（項目２７）
シグナルペプチドをさらに含む、項目１〜２６のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
（項目２８）
前記シグナルペプチドが、ＩｇＧ１重鎖シグナルポリペプチド、ＣＤ８αシグナルポリペプチドまたはヒトＧＭ−ＣＳＦ受容体アルファシグナルポリペプチドを含む、項目２７に記載のＣＡＲ。
（項目２９）
配列番号１５〜２９、７１および７３のいずれか１つに表記されているアミノ酸配列を含む、項目１〜２８のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
（項目３０）
配列番号１５に表記されているアミノ酸配列を含む、項目１〜２９のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
（項目３１）
配列番号１６に表記されているアミノ酸配列を含む、項目１〜２９のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
（項目３２）
配列番号１７に表記されているアミノ酸配列を含む、項目１〜２９のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
（項目３３）
配列番号１８に表記されているアミノ酸配列を含む、項目１〜２９のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
（項目３４）
配列番号１９に表記されているアミノ酸配列を含む、項目１〜２９のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
（項目３５）
配列番号２０に表記されているアミノ酸配列を含む、項目１〜２９のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
（項目３６）
配列番号２１に表記されているアミノ酸配列を含む、項目１〜２９のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
（項目３７）
配列番号２２に表記されているアミノ酸配列を含む、項目１〜２９のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
（項目３８）
配列番号２３に表記されているアミノ酸配列を含む、項目１〜２９のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
（項目３９）
配列番号２４に表記されているアミノ酸配列を含む、項目１〜２９のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
（項目４０）
配列番号２５に表記されているアミノ酸配列を含む、項目１〜２９のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
（項目４１）
配列番号２６に表記されているアミノ酸配列を含む、項目１〜２９のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
（項目４２）
配列番号２７に表記されているアミノ酸配列を含む、項目１〜２９のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
（項目４３）
配列番号２８に表記されているアミノ酸配列を含む、項目１〜２９のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
（項目４４）
配列番号２９に表記されているアミノ酸配列を含む、項目１〜２９のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
（項目４５）
配列番号７１に表記されているアミノ酸配列を含む、項目１〜２９のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
（項目４６）
配列番号７３に表記されているアミノ酸配列を含む、項目１〜２９のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
（項目４７）
項目１〜４６のいずれか一項に記載のＣＡＲをコードするポリヌクレオチド。
（項目４８）
ポリヌクレオチド配列が、配列番号３０〜４４、７０および７２のいずれか１つに表記されている、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチド。
（項目４９）
項目４７または項目４８に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
（項目５０）
発現ベクターである、項目４９に記載のベクター。
（項目５１）
エピソームベクターである、項目４９に記載のベクター。
（項目５２）
ウイルスベクターである、項目４９に記載のベクター。
（項目５３）
レトロウイルスベクターである、項目４９に記載のベクター。
（項目５４）
レンチウイルスベクターである、項目４９に記載のベクター。
（項目５５）
レンチウイルスベクターが、ヒト免疫不全ウイルス１（ＨＩＶ−１）；ヒト免疫不全ウイルス２（ＨＩＶ−２）、ビスナ・マエディウイルス（ＶＭＶ）ウイルス；ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）；ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）；ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）；ウシ免疫欠損ウイルス（ＢＩＶ）；およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）から本質的になる群より選択される、項目４９に記載のベクター。
（項目５６）
左（５’）レトロウイルスＬＴＲと、プシー（Ψ）パッケージングシグナルと、中心ポリプリントラクト／ＤＮＡフラップ（ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ）と、レトロウイルス輸送エレメントと、項目２６または項目２７に記載のポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターと、右（３’）レトロウイルスＬＴＲとを含む、項目５２〜５５のいずれか一項に記載のベクター。
（項目５７）
異種ポリアデニル化配列をさらに含む、項目５６に記載のベクター。
（項目５８）
Ｂ型肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＨＰＲＥ）またはウッドチャック転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）をさらに含む、項目５６または項目５７に記載のベクター。
（項目５９）
前記５’ＬＴＲのプロモーターが、異種プロモーターに置き換えられている、項目５６〜５８のいずれか一項に記載のベクター。
（項目６０）
前記異種プロモーターが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターまたはサルウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーターである、項目５９に記載のベクター。
（項目６１）
前記５’ＬＴＲまたは前記３’ＬＴＲが、レンチウイルスＬＴＲである、項目５６〜６０のいずれか一項に記載のベクター。
（項目６２）
前記３’ＬＴＲが、１個または複数の改変を含む、項目５６〜６１のいずれか一項に記載のベクター。
（項目６３）
前記３’ＬＴＲが、１個または複数の欠失を含む、項目５６〜６２のいずれか一項に記載のベクター。
（項目６４）
前記３’ＬＴＲが、自己不活性化（ＳＩＮ）ＬＴＲである、項目５６〜６３のいずれか一項に記載のベクター。
（項目６５）
前記ポリアデニル化配列が、ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列またはシグナルウサギβ−グロビンポリアデニル化配列である、項目５６〜６４のいずれか一項に記載のベクター。
（項目６６）
項目５７または項目５８に記載のポリヌクレオチドが、最適化されたコザック配列を含む、項目５９〜６５のいずれか一項に記載のベクター。
（項目６７）
項目５７または項目５８に記載のポリヌクレオチドに作動可能に連結された前記プロモーターが、サイトメガロウイルス最初期遺伝子プロモーター（ＣＭＶ）、伸長因子１アルファプロモーター（ＥＦ１−α）、ホスホグリセリン酸キナーゼ−１プロモーター（ＰＧＫ）、ユビキチン−Ｃプロモーター（ＵＢＱ−Ｃ）、サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリベータ−アクチンプロモーター（ＣＡＧ）、ポリオーマエンハンサー／単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（ＭＣ１）、ベータアクチンプロモーター（β−ＡＣＴ）、サルウイルス４０プロモーター（ＳＶ４０）および骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、負の制御領域欠失、ｄｌ５８７ｒｅｖプライマー結合性部位置換（ＭＮＤ）プロモーターからなる群より選択される、項目５６〜６６のいずれか一項に記載のベクター。
（項目６８）
項目４９〜６７のいずれか一項に記載のベクターを含む免疫エフェクター細胞。
（項目６９）
Ｔリンパ球およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞からなる群より選択される、項目６８に記載の免疫エフェクター細胞。
（項目７０）
項目６８または項目６９に記載の免疫エフェクター細胞と、生理的に許容される賦形剤とを含む組成物。
（項目７１）
項目１〜４６のいずれか一項に記載のＣＡＲを含む免疫エフェクター細胞を生成する方法であって、項目４９〜６７のいずれか一項に記載のベクターを免疫エフェクター細胞に導入するステップを含む、方法。
（項目７２）
前記免疫エフェクター細胞をＣＤ３に結合する抗体およびＣＤ２８に結合する抗体と接触させることにより、前記細胞を刺激し、前記細胞を誘導して増殖させ、これにより、免疫エフェクター細胞の集団を生成するステップをさらに含む、項目７１に記載の方法。
（項目７３）
前記ベクターを導入する前に、前記免疫エフェクター細胞が刺激され、増殖するように誘導される、項目７２に記載の方法。
（項目７４）
前記免疫エフェクター細胞が、Ｔリンパ球を含む、項目７２に記載の方法。
（項目７５）
前記免疫エフェクター細胞が、ＮＫ細胞を含む、項目７２に記載の方法。
（項目７６）
Ｂ細胞関連状態の治療を必要とする被験体におけるＢ細胞関連状態を治療する方法であって、前記被験体に治療有効量の項目７０に記載の組成物を投与するステップを含む、方法。
（項目７７）
前記Ｂ細胞関連状態が、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、不確定悪性度のＢ細胞増殖、リンパ腫様肉芽腫症、移植後リンパ増殖性障害、免疫調節性障害、関節リウマチ、重症筋無力症、特発性血小板減少性紫斑病、抗リン脂質抗体症候群、シャーガス病、グレーブス病、ウェゲナー肉芽腫症、結節性多発動脈炎、シェーグレン症候群、尋常性天疱瘡、強皮症、多発性硬化症、抗リン脂質抗体症候群、ＡＮＣＡ関連血管炎、グッドパスチャー病、川崎病、自己免疫性溶血性貧血および急速進行性糸球体腎炎、重鎖病、原発性もしくは免疫細胞関連アミロイドーシスまたは意義未確定の単クローン性ガンマグロブリン血症である、項目７６に記載の方法。
（項目７８）
前記Ｂ細胞関連状態が、Ｂ細胞悪性疾患である、項目７６に記載の方法。
（項目７９）
前記Ｂ細胞悪性疾患が、多発性骨髄腫（ＭＭ）または非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）である、項目７８に記載の方法。
（項目８０）
前記ＭＭが、顕性多発性骨髄腫、くすぶり型多発性骨髄腫、形質細胞白血病、非分泌性骨髄腫、ＩｇＤ骨髄腫、骨硬化性骨髄腫、骨の孤立性形質細胞腫および髄外性形質細胞腫からなる群より選択される、項目７９に記載の方法。
（項目８１）
前記ＮＨＬが、バーキットリンパ腫、慢性リンパ球性白血病／小リンパ球性リンパ腫（ＣＬＬ／ＳＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、免疫芽球性大細胞型リンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫およびマントル細胞リンパ腫からなる群より選択される、項目７９に記載の方法。
（項目８２）
前記Ｂ細胞関連状態が、形質細胞悪性疾患である、項目７６に記載の方法。
（項目８３）
前記Ｂ細胞関連状態が、自己免疫性疾患である、項目７６に記載の方法。
（項目８４）
前記自己免疫性疾患が、全身性エリテマトーデスである、項目８３に記載の方法。
（項目８５）
前記Ｂ細胞関連状態が、関節リウマチである、項目８３に記載の方法。
（項目８６）
前記Ｂ細胞関連状態が、特発性血小板減少性紫斑病または重症筋無力症または自己免疫性溶血性貧血である、項目８３に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００９６】
【図１】図１は、ヒト化抗Ｂ細胞成熟抗原（抗ＢＣＭＡ）ＣＡＲ構築物の模式図を示す。
【００９７】
【図２】図２は、ＢＣＭＡを発現するＫ５６２細胞と共に細胞を２４時間共培養した後に、抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞から放出されたＩＦＮγの量を示す。
【００９８】
【図３】図３は、ＢＣＭＡを発現するＫ５６４−細胞と共に４時間共培養された抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の細胞溶解活性を示す。
【００９９】
【図４】図４は、マウス（抗ＢＣＭＡ−０２）またはヒト化（抗ＢＣＭＡ、抗ＢＣＭＡ−１０、抗ＢＣＭＡ−１１、抗ＢＣＭＡ−３１）ＣＡＲ配列を形質導入されたＴ細胞における抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ発現を示す。
【０１００】
【図５】図５は、少量もしくは多量のＢＣＭＡを発現するＫ５６２  ＢＣＭＡ細胞、多発性骨髄腫細胞株（ＲＰＭＩ−８２２６、ＮＣＩ−Ｈ９２９）またはＢＣＭＡ陰性細胞株（Ｋ５６２、ＨＤＬＭ−２）と共に細胞を２４時間共培養した後に、抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞から放出されたＩＦＮγの量を示す。
【０１０１】
【図６】図６は、Ｋ５６４−ＢＣＭＡ細胞と４時間共培養された、抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲを発現するＴ細胞の細胞溶解活性を示す。
【０１０２】
【図７】図７は、ヒト血清を含有するがＢＣＭＡを欠く培地において培養されたヒト化抗ＢＣＭＡ−１０  ＣＡＲ構築物を発現するＴ細胞による、抗原非依存的サイトカイン放出を示す。
【０１０３】
【図８】図８は、ヒト血清を含有するがＢＣＭＡを欠く培地において培養された、ヒト化抗ＢＣＭＡ−１０  ＣＡＲ構築物を発現するＴ細胞による抗原非依存的サイトカイン放出を示す。
【０１０４】
【図９】図９は、抗ＢＣＭＡ−０２、抗ＢＣＭＡ−１０、抗ＢＣＭＡ−１０．２および抗ＢＣＭＡ−１０．５  ＣＡＲ構築物の模式図を示す。
【０１０５】
【図１０】図１０は、ＢＣＭＡを発現するＫ５６２細胞と共に細胞を２４時間共培養した後に、抗ＢＣＭＡ−１０、抗ＢＣＭＡ−１０．２または抗ＢＣＭＡ−１０．５  ＣＡＲ  Ｔ細胞から放出されたＩＦＮγの量を示す。
【０１０６】
【図１１】図１１は、培養２４時間後の、マウス抗ＢＣＭＡ−０２  ＣＡＲを発現するまたはヒト化抗ＢＣＭＡ−１０、抗ＢＣＭＡ−１０．２もしくは抗ＢＣＭＡ−１０．５  ＣＡＲを発現するＴ細胞からの強壮性ＩＦＮγ放出の量の比較を示す。
【発明を実施するための形態】
【０１０７】
配列識別子の簡単な説明
配列番号１〜３は、本明細書において意図されている抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲの例示的な軽鎖ＣＤＲ配列のアミノ酸配列を表記する。
【０１０８】
配列番号４〜６は、本明細書において意図されている抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲの例示的な重鎖ＣＤＲ配列のアミノ酸配列を表記する。
【０１０９】
配列番号７〜９は、本明細書において意図されている抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲの例示的な軽鎖配列のアミノ酸配列を表記する。
【０１１０】
配列番号１０〜１４は、本明細書において意図されている抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲの例示的な重鎖配列のアミノ酸配列を表記する。
【０１１１】
配列番号１５〜２９、７１および７３は、本明細書において意図されている例示的な抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲのアミノ酸配列を表記する。
【０１１２】
配列番号３０〜４４、７０および７２は、本明細書において意図されている例示的な抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲをコードするポリヌクレオチド配列を表記する。
【０１１３】
配列番号４５は、ヒトＢＣＭＡのアミノ酸配列を表記する。
【０１１４】
配列番号４６〜５６は、種々のリンカーのアミノ酸配列を表記する。
【０１１５】
配列番号５７〜６９は、プロテアーゼ切断部位および自己切断ポリペプチド切断部位のアミノ酸配列を表記する。
【０１１６】
詳細な説明
Ａ．概要
本発明は、一般に、Ｂ細胞関連状態を治療するための改善された組成物および方法に関する。本明細書で使用される場合、用語「Ｂ細胞関連状態」は、不適切なＢ細胞活性およびＢ細胞悪性疾患に関与する状態に関する。
【０１１７】
特定の実施形態では、本発明は、遺伝子改変された免疫エフェクター細胞を使用した、Ｂ細胞関連状態の改善された養子細胞療法に関する。遺伝的アプローチは、がん細胞の免疫認識および排除を増強するための潜在的な手段を提供する。有望な一戦略は、がん細胞に対して細胞傷害性を向け直す（ｒｅｄｉｒｅｃｔ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように、免疫エフェクター細胞を遺伝子工学的に作製することである。しかし、細胞が、Ｂ細胞の全てまたは大部分において発現された抗原を標的化するため、Ｂ細胞障害を治療するための現存する養子細胞免疫療法は、液性免疫を損なう重篤なリスクを呈する。したがって、このような療法は、臨床的に望ましくないため、液性免疫を温存するＢ細胞関連状態のより効率的な療法の必要が当技術分野には依然としてある。
【０１１８】
本明細書に開示されている養子細胞療法の改善された組成物および方法は、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ、ＣＤ２６９または腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー、メンバー１７；ＴＮＦＲＳＦ１７としても公知）を発現するＢ細胞を標的化することにより、容易に増大し、ｉｎ  ｖｉｖｏでの長期持続性を示し、液性免疫の機能障害を低下させることができる、遺伝子改変された免疫エフェクター細胞をもたらす。
【０１１９】
ＢＣＭＡは、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーのメンバーである（例えば、Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、１９２巻（１号）：１２９〜１３５頁、２０００年およびＭａｃｋａｙら、Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、２１巻：２３１〜２６４頁、２００３年を参照）。ＢＣＭＡは、Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）および増殖誘導リガンド（ＡＰＲＩＬ）に結合する（例えば、Ｍａｃｋａｙら、２００３年およびＫａｌｌｅｄら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、２０４巻：４３〜５４頁、２００５年を参照）。非悪性細胞の中で、ＢＣＭＡは、大部分は、形質細胞および成熟Ｂ細胞サブセットにおいて発現されることが報告された（例えば、Ｌａａｂｉら、ＥＭＢＯ  Ｊ．、７７巻（１号）：３８９７〜３９０４頁、１９９２年；Ｌａａｂｉら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２２巻（７号）：１１４７〜１１５４頁、１９９４年；Ｋａｌｌｅｄら、２００５年；Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒら、Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、１９９巻（１号）：９１〜９７頁、２００４年；およびＮｇら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、７３巻（２号）：８０７〜８１７頁、２００４年を参照）。ＢＣＭＡを欠損するマウスは、健康であり、正常な数のＢ細胞を有するが、長寿命形質細胞の生存は損なわれる（例えば、Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒら、２００４年；Ｘｕら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ、２１巻（１２号）：４０６７〜４０７４頁、２００１年；およびＳｃｈｉｅｍａｎｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９３巻（５５３７号）：２１１１〜２１１４頁、２００１年を参照）。ＢＣＭＡ  ＲＮＡは、多発性骨髄腫細胞および他のリンパ腫において普遍的に検出され、ＢＣＭＡタンパク質は、数名の研究者によって多発性骨髄腫患者由来の形質細胞の表面において検出された（例えば、Ｎｏｖａｋら、Ｂｌｏｏｄ、１０３巻（２号）：６８９〜６９４頁、２００４年；Ｎｅｒｉら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、７３巻（１９号）：５９０３〜５９０９頁、２００７年；Ｂｅｌｌｕｃｃｉら、Ｂｌｏｏｄ、１０５巻（１０号）：３９４５〜３９５０頁、２００５年；およびＭｏｒｅａｕｘら、Ｂｌｏｏｄ、７０３巻（８号）：３１４８〜３１５７頁、２００４年を参照）。
【０１２０】
種々の実施形態では、ヒト化抗ＢＣＭＡ抗体配列を含むＣＡＲは、マウス抗体配列を含む抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲと比較して高度に効果的であり；頑強なｉｎ  ｖｉｖｏ増大を行い；ＢＣＭＡを発現するヒトＢ細胞を認識し、ＢＣＭＡ発現Ｂ細胞に対する細胞傷害活性を示す。本発明者らは、構造的およびマイナー抗原認識ドメインを含むマウス抗ヒトＢＣＭＡ抗体配列の部分の実質的な改変が、ヒト化抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の機能を実質的に変更しなかったこと、およびヒト化抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲの少なくとも膜貫通ドメインを変更することにより、ヒト化抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞のサイトカイン放出特性が、参照ヒト化抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲを発現するＴ細胞と比較して増加または減少され得ることを予期せず発見した。
【０１２１】
特定の実施形態では、ヒト化抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲは、驚くほど高い抗原非依存的または強壮性サイトカイン放出をもたらす。特定の実施形態では、変更されたヒト化抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞のシグナル伝達特性（例えば、サイトカイン放出）が、変更されていないヒト化抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲを発現するＴ細胞と比較して実質的に抗原依存的になるように、抗原非依存的サイトカイン放出を生じるヒト化抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲの膜貫通ドメインが変更される。
【０１２２】
ある特定の実施形態では、変更されたヒト化抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞が、変更されていないヒト化抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲを発現するＴ細胞と比較して実質的に抗原依存的になるまたは抗原の非存在下で実質的に少ないサイトカインを放出するように、抗原非依存的サイトカイン放出を生じるヒト化抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲの膜貫通ドメインが変更される。
【０１２３】
一実施形態では、ヒト化抗ＢＣＭＡ抗体または抗原結合性断片、膜貫通ドメインおよび１個または複数の細胞内シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲが提供される。
【０１２４】
一実施形態では、本明細書において意図されているＣＡＲを発現するように遺伝子改変された免疫エフェクター細胞が提供される。ＣＡＲを発現するＴ細胞は、本明細書において、ＣＡＲ  Ｔ細胞またはＣＡＲ改変Ｔ細胞と称される。
【０１２５】
種々の実施形態では、本明細書において意図されている遺伝子改変された免疫エフェクター細胞は、Ｂ細胞関連状態、例えば、Ｂ細胞に関連する自己免疫性疾患またはＢ細胞悪性疾患の患者に投与される。
【０１２６】
本発明の実施には、特にそれに反する指示がなければ、当技術分野の技術の範囲内に入る化学、生化学、有機化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ技法、遺伝学、免疫学、および細胞生物学の従来の方法を使用し、その多くを例示目的で以下に記載する。そのような技法は、文献において十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第３版、２００１年）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版、１９８９年）；Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８２年）；Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、２００８年７月更新）；Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ｇｌｏｖｅｒ、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｉ巻＆ＩＩ巻（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、１９８５年）；Ａｎａｎｄ、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｇｅｎｏｍｅｓ、（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９２年）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．  ＨａｍｅｓおよびＳ．  Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８４年）；Ｐｅｒｂａｌ、Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４年）；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９９８年）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｑ．  Ｅ．  Ｃｏｌｉｇａｎ、Ａ．  Ｍ．  Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ、Ｄ．  Ｈ．  Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ、Ｅ．  Ｍ．  ＳｈｅｖａｃｈおよびＷ．  Ｓｔｒｏｂｅｒ編、１９９１年）；Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ；ならびにＡｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙなどの学術誌内のモノグラフを参照されたい。
【０１２７】
Ｂ．定義
別段の定義のない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載の方法および材料と類似した、またはそれと等しい任意の方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、組成物、方法および材料の好ましい実施形態が本明細書に記載されている。本発明の目的に関して、次の用語を以下に定義する。
【０１２８】
冠詞「ａ（１つの）」、「ａｎ（１つの）」および「ｔｈｅ（その）」は、本明細書において、この冠詞の文法上の目的語のうち１個または２個以上（すなわち、少なくとも１個または１個もしくは複数）を指すために使用される。例として「要素（ａｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ）」は、１個の要素または１個もしくは複数の要素を意味する。
【０１２９】
選択肢（例えば、「または」）の使用は、この選択肢のいずれか一方、両方またはこれらのいずれかの組合せを意味するものと理解されたい。
【０１３０】
用語「および／または」は、この選択肢のいずれか一方または両方を意味するものと理解されたい。
【０１３１】
本明細書で使用される場合、用語「約」または「およそ」は、参照の数量（ｑｕａｎｔｉｔｙ）、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量または長さに対して１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％または１％の多さで変動する数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量または長さを指す。一実施形態では、用語「約」または「およそ」は、参照の数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量または長さに関して数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量または長さ±１５％、±１０％、±９％、±８％、±７％、±６％、±５％、±４％、±３％、±２％または±１％の範囲を指す。
【０１３２】
本明細書を通して、文脈がそれ以外を要求しない限り、単語「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「を含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、記述されたステップもしくは要素またはステップもしくは要素の群の包含を含意するが、他のいずれかのステップもしくは要素またはステップもしくは要素の群の排除を含意しないものと理解されるであろう。語句「からなる」の前に書かれたものが何であれ、「からなる」とは、「を含みこれらに限定される」ことを意味する。よって、語句「からなる」は、列挙されている要素が、必要とされるまたは強制的であり、他の要素が存在しなくてよいことを示す。「から本質的になる」とは、この語句の前に列挙されているいずれかの要素を含み、列挙されている要素に関する本開示で指定されている活性または作用に干渉しないまたは寄与しない他の要素に限定されることを意味する。よって、語句「から本質的になる」は、列挙されている要素が、必要とされるまたは強制的であるが、列挙されている要素の活性または作用に実質的に影響する他の要素が存在しないことを示す。
【０１３３】
本明細書全体を通して、「一実施形態」、「ある実施形態」、「特定の実施形態」、「関連する実施形態」、「ある特定の実施形態」、「追加的な実施形態」または「さらなる実施形態」またはこれらの組合せへの言及は、実施形態に関連して記載されている特定の特徴、構造または特性が本発明の少なくとも１つの実施形態に包含されることを意味する。したがって、本明細書全体を通して種々の箇所における前述の句の出現は、必ずしも全てが同じ実施形態について言及しているのではない。さらに、１つまたは複数の実施形態において、特定の特徴、構造、または特性を任意の適切な様式で組み合わせることができる。一実施形態における特色の肯定的な列挙が、特定の実施形態における特色を除外するための基盤として機能することも理解される。
【０１３４】
Ｃ．キメラ抗原受容体
種々の実施形態では、Ｂ細胞に対し免疫エフェクター細胞の細胞傷害性を向け直す遺伝子工学的に作製された受容体が提供される。これらの遺伝子工学的に作製された受容体は、本明細書において、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と称される。ＣＡＲは、所望の抗原（例えば、ＢＣＭＡ）に対する抗体に基づく特異性を、Ｔ細胞受容体活性化細胞内ドメインと組み合わせて、特異的な抗ＢＣＭＡ細胞性免疫活性を示すキメラタンパク質を生成する分子である。本明細書で使用される場合、用語「キメラ」は、異なる起源の異なるタンパク質またはＤＮＡの部分で構成されていることを説明する。
【０１３５】
本明細書において意図されているＣＡＲは、ＢＣＭＡに結合する細胞外ドメイン（結合性ドメインまたは抗原特異的結合性ドメインとも称される）、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含む。標的細胞の表面におけるＢＣＭＡとＣＡＲの抗ＢＣＭＡ抗原結合性ドメインとの係合は、ＣＡＲのクラスター形成をもたらし、ＣＡＲ含有細胞に活性化刺激を送達する。ＣＡＲの主な特徴は、免疫エフェクター細胞特異性を向け直し、これにより、増殖、サイトカイン産生、食作用または主要組織適合性（ＭＨＣ）非依存的様式で標的抗原発現細胞の細胞死を媒介し得る分子の産生を誘発し、モノクローナル抗体、可溶性リガンドまたは細胞特異的共受容体の細胞特異的標的化能力を活用するその能力である。
【０１３６】
種々の実施形態では、ＣＡＲは、ヒト化ＢＣＭＡ特異的結合性ドメインを含む細胞外結合性ドメイン；膜貫通ドメイン；１個または複数の細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン；および一次シグナル伝達ドメインを含む。
【０１３７】
特定の実施形態では、ＣＡＲは、ヒト化抗ＢＣＭＡ抗体またはその抗原結合性断片を含む細胞外結合性ドメイン；１個または複数のヒンジドメインまたはスペーサードメイン；膜貫通ドメイン；１個または複数の細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン；および一次シグナル伝達ドメインを含む。
【０１３８】
１．結合性ドメイン
特定の実施形態では、本明細書において意図されているＣＡＲは、Ｂ細胞上に発現されたヒトＢＣＭＡポリペプチドに特異的に結合するヒト化抗ＢＣＭＡ抗体またはその抗原結合性断片を含む細胞外結合性ドメインを含む。本明細書で使用される場合、用語「結合性ドメイン」、「細胞外ドメイン」、「細胞外結合性ドメイン」、「抗原特異的結合性ドメイン」および「細胞外抗原特異的結合性ドメイン」は、互換的に使用されており、目的の標的抗原、例えば、ＢＣＭＡに特異的に結合する能力をＣＡＲに与える。結合性ドメインは、天然、合成、半合成または組換え供給源のいずれかに由来することができる。
【０１３９】
本明細書で使用される用語「特異的結合親和性」または「特異的に結合する」または「特異的に結合される」または「特異的結合」または「特異的に標的化する」は、バックグラウンド結合よりも大きい結合親和性での、ＢＣＭＡへの抗ＢＣＭＡ抗体またはその抗原結合性断片（またはこれを含むＣＡＲ）の結合を説明する。結合性ドメイン（または結合性ドメインを含むＣＡＲまたは結合性ドメインを含有する融合タンパク質）は、例えば、約１０５Ｍ−１を超えるまたはこれに等しい親和性またはＫａ（すなわち、１／Ｍの単位による特定の結合相互作用の平衡会合定数）でＢＣＭＡに結合またはこれと会合する場合、ＢＣＭＡに「特異的に結合する」。ある特定の実施形態では、結合性ドメイン（またはその融合タンパク質）は、約１０６Ｍ−１、１０７Ｍ−１、１０８Ｍ−１、１０９Ｍ−１、１０１０Ｍ−１、１０１１Ｍ−１、１０１２Ｍ−１または１０１３Ｍ−１を超えるまたはこれに等しいＫａで標的に結合する。「高親和性」結合性ドメイン（またはその単鎖融合タンパク質）は、少なくとも１０７Ｍ−１、少なくとも１０８Ｍ−１、少なくとも１０９Ｍ−１、少なくとも１０１０Ｍ−１、少なくとも１０１１Ｍ−１、少なくとも１０１２Ｍ−１、少なくとも１０１３Ｍ−１またはそれを超えるＫａを有する結合性ドメインを指す。
【０１４０】
あるいは、親和性は、単位Ｍの、特定の結合相互作用の平衡解離定数（Ｋｄ）と定義することができる（例えば、１０−５Ｍ〜１０−１３Ｍまたはそれ未満）。本開示による結合性ドメインポリペプチドおよびＣＡＲタンパク質の親和性は、従来の技法を使用して、例えば、競合ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）によって、または結合会合、または標識したリガンドを使用した置換アッセイによって、または、Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪから入手可能なＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００などの表面プラズモン共鳴デバイス、またはそれぞれＣｏｒｎｉｎｇおよびＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒから入手可能なＥＰＩＣ  ｓｙｓｔｅｍもしくはＥｎＳｐｉｒｅなどの光学バイオセンサー技術を使用して、容易に決定することができる（例えば、Ｓｃａｔｃｈａｒｄら（１９４９年）Ａｎｎ．  Ｎ．Ｙ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ５１巻：６６０頁；および米国特許第５，２８３，１７３号；同第５，４６８，６１４号、または等価物も参照されたい）。
【０１４１】
一実施形態では、特異的な結合の親和性は、バックグラウンド結合の約２倍、バックグラウンド結合の約５倍、バックグラウンド結合の約１０倍、バックグラウンド結合の約２０倍、バックグラウンド結合の約５０倍、バックグラウンド結合の約１００倍、またはバックグラウンド結合の約１０００倍またはそれ超である。
【０１４２】
特定の実施形態では、ＣＡＲの細胞外結合性ドメインは、抗体またはその抗原結合性断片を含む。「抗体」とは、免疫細胞によって認識されるものなどの抗原決定基を含有するペプチド、脂質、多糖、または核酸などの抗原のエピトープを特異的に認識し、それに結合する、少なくとも軽鎖または重鎖免疫グロブリン可変領域を含むポリペプチドである結合性作用物質を指す。
【０１４３】
「抗原（Ａｇ）」は、動物における抗体の産生またはＴ細胞応答を刺激することができる化合物、組成物または物質を指し、動物に注射または吸収される組成物（がん特異的タンパク質を含む組成物など）を含む。抗原は、開示されている抗原など、異種抗原によって誘導される産物を含む特異的液性または細胞性免疫の産物と反応する。特定の実施形態では、標的抗原は、ＢＣＭＡポリペプチドのエピトープである。
【０１４４】
「エピトープ」または「抗原決定基」は、結合性作用物質が結合する抗原の領域を指す。エピトープは、連続するアミノ酸またはタンパク質の三次フォールディングによって並置される連続しないアミノ酸の両方から形成することができる。連続するアミノ酸から形成されたエピトープは、典型的には、変性溶媒への曝露において保持される一方、三次フォールディングによって形成されるエピトープは、典型的には、変性溶媒による処理において失われる。エピトープは、典型的には、特有の空間コンホメーションにおいて少なくとも３、より通常は、少なくとも５、約９または約８〜１０アミノ酸を含む。
【０１４５】
抗体は、ラクダＩｇ、Ｉｇ  ＮＡＲ、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）’２断片、Ｆ（ａｂ）’３断片、Ｆｖ、単鎖Ｆｖタンパク質（「ｓｃＦｖ」）、ビス−ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ジスルフィド安定化Ｆｖタンパク質（「ｄｓＦｖ」）および単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ、ナノボディ）および抗原結合の原因となる全長抗体の部分など、その抗原結合性断片を含む。この用語は、キメラ抗体（例えば、ヒト化マウス抗体）、ヘテロコンジュゲート抗体（二特異性抗体など）およびそれらの抗原結合性断片など、遺伝子工学的に作製された形態も含む。Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃａｔａｌｏｇ  ａｎｄ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ、１９９４〜１９９５年（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，  Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，  ＩＬ）；Ｋｕｂｙ，  Ｊ．、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第３版、Ｗ．  Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９７年も参照されたい。
【０１４６】
当業者によって理解される通り、また、本明細書の他の箇所に記載されている通り、完全抗体は、２本の重鎖および２本の軽鎖を含む。各重鎖は、可変領域ならびに第１、第２および第３の定常領域からなる一方、各軽鎖は、可変領域および定常領域からなる。哺乳動物重鎖は、α、δ、ε、γおよびμとして分類される。哺乳動物軽鎖は、λまたはκとして分類される。α、δ、ε、γおよびμ重鎖を含む免疫グロブリンは、免疫グロブリン（Ｉｇ）Ａ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭとして分類される。完全抗体は、「Ｙ」形状を形成する。Ｙのステムは、一緒に結合された２本の重鎖の第２および第３の定常領域（ならびにＩｇＥおよびＩｇＭに関しては、第４の定常領域）からなり、ヒンジにおいてジスルフィド結合（鎖間）が形成される。重鎖γ、αおよびδは、３個のタンデム型（一列になった）Ｉｇドメインで構成された定常領域および可撓性を加えるためのヒンジ領域を有する；重鎖μおよびεは、４個の免疫グロブリンドメインで構成された定常領域を有する。第２および第３の定常領域は、それぞれ「ＣＨ２ドメイン」および「ＣＨ３ドメイン」と称される。Ｙの各腕は、１本の軽鎖の可変および定常領域に結合された、１本の重鎖の可変領域および第１の定常領域を含む。軽鎖および重鎖の可変領域は、抗原結合の原因となる。
【０１４７】
軽鎖可変領域および重鎖可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」とも称される３つの超可変領域が間に存在する「フレームワーク」領域を含有する。ＣＤＲは、例えば、Ｋａｂａｔら（Ｗｕ，  ＴＴおよびＫａｂａｔ，  Ｅ．  Ａ．、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．  １３２巻（２号）：２１１〜５０頁、（１９７０年）；Ｂｏｒｄｅｎ，  Ｐ．およびＫａｂａｔ  Ｅ．  Ａ．、ＰＮＡＳ、８４巻：２４４０〜２４４３頁（１９８７年）；（これによって参照により組み込まれるＫａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、Ｕ．Ｓ．  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、１９９１年を参照されたい）による配列によって、または、Ｃｈｏｔｈｉａら（Ｃｈｏｔｈｉａ，  Ｃ．およびＬｅｓｋ，  Ａ．Ｍ．、Ｊ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、１９６巻（４号）：９０１〜９１７頁（１９８７年）、Ｃｈｏｔｈｉａ、Ｃ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、３４２巻：８７７〜８８３頁（１９８９年））による構造によってなど、従来の方法によって定義または同定することができる。
【０１４８】
異なる軽鎖または重鎖のフレームワーク領域の配列は、ヒトなどの種の中で比較的保存されている。構成要素である軽鎖および重鎖の組み合わせたフレームワーク領域である抗体のフレームワーク領域はＣＤＲを３次元空間内に位置付け、整列させるのに役立つ。ＣＤＲは、主に、抗原のエピトープへの結合に関与する。各鎖のＣＤＲは、一般には、Ｎ末端から開始して逐次的に番号が付され、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３と称され、また、一般には、特定のＣＤＲが位置する鎖によって同定される。したがって、抗体の重鎖の可変ドメインに位置するＣＤＲはＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３と称され、抗体の軽鎖の可変ドメインに位置するＣＤＲはＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３と称される。異なる特異性（すなわち、異なる抗原に対する異なる結合部位）を有する抗体は異なるＣＤＲを有する。ＣＤＲは抗体間で変動するが、抗原結合に直接関与するのはＣＤＲ内の限られた数のアミノ酸位置である。ＣＤＲ内のこれらの位置は、特異性決定残基（ＳＤＲ）と称される。本明細書において意図されているヒト化抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲの構築に適した軽鎖ＣＤＲの実例として、これらに限定されないが、配列番号１〜３に表記されているＣＤＲ配列が挙げられる。本明細書において意図されているヒト化抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲの構築に適した重鎖ＣＤＲの実例として、これらに限定されないが、配列番号４〜６に表記されているＣＤＲ配列が挙げられる。
【０１４９】
「ＶＨ」または「ＶＨ」への言及は、抗体、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、Ｆａｂ、または本明細書に開示されている他の抗体断片のものを含めた、免疫グロブリン重鎖の可変領域を指す。「ＶＬ」または「ＶＬ」への言及は、抗体、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、Ｆａｂ、または本明細書に開示されている他の抗体断片のものを含めた、免疫グロブリン軽鎖の可変領域を指す。
【０１５０】
「モノクローナル抗体」は、Ｂリンパ球の単一のクローンによって、または単一の抗体の軽鎖遺伝子および重鎖遺伝子がトランスフェクトされた細胞によって産生される抗体である。モノクローナル抗体は、当業者に公知の方法によって、例えば、骨髄腫細胞と免疫脾臓細胞の融合によるハイブリッドの抗体形成細胞を作出することにより産生される。モノクローナル抗体はヒト化モノクローナル抗体を含む。
【０１５１】
「キメラ抗体」は、１つの種、例えばヒトなどに由来するフレームワーク残基と、別の種、例えばマウスなどに由来するＣＤＲ（一般に、抗原結合を付与する）を有する。特定の好ましい実施形態では、本明細書において意図されているＣＡＲは、キメラ抗体またはその抗原結合性断片である抗原特異的結合性ドメインを含む。
【０１５２】
好ましい実施形態では、抗体は、ヒトＢＣＭＡポリペプチドに特異的に結合するヒト化抗体（ヒト化モノクローナル抗体など）またはその断片である。「ヒト化」抗体は、ヒトフレームワーク領域および非ヒト（例えば、マウス、ラットまたは合成）免疫グロブリン由来の１個または複数のＣＤＲを含む免疫グロブリンである。ＣＤＲを提供する非ヒト免疫グロブリンは、「ドナー」と命名され、フレームワークを提供するヒト免疫グロブリンは、「アクセプター」と命名される。一実施形態では、ＣＤＲは全て、ヒト化免疫グロブリンにおけるドナー免疫グロブリン由来である。定常領域が存在する必要はないが、存在する場合、ヒト免疫グロブリン定常領域と実質的に同一、すなわち、少なくとも約８５〜９０％、例えば約９５％またはそれ超同一でなければならない。したがって、おそらくＣＤＲを除くヒト化免疫グロブリンの全部分は、天然ヒト免疫グロブリン配列の対応する部分と実質的に同一である。ヒト化または他のモノクローナル抗体は、抗原結合または他の免疫グロブリン機能に実質的な影響がない追加的な保存的アミノ酸置換を有することができる。ヒト化抗体は、遺伝子工学によって構築することができる（例えば、米国特許第５，５８５，０８９号を参照）。
【０１５３】
特定の実施形態では、ヒト化抗ＢＣＭＡ抗体またはその抗原結合性断片として、これらに限定されないが、ラクダＩｇ（ラクダ科動物抗体（ＶＨＨ））、Ｉｇ  ＮＡＲ、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）’２断片、Ｆ（ａｂ）’３断片、Ｆｖ、単鎖Ｆｖ抗体（「ｓｃＦｖ」）、ビス−ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ジスルフィド安定化Ｆｖタンパク質（「ｄｓＦｖ」）および単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ、ナノボディ）が挙げられる。
【０１５４】
「ラクダＩｇ」または「ラクダ科動物ＶＨＨ」とは、本明細書で使用される場合、重鎖抗体の最小の公知の抗原結合単位を指す（Ｋｏｃｈ−Ｎｏｌｔｅら、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．、２１巻：３４９０〜３４９８頁（２００７年））。「重鎖抗体」または「ラクダ科動物抗体」とは、ＶＨドメインを２つ含有し、軽鎖を含有しない抗体を指す（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  Ｌ．ら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３１巻：２５〜３８頁（１９９９年）；ＷＯ９４／０４６７８；ＷＯ９４／２５５９１；米国特許第６，００５，０７９号）。
【０１５５】
「ＩｇＮＡＲ」または「免疫グロブリン新抗原受容体（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｎｅｗ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）」は、１個の可変新抗原受容体（ＶＮＡＲ）ドメインおよび５個の定常新抗原受容体（ＣＮＡＲ）ドメインのホモ二量体からなるサメ免疫レパートリー由来の抗体のクラスを指す。ＩｇＮＡＲは、最小の公知の免疫グロブリンに基づくタンパク質足場の一部を表し、高度に安定的であり、効率的な結合特徴を保有する。固有の安定性は、（ｉ）マウス抗体に見出される従来の抗体ＶＨおよびＶＬドメインと比較して相当な数の荷電および親水性表面露出残基を呈する根底にあるＩｇ足場；ならびに（ｉｉ）ループ間ジスルフィド架橋およびループ内水素結合のパターンを含む相補性決定領域（ＣＤＲ）ループにおける安定化構造特色の両方に起因し得る。
【０１５６】
抗体のパパイン消化は、それぞれ単一の抗原結合部位を有する「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２個の同一抗原結合性断片と、名称が容易に結晶化するその能力を反映している、残りの「Ｆｃ」断片とを産生する。ペプシン処理は、２個の抗原結合性部位を有し、依然として、抗原を架橋することができるＦ（ａｂ’）２断片を生じる。
【０１５７】
「Ｆｖ」は、完全抗原結合部位を含有する最小抗体断片である。一実施形態では、二鎖Ｆｖ種は、緊密に非共有結合的に会合した１個の重鎖および１個の軽鎖可変ドメインの二量体からなる。単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）種において、１個の重鎖および１個の軽鎖可変ドメインは、二鎖Ｆｖ種のものに類似した「二量体」構造において軽鎖および重鎖が会合できるように、可撓性ペプチドリンカーによって共有結合により連結され得る。この構成において、各可変ドメインの３個の超可変領域（ＨＶＲ）が相互作用して、ＶＨ−ＶＬ二量体の表面上に抗原結合部位を画定する。まとめると、６個のＨＶＲが、抗体に抗原結合特異性を付与する。しかし、単一の可変ドメイン（または抗原に特異的な３個のＨＶＲのみを含むＦｖの半分）であっても、全体的な結合部位よりも低い親和性ではあるが、抗原を認識および結合する能力を有する。
【０１５８】
Ｆａｂ断片は、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含有し、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）も含有する。Ｆａｂ’断片は、Ｆａｂ断片とは、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端において抗体ヒンジ領域由来の１つまたは複数のシステインを含めた数個の残基が付加されていることによって異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、本明細書では、定常ドメインのシステイン残基（複数可）が遊離のチオール基を有するＦａｂ’に対する名称である。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、元々、間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片の対として作製された。抗体断片の他の化学的カップリングも公知である。
【０１５９】
「ダイアボディ」という用語は、２つの抗原結合性部位を有する抗体断片を指し、この断片は、同じポリペプチド鎖内で接続した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）（ＶＨ−ＶＬ）を含む。同じ鎖上の２つのドメイン間での対形成が可能になるには短すぎるリンカーを使用することにより、ドメインは、強制的に別の鎖の相補的なドメインと対形成し、２つの抗原結合性部位が創出される。ダイアボディは二価または二特異性であってよい。ダイアボディは、例えば、ＥＰ４０４，０９７；ＷＯ１９９３／０１１６１；Ｈｕｄｓｏｎら、Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  ９巻：１２９〜１３４頁（２００３年）；およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９０巻：６４４４〜６４４８頁（１９９３年）においてより詳細に記載されている。トリアボディおよびテトラボディもＨｕｄｓｏｎら、Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  ９巻：１２９〜１３４頁（２００３年）に記載されている。
【０１６０】
「単一ドメイン抗体」または「ｓｄＡｂ」または「ナノボディ」とは、抗体重鎖の可変領域（ＶＨドメイン）または抗体軽鎖の可変領域（ＶＬドメイン）からなる抗体断片を指す（Ｈｏｌｔ，  Ｌ．ら、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２１巻（１１号）：４８４〜４９０頁）。
【０１６１】
「単鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含み、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖内にいずれかの方向で存在する（例えば、ＶＬ−ＶＨまたはＶＨ−ＶＬ）。一般に、ｓｃＦｖポリペプチドは、ＶＨドメインとＶＬドメインの間にポリペプチドリンカーをさらに含み、それにより、ｓｃＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成することが可能になる。ｓｃＦｖの概説については、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｅｎ、Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、１１３巻、ＲｏｓｅｎｂｕｒｇおよびＭｏｏｒｅ編、（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９４年）、２６９〜３１５頁を参照されたい。
【０１６２】
好ましい実施形態では、本明細書において意図されているＣＡＲは、ｓｃＦｖであり、マウス、ヒトまたはヒト化ｓｃＦｖであり得る抗原特異的結合性ドメインを含む。単鎖抗体は、所望の標的に特異的なハイブリドーマのＶ領域遺伝子からクローニングすることができる。このようなハイブリドーマの産生は、慣例的なものとなっている。可変領域重鎖（ＶＨ）および可変領域軽鎖（ＶＬ）のクローニングに使用することができる技法は、例えば、Ｏｒｌａｎｄｉら、ＰＮＡＳ、１９８９年；８６巻：３８３３〜３８３７頁に記載されている。
【０１６３】
特定の実施形態では、抗原特異的結合性ドメインは、ヒトＢＣＭＡポリペプチドに結合するヒト化ｓｃＦｖである。本明細書において意図されている抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲの構築に適した可変重鎖の実例として、これらに限定されないが、配列番号１０〜１４に表記されているアミノ酸配列が挙げられる。本明細書において意図されている抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲの構築に適した可変軽鎖の実例として、これらに限定されないが、配列番号７〜９に表記されているアミノ酸配列が挙げられる。
【０１６４】
例示的なヒト化抗ＢＣＭＡ特異的結合性ドメインは、少なくとも１個のヒトフレームワーク領域を含むＢＣＭＡに特異的な免疫グロブリン可変領域である。「ヒトフレームワーク領域」は、ヒト免疫グロブリン可変領域の野生型（すなわち、天然に存在する）フレームワーク領域、領域におけるアミノ酸の約５０％未満（例えば、好ましくは約４５％、４０％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％または１％未満）が欠失もしくは置換された（例えば、対応する位置に非ヒト免疫グロブリンフレームワーク領域の１個または複数のアミノ酸残基を有する）ヒト免疫グロブリン可変領域の変更されたフレームワーク領域、または領域におけるアミノ酸の約５０％未満（例えば、４５％、４０％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％または５％未満）が欠失もしくは置換された（例えば、露出した残基の位置における、および／または対応する位置にヒト免疫グロブリンフレームワーク領域の１個もしくは複数のアミノ酸残基を有する）非ヒト免疫グロブリン可変領域の変更されたフレームワーク領域（一態様では、免疫原性が低下されるように）を指す。
【０１６５】
ある特定の実施形態では、ヒトフレームワーク領域は、ヒト免疫グロブリン可変領域の野生型フレームワーク領域である。ある特定の他の実施形態では、ヒトフレームワーク領域は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれを超える位置にアミノ酸欠失または置換を有するヒト免疫グロブリン可変領域の変更されたフレームワーク領域である。他の実施形態では、ヒトフレームワーク領域は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれを超える位置にアミノ酸欠失または置換を有する非ヒト免疫グロブリン可変領域の変更されたフレームワーク領域である。
【０１６６】
特定の実施形態では、ＢＣＭＡ特異的結合性ドメインは、ヒト軽鎖ＦＲ１、ヒト重鎖ＦＲ１、ヒト軽鎖ＦＲ２、ヒト重鎖ＦＲ２、ヒト軽鎖ＦＲ３、ヒト重鎖ＦＲ３、ヒト軽鎖ＦＲ４およびヒト重鎖ＦＲ４から選択される少なくとも１、２、３、４、５、６、７または８個のヒトフレームワーク領域（ＦＲ）を含む。
【０１６７】
ＢＣＭＡ特異的結合性ドメインに存在し得るヒトＦＲは、本明細書に提供される例示的なＦＲのバリアントも含み、この例示的なＦＲの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれを超えるアミノ酸は、置換または欠失されている。
【０１６８】
ある特定の実施形態では、ヒト化抗ＢＣＭＡ特異的結合性ドメインは、（ａ）ヒト軽鎖ＦＲ１、ヒト軽鎖ＦＲ２、ヒト軽鎖ＦＲ３およびヒト軽鎖ＦＲ４を含むヒト化軽鎖可変領域ならびに（ｂ）ヒト重鎖ＦＲ１、ヒト重鎖ＦＲ２、ヒト重鎖ＦＲ３およびヒト重鎖ＦＲ４を含むヒト化重鎖可変領域を含む。
【０１６９】
本明細書に提供されるＢＣＭＡ特異的結合性ドメインは、１、２、３、４、５または６個のＣＤＲも含む。このようなＣＤＲは、軽鎖のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３ならびに重鎖のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３から選択される、非ヒトＣＤＲまたは変更された非ヒトＣＤＲであってもよい。ある特定の実施形態では、ＢＣＭＡ特異的結合性ドメインは、（ａ）軽鎖ＣＤＲＬ１、軽鎖ＣＤＲＬ２および軽鎖ＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域ならびに（ｂ）重鎖ＣＤＲＨ１、重鎖ＣＤＲＨ２および重鎖ＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域を含む。
【０１７０】
２．リンカー
ある特定の実施形態では、本明細書において意図されているＣＡＲは、例えば、分子の適切なスペーシングおよびコンホメーションのために付加された種々のドメインの間にリンカー残基を含むことができる。特定の実施形態では、リンカーは、可変領域連結配列である。「可変領域連結配列」は、ＶＨおよびＶＬドメインを接続するアミノ酸配列であり、得られるポリペプチドが、同じ軽鎖および重鎖可変領域を含む抗体と同じ標的分子に対する特異的な結合親和性を保持することができるように、２個のサブ結合性ドメインの相互作用と適合性のスペーサー機能を提供する。本明細書において意図されているＣＡＲは、１、２、３、４もしくは５個またはそれを超えるリンカーを含むことができる。特定の実施形態では、リンカーの長さは、約１〜約２５アミノ酸、約５〜約２０アミノ酸もしくは約１０〜約２０アミノ酸、または間に入る任意のアミノ酸の長さである。一部の実施形態では、リンカーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５またはそれを超えるアミノ酸長である。
【０１７１】
リンカーの実例としては、グリシンポリマー（Ｇ）ｎ；グリシン−セリンポリマー（Ｇ１−５Ｓ１−５）ｎ（式中、ｎは、少なくとも１、２、３、４、または５の整数である）；グリシン−アラニンポリマー；アラニン−セリンポリマー；および当技術分野で公知の他の柔軟なリンカーが挙げられる。グリシンおよびグリシン−セリンポリマーは、比較的構造化されておらず、したがって、本明細書に記載のＣＡＲなどの融合タンパク質のドメイン間の中性テザーとして機能することが可能であり得る。グリシンはアラニンに対してさえ、それよりも有意に多くｐｈｉ−ｐｓｉ空間に近づき、また、側鎖が長い残基よりも制限がはるかに少ない（Ｓｃｈｅｒａｇａ、Ｒｅｖ．  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｅｍ．  １１１７３〜１４２頁（１９９２年）を参照されたい）。特定の実施形態では、ＣＡＲの設計には、全体的にまたは部分的に柔軟であるリンカーを含めることができ、したがって、リンカーは、所望のＣＡＲ構造をもたらすために、柔軟なリンカーならびにより柔軟性の低い構造を付与する１つまたは複数の部分を含んでよいことが当業者には認識されよう。
【０１７２】
他の例示的なリンカーとしては、これらに限定されないが、以下のアミノ酸配列：ＧＧＧ；ＤＧＧＧＳ（配列番号４６）；ＴＧＥＫＰ（配列番号４７）（例えば、Ｌｉｕら、ＰＮＡＳ  ５５２５〜５５３０頁（１９９７年）を参照されたい）；ＧＧＲＲ（配列番号４８）（Ｐｏｍｅｒａｎｔｚら、１９９５年、上記）；（ＧＧＧＧＳ）ｎ（式中、＝１、２、３、４または５）（配列番号４９）（Ｋｉｍら、ＰＮＡＳ  ９３巻、１１５６〜１１６０頁（１９９６年）；ＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＶＤ（配列番号５０）（Ｃｈａｕｄｈａｒｙら、１９９０年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ８７巻：１０６６〜１０７０頁）；ＫＥＳＧＳＶＳＳＥＱＬＡＱＦＲＳＬＤ（配列番号５１）（Ｂｉｒｄら、１９８８年、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２巻：４２３〜４２６頁）、ＧＧＲＲＧＧＧＳ（配列番号５２）；ＬＲＱＲＤＧＥＲＰ（配列番号５３）；ＬＲＱＫＤＧＧＧＳＥＲＰ（配列番号５４）；ＬＲＱＫｄ（ＧＧＧＳ）２ＥＲＰ（配列番号５５）が挙げられる。あるいは、柔軟なリンカーは、ＤＮＡ結合性部位とペプチド自体の両方をモデリングすることが可能なコンピュータプログラムを使用して（ＤｅｓｊａｒｌａｉｓおよびＢｅｒｇ、ＰＮＡＳ  ９０巻：２２５６〜２２６０頁（１９９３年）、ＰＮＡＳ  ９１巻：１１０９９〜１１１０３頁（１９９４年）、またはファージディスプレイ法によって合理的に設計することができる。一実施形態では、リンカーは、次のアミノ酸配列を含む：ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ（配列番号５６）（Ｃｏｏｐｅｒら、Ｂｌｏｏｄ、１０１巻（４号）：１６３７〜１６４４頁（２００３年））。
【０１７３】
３．スペーサードメイン
特定の実施形態では、ＣＡＲの結合性ドメインの後ろに、１つまたは複数の「スペーサードメイン」が続き、これは、抗原結合性ドメインをエフェクター細胞表面から離して適切な細胞間接触、抗原結合および活性化を可能にする領域を指す（Ｐａｔｅｌら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、１９９９年；６巻：４１２〜４１９頁）。ヒンジドメインは、天然、合成、半合成、または組換え供給源のいずれかに由来するものであってもよい。ある特定の実施形態では、スペーサードメインは、これらに限定されないが、１つまたは複数の重鎖定常領域、例えば、ＣＨ２およびＣＨ３を含めた、免疫グロブリンの部分である。スペーサードメインは、天然に存在する免疫グロブリンヒンジ領域または変更された免疫グロブリンヒンジ領域のアミノ酸配列を含んでよい。
【０１７４】
一実施形態では、スペーサードメインは、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４のＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含む。
【０１７５】
４．ヒンジドメイン
ＣＡＲの結合性ドメインの後ろには、一般に、１つまたは複数の「ヒンジドメイン」が続き、これは、抗原結合性ドメインをエフェクター細胞表面から離して位置づけ適切な細胞間接触、抗原結合および活性化を可能にすることにおいて役割を果たす。ＣＡＲは、一般に、結合性ドメインと膜貫通ドメイン（ＴＭ）の間に１つまたは複数のヒンジドメインを含む。ヒンジドメインは、天然、合成、半合成、または組換え供給源のいずれかに由来するものであってもよい。ヒンジドメインは、天然に存在する免疫グロブリンヒンジ領域または変更された免疫グロブリンヒンジ領域のアミノ酸配列を含んでよい。
【０１７６】
「変更されたヒンジ領域」は、（ａ）最大３０％のアミノ酸変化（例えば、最大２５％、２０％、１５％、１０％または５％のアミノ酸置換または欠失）を有する天然に存在するヒンジ領域、（ｂ）最大３０％のアミノ酸変化（例えば、最大２５％、２０％、１５％、１０％または５％のアミノ酸置換または欠失）を有する少なくとも１０アミノ酸（例えば、少なくとも１２、１３、１４または１５アミノ酸）の長さである天然に存在するヒンジ領域の部分、または（ｃ）コアヒンジ領域（４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４もしくは１５、または少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４もしくは１５アミノ酸の長さであり得る）を含む天然に存在するヒンジ領域の部分を指す。ある特定の実施形態では、天然に存在する免疫グロブリンヒンジ領域における１個または複数のシステイン残基は、１個または複数の他のアミノ酸残基（例えば、１個または複数のセリン残基）によって置換されていてよい。変更された免疫グロブリンヒンジ領域は、それに代えてまたはそれに加えて、別のアミノ酸残基（例えば、セリン残基）によって置換された野生型免疫グロブリンヒンジ領域のプロリン残基を有することができる。
【０１７７】
本明細書に記載されているＣＡＲにおける使用に適した他の例示的なヒンジドメインは、ＣＤ８α、ＣＤ４、ＣＤ２８、ＰＤ１、ＣＤ１５２およびＣＤ７など、１型膜タンパク質の細胞外領域に由来するヒンジ領域を含み、これは、これらの分子由来の野生型ヒンジ領域であっても、変更されていてもよい。別の実施形態では、ヒンジドメインは、ＰＤ１、ＣＤ１５２またはＣＤ８αヒンジ領域を含む。
【０１７８】
５．膜貫通（ＴＭ）ドメイン
「膜貫通ドメイン」は、細胞外結合部分および細胞内シグナル伝達ドメインを融合し、免疫エフェクター細胞の細胞膜にＣＡＲを繋留するＣＡＲの部分である。ＴＭドメインは、天然、合成、半合成または組換え供給源のいずれかに由来することができる。ＴＭドメインは、Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータまたはゼータ鎖、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４およびＰＤ１に由来する（すなわち、その少なくとも膜貫通領域（複数可）を含む）ことができる。特定の実施形態では、ＴＭドメインは、合成であり、ロイシンおよびバリンなど、疎水性残基を主に含む。
【０１７９】
一実施形態では、本明細書において意図されているＣＡＲは、ＰＤ１、ＣＤ１５２またはＣＤ８αに由来するＴＭドメインを含む。別の実施形態では、本明細書において意図されているＣＡＲは、ＰＤ１、ＣＤ１５２またはＣＤ８αに由来するＴＭドメインと、ＣＡＲのＴＭドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを連結する、好ましくは、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０アミノ酸の間の長さの短いオリゴまたはポリペプチドリンカーとを含む。グリシン−セリンに基づくリンカーは、特に適したリンカーを提供する。
【０１８０】
６．細胞内シグナル伝達ドメイン
特定の実施形態では、本明細書において意図されているＣＡＲは、細胞内シグナル伝達ドメインを含む。「細胞内シグナル伝達ドメイン」は、ヒトＢＣＭＡポリペプチドへの有効な抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ結合のメッセージを免疫エフェクター細胞の内部へと伝達して、エフェクター細胞機能、例えば、活性化、サイトカイン産生、増殖およびＣＡＲが結合した標的細胞への細胞傷害性因子の放出を含む細胞傷害活性、または細胞外ＣＡＲドメインへの抗原結合により誘発される他の細胞応答を誘発することに関与するＣＡＲの一部を指す。
【０１８１】
用語「エフェクター機能」は、免疫エフェクター細胞の特殊化された機能を指す。例えば、Ｔ細胞のエフェクター機能は、細胞溶解活性またはサイトカインの分泌を含む活性の補助となり得る。よって、用語「細胞内シグナル伝達ドメイン」は、エフェクター機能シグナルを伝達し、特殊化された機能を実行するように細胞を導くタンパク質の部分を指す。通常、細胞内シグナル伝達ドメイン全体を用いることができるが、多くの場合、ドメイン全体を使用する必要はない。細胞内シグナル伝達ドメインの短縮された部分が使用される程度まで、エフェクター機能シグナルを伝達する限りにおいて、ドメイン全体の代わりにこのような短縮された部分を使用することができる。用語、細胞内シグナル伝達ドメインは、エフェクター機能シグナルの伝達に十分な、細胞内シグナル伝達ドメインの任意の短縮された部分を含むことを意味する。
【０１８２】
ＴＣＲ単独によって生成されるシグナルはＴ細胞の完全な活性化に不十分であること、および二次または共刺激シグナルも必要であることが公知である。したがって、Ｔ細胞の活性化は、２つの別個のクラスの細胞内シグナル伝達ドメイン：ＴＣＲ（例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体）によって抗原依存的一次活性化を開始する一次シグナル伝達ドメインと、抗原非依存的に作用して二次または共刺激シグナルをもたらす共刺激シグナル伝達ドメインとによって媒介されるということができる。好ましい実施形態では、本明細書において意図されているＣＡＲは、１つまたは複数の「共刺激シグナル伝達ドメイン」および「一次シグナル伝達ドメイン」を含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
【０１８３】
一次シグナル伝達ドメインは、ＴＣＲ複合体の一次活性化を刺激性に、または阻害性に調節する。刺激性に作用する一次シグナル伝達ドメインは、免疫受容活性化チロシンモチーフ（ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｂａｓｅｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｍｏｔｉｆ）またはＩＴＡＭとして公知であるシグナル伝達モチーフを含有してよい。
【０１８４】
本発明において特に使用される、一次シグナル伝達ドメインを含有するＩＴＡＭの実例としては、ＴＣＲζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、およびＣＤ６６ｄに由来するものが挙げられる。特定の好ましい実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインおよび１つまたは複数の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。細胞内一次シグナル伝達および共刺激シグナル伝達ドメインは、任意の順序でタンデムに膜貫通ドメインのカルボキシル末端と連結することができる。
【０１８５】
本明細書において意図されているＣＡＲは、ＣＡＲ受容体を発現するＴ細胞の有効性および増大を増強するための１個または複数の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。本明細書で使用される場合、用語「共刺激シグナル伝達ドメイン」または「共刺激ドメイン」は、共刺激分子の細胞内シグナル伝達ドメインを指す。共刺激分子は、抗原への結合の際のＴリンパ球の効率的な活性化および機能に必要とされる第２のシグナルをもたらす抗原受容体またはＦｃ受容体以外の細胞表面分子である。このような共刺激分子の実例として、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ１５０（ＳＬＡＭＦ１）、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ４）、ＣＤ２２３（ＬＡＧ３）、ＣＤ２７０（ＨＶＥＭ）、ＣＤ２７３（ＰＤ−Ｌ２）、ＣＤ２７４（ＰＤ−Ｌ１）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＤＡＰ１０、ＬＡＴ、ＮＫＤ２Ｃ  ＳＬＰ７６、ＴＲＩＭおよびＺＡＰ７０が挙げられる。一実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ２８、ＣＤ１３７およびＣＤ１３４からなる群より選択される１個または複数の共刺激シグナル伝達ドメインと、ＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインとを含む。
【０１８６】
別の実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ２８およびＣＤ１３７共刺激シグナル伝達ドメインと、ＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインとを含む。
【０１８７】
さらに別の実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ２８およびＣＤ１３４共刺激シグナル伝達ドメインと、ＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインとを含む。
【０１８８】
一実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ１３７およびＣＤ１３４共刺激シグナル伝達ドメインと、ＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインとを含む。
【０１８９】
一実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ１３７共刺激シグナル伝達ドメインと、ＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインとを含む。
【０１９０】
一実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ１３４共刺激シグナル伝達ドメインと、ＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインとを含む。
【０１９１】
一実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメインと、ＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインとを含む。
【０１９２】
特定の実施形態では、本明細書において意図されているＣＡＲは、Ｂ細胞において発現されるＢＣＭＡポリペプチドに特異的に結合するヒト化抗ＢＣＭＡ抗体またはその抗原結合性断片を含む。
【０１９３】
一実施形態では、ＣＡＲは、ＢＣＭＡポリペプチドに結合するヒト化抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖと；Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータまたはゼータ鎖、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４およびＰＤ１からなる群より選択されるポリペプチドに由来する膜貫通ドメインと；ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ１５０（ＳＬＡＭＦ１）、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ４）、ＣＤ２２３（ＬＡＧ３）、ＣＤ２７０（ＨＶＥＭ）、ＣＤ２７３（ＰＤ−Ｌ２）、ＣＤ２７４（ＰＤ−Ｌ１）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＤＡＰ１０、ＬＡＴ、ＮＫＤ２Ｃ  ＳＬＰ７６、ＴＲＩＭおよびＺＡＰ７０からなる群より選択される共刺激分子由来の１個または複数の細胞内共刺激シグナル伝達ドメインと；ＴＣＲζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂおよびＣＤ６６ｄ由来の一次シグナル伝達ドメインとを含む。
【０１９４】
一実施形態では、ＣＡＲは、ＢＣＭＡポリペプチドに結合するヒト化抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖと；ＩｇＧ１ヒンジ／ＣＨ２／ＣＨ３、ＩｇＧ４ヒンジ／ＣＨ２／ＣＨ３、ＰＤ１ヒンジ、ＣＤ１５２ヒンジおよびＣＤ８αヒンジからなる群より選択されるヒンジドメインと；Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータまたはゼータ鎖、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４およびＰＤ１からなる群より選択されるポリペプチドに由来する膜貫通ドメインと；ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ１５０（ＳＬＡＭＦ１）、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ４）、ＣＤ２２３（ＬＡＧ３）、ＣＤ２７０（ＨＶＥＭ）、ＣＤ２７３（ＰＤ−Ｌ２）、ＣＤ２７４（ＰＤ−Ｌ１）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＤＡＰ１０、ＬＡＴ、ＮＫＤ２Ｃ  ＳＬＰ７６、ＴＲＩＭおよびＺＡＰ７０からなる群より選択される共刺激分子由来の１個または複数の細胞内共刺激シグナル伝達ドメインと；ＴＣＲζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂおよびＣＤ６６ｄ由来の一次シグナル伝達ドメインとを含む。
【０１９５】
一実施形態では、ＣＡＲは、ＢＣＭＡポリペプチドに結合するヒト化抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖと；ＩｇＧ１ヒンジ／ＣＨ２／ＣＨ３、ＩｇＧ４ヒンジ／ＣＨ２／ＣＨ３、ＰＤ１ヒンジ、ＣＤ１５２ヒンジおよびＣＤ８αヒンジからなる群より選択されるヒンジドメインと；Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータまたはゼータ鎖、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４およびＰＤ１からなる群より選択されるポリペプチドに由来する膜貫通ドメインと；ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインにＴＭドメインを連結する、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０アミノ酸の間の長さの短いオリゴまたはポリペプチドリンカーと；ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ１５０（ＳＬＡＭＦ１）、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ４）、ＣＤ２２３（ＬＡＧ３）、ＣＤ２７０（ＨＶＥＭ）、ＣＤ２７３（ＰＤ−Ｌ２）、ＣＤ２７４（ＰＤ−Ｌ１）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＤＡＰ１０、ＬＡＴ、ＮＫＤ２Ｃ  ＳＬＰ７６、ＴＲＩＭおよびＺＡＰ７０からなる群より選択される共刺激分子由来の１個または複数の細胞内共刺激シグナル伝達ドメインと；ＴＣＲζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂおよびＣＤ６６ｄ由来の一次シグナル伝達ドメインとを含む。
【０１９６】
特定の実施形態では、ＣＡＲは、ＢＣＭＡポリペプチドに結合するヒト化抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖと；ＩｇＧ１ヒンジ／ＣＨ２／ＣＨ３ポリペプチドおよびＣＤ８αポリペプチドを含むヒンジドメインと；約３〜約１０アミノ酸のポリペプチドリンカーを含むＣＤ８α膜貫通ドメインと；ＣＤ１３７細胞内共刺激シグナル伝達ドメインと；ＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインとを含む。
【０１９７】
特定の実施形態では、ＣＡＲは、ＢＣＭＡポリペプチドに結合するヒト化抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖと；ＣＤ８αポリペプチドを含むヒンジドメインと；約３〜約１０アミノ酸のポリペプチドリンカーを含むＣＤ８α膜貫通ドメインと；ＣＤ１３４細胞内共刺激シグナル伝達ドメインと；ＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインとを含む。
【０１９８】
特定の実施形態では、ＣＡＲは、ＢＣＭＡポリペプチドに結合するヒト化抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖと；ＣＤ８αポリペプチドを含むヒンジドメインと；約３〜約１０アミノ酸のポリペプチドリンカーを含むＣＤ８α膜貫通ドメインと；ＣＤ２８細胞内共刺激シグナル伝達ドメインと；ＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインとを含む。
【０１９９】
特定の実施形態では、ＣＡＲは、ＢＣＭＡポリペプチドに結合するヒト化抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖと；ＰＤ１ヒンジ、ポリペプチドを含むヒンジドメインと；約３〜約１０アミノ酸のポリペプチドリンカーを含むＰＤ１またはＣＤ１５２膜貫通ドメインと；ＣＤ１３７細胞内共刺激シグナル伝達ドメインと；ＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインとを含む。
【０２００】
特定の実施形態では、ＣＡＲは、ＢＣＭＡポリペプチドに結合するヒト化抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖと；ＰＤ１ヒンジ、ポリペプチドを含むヒンジドメインと；約３〜約１０アミノ酸のポリペプチドリンカーを含むＰＤ１またはＣＤ１５２膜貫通ドメインと；ＣＤ１３４細胞内共刺激シグナル伝達ドメインと；ＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインとを含む。
【０２０１】
特定の実施形態では、ＣＡＲは、ＢＣＭＡポリペプチドに結合するヒト化抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖと；ＰＤ１ヒンジ、ポリペプチドを含むヒンジドメインと；約３〜約１０アミノ酸のポリペプチドリンカーを含むＰＤ１またはＣＤ１５２膜貫通ドメインと；ＣＤ２８細胞内共刺激シグナル伝達ドメインと；ＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインとを含む。
【０２０２】
特定の実施形態では、ＣＡＲは、ＢＣＭＡポリペプチドに結合するヒト化抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖと；ＣＤ１５２ヒンジ、ポリペプチドを含むヒンジドメインと；約３〜約１０アミノ酸のポリペプチドリンカーを含むＰＤ１またはＣＤ１５２膜貫通ドメインと；ＣＤ１３７細胞内共刺激シグナル伝達ドメインと；ＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインとを含む。
【０２０３】
特定の実施形態では、ＣＡＲは、ＢＣＭＡポリペプチドに結合するヒト化抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖと；ＣＤ１５２ヒンジ、ポリペプチドを含むヒンジドメインと；約３〜約１０アミノ酸のポリペプチドリンカーを含むＰＤ１またはＣＤ１５２膜貫通ドメインと；ＣＤ１３４細胞内共刺激シグナル伝達ドメインと；ＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインとを含む。
【０２０４】
特定の実施形態では、ＣＡＲは、ＢＣＭＡポリペプチドに結合するヒト化抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖと；ＣＤ１５２ヒンジ、ポリペプチドを含むヒンジドメインと；約３〜約１０アミノ酸のポリペプチドリンカーを含むＰＤ１またはＣＤ１５２膜貫通ドメインと；ＣＤ２８細胞内共刺激シグナル伝達ドメインと；ＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインとを含む。
【０２０５】
さらに、本明細書において意図されているＣＡＲの設計は、非改変Ｔ細胞または他のＣＡＲを発現するように改変されたＴ細胞と比較して、ＣＡＲを発現するＴ細胞における改善された増大、長期持続性および細胞傷害性特性を可能にする。
【０２０６】
Ｄ．ポリペプチド
本発明は、一部には、ＣＡＲポリペプチドおよびその断片、これを含む細胞および組成物、ならびにポリペプチドを発現するベクターを意図する。好ましい実施形態では、配列番号１５〜２９、７１および７３のいずれか１つに表記されている１種または複数のＣＡＲを含むポリペプチドが提供される。
【０２０７】
「ポリペプチド」、「ポリペプチド断片」、「ペプチド」および「タンパク質」は、それとは反対のことが指示されていない限り、また、従来の意味に従って、すなわちアミノ酸の配列として、互換的に使用される。ポリペプチドは、特定の長さに限定されず、例えば、全長タンパク質配列または全長タンパク質の断片を含むことができ、ポリペプチドの翻訳後修飾、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化などと共に、天然に存在するものと天然に存在しないものの両方の当技術分野で公知の他の修飾を含むことができる。種々の実施形態では、本明細書において意図されているＣＡＲポリペプチドは、タンパク質のＮ末端にシグナル（またはリーダー）配列を含み、この配列はタンパク質の移入を翻訳と同時に（ｃｏ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｌｙ）または翻訳後に導く。本明細書に開示されているＣＡＲにおいて有用な適したシグナル配列の実例として、これらに限定されないが、ＩｇＧ１重鎖シグナルポリペプチド、ＣＤ８αシグナルポリペプチドまたはヒトＧＭ−ＣＳＦ受容体アルファシグナルポリペプチドが挙げられる。ポリペプチドは、様々な周知の組換えおよび／または合成技法のいずれかを使用して調製することができる。本明細書において意図されているポリペプチドは、本開示のＣＡＲ、または本明細書に開示されているＣＡＲの１個もしくは複数のアミノ酸からの欠失、それらへの付加、および／もしくはそれらの置換を有する配列を特に包含する。
【０２０８】
「単離されたペプチド」または「単離されたポリペプチド」などは、本明細書で使用される場合、細胞環境からの、および細胞の他の構成成分との関連からのペプチドまたはポリペプチド分子のｉｎ  ｖｉｔｒｏ単離および／または精製を指す、すなわち、これは、ｉｎ  ｖｉｖｏ物質と有意に関連していない。同様に、「単離された細胞」は、ｉｎ  ｖｉｖｏ組織または器官から得られた、細胞外マトリックスを実質的に含まない細胞を指す。
【０２０９】
ポリペプチドは、「ポリペプチドバリアント」を含む。ポリペプチドバリアントは、１個または複数の置換、欠失、付加および／または挿入において天然に存在するポリペプチドと異なり得る。このようなバリアントは、天然に存在するものであっても、例えば、上述のポリペプチド配列のうち１種または複数を改変することにより合成により生成してもよい。例えば、特定の実施形態では、ＣＡＲポリペプチドの結合性ドメイン、ヒンジ、ＴＭドメイン、共刺激シグナル伝達ドメインまたは一次シグナル伝達ドメインに１個または複数の置換、欠失、付加および／または挿入を導入することにより、ＣＡＲの結合親和性および／または他の生物学的特性を改善することが望ましい場合がある。好ましくは、本発明のポリペプチドは、それに対し少なくとも約６５％、７０％、７５％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％アミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０２１０】
ポリペプチドは、「ポリペプチド断片」を含む。ポリペプチド断片は、天然に存在するまたは組換えにより産生されたポリペプチドのアミノ末端欠失、カルボキシル末端欠失および／または内部欠失もしくは置換を有する単量体または多量体であり得るポリペプチドを指す。ある特定の実施形態では、ポリペプチド断片は、少なくとも５〜約５００アミノ酸長のアミノ酸鎖を含むことができる。ある特定の実施形態では、断片が、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００または４５０アミノ酸長であることが認められるであろう。特に有用なポリペプチド断片は、抗体の抗原結合性ドメインまたは断片を含む機能ドメインを含む。ヒト化抗ＢＣＭＡ抗体の場合、有用な断片として、これらに限定されないが、重鎖または軽鎖のＣＤＲ領域、ＣＤＲ３領域；重鎖または軽鎖の可変領域；２個のＣＤＲを含む抗体鎖または可変領域の部分；などが挙げられる。
【０２１１】
ポリペプチドはまた、ポリペプチドの合成、精製もしくは同定を容易にするため（例えば、ポリ−Ｈｉｓ）、またはポリペプチドの固体支持体への結合を増強するためのリンカーまたは他の配列とインフレームで融合することもでき、またはコンジュゲートすることもできる。
【０２１２】
上に記す通り、本発明のポリペプチドは、アミノ酸置換、欠失、短縮および挿入を含む種々の仕方で変更することができる。このような操作のための方法は、一般に当技術分野で公知である。例えば、参照ポリペプチドのアミノ酸配列バリアントは、ＤＮＡにおける変異によって調製することができる。変異誘発およびヌクレオチド配列変更のための方法は、当技術分野で周知である。例えば、Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ．８２巻：４８８〜４９２頁）、Ｋｕｎｋｅｌら（１９８７年、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ、１５４巻：３６７〜３８２頁）、米国特許第４，８７３，１９２号、Ｗａｔｓｏｎ，  Ｊ．  Ｄ．ら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅ、第４版、Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ，  Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，  Ｃａｌｉｆ．、１９８７年）およびそれらに引用されている参考文献を参照されたい。目的のタンパク質の生物学的活性に影響しない適切なアミノ酸置換に関するガイダンスは、Ｄａｙｈｏｆｆら（１９７８年）Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｎａｔｌ．  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｒｅｓ．  Ｆｏｕｎｄ．、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，  Ｄ．Ｃ．）のモデルに見出すことができる。
【０２１３】
ある特定の実施形態では、バリアントは、保存的置換を含有するであろう。「保存的置換」は、ペプチド化学の技術分野の当業者によって、ポリペプチドの二次構造および疎水性親水性指標性質が実質的に変化しないと予想されるように、あるアミノ酸が、同様の特性を有する別のアミノ酸の代わりになる置換である。改変は、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの構造において為すことができ、依然として、望ましい特徴を有するバリアントまたは誘導体ポリペプチドをコードする機能的な分子を得ることができる。等価な、またはさらには改善された本発明のバリアントポリペプチドを作製するようにポリペプチドのアミノ酸配列を変更することが望まれる場合、当業者は、例えば、表１に従った、例えば、コードＤＮＡ配列のコドンのうち１個または複数を変化させることができる。
【表１】
0006706244.tif 000002
【０２１４】
生物学的活性を消失させることなくいずれのアミノ酸残基を置換、挿入または欠失することができるかに関する決定におけるガイダンスは、ＤＮＡＳＴＡＲ（商標）ソフトウェアなど、当技術分野で周知のコンピュータプログラムを使用して見出すことができる。好ましくは、本明細書に開示されているタンパク質バリアントにおけるアミノ酸変化は、保存的アミノ酸変化、すなわち、同様に荷電したまたは荷電していないアミノ酸の置換である。保存的アミノ酸変化は、その側鎖に関連するアミノ酸ファミリーのうち１種の置換に関与する。天然に存在するアミノ酸は、一般に、４種のファミリーに分けられる：酸性（アスパラギン酸、グルタミン酸）、塩基性（リシン、アルギニン、ヒスチジン）、非極性（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）および非荷電極性（グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン）アミノ酸。フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンは、芳香族アミノ酸として一緒に分類される場合もある。ペプチドまたはタンパク質において、アミノ酸の適した保存的置換は、当業者に公知であり、一般に、得られる分子の生物学的活性を変更することなく為すことができる。当業者は、一般に、ポリペプチドの非必須領域における単一のアミノ酸置換が、生物学的活性を実質的に変更しないことを認識する（例えば、Ｗａｔｓｏｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅ、第４版、１９８７年、Ｔｈｅ  Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ  Ｐｕｂ．  Ｃｏ．、２２４頁を参照）。例示的な保存的置換は、その開示が参照により本明細書に組み込まれる、米国仮特許出願第６１／２４１，６４７号に記載されている。
【０２１５】
このような変化を為す際に、アミノ酸の疎水性親水性指数を考慮することができる。タンパク質における相互作用性生物学的機能の付与における疎水性親水性指標アミノ酸指数の重要性は、一般に、当技術分野で理解されている（ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ、１９８２年、参照により本明細書に組み込まれる）。各アミノ酸は、その疎水性および電荷特徴に基づいて疎水性親水性指数を割り当てられた（ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ、１９８２年）。これらの値は、イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／システイン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リシン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５）である。
【０２１６】
ある特定のアミノ酸を、同様の疎水性親水性指数またはスコアを有する他のアミノ酸によって置換し、依然として、同様の生物学的活性を有するタンパク質をもたらすことができる、すなわち、依然として、生物学的機能的に等価なタンパク質を得ることができることが当技術分野で公知である。このような変化を為す際に、その疎水性親水性指数が±２以内のアミノ酸の置換が好ましく、±１以内が特に好ましく、±０．５以内がさらにより特に好ましい。当技術分野において、同様のアミノ酸の置換を、親水性に基づいて有効に為すことができることも理解される。
【０２１７】
米国特許第４，５５４，１０１号に詳述される通り、次の親水性値がアミノ酸残基に割り当てられた：アルギニン（＋３．０）；リシン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；トリプトファン（−３．４）。アミノ酸を、同様の親水性値を有する別のアミノ酸の代わりに使用して、依然として、生物学的に等価な、特に免疫学的に等価なタンパク質を得ることができることが理解される。このような変化において、その親水性値が±２以内のアミノ酸の置換が好ましく、±１以内が特に好ましく、±０．５以内がさらにより特に好ましい。
【０２１８】
上に概要を述べる通り、アミノ酸置換は、アミノ酸側鎖置換基の相対的類似性、例えば、その疎水性、親水性、電荷、サイズなどに基づき得る。
【０２１９】
ポリペプチドバリアントは、グリコシル化された形態、他の分子との集合的コンジュゲート、および無関係の化学的部分（例えば、ペグ化分子）との共有結合コンジュゲートをさらに含む。共有結合バリアントは、当技術分野で公知の通り、アミノ酸の鎖内またはＮ末端もしくはＣ末端の残基に見いだされる基に官能基を連結することによって調製することができる。バリアントとしては、対立遺伝子バリアント、種バリアント、および変異タンパク質も挙げられる。タンパク質の機能活性に影響を及ぼさない領域の短縮または欠失もバリアントである。
【０２２０】
一実施形態では、２種またはそれ超のポリペプチドの発現が望まれる場合、それらをコードするポリヌクレオチド配列を、本明細書の他の箇所で論じられているＩＲＥＳ配列によって分離することができる。別の実施形態では、２種またはそれ超のポリペプチドを、１つまたは複数の自己切断性ポリペプチド配列を含む融合タンパク質として発現させることができる。
【０２２１】
本発明のポリペプチドは、融合ポリペプチドを含む。好ましい実施形態では、融合ポリペプチドおよび融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、例えば、ＣＡＲが提供される。融合ポリペプチドおよび融合タンパク質は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０個またはそれを超えるポリペプチドセグメントを有するポリペプチドを指す。融合ポリペプチドは、Ｃ末端からＣ末端、Ｎ末端からＮ末端またはＮ末端からＣ末端に連結することもできるが、典型的には、Ｃ末端からＮ末端に連結される。融合タンパク質のポリペプチドは、任意の順序または指定の順序であり得る。融合ポリペプチドの所望の転写活性が保存されるのであれば、融合ポリペプチドまたは融合タンパク質は、保存的に改変されたバリアント、多型バリアント、対立遺伝子、変異体、部分配列および種間ホモログを含むこともできる。融合ポリペプチドは、化学的合成方法もしくは２部分間の化学的連結により産生することができる、または一般に、他の標準技法を使用して調製することができる。融合ポリペプチドを含むライゲーションされたＤＮＡ配列は、本明細書の他の箇所で論じられている適切な転写または翻訳制御エレメントに作動可能に連結される。
【０２２２】
一実施形態では、融合パートナーは、ネイティブな組換えタンパク質よりも高収量でのタンパク質の発現を補助する配列（発現エンハンサー）を含む。他の融合パートナーは、タンパク質の溶解度が増加するように、またはタンパク質を所望の細胞内区画にターゲティングすることが可能になるように、または融合タンパク質の細胞膜を通る輸送が容易になるように、選択することができる。
【０２２３】
融合ポリペプチドは、本明細書に記載のポリペプチドドメインのそれぞれの間にポリペプチド切断シグナルをさらに含んでよい。さらに、ポリペプチド部位を任意のリンカーペプチド配列に入れることができる。例示的なポリペプチド切断シグナルは、プロテアーゼ切断部位、ヌクレアーゼ切断部位（例えば、希な制限酵素認識部位、自己切断性リボザイム認識部位）、および自己切断性ウイルスオリゴペプチドなどのポリペプチド切断認識部位を含む（ｄｅＦｅｌｉｐｅおよびＲｙａｎ、２００４年、Ｔｒａｆｆｉｃ、５巻（８号）；６１６〜２６頁を参照されたい）。
【０２２４】
適切なプロテアーゼ切断部位および自己切断性ペプチドは当業者に公知である（例えば、Ｒｙａｎら、１９９７年、Ｊ．  Ｇｅｎｅｒ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７８巻、６９９〜７２２頁；Ｓｃｙｍｃｚａｋら（２００４年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  ５巻、５８９〜５９４頁を参照されたい）。例示的なプロテアーゼ切断部位としては、これらに限定されないが、ポティウイルスＮＩａプロテアーゼ（例えば、タバコエッチ病ウイルスプロテアーゼ）、ポティウイルスＨＣプロテアーゼ、ポティウイルスＰ１（Ｐ３５）プロテアーゼ、ビオウイルス（ｂｙｏｖｉｒｕｓ）ＮＩａプロテアーゼ、ビオウイルス（ｂｙｏｖｉｒｕｓ）ＲＮＡ−２にコードされるプロテアーゼ、アフトウイルスＬプロテアーゼ、エンテロウイルス２Ａプロテアーゼ、ライノウイルス２Ａプロテアーゼ、ピコルナ３Ｃプロテアーゼ、コモウイルス２４Ｋプロテアーゼ、ネポウイルス２４Ｋプロテアーゼ、ＲＴＳＶ（イネツングロ球状ウイルス）３Ｃ様プロテアーゼ、ＰＹＶＦ（パースニップ黄斑ウイルス）３Ｃ様プロテアーゼ、ヘパリン、トロンビン、第Ｘａ因子およびエンテロキナーゼの切断部位が挙げられる。一実施形態では、切断ストリンジェンシーが高いことに起因して、ＴＥＶ（タバコエッチ病ウイルス）プロテアーゼ切断部位、例えば、ＥＸＸＹＸＱ（Ｇ／Ｓ）（配列番号５７）、例えば、ＥＮＬＹＦＱＧ（配列番号５８）およびＥＮＬＹＦＱＳ（配列番号５９）（式中、Ｘは任意のアミノ酸を表す）（ＴＥＶによる切断は、ＱとＧの間またはＱとＳの間で起こる）が好ましい。
【０２２５】
特定の実施形態では、自己切断性ペプチドは、ポティウイルスおよびカルジオウイルス２Ａペプチド、ＦＭＤＶ（口蹄疫ウイルス）、ウマ鼻炎Ａウイルス、Ｔｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａウイルスおよびブタテッショウウイルスから得られるポリペプチド配列を含む。
【０２２６】
ある特定の実施形態では、自己切断性ポリペプチド部位は、２Ａまたは２Ａ様部位、配列またはドメインを含む（Ｄｏｎｎｅｌｌｙら、２００１年、Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ．  ８２巻：１０２７〜１０４１頁）。
【表２】
0006706244.tif 000003
【０２２７】
好ましい実施形態では、本明細書において意図されているポリペプチドは、ＣＡＲポリペプチドを含む。
【０２２８】
Ｅ．ポリヌクレオチド
好ましい実施形態では、１種または複数のＣＡＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、例えば、配列番号３０〜４４、７０および７２が提供される。本明細書で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ＲＮＡ、ゲノムＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、プラス鎖ＲＮＡ（ＲＮＡ（＋））、マイナス鎖ＲＮＡ（ＲＮＡ（−））、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）または組換えＤＮＡを指す。ポリヌクレオチドは、一本鎖および二本鎖ポリヌクレオチドを含む。好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、本明細書に記載されている参照配列（例えば、配列表を参照）のいずれかに対し少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％配列同一性を有するポリヌクレオチドまたはバリアントを含み、典型的には、バリアントは、参照配列の少なくとも１種の生物学的活性を維持する。種々の例示的な実施形態では、本発明は、一部には、発現ベクター、ウイルスベクターおよび移入プラスミドを含むポリヌクレオチド、ならびにこれを含む組成物および細胞を意図する。
【０２２９】
特定の実施形態では、本発明により、少なくとも約５個、１０個、２５個、５０個、１００個、１５０個、２００個、２５０個、３００個、３５０個、４００個、５００個、１０００個、１２５０個、１５００個、１７５０個、または２０００個またはそれ超の本発明のポリペプチドの連続したアミノ酸残基、ならびに全ての中間の長さの本発明のポリペプチドの連続したアミノ酸残基をコードするポリヌクレオチドが提供される。「中間の長さ」とは、この文脈において、引用された値の間の任意の長さ、例えば、６、７、８、９など；１０１、１０２、１０３など；１５１、１５２、１５３など；２０１、２０２、２０３などを意味することが容易に理解されよう。
【０２３０】
本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチドバリアント」および「バリアント」などの用語は、参照ポリヌクレオチド配列に対して実質的な配列同一性を示すポリヌクレオチド、または下で定義されているストリンジェントな条件下で参照配列とハイブリダイズするポリヌクレオチドを指す。これらの用語は、参照ポリヌクレオチドと比較して、１つまたは複数のヌクレオチドが付加されているもしくは欠失している、または異なるヌクレオチドで置き換えられているポリヌクレオチドを包含する。この点について、参照ポリヌクレオチドに対して変異、付加、欠失および置換を含めたある特定の変更を行うことができ、それにより、変更されたポリヌクレオチドが参照ポリヌクレオチドの生物学的機能または活性を保持することは当技術分野においてよく理解されている。
【０２３１】
「配列同一性」または、例えば、「と５０％同一の配列」を含む記述は、本明細書で使用される場合、比較のウインドウにわたって、配列がヌクレオチドごとまたはアミノ酸ごとに同一である程度を指す。したがって、「配列同一性の百分率」は、最適にアラインされた２つの配列を比較のウインドウにわたって比較し、両方の配列に同一の核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｉ）または同一のアミノ酸残基（例えば、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、ＣｙｓおよびＭｅｔ）が存在する位置の数を決定してマッチする位置の数を得、マッチする位置の数を比較のウインドウ内の位置の総数（すなわち、ウインドウサイズ）で割り、その結果に１００を掛けて、配列同一性の百分率を得ることによって算出することができる。本明細書に記載の参照配列のいずれかに対して少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するヌクレオチドおよびポリペプチドが包含され、一般には、その場合、ポリペプチドバリアントは参照ポリペプチドの少なくとも１つの生物活性を維持する。
【０２３２】
２つまたはそれ超のポリヌクレオチドまたはポリペプチド間の配列の関係を記載するために使用される用語として、「参照配列」、「比較ウインドウ」、「配列同一性」、「配列同一性の百分率」、および「実質的な同一性」が挙げられる。「参照配列」は、ヌクレオチドおよびアミノ酸残基を含めて長さが少なくとも１２単量体単位であるが、１５〜１８単量体単位の頻度が高く、多くの場合には、少なくとも２５単量体単位である。２つのポリヌクレオチドはそれぞれ（１）２つのポリヌクレオチド間で類似した配列（すなわち、完全なポリヌクレオチド配列の一部のみ）、および（２）２つのポリヌクレオチド間で多岐にわたる配列を含み得るので、２つ（またはそれ超）のポリヌクレオチド間の配列の比較は、一般には、２つのポリヌクレオチドの配列を「比較ウインドウ」にわたって比較して、同定し、配列類似性の局所的な領域を比較することによって実施される。「比較ウインドウ」とは、配列を、２つの配列を最適にアラインした後に、同じ数の連続した位置の参照配列と比較する、少なくとも６カ所、通常は約５０〜約１００カ所、より通常は約１００〜約１５０カ所の連続した位置の概念的なセグメントを指す。比較ウインドウは、２つの配列を最適にアラインするために、参照配列（付加も欠失も含まない）と比較して約２０％またはそれ未満の付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含んでよい。比較ウインドウをアラインするための配列の最適なアラインメントは、アルゴリズム（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ７．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ  Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ））のコンピュータによる実行によって、または選択された種々の方法のいずれかによって生成される検査および最良のアラインメント（すなわち、比較ウインドウにわたって最も高い百分率相同性がもたらされる）によって行うことができる。例として、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９７年、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５巻：３３８９頁により開示されているプログラムのＢＬＡＳＴファミリーに対して参照を行うこともできる。配列解析に関する詳細な論述は、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ、１９９４〜１９９８年、１５章のＵｎｉｔ  １９．３に見いだすことができる。
【０２３３】
本明細書で使用される場合、「単離されたポリヌクレオチド」は、天然に存在する状態でこれに隣接する配列から精製されたポリヌクレオチド、例えば、ＤＮＡ断片に通常近接する配列から除去されたそのＤＮＡ断片を指す。「単離されたポリヌクレオチド」は、天然に存在しない、人の手によって作製された、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、組換えＤＮＡまたは他のポリヌクレオチドも指す。
【０２３４】
ポリヌクレオチドの配向性について説明する用語は、５’（通常は、遊離リン酸基を有するポリヌクレオチドの末端）および３’（通常は、遊離ヒドロキシル（ＯＨ）基を有するポリヌクレオチドの末端）を含む。ポリヌクレオチド配列は、５’から３’の配向性または３’から５’の配向性でアノテートすることができる。ＤＮＡおよびｍＲＮＡに関して、５’から３’の鎖は、その配列が、プレメッセンジャー（プレｍＲＮＡ）の配列と同一であるため［ＤＮＡにおけるチミン（Ｔ）に代わるＲＮＡにおけるウラシル（Ｕ）を除き］、「センス」、「プラス」または「コード」鎖と命名される。ＤＮＡおよびｍＲＮＡに関して、ＲＮＡポリメラーゼによって転写された鎖である相補的な３’から５’の鎖は、「鋳型」、「アンチセンス」、「マイナス」または「非コード」鎖と命名される。本明細書で使用される場合、用語「逆向き配向性」は、３’から５’の配向性で書かれた５’から３’の配列または５’から３’の配向性で書かれた３’から５’の配列を指す。
【０２３５】
用語「相補的」および「相補性」は、塩基対形成の法則によって関連付けられたポリヌクレオチド（すなわち、ヌクレオチドの配列）を指す。例えば、ＤＮＡ配列５’ＡＧＴＣＡＴＧ３’の相補鎖は、３’ＴＣＡＧＴＡＣ５’である。後者の配列は、多くの場合、５’末端を左に、３’末端を右にした逆向き相補体として、５’ＣＡＴＧＡＣＴ３’と書かれる。その逆向き相補体に等しい配列は、パリンドローム配列と言われる。相補性は、塩基対形成の法則に従って核酸塩基の一部のみがマッチした「部分的」であってもよい。あるいは、核酸の間に「完全」または「全体」相補性が存在してもよい。
【０２３６】
さらに、当業者であれば、遺伝暗号の縮重の結果として、本明細書に記載されているポリペプチドまたはその断片もしくはバリアントをコードする多くのヌクレオチド配列が存在することを認めるであろう。これらのポリヌクレオチドの一部は、任意のネイティブ遺伝子のヌクレオチド配列に対する最小の相同性を有する。にもかかわらず、コドン使用の差のために変動するポリヌクレオチド、例えば、ヒトおよび／または霊長類コドン選択に最適化されたポリヌクレオチドが、本発明によって特に意図される。さらに、本明細書に提供されるポリヌクレオチド配列を含む遺伝子の対立遺伝子を使用することもできる。対立遺伝子は、ヌクレオチドの欠失、付加および／または置換など、１個または複数の変異の結果として変更された内在性遺伝子である。
【０２３７】
本明細書で使用される用語「核酸カセット」は、ＲＮＡおよびその後にタンパク質を発現することができるベクター内の遺伝的配列を指す。核酸カセットは、目的の遺伝子、例えば、ＣＡＲを含有する。カセットにおける核酸をＲＮＡへと転写し、必要であれば、タンパク質またはポリペプチドに翻訳し、形質転換細胞における活性に必要とされる適切な翻訳後修飾に付し、適切な細胞内区画へと標的化または細胞外区画に分泌することにより生物学的活性に適切な区画へとトランスロケーションすることができるように、核酸カセットは、ベクター内に位置的および配列的に配向される。好ましくは、カセットは、その３’および５’端を、ベクターへの容易な挿入に適合させており、例えば、各端に制限エンドヌクレアーゼ部位を有する。本発明の好ましい実施形態では、核酸カセットは、Ｂ細胞悪性疾患の治療に使用されるキメラ抗原受容体の配列を含有する。カセットを除去し、単一ユニットとしてプラスミドまたはウイルスベクターに挿入することができる。
【０２３８】
特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、少なくとも１種の目的のポリヌクレオチドを含む。本明細書で使用される場合、用語「目的のポリヌクレオチド」は、発現されることが望まれる発現ベクターに挿入されるポリペプチド（すなわち、目的のポリペプチド）をコードするポリヌクレオチドを指す。ベクターは、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０種の目的のポリヌクレオチドを含むことができる。ある特定の実施形態では、目的のポリヌクレオチドは、疾患または障害の治療または予防における治療効果をもたらすポリペプチドをコードする。目的のポリヌクレオチドおよびこれにコードされるポリペプチドは、野生型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドならびにその機能バリアントおよび断片の両方を含む。特定の実施形態では、機能バリアントは、対応する野生型参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列に対し、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％の同一性を有する。ある特定の実施形態では、機能バリアントまたは断片は、対応する野生型ポリペプチドの生物学的活性の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％を有する。
【０２３９】
一実施形態では、目的のポリヌクレオチドは、ポリペプチドをコードせず、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ、リボザイムまたは他の阻害性ＲＮＡを転写するための鋳型として機能する。種々の他の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＣＡＲをコードする目的のポリヌクレオチド、ならびにｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡおよびリボザイムが挙げられるがこれらに限定されない阻害性核酸配列が挙げられるがこれに限定されない、１種または複数の追加的な目的のポリヌクレオチドを含む。
【０２４０】
本明細書で使用される場合、用語「ｓｉＲＮＡ」または「低分子干渉ＲＮＡ」は、動物における配列特異的転写後遺伝子サイレンシング、翻訳阻害、転写阻害またはエピジェネティックＲＮＡｉのプロセスを媒介する短いポリヌクレオチド配列を指す（Ｚａｍｏｒｅら、２０００年、Ｃｅｌｌ、１０１巻、２５〜３３頁；Ｆｉｒｅら、１９９８年、Ｎａｔｕｒｅ、３９１巻、８０６頁；Ｈａｍｉｌｔｏｎら、１９９９年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８６巻、９５０〜９５１頁；Ｌｉｎら、１９９９年、Ｎａｔｕｒｅ、４０２巻、１２８〜１２９頁；Ｓｈａｒｐ、１９９９年、Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖ．、１３巻、１３９〜１４１頁；およびＳｔｒａｕｓｓ、１９９９年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８６巻、８８６頁）。ある特定の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、同数のヌクレオシドを有する第１の鎖および第２の鎖を含む；しかし、第１および第２の鎖は、第１および第２の鎖における２個の末端ヌクレオシドが、相補鎖における残基と対形成しないように相殺されている（ｏｆｆｓｅｔ）。ある特定の事例では、対形成しない２個のヌクレオシドは、チミジン残基である。ｓｉＲＮＡは、標的遺伝子に十分な相同性の領域を含むべきであり、ｓｉＲＮＡまたはその断片が、標的遺伝子の下方調節を媒介することができるように、ヌクレオチドの観点から十分な長さであるべきである。よって、ｓｉＲＮＡは、標的ＲＮＡに対し少なくとも部分的に相補的である領域を含む。ｓｉＲＮＡおよび標的の間に完璧な相補性が存在する必要はないが、一致は、ｓｉＲＮＡまたはその切断産物が、標的ＲＮＡのＲＮＡｉ切断などにより配列特異的サイレンシングを導くことが可能になるのに十分でなければならない。標的鎖との相補性または相同性の程度は、アンチセンス鎖において最も重大である。多くの場合、特にアンチセンス鎖における完璧な相補性が望まれるが、一部の実施形態は、標的ＲＮＡに関して１個または複数の、ただし好ましくは、１０、８、６、５、４、３、２個またはそれより少ないミスマッチを含む。ミスマッチは、末端領域において最もよく耐容性を示し、存在する場合、好ましくは、例えば、５’および／または３’末端の６、５、４または３ヌクレオチド以内の末端領域（単数または複数）に存在する。センス鎖は、分子の全体的な二本鎖特徴を維持するために、アンチセンス鎖と十分に相補的であることのみを必要とする。
【０２４１】
加えて、ｓｉＲＮＡは、改変されていてよい、またはヌクレオシドアナログを含むことができる。ｓｉＲＮＡの一本鎖領域は、改変されていてよい、またはヌクレオシドアナログを含むことができる、例えば、ヘアピン構造の対形成されない領域（単数または複数）、例えば、２個の相補的領域を連結する領域は、改変またはヌクレオシドアナログを有することができる。例えばエキソヌクレアーゼに対してｓｉＲＮＡの１個もしくは複数の３’もしくは５’末端を安定化するための、またはアンチセンスｓｉＲＮＡ剤のＲＩＳＣへの進入を有利にするための改変も有用である。改変は、Ｃ３（またはＣ６、Ｃ７、Ｃ１２）アミノリンカー、チオールリンカー、カルボキシルリンカー、非ヌクレオチドスペーサー（Ｃ３、Ｃ６、Ｃ９、Ｃ１２、脱塩基、トリエチレングリコール、ヘキサエチレングリコール）、ＲＮＡ合成中の複数カップリングを可能にする、ホスホラミダイトとなり、別のＤＭＴ保護されたヒドロキシル基を有する特殊なビオチンまたはフルオレセイン試薬を含むことができる。ｓｉＲＮＡの各鎖は、３０、２５、２４、２３、２２、２１または２０ヌクレオチドの長さに等しいまたはそれ未満であり得る。鎖は、好ましくは少なくとも１９ヌクレオチドの長さである。例えば、各鎖は、２１〜２５ヌクレオチドの間の長さであり得る。好ましいｓｉＲＮＡは、１７、１８、１９、２９、２１、２２、２３、２４または２５ヌクレオチド対の二重鎖領域と、２〜３ヌクレオチドの１個または複数のオーバーハング、好ましくは、２〜３ヌクレオチドの１または２個の３’オーバーハングとを有する。
【０２４２】
本明細書で使用される場合、用語「ｍｉＲＮＡ」または「マイクロＲＮＡ」は、典型的には、プレｍｉＲＮＡとして公知のほぼ７０ヌクレオチドの折り畳み（ｆｏｌｄｂａｃｋ）ＲＮＡ前駆体構造から切除された、２０〜２２ヌクレオチドの小分子非コードＲＮＡを指す。ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡおよび標的の間の相補性の程度に依存した２通りの仕方のうち一方で、その標的を負に調節する。第一に、タンパク質コードｍＲＮＡ配列に完璧なまたはほとんど完璧な相補性により結合するｍｉＲＮＡは、ＲＮＡ媒介性干渉（ＲＮＡｉ）経路を誘導する。そのｍＲＮＡ標的の３’非翻訳領域（ＵＴＲ）内の不完全な相補的部位に結合することによりその調節効果を発揮するｍｉＲＮＡは、見かけ上翻訳のレベルで、ＲＮＡｉ経路に使用されるものと同様のまたはおそらく同一のＲＩＳＣ複合体により、転写後に標的遺伝子発現を抑制する。翻訳制御と一貫して、この機構を使用するｍｉＲＮＡは、その標的遺伝子のタンパク質レベルを低下させるが、これらの遺伝子のｍＲＮＡレベルは、最小限にしか影響されない。ｍｉＲＮＡは、任意のｍＲＮＡ配列を特異的に標的化することができる、天然に存在するｍｉＲＮＡおよび人工的に設計されたｍｉＲＮＡの両方を包含する。例えば、一実施形態では、当業者は、ヒトｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ−３０またはｍｉＲ−２１）一次転写物として発現される低分子ヘアピン型ＲＮＡ構築物を設計することができる。この設計は、ヘアピン型構築物にドローシャプロセシング部位を付加し、ノックダウン効率を大幅に増加させることが示された（Ｐｕｓｃｈら、２００４年）。ヘアピンステムは、２２ｎｔのｄｓＲＮＡ（例えば、アンチセンスは、所望の標的に対し完璧な相補性を有する）およびヒトｍｉＲ由来の１５〜１９ｎｔループからなる。ヘアピンの片側または両側におけるｍｉＲループおよびｍｉＲ３０隣接配列の付加は、マイクロＲＮＡなしの従来のｓｈＲＮＡ設計と比較した場合、発現されたヘアピンのドローシャおよびダイサープロセシングの１０倍を超える増加をもたらす。増加したドローシャおよびダイサープロセシングは、より大きいｓｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ産生および発現されたヘアピンについてのより大きい効力となる。
【０２４３】
本明細書で使用される場合、用語「ｓｈＲＮＡ」または「低分子ヘアピン型ＲＮＡ」は、単一の自己相補的ＲＮＡ鎖によって形成された二本鎖構造を指す。標的遺伝子のコードまたは非コード配列のいずれかの部分と同一のヌクレオチド配列を含有するｓｈＲＮＡ構築物が、阻害に好ましい。標的配列と比べて挿入、欠失および単一の点変異を有するＲＮＡ配列も、阻害に有効であることが判明した。阻害性ＲＮＡおよび標的遺伝子の部分の間の９０％を超える配列同一性またはさらには１００％の配列同一性が好ましい。ある特定の好ましい実施形態では、ｓｈＲＮＡの二重鎖形成部分の長さは、少なくとも２０、２１または２２ヌクレオチドの長さであり、例えば、ダイサー依存的切断によって産生されるＲＮＡ産物のサイズに対応する。ある特定の実施形態では、ｓｈＲＮＡ構築物は、少なくとも２５、５０、１００、２００、３００または４００塩基の長さである。ある特定の実施形態では、ｓｈＲＮＡ構築物は、４００〜８００塩基の長さである。ｓｈＲＮＡ構築物は、ループ配列およびループサイズにおける変動に高度に耐容性である。
【０２４４】
本明細書で使用される場合、用語「リボザイム」は、標的ｍＲＮＡの部位特異的切断が可能な触媒的に活性なＲＮＡ分子を指す。数種のサブタイプ、例えば、ハンマーヘッド型およびヘアピン型リボザイムについて記載されている。リボザイム触媒活性および安定性は、非触媒的塩基においてリボヌクレオチドをデオキシリボヌクレオチドに置換することにより改善することができる。部位特異的認識配列においてｍＲＮＡを切断するリボザイムを使用して、特定のｍＲＮＡを破壊することができるが、ハンマーヘッド型リボザイムの使用が好ましい。ハンマーヘッド型リボザイムは、標的ｍＲＮＡと相補的塩基対を形成する隣接領域によって指示される位置においてｍＲＮＡを切断する。唯一の要件は、標的ｍＲＮＡが、次の２塩基配列：５’−ＵＧ−３’を有することである。ハンマーヘッド型リボザイムの構築および産生は、当技術分野で周知である。
【０２４５】
ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはリボザイムを含む目的のポリヌクレオチドの好ましい送達方法は、本明細書の他の箇所に記載されている通り、例えば、強い構成的ｐｏｌ  ＩＩＩ、例えば、ヒトＵ６  ｓｎＲＮＡプロモーター、マウスＵ６  ｓｎＲＮＡプロモーター、ヒトおよびマウスＨ１  ＲＮＡプロモーターならびにヒトｔＲＮＡ−ｖａｌプロモーターまたは強い構成的ｐｏｌ  ＩＩプロモーターなど、１種または複数の調節配列を含む。
【０２４６】
本発明のポリヌクレオチドは、それ自体のコード配列の長さにかかわらず、本明細書の他の箇所で開示されているまたは当技術分野で公知のプロモーターおよび／またはエンハンサー、非翻訳領域（ＵＴＲ）、シグナル配列、コザック配列、ポリアデニル化シグナル、追加的な制限酵素部位、多重クローニング部位、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、リコンビナーゼ認識部位（例えば、ＬｏｘＰ、ＦＲＴ、およびＡｔｔ部位）、終止コドン、転写終結シグナル、および自己切断性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、エピトープタグなどの他のＤＮＡ配列と組み合わせることができ、したがって、それらの全体の長さは相当に変動し得る。したがって、ほぼどんな長さのポリヌクレオチド断片でも使用することができ、全長は調製の容易さおよび意図された組換えＤＮＡプロトコールでの使用により限定されることが好ましいことが意図されている。
【０２４７】
ポリヌクレオチドは、当技術分野において公知であり、利用可能である種々の十分に確立された技法のいずれかを使用して調製し、操作し、かつ／または発現させることができる。所望のポリペプチドを発現させるために、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を適切なベクターに挿入することができる。ベクターの例は、プラスミド、自己複製配列、および転移因子である。追加の例示的なベクターとしては、限定することなく、プラスミド、ファージミド、コスミド、人工染色体、たとえば、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、またはＰ１由来の人工染色体（ＰＡＣ）、ラムダファージまたはＭ１３ファージなどのバクテリオファージ、および動物ウイルスが挙げられる。ベクターとして有用な動物ウイルスのカテゴリーの例としては、限定することなく、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス）、ポックスウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルス、およびパポーバウイルス（例えば、ＳＶ４０）が挙げられる。発現ベクターの例は、哺乳動物細胞において発現させるためのｐＣｌｎｅｏベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）；哺乳動物細胞におけるレンチウイルス媒介性遺伝子導入および発現のためのｐＬｅｎｔｉ４／Ｖ５−ＤＥＳＴ（商標）、ｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５−ＤＥＳＴ（商標）、およびｐＬｅｎｔｉ６．２／Ｖ５−ＧＷ／ｌａｃＺ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である。特定の実施形態では、本明細書に開示されているキメラタンパク質のコード配列を、哺乳動物細胞においてキメラタンパク質を発現させるためにそのような発現ベクターにライゲーションすることができる。
【０２４８】
特定の実施形態では、ベクターは、エピソームベクターまたは染色体外に維持されるベクターである。本明細書で使用される場合、用語「エピソーム」は、宿主の染色体ＤＮＡに組み込むことなく、また、分裂する宿主細胞から漸進的に喪失することなく複製することができるベクターを指し、前記ベクターが、染色体外にまたはエピソームに複製することも意味する。ベクターは、リンパ増殖性ヘルペスウイルスまたはガンマヘルペスウイルス、アデノウイルス、ＳＶ４０、ウシパピローマウイルスまたは酵母由来のＤＮＡ複製の起点または「ｏｒｉ」、特に、ＥＢＶのｏｒｉＰに対応するリンパ増殖性ヘルペスウイルスまたはガンマヘルペスウイルスの複製起点をコードする配列を持つように工学的に作製される。特定の態様では、リンパ増殖性ヘルペスウイルスは、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、カポジ肉腫ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）、ヘルペスウイルス・サイミリ（ＨＳ）またはマレク病ウイルス（ＭＤＶ）であってもよい。エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）およびカポジ肉腫ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）は、ガンマヘルペスウイルスの例でもある。典型的には、宿主細胞は、複製を活性化するウイルス複製トランス活性化因子タンパク質を含む。
【０２４９】
発現ベクター内に存在する「制御エレメント」または「調節配列」は、宿主細胞のタンパク質と相互作用して転写および翻訳を行うベクターの非翻訳（ｎｏｎ−ｔｒａｎｓｌａｔｅｄ）領域−複製起点、選択カセット、プロモーター、エンハンサー、翻訳開始シグナル（シャイン・ダルガーノ配列またはコザック配列）イントロン、ポリアデニル化配列、５’および３’非翻訳（ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ）領域である。そのようなエレメントは、それらの強度および特異性が変動し得る。利用するベクター系および宿主に応じて、遍在プロモーターおよび誘導性プロモーターを含めた、多くの適切な転写および翻訳エレメントを使用することができる。
【０２５０】
特定の実施形態では、これらに限定されないが、発現ベクターおよびウイルスベクターを含めた、本発明の実施において使用するためのベクターは、プロモーターおよび／またはエンハンサーなどの外因性、内因性、または異種性制御配列を含む。「内因性」制御配列とは、ゲノム内で所与の遺伝子に天然に連結した制御配列である。「外因性」制御配列とは、遺伝子操作（すなわち、分子生物学的技法）によって遺伝子の近位に配置された制御配列であり、したがって、その遺伝子の転写が連結したエンハンサー／プロモーターによって導かれる。「異種性」制御配列とは、遺伝子操作される細胞とは異なる種に由来する外因性配列である。
【０２５１】
「プロモーター」という用語は、本明細書で使用される場合、ＲＮＡポリメラーゼが結合するポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）の認識部位を指す。ＲＮＡポリメラーゼは、プロモーターに作動可能に連結したポリヌクレオチドを惹起および転写する。特定の実施形態では、哺乳動物細胞において作動可能なプロモーターは、転写が開始される部位からおよそ２５〜３０塩基上流に位置するＡＴリッチ領域および／または転写開始から７０〜８０塩基上流に見いだされる別の配列、ＣＮＣＡＡＴ領域（Ｎは任意のヌクレオチドであってよい）を含む。
【０２５２】
「エンハンサー」という用語は、転写の増強をもたらすことが可能な配列を含み、一部の場合には、別の制御配列に対する方向とは独立して機能し得るＤＮＡのセグメントを指す。エンハンサーは、プロモーターおよび／または他のエンハンサーエレメントと協同的にまたは相加的に機能し得る。「プロモーター／エンハンサー」という用語は、プロモーター機能とエンハンサー機能の両方をもたらすことが可能な配列を含有するＤＮＡのセグメントを指す。
【０２５３】
「作動可能に連結した」という用語は、記載されている構成成分が、それらの意図された様式で機能することが可能になる関係にある近位を指す。一実施形態では、この用語は、核酸発現制御配列（例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサーなど）と第２のポリヌクレオチド配列、例えば、目的のポリヌクレオチドの機能的な連結を指し、ここで、発現制御配列は、第２の配列に対応する核酸の転写を導く。
【０２５４】
本明細書で使用される場合、「構成的発現制御配列」という用語は、作動可能に連結した配列の転写を絶え間なくまたは連続的に可能にするプロモーター、エンハンサー、またはプロモーター／エンハンサーを指す。構成的発現制御配列は、多種多様な細胞および組織型における発現を可能にする「遍在」プロモーター、エンハンサー、またはプロモーター／エンハンサーであってもよく、それぞれ制限された種類の細胞および組織型における発現を可能にする「細胞特異的」、「細胞型特異的」、「細胞系列特異的」または「組織特異的」プロモーター、エンハンサー、またはプロモーター／エンハンサーであってもよい。
【０２５５】
本発明の特定の実施形態において使用するのに適した例示的な遍在発現制御配列としては、これらに限定されないが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモーター、ウイルスシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）（例えば、初期または後期）、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）ＬＴＲプロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲ、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）（チミジンキナーゼ）プロモーター、ワクシニアウイルス由来のＨ５、Ｐ７．５、およびＰ１１プロモーター、伸長因子１−アルファ（ＥＦ１ａ）プロモーター、初期増殖応答１（ＥＧＲ１）、フェリチンＨ（ＦｅｒＨ）、フェリチンＬ（ＦｅｒＬ）、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、真核生物翻訳開始因子４Ａ１（ＥＩＦ４Ａ１）、熱ショック７０ｋＤａタンパク質５（ＨＳＰＡ５）、熱ショックタンパク質９０ｋＤａベータ、メンバー１（ＨＳＰ９０Ｂ１）、熱ショックタンパク質７０ｋＤａ（ＨＳＰ７０）、β−キネシン（β−ＫＩＮ）、ヒトＲＯＳＡ２６遺伝子座（Ｉｒｉｏｎｓら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２５巻、１４７７〜１４８２頁（２００７年））、ユビキチンＣプロモーター（ＵＢＣ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ−１（ＰＧＫ）プロモーター、サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリβ−アクチン（ＣＡＧ）プロモーター、β−アクチンプロモーターおよび骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、負の制御領域欠失、ｄｌ５８７ｒｅｖプライマー結合性部位置換（ＭＮＤ）プロモーター（Ｃｈａｌｌｉｔａら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．  ６９巻（２号）：７４８〜５５頁（１９９５年））が挙げられる。
【０２５６】
一実施形態では、本発明のベクターは、ＭＮＤプロモーターを含む。
【０２５７】
一実施形態では、本発明のベクターは、ヒトＥＦ１ａ遺伝子の第１のイントロンを含むＥＦ１ａプロモーターを含む。
【０２５８】
一実施形態では、本発明のベクターは、ヒトＥＦ１ａ遺伝子の第１のイントロンを欠くＥＦ１ａプロモーターを含む。
【０２５９】
特定の実施形態では、Ｔ細胞特異的プロモーターから、ＣＡＲを含むポリヌクレオチドを発現させることが望ましい場合がある。
【０２６０】
本明細書で使用される場合、「条件的発現」とは、これらに限定されないが、誘導性発現；抑制可能な発現；特定の生理的状態、生物学的状態、または疾患状態を有する細胞または組織における発現などを含めた、任意の型の条件的発現を指し得る。この定義は、細胞型または組織に特異的な発現を排除するものではない。本発明のある特定の実施形態は、目的のポリヌクレオチドの条件的発現を提供し、例えば、細胞、組織、生物体などを、ポリヌクレオチドの発現が引き起こされる処理もしくは条件、または目的のポリヌクレオチドによりコードされるポリヌクレオチドの発現の増加もしくは減少が引き起こされる処理もしくは条件に供することによって発現を制御する。
【０２６１】
誘導性プロモーター／系の実例としては、これらに限定されないが、グルココルチコイドまたはエストロゲン受容体（対応するホルモンを用いた処理によって誘導可能）をコードする遺伝子に対するプロモーターなどのステロイド誘導性プロモーター、メタロチオネイン（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｉｎｅ）プロモーター（種々の重金属を用いた処理によって誘導可能）、ＭＸ−１プロモーター（インターフェロンによって誘導可能）、「ＧｅｎｅＳｗｉｔｃｈ」ミフェプリストンにより調節可能な系（Ｓｉｒｉｎら、２００３年、Ｇｅｎｅ、３２３巻：６７頁）、クメート（ｃｕｍａｔｅ）誘導性遺伝子スイッチ（ＷＯ２００２／０８８３４６）、テトラサイクリン依存性調節系などが挙げられる。
【０２６２】
条件的発現は、部位特異的ＤＮＡリコンビナーゼを使用することによって達成することもできる。本発明のある特定の実施形態によると、ベクターは、部位特異的リコンビナーゼによって媒介される組換えのための少なくとも１つ（一般には、２つ）の部位を含む。本明細書で使用される場合、「リコンビナーゼ」または「部位特異的リコンビナーゼ」という用語は、１つまたは複数の組換え部位（例えば、２、３、４、５、７、１０、１２、１５、２０、３０、５０など）が関与する組換え反応に関与する、除去的（ｅｘｃｉｓｉｖｅ）または統合的なタンパク質、酵素、補因子または関連タンパク質を含み、これは、野生型タンパク質であってもよく（Ｌａｎｄｙ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３巻：６９９〜７０７頁（１９９３年））、その変異体、誘導体（例えば、組換えタンパク質配列またはその断片を含有する融合タンパク質）、断片、およびバリアントであってもよい。本発明の特定の実施形態における使用に適したリコンビナーゼの実例としては、これらに限定されないが、Ｃｒｅ、Ｉｎｔ、ＩＨＦ、Ｘｉｓ、Ｆｌｐ、Ｆｉｓ、Ｈｉｎ、Ｇｉｎ、ΦＣ３１、Ｃｉｎ、Ｔｎ３レソルバーゼ、ＴｎｄＸ、ＸｅｒＣ、ＸｅｒＤ、ＴｎｐＸ、Ｈｊｃ、Ｇｉｎ、ＳｐＣＣＥ１、およびＰａｒＡが挙げられる。
【０２６３】
ベクターは、多種多様な部位特異的リコンビナーゼのいずれかのための１個または複数の組換え部位を含むことができる。部位特異的リコンビナーゼのための標的部位が、ベクター、例えば、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターの組み込みに必要とされるいずれかの部位（複数可）に加えて存在することを理解されたい。本明細書で使用される場合、用語「組換え配列」、「組換え部位」または「部位特異的組換え部位」は、リコンビナーゼが認識および結合する特定の核酸配列を指す。
【０２６４】
例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼのための１種の組換え部位は、８塩基対コア配列を挟む２個の１３塩基対逆方向反復（リコンビナーゼ結合部位として機能する）を含む３４塩基対配列であるｌｏｘＰである（Ｓａｕｅｒ，  Ｂ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ５巻：５２１〜５２７頁（１９９４年）の図１を参照）。他の例示的なｌｏｘＰ部位として、これらに限定されないが、ｌｏｘ５１１（Ｈｏｅｓｓら、１９９６年；ＢｅｔｈｋｅおよびＳａｕｅｒ、１９９７年）、ｌｏｘ５１７１（ＬｅｅおよびＳａｉｔｏ、１９９８年）、ｌｏｘ２２７２（ＬｅｅおよびＳａｉｔｏ、１９９８年）、ｍ２（Ｌａｎｇｅｒら、２００２年）、ｌｏｘ７１（Ａｌｂｅｒｔら、１９９５年）およびｌｏｘ６６（Ａｌｂｅｒｔら、１９９５年）が挙げられる。
【０２６５】
ＦＬＰリコンビナーゼに適した認識部位として、これらに限定されないが、ＦＲＴ（ＭｃＬｅｏｄら、１９９６年）、Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３（ＳｃｈｌａｋｅおよびＢｏｄｅ、１９９４年）、Ｆ４、Ｆ５（ＳｃｈｌａｋｅおよびＢｏｄｅ、１９９４年）、ＦＲＴ（ＬＥ）（Ｓｅｎｅｃｏｆｆら、１９８８年）、ＦＲＴ（ＲＥ）（Ｓｅｎｅｃｏｆｆら、１９８８年）が挙げられる。
【０２６６】
認識配列の他の例は、リコンビナーゼ酵素λインテグラーゼ、例えば、ｐｈｉ−ｃ３１によって認識されるａｔｔＢ、ａｔｔＰ、ａｔｔＬおよびａｔｔＲ配列である。φＣ３１  ＳＳＲは、ヘテロタイプ部位ａｔｔＢ（３４ｂｐの長さ）およびａｔｔＰ（３９ｂｐの長さ）の間の組換えのみを媒介する（Ｇｒｏｔｈら、２０００年）。それぞれ細菌およびファージゲノムにおけるファージインテグラーゼのための付着部位にちなんで命名されたａｔｔＢおよびａｔｔＰは両者共に、φＣ３１ホモ二量体によって結合される可能性がある不完全な逆方向反復を含有する（Ｇｒｏｔｈら、２０００年）。産物部位、ａｔｔＬおよびａｔｔＲは、さらなるφＣ３１媒介性組換えに対し有効に不活性であり（Ｂｅｌｔｅｋｉら、２００３年）、反応を不可逆的なものとする。挿入を触媒するために、ａｔｔＢを有するＤＮＡが、ゲノムａｔｔＢ部位へのａｔｔＰ部位よりも容易にゲノムａｔｔＰ部位に挿入することが判明した（Ｔｈｙａｇａｒａｊａｎら、２００１年；Ｂｅｌｔｅｋｉら、２００３年）。よって、典型的な戦略は、定義された遺伝子座へのａｔｔＰを有する「ドッキング部位」の相同組換えによって位置決めし、これは次いで、挿入のためのａｔｔＢを有する後継（ｉｎｃｏｍｉｎｇ）配列とパートナー形成される。
【０２６７】
本明細書で使用される場合、「配列内リボソーム進入部位（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｅｎｔｒｙ  ｓｉｔｅ）」または「ＩＲＥＳ」は、シストロン（タンパク質コード領域）のＡＴＧなど、開始コドンへの直接的な配列内リボソーム進入を促進し、これにより、遺伝子のｃａｐ非依存的翻訳をもたらすエレメントを指す。例えば、Ｊａｃｋｓｏｎら、１９９０年、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ  １５巻（１２号）：４７７〜８３頁）ならびにＪａｃｋｓｏｎおよびＫａｍｉｎｓｋｉ、１９９５年、ＲＮＡ  １巻（１０号）：９８５〜１０００頁を参照されたい。特定の実施形態では、本発明によって意図されるベクターは、１種または複数のポリペプチドをコードする１種または複数の目的のポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、複数のポリペプチドのそれぞれの効率的な翻訳を達成するために、ポリヌクレオチド配列は、１個または複数のＩＲＥＳ配列または自己切断ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列によって離間されていてよい。
【０２６８】
本明細書で使用される場合、用語「コザック配列」は、リボソームの小サブユニットへのｍＲＮＡの初期結合を大幅に容易にし、翻訳を増加させる短いヌクレオチド配列を指す。コンセンサスコザック配列は、（ＧＣＣ）ＲＣＣＡＴＧＧ（式中、Ｒは、プリン（ＡまたはＧ）である）である（Ｋｏｚａｋ、１９８６年、Ｃｅｌｌ  ４４巻（２号）：２８３〜９２頁およびＫｏｚａｋ、１９８７年、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５巻（２０号）：８１２５〜４８頁）。特定の実施形態では、本発明によって意図されるベクターは、コンセンサスコザック配列を有し、所望のポリペプチド、例えば、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含む。
【０２６９】
本発明の一部の実施形態では、ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを持つ細胞は、直接的な毒性および／または制御されない増殖のリスクを低下させるための誘導性自殺遺伝子を含む自殺遺伝子を利用する。特異的な態様では、自殺遺伝子は、ポリヌクレオチドまたは細胞を持つ宿主に対し免疫原性ではない。使用することができる自殺遺伝子のある特定の例は、カスパーゼ−９またはカスパーゼ−８またはシトシンデアミナーゼである。カスパーゼ−９は、二量体形成の特異的な化学的誘導因子（ＣＩＤ）を使用して活性化することができる。
【０２７０】
ある特定の実施形態では、ベクターは、本発明の免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞を、ｉｎ  ｖｉｖｏの負の選択に対し感応性にする遺伝子セグメントを含む。「負の選択」とは、注入された細胞が、個体のｉｎ  ｖｉｖｏ状態の変化の結果として排除され得ることを意味する。負の選択可能表現型は、投与される薬剤、例えば、化合物に対する感受性を付与する遺伝子の挿入に起因し得る。負の選択可能遺伝子は、当技術分野で公知であり、とりわけ次のものを含む：ガンシクロビル感受性を付与する単純ヘルペスウイルスＩ型チミジンキナーゼ（ＨＳＶ−Ｉ  ＴＫ）遺伝子（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｃｅｌｌ  １１巻：２２３頁、１９７７年）；細胞ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｐｈｏｓｐｈｒｉｂｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）（ＨＰＲＴ）遺伝子、細胞アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＡＰＲＴ）遺伝子および細菌シトシンデアミナーゼ（Ｍｕｌｌｅｎら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ．８９巻：３３頁（１９９２年））。
【０２７１】
一部の実施形態では、Ｔ細胞など、遺伝子改変された免疫エフェクター細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで負の選択可能表現型の細胞の選択を可能にする正のマーカーをさらに含むポリヌクレオチドを含む。正の選択可能マーカーは、宿主細胞に導入されると、この遺伝子を保持する細胞の正の選択を可能にする優性表現型を発現する遺伝子であり得る。この種の遺伝子は、当技術分野で公知であり、とりわけ、ハイグロマイシンＢに対する抵抗性を付与するハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｈｐｈ）、抗生物質Ｇ４１８に対する抵抗性をコードするＴｎ５由来のアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｎｅｏまたはａｐｈ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子、アデノシンデアミナーゼ遺伝子（ＡＤＡ）および多剤耐性（ＭＤＲ）遺伝子を含む。
【０２７２】
好ましくは、負の選択可能エレメントの喪失が、正の選択可能マーカーの喪失も必然的に伴うように、正の選択可能マーカーおよび負の選択可能エレメントは連結される。さらにより好ましくは、正のおよび負の選択可能マーカーは、一方の喪失が、他方の喪失を強制的にもたらすことができるように融合される。発現産物として、上述の所望の正および負の選択特色の両方を付与するポリペプチドを生じる融合されたポリヌクレオチドの例は、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼチミジンキナーゼ融合遺伝子（ＨｙＴＫ）である。この遺伝子の発現は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける正の選択のためにハイグロマイシンＢ抵抗性およびｉｎ  ｖｉｖｏにおける負の選択のためにガンシクロビル感受性を付与するポリペプチドを生じる。Ｌｕｐｔｏｎ  Ｓ．  Ｄ．ら、Ｍｏｌ．  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １１巻：３３７４〜３３７８頁、１９９１年を参照されたい。加えて、好ましい実施形態では、キメラ受容体をコードする本発明のポリヌクレオチドは、融合された遺伝子、特に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける正の選択のためにハイグロマイシンＢ抵抗性およびｉｎ  ｖｉｖｏにおける負の選択のためにガンシクロビル感受性を付与する融合された遺伝子を含有するレトロウイルスベクター、例えば、Ｌｕｐｔｏｎ，  Ｓ．  Ｄ．ら（１９９１年）、上記参照に記載されているＨｙＴＫレトロウイルスベクター中に存在する。負の選択可能マーカーと優性の正の選択可能マーカーとの融合に由来する二機能性選択可能融合遺伝子の使用について記載する、Ｓ．  Ｄ．  ＬｕｐｔｏｎによるＰＣＴ  ＵＳ９１／０８４４２およびＰＣＴ／ＵＳ９４／０５６０１の公開も参照されたい。
【０２７３】
好ましい正の選択可能マーカーは、ｈｐｈ、ｎｃｏおよびｇｐｔからなる群より選択される遺伝子に由来し、好ましい負の選択可能マーカーは、シトシンデアミナーゼ、ＨＳＶ−Ｉ  ＴＫ、ＶＺＶ  ＴＫ、ＨＰＲＴ、ＡＰＲＴおよびｇｐｔからなる群より選択される遺伝子に由来する。特に好ましいマーカーは、正の選択可能マーカーが、ｈｐｈまたはｎｅｏに由来し、負の選択可能マーカーが、シトシンデアミナーゼまたはＴＫ遺伝子または選択可能マーカーに由来する二機能性選択可能融合遺伝子である。誘導性自殺遺伝子。
【０２７４】
Ｆ．ウイルスベクター
特定の実施形態では、細胞（例えば、免疫エフェクター細胞）は、ＣＡＲをコードするレトロウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクターを形質導入される。例えば、免疫エフェクター細胞は、ＢＣＭＡポリペプチドに結合するヒト化抗ＢＣＭＡ抗体またはその抗原結合性断片と、ＣＤ３ζ、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、Ｏｘ４０の細胞内シグナル伝達ドメインまたはこれらのいずれかの組合せを含むＣＡＲをコードするベクターを形質導入される。よって、これらの形質導入された細胞は、ＣＡＲ媒介性細胞傷害性応答を誘発することができる。
【０２７５】
レトロウイルスは、遺伝子送達のための一般的なツールである（Ｍｉｌｌｅｒ、２０００年、Ｎａｔｕｒｅ、３５７巻：４５５〜４６０頁）。特定の実施形態では、レトロウイルスは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするポリヌクレオチドを細胞に送達するために使用される。本明細書で使用される場合、用語「レトロウイルス」は、そのゲノムＲＮＡを直鎖状二本鎖ＤＮＡコピーへと逆転写し、その後、そのゲノムＤＮＡを宿主ゲノムへと共有結合により組み込むＲＮＡウイルスを指す。ウイルスは、宿主ゲノムに組み込まれると、「プロウイルス」と称される。プロウイルスは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩの鋳型として機能し、新たなウイルス粒子の産生に必要な構造タンパク質および酵素をコードするＲＮＡ分子の発現を導く。
【０２７６】
特定の実施形態における使用に適した例示的なレトロウイルスとして、これらに限定されないが、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ−ＭｕＬＶ）、モロニーマウス肉腫ウイルス（ＭｏＭＳＶ）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭｕＭＴＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、ネコ白血病ウイルス（ＦＬＶ）、スプーマウイルス、フレンドマウス白血病ウイルス、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ））およびレンチウイルスが挙げられる。
【０２７７】
本明細書で使用される場合、「レンチウイルス」という用語は、複合レトロウイルスのある群（または属）を指す。例示的なレンチウイルスとしては、これらに限定されないが、：ＨＩＶ（ヒト免疫不全症ウイルス；ＨＩＶ  １型およびＨＩＶ  ２型を含む）；ビスナ・マエディウイルス（ＶＭＶ）ウイルス；ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）；ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）；ネコ免疫不全症ウイルス（ＦＩＶ）；ウシ免疫不全症ウイルス（ＢＩＶ）；およびサル免疫不全症ウイルス（ＳＩＶ）が挙げられる。一実施形態では、ＨＩＶに基づくベクターの骨格（すなわち、ＨＩＶシス作用性配列エレメント）が好ましい。特定の実施形態では、レンチウイルスは、ＣＡＲを含むポリヌクレオチドを細胞に送達するために使用される。
【０２７８】
レトロウイルスベクターおよびより具体的には、レンチウイルスベクターは、本発明の特定の実施形態の実施において使用することができる。したがって、用語「レトロウイルス」または「レトロウイルスベクター」は、本明細書で使用される場合、それぞれ「レンチウイルス」および「レンチウイルスベクター」を含むことを意味する。
【０２７９】
「ベクター」という用語は、本明細書では、別の核酸分子を移行させるまたは運搬することが可能な核酸分子を指すために使用される。移行される核酸は、一般に、ベクター核酸分子に連結される、例えば、それに挿入される。ベクターは、細胞における自律複製を導く配列を含んでもよく、宿主細胞ＤＮＡへの組み込みを可能にするのに十分な配列を含んでもよい。有用なベクターとしては、例えば、プラスミド（例えば、ＤＮＡプラスミドまたはＲＮＡプラスミド）、トランスポゾン、コスミド、細菌人工染色体、およびウイルスベクターが挙げられる。有用なウイルスベクターとしては、例えば、複製欠損性レトロウイルスおよびレンチウイルスが挙げられる。
【０２８０】
当業者には明らかになる通り、「ウイルスベクター」という用語は、一般には核酸分子の移行もしくは細胞のゲノム内への組み込みを容易にするウイルス由来の核酸エレメントを含む核酸分子（例えば、導入プラスミド）、または、核酸移行を媒介するウイルス粒子のいずれかを指すために広く使用されている。ウイルス粒子は、一般には、核酸（複数可）に加えて、種々のウイルス構成成分および時には宿主細胞構成成分も含む。
【０２８１】
ウイルスベクターという用語は、核酸を細胞内に移行することが可能なウイルスもしくはウイルス粒子、または移行される核酸自体のいずれかを指し得る。ウイルスベクターおよび導入プラスミドは、主にウイルスに由来する構造的かつ／または機能的な遺伝エレメントを含有する。「レトロウイルスベクター」という用語は、主にレトロウイルスに由来する構造的かつ機能的な遺伝エレメントまたはその一部を含有するウイルスベクターまたはプラスミドを指す。「レンチウイルスベクター」という用語は、主にレンチウイルスに由来するＬＴＲを含めた、構造的かつ機能的な遺伝エレメントまたはその一部を含有するウイルスベクターまたはプラスミドを指す。「ハイブリッドベクター」という用語は、レトロウイルス、例えばレンチウイルス配列とレンチウイルスものではないウイルス配列の両方を含有するベクター、ＬＴＲまたは他の核酸を指す。一実施形態では、ハイブリッドベクターとは、逆転写、複製、組み込みおよび／またはパッケージングのための、レトロウイルス、例えばレンチウイルス配列を含むベクターまたは導入プラスミドを指す。
【０２８２】
特定の実施形態では、「レンチウイルスベクター」、「レンチウイルス発現ベクター」という用語は、レンチウイルス導入プラスミドおよび／または感染性レンチウイルス粒子を指すために使用することができる。本明細書において、例えばクローニング部位、プロモーター、調節エレメント、異種核酸などのエレメントに言及する場合、これらのエレメントの配列は、本発明のレンチウイルス粒子ではＲＮＡ形態で存在し、本発明のＤＮＡプラスミドではＤＮＡ形態で存在することが理解されるべきである。
【０２８３】
プロウイルスの各末端には、「長い末端反復」または「ＬＴＲ」と称される構造がある。「長い末端反復（ＬＴＲ）」という用語は、レトロウイルスＤＮＡの末端に位置する、それらの天然配列に関しては直接反復配列であり、Ｕ３、ＲおよびＵ５領域を含有する、塩基対のドメインを指す。ＬＴＲは、一般に、レトロウイルス遺伝子の発現（例えば、促進、開始および遺伝子転写物のポリアデニル化）のため、およびウイルス複製のための基本的な機能をもたらす。ＬＴＲは、転写制御エレメント、ポリアデニル化シグナルならびにウイルスゲノムの複製および組み込みのために必要な配列を含めた多数の調節シグナルを含有する。ウイルスＬＴＲは、Ｕ３、ＲおよびＵ５と称される３つの領域に分けられる。Ｕ３領域は、エンハンサーおよびプロモーターエレメントを含有する。Ｕ５領域は、プライマー結合性部位とＲ領域の間の配列であり、ポリアデニル化配列を含有する。Ｒ（反復）領域は、Ｕ３領域とＵ５領域に挟まれている。ＬＴＲは、Ｕ３、ＲおよびＵ５領域で構成され、ウイルスゲノムの５’末端と３’末端の両方に見られる。５’ＬＴＲには、ゲノムの逆転写に必要な配列（ｔＲＮＡプライマー結合性部位）およびウイルスＲＮＡの、粒子への効率的なパッケージングに必要な配列（プシー部位）が隣接している。
【０２８４】
本明細書で使用される場合、「パッケージングシグナル」または「パッケージング配列」という用語は、ウイルスＲＮＡのウイルスカプシドまたは粒子への挿入に必要である、レトロウイルスゲノム内に位置する配列を指す。例えば、Ｃｌｅｖｅｒら、１９９５年、Ｊ．  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、６９巻、４号；２１０１〜２１０９頁を参照されたい。いくつかのレトロウイルスベクターは、ウイルスゲノムのカプシド形成に必要な最小のパッケージングシグナル（プシー［Ψ］配列とも称される）を使用する。したがって、本明細書で使用される場合、「パッケージング配列」、「パッケージングシグナル」、「プシー」という用語および「Ψ」という記号は、ウイルス粒子形成の間のレトロウイルスＲＮＡ鎖のカプシド形成に必要な非コード配列への言及に使用されている。
【０２８５】
種々の実施形態では、ベクターは、改変された５’ＬＴＲおよび／または３’ＬＴＲを含む。ＬＴＲのいずれかまたは両方が、これらに限定されないが、１つまたは複数の欠失、挿入、または置換を含めた、１つまたは複数の改変を含んでよい。３’ＬＴＲの改変は、多くの場合、レンチウイルスまたはレトロウイルス系の安全性を改善するために、ウイルスを複製欠損性にすることによって行われる。本明細書で使用される場合、「複製欠損性」という用語は、完全な、有効な複製を行うことができず、したがって、感染性ビリオンが産生されないウイルス（例えば、複製欠損性レンチウイルス後代）を指す。「複製コンピテント」という用語は、複製することが可能であり、したがって、ウイルスのウイルス複製が感染性ビリオンを産生可能である野生型ウイルスまたは変異体ウイルス（例えば、複製コンピテントレンチウイルス後代）を指す。
【０２８６】
「自己不活性化」（ＳＩＮ）ベクターとは、最初のラウンドのウイルス複製を超えてのウイルス転写を防止するために、Ｕ３領域として公知の右側（３’）ＬＴＲエンハンサー−プロモーター領域が改変された（例えば、欠失または置換によって）複製欠損性ベクター、例えば、レトロウイルスまたはレンチウイルスベクターを指す。これは、右側（３’）ＬＴＲ  Ｕ３領域がウイルス複製の間に左側（５’）ＬＴＲ  Ｕ３領域の鋳型として使用され、したがって、ウイルス転写物はＵ３エンハンサー−プロモーターなしでは作られないことに起因する。本発明のさらなる実施形態では、Ｕ５領域が、例えば理想的なポリ（Ａ）配列で置き換えられるように、３’ＬＴＲを改変する。３’ＬＴＲ、５’ＬＴＲ、または３’ＬＴＲと５’ＬＴＲの両方に対する改変などのＬＴＲに対する改変も本発明に包含されることに留意するべきである。
【０２８７】
５’ＬＴＲのＵ３領域を異種プロモーターで置き換えて、ウイルス粒子の産生の間にウイルスゲノムの転写を駆動することにより、追加的な安全性の増強が提供される。使用することができる異種プロモーターの例としては、例えば、ウイルスシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）（例えば、初期または後期）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（例えば、最初期の）、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、および単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）（チミジンキナーゼ）プロモーターが挙げられる。典型的なプロモーターは、Ｔａｔ非依存的に高レベルの転写を駆動することができる。この置き換えにより、ウイルス産生系に完全なＵ３配列が存在しなくなるので、複製コンピテントウイルスを生成する組換えの可能性が低下する。ある特定の実施形態では、異種プロモーターは、ウイルスゲノムが転写される様式の制御における追加的な利点を有する。例えば、異種プロモーターは、誘導性であってよく、したがって、ウイルスゲノムの全部または一部の転写は、誘導因子が存在する場合にのみ起こる。誘導因子としては、これらに限定されないが、１つまたは複数の化学化合物または宿主細胞を培養する温度またはｐＨなどの生理的条件が挙げられる。
【０２８８】
一部の実施形態では、ウイルスベクターは、ＴＡＲエレメントを含む。「ＴＡＲ」という用語は、レンチウイルス（例えば、ＨＩＶ）ＬＴＲのＲ領域に位置する「トランス活性化応答」遺伝エレメントを指す。このエレメントは、レンチウイルストランス活性化因子（ｔａｔ）遺伝エレメントと相互作用してウイルス複製を増強する。しかし、このエレメントは、５’ＬＴＲのＵ３領域を異種プロモーターで置き換える実施形態では必要ない。
【０２８９】
「Ｒ領域」とは、キャップ形成基の開始（すなわち、転写の開始）で始まり、ポリＡトラクトが始まる直前で終わる、レトロウイルスＬＴＲ内の領域を指す。Ｒ領域は、Ｕ３領域とＵ５領域に挟まれているとも定義される。Ｒ領域は、逆転写の間に新生ＤＮＡのゲノムの一方の末端から他方の末端への移行を可能にする役割を果たす。
【０２９０】
本明細書で使用される場合、「ＦＬＡＰエレメント」という用語は、その配列に、レトロウイルス、例えば、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２の中心ポリプリントラクト（ｃｅｎｔｒａｌ  ｐｏｌｙｐｕｒｉｎｅ  ｔｒａｃｔ）および中心終結配列（ｃＰＰＴおよびＣＴＳ）を含む核酸を指す。適切なＦＬＡＰエレメントは、米国特許第６，６８２，９０７号およびＺｅｎｎｏｕら、２０００年、Ｃｅｌｌ、１０１巻：１７３頁に記載されている。ＨＩＶ−１逆転写の間、中心ポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）におけるプラス鎖ＤＮＡの中心的な開始および中心終結配列（ＣＴＳ）における中心的な終結により、三本鎖ＤＮＡ構造：ＨＩＶ−１中心ＤＮＡフラップの形成が導かれる。いかなる理論に縛られることも望むものではないが、ＤＮＡフラップは、レンチウイルスゲノム核内移行のシス活性決定因子として作用し得、かつ／またはウイルスの力価を増大させ得る。特定の実施形態では、レトロウイルスまたはレンチウイルスベクターの骨格は、ベクター内の目的の異種遺伝子の上流または下流の１つまたは複数のＦＬＡＰエレメントを含む。例えば、特定の実施形態では、導入プラスミドはＦＬＡＰエレメントを含む。一実施形態では、本発明のベクターは、ＨＩＶ−１から単離されたＦＬＡＰエレメントを含む。
【０２９１】
一実施形態では、レトロウイルスまたはレンチウイルス移入ベクターは、１つまたは複数の移出エレメントを含む。「移出エレメント」という用語は、ＲＮＡ転写物の細胞の核から細胞質への輸送を調節するシス作用性転写後調節エレメントを指す。ＲＮＡ移出エレメントの例としては、これらに限定されないが、ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）（例えば、Ｃｕｌｌｅｎら、１９９１年、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６５巻：１０５３頁；およびＣｕｌｌｅｎら、１９９１年、Ｃｅｌｌ  ５８巻：４２３頁を参照されたい）、およびＢ型肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＨＰＲＥ）が挙げられる。一般に、ＲＮＡ移出エレメントは、遺伝子の３’ＵＴＲ内に配置され、また、１つまたは多数のコピーとして挿入することができる。
【０２９２】
特定の実施形態では、ウイルスベクター内の異種配列の発現を、転写後調節エレメント、効率的なポリアデニル化部位、および場合によって、転写終結シグナルをベクターに組み入れることによって増加させる。種々の転写後調節エレメント、例えば、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ；Ｚｕｆｆｅｒｅｙら、１９９９年、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、７３巻：２８８６頁）；Ｂ型肝炎ウイルスに存在する転写後調節エレメント（ＨＰＲＥ）（Ｈｕａｎｇら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．、５巻：３８６４頁）などは、異種核酸のタンパク質での発現を増加させることができる（Ｌｉｕら、１９９５年、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．、９巻：１７６６頁）。特定の実施形態では、本発明のベクターは、ＷＰＲＥまたはＨＰＲＥなどの転写後調節エレメントを含む。
【０２９３】
特定の実施形態では、本発明のベクターは、ＷＰＲＥまたはＨＰＲＥなどの転写後調節エレメントを欠くまたはそれを含まない。なぜなら、一部の場合には、これらのエレメントが、細胞形質転換のリスクを上昇させ、かつ／または、ｍＲＮＡ転写物の量を実質的にもしくは有意に増加させないまたはｍＲＮＡ安定性を増加させないからである。したがって、一部の実施形態では、本発明のベクターは、追加的な安全策として、ＷＰＲＥまたはＨＰＲＥを欠くまたはそれを含まない。
【０２９４】
異種核酸転写物の効率的な終結およびポリアデニル化を導くエレメントは、異種遺伝子発現を増加させる。転写終結シグナルは、一般に、ポリアデニル化シグナルの下流に見いだされる。特定の実施形態では、ベクターは、発現させるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの３’側にポリアデニル化配列を含む。「ポリＡ部位」または「ポリＡ配列」という用語は、本明細書で使用される場合、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによる新生ＲＮＡ転写物の終結およびポリアデニル化の両方を導くＤＮＡ配列を示す。ポリアデニル化配列は、コード配列の３’末端にポリＡ尾部を付加することによってｍＲＮＡ安定性を促進し、したがって、翻訳効率の上昇に寄与することができる。ポリＡ尾部を欠く転写物は不安定であり、迅速に分解されるので、組換え転写物の効率的なポリアデニル化が望ましい。本発明のベクターに使用することができるポリＡシグナルの実例としては、理想的なポリＡ配列（例えば、ＡＡＴＡＡＡ、ＡＴＴＡＡＡ、ＡＧＴＡＡＡ）、ウシ成長ホルモンポリＡ配列（ＢＧＨｐＡ）、ウサギβ−グロビンポリＡ配列（ｒβｇｐＡ）、または当技術分野で公知の別の適切な異種性もしくは内因性ポリＡ配列が挙げられる。
【０２９５】
ある特定の実施形態では、レトロウイルスまたはレンチウイルスベクターは、１個または複数のインスレーターエレメントをさらに含む。インスレーターエレメントは、ゲノムＤＮＡに存在するシス作用性エレメントによって媒介され、移入された配列の調節解除された発現をもたらし得る組み込み部位効果（すなわち、位置効果；例えば、Ｂｕｒｇｅｓｓ−Ｂｅｕｓｓｅら、２００２年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ＵＳＡ、９９巻：１６４３３頁；およびＺｈａｎら、２００１年、Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅｔ．、１０９巻：４７１頁を参照）からの、レンチウイルスに発現される配列、例えば治療用ポリペプチドの保護に寄与することができる。一部の実施形態では、移入ベクターは、３’ＬＴＲに１個または複数のインスレーターエレメントを含み、宿主ゲノムへのプロウイルスの組み込み後に、プロウイルスは、３’ＬＴＲの重複のおかげで、５’ＬＴＲまたは３’ＬＴＲの両方に１個または複数のインスレーターを含む。本発明における使用に適したインスレーターとして、これに限定されないが、ニワトリβ−グロビンインスレーターが挙げられる（参照により本明細書に組み込まれるＣｈｕｎｇら、１９９３年、Ｃｅｌｌ  ７４巻：５０５頁；Ｃｈｕｎｇら、１９９７年、ＰＮＡＳ  ９４巻：５７５頁；およびＢｅｌｌら、１９９９年、Ｃｅｌｌ  ９８巻：３８７頁を参照）。インスレーターエレメントの例として、これに限定されないが、ニワトリＨＳ４など、β−グロビン遺伝子座由来のインスレーターが挙げられる。
【０２９６】
本発明のある特定の特異的な実施形態によると、ウイルスベクター骨格配列の大部分または全ては、レンチウイルス、例えば、ＨＩＶ−１に由来する。しかし、レトロウイルスおよび／またはレンチウイルス配列の多くの異なる供給源を使用または組み合わせることができ、レンチウイルス配列のいくつかにおける多数の置換および変更は、本明細書に記載されている機能を実行する移入ベクターの能力を損なうことなく順応させることができることを理解されたい。さらに、様々なレンチウイルスベクターが当技術分野で公知であり、Ｎａｌｄｉｎｉら（１９９６年ａ、１９９６年ｂおよび１９９８年）；Ｚｕｆｆｅｒｅｙら（１９９７年）；Ｄｕｌｌら、１９９８年、米国特許第６，０１３，５１６号；および同第５，９９４，１３６号を参照されたく、その多くは、本発明のウイルスベクターまたは移入プラスミドを産生するように適応させることができる。
【０２９７】
種々の実施形態では、本発明のベクターは、ＣＡＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む。ベクターは、１個または複数のＬＴＲを有することができ、ＬＴＲのいずれかは、１個または複数のヌクレオチド置換、付加または欠失など、１個または複数の改変を含む。ベクターは、形質導入効率（例えば、ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ）、ウイルスパッケージング（例えば、プシー（Ψ）パッケージングシグナル、ＲＲＥ）を増加させるための１個もしくは複数のアクセサリーエレメントおよび／または治療用遺伝子発現を増加させる他のエレメント（例えば、ポリ（Ａ）配列）をさらに含むことができ、任意選択で、ＷＰＲＥまたはＨＰＲＥを含むことができる。
【０２９８】
特定の実施形態では、本発明の移入ベクターは、左（５’）レトロウイルスＬＴＲ；中心ポリプリントラクト／ＤＮＡフラップ（ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ）；レトロウイルス輸送エレメント；本明細書において意図されているＣＡＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された、Ｔ細胞において活性なプロモーター；および右（３’）レトロウイルスＬＴＲ；および任意選択でＷＰＲＥまたはＨＰＲＥを含む。
【０２９９】
特定の実施形態では、本発明の移入ベクターは、左（５’）レトロウイルスＬＴＲ；レトロウイルス輸送エレメント；本明細書において意図されているＣＡＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された、Ｔ細胞において活性なプロモーター；右（３’）レトロウイルスＬＴＲ；およびポリ（Ａ）配列；および任意選択でＷＰＲＥまたはＨＰＲＥを含む。別の特定の実施形態では、本発明は、左（５’）ＬＴＲ；ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ；ＲＲＥ；本明細書において意図されているＣＡＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された、Ｔ細胞において活性なプロモーター；右（３’）ＬＴＲ；およびポリアデニル化配列；および任意選択でＷＰＲＥまたはＨＰＲＥを含むレンチウイルスベクターを提供する。
【０３００】
ある特定の実施形態では、本発明は、左（５’）ＨＩＶ−１  ＬＴＲ；プシー（Ψ）パッケージングシグナル；ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ；ＲＲＥ；本明細書において意図されているＣＡＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された、Ｔ細胞において活性なプロモーター；右（３’）自己不活性化（ＳＩＮ）ＨＩＶ−１  ＬＴＲ；およびウサギβ−グロビンポリアデニル化配列；および任意選択でＷＰＲＥまたはＨＰＲＥを含むレンチウイルスベクターを提供する。
【０３０１】
別の実施形態では、本発明は、少なくとも１個のＬＴＲ；中心ポリプリントラクト／ＤＮＡフラップ（ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ）；レトロウイルス輸送エレメント；および本明細書において意図されているＣＡＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された、Ｔ細胞において活性なプロモーター；および任意選択でＷＰＲＥまたはＨＰＲＥを含むベクターを提供する。
【０３０２】
特定の実施形態では、本発明は、少なくとも１個のＬＴＲ；ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ；ＲＲＥ；本明細書において意図されているＣＡＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された、Ｔ細胞において活性なプロモーター；およびポリアデニル化配列；および任意選択でＷＰＲＥまたはＨＰＲＥを含むベクターを提供する。
【０３０３】
ある特定の実施形態では、本発明は、少なくとも１個のＳＩＮ  ＨＩＶ−１  ＬＴＲ；プシー（Ψ）パッケージングシグナル；ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ；ＲＲＥ；本明細書において意図されているＣＡＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された、Ｔ細胞において活性なプロモーター；およびウサギβ−グロビンポリアデニル化配列；および任意選択でＷＰＲＥまたはＨＰＲＥを提供する。
【０３０４】
「宿主細胞」は、本発明の組換えベクターまたはポリヌクレオチドにより、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏでエレクトロポレーション、トランスフェクト、感染または形質導入された細胞を含む。宿主細胞は、パッケージング細胞、産生細胞およびウイルスベクターに感染した細胞を含むことができる。特定の実施形態では、本発明のウイルスベクターに感染した宿主細胞は、療法を必要とする被験体に投与される。ある特定の実施形態では、用語「標的細胞」は、宿主細胞と互換的に使用され、トランスフェクト、感染または形質導入された所望の細胞型の細胞を指す。好ましい実施形態では、標的細胞は、Ｔ細胞である。
【０３０５】
妥当なウイルス力価を達成するためには、多くの場合、大規模なウイルス粒子産生が必要である。ウイルス粒子は、ウイルス構造遺伝子および／またはアクセサリー遺伝子、例えば、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｖｐｘ、またはｎｅｆ遺伝子または他のレトロウイルス遺伝子を含むパッケージング細胞株に移入ベクターをトランスフェクトすることによって産生される。
【０３０６】
本明細書で使用される場合、「パッケージングベクター」という用語は、パッケージングシグナルを欠き、１種、２種、３種、４種またはそれ超のウイルス構造遺伝子および／またはアクセサリー遺伝子をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターまたはウイルスベクターを指す。一般には、パッケージング細胞にパッケージングベクターを含め、トランスフェクション、形質導入または感染によって細胞に導入する。トランスフェクション、形質導入または感染のための方法は当業者に周知である。本発明のレトロウイルス／レンチウイルス移入ベクターをパッケージング細胞株にトランスフェクション、形質導入または感染によって導入して、産生細胞または細胞株を生成することができる。本発明のパッケージングベクターは、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、リポフェクションまたは電気穿孔を含めた標準の方法によってヒト細胞または細胞株に導入することができる。一部の実施形態では、パッケージングベクターを、ネオマイシン、ハイグロマイシン、ピューロマイシン、ブラストサイジン、ゼオシン、チミジンキナーゼ、ＤＨＦＲ、ＧｌｎシンテターゼまたはＡＤＡなどの優性選択可能マーカーと一緒に細胞に導入し、その後、適切な薬物の存在下で選択し、クローンを単離する。選択可能マーカー遺伝子を、パッケージングベクターによりコードされる遺伝子と、例えば、ＩＲＥＳまたは自己切断性ウイルスペプチドによって物理的に連結することができる。
【０３０７】
ウイルスエンベロープタンパク質（ｅｎｖ）は、細胞株から生成される組換えレトロウイルスによって最終的に感染および形質転換することができる宿主細胞の範囲を決定する。ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＳＩＶ、ＦＩＶおよびＥＩＶなどのレンチウイルスの場合では、ｅｎｖタンパク質は、ｇｐ４１およびｇｐ１２０を含む。本発明のパッケージング細胞によって発現されるウイルスｅｎｖタンパク質は、以前記載されている通り、ウイルスｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子とは別のベクター上にコードされることが好ましい。
【０３０８】
本発明において使用することができるレトロウイルス由来のｅｎｖ遺伝子の実例としては、これらに限定されないが、ＭＬＶエンベロープ、１０Ａ１エンベロープ、ＢＡＥＶ、ＦｅＬＶ−Ｂ、ＲＤ１１４、ＳＳＡＶ、エボラ、センダイ、ＦＰＶ（家禽ペストウイルス）、およびインフルエンザウイルスエンベロープが挙げられる。同様に、ＲＮＡウイルス（例えば、Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｃａｌｃｉｖｉｒｉｄａｅ、Ａｓｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ、Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ、Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｂｉｒｎａｖｉｒｉｄａｅ、ＲｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅのＲＮＡウイルスファミリー）に由来するエンベロープ、ならびにＤＮＡウイルス（Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｃｉｒｃｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｐａｐｏｖａｖｉｒｉｄａｅ、Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ、Ｐｏｘｙｉｒｉｄａｅ、およびＩｒｉｄｏｖｉｒｉｄａｅのファミリー）に由来するエンベロープをコードする遺伝子を利用することができる。代表例としては、ＦｅＬＶ、ＶＥＥ、ＨＦＶＷ、ＷＤＳＶ、ＳＦＶ、狂犬病、ＡＬＶ、ＢＩＶ、ＢＬＶ、ＥＢＶ、ＣＡＥＶ、ＳＮＶ、ＣｈＴＬＶ、ＳＴＬＶ、ＭＰＭＶ、ＳＭＲＶ、ＲＡＶ、ＦｕＳＶ、ＭＨ２、ＡＥＶ、ＡＭＶ、ＣＴ１０、およびＥＩＡＶが挙げられる。
【０３０９】
他の実施形態では、本発明のウイルスをシュードタイピングするためのエンベロープタンパク質として、これらに限定されないが、以下のウイルスのいずれかが挙げられる：Ｈ１Ｎ１、Ｈ１Ｎ２、Ｈ３Ｎ２およびＨ５Ｎ１（トリインフルエンザ）などのＡ型インフルエンザ、Ｂ型インフルエンザ、Ｃ型インフルエンザウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｄ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、ロタウイルス、ノーウォークウイルス群の任意のウイルス、腸内アデノウイルス、パルボウイルス、デング熱ウイルス、サル痘、モノネガウイルス目、リッサウイルス、例えば、狂犬病ウイルス、ラゴスコウモリウイルス（Ｌａｇｏｓ  ｂａｔ  ｖｉｒｕｓ）、モコラウイルス（Ｍｏｋｏｌａ  ｖｉｒｕｓ）、ドゥベンヘイジウイルス（Ｄｕｖｅｎｈａｇｅ  ｖｉｒｕｓ）、ヨーロッパコウモリウイルス１＆２およびオーストラリアコウモリウイルスなど、エフェメロウイルス、ベシクロウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、ヘルペスウイルス、例えば、単純ヘルペスウイルス１型および２型、水痘帯状疱疹、サイトメガロウイルス、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、ヒトヘルペスウイルス（ＨＨＶ）、ヒトヘルペスウイルス６型および８型、ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）、パピローマウイルス、マウスガンマヘルペスウイルス、アレナウイルス、例えば、アルゼンチン出血熱ウイルス、ボリビア出血熱ウイルス、サビア関連出血熱ウイルス、ベネズエラ出血熱ウイルス、ラッサ熱ウイルス、マチュポウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）、Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄｉａｅ、例えば、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス、ハンタウイルス、腎症候群を伴う出血熱を引き起こすウイルス、リフトバレー熱ウイルス、エボラ出血熱およびマールブルグ出血熱を含めたＦｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ（フィロウイルス）、キャサヌール森林病（Ｋａｙｓａｎｕｒ  Ｆｏｒｅｓｔ  ｄｉｓｅａｓｅ）ウイルス、オムスク出血熱ウイルス、ダニ媒介脳炎を引き起こすウイルスを含めたＦｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ、ならびにＰａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ、例えば、ヘンドラウイルスおよびニバーウイルス、大痘瘡および小痘瘡（天然痘）、アルファウイルス、例えば、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、ＳＡＲＳ関連コロナウイルス（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ）、西ナイルウイルス、任意の脳炎を引き起こすウイルス。
【０３１０】
一実施形態では、本発明は、組換えレトロウイルス、例えば、ＶＳＶ−Ｇ糖タンパク質を用いてシュードタイピングされたレンチウイルスを産生するパッケージング細胞を提供する。
【０３１１】
「シュードタイプ」または「シュードタイピング」という用語は、本明細書で使用される場合、ウイルスエンベロープタンパク質が、好ましい特性を有する別のウイルスのエンベロープタンパク質で置換されたウイルスを指す。例えば、ＨＩＶエンベロープタンパク質（ｅｎｖ遺伝子によりコードされる）は通常ウイルスをＣＤ４＋提示細胞にターゲティングするので、ＨＩＶを水疱性口内炎ウイルスＧタンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）エンベロープタンパク質でシュードタイピングし、それにより、ＨＩＶをより広い範囲の細胞に感染させることを可能にすることができる。本発明の好ましい実施形態では、レンチウイルスエンベロープタンパク質をＶＳＶ−Ｇでシュードタイピングする。一実施形態では、本発明は、ＶＳＶ−Ｇエンベロープ糖タンパク質を用いてシュードタイピングした組換えレトロウイルス、例えば、レンチウイルスを産生するパッケージング細胞を提供する。
【０３１２】
本明細書で使用される場合、「パッケージング細胞株」という用語は、パッケージングシグナルを含有しないが、ウイルス粒子の正しいパッケージングに必要なウイルス構造タンパク質および複製酵素（例えば、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ）を安定にまたは一過性に発現する細胞株に関して使用される。本発明のパッケージング細胞を調製するために、任意の適切な細胞株を使用することができる。一般に、細胞は、哺乳動物細胞である。特定の実施形態では、パッケージング細胞株を作製するために使用する細胞は、ヒト細胞である。使用することができる適切な細胞株としては、例えば、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、Ｃ３Ｈ  １０Ｔ１／２細胞、ＦＬＹ細胞、Ｐｓｉ−２細胞、ＢＯＳＣ  ２３細胞、ＰＡ３１７細胞、ＷＥＨＩ細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＳＣ  １細胞、ＢＳＣ  ４０細胞、ＢＭＴ  １０細胞、ＶＥＲＯ細胞、Ｗ１３８細胞、ＭＲＣ５細胞、Ａ５４９細胞、ＨＴ１０８０細胞、２９３細胞、２９３Ｔ細胞、Ｂ−５０細胞、３Ｔ３細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＨｅｐＧ２細胞、Ｓａｏｓ−２細胞、Ｈｕｈ７細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｗ１６３細胞、２１１細胞、および２１１Ａ細胞が挙げられる。好ましい実施形態では、パッケージング細胞は、２９３細胞、２９３Ｔ細胞、またはＡ５４９細胞である。別の好ましい実施形態では、細胞は、Ａ５４９細胞である。
【０３１３】
本明細書で使用される場合、「産生細胞株」という用語は、パッケージング細胞株およびパッケージングシグナルを含む移入ベクター構築物を含む、組換えレトロウイルス粒子を産生することができる細胞株を指す。感染性ウイルス粒子およびウイルスストック溶液の作製は、従来の技法を使用して行うことができる。ウイルスストック溶液を調製する方法は当技術分野で公知であり、例えば、Ｙ．  Ｓｏｎｅｏｋａら（１９９５年）Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２３巻：６２８〜６３３頁、およびＮ．  Ｒ．  Ｌａｎｄａｕら（１９９２年）Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６６巻：５１１０〜５１１３頁によって例示されている。感染性ウイルス粒子は、従来の技法を使用してパッケージング細胞から収集することができる。例えば、感染性粒子は、当技術分野で公知の通り、細胞溶解、または細胞培養物の上清の収集により収集することができる。場合によって、所望であれば、収集されたウイルス粒子を精製することができる。適切な精製技法は、当業者に周知である。
【０３１４】
遺伝子（複数可）または他のポリヌクレオチド配列を、トランスフェクションではなく、レトロウイルスまたはレンチウイルスベクターを使用してウイルス感染によって送達することは、「形質導入」と称される。一実施形態では、レトロウイルスベクターを、感染およびプロウイルスの組み込みによって細胞に形質導入する。ある特定の実施形態では、標的細胞、例えば、Ｔ細胞は、ウイルスまたはレトロウイルスベクターを使用した感染によって細胞に送達された遺伝子または他のポリヌクレオチド配列を含む場合、「形質導入」されている。特定の実施形態では、形質導入された細胞は、細胞のゲノム内に、レトロウイルスまたはレンチウイルスベクターによって送達された１つまたは複数の遺伝子または他のポリヌクレオチド配列を含む。
【０３１５】
特定の実施形態では、１つまたは複数のポリペプチドを発現する本発明のウイルスベクターを用いて形質導入を行った宿主細胞を、Ｂ細胞悪性疾患を治療および／または予防するために被験体に投与する。本発明のある特定の実施形態に従って利用することができる、遺伝子療法におけるウイルスベクターの使用に関する他の方法は、例えば、Ｋａｙ，  Ｍ．  Ａ．（１９９７年）Ｃｈｅｓｔ  １１１巻（補遺６号）：１３８Ｓ〜１４２Ｓ頁；Ｆｅｒｒｙ，  Ｎ．およびＨｅａｒｄ，  Ｊ．  Ｍ．（１９９８年）Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ９巻：１９７５〜８１頁；Ｓｈｉｒａｔｏｒｙ，  Ｙ．ら（１９９９年）Ｌｉｖｅｒ  １９巻：２６５〜７４頁；Ｏｋａ，  Ｋ．ら（２０００年）Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｌｉｐｉｄｏｌ．  １１巻：１７９〜８６頁；Ｔｈｕｌｅ，  Ｐ．  Ｍ．およびＬｉｕ，  Ｊ．  Ｍ．（２０００年）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ７巻：１７４４〜５２頁；Ｙａｎｇ，  Ｎ．  Ｓ．（１９９２年）Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １２巻：３３５〜５６頁；Ａｌｔ，  Ｍ．（１９９５年）Ｊ．  Ｈｅｐａｔｏｌ．  ２３巻：７４６〜５８頁；Ｂｒｏｄｙ，  Ｓ．  Ｌ．およびＣｒｙｓｔａｌ，  Ｒ．  Ｇ．（１９９４年）Ａｎｎ．  Ｎ．Ｙ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ７１６巻：９０〜１０１頁；Ｓｔｒａｙｅｒ，  Ｄ．  Ｓ．（１９９９年）Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．  Ｄｒｕｇｓ  ８巻：２１５９〜２１７２頁；Ｓｍｉｔｈ−Ａｒｉｃａ，  Ｊ．  Ｒ．およびＢａｒｔｌｅｔｔ，  Ｊ．  Ｓ．（２００１年）Ｃｕｒｒ．  Ｃａｒｄｉｏｌ．  Ｒｅｐ．  ３巻：４３〜４９頁；およびＬｅｅ，  Ｈ．  Ｃ．ら（２０００年）Ｎａｔｕｒｅ  ４０８巻：４８３〜８頁に見いだすことができる。
【０３１６】
Ｇ．遺伝子改変された細胞
本発明は、特定の実施形態では、Ｂ細胞関連状態の治療における使用のための、本明細書において意図されているＣＡＲを発現するように遺伝子改変された細胞を意図する。本明細書で使用される場合、用語「遺伝子工学的に作製された」または「遺伝子改変された」は、細胞における総遺伝物質へのＤＮＡまたはＲＮＡの形態の余分な遺伝物質の付加を指す。用語「遺伝子改変された細胞」、「改変された細胞」および「向け直された細胞」は、互換的に使用される。本明細書で使用される場合、用語「遺伝子療法」は、遺伝子の発現を回復、補正もしくは改変する、または治療用ポリペプチド、例えば、ＣＡＲを発現する目的の、細胞における総遺伝物質へのＤＮＡまたはＲＮＡの形態の余分な遺伝物質の導入を指す。
【０３１７】
特定の実施形態では、本明細書において意図されているＣＡＲは、目的の標的抗原、例えば、ＢＣＭＡポリペプチドへとその特異性を向け直すことができるように、免疫エフェクター細胞に導入および発現される。「免疫エフェクター細胞」は、１種または複数のエフェクター機能（例えば、細胞傷害性細胞殺傷活性、サイトカインの分泌、ＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣの誘導）を有する免疫系の任意の細胞である。
【０３１８】
本発明の免疫エフェクター細胞は、自己由来／自原性（「自己」）または非自己由来（「非自己」、例えば、同種異系、同系または異種）であってもよい。
【０３１９】
「自己由来」は、本明細書で使用される場合、同じ被験体由来の細胞を指す。
【０３２０】
「同種異系」は、本明細書で使用される場合、比較している細胞とは遺伝的に異なる同じ種の細胞を指す。
【０３２１】
「同系」は、本明細書で使用される場合、比較している細胞と遺伝的に同一である異なる被験体の細胞を指す。
【０３２２】
「異種」は、本明細書で使用される場合、比較している細胞とは異なる種の細胞を指す。好ましい実施形態では、本発明の細胞は、同種異系である。
【０３２３】
本明細書において意図されているＣＡＲと共に使用される例示的な免疫エフェクター細胞は、Ｔリンパ球を含む。用語「Ｔ細胞」または「Ｔリンパ球」は、当技術分野で認識されており、胸腺細胞、未成熟Ｔリンパ球、成熟Ｔリンパ球、休止Ｔリンパ球または活性化Ｔリンパ球を含むものとする。Ｔ細胞は、Ｔヘルパー（Ｔｈ）細胞、例えば、Ｔヘルパー１（Ｔｈ１）またはＴヘルパー２（Ｔｈ２）細胞であり得る。Ｔ細胞は、ヘルパーＴ細胞（ＨＴＬ；ＣＤ４＋Ｔ細胞）ＣＤ４＋Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ；ＣＤ８＋Ｔ細胞）、ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４−ＣＤ８−Ｔ細胞またはＴ細胞の任意の他のサブセットであり得る。特定の実施形態における使用に適したＴ細胞の他の例示的な集団は、ナイーブＴ細胞およびメモリーＴ細胞を含む。
【０３２４】
当業者によって理解される通り、本明細書に記載されているＣＡＲによる免疫エフェクター細胞として他の細胞を使用することもできる。特に、免疫エフェクター細胞は、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、好中球およびマクロファージも含む。免疫エフェクター細胞は、エフェクター細胞の前駆体も含み、このような前駆細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで免疫エフェクター細胞に分化するように誘導することができる。よって、特定の実施形態では、免疫エフェクター細胞は、被験体における投与の際に成熟免疫エフェクター細胞に分化する、または成熟免疫エフェクター細胞に分化するようにｉｎ  ｖｉｔｒｏで誘導され得る、臍帯血、骨髄または動員された末梢血に由来する細胞のＣＤ３４＋集団内に含有される造血幹細胞（ＨＳＣ）など、免疫エフェクター細胞の前駆体を含む。
本明細書で使用される場合、ＢＣＭＡ特異的ＣＡＲを含有するように遺伝子工学的に作製された免疫エフェクター細胞は、「ＢＣＭＡ特異的な向け直された免疫エフェクター細胞」と称することができる。
【０３２５】
用語「ＣＤ３４＋細胞」は、本明細書で使用される場合、その細胞表面においてＣＤ３４タンパク質を発現する細胞を指す。「ＣＤ３４」は、本明細書で使用される場合、細胞−細胞接着因子として作用することが多い細胞表面糖タンパク質（例えば、シアロムチンタンパク質）を指し、リンパ節へのＴ細胞進入に関与する。ＣＤ３４＋細胞集団は、患者への投与の際に、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、好中球および単球／マクロファージ系列の細胞を含む全造血系列に分化および寄与する、造血幹細胞（ＨＳＣ）を含有する。
【０３２６】
本発明は、本明細書において意図されているＣＡＲを発現する免疫エフェクター細胞を作製するための方法を提供する。一実施形態では、本方法は、免疫エフェクター細胞が、本明細書に記載されている１種または複数のＣＡＲを発現するように、個体から単離された免疫エフェクター細胞をトランスフェクトまたは形質導入するステップを含む。ある特定の実施形態では、免疫エフェクター細胞は、個体から単離され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでさらに操作されることなく遺伝子改変される。次いで、このような細胞は、個体に直接的に再投与することができる。さらなる実施形態では、免疫エフェクター細胞は、ＣＡＲを発現するように遺伝子改変される前に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖するようにまず活性化および刺激される。この点に関して、免疫エフェクター細胞は、遺伝子改変（すなわち、本明細書において意図されているＣＡＲを発現するように形質導入またはトランスフェクト）する前および／または後に培養することができる。
【０３２７】
特定の実施形態では、本明細書に記載されている免疫エフェクター細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ操作または遺伝的改変に先立ち、細胞の供給源は、被験体から得られる。特定の実施形態では、ＣＡＲ改変免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞を含む。Ｔ細胞は、これらに限定されないが、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位由来の組織、腹水、胸水、脾臓組織および腫瘍を含めたいくつかの供給源から得ることができる。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞は、沈降、例えば、ＦＩＣＯＬＬ（商標）分離など、当業者に公知のいくつもの技法を使用して、被験体から収集される血液の単位から得ることができる。一実施形態では、個体の循環血由来の細胞は、アフェレーシスによって得られる。アフェレーシス産物は、典型的には、Ｔ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核白血球、赤血球および血小板を含むリンパ球を含有する。一実施形態では、アフェレーシスによって収集した細胞を、血漿画分を除去するため、およびその後の加工処理のために適切な緩衝液または培地中に細胞を置くために洗浄することができる。細胞は、ＰＢＳで、またはカルシウム、マグネシウムおよび他の全てではないが大多数の二価カチオンを欠く別の適切な溶液で洗浄することができる。当業者によって認められる通り、洗浄ステップは、半自動フロースルー遠心分離機の使用によるなど、当業者に公知の方法によって達成することができる。例えば、Ｃｏｂｅ  ２９９１細胞プロセッサー、Ｂａｘｔｅｒ  ＣｙｔｏＭａｔｅなど。洗浄後に、細胞は、様々な生体適合性緩衝液または緩衝液を含むか含まない他の食塩溶液に再懸濁することができる。ある特定の実施形態では、細胞が直接的に再懸濁された培養培地におけるアフェレーシス試料の望ましくない構成成分を除去することができる。
【０３２８】
ある特定の実施形態では、Ｔ細胞は、赤血球を溶解し、例えば、ＰＥＲＣＯＬＬ（商標）勾配による遠心分離によって単球を枯渇させることにより、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離される。次のマーカー：ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ４５ＲＯのうち１種または複数を発現するＴ細胞の特異的亜集団は、正のまたは負の選択技法によってさらに単離することができる。一実施形態では、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ４５ＲＯを発現するＴ細胞の特異的亜集団は、正のまたは負の選択技法によってさらに単離される。例えば、負の選択によるＴ細胞集団の濃縮は、負に選択された細胞に特有の表面マーカーに対する抗体の組合せにより達成することができる。本明細書における使用のための一方法は、負に選択された細胞上に存在する細胞表面マーカーに対するモノクローナル抗体のカクテルを使用する、負の磁性免疫接着またはフローサイトメトリーによる細胞選別および／または選択である。例えば、負の選択によりＣＤ４＋細胞を濃縮するために、モノクローナル抗体カクテルは、典型的には、ＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＨＬＡ−ＤＲおよびＣＤ８に対する抗体を含む。フローサイトメトリーおよび細胞選別を使用して、本発明における使用のための目的の細胞集団を単離することもできる。
【０３２９】
ＰＢＭＣは、本明細書において意図されている方法を使用して、ＣＡＲを発現するように直接的に遺伝子改変することができる。ある特定の実施形態では、ＰＢＭＣの単離後に、Ｔリンパ球は、さらに単離され、ある特定の実施形態では、細胞傷害性およびヘルパーＴリンパ球の両方は、遺伝的改変および／または増大の前または後のいずれかに、ナイーブ、メモリーおよびエフェクターＴ細胞亜集団へと選別することができる。
【０３３０】
ＣＤ８＋細胞は、標準方法を使用して得ることができる。一部の実施形態では、ＣＤ８＋細胞は、ＣＤ８＋細胞の型のそれぞれに関連する細胞表面抗原を同定することにより、ナイーブ、セントラルメモリーおよびエフェクター細胞へとさらに選別される。
【０３３１】
ある特定の実施形態では、ナイーブＣＤ８＋Ｔリンパ球は、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ１２７およびＣＤ４５ＲＡを含むナイーブＴ細胞の表現型マーカーの発現によって特徴付けられる。
【０３３２】
特定の実施形態では、メモリーＴ細胞は、ＣＤ８＋末梢血リンパ球のＣＤ６２Ｌ＋およびＣＤ６２Ｌ−サブセットの両方に存在する。ＰＢＭＣは、抗ＣＤ８および抗ＣＤ６２Ｌ抗体による染色後に、ＣＤ６２Ｌ−ＣＤ８＋およびＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ８＋画分へと選別される。一部の実施形態では、セントラルメモリーＴ細胞の表現型マーカーの発現は、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ３およびＣＤ１２７を含み、グランザイムＢについて陰性である。一部の実施形態では、セントラルメモリーＴ細胞は、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ８＋Ｔ細胞である。
【０３３３】
一部の実施形態では、エフェクターＴ細胞は、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８およびＣＤ１２７については陰性であり、グランザイムＢおよびパーフォリンについては陽性である。
【０３３４】
ある特定の実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、亜集団へとさらに選別される。例えば、ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞は、細胞表面抗原を有する細胞集団を同定することにより、ナイーブ、セントラルメモリーおよびエフェクター細胞へと選別することができる。ＣＤ４＋リンパ球は、標準方法によって得ることができる。一部の実施形態では、ナイーブＣＤ４＋Ｔリンパ球は、ＣＤ４５ＲＯ−、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞である。一部の実施形態では、セントラルメモリーＣＤ４＋細胞は、ＣＤ６２Ｌ陽性およびＣＤ４５ＲＯ陽性である。一部の実施形態では、エフェクターＣＤ４＋細胞は、ＣＤ６２ＬおよびＣＤ４５ＲＯ陰性である。
【０３３５】
Ｔ細胞など、免疫エフェクター細胞は、公知方法を使用して単離後に遺伝子改変することができる、または免疫エフェクター細胞は、遺伝子改変に先立ちｉｎ  ｖｉｔｒｏで活性化および増大（または前駆体の場合は分化）することができる。特定の実施形態では、Ｔ細胞など、免疫エフェクター細胞は、本明細書において意図されているキメラ抗原受容体により遺伝子改変（例えば、ＣＡＲをコードする核酸を含むウイルスベクターにより形質導入）され、次いでｉｎ  ｖｉｔｒｏで活性化および増大される。種々の実施形態では、Ｔ細胞は、例えば、米国特許第６，３５２，６９４号；同第６，５３４，０５５号；同第６，９０５，６８０号；同第６，６９２，９６４号；同第５，８５８，３５８号；同第６，８８７，４６６号；同第６，９０５，６８１号；同第７，１４４，５７５号；同第７，０６７，３１８号；同第７，１７２，８６９号；同第７，２３２，５６６号；同第７，１７５，８４３号；同第５，８８３，２２３号；同第６，９０５，８７４号；同第６，７９７，５１４号；同第６，８６７，０４１号；および米国特許出願公開第２００６０１２１００５号に記載されている方法を使用して、ＣＡＲを発現するための遺伝的改変の前または後に活性化および増大させることができる。
【０３３６】
一般に、Ｔ細胞は、Ｔ細胞の表面における共刺激分子を刺激するＣＤ３  ＴＣＲ複合体関連シグナルおよびリガンドを刺激する薬剤を取り付けた表面と接触させることにより増大される。Ｔ細胞集団は、表面に固定化された抗ＣＤ３抗体もしくはその抗原結合性断片または抗ＣＤ２抗体と接触させることにより、あるいはカルシウムイオノフォアと併せたタンパク質キナーゼＣ活性化因子（例えば、ブリオスタチン）と接触させることにより刺激することができる。Ｔ細胞の表面におけるアクセサリー分子の共刺激も意図される。
【０３３７】
特定の実施形態では、ＰＢＭＣまたは単離されたＴ細胞は、ＩＬ−２、ＩＬ−７および／またはＩＬ−１５など、適切なサイトカインを有する培養培地において、ビーズまたは他の表面に一般に取り付けられた抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体など、刺激剤および共刺激剤と接触させる。ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞のいずれかの増殖を刺激するために、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体が用いられる。抗ＣＤ２８抗体の例として、９．３、Ｂ−Ｔ３、ＸＲ−ＣＤ２８（Ｄｉａｃｉｏｎｅ、Ｂｅｓａｎｃｏｎ、Ｆｒａｎｃｅ）が挙げられ、当技術分野で一般的に公知の他の方法と同様に使用することができる（Ｂｅｒｇら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  Ｐｒｏｃ．３０巻（８号）：３９７５〜３９７７頁、１９９８年；Ｈａａｎｅｎら、Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．１９０巻（９号）：１３１９１３２８頁、１９９９年；Ｇａｒｌａｎｄら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈ．２２７巻（１〜２号）：５３〜６３頁、１９９９年）。同じビーズに取り付けられた抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体は、「代理」抗原提示細胞（ＡＰＣ）として機能する。他の実施形態では、ＵＳ６０４０１７７；ＵＳ５８２７６４２；およびＷＯ２０１２１２９５１４に記載されている方法などの方法を使用して、Ｔ細胞を活性化および刺激して、フィーダー細胞および適切な抗体およびサイトカインと共に増殖させることができる。
【０３３８】
他の実施形態では、人工ＡＰＣ（ａＡＰＣ）は、様々な共刺激分子およびサイトカインの安定的な発現および分泌を導くようにＫ５６２、Ｕ９３７、７２１．２２１、Ｔ２およびＣ１Ｒ細胞を工学的に作製することにより作製される。特定の実施形態では、Ｋ３２またはＵ３２  ａＡＰＣは、ａＡＰＣ細胞表面における１種または複数の抗体に基づく刺激性分子の提示を導くように使用される。ａＡＰＣにおける遺伝子の種々の組合せの発現は、特異的成長要件および別個の機能を有するＴ細胞サブセットの最適な繁殖のためにａＡＰＣを調節することができるように、ヒトＴ細胞活性化要件の正確な決定を可能にする。ａＡＰＣは、天然ＡＰＣの使用とは対照的に、外因的サイトカインの添加を必要としない、機能的ヒトＣＤ８  Ｔ細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ成長および長期増大を支持する。Ｔ細胞の集団は、これらに限定されないが、ＣＤ１３７Ｌ（４−１ＢＢＬ）、ＣＤ１３４Ｌ（ＯＸ４０Ｌ）および／またはＣＤ８０もしくはＣＤ８６を含めた、様々な共刺激分子を発現するａＡＰＣによって増大させることができる。最後に、ａＡＰＣは、遺伝子改変されたＴ細胞を増大させ、ＣＤ８  Ｔ細胞におけるＣＤ２８発現を維持するための効率的なプラットフォームを提供する。ＷＯ０３／０５７１７１およびＵＳ２００３／０１４７８６９に提供されているａＡＰＣは、これらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０３３９】
一実施形態では、ＣＤ３４＋細胞は、本発明に従った核酸構築物を形質導入される。ある特定の実施形態では、形質導入されたＣＤ３４＋細胞は、被験体、一般に、この細胞が本来単離された被験体への投与後に、ｉｎ  ｖｉｖｏで成熟免疫エフェクター細胞に分化する。別の実施形態では、ＣＤ３４＋細胞は、以前に記載された方法（Ａｓｈｅｕｅｒら、２００４年；Ｉｍｒｅｎら、２００４年）に従って、次のサイトカイン：Ｆｌｔ−３リガンド（ＦＬＴ３）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、巨核球増殖分化因子（ＴＰＯ）、ＩＬ−３およびＩＬ−６のうち１種または複数により、本明細書に記載されているＣＡＲへの曝露に先立ち、またはそれによる遺伝子改変後に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで刺激することができる。
【０３４０】
本発明は、がんの治療のための改変された免疫エフェクター細胞の集団であって、改変された免疫エフェクター細胞が、本明細書に開示されているＣＡＲを含む集団を提供する。例えば、改変された免疫エフェクター細胞の集団は、本明細書に記載されているＢ細胞悪性疾患と診断された患者から得られる末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から調製される（自己由来ドナー）。ＰＢＭＣは、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、またはＣＤ４＋およびＣＤ８＋であり得るＴリンパ球の不均一集団を形成する。
【０３４１】
ＰＢＭＣは、ＮＫ細胞またはＮＫＴ細胞など、他の細胞傷害性リンパ球を含むこともできる。本明細書において意図されているＣＡＲのコード配列を保持する発現ベクターは、ヒトドナーＴ細胞、ＮＫ細胞またはＮＫＴ細胞の集団に導入することができる。発現ベクターを保持する成功裏に形質導入されたＴ細胞は、抗ＣＤ３抗体および／もしくは抗ＣＤ２８抗体ならびにＩＬ−２を使用した細胞活性化、または本明細書の他の箇所に記載されている当技術分野で公知の任意の他の方法に加えて、ＣＤ３陽性Ｔ細胞を単離するためのフローサイトメトリーを使用して選別し、次いでさらに繁殖させて、これらのＣＡＲタンパク質を発現するＴ細胞の数を増加させることができる。標準手順は、ヒト被験体における使用のための貯蔵および／または調製のための、ＣＡＲタンパク質を発現するＴ細胞の凍結保存のために使用される。一実施形態では、Ｔ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ形質導入、培養および／または増大は、ウシ胎仔血清およびウシ胎児血清など、非ヒト動物由来産物の非存在下で行われる。ＰＢＭＣの不均一集団は、遺伝子改変されているため、その結果得られる形質導入細胞は、本明細書において意図されているＣＡＲを標的化するＢＣＭＡを含む改変された細胞の不均一集団である。
【０３４２】
さらなる実施形態では、免疫エフェクター細胞のドナー集団の遺伝子改変において、例えば、１、２、３、４、５種またはそれを超える異なる発現ベクターの混合物を使用することができ、各ベクターは、本明細書において意図されている異なるキメラ抗原受容体タンパク質をコードする。その結果得られる改変された免疫エフェクター細胞は、ある割合で２種以上の異なるＣＡＲタンパク質を発現する改変された細胞を有する改変された細胞の混合集団を形成する。
【０３４３】
一実施形態では、本発明は、ＢＣＭＡタンパク質を標的化する、遺伝子改変されたマウス、ヒトまたはヒト化ＣＡＲタンパク質発現免疫エフェクター細胞を貯蔵する方法であって、細胞が解凍の際に生存可能なままであるように、免疫エフェクター細胞を凍結保存するステップを含む方法を提供する。ＣＡＲタンパク質を発現する免疫エフェクター細胞の一部を、当技術分野で公知の方法によって凍結保存して、Ｂ細胞関連状態を患う患者の将来的な治療のためにこのような細胞の永続的な供給源を提供することができる。必要に応じて、凍結保存された形質転換免疫エフェクター細胞を解凍し、成長させ、より多くのこのような細胞を得るために増大させることができる。
【０３４４】
本明細書で使用される場合、「凍結保存」は、（典型的には）７７Ｋまたは−１９６℃（液体窒素の沸点）など、氷点下（ｓｕｂ−ｚｅｒｏ）の温度まで冷却することによる細胞の保存を指す。氷点下の温度において、凍結保護剤が頻繁に使用されて、保存されている細胞が低温における凍結または室温への加温により損傷を受けることを防止する。凍結保存剤および最適冷却速度は、細胞傷害から保護することができる。使用することができる凍結保護剤として、これらに限定されないが、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（ＬｏｖｅｌｏｃｋおよびＢｉｓｈｏｐ、Ｎａｔｕｒｅ、１９５９年；１８３巻：１３９４〜１３９５頁；Ａｓｈｗｏｏｄ−Ｓｍｉｔｈ、Ｎａｔｕｒｅ、１９６１年；１９０巻：１２０４〜１２０５頁）、グリセロール、ポリビニルピロリドン（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｅ）（Ｒｉｎｆｒｅｔ、Ａｎｎ．  Ｎ．Ｙ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．、１９６０年；８５巻：５７６頁）およびポリエチレングリコール（ＳｌｏｖｉｔｅｒおよびＲａｖｄｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ、１９６２年；１９６巻：４８頁）が挙げられる。好ましい冷却速度は、１°〜３℃／分である。少なくとも２時間後、Ｔ細胞は、−８０℃の温度に達し、長期低温貯蔵用貯蔵容器内など、永久貯蔵のために液体窒素（−１９６℃）中に直接的に置くことができる。
【０３４５】
Ｈ．組成物および製剤
本明細書において意図されている組成物は、本明細書において意図されている１種または複数のポリペプチド、ポリヌクレオチド、これを含むベクター、遺伝子改変された免疫エフェクター細胞などを含むことができる。組成物として、これらに限定されないが、医薬組成物が挙げられる。「医薬組成物」は、単独で、または１種もしくは複数の他の治療様式と組み合わせて、細胞または動物への投与のための薬学的に許容されるまたは生理的に許容される溶液において製剤化された組成物を指す。所望される場合、本発明の組成物を、例えば、サイトカイン、増殖因子、ホルモン、小分子、化学療法薬、プロドラッグ、薬物、抗体または他の種々の薬学的に活性な薬剤など、同様に他の薬剤と組み合わせて投与してよいことも理解されるであろう。追加的な薬剤が、意図される療法を送達する組成物の能力に有害に影響を与えない条件で、組成物に含めることができる他の構成成分に関して実質的に制限はない。
【０３４６】
「薬学的に許容される」という句は、本明細書では、健全な医学的判断の範囲内で、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題または合併症を伴わずにヒトおよび動物の組織と接触させて使用するのに適した、妥当な損益比に見合う化合物、材料、組成物、および／または剤形を指すために使用される。
【０３４７】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤」としては、限定することなく、米国食品医薬品局により、ヒトまたは家畜動物における使用に関して許容されるとして認可を受けている任意のアジュバント、担体、賦形剤、流動促進剤（ｇｌｉｄａｎｔ）、甘味剤、希釈剤、防腐剤、色素／着色剤、香味増強剤（ｆｌａｖｏｒ  ｅｎｈａｎｃｅｒ）、界面活性剤、湿潤剤、分散剤、懸濁化剤、安定剤、等張剤（ｉｓｏｔｏｎｉｃ  ａｇｅｎｔ）、溶媒、界面活性剤、または乳化剤が挙げられる。例示的な薬学的に許容される担体としては、これらに限定されないが、糖、例えば、ラクトース、グルコースおよびスクロースなど；デンプン、例えば、トウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプンなど；セルロースおよびその誘導体、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロースなど；トラガント；麦芽；ゼラチン；タルク；カカオバター、ろう、動物性および植物性脂肪、パラフィン、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、酸化亜鉛；油、例えば、ピーナッツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油およびダイズ油など；グリコール、例えば、プロピレングリコールなど；ポリオール、例えば、グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコールなど；エステル、例えば、オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなど；寒天；緩衝剤、例えば、水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなど；アルギン酸；発熱物質不含水；等張性の食塩水；リンゲル液；エチルアルコール；リン酸緩衝溶液；および医薬製剤に使用される任意の他の適合する物質が挙げられる。
【０３４８】
特定の実施形態では、本発明の組成物は、ある量の本明細書において意図されているＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞を含む。本明細書で使用される場合、用語「量」は、臨床結果を含む有益なまたは所望の予防的または治療的結果を達成するのに「有効な量」または「有効量」の遺伝子改変された治療用細胞、例えば、Ｔ細胞を指す。
【０３４９】
「予防有効量」は、所望の予防的結果を達成するのに有効な遺伝子改変された治療用細胞の量を指す。必要ではないが典型的に、予防的用量は、疾患に先立ってまたはその初期段階で被験体において使用されるため、予防有効量は、治療有効量より少ない。
【０３５０】
遺伝子改変された治療用細胞の「治療有効量」は、個体の疾患状態、年齢、性別および体重、ならびに個体における所望の応答を誘発する幹細胞および前駆細胞の能力などの因子に応じて変動し得る。治療有効量は、ウイルスまたは形質導入される治療用細胞のいかなる有毒または有害効果よりも治療有益効果が上回る量でもある。用語「治療有効量」は、被験体（例えば、患者）を「治療」するのに有効な量を含む。治療量が示される場合、投与するべき本発明の組成物の正確な量は、年齢、体重、腫瘍サイズ、感染または転移の程度、および患者（被験体）の状態の個体差を考慮しつつ、医師によって決定することができる。一般に、本明細書に記載されているＴ細胞を含む医薬組成物は、範囲内のあらゆる整数値を含む、体重１ｋｇ当たり細胞１０２〜１０１０個、好ましくは体重１ｋｇ当たり細胞１０５〜１０６個の投薬量で投与することができることが規定され得る。細胞の数は、組成物に含まれる細胞型と同様に、組成物の意図された最終的な使用に左右される。本明細書に提供される使用に関して、細胞は、一般に、１リットルまたはそれ未満の体積であり、５００ｍＬまたはそれ未満、さらには２５０ｍＬまたは１００ｍＬまたはそれ未満であってよい。したがって、所望の細胞の密度は、典型的には、１ｍｌ当たり細胞１０６個超であり、一般に、１ｍｌ当たり細胞１０７個超、一般に、１ｍｌ当たり細胞１０８個またはそれ超である。免疫細胞の臨床的に関連がある数は、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１または１０１２個の細胞に累積的に等しいまたはこれを超える多数の注入に配分することができる。本発明の一部の態様では、特に、注入された細胞の全てが、特定の標的抗原に向け直されるため、１０６／キログラム（患者当たり１０６〜１０１１）の範囲内の、より少数の細胞を投与することができる。ＣＡＲ発現細胞組成物は、これらの範囲内の投薬量で複数回投与することができる。細胞は、療法を受けている患者にとって同種異系、同系、異種または自己由来であってもよい。所望であれば、治療は、免疫応答の誘導を増強するために、本明細書に記載されている通り、マイトジェン（例えば、ＰＨＡ）またはリンホカイン、サイトカインおよび／またはケモカイン（例えば、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−アルファ、ＩＬ−１８およびＴＮＦ−ベータ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１３、Ｆｌｔ３−Ｌ、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ１αなど）の投与を含むこともできる。
【０３５１】
一般に、本明細書に記載されている通りに活性化および増大された細胞を含む組成物は、免疫無防備状態の個体に生じる疾患の治療および予防において利用することができる。特に、本明細書において意図されているＣＡＲ改変Ｔ細胞を含む組成物は、Ｂ細胞悪性疾患の治療において使用される。本発明のＣＡＲ改変Ｔ細胞は、単独で、あるいは担体、希釈剤、賦形剤、および／またはＩＬ−２もしくは他のサイトカインもしくは細胞集団などの他の構成成分と組み合わせた医薬組成物として投与することができる。特定の実施形態では、本明細書において意図されている医薬組成物は、１種または複数の薬学的または生理的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と組み合わせて、ある量の遺伝子改変されたＴ細胞を含む。
【０３５２】
Ｔ細胞など、ＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞集団を含む本発明の医薬組成物は、中性緩衝食塩水、リン酸緩衝食塩水などの緩衝液；グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン、マンニトールなどの炭水化物；タンパク質；ポリペプチドまたはグリシンなどのアミノ酸；抗酸化剤；ＥＤＴＡまたはグルタチオンなどのキレート剤；アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）；および保存料を含むことができる。本発明の組成物は、好ましくは、非経口的投与、例えば、血管内（静脈内または動脈内）、腹腔内または筋肉内投与のために製剤化される。
【０３５３】
液体の医薬組成物は、溶液か、懸濁物か、または他の同様の形態であるかにかかわらず、以下のうちの１つまたは複数を含んでよい：滅菌希釈剤、例えば、注射用水、食塩溶液、好ましくは生理的食塩水、リンゲル液、等張性塩化ナトリウム、溶媒または懸濁媒体としての機能を果たし得る合成モノグリセリドまたはジグリセリドなどの不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の溶媒；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート化剤；酢酸、クエン酸またはリン酸などの緩衝液、および、張度を調整するための薬剤、例えば、塩化ナトリウムまたはデキストロースなど。非経口的調製物は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジまたは複数用量バイアルに封入することができる。注射用医薬組成物は、好ましくは無菌である。
【０３５４】
特定の実施形態では、本明細書において意図されている組成物は、有効量のＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞を単独で、または１種もしくは複数の治療剤と組み合わせて含む。よって、ＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞組成物は、単独で、または放射線療法、化学療法、移植、免疫療法、ホルモン療法、光ダイナミック療法など、他の公知のがん治療と組み合わせて投与することができる。組成物は、抗生物質と組み合わせて投与することもできる。このような治療剤は、特定のがんなど、本明細書に記載されている特定の疾患状態のための標準治療として、当技術分野で許容することができる。意図される例示的な治療剤は、サイトカイン、増殖因子、ステロイド、ＮＳＡＩＤ、ＤＭＡＲＤ、抗炎症薬、化学療法薬、放射線療法薬、治療用抗体または他の活性および補助的薬剤を含む。
【０３５５】
ある特定の実施形態では、本明細書に開示されているＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞を含む組成物は、いくつもの化学療法剤と併せて投与することができる。化学療法剤の実例として、チオテパおよびシクロホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ（商標））など、アルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファン（ｐｉｐｏｓｕｌｆａｎ）など、スルホン酸アルキル；ベンゾドパ、カルボコン、メツレドパ（ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）およびウレドパ（ｕｒｅｄｏｐａ）など、アジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド（ｐｈｏｓｐｈａｏｒａｍｉｄｅ）およびトリメチロールメラミン（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｏｌｏｍｅｌａｍｉｎｅ）レジューム（ｒｅｓｕｍｅ）を含むエチレンイミンおよびメチロールメラミン（ｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅ）；クロラムブシル、クロルナファジン（ｃｈｌｏｒｎａｐｈａｚｉｎｅ）、コロホスファミド（ｃｈｏｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノボビオシン、フェネステリン（ｐｈｅｎｅｓｔｅｒｉｎｅ）、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードなど、ナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチンなど、ニトロソウレア（ｎｉｔｒｏｓｕｒｅａ）；アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オースラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリチアマイシン、カラビシン（ｃａｒａｂｉｃｉｎ）、カルミノマイシン（ｃａｒｍｉｎｏｍｙｃｉｎ）、カルジノフィリン（ｃａｒｚｉｎｏｐｈｉｌｉｎ）、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン（ｄｅｔｏｒｕｂｉｃｉｎ）、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ロドルビシン（ｒｏｄｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシンなど、抗生物質；メトトレキセートおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）など、代謝拮抗薬；デノプテリン（ｄｅｎｏｐｔｅｒｉｎ）、メトトレキセート、プテロプテリン（ｐｔｅｒｏｐｔｅｒｉｎ）、トリメトレキセートなど、葉酸アナログ；フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン（ｔｈｉａｍｉｐｒｉｎｅ）、チオグアニンなど、プリンアナログ；アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン、５−ＦＵなど、ピリミジンアナログ；カルステロン（ｃａｌｕｓｔｅｒｏｎｅ）、ドロモスタノロンプロピオン酸塩、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなど、アンドロゲン；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンなど、抗副腎薬（ａｎｔｉ−ａｄｒｅｎａｌ）；フロリン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）など、葉酸補充薬；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル；ビスアントレン（ｂｉｓａｎｔｒｅｎｅ）；エダトレキセート；デフォファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）；デメコルチン；ジアジコン（ｄｉａｚｉｑｕｏｎｅ）；エルフォルミチン（ｅｌｆｏｒｍｉｔｈｉｎｅ）；エリプチニウム酢酸塩（ｅｌｌｉｐｔｉｎｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ）；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダミン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメット（ｐｈｅｎａｍｅｔ）；ピラルビシン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）；ラゾキサン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２”−トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えば、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、Ｎ．Ｊ．）およびドセタキセル（ｄｏｘｅｔａｘｅｌ）（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）、Ｒｈｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｒｅｒ、Ａｎｔｏｎｙ、Ｆｒａｎｃｅ）；クロラムブシル；ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；シスプラチンおよびカルボプラチンなど、白金アナログ；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン；ノバントロン（ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ）；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；ＣＰＴ−１１；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ  ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ｄｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌｏｍｉｔｈｉｎｅ）（ＤＭＦＯ）；Ｔａｒｇｒｅｔｉｎ（商標）（ベキサロテン）、Ｐａｎｒｅｔｉｎ（商標）（アリトレチノイン）など、レチノイン酸誘導体；ＯＮＴＡＫ（商標）（デニロイキンジフチトクス）；エスペラミシン；カペシタビン；ならびに上述のいずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体が挙げられる。この定義には、例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害４（５）−イミダゾール、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン（ｔｒｉｏｘｉｆｅｎｅ）、ケオキシフェン（ｋｅｏｘｉｆｅｎｅ）、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン（ｏｎａｐｒｉｓｔｏｎｅ）およびトレミフェン（フェアストン）を含む抗エストロゲン剤；ならびにフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、リュープロリドおよびゴセレリンなど、抗アンドロゲン剤；ならびに上述のいずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体など、がんにおけるホルモン作用を調節または阻害するように作用する抗ホルモン剤も含まれる。
【０３５６】
様々な他の治療剤を、本明細書に記載されている組成物と併せて使用することができる。一実施形態では、ＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞を含む組成物は、抗炎症剤と共に投与される。抗炎症剤または薬として、これらに限定されないが、ステロイドおよびグルココルチコイド（ベタメタゾン、ブデソニド、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン酢酸塩、ヒドロコルチゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、プレドニゾン、トリアムシノロンを含む）、アスピリン、イブプロフェン、ナプロキセン、メトトレキセート、スルファサラジン、レフルノミド、抗ＴＮＦ薬物療法、シクロホスファミドおよびミコフェノール酸塩を含む非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）が挙げられる。
【０３５７】
他の例示的なＮＳＡＩＤは、イブプロフェン、ナプロキセン、ナプロキセンナトリウム、ＶＩＯＸＸ（登録商標）（ロフェコキシブ）およびＣＥＬＥＢＲＥＸ（登録商標）（セレコキシブ）、およびシアリレートなどのＣｏｘ−２阻害剤からなる群より選択される。例示的な鎮痛薬は、アセトアミノフェン、オキシコドン、トラマドールまたは塩酸プロポキシフェンからなる群より選択される。例示的なグルココルチコイドは、コルチゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、またはプレドニゾンからなる群より選択される。例示的な生物学的反応修飾物質としては、細胞表面マーカー（例えば、ＣＤ４、ＣＤ５など）を対象とする分子、ＴＮＦアンタゴニスト（例えば、エタネルセプト（ＥＮＢＲＥＬ（登録商標））、アダリムマブ（ＨＵＭＩＲＡ（登録商標））およびインフリキシマブ（ＲＥＭＩＣＡＤＥ（登録商標））などのサイトカイン阻害剤、ケモカイン阻害剤および接着分子阻害剤が挙げられる。生物学的反応修飾物質としては、モノクローナル抗体ならびに組換え型の分子が挙げられる。例示的なＤＭＡＲＤとしては、アザチオプリン、シクロホスファミド、シクロスポリン、メトトレキサート、ペニシラミン、レフルノミド、スルファサラジン、ヒドロキシクロロキン、Ｇｏｌｄ（経口用（オーラノフィン）および筋肉内用）およびミノサイクリンが挙げられる。
【０３５８】
本明細書において意図されているＣＡＲ改変Ｔ細胞との組合せに適した治療用抗体の実例として、これらに限定されないが、バビツキシマブ、ベバシズマブ（アバスチン）、ビバツズマブ（ｂｉｖａｔｕｚｕｍａｂ）、ブリナツモマブ、コナツムマブ（ｃｏｎａｔｕｍｕｍａｂ）、ダラツムマブ、デュリゴツマブ（ｄｕｌｉｇｏｔｕｍａｂ）、ダセツズマブ、ダロツズマブ（ｄａｌｏｔｕｚｕｍａｂ）、エロツズマブ（ＨｕＬｕｃ６３）、ゲムツズマブ、イブリツモマブ、インダツキシマブ（ｉｎｄａｔｕｘｉｍａｂ）、イノツズマブ、ロルボツズマブ（ｌｏｒｖｏｔｕｚｕｍａｂ）、ルカツムマブ（ｌｕｃａｔｕｍｕｍａｂ）、ミラツズマブ、モキセツモマブ（ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂ）、オカラツズマブ（ｏｃａｒａｔｕｚｕｍａｂ）、オファツムマブ、リツキシマブ、シルツキシマブ、テプロツムマブ（ｔｅｐｒｏｔｕｍｕｍａｂ）およびウブリツキシマブ（ｕｂｌｉｔｕｘｉｍａｂ）が挙げられる。
【０３５９】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載されている組成物は、サイトカインと併せて投与される。本明細書で使用される「サイトカイン」とは、細胞間メディエータとして別の細胞に作用するある細胞集団によって放出されるタンパク質の総称を意味する。このようなサイトカインの例は、リンホカイン、モノカインおよび伝統的ポリペプチドホルモンである。サイトカインには、ヒト成長ホルモン、Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモンおよびウシ成長ホルモンなど、成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；リラキシン；プロリラキシン；卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）および黄体形成ホルモン（ＬＨ）など、糖タンパク質ホルモン；肝増殖因子；線維芽細胞増殖因子；プロラクチン；胎盤性ラクトゲン；腫瘍壊死因子−アルファおよび−ベータ；ミュラー阻害物質；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子；インテグリン；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；ＮＧＦ−ベータなど、神経増殖因子；血小板増殖因子；ＴＧＦ−アルファおよびＴＧＦ−ベータなど、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）；インスリン様増殖因子−Ｉおよび−ＩＩ；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；骨誘導因子（ｏｓｔｅｏｉｎｄｕｃｔｉｖｅ  ｆａｃｔｏｒ）；インターフェロン−アルファ、ベータおよび−ガンマなど、インターフェロン；マクロファージ−ＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）；顆粒球−マクロファージ−ＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）；および顆粒球−ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦ）など、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）；ＩＬ−１、ＩＬ−１アルファ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２；ＩＬ−１５など、インターロイキン（ＩＬ）、ＴＮＦ−アルファまたはＴＮＦ−ベータなど、腫瘍壊死因子；ならびにＬＩＦおよびｋｉｔリガンド（ＫＬ）を含む他のポリペプチド因子が含まれる。本明細書で使用される場合、用語、サイトカインは、天然供給源または組換え細胞培養物由来のタンパク質およびネイティブ配列サイトカインの生物学的に活性な等価物を含む。
【０３６０】
Ｉ．治療方法
本明細書において意図されている遺伝子改変された免疫エフェクター細胞は、これらに限定されないが、免疫調節性状態および血液学的悪性疾患を含めた、Ｂ細胞関連状態の治療における使用のための養子免疫療法の改善された方法を提供する。
【０３６１】
特定の実施形態では、初代免疫エフェクター細胞の特異性は、本明細書において意図されているＣＡＲにより初代免疫エフェクター細胞を遺伝子改変することにより、Ｂ細胞に向け直される。種々の実施形態では、ウイルスベクターを使用して、ＢＣＭＡポリペプチドに結合するヒト化抗ＢＣＭＡ抗原結合性ドメイン；ヒンジドメイン；膜貫通（ＴＭ）ドメイン、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインにＴＭドメインを連結する短いオリゴまたはポリペプチドリンカー；および１個または複数の細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン；および一次シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲをコードする特定のポリヌクレオチドにより、免疫エフェクター細胞を遺伝子改変する。
【０３６２】
一実施形態では、本発明は、Ｔ細胞が、ＢＣＭＡ発現Ｂ細胞を標的化するＣＡＲを発現するように遺伝子改変され、このＣＡＲ  Ｔ細胞が、それを必要とするレシピエントに注入される、ある種の細胞療法を含む。注入された細胞は、レシピエントにおける疾患を引き起こすＢ細胞を殺傷することができる。抗体療法とは異なり、ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏで複製し、持続したがん療法を導き得る長期持続性をもたらすことができる。
【０３６３】
一実施形態では、本発明のＣＡＲ  Ｔ細胞は、頑強なｉｎ  ｖｉｖｏ  Ｔ細胞増大を行うことができ、延長された量の時間にわたり持続することができる。別の実施形態では、本発明のＣＡＲ  Ｔ細胞は、いずれか追加的な腫瘍形成または成長を阻害するよう再活性化され得る特異的メモリーＴ細胞へと進化する。
【０３６４】
特定の実施形態では、本明細書において意図されているＣＡＲを含む免疫エフェクター細胞を含む組成物は、異常Ｂ細胞活性に関連する状態の治療において使用される。
【０３６５】
本明細書において意図されているＣＡＲを含む免疫エフェクター細胞を使用して治療、予防または好転され得る状態の実例として、これらに限定されないが、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、重症筋無力症、自己免疫性溶血性貧血、特発性血小板減少性紫斑病、抗リン脂質抗体症候群、シャーガス病、グレーブス病、ウェゲナー肉芽腫症、結節性多発動脈炎、シェーグレン症候群、尋常性天疱瘡、強皮症、多発性硬化症、抗リン脂質抗体症候群、ＡＮＣＡ関連血管炎、グッドパスチャー病、川崎病および急速進行性糸球体腎炎が挙げられる。
【０３６６】
改変された免疫エフェクター細胞は、重鎖病、原発性または免疫細胞関連アミロイドーシスおよび意義未確定の単クローン性ガンマグロブリン血症（ＭＧＵＳ）など、形質細胞障害における用途を有することもできる。
【０３６７】
本明細書で使用される場合、「Ｂ細胞悪性疾患」は、以下に論じられる通り、Ｂ細胞（ある種の免疫系細胞）において形成するある種のがんを指す。
【０３６８】
特定の実施形態では、本明細書において意図されているＣＡＲ改変Ｔ細胞を含む組成物は、これらに限定されないが、例えば、多発性骨髄腫（ＭＭ）および非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）などのＢ細胞悪性疾患を含めた、血液学的悪性疾患の治療において使用される。
【０３６９】
多発性骨髄腫は、成熟形質細胞形態のＢ細胞悪性疾患であり、これらの型の細胞の単一のクローンの腫瘍性形質転換を特徴とする。これらの形質細胞は、ＢＭにおいて増殖し、近接する骨、および時には血液に浸潤し得る。多発性骨髄腫のバリアント形態としては、顕性多発性骨髄腫、くすぶり型多発性骨髄腫、形質細胞白血病、非分泌性骨髄腫、ＩｇＤ骨髄腫、骨硬化性骨髄腫、骨の孤立性形質細胞腫、および髄外性形質細胞腫が挙げられる（例えば、Ｂｒａｕｎｗａｌｄら（編）、Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、第１５版（ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  ２００１年）を参照されたい）。
【０３７０】
非ホジキンリンパ腫は、リンパ球（白血球）のがんの大きな群を包含する。非ホジキンリンパ腫は、あらゆる年齢で生じ得、多くの場合、正常よりも大きいリンパ節、発熱、および体重減少を特徴とする。非ホジキンリンパ腫には多くの異なる型が存在する。例えば、非ホジキンリンパ腫は、侵襲性（成長が早い）型と無痛性（成長が遅い）型に分けることができる。非ホジキンリンパ腫は、Ｂ細胞およびＴ細胞に由来し得るが、本明細書で使用される場合、「非ホジキンリンパ腫」および「Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫」という用語は、互換的に使用される。Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）としては、バーキットリンパ腫、慢性リンパ球性白血病／小リンパ球性リンパ腫（ＣＬＬ／ＳＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、濾胞性リンパ腫、免疫芽球性大細胞型リンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫、およびマントル細胞リンパ腫が挙げられる。骨髄または幹細胞移植後に生じるリンパ腫は、通常はＢ細胞非ホジキンリンパ腫である。
【０３７１】
慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）は、Ｂリンパ球またはＢ細胞と称される未成熟白血球のゆっくりとした増加を引き起こす無痛性（成長が遅い）がんである。がん細胞は血液および骨髄を通じて拡散し、リンパ節または肝臓および脾臓などの他の器官にも影響を及ぼす可能性がある。ＣＬＬは、最終的には骨髄不全を引き起こす。時には、当該疾患の後期には、当該疾患は小リンパ球性リンパ腫と称される。
【０３７２】
特定の実施形態では、治療有効量の本明細書において意図されているＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞またはこれを含む組成物をそれを必要とする患者に単独で、または１種もしくは複数の治療剤と組み合わせて投与するステップを含む方法が提供される。ある特定の実施形態では、本発明の細胞は、異常Ｂ細胞活性に関連する状態またはＢ細胞悪性疾患を発症するリスクのある患者の治療において使用される。よって、本発明は、異常Ｂ細胞活性に関連する状態またはＢ細胞悪性疾患の治療または予防のための方法であって、それを必要とする被験体に治療有効量の本明細書において意図されているＣＡＲ改変細胞を投与するステップを含む方法を提供する。
【０３７３】
本明細書で使用される場合、用語「個体」および「被験体」は多くの場合、互換的に使用され、遺伝子療法ベクター、細胞ベースの治療薬および本明細書の他の箇所に開示されている方法により治療することができる疾患、障害または状態の症状を示す任意の動物を指す。好ましい実施形態では、被験体は、遺伝子療法ベクター、細胞ベースの治療薬および本明細書の他の箇所に開示されている方法により治療することができる、造血系の疾患、障害または状態、例えば、Ｂ細胞悪性疾患の症状を示す任意の動物を含む。適切な被験体（例えば、患者）は、実験動物（マウス、ラット、ウサギまたはモルモットなど）、農場動物および家畜またはペット（ネコまたはイヌなど）を含む。非ヒト霊長類、および好ましくはヒト患者が含まれる。典型的な被験体は、Ｂ細胞悪性疾患を有する、Ｂ細胞悪性疾患と診断された、またはＢ細胞悪性疾患を有するリスクがあるヒト患者を含む。
【０３７４】
本明細書で使用される場合、用語「患者」は、遺伝子療法ベクター、細胞ベースの治療薬および本明細書の他の箇所に開示されている方法により治療することができる特定の疾患、障害または状態と診断された被験体を指す。
【０３７５】
本明細書で使用される場合、「治療」または「治療すること」は、疾患または病的状態の症状または病態に対するあらゆる有益なまたは望ましい効果を含み、治療されている疾患または状態の１種または複数の測定可能なマーカーの最小の低下さえも含むことができる。治療は、場合によって、疾患もしくは状態の症状の低下もしくは好転、または疾患もしくは状態の進行の遅延のいずれかを伴い得る。「治療」は、疾患もしくは状態またはその関連する症状の完全な根絶または治癒を必ずしも示さない。
【０３７６】
本明細書で使用される場合、「予防する」および「予防される」、「予防すること」などの同様の単語は、疾患または状態の発生または再発の見込みを予防、阻害または低下するためのアプローチを示す。これは、疾患もしくは状態の発病もしくは再発の遅延、または疾患もしくは状態の症状の発生もしくは再発の遅延も指す。本明細書で使用される場合、「予防」および同様の単語は、疾患または状態の発病または再発に先立つ、疾患または状態の強度、影響、症状および／または負荷の低下も含む。
【０３７７】
「増強する」または「促進する」または「増加させる」または「増大させる」とは、ビヒクルまたは対照分子／組成物のいずれかによって引き起こされる応答と比較して、より大きい生理的応答（すなわち、下流の効果）を産生、誘発または引き起こす、本明細書において意図されている組成物、例えば、遺伝子改変されたＴ細胞またはＣＡＲをコードするベクターの能力を一般に指す。測定可能な生理的応答は、とりわけ、当技術分野における理解および本明細書における記載から明らかな、Ｔ細胞増大、活性化、持続性の増加、および／またはがん細胞殺傷能力の増加を含むことができる。「増加された」または「増強された」量は、典型的には、「統計的に有意な」量であり、ビヒクルまたは対照組成物によって産生される応答の１．１、１．２、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０倍またはそれ超（例えば、５００、１０００倍）（中間の１を超えるあらゆる整数および小数点、例えば、１．５、１．６、１．７、１．８などを含む）である増加を含むことができる。
【０３７８】
「減少する」または「減らす」または「低減する」または「低下する」または「減弱する」とは、ビヒクルまたは対照分子／組成物のいずれかによって引き起こされる応答と比較して、より少ない生理的応答（すなわち、下流の効果）を産生、誘発または引き起こす、本明細書において意図されている組成物の能力を一般に指す。「減少」または「低下された」量は、典型的には、「統計的に有意な」量であり、ビヒクル、対照組成物によって産生される応答（参照応答）または特定の細胞系列における応答の１．１、１．２、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０分の１またはそれ未満（例えば、５００、１０００分の１）（中間の１を超えるあらゆる整数および小数点、例えば、１．５、１．６、１．７、１．８分の１などを含む）である減少を含むことができる。
【０３７９】
「維持する」または「保存する」または「維持」または「変化なし」または「実質的な変化なし」または「実質的な減少なし」とは、ビヒクル、対照分子／組成物のいずれかによって引き起こされる応答、または特定の細胞系列における応答と比較して、細胞におけるより少ない生理的応答（すなわち、下流の効果）を産生、誘発または引き起こす、本明細書において意図されている組成物の能力を一般に指す。同等の応答は、参照応答と有意に異ならないまたは測定可能なほど異ならない応答である。
【０３８０】
一実施形態では、それを必要とする被験体におけるＢ細胞関連状態を治療する方法は、本明細書において意図されている遺伝子改変された免疫エフェクター細胞を含む有効量、例えば、治療有効量の組成物を投与するステップを含む。適切な投薬量は、臨床試験によって決定することができるが、投与の数量および頻度は、患者の状態、ならびに患者の疾患の種類および重症度などの因子によって決定されるであろう。
【０３８１】
ある特定の実施形態では、活性化された免疫エフェクター細胞を被験体に投与し、その後、血液を再び採取し（またはアフェレーシスを行い）、本発明に従ってそれに由来する免疫エフェクター細胞を活性化し、これらの活性化および増大された免疫エフェクター細胞を患者に再注入することが望ましい場合がある。このプロセスは、数週間毎に複数回実行することができる。ある特定の実施形態では、免疫エフェクター細胞は、１０ｃｃ〜４００ｃｃの採血から活性化することができる。ある特定の実施形態では、免疫エフェクター細胞は、２０ｃｃ、３０ｃｃ、４０ｃｃ、５０ｃｃ、６０ｃｃ、７０ｃｃ、８０ｃｃ、９０ｃｃ、１００ｃｃ、１５０ｃｃ、２００ｃｃ、２５０ｃｃ、３００ｃｃ、３５０ｃｃもしくは４００ｃｃまたはそれを超える採血から活性化される。理論に縛られるべきではないが、この複数の採血／複数の再注入プロトコールの使用は、免疫エフェクター細胞のある特定の集団の選択に役立つことができる。
【０３８２】
本明細書において意図されている組成物の投与は、エアロゾル吸入、注射、摂取、輸血、埋め込みまたは移植によるものを含めた任意の都合のよい様式で行うことができる。好ましい実施形態では、組成物を非経口的に投与する。「非経口投与」および「非経口的に投与する」という句は、本明細書で使用される場合、経腸および局所投与以外の投与形式、通常は注射によるものを指し、限定することなく、血管内、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、腫瘍内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内および胸骨内への注射および注入が挙げられる。一実施形態では、本明細書において意図されている組成物を、被験体に、腫瘍、リンパ節、または感染部位に直接注射することによって投与する。
【０３８３】
一実施形態では、それを必要とする被験体は、有効量の組成物を投与されて、被験体におけるＢ細胞関連状態に対する細胞性免疫応答を増加させる。免疫応答は、感染細胞を殺傷することができる細胞傷害性Ｔ細胞によって媒介される細胞性免疫応答、調節性Ｔ細胞およびヘルパーＴ細胞応答を含むことができる。Ｂ細胞を活性化し、これにより抗体産生をもたらすことができるヘルパーＴ細胞によって主に媒介される液性免疫応答を誘導することもできる。本発明の組成物によって誘導される免疫応答の種類を解析するために、様々な技法を使用することができ、これらは当技術分野、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、編者：Ｊｏｈｎ  Ｅ．  Ｃｏｌｉｇａｎ、Ａｄａ  Ｍ．  Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ、Ｄａｖｉｄ  Ｈ．  Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ、Ｅｔｈａｎ  Ｍ．  Ｓｈｅｖａｃｈ、Ｗａｒｒｅｎ  Ｓｔｒｏｂｅｒ（２００１年）Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ＮＹ、Ｎ．Ｙ．において十分に説明されている。
【０３８４】
Ｔ細胞媒介性死滅の場合では、ＣＡＲ−リガンド結合により、Ｔ細胞へのＣＡＲシグナル伝達が開始され、それにより、種々の機構によって標的細胞のアポトーシスを誘導することができるタンパク質を産生または放出するようにＴ細胞を誘導する種々のＴ細胞シグナル伝達経路が活性化される。これらのＴ細胞媒介性機構としては（これらに限定されないが）、細胞内細胞傷害性顆粒のＴ細胞から標的細胞への移行、標的細胞の死滅を直接（または他のキラーエフェクター細胞の動員によって間接的に）誘導することが可能な炎症促進性サイトカインのＴ細胞による分泌、および、標的細胞上のそれらの同族の細胞死受容体（例えば、Ｆａｓ）に結合した後、標的細胞のアポトーシスを誘導する、Ｔ細胞表面上の細胞死受容体リガンド（例えば、ＦａｓＬ）の上方制御が挙げられる。
【０３８５】
一実施形態では、本発明は、Ｂ細胞関連状態と診断された被験体を治療する方法であって、ＢＣＭＡ発現Ｂ細胞関連状態と診断された被験体から免疫エフェクター細胞を取り出すステップと、本明細書において意図されているＣＡＲをコードする核酸を含むベクターにより前記免疫エフェクター細胞を遺伝子改変し、これにより、改変された免疫エフェクター細胞の集団を産生するステップと、改変された免疫エフェクター細胞の集団を同じ被験体に投与するステップとを含む方法を提供する。好ましい実施形態では、免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞を含む。
【０３８６】
ある特定の実施形態では、本発明は、被験体における標的細胞集団に対する免疫エフェクター細胞媒介性免疫モジュレーター応答を刺激するための方法であって、被験体にＣＡＲ分子をコードする核酸構築物を発現する免疫エフェクター細胞集団を投与するステップを含む方法も提供する。
【０３８７】
本明細書に記載されている細胞組成物を投与するための方法は、被験体において本発明のＣＡＲを直接的に発現するｅｘ  ｖｉｖｏで遺伝子改変された免疫エフェクター細胞の再導入をもたらすのに、または被験体への導入により、ＣＡＲを発現する成熟免疫エフェクター細胞に分化する免疫エフェクター細胞の遺伝子改変された前駆体の再導入に対して有効である任意の方法を含む。一方法は、本発明に従った核酸構築物により末梢血Ｔ細胞をｅｘ  ｖｉｖｏで形質導入するステップと、形質導入された細胞を被験体に戻すステップとを含む。
【０３８８】
本明細書において引用されている刊行物、特許出願、および発行された特許は全て、個々の刊行物、特許出願、または発行された特許のそれぞれが参照により組み込まれることが具体的にかつ個別に示されたものと同じく参照により本明細書に組み込まれる。
【０３８９】
前述の発明は、明瞭な理解のために図解および実施例により少し詳細に記載されているが、本発明の教示に照らして、添付の特許請求の範囲の主旨または範囲から逸脱することなく、それらに対してある特定の変化および改変を成すことができることが当業者には容易に明らかになろう。以下の実施例は、単に例示として提供され、限定としては提供されない。基本的に同様の結果を得るために変化または改変することができる種々の重大でないパラメータは当業者には容易に認識されよう。
【実施例】
【０３９０】
（実施例１）
抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲの構築
ヒト化抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖ抗体を含有するＣＡＲは、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖに作動可能に連結されたＭＮＤプロモーター、ＣＤ８α由来のヒンジおよび膜貫通ドメインならびにＣＤ１３７共刺激性ドメインと、続くＣＤ３ζ鎖の細胞内シグナル伝達ドメインを含有するように設計した。図１。抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲは、免疫エフェクター細胞における表面発現のためのＣＤ８αシグナルペプチド（ＳＰ）配列を含む。抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲのポリヌクレオチド配列は、配列番号３０〜４４、７０および７２に表記されており；抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲのポリペプチド配列は、配列番号１５〜２９、７１および７３に表記されており；ベクターマップは、図１に示す。表３〜５は、種々の例示的な抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲレンチウイルスベクターの種々のヌクレオチドセグメントの正体、Ｇｅｎｂａｎｋ参照、供給源名および引用を示す。
【表３−１】
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【表３−２】
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【表４−１】
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【表４−２】
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【表５−１】
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【表５−２】
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【０３９１】
（実施例２）
ヒト化抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲのハイスループットスクリーニング
抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲを迅速にスクリーニングするための微小培養アッセイを開発した。微小培養アッセイは、１５〜２０種のＣＡＲ改変Ｔ細胞（ＣＡＲ  Ｔ細胞）を比較することができる。２４ウェルプレート内で、ＩＬ−２（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ）ならびにＣＤ３およびＣＤ２８に特異的な抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を含有する培地において末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を培養して、Ｔ細胞の成長（ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ）を惹起した。培養７日後に、増大されたＴ細胞は、＞９９％ＣＤ３陽性Ｔ細胞であった。
【０３９２】
ＰＢＭＣから増大されたＴ細胞を、抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲを発現するようにレンチウイルスによって改変した。培養開始１日後に、一過性レンチウイルス上清をＰＢＭＣ培養物に１：１比（体積：体積）で添加した。倒立光学顕微鏡を使用して光学的にコンフルエントになった後に、ＩＬ−２を含有する新鮮培地により、培養物を必要に応じて分割した。培養１２日後に、ＣＡＲ  Ｔ細胞を収集し、ＣＡＲ発現および機能に関して評価した。
【０３９３】
ＣＡＲの単鎖可変断片部分に対し反応性の抗体（ヤギ抗マウスＩｇ（ＧＡＭ）、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用したフローサイトメトリーにより、Ｔ細胞表面におけるＣＡＲの発現をアッセイした。３種の別々の正常ドナーにおける１５種のＣＡＲのそれぞれの平均発現を表６に示す。ＣＡＲの発現は、４７％〜６３％ＣＡＲ陽性Ｔ細胞にわたって同等であった。検査した種々のＣＡＲ構築物の間の形質導入効率（表６においてＶＣＮとして表す）。組み込まれたウイルスを増幅するプライマーを使用したＰＣＲにより、ＶＣＮをアッセイした。
【表６】
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【０３９４】
（実施例３）
ＣＡＲ  Ｔ細胞の抗原特異的反応性
ＢＣＭＡ陽性細胞株と共培養した後に、抗原特異的反応性を試験した。抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を、ＢＣＭＡを工学的に作製したＫ５６２（Ｋ５６２−ＢＣＭＡ）細胞と２４時間共培養した。ＥＬＩＳＡによる上清へのＩＦＮ−ガンマ（ＩＦＮγ）放出により、Ｋ５６２−ＢＣＭＡに対する抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の反応性をアッセイした。検査した全てのヒト化抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、同様の量のＩＦＮγを放出し、この量は、親マウス抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲと同等であった。図２。対照的に、ＩＦＮγは、形質導入されていないまたはＣＤ１９特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞のいずれかを含有する培養物において検出されず、ＣＡＲ  Ｔ細胞のＢＣＭＡ特異性が、Ｋ５６２−ＢＣＭＡ細胞に対する反応性に必要とされたことが確認された。
【０３９５】
別の実験セットにおいて、５種のヒト化抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲのうち１種を発現するＴ細胞の腫瘍細胞溶解活性を試験した。抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を、Ｋ５６２−ＢＣＭＡ細胞と４時間共培養した。５種のヒト化抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、３種のＴ細胞：腫瘍比にわたってＫ５６２−ＢＣＭＡと同様の細胞溶解活性を示した。図３。驚くべきことに、検査した全てのヒト化抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、親マウス抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞よりも大きい細胞溶解活性を示した。
【０３９６】
（実施例４）
ヒト化抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の表現型および機能
大規模臨床製造プロセスへと直接的に拡張可能な培養系において、３種のヒト化抗ＢＣＭＡ構築物（抗ＢＣＭＡ−１０、抗ＢＣＭＡ−１１、抗ＢＣＭＡ−３１）の表現型および機能を評価した。簡潔に説明すると、静置フラスコ内で、ＩＬ−２（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ）ならびにＣＤ３およびＣＤ２８に特異的な抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を含有する培地において、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を培養した。培養開始１日後に、抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲをコードするレンチウイルスの２×１０８形質導入単位を添加した。ＩＬ−２を含有する新鮮培地を添加することにより、合計１０日間の培養において、抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を対数期に維持した。マウス抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ（ＢＣＭＡ−０２）、３種のヒト化抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲまたはシグナル伝達能力を欠く抗ＣＤ１９  ＣＡＲ（ＣＡＲ１９Δ）を形質導入したＴ細胞を、３種の正常ドナー（８００２９０、８００３０９、８０１２６９）から増大した。培養の終わりに、ＣＡＲ発現ならびに抗原および腫瘍細胞反応性に関してＣＡＲ  Ｔ細胞を評価した。
【０３９７】
ＣＡＲの単鎖可変断片部分に対し反応性の抗体（ヤギ抗マウスＩｇ（ＧＡＭ）、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用したフローサイトメトリーにより、Ｔ細胞表面における抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲの発現をアッセイした。図４。マウス（ｍｓＢＣＭＡ−０２）またはヒト化配列（抗ＢＣＭＡ−１０、抗ＢＣＭＡ−１１、抗ＢＣＭＡ−３１）の両方に、同等のＣＡＲ発現が観察された。全３種のドナーの間で、マウスまたはヒト化抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ発現に有意差は観察されなかった（表７）。
【表７】
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【０３９８】
抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の間の形質導入効率に有意差はなかった。組み込まれたウイルスを増幅するプライマーを使用したＰＣＲによってアッセイされたベクターコピー数（ＶＣＮ）は、全抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞において同等であった（表８）。
【表８】
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【０３９９】
ＢＣＭＡ陽性細胞株および腫瘍に対する抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の反応性を評価した。抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞をＫ５６２−ＢＣＭＡ（少量または多量のＢＣＭＡを発現）細胞または多発性骨髄腫細胞株（ＲＰＭＩ−８２２６、ＮＣＩ−Ｈ９２９）と共培養した後に、同等のＩＦＮγ放出が観察されたが、ＢＣＭＡ陰性細胞株（ＨＤＬＭ−２、Ｋ５６２）では観察されなかった。図５。
【０４００】
抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲを発現するＴ細胞の細胞溶解活性を試験した。抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を、Ｋ５６２−ＢＣＭＡ細胞と４時間共培養した。検査した全抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、同等のＫ５６２−ＢＣＭＡ細胞の細胞傷害性を引き起こした。図６。
【０４０１】
（実施例５）
ヒト化抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞における強壮性サイトカイン放出
特定の実施形態では、抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ分子は、刺激の非存在下でサイトカインを放出することができる。この抗原非依存的（「強壮性」）サイトカイン放出は、その抗原の存在を欠く条件下のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養後に観察することができる。
【０４０２】
ヒト化抗ＢＣＭＡ−１０  ＣＡＲを発現するように工学的に作製されたＴ細胞からの強壮性サイトカイン放出が観察された。ヒト化抗ＢＣＭＡ１０は、マウス配列に対する免疫反応に起因する潜在的な免疫原性を低下させるためのマウス抗ＢＣＭＡ−０２に由来した。合計して、２０％未満の配列の差異が、抗ＢＣＭＡ−０２および抗ＢＣＭＡ−１０  ＣＡＲ分子の間に存在する。これらの変化にもかかわらず、ＣＡＲ発現またはＢＣＭＡ抗原に対する反応性の差は、マウス抗ＢＣＭＡ−０２およびヒト化抗ＢＣＭＡ−１０の間に観察されなかった（図５および表７）。ＢＣＭＡの非存在下であっても、ヒト化抗ＢＣＭＡ−１０  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、有意により多い炎症性サイトカインを放出した。図７。
【０４０３】
マウス抗ＢＣＭＡ−０２またはヒト化抗ＢＣＭＡ−１０  ＣＡＲ  Ｔ細胞を、ヒト血清を含有するが、いかなるＢＣＭＡも欠く培地において一晩培養した。上清に放出された１２種のサイトカインのレベルは、マルチプレックスビーズアプローチ（Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイ）を使用して決定した。５×１０４個のヒト化抗ＢＣＭＡ−１０  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＭＩＰ１α、ＭＩＰ１β、ＩＦＮγ、ＧＭＣＳＦ、ＩＬ−８およびＴＮＦαを含む、最大５ｎｇ／ｍｌの炎症性サイトカインを放出した。同じ量のマウス抗ＢＣＭＡ−０２  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、２００ｐｇ／ｍｌ未満を放出した。いずれのＣＡＲ改変も、ＩＬ−１０およびＩＬ−４を含む抗炎症サイトカインの放出に影響を与えなかった。
【０４０４】
強壮性サイトカイン放出は、抗ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞で治療した患者における過剰なサイトカイン放出に起因する公知の毒性に関する懸念を生じた。ヒト化抗ＢＣＭＡ−１０  ＣＡＲ  Ｔ細胞から観察された高い抗原非依存的、強壮性サイトカイン放出は、ＢＣＭＡ抗原の非存在下であっても患者における有毒レベルのサイトカインを引き起こし得た。ヒト化抗ＢＣＭＡ−１０を生成するためのマウス抗ＢＣＭＡ−０２に為された配列変化は、マウス抗ＢＣＭＡ−０２  Ｔ細胞には見られない、ヒト血清におけるタンパク質に対する新生反応性を導入することができた。ヒト血清タンパク質に対する反応性は、ヒト化抗ＢＣＭＡ−１０に見られる「強壮性」サイトカイン放出を説明することができた。
【０４０５】
マウス抗ＢＣＭＡ−０２およびヒト化抗ＢＣＭＡ−１０  ＣＡＲ  Ｔ細胞を、ヒト血清の代わりにウシ胎仔血清を含有する培地において４８時間休ませた。ＣＡＲ  Ｔ細胞を、ヒト血清を含有する培地に切り替えて、放出されたＩＦＮγの量を、ウシ胎仔血清に維持した培養物と比較した。培養培地は、いずれのＣＡＲ  Ｔ細胞からのＩＦＮ−γ放出にも影響を与えなかった。ＩＦＮγは、マウス抗ＢＣＭＡ−０２  ＣＡＲ  Ｔ細胞の培養の終わりに検出されなかったが、ヒト化抗ＢＣＭＡ１０培養物は、培養培地に関係なく約４ｎｇ／ｍｌ  ＩＦＮγを含有した（図８）。マウス抗ＢＣＭＡ−０２  ＣＡＲ  Ｔ細胞における反応性の欠如は、Ｔ細胞機能不全によるものではなかった：両方の抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、プレート固定化ＢＣＭＡに対し反応した（データ図示せず）。
【０４０６】
（実施例６）
ヒト化抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞におけるサイトカイン放出の調整
マウス配列を含有するＣＡＲは、望ましくない免疫応答を引き起こす潜在性を有する。ＣＡＲ臨床試験における事例的な証拠は、これらの免疫応答が、一部の患者におけるＣＡＲ  Ｔ細胞の有効性を限定し得ることを示唆した。マウス配列のヒト化は、マウス配列に対する免疫応答を低下させるための戦略である。さらにヒト化抗ＢＣＭＡ−１０  ＣＡＲは、強壮性炎症性放出を導入した。抗ＢＣＭＡ−１０  ＣＡＲ  Ｔ細胞の抗原認識ドメインは、ＣＤ８α膜貫通ドメインを使用して、Ｔ細胞表面に繋留される。膜貫通ドメインの正体ならびにＣＡＲ分子の二量体形成および抗原の非存在下でのその後の活性化に対するその影響を試験した。
【０４０７】
抗ＢＣＭＡ−１０  ＣＡＲ分子を構築して、ＣＴＬＡ−４（抗ＢＣＭＡ−１０．２）またはＰＤ−１（抗ＢＣＭＡ−１０．５）膜貫通ドメインのいずれかによりＣＤ８α膜貫通ドメインを置き換えた（図９）。ＩｇＧ１  Ｆｃ−ＰＥにコンジュゲートされた組換えヒトＢＣＭＡタンパク質を染色し、フローサイトメトリーを使用してアッセイすることにより、抗ＢＣＭＡ−１０．２および抗ＢＣＭＡ−１０．５の発現を抗ＢＣＭＡ−１０と比較した。表９は、全３種のＣＡＲ分子の頑強な表面発現が観察された、２種の代表的な正常ドナーＴ細胞の結果を示す。
【表９】
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【０４０８】
ＢＣＭＡ陽性Ｋ５６２細胞株に対する抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の反応性を評価した。Ｋ５６２−ＢＣＭＡ細胞と抗ＢＣＭＡ−１０、抗ＢＣＭＡ−１０．２または抗ＢＣＭＡ−１０．５の共培養後に、同等のＩＦＮγ放出が観察された（図１０）。これらのデータは、膜貫通ドメインをＣＴＬＡ−４またはＰＤ−１のいずれかに由来する配列に交換することが、抗ＢＣＭＡ−１０  ＣＡＲ  Ｔ細胞の反応性に影響を与えないことを示す。
【０４０９】
マウス抗ＢＣＭＡ−０２またはヒト化抗ＢＣＭＡ−１０、抗ＢＣＭＡ−１０．２もしくは抗ＢＣＭＡ−１０．５との一晩培養物の上清におけるＩＦＮγを測定することにより、強壮性サイトカイン放出を評価した。以前に観察された通り、抗ＢＣＭＡ−０２培養物は、少量のＩＦＮγを含有した。抗ＢＣＭＡ−１０培養物由来の上清は、より多量のＩＦＮγを含有した。抗ＢＣＭＡ−１０．２および抗ＢＣＭＡ−１０．５培養物は、抗ＢＣＭＡ−０２と同等のＩＦＮγレベルおよび抗ＢＣＭＡ−１０  ＣＡＲ  Ｔ細胞よりも低いレベルを含有した（図１１）。これらのデータは、膜貫通ドメインの交換が、ＣＡＲ  Ｔ細胞の抗原反応性に影響を与えることなく、強壮性サイトカイン放出を低下し得ることを示唆する。
【０４１０】
一般に、以下の特許請求の範囲において、使用される用語は、特許請求の範囲を本明細書および特許請求の範囲に開示されている特定の実施形態に限定するものと解釈されるべきではなく、全ての可能性のある実施形態を、そのような特許請求の範囲に権利が与えられる等価物の全範囲と共に包含すると解釈されるべきである。したがって、特許請求の範囲は本開示により限定されない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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