(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
【化１−１】
0006651546.tif 000036
【化１−２】
0006651546.tif 000037
【化１−３】
0006651546.tif 000038
【化１−４】
0006651546.tif 000039
から選択されるペプチド。
【請求項２】
治療に有効な量の請求項1に記載のペプチド及び任意選択の1種以上の薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項３】
内臓痛、痛覚過敏、関節リウマチ炎症、骨関節炎、IBD炎症、IBS炎症、眼の炎症、耳炎症、又は自己免疫性炎症の治療又は予防のための薬剤の調製における、請求項1に記載のペプチドの使用。
【請求項４】
好適なオピオイド、カンナビノイド、抗鬱剤、抗痙攣剤、神経弛緩剤、抗ヒスタミン剤、アセトアミノフェン、コルチコステロイド、イオンチャネル遮断薬、非ステロイド性抗炎症薬(NSAID)又は利尿薬と併用する、請求項2に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、内臓痛、痛覚過敏、関節リウマチ炎症、骨関節炎、IBD炎症、IBS炎症、眼の炎症、耳炎症、又は自己免疫性炎症の治療又は予防等、カッパ(κ)オピオイド受容体(KOR)が関与する疾患の治療又は予防において有用な、選択的かつ末梢に作用するKORアゴニストである一般式(I)の新規の短鎖ペプチド、その互変異性型、その鏡像異性体、ジアステレオ異性体、その立体異性体、その薬学的に許容される塩、又はそのプロドラッグに関する。本発明はまた、前記化合物の製造方法、それを含む医薬組成物、及びその使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
CNS及び末梢の両方で発現する3つのタイプのオピオイド受容体(ミュー(μ)、カッパ(κ)及びデルタ(δ))があることが判明しており、利用可能なオピオイド鎮痛薬は、これらのオピオイド受容体を通してその効果を媒介する(Evans, C.、Keith, J.D.、Morrison, H.、Magendzo, K及びEdwards, R.、Science、258、1952〜1955、1992; Cox, B. M.、Mol. Pharmacol.、83、723〜728、2013; Chen, Y.、Mestek, A.、Liu, J.、Hurley, J.及びYu, L.、Mol. Pharmacol.、44、8〜12、1993; Meng, F.、Xie, G. X.、Thompson, R.、Mansour, A.、Goldstein, A.、Watson, S. J.及びAkil, H.、Proc. Natl. Acad. Sci.、U. S. A.、90、9954〜9958、1993; Simonin, F.、Gaveriaux, R. C.、Befort, K.、Matthes, H.、Lannes, B.、Micheletti, G.、Mattei, M. G.、Charron, G.、Bloch, B.及びKieffer, B.、Proc. Natl. Acad. Sci.、U. S. A.、92、7006〜7010、1995; Stein, C.、Anesth. Analg.、76、182〜191、1993)。現在のほとんどのオピオイド鎮痛薬、例えば、モルヒネは、μ-オピオイド受容体に結合することによって作用し、その鎮痛作用は、身体依存、呼吸抑制、尿閉、多幸/不快、及び便秘等の様々な望ましくない副作用を伴う(Pasternak, G. W.、Clin. Neuropharmacol.、16、1〜18、1993)。
【０００３】
近年、μ鎮痛薬の望ましくない副作用がない強力かつ有効な鎮痛薬として、受容体選択的κ-アゴニストの開発がかなりの注目を集めている(Barber, A.及びGottschlich, R.、Med. Rev.、12、525〜562、1992)。δ及びμ受容体のアゴニストとは異なり、κ-オピオイド受容体のアゴニストは、便秘及び多幸を誘発しない。κ-オピオイド受容体は、Gタンパク質共役受容体(GPCR)のスーパーファミリーのメンバーである。κ-受容体に結合したアゴニストは、細胞内結合Giタンパク質を活性化し、Ca2+チャネル伝導を低減する又はアデニリルシクラーゼ(AC)を阻害する(Prather, P. L.、McGinn, T. M.、Claude, P. A.、Liu-Chen, L. Y.、Loh, H. H.及びLaw, P. Y.、Mol. Brain. Res.、29、336〜346、1995)。
【０００４】
κ-オピオイドアゴニストは、切開/炎症性痛覚、火傷の痛み(Field, M. J.、Carnell, A. J.、Gonzalez, M. I.、McCleary, S.、Oles, R. J.、Smith, R.、Hughes, J.及びSingh, L.、Pain、80、383〜389、1999)、神経障害痛(Catheline, G.、Guilbaud, G.及びKayser, V.、Eur. J. Pharmacol.、357、171〜178、1998)、月経困難症又は胃腸の痛みを含めた内臓痛(Delgado Aros S.、Chial H.J.、Camilleri M.、Szarka L.A.、Weber F.T.、Jacob, J.、Ferber, I.、McKinzie, S.、Burton, D.D.及びZinsmeister, A.R.、Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol.、284、G558〜G566、2002)、過敏性腸症候群(IBS)(Dapoigny, M.、Abitbol, J.L.、Fraitag, B.、Digest. Dis. Sci.、40、2244〜2249、1995; Mangel, A.W.、Bornstein, J.D.、Hamm, L.R.、Buda, J.、Wang, J.、Irish, W.、Urso, D.、Pharmacol. Ther.、28、239〜249、2008)、関節リウマチ(Endoh, T.、Tajima, A.、Suzuki, T.、Kamei, J.、Suzuki, T.、Narita, M.、Tseng, L.及びNagase, H.、Eur. J. Pharmacol. 387、133〜140、2000)、及び鎮痒(Peters, G.及びGaylor, S.、Clin. Pharmacol. Ther.、51、PPF-5、1989)の治療の可能性があることが示唆されている。Walkerら(Walker, J.S.、Adv. Exp. Med. Biol.、521、148〜60、2003)は、骨関節炎、関節リウマチ、炎症性腸疾患及び湿疹の治療のためのカッパアゴニストの抗炎症特性を評価した。
【０００５】
Bileviciute-Ljungarら(Bileviciute-Ljungar、T. Saxne、及びM. Spetea、Rheumatology、45、295〜302、2006)は、カッパアゴニストU-50,488によるフロイントのアジュバントにより誘発された関節炎における痛み及び変性の低減を記載している。したがって、κ-受容体は、重要な治療標的を表す(Pan, Z.Z.、Tershner, S.A.、Fields, H.L.、Nature、389、382〜385、1997; Chavkin, C.、Neuropsychopharmacology、36、369〜370、2011)。
【０００６】
κ-オピオイド受容体は、中枢神経系(CNS)中に広範囲にわたって存在し、多くの生理的及び病理的機能において重要な役割を果たす。このような潜在用途にもかかわらず、臨床研究は、κ-受容体アゴニストが、一般に「不快な作用」(Pfeiffer, A.、Brantl, V.、Herz, A.及びEmrich, H.M.、Science、233、774〜776、1986)、水利尿(Dykstra, L.A.、Gmerek, D.E.、Winger, G.及びWoods, J.H.、J. Pharmacol. Exp. Ther.、242、413〜420、1987)、及び精神異常作用(Rimoy, G.H.、Wright, D.M.、Bhaskar, N.K.、Rubin, P.C.、Eur. J. Clin. Pharmacol. 46 (3)、203〜207、1994)として記載される、重篤な中枢媒介性の副作用を誘発することを示している。これらの副作用は、このクラスの化合物の更なる臨床開発を明らかに停止している。多くの研究は、アヘン薬は、特に炎症又は痛覚過敏状態下で、末梢鎮痛効果があることを示している(Barber, A.及びGottschlich, R.、Med. Res. Rev.、12、525〜562、1992)。
【０００７】
κ-オピオイド受容体のアゴニストは、無痛覚をもたらし、局所投与後に関節リウマチのモデルにおいて炎症を低減することが示されている(Wilson, J.L.、Nayanar, V.及びWalker, J.S.、Br. J. Pharmacol.、118、1754〜1760、1996)。CNSへの浸透の制限は、有益な末梢作用によって薬物の中枢の副作用を低減する一般的な戦略である。ICI204448(Shaw, J.S.、Carroll, J.A.、Alcoc, P及びMain, B.G.、Br. J. Pharmacol.、96、986〜992、1989)、GR94839(Rogers, H.、Birch, P.J.、Harrison, S.M.、Palmer, E.、Manchee, G.R.、Judd, D.B.、Naylor, A.、Scopes, D.I.C.及びHayes, A.G.、Br. J. Pharmacol.、106、783〜789、1992)、Cadila Healthcare Ltd.の、カッパオピオイドアゴニストとしての新規の複素環式化合物(WO2015/119660)、並びにEMD61753/ Asimadoline(Barber, A.、Bartoszyk, G.D.、Bender, H.M.、Gottschlich, R.、Greiner, H.E.、Harting, J.、Mauler, F.、Minck, K.O.、Murray, R.D.、Simon, M及びSeyfried, C.A.、Br. J. Pharmacol.、113、1317〜1327、1994)等の、末梢制限されたκ-オピオイドアゴニストの開発を試みた。
【０００８】
残念ながら、これらの化合物のほとんどは、不満足なバイオアベイラビリティ、効力の欠如又は鎮痛薬の投与でのCNS副作用のために、臨床試験を続けられなかった(Barber, A.及びGottschlich, R.、Exp. Opin. Invest. Drugs、6、1351〜1368、1997)。アシマドリンは、ICI204448、GR94839、及びBRL52974等の他に報告されている末梢KORアゴニストと区別されるように設計され、合成された。アシマドリンは、疎水性ジフェニルメチル基及び親水性ヒドロキシル基を含有する両親媒性分子である。アシマドリンは、成功裏に、過敏性腸症候群(IBS)の徴候/治療に関する第II相の臨床試験に合格し、現在は、下痢型IBS(D-IBS)に罹患した患者の治療に関する第III相の臨床試験下にある。
【０００９】
CR665及びCR845は、KORに非常に強く選択的に結合する全てのD-アミノ酸からなるテトラペプチドである。Dooleyら(Dooley, C.T.、Ny, P.、Bidlack, J.M.及びHoughten, R.A.、J. Biol. Chem.、273、18848〜18856、1998)は、高親和性かつ選択的なκ-オピオイドアゴニストとしてのテトラペプチド(FE200041/CR665)の発見を報告した。データは、FE200041が、有効な用量より多い用量でCNS副作用がない、高選択的κ-オピオイド抗侵害受容作用剤であることを実証する。FE200041の末梢抗侵害受容作用は、痛みを制御する上で使用される末梢制限オピオイドペプチドの開発が可能であることを示唆する。第I相の研究において、CR845は、不快又は精神異常作用の徴候がなく、耐容性が良好であると思われる。しかし、第III相の研究では、CR845は、高ナトリウム血症(血液中のナトリウムレベルの上昇)により臨床試験差し止めになった。
【００１０】
Cara Therapeutics Inc.は、様々な疾患及び状態に関連する疼痛及び炎症の治療に有用な、末梢KORアゴニストとしての合成ペプチドアミド配位子を開示する(WO99/32510、US2008/7402564、US2009/0075907、US2009/0156508、US2009/0264373、US2010/7727963、US2010/0075910、US2010/7713937、US2010/7842662、US2010/0029575、US2011/0118186、US2011/0257105、US2011/0212882、US2013/0012448、WO2007/139921、WO2008/060552、WO2013/184794、WO2015/065867及びUS2015/0150935)。Cara Therapeuticsからの特許出願(WO2008/057608)は、κ-オピオイド受容体として以下の一般式の合成ペプチドアミド化合物を開示する。
【００１１】
【化１】
0006651546.tif 000002
【００１２】
式中、部分:
【００１３】
【化２】
0006651546.tif 000003
【００１４】
は、
【００１５】
【化３】
0006651546.tif 000004
【００１６】
から選択される。
【００１７】
内臓痛、痛覚過敏、関節リウマチの炎症、骨関節炎、IBD炎症、IBS炎症、眼の炎症、耳炎症、又は自己免疫性炎症の状態を制御/予防する上でのKORアゴニストの可能性を考慮して、我々は、最初に、少数の短鎖ペプチド(WO2008/057608、チャート1に列挙された2種の化合物)及びそれらの類似体を調製した。
【００１８】
【表１】
0006651546.tif 000005
【００１９】
しかし、これらの合成ペプチドは、酢酸誘発ライジングモデルにおいて強力なin vitroカッパオピオイド受容体アゴニスト活性(EC50>10nM濃度)又はin vivo活性(in vivo抗侵害受容活性、EC50>3mg/kg、iv用量)を示さなかった。驚くべきことに、特定の2環を含むペプチド(Table 1(表2)に列挙した化合物4、5、15、16、35、36及び37)は、酢酸誘発ライジングモデルにおいて、強力なin vitro KORアゴニスト活性(EC50<100pM濃度、Table 4(表5))及びin vivo効力を示した(in vivo抗侵害受容活性、EC50≦0.1mg/kg、iv用量、Table 5(表6))。これは、合成ペプチドの右末端(窒素含有二環及び架橋環状環系)が、このクラスの分子において、強力なin vitro KORアゴニスト活性及びin vivo抗侵害受容活性をもたらすために必要な重要因子の1つであることを明確に示す。
【００２０】
我々は、本明細書において、内臓痛、痛覚過敏、関節リウマチ炎症、骨関節炎、IBD炎症、IBS炎症、眼の炎症、耳炎症、又は自己免疫性炎症の治療又は予防等、カッパ(κ)オピオイド受容体(KOR)が関与する疾患の治療又は予防において有用な、選択的かつ末梢に作用するKORアゴニストである一連の一般式(I)の新規の短鎖ペプチドを開示する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２１】
【特許文献１】WO2015/119660
【特許文献２】WO99/32510
【特許文献３】US2008/7402564
【特許文献４】US2009/0075907
【特許文献５】US2009/0156508
【特許文献６】US2009/0264373
【特許文献７】US2010/7727963
【特許文献８】US2010/0075910
【特許文献９】US2010/7713937
【特許文献１０】US2010/7842662
【特許文献１１】US2010/0029575
【特許文献１２】US2011/0118186
【特許文献１３】US2011/0257105
【特許文献１４】US2011/0212882
【特許文献１５】US2013/0012448
【特許文献１６】WO2007/139921
【特許文献１７】WO2008/060552
【特許文献１８】WO2013/184794
【特許文献１９】WO2015/065867
【特許文献２０】US2015/0150935
【特許文献２１】WO2008/057608
【非特許文献】
【００２２】
【非特許文献１】Evans, C.、Keith, J.D.、Morrison, H.、Magendzo, K及びEdwards, R.、Science、258、1952〜1955、1992
【非特許文献２】Cox, B. M.、Mol. Pharmacol.、83、723〜728、2013
【非特許文献３】Chen, Y.、Mestek, A.、Liu, J.、Hurley, J.及びYu, L.、Mol. Pharmacol.、44、8〜12、1993
【非特許文献４】Meng, F.、Xie, G. X.、Thompson, R.、Mansour, A.、Goldstein, A.、Watson, S. J.及びAkil, H.、Proc. Natl. Acad. Sci.、U. S. A.、90、9954〜9958、1993
【非特許文献５】Simonin, F.、Gaveriaux, R. C.、Befort, K.、Matthes, H.、Lannes, B.、Micheletti, G.、Mattei, M. G.、Charron, G.、Bloch, B.及びKieffer, B.、Proc. Natl. Acad. Sci.、U. S. A.、92、7006〜7010、1995
【非特許文献６】Stein, C.、Anesth. Analg.、76、182〜191、1993
【非特許文献７】Pasternak, G. W.、Clin. Neuropharmacol.、16、1〜18、1993
【非特許文献８】Barber, A.及びGottschlich, R.、Med. Res. Rev.、12、525〜562、1992
【非特許文献９】Prather, P. L.、McGinn, T. M.、Claude, P. A.、Liu-Chen, L. Y.、Loh, H. H.及びLaw, P. Y.、Mol. Brain. Res.、29、336〜346、1995
【非特許文献１０】Field, M. J.、Carnell, A. J.、Gonzalez, M. I.、McCleary, S.、Oles, R. J.、Smith, R.、Hughes, J.及びSingh, L.、Pain、80、383〜389、1999
【非特許文献１１】Catheline, G.、Guilbaud, G.及びKayser, V.、Eur. J. Pharmacol.、357、171〜178、1998
【非特許文献１２】Delgado Aros S.、Chial H.J.、Camilleri M.、Szarka L.A.、Weber F.T.、Jacob, J.、Ferber, I.、McKinzie, S.、Burton, D.D.及びZinsmeister, A.R.、Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol.、284、G558〜G566、2002
【非特許文献１３】Dapoigny, M.、Abitbol, J.L.、Fraitag, B.、Digest. Dis. Sci.、40、2244〜2249、1995
【非特許文献１４】Mangel, A.W.、Bornstein, J.D.、Hamm, L.R.、Buda, J.、Wang, J.、Irish, W.、Urso, D.、Pharmacol. Ther.、28、239〜249、2008
【非特許文献１５】Endoh, T.、Tajima, A.、Suzuki, T.、Kamei, J.、Suzuki, T.、Narita, M.、Tseng, L.及びNagase, H.、Eur. J. Pharmacol. 387、133〜140、2000
【非特許文献１６】Peters, G.及びGaylor, S.、Clin. Pharmacol. Ther.、51、PPF-5、1989
【非特許文献１７】Walker, J.S.、Adv. Exp. Med. Biol.、521、148〜60、2003
【非特許文献１８】Bileviciute-Ljungar、T. Saxne、及びM. Spetea、Rheumatology、45、295〜302、2006
【非特許文献１９】Pan, Z.Z.、Tershner, S.A.、Fields, H.L.、Nature、389、382〜385、1997
【非特許文献２０】Chavkin, C.、Neuropsychopharmacology、36、369〜370、2011
【非特許文献２１】Pfeiffer, A.、Brantl, V.、Herz, A.及びEmrich, H.M.、Science、233、774〜776、1986
【非特許文献２２】Dykstra, L.A.、Gmerek, D.E.、Winger, G.及びWoods, J.H.、J. Pharmacol. Exp. Ther.、242、413〜420、1987
【非特許文献２３】Rimoy, G.H.、Wright, D.M.、Bhaskar, N.K.、Rubin, P.C.、Eur. J. Clin. Pharmacol. 46 (3)、203〜207、1994
【非特許文献２４】Wilson, J.L.、Nayanar, V.及びWalker, J.S.、Br. J. Pharmacol.、118、1754〜1760、1996
【非特許文献２５】Shaw, J.S.、Carroll, J.A.、Alcoc, P及びMain, B.G.、Br. J. Pharmacol.、96、986〜992、1989
【非特許文献２６】Rogers, H.、Birch, P.J.、Harrison, S.M.、Palmer, E.、Manchee, G.R.、Judd, D.B.、Naylor, A.、Scopes, D.I.C.及びHayes, A.G.、Br. J. Pharmacol.、106、783〜789、1992
【非特許文献２７】Barber, A.、Bartoszyk, G.D.、Bender, H.M.、Gottschlich, R.、Greiner, H.E.、Harting, J.、Mauler, F.、Minck, K.O.、Murray, R.D.、Simon, M及びSeyfried, C.A.、Br. J. Pharmacol.、113、1317〜1327、1994
【非特許文献２８】Barber, A.及びGottschlich, R.、Exp. Opin. Invest. Drugs、6、1351〜1368、1997
【非特許文献２９】Dooley, C.T.、Ny, P.、Bidlack, J.M.及びHoughten, R.A.、J. Biol. Chem.、273、18848〜18856、1998
【非特許文献３０】M. Bodansky、A. Bodansky、「The practice of peptide synthesis」、Springer-Verlag、Berlim、1984
【非特許文献３１】E. Gross、J. Meinhofer、「The peptide synthesis, analysis, biology」、1巻、Academic Press、London、1979
【非特許文献３２】G. Barany & R. B. Merrifield、「The peptides: Analysis, synthesis, Biology」;2巻-「Special methods in peptide synthesis, Part A」、3〜284頁、E. Gross & J. Meienhofer編、Academic Press、New York、1980
【非特許文献３３】J. M. Stewart及びJ. D. Young、「Solid-phase peptide synthesis」第2版、Pierce chemical Co.、Rockford、II、1984
【非特許文献３４】E. Atherton & R.C. Sheppard、「The Fluorenylmethoxycarbonyl amino protecting group」、「The peptides: Analysis, synthesis, Biology」;9巻-「Special methods in peptide synthesis, Part C」、1〜38頁、S. Undenfriend & J. Meienhofer編、Academic Press、San Diego、1987
【非特許文献３５】Boesten, W.H.J.ら、Org. Lett.、3(8)、2001、1121〜1124
【非特許文献３６】Cativiela C.、Diaz-de-villegas M.D.、Tetrahedran Asymmetry、9、1988、3517〜3599
【非特許文献３７】King D.S.ら、Int. J. Peptide Protein Res.、1990、36、255〜266
【非特許文献３８】TL 53、6332〜6334、2012
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２３】
本発明は、内臓痛、痛覚過敏、関節リウマチ炎症、骨関節炎、IBD炎症、IBS炎症、眼の炎症、耳炎症、又は自己免疫性炎症の治療又は予防等、カッパ(κ)オピオイド受容体(KOR)が関与する疾患の治療又は予防において有用な、一般式(I)の新規の短鎖ペプチド、その互変異性型、その鏡像異性体、そのジアステレオ異性体、その立体異性体、その薬学的に許容される塩に関する。本発明はまた、前記化合物の製造方法、それを含む医薬組成物、及びその使用にも関する。
A-B-C-D-E (式I)
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明の実施形態は、一般式(I)の新規の短鎖ペプチド、その互変異性型、その鏡像異性体、そのジアステレオ異性体、その立体異性体、その薬学的に許容される塩、及びそれらを含有する医薬組成物又はそれらの好適な混合物を提供する。
【００２５】
本発明の更なる実施形態において、一般式(I)の短鎖ペプチド、その互変異性型、その鏡像異性体、そのジアステレオ異性体、その立体異性体、その薬学的に許容される塩、又はそれらの混合物を、好適な担体、溶媒、希釈剤、及びこのような組成物の調製に通常用いられるその他の媒体と組み合わせて含有する医薬組成物を提供する。
【００２６】
更なる実施形態では、治療に有効かつ非毒性の量の一般式(I)の短鎖ペプチド又はその薬学的に許容される組成物を哺乳動物に投与することによる、KORアゴニストとしての本発明の新規の短鎖ペプチドの使用を提供する。
【００２７】
更に別の実施形態では、式(I)の短鎖ペプチド又はその薬学的に許容される塩、互変異性型及び鏡像異性型の調製方法を提供する。
【００２８】
本発明の化合物の調製の記述に使用される略語の一覧は以下の通りである:
AC: アデニリルシクラーゼ
ACN: アセトニトリル
Ala: アラニン
Asn: アスパラギン
Asp: アスパラギン酸
Arg: アルギニン
Boc: tert-ブトキシカルボニル
BOP: ベンゾトリアゾール-1-イル-オキシ-トリス-(ジメチルアミノ)-ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート
Cbz: ベンジルオキシカルボニル
CNS: 中枢神経系
DCC: N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド
DIPCDI: N,N'-ジイソプロピルカルボジイミド
DCM: ジクロロメタン
DIPEA: N,N'-ジイソプロピルエチルアミン
DMAP: ジメチルアミノピリジン
DMF: N,N'-ジメチルホルムアミド
Gln: グルタミン
Glu: グルタミン酸
Gly: グリシン
GPCR: Gタンパク質共役受容体
δ: デルタ
Har: ホモアルギニン
His: ヒスチジン
Hlys: ホモリジン
HOBt: 1-ヒドロキシベンゾトリアゾール
HPLC: 高速液体クロマトグラフィー
IBD: 炎症性腸疾患
IBS: 過敏性腸症候群
κ: カッパ
KOR: カッパ(κ)オピオイド受容体
μ: ミュー
Leu: ロイシン
Lys: リジン
NMM: N-メチルモルホリン
Orn: オルニチン
PNS: 末梢神経系
Ser: セリン
TFA: トリフルオロ酢酸
Thr: トレオニン
TIS: トリイソプロピルシラン
Trt: トリチル
Tyr: チロシン
Val: バリン
【００２９】
発明の説明
これに応じて、本発明は、以下に表す一般式(I)
A-B-C-D-E (式I)
の新規の短鎖ペプチド(その薬学的に許容される塩を含む)であって、式中、「A」及び「B」は、独立に、Phe、α-Me-Phe、Tyr、フェニルグリシン、ホモフェニルアラニン、シクロヘキシルグリシン、シクロヘキシルアラニンから独立に選択することができる、第1及び第2のアミノ酸を表し、これらのアミノ酸のいずれかに存在する芳香族環は、H、ハロ、NO2、NH2、アルキル、CF3及びCNで置換することができ、
「C」は、ノルロイシン、Phe、Ala、Leu、α-Me-Leu、ホモロイシン、Val、1-アミノシクロヘキサンカルボン酸、1-アミノシクロペンタンカルボン酸、シクロヘキシルグリシンから選択することができる第3のアミノ酸を表し、
「D」は、Arg、Lys、Har、Orn、Ala、Hlys、ノルロイシン、Hisからなる群から選択され、
「E」は、
【００３０】
【化４】
0006651546.tif 000006
【００３１】
からなる群から選択され、式中、Rは、それぞれの出現において、H、-NR'R"、-CN、-COOR'、-CONR'R"、-CO(CH2)n-OR'、-OR'、-(CH2)nOR'、-SO2R'又は-SO2NR'R"、-(CH2)nCOOR'、-(CH2) nCONR'R"、-(CH2)nNR'R"、-NH(CH2)nCOOR'、-(CH2)nCONHR、-CH2CON[(CH2)nCOOR']2、-CH2CON[(CH2)nOR']2、-COCH2N[(CH2)nCOOR']2、-CO(CH2)n-NR'R"、-CO(CH2)nCOOR'、-CO(CH2)nCONR'R"、-(CH2)nCONHNR'R"、-CO(CH2)nCONHNR'R"、-(CH2)nNHNR'R"、-(CH2)nCN、-CHR1COOR'、-CR1R2COOR'、-アルキルアリール、アリール、C1〜C10アルキル、アミジノ、C1〜C6アルキル置換アミジノから選択され、R'及びR"のそれぞれは、それぞれの出現において、独立に又は両方とも、H、C1〜C10アルキル、分枝アルキル、アルキルアリール、アリールから選択してもよく、又はR'及びR"を組み合わせて4〜6員環を形成してもよく、n=1〜10であり、R1及びR2は、それぞれの出現において、独立に又は両方とも、アルキル及びハロゲンから選択することができる、ペプチドに関する。
【００３２】
代替の実施形態では、R及びR'のそれぞれはまた、Asp、Glu、Asn、Gln、Lys、Arg、His、Ala、Ser、Thr、Leu、Val、Gly、Har、2-アミノヘプタン二酸からなる群から選択されるアミノ酸も表すことができる。
【００３３】
好ましい実施形態では、「A」及び「B」のそれぞれは、独立にPhe及びTyrから選択され、「C」は、好ましくはLeu、ノルロイシン及び1-アミノシクロヘキサンカルボン酸から選択することができる第3のアミノ酸を表し、「D」は、好ましくはLys、Arg及びAlaから選択することができる第4のアミノ酸を表す。
【００３４】
特に有用な化合物は、以下から選択してよいが、以下に限定されない。
【００３５】
【表２Ａ】
0006651546.tif 000007
【００３６】
【表２Ｂ】
0006651546.tif 000008
【００３７】
【表２Ｃ】
0006651546.tif 000009
【００３８】
【表２Ｄ】
0006651546.tif 000010
【００３９】
【表２Ｅ】
0006651546.tif 000011
【００４０】
【表２Ｆ】
0006651546.tif 000012
【００４１】
【表２Ｇ】
0006651546.tif 000013
【００４２】
【表２Ｈ】
0006651546.tif 000014
【００４３】
【表２Ｉ】
0006651546.tif 000015
【００４４】
短鎖ペプチドの調製
本発明の短鎖ペプチドを調製するために、いくつかの合成経路を用いることができる。式(I)の短鎖ペプチド(式中、全ての記号は先に定義した通りである)は、ペプチド合成の当業者に公知の従来技術又は当業者に認められた前記技術の改変形態と一緒に、下記の方法を用いて合成することができる。参照される方法は、下記の方法を含むが、これに限定されない。本明細書に記載の短鎖ペプチドは、液相(好ましくは、M. Bodansky、A. Bodansky、「The practice of peptide synthesis」、Springer-Verlag、Berlim、1984; E. Gross、J. Meinhofer、「The peptide synthesis, analysis, biology」、1巻、Academic Press、London、1979に一般的に記載されている、Boc化学を使用)及び/又は固相技術、例えば一般的にG. Barany & R. B. Merrifield、「The peptides: Analysis, synthesis, Biology」;2巻-「Special methods in peptide synthesis, Part A」、3〜284頁、E. Gross & J. Meienhofer編、Academic Press、New York、1980;並びにJ. M. Stewart及びJ. D. Young、「Solid-phase peptide synthesis」第2版、Pierce chemical Co.、Rockford、II、1984に記載されているものの両方の好適な改変形態を使用した化学合成によって生成してよい。
【００４５】
本発明の短鎖ペプチドの調製の好ましい戦略は、固相及び/又は液相手法の使用に基づく。
【００４６】
固相ペプチド合成(SPPS):
式(I)の化合物は、スキーム-1に記載の固相合成と共に十分に当業者の範囲内の好適な修正/改変によって調製することができる。
【００４７】
アミノ酸側鎖(存在する場合)の一時的な保護のためのtert-ブトキシカルボニル(Boc)、tert-ブチル(But)、トリチル(Trt)基(図1)等の酸に不安定な保護基と組み合わせて、Fmoc(9-フルオレニルメトキシカルボニル)基をα-アミノ基の一時的な保護のために使用する、FmocベースのSPPS手法を利用する(例えば、E. Atherton & R.C. Sheppard、「The Fluorenylmethoxycarbonyl amino protecting group」、「The peptides: Analysis, synthesis, Biology」;9巻-「Special methods in peptide synthesis, Part C」、1〜38頁、S. Undenfriend & J. Meienhofer編、Academic Press、San Diego、1987を参照)。
【００４８】
短鎖ペプチドは、ペプチドのC末端から開始して、不溶性ポリマー支持剤(樹脂)上で段階的なやり方で合成することができる。実施形態において、合成は、アミド、エステル又はエーテル結合の形成を通してペプチドのC末端アミノ酸を樹脂に付けることによって開始される。これは、それぞれ、C末端アミド、カルボン酸又はアルコールとして得られたペプチドの最終放出を可能にする。
【００４９】
FmocベースのSPPSにおいて、合成中に使用されるC末端アミノ酸及び他の全てのアミノ酸は、それらのα-アミノ基及び側鎖官能基(存在する場合)を有する必要があり、これらは示差的に保護され(直交保護)、20%ピペリジン溶液等の好適な塩基を使用して、いずれも時期尚早に樹脂からペプチドが切断されることなく、又は、通常、酸に不安定な保護基で保護されている側鎖保護基が脱保護されることなく、合成中にα-アミノ保護基を選択的に除去できる。
【００５０】
アミノ酸のカップリングは、そのカルボキシル基を活性エステルとして活性化することと、それと樹脂に付されたN末端アミノ酸の非ブロック化α-アミノ基とを反応させることとによって実施される。カップリング及び脱保護が終わるごとに、ペプチジル樹脂を過剰な溶媒、例えばDMF、DCM及びジエチルエーテルで洗浄した。一連のα-アミノ基の脱保護及びカップリングは、所望のペプチド配列が組み立てられるまで繰り返される(スキーム-1)。次いで、通常、副反応を制限するための適当なスカベンジャーの存在下で適当な切断混合物を使用して、樹脂からペプチドを切断し、それと同時に側鎖官能基の脱保護が起こる。得られたペプチドを、逆相HPLCによって最終的に精製する。
【００５１】
最終ペプチドの前駆体として必要なペプチジル樹脂の合成は、市販の架橋ポリスチレンポリマー樹脂(Novabiochem, San Diego, CA)を利用する。本発明における使用に好ましいのは、Fmoc-PAL-PEG-PS樹脂、4-(2',4'-ジメトキシフェニル-Fmoc-アミノメチル)-フェノキシアセチル-p-メチルベンズヒドリルアミン樹脂(Fmoc-RinkアミドMBHA樹脂)、2-クロロ-トリチル-クロリド樹脂又はp-ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂(HMP樹脂)、トリクロロアセトイミデート樹脂、p-ニトロフェニルカーボネートワング(wang)樹脂(これにC末端アミノ酸が既に結合していても結合していなくてもよい)である。C末端アミノ酸が結合していない場合、DIPCDIとの反応によって形成されるFmoc保護アミノ酸のHOBt活性エステルによってその結合が実現できる。2-クロロ-トリチル樹脂の場合、DIPEAを使用して、第1のFmoc保護アミノ酸のカップリングを実現した。次のアミノ酸の集合体では、10〜20%のピペリジン溶液を使用して、ペプチジル樹脂のN末端の保護を選択的に脱保護した。カップリング及び脱保護を終わるごとに、DMF、DCM及びエーテルで洗浄することによって過剰なアミノ酸及びカップリング試薬を除去した。後続のアミノ酸のカップリングは、それぞれDIPCDI/HOBt又はDIPCDI/HOAtから生成されるHOBt又はHOAt活性エステルを使用して実現することができる。いくつかの難しいカップリング、特に疎水性のアミノ酸又は巨大な側鎖の保護を有するアミノ酸のカップリングの場合、完全カップリングは、HBTU、PyBOP又はTBTU等の高効率のカップリング剤とDIPEA等の添加剤との組み合わせを使用して達成できる。
【００５２】
本明細書に記載の短鎖ペプチドの合成は、Fmoc/トリチル保護戦略を利用して、CS-Bio又はAAPPTECペプチドシンセサイザー等のバッチ又は連続フロー型ペプチド合成装置を使用することによって実施することができる。異なる位置に存在する非天然かつ非市販のアミノ酸を、当技術分野で公知の1つ以上の方法を利用して、ペプチド鎖に組み入れた。一手法において、適当な文献手順を利用して、Fmoc保護された非天然のアミノ酸を溶液中で調製した。
【００５３】
【化５】
0006651546.tif 000016
【００５４】
図1:  短鎖ペプチドのFmocベース固相ペプチド合成(SPPS)において使用された、いくつかの保護アミノ酸の例
【００５５】
Fmoc保護α-メチル化アミノ酸は、不斉ストレッカー合成法を利用して調製した(Boesten, W.H.J.ら、Org. Lett.、3(8)、2001、1121〜1124; Cativiela C.、Diaz-de-villegas M.D.、Tetrahedran Asymmetry、9、1988、3517〜3599)。次いで、結果として得られた誘導体を、ペプチドの段階的合成において使用した。或いは、有機合成化学手順を用いて必要な非天然アミノ酸を直接樹脂上に構築し、直鎖状ペプチド鎖を構築した。
【００５６】
各短鎖ペプチドのためのペプチド-樹脂前駆体を、文献(King D.S.ら、Int. J. Peptide Protein Res.、1990、36、255〜266)に記載の標準切断手順のうちのいずれかの好適な改変形態を利用して切断及び脱保護してよい。本発明における使用に好ましい方法は、水及びスカベンジャーとしてのTIPSの存在下での、TFA切断混合物の使用である。典型的には、ペプチジル樹脂をTFA/水/TIPS(95:2.5:2.5)中、室温で1.5〜4時間インキュベートした。次いで切断された樹脂を濾過し、TFA溶液を減圧下で濃縮する又は乾燥する。結果として得られた未精製ペプチドをEt2Oで沈殿させるか若しくは洗浄し、又は分取HPLCによる精製のために直接DMF若しくは50%水性酢酸に再び溶解させる。
【００５７】
所望の純度を有する短鎖ペプチドは、分取HPLCを利用した精製によって得ることができる。未精製ペプチドの溶液をセミ分取カラム(Luna 10μ; Ci8; 100A°)寸法250×50mmに注入し、水中ACNの直線勾配で溶出し、両方とも0.1% TFAで緩衝し、40mL/分の流量を使用し、流出液を220nmでPDA検出器によってモニタリングする。精製短鎖ペプチドの構造は、エレクトロスプレー質量分析法(ES-MS)によって確認することができる。
【００５８】
調製した全てのペプチドは、分取HPLCによる精製の後、対イオンとしてのTFAを用いて、トリフルオロ酢酸塩として単離した。しかし、一部のペプチドは、好適なイオン交換樹脂床、好ましくは陰イオン交換樹脂Dowex SBR P(Cl)又は同等の塩基性陰イオン交換樹脂を通過させることによって脱塩した。場合によっては、希酢酸緩衝剤で溶出し、好適なイオン交換樹脂を通過させることによって、TFA対イオンを酢酸イオンと置き換えた。ペプチドの塩酸塩の調製では、製造の最終段階において、選択ペプチドを、酢酸塩と共に4M HClで処理した。結果として得られた溶液をメンブレンフィルター(0.2□m)に通して濾過し、後続して凍結乾燥して、白色からオフホワイト色のHCl塩を回収した。十分に当業者の範囲内の同様の技術及び/又はそのような好適な改変に従って、その他の好適な薬学的に許容される本発明の短鎖ペプチドの塩を調製した。
【００５９】
スキーム1:  固相法による式(I)の化合物の合成の一般的スキーム
【００６０】
【化６】
0006651546.tif 000017
【００６１】
SPPS手法を利用した、短鎖ペプチドの一般的調製方法:
樹脂上の短鎖ペプチドの集合:
十分な量(50〜100mg)のFmoc-PAL-PEG-PS樹脂若しくはFmoc-RinkアミドMBHA樹脂、又は2-クロロ-トリチル樹脂(投入量:0.5〜1.0mmol/g)をDMF(1〜10mL/樹脂100mg)中で2〜10分間膨潤させた。樹脂をDMF(10〜30mL/樹脂100mg)中の10〜30%ピペリジンと一緒に、10〜30分間インキュベートすることによって、樹脂上のFmoc基を外した。脱保護樹脂を濾過し、過度のDMF、DCM及びエーテルで洗浄した。洗浄した樹脂を、新たに蒸留したDMF(1mL/100mg樹脂)中で、窒素雰囲気下で5分間インキュベートした。予めHOBt(1〜3当量)で活性化された第1のFmoc保護アミノ酸(1〜3当量)及びDMF中DIPCDI(1〜2当量)の0.5M溶液を樹脂に添加し、次いで樹脂を、窒素雰囲気下で1〜3時間振盪させた。カップリングの完了を、定性ニンヒドリン試験を利用してモニタリングした。第1のアミノ酸のカップリング後、樹脂をDMF、DCM及びジエチルエーテルで洗浄した。次のアミノ酸のカップリングでは、先ず、10〜20%ピペリジン溶液を使用して、樹脂とカップリングした第1のアミノ酸上のFmoc保護を脱保護した後、上記の通り、好適なカップリング剤を使用して、Fmoc保護された第2のアミノ酸をカップリングした。上記の一般的スキーム1の通りに、樹脂上に所望のペプチド鎖が集合するまで、脱保護、洗浄、カップリング及び洗浄のサイクルを繰り返した。最後に、上記で調製したFmoc保護ペプチジル樹脂を、上記の20%ピペリジン処理によって脱保護し、ペプチジル樹脂をDMF、DCM及びジエチルエーテルで洗浄した。所望のペプチドを含有する樹脂を、窒素圧下で10〜15分間乾燥し、切断/脱保護を経させた。
【００６２】
当業者の範囲内にある、上記のプロトコル及びその好適な改変形態を利用して、本発明において設計された短鎖ペプチドを、Fmoc-SPPS手法を利用して調製した。更に、以下のプロトコルを利用して、樹脂に結合した短鎖ペプチドを、切断し、脱保護し、精製し、特性化した。
【００６３】
切断及び脱保護:
所望の短鎖ペプチドを、以下の通りにTFA切断混合物で処理することによって、それら各々のペプチジル樹脂から切断及び脱保護した。TFA/水/トリイソプロピルシラン(95:2.5:2.5)(10mL/100mgのペプチジル樹脂)溶液をペプチジル樹脂に添加し、混合物を時々攪拌しながら室温で維持した。樹脂を濾過し、切断混合物で洗浄し、合わせた濾液を蒸発して乾燥した。得られた残留物を10mLの水に溶解し、水性層をエーテル(各20mL)で3回抽出し、最終的に水性層を凍結乾燥した。凍結乾燥後に得られた未精製ペプチドを、以下の通りに分取HPLCによって精製した。
【００６４】
未精製短鎖ペプチドの分取HPLC精製:
分取HPLCを、Shimadzu LC-8A液体クロマトグラフ上で実施した。DMF又は水に溶解した未精製ペプチドの溶液をセミ分取カラム(Luna 10□; Ci8; 100A□)寸法250×50mmに注入し、水中ACNの直線勾配で溶出し、両方とも0.1% TFAで緩衝し、15〜50mL/分の流量を使用し、流出液を220nmでPDA検出器によってモニタリングした。典型的な20%〜70%の水-ACN混合物の勾配を、0.1% TFAで緩衝し、1分当たり1%の勾配変化で、50分間にわたって使用した。所望の溶出生成物を、単一画分10〜20mLに集め、それぞれのHPLC画分を凍結乾燥することによって非晶質の白色粉末の純短鎖ペプチドを得た。
【００６５】
精製短鎖ペプチドのHPLC分析
上記の分取HPLCによる精製後、各ペプチドを、Shimadzu LC-10AD分析HPLC系上での分析RP-HPLCによって分析した。短鎖ペプチドの分析用HPLCによる分析では、Luna 5□; Ci8; 100A°の寸法250×4.6mmのカラムを、0.1% TFA及びACN緩衝剤の直線勾配で使用し、PDA検出器を使用して220nmでクロマトグラムを取得した。
【００６６】
質量分析による特性化
各ペプチドは、フローインジェクション又はLC/MSモードのいずれかで、エレクトロスプレーイオン化質量分析(ESI-MS)によって特性化した。全ての分析において三連四重極質量分析計(API-3000(MDS-SCIES, Canada))を陽イオン及び陰イオンエレクトロスプレーモードで使用した。単位解像度で操作した四重極の質量範囲にわたってフルスキャンデータを取得した。いずれの場合も、実験的に測定された分子量は、計算したモノアイソトピック分子量の0.5ダルトン以内だった。Analyst 1.4.1ソフトウェアを使用してマスクロマトグラムの定量化を行った。
【００６７】
化合物No.17の自動固相合成の代表例:
【００６８】
【化７】
0006651546.tif 000018
【００６９】
Fmoc固相ペプチド合成(SPPS)手法を利用して、直鎖状短鎖ペプチドH2N-Phe-Phe-Leu-Lys-Hpp-PAL-PEG-PSを、自動CS-Bio 536 PepSynthesiser(商標)上に集合させた(スキーム2)。Fmocアミノ酸及び2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート(TBTU)をバイアルに一緒に充填し、シンセサイザーのアミノ酸モジュール中に配置した。
【００７０】
ジイソプロピルエチルアミン(DIPEA; 0.9M)及びDMFの保存溶液を、乾燥窒素雰囲気下、試薬瓶に貯蔵した。樹脂Fmoc-PAL-PEG-PS(0.38mmol/g; 1g)を真空内で(1時間)P2O5上で乾燥し、新たに蒸留したDMF(5mL)中で膨潤させた。膨潤した樹脂は、スラリーであり、ガラス管に充填し、シンセサイザー中に配置した。全ての合成サイクルは、5mL  分-1の流量で実施した(Table 2(表3))。樹脂を、新たに蒸留したDMFで10分間洗浄した。Fmoc基の脱保護を、20%ピペリジン(DMF中)を用いて10分間実行し、304nmでカラム流出液をUV検出することによって脱保護をモニタリングした。
【００７１】
【表３】
0006651546.tif 000019
【００７２】
補助的な洗浄サイクル3回及び蒸留DMF洗浄サイクル(各サイクル15分)によって、過剰なピペリジンを除去した。アミノ基をFmoc-アミノ酸(4当量)で処理し、DIPEA(8当量)の存在下でTBTU(3.9当量)によって事前に活性化し、120分間リサイクルした。補助的な洗浄サイクル4回及び蒸留DMF洗浄サイクル(各サイクル10分)によってカラム及びループから過剰なアミノ酸及び溶解性副生成物を除去した。
【００７３】
【化８】
0006651546.tif 000020
【００７４】
更に、合成サイクル(脱保護、洗浄、アシル化及び洗浄)を繰り返して、直鎖状ペプチドの集合体を完成した。最終の脱保護サイクルを、15分間、DMF中の20%ピペリジンを用いて実施して末端Fmoc基を外した後、洗浄サイクル(10×4分)を実施した。完了ペプチド樹脂を焼結ガラス濾過器に通して濾過し、3回連続で、DMF、DCM、メタノール、DMF及びジエチルエーテル(各100mL)で洗浄した。ペプチド樹脂を真空内で、P2O5上で乾燥し(2時間)、-20℃で貯蔵した。
【００７５】
スキーム2:  化合物No.17のSPPS
ニンヒドリン樹脂試験を実施して、樹脂に結合したペプチドのN末端遊離アミノ基を確認した。溶液及び樹脂ビーズの青紫色の出現は、樹脂に結合したペプチド上の遊離アミノ基の存在を示し、これは陽性試験と見なした。小規模の切断を実施して樹脂に結合したペプチドの純度を評価した。乾燥ペプチド樹脂(約10mg)を、時々軽く掻き混ぜながら室温で90分間、TFA、水、トリイソプロピルシラン(95:2.5:2.5 v/v)の混合物(1mL)で処理した。樹脂を濾過し、純粋なTFA(1mL)で完全に洗浄し、全濾液を減圧下で蒸発させた。残留TFAをジエチルエーテル(2mL)と一緒に3回共沸した。得られた残留物を蒸留水(2mL)中に懸濁し、水性層をジエチルエーテル(3mL)で3回抽出した。水性層を分離し、凍結乾燥して、未精製ペプチドH2N-Phe-Phe-Leu-Lys-Hpp-CONH2を得た。凍結乾燥したペプチドH2N-Phe-Phe-Leu-Lys-Hpp-CONH2を0.1%の水性TFA(約1mg/1mL)に溶解し、その純度を分析用RP-HPLCによって分析し、エレクトロスプレーイオン化質量分析(ESI-MS)によって特性化した。HPLCによる純度:85%(未精製ペプチド)。ESI-MS: H2N-Phe-Phe-Leu-Lys-Hpp-CONH2について計算した値; 706.8(M+H+)、728.8(M+Na+)及び744.8(M+K+);測定値(m/z):706.8(M+H+)、728.8(M+Na+)及び744.8(M+K+);HPLCによる純度:99.18%(純ペプチド)。
【００７６】
液相ペプチド合成:
式(I)の化合物は、十分に当業者の範囲内の好適な改変/変更と共に、スキーム3に記載の液相合成によって調製することができる。
【００７７】
工程i:  DMAP、DIPEA等の塩基の存在下又は不在下で、DCM、DMF等の好適な溶媒中の、EDCI/HOBt、HATU、BOP、PyBOP、DCC/HOBt等の好適なカップリング剤を使用して、化合物(2)を用いた化合物(1)の凝縮は、化合物(3)を生成することができる。
【００７８】
工程ii:  化合物(3)は、THF、MeOH、EtOH等の好適な溶媒中の、LiOH、NaOH、KOH等の好適な塩基を使用して、化合物(4)に加水分解することができる。
【００７９】
工程iii:  DMAP、DIPEA等の塩基の存在下又は不在下で、DCM、DMF等の好適な溶媒中の、EDCI/HOBt、HATU、BOP、PyBOP、DCC/HOBt等の好適なカップリング剤を使用して、化合物(5)を用いた化合物(4)の凝縮は、化合物(6)を生成することができる。
【００８０】
スキーム3:  液相法による式(I)の化合物の合成の一般的スキーム
【００８１】
【化９】
0006651546.tif 000021
【００８２】
式中、A、B、C、D、及びEは、本発明の記述に記載されている。
【００８３】
工程iv:  化合物(6)は、THF、MeOH、EtOH等の好適な溶媒中の、LiOH、NaOH、KOH等の好適な塩基を使用して、化合物(7)に加水分解することができる。
【００８４】
工程v:  DMAP、DIPEA等の塩基の存在下又は不在下で、DCM、DMF等の好適な溶媒中の、EDCI/HOBt、HATU、BOP、PyBOP、DCC/HOBt等の好適なカップリング剤を使用して、化合物(8)を用いた化合物(7)の凝縮は、化合物(9)を生成することができる。
【００８５】
工程vi:  化合物(9)は、THF、MeOH、EtOH等の好適な溶媒中の、LiOH、NaOH、KOH等の好適な塩基を使用して、化合物(10)に加水分解することができる。
【００８６】
工程vii:  DMAP、DIPEA等の塩基の存在下又は不在下で、DCM、DMF等の好適な溶媒中の、EDCI/HOBt、HATU、BOP、PyBOP、DCC/HOBt等の好適なカップリング剤を使用して、化合物(11)を用いた化合物(10)の凝縮は、化合物(12)を生成することができる。
【００８７】
工程viii:  DCM等の好適な溶媒中のTFAによって化合物(12)のBoc保護基を外して、式(I)の化合物を生成することができる。
【００８８】
本明細書に記載の合成方法を、その他の一般に公知の技術及びその好適な改変形態と共に利用して、以下の新規の短鎖ペプチドを調製した。この一覧は、本発明に従って調製できる様々な短鎖ペプチド群を示し、少なくともこれらの短鎖ペプチドの明白な改変形態を含むことが予想される。しかし、このような開示は、本発明の範囲を決して制限するものではないと解釈すべきである。
【００８９】
化合物No.34の液相合成の代表例:
【００９０】
【化１０】
0006651546.tif 000022
【００９１】
工程i:  メチル2-(2-((tert-ブトキシカルボニル)アミノ)-3-フェニルプロパンアミド)-3-フェニルプロパノエートの合成
【００９２】
【化１１】
0006651546.tif 000023
【００９３】
Boc-Phe-OH(2.0g、7.53mmol)のDCM(20ml)溶液に、HOBt(1.02g、7.53mmol)及びDCC(1.55g、7.53mmol)を25〜30℃で添加した。混合物を10分間攪拌し、これにH2N-Phe-OMe(1.35g、7.53mmol)を添加した。反応混合物を25〜30℃で24時間攪拌し、濾過し、濾液をDCMで希釈した。有機層を飽和NaHCO3溶液、クエン酸溶液及びブラインで洗浄し、Na2SO4上で乾燥し、蒸発させて未精製生成物を得た。未精製生成物は、溶出液系としてDCM中の0〜2%のMeOHを使用したカラムクロマトグラフィーによって精製し、白色固体の標題化合物(3.0g、94%収率);ESI-MS:427.2(M+H+)を得た。
【００９４】
工程ii:  2-(2-((tert-ブトキシカルボニル)アミノ)-3-フェニルプロパンアミド)-3-フェニルプロパン酸の合成
【００９５】
【化１２】
0006651546.tif 000024
【００９６】
メチル2-(2-((tert-ブトキシカルボニル)アミノ)-3-フェニルプロパンアミド)-3-フェニルプロパノエート(2.0g、4.69mmol)のMeOH(20ml)溶液に、H2O(10ml)中のNaOH(0.38g、9.38mmol)を25〜30℃で添加した。反応混合物を25〜30℃で1時間攪拌した。1時間後、MeOHを蒸発させ、水性層をクエン酸溶液で酸性化し、固体を得た。固体を濾過し、乾燥して、白色固体の標題化合物(1.89g、98%収率);ESI-MS:413.2(M+H+)を得た。
【００９７】
工程iii:  メチル6,9-ジベンジル-12-イソブチル-2,2-ジメチル-4,7,10-トリオキソ-3-オキサ-5,8,11-トリアザトリデカン-13-オエートの合成
【００９８】
【化１３】
0006651546.tif 000025
【００９９】
2-(2-((tert-ブトキシカルボニル)アミノ)-3-フェニルプロパンアミド)-3-フェニルプロパン酸(1.5g、3.64mmol)のDCM(15ml)溶液に、HOBt(0.49g、3.64mmol)及びDCC(0.75g、3.64mmol)を25〜30℃で添加した。混合物を10分間攪拌し、それにH2N-Leu-OMe(0.52g、3.64mmol)を添加した。反応混合物を25〜30℃で24時間攪拌し、濾過し、濾液をDCMで希釈した。有機層を飽和NaHCO3溶液、クエン酸溶液及びブラインで洗浄し、Na2SO4上で乾燥し、蒸発させて未精製生成物を得た。未精製生成物は、溶出液系としてDCM中の0〜2% MeOHを使用したカラムクロマトグラフィーによって精製し、白色固体の標題化合物(1.82g、93%収率);ESI-MS:541.1(M+H+)を得た。
【０１００】
工程iv:  6,9-ジベンジル-12-イソブチル-2,2-ジメチル-4,7,10-トリオキソ-3-オキサ-5,8,11-トリアザトリデカン-13-オイック酸の合成
【０１０１】
【化１４】
0006651546.tif 000026
【０１０２】
メチル6,9-ジベンジル-12-イソブチル-2,2-ジメチル-4,7,10-トリオキソ-3-オキサ-5,8,11-トリアザトリデカン-13-オエート(1.3g、2.41mmol)のMeOH(13ml)溶液に、H2O(7ml)中のNaOH(0.19g、4.82mmol)を25〜30℃で添加した。反応混合物を25〜30℃で1時間攪拌した。1時間後、MeOHを蒸発させて、水性層をクエン酸溶液で酸性化し、固体を得た。固体を濾過し、乾燥して、白色固体の標題化合物(1.22g、96%収率)ESI-MS:527.0(M+H+)を得た。
【０１０３】
工程v:  メチル6,9-ジベンジル-15-(4-((tert-ブトキシカルボニル)アミノ)ブチル)-12-イソブチル-2,2-ジメチル-4,7,10,13-テトラオキソ-3-オキサ-5,8,11,14-アテトラアザヘキサデカン-16-オエートの合成
【０１０４】
【化１５】
0006651546.tif 000027
【０１０５】
6,9-ジベンジル-12-イソブチル-2,2-ジメチル-4,7,10-トリオキソ-3-オキサ-5,8,11-トリアザトリデカン-13-オイック酸(1.0g、1.90mmol)のDCM(10ml)溶液に、HOBt(0.26g、1.90mmol)及びDCC(0.39g、1.90mmol)を25〜30℃で添加した。混合物を10分間攪拌し、これにH2N-Lys(Boc)-OMe(0.49g、1.90mmol)を添加した。反応混合物を25〜30℃で24時間攪拌し、濾過し、濾液をDCMで希釈した。有機層を飽和NaHCO3溶液、クエン酸溶液及びブラインで洗浄し、Na2SO4上で乾燥し、蒸発させて未精製生成物を得た。未精製生成物は、溶出液系としてDCM中の0〜2% MeOHを使用したカラムクロマトグラフィーによって精製し、白色固体の標題化合物(1.34g、92%収率);ESI-MS:768.4(M+H+)を得た。
【０１０６】
工程vi:  6,9-ジベンジル-15-(4-((tert-ブトキシカルボニル)アミノ)ブチル)-12-イソブチル-2,2-ジメチル-4,7,10,13-テトラオキソ-3-オキサ-5,8,11,14-テトラアザヘキサデカン-16-オイック酸の合成
【０１０７】
【化１６】
0006651546.tif 000028
【０１０８】
メチル6,9-ジベンジル-15-(4-((tert-ブトキシカルボニル)アミノ)ブチル)-12-イソブチル-2,2-ジメチル-4,7,10,13-テトラオキソ-3-オキサ-5,8,11,14-テトラアザヘキサデカン-16-オエート(1.0g、1.33mmol)のMeOH(10ml)溶液に、H2O(5ml)中のNaOH(0.11g、2.66mmol)を25〜30℃で添加した。反応混合物を25〜30℃で1時間攪拌した。1時間後、MeOHを蒸発させて、水性層をクエン酸溶液で酸性化し、固体を得た。固体を濾過し、乾燥して白色固体の標題化合物(0.95g、97%収率);ESI-MS:754.4(M+H+)を得た。
【０１０９】
工程vii:  ビス-Boc-N-(6-アミノ-1-(3-ベンジル-3,6-ジアザビシクロ[3.1.1]ヘプタン-6-イル)-1-オキソヘキサン-2-イル)-2-(2-(2-アミノ-3-フェニルプロパンアミド)-3-フェニルプロパンアミド)-4-メチルペンタンアミドの合成
【０１１０】
【化１７】
0006651546.tif 000029
【０１１１】
6,9-ジベンジル-15-(4-((tert-ブトキシカルボニル)アミノ)ブチル)-12-イソブチル-2,2-ジメチル-4,7,10,13-テトラオキソ-3-オキサ-5,8,11,14-テトラアザヘキサデカン-16-オイック酸(0.2g、0.26mmol)のDCM(2ml)溶液に、HOBt(0.04g、0.26mmol)及びDCC(0.06g、0.26mmol)を25〜30℃で添加した。混合物を10分間攪拌し、これに3-ベンジル-3,6-ジアザビシクロ[3.1.1]ヘプタン(0.05g、0.26mmol)[参考文献:TL 53、6332〜6334、2012に従って調製]を添加した。反応混合物を25〜30℃で24時間撹拌し、濾過し、濾液をDCMで希釈した。有機層を飽和NaHCO3溶液、クエン酸溶液及びブラインで洗浄し、Na2SO4上で乾燥し、蒸発させて未精製生成物を得た。未精製生成物は、溶出液系としてDCM中の0〜3% MeOHを使用したカラムクロマトグラフィーによって精製し、白色固体の標題化合物(0.22g、89%収率);ESI-MS:924.6(M+H+)を得た。
【０１１２】
工程viii:  N-(6-アミノ-1-(3-ベンジル-3,6-ジアザビシクロ[3.1.1]ヘプタン-6-イル)-1-オキソヘキサン-2-イル)-2-(2-(2-アミノ-3-フェニルプロパンアミド)-3-フェニルプロパンアミド)-4-メチルペンタンアミドの合成
【０１１３】
【化１８】
0006651546.tif 000030
【０１１４】
ビス-Boc-N-(6-アミノ-1-(3-ベンジル-3,6-ジアザビシクロ[3.1.1]ヘプタン-6-イル)-1-オキソヘキサン-2-イル)-2-(2-(2-アミノ-3-フェニルプロパンアミド)-3-フェニルプロパンアミド)-4-メチルペンタンアミド(0.18g、0.19mmol)のDCM(2ml)溶液に、TFA(2ml)を25〜30℃で添加した。反応混合物を25〜30℃で3時間攪拌した。3時間後、溶媒を蒸発させ、得られた残留物をジエチルエーテルで洗浄した。未精製化合物は、分取HPLCによって精製し、純画分を集め、凍結乾燥して、白色固体の標題化合物(0.12g、84%収率);ESI-MS:725.0(M+H+)を得た。
【０１１５】
Table 1(表2)に記載の本発明の他の化合物は、上記の方法を、必要に応じて、十分に当業者の範囲内である慣例的な改変形態と組み合わせて合成した。化合物を、質量分析によって特性化し、以下に列挙する(Table 3(表4))。
【０１１６】
代表的な化合物の質量分析データをTable 3(表4)に列挙する。
【０１１７】
【表４Ａ】
0006651546.tif 000031
【０１１８】
【表４Ｂ】
0006651546.tif 000032
【０１１９】
【表４Ｃ】
0006651546.tif 000033
【０１２０】
合成した化合物を、下記の通りに、その生物活性について試験した。
【０１２１】
生物活性スクリーニング:
a)cAMPベース機能アッセイによるin vitro (EC50)の決定
cAMPベース機能アッセイを利用して、in vitroでの試験化合物のKORアゴニスト活性を評価した。完全Ham F-12培地100μl/ウェル中、30,000細胞/ウェルの密度で96ウェルプレートに播種した。播種後、プレートを、CO2インキュベーター中、37℃、5% CO2下で終夜インキュベートした。一晩置いた培地は廃棄し、プレートを100μl/ウェルの滅菌PBSで洗浄した。次いで無添加Ham F12中に0.5%脂肪酸フリーBSAを含む0.1mM IBMX(90μl)を各ウェルに添加した。これを、37℃、5% CO2下で30分間インキュベートさせた。0.5%脂肪酸フリーBSA中のホルスコリン20μMを各ウェルに添加し、室温で5分間インキュベートさせた。試験化合物をDMSO中で200倍に希釈し、次いで無添加Ham F12を含有するBSA中で1:10倍に希釈した。アゴニスト(10% DMSO中の試験化合物)を各ウェル(5μl)に添加し、37℃、5%CO2下で20分間インキュベートさせた。20分後、培地をウェルから吸引し、ウェルを1×PBSで洗浄した。細胞溶解緩衝剤4X(Arbor Assays、カタログ番号X074-60ML)をMilliQ中で1:4に希釈し、この緩衝剤90μlをウェルごとに添加した。細胞を室温で、500rpmにて20分間振盪させた。細胞溶解物を1.5mlエッペンドルフ型チューブに集め、13.2k rpm、4℃で15分間遠心分離した。次いで、細胞溶解物の上澄み50μlを、cAMP direct ELISA kit (Arbor Assay、カタログ番号K019-H5)によってcAMPを推定するために使用した。代表的な化合物のin vitroのカッパオピオイド受容体アゴニスト活性(EC50)をTable 4(表5)に列挙する。
【０１２２】
【表５】
0006651546.tif 000034
【０１２３】
本発明の試験化合物を、同様のアッセイで、ヒトミュー及びデルタオピオイド受容体上での効力について試験した。各試験化合物のヒトミュー及びデルタオピオイド受容体のEC50は10μM以上であり、選択的なカッパオピオイド受容体アゴニスト活性を示す。
【０１２４】
in vivoでの効力研究:
動物
動物を、1ケージ当たり6匹のグループで、一週間収容し、動物施設条件(25±4℃、60〜65%相対湿度、12:12の明:暗サイクル、午前7:30に点灯)に慣れさせた。全ての動物実験は、Zydus研究センター動物倫理委員会(Zydus Research Center animal ethical committee)による認可に従う国際的に有効なガイドラインに従って実施した。
【０１２５】
疼痛モデル
酢酸誘発ライジングモデルの利用によるin vivo (ED50)の決定
酢酸誘発ライジングアッセイは、末梢、脊髄及び脊柱上レベルで作用するオピオイド薬物の抗侵害受容活性を検出することができる。試験に先立って、動物を12〜16時間絶食させた。侵害刺激反応(腹部収縮又は苦悶)を、0分の時間で腹腔内(i.p.)に投与された希酢酸(マウスで0.6%、10ml/kg、ラットで2.5%、0.5ml/kg)によって誘発した。
【０１２６】
マウス実験において、化合物を経口、静脈内(i.v.)又は皮下(s.c.)投与した。抗侵害効能及び効力を決定するために、酢酸を投与する5分前に与えられた試験化合物で総用量反応曲線を構築した。用量反応曲線の研究中に規定された亜最大限に効果的な用量のための、作用の継続時間は、酢酸を投与する前の、次第に長くなる前処理時間(5、60、及び120分)を使用することによって決定した。ラット実験では、酢酸を投与する15分前に、化合物を経口、静脈内(i.v.)又は皮下(s.c.)投与した。酢酸の投与に引き続き、ライジングの数を15分間かけて計数した。ライジングは、多くの場合に後肢の伸展を伴う、腹部の収縮として定義される。最大効果(MPE)パーセントは、%MPE=100-[(試験化合物で処置した動物におけるライジング回数/ビヒクルで処置した動物におけるライジング回数)]×100で計算した。ED50用量は、GraphPad Prismを使用して決定した。いくつかの試験化合物の代表的なデータ(ED50)をTable 5(表6)に列挙する。
【０１２７】
【表６】
0006651546.tif 000035
【０１２８】
試験化合物のCNS効果の評価
試験化合物を生理食塩水に溶解し、経口、静脈内(i.v.)又は皮下(s.c.)経路で投与した。第1の用量3mg/kgを注射し、動物(ラット又はマウス)を、自然移動、鎮静作用及びカタレプシーについて観察した。薬力学的効果がある場合又はない場合、それぞれ、用量をスケールダウン又はスケールアップする。薬力学的効果を示す最小用量は、閾値用量(TD)と考えた。
【０１２９】
試験化合物の鎮痛効果対鎮静効果:
試験化合物による酢酸誘発ライジングの阻害は、鎮痛効果を示すが、試験化合物によってもたらされた自然移動、鎮静作用及びカタレプシーの低減は、全般的な鎮静作用の基準として使用することができる。安全性指数(SI)は、ED50用量のTDに対する比として計算することができる。代表的な化合物(化合物4、5、15、35及び36)は、50〜100倍の安全性指数を示し、試験化合物が、他のオピオイド受容体アゴニストに主に関連するCNS副作用を起こさないことを示した。
【０１３０】
これらの化合物は、関節リウマチ等の慢性炎症性疾患によって与えられる痛み及び苦痛を緩和する上で、並びに外科手術によって誘発される腸閉塞又は腹膜炎等の胃腸の運動障害の治療において有用である。好ましい実用性は、CNSを介したオピオイドの副作用を起こさずに末梢鎮痛をもたらすことである。例えば、腹腔鏡手術によって誘発される腹痛を低減できる。
【０１３１】
本発明は、ヒト等の哺乳動物におけるカッパオピオイド受容体関連の疾患又は状態の治療又は予防方法であって、有効な量の本発明の一般式(I)の化合物を含む組成物を哺乳動物に投与することを含む方法を提供する。別の実施形態では、カッパオピオイド受容体関連の状態は、痛み、炎症、掻痒、浮腫、腸閉塞、咳嗽又は緑内障である。
【０１３２】
本発明の新規の化合物は、周知の技術及び方法及び濃度で好適な賦形剤と合わせることによって好適な薬学的に許容される組成物に製剤化することができる。
【０１３３】
式(I)の化合物又はそれを含有する医薬組成物は、KORアゴニストとしての薬剤として有用であり、ヒト及びその他の温血動物に適しており、経口、局所又は非経口投与のいずれかによって投与することができる。
【０１３４】
したがって、本発明の化合物を含む医薬組成物は、好適な結合剤、好適な増量剤、及び/又は希釈剤並びに必要に応じてその他の好適な物質を含んでいてもよい。任意選択により、医薬組成物は、好適なコーティング剤で好適にコーティングされていてもよい。
【０１３５】
本発明の化合物(I)はKORアゴニストであり、カッパ(κ)オピオイド受容体(KOR)が関与する疾患の治療又は予防、例えば内臓痛、痛覚過敏、関節リウマチ炎症、骨関節炎、IBD炎症、IBS炎症、眼の炎症、耳炎症、又は自己免疫性炎症の治療又は予防において有用である。
【０１３６】
実施形態のうちの1つでは、本発明の式(I)は、1つ以上の好適な薬学的活性剤と組み合わせて同時投与することができる。特定の実施形態では、本発明の医薬組成物は、1つ以上の他の治療用化合物若しくは補助薬、例えばこれらに限定されないが、他のオピオイド、カンナビノイド、抗鬱剤、鎮痙剤、神経弛緩剤、抗ヒスタミン剤、アセトアミノフェン、コルチコステロイド、イオンチャネル遮断剤、非ステロイド系抗炎症薬(NSAID)及び利尿剤(これらの多くは、本発明の化合物と相乗効果がある)と同時投与することができる、又はこれらを含むことができる。
【０１３７】
好適なオピオイドには、アルフェンタニル、アルファプロジン、アニレリジン、ブレマゾシン、コデイン、デキストロモラミド、デゾシン、ジアモルヒネ、ジヒドロコデイン、ジヒドロモルヒネ、エチルケタゾシン、エチルモルヒネ、フェンタニル、ヒドロコドン、ヒドロモルホン、ロペラミド、メサドン、モルヒネ、ナロルフィン、オキシコドン、オキシモルホン、プロピラム及びトラマドールが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３８】
本発明の一実施形態は、式(I)の化合物とミューオピオイド受容体アゴニスト、例えばモルヒネ、フェンタニル又はオキシコドンとの同時処方及び/又は同時投与であり、ミューオピオイド用量の節約効果を目的とし、ミューオピオイドの用量は、便秘、吐き気、嘔吐、鎮静、呼吸抑制、掻痒、精神錯乱及び発作を含めた一般的なミューオピオイド副作用を最小限に抑えるために低減される。
【０１３９】
本発明の医薬組成物と同時投与することができる又はこれに取り入れることができる好適な抗鬱剤には、例えば、イミプラミン、デシプラミン、トリミプラミン及びクロミプラミン等の三環系抗鬱剤が挙げられる。本発明の医薬組成物と同時投与することができる又はこれに取り入れることができる好適な神経弛緩剤には、任意の神経弛緩剤、例えばドンペリドン、メトクロプラミド、ゾテピン、クロルプロマジン、アセトフェナジン、プロクロルペラジン及びチオチキセン等のD2ドーパミン受容体アンタゴニスト活性を有する化合物が挙げられる。フェノバルビタール、フェニトイン、カルバマゼピン、バルプロ酸、ガバペンチン及びトピラメート等の鎮痙剤も、本発明の医薬組成物に取り入れることができる。メトカルバモール、ジアゼパム及びクロルゾキサゾン等の筋肉弛緩剤;スマトリプタン等の抗偏頭痛薬;カフェイン等の中枢神経興奮剤;クロルフェニラミン及びピリラミン等の抗ヒスタミン剤;ナトリウムイオンチャネル遮断剤等のイオンチャネル遮断剤、カルバマゼピン、ジコノチド等のカルシウムイオンチャネル遮断剤;アミノアリールカルボン酸誘導体、アリール酢酸誘導体、アリール酪酸誘導体、アリールプロピオン酸誘導体、フェニルアルカン酸誘導体及びサリチル酸誘導体等の好適なNSAID;並びにメチルプレドニゾロン、ヒドロコルチゾン、コルチゾン及びトリアムシノロン等のコルチコステロイドを、本発明の医薬組成物に取り入れることができる。
【０１４０】
医薬組成物及びその単一剤形中の、本発明による式(I)の化合物である活性成分の量は、特定の適用方法、特定の化合物の効力、及び所望の濃度に応じて広範に変動し得る又は調節可能である。一般的に、活性成分の量は、組成物の0.5質量%〜90質量%の間の範囲になる。
【０１４１】
本発明は、具体的な実施形態の観点から記載しているが、特定の改変及び同等物は当業者に明らかであり、本発明の範囲内に含まれることが意図される。