(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １で表されるセンス鎖とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２で表されるアンチセンス鎖とからなる、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３で表されるセンス鎖とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ４で表されるアンチセンス鎖とからなる、ＡＤＡＭＴＳ−５を標的とする二重鎖ｓｉＲＮＡ。
【請求項２】
前記ｓｉＲＮＡの少なくとも１本鎖が、末端修飾、塩基修飾、糖修飾及び骨格修飾から選ばれた少なくとも１種類の化学修飾を含む請求項１に記載の二重鎖ｓｉＲＮＡ。
【請求項３】
前記ｓｉＲＮＡの少なくとも１本鎖が、
ａ）リン酸骨格のホスホロチオエート修飾、
ｂ）リボース又はデオキシリボースの２’−Ｏ−メチル修飾、
ｃ）リボース又はデオキシリボースの２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾、
ｄ）ロックド核酸（ＬＮＡ）修飾、
ｅ）開環核酸修飾、
ｆ）インドール修飾、
ｇ）塩基の５−メチルシトシン修飾、
ｈ）塩基の５−エチニルウラシル修飾、
ｉ）末端ヌクレオチドのコレステロール又はその誘導体修飾、
ｊ）末端ヌクレオチドのガラクトース修飾、
ｋ）末端ヌクレオチドのポリペプチド修飾、
ｌ）リン酸化修飾、
ｍ）末端ヌクレオチドの蛍光標記修飾、
ｎ）末端ヌクレオチドのビオチン修飾
から選ばれた少なくとも一つの化学修飾を含む請求項２に記載の二重鎖ｓｉＲＮＡ。
【請求項４】
前記センス鎖がヌクレオチド配列５’−Ｋ−ＬＬＭＵＵＵＡＵＧＵＧＧＧＣＡＵＰＭＱｄＴｄＴ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １３）であり、前記アンチセンス鎖がヌクレオチド配列５’−Ｒ−ＭＱＬＡＵＧＣＣＣＡＣＡＵＡＡＡＱＰＰｄＴｄＴ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １４）である請求項３に記載の二重鎖ｓｉＲＮＡ。
（ここで、Ｋは、５’−末端ヌクレオチドに接続されたコレステロール基であることができ、
Ｒは５’−末端ヌクレオチドのリン酸化修飾であることができ、
ｄＴはチミンデオキシリボヌクレオチドで、
Ｌは未修飾又は２’−Ｏ−メチル修飾のグアニンデオキシリボースヌクレオチドであって、
Ｍは未修飾又は２’−Ｏ−メチル修飾のアデニンデオキシリボースヌクレオチドであって、
Ｐは未修飾又は２’−Ｏ−メチル修飾のシトシンデオキシリボースヌクレオチドであって、
Ｑは未修飾又は２’−Ｏ−メチル修飾のウラシルリボースヌクレオチドであって、
Ｌ、Ｍ、Ｐ及びＱの中の少なくとも一つがチオリン酸骨格を有する。）
【請求項５】
前記センス鎖が表７のセンス配列から選ばれ、前記アンチセンス鎖が表７のアンチセンス配列から選ばれる請求項２乃至４の中のいずれかに記載の二重鎖ｓｉＲＮＡ。
【請求項６】
請求項１乃至５の中のいずれかに記載のｓｉＲＮＡと、選択可能な１種類の製薬的に許容されるベクターと、を含む薬物組成物。
【請求項７】
前記ｓｉＲＮＡは、少なくとも１種類のＡＤＡＭＴＳ−５を標的とするｓｉＲＮＡと、少なくとも１種類のＡＤＡＭ１７を標的とするｓｉＲＮＡとを含み、
前記ＡＤＡＭ１７を標的とする二重鎖ｓｉＲＮＡは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ７と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むセンス鎖と、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ８と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、前記センス鎖と相互補完するアンチセンス鎖と、を含む請求項６に記載の薬物組成物。
【請求項８】
前記ＡＤＡＭ１７の二重鎖ｓｉＲＮＡは、少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを有し且つＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ７とのヌクレオチドの差異が４個を超えない配列を含むセンス鎖と、少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを有し且つＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ８とのヌクレオチドの差異が４個を超えない配列を含み、前記センス鎖と相互補完するアンチセンス鎖と、を含む請求項７に記載の薬物組成物。
【請求項９】
前記ＡＤＡＭ１７を標的とする二重鎖ｓｉＲＮＡにおいて、前記センス鎖がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ９に示すヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １０に示すヌクレオチド配列を含む請求項７に記載の薬物組成物。
【請求項１０】
前記ＡＤＡＭ１７を標的とする二重鎖ｓｉＲＮＡの少なくとも１本鎖が、末端修飾、塩基修飾、糖修飾及び骨格修飾から選ばれた少なくとも１種類の化学修飾を含み、好ましくは、前記化学修飾は、
ａ）リン酸骨格のホスホロチオエート修飾、
ｂ）リボース又はデオキシリボースの２’−Ｏ−メチル修飾、
ｃ）リボース又はデオキシリボースの２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾、
ｄ）ロックド核酸（ＬＮＡ）修飾、
ｅ）開環核酸修飾、
ｆ）インドール修飾、
ｇ）塩基の５’−メチルシトシン修飾、
ｈ）塩基の５’−エチニルウラシル修飾、
ｉ）末端ヌクレオチドのコレステロール又はその誘導体修飾、
ｊ）末端ヌクレオチドのガラクトース修飾、
ｋ）末端ヌクレオチドのポリペプチド修飾、
ｌ）リン酸化修飾、
ｍ）末端ヌクレオチドの蛍光標記修飾、
ｎ）末端ヌクレオチドのビオチン修飾
から選ばれる請求項７又は９に記載の薬物組成物。
【請求項１１】
前記ＡＤＡＭ１７を標的とする二重鎖ｓｉＲＮＡにおいて、前記センス鎖のヌクレオチド配列が５’−Ｋ’−Ｌ’Ｐ’Ｍ’ＵＣＡＵＧＵＡＵＣＵＧＡＡＰ’Μ’Ｍ’ｄＴｄＴ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １５）であり、アンチセンス鎖のヌクレオチド配列が５’−Ｒ’−Ｑ’Ｑ’Ｌ’ＵＵＣＡＧＡＵＡＣＡＵＧＡＱ’Ｌ’  Ｐ’ｄＴｄＴ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １６）である請求項１０に記載の薬物組成物。
（ここで、
Ｋ’は５’−末端ヌクレオチドに接続されたコレステロールであることができ、
Ｒ’は５’−末端ヌクレオチドのリン酸化修飾であることができ、
ｄＴはチミンデオキシリボースヌクレオチドであって、
Ｌ’は未修飾又は２’−Ｏ−メチル修飾のグアニンデオキシリボースヌクレオチドであって、
Ｍ’は未修飾又は２’−Ｏ−メチル修飾のアデニンデオキシリボースヌクレオチドであって、
Ｐ’は未修飾又は２’−Ｏ−メチル修飾のシトシンデオキシリボースヌクレオチドであって、
Ｑ’は未修飾又は２’−Ｏ−メチル修飾のウラシルリボースヌクレオチドであって、
Ｌ’、Ｍ、’Ｐ’及びＱ’の中の少なくとも一つはチオリン酸骨格を有する。）
【請求項１２】
前記ＡＤＡＭ１７を標的とする二重鎖ｓｉＲＮＡにおいて、前記センス鎖が表１３のセンス配列から選ばれ、前記アンチセンス鎖が表１３のアンチセンス配列から選ばれる請求項１０又は１１に記載の薬物組成物。
【請求項１３】
請求項１乃至５の中のいずれかに記載のｓｉＲＮＡ、又は請求項６乃至１２の中のいずれかに記載の薬物組成物を含むキット。
【請求項１４】
ＡＤＡＭＴＳ−５又はＡＤＡＭ１７に関連する病気を予防及び／又は治療する薬剤の調製における請求項１乃至５の中のいずれかに記載のｓｉＲＮＡ、又は請求項６乃至１２の中のいずれかに記載の薬物組成物、又は請求項１３に記載のキットの応用。
【請求項１５】
前記ＡＤＡＭＴＳ−５又はＡＤＡＭ１７に関連する疾患が炎症に関連する疾患であり、
好ましくは、前記炎症に関連する疾患が関節炎であり、
好ましくは、前記炎症に関連する疾患が変形性関節症或いはリウマチ性関節炎である請求項１４に記載の応用。
【請求項１６】
関節線維化を抑制し、軟骨浸食を抑制し、滑膜炎を予防及び／又は治療し、又は軟骨及び／又は滑膜を保護する薬剤の調製における請求項１乃至５の中のいずれかに記載のｓｉＲＮＡ、又は請求項６乃至１２の中のいずれかに記載の薬物組成物、又は請求項１３に記載のキットの応用。
【請求項１７】
細胞を有効量の請求項１乃至５の中のいずれかに記載のｓｉＲＮＡ、又は請求項６乃至１２の中のいずれかに記載の薬学組成物の中の前記ｓｉＲＮＡに接触させて、前記細胞におけるＡＤＡＭＴＳ−５又はＡＤＡＭ１７又は炎症性因子の発現を抑制することを含む生体外で細胞におけるＡＤＡＭＴＳ−５又はＡＤＡＭ１７又は炎症性因子の発現を抑制する方法。
【請求項１８】
前記炎症性因子が、ＴＮＦ、ＣＯＸ−２、ＩＬ−１βから選ばれ、好ましくは、前記細胞が哺乳類動物の細胞であり、更に好ましくは、前記細胞がヒトの細胞である請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２０１４年１２月２５日に提出した中国特許出願第２０１４１０８２８５８７．５号と、２０１４年１２月２５日に提出した中国特許出願第２０１４１０８２７６５０．３号の優先権を主張し、引用する形態で本文に導入する。
【０００２】
本願は、電子方式（ＡＳＣＩＩフォーマット）で提出し引用する形態でその全体を本文に合併した配列表を含む。上記したＡＳＣＩＩフォーマット配列表は２０１５年１２月１８日に作成されて、１３０９１．０００１−００３０４_ＳＬ．ｔｘｔと命名され、そのサイズは１３１，６３８個のバイトである。
【０００３】
本発明は、小干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）及びＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）に仲介してＡＤＡＭＴＳ−５又はＡＤＡＭ１７遺伝子発現を抑制するにおける用途及び当該ｓｉＲＮＡのＡＤＡＭＴＳ−５又はＡＤＡＭ１７のダウンレギュレーションによる病理治療中の用途に関する。前記病理過程は、例えば変形性関節症（ＯＡ）、リウマチ性関節炎（ＲＡ）等の関節炎を含むことができる。
【背景技術】
【０００４】
変形性関節症（Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ、ＯＡ）は、退行性骨関節病理変化を有する慢性疾患である。変形性関節症は、人類の健康に深刻な被害を与えていて、現在、未だに有効な治療手段がない。従って、ＯＡを有効に予防及び／又は治療することのできる新しい方法が必要である。変形性関節症の臨床病理学的な特徴は細胞外マトリックス（ＥＣＭ）のタンパク質分解による軟骨損傷を含み、複種類のタンパク質分解活性の増加による軟骨ＥＣＭの分解は軟骨退化の直接的な原因であって、最終的に軟骨損傷に至る。インターロイキン−１（ＩＬ−１）と腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）は、ｈＦＬＳ細胞異化及びＥＣＭ分解において重要な作用を果たしている。研究によると、関節炎患者の関節滑液には高濃度のＩＬ−１とＴＮＦ−αがあって、それが関節炎発病中に肝心な作用を果たす炎症性サイトカインであると認定された。
【０００５】
Ｉ型血小板結合タンパク質モチーフ（ＴＳＰ）を含有する解重合タンパク質様メタロプロテアーゼ （ＡＤＡＭＴＳ）は分泌型マルチドメインのジンクフィンガーメタロプロテアーゼファミリーで、胚発育、血管生成、血液凝固、炎症反応等の生理中にさまざまな機能を発揮している。当該ファミリーは、現在１９個の成員を発現し、複種類のＥＣＭ成分を基質とする。ＡＤＡＭＴＳファミリーは高度のタンパク質構造類似性を有し、例えば各成員はいずれもＮ−末端シグナルペプチド配列を有する前駆体タンパク質ドメインを含み、また、全て翻訳後に活性のあるプロテアーゼに切断される。そして、これらのプロテアーゼは全てＣ末端に少なくとも一つの保守的なＴＳＰ１のような繰り返しモチーフを含有し、当該モチーフはこれらのプロテアーゼとＥＣＭの結合を仲介する。
【０００６】
ＡＤＡＭＴＳ−５は、プロテオグリカン（ａｇｇｒｅｃａｎ）の分解を触媒するので、プロテオグリカン分解酵素（ａｇｇｒｅｃａｎａｓｅｓ  ｏｒ  ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎａｓｅｓ）である。プロテオグリカンは二つの主要な切断部位を有し、その一つはＡｓｎ３４１とＰｈｅ３４２の位置に位置するマトリックメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）切断部位で、他の一つはＧｌｕ３７３とＡｌａ３７４の位置に位置するアグリカナーゼ切断部位である。関節軟骨に大量のプロテオグリカンを含有し、関節の圧縮や張力の改善に貢献する。ＯＡとＲＡ患者から厳しいプロテオグリカンのダメージを発現した。よって、アグリカナーゼはすでに関節炎と他の疾患を治療する新しい標的になった。悪性神経膠腫において、ＡＤＡＭＴＳ−５の発現レベルは明らかに高まっていて、プロテオグリカンの分解が神経膠腫の攻撃と転移を仲介する。そして、細胞外タンパク質の分解又はダメージは、例えば癌、ぜんそく、慢性閉塞性肺疾患、アテローム性動脈硬化症、年齢に関連つけられた黄斑変性症、心筋梗塞、肝炎、腱炎、血管新生、多発性硬化症、糸球体腎炎、骨減少症、歯周病などの他の疾患をもたらす可能性がある。
【０００７】
ＡＤＡＭ１７はディスインテグリンとメタロプロテアーゼ（ＡＤＡＭ）ファミリーに属する。細胞表面糖タンパク質の一つとして、ＡＤＡＭファミリーは複種類の生理や病理過程に参与し、例えば細胞同士や細胞とマトリックとの粘着、細胞融合、ＥＣＭ分解、シグナル伝達及び腫瘍の形成、増殖、転移等に参与する。ＡＤＡＭ１７は、ＴＮＦ−α変換酵素（ＴＡＣＥ）とも呼ばれ、膜結合されたＴＮＦ−αを放出して、遊離されたＴＮＦ−αを生成する。遊離されたＴＮＦ−αは、炎症性サイトカインの過剰分泌、細胞アポトーシス及び細胞内シグナル伝達の異常等をもたらして、ＲＡ、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、多発性硬化症、急性感染症、ぜんそく、アトピー性皮膚炎、乾癬等を含む複種類の疾患をもたらす。ＴＮＦ−αを調節する以外、ＡＤＡＭ１７は、マクロファージコロニー刺激因子、ケモカイン、フラクタルカイン（ＦＫＮ）等も調節する。よって、ＡＤＡＭ１７阻害剤を炎症性疾患の候補物とする可能性があるが、先行の研究によると、広域スペクトルのＡＤＡＭ阻害剤が組織毒性を有し、保守的なＡＤＡＭｓファミリーを対象に高特異性の小分子阻害剤を開発するには困難があった。
【０００８】
１９９８年に、Ｃｒａｉｇ  ＭｅｌｌｏとＡｎｄｒｅｗ  Ｆａｒｒが遺伝子サイレンシング現象を発現し、その後、Ｔｕｓｃｈｌと同僚が哺乳類動物細胞から化学合成された１９−２５ｂｐのｓｉＲＮＡｓが特異且つ有効に標的ｍＲＮＡｓをサイレンシングできることを発現した。それから、ｓｉＲＮＡは遺伝子機能の研究や疾患の治療に汎用されている。
【発明の概要】
【０００９】
一態様において、本発明はＡＤＡＭＴＳ−５を標的とする二重鎖ｓｉＲＮＡを開示し、センス鎖と、センス鎖と相互補完するアンチセンス鎖とを含む。一部の実施例において、アンチセンス鎖は、ＡＤＡＭＴＳ−５  ｍＲＮＡと交雑することができ、センス鎖はアンチセンス鎖と交雑することができる。
【００１０】
一部の実施例において、センス鎖は、５’−ＧＧＡＵＵＵＡＵＧＵＧＧＧＣＡＵＣＡＵ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １）と少なくとも６０％の同一性を有する配列を含むことができ、アンチセンス鎖は、５’−ＡＵＧＡＵＧＣＣＣＡＣＡＵＡＡＡＵＣＣ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２）と少なくとも６０％の同一性を有する配列を含むことができる。一部の実施例において、センス鎖は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有する配列を含むことができ、アンチセンス鎖はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有する配列を含むことができる。一部の実施例において、センス鎖はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １と少なくとも６０％（例えば、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％）の同一性を有する配列を含むことができ、アンチセンス鎖はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２を含むことができる。一部の実施例において、センス鎖はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １を含むことができ、アンチセンス鎖はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２と少なくとも６０％（例えば、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％）と同一性を有する配列を含むことができる。
【００１１】
各種の実施例において、センス鎖は少なくとも１１個の連続するヌクレオチドを有し、且つＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １と差異が８個のヌクレオチドを超えない配列を含むことができ、アンチセンス鎖は少なくとも１１個の連続するヌクレオチドを有し、且つＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２と差異が８個のヌクレオチドを超えない配列を含むことができる。一部の実施例において、センス鎖は少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを有し、且つＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １と差異が４個のヌクレオチドを超えない配列を含むことができ、アンチセンス鎖は少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを有し、且つＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２と差異が４個のヌクレオチドを超えない配列を含むことができる。
【００１２】
一部の実施例において、センス鎖はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １又は表１と表３から選ばれたセンス配列を含むことができる。一部の実施例において、アンチセンス鎖はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２又は表２と表３から選ばれたアンチセンス配列を含むことができる。一部の実施例において、センス鎖はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １を含むことができ、アンチセンス鎖はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２を含むことができる。
【００１３】
一部の実施例において、センス鎖とアンチセンス鎖の中の少なくとも一つは、鎖の少なくとも一端に、少なくとも一つのヌクレオチドオーバーハングを更に含むことができる。一部の実施例において、センス鎖とアンチセンス鎖の中の少なくとも一つは、鎖の３’端に、二つのヌクレオチドオーバーハングを更に含むことができる。一部の実施例において、センス鎖は、５’−ＧＧＡＵＵＵＡＵＧＵＧＧＧＣＡＵＣＡＵｄＴｄＴ−３’  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３）を含むことができ、アンチセンス鎖は５’−ＡＵＧＡＵＧＣＣＣＡＣＡＵＡＡＡＵＣＣｄＴｄＴ−３’  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ４）を含むことができる。
【００１４】
他の実施例において、ｓｉＲＮＡの少なくとも１本の鎖は、末端修飾、塩基修飾、糖修飾及び骨格修飾から選ばれた少なくとも１種類の化学修飾を含むことができる。一部の実施例において、ｓｉＲＮＡの少なくとも１本の鎖は、以下の中の少なくとも１種類の化学修飾を含むことができる：
【００１５】
ａ）リン酸骨格のホスホロチオエート修飾；
ｂ）リボース又はデオキシリボースの２’−Ｏ−メチル修飾；
ｃ）リボース又はデオキシリボースの２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾；
ｄ）ロックド核酸（ＬＮＡ）修飾；
ｅ）開環核酸修飾；
ｆ）インドール修飾；
ｇ）塩基の５−メチルシトシン修飾；
ｈ）塩基の５−エチニルウラシル修飾；
ｉ）末端ヌクレオチドのコレステロール又はその誘導体修飾；
ｊ）末端ヌクレオチドのガラクトース修飾；
ｋ）末端ヌクレオチドのポリペプチド修飾；
ｌ）リン酸化修飾；
ｍ）末端ヌクレオチドの蛍光標記修飾；
ｎ）末端ヌクレオチドのビオチン修飾。
【００１６】
一部の実施例において、センス鎖は５’−Ｋ−ＬＬＭＵＵＵＡＵＧＵＧＧＧＣＡＵＰＭＱｄＴｄＴ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １３）を含むことができ、アンチセンス鎖は５’−Ｒ−ＭＱＬＡＵＧＣＣＣＡＣＡＵＡＡＡＱＰＰｄＴｄＴ−３’  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １４）を含むことができ、ここで、
Ｋは、５’−末端ヌクレオチドに接続されたコレステロール基であることができ、
Ｒは５’−末端ヌクレオチドのリン酸化修飾であることができ、
ｄＴはチミンデオキシリボヌクレオチドであることができ、
Ｌは未修飾又は２’−Ｏ−メチル修飾のグアニンデオキシリボースヌクレオチドであって、
Ｍは未修飾又は２’−Ｏ−メチル修飾のアデニンデオキシリボースヌクレオチドであって、
Ｐは未修飾又は２’−Ｏ−メチル修飾のシトシンデオキシリボースヌクレオチドであって、
Ｑは未修飾又は２’−Ｏ−メチル修飾のウラシルリボースヌクレオチドであって、
Ｌ、Ｍ、Ｐ及びＱの中の少なくとも一つがチオリン酸骨格を有することができる。
【００１７】
一部の実施例において、Ｌ、Ｍ、Ｐ及びＱの中の少なくとも一つがチオリン酸骨格を有することができる。一部の実施例において、Ｌ、Ｍ、ＰとＱがいずれもチオリン酸骨格を有することができる。一部の実施例において、センス鎖は表７から選ばれたセンス配列を含むことができ、アンチセンス鎖は表７から選ばれたアンチセンス配列を含むことができる。
【００１８】
さらに、本発明はＡＤＡＭ１７を標的とする二重鎖ｓｉＲＮＡを開示し、センス鎖と相互補完するアンチセンス鎖とを含む。一部の実施例において、アンチセンス鎖はＡＤＡＭ１７  ｍＲＮＡと交雑することができ、センス鎖はアンチセンス鎖と交雑することができる。
【００１９】
一部の実施例において、センス鎖は５’−ＧＣＡＵＣＡＵＧＵＡＵＣＵＧＡＡＣＡＡ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ７）と少なくとも６０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むことができ、アンチセンス鎖は５’−ＵＵＧＵＵＣＡＧＡＵＡＣＡＵＧＡＵＧＣ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ８）と少なくとも６０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むことができる。一部の実施例において、センス鎖はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ７と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むことができ、アンチセンス鎖はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ８と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むことができる。一部の実施例において、センス鎖はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ７と少なくとも６０％（例えば、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％）の同一性を有する配列を含むことができ、アンチセンス鎖はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ８を含むことができる。一部の実施例において、センス鎖はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ７を含むことができ、アンチセンス鎖はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ８と少なくとも６０％（例えば、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％）の同一性を有する配列を含むことができる。
【００２０】
各種実施例において、センス鎖は少なくとも１１個の連続するヌクレオチドを有し、且つＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ７と差異が８個のヌクレオチドを超えない配列を含むことができ、アンチセンス鎖は少なくとも１１個の連続するヌクレオチドを有し、且つＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ８と差異が８個のヌクレオチドを超えない配列を含むことができる。一部の実施例において、センス鎖は少なくとも１５個の連続して同一なヌクレオチドを有し、且つＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ７と差異が４個のヌクレオチドを超えない配列を含むことができ、アンチセンス鎖は少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを有し、且つＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ８と差異が４個のヌクレオチドを超えない配列を含むことができる。一部の実施例において、センス鎖はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ７又は表８と表１０から選ばれたセンス配列を含むことができる。一部の実施例において、アンチセンス鎖はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ８又は表９と表１０から選ばれたセンス配列を含むことができる。一部の実施例において、センス鎖はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ７を含むことができ、アンチセンス鎖はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ８を含むことができる。
【００２１】
一部の実施例において、センス鎖とアンチセンス鎖の中の少なくとも一つは、鎖の少なくとも一端に、少なくとも一つのヌクレオチドオーバーハングを含むことができる。一部の実施例において、センス鎖とアンチセンス鎖の中の少なくとも一つは、鎖の３’−端に、二つのヌクレオチドオーバーハングを含むことができる。一部の実施例において、センス鎖は５’−ＧＣＡＵＣＡＵＧＵＡＵＣＵＧＡＡＣＡＡｄＴｄＴ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ９）を含むことができ、アンチセンス鎖は５’−ＵＵＧＵＵＣＡＧＡＵＡＣＡＵＧＡＵＧＣｄＴｄＴ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １０）を含むことができる。
【００２２】
他の実施例において、ｓｉＲＮＡの少なくとも１本の鎖は、末端修飾、塩基修飾、糖修飾及び骨格修飾から選ばれた少なくとも１種類の化学修飾を含むことができる。一部の実施例において、ｓｉＲＮＡの少なくとも１本の鎖は、以下の中の少なくとも１種類の化学修飾を含むことができる：
ａ）リン酸骨格のホスホロチオエート修飾；
ｂ）リボース又はデオキシリボースの２’−Ｏ−メチル修飾；
ｃ）リボース又はデオキシリボースの２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾；
ｄ）ロックド核酸（ＬＮＡ）修飾；
ｅ）開環核酸修飾；
ｆ）インドール修飾；
ｇ）塩基の５−メチルシトシン修飾；
ｈ）塩基の５−エチニルウラシル修飾；
ｉ）末端ヌクレオチドのコレステロール又はその誘導体修飾；
ｊ）末端ヌクレオチドのガラクトース修飾；
ｋ）末端ヌクレオチドのポリペプチド修飾；
ｌ）リン酸化修飾；
ｍ）末端ヌクレオチドの蛍光標記修飾；
ｎ）末端ヌクレオチドのビオチン修飾。
【００２３】
一部の実施例において、センス鎖は５’−Ｋ’−Ｌ’Ｐ’Ｍ’ＵＣＡＵＧＵＡＵＣＵＧＡＡＰ’Μ’Ｍ’ｄＴｄＴ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １５）を含むことができ、アンチセンス鎖は５’−Ｒ’−Ｑ’Ｑ’Ｌ’ＵＵＣＡＧＡＵＡＣＡＵＧＡＱ’Ｌ’Ｐ’ｄＴｄＴ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １６）を含むことができ、ここで、
Ｋ’は５’−末端ヌクレオチドに接続されたコレステロールであることができ、
Ｒ’は５’−末端ヌクレオチドのリン酸化修飾であることができ、
ｄＴはチミンデオキシリボースヌクレオチドであって、
Ｌ’は未修飾又は２’−Ｏ−メチル修飾のグアニンデオキシリボースヌクレオチドであって、
Ｍ’は未修飾又は２’−Ｏ−メチル修飾のアデニンデオキシリボースヌクレオチドであって、
Ｐ’は未修飾又は２’−Ｏ−メチル修飾のシトシンデオキシリボースヌクレオチドであって、
Ｑ’は未修飾又は２’−Ｏ−メチル修飾のウラシルリボースヌクレオチドであって、
Ｌ’、Ｍ、’Ｐ’及びＱ’の中の少なくとも一つはチオリン酸骨格を有することができる。
【００２４】
一部の実施例において、少なくともＬ’、Ｍ’、Ｐ’、及びＱ’の中の少なくとも一つはチオリン酸骨格を有することができる。一部の実施例において、Ｌ’、Ｍ’、Ｐ’、及びＱ’がいずれもチオリン酸骨格を有することができる。一部の実施例において、センス鎖は表１３から選ばれたセンス配列を含むことができ、アンチセンス鎖は表１３から選ばれたアンチセンス配列を含むことができる。
【００２５】
一部の実施例において、前記ｓｉＲＮＡをコーディングする核酸を更に含む。一部の実施例において、核酸はＤＮＡ分子であることができる。一部の実施例において、ＤＮＡ分子は５’−ＧＡＴＣＣＣＣＡＴＧＡＴＧＣＣＣＡＣＡＴＡＡＡＴＣＣＴＴＣＡＡＧＡＧＡＧＧＡＴＴＴＡＴＧＴＧＧＧＣＡＴＣＡＴＴＴＴＴＴ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ６）中の第３６〜５４位のヌクレオチドを含有する配列を含むことができる。一部の実施例において、ＤＮＡ分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ６を含む。一部の実施例において、ＤＮＡ分子は５’−ＡＧＣＴＡＡＡＡＡＴＴＧＴＴＣＡＧＡＴＡＣＡＴＧＡＴＧＣＴＣＴＣＴＴＧＡＡＧＣＡＴＣＡＴＧＴＡＴＣＴＧＡＡＣＡＡＧＧＧ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １１）中の第３８〜５６位のヌクレオチドを含有する配列を含むことができる。一部の実施例において、ＤＮＡ分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １１を含む。
【００２６】
他の態様において、前記ｓｉＲＮＡ又は核酸を含有する薬物組成物を開示し、製薬的に許容されるベクターと、希釈剤又は賦形剤を更に含むことができる。一部の実施例において、薬物組成物は少なくとも１種類のＡＤＡＭＴＳ−５を標的とするｓｉＲＮＡと、少なくとも１種類のＡＤＡＭ１７を標的とするｓｉＲＮＡとを含むことができる。
【００２７】
他の態様において、前記ｓｉＲＮＡと、核酸又は薬物組成物とを含むキットを開示する。
【００２８】
さらに、前記ｓｉＲＮＡ、核酸又は薬物組成物によるＡＤＡＭＴＳ−５又はＡＤＡＭ１７に関連する疾患の予防及び／又は治療する薬剤の調製における用途を開示する。異なる実施例において、関節線維化や軟骨浸食を抑制したり、滑膜炎を予防及び／又は治療したり、又は軟骨及び／又は滑膜を保護する薬剤の調製における用途を更に含む。一部の実施例において、ＡＤＡＭＴＳ−５又はＡＤＡＭ１７に関連する疾患は炎症に関連する疾患であることができる。一部の実施例において、炎症に関連する疾患は関節炎であることができる。一部の実施例において、関節炎はＯＡであることができる。一部の実施例において、関節炎はＲＡであることができる。
【００２９】
さらに、被験者においてＡＤＡＭＴＳ−５又はＡＤＡＭ１７に関連する疾患を予防及び／又は治療する方法を開示する。被験者に治療有効量の前記ｓｉＲＮＡ、核酸又は薬物組成物を適用することを含む。異なる実施例において、当該方法は、被験者の関節線維化や軟骨浸食を抑制し、滑膜炎を予防及び／又は治療し、又は軟骨及び／又は滑膜を保護することを更に含むことができる。一部の実施例において、被験者はＡＤＡＭＴＳ−５又はＡＤＡＭ１７に関連する病気にかかっていて、又は病気にかかるリスクを有する。一部の実施例において、前記適用は、関節又は関節内への注射を含むことができる。一部の実施例において、適用は、被験者の関節腔への注射を含むことができる。一部の実施例において、ＡＤＡＭＴＳ−５又はＡＤＡＭ１７に関連する疾患は炎症に関連する疾患であることができる。一部の実施例において、炎症に関連する疾患が関節炎であることができる。一部の実施例において、関節炎がＯＡであることができる。一部の実施例において、関節炎がＲＡであることができる。一部の実施例において、被験者はヒトであることができる。
【００３０】
開示した他の部分は、細胞中のＡＤＡＭＴＳ−５又はＡＤＡＭ１７の発現を抑制する方法をさらに含み、細胞を有効量の前記ｓｉＲＮＡｓと接触させて、細胞中のＡＤＡＭＴＳ−５又はＡＤＡＭ１７の発現を抑制することを含む。開示した一態様はさらに、細胞中の炎症性因子の発現を抑制する方法を含み、細胞を有効量の前記ｓｉＲＮＡｓと接触させて、細胞中の炎症性因子の発現を抑制することを含む。一部の実施例において、炎症性因子はＴＮＦ、ＣＯＸ−２、ＩＬ−１βから選ぶことができる。一部の実施例において、接触は体外又は体内接触であることができる。一部の実施例において、細胞は哺乳類動物の細胞であることができる。一部の実施例において、細胞はヒトの細胞であることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】ＡＤＡＭＴＳ−５の発現を抑制するｓｉＲＮＡを選別した結果を示す。
【図２】ｓｉＲＮＡ−ＲＢ−０４のＷｅｓｔｅｒｎブロット解析を示す。
【図３Ａ】ｓｉＲＮＡ−ＲＢ−０４が一部の炎症性因子をダウンレギュレーションしたことを示す。
【図３Ｂ】ｓｉＲＮＡ−ＲＢ−０４が一部の炎症性因子をダウンレギュレーションしたことを示す。
【図４】ｓｉＲＮＡ  リン酸骨格中のＰ−Ｓ結合のホスホロチオエート修飾を示す。
【図５】一部の化学修飾によってＡＤＡＭＴＳ−５を標的とする一部の例示のｓｉＲＮＡｓの血清安定性を向上させたことを示す。
【図６】Ａ〜Ｐ  一部のＡＤＡＭＴＳ−５を標的とする例示のｓｉＲＮＡｓによって関節炎モデルラットを処理した後の組織生検結果を示す。
【図７】一部のＡＤＡＭＴＳ−５を標的とする例示のｓｉＲＮＡｓがラット関節を処理した後の炎症性因子の発現レベルを示す。
【図８】ＡＤＡＭ１７の発現を抑制するｓｉＲＮＡを選別した結果を示す。
【図９】ｓｉＲＮＡ−ＡＤ−０８のＷｅｓｔｅｒｎブロット解析を示す。
【図１０Ａ】ｓｉＲＮＡ−ＡＤ−０８が一部の炎症性因子をダウンレギュレーションしたことを示す。
【図１０Ｂ】ｓｉＲＮＡ−ＡＤ−０８が一部の炎症性因子をダウンレギュレーションしたことを示す。
【図１１】一部の化学修飾によってＡＤＡＭ１７を標的とする一部の例示のｓｉＲＮＡｓの血清安定性を向上させたことを示す。
【図１２】Ａ〜Ｐ  一部のＡＤＡＭ１７を標的とする例示のｓｉＲＮＡｓによって関節炎モデルラットを処理した後の組織生検結果を示す。
【図１３】一部のＡＤＡＭ１７を標的とするｓｉＲＮＡｓによってラット関節を処理した後の炎症性因子の発現レベルを示す。
【図１４Ａ】ＡＤＡＭ１７を標的とする一部の例示のｓｉＲＮＡｓを長期間適用した結果を示す。
【図１４Ｂ】ＡＤＡＭ１７を標的とする一部の例示のｓｉＲＮＡｓを長期間適用した結果を示す。
【図１５】ＡＤＡＭ１７とＡＤＡＭＴＳ−５を標的とする一部の例示のｓｉＲＮＡｓを組み合わせて使用して一部の炎症性因子の発現を低減したことを示す。
【図１６Ａ】ＡＤＡＭ１７とＡＤＡＭＴＳ−５を標的とする一部の例示のＡＤＡＭ１７  ｓｉＲＮＡｓを組み合わせて関節炎モデルラットを処理した後の組織生検結果を示す。
【図１６Ｂ】ＡＤＡＭ１７とＡＤＡＭＴＳ−５を標的とする一部の例示のＡＤＡＭ１７  ｓｉＲＮＡｓを組み合わせて関節炎モデルラットを処理した後の組織生検結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
Ｉ定義
特別に定義していない限り、本文で使用する全ての科学技術用語は当業者が通常に理解している意味と同じ意味を持つ。情報を開示するため、以下のものを定義する。
【００３３】
冠詞「一つ」と「１種類」は、一つ又は一つより多い（即ち、少なくとも一つ）冠詞修飾対象を指す。例えば、「一つの要素」は、一つの要素又は一つより多い要素を指す。
【００３４】
用語「又は」と用語「及び／又は」とは、明確な説明がない限り、相互交換することができる。
【００３５】
明細書又は請求項中の用語「含む」、「含有する」、「有する」又はその文法上の変形は、「含むが、それらに限定されることはない」ことを指し、また相互交換することができる。
【００３６】
用語「約」は、数量、レベル、数値、頻度、パーセント、サイズ、大きさ、重量又は長さの差異範囲が最大で対応する参照指標の３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１％であることを指す。「約」で一つの数値を修飾した時、数値の上下範囲を拡張したことを指す。通常、「約」による数値の拡張範囲は平方偏差が≦１０％であることを指す。
【００３７】
前記「ＡＤＡＭＴＳ−５」は、血小板結合タンパク質モチーフを有する解重合タンパク質金属様プロテアーゼ５である。「ＡＤＡＭＴＳ−５」は、ヒトのＡＤＡＭＴＳ−５（そのｍＲＮＡ配列はＧｅｎＢａｎｋの登録番号ＮＭ_００７０３８．３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １９１）を参照することができる）と、ラットＡＤＡＭＴＳ−５（そのｍＲＮＡ配列はＧｅｎＢａｎｋの登録番号ＮＭ_１９８７６１．１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９２）を参照することができる）と、マウスＡＤＡＭＴＳ−５（そのｍＲＮＡ配列はＧｅｎＢａｎｋの登録番号ＮＭ_０１１７８２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９３）を参照することができる）とを含む。他のＡＤＡＭＴＳ−５のｍＲＮＡ配列も、例えばＧｅｎＢａｎｋから簡単に入手できる。
【００３８】
前記「ＡＤＡＭ１７」は、解重合タンパク質金属様プロテアーゼ１７を含有し、腫瘍壊死因子−α変換酵素（ＴＡＣＥ）とも呼ばれる。「ＡＤＡＭ１７」は、ヒトのＡＤＡＭ１７（そのｍＲＮＡ配列はＧｅｎＢａｎｋ、登録番号ＮＭ_００３１８３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９４）を参照することができる）と、ラットＡＤＡＭ１７（そのｍＲＮＡ配列はＧｅｎＢａｎｋ、登録番号ＮＭ_０２０３０６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９５）を参照することができる）と、マウスＡＤＡＭ１７（そのｍＲＮＡ配列はＧｅｎＢａｎｋ、登録番号ＮＭ_００１２７７２６６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９６）、ＮＭ_００１２９１８７１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９７）、又はＮＭ_００９６１５  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９８）を参照することができる）とを含む。他のＡＤＡＭＴＳ−１７のｍＲＮＡ配列も、例えばＧｅｎＢａｎｋから簡単に入手できる。
【００３９】
用語「標的配列」は、例えばＡＤＡＭＴＳ−５又はＡＤＡＭ１７遺伝子転写中に形成したＲＮＡ分子のヌクレオチド配列中の一区間の連続する部分等の標的遺伝子を指し、一次転写産物ＲＮＡを加工した後のｍＲＮＡ産物を含む。複数の実施例において、標的配列は、ＡＤＡＭＴＳ−５又はＡＤＡＭ１７のｍＲＮＡの連続する１０〜３０個のヌクレオチドを含み、例えばｍＲＮＡ中の１０〜２５又は１５〜２０個のヌクレオチドを含む。一部の実施例において、標的配列は、ｍＲＮＡ中の連続する１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５又は２７個のヌクレオチドを含むことができる。一部の実施例において、標的配列はｍＲＮＡ中の連続する１９個のヌクレオチドを含むことができる。
【００４０】
用語「相互補完」は、一定の条件で、核酸同士が水素結合によって交雑して二重鎖構造を形成することを指す。一定の条件は厳格な条件であることができる。「厳格な条件」で、核酸が標的配列と交雑し、非標的配列とは交雑しない。厳格な条件は、配列が依頼するものであって、且つ一部の要因の影響を受け、例えば長い配列のほど必要とする標的配列との交雑温度が高いことがある。非制限の厳格な条件の例としては、４００  ｍＭ  ＮａＣｌ、４０  ｍＭ  ＰＩＰＥＳ、ｐＨ  ６．４、１  ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０℃又は７０℃で１２〜１６時間持続してから洗浄する。他の条件として、例えば生物体内で会えることのある生理関連条件を応用することができる。当業者は、交雑ヌクレオチドの最終的な応用に応じて、二つの配列の相互補完に適合する１セットの条件を確定できる。前記交雑は、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基によりペアリングし、又は非Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基によりペアリングし、又は非天然又は修飾のヌクレオチドと形成した塩基によりペアリングして仲介することができ、交雑要求を満たすのであればよい。非Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基によりペアリングする例として、Ｇ：Ｕ  Ｗｏｂｂｌｅ又はＨｏｏｇｓｔｅｉｎ塩基によりペアリングすることを含む。一部の実施例において、核酸分子とそれと相互補完する配列との交雑は、核酸機能（例えば、ＲＮＡｉ活性）の発揮に充分である。
【００４１】
一部の実施例において、二つのヌクレオチド配列は完全に相互補完し、即ち第１ヌクレオチド配列の全ての連続するヌクレオチドが第２ヌクレオチド配列の同数量の連続するヌクレオチド塩基とペアリングする。「実質的相互補完」とは、二つの配列が完全に相互補完するか、又は交雑する時一つ又は複数の塩基のミスマッチを形成するが、最終的な応用に関連する条件で交雑の能力を保留することを指す。一部の実施例において、二つの配列同士のミスマッチは６個を超えない。例えば、二つの配列同士のミスマッチは４、３、２又は１個を超えない。二つの配列を交雑する際に一つ又は複数の一本鎖オーバーハングを形成するように設計した場合、相互補完性を確定する際、このようなオーバーハングをミスマッチとみなしてはいけない。例えば、１９ｎｔのオリゴヌクレオチドと２３ｎｔのオリゴヌクレオチドの場合、長いオリゴヌクレオチドは短いオリゴヌクレオチドと完全に相互補完する１９個のヌクレオチドを含み、「完全相互補完」と称すこともできる。
【００４２】
用語「配列同一性」（例えば、配列が……と５０％の同一性を有する）は、１本の配列を比較ウィンドウにおいて（例えば、参照配列全体）ヌクレオチドを逐一比較した場合の配列の同一程度を指す。「同一性パーセント」（又は「％  同一性」）は、比較ウィンドウにおいて二つの配列を比較することで、マッチング位置の数量を計算することができ、当該位置で、２本の鎖の核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ）は同一である。そして、マッチング位置の数量を比較ウィンドウの位置総数（例えば、参照配列の長さ）で割って、１００を掛け算すると、配列の同一性のパーセントを得ることができる。既存技術におけるコンピュータが実行可能なアルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴ（登録商標）アルゴリズム）、又は検査と選択可能な複種類の方法の最適化比較（例えば、比較ウィンドウに最も高いホモロジーを有する）によって比較ウィンドウにおける最適な配列比較を実現する。よって、用語「配列同一性」は、配列を参照配列の全体配列と比較した場合の同一であるヌクレオチド数量の比である。化学修飾のｓｉＲＮＡ配列の配列同一性は対応する未修飾ヌクレオチドから計算する。例えば、長さが１５ｎｔである一本の鎖ＲＮＡは、長さが１９ｎｔである参照ＲＮＡと１４個の連続又は非連続するヌクレオチドが同一で、両方の同一性は７４％である（１４ｎｔ／１９ｎｔ）。他の例として、例えば、長さが２３ｎｔである一本の鎖ＲＮＡが、長さが１９ｎｔである参照ＲＮＡと１９個の連続又は非連続するヌクレオチドが同一であると、「長いＲＮＡが短いＲＮＡを含む」と称すことができる。即ち、同一性を計算する時、参照配列は挿入、欠失、入れ替えによって切断される。
【００４３】
「Ｇ」、「Ｃ」、「Ａ」と「Ｕ」はそれぞれ、グアニン、シトシン、アデニン、ウラシル塩基を表す。「Ｔ」と「ｄＴ」は相互交換可能であって、核酸塩基が、例えばデオキシリボースチミン、２’−デオキシチミジン又はチミジン等のチミンのデオキシリボースヌクレオチドを含むことを指す。用語「ヌクレオチド」又は「リボースヌクレオチド」又は「デオキシリボースヌクレオチド」は、１種類の天然ヌクレオチドを指し、核酸塩基と、糖と、少なくとも一つのリン酸基（例えば、ホスホジエステル接続基）とからなる。そして、修飾のヌクレオチドを指し、例えば一つの化学修飾のヌクレオチド、又は入れ替えされたモチーフを有する。アデニン、グアニン、シトシン、ウラシルは他のモチーフにより置換されることができるが、このような置換されたヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの塩基ペアリング能力は実質的な変化がない。例えば、イノシンを塩基とするヌクレオチドは、アデニン、シトシン、ウラシルを含むヌクレオチドとペアリングされることができる。従って、上記したヌクレオチド配列においてウラシル、グアニン、アデニンを含むヌクレオチドは、例えばイノシンを含むヌクレオチドにより置換されることができる。前記ヌクレオチド配列におけるいずれかの位置のシトシンはグアニン又はウラシルにより置換されることができる。
【００４４】
用語「核酸塩基」又は「塩基」は、天然ＤＮＡ又はＲＮＡ（例えば、Ｕ、Ｔ、Ａ、Ｃ、Ｇ）中のプリンとピリミジンに係わる時に相互交換可能である。当該用語は、このような天然プリンとピリミジンの類似物又は修飾物をさらに含み、核酸分子の性能を改善することができる。
【００４５】
用語「短干渉ＲＮＡ」又は「ｓｉＲＮＡ」は、遺伝子発現を抑制又はダウンレギュレーションできる全ての核酸分子を指し、例えばＲＮＡｉ又は遺伝子サイレンシングによって配列が特異であるＲＮＡ転写物（例えば、ｍＲＮＡ）の分解を仲介する。一部の実施例において、ｓｉＲＮＡは、相互補完するセンスとアンチセンス領域のある二重鎖ポリヌクレオチド分子を含むことができる。アンチセンス領域は、標的核酸分子（例えば、ＡＤＡＭＴＳ−５又はＡＤＡＭ１７  ｍＲＮＡ）又はその一部（例えば、標的配列又はその一部）のヌクレオチド配列と相互補完するヌクレオチド配列を含み、センス領域は、標的配列又はその一部に対応するヌクレオチド配列を含む。一部の実施例において、ｓｉＲＮＡは、二つの分離したオリゴヌクレオチドから構成され、センス鎖とアンチセンス鎖とを含み、センス鎖とアンチセンス鎖は相互補完し、例えば、各鎖は他の１本の鎖のヌクレオチド配列と相互補完するヌクレオチド配列を含み、このように、アンチセンスとセンス鎖により二倍体又は二重鎖構造を形成する。アンチセンス鎖は標的核酸分子（例えば、ＡＤＡＭＴＳ−５又はＡＤＡＭ１７  ｍＲＮＡ）又はその一部（例えば、標的配列又はその一部）のヌクレオチド配列と相互補完するヌクレオチド配列を含み、センス鎖は標的配列又はその一部に対応するヌクレオチド配列を含む。一部の実施例において、ｓｉＲＮＡは一本鎖オリゴヌクレオチドからなり、上記した自行相互補完するｓｉＲＮＡのセンスとアンチセンス領域は、ヌクレオチド又は非ヌクレオチドの接続によってサブ接続を実現する。一部の実施例において、ｓｉＲＮＡは、二倍、非対称二倍、ヘアピン、非対称ヘアピン二級構造のポリヌクレオチドであることができる。一部の実施例において、ｓｉＲＮＡは二つ又は複数のループ構造と、自行相互補完するセンスとアンチセンス領域とを含む一つの茎と、を有する環状ポリヌクレオチドであることができる。環状ポリヌクレオチドは、体外又は体内処理を経て、ＲＮＡｉを仲介することのできる活性ｓｉＲＮＡ分子を生成する。一部の実施例において、ｓｉＲＮＡは、１種類の一本鎖のポリヌクレオチドを含むこともでき、標的核酸分子中のヌクレオチド配列又はその一部（例えば、ＡＤＡＭＴＳ−５又はＡＤＡＭ１７  ｍＲＮＡ）と相互補完するヌクレオチド配列を有し、ここで、このようなｓｉＲＮＡ分子はｓｉＲＮＡ分子内で標的配列又はその一部に対応するヌクレオチド配列を現す必要がない。
【００４６】
特定の実施例において、ｓｉＲＮＡ分子が天然ヌクレオチドのみを含むと限定しなく、修飾のヌクレオチド又は非ヌクレオチドを含むこともできる。例えば、ｓｉＲＮＡ分子の各本の鎖の多くのヌクレオチドはリボースヌクレオチドであるが、ｓｉＲＮＡの１本又は２本の鎖は、例えばデオキシリボースヌクレオチド及び／又は修飾のヌクレオチド、例えば化学修飾のヌクレオチド等の一つ又は複数の非リボースヌクレオチドを含むこともできる。一部の実施例において、ｓｉＲＮＡ分子の複数のヌクレオチドに化学修飾を含み、又は単一のヌクレオチドに複数の化学修飾を含む。上記修飾は開示された又は当該分野で周知の全てのタイプの修飾を含むことができる。
【００４７】
用語「ｓｉＲＮＡ」は、例えば二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ｍｉｃｒｏ−ＲＮＡ  （ｍｉＲＮＡ）、短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、短干渉オリゴヌクレオチド、短干渉核酸、短干渉修飾オリゴヌクレオチド等の他の配列特異ＲＮＡｉを仲介できる核酸分子、化学修飾のｓｉＲＮＡ、転写後遺伝子サイレンシングＲＮＡ（ｐｔｇｓＲＮＡ）を含むこともできる。そして、用語「ＲＮＡｉ」は、例えば転写後遺伝子サイレンシング、遺伝子サイレンシング、翻訳抑制又はエピジェネティクス等の他の配列特異ＲＮＡｉを記述する用語を含むこともできる。一部の実施例において、ｓｉＲＮＡは調節することができ、例えば細胞中のＡＤＡＭＴＳ−５又はＡＤＡＭ１７の発現を抑制することができ、細胞は培養した細胞又は被験者中の細胞であることができ、例えば人類等の哺乳類動物の被験者であることができる。
【００４８】
「ヌクレオチドオーバーハング」は、ｓｉＲＮＡ  １本鎖の３'端の延出が他の１本鎖の５'端を超える時当該二重鎖ｓｉＲＮＡの二量体構造から突出した一つ又は複数のペアを成さないヌクレオチドを指し、又はその逆も同じである。「平滑端」又は「平滑末端末端」は、当該二重鎖ｓｉＲＮＡの末端にペアを成さないヌクレオチドがない、即ちヌクレオチドオーバーハングがないことを指す。前記ｓｉＲＮＡｓは一つの末端にヌクレオチドオーバーハングがあって、即ち一つのオーバーハング端と一つの平滑端を有し、又は両端にいずれもオーバーハングがある。前記ｓｉＲＮＡは全長さが二重鎖であることもでき、即ち分子のいずれの一端にもヌクレオチドオーバーハングがないこともできる。
【００４９】
用語「調節」は、遺伝子発現レベル、ｍＲＮＡ分子レベル、一つ又は複数のタンパク質又はタンパク質サブユニットをコーディングする等価ＲＮＡ分子、又は一つ又は複数のタンパク質又はタンパク質サブユニットの活性レベルのアップレギュレーション又はダウンレギュレーションを指し、上記した発現、レベル又は活性値はレギュロンがない時の値より高い又は低い。例えば、用語「調節」は、「抑制」を指すことができるが、「調節」の使用は当該定義に限定されることはない。
【００５０】
用語「抑制」、「ダウンレギュレーション」、「低下」、「サイレンシング」、又は「阻止」は相互交換可能であって、遺伝子の発現レベル、ｍＲＮＡ分子レベル、一つ又は複数のタンパク質又はタンパク質サブユニットをコーディングする等価ＲＮＡ分子、又は一つ又は複数のタンパク質又はタンパク質サブユニットの活性又はレベルが、核酸分子（例えば、ｓｉＲＮＡ）が存在しない時に比べて、低下することを指す。特定の実施例において、ｓｉＲＮＡ分子の抑制、ダウンレギュレーション、低下、サイレンシング、阻止又は抑制は、不活性化分子又は削減分子が存在する時のレベルより低い。他の一つの例において、ｓｉＲＮＡ分子の抑制、ダウンレギュレーション、低下、サイレンシング、阻止又は抑制は、例えば乱雑配列又はミスマッチのあるｓｉＲＮＡ分子（例えば、ランダムで非特異配列のｓｉＲＮＡ分子）が存在する時のレベルより低い。
【００５１】
「ＡＤＡＭＴＳ−５の発現を抑制する」又は「ＡＤＡＭ１７の発現を抑制する」は、いずれかのＡＤＡＭＴＳ−５又はＡＤＡＭ１７遺伝子（例えば、マウス、ラット、猿又はヒトの遺伝子）及びその変異体（例えば、自然発生変異体）の発現又はＡＤＡＭＴＳ−５又はＡＤＡＭ１７遺伝子の突然変異体を抑制することを指す。従って、ＡＤＡＭＴＳ−５又はＡＤＡＭ１７遺伝子は、野生型遺伝子、変異遺伝子、突然変異遺伝子又は遺伝子操作細胞の導入遺伝子、細胞群の導入遺伝子又は生物中の導入遺伝子であることもできる。
【００５２】
「ＡＤＡＭＴＳ−５の発現を抑制する」又は「ＡＤＡＭ１７の発現を抑制する」は、標的遺伝子の全てのレベルの抑制を含み、例えば少なくともＡＤＡＭＴＳ−５又はＡＤＡＭ１７遺伝子の発現の一部を抑制する。標的遺伝子の発現は、例えばＡＤＡＭＴＳ−５又はＡＤＡＭ１７  ｍＲＮＡレベル、ＡＤＡＭＴＳ−５又はＡＤＡＭ１７タンパク質レベル、又はＡＤＡＭＴＳ−５又はＡＤＡＭ１７に関連する異常に参与した炎症性因子を含む免疫性因子のレベル、例えば腫瘍壊死因子（ＴＮＦ、例えば、ＴＮＦ−α）、シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ、例えばＣＯＸ−２）、インターロイキン（ＩＬ、例えばＩＬ−１β）等の標的遺伝子の発現に関連するいずれかの変数レベルに基づいて評価することができる。
抑制を、このような一つ又は複数の変量とコントロールと比較した絶対又は相対的減少によって評価することができる。コントロールレベルは本分野で使用されるいずれかのコントロールレベル、例えば薬物投入前の基線レベル、又は類似する被験者、細胞から定められるレベル、又は未処理のサンプル又はコントロール（例えば、緩衝液のみのコントロール又は非活性剤コントロール）で処理した後のレベルであることができる。
【００５３】
用語「細胞に接触する」、「導入」又は「配達」は、開示したオリゴマーを、例えばトランスフェクション（例えば、リポソーム、リン酸カルシウム、ポリエチレンイミンを介して）、電気穿孔法（単一孔細胞ヌクレオフェクション）又は顕微注射などの本分野で周知の方法で細胞へ配達することを含む。接触は体内又は体外の接触を含む。体外接触細胞は、細胞をｓｉＲＮＡと一緒に孵化することができる。体内接触細胞は、ｓｉＲＮＡを細胞が位置する組織又は細胞が位置する組織付近に注射するか、又はｓｉＲＮＡを他の領域、例えば血液又は皮下領域に注射して、ｓｉＲＮＡがその後に細胞が位置する組織に達することができる。
【００５４】
用語「被験者」又は「必要な被験者」は、例えばヒト被験者などの哺乳類動物被験者を含む。実例の哺乳類動物被験者は、ＡＤＡＭＴＳ−５又はＡＤＡＭ１７に関連する病気（例えば、ＯＡとＲＡを含む関節炎）にかかっていて、又は病気にかかる可能性がある。
【００５５】
ＡＤＡＭＴＳ−５又はＡＤＡＭ１７に関連する病気は、ＡＤＡＭＴＳ−５又はＡＤＡＭ１７遺伝子又はタンパク質と関連する失調、疾患又は状況を含む。上記疾患は、ＡＤＡＭＴＳ−５又はＡＤＡＭ１７遺伝子の変異又は突然変異、ＡＤＡＭＴＳ−５又はＡＤＡＭ１７タンパク質のミスフォールディング、細胞内タンパク質（例えば、ミスフォールディングのタンパク質）の蓄積、タンパク質過剰産生、タンパク質異常切断、ＡＤＡＭＴＳ−５又はＡＤＡＭ１７と他のタンパク質又は内外因性物質の異常相互作用によるものである。一部の実施例において、ＡＤＡＭＴＳ−５又はＡＤＡＭ１７に関連する疾患は、炎症に関連する疾患であることができる。一部の実施例において、ＡＤＡＭＴＳ−５又はＡＤＡＭ１７に関連する疾患は、関節炎、例えばＯＡ、ＲＡ、慢性感染性関節炎、脊椎炎、乾癬関節炎、痛風であることができる。ＡＤＡＭＴＳ−５又はＡＤＡＭ１７に関連する疾患の状況又は症状は、関節線維化、軟骨浸食、軟骨コラーゲン損失、関節軟骨表面ダメージ、滑膜炎、関節包炎、関節痛、関節靭帯肥厚、メニスカス骨化、軟骨細胞配列混乱を含む。
【００５６】
化合物又は組成物の「治療有効量」又は「有効量」は、失調の予防又は治療における有効量を指す。用語は、被験者にＡＤＡＭＴＳ−５又はＡＤＡＭ１７に関連する疾患を充分に有効治療できるｓｉＲＮＡ量を適用することを指し、例えば症状の緩和、改善、維持、症状を維持する１種類又は複種類の症状又は病気を抑制する過程を含む。「治療有効量」又は「有効量」は、ｓｉＲＮＡ分子、薬物投入ルート、疾患タイプ及びその厳重程度及び被験者の健康、年齢、体重、家族歴、遺伝組み合わせ、ＡＤＡＭＴＳ−５又はＡＤＡＭ１７の発現によって仲介された病理過程の段階、前期治療又は随伴治療のタイプ、又は被験者の他の個体特性の影響を受ける。
【００５７】
複種類の実施例において、用語「治療」は、被験者（例えば、哺乳類動物、例えばヒト）又は細胞について治療して、被験者又は細胞の現状を変更することを指す。治療は、これらに限定されないが、薬物組成物の投薬を含み、予防性投薬又は病理開始後又は病原体と接触した後の投薬を行なうことができる。さらに、「予防性治療」を含み、被治療の疾患又は状況の進捗速度を低下し、疾患又は状況の発生を遅延し、又は発生した厳重程度を緩和する。「治療」又は「予防」は、必ずしも疾患又は状況又は関連する症状を完全に除去、キュアー又は阻止することを示すものではない。複数の実施例において、用語「治療」は、例えば関節炎（例えば、ＯＡ、ＲＡ、慢性感染性関節炎、脊椎炎、乾癬関節炎、痛風）の緩和、例えば症状の緩和、例えば関節線維化、軟骨浸食、軟骨コラーゲン損失、関節軟骨表面ダメージ、滑膜炎、関節包炎、関節痛、関節靭帯肥厚、メニスカス骨化、軟骨細胞配列混乱等のＡＤＡＭＴＳ−５又はＡＤＡＭ１７の発現が仲介した病理過程又は症状の緩和、軽減又は逆転を含むことができる。
【００５８】
用語「投薬」又は「適用」は、前記ｓｉＲＮＡを一部又はシステムによって投薬して被験者に配達することを含む。投薬は、一部（眼部、粘膜、膣、直腸配達を含む）、肺（例えば、気体粉末又はエアロゾルの吸い込み又は注入を含む。噴霧器、気管内又は鼻内によるものを含む）、上皮、皮膚、経口又は非経口であることができる。非経口投薬は、静脈、動脈、皮下、腹腔又は筋肉内注射又は灌流と、例えば髄腔内又は脳室投薬の脳内投薬、又は関節又は関節内注射を含む。
【００５９】
II  ｓｉＲＮＡ
開示したある態様によると、体外で、例えば溶液又は無細胞系（例えば、細胞溶解物又は再構成システム）において、又は細胞、例えば体外培養細胞（例えば、ＡＤＡＭＴＳ−５又はＡＤＡＭ１７を発現する細胞）において、又は被験者体内の細胞においては、ＡＤＡＭＴＳ−５又はＡＤＡＭ１７遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡｓを提供する。被験者は、例えばラット、マウス又はヒトのような哺乳類動物であることができる。一部の実施例において、被験者は、例えば炎症に関連する病気等のＡＤＡＭＴＳ−５又はＡＤＡＭ１７に関連する病気にかかっているか又は上記病気にかかる可能性がある。実例の炎症に関連する疾患は、関節炎（ＯＡ、ＲＡ、慢性感染性関節炎、脊椎炎、乾癬関節炎、痛風を含む）を含む。一部の実施例において、疾患は関節炎であることができる。一部の実施例において、疾患はＯＡであることができる。一部の実施例において、疾患はＲＡであることができる。
【００６０】
ｓｉＲＮＡｓはそれと交雑する標的配列に案内され又はそれと交雑する標的配列を標的とする。複数の実施例において、標的配列はＡＤＡＭＴＳ−５又はＡＤＡＭ１７遺伝子のＲＮＡ転写物（例えば、標的ｍＲＮＡ）の１０〜３０個の連続するヌクレオチドを含み、例えば１０〜２５又は１５〜２０個の標的ｍＲＮＡの連続するヌクレオチドを含み、範囲内の全ての整数を含む。例えば、標的配列は１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５又は２７個の標的ｍＲＮＡの連続するヌクレオチドを含むことができる。一部の実施例において、標的配列は、１９個の標的ｍＲＮＡの連続するヌクレオチドを含むことができる。複数の実施例において、前記ｓｉＲＮＡｓは、標的ｍＲＮＡ配列と充分の相互補完性を有するアンチセンス領域を含んで、ＲＮＡｉ機能を実現する。例えば、アンチセンス領域は、少なくとも１１個の連続又は非連続の標的ｍＲＮＡ配列と相互補完するヌクレオチドを含むことができ、例えば少なくとも１５個の連続又は非連続の標的ｍＲＮＡ配列と相互補完するヌクレオチドを含む。一部の実施例において、アンチセンス領域は、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５又は２７個の連続又は非連続の標的ｍＲＮＡ配列と相互補完するヌクレオチドを含むことができる。一部の実施例において、アンチセンス領域は、１５個の連続又は非連続の標的ｍＲＮＡ配列と相互補完するヌクレオチドを含むことができる。一部の実施例において、アンチセンス領域は１７個の連続又は非連続の標的ｍＲＮＡ配列と相互補完するヌクレオチドを含むことができる。一部の実施例において、アンチセンス領域は１９個の連続又は非連続の標的ｍＲＮＡ配列と相互補完するヌクレオチドを含むことができ、一部の実施例において、アンチセンス領域は実質的に少なくとも一部のＡＤＡＭＴＳ−５又はＡＤＡＭ１７遺伝子ＲＮＡ転写物（ＡＤＡＭＴＳ−５又はＡＤＡＭ１７  ｍＲＮＡ）と相互補完する。一部の実施例において、アンチセンス領域は少なくとも一部のＡＤＡＭＴＳ−５又はＡＤＡＭ１７遺伝子ＲＮＡ転写物と完全に相互補完する。
【００６１】
異なる実施例は、一本鎖ｓｉＲＮＡｓを含み、ここで、ｓｉＲＮＡの自行相互補完するセンスとアンチセンス領域とはヌクレオチド又は非ヌクレオチド接続によってサブ接続を実現する。一部の実施例において、ｓｉＲＮＡは二倍、非対称二倍、ヘアピン、非対称ヘアピン二級構造を有する一本鎖ポリヌクレオチドであることができる。一部の実施例において、ｓｉＲＮＡは二つ又は複数のループ構造と、自行相互補完するセンスとアンチセンス領域とを含む一つの茎とを有する環状一本鎖ポリヌクレオチドを含む。一部の実施例において、環状ポリヌクレオチドは体外又は体内処理を経て、ＲＮＡｉを仲介できる活性ｓｉＲＮＡ分子を生成することができる。一部の実施例において、ｓｉＲＮＡは１種類の一本鎖のポリヌクレオチドを含むこともでき、標的配列（例えば、ＡＤＡＭＴＳ−５又はＡＤＡＭ１７  ｍＲＮＡ又はその一部）と相互補完するアンチセンス領域を有し、このようなｓｉＲＮＡは内部に標的配列に対応するセンス領域を有する必要がない。
【００６２】
一部の実施例において、ｓｉＲＮＡは、センス鎖とアンチセンス鎖を含む二重鎖のｓｉＲＮＡであることができる。アンチセンス鎖はｓｉＲＮＡのアンチセンス領域を含むことができる。ｓｉＲＮＡのセンスとアンチセンス鎖は、二重鎖構造を形成することができる。一部の実施例において、アンチセンス鎖はＡＤＡＭ−５  ｍＲＮＡと交雑し、センス鎖はアンチセンス鎖と交雑することができる。一部の実施例において、アンチセンス鎖はＡＤＡＭ１７  ｍＲＮＡと交雑し、センス鎖はアンチセンス鎖と交雑することができる。一部の実施例において、ＲＮＡｉは、例えば少なくとも１５ｂｐ、少なくとも１７ｂｐ又は少なくとも１９ｂｐのように少なくとも１１ｂｐの二重鎖領域を有することができる。例えば、ＲＮＡｉの二重鎖領域は、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５又は２７ｂｐであることができる。一部の実施例において、ＲＮＡｉの二重鎖領域は１５ｂｐであることができる。一部の実施例において、ＲＮＡｉの二重鎖領域は１７ｂｐであることができる。一部の実施例において、ＲＮＡｉの二重鎖領域は１９ｂｐであることができる。
【００６３】
ｓｉＲＮＡは二重鎖分子で、各鎖の長さは同一又は異なっている。一部の実施例において、ｓｉＲＮＡの各鎖、一本鎖又は二重鎖の、長さは１０〜６０ｎｔであることができる。例えば、各鎖の長さは１０〜５０ｎｔ、１０〜４０ｎｔ、１０〜３０ｎｔ、１０〜２５ｎｔ、１０〜２０ｎｔ、１５〜２５ｎｔ、１５〜２７ｎｔ又は１５〜２０ｎｔであることができ、且つ当該範囲内の全ての整数を含む。一部の実施例において、各鎖の長さは１５〜２７ｎｔであることができ、且つ当該範囲内の全ての整数を含む。一部の実施例において、各鎖の長さは１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５又は２７ｎｔであることができる。一部の実施例において、各鎖の長さは１５ｎｔである。一部の実施例において、各鎖の長さは１７ｎｔである。一部の実施例において、各鎖の長さは１９ｎｔである。２種類又は複種類のｓｉＲＮＡ分子を組み合わせて使用する場合、それぞれのｓｉＲＮＡの各鎖の長さは同じであるか又は異なることができる。開示するため、いずれかの二重鎖のｓｉＲＮＡ鎖の長さを計算する方法もいずれかのヌクレオチドオーバーハングを排除するべきである。
【００６４】
当業者であれば、ｓｉＲＮＡｓに、既存方法でヌクレオチドの挿入、入れ替え、欠失又はミスマッチがあったことが分かる。例えばヌクレオチド配列におけるＵ、Ｇ、Ａを含むヌクレオチドは、例えばイノシンを含むヌクレオチドに置換されることができる。ヌクレオチド配列の任意位置のＣはＵ又はＧに置換されることができる。一部の実施例において、ｓｉＲＮＡはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２、４、８又は１０、又は表２、３、９と１０から選ばれた配列のアンチセンス配列を含むことができ、１、２、３、４、５、６、７又は８個のヌクレオチドの挿入、入れ替え、欠失又はミスマッチを有する。一部の実施例において、ｓｉＲＮＡはさらにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １、３、７又は９、又は表１、３、８と１０から選ばれたセンス配列を含むことができ、１、２、３、４、５、６、７又は８個のヌクレオチドの挿入、入れ替え、欠失又はミスマッチを有する。一部の実施例において、ｓｉＲＮＡは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２、４、８又は１０又は表２、３、９と１０から選ばれた配列のアンチセンス配列を含むことができ、１、２、３又は４個のヌクレオチドの挿入、入れ替え、欠失又はミスマッチを有する。一部の実施例において、ｓｉＲＮＡはさらに、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １、３、７又は９、又は表１、３、８と１０から選ばれたセンス配列を含むことができ、１、２、３又は４個のヌクレオチドの挿入、入れ替え、欠失又はミスマッチを有する。一部の実施例において、ｓｉＲＮＡは、１、２、３又は４個のヌクレオチドの挿入、入れ替え、欠失又はミスマッチを有するＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２を含むアンチセンス配列を含むことができる。一部の実施例において、ｓｉＲＮＡはさらに、１、２、３又は４個のヌクレオチドの挿入、入れ替え、欠失又はミスマッチを有するＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １を含むセンス配列を含むことができる。一部の実施例において、ｓｉＲＮＡは、１、２、３又は４個のヌクレオチドの挿入、入れ替え、欠失又はミスマッチのあるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ８を含むセンス鎖を含むことができる。一部の実施例において、ｓｉＲＮＡはさらに、１、２、３又は４個のヌクレオチドの挿入、入れ替え、欠失又はミスマッチを有するＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ７を含むセンス配列を含むことができる。
【００６５】
一部の実施例において、ｓｉＲＮＡはアンチセンス配列を含み、当該アンチセンス配列は表１、３、８、１０から選ばれたアンチセンス配列とのヌクレオチド差異が８個を超えない少なくとも１１個の、例えば少なくとも１５個又は少なくとも１９個の連続するヌクレオチドを含む。一部の実施例において、ｓｉＲＮＡはアンチセンス配列を含み、当該アンチセンス配列は表１、３、８、１０から選ばれたアンチセンス配列とのヌクレオチド差異が４個を超えない少なくとも１１個の、例えば少なくとも１５個又は少なくとも１９個の連続するヌクレオチドを含む。一部の実施例において、ｓｉＲＮＡはさらにセンス配列を含み、当該センス配列は表２、３、９、１０から選ばれたセンス配列とのヌクレオチド差異が８個を超えない少なくとも１１個、例えば少なくとも１５個又は少なくとも１９個の連続するヌクレオチドを含む。一部の実施例において、ｓｉＲＮＡはさらにセンス配列を含み、当該センス配列は表２、３、９、１０から選ばれたセンス配列とのヌクレオチド差異が４個を超えない少なくとも１１個、例えば少なくとも１５個又は少なくとも１９個の連続するヌクレオチドを含む。
【００６６】
ｓｉＲＮＡｓの実施例は、例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ：  １〜４、７〜１０及び表１〜３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ：１７〜４９）と表８〜１０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ：９８〜１２８）の配列等の開示したヌクレオチド配列と一定の同一性を有するヌクレオチド配列を含むことができる。例えばｓｉＲＮＡは開示したいずれかの配列との同一性が少なくとも６０％、例えば７０％、８０％、９０％、９５％又はさらに高い同一性のある配列を含むことができる。一部の実施例において、ｓｉＲＮＡは開示したいずれかの配列との同一性が少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％である配列を含むことができる。
【００６７】
実例のＡＤＡＭＴＳ−５を標的とするｓｉＲＮＡｓはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２又は４、又は表２と３から選ばれたアンチセンス配列と少なくとも６０％（例えば、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％）の同一性を有するアンチセンス配列を含むことができる。一部の実施例において、ｓｉＲＮＡはさらにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １又は３、又は表１と３から選ばれたセンス配列と少なくとも６０％（例えば、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％）の同一性を有するセンス配列を含むことができる。
【００６８】
一部の実施例において、ｓｉＲＮＡはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２と少なくとも６０％（例えば、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％）の同一性を有するアンチセンス配列を含むことができる。一部の実施例において、ｓｉＲＮＡはさらにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １と少なくとも６０％（例えば、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％）の同一性を有するセンス配列を含むことができる。一部の実施例において、ｓｉＲＮＡはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２のアンチセンス配列を含むことができる。一部の実施例において、ｓｉＲＮＡはさらにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １のセンス配列を含むことができる。一部の実施例において、ｓｉＲＮＡはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２と少なくとも６０％（例えば、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％）の同一性を有するアンチセンス配列と、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １のセンス配列とを含むことができる。一部の実施例において、ｓｉＲＮＡはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２のアンチセンス配列と、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １と少なくとも６０％（例えば、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％）の同一性を有するセンス配列とを含むことができる。
【００６９】
一部の実施例において、ｓｉＲＮＡはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ４と少なくとも６０％（例えば、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％）の同一性を有するアンチセンス配列を含むことができる。一部の実施例において、ｓｉＲＮＡはさらにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３と少なくとも６０％（例えば、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％）の同一性を有するセンス配列を含むことができる。一部の実施例において、ｓｉＲＮＡはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ４のアンチセンス配列を含むことができる。一部の実施例において、ｓｉＲＮＡはさらにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３のセンス配列を含むことができる。一部の実施例において、ｓｉＲＮＡはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ４と少なくとも６０％（例えば、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％）の同一性を有するアンチセンス配列と、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３のセンス配列とを含むことができる。一部の実施例において、ｓｉＲＮＡはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ４のアンチセンス配列と、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３と少なくとも６０％（例えば、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％）の同一性を有するセンス配列とを含むことができる。
【００７０】
一部の実施例において、ｓｉＲＮＡは表２と３から選ばれたアンチセンス配列と少なくとも６０％（例えば、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％）の同一性を有するアンチセンス配列を含むことができる。一部の実施例において、ｓｉＲＮＡはさらに表１と３から選ばれたセンス配列と少なくとも６０％（例えば、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％）の同一性を有するセンス配列を含むことができる。一部の実施例において、ｓｉＲＮＡは表２と３から選ばれたアンチセンス配列を含むことができる。一部の実施例において、ｓｉＲＮＡはさらに表１と３から選ばれたセンス配列を含むことができる。一部の実施例において、ｓｉＲＮＡは表２と３から選ばれたアンチセンス配列と少なくとも６０％（例えば、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％）の同一性を有するアンチセンス配列と、表１と３から選ばれたセンス配列とを含むことができる。一部の実施例において、ｓｉＲＮＡは表２と３から選ばれたアンチセンス配列と、表１と表３から選ばれたセンス配列と少なくとも６０％（例えば、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％）の同一性を有するセンス配列とを含むことができる。
【００７１】
実例のＡＤＡＭ１７を標的とするｓｉＲＮＡｓはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ８又は１０、又は表９と１０から選ばれたアンチセンス配列と少なくとも６０％（例えば、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％）の同一性を有するアンチセンス配列とを含むことができる。一部の実施例において、ｓｉＲＮＡはさらにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ７又は９又は表８と１０から選ばれたセンス配列と少なくとも６０％（例えば、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％）の同一性を有するセンス配列を含むことができる。
【００７２】
一部の実施例において、ｓｉＲＮＡはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ８と少なくとも６０％（例えば、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％）の同一性を有するアンチセンス配列を含むことができる。一部の実施例において、ｓｉＲＮＡはさらにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ７と少なくとも６０％（例えば、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％）の同一性を有するセンス配列を含むことができる。一部の実施例において、ｓｉＲＮＡはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ８のアンチセンス配列を含むことができる。一部の実施例において、ｓｉＲＮＡはさらにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ７のセンス配列を含むことができる。一部の実施例において、ｓｉＲＮＡはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ８と少なくとも６０％（例えば、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％）の同一性を有するアンチセンス配列と、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ７のセンス配列とを含むことができる。一部の実施例において、ｓｉＲＮＡはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ８のアンチセンス配列と、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ７と少なくとも６０％（例えば、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％）の同一性を有するセンス配列を含むことができる。
【００７３】
一部の実施例において、ｓｉＲＮＡはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １０と少なくとも６０％（例えば、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％）の同一性を有するアンチセンス配列を含むことができる。一部の実施例において、ｓｉＲＮＡはさらにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ９と少なくとも６０％（例えば、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％）の同一性を有するセンス配列を含むことができる。一部の実施例において、ｓｉＲＮＡはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １０のアンチセンス配列を含むことができる。一部の実施例において、ｓｉＲＮＡはさらにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ９のセンス配列を含むことができる。一部の実施例において、ｓｉＲＮＡはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １０と少なくとも６０％（例えば、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％）の同一性を有するアンチセンス配列と、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ９のセンス配列とを含むことができる。一部の実施例において、ｓｉＲＮＡはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １０のアンチセンス配列と、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ９と少なくとも６０％（例えば、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％）の同一性を有するセンス配列とを含むことができる。
【００７４】
一部の実施例において、ｓｉＲＮＡは表９と１０から選ばれたアンチセンス配列と少なくとも６０％（例えば、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％）の同一性を有するアンチセンス配列を含むことができる。一部の実施例において、ｓｉＲＮＡはさらに表８と１０から選ばれたセンス配列と少なくとも６０％（例えば、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％）の同一性を有するセンス配列を含むことができる。一部の実施例において、ｓｉＲＮＡは表９と１０から選ばれたアンチセンス配列を含むことができる。一部の実施例において、ｓｉＲＮＡはさらに表８と１０から選ばれたセンス配列を含むことができる。一部の実施例において、ｓｉＲＮＡは表９と１０から選ばれたアンチセンス配列と少なくとも６０％（例えば、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％）の同一性を有するアンチセンス配列と、表８と１０から選ばれたセンス配列とを含むことができる。一部の実施例において、ｓｉＲＮＡは表９と１０から選ばれたアンチセンス配列と、表８と表１０から選ばれたセンス配列と少なくとも６０％（例えば、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％）の同一性を有するセンス配列とを含むことができる。
【００７５】
前記二重鎖ｓｉＲＮＡの特定の実施例は、一本鎖／二重鎖の５’端、３’端、又は両端に、一つ又は複数の一本鎖ヌクレオチドオーバーハングを含むことができる。各鎖のヌクレオチドオーバーハングの数量、長さ、配列、位置は同一であるか又は異なることができる。例えば、ヌクレオチドオーバーハング位置がセンス鎖、アンチセンス鎖又は二重鎖の３’端に位置することができる。ｓｉＲＮＡがアンチセンス鎖５’端（又はセンス鎖３’端）に一つの平滑末端を有することができ、その逆であってもよい。一部の実施例において、ｓｉＲＮＡアンチセンス鎖は３’端にヌクレオチドオーバーハングを有し、５’端に平滑末端を有することができる。オーバーハング端は標的配列とミスマッチすることができ、又は標的配列と相互補完することができ、又は他の配列と相互補完することができる。一部の実施例において、少なくともｓｉＲＮＡのいずれかの鎖の少なくとも一端に、長さが例えば１〜８、２〜８、１〜６、２〜６、１〜５、２〜５、１〜４、２〜４、１〜３、２〜３、又は１〜２個のような、１〜１０個のヌクレオチドであるオーバーハングを含むことができ、且つ区間内の全ての整数を含む。一部の実施例において、オーバーハング長さは一つ又は二つのヌクレオチドであることができる。異なる実施例において、オーバーハング中のヌクレオチドは、それぞれが独立した未修飾の又は開示又は本分野の周知の修飾ヌクレオチドであることができる。例えば、オーバーハングは少なくとも一つのｄＴを含むことができる。一部の実施例において、オーバーハングはｄＴｄＴであることができる。一部の実施例において、ｓｉＲＮＡアンチセンス鎖は３’端にｄＴｄＴを有することができる。一部の実施例において、ｓｉＲＮＡセンス鎖は３’端にｄＴｄＴを有することができる。一部の実施例において、ｓｉＲＮＡ二重鎖は３’端にｄＴｄＴを有することができる。２種類又は複種類のｓｉＲＮＡ分子を組み合わせて使用する時、それぞれのｓｉＲＮＡのオーバーハング構造は同一であるか又は異なることができる。例えば、各鎖ヌクレオチドオーバーハングの数量、長さ、配列又は位置を別途に選択することができる。
【００７６】
III  化学修飾
複数の実施例において、ｓｉＲＮＡは活性（例えば、安定性、有効性、特異性）、細胞分布、細胞取込又は他の性能を向上させるため化学修飾されることができる。前記ｓｉＲＮＡは、既存の方法で合成及び／又は修飾されることができる。異なる実施例において、ｓｉＲＮＡは少なくとも一つの任意の適切な基によって修飾されたヌクレオチド（例えば、化学修飾、共役又は置換）を含むことでｓｉＲＮＡ性能を向上させる。所定のｓｉＲＮＡの全ての位置に同一の修飾を行う必要はない。一部の実施例において、単一のｓｉＲＮＡ又はｓｉＲＮＡの単一のヌクレオチドに１個を超える修飾を含むことができる。実例の修飾は、例えば５’端修飾（例えば、リン酸化、共役、反転結合等）又は３’端修飾（例えば、共役、ＤＮＡヌクレオチド、反転結合等）のような末端修飾と、例えば安定な塩基、不安定な塩基、又は拡張した配偶体レパートリーと塩基ペアリングする塩基への入れ替え、塩基の移転（非塩基ヌクレオチド）又は塩基の共役のような塩基修飾と、糖修飾（例えば、２'位又は４'位）又は糖置換と、及び／又は、ホスホジエステル結合の修飾又は入れ替えを含む骨格修飾とを含む。
【００７７】
実施例において、骨格修飾のあるｓｉＲＮＡｓは骨格にリン原子を有するかリン原子のないものを含む。実例のｓｉＲＮＡリン酸骨格修飾は、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、リン酸トリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、アルキルホスホン酸エステル、逆極性のあるエステルを含み、ここで、隣接するヌクレオチドは３’〜５’乃至５’〜３’、又は２’〜５’乃至５’〜２’接続される。一部の実施例において、ｓｉＲＮＡ糖骨格は、アミド、モルホリン、シクロブチル等に置換可能である。特定の実施例において、ｓｉＲＮＡの少なくとも１本鎖は、ホスホロチオエート修飾のリン酸骨格を有する。リン酸骨格において、ホスホロチオエートはＰ−Ｓ結合でＰ−ＯＨ結合を置換できる。
【００７８】
複数の実施例において、上述した任意の修飾のｓｉＲＮＡｓは、一つ又は複数の修飾のグリコシルを含むことができる。修飾のグリコシルはリボース又はデオキシリボースであることができる。例えばｓｉＲＮＡは、例えば２’−デオキシ−２’−フッ素、２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）（又は２’−ＭＯＥ）、２’−アミノ基、２’−アルキル基、２’−ＳＨ修飾のヌクレオチドから選ばれた少なくとも一つを含むことができる。実例の修飾グリコシルはさらに、例えばロックド核酸（ＬＮＡ）、オープンループ又は非ロックド核酸（ＵＮＡ）及びペプチド核酸（ＰＮＡ）を含むことができる。類似する修飾はさらに、例えば３’末端ヌクレオチドにおける糖の３’位置又は５’末端ヌクレオチドにおける糖の５’位置等のｓｉＲＮＡの他の位置にあることができる。一部の実施例において、ｓｉＲＮＡの少なくとも１本鎖は２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、即ち２’−Ｏ−メチル修飾のリボース又はデオキシリボースを含むことができる。一部の実施例において、ｓｉＲＮＡの少なくとも１本鎖は２’−デオキシ−２’−フッ素修飾ヌクレオチド、即ち２’−デオキシ−２’−フッ素修飾のリボース又はデオキシリボースを含むことができる。一部の実施例において、ｓｉＲＮＡの少なくとも１本鎖はＬＮＡを含むことができる。前記ＬＮＡはリボース又はデオキシリボースの２’−Ｏと４’−Ｃとの間に環状構造を形成することができる。一部の実施例において、ｓｉＲＮＡの少なくとも１本鎖は開環核酸又はＵＮＡを含むことができる。前記開環核酸又はＵＮＡはリボース又はデオキシリボースの２’−Ｃと３’−Ｃとの間の割れを含むことができる。一部の実施例において、ｓｉＲＮＡの少なくとも１本鎖はＰＮＡを含むことができる。前記ＰＮＡはアミノ基を含有する骨格でヌクレオチドの糖骨格を置換して含むことができる。
【００７９】
複数の実施例において、前記ｓｉＲＮＡｓは核酸塩基（又は塩基）修飾を含むことができる。「未修飾」又は「天然」核酸塩基はプリン塩基ＡとＧ、ピリミジン塩基Ｔ、Ｃ、Ｕを含む。修飾の核酸塩基は他の合成及び天然の核酸塩基を含み、例えば５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、５−アセチリエニルウラシル、又は５−エチニルウラシル、５−プロピニルウラシル、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノ基アデニン、６−メチル及び他のアルキル基誘導体修飾のアデニンやグアニン、２−チオウラシル、５−ハロウラシル、５−プロピニルウラシル、６−アゾシトシン、５−ウラシル（偽ウラシル）、インドール、８−ハロ基、８−アミノ基、及び他の８−修飾のアデニンやグアニンを含む。一部の実施例において、ｓｉＲＮＡの少なくとも１本鎖はインドール修飾を含むことができる。一部の実施例において、ｓｉＲＮＡの少なくとも１本鎖は５−メチルシトシン修飾を含むことができる。一部の実施例において、ｓｉＲＮＡの少なくとも１本鎖は５−エチニルウラシル修飾を含むことができる。
【００８０】
上記実例のｓｉＲＮＡｓ修飾もｓｉＲＮＡを１種類又は複種類の細胞取込や標的指向性を強化し、ｓｉＲＮＡ半減期を延長することのできる部分又は共役物に接続するためのものを含むことができる。当該部分は脂質部分（例えば、コレステリル誘導体、リン脂質、脂肪族鎖）、ペプタイド、ナノ粒子、標記物（例えば、アントシアン蛍光染料、例えばＣｙ３又はＣｙ５）、ポリマー（例えば、ポリアミン又はポリエチレングリコール鎖）、糖（例えば、ガラクトシル誘導体）、抗体、ビオチン、コール酸、リガンド、メルカプタン、ビタミン（例えば、ビタミンＥ）、ＮＨ２、リン酸、葉酸を含むがこれらに限定されることはない。共役物はｓｉＲＮＡの５’端、３’端又は両端又は内部に接続されることができる。一部の実施例において、ｓｉＲＮＡの少なくとも１本鎖はコレステリル誘導体に接続される末端ヌクレオチドを含むことができる。一部の実施例において、コレステリル誘導体はコレステロールである。一部の実施例において、ｓｉＲＮＡの少なくとも１本鎖はガラクトシル誘導体に接続される末端ヌクレオチドを含むことができる。一部の実施例において、ガラクトシル誘導体はガラクトースである。一部の実施例において、ｓｉＲＮＡの少なくとも１本鎖はペプタイドに接続される末端ヌクレオチドを含むことができる。一部の実施例において、ペプタイドはアミノ酸配列Ｎ’−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｃ’、即ちＲＧＤペプタイドを含むことができる。一部の実施例において、ｓｉＲＮＡの少なくとも１本鎖は蛍光標記物に接続される末端ヌクレオチドを含むことができる。一部の実施例において、蛍光標記物はアントシアン標記物である。一部の実施例において、ｓｉＲＮＡの少なくとも１本鎖はビオチン物に接続される末端ヌクレオチドを含むことができる。一部の実施例において、ｓｉＲＮＡの少なくとも１本鎖はリン酸化の末端ヌクレオチドを含むことができる。
【００８１】
ｓｉＲＮＡの複数の実施例は、上述した又は本分野で周知の１種類又は複種類の修飾組み合せを含むことができる。一部の実施例において、ｓｉＲＮＡの少なくとも１本鎖は、（ａ）ホスホロチオエート修飾のリン酸骨格、（ｂ）リボース又はデオキシリボースの２’−Ｏ−メチル修飾、（ｃ）リボース又はデオキシリボースの２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾、（ｄ）ロックド核酸（ＬＮＡ）修飾、（ｅ）開環核酸又はＵＮＡ、（ｆ）インドール修飾、（ｇ）５−メチルシトシン、（ｈ）５’−エチニルウラシル、（ｉ）コレステリル誘導体に接続される末端ヌクレオチド（例えばコレステロール）、（ｊ）ガラクトシル誘導体に接続される末端ヌクレオチド（例えばガラクトース）、（ｋ）ペプタイドに接続される末端ヌクレオチド（例えばＲＧＤペプタイド）、（ｌ）リン酸化の末端ヌクレオチド（例えば５’−リン酸化）、（ｍ）蛍光標記物に接続される末端ヌクレオチド（例えばアントシアン標記）、（ｎ）ビオチン標記に接続される末端ヌクレオチドから選ばれた少なくとも一つの化学修飾を含むことができる。例えばｓｉＲＮＡの少なくとも１本鎖は表７と１３から選ばれた一つ又は複数の修飾の組み合せを含むことができる。
【００８２】
一部の実施例において、前記ｓｉＲＮＡは表７から選ばれた化学修飾のアンチセンス鎖を含むことができる。一部の実施例において、ｓｉＲＮＡはさらに表７から選ばれた化学修飾のセンス鎖を含むことができる。一部の実施例において、ｓｉＲＮＡは表１３から選ばれた化学修飾のアンチセンス鎖を含むことができる。一部の実施例において、ｓｉＲＮＡはさらに表１３から選ばれた化学修飾のセンス鎖を含むことができる。
【００８３】
一部の実施例において、センス鎖はヌクレオチド配列５’−Ｋ−ＬＬＭＵＵＵＡＵＧＵＧＧＧＣＡＵＰＭＱｄＴｄＴ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １３）を含むことができ、アンチセンス鎖はヌクレオチド配列５’−Ｒ−ＭＱＬＡＵＧＣＣＣＡＣＡＵＡＡＡＱＰＰｄＴｄＴ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １４）を含むことができ、ここで、
Ｋは５’−末端ヌクレオチドに接続されたコレステロール基であることができ、
Ｒは５’−末端ヌクレオチドのリン酸化修飾であることができ、
ｄＴはチミンデオキシリボヌクレオチドであって、
Ｌは未修飾又は２’−Ｏ−メチル修飾のグアニンデオキシリボースヌクレオチドであって、
Ｍは未修飾又は２’−Ｏ−メチル修飾のアデニンデオキシリボースヌクレオチドであって、
Ｐは未修飾又は２’−Ｏ−メチル修飾のシトシンデオキシリボースヌクレオチドであって、
Ｑは未修飾又は２’−Ｏ−メチル修飾のウラシルデオキシリボースヌクレオチドであって、
Ｌ、Ｍ、Ｐ及びＱの中の少なくとも一つがチオリン酸骨格を有することができる。
【００８４】
一部の実施例において、少なくともＬ、Ｍ、Ｐ及びＱの中の一つがチオリン酸骨格を有することができる。一部の実施例において、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑがいずれもチオリン酸骨格を有することができる。一部の実施例において、センス鎖は表７から選ばれたセンス配列を含むことができ、アンチセンス鎖は表７から選ばれたアンチセンス配列を含むことができる。
【００８５】
一部の実施例において、センス鎖はヌクレオチド配列５’−Ｋ’−Ｌ’Ｐ’Ｍ’ＵＣＡＵＧＵＡＵＣＵＧＡＡＰ’Μ’Ｍ’ｄＴｄＴ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １５）を含むことができ、アンチセンス鎖はヌクレオチド配列５’−Ｒ’−Ｑ’Ｑ’Ｌ’ＵＵＣＡＧＡＵＡＣＡＵＧＡＱ’Ｌ’Ｐ’ｄＴｄＴ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １６）を含むことができ、ここで、
Ｋ’は５’−末端ヌクレオチドに接続されたコレステロール基であることができ、
Ｒ’は５’−末端ヌクレオチドのリン酸化修飾であることができ、
ｄＴはチミンデオキシリボースヌクレオチドであって、
Ｌ’は未修飾又は２’−Ｏ−メチル修飾のグアニンデオキシリボースヌクレオチドであって、
Ｍ’は未修飾又は２’−Ｏ−メチル修飾のアデニンデオキシリボースヌクレオチドであって、
Ｐ’は未修飾又は２’−Ｏ−メチル修飾のシトシンデオキシリボースヌクレオチドであって、
Ｑ’は未修飾又は２’−Ｏ−メチル修飾のウラシルリボースヌクレオチドであって、
Ｌ’、Ｍ,’、Ｐ’及びＱ’の中の少なくとも一つがチオリン酸骨格を有することができる。
【００８６】
一部の実施例において、Ｌ’、Ｍ’、Ｐ’及びＱ’の中の少なくとも一つがチオリン酸骨格を有することができる。一部の実施例において、Ｌ’、Ｍ’、Ｐ’及びＱ’がいずれもチオリン酸骨格を有することができる。一部の実施例において、センス鎖は表１３から選ばれたセンス配列を含むことができ、アンチセンス鎖は表１３から選ばれたアンチセンス配列を含むことができる。
【００８７】
IV  ｓｉＲＮＡをコーディングする核酸
開示した他の態様は前記ｓｉＲＮＡｓをコーディングする核酸を含む。例えば、核酸は、例えばヌクレオチド配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ：１〜４、７〜１０、又は表１〜３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ：  １７−４９）と表８〜１０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ：  ９８〜１２８）に開示した任意のヌクレオチド配列との同一性が少なくとも６０％（例えば、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％）又は１００％であるｓｉＲＮＡをコーディングすることができる。一部の実施例において、核酸がコーディングしたｓｉＲＮＡは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２との同一性が少なくとも６０％（例えば、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％）であるアンチセンス配列を含むことができる。一部の実施例において、核酸がコーディングしたｓｉＲＮＡは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２に示すヌクレオチド配列を含むことができる。一部の実施例において、核酸はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ６の３６〜５４位を有するヌクレオチドを含むことができる。一部の実施例において、核酸はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ６に示すヌクレオチド配列を含むことができる。一部の実施例において、核酸がコーディングしたｓｉＲＮＡは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １との同一性が少なくとも６０％（例えば、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％）であるセンス配列を含むことができる。一部の実施例において、核酸がコーディングしたｓｉＲＮＡはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １に示すヌクレオチド配列を含むことができる。一部の実施例において、核酸はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ５の１０〜２８位ヌクレオチドを有することができる。一部の実施例において、核酸はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ５を含むことができる。
【００８８】
他の実施例において、核酸はｓｉＲＮＡをコーディングすることができ、当該ｓｉＲＮＡはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ８と少なくとも６０％の同一性（例えば、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％）を有するアンチセンス配列を含むことができる。一部の実施例において、核酸はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ８ヌクレオチド配列を含むｓｉＲＮＡをコーディングする。一部の実施例において、核酸はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １１の３８〜５６位ヌクレオチドを有する配列を含むことができる。一部の実施例において、核酸はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １１を含む。一部の実施例において、核酸はｓｉＲＮＡをコーディングすることができ、当該ｓｉＲＮＡはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ７と少なくとも６０％の同一性（例えば、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％）を有するセンス配列を含むことができる。一部の実施例において、核酸はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ７を含むｓｉＲＮＡをコーディングする。一部の実施例において、核酸はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １２の８〜２６位ヌクレオチドを有する配列を含むことができる。一部の実施例において、核酸はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １２のヌクレオチド配列を含むことができる。
【００８９】
一部の実施例において、核酸はベクターであることができる。前記「ベクター」は、一つの実体の一つの環境から他の環境への転移を許可するか促進する。ベクターはレプリコンであることができ、例えばプラスミド、ファージ、コスミドであることができ、他の核酸断片はレプリコンに挿入されて挿入断片を複製することができる。一部の実施例において、ベクターが適切な制御素子の存在下で複製することができる。概して、用語「ベクター」は、接続された他の核酸分子を搬送できる核酸分子を指す。実例のベクターは、一本鎖、二重鎖又は一部の二重鎖の核酸分子を含み、一つ又は複数の自由末端又は自由末端のない核酸分子（例えば環状）を含み、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡの核酸分子を含む。他の周知のポリヌクレオチド変異体も含む。ベクターの一つのである「プラスミド」は、環状の二重鎖ＤＮＡを指し、他のＤＮＡ断片の挿入を許可する（例えば、通常の分子生物学技術によって挿入する）。他のベクターとしてのウイルスベクターは、ウイルス由来のＤＮＡ又はＲＮＡ配列がベクター中に現れ、例えばレトロウイルス、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、複製欠損アデノウイルス及びアデノ関連ウイルス等のウイルス中へのパッケージングに用いられる。ウイルスベクターは、ウイルスにより配達される宿主細胞のトランスフェクションに用いられるポリヌクレオチドを含むことができる。一部のベクターは侵入した宿主細胞にて自行複製することができる（例えば、細菌複製開始点がある細菌ベクター及びエピソーマル哺乳類動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーマル哺乳類動物ベクター）は宿主細胞に侵入した後、宿主細胞の遺伝子組に統合され、遺伝子組の複製によって複製される。そして、一部のベクターは接続された遺伝子を発現させることができ、「発現ベクター」と呼ばれる。組換ＤＮＡ技術に使用される通常の発現ベクターの形式は大部分がプラスミドである。
【００９０】
組換発現ベクターは、上述したｓｉＲＮＡをコーディングする核酸を含み、宿主細胞における核酸の発現に適切な形式で存在する。例えば、組換発現ベクターは一つ又は複数の発現する宿主細胞に基づいて選択したレギュレータを含むことができ、発現しようとする核酸配列と操作可能に接続される。組換発現ベクターにおいて、「操作可能に接続される」とは、目標ヌクレオチド配列を、例えば体外転写／翻訳体系、又はベクターで宿主細胞に導入した後の宿主細胞内においては発現可能な形態でレギュレータに接続することを指す。
【００９１】
一部の実施例において、ベクターはリニア構造体で、環状プラスミド、統合又は非統合のウイルスベクターであることができる。一部の実施例において、ｓｉＲＮＡ中の一つ又は二つの鎖は発現ベクター上のプロモーターから転写することができる。二つの別途の鎖の発現によって二重鎖ｓｉＲＮＡを発生した状況で、二つの単独の発現ベクターを共に（例えば、トランスフェクション又は感染によって）標的細胞に導入することができる。そして、二重鎖ｓｉＲＮＡ中のそれぞれの鎖は同一の発現プラスミド上に位置するプロモーターから転写されることができる。一部の実施例において、二重鎖ｓｉＲＮＡは、１種類の接続基ポリヌクレオチド配列が参与される逆方向反復ヌクレオチドの発現によって、当該二重鎖ｓｉＲＮＡは茎ループ構造を有することになる。
【００９２】
一部の実施例において、ｓｉＲＮＡ発現ベクターはＤＮＡプラスミド又はウイルスベクターであることができる。一部の実施例において、ｓｉＲＮＡを配達するベクターは、充分な標的細胞又は組織にてｓｉＲＮＡを発現できる調節要素（プロモーター、エンハンサー等）を含むことができる。調節要素は、構成性又は調整型／誘導型発現を提供することに選択される。ｓｉＲＮＡ発現は、例えば、循環グルコースレベル又はホルモンなどの一部の生理レギュロンに敏感である誘導調節配列を使用して調整される。前記誘導発現系は、細胞と哺乳類動物中のｓｉＲＮＡ発現の調整に適合し、例えばエクジソン、エストロゲン、黄体ホルモン、テトラサイクリン、二量化化学誘導物及びイソプロピル−ベタ−Ｄ１−チオガラクトピラノシード（ＩＰＴＧ）によって調整を行なう。当業者はｓｉＲＮＡ導入遺伝子の応用に応じて、適切な調整／開始配列を選択することができる。
【００９３】
発現ベクターは真核細胞と互換性を有し、例えば哺乳類動物細胞と互換して組換構築体を生成して前記ｓｉＲＮＡを発現するベクターである。真核細胞発現ベクターは本分野で周知であって且つ各種の商業源から購入することができ、例えば必要な核酸断片を挿入する制限部位を含むベクターがある。一部の実施例において、ｓｉＲＮＡ発現ベクターはプラスミドｐＧＣｓｉ−Ｈ１／Ｎｅｏを含むことができ、制限部位ＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩとの間に入れ替えられたヌクレオチド配列を有する。一部の実施例において、入れ替えられたヌクレオチド配列は上述したいずれかのｓｉＲＮＡをコーディングすることができる。
【００９４】
ｓｉＲＮＡ発現ベクターの配達は全身に達することができ、例えば静脈内、筋肉内、関節又は関節腔を介して適用できる。被験者の体内から取り出した細胞の標的に適用した後に再び被験者の体内に導入し、又は例えば被験者の体内の標的細胞等の他のいずれかの標的細胞に導入可能な手段にて導入する。一部の実施例において、ｓｉＲＮＡ発現ベクターは、例えばカチオン脂質ベクター（例えば、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）又は非カチオン脂質ベクター（例えばＴｒａｎｓｉｔ−ＴＫＯ．ＴＭ．）等の一部の配達ベクターと一緒に複合体を形成して標的細胞をトランスフェクションすることができる。本発明は、一週間又はさらに長い時間内に複数回のリポソームトランスフェクションを経て、ｓｉＲＮＡが標的ＲＮＡの異なる領域のノックダウンを仲介することになることも構想する。ベクターが宿主細胞への導入に成功したかは各種の周知の方法で監視することができる。例えば、瞬間トランスフェクションすると、報告物で、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などの蛍光標記のような受態によって信号化することができる。安定した離間細胞トランスフェクションは、トランスフェクション細胞へ、特定の環境因子（例えば、抗生物質及び薬物）に対する抵抗性、例えばハイグロマイシンＢ抵抗を提供する標記の使用によって確保できる。
【００９５】
本願で説明した方法や組成物に使用されるウイルスベクター系は、（ａ）アデノウイルスベクター、（ｂ）レトロウイルスベクター、例えば慢性ウイルスベクター、モロニーマウス白血病ウイルス等、（ｃ）アデノ随伴ウイルスベクター、（ｄ）単純疱疹ウイルスベクター、（ｅ）ＳＶ  ４０  ベクター、（ｆ）ポリオーマウイルスベクター、（ｇ）パピローマウイルスベクター、（ｈ）小ＲＮＡウイルスベクター、（ｉ）ポックスウイルスベクター、例えばワクシニアウイルスベクターなどのオルトウイルス、カナリアポックスウイルスなどの鶏痘ウイルス、又は鶏ＦＰＶウイルス、（ｊ）ヘルパー依存のアデノウイルス又は腸管無しアデノウイルスを含むが、これらに限定されることはない。複製欠損型ウイルスが有利であることもある。異なるベクターは標的細胞の遺伝子組に統合されるか統合されない。必要の場合、構築体は、トランスフェクション用としてウイルス配列を含むことができる。そして、構築体はエピソーム型複製を発生可能なベクター（例えば、ＥＰＶとＥＢＶベクター）に統合されることができる。ｓｉＲＮＡの組換発現に用いられる構築体はさらに、例えばプロモーター、エンハンサー等の調節素子を含んで、ｓｉＲＮＡによる標的細胞中の発現を確保する。
【００９６】
本開示はｓｉＲＮＡをコーディングする核酸を含む宿主細胞に係わっている。一部の実施例において、宿主細胞は、例えば前記ベクター等の一つ又は複数の核酸を瞬間的又は非瞬間的にトランスフェクションすることができる。一部の実施例において、細胞は被験者の体内に位置する時にトランスフェクションされる。一部の実施例において、トランスフェクションされた細胞は、例えば細胞系等の被験者から取る。本分野で周知の各種の組織培養の細胞系は、Ｃ８１６１、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ、ＭＯＬＴ、ｍＩＭＣＤ−３、ＮＨＤＦ、ＨｅＬａ−Ｓ３、Ｈｕｈ１、Ｈｕｈ４、Ｈｕｈ７、ＨＵＶＥＣ、ＨＡＳＭＣ、ＨＥＫｎ、ＨＥＫａ、ＭｉａＰａＣｅｌｌ、Ｐａｎｃ１、ＰＣ−３、ＴＦ１、ＣＴＬＬ−２、Ｃ１Ｒ、Ｒａｔ６、ＣＶ１、ＲＰＴＥ、Ａ１０、Ｔ２４、Ｊ８２、Ａ３７５、ＡＲＨ−７７、Ｃａｌｕｌ、ＳＷ４８０、ＳＷ６２０、ＳＫＯＶ３、ＳＫ−ＵＴ、ＣａＣｏ２、Ｐ３８８Ｄ１、ＳＥＭ−Ｋ２、ＷＥＨＩ−２３１、ＨＢ５６、ＴＩＢ５５、Ｊｕｒｋａｔ、Ｊ４５．０１、ＬＲＭＢ、Ｂｃｌ−１、ＢＣ−３、ＩＣ２１、ＤＬＤ２、Ｒａｗ２６４．７、ＮＲＫ、ＮＲＫ−５２Ｅ、ＭＲＣＳ、ＭＥＦ、Ｈｅｐ  Ｇ２、ＨｅＬａ  Ｂ、ＨｅＬａ  Ｔ４、ＣＯＳ、ＣＯＳ−１、ＣＯＳ−６、ＣＯＳ−Ｍ６Ａ、ＢＳ−Ｃ−１猿の腎臓上皮細胞、ＢＡＬＢ／３  Ｔ３マウス胚線維芽細胞、３Ｔ３  Ｓｗｉｓｓ、３Ｔ３−Ｌ１、１３２−ｄ５ヒト胎児線維芽細胞１０．１マウス線維芽細胞、２９３Ｔ、３Ｔ３、７２１、９Ｌ、Ａ２７８０、Ａ２７８０ＡＤＲ、Ａ２７８０ｃｉｓ、Ａ１７２、Ａ２０、Ａ２５３、Ａ４３１、Ａ−５４９、ＡＬＣ、Ｂ１６、Ｂ３５、ＢＣＰ−１細胞、ＢＥＡＳ−２Ｂ、ｂＥｎｄ．３、ＢＨＫ−２１、ＢＲ  ２９３、ＢｘＰＣ３、Ｃ３Ｈ−１０Ｔ１／２、Ｃ６／３６、Ｃａｌ−２７、ＣＨＯ、ＣＨＯ−７、ＣＨＯ−ＩＲ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−Ｋ２、ＣＨＯ−Ｔ、ＣＨＯ  Ｄｈｆｒ−／−、ＣＯＲ−Ｌ２３、ＣＯＲ−Ｌ２３／ＣＰＲ、ＣＯＲ−Ｌ２３／５０１０、ＣＯＲ−Ｌ２３／Ｒ２３、ＣＯＳ−７、ＣＯＶ−４３４、ＣＭＬ  Ｔ１、ＣＭＴ、ＣＴ２６、Ｄ１７、ＤＨ８２、ＤＵ１４５、ＤｕＣａＰ、ＥＬ４、ＥＭ２、ＥＭ３、ＥＭＴ６／ＡＲ１、ＥＭＴ６／ＡＲ１０．０、ＦＭ３、Ｈ１２９９、Ｈ６９、ＨＢ５４、ＨＢ５５、ＨＣＡ２、ＨＥＫ−２９３、ＨｅＬａ、Ｈｅｐａ１ｃ１ｃ７、ＨＬ−６０、ＨＭＥＣ、ＨＴ−２９、Ｊｕｒｋａｔ、ＪＹ細胞、Ｋ５６２細胞、Ｋｕ８１２、ＫＣＬ２２、ＫＧ１、ＫＹＯ１、ＬＮＣａｐ、Ｍａ−Ｍｅｌ  １−４８、ＭＣ−３８、ＭＣＦ−７、ＭＣＦ−１０Ａ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５、ＭＤＣＫ  ＩＩ、ＭＤＣＫ  ＩＩ、ＭＯＲ／０．２Ｒ、ＭＯＮＯ−ＭＡＣ  ６、ＭＴＤ−１Ａ、ＭｙＥｎｄ、ＮＣＩ−Ｈ６９／ＣＰＲ、ＮＣＩ−Ｈ６９／ＬＸ１０、ＮＣＩ−Ｈ６９／ＬＸ２０、ＮＣＩ−Ｈ６９／ＬＸ４、ＮＩＨ−３Ｔ３、ＮＡＬＭ−１、ＮＷ−１４５、ＯＰＣＮ／ＯＰＣＴ細胞系、Ｐｅｅｒ、ＰＮＴ−１Ａ／ＰＮＴ  ２、ＲｅｎＣａ、ＲＩＮ−５Ｆ、ＲＭＡ／ＲＭＡＳ、Ｓａｏｓ−２細胞、Ｓｆ−９、ＳｋＢｒ３、Ｔ２、Ｔ−４７Ｄ、Ｔ８４、ＴＨＰ１、Ｕ３７３、Ｕ８７、Ｕ９３７、ＶＣａＰ、Ｖｅｒｏ細胞、ＷＭ３９、���Ｔ−４９、Ｘ６３、ＹＡＣ−１、ＹＡＲ及びその導入遺伝子変異体を含む。細胞系は各種の商業源から取得できる（例えばＡＴＣＣ）。一部の実施例において、前記一つ又は複数のベクターのトランスフェクションが行われた細胞は、新しい一つ又は複数のベクター由来配列を含む細胞系の構築に利用されることができる。
【００９７】
Ｖ  薬物組成物
本開示はさらに、１種類又は複種類の上述したｓｉＲＮＡｓを含む薬物組成物に係わっている。一部の実施例において、薬物組成物はｓｉＲＮＡと選択できる１種類の製薬的に許容されるベクター、希釈剤又は賦形剤を含むことができる。一部の実施例において、ｓｉＲＮＡはＡＤＡＭＴＳ−５の発現を抑制できる。他の実施例において、ｓｉＲＮＡはＡＤＡＭ１７の発現を抑制できる。特定の実施例において、前記薬物組成物は一つ又は複数の第１核酸を標的とするｓｉＲＮＡと、一つ又は複数の第２核酸を標的とするｓｉＲＮＡとを含む。例えば、前記薬物組成物はＡＤＡＭＴＳ−５の発現を抑制するｓｉＲＮＡと、ＡＤＡＭ１７の発現を抑制するｓｉＲＮＡとを含むことができる。一部の実施例において、薬物組成物はＡＤＡＭＴＳ−５又はＡＤＡＭ１７の発現を抑制するｓｉＲＮＡと、１種類の他の遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡとを含むことができる。他の実施例において、化学組成物は二つ又は複数の同一の標的核酸の異なる領域を標的とするｓｉＲＮＡｓを含むことができる。例えば、薬物組成物は二つ又は複数のＡＤＡＭＴＳ−５  ｍＲＮＡの異なる領域を標的とするｓｉＲＮＡｓを含むことができる。一部の実施例において、薬物組成物は二つ又は複数のＡＤＡＭ１７  ｍＲＮＡの異なる領域を標的とするｓｉＲＮＡを含むことができる。２種類又は複種類の異なるｓｉＲＮＡｓを組み合わせて使用する時、ｓｉＲＮＡｓのモルが同じであることができる。２種類又は複種を組み合せしたｓｉＲＮＡｓを同時に使用することができれば、順序に使用することもできる。
【００９８】
前記薬物組成物は、ＡＤＡＭＴＳ−５及び／又はＡＤＡＭ１７発現又は活性に関連する疾患又は病理過程、例えば炎症に関連する疾患や変形性関節症、リウマチ性関節炎、慢性感染性関節炎、脊椎炎、乾癬関節炎、痛風を含む関節炎等の予防又は治療に用いられる。一部の実施例において、疾患は関節炎であることができる。一部の実施例において、疾患は変形性関節症であることができる。一部の実施例において、疾患はリウマチ性関節炎であることができる。前記薬物組成物は、例えば関節線維化、軟骨浸食、軟骨コラーゲン損失、関節軟骨表面ダメージ、滑膜炎、関節包炎、関節痛、関節靭帯肥厚、メニスカス骨化、軟骨細胞配列混乱を含むＡＤＡＭＴＳ−５又はＡＤＡＭ１７に関連する疾患の状況又は症状の予防又は治療に利用されることができる。前記薬物組成物は、ＴＮＦ−α、ＣＯＸ−２又はＩＬ−１βに関連する関節炎にかかった被験者の治療に利用されることができる。実例の薬物組成物の応用はさらに、例えばＥＣＭ分解の抑制、炎症性因子の発現の調整、免疫細胞の移転、炎症性シグナル伝達、軟骨や滑膜や関節や骨の保護を含む。前記薬物組成物はさらに、例えば骨痛み又は関節痛等の痛みの治療又は緩和に利用されることができる。複数の実施例はさらに、薬物組成物を利用して前記疾患、状況又は症状を予防又は治療することを含む。
【００９９】
「製薬的に許容されるベクター、希釈剤、賦形剤」は、任意標準の薬学ベクター、希釈剤、緩衝液及び賦形剤を指し、例えばリン酸緩衝液（ＰＢＳ）、５％グルコース溶液、オイル／水又は水／オイルエマルジョン、複種類の湿潤剤及び／又はアジュバントを指す。適切な薬学ベクター、希釈剤又は賦形剤及び製剤は本分野で周知のものであって、薬学ベクター、希釈剤又は賦形剤は活性剤の投薬モードに応じて合理的に選択することができる。
【０１００】
前記薬物組成物に、本分野で周知の方法と開示された方法を適用することができる。例えば、局部又は全身への投薬及び治療位置によって投薬方式を決定することができる。投薬は局部（眼部、粘膜、膣、直腸配達を含む）、肺（例えば、気体粉末又はエアロゾルの吸い込み又は注入、噴霧器、気管内又は鼻内によるものを含む）、上皮、皮膚、背骨、経口又は非経口であることができる。非経口投薬は、静脈、動脈、皮下、腹腔又は筋肉内注射又は灌流と、例えば植入装置による皮下と、例えば髄腔内又は脳室投薬の脳内投薬と、又は関節又は関節内注射を含む。一部の実施例において、ｓｉＲＮＡは、例えば関節（例えば関節腔）のような特定の組織を標的とする方式で配達される。例えば、薬物組成物は関節又は関節内注射によって投薬することができる。一部の実施例において、薬物組成物は治療しようとする被験者の関節腔に注射することができる。
【０１０１】
薬物組成物は例えばリポソーム、ポリマー、ポリペプチド、ナノ材料、キトサン、ヒアルロン酸等の複種類の配達ベクターによって細胞に配達される。一部の実施例において、薬物組成物はカチオンリポソーム、キトサンナノ粒子、ペプチド、ポリマーから選ばれたベクターによって細胞に配達される。
【０１０２】
ベクター化合物に比べ、「製薬的に許容されるベクター」又は「賦形剤」は、被験者に一つ又は複数の核酸を配達する製薬的に許容される溶剤、沈殿防止剤、又は任意の他の薬物不活性の媒介物を指す。当該賦形剤は液体又は固体であることができ、且つ核酸と特定の薬物組成物の他の成分とを組み合せする時、所望の容積、粘度等を提供するように、投薬方式に応じて賦形剤を選択することができる。典型的な薬物ベクターは、バインダー（例えば、アルファ化コーンスターチ、ポリビニルピロリドン又はヒドロキシプロピルメチルセルロース等）と、充填剤（例えば、乳糖と他の糖、微結晶セルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシウム、エチルセルロース、ポリアクリル酸エステル又はリン酸水素カルシウム等）と、潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ、コロイド状シリカ、ステアリン酸、ステアリン酸金属塩、水素化植物油、コーンスターチ、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム等）と、崩壊剤（例えば、澱粉、澱粉グリコール酸ナトリウム等）と、湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム等）を含む。製薬的に許容されるベクターは、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、乳糖、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク粉末、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン等を含む。
【０１０３】
前記薬物組成物は、例えば錠剤、カプセル、ゲルカプセル、粉末又は粒子のいずれかの剤形に調製されてもよい。前記薬物組成物は溶液、懸濁液、乳剤、又は混合溶液に調製されてもよい。
【０１０４】
一部の実施例において、薬物組成物を溶液状に調製することもできる。例えばｓｉＲＮＡが、水又は塩水等の非緩衝溶液に位置することができる。一部の実施例において、ｓｉＲＮＡは、例えば酢酸、クエン酸、プロラミン、炭酸塩、リン酸塩又はその任意の組み合せ緩衝液等の適切な緩衝液に位置することができる。一部の実施例において、緩衝液はリン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）であることができる。ｓｉＲＮＡを含有する緩衝液のｐＨと浸透圧は被験者への投薬に適合するものに調整することができる。
【０１０５】
一部の実施例において、薬物組成物は水性、非水性又は混合媒体中の懸濁液に調製されることができる。水性懸濁液はさらに、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール及び／又はデキストラン等のを含むことができる。懸濁液はさらに安定剤を含むことができる。
【０１０６】
一部の実施例において、薬物組成物は、乳剤状に調製されることもできる。典型的な乳剤は、１種類の液体が液滴形態（通常、直径が０．１  μｍを超える）で他の１種類に分散された非均一系である。分散相（水相、オイル相中の溶液、又はその自体を独立相とする）と活性薬物以外、乳剤は他の成分を更に含むこともできる。ミクロ乳剤も開示した実例に含まれる。
【０１０７】
一部の実施例において、薬物組成物がリポソームに調製されることもできる。前記「リポソーム」とは、一つ又は複数の球形二分子層に配列された両性リポソームから構成される小嚢を指す。リポソームは、単層又は多層小嚢で、親油性物質からなる膜と配達しようとする組成物を含有する水性内部とを有する。カチオンリポソームは、正に帯電したリポソームで、例えばＤＮＡ分子のような負に帯電した核酸分子と相互作用して安定したコンプレックスを形成する。ｐＨ敏感又は負に帯電したリポソームはＤＮＡと複合するのではなく、ＤＮＡを捕捉する。カチオンと非カチオンリポソームはいずれも前記核酸分子の細胞内への配達に利用される。
【０１０８】
リポソームはさらに「空間的に安定する」リポソームを含み、１種類又は複種類の特別な脂質を含むことができる。このような特別な脂質のないリポソームに比べ、特別な脂質をトーピングしたリポソームは循環周期が延長される。空間的に安定するリポソームの実例としては、リポソームの小嚢が形成されたリポソーム部分は、１種類又は複種類の糖脂質を含み、又は１種類又は複種類の親水性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ））から派生されたものを含む。
【０１０９】
前記薬物組成物は、界面活性剤を含むことができる。一部の実施例において、薬物組成物は、複種類の浸透促進剤を利用することで、核酸の配達効率を向上させる。浸透促進剤は、非親油性薬物が拡散して細胞膜を通過するに協力する以外、親油性薬物の透過性を促進する。典型的な浸透促進剤は、界面活性剤、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート剤及び非キレート性非界面活性剤を含む。
【０１１０】
VI  使用方法
開示した一態様において調整方法を提供し、例えばＡＤＡＭＴＳ−５又はＡＤＡＭ１７の体外発現を、例えば溶液又は無細胞系（例えば、再構築系又は細胞溶解物）において、又は、体外培養した細胞（例えば、ＡＤＡＭＴＳ−５又はＡＤＡＭ１７を発現した細胞）又は被験者の体内細胞のような細胞において抑制する。一部の実施例において、前記方法は、細胞を有効量のｓｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡをコーディングする核酸、又はｓｉＲＮＡを含む薬物組成物と接触させて、細胞中のＡＤＡＭＴＳ−５又はＡＤＡＭ１７の発現を抑制することを含む。開示した他の態様において調整方法を提供し、例えば炎症性因子の発現を、例えば溶液又は無細胞系（例えば、再構築系又は細胞溶解物）のような試験管内において、又は体外培養した細胞（例えば、発現ＡＤＡＭＴＳ−５又はＡＤＡＭ１７の細胞）又は被験者の体内細胞において抑制する方法を提供する。一部の実施例において、前記方法は、細胞を有効量のｓｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡをコーディングする核酸、又はｓｉＲＮＡを含む薬物組成物と接触させて、細胞中の炎症性因子の発現を抑制することを含む。一部の実施例において、炎症性因子は、ＴＮＦ、ＣＯＸ−２、ＩＬ−１βから選ばれるものであることができる。
【０１１１】
一部の実施例において、細胞は、哺乳類動物細胞（例えば、ラット、マウス、人類細胞）、滑膜細胞又は組換細胞であることができる。一部の実施例において、細胞は人類細胞であることができる。被験者は、例えばラット、マウス、又はヒト等の哺乳類動物であることができる。一部の実施例において、被験者はヒトであることができる。一部の実施例において、被験者は、例えば炎症に関連する病気のようなＡＤＡＭＴＳ−５又はＡＤＡＭ１７に関連する病気にかかっているかこのような病気にかかるリスクがある。典型的な炎症に関連する病気は、変形性関節症、リウマチ性関節炎、慢性感染性関節炎、脊椎炎、乾癬関節炎、痛風等を含む関節炎を含む。一部の実施例において、疾患は関節炎であることができる。一部の実施例において、疾患は変形性関節症であることができる。一部の実施例において、疾患はリウマチ性関節炎であることができる。
【０１１２】
他の開示した態様において調整方法を提供し、例えば被験者体内におけるＡＤＡＭＴＳ−５又はＡＤＡＭ１７遺伝子の発現を抑制する。一部の実施例において、前記方法は、被験者に治療有効量のｓｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡをコーディングする核酸、又はｓｉＲＮＡを含む薬物組成物を適用して、ＡＤＡＭＴＳ−５及び／又はＡＤＡＭ１７遺伝子の発現を抑制することを含む。一部の実施例において、前記方法は、治療しようとする被験者に治療有効量の、２種類又は複種類の異なるｓｉＲＮＡ分子を含む組成物を適用することをさらに含むことができ、その中の１種類はＡＤＡＭＴＳ−５遺伝子を標的とし、他の１種類はＡＤＡＭ１７遺伝子を標的とする。被験者は、例えばラット、マウス、又はヒト等の哺乳類動物であることができる。一部の実施例において、被験者はヒトであることができる。一部の実施例において、被験者は、例えば炎症に関連する病気等のＡＤＡＭＴＳ−５又はＡＤＡＭ１７に関連する病気にかかっているか、又はこのような病気にかかるリスクがある。典型的な炎症に関連する病気は、、例えば変形性関節症、リウマチ性関節炎、慢性感染性関節炎、脊椎炎、乾癬関節炎、痛風を含む関節炎を含む。一部の実施例において、疾患は関節炎であることができる。一部の実施例において、疾患は変形性関節症であることができる。一部の実施例において、疾患はリウマチ性関節炎であることができる。
【０１１３】
開示した他の態様において少なくとも１種類のｓｉＲＮＡ（例えば、ＡＤＡＭＴＳ−５−ｓｉＲＮＡ、ＡＤＡＭ１７−ｓｉＲＮＡ又はその組み合せ）、ｓｉＲＮＡをコーディングする核酸、又はｓｉＲＮＡを含む薬物組成物の用途を提供し、例えば変形性関節症、リウマチ性関節炎、慢性感染性関節炎、脊椎炎、乾癬関節炎、痛風を含む関節炎のような炎症に関連する疾患の予防又は治療に利用される。一部の実施例において、疾患は関節炎であることができる。一部の実施例において、疾患は変形性関節症であることができる。一部の実施例において、疾患はリウマチ性関節炎であることができる。ｓｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡをコーディングする核酸、又はｓｉＲＮＡを含む薬物組成物は、例えば関節線維化、軟骨浸食、軟骨コラーゲン損失、関節軟骨表面ダメージ、滑膜炎、関節包炎、関節痛、関節靭帯肥厚、メニスカス骨化、軟骨細胞配列混乱等のＡＤＡＭＴＳ−５又はＡＤＡＭ１７に関連する疾患の状況又は症状の予防又は治療に利用されることができる。ｓｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡをコーディングする核酸、又はｓｉＲＮＡを含む薬物組成物は、ＴＮＦ−α、ＣＯＸ−２又はＩＬ−１βに関連する関節炎にかかってる被験者の治療に利用されることができる。典型的なｓｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡをコーディングする核酸、又はｓｉＲＮＡを含む薬物組成物の応用は、例えばＥＣＭ分解の抑制、炎症性因子の発現の調整、免疫細胞の移転、炎症性シグナルの伝達、及び軟骨、滑膜、関節、骨の保護をさらに含む。前記ｓｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡをコーディングする核酸、又はｓｉＲＮＡを含む薬物組成物は、例えば骨痛み又は関節痛の痛みの治療又は緩和に利用されることもできる。複数の実施例は、ｓｉＲＮＡの前記疾患、状況又は症状を予防又は治療する薬物の調製における応用をさらに含む。一部の実施例において、前記用途又は方法は、前記疾患、状況又は症状のある又は病気にかかるリスクのある被験者に治療有効量のｓｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡをコーディングする核酸、又はｓｉＲＮＡを含む薬物組成物を適用することを含むことができる。
【０１１４】
前記薬物組成物は、本分野で周知の方法と開示した方法で適用されることができる。例えば、局部又は全身への投薬及び治療位置に基づいて投薬方式を決定する。投薬は局部（眼部、粘膜、膣、直腸配達を含む）、肺（例えば、気体粉末又はエアロゾルの吸い込み又は注入を含む。噴霧器、気管内又は鼻内によるものを含む）、上皮、皮膚、背骨、経口又は非経口であることができる。非経口投薬は、静脈、動脈、皮下、腹腔又は筋肉内注射又は灌流と、例えば植入装置による皮下と、例えば髄腔内又は脳室投薬のような脳内投薬と、又は関節又は関節内注射とを含む。一部の実施例において、ｓｉＲＮＡは特定の組織を標的とする方式で配達されることがで、例えば関節（例えば、関節内）注射することができる。一部の実施例において、薬物組成物は、例えば関節（例えば関節腔）等の特定の組織を標的として配達されることができる。例えば、薬物組成物は関節又は関節内注射によって適用されることができる。一部の実施例において、薬物組成物は治療しようとする被験者の関節腔に注射されることができる。
【０１１５】
複数の実施例において、ｓｉＲＮＡは、ＡＤＡＭＴＳ−５又はＡＤＡＭ１７の発現を抑制するに充分な一回量で適用される。例えば、ｓｉＲＮＡの適切な一回量は約２０〜１０００ｎｍｏｌ／受容体体重ｋｇである。一部の実施例において、１０００ｇあたりの一回量範囲は約４０〜５００ｎｍｏｌである。一部の実施例において、薬物組成物は、体重１０００ｇあたりに約４０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０又は５００ｎｍｏｌの一回量で適用される。薬物組成物の投薬は、一回量又は複数回の投薬であることができる。例えば、毎日に１回又は複数回、又は例えば毎週、２週間、毎月又は毎年のようなもっと長い間隔単位で投薬することができる。特定の実施例において、薬物組成物は、毎週に２回投薬することができる。前記薬物組成物は、短期間内で一定の間隔、例えば毎日又は毎週に投薬して数週間又はそれより短い時間持続することができる。一部の例において、薬物組成物を長期間に渡って断続的に投薬することもできる。
【０１１６】
一部の実施例において、前記ｓｉＲＮＡｓを、例えば他のｓｉＲＮＡｓ又は抗炎症剤等の前記ｓｉＲＮＡｓの効能を向上させることのできる化合物等の他の薬学活性化合物と組み合せて使用することができる。一部の実施例において、ｓｉＲＮＡを、例えばコルチコステロイド、ヒアルロン酸又はその塩、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤｓ、例えばイブプロフェン、パラセタモール）、疾患修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤｓ、例えばメトトレキサート）、疾患修飾性変形性関節症薬物（ＤＭＯＡＤｓ）、軟骨保護剤（例えば、アミノ基グルコース、コンドロイチン硫酸）等の他の薬物と同時又は順序に投薬して治療することができる。
【０１１７】
一部の実施例において、前記ｓｉＲＮＡｓを、１種類又は複種類の炎症性因子、免疫性因子、又は炎症過程を調整できる試薬と組み合せて使用することができる（例えば、小分子、モノクローナル抗体、ＲＮＡｉ試薬等）。典型的な試薬は、例えばＣＯＸ−２阻害剤（例えばセレコキシブ）、ＴＮＦ−αアンタゴニスト（例えばエタネルセプト、アダリムマブ、インフリキシマブ）、ＪＡＫ３  阻害剤、インターロイキン阻害剤を含む。一部の実施例において、前記ｓｉＲＮＡｓは、例えば痛み止め薬又は鎮痛剤（例えばジピロン）のような１種類又は複種類の補助治療剤と組み合わせて使用することができ、又は他の遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡと組み合せて使用することもできる。上述した薬物組成物を、例えば手術（例えば軟骨移植等）、免疫抑制、放射線治療、理学療法等の他の治療と組み合せて使用することができる。
【０１１８】
VII  キット
他の部分は、上述したいずれかのｓｉＲＮＡｓ及び／又は方法を使用したキットを含む。一部の実施例において、キットは、１種類又は複種類のｓｉＲＮＡ（ｓ）と、例えば細胞を有効量のｓｉＲＮＡ（ｓ）に接触させることでＡＤＡＭＴＳ−５又はＡＤＡＭ１７の発現を抑制することを説明したり又は被験者に治療有効量のｓｉＲＮＡ（ｓ）を適用してＡＤＡＭＴＳ−５又はＡＤＡＭ１７に関連する疾患を治療又は予防することを説明したその使用説明を含む。一部の実施例において、読み取り可能な媒体に記録されていると説明した。一部の実施例において、炎症が発生した箇所に前記ｓｉＲＮＡｓ、ｓｉＲＮＡをコーディングする核酸、又は薬物組成物を適用可能であると説明した。
【０１１９】
キットはさらに、細胞をｓｉＲＮＡに接触させる方法又は被験者にｓｉＲＮＡを適用する方法（例えば、関節又は関節内注射に用いられる装置等の注射機器）、又はＡＤＡＭＴＳ−５又はＡＤＡＭ１７の抑制を検出する方法（例えば、ＡＤＡＭＴＳ−５又はＡＤＡＭ１７  ｍＲＮＡの抑制を検出する方法）を含むことができる。前記ＡＤＡＭＴＳ−５又はＡＤＡＭ１７の抑制を検出する方法は、被験者から例えば血液又は関節滑液サンプルのようなサンプルを取得する方法を含むことができる。一部の実施例において、関節滑液サンプルは、例えば手、足、手首、手肘又は足首から取得する。キットは、被験者にｓｉＲＮＡ（ｓ）を適用する方法又は治療又は予防有効量を確定する方法を更に含むこともできる。
【０１２０】
特別に定義されていない限り、ここで使用する全ての科学技術用語は当業者が通称に理解している意味と同じ意味を持つ。上述した方法又は材料に類似又は同一の方法又は材料を本発明に応用することが可能であるが、以下でも適切な方法や材料を提供する。全ての出版物、特許出願、特許、他の記載された引用文献を参照により完全に組み込む。衝突する場合、定義を含む本発明の説明を基準とする。そして、材料、方法、例は説明用で、本発明を限定するものではない。
【実施例】
【０１２１】
特別な説明がないと、実施例中の材料と試薬はいずれも商業ルートで購入することができる。実施例で使用する材料と試薬は以下のようである：変形性関節症ｈＦＬＳ細胞（広東省中国医学病院により提供）、２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ製品、製品リスト番号：ＣＲＬ−３２１６）、ＭＣＦ−７細胞（ＡＴＣＣ製品、製品リスト番号：ＨＴＢ−２２）、ＡｓｓａｙＭａｘＴＭ  Ｈｕｍａｎ  ＩＬ−１β  ＥＬＩＳＡ  キット（ＡｓｓａｙＰｒｏ製品、製品リスト番号：ＥＩ２２００−１）、ｐＧＣｓｉ−Ｈ１／Ｎｅｏ発現ベクター（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ、文献「季国忠、張発明、黄曙等、Ｓｍａｄ４／ＤＰＣ４遺伝子小ヘアピンＲＮＡプラスミド発現ベクターの構築及び鑑定、医学研究生学報、２００６、１９(１１）：９７３−９７７」にも開示された）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）２０００キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、雄性ＳＤラット（２２０±２０ｇ）（広東省医学実験動物センターから入手した）。
【０１２２】
特別な説明がないと、以下の実施例中のｓｉＲＮＡｓはいずれも二重鎖ｓｉＲＮＡ分子であって、ラット注射液の溶剤はいずれもＰＢＳであって、ｈＦＬＳ細胞は変形性関節症ｈＦＬＳ細胞である。
【０１２３】
実施例１          ＡＤＡＭＴＳ−５の発現を抑制するｓｉＲＮＡｓの選別
【０１２４】
ｓｉＲＮＡ設計
生物情報学技術、例えばＢＬＡＳＴ（登録商標）を利用して、ＡＤＡＭＴＳ−５を標的とするｓｉＲＮＡｓを設計した。ヒトソースＡＤＡＭＴＳ−５のｍＲＮＡ配列（登録番号：ＮＭ_００７０３８．３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １９１）、ラットソースＡＤＡＭＴＳ−５の  ｍＲＮＡ配列（登録番号：ＮＭ_１９８７６１．１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １９２）、マウスソースＡＤＡＭＴＳ−５の  ｍＲＮＡ配列（登録番号：Ｎｏ．  ＮＭ_０１１７８２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １９３）を使用する。選択したいずれのｓｉＲＮＡが標的ＡＤＡＭＴＳ−５に対して特異性を有することを確保するため、即ち、選択した配列がターゲットの遺伝子のみを標的とし、他の遺伝子を標的とすることがないように、ＢＬＡＳＴ（登録商標）で配列のホモロジー解析を行って、潜在的な標的ｍＲＮＡと一部配列ホモロジーを有する多くの遺伝子中の配列差異が最も大きい配列のみを選択する。選別した８個のＡＤＡＭＴＳ−５の発現を抑制できるｓｉＲＮＡｓは、ｓｉＲＮＡ−ＲＢ−０１、ｓｉＲＮＡ−ＲＢ−０２、ｓｉＲＮＡ−ＲＢ−０３、ｓｉＲＮＡ−ＲＢ−０４、ｓｉＲＮＡ−ＲＢ−０５、ｓｉＲＮＡ−ＲＢ−０６、ｓｉＲＮＡ−ＲＢ−０７、ｓｉＲＮＡ−ＲＢ−０８である。８個の配列の全てが同時にヒト、ラット、マウスの三つの物の中のＡＤＡＭＴＳ−５を標的とすることができる。
【０１２５】
ｓｉＲＮＡ合成
５'−Ｏ−（４、４'−ジメトキシトリチル）−２'−Ｏ−t−ブチルジメチルシリル−３'−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ、Ｎ−ジイソプロピル）ＲＮＡ、２'−デオキシ−ＤＮＡフォスフォラミダイト、２'−Ｏ−メチルフォスフォラミダイト、６−Ｎ−ベンゾイルアデノシンのモノマー（Ａ−Ｂz）、４−Ｎ−アセチルシチジン（Ｃ−Ａｃ）、２−Ｎ−イソブチリル−グアノシン（Ｇ−ｉＢｕ）、ウリジン（Ｕ）はＰｒｏｌｉｇｏから購入した。２’−デオキシ−２’−フルオロフォスフォラミダイト、５−メチル−２’−デオキシシチジン、Ｃｙ５蛍光修飾のフォスフォラミダイトはＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒから購入した。２’−Ｏ−ＴＢＤＭＳ−イノシン、コレステロールフォスフォラミダイト、ベンゾジチオール−３−オン−１,１−二酸化物（ＣＡＳ番号：６６３０４−０１−６）（Ｂｅａｕｃａｇｅ試薬）、チオール基修飾のＣ６  Ｓ−Ｓ及びＣＰＧ固体支持体はＣｈｅｍｇｅｎｅｓから購入した。環状ペプチドシクロ[Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＰＥＧ−ＭＡＬ）]（ｃＲＧＤ）はＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｃから購入した。ロックド核酸、開環核酸及びガラクトース修飾のフォスフォラミダイトは、中国科学院広州生物医薬と健康研究院により提供した。他の溶剤又は試薬はＡｌａｄｄｉｎ  Ｒｅａｇｅｎｔｓから購入した。
【０１２６】
全ての合成はＡＢＩ  ３９４  ＤＮＡシンセサイザーで行われ、基準プロセスと延長した２〜１０ｍｉｎのカップリング工程を使用する。それぞれのカップリング循環は、１０〜４０倍のフォスフォラミダイトと１５０〜３００倍の５−エチルチオ−１Ｈ−テトラゾールを使用する。合成規模は１μｍｏｌである。ｔｒｉｔｙによりモニタリングしたカップリング平均収量は９５〜９８％であった。ＣＰＧ結合したオリゴヌクレオチドを合成カラムから５ｍｌガラススクリューキャップボトルに転移した。２〜３ｍｌエタノールアミンを添加し、５５℃で１２〜１６時間加熱する。−２０℃まで冷却した後、ＣＰＧビーズからエタノールアミンを除去し、５０：５０のアルコール：水でＣＰＧビーズを洗浄した。洗浄して得たオリゴヌクレオチドを含有する上清液を複数回乾燥した。２’−Ｏ−ＴＢＤＭＳ保護基を除去するため、２００μｌ〜１ｍｌの１Ｍ  ＴＢＡＦ／ＴＨＦを投入して、室温で１２〜２４ｈｒ孵化した。溶液に２〜１０ｍｌの０．１Ｍ  ＴＥＡＢを添加した後、脱塩カラムにロードした。ＵＶ−検出器でオリゴヌクレオチド含有量を測定し、Ｏｌｉｇｏ  ＨＴＣＳ  ＬＣ−ＭＳシステム（Ｎｏｖａｔｉａ）でオリゴヌクレオチドの品質を検出した。ｃＲＧＤペプタイド  ｓｉＲＮＡの共役物調製方法は、文献Ｌｉｕ、ｅｔ  ａｌ．  「Ｔｕｍｏｒ−ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｇｅｎｅ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｖｉａ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｃＲＧＤ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｓｉＲＮＡ、」Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、４２（１８）：１１８０５−１７．  （２０１４）を参照することができる。二重鎖を９５℃で３ｍｉｎアニーリングし、徐々に２０℃まで冷却し、体外に応用されるｓｉＲＮＡを得た。さらに、標準プロセスに従って脱塩や濾過処理を経て、体内に応用することができる。
【０１２７】
細胞トランスフェクション
実験を、標的無し（Ｎｏ  ｔａｒｇｅｔ）対照組（ＮＴＣ）と、陰性対照組（ＮＣ）と、ｓｉＲＮＡ−ＲＢ−０１〜ｓｉＲＮＡ−ＲＢ−０８の８つの実験組との１０組に分けて行った。
【０１２８】
実験組：ｈＦＬＳ細胞を０．２５％のトリプシンで消化し、濃度が１０４個の細胞／ｍｌの細胞懸濁液を調製し、それを１２ウェル培養プレートに接種し、各ウェルは５００μｌである。ｈＦＬＳ細胞が対数増殖期まで成長した（即ち、成長が８０％に達してシートに融合した）時、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）２０００キットの説明書に従って、ｓｉＲＮＡを５０ｎＭの最終濃度でｈＦＬＳ細胞にトランスフェクションした。
【０１２９】
ＮＴＣ組：実験組のｓｉＲＮＡをランダムな非特異ｓｉＲＮＡに入れ替えし、他の工程は変更ない。
センス鎖：５’−ＡＧＡＵＣＧＵＵＡＧＵＵＡＧＧＵＵＧＣｄＴｄＴ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １７５）；
アンチセンス鎖：５’−ＧＣＡＡＣＣＵＡＡＣＵＡＡＣＧＡＵＣＵｄＴｄＴ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １７６）。
【０１３０】
ＮＣ組：ｓｉＲＮＡを添加しなく、その他の工程は実験組と同じである。
【０１３１】
リアルタイム定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）
２４ｈトランスフェクションした後、各組のｈＦＬＳ細胞を収集し、１０００ｒｐｍで５分遠心処理し、上清液を除去した。Ｔｒｉｚｏｌ（登録商標）でＲＮＡを抽出した後、各組のＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。ｃＤＮＡをモデルとし、以下のＦとＲをプライマーとし、β−ａｃｔｉｎを参照遺伝子としてｑＰＣＲを行った。
Ｆ：  ５’−ＣＴＧＣＴＣＣＣＡＧＡＡＡＣＡＡＣＧ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １７７）
Ｒ：  ５’−ＡＴＴＣＡＧＴＧＣＣＡＴＣＧＧＴＣＡ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １７８）
【０１３２】
図１は、８個のｓｉＲＮＡｓがＡＤＡＭＴＳ−５の発現を抑制した結果である。図１に示すように、ｓｉＲＮＡ−ＲＢ−０４のｈＦＬＳ細胞におけるＡＤＡＭＴＳ−５  ｍＲＮＡ発現に対する抑制効果が最も優れていて、９０％の遺伝子発現を抑制した。
【０１３３】
ｓｉＲＮＡ−ＲＢ−０４センス配列とアンチセンス配列は以下のようである：ｓｉＲＮＡ−ＲＢ−０４センス鎖：５'−ＧＧＡＵＵＵＡＵＧＵＧＧＧＣＡＵＣＡＵ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １）；ｓｉＲＮＡ−ＲＢ−０４アンチセンス鎖：５'−ＡＵＧＡＵＧＣＣＣＡＣＡＵＡＡＡＵＣＣ−３'（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２）。
【０１３４】
Ｗｅｓｔｅｒｎブロット
ｓｉＲＮＡ−ＲＢ−０４実験組、ＮＴＣ組、ＮＣ組のｈＦＬＳ細胞を取ってＷｅｓｔｅｒｎブロットを行った。細胞培養液を除去し、ＰＢＳで細胞を２回洗浄し、ＰＢＳを捨て、その後、適切な量の予備冷却された２×溶解緩衝液（Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ）を加入し、セルスクレーパーで細胞を掻き取って氷上で３０ｍｉｎ孵化し、そして、サンプルを４℃に放置し、１２０００ｇ、１５ｍｉｎ遠心処理して、上清液を取って、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法でタンパク質濃度を測定し、最後に、サンプルタンパク質の最終濃度を２μｇ／μｌに調整して、−８０℃に保存した。それぞれ１２μｇの総タンパク質量サンプルを取って、同体積の２Ｘローディング緩衝液（ｌｏａｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ）を加入し、両方を充分且つ均一に混合した後、沸騰水浴で１０分孵化した後、４℃に放置する。１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離ゲルと５％濃縮ゲルを利用して、タンパク質を分離させた。電気泳動を終了した後、４℃、４００ｍＡ定電流条件で、２時間電力トレーディングし、タンパク質をＰＶＤＦ膜に転移した。
【０１３５】
その結果は図２に示すとおりである。「Ｃｏｎｔｒｏｌ」はＮＣ組で、「ｎｏ  ｔａｒｇｅｔ」はＮＴＣ組で、「ｓｉＲＮＡ」はｓｉＲＮＡ−ＲＢ−０４組である。図２に示すように、ｓｉＲＮＡ−ＲＢ−０４はＡＤＡＭＴＳ−５のタンパク質の発現を有効に低下させ、後述においてｓｉＲＮＡ−ＲＢ−０４を選択して分析する。
【０１３６】
ＩＣ５０検出
濃度がそれぞれ０．０１ｎＭ、０．５ｎＭ、２．５ｎＭ、５ｎＭ、１０ｎＭ、２５ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭであるｓｉＲＮＡ−ＲＢ−０４をトランスフェクションしたｈＦＬＳ細胞にＩＣ５０検出を行った（対照組に比べ、ＡＤＡＭＴＳ−５  ｍＲＮＡ発現を５０％抑制したｓｉＲＮＡの濃度）。ＩＣ５０値をソフトウェアＯｒｉｇｉｎ  ８．０で計算した結果、ｓｉＲＮＡ−ＲＢ−０４のＩＣ５０は１２．６ｎＭで、ＡＤＡＭＴＳ−５  ｍＲＮＡの発現レベルはｓｉＲＮＡの使用量に依存し、上記濃度において、発現レベルはそれぞれ１６％、１９％、３６％、３９％、４１％、６３％、７３％、７４％低下された。
【０１３７】
実施例２            ｓｉＲＮＡｓによる炎症因子の発現の抑制
【０１３８】
実験を以下の組に分けて行った：
【０１３９】
ｈＦＬＳ−ｓｉＲＮＡ−ＲＢ−０４実験組：初代培養したｈＦＬＳ細胞を６ウェルプレートに接種し、５０％まで成長してシート状に融合された時、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）２０００キット説明書に従って、ｓｉＲＮＡ−ＲＢ−０４を５０ｎＭの最終濃度で細胞にトランスフェクションした。
【０１４０】
２９３Ｔ−ｓｉＲＮＡ−ＲＢ−０４実験組：初代培養した２９３Ｔ細胞を６ウェルプレートに接種し、５０％まで成長してシート状に融合された時、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）２０００キット説明書に従って、ｓｉＲＮＡ−ＲＢ−０４を５０ｎＭの最終濃度で細胞にトランスフェクションした。
【０１４１】
ｈＦＬＳ−Ｎｏ  ｔａｒｇｅｔ（ＮＴＣ）組：ｈＦＬＳ−ｓｉＲＮＡ−ＲＢ−０４実験組のｓｉＲＮＡを以下のランダムな非特異ｓｉＲＮＡに入れ替えし、その他の工程はｈＦＬＳ−ｓｉＲＮＡ−ＲＢ−０４実験組と同じである。
センス鎖：５’−ＡＧＡＵＣＧＵＵＡＧＵＵＡＧＧＵＵＧＣｄＴｄＴ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １７５）
アンチセンス鎖：５’−ＧＣＡＡＣＣＵＡＡＣＵＡＡＣＧＡＵＣＵｄＴｄＴ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １７６）
【０１４２】
２９３Ｔ−Ｎｏ  ｔａｒｇｅｔ（ＮＴＣ）組：２９３Ｔ−ｓｉＲＮＡ−ＲＢ−０４実験組のｓｉＲＮＡを以下のランダムな非特異ｓｉＲＮＡに入れ替えし、その他の工程は２９３Ｔ−ｓｉＲＮＡ−ＲＢ−０４実験組と同じである。
センス鎖：５’−ＡＧＡＵＣＧＵＵＡＧＵＵＡＧＧＵＵＧＣｄＴｄＴ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １７５）
アンチセンス鎖：５’−ＧＣＡＡＣＣＵＡＡＣＵＡＡＣＧＡＵＣＵｄＴｄＴ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １７６）
【０１４３】
ｈＦＬＳ−陰性（ＮＣ）対照組：ｓｉＲＮＡのトランスフェクションがなく、その他の工程はｈＦＬＳ−ｓｉＲＮＡ−ＲＢ−０４実験組と同じである。
【０１４４】
２９３Ｔ−陰性対照組（ＮＣ）：ｓｉＲＮＡのトランスフェクションがなく、その他の工程は２９３Ｔ−ｓｉＲＮＡ−ＲＢ−０４実験組と同じである。
【０１４５】
２４時間トランスフェクションした後、無血清培地に換えて、各組の細胞を２４時間飢餓培養した。各組の細胞に最終濃度が１０ｎｇ／ｍｌであるＩＬ−１αを加入し、２４時間刺激した後、各組の細胞のＲＮＡを抽出して、以下のプライマーで、β−ａｃｔｉｎを参照遺伝子として、ＴＮＦ、ＣＯＸ−２、ＩＬ−１β遺伝子発現レベルをｑＰＣＲ検出した。
ＴＮＦ−Ｆ：５’−ＣＧＡＧＴＧＡＣＡＡＧＣＣＴＧＴＡＧＣＣ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １７９）
ＴＮＦ−Ｒ：５’−ＴＧＡＡＧＡＧＧＡＣＣＴＧＧＧＡＧＴＡＧＡＴ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １８０）
Ｃｏｘ２−Ｆ：５’−ＣＡＧＧＧＴＴＧＣＴＧＧＴＧＧＴＡＧＧＡ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １８１）
Ｃｏｘ２−Ｒ：５’−ＧＣＡＴＡＡＡＧＣＧＴＴＴＧＣＧＧＴＡＣ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １８２）
ＩＬ−Ｉβ  −Ｆ：５’−ＡＣＧＡＡＴＣＴＣＣＧＡＣＣＡＣＣＡ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １８３）
ＩＬ−Ｉβ  −Ｒ：５’−ＧＧＡＣＣＡＧＡＣＡＴＣＡＣＣＡＡＧＣ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １８４）
【０１４６】
図３Ａに示すように、ｓｉＲＮＡ−ＲＢ−０４はｈＦＬＳと２９３Ｔ細胞中のＴＮＦ、ＣＯＸ−２、ＩＬ−１β  ｍＲＮＡの発現を有効に低下させた。特に、ｈＦＬＳ細胞中のＩＬ−１β発現レベルを８９％低下させた。
【０１４７】
細胞の上清液を収集して、ＡｓｓａｙＭａｘＴＭ  Ｈｕｍａｎ  ＩＬ−１β  ＥＬＩＳＡキットで、ＩＬ−１βの分泌を検出した。ここで、ＮＴＣ組はさらに以下の各組を設けた：
ｈＦＬＳ−Ｎｏ  ｔａｒｇｅｔ（ＮＴＣ＋）対照組：ＩＬ−１α処理したｈＦＬＳ−ＮＴＣ組。
ｈＦＬＳ−Ｎｏ  ｔａｒｇｅｔ（ＮＴＣ−）対照組：ＩＬ−１α処理していないｈＦＬＳ−ＮＴＣ組。
２９３Ｔ−Ｎｏ  ｔａｒｇｅｔ（ＮＴＣ＋）対照組：ＩＬ−１α処理した２９３Ｔ−ＮＴＣ組。
２９３Ｔ−Ｎｏ  ｔａｒｇｅｔ（ＮＴＣ）対照組：ＩＬ−１α処理していないの２９３Ｔ−ＮＴＣ組。
【０１４８】
図３Ｂに示すように、ｓｉＲＮＡ−ＲＢ−０４はＩＬ−１βタンパク質の分泌を抑制し、その分泌レベルは刺激のないＮＴＣ組より低い。
【０１４９】
実施例３        ｓｉＲＮＡ−ＲＢ−０４と一定の配列同一性のあるｓｉＲＮＡｓによるＡＤＡＭＴＳ−５の抑制
【０１５０】
第１組の実験に使用されたｓｉＲＮＡｓは、ｓｉＲＮＡ−ＲＢ−０４のアンチセンス鎖５’−ＡＵＧＡＵＧＣＣＣＡＣＡＵＡＡＡＵＣＣ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２）を有し、センス鎖はｓｉＲＮＡ−ＲＢ−０４のセンス鎖５’−ＧＧＡＵＵＵＡＵＧＵＧＧＧＣＡＵＣＡＵ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １）又はそれと同一性のある配列を含み、表１に示すとおりである。
【０１５１】
【表１】
0006706628.tif 000002
【０１５２】
第２組の実験に使用されたｓｉＲＮＡｓは、ｓｉＲＮＡ−ＲＢ−０４のセンス鎖５’−ＧＧＡＵＵＵＡＵＧＵＧＧＧＣＡＵＣＡＵ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １）を有し、アンチセンス鎖はｓｉＲＮＡ−ＲＢ−０４のアンチセンス鎖５’−ＡＵＧＡＵＧＣＣＣＡＣＡＵＡＡＡＵＣＣ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２）、又はそれと同一性のある配列を含み、表２に示すとおりである。
【０１５３】
【表２】
0006706628.tif 000003
【０１５４】
第３組の実験に使用されたｓｉＲＮＡｓは、ｓｉＲＮＡ−ＲＢ−０４のセンス鎖５’−ＧＧＡＵＵＵＡＵＧＵＧＧＧＣＡＵＣＡＵ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １）又はそれと一定の同一性のある配列を含み、アンチセンス鎖はｓｉＲＮＡ−ＲＢ−０４のアンチセンス鎖５’−ＡＵＧＡＵＧＣＣＣＡＣＡＵＡＡＡＵＣＣ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２）又はそれと一定の同一性のある配列を含み、表３に示すとおりである。
【０１５５】
【表３】
0006706628.tif 000004
【０１５６】
表１〜３中のｓｉＲＮＡｓをｈＦＬＳ細胞にトランスフェクションし、実施例１の方法でＡＤＡＭＴＳ−５遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルを検出した。以上の３組の実験で、実施例１の方法でＮＴＣ組とＮＣ組を設定した。
【０１５７】
表１〜３に示すように、３組で設計したｓｉＲＮＡはいずれもＡＤＡＭＴＳ−５  ｍＲＮＡ発現を低下させることができる。最も有効であるｓｉＲＮＡｓは、（１）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示すアンチセンス鎖と、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と少なくとも６０％の同一性のあるセンス鎖とを含有するｓｉＲＮＡｓ、（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示すセンス鎖と、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２と少なくとも６０％の同一性のあるアンチセンス鎖とを含有するｓｉＲＮＡｓ、（３）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と少なくとも６０％の同一性のあるセンス鎖と、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２と少なくとも６０％の同一性のあるアンチセンス鎖とを含有するｓｉＲＮＡｓである。特に、３’端オーバーハングした２１−ｎｔを有するｓｉＲＮＡ−ＲＢ−１３は、ＡＤＡＭＴＳ−５の発現レベルを９１％低下させることができる。
【０１５８】
実施例４    ｓｉＲＮＡをコーディングするプラスミドによるＡＤＡＭＴＳ−５のサイレンシング
【０１５９】
ｓｉＲＮＡ−ＲＢ−０４配列をコーディングするＤＮＡオリゴヌクレオチドを設計し、表４に示すとおりである。
【０１６０】
【表４】
0006706628.tif 000005
【０１６１】
下線部は塩基相互補完領域である。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５中の第１０〜２８位（太字）のヌクレオチドによりｓｉＲＮＡ−ＲＢ−０４のセンス鎖（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）をコーディングする。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６中の第３６〜５４位のヌクレオチド（太字）によりｓｉＲＮＡ−ＲＢ−０４のアンチセンス鎖（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）をコーディングする。
【０１６２】
表４中のＤＮＡ鎖にアニーリング処理を行った後二重鎖を形成し、ｓｉＲＮＡ発現ベクターｐＧＣｓｉ−Ｈ１／ＮｅｏのＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩの酵素切断部位間にクローンして、ベクター１である組換されたｓｉＲＮＡ発現プラスミドを得た。
【０１６３】
実験は以下の組に分けて行われた：
【０１６４】
実験組：トランスフェクションする前日、ｈＦＬＳ細胞を６ウェルプレートに接種した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）２０００説明書に従って、５０ｎＭ最終濃度のベクター１をｈＦＬＳ細胞にトランスフェクションした。トランスフェクション後に４８ｈ経過した後、細胞を収集した。実施例１の方法でＡＤＡＭＴＳ−５  ｍＲＮＡの発現レベルを検出した。
【０１６５】
標的無し対照組（ＮＴＣ）：以下のランダムな非特異ｓｉＲＮＡをコーディングするＤＮＡをｐＧＣｓｉ−Ｈ１／Ｎｅｏにクローンし、他の工程は実験組と同じである。
センス鎖：５’−ＡＧＡＵＣＧＵＵＡＧＵＵＡＧＧＵＵＧＣｄＴｄＴ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １７５）
アンチセンス鎖：５’−ＧＣＡＡＣＣＵＡＡＣＵＡＡＣＧＡＵＣＵｄＴｄＴ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １７６）
【０１６６】
陰性対照組（ＮＣ）：干渉断片を追加していない原始ｐＧＣｓｉ−Ｈ１／Ｎｅｏプラスミドを使用し、他の工程は実験組と同じである。表５に結果を示す。
【０１６７】
【表５】
0006706628.tif 000006
【０１６８】
表５に示すように、ｓｉＲＮＡ−ＲＢ−０４をコーディングするＤＮＡをトランスフェクションしても、ＡＤＡＭＴＳ−５を有効にサイレンシングした。
【０１６９】
実施例５  化学修飾のｓｉＲＮＡｓによるＡＤＡＭＴＳ−５のサイレンシング
【０１７０】
ｓｉＲＮＡ−ＲＢ−１３とｓｉＲＮＡ−ＲＢ−０４に異なる種類又は異なる組み合せの化学修飾（例えば表６と表７）を行って、ｓｉＲＮＡの安定性や干渉効果を向上させた。
【０１７１】
【表６】
0006706628.tif 000007
【０１７２】
ホスホロチオエート（Ｐ−Ｓ結合）修飾は図４に示すとおりである。ＬＮＡ修飾は、リボース又はデオキシリボースの２′−Ｏ位と４′−Ｃ位とに環状構造を形成することである。使用したポリペプチドはＲＧＤ（（Ｎ’−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｃ’、Ｓｉｇｍａ）である。Ａはいずれかのヌクレオチドを表す。
【０１７３】
【表７−１】
0006706628.tif 000008
【０１７４】
【表７−２】
0006706628.tif 000009
【０１７５】
表７に示す化学修飾ｓｉＲＮＡはｈＦＬＳ細胞にトランスフェクションされ、実施例１の方法でＡＤＡＭＴＳ−５  ｍＲＮＡレベルを検出した。コレステロール、ポリペプチド、ガラクトース修飾のｓｉＲＮＡｓを使用する時、トランスフェクション試薬を加入しない。
【０１７６】
表７に示すように、適切に化学修飾された後のｓｉＲＮＡ−ＲＢ−１３とｓｉＲＮＡ−ＲＢ−０４は、ＡＤＡＭＴＳ−５を有効にサイレンシングした。
【０１７７】
実施例６          化学修飾によるｓｉＲＮＡｓ血清安定性
【０１７８】
実施例５の化学修飾ｓｉＲＮＡｓに血清安定性の検出を行って、その工程は、各ｓｉＲＮＡｓ分子をＲＮＡａｓｅ無し水で５μＭまで希釈した後、同体積の新鮮なラット血清を加入し、混合物を３７℃で３分孵化し、その後、ｓｉＲＮＡｓの完全性を電気泳動検出した。
【０１７９】
図５に示すように、ラット血清と３０分孵化した後、未修飾のｓｉＲＮＡ−ＲＢ−１３は明らかに分解され、化学修飾のｓｉＲＮＡ−ＲＢ−４１、ｓｉＲＮＡ−ＲＢ−４０、ｓｉＲＮＡ−ＲＢ−３５は分解の傾向が見られなかった。
【０１８０】
実施例７      ｓｉＲＮＡｓで関節炎モデルラットを処理した場合の有効性
【０１８１】
関節炎モデルラットを構築し、ウシII型コラーゲンを誘導剤として使用して変形性関節症の症状を含む関節炎の形成を促進した。ウシII型コラーゲン（４ｍｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ）を雄性ＳＤラット（２２０±２０ｇ）の関節腔に注射し、１００μＬ／足、各動物に２００μＬ注射した。
【０１８２】
ウシII型コラーゲン３ｄを注射した後、関節炎ラットを８匹ずつランダムに、１００μＬ  ＰＢＳを注射する対照組であるＰＢＳ組と、５０μＬ／足で１０ｎｍｏｌのｓｉＲＮＡ溶液（１００μＬ）を注射するｓｉＲＮＡ−ＲＢ−４０、ｓｉＲＮＡ−ＲＢ−３５、ｓｉＲＮＡ−ＲＢ−４１実験組の４組に分けた。各組はいずれも毎週に２回投薬し（対照又はｓｉＲＮＡ）、連続して２週間投薬した。
【０１８３】
各組から４匹のラットを取って、第４回の投薬が終了した後の次の日に動物を殺して、膝関節を取って組織保存液に固定し、標準方法であるヘマトキシリン‐エンジン（ＨＥ）とトルイジンブルー（ＴＢ）で染色し、顕微鏡で組織構造の変化を分析した。
【０１８４】
結果は図６に示し、ここで、ＡとＢはＰＢＳ組モデル組のＨＥとＴＢ染色（２０×）で、ＣはＤはＰＢＳ組モデル組のＨＥとＴＢ染色（１０×）であって、ＥはＦは投薬組ｓｉＲＮＡ−ＲＢ−３５のＨＥとＴＢ染色（２０×）で、ＧとＨは投薬組ｓｉＲＮＡ−ＲＢ−３５のＨＥとＴＢ染色（１０×）であって、ＩとＪはｓｉＲＮＡ−ＲＢ−４０投薬組のＨＥとＴＢ染色（２０×）で、ＫとＬはｓｉＲＮＡ−ＲＢ−４０投薬組のＨＥとＴＢ染色（１０×）であって、ＭとＮはｓｉＲＮＡ−ＲＢ−４１投薬組のＨＥとＴＢ染色（２０×）で、ＯとＰはｓｉＲＮＡ−ＲＢ−４１投薬組のＨＥとＴＢ染色（１０×）である。
【０１８５】
図６に示すように、２週間投薬した後、ＰＢＳモデル組に、半月板軟骨細胞骨化、関節面の軟骨層の明らかな骨化変性、細胞配列混乱、コラーゲンの厳重流出、関節腔の指状の線維性組織突起、関節嚢結合組織過形成等の炎症性症状が現れた。ＰＢＳ組に比べ、ｓｉＲＮＡ−ＲＢ−４０投薬組の関節面は滑らかで、関節嚢における局部線維性肥厚が少量だけで、軟骨層の細胞はすっきり配列され、形状が完全で、明らかなコラーゲン流出は見られなかった。ｓｉＲＮＡ−ＲＢ−３５投薬組は、一部でコラーゲンが欠失し、関節の表面に一部の線維化があったが、半月板、軟骨層構造は完全であった。ｓｉＲＮＡ−ＲＢ−４１投薬組は、関節の表面が滑らかで、軟骨層構造が完全で、半月板と軟骨局部に石灰変性があったが、線維化構造を見られなかった。
【０１８６】
結果、ｓｉＲＮＡ−ＲＢ−４０、ｓｉＲＮＡ−  ＲＢ−３５、ｓｉＲＮＡ−  ＲＢ−４１は変形性関節症ラットの病理過程を抑制し、関節表面線維化、軟骨浸食、滑膜炎等を含む多種類の症状を緩和した。前記ｓｉＲＮＡｓを潜在的な関節炎を治療する治療剤とすることができる。
【０１８７】
実施例８      ｓｉＲＮＡｓがラット関節免疫性因子を抑制する有効性
【０１８８】
実施例７の方法でＰＢＳ組、ｓｉＲＮＡ−ＲＢ−３５組、ｓｉＲＮＡ−ＲＢ−４０組、ｓｉＲＮＡ−ＲＢ−４１組を構築した。ここで、ｓｉＲＮＡ−ＲＢ−３５組はｓｉＲＮＡをキトサンナノ粒子でラップしてから注射し、その他の工程は同じである。
【０１８９】
第４回の投薬処理後の次の日に動物を殺して、膝関節を取って液体窒素で冷凍した。ＲＮｅａｓｙ（登録商標）  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）で膝関節ＲＮＡを抽出して逆転写した。それぞれ実施例１と９の方法でＡＤＡＭＴＳ−５とＡＤＡＭ１７  ｍＲＮＡの発現レベルを測定した。実施例２の方法でＴＮＦ、ＣＯＸ−２、ＩＬ−１βの発現レベルを検出した。
【０１９０】
結果は図７に示し、「Ｎｏｒｍａｌ（健康組）」は、健康な雄性ＳＤラット組を指し、「モデル組」はＰＢＳ組である。図７に示すように、健康組に比べ、ＰＢＳ組中のＡＤＡＭＴＳ−５、ＡＤＡＭ１７、ＴＮＦ、ＣＯＸ−２、ＩＬ−１βの発現は増加した。しかし、ｓｉＲＮＡ−ＲＢ−４０、ｓｉＲＮＡ−ＲＢ−３５、ｓｉＲＮＡ−ＲＢ−４１は、このような免疫性因子の発現レベルを顕著にダウンレギュレーションし、軟骨と滑膜を保護する効果があった。これに基づいて、前記ｓｉＲＮＡｓは、炎症に関連する疾患を有効に予防及び／又は治療できることが分かる。
【０１９１】
実施例９      ＡＤＡＭ１７の発現を抑制するｓｉＲＮＡｓの選別
【０１９２】
ｓｉＲＮＡの設計
生物情報学技術を利用して、例えばＢＬＡＳＴ（登録商標）に基づいて、ＡＤＡＭ１７を標的とするｓｉＲＮＡｓを設計した。設計中にヒトソースＡＤＡＭ１７のｍＲＮＡ配列（登録番号：ＮＭ_００３１８３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １９４））、ラットソースＡＤＡＭ１７の  ｍＲＮＡ配列（登録番号：ＮＭ_０２０３０６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １９５）、マウスソースＡＤＡＭ１７の  ｍＲＮＡ配列（登録番号：ＮＭ_００１２７７２６６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １９６；ＮＭ_００１２９１８７１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １９７；ＮＭ_００９６１５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １９８）を使用した。ＡＤＡＭ１７を標的とするｓｉＲＮＡｓの特異性は実施例１の方法で確認した。選別した８個のＡＤＡＭ１７の発現を抑制できるｓｉＲＮＡｓは、ｓｉＲＮＡ−ＡＤ−０１、ｓｉＲＮＡ−ＡＤ−０２、ｓｉＲＮＡ−ＡＤ−０３、ｓｉＲＮＡ−ＡＤ−０４、ｓｉＲＮＡ−ＡＤ−０５、ｓ  ｉＲＮＡ−ＡＤ−０６、ｓｉＲＮＡ−ＡＤ−０７、ｓｉＲＮＡ−ＡＤ−０８である。
【０１９３】
ｓｉＲＮＡ合成
ＡＤＡＭ１７を標的とするｓｉＲＮＡｓの合成は実施例１と同じである。
【０１９４】
細胞のトランスフェクション
実験を、標的無し対照組（ＮＴＣ）と、陰性対照組（ＮＣ）と、ｓｉＲＮＡ−ＡＤ−０１〜ｓｉＲＮＡ−ＡＤ−０８の八つの実験組との１０組に分けて行った。
【０１９５】
実験組：ｈＦＬＳ細胞を０．２５％のトリプシンで消化し、濃度が１０４個／ｍｌの細胞懸濁液を調製し、それを１２ウェル培養プレートに接種し、各ウェルは５００μｌである。ｈＦＬＳ細胞が対数増殖期まで成長した（即ち、成長が８０％に達してシートに融合した）時、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）２０００キットの説明書に従って、それぞれの対応するｓｉＲＮＡｓを５０ｎＭの最終濃度でｈＦＬＳ細胞にトランスフェクションした。
【０１９６】
ＮＴＣ組：実験組のｓｉＲＮＡを以下のランダムな非特異ｓｉＲＮＡに入れ替えし、他の工程は変更ない。
センス鎖：５’−ＡＧＵＡＵＧＣＣＡＣＡＵＡＡＧＣＡＵＣｄＴｄＴ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １８５）；
アンチセンス鎖：５’−ＧＡＵＧＣＵＵＡＵＧＵＧＧＣＡＵＡＣＵｄＴｄＴ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １８６）
【０１９７】
ＮＣ組：ｓｉＲＮＡのトランスフェクションがなく、その他の工程は実験組と同じである。
【０１９８】
リアルタイム定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）
２４ｈトランスフェクションした後、各組のｈＦＬＳ細胞を収集し、１０００ｒｐｍで５分遠心処理し、上清液を除去した。Ｔｒｉｚｏｌ（登録商標）法で各組のＲＮＡを抽出した後、ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。ｃＤＮＡをモデルとし、以下のＡＤＡＭ１７−Ｆ１とＡＤＡＭ１７−Ｒ１をプライマーとし、β−ａｃｔｉｎを参照遺伝子としてｑＰＣＲ検出を行った。
ＡＤＡＭ１７−Ｆ１：５’−ＧＧＡＣＣＡＧＧＧＡＧＧＧＡＡＡＴＡ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １８７）
ＡＤＡＭ１７−Ｒ１：３’−ＴＴＧＣＴＧＴＧＧＡＣＧＡＣＧＴＴＧ−５’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １８８）
【０１９９】
図８は、８個のｓｉＲＮＡｓがＡＤＡＭ１７の発現を抑制した結果である。図８に示すように、ｓｉＲＮＡ−ＡＤ−０８のｈＦＬＳ細胞におけるＡＤＡＭ１７  ｍＲＮＡ発現に対する抑制効果が最も優れていて、８６％の遺伝子発現を低下した。
【０２００】
ｓｉＲＮＡ−ＡＤ−０８センス配列とアンチセンス配列は、
ｓｉＲＮＡ−ＡＤ−０８  センス鎖：５’−ＧＣＡＵＣＡＵＧＵＡＵＣＵＧＡＡＣＡＡ−３’  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ７）；
ｓｉＲＮＡ−ＡＤ−０８アンチセンス鎖：５’−ＵＵＧＵＵＣＡＧＡＵＡＣＡＵＧＡＵＧＣ−３’  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ８）である。
【０２０１】
Ｗｅｓｔｅｒｎブロット
ｓｉＲＮＡ−ＡＤ−０８実験組、ＮＴＣ組、ＮＣ組のｈＦＬＳ細胞を取ってＷｅｓｔｅｒｎブロットを行った。細胞培養液を除去し、ＰＢＳで細胞を２回洗浄し、ＰＢＳを捨て、その後、適切な量の予備冷却された２×溶解緩衝液を加入した。その後、セルスクレーパーで細胞を掻き取って氷上で３０ｍｉｎ孵化し、そして、４℃に放置し、１２０００ｇ、１５ｍｉｎ遠心処理して、上清液を取って、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法でタンパク質濃度を測定し、最後に、サンプルタンパク質の最終濃度を２μｇ／μｌに調整して、−８０℃に保存した。それぞれ１２μｇの総タンパク質量サンプルを取って、同体積の２Ｘローディング緩衝液を加入した。両方を充分且つ均一に混合した後、沸騰したお湯で１０分煮て、４℃に放置する。１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離ゲルと５％濃縮ゲルを利用して、タンパク質を電気泳動分離させた。電気泳動を終了した後、４℃、４００ｍＡ定電流条件で、２時間電力トレーディングし、タンパク質をＰＶＤＦ膜に転移した。
【０２０２】
その結果は図９に示すとおりである。「対照」はＮＣ組で、「標的無し」はＮＴＣ組で、「ｓｉＲＮＡ」はｓｉＲＮＡ−ＡＤ−０８組である。図９に示すように、ｓｉＲＮＡ−ＡＤ−０８はＡＤＡＭ１７のタンパク質の発現を有効に低下させ、後述においてｓｉＲＮＡ−ＡＤ−０８を選択して分析する。
【０２０３】
ＩＣ５０検出
濃度がそれぞれ０．０１ｎＭ、０．１ｎＭ、０．５ｎＭ、２．５ｎＭ、２５ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭであるｓｉＲＮＡ−ＡＤ−０８をトランスフェクションしたｈＦＬＳ細胞にＩＣ５０検出を行った（対照組に比べ、ＡＤＡＭ１７  ｍＲＮＡを５０％抑制したｓｉＲＮＡの濃度）。ＩＣ５０値をソフトウェアＯｒｉｇｉｎ  ８．０で計算した結果、ｓｉＲＮＡ−ＡＤ−０８のＩＣ５０は０．２５ｎＭで、ＡＤＡＭ１７  ｍＲＮＡの発現レベルがそれぞれ２６％、３９％、７７％、８４％、８７％、８９％、９１％低下された。
【０２０４】
実施例１０        ｓｉＲＮＡｓによる炎症因子の発現の抑制
【０２０５】
実験を以下の組に分けて行った：
【０２０６】
ｈＦＬＳ−ｓｉＲＮＡ−ＡＤ−０８実験組：初代培養したｈＦＬＳ細胞を６ウェルプレートに接種し、５０％まで成長してシート状に融合された時、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）２０００キット説明書に従って、ｓｉＲＮＡ−ＡＤ−０８を５０ｎＭの最終濃度で細胞にトランスフェクションした。
【０２０７】
ＭＣＦ７−ｓｉＲＮＡ−ＡＤ−０８実験組：初代培養したＭＣＦ７細胞を６ウェルプレートに接種し、５０％まで成長してシート状に融合された時、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）２０００キット説明書に従って、ｓｉＲＮＡ−ＡＤ−０８を５０ｎＭの最終濃度で細胞にトランスフェクションした。
【０２０８】
ｈＦＬＳ−標的無し対照組（ＮＴＣ）：ｈＦＬＳ−ｓｉＲＮＡ−ＡＤ−０８実験組のｓｉＲＮＡを以下のランダムな非特異ｓｉＲＮＡに入れ替えし、その他の工程はｈＦＬＳ−ｓｉＲＮＡ−ＡＤ−０８実験組と同じである。
センス鎖：５’−ＡＧＵＡＵＧＣＣＡＣＡＵＡＡＧＣＡＵＣｄＴｄＴ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １８５）
アンチセンス鎖：５’−ＧＡＵＧＣＵＵＡＵＧＵＧＧＣＡＵＡＣＵｄＴｄＴ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １８６）
【０２０９】
ＭＣＦ７−標的無し対照組（ＮＴＣ）：以下のランダムな非特異ｓｉＲＮＡでＭＣＦ７細胞をトランスフェクションし、その他の工程はｈＦＬＳ−ｓｉＲＮＡ−ＡＤ−０８組と同じである。
センス鎖：５’−ＡＧＵＡＵＧＣＣＡＣＡＵＡＡＧＣＡＵＣｄＴｄＴ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １８５）
アンチセンス鎖：５’−ＧＡＵＧＣＵＵＡＵＧＵＧＧＣＡＵＡＣＵｄＴｄＴ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １８６）
【０２１０】
ｈＦＬＳ−陰性（ＮＣ）対照組：ｓｉＲＮＡのトランスフェクションがなく、その他の工程はｈＦＬＳ−ｓｉＲＮＡ−ＡＤ−０８組と同じである。
【０２１１】
ＭＣＦ７−陰性対照組（ＮＣ）：ｓｉＲＮＡがなく、その他の工程はＭＣＦ７−ｓｉＲＮＡ−ＡＤ−０８組と同じである。
【０２１２】
２４時間トランスフェクションした後、無血清培地に換えて、各組の細胞を２４時間飢餓培養した。各組の細胞に最終濃度が１０ｎｇ／ｍｌであるようにＩＬ−１αを加入し、２４時間刺激した後、各組の細胞のＲＮＡを抽出して、実施例２のプライマーで、β−ａｃｔｉｎを参照遺伝子として、ＴＮＦ、ＣＯＸ−２、ＩＬ−１βの発現レベルを検出した。
【０２１３】
図１０Ａに示すように、ｓｉＲＮＡ−ＡＤ−０８は、ＭＣＦ−７とｈＦＬＳ細胞においていずれもＣＯＸ−２とＩＬ−１βのｍＲＮＡ発現を有効に低下させる。特に、ｈＦＬＳ中のＩＬ−１β発現レベルは８８％低下された。ＭＣＦ−７におけるｓｉＲＮＡ−ＡＤ−０８をトランスフェクションした後のＴＮＦレベルはＮＴＣ組より高く、これはＴＮＦの細胞機能の複雑性によるものである可能性がある。
【０２１４】
細胞の上清液を収集して、ＡｓｓａｙＭａｘＴＭ  Ｈｕｍａｎ  ＩＬ−１β  ＥＬＩＳＡキットで、ＩＬ−１βの分泌を検出した。ここで、ＮＴＣ組はさらに以下の各組を設けた：
ｈＦＬＳ−標的無し（ＮＴＣ＋）対照組：ＩＬ−１α処理したｈＦＬＳ−ＮＴＣ組。
ｈＦＬＳ−標的無し（ＮＴＣ−）対照組：ＩＬ−１α処理していないｈＦＬＳ−ＮＴＣ組。
ＭＣＦ７−標的無し（ＮＴＣ＋）対照組：ＩＬ−１α処理したＭＣＦ７−ＮＴＣ組。
ＭＣＦ７−標的無し（ＮＴＣ−）対照組：ＩＬ−１α処理していないＭＣＦ７−ＮＴＣ組。
【０２１５】
図１０Ｂに示すように、ｓｉＲＮＡ−ＡＤ−０８はＩＬ−１βタンパク質の分泌を抑制し、その分泌レベルは刺激のないＮＴＣ組より低い。
【０２１６】
実施例１１      ｓｉＲＮＡ−ＡＤ−０８と一定の配列同一性のあるｓｉＲＮＡｓによるＡＤＡＭ１７の抑制
【０２１７】
第１組の実験に使用されたｓｉＲＮＡｓは、ｓｉＲＮＡ−ＡＤ−０８のアンチセンス鎖５’−ＵＵＧＵＵＣＡＧＡＵＡＣＡＵＧＡＵＧＣ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ８）を有し、センス鎖はｓｉＲＮＡ−ＡＤ−０８のセンス鎖５’−ＧＣＡＵＣＡＵＧＵＡＵＣＵＧＡＡＣＡＡ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ７）又はそれと同一性のある配列を含み、表８に示すとおりである。
【０２１８】
【表８】
0006706628.tif 000010
【０２１９】
第２組の実験に使用されたｓｉＲＮＡｓはｓｉＲＮＡ−ＡＤ−０８のセンス鎖５’−ＧＣＡＵＣＡＵＧＵＡＵＣＵＧＡＡＣＡＡ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ７）を有し、アンチセンス鎖はｓｉＲＮＡ−ＡＤ−０８のアンチセンス鎖５’−ＵＵＧＵＵＣＡＧＡＵＡＣＡＵＧＡＵＧＣ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ８）、又はそれと同一性のある配列を含み、表９に示すとおりである。
【０２２０】
【表９】
0006706628.tif 000011
【０２２１】
第３組の実験に使用されたｓｉＲＮＡｓはｓｉＲＮＡ−ＡＤ−０８のセンス鎖５’−ＧＣＡＵＣＡＵＧＵＡＵＣＵＧＡＡＣＡＡ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ７）又はそれと一定の同一性のある配列を含み、アンチセンス鎖はｓｉＲＮＡ−ＡＤ−０８のアンチセンス鎖５’−ＵＵＧＵＵＣＡＧＡＵＡＣＡＵＧＡＵＧＣ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ８）又はそれと一定の同一性の配列を含み、表１０に示すとおりである。
【０２２２】
【表１０】
0006706628.tif 000012
【０２２３】
表８〜１０中のｓｉＲＮＡｓをそれぞれｈＦＬＳ細胞トランスフェクションし、実施例８の方法でＡＤＡＭ１７遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルを検出した。以上の３組の実験は実施例８の方法でＮＴＣ組とＮＣ組を設定した。
【０２２４】
表８〜１０に示すように、３組のｓｉＲＮＡｓはいずれもＡＤＡＭ１７  ｍＲＮＡの発現を低下させることができる。最も有効なｓｉＲＮＡｓは、（１）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８に示すアンチセンス鎖と、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７と少なくとも６０％の同一性を有するセンス鎖とを含むｓｉＲＮＡｓ、（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７に示すセンス鎖と、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８と少なくとも６０％の同一性を有するアンチセンス鎖とを含むｓｉＲＮＡｓ、（３）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７と少なくとも６０％の同一性を有するセンス鎖と、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８と少なくとも６０％の同一性を有するアンチセンス鎖とを含むｓｉＲＮＡｓと、を含む。特に、３’端オーバーハングした２１−ｎｔを有するｓｉＲＮＡ−ＡＤ−１３は、ＡＤＡＭ１７の発現レベルを８８％低下させることができる。
【０２２５】
実施例１２      ｓｉＲＮＡをコーディングするプラスミドによるＡＤＡＭ１７のサイレンシング
【０２２６】
ｓｉＲＮＡ−ＡＤ−０８配列をコーディングするＤＮＡオリゴヌクレオチドを設計し、表１１に示すとおりである。
【０２２７】
【表１１】
0006706628.tif 000013
【０２２８】
下線部は塩基相互補完領域である。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１中の第３８〜５６位（太字）のヌクレオチドによりｓｉＲＮＡ−ＡＤ−０８のアンチセンス鎖（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８  ）をコーディングする。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２中の第８〜２６位（太字）のヌクレオチドによりｓｉＲＮＡ−ＡＤ−０８のセンス鎖（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）をコーディングする。
【０２２９】
表１２中のＤＮＡ鎖にアニーリング処理を行った後二重鎖を形成し、ｓｉＲＮＡ発現ベクターｐＧＣｓｉ−Ｈ１／ＮｅｏのＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩの酵素切断部位間にクローンして、ベクター２である組換されたｓｉＲＮＡ発現プラスミドを得た。
【０２３０】
実験は以下の組に分けて行われた：
【０２３１】
実験組：トランスフェクションする前日、ｈＦＬＳ細胞を６ウェルプレートに接種した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）  ２０００説明書に従って、５０ｎＭ最終濃度のベクター２をｈＦＬＳ細胞にトランスフェクションした。トランスフェクション後に４８ｈ経過した後、細胞を収集した。実施例９の方法でＡＤＡＭ１７  ｍＲＮＡの発現レベルを検出した。
【０２３２】
標的無し対照組（ＮＴＣ）：以下のランダムな非特異ｓｉＲＮＡをコーディングするＤＮＡをｐＧＣｓｉ−Ｈ１／Ｎｅｏにクローンし、他の工程は実験組と同じである。
センス鎖：５’−ＡＧＵＡＵＧＣＣＡＣＡＵＡＡＧＣＡＵＣｄＴｄＴ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １８５）
アンチセンス鎖：５’−ＧＡＵＧＣＵＵＡＵＧＵＧＧＣＡＵＡＣＵｄＴｄＴ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １８６）
【０２３３】
陰性対照組（ＮＣ）：干渉断片を追加していない原始ｐＧＣｓｉ−Ｈ１／Ｎｅｏプラスミド、他の工程は実験組と同じである。表１２に結果を示す。
【０２３４】
【表１２】
0006706628.tif 000014
【０２３５】
表１２に示すように、ｓｉＲＮＡ−ＡＤ−０８をコーディングするＤＮＡをトランスフェクションしても、ＡＤＡＭ１７を有効にサイレンシングした。
【０２３６】
実施例１３      化学修飾のｓｉＲＮＡｓによるＡＤＡＭ１７のサイレンシング
【０２３７】
ｓｉＲＮＡ−ＲＢ−１３に異なる種類又は異なる組み合せの化学修飾（例えば表６と表１４）を行って、ｓｉＲＮＡの安定性や干渉効果を向上させた。
【０２３８】
【表１３−１】
0006706628.tif 000015
【０２３９】
【表１３−２】
0006706628.tif 000016
【０２４０】
表１３に示す化学修飾ｓｉＲＮＡはｈＦＬＳ細胞にトランスフェクションされ、実施例９の方法でＡＤＡＭ１７  ｍＲＮＡレベルを検出した。コレステロール、ポリペプチド又はガラクトース修飾のｓｉＲＮＡｓを使用する時、トランスフェクション試薬を加入しない。
【０２４１】
表１３に示すよう、適切に化学修飾された後のｓｉＲＮＡ−ＡＤ−１３とｓｉＲＮＡ−ＡＤ−０８は、ＡＤＡＭ１７を有効にサイレンシングした。
【０２４２】
実施例１４        化学修飾によるｓｉＲＮＡｓの血清安定性
【０２４３】
実施例１３の化学修飾ｓｉＲＮＡｓに血清安定性の検出を行って、その工程は、各ｓｉＲＮＡ分子をＲＮＡａｓｅ無し水で５μＭまで希釈した後、同体積の新鮮なラット血清を加入し、混合物を３７℃で３分孵化し、その後、ｓｉＲＮＡｓの完全性を電気泳動検出した。
【０２４４】
図１１に示すように、ラット血清と３０分孵化した後、未修飾のｓｉＲＮＡ−ＡＤ−１３は明らかに分解され、化学修飾のｓｉＲＮＡ−ＡＤ−２６、ｓｉＲＮＡ−ＡＤ−３９、ｓｉＲＮＡ−ＡＤ−４０は分解の傾向が見られなかった。
【０２４５】
実施例１５        ｓｉＲＮＡｓで関節炎モデルラットを処理した場合の有効性
【０２４６】
関節炎モデルラットの構築は実施例７と同じである。
【０２４７】
ウシII型コラーゲン３ｄを注射した後、関節炎ラットを８匹ずつランダムに、１００μＬ  ＰＢＳを注射する対照組であるＰＢＳ組と、５０μＬ／足で１０ｎｍｏｌのｓｉＲＮＡ溶液（１００μＬ）を注射するｓＲＮＡ−ＡＤ−２６、ｓｉＲＮＡ−ＡＤ−４０、ｓｉＲＮＡ  −ＡＤ−３９実験組との４組に分けた。各組はいずれも毎週に２回投薬し（対照又はｓｉＲＮＡ）、連続して２週間投薬した。
【０２４８】
各組から４匹のラットを取って、第４回の投薬が終了した後の次の日に動物を殺して、膝関節を取って組織保存液に固定し、標準方法であるヘマトキシリン‐エンジン（ＨＥ）とトルイジンブルー（ＴＢ）で染色し、顕微鏡で組織構造の変化を分析した。
【０２４９】
結果は図１２に示し、ここで、ＡとＢはＰＢＳ組モデル組のＨＥとＴＢ染色（２０×）で、ＣとＤはＰＢＳ組モデル組のＨＥとＴＢ染色（１０×）であって、ＥとＦは投薬組ｓｉＲＮＡ−ＡＤ−４０のＨＥとＴＢ染色（２０×）で、ＧとＨは投薬組ｓｉＲＮＡ−ＡＤ−４０のＨＥとＴＢ染色（１０×）であって、ＩとＪはｓｉＲＮＡ−ＡＤ−２６投薬組のＨＥとＴＢ染色（２０×）で、ＫとＬはｓｉＲＮＡ−ＡＤ−２６投薬組のＨＥとＴＢ染色（１０×）であって、ＭとＮはｓｉＲＮＡ−ＡＤ−３９投薬組のＨＥとＴＢ染色（２０×）で、ＯとＰはｓｉＲＮＡ−ＡＤ−３９投薬組のＨＥとＴＢ染色（１０×）である。
【０２５０】
図１２に示すように、２週間投薬した後、ＰＢＳモデル組に、関節面と関節腔の大量線維化、メニスカス骨化、軟骨層細胞混乱、コラーゲン大量流出等の炎症性症状が現れた。ＰＢＳ組に比べ、ｓｉＲＮＡ−ＡＤ−４０投薬組はメニスカス骨化が見られたが、形状は正常であって、関節面は滑らかで、骨化と線維化が局部的で、軟骨層細胞の配列は正常で、コラーゲンの流出は局部的でした。ｓｉＲＮＡ−ＡＤ−２６投薬組はメニスカス骨化やコラーゲン流出が見られたが、関節腔内は鮮明であった。ｓｉＲＮＡ−ＡＤ−３９投薬組は関節面が滑らかで、関節腔における線維化組織が少量で、半月板や軟骨の骨化が局部的で、軟骨層細胞は順序に配列されていて、コラーゲンの流出が一部だけでした。
【０２５１】
結果、ｓｉＲＮＡ−ＡＤ−２６、ｓｉＲＮＡ−ＡＤ−３９、ｓｉＲＮＡ−ＡＤ−４０は関節炎ラットの疾患過程を抑制したことが分かる。前記ｓｉＲＮＡｓを潜在的な関節炎を治療する薬剤とすることができる。
【０２５２】
実施例１６      ｓｉＲＮＡｓがラット関節免疫性因子を抑制する有効性
【０２５３】
実施例１５の方法でＰＢＳ組、ｓｉＲＮＡ−ＡＤ−２６、ｓｉＲＮＡ−ＡＤ−３９、ｓｉＲＮＡ−ＡＤ−４０組を構築した。ここで、ｓｉＲＮＡ−ＡＤ−４１組中のｓｉＲＮＡがキトサンナノ粒子でラップされ、その他の工程は同じである。
【０２５４】
第４回の投薬処理後の次の日に動物を殺して、膝関節を取って液体窒素で冷凍した。ＲＮｅａｓｙ（登録商標）  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）で膝関節ＲＮＡを抽出して逆転写した。それぞれ実施例１と９の方法でＡＤＡＭＴＳ−５とＡＤＡＭ１７  ｍＲＮＡの発現レベルを測定した。実施例１０の方法でＴＮＦ、ＣＯＸ−２、ＩＬ−１βの発現レベルを検出した。
【０２５５】
結果は図１３に示し、「Ｎｏｒｍａｌ（健康組）」は、健康な雄性ＳＤラット組を指し、「モデル組」はＰＢＳ組である。図１３に示すように、健康な雄性ＳＤラット組に比べ、ＰＢＳ組中のＡＤＡＭＴＳ−５、ＡＤＡＭ１７、ＴＮＦ、ＣＯＸ−２、ＩＬ−１βの発現は増加した。しかし、ｓｉＲＮＡ−ＡＤ−４０、ｓｉＲＮＡ−ＡＤ−３９、ｓｉＲＮＡ−ＡＤ−２６は、このような免疫性因子の発現レベルを顕著にダウンレギュレーションし、軟骨と滑膜を保護する効果があった。これに基づいて、前記ｓｉＲＮＡｓは、炎症に関連する疾患を有効に予防及び／又は治療できることが分かる。
【０２５６】
実施例１７      ｓｉＲＮＡｓ長期投薬の効果
【０２５７】
実施例１６の方法でＰＢＳ組と、ｓｉＲＮＡ−ＡＤ−４０一回量投薬組（一回量投薬、１．５又は３週間投薬した後に発現レベルを検出した）と、ｓｉＲＮＡ−ＡＤ−４０長期投薬組（長期投薬、０．５週あたりに１回投薬し、１．５週又は３週持続する）とを構築した。実施例９の方法でＡＤＡＭ１７  ｍＲＮＡの発現レベルを検出した。実施例１０の方法でＴＮＦ、ＣＯＸ−２とＩＬ−１βの発現レベルを検出した。
【０２５８】
図１４Ｂに示すように、１．５週の時間において長期投薬と一回量投薬との免疫性因子の発現レベルに対する抑制効果は類似である。２種類の投薬方案で、ＡＤＡＭ１７、ＴＮＦ、ＣＯＸ−２、ＩＬ−１βの発現レベルはいずれも低下された。図１４Ａに示すように、治療が３週まで延長された時、長期投薬の抑制効果がもっと優れている。
【０２５９】
実施例１８      ｓｉＲＮＡｓを組み合せて使用する際の炎症因子に対する抑制
【０２６０】
ＡＤＡＭＴＳ−５＋ＡＤＡＭ１７組：初代培養ｈＦＬＳ細胞を６ウェルプレートに接種し、５０％まで成長してシート状に融合された時、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅｒ（登録商標）２０００キットの説明書に従って、２５ｎＭ  最終濃度のｓｉＲＮＡ−ＲＢ−１３と２５  ｎＭ最終濃度のｓｉＲＮＡ−ＡＤ−１３とを細胞にトランスフェクションした。
【０２６１】
ＡＤＡＭＴＳ−５組：ｓｉＲＮＡ−ＲＢ−１３を５０ｎＭの最終濃度でｈＦＬＳ細胞にトランスフェクションし、その他の工程はＡＤＡＭＴＳ−５＋ＡＤＡＭ１７組と同じである。
【０２６２】
ＡＤＡＭ１７組：ｓｉＲＮＡ−ＡＤ−１３を５０ｎＭの最終濃度でｈＦＬＳ細胞にトランスフェクションし、その他の工程はＡＤＡＭＴＳ−５＋ＡＤＡＭ１７組と同じである。
【０２６３】
標的無し（ＮＴＣ）対照組：以下のランダムな非特異ｓｉＲＮＡをｈＦＬＳ細胞にトランスフェクションし、その他の工程はＡＤＡＭＴＳ−５＋ＡＤＡＭ１７組と同じである。
センス鎖：５’−ＵＵＣＵＣＣＧＡＡＣＧＵＧＵＣＡＣＧＵｄＴｄＴ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １８９）；
アンチセンス鎖：５’−ＡＣＧＵＧＡＣＡＣＧＵＵＣＧＧＡＧＡＡｄＴｄＴ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １９０）。
【０２６４】
陰性対照組（ＮＣ）：ｓｉＲＮＡのトランスフェクションがなく、その他の工程はＡＤＡＭＴＳ−５＋ＡＤＡＭ１７組と同じである。
【０２６５】
２４時間トランスフェクションした後、無血清培地に換えて、各組の細胞を２４時間飢餓培養した。最終濃度が１０ｎｇ／ｍｌになるように、ＩＬ１−α（１０ｎｇ／ｍｌ）を加入し、２４時間刺激した。実施例２の方法でＩＬ−１βの分泌レベルを検出した。
【０２６６】
結果は図１５に示し、単一のｓｉＲＮＡ投薬に比べ、ｓｉＲＮＡ−ＲＢ−１３とｓｉＲＮＡ−ＡＤ−１３とを組み合せて投薬した場合、ＩＬ−１β分泌に対する抑制効果が顕著に向上された。
【０２６７】
実施例１９      組み合せのｓｉＲＮＡが関節炎モデルラットを治療する有効性
【０２６８】
関節炎モデルラットの構築は実施例７と同じである。
【０２６９】
ウシII型コラーゲン３ｄを注射した後、１２匹の関節炎ラットそれぞれの一側の後ろ足に１００μＬ  ＰＢＳを適用して対照組とし、他の側の後ろ足に１０ｎｍｏｌ  ｓｉＲＮＡ−ＲＢ−４０と１０ｎｍｏｌ  ｓｉＲＮＡ−ＡＤ−２６とを合計１００μＬ適用してＡＤ５＆１７組とし、毎週に２回投薬し、連続して３週間投薬した。第２、４、６回の投薬処理後の次の日に動物をそれぞれ殺して材料をとった。膝関節を組織保存液に固定し、標準方法であるヘマトキシリン‐エンジン（ＨＥ）とトルイジンブルー（ＴＢ）で染色し、顕微鏡で組織構造の変化を分析した。
【０２７０】
ＨＥとＴＢ染色結果は図１６Ａと１６Ｂに示す。結果から、モデルを構築してから１週間後に、対照組の軟骨細胞の配列が混乱し、軟骨層が肥厚し、メニスカスが骨化し、軟骨コラーゲンが流出した。反対に、ＡＤ５＆１７組は軟骨コラーゲンの流出が見られなく、わずかなメニスカスの骨化のみがあった。モデルを構築してから２週間後に、対照組の軟骨下骨層に局部的な線維化が見られ、軟骨層の関節腔に接近する部分と滑膜層とのいずれも線維化肥厚があって、同時に、コラーゲンが厳重に流出し、関節嚢線維化が厳重で、メニスカスが骨化した。しかし、ＡＤ５＆１７組は局部的な軟骨層コラーゲンの少量流出しかなかった。モデルを構築してから３週間後に、対照組は関節面が厳重に線維化され、関節腔に組織断片があって、大量の炎症性細胞浸潤もあった。一方、ＡＤ５＆１７組は滑らかな関節面及び活性の軟骨細胞を維持した。当該結果によると、観察した各段階において、ＡＤ５＆１７組の病理変化はいずれも対照組より軽いことが分かる。ＡＤ５＆１７  ｓｉＲＮＡｓを組み合せて使用すると、ラット関節炎の進捗を抑制できることが分かる。
【０２７１】
実施例２０  組み合せｓｉＲＮＡによってラット関節免疫性因子を抑制する有効性
【０２７２】
実施例７の方法でＡＤＡＭＴＳ−５−ｓｉＲＮＡ＆ＡＤＡＭ１７−ｓｉＲＮＡ投薬組を構築し、ここで、各足にそれぞれ５ｎｍｏｌのｓｉＲＮＡ−ＲＢ−４０とｓｉＲＮＡ−ＡＤ−２６を注射し、毎週に２回投薬した。関節炎モデル組の構築方法は実施例７と同じであって、同使用量のＰＢＳを注射した。健康なラット組は雄性ＳＤラット（２２０±２０ｇ）である。
【０２７３】
それぞれ第２、４、６回の投薬処理を行った次の日に動物を殺して材料を取って、膝関節滑液体を取って窒素冷凍した。冷凍した膝関節からＲＮＡを抽出し、ＲＮｅａｓｙ（登録商標）  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）でｃＤＮＡに逆転写した。実施例１と９の方法でＡＤＡＭＴＳ−５とＡＤＡＭ１７  ｍＲＮＡ発現レベルを検出した。実施例２の方法でＴＮＦ、ＣＯＸ−２、ＩＬ−１βの発現レベルを検出した。結果は表１４に示す。
【０２７４】
【表１４】
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【０２７５】
健康なラット組に比べ、関節炎モデルラット組中のＡＤＡＭＴＳ−５、ＡＤＡＭ１７、ＴＮＦ、ＣＯＸ−２、ＩＬ−Ｉβの発現レベルは向上された。しかし、ｓｉＲＮＡｓ組み合せ投薬組は、１〜３週間投薬した後、顕著な遺伝子サイレンシング作用が見られた。よって、ＡＤＡＭＴＳ−５とＡＤＡＭ１７  ｓｉＲＮＡｓを組み合せて使用すると、炎症に関連する疾患を効率的に治療することができる。
【０２７６】
実施例２１        毒性の検出（データは示していない）
【０２７７】
異なる使用量でのｓｉＲＮＡｓによる健康な雄性ＳＤラット（２２０±２０ｇ）に対する毒性影響を研究した。１組は尾静脈に注射し、１組は局部の関節に注射し、２組の注射体積はいずれも０．２ｍｌである。尾静脈組はさらに、ＰＢＳ子組と、１０ｎｍｏｌ、５０ｎｍｏｌ、１００ｎｍｏｌの三つのｓｉＲＮＡ子組とに分けられ、各子組は６匹のラットを含む。ｓｉＲＮＡ−ＲＢ−４０＆ｓｉＲＮＡ−ＡＤ−２６を組み合せ、各子組の使用量はそれぞれ１０ｎｍｏｌ、５０ｎｍｏｌ、１００ｎｍｏｌである。局部関節注射組も上述した四つの子組に分けられ、各組は９匹のラットを含む。毎週に２回投薬した。
【０２７８】
毎回の投薬を行う前に尾静脈組の動物の体重を計って、３週間投薬した後に殺す。局部関節注射組の動物は、それぞれ第２回、第４回、第６回の投薬を行った後の三日目に動物を殺し、各子組は３匹を含み、病理分析と生物化学検出に利用した。結果、尾静脈組動物は死亡がなく、実験中に体重の低減が見られなかった。局部関節注射組の動物も死亡がなく、実験中に動物の行為に異常がなく、病理セクション分析した結果、明確な線維化損害はなかった。
【０２７９】
実施例２２      ｓｉＲＮＡｓのプリ投薬の影響（データは示していない）
【０２８０】
４５匹の健康な雄性ＳＤラット（２２０±２０ｇ）それぞれの膝関節にそれぞれ１０ｎｍｏｌ、５０ｎｍｏｌ、又は１００ｎｍｏｌのｓｉＲＮＡ組成物ｓｉＲＮＡ−ＲＢ−４０とｓｉＲＮＡ−ＡＤ−２６を適用した後、所定の時間で０．２ｍｌウシII型コラーゲン（２ｍｇ／ｍｌ）を供給して刺激し、３日刺激した後に動物を殺した。
【０２８１】
１０ｎｍｏｌ  組：コラーゲンで刺激する日の３日と５日前に前処理を行って、ＰＢＳを注射した関節炎モデル組に比べ、一定の保護作用が見られた。ｓｉＲＮＡｓプリ投薬組は、膝関節のダメージが軽く、軟骨細胞が完全であって、順序に排列されていて、滑膜層に明確な線維性肥厚がなく、半月板が完全であった。コラーゲンで刺激する日の８日と１２日前に前処理した症状はモデル組に類似し、明確な線維性ダメージがあって、半月板は一部又は全部壊れて、関節の表面は線維性肥厚し、軟骨細胞の配列は混乱し、局部的に骨化があった。
【０２８２】
５０ｎｍｏｌと１００ｎｍｏｌ組：コラーゲンで刺激する日の３日と８日前の前処理はいずれも耐コラーゲン誘導の関節ダメージの保護作用があった。ここで、コラーゲンで刺激する日の３日前に前処理したラットはコラーゲンで刺激していない健康な雄性ＳＤラット（正常組）に類似した。しかし、コラーゲンで刺激する日の８日前に前処理したラットには、軽い半月板壊れや骨化があって、関節周囲の結合組織は線維性肥厚したが、関節面は滑らかで完全であって、軟骨細胞は順序に排列され、局部から軟骨細胞の骨化が見られた。コラーゲンで刺激する日の１２日前に前処理した状況はモデル組に類似する。
【０２８３】
従って、ＯＡが発生する前のｓｉＲＮＡ前処理は保護作用があって、且つ当該保護作用はプリ投薬の時間と関連する可能性がある。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【配列表】
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