(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
チロシンアンモニアリアーゼ（ＴＡＬ）ポリペプチドをコードする組み換え遺伝子を含む組み換え宿主であって、宿主がフェニルプロパノイドまたはフェニルプロパノイド誘導体化合物を生産することができ、およびＴＡＬポリペプチドをコードする遺伝子が、配列番号３１に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するポリペプチドをコードする、前記宿主。
【請求項２】
ＴＡＬポリペプチドをコードする遺伝子が、配列番号３１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、請求項１に記載の宿主。
【請求項３】
ＴＡＬポリペプチドをコードする遺伝子が、過剰発現される、請求項１または２に記載の宿主。
【請求項４】
組み換え宿主が、ＴＡＬポリペプチドをコードする組み換え遺伝子を含まない組み換え宿主と比較して、増加した収量のフェニルプロパノイドまたはフェニルプロパノイド誘導体化合物を生産することができる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の宿主。
【請求項５】
（ａ）スチルベンシンターゼ（ＳＴＳ）ポリペプチド；または
（ｂ）カルコンシンターゼ（ＣＨＳ）ポリペプチド
をコードする組み換え遺伝子をさらに含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の宿主。
【請求項６】
１以上の（ａ）Ｌ−フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）ポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｂ）シンナマート−４−ヒドロキシラーゼ（Ｃ４Ｈ）ポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｃ）ＮＡＤＰＨ：シトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｄ）４−クマラート−ＣｏＡリガーゼ（４ＣＬ）ポリペプチドをコードする遺伝子；または
（ｅ）カルコンイソメラーゼ（ＣＨＩ）ポリペプチドをコードする遺伝子
ここで少なくとも１つの遺伝子が、組み換え遺伝子である
をさらに含む、
請求項１〜５のいずれか一項に記載の宿主。
【請求項７】
フェニルプロパノイド化合物が、クマル酸である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の宿主。
【請求項８】
フェニルプロパノイド誘導体化合物が、スチルベノイド化合物またはカルコン化合物である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の宿主。
【請求項９】
スチルベノイド化合物が、レスベラトロールまたはレスベラトロール誘導体である、請求項８に記載の宿主。
【請求項１０】
カルコン化合物が、ナリンゲニンまたはナリンゲニン誘導体である、請求項８に記載の宿主。
【請求項１１】
フェニルプロパノイド誘導体化合物が、レスベラトロールである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の宿主。
【請求項１２】
宿主が、酵母細胞、植物細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、真菌細胞、または細菌細胞である微生物を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の宿主。
【請求項１３】
微生物が、細菌細胞であり、および細菌細胞が、Escherichia細菌細胞、Lactobacillus細菌細胞、Lactococcus細菌細胞、Cornebacterium細菌細胞、Acetobacter細菌細胞、Acinetobacter細菌細胞、またはPseudomonas細菌細胞を含む、請求項１２に記載の宿主。
【請求項１４】
微生物が、酵母細胞であり、および酵母細胞が、Saccharomyces cerevisiae、Schizosaccharomyces pombe、Yarrowia lipolytica、Candida glabrata、Ashbya gossypii、Cyberlindnera jadinii、Pichia pastoris、Kluyveromyces lactis、Hansenula polymorpha、Candida boidinii、Arxula adeninivorans、Xanthophyllomyces dendrorhous、またはCandida albicans種由来の細胞である、請求項１２に記載の宿主。
【請求項１５】
酵母細胞が、Saccharomyceteである、請求項１４に記載の宿主。
【請求項１６】
酵母細胞が、Saccharomyces cerevisiae種由来の細胞である、請求項１５に記載の宿主。
【請求項１７】
フェニルプロパノイドまたはフェニルプロパノイド誘導体化合物を生産する方法であって、組み換え遺伝子が発現される条件下で、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の組み換え宿主を培養培地中で増殖させることを含み、フェニルプロパノイドまたはフェニルプロパノイド誘導体化合物が、組み換え宿主により合成される、前記方法。
【請求項１８】
培養培地からフェニルプロパノイドまたはフェニルプロパノイド誘導体化合物を回収することをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
培養培地からフェニルプロパノイドまたはフェニルプロパノイド誘導体化合物を単離することをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
発明の分野
本明細書に開示される発明は、一般的に、遺伝子工学の分野に関する。特に、本明細書に開示される発明は、フェニルプロパノイド、ならびにカルコンおよびスチルベンなどのフェニルプロパノイド誘導体、例えば生合成的生産のための方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
関連技術の説明
フェニルプロパノイドは、フェノールアミノ酸前駆体から植物において生合成で生産されるフェノール化合物の多様なファミリーである。フェニルプロパノイドおよびその誘導体は、例えば、食品および健康産業において所望の用途を有する。
【０００３】
例示的なフェニルプロパノイド誘導体は、下流のフェニルプロパノイド誘導体の生産における中間体でもある化合物である、ナリンゲニンである。ナリンゲニンは、化学構造：
【化１】
0006799010.tif 000002
を有する。
【０００４】
ナリンゲニンは、植物において天然に、および、またフラボノイド生合成経路の構成要素で遺伝子的に操作された細胞において生合成で生産される（例えば、Koopman et al., (2012) Microbial Cell Factories 2012, 11:155を参照）。例えば、クマロイル−ＣｏＡを生産するために操作された細胞は、クマロイル−ＣｏＡをナリンゲニンに変換するタンパク質を発現する組み換え遺伝子でさらに操作される。
【０００５】
別の例示的なフェニルプロパノイド誘導体は、他の下流のフェニルプロパノイド誘導体の生産における中間体でもある、スチルベンレスベラトロールである。レスベラトロールは、化学構造：
【化２】
0006799010.tif 000003
を有する。レスベラトロールはまた、クマロイル−ＣｏＡ前駆体分子を使用して生産される。
【０００６】
一般的に、レスベラトロールを含むスチルベン、および、カルコンは、図1に示される反応により例証されるように、およびU.S. 2008/0286844（参照によりその全体において本明細書に組み込まれる）に記載されるように、フェニルプロパノイド経路を通じて植物および酵母において生産される。
【０００７】
酵母において、出発代謝物は、マロニル−ＣｏＡ、および、フェニルアラニンまたはチロシンのいずれかである。アミノ酸Ｌ−フェニルアラニンは、Ｌ−フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）により非酸化的脱アミノを通じてトランス−ケイ皮酸に変換される。次に、トランス−ケイ皮酸は、ＮＡＤＰＨ：シトクロムＰ４５０レダクターゼ（ＣＰＲ）とともに、シンナマート−４−ヒドロキシラーゼ（Ｃ４Ｈ）、シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ酵素により、４−クマル酸（４−ヒドロキシケイ皮酸）へとパラ位においてヒドロキシル化される。あるいは、アミノ酸Ｌ−チロシンは、チロシンアンモニアリアーゼ（ＴＡＬ）により、４−クマル酸に直接変換される。どちらの経路からの４−クマル酸も、その後、４−クマラート−ＣｏＡリガーゼ（４ＣＬ）の作用により、４−クマロイル−ＣｏＡへと活性化される。フェニルプロパノイド経路の中でも、４−クマロイル−ＣｏＡは、カルコンおよびスチルベンを含むフェニルプロパノイド誘導体がそれから誘導される重要な分岐点を代表する。スチルベンは、レスベラトロールシンターゼ（ＲＳ）としても知られているスチルベンシンターゼ（ＳＴＳ）を介して合成され、４−クマロイル−ＣｏＡのフェニルプロパンユニットのマロニル−ＣｏＡとの縮合を触媒し、レスベラトロールの形成をもたらす。反対に、カルコンは、４−クマロイル−ＣｏＡのフェニルプロパンユニットのマロニル−ＣｏＡおよびカルコンシンターゼ（ＣＨＳ）との縮合を介して合成され、テトラヒドロキシカルコンの形成をもたらす。
【０００８】
ナリンゲニン、レスベラトロール、および他のフェニルプロパノイド誘導体を生産する現在の方法は、基質としてクマロイル−ＣｏＡなどのフェニルプロパノイドと競合する経路により限定されている。例えば、ナリンゲニンを生産するために操作された細胞はまた、未知のメカニズムによりフロレト酸を生産する（例えば、Koopman et al., (2012) Microbial Cell Factories 2012, 11:155を参照）。フロレト酸は、フェニルプロパノイド経路の副生成物である。それは、フェニルプロパノイド（例えば、ｐ−クマロイル−ＣｏＡ）からジヒドロフェニルプロパノイド（例えば、ｐ−ジヒドロクマロイル−ＣｏＡ）に変換される、ジヒドロフェニルプロパノイドである。しかしながら、ジヒドロフェニルプロパノイドの生産（およびナリンゲニン生産の減少）を担う酵素は、現在知られていない。
【０００９】
Ｌ−フェニルアラニンをアンモニアおよびトランス−ケイ皮酸に変換するフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）、ならびにＬ−チロシンをｐ−クマル酸に変換するチロシンアンモニアリアーゼ（ＴＡＬ）は、両者ともに芳香族アミノ酸リアーゼファミリーのメンバーである。芳香族アミノ酸リアーゼファミリーの第３のメンバーは、ヒスチジンをトランス−ウロカニン酸に変換するヒスチジンアンモニアリアーゼ（ＨＡＬ）である。ほとんどのアンモニアリアーゼは、フェニルアラニンに対する強い選好とともに、フェニルアラニンおよびチロシンの両者に親和性を有する。これらの酵素は、ＰＡＬ／ＴＡＬと称される。Watts, K.T. et al. (2006)は、基質特異性を担う単一の活性部位残基を同定し、Rhodobacter sphaeroides  ＴＡＬにおける活性部位残基Ｈｉｓ８９のＰｈｅでの置き換えが、その基質選択性をチロシンからフェニルアラニンへ切り替えたこと（Watts, K.T. et al. (2006) Chemistry & Biology 13, 1317-1326）を報告している。
【００１０】
一般的に、ＰＡＬは、ＴＡＬよりもより活性な酵素であり、それゆえ、Saccharomyces cerevisiaeなどの酵母株において、フェニルプロパノイドの生産に好まれている（例えば、U.S. Pat. No. 8,895,287を参照）。しかしながら、S. cerevisiaeなどのフェニルプロパノイドおよびフェニルプロパノイド誘導体を生産する株において、活性で特異的なＴＡＬを発見することおよび導入することは、フェニルプロパノイド経路を経る炭素流動（flux）の実質的な増加をもたらし、それゆえフェニルプロパノイドまたはカルコンおよびスチルベンを含むフェニルプロパノイド誘導体の増加した生産をもたらす可能性がある。
【００１１】
ＰＡＬおよびＴＡＬの両者の使用を通じた異種のフェニルプロパノイド経路の発現は報告されている（Koopman, F. et al., 2012, Microbial Cell Factories, 11:155を参照）。Koopman, F. et al. (2012)（同文献）は、Rhodobacter capsulatus由来のＴＡＬ（ＲｃＴＡＬ）を使用した。しかしながら、芳香族アミノ酸の合成を調節解除し、それにより利用可能なチロシンが増加した後でさえ、ＲｃＴＡＬは、非常に乏しい活性を示し、したがって、産業用途において使用することはできない。したがって、高い収量のフェニルプロパノイドまたはフェニルプロパノイド誘導体を生産する、酵母において活性で特異的なＴＡＬの発現についての需要はいまだ存在する。
【発明の概要】
【００１２】
発明の概要
上述の背景に対して、本発明は、先行技術に対する特定の利点および進歩を提供する。
【００１３】
本明細書に開示される発明は、特定の利点または機能性に限定されないが、本明細書に開示される発明は、チロシンアンモニアリアーゼ（ＴＡＬ）ポリペプチドをコードする組み換え遺伝子を含む組み換え宿主であって、宿主がフェニルプロパノイドまたはフェニルプロパノイド誘導体化合物を生産することができ、ＴＡＬポリペプチドが、好ましい基質としてチロシンを使用する、前記組み換え宿主を提供する。
【００１４】
本発明は、フェニルプロパノイドまたはフェニルプロパノイド誘導体化合物を生産する方法であって、組み換え遺伝子が発現される条件下で、本明細書に記載される組み換え宿主を培養培地中で増殖させることを含み、フェニルプロパノイドまたはフェニルプロパノイド誘導体化合物が、組み換え宿主により合成される、前記方法をさらに提供する。
【００１５】
いくつかの側面において、ＴＡＬポリペプチドをコードする遺伝子は、配列番号３１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。
【００１６】
いくつかの側面において、ＴＡＬポリペプチドをコードする遺伝子は、配列番号３１に記載のアミノ酸配列と少なくとも６５％の同一性を有するポリペプチドをコードする。
【００１７】
いくつかの側面において、ＴＡＬポリペプチドをコードする遺伝子は、組み換え宿主において過剰発現される。
【００１８】
いくつかの側面において、ＴＡＬ遺伝子を含有する組み換え宿主は、ＴＡＬポリペプチドをコードする遺伝子を含まない組み換え宿主と比較して、増加した収量のフェニルプロパノイドまたはフェニルプロパノイド誘導体化合物を生産することができる。
【００１９】
いくつかの側面において、ＴＡＬ遺伝子を含有する組み換え宿主は、ＴＡＬポリペプチドをコードする遺伝子を含まない組み換え宿主と比較して、増加した収量のフェニルプロパノイドまたはフェニルプロパノイド誘導体化合物を生産する。
【００２０】
いくつかの側面において、ＴＡＬ遺伝子を含有する組み換え宿主は、ＴＡＬポリペプチドをコードする遺伝子を含まない組み換え宿主と比較して、増加した収量の１以上の（１）レスベラトロールおよび（２）クマル酸を生産する。
【００２１】
本明細書に開示される組み換え宿主または方法のいくつかの側面において、組み換え宿主は、
（ａ）スチルベンシンターゼ（ＳＴＳ）ポリペプチド；または
（ｂ）カルコンシンターゼ（ＣＨＳ）ポリペプチド
をコードする組み換え遺伝子をさらに含む。
【００２２】
本明細書に開示される組み換え宿主または方法のいくつかの側面において、組み換え宿主は、１以上の（ａ）Ｌ−フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）ポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｂ）シンナマート−４−ヒドロキシラーゼ（Ｃ４Ｈ）ポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｃ）ＮＡＤＰＨ：シトクロムＰ４５０レダクターゼポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｄ）４−クマラート−ＣｏＡリガーゼ（４ＣＬ）ポリペプチドをコードする遺伝子；または
（ｅ）カルコンイソメラーゼ（ＣＨＩ）ポリペプチドをコードする遺伝子、
ここで少なくとも１つの遺伝子が、組み換え遺伝子である、
をさらに含む。
【００２３】
本明細書に開示される組み換え宿主または方法のいくつかの側面において、フェニルプロパノイド化合物は、クマル酸である。
【００２４】
本明細書に開示される組み換え宿主または方法のいくつかの側面において、フェニルプロパノイド誘導体化合物は、スチルベノイド化合物またはカルコン化合物である。
【００２５】
本明細書に開示される組み換え宿主または方法のいくつかの側面において、スチルベンは、レスベラトロールまたはレスベラトロール誘導体である。
【００２６】
本明細書に開示される組み換え宿主または方法のいくつかの側面において、カルコンは、ナリンゲニンまたはナリンゲニン誘導体である。
【００２７】
本明細書に開示される組み換え宿主または方法のいくつかの側面において、組み換え宿主は、酵母細胞、植物細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、真菌細胞、または細菌細胞である微生物を含む。
【００２８】
本明細書に開示される組み換え宿主または方法のいくつかの側面において、細菌細胞は、Escherichia細菌細胞、Lactobacillus細菌細胞、Lactococcus細菌細胞、Cornebacterium細菌細胞、Acetobacter細菌細胞、Acinetobacter細菌細胞、またはPseudomonas細菌細胞を含む。
【００２９】
本明細書に開示される組み換え宿主または方法のいくつかの側面において、酵母細胞は、Saccharomyces cerevisiae、Schizosaccharomyces pombe、Yarrowia lipolytica、Candida glabrata、Ashbya gossypii、Cyberlindnera jadinii、Pichia pastoris、Kluyveromyces lactis、Hansenula polymorpha、Candida boidinii、Arxula adeninivorans、Xanthophyllomyces dendrorhous、またはCandida albicans種由来の細胞である。
【００３０】
本明細書に開示される組み換え宿主または方法のいくつかの側面において、酵母細胞は、Saccharomyceteである。
【００３１】
本明細書に開示される組み換え宿主または方法のいくつかの側面において、酵母細胞は、Saccharomyces cerevisiae種由来の細胞である。
【００３２】
いくつかの側面において、本明細書に開示される方法は、培養培地からフェニルプロパノイドまたはフェニルプロパノイド誘導体化合物を回収することをさらに含む。
【００３３】
いくつかの側面において、本明細書に開示される方法は、培養培地からフェニルプロパノイドまたはフェニルプロパノイド誘導体化合物を単離することをさらに含む。
【００３４】
これらおよび他の特徴および利点は、添付の特許請求の範囲とともに以下の詳細な説明からより十分に理解される。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
図面の簡単な説明
以下の詳細な説明は、以下の図面とともに読む場合に最も理解することができる。
【００３６】
【図１】図１は、ｐ−クマロイル−ＣｏＡから様々なフェニルプロパノイド誘導体へ分岐するフェニルプロパノイド経路を示す。経路の２つの分岐は、２つのＰＫＳＩＩＩ型酵素：カルコンシンターゼ（ＣＨＳ）およびスチルベンシンターゼ（ＳＴＳ）により生産される例示的なフェニルプロパノイド誘導体とともに示される。レダクターゼ酵素の作用を介したジヒドロフェニルプロパノイド誘導体を生産する分岐もまた示される。他の酵素の略称は、フェニルアラニンリアーゼ（ＰＡＬまたはＴＡＬ）；レダクターゼ（ＣＰＲ）の活性を要求するシンナマート−４−ヒドロキシラーゼ（Ｃ４Ｈ）；４−クマロイル−ＣｏＡリガーゼ（４ＣＬ）；およびカルコンイソメラーゼ（ＣＨＩ）である。
【００３７】
【図２】図２は、ＰＡＬ活性の結果としてケイ皮酸またはＴＡＬ活性の結果としてクマル酸のいずれかから誘導されるフェニルプロパノイド経路の生成物の生産を介した、１５の異なる酵素のＰＡＬおよびＴＡＬ活性を示す。
【００３８】
【図３】図３は、Ａｓａｌ  ＴＡＬを過剰発現するレスベラトロール生産酵母株、およびレスベラトロール生産を導く全ての必要な遺伝子を含有する直接の親のレスベラトロール生産酵母株（対照）におけるレスベラトロールおよび二次代謝物の生産を示す。二次代謝物は、出発代謝物であるマロニル−ＣｏＡ、フェニルアラニンおよび／またはチロシンの中間体（例えば、クマル酸）および副生成物（例えば、フロレト酸）への変換により、むしろレスベラトロールよりも生産されるようである。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
詳細な説明
本明細書で引用される全ての刊行物、特許および特許出願は、全ての目的のために参照により明確に組み込まれる。
【００４０】
多くのフェニルプロパノイド誘導体は、とりわけ医薬化合物として有用であるので、その生産の効率的な方法についての需要が存在する。例えば、カルコンナリンゲニン、およびスチルベンレスベラトロールは、血糖値の制御、およびヒトの健康を改善するための他の潜在的な用途に有用である。
【００４１】
したがって、カルコンおよびスチルベンを含むフェニルプロパノイド誘導体の生合成に有用な材料および方法は、本明細書において提供される。ある態様において、本開示は、ナリンゲニンおよび他のカルコンの生合成のための組み換え宿主および方法を提供する。代替の態様において、本開示は、レスベラトロールおよび他のスチルベンの生合成のための組み換え宿主および方法を提供する。
【００４２】
開示された方法および組成物を詳細に記載する前に、いくつかの用語が定義される。本明細書において用いられる単数形「a」、「an」、および「the」は、文脈が明確に他に指示しない限り、複数の指示対象を含む。例えば、「核酸」（a “nucleic acid”）への言及は、１以上の核酸を意味する。
【００４３】
「好ましくは」、「一般には」および「典型的には」などの用語は、本明細書において、特許請求の範囲を限定するために、または特定の特徴が、特許請求の範囲に記載された発明の構造または機能にとって重要、必須または大切でさえあることを示唆するために利用されないことが留意される。むしろ、これらの用語は、本発明の特定の態様において利用することができる、あるいはできない、代替的なまたは付加的な特徴を強調することが単に意図される。
【００４４】
本発明を説明および定義する目的のために、「増加する（increase）」、「増加する（increases）」、「増加した（increased）」、「より多い」、「より高い」、および「より低い」なる用語は、本明細書において、所定の参照または対照に対する非定量的な比較、値、測定、または他の表現を表すために利用されることが留意される。
【００４５】
本発明を説明および定義する目的のために、「好ましい基質」および「主な基質」などの用語は、互換可能であり、本明細書において、所定の基質に関する非定量的な比較、値、測定、または他の表現を表すために利用されることが留意される。
【００４６】
本発明を説明および定義する目的のために、「実質的な」および「実質的に」なる用語は、本明細書において、任意の定量的な比較、値、測定、または他の表現に起因し得る不確実の固有の程度を表すために利用されることが留意される。用語「実質的な」および「実質的に」はまた、本明細書において、定量的な表現が、問題の主題の基本的な機能に変化をもたらすことなく所定の参照から変更することができる程度を表すために利用される。
【００４７】
当業者によく知られている方法は、本明細書に開示される遺伝子発現コンストラクトおよび組み換え細胞を構築するために用いることができる。これらの方法は、in vitro組み換えＤＮＡ技術、合成技術、in vivo組み換え技術、およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を含む。例えば、Maniatis et al., 1989, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory, New York；Ausubel et al., 1989, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, New York, and PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications（Innis et al., 1990, Academic Press, San Diego, CA）に記載される技術を参照。
【００４８】
本明細書で用いられる用語「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、および「核酸」は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、それらの誘導体、またはそれらの組み合わせを含む核酸を指すために、互換可能に用いることができる。
【００４９】
本明細書で用いられる用語「微生物」、「微生物宿主」、「微生物宿主細胞」、「宿主細胞」、および「組み換え宿主細胞」は、互換可能に使用することができる。本明細書で用いられる用語「組み換え宿主」は、そのゲノムが少なくとも１つのＤＮＡ配列により増強されている、宿主を指すことが意図される。かかるＤＮＡ配列は、限定されないが、天然に存在しない、通常ＲＮＡに転写されない、もしくは細胞中で自然にタンパク質に翻訳され（「発現され」）ない、遺伝子もしくはＤＮＡ配列、および宿主に導入されることを望む他の遺伝子もしくはＤＮＡ配列を含む。典型的には、本明細書に記載される組み換え宿主のゲノムは、１以上の組み換え遺伝子の安定的な導入を通じて増強されることが理解される。一般的に、導入されたＤＮＡは、ＤＮＡのレシピエントである宿主に元から存在しないが、所与の宿主からＤＮＡセグメントを単離すること、および同じ宿主にＤＮＡの１以上の追加のコピーを続いて導入すること、例えば、遺伝子産物の生産を増大させること、または遺伝子の発現パターンを変更することは、本開示の範囲内である。いくつかの例において、導入されたＤＮＡは、例えば、相同組み換え、または部位特異的突然変異により内在の遺伝子またはＤＮＡ配列を改変する、または置き換えさえする。好適な組み換え宿主は、微生物を含む。
【００５０】
本明細書で用いられる用語「遺伝子」は、本明細書に開示される少なくとも１つのＤＮＡ配列、または本明細書に開示されるアミノ酸配列をコードする任意のＤＮＡ配列、または本明細書に開示されるコード配列の相補鎖にハイブリダイズする任意のＤＮＡ配列からなるポリヌクレオチド単位を指す。好ましくは、この用語は、コードおよび非コード領域、および好ましくは、プロモーター、エンハンサー、および他の調節配列を含む通常の遺伝子発現に必要な全ての配列を含む。
【００５１】
本明細書で用いられる用語「組み換え遺伝子」は、同じまたは同様の遺伝子またはＤＮＡ配列が、かかる宿主中にすでに存在しているかどうかにかかわらず、レシピエント宿主に導入される遺伝子またはＤＮＡ配列を指す。この文脈において、「導入された」または「増強された」は、人の手によって導入または増強されたことを意味することが、当該技術分野において知られている。したがって、組み換え遺伝子は、別の種からのＤＮＡ配列であり得、あるいは同じ種に起源する、または同じ種において存在するが、組み換え宿主を形成するための組み換え方法により宿主中に組み込まれているＤＮＡ配列であり得る。宿主に導入される組み換え遺伝子は、形質転換される宿主に通常存在し、ＤＮＡの１以上の追加のコピーを提供し、それにより、そのＤＮＡの遺伝子産物の過剰発現または改変された発現を可能にするために導入されるＤＮＡ配列と同一であり得る。組み換え遺伝子は、特にｃＤＮＡによりコードされる。
【００５２】
本明細書で用いられる用語「操作された生合成経路」は本明細書に記載されるような組み換え宿主において生じるが、宿主中で天然に生じない生合成経路を指す。いくつかの態様において、操作された生合成経路は、宿主により天然に生産される酵素を含み、ここである態様において、これらの酵素をコードする遺伝子の発現の程度および量が、組み換え宿主において変更される；いくつかの態様において、組み換え宿主において、これらの酵素が過小発現される、またはそれらの発現が排除される。
【００５３】
本明細書で用いられる用語「内在の遺伝子」は、特定の生物、組織または細胞に起源する、または特定の生物、組織もしくは細胞内で生産または合成される遺伝子を指す。
【００５４】
本明細書で用いられる用語「異種配列」および「異種コード配列」は、組み換え宿主以外の種に由来する配列を記載するために用いられる。いくつかの態様において、組み換え宿主は、S. cerevisiae細胞であり、異種配列は、S. cerevisiae以外の生物に由来する。異種コード配列は、例えば、異種配列を発現する組み換え宿主と異なる、原核微生物、真核微生物、植物、動物、昆虫、または真菌に由来し得る。いくつかの態様において、コード配列は、宿主に元から備わっている配列である。
【００５５】
遺伝子コードの縮重により、多くの核酸は、特定のポリペプチドをコードし得る；すなわち、多くのアミノ酸について、アミノ酸のためのコドンとして役割を果たす１超のヌクレオチドトリプレットが存在することが理解される。したがって、所与のポリペプチドのためのコード配列中のコドンは、その微生物についての適切なコドンバイアス表（codon bias table）を用いて、特定の微生物において最適な発現が得られるように改変することができる。核酸はまた、特定の微生物に好ましいＧＣ含量に最適化されてもよく、および／またはリピート配列の数を減少させてもよい。単離された核酸として、これらの改変された配列は、精製された分子とした存在し得、組み換え核酸コンストラクトのためのモジュールの構築における使用のためのベクターまたはウイルスに組み込まれ得る。加えて、異種核酸は、関連する微生物において増加した発現、またはさらに最適化された発現のために改変することができる。したがって、本明細書に開示される方法および組成物のいくつかの態様において、異種核酸は、関連する微生物における発現においてコドン最適化されている。コドン最適化は、当該技術分野において知られている慣用の方法により行われてもよい（例えば、Welch, M., et al. (2011), Methods in Enzymology 498:43-66を参照）。
【００５６】
カルコンおよびスチルベン合成
本明細書で用いられる用語「カルコン」および「カルコノイド」は、互換可能であり、式（Ｉ）：
【化３】
0006799010.tif 000004
の化合物である誘導体を指し、式（Ｉ）は、１以上の好適な位置において置換されていてもよい。例示的な置換基は、限定されないが、ハロゲン、シアノ、ニトロ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６ハロアルキル、Ｃ１−Ｃ６ヒドロキシアルキル、ヒドロキシ、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、チオール、Ｃ１−Ｃ６アルキルチオ、アミノ、Ｃ１−Ｃ６アルキルアミノ、ジ−Ｃ１−Ｃ６アルキルアミノ、カルボキシル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシカルボニル、アミド、およびグリコシルを含む。
【００５７】
本明細書で用いられる用語「スチルベン」および「スチルベノイド」は、互換可能であり、式（ＩＩ）：
【化４】
0006799010.tif 000005
の化合物に基づく化合物を指し、式（ＩＩ）は、１以上の好適な位置において置換されていてもよい。例示的な置換基は、限定されないが、ハロゲン、シアノ、ニトロ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６ハロアルキル、Ｃ１−Ｃ６ヒドロキシアルキル、ヒドロキシ、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、チオール、Ｃ１−Ｃ６アルキルチオ、アミノ、Ｃ１−Ｃ６アルキルアミノ、ジ−Ｃ１−Ｃ６アルキルアミノ、カルボキシル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシカルボニル、アミド、およびグリコシルを含む。
【００５８】
本明細書で用いられる用語「フェニルプロパノイド」は、３−フェニルプロパ−２−エノアート骨格に基づく化合物を指す。かかる化合物の例は、限定されないが、ケイ皮酸、クマル酸、コーヒー酸、フェルラ酸、５−ヒドロキシフェルラ酸、シナピン酸、シンナモイル−ＣｏＡ、ｐ−クマロイル−ＣｏＡなどを含む。
【００５９】
本明細書で用いられる用語「フェニルプロパノイド誘導体」は、フェニルプロパノイドから誘導、合成、または生合成された任意の化合物を指し；すなわち、フェニルプロパノイド誘導体は、フェニルプロパノイド化合物が前駆体または中間体である任意の化合物を含む。フェニルプロパノイド誘導体の例は、限定されないが、スチルベノイド化合物およびカルコン化合物を含む。フェニルプロパノイド誘導体の特定の例は、限定されないが、ナリンゲニン、レスベラトロール、ピノシルビン、ピノセムブリンカルコン、およびピノセムブリンを含む。
【００６０】
本明細書で用いられる用語「ジヒドロフェニルプロパノイド」は、フェニルプロパノアート骨格に基づく化合物を意味する。かかる化合物の例は、限定されないが、ジヒドロケイ皮酸、フロレト酸、３，４−ジヒドロキシヒドロケイ皮酸、ヒドロフェルラ酸、ジヒドロクマロイル−ＣｏＡ、ジヒドロシンナモイル−ＣｏＡなどを含む。
【００６１】
本明細書で用いられる用語「ジヒドロフェニルプロパノイド誘導体」は、ジヒドロフェニルプロパノイドから誘導、合成、または生合成された任意の化合物を指し；すなわち、ジヒドロフェニルプロパノイド誘導体は、ジヒドロフェニルプロパノイド化合物が前駆体または中間体である任意の化合物を含む。ジヒドロフェニルプロパノイド誘導体の例は、限定されないが、ジヒドロスチルベノイド化合物およびジヒドロカルコン化合物を含む。ジヒドロフェニルプロパノイド誘導体の特定の例は、限定されないが、フロレチン、フロリジン、ジヒドロピノシルビン、ジヒドロピノシルビンカルボキシラート、３−Ｏ−メチルジヒドロピノシルビンカルボキシラート、４−イソプレニル−３−Ｏ−メチルジヒドロピノシルビンカルボキシラート（アモルフルチン１）、３−Ｏ−メチルジヒドロピノシルビン、４−イソプレニル−３−Ｏ−メチルジヒドロピノシルビン（アモルフルチン２）、５−ヒドロキシ−ルヌラリン酸，およびジヒドロレスベラトロールを含む。
【００６２】
本明細書で用いられる用語「フェニルプロパノイド経路」、「フェニルプロパノイド誘導体経路」、「フェニルプロパノイド誘導体合成経路」および、「フェニルプロパノイド誘導体生合成経路」は、互換可能であり、フェニルプロパノイドが前駆体または中間体である任意の生合成経路を指す。
【００６３】
「任意の」または「任意に」は、後に記載される事象または状況が起こっても起こらなくてもよいことを意味し、その記載が、前記事象または状況が起こる場合および起こらない場合を含む。
【００６４】
本明細書中で使用される「減少した発現」は、遺伝子またはタンパク質の自然の発現よりも低いレベルでの遺伝子またはタンパク質の発現を指す。例えば、いくつかの態様において、レダクターゼの活性は、レダクターゼをコードする遺伝子のタンパク質生成物または発現の量を減少させることによって、減少する。
【００６５】
遺伝子の発現の減少または排除（すなわち、破壊）は、ＤＮＡ配列の挿入、ミスセンス突然変異、フレームシフト突然変異、欠失、置換または置き換え、またはそれらの任意の組み合わせを含む任意の知られている方法によって達成することができる。挿入は、任意の起源であってもよい遺伝子全体の挿入を含む。遺伝子発現の減少または排除は、例えば、プロモーター、エンハンサーまたは遺伝子のスプライス部位の変更または置き換えを含み、部分的にまたは完全に正常な遺伝子産物の産生の阻害を導くことができる。いくつかの態様において、遺伝子発現の減少または排除は、細胞または生物において発現されるタンパク質生成物の総レベルを変更することを含む。他の態様において、遺伝子の破壊は、細胞または生物における遺伝子のタンパク質生成物の活性を減少または排除することを含む。本開示のいくつかの態様において、破壊はヌル破壊であり、遺伝子の顕著な発現がない。いくつかの態様において、宿主または生物における遺伝子の破壊は、両方の染色体上で起こり、この場合、ホモ接合型破壊である。いくつかの態様において、宿主または生物における遺伝子の破壊は、単に１つの染色体上で起こり、他の染色体コピーは無傷のままであり、この場合、ヘテロ接合型遺伝子破壊である。さらに他の態様において、宿主または生物における遺伝子の各コピーは、異なって破壊される。
【００６６】
遺伝子発現の減少または排除はまた、遺伝子ノックアウトまたはノックダウンを含んでもよい。「遺伝子ノックアウト」は、１以上の遺伝子の発現が排除される細胞または生物を意味する。「遺伝子ノックダウン」は、１以上の遺伝子のレベルが減少しているが、完全には排除されていない細胞または生物を意味する。
【００６７】
いくつかの態様において、組み換え宿主は、フェニルプロパノイド誘導体生合成経路の１以上のポリペプチドをさらに含む。いくつかの態様において、カルコン、スチルベン、または他のフェニルプロパノイド誘導体の生合成において中間体の形成を触媒する組み換え遺伝子が提供される。中間体は、とりわけケイ皮酸、シンナモイル−ＣｏＡ、ｐ−クマル酸、ｐ−クマロイルＣｏＡ、ナリンゲニン、およびレスベラトロールを含む。
【００６８】
いくつかの態様において、Ｌ−フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）ポリペプチドは、前記微生物において発現、過剰発現、または組み換え的に発現され得る。いくつかの態様において、前記ＰＡＬは、Arabidopsis、Brassica、Citrus、Phaseolus、Pinus、Populus、Solanum、Prunus、Vitis、Zea、Agastache、Ananas、Asparagus、Bromheadia、Bambusa、Beta、Betula、Cucumis、Camellia、Capsicum、Cassia、Catharanthus、Cicer、Citrullus、Coffea、Cucurbita、Cynodon、Daucus、Dendrobium、Dianthus、Digitalis、Dioscorea、Eucalyptus、Gallus、Ginkgo、Glycine、Hordeum、Helianthus、Ipomoea、Lactuca、Lithospermum、Lotus、Lycopersicon、Medicago、Malus、Manihot、Medicago、Mesembryanthemum、Nicotiana、Olea、Oryza、Pisum、Persea、Petroselinum、Phalaenopsis、Phyllostachys、Physcomitrella、Picea、Pyrus、Quercus、Raphanus、Rehmannia、Rubus、Sorghum、Sphenostylis、Stellaria、Stylosanthes、Triticum、Trifolium、Triticum、Vaccinium、VignaもしくはZinnia属に属する植物、またはAgaricus、Aspergillus、Ustilago、Rhodobacter、もしくはRhodotorula属に属する微生物に由来するＰＡＬ（ＥＣ４．３．１．５）である。例えば、その全体において参照により組み込まれているWO 2006/089898を参照。いくつかの態様において、ＰＡＬは、Arabidopsis thaliana  ＰＡＬ、例えば、A. thaliana  ＰＡＬ２（配列番号１５）である。
【００６９】
いくつかの態様において、チロシンアンモニアリアーゼ（ＴＡＬ）ポリペプチドは、前記微生物において発現、過剰発現、または組み換え的に発現され得る。いくつかの態様において、前記ＴＡＬは、チロシンおよびフェニルアラニンの両方を基質として使用することができる。いくつかの態様において、前記ＴＡＬは、その主なまたは好ましい基質としてフェニルアラニンを使用しない。いくつかの態様において、前記ＴＡＬは、その主なまたは好ましい基質としてチロシンを使用する。いくつかの態様において、前記ＴＡＬは、チロシンについてのそのＫｍよりも高い、フェニルアラニンについてのＫｍを有し、および／または、前記ＴＡＬは、チロシンについてのそのＫｃａｔよりも低い、フェニルアラニンについてのＫｃａｔを有する。いくつかの態様において、前記ＴＡＬは、Rhodotorula属に属する酵母またはRhodobacter属に属する細菌に由来するＴＡＬ（ＥＣ４．３．１．５）である。例えば、その全体において参照により組み込まれているWO2006/089898を参照。いくつかの態様において、ＴＡＬは、Rhodobacter capsulatus  ＴＡＬ、例えば、R. capsulatus  ＴＡＬ（配列番号１）である。いくつかの態様において、ＴＡＬは、Aeromonas salmonicida  ＴＡＬ、例えば、A. salmonicida subsp. salmonicida A449（Ａｓａｌ）  ＴＡＬ（配列番号３１）である。
【００７０】
いくつかの態様において、シンナマート４−ヒドロキシラーゼ（Ｃ４Ｈ）ポリペプチドは、前記微生物において発現、過剰発現、または組み換え的に発現され得る。いくつかの態様において、前記Ｃ４Ｈは、Arabidopsis、Citrus、Phaseolus、Pinus、Populus、Solanum、Vitis、Zea、Ammi、Avicennia、Camellia、Camptotheca、Catharanthus、Glycine、Helianthus、Lotus、Mesembryanthemum、Physcomitrella、Ruta、SaccharumもしくはVigna属に属する植物、またはAspergillus属に属する微生物に由来するＣ４Ｈ（ＥＣ１．１４．１３．１１）である。例えば、その全体において参照により組み込まれているWO 2006/089898を参照。例えば、その全体において参照により組み込まれているWO 2006/089898を参照。いくつかの態様において、Ｃ４Ｈは、Arabidopsis thaliana  Ｃ４Ｈ（配列番号２）である。
【００７１】
いくつかの態様において、４−クマラート−ＣｏＡリガーゼ（４ＣＬ）ポリペプチドは、前記微生物において発現、過剰発現、または組み換え的に発現され得る。いくつかの態様において、前記４ＣＬは、Abies、Arabidopsis、Brassica、Citrus、Larix、Phaseolus、Pinus、Populus、Solanum、Vitis、Zea、例えば、Z. mays、Agastache、Amorpha、Cathaya、Cedrus、Crocus、Festuca、Glycine、Juglans、Keteleeria、Lithospermum、Lolium、Lotus、Lycopersicon、Malus、Medicago、Mesembryanthemum、Nicotiana、Nothotsuga、Oryza、Pelargonium、Petroselinum、Physcomitrella、Picea、Prunus、Pseudolarix、Pseudotsuga、Rosa、Rubus、Ryza、Saccharum、Suaeda、Thellungiella、TriticumもしくはTsuga属に属する植物、Aspergillus、Neurospora、Yarrowia、Mycosphaerella、Mycobacterium、Neisseria、StreptomycesもしくはRhodobacter属に属する微生物、またはAncylostoma、Caenorhabditis、Haemonchus、Lumbricus、Meilodogyne、StrongyloidusもしくはPristionchus属に属する線虫に由来する４ＣＬ（ＥＣ６．２．１．１２）である。例えば、その全体において参照により組み込まれているWO 2006/089898を参照。いくつかの態様において、４ＣＬは、Arabidopsis thaliana  ４ＣＬ、例えば、A. thaliana  ４ＣＬ２（配列番号３）である。
【００７２】
いくつかの態様において、本開示は、ｐ−クマロイル−ＣｏＡからのスチルベノイドの形成を触媒する組み換えポリペプチドを発現するように操作された組み換え宿主を提供する。したがって、いくつかの態様において、組み換え宿主は、１以上のスチルベンシンターゼ遺伝子をさらに含む。
【００７３】
いくつかの態様において、スチルベンシンターゼ（ＳＴＳ）ポリペプチドは、前記微生物において発現、過剰発現、または組み換え的に発現され得る。いくつかの態様において、前記ＳＴＳは、Arachis、Rheum、Vitis、Pinus、Piceea、Lilium、Eucalyptus、Parthenocissus、Cissus、Calochortus、Polygonum、Gnetum、Artocarpus、Nothofagus、Phoenix、Festuca、Carex、Veratrum、BauhiniaまたはPterolobium属に属する植物に由来するＳＴＳ（ＥＣ２．３．１．９５）である。例えば、その全体において参照により組み込まれているWO 2006/089898を参照。いくつかの態様において、ＳＴＳは、Vitis pseudoreticulata  ＳＴＳ（配列番号４）である。
【００７４】
いくつかの態様において、ＮＡＤＰＨ：シトクロムＰ４５０レダクターゼ（ＣＰＲ）ポリペプチドは、前記微生物において発現、過剰発現、または組み換え的に発現され得る。いくつかの態様において、前記ＣＰＲは、Arabidopsis属、例えば、A. thalianaに属する植物、Citrus属、例えば、Citrus x sinensisもしくはCitrus x paradisiに属する植物、Phaseolus属、例えば、P. vulgarisに属する植物、Pinus属、例えば、P. taedaに属する植物、Populus属、例えば、P. deltoides、R. tremuloidesもしくはR. trichocarpaに属する植物、Solanum属、例えば、S. tuberosumに属する植物、Vitis属、例えば、Vitis viniferaに属する植物、Zea属、例えば、Z. maysに属する植物、または他の植物の属、例えば、Ammi、Avicennia、Camellia、Camptotheca、Catharanthus、Glycine、Helianthus、Lotus、Mesembryanthemum、Physcomitrella、Ruta、SaccharumもしくはVignaに由来するＣＰＲ（ＥＣ１．６．２．４）である。例えば、その全体において参照により組み込まれているWO 2006/089898を参照。いくつかの態様において、ＣＰＲは、Arabidopsis thaliana CPR、例えば、A. thaliana  ＡＴＲ２（配列番号５）である。
【００７５】
いくつかの態様において、本開示は、カルコンおよびスチルベノイドなどのフェニルプロパノイド誘導体の形成を触媒する組み換えポリペプチドを発現するように操作された組み換え宿主を提供する。
【００７６】
いくつかの態様において、カルコンシンターゼ（ＣＨＳ）ポリペプチドは、前記微生物において発現、過剰発現、または組み換え的に発現され得る。いくつかの態様において、前記ＣＨＳは、Hordeum vulgare  ＣＨＳ、例えば、H. vulgare  ＣＨＳ２（配列番号７）である。
【００７７】
いくつかの態様において、カルコンイソメラーゼ（ＣＨＩ）ポリペプチドは、前記微生物において発現、過剰発現、または組み換え的に発現され得る。いくつかの態様において、ＣＨＩは、Petunia hybrida  ＣＨＩ、例えば、P. hybrida  ＣＨＩ１（配列番号９）またはP. hybrida  ＣＨＩ２（配列番号１１）である。
【００７８】
別の側面において、本開示は、カルコンまたはスチルベン化合物を生産する方法であって、組み換え遺伝子が発現される条件下で、本明細書に開示される組み換え宿主を培養培地中で増殖させることを含み、前記化合物は、組み換え宿主により合成される、前記方法を提供する。
【００７９】
いくつかの態様において、本開示の方法は、カルコン化合物を生産するために使用される。いくつかの態様において、カルコン化合物は、ナリンゲニンまたはナリンゲニン誘導体である。ナリンゲニンに加えて、本明細書に開示されるいくつかの態様は、他のカルコン、例えば、イソリキリチゲニン（リキリチゲニンカルコン）、ブテイン（ブチンカルコン）、ピノセムブリンカルコン、エリオジクチオールカルコンおよびホモエリオジクチオールカルコンの生産に有用である。
【００８０】
いくつかの態様において、本開示の方法は、スチルベノイド化合物を生産するために使用される。いくつかの態様において、スチルベン化合物は、レスベラトロールである。レスベラトロールに加えて、本開示のいくつかの態様は、他のスチルベノイド、例えば、ピセタノール、ジヒドロレスベラトロール、レスベラトロール３−Ｏ−グルコシド（ピセイド、ポリダチン）、イプシロン−ビニフェリン、デルタ−ビニフェリンおよびパリドールの生産に有用である。
【００８１】
いくつかの態様において、カルコンまたはスチルベン化合物を生産する方法は、前記化合物を回収することをさらに含む。いくつかの態様において、カルコンまたはスチルベン化合物を生産する方法は、前記化合物を単離することをさらに含む。
【００８２】
機能的ホモログ
上記で記載されるポリペプチドの機能的ホモログはまた、本明細書において提供される組み換え宿主においてフェニルプロパノイド誘導体の生産における使用に好適であってもよい。機能的ホモログは、参照ポリペプチドに対して配列類似性を有し、参照ポリペプチドの１以上の生化学的または生理学的機能を成し遂げるポリペプチドである。機能的ホモログおよび参照ポリペプチドは、天然のポリペプチドであり得、配列類似性は、進化的事象の収束または発散によるものであり得る。そのようなものとして、機能的ホモログは、時おり、ホモログ、またはオルソログ、またはパラログとして文献において指定されることがある。天然の機能的ホモログの変異体、例えば野生型コード配列の突然変異体によりコードされるポリペプチドは、それ自身が機能的ホモログであり得る。機能的ホモログはまた、ポリペプチドについてのコード配列の部位特異的突然変異を介して、あるいは異なる天然のポリペプチドについてのコード配列からドメインを組み合わせること（「ドメイン交換」）により、作成され得る。本明細書に記載される機能性ポリペプチドをコードする遺伝子を改変するための技術は知られており、とりわけ、定向進化技術、部位特異的突然変異技術およびランダム突然変異技術を含み、ポリペプチドの特異的活性を増加させるのに、基質特異性を変更するのに、発現レベルを変更するのに、細胞内の位置を変更するのに、またはポリペプチド−ポリペプチド相互作用を所望の様式に改変するのに、有用であり得る。そのような改変されたポリペプチドは、機能的なホモログとみなされる。用語「機能的ホモログ」は、時おり、機能的に相同のポリペプチドをコードする核酸に適用される。
【００８３】
機能的なホモログは、ヌクレオチドおよびポリペプチド配列アライメントの解析により、同定され得る。例えば、ヌクレオチドまたはポリペプチド配列のデータベースに関するクエリの実行は、フェニルプロパノイドまたはフェニルプロパノイド誘導体生合成経路ポリペプチドのホモログを同定し得る。配列解析は、例えば、参照配列として、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ、チロシンアンモニアリアーゼ、カルコンイソメラーゼ、またはスチルベンシンターゼアミノ酸配列を用いた非重複のデータベースのBLAST、Reciprocal BLAST、またはPSI-BLAST解析を含み得る。アミノ酸配列は、いくつかの例において、ヌクレオチド配列から推測される。４０％超の配列同一性を有する、データベース中のこれらのポリペプチドは、フェニルプロパノイド誘導体生合成経路ポリペプチドとしての適合性について、さらなる評価のための候補である。アミノ酸配列類似性は、保存的アミノ酸置換、例えば、１つの疎水性残基の別の疎水性残基への置換、または１つの極性残基の別の極性残基への置換などを可能にする。所望の場合、さらに評価される候補の数を絞り込むために、そのような候補の手動の検査を実行することができる。手動の検査は、フェニルプロパノイド誘導体生合成経路ポリペプチド中に存在するドメイン、例えば、保存された機能性ドメインを有するように思われるそれらの候補を選択することにより行うことができる。
【００８４】
保存領域は、リピート配列であり、いくつかの二次構造（例えば、ヘリックスおよびベータシート）を形成し、正または負に帯電したドメインを確立し、またはタンパク質モチーフまたはドメインを表す、フェニルプロパノイド誘導体生合成経路ポリペプチドの一次アミノ酸配列内の領域を突き止めることにより同定され得る。例えば、様々なタンパク質モチーフおよびドメインについてのコンセンサス配列を記載する、World Wide Web上のsanger.ac.uk/Software/Pfam/およびpfam.janelia.org/におけるPfamウェブサイトを参照。Pfamデータベースにおいて含まれる情報は、Sonnhammer et al., Nucl. Acids Res., 26:320-322 (1998)；Sonnhammer et al., Proteins, 28:405-420 (1997)；およびBateman et al., Nucl. Acids Res., 27:260-262 (1999)において記載される。保存領域はまた、密接に関連する種に由来する同じまたは関連するポリペプチドの配列をアラインメントすることによっても決定することができる。密接に関連する種は、好ましくは、同じファミリーに由来する。いくつかの態様において、２つの異なる種に由来する配列のアライメントは、かかるホモログを同定するのに十分である。
【００８５】
典型的に、少なくとも約４０％アミノ酸配列同一性を示すポリペプチドは、保存領域を同定するのに有用である。関連するポリペプチドの保存領域は、少なくとも４５％アミノ酸配列同一性（例えば、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％アミノ酸配列同一性）を示す。いくつかの態様において、保存領域は、少なくとも９２％、９４％、９６％、９８％、または９９％アミノ酸配列同一性）を示す。
【００８６】
例えば、組み換え宿主におけるナリンゲニンを生産するために好適なホモログは、カルコンシンターゼおよび／またはカルコンイソメラーゼ遺伝子の組み換えホモログを含む。
【００８７】
所与のポリペプチド、例えば、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ、チロシンアンモニアリアーゼ、カルコンシンターゼ、カルコンイソメラーゼ、またはスチルベンシンターゼなどの基質特異性を改変する方法は、当業者に知られており、限定することなく、部位特異的／合理的突然変異導入アプローチ、ランダム定向進化アプローチ、およびランダム突然変異導入／飽和技術が酵素の活性部位の近くで行われる組み合わせを含む。例えば、Osmani et al., 2009, Phytochemistry 70: 325-347を参照。
【００８８】
候補配列は、典型的に、参照配列の長さの８０％〜２００％、例えば、参照配列の長さの８２、８５、８７、８９、９０、９３、９５、９７、９９、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、または２００％である長さを有する。機能的ホモログポリペプチドは、典型的に、参照配列の長さの９５〜１０５％、例えば、参照配列の長さの９０、９３、９５、９７、９９、１００、１０５、１１０、１１５、または１２０％、または任意の範囲の間である長さを有する。参照核酸またはポリペプチドと比較した任意の候補核酸またはポリペプチドについての％同一性は、以下のように決定することができる。参照配列（例えば、本明細書に記載される核酸配列またはアミノ酸配列）は、コンピュータープログラムClustalW（version 1.83、デフォルトパラメーター）を用いて１以上の候補配列とアライメントされ、それは、それらの全体の長さにわたって行われる核酸またはポリペプチド配列のアライメント（グローバルアライメント）を可能にする。Chenna et al., 2003, Nucleic Acids Res. 31(13):3497-500。
【００８９】
ClustalWは、参照配列と１以上の候補配列との間のベストマッチを計算し、それらをアラインメントし、それにより、同一性、類似性および差異を決定することができる。配列アラインメントを最大化するために、参照配列、候補配列、または両方に、１以上の残基のギャップを挿入することができる。核酸配列の迅速なペアワイズアラインメントのために、以下のデフォルトパラメーターを用いる：ワードサイズ：２；ウィンドウサイズ：４；スコアリング法：パーセンテージ；トップ（ｔｏｐ）の対角線の数：４；およびギャップペナルティ：５。核酸配列の多重アラインメントのために、以下のパラメーターを用いる：ギャップ開始ペナルティ：１０．０；ギャップ伸長ペナルティ：５．０；および、ウェイトトランジション：あり。タンパク質配列の迅速なペアワイズアラインメントのために、以下のパラメーターを用いる：ワードサイズ：１；ウィンドウサイズ：５；スコアリング法：パーセンテージ；トップの対角線の数：５；ギャップペナルティ：３。タンパク質配列の多重アラインメントのために、以下のパラメーターを用いる：ウェイトマトリックス：blosum；ギャップ開始ペナルティ：１０．０；ギャップ伸長ペナルティ：０．０５；親水性ギャップ：あり；親水性残基：Gly、Pro、Ser、Asn、Asp、Gln、Glu、Arg、およびLys；残基特異的ギャップペナルティ：あり。ClustalWの出力は、配列間の関係を反映する配列アラインメントである。ClustalWは、例えば、World Wide Web上のBaylor College of Medicine Search Launcherのサイト（searchlauncher.bcm.tmc.edu/multi-align/multi-align.html）、およびWorld Wide Web上のEuropean Bioinformatics Instituteのサイト（ebi.ac.uk/clustalw）において、実行することができる。
【００９０】
候補の核酸またはアミノ酸配列の参照配列に対するパーセント同一性を決定するために、ClustalWを用いて配列をアラインメントし、アラインメント中の同一なマッチの数を参照配列の長さで除算し、結果に１００を乗じる。パーセント同一性値は、最も近い１０分の１値まで概数化できることに留意する。例えば、７８．１１、７８．１２、７８．１３および７８．１４は、７８．１まで概数化され、一方、７８．１５、７８．１６、７８．１７、７８．１８および７８．１９は、７８．２に概数化される。
【００９１】
機能的ホモログ、例えばフェニルプロパノイド誘導体生合成に関与する酵素の機能的ホモログは、酵素により行われる酵素活性に関与しない追加のアミノ酸を含み得ることは、理解されるであろう。
【００９２】
組み換え核酸
本明細書において記載されるポリペプチドをコードする組み換え遺伝子は、ポリペプチドを発現させるために好適な１以上の調節領域にセンス方向で作動可能に（operably）連結した、ポリペプチドについてのコード配列を含む。多くの微生物は、ポリシストロニックなｍＲＮＡから複数の遺伝子産物を発現することができるので、所望の場合、これらの微生物について、複数のポリペプチドを単一の調節領域の制御下において発現させることができる。コード配列および調節領域は、調節領域およびコード配列が、調節領域が配列の転写または翻訳を調節するのに有効であるように位置する場合に、作動可能に連結するとみなされる。典型的には、モノシストロニックな遺伝子について、コード配列の翻訳リーディングフレームの翻訳開始部位は、調節領域の１〜約５０ヌクレオチド下流に位置する。
【００９３】
多くの場合において、本明細書において記載されるポリペプチドについてのコード配列は、組み換え宿主以外の種において同定され、すなわち、異種核酸である。したがって、組み換え宿主が微生物である場合、コード配列は、他の原核または真核微生物から、植物から、または動物に由来してもよい。いくつかの場合においては、しかしながら、コード配列は、宿主に対してネイティブである配列であり、その生物に再導入されている。ネイティブな配列は、しばしば、外来性核酸に連結した非天然の配列、例えば、組み換え核酸コンストラクト中でネイティブな配列に隣接する非ネイティブな調節配列の存在により、天然に存在する配列と区別することができる。さらに、安定に形質転換された外来性核酸は、典型的には、ネイティブな配列が見出される位置とは異なる位置において統合される。「調節領域」とは、転写または翻訳の開始および速度、ならびに転写または翻訳産物の安定性および／または移動性に影響を及ぼすヌクレオチド配列を有する核酸を指す。調節配列として、限定することなく、プロモーター配列、エンハンサー配列、応答エレメント、タンパク質認識部位、誘導性エレメント、タンパク質結合配列、５’および３’非翻訳領域（ＵＴＲ）、転写開始部位、終結配列、ポリアデニル化配列、イントロン、ならびにこれらの組み合わせが挙げられる。調節領域は、典型的には、少なくともコア（基本）プロモーターを含む。調節領域はまた、エンハンサー配列、上流エレメントまたは上流活性化領域（ＵＡＲ）などの、少なくとも１つの制御エレメントを含み得る。調節領域は、調節領域が配列の転写または翻訳を調節するのに有効であるように、調節領域およびコード配列を配置することにより、コード配列に作動可能に連結される。例えば、コード配列およびプロモーター配列を作動可能に連結するために、コード配列の翻訳リーディングフレームの翻訳開始部位は、典型的には、プロモーターの１〜約５０ヌクレオチド下流に配置される。調節領域は、しかしながら、翻訳開始部位の約５，０００ヌクレオチドもの上流、または転写開始部位の約２，０００ヌクレオチドもの上流に位置することができる。
【００９４】
含められるべき調節領域の選択は、限定されないが、効率、選択可能性、誘導能、所望の発現レベル、および特定の培養段階の間の優先的発現を含むいくつかの要因に依存する。当業者にとって、コード配列に対して調節領域を適切に選択して配置することによりコード配列の発現を調整することは、慣用的な事柄である。１超の調節領域（例えば、イントロン、エンハンサー、上流活性化領域、転写終結因子、および誘導性エレメント）が存在し得ることが理解されるであろう。
【００９５】
組み換え宿主
組み換え宿主は、フェニルプロパノイド誘導体生産についてのポリペプチドを発現するために用いることができ、哺乳動物、昆虫、植物および藻類細胞を含む。多数の原核生物および真核生物はまた、本明細書において記載される組み換え微生物、例えばグラム陰性細菌、酵母および真菌の構築における使用のために好適である。フェニルプロパノイド誘導体生産株としての使用のために選択される種および株は、第１に、どの生産遺伝子が株に対して内在性であり、どの遺伝子が存在しないかを決定するために分析される。株において内在性の相当するものが存在しない遺伝子は、１以上の組み換えコンストラクトにおいて有利に組み立てられ、これらは、次いで、欠損した機能を供給するために株中に形質転換される。
【００９６】
本明細書において提供される構築された、および遺伝子的に操作された微生物は、とりわけ、ケモスタット、バッチ、フェドバッチ培養、連続灌流発酵、および連続灌流細胞培養を含む、従来の発酵プロセスを用いて培養され得る。
【００９７】
本方法における炭素源の使用は、フェニルプロパノイド誘導体の増殖および／または生産を促進するための、組み換え宿主により代謝され得る任意の分子を含む。好適な炭素源の例は、限定されないが、スクロース（例えば、糖蜜において見出される）、フルクトース、キシロース、エタノール、グリセロール、グルコース、セルロース、スターチ、セロビオースまたはポリマーを含む他のグルコースを含む。宿主として酵母を用いる態様において、例えば、スクロース、フルクトース、キシロース、エタノール、グリセロール、およびグルコースなどの炭素源が、好適である。炭素源は、培養期間を通じて宿主生物に提供することができ、あるいは、生物は、別のエネルギー源、例えばタンパク質の存在下、一定期間増殖し、その後、フェドバッチ段階の間のみ炭素源を提供することができる。
【００９８】
例示的な原核生物および真核生物種を、以下により詳細に記載する。しかしながら、他の種が好適である場合があることが理解されるであろう。例えば、好適な種は、Agaricus、Aspergillus、Bacillus、Candida、Corynebacterium、Eremothecium、Escherichia、Fusarium/Gibberella、Kluyveromyces、Laetiporus、Lentinus、Phaffia、Phanerochaete、Pichia、Physcomitrella、Rhodoturula、Saccharomyces、Schizosaccharomyces、Sphaceloma、XanthophyllomycesまたはYarrowiaなどの属におけるものであり得る。かかる属からの例示的な種として、Lentinus tigrinus、Laetiporus sulphureus、Phanerochaete chrysosporium、Pichia pastoris、Cyberlindnera jadinii、Physcomitrella patens、Rhodoturula glutinis 32、Rhodoturula mucilaginosa、Phaffia rhodozyma UBV-AX、Xanthophyllomyces dendrorhous、Fusarium fujikuroi/Gibberella fujikuroi、Candida utilis、Candida glabrata、Candida albicans、およびYarrowia lipolyticaが挙げられる。
【００９９】
いくつかの態様において、微生物は、Escherichia coli、Saccharomyces cerevisiae、Rhodobacter sphaeroides、Rhodobacter capsulatus、またはRhodotorula toruloidesなどの原核生物であり得る。
【０１００】
いくつかの態様において、微生物は、Gibberella fujikuroi、Kluyveromyces lactis、Schizosaccharomyces pombe、Aspergillus niger、Yarrowia lipolytica、Ashbya gossypii、またはSaccharomyces cerevisiaeなどの子嚢菌であり得る。
【０１０１】
いくつかの態様において、微生物は、Blakeslea trispora、Dunaliella salina、Haematococcus pluvialis、Chlorella sp.、Undaria pinnatifida、Sargassum、Laminaria japonica、Scenedesmus almeriensis種などの藻類細胞であり得る。
【０１０２】
いくつかの態様において、微生物は、Blakeslea trispora、Dunaliella salina、Haematococcus pluvialis、Chlorella sp.、Undaria pinnatifida、Sargassum、Laminaria japonica、Scenedesmus almeriensisなどのシアノ細菌細胞であり得る。
【０１０３】
Saccharomyces spp.
Saccharomycesは、合成生物学において広く用いられている筐体（chassis）生物であり、組み換え微生物プラットフォームとして用いることができる。例えば、突然変異体のライブラリー、プラスミド、代謝の詳細なコンピューターモデル、およびS. cerevisiaeについて利用可能な他の情報が存在し、生成物の収量を増大させるための様々なモジュールの合理的な設計が可能になる。組み換え微生物を作製するための方法は知られている。
【０１０４】
Aspergillus spp.
A. oryzae、A. nigerおよびA. sojaeなどのAspergillus種は、食品の生産において広く用いられている微生物であり、また、組み換え微生物プラットフォームとして用いることができる。A. nidulans、A. fumigatus、A. oryzae、A. clavatus、A. flavus、A. niger、およびA. terreusのゲノムについてヌクレオチド配列が利用可能であり、流動を増大させ、生成物の収量を増加させるための内在経路の合理的な設計および改変が可能になる。Aspergillusについては、代謝モデルが開発されている。一般的に、A. nigerは、クエン酸およびグルコン酸などの多数の食品原料の工業的生産のために培養されており、したがって、A. nigerなどの種は、一般に、フェニルプロパノイド誘導体の生産のために好適である。
【０１０５】
Escherichia coli
合成生物学において広く用いられている別のプラットフォーム生物であるEscherichia coliもまた、組み換え微生物プラットフォームとして用いることができる。Saccharomycesと同様に、突然変異体のライブラリー、プラスミド、代謝の詳細なコンピューターモデル、およびE. coliについて利用可能な他の情報が存在し、生成物の収量を増大するための様々なモジュールの合理的な設計が可能になる。Saccharomycesについて上で記載されるものと同様の方法を用いて、組み換えE. coli微生物を作製することができる。
【０１０６】
Agaricus、Gibberella、およびPhanerochaete spp.
Agaricus、Gibberella、およびPhanerochaete種は、培養において大量のイソプレノイドを生産することが知られているので、有用であり得る。したがって、大量のフェニルプロパノイド誘導体を生成するための前駆体は、内在遺伝子により既に生成されている。
【０１０７】
Arxula adeninivorans（Blastobotrys adeninivorans）
Arxula adeninivoransは、異常な生化学的特性を有する二形性酵母である（４２℃の温度までパン類製造業者の酵母のような出芽酵母として増殖し、この閾値を超えると糸状の形態で増殖する）。それは、広範囲の基質で増殖し得、ニトラートを同化し得る。それは、天然プラスチックを生産し得る株の生成または環境サンプルにおけるエストロゲンのバイオセンサーの開発にうまく適用されている。
【０１０８】
Yarrowia lipolytica
Yarrowia lipolyticaは、二形性酵母（Arxula adeninivoransを参照）であり、半子嚢菌類ファミリーに属する。Yarrowia lipolyticaの全ゲノムは、知られている。Yarrowia種は、好気性菌であり、非病原性であるものと考えられる。Yarrowiaは、疎水性基質（例えば、アルカン、脂肪酸、油）を使用することにおいて効率的であり、糖で増殖し得る。それは、工業的応用に高いポテンシャルを有し、油性（oleaginous）微生物である。Yarrowia lipolypticaは、その乾燥細胞重量のおよそ４０％まで脂質含量を蓄積し得、脂質蓄積および再移動のためのモデル生物である。例えば、Nicaud, 2012, Yeast 29(10):409-18；Beopoulos et al., 2009, Biohimie 91(6):692-6；Bankar et al., 2009, Appl Microbiol Biotechnol. 84(5):847-65を参照。
【０１０９】
Rhodotorula sp.
Rhodotorulaは、単細胞の着色した酵母である。油性の赤色酵母であるRhodotorula glutinisは、粗製グリセロールから脂質およびカロテノイドを生産することが示されている（Saenge et al., 2011, Process Biochemistry 46(1):210-8）。Rhodotorula toruloides株は、改良されたバイオマスおよび脂質生産性のための効率的なフェドバッチ発酵システムであることが示されている（Li et al., 2007, Enzyme and Microbial Technology 41:312-7）。
【０１１０】
Rhodosporidium toruloides
Rhodosporidium toruloidesは、油性酵母であり、脂質生産経路の操作に有用である（例えば、Zhu et al., 2013, Nature Commun. 3:1112；Ageitos et al., 2011, Applied Microbiology and Biotechnology 90(4):1219-27を参照）。
【０１１１】
Rhodobacter spp.
Rhodobacterは、組み換え微生物のプラットフォームとして用いることができる。E. coliと同様に、利用可能な突然変異体のライブラリー、ならびに好適なプラスミドベクターが存在し、生成物の収量を増大させるための様々なモジュールの合理的な設計が可能になる。イソプレノイド経路は、カロテノイドおよびＣｏＱ１０の増加した生産のために、Rhodobacterの膜性細菌種において操作されてきた。米国特許公開第20050003474号および同第20040078846号を参照。E. coliについて上で記載したものと同様の方法を用いて、組み換えRhodobacter微生物を作製することができる。
【０１１２】
Candida boidinii
Candida boidiniiは、（メタノールで増殖し得る）メチロトローフの酵母である。Hansenula polymorphaおよびPichia pastorisなどの他のメチロトローフの種のように、それは、異種タンパク質を生産するための優れたプラットフォームを提供する。数グラムの範囲の分泌された外来タンパク質の収量が報告されている。計算的な方法であるＩＰＲＯは、Candida boidiniiキシロースレダクターゼの補因子特異性を、ＮＡＤＰＨからＮＡＤＨへ実験的に切り替える突然変異を近年予測した。
【０１１３】
Hansenula polymorpha (Pichia angusta) 
Hansenula polymorphaは、別のメチロトローフの酵母である（Candida boidiniiを参照）。それは広範囲の他の基質でさらに増殖し得る；それは熱耐性であり、ニトラートを同化し得る（Kluyveromyces lactisもまた参照）。それは、Ｂ型肝炎ワクチン、インスリンおよびＣ型肝炎の処置のためのインターフェロンアルファ−２ａを生産すること、さらに技術的酵素の範囲にまでに適用されている。
【０１１４】
Kluyveromyces lactis
Kluyveromyces lactisは、通常、ケフィアの生産に適用される酵母である。それは、いくつかの糖で増殖し得、最も重要なことに、乳および乳清中に存在するラクトースで増殖し得る。それは、チーズを生産するためのキモシン（通常仔牛の胃において存在する酵素）を生産するためにとりわけうまく適用されている。生産は、４０，０００Ｌ規模の発酵槽で行われる。
【０１１５】
Pichia pastoris
Pichia pastorisはメチロトローフの酵母である（Candida boidiniiおよびHansenula polymorphaを参照）。それは、外来タンパク質を生産するための効率的なプラットフォームを提供する。プラットフォームエレメントは、キットとして利用可能であり、それは、タンパク質を生産するためにアカデミアで世界的に使用されている。複雑なヒトＮ−グリカン（酵母グリカンは、ヒトにおいて見出されたものに類似しているが、同一ではない）を生産し得る株に操作がなされてきた。
【０１１６】
Physcomitrella spp.
Physcomitrella mossesは、懸濁培養中で増殖させた場合、酵母または他の真菌の培養物と同様の特徴を有する。この属は、他の種の細胞において生産することが困難であり得る植物の二次代謝物の生産のために重要な種の細胞となりつつある。
【０１１７】
フェニルプロパノイド誘導体を生産する方法
本明細書に記載される組み換え宿主は、フェニルプロパノイド誘導体を生産する方法において用いることができる。
【０１１８】
例えば、方法は、フェニルプロパノイド誘導体生合成遺伝子が発現される条件下で、組み換え宿主を培養培地中で培養することを含むことができる。組み換え宿主は、フェドバッチまたは連続プロセスにおいて増殖させることができる。典型的には、組み換え宿主は、所望の期間、規定の温度において発酵槽において増殖させられる。本方法に使用される特定の宿主に依存して、他の組み換え遺伝子、例えばフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）、チロシンアンモニアリアーゼ（ＴＡＬ）、シンナマート４−ヒドロキシラーゼ（Ｃ４Ｈ）、シトクロムＰ４５０レダクターゼ（ＣＰＲ）、４−クマラート−ＣｏＡリガーゼ（４ＣＬ）、スチルベンシンターゼ（ＳＴＳ）、カルコンシンターゼ（ＣＨＳ）、またはカルコンイソメラーゼ（ＣＨＩ）などはまた、存在し、または発現され得る。基質および中間体、例えば、フェニルアラニン、チロシン、ケイ皮酸、クマル酸、ジヒドロケイ皮酸またはフロレト酸のレベルは、公開されている方法に従った分析のために、培養培地からサンプルを抽出することにより決定することができる。いくつかの態様において、培養培地は、外部源からのフェニルプロパノイド前駆体または中間体を含有しない（すなわち、フェニルプロパノイド前駆体または中間体は、培養培地に添加されない）。
【０１１９】
本明細書に記載される遺伝子は、任意のいくつかの知られているプロモーターを用いて酵母において発現され得る。フェニルプロパノイドを過剰生産する株は、知られており、フェニルプロパノイドまたはフェニルプロパノイド誘導体の生産においてアクセプター分子として用いることができる。
【０１２０】
いくつかの態様において、酵素は、ＴＡＬおよび／またはＰＡＬ活性についてスクリーニングされてもよい。いくつかの態様において、ＰＡＬおよびＴＡＬ活性についてスクリーニングされる酵素に対応するＤＮＡ配列は、Saccharomyces cerevisiaeにおける最適な発現のためにコドン最適化される。いくつかの態様において、各ＰＡＬ／ＴＡＬ酵素は、クマル酸からのナリンゲニンの生産のための全ての必要な遺伝子（Ｃ４Ｈ−ＣＰＲ、４ＣＬ、ＣＨＳおよびＣＨＩ）とともにクローニングされ、ＰＡＬ＋ＴＡＬ活性が測定され、またはケイ皮酸からのナリンゲニンの生産のための全ての必要な遺伝子（４ＣＬ、ＣＨＳおよびＣＨＩ）とともにクローニングされ、ＴＡＬ活性が単独で測定される。いくつかの態様において、遺伝子はその後、フェニルプロパノイドまたはフェニルプロパノイド誘導体を生産しないSaccharomyces cerevisiae酵母株（「非生産酵母株」）に、単一のステップにおいて導入される。
【０１２１】
いくつかの態様において、形質転換体は、９６ディープウェルプレート中に播種され、３０℃および４００ｒｐｍにおいて５００μｌのＳＣ−ＵＲＡ培地中で一晩インキュベートされる。いくつかの態様において、５０μｌの一晩培養した培養物を、４％ｗ／ｖグルコースが加えられた５００μｌのＤＥＬＦＴ培地を含有する新しい９６ディープウェルプレートに播種した。いくつかの態様において、同じ条件下での７２時間の増殖後、ＯＤ６００を測定し、細胞増殖を推定し、サンプルを採取し、以下のように、ＨＰＬＣによりケイ皮酸、クマル酸、ナリンゲニンおよびフロレト酸を測定した。いくつかの態様において、培養物（３００μｌ）のサンプルを振動台上で９６％ＥｔＯＨ（３００μｌ）と混合し、遠心分離した。いくつかの態様において、上清（１００μｌ）をＨＰＬＣ分析に使用した。いくつかの態様において、標準として純粋な化合物を使用して、測定を行った。
【０１２２】
いくつかの態様において、ＴＡＬ遺伝子は、配列番号１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６または４８のいずれか１つのヌクレオチド配列によりコードされる。いくつかの態様において、ＴＡＬポリペプチドは、配列番号１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７または４９のいずれか１つである。いくつかの態様において、ＴＡＬポリペプチドは、Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida A449（Ａｓａｌ）（配列番号３１）由来である。いくつかの態様において、ＴＡＬポリペプチドは、配列番号３１のアミノ酸配列と少なくとも５０％同一性を有する。いくつかの態様において、ＴＡＬポリペプチドは、配列番号３１のアミノ酸配列と少なくとも６５％同一性を有する。いくつかの態様において、ＴＡＬ遺伝子は、配列番号３０のヌクレオチド配列によりコードされる。いくつかの態様において、ＴＡＬ遺伝子は、配列番号３０と少なくとも６０％同一性を有する。
【０１２３】
いくつかの態様において、ＡｓａｌのＴＡＬ活性は、すでに知られているRhodotorula graminis由来のＴＡＬ（Vanneli, J. et al. (2007), Enzyme and Microbial Technology 41, 413-422）およびBambusa oldhamii由来のＰＡＬ４（Hseih, L. et al. (2010), Phytochemistry 71）と比較することができる一方で、Ａｓａｌは、２つの言及されたＴＡＬよりもはるかに高い特異性を保有する（例えば、図２を参照）。いくつかの態様において、Ａｓａｌ  ＴＡＬはまた、Rodobacter capsulatus由来のＲｃＴＡＬ（Koopman, F. et al. (2012)；Kyndt, J A. et al. (2002), FEBS Letters 512, 240-244）およびSaccharothrix espanaensis由来のＳａｍ８（Berner, M. et al. (2006), J Bacteriol. Apr;188(7):2666-73）としてすでに報告されている特定のＴＡＬよりも高い活性を有する（例えば、図２を参照）。いくつかの態様において、Ａｓａｌ  ＴＡＬの活性は、すでに報告されている特定のＴＡＬ、例えば、限定されないが、R. capsulatus由来のＲｃＴＡＬおよびS. espanaensis由来のＳａｍ８の５倍超である。
【０１２４】
組み換え宿主を、所望の期間、培養にて増殖させた後、フェニルプロパノイド誘導体(例えば、ナリンゲニンまたはレスベラトロールなど)は、その後、当該技術分野において知られている様々な技術を用いて培養から回収することができる。いくつかの態様において、透過剤（permeabilizing agent）は、宿主にフィードストックを入れるのを助けるために、および宿主からの生成物放出を助けるために添加することができる。例えば、培養された微生物の粗製の溶解物を遠心分離し、上清を得ることができる。得られた上清をその後、クロマトグラフィーカラム、例えばＣ−１８カラムに適用し、水で洗浄して親水性化合物を除去し、その後、メタノールなどの溶媒で目的の化合物を溶出することができる。化合物は、その後、当該技術分野において知られている方法に従って、調製用ＨＰＬＣによりさらに精製され得る。
【０１２５】
本明細書で議論される様々な遺伝子およびモジュールは、単一の宿主よりもむしろ２以上の組み換え宿主に存在し得ることは、理解される。複数の組み換え宿主が使用される場合、それらは、混合された培養において増殖され得、フェニルプロパノイド誘導体を生産する。
【０１２６】
あるいは、２以上の宿主のそれぞれは、分けられた培養培地中で増殖され得、および第１の培養培地の生成物、例えば、ナリンゲニンまたはレスベラトロール前駆体は、第２の培養培地に導入され、続く中間体または最終生成物、例えば、ナリンゲニンなどに変換され得る。第２の、または最終の宿主により生産される生成物は、その後回収される。いくつかの態様において、組み換え宿主は、培養培地以外の栄養源を使用して、および発酵槽以外のシステムを利用して増殖されることはまた、理解される。
【０１２７】
いくつかの態様において、フェニルプロパノイド誘導体は、組み換え宿主におけるフェニルプロパノイド誘導体生合成経路に関与する１以上の酵素の発現を通してin vivoで生産される。例えば、１以上のArabidopsis thaliana  フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ２）ポリペプチドをコードする組み換え遺伝子、Ammi majus  シンナマート４−ヒドロキシラーゼ（ＣＨ４）ポリペプチドをコードする遺伝子、Arabidopsis thaliana  ４−クマラート−ＣｏＡリガーゼ（４ＣＬ２）ポリペプチドをコードする遺伝子、Hordeum vulgareカルコンシンターゼ２（ＣＨＳ２）ポリペプチドをコードする遺伝子、シトクロムＰ４５０レダクターゼ（ＣＰＲ１）ポリペプチドをコードする遺伝子を発現するナリンゲニン生産またはレスベラトロール生産組み換え宿主は、カルコン化合物、例えば、ナリンゲニンをin vivoで生産するために使用することができる。
【０１２８】
いくつかの態様において、フェニルプロパノイド誘導体は、組み換え宿主におけるフェニルプロパノイド誘導体生合成経路に関与する１以上の酵素の発現を通じてin vivoで生産される。例えば、１以上のAeromonas salmonicida  チロシンアンモニアリアーゼ（Ａｓａｌ  ＴＡＬ）ポリペプチドをコードする組み換え遺伝子、Arabidopsis thaliana  ４−クマラート−ＣｏＡリガーゼ（４ＣＬ２）ポリペプチドをコードする遺伝子、Hordeum vulgare  カルコンシンターゼ２（ＣＨＳ２）ポリペプチドをコードする遺伝子、シトクロムＰ４５０レダクターゼ（ＣＰＲ１）ポリペプチドをコードする遺伝子を発現するナリンゲニン生産またはレスベラトロール生産組み換え宿主は、カルコン化合物、例えば、ナリンゲニンをin vivoで生産するために使用することができる。
【０１２９】
別の例としては、Saccharomyces cerevisiae  トランス−２−エノイル−ＣｏＡレダクターゼポリペプチドをコードする１以上の遺伝子を過小発現または不発現し、１以上のArabidopsis thaliana  フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ２）ポリペプチドをコードする組み換え遺伝子、Ammi majus  シンナマート４−ヒドロキシラーゼ（ＣＨ４）ポリペプチドをコードする遺伝子、Arabidopsis thaliana  ４−クマラート−ＣｏＡリガーゼ（４ＣＬ２）ポリペプチドをコードする遺伝子、およびスチルベンシンターゼ（ＳＴＳ）ポリペプチドをコードする遺伝子を発現する、スチルベノイド（例えば、レスベラトロールなど）生産組み換え宿主は、スチルベノイド化合物、例えば、レスベラトロールをin vivoで生産するために使用することができる。
【０１３０】
別の例としては、Saccharomyces cerevisiae  トランス−２−エノイル−ＣｏＡレダクターゼポリペプチドをコードする１以上の遺伝子を過小発現または不発現し、１以上のAeromonas salmonicida  チロシンアンモニアリアーゼ（Ａｓａｌ＿ＴＡＬ）ポリペプチドをコードする組み換え遺伝子、Arabidopsis thaliana  ４−クマラート−ＣｏＡリガーゼ（４ＣＬ２）ポリペプチドをコードする遺伝子、およびスチルベンシンターゼ（ＳＴＳ）ポリペプチドをコードする遺伝子を発現する、スチルベノイド（例えば、レスベラトロールなど）生産組み換え宿主は、スチルベノイド化合物、例えば、レスベラトロールをin vivoで生産するために使用することができる。
【０１３１】
いくつかの態様において、フェニルプロパノイド誘導体は、所望の化合物の前駆体と、フェニルプロパノイド誘導体生合成経路に関与する１以上の酵素とのin vitroでの接触を通じて生産される。例えば、チロシンをチロシンアンモニアリアーゼ、４−クマラート−ＣｏＡリガーゼおよびカルコンシンターゼポリペプチドと接触させることは、ナリンゲニンまたはナリンゲニン誘導体化合物のin vitroにおける生産をもたらし得る。いくつかの態様において、上流のナリンゲニン前駆体と、ナリンゲニン経路に関与する１以上の酵素との接触を通じてin vitroで生産される。
【０１３２】
いくつかの態様において、フェニルプロパノイド誘導体前駆体は、生物変換により生産される。生物変換が生じるために、フェニルプロパノイド誘導体生合成路に関与する１以上の酵素を発現する組み換え宿主は、細胞中でフェニルプロパノイド誘導体前駆体を取り込み、改変し；in vivoでの改変に続いて、フェニルプロパノイド誘導体は、細胞中に残るか、および／または培養培地へ排出される。例えば、チロシンアンモニアリアーゼ、４−クマラート−ＣｏＡリガーゼおよびカルコンシンターゼポリペプチドをコードする遺伝子を発現する組み換え宿主は、チロシンを取り込み、細胞中でそれをナリンゲニンに変換することができ；in vivoでの変換に続いて、ナリンゲニン化合物は、培養培地へ排出される。
【０１３３】
いくつかの態様において、本明細書に開示されるフェニルプロパノイド誘導体は、単離され、均質に精製される（例えば、少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、または９８％純度）。他の態様において、フェニルプロパノイド誘導体は、組み換え宿主からの抽出物として、またはin vitro生産方法において単離される。この点において、フェニルプロパノイド誘導体は、単離されてもよく、必ずしも均質に精製されなくてもよい。望ましくは、生産されるフェニルプロパノイド誘導体の量は、約１ｍｇ／Ｌ〜約２０，０００ｍｇ／Ｌまたはそれ以上であり得る。例えば、約１〜約１００ｍｇ／Ｌ、約３０〜約１００ｍｇ／Ｌ、約５０〜約２００ｍｇ／Ｌ、約１００〜約５００ｍｇ／Ｌ、約１００〜約１，０００ｍｇ／Ｌ、約２５０〜約５，０００ｍｇ／Ｌ、約１，０００〜約１５，０００ｍｇ／Ｌ、または約２，０００〜約１０，０００ｍｇ／Ｌのフェニルプロパノイド誘導体が、生産され得る。一般的に、長い培養時間は、より多くの量の生成物を導く。したがって、組み換え微生物は、１日〜７日、１日〜５日、３日〜５日、約３日、約４日、または約５日培養され得る。
【０１３４】
いくつかの態様において、ＴＡＬ活性を有しないレスベラトロール生産酵母株は、Aeromonas salmonicida由来のＴＡＬ遺伝子（Ａｓａｌ  ＴＡＬ、配列番号３１）を含有するプラスミドで形質転換される。いくつかの態様において、プラスミドは、酵母ゲノムを通じて、Ｔｙ１領域におけるＴＡＬ遺伝子の複数の統合を可能にする。いくつかの態様において、ＴＡＬ遺伝子は、強力なプロモーターであるｐＰＧＫ１の制御下にあり、遺伝子の過剰発現をもたらす。
【０１３５】
いくつかの態様において、ＴＡＬ遺伝子が過剰発現する得られた株は、レスベラトロール生産を導く全ての必要な遺伝子を含有する直接の親株（対照）と比較される。いくつかの態様において、レスベラトロールおよび経路中間体（クマル酸およびフロレト酸）のレベルは、最小培地において指定された株を３日間増殖させた後、測定される。いくつかの態様において、化合物の抽出は、５０体積％の終濃度までエタノールを発酵サンプルと混合すること、および３２２２ｘｇにおける５分間の遠心分離により行われる。
【０１３６】
いくつかの態様において、レスベラトロール力価は、A. salmonicida（Ａｓａｌ）  ＴＡＬが過剰発現する娘株において、対照親株よりも少なくとも２５％増加する。いくつかの態様において、レスベラトロール力価の２５％の増加は、おおよそ３７５ｍｇ／Ｌのレスベラトロール生産の増加である。いくつかの態様において、クマル酸蓄積は、Ａｓａｌ  ＴＡＬが過剰発現する娘株において、親対照株よりも少なくとも２．５倍増加する。いくつかの態様において、クマル酸蓄積の２．５倍の増加は、対照親株と比較した場合、おおよそ１０８ｍｇ／Ｌの増加である。いくつかの態様において、レスベラトロールおよび主要な副生成物の合計として測定される潜在的なレスベラトロール流動は、Ａｓａｌ  ＴＡＬを保有し、過剰発現する新しい株において２６．２％増加する。
【実施例】
【０１３７】
例
以下に続く例は、本明細書に開示される特定の態様およびそれらの様々な使用の例示である。それらは、説明の目的のためのみに記載され、限定するものとして取り扱われない。
【０１３８】
例１：ＴＡＬ酵素のスクリーニング
ＰＡＬ／ＴＡＬ酵素を、ＰＡＬおよびＴＡＬ活性についてスクリーニングした。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、配列番号１２〜４９として本明細書において同定される。
【０１３９】
各ヌクレオチド配列を、Saccharomyces cerevisiaeにおける最適な発現のためにコドン最適化した。各ＰＡＬ／ＴＡＬ酵素をケイ皮酸からのナリンゲニンの生産のためのすべての必要な遺伝子（Ｃ４Ｈ−ＣＰＲ、４ＣＬ、ＣＨＳおよびＣＨＩ）とともにクローニングして、ＰＡＬおよびＴＡＬ活性を測定し、またはクマル酸からのナリンゲニンの生産のためのすべての必要な遺伝子（４ＣＬ、ＣＨＳおよびＣＨＩ）とともにクローニングして、ＴＡＬ活性を単独で測定した。遺伝子をその後、フェニルプロパノイドまたはフェニルプロパノイド誘導体を生産しないS. cerevisiae酵母株（「非生産酵母株」）に単一のステップにおいて導入した。
【０１４０】
形質転換体を９６ディープウェルプレートに播種し、３０℃および４００ｒｐｍにおいて、５００μｌのＳＣ−ＵＲＡ培地中で、一晩インキュベートした。その後、５０μｌの一晩培養した培養物を、４％ｗ／ｖグルコース加えられた５００μｌのＤＥＬＦＴ培地を含有する新しい９６ディープウェルプレートに播種した。同じ条件下での７２時間の増殖後、ＯＤ６００を測定し、細胞増殖を推定し、サンプルを採取し、以下のようにＨＰＬＣによりケイ皮酸、クマル酸、ナリンゲニンおよびフロレト酸を測定した。培養物（３００μｌ）のサンプルを振動台上で９６％ＥｔＯＨ（３００μｌ）と混合し、遠心分離した。上清（１００μｌ）をＨＰＬＣ分析に使用した。標準として純粋な化合物を使用して、測定を行った。ピークがケイ皮酸と重複するため、フロレチンは測定することができなかった。
【０１４１】
図２は、Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida A449（Ａｓａｌ）由来のＴＡＬ（配列番号３０および３１）が、Rhodotorula graminis由来のＴＡＬ（配列番号３６および３７）（Vanneli, J. et al. (2007), Enzyme and Microbial Technology 41, 413-422）およびBambusa oldhamii由来のＰＡＬ４（配列番号３８および３９）（Hseih, L. et al. (2010), Phytochemistry 71）よりも基質としてチロシンにはるかに高い特異性を有することを示す。図２はまた、Ａｓａｌ  ＴＡＬが、Rodobacter capsulatus由来のＲｃＴＡＬ（配列番号２０および２１）（Koopman, F. et al. (2012); Kyndt, J A. et al. (2002), FEBS Letters 512, 240-244）およびSaccharothrix espanaensis由来のＳａｍ８（配列番号２２および２３）（Berner, M. et al. (2006), J Bacteriol. Apr;188(7):2666-73）の両者の活性の５倍超を有することを示す。
【０１４２】
例２：Aeromonas salmonicida  ＴＡＬ（配列番号３０および３１）を過剰発現するレスベラトロール生産株におけるレスベラトロール生産
ＴＡＬ活性を有しないレスベラトロール生産酵母株を、Aeromonas salmonicida由来のＴＡＬ遺伝子（Ａｓａｌ  ＴＡＬ、配列番号３０および３１）を含有するプラスミドで形質転換した。プラスミドは、酵母ゲノム全体に存在するＴｙ１領域でのＴＡＬ遺伝子の複数の統合を可能にした。ＴＡＬ遺伝子は強力なプロモーターｐＰＧＫ１の制御下にあり、遺伝子の過剰発現をもたらした。
【０１４３】
ＴＡＬ遺伝子が過剰に発現された得られた株を、レスベラトロール生産を導く全ての必要な遺伝子を含有する直接の親株（対照）と比較した。
【０１４４】
レスベラトロールおよび経路中間体（クマル酸およびフロレト酸）のレベルは、指定された株を最小培地において３日間増殖後、測定した。化合物の抽出は、５０体積％の終濃度までエタノールを発酵サンプルと混合し、３２２２ｘｇにおける５分間の遠心分離により行った。
【０１４５】
結果は、レスベラトロール力価が、A. salmonicida  ＴＡＬが過剰発現した娘株において、２５％増加したこと（おおよそ３７５ｍｇ／Ｌの増加）を示す。加えて、クマル酸蓄積は、対照親株と比較した場合、２．５倍増加したこと（おおよそ１０８ｍｇ／Ｌの増加）を示した。全体として、レスベラトロールおよび主要な副生成物の合計として測定された潜在的なレスベラトロール流動は、Ａｓａｌ  ＴＡＬを有し、過剰発現する新しい株において、２６．２％増加した（図３）。
【０１４６】
配列
【表１−１】
0006799010.tif 000006
【０１４７】
【表１−２】
0006799010.tif 000007
【０１４８】
【表１−３】
0006799010.tif 000008
【０１４９】
【表１−４】
0006799010.tif 000009
【０１５０】
【表１−５】
0006799010.tif 000010
【０１５１】
【表１−６】
0006799010.tif 000011
【０１５２】
【表１−７】
0006799010.tif 000012
【０１５３】
【表１−８】
0006799010.tif 000013
【０１５４】
【表１−９】
0006799010.tif 000014
【０１５５】
【表１−１０】
0006799010.tif 000015
【０１５６】
【表１−１１】
0006799010.tif 000016
【０１５７】
【表１−１２】
0006799010.tif 000017
【０１５８】
【表１−１３】
0006799010.tif 000018
【０１５９】
【表１−１４】
0006799010.tif 000019
【０１６０】
【表１−１５】
0006799010.tif 000020
【０１６１】
【表１−１６】
0006799010.tif 000021
【０１６２】
【表１−１７】
0006799010.tif 000022
【０１６３】
【表１−１８】
0006799010.tif 000023
【０１６４】
【表１−１９】
0006799010.tif 000024
【０１６５】
【表１−２０】
0006799010.tif 000025
【０１６６】
【表１−２１】
0006799010.tif 000026
【０１６７】
【表１−２２】
0006799010.tif 000027
【０１６８】
【表１−２３】
0006799010.tif 000028
【０１６９】
【表１−２４】
0006799010.tif 000029
【０１７０】
【表１−２５】
0006799010.tif 000030
【０１７１】
【表１−２６】
0006799010.tif 000031
【０１７２】
【表１−２７】
0006799010.tif 000032
【０１７３】
【表１−２８】
0006799010.tif 000033
【０１７４】
【表１−２９】
0006799010.tif 000034
【０１７５】
【表１−３０】
0006799010.tif 000035
【０１７６】
【表１−３１】
0006799010.tif 000036
【０１７７】
【表１−３２】
0006799010.tif 000037
【０１７８】
【表１−３３】
0006799010.tif 000038
【０１７９】
本発明を詳細に、およびその特定の態様を参照して説明してきたが、添付の特許請求の範囲に定義された本発明の範囲から逸脱することなく改変および変更が可能であることは明らかである。より具体的には、本発明のいくつかの側面が、特別な利点として本明細書において同定されるが、本発明は、本発明のこれらの特定の側面に必ずしも限定されることを企図しない。
【図１】
0006799010.tif 000039
【図２】
0006799010.tif 000040
【図３】
0006799010.tif 000041
【配列表】
0006799010000001.app