(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
宿主細胞系と少なくとも１種の化学薬剤とを接触させるステップを含む、宿主細胞系から治療用組換えタンパク質もしくはウイルス粒子、予防用組換えタンパク質もしくはウイルス粒子または診断用組換えタンパク質もしくはウイルス粒子を産生するための方法であって、前記化学薬剤は、式２
【化Ａ】
0006741587.tif 000058
の化学薬剤であり、式中、
ＲおよびＲＯのそれぞれは、独立に、Ｃ１〜６アルキル（第一級、第二級または第三級）、Ｃ３〜７シクロアルキルまたは環Ａ
【化Ｂ】
0006741587.tif 000059
であり、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５のそれぞれは、独立に、水素、Ｃ１〜４アルキル、Ｃ１〜４アルコキシ、トリフルオロメチル、フルオロ、クロロ、フェノキシ、ベンジルオキシまたはヒドロキシであり、ただし、Ｒ１およびＲ２の１つ以下がトリフルオロメチルであり、Ｒ１およびＲ２の１つ以下がフェノキシであり、Ｒ１およびＲ２の１つ以下がベンジルオキシであり、Ｒ１およびＲ２の１つ以下がヒドロキシであり、Ｒ３〜Ｒ５の１つ以下がトリフルオロメチルであり、Ｒ３〜Ｒ５の１つ以下がヒドロキシであり、
Ｘは、−（ＣＨ２）２−または−ＣＨ＝ＣＨ−（ｃｉｓおよび／もしくはｔｒａｎｓ）であり、
Ｚは、
【化Ｃ】
0006741587.tif 000060
であり、ここで、Ｑは、
【化Ｄ】
0006741587.tif 000061
であり、
ただし、Ｘが−ＣＨ＝ＣＨ−でありかつ／またはＲ６がＣ１〜３アルキルである場合のみ、Ｑは、
【化Ｅ】
0006741587.tif 000062
であり得、
Ｒ６は水素またはＣ１〜３アルキルであり、
Ｒ７は、水素、Ｒ８またはＭであり、Ｒ８は、薬学的に許容されるおよび加水分解性エステル基であり、Ｍは薬学的に許容されるカチオンである、
方法。
【請求項２】
前記宿主細胞系が、細胞培養物または孵化卵である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞培養物が、ＭＤＣＫ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＢＨＫ細胞またはＣＨＯ細胞からなる群より選択される、請求項１または２のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
前記化学薬剤が、０．００１μＭ〜１０μＭの最終濃度を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記化学薬剤が、０．０５μＭまたはそれ未満の濃度を含む、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記宿主細胞系が、ウイルスに感染している、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記化学薬剤が、前記宿主細胞のウイルス接種と同時的に添加される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ウイルスが、インフルエンザである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記宿主細胞系によって産生される前記組換えタンパク質もしくはウイルス粒子が、インフルエンザウイルス粒子、スプリットインフルエンザビリオンまたはインフルエンザウイルス糖タンパク質から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記インフルエンザウイルス糖タンパク質が、ヘマグルチニンである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
産生される前記組換えタンパク質もしくはウイルス粒子の収量が、ＥＬＩＳＡによって測定すると、対照と比較して少なくとも１．５倍増加する、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記化学薬剤が、ピタバスタチンまたはこれの異性体である、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記組換えタンパク質がインフルエンザタンパク質であり、前記宿主細胞系が細胞培養物であり、前記化学薬剤が０．０５μＭまたはそれ未満の濃度である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記宿主細胞系が細胞培養物であり、前記組換えタンパク質が、ＥＬＩＳＡによって測定すると、対照と比較して少なくとも２倍増加して産生されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記細胞培養物がＭＤＣＫ細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記細胞培養物がＭＤＣＫ細胞である、請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般に、宿主細胞において生体分子（例えば、生物製剤）、例えば、治療用、予防用および診断用タンパク質を産生するための方法および組成物に関する。本発明はまた、培養細胞からの生体分子の収量を増加させることに関する。
【背景技術】
【０００２】
多くの生物製剤、例えば、治療用、予防用および診断用タンパク質は、宿主細胞において産生される。例えば、インフルエンザワクチンのためのワクチン抗原は、哺乳動物細胞または鶏卵において産生されることが多い（Ｇｏｖｏｒｋｏｖａら、Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  Ｓｔａｎｄ、９８巻：３９〜５１頁（１９９８年））。同様に、モノクローナル抗体およびペプチドをベースとする治療薬を含めた多くの組換えタンパク質は、適切な宿主細胞において産生される。それにも関わらず、これらの産生系における収量は依然として最適以下であることが多い。
【０００３】
いくつかの研究は、細胞培養物または卵から産生される抗原性タンパク質またはウイルスの収量を増加させることを探究してきた。インフルエンザ製造者は、孵化卵を感染させるために使用される新鮮な接種材料において添加物として２５μｇ／ｍｌのヒドロコルチゾンを組み込んできた（国際公開第ＷＯ０２／０７４３３６号）。小分子化合物、薬物またはタンパク質による処理が、細胞培養物の産生能力を増加させるために試験されてきた。国際公開第ＷＯ２０１２／１３４１３０号は、ウイルス複製の負のモジュレーターとしての、ＣＨＤ６タンパク質およびインフルエンザウイルスポリメラーゼの相互作用を同定した。ＣＨＤ６遺伝子は、インフルエンザに感染したＨＥＫ２９３ＴまたはＡ５４９細胞系統に短鎖ヘアピンＲＮＡをトランスフェクトすることによってサイレンシングされた。この技術は、ウイルス力価において対照細胞を超える概ね５〜１０倍の増加を生じさせた。
【０００４】
別の研究において、米国特許第７，１３２，２７１号は、インターフェロンが媒介する抗ウイルス応答の抑制、特に、二本鎖ＲＮＡ依存性キナーゼが、ウイルス繁殖の増加を誘発する細胞培養物の許容性を変化させることができたことを開示している。ウイルスの感染の前に、安定的または一過性細胞を修飾して、ＰＫＲ欠損変異または２−５Ａシンテターゼ欠損変異を生じさせた。ＥＭＣＶ（脳心筋炎ウイルス）は、０．００１ＴＣＩＤ５０／細胞でＰＫＲ欠損細胞において複製されることができ、ウイルス複製における対照を超える千倍もの増加をもたらしたことが開示されている。
米国特許出願公開第２０１３−０３１５９５４号において、インフルエンザウイルスの産生を改善する方法が開示されており、産生はＭｄｍ２タンパク質およびｐ５３タンパク質の間の相互作用の小分子阻害剤の存在下で行われる。小分子化合物には、イミダゾリン誘導体、イミダゾール誘導体、オキシインドール誘導体、スピロインドリノン誘導体、キノロン誘導体、ビスアリールスルホンアミド誘導体、ベンゾジアゼピン（ｂｅｎｚｏｄｉａｐｅｚｉｎｅ）誘導体、ピペリジン誘導体、フェノキシ酢酸誘導体、フェノキシメチルテトラゾール誘導体、カルコン誘導体、テトラゾール誘導体、ジスルフィド誘導体、ジアミノアリール誘導体、およびＭｄｍ２タンパク質のペプチド阻害剤が含まれる。１つの特定の実験において、インフルエンザＨ３Ｎ２ウイルスに感染したＭＤＣＫ細胞系統を、０．１μＭ、１．０μＭ、および１０μＭのジヒドロイミダゾール化合物（Ｎｕｔｌｉｎ−３）で処理した。上清中のウイルスゲノムの測定は、１０−３の最初の感染多重度（ＭＯＩ）で、Ｎｕｔｌｉｎによる事前処理は、対照と比較して、上清中で感染２４時間後に最大１９倍多いウイルスゲノムのコピーを生じさせたことを示した。
国際公開第ＷＯ２０１２／１３６８５２号は、ＭＤＣＫまたはＡ５４９細胞におけるインフルエンザＡ型ウイルスの産生能力を増加させる医薬の使用について開示している。感染後２４〜４８時間の薬物とのインキュベーションの後、ウイルス力価およびノイラミニダーゼ活性を測定した。インフルエンザＡ亜型ウイルスの接種の前に、０．０１〜１０μＭのシンバスタチンを添加し、１．０μＭの濃度で概ね１．５〜３倍のＨ１Ｎ１ウイルス力価の増加を生じさせた。１種のインフルエンザＡ亜型株のみ（Ｈ１Ｎ１であるが、Ｈ３Ｎ２およびＨ５Ｎ１ではない）が、シンバスタチン処理された細胞において概ね１．５倍超のウイルス力価を生じさせたことが示された。インフルエンザＡ型株を使用して試験した他の医薬についてのウイルス収量の増加は、株、用量および／または薬物に依存した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２００２／０７４３３６号
【特許文献２】国際公開第２０１２／１３４１３０号
【特許文献３】米国特許第７，１３２，２７１号明細書
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｇｏｖｏｒｋｏｖａら、Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  Ｓｔａｎｄ（１９９８年）９８巻：３９〜５１頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
今日までに、特許も文献も、宿主細胞系からの生体分子の収量を増加させるために非常に低い濃度、例えば、０．０５μＭまたはそれ未満で小分子化合物を使用することについて記載していない。治療用、予防用および診断用の使用のための生体産物のロバストな製造、産生効率の上昇および対費用効果の高い加工が依然として必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は一般に、医薬品適用、例えば、診断、治療または予防適用における使用に適したタンパク質の産生を増加させる方法を提供する。したがって、本発明は、医薬製品、例えば、ワクチンを含めた生物製剤の製造に適している。
【０００９】
本発明は、宿主細胞系における特定の細胞経路（複数可）のモジュレーションが、宿主における生体分子の産生の増進をもたらすことができるという認識を広い意味で包含する。一部の実施形態では、本発明を行うために有用な化合物は、タンパク質の脂質付加（プレニル化）、コレステロール生合成、および／またはＧタンパク質共役受容体シグナル伝達、例えば、細胞内のｃＡＭＰ依存性シグナル伝達をレギュレートし得る。
【００１０】
さらに具体的には、一態様では、本発明は、スタチンが関連する細胞経路をモジュレートすることによって、宿主細胞系において産生される生体分子、例えば、組換えタンパク質およびウイルス粒子の収量を増加させるための方法を提供する。特定の理論に束縛されることを望まないが、本明細書において提示されるデータは、増進効果が、コレステロール依存性およびコレステロール非依存性作用機序の両方が関与するメバロン酸経路を介して媒介され得ることを示唆する。
【００１１】
別の態様では、本発明は、ドパミンおよび／またはセロトニンが関連する細胞経路をモジュレートすることによって、宿主細胞系において産生される生体分子、例えば、組換えタンパク質およびウイルス粒子の収量を増加させる方法を提供する。一部の実施形態では、ドパミン経路および／またはセロトニン経路に影響を与える適切な化合物は、受容体の１つまたは複数についての選択的リガンド、例えば、アゴニストおよびアンタゴニスト（例えば、完全アゴニスト、部分アゴニスト、ニュートラルアンタゴニスト、インバースアゴニストなど）である。一部の実施形態では、このような化合物は、これらに限定されないが、宿主細胞における５−ＨＴ７、５−ＨＴ１、および／または５−ＨＴ５受容体シグナル伝達を含めた少なくとも１つのセロトニン受容体を介して作用する。一部の実施形態では、このような化合物は、５−ＨＴ７受容体シグナル伝達を介して作用する。一部の実施形態では、このような化合物は、細胞内のｃＡＭＰレベルを低減させることができる。
【００１２】
驚いたことに、観察された増進効果が、宿主細胞におけるウイルス産生に限定されず、特定の細胞系統にも限定されないことを本出願の発明者らは発見した。むしろ、本明細書に記載されている適切な化合物（例えば、スタチンおよびスタチン様分子、受容体リガンド、構造的類似体または誘導体、機能的等価物、およびこれらの組み合わせを含めた、スタチンが関連するおよび／または５ＨＴＲが関連するシグナル伝達をモジュレートすることができる化合物）の使用は、種々の宿主細胞系においてタンパク質産生を増加させるより一般的手段を提供し得る。さらに、本発明者らは、驚くほど低濃度で使用されるとき、本明細書において提供される特定の分子がウイルス／タンパク質産生の増進において有効であることを同定した。これは、ヒトへの使用に適した高度の純度を必要とする医薬製品を製造するために特に有利である。このように、このような方法は、生物製剤の商業スケールの産生に適している。
【００１３】
したがって、宿主細胞と表１から選択される少なくとも１種の薬剤とを接触／処理することを含む、宿主細胞系、例えば、細胞培養物または孵化卵からタンパク質を産生する方法を提供する。化合物についての残基を、さらに下記で詳細に定義する。
【表１−１】
0006741587.tif 000002
【表１−２】
0006741587.tif 000003
【表１−３】
0006741587.tif 000004
【００１４】
一部の実施形態では、少なくとも１種の薬剤（例えば、１種または複数の薬剤）は、本発明を実施するための下記の表において提供する化合物から選択される。
【表４−１】
0006741587.tif 000005
【表４−２】
0006741587.tif 000006
【表４−３】
0006741587.tif 000007
【００１５】
商業的および安全性の観点の両方から、本明細書に記載されている化合物を比較的低濃度で使用することによって、宿主細胞系（例えば、細胞培養物および卵）におけるタンパク質収量の増進を達成することは特に有利である。したがって、本発明は、宿主細胞と、低濃度での少なくとも１種の化学薬剤、例えば、スタチンまたはスタチン誘導体とを接触させることを含む、宿主細胞系、例えば、細胞培養物または卵から生体分子を産生する方法を提供する。一部の実施形態では、スタチンまたは誘導体は、シンバスタチンではない。このような薬剤は、宿主細胞が細胞培養物であるとき、０．００１μＭ〜１０μＭの間、好ましくは、０．０５μＭまたはそれ未満の最終濃度で存在し得る。宿主細胞が孵化卵であるとき、化学薬剤は、卵毎に少なくとも１０〜２０μＭ、３０μＭ、４０μＭ、５０μＭ、６０μＭ、７０μＭ、８０μＭ、９０μＭ、１００μＭまたはそれ超の濃度で存在し得る。
【００１６】
本発明において使用される適切な化学薬剤は、治療有効性を有し、かつ細胞または動物において使用されたとき有毒でないものである。このような化合物は、規制する目的のために十分に特徴付けられた安全性プロファイルを有することが特に望ましい。このように、有用な化学薬剤は、ヒトへの使用について安全であると承認され、それによって毒性およびクリアランスについて厳密な試験を受けてきた市販の医薬から選択し得る。このような薬剤は、生体産生系における成長増進剤として特に適している。したがって、本発明の方法は、公知の医薬品、本明細書に記載されている化学薬剤およびその類似体を包含する。好ましくは、これらの薬剤は、生体産物収量を、比較対照で見られるものより少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４倍、少なくとも約４．５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約５．５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約６．５倍、少なくとも約７倍、少なくとも約７．５倍、少なくとも約８倍、少なくとも約８．５倍、少なくとも約９倍、少なくとも約９．５倍、または約１０倍までまたはそれ超増加させるのに有効な量で使用される。
【００１７】
本発明の方法はまた、対照と比較して少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、５００％またはそれ超の、収量における少なくとも増加だけ、本明細書において産生されるように、生体分子または生体産物の収量を増加し得る。好ましくは、収量の増加は、対照と比較した、培養上清中の産生された生体分子の量、例えば、総粒子（ｖＲＮＡコピー／ｍｌ）、感染性粒子（ＩＵ／ｍｌ）またはタンパク質（μｇ／ｍｌ）によって測定することができる。インフルエンザウイルス製造のために、好ましくは、ＨＡ抗原収量の増加は、対照と比較して測定される。本特許の目的のために、収量の増加は好ましくは、産生される標的産物を検出するＥＬＩＳＡ、インフルエンザワクチンについては、ＨＡ−ＥＬＩＳＡによって測定される。
【００１８】
好ましい化学薬剤は、宿主細胞によって高度に代謝されないものである。化学薬剤は安定的であり、宿主細胞、試薬および製造条件の存在下で実質的に分解せず、産生プロセスを通して適用可能なアッセイによって追跡することができる。本明細書に記載されている宿主細胞系において使用される化学薬剤のクリアランスまたは分解を検出する方法をまた提供する。
【００１９】
化学薬剤は精製された試料（例えば、産物）中に存在すべきでないが、化学薬剤は、製造プロセスの間に追跡することができる。化学薬剤は化学的に安定的であり、宿主細胞との０時間、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１５時間、２０時間、２５時間、３０時間、３５時間、４０時間、４５時間、５０時間、５５時間および６０時間の接触の後に、細胞培養上清中でこれらの未代謝形態で測定または検出することができる。好ましくは、化学薬剤は、純粋な溶媒（概ね５０％のアセトニトリル）中での０．５ｎｇ／ｍｌの検出限界を伴う質量分析法を使用して、最終産物において測定すると分解していない。インフルエンザワクチン産生のために、未代謝の化学薬剤は、存在しないか、またはすなわち感染後６０時間まで、純粋な溶媒中で、細胞培養上清中で、０．５ｎｇ／ｍｌもしくはそれ未満の検出限界（ＬＯＤ）で検出することができないレベルで検出不能である（例えば、１０−３または１０−４の低ＭＯＩウイルス感染）。
【００２０】
本発明の一部の実施形態では、製造は０．０５μＭもしくはそれ未満の最終濃度を含む少なくとも１種の化学薬剤の存在下で行われるか、またはそれによって、産物における２倍の増加が達成されることを特徴とする、宿主細胞系において目的の生体産物、例えば、タンパク質およびウイルスを製造する方法を提供する。
【００２１】
一部の実施形態では、本発明は、０．００１μＭ〜１．０μＭの範囲の最終濃度を有する少なくとも１種の化学薬剤を使用した、細胞培養物または孵化卵からウイルスを製造する方法を提供し、それによって、抗原産生における少なくとも２倍の増加が達成される。
【００２２】
本発明は、ウイルスの成長を改善させ、細胞の産生能を増加させ、ウイルス力価、ＨＡ抗原の発現および／または収量を増加させることによって、インフルエンザワクチン製造において特定の使用および効果を有する。本発明の方法は、製造バッチ当たりに得られる増加した量および用量の抗原性産物を生じさせる。したがって、本発明は、産生が１μＭまたはそれ未満、好ましくは、０．０５μＭまたはそれ未満の濃度を有する少なくとも１種の薬剤の存在下で行われ、それによってウイルス粒子または抗原が、対照と比較して２倍超の収量で産生されることを特徴とする、宿主細胞、好ましくは、哺乳動物細胞、より好ましくは、培養細胞においてインフルエンザウイルスを産生する方法を提供する。
【００２３】
一部の実施形態では、本発明は、その産生が薬剤またはその誘導体の存在下で行われ、対照と比較して２倍超のウイルス粒子または抗原の収量を生じさせることを特徴とする、宿主細胞系、例えば、細胞培養物または孵化卵においてインフルエンザＢ型株を産生する方法を提供する。
【００２４】
一部の実施形態では、ウイルスまたは別のベクターによる宿主細胞のトランスフェクション／感染の前にか、それと同時的にか、またはその後に、少なくとも１種の化学薬剤を使用して、宿主細胞を処理することができる。目的の生体産物の収量の増加を達成するために、宿主細胞は、トランスフェクション／感染の前にか、または後に、０〜１時間、０〜２時間、０〜３時間、０〜４時間、０〜５時間、０〜１２時間、０〜２０時間、０〜３０時間、０〜４０時間、０〜５０時間、０〜６０時間の期間、少なくとも１種の化学薬剤と接触させ得る。
【００２５】
本発明はさらに、典型的な成長条件下で特定の宿主細胞において発現しているとき、その産生収量が最適以下であると考えられる組換えタンパク質（またはその断片）（例えば、「低収量体（ｌｏｗ  ｙｉｅｌｄｅｒ）」および「中間収量体（ｍｉｄ−ｙｉｅｌｄｅｒ）」）の産生を増加させる方法を提供する。タンパク質産生は、収量が典型的には、２〜１０ｍｇ／Ｌの範囲（「中間収量体から低収量体」）、特に、約５ｍｇ／Ｌまたはそれ未満（「低収量体」）であるとき、最適以下であると考えられる。このような方法は、本開示によって包含される化合物、例えば、スタチンおよびこれらの構造的類似体（シンバスタチンを含む）ならびにこれらの機能的等価物、ならびに本明細書に記載のような特定のＧＰＣＲ結合剤の１つまたは複数の使用を含む。本発明の方法は、低収量体のタンパク質産生を増進させるために特に有用である。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
宿主細胞系と表１から選択される少なくとも１種の化学薬剤とを接触させるステップを含む、宿主細胞系から治療用生体分子、予防用生体分子または診断用生体分子を産生するための方法。
（項目２）
前記宿主細胞系が、細胞培養物または孵化卵である、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記細胞培養物が、ＭＤＣＫ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＢＨＫ細胞またはＣＨＯ細胞からなる群より選択される、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目４）
前記化学薬剤が、０．００１μＭ〜１０μＭの最終濃度を有するスタチンまたはその類似体である、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記化学薬剤が、０．０５μＭまたはそれ未満の濃度、および下記のような構造：
【化４４】
0006741587.tif 000008
を含む、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目６）
前記宿主細胞系が、ウイルスに感染している、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目７）
前記化学薬剤が、前記宿主細胞のウイルス接種と同時的に添加される、項目６に記載の方法。
（項目８）
ウイルスが、インフルエンザである、項目７に記載の方法。
（項目９）
前記宿主細胞系によって産生される前記生体分子が、インフルエンザウイルス粒子、スプリットインフルエンザビリオンまたはインフルエンザウイルス糖タンパク質から選択される、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記インフルエンザウイルス糖タンパク質が、ヘマグルチニンである、項目９に記載の方法。
（項目１１）
産生される前記生体分子の収量が、ＥＬＩＳＡによって測定すると、対照と比較して少なくとも１．５倍増加する、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目１２）
類似体が、フルバスタチン、ピタバスタチン、アトルバスタチン、セリバスタチン、ロバスタチン、メバスタチン、プラバスタチンまたはこれらの異性体からなる群より選択される、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目１３）
前記化学薬剤が、フルバスタチンもしくはピタバスタチンまたはこれらの異性体である、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目１４）
細胞培養物と０．０５μＭまたはそれ未満の濃度の少なくとも１種のスタチン化合物またはその類似体とを接触させるステップを含む、細胞培養物において治療用インフルエンザタンパク質、予防用インフルエンザタンパク質または診断用インフルエンザタンパク質を産生するための方法。
（項目１５）
細胞培養物において治療用タンパク質、予防用タンパク質または診断用タンパク質を産生するための方法であって、前記産生が、シンバスタチン以外の少なくとも１種のスタチンまたはその誘導体の存在下で行われ、前記タンパク質が、ＥＬＩＳＡによって測定すると、対照と比較して少なくとも２倍増加して産生されることを特徴とする、方法。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図１は、ＨＡ収量を改善する化学薬剤の同定のためのプロセスフローダイアグラムを示す。
【００２７】
【図２】図２は、感染６０時間後（ｈｐｉ）におけるＭＯＩ＝１０−４でのＨ３Ｎ２株ＩＶＲ−１６５によるＥＬＩＳＡによって測定したＨＡ収量の用量反応の増進を示す。
【００２８】
【図３】図３は、１μＭのスルホンアミドまたは０．０５μＭのピタバスタチンを使用した、複数のインフルエンザＡ亜型Ｈ３Ｎ２株から得た増進されたＨＡ収量を例示する棒グラフを示す。これらの研究において、２〜３倍のＨＡ収量が典型的には観察された。
【００２９】
【図４】図４は、１μＭのスルホンアミドおよび０．０５μＭのピタバスタチンについての、複数のＢ亜型株から得た増進されたＨＡ収量を示す棒グラフを示す。株によって、少なくとも２〜１０倍のＨＡ収量が典型的には観察された。
【００３０】
【図５Ａ】図５は、ＲＮＡａｓｅ耐性インフルエンザＭ転写物のｑＰＣＲによって測定したＨＡ収量の増進を示す。（ａ）１μＭのスルホンアミドまたは０．０５μＭのピタバスタチンについて、総粒子はＨＡ収量と比較することができる。（ｂ）０．０５μＭのピタバスタチンを使用した総粒子とＨＡ収量の増加の比較。
【図５Ｂ】図５は、ＲＮＡａｓｅ耐性インフルエンザＭ転写物のｑＰＣＲによって測定したＨＡ収量の増進を示す。（ａ）１μＭのスルホンアミドまたは０．０５μＭのピタバスタチンについて、総粒子はＨＡ収量と比較することができる。（ｂ）０．０５μＭのピタバスタチンを使用した総粒子とＨＡ収量の増加の比較。
【００３１】
【図６−１】図６は、ピタバスタチンおよびスルホンアミドの検出のための質量分析を使用した、化合物の追跡可能性を示す直線状プロットを示す。アッセイは、純粋な溶媒（５０％のアセトニトリル）からの概ね０．５ｎｇ／ｍｌの検出限界を有する。
【図６−２】図６は、ピタバスタチンおよびスルホンアミドの検出のための質量分析を使用した、化合物の追跡可能性を示す直線状プロットを示す。アッセイは、純粋な溶媒（５０％のアセトニトリル）からの概ね０．５ｎｇ／ｍｌの検出限界を有する。
【図６−３】図６は、ピタバスタチンおよびスルホンアミドの検出のための質量分析を使用した、化合物の追跡可能性を示す直線状プロットを示す。アッセイは、純粋な溶媒（５０％のアセトニトリル）からの概ね０．５ｎｇ／ｍｌの検出限界を有する。
【図６−４】図６は、ピタバスタチンおよびスルホンアミドの検出のための質量分析を使用した、化合物の追跡可能性を示す直線状プロットを示す。アッセイは、純粋な溶媒（５０％のアセトニトリル）からの概ね０．５ｎｇ／ｍｌの検出限界を有する。
【図６−５】図６は、ピタバスタチンおよびスルホンアミドの検出のための質量分析を使用した、化合物の追跡可能性を示す直線状プロットを示す。アッセイは、純粋な溶媒（５０％のアセトニトリル）からの概ね０．５ｎｇ／ｍｌの検出限界を有する。
【００３２】
【図７】図７は、０．０５μＭでのピタバスタチンおよび対照と比較した、フルバスタチン誘導体で処理された細胞からのＡ亜型Ｈ３Ｎ２のＨＡ収量（μｇ／ｍｌ）を示す。
【００３３】
【図８】図８は、市販のスタチンで処理された細胞のＡ亜型／テキサスＸ２２３ＡのＨＡ収量（μｇ／ｍｌ）の比較を示す。
【００３４】
【図９】図９は、メバロン酸経路の関与を示す。（Ａ）メバロン酸経路の略図を例示する。（Ｂ）特定の酵素阻害剤の組み合わせでメバロン酸経路の３つのアーム全てを遮断することは、宿主細胞におけるタンパク質収量に対するスタチンの効果を模倣することができる。
【００３５】
【図１０】図１０は、Ａｍｂｒ１５  対  振とうフラスコにおけるＨＡ収量の並列比較を提供する。両方のリード化合物は、Ａｍｂｒ１５においてＣＤＭおよびＤＭ１３４培地の両方中で低発現Ｂ／Ｍａｓｓ／２／１２についての収量を増進させた。
【００３６】
【図１１】図１１は、Ａｍｂｒ１５  対  振とうフラスコにおけるＨＡ収量の並列比較を提供する。ＡＦＺ０７７のみが、Ａｍｂｒ１５においてＣＤＭおよびＤＭ１３４培地の両方中で高発現Ａ／Ｖｉｃ／３６１／１１（ＩＶＲ１６５）についての収量を増進させた。
【００３７】
【図１２】図１２は、ＨＡ−ＥＬＩＳＡによって測定した、２つの濃度での、２つの異なる細胞密度（低および高ＩＣＤ）での２種のリード化合物による、Ａ型株およびＢ型株におけるＨＡ収量を提供する。
【００３８】
【図１３】図１３は、示したような濃度でＢＹＦ５８９によって試験した、Ｂ型株におけるＨＡ収量を示すグラフを提供する。
【００３９】
【図１４】図１４は、示したような濃度でＡＦＺ０７７によって試験した、Ｂ型株におけるＨＡ収量を示すグラフを提供する。
【００４０】
【図１５】図１５は、ＡＦＺ０７７によるインフルエンザＨＡ収量増進が５ＨＴ７受容体の減少する活性によって決まることを示すグラフを提供する。ＤＭ１３４培地中のインフルエンザＢ型株（Ｂ／Ｍａｓｓ）；ＥＬＩＳＡによる６５時間のＨＡ収量（μｇ／ｍｌ）。
【００４１】
【図１６】図１６は、示すように変化する濃度での示した化合物で処理した、Ａ型株（ＩＶＲ１６５）からのＨＡ収量のＥＬＩＳＡ結果を要約する。
【００４２】
【図１７】図１７は、ＡＦＺ０７７に対するＳＡＲからの利用可能な類似体の、ＨＡ収量を示すグラフを提供する。
【００４３】
【図１８】図１８は、２つのグラフを提供する。（Ａ）ＢＦＹ５８９処理された細胞に対する処理されていない細胞のタンパク質収量。各データポイントは、試験した標的タンパク質を表す。（Ｂ）対照収量（処理されていない）の関数としての倍数増加（ｆｏｌｄ−ｉｎｃｒｅａｓｅ）でのタンパク質発現。各データポイントは、試験した標的タンパク質を表す。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
本発明者らは、宿主細胞系からの生体産物の産生または発現の増加を促進する方法を同定した。その他の点で同等な条件下で適切なビヒクル、例えば、ＤＭＳＯで処理された対応する対照細胞から産生された生体分子と比較して、本明細書において包含される低濃度の少なくとも１種の化学薬剤を使用して、産生は有意に改善する。
【００４５】
したがって、一部の実施形態では、宿主細胞系からの生体分子の収量における増加は、対応する対照と比較して少なくとも２倍である。本発明において使用される化学薬剤の存在下で産生される生体分子における収量は、特定の宿主細胞、ウイルス、タンパク質、化学薬剤の個々の特徴、何が所望の細胞活性を構成するかの決定、または所与の実験分析において一般に使用される他の使用者が定義するパラメーターによって変化し得る。一部の実施形態では、目的の生体産物の産生収量は、対照（すなわち、化合物を伴わないが、その他の点で同等な条件での成長）と比較して少なくとも２０％、例えば、少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、２２５％、２５０％、２７５％、３００％、３５０％、４００％、４５０％、および５００％増加する。
【００４６】
本発明において使用される化学薬剤の適切な濃度は、約０．１ｎＭ〜１０μＭの範囲から選択し得る。本発明を行うために使用される化合物の適切な濃度は、対照と比較して産生収量を増加させるのに有効な濃度を指す。適切な濃度は、例えば、０．１〜５０００ｎＭ、例えば、０．５〜１０００ｎＭ、０．５〜５００ｎＭ、０．５〜２５０ｎＭ、０．５〜２００ｎＭ、０．５〜１５０ｎＭ、０．５〜１００ｎＭ、０．５〜７５ｎＭ、０．５〜５０ｎＭ、０．５〜２５ｎＭ、０．５〜２０ｎＭ、０．５〜１５ｎＭ、０．５〜１０ｎＭ、０．５〜５ｎＭ、１〜１００ｎＭ、１〜７５ｎＭ、１〜５０ｎＭ、１〜２５ｎＭ、１〜２０ｎＭ、１〜１５ｎＭ、１〜１０ｎＭ、２〜５０ｎＭ、２〜４０ｎＭ、２〜２０ｎＭ、２〜１０ｎＭの間などの範囲であり得る。一部の実施形態では、有効濃度は、≦５０ｎＭ、例えば、≦４０ｎＭ、≦３０ｎＭ、≦２５ｎＭ、≦２０ｎＭ、≦１５ｎＭ、≦１４ｎＭ、≦１３ｎＭ、≦１２ｎＭ、≦１１ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦９ｎＭ、≦８ｎＭ、≦７ｎＭ、≦６ｎＭ、≦５ｎＭである。例として、本発明において使用される化学薬剤は、０．００１μＭ〜０．５μＭ、好ましくは、約０．０１μＭ、０．０２μＭ、０．０３μＭ、０．０４μＭ、０．０５μＭ、０．０６μＭ、０．０７μＭ、０．０８μＭ、０．０９μＭ、または０．１０μＭの最終濃度で存在し得る。好ましくは、化学薬剤は、産物収量において少なくとも２０％の増加を達成することができる最も低い濃度で宿主細胞と接触する。より好ましくは、化学薬剤は、産物収量において少なくとも２倍の増加を達成することができる最も低い濃度で宿主細胞と接触する。
【００４７】
化学薬剤の濃度はまた、本発明に記載する結果を生じさせることができる特定の薬剤、系または条件によって決まり、宿主細胞、ウイルス、または生体産物に対して無毒性のままである。本発明の結果を達成する最適濃度は、通例の方法を使用して調節することができる。例えば、産生スケールのための適切な条件および結果を達成するために、実験条件を合わせることができる。
【００４８】
本明細書に記載されている特定の化学薬剤は、これらの物理的、化学的および薬理学的な質によって特徴付けられ得る。これらの化学薬剤を化学的に操作して、最適濃度で薬剤を提供し、宿主細胞系、特に、細胞培養物および卵における生体産物の収量を増加し得る。
【００４９】
一態様では、宿主細胞と接触する特定の化学薬剤の効果または活性は、化学薬剤の親油性が増加する場合、増進させることができる。化学薬剤の化学的および構造的修飾によって、細胞膜輸送またはタンパク質発現を増進し得る。特定の態様では、化学薬剤を化学修飾して、プロドラッグ類似体を生成することができる。プロドラッグを作製および使用することにおいて関与する標準的な技術は、本発明において使用される化学薬剤に適切に適用可能である。Ｔｈｅ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３１〜３２章（Ｗｅｒｍｕｔｈ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．、２００１年）を参照されたい。
【００５０】
本発明において使用される薬剤の例示的なプロドラッグは、被験体へのプロドラッグの投与に続いてｉｎ  ｖｉｖｏでの生理学的作用、例えば、加水分解、代謝などを示すことが既に公知である市販の医薬物質である。一般に、生体前駆体プロドラッグは、対応する活性薬物化合物と比較して不活性であるか、または低活性を有し、１個または複数の保護基を含有し、代謝または加溶媒分解によって活性形態に変換される化合物である。活性薬物形態および任意の放出された代謝産物の両方は、許容できる程度に低毒性を有するべきである。担体プロドラッグは、輸送部分を含有し、例えば、取込みおよび／または作用の部位（複数可）への局在的送達を改善させる薬物化合物である。望ましくはこのような担体プロドラッグについて、薬物部分および輸送部分の間の連結は共有結合であり、プロドラッグは、不活性か、または薬物化合物より活性でなく、任意の放出された輸送部分は許容できる程度に無毒性である。輸送部分が取込みを増進させることを意図するプロドラッグについて、典型的には、輸送部分の放出は、急速であるべきである。他の場合では、遅い放出を提供する部分、例えば、特定のポリマーまたは他の部分、例えば、シクロデキストリンを利用することが望ましい。例えば、担体プロドラッグを使用して、下記の特性、親油性の増加、薬理学的効果の期間の増加、部位特異性の増加、毒性および有害反応の減少、ならびに／または薬物製剤の改善（例えば、安定性、水溶解性、望ましくない感覚受容または生理化学的特性の抑制）の１つまたは複数を改善させることができる。例えば、親油性は、（ａ）親油性カルボン酸（例えば、少なくとも１つの親油性部分を有するカルボン酸）を有するヒドロキシル基、または（ｂ）親油性アルコール（例えば、少なくとも１つの親油性部分を有するアルコール、例えば、脂肪族アルコール）を有するカルボン酸基のエステル化によって増加させることができる。本発明において使用されるように、化学薬剤を修飾して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで生体産物を発現させるための宿主細胞系の産生能を促進する。
【００５１】
このように、本発明は、従来の薬学的に許容される酸、例えば、マレイン酸、塩酸、臭化水素酸、リン酸、酢酸、フマル酸、サリチル酸、クエン酸、乳酸、マンデル酸、酒石酸およびメタンスルホン酸の形態で化学薬剤を包含する。化学薬剤はまた、溶媒和物、例えば、水和物を形成してもよく、本発明はまた、これらの形態にまで及ぶ。
【００５２】
本発明において使用される化学薬剤のいくつかの構造は、１つまたは複数の立体中心を有してもよく、各中心は、Ｒ配置もしくはＳ配置、またはこれらの組み合わせで存在し得ることに留意されたい。同様に、本明細書において提示される化合物は、１つまたは複数の二重結合を有してもよく、それぞれはＥ（ｔｒａｎｓ）もしくはＺ（ｃｉｓ）配置、またはこれらの組み合わせで存在し得る。１つの特定の立体異性体、位置異性体（ｒｅｇｉｏｉｓｏｍｅｒ）、ジアステレオマー、エナンチオマーまたはエピマーの提示は、全ての可能性のある立体異性体、位置異性体、ジアステレオマー、エナンチオマーまたはエピマーおよびこれらの混合物を含むと理解すべきである。このように、本明細書において提示される化合物は、全ての別々の立体配置的な立体異性体形態、位置異性体形態、ジアステレオマー形態、鏡像異性形態、およびエピマー形態、ならびに対応するこれらの混合物を含む。１つまたは複数のキラル中心を含有するが、特定の立体化学を指定しない化合物についての１つの特定の化学構造または化学名の提示は、全ての可能性のある立体異性体の混合物、１つの特定の立体異性体の純粋な形態または実質的に純粋な形態、および交互立体異性体（ａｌｔｅｒｎａｔｅ  ｓｔｅｒｅｏｉｓｏｍｅｒ）の純粋な形態または実質的に純粋な形態を含めた全ての可能性のある立体異性体を含むと理解すべきである。未変化の特定の立体中心を反転させるか、または残すための技術、および立体異性体の混合物を分解するための技術は当技術分野で周知であり、特定の状況についての適当な方法を選択することは十分に当業者の能力の範囲内である。例えば、Ｆｕｒｎｉｓｓら（編）、ＶＯＧＥＬ’Ｓ  ＥＮＣＹＣＬＯＰＥＤＩＡ  ＯＦ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＯＲＧＡＮＩＣ  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ、第５版、Ｌｏｎｇｍａｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｌｔｄ．、Ｅｓｓｅｘ、１９９１年、８０９〜８１６頁；およびＨｅｌｌｅｒ、Ａｃｃ．  Ｃｈｅｍ．  Ｒｅｓ．、１９９０年、２３巻、１２８頁を参照されたい。
【００５３】
本発明において使用される薬剤（複数可）の任意の不斉原子（例えば、炭素など）は、ラセミのまたは鏡像異性的に富化した、例えば、（Ｒ）−、（Ｓ）−または（Ｒ，Ｓ）−配置で存在することができる。ある特定の実施形態では、各不斉原子は、（Ｒ）−または（Ｓ）−配置において、少なくとも５０％の鏡像体過剰率、少なくとも６０％の鏡像体過剰率、少なくとも７０％の鏡像体過剰率、少なくとも８０％の鏡像体過剰率、少なくとも９０％の鏡像体過剰率、少なくとも９５％の鏡像体過剰率、または少なくとも９９％の鏡像体過剰率を有する。不飽和結合を有する原子における置換基は、可能な場合、ｃｉｓ−（Ｚ）−またはｔｒａｎｓ−（Ｅ）−形態で存在し得る。本明細書において包含される化学薬剤は、Ｒ−もしくはＳ−形態の両方を含有するラセミ混合物中に存在してもよいか、または代わりにＲ−もしくはＳ−形態で鏡像異性的に富化してもよく、かつ／または各エナンチオマーにおける所望のレベルの機能活性に依存する。
【００５４】
異性体の任意のこのように得られた混合物は、例えば、クロマトグラフィーおよび／または分別結晶によって、構成要素の物理化学的差異に基づいて、純粋もしくは実質的に純粋な幾何異性体または光学異性体、ジアステレオマー、ラセミ化合物に分離することができる。
【００５５】
本発明において使用される化学薬剤は、一般の化学分析によって設計またはモデル化することができる。例えば、当業者は、構造活性相関（ＳＡＲ）を用いて、立体配座類似体への化合物の構成要素および側基を修飾し得る。ＳＡＲは、生物学的活性のさらなるプロファイリングのための十分な各活性化合物を提供することを目的とする。構造は、主に質量分析法および核磁気共鳴データに基づいて決定し得る。
【００５６】
化学薬剤、中間体および類似体の単離および精製は、必要に応じて、任意の適切な分離または精製手順、例えば、濾過、抽出、結晶化、カラムクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、遠心分離クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、またはこれらの手順の組み合わせによって達成される。適切な合成および単離手順の特定の例示は、その全体が参照により組み込まれている本明細書に記載されている特許において見出すことができる。
【００５７】
製造プロセスへと合成化合物を加えることにおける懸念は、分解産物、例えば、代謝物からの毒性についての可能性である。分解産物は、宿主細胞におけるその生体内変化、例えば、酸化、還元などによるより極性分子への生体内変化の結果として産生された化合物の代謝物であり得る。分解産物は、分子量、溶解度の程度、および分子構造または組成などにおいて当初の化合物と異なり得る。分解産物が製造プロセスに供されると、これらの分解産物を許容できないレベルに濃縮し得ることが可能であり、これは下流のプロセスにおいて特に問題がある。
【００５８】
化学薬剤、代謝物、またはその類似体のクリアランスについてのアッセイは、本質的に本明細書に記載のように達成し得る。代謝物の定量化または同定のためのアッセイは、ＨＰＬＣ、ＴＬＣ、電気化学分析、質量分析法、屈折率分光法、紫外分光法、蛍光分析、放射化学分析、近赤外分光法、核磁気共鳴分光法、光散乱分析および当技術分野において公知の他の方法を含めた標準的分析方法を使用して当業者には公知である。
【００５９】
一態様では、本発明において使用される化学薬剤は、インフルエンザＨＡ抗原の加工、精製または濃縮の間に実質的に代謝も分解もされない。質量分析によって測定するとインフルエンザウイルス精製後に微量の未代謝の化合物が残り得、典型的には、当初の投入量の０．２５％未満が精製プロセス後に残る。
【００６０】
培地または産物中に存在する代謝物のレベルは、例えば、親化合物の少なくとも１つの試験した活性の約１％超、２％、約３％超、約４％超、約５％超、約１０％超、約２０％超、約３０％超、約４０％超、約５０％超、または選択した化学薬剤の投入量を超えるべきではない。
【００６１】
一態様では、化学薬剤は、精製された試料中で検出されない。化学薬剤は、本明細書において例示するように、約０．５ｎｇ／ｍｌの純粋な溶媒（５０％アセトニトリル）の検出限界（ＬＯＤ）で追跡することができる。好ましくは、精製された試料中に存在し得る任意の化学薬剤は、細胞培養上清中、より好ましくは、精製された試料、例えば、インフルエンザウイルスまたは抗原の一価のバルクを含むモノバルク（ｍｏｎｏｂｕｌｋ）である最終産物中に０．５ｎｇ／ｍｌまたはそれ未満で検出される。
【００６２】
スタチン類似体
成長増進剤としてのシンバスタチンの使用は、従前に記載されてきた（上記を参照されたい）。しかし、いくつかの他のスタチン化合物が、宿主細胞系において産生される生体分子の収量の増加を促進することを本発明者らは発見した。これらのスタチン剤は、低スタチン濃度で少なくとも２倍の収量をもたらすことができる。特定の態様では、本発明に記載されている化学薬剤は、特に低濃度で多くのインフルエンザ亜型および株に驚くほど広範な適用を有する。
【００６３】
本発明の原理は一般に、多くのスタチンに広範に適用可能であるが、好ましくは、シンバスタチンを除外する。本発明における３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−コエンザイム−Ａレダクターゼ阻害剤（「ＨＭＧ−ＣｏＡ阻害剤」）の意味および定義は、メバロン酸へとＨＭＧ−ＣｏＡを変換する律速酵素であるＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼの任意の選択的競合阻害剤を指し、コレステロール低下スタチンと一般に称される。
【００６４】
スタチンは、芳香族または脂環式コアに結合しているヘプテン酸またはヘプタン酸部分（遊離酸、塩またはラクトン）からなる特徴的な構造を共有する。スタチンの生物学的活性は、これらの立体化学、特に、前記ヘプテン酸またはヘプタン酸部分のキラル原子における配置に密接に関連する。スタチンおよびその類似体は商業的に入手可能であり、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼによるコレステロールへのメバロン酸の変換を阻害するために広範に使用される。スタチンがこの生物学的経路によって作用するかどうかを決定するためのアッセイは、米国特許第４，２３１，９３８号に開示されている。
【００６５】
スタチンは、２つの群：発酵由来および合成に分割することができる。天然に存在するスタチンは、Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｕｌｔｉｍｕｍ、Ｍｏｎａｃｕｓ  ｒｕｂｅｒ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｉｔｒｉｎｕｍ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｂｒｅｖｉｃｏｍｐａｃｔｕｍおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓから単離した真菌代謝物の誘導体（ＭＬ−２３６Ｂ／コンパクチン／モノカリンＫ（ｍｏｎｏｃａｌｉｎ  Ｋ））であるが、示されるようにこれらは、また合成的に調製することができる。例として、スタチンは、アトルバスタチン、メバスタチン（もしくはコンパクチン）、フルインドスタチン（ｆｌｕｉｎｄｏｓｔａｔｉｎ）、ベロスタチン（ｖｅｌｏｓｔａｔｉｎ）、フルバスタチン、ダルバスタチン、セリバスタチン、ペントスタチン、ロスバスタチン、ロバスタチン（例えば、メビノリン）、ピタバスタチン、シンバスタチン、またはその類似体から選択し得る。
【００６６】
スタチン誘導体は文献において周知であり、Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：第５巻、Ａｎａｌｙｓｉｓ，  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  ＮＹ（１９８３年）；およびＵＳ４３９７７８６に開示されている方法によって調製することができる。種々のスタチン類似体は、生体分子および産物、特に、培養細胞および卵から産生されたインフルエンザウイルス産物の発現および収量を増加させる。
【００６７】
これらのスタチンおよびその類似体のいずれかを、本発明において使用することができる。
【００６８】
式１−フルバスタチンおよび関連する類似体
１つの好ましい態様では、本発明は、宿主細胞系、例えば、細胞培養物または卵における、生物学的産物、特に、インフルエンザワクチンの製造のための式１の化学薬剤の使用に関する。式１は、構造
【化１】
0006741587.tif 000009
を有するスタチンを含み、式中、ＲおよびＲｏの一方は、
【化２】
0006741587.tif 000010
であり、他方は、不斉炭素原子を含有しない第一級または第二級Ｃ１〜６アルキル；Ｃ３〜６シクロアルキルまたはフェニル−（ＣＨ２）ｍ−であり、式中、Ｒ４は、水素、Ｃ１〜３アルキル、ｎ−ブチル、ｉ−ブチル、ｔ−ブチル、Ｃ１〜３アルコキシ、ｎ−ブトキシ、ｉ−ブトキシ、トリフルオロメチル、フルオロ、クロロ、フェノキシまたはベンジルオキシであり、Ｒ５は、水素、Ｃ１〜３アルキル、Ｃ１〜３アルコキシ、トリフルオロメチル、フルオロ、クロロ、フェノキシまたはベンジルオキシであり、Ｒ５ａは、水素、Ｃ１〜２アルキル、Ｃ１〜２アルコキシ、フルオロまたはクロロであり、ｍは、１、２または３であり、ただし、Ｒ４が水素であるとき、Ｒ５およびＲ５ａの両方は、水素でなければならなく、Ｒ５が水素であるとき、Ｒ５ａは、水素でなければならなく、Ｒ４およびＲ５の１つ以下は、トリフルオロメチルであり、Ｒ４およびＲ５の１つ以下は、フェノキシであり、Ｒ４およびＲ５の１つ以下は、ベンジルオキシであり、Ｒ２は、水素、Ｃ１〜３アルキル、ｎ−ブチル、ｉ−ブチル、ｔ−ブチル、Ｃ３〜６シクロアルキル、Ｃ１〜３アルコキシ、ｎ−ブトキシ、ｉ−ブトキシ、トリフルオロメチル、フルオロ、クロロ、フェノキシまたはベンジルオキシであり、Ｒ３は、水素、Ｃ１〜３アルキル、Ｃ１〜３アルコキシ、トリフルオロメチル、フルオロ、クロロ、フェノキシまたはベンジルオキシであり、ただし、Ｒ２が水素であるとき、Ｒ３は、水素でなければならなく、Ｒ２およびＲ３の１つ以下は、トリフルオロメチルであり、Ｒ２およびＲ３の１つ以下は、フェノキシであり、Ｒ２およびＲ３の１つ以下は、ベンジルオキシであり、Ｘは、−（ＣＨ２）ｎ−または−ＣＨ＝ＣＨ−であり、式中、ｎは、０、１、２または３であり、Ｚは、
【化３】
0006741587.tif 000011
であり、式中、Ｒ６は、水素またはＣ１〜３アルキルであり、Ｒ７は、水素、Ｃ１〜３アルキル、ｎ−ブチル、ｉ−ブチル、ｔ−ブチル、ベンジルまたはＭであり、Ｍは、薬学的に許容されるカチオンである。
【００６９】
Ｎｏｖａｒｔｉｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓによって名称ＬＥＳＣＯＬで販売されているフルバスタチンナトリウムは、米国特許第５，３５４，７７２号において記載されているように調製することができる。特定の好ましい実施形態では、式１のスタチン類似体は、構造
【化４】
0006741587.tif 000012
を有するフルバスタチン（Ｃ２４Ｈ２６ＦＮＯ４または（３Ｒ，５Ｓ，６Ｅ）−７−［３−（４−フルオロフェニル）−１−（プロパン−２−イル）−１Ｈ−インドール−２−イル］−３，４−ジヒドロキシヘプタ−６−エン酸）である。
【００７０】
増加した細胞活性は、０．００１μＭ〜１０μＭの範囲のフルバスタチンまたはその類似体の最終濃度によって得てもよい。特定の好ましいが非限定的な態様では、フルバスタチンの最適な最終濃度は、０．０５μＭまたはそれ未満である。
【００７１】
式２−ピタバスタチンおよび関連する類似体
別の好ましい態様では、本発明は、宿主細胞系、例えば、細胞培養物または卵における、生物学的産物、特に、インフルエンザワクチンの製造のための式２の化学薬剤の使用に関する。好ましくは、式２は、構造
【化５】
0006741587.tif 000013
を有するスタチンを含み、式中、ＲおよびＲｏのそれぞれは、独立に、Ｃ１〜６アルキル（第一級、第二級もしくは第三級）、Ｃ３〜７シクロアルキルまたは環Ａ
【化６】
0006741587.tif 000014
であり、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５のそれぞれは、独立に、水素、Ｃ１〜４アルキル、Ｃ１〜４アルコキシ、トリフルオロメチル、フルオロ、クロロ、フェノキシ、ベンジルオキシまたはヒドロキシであり、ただし、Ｒ１およびＲ２の１つ以下は、トリフルオロメチルであり、Ｒ１およびＲ２の１つ以下は、フェノキシであり、Ｒ１およびＲ２の１つ以下は、ベンジルオキシであり、Ｒ１およびＲ２の１つ以下は、ヒドロキシであり、Ｒ３〜Ｒ５の１つ以下は、トリフルオロメチルであり、Ｒ３〜Ｒ５の１つ以下は、ヒドロキシルであり、
Ｘは、−（ＣＨ２）２−または−ＣＨ≡ＣＨ−（ｃｉｓおよび／もしくはｔｒａｎｓ）であり、
Ｚは、
【化７】
0006741587.tif 000015
であり、式中、Ｑは、
【化８】
0006741587.tif 000016
であり、ただし、Ｘが−ＣＨ＝ＣＨであり、かつ／またはＲ６がＣ１〜３アルキルであるときのみ、Ｑは、
【化９】
0006741587.tif 000017
であり得、Ｒ６は、水素またはＣ１〜３アルキルであり、
Ｒ７は、水素、Ｒ８またはＭであり、Ｒ８は、生理学的に許容されるおよび加水分解性エステル基であり、Ｍは、薬学的に許容されるカチオンである。
【００７２】
Ｋｏｗａ  Ｃｏ．によって名称ＬＩＶＡＬＯで販売されているピタバスタチンカルシウムは、他の文献の中でも、米国特許第５，７５３，６７５号において記載されているように調製することができる。特定の好ましい実施形態では、ピタバスタチン（Ｐｉｔａｖａｓａｔｉｎ）が使用され（表４における化合物Ｇとして示されている）、これは、構造
【化１０】
0006741587.tif 000018
を有する式２のスタチン類似体（Ｃ２５Ｈ２４ＦＮＯ４または（３Ｒ，５Ｓ，６Ｅ）−７−［２−シクロプロピル−４−（４−フルオロフェニル）−キノリン−３−イル）−３，５−ジヒドロキシヘプタ−６−エン酸）である。
【００７３】
増加した細胞活性は、０．００１〜１０μＭの範囲の式２の誘導体の最終濃度で得られる。特定の好ましくはあるが、非限定的な実施形態では、ピタバスタチンの最適な最終濃度は、０．０５μＭまたはそれ未満である。本明細書においてさらに例示するように、予想外に、ピタバスタチン化合物は、５０ｎＭよりも５ｎＭにてタンパク質の産生収量を増加させることにおいてより有効であることが見出されたが、これは５００ｎＭよりも有効であった。これは、ヒトへの使用のための治療組成物の製造のために特に有利である。
【００７４】
しかし、本発明は、ピタバスタチンまたはフルバスタチン剤にもっぱら制限されない。式１および式２の類似体が試験されてきており、本発明によって包含される驚くべき効果を生じさせる。これらの類似体を、下記でさらに記載するように試験した。
【００７５】
式３−アトルバスタチンおよび関連する類似体
一態様では、本発明は、宿主細胞系、例えば、細胞培養物または卵における、生物学的産物、特に、インフルエンザワクチンの製造のための式３の化学薬剤の使用に関する。好ましくは、式３は、構造
【化１１】
0006741587.tif 000019
を有するスタチン類似体を含み、式中、Ｘは、−ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−または−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）−である。
Ｒ１は、１−ナフチル；２−ナフチル；シクロヘキシル；ノルボルネニル；２−、３−、もしくは４−ピリジニル；フェニル；フッ素、塩素、臭素、ヒドロキシルで置換されているフェニル；トリフルオロメチル；１〜４個の炭素原子のアルキル、１〜４個の炭素原子のアルコキシ、または２〜８個の炭素原子のアルカノイルオキシである。Ｒ２またはＲ３は、−ＣＯＮＲ５Ｒ６であり、Ｒ５およびＲ６は、独立に、水素；１〜６個の炭素原子のアルキル；２−、３−、もしくは４−ピリジニル；フェニル；フッ素、塩素、臭素、シアノ、トリフルオロメチルで置換されているフェニル、または３〜８個の炭素原子のカルボアルコキシであり、Ｒ２またはＲ３の他方は、水素；１〜６個の炭素原子のアルキル；シクロプロピル；シクロブチル；シクロペンチル；シクロヘキシル；フェニル；またはフッ素、塩素、臭素、ヒドロキシルで置換されているフェニル；トリフルオロメチル；１〜４個の炭素原子のアルキル、１〜４個の炭素原子のアルコキシ、または２〜８個の炭素原子のアルカノイルオキシである。Ｒ４は、１〜６個の炭素原子のアルキル；シクロプロピル；シクロブチル；シクロペンチル；シクロヘキシル；またはトリフルオロメチルである。
【００７６】
Ｐｆｉｚｅｒによって名称ＬＩＰＩＴＯＲで販売されているアトルバスタチンカルシウムは、他の文献の中でも、米国特許第５，２７３，９９５号において記載されているように調製される。特定の好ましい実施形態では、式３のスタチン類似体は、構造
【化１２】
0006741587.tif 000020
を有するアトルバスタチン（Ｃ３３Ｈ３４ＦＮ２Ｏ５；［Ｒ−（Ｒ＊，Ｒ＊）］−２−（４−フルオロフェニル）−β、δ−ジヒドロキシ−５−（１−メチルエチル）−３−フェニル−４−［（フェニルアミノ）カルボニル］−１Ｈピロール−１−ヘプタン酸、カルシウム塩（２：１）三水和物）である。
【００７７】
式４−セリバスタチンおよび関連する化合物
別の態様では、本発明は、細胞培養物または卵における、生物学的産物、特に、インフルエンザワクチンの製造のための式４の化学薬剤の使用に関する。好ましくは、式４は、構造
【化１３】
0006741587.tif 000021
を有するスタチン類似体を含み、式中、Ａ−Ｂは、式−ＣＨ＝ＣＨ−または−ＣＨ２−ＣＨ２−のラジカルを示し、Ｚは、式−ＣＨのラジカルまたは窒素原子を示し、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、互いに独立に、水素；６個までの炭素原子を有し、かつ末端炭素上で３〜６個の炭素原子を有する飽和もしくは不飽和の環状炭化水素ラジカルで任意選択で置換されることができる飽和もしくは不飽和の直鎖もしくは分岐状の炭化水素ラジカル；３〜７個の炭素原子を有し、かつ飽和しているか、または１回もしくは２回不飽和である環状炭化水素ラジカル；フェニル、フリル、チエニルまたはピリジニルを含む群より選択される芳香族ラジカル（核において、下記の基：ハロゲン、トリフルオロメチル、それぞれが６個までの炭素原子を有するアルキルもしくはアルケニル、ヒドロキシル、１〜６個の炭素原子を有するアルコキシ、カルボキシル、またはアルコキシ部分中に１〜６個の炭素原子を有するカルバルコキシ（ｃａｒｂａｌｋｏｘｙ）からの１〜３個の同一のまたは異なる置換基を任意選択で担持することができる）を示し、Ｒ４は、水素、５個までの炭素原子を有する直鎖もしくは分岐状の飽和もしくは不飽和の炭化水素ラジカル、その核がハロゲンによって１〜２回置換されることができるベンジルラジカル、または１〜４個の炭素原子を有するアルキルラジカル、アルカリ金属またはアンモニウムイオンＮＲ５Ｒ６Ｒ７Ｒ８を示し、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は、同一または異なり、水素、１〜４個の炭素原子を有するアルキル、または１〜４個の炭素原子を有するヒドロキシアルキルを示す。
【００７８】
Ｂａｙｅｒによって名称ＢＡＹＣＯＬで販売されているセリバスタチンナトリウムは、他の文献の中でも、米国特許第５，１７７，０８０号において記載されているように調製することができる。特定の好ましい実施形態では、式４のスタチン類似体は、構造
【化１４】
0006741587.tif 000022
を有するセリバスタチン（［Ｓ−［Ｒ＊，Ｓ＊−（Ｅ）］］−７−［４−（４−フルオロフェニル）−５−メトキシメチル）−２，６ビス（１−メチルエチル）−３−ピリジニル］−３，５−ジヒドロキシ−６−ヘプタノエート（ｈｅｐｔｅｎｏａｔｅ）；Ｃ２６Ｈ３３ＦＮＯ５Ｎａ）である。
【００７９】
式５−ロバスタチン／メバスタチンおよび関連する化合物
別の態様では、本発明は、細胞培養物または卵における、生物学的産物、特に、インフルエンザワクチンの製造のための式５の化学薬剤の使用に関する。好ましくは、式５は、構造
【化１５】
0006741587.tif 000023
を有するスタチン類似体を含み、式中、Ｒは、水素原子、ヒドロキシ基または２−メチルブチリルオキシ基（−ＯＣＯＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３）である。
【００８０】
Ｍｅｒｃｋによって商標ＭＥＶＡＣＯＲで販売されているロバスタチンは、他の文献の中でも、米国特許第４，２３１，９３８号において記載されているように調製することができる。特定の好ましい実施形態では、式５のスタチン類似体は、構造
【化１６】
0006741587.tif 000024
を有するロバスタチン（［１Ｓ−［１α（Ｒ＊），３α，７α，８α（２Ｓ＊，４Ｓ＊），８ａα］］−１，２，３，７，８，８ａ−ヘキサヒドロ−３，７−ジメチル−８−［２−（テトラヒドロ−４−ヒドロキシ−６−オキソ−２Ｈ−ピラン−２−イル）エチル］−１−ナフタレニル２−メチルブタノエート；Ｃ２４Ｈ３６Ｏ５）である。
【００８１】
別の特定の好ましい実施形態では、式５のスタチン類似体は、構造
【化１７】
0006741587.tif 000025
を有するメバスタチン（１Ｓ，７Ｒ，８Ｓ，８ａＲ）−８−｛２−［（２Ｒ，４Ｒ）−４−ヒドロキシ−６−オキソテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル］エチル｝−７−メチル−１，２，３，７，８，８ａ−ヘキサヒドロナフタレン−１−イル（２Ｓ）−２−メチルブタノエート；Ｃ２３Ｈ３４Ｏ６）である。
【００８２】
本発明のある特定の実施形態では、式５の類似体であるシンバスタチンを使用しない。
【００８３】
式６−プラバスタチンおよび関連する化合物
別の態様では、本発明は、細胞培養物または卵における、生物学的産物、特に、インフルエンザワクチンの製造のための式６の化学薬剤の使用に関する。好ましくは、式６は、構造
【化１８】
0006741587.tif 000026
を有するスタチン類似体を含み、式中、Ｒは、構造
【化１９】
0006741587.tif 000027
の基、ならびに閉環ラクトン、その塩およびエステルを表す。
【００８４】
Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ−Ｓｑｕｉｂｂによって商標ＰＲＡＶＡＣＨＯＬで販売されているプラバスタチンナトリウムは、他の文献の中でも、米国特許第４，３４６，２２７号において記載されているように調製することができる。特定の好ましい実施形態では、式６のスタチン類似体は、構造
【化２０】
0006741587.tif 000028
を有するプラバスタチン（１−ナフタレン−ヘプタン酸，１，２，６，７，８，８ａヘキサヒドロ−β，δ，６−トリヒドロキシ−２−メチル−８−（２−メチル−１−オキソブトキシ）−、モノナトリウム塩、［１Ｓ［１α（βＳ＊，δＳ＊），２α，６α，８β（Ｒ＊），８ａα］；Ｃ２３Ｈ３５ＮａＯ７］である。
【００８５】
式７−ロスバスタチン（Ｒｏｓｕｖａｓａｔｉｎ）および関連する化合物
別の態様では、本発明は、細胞培養物または卵における、生物学的産物、特に、インフルエンザワクチンの製造のための式７の化学薬剤の使用に関する。好ましくは、式７は、構造
【化２１】
0006741587.tif 000029
を有するスタチン類似体を含み、式中、Ｒ１は、低級アルキル、アリール、またはアラルキルであり、これらのそれぞれは、１個または複数の置換基を有してもよく、Ｒ２およびＲ３のそれぞれは、独立に、水素、低級アルキル、またはアリールであり、前記低級アルキルおよびアリールのそれぞれは、１個または複数の置換基を有してもよく、Ｒ４は、水素、低級アルキル、または無毒性の薬学的に許容される塩を形成することができるカチオンであり、Ｘは、置換基を有し得る硫黄、酸素、またはスルホニル、またはイミノであり、点線は、二重結合、または対応する閉環ラクトンの存在もしくは非存在を表す。
【００８６】
ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａによって商標ＣＲＥＳＴＯＲで販売されているロスバスタチンナトリウムは、他の文献の中でも、米国特許第４，３４６，２２７号において記載されているように調製することができる。特定の好ましい実施形態では、式７のスタチン類似体は、下記に示す構造を有するロスバスタチンビス［（Ｅ）−７−［４−（４−フルオロフェニル）−６−イソプロピル−２−［メチル（メチルスルホニル）アミノ］ピリミジン−５−イル］（３Ｒ，５Ｓ）−３，５−ジヒドロキシヘプタ−６−エン酸］；Ｃ２２Ｈ２７ＦＮ３Ｏ６Ｓ）２］である。
【００８７】
本発明は、宿主細胞のメバロン酸経路を阻害することを含む、宿主細胞において目的の生体産物の産生収量を増進する方法をさらに包含する。一部の実施形態では、メバロン酸経路の阻害は、メバロン酸自体の直接的または間接的阻害が関与する。さらにまたは代わりに、メバロン酸経路の阻害は、下流シグナル伝達カスケード、すなわち、それぞれ、タンパク質プレニル化およびコレステロール生合成を制御する経路を阻害することが関与し得る。図９Ｂにおいて示されるように、特定の酵素阻害剤の組み合わせでメバロン酸経路の３つのアームの全てを遮断することは、宿主細胞におけるタンパク質収量に対するスタチンの効果を模倣することができる。したがって、一部の実施形態では、経路を触媒する酵素の特定の阻害剤、例えば、スクアレンシンターゼ阻害剤（例えば、ザラゴジン酸）、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼ阻害剤、および任意のこれらの組み合わせが用いられる。このように、本発明は、宿主細胞における生物製剤の製造における使用のための、メバロン酸経路の１種または複数の阻害剤を提供する。本発明はまた、生物学的産物を製造する方法であって、宿主細胞のメバロン酸経路を阻害するステップを含み、阻害が、宿主細胞と、タンパク質プレニル化およびコレステロール合成において関与している酵素の１種または複数の阻害剤とを接触させることを含み得る、方法を提供する。本発明は、このような方法のいずれかの１つによって産生される生体産物を包含する。
【化２２】
0006741587.tif 000030
【００８８】
非スタチン化合物
本発明によってまた包含されるのは、宿主細胞において生体分子の収量を増加させるために使用することができる非スタチン化合物である。一部の実施形態では、本発明を行うための適切な非スタチン化合物は、セロトニンが関連する経路、ドパミンが関連する経路、またはこれらの組み合わせを介して作用する薬剤である。一部の実施形態では、適切な化合物は、特定のＧタンパク質共役受容体をモジュレートする薬剤である。
【００８９】
式８−スルホンアミド、その類似体、および５ＨＴ７の他のインバースアゴニスト
一態様では、本発明において有用な化学薬剤は、スルホンアミド類似体を含む。スルホンアミド類似体は、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）のインバースアゴニスト、特に、５ＨＴ７のインバースアゴニストとして同定されてきた。したがって、本発明はまた、５ＨＴ７受容体と相互作用するか、またはモジュレートする化学薬剤、特に、５ＨＴ７のインバースアゴニストの使用を包含する。本発明によって包含される５ＨＴ７の他のアゴニストには、これらに限定されないが、アリールピペラジンおよび１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリンをベースとするアリールスルホンアミド（Ｖｅｒｍｅｕｌｅｎら（２００４年）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４７巻、５４５１〜５４６６頁）、５−ヒドロキシトリプトファン、８−ヒドロキシ−２−（ジ−ｎ−プロピルアミノ）テトラリン１−Ｂｒ（８−ＯＨ  ＤＰＡＴ）および５−カルボキシ−アミノトリプタミン（５−ＣＴ）が含まれる。（Ｓｉｄｄｉｑｕｉら（２００７年）Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｅｈａｖｉｏｒ、８７巻、３８６〜３９２頁）
【００９０】
一態様では、本発明は、細胞培養物または卵における、生物学的産物、特に、インフルエンザワクチンの製造のための式８の化学薬剤の使用を提供する。好ましくは、式８は、構造
【化２３】
0006741587.tif 000031
を有するスルホンアミド化合物を含み、式中、Ａｒは、任意選択で置換されている単環式または二環式の芳香族またはヘテロ芳香族環であり、Ｒ１およびＲ２は、独立に、水素、Ｃ１〜６アルキル、アリールＣ１〜６アルキルであり、あるいはそれらが付着している窒素原子と一緒になって、窒素、硫黄または酸素から選択されるヘテロ原子を任意選択でさらに含有する任意選択で置換されている５〜７員の複素環式環を形成し、窒素原子は、水素、Ｃ１〜６アルキル、シクロＣ３〜７アルキル、または任意選択で置換されているアリール、ヘテロアリールもしくはアリールＣ１〜６アルキル基で置換されており、Ｒ３は、水素またはＣ１〜６アルキルであり、Ｘは、酸素、硫黄または結合であり、ｎは、２または３であり、ｍは、１または２である。Ｃ１〜６アルキル基は、単独でまたは別の基の部分として、直鎖もしくは分岐状であり得る。芳香族およびヘテロ芳香族基のための任意選択の置換基は、ＮＲ７Ｒ８で任意選択で置換されているＣ１〜６アルキル；Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、Ｃ１〜６アルキルチオ、シアノ、ニトロ、ハロゲン、ＣＦ３、Ｃ２Ｆ５、ＮＲ７Ｒ８、ＣＯＮＲ７Ｒ８、ＮＲ７ＣＯＲ８、Ｓ（Ｏ）ｐＮＲ７Ｒ８、ＣＨＯ、ＯＣＦ３、ＳＣＦ３、ＣＯＲ９、ＣＨ２ＯＲ９、ＣＯ２Ｒ９またはＯＲ９を含み、ｐは、１または２であり、Ｒ７、Ｒ８およびＲ９は、独立に、水素、Ｃ１〜６アルキル、任意選択で置換されているアリールまたは任意選択で置換されているアリールＣ１〜６アルキルである。複数個の置換基が存在することができ、複数の置換基の場合は、これらは同じであるか、または異なり得る。
【００９１】
適切に、Ａｒは、任意選択で置換されている単環式または二環式の芳香族またはヘテロ芳香族環である。好ましくは、Ａｒは、任意選択で置換されているナフチル、フェニルまたはチエニル基である。最も好ましくは、Ａｒは、１個または複数のハロゲンで置換されているナフチル、フェニルまたはチエニル、特に、２，３−ジ−ブロモチエニルである。Ｒ１およびＲ２において、複素環式環のための任意選択の置換基は、Ｃ１〜６アルキルを含む。好ましくは、Ｒ１およびＲ２は、任意選択で置換されている５〜７員の複素環式環、特に、任意選択で置換されている６員環を形成する。最も好ましくは、Ｒ１およびＲ２は、１個もしくは２個のメチル基で任意選択で置換されているピペリジン環を形成するか、またはＲ１およびＲ２は、窒素上で任意選択で置換されているアリール環で置換されているピペラジン環を形成する。好ましくは、Ｒ３は、水素である。
【００９２】
好ましくは、Ｘは、結合である。好ましくは、ｎおよびｍは、Ｘと一緒に、５員または６員環の部分を形成するような値を有する。
【００９３】
式８の好ましい最適な最終濃度は、１．０μＭまたはそれ未満である。
【００９４】
式８の特に好ましいスルホンアミド類似体（Ｃ１９Ｈ３０Ｎ２ＳＯ２）は、米国特許第６，２６５，４０８号に記載されているように調製してもよく、構造
【化２４】
0006741587.tif 000032
を有する。
【００９５】
非限定的な実施形態は、表４において化合物Ｅとして示され、これはセロトニン５ＨＴ−２および５ＨＴ−７受容体のインバースアゴニストである。インバースアゴニストは、そのアゴニストと同じ受容体に結合するが、アゴニストと反対の薬理学的反応を誘発する薬剤である。このように、インバースアゴニスト反応について必須であるものは、受容体が任意のリガンドの非存在下で構成的な（内因性のまたは基底のとしてもまた公知である）レベル活性を有さなくてはならないことである。これは、インバースアゴニストが活性を基底レベル未満に減少させることを意味する。
【００９６】
リガンド結合によって、５ＨＴ７受容体は、アデニリルシクラーゼ（ＡＣ）活性を介した細胞内ｃＡＭＰの増加によってシグナルを出すことが公知であった。実施例１３における知見（図１５）は、産生収量の増進が、５ＨＴ７受容体のリガンドが媒介する活性の減少によって決まることを示唆する。なぜなら、増進効果が、受容体への結合について阻害剤と競合するはずであるセロトニン（５ＨＴ）の存在によって抑止することができるためである。
【００９７】
式９−トロパノールエステル、その類似体および自己受容体の他の阻害剤
別の好ましい態様では、本発明は、細胞培養物または卵における、生物学的産物、特に、インフルエンザワクチンの製造のための式９の化学薬剤の使用を提供する。このクラスの分子は、シナプス前自己受容体の阻害剤として同定されてきており、抗コリン作用薬として作用する。したがって、本発明は、これらに限定されないが、７−（４−［４−（２，３−ジクロロフェニル）−１−ピペラジニル］ブチルオキシ）−３，４−ジヒドロ−２（１Ｈ）−キノリノン（Ｋｉｋｕｃｈｉら（１９９５年）Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、２７４巻、３２９〜３３６頁）および（−）−３−（３−ヒドロキシフェニル）−Ｎ−プロピルピペリジン［（−）−３−ＰＰＰ］（Ｔｈｏｒｂｅｒｇら（１９８７年）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３０巻、２００８〜２０１２頁）を含めた、コリン作動性シナプス上のシナプス前自己受容体および他のシナプス前ヘテロ受容体をモジュレートする化学薬剤の使用を包含する。本発明に包含される抗コリン作用薬には、これらに限定されないが、ネオスチグミン、グリコピロニウム、フィゾスチグミンおよびピリドスチグミンが含まれる。（Ｎａｉｒら（２００４年）Ｃｏｎｔｉｎｕｉｎｇ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ａｎａｅｓｔｈｅｓｉａ，  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｃａｒｅ  ＆  Ｐａｉｎ、４巻、１６４〜１６８頁）
【００９８】
好ましくは、式９は、式
【化２５】
0006741587.tif 000033
を有するトロパニル類似体を含み、式中、Ａｒは、フェニルまたはベータ−ナフチル、または２個の窒素原子の１つを含有する芳香族複素環式６員環であり、Ｒ１は、好ましくは、パラ位における、Ａｒ核の１個または複数の置換基であり、Ｈ、ＣＨ３、ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）２、Ｏ−ＣＨ３、Ｃｌ、Ｆ、Ｂｒ、ＣＦ３、ＮＨ２、Ｓ−ＣＨ３、ＣＮ、ＮＯ２からなる群より選択され；Ｒ２＝Ｈ、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、ＣＨ（ＣＨ３）２；Ｒ３は、
【化２６】
0006741587.tif 000034
であり、式中、Ｒ４は、Ｈ、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５であり、Ｒ５は、Ｈ、ＣＨ３であり、Ｘは、非存在、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、ＮＣＨ３、−ＣＨ＝ＣＨ−、−Ｃ≡Ｃ−であり、Ｙは、Ｏ、ＮＨである。
【００９９】
式９の好ましいトロパニル類似体（Ｃ１８Ｈ２５ＮＯ２Ｓ）は、他の文献の中でも、ＷＯ９４／０１４３５において記載されているように調製してもよく、構造：
【化２７】
0006741587.tif 000035
を有する。
【０１００】
式１０−ベンゾチアゾール（Ｂｅｎｚｉｏｔｈｉａｚｏｌｅ）、その類似体および他のドパミン、５ＨＴ２Ａおよび５ＨＴ１Ａ結合剤
別の態様では、本発明は、細胞培養物または卵における、生物学的産物、特に、インフルエンザワクチンの製造のための式１０の化学薬剤の使用を提供する。このクラスの分子は、神経弛緩活性を有すると同定されてきた。したがって、本発明は、ドパミンＤ２ならびにセロトニン５ＨＴ２Ａおよび５ＨＴ１Ａ受容体に対して親和性を有する化学薬剤を包含する（Ｈｒｉｂら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ、２２巻；３７号（１５）：２３０８〜２３１４頁（１９９４年））。本発明によって包含される他のドパミン、５ＨＴ２Ａおよび５ＨＴ１Ａ結合剤には、これらに限定されないが、クロザピン、ハロペリドール、および水酸化ジベンゾアゼシン（ｄｉｂｅｎｚａｚｅｃｉｎｅｓ）が含まれる。（Ｈａｍａｃｈｅｒら、（２００６年）ＢＭＣ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、６巻、１１頁）
【０１０１】
好ましくは、式１０は、式
【化２８】
0006741587.tif 000036
を有するベンゾチアゾールおよびベンゾイソオキサゾール類似体（式中、Ｒは、
【化２９】
0006741587.tif 000037
を表し、式中、ｎは、３または４であり、Ｒ１およびＲ２は、独立に、１〜４個の炭素原子の低級アルキルであり、Ｙは、酸素または硫黄であり、Ｚは、水素またはハロゲンである）、またはその薬学的に許容される無毒性の酸付加塩を含む。
【０１０２】
一態様では、式１０の類似体（Ｃ２４Ｈ３２Ｎ４Ｏ２Ｓ）は、他の文献の中でも、ＤＥ３２４７５３０において記載されているように調製してもよく、構造：
【化３０】
0006741587.tif 000038
を有する。
【０１０３】
式１１−ベンゾピラン、その類似体および他の抗不整脈剤（ａｎｔｉａｒｒｙｔｈｍｉｃ  ａｇｅｎｔ）
別の態様では、本発明は、細胞培養物または卵における、生物学的産物、特に、インフルエンザワクチンの製造のための式１１の化学薬剤の使用を提供する。このクラスの分子は、抗不整脈活性を有すると同定されてきた。したがって、本発明は、リドカイン、ジフェニルヒダントイン（ｄｉｐｈｅｎｙｌｈｄａｎｔｏｉｎ）、キニジン、プロカインアミド、フレカイニド、ベータ遮断薬、ベラパミル、ジギタリス、ブレチリウム、イブチリド、ソタロール、アミオダロン、ドフェチリドを含めた、クラスＩ、クラスＩＩ、クラスＩＩＩまたはクラスＩＶの抗不整脈活性を有する化学薬剤を包含する。（Ｋｏｗｅｙら（２０００年）Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｈｅａｒｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ、１４０巻、１２〜２０頁）
【０１０４】
好ましくは、式１１は、式
【化３１】
0006741587.tif 000039
を有するベンゾピラン類似体（式中、Ｒ１は、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、ニトロ、アミノまたはアルキルスルホンアミド、ビス（アルキルスルホニル）アミノ、またはアシルアミノであり、Ｘは、窒素原子または＞ＣＨ−ラジカルを示し、Ｒは、式
【化３２】
0006741587.tif 000040
のラジカルであり、式中、Ａは、単結合、メチレン、または、Ｘが窒素原子であるとき、カルボニルであり、同一または異なるＲ２およびＲ３は、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、アルキル、アルコキシ、ニトロ、アミノ、アルキルスルホンアミド、ビス（アルキルスルホニル）アミノ、アシルアミノ、スルファモイルまたはシアノであり、あるいはＲ２およびＲ３は、これらが隣接しているとき、一緒にメチレンジオキシまたはエチレンジオキシラジカルを形成し、あるいはＸが＞ＣＨ−を示す場合、Ｒは、ピリジルまたは２（２Ｈ）−ベンゾイミダゾロニル（ｂｅｎｚｉｍｉｄａｚｏｌｏｎｙｌ）であり、同一であるＲ’およびＲ’’は、水素またはアルキルである）、ならびにこれらの塩を含む。
【０１０５】
式１１の類似体（Ｃ２４Ｈ３１ＮＯ３）は、他の文献の中でも、ＥＰ３００９０８において記載されているように調製してもよく、構造：
【化３３】
0006741587.tif 000041
を有する。
【０１０６】
式１２−テトラヒドロピリジン、その類似体、およびＭＡＯの他の阻害剤
別の態様では、本発明は、細胞培養物または卵における、生物学的産物、特に、インフルエンザワクチンの製造のための式１２の化学薬剤の使用を提供する。このクラスの分子は、精神の抑うつの処置において治療上の利点を有すると同定されてきた。したがって、本発明は、モノアミンオキシダーゼ（ＭＡＯ）を阻害するか、またはテトラベナジンの作用をアンタゴナイズするか、または脳におけるドパミン作動性系およびセロトニン作動性系を標的とする化学薬剤の使用を包含する（Ｍａｔｔｓｏｎ、Ｄｏｃｔｏｒａｔｅｓ  Ｔｈｅｓｉｓ、Ｇｏｔｈｅｎｂｏｒｇ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、ＩＳＢＮ：９７８−６２８−８７４１−４（２０１３年））。本発明に包含される他のＭＡＯ阻害剤には、これらに限定されないが、オキサジアゾロン、テトラゾール、オキサジアジノン、インデノピリダジン（ｉｎｄｅｎｏｐｙｒｉｄａｚｉｎｅ）誘導体、および（１Ｈ）−ピラゾール誘導体が含まれる。（Ｃｈｉｍｅｎｔｉら（２００６年）Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ＆  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ、６７巻、２０６〜２１４頁）
【０１０７】
好ましくは、式１２は、式：
【化３４】
0006741587.tif 000042
を有するテトラヒドロピリジンおよびピペリジン類似体（式中、Ｒ１は、水素、１〜４個の炭素原子を含有し、かつヒドロキシルまたはオキソラジカルで置換されていてもよいアルキル基、それぞれが３〜４個の炭素原子を含有するアルケニルまたはアルキニル基、４〜７個の炭素原子を含有するシクロアルキルメチル（ｃｙｃｌｏａｋｙｌｍｅｔｈｙｌ）基、またはベンジル基を表し、フェニルラジカルは、それぞれが１〜４個の炭素原子を含有するアルキルおよびアルコキシ基からなる群からの最大で３個の置換基で置換されていてもよいが、Ａがエチレンラジカルを表し、Ｂがメチレンラジカルを表す場合、Ｒ１は、メチル基であってはならず、同時に、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、それぞれが水素を表し、Ｒ２は、水素、または１〜４個の炭素原子を含有するアルキルを表し、Ｒ３は、水素、それぞれが１〜４個の炭素原子を含有するアルキルまたはアルコキシ基、原子番号３５までのハロゲンまたはヒドロキシル基を表し、あるいはＲ３およびＲ４は一緒に、トリメチレンもしくはテトラメチレンラジカル、または、縮合したベンゼン環に対応して、１，３−ブタジエニレン（ｂｕａｔｄｉｅｎｙｌｅｎｅ）ラジカルを表し、Ｒ５は、水素、または１〜４個の炭素原子を含有するアルキル基を表し、Ａは、エチレンまたはメチレンラジカルまたは直接結合を表し、Ｂは、メチレン、エチレンまたはトリメチレンラジカルを表し、それによってＡおよびＢは一緒に常に３個の炭素原子を含有し、ＸおよびＹはそれぞれ、水素原子を表し、あるいは一緒にこれらは、さらなる結合を表す）、ならびに無機酸および有機酸を有するその付加塩を含む。
【０１０８】
式１２の類似体（Ｃ１５Ｈ１９ＮＯ）は、他の文献の中でも、ＤＥ２４０８４７６において記載されているように調製してもよく、構造：
【化３５】
0006741587.tif 000043
を有する。
【０１０９】
式１３−ジメトキシフェニル−ピペリジンメタノール、その類似体。
別の態様では、本発明は、細胞培養物または卵における、生物学的産物、特に、インフルエンザワクチンの製造のための式１３の化学薬剤の使用を提供する。これらの類似体は、５ＨＴ２アンタゴニストおよび抗不整脈薬として作用することが記載されてきた。したがって、本発明は、リドカイン、ジフェニルヒダントイン、キニジン、プロカインアミド、フレカイニド、ベータ遮断薬、ベラパミル、ジギタリス、ブレチリウム、イブチリド、ソタロール、アミオダロン、ドフェチリドを含めた、クラスＩ、クラスＩＩ、クラスＩＩＩまたはクラスＩＶの抗不整脈活性を有する化学薬剤を包含する（Ｋｏｗｅｙら（２０００年）Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｈｅａｒｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ、１４０巻、１２〜２０頁）。
【０１１０】
好ましくは、式１３の類似体は、式
【化３６】
0006741587.tif 000044
を有し、式中、ｎは、２、３または４であり、各ＲおよびＲ１は、独立に、水素、Ｃ１〜６アルキル、ハロゲン、トリフルオロメチル、ヒドロキシ、Ｃ１〜６アルコキシ、またはアミノを表し、Ｃ１〜６アルキルについてのＲおよびＲ１置換基は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル、シクロプロピル、シクロペンチルであり、メチルおよびエチルが好ましい。全てのハロゲンが包含され、フルオロおよびクロロが好ましい。代表的なＣ１〜６アルコキシ置換基は、メトキシ、エトキシ、イソプロポキシおよび酸素を介して付着している上記のアルキル基のものである。ＲまたはＲ１が水素以外である場合において、置換基は、任意の位置（オルト、メタまたはパラ）に位置してもよいが、一置換フェニル部分についてパラが好ましい。２，３−、２，４−、２，５−、３，４−、または３，５−二置換フェニル部分が、本明細書において包含される。
【０１１１】
一態様では、式１３の類似体はアルファ−（２，３−ジメトキシフェニル）−１−［２−（４−フルオロフェニル）エンチル（ｅｎｔｈｙｌ）］−４−ピペリジンメタノール（Ｃ２２Ｈ２８ＮＯ３Ｆ）であり、他の文献の中でも、米国特許第５，１３４，１４９号において記載されているように調製してもよく、構造：
【化３７】
0006741587.tif 000045
を有する。
【０１１２】
本発明は、宿主細胞において目的の生体分子を産生させることにおける同様の薬理活性を有する他の薬剤の使用を含む。一部の実施形態では、このような薬剤は、同じまたは重複する細胞間シグナル伝達経路（複数可）に対して作用するものを含む。このように、一部の実施形態では、このような薬剤は、宿主細胞において特定の細胞の成果をもたらす同じまたは重複する作用機序を共有する。このような機構的に同等な薬剤は、互いに構造的に関連していてもよいか、または関連していなくてもよい。
【０１１３】
したがって、本発明は、宿主細胞において目的の生体産物を産生させるか、またはこのような産物の収量を増進する方法であって、宿主細胞においてタンパク質産生を増進させるために宿主細胞と薬剤とを接触させることを含み、薬剤が、５ＨＴ７受容体シグナル伝達を阻害する薬剤、１種または複数のドパミン受容体シグナル伝達を阻害する薬剤、１種または複数のヒスタミン受容体のインバースアゴニストである薬剤、イオンチャネル（例えば、ナトリウムチャネル、カルシウムチャネルなど）を遮断する薬剤、ｃＡＭＰ産生を阻害する薬剤、ヒスタミン受容体シグナル伝達を阻害する薬剤、および任意のこれらの組み合わせからなる群より選択される、方法を提供する。方法は一般に、宿主細胞と薬剤とを接触させることと；宿主細胞をある期間、成長させるか、または培養することであって、この少なくとも部分は薬剤の存在下で行われることと、宿主細胞から目的の生体産物を収集することと、生体産物を任意選択でさらに精製することと、生体産物を生体産物ならびに任意選択で薬学的に許容される担体および／または賦形剤を含む医薬組成物へと製剤化することと、医薬組成物を任意選択で無菌濾過することと、無菌の医薬組成物を適切な剤形へとパッケージ化することとを含む。本明細書に記載の方法によって調製される医薬組成物は、本発明に包含される。
【０１１４】
一部の実施形態では、薬剤は、５ＨＴＲシグナル伝達を阻害し、薬剤は、受容体のインバースアゴニストでよい。一部の実施形態では、薬剤は、ドパミン受容体（複数可）の阻害剤であり得る。一部の実施形態では、薬剤は、ドパミンＤ１および／またはＤ２アンタゴニストでよい。このように、生物製剤を含む治療組成物の製造のための５ＨＴ７Ｒのインバースアゴニストとして作用する薬剤の使用は、本発明によって包含される。
【０１１５】
このような薬剤の例には、これらに限定されないが：ＳＢ−２５８７１９（ＧＳＫから入手可能なニュートラル５ＨＴ７Ｒアンタゴニスト）、ＳＢ−２５８７４１（ＧＳＫから入手可能な「ＡＦＺ」；部分的インバース５ＨＴ７Ｒアゴニスト）、ＳＢ−２６９９７０（ＧＳＫから入手可能なロバストな５ＨＴ７Ｒインバースアゴニスト）、リスペリドン（Ｄ１およびＤ２ドパミン受容体のアンタゴニスト、ならびに５ＨＴ７セロトニン受容体のインバースアゴニスト；また、Ｈ１およびＨ２ヒスタミン受容体のインバースアゴニスト）、セルチンドール（Ｄ２、５−ＨＴ２Ａ、５−ＨＴ２Ｃ、５−ＨＴ６、５−ＨＴ７、Ｄ３、ａ１に結合）；ジプラシドン（Ｄ２、５−ＨＴ２Ａ、５−ＨＴ１Ａ、５−ＨＴ１Ｄ、５−ＨＴ２Ｃ、５−ＨＴ７、Ｄ３、ａ１、ＮＲＩ、ＳＲＩに結合）；ロキサピン（Ｄ２、５−ＨＴ２Ａ、５−ＨＴ６、５−ＨＴ７、Ｄ１、Ｄ４、ａ１、Ｍ１、Ｈ１、ＮＲＩに結合）；ゾテピン（Ｄ２、５−ＨＴ２Ａ、５−ＨＴ２Ｃ、５−ＨＴ６、５−ＨＴ７、Ｄ１、Ｄ３、Ｄ４、ａ１、Ｈ１、ＮＲＩに結合）；クロザピン（Ｄ２、５−ＨＴ２Ａ、５−ＨＴ１Ａ、５−ＨＴ３、５−ＨＴ６、５−ＨＴ７、Ｄ１、Ｄ３、Ｄ４、ａ１、ａ２、Ｍ１、Ｈ１に結合）；オランザピン（Ｄ２、５−ＨＴ２Ａ、５−ＨＴ２Ｃ、５−ＨＴ３、５−ＨＴ６、Ｄ１、Ｄ３、Ｄ４、Ｄ５、ａ１、Ｍ１−５、Ｈ１に結合）、クエチアピン（Ｄ２、５−ＨＴ２Ａ、５−ＨＴ６、５−ＨＴ７、ａ１、ａ２、Ｈ１に結合）；プロメタジン（５ＨＴ２ａ／ｃセロトニン受容体およびドパミンＤ２受容体に対して弱い親和性から中程度の親和性を有するＨ１ヒスタミン受容体の強力なアンタゴニスト；また、Ｎａ＋チャネルの遮断薬）が含まれる。特定のイオンチャネル遮断薬はまた、適切であり得る。例には、これらに限定されないが、脂質輸送および代謝に関与している電位依存性Ｎａ＋チャネルおよびコリンエステラーゼの阻害剤および遮断薬、例えば、ジブカイン（ブチンエステラーゼ（ｂｕｔｙｎｅｓｔｅｒａｓｅ）阻害剤）；電位作動型Ｌ型カルシウムチャネルの阻害剤および遮断薬（例えば、ニモジピン）；ナトリウムチャネルの阻害剤および遮断薬、例えば、アプリンジン（クラス１ｂの抗不整脈膜安定剤）、アミロリド（上皮性ナトリウムチャネルＥＮａＣの直接の遮断薬）；ならびに内向き遅延整流性カリウムチャネルおよびＬ型カルシウムチャネルの阻害剤および遮断薬、例えば、イブチリドヘミフマレート（クラスＩＩＩの抗不整脈剤）が含まれる。
【０１１６】
宿主細胞の処理
他に示さない限り、本発明において利用される組換えタンパク質、細胞培養物、免疫学的および微生物学的技術は、当業者には周知の標準的手順である。このような技術は、出典、例えば、Ｊ．  Ｐｅｒｂａｌ、Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９８４年）、Ｊ．  Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９年）、Ｔ．Ａ．  Ｂｒｏｗｎ（編）、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、第１巻および第２巻、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９１年）、Ｄ．Ｍ．  ＧｌｏｖｅｒおよびＢ．．Ｄ．  Ｈａｎｅｓ（編）、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、第１巻〜第４巻、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５年および１９９６年）、ならびにＦ．Ｍ．  Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９９６年）、ならびにＪ．Ｅ．  Ｃｏｌｉｇａｎら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（現在までの全ての更新データを含む）において文献を通して記載および説明されており、これらは参照により本明細書中に組み込まれている。
【０１１７】
本発明の方法の特色は、宿主細胞系において産生される生体分子または産物の改善された収量の効果である。生体分子の収量は、本明細書において使用する場合、組換え発現された回収可能である生体分子、例えば、発現、分泌または産生に適した条件下で生じた、宿主細胞、好ましくは、真核細胞培養物、例えば、植物、トリまたは哺乳動物細胞培養物によって産生された、タンパク質、ポリペプチド、抗体（例えば、完全長または抗原結合性断片、その操作された対応物、そのヒト化対応物など）、核酸、ウイルス、酵素、ウイルス様粒子の総量を指す。特に、生体分子は、所望の生体産物、例えば、ワクチンにさらに加工することができる。
【０１１８】
収量の増加は典型的には、１ミリリットルの容量当たりのミリグラムのタンパク質（ｍｇ／ｍＬ）、または１リットルの容量当たりのグラムのタンパク質（ｇ／Ｌ）で測定される。
【０１１９】
収量の増加はまた、このような化学薬剤で処理されていない対応する宿主細胞系を含めた対応する対照と比較して、本発明において使用される化学薬剤に曝露された宿主細胞系によって産生される生体分子の倍数増加として測定することができる。
【０１２０】
本発明の方法を使用して、発現した生体分子のレベルは、対照によって産生されるものより約２倍から約２０倍まで上回って増加する。好ましい実施形態では、収量の増加は、比較対照における収量より少なくとも約２．５倍、約３倍、約３．５倍、約４倍、約４．５倍、約５倍、約５．５倍、約６倍、約６．５倍、約７倍、約７．５倍、約８倍、約８．５倍、約９倍、約９．５倍、または約１０倍までまたはそれ超である。
【０１２１】
代替の態様では、収量の増加は、比較対照を超えるパーセント量として測定し得る。例えば、収量または細胞の産生能の増加は、対照と比較した、任意の測定したパラメーターにおける２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、５００％またはそれ超の増加を含むことができる。
【０１２２】
本明細書の下記の実施例において示すように、本発明の好ましい態様は、培養上清において産生される、ウイルス粒子（ｖＲＮＡコピー／ｍｌ）、感染性粒子（ＩＵ／ｍｌ）またはウイルスタンパク質（μｇ／ｍｌ）の量の増加を測定することによって特徴付けられる。１タイプの測定において、ＨＡまたはＮＰタンパク質の増加は、宿主細胞系によって産生される抗原性タンパク質の収量を増加させる化学薬剤の能力を示す。細胞産生能の増加はまた、ウイルス粒子、感染性ウイルス粒子またはウイルスタンパク質、好ましくは、ＨＡ収量における少なくとも２倍、４倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍の増加を示すパラメーターの測定によって特徴付けられ得る。
【０１２３】
収量の測定は、ウイルス製造の上流の加工の間に、例えば、ウイルス遺伝子転写、タンパク質発現または細胞培養物からのウイルス粒子産生もしくは放出の間に行うことができる。組換え系における生体産物の検出のための標準的方法を、測定した生体分子の特徴に依存して使用し得る。測定は、宿主細胞系の産生能および能力を示してもよく、当技術分野において周知の方法、例えば、技術、例えば、フローサイトメトリーまたは免疫細胞化学（例えば、組織特異的または細胞マーカー特異的抗体での細胞の染色）を使用した形態および細胞表面マーカーにおける変化を測定することによって、光学顕微鏡または共焦点顕微鏡を使用して細胞の形態を調査することによって、または当技術分野で周知の技術、例えば、ＰＣＲおよび遺伝子発現プロファイリングを使用して遺伝子発現における変化を測定することによって達成し得る。
【０１２４】
好ましい態様では、ウイルス発現産物、好ましくは、インフルエンザウイルス産物は、粒子産生、感染性粒子または抗原性タンパク質について測定される。インフルエンザウイルスおよび抗原は、これらに限定されないが、ウエスタンブロット、免疫組織化学ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素免疫測定法）、「サンドイッチ」免疫アッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、イムノラジオメトリックアッセイ、蛍光免疫アッセイ、タンパク質Ａ免疫アッセイおよびＦＡＣＳ分析などの技術を使用した競合および非競合アッセイ系を含めた免疫アッセイなどの技術によって測定することができる。
【０１２５】
ウイルス力価は、フォーカス形成アッセイおよび血球凝集アッセイによって宿主細胞系において測定し得る。これらのアッセイ技術は、当技術分野で周知である。
【０１２６】
本発明の方法は、宿主細胞系、例えば、細胞培養物において、または卵において使用されることを意図する。好ましい態様では、細胞培養物を、約２００マイクロリットル超、例えば、約１ミリリットル超の細胞培養容量において少なくとも１種の化学薬剤で処理する。より好ましくは、細胞培養容量は、約１ミリリットル〜１００００リットル、例えば、約２ミリリットル〜約１００００リットルである。一部の実施形態では、適切な産生のバッチ容量は、約１５ｍＬ、５０ｍＬ、７５ｍＬ、１００ｍＬ、１５０ｍＬ、２００ｍＬ、２５０ｍＬ、５００ｍＬ、１Ｌ、５Ｌ、１０Ｌ、１５Ｌ、２０Ｌ、３０Ｌ、４０Ｌ、５０Ｌ、７５Ｌ、１００Ｌ、１５０Ｌ、２００Ｌ、３５０Ｌ、３００Ｌ、４００Ｌ、５００Ｌ、１，０００Ｌ、２，０００Ｌ、３，０００Ｌ、４，０００Ｌ、５，０００Ｌ、またはそれ超である。
【０１２７】
好ましい態様では、十分な量の化学薬剤の存在下でウイルスの複製およびアセンブリー、または生体産物の発現に適した条件下で、培養物中で細胞は成長することができる。一部の態様では、細胞は、約３７℃未満の温度、好ましくは、約３５℃またはそれ未満の温度で培養することができる。典型的には、細胞は、薬剤の存在下で約３２℃〜約３５℃の間の温度にて培養される。一部の実施形態では、細胞は、約３２℃〜３４℃の間の温度、例えば、約３３℃にて培養される。好ましい態様では、本明細書において使用されるＭＤＣ細胞は、約３４℃にて培養される。
【０１２８】
研究者が決定した実験条件によって、細胞を化学薬剤と接触させることができる。下記の実施例は、特に、懸濁条件下で哺乳動物細胞に有用な、条件の少なくとも１つの機能的セットを示す。１つの好ましい態様では、宿主細胞を接触させるステップは、細胞のインキュベーションまたは増殖の間に、およびウイルスの接種の前にまたはそれと同時的に行い得る。
【０１２９】
宿主細胞における生体分子の組換え発現は、当業者が利用可能な標準的な技術である。細胞をトランスフェクトさせる方法は、電気穿孔（遺伝子電気移入（ｇｅｎｅ  ｅｌｅｃｔｒｏｔｒａｎｓｆｅｒ））、ソノポレーション（ｓｏｎｏ−ｐｏｒａｔｉｏｎ）、光学的トランスフェクション、原形質融合、インペールフェクション（ｉｍｐａｌｅｆｅｃｔｉｏｎ）、マグネトフェクション（ｍａｇｎｅｔｏｆｅｃｔｉｏｎ）、またはウイルス形質導入を含み得る。一般に使用されるトランスフェクション試薬は、例えば、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストランおよび脂質を含む。詳細なプロトコールの例について、多数の参照文献、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第９章、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、１９９８年が利用可能である。ウイルスまたは細菌の場合、細胞は、所望の感染多重度（ＭＯＩ）で感染または接種される。トランスフェクションおよび感染は、本明細書において互換的に使用し得る。
【０１３０】
化学薬剤で処理された宿主細胞によって産生された生体分子の量は、ウイルスによる接種の前か、後か、または同時に測定し得る。化学薬剤の添加の時の前後に細胞膜のウイルス感染の反応をモニターすることは、例えば、細胞へのウイルス侵入、影響されるウイルスゲノムＤＮＡおよび／もしくはＲＮＡのレベル、ＲＮＡへのウイルスゲノムＤＮＡの転写のレベル、発現した１種もしくは複数のウイルスタンパク質のレベル、細胞内に形成されるウイルス粒子の数、および／または細胞から放出されるウイルス粒子の数についての理解を提供することができる。理論に束縛されることを望まないが、化学薬剤は、宿主細胞におけるウイルス成長相に対してこれらの効果を発揮すると考えられる。
【０１３１】
トランスフェクションの前の一定の期間においてか、それと同時的にか、またはトランスフェクションの後の一定の期間において、および宿主細胞または発現した生体分子を収集する前に、宿主細胞を含有する培地に薬剤を添加してもよい。例えば、宿主細胞は、トランスフェクションの前もしくは後、または感染の後、０〜１時間、０〜２時間、０〜３時間、０〜４時間、０〜５時間、０〜１２時間、０〜２０時間、０〜３０時間、０〜４０時間、０〜５０時間、０〜６０時間の間の時間間隔で、有効濃度の化学薬剤と接触させることができる。接触時間を最適化して、対照と比較して達成されるものの少なくとも２倍である収量のレベルを達成し得る。驚いたことに、本発明において使用される化学薬剤は、短期間、宿主細胞と接触させてもよく、好ましくは、細胞は、事前処理を必要とせず、化学薬剤は、ウイルスと同時的に添加され得る。
【０１３２】
宿主細胞系における目的の生体分子の産生の増進を助ける適切な薬剤の選択において、１つの望ましい特色は、薬剤が、少なくとも２つの理由のために、比較的低濃度で使用されるとき産生を増加させるのに有効であることであり得る。第１に、より少ない量のこのような薬剤が、このような産物の商業スケールの製造のために必要とされる。第２に、医薬、栄養補助および美容適用のために、最終産物が、汚染物質または不純物を含有しない純粋な形態であることが望ましい。製造のプロセスの間に使用される低濃度のこのような薬剤は、最終産物からの薬剤の除去がより容易であることを意味する。目的の生体分子の産生を助けることにおいて適切な薬剤についての別の望ましい特色は、このような薬剤が、その安全性プロファイルが十分に特徴付けられている既に承認されている市販の製品であることである。
【０１３３】
一部の実施形態では、本発明において使用される薬剤は、トランスフェクションの時に十分な濃度で存在する。生体分子の収量増加のための所望のパラメーターを達成するために、当業者は条件を調節および最適化することができる。上記のように、好ましくは、目的の生体分子の産生または収量を増進するのに有効な量は、これが商業的に実行可能であり、ヒトへの使用のために安全であるように十分に低い。典型的には、有効量は、薬剤が存在するときの調製物の総容量、例えば、細胞培養物のバッチ容量中の濃度によって測定される。一部の実施形態では、本明細書において使用される適切な薬剤の有効量は、０．１ｎＭ〜１０μＭの間、好ましくは、５μＭ未満、より好ましくは、１μＭ未満、さらにより好ましくは、１００ｎＭ未満である。
【０１３４】
増加した収量または産生能を表すパラメーターの最適濃度は、発現系の個々の特徴、使用者の要件によって変化してもよく、所与の実験シナリオにおいて何が任意の１種または複数の発現増進剤の最適濃度を構成するかの決定は十分に当技術分野で通常の技術レベルを有する実施者の範囲内である。
【０１３５】
化学薬剤の組み合わせ、例えば、逐次的にまたはカクテル中で添加された少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種の薬剤を使用して、宿主細胞系に接触し得ることは可能である。それに続く薬剤の添加は、最初または従前の化合物の添加後、０〜１時間の間、２時間、３時間、４時間、５時間後の時間間隔で行うことができる。ウイルス、宿主細胞、トランスフェクション条件、および発現産物によって、化学薬剤または化学薬剤の組み合わせによる処理は、超相加（「相乗」）効果をもたらし得る。例えば、収量の増加に加えて、実際に予想される効果を超える下記の効果が可能である：製造した生体産物の用量の数の増加、製造から患者への薬物送達までの時間の低減、処置される患者の数の増加、タンパク質／抗原発現の増加、ウイルス粒子の放出の増加、ウイルス粒子産生の増加を示すＮＰ検出の増加、ウイルス粒子上のＨＡ抗原密度の増加、生体産物を産生する化学薬剤の組み合わせの有効性の増加。相乗効果は、本明細書に記載のような適用可能な方法によって検出し得る。
【０１３６】
一態様では、宿主細胞の処理は、培地を変更する必要性を伴わずに宿主細胞系と化学薬剤との相互作用を可能とする培地中で行い得る。好ましい一実施形態では、本発明は、培地を包含し、細胞の培養およびトランスフェクションの両方を、ウイルスの接種の前に少なくとも１種の化学薬剤の存在下で行い得る。
【０１３７】
その中で宿主細胞を処理する培地はまた、アミノ酸、ビタミン、有機塩および無機塩、糖、ならびに他の構成成分を含めたいくつかの成分を含んでもよく、各成分は哺乳動物の上皮細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの培養を支持する量で存在する。
【０１３８】
いくつかの適用のために、完全培地の栄養内容物をさらに富化して、宿主細胞によるより速い成長および生体分子の産生の増進を支持し、好ましくは、選好性哺乳動物細胞の培養のためのより適切な環境を提供することが好ましくあり得る。このような富化を達成するために、１種または複数の補充物を、本発明の基本培地または完全培地に任意選択で添加し得る。本培地に有利に添加し得る補充物には、１種または複数のサイトカイン（例えば、成長因子、例えば、ＥＧＦ、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２、ＨＢ−ＥＧＦ、ＫＧＦ、ＨＧＦなど）、ヘパリン（ヘパリン結合性成長因子、例えば、ＦＧＦ、ＨＢ−ＥＧＦ、ＫＧＦおよびＨＧＦを安定化させる）、ならびに動物に由来する１種または複数のペプチド（例えば、ＨＳＡまたはＢＳＡ）、酵母（例えば、酵母エキス、イーストレート（ｙｅａｓｔｏｌａｔｅ）もしくは酵母エキス限外濾過液）または植物（例えば、コメまたはダイズペプチド）が含まれる。天然でも組換えでもよいサイトカインは、例えば、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍｄ．）またはＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、Ｍｉｎｎ）から商業的に入手可能であり、培養される特定の細胞型について製造業者が推奨する濃度（典型的には約０．００００１〜１０ｍｇ／リットルの最終濃度）で培地に添加し得る。ヘパリンは、例えば、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．）から商業的に入手可能であり、好ましくは、培地中で約１〜５００Ｕ．Ｓ．Ｐ．単位／リットルの最終濃度で使用されるブタ粘膜ヘパリンである。動物、酵母および植物ペプチドは、商業的に得てもよいか（例えば、動物ペプチドについてＳｉｇｍａから；酵母ペプチドについてＤｉｆｃｏ、Ｎｏｒｗｅｌｌ、Ｍａｓｓ．から；および植物ペプチドについてＱｕｅｓｔ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｎｏｒｗｉｃｈ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋから）、またはその開示内容の全体が参照により本明細書に組み込まれている１９９６年１０月１０日に出願された同時係属中の共有に係る米国特許出願第６０／０２８，１９７号に詳細に記載されているように、派生させ、本培養培地中に配合し得る。
【０１３９】
本発明の一部の態様では、本発明の実施のための特に適切なタイプの培地は、タンパク質を完全に欠いている（例えば、血清タンパク質、例えば、血清アルブミンまたは付着因子、栄養素のタンパク質、例えば、成長因子、または金属イオン担体タンパク質、例えば、トランスフェリン、セルロプラスミンなどを欠いている）タンパク質非含有培地（「ＰＦＭ培地」と称されることがある）である。
【０１４０】
理想的には、本発明による使用のために企図される無血清培地およびタンパク質非含有培地の両方は、任意の動物に由来する材料、または組換え動物ＤＮＡもしくは組換え動物性タンパク質ＤＮＡを含めた動物供給源に全体的もしくは部分的に由来する任意の材料をさらに欠いている。
【０１４１】
細胞系統および細胞培養物
本発明によれば、任意の宿主細胞系、好ましくは、真核生物、好ましくは、哺乳動物のものを使用し得る。典型的には、脊椎動物宿主細胞には、これらに限定されないが、霊長類（例えば、ヒト、サルなど）、イヌ、鳥類（例えば、ニワトリ、アヒルなど）、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、げっ歯類、およびウサギからの細胞が含まれる。１つの好ましい態様では、脊椎動物細胞は、孵化卵由来である。
【０１４２】
別の態様では、細胞は、細胞系統である。典型的には、培養細胞は、ワクチン産生についてのＷＨＯの要件によって認証される。このような細胞系統を認証するための要件は、系統学、成長の特徴、免疫学的マーカー、ウイルス感受性、腫瘍形成能および貯蔵条件の少なくとも１つに関する、ならびに動物、卵、および細胞培養物において試験することによる特徴付けを含む。本発明に適した宿主細胞の非限定的例には、真核細胞、例えば、植物細胞、哺乳動物細胞、トリ細胞（例えば、アヒル細胞）、昆虫細胞、酵母細胞などが含まれる。適切な細胞の非限定的例には、初代細胞、例えば、初代上皮細胞（例えば、ケラチノサイト、頸部上皮細胞（ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ）、気管支上皮細胞、気管上皮細胞、腎臓上皮細胞および網膜上皮細胞）ならびに樹立細胞系統およびこれらの株または誘導体（例えば、２９３胚性腎細胞、ＢＨＫ細胞、ＨｅＬａ頸部上皮細胞およびＰＥＲ−Ｃ６網膜細胞、ＭＤＢＫ（ＮＢＬ−１）細胞、９１１細胞、ＣＲＦＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＣａＣｏ−２、ＣａｐＴ細胞、ＣＨＯ細胞、ＢｅＷｏ細胞、Ｃｈａｎｇ細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５６２細胞、ＦＲｌｌＫ−４、ＨＥＫ−２９３、ＨｅＬａ２２９細胞、ＨｅＬａ  Ｓ３細胞、Ｈｅｐ−２細胞、ＫＢ細胞、ＬＳ１８０細胞、ＬＳ１７４Ｔ細胞、ＮＣＩ−Ｈ−５４８細胞、ＲＰＭＩ２６５０細胞、ＳＷ−１３細胞、Ｔ２４細胞、ＷＩ−２８ＶＡ１３、２ＲＡ細胞、ＷＩＳＨ細胞、ＢＳ−Ｃ−Ｉ細胞、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞、クローンＭ−３細胞、１−１０細胞、ＲＡＧ細胞、ＲＤ、ＴＣＭＫ−１細胞、Ｙ−１細胞、ＬＬＣ−ＰＫ１細胞、ＰＫ（１５）細胞、ＧＨ１細胞、ＧＨ３細胞、Ｌ２細胞、ＬＬＣ−ＲＣ２５６細胞、ＭＨ１Ｃ１細胞、ＸＣ細胞、ＭＤＯＫ細胞、ＶＳＷ細胞、およびＴＨ−Ｉ、Ｂ１細胞、またはその誘導体）、ＮＳ０（マウス骨髄腫細胞）、幹細胞、例えば、胚性幹細胞（例えば、ＥＢ６６（登録商標）細胞）、任意の組織または器官（これらに限定されないが、心臓、肝臓、腎臓、結腸、腸、食道、胃、神経組織（脳、脊髄）、肺、血管組織（動脈、静脈、毛細血管）、リンパ組織（リンパ腺、咽頭扁桃、扁桃腺、骨髄、および血液）、脾臓を含む）からの線維芽細胞、ならびに線維芽細胞および線維芽細胞様細胞系統（例えば、ＣＨＯ細胞、ＴＲＧ−２細胞、ＩＭＲ−３３細胞、Ｄｏｎ細胞、ＧＨＫ−２１細胞、シトルリン血症細胞、Ｄｅｍｐｓｅｙ細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５５１細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５１０細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５２５細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５２９細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５３２細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５３９細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５４８細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５７３細胞、ＨＥＬ２９９細胞、ＩＭＲ−９０細胞、ＭＲＣ−５細胞、ＷＩ−３８細胞、ＷＩ−２６細胞、ＭｉＣｌ１細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＶ−１細胞、ＣＯＳ−１細胞、ＣＯＳ−３細胞、ＣＯＳ−７細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＤＢＳ−ＦｒｈＬ−２細胞、ＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞、Ｆ９細胞、ＳＶ−Ｔ２細胞、Ｍ−ＭＳＶ−ＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞、Ｋ−ＢＡＬＢ細胞、ＢＬＯ−１１細胞、ＮＯＲ−１０細胞、Ｃ３Ｈ／ＩＯＴＩ／２細胞、ＨＳＤＭ１Ｃ３細胞、ＫＬＮ２Ｏ５細胞、ＭｃＣｏｙ細胞、マウスＬ細胞、株２０７１（マウスＬ）細胞、Ｌ−Ｍ株（マウスＬ）細胞、Ｌ−ＭＴＫ−（マウスＬ）細胞、ＮＣＴＣクローン２４７２および２５５５、ＳＣＣ−ＰＳＡ１細胞、スイス／３Ｔ３細胞、Ｉｎｄｉａｎ  ｍｕｎｔｊａｃ細胞、ＳＩＲＣ細胞、ＣＩＩ細胞、およびＪｅｎｓｅｎ細胞、またはその誘導体）が含まれる。好ましくは、哺乳動物細胞は、ＭＤＣＫ細胞、２９３細胞、ＰＥＲ−Ｃ６細胞、ＣＨＯ細胞またはその誘導体からなる群より選択される。
【０１４３】
所与の動物細胞型についての最適なプレーティングおよび培養条件は、慣例的な実験法のみを使用して当業者が決定することができる。慣例的な単層培養条件のために、付着因子を伴わずに細胞を培養容器の表面上にプレーティングすることができる。代わりに、容器は、例えば、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍｄ．）、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、Ｍｉｎｎ．）、Ｇｅｎｚｙｍｅ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｍａｓｓ．）およびＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．）から商業的に入手可能である、天然、組換えもしくは合成の付着因子またはペプチド断片（例えば、コラーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニンなど、またはその天然もしくは合成断片）で事前コーティングすることができる。単離した細胞はまた、天然もしくは合成の三次元支持マトリックス、例えば、事前形成されたコラーゲンゲルもしくは合成バイオポリマー材料中に、またはこれらの上に播種することができる。懸濁培養のために、細胞を典型的には、培養培地に懸濁させ、懸濁物中での細胞の培養を促進する培養容器、例えば、スピナーフラスコ、灌流装置、またはバイオリアクター中に導入する（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，  Ｒ．  Ｉ．、Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：  Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：  Ａｌａｎ  Ｒ．  Ｌｉｓｓ，  Ｉｎｃ．、１２３〜１２５頁（１９８３年）を参照されたい）。理想的には、培地および懸濁した細胞の撹拌を最小化して、培地構成成分の変性、および培養の間の細胞の剪断を回避する。
【０１４４】
好ましい態様では、インフルエンザウイルスの産生のための細胞は、血清含有培地または無血清培地中で培養することができる。場合によって、例えば、精製されたウイルスの調製のために、無血清条件において細胞を成長させることが望ましい。細胞は、小さなスケール、例えば、２５ｍｌ未満の培地、培養管もしくはフラスコ中で、または撹拌しながら大きなフラスコ、回転式ボトル中で、またはフラスコ、ボトルもしくは反応器培養物中のミクロ担体ビーズ（例えば、ＤＥＡＥ−デキストランミクロ担体ビーズ、例えば、Ｄｏｒｍａｃｅｌｌ、Ｐｆｅｉｆｅｒ  ＆  Ｌａｎｇｅｎ；Ｓｕｐｅｒｂｅａｄ、Ｆｌｏｗ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；スチレンコポリマー−トリ−メチルアミンビーズ、例えば、Ｈｉｌｌｅｘ、ＳｏｌｏＨｉｌｌ、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ）上で培養することができる。ミクロ担体ビーズは、小さな球（直径が１００〜２００ミクロンの範囲）であり、これは細胞培養物の容量当たりの接着細胞の成長のための大きな表面積を提供する。例えば、１リットルの培地は、２千万個超のミクロ担体ビーズを含み、８０００平方センチメートル超の成長表面を提供することができる。ウイルスの商業的産生、例えば、ワクチン産生のために、細胞をバイオリアクターまたは発酵槽中で培養することが望ましいことが多い。バイオリアクター、例えば、Ｃｙｔｏ３バイオリアクター（Ｏｓｍｏｎｉｃｓ、Ｍｉｎｎｅｔｏｎｋａ、Ｍｉｎｎ．）；ＮＢＳバイオリアクター（Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｅｄｉｓｏｎ、Ｎ．Ｊ．）；Ｂ．Ｂｒａｕｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｂ．Ｂｒａｕｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｍｅｌｓｕｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）からの実験室スケールおよび商業スケールのバイオリアクターは、１リットル未満から１００リットル超の容量で入手可能である。
【０１４５】
好ましい態様によれば、宿主細胞は、化学薬剤との接触の前にか、それと同時にか、またはその後にウイルスと接触させ得る。哺乳動物細胞をウイルスに感染させる最適な方法は当技術分野において周知であり、当業者にはよく知られている。細胞のウイルス感染は、種々の方法で定量化することができる。ＭＯＩは、感染性ウイルス粒子と感染させる細胞の数の比である。このように、０．１のＭＯＩは、１０個の細胞毎に１個のウイルス粒子の平均接種をもたらす。ＭＯＩの背景の一般理論は、培養物中に存在する宿主細胞毎に１個の感染性ウイルス粒子を導入することである。しかし、１個より多いウイルスが、同じ細胞に感染し、これによって一定の百分率の感染していない細胞が残り得る。より高いＭＯＩを使用することによって、これが起こることを低減させて、全ての細胞が感染されることを確実にすることができる。したがって、提供されるウイルス粒子は、本明細書に記載のように、０．００１〜１００、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００のＭＯＩを伴って細胞に投与することができる。
【０１４６】
薬剤の存在下で懸濁物中にて培養されたウイルス感染した哺乳動物細胞は、候補化合物と接触していない細胞より高いウイルス力価（例えば、２倍、３倍、５倍、１０倍、２０倍、２５倍、５０倍、１００倍、２５０倍、５００倍、または１０００倍高い力価）を生じさせることが予想され得る。これらの方法を使用して、これらに限定されないが、レトロウイルスなどを含めた種々の哺乳動物のウイルスおよびウイルスベクターを産生させてもよく、最も好ましくは、これらの方法を使用して、インフルエンザウイルスを産生させる。化学薬剤による感染細胞の処理に続いて、ウイルス、ウイルスベクター、ウイルス粒子またはその構成成分（タンパク質および／もしくは核酸（ＤＮＡおよび／もしくはＲＮＡ））を含む使用した培養培地は、ワクチン産生、細胞トランスフェクションまたは遺伝子療法における使用のためのウイルスベクターの産生、動物または細胞培養物の感染、ウイルスタンパク質および／または核酸の研究などを含めた種々の目的のために使用し得る。代わりに、ウイルス、ウイルスベクター、ウイルス粒子またはその構成成分は、当業者にはよく知られているタンパク質および／または核酸単離のための技術によって、使用した培養培地から任意選択で単離し得る。
【０１４７】
本発明はまた、哺乳動物細胞、特に、懸濁物中で成長させた哺乳動物細胞からの組換えタンパク質の産生のための方法において使用し得る。細胞は化学薬剤との接触の前に遺伝子操作され得るか、または細胞に１つもしくは複数の外因性核酸分子をトランスフェクトし、十分な量の化学薬剤と接触させてもよい。哺乳動物細胞を遺伝子操作して、目的のポリペプチドを発現させる最適な方法は当技術分野において周知であり、したがって、当業者にはよく知られている。遺伝子操作した細胞は、薬剤の存在下で、単層培養物として、またはより好ましくは、懸濁培養物として本明細書に記載の方法によって培養し得る。細胞の培養に続いて、目的の生体分子は、当業者にはよく知られているタンパク質単離の技術によって、細胞および／または使用した培養培地から任意選択で精製し得る。本発明の方法によって産生された生体分子またはその誘導体の単離および精製は、当業者には公知の通常の方法の手段によって行い得る。
【０１４８】
一般に、タンパク質の単離は、最初はそれらの起源によって決まる。細胞内タンパク質および細胞外タンパク質の間には区別がある。タンパク質が細胞本体内に位置している場合、細胞を破壊することが最初に必要であり、これは例えば、剪断力または浸透圧分解（ｏｓｍｏｌｙｓｉｓ）によって行われる。その後、不溶性材料、例えば、細胞膜および細胞壁の分離が、例えば、遠心分離によって行われる。細胞、細胞小器官およびタンパク質の分離のために、遠心分離を既定として使用する。分離能力に関してより有効な方法は、パルス電気泳動である。さらに、他の細胞構成成分の分離の後、異なるサイズのタンパク質、ペプチドおよびアミノ酸を分離する必要がまだ存在する。タンパク質の分離は、一次元または二次元ゲル電気泳動またはキャピラリー電気泳動によって行い得る。アミノ酸およびペプチドの分野において、例えば、クロマトグラフ法、例えば、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）、または逆相クロマトグラフィー（ＲＰＣ）を使用する。脂質の存在、およびプロテアーゼの除去または非活性化の必要性は、精製に関しては不利である。細胞外マトリックス中に存在するタンパク質は細胞から抽出する必要はないが、全ての不溶物の分離の後、それらが高度に希釈されており、通常、細胞内タンパク質よりも非常に少ない量である。
【０１４９】
ウイルスの加工
高い力価までのウイルスの複製を可能とする適切な期間にわたる宿主細胞の培養に続いて、ウイルスを回収することができる。ウイルスは典型的には、その中で感染細胞が成長してきた培養培地から回収することができる。典型的には、粗培地は、インフルエンザウイルスの濃縮の前に清澄化される。一般の方法は、濾過、限外濾過、硫酸バリウム上の吸着および溶出、ならびに遠心分離を含む。例えば、感染した培養物からの粗培地を、最初に細胞デブリおよび他の大きな微粒子状物質を除去するのに十分な時間、例えば、１０分〜３０分の間、例えば、１０００〜２０００×ｇの遠心分離によって清澄化することができる。代わりに、培地を０．８μｍの酢酸セルロースフィルターを通して濾過し、無傷の細胞および他の大きな微粒子状物質を除去する。任意選択で次いで、清澄化した培地上清を遠心分離して、インフルエンザウイルスを、例えば、１５，０００×ｇで概ね３〜５時間で遠心分離して、ペレット化する。ウイルスペレットのｐＨ７．４での適当な緩衝液、例えば、ＳＴＥ（０．０１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ；０．１５ＭのＮａＣｌ；０．０００１ＭのＥＤＴＡ）またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）への再懸濁に続いて、スクロース（６０％〜１２％）または酒石酸カリウム（５０％〜１０％）上の密度勾配遠心分離によってウイルスを濃縮する。連続またはステップ勾配、例えば、４つの１２％ステップでの１２％から６０％の間のスクロース勾配が適切である。勾配物を、ウイルスが回収のために目に見えるバンドへと濃縮するのに十分なスピードおよび時間で遠心分離する。代わりに、および大部分の大きなスケールの商業適用のために、連続モードで作動するゾーン遠心分離ローターを使用してウイルスを密度勾配から溶出させる。組織培養物からのインフルエンザウイルスの調製について当業者をガイドするのに十分なさらなる詳細は、例えば、本明細書において参照により組み込まれているＦｕｒｍｉｎｇｅｒ．  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ、Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎら（編）Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ、３２４〜３３２頁；Ｍｅｒｔｅｎら（１９９６年）Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｆｏｒ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ、Ｃｏｈｅｎ  ＆  Ｓｈａｆｆｅｒｍａｎ（編）Ｎｏｖｅｌ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｉｎ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ、１４１〜１５１頁、および米国特許第５，６９０，９３７号、米国特許出願公開第２００４０２６５９８７号、同第２００５０２６６０２６号および同第２００５０１５８３４２号に提供されている。必要に応じて、回収されたウイルスは、安定剤としてスクロース−ホスフェート−グルタメート（ＳＰＧ）の存在下で−８０℃にて貯蔵することができる。
【０１５０】
本発明の方法によって産生されたウイルスは、ワクチン調製物に加工することができる。このようなワクチン調製物は、特に好ましい実施形態である下記のプロセスによって得ることができる。インフルエンザウイルスワクチンは、下記のように調製することができる；インフルエンザウイルスを、細胞培養物、例えば、ＭＤＣＫ懸濁細胞（ＷＯ９７／０３７０００）中で成長させる。ウイルスを収集し、精製し、０．４５マイクロメートル濾過およびＣＳクロマトグラフィーによって濃縮する。界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ８０）の添加の後、ウイルス調製物を、ＢＰＬで処理する。その後、ウイルスをＣＴＡＢで分割する。超遠心分離および吸着ステップの後、ウイルスタンパク質調製物を、ＴＭＡＥまたはＳａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｑを樹脂として使用してイオン交換クロマトグラフィーに供する。クロマトグラフィーは、カプリル酸ナトリウム（Ｓａｒｔｏｂｉｎｄについて約５０ｍＭ；ＴＭＡＥについて１００ｍＭ）および塩化ナトリウム（Ｓａｒｔｏｂｉｎｄについて４００ｍＭ）、ならびにＴＭＡＥについて２００ｍＭ）の存在下で行い得る。イオン交換クロマトグラフィーと組み合わせた界面活性剤の使用の前に、断片化した残留ＤＮＡの部分を、Ｏｎｉｏｎｓら、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、２０１０年（３８巻）５４４〜５５１頁に記載されているように、陽イオン界面活性剤、例えば、ＣＴＡＢによる沈殿によって除去することができる。本発明は、Ｏｎｉｏｎｓのプロセスの部分として適用することができる。
【０１５１】
その後、タンパク質調製物を、限外濾過によって濃縮する。タンパク質は、他のウイルス調製物（三価または四価の季節性ワクチンの場合）と任意選択でブレンドし、任意選択で無菌濾過し、充填し、パッケージ化し得る。本発明の部分は、このプロセスによって得ることができるインフルエンザワクチンを含む。
【０１５２】
アッセイ
一例において、化学薬剤に曝露された宿主細胞の細胞の産生能を分析することは、細胞の産生能の決定、例えば、少なくとも１つの発現産物の測定が関与し得る。細胞の産生能は、本明細書において使用する場合、特定の成長条件下で、単位時間当たりに細胞１個によって産生される、組換え発現されたタンパク質（例えば、ポリペプチド、抗体など）または粒子の総量を指す。
【０１５３】
細胞の産生能はまた、化学薬剤の非存在下での対応する対照と比較した、化学薬剤の存在下での生体産物または細胞表現型の性質の変化を同定することによって決定することができる。好ましくは、この方法における発現または生体産物は、ウイルス粒子、核酸またはタンパク質の産生を測定する。
【０１５４】
特定の態様では、生体分子の直接の測定は、標準的プラークアッセイより正確である。
【０１５５】
好ましい例において、発現産物は、ＥＬＩＳＡおよび当業者が容易に利用可能な技術を使用して測定されるＨＡタンパク質である。ＨＡタンパク質は、精製された糖タンパク質であってもよいか、またはウイルス構成成分、例えば、分割または全ビリオン膜に結合していてもよい。
【０１５６】
組換えタンパク質をコードする核酸配列の合成を測定するために、ＲＮＡまたはＤＮＡを、周知の方法、例えば、ノーザンブロット法、および古典的な核酸ハイブリダイゼーション技術を利用するＲＴ−ＰＣＴを使用して測定し得る。
【０１５７】
抗原
抗原は、免疫系の活性化を引き起こすことができるかどうかに関わらず、免疫系の構成成分によって認識されることができる任意の分子（例えば、核酸、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、糖ペプチド、炭水化物、脂質、リポペプチド、多糖）でよい。
【０１５８】
抗原は、病原体、例えば、ワクチニア、トリポックスウイルス、シチメンチョウインフルエンザウイルス、ウシ白血病ウイルス、ネコ白血病ウイルス、トリインフルエンザ、鶏肺炎ウイルス症ウイルス（ｃｈｉｃｋｅｎ  ｐｎｅｕｍｏｖｉｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ）、イヌパルボウイルス、ウマインフルエンザ、ＦＨＶ、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、鶏／ペンシルヴァニア／１／８３インフルエンザウイルス、感染性気管支炎ウイルス；デング熱ウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、仮性狂犬病、エプスタイン−バーウイルス、ＨＩＶ、ＳＩＶ、ＥＨＶ、ＢＨＶ、ＨＣＭＶ、Ｈａｎｔａａｎ、Ｃ．ｔｅｔａｎｉ、流行性耳下腺炎、モルビリウイルス、単純ヘルペスウイルス１型、単純ヘルペスウイルス２型、ヒトサイトメガロウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、ヒトパピローマウイルス、インフルエンザウイルス、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ（例えば、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍおよびＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｖｉｖａｘ）、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｄｉｐｔｈｅｒｉａ、Ｔｅｔａｎｕｓ、Ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｅｎｔａｍｏｅｂａ、ＧｉａｒｄｉａおよびＴｒｙｐａｎａｓｏｍａと関連し得る。抗原は、天然に存在する抗原の断片もしくは部分、または天然に存在する抗原、または天然に存在する抗原の部分を模倣する合成分子でよい。
【０１５９】
好ましい態様では、任意のインフルエンザウイルス株または亜型は、本発明に包含される。好ましくは、インフルエンザウイルス株は、インフルエンザＡ型またはＢ型ウイルスの少なくとも１種の循環株の臨床単離株に対応する。Ａ型ウイルスは主に、２種のウイルス表面糖タンパク質、ヘマグルチニン（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）に基づいて、抗原性亜型に分類される。現在、１６種の同定されたＨＡ亜型（Ｈ１〜Ｈ１６と指定）および９種のＮＡ亜型（Ｎ１〜Ｎ９）が存在し、これらの全ては野生の水鳥において見出すことができる。ウイルスは１９３３年に初めて単離されて以来、ＨＡおよびＮＡの１３５の可能性のある組み合わせのうち、４つのみ（Ｈ１Ｎ１、Ｈ１Ｎ２、Ｈ２Ｎ２、Ｈ５Ｎ１およびＨ３Ｎ２）がヒト集団において広範に循環している。
【０１６０】
本発明の方法は、産生することが困難であった亜型および株の産生において特定の改善を示す。例えば、再集合プロセスは一般に、抗原的に十分に別個なものである適切な高収量インフルエンザＢ型ドナー株の欠如のために、インフルエンザＢ型ワクチンのために使用されない。インフルエンザＢ型ウイルスの進化は、ＨＡ遺伝子のみから得たデータを使用してたいがい測定されてきたため、プロセスとしての再集合は過小評価されてきた。それにも関わらず、本発明は、今までのところ本発明の前に達成できていない、より普遍でより労働集約的でない様式で、株を含めたＢ型株から得た抗原性タンパク質の収量を有意に改善させる。Ｂ型株は、スクロース精製したウイルス培養物のＲＰ−ＨＰＬＣによって測定するように、２０μｇ／ｍｌ超、３０μｇ／ｍｌ超、４０μｇ／ｍｌ超、５０μｇ／ｍｌ超、６０μｇ／ｍｌ超で産生することができた。Ｂ型抗原の収量は株特異的であり、特定の株が、一般のインフルエンザ株および亜型において見られる平均２０μｇ／ｍｌよりも少ない量しか産生できないことが考えられる。収量が株またはタイプによって決まる場合、収量の増加は、相対的な測定値でよく、これは対照株またはタイプと比較して決定することがきる。
【０１６１】
インフルエンザＢ型ワクチンは、一価、二価、三価、四価または七価ワクチンの部分であり得る、これは複数種のＢ亜型株を含んでもよく、これらに限定されないが、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ７および／またはＨ９株などの他の株の組み合わせを含み得る。
【０１６２】
本発明によって産生されるＢ亜型インフルエンザウイルスの適切な株には、インフルエンザウイルスＢ、インフルエンザウイルスＢ／アンアーバー１／８６、インフルエンザウイルスＢ／ハルビン／７／９４、インフルエンザウイルスＢ／香港／５／７２、インフルエンザウイルスＢ／Ｌｅｅ／４０、インフルエンザウイルスＢ／ビクトリア群、インフルエンザウイルスＢ／山形１６／８８、インフルエンザウイルスＢ／山形群、インフルエンザウイルスＢ／山梨／１６６／９８、インフルエンザウイルスＢ型／パナマ４５／９０が含まれる。
【０１６３】
特に有利な態様では、本発明の方法は、これらに限定されないが、シチメンチョウインフルエンザウイルス株Ａ／シチメンチョウ／アイルランド／１３７８／８３（Ｈ５Ｎ８）、シチメンチョウインフルエンザウイルス株Ａ／シチメンチョウ／英国／６３（Ｈ７Ｎ３）、シチメンチョウインフルエンザウイルス株Ａ／シチメンチョウ／英国／６６（Ｈ６Ｎ２）、Ａ／シチメンチョウ／英国／６９（Ｈ７Ｎ２）、Ａ／シチメンチョウ／スコットランド／７０（Ｈ６Ｎ２）；シチメンチョウインフルエンザウイルス株Ａ／シチメンチョウ／英国Ｎ２８／７３（Ｈ５Ｎ２）、シチメンチョウインフルエンザウイルス株Ａ／シチメンチョウ／英国／１１０／７７（Ｈ６Ｎ２）、シチメンチョウインフルエンザウイルス株Ａ／シチメンチョウ／英国／６４７／７７（Ｈ１Ｎ１）、シチメンチョウインフルエンザウイルス株Ａ／シチメンチョウ／オンタリオ／７７３２／６６（Ｈ５Ｎ９）、シチメンチョウインフルエンザウイルス株Ａ／シチメンチョウ／英国／１９９／７９（Ｈ７Ｎ７）、シチメンチョウインフルエンザウイルス株Ａ／シチメンチョウ／オンタリオ／７７３２／６６（Ｈ５Ｎ９）、シチメンチョウインフルエンザウイルス株Ａ／シチメンチョウ／アイルランド／１３７８／８５（Ｈ５Ｎ８）、シチメンチョウインフルエンザウイルス株Ａ／シチメンチョウ／英国／５０−９２／９１（Ｈ５Ｎ１）、シチメンチョウインフルエンザウイルス株Ａ／シチメンチョウ／ウィスコンシン／６８（Ｈ５Ｎ９）、シチメンチョウインフルエンザウイルス株Ａ／シチメンチョウ／マサチューセッツ／６５（Ｈ６Ｎ２）、シチメンチョウインフルエンザウイルス株Ａ／シチメンチョウ／オレゴン／７１（Ｈ７Ｎ３）、シチメンチョウインフルエンザウイルス株Ａ／シチメンチョウ／オンタリオ／６２２８／６７（Ｈ８Ｎ４）、シチメンチョウインフルエンザウイルス株Ａ／シチメンチョウ／ウィスコンシン／６６（Ｈ９Ｎ２）、シチメンチョウインフルエンザウイルス株Ａ／シチメンチョウ／英国／６４７／７７（Ｈ１Ｎ１）、シチメンチョウインフルエンザウイルス株Ａ／シチメンチョウ／オンタリオ／６１１８／６８（Ｈ８Ｎ４）、シチメンチョウインフルエンザウイルス株Ａ／Ｔｕｒ／Ｇｅｒ３／９１、シチメンチョウインフルエンザウイルス株Ａ／シチメンチョウ／ミネソタ／８３３／８０（Ｈ４Ｎ２）、鶏インフルエンザウイルス株Ａ／鶏／インドネシア／０３（Ｈ５Ｎ１）、鶏インフルエンザウイルス株Ａ／鶏／ＦＰＶ／ロストック／１９３４、鶏インフルエンザウイルス株Ａ／鶏／テキサス／２９８３１３／０４、鶏インフルエンザウイルス株Ａ／鶏／テキサス／１６７２８０−４−／０２、鶏インフルエンザウイルス株Ａ／鶏／香港／２２０／９７、鶏インフルエンザウイルス株Ａ／鶏／イタリア／８／９８、鶏インフルエンザウイルス株Ａ／鶏／ビクトリア／７６（Ｈ７Ｎ７）、鶏インフルエンザウイルス株Ａ／鶏／ドイツ／７９（Ｈ７Ｎ７）、鶏インフルエンザウイルス株Ａ／鶏／スコットランド／５９（Ｈ５Ｎ１）；鶏インフルエンザウイルス株Ａ／鶏／ペンシルヴァニア／１３７０／８３（Ｈ５Ｎ２）、鶏インフルエンザウイルス株Ａ／鶏／ケレタロ−１９／９５（Ｈ５Ｎ２）、鶏インフルエンザウイルス株Ａ／鶏／ケレタロ−２０／９５（Ｈ５Ｎ２）、鶏インフルエンザウイルス株Ａ／鶏／香港／２５８／９７（Ｈ５Ｎ１）、鶏インフルエンザウイルス株Ａ／鶏／イタリア／１４８７／９７（Ｈ５Ｎ２）、鶏インフルエンザウイルス株Ａ／鶏／ライプチヒ／７９（Ｈ７Ｎ７）、鶏インフルエンザウイルス株Ａ／鶏／ビクトリア／１８５（Ｈ７Ｎ７）、鶏インフルエンザウイルス株Ａ／鶏／ビクトリア／９２（Ｈ７Ｎ３）、鶏インフルエンザウイルス株Ａ／鶏／クイーンズランド／９５（Ｈ７Ｎ３）、鶏インフルエンザウイルス株Ａ／鶏／パキスタン／１３６９／９５（Ｈ７Ｎ２）、鶏インフルエンザウイルス株Ａ／鶏／パキスタン／４４７−４／９５（Ｈ７Ｎ３）、鶏インフルエンザウイルス株Ａ／鶏／ＨＫ／Ｇ９／９７（Ｈ９Ｎ２）、鶏インフルエンザウイルス株Ａ／鶏／Ｎａｋｏｍ−Ｐａｔｏｍ／タイ／ＣＵ−Ｋ２／２００４（Ｈ５Ｎ１）、鶏インフルエンザウイルス株Ａ／鶏／香港／３１．２／２００２（Ｈ５Ｎ１１）、鶏インフルエンザウイルス株Ａ／鶏／ベトナム／Ｃ５８／０４（Ｈ５Ｎ１）、鶏インフルエンザウイルス株Ａ／鶏／ベトナム／３８／２００４（Ｈ５Ｎ１）、鶏インフルエンザウイルス株Ａ／鶏／アラバマ／７３９５／７５（Ｈ４Ｎ８）、鶏インフルエンザウイルス株Ａ／鶏／ドイツ／Ｎ／４９（Ｈ１００Ｎ７）、鶏インフルエンザウイルス株Ａ／鶏／北京／１／９４（Ｈ９Ｎ２）、鶏インフルエンザウイルス株Ａ／鶏／香港／Ｇ２３／９７（Ｈ９Ｎ２）、鶏インフルエンザウイルス株Ａ／鶏／ペンシルヴァニア／８１２５／８３（Ｈ５Ｎ２）、鶏インフルエンザウイルス株Ａ／鶏／香港／９７（Ｈ５Ｎ１）、アヒルインフルエンザウイルス株Ａ／アヒル／Ａｎｙａｎｇ／ＡＶＬ−１／０１、アヒルインフルエンザウイルス株Ａ／アヒル／ニューヨーク／１７５４２−４／８６（Ｈ９Ｎ１）、アヒルインフルエンザウイルス株Ａ／アヒル／アルバータ／２８／７６（Ｈ４Ｎ６）、アヒルインフルエンザウイルス株Ａ／アヒル／南昌／４−１６５／２０００（Ｈ４Ｎ６）、アヒルインフルエンザウイルス株Ａ／アヒル／ドイツ／４９（Ｈ１０Ｎ７）、アヒルインフルエンザウイルス株Ａ／アメリカガモ／オーストラリア／７０２／７８（Ｈ３Ｎ８）、アヒルインフルエンザウイルス株Ａ／アヒル／ベトナム／１１／２００４（Ｈ５Ｎ１）、アヒルインフルエンザウイルス株Ａ／アヒル／アルバータ／６０／７６（Ｈ１２Ｎ５）、アヒルインフルエンザウイルス株Ａ／アヒル／香港／１９６／７７（Ｈ１）、アヒルインフルエンザウイルス株Ａ／アヒル／ウィスコンシン／１９３８／８０（Ｈ１Ｎ１）、アヒルインフルエンザウイルス株Ａ／アヒル／ババリア／２／７７（Ｈ１Ｎ１Ｎ１）、アヒルインフルエンザウイルス株Ａ／アヒル／ババリア／１／７７（Ｈ１Ｎ１）、アヒルインフルエンザウイルス株Ａ／アヒル／オーストラリア／７４９／８０（Ｈ１Ｎ１）、アヒルインフルエンザウイルス株Ａ／アヒル／香港／Ｙ２８０／９７（Ｈ９Ｎ２）、アヒルインフルエンザウイルス株Ａ／アヒル／アルバータ／３５／７６  Ｈ１Ｎ１）、トリインフルエンザウイルス株Ａ／マガモ／Ｇｕｒｊｅｖ／２６３／８２（Ｈ１４Ｎ５）、トリインフルエンザウイルス株Ａ／マガモ／ＰＡ／１０２１８／８４（Ｈ５Ｎ２）、トリインフルエン���ウイルス株Ａ／マガモ／アストラハン／２４４／８２（Ｈ１４Ｎ６）、ガチョウインフルエンザウイルス株Ａ／ガチョウ／広東／１／９６、ガチョウインフルエンザウイルス株Ａ／ガチョウ／ライプチヒ／１３７−８／７９（Ｈ７Ｎ７）、ガチョウインフルエンザウイルス株Ａ／ガチョウ／香港／Ｗ２２２／９７（Ｈ６Ｎ７）、ガチョウインフルエンザウイルス株Ａ／ガチョウ／ライプチヒ／１８７−７／７９（Ｈ７Ｎ７）、ガチョウインフルエンザウイルス株Ａ／ガチョウ／ライプチヒ／１９２−７／７９（Ｈ７Ｎ７）、トリインフルエンザウイルス株Ａ／Ｅｎｖ／ＨＫ／４３７−４／９９、トリインフルエンザウイルス株Ａ／Ｅｎｖ／ＨＫ／４３７−６／９９、トリインフルエンザウイルス株Ａ／Ｅｎｖ／ＨＫ／４３７−８／９９、トリインフルエンザウイルス株Ａ／Ｅｎｖ／ＨＫ／４３７−１０／９９、トリインフルエンザウイルス株Ａ／家禽ペストウイルス株／オランダ／２７（Ｈ７Ｎ７）、トリインフルエンザウイルス株Ａ／家禽ペストウイルス株／Ｄｏｂｓｏｎ／２７（Ｈ７Ｎ７）、トリインフルエンザウイルス株Ａ／家禽ペストウイルス株／ロストック／３４（Ｈ７Ｎ１）、トリインフルエンザウイルス株Ａ／家禽ペストウイルス株／エジプト／４５（Ｈ７Ｎ１）、トリインフルエンザウイルス株Ａ／家禽ペストウイルス株／ウェーブリッジ（Ｈ７Ｎ７）、トリインフルエンザウイルス株Ａ／Ｔｅｍ／南アフリカ／６１（Ｈ５Ｎ３）、トリインフルエンザウイルス株Ａ／Ｔｅｒｎ／オーストラリア／Ｇ７０Ｃ／７５（Ｈ１１Ｎ９）、トリインフルエンザウイルス株Ａ／ウズラ／ベトナム／３６／０４（Ｈ５Ｎ１）、トリインフルエンザウイルス株Ａ／カモメ／メリーランド／７０４／７７（Ｈ１３Ｎ６）、トリインフルエンザウイルス株Ａ／頭の黒いカモメ（Ｂｌａｃｋ−ｈｅａｄｅｄ  ｇｕｌｌ）／スウェーデン／５／９９（Ｈ１６Ｎ３）、トリインフルエンザウイルス株Ａ／セグロカモメ／ＤＥ／６７７／８８（Ｈ２Ｎ８）、トリインフルエンザウイルス株Ａ／ハクチョウ／イタリア／１７９／０６（Ｈ５Ｎ１）、トリインフルエンザウイルス株Ａ／香港／１５６／９７（Ａ／ＨＫ／１５６／９７）、トリインフルエンザウイルス株Ａ／ウズラ／ＨＫ／Ｇ１／９７（Ｈ９Ｎ２）、トリインフルエンザウイルス株Ａ／ウズラ／香港／ＡＦ１５７／９３（Ｈ９Ｎ２）、トリインフルエンザウイルス株Ａ／コガモ／ＨＫ／Ｗ３１２／９７（Ｈ６Ｎ１）、トリインフルエンザウイルス株Ａ／ミズナギドリ／西オーストラリア／２５７６／７９（Ｈ１５Ｎ９）、トリインフルエンザウイルス株Ａ／ミズナギドリ／オーストラリア／７２（Ｈ６Ｎ５）、トリインフルエンザウイルス株Ａ／香港／２１２／０３、トリインフルエンザウイルス株Ａ／英国／３２１／７７（Ｈ３Ｎ２）、トリ起源のトリパンデミックインフルエンザＡ型ウイルス、トリＨ５Ｎ１インフルエンザウイルス、トリＨ７Ｎ１インフルエンザ株、トリＨ９Ｎ２インフルエンザウイルス、およびトリインフルエンザウイルス、低温適応（ｃａ）および温度感受性（ｔｓ）マスタードナー株、Ａ／レニングラード／１３４／１７／５７（Ｈ２Ｎ２）を含めたパンデミックインフルエンザ株の収量を増進させる。
【０１６４】
インフルエンザウイルスワクチンは、インフルエンザウイルス、ならびにインフルエンザウイルス粒子自体；インフルエンザエンベロープタンパク質、サブウイルス粒子、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、ＶＬＰ複合体、および／またはインフルエンザに対する免疫化の目的のために使用し得るその部分を含めた組換えインフルエンザウイルスタンパク質の全てのタンパク質、ペプチドまたはその部分、ならびにこれらのタンパク質、ペプチドまたはその部分をコードする核酸を含み得る。
【０１６５】
不活化インフルエンザウイルスワクチンは典型的には、これらに限定されないが、ホルマリンまたはベータ−プロピオラクトン処理などの公知の方法を使用して、本発明の複製されたウイルスを不活化することによって提供することができる。本発明において使用することができる不活化ワクチンタイプは、全ウイルス（ＷＶ）ワクチンまたはサブビリオン（ＳＶ）ウイルスワクチンを含むことができる。ＷＶワクチンは、無傷の不活性化ウイルスを含有し、一方、ＳＶワクチンは、脂質含有ウイルスエンベロープを可溶化する界面活性剤で破壊され、それに続いて残留ウイルスを化学的不活化した精製されたウイルスを含有する。
【０１６６】
さらに、使用することができるワクチンは、表面抗原ワクチンと称される単離したＨＡおよびＮＡ表面タンパク質を含有するものを含む。一般に、ＳＶ表面抗原（すなわち、精製されたＨＡまたはＮＡ）ワクチンへの反応は同様である。流行性ウイルスと免疫学的に関連するＮＡ抗原、および関係のないＨＡを含有する実験用不活性化ＷＶワクチンは、通常のワクチンより有効でないようである。両方の関連性のある表面抗原を含有する不活化ワクチンが好ましい。
【０１６７】
複製されたウイルスを使用した生きている弱毒化インフルエンザウイルスワクチンはまた、公知の方法ステップによって、インフルエンザウイルス感染を防止または処置するために使用することができる。弱毒化は好ましくは、公知の方法によって、弱毒化ドナーウイルスから複製された単離株または再集合ウイルスへの弱毒遺伝子の転移によって単一のステップで達成される（例えば、Ｍｕｒｐｈｙ、Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｄｉｓ．  Ｃｌｉｎ．  Ｐｒａｃｔ．２巻：１７４〜１８１頁（１９９３年）を参照されたい）。インフルエンザＡ型ウイルスへの耐性はＨＡおよびＮＡ糖タンパク質への免疫応答の発生によって媒介されるため、これらの表面抗原をコードする遺伝子は、再集合ウイルスまたは高成長臨床単離株から来るはずである。弱毒遺伝子は、弱毒化親に由来する。このアプローチにおいて、弱毒化を与える遺伝子は好ましくは、ＨＡおよびＮＡ糖タンパク質をコードしない。その他の場合は、これらの遺伝子は、臨床用ウイルス単離株の表面抗原を担持する再集合体に転移することができなかった。多くのドナーウイルスが、インフルエンザウイルスを再現性よく弱毒化させるこれらの能力について評価されてきた。非限定的例として、Ａ／アンアーバー（ＡＡ）／６／６０（Ｈ２Ｎ２）低温適応（ｃａ）ドナーウイルスを、弱毒化ワクチン産生のために使用することができる（例えば、Ｅｄｗａｒｄｓ，  Ｊ．  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｄｉｓ．１６９巻：６８〜７６頁（１９９４年）；Ｍｕｒｐｈｙ、Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｄｉｓ．  Ｃｌｉｎ．  Ｐｒａｃｔ．２巻：１７４〜１８１頁（１９９３年）を参照されたい）。さらに、生きている弱毒化再集合ウイルスワクチンは、ドナーウイルスと本発明の複製されたビルレントウイルスとを組み合わせることによって生じさせることができる。次いで、再集合子孫は、弱毒化ＡＩ  ＡＡＩ６／６０（Ｈ２Ｎ２）ｃａドナーウイルスの表面抗原を担持するウイルスの複製を阻害するＨ２Ｎ２抗血清の存在下で２５℃（ビルレントウイルスの複製について制限的）にて選択される。
【０１６８】
他の弱毒変異を、部位特異的変異誘発によってインフルエンザウイルス遺伝子中に導入し、これらの変異体遺伝子を担持する感染性ウイルスをレスキューすることができる。弱毒変異は、ゲノムの非コード領域中、およびコード領域中に導入することができる。このような弱毒変異はまた、ＨＡまたはＮＡ以外の遺伝子、例えば、ＰＢ２ポリメラーゼ遺伝子中に導入することができる（Ｓｕｂｂａｒａｏら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、６７巻：７２２３〜７２２８頁（１９９３年））。このように、新規なドナーウイルスはまた、部位特異的変異誘発によって導入される弱毒変異を担持して生じさせることができ、このような新規なドナーウイルスは、ＡＩ  ＡＡＩ６／６０ｃａドナーウイルスについて上記で記載したものと類似の様式で、生きている弱毒化再集合体Ｈ１Ｎ１およびＨ３Ｎ２ワクチン候補の産生において使用することができる。同様に、他の公知のおよび適切な弱毒化ドナー株は、本発明の複製されたインフルエンザウイルスと再集合させて、哺乳動物のワクチン接種における使用に適した弱毒化ワクチンを得ることができる。（Ｅｗａｍｉら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８７巻：３８０２〜３８０５頁（１９９０年）；Ｍｕｓｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８８巻：５１７７〜５１８１頁（１９９１年）；Ｓｕｂｂａｒａｏら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、６７巻：７２２３〜７２２８頁（１９９３年）；米国特許出願第０８／４７１，１００号、これらの参照文献は参照により全体が組み込まれている）。
【０１６９】
ワクチン製剤
接種または非経口もしくは経口投与に適した本発明のワクチン組成物は、無菌の水溶液または非水性の溶液、懸濁剤、および乳剤を任意選択でさらに含む、弱毒化または不活性化インフルエンザウイルスを含む。組成物は、当技術分野において公知のように、助剤または賦形剤をさらに含むことができる。
【０１７０】
非経口投与のための調製物は、当技術分野において公知の助剤または賦形剤を含有し得る無菌の水溶液または非水性の溶液、懸濁剤、および／または乳剤を含む。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物性油、例えば、オリーブ油、および注射可能な有機エステル、例えば、オレイン酸エチルである。
【０１７１】
担体または閉鎖包帯を使用して、皮膚浸透性を増加させ、抗原吸収を増進させることができる。経口投与のための液体剤形は一般に、液体剤形を含有するリポソーム溶液を含み得る。リポソームを懸濁させるために適切な形態は、当技術分野で一般に使用される不活性な希釈剤、例えば、精製水を含有する乳剤、懸濁剤、溶液剤、シロップ剤、およびエリキシル剤を含む。不活性な希釈剤以外に、このような組成物はまた、アジュバント、湿潤剤、乳化剤および懸濁化剤、または甘味剤、香味剤、または香料を含むことができる。例えば、その中で引用されている全ての参照文献を含めて参照により本明細書中に全体が組み込まれている、下記のＢｅｒｋｏｗ、下記のＧｏｏｄｍａｎ、下記のＡｖｅｒｙ’ｓ、下記のＯｓｏｌおよび下記のＫａｔｚｕｎｇを参照されたい。
【０１７２】
本発明のワクチン組成物が個体への投与のために使用されるとき、これは塩、緩衝液、アジュバント、または他の化合物をさらに含むことができ、これらは組成物の有効性を改善するために望ましい。
【０１７３】
アジュバントは、特異的免疫応答を増大させるのに使用することができる化合物である。通常、アジュバントおよび組成物は、免疫系への提示の前に混合されるか、または別々に提示されるが、免疫化される哺乳動物の同じ部位中に提示される。
【０１７４】
ワクチンにおける不均一性は、少なくとも２つのインフルエンザウイルス株、例えば、２〜５０の株またはその中の任意の範囲もしくは値について複製されたインフルエンザウイルスを混合することによって提供され得る。
【０１７５】
本発明によれば、ワクチンは、当技術分野で公知の技術を使用して、インフルエンザウイルスの単一の株におけるバリエーションのために、またはインフルエンザウイルスの複数種の株のために提供され得る。
【０１７６】
次いで、ワクチン組成物は、調製されると、それを必要とする被験体において投与し得る。典型的には、本発明の弱毒化または不活性化ワクチン組成物は、このように感染の発生の前にか（予測される感染を防止するか、もしくは弱毒化させるため）、または実際の感染の開始の後に提供し得る。例えば、このようなワクチン組成物の投与は、様々な非経口経路、例えば、皮下、静脈内、皮内、筋内、腹腔内、鼻腔内、経口または経皮経路によってでよい。非経口投与は、ボーラス注射または時間をわたっての徐々の灌流によってでよい。本発明のワクチン組成物を使用する好ましいモードは、筋内または皮下適用による。例えば、その中で引用されている全ての参照文献を含めて参照により本明細書中にその全体が組み込まれている、下記のＢｅｒｋｏｗ、下記のＧｏｏｄｍａｎ、下記のＡｖｅｒｙおよび下記のＫａｔｚｕｎｇを参照されたい。
【０１７７】
ワクチン組成物は、被験体に有効量で投与される。ワクチン組成物の有効量は、所望の生物学的効果を達成するのに十分なものである。有効投与量は、レシピエントの年齢、性別、健康、および体重、もしあれば、併用処置の種類、処置の頻度、および所望の効果の性質によって決まることが理解される。下記で提供する有効用量の範囲は本発明を限定することを意図せず、好ましい用量範囲を表す。しかし、最も好ましい投与量は、過度の実験をするまでもなく、当業者が理解および決定できるように、個々の被験体に合わせて作られる。
【０１７８】
本特許は、下記の特定の実施形態を含む。一実施形態では、本発明は、宿主細胞系と、表１から選択される少なくとも１種の化学薬剤とを接触させることを含む、宿主細胞系から治療用、予防用または診断用生体分子を産生する方法に関する。宿主細胞は、細胞培養物または孵化卵でよい。細胞培養物は好ましくは、ＭＤＣＫ、Ｖｅｒｏ、ＢＨＫ、ＰＥＲＣ６またはＣＨＯの群より選択される。好ましい実施形態では、生体分子は、抗体、抗体断片、またはワクチン抗原、特に、ウイルス抗原、特に好ましくは、インフルエンザ抗原である。好ましい実施形態では、シンバスタチン以外のスタチンまたはスタチン類似体が、化学薬剤として使用される。好ましい実施形態では、これらのシンバスタチンではないスタチンの濃度は、０．００１μＭ〜１０μＭの間、特に好ましくは、０．０５μＭと等しいかまたはそれ未満である。好ましい実施形態では、下記の一般式：  
【化３８】
0006741587.tif 000046
の化合物を使用する。
【０１７９】
特に好ましい実施形態では、フルバスタチン、ピタバスタチン、アトルバスタチン、セリバスタチン、ロバスタチン、メバスタチン、プラバスタチンもしくはロスバスタチン、またはこれらの化合物の誘導体、特に、フルバスタチンまたはピタバスタチンまたは誘導体を使用する。
【０１８０】
本発明の別の好ましい実施形態では、産生された生体分子は、例えば、さらなる濃縮、精製、濾過、製剤、無菌化および充填ステップによってさらに加工されて、無菌の最終産物を生じさせる。したがって、一実施形態では、本特許は、宿主細胞と表１に記載した化合物とを接触させることと、生体分子を収集することと、生体分子を最終の治療用、予防用または診断用産物に加工することとを含む、宿主細胞から治療用、予防用または診断用生体分子を産生する方法に関する。好ましくは、産物は、インフルエンザワクチン、特に、インフルエンザＢ型ワクチンである。
【０１８１】
定義
用語「宿主細胞」は、異種核酸、例えば、ベクターを含有し、かつ核酸の複製および／または発現、ならびに任意選択でポリペプチドおよび／またはウイルスを含めた１種もしくは複数のコードされた産物の産生を支持する細胞を意味する。宿主細胞は、原核細胞、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、または真核生物、例えば、酵母、昆虫、両生類、トリまたは哺乳動物細胞（ヒト細胞および孵化卵中の細胞を含む）でよい。宿主細胞という用語は、培養細胞、例えば、異なる細胞型または細胞系統（例えば、ＶｅｒｏおよびＣＥＫ細胞）の混合した培養物を含めた宿主細胞の組み合わせまたは混合物を包含する。
【０１８２】
「生体分子」、「生体産物」は、本明細書において使用する場合、生きている生物から単離した任意の分子、ならびにその誘導体、変異体もしくはバリアントおよび／または生物学的に活性な断片を含む。本発明の状況において、生体分子または生体産物は、バイオ医薬または生物製剤を包含する。例えば、生体産物は、タンパク質、例えば、抗原、酵素（例えば、キナーゼ、プロテアーゼ、ホスファターゼ、トランスフェラーゼ、凝固因子など）、ペプチド、抗体、受容体、融合タンパク質、成長因子、ホルモン、サイトカイン（例えば、ケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、リンフォカイン、腫瘍壊死因子）、神経毒などでよい。生体産物は、例えば、ワクチン、ウイルス粒子において使用するための、核酸、ヌクレオチド、炭水化物、脂質、ウイルスまたは細菌タンパク質でよい。好ましくは、生体分子は、活性成分として、医薬調製物、例えば、ワクチンまたは医薬において使用することができる。本発明の状況において、用語「産物」、「タンパク質」および生体分子は、本明細書において互換的に使用し得る。一部の実施形態では、適切な生体分子は、これらに限定されないが、分泌されたタンパク質、タンパク質の断片（例えば、膜貫通タンパク質の細胞外ドメイン）、キメラタンパク質、および／またはタグをつけたタンパク質を含めた組換えタンパク質である。１つまたは複数のタグは、存在する場合、Ｃ末端、Ｎ末端上にあってもよく、かつ／またはタンパク質内（例えば、２つのモジュールの間）に配置し得る。一部の実施形態では、このような組換えタンパク質は、１つまたは複数のシグナルペプチド部分を含有し得る。一部の実施形態では、このような組換えタンパク質は、その前駆体（例えば、プロホルモン）または代謝物の形態であり得る。
【０１８３】
用語「改善する」、「増加する」または「増進する」は、対応する対照と比較して統計的に有意または生理学的に有意な量を指す。
【０１８４】
用語「候補化合物」または「化学薬剤」は、宿主細胞系、例えば、細胞培養物または卵における生体分子の発現または産生をモジュレートするために使用される任意の化学的実体、医薬品、薬物などを指す。化学薬剤はまた、本明細書において使用する場合、類似体および薬学的に許容される担体、希釈剤およびその製剤を含む。
【０１８５】
本明細書において使用する場合、用語「異性体」は、同じ分子式を有するが、原子の配列および配置において異なる、異なる化合物を指す。また本明細書において使用する場合、用語「光学異性体」または「立体異性体」は、本発明の所与の化合物のために存在し得る様々な立体異性体配置のいずれかを指し、幾何異性体を含む。置換基は、炭素原子のキラル中心において付着し得ることが理解される。したがって、本発明は、化合物のエナンチオマー、ジアステレオマーまたはラセミ化合物を含む。「エナンチオマー」は、互いに重ね合わせることができない鏡像である１対の立体異性体である。１対のエナンチオマーの１：１混合物は、「ラセミ」混合物である。この用語は、適切な場合には、ラセミ混合物を指定するために使用される。「ジアステレオ異性体」は、互いの鏡像でない、少なくとも２個の不斉原子を有する立体異性体である。絶対立体配置は、カーン−インゴルド−プレローグＲ−Ｓ系によって特定される。化合物が純粋なエナンチオマーであるとき、各キラル炭素における立体化学は、ＲまたはＳによって特定し得る。その絶対配置が未知である分解した化合物は、これらがナトリウムＤ線の波長において平面偏光を回転させる方向（右旋性または左旋性）によって（＋）または（−）と指定することができる。特定の本明細書に記載されている化合物は、１つまたは複数の不斉中心または軸を含有し、このように、エナンチオマー、ジアステレオマー、および絶対立体配置に関して、（Ｒ）−または（Ｓ）−と定義し得る他の立体異性体の形態を生じさせ得る。本発明は、ラセミ混合物、光学的に純粋な形態および中間体混合物を含めた全てのこのような可能性のある異性体を含むことを意味する。光学活性な（Ｒ）異性体および（Ｓ）異性体は、キラルシントンもしくはキラル試薬を使用して調製してもよいか、または従来の技術を使用して分解してもよい。化合物が二重結合を含有する場合、置換基は、Ｅ配置またはＺ配置であり得る。化合物が二置換シクロアルキルを含有する場合、シクロアルキル置換基は、ｃｉｓ−またはｔｒａｎｓ−配置を有し得る。全ての互変異性形態をまた含むことを意図する。
【０１８６】
本明細書において使用する場合、「プロドラッグ」は、生理学的条件下でまたは加溶媒分解によって、特定の化合物またはこのような化合物の薬学的に許容される塩に変換し得る化合物である。プロドラッグは、アミノ酸残基、または２個もしくはそれ超のアミノ酸残基のポリペプチド鎖が、アミドまたはエステル結合を介して遊離アミノ、ヒドロキシ、またはカルボン酸基に共有結合的に接合している化合物を含む。企図されるアミノ酸残基には、これらに限定されないが、２０種の天然に存在するアミノ酸が含まれる。他の適切なアミノ酸は、４−ヒドロキシプロリン、ヒドロキシリシン、デモシン（ｄｅｍｏｓｉｎｅ）、イソデモシン（ｉｓｏｄｅｍｏｓｉｎｅ）、３−メチルヒスチジン、ノルバリン、β−アラニン、δ−アミノ酪酸、シトルリン（ｃｉｒｔｕｌｌｉｎｅ）、ホモシステイン、ホモセリン、オルニチンおよびメチオニンスルホンを含む。
【０１８７】
用語「処置する」、「処置」、「接触する」、「の存在下で」は、細胞と薬剤との相互作用を促進する溶液または培地における化学薬剤の添加または混合を指す。用語「処置する」または「処置」は、被験体（例えば、患者）への投与との関連で使用されるとき、被験体において望ましい成果をもたらし、例えば、集団における状態もしくは疾患を軽減するか、治癒するか、発生を遅延するか、重症度を低減するか、発生の可能性を防止または低減する、治療的および／または予防的介入の行為を指す。例えば、本発明は、それを必要とする被験体を処置する方法において使用し得る医薬組成物（治療用および／または予防用）を製造するために行ってもよく、この方法は、被験体に有効量の組成物を投与することを含む。
【０１８８】
本明細書において使用する場合、用語「有効量」および「有効用量」は、その意図する目的（複数可）、すなわち、許容できる利益／リスク比で組織または被験体における所望の生体反応または薬の反応を満たすのに十分な、化合物または組成物の任意の量または用量を指す。関連性のある意図する目的は、客観的（すなわち、いくつかの試験もしくはマーカーによって測定可能である）または主観的（すなわち、被験体が効果の指標を示すか、もしくは効果を感じる）であり得る。一部の実施形態では、有効量は、特定の臨床的判断基準を満たす被験体の集団に投与したとき、集団において統計的に有意な反応が得られる量である。有効量は一般に、複数の単位用量を含み得る投薬レジメンで投与される。任意の特定の医薬品について、有効量（および／または有効な投薬レジメン内の適当な単位用量）は、例えば、投与経路、他の医薬品との組み合わせによって変化し得る。一部の実施形態では、有効量は、標的集団において統計的に有意な十分な（例えば、保護的）免疫応答を引き出す量である。一部の実施形態では、任意の特定の患者についての特定の有効量（および／または単位用量）は、処置される障害および障害の重症度；用いる特定の医薬品の活性；用いる特定の組成物；患者の年齢、体重、身体全体の健康、性別および食事；用いる特定の医薬品の投与の時間、投与経路、および／または排せつもしくは代謝の速度；処置の期間；ならびに医療分野において周知であるような同様の要因を含めた種々の要因によって決まり得る。一部の実施形態では、有効量は、特定のレジメンによって投与されるとき、副作用が存在する場合、患者にとってレジメンを続けるのに十分に容認できるように、合理的に許容できるレベルの有害な副作用を伴うポジティブな成果を生じさせる量である。本発明の一部の実施形態では、単位投与量は、ポジティブな成果と相関する投与量レジメンとの関連で投与に適した量を含有する場合、有効量を含有すると考えてもよいことを当業者は認識する。
【０１８９】
「集団」（「標的集団」におけるような）は、特定の臨床的判断基準を満たす個体（例えば、患者）の群を指し得る。典型的には、統計的に有意な生物学的効果は、少なくとも５０の個体、好ましくは、それ超の集団において観察し得る。集団は、年齢によって定義してもよく、例えば、高齢者（例えば、６５歳またはそれ超）；子供（例えば、新生児、幼児、小児２〜１２歳、３〜６歳、２〜７歳、または６〜１２歳）、青年（例えば、１２〜１６歳、１２〜１８歳、１３〜１９歳または１９〜２１歳）、若年成人（例えば、１７〜２４歳）、成人（例えば、１８〜６４歳）などである。さらにまたは代わりに、集団は、特定の医学的状態（複数可）、例えば、免疫が抑制されたもの、特定の状態の従前の病歴を有するもの、特定の医学的状態を発生するより高い危険性があるもの、特定の遺伝的背景を有するもの、特定の疾患もしくは障害であると診断されたもの、特定の処置治療を受けているか、もしくは受けることが予定されているもの、または任意のこれらの組み合わせによって定義し得る。
【０１９０】
「対照」は、実質的に同一の試験を受けるが、化学薬剤と接触していないか、またはＤＭＳＯで処理されている宿主細胞を含めた、宿主細胞（複数可）または系を指す。代わりに、対照は、他の化合物または系を比較する比較上の薬剤として使用される試験化合物を指す。
【０１９１】
語句「低濃度」の化学薬剤は、本明細書において使用する場合、０．１ｎＭ〜１０μＭでの化合物の存在を指す。低濃度は相対量であり、本明細書において開示されているものを超える濃度を包含することができる。適切には、より低い濃度という用語は、特定の系において対照と比較して、本明細書において所望の結果を適当に生じさせることができる範囲の濃度を指す。
【０１９２】
用語「分解産物」は、本状況において、例えば、光、温度、ｐＨ、水の作用によって、または賦形剤および／もしくは直接容器閉鎖システムとの反応によって、組成物の製造および／または貯蔵の間に引き起こされる組成物における化学変化からもたらされる不純物を意味する。
【実施例】
【０１９３】
科学的アプローチの概略
成長または生体産生系から回収される産物（例えば、ＭＤＣＫ細胞におけるインフルエンザウイルス産生）を増進させるのに適した化合物を同定するために、下記のアプローチを使用した：（１）インフルエンザウイルスのライフサイクルの異なる段階において関連性のある生物学的過程および細胞経路を標的とする先天性免疫抑制因子および低毒性化合物を含む小分子のライブラリーを使用してハイスループットスクリーニングを行った。（２）リード化合物の効果を、複数のインフルエンザ株および亜型を使用して調査スケールのＭＤＣＫ懸濁細胞培養物において確認した。（３）リード化合物のＳＡＲ分析を行い、さらなる構造的に関連する類似体をスクリーニングした。（４）リード化合物の作用機序（ＭＯＡ）を分析した。（５）概念実証研究を、バイオリアクターシステムにおいて行う。低濃度においてでさえ、インフルエンザＢ型株を含めた様々なインフルエンザ株および亜型にわたり収量の実質的な増加を生じさせるいくつかの化合物が同定される。
【０１９４】
（実施例１  ハイスループットスクリーニング）
アッセイ手順（ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ））において、化合物を、Ａ／再集合体／ＮＹＭＣ  Ｘ−１８３Ｈ３Ｎ２インフルエンザに感染しているＭＤＣＫ３３０１６ＰＦ細胞（細胞はＵＳ６４５５２９８に記載されている）を含有する３８４ウェルフォーマットで試験した。１４，３９８種の化学薬剤のライブラリーを、１μＭの化合物濃度で核タンパク質（ＮＰ）−ＥＬＩＳＡを使用して一次スクリーニングに供した。一次スクリーニングからの１５４７のヒットを、０．００１μＭ〜１０μＭの化合物濃度範囲を使用して、用量反応アッセイにおいてＮＰ−ＥＬＩＳＡに供した。次いで、二次スクリーニングを、用量反応アッセイにおいてＨＡ−ＥＬＩＳＡによって一次スクリーニングからの２６８のヒット上で行った。二次スクリーニングは８８のヒットを生じ、これらのヒットのうち８０は、１０μＭ未満の化合物濃度でＮＰおよび／またはＨＡにおいて少なくとも５０％の増加を示した。
【０１９５】
ある場合においては、試験した最も高い濃度について、ＨＡもＮＰシグナルも、測定可能でなかった。例えば、１０．０μＭのスタチン薬物濃度は、ＨＡの−１２．３４％の増加および−１１．４４％のＮＰシグナルを生じさせた。この高用量で、例えば、宿主細胞膜またはウイルス膜からのコレステロール枯渇は、スタチン機能の結果であったが、それによって細胞およびウイルス膜の完全性を損なうことがあり得る。試験のために選択した上位１０の化合物を、表２に含める。
【０１９６】
さらなる試験のために選択した２種の最も有効な化合物は、スルホンアミド（式３の類似体）
【化３９】
0006741587.tif 000047
およびピタバスタチン（式２の類似体）
【化４０】
0006741587.tif 000048
である。
【表２−１】
0006741587.tif 000049
【表２−２】
0006741587.tif 000050
【０１９７】
（実施例２  リード化合物についての確認研究）
選択した２種の最良の化合物を、複数のインフルエンザ株および亜型を使用して、１０ｍｌの懸濁培養物中で行った確認試験に供した。ウイルスのインキュベーションの後、上清を収集し、ウイルス／ＨＡ収量を定量化した。ＨＡ収量を、ＥＬＩＳＡによって測定した。感染性粒子を、ＮＰをベースとするフォーカス形成アッセイ（ＦＦＡ）によって測定した。ウイルス粒子を、核酸配列のｑＰＣＲ定量化によって測定した。培養上清中で測定した総ウイルス粒子、感染性粒子およびＨＡの収量は、対照と比較して、スルホンアミド類似体（以下、「スルホンアミド類似体」）またはピタバスタチンを使用して同様の増加を示した。しかし、ピタバスタチンは、スルホンアミド類似体より実質的に低い濃度で収量を増加させた。Ｈ３Ｎ２株ＩＶＲ−１６５についての用量反応増進研究の結果を、図２に示す。ピタバスタチンは、０．０５μＭまたは０．０１μＭもの低い濃度においてでさえＨＡ収量において３倍の増加をもたらした。
【０１９８】
（実施例３  様々なインフルエンザウイルス株での試験リード化合物）
本明細書における化合物による処理によって影響を受け得るインフルエンザ株の範囲を研究するために、１μＭのスルホンアミドまたは０．０５μＭのピタバスタチンを使用して、ＭＤＣＫ細胞を異なるインフルエンザウイルス株および亜型に感染させた。３４℃にて概ね６０時間、ウイルス感染を１０−３または１０−４のＭＯＩで行った。
【０１９９】
Ｉ．インフルエンザＡ型
試料は、遺伝子発現またはタンパク質発現を同定する作用機序研究のためにウイルス接種の６０時間後において上清から得た。図３に示すように、有意なＨＡ収量増進が、複数のインフルエンザ株、例えば、インフルエンザＡ亜型Ｈ１Ｎ１（株Ａ／ブリズベン／１０／１０およびＡ／ソロモンｘ１４５）、インフルエンザＡ亜型Ｈ３Ｎ２（株Ａ／ビクトリア／３６１／１１、Ａ／ブリズベン／１０／０７、Ａ／ウルグアイ／７１６／０７およびＡ／テキサス／５０／１２）について観察された。
【０２００】
ＩＩ．インフルエンザＢ亜型
本発明において使用される化学薬剤は、インフルエンザＢ亜型ウイルス／タンパク質の産生に対して有意な効果を示す。図４に示すように、スルホンアミドおよびピタバスタチンは、インフルエンザＢ亜型の複数の株（株Ｂ／パナマ／４５／９０、Ｂ／フロリダ／４／０６、Ｂ／ウィスコンシン／１／１０、Ｂ／ブリズベン／６０／０８およびＢ／Ｍａｓｓ／２／１２）において、対照に対してＨＡにおいて少なくとも２倍の増加を生じさせた。
【０２０１】
このデータは、化合物の効果が特定のウイルス株に制限されないことを示す。
【０２０２】
（実施例４  作用機序および細胞生存率研究）
作用機序研究を行って、ウイルスのライフサイクルの異なる段階に対する化学薬剤の効果を決定した。添加の時点を、細胞の感染から−３２時間、−２４時間、−８時間、−１時間、＋２時間、＋４時間、＋６時間で研究した。単一サイクルウイルス感染研究において、細胞を５のＭＯＩでウイルスと共に氷上で１時間インキュベートし、ウイルス付着を可能とした。１時間後、付着していないウイルスを洗い流し、細胞を３４℃にして、ウイルスが融合し、細胞に入ることを可能とした。１．０ｕＭのスルホンアミドまたは０．０５ｕＭのピタバスタチンを、洗浄ステップの後の異なる時点（Ｔ＝０、２、４、６時間）において添加した。スルホンアミド類似体およびピタバスタチンは、インフルエンザＨ３Ｎ２株ＩＶＲ−１６５（Ａ／ビクトリア／３６１／２０１１）による感染の前に培養物中で３２時間まで安定的であるように見えた。ＨＡ収量は、スルホンアミド類似体について感染６時間後に約２０μｇ／ｍｌから約５μｇ／ｍｌに減少し、ピタバスタチンについて感染２時間後に約２０μｇ／ｍｌから約５μｇ／ｍｌに減少することが起こった。ＨＡ収量がウイルス感染後の添加の時間によって決まり、これは特定の薬剤およびウイルスのライフサイクルの特定の段階の効果の結果であり得ることを結果は示唆する。
【０２０３】
１ｕＭのスルホンアミドまたはＤＭＳＯ対照で処理したＭＤＣＫ細胞を使用して細胞生存率アッセイを行った。ＶＩ−ＣＥＬＬ機器（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して６０時間まで時間をわたり細胞生存率をモニターした（トリパンブルー色素排除に基づいて測定した細胞生存率）。本明細書において使用されるスルホンアミド類似体は販売されている薬物ではなく、したがって、毒性を行って、インキュベーションの過程に亘って１０μＭの最も高い試験した濃度および６０時間の接触での細胞生存率を同定した。スルホンアミドもピタバスタチンも、細胞生存率に対してマイナスの影響を有さなかった。少なくとも９１％の生存率が、スルホンアミドで処理された細胞において検出される。
【０２０４】
（実施例５  質量分析）
多重反応モニタリング（ＭＲＭ）モードで作動するトリプル四重極型質量分析計を使用した液体クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣ−ＭＳ）アッセイを開発し、細胞培養上清中、およびスクロース−密度勾配によるウイルス精製プロセス後の化合物の存在／クリアランスをモニターした。検出限界（ＬＯＤ）についての推定値は、ワクチンモノバルク流体中の化合物の段階希釈、次いで、１ｎｇ／ｍｌまでの濃度のモノバルクを使用した化合物の段階希釈を行うことによって決定した。分析の前に、アセトニトリルを全ての試料に添加し（５０％ｖ／ｖ）、試料を５分間ベンチトップ遠心分離機上で遠心分離し、タンパク質沈殿物を除去した。スルホンアミドおよびピタバスタチンの１ｎｇ／ｍｌの試料の両方について、シグナル対ノイズは、１００超（スルホンアミドの場合、４００超）であると推定された。１ｎｇ／ｍｌの濃度での観察されたシグナル対ノイズレベルから、検出限界は控えめに０．５ｎｇ／ｍｌ未満であると推定され、定量化の限界は約５ｎｇ／ｍｌであると推定される（図６Ａ）。各化合物についての較正曲線は一貫して、０．９５超のＲ２値を伴って１ｎｇ／ｍｌから５０ｎｇ／ｍｌ超まで直線状であることを観察した（図６Ａ、６Ｂ）。化合物が細胞培養物において代謝または分解されるかを決定するために、化合物を培地のみの中にまたは培地＋ＭＤＣＫ細胞中にスパイクした。これらのスパイクした試料からの上清を、質量分析のために０時間および６０時間において採取した。６０時間後に化合物の喪失は観察されなかった（図６Ｂ）。化合物がウイルス精製プロセスの後に細胞培養上清から排除することができたかどうかを決定するために、ＭＤＣＫ細胞を、化合物の存在下でインフルエンザＡ型またはＢ型ウイルスに感染させた。６０時間後、清澄化した細胞培養上清は、（１）−８０℃にてそれに続くＬＣ−ＭＳ分析のために冷凍するか、または（２）スクロース−密度勾配遠心分離およびウイルス粒子のペレット化を伴うウイルス精製プロセスに供した。これらの「精製された」試料をまたＬＣ−ＭＳによって試験し、精製プロセスの間に化合物が排除されたかどうかを決定した。微量のみ（ＬＯＱ未満、およびＬＯＤに近い）が、これらの精製された試料において検出された。ウイルス精製の後に残った化合物の総量（ｎｇでの）は、細胞培養物への当初の投入量の０．２５％未満である（図６Ｃ）。
【０２０５】
（実施例６  スケールアップされた容量での研究）
ＨＡ収量がより大きな試験容量で再現性があるかどうかを同定するために、２種のリード化合物をＤＭＳＯに希釈し、０．２μＭおよび５μＭの濃度で、ＭＯＩ＝１０−４でＨ３Ｎ２株（ＩＶＲ１６５）に感染したＭＤＣＫ細胞培養物を含む１０ｍｌまたは６０ｍｌのいずれかの試料容量に６０時間にわたり適用した。ウイルス粒子を、ＲＮＡｓｅ耐性ＲＮＡ転写物、例えば、インフルエンザＭ遺伝子のｑＰＣＲによって測定した（Ｎｇａｏｓｕｗａｎｋｕｌら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  Ｊｏｕｒｎａｌ、７巻：７５頁（２０１０年）ｄｏｉ：１０．１１８６／１７４３−４２２Ｘ−７−７５を参照されたい）。ＨＡ収量を、対照に対して正規化した。１０ｍｌおよび６０ｍｌの培養物の両方においてＨＡ収量における対応する増加が観察されたことを研究は示した。
【０２０６】
図５に示すように、ＨＡ収量または粒子の増加は、ＥＬＩＳＡおよびｑＰＣＲの両方によって確認すると、比例的に相関したことを結果は示した。
【０２０７】
リード化合物の複数の類似体を、互いに対する比較のために試験した。類似体の大部分は試験した濃度においてインフルエンザの収量を増加させた。しかし、特定の類似体について、試験した濃度は最適でなかった。図８に示すように、スタチン類似体を０．０５μＭでの活性の比較のために試験した。ロスバスタチンを、０．０５μＭにて比較上のスタチンの収量能力を生じなかった類似体として同定した。しかし、効果を試験した化学薬剤、例えば、ロスバスタチンに合わせるよう、代替の濃度および実験条件を最適化すべきである。
【０２０８】
（実施例７  ＳＡＲ研究）
構造活性相関（ＳＡＲ）研究を行い、リード化合物の類似体を同定した。８８種のスルホンアミド類似体が同定されたが、これらの内、３種の化合物を試験した。１種の類似体は、リード化合物のような同様の収量の増加をもたらした。１５５種のピタバスタチン類似体が同定されたが、このうち１４８種超を試験した。さらに、いくつかの他の市販のスタチンを試験した（図８）。試験した類似体の大部分は、ウイルス粒子の収量において少なくとも２倍の増加を示した。特に、（ｉ）リード化合物であるピタバスタチンは、シンバスタチンを含めたいくつかの他の市販のスタチンよりも優れており（図８）、（ｉｉ）フルバスタチン、およびフルバスタチンメチルエステルまたはフルバスタチンエチルエステルなどのいくつかのフルバスタチン誘導体はピタバスタチンよりさらに良好に機能した（図７）ことが示された。本発明のスタチン類似体の特に好ましい実施形態は、表３において列挙した薬剤を含み、これらはＥＬＩＳＡによって測定して、上記の条件下でのＤＭＳＯ処理を使用した対照と比較して、ＨＡ収量の少なくとも２倍の増加を提示する。
【表３】
0006741587.tif 000051
【０２０９】
（実施例８  シグナル伝達経路の解明）
細胞培養物における生物学的産生を増進する本発明者らの化学添加物アプローチにおいて、観察された増進効果を明確に示す作用機序を評価した。適用のための化学添加物を同定および特徴付けするために、本発明者らのＭＤＣＫ３３０１６ＰＦ細胞におけるインフルエンザワクチン産生をワーキングモデルとして使用し、このような産物の製造におけるこのアプローチの実現可能性を決定するために使用した。このために、インフルエンザの複数の株および亜型においてＨＡ収量を少なくとも２倍増進させる上位の化合物であるＢＹＦ５８９（表４における化合物Ｇ）を、詳細な評価のために選択した。ＢＹＦ５８９によるＨＡ収量増進がＨＭＧＣＲ阻害の結果であるかどうかを決定するために、研究を行って、系におけるその作用モードをより良好に理解した。メバロン酸（ＭＥＶ）経路を調査するために、特異的な酵素阻害剤を利用した（図９Ａにおいて例示）。これらの酵素阻害剤はＭＥＶ経路の特異的な枝を選択的に標的とし、ＢＹＦ作用機序（「ＭＯＡ」）の決定に向かうより良い道筋を提供する。
【０２１０】
細胞生存率および総細胞コレステロールレベルに対する、ＢＹＦ５８９ならびに経路の様々な酵素阻害剤の可能性のある効果を調査した。試験した試料は、ＤＭＳＯ、ＢＹＦ５８９（１μＭ）、ＭＥＶ（１００μＭ）、ＦＴＩ（０．５μＭ）、ＺＡ（１μＭ）およびＧＴＩ（０．５μＭ）を含んだ。２４時間の処理の後、ｃｅｌｌ  ｔｉｔｅｒ  ｇｌｏｗによって測定して、細胞生存率に対するマイナスの効果は検出されなかった。
【０２１１】
遊離コレステロールをコレステロールオキシダーゼによって酸化させて、コレステロールケトンおよびＨ２Ｏ２を形成させ、これを次いでＡｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄ＋ＨＲＰと反応させて、蛍光産物であるレゾルフィンを産生する。実験のこの部分について、両方ともＤＭＳＯに正規化したＨＡ収量および細胞コレステロールを測定し、ＨＡ増進はＢＹＦで処理した細胞におけるより低いコレステロールと相関し、これは用量依存的であったが、これはコレステロール含量が増進に関与し得ることを示唆する。ＭＥＶは単独で、細胞コレステロールレベルに対して効果は有さなかった。ＢＹＦと組み合わせて使用したとき、ＭＥＶはＨＡ収量の増進を低減させるが、細胞コレステロールレベルを補充せず、これはコレステロールの低減のみでは、ＨＡ増進を付与するのに十分ではないことを示唆する。
【０２１２】
ＭＥＶ経路の対応するアームの３種の阻害剤を様々な組み合わせ中で使用したとき、相加効果が観察されたが、これは経路の複数の枝が実際増進効果を与えることにおいて関与していることを示唆する。結果を図９Ｂにおいて要約する。これらの結果は、この経路の３つのアーム全てを特異的な酵素阻害剤の組み合わせで遮断することによって、化合物のＨＡ増進効果を模倣することができることを示す。ＢＹＦ５８９作用の下流であるが、シグナル伝達分枝点の上流である阻害剤のビスホスホネート（Ｂｉｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ）は、たとえＢＹＦ５８９よりロバストでないにも関わらず、ＨＡ効果の同様の用量依存的な増進を引き出すことができることがさらに確認された。
【０２１３】
（実施例９  遺伝子発現研究）
文献における証拠は、スタチンが、ＩＦＮおよびＩＦＮが媒介する遺伝子、例えば、ＩＰ１０（ＣｘＣＬ１０）を抑制できることを示唆する。したがって、インフルエンザＨＡの増進が、スタチンによるインターフェロン（ＩＦＮ）反応の抑制と関連し得るかどうかを調査した。ＢＹＦ５８９化合物の存在下または非存在下での感染に続いて、ＩＰ１０およびＩＦＮＢ１の遺伝子発現を測定した。予備的なｑＲＴ−ＰＣＲデータは、ＢＹＦ５８９の存在下でのウイルス感染したＭＤＣＫ細胞におけるＩＦＮｂおよびＩＰ１０の遅延され／抑制された誘発を示唆する。ＢＹＦ５８９化合物の存在下で試験した遺伝子の両方における観察された遅延時間は、ＢＹＦ５８９化合物の非存在下での遺伝子誘発のタイミング（ピークにおいて測定）と比較して少なくとも２時間であった。
【０２１４】
（実施例１０  増進剤による宿主細胞処理のタイミング）
２種のリード化合物（ＢＹＦ５８９およびＡＦＺ０７７）が共通の経路を介して作用し得るかどうかを評価するために、各化合物を感染後の様々な時点において宿主細胞培養物に添加し、ＨＡ収量に対する効果を感染２４時間後に測定した。ＢＹＦ５８９をウイルス感染の時点（Ｔ＝０）において添加したとき、化合物を伴わずに成長させた対照と比較して、２４時間におけるＨＡ収量における概ね４倍の増加が達成されたことを結果は示した。しかし、ＢＹＦ５８９化合物をより遅い時点（Ｔ＝２、４または６）に添加したとき、ＨＡ収量における有意な増進は２４時間において観察されなかった。対照的に、感染の時（Ｔ＝０）、ならびにより遅い時点（Ｔ＝２および４）におけるＡＦＺ０７７の添加、ＨＡ収量の概ね４倍の増加が、感染の２４時間後において達成された。しかし、ＡＦＺ０７７が感染６時間後（Ｔ＝６）において添加したとき、有意な増加は見られなかった。これらの結果は、２種の化合物によるＨＡ増進が、感染した宿主細胞培養物への添加の時点によって決まることを示す。さらに、各化合物の効果における時間的な差異に基づいて、２種の化合物がウイルスのライフサイクルの異なる段階を標的にする可能性がある。さらにまたは代わりに、２種の化合物は、宿主細胞の異なる経路をレギュレートし得る。
【０２１５】
（実施例１１  ミニバイオリアクターの並列比較）
２種のリード化合物を、市販の小さなスケールのバイオリアクターシステムであるａｍｂｒ１５（商標）（ＴＡＰ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）においてさらに試験した。ａｍｂｒ１５システムは、マイクロスケールでの複数のバイオリアクター培養物の迅速な評価を可能とする自動化したワークステーションによって制御された古典的なバイオリアクターの特徴をマイクロスケール（１０〜１５ｍｌ）にて模倣する。
【０２１６】
両方のリード化合物を、２種の感染培地配合物（ＤＭ１３４およびＣＤＭ）ならびに２種のインフルエンザ株であるＡ／ビクトリア／３６１／２０１１（ＩＶＲ−１６５）（高発現）およびＢ／マサチューセッツ／２／２０１２（低発現）と共に制御条件下にて並列で試験した。実験において使用した感染パラメーターは下記の通りであった：播種密度は、１．０×１０６個の細胞／ｍｌまたは２．５×１０６個の細胞／ｍＬであった；ｐＨは、７．１＋／−０．０２であった（０．０５ＮのＮａＯＨおよびＣＯ２ガスによる二重制御によるｐＨ制御）；ＤＯは、Ｏ２ガスによって制御されて５０％（５０〜８０％の範囲）であった；撹拌は、１０００ｒｐｍであった（局所制御）；温度は、バイオリアクターコントローラープローブによって局所的にモニターされて３４．０℃であった；容器タイプは、Ｓｐａｒｇｅｌｅｓｓ、拡張温度容器であった；操作の間の通気速度は、１ｍＬ／分であった。
【０２１７】
ａｍｂｒ１５実験からの結果を図１０および１１において要約する。両方のリード化合物は、両方の培地において低発現Ｂ型株についてＨＡ収量を増進した。しかし、試験した高発現Ａ型株について、ＡＦＺ０７７は、試験した両方の培地においてＨＡ収量において非常により大きな増進を達成した。ＨＡの定量化をＥＬＩＳＡによって行い、次いで、それに続いてＨＰＬＣによって確認した。ＡＦＺ０７７は、このシステムにおいて低（１ｍＬ毎に１×１０６個）および高（１ｍＬ毎に２．５×１０６個）感染細胞密度の両方について、ＤＭ１３４培地においてＨＡ収量を強化できたことがまた示された。後者について、高ＩＣＤフォーマットとＡＦＺ処理とを合わせることによって、ＡＦＺ０７７による増進は、当初の２倍の標的を凌ぐ、当初の収量に対して約４倍高い収量をもたらした（図１２）。要約すれば、ａｍｂｒ１５システムでは、ＡＦＺ０７７は、試験した全ての株についてこれまで、振とうフラスコおよび１５ｍｌのバイオリアクター中でＤＭ１３４培地においてＨＡ収量を強化する。ＢＹＦ５８９は、振とうフラスコおよび１５ｍｌのバイオリアクター中でＤＭ１３４培地において発現が乏しいインフルエンザＢ型株についてのＨＡ収量を強化する。全体的に、より大きな増進効果が低発現株について見られる。さらに、相加効果がＡＦＺ０７７およびより高い感染細胞密度を使用して観察される。
【０２１８】
（実施例１２  大きなスケールのバイオリアクター）
従前の研究において、ＡＦＺ０７７化合物は、Ｒｅｓｅａｒｃｈ振とうフラスコおよび１５ｍＬのバイオリアクターの両方中でＤＭ１３４培地においてＨＡ収量を強化することが示された。結果を、３種の異なるウイルス（高発現株、中間の発現株、および発現が乏しい株）を使用して確認した。ＢＹＦ５８９は、発現が乏しいインフルエンザＢ型株についてＲｅｓｅａｒｃｈ振とうフラスコおよび１５ｍＬのバイオリアクター中でＤＭ１３４培地においてＨＡ収量を強化することが示されたが、高発現Ｈ３Ｎ２株についてはそうでなかった。より大きなスケールのシステムにおいてこれらの知見を確認するために、ＴＤ  ａｍｂｒ（商標）２５０ｍＬバイオリアクターを用いた。リード化合物の両方（ならびに陰性対照としてＤＭＳＯ単独、および、二重陰性対照として化合物なし／ＤＭＳＯなし）を、高発現および低発現株で試験して、小さなスケールの培養物における観察される増進が、大きなスケールのシステムにおいて再現することができるかどうかを決定した。下記のパラメーターを使用した：使用済みＤＭ１３４：新鮮なＰＦＭ（１：３）；ウイルス株は、Ａ／ビクトリア／３６１／２０１１（ＩＶＲ−１６５）およびＢ／マサチューセッツ／０２／２０１２であった。ＭＯＩは、Ａ／ビクトリアＩＶＲ−１６５について１０−５であり、Ｂ／マサチューセッツについて１０−４であった。ＩＣＤ：２．０ｅ６〜３．０ｅ６細胞／ｍＬ；Ｎ−１プロセス：１Ｂ（培地の交換なし）。収集時間は、感染６５〜７２時間後であった。ＨＡ収量を、２つの方法：ＲＰ−ＨＰＬＣおよびＨＡ−ＥＬＩＳＡによって測定した。データを図１３および１４において提供する。０．００５μＭの用量でのＢＹＦ５８９が、ＨＡ−ＨＰＬＣによって決定して収量においてＤＭＳＯなしの対照を超えた約３７％の増加を示したことを図１３は示す。試験した特定の条件下で、ＡＦＺ０７７は、ａｍｂｒ２５０システムにおいてＢ／マサチューセッツ株について試験した用量のいずれかで、ＨＡ収量において対照を超えた有意な増加を生じさせないようであったことを図１４は示す。エラーバーは、アッセイの繰返しの間のＨＡ−ＥＬＩＳＡアッセイの可変性を例示する、平均からの１標準偏差を表すことに留意されたい。
【０２１９】
（実施例１３  機構的に関連した化合物（機能的等価物））
ＡＦＺ０７７によるインフルエンザＨＡに対する増進効果は、５ＨＴ７受容体の活性の減少によって決まることが見出された。なぜなら、リガンドとしてセロトニン（５ＨＴ）を添加することによってＡＦＺ効果を抑止することができるためである（図１５を参照されたい）。これは、このような効果が受容体活性によって媒介されることを示唆し、同じまたは同様の細胞の効果を媒介することができる他の薬剤がまた、リード化合物が行うことができる方法で、タンパク質収量を増進し得ることを示す。式８（例えば、化合物Ｅ）をベースとする研究を、下記の表５において要約するように特定の作用機序を共有し得る潜在的な化合物を同定することに拡大した。
【表５−１】
0006741587.tif 000052
【表５−２】
0006741587.tif 000053
【０２２０】
相対的ＨＡ収量を評価する比較研究からの結果を、図１６において提供する。これらの候補のいくつかを、ＡＦＺ０７７に対して、ＨＡ収量を増進させるこれらの能力についてさらに試験した（図１７）。
【０２２１】
さらなるＳＡＲ研究を行って、収量を増加させる候補化合物をさらに同定した。１６５種の類似体を、０．０５ｕＭにてＨ３Ｎ２株を有する１０ｍｌのウイルス培養物中で試験した。ＢＹＦ５８９は、化合物なしの（ＤＭＳＯ）対照よりも約２倍収量を増進させた。スクリーニングされた１６５種のうち１４種は、試験した濃度でＢＹＦ５８９よりＨＡ収量を増進させることにおいて同様に良好またはより優れていた。最良の類似体は、ＢＹＦ５８９より約２倍優れていることが見出された。
【０２２２】
（実施例１４  組換えタンパク質発現の増進）
ＨＡ収量研究において同定された化合物の一般的な利用をさらに評価するために、リード化合物の１つであるＢＹＦ５８９を、異種細胞を使用して組換えタンパク質発現に対して試験した。特に、「低収量体」と称される、ＨＥＫ２９３細胞において発現することが困難であることが従前見出されてきたタンパク質が含まれた。典型的な最適化した系において、低収量体は、５ｍｇ／Ｌまたはそれ未満の収量を有すると定義される。２〜１０ｍｇ／Ｌの間の典型的な収量を伴う標的タンパク質の約２０種のコンストラクトを実験のために選択した。これらは分泌された哺乳動物のタンパク質であり、完全長の対応物の切断バージョンである。（ｐＲＳ５ａベクターのバリアントにおいて）各コンストラクトは、少なくとも１つのタグ（例えば、少なくともＣ末端ＦｌａｇＨｉｓタグ−さらに、多くはマウスＩｇＧ１  ＦｃにＮ末端またはＣ末端で縮合している）を含有した。概ね等しい数の各タグタイプを選択して、偏りを低減させた。
【０２２３】
＜１ｍｇ／Ｌまたは＞１０ｍｇ／Ｌの収量を有する全ての標的を除去した。次に、標的をタグタイプによって分別した。最終的に、特定の分子量範囲が重度に表れているように見える場合、少数の「複製物」を選別した。次いで、試料を選択するために、各タグタイプからの最初の６〜７つを、さらなる選択の判断基準なしに含めた。結果として得られた標的リストを、下記に再現する。
【０２２４】
ＢＹＦ５８９化合物をＤＭＳＯに溶解し、７０μＭの作業用ストック（１０００×）を最終的に提供した。
【０２２５】
使用した細胞は、産物の受領まで直接追跡可能な低継代マスター細胞バンクからのＨＥＫ２９３Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ細胞（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）であった。細胞を、２．５ＬのＴｈｏｍｓｏｎ  ＵｌｔｒａＹｉｅｌｄフラスコにおいてＨＥＫ２９３Ｆ培地において成長させ、２０万個の細胞／ｍｌに分割し、１５０万個の細胞／ｍｌの標的密度まで３日間倍加させた。次いで、細胞を、トランスフェクション前に３００ｍｌの充填容量で１Ｌの標準的なＣｏｒｎｉｎｇスクリューキャップフラスコ中に分注した。各標的について、１つのフラスコは、３００ｕｌのＢＹＦ５８９を添加し、他方は添加しなかった。次いで、細胞に下記のように調製したＰＥＩプラスミド複合体をトランスフェクトした：Ｍａｘｉｐｒｅｐプラスミドを解凍し、混合し、次いで、示した容量を２９３Ｆ培地に添加した。直線状２５，０００ＭＷのＰＥＩ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ＃２３９６６−２）の２ｍｇ／ｍｌのストックを、２９３Ｆ培地で１ｍｇ／ｍｌに希釈し、次いで、示した容量をプラスミドＤＮＡに添加し、反転させることによって混合し、次いで、２〜１０分静置した。次いで、等しい容量のＰＥＩ／ＤＮＡミックスを、２個のフラスコ（１個は化合物を有し、他方は有さない）のそれぞれに添加し、次いでこれを激しく回転させ、次いで、振とう器に戻し、３７Ｃ、１２０ｒｐｍの振とうおよび８％ＣＯ２（上記の成長のためと同じ条件）でインキュベートした。使用した量は、本発明者らの従前に最適化した条件を反映し、これは（１リットル当たり）１．６ｍｌの培地中の４００ｕｇのプラスミド、および３．２ｍｌの１ｍｇ／ｍｌのＰＥＩである。
【０２２６】
培地上清の小試料を集め（Ｆｉｌｉｐｐ  Ｇｏｒｔａｌｕｍ）、Ｏｃｔｅｔによってアッセイした。処理されていない最初の収量、および処理された細胞からの収量と処理されていない細胞からの収量の比の間の相関関係。
【０２２７】
標準的プロトコールによって、細胞懸濁物をＮｉ−ＮＴＡ樹脂カラムに添加した。当技術分野で周知であるイミダゾールをベースとする精製方法を使用した。タンパク質収量の予備的分析は、ＢＣＡアッセイによって行ったが、次いでそれに続いて確認のためのＬＣ９０電気泳動図を行った。
【０２２８】
実験の結果を図１８において要約する。左側のグラフ（図１８Ａ）は、ＢＹＦ５８９化合物（７０ｎＭで）の存在下および非存在下でのタンパク質収量の間の関係を示す。グラフにおける各データポイントは、試験した２０の標的を表す。グラフは、化合物が、たとえ変化する程度であってもタンパク質収量を増加させることができるという傾向を示す。右側のグラフ（図１８Ｂ）は、最初の収量（化合物で処理されていないとき）の関数としてタンパク質収量の倍数増加をプロットする。高収量を既に有する傾向があるタンパク質（「高収量体」）は、化合物の存在によってさらに増進されず、一方、低収量体の発現は、化合物によって増進される可能性が高いという一般的な傾向をこれは示す。２０種の試験したタンパク質のうち、約≦４ｍｇ／Ｌの収量を有するものは全て、試験した条件下で、ＢＹＦ５８９化合物で処理したとき、収量において少なくとも１．５倍の増加を示す。一緒に、これらの知見は、試験した化合物が、多種多様のタンパク質についてのタンパク質収量に対する一般的増進効果を示すことを示唆する。
【表６】
0006741587.tif 000054
本発明の実施形態
１．宿主細胞系と表１〜５から選択される少なくとも１種の化学薬剤とを接触させることを含む、宿主細胞系から治療用、予防用または診断用生体分子を産生するための方法。
２．宿主細胞系が、細胞培養物または孵化卵である、実施形態１に記載の方法。
３．細胞培養物が、ＭＤＣＫ、Ｖｅｒｏ、ＢＨＫ、ＥＢ６６またはＣＨＯ細胞からなる群より選択される、前記実施形態のいずれかに記載の方法。
４．化学薬剤が、０．０００１μＭ〜１０μＭの最終濃度を有するスタチンもしくはその類似体、またはセロトニン受容体リガンドである、実施形態１に記載の方法。
５．化学薬剤が、０．０５μＭまたはそれ未満の濃度、および下記のような構造：
【化４１】
0006741587.tif 000055
を含む、前記実施形態のいずれかに記載の方法。
６．宿主細胞系が、ウイルスに感染している、前記実施形態のいずれかに記載の方法。
７．化学薬剤が、宿主細胞のウイルス接種と同時的に添加される、実施形態６に記載の方法。
８．ウイルスが、インフルエンザである、実施形態７に記載の方法。
９．宿主細胞系によって産生された生体分子が、インフルエンザウイルス粒子、スプリットインフルエンザビリオンまたはインフルエンザウイルス糖タンパク質から選択される、実施形態８に記載の方法。
１０．インフルエンザウイルス糖タンパク質が、ヘマグルチニンである、実施形態９に記載の方法。
１１．産生される生体分子の収量が、ＥＬＩＳＡによって測定すると、対照と比較して少なくとも２倍増加する、前記実施形態のいずれかに記載の方法。
１２．類似体が、フルバスタチン、ピタバスタチン、アトルバスタチン、セリバスタチン、ロバスタチン、メバスタチン、プラバスタチンまたはこれらの異性体からなる群より選択される、前記実施形態のいずれかに記載の方法。
１３．化学薬剤が、フルバスタチンもしくはピタバスタチンまたはこれらの異性体である、前記実施形態のいずれかに記載の方法。
１４．細胞培養物と０．０５μＭまたはそれ未満の濃度の少なくとも１種のスタチン化合物またはその類似体とを接触させることを含む、細胞培養物において治療用、予防用または診断用インフルエンザタンパク質を産生するための方法。
１５．細胞培養物において治療用、予防用または診断用タンパク質を産生するための方法であって、産生が、シンバスタチン以外の少なくとも１種のスタチンまたはその誘導体の存在下で行われ、タンパク質が、ＥＬＩＳＡによって測定すると、対照と比較して少なくとも１．５倍増加して産生されることを特徴とする、方法。
１６．スタチンが、
【化４２】
0006741587.tif 000056
およびその類似体である、実施形態１４または１５に記載の方法。
１７．スタチン類似体が、フルバスタチン、ピタバスタチン、アトルバスタチン、セリバスタチン、ロバスタチン、メバスタチン、プラバスタチンまたはこれらの異性体からなる群より選択される、実施形態１６に記載の方法。
１８．スタチン剤が、フルバスタチンまたはピタバスタチンまたはこれらの異性体である、実施形態１７に記載の方法。
１９．宿主細胞と、ＥＬＩＳＡによって測定すると０．０５μＭまたはそれ未満の濃度で収量を少なくとも１．５倍増加させる化学薬剤とを接触させることを含む、宿主細胞においてインフルエンザＢ型株を産生するための方法。
２０．化学薬剤が、
【化４３】
0006741587.tif 000057
およびその類似体である、実施形態１９に記載の方法。
２１．インフルエンザＢ型株ウイルス粒子、スプリットインフルエンザＢ型ビリオンまたはインフルエンザＢ型ウイルス糖タンパク質が産生される、実施形態１９または２０に記載の方法。
２２．インフルエンザＢ型ウイルス糖タンパク質が、ヘマグルチニンである、実施形態２１に記載の方法。
２３．以下：
（ａ）前記実施形態のいずれかにおいて実施された方法、
（ｂ）産生された分子を最終的な治療用、予防用または診断用産物に加工すること
を含む、宿主細胞から治療用、予防用または診断用生体分子を産生するための方法。
２４．下記のステップ：
ａ．細胞培養物および表１から選択される少なくとも１種の化学薬剤を含む培地中でウイルスを成長させるステップ、
ｂ．ウイルスを加工して、無菌のワクチンを産生させるステップ
を行う、インフルエンザワクチンを産生するための方法。
２５．下記のステップ：
ａ．細胞培養物および少なくとも１種の化学薬剤を含む培地中でウイルスを成長させて、ＥＬＩＳＡによって測定すると、対照と比較してインフルエンザＢ型の少なくとも１．５倍の増加を生じさせるステップ、
ｂ．ウイルスを加工して、無菌のワクチンを産生させるステップ
を行う、インフルエンザＢ型ワクチンを産生するための方法。
２６．化学薬剤が、表１または表３から選択される、実施形態２３から２５に記載の方法。
２７．下記のステップ：
ａ．０．０５μＭまたはそれ未満の濃度のスタチン剤の存在下でウイルスを細胞培養物中で成長させるステップ、
ｂ．ウイルスを加工して、無菌のワクチンを産生させるステップ
を行う、インフルエンザワクチンを産生するための方法。
【図１】
0006741587.tif 000063
【図２】
0006741587.tif 000064
【図３】
0006741587.tif 000065
【図４】
0006741587.tif 000066
【図５Ａ】
0006741587.tif 000067
【図５Ｂ】
0006741587.tif 000068
【図６−１】
0006741587.tif 000069
【図６−２】
0006741587.tif 000070
【図６−３】
0006741587.tif 000071
【図６−４】
0006741587.tif 000072
【図６−５】
0006741587.tif 000073
【図７】
0006741587.tif 000074
【図８】
0006741587.tif 000075
【図９】
0006741587.tif 000076
【図１０】
0006741587.tif 000077
【図１１】
0006741587.tif 000078
【図１２】
0006741587.tif 000079
【図１３】
0006741587.tif 000080
【図１４】
0006741587.tif 000081
【図１５】
0006741587.tif 000082
【図１６】
0006741587.tif 000083
【図１７】
0006741587.tif 000084
【図１８】
0006741587.tif 000085