(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
安定型糖化ヘモグロビンｓＡ１ｃの測定方法であって、（１）血液試料を溶血後、陽イオン交換クロマトグラフィーに供してｓＡ１ｃを他のヘモグロビンから分離して溶出し、各ヘモグロビン分画の溶出を示すクロマトグラムを取得する工程、（２）取得したクロマトグラムからｓＡ１ｃのピークを同定し、そのピーク面積を計算する工程、（３）取得したクロマトグラムから、ｓＡ１ｃ以外のヘモグロビンのピークを同定し、それらのピーク面積を計算する工程、及び、（４）ヘモグロビンＡの非糖化ピークの後ろに出現するピークから異常ヘモグロビンＤ、異常ヘモグロビンＳ又は異常ヘモグロビンＣの非糖化ピークを同定する工程、（５）同定された異常ヘモグロビンＤ、異常ヘモグロビンＳ又は異常ヘモグロビンＣの非糖化ピーク面積を用いて、前記異常ヘモグロビンＤ、異常ヘモグロビンＳ又は異常ヘモグロビンＣの糖化ピークの面積を推定する工程を含み、その推定計算結果を用いて補正されたｓＡ１ｃのピーク面積の割合（％）を求める方法。
【請求項２】
前記工程４において、異常ヘモグロビンＤ又は異常ヘモグロビンＳの非糖化ピークが同定されたときに、その異常ヘモグロビンＤ又は異常ヘモグロビンＳの糖化ピークはヘモグロビンＡの非糖化ピークＡ０と重なって溶出され、かつｓＡ１ｃピーク面積のヘモグロビンＡに関わる全ピーク面積の和に対する割合と、その異常ヘモグロビンの糖化ピーク面積のその異常ヘモグロビンに関わる全てのピーク面積の和に対する割合が等しいという前提の元に、ｓＡ１ｃピーク面積のヘモグロビンＡに関わる全ピーク面積に対する割合（％）を補正する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記工程４において、異常ヘモグロビンＣの非糖化ピークが同定されたときに、その異常ヘモグロビンＣの糖化ピークはヘモグロビンＡの非糖化ピークＡ０の後ろに溶出されるという前提の元に、ｓＡ１ｃのピーク面積のヘモグロビンＡに関わる全ピーク面積に対する割合（％）を補正する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記工程４において、異常ヘモグロビンＤ又は異常ヘモグロビンＳの非糖化ピークが同定されたときに、その異常ヘモグロビンＤ又は異常ヘモグロビンＳの糖化ピークはヘモグロビンＡの非糖化ピークＡ０と重なって溶出され、かつｓＡ１ｃピーク面積のヘモグロビンＡに関わる全ピーク面積の和に対する割合と、その異常ヘモグロビンの糖化ピーク面積のその異常ヘモグロビンに関わる全てのピーク面積の和に対する割合が等しいという前提の元に、ｓＡ１ｃピーク面積のヘモグロビンＡに関わる全ピーク面積に対する割合（％）を以下の式に従って補正する、請求項１又は２に記載の方法。
【数１】
0006780290.tif 000002
ここで、Ａ´はＡ０とそれと同時に溶出する異常ヘモグロビンの糖化ピーク面積の和で、クロマトグラム上はＡ０として観測されるピーク面積。ｓＡ１ｃ、Ａ０はそれぞれヘモグロビンＡの糖化、非糖化ピーク面積、Ｘ１ｃ及びＸ０はそれぞれＡ０と同時に溶出される異常ヘモグロビンの糖化ピーク面積、Ａ０の後で溶出される異常ヘモグロビンの非糖化ピーク面積を表し、又、α＝Ａ１ａ＋Ａ１ｂ＋ＬＡ１ｃ＋ｓＡ１ｃ、βはＡ０から後ろに溶出されるピーク総面積からＸ０を除いたものである。
【請求項５】
前記工程４において、異常ヘモグロビンＣの非糖化ピークが同定されたときに、その異常ヘモグロビンＣの糖化ピークはヘモグロビンＡの非糖化ピークＡ０の後ろに溶出されるという前提の元に、ｓＡ１ｃのピーク面積のヘモグロビンＡに関わる全ピーク面積に対する割合（％）を以下の式に従って補正する、請求項１又は３に記載の方法。
【数２】
0006780290.tif 000003
ここで、Ａ´はクロマトグラム上Ａ０として観測されるピーク面積。ｓＡ１ｃ、Ａ０はそれぞれヘモグロビンＡの糖化、非糖化ピーク面積、又、α＝Ａ１ａ＋Ａ１ｂ＋ＬＡ１ｃ＋ｓＡ１ｃである。
【請求項６】
安定型糖化ヘモグロビンｓＡ１ｃの測定装置であって、
（１）溶血した血液試料を導入するための試料導入手段、
（２）陽イオン交換能を有する樹脂からなる分離手段、
（３）液体を移送するための送液手段、
（４）前記分離手段から溶出するヘモグロビンを検出しクロマトグラムを得るための検出手段、
（５）前記検出手段が検出したクロマトグラムを分析するための分析手段、
の各手段を備え、前記分析手段は、
ａ）クロマトグラムに出現したピーク面積を計算するためのベースラインの設定、
ｂ）クロマトグラムに出現したピークがいずれのヘモグロビンに由来するものであるかの同定、
ｃ）クロマトグラムに出現したピーク面積の計算、
ｄ）ｓＡ１ｃピーク面積のヘモグロビンＡに関わる全ピーク面積に対する割合（％）の計算、
を実施するものであり、上記ｂにおいて異常ヘモグロビンＤ、異常ヘモグロビンＳ又は異常ヘモグロビンＣの非糖化ピークが同定されたときには、その異常ヘモグロビンのピークの面積を計算し、その計算結果を用いて上記ｄにおいてｓＡ１ｃのピーク面積の割合（％）を求め、その求めたｓＡ１ｃのピーク面積の割合（％）を測定することを特徴とする、前記装置。
【請求項７】
ヘモグロビンＡの非糖化ピークの後に出現する最も顕著なピークを異常ヘモグロビンＤ，異常ヘモグロビンＳ又は異常ヘモグロビンＣの非糖化ピークとして同定し、分析手段において上記分析を実施することを特徴とする請求項６に記載の測定装置。
【請求項８】
前記ｂにおいて、異常ヘモグロビンＤ又は異常ヘモグロビンＳの非糖化ピークが同定されたときに、前記ｄにおいてその異常ヘモグロビンＤ又は異常ヘモグロビンＳの糖化ピークはヘモグロビンＡの非糖化ピークＡ０と重なって溶出され、かつｓＡ１ｃピーク面積のヘモグロビンＡに関わる全ピーク面積の和に対する割合と、その異常ヘモグロビンの糖化ピーク面積のその異常ヘモグロビンに関わる全てのピーク面積の和に対する割合が等しいという前提の元に、ｓＡ１ｃのピーク面積の割合（％）を測定する、請求項６又は７に記載の測定装置。
【請求項９】
前記ｂにおいて、異常ヘモグロビンＣの非糖化ピークが同定されたときに、前記ｄにおいてその異常ヘモグロビンＣの糖化ピークはヘモグロビンＡの非糖化ピークＡ０の後ろに溶出されるという前提の元に、ｓＡ１ｃのピーク面積の割合（％）を測定する、請求項６又は７に記載の測定装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、液体クロマトグラフィーにより血液試料中の糖化ヘモグロビンを測定する方法と装置に関するものであり、詳しくは、異常ヘモグロビンを含有する血液試料が混在する可能性のある血液試料群について、糖尿病診断の指標となる糖化ヘモグロビンの測定を実施可能な糖化ヘモグロビンの測定方法と測定装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ヘモグロビンは、２個のα鎖及び２個のβ鎖からなるα２β２の構造を持ち、全ヘモグロビンの約９７％を占めるヘモグロビンＡの他、２個のα鎖及び２個のγ鎖からなるα２γ２構造を持ち、全ヘモグロビンの１％弱を占めるヘモグロビンＦ、２個のα鎖及び２個のδ鎖からなるα２δ２構造を持ち、全ヘモグロビンの１％弱を占めるヘモグロビンＡ２から構成される。
【０００３】
ヘモグロビンは、血中に存在する糖（血糖）やその代謝物と非酵素的に結合（糖化）して糖化ヘモグロビンを形成する。全ヘモグロビンの大半を占めるヘモグロビンＡが糖化したヘモグロビンＡ１は、厳密には糖化ヘモグロビンの全てではないが、臨床的に糖化ヘモグロビンと同義に扱われることが多い。ヘモグロビンＡ１は、更にＡ１ａ、Ａ１ｂ、Ａ１ｃに分離できるが、食事等による一時的な血糖値の上昇に影響されず、過去２から３ヶ月間の血糖値の変化を反映して濃度が変化する、いわゆる安定型のヘモグロビンＡ１ｃ（以下「ｓＡ１ｃ」と略記することがある）の全ヘモグロビンに対する割合（以下Ａ１ｃ％と略記することがある）は、糖尿病の診断や、糖尿病患者の経過観察の指標として広く用いられている。
【０００４】
糖化ヘモグロビンの測定は、従来、液体クロマトグラフィーの手法により実施されている。液体クロマトグラフィーによる糖化ヘモグロビンの測定には、大別すると、イオン交換物質を固定した充填材を用い、種々のヘモグロビンをその電荷の相違を利用して分画して測定する陽イオン交換クロマトグラフィーによる測定方法と、糖に対して親和性の高いアミノフェニルボロン酸基を固定した充填材を用いるアフィニティークロマトグラフィーによる測定方法とがある。アフィニティークロマトグラフィーによる測定方法は、糖鎖部分に対する親和性を利用することから、ｓＡ１ｃを含む種々の糖化ヘモグロビンを測定することになる（非特許文献２）が、この場合も全ヘモグロビンに対する糖化ヘモグロビンの割合が利用される。一方、陽イオン交換クロマトグラフィーによる測定方法では、種々のヘモグロビンを分離したうえで、ｓＡ１ｃのみを測定し、全ヘモグロビンに対する割合Ａ１ｃ％を計算することができる。
【０００５】
ヘモグロビンには、ヘモグロビン遺伝子に変異が生じることにより生じるヘモグロビンＥ、ヘモグロビンＤ、ヘモグロビンＳ、ヘモグロビンＣなどの様々な異常ヘモグロビンも存在する。そして近年、希にではあるが、糖化ヘモグロビンの測定を実施すべき血液試料がかかる遺伝子変異の結果生じた種々の異常ヘモグロビンを含有する場合、アフィニティークロマトグラフィーによる測定方法では血液試料を提供した被験者の症状を反映する測定結果が得られる一方で、陽イオンクロマトグラフィーによる測定方法では、ｓＡ１ｃ％測定値が低い値を示し、時として血液試料を提供した被験者の症状を反映し難いことがある、と報告されている（非特許文献１−３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開平９−２６４８８９号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｒ．Ｒ．Ｌｉｔｔｌｅ  ａｎｄ  Ｗ．Ｌ．Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｊ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｓｃｉ  Ｔｅｃｈｎｏｌ，  Ｖｏｌ  ３（３），４４６−４５１（２００９）．
【非特許文献２】Ｒ．Ｒ．Ｌｉｔｔｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ，  Ｖｏｌ  ５４（８），  １２７７−１２８２（２００８）．
【非特許文献３】Ｌ．Ｂｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ，  Ｖｏｌ  ４７（２），  １５３−１６３（２００１）．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
測定を実施すべき血液試料が異常ヘモグロビンＤ、異常ヘモグロビンＳ又は異常ヘモグロビンＣを含有する場合、陽イオン交換クロマトグラフィーによってｓＡ１ｃの測定を実施すると、ヘモグロビンＡの非糖化成分であるＡ０と同時又はその後に、これら異常ヘモグロビン成分の一部が溶出する。この場合、それに対応する顕著なピークをＡ１ｃ％の計算から除外しても、Ａ１ｃ％は低値を示してしまう一方で、アフィニティークロマトグラフィーによる糖化ヘモグロビンの測定では、全ヘモグロビンに占める糖化ヘモグロビンの値は影響を受けないことが認められた。そこで本発明は、全世界的に保因者の多いことが知られている異常ヘモグロビンＤ、異常ヘモグロビンＳ又は異常ヘモグロビンＣを含有する血液試料を陽イオン交換クロマトグラフィーにより測定する場合に、それらの異常ヘモグロビンによる影響を排除して、血液試料を提供した被験者の症状を反映するＡ１ｃ％の測定結果を得ようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、異常ヘモグロビンＤ、異常ヘモグロビンＳ又は異常ヘモグロビンＣを含有する血液試料を陽イオン交換クロマトグラフィーに供してクロマトグラムを取得し、分析した結果、健常者のクロマトグラムにはないピークが出現することを見いだした。更に、このピークの面積に基づいて補正したＡ１ｃ％を算出すると、その補正された結果は異常ヘモグロビンＤ、異常ヘモグロビンＳ又は異常ヘモグロビンＣの影響を受けにくいとされるアフィニティークロマトグラフィーによる測定結果と良好に相関することを見いだし、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち本発明は、上記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、完成するに至ったものである。
［１］  安定型糖化ヘモグロビンｓＡ１ｃの測定方法であって、（１）血液試料を溶血後、陽イオン交換クロマトグラフィーに供してｓＡ１ｃを他のヘモグロビンから分離して溶出し、各ヘモグロビン分画の溶出を示すクロマトグラムを取得する工程、（２）取得したクロマトグラムからｓＡ１ｃのピークを同定し、そのピーク面積を計算する工程、（３）取得したクロマトグラムから、ｓＡ１ｃ以外のヘモグロビンのピークを同定し、それらのピーク面積を計算する工程、及び、（４）全ヘモグロビンのピーク面積に占めるｓＡ１ｃのピーク面積の割合（％）を計算する工程、（５）ヘモグロビンＡの非糖化ピークの後ろに出現するピークから異常ヘモグロビンＤ、異常ヘモグロビンＳ又は異常ヘモグロビンＣの非糖化ピークを同定する工程（６）同定された異常ヘモグロビンＤ、異常ヘモグロビンＳ又は異常ヘモグロビンＣの非糖化ピーク面積等を用いて、その糖化ピークの面積を推定する工程を含み、その推定計算結果を用いて上記工程４におけるｓＡ１ｃのピーク面積の割合（％）を補正することを特徴とする、その方法。
[２]  工程５において、異常ヘモグロビンＤ又は異常ヘモグロビンＳのピークが同定されたときに、その異常ヘモグロビンＤ又は異常ヘモグロビンＳの糖化ピークはヘモグロビンＡの非糖化ピークＡ０と重なって溶出され、かつｓＡ１ｃのヘモグロビンＡに関わる全ピーク面積の和に対する割合は、その異常ヘモグロビンの糖化ピーク面積のその他のピークの面積の和に対する割合に等しいという前提の元に、ｓＡ１ｃピーク面積のヘモグロビンＡに関わる全ピーク面積に対する割合（％）を補正する、[１]に記載の方法。
[３]  前記工程５において、異常ヘモグロビンＣのピークが同定されたときに、その異常ヘモグロビンＣの糖化ピークはヘモグロビンＡの非糖化ピークＡ０の後ろに溶出されるという前提の元に、ｓＡ１ｃのピーク面積のヘモグロビンＡに関わる全ピーク面積に対する割合（％）を補正する、[１]に記載の方法。
[４]  前記工程５において、異常ヘモグロビンＤ又は異常ヘモグロビンＳのピークが同定されたときに、その異常ヘモグロビンＤ又は異常ヘモグロビンＳの糖化ピークはヘモグロビンＡの非糖化ピークＡ０と重なって溶出され、かつｓＡ１ｃのヘモグロビンＡに関わる全ピーク面積の和に対する割合は、その異常ヘモグロビンの糖化ピーク面積のその他のピークの面積の和に対する割合に等しいという前提の元に、ｓＡ１ｃピーク面積のヘモグロビンＡに関わる全ピーク面積に対する割合（％）を以下の式に従って補正する、[１]又は[２]に記載の方法。
［数１］
Ａ１ｃ％＝１００ｓＡ１ｃ／（Ａ０＋α）＝１００Ｘ１ｃ／（Ｘ０＋β＋Ｘ１ｃ）
Ａ´＝Ａ０＋Ｘ１ｃ
Ｘ１ｃ＝［（Ａ´＋α−ｓＡ１ｃ）
−√｛（Ａ´＋α−ｓＡ１ｃ）２−４ｓＡ１ｃ（Ｘ０＋β）｝］／２
ここで、Ａ´はＡ０とそれと同時に溶出する異常ヘモグロビンの糖化ピーク面積の和で、クロマトグラム上はＡ０として観測されるピーク面積。ｓＡ１ｃ、Ａ０はそれぞれヘモグロビンＡの糖化、非糖化ピーク面積、Ｘ１ｃ及びＸ０はそれぞれＡ０と同時に溶出される異常ヘモグロビンの糖化ピーク面積、Ａ０の後で溶出される異常ヘモグロビンの非糖化ピーク面積を表し、又、α＝Ａ１ａ＋Ａ１ｂ＋ＬＡ１ｃ＋ｓＡ１ｃ、βはＡ０から後ろに溶出されるピーク総面積からＸ０を除いたものである。
[５]  前記工程５において、異常ヘモグロビンＣのピークが同定されたときに、その異常ヘモグロビンＣの糖化ピークはヘモグロビンＡの非糖化ピークＡ０の後ろに溶出されるという前提の元に、ｓＡ１ｃのピーク面積のヘモグロビンＡに関わる全ピーク面積に対する割合（％）を以下の式に従って補正する、[１]又は[３]に記載の方法。
［数２］
Ａ１ｃ％＝１００ｓＡ１ｃ／（Ａ´＋α）
ここで、Ａ´はクロマトグラム上Ａ０として観測されるピーク面積。ｓＡ１ｃ、Ａ０はそれぞれヘモグロビンＡの糖化、非糖化ピーク面積、又、α＝Ａ１ａ＋Ａ１ｂ＋ＬＡ１ｃ＋ｓＡ１ｃである。
[６]  安定型糖化ヘモグロビンｓＡ１ｃの測定装置であって、
（１）溶血した血液試料を導入するための試料導入手段、
（２）陽イオン交換能を有する樹脂からなる分離手段、
（３）液体を移送するための送液手段、
（４）前記分離手段から溶出するヘモグロビンを検出しクロマトグラムを得るための検出手段、
（５）前記検出手段が検出したクロマトグラムを分析するための分析手段、
の各手段を備え、前記分析手段は、
ａ）クロマトグラムに出現したピーク面積を計算するためのベースラインの設定、
ｂ）クロマトグラムに出現したピークがいずれのヘモグロビンに由来するものであるかの同定、
ｃ）クロマトグラムに出現したピーク面積の計算、
ｄ）全ヘモグロビンのピーク面積に占めるｓＡ１ｃのピーク面積の割合（％）の計算、
を実施するものであり、上記ｂにおいて異常ヘモグロビンＤ、異常ヘモグロビンＳ又は異常ヘモグロビンＣのピークが同定されたときには、その異常ヘモグロビンのピークの面積を計算し、その計算結果を用いて上記ｄにおいてｓＡ１ｃのピーク面積の割合（％）を補正し、その補正したｓＡ１ｃのピーク面積の割合（％）を測定することを特徴とする、前記装置。
[７]  ヘモグロビンＡの非糖化ピークの後に出現する最も顕著なピークを異常ヘモグロビンＤ，異常ヘモグロビンＳ又は異常ヘモグロビンＣのピークとして同定し、分析手段において上記分析を実施することを特徴とする[６]に記載の測定装置。
[８]  前記ｂにおいて、異常ヘモグロビンＤ又は異常ヘモグロビンＳのピークが同定されたときに、前記ｄにおいてその異常ヘモグロビンＤ又は異常ヘモグロビンＳの糖化ピークはヘモグロビンＡの非糖化ピークＡ０と重なって溶出され、かつｓＡ１ｃピーク面積のヘモグロビンＡに関わる全ピーク面積の和に対する割合は、その異常ヘモグロビンの糖化ピーク面積のその他のピークの面積の和に対する割合に等しいという前提の元に、ｓＡ１ｃのピーク面積の割合（％）を補正する、[６]又は[７]に記載の測定装置。
[９]  前記ｂにおいて、異常ヘモグロビンＣのピークが同定されたときに、前記ｄにおいてその異常ヘモグロビンＣの糖化ピークはヘモグロビンＡの非糖化ピークＡ０の後ろに溶出されるという前提の元に、ｓＡ１ｃのピーク面積の割合（％）を補正する、[６]又は[７]に記載の測定装置。
【００１１】
以下、本発明を詳細に説明する。後述する実施例に示した条件下では、異常ヘモグロビンＤ、異常ヘモグロビンＳ及び異常ヘモグロビンＣを含有する血液試料を陽イオン交換クロマトグラフィーに供すると、それぞれ図３Ａ、図３Ｂ及び図３Ｃのようなクロマトグラムが取得できる。このクロマトグラムを、健常者の血液試料を陽イオンクロマトグラフィーに供して得たクロマトグラム（図２）と比較すると、非糖化のヘモグロビンＡのピーク（Ａ０）の後ろに各異常ヘモグロビンに対応した顕著なピーク（Ｈ−Ｖ０、Ｈ−Ｖ１及びＨ−Ｖ２）が出現する。
また、本発明においてＨ−Ｖ０、Ｈ−Ｖ１及びＨ−Ｖ２とは、クロマトグラム上において、溶離液の組成とその流速によってその同定溶出時間が設定されたヘモグロビンＡ以外の顕著なピークのことを指す。これらのＨ−Ｖ０、Ｈ−Ｖ１及びＨ−Ｖ２のピークは、各異常ヘモグロビンに由来する非糖化ピークであると推定され、また各異常ヘモグロビンの糖化ピークはＡ０と同時に溶出されると推定される。
そこで本発明では、異常ヘモグロビンに由来すると考えられるＡ０と同時に溶出されるピーク面積、つまり、Ａ０と同時に溶出される糖化異常ヘモグロビンピークの面積の、異常ヘモグロビンの顕著な非糖化ピーク（Ｈ−Ｖ０、Ｈ−Ｖ１又はＨ−Ｖ２）を含む異常ヘモグロビンに由来すると考えられるＡ０以降に溶出するピーク面積に対する割合について次のような仮定のもとにその異常ヘモグロビン検体を測定した際に、ヘモグロビンＡに関するＡ１ｃ％の補正が行えることを見出した。
本発明は、ヘモグロビンＡに関する糖化ピークｓＡ１ｃのＡ０を含むヘモグロビンＡに由来するＡ１ａ，Ａ１ｂ，ＬＡ１ｃとｓＡ１ｃの和に対する割合は異常ヘモグロビンの場合も同じであるという仮定に基づいて、Ａ１ｃ％を補正することを特徴とする。具体的には、Ａ０と同時に溶出する異常ヘモグロビンの糖化ピークは、クロマトグラム上で分離できないという課題を解決するため、前記仮定に則り、
Ａ１ｃ％＝１００ｓＡ１ｃ／（Ａ０＋α）＝１００Ｘ１ｃ／（Ｘ０＋β＋Ｘ１ｃ）    式（１）
Ａ´＝Ａ０＋Ｘ１ｃ                                              式（２）
を満足する、
Ｘ１ｃ＝［（Ａ´＋α−ｓＡ１ｃ）
−√｛（Ａ´＋α−ｓＡ１ｃ）２−４ｓＡ１ｃ（Ｘ０＋β）｝］／２        式（３）
でＸ１ｃ及びＡ０を推定し、式（１）の１００ｓＡ１ｃ／（Ａ０＋α）から補正されたＡ１ｃ％を計算することで前記課題を達成することが可能となった。
ここで、Ａ´はＡ０とそれと同時に溶出する異常ヘモグロビンの糖化ピーク面積の和を指す。Ａ０とそれと同時に溶出する異常ヘモグロビンの糖化ピークは、クロマトグラム上では分離できず、その和として観測される。ｓＡ１ｃ、Ａ０はそれぞれヘモグロビンＡの糖化、非糖化ピーク面積、Ｘ１ｃ及びＸ０はそれぞれＡ０と同時に溶出される異常ヘモグロビンの糖化ピーク面積、Ａ０の後で溶出される異常ヘモグロビンの非糖化ピーク面積を表す。また、α＝Ａ１ａ＋Ａ１ｂ＋ＬＡ１ｃ＋ｓＡ１ｃ、βはＡ０から後ろに溶出されるピーク総面積からＸ０を除いたものである。
なお、異常ヘモグロビンとして、Ｈ−Ｖ２ピーク、つまり異常ヘモグロビンＣが検出された際は、その糖化ピークもＡ０から後に溶出される可能性が高いため、式（２）の仮定は適用できず、補正Ａ１ｃ％は式（１）でＡ０＝Ａ´とおいて、
Ａ１ｃ％＝１００ｓＡ１ｃ／（Ａ´＋α）                                        式（４）
を計算することで前記課題を達成することが可能となった。
また本発明を用いることによって、異常ヘモグロビンに由来すると考えられるＡ０以降に溶出するピーク面積、つまり異常ヘモグロビンの顕著な非糖化ピーク（Ｈ−Ｖ０、Ｈ−Ｖ１又はＨ−Ｖ２）と、Ａ０と同時に溶出する異常ヘモグロビン糖化ピークの和に対する異常ヘモグロビン糖化ピークの割合を、上記式を用いて算出することができれば、異常ヘモグロビンが異常ヘモグロビンＤ、異常ヘモグロビンＳ、異常ヘモグロビンＣ以外であっても算出することができる。
【００１２】
本発明の測定方法は、自動化した測定装置により容易に実施することが可能であり、（１）溶血した血液試料を導入するための試料導入手段、（２）陽イオン交換能を有する樹脂からなる分離手段、（３）液体を移送するための送液手段、（４）前記分離手段から溶出するヘモグロビンを検出しクロマトグラムを得るための検出手段、（５）前記検出手段が検出したクロマトグラムを分析するための分析手段、との各手段により構成される装置を例示することができる。さらに本発明は、上記（１）〜（５）の手段をコンピューターに実行させる安定型糖化ヘモグロビンｓＡ１ｃの測定プログラムにも関する。
【００１３】
上記（１）の試料導入手段は、一定量の血液試料を後述する分離手段に導入するためのものであり、市販のオートサンプラーを使用すること、六方バルブを用いるなどして構成することができる。なお、ｓＡ１ｃの測定は、溶血した血液試料を使用するが、試料導入手段で溶血操作を実施しても良いし、溶血操作を実施後の血液試料を試料導入手段に供するようにしても良い。溶血は、血球成分を含む血液試料を高張液に添加する等により行えば良い。
【００１４】
上記（２）の陽イオン交換能を有する樹脂からなる分離手段は、スルホン系等の、いわゆる陽イオン交換クロマトグラフィー用の修飾基を結合した樹脂を充填したカラム等を使用することができる。陽イオン交換クロマトグラフィー用の樹脂としては、例えば非多孔性陽イオン交換体等が例示でき、また、かかる樹脂を充填したカラムとしては、例えば東ソー（株）製の非多孔性陽イオン交換体カラム  ＴＳＫｇｅｌ（登録商標）  ＳＰ−ＮＰＲ  等を例示することができる。
【００１５】
上記（３）の液体を移送するための送液手段は、試料導入手段から導入された血液試料やヘモグロビンを溶出させるための溶離液を分離手段に移送するためのものであり、ポンプを例示することができる。なお、溶離液としては、従来から種々のものが利用されており、例えば塩濃度の異なる３種類の溶離液を利用してグラジエント溶出させるためのミキサー等を装備しても良い。
【００１６】
上記（４）の、分離手段から溶出するヘモグロビンを検出しクロマトグラムを得るための検出手段は、ヘモグロビンを検出できるものであれば制限はなく、例えば蛋白質であるヘモグロビンの溶出を４１５ｎｍの吸光度に基づいて検出可能な吸光検出器や、電気伝導度検出器等を例示できる。
【００１７】
上記（５）の分析手段は、検出手段が検出したクロマトグラムを分析するための手段であるが、本発明の測定装置はこの分析手段に特徴を有する。この分析手段は、まず、クロマトグラムに出現したピーク面積を計算するためのベースラインの設定を行う。ベースラインの設定方法は種々提案されているが（例えば特許文献１参照）、特に制限はない。ベースラインの設定に続いて、クロマトグラムに出現したピークがいずれのヘモグロビンに由来するものであるかを同定する。この同定のためには、装置にヘモグロビンごとに予想される溶出時間を記憶する記憶手段を設け、溶出時間から同定を行うように構成することができる。なお、ベースラインの設定とピーク同定は順序が逆になっても良い。このようにしてクロマトグラムに出現した各ピーク面積の計算を行った後に、ｓＡ１ｃのピーク面積を全ヘモグロビンのピーク面積の和で割った割合（％）を求めるが、ピーク同定の際に異常ヘモグロビンＤ、異常ヘモグロビンＳに対応したピーク、それぞれＨ−Ｖ０、Ｈ−Ｖ１が同定されたときは、クロマトグラムの全ピーク面積合計（Ｔｏｔａｌ  ａｒｅａ）及びＡ１ａ、Ａ１ｂ，ＨｂＦ、ＬＡ１ｃ、ｓＡ１ｃ、Ａ´、Ｈ−Ｖ０又はＨ−Ｖ１の各ピーク面積を計算しておき、式（３）によりＸ１ｃ面積、又式（２）によりＡ０面積を確定し、式（１）により、Ａ１ｃ％を算出する。
なお、ピーク同定の際、異常ヘモグロビンＣに対応したピーク、Ｈ−Ｖ２が同定されたときは、Ａ１ａ、Ａ１ｂ，ＨｂＦ、ＬＡ１ｃ、ｓＡ１ｃ、Ａ´、Ｈ−Ｖ２の各ピーク面積を計算しておき、式（４）からＡ１ｃ％を算出する。この際、式（４）の分母は、Ｔｏｔａｌ  ａｒｅａ、Ｘ０及びβの各ピーク面積を計算しておき、Ｔｏｔａｌ  ａｒｅａ−Ｘ０−β−ＨｂＦで計算してもよい。
【００１８】
上記分析手段は、検出手段で検出したクロマトグラムについて上記のような分析を実施できれば制限されず、例えばプロセッサを備えたコンピューターに上記分析のためのプログラムをインストールすることにより構成することができる。かかるコンピューターは、本発明の装置に一体不可分に組み込まれた形態であっても良いし、いわゆる外付けの形態であっても良い。
【００１９】
本発明に係る測定装置を図５に基づいて更に具体的に説明する。試料導入手段１１に導入された溶血した血液試料は、分離手段１３に送られ、さらに送液手段１２により溶離液が分離手段１３に送られることにより、ヘモグロビン類が分画されて溶出する。溶出されたヘモグロビンは、検出手段１４により検出されて、クロマトグラムを与え、得られたクロマトグラムが分析手段１５により分析される。分析手段１５は、ベースライン設定モジュール１６、ピーク同定モジュール１７、ピーク面積計算モジュール１８、及びｓＡ１ｃ割合計算モジュール１９を含み、まずベースライン設定モジュール１６が、クロマトグラムに出現したピーク面積を計算するためのベースラインの設定を行う。続いて、ピーク同定モジュール１７が、クロマトグラムに出現したピークがいずれのヘモグロビンに由来するものであるかを同定する。ここでピーク同定モジュール１７は、例えば、記憶手段に予め記憶された異常ヘモグロビンＤ、異常ヘモグロビンＳ及び異常ヘモグロビンＣを含有しない血液試料のクロマトグラムと、検出手段１４により与えられたクロマトグラムとを比較することにより、それぞれ異常ヘモグロビンＤ、Ｓ、Ｃに由来するピーク（Ｈ−Ｖ０、Ｈ−Ｖ１、Ｈ−Ｖ２）の有無を判定することができる。他の特定方法として、例えば、異常ヘモグロビンＤ、Ｓ又はＣを含有する血液試料のクロマトグラムから得られた異常ヘモグロビンに由来するピークの溶出時間を記憶手段に予め記憶しておき、クロマトグラム上の当該時間に該当するピークが出現するかどうかを判断して、ピークが出現した場合にはそのピークを異常ヘモグロビンＤ、Ｓ又はＣに由来するピーク（Ｈ−Ｖ０、Ｈ−Ｖ１、Ｈ−Ｖ２）と同定することも例示できる。続いて、ピーク面積計算モジュール１８が各ヘモグロビン類のピーク面積を計算する。最後に、ｓＡ１ｃ割合計算モジュール１９が、全ヘモグロビンのピーク面積の和に対するｓＡ１ｃのピーク面積の割合（％）、Ａ１ｃ％を求める。ここでピーク同定モジュール１７が異常ヘモグロビンＤ、Ｓ又はＣに由来するピークを同定した場合、ｓＡ１ｃ割合計算モジュール１９は、本発明の特徴であるＡ１ｃ％を補正するものである。当然のことであるが、ピーク同定モジュール１７にて異常ヘモグロビンＤ、Ｓ又はＣに由来するピークが同定されなかった場合には、Ａ１ｃ％計算モジュール１９は、Ａ１ｃ％について補正を行うことなくＡ１ｃ％を計算する。具体的には、ピーク同定モジュール１７が、Ｈ−Ｖ０又はＨ−Ｖ１が存在すると判定したときは、クロマトグラムの全ピーク面積合計（Ｔｏｔａｌ  ａｒｅａ）及びＡ１ａ、Ａ１ｂ，ＨｂＦ、ＬＡ１ｃ、ｓＡ１ｃ、Ａ´、Ｈ−Ｖ０又はＨ−Ｖ１の各ピーク面積を計算しておき、式（３）によりＸ１ｃ面積を得て、式（２）によりＡ０面積を確定し、式（１）により、Ａ１ｃ％を算出する。一方、ピーク同定モジュール１７が、Ｈ−Ｖ２が存在すると判定したときは、Ａ１ａ、Ａ１ｂ，ＨｂＦ、ＬＡ１ｃ、ｓＡ１ｃ、Ａ´、Ｈ−Ｖ２の各ピーク面積を計算し、式（４）からＡ１ｃ％を算出する。或いは、Ｔｏｔａｌ  ａｒｅａ、Ｘ０、β及びＨｂＦの各ピーク面積を計算し、式（４）の分母をＴｏｔａｌ  ａｒｅａ−Ｘ０−β−ＨｂＦで計算して、Ａ���ｃ％を算出する。
以上の様にして計算したＡ１ｃ％に、更にＮａｔｉｏｎａｌ  Ｇｌｙｃｏｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ  Ｓａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｇｒａｍ（ＮＧＳＰ）、国際臨床化学連合（ＩＦＣＣ）、日本糖尿病学会（ＪＤＳ）等の各学会が定めた標準品を用いてキャリブレーションを行い、補正することで当該学会が定めた基準に沿った診断等を実施するための指標となるＡ１ｃ％を計算することができ、また異常ヘモグロビンＤ、Ｓ、及びＣによる影響を排除して、アフィニティークロマトグラフィーによる測定結果との良好な相関を達成できる。こうして分析手段１５により分析された結果は、出力手段２０を介して表示又は印字することもできる。本発明は、分析手段内の各モジュールをコンピューターに実行させる安定型糖化ヘモグロビンｓＡ１ｃの測定プログラムにも関する。
【００２０】
図６は、分析手段１５をハードウェア構成から説明した図である。分析手段１５は、プロセッサー２１、メモリ２２、出力インターフェース２３、補助記憶手段２４、入力インターフェース２５、入力手段２６等を備える。プロセッサー２１は、補助記憶手段２４に記載されるプログラムを実行することにより、上述した分析手段１５が果たす機能を実現するための処理を実行する。メモリー２２には、プロセッサ２１が実行中のプログラムや、このプログラムにより一時的に使用されるデータが記憶される。メモリー２２は読み出し専用メモリ（ＲＯＭ）やランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）を含んでも良い。上記２１〜２６はデータバス２７により電気的に接続されている。出力インターフェース２３は、クロマトグラムや計算したｓＡ１ｃの割合（％）をモニターやプリンター等の出力手段へ出力するインターフェース回路である。入力インターフェース２５は、検出手段から出力されるクロマトグラムを入力するインターフェース回路である。入力手段２６は、ユーザーの操作入力を受け付けるためのものであり、装置の起動、終了、血液試料に関する情報等を入力するため、キーボード等の通常の入力機器を備える。各手段は、バスで電気的に接続されている。
【００２１】
本発明の測定装置において、上記例示したようにモニターやプリンター等の表示手段を装備する場合には、異常ヘモグロビンＤ、Ｓ、Ｃに由来するピーク（それぞれＨ−Ｖ０、Ｈ−Ｖ１、Ｈ−Ｖ２）が同定された場合にはその旨をこれらの表示手段に表示して注意を喚起することができる。また、Ｈ−Ｖ０、Ｈ−Ｖ１又はＨ−Ｖ２が同定された血液試料に関する測定結果（Ａ１ｃ％）とともに本発明を適用した旨を表示するように構成することも例示できる。
【発明の効果】
【００２２】
測定を実施すべき血液試料が異常ヘモグロビンＤ、異常ヘモグロビンＳ又は異常ヘモグロビンＣを含有する場合、陽イオン交換クロマトグラフィーによってｓＡ１ｃの測定を実施すると、異常ヘモグロビンＤ、異常ヘモグロビンＳ又は異常ヘモグロビンＣ由来の顕著なピークを除外して計算しても、全ヘモグロビンに占めるｓＡ１ｃの値が低値を示すことが報告されているが、本発明によれば、異常ヘモグロビンＤ、異常ヘモグロビンＳ又は異常ヘモグロビンＣによる影響を排除して、それらの異常ヘモグロビンの影響を受けにくいと報告されているアフィニティークロマトグラフィーによる測定結果との良好な相関を達成し、血液試料を提供した被験者の症状を反映するＡ１ｃ％の測定結果を得ることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】異常ヘモグロビンＤを含有する血液試料と、異常ヘモグロビンＤを含有しない血液試料について、アフィニティークロマトグラフィーによる測定結果と陽イオン交換クロマトグラフィーによる測定結果との相関を示す図である。
【図２】異常ヘモグロビンＳを含有する血液試料と、異常ヘモグロビンＳを含有しない血液試料について、アフィニティークロマトグラフィーによる測定結果と陽イオン交換クロマトグラフィーによる測定結果との相関を示す図である。
【図３】異常ヘモグロビンＣを含有する血液試料と、異常ヘモグロビンＣを含有しない血液試料について、アフィニティークロマトグラフィーによる測定結果と陽イオン交換クロマトグラフィーによる測定結果との相関を示す図である。
【図４】異常ヘモグロビンＤ、異常ヘモグロビンＳ及び異常ヘモグロビンＣを含有しない血液試料について、陽イオン交換クロマトグラフィーによって得られたクロマトグラムである。
【図５】異常ヘモグロビンＤを含有する血液試料について、陽イオン交換クロマトグラフィーによって得られたクロマトグラムである。
【図６】異常ヘモグロビンＳを含有する血液試料について、陽イオン交換クロマトグラフィーによって得られたクロマトグラムである。
【図７】異常ヘモグロビンＣを含有する血液試料について、陽イオン交換クロマトグラフィーによって得られたクロマトグラムである。
【図８】異常ヘモグロビンＤを含有する血液試料と、異常ヘモグロビンＤを含有しない血液試料について、アフィニティークロマトグラフィーによる測定結果と、異常ヘモグロビンＤに対応した顕著なピーク（Ｈ−Ｖ０）面積、その他クロマトグラム上のピーク面積情報に基づいて、Ａ１ｃ％を補正することに基づく本発明の方法によって得られた測定結果との相関を示す図である。
【図９】異常ヘモグロビンＳを含有する血液試料と、異常ヘモグロビンＳを含有しない血液試料について、アフィニティークロマトグラフィーによる測定結果と、異常ヘモグロビンＳに対応した顕著なピーク（Ｈ−Ｖ１）面積、その他クロマトグラム上のピーク面積情報に基づいて、Ａ１ｃ％を補正することに基づく本発明の方法によって得られた測定結果との相関を示す図である。
【図１０】異常ヘモグロビンＣを含有する血液試料と、異常ヘモグロビンＣを含有しない血液試料について、アフィニティークロマトグラフィーによる測定結果と、異常ヘモグロビンＣに対応した顕著なピーク（Ｈ−Ｖ２）面積、その他クロマトグラム上のピーク面積情報に基づいて、Ａ１ｃ％を補正することに基づく本発明の方法によって得られた測定結果との相関を示す図である。
【図１１】本発明の測定装置を説明するための図である。
【図１２】本発明の測定装置を説明するための図である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
図１Ａ、図１Ｂ及び図１Ｃは、それぞれ異常ヘモグロビンＤ、異常ヘモグロビンＳ及び異常ヘモグロビンＣを含有する血液試料（それぞれ３８、３３及び５３種）とそれらの異常ヘモグロビンを含有しない血液試料（２２種、白抜き）について、アフィニティークロマトグラフィーによる測定結果と陽イオン交換クロマトグラフィーによる測定結果との相関を示す図である。なお前者については、市販の装置（Ｓｅｂｉａ社  Ｃａｐｉｌｌａｒｙｓ２）により異常ヘモグロビンＤ、異常ヘモグロビンＳ及び異常ヘモグロビンＣを含有することを確認した。
【００２５】
アフィニティークロマトグラフィーによる測定は、市販の装置（Ｔｒｉｎｉｔｙ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社  Ｕｌｔｒａ２）により、陽イオンクロマトグラフィーによる測定は、非多孔性陽イオン交換体カラムを装備した東ソー（株）製自動グリコヘモグロビン分析計ＨＬＣ−７２３Ｇ８（商品名）を用いた陽イオン交換クロマトグラフィーによる測定結果である。
【００２６】
図１Ａ，図１Ｂ及び図１Ｃの縦軸は陽イオン交換クロマトグラフィーによる測定結果、横軸はアフィニティークロマトグラフィーによる測定結果を示し、いずれの結果も全ヘモグロビンに占めるｓＡ１ｃの割合（％）であり、いずれも専用試薬を用いて装置をキャリブレーション後、装置から出力された測定結果をそのままプロットしたものである。
【００２７】
異常ヘモグロビンを含有しない血液試料（２２種、白抜き）ではアフィニティークロマトグラフィーの結果と陽イオン交換クロマトグラフィーの結果は良好な相関性を示したが、異常ヘモグロビンＤ、異常ヘモグロビンＳ又は異常ヘモグロビンＣを含有する血液試料（それぞれ、３８、３３及び５３種、いずれも黒塗り）では、陽イオン交換クロマトグラフィーの結果はアフィニティークロマトグラフィーの結果と比較して低い値を示すことが分かる。
【００２８】
図２は、健常者の血液試料を、陽イオン交換クロマトグラフィー測定に供して得たクロマトグラムの例である。健常者の血液試料では、ヘモグロビンＡのピーク（Ａ０）の後ろに他の成分に由来する顕著なピークは出現しない。一方、図３Ａ，図３Ｂ及び図３Ｃは、それぞれ異常ヘモグロビンＤ、異常ヘモグロビンＳ及び異常ヘモグロビンＣを含有する被験者の血液試料を、陽イオン交換クロマトグラフィー測定に供して得たクロマトグラムの例である。これら図３Ａ，図３Ｂ及び図３Ｃから明らかなように、異常ヘモグロビンＤ、異常ヘモグロビンＳ及び異常ヘモグロビンＣを含有する血液試料では、ヘモグロビンＡの（Ａ０）の後ろに、図２では観察されなかったそれら異常ヘモグロビンに由来する顕著なピーク（それぞれＨ−Ｖ０，Ｈ−Ｖ１及びＨ−Ｖ２）が出現する。
【００２９】
このように、異常ヘモグロビンＤ、異常ヘモグロビンＳ及び異常ヘモグロビンＣに由来するピーク（それぞれＨ−Ｖ０，Ｈ−Ｖ１及びＨ−Ｖ２）は、それらの異常ヘモグロビンを含有しない血液試料のクロマトグラムと比較することにより同定することができる。従って、所定の条件下、Ｈ−Ｖ０，Ｈ−Ｖ１及びＨ−Ｖ２が出現する溶出時間（図の例では、それぞれ１．０分、１．２分、１．３分）を記憶しておけば、同一条件下でｓＡ１ｃの測定を実施する限り、溶出時間から異常ヘモグロビンＤ、異常ヘモグロビンＳ又は異常ヘモグロビンＣに由来するピークを同定することが可能である。
【実施例】
【００３０】
実施例１
異常ヘモグロビンＤを含有する血液試料について、陽イオン交換クロマトグラフィーによって得たクロマトグラム（図３Ａ）において、クロマトグラムの全ピーク面積合計（Ｔｏｔａｌ  ａｒｅａ）及びＡ１ａ、Ａ１ｂ，ＨｂＦ、ＬＡ１ｃ、ｓＡ１ｃ、Ａ´、Ｈ−Ｖ０の各ピーク面積を計算し、式（３）によりＸ１ｃ面積を得て、式（２）によりＡ０面積を確定し、式（１）により、Ａ１ｃ％を算出する本発明の方法を実施した。なお、Ｈ−Ｖ０のピーク検出レンジは１．００±０．０７分とした。
（１）Ａ´のピーク面積
クロマトグラムから、Ａ´のピーク面積を９２１．２と計算した。
（２）αのピーク面積
クロマトグラムから、αのピーク面積を８．０＋６．７＋３８．１＋６３．９＝１１６．７と計算した。
（３）ｓＡ１ｃのピーク面積
クロマトグラムから、ｓＡ１ｃのピーク面積を６３．９と計算した。
（４）Ｘ０のピーク面積
クロマトグラムから、Ｘ０＝Ｈ−Ｖ０のピーク面積を５７６．７と計算した。
（５）βのピーク面積
Ｔｏｔａｌ  ａｒｅａを用いると、ピーク面積に関して、Ｔｏｔａｌ  ａｒｅａ−ＨｂＦ−α−Ａ´−Ｘ０で計算できるので、クロマトグラムから、βのピーク面積を１６４５．２−１２．６−１１６．７−９２１．２−５７６．７＝１８．０と計算した。
（６）Ｘ１ｃの計算
上記の数値を式（３）に代入して、Ｘ１ｃ＝４０．７と計算した。
（７）Ａ０の計算
上で得られたＸ１ｃの値を式（２）に代入して、Ａ０＝８８０．５と計算した。
（８）Ａ１ｃ％の計算
上記で得られた数値を式（１）に代入して、Ａ１ｃ％＝６．４％と計算した。
（９）ＮＧＳＰ値への換算（換算ファクター  １．１１５１、０．６５５８）
ＮＧＳＰ値換算値（％）＝６．４ｘ１．１１５１＋０．６５５８
＝７．８（％）
【００３１】
実施例２
異常ヘモグロビンＳを含有する血液試料について、陽イオン交換クロマトグラフィーによって得たクロマトグラム（図３Ｂ）において、クロマトグラムの全ピーク面積合計（Ｔｏｔａｌ  ａｒｅａ）及びＡ１ａ、Ａ１ｂ，ＨｂＦ、ＬＡ１ｃ、ｓＡ１ｃ、Ａ´、Ｈ−Ｖ１の各ピーク面積を計算し、式（３）によりＸ１ｃ面積を得て、式（２）によりＡ０面積を確定し、式（１）により、Ａ１ｃ％を算出する本発明の方法を実施した。なお、Ｈ−Ｖ１のピーク検出レンジは１．１６±０．０９分とした。
（１）Ａ´のピーク面積
クロマトグラムから、Ａ´のピーク面積を８９９．０と計算した。
（２）αのピーク面積
クロマトグラムから、αのピーク面積を１１．８＋７．８＋３１．４＋７８．６＝１２９．６と計算した。
（３）ｓＡ１ｃのピーク面積
クロマトグラムから、ｓＡ１ｃのピーク面積を７８．６と計算した。
（４）Ｘ０のピーク面積
クロマトグラムから、Ｘ０＝Ｈ−Ｖ１のピーク面積を５７３．６と計算した。
（５）βのピーク面積
Ｔｏｔａｌ  ａｒｅａを用いると、ピーク面積に関して、Ｔｏｔａｌ  ａｒｅａ−ＨｂＦ−α−Ａ´−Ｘ０で計算できるので、クロマトグラムから、βのピーク面積を１６１９．０−１０．５−１２９．６−８９９．０−５７３．６＝６．３と計算した。
（６）Ｘ１ｃの計算
上記の数値を式（３）に代入して、Ｘ１ｃ＝５０．７と計算した。
（７）Ａ０の計算
上で得られたＸ１ｃの値を式（２）に代入して、Ａ０＝８４８．３と計算した。
（８）Ａ１ｃ％の計算
上記で得られた数値を式（１）に代入して、Ａ１ｃ％＝８．０％と計算した。
（９）ＮＧＳＰ値への換算（換算ファクター  １．１１５１、０．６５５８）
ＮＧＳＰ値換算値（％）＝８．０ｘ１．１１５１＋０．６５５８
＝９．６（％）
【００３２】
実施例３
異常ヘモグロビンＣを含有する血液試料について、陽イオン交換クロマトグラフィーによって得たクロマトグラム（図３Ｃ）において、Ａ１ａ、Ａ１ｂ，ＬＡ１ｃ、ｓＡ１ｃ、Ａ０の各ピーク面積を計算し、式（４）により、Ａ１ｃ％を算出する本発明の方法を実施した。なお、Ｈ−Ｖ２のピーク検出レンジは１．３４±０．０９分とした。
（１）Ａ０のピーク面積
クロマトグラムから、Ａ０のピーク面積を１１４０．３と計算した。
（２）αのピーク面積
クロマトグラムから、αのピーク面積を１０．８＋１１．８＋３４．８＋８９．９＝１４７．３と計算した。
（３）ｓＡ１ｃのピーク面積
クロマトグラムから、ｓＡ１ｃのピーク面積を８９．９と計算した。
（８）Ａ１ｃ％の計算
上記で得られた数値を式（４）に代入して、Ａ１ｃ％＝６．７％と計算した。
（９）ＮＧＳＰ値への換算（換算ファクター  １．１１５１、０．６５５８）
ＮＧＳＰ値換算値（％）＝６．７ｘ１．１１５１＋０．６５５８
＝８．１（％）
【００３３】
実施例４
図１Ａ、１Ｂ、１Ｃに示した異常ヘモグロビンＤ、Ｓ及びＣを含有する血液試料を陽イオンクロマトグラフィーによる測定に供して得られたクロマトグラムについて、実施例１、２、３で示した本発明を適用した結果をそれぞれ図４Ａ、４Ｂ及び４Ｃに示す。これらに示したように、本発明を適用した結果、アフィニティークロマトグラフィーによる測定結果との差が改善され、相関係数の傾きは図１Ａ、１Ｂ、１Ｃにおける場合より、それぞれ０．８８４１から０．９７３１、０．８７６７から０．９７３２及び０．８９１９から１．０１８と改善された。
【符号の説明】
【００３４】
１    陽イオン交換クロマトグラフィー装置
１１  試料導入手段
１２  送液手段
１３  分離手段
１４  検出手段
１５  分析手段
１６  ベースライン設定モジュール
１７  ピーク同定モジュール
１８  ピーク面積計算モジュール
１９  ｓＡ１ｃ割合計算モジュール
２０  出力手段
【図１】
0006780290.tif 000004
【図２】
0006780290.tif 000005
【図３】
0006780290.tif 000006
【図４】
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【図５】
0006780290.tif 000008
【図６】
0006780290.tif 000009
【図７】
0006780290.tif 000010
【図８】
0006780290.tif 000011
【図９】
0006780290.tif 000012
【図１０】
0006780290.tif 000013
【図１１】
0006780290.tif 000014
【図１２】
0006780290.tif 000015