(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトにおけるＭ２ハプロタイプ妊娠を処置するための、有効量の抗凝固剤を含む組成物であって、前記組成物は、Ｍ２ハプロタイプ妊娠の生物学的母親に投与され、ここで、前記Ｍ２ハプロタイプ妊娠が、生物学的母親または生物学的父親のいずれかがＡＮＸＡ５  Ｍ２ハプロタイプのキャリアであることによって同定され、前記抗凝固剤は：
ａ．妊娠する前の１日以内、２日以内、３日以内、４日以内、５日以内、６日以内、７日以内、８日以内、９日以内、１０日以内、１１日以内、１２日以内、１３日以内、または１４日以内に；および／または
ｂ．着床と同時に；および／または
ｃ．体外受精と同時に；および／または
ｄ．妊娠の１日以内、２日以内、３日以内、４日以内、５日以内、６日以内、７日以内、８日以内、９日以内、１０日以内、１１日以内、１２日以内、１３日以内、または１４日以内に；および／または
ｅ．妊娠の判明の１日以内、２日以内、３日以内、４日以内、５日以内、６日以内、７日以内、８日以内、９日以内、１０日以内、１１日以内、１２日以内、１３日以内、または１４日以内に
投与されることを特徴とする、組成物。
【請求項２】
前記生物学的母親および前記生物学的父親の両方が、ＡＮＸＡ５  Ｍ２ハプロタイプのキャリアである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記抗凝固剤がＬＭＷＨである、請求項１〜２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４】
前記母親が、体外受精を経験している、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記抗凝固剤が、産む直前まで妊娠中毎日投与される、および／または、産んだ後さらに６週間にわたって投与される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記母親が、産科合併症の増加したリスクを有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
前記産科合併症が、不育症（ＲＰＬ）、体外受精（ＩＶＦ）の失敗、着床の失敗、胎児発育不全（ＦＧＲ）、在胎不当過小（ＳＧＡ）新生児、子宮内胎児死亡（ＩＵＦＤ）、妊娠高血圧（ＧＨ）、子癇前症（ＰＥ）、および／または静脈血栓塞栓症（ＶＴＥ）から選択される、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記母親または父親のＡＮＸＡ５  Ｍ２キャリア状態が、ＰＣＲ、配列決定技術またはＩＨＧテクノロジーによって決定される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
前記キャリア状態が、蛍光分子、少なくとも１０ヌクレオチドを含むオリゴマー、または固相を使用して検出される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記固相が、ビーズまたはプレートである、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記固相が、プラスチック、シリコン、ガラス、ポリスチレン、アルミニウム、鋼、鉄、銅、ニッケル、銀、金、ニトロセルロース、またはナイロンを含む、請求項９または１０に記載の組成物。
【請求項１２】
少なくとも１５ヌクレオチド長を有するオリゴマーを使用して、ＡＮＸＡ５  Ｍ２ハプロタイプを検出する、請求項９に記載の組成物。
【請求項１３】
前記配列決定技術が、次世代配列決定技術を利用する、請求項８〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
妊娠率を増大させる、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、妊娠前または後に両親（男性および女性の両方）のアネキシンＡ５  Ｍ２ハプロタイプのキャリア状態を決定して、不育症（ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｅｇｎａｎｃｙ  ｌｏｓｓ）（ＲＰＬ）、不妊（例えば、原因不明の男性不妊、原因不明の女性不妊、未知の原因の不妊など）、体外受精（ＩＶＦ）の失敗、子宮内受精（ＩＵＩ）の失敗、胎児発育不全（ｆｏｅｔａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ）（ＦＧＲ）、在胎不当過小（ｓｍａｌｌ  ｆｏｒ  ｇｅｓｔａｔｉｏｎａｌ  ａｇｅ）（ＳＧＡ）新生児、子宮内胎児死亡（ＩＵＦＤ）、妊娠高血圧（ＧＨ）、子癇前症（ＰＥ）、および／または静脈血栓塞栓症（ＶＴＥ）を含むが、これらに限定されない、妊娠合併症のリスクを最小にすることに関する。Ｍ２キャリア状態が決定されると、低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）および／または他の抗凝固剤の投与を含む介入方法が、妊娠前および／または後のいずれかに投与され得る。さらに、生児出生および／もしくはＩＶＦ着床率を増大させる方法、ならびに／または臨床的流産を低下させる方法も企図される。キャリア状態を検出する方法、ならびに患者および／またはカップルのＭ２キャリア状態に基づき診断する、およびまたは予後を予測する方法も企図される。
【背景技術】
【０００２】
血栓形成傾向は、不都合な妊娠結果の主要な原因であり（Ｍａｒｋｏｆｆら、２０１１年）、胎盤脈管構造の機能障害が、不育症（ＲＰＬ）、子宮内胎児死亡（ＩＵＦＤ）、妊娠高血圧（ＧＨ）、子癇前症（ＰＥ）、静脈血栓塞栓症（ＶＴＥ）、胎児発育不全（ＦＧＲ）、および在胎不当過小（ＳＧＡ）新生児のリスクを増大させることを示唆する証拠が増えている（Ｙｏｕｎｉｓら、２００３年；Ｇｒａｎｄｏｎｅら、２００３年；Ｃｈｉｎｎｉら、２００９年；Ｔｉｓｃｉａら、２００９年；Ｇｒａｎｄｏｎｅら、２０１０年；Ｔｉｓｃｉａら、２０１２年）。
【０００３】
正常妊娠は後天性過凝固状態であり、それ故に、血栓形成傾向の遺伝的素因を有する女性は、妊娠中または産褥期中に凝固欠損の臨床兆候を新規に発症し得る（Ｒｅｙら、２００３年；Ｃｈｕｎｉｌａｌら、２００９年）。遺伝性血栓形成傾向因子の素因となる役割がいくつかの臨床研究（Ｒｏｄｇｅｒら、２０１０年）において報告されており、歴史的に、患者の大部分において、遺伝性因子は第Ｖ因子ライデン（ＦＶＬ）またはプロトロンビン（ＰＴｍ）であった（Ｂｉｃｋら、２０００年）。しかしながら、２００７年に、ＲＰＬおよびさらに血栓形成傾向に関連する産科の合併症の新規の遺伝性因子が同定された（Ｂｏｇｄａｎｏｖａら、２００７年；Ｃｈｉｎｎｉら、２０１０年）。Ｍ２ハプロタイプと呼ばれるこの欠損は、アネキシンＡ５  ＡＮＸＡ５遺伝子のコアプロモーターにおける配列バリエーションである。これは、コアプロモーターにおける４個の連続するヌクレオチド置換からなり、非キャリアと比較されたとき、Ｍ２ハプロタイプキャリア由来の胎盤においてＡＮＸＡ５の発現の低減をもたらす。
【０００４】
アネキシンＡ５は、カルシウムおよびリン脂質を結合する特性を共有するアネキシンタンパク質ファミリーのメンバーである。それは、多くは、腎臓、肝臓、および胎盤において大量かつ一様に分布する（Ｍｏｒｇａｎら、１９９８年）。それは、母系と胎児循環の界面である、胎盤合胞体栄養細胞層の先端の膜において最大量である。ＡＮＸＡ５は、元々、「胎盤抗凝固性タンパク質」と呼ばれた。それは、ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏ両方において大規模で研究された（Ｔｈｉａｇａｒａｊａｎら、１９９０年；Ｒｏｍｉｓｃｈら、１９９１年）。それは、リン脂質結合活性と関連する強力な抗凝固性質を有し、細胞外で見られる数種類のアネキシンの１つである（Ｇｅｒｋｅら、２００５年）。ＡＮＸＡ５の細胞膜上で２次元凝集物を形成する能力は、ＡＮＸＡ５が、この部位のリン脂質を凝血反応についての利用可能性から遮蔽し、これにより、胎盤における血液流動性の維持に寄与することを仮定する、ＡＮＸＡ５「保護的遮蔽」モデルの展開を導いた。
【０００５】
アネキシン５は、抗リン脂質症候群（ＡＰＳ）を有する患者の胎盤において欠損しており、血管内皮におけるアネキシン５の抗リン脂質抗体により媒介される低減はまた、全身の血栓症にも寄与し得る（Ｒａｎｄ、１９９９年）。Ｂｏｇｄａｎｏｖａら（２０１２年）は、アネキシンＡ５の保護的遮蔽モデルを再考し、産科ＡＰＳを有するループス抗凝固患者（ＬＡＣ陽性）３０人のコホートの予備的遺伝子型判定分析が、３０人のうち１１人がＭ２キャリアであったことを明らかにし、これは、産科抗リン脂質抗体（ａＰＡ）を発生する３倍の相対的リスクを示唆していることを報告した。
【０００６】
胎盤組織を調べた際の非常に予備的なデータにおいて、Ｍａｒｋｏｆｆら（２０１０年）は、Ｍ２／ＡＮＸＡ５胎盤（ＦＧＲおよび／またはＰＥを有する女性由来のものを含む）におけるＡＮＸＡ５発現の低下が、Ｍ２ハプロタイプの保因の結果であることだけでなく、これは、親起源に関わらず起こる可能性があり、母系全体というよりむしろ胚により誘導されるリスクに対して明らかな影響を及ぼすことも示唆した。彼らは、正常なＡＮＸＡ５対立遺伝子が、観察したメッセンジャーＲＮＡレベルのＭ２対立遺伝子特異的な低下を補償しないことを観察し、父系の血栓形成傾向遺伝子がＲＰＬと関連しない（Ｔｏｔｈら、２００８年）、ＦＶＬおよびＰＴｍと異なり、Ｍ２／ＡＮＸＡ５が胚を介して作用することを示唆した。
【０００７】
これは、ＲＰＬの全ての他の原因が排除された（遺伝性血栓形成傾向およびＡＰＳを含む）ＲＰＬカップル３０組のパイロット研究を導いた。この小規模かつ検出力がない（ｎｏｔ  ｐｏｗｅｒｅｄ）サンプリングにおいて、研究は、これらのＲＰＬカップルにおける男性および女性が、対照集団と比較したとき、同等および増大したＭ２キャリアシップを有し得ることを示唆した。著者らは、Ｍ２／ＡＮＸＡ５ハプロタイプの父系および母系保因が、ＲＰＬと関連し、同等のリスクを与え得ると結論付けた。彼らは、Ｍ２／ＡＮＸＡ５が、胚の抗凝血に影響することにより、妊娠病理を生じる遺伝性要因の第１の例であり得るとさらに仮定した（Ｒｏｇｅｎｈｏｆｅｒら、２０１２年）。
【０００８】
Ｕｅｋｉらは、２０１２年、彼らのノックアウトマウスモデルにおいて、ＡＮＸＡ５ヌルマウス（ＡＮＸＡ５−ＫＯ）の産仔数および仔体重の両方において有意な低減を見出し、したがって、ＡＮＸＡ５の循環への母系供給が、正常妊娠を維持するのに重大であったことを示した。彼らは、ＡＮＸＡ５−ＫＯとＷＴマウスの交配で、ＡＮＸＡ５−ＫＯ雌を使用して産んだ同腹仔のみ仔の数が低減したことをさらに観察した。彼らはまた、妊娠日数１２、１４および１６でのＡＮＸＡ５−ＫＯマウスへのヘパリンの投与が、産仔数を有意に増大させたことを示した。
【０００９】
しかしながら、これらの動物の研究をヒトまで拡大したとき、低分子量ヘパリンの使用は、有益な作用を示さなかった。例えば、学術誌Ｌａｎｃｅｔにおいて報告されたＲｏｄｇｅｒらにおいて、「既に公開された高品質な証拠」が存在し、これは、「以前に妊娠喪失を有する女性、以前に重篤でないもしくは後期発症の子癇前症を有する女性、または以前にパーセンタイル５〜１０の間の在胎不当過小出生を有する女性において分娩前の低分子量ヘパリンは有益ではない」ことを示唆する。Ｒｏｄｇｅｒら、「Ａｎｔｅｐａｒｔｕｍ  Ｄａｌｔｅｐａｒｉｎ  Ｖｅｒｓｕｓ  Ｎｏ  Ａｎｔｅｐａｒｔｕｍ  Ｄａｌｔｅｐａｒｉｎ  Ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｐｒｅｇｎａｎｃｙ  Ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｉｎ  Ｐｒｅｇｎａｎｔ  Ｗｏｍｅｎ  Ｗｉｔｈ  Ｔｈｒｏｍｂｏｐｈｉｌｉａ  （ＴＩＰＰＳ）：Ａ  Ｍｕｌｔｉｎａｔｉｏｎａｌ  Ｏｐｅｎ−Ｌａｂｅｌ  Ｒａｎｄｏｍｉｓｅｄ  Ｔｒｉａｌ」、Ｌａｎｃｅｔ、２０１４年１１月８日；３８４巻（９９５５号）：１６７３〜８３頁を参照のこと。それ故に、著者らは、この未解決問題を統計的な根拠で最終的に解くために、十分に検出力のある研究（実施するのに１２年かかった）を設計した。具体的には、Ｒｏｄｇｅｒｓらは以下と説明した。
【００１０】
我々の無作為化試験は、以前に静脈血栓症を有しない血栓形成傾向の女性が、分娩前の低分子量ヘパリンは有益ではないことを最初に示す。我々のメタ分析は、より質の低い根拠が、低分子量ヘパリンは胎盤により媒介される反復性の重篤な妊娠合併症（重篤または早期発症子癇前症、パーセンタイル５未満の在胎不当過小出生、および胎盤剥離）を防ぎ得ることを示唆することを示すが、我々は、我々の試験の亜群分析においてこの有益性を記録しなかった。
Ｒｏｄｇｅｒら、９頁。
【００１１】
筆者らはさらに述べた：
この試験は、巨大かつ脆弱な患者群において鍵となる治療課題に取り組む。有益性の欠如は、重要な知見である。１９９０年代半ばの血栓形成傾向と妊娠合併症の関連の発見は、以前に妊娠合併症を有した、血栓形成傾向を有するおよび有しない、妊娠中の女性における低分子量ヘパリンの広く普及した適応外の使用を導いた。この適応外の使用は、専門家の意見、コンセンサスパネル、および有益性を示唆する小規模な非無作為化研究と合わさってこれらの合併症の感情的結果によりあおられた。分娩前の低分子量ヘパリンは、害のない介入ではなく、それは、ヘパリンにより誘導される血小板減少症（稀ではあるが）、硬膜外鎮痛の保留、ならびに我々の試験において示した通り、微量の出血の増大、アレルギー反応、皮膚反応、肝臓トランスアミナーゼ濃度の上昇、および分娩誘発のリスクを併発する可能性がある。加えて、１回の妊娠期間当たり最大４００回の薬物の皮下注射は、個人的負担および経済的負担の両方である。臨床医および患者にとって、分娩前の期間を通じたダルテパリンの使用は骨ミネラル密度の有意な変化を導かないことが再保証された。最後に、有効でない治療を信じ続けることは、静脈血栓塞栓症および妊娠合併症のリスクのある女性のための有効な処置のさらなる研究の妨げとなる。
Ｒｏｄｇｅｒ、８頁。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｒｏｇｅｎｈｏｆｅｒ，Ｎら、Ｆｅｒｔｉｌ．Ｓｔｅｒｉｌ．（２０１２）９８（２）３８３〜３８８
【非特許文献２】Ｕｅｋｉ  Ｈら、Ｓｃｉ  Ｒｅｐ．（２０１２）２：８２７
【非特許文献３】Ｒｏｄｇｅｒら、Ｌａｎｃｅｔ（２０１４）３８４（９９５５）１６７３〜８３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
故に、ＡＮＸＡ５  Ｍ２ハプロタイプにより引き起こされる血栓形成傾向と関連する妊娠合併症を低減する改良された方法の必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
この概要は、発明を実施するための形態においてさらに後述される、簡略化された形式の概念の選択を導入するために提供される。この概要は、請求される主題の鍵となる特性または必須の特性を同定することを意図されず、請求される対象の範囲を決定する際の補助として使用されることも意図されない。
【００１５】
本発明は、Ｍ２ハプロタイプ妊娠を処置する方法であって、Ｍ２ハプロタイプ妊娠が、生物学的母親または生物学的父親のいずれかがＡＮＸＡ５  Ｍ２ハプロタイプのキャリアであると決定されるとき、同定され、次に、Ｍ２ハプロタイプ妊娠の母親が、有効量の抗凝固剤を投与される、方法に関する。驚くべきことに、かつ他の臨床試験において得られた結果と対照的に、抗凝固剤が、受胎、子宮内受精、胚移植および／または着床の直前、同時、および／または直後に投与される場合に、生児出生率が実質的に改善される。一部の実施形態では、生物学的母親および生物学的父親の両方が、Ａ５  Ｍ２ハプロタイプのキャリアであることが見出される。
【００１６】
本発明の他の実施形態は、産科の合併症を低減する方法であって、Ｍ２ハプロタイプ妊娠を同定するステップであって、前記Ｍ２ハプロタイプ妊娠が、生物学的母親または生物学的父親のいずれかがＡＮＸＡ５  Ｍ２ハプロタイプのキャリアであるときに存在するステップと、次に、Ｍ２ハプロタイプ妊娠の母親に有効量の抗凝固剤を投与するステップとを含み、前記抗凝固剤が産科の合併症のリスクを低減する、方法を含む。好ましくは、抗凝固剤は、受胎、子宮内受精、胚移植および／または着床の直前、同時、および／または直後に投与される。他の実施形態では、抗凝固剤は、少なくとも４週間、少なくとも８週間、少なくとも１２週間、または少なくとも１６週間投与される。産科の合併症の例は、不育症（ＲＰＬ）、不妊、体外受精（ＩＶＦ）の失敗、子宮内受精（ＩＵＩ）の失敗、胎児発育不全（ＦＧＲ）、在胎不当過小（ＳＧＡ）新生児、子宮内胎児死亡（ＩＵＦＤ）、妊娠高血圧（ＧＨ）、子癇前症（ＰＥ）および／または静脈血栓塞栓症（ＶＴＥ）を含むが、これらに限定されない。
【００１７】
本発明の他の好ましい実施形態は、Ｍ２ハプロタイプ妊娠を決定する方法であって、生物学的母親または生物学的父親のいずれかのＭ２ハプロタイプキャリア状態を同定するステップであって、前記同定がゲノム分析に基づき決定されるステップと、生物学的母親および生物学的父親のＭ２ハプロタイプキャリア状態を記録するステップと、生物学的母親または生物学的父親のいずれかがＡＮＸＡ５  Ｍ２ハプロタイプのキャリアである場合に、Ｍ２ハプロタイプ妊娠が存在するかどうかを報告するステップとを含む、方法を含む。好ましい検出方法は、配列決定、ＰＣＲおよび／またはＳＮＰ検出技術を含む。
【００１８】
Ｍ２キャリア状態が決定されると、低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）および／または他の抗凝固剤の投与を含む、介入方法が、妊娠前および／または後のいずれかに投与され得る。好ましくは、抗凝固剤は、受胎、子宮内受精、胚移植および／または着床の直前、同時、および／または直後に投与される。これにより、生児出生および／もしくはＩＶＦ着床および／もしくは臨床的妊娠率を増大させるさらなる方法、ならびに／または臨床的流産を低下させるさらなる方法が企図される。他の実施形態では、抗凝固剤は、着床率を増大させる。他の実施形態では、抗凝固剤は、胎児心拍の検出前の流産率を低下させる。例えば、好ましい実施形態では、ＡＮＸＡ５  Ｍ２ハプロタイプ妊娠の母親は、妊娠が確立されるとすぐに早期妊娠を検出するための方法を用いて妊娠を検出した直後に抗凝固剤を投与される。他の実施形態では、抗凝固剤は、ＩＶＦ設定において胚移植と同時に投与される。なおさらに好ましい実施形態では、抗凝固剤は、ＩＶＦ設定において妊娠または胚移植前に投与される。他の実施形態では、抗凝固剤は、母親が児を産むまで投与される。
【００１９】
他の好ましい実施形態では、抗凝固剤は低分子量ヘパリン（「ＬＭＷＨ」）である。好ましい実施形態では、抗凝固剤は、体外受精の一部として投与される。母親は、ＩＶＦ処置中、胚移植の時、胚移植前、または胚移植の数日以内にＬＭＷＨを投与されてもよい。好ましくは、ＬＭＷＨなどの抗凝固剤の投与は、胚移植と同時に生じる。他の実施形態では、ＬＭＷＨは、少なくとも４週間、少なくとも８週間、少なくとも１２週間、または少なくとも１６週間投与される。他の実施形態では、ＬＭＷＨは、母親が児を産むまで投与される。
例えば、本発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
Ｍ２ハプロタイプ妊娠を処置する方法であって、
ａ．Ｍ２ハプロタイプ妊娠を同定するステップであって、前記Ｍ２ハプロタイプ妊娠が、生物学的母親または生物学的父親のいずれかがＡＮＸＡ５  Ｍ２ハプロタイプのキャリアであるときに存在する、ステップと、
ｂ．Ｍ２ハプロタイプ妊娠の前記母親に有効量の抗凝固剤を投与するステップと
を含む、方法。
（項目２）
前記生物学的母親および前記生物学的父親の両方が、ＡＮＸＡ５  Ｍ２ハプロタイプのキャリアである、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記抗凝固剤が、前記母親が妊娠した後に投与される、項目１または項目２のいずれかに記載の方法。
（項目４）
前記抗凝固剤が、胚移植の時と同時、またはそのすぐ後に投与される、項目１または項目２のいずれかに記載の方法。
（項目５）
前記抗凝固剤が、妊娠前に投与される、項目１または項目２のいずれかに記載の方法。
（項目６）
前記抗凝固剤がＬＭＷＨである、項目１〜５のいずれか一項に記載の方法。
（項目７）
前記母親が、体外受精または子宮内受精を経験している、項目１〜６のいずれか一項に記載の方法。
（項目８）
産科合併症を低減する方法であって、
ａ．Ｍ２ハプロタイプ妊娠を同定するステップであって、前記Ｍ２ハプロタイプ妊娠が、生物学的母親または生物学的父親のいずれかがＡＮＸＡ５  Ｍ２ハプロタイプのキャリアであるときに存在する、ステップと、
ｂ．Ｍ２ハプロタイプ妊娠の前記母親に有効量の抗凝固剤を投与するステップと
を含み、前記抗凝固剤が産科合併症のリスクを低減する、方法。
（項目９）
前記生物学的母親および前記生物学的父親の両方が、ＡＮＸＡ５  Ｍ２ハプロタイプのキャリアである、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記抗凝固剤が、前記母親が妊娠した後すぐに投与される、項目８または項目９のいずれかに記載の方法。
（項目１１）
前記抗凝固剤が、胚移植または子宮内受精と同時に投与される、項目８または項目９のいずれかに記載の方法。
（項目１２）
前記抗凝固剤が、妊娠前に投与される、項目８または項目９のいずれかに記載の方法。
（項目１３）
前記抗凝固剤がＬＭＷＨである、項目８〜１２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４）
前記母親が、体外受精または子宮内受精を経験している、項目８〜１３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５）
前記産科合併症が、不育症（ＲＰＬ）、不妊、流産、体外受精（ＩＶＦ）の失敗、ＩＵＩの失敗、着床の失敗、胎児発育不全（ＦＧＲ）、在胎不当過小（ＳＧＡ）新生児、子宮内胎児死亡（ＩＵＦＤ）、妊娠高血圧（ＧＨ）、子癇前症（ＰＥ）、および／または静脈血栓塞栓症（ＶＴＥ）である、項目８〜１４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６）
前記不妊が、原因不明の男性不妊、原因不明の女性不妊、または未知の原因の不妊から選択される、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
Ｍ２ハプロタイプ妊娠を決定する方法であって、
ａ．生物学的母親または生物学的父親のいずれかのＭ２ハプロタイプキャリア状態を同定するステップであって、前記同定がゲノム分析に基づき決定される、ステップと、
ｂ．前記生物学的母親および前記生物学的父親のＭ２ハプロタイプキャリア状態を記録するステップと、
ｃ．前記生物学的母親または前記生物学的父親のいずれかがＡＮＸＡ５  Ｍ２ハプロタイプのキャリアである場合に、Ｍ２ハプロタイプ妊娠が存在するかどうかを報告するステップと
を含む、方法。
（項目１８）
前記生物学的母親および前記生物学的父親の両方が、ＡＮＸＡ５  Ｍ２ハプロタイプのキャリアである、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
前記母親が、体外受精またはＩＵＩを経験している、項目１７または１８のいずれかに記載の方法。
（項目２０）
前記同定が、ＰＣＲまたは配列決定技術を使用する、項目１７〜１９のいずれか一項に記載の方法。
（項目２１）
前記同定が、ＩＨＧテクノロジーを使用する、項目１７〜２０のいずれか一項に記載の方法。
（項目２２）
蛍光分子を使用して、ＡＮＸＡ５  Ｍ２ハプロタイプを検出する、項目１７〜２１のいずれか一項に記載の方法。
（項目２３）
前記検出の方法が固相を使用する、項目１７〜２２のいずれか一項に記載の方法。
（項目２４）
前記固相が、ビーズまたはプレートである、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
前記固相が、プラスチック、シリコン、ガラス、ポリスチレン、アルミニウム、鋼、鉄、銅、ニッケル、銀、金、ニトロセルロース、またはナイロンを含む、項目２３または２４のいずれかに記載の方法。
（項目２６）
少なくとも１５ヌクレオチド長を有するオリゴマーを使用して、ＡＮＸＡ５  Ｍ２ハプロタイプを検出する、項目１７〜２５のいずれか一項に記載の方法。
（項目２７）
前記方法が、次世代配列決定技術を利用する、項目１７〜２６のいずれか一項に記載の方法。
（項目２８）
妊娠率を増大させる方法であって、
ａ．Ｍ２ハプロタイプ妊娠を同定するステップであって、前記Ｍ２ハプロタイプ妊娠が、生物学的母親または生物学的父親のいずれかがＡＮＸＡ５  Ｍ２ハプロタイプのキャリアであるときに存在する、ステップと、
ｂ．Ｍ２ハプロタイプ妊娠の前記母親に有効量の抗凝固剤を投与するステップと
を含み、前記抗凝固剤が前記妊娠率を増大させる、方法。
（項目２９）
前記生物学的母親および前記生物学的父親の両方が、ＡＮＸＡ５  Ｍ２ハプロタイプのキャリアである、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
前記抗凝固剤が、前記母親が妊娠した後すぐに投与される、項目２８または項目２９のいずれかに記載の方法。
（項目３１）
前記抗凝固剤が、胚移植またはＩＵＩと同時に投与される、項目２８または項目２９のいずれかに記載の方法。
（項目３２）
前記抗凝固剤が、妊娠前に投与される、項目２８または項目２９のいずれかに記載の方法。
（項目３３）
前記抗凝固剤がＬＭＷＨである、項目２８〜３２のいずれか一項に記載の方法。
（項目３４）
前記母親が、体外受精またはＩＵＩを経験している、項目２８〜３２のいずれか一項に記載の方法。
（項目３５）
前記母親が、不育症（ＲＰＬ）、不妊、流産、体外受精（ＩＶＦ）の失敗、ＩＵＩの失敗、着床の失敗、胎児発育不全（ＦＧＲ）、在胎不当過小（ＳＧＡ）新生児、子宮内胎児死亡（ＩＵＦＤ）、妊娠高血圧（ＧＨ）、子癇前症（ＰＥ）、および／または静脈血栓塞栓症（ＶＴＥ）から選択される産科合併症の増大したリスクを有する、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
前記不妊が、原因不明の男性不妊、原因不明の女性不妊、または未知の原因の不妊から選択される、項目３５に記載の方法。
（項目３７）
治療有効量の抗凝固剤が、少なくとも４週間投与される、項目１〜１６または２８〜３６のいずれか一項に記載の方法。
（項目３８）
前記抗凝固剤が、少なくとも８週間投与される、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
前記抗凝固剤が、少なくとも１２週間投与される、項目３８に記載の方法。
（項目４０）
前記抗凝固剤が、少なくとも１６週間投与される、項目３９に記載の方法。
（項目４１）
前記抗凝固剤が、前記母親が児を産むまで投与される、項目４０に記載の方法。
（項目４２）
治療有効量の抗凝固剤が、着床率を増大させるのに有効である、項目１〜１６または２８〜４１のいずれか一項に記載の方法。
（項目４３）
治療有効量の抗凝固剤が、胎児心拍の検出前の流産率を低下させるのに有効である、項目１〜１６または２８〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、Ｃａｒｃｅｄｏ（２００１年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．、３５６巻、５７１〜５７９頁）、およびＢｏｇｄａｎｏｖａ  Ｎ、Ｈｏｒｓｔ  Ｊ、Ｃｈｌｙｓｔｕｎ  Ｍ、Ｃｒｏｕｃｈｅｒ  ＰＪ、Ｎｅｂｅｌ  Ａ、Ｂｏｈｒｉｎｇ  Ａ、Ｔｏｄｏｒｏｖａ  Ａ、Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ  Ｓ、Ｇｅｒｋｅ  Ｖ、Ｋｒａｗｃｚａｋ  Ｍ、Ｍａｒｋｏｆｆ  Ａにおいて開示されるＡＮＸＡ５プロモーター構造を描写する（配列番号１）。アネキシン（ＡＮＸＡ５）遺伝子プロモーターの一般的なハプロタイプは、不育症と関連する。Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ、２００７年；１６巻：５７３〜７８頁。Ｂｏｇｄａｎｏｖａにおいて報告される通り、図１は、ＡＮＸＡ５遺伝子コアプロモーター領域の構造を示す。境界は縦棒でマーキングし、第１の転写開始点（ｔｓｐ１）の位置に従い番号を付ける。翻訳されないエクソン１は、灰色で網掛けにする。転写因子コンセンサスモチーフは小文字にし、対応する転写因子の略語は配列情報の上にイタリック体で表示する。ＮｏｔＩおよびＢａｍＨＩ制限部位は下線付きにし、プロモーター中のＺ−ＤＮＡストレッチの配列は、イタリック体で示す。転写開始点（ｔｓｐ）を標識するヌクレオチドは下線付きにする。プロモーター機能に重要な領域（モチーフＡならびにＢ）は、ヌクレオチド位置２９５〜３１１および３２８〜３３７に広がる。Ｍ２  ＡＮＸＡ５プロモーターハプロタイプにおける変化したヌクレオチドは、太字で印字し、置換後のヌクレオチドは、それぞれの位置の上部に太い大文字で示す。Ｂｏｇｄａｎｏｖａらにおいて、Ｍ２  ＡＮＸＡ５ハプロタイプ置換の位置は、１９Ｇ→Ａ、１Ａ→Ｃ、２７Ｔ→Ｃ、および７６Ｇ→Ａと指定され（例えば、５７４頁、「結果」の第１の段落を参照のこと）、本明細書における図１において示される２４３Ｇ→Ａ、２６２Ａ→Ｃ、２８８Ｔ→Ｃ、および３３７Ｇ→Ａに対応する。同様に、これらの同一の置換はまた、（１）ＵＳ２０１２／０１７８１５６における配列番号２のヌクレオチド１８６に対応する位置のＧからＡ；（２）ＵＳ２０１２／０１７８１５６における配列番号２のヌクレオチド２０３に対応する位置のＡからＣ；（３）ＵＳ２０１２／０１７８１５６における配列番号２のヌクレオチド２２９に対応する位置のＴからＣ；および（４）ＵＳ２０１２／０１７８１５６における配列番号２のヌクレオチド２７６に対応する位置のＧからＡとも称する。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明の１つまたは複数の実施形態の詳細は、以下の記載において説明される。本発明の他の特性、目的、および利点は、説明および図面から、ならびに特許請求の範囲から明らかであろう。
【００２２】
本発明を詳細に記載する前に、この発明は、自体がもちろん変動し得る具体的に例示される物質またはプロセスパラメーターに制限されないことは理解されるべきである。本明細書において使用される専門用語は、本発明の特定の実施形態のみを記載する目的のためであり、本発明を記載する代替の専門用語の使用の制限であることは意図されないことも理解されるべきである。
【００２３】
上記または下記に関わらず、本明細書において引用される全ての刊行物、特許および特許出願は、全ての目的のためその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００２４】
本明細書および添付の特許請求の範囲において用いられる、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈がそうでないことを明確に指示しない限り、複数の指示対象を含む。例えば、「ポリヌクレオチド」への参照は、２つまたはそれ超のかかるポリヌクレオチド分子または複数のかかるポリヌクレオチド分子の混合物を含む。
【００２５】
本明細書において用いられる、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などのそのバリエーションは、任意の列挙された完全体（例えば、特性、構成要素、特徴、特性、方法／プロセスステップ、もしくは制限）または完全体の群（例えば、複数の特性、構成要素、特徴、性質、方法／プロセスステップ、もしくは制限）の包含を示すが、任意の他の完全体または完全体の群の排除を示さないことは読み取られるべきである。したがって、本明細書において用いられる、用語「含むこと」は、包括的であり、さらなる、列挙されていない完全体または方法／プロセスステップを排除しない。
【００２６】
本明細書において提供される組成物および方法のいずれかの実施形態では、「含むこと」は、「から本質的になる」または「からなる」と置き換えられ得る。語句「から本質的になる」を本明細書において使用して、特定の完全体またはステップ、ならびに請求される発明の特徴もしくは機能に実質的に影響しないものが必要とされる。本明細書において用いられる、用語「からなる」を使用して、列挙される完全体（例えば、特性、構成要素、特徴、性質、方法／プロセスステップ、もしくは制限）または完全体の群（例えば、複数の特性、構成要素、特徴、性質、方法／プロセスステップ、もしくは制限）のみの存在が示される。
【００２７】
本発明は、以下により詳細に記載される。
【００２８】
Ａ．定義
本発明において、「Ｍ２ハプロタイプ妊娠」または「ＡＮＸＡ５  Ｍ２ハプロタイプ妊娠」は、生物学的母親および／または生物学的父親のいずれかがアネキシンＡＮＸＡ５  Ｍ２ハプロタイプのキャリアである妊娠として定義される。「Ｍ２ハプロタイプ妊娠」は、生物学的母親がこれから妊娠する状況も含むことが企図される。さらに、代理母の状況において、ドナー卵子および／または精子の両方が、ならびにレシピエントである母親が自身のリスクについてスクリーニングされるべきである。
【００２９】
本発明において、「アネキシンＡ５  Ｍ２ハプロタイプ」、「Ｍ２ハプロタイプ」、または「ＡＮＸＡ５  Ｍ２ハプロタイプ」（配列番号２）は、アネキシン（ＡＮＸＡ５）プロモーターにおける置換として定義され、置換は、
（ｉ）図１のヌクレオチド２４３に対応する位置の点変異ＧからＡ；
（ｉｉ）図１のヌクレオチド２６２に対応する位置の点変異ＡからＣ；
（ｉｉｉ）図１のヌクレオチド２８８に対応する位置の点変異ＴからＣ；および
（ｉｖ）図１のヌクレオチド３３７に対応する位置の点変異ＧからＡ
である。
【００３０】
本発明において、「Ｍ１ハプロタイプ」、「アネキシンＡ５  Ｍ１ハプロタイプ」、または「ＡＮＸＡ５  Ｍ１ハプロタイプ」（配列番号３）はまた、ＷＯ２００６／０５３７２５およびＢｏｇｄａｎｏｖａらにおいても開示され、次の２つのヌクレオチド交換、（１）図１のヌクレオチド２６２に対応する位置のＡからＣ、および（２）図１のヌクレオチド２８８に対応する位置のＴからＣにより特徴付けられる。
【００３１】
本発明において、「抗凝固剤」は、血餅形成を防ぐため、または形成された血餅が拡大することを防ぐために使用される薬物として定義される。抗凝固薬物は、凝固因子または血小板の作用をブロックすることにより、血餅形成を阻害する。抗凝固薬物は、３つの群：凝固因子合成の阻害剤、トロンビンの阻害剤、および抗血小板薬物に分類される。抗凝固剤は、胚移植もしくはＩＵＩの時（例えば、同一の手法と同時に、および／または同一の手法中に）、例えば、または受胎、着床、ＩＵＩ、胚移植、妊娠、および／または妊娠の判明後すぐに（例えば、１日以内、２日以内、３日以内、４日以内、５日以内、６日以内、７日以内、８日以内、９日以内、１０日以内、１１日以内、１２日以内、１３日以内、または１４日以内）に投与され得る。抗凝固剤は、少なくとも４週間、少なくとも８週間、少なくとも１２週間、または少なくとも１６週間投与され得る。抗凝固剤は、母親が児を産むまで投与され得る。加えて、抗凝固剤は、妊娠、受胎、着床、ＩＵＩ、および／または胚移植の直前（例えば、１日以内、２日以内、３日以内、４日以内、５日以内、６日以内、７日以内、８日以内、９日以内、１０日以内、１１日以内、１２日以内、１３日以内、または１４日以内）に投与され得る。
【００３２】
抗凝固剤の好ましい例は、低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）またはアスピリン、好ましくは、低用量アスピリンを含むが、これらに限定されない。
【００３３】
特に好ましい実施形態では、低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）は、妊娠中の母親に投与される。ＬＭＷＨは、多数の異なる市販の供給源によって購入することができる。本発明において、ＬＭＷＨは、処置する医師の判断に基づき、産む直前まで妊娠中毎日、患者に投与され得る。Ｍ２ハプロタイプの女性キャリアはまた、産んだ後およびその後６週間、ＬＭＷＨを与えられて、静脈血栓塞栓症（ＶＴＥ）のリスクを低減すべきである。ＬＭＷＨは、胚移植もしくはＩＵＩの時（例えば、同一の手法と同時に、および／または同一の手法中に）、例えば、または受胎、着床、ＩＵＩ、胚移植、妊娠、および／または妊娠の判明後すぐに（例えば、１日以内、２日以内、３日以内、４日以内、５日以内、６日以内、７日以内、８日以内、９日以内、１０日以内、１１日以内、１２日以内、１３日以内、または１４日以内）に投与され得る。ＬＭＷＨは、少なくとも４週間、少なくとも８週間、少なくとも１２週間、または少なくとも１６週間投与され得る。ＬＭＷＨは、母親が児を産むまで投与され得る。加えて、ＬＭＷＨは、妊娠、受胎、着床、ＩＵＩ、および／または胚移植の直前（例えば、１日以内、２日以内、３日以内、４日以内、５日以内、６日以内、７日以内、８日以内、９日以内、１０日以内、１１日以内、１２日以内、１３日以内、または１４日以内）に投与され得る。
【００３４】
本明細書において用いられる、語句「同時に」は、受精、ＩＵＩ、受胎、および／または胚移植を経験した数時間以内として定義される。好ましくは、「数時間以内」は、受精、ＩＵＩ、受胎、および／または胚移植を経験した３０分、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０時間以内として定義される。
【００３５】
本明細書において用いられる、「子宮内受精」または「ＩＵＩ」は、精子の濃縮溶液が、卵巣からの卵子放出の前後に子宮または膣に直接置かれる、一種の人工授精を指す。ＩＵＩは、卵巣からの放出された卵子の数を増大させるためのホルモンおよび／または他の薬物（例えば、クロミッドなど）と共にまたは無しで行われてもよい。
【００３６】
本発明において、「産科の合併症」は、血栓形成傾向および／または障害された胎盤脈管構造に起因する、妊娠中に生じる合併症として定義される。産科合併症の例は、不育症（ＲＰＬ）、不妊、体外受精（ＩＶＦ）の失敗、ＩＵＩの失敗、胎児発育不全（ＦＧＲ）、在胎不当過小（ＳＧＡ）新生児、子宮内胎児死亡（ＩＵＦＤ）、死産、妊娠高血圧（ＧＨ）、子癇前症（ＰＥ）、および／または静脈血栓塞栓症（ＶＴＥ）を含むが、これらに限定されない。
【００３７】
本発明において、抗凝固剤は、着床率を増大させるのに有効である。他の実施形態では、抗凝固剤は、早期流産（すなわち、胎児心拍の検出前）率を低下させるのに有効である。
【００３８】
本発明において、「不妊」は、排卵をモニターすることにより、および／または妊娠の機会を増加させるためのホルモンおよび／または他の薬物（例えば、クロミッド）を投与されることにより妊娠を試みてもカップルが妊娠できないこととして定義される。不妊の例は、原因不明の男性不妊、原因不明の女性不妊、および／または未知の原因の不妊を含むが、これらに限定されない。
【００３９】
本明細書において記載される実施形態の文脈において、女性対象が、本明細書において言及される「生物学的父親」により妊娠したことは理解されるであろう。したがって、本明細書において用いられる、用語「生物学的父親」は、本明細書において定義される女性対象のヒト胚の生物学的父親を意味する。一部の実施形態では、女性対象は、既に妊娠しており、それ故、「生物学的母親」であり、他の実施形態では、女性対象は、まだ妊娠しておらず、それ故、予定の「生物学的母親」である。
【００４０】
それ故、用語「予定の生物学的父親」は、女性対象がヒト男性対象によりまだ妊娠していないが、ヒト女性対象が前記ヒト男性対象により妊娠することが予定されることを意味する。その間、女性対象はまた、「予定の」生物学的母親である。女性対象が前記ヒト男性対象により妊娠すると、「予定の生物学的父親」は「生物学的父親」になり、「予定の生物学的母親」は「生物学的母親」になる。
【００４１】
それ故、本発明の方法は、女性対象が予定の生物学的父親によりまだ妊娠していない、すなわち、女性および／または予定の生物学的母親ならびに予定の生物学的父親が、妊娠前に、女性対象の産科の合併症に対する素因を検査することを計画する状況を包含する。これは、例えば、自然生殖または体外受精のいずれかによって、児を持つことを計画するカップル、または妊娠することを計画する女性を含む。
【００４２】
本発明の方法を使用して、生児出生率を増大させ、着床の発生率を増大させ、臨床的妊娠の発生率を増大させ、および／または臨床的流産率を低下させることができる。本発明において、語句「生児出生」は、児が満期であるかどうかに関わらず、生児を産むことに成功したことと定義される。
【００４３】
「臨床的流産」は、受精された胚（例えば、体外受精中、胚移植）が臨床的流産または生児出生をもたらすかどうかとして定義される。患者は、妊娠が、例えば、胎児心臓を検出する超音波スキャンにより確認され得ると「臨床的妊娠」期に達する。
【００４４】
本発明の「着床」は、胚の子宮壁に接着する能力（たとえ一時的でも）を指す。
【００４５】
本発明の方法は、女性対象が既に妊娠している状況をさらに包含する。かかる場合において、生物学的父親の試料を検査すること、および／または胚自体の胚性試料を検査すること（例えば、いずれも胚起源の試料となる、循環胎児細胞により、絨毛膜生検により、もしくは羊水穿刺により）のいずれかにより、女性対象の産科の合併症に対する素因を検査することを依然望んでいる可能性がある。加えて、排他的はないが、（予定の）生物学的母親を検査することも予想される。
【００４６】
受精がｉｎ  ｖｉｔｒｏ、すなわち、体外受精により行われるならば、前記女性対象へのその着床前に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精された胚の桑実胚期前または中に得られる単一細胞試料を分析することも想定される。
【００４７】
「桑実胚期」は、ヒト胚形成の１６細胞期を表す。「桑実胚期前または中」は、１６細胞期前、例えば、ヒト胚形成の６〜８細胞期中に１つの単一細胞を得ることも想定されることを意味する。
【００４８】
体外受精（ＩＶＦ）は、卵子細胞が子宮の外側、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで精子により受精される、周知のプロセスである。
【００４９】
精子ドナーによる妊娠が予定される女性は、それぞれの女性対象の体外受精のため使用する前に、それぞれの精子ドナー試料を検査し、次に、受胎、子宮内受精、胚移植、および／または着床の前、同時、および／または直後に抗凝固剤で処置することにより、産科の合併症に対するその素因を検査するために、本発明の方法を使用することも想定される。それ故、本発明および特に本発明の方法はまた、リスクハプロタイプＭ２のキャリアでない精子ドナーを選択する層別化方法も包含する。
【００５０】
したがって、本発明の方法により、それぞれの女性対象の産科の合併症に対する素因におそらく寄与しないであろう精子ドナーを検出すること、続いて選択することも可能である。かかる場合において、予定の生物学的父親（例えば、精子ドナー）が、リスクハプロタイプＭ２のキャリアであるかどうかを検査することが重要であるので、これらの層別化方法は、母親の母系試料が上述のリスクハプロタイプのキャリアでないことを既に検査されたとき、特に意味を成す。そうであれば、異なる精子ドナー、好ましくは、リスクハプロタイプＭ２のキャリアでもない精子ドナーを選択することも合理的であり得る。
【００５１】
同様に、本発明の実施形態において、生物学的母親（もしくは予定の生物学的母親）がリスクハプロタイプＭ２のキャリアでない（母系試料において試験された）状況の予定の生物学的父親または生物学的父親を検査することも合理的であり、それ故に、特に想定される。
【００５２】
ドナー卵子により妊娠することが予定される女性は、体外受精のため使用される前に、それぞれの卵子ドナー遺伝子型を検査することにより、産科の合併症に対するその素因を検査するために、本発明の方法を使用することも想定される。それ故、本発明および特に本発明の方法はまた、リスクハプロタイプＭ２のキャリアでない卵子ドナーを選択する層別化方法も包含する。
【００５３】
したがって、本発明の方法により、それぞれの女性対象の産科の合併症に対する素因におそらく寄与しないであろう卵子ドナーを検出すること、続いて選択することも可能である。かかる場合において、予定の生物学的卵子ドナーが、リスクハプロタイプＭ２のキャリアであるかどうかを検査することが重要であるので、これらの層別化方法は、母親の母系試料が上述のリスクハプロタイプのキャリアでないことを既に検査されたとき、特に意味を成す。そうであれば、異なる卵子ドナー、好ましくは、リスクハプロタイプＭ２のキャリアでもない卵子ドナーを選択することも合理的であり得る。
【００５４】
同様に、本発明の実施形態において、母親（もしくは予定の母親）がリスクハプロタイプＭ２のキャリアでない（母系試料において試験された）状況の予定の生物学的卵子ドナーおよび／または生物学的父親を検査することも合理的であり、それ故に、特に想定される。
【００５５】
本発明において、母親だけでなく父親も、女性対象の産科の合併症に対する素因に寄与し得る。したがって、女性対象自身がリスクハプロタイプのキャリアでない（母系試料において試験された）場合、生物学的父親および／または予定の生物学的父親は、上述の素因に依然寄与し得、それ故、同様に検査されるべきである。
【００５６】
胚の生物学的父親または胚の生物学的母親のいずれかが、リスクハプロタイプのヘテロ接合体キャリアである場合、胚がリスクハプロタイプのキャリアであるかどうか（例えば、体外受精の場合において）を検査するために、前記胚の試料（例えば、絨毛膜生検試料、または本明細書において記載される単一細胞試料）を検査することも可能である。生物学的母親または生物学的父親のいずれかが、リスクハプロタイプのホモ接合体キャリアである場合、リスクハプロタイプＭ２のヘテロ接合体存在が、それぞれの女性対象の産科の合併症に対する素因を既に意味しているので、同様に胚を検査することは不要であると思われる。生物学的父親が追跡不可能であるか、または分からず、さらに、女性対象（この場合、生物学的母親）がＭ２リスクハプロタイプのキャリアでない場合、人はそれぞれの女性対象の産科の合併症に対する素因を検査することを依然望み得る。この場合において、胚に由来する試料（例えば、循環胎児血液細胞、絨毛膜生検、および／または羊水穿刺試料）を検査することが想定される。しかしながら、女性対象が産科の合併症に対するその素因を検査する意向があるというだけの理由では、好ましくは、胚性試料を得るべきでないことは理解されるであろう。試料が他の理由のため既に手元にあるときのみ、胚に由来する試料において、検査することがむしろ想定される。
【００５７】
本発明において、不育症（ＲＰＬ）は、２回またはそれ超の妊娠を起こして胎児の流産に終わることとして典型的に特徴付けられる。前記２回またはそれ超の妊娠は、継続的または断続的のいずれかで起こり、継続的が好ましい。
【００５８】
本発明において、子癇前症（ＰＥ）は、高血圧が妊娠において起こる医学的状態（妊娠高血圧症候群）である。
【００５９】
胎児発育不全（または胎児成長遅延）は、胎児が適切に成長しない状態である。例えば、眼底高が予測されるよりも３ｃｍ超小さいとき、ＦＧＲが疑われるべきである。
【００６０】
本発明の方法において、前記試料は、血液試料、精子試料、組織試料、または細胞試料由来の、個体（母親または父親のいずれか）から得られることが想定される。任意の生物学的試料は、それぞれの試料が、本発明の方法の対象である検出／診断を可能にする遺伝子材料を含有する限り、適当であることは理解されるであろう。
【００６１】
かかる試料は、針生検、外科生検などの生検を介して、任意の種のスメア技術を介して、例えば、口腔スワブなどの使用により、またはその他により、得られ得る。当業者は、ヒト対象から遺伝子材料を含有する試料を得ることを可能にするさらなる手段および方法をよく知っている。
【００６２】
当業者は、コンタミネーションをどのように回避するか、または避けるかをよく知っており、例えば、対応する標準が、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓから入手可能である「Ｇｅｎｅｒａｌ  ｓｔａｎｄａｒｄｓ  ａｎｄ  ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｐｒｅｎａｔａｌ  ｔｅｓｔｉｎｇ」（２００６年、Ｅｄｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  ａｎｄ  ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｃｍｇ．ｎｅｔ／Ｐａｇｅｓ／ＡＣＭＧ＿Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ／ｓｔｄｓ−２００２／ｇ．ｈｔｍ）において要約される。
【００６３】
Ｂ．検出する方法
ＷＯ２００６／０５３７２５およびＢｏｇｄａｎｏｖａ  Ｎ、Ｈｏｒｓｔ  Ｊ、Ｃｈｌｙｓｔｕｎ  Ｍ、Ｃｒｏｕｃｈｅｒ  ＰＪ、Ｎｅｂｅｌ  Ａ、Ｂｏｈｒｉｎｇ  Ａ、Ｔｏｄｏｒｏｖａ  Ａ、Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ  Ｓ、Ｇｅｒｋｅ  Ｖ、Ｋｒａｗｃｚａｋ  Ｍ、Ｍａｒｋｏｆｆ  Ａ．Ａにおいて既に開示される通り、アネキシン（ＡＮＸＡ５）遺伝子プロモーターの共通ハプロタイプは、不育症と関連する。Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ、２００７年；１６巻：５７３〜７８頁において、ヒトＡＮＸＡ５プロモーターにおいて検出され得るリスクハプロタイプＭ２は、次の４つのヌクレオチド交換：
（１）図１のヌクレオチド２４３に対応する位置のＧからＡ；
（２）図１のヌクレオチド２６２に対応する位置のＡからＣ；
（３）図１のヌクレオチド２８８に対応する位置のＴからＣ；および
（４）図１のヌクレオチド３３７に対応する位置のＧからＡ（配列番号２）
により特徴付けられる。
【００６４】
ヒトＡＮＸＡ５プロモーターにおいても検出され得るリスクハプロタイプＭ１はまた、ＷＯ２００６／０５３７２５およびＢｏｇｄａｎｏｖａらにおいても開示され、次の２つのヌクレオチド交換、（１）図１のヌクレオチド２６２に対応する位置のＡからＣ、および（２）図１のヌクレオチド２８８に対応する位置のＴからＣ（配列番号３）により特徴付けられる。図１は、Ｃａｒｃｅｄｏ（２００１年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．、３５６巻、５７１〜５７９頁）およびＢｏｇｄａｎｏｖａらにおいて開示されるＡＮＸＡ５プロモーター構造を描写する（配列番号１）。
【００６５】
Ｍ２ハプロタイプを決定する、および／または検出する手段ならびに方法は周知であり（例えば、ＷＯ２００６／０５３７２５およびＢｏｇｄａｎｏｖａら）、本明細書において詳細にさらに開示される。
【００６６】
「核酸検出技術」は、当業者に周知であり、とりわけ任意の種のＰＣＲベースの技術、またはリスクハプロタイプＭ２を特徴付けるヌクレオチド交換の同定を可能にする任意の他の適当な技術を含む。かかる方法は、本明細書（実施例を参照のこと）に記載され、例えば、ＷＯ２００６／０５３７２５においても公開される。
【００６７】
前記技術は、一部の例を挙げると、ハイブリダイゼーション技術、核酸配列決定、ＰＣＲ、制限断片決定、一塩基多型（ＳＮＰ）決定、ＬＣＲ（ライゲーション連鎖反応）、または制限断片長多型（ＲＦＬＰ）決定からなる非限定的群から選択され得る。
【００６８】
対応する例およびさらなる詳細は、標準的な技術的助言の文献（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｒｕｓｓｅｌｌ、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎ．Ｙ．、（２００１年）；Ａｕｓｕｂｅｌ、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎ．Ｙ．、（１９８９年）、またはＨｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｈａｍｅｓ（編））から得ることができる。ＷＯ２００６／０５３７２５の実施例において実証される通り、さらなる適当な方法は、ＢａｍＨＩ制限部位の決定を含む、制限断片決定またはＲＦＬＰ法である。ＷＯ２００６／０５３７２５において示される通り、ＢａｍＨＩ制限部位の不存在（ＢａｍＨＩ’）または存在（ＢａｍＨＩ＋）が決定され、本明細書において定義される点変異の不存在または存在を示す。この方法についての詳細は、ＷＯ２００６／０５３７２５の添付の実施例において示される。
【００６９】
一実施形態では、関連するＤＮＡストレッチは、ＰＣＲテクノロジーによりゲノムＤＮＡから増幅され得る。利用されるべき可能性のあるプライマーは、配列番号４（ＡＮＸ５．Ｐ．Ｆ；ＷＯ２００６／０５３７２５の配列番号２２）、および配列番号５（ＡＮＸ５．ｅｘｌ．Ｒ；ＷＯ２００６／０５３７２５の配列番号２３）において提供されるプライマーを含むが、これらに限定されない。当業者は、本明細書において定義されるアネキシンＡ５（ＡＮＸＡ５）プロモーターまたはその断片の関連するストレッチを増幅するために、利用されるべきさらなるプライマー対またはプライマーを推定するための立場に容易にいる。アンプリコンが得られた（実施例部分も参照のこと）後、それは、制限酵素ＢａｍＨＩ（種々の供給源、とりわけ：Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、ドイツ；ＭＢＩ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ、Ｓｔ．  Ｌｅｏｎ−Ｒｏｔ、ドイツ；Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ  ａｍ  Ｍａｉｎ、ドイツから得ることができる）で消化（制限消化）され得る。再度、詳細が実施例部分において示される。当該技術分野で周知の方法（とりわけＳａｍｂｒｏｏｋ／Ｒｕｓｓｅｌ、２００１年、（ｌｏｇ．ｃｉｔ．）を参照のこと）に従い行われるべきこの消化後、ＢａｍＨＩ／ＢａｍＨＩ＋制限部位のさらなる分析は、公知の技術、例えば、ゲル分析、例えば、アガロースゲル分析により行われ得る。
【００７０】
本発明の文脈において具体的に予想されるさらなる技術は、ＩＨＧ  Ｐｈａｒｍａｃｏにより確立されたＳＮＰ検出技術である。前記技術は、ＷＯ２００６／０３８０３７およびＵＳ７，８０３，５４５において十分に説明され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００７１】
具体的には、ＩＨＧテクノロジーを用いた遺伝子型判定において、核酸の試料は対象から得られ、多型部位を含有する遺伝子セグメントを増幅して、遺伝子セグメントの配列を有しているアンプリコンの集団が提供される。典型的には、遺伝子セグメントのこの増幅は、前記遺伝子セグメントに隣接するプライマーの対を用いたＰＣＲにより行われる。考慮中の遺伝子セグメントに特異的である適当なプライマーが選択される。プライマーを選択して、およそ９０〜４００塩基長、好ましくは、およそ１００〜１５０塩基対長である遺伝子セグメントが増幅される。多型部位は遺伝子セグメントの中央領域、すなわち大まかに言えば、遺伝子セグメントの中央３分の１に位置することが通常好ましい。遺伝子セグメントのＰＣＲ増幅は、周知の通り、２本鎖アンプリコンの集団をもたらす。ＰＣＲ増幅のため使用され得る手法のさらなる詳細は、ＷＯ９３／１９２０１において見出され得る。
【００７２】
試験中の核酸は哺乳類のゲノムＤＮＡである場合、ＤＮＡの試料は、特異的な特徴についての遺伝子型が研究されることが望まれる個体または他の対象から得られる。（用語「個体」は、胎児を含むものとする。）ＤＮＡは、全ての有核細胞から抽出され得る。典型的には、ＤＮＡは、便宜上末梢血細胞から得られる。胎児のＤＮＡは、胎盤細胞または羊水から得ることができる。ＤＮＡの他の供給源は、毛包、ミイラ化した身体などを含む。ＤＮＡは、任意の適当な方法、例えば、Ｍｉｌｌｅｒら（Ｍｉｌｌｅｒ，  Ｓ．、Ｄｙｋｅｓ，  Ｄ．およびＰｏｌｅｓｋｙ，  Ｈ．（１９８８年）、「Ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ｓａｌｔｉｎｇ  ｏｕｔ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  ｆｏｒ  ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ  ＤＮＡ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｎｕｃｌｅａｔｅｄ  ｃｅｌｌｓ」；Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１６巻：１２１５頁）により記載される迅速塩析法により単離され得る。あるいは、ＤＮＡは、逆転写によりｍＲＮＡからｃＤＮＡとして単離され得る。
【００７３】
遺伝子セグメントに対応する配列を有するが、本明細書において考察される通り修飾されて、制御されたヌクレオチド置換、欠失、挿入、またはその組合せを含むＩＨＧ分子の集団も提供される。典型的には、ＩＨＧ集団は、例えば、ＰＣＲを用いた増幅により調製される。再度、ＰＣＲ増幅のため使用され得る手法のさらなる詳細は、ＷＯ９３／１９２０１において見出され得、それは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。ＰＣＲのために選択されたプライマーは、ＩＨＧ分子の増幅を提供するために選択される。ＰＣＲ増幅は、２本鎖ＩＨＧアンプリコンの集団をもたらす。ＩＨＧは、好ましくは、考慮中の遺伝子セグメントと実質的に同一の長さであってもよく（ＩＨＧの必須の挿入または欠失した塩基を無視する）、または異なる長さ、例えば、遺伝子セグメントより短いかもしくは長くてもよい。しかしながら、遺伝子セグメントおよびＩＨＧが異なる長さである（ＩＨＧの必須の挿入または欠失した塩基を無視する）場合、遺伝子セグメントおよびＩＨＧの増幅された集団間でヘテロ２本鎖形成を許容するのに十分な程度の重複が存在しなければならない。それぞれ、ＩＨＧおよび遺伝子セグメントを増幅する際に使用されるプライマーは、同一であっても、または異なってもよい。しかしながら、典型的には、同一のプライマーが使用され、実質的に同一の長さ（ＩＨＧにおける必須の挿入または欠失した塩基を無視する）である増幅されたＩＨＧおよび遺伝子セグメントをもたらす。ＷＯ９３／１９２０１において教示される通り、プライマーは標識されてもよい。
【００７４】
遺伝子セグメントおよびＩＨＧのＰＣＲ増幅は、同一または別個の容器（それぞれ、「混合した」または「別個の」ＰＣＲ）において行われてもよい。ヘテロ２本鎖形成を進めることを許容するために、増幅を別々に行い、次に、遺伝子セグメントおよびＩＨＧの増幅された集団を合わせるか、またはプールすることが好ましい。
【００７５】
多型部位を含有するＩＨＧおよび遺伝子セグメントの合わせられた集団間でのヘテロ２本鎖形成は、例えば、ＷＯ−Ａ−９３／１９２０１において記載される通り、２本鎖ＤＮＡを１本鎖ＤＮＡに分離するために、ＩＨＧおよび遺伝子セグメントの合わせられた集団をまず加熱し、次に、ヘテロ２本鎖形成を許容するよう冷却することにより、成される。
【００７６】
形成されたヘテロ２本鎖は、それらの見かけ分子量に影響するが、実際の分子量に影響しないそれらの分子コンフォメーションに従い分離される。これは、例えば、電気泳動により達成されてもよい。分離は、非変性ポリアクリルアミドゲルなどの、核酸を完全には変性しないゲル上で典型的になされる。電気泳動は、所望の程度の２本鎖の解離をもたらす条件下で行われる。その異なる分子コンフォメーションからもたらされる「見かけサイズ」がわずか約１０ｂｐだけ異なる２本鎖を分離する解離の程度は、通常十分である。サイズマーカーはまた、移動度、これにより、２本鎖の見かけサイズの推定を許容するようゲルに流されてもよい。加えて、またはあるいは、考慮中の遺伝子の既知の対立遺伝子に対応する配列を有する対照ＤＮＡ分子もＰＣＲを使用して別々に増幅し、使用されるＩＨＧとヘテロ２本鎖を形成させ、次に、得られた試料をゲルに流して、生じた異なるヘテロ２本鎖についてゲル上のマーカーとすることができる。
【００７７】
ヘテロ２本鎖の分布、すなわち、解離パターンは、対立遺伝子特異的であろう。この解離パターンまたはＰＣＲフィンガープリントが次に視覚化され得る。ＰＣＲプライマーが標識された場合、この標識は明らかにされ得る。分離された標識２本鎖を有する基質を、標識の存在を検出する試薬と接触させる。ＰＣＲプライマーが標識されなかった場合、ＰＣＲフィンガープリントを有している基質を、例えば、エチジウムブロマイドまたはＳＹＢＲ（商標）グリーン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓから入手可能）と接触させ、核酸断片を紫外線下で視覚化するか、あるいは、ヘテロ２本鎖を銀染色で視覚化し得る。
【００７８】
Ｍ２ハプロタイプ状態を検出するさらなる方法は、蛍光分子および／または固相を利用する方法を含むが、これらに限定されない。好ましい固相構造は、ビーズおよび／またはプレートであり得る。固相は、プラスチック、シリコン、ガラス、ポリスチレン、アルミニウム、鋼、鉄、銅、ニッケル、銀、金、ニトロセルロース、またはナイロンを含み得る。加えて、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、および／または少なくとも３０ヌクレオチド長のオリゴを使用して、ＡＮＸＡ５  Ｍ２ハプロタイプを検出することができる。さらに、ＡＮＸＡ５  Ｍ２ハプロタイプ状態を検出する方法は、次世代配列決定技術を利用する方法を含み得る。これらの検出方法は全て当業者の範囲内である。
【実施例】
【００７９】
実施例１  研究集団
２０１２年３月〜２０１３年２月の間に、５箇所の不妊治療病院にかかっている患者から研究患者を採用した。全ての患者からインフォームド・コンセントを得た。この期間中、３１４人の患者（１５７組のカップル）は、少なくとも１回の以前に失敗したＩＶＦサイクル（平均１．９回のＩＶＦ、および０．２回のＩＵＩ）を示した。詳細な臨床履歴を得て、Ｍ２／ＡＮＸＡ５ハプロタイプの保因の存在または不存在についての遺伝子型判定は、不妊についての診断的調査の一部を形成した。女性の平均年齢は３６．３（範囲２３〜４９）歳であり、その男性パートナーの平均年齢は３８．６（範囲２３〜６４）歳であった。女性の平均ボディ・マス・インデックスは２５．５（範囲１９〜４０．５）であり、その男性パートナーの平均ボディ・マス・インデックスは、３３．７（範囲２１〜３６）であった。スクリーニングのための患者の選択は、女性の以前の履歴、および診察時に女性に提供された研究の詳細な性質に従い、検査されることの患者の意向に基づいた。抗リン脂質抗体について、女性患者をスクリーニングした。女性の不妊状態に関して、男性集団の大部分は、精子減少症（４８％）、精子無力症／精子減少無力症（２７％）、または無精子症（１３％）を有していた。これらはキャリア状態に従い変動し、非キャリアにおける発生率はそれぞれ４１％、２６％、および１１％であり、キャリアについてはそれぞれ３５％、１２％、および１２％であった。女性集団に関して、原因不明（２７％）、乏卵巣予備能力（１７％）、ＰＣＯＳ（１１％）、および子宮内膜症（６％）が最も優勢であった。非キャリアにおける発生率に関する、キャリア状態に従った変動は、それぞれ、３０％、１６％、１６％、および３％であり、キャリアについてはそれぞれ、２６％、９％、１８％、および８％であった。
【００８０】
これらの患者の大部分は、白人の英国人（男性の７７％、および女性の７５％）、インド人／パキスタン人（８％）であり、残りは多様な民族であった。全体として、このコホートは、代表的な英国およびアイルランドの人口統計である。
【００８１】
実施例２  ＤＮＡの採取およびＭ２キャリア状態の決定
血液試料（第１のコホート）により、カップルのいずれかからデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を採取し、残りのコホートは、特定の採取ペーパーでの口腔細胞分析を経験した。大規模な実験室検査を行い、口腔細胞採取への移行がデータの質の低下を生じなかったことを確認した。ＱＩＡｍｐ  ＤＮＡ  ｂｌｏｏｄ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ  ＧｍｂＨ、Ｈｉｌｄｅｎ、ドイツ）を用いて白血球から、または採取ペーパーの溶出液からＤＮＡを抽出した。Ｑｉａｍｐ  ｂｌｏｏｄ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔを使用して血液試料から、または精製した採取ペーパーパンチから単離した、鋳型として続くＰＣＲ反応物に含まれるゲノムＤＮＡ１００ｎｇに対してＰＣＲ反応を行った。Ｂｉｏｔａｑ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｂｉｏｌｉｎｅ．  Ｂｉｏｌｉｎｅ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ、Ｌｏｎｄｏｎ、英国）を使用して、１０×ＮＨ４反応バッファー：１６０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、６７０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２（最終濃度１．５ｍＭ）、５０ｐＭプライマー（フォワードおよびリバース）、２００μＭ  ｄＮＴＰ、ｐｏｌｙｍａｔｅ  ａｄｄｉｔｉｖｅ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）、および２．５ユニットのＢｉｏｔａｑポリメラーゼを含有する２５μｌの容量でＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲサイクル条件は、以下の通り、９４℃で４５秒間、３０サイクルの９４℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、６８℃で１分間、および７分間の最終伸長ステップであった。Ｚｙｍｏ  ＺＲ−９６ＤＮＡ  Ｃｌｅａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ  ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ．  Ｉｒｖｉｎｅ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、米国）を使用し、標準的カラム精製法を使用して、ＰＣＲ産物を精製した。ＡＢＩ  ＢｉｇＤｙｅ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｖ３．１を使用し、標準的条件を使用して、精製したアンプリコンを配列決定し、ＡＢＩ  ３７３０ｘｌ  ＤＮＡ分析器にて電気泳動した。ＡＢＩ  Ｓｅｑｓｃａｐｅ  ｖ  ２．５．（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、米国）を使用して、トレースを分析し、遺伝子型を判定した。Ｍ２ハプロタイプ（ＡＮＸＡ５遺伝子プロモーターにおける４つの連続するヌクレオチド置換のセット：２４３Ｇ／Ａ［ｒｓ１１２７８２７６３］、２６２Ａ／Ｃ［ｒｓ２８７１７００１］、２８８Ｔ／Ｃ［ｒｓ２８６５１２４３］、および３３７Ｇ／Ａ［ｒｓ１１３５８８１８７］）の存在を調べた（配列番号２）。４つの変異体のうち２つ（２６２Ａ／Ｃ、２８８Ｔ／Ｃ）のみが存在したとき、ハプロタイプをＭ１と定義した（配列番号３）。
【００８２】
Ｓｅｑｓｃａｐｅソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、米国）を使用して、２５％混合塩基判定閾値で全ての遺伝子型判定を行った。Ｓｅｑｓｃａｐｅをプログラム化して、文献に記載される４つの特異的塩基におけるヌクレオチドバリエーションを分析した。目的の領域にわたる変異を詳述する変異の報告の形で結果を作成した。変異のある種の組合せを可能にするようにのみプログラム化した、社内ＬＩＭＳ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍ）により、報告作成を行った。ＬＩＭＳシステムにより、予想外の結果を生じたあらゆる試料にフラグを付け、オペレーターによりチェックし、その後、新鮮な試料で検査を繰り返した。
【００８３】
実施例３  遺伝子型判定および統計的分析
Ｍ２／ＡＮＸＡ５ハプロタイプのヘテロ接合体またはホモ接合体キャリアであった患者を、影響されたヘテロまたはホモ接合体キャリアとして記録した。ＧｕｏおよびＴｈｏｍｐｓｏｎ、１９９２年の方法（Ｂｏｇｄａｎｏｖａら、２００７年、およびＲｏｇｅｎｈｏｆｅｒら、２０１２年によっても使用される）を使用して、ハーディ・ワインベルクからの偏差についての検査を行った。本発明者らは、別々および全体とみなされる男性および女性群内でこの検査を行った。本発明者らはまた、非英国民族が結果に影響したかどうかをみるために非英国民族の個体を排除しても検査した。
【００８４】
女性亜群において観察したハーディ・ワインベルク平衡（ＨＷＥ）からの有意な偏差が、偶然に起因し得るかどうかをチェックするために、本発明者らは、全体のセット（男性および女性を合わせた）から無作為に１５５人の個体をサブサンプリングし、同一の方法を使用してＨＷＥからの偏差についてのｐ値を推定し、ｐ値を記録した。本発明者らは、この手法を１０００回行い、このうち、記録した３つのｐ値のみが、全ての女性群について観察したものよりも極端であり、これにより、女性におけるＨＷＥからの偏差が実際のものであり、偶然に起因しないことが示唆された。
【００８５】
比較のため使用した対照は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｌｉｎｉｃ  Ｓｃｈｌｅｓｗｉｇ−Ｈｏｌｓｔｅｉｎ  ＫｉｅｌのＰｏｐＧｅｎ  ｂｉｏｂａｎｋから選んだ集団対照試料由来のＲｏｇｅｎｈｏｆｅｒら、２０１２年により使用されたものである（ｎ＝５３３）。ＰｏｐＧｅｎ集団対照は、Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ  Ｇｅｒｍａｎｙ由来であり、公的登録人口を通じて同定した健常対象であった（Ｋｒａｗｃｚａｋら、２００６年）。この研究において使用した試料は、３つの年齢群（１８〜３０、３０〜５０、および５０〜８０歳）に分布した、およそ等しい数の男性および女性を含んでいた。ミュンスター繁殖対照のコホートは、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ’ｓ  ｒｅｇｉｓｔｒｙ（Ｒｏｇｅｎｈｏｆｅｒら、２０１２年）由来の匿名の個体であり、全員が妊娠に成功しており、不育症の記録された履歴はなかった。
【００８６】
実施例４  患者遺伝子型頻度
患者３１４人（男性４人（無精子症２人、精子減少症１人、６５歳１人）；女性２人：早発閉経１人、閉経１人のため、患者６人を遺伝子型判定しなかった）、およびカップル１５７組のうち、全患者の保因率は２５％（Ｎ＝７８）であり、女性（２４％、Ｎ＝３７）および男性（２７％、Ｎ＝４１）における発生率と類似した。しかしながら、カップルにおいて、Ｍ２保因の発生率は高かった（４４％；ｎ＝６９）（パートナーの一方または両方がＭ２キャリアもしくはホモ接合体であると定義した）。検査したこれらの患者のいずれも、抗リン脂質症候群（ＡＰＳ）陽性ではなかった。これらのキャリアのカップルのうち、カップルの小サブセットは、パートナー１人が非キャリア、１人がホモ接合体（４％、Ｎ＝７）、またはパートナーの両方がキャリア（４％、Ｎ＝６）、またはパートナー１人がキャリア、１人がホモ接合体（２％、Ｎ＝３）であった。女性ホモ接合体９人、および男性ホモ接合体１人が存在した。男性および女性患者の遺伝子型分布を表１に示す。
【表１】
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【００８７】
男性および女性それぞれについて、ＨＷＥ下で予測された遺伝子型および観察された遺伝子型頻度を表２に提示する。男性において、ＨＷＥからの有意な偏差は存在しないが、女性の間で有意な偏差が存在した（ｐ＝０．００５）。分析を英国民族またはアイルランド民族の個体に制限し、類似の結果を得た（データを示さず）。
【表２】
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【００８８】
現研究に含まれるＩＶＦカップルおよび２つの異なる対照群におけるＡＮＸＡ５遺伝子プロモーターハプロタイプの遺伝子型頻度を表３に示す。Ｍ２ハプロタイプの存在量は、ミュンスター対照（女性）およびＰｏｐＧｅｎ対照（男性および女性）の両方と比較して、男性および女性ＩＶＦ患者の両方において富化されていた。
【表３】
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【００８９】
ＩＶＦ女性患者は、過剰のＭ２ヘテロ接合体、特にＭ２ホモ接合体（観察９人  対  予測３．４人）のため、ＨＷＥになかった（ｐ＝０．００５２）。女性亜群において観察したＨＷＥからの有意な偏差が偶然に起因し得るかどうかをチェックするために、本発明者らは、全体のセット（男性および女性を合わせた）から無作為に１５５人の個体をサブサンプリングし、同一の方法を使用してＨＷＥからの偏差についてのｐ値を推定し、ｐ値を記録した。本発明者らは、この手法を１０００回行い、このうち、記録した３つのｐ値のみが、全ての女性群について観察したものよりも極端であり、これにより、女性におけるＨＷＥからの偏差が実際のものであり、偶然に起因しないことが示唆された。
【００９０】
患者の以前のＩＶＦ、ＩＵＩ、および妊娠履歴を表４に示す。以前に失敗したＩＶＦサイクルの数は、パートナー１人がホモ接合体であり、１人が非キャリアであるカップル（平均３．１回の以前のＩＶＦ）、および男性パートナーがキャリアであるカップル（平均２．１回の以前のＩＶＦ）において最大であった。
【表４】
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【００９１】
全てのキャリア／ホモ接合体群において、以前の生児出生は非常に少なく（範囲０〜４）、非キャリアカップルにおいて、わずかに高い発生率を観察した（Ｎ＝１３）。キャリアカップルにおいて患者の最近報告された流産は、喪失の日を報告した流産１７回において平均１０．１週（範囲５〜２３週）で生じた。非キャリアカップルにおいて、流産（Ｎ＝５３）は、流産５３回のうち２５回において平均９週（範囲５〜２６）で生じた。
【００９２】
実施例５  男性不妊およびＭ２保因頻度
男性１５７人のうち全部で６３人（４０％）が、関連する不妊要因を有していた。この群における保因発生率は、２７％（Ｎ＝１７）であった。全体的に、精子減少症が最も頻繁であり（４０％、不妊の男性のうちＮ＝２５）、続いて、乏無力奇形精子症（ＯＡＴＳ、１３％、不妊の男性のうちＮ＝８）であった。
【００９３】
女性患者１５７人のうち、９３人（５９％）が、原因不明または男性要因以外の不妊の診断を受けた。加えて、診断を受けた９３人のうち２５人（２７％）がＭ２キャリアであることも見出された。原因不明、乏卵巣予備能力／排卵の失敗は、年齢としばしば関連し、さらに、ＰＣＯＳは、群の両方において不妊の最も頻繁に挙げられる原因である。しかしながら、男性不妊は、非キャリア群の２１％においてカップルにおける不妊の第１の原因となるが、Ｍ２ハプロタイプを有する患者３７人の群のうち１人でしか認められなかった。ＰＣＯＳケース１７人のうち６人（３５％）もキャリアであった。
【００９４】
実施例６  原因不明の不妊およびＭ２保因頻度
患者１０４人（３３％）は、不妊について原因不明とした。これらのうち、患者３８人（３７％）をＭ２キャリアとして同定した：男性２５人（２４％）および女性１３人（１３％）。女性ホモ接合体９人（全女性の６％）が存在した。４９歳の男性ホモ接合体１人も存在し、そのカップルが受けた他の診断は不明であったが、彼の女性パートナーは、流産となったＩＶＦサイクルが２回であった。
【００９５】
実施例７  予備的結果
患者カップルのこのコホートにおけるハプロタイプＭ２／ＡＮＸＡ５のキャリアシップは４４％であり、これは非常に高い発生率を表す。さらに、それは、男性不妊患者の２７％、女性不妊患者の２７％、および不妊の理由が以前に不明であった患者の３７％において存在した。本研究においてＭ２ハプロタイプのキャリアであった患者のうち、検査したいずれの患者もＡＰＳ陽性ではなかった。遺伝子型Ｍ１／Ｍ１は、ＲＰＬコホートにおいて存在せず、対照において稀であった。遺伝子型Ｍ１／Ｍ２は、不育症コホートにおいて観察されず、対照群からは合計８人のみ、そしてこのＩＶＦコホートでは患者４人のみにおいて観察された。しかしながら、ホモ接合体Ｍ２女性患者の発生率は、このコホートにおいて６％に上昇し、男性Ｍ２ホモ接合体１人を記録した。
【００９６】
女性ホモ接合体頻度は、他の対照群から報告されたものより３倍高く、不育症女性のものより２倍高かった（Ｒｏｇｅｎｈｏｆｅｒら、２０１２年）。
【００９７】
Ｎｅｌｉｓら（２００９年）が、４箇所の領域、すなわち、１）中欧および西欧、２）バルト諸国、ポーランド、および西ロシア、３）フィンランド、ならびに４）イタリアが、同定され得、集団間の差について修正されなければ疾患遺伝子関連性の有意性に影響するであろうと結論付けたので、本発明者らは、ＰｏｐＧｅｎおよびミュンスター対照の使用を正当化する。これらの領域のうち３つを代表する、ドイツ、南イタリア、およびブルガリア由来の公開された研究由来の対照における発生率は全て、Ｍ２ハプロタイプ頻度における一貫性を示した。ＩＶＦ患者の大部分は白人の英国人（男性の７７％、女性の７５％）であり、これは中欧および西欧領域に対応する。本発明者らは、フィンランド人の患者を有さず、インド人／パキスタン人などのサブセットを用いた、および用いない分析は、主に、Ｍ２ホモ接合体の存在量に起因して、女性においてＨＷＥからの有意な逸脱を依然示したが、男性において示さなかった。
【００９８】
民族性の点で、本発明者らは、インド人およびパキスタン人の患者に加えて、ユダヤ人、トルコ人、および中東人の患者を含む広範な民族においてＭ２キャリアを見出した。発生率および病理における有意な差が存在し得るので、保因率における可能性のある差およびこれらの民族における臨床効果は、さらなる調査の理由となる。欧州のコーカサス人の集団における発生率は十分に確立され（Ｍａｒｋｏｆｆら、２０１１年）、Ｍｙａｍｕｒａら（２０１１年）は、ハプロタイプの保因が、日本人の集団において、中欧の集団において観察されたものと類似の不育症のリスクをもたらしたが、集団発生率はより低い（５．５対１５％）ことを報告した。したがって、白人のヨーロッパ人および日本人以外の異なる民族のさらなる研究が望まれる。
【００９９】
焦点は、しばしば、健常配偶子および胚のため管理することおよび提供すること、最適な胚生存度を選択すること、ならびに妊娠を持続することを可能にする健常な子宮を保証することにあるので、胚の凝血の任意の機能障害は、ＩＶＦ実施において特に重要である。しかしながら、流産の最大の１つの原因は、異数体胚であると考えられるが、特に、ＩＶＦ後に正倍数体胚の移植後でさえ流産が依然として問題となり得るＲＰＬケースにおいて、他の要因が重要であることは明らかである。比較的最近発見された遺伝因子Ｍ２／ＡＮＸＡ５だけが、胚の抗凝血に対する有害作用を介して胎盤機能へ影響し、検出されなければＩＶＦを介して健常な妊娠を確立するために負担する相当な労力およびコストをなくすことができよう。本発明者らの研究において、Ｍ２保因が、既に決定されたものに加えた要因であるか、またはＭ２保因が他の不妊の診断のない有意な数の患者に存在した、男性および女性間で等しく分布する有意な数の患者が存在した。母系の健康に対するＭ２／ＡＮＸＡ５ハプロタイプの保因のリスクを示す証拠が相次いでいる（ＲＰＬ、ＶＴＥ、ＰＥ、ＧＨ  ＡＰＳ：Ｔｉｓｃｉａら、２００９年；Ｇｒａｎｄｏｎｅら、２０１０年；Ｂｏｇｄａｎｏｖａら、２０１２年）。Ｂｏｇｄａｎｏｖａら（２０１２年）は、Ｍ２／ＡＮＸＡ５ハプロタイプの保因が、露出したホスファチジルセリン表面のＡＮＸＡ５カバーの低減を導き、この低減された遮蔽が、凝固因子がリン脂質結合について競合することを可能にするであろうことを主張する。第２に、リン脂質抗原因子のより多大な露出が存在し、次にａＰＡの発生をもたらし、次いでＡＮＸＡ５遮蔽をさらに妨害するであろう。Ｓｉｆａｋｉｓら（２０１０年）は、正常およびＦＧＲ妊娠の間のｍＲＮＡ発現には有意差があるが、ＡＮＸＡ５タンパク質レベルでは差がないことを示した。しかしながら、著者らは、試料をＭ２／ＡＮＸＡ５について遺伝子型判定しなかった。
【０１００】
加えて、ＩＶＦ処置前の、ＡＮＸＡ５キャリアである患者のサブセットの同定は、この研究から。これらの患者のＩＶＦサイクルの失敗率が非キャリアより高いので、重要である。本発明者らは、本明細書において、女性パートナーが以前失敗したＩＶＦサイクル２回を有した、他の不妊の診断を受けていない、男性ホモ接合体患者１人を報告する。したがって、自身がＭ２キャリアであるか、または男性パートナーがキャリアである、女性患者を同定し、処置することは、胚の抗凝血に対する有害作用を軽減することにより、在胎不当過小（ＳＧＡ）の発生率を低減する際の助けとなり得る。
【０１０１】
欠陥は胚で伝達され、胚の抗凝血に影響し、リスクは、任意の特定の親の伝搬と無関係である、すなわち、伝搬が母系もしくは父系のいずれか（または両方）である場合、胚で誘導され得るので、Ｍ２／ＡＮＸＡ５ハプロタイプの保因についてのＩＶＦに参加するパートナーの両方のスクリーニングは、自身の配偶子で処置するカップルの精密診断において慣例としてまた早期に考えられるべきである。Ｍ２ハプロタイプは、妊娠失敗のリスクに寄与するさらなる独立した要因であると思われる。
【０１０２】
実施例８  ＬＭＷＨで処置したＭ２ハプロタイプ患者についての最初の結果データ
Ｍ２ハプロタイプについて患者を検査し、２つの群に分けた。「処置群」と呼ばれる第１の群は、患者６３人からなった。これらの患者をいずれも、Ｍ２ハプロタイプキャリア状態について検査し、胚移植時にＬＭＷＨで処置した。「非処置群」と呼ばれる第２の群は、患者６２人を含み、患者をＭ２ハプロタイプについて検査したが、ＬＭＷＨで処置しなかった。処置群と非処置群の比較において、非処置群は処置群（３６．１）よりも丸１年若く（３５）、また、非処置群は処置群（５．２４）よりも丸１年少ない間（４．２４）不妊であった。表５を参照されたい。加えて、処置群の１５人の患者は、ｅｍｂｒｙｏｓｃｏｐｅとして公知の、タイムラプス胚培養を用いたが、一方、非処置群の患者１人のみがｅｍｂｒｙｏｓｃｏｐｅを用いた。処置群はまた、臨床的妊娠および生児出生に進む胚タイムラプス培養の患者を１５人のうち７人も有していた。しかしながら、群の両方は２つの特徴を共有した。第１に、非処置群は平均０．３８回の以前の流産を有し、処置群は平均０．５２回の以前の流産を有した。第２に、非処置群は平均２．７回の以前のＩＶＦサイクルを有し、処置群は平均２．６回の以前のＩＶＦサイクルを有した。たとえ上述のわずかな差および近い類似性を有しても、処置群は、全体平均３０〜３５％と比較して、上昇した生児出生率３８％を有し、一方、非処置群の患者のいずれも（０％）生児出生まで到達しなかった。
【表５】
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【０１０３】
したがって、母親または父親のいずれかがＭ２ハプロタイプのキャリアである、抗凝固剤（好ましくは、ＬＭＷＨ）で処置した母親は、改善した臨床的妊娠率および／または改善した生児出生率を有するであろうと考えられる。好ましい実施形態では、母親は、胚移植と同時、またはその間近、またはその後間もなく処置される。ＬＭＷＨは、少なくとも４週間、少なくとも８週間、少なくとも１２週間、または少なくとも１６週間投与される。ＬＭＷＨなどの抗凝固剤での処置は、臨床的妊娠の機会を増加させ、および／または流産率を低下させ、これにより、生児出生の機会を増加させる能力を有する。本発明者らの結果は、Ｒｏｄｇｅｒｓにより得られた結果と正反対である。さらに、ＬＭＷＨなどの抗凝固剤での処置を使用して、体外受精を受けた母親において、妊娠成功および／または生児出生率が増大され得る。
【０１０４】
パートナーの両方がＭ２ハプロタイプのキャリアである患者は、妊娠する前、それと同時、および／またはその数週間以内のＬＭＷＨなどの抗凝固剤の処置で最大に有益であると予測される。
【表６】
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【０１０５】
実施例９  ＬＭＷＨで処置したＭ２ハプロタイプ患者についての結果データの統計的分析
２つの研究群：検査／処置群の患者６３人（５０．４％）、および基準（または対照）群の６２人（４９．６％）に分けた胚移植を有する患者１２５人について、最終結果データを統計学的に分析した。最終データは、暫定の分析のため上で報告した結果に拡大した。データセットは、妊娠結果についての情報を含むだけでなく、患者の人口統計および処置履歴を要約するさらなる変数も記録した。このデータセットの分析は、特定した３つのエンドポイント：生児出生、臨床的流産、および着床成功に焦点を当てる。
【０１０６】
分析した３つのエンドポイントの定義は以下の通りである。
【０１０７】
生児出生エンドポイントは、胚移植が生児出生をもたらしたかどうかを示す二値の変数である。胚移植を有する全ての患者を生児出生エンドポイントの分析に含めた。
【０１０８】
臨床的流産は、胚移植が臨床的流産または生児出生をもたらしたかどうかを示す二値の変数である。臨床的妊娠期（すなわち、超音波スキャンが胎児心拍を検出した場合）に達した患者のみを、臨床的流産の分析に含めた。
【０１０９】
胚移植を有するそれぞれの患者について、１、２、または３つの胚を患者に移植した。次に、着床発生率を、移植した胚の数で割った胎児心拍の検出数として定義した。着床発生率を、分析前に、着床成功エンドポイントに変換した。着床成功エンドポイントは、移植したそれぞれの胚について、着床が成功したかまたは失敗したか（すなわち、胎児心拍を検出したかまたはしなかったか）を示す二値の変数である。移植したそれぞれの胚を、着床成功の分析に含めた。
【０１１０】
研究群（処置／対照）に加えて、次の独立した変数（患者人口統計および処置履歴）も研究して、独立した変数と上で定義した３つのエンドポイントとの間に関連が存在するかどうかを決定した。
患者の年齢
Ｍ２ハプロタイプ結果（女性および男性）。患者（女性）およびそのパートナー（男性）の両方について、Ｍ２ハプロタイプ結果を得た。Ｆｉｓｈｅｌら（２０１４年）において適用されたグループ化の慣習に従い、これらを次の通りカテゴリーに分けた：
・両方がキャリア；
・男性のみがキャリア；
・女性のみがキャリア；
・１人がホモ接合体、１人がキャリア；および
・１人がホモ接合体のみ。
「１人がホモ接合体、１人がキャリア」（観察数８）および「１人がホモ接合体のみ」（観察数４）カテゴリーにおいて患者がほとんど存在しなかったことを見出し、それ故に、これらを単一のホモ接合体カテゴリー（「１人がホモ接合体のみ、または１人がホモ接合体／１人がキャリア」）に再グループ化した。
移植した胚の数。この変数を２つのカテゴリー：胚１つを移植した胚移植のカテゴリー；および胚２つまたは３つを移植した胚移植のカテゴリーにグループ化した。
インキュベーターの種類
不妊の継続期間（年数）
以前のＩＶＦサイクルの数：この変数を、患者が以前に０、１、２、３、または４回もしくはそれ超のＩＶＦサイクルを有したかどうかに依存して、５つのカテゴリーにグループ化した。
以前の流産の数：この変数を、患者が以前に０、１、または２回もしくはそれ超の流産を有したかどうかに依存して、３つのカテゴリーにグループ化した。
胚移植：移植したそれぞれの胚について、胚の種類を記録した。これらを、桑実胚、胚盤胞、または移植した細胞数として記録した。観察したカテゴリーが多数であることを考慮して、単一の変数を創出し、胚移植を、胚盤胞移植であったもの、およびそうでなかったものにグループ化した。胚盤胞移植は、移植において胚にわたって一貫していたので、単一の変数のみを必要とする（移植した胚の数に関わらず）。
イントラリピッド（ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄｓ）の使用：処置群における３３個の胚移植は、イントラリピッドを与えられた患者と関連した。大部分のケースについて、これらの患者が、免疫学的問題を有していたので、イントラリピッドを与えられ、これが、妊娠結果と関連する可能性が高いと決定された。それ故に、これらの患者を、免疫学的問題のためイントラリピッドで処置したもの、および処置しなかったものにグループ化した。患者２人を、臨床的理由なしにイントラリピッドを与えられたと同定し（患者２人）、それ故に、「免疫学的問題のためイントラリピッドで処置した」カテゴリーに含めなかった。
ドナー卵子の使用
【０１１１】
それぞれのエンドポイントについて、結果の個々の予測変数としてのそれらの統計的有意を評価するために、独立した変数で関連性の個々の検査（単変量回帰モデルを介した）を行った。分析したエンドポイントの３つ全てが二値の変数であった。この場合において、ロジスティック回帰モデルが適当であり、それは、結果（例えば、生児出生）の確率を独立した変数の線形関数として表すためのロジスティック変換を使用する。
【０１１２】
単変量試験後、多重ロジスティック回帰モデルを適用して、結果について独立した変数の集合的予測正確度を評価する。これは、それぞれの結果を有する偶然に対する研究群の可能性のある作用の調査を可能にし、他の独立する変数についても説明する（そしてその独立する変数の作用を推定する）ことを可能にする。
【０１１３】
単変量分析において統計学的に有意であると見出される変数のみを（１０％の危険率を有する少なくともオッズ比１について、すなわち、観察した作用が偶然のみに起因する確率が１０％未満であることを要件とする）、この多重変数モデルに含めることが考慮される。
【０１１４】
多重ロジスティック回帰モデル化について、単変量試験から有意と同定された全ての独立した変数を含むモデルで始め、次に、最良の適合をもたらすモデルを決定するために、モデルからそれらを逐次的に取り出す、後方段階的回帰アルゴリズム（ｂａｃｋｗａｒｄ  ｓｔｅｐｗｉｓｅ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）を使用した。モデル適合を尤度比検定を使用して決定し（５％の危険率を有すると、すなわち、観察した作用が偶然のみに起因する確率が５％未満であることを要件とする）、これにより、最終モデルの成績に対して実質的な作用を有する変数のみを含めることを確実にする。
【０１１５】
胚移植を記録した患者１２５人のうち、両方の研究群で観察された患者が３４人存在した。これは、研究においてＩＶＦを２回経験した患者が存在し、１回は研究処置を有しないが、１回は処置を有していたことを意味する。これらの患者について複数の妊娠結果は独立しておらず、それ故に、統計的モデル内でそのようなものとして処理され得ない。データの繰り返される性質（患者１人当たり複数の観察）を説明するために、それらの複数の応答のうちの相関をモデル化するために、それぞれの患者についての無作為な作用を含む、ロジスティック混合作用モデルを適用する。
【０１１６】
多数の場合において分離も同定した。分離は、二値の結果が独立した変数により分けられ得るとき、ロジスティック回帰に生じる。完全な分離は、分離が完璧であるとき生じ、他方、準完全分離は、例えば、カテゴリー変数の１つの要因（全ての要因よりむしろ）についての応答の全てが同一の結果を有する場合、結果がある程度まで分離されるとき生じる（ＨｅｉｎｚｅおよびＳｃｈｅｍｐｅｒ、２００２年）。以下で記載する通り、この研究において、生児出生は、処置群内の患者においてのみ生じ、対照群において全く生じなかった。したがって、二値の結果である「生児出生」は、独立した変数、「研究群」により分けられる。同様に、臨床的妊娠期に達した対照群の全ての患者は臨床的流産を有し、故に、「臨床的流産」も、独立した変数、「研究群」により分けられる。
【０１１７】
分離の存在において、最大の尤度を介して適合させた標準的ロジスティック回帰モデルは、無限または偏った推定値を生じ得る。分離は、ロジスティック回帰において共通する問題であり、より小さな試料サイズで、より二分法の共変数で、およびより極端なオッズ比で、ならびにそれらの分布のより大きな不均衡で生じる可能性が高い。
【０１１８】
分析においてこれを扱うことについて数種類の選択肢が存在する。第一に、分離を生じるケースを、分析から省くことができる。しかしながら、これは、この場合において、この重要な独立した変数の作用についての情報が存在しなかったを意味し、そしてそれはまた、この変数の作用について他の独立した変数の作用の調整を可能にしなかったので、適当ではない。さらに、これは、データを投げ捨て、モデル化の予測力を低減することを意味するであろう。
【０１１９】
それ故に、２種の他の代替法は、Ｆｉｒｔｈのバイアス低減、罰則付き最尤ロジスティック回帰（ｍａｘｉｍｕｍ  ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ  ｌｏｇｉｓｔｉｃ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ）（Ｆｉｓｈｅｒ、１９９２年、１９９３年）、またはベイズのロジスティック混合作用モデル（Ｆｏｎｇら、２０１０年；Ｚｈａｏら、２００６年）のいずれかの適用である。この場合において、ベイズのアプローチは、分離の問題を扱うだけでなく、上で考察した通り、一部の患者について繰り返した観察を説明するためのモデルにおける無作為な作用も含めるためのより柔軟な枠組みを提供するため、後者を選択した。Ｆｉｒｔｈのロジスティック回帰モデル内の無作為な作用を取り込むことは可能ではない。ベイズのロジスティック混合作用モデルの使用は、固定した作用および無作為な作用についての事前分布を特定することを要求する。他の入手可能な情報がない、この場合において、正規分布を固定した作用について選択し、デフォルトフラット事前分布（ｄｅｆａｕｌｔ  ｆｌａｔ  ｐｒｉｏｒ）を無作為な作用について選択した。
【０１２０】
着床成功エンドポイントは、考慮した独立した変数のいずれでの分離を示さなかった。しかしながら、他の結果との一貫性について、ベイズのロジスティック混合作用モデル化も、このエンドポイントについて使用した。この場合におけるより標準的なアプローチは、標準的ロジスティック混合作用分析であった。このアプローチを使用して分析を再度実行し、それがベイズのモデルと一致する結果を生じたことを見出した。
【０１２１】
統計的ソフトウェアパッケージＲバージョン３．１．１（Ｒ  Ｃｏｒｅ  Ｔｅａｍ、２０１３年）において、全ての分析を行った。ｂｌｍｅパッケージにおけるｂｇｌｍｅｒ機能を使用して、ベイズのロジスティック混合作用モデル（Ｄｏｒｉｅ、２０１４年）を実行した。
【０１２２】
生児出生
表７に示す通り、研究において記録した胚移植を有する患者１２５人の妊娠結果は、研究群で割れた。記録した胚移植を有する患者１２５人のうち、驚くべきことに、処置群内の２５／６３（３９．７％）が、生児出生をもたらし、対照群においてはなかった（６２人のうち）。データは、生児出生成功のオッズは、対照群と比較して、処置群の患者についておよそ５６倍高い（ＯＲ＝５６．０８；９５％  ＣＩ：４．９５、６３５．６４）と推定される（ｐ＝０．００１２）ことを示した。
【表７】
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【０１２３】
さらに、生児出生成功のオッズは、１つの胚を移植した場合の胚移植と比較して、２つまたはそれ超の胚を移植した胚移植について２．７倍高い（ＯＲ＝２．６９；９５％  ＣＩ：１．００、７．２３）と推定される（ｐ＝０．０５０）。
【表８】
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【０１２４】
加えて、以前のＩＶＦサイクルの数は、生児出生成功のオッズと正に相関した。オッズは、２回の以前のサイクルを有する患者については、サイクルを有さない場合と比較して４倍高い（ＯＲ＝４．０４；９５％  ＣＩ：０．８９、１８．３７）と推定され（ｐ＝０．０７１１）、３回の以前のサイクルを有する患者については、サイクルを有さない場合と比較して７．５倍高い（ＯＲ＝７．４６、９５％信頼区間：１．６６、３３．５５）と推定される（ｐ＝０．００８８）。
【表９】
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【０１２５】
さらに、生児出生成功のオッズはまた、以前の流産１回を有する患者については、流産を有さない場合と比較して２．４倍高い（ＯＲ＝２．３７、９５％  ＣＩ：０．９１、６．１５）と推定される（ｐ＝０．０７７３）。
【表１０】
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【０１２６】
イントラリピッドの使用（免疫学的問題に起因する）は、イントラリピッドを使用しない患者と比較して、生児出生成功の３倍のオッズ（ＯＲ＝３．０２、９５％  ＣＩ：１．１９、７．６４）と関連した（ｐ＝０．０１９９）。表１１に示す通り、イントラリピッドを使用したもの（免疫学的問題に起因する）についての生児出生を有する患者の割合は、イントラリピッドを使用しないものについての１４．９％と比較して、３５．５％であった。しかしながら、イントラリピッドを使用する全患者は処置群であった。また表１１に示す、処置群のそれらの患者のみを見ると、これらの割合は、それぞれ、３５．５％対４３．８％になる。
【表１１】
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【０１２７】
ドナー卵子の使用は、ドナー卵子を使用しない患者と比較して、生児出生成功の４倍のオッズ（ＯＲ＝４．０３、９５％  ＣＩ：０．９３、１７．４６）と関連した（ｐ＝０．０６２２）。
【表１２】
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【０１２８】
ドナー卵子の使用は、ドナー卵子を使用しない患者と比較して、生児出生成功の４倍のオッズ（ＯＲ＝４．０３、９５％  ＣＩ：  ０．９３、１７．４６）と関連した（ｐ＝０．０６２２）。
【０１２９】
故に、データは、研究群（例えば、低分子量ヘパリンでの胚移植／着床における処置）が、生児出生についての統計学的に有意な予測変数であり、生児出生のオッズは、対照群と比較して、検査／処置群の患者についておよそ５６倍高いと推定される（ＯＲ＝５６．０８；９５％  ＣＩ：４．９５、６３５．６４；ｐ＝０．００１２）ことを示唆する。対照群における生児出生のオッズが１対８９（すなわち、ｐ＝１／９０＝１．１１％、および１−ｐ＝８９／９０＝９８．８９％；モデル推定オッズに基づく）であり、ＯＲ＝５６であった場合、処置群についての生児出生のオッズは、５６倍良いか、またはおよそ１対１．５９（すなわち、ｐ＝３４．７／９０＝３８．６％、および１−ｐ＝５５．３／９０＝６１．４％）であったであろう。故に、平均的に、妊娠成功をもたらす対照群における全ての妊娠について、８９人が成功しないが、妊娠成功をもたらす処置群の全ての妊娠について、平均してほんの１．５９が成功しない。
【０１３０】
臨床的流産
臨床的妊娠期（すなわち、超音波スキャンで胎児心拍が検出される）に達した胚移植を有する患者４０人のうち、対照群のもののうち１２／１２（１００％）が臨床的流産をもたらし、処置群のもののうち３／２８（１０．７％）が臨床的流産をもたらした。臨床的流産のオッズは、対照群と比較して、処置群の患者について０．０１倍（すなわち、９９％）低い（ＯＲ＝０．０１０；９５％  ＣＩ：０．００１、０．１３５）と推定される（ｐ＝０．０００５）。
【表１３】
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【０１３１】
故に、データは、研究群（例えば、低分子量ヘパリンでの処置）が、臨床的流産（所定の臨床的妊娠、すなわち、検出した胎児心拍）についての統計学的に有意な予測変数であり、臨床的流産のオッズは、基準群と比較して検査／処置群の患者について０．０１倍（すなわち、９９％）低いと推定される（ＯＲ＝０．０１０；９５％  ＣＩ：０．０００７９、０．１３５；  ｐ＝０．０００５）ことを示唆する。
【０１３２】
着床成功
移植した胚１９９個のうち、処置群におけるものの３６／１０４（３４．６％）、および対照群におけるものの１２／９５（１２．６％）が着床成功（胎児心拍を検出）をもたらした。したがって、着床成功のオッズは、対照群と比較して、処置群における胚移植について４．１倍高い（ＯＲ＝４．０８；９５％  ＣＩ：１．８５、８．９７）と推定される（ｐ＝０．０００５）。
【表１４】
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【０１３３】
故に、データは、研究群が、着床成功（すなわち、検出した胎児心拍、所定の移植した胚）についての統計学的に有意な予測変数であり、着床成功のオッズは、対照群と比較して検査／処置群の患者についておよそ４倍高いと推定される（ＯＲ＝４．０８；９５％  ＣＩ：１．８５、８．９７；  ｐ＝  ０．０００５）ことを示唆する。
【化１】
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【化２】
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【化３】
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【化４】
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【図１】
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【配列表】
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