(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
皮膚感染の治療及び予防に使用するための局所組成物であって、プロバイオティック細菌から分泌された物質を含有し、実質的にインタクトなプロバイオティック細菌、溶解細菌、又は細菌断片を含まず、前記プロバイオティック細菌が、ラクトバチルス・ラムノサスＧＧ（Lactobacilllus rhamnosus GG）である、局所組成物。
【請求項２】
担体中に分泌物を含有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記担体が、プロバイオティック細菌を含む培養物から得られた培地を含有する、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
クリーム、ゲル又はスプレーとしての使用のために製剤化される、請求項１から３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記プロバイオティック細菌が嫌気的条件下で培養された、請求項１から４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
細菌皮膚感染の治療又は予防のための、請求項１から５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
前記細菌皮膚感染がブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）感染である、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記細菌皮膚感染が黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）感染である、請求項７に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、プロバイオティック細菌に関し、特に、排他的ではないが、プロバイオティック細菌に由来する抗菌組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
プロバイオティクスが腸の健康に有益であるという概念は、長年にわたって研究されてきた。研究は、プロバイオティクスが上皮バリア機能の向上（４０）及び免疫応答の調節（６、５１）を含む多くのメカニズムを介して腸機能を潜在的に改善することを実証した。プロバイオティクスが病原体による腸のコロニー形成（ｃｏｌｏｎｉｓａｔｉｏｎ）を防ぐことができるという証拠もある。これは、毒性因子の下方制御及び上皮への病原体付着の阻害などのメカニズムを介して行われる（２）。例えば、ラクトバチルス（ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）種は、競争的排除によって腸粘液へのエンテロバクター・サカザキ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓａｋａｚａｋｉｉ）の付着を抑制する（３２）。他の研究は、いくつかのプロバイオティクスが腸ムチンの産生を増加させ、したがって腸上皮細胞への病原体付着を抑制することを実証した（３１）。プロバイオティクスは抗菌性ペプチド（バクテリオシン）及び酸を産生することもできる。まとめると、病原体のコロニー形成を制限する多数のプロバイオティクス媒介メカニズムがある（３３）。
【０００３】
プロバイオティクスは腸に良い影響を与え得るので、他の系統、例えば口（１８）及び尿生殖路（ｕｒｏｇｅｎｉｔａｌ  ｔｒａｃｔ）（４４）へのそれらの潜在的な影響も調査され始めている。細菌性膣症を患っている女性の臨床試験における乳酸菌の経口投与の影響を調査する２００１年の研究は、乳酸菌が実際に病原体による尿路上皮細胞（ｕｒｏ−ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ）のコロニー形成を抑制できたことを示した（４４）。近年、皮膚へのプロバイオティクスの局所適用が限られた数の研究において調査されている。アトピー性皮膚炎を患っている患者への超音波処理したストレプトコッカス・サリバリウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）株の局所適用は、角質層におけるセラミドのレベルを増加させることによって明らかに改善されたバリア機能をもたらした（１３）。感染創の治療のために局所的に適用されたＬ．プランタラム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）は、マウスの熱傷モデルにおける改善された組織修復、ならびにヒトの慢性下肢潰瘍及び熱傷における感染の予防をもたらした（４１、４２）。しかしながら、一般に、これらの影響の根底にあるメカニズムは十分に理解されていない。
【０００４】
黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）は、皮膚の一過性の生着菌（ｃｏｌｏｎｉｓｅｒ）であり、かつ主要な日和見皮膚病原体でもあって、膿痂疹から生命を脅かす状態に及ぶ疾患、例えば敗血症を引き起こす（２５）。これまでに、発明者らの研究室では、プロバイオティクスのＬ．ロイテリ（Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ）が角化細胞結合部位からの病原体の競争的排除を介して、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の毒作用から表皮角化細胞を保護できたことを実証した（４３）。発明者らは現在、Ｌ．ラムノサス（Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＧＧを、黄色ブドウ球菌の作用から皮膚細胞を保護する能力を有する第２のプロバイオティクスとして同定している。しかしながら、Ｌ．ラムノサスＧＧは、黄色ブドウ球菌の増殖の抑制、角化細胞からの病原体の競争的排除及び置換を含む、感染から保護するための複数のメカニズムを使用する。
【発明の概要】
【０００５】
発明の概要
プロバイオティック細菌又はそれらに由来する物質の局所適用の潜在的な利点を評価した研究はほとんどない。発明者らは、プロバイオティック細菌であるラクトバチルス・ラムノサスＧＧ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ  ＧＧ）が、培養中のヒト初代角化細胞の黄色ブドウ球菌感染を抑制できるかどうかを調査した。初代ヒト角化細胞を黄色ブドウ球菌に曝露した場合、角化細胞のわずか２５％がその後２４時間で生存を維持した。しかしながら、生きたＬ．ラムノサスＧＧの１０8ＣＦＵ／ｍｌの存在下では、感染した角化細胞の生存率は５７％まで増加した（Ｐ＝０．０１）。興味深いことに、Ｌ．ラムノサスＧＧの溶解物及び使用済み培養液も、それぞれ細胞の６５％（Ｐ＝０．００６）、及び５７％（Ｐ＝０．０１）で角化細胞に顕著な保護を与え、２４時間のインキュベーション後に生存していた。プロバイオティクスが黄色ブドウ球菌感染の２時間前又は同時（Ｐ＝０．００５）あるいは１２時間後（Ｐ＝０．０１）に、生存型で、又は溶解物として適用されたか否かにかかわらず、角化細胞の生存率は顕著に強化された。しかしながら、使用済み培養液は、黄色ブドウ球菌に前又は同時に添加された場合にのみ保護的であった。メカニズムに関して、Ｌ．ラムノサスＧＧの溶解物又は使用済み培養液のいずれも競争的排除によって角化細胞への黄色ブドウ球菌の付着を一見抑制したが、生菌又は溶解物のみが黄色ブドウ球菌を置換する（ｄｉｓｐｌａｃｅ）ことができた（それぞれＰ＝０．０４及び０．０１）。さらに、黄色ブドウ球菌の増殖は、使用済み培養液ではなく生菌又は溶解物のいずれかによって抑制された。共に、これらのデータは、黄色ブドウ球菌に対するＬ．ラムノサスＧＧの保護効果、増殖抑制及び細菌付着の減少に関与する、少なくとも２つの別個の活性を示差する。
【０００６】
発明者らはこれまでに、病原細菌、例えば黄色ブドウ球菌による感染から細胞を保護するプロバイオティック細菌及びそれらの溶解物を実証した（国際公開第２０１３／１５３３５８号参照）。発明者らは現在、プロバイオティック細菌が以前に培養された、細胞を含まない培養上清も、細胞に付着し又は感染する病原細菌を防ぐことができることを実証した。したがって、プロバイオティック細菌は少なくとも２つのメカニズムによって感染から細胞を保護することができる。第一に、プロバイオティック細菌は、病原細菌の増殖及び／又は生存能を直接抑制することができるプロバイオティック細菌中に含まれる１又は複数の物質を介して、病原細菌の増殖を減少させ又は抑制することができるかもしれない。第二に、本明細書に同定された、プロバイオティック細菌から分泌された（したがって培養培地中に存在する）１又は複数の物質は、おそらく細胞への病原細菌の付着防止を介して、細胞に感染する病原細菌の能力を抑制することができる。それゆえ、プロバイオティック細菌によって分泌された物質は病原細菌感染を防ぐ。したがって、当該分泌物は本明細書に記載の様々な抗菌組成物に利用することができる、抗菌又は抗感染特性を有する。
【０００７】
本発明の態様及び実施形態をこれより添付図面を参照して例として説明することになる。さらなる態様及び実施形態が当業者に明らかになるであろう。本文書に記述された全ての文献は参照により本明細書に組み込まれる。
【０００８】
図面の簡単な説明
本発明の原理を説明する実施形態及び実験を、これより以下の添付図面を参照して論じることになる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】Ｌ．ラムノサスＧＧは黄色ブドウ球菌の毒作用から角化細胞を保護する。非感染細胞は（９０％）の平均生存率を有した。黄色ブドウ球菌感染細胞は（２５％±３．４）の平均生存率を有した。黄色ブドウ球菌及びＬ．ラムノサスＧＧの組み合わせに感染した角化細胞（ＬＧＧ＋ＳＡ）では、２４時間後の生存率は５７％±２．７であった（Ｐ＝０．０１、ｎ＝３）。
【図２】Ｌ．ラムノサスＧＧからの溶解物及び使用済み培養液（ＣＭ）は、黄色ブドウ球菌の影響から角化細胞を保護する。黄色ブドウ球菌感染角化細胞の生存率は、黄色ブドウ球菌（ＳＡ）に単独で感染した角化細胞における２５％±３．１と比較して、Ｌ．ラムノサスＧＧの溶解物（ＬＧＧＬＹＳ＋ＳＡ）で６５％±２．４であり、使用済み培養液（ＬＧＧＣＭ＋ＳＡ）で５７％±１．５であった。（それぞれＰ＝０．００６、Ｐ＝０．０１、ｎ＝３）。
【図３】Ｌ．ラムノサスＧＧは黄色ブドウ球菌による感染から角化細胞を保護する。角化細胞のパーセンテージの生存率は、黄色ブドウ球菌（ＳＡ）感染細胞（２５％±１．３）と比較して、Ｌ．ラムノサスＧＧ（ＬＧＧ＋ＳＡ）、溶解物（ＬＧＧ  ＬＹＳ＋ＳＡ）又は使用済み培養液（ＬＧＧ  ＣＭ＋ＳＡ）に事前曝露された細胞において有意に高かった（５８％±１．４、５７％±１．９、５５％±０．５、Ｐ＝０．００６、Ｐ＝０．００５、Ｐ＝０．００４）（ｎ＝３）。
【図４Ａ】Ｌ．ラムノサスＧＧは黄色ブドウ球菌媒介毒性から角化細胞を救うが、その使用済み培養液は救わない。Ａ）非感染角化細胞を一晩インキュベートした；当該細胞の約９０％が２４時間後に生存していた。黄色ブドウ球菌感染角化細胞の生存率は、Ｌ．ラムノサスＧＧ（Ｐ＝０．００３、ｎ＝３）で、２時間（５２％±１．６）、４時間（５４％±１．４）、６時間（５７％±１．３）、８時間（５８％±１．３）又は１２時間（５８％±１．５）、事後曝露した細胞において、有意により高かった。
【図４Ｂ】Ｂ）黄色ブドウ球菌（ＳＡ）に単独で感染した角化細胞の生存率（２５％±１．７）に対して、感染が始まった２時間（５７４％±３．１）、４時間（５８％±２．１）、６時間（６３％±１．２）、８時間（６３％±１．３）又は１２時間（５５％±２．４）後にＬラムノサスＧＧ溶解物で処理した細胞の生存率の間には有意差があった（Ｐ＝０．０１、ｎ＝３）。
【図４Ｃ】Ｃ）同時曝露された細胞が黄色ブドウ球菌感染からの有意な保護を有するのに対し（５６％±２．１、Ｐ＝０．０１、ｎ＝３）、Ｌ．ラムノサスＧＧ使用済み培養液（ＣＭ）で事後曝露した細胞は、２時間（３２％±２．６）、４時間（３９％±２．４）、６時間（３７％±１．８）、８時間（３６％±１．３）又は１２時間（３５％±３．５）で、有意な保護を有さなかった（Ｐ＝０．１５、ｎ＝３）。
【図５Ａ】Ｌ．ラムノサスＧＧの溶解物はブドウ球菌の生存率を減少させたが、使用済み培養液は減少させなかった。Ａ）角化細胞の存在下で増殖し、Ｌ．ラムノサスＧＧの溶解物（ＬＧＧ  ＬＹＳ）又は使用済み培養液（ＬＧＧ  ＣＭ）で処理した黄色ブドウ球菌（ＳＡ）培養物の光学密度を、細菌の増殖を観察するために１時間毎に測定した。使用済み培養液が効果を有しなかったのに対し、プロバイオティック溶解物の存在下における黄色ブドウ球菌の増殖は、黄色ブドウ球菌培養物よりも有意に低かった（Ｐ＝０．０２、ｎ＝３）。
【図５Ｂ】Ｂ）黄色ブドウ球菌（ＳＡ）の５ｌｏｇＣＦＵ／ｍｌがＬ．ラムノサスＧＧの溶解物の存在下で生存していたのに対し、角化細胞培養物単独における生存黄色ブドウ球菌（ＳＡ）の数は８ｌｏｇＣＦＵ／ｍｌであり、あるいは使用済み培養液（ＬＧＧ  ＣＭ）で７．８７ｌｏｇＣＦＵ／ｍｌであった。
【図５Ｃ】Ｃ）角化細胞培養物中の生存ブドウ球菌の総数は感染後アッセイ（２−４−６−８及び１２時間）でＬラムノサスＧＧ溶解物により減少し、また、黄色ブドウ球菌単独と比較して、２時間のインキュベーション後の黄色ブドウ球菌生存率の有意な減少を示した（Ｐ＝０．０５、ｎ＝３）。
【図６】生きたＬ．ラムノサスＧＧ、溶解物又は使用済み培養液は、結合部位からの競争的排除によって黄色ブドウ球菌が角化細胞に付着することを抑制した。角化細胞に付着する細菌の能力は、黄色ブドウ球菌（ＳＡ）（１０6）が１時間角化細胞に適用された場合、約７．５±０．６ｌｏｇＣＦＵ／ｍｌで細胞に付着したが、Ｌ．ラムノサスＧＧ（ＬＧＧ）（１０8）は約７．９±０．５ｌｏｇＣＦＵ／ｍｌで付着した。黄色ブドウ球菌（ＳＡ）に単独で感染した細胞と比較して（７．９±０．６ｌｏｇＣＦＵ／ｍｌ）、Ｌ．ラムノサスＧＧ（ＬＧＧ＋ＳＡ）、溶解物（ＬＧＧＬＹＳ＋ＳＡ）又は使用済み培養液（ＬＧＧ  ＣＭ＋ＳＡ）に事前曝露した細胞は、それらに付着した有意に少ないブドウ球菌を有した（それぞれ５．８３±０．２ｌｏｇＣＦＵ／ｍｌ、５．９±０．６ｌｏｇＣＦＵ／ｍｌ及び６．４±０．７ｌｏｇＣＦＵ／ｍｌ）（Ｐ＝０．０４、ｎ＝３）。
【図７】生きたＬ．ラムノサスＧＧ又は溶解物は、黄色ブドウ球菌が結合部位への競争的置換によって角化細胞に付着することを抑制した。黄色ブドウ球菌（ＳＡ）に単独で感染した細胞と比較して（７．９５±０．６ｌｏｇＣＦＵ／ｍｌ）、Ｌ．ラムノサスＧＧ（ＬＧＧ−１２時間）又は溶解物（ＬＧＧＬＹＳ−１２時間）に事後曝露した細胞は、１２時間後にそれらに付着した有意に少ないブドウ球菌を有した（それぞれ５．８±０．７ｌｏｇＣＦＵ／ｍｌ、５．４±０．３ｌｏｇＣＦＵ／ｍｌ）（Ｐ＝０．０１、ｎ＝３）。一方で、Ｌ．ラムノサスＧＧ使用済み培養液（ＬＧＧ  ＣＭ−１２時間）に事後曝露した細胞は黄色ブドウ球菌付着数を減少させなかった（７±０．６ｌｏｇＣＦＵ／ｍｌ、Ｐ＞０．０５、ｎ＝３）。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
説明
本発明は、記載された態様及び好ましい特徴の組み合わせが明らかに許されない又は明示的に避けられる場合を除き、そのような組み合わせを含む。
【００１１】
本明細書で使用される節の見出しは構成上の目的だけのためであり、記載された主題を限定するものと解釈されるべきではない。
【００１２】
プロバイオティック細菌
本発明は、プロバイオティック細菌の使用に関する。プロバイオティクスは一般に、「十分な量で投与された場合に宿主に健康上の利益を与える生きた微生物」として定義される。腸における研究は、宿主組織への病原体付着の排除、競争及び置換を含むメカニズムを介して、病原体によるコロニー形成を抑制するプロバイオティック細菌の能力を実証した。本明細書で用いられる、用語「プロバイオティック細菌」はまた、それらがもはや生きていない場合、例えば熱又は放射線による不活化後の、そのような細菌に言及してもよい。
【００１３】
ラクトバチルス・ラムノサス
本発明は特に、ラクトバチルス・ラムノサス種のプロバイオティック細菌に関する。そのような細菌は、当初はラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ）の亜種であると考えられたが、後の遺伝的研究によりその独自の種であることが分かった。多くのＬ．ラムノサス株が知られている。例えば、株Ｉ−１７２０（Ｐａｓｔｅｕｒ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ）、ＡＣ４１３、ＧＲ−１（Ｋａｒｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２０１２、１２：１５）、ＪＢ−１（Ｂｒａｖｏ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ２０１１  １０８（３８）１６０５０−１６０５５）ＧＧ及びＬＣ７０５（Ｓａｖｉｊｏｋ  ｅｔ  ａｌ．  ，Ｊ．  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０１１  １０（８）３４６０−３４７４）。Ｌ．ラムノサスのその他の株は容易に単離され得る。
【００１４】
特に、本発明は、Ｌ．ラムノサスＧＧに関する。Ｌ．ラムノサスＧＧ（本明細書ではＬＧＧとも言う）はＡＴＣＣ（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ））に、受託番号ＡＴＣＣ  ５３１０３の下で寄託されている。ＬＧＧは１９８３年にＧｏｒｂａｃｈ及びＧｏｌｄｉｎによって健康な人間の腸管から単離された。
【００１５】
組成物
本発明に係る組成物は、プロバイオティック細菌由来の分泌物を含み、又はその分泌物からなる。
【００１６】
分泌物とは、プロバイオティック細菌から分泌された物質をいう。当該分泌物は、単一の物質であってもよい。それは２以上の物質の混合物であってもよい。当該分泌物はタンパク質、炭水化物、核酸又は脂質を含んでもよい。分泌物は、プロバイオティック細菌の分泌されたタンパク質及び分泌機構のすべてである、セクレトーム（ｓｅｃｒｅｔｏｍｅ）を含んでもよい。それはさらに、炭水化物、脂質及び核酸などのタンパク質ではない分子を包含してもよい。
【００１７】
本明細書に記載されるいくつかの組成物は、担体中に分泌物を含有する。当該担体は通常、分泌物が溶解、懸濁、希釈、又は混合される溶液である。
【００１８】
ある場合には、当該担体は、培養中にプロバイオティック細菌に接触していた培地であってもよい。培地の組成は、例えばプロバイオティック細菌からの物質の分泌によって、培養中に変化しているであろう。当該組成物は、プロバイオティック細菌が増殖した培養培地からなり、又はその培養培地を含む。
【００１９】
プロバイオティック細菌の培養に適した培地は当業者によく知られている。本明細書で用いられる用語「培地（ｍｅｄｉａ）」及び「培地（ｍｅｄｉｕｍ）」は、微生物、例えば細菌が支持され、生存を維持し、増殖し及び／又は拡大されてもよい液体を含む、任意の栄養素を包含する。当該培地は、細菌の生命を維持するための最小限の栄養素、及び任意に他の栄養素を含んでもよい。培養液中に含まれる代表的な栄養素には、糖、マグネシウム、リン酸、リン及び硫黄が挙げられる。当該培地は、当該技術分野でよく知られた栄養素の組み合わせ、例えばＷｉｌｋｉｎｓ−Ｃｈａｌｇｒｅｎ培養液に作製され、又はそれから改変されてもよい。培地は商業的供給源から得られた予混合であってもよく、又は自家製造されてもよい。
【００２０】
プロバイオティック細菌は、少なくとも６時間、少なくとも１２時間、少なくとも１８時間、少なくとも２４時間、少なくとも３日間、少なくとも４日間、少なくとも５日間、少なくとも６日間、少なくとも７日間、少なくとも８日間、少なくとも９日間、少なくとも１０日間、少なくとも２週間、又はそれ以上、培地と接触していてもよい。
【００２１】
プロバイオティック細菌は、培地中で、又は培地と接触して、好気的又は嫌気的条件下で培養されていてもよい。好ましくはプロバイオティック細菌は、嫌気的条件下で培養された。例えば、培養は１０％Ｈ2、１０％ＣＯ2、８０％Ｎ2の下で行われてもよい。
【００２２】
プロバイオティック細菌は、培地中で、プロバイオティック細菌の増殖及び拡大を促進する条件下で培養されていてもよい。そのような条件は当業者によく知られている。例えば、培養は３７℃でインキュベートされてもよい。
【００２３】
好ましくは当該組成物は、プロバイオティック細菌を含まない。プロバイオティック細菌は、例えば遠心分離及び／又は濾過によって、培地から除去されていてもよい。例えば、細菌は、実質的にすべての細菌が培地から沈降するのに十分な時間、１５，０００ｘｇでの遠心分離で、培地からそれらを沈降させることによって除去されてもよい。培地は、実質的に全ての細菌を培地から除去するのに適したサイズの孔を有する微孔性フィルターを使用して濾過されてもよい。これらの方法はインタクトな細菌を除去することができ、細菌破片、例えばアポトーシスなどによって細胞溶解を受けた任意の細菌の残骸を除去することもできる。分泌物を含む培地は、溶解処理された培養物からは得られておらず、したがって溶解物からは得られず、かつ得られていない。
【００２４】
当該組成物は無菌であってもよい。すなわち、当該分泌物は滅菌処理、例えば放射線照射、熱、化学物質、圧力、又は濾過、あるいはそれらの任意の組み合わせに供された。これは、オートクレーブ処理、Ｘ線滅菌又はＵＶ光殺菌を含んでもよい。分泌物を含む培地の場合、当該培地は、プロバイオティック細菌を導入し培養する前に、そしてまた、細菌がその培地から除去された後に、滅菌されていてもよい。
【００２５】
ある場合には、分泌物を含有する組成物は、実質的にインタクトな細菌を含まない。当該組成物はまた、溶解細菌又は細菌断片、例えばアポトーシスを受けた細菌を実質的に含まなくてもよい。インタクトな細菌及び／又は溶解細菌又は細菌断片は、分泌物から分離されていてもよい。分離は当該技術分野で知られている任意の好適な方法、例えば遠心分離又は濾過によって行われてもよい。「実質的に含まない」とは、分泌物が、非分泌性の細菌成分、例えば細菌全体、溶解細菌又は細菌断片の最小限の夾雑物を含み、あるいはそれらを含まないことを意味する。したがって、当該組成物は、１００％の分泌物、少なくとも９９％の分泌物、少なくとも９５％の分泌物、少なくとも９０％の分泌物、少なくとも８５％の分泌物、少なくとも８０％の分泌物、少なくとも７５％の分泌物、又は少なくとも７０％の分泌物を含んでもよい。当該分泌物は、本明細書に記載される非細菌由来の追加の成分、例えば担体溶液、他の活性剤、又は保存剤を含んでもよい。
【００２６】
本明細書に記載の組成物は、培地中でプロバイオティック細菌を培養し、培地からプロバイオティック細菌を分離し、そして培地から組成物を調製することによって調製されてもよい。プロバイオティック細菌は嫌気的条件下で培養されてもよい。プロバイオティック細菌は、人体の正常体温を超える温度で培養されてもよい。プロバイオティック細菌は、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃又は４１℃で培養されてもよい。好ましくはプロバイオティック細菌は３７℃で培養される。プロバイオティック細菌は、培地中で１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間又は１４日間、培養されてもよい。プロバイオティック細菌又は溶解細菌又は細菌の断片は遠心分離、例えば１５０００ｘｇでの遠心分離によって培地から分離されてもよい。培地は、濾過によって、プロバイオティック細菌、溶解細菌又は細菌の断片から分離されてもよい。培地は、濾過及び遠心分離の組み合わせによって分離されてもよい。培地は、プロバイオティック細菌が除去される前又は後に、滅菌に供してもよい。例えば、細菌全体、溶解細菌又は細菌断片からの培地の分離後に、当該培地を滅菌に供する。培地は、培地の全容積に対して分泌物の割合が大きくなるように濃縮に供してもよい。濃縮は当該技術分野で知られている任意の方法、例えば蒸発によって行われてもよい。分泌物は、培地から分離されてもよい。担体溶液から物質を分離する任意の方法が使用されてもよい。例えば分泌物は、クロマトグラフィー、結晶化、蒸留、乾燥、電気泳動又は沈殿によって、培地から分離されてもよい。一度培地から単離され、又は培地中で濃縮されて、分泌物は担体に溶解又は希釈されてもよく、あるいは別の方法で本明細書に開示される組成物へと製剤化されてもよい。
【００２７】
治療適用
本発明の化合物及び組成物は、広範囲の疾患及び症状の治療に有用である。特にそれらは細菌感染を含む皮膚感染の治療及び予防に有用である。特に、当該化合物及び組成物は黄色ブドウ球菌感染の治療又は予防に有用である。当該化合物及び組成物は特に、軟組織の細菌感染、例えば皮膚感染の治療に有用である。本発明の化合物及び組成物は特に、黄色ブドウ球菌皮膚感染の予防又は治療に有用である。
【００２８】
本発明は、感染の予防又は治療に関する。本発明のプロバイオティック組成物は抗感染活性を示す。例えば、細胞への黄色ブドウ球菌の付着を予防することを含む、抗付着活性。したがって、当該組成物は細菌感染を含む感染の予防又は治療、例えば多剤耐性細菌感染、院内細菌感染、抗生物質耐性細菌感染、グラム陰性及び／又はグラム陽性細菌感染による感染の予防又は治療に有用である。
【００２９】
本発明の組成物は、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）種、例えば腐性ブドウ球菌（Ｓ．ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｓ）、Ｓ．キシローサス（Ｓ．ｘｙｌｏｓｕｓ）、Ｓ．ルグドゥネンシス（Ｓ．ｌｕｇｄｅｎｅｎｓｉｓ）、Ｓ．シュライフェリ（Ｓ．ｓｃｈｌｅｉｆｅｒｉ）、Ｓ．カプラエ（Ｓ．ｃａｐｒａｅ）、表皮ブドウ球菌（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、Ｓ．サプロフィティクス（Ｓ．ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｓ）、Ｓ．ワーネリ（Ｓ．ｗａｒｎｅｒｉ）、黄色ブドウ球菌、Ｓ．ホミニス（Ｓ．ｈｏｍｉｎｉｓ）、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）、Ｓ．ピロジェネス（Ｓ．ｐｙｒｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サイイバリウ（Ｓ．ｓａｉｉｖａｒｉｕ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）及びブドウ球菌肺炎（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）による感染の予防に有用である。
【００３０】
特に本発明の組成物は、抗ブドウ球菌付着活性を示し、それゆえブドウ球菌感染の予防又は治療に有用である。例えば、本発明の組成物は抗黄色ブドウ球菌活性を示し、それゆえ黄色ブドウ球菌感染の予防又は治療に有用である。
【００３１】
感染は、微生物を身体の組織に侵入させる疾患で起こる。これらの微生物及びそれらが産生する毒素の増加は身体の組織と反応し、しばしば感染した宿主による免疫応答を引き起こす。感染は、細菌、ウイルス、ウイロイド、真菌及びその他の寄生虫によって引き起こされ得る。感染は身体の組織、例えば皮膚、腸又は膜のいずれかを介して生じ得る。本発明のいくつかの実施形態では、本発明のプロバイオティック細菌又は溶解物は腸以外の組織の感染を治療するために使用され、例えばいくつかの実施形態では、本発明に係るプロバイオティック細菌又は溶解物は消化管、食道、胃、腸、直腸又は肛門の感染の治療には使用されない。特に本発明の態様は、体の外表面、及び特に皮膚の感染の治療又は予防に関する。
【００３２】
本発明に係る組成物は、皮膚感染の予防又は治療に使用されてもよい。当該感染は細菌、例えば黄色ブドウ球菌を含むブドウ球菌細菌によるものであってもよい。当該組成物は感染因子への曝露と別々に、連続して又は同時に適用されてもよい。好ましくは、当該組成物は感染因子への曝露前に適用される。
【００３３】
本発明の組成物は好ましくは細菌感染の予防のために使用される。それらは、対象が感染因子、例えば黄色ブドウ球菌に曝露される前に対象に優先的に投与される。当該対象は、感染因子による感染の危険性があると同定されていてもよい。対象は、当該対象の環境、例えば本発明の因子が存在することが知られている環境におかれているために、あるいは、当該対象の健康状態、例えば開放創の存在又は貧しい免疫健康のために、感染因子による感染の危険性があると同定されてもよい。例えば、当該組成物は、病理細菌が存在することが知られ又は疑われている、病院又はその他の臨床環境で使用されてもよい。
【００３４】
ある場合には、患者は外科手術を受けようとしている、又は最近受けている。本明細書に記載の組成物は、病原細菌による開放創、例えば外科的切開又は移植片の感染を予防するために使用されてもよい。
【００３５】
ある場合には、対象は感染因子による感染を有さないと判断される。例えば、当該対象は黄色ブドウ球菌感染を有さないと判断され得る。対象が感染を有するかどうかを判断するための方法は、当該技術分野でよく知られており、感染因子の存在について対象から得られた試料の分析を含んでもよい。
【００３６】
組成物は、治療される症状によって同時に又は連続のいずれかで、単独で又は他の治療との組み合わせで投与されてもよい。
【００３７】
分泌物は、１又は複数の他の薬学的に許容される成分に溶解され、懸濁され、又は混合されてもよい。プロバイオティック細菌又はそれらの溶解物は、リポソーム又は他の微粒子で提示されてもよい。
【００３８】
いくつかの実施形態では、分泌物は薬学的に許容される賦形剤、希釈剤又は担体中の懸濁液として提供されてもよい。いくつかの実施形態では、プロバイオティック細菌は凍結乾燥物として提供されてもよい。
【００３９】
非治療的適用
本発明はまた、洗浄用品、洗浄剤、表面コーティング、あるいはヒト又は動物の体の治療用でない他の組成物の形態で、抗細菌組成物を提供する。
【００４０】
そのような薬剤は表面上の細菌の蓄積を除去し、死滅させ、又は予防し、あるいは細菌の活動又は増殖を抑制するために有用であり得る。当該分泌物は抗細菌組成物として製剤化される。
【００４１】
本発明に係る抗菌組成物は、患者もしくは対象への投与、又は治療、又は使用に先立って、生体材料、インプラント及びプロテーゼ（ステント、バルブ、眼、補聴器、胃バンド、義歯、人工関節置換などを含む）、手術器具、あるいは他の医療用機器を処理するために有用で有り得る。当該抗細菌組成物は、コロニー形成又は細菌に曝露しやすい表面、例えば手すり、食品調理面、台所表面もしくは台所用品、テーブル、シンク、トイレ、又はその他の浴室機器を処理するために有用で有り得る。
【００４２】
抗細菌組成物は、溶解物に加えて薬剤、例えば洗浄剤、安定化剤、アニオン性界面活性剤、香料、キレート剤、酸、アルカリ、緩衝剤又は洗剤を含有してもよい。そのような薬剤は、例えば細菌を死滅させ又は抑制し、あるいは洗浄された表面の再コロニー形成を予防する、薬剤の抗菌特性を促進し又は強化してもよい。
【００４３】
本発明はまた、表面の調製方法であって、当該表面に分泌物を適用することを含む、方法を生み出す。当該方法は病原性微生物による表面のコロニー形成の減少をもたらし得る。
【００４４】
製剤
分泌物を単独で使用することは可能であるが、当該物質と担体とを含む製剤として提供することが好ましい。分泌物は、１又は複数の他の成分に溶解され、懸濁され、又は混合されてもよい。ある場合には、分泌物はリポソーム又は他の微粒子で提供される。
【００４５】
本明細書に開示される製剤は、医療用、パーソナルケア及び消費者製品を含む、皮膚のケア、創傷ケア、呼吸器ケア、ならびに口腔ケア製剤を含む。
【００４６】
製剤は好適には、液体、溶液（例えば、水性、非水性）、懸濁液（例えば、水性、非水性）、乳濁液（例えば、水中油型、油中水型）、エリキシル剤、シロップ剤、舐剤、洗口剤、滴剤、錠剤（例えば、コーティング錠を含む）、顆粒剤、散剤、ロゼンジ（ｌｏｓｅｎｇｅｓ）、トローチ剤、カプセル剤（例えば、ハード及びソフトゼラチンカプセルを含む）、カシェ剤、丸剤、アンプル、ボーラス、坐剤、ペッサリー、チンキ剤、ゲル、ペースト、軟膏、クリーム、ローション、オイル、フォーム、スプレー、ミスト、又はエアロゾルの形態であってもよい。
【００４７】
製剤は好適には、１又は複数の活性化合物、ならびに任意に、例えば浸透、透過及び吸収促進剤を含む、１又は複数の他の薬学的に許容される成分を染み込ませた、パッチ、絆創膏、包帯、ドレッシングなどとして提供されてもよい。製剤はまた好適には、デポ剤又はリザーバーの形態で提供されてもよい。
【００４８】
いくつかの製剤では、分泌物は１又は複数の薬学的に許容される成分とともに製剤化される。薬学的に許容される成分は、当業者によく知られており、そして、薬学的に許容される担体、アジュバント、賦形剤、希釈剤、充填剤、緩衝剤、保存剤、抗酸化剤、潤滑剤、安定剤、可溶化剤、界面活性剤（例えば、湿潤剤）、マスキング剤、着色剤、香味剤、及び甘味剤を含むが、これらに限定されない。当該製剤はさらに、他の活性成分、例えば他の治療剤又は予防剤を含んでもよい。
【００４９】
本明細書での特定の製品及び製剤は、皮膚ケア又は創傷ケアに適している。「皮膚ケア」とは、皮膚の健康を維持し又は改善するための、あるいは皮膚の外観を改善するための、成人又は幼児の皮膚の治療に有用な製品を含む局所パーソナルケア及び／又はヘルスケア製品を意味する。「創傷ケア」は、創傷の閉鎖もしくは治癒を助けるための、及び／又は、創傷に関連する疼痛もしくは瘢痕を減少させるための、創傷の治療のための製品を含んで、そのような組織又は皮膚の健康を維持し又は改善し、そのような組織又は皮膚を修復し、かつ、そのような組織又は皮膚の炎症、かゆみ及び／又は赤みを低減する。
【００５０】
いくつかの実施形態では、本発明に係る分泌物は局所投与のために、特に皮膚へ又は皮膚上への使用又は適用のために製剤化される。
【００５１】
局所投与に適している製剤は、ゲル、ペースト、軟膏、クリーム、ローション、及び油、ならびにパッチ、絆創膏、包帯、ドレッシング、デポ剤、セメント、グル―、及びリザーバーを含む。
【００５２】
軟膏は典型的には、当該分泌物、及びパラフィン系又は水混和性基材から調製される。
【００５３】
クリームは典型的には、プロバイオティック細菌又は溶解物、及び水中油型クリーム基材から調製される。所望であれば、クリーム基材の水相は、例えば、少なくとも約３０％ｗ／ｗの多価アルコール、すなわち、２以上のヒドロキシル基を有するアルコール、例えばプロピレングリコール、ブタン１，３−ジオール、マンニトール、ソルビトール、グリセロール、及びポリエチレングリコール、ならびにそれらの混合物を含んでもよい。局所製剤は望ましくは、皮膚又は他の患部を通じた活性化合物の吸収又は浸透を促進する化合物を含んでもよい。そのような皮膚浸透促進剤の例としては、ジメチルスルホキシド及び関連類似体が挙げられる。
【００５４】
乳濁液は典型的には、プロバイオティック細菌又は溶解物、及び油相から調製され、それは単に乳化剤（さもなければエマルジェント（ｅｍｕｌｇｅｎｔ）として知られる）を任意に含んでもよく、あるいはそれは少なくとも１つの乳化剤と脂肪もしくは油との、又は脂肪もしくは油の両方との混合物を含んでもよい。好ましくは、親水性乳化剤は、安定剤として作用する親油性乳化剤と共に含まれる。油及び脂肪の両方を含むことも好ましい。共に、安定剤（複数）の有無に関わらず乳化剤（複数）はいわゆる乳化ワックスを構成し、そして当該ワックスは油及び／又は脂肪と共に、クリーム製剤の油性分散相を形成するいわゆる乳化軟膏基材を構成する。
【００５５】
好適なエマルジェント及び乳濁液安定剤には、Ｔｗｅｅｎ６０、Ｓｐａｎ８０、セトステアリルアルコール、ミリスチルアルコール、モノステアリン酸グリセリルおよびラウリル硫酸ナトリウムが挙げられる。医薬乳濁液製剤に使用されやすいほとんどの油における活性化合物の溶解度は非常に低くてもよいので、当該製剤に適した油又は脂肪の選択は所望の化粧品特性を達成することに基づく。したがって、クリームは好ましくは、チューブ又はその他の容器からの漏れを避けるために好適な稠度を有する、非グリース状（ｎｏｎ−ｇｒｅａｓｙ）、非染色及び洗浄可能な製品であるべきである。直鎖又は分岐鎖、一塩基性又は二塩基性アルキルエステル、例えばジイソアジペート（ｄｉ−ｉｓｏａｄｉｐａｔｅ）、ステアリン酸イソセチル、ココナッツ脂肪酸のプロピレングリコールジエステル、ミリスチン酸イソプロピル、オレイン酸デシル、パルミチン酸イソプロピル、ステアリン酸ブチル、パルミチン酸２−エチルヘキシル、あるいはＣｒｏｄａｍｏｌ  ＣＡＰとして知られる分岐鎖エステルのブレンドが使用されてもよく、最後の３つが好ましいエステルである。これらは必要とされる特性に応じて、単独で又は組み合わせで使用されてもよい。あるいは、高融点の脂質、例えば白色ワセリン及び／又は流動パラフィンあるいはその他の鉱油を使用することができる。
【００５６】
本明細書に記載のいくつかの製品及び製剤は口腔ケアに適している。「口腔ケア」とは、歯、粘膜、下などにおける使用のための製品を含む、口腔もしくはその任意の部分における物質の使用、及び／又は使用のための製品を意味する。口腔ケアの分野における製品及び使用は、例えば歯のホワイトニング、着色予防などを含む歯の美観、ならびに抗歯垢、抗歯肉炎、抗過敏（ａｎｔｉ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）、虫歯予防、口臭除去、口渇緩和、酸蝕の修復及び予防、活性送達（ａｃｔｉｖｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ）及び保持、感覚の強化及び食感の変化（ｍｏｕｔｈ  ｆｅｅｌ  ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ）などを対象としたものを含む。
【００５７】
口腔ケアのための製剤には、歯科スプレー、洗口剤、練り歯磨き、ロゼンジ、抗菌洗浄剤、飲料（例えば牛乳、ヨーグルト）、食品（例えばヨーグルト、アイスクリーム、キャンディーバー）、又は粉末食品（例えば粉ミルク）が挙げられる。口腔ケアに適している製剤は、口腔及び／又は頬側投与に適している製剤を含む。
【００５８】
経口投与に適している製剤（例えば摂取による）には、液体、溶液（例えば、水性、非水性）、懸濁液（例えば、水性、非水性）、乳濁液（例えば、水中油型、油中水型）、エリキシル剤、シロップ剤、舐剤、錠剤、顆粒、散剤、カプセル剤、カシュ剤、丸剤、アンプル、ボーラスが挙げられる。
【００５９】
頬側投与に適している製剤には、洗口剤、ロゼンジ、トローチ剤、ならびにパッチ、絆創膏、デポ剤、及びリザーバーが挙げられる。ロゼンジは典型的には、風味付けした基剤（ｆｌａｖｏｒｅｄ  ｂａｓｉｓ）中、通常はスクロース及びアカシア又はトラガカントに、活性化合物を含む。トローチ剤は典型的には、不活性マトリックス中、例えばゼラチン及びグリセリン、又はスクロース及びアカシアに、活性化合物を含む。洗口剤は典型的には、好適な液体担体中に活性化合物を含む。
【００６０】
本明細書に開示されるいくつかの製剤は好適には、１又は複数の本発明に係る分泌物、ならびに任意に、例えば浸透、透過及び吸収促進剤を含む、１又は複数の他の薬学的に許容される成分を染み込ませ、あるいはそれらでコートされた、パッチ、絆創膏、包帯、ドレッシングなどとして提供される。プロバイオティック細菌、溶解物又は培養培地はまた、医療機器、例えばインプラント、補綴、手術器具、手袋、カテーテル、バルブ、ペースメーカーなどのためのコーティングの形態で提供されてもよい。
【００６１】
本明細書に開示されるいくつかの組成物及び製剤は呼吸器ケアに適している。「呼吸器ケア」とは、鼻炎、副鼻腔炎、季節性アレルギー、鼻詰まり及び風邪の予防及び治療を含む、症状の治療のための製品を意味する。当該組成物は副鼻腔、気道、喉又は肺を含む呼吸器の細菌感染を予防するために有用で有り得る。ある場合には、そのような製剤は鼻腔内投与又は肺内投与のために製剤化される。
【００６２】
担体が液体である鼻腔内投与に適している製剤は、例えば鼻腔用スプレー、点鼻薬を含み、あるいはネブライザーによるエアロゾル投与では、活性化合物の水性又は油性溶液を含む。
【００６３】
担体が固体である鼻腔内投与に適している製剤は、例えば約２０から約５００ミクロンの範囲内の粒子サイズを有する粗粉末として提供されるものを例として含み、当該製剤は嗅ぎ薬を吸う方法で、すなわち、鼻の近くに保持した粉末の容器から鼻腔を通じた急速な吸引によって投与される。
【００６４】
肺内投与に適している製剤（例えば、吸入又は通気療法による）は、好適な噴射剤、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロ−テトラフルオロエタン、二酸化炭素、又はその他の好適なガス、を使用して、加圧パックからエアロゾルスプレーとして提供されるものを含む。
【００６５】
本発明に係る組成物及び製剤はさらに、他の活性成分、例えば殺菌剤などの他の抗菌剤を含んでもよい。
【００６６】
いくつかの実施形態では、本発明に係る使用のための製剤は、分泌物の少なくとも約０．０１重量％、約０．０５重量％、約０．１重量％、約０．２重量％、約０．３重量％、約０．４重量％、約０．５重量％、約０．６重量％、約０．７重量％、約０．８重量％、約０．９重量％、約１．０重量％、約１．５重量％、約２．０重量％、約３．０重量％、約４．０重量％、約５．０重量％、約６．０重量％、約７．０重量％、約８．０重量％、約９．０重量％、約１０．０重量％、約１１．０重量％、約１２．０重量％、約１３．０重量％、約１４．０重量％、約１５．０重量％、約１６．０重量％、約１７．０重量％、約１８．０重量％、約１９．０重量％、約２０．０重量％、約２５．０重量％、約３０．０重量％、約３５．０重量％、約４０．０重量％、約４５．０重量％、約５０．０重量％を含んでもよい。
【００６７】
いくつかの実施形態では、当該製剤は、分泌物の少なくとも約０．０１重量％から約３０重量％、約０．０１重量％から約２０重量％、約０．０１重量％から約５重量％、約０．１重量％から約３０重量％、約０．１重量％から約２０重量％、約０．１重量％から約１５重量％、約０．１重量％から約１０重量％、約０．１重量％から約５重量％、約０．２重量％から約５重量％、約０．３重量％から約５重量％、約０．４重量％から約５重量％、約０．５重量％から約５重量％、約１重量％から１０約５重量％の１つを含んでもよい。
【００６８】
医薬製剤
本発明に係るプロバイオティック製剤は、臨床使用のための医薬組成物として製剤化されてもよく、薬学的に許容される担体、希釈剤又はアジュバントを含んでもよい。それらは局所投与のために製剤化されてもよい。
【００６９】
投与は好ましくは予防上又は治療上有効量であり、これは個体に効果を示すのに十分な量である。投与される実際の量、ならびに投与の速度及び経時変化は、治療されている疾患の性質及び重症度に依存するであろう。治療の処方、例えば投与量の決定などは、一般開業医及び他の医師の責任の範囲内であり、そして典型的には治療又は予防されることになる疾患、個々の患者の状態、送達部位、投与方法、及び医師に知られているその他の要因を考慮する。上述の技術及びプロトコルの例は、レミントンの薬学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、第２０版、２０００年、出版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓに見られる。活性化合物及び活性化合物を含有する組成物の適切な用量は患者によって異なり得ることが当業者によって理解されるであろう。
【００７０】
本発明の組成物は薬剤として製剤化されてもよい、すなわち、医薬品として製剤化されてもよい。当該薬剤は、当業者によく知られている他の薬学的に許容される成分を含んでもよく、薬学的に許容される担体、アジュバント、賦形剤、希釈剤、充填剤、緩衝剤、保存剤、抗酸化剤、潤滑剤、安定剤、可溶化剤、界面活性剤（例えば湿潤剤）、マスキング剤、着色剤、香味剤、及び甘味剤を含むが、これらに限定されない。当該製剤はさらに、他の活性成分、例えば他の治療剤又は予防剤を含んでもよい。
【実施例】
【００７１】
実施例１：材料及び方法
哺乳動物細胞培養
サプリメントミックス（ウシ脳下垂体抽出物０．００４ｍｇ／ｍｌ、上皮成長因子（組換えヒト）０．１２５ｎｇ／ｍｌ、インスリン（組換えヒト）５μｇ／ｍｌ、ヒドロコルチゾン０．３３μｇ／ｍｌ、エピネフリン０．３９μｇ／ｍｌ及びトランスフェリン、ホロ（ヒト）１０μｇ／ｍｌ）ならびに０．０６ｍＭのＣａＣｌ2（プロモセル、ハイデルベルク、ドイツ）を含む角化細胞基本培地（プロモセル（Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ）、ハイデルベルク、ドイツ）中で培養された正常ヒト表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）を、モデル系として使用した。これらを、前述のようにＴ−７５培養フラスコ中で５％ＣＯ2の湿潤雰囲気で３７℃で定期的に培養した（４３）。
【００７２】
細菌細胞培養
ラクトバチルス・ラムノサス・ゴルディン及びゴルバッハ（Ｇｏｌｄｉｎ  ａｎｄ  Ｇｏｒｂａｃｈ）（Ｌ．ラムノサスＧＧ）（ＡＴＣＣ５３１０３、ＡＴＣＣ、ミドルセックス、ＵＫ）を、嫌気的キャビネット（雰囲気、１０：１０：８０、Ｈ2−ＣＯ2−Ｎ2）中でインキュベートされた３７℃でＷｉｌｋｉｎｓ−Ｃｈａｌｇｒｅｎ培養液又は寒天（オキソイド（Ｏｘｏｉｄ）、ベイジングストーク、ＵＫ）で、定期的に増殖させた。黄色ブドウ球菌を、前述のようにニュートリエントブロス（Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｂｒｏｔｈ）（オキソイド、ベイジングストーク、ＵＫ）中、３７℃で好気的に増殖させた（４３）。
【００７３】
細菌による角化細胞の処理
細菌（１０8ＣＦＵ／ｍｌのプロバイオティクス及び１０6ＣＦＵ／ｍｌの黄色ブドウ球菌）を１５，０００ｘｇで遠心分離し、０．８５％のＮａＣｌで２回洗浄し、そして角化細胞基本培地に再懸濁した。この懸濁液を、２４ウェルプレートで増殖している５ｘ１０3細胞／ｃｍ2のＮＨＥＫに直接添加した。プロバイオティック溶解物を使用する実験のために、ＬラムノサスＧＧの１０8ＣＦＵ／ｍｌの１０ｍｌを遠心分離し、洗浄し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ＝７．４（１０ｍＭ）に再懸濁し、そしてＭＳＥ  Ｓｏｎｉｐｒｅｐ  １５０を使用して溶解した。試料を０．２２μｍ孔フィルター（ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ビレリカ、ＵＳＡ）を使用してろ過して、残りの任意の細菌全体を除去した。
【００７４】
この溶解物の約１００μｌを角化細胞（５ｘ１０3細胞／ｃｍ2）を処理するために使用した。いくつかの実験では、細胞を１５，０００ｘｇで５分間の遠心分離で沈降させ、そしてその無細胞上清（使用済み培養液）を回収し、０．２２μｍ孔フィルター（ミリポア、ビレリカ、ＵＳＡ）を使用して濾過して、残りの任意の細菌全体を除去した。他の実験では、角化細胞の単層を病原体に加えてプロバイオティクス又は溶解物を同時に同時感染させた。別の実験では、黄色ブドウ球菌感染が消費された２、４、６、８及び１２時間後に、Ｌ．ラムノサスＧＧの溶解物に細胞を曝露した。すべての実験において角化細胞を分離し、そして（４３）に記載のように細胞生存率をトリパンブルー排除アッセイを用いて決定した。
【００７５】
細胞培養物中の黄色ブドウ球菌生存率の測定
Ｌ．ラムノサスＧＧの溶解物又は角化細胞が細胞培養物中の黄色ブドウ球菌の増殖を抑制することができたかどうかを判断するために、角化細胞を２４ウェルプレートでコンフルエンスまで増殖させた。これらを黄色ブドウ球菌単独、又は黄色ブドウ球菌に加えてＬ．ラムノサスＧＧの溶解物、又は馴化培地に曝露した。別の実験では、細胞を黄色ブドウ球菌による感染後２、４、６、８及び１２時間にＬ．ラムノサスＧＧの溶解物に曝露した。生存ブドウ球菌の総数を前述のようにコロニーを数えることによって測定した（４３）。
【００７６】
角化細胞への細菌付着の測定
コンフルエントな角化細胞を細菌に１時間曝露した。次いで細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ＝７．４（１０ｍＭ）（インビトロジェン，ライフテクノロジーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｌｔｄ）、ペイズリー、ＵＫ）で３回洗浄して、非付着細菌を除去した。当該細胞をトリプシン処理し、そして連続希釈プレートカウントを行って、付着細菌の数を評価した。選択寒天をブドウ球菌の増殖のために使用した。
【００７７】
細菌性拮抗の決定
黄色ブドウ球菌の一晩培養物の１０μｌアリコートを７ｍｌの軟寒天培地（０．７％の寒天）に接種し、寒天基材で事前に分注されたプレート上に直接加えた。Ｌ．ラムノサスＧＧ培養物の微生物又は抽出物それぞれの１００μｌを黄色ブドウ球菌叢上にスポットした。
【００７８】
共培養の結果の決定（競争アッセイ）
Ｌ．ラムノサスＧＧの溶解物及び黄色ブドウ球菌のアリコート（１００μｌ）を１０ｍｌのＷＣＢ培養液に接種した。培養物のｐＨ及び光学密度を０時間及び２４時間で測定した。一定の間隔（本文書に示される）で、細菌を選択寒天を使用して連続希釈プレートカウントによって数えた。
【００７９】
統計分析
すべての実験を、各実験につき３つの複製で最低３回行った。生成されたデータを、ＳＰＳＳ（ＩＢＭ  ＳＰＳＳ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓバージョン１６．０）プログラムを使用して、一元配置分散分析（ｏｎｅ  ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）及び事後Ｔｕｋｅｙ検定（ｐｏｓｔ  ｈｏｃ  Ｔｕｋｅｙ  ｔｅｓｔ）によって分析した。結果をＰ＜０．０５の場合に有意であるとみなした。データを平均値±平均値の標準誤差（ＳＥＭ）として表す。
【００８０】
実施例２：結果
Ｌ．ラムノサスＧＧは黄色ブドウ球菌の病原性の影響から角化細胞を保護する。
始めに、本発明者らは、角化細胞の生存率がＬ．ラムノサスＧＧとのインキュベーションによって影響をうけたかどうかを調査した。しかしながら、２４時間のインキュベーション後に、プロバイオティック細菌とインキュベートした角化細胞、対、未処理の角化細胞の対照の生存率に差は無かった（データは示さず）。次に、黄色ブドウ球菌の影響から角化細胞を保護するＬ．ラムノサスＧＧの能力を調査した。発明者らの先の知見（４３）と一致して、１０6ＣＦＵ／ｍｌの黄色ブドウ球菌への角化細胞の２４時間曝露は、顕著な角化細胞の細胞死をもたらした。しかしながら、病原体及びＬ．ラムノサスＧＧと同時にインキュベートされた角化細胞は、病原体単独に感染した単層よりも有意に高いパーセンテージの生存率を有した（５７％Ｐ＝０．０１）（図１）。
【００８１】
Ｌ．ラムノサスＧＧの溶解物及び使用済み培養液は黄色ブドウ球菌の影響から角化細胞を保護する。
本発明者らは、黄色ブドウ球菌感染角化細胞に対するプロバイオティック溶解物及び使用済み培養液の影響を調べることによって、生菌がＬ．ラムノサスＧＧの保護効果に必要であったかどうかを調査した。溶解物も使用済み培養液のいずれも、角化細胞の生存率に有意に影響しなかった（Ｐ＞０．０５）（データは示さず）。しかしながら、溶解物及び使用済み培養液のいずれも、黄色ブドウ球菌に単独で感染した角化細胞における２５％と比較して、処理された角化細胞の生存率はそれぞれ６５％及び５７．９３％であったように、黄色ブドウ球菌の毒性を減少させた（それぞれＰ＝０．００６及びＰ＝０．０１）（図２）。
【００８２】
Ｌ．ラムノサスＧＧ、溶解物は黄色ブドウ球菌の毒性から角化細胞を救うが、使用済み培養液は救わない。
本発明者らは次にＬ．ラムノサスＧＧの保護効果のタイミングを、生菌又は溶解物を、黄色ブドウ球菌による角化細胞の感染前又は感染後のいずれかで加えることによって調査した。角化細胞生存率のパーセンテージは、黄色ブドウ球菌に単独で感染した単層よりも、黄色ブドウ球菌による感染に先立って２時間、Ｌ．ラムノサスＧＧ又は使用済み培養液に曝露した単層において有意に高かった（Ｐ＝０．００６）。溶解物及び使用済み培養液のいずれも同様の保護のレベルを示した（Ｐ＝０．００５、ｐ＝０．００４）、（図３）。感染後の実験では、角化細胞を、生きたＬ．ラムノサスＧＧ、溶解物、又は使用済み培養液の添加前、２時間、４時間、６時間、８時間及び１２時間、黄色ブドウ球菌に曝露した。次いで角化細胞の生存率を黄色ブドウ球菌による感染後２４時間で測定した。図４（Ａ、Ｂ）におけるデータは、生きたプロバイオティクス及びその溶解物のいずれも、黄色ブドウ球菌の後に添加された場合、角化細胞を保護することができたことを示す。黄色ブドウ球菌感染後１２時間であっても、Ｌ．ラムノサスＧＧ又は溶解物は、黄色ブドウ球菌単独で曝露した場合の２５％と比較して、細胞のそれぞれ５８％及び５５％が生存を維持したように（それぞれＰ＝０．００３、Ｐ＝０．０１）、依然として角化細胞への保護を示した。しかしながら、Ｌ．ラムノサスＧＧからの使用済み培養液は黄色ブドウ球菌の後に添加された場合、角化細胞に対する保護効果を有さなかった（図４Ｃ）。
【００８３】
Ｌ．ラムノサスＧＧ溶解物は黄色ブドウ球菌の増殖を抑制するが、使用済み培養液は抑制しない。
ラムノサスＧＧ溶解物がその保護効果を発揮するメカニズムを調査した。本発明者らは、プロバイオティック溶解物が病原体の増殖に対する直接的な影響を有するかどうかを、培養中にそれらを同時に増殖させることによって調査した。競争アッセイは、未処理の培養物と比較して、Ｌ．ラムノサスＧＧ溶解物の存在下での角化細胞培養培地中で２４時間にわたって黄色ブドウ球菌増殖の有意な減少を示した（Ｐ＝０．０２）（図５Ａ）。しかしながら、Ｌ．ラムノサスＧＧからの使用済み培養液は黄色ブドウ球菌の増殖に影響を与えなかった（図５Ａ）。生存ブドウ球菌の総数も、単独で増殖した黄色ブドウ球菌についての８ｌｏｇ10ｃｆｕ／ｍｌと比較して、溶解物の存在下で５ｌｏｇ10ｃｆｕ／ｍｌまで有意に減少した（しかし使用済み培養液では減少しなかった）（Ｐ＝０．０２）（図５Ｂ）。さらに、生存ブドウ球菌培養物の総数はＬ．ラムノサスＧＧ溶解物によって時間とともに減少した（図５Ｃ）。乳酸菌は有機酸を産生し得るので、本発明者らは黄色ブドウ球菌、Ｌ．ラムノサスＧＧ溶解物、又は両方に同時に、２４時間感染させた角化細胞培地のｐＨを測定した。しかしながら、処理群間のｐＨに有意差は無かった（データは示さず）。本発明者らはまた、溶解物単独のｐＨを測定し、ｐＨ＝７．２であることを見出し、したがって酸媒介性の影響の可能性を排除した。
【００８４】
Ｌ．ラムノサスＧＧは角化細胞への黄色ブドウ球菌の付着を抑制する。
Ｌ．ラムノサスＧＧの生菌、溶解物又は使用済み培養液が角化細胞を保護し得る他のメカニズムは、病原体付着の抑制によるものである。これまでに本発明者らは、付着が黄色ブドウ球菌の毒作用の必要条件であり、そして特定のプロバイオティック、例えばＬ．ロイテリが角化細胞の結合部位からの病原体の競争的排除によって角化細胞を保護したことを示した（４３）。したがって本発明者らは、付着の抑制もＬ．ラムノサスＧＧ、溶解物又は使用済み培養液の保護メカニズムの一部であると考えた。抑制が角化細胞上の結合部位からの病原体の競争、排除又は置換によるものであったかどうかを判断するために、付着アッセイを行った（図６Ａ及びＢならびに図７）。本発明者らの結果は、角化細胞を同時感染（競争、Ｐ＝０．０３）、事前曝露（排除、Ｐ＝０．０４）、又は黄色ブドウ球菌による感染を開始した１２時間後に適用した場合であっても（置換、Ｐ＝０．０１）、生きたＬ．ラムノサスＧＧ又は溶解物が病原体の付着を抑制することができたことを実証した。しかしながら、使用済み培養液は、それが病原体より前に又は同時のいずれかで角化細胞に添加された場合にのみ、病原体の付着を抑制した（図７）。
【００８５】
考察
本研究は、腸溶性プロバイオティクス、Ｌ．ラムノサスＧＧが黄色ブドウ球菌の病原性の影響から角化細胞を保護することができたかどうかを検討した。黄色ブドウ球菌及びＬ．ラムノサスＧＧを同時に添加することの、角化細胞の生存率への影響を判断するための予備実験は、黄色ブドウ球菌に単独で感染した角化細胞と比較して、プロバイオティックの存在下における生存角化細胞の数の増加によって観察された、顕著な保護効果を示した（図１）。さらに、プロバイオティックからの溶解物及び使用済み培養液も、黄色ブドウ球菌からの角化細胞の保護を与えたので、Ｌ．ラムノサスＧＧの保護効果は生菌を必要としなかった。
【００８６】
Ｌ．ラムノサスＧＧ又は溶解物の適用のタイミングは、黄色ブドウ球菌誘導細胞死から角化細胞を保護するプロバイオティクス又は溶解物によって与えられた保護の程度に影響を与えなかった（図３）。データは、Ｌ．ラムノサスＧＧ又は溶解物に事前、事後又は同時曝露された角化細胞が黄色ブドウ球菌誘導細胞死から保護されたことを示す。しかしながら、プロバイオティック使用済み培養液のみが、病原体より前に又は同時のいずれかで添加された場合に、角化細胞を保護した。これらのデータは、黄色ブドウ球菌に対するＬ．ラムノサスＧＧの保護効果に関与する少なくとも２つの別個の活動があることを示唆し、１つは使用済み培養液中に含まれ、１つは溶解物中に含まれる。発明者らのデータは、使用済み培養液に含まれる活性がおそらく抗付着効果を有することを示す。これは、以下の観察に基づく。Ａ）黄色ブドウ球菌による感染前又は同時に添加される場合にのみ、Ｌ．ラムノサスＧＧ−使用済み培養液が角化細胞への病原体付着を抑制する。Ｂ）本発明者らはこれまでに、黄色ブドウ球菌は角化細胞に対して毒性を持つために角化細胞に付着しなければならず、付着を抑制する成分はこの病原体から角化細胞を保護することを示した（４３）。Ｃ）これに一致して、黄色ブドウ球菌による事前又は同時感染を加えた場合にのみ、使用済み培養液が保護的である。イン・ビトロのその他の研究は、想定されるプロバイオティクス（ラクトバチルス、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ））からの無細胞培養上清（ＣＦＣＳ）が、いくつかの病原体、例えばサルモネラ・ティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、黄色ブドウ球菌及び大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）の、Ｃａｃｏ−２細胞への付着を抑制することができたことを実証した（１１）。
【００８７】
ラクトバチルス溶解物による角化細胞の保護は少なくとも２つのメカニズムを含み得る。第一に、当該溶解物は黄色ブドウ球菌の増殖を減少させることができるかもしれない。競争アッセイは、Ｌ．ラムノサスＧＧの溶解物が生存ブドウ球菌の総数を減少させたことを実証した（図５Ａ、Ｂ、Ｃ）。加えて、抑制アッセイでは、黄色ブドウ球菌を嫌気的に増殖させたプロバイオティックからの溶解物でチャレンジした場合、抑制域を観察した（表１）。これらのデータは黄色ブドウ球菌の増殖を抑制するＬラムノサスＧＧ溶解物の能力を示唆する。これは、黄色ブドウ球菌の増殖及び／又は生存を直接抑制することができるプロバイオティック内の毒性分子（複数）の存在によるものであり得た。黄色ブドウ球菌の生存率にＬ．ラムノサスＧＧ使用済み培養液の影響がなかったので、この分子（複数）は合成され得るが、分泌され得ない可能性がある。Ｌ．ラムノサスＧＧが静菌性物質を含む場合、これはまた、少なくとも部分的に角化細胞生存アッセイにおけるプロバイオティクスの保護効果を説明することができる。プロバイオティクス、特に乳酸菌はこれまでに、黄色ブドウ球菌増殖に対する強い抑制効果を発揮することが示されている。特定のラクトバチルス株は、バイオフィルムを形成する黄色ブドウ球菌に高度に拮抗することが報告されている（２８、３０）。他の研究は、プロバイオティクスがバクテリオシンの産生を介して病原体の増殖を抑制することにより腸の健康を改善することができることを報告した（１６、４８）。また、Ｌ．ラムノサスＧＧは乳酸の産生を介してサルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ）の増殖を抑制することが示された（２９）。しかしながら、本研究では発明者らは、Ｌ．ラムノサスＧＧの保護効果の一部として酸産生の関与の証拠を見出すことはできなかった。実際に、この微生物からの溶解物は中性（ｐＨ７．２）であったが、それでも黄色ブドウ球菌の増殖を抑制することができた。
【００８８】
【表１】
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【００８９】
Ｌ．ラムノサスＧＧの生菌又は溶解物が角化細胞を保護できた第二のメカニズムは、病原体付着の抑制によるものである。実際に、本発明者らのデータは、Ｌ．ラムノサスＧＧ又はその溶解物の存在下で角化細胞への黄色ブドウ球菌の付着の減少を実証した。本発明者らがこれまでにＬ．ロイテリについて観察したように、このデータは排除のメカニズムを示唆する（４３）。しかしながら、興味深いことに、生存Ｌ．ラムノサスＧＧ又はその溶解物も存在する感染に加えられた場合、黄色ブドウ球菌の付着を抑制し、保護の他のメカニズム、すなわちＬ．ラムノサスＧＧは角化細胞から病原体を置換することができることを示した（図７）。同様に、生きたＬ．ラムノサスＧＧは腸内で腸細胞から病原体を置換することが示された（４７）。しかしながら、発明者らのデータは、生菌の存在が角化細胞からの黄色ブドウ球菌の置換には必要でないことを実証した。重要なことに、発明者らのデータは、病原体の毒性を低減する乳酸菌によって使用されるメカニズムの種依存的な違いを実証した。発明者らの過去の研究は、角化細胞の結合部位から黄色ブドウ球菌を排除することができる生物としてＬ．ロイテリを強調した（４３）。本研究では、発明者らはＬ．ラムノサスＧＧは病原体を排除できるだけでなく、病原体の増殖を減少させ、かつ角化細胞から病原体を置換することもできることを示した。もちろん、この置換活性が増殖を抑制するＬ．ラムノサスＧＧの能力に関連し得る可能性があり、この点を明らかにするためにさらなる研究が必要とされるであろう。
【００９０】
結論として、本発明者らは、Ｌ．ラムノサスＧＧが黄色ブドウ球菌の病原性を抑制する可能性のある新たな薬剤であることを報告する。さらに発明者らのデータは、微生物の溶解物は生菌と同様に黄色ブドウ球菌のコロニー形成を予防することに効果的であるので、皮膚でのＬ．ラムノサスＧＧの有用性は、それが皮膚上で増殖し生存できるかどうかによって限定されるものではないことを示す。さらに、当該溶解物は、潜在的に既存の感染症における抗生物質の補助又は代替としてではなく、予防として、例えばハンドウォッシュに有用であり得た。
【００９１】
【表２−１】
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【表２−２】
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【表２−３】
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【表２−４】
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【表２−５】
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【表２−６】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７】
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