(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
切断可能な結合を介して標的細胞結合抗体に結合したＭＨＣクラスＩを介して提示可能な少なくとも１つの天然に存在するＴ細胞応答誘発ペプチドを含むイムノコンジュゲートであって、ここで切断可能な結合は、切断時に、ＭＨＣクラスＩ分子を介して直接提示可能である前記Ｔ細胞応答誘発ペプチドがイムノコンジュゲートから放出されるように配置され、天然に存在するＴ細胞応答誘発ペプチドは少なくとも１つのシステイン残基を含み、かつ、天然に存在するＴ細胞応答誘発ペプチドはジスルフィド結合を介して標的細胞結合抗体に共有結合されることを特徴とする、イムノコンジュゲート。
【請求項２】
標的細胞が腫瘍細胞である、請求項１に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項３】
標的細胞内に内部移行することができる、請求項１又は２に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項４】
イムノコンジュゲートがトランスロケーションドメインを含まない、請求項１から３の何れか一項に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項５】
イムノコンジュゲートの標的細胞内への内部移行後１２時間未満で、Ｔ細胞応答誘発ペプチドがＭＨＣクラスＩ分子を介して標的細胞の表面上に提示される、請求項１から４の何れか一項に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項６】
薬学的に許容される担体と組み合わせた、請求項１から５の何れか一項に記載のイムノコンジュゲートを含む薬学的組成物。
【請求項７】
請求項１から５の何れか一項に記載のイムノコンジュゲートの生成のための、ＭＨＣクラスＩを介して提示可能なＴ細胞応答誘発ペプチドの使用。
【請求項８】
標的細胞に対するＴ細胞の細胞傷害性を特異的に誘導するための医薬であって、請求項１から５の何れか一項に記載のイムノコンジュゲートを含む、医薬。
【請求項９】
ａ）組み換え標的細胞結合抗体を提供する工程、
ｂ）天然に存在するＴ細胞応答誘発ペプチドを提供する工程、
ｃ）切断可能な結合を介して前記Ｔ細胞応答誘発ペプチドの少なくとも１つを前記標的細胞結合抗体に結合させる工程
を含む、請求項１から５の何れか一項に記載のイムノコンジュゲートの生成方法。
【請求項１０】
天然に存在するＴ細胞応答誘発ペプチドが標的細胞結合抗体に結合される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
医薬としての使用のための、請求項１から５の何れか一項に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項１２】
疾患に罹患している、治療を必要とする患者を治療するための医薬であって、請求項１から５の何れか一項に記載のイムノコンジュゲートを含む、医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、標的細胞結合部分に結合したＭＨＣクラスＩを介して提示可能な少なくとも１つのＴ細胞応答誘発ペプチド、並びにそれらの産生方法及びその使用を含む、標的細胞に対するＴ細胞の細胞傷害性の特異的誘導のためのイムノコンジュゲートに関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｔ細胞は、Ｂ細胞とは対照的に、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）の自己細胞表面分子を介して細胞表面に提示される処理された抗原に由来するペプチドを認識する。
【０００３】
ＭＨＣクラスＩＩ（ＭＨＣ  ＩＩ）による抗原提示の現在の考え方は、外因性タンパク質が食作用及びエンドサイトーシスによってＭＨＣ  ＩＩに接近し、内因性タンパク質がオートファジーによってＭＨＣ  ＩＩに接近するということである。抗原は、ファゴソーム、エンドソーム又はオートファゴソーム中のＭＨＣ  ＩＩ分子への結合のために適切な長さ（約１０−１６アミノ酸）のペプチド抗原（ペプチドエピトープ）にプロセシングされる。無負荷の（Ｕｎｌｏａｄｅｄ）ＭＨＣ  ＩＩαβ鎖二量体は、プレリソソーム区画における未成熟ペプチド又はタンパク質相互作用を防ぐ不変鎖（Ｉｉ）との九量体（ｎｏｎａｍｅｒｉｃ）複合体として小胞体（ＥＲ）に集合する。この複合体は、不変鎖が逐次的なタンパク質分解を受けるリソソームＭＨＣ  ＩＩ区画に移動する。クラスＩＩ関連Ｉｉペプチド（ＣＬＩＰ）として知られるペプチドである最終切断産物は、ペプチド結合溝を占有し、ＭＨＣ  ＩＩ分子に高親和性ペプチド（ＭＨＣ  ＩＩ拘束性ペプチド）を負荷する前に放出されなければならない（Wearsch P and Creswell P, Nat. Rev. Immunol.: Antigen processing and presentation, オンラインで利用可能なポスター、 http://www.nature.com/nri/posters/antigenprocessing）。
【０００４】
ナイーブＣＤ４  Ｔ細胞を細胞表面上のペプチド負荷ＭＨＣ  ＩＩに結合させると、ナイーブＣＤ４  Ｔ細胞をプライミングしてエフェクターＴ細胞（Ｔｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ１７）又は記憶Ｔ細胞に分極させることにより抗原に対する免疫化を媒介する。あるいは、ＡＰＣの微小環境における局所環境（例えば、サイトカインバランス）に応じて、ナイーブＣＤ４  Ｔ細胞のペプチド負荷ＭＨＣ  ＩＩへの結合は、ナイーブＣＤ４  Ｔ細胞をプライミングして制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）に分極させることによって抗原に対する免疫寛容を媒介する。
【０００５】
ＭＨＣ  ＩＩ分子は、通常、マクロファージ、Ｂ細胞及び樹状細胞のような抗原提示細胞上でのみ生じるが、ＭＨＣクラスＩ（ＭＨＣ  Ｉ）は全ての有核細胞上に生じる。
【０００６】
ＭＨＣクラスＩ（ＭＨＣ  Ｉ）を介した抗原提示の現在想定されている機構は、細胞内で産生されるウイルスタンパク質又は自己タンパク質などの内因性抗原が、プロテアソーム及び細胞質プロテアーゼによって細胞質ゾル内部のペプチドにプロセシングされることである。次いで、これらのペプチドは、抗原ペプチド輸送体（transporter associated with antigen processing）（ＴＡＰ）と呼ばれる特定のポンプを介してＥＲに輸送され、ＥＲアミノペプチダーゼ（ＥＲＡＰ）によって更にトリミングされて８−１２アミノ酸のペプチドを生成する。
【０００７】
細胞内に、優先的には樹状細胞又はマクロファージのようなプロフェッショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ）に内在化される外因性タンパク質のペプチドエピトープも、ＭＨＣ  Ｉによって提示され得ることが実証されている。これは、ファゴソーム又はエンドソームからの前記タンパク質のレトロトランスロケーション（retrotranslocation）をサポートし、それによって前記タンパク質を細胞の細胞質に誘導する、外因性タンパク質に含まれるトランスロケーションドメインの存在に起因する（Donnelly JJ et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 1993 Apr 15;90(8):3530-4; Wearsch P and Creswell P, Nat. Rev. Immunol.: Antigen processing and presentation, オンラインで利用可能なポスター、http://www.nature.com/nri/posters/antigenprocessing）。
【０００８】
短いペプチドを有するＭＨＣ  Ｉ重鎖−β２−ミクログロブリンヘテロ二量体のアセンブリーは、タパシンとＥＲｐ５７のジスルフィド結合二量体、カルレティキュリン（ＣＲＴ）及びＴＡＰ分子からなるペプチド負荷複合体によって配位される。タパシンはまた、細胞表面上の安定なペプチド−ＭＨＣ  Ｉ複合体の提示を選択するためのペプチド編集をサポートする（Wearsch P and Creswell P, Nat. Rev. Immunol.: Antigen processing and presentation, オンラインで利用可能なポスター、http://www.nature.com/nri/posters/antigenprocessing）。ペプチドがＭＨＣ  Ｉ分子上に負荷されると、ペプチド負荷複合体が解離し、ペプチド負荷ＭＨＣ  Ｉは分泌経路を介してＥＲから出て細胞表面に到達する。ＥＲの内腔においてＭＨＣ  Ｉ分子に結合できないペプチドは、ｓｅｃ６１チャネルを介してＥＲから細胞質ゾルへと除去され、そこでサイズが更にトリミングされ、ＭＨＣ  Ｉ分子への結合のために、ＴＡＰによってＥＲに移動されて戻る可能性がある（Koopmann JO, Albring J, Hueter E, et al. (July 2000) Immunity, 13 (1): 117-27.; Albring J, Koopmann JO, Haemmerling GJ, Momburg F (January 2004), Mol. Immunol. 40 (10): 733-41）。
【０００９】
細胞表面上のＭＨＣ  Ｉ分子は、それらの負荷されたペプチドを細胞傷害性ＣＤ８  Ｔリンパ球（ＣＤ８  Ｔ細胞、ＣＴＬとも呼ばれる）に提示する。ＣＴＬは、ＭＨＣ  Ｉを介してペプチドエピトープを提示している細胞を、アポトーシスによってプログラム細胞死を起こすよう誘発する。従って、ＭＨＣ  Ｉは、細胞内病原菌に対処するが、突然変異又は異常なタンパク質を発現する自己細胞にも対処する免疫系の主要な手段である細胞媒介性免疫を媒介する。
【００１０】
細胞内病原体によって影響されない種々の疾患細胞（例えば、腫瘍細胞）の死滅を誘導するために、細胞媒介性免疫を誘導するメカニズムを利用することは、過去数年間に研究の焦点となってきた。全ての有核細胞がＭＨＣ  Ｉを発現するので、ＭＨＣ  Ｉによる細胞内病原体の抗原の提示を誘導することは、種々の疾患細胞集団、例えば腫瘍細胞において、ＣＴＬを介してプログラム細胞死を誘導する有望なアプローチである。
【００１１】
この点に関して、標的細胞に結合する結合パートナーと、細胞内病原体のペプチド画分とから構築されたイムノコンジュゲートによって、細胞内病原体、例えばウイルスに由来する抗原を、ＭＨＣ  Ｉを介して疾患細胞の表面上に送達されたペプチドの処理された断片の提示を誘導する特定の疾患細胞集団に送達するためのアプローチが開発されている。疾患細胞は次いでＣＴＬによって除去されるであろう。
【００１２】
１つのアプローチが欧州特許第０６５９４３９号（Ａ１）に開示されている。欧州特許第０６５９４３９号（Ａ１）は、ウイルス由来ペプチド（修飾されたインフルエンザマトリックスペプチド５７−６８）又は細菌由来ペプチド（プラスモディウム・ベルゲイ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｂｅｒｇｅｉ）ペプチド２４９−２６０）が標的細胞結合抗体に結合されるイムノコンジュゲートを開示している。それぞれのペプチドは、Ｎ末端システイン残基を付加し、続いてＳＰＤＰ−リンカーを介して抗体に架橋させてイムノコンジュゲートを製造することによって抗体に結合される。内部移行の際に、付加されたＮ末端システイン残基を含むそれぞれのペプチドがコンジュゲートから分離され、細胞内で更に処理され、ＭＨＣ  Ｉによって提示される。しかしながら、イムノコンジュゲートのＩＣ５０値は非常に高かった（０．５μｍｏｌ／ｌ）。
【００１３】
欧州特許第０６５９４３９号（Ａ１）によるアプローチに記載されているように、主要な課題は、外因性抗原に対するＭＨＣ  Ｉ拘束性ＣＴＬ応答を刺激することである。ほとんどの場合、抗原は外因的に提供されるが、ＭＨＣ  Ｉ経路に輸送され得る細胞質には送達されない。
【００１４】
プロセシング時にＭＨＣ  Ｉを介して提示することができるペプチドを含むイムノコンジュゲートのＩＣ５０値を改善するための１つの方法論が欧州特許第０６５９４３９号（Ａ１）に示唆されている。ここでは、レトロトランスロケーションを介してイムノコンジュゲートを細胞質に送達するために、イムノコンジュゲートにトランスロケーションドメインを含めることが推奨される。しかし、欧州特許第０６５９４３９号（Ａ１）は、この方法に関する結果を実証していない。
【００１５】
従って、細胞媒介性免疫を誘導することによって標的細胞の死滅を誘導する改善されたアプローチが依然として必要である。
【発明の概要】
【００１６】
本発明は、切断可能な結合を介して標的細胞結合部分に結合したＭＨＣクラスＩを介して提示可能な少なくとも１つのＴ細胞応答誘発ペプチドを含むイムノコンジュゲートに関する。イムノコンジュゲート内で、切断可能な結合は、切断時に、ＭＨＣクラスＩ分子を介して直接提示可能である前記Ｔ細胞応答誘発ペプチドがイムノコンジュゲートから放出されるように配置される。
【００１７】
本発明の一実施態様は、Ｔ細胞応答誘発ペプチドが天然に存在するＴ細胞応答誘発ペプチドであるイムノコンジュゲートに関する。
【００１８】
本発明の一実施態様は、Ｔ細胞応答誘発ペプチドが、少なくとも１つのシステイン残基を含む天然に存在するＴ細胞応答誘発ペプチドであるイムノコンジュゲートに関する。
【００１９】
本発明の一実施態様は、切断可能な結合が、標的細胞のエンドソーム区画内で切断可能であるイムノコンジュゲートに関する。
【００２０】
本発明の一実施態様は、イムノコンジュゲートが、トランスロケーションドメインを含まないイムノコンジュゲートに関する。
【００２１】
本発明の一実施態様は、イムノコンジュゲートの標的細胞内への内部移行後１２時間未満で、Ｔ細胞応答誘発ペプチドがＭＨＣクラスＩ分子を介して標的細胞の表面上に提示されるイムノコンジュゲートに関する。
【００２２】
本発明の別の態様は、薬学的に許容される担体と組み合わせた本発明によるイムノコンジュゲートを含む薬学的組成物である。
【００２３】
本発明の別の態様は、標的細胞に対するＴ細胞の細胞傷害性を特異的に誘導するための、本発明によるイムノコンジュゲートの使用である。
【００２４】
本発明の別の態様は、
ａ）組み換え標的細胞結合部分を提供する工程、
ｂ）Ｔ細胞応答誘発ペプチドを提供する工程、及び
ｃ）切断可能な結合を介して前記Ｔ細胞応答誘発ペプチドの少なくとも１つを前記標的細胞結合部分に結合させる工程
を含む、本発明によるイムノコンジュゲートの生成方法である。
【００２５】
本発明の一実施態様は、非修飾Ｔ細胞応答誘発ペプチドが標的細胞結合部分に結合されるイムノコンジュゲートの生成方法に関する。
【００２６】
本発明の別の態様は、医薬としての使用のための本発明によるイムノコンジュゲートである。
【００２７】
本発明の別の態様は、がんの治療のための、がん細胞結合部分を含む本発明によるイムノコンジュゲートである。
【００２８】
本発明の別の態様は、感染性疾患、自己免疫疾患、糖尿病又はアレルギーの治療に使用のための、本発明によるイムノコンジュゲートである。
【００２９】
本発明の別の態様は、本発明によるイムノコンジュゲートを、治療を必要とする患者に投与することによる、疾患に罹患している患者の治療方法である。
【００３０】
本発明によれば、イムノコンジュゲートから切断されたＴ細胞応答誘発ペプチドは、標的細胞内での更なるプロセシング又はトリミングなしに、ＭＨＣクラスＩ分子を介して直接提示され得る。Ｔ細胞応答誘発ペプチドは、イムノコンジュゲートの内部移行時に標的細胞のエンドソーム区画内でイムノコンジュゲートから切断され、ペプチドは、エンドソーム区画内でＭＨＣクラスＩ分子上に直接（すなわち、更なるプロセシング又はトリミングなしで）負荷され、ＭＨＣクラスＩを介する提示のために標的細胞表面に輸送された。驚くべきことに、当該技術分野で公知のアプローチと比較して、かなり低いＩＣ５０値に達する。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】異なる腫瘍細胞株及び細胞培養培地を用いてＩＦＮγ−ＥＬＩＳＰＯＴによって測定した修飾されたＣＭＶペプチドにおけるＴ細胞活性化の減少。Ａ）ＲＰＭＩ＋中のＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞、Ｂ）ＡＩＭ−Ｖ中のＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞、Ｃ）ＲＰＭＩ＋中のＨＣＴ−１１６細胞、Ｄ）ＡＩＭ−Ｖ中のＨＣＴ−１１６細胞、Ｅ）ＲＰＭＩ＋中のＴ２細胞。分析は示された１３，２４５μＭ又は１，３２４５μＭのペプチド濃度を用いて行われた。
【図２】本発明によるイムノコンジュゲートの提案された作用機序。Ａ：イムノコンジュゲートの標的細胞への結合。Ｂ：エンドソーム区画へのイムノコンジュゲートの内部移行。Ｃ：エンドソーム区画中のイムノコンジュゲートからのＴ細胞応答誘発ペプチドの放出。Ｄ：エンドソーム区画において放出されたペプチドによるＭＨＣ  Ｉ分子の負荷。Ｅ：標的細胞表面へのペプチド負荷ＭＨＣ  Ｉ分子の送達。Ｆ：標的細胞における細胞死を誘導するペプチド特異的ＣＤ８  Ｔ細胞による標的細胞表面上のペプチド負荷ＭＨＣ  Ｉ分子の認識。
【図３】ＥＢＶ及び／又はＦＬＵペプチドに結合した抗ＣＤＣＰ１抗体を含むイムノコンジュゲートのＣＤＣＰ１発現ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞への結合。
【図４】ＥＢＶ及び／又はＦＬＵペプチドに結合した抗ＣＤ１９抗体を含むイムノコンジュゲートのＣＤ１９発現ＲＬ細胞への結合。
【図５】ペプチド特異的Ｔ細胞活性化のための本発明によるイムノコンジュゲートを用いたＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴの結果。示された濃度は、ペプチド濃度を指す。Ａ）モノクローナル抗ＣＤＣＰ−１抗体及びＨＬＡ−Ａ２拘束性ＥＢＶペプチドを含むイムノコンジュゲートで処置したＣＤＣＰ−１発現ＨＣＴ−１１６細胞。Ｂ）モノクローナル抗ＣＤ１９抗体及びＨＬＡ−Ａ２拘束性ＥＢＶペプチドを含むイムノコンジュゲートで処置したＣＤ１９発現ＨＬＡ−Ａ２陽性ＲＬ細胞及びＨＬＡ−Ａ２陰性Ｒａｍｏｓ細胞。Ｃ）モノクローナル抗ＣＤＣＰ−１抗体及びＨＬＡ−Ａ２拘束性ＥＢＶペプチドを含むイムノコンジュゲートで処置した異なるＣＤＣＰ−１発現腫瘍細胞。
【図６】ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ及びＬＤＨ放出アッセイによって評価された示された腫瘍細胞の腫瘍細胞死滅。（Ａ）ＨＬＡ−Ａ２拘束性ＥＢＶペプチドに結合した抗ＣＤＣＰ１抗体を含むイムノコンジュゲートによって媒介されるＨＬＡ−Ａ２陽性ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞の腫瘍細胞死滅。（Ｂ）非末端システイン残基を有するＨＬＡ−Ａ２拘束性ＥＢＶペプチドに結合した抗ＣＤＣＰ１抗体を含むイムノコンジュゲートによって媒介されるＡ−３７５細胞の特異的死滅。（Ｃ）非末端システイン残基を有するＨＬＡ−Ａ２拘束性ＥＢＶペプチドに結合した抗ＣＤＣＰ１抗体を含むイムノコンジュゲートによって媒介されるＨＬＡ−Ａ２陽性ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞の特異的死滅。示された濃度は、ペプチド濃度を指す。
【図７】ＨＬＡ−Ａ１拘束性ＦＬＵペプチドを含むイムノコンジュゲートによって媒介されるＨＬＡ−Ａ１陽性腫瘍細胞の腫瘍細胞死滅。Ａ−Ｃ）６，１０及び１８時間後のｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅアッセイによって測定された結果。Ｄ−Ｆ）ＬＤＨ放出アッセイによって測定された結果。Ａ及びＤ）エフェクター細胞対標的細胞比（Ｅ：Ｔ）が１：１及び１：２であるＡ−３７５細胞、Ｂ及びＥ）ＨＣＴ−１１６細胞、Ｃ及びＦ）ＰＣ３細胞。
【図８】ｈｕＰＢＭＣの静脈内移入を受けたＭＤＡ−ＭＢ２３１皮下注射モデルにおけるモノクローナル抗ＣＤＣＰ１抗体を含む本発明によるイムノコンジュゲートの抗腫瘍活性。試験計画（図８Ａ）及び結果（図８Ｂ）。
【図９】ｈｕＰＢＭＣの静脈内移入を受けた既存のＭＤＡ−ＭＢ２３１皮下注射モデルにおける、抗ＰＤ１処置と組み合わせた、モノクローナル抗ＣＤＣＰ１抗体を含む本発明によるイムノコンジュゲートの抗腫瘍活性。試験計画（図９Ａ）並びに腫瘍増殖阻害（図９Ｂ）及びＴ細胞増加（図９Ｃ）の結果。
【００３２】
発明の詳細な説明
１．定義
本明細書で使用する用語「イムノコンジュゲート」は、異種機能的分子に結合した標的細胞結合部分（例えば、標的細胞に特異的に結合する抗体又は標的細胞上のその受容体に結合するリガンド）を指す。本発明によるイムノコンジュゲート中に本質的に存在する機能的分子は、Ｔ細胞応答誘発ペプチドである。更に、細胞傷害性剤のような更なる機能的分子を使用することができる。
【００３３】
本明細書で使用される「標的細胞結合部分」は、標的細胞に特異的に結合する部分を指す。この用語は、抗体、並びに標的細胞に特異的に結合することができる他の天然（例えば、受容体、リガンド）分子又は合成（例えば、ＤＡＲＰｉｎｓ）分子を含む。本明細書で使用される「標的細胞への特異的結合」とは、前記部分が複合体混合物内の標的細胞に優先的に結合することを意味する。
【００３４】
標的細胞結合部分の標的細胞への結合の親和性は、ｋａ（タンパク質／標的細胞複合体からのタンパク質の会合の速度定数）、ｋＤ（解離定数）、及びＫＤ（ｋＤ／ｋａ）によって定義される。標的細胞結合部分が標的細胞に特異的に結合する抗体である一実施態様では、１０−８ｍｏｌ／ｌ以下の結合親和性（ＫＤ）を意味し、一実施態様では１０−８Ｍから１０−１３ｍｏｌ／ｌを意味する。
【００３５】
本明細書において用語「抗体」は、最も広い意味で用いられ、様々な抗体構造を包含し、限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び、所望の抗原結合活性を示す限り、抗体断片を含む。
【００３６】
本明細書における用語「リガンド」は、生物学的目的を果たすために標的細胞上の生体分子と複合体を形成する分子、好ましくはタンパク質について使用される。一実施態様において、リガンドは、限定された型の受容体に結合する傾向がある選択的リガンドである。
【００３７】
本明細書で使用される「ペプチド」は、ペプチド結合によって連結されたアミノ酸モノマーの短鎖である。ＭＨＣクラスＩに結合するペプチドは、典型的には８から１２アミノ酸の長さである。本明細書で使用する用語「ＭＨＣクラスＩを介して提示可能なＴ細胞応答誘発ペプチド」は、ＭＨＣクラスＩ分子を介して提示可能であるが、ＭＨＣ  ＩＩを介しては提示できず、ＣＤ８  Ｔ細胞応答を引き起こすペプチドを指す。簡略化のために、本明細書においてその用語は、「Ｔ細胞応答誘発ペプチド」とのみ呼ばれ得る。
【００３８】
本発明の範囲内で使用されるＴ細胞応答誘発ペプチドは、典型的には、非自己（すなわち、非ヒト）病原体に由来する。この文脈において「由来する」という用語は、Ｔ細胞応答誘発ペプチドが、非自己病原性供給源の天然に存在するＴ細胞エピトープと同一である（すなわち、同じアミノ酸配列を共有する）ことを意味する。換言すれば、Ｔ細胞応答誘発ペプチドのアミノ酸配列は、非自己病原性供給源のタンパク質抗原のアミノ酸配列の部分配列と同一である。Ｔ細胞応答誘発ペプチドの病原性供給源は、ウイルス起源又は細菌起源であり得るが、典型的には、ＭＨＣ  Ｉ提示Ｔ細胞応答誘発ペプチドは、細胞内又は細胞外の病原体に由来する。細胞内病原体にはウイルス、細胞内細菌又は寄生虫が含まれる。細胞外病原体には、寄生虫及び細菌が含まれる。本発明に使用されるＴ細胞応答誘発ペプチドは、対応する天然に存在するＴ細胞エピトープと同じアミノ酸配列を共有するが、本発明によるイムノコンジュゲートのＴ細胞応答誘発ペプチドは、典型的には合成起源である。
【００３９】
当技術分野では、標的細胞に対するＴ細胞の細胞傷害性を誘導するために使用される細胞内病原体に由来するペプチドは、場合によっては、それらの生理学的特性、例えばそれらの溶解性を改善するためにアミノ酸置換又は付加によって修飾された。しかしながら、本発明に関しては、天然に存在するＴ細胞応答誘発ペプチドのみが使用される（すなわち、更なるアミノ酸配列修飾を含まずに野生型病原性ペプチドのアミノ酸配列を共有するペプチド）。
【００４０】
本明細書で使用する「天然に存在する」とは、標的細胞結合部分に結合したＭＨＣクラスＩを介して提示可能なＴ細胞応答誘発ペプチドが、ＭＨＣクラスＩを介して提示可能な対応する非自己病原性Ｔ細胞エピトープのアミノ酸配列を共有する（すなわちそれからなる）ことを意味する。言い換えれば、Ｔ細胞応答誘発ペプチドは、標的細胞内の対応する天然に存在する非自己病原体の切断によって生成可能なアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列からなる。従って、本発明の用語の範囲内で「天然に存在するＴ細胞応答誘発ペプチド」又は「ＭＨＣクラスＩを介して提示可能な天然に存在するＴ細胞応答誘発ペプチドは、合成起源であり得るが、そのアミノ酸配列は、対応する天然に存在する非自己病原体の切断によって生成可能なペプチドと比較して、任意のアミノ酸の修飾、特にアミノ酸の付加、欠失又は置換を含まない。今一度、言い換えれば、標的細胞結合部分に結合した天然に存在するＴ細胞応答誘発ペプチドのアミノ酸配列は、非自己病原体のタンパク質抗原のアミノ酸配列の（ある好ましい実施態様においては８から１２アミノ酸長の）部分配列と同一である。
【００４１】
Ｔ細胞応答誘発ペプチドが異なるアミノ酸残基を「天然に含む」と述べることにより、対応する天然に存在するＴ細胞応答誘発ペプチド内の同じ位置に、異なるアミノ酸残基が存在することを意味する。従って、システイン残基を天然に含むＴ細胞応答誘発ペプチドは、非自己病原体に由来するペプチドを意味し、ここで、Ｔ細胞応答誘発ペプチドのアミノ酸配列に対応する非自己病原体のタンパク質抗原のアミノ酸配列の部分配列は、同じ位置にシステイン残基を含む。
【００４２】
Ｔ細胞応答誘発ペプチドが野生型病原性Ｔ細胞エピトープに関して「アミノ酸配列修飾なし」で提供されることが示された場合、それは、ペプチドのアミノ酸配列が、非自己病原体の対応する天然に誘導可能なＴ細胞エピトープ（すなわち、対応する天然に存在する非自己病原体の切断によって生成可能なＴ細胞エピトープ）のアミノ酸配列と同一であることを意味する。特に、ペプチドのアミノ酸配列は、天然に存在するペプチドと比較して、アミノ酸残基の付加、欠失又は置換を含まない。
【００４３】
本明細書で使用する用語「アミノ酸」は、カルボキシル基に対してα位に位置するアミノ部分を有する有機分子を意味する。アミノ酸の例には、アルギニン、グリシン、オルニチン、リジン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、イソロイシン、ロイシン、アラニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、メチオニン、セリン、プロリンが含まれる。使用されるアミノ酸は、任意選択的に、それぞれＬ−体である。アミノ酸は共通の側鎖特性に基づいてグループに分けることができる：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性の親水性Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ．
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【００４４】
「エピトープ」は、免疫系によって、例えば、抗体、Ｂ細胞又はＴ細胞によって認識されるタンパク質抗原の一部である。「Ｔ細胞エピトープ」は、ＭＨＣ分子に結合している細胞の表面上に提示される。ＭＨＣ  Ｉによって提示可能なＴ細胞エピトープは、細胞傷害性ＣＤ８  Ｔリンパ球（ＣＤ８  Ｔ細胞又はＣＴＬ）のＴ細胞受容体に結合することができる。ＭＨＣ  Ｉによって提示可能なＴ細胞エピトープは、典型的には８から１２アミノ酸長のペプチドである。従って、本明細書において言及される「ＭＨＣクラスＩを介して提示可能なＴ細胞応答誘発ペプチド」は、病原体由来ペプチド（一実施態様では８から１２アミノ酸残基からなるペプチド）は、標的細胞内における（例えば、１つ又は複数のアミノ酸残基の切断による）処理を必要とすることなく、ＭＨＣ  Ｉ複合体に結合することができる（ただしＭＨＣ  ＩＩには結合しない）ことを意味する。
【００４５】
本発明の用語の範囲内で、「切断可能な結合」とは、ＭＨＣクラスＩ分子によって直接提示されるために、Ｔ細胞応答誘発ペプチドが分離されることを可能にする、標的細胞結合部分とＴ細胞応答誘発ペプチドとの間に配置されたイムノコンジュゲート内の結合に関する。切断可能な結合は、Ｔ細胞応答誘発ペプチドと直接連結して位置する。イムノコンジュゲートからのＴ細胞応答誘発ペプチドの切断は、付加的アミノ酸残基を伴わない、その元のアミノ酸配列のＴ細胞応答誘発ペプチドの放出をもたらす。
【００４６】
切断可能な結合の型に依存して、Ｔ細胞応答誘発ペプチドは、切断時にイムノコンジュゲートから「無痕跡（traceless）」又は「非無痕跡（non-traceless）」の何れかで放出される。本明細書で使用される「非無痕跡」放出とは、放出されたＴ細胞応答誘発ペプチドが痕跡量のリンカー（すなわち、アミノ酸以外の化学的部分の形態の痕跡）を含むことを意味するが、その痕跡がＭＨＣクラスＩ結合に干渉しないことを条件とする。本発明の用語の範囲内で、本明細書で言及される「非無痕跡放出」は、付加的アミノ酸残基を含むＴ細胞応答誘発ペプチドの放出を含まないことは明白に言及される。本明細書で使用される「無痕跡」放出とは、放出されるＴ細胞応答誘発ペプチドがリンカーの痕跡を全く含まないことを意味する。
【００４７】
「ｐＨ依存性切断」とは、切断可能な結合の切断がｐＨの変化によって引き起こされることを意味する。本発明の１つの実施態様において、ｐＨ依存性切断は、標的細胞のエンドソーム区画内に存在するｐＨで引き起こされる。本発明の一実施態様において、ｐＨ依存性切断は、ｐＨ５．５−６．５で引き起こされる。
【００４８】
本明細書で使用する「酵素的切断」とは、イムノコンジュゲートのタンパク質切断を意味し、これは一般にペプチド結合の加水分解によって生じる。酵素的切断は、プロテアーゼ、例えば、フーリンにより影響を受ける。酵素切断によって切断可能なイムノコンジュゲート内の切断可能な結合の生成は、例えば、Ｔ細胞応答誘発ペプチドのペプチドリンカーを介した標的細胞結合部分への結合によって達成することができる。
【００４９】
標的細胞結合部分へのＴ細胞応答誘発ペプチドの結合は、ジスルフィド結合、エステル結合、化学的リンカー、ペプチドリンカーによって、又は非共有結合によって（例えば、ビオチン／ストレプトアビジン、ビオチン／テオフィリンによって）達成され得る。
【００５０】
Ｔ細胞応答誘発ペプチドの標的細胞結合部分への「共有結合（covalent coupling）」又は「共有結合（covalent binding）」は、Ｔ細胞応答誘発ペプチドの原子と標的細胞結合部分の原子との間に電子対を共有することを含む化学結合による結合（coupling）を意味する。
【００５１】
標的細胞結合部分に対するＴ細胞応答誘発ペプチドの「非共有結合」又は「非共有結合」は、電子の共有を伴わない結合を意味する。非共有結合の例には、免疫学的結合又はビオチン／アビジン、ビオチン／ストレプトアビジンなどを介する結合が含まれる。結合がイムノコンジュゲートに含まれる抗体を介して影響される免疫学的結合の一実施態様では、抗体は、Ｔ細胞応答誘発ペプチドに結合した有機分子に特異的に結合する。内部移行後にＴ細胞応答誘発ペプチドを放出するために、この実施態様では、Ｔ細胞応答誘発ペプチドは切断可能な結合を介して前記有機分子に結合される。有機分子は、好ましくは９００Ｄａまでの分子量を有する小分子である。そのような有機分子の例には、ビオチン及びテオフィリンが含まれる。
【００５２】
本明細書で使用される「ペプチドリンカー」又は「リンカーペプチド」は、好ましくは合成起源のアミノ酸配列を有するペプチドをいう。本明細書中で使用されるペプチドリンカーは、切断部位（一実施態様ではプロテアーゼ切断部位）を含む機能的ドメインを含むか、又はペプチドリンカーはＴ細胞応答誘発ペプチドに融合される場合に切断部位（一実施態様ではプロテアーゼ切断部位）を作成する。本明細書で使用されるペプチドリンカーのアミノ酸配列は、典型的には、８から５０アミノ酸残基の長さを有する。一実施態様では、本明細書で使用されるペプチドリンカーは、フーリン切断部位を含み、ペプチドリンカーのアミノ酸配列は、
−  Ｒ−Ｘ−Ｒ−Ｒ（Ｘは任意のアミノ酸残基である）、又は
−  Ｒ−Ｘ−Ｋ−Ｒ（Ｘは任意のアミノ酸残基である）
を含む。
【００５３】
本発明の用語中の「トランスロケーションドメイン」は、細胞質ゾルへのアクセスを可能にする膜トランスロケーションに関与する構造タンパク質ドメイン、又は前記タンパク質ドメインの機能的部分である。トランスロケーションドメインの例は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ外毒素Ａ由来のドメインＩＩである。
【００５４】
用語「薬学的組成物」は、その中に含まれる活性成分の生物学的活性が有効であるような形態であって、組成物が投与される被験体にとって容認できないほど毒性である追加の成分を含まない調製物を指す。本発明の薬学的組成物は、当該技術分野で公知の様々な方法によって投与することができる。当業者によって理解されるように、投与の経路及び／又は方法は、所望の結果に依存して変化するであろう。特定の投与経路によって本発明によるイムノコンジュゲートを投与するためには、イムノコンジュゲートをその不活性化を防止する物質でコーティングするか、又はイムノコンジュゲートをその物質と同時投与する必要があり得る。例えば、イムノコンジュゲートは、被験体に、適切な担体、例えば、リポソーム又は希釈剤中で投与することができる。薬学的に許容される希釈剤としては、生理食塩水及び水性緩衝液が挙げられる。
【００５５】
「薬学的に許容される担体」は、被験体に非毒性であり、有効成分以外の製剤処方中の成分を指す。薬学的に許容される担体には、生理学的に適合する任意の及び全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などが含まれる。好ましくは、担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄又は表皮投与（例えば、注射又は注入による）に適している。
【００５６】
本発明による薬学的組成物はまた、防腐剤、湿潤剤、乳化剤及び分散剤などのアジュバントを含有してもよい。微生物の存在の防止は、上記の滅菌手順によって、並びにパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などの様々な抗菌剤及び抗真菌剤の包含の両方によって保証され得る。組成物中に糖、塩化ナトリウムなどの等張剤を含めることも望ましいことがある。更に、注射用の薬学的形態の持続的吸収は、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンのような吸収を遅らせる薬剤を含めることによってもたらされ得る。
【００５７】
本明細書で使用される「非経口投与」及び「非経口的に投与される」という語句は、経腸及び局所投与以外の、通常は注射による投与様式を意味し、限定されないが、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、関節内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、脊髄内、硬膜外及び胸骨内注射及び注入が挙げられる。
【００５８】
選択された投与経路に関わらず、適切な水和形態で使用され得る本発明のイムノコンジュゲート、及び／又は本発明の薬学的組成物は、当業者に知られている一般的な方法により薬学的に許容される剤形に製剤化される。
【００５９】
本発明の薬学的組成物中の有効成分の実際の用量レベルは、患者に対して毒性でなく、特定の患者、組成物、及び投与様式に関して所望の治療的応答を達成するために効果的な有効成分の量を得るために変化させることができる。選択された用量レベルは、使用される本発明の特定の組成物の活性、投与経路、投与時間、投与経路、使用される特定の化合物の排泄速度、治療期間、使用される特定の組成物と併用で用いられる他の薬物、化合物、及び／又は物質、治療される患者の年齢、性別、体重、状態、全身健康状態、及び既往歴、並びに医学の技術分野において周知である同様の要因を含む多様な薬物動態因子に依存するであろう。
【００６０】
組成物は無菌であって、組成物がシリンジによって送達可能である程度に流動性でなければならない。水に加えて、担体は、好ましくは等張性の緩衝食塩水である。
【００６１】
適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散体の場合には必要とされる粒子径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持することができる。多くの場合、組成物中に等張剤、例えば糖、マンニトール又はソルビトールなどのポリアルコール、及び塩化ナトリウムを含むことが好ましい。
【００６２】
本明細書で用いられる「細胞傷害性剤」という用語は、細胞の機能を阻害又は阻止し及び／又は細胞死若しくは破壊を生ずる物質を指す。細胞傷害性剤は、限定されないが、放射性同位体（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位体）；化学療法剤又は薬物（例えば、メトトレキセート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシン又は他の挿入剤）；成長阻害剤、酵素及びその断片、例えば核酸分解酵素など；抗生物質；小分子毒素などの毒素、又は細菌、真菌、植物又は動物由来の酵素活性毒素（それらの断片及び／又はその変異体を含む）；及び様々な抗腫瘍剤又は抗癌剤を包含する。
【００６３】
本明細書で使用する用語「がん」は、例えば、リンパ腫、リンパ性白血病、肺がん、非小細胞肺（ＮＳＣＬ）がん、細気管支肺胞性細胞肺がん、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭部又は頸部のがん、皮膚又は眼内黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門領域のがん、胃がん（stomach cancer）、胃がん（gastric cancer）、結腸がん、乳がん、子宮がん、卵管の癌、子宮内膜癌、子宮頸部癌、膣の癌、外陰部の癌、ホジキン病、食道のがん、小腸のがん、内分泌系のがん、甲状腺のがん、副甲状腺のがん、副腎のがん、軟組織の肉腫、尿道のがん、陰茎のがん、前立腺がん、膀胱のがん、腎臓又は尿管のがん、腎細胞癌、腎盂の癌、中皮腫、肝細胞がん、胆管がん、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、脊髄軸腫瘍、脳幹グリオーマ、多形性膠芽腫、星状細胞腫、シュワン腫、上衣腫、髄芽腫、髄膜腫、扁平上皮癌、下垂体腺腫及びユーイング肉腫などの増殖性疾患を意味し、上記癌の任意の難治性バージョン、又は上記がんのうちの一又は複数の組み合わせを含む。
【００６４】
用語「半最大阻害濃度」（「ＩＣ５０」）は、インビトロで生物学的プロセスを５０％阻害するために必要とされる特定の化合物又は分子の濃度を示す。ＩＣ５０値は対数的にｐＩＣ５０値（−ｌｏｇ  ＩＣ５０）に変換することができ、高い値は指数関数的に大きな効力を示す。ＩＣ５０値は絶対値ではなく、実験条件、例えば使用される濃度に依存する。Ｃｈｅｎｇ−Ｐｒｕｓｏｆｆ方程式を用いて、ＩＣ５０値を絶対阻害定数（Ｋｉ）に変換することができる（Biochem. Pharmacol. (1973) 22:3099）。
【００６５】
「組み換えタンパク質」は、組み換え操作された宿主細胞によって産生されたタンパク質である。場合により単離又は精製される。
【００６６】
標的細胞結合部分がタンパク質である場合、標的細胞結合タンパク質は好ましくは組み換え手段によって産生される。タンパク質の組み換え産生の方法は当該技術分野で広く知られており、原核細胞及び真核細胞におけるタンパク質の発現を含み、その後のタンパク質の単離、及び通常は薬学的に許容される純度までの精製を伴う。宿主細胞におけるタンパク質の発現のために、タンパク質又はその一部をコードする核酸は、標準的な方法によって発現ベクターに挿入される。発現は、ＣＨＯ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、酵母、又は大腸菌細胞などの適当な原核生物又は真核生物宿主細胞中で行われ、タンパク質は細胞（上清又は溶解後の細胞）から回収される。組み換えによる抗体の産生の一般的な方法は当該技術分野で広く知られており、例えば、Makrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202; Geisse, S., et al., Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282; Kaufman, R.J., Mol. Biotechnol. 16 (2000) 151-161; Werner, R.G., Drug Res. 48 (1998) 870-880の総説に記載されている。
【００６７】
２．発明の実施態様の詳細な説明
Ｔ細胞特異的病原性ペプチドを含むコンジュゲート及び標的細胞上の表面受容体に特異的に結合するタンパク質は、欧州特許第０６５９４３７号（Ａ１）から公知である。しかしながら、細胞表面上のＭＨＣクラスＩペプチド提示及びＴ細胞活性化の効率は、欧州特許第０６５９４３７号（Ａ１）に開示されたアプローチでは低かった。本発明の発明者らは、この理論に束縛されることなく、この効果は、欧州特許第０６５９４３７号（Ａ１）に開示されたコンジュゲートを含有するペプチドが標的細胞内での更なるプロセシングを必要とするという事実に起因して生じることを観察した。これは、ほとんどの場合、外因性に提供された抗原が細胞質に送達されず、プロテオソームによってプロセシングされ、ＭＨＣクラスＩ経路に更に輸送され、細胞表面上に提示されるという問題によって制限される。おそらく追加的に起こる別の効果は、特に腫瘍細胞内の抗原プロセシング機構及び提示プロセスが不完全であることであり得る（Ferrone S., Advances in Cancer Research, 93 (2005) 189-234）。
【００６８】
本発明は、Ｔ細胞特異的病原性ペプチドのＭＨＣクラスＩ提示を改善するアプローチを提供する。本発明によれば、イムノコンジュゲートの内部移行後に、エンドソーム区画のイムノコンジュゲートから放出されたＴ細胞応答誘発ペプチドは、ＭＨＣクラスＩ複合体への結合を介する提示にそのまま適している（標的細胞内で更なるプロセシング又はトリミングを必要としない）。Ｔ細胞応答誘発ペプチドは、エンドソーム区画においてＭＨＣクラスＩ分子に結合し、エンドソームリサイクル経路によりＭＨＣクラスＩに関連して標的細胞の表面に進行し（Donaldson J.G., Nat Rev Mol Cell Biol. Sep 2009; 10(9): 597-608）、細胞質ゾル中の抗原プロセシング機構への輸送及び細胞内での更なるプロセシングを必要としない。従って、Ｔ細胞応答誘発ペプチド及び標的細胞結合部分は、その元のアミノ酸配列からなるＴ細胞応答誘発ペプチドを（切断後に）放出するように、切断可能な結合を介して互いに結合される。言い換えれば、Ｔ細胞応答誘発ペプチドがイムノコンジュゲートから切断される場合、それは、天然に存在するＴ細胞応答誘発ペプチドのアミノ酸配列と比較した場合、付加的な任意のアミノ酸残基を含まないか、又は任意のアミノ酸残基を欠いていない（すなわち、放出されたＴ細胞応答誘発ペプチドは、対応する天然に存在するＴ細胞応答誘発ペプチドと同じ長さである）。このため、本発明によるイムノコンジュゲートは、ＣＤ８  Ｔ細胞活性化を媒介し、標的細胞における細胞死を誘発するのにより適した候補である。本発明によるイムノコンジュゲートでは、特に標的細胞内での更なるプロセシングを必要とするペプチドが分離されるコンストラクトと比較した場合、標的細胞溶解は、（ａ）必要とされるイムノコンジュゲートの量がかなり減少して、（ｂ）より速く誘導される。
【００６９】
本発明は、切断可能な結合を介して標的細胞結合部分に結合したＭＨＣクラスＩを介して提示可能な少なくとも１つのＴ細胞応答誘発ペプチドを含むイムノコンジュゲートに関し、切断可能な結合は、切断時に、ＭＨＣクラスＩ分子を介して（直接）提示可能である前記Ｔ細胞応答誘発ペプチドがイムノコンジュゲートから放出されるように配置される。本発明の１つの実施態様において、Ｔ細胞応答誘発ペプチドは、標的細胞のエンドソーム区画において放出される。本発明の別の実施態様において、放出されたＴ細胞応答誘発ペプチドは、標的細胞内での更なるプロセシングなしに、ＭＨＣクラスＩを介して提示可能である。
【００７０】
本発明はまた、放出されたＴ細胞応答誘発ペプチドのアミノ酸配列が天然に存在するＴ細胞応答誘発ペプチドのアミノ酸配列と同一であるイムノコンジュゲートに関する。
【００７１】
本発明の一実施態様では、放出されたＴ細胞応答誘発ペプチドのアミノ酸配列は、標的細胞結合部分に結合したＴ細胞応答誘発ペプチドのアミノ酸配列と同一である。
【００７２】
本発明はまた、切断可能な結合を介して標的細胞結合部分に結合したＭＨＣクラスＩを介して提示可能な少なくとも１つのＴ細胞応答誘発ペプチドを含むイムノコンジュゲートに関し、切断可能な結合は、切断時にＴ細胞応答誘発ペプチドがイムノコンジュゲートから放出されるように配置され、放出されたＴ細胞応答誘発ペプチドは、標的細胞結合タンパク質に結合したＴ細胞応答誘発ペプチドと同一の数のアミノ酸からなり、放出されたＴ細胞応答誘発ペプチドは、ＭＨＣクラスＩ複合体を介した提示に適している。
【００７３】
本発明はまた、切断可能な結合を介して標的細胞結合部分に結合したＭＨＣクラスＩを介して提示可能な８−１２アミノ酸残基からなる少なくとも１つのＴ細胞応答誘発ペプチドを含むイムノコンジュゲートに関し、切断可能な結合は、切断時にＴ細胞応答誘発ペプチドがイムノコンジュゲートから放出されるように配置され、放出されたＴ細胞応答誘発ペプチドは、標的細胞結合部分に結合したＴ細胞応答誘発ペプチドと同一の数のアミノ酸からなる。
【００７４】
本発明の１つの実施態様において、Ｔ細胞応答誘発ペプチドは８から１２アミノ酸からなる。
【００７５】
本発明の一実施態様において、Ｔ細胞応答誘発ペプチドは天然に存在するＴ細胞応答誘発ペプチドである。
【００７６】
本発明の１つの実施態様において、Ｔ細胞応答誘発ペプチドは少なくとも１つのシステイン残基を含む。本発明の一実施態様において、Ｔ細胞応答誘発ペプチドは、少なくとも１つのシステイン残基を含む天然に存在するＴ細胞応答誘発ペプチドである。本発明の１つの実施態様において、Ｔ細胞応答誘発ペプチドはＮ又はＣ末端システイン残基を含む。本発明の一実施態様において、Ｔ細胞応答誘発ペプチドは、Ｎ又はＣ末端システイン残基を含む天然に存在するＴ細胞応答誘発ペプチドである。
【００７７】
本発明の一実施態様において、Ｔ細胞応答誘発ペプチドは、そのアミノ酸配列のＮ末端位置（Ｎ末端からＣ末端方向の１位）にシステイン残基を含む。本発明の一実施態様において、Ｔ細胞応答誘発ペプチドは、そのアミノ酸配列のＮ末端位置（Ｎ末端からＣ末端方向の１位）にシステイン残基を天然に含む。
【００７８】
本発明の一実施態様において、Ｔ細胞応答誘発ペプチドは、そのアミノ酸配列のＮ末端からＣ末端方向の２位にロイシン残基を含む。本発明の一実施態様において、Ｔ細胞応答誘発ペプチドは、そのアミノ酸配列のＮ末端からＣ末端方向の２位にロイシン残基を天然に含む。本発明の一実施態様において、Ｔ細胞応答誘発ペプチドは８から１２アミノ酸残基からなり、そのアミノ酸配列のＮ末端からＣ末端方向の２位にロイシン残基を天然に含む。
【００７９】
本発明の一実施態様において、イムノコンジュゲートは最大５個のＴ細胞応答誘発ペプチドを含む。本発明の一実施態様において、イムノコンジュゲートは最大１０個のＴ細胞応答誘発ペプチドを含む。
【００８０】
本発明の一実施態様において、Ｔ細胞応答誘発ペプチドは、標的細胞の宿主生物の免疫細胞によって認識される非自己病原体に由来する。本発明の一実施態様において、Ｔ細胞応答誘発ペプチドは細胞内又は細胞外の病原体に由来する。本発明の一実施態様において、Ｔ細胞応答誘発ペプチドは細胞内の病原体に由来する。本発明の一実施態様において、Ｔ細胞応答誘発ペプチドはウイルス細胞内の病原体に由来する。
【００８１】
一実施態様において、Ｔ細胞応答誘発ペプチドは配列番号２から配列番号５から選択される。
【００８２】
一実施態様において、Ｔ細胞応答誘発ペプチドはエプスタイン・バーウイルスに由来する。一実施態様において、Ｔ細胞応答誘発ペプチドはエプスタイン・バーウイルスに由来し、配列番号２及び配列番号４から選択される。
【００８３】
一実施態様において、Ｔ細胞応答誘発ペプチドはヒトヘルペスウイルス５に由来する。一実施態様において、Ｔ細胞応答誘発ペプチドはヒトヘルペスウイルス５に由来し、配列番号５である。
【００８４】
一実施態様において、Ｔ細胞応答誘発ペプチドはインフルエンザＡに由来する。一実施態様において、Ｔ細胞応答誘発ペプチドはインフルエンザＡに由来し、配列番号３である。
【００８５】
一実施態様において、標的細胞結合部分に結合したＴ細胞応答誘発ペプチドのアミノ酸配列は、非自己病原体（一実施態様では細胞内病原体）のタンパク質抗原のアミノ酸配列の、好ましくは８から１２アミノ酸長の部分配列である。
【００８６】
Ｔ細胞応答誘発ペプチドは、切断可能な結合を介して標的細胞結合部分に結合される。本発明の一実施態様では、切断可能な結合は、化学的、ｐＨ依存性又は酵素的切断によって切断可能である。
【００８７】
本発明の一実施態様では、切断可能な結合は、イムノコンジュゲートの標的細胞内への内部移行後に切断可能である。
【００８８】
本発明の一実施態様では、切断可能な結合は、標的細胞のエンドソーム区画内で切断可能である。本発明の一実施態様では、切断可能な結合は、標的細胞のエンドソーム区画内の標的細胞へのイムノコンジュゲートの内部移行後に切断可能である。
【００８９】
本発明の一実施態様では、切断可能な結合は、イムノコンジュゲートからのＴ細胞応答誘発ペプチドペプチドの無痕跡放出を可能にする。
【００９０】
本発明の一実施態様において、Ｔ細胞応答誘発ペプチドは、標的細胞結合部分に共有結合される。本発明の一実施態様において、Ｔ細胞応答誘発ペプチドは、ジスルフィド結合、エステル結合、ペプチド結合を介して、又はリンカー部分を介して標的細胞結合部分に共有結合する。
【００９１】
本発明の一実施態様において、切断可能な結合は、ジスルフィド結合及びエステル結合から選択される。本発明の一実施態様において、切断可能な結合はジスルフィド結合である。本発明の１つの実施態様において、Ｔ細胞応答誘発ペプチドは少なくとも１つのシステイン残基を含み、切断可能な結合はジスルフィド結合である。本発明の好ましい一実施態様において、標的細胞結合部分はタンパク質であり、Ｔ細胞応答誘発ペプチドのシステイン残基と標的細胞結合タンパク質のシステイン残基との間にジスルフィド結合が形成される。別の好ましい実施態様において、ペプチドリンカーは、標的細胞結合部分とＴ細胞応答誘発ペプチドとの間に存在する。この場合、ジスルフィド結合は、Ｔ細胞応答誘発ペプチドのシステイン残基とペプチドリンカーのシステイン残基との間に形成される。
【００９２】
本発明の一実施態様において、Ｔ細胞応答誘発ペプチド及び標的細胞結合部分は、切断可能なリンカー部分を介して結合される。
【００９３】
本発明の一実施態様において、Ｔ細胞応答誘発ペプチド及び標的細胞結合部分は、ペプチドリンカー又は化学的リンカーを介して結合される。
【００９４】
本発明の一実施態様において、Ｔ細胞応答誘発ペプチド及び標的細胞結合部分はペプチドリンカーを介して結合される。本発明の一実施態様において、Ｔ細胞応答誘発ペプチド及び標的細胞結合部分は、８から５０個のアミノ酸残基のアミノ酸配列長を有するペプチドリンカーを介して結合される。
【００９５】
本発明の一実施態様では、切断可能なリンカー部分は、プロテアーゼ切断部位を含む。本発明の一実施態様では、切断可能なリンカー部分は、標的細胞のエンドソーム又はリソソーム区画において切断可能なプロテアーゼ切断部位を含む。本発明の好ましい一実施態様では、切断可能なリンカー部分は、フーリン切断部位を含む。
【００９６】
本発明の一実施態様では、プロテアーゼ切断部位を含む切断可能なリンカー部分は、ペプチドリンカーである。本発明の一実施態様では、プロテアーゼ切断部位を含む切断可能なリンカー部分は、前記プロテアーゼ切断部位を含むペプチドリンカーである。本発明の一実施態様では、プロテアーゼ切断部位を含む切断可能なリンカー部分は、前記フーリン切断部位を含むペプチドリンカーである。
【００９７】
本発明の一実施態様では、切断可能なリンカー部分は、ｐＨ依存性切断部位を含む。本発明の一実施態様では、切断可能なリンカー部分は、標的細胞のエンドソーム区画において切断可能なｐＨ依存性切断部位を含む。本発明の一実施態様では、切断可能なリンカー部分は、ｐＨ５．５−６．５で切断可能なｐＨ依存性切断部位を含む。
【００９８】
本発明の一実施態様では、ｐＨ依存性切断部位を含む切断可能なリンカー部分は、化学的リンカーである。一実施態様において、ｐＨ依存性切断部位を含む切断可能なリンカー部分は、以下に示すヒドラゾン、オキシム、マレイン酸アミド及びケタールから選択される。
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【００９９】
本発明の一実施態様において、Ｔ細胞応答誘発ペプチドは、標的細胞結合部分に非共有結合される。本発明の一実施態様において、非共有結合は、免疫学的結合によって達成される。
【０１００】
１つの好ましい実施態様において、免疫学的結合は、イムノコンジュゲートに含まれる有機分子に特異的に結合する抗体の影響を受ける。Ｔ細胞応答誘発ペプチドへの結合は、次いでＴ細胞応答誘発ペプチドに結合した抗体と前記有機分子との間で影響を受ける。Ｔ細胞応答誘発ペプチドの無痕跡放出を達成するために、Ｔ細胞応答誘発ペプチドは切断可能な結合を介して前記有機分子に結合される。従って、本発明の一実施態様において、イムノコンジュゲートは、
−  標的細胞結合部分を含む、多重特異性、好ましくは二重特異性の実体（一実施態様において、組み換え融合タンパク質）の形態の標的細胞結合部分、及び有機分子、好ましくはビオチン又はテオフィリンに特異的に結合する第２の部分（一実施態様において、抗体）、並びに
−  切断可能な結合を介して、第２のタンパク質によって特異的に結合され得る有機分子に結合されるＴ細胞応答誘発ペプチドペプチド
を含む。
【０１０１】
一実施態様において、有機分子は、好ましくは９００Ｄａまでの分子量を有する小分子である。好ましい一実施態様では、有機分子はビオチン又はテオフィリンである。別の好ましい実施態様では、有機分子はテオフィリンである。
【０１０２】
別の実施態様では、非共有結合は、高親和性結合によって、一実施態様ではビオチン−アビジン結合によって達成される。別の実施態様では、非共有結合は、標的細胞結合部分に存在する第２の結合部分（例えば、Ｆａｂ断片）によって認識されるペプチドタグ間の高親和性結合によって達成され、ここで切断可能な結合は、Ｔ細胞応答誘発ペプチドとペプチドタグとの間に存在する。従って、本発明の一実施態様において、イムノコンジュゲートは、
−  標的細胞結合部分を含む、多重特異性、好ましくは二重特異性の実体（一実施態様において、組み換え融合タンパク質）の形態の標的細胞結合部分、及びペプチドタグ、好ましくはＦＬＡＧ又はＶ５に特異的に結合する第２の部分（一実施態様において、抗体）、並びに
−  切断可能な結合を介して、第２のタンパク質によって特異的に結合され得るペプチドタグに結合されるＴ細胞応答誘発ペプチドペプチド
を含む。
【０１０３】
本発明による免疫複合体は、Ｔ細胞応答誘発ペプチドを標的細胞に送るために、標的細胞結合部分を含む。
【０１０４】
本発明の一実施態様では、標的細胞結合部分は標的細胞内に内部移行することができる。
【０１０５】
本発明の一実施態様では、標的細胞結合部分は、標的細胞の細胞表面抗原に結合する。
【０１０６】
本発明の一実施態様において、標的細胞は腫瘍細胞である。標的細胞が腫瘍細胞である本発明の別の実施態様において、標的細胞結合部分は、表面発現腫瘍特異的抗原（腫瘍細胞上にのみ存在し、他の細胞には存在しないＴＳＡ）又は表面発現腫瘍関連抗原（ＴＡＡ、腫瘍細胞上に存在し、より少ない程度で他の細胞に存在する）に特異的に結合することができる。
【０１０７】
本発明の一実施態様において、標的細胞は、感染症、自己免疫疾患、糖尿病又はアレルギーにおける疾患の重症度に関連する細胞である。
【０１０８】
本発明の一実施態様において、標的細胞結合部分はタンパク質である。本発明の一実施態様において、標的細胞結合タンパク質は組み換えタンパク質である。本発明の一実施態様において、標的細胞結合タンパク質は、標的細胞に特異的に結合する抗体又は標的細胞上のその受容体に結合するリガンドである。本発明の別の実施態様において、標的細胞結合タンパク質は、抗体、サイトカイン及び成長因子から選択される。本発明の好ましい一実施態様において、標的細胞結合部分は抗体である。
【０１０９】
一実施態様において、標的細胞結合部分は、ＣＤ１９又はＣＤＣＰ−１に特異的に結合する。一実施態様において、標的細胞結合部分は、ＣＤ１９に特異的に結合する。一実施態様において、標的細胞結合部分は、ＣＤＣＰ−１に特異的に結合する。
【０１１０】
本発明の好ましい一実施態様において、標的細胞結合部分はＣＤ１９又はＣＤＣＰ−１に特異的に結合する抗体である。本発明の好ましい一実施態様において、標的細胞結合部分はＣＤ１９に特異的に結合する抗体である。本発明の好ましい一実施態様において、標的細胞結合部分はＣＤＣＰ−１に特異的に結合する抗体である。
【０１１１】
本発明の一実施態様では、イムノコンジュゲートは標的細胞内に内部移行することができる。
【０１１２】
本発明によれば、Ｔ細胞応答誘発ペプチドは、ＭＨＣクラスＩによって直接提示可能であり、標的細胞内での更なるプロセシングを必要としない。従って、本発明の一実施態様では、イムノコンジュゲートはトランスロケーションドメインを含まない。
【０１１３】
本発明により、ＭＨＣクラスＩを介して直接提示可能なＴ細胞応答誘発ペプチドの放出を可能にするイムノコンジュゲートが提供される。放出されたＴ細胞応答誘発ペプチドは、細胞質ゾル中の抗原プロセシング機構への送達を必要としないので、Ｔ細胞応答誘発ペプチドは、短時間で標的細胞の表面上に提示される。従って、本発明の一実施態様では、イムノコンジュゲートの標的細胞内への内部移行後１２時間未満で、Ｔ細胞応答誘発ペプチドがＭＨＣクラスＩ分子を介して標的細胞の表面上に提示される。本発明の別の実施態様では、イムノコンジュゲートの標的細胞内への内部移行後６時間未満で、Ｔ細胞応答誘発ペプチドがＭＨＣクラスＩ分子を介して標的細胞の表面上に提示される。本発明の別の実施態様では、イムノコンジュゲートは、そのイムノコンジュゲートの標的細胞内への内部移行後６時間以内に標的細胞に対するＴ細胞の細胞傷害性を媒介することができる。
【０１１４】
本発明は更に、本発明によるイムノコンジュゲートを含む薬学的組成物に関する。本発明の一実施態様は、薬学的に許容される担体と組み合わせた本発明によるイムノコンジュゲートを含む薬学的組成物である。
【０１１５】
本発明の別の態様は、本発明によるイムノコンジュゲートの生成のために上記に更に記載され定義されたＭＨＣクラスＩを介して提示可能なＴ細胞応答誘発ペプチドの使用である。
【０１１６】
本発明の別の態様は、標的細胞に対するＴ細胞の細胞傷害性を特異的に誘導するための、本発明によるイムノコンジュゲートの使用である。本発明の一実施態様では、イムノコンジュゲートは、標的細胞に対するＣＤ８  Ｔ細胞による細胞媒介性免疫を特異的に誘導するために使用される。本発明の一実施態様では、イムノコンジュゲートは標的細胞内に内部移行され、Ｔ細胞応答誘発ペプチドが標的細胞のエンドソーム区画内のイムノコンジュゲートから放出される。本発明の一実施態様では、イムノコンジュゲートの標的細胞内への内部移行後１２時間未満で、Ｔ細胞応答誘発ペプチドがＭＨＣクラスＩ分子を介して標的細胞の表面上に提示される。本発明の別の実施態様では、イムノコンジュゲートの標的細胞内への内部移行後６時間未満で、Ｔ細胞応答誘発ペプチドがＭＨＣクラスＩ分子を介して標的細胞の表面上に提示される。
【０１１７】
本発明の別の実施態様では、イムノコンジュゲートは、そのイムノコンジュゲートの標的細胞内への内部移行後６時間以内に標的細胞に対するＴ細胞の細胞傷害性を媒介するために使用される。
【０１１８】
本発明の別の態様は、
ａ）組み換え標的細胞結合部分を提供する工程、
ｂ）Ｔ細胞応答誘発ペプチドを提供する工程、及び
ｃ）切断可能な結合を介して前記Ｔ細胞応答誘発ペプチドの少なくとも１つを前記標的細胞結合部分に結合させる工程
を含む、本発明によるイムノコンジュゲートの生成方法である。
【０１１９】
本発明の一実施態様は、非修飾Ｔ細胞応答誘発ペプチドが標的細胞結合部分に結合されるイムノコンジュゲートの生成方法に関する。言い換えれば、本発明の一実施態様は、Ｔ細胞応答誘発ペプチドがアミノ酸配列修飾なしで提供され、標的細胞結合部分に結合されるイムノコンジュゲートの生成方法に関する。
【０１２０】
本発明の別の態様は、標的細胞に対するＣＤ８  Ｔ細胞を介する細胞媒介性免疫を特異的に誘導するための、本発明によるイムノコンジュゲートの製造方法であって、
ａ）組み換え標的細胞結合部分を提供する工程、
ｂ）Ｔ細胞応答誘発ペプチドを提供する工程、及び
ｃ）切断可能な結合を介して前記Ｔ細胞応答誘発ペプチドの少なくとも１つを前記標的細胞結合部分に結合させる工程
を含む、本発明によるイムノコンジュゲートの生成方法である。一実施態様において、非修飾Ｔ細胞応答誘発ペプチドは、標的細胞結合部分に結合される。
【０１２１】
本発明の別の目的は、薬学的組成物の製造のための本発明によるイムノコンジュゲートの使用である。本発明の別の目的は、少なくとも１つの薬学的に許容される担体と組み合わせて本発明によるイムノコンジュゲートを処方することを含む、本発明によるイムノコンジュゲートを含む薬学的組成物の製造方法である。
【０１２２】
本発明の別の態様は、医薬としての使用のための本発明によるイムノコンジュゲートである。本発明の別の態様は、がんの治療のための、がん細胞結合部分を含む本発明によるイムノコンジュゲートである。
【０１２３】
本発明の別の態様は、感染性疾患、自己免疫疾患、糖尿病又はアレルギーの治療に使用のための、本発明によるイムノコンジュゲートである。
【０１２４】
本発明の別の態様は、標的細胞に対するＣＤ８  Ｔ細胞を介した細胞媒介性免疫を特異的に誘導することに使用のための、本発明によるイムノコンジュゲートである。
【０１２５】
本発明の別の態様は、医薬としての使用のための本発明による薬学的組成物である。本発明の別の態様は、薬学的組成物に含まれるイムノコンジュゲートが、がんの治療のために、がん細胞結合部分を含む、本発明の薬学的組成物である。本発明の別の態様は、感染性疾患、自己免疫疾患、糖尿病又はアレルギーの治療に使用のための、本発明による薬学的組成物である。本発明の別の態様は、標的細胞に対するＣＤ８  Ｔ細胞を介した細胞媒介性免疫を特異的に誘導することに使用のための、本発明による薬学的組成物である。
【０１２６】
本発明の別の目的は、医薬の製造のための本発明によるイムノコンジュゲートの使用である。本発明の別の目的は、がんの治療のための医薬の製造のための本発明によるイムノコンジュゲートの使用である。
【０１２７】
本発明の別の目的は、感染性疾患、自己免疫疾患、糖尿病又はアレルギーの治療のための医薬の製造のための本発明によるイムノコンジュゲートの使用である。本発明の別の目的は、標的細胞に対するＣＤ８  Ｔ細胞を介した細胞媒介性免疫の特異的誘導のための医薬の製造のための、本発明によるイムノコンジュゲートの使用である。
【０１２８】
本発明の別の態様は、本発明によるイムノコンジュゲートを、治療を必要とする患者に投与することによる、疾患に罹患している患者の治療方法である。本発明の別の態様は、がん細胞結合部分を含む本発明によるイムノコンジュゲートを、治療を必要とする患者に投与することによる、がんに罹患している患者の治療方法である。本発明の別の態様は、本発明によるイムノコンジュゲートを、治療を必要とする患者に投与することによって、感染症、自己免疫疾患、糖尿病又はアレルギーに罹患している患者を治療する方法である。
【０１２９】
本発明の別の態様は、本発明による薬学的組成物を、治療を必要とする患者に投与することによる、疾患に罹患している患者の治療方法である。本発明の別の態様は、本発明による薬学的組成物を、治療を必要とする患者に投与することによる、がんに罹患している患者の治療方法である。本発明の別の態様は、本発明による薬学的組成物を、治療を必要とする患者に投与することによって、感染症、自己免疫疾患、糖尿病又はアレルギーに罹患している患者を治療する方法である。
【０１３０】
３．本発明の特定の実施態様
以下に、本発明の特定の実施態様が記載される。
１．  切断可能な結合を介して標的細胞結合部分に結合したＭＨＣクラスＩを介して提示可能な少なくとも１つのＴ細胞応答誘発ペプチドを含むイムノコンジュゲートであって、ここで切断可能な結合は、ＭＨＣクラスＩ分子を介して直接提示可能である前記Ｔ細胞応答誘発ペプチドが、切断時にイムノコンジュゲートから放出されるように配置される、イムノコンジュゲート。
２．  放出されたＴ細胞応答誘発ペプチドのアミノ酸配列が天然に存在するＴ細胞応答誘発ペプチドのアミノ酸配列と同一である、実施態様１に記載のイムノコンジュゲート。
３．  放出されたＴ細胞応答誘発ペプチドが天然に存在するＴ細胞応答誘発ペプチドと同じ長さである、実施態様２に記載のイムノコンジュゲート。
４．  Ｔ細胞応答誘発ペプチドが天然に存在するＴ細胞応答誘発ペプチドである、前述の実施態様の何れか一に記載のイムノコンジュゲート。
５．  Ｔ細胞応答誘発ペプチドが少なくとも１つのシステイン残基を含む、前述の実施態様の何れか一に記載のイムノコンジュゲート。
６．  Ｔ細胞応答誘発ペプチドがＮ又はＣ末端システイン残基を含む、前述の実施態様の何れか一に記載のイムノコンジュゲート。
７．  Ｔ細胞応答誘発ペプチドが２位にロイシン残基（Ｎ末端からＣ末端方向に数える）を含む、前述の実施態様の何れか一に記載のイムノコンジュゲート。
８．  最大５個のＴ細胞応答誘発ペプチドを含む、前述の実施態様の何れか一に記載のイムノコンジュゲート。
９．  Ｔ細胞応答誘発ペプチドが８から１２アミノ酸からなる、前述の実施態様の何れか一に記載のイムノコンジュゲート。
１０．  Ｔ細胞応答誘発ペプチドが、エプスタイン・バーウイルス、ヒトヘルペスウイルス５又はインフルエンザＡに由来する、前述の実施態様の何れか一に記載のイムノコンジュゲート。
１１．  Ｔ細胞応答誘発ペプチドがエプスタイン・バーウイルスに由来する、前述の実施態様の何れか一に記載のイムノコンジュゲート。
１２．  Ｔ細胞応答誘発ペプチドがヒトヘルペスウイルス５に由来する、前述の実施態様の何れか一に記載のイムノコンジュゲート。
１３．  Ｔ細胞応答誘発ペプチドがインフルエンザＡに由来する、前述の実施態様の何れか一に記載のイムノコンジュゲート。
１４．  Ｔ細胞応答誘発ペプチドが配列番号２から配列番号５から選択される、前述の実施態様の何れか一に記載のイムノコンジュゲート。
１５．  切断可能な結合が、化学的、ｐＨ依存性又は酵素的切断によって切断可能である、前述の実施態様の何れか一に記載のイムノコンジュゲート。
１６．  切断可能な結合が、イムノコンジュゲートの標的細胞内への内部移行後に切断可能である、前述の実施態様の何れか一に記載のイムノコンジュゲート。
１７．  切断可能な結合が、標的細胞のエンドソーム区画内で切断可能である、前述の実施態様の何れか一に記載のイムノコンジュゲート。
１８．  Ｔ細胞応答誘発ペプチドが、標的細胞結合部分に共有結合される、前述の実施態様の何れか一に記載のイムノコンジュゲート。
１９．  切断可能な結合が、ジスルフィド結合及びエステル結合から選択される、前述の実施態様の何れか一に記載のイムノコンジュゲート。
２０．  切断可能な結合が、ジスルフィド結合である、前述の実施態様の何れか一に記載のイムノコンジュゲート。
２１．  Ｔ細胞応答誘発ペプチドが少なくとも１つのシステイン残基を含み、切断可能な結合がジスルフィド結合である、前述の実施態様の何れか一に記載のイムノコンジュゲート。
２２．  Ｔ細胞応答誘発ペプチド及び標的細胞結合部分が、切断可能なリンカー部分を介して結合される、実施態様１から１８の何れか一に記載のイムノコンジュゲート。
２３．  切断可能なリンカー部分が、プロテアーゼ切断部位を含む、実施態様２２に記載のイムノコンジュゲート。
２４．  切断可能なリンカー部分が、フーリン切断部位を含む、実施態様２３に記載のイムノコンジュゲート。
２５．  切断可能なリンカー部分が、ｐＨ依存性切断部位を含む、実施態様２２に記載のイムノコンジュゲート。
２６．  ｐＨ依存性切断部位は、ｐＨ５．５−６．５で切断可能である、実施態様２５に記載のイムノコンジュゲート。
２７．  切断可能なリンカー部分が、化学的リンカーである、実施態様２２から２６の何れか一に記載のイムノコンジュゲート。
２８．  標的細胞結合部分が標的細胞内に内部移行することができる、前述の実施態様の何れか一に記載のイムノコンジュゲート。
２９．  標的細胞結合部分が、標的細胞の細胞表面抗原に結合する、前述の実施態様の何れか一に記載のイムノコンジュゲート。
３０．  標的細胞が腫瘍細胞である、前述の実施態様の何れか一に記載のイムノコンジュゲート。
３１．  標的細胞結合部分がタンパク質である、前述の実施態様の何れか一に記載のイムノコンジュゲート。
３２．  標的細胞結合部分が、標的細胞に特異的に結合する抗体又は標的細胞上のその受容体に結合するリガンドである、前述の実施態様の何れか一に記載のイムノコンジュゲート。
３３．  標的細胞結合部分がＣＤ１９又はＣＤＣＰ−１に特異的に結合する、前述の実施態様の何れか一に記載のイムノコンジュゲート。
３４．  標的細胞結合部分がＣＤ１９に特異的に結合する、前述の実施態様の何れか一に記載のイムノコンジュゲート。
３５．  標的細胞結合部分がＣＤＣＰ−１に特異的に結合する、前述の実施態様の何れか一に記載のイムノコンジュゲート。
３６．  標的細胞結合部分がＣＤ１９又はＣＤＣＰ−１に特異的に結合する抗体である、前述の実施態様の何れか一に記載のイムノコンジュゲート。
３７．  標的細胞結合部分がＣＤ１９に特異的に結合する抗体である、前述の実施態様の何れか一に記載のイムノコンジュゲート。
３８．  標的細胞結合部分がＣＤＣＰ−１に特異的に結合する抗体である、前述の実施態様の何れか一に記載のイムノコンジュゲート。
３９．  標的細胞内に内部移行することができる、前述の実施態様の何れか一に記載のイムノコンジュゲート。
４０．  イムノコンジュゲートがトランスロケーションドメインを含まない、前述の実施態様の何れか一に記載のイムノコンジュゲート。
４１．  イムノコンジュゲートの標的細胞内への内部移行後１２時間未満で、Ｔ細胞応答誘発ペプチドがＭＨＣクラスＩ分子を介して標的細胞の表面上に提示される、前述の実施態様の何れか一に記載のイムノコンジュゲート。
４２．  薬学的に許容される担体と組み合わせた、先述の実施態様の何れか一に記載のイムノコンジュゲートを含む薬学的組成物。
４３．  実施態様１から４１の何れか一に記載のイムノコンジュゲートの生成のための、ＭＨＣクラスＩを介して提示可能なＴ細胞応答誘発ペプチドの使用。
４４．  標的細胞に対するＴ細胞の細胞傷害性を特異的に誘導するための、実施態様１から４１の一に記載のイムノコンジュゲートの使用。
４５．  イムノコンジュゲートが標的細胞内に内部移行され、Ｔ細胞応答誘発ペプチドが標的細胞のエンドソーム区画内のイムノコンジュゲートから放出される、実施態様４４に記載の使用。
４６．  イムノコンジュゲートの標的細胞内への内部移行後１２時間未満で、Ｔ細胞応答誘発ペプチドがＭＨＣクラスＩ分子を介して標的細胞の表面上に提示される、実施態様４４又は４５に記載の使用。
４７．  
ｏ  組み換え標的細胞結合部分を提供する工程、
ｏ  Ｔ細胞応答誘発ペプチドを提供する工程、
ｏ  切断可能な結合を介して前記Ｔ細胞応答誘発ペプチドの少なくとも１つを前記標的細胞結合部分に結合させる工程
を含む、実施態様１から４１の何れか一に記載のイムノコンジュゲートの生成方法。
４８．  非修飾Ｔ細胞応答誘発ペプチドが、標的細胞結合部分に結合される、実施態様４７に記載の方法。
４９．  医薬としての使用のための、実施態様１から４１の何れか一に記載のイムノコンジュゲート。
５０．  がんの治療のために、がん細胞結合部分を含む、実施態様１から４１の何れか一に記載のイムノコンジュゲート。
５１．  感染性疾患、自己免疫疾患、糖尿病又はアレルギーの治療のための、実施態様１から４１の何れか一に記載のイムノコンジュゲート。
５２．  実施態様１から４１の何れか一に記載のイムノコンジュゲートを、治療を必要とする患者に投与することによる、疾患に罹患している患者の治療方法。
５３．  がん細胞結合部分を含む、実施態様１から４１の何れか一に記載のイムノコンジュゲートを、治療を必要とする患者に投与することによる、がんに罹患している患者の治療方法。
【０１３１】
アミノ酸配列の記述
0006791865.tif 000004
【実施例】
【０１３２】
以下の実施例は、本発明の理解を助けるために提供され、その真の範囲は、添付の特許請求の範囲に記載されている。本発明の精神から逸脱することなく、記載された手順において改変を行うことができることが理解される。
【０１３３】
実施例１：
ＭＨＣクラスＩ（ＨＬＡ−Ａ２）への結合及びＣＭＶ特異的Ｔ細胞活性化に対するＣＭＶペプチドのＣ又はＮ末端修飾の影響
天然に存在するＴ細胞応答誘発ペプチドに含まれるＣ末端又はＮ末端アミノ酸修飾の影響を評価するために、アミノ酸配列ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ（配列番号１）の天然にプロセシングされたＣＭＶペプチドに、以下の修飾を施した：
0006791865.tif 000005
標準的なＦｍｏｃ化学を用いてペプチドを合成した。使用したアミノ酸は全てＬ−異性体であった。
【０１３４】
実施例１Ａ
健康ドナーの末梢血からのＣＭＶペプチド特異的Ｔ細胞の生成
【０１３５】
健康なドナーからの新鮮な単離されたＰＢＭＣ又はＴ細胞培養物におけるＣＭＶペプチド特異的ＣＤ８  Ｔ細胞の頻度を、ペンタマー染色を介してＦＡＣＳで調べた。
【０１３６】
簡潔には、３−５×１０Ｅ０５個のＴ細胞培養物又はＨＬＡ−Ａ２適合健常ドナー由来の新たに単離されたＰＢＭＣをＢＤ  ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、５μＬのヒトＴｒｕＳｔａｉｎ  ＦｃＸ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、４２２３０２）を含む１００μＬのＢＤ  ＦＡＣＳ緩衝液と室温で１５分間インキュベートした。その後、１０μＬのビオチン結合ＣＭＶ−ペンタマー（ＰｒｏＩｍｍｕｎｅ、Ｆ００８−４、１：１０）を含む９０μＬのＢＤ  ＦＡＣＳ緩衝液を添加し、４℃で１時間インキュベートした。
【０１３７】
ＢＤ  ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、細胞を、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ８ａ  ｍＡｂ（クローンＬＴ８、ＰｒｏＩｍｍｕｎｅ）並びにストレプトアビジン−ＡＰＣコンジュゲートとともに１００μｌのＢＤ  ＦＡＣＳ緩衝液中で４℃で２０分間染色した。ＢＤ  ＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄し、遠心分離後、細胞を１μｇ／ｍｌのＤＡＰＩを含有する２００μｌのＢＤ  ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、染色された細胞のＭＦＩシグナルをＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩフローサイトメーターで分析した。ＨＬＡ−Ａ１ドナーからの細胞をテトラマーの非特異的結合の評価に使用した。
【０１３８】
新たに単離されたＰＢＭＣを、ＣＭＶ由来ペプチドＮＬＶＰＭＶＡＴＶ（配列番号１）による単離の日の刺激のために以下のように使用した：
１μＭのペプチドを含有する２００μＬのＲＰＭＩ＋培地中の９６ウェルあたり２×１０Ｅ５個の細胞を、９６ウェルプレート中で３日間インキュベートした。３日目に、プレートを３００ｇで２分間遠心分離した。１６０μｌの上清をウェルから除去し、１μＭのペプチド及び１００Ｕ／ｍＬのＩＬ−２を含有する新鮮なＲＰＭＩ＋培地で置換した。８日目及び１０日目に、３日目に記載したように培地を再び置換した。培養した細胞は、ペプチドで刺激することなく１４日目にスプリットされた。１６日目に、細胞培養物を自己ＰＢＭＣ（１１グレイで照射）で再刺激し、以下のようにＣＭＶペプチドを瞬間適用した（ｐｕｌｓｅｄ）：６ウェルプレートにおいて１μＭのペプチドを含有する２０００μＬのＲＰＭＩ＋培地中のウェルあたり１２ｘ１０Ｅ６個のＴ細胞とウェルあたり８，７ｘ１０Ｅ６個の照射ＰＢＭＣ。培養物は１９、２１及び２５日目にスプリットされ、３０日目に上記のように刺激された。培養物は３５、３７、４１日目にスプリットされ、プロトコールに従って４４日目に再刺激された。培養物をＣＭＶペプチド特異的細胞の頻度について試験し、示されたＣＭＶペプチドを負荷した細胞に対する特異性について、５１日目にＬＤＨ細胞傷害性アッセイにおいて、５４日目にＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて使用した。
【０１３９】
実施例１Ｂ
ＩＦＮγ−ＥＬＩＳＰＯＴによる遊離ＣＭＶペプチドによる腫瘍細胞の処置後のＣＭＶペプチド特異的Ｔ細胞活性化の評価
ＨＬＡ−Ａ２拘束性ＣＭＶペプチド特異的Ｔ細胞活性化を、関連するＭＨＣ  Ｉ分子の異なるレベルを表面上に発現する異なる腫瘍細胞株について、ＩＦＮγ−ＥＬＩＳＰＯＴによって評価した：
−  ＭＤＡ−ＭＢ  ２３１：ＨＬＡ−Ａ２高
−  ＨＣＴ−１１６：ＨＬＡ−Ａ２低
−  Ｔ２：無負荷のＭＨＣクラスＩ分子を細胞の表面上に発現しないＴＡＰ欠損細胞株
【０１４０】
簡潔に言えば、１０，０００個の腫瘍細胞を、実施例１Ａで得られた５００個のＣＭＶ特異的ＣＤ８  Ｔ細胞の存在下で、それぞれ異なる濃度の遊離修飾ＣＭＶペプチド（ｃＣＭＶ、ＣＭＶｃ、ｒｃＣＭＶ、ＣＭＶｒｃ、ＣＭＶｐｅｎ）又は天然に存在する未修飾ＣＭＶペプチド（１３，２４５μＭ又は１，３２４５μＭの濃度）により処置した。対照として、腫瘍細胞及びＴ細胞を遊離ペプチドの非存在下でインキュベートし、更なる対照としてＴ細胞を同じ条件下で単独でインキュベートした。
【０１４１】
実験は、血清含有ＲＰＭＩ＋培地又は無血清ＡＩＭ−Ｖ培地のどちらかを用いて行った。
【０１４２】
ＩＦＮγ−ＥＬＩＳＰＯＴは以下のように実施された：
１日目に、プレートを滅菌ＰＢＳで洗浄した。続いて、ウェル当たり５０μＬのＲＰＭＩ＋培地を添加し、プレートを２０−３０分間インキュベートした。続いて、各ウェルに対してペプチドに５０μＬのＲＰＭＩ＋を添加した。各腫瘍細胞はＡｃｃｕｔａｓｅを用いて回収した。ウェルあたり１０．０００個の腫瘍細胞をそれぞれのウェルにおいて１００μＬのＲＰＭＩ＋中に添加した。２０分間インキュベートした後、プレートを暗所で約６時間インキュベートした。Ｔ細胞を４０μｍのマッシュを通して濾過し、ＲＰＭＩ＋（３００ｇで遠心分離、２分間）で１回洗浄した。５００個のペプチド特異的ＣＤ８  Ｔ細胞を含有する５０μＬのＲＰＭＩ＋培地を添加した。プレートを一晩インキュベートした。
【０１４３】
２日目に、プレートを空にし、ＰＢＳで洗浄した。抗ヒトＩＦＮ−γモノクローナル抗体（Ｍａｂｔｅｃｈ  ７−Ｂ６−ＡＬＰ）を、濾過したＰＢＳ／０．５％ＦＣＳ中で１：２００に希釈した。ウェルあたり１００μＬの希釈抗体を添加し、２時間インキュベートした。続いて、プレートをＰＢＳで洗浄した。基質溶液（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ−ｐｌｕｓ）を０．４５μｍフィルターを通じて濾過した。ウェルあたり１００μＬの基質溶液を添加し、明瞭なスポットが現れるまで現像した。水道水で洗浄して現像を停止した後、プレートを暗所で乾燥させた。
【０１４４】
プレートは、「ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ  ５．０  ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ  ＤＣ」ソフトウェアを用いてＥＬＩＳＰＯＴ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｔｄ．）で分析した。
【０１４５】
ＲＰＭＩ＋培地の組成は以下の通りであった：
５００ｍＬ  ＲＰＭＩ培地１６４０（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）
８％  ヒト血清（熱不活性化及び濾過）
１％  Ｌ−グルタミン
１％  ＮＥＡＡ
１％  ピルビン酸ナトリウム
０．２％  ＰｅｎＳｔｒｅｐ
０．１％  β−メルカプトエタノール
【０１４６】
結果を図１に示す。
【０１４７】
ＣＭＶペプチドのＮ末端修飾がＴ細胞活性化の喪失につながることが観察された。Ｃ末端修飾は、Ｔ細胞の活性化を減少させた。更に、ＣＭＶペプチドのアミノ酸配列内に天然に存在するアミノ酸の側鎖の修飾は、Ｔ細胞活性化の喪失につながる。従って、天然に存在するＴ細胞応答誘発ペプチド内の修飾は、ＭＨＣクラスＩ分子への負荷、従ってＴ細胞活性化に影響を与える（すなわち減少させる）可能性があると結論付けることができる。
【０１４８】
しかしながら、天然に存在するＴ細胞応答誘発ペプチドを使用する場合、最適なＭＨＣクラスＩの結合及び負荷が保証され得る。
【０１４９】
実施例２：
本発明によるイムノコンジュゲートの提案された作用機序
図２は、本発明によるイムノコンジュゲートの提案された作用機序を示す。例示的に、抗体は標的細胞結合部分として示されるが、他の部分も同様に適切である。
【０１５０】
定常状態では、標的細胞表面（例えば、腫瘍細胞の表面）は、標的細胞結合部分が特異的に結合する標的抗原で飾られる。更に、自己ペプチドを提示するＭＨＣクラスＩ分子が細胞表面上に発現される。
【０１５１】
この理論に拘束されることなく、標的抗原へのイムノコンジュゲートの結合（Ａ）は、標的抗原−イムノコンジュゲート複合体の内部移行（Ｂ）、及びその後の初期エンドソーム区画におけるイムノコンジュゲートからのＴ細胞応答誘発ペプチドペプチドの放出（Ｃ）をもたらす。重要なことに、放出されたペプチドは、対応する天然に存在するペプチドと同一のアミノ酸配列からなり、アミノ酸修飾を含まず、具体的にはＣ末端修飾又はＮ末端アミノ酸修飾を含まない。
【０１５２】
ＭＨＣクラスＩ分子上に存在する自己ペプチドは、エンドソーム区画内の非自己ペプチド（すなわち、イムノコンジュゲートから切断されたＴ細胞応答誘発ペプチド）によって受動的に交換される（Ｄ）。ペプチドが負荷されたＭＨＣクラスＩ分子は、エンドソーム輸送によって細胞表面に送達され（Ｅ）、ＭＨＣクラスＩの文脈において標的細胞表面上にＴ細胞応答誘発ペプチドペプチドの提示をもたらす。
【０１５３】
ペプチド特異的ＣＤ８  Ｔ細胞は、標的細胞上のペプチド負荷ＭＨＣクラスＩ分子を認識して結合し（Ｆ）、標的細胞に対するＴ細胞の細胞傷害性の特異的誘導をもたらす。
【０１５４】
実施例３：
モノクローナル抗ＣＤＣＰ１抗体と、ＭＨＣクラスＩを介して提示可能な少なくとも１つのＴ細胞応答誘発ペプチドとのコンジュゲーション
本発明によるイムノコンジュゲートを生成するために、ＣＵＢドメイン含有タンパク質１（ＣＤ１３１、ＣＤ３１８とも表され、ＥＰ１３９６５０１に開示されている）に特異的に結合するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を、以下の病原体由来のペプチドのうちのどちらかと結合させた：
−  エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）ペプチド４２６−４３４（配列番号２、ＣＬＧＧＬＬＴＭＶ）、又は
−  インフルエンザＡ  ＮＰ（ＦＬＵ）ペプチド４４−５２（配列番号３、ＣＴＥＬＫＬＳＤＹ）。
【０１５５】
ペプチドは、標準的なＦｍｏｃ化学を用いてペプチドを合成された。使用したアミノ酸は全てＬ−異性体であった。
【０１５６】
実施例３Ａ：
ペプチドが切断可能なＳ−Ｓ結合を介して抗体に結合される、モノクローナル抗ＣＤＣＰ１抗体とＥＢＶ及び／又はＦＬＵペプチドとを含むイムノコンジュゲートの製造
イムノコンジュゲートが標的細胞内への内部移行の際にペプチドを放出するためにジスルフィド結合を含む、本発明によるイムノコンジュゲートの例の製造のために、ペプチドを以下のように抗体にコンジュゲートさせた：
【０１５７】
αＣＤＣＰ１−ｍＡｂを、１０当量のＮ−スクシンイミジル ３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオナート（ＳＰＤＰ、Ｐｉｅｒｃｅ）の存在下で、ｐＨ７．２の０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液中で最初に誘導体化した。２時間の反応時間後、誘導体化された抗体を、ｐＨ７．０の１０ｍＭのＥＤＴＡを含む０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液中へのゲル濾過によって精製した。
【０１５８】
ＥＢＶ又はＦＬＵペプチドの何れかを含むイムノコンジュゲートを製造するために、１０当量のそれぞれのペプチドを誘導体化した抗体に添加し、一晩反応させた。本発明によるイムノコンジュゲートをゲル濾過により精製した。
【０１５９】
ＥＢＶ及びＦＬＵペプチドを含むイムノコンジュゲートを製造するために、誘導体化された抗体を各々５当量のＥＢＶ及びＦＬＵペプチドと一晩反応させた。本発明によるイムノコンジュゲートをゲル濾過により精製した。
【０１６０】
本発明により製造されたイムノコンジュゲートは、本明細書において以下のように言及される：
−  ジスルフィド結合によってＥＢＶペプチド４２６−４３４に結合した抗ＣＤＣＰ１  ＭＡｂを含む＜ＣＤＣＰ１−ＳＳ−ｐＥＢＶ＞イムノコンジュゲート
−  ジスルフィド結合によってＦＬＵペプチド４４−５２に結合した抗ＣＤＣＰ１  ＭＡｂを含む＜ＣＤＣＰ１−ＳＳ−ｐＦＬＵ＞イムノコンジュゲート
−  ＥＢＶペプチド４２６−４３４及びＦＬＵペプチド４４−５２にそれぞれのジスルフィド結合によって結合した抗ＣＤＣＰ１  ＭＡｂを含む＜ＣＤＣＰ１−ＳＳ−ｐＥＢＶ／ＦＬＵ＞イムノコンジュゲート
【０１６１】
実施例３Ｂ（比較）：
ペプチドが切断不能なチオエーテル結合を介して抗体に結合される、モノクローナル抗ＣＤＣＰ１抗体とＥＢＶ又はＦＬＵペプチドとを含むイムノコンジュゲートの製造
比較分析のために、ペプチドは、チオエーテル結合を介して非切断可能様式で抗体にコンジュゲートされた：
【０１６２】
αＣＤＣＰ１−ｍＡｂを、１０当量のＮ−イプシロン−マレミドカプロイル−オキシスクシンイミドエステル（ＥＭＣＳ、Ｐｉｅｒｃｅ）の存在下で、ｐＨ７．２の０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液中で最初に誘導体化した。２時間の反応時間後、誘導体化された抗体を、ｐＨ７．０の１０ｍＭのＥＤＴＡを含む０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液中へのゲル濾過によって精製した。
【０１６３】
その後、１０当量のそれぞれのペプチドを誘導体化した抗体に添加し、一晩反応させた。イムノコンジュゲートをゲル濾過により精製した。
【０１６４】
比較のために使用される製造されたイムノコンジュゲートは、本明細書において以下のように言及される：
−  チオエーテル結合によってＥＢＶペプチド４２５−４３３に結合した抗ＣＤＣＰ１  ＭＡｂを含む＜ＣＤＣＰ１−Ｓ−ｐＥＢＶ＞イムノコンジュゲート
−  チオエーテル結合によってＦＬＵペプチド４４−５２に結合した抗ＣＤＣＰ１  ＭＡｂを含む＜ＣＤＣＰ１−Ｓ−ｐＦＬＵ＞イムノコンジュゲート
【０１６５】
実施例３Ｃ：
ＥＢＶ及び／又はＦＬＵペプチドに結合したモノクローナル抗ＣＤＣＰ１抗体を含む免疫複合体のＭＳ分析及び安定性評価
実施例３Ａ及び３Ｂで形成されたイムノコンジュゲートの標識率（labeling rate）をＬＣ−ＥＳＩ質量分析法によって分析した。
【０１６６】
試料調製：ＩｇＧ又は標識されたＩｇＧを測定前にＮ−グリコシダーゼＦで脱グリコシル化した。ＩｇＧ又は標識されたＩｇＧは、代わりに、軽鎖及び重鎖を別々に測定するために、脱グリコシル化後にＴＣＥＰで還元された。
【０１６７】
分析は、逆相カラムを備えたＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ（Ｗａｔｅｒｓ）ＨＰＬＣシステムを用いて、水：アセトニトリル勾配並びにＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳ測定及び検出により行った。ＭＳデータ分析は、ＭａｓｓＬｙｎｘ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｗａｔｅｒｓ）を用いて行った。
【０１６８】
この分析は、平均０．８個のペプチドが各抗体分子に結合されることを示した（データ非表示）。
【０１６９】
イムノコンジュゲートの安定性を確認するために、ストック溶液内及び細胞培養培地内の安定性を評価した。イムノコンジュゲートのストック溶液をスピンカラム（ＭＷカットオフ５０ｋＤａ）により濾過し、ＬＣ−ＭＳで分析した。遊離ペプチドは検出されなかった。イムノコンジュゲートをスパイクした細胞培養培地をＬＣ−ＭＳにより分析した。遊離ペプチドは検出されなかった。陽性対照として、細胞培養培地に遊離ペプチドをスパイクした。
【０１７０】
実施例３Ｄ：
ＥＢＶ及び／又はＦＬＵペプチドに結合したモノクローナル抗ＣＤＣＰ１抗体を含むイムノコンジュゲートの、ＣＤＣＰ１発現ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞への細胞結合研究
イムノコンジュゲートのそのそれぞれの抗原への結合を評価するために、実施例３Ａ及び３ＢのイムノコンジュゲートのＣＤＣＰ１発現ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞への結合を、ＦＡＣＳに基づく結合アッセイで評価した。
【０１７１】
簡潔には、ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞を、アクターゼ（Ａｃｃｕｔａｓｅ）による処理を介して剥離し、遠心分離によって分離培地から分離し、４×１０Ｅ０６個の細胞／ｍｌの濃度でＭＤＡ−ＭＢ２３１培地に懸濁した。５０μｌの細胞アリコートをイムノコンジュゲート又は非結合抗ＣＤＣＰ１抗体（親抗ＣＤＣＰ１抗体）の連続希釈液（ＢＤ  ＦＡＣＳ緩衝液中２０μｇ／ｍｌ〜０．０２μｇ／ｍｌのイムノコンジュゲート）とともに４℃で３０分間インキュベートした。ＢＤ  ＦＡＣＳで洗浄後、４℃で３０分間、ＦＩＴＣ標識抗ヒトＩｇＧ  Ｈ＋Ｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ａ１１０１３；ＢＤ  ＦＡＣＳ緩衝液中１０μｇ／ｍｌ）で細胞を染色した。洗浄及び遠心分離後、染色された細胞のＭＦＩシグナルをＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＦＡＣＳＣａｎｔｏフローサイトメーターによって分析した（図３）。
【０１７２】
図３に示すＦＡＣＳに基づく細胞結合研究の結果は、全てのイムノコンジュゲートが、ＣＤＣＰ１発現ＭＤＡ−ＭＢ  ２３１腫瘍細胞に同等の様式で結合することを実証している。
【０１７３】
実施例３Ｅ：
表面プラズモン共鳴による、ＥＢＶ及び／又はＦＬＵペプチドに結合したモノクローナル抗ＣＤＣＰ１抗体を含むイムノコンジュゲートの、ＣＤＶ１の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）への結合研究
実施例３Ａ及び３ＢのイムノコンジュゲートのヒトＣＤＣＰ１−ＥＣＤへの生化学的結合を、ＢＩＡＣＯＲＥ  Ｔ１００装置（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いた表面プラズモン共鳴によって調べた。
【０１７４】
捕捉系の約２０００共鳴単位（ＲＵ）（１０μｇ／ｍｌのヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ断片特異的；Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を、ｐＨ５．０でＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅが提供するアミンカップリングキットを使用してＣＭ４チップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＢＲ−１００５−３４）上に結合させた。固定化のためのランニング緩衝液は、ＨＢＳ−Ｎ  ｐＨ７．４（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＢＲ−１００６−７０）であった。追跡される動態アッセイ用には、ランニング及び希釈緩衝液は、ＨＢＳ−Ｐ  ｐＨ７．４（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％界面活性剤Ｐ２０、ｐＨ７．４、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＢＲ−１００６−７１）であった。
【０１７５】
フローセルを２５℃に設定し、サンプルブロックを１２℃に設定し、ランニング緩衝液で２回刺激した。イムノコンジュゲート及び比較のために、親抗ＣＤＣＰ１  ｍＡｂ抗体（（ＲＯ５４６４１６９−０００−０００４）を、１０μｌ／分の流速で１μｇ／ｍｌの溶液を６０秒間注入することによって捕捉した。
【０１７６】
会合は、３０μｌ／分の流速で１８０秒間、１，３５０ｎＭで開始し、続いて１：１．５希釈を１回、更に１：３希釈した、溶液中の様々な濃度のヒトＣＤＣＰ１−ＥＣＤの注入によって測定した。解離相を最高３００秒間モニターし、試料溶液からランニング緩衝液に切り替えることによってトリガーした。表面を、１０μｌ／分の流速で６０秒間、グリシンｐＨ１．７溶液の２回の連続注入で洗浄することによって再生した。バルク屈折率の差は、ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ表面から得られた応答を差し引くことによって補正した。ブランク注入もまた減算される（＝二重参照）。ＫＤ及び他の動態パラメーターの計算のために、Ｌａｎｇｍｕｉｒの１：１モデルを使用した。
【０１７７】
結果を表１に示す。
0006791865.tif 000006
【０１７８】
表１に示すＢｉａｃｏｒｅ研究の結果は、全てのイムノコンジュゲートが、親抗ＣＤＣＰ１参照抗体と比較して同等の様式でＣＤＣＰ１−ＥＣＤに結合することを実証している。
【０１７９】
実施例３Ｆ：
ＥＢＶ及び／又はＦＬＵペプチドに結合したモノクローナル抗ＣＤＣＰ１抗体を含むイムノコンジュゲートの、ＣＤＣＰ１発現ヒト腫瘍細胞（ＭＤＡ−ＭＢ２３１）への内部移行研究
親抗ＣＤＣＰ１  ｍＡｂと比較して、生成したイムノコンジュゲートの内部移行能力を評価するために、ＣＤＣＰ１発現ヒト腫瘍細胞株ＭＤＡ−ＭＢ  ２３１を用いたＦＡＣＳに基づく内部移行アッセイを行った。
【０１８０】
簡潔には、ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞を、アクターゼ（Ａｃｃｕｔａｓｅ）による処理を介して剥離し、遠心分離によって分離培地から分離し、３×１０Ｅ０６個の細胞／ｍｌの濃度でＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞培地（ＲＰＭＩ／２ｍＭグルタミン／１０％ＦＣＳ）に懸濁した。５０μｌの細胞アリコートをイムノコンジュゲート又は親抗体（ＭＤＡ−ＭＢ  ２３１細胞培養培地中５μｇ／ｍｌ）とともに４℃で３０分間インキュベートした。冷ＭＤＡ−ＭＢ  ２３１細胞培養培地（ＲＰＭＩ／２ｍＭグルタミン／１０％ＦＣＳ）で２回洗浄した後、細胞を４℃又は３７℃で３０，６０，１２０，２４０分及び一晩［２３時間］、１００μｌの培地中でインキュベートした。
【０１８１】
上記の時点後、細胞を洗浄し、遠心分離し、Ａｌｅｘａ４８８標識抗ヒトＩｇＧ  Ｈ＋Ｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ａ１１０１３；ＢＤ  ＦＡＣＳ緩衝液中１０μｇ／ｍｌ）で４℃で３０分間染色した。２回の洗浄及び遠心分離後、細胞を１００μｌのＢＤ  Ｃｅｌｌ−Ｆｉｘ緩衝液中に保持し、染色された細胞のＭＦＩシグナルをＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＦＡＣＳＣａｎｔｏフローサイトメーターによって分析した。
【０１８２】
４℃でのインキュベーションで内部移行は検出されなかった。３７℃での内部移行研究の結果を表２に示す。
0006791865.tif 000007
【０１８３】
ＦＡＣＳに基づく内部移行研究の結果は、全ての試験したイムノコンジュゲートが、親抗ＣＤＣＰ１参照抗体（ＲＯ５４６４１６９−０００−０００４）に匹敵して、ＣＤＣＰ１発現ＭＤＡ−ＭＢ  ２３１腫瘍細胞内に内部移行することを示している。
【０１８４】
実施例４：
モノクローナル抗ＣＤ１９抗体と、ＭＨＣクラスＩを介して提示可能な少なくとも１つのＴ細胞応答誘発ペプチドとのコンジュゲーション
【０１８５】
実施例４Ａ：
ペプチドが切断可能なＳ−Ｓ結合を介して抗体に結合される、モノクローナル抗ＣＤ１９抗体とＥＢＶ及び／又はＦＬＵペプチドとを含むイムノコンジュゲートの製造
ＣＤ１９に特異的に結合するｍＡｂ（ハイブリドーマ上清から精製した社内調製物）を、実施例３Ａで使用したペプチドの何れか１つに結合させた。
【０１８６】
イムノコンジュゲートが標的細胞内への内部移行の際にペプチドを放出するためにジスルフィド結合を含む、本発明によるイムノコンジュゲートの例の製造のために、ペプチドを実施例３Ａに記載されるようにジスルフィド結合を介して抗体にコンジュゲートさせた：
【０１８７】
本発明により製造されたイムノコンジュゲートは、本明細書において以下のように言及される：
−  ジスルフィド結合によってＥＢＶペプチド４２６−４３４に結合した抗ＣＤ１９  ＭＡｂを含む＜ＣＤ１９−ＳＳ−ｐＥＢＶ＞イムノコンジュゲート
−  ジスルフィド結合によってＦＬＵペプチド４４−５２に結合した抗ＣＤ１９  ＭＡｂを含む＜ＣＤ１９−ＳＳ−ｐＦＬＵ＞イムノコンジュゲート
−  ＥＢＶペプチド４２６−４３４及びＦＬＵペプチド４４−５２にジスルフィド結合によって結合した抗ＣＤ１９  ＭＡｂを含む＜ＣＤ１９−ＳＳ−ｐＥＢＶ／ＦＬＵ＞イムノコンジュゲート
【０１８８】
実施例４Ｂ：
ＥＢＶ及び／又はＦＬＵペプチドに結合したモノクローナル抗ＣＤ１９抗体を含むイムノコンジュゲートの、ＣＤ１９発現ＲＬ非ホジキンリンパ腫細胞への細胞結合研究
イムノコンジュゲートのそのそれぞれの抗原への結合を評価するために、実施例４ＡイムノコンジュゲートのＣＤ１９発現ＲＬ細胞への結合を、ＦＡＣＳに基づく結合アッセイで評価した。
【０１８９】
簡潔には、ＲＬ細胞を、ＲＰＭＩ／２ｍＭグルタミン／１０％ＦＣＳ（低ＩｇＧ）培地中でインビトロで培養した。ＲＬ細胞懸濁液（４×１０Ｅ０６個の細胞／ｍｌ）の５０μｌアリコートをイムノコンジュゲート（ＢＤ  ＦＡＣＳ緩衝液中２μｇ／ｍｌ）とともに４℃で３０分間インキュベートした。ＢＤ  ＦＡＣＳで洗浄後、細胞を４℃で３０分間、Ａｌｅｘａ４８８標識抗マウスＩｇＧ  Ｈ＋Ｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ６５Ｅ１−１；  ＢＤ  ＦＡＣＳ緩衝液中１０μｇ／ｍｌ）で染色した。洗浄及び遠心分離後、染色された細胞のＭＦＩシグナルをＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＦＡＣＳＣａｎｔｏフローサイトメーターによって分析した。結果を図４に示す。
【０１９０】
図４に示すＦＡＣＳに基づく細胞結合研究の結果は、全てのイムノコンジュゲートが、ＣＤ１９発現ＲＬ細胞に同等の様式で結合することを実証している。
【０１９１】
実施例４Ｃ：
ＣＤ１９発現ヒト非ホジキンリンパ腫細胞（ＲＬ細胞）及びヒトバーキットリンパ腫細胞株（Ｒａｍｏｓ細胞）への、ＥＢＶ及び／又はＦＬＵペプチドに結合したモノクローナル抗ＣＤ１９抗体を含むイムノコンジュゲートの内部移行研究
親抗ＣＤ１９  ｍＡｂと比較して、生成したイムノコンジュゲートの内部移行能力を評価するために、ＣＤ１９発現細胞株ＲＬ及びＲａｍｏｓを用いたＦＡＣＳに基づく内部移行アッセイを行った。
【０１９２】
簡潔には、ＲＬ及びＲａｍｏｓ細胞を、ＲＰＭＩ／２ｍＭグルタミン／１０％ＦＣＳ（低ＩｇＧ）培地中でインビトロで培養した。ＲＬ及びＲａｍｏｓ細胞懸濁液（４×１０Ｅ０６個の細胞／ｍｌ）の５０μｌアリコートをイムノコンジュゲート又は親抗ＣＤ１９  ｍＡｂ（ＲＬ細胞培養培地中５μｇ／ｍｌ）とともに４℃で３０分間インキュベートした。冷ＲＬ細胞培地で２回洗浄した後、細胞を１００μｌの培地中、４℃又は３７℃で３０，６０，１２０，２４０及び３６０分間、及び一晩［２３時間］インキュベートした。
【０１９３】
上記の時点後、細胞を洗浄し、遠心分離し、Ａｌｅｘａ４８８標識抗ヒトＩｇＧ  Ｈ＋Ｌ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  ７１５−１１６−１５０  Ｌｏｔ  ９０８１２；ＢＤ  ＦＡＣＳ緩衝液中２．５μｇ／ｍｌ）で４℃で３０分間染色した。２回の洗浄及び遠心分離後、細胞を１００μｌのＢＤ  Ｃｅｌｌ−Ｆｉｘ緩衝液中に保持し、染色された細胞のＭＦＩシグナルをＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＦＡＣＳＣａｎｔｏフローサイトメーターによって分析した。
【０１９４】
４℃でのインキュベーションで内部移行は検出されなかった。３７℃での内部移行研究の結果を表３に示す。
0006791865.tif 000008
【０１９５】
ＦＡＣＳに基づく内部移行研究の結果は、全ての試験したイムノコンジュゲートが、親抗ＣＤ１９参照抗体に匹敵して、ＣＤ１９発現ＲＬ細胞内に内部移行することを示している。
【０１９６】
実施例５：
モノクローナル抗ＣＤＣＰ１抗体及びＥＢＶペプチドを含むイムノコンジュゲート並びにモノクローナル抗ＣＤ１９抗体及びＥＢＶペプチドを含むイムノコンジュゲートによる腫瘍細胞の処置後のＣＤ８  Ｔ細胞の活性化
【０１９７】
実施例５Ａ：
健康ドナーの末梢血からのＥＢＶペプチド特異的Ｔ細胞の生成
健康なドナーからの新鮮な単離されたＰＢＭＣ又はＴ細胞培養物におけるＥＢＶペプチド特異的ＣＤ８  Ｔ細胞の頻度を、ペンタマー染色を介してＦＡＣＳで調べた。
【０１９８】
簡潔には、４−５×１０Ｅ０５個のＴ細胞培養物又はＨＬＡ−Ａ２適合健常ドナー由来の新たに単離されたＰＢＭＣをＢＤ  ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、５μＬのヒトＴｒｕＳｔａｉｎ  ＦｃＸ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、４２２３０２）を含む１００μＬのＢＤ  ＦＡＣＳ緩衝液と室温で１５分間インキュベートした。その後、１０μＬのビオチン結合ＥＢＶ−ペンタマー（ＰｒｏＩｍｍｕｎｅ、Ｆ０４２−８４Ａ−Ｅ）を含む９０μＬのＢＤ  ＦＡＣＳ緩衝液を添加し、４℃で１時間インキュベートした。
【０１９９】
ＢＤ  ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、細胞を、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ８ａ  ｍＡｂ（クローンＬＴ８、ＰｒｏＩｍｍｕｎｅ）並びにストレプトアビジン−ＡＰＣコンジュゲートとともに１００μｌのＢＤ  ＦＡＣＳ緩衝液中で４℃で２０分間染色した。ＢＤ  ＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄し、遠心分離細胞を２００μｌのＢＤ  ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、染色された細胞のＭＦＩシグナルをＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩフローサイトメーターで分析した。ＨＬＡ−Ａ１ドナーからの細胞をテトラマーの非特異的結合の評価に使用した。
【０２００】
この実験では、配列番号２のＥＢＶペプチドを刺激に使用したことを除いて、ＣＭＶ由来ペプチドについて実施例１に記載のプロトコールに従ってＥＢＶペプチド特異的Ｔ細胞を生成した。
【０２０１】
実施例５Ｂ：
ＩＦＮγ−ＥＬＩＳＰＯＴによるモノクローナル抗ＣＤＣＰ１抗体及びＥＢＶペプチドを含むイムノコンジュゲート並びにモノクローナル抗ＣＤ１９抗体及びＥＢＶペプチドを含むイムノコンジュゲートによるＨＣＴ−１１６腫瘍細胞の処置後のＥＢＶペプチド特異的Ｔ細胞活性化の評価
ＥＢＶペプチド特異的Ｔ細胞活性化は、実施例５Ａで得られたＣＤ８  Ｔ細胞の存在下で、実施例３Ａ、３Ｂからのイムノコンジュゲート（ＩＣ）（抗ＣＤＣＰ１及びＥＢＶペプチドを含むＩＣ）及び４Ａからのイムノコンジュゲート（抗ＣＤ１９及びＥＢＶペプチドを含むＩＣ）で処置したＨＣＴ−１１６腫瘍細胞を用いて、ＩＦＮγ−ＥＬＩＳＰＯＴによって評価した。比較分析のために、実験は、遊離ペプチド（ｐＥＢＶ、陽性対照）及び実施例３Ａに記載のようにＥＢＶペプチドに結合した抗Ｄｉｇ抗体で構築される対照イムノコンジュゲート（＜ＤＩＧ−ＳＳ−ｐＥＢＶ＞、陰性対照）を用いて同時に実施された。
【０２０２】
ＩＦＮγ−ＥＬＩＳＰＯＴは、実施例１Ｂに記載の一般的プロトコールに従って行った。
【０２０３】
結果を図５に示す。
【０２０４】
ＩＦＮγ−ＥＬＩＳＰＯＴからの結果は、試験したイムノコンジュゲートから、切断可能な結合を介して結合したモノクローナル抗ＣＤＣＰ１抗体及びＥＢＶペプチドを含むもの（＜ＣＤＣＰ１−ＳＳ−ＥＢＶ＞）のみが、腫瘍細胞における内部移行の際にＣＤ８Ｔ細胞を十分に活性化するが、一方モノクローナル抗ＣＤＣＰ１抗体と非切断可能な結合を介して結合したＥＢＶペプチドとを含むイムノコンジュゲート（＜ＣＤＣＰ１−Ｓ−ＥＢＶ＞）は、ペプチド特異的ＣＤ８  Ｔ細胞を活性化することができなかったことを実証する。標的細胞に結合しない抗体を含むイムノコンジュゲート（＜ＤＩＧ−ＳＳ−ＥＢＶ＞及び＜ＣＤ１９−ＳＳ−ＥＢＶ＞）は、Ｔ細胞を活性化しない。更に、本発明によるイムノコンジュゲートは、ＣＤ８  Ｔ細胞を１ｎｍｏｌ／ｌ未満の少量でも活性化することができる。
【０２０５】
実施例５Ｃ：
ＩＦＮγ−ＥＬＩＳＰＯＴによるモノクローナル抗ＣＤ１９抗体及びＥＢＶペプチドを含むイムノコンジュゲートによるＲＬ及びＲａｍｏｓ細胞の処置後のＥＢＶペプチド特異的Ｔ細胞活性化の評価
腫瘍細胞死滅が、それぞれのＴ細胞応答誘発ペプチドを提示することができるＨＬＡサブタイプを発現する標的細胞に限定されることを実証するために、ＥＢＶペプチド特異的Ｔ細胞活性化は、実施例５Ａで得られたＣＤ８  Ｔ細胞の存在下で、実施例４Ａからのイムノコンジュゲート（ＩＣ）（抗ＣＤ１９及びＨＬＡ−Ａ２拘束性ＥＢＶペプチドを含むＩＣ）で処置された、ＨＬＡ−Ａ２を発現するＲＬ細胞及びＨＬＡ−Ａ２を発現しないＲａｍｏｓ細胞を用いてＩＦＮγ−ＥＬＩＳＰＯＴによって評価した。比較分析のために、実験が、遊離ペプチド（ｐＥＢＶ、陽性対照）を用いて同時に実施された。
【０２０６】
ＩＦＮγ−ＥＬＩＳＰＯＴは、実施例１Ｂに記載の一般的プロトコールに従って行った。
【０２０７】
結果は図５Ｂに示されており、腫瘍細胞の死滅はＲａｍｏｓ細胞ではなくＲＬ細胞でのみ観察されたことを示している。
【０２０８】
実施例６：
ＥＢＶペプチドが非末端システイン残基を天然に含む、切断可能なジスルフィド結合を介してＥＢＶペプチドに結合したモノクローナル抗ＣＤＣＰ１抗体を含むイムノコンジュゲートの提供及びＩＦＮγ−ＥＬＩＳＰＯＴによるＣＤ８  Ｔ細胞活性化の評価
実施例３及び４では、Ｔ細胞応答誘導ペプチドがそれぞれの抗体に末端で連結されてイムノコンジュゲートを形成するイムノコンジュゲートが提供されたが、この実施例では、切断可能なジスルフィド結合が、ペプチドの非末端システイン残基と抗体との間に形成された。このために、アミノ酸配列ＧＬＣＴＬＶＡＭＬ（配列番号４）のＥＢＶペプチドが提供され、実施例３Ａに記載のように抗ＣＤＣＰ１抗体に結合させた。
【０２０９】
ペプチド特異的Ｔ細胞活性化を、ＭＨＣ  Ｉ分子の異なるレベルを発現する異なる腫瘍細胞株について、ＩＦＮγ−ＥＬＩＳＰＯＴによって評価した：
−  ＭＤＡ−ＭＢ  ２３１、ＨＬＡ−Ａ２高、及び
−  Ａ３７５、ＨＬＡ−Ａ２低。
【０２１０】
簡潔には、実施例５Ｂに記載のように、しかし代わりにＥＢＶペプチドＧＬＣＴＬＶＡＭＬを用いて得られた５００個のペプチド特異的ＣＤ８  Ｔ細胞の存在下で、１０，０００個の腫瘍細胞を異なる濃度のイムノコンジュゲートでそれぞれ処置した。対照として、腫瘍細胞及びＴ細胞をイムノコンジュゲートの非存在下でインキュベートし、更なる対照としてＴ細胞を同じ条件下で単独でインキュベートした。
【０２１１】
本発明により製造されたイムノコンジュゲートは、本明細書において以下のように言及される：
−  ジスルフィド結合によってＥＢＶペプチドＧＬＣＴＬＶＡＭＬに結合した抗ＣＤＣＰ１  ＭＡｂを含む＜ＣＤＣＰ１−ＳＳ−ｐＥＢＶ（ＧＬＣ）＞イムノコンジュゲート
【０２１２】
ＩＦＮγ−ＥＬＩＳＰＯＴの結果を図５Ｃに示す。ペプチド特異的Ｔ細胞活性化は、用量依存的様式で、本発明によるイムノコンジュゲートについて試験した両方の腫瘍細胞株について観察された。
【０２１３】
実施例７：
ＬＤＨ放出アッセイ及びｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅによって評価されたモノクローナル抗ＣＤＣＰ１抗体及びＥＢＶペプチドを含む本発明によるイムノコンジュゲートで処置したＭＤＡ−ＭＢ２３１腫瘍細胞におけるＣＤ８  Ｔ細胞誘発細胞死の媒介
ＥＢＶペプチド特異的Ｔ細胞活性化及び腫瘍細胞死滅を、実施例５Ａで得られたＣＤ８  Ｔ細胞の存在下で、エフェクター細胞対標的細胞比３：１で、実施例３Ａ、３Ｂからの異なる濃度のイムノコンジュゲート（ＩＣ）（抗ＣＤＣＰ１及びＥＢＶペプチドを含むＩＣ）で処置したＭＤＡ−ＭＢ２３１腫瘍細胞を用いたＬＤＨ放出アッセイ及びｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅアッセイによって評価した。比較分析のために、実験が、遊離ペプチド（ｐＥＢＶ、陽性対照）を用いて同時に実施された。
【０２１４】
イムノコンジュゲートによる処置の結果としてのウイルスペプチドを負荷した腫瘍細胞の死滅の評価は、以下の一般的方法を用いて、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ  Ｓｙｓｔｅｍにおける細胞増殖及び生存率の動的モニタリングを介して行った：ウェルあたり５０μＬの腫瘍細胞培地を添加し、ＲＴＣＡ装置（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）において最初のバックグラウンド測定（ステップ１）を行った。５０μｌの腫瘍細胞培地に懸濁した物質をＥプレートに添加した。Ａｃｃｕｔａｓｅを用いて腫瘍細胞を回収し、それぞれの細胞数を５０μＬの腫瘍細胞培地に懸濁し、Ｅプレートに培地を添加した。
【０２１５】
異なる腫瘍細胞株について以下の細胞数を用いた：Ａ−３７５：１０．０００細胞；ＨＣＴ−１１６：２０．０００細胞；ＰＣ−３：１０．０００細胞；ＭＤＡ−ＭＢ２３１：１０．０００細胞。
【０２１６】
室温で１０分後、プレートをＲＴＣＡ装置に入れ、ステップ２を行った（間隔１０分、２００間隔）。続いて、プレートを約２４時間インキュベートした。
【０２１７】
翌日、Ｔ細胞をＡＩＭ−Ｖ培地で洗浄し、ＡＩＭ−Ｖ培地に懸濁させた。Ｔ細胞をプレートに添加して総量２００μｌとした。プレートをＲＴＣＡ装置に入れ、ステップ３（間隔５分、３００間隔）を行った。プレートを一晩インキュベートした。
【０２１８】
試料はその後のＬＤＨ放出分析のために使用した。
【０２１９】
ＬＤＨ放出評価のために、細胞を１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の添加を用いて溶解させた。上清をＶ底９６ウェルプレートに移し、遠心分離及び平底９６ウェルプレートに細胞破片を含まない上清をもう一度移すことによって細胞破片を除去した。ＬＤＨ細胞傷害性アッセイ（Ｒｏｃｈｅ、＃１１６４４７９３００１）を用いて、製造業者の指示に従ってＬＤＨ放出を分析した。簡潔には、触媒及び色素溶液を混合し、得られた反応混合物１００μｌを各ウェルに添加し、暗所で室温でインキュベートした。４９２ｎｍ（参照：６２０ｎｍ）での吸光度を、Ｔｅｃａｎ  ＥＬＩＳＡリーダーを用いてｔ＝１５−４５分（通常３０分）で測定した。
【０２２０】
結果を図６Ａに示し、本発明によるイムノコンジュゲートを用いて、強力な腫瘍細胞死滅をピコモル濃度で観察することができることを示す。
【０２２１】
実施例８：
ＬＤＨ放出アッセイ及びｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅによって評価されたモノクローナル抗ＣＤＣＰ１抗体と非末端システイン残基を天然に含むＥＢＶペプチドとを含む本発明によるイムノコンジュゲートで処置したＭＤＡ−ＭＢ２３１及びＡ−３７５腫瘍細胞におけるＣＤ８  Ｔ細胞誘発細胞死の媒介
ＥＢＶペプチド特異的Ｔ細胞活性化及び腫瘍細胞死滅を、実施例５Ａに従って得られたペプチド特異的ＣＤ８  Ｔ細胞の存在下で、しかし、刺激の代わりにＥＢＶペプチドＧＬＣＴＬＶＡＭＬを使用して、エフェクター細胞対標的細胞比３：１で、ＬＤＨ放出アッセイによって、並びにｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅアッセイ及び異なる濃度の実施例６のイムノコンジュゲート（ＩＣ）（抗ＣＤＣＰ１と非末端システイン残基を天然に含むＥＢＶペプチドとを含むＩＣ）で処置したＭＤＡ−ＭＢ２３１及びＡ−３７５腫瘍細胞を用いたＬＤＨ放出評価によって評価した。比較分析のために、実験が、２つの異なるペプチド濃度の遊離ペプチド（ｐＥＢＶ、陽性対照）を用いて同時に実施された。
【０２２２】
実施例７に記載したように、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅアッセイ及びＬＤＨ放出評価を行った。
【０２２３】
結果を図６Ｂ（Ａ−３７５細胞について）及び６Ｃ（ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞について）に示し、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅアッセイのデータは１３，５時間後に測定されたものである。
【０２２４】
この結果は、本発明によるイムノコンジュゲートのみが、ペプチド特異的Ｔ細胞を介して試験した腫瘍細胞の特異的死滅を媒介することができることを示している。対照的に、等モル濃度の遊離ＥＢＶペプチドを用いると特異的な腫瘍細胞死滅は観察されなかった。
【０２２５】
実施例９：
ＬＤＨ放出アッセイ及びｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅによって評価されたモノクローナル抗ＣＤＣＰ１抗体及びＦＬＵペプチドを含む本発明によるイムノコンジュゲートで処置した腫瘍細胞におけるＣＤ８  Ｔ細胞誘発細胞死の媒介
ＦＬＵ特異的ＣＤ８  Ｔ細胞の存在下における異なる腫瘍細胞株（Ａ−３７５、ＰＣ−３、ＨＣＴ−１１６）の処置のためのＨＬＡ−Ａ１拘束性ＦＬＵペプチド含有イムノコンジュゲート（実施例３Ａで得られたＣＤＣＰ１−ＳＳ−ｐＦＬＵ）を使用して、本発明によるイムノコンジュゲートの腫瘍細胞死滅を評価した。ペプチド特異的Ｔ細胞活性化及び腫瘍細胞死滅を、実施例７に記載のＬＤＨ放出アッセイによって及びｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅアッセイによって評価した。
【０２２６】
試験した細胞株は、ＨＬＡサブタイプ及び発現並びに標的（ＣＤＣＰ−１）の発現に関して以下の特性を提供する：
0006791865.tif 000009
【０２２７】
ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ分析の結果を図７Ａ−Ｃに示す。ＬＤＨ放出アッセイの結果を図７Ｄ−Ｆに示す。
【０２２８】
試験された全ての腫瘍細胞株について、イムノコンジュゲートによる腫瘍細胞の処置の際の効果的な腫瘍細胞死滅が観察された。遊離ペプチドを使用するのと比較した場合、イムノコンジュゲートは、１００倍高い濃度での遊離ペプチドよりも効率的にＴ細胞活性化を媒介する。
【０２２９】
イムノコンジュゲートによって媒介された腫瘍細胞死滅は、イムノコンジュゲートによる処置の６時間後に観察され、ペプチドがＭＨＣクラスＩによる提示のために細胞質ゾル中の抗原プロセシング機構への輸送を必要としないことを示している。更に、時間の経過とともに腫瘍細胞死滅の増加が観察されたが、対照的に、遊離ペプチドによって媒介される腫瘍細胞死滅は、通常、より長いインキュベーション時間で減少した。異なる腫瘍細胞株でも同様の効果が観察され、この効果は標的細胞におけるＭＨＣクラスＩ発現のレベルとは無関係であることが示された。ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ分析の結果は、ＬＤＨ放出アッセイの結果によって確認された。
【０２３０】
実施例１０：インビボでの概念Ｉの証明
ｈｕＰＢＭＣ（ＥＢＶ特異的ＣＤ８  Ｔ細胞を含む）の静脈内移入を受けたＭＤＡ−ＭＢ２３１皮下注射モデルにおけるモノクローナル抗ＣＤＣＰ１抗体及びＥＢＶペプチドを含む本発明によるイムノコンジュゲートの抗腫瘍活性
０日目にＮＯＧマウスにヒト腫瘍細胞（５×１０６  Ｍｉｏ  ＭＤＡ−ＭＢ  ２３１）を皮下注射により異種移植した。ヒトＰＢＭＣ刺激（〜１０％のＣＬＧペプチドＥＢＶ特異的ＣＤ８  Ｔ細胞）を、０日目及び２０日目に１０×１０６個の静脈内移入を介して２回加えた（図８Ａにおいて詳細を参照）。抗体／イムノコンジュゲートの処置スケジュールは以下の通りであった。
＜ＣＤＣＰ１＞−ＩｇＧ４−ＳＳ−ＣＬＧペプチド（実施例３に記載されるように生成、ＩｇＧ４定常鎖を有する）：
５ｍｇ／ｋｇ（０、３、６、９、１３、１６、２０、２３、２７、３０日目）
対照ＡＢ：＜ＣＤＣＰ１＞−ＩｇＧ４（ＩｇＧ４定常鎖）：
５ｍｇ／ｋｇ（０、３、６、９、１３、１６、２０、２３、２７、３０日目）
【０２３１】
試験スキーム及び結果を図８Ａ及びＢに示す。結果は、ＣＬＧ特異的ｈｕＰＢＭＣの養子移入を受けたＭＤＡ−ＭＢ２３１皮下注射異種移植モデルにおける、モノクローナル抗ＣＤＣＰ１抗体を含む本発明によるイムノコンジュゲートのインビボ有効性を実証する。
【０２３２】
実施例１１：インビボでの概念ＩＩの証明
ｈｕＰＢＭＣ（ＥＢＶ特異的ＣＤ８  Ｔ細胞を含む）の静脈内移入を受けた樹立されたＭＤＡ−ＭＢ２３１皮下注射モデルにおいて、抗ＰＤ１処置と組み合わせた、モノクローナル抗ＣＤＣＰ１抗体及びＥＢＶペプチドを含む本発明によるイムノコンジュゲートの抗腫瘍活性
０日目にＮＯＧマウスにヒト腫瘍細胞（５×１０６  Ｍｉｏ  ＭＤＡ−ＭＢ  ２３１）を皮下注射により異種移植した。ヒトＰＢＭＣ刺激（〜１０％のＣＬＧペプチドＥＢＶ特異的ＣＤ８  Ｔ細胞）を、２０日目及び３２日目に１０×１０６個の静脈内移入を介して２回加えた（図８Ａにおいて詳細を参照）。試験コンジュゲート＜ＣＤＣＰ１＞−ＩｇＧ１−ＰＧＬａｌａ−ＳＳ−ＣＬＧペプチド（実施例３に記載されるように生成、Ｆｃ部分に変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックス）を有するＩｇＧ１定常鎖を有する）による試験群及び対照抗体＜ＣＤＣＰ１＞−ＩｇＧ１  ＰＧＬＡＬＡによる対照群、及び両方の群において抗ＰＤ１抗体を加えたものの処置スケジュールは以下の通りであった：
0006791865.tif 000010
【０２３３】
試験スキーム及び結果を図９Ａ及びＢに示す。結果は、養子移入されたＥＢＶ  ＣＬＧ特異的ｈｕＰＢＭＣを有するＭＤＡ−ＭＢ２３１異種移植モデルにおける、モノクローナル抗ＣＤＣＰ１抗体を含む本発明によるイムノコンジュゲートと抗ＰＤ−１療法の組み合わせ効果を実証する。抗ＰＤ−１抗体と組み合わせたＡＴＰＰによる処置後の腫瘍におけるＣＬＧ特異的Ｔ細胞の強力な増加が示された。
【図１Ａ】
0006791865.tif 000011
【図１Ｂ】
0006791865.tif 000012
【図１Ｃ】
0006791865.tif 000013
【図１Ｄ】
0006791865.tif 000014
【図１Ｅ】
0006791865.tif 000015
【図２】
0006791865.tif 000016
【図３】
0006791865.tif 000017
【図４】
0006791865.tif 000018
【図５Ａ】
0006791865.tif 000019
【図５Ｂ】
0006791865.tif 000020
【図５Ｃ】
0006791865.tif 000021
【図６Ａ】
0006791865.tif 000022
【図６Ｂ】
0006791865.tif 000023
【図６Ｃ】
0006791865.tif 000024
【図７Ａ】
0006791865.tif 000025
【図７Ｂ】
0006791865.tif 000026
【図７Ｃ】
0006791865.tif 000027
【図７Ｄ】
0006791865.tif 000028
【図７Ｅ】
0006791865.tif 000029
【図７Ｆ】
0006791865.tif 000030
【図８Ａ】
0006791865.tif 000031
【図８Ｂ】
0006791865.tif 000032
【図９Ａ】
0006791865.tif 000033
【図９Ｂ】
0006791865.tif 000034
【図９Ｃ】
0006791865.tif 000035
【配列表】
0006791865000001.app